(57)【要約】      （修正有）【課題】修飾したフューリン抵抗性ヒトＴＳＬＰポリペプチド、および修飾したヒトＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、該配列の１２７−１３１の位置にあるフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫを不活性化するように修飾され、かつ少なくとも１つのＴＳＬＰ活性を有するポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドを含む医薬組成物、Ｂ細胞およびＴ細胞活性化薬、並びに、患者に有効量の前記タンパク質を投与することを含む疾患の治療法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の１２７−１３１の位置にあるフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫを不活性化するように修飾され、かつ少なくとも１つのＴＳＬＰ活性を有するポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４、１６、１７または１８に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ不活性化フューリン開裂部位および少なくとも１つのＴＳＬＰ活性を有するポリペプチドを、ポリヌクレオチドがコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはその相補体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、該ポリヌクレオチドが不活性化フューリン開裂部位および少なくとも１つのＴＳＬＰ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
さらに、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、請求項１に記載のポリヌクレオチドと読み枠が一致した状態で含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
異種タンパク質が細胞ターゲティング部分またはペプチドタグである、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
細胞ターゲティング部分が、細胞表面抗原を結合する抗体または細胞表面受容体に結合するリガンドである、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
異種タンパク質がＦｃポリペプチドである、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項８】
機能可能な状態で転写または翻訳調節配列に結合した、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
転写または翻訳調節配列が転写プロモーターまたはエンハンサーを含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の１２７−１３１の位置にあるフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫを不活性化するように修飾され、かつ少なくとも１つのＴＳＬＰ活性を有する、修飾したヒト胸腺ストローマ細胞リンホポエチン（ＴＳＬＰ）ポリペプチドを含むタンパク質。
【請求項１１】
ポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４、１６、１７および１８に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、ポリペプチドが不活性化フューリン開裂部位および少なくとも１つのＴＳＬＰ活性を有する、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１２】
ポリペプチドが異種タンパク質に融合している、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１３】
異種タンパク質がペプチドタグまたは細胞ターゲティング部分である、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
異種タンパク質がＦｃポリペプチドである、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子を発現するように遺伝子工学的に処理された宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１０に記載のポリペプチドおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子を発現するように遺伝子工学的に処理された宿主細胞をインキュベートし、そして、少なくとも１つの機能性ヒトＴＳＬＰ活性を有するフューリン抵抗性ポリペプチドを産生させる方法。
【請求項１９】
患者においてリンパ球増殖、リンパ球形成を刺激する療法であって、患者に有効量の請求項１０に記載のタンパク質または請求項１２に記載のタンパク質を投与することを含む方法。
【請求項２０】
ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発する方法であって、ＳＴＡＴ５を含有する試料を請求項１０に記載のタンパク質または請求項１２に記載のタンパク質と接触させることを含む方法。
【請求項２１】
請求項１０に記載のタンパク質およびキャリヤーを含むワクチンアジュバント。
【請求項２２】
リンパ球増殖を刺激するための、リンパ球形成を促進するための、あるいはＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発するための医薬の製造における、請求項１に記載の核酸分子または請求項１０に記載のタンパク質の使用。
【請求項２３】
請求項１０に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、米国仮特許出願番号６０／３０７，３４５（２００１年７月２３日出願）の優先権を主張し、その開示内容全体をよりどころとし、参考として援用する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般に、組換えタンパク質の発現に関する。より詳細には本発明は、哺乳動物細胞培養における分解に対して抵抗性である、修飾した組換えヒト胸腺ストローマ細胞リンホポエチン（ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＳＬＰ）ポリペプチド、修飾ＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ならびにＴＳＬＰの製造方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の記載
胸腺ストローマ細胞リンホポエチン（ＴＳＬＰ）は、Ｂ細胞およびＴ細胞の発達と成熟の両方に不可欠な成長因子である。特にネズミＴＳＬＰはＢリンパ球形成を支持し、Ｂ細胞増殖に必要である。ネズミＴＳＬＰは、Ｔ細胞受容体−ガンマ（ＴＣＲγ）遺伝子座の再配列の制御にも重要であり、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞に対して実質的な刺激作用をもつ。たとえばＦｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２２：３２１−３２８；Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：１０−１６；Ｃａｎｄｅｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５７：９−１４参照。
【０００４】
ＴＳＬＰは、ＩＬ−７に類似するサイトカイン活性をもつ。たとえば、ＴＳＬＰはＢ細胞増殖応答の刺激においてＩＬ−７の代替となりうる（Ｆｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。ＴＳＬＰとＩＬ−７は異なるメカニズムでそれらのリンパ球形成作用を仲介すると思われる。たとえばＩＬ−７は、ＪＡＫ１およびＪＡＫ３を含めたジャヌス（Ｊａｎｕｓ）ファミリーのチロシンキナーゼを活性化し、ＳＴＡＴ５（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ５）タンパク質の活性を調節する。ＴＳＬＰはＳＴＡＴ５の活性を調節するが、ジャヌスファミリーのチロシンキナーゼメンバーのいずれも活性化しない（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：６７７−６８３）。ＴＳＬＰおよびＩＬ−７はターゲット細胞に対する類似の作用を仲介するが、それらは異なるシグナリング経路をもち、それらの生物学的応答は若干相異するとも思われる。
【０００５】
免疫系の調節において、特にＢおよびＴ細胞の増殖、発達および成熟の刺激においてＴＳＬＰが活性をもつことが知られていることから、この分子は魅力的な療法ツールとなっている。大量の活性ポリペプチドを産生する能力は、商業的なヒトＴＳＬＰ製造に必須である。哺乳動物細胞発現系における組換えポリペプチドの産生は、商業的なヒト療法用途に最も一般的に用いられる。
【０００６】
組換えｈｕＴＳＬＰポリペプチドは、ＷＯ  ００／２９５８１に記載されるように、哺乳動物細胞系を含めた多数の異なる発現系で発現されている。しかし、有用な量の活性ｈｕＴＳＬＰタンパク質を哺乳動物細胞において産生させるのは困難であった。特に、哺乳動物においてｈｕＴＳＬＰを発現させると分解生成物が得られることがしばしばある。代替ポリヌクレオチド分子、および有用な量の活性ｈｕＴＳＬＰポリペプチドの製造を達成する方法が求められている。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列はフューリン開裂部位を含むユニークアミノ酸配列を含有することが見いだされた。本発明に従ってフューリン開裂部位を不活性化するようにポリペプチドを修飾すると、修飾されたプロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰポリペプチドが得られる。これらは、哺乳動物細胞系での発現に際し、非修飾ＴＳＬＰポリペプチドと比較して安定である。
【０００８】
本発明の修飾したプロテアーゼ抵抗性ヒトＴＳＬＰポリペプチドには、後記の表１に示すように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のほぼアミノ酸残基１２７−１３１に位置するフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫを変化させて不活性化するアミノ酸配列修飾を１以上もつものが含まれる。適切な修飾には、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはこれらの組合わせであって、アミノ酸配列ＲＲＫＲＫを変化させてフューリン開裂部位パターンＲＸＸＲを撹乱するもの、特にパターンＲＸ（Ｒ／Ｋ）Ｒを撹乱するものが含まれる。アミノ酸配列がこれらの修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドおよびそのフラグメントであって、天然ＴＳＬＰの望ましい活性を保持しかつプロテアーゼ抵抗性であるものも含まれる。１態様においては、ｈｕＴＳＬＰポリペプチドのアミノ酸配列から配列ＲＫＲＫまたはＲＫＲＫＶを欠失させた。
【０００９】
本発明は、前記の修飾したプロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子をも提供する。本発明のポリヌクレオチド分子には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基１２７−１３１に位置するフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］をコードするコドンを撹乱その他の形で不活性化する、読み枠内の核酸配列修飾をもつものが含まれる。この開裂部位の適切な修飾には、読み枠内の核酸置換、欠失、付加、またはこれらの組合わせであって、ＲＲＫＲＫをコードする核酸配列を変化させて、コードされるフューリン開裂部位パターンＲＸＸＲ、特にＲＸ（Ｒ／Ｋ）Ｒを撹乱するものが含まれる。態様には、たとえばＲＲＫＲＫをコードするヌクレオチド配列ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］を欠失した、またはアミノ酸配列ＲＫＲＫＶ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８］をコードするヌクレオチド配列ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＣ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］を欠失した、欠失変異体が含まれる。修飾ＴＳＬＰポリペプチドおよびそのフラグメントであって天然ＴＳＬＰの目的活性を保持しかつプロテアーゼ抵抗性であるものをコードするポリヌクレオチド分子に実質的に類似する配列をもつポリヌクレオチド分子も含まれる。
【００１０】
本発明は、可溶形および融合タンパク質を含めた、さらなる型の修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドをも提供する。たとえば本発明の融合タンパク質には、ポリペプチドの精製、オリゴマー化、安定性、分泌または同定を容易にするなどの目的機能を与える異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質またはペプチドに融合した、修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドが含まれる。本発明の融合タンパク質は、たとえば、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子と読み枠が一致した状態でプロテアーゼ抵抗性修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含有する発現構築体から調製できる。
【００１１】
本発明は、修飾したプロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰポリヌクレオチド分子を含有するベクター、プラスミド、発現系、宿主細胞などをも提供する。本発明の修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドを調製するための遺伝子工学的方法には、無細胞系、細胞性宿主、組織および動物モデルにおける既知方法でのポリヌクレオチド分子の発現が含まれる。
【００１２】
本発明にはさらに、実質的に精製された本発明の修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドおよび許容できるキャリヤーを含有する組成物が含まれる。好ましいものは、細胞、組織または患者に投与するのに適した、たとえば免疫不全障害、ウイルス感染症および細菌感染症の療法処置においてＢ細胞およびＴ細胞の活性を誘発するのに有用な、医薬組成物である。
【００１３】
これらおよび他の多様な本発明の特色および利点は、以下の詳細な説明を読み、特許請求の範囲を見ることによって明らかになるであろう。
配列の簡単な説明
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ネズミＴＳＬＰをコードするポリヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ２３２９３７）である。
【００１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によりコードされるネズミＴＳＬＰのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ヒトＴＳＬＰをコードするポリヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ０３７１１５）である。
【００１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によりコードされるヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、フューリン開裂部位ＲＲＫＲＫをコードするポリヌクレオチド配列ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡである。
【００１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５によりコードされるアミノ酸配列ＲＲＫＲＫである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、ヒトＴＳＬＰには存在するがネズミＴＳＬＰには存在しないアミノ酸配列ＲＫＲＫＶをコードする、ポリヌクレオチド配列ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＣである。
【００１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７によりコードされるアミノ酸配列ＲＫＲＫＶである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９は、フューリン開裂部位ＲＲＫＲＫをコードする配列ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡに対して読み枠内の１以上の修飾をもち、その結果フューリン開裂部位が不活性化された修飾ヒトＴＳＬＰをコードする、ポリヌクレオチド配列である。
【００１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９によりコードされる修飾ＴＳＬＰのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、アミノ酸ＲＫＲＫをコードするコドンＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡが欠失した、修飾ＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１によりコードされる修飾ＴＳＬＰポリペプチドのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３は、アミノ酸ＲＲＫＲＫをコードするコドンＡＧＧ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡが欠失した、修飾ＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３によりコードされる修飾ＴＳＬＰポリペプチドのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５は、アミノ酸ＲＫＲＫＶをコードするコドンＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＣが欠失した、修飾ＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５によりコードされる修飾ＴＳＬＰポリペプチドのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７は、修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチドである。
【００２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８は、修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチドである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９は、ＰＣＲフォアワードプライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は、ＰＣＲフォアワードプライマーである。
【００２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１は、ＰＣＲリバースプライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２は、ＰＣＲリバースプライマーである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
定義：
本明細書中で頻繁に使用する特定の用語の理解を容易にするために以下の定義を示す。これらは本発明の範囲を限定するためのものではない。
【００２５】
”アミノ酸”は、２０種類の標準的α−アミノ酸のいずれか、ならびに天然および合成誘導体のいずれかを表わす。アミノ酸またはアミノ酸配列に対する修飾は自然のプロセス、たとえば翻訳後プロセシングに際して起きる可能性があり、あるいは既知の化学的修飾を含むことができる。修飾には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：リン酸化、ユビキチン化、アセチル化、アミド化、グリコシル化、フラビンの共有結合、ＡＤＰ−リボシル化、架橋、ヨウ素化、メチル化など。
【００２６】
本明細書中で用いる用語”抗体”は、下記を含めた無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体を表わす：ポリクローナル抗体（たとえばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）参照）、およびモノクローナル抗体（たとえばＵＳＰ  ＲＥ３２，０１１、４，９０２，６１４、４，５４３，４３９および４，４１１，９９３、ならびにＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔ，ＭｃＫｅａｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ（編）（１９８０）参照）。用語”抗体”は、組換えＤＮＡ法、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的開裂により生成する抗体フラグメント、たとえばＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、および一本鎖抗体をも表わす。用語”抗体”は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位をもつ人工的ハイブリッド抗体である二特異性または二機能性抗体をも表わす。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含めた多様な方法で調製できる（Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−１５５３参照）。本明細書中で用いる用語”抗体”は、キメラ抗体、すなわちヒト抗体免疫グロブリン定常ドメインが１以上の非ヒト抗体免疫グロブリン可変ドメインに結合した抗体、またはそのフラグメントをも表わす（たとえばＵＳＰ５，５９５，８９８およびＵＳＰ５，６９３，４９３参照）。抗体は下記のものをも表わす：”ヒト化抗体”（たとえばＵＳＰ４，８１６，５６７およびＷＯ９４／１０３３２参照）、ミニボディー（ＷＯ９４／０９８１７）、およびヒト抗体を産生しうるトランスジェニック動物であって、ある割合のヒト抗体産生遺伝子を含むが内因性抗体を産生しないトランスジェニック動物が産生する抗体（たとえばＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６；およびＵＳＰ６，３００，１２９参照）。用語”抗体”には、多量体形抗体、すなわちタンパク質の高次複合体、たとえばヘテロ二量体抗体も含まれる。”抗体”には下記のものも含まれる：抗イディオタイプ抗体、たとえば腫瘍抗原ｇｐ７２をターゲティングする抗体に対する抗イディオタイプ抗体；ガングリオシドＧＤ３に対する抗体；またはガングリオシドＧＤ２に対する抗体。
【００２７】
”Ｆｃ”または”Ｆｃポリペプチド”は、抗体のＦｃドメインを含有するポリペプチドを表わす。”Ｆｃドメイン”は、細胞上にある抗体受容体への結合に関与する抗体部分を表わす。Ｆｃドメインは、下記のうちの１つ、２つ、またはすべてを含有することができる：定常Ｈ１ドメイン（ＣＨ１）、定常Ｈ２ドメイン（ＣＨ２）、定常Ｈ３ドメイン（ＣＨ３）、およびヒンジ部。たとえばヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ部を含有するが、ＣＨ１ドメインを含有しない。二量体化を促進するヒンジ部を含有するトランケート形のそのようなポリペプチドも含まれる。たとえばＣ．Ａ．Ｈａｓｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄｏｎａｌｄ  Ｃａｐｒａ，免疫グロビン：構造と機能，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，２０９，２１０−２１８（１９８９）参照。
【００２８】
”アンチセンス”は、ターゲット”センス”ポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を表わす。
”細胞ターゲティング部分”は、天然に生じたまたは遺伝子工学的に作製したポリペプチド上のいずれかのシグナルであって、ポリペプチドを細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは自然材料へターゲティングするために用いられるものを表わす。
【００２９】
”相補的”または”相補性”は、あるポリヌクレオチド分子中のポリヌクレオチドが第２ポリヌクレオチド分子中の他のポリヌクレオチドと塩基対を形成する能力を表わす。たとえば配列Ａ−Ｇ−Ｔは配列Ｔ−Ｃ−Ａに対して相補的である。相補性は、一部のポリヌクレオチドのみが塩基対合に従って整合する部分的なものであってもよく、あるいは全部のポリヌクレオチドが塩基対合に従って整合する完全なものであってもよい。
【００３０】
本明細書中で用いる用語”誘導体”は、少なくとも１つの化学的付加部分または少なくとも１つの付加ポリペプチド、たとえばグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基、またはＣ−末端もしくはＮ−末端融合タンパク質などに結合して共有結合体または凝集結合体を形成した、修飾された抵抗性ＴＳＬＰポリペプチドを表わす。
【００３１】
”発現”は、宿主細胞内で起きる転写および翻訳を表わす。宿主細胞におけるＤＮＡ分子発現レベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量、または宿主細胞が産生する、ＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質の量に基づいて測定できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１８．１−１８．８８）。
【００３２】
本明細書中で用いる用語”フューリン開裂部位”は、フューリンが認識して開裂するアミノ酸配列を表わす。たとえばヒトＴＳＬＰにおいて、フューリン開裂部位は配列ＲＲＫＲＫ内に同定されている。一般にフューリンに対する最小開裂部位はＲＸＸＲ、より好ましくはＲＸ（Ｒ／Ｋ）Ｒである（Ｎａｋａｙａｍａ  １９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２７：６２５−３５）。用語”フューリン”は、多様なタンパク質のプロセシングに関与するカルシウム依存性セリンプロテアーゼを表わす。フューリンは、種々のプロタンパク質、たとえば成長因子前駆体を開裂して生物活性タンパク質にすることが知られている。フューリンｍＲＮＡは検査されたすべての組織および細胞系に検出されており、これは、その活性が遍在性であってタンパク質のいずれか特定のターゲット基に限定されるわけではないことを示唆する。フューリンが開裂するプレタンパク質の例には、種々の成長因子、成長因子受容体、血液の凝固および相補カスケードに関与する血漿タンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ウイルスエンベロープ糖タンパク質、および細菌内毒素が含まれる。
【００３３】
本明細書中で用いる用語”修飾ＴＳＬＰポリペプチド”または”修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチド”は、”フューリン抵抗性ＴＳＬＰ”または”プロテアーゼ抵抗性ＴＳＬＰ”と互換性をもって用いられ、フューリン開裂部位ＲＸＸＲを不活性化するように修飾され、なおかつＴＳＬＰ活性（たとえばＢ細胞もしくはＴ細胞の増殖もしくは発達の刺激、またはＴＳＬＰ受容体への結合）を維持する、いずれかのｈｕＴＳＬＰポリペプチドを表わす；たとえばＷＯ  ００／２９５８１または後記実施例に記載。用語”修飾ＴＳＬＰポリペプチド”には、変異体、およびフラグメント、たとえば細胞外ドメイン、および誘導体、たとえば融合タンパク質も含まれる。
【００３４】
”融合タンパク質”は、異種ポリペプチドを組換えＤＮＡ法により結合させたタンパク質を表わす。融合異種ポリペプチドは、特定の機能、たとえば細胞における融合タンパク質の位置を決定し、融合タンパク質の安定性を高め、融合タンパク質の精製を容易にし、またはそのタンパク質を目的とする抗原もしくは細胞へターゲティングするなどの機能を備えることができる。そのような融合タンパク質の例には、免疫グロブリン分子の一部（たとえばＦｃフラグメント）に融合したポリペプチド、ヒスチジンタグ、成長因子などに融合したポリペプチドが含まれる；ＷＯ  ００／２９５８１に記載。
【００３５】
”遺伝子工学的に処理（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）”は、当該タンパク質を発現する真核宿主細胞を処理するために用いられるいずれかの組換え法を表わす。宿主細胞を遺伝子工学的に作製するための方法およびベクターは周知である；たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，１９８８，および年４回の改訂版）に種々の技術が示されている。遺伝子工学的方法には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：発現ベクター、ターゲティングした相同組換え、ならびに遺伝子活性化（たとえばＵＳＰ５，２７２，０７１参照，Ｃｈａｐｐｅｌ）および工学的に作製した転写因子によるトランス活性化（たとえばＳｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６）：２７５８−６３参照）。
【００３６】
”相同性”は、ポリヌクレオチド間の相補度を表わす。ポリヌクレオチド分子間の相補度は、ポリヌクレオチド分子間のハイブリダイゼーションの効率および強度に重要な影響を及ぼす。
【００３７】
”宿主細胞（単数又は複数）”は、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養において樹立した細胞を表わす。本明細書に定義するフューリン抵抗性ＴＳＬＰを発現しうることが、本明細書中で述べる宿主細胞の特徴である。本発明の各態様に有用な適切な宿主細胞の例には哺乳動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。そのような細胞系の具体例には下記のものが含まれる：ヒト胚性腎細胞（２９３細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９５８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５−１２８１）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）（ＡＴＣＣ  ＨＢ８０６５）、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ２２）、ヒト大腸癌細胞（ＤＬＤ−１）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２２１）、ダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１３）、ＣＯＳ細胞およびＣＶ−１細胞。
【００３８】
”ハイブリダイゼーション”は、アニーリング期間中における相補的ポリヌクレオチドの対合を表わす。２つのポリヌクレオチド分子間のハイブリダイゼーションの強度は、２分子間の相同性、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドの融点、およびポリヌクレオチド内のＧ：Ｃ比により影響される。
【００３９】
”不活性化された”は、活性が非機能性にされたことを表わす。たとえばポリペプチド中のフューリン開裂部位は、アミノ酸配列を修飾することにより不活性化できる。野生型ポリペプチドと比較して、フューリン存在下での修飾ポリペプチドの開裂が低下し、好ましくは排除される。開裂の低下または排除は、たとえば野生型の開裂生成物と比較した開裂生成物の変化により証明される。
【００４０】
”単離された”は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが普通は付随する少なくとも１種類の混入物質（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）から分離されたことを表わす。たとえば単離されたポリヌクレオチドは、自然界でみられるものと異なる概念または形態である。
【００４１】
本明細書中で用いる用語”ｈｕＴＳＬＰポリペプチド”は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示したアミノ酸配列をもつヒトＴＳＬＰポリペプチド、またはそのポリペプチドの変異体もしくはフラグメントであってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＴＳＬＰがもつ少なくとも１つの活性を保持するものを表わす。変異体は、変化していないタンパク質のアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列をもつポリペプチド、またはそのフラグメントである。本発明の目的について”実質的に類似する”は、変化していないタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一、好ましくは少なくとも約９０％同一、より好ましくは少なくとも約９５％同一、より好ましくは少なくとも約９８％同一、最も好ましくは少なくとも約９９％同一であり、かつ変化していないポリペプチドの活性を保持することである。生物学的活性に影響を及ぼさないと思われる保存的置換であるアミノ酸置換は、本発明の目的について同一とみなされ、下記のものがこれに含まれる：ＡｌａがＳｅｒ、ＶａｌがＩｌｅ、ＡｓｐがＧｌｕ、ＴｈｒがＳｅｒ、ＡｌａがＧｌｙ、ＡｌａがＴｈｒ、ＳｅｒがＡｓｎ、ＡｌａがＶａｌ、ＳｅｒがＧｌｙ、ＴｙｒがＰｈｅ、ＡｌａがＰｒｏ、ＬｙｓがＡｒｇ、ＡｓｐがＡｓｎ、ＬｅｕがＩｌｅ、ＬｅｕがＶａｌ、ＡｌａがＧｌｕ、ＡｓｐがＧｌｙを置換、およびその逆（たとえばＮｅｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９７９）参照）。
【００４２】
同一性％は、視覚検査と数学的計算により、または当業者が用いる種々のコンピュータープログラムによる２配列の比較により決定できる。たとえば、２配列の同一性％は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９（１９８１）のアルゴリズムに基づくＧＡＰコンピュータープログラム（ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手できる；ウィスコンシン州マディソン、ユニバーシティー・リサーチ・パーク）を用いて決定できる。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには下記のものが含まれる：（１）スコアリングマトリックスｂｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５（１９９２）に記載）；ギャップ加重１２；（３）ギャップ長さ加重４；および（４）末端ギャップにはペナルティなし。配列比較技術分野の当業者が用いる他のプログラムも使用できる。
【００４３】
”ポリヌクレオチド”は、ヌクレオチド配列を表わす。ヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチド配列、または両者の混合物である。本発明の概念におけるポリヌクレオチドの例には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ両方の混合物を含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは１以上の修飾ヌクレオチドを含有することができる。
【００４４】
本明細書中で用いる用語”タンパク質”と”ポリペプチド”は互換性をもって用いられ、ペプチド結合により結合した少なくとも１０個のアミノ酸の鎖であると考えられる。混入タンパク質からのタンパク質の精製は、任意数の既知方法により達成でき、これには硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。種々のタンパク質精製法がＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，１９８８，および年４回の改訂版）に示されている。
【００４５】
”ＳＴＡＴ５”は、１種類以上のＪＡＫキナーゼにより活性化され、核へ転位し、特異的ＤＮＡ部位への結合により転写調節に関与することが知られている、ＳＴＡＴ（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ファミリーの転写因子のメンバーを表わす。ＳＴＡＴ５活性の測定する技術には、ＤＮＡ結合アッセイ、ＳＴＡＴ５依存性レポーターアッセイ、ＳＴＡＴ５の３２Ｐ−標識などが含まれる；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，１９８８，および年４回の改訂版）に説明。
【００４６】
”胸腺ストローマ細胞リンホポエチン”（ＴＳＬＰ）は、血液リンパ球の発達プロセスを刺激する成長因子を表わす；たとえばＷＯ  ００／２９５８１、およびＳｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：６７１−６８０に記載。
【００４７】
”ベクター”、”染色体外ベクター”、または”発現ベクター”は、通常は二本鎖の第１ポリヌクレオチド分子であって、これに第２ポリヌクレオチド分子、たとえばフューリン抵抗性ヒトＴＳＬＰをコードするポリヌクレオチドなど異種ポリヌクレオチドを挿入できる分子を表わす。異種ポリヌクレオチドは、自然界で宿主細胞中にあるものまたは無いものであってもよく、自然界で宿主ゲノム中に存在する核酸配列の１以上の追加コピーであってもよい。ベクターは外来ポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内へ輸送する。ベクターは、宿主細胞に進入すると宿主細胞の染色体に組み込まれる。ベクターは、組み込まれたポリヌクレオチドを含有する細胞を選択するために必要な要素、およびトランスフェクションされたポリヌクレオチドからのｍＲＮＡの転写を促進するための要素をも含むことができる。本発明の範囲におけるベクターの例にはプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、レトロウイルス、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
別途記載しない限り、用いた技術は幾つか周知の参考文献、たとえば下記に見ることができる：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ）；”タンパク質精製の指針”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，３ｄ（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク）；およびＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，ニュージャージー州クリフトン）。
【００４９】
ＴＳＬＰポリペプチド
胸腺ストローマ細胞リンホポエチン（ＴＳＬＰ）は、サイトカインファミリーのリンパ球形成信号伝達因子のメンバーであって、Ｂ細胞およびＴ細胞の発達と成熟の両方に不可欠な成長因子である。ＴＳＬＰはＢ細胞リンパ球形成をＢ２２０＋／ＩｇＭ＋未熟Ｂ細胞段階にまで推進し、この因子に依存性の細胞系ＮＡＧ８／７の増殖を誘発する。ＴＳＬＰはＴ細胞受容体ガンマ（ＴＣＲγ）遺伝子座の再配列の制御に関与し、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞に対して実質的な刺激作用をもつ。
【００５０】
Ｂ細胞およびＴ細胞に対するＴＳＬＰの生物学的活性は、サイトカインＩＬ−７の活性と一部オーバーラップする。たとえばＴＳＬＰとＩＬ−７は両方とも、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞を共刺激し、ＮＡＧ８／７細胞系を維持し、胎児肝細胞においてＢ細胞リンパ球形成を支持する。これらのオーバーラップする機能は、ＴＳＬＰおよびＩＬ−７の受容体複合体がＩＬ−７Ｒアルファ鎖を共通に利用することにより生じると思われる（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９２（５）：６５９−６６９；Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２（２）：６７７−８３；Ｉｓａｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３（１１）：５９１−７）。ＩＬ−７受容体を遮断すると、ＩＬ−７およびＴＳＬＰ両方の活性が遮断されると思われる。
【００５１】
ＩＬ−７はＩＬ−１５と共に、免疫細胞であるＢ細胞およびＴ細胞の発達と機能に重要である。ＩＬ−７は、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の発達、ならびにナイーブおよび記憶ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖と生存を補助する。ＩＬ−１５はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の発達に重要であり、記憶ＣＤ８細胞の発達に関与するが、記憶ＣＤ４細胞の発達には関与しない。
【００５２】
ＩＬ−１５ノックアウトマウスモデルおよびＩＬ−７受容体アルファ鎖に対して形成された抗体を用いて、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞（ＯＴＩ  ＴｇＴ細胞およびポリクローナル抗体ＣＤ４４  ｌｏを含む）の増殖にはＩＬ−１５ではなくＩＬ−７が必要であると判定された。短期ＨＤＰ（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｄｒｉｖｅｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）による記憶ＣＤ８  Ｔ細胞（ＯＴＩまたはポリクローナルＣＤ４４  ｈｉ）の増殖は、ＩＬ−１５ノックアウトマウスにおいて、および抗ＩＬ−７受容体モノクローナル抗体による野生型マウスの処理により、遅延する。ＩＬ−１５の不存在およびＩＬ−７受容体機能の阻害により、記憶Ｔ細胞増殖はほぼ完全に阻害される。ＣＤ８記憶Ｔ細胞の恒常的な基礎増殖は、ＩＬ−１５ノックアウトマウスにおいて遮断される。抗ＩＬ−７受容体モノクローナル抗体による処理は、野生型マウスにおける増殖を遅延させた。ＩＬ−１５の不存在下およびＩＬ−７受容体機能の阻害下では、Ｔ細胞の生存が影響を受ける。これらの結果は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５がＣＤ８記憶Ｔ細胞の増殖と生存に必須であることを示す。ＴＳＬＰとＩＬ−７はＴ細胞に対しＩＬ−７受容体を介して共通のオーバーラップした機能活性をもつので、ＴＳＬＰもＣＤ８記憶Ｔ細胞の増殖と生存を促進する機能をもつと推定される。記憶Ｔ細胞データは、ＴＳＬＰが長期免疫獲得に有用であり、したがってワクチンアジュバントとして使用できることを示す。
【００５３】
より具体的には、ＴＳＬＰは方向づけられた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）Ｂ２２０＋  Ｂ細胞前駆体の増殖および分化をインビトロで支持する（Ｒａｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：１０−１６）。ＩＬ−７またはＴＳＬＰの存在下でインキュベートした細胞は、プロＢ細胞段階のＢ細胞分化に特徴的な細胞表面マーカーを発現する。ＴＳＬＰは、インビトロ培養の最初の４〜６日間は、ＩＬ−７の代わりに、方向づけられていないバイオポテンシャル前駆体からＢ細胞前駆体への進行を支持することができる。ＴＳＬＰは、ＣＢＡ／Ｎマウス由来のＢ細胞前駆体が示す持続増殖応答の支持においても、ＩＬ−７の代替となりうる。ＴＳＬＰは、胎児肝または骨髄由来のＢ２２０＋プレＢ細胞の拡張も、インビトロで数日間支持する。ＴＳＬＰは、骨髄から単離したプレＢ細胞の増殖および分化も、ストローマ細胞系Ｓ１７の存在下で、マイトジェン応答性になる段階まで促進する。
【００５４】
ＴＳＬＰは、インビトロでＢ細胞前駆体の拡張および分化を促進し、インビトロでＢ２２０＋前駆体および方向づけられていないバイオポテンシャル前駆体からのＢ細胞の発達の支持においてＩＬ−７の代替となりうる。Ｂ系列およびＴ系列の細胞増殖を刺激する技術は周知であり（Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，前掲；Ｎａｍｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８７：１８８１−１８９０）、臍帯血および骨髄などの供給源に由来する造血細胞を拡張する技術も周知である（Ｗ．Ｐｉａｃｉｂｅｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ，８９（８）：２６４４−２６５３）。ＴＳＬＰは、単独で、または他のサイトカイン、たとえばＩＬ−７と組み合わせて、臍帯血または骨髄の移植のために多能性幹細胞の再生および拡張を制御し、増幅するのに使用できる。
【００５５】
組換えＩＬ−７は、オートロガス骨髄移植後の患者の免疫系を再構成するために用いられている（Ａｂｄｕｌ−Ｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：１４１６−１４２２）。ＩＬ−７はプレＢ細胞および未熟胸腺細胞の増殖および分化を誘発する。ＴＳＬＰは、プレＢ細胞に対して類似の増殖作用を誘発する。したがって、ＴＳＬＰは、単独で、または他のサイトカインもしくは成長因子、たとえばＩＬ−７と組み合わせて、造血細胞の増殖および分化を刺激するのに使用できる。
【００５６】
ＴＳＬＰは、両イソ形ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂ）のチロシンリン酸化を誘発し、その結果ＳＴＡＴ５−ＤＮＡ複合体が形成され、ＳＴＡＴ５のフィードバックモジュレーターであるＳＴＡＴ５応答遺伝子ＣＩＳが転写される（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，前掲；Ｉｓａｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。ＳＴＡＴ５は、ＳＴＡＴ５欠損マウスにおいて広く研究されている。一方または両方の形のＳＴＡＴ５が、免疫系の調節、造血、性的二形性成長、乳腺の発達、毛髪の成長、脂肪組織の沈着、および妊娠において役割をもつ（Ｄａｖｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６５：９５９−９６５）。単離したばかりのリンパ性白血病細胞の多くの例がＳＴＡＴ５の構成性活性化を呈することが示された（Ｎｏｓａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１７）：４７５４−４７６５）。
【００５７】
ＳＴＡＴ５により調節される活性の一例として、乳腺の正常な成長および分化にＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂが必要である（Ｒｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４７）：３１３１７−３１３２６）。ＳＴＡＴ５ａ欠損マウスは乳腺小葉の増殖成長がなく、雌は授乳できない。ＳＴＡＴ５ｂ欠損雌マウスは、乳腺の発達に欠陥がある。
【００５８】
ＴＳＬＰは、Ｂ細胞およびＴ細胞の発達において中心的な作用因子であると思われる。ＴＳＬＰタンパク質は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の増殖および成熟を刺激することを目標とした療法および処置、たとえばエイズなどの免疫障害の処置に有用である。たとえば抗ＴＳＬＰ抗体により、またはＴＳＬＰ受容体と不活性ＴＳＬＰフラグメントもしくはＴＳＬＰの阻害性類似体との結合によりＴＳＬＰの発現を阻害すると、Ｂ細胞およびＴ細胞の発達および増殖を阻害することができ、たとえば自己免疫疾患の処置または移植臓器の拒絶予防の療法に有用である。
【００５９】
ヒトＴＳＬＰポリペプチドはＷＯ  ００／２９５８１に記載されている。全長ヒトＴＳＬＰの好ましい１態様のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示す。コンピューター分析により、成熟ポリペプチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸２９−１５９に対応すると推定され、一方シグナルペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１−２８またはアミノ酸１から３４までもしくは１１６までに対応すると考えられる。ｈｕＴＳＬＰポリペプチドは、膜結合形または可溶性分泌形ポリペプチドであってよい。１態様において、可溶性ポリペプチドは細胞外ドメインの全部または一部を含むことができるが、ポリペプチドを細胞膜に保持させる膜貫通領域を欠失する。ヒトＴＳＬＰポリペプチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４がコードするポリペプチドの変異体であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の同一性をもち、かつ少なくとも１つのＴＳＬＰ機能を保持するもの、およびＴＳＬＰ機能を保持するそのフラグメントが含まれる。
【００６０】
プロテアーゼ抵抗性
ネズミＴＳＬＰをコードする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ２３２９３７）およびヒトＴＳＬＰをコードする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ０３７１１５）は、ＰＣＴ出願ＷＯ  ００／２９５８１に開示されている。後記実施例に詳述するように、ヒトＴＳＬＰ  ｃＤＮＡを哺乳動物において発現させると、分解生成物が得られることがしばしばある。
【００６１】
ヒトＴＳＬＰと異なり、ネズミＴＳＬＰは哺乳動物において発現させても分解しなかった。ヒトＴＳＬＰとネズミＴＳＬＰの核酸配列およびアミノ酸配列を比較すると、有意の相異がみられた。特に、ヒト核酸配列はネズミタンパク質に存在しないユニークアミノ酸領域１２７−ＲＲＫＲＶ−１３２をコードする。詳細な分析により、このユニークアミノ酸領域は推定フューリン開裂部位１２７−ＲＲＫＲＫ−１３１を含むことが示唆された。
【００６２】
後記実施例に詳述するように、哺乳動物細胞培養において過剰発現させ、単離したヒトＴＳＬＰタンパク質は、たとえば電気泳動により分析すると、ゲル上の多数のバンドとして示されるように多数のポリペプチドを含有する。このタンパク質混合物中の顕著なバンドは、約６ｋＤの分子量をもつ。この６ｋＤフラグメントのアミノ酸配列はＴＳＬＰのＣ末端に対応し、開裂点がフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫにあることを示唆した。このデータは、哺乳動物細胞において発現したヒトＴＳＬＰの分解がフューリン開裂部位における開裂の結果であることの直接的な証拠となる。
【００６３】
フューリン開裂部位は、ｈｕＴＳＬＰのアミノ酸配列において活性に必要であると考えられる４ヘリックス束の第４ヘリックス開始の約８残基前に位置する。ｈｕＴＳＬＰがこのフューリン開裂部位においてトランケートすると、３ヘリックス束サイトカインが生成し、マウスＴＳＬＰとｈｕＴＳＬＰに共通の保存システイン残基のうち最後のもの（分子内ジスルフィド結合形成に関与すると考えられる）も除去される。したがって、フューリン開裂部位におけるｈｕＴＳＬＰの開裂により、生物学的活性に必要な分子部分が除去されると考えられる。
【００６４】
本発明においては、ｈｕＴＳＬＰのフューリン開裂部位を同定し、ｈｕＴＳＬＰのフューリン開裂を阻止するように修飾した。本発明によれば、フューリン開裂部位ＲＲＫＲＫをコードするコドンのうち１以上を、たとえば部位特異的変異誘発により変化させて、フューリンによる開裂部位認識を阻止する。好ましくは、開裂部位を撹乱するように１以上のコドンを変化させる。最小フューリン認識部位はＲＸＸＲであるので、ｈｕＴＳＬＰのＲＸＸＲパターンを撹乱するいかなる修飾も本発明の範囲に含まれる。
【００６５】
修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチド
本発明の修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示したヒトＴＳＬＰアミノ酸配列を修飾してフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］を不活性化したポリペプチド、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列またはそのフラグメントに実質的に類似するアミノ酸配列をもち、フューリン開裂に対して抵抗性であり、かつヒトＴＳＬＰの機能活性を保持する変異体が含まれる。
【００６６】
本発明の目的について、用語”実質的に類似する”は、変化していないタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一、好ましくは少なくとも約９０％同一、より好ましくは少なくとも約９５％同一、より好ましくは少なくとも約９８％同一、最も好ましくは少なくとも約９９％同一であり、かつ変化していないポリペプチドの活性のうち少なくとも１つを少なくともある程度保持することを表わす。生物学的活性に影響を及ぼさないと思われる保存的置換であるアミノ酸置換は、本発明の目的について同一とみなされ、下記のものがこれに含まれる：ＡｌａがＳｅｒ、ＶａｌがＩｌｅ、ＡｓｐがＧｌｕ、ＴｈｒがＳｅｒ、ＡｌａがＧｌｙ、ＡｌａがＴｈｒ、ＳｅｒがＡｓｎ、ＡｌａがＶａｌ、ＳｅｒがＧｌｙ、ＴｙｒがＰｈｅ、ＡｌａがＰｒｏ、ＬｙｓがＡｒｇ、ＡｓｐがＡｓｎ、ＬｅｕがＩｌｅ、ＬｅｕがＶａｌ、ＡｌａがＧｌｕ、ＡｓｐがＧｌｙを置換、およびその逆（たとえばＮｅｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９７９）参照）。表現型においてサイレントなアミノ酸交換に関する情報はさらに、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０中にみられる。
【００６７】
フューリン開裂部位を不活性化するのに適した修飾には、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはこれらの組合わせであって、アミノ酸配列ＲＲＫＲＫを変化させてフューリン開裂部位パターンＲＸＸＲを撹乱するもの、特にパターンＲＸ（Ｒ／Ｋ）Ｒを撹乱するものが含まれる（これらにおいてＲはアルギニンを表わし、Ｋはリシンを表わし、Ｘは任意のアミノ酸を表わす）。１態様において、本発明の修飾ＴＳＬＰポリペプチド配列ではＲＫＲＫまたはＲＫＲＫＶを欠失させた。
【００６８】
好ましくは、フューリンが認識しうる二塩基性アミノ酸であるアルギニンまたはリシンが除去されるように、フューリン開裂部位内の少なくとも２個のアミノ酸を変化させる。たとえば、この修飾により１個以上の二塩基性アミノ酸を１個以上の中性アミノ酸で置換することができる。二塩基性アミノ酸を欠失させてもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の１２７−１３１アミノ酸領域内に挿入を行って開裂部位を撹乱することもできる。
【００６９】
１態様において、本発明の修飾ＴＳＬＰポリペプチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基１２７−ＲＲＫＲＫ−１３１のうち１個以上、好ましくは２個以上を欠失させて、ＲＸＸＲフューリン開裂パターンを撹乱したものが含まれる。たとえば、１個のアルギニン（Ｒ）を欠失させると、撹乱配列ＲＫＲＫまたはＲＲＫＫが得られる；２個のアルギニンを欠失させると、撹乱配列ＫＲＫまたはＲＫＫが得られる；３個のアルギニンを欠失させると、撹乱配列ＫＫが得られる。修飾ＴＳＬＰポリペプチドには、４個または５個すべての塩基性アミノ酸の欠失、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置１２８−ＲＫＲＫ−１３１または１２８−ＲＫＲＫＶ−１３２におけるＲＫＲＫ、ＲＲＫＲまたはＲＲＫＲＫの欠失も含まれる。
【００７０】
別態様において、本発明の修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチドには、ヒトＴＳＬＰアミノ酸配列におけるアミノ酸置換であって、アミノ酸残基１２７−ＲＲＫＲＫ−１３１のうち１個以上、好ましくは２個以上を異なるアミノ酸残基で置換して、ＲＸＸＲパターンを撹乱したものが含まれる。好ましくは、１個以上のアルギニンおよび／またはリシンを非塩基性アミノ酸、より好ましくは中性アミノ酸で置換する。たとえば、１個のアルギニン（Ｒ）を置換すると、撹乱配列ＲＸＫＲＫまたはＲＲＫＸＫが得られる；２個のアルギニンを置換すると、撹乱配列ＸＸＫＲＫまたはＸＲＫＸＫが得られる；３個のアルギニンを置換すると、撹乱配列ＸＸＫＸＫが得られる。５個すべての塩基性アミノ酸を置換して配列ＸＸＸＸＸにしたものが好ましい。ここでＸは非塩基性アミノ酸、好ましくは中性アミノ酸である。
【００７１】
本発明の修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチドには、ｈｕＴＳＬＰアミノ酸配列への付加も含まれる。この場合、１個以上のアミノ酸残基をフューリン開裂配列１２７−ＲＲＫＲＫ−１３１に挿入して、ＲＸＸＲパターンを撹乱する。たとえば２個以上のアミノ酸を挿入できる：たとえば配列１２７−ＲＲＺｎＫＲＫ−１３１（ＺはＲまたはＫではなく、ｎは１ではない）；１個以上、好ましくは２個以上のアミノ酸をアルギニン間に挿入できる：すなわち配列１２７−ＲＺｎＲＫＲＫ−１３１（ＺはＲまたはＫではなく、ｎは２ではない）など。好ましくは、ｎは３、４または５であり、Ｚは中性アミノ酸である。
【００７２】
修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチドの例
【００７３】
【表１】
2010279365.tif 000002
【００７４】
Ｘ（＊）は、フューリン開裂部位の活性を撹乱するアミノ酸置換、欠失、挿入、またはこれらの組合わせを表わすことができる。１態様例、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示した例では、Ｘで表わしたすべてのアミノ酸が修飾されて、ＲまたはＬ以外の任意のアミノ酸、好ましくは中性アミノ酸になっている。他の態様においては、１個以上、好ましくは２個以上のＸがアミノ酸欠失であり、最も好ましくは２個以上のアルギニン（Ｒ）残基が欠失し、最も好ましくは各Ｘが欠失アミノ酸を表わす。他の態様においては、１個以上、好ましくは２個以上のＸがＫまたはＲではないアミノ酸置換であり、好ましくは中性アミノ酸である。この態様においてＸＸＸＸＸは、たとえばＸＲＸＲＸ、ＸＲＸＲＫ、ＲＸＲＸＸまたはＲＸＲＸＫであってよい。
【００７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示すように、Ｚ（＊＊）はＲまたはＫではない任意のアミノ酸であってよく、好ましくは中性アミノ酸である。前記のように、ｎはＲＸＸＲパターンを撹乱する任意の数値であってよく、たとえばｎは１以上、好ましくは３、４または５である。フューラン開裂部位パターンＲＸＸＲ、特にＲＸＲ／ＫＲを不活性化するための方法の他の例は自明であり、本発明に含まれる。
【００７６】
前記に示した修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドの例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４、１６、１７または１８に示すアミノ酸配列をもつポリペプチド、および実質的にこれらの配列に類似するアミノ酸配列をもつポリペプチド、すなわちこれらのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の同一性をもち、フューリン開裂に対する抵抗性を保持し、かつ少なくとも１つのＴＳＬＰ活性をもつものが含まれる。ヒトＴＳＬＰポリペプチド活性は、たとえばヒトＴＳＬＰポリペプチドの変異体、誘導体またはフラグメントを後記実施例３に記載するＢＡＦ／ＨＲＴバイオアッセイすることにより、またはＦｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）の記載に従ったＮＡＧ８／７細胞増殖アッセイにより、またはＬｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）の記載に従ってＳＴＡＴ５活性化アッセイすることにより、容易に測定できる。
【００７７】
修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドは、膜結合形または可溶性分泌形ポリペプチドであってもよい。１態様において、可溶性の修飾ポリペプチドは細胞外ドメインの全部または一部を含むことができるが、ポリペプチドを細胞膜に保持させる膜貫通領域を欠失する。ヒトＴＳＬＰポリペプチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４がコードするポリペプチドの変異体であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の同一性をもち、かつ少なくとも１つのＴＳＬＰ機能を保持するもの、およびＴＳＬＰ機能を保持するそのフラグメント、たとえば可溶性ドメインが含まれる。
【００７８】
本発明の修飾ポリペプチドの有用な誘導体には、たとえば少なくとも１つの化学的付加部分または少なくとも１つの付加異種ポリペプチド、たとえばグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基、またはＣ−末端もしくはＮ−末端融合タンパク質などに結合して共有結合体または凝集結合体を形成した、修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチドが含まれる。好ましい異種ポリペプチドには、修飾ヒトＴＳＬＰの精製、安定性、細胞もしくは組織のターゲティング、または分泌を容易にするものが含まれる。
【００７９】
ヒトＴＳＬＰポリペプチドのアミノ酸配列の修飾は、多数の既知技術のいずれかにより達成できる。たとえば、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発などの既知方法により、特定の位置に変異を導入できる（Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ，４２：１３３；Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ，３７：７３；Ｃｒａｉｋ，１９８５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２−１９；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｏｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＵＳＰ４，５１８，５８４およびＵＳＰ４，７３７，４６２）。
【００８０】
本発明の修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチドは、好ましくは単離した形で、好ましくは実質的に精製した形で提供される。下記を含めた既知の方法で、組換え細胞培養物からポリペプチドを回収および精製することができる：硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。好ましい態様においては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を精製に用いる。
【００８１】
修飾ヒトＴＳＬＰを、そのポリペプチドの精製を容易にするために用いる異種領域に融合させることができる。入手可能な多数のペプチド（ペプチドタグ）により、融合タンパク質を結合パートナーに選択的に結合させることができる。限定ではないが、ペプチドタグの例には６−Ｈｉｓ、チオレドキシン、ヘマグルチニン、ＧＳＴ、およびＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる。ペプチドを認識してそれに結合する結合パートナーはいかなる分子または化合物であってもよく、異種ペプチドを結合して融合タンパク質の精製を可能にする金属イオン（たとえば金属アフィニティーカラム）、抗体、抗体フラグメント、およびいずれかのタンパク質またはペプチドがこれに含まれる。
【００８２】
修飾したフューリン開裂部位を含むフラグメント（フューリン開裂部位を欠失したフラグメントも含まれる）を用いて、修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドに特異的な抗体を生成することができる。これらのフラグメントは、アミノ酸５〜２０個、好ましくはアミノ酸５〜１０個の短いものである。既知の選択方法を用いて、特異的エピトープを選択し、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の生成に使用できる。そのような抗体は、プロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰ活性のアッセイ、プロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰの発現の特異的同定、および細胞培養物からの修飾ｈｕＴＳＬＰの精製に有用である。
【００８３】
修飾ＴＳＬＰポリヌクレオチド配列
本発明は、本発明の修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子をも提供する。本発明のポリヌクレオチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のほぼアミノ酸残基１２７−１３１に位置するフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］をコードするコドン、たとえばポリヌクレオチド配列ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］を撹乱その他の形で不活性化する、読み枠内のヌクレオチド配列修飾をもつものが含まれる。適切な修飾には、読み枠内の核酸置換、欠失、付加、またはこれらの組合わせであって、ＲＲＫＲＫをコードする配列を変化させて、コードされるフューリン開裂部位パターンＲＸＸＲ、特にＲＸ（Ｒ／Ｋ）Ｒを撹乱するものが含まれる。たとえば１態様においては、アミノ酸配列ＲＫＲＫＶ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８］をコードする配列ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＣ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］が欠失している。
【００８４】
修飾ヒトＴＳＬＰポリヌクレオチドの例
【００８５】
【表２】
2010279365.tif 000003
【００８６】
ｘ（＊）は、フューリン開裂部位の活性を撹乱する、読み枠内のヌクレオチド置換、欠失、挿入、またはこれらの組合わせを表わすことができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示した１態様例では、各ｘｘｘがＲまたはＬ以外の任意のアミノ酸、好ましくは中性アミノ酸をコードする。他の態様においては、１以上、好ましくは２以上のコドンｘｘｘが欠失し、最も好ましくはアルギニン（Ｒ）残基をコードする２以上のコドンが欠失し、最も好ましくは各ｘｘｘが欠失コドンを表わす。他の態様においては、１個以上、好ましくは２個以上のｘが、ＫまたはＲをコードするコドンを形成しない、好ましくは中性アミノ酸をコードするヌクレオチド置換である。他の態様においては、１以上のコドンが挿入されて、前記フューリン開裂部位のアミノ酸配列を撹乱する；たとえばＲＲＫＺｎＲＫ。コドンを修飾してフューリン開裂部位パターンＲＸＸＲ、特にＲＸＲ／ＫＲを不活性化するための他の方法の例は自明であり、本発明に含まれる。
【００８７】
したがって、本発明の修飾ｈｕＴＳＬＰポリヌクレオチドには、付加、欠失または置換が開裂部位を不活性化し、かつＴＳＬＰ活性を保持したフューリン抵抗性ｈｕＴＳＬＰポリペプチド分子をコードする限り、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対する、読み枠内の欠失、置換、または付加をもつポリヌクレオチドが含まれる。さらに、本発明のポリヌクレオチドには、実質的にこの修飾ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と類似する配列をもつポリヌクレオチドまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のフラグメントであって、少なくとも１つのＴＳＬＰ活性とフューリン抵抗性の両方を保持した修飾ＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。本明細書中で用いるように、核酸分子は、そのポリヌクレオチド配列が他の核酸分子の配列と少なくとも約８０％同一、好ましくは少なくとも約９０％同一、より好ましくは少なくとも約９５％同一、より好ましくは少なくとも約９８％同一、最も好ましくは少なくとも約９９％同一であり、かつＴＳＬＰ活性とフューリン抵抗性の両方を保持した本発明の修飾ＴＳＬＰポリペプチドをコードする場合、この他の（第２の）核酸分子と”実質的に類似する”。ポリヌクレオチド配列の同一性は、既知方法により、たとえばＧｒｅｇ  Ｓｃｈｕｌｅｒが作製したＭＡＣＡＷなどのソフチウェアプログラムにおいて２配列をアラインすることにより決定される。同一性％はさらに、視覚検査と数学的計算により、またはＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７が記載したＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６（ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手できる）を用いて配列情報を比較することにより決定できる。
【００８８】
本発明の修飾ｈｕＴＳＬＰポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組合わせであってよい。遺伝子コードの縮重のため、２つのＤＮＡ配列が異なるにもかかわらず同一アミノ酸配列をコードする可能性がある。したがって本発明は、修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をもつ核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、フューリン開裂部位ＲＲＫＲＫを不活性化するように修飾したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に実質的に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をもつ。本明細書中で用いる”実質的に類似する”とは、修飾ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも約８０％の同一性をもつポリペプチドであって、フューリン開裂に対する抵抗性とＴＳＬＰ活性の両方を保持したポリペプチドを表わす。
【００８９】
本発明には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１１、１３または１５をもつポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチド配列に実質的に類似するポリヌクレオチドも含まれる。本発明はさらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４、１６、１７または１８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらのポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００９０】
本発明ポリヌクレオチドの有用なフラグメントには、プローブおよびプライマーが含まれる。これらは、たとえばＰＣＲ法において修飾ｈｕＴＳＬＰポリヌクレオチドをインビトロで増幅してその存在を検出するために、ならびにサザンおよびノーザンブロット法においてプロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰを分析するために使用できる。本発明のプロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰポリヌクレオチド分子を一過性または安定に過剰発現する細胞も、このようなプローブを用いて同定できる。そのようなプライマーおよびプローブを調製および使用する方法は既知である。
【００９１】
他の有用なフラグメントには、ターゲットである修飾ｈｕＴＳＬＰ  ｍＲＮＡ（センス鎖を使用）またはＤＮＡ（アンチセンス鎖を使用）配列に結合しうる一本鎖核酸配列を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００９２】
ベクターおよび宿主細胞
本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクター、およびそのようなベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチド分子はいずれもベクターに含有させることができる。ベクターは一般に、選択マーカーおよび宿主における増殖のための複製起点を含む。ベクターはさらに、修飾ｈｕＴＳＬＰポリヌクレオチド分子に機能可能な状態で結合した適切な転写または翻訳調節配列、たとえば哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来するものを含む。そのような調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳を制御する適切な配列が含まれる。調節配列がターゲットタンパク質をコードするＤＮＡに対して機能的関係にある場合、それらのヌクレオチド配列は機能可能な状態で結合している。よって、プロモーターヌクレオチド配列が修飾ＴＳＬＰ配列の転写を指令するならば、そのプロモーターヌクレオチド配列は修飾ｈｕＴＳＬＰ  ＤＮＡ配列に機能可能な状態で結合している。
【００９３】
本発明のプロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰポリヌクレオチド分子のクローニングに適したベクターの選択は、ベクターにより形質転換する宿主細胞、および適用可能な場合にはターゲットポリペプチドを発現させる宿主細胞に依存するであろう。適切な宿主細胞には、原核細胞、酵母および高等動物細胞が含まれ、これらのそれぞれについて後記に述べる。哺乳動物細胞において修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドを発現させるのが好ましいことを留意されたい。
【００９４】
宿主細胞において発現させる修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドは、ＴＳＬＰポリペプチドおよび少なくとも１つの異種ポリペプチドを含む融合タンパク質であってもよい。前記のように、たとえば修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドの分泌、安定性、精製および／またはターゲティングを容易にするために、異種ポリペプチドをＴＳＬＰに融合させることができる。本発明により提供される融合タンパク質の例には、修飾ＴＳＬＰポリペプチドと、たとえばＦｃポリペプチドとの融合体、およびＴＳＬＰポリペプチドのオリゴマー化を促進するロイシンジッパードメインとの融合体が含まれる；ＷＯ  ００／２９５８１に記載。
【００９５】
他の態様においては、適切なシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに取り込ませることができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードする核酸配列を、読み枠が一致した状態で修飾ｈｕＴＳＬＰ配列に融合させることができ、これにより修飾ｈｕＴＳＬＰはシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳される。目的とする宿主細胞において機能するシグナルペプチドは、そのポリペプチドの細胞外分泌を促進する。好ましくは、修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドが細胞から分泌されると、シグナル配列はそのポリペプチドから開裂する。限定ではないが、本発明を実施する際に使用できるシグナル配列の例には、酵母Ｉ−因子およびＳｆ９昆虫細胞中のミツバチメラチン（ｍｅｌａｔｉｎ）リーダーが含まれる。
【００９６】
本発明のターゲットポリペプチドを発現させるのに適した宿主細胞には、原核細胞、酵母および高等真核細胞が含まれ；哺乳動物細胞が最も好ましい。これらのポリペプチドの発現に使用できる適切な原核細胞宿主には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の細菌、ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のメンバーが含まれる。原核細胞、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現について、修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、好ましくは組換えポリペプチドの発現を容易にするためのＮ末端メチオニン残基を含む。このＮ末端Ｍｅｔは所望により発現ポリペプチドから開裂してもよい。
【００９７】
原核宿主細胞において発現させるために用いる発現ベクターは、一般に１以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。そのような遺伝子は一般に、たとえば抗生物質耐性を付与するタンパク質または栄養要求性を与えるタンパク質をコードする。多様なそのようなベクターを業者から容易に入手できる。一例には、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ、メリーランド州ベテスダ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐＱＥベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ）が含まれる。
【００９８】
修飾ｈｕＴＳＬＰは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）およびクルベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を含めた属の酵母宿主細胞において発現させることもできる。好ましい酵母宿主はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。酵母ベクターは、２Ｔ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止のための配列、および選択マーカー遺伝子を含むことがしばしばある。酵母と大腸菌の両方において複製可能なベクター（シャトルベクターという）も使用できる。シャトルベクターは、酵母ベクターの前記特色のほか、大腸菌における複製および選択のための配列をも含む。酵母宿主において発現したターゲットポリペプチドの直接分泌は、修飾ｈｕＴＳＬＰをコードするヌクレオチド配列の５’末端に、酵母Ｉ−因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を組み込むことにより達成できる。
【００９９】
昆虫宿主細胞系も修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドの発現に使用できる。本発明のターゲットポリペプチドは、好ましくはバキュロウイルス発現系を用いて発現させる；Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７の概説に記載。
【０１００】
好ましい態様においては、本発明の修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドを哺乳動物宿主細胞において発現させる。限定ではないが、適切な哺乳動物細胞系の例には、下記のものが含まれる：ＣＯＳ−７サル腎細胞系（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ，２３：１７５）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９５８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５−１２８１）；ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０４７８）；２９３細胞、ＣＯＳ細胞およびヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）。
【０１０１】
本発明のターゲットポリペプチドを発現させるのに適した発現ベクターの選択は、使用する個々の宿主細胞に依存するであろう。適切な発現ベクターの例には、ｐＤＣ  ４０９（ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１）、ｐＤＣ  ３１７（Ｓｏｕｒｃｅ）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、およびＷＯ  ０１／２７２９９に記載のベクターが含まれる。
【０１０２】
哺乳動物宿主細胞に用いる発現ベクターは、ウイルスゲノム由来の転写および翻訳制御配列を含むことができる。慣用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列であって修飾ヒトＴＳＬＰを発現させるために使用できるものには、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現ベクターの構築方法は、たとえばＯｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２８０；Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５；Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：７６８；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６；およびＷＯ  ９１／１８９８２に示されている。
【０１０３】
特定のベクターへの挿入を容易にするため（たとえば制限部位の修飾による）、特定の発現系または宿主における使用を容易にするため（たとえば好ましい宿主コドンを使用）など、プロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰポリヌクレオチド分子の修飾は既知であり、本発明に使用できると考えられる。修飾ヒトＴＳＬＰポリペプチドを産生するための遺伝子工学的方法には、既知方法による無細胞発現系、細胞性宿主、組織、および動物モデルにおけるポリヌクレオチド分子の発現が含まれる。
【０１０４】
組成物
本発明は、実質的に精製された本発明の修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドおよびキャリヤーを含有する組成物を提供する。本発明は、医薬用途に適した、たとえば医薬的に許容できるキャリヤーを含有する組成物を、療法用として提供する。本発明の医薬組成物は、たとえばＢ細胞およびＴ細胞の活性を誘発するために；たとえば免疫抑制患者（たとえばエイズ）において免疫細胞の増殖および発達を刺激する療法処置のために、細胞、組織または患者に投与される。修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドを含有する医薬組成物は、ワクチンアジュバントとしても有用であり、たとえば長期免疫の獲得のために有用である。
【０１０５】
本発明は、ＢおよびＴ細胞活性の分析；ＳＴＡＴ５活性の分析；ならびに自然免疫系応答に関与するシグナル分子の阻害／刺激作用の分析に有用な試薬、組成物および方法をも提供する。
【０１０６】
抗体
本発明のポリペプチドの全部または一部を用いて、修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドの発現を検出するアッセイに有用な、また過剰発現させた修飾ヒトＴＳＬＰの精製に用いるための、抗体を生成することができる。修飾ＴＳＬＰポリペプチドに対する抗体は、ある系のＴＳＬＰ活性に対するアンタゴニストとして使用できる。ペプチドエピトープの選択および抗体産生のための方法は既知である。たとえば下記を参照：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｄ（編），１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（編），１９８０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク。
【０１０７】
本発明の修飾ＴＳＬＰポリペプチドの全部または一部は、抗体産生のほか、たとえばＴＳＬＰ受容体を発現する細胞および組織への結合をターゲティングするためのターゲティング部分として使用できる。
【０１０８】
アッセイ法
ヒトＴＳＬＰ活性は、Ｂ細胞およびＴ細胞の増殖および発達に対するｈｕＴＳＬＰ作用に関するアッセイ法を含めた多数のアッセイ法を用いて同定および測定できる。そのようなアッセイ法のひとつを実施例３に記載する。本明細書の実施例３に記載するように、増殖のために活性ＴＳＬＰを必要とし、ヒトＴＳＬＰ受容体を発現するＢＡＦ細胞（ＢＡＦ／ＨＴＲ）を用いて、ＴＳＬＰ活性を測定できる。ｈｕＴＳＬＰ活性を測定するための他のアッセイ法には、たとえばＷＯ  ００／２９５８１に記載されるように、ＴＳＬＰによるヒト骨髄からのＴ細胞増殖の誘発を測定するアッセイ法が含まれる。他のＴＳＬＰ活性は、参考文献Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：６７７−６８３および本明細書の実施例４に記載されるように、ＳＴＡＴ５を活性化する能力である。
【０１０９】
これらのアッセイ法を用いて、種々の修飾ＴＳＬＰポリペプチドならびにその変異体および誘導体についてＴＳＬＰ活性を相対的に測定および定量できる。さらに、これらのアッセイ法を用いて、ＴＳＬＰ活性を修飾する作用またはＴＳＬＰ活性を排除する作用をもつ薬剤を同定できる。たとえば被験薬剤の存在下で修飾ｈｕＴＳＬＰにより活性化される試験活性が被験薬剤の不存在下での活性と比較して低い場合、その被験薬剤は修飾ｈｕＴＳＬＰの活性を低下させたことを示す。被験薬剤の存在下でプロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰにより活性化された試験活性が被験薬剤の不存在下での活性より高い場合、その被験薬剤はプロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰの活性を高めたことを示す。修飾ｈｕＴＳＬＰの刺激薬および阻害薬は、ｈｕＴＳＬＰ仲介による活性の増強、阻害または修飾に使用でき、したがって療法用として使用できる。たとえば修飾ｈｕＴＳＬＰの阻害薬は、たとえば自己免疫疾患または臓器移植を受ける患者において、Ｂ細胞およびＴ細胞の活性を低下させるのに有用である。
【０１１０】
療法用途
本発明の修飾ｈｕＴＳＬＰポリペプチドは、前記刊行物に述べられたｈｕＴＳＬＰポリペプチドの療法使用について既知のものと同じ方法で療法に使用できる。ヒトＴＳＬＰはＢ細胞およびＴ細胞の活性を刺激するのに有用である。たとえば、ｈｕＴＳＬＰ、好ましくはマイクロモル量の可溶性修飾ｈｕＴＳＬＰは、Ｂ細胞およびＴ細胞の分化、増殖および活性化を誘発する。そのような投与は、細菌およびウイルス感染症の処置ならびに腫瘍細胞および自己免疫不全の処置において療法上有用である。
【０１１１】
さらに、本発明のポリペプチドを単独でまたはＩＬ−７と組み合わせて用いて、オートロガス骨髄移植後の患者の免疫系を再構成できる（たとえばＡｂｄｕｌ−Ｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：１４１６−１４２２参照）。ＴＳＬＰはＳＴＡＴ５に作用することが知られているので、患者に対するＳＴＡＴ５作用の改変を目標とした療法にも使用できる（Ｒｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４７）：３１３１７−３１３２６；Ｄａｖｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６５：９５９−９６５；Ｎｏｓａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＥＭＢＯ  Ｊ，１８（１７）：４７５４−４７６５参照）。
【０１１２】
本発明の修飾ヒトＴＳＬＰポリヌクレオチドおよびポリペプチド（修飾ｈｕＴＳＬＰを発現するベクターを含む）は、選択した投与経路に適合する多様な形態の医薬組成物として配合して、宿主、好ましくは哺乳動物宿主（ヒト患者を含む）に投与することができる。本発明化合物は好ましくは医薬的に許容できるキャリヤーと組み合わせて投与され、ターゲティング抗体および／またはサイトカインを含めた特異的送達物質と組み合わせ、または結合させることができる。
【０１１３】
修飾ヒトＴＳＬＰは、既知の手法で、たとえば経口、非経口（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入法を含む）、吸入、噴霧、局所、粘膜からの吸収、または直腸投与により、医薬的に許容できる一般的な無毒性キャリヤー、アジュバントまたはビヒクルを含有する投与単位配合物として投与できる。本発明の医薬組成物は、経口投与に適した懸濁液剤もしくは錠剤、鼻腔スプレー剤、クリーム剤、無菌注射用製剤、たとえば無菌注射用水性もしくは油脂性懸濁液剤、または坐剤の形であってもよい。
【０１１４】
懸濁液剤として経口投与するためには、医薬製剤技術分野で周知の技術に従って組成物を調製することができる。本発明組成物は、バルクを与えるための微結晶セルロース、沈殿防止剤（ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、および甘味剤または着香剤を含有することができる。即時放出錠としての組成物は、微結晶セルロース、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび乳糖、または当技術分野で既知である他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤を含有することができる。
【０１１５】
吸入またはエアゾル剤による投与のためには、医薬製剤技術分野で周知の技術に従って組成物を調製することができる。本発明組成物は、当技術分野で既知であるベンジルアルコールその他の適切な保存剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボンその他の可溶化剤または分散剤を用いて、塩類溶液中の液剤として調製できる。
【０１１６】
注射用液剤または懸濁液剤として投与するためには、当技術分野で周知の技術に従って、適切な分散剤または湿潤剤、および沈殿防止剤、たとえば無菌の油（合成モノ−またはジグリセリドを含む）および脂肪酸（オレイン酸を含む）を用いて、組成物を調製できる。
【０１１７】
坐剤として直腸投与するためには、適切な非刺激性賦形剤、たとえばカカオ脂、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールと混合することにより組成物を調製できる。これらの賦形剤は周囲温度では固体であるが、直腸腔内では液化または溶解して薬物を放出する。
【０１１８】
好ましい投与経路には、経口、非経口、および静脈内、筋肉内または皮下経路が含まれる。より好ましくは、本発明組成物を非経口的に、すなわち静脈内もしくは腹腔内に、注入または注射により投与する。本発明の１態様においては、本発明化合物を腫瘍内注射により腫瘍に直接投与するか、あるいは静脈内注射により全身送達することができる。
【０１１９】
本発明化合物の液剤または懸濁液剤は、水、等張生理食塩水（ＰＢＳ）中に、所望により無毒性界面活性剤と混合して調製できる。分散液剤は、グリセロール、液体ポリエチレン、グリコール、ＤＮＡ、植物油、トリアセチン、およびその混合物中に調製することもできる。通常の保存および使用条件下で微生物の増殖を防止するために、これらの組成物は保存剤を含有することができる。
【０１２０】
注射または注入に適した剤形には、無菌水性液剤もしくは分散液剤、または有効成分を含む無菌散剤であって注射または注入用の無菌水性液剤もしくは分散液剤を即時調製するために調製されたものが含まれる。すべての場合、最終剤形は無菌の流体であり、かつ調製および保存の条件下で安定でなければならない。液状のキャリヤーまたはビヒクルは溶剤または液状分散媒質であってもよく、たとえば水、エタノール、ポリオール、たとえばグリセロール、プロピレングリコールまたは液体ポリエチレングリコールなど、植物油、無毒性グリセリルエステル、およびその適切な混合物が含まれる。たとえばリポソームの形成により、分散液剤の場合は必要な粒度の維持により、または無毒性界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持できる。微生物作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合、等張剤、たとえば糖類、緩衝剤または塩化ナトリウムを含有することが望ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、組成物に吸収遅延剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチンを含有させることにより得ることができる。
【０１２１】
無菌注射用液剤は、必要量の本発明化合物を前記に述べた他の種々の成分と共に適切な溶剤に装入し、次いで必要に応じてフィルター除菌することにより調製される。無菌注射用液剤を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、予め無菌濾過した溶液中に存在する有効成分および目的とする追加成分の真空乾燥法および凍結乾燥法により粉末を得る方法である。
【０１２２】
本発明を全般的に記載したが、本発明は以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。実施例は説明のために示したものであり、限定のためのものではない。
【実施例】
【０１２３】
実施例
実施例１：フューリン開裂部位の識別および修飾
ネズミＴＳＬＰをコードする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ２３２９３７）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３］およびヒトＴＳＬＰをコードする核酸配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］は、ＰＣＴ出願ＷＯ  ００／２９５８１に開示されている。しかし、哺乳動物細胞はしばしば分解生成物を生じるので、有用な量のヒトＴＳＬＰ  ｃＤＮＡを哺乳動物細胞において産生させるのが妨げられる。
【０１２４】
ヒト組換えＴＳＬＰを哺乳動物細胞において発現させると、予想より実質的に少ない量の全長組換えタンパク質が得られた。発現タンパク質の一部は開裂フラグメント状であり、６ｋＤの主分解生成物を含んでいた。ヒトＴＳＬＰと異なり、ネズミＴＳＬＰは哺乳動物細胞において発現させても分解しなかった。そこで、ヒトとネズミのＴＳＬＰの核酸配列およびアミノ酸配列を比較した。表１に示すように、ヒトＴＳＬＰアミノ酸配列とネズミＴＳＬＰアミノ酸配列の比較により、ヒトＴＳＬＰのみにみられる、残基１２８に始まる一連の残基が明らかになった（１２８−ＲＫＲＫＶ−１３２）。さらに調べると、これらの残基は推定フューリン開裂部位（１２７−ＲＲＫＲＫ−１３１）を表わすと判定された。重要な点は、この推定フューリン開裂部位の位置がヒトＴＳＬＰの約６ｋＤのＣ末端フラグメントの放出と相関することであった。
【０１２５】
ｈｕＴＳＬＰアミノ酸配列は、シグナルペプチドとして機能するＮ末端疎水性領域を含み、４ヘリックス束サイトカイン構造を形成する一連の４ヘリックスがこれに続く。推定フューリン開裂部位はこの４ヘリックス束の第４ヘリックス開始点の約８アミノ酸前に位置する。このタンパク質をこの開裂部位でトランケーションすると、不活性化したヒトＴＳＬＰタンパク質が得られる。
【０１２６】
【表３】
2010279365.tif 000004
【０１２７】
ＴＳＬＰタンパク質を哺乳動物細胞培養において発現させて単離し、たとえば電気泳動により分析すると、ゲル上の多数のバンドが示すように、多数のポリペプチドが得られる。タンパク質混合物中の最も顕著なバンドは約６ｋＤの分子量をもつ。６ｋＤフラグメントのアミノ酸配列はＴＳＬＰのＣ末端に対応し、これは開裂点がフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫにあることを示唆する。このデータは、哺乳動物細胞において発現したヒトＴＳＬＰの分解がフューリン開裂部位における開裂により生じたことの直接的証拠となる。
【０１２８】
実施例２：ヒトＴＳＬＰのフューリン部位の変異誘発
部位特異的変異誘発を利用して、３１３−ヒト−ＴＳＬＰ  Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ（＃１４０９５）（１ｍｇ／ｍｌ）を鋳型として用いたヒトＴＳＬＰポリ−Ｈｉｓ  ＦＬＡＧ転写体から、フューリン開裂部位を不活性化した。一連のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、推定フューリン開裂部位を含むｈｕＴＳＬＰセグメント：ＲＫＲＫＶ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８］をコードするヌクレオチド配列：ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＣ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］を欠失させた。さらに、Ｓａｌ−１制限部位を５’末端に、Ｎｏｔ−１部位を３’末端に形成するプライマーの組合わせを設計した。これらのプライマーは下記のものであった：
【０１２９】
【表４】
2010279365.tif 000005
【０１３０】
ヒトＴＳＬＰのポリヌクレオチド配列を下記に示す：
【０１３１】
【表５】
2010279365.tif 000006
【０１３２】
プライマー１および３を第１ＰＣＲ反応に用いて、４０９塩基のＰＣＲ生成物を形成した。プライマー１はＳａｌ−１制限部位を含み、一方、プライマー３は１５塩基のフューリン開裂配列を欠失している。プライマー２および４を第２ＰＣＲ反応に用いて、１６２塩基の第２ＰＣＲ生成物を形成した。プライマー４はＮＯＴ−１制限部位を含み、一方プライマー２は１５塩基のフューリン開裂部位を欠失している。
【０１３３】
ＰＣＲ反応物は下記のものを含有していた：１０ＴｌのＡｍｐｌｉｔａｑ  １０×緩衝液；１ＴｌのＡｍｐｌｉｔａｑ；２ＴｌのｄＮＴＰ（各１０ｐＭ）；４０ｐＭの各プライマー；１Ｔｌの鋳型；最終体積１００Ｔｌとなる量の水。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲシステム２４００装置を用いて下記の条件で実施された：９４℃，２：００分を１サイクル；９４℃，０：３０分，５０℃，０：１５分，および７２℃，１：００分を３０サイクル；そして７２℃，２：００分を１サイクル。
【０１３４】
ＰＣＲ生成物を１％低融点アガロースゲル上で精製した。適宜なサイズのバンドをゲルから切り取り、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ生成物精製キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手）によりＤＮＡを精製した。ゲル精製した４０９および１６２塩基の生成物をプライマー１および４と混和して、５５８塩基対のＰＣＲ生成物を形成した。これは、フューリン開裂部位をコードする１５塩基対領域を欠失した全長ヒトＴＳＬＰポリ−Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ配列を含んでいた。
【０１３５】
反応溶液は下記のものを含有していた：１０ＴｌのＡｍｐｌｉｔａｑ  １０×緩衝液；１ＴｌのＡｍｐｌｉｔａｑ；２Ｔｌ（各１０ｐＭ）のｄＮＴＰ；１５．４Ｔｌ（４０ｐＭ）のプライマー１；１６Ｔｌ（４０ｐＭ）のプライマー４；１Ｔｌ（４１ｎｇ）のＰＣＲ生成物Ａ；２Ｔｌ（１１９ｎｇ）のＰＣＲ生成物Ｂ；および最終体積１００Ｔｌとなる量の水。前記のように、ＰＣＲ反応／条件はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲシステム２４００装置を用いて実施された。反応終了後、５５８塩基対の生成物を１％低融点アガロースゲル上で分離および精製した。
【０１３６】
精製した修飾ヒトＴＳＬＰ配列を、ベクターキットと共に供給される試薬を用いてベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中へライゲートした：１Ｔｌ  ｐＧＥＭ−Ｔベクター；５Ｔｌ  ２×ライゲーション緩衝液；１Ｔｌリガーゼ；および１Ｔｌ  ５５８塩基対の修飾ヒトＴＳＬＰ（１２ｎｇ）。反応溶液を室温に１時間放置した。ライゲーション混合物（２Ｔｌ）を４０ＴｌのＤＨ１０Ｉ−エレクトロコンピテント大腸菌と混和し、この細菌中へエレクトロポレーションした。次いで、エレクトロポレーションした細菌を０．９ｍｋのＳＯＣ溶液に移し、３７℃で１時間振とうした。
【０１３７】
体積０．１Ｔｌのこの溶液をアンピシリン耐性プレート上に広げ、３７℃で一夜インキュベートした。コロニーを採取して、アンピシリン含有ＬＢブロス４ｍＬ中へ接種した。振とうプラットフォーム上３７℃で一夜インキュベートした後、プラスミドＤＮＡを精製し、ＮＯＴ−１／Ｓａｌ−１で消化して、挿入配列のサイズが適正であることを確認した。５５８塩基対の挿入配列を含むｐＧＥＭ−Ｔベクターを配列決定して、この分子操作により目的変異が得られたことを確認した。
【０１３８】
ｐＧＥＭ−ＴベクターをＮＯＴ−１およびＳａｌ−１で消化して、５５８塩基対の挿入配列を発現ベクターｐＤＣ  ４０９およびｐＤＣ  ３１７中へサブクローニングした。消化およびライゲーション反応は当技術分野で周知のように実施された。次いで発現ベクターを用いて一過性トランスフェクションしたＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０４７８）を作製し、あるいは安定発現するＣＨＯ細胞を作製した。比較のため、無傷のフューリン開裂部位をもつヒトＴＳＬＰをコードする対照発現ベクターを用いて一過性および安定トランスフェクションした細胞を作製したことを留意されたい。
【０１３９】
ｈｕＴＳＬＰおよび修飾ｈｕＴＳＬＰタンパク質を、それぞれＣＶ−１細胞においてＨＩＳ、Ｆｌａｇ融合タンパク質として発現させた。発現タンパク質をＩＭＡＣ（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、製造業者（Ｑｕｉａｇｅｎ）の指示を採用）により精製した。発現タンパク質を還元および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、修飾ｈｕＴＳＬＰが生成したことを証明した。
【０１４０】
フューリン開裂部位を除去した構築された修飾ヒトＴＳＬＰ配列を、全長ヒトＴＳＬＰタンパク質として哺乳動物培養（ＣＶ−１細胞）において発現させた。非修飾ヒトＴＳＬＰと比較すると、フューリン部位欠失ＴＳＬＰの発現に際しては分解生成物がほとんどまたは全く生成しなかった。これは、フューリン部位が実際に組換えヒトＴＳＬＰのフラグメント化に関与していたことを証明する。
【０１４１】
実施例３：活性な修飾ヒトＴＳＬＰ
実施例２の記載に従って調製した修飾ｈｕＴＳＬＰの活性を、ＢＡＦ／ＨＲＴ細胞バイオアッセイにより証明した。ＢＡＦ／ＨＴＲバイオアッセイには、ヒトＴＳＬＰ受容体でトランスフェクションしたネズミプロＢリンパ球系を使用する（Ｓｔｅｖｅｎ  Ｆ．Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｍａｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，ワイオミング州シアトルから入手した細胞系）。このＴＳＬＰ  ＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋに寄託され（寄託番号ＡＦ２０１９６３）、Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎ  １（１），５９−６４に記載されている。ＢＡＦ／ＨＴＲ細胞は増殖をｈｕＴＳＬＰに依存し、被験試料に添加した活性ｈｕＴＳＬＰに応答して増殖する。
【０１４２】
試料および標準品の力価測定を９６ウェルマイクロタイター方式で実施した。ベースライン量のＢＡＦ／ＨＲＴ細胞を各ウェルに添加した。修飾ｈｕＴＳＬＰの試料および標準品をウェルに添加した。インキュベーション期間後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ色素Ｉ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，カタログ＃ＤＡＬ１１００，１０ｕＬ／ウェル）の添加により細胞増殖を測定した。代謝活性ＢＡＦ／ＨＲＴ細胞はＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを取り込んで還元し、これにより色素の蛍光特性を変化させる。修飾したプロテアーゼ抵抗性ｈｕＴＳＬＰによりこのアッセイにおいて得られた蛍光単位の数値は、標準の非修飾ｈｕＴＳＬＰのものと類似し、修飾ｈｕＴＳＬＰが非修飾ｈｕＴＳＬＰと同等に活性であることを示した。
【０１４３】
実施例４：修飾ｈｕＴＳＬＰによるＳＴＡＴ５の活性化
本発明の修飾ｈｕＴＳＬＰがＳＴＡＴ５を活性化する能力を、Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（前掲）に記載の方法に従って分析する。要約すると、ＮＡＧ８／７細胞を４〜５時間サイトカイン枯渇させ、次いで１０７個／ｍｌを１００ｎｇ／ｍｌの修飾ヒトＴＳＬＰで刺激する。非修飾ｈｕＴＳＬＰを対照として用いる。インキュベーション後、細胞を収穫、洗浄および溶解した。刺激した細胞溶解物をイムノブロットアッセイにより分析し、対照と比較して修飾ｈｕＴＳＬＰ活性を証明する。
【０１４４】
本発明を具体例について本明細書に記載した。これらの例を本発明の範囲内で多様に変更および改変できる。多数の他の変更が当業者に自明であり、これらも本明細書に開示しかつ特許請求の範囲に定める本発明の精神に含まれる。
【０１４５】
本明細書に引用したすべての刊行物を参考として援用する。
【配列表】
2010279365000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月4日(2010.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の１２７−１３１の位置にあるフューリン開裂部位ＲＲＫＲＫを不活性化するように修飾され、かつ少なくとも１つのＴＳＬＰ活性を有するポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子。