(57)【要約】【課題】アスペルギルス・オリゼのような麹菌においても好適に利用され得る表層提示技術を提供すること。【解決手段】本発明によれば、微生物の細胞表層にタンパク質を提示させる方法および該方法により作製された細胞表層に提示されたタンパク質を有する微生物が提供される。本発明の方法は、分泌シグナル、キチン結合ドメイン、および提示されるべき該タンパク質をそれぞれコードするＤＮＡを含む発現ユニットＤＮＡを微生物に導入する工程、および該発現ユニットＤＮＡが導入された微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に発現させる工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の細胞表層にタンパク質を提示させる方法であって、
分泌シグナル、キチン結合ドメイン、および提示されるべき該タンパク質をそれぞれコードするＤＮＡを含む発現ユニットＤＮＡを微生物に導入する工程；および
該発現ユニットＤＮＡが導入された微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に発現させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、前記キチン結合ドメインのＮ末端側に融合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、前記キチン結合ドメインのＣ末端側に融合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キチン結合ドメインのＮ末端側およびＣ末端側の両方に、提示されるべきタンパク質がそれぞれ融合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キチン結合ドメインが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド領域である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
微生物の細胞表層にタンパク質を提示させるための組換えベクターであって、分泌シグナル、キチン結合ドメイン、および提示されるべき該タンパク質をそれぞれコードするＤＮＡを含む発現ユニットＤＮＡを含む、組換えベクター。
【請求項７】
前記タンパク質が、前記キチン結合ドメインのＮ末端側に融合されている、請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項８】
前記タンパク質が、前記キチン結合ドメインのＣ末端側に融合されている、請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項９】
前記キチン結合ドメインのＮ末端側およびＣ末端側の両方に、提示されるべきタンパク質がそれぞれ融合されている、請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記キチン結合ドメインが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド領域である、請求項６から９のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれかに記載の方法で作製された、または請求項６から１０のいずれかに記載の組換えベクターが導入されて得られる、細胞表層に提示されたタンパク質を有する微生物。
【請求項１２】
前記微生物がアスペルギルス・オリゼである、請求項１１に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の表層に分子を提示させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素などの目的タンパク質と、固定化するための足場となるアンカータンパク質とを遺伝子的に融合し、発現させることで、酵母などの生物の細胞表層にタンパク質を提示させることができる。
【０００３】
酵素を含む種々のタンパク質を細胞表層に提示した微生物が作出されている（例えば、酵母について特許文献１〜２１、細菌については、例えば、大腸菌について特許文献２２、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌について特許文献２３、乳酸菌について特許文献２４）。微生物が酵母の場合は、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列、または細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインが利用され得る（特許文献１〜２１）。細菌（例えば、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、乳酸菌など）の場合は、外膜局在タンパク質の一部が利用され得る。例えば、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素のＰｇｓＡは、細胞表層に局在するタンパク質であり、そのＣ末端側に目的タンパク質を融合して表層に提示することができる（特許文献２２〜２４）。
【０００４】
目的とするタンパク質を酵母細胞表層に提示させることにより、タンパク質の取り扱いが容易になる。酵素を表層提示した微生物は、培養するだけで酵素を表層に固定するので、固定化酵素剤として利用できる。そして反応後に回収して再利用することができる。
【０００５】
麹菌（例えば、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）は、微生物の中で最大級のタンパク質生産能を保持し、ＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）と呼ばれる安全性の認められた有用微生物である。このようなタンパク質生産能のために、麹菌による有用タンパク質の生産法の開発が盛んである。例えば、特許文献２５には、タンパク質を効率的に分泌生産する方法が記載されている。有用タンパク質の生産および利用のために、麹菌に対しても、上記のように有用な表層提示技術の応用が望まれている。
【特許文献１】特開平１１−２９００７８号公報
【特許文献２】特開２００２−１７３６８号公報
【特許文献３】特開２００２−１７６９７９号公報
【特許文献４】特開２００２−２５３２６７号公報
【特許文献５】特開２００３−２３５５７９号公報
【特許文献６】特開２００４−４９０１４号公報
【特許文献７】特開２００４−１９４５５９号公報
【特許文献８】特開２００４−３０５０９６号公報
【特許文献９】特開２００４−３０５０９７号公報
【特許文献１０】特開２００５−５８０１０号公報
【特許文献１１】特開２００５−１７６６０５号公報
【特許文献１２】特開２００５−２４５３３４号公報
【特許文献１３】特開２００５−２４５３３５号公報
【特許文献１４】特開２００５−３１２４２６号公報
【特許文献１５】特開２００６−１３６２２３号公報
【特許文献１６】特開２００６−１７４７６７号公報
【特許文献１７】特開２００６−２６２７２４号公報
【特許文献１８】特開２００７−２０５３９号公報
【特許文献１９】特開２００７−８９５０６号公報
【特許文献２０】特開２００７−３００９１４号公報
【特許文献２１】国際特許出願公開第０２／０８５９３５号公報
【特許文献２２】特開２００５−３１２４２６号公報
【特許文献２３】特開２００７−８９５０６号公報
【特許文献２４】特開２００６−２６２７２４号公報
【特許文献２５】特開２００７−１７４９６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アスペルギルス・オリゼのような麹菌においても好適に利用され得る表層提示技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、微生物の細胞表層にタンパク質を提示させる方法を提供し、この方法は、
分泌シグナル、キチン結合ドメイン、および提示されるべき該タンパク質をそれぞれコードするＤＮＡを含む発現ユニットＤＮＡを微生物に導入する工程；および
該発現ユニットＤＮＡが導入された微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に発現させる工程
を含む。
【０００８】
本発明は、また、微生物の細胞表層にタンパク質を提示させるための組換えベクターを提供し、この組換えベクターは、分泌シグナル、キチン結合ドメイン、および提示されるべき該タンパク質をそれぞれコードするＤＮＡを含む発現ユニットＤＮＡを含む。
【０００９】
１つの実施態様では、上記タンパク質は、上記キチン結合ドメインのＮ末端側に融合されている。
【００１０】
別の実施態様では、上記タンパク質は、上記キチン結合ドメインのＣ末端側に融合されている。
【００１１】
なお別の実施態様では、上記キチン結合ドメインのＮ末端側およびＣ末端側の両方に、提示されるべきタンパク質がそれぞれ融合されている。
【００１２】
１つの実施態様では、上記キチン結合ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド領域である。
【００１３】
本発明はさらに、上記方法で作製された、または上記組換えベクターが導入されて得られる、細胞表層に提示されたタンパク質を有する微生物を提供する。
【００１４】
１つの実施態様では、上記微生物はアスペルギルス・オリゼである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、アスペルギルス・オリゼのような麹菌においても好適に利用され得る表層提示技術が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明においては、キチン結合ドメイン（本明細書中では「ＣＢＤ」ともいう）が、アンカータンパク質として利用され得る。アンカータンパク質とは、細胞の細胞壁に結合して細胞の表層から細胞外に配向させる役割を有するタンパク質である。「キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）」とは、細胞表層に存在するキチンと結合可能な任意のドメインをいう。
【００１７】
キチン結合ドメインは、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド領域である。配列番号１に記載のアミノ酸配列は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisie）のキチナーゼ（ＣＴＳ１；ＤＤＢＪアクセッション番号Ｕ１７２４３−９）のアミノ酸４８１位から５６２位までの領域のキチン結合ドメインに由来する配列であるが、本発明における使用については、その由来を問わない。上記の「配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド領域」とは、キチン結合能を失わない限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列にさらにアミノ酸の付加、削除、および／または置換がされているものも含む。この付加、削除、置換などがされる残基の数は、１または複数（例えば、１から１０残基までのいずれか）であり得る。
【００１８】
キチン結合ドメインに、細胞表層に提示されるべき目的のタンパク質（以下、単に「目的のタンパク質」ともいう）を融合させる。目的のタンパク質は、キチン結合ドメインのＮ末端側またはＣ末端側のどちら側に融合してもよい。キチン結合ドメインのＮ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる種類の目的のタンパク質を融合してもよい。目的のタンパク質は、キチン結合ドメインに直接結合されていてもよいし、リンカーを介して結合されていてもよい。
【００１９】
細胞表層に提示することを目的とするタンパク質は、種類を問わない。ここで、目的のタンパク質とは、分子量の大きさに関わらず、アミノ酸からなるいかなる分子も包含し、より少ないアミノ酸で構成されるペプチドを除外するものではない。本来であれば微生物の細胞表層に局在しないが、該微生物の細胞表層に固定することを目的として配置されるタンパク質が好ましい。例えば、酵素（例えば、リパーゼ類、アミラーゼ類（例えば、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼなど）、セルラーゼ類（例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼなど））、抗体、リガンド、蛍光タンパク質、プロテインＡおよびその誘導体などが挙げられる。
【００２０】
目的のタンパク質は、その特性に応じて、キチン結合ドメインのＮ末端側に融合させるか、Ｃ末端側に融合させるかを決定すればよい。例えば、リパーゼのようにＣ末端側に活性中心を有するタンパク質は、キチン結合ドメインのＣ末端側に融合されることが好ましい。
【００２１】
上で説明したようなキチン結合ドメインと目的のタンパク質との融合物のさらにＮ末端側に、分泌シグナルが連結される。ここで、分泌シグナルとは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のＮ末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸領域をいい、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。分泌シグナルをコードする遺伝子としては、タンパク質を発現させる宿主細胞で有効に働く任意の分泌シグナルが利用可能である。目的のタンパク質が本来分泌性である場合は、そのタンパク質由来の分泌シグナルを使用し得る。例えば、分泌能力の高いグルコアミラーゼ遺伝子（glaA）由来の分泌シグナルが、好ましく用いられる。宿主細胞が麹菌（例えば、アスペルギルス・オリゼ）の場合、例えば、アスペルギルス・オリゼのトリアシルグリセロールリパーゼ由来分泌シグナル（tglA）が好ましく使用される。酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）のα−アグルチニンまたはａ−アグルチニンのシグナル配列なども用いられ得る。
【００２２】
特許文献２５に記載のような、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来リパーゼ（ＲＯＬ）の９７個のアミノ酸配列からなるプロ配列のＣ末端側から数えて２８アミノ酸までの領域（本明細書中では「Ｎ２８領域」ともいう）を、細胞外分泌の補助のために用いてもよい。Ｎ２８領域は、分泌シグナル配列と、キチン結合ドメインと目的のタンパク質との融合物との間に配置され得る。Ｎ２８領域は、特に、糸状菌（例えば、アスペルギルス・オリゼ）において好適に用いられ得る。
【００２３】
宿主細胞で目的のタンパク質を発現させるためには、キチン結合ドメイン、目的のタンパク質、および分泌シグナル、ならびに必要に応じてＮ２８領域を含む発現ユニットをコードするＤＮＡ（本明細書中では「発現ユニットＤＮＡ」ともいう）を細胞に導入する。
【００２４】
発現ユニットＤＮＡは、キチン結合ドメイン、目的のタンパク質、および分泌シグナル、ならびに必要に応じてＮ２８領域をそれぞれコードするＤＮＡを、当業者が通常用い得る技術で合成および結合して調製され得る。発現ユニットＤＮＡを作製するために、本明細書中に記載の配列情報と公知の配列情報（分泌シグナルおよび目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列について）とに基づいてプライマーを作製し、染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲによって目的の断片を得ることができる。結合は、適切な制限酵素、リンカーなどを用いて行うことができる。
【００２５】
ＤＮＡの導入とは、細胞の中にＤＮＡを導入し、発現させることを意味する。ＤＮＡの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法がある。導入されるＤＮＡは、プラスミドの形態であってもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。
【００２６】
宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる。組換えベクターのためのプラスミドは、宿主に適合した任意のプラスミドが用いられ得る。
【００２７】
表層提示発現のための宿主には、細菌、真菌、植物細胞など、細胞壁を有する細胞であれば、特に限定されない。細胞表層（または細胞壁）にキチンを豊富に含む微生物が好ましい。このようなキチンを豊富に含む好ましい微生物としては、麹菌（例えば、アスペルギルス・オリゼ）、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）などが挙げられるが、これに限定されない。
【００２８】
組換えベクターは、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを上記発現ユニットＤＮＡの５’側上流に、より好ましくはターミネーターを３’側下流に、それぞれ組み込み得る。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られている任意のプロモーターおよびターミネーターが用いられる。宿主細胞が糸状菌（例えば、アスペルギルス・オリゼ）である場合、このプロモーターは、好ましくは、高発現糸状菌遺伝子に由来する。多数の好ましい高発現真菌遺伝子は、例えば以下の例によって提供される：アスペルギルス属（Aspergilli）またはトリコデルマ属（Trichoderma)に由来するアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたはセロビオヒドラーゼ遺伝子。これらの目的のための最も好ましい高発現遺伝子は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のグルコアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）のｇｐｄＡ遺伝子またはトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のセロビオヒドラーゼ遺伝子である。宿主細胞がアスペルギルス・オリゼの場合、好ましくは、P-glaA142またはP-No8142（これらはそれぞれ、glaA（Hata, Y.ら、Gene, 1992年, 108巻, pp.145-150）遺伝子およびNo. 8AN（Ozeki, K.ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996年, 60巻, pp.383-389）遺伝子の改良プロモーター領域である）が用いられる。ターミネーターとしては、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子由来のターミネーター、グルコアミラーゼ遺伝子（glaAまたはglaB）由来のターミネーターなどが挙げられる。酵母に関しては、例えば、グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーターおよびターミネーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーターおよびターミネーターなどが挙げられる。このような出発材料のプラスミドの例としては、GAPDH（グリセルアルデヒド３’-リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター配列およびGAPDHターミネーター配列を含むプラスミドpYGA2270またはpYE22m、あるいはUPR-ICL（イソクエン酸リアーゼ上流領域）配列とTerm-ICL（イソクエン酸リアーゼのターミネーター領域）配列とを含むプラスミドpWI3、PGKプロモーターおよびターミネーター配列を含むプラスミドpGK404などが挙げられる。
【００２９】
組換えベクターはさらに、選択マーカー遺伝子を含み得る。選択マーカー遺伝子は、例えば、糸状菌（例えば、アスペルギルス・オリゼのような麹菌）の形質転換で有用な多数のマーカー遺伝子から選択できる。これらのマーカーには、例えば、amnS（アセトアミド）遺伝子、栄養要求マーカー遺伝子（例えばargB、trpCまたはpyrG）、および抗生物質耐性遺伝子（例えばブレオマイシン、ハイグロマイシンＢまたはＧ４１８に対する抵抗性を提供する）が含まれるが、これらに限定されない。好ましいマーカー遺伝子としては、アスペルギルス属糸状菌由来のマーカー遺伝子であって、niaD、argB、ｓＣ、ptrA、pyrG、amdS、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。宿主染色体ＤＮＡ中への目的遺伝子の挿入効率の点で、特に、niaDが好ましい。酵母に関しては、ＤＮＡの取得の簡易化の点からは、大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。ベクター作製の出発材料としては、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ori）とColE1の複製開始点とを有しており、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、HIS3、LEU2、URA3、LYS2など）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有することがさらに好ましい。
【００３０】
宿主の形質転換は、当業者が通常用いる方法で行うことができる。形質転換体の作製のための手順は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる。糸状菌（例えば、アスペルギルス・オリゼのような麹菌）の場合、好適には、アスペルギルス属のために開発された形質転換プロトコル、プロトプラスト−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を用いて形質転換され得る。酵母については、例えば、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。
【００３１】
形質転換体の培養は、当業者が通常用いる方法に従って、当該形質転換体の生育または所望のタンパク質の生産に適した培地および培養条件を適宜選択することにより行うことができる。
【００３２】
上述したようなキチン結合ドメインを利用した表層提示技術は、従来の表層提示技術（例えば、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列の利用、細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインの利用など）と組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
タンパク質を細胞表層に提示する微生物は、細胞表層に発現したタンパク質を基質と接触させ、この基質を結合するか、またはこの基質を他の物質に変換させる目的で使用され得る。例えば、タンパク質が酵素である場合、酵素を発現する細胞を含む酵素剤として、提供されてもよい。このような酵素剤としては、酵素を細胞表層に提示した細胞および細胞を維持し得る培地を含む懸濁液、および酵素を細胞表層に提示した細胞が凍結保存あるいは凍結乾燥、さらには低温乾燥されたものが挙げられる。
【００３４】
また、ランダムに変異を導入した種々のタンパク質をそれぞれ別の細胞の表層に提示させたコンビナトリアルライブラリーを作製することもできる。このようなライブラリーから、目的に応じた最適な性質を有するクローンを迅速かつ簡便に選択することも可能である。ここでいうコンビナトリアルライブラリーとは、遺伝子レベルでランダムに変異を導入し、タンパク質の多様性を人為的に拡大した種々の変異体の集合をいう。
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
（実施例１：ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株の作製）
サッカロマイセス・セレビシエW303-1B株（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より入手）のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号２（forward）および配列番号３（reverse）に示されるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）を増幅した。
【００３７】
他方、アスペルギルス・オリゼのトリアシルグリセロールリパーゼ由来分泌シグナル（tglA）、Ｎ２８領域、および改変型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のそれぞれをコードする遺伝子を含むプラスミドである、pIS1-ss-N28-EGFPベクターを用意した（月桂冠株式会社より入手）。
【００３８】
ＰＣＲ増幅により得られたＣＢＤを制限酵素NotIとSwaIで切断し、同様に制限酵素NotIとSwaIで切断したpIS1-ss-N28-EGFPベクターに連結し、プラスミドpIS1-sN-EGFP-L-CBDを得た。このプラスミドは、発現目的タンパク質であるＥＧＦＰのＣ末端側にリンカーを挟んで連結したＣＢＤをコードする遺伝子を含む。
【００３９】
プロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて、プラスミドpIS1-sN-EGFP-L-CBDをアスペルギルス・オリゼIF4 niaD-株（月桂冠株式会社より入手）に導入した。得られた形質転換体を、Czapek-Dox培地（ＣＤ培地）のNaNO2をNaNO３に代えたＣＤ−ＮＯ３培地にて約７日間培養した。次いで、100mlのデキストリン−ペプトン−酵母エキス液体培地（ＤＰＹ液体培地）に植菌し、30℃、150rpmにて10日間振盪培養した。
【００４０】
（比較例１：ＥＧＦＰ分泌発現株の作製）
アスペルギルス・オリゼIF4 niaD-株の形質転換にpIS1-ss-N28-EGFPベクターを用いたこと以外は、実施例１に記載の方法と同様にして形質転換株を作製した。この形質転換により、ＥＧＦＰ分泌発現株を得た。
【００４１】
（実施例２：ウェスタンブロッティングによるＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合蛋白質の発現の確認）
まず、実施例１のＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株および比較例１のＥＧＦＰ分泌発現株のそれぞれの培養液からの細胞を超音波処理によって細胞破砕し、14000rpmにて４℃で５分間遠心分離し、培養上清画分、可溶性画分および細胞壁画分を得た。これらの画分を、一次抗体として抗ＥＧＦＰ抗体および二次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を用いるウェスタンブロッティングに供し、ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合蛋白質の発現について分析した。対照として、アスペルギルス・オリゼIF4 niaD-未形質転換株もまた用いた。
【００４２】
図１に、その結果の電気泳動写真を示す。この電気泳動写真において、レーン１〜３は培養上清、レーン４〜６は可溶性画分、レーン７〜９は細胞壁画分を表し、またレーン１、４、７はＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株（実施例１）、レーン２、５、８はＥＧＦＰ分泌発現株（比較例１）、レーン３、６、９はアスペルギルス・オリゼIF4 niaD-未形質転換株の結果を表す。図１に示されるように、ＥＧＦＰ分泌発現株では、ＥＧＦＰの分子量に対応する約３０ｋＤａの位置のバンドが、培養上清であるレーン２においてのみ現れ、細胞壁画分であるレーン８では現れなかったのに対し、ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株では、細胞壁画分であるレーン７において約１５０ｋＤａの位置にバンドが現れた。これにより、ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株が、ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合タンパク質を細胞壁に発現していることが確認された。
【００４３】
（実施例３：蛍光顕微鏡観察による蛋白質の表層提示の確認）
実施例１のＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株および比較例１のＥＧＦＰ分泌発現株、ならびに対照として用いたアスペルギルス・オリゼIF4 niaD-未形質転換株の培養液を、１×ＰＢＳ溶液で３０℃にて２４時間処理した後、蛍光顕微鏡下で観察した。微分干渉顕微鏡下の観察との比較により、ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株では、細胞表層にＥＧＦＰ由来の緑色蛍光が局在していることが分かった。ＥＧＦＰ分泌発現株および未形質転換株では、そのような蛍光分布は示さなかった。これにより、ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株では、ＥＧＦＰ−ＣＢＤが細胞表層に提示されていることが示された。
【００４４】
さらに、菌体をプロテイナーゼＫで３０℃にて２４時間処理した後、再度、蛍光顕微鏡下の観察を行った。図２は、プロテイナーゼＫ処理および未処理のＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株およびＥＧＦＰ分泌発現株の蛍光顕微鏡写真を示す。図２の左側の列にＥＧＦＰ分泌発現株、右側の列にＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株を、そして上段に未処理株（１×ＰＢＳ溶液処理）、下段にプロテイナーゼＫ処理株を示す。ＥＧＦＰ分泌発現株では、プロテイナーゼＫ処理による蛍光の変化はあまり見られなかったのに対し、ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株では、未処理株では表層にＥＧＦＰ由来の蛍光が存在しているのに対し、プロテイナーゼＫ処理後は、存在していた蛍光が消失した。これにより、ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株では、ＥＧＦＰ−ＣＢＤが細胞表層に提示されていることがさらに確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明による新しいアンカータンパク質および表層提示技術は、菌体触媒に応用できる。また、既往の技術と組み合わせて用いることが可能であり、表層に提示するタンパク質の量の増加が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株およびＥＧＦＰ分泌発現株のＥＧＦＰ−ＣＢＤまたはＥＧＦＰの発現を調べるウェスタンブロットの電気泳動写真である。
【図２】プロテイナーゼＫ処理および未処理のＥＧＦＰ−ＣＢＤ融合発現株およびＥＧＦＰ分泌発現株のそれぞれの蛍光顕微鏡写真である。
【図１】
2010004774.tif 000002
【図２】
2010004774.tif 000003
【配列表】
2010004774000001.app