(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なマーカー遺伝子を用いて注意欠陥多動性障害を簡便かつ正確に検査することのできる方法と、このマーカー遺伝子の発現を指標として、注意欠陥多動性障害の原因因子や注意欠陥多動性障害の治療薬剤の成分特定する方法を提供する。【解決手段】被験者から単離した生体試料におけるPmch遺伝子の発現を測定し、この遺伝子発現に変調がある場合に、被験者が注意欠陥多動性障害の状態にあるか、または注意欠陥多動性障害を発症する危険性があると評価する評価方法。また、Pmch遺伝子発現変調を生じさせる因子を注意欠陥多動性障害の原因因子として特定する方法、およびPmch遺伝子の発現変調を改善させる物質を注意欠陥多動性障害の治療薬の成分として特定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から単離した生体試料におけるPmch遺伝子の発現を測定し、この遺伝子発現に変調がある場合に、被験者が注意欠陥多動性障害の状態にあるか、または注意欠陥多動性障害の発症危険性が高いと評価することを特徴とする評価方法。
【請求項２】
生体試料が、血漿である請求項１の評価方法。
【請求項３】
注意欠陥多動性障害の原因因子をスクリーニングする方法であって、Pmch遺伝子を正常に発現する細胞に候補因子を作用させ、Pmch遺伝子の発現変調を生じさせる因子を目的因子として特定することを特徴とする注意欠陥多動性障害の原因因子スクリーニング方法。
【請求項４】
注意欠陥多動性障害の治療薬成分をスクリーニングする方法であって、Pmch遺伝子の発現変調を示す細胞に候補物質を作用させ、Pmch遺伝子の発現変調を改善させる物質を目的物質として特定することを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Pmch遺伝子の発現量を指標として注意欠陥多動性障害を評価する方法および注意欠陥多動性障害治療薬成分をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
注意欠陥多動性障害（attention deficit hyperactive disorder：ＡＤＨＤ）は多動性、不注意、衝動性を症状の特徴とする発達障害の一つとされ、アメリカ精神医学会による精神疾患の診断統計マニュアル（DSM-IV）や世界保健機関（ICD-10）の診断基準では神経行動障害に分類されている。注意力維持が困難、時間感覚のずれ、情報をまとめることが苦手などの特徴がある。この障害は遺伝的な要因が強いとされているが、早期発見・早期療育（適切な治療と環境改善）によって行動異常を緩和し得ることが分かってきた。多動性、不注意、衝動性などの症状は通常7歳までに確認され、一般的には就学年齢の子供の4〜12%が発症しているとも言われるが、症状が顕著でない不注意優勢型の場合、幼少期に診断されない場合も多い。ＡＤＨＤが早期に診断され、適切な処置がなされないと、家庭や学校での生活に支障をきたし、二次的な精神障害等を引き起こす可能性もある。よって特に小児期における早期診断により適切な治療を行なうことが重要とされている。
【０００３】
ADHDの診断は他の精神疾患と同様に問診や行動基準等で行われADHDの診断における有用な生物学的マーカーは現在のところまだ開発されていない。特に子供達の行動は複雑なため、ADHDであると診断することは困難とされる場合も多いため、客観的で生物学的に診断できるマーカーの開発等が強く望まれている。
【０００４】
ADHDを診断あるいは評価するいくつかの方法として例えば以下にあげられるような方法が提案されている。
【０００５】
個体の抹消温度を測定して、ＡＤＨＤを示す値を測定するための技法（特許文献１）、聴覚刺激に対する被験体の反応を点数化することにより被験体の注意状態を査定するための方法（特許文献２）、中枢神経系の少なくとも１領域におけるドーパミントランスポータを査定することにより注意欠陥多動性障害（ＡＤ−ＨＤ）を診断する方法（特許文献３）、ＰＲＫＣＢ１遺伝子および発現生成物中の特定の突然変異、ならびにこれらの突然変異に基づく自閉症および関連障害の診断（特許文献４）。しかし、客観的で明確にＡＤＨＤを診断する方法は確立していないのが現状で、さらに環境によって左右しがちな特徴をもつことからも、多くの場合においてあいまいな結果がでることもある。生物学的マーカーとしていくつかの遺伝子も指標にされているが、広く受け入れられるには至っていない。
【０００６】
また、多動性障害のモデル動物としては、北海道大学実験生物センターで進めている肝炎・肝癌・ヒトWilson病モデルLECラットのオリジナル系統の維持過程で、
１）歩行中、絶えず頭部を小さく振る、
２）突然、旋回運動をしたり、頭部を大きく後方にそらす行動をする、
３）一般のラットは尾を持ち体を引き揚げた場合、四肢を一旦伸ばした後、少ししてその状態から逃れようと体をよじり出すが、この異常行動のラットは、体を持ち上げた瞬間に体を左右に大きくよじり（くねらせる）、時には持たれた尾を中心に、空中で円を描くように回転する
などの異常行動をもつ個体が見出され、これらを従来のLEC系統維持ラインとは分離し、維持されている「多動性障害モデルラット(WKAH Wig)」が知られている（特許文献５）。
【０００７】
一方、Pmch遺伝子ついては以下が知られている。
【０００８】
Pmch (pro-melanin-concentrating hormone : メラニン凝集ホルモン前駆体) 遺伝子は、Neuropeptide-glycine-glutamic acid（NGE）、Neuropeptide-glutamic acid-isoleucine（NEI）、Melanin-concentrating hormone（MCH:メラニン凝集ホルモン）の複数のタンパク質コード配列を含む遺伝子であり、主として視床下部において発現が多く見られることで知られている。MCHはNGE、NEIを含むpre-pro-MCH（PMCH）がプロセッシングの過程を経て、19アミノ酸からなるペプチド系の神経ホルモンMCHとして分泌される。
【０００９】
MCHは魚類では皮膚やウロコのメラニン(色素)を凝集させて体色を明るくする働きを持つ。一方、ほ乳類では主に摂食調節に深く関与しているといわれている。MCH欠損マウスは摂食低下と体重減少が見られ代謝率が高いこと（非特許文献１）、さらにMCHを過剰発現するトランスジェニックマウスは摂食亢進し、インスリン抵抗性と軽度の肥満が見られるなどの報告（非特許文献２）もある。
【００１０】
また、MCHに関しする特許出願としては、飼育する魚類のメラニン凝集ホルモンの産生を刺激して、魚類の食欲を増進させることを特徴とする魚類の肥育促進法（特許文献６）、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩およびＳＬＣ−１またはその塩を用いることを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＣ−１またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法（特許文献７）、メラニン凝集ホルモン受容体１（ＭＣＨ Ｒ１）のアンタゴニストである新規アリールアミン、前記化合物を含有する医薬組成物、その製造方法、及び肥満、糖尿病、うつ病及び／または不安の治療用薬剤におけるその使用（特許文献８）が知られている。すなわち、これらの特許出願の発明は、メラニン凝集ホルモン受容体１（ＭＣＨ Ｒ１）の拮抗剤に関するもので、肥満、代謝障害、食障害、うつ病治療等への利用が大半を占めている。
【特許文献１】特開２００３−３３３５５号公報
【特許文献２】特表２００８−５１０５８０号公報
【特許文献３】特表２００３−５０３３２５号公報
【特許文献４】特表２００８−５０４８３８号公報
【特許文献５】特開２００１−１８６８２８号公報
【特許文献６】特開２００４−２９８０５９号公報
【特許文献７】特開２００１−１４１７２８号公報
【特許文献８】特表２００７−５０９１５８号公報
【非特許文献１】Shimada M. et al, 1998, Nature 396:670-674
【非特許文献２】Ludeig D S.et al, 2001, Clin. Invest. 107, 379-386
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、新規なマーカー遺伝子を用いて注意欠陥多動性障害を簡便かつ正確に検査することのできる方法を提供することを課題としている。また本発明は、このマーカー遺伝子の発現を指標として、注意欠陥多動性障害の原因因子を特定する方法および注意欠陥多動性障害の治療薬剤成分を特定する方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、多動性障害モデルラットの脳を用い、ADHDに特異的なマーカーを探索していたところ、多動性障害モデルラットの中脳においてPmch (pro-melanin-concentrating hormone)遺伝子（GenBank Accession No. NM_012625）の発現が顕著に増加していることを新たに見出した。
【００１３】
これらのことから、本発明者らは、Pmch遺伝子が注意欠陥多動性障害の疾患マーカーとなる遺伝子であるとの確信が得られた。更に本発明者らはPmch遺伝子の発現変調が血漿においても検出できることを見出した。
【００１４】
そのため、Pmch遺伝子の発現増加や、Pmch遺伝子によりコードされるタンパク質（MCH）の発現増加を指標としたスクリーニングは、注意欠陥多動性障害の予防、治療薬の探索に有効であるとの確信を得て、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本出願は、前記の課題を解決するものとして、被験者から単離した生体試料におけるPmch遺伝子の発現を測定し、この遺伝子発現に変調がある場合に、被験者が注意欠陥多動性障害の状態にあるか、または注意欠陥多動性障害の発症危険性が高いと評価することを特徴とする評価方法を提供する。
【００１６】
この評価方法においては、前記生体試料が血漿であることを好ましい態様としている。
【００１７】
本出願はまた、注意欠陥多動性障害の原因因子をスクリーニングする方法であって、Pmch遺伝子を正常に発現する細胞に候補因子を作用させ、Pmch遺伝子の発現変調を生じさせる因子を目的因子として特定することを特徴とする注意欠陥多動性障害の原因因子スクリーニング方法を提供する。
【００１８】
本出願はさらに、注意欠陥多動性障害の治療薬成分をスクリーニングする方法であって、Pmch遺伝子の発現変調を示す細胞に候補物質を作用させ、Pmch遺伝子の発現変調を改善させる物質を目的物質として特定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
【００１９】
なお、以上の評価方法およびスクリーニングする方法において、「Pmch遺伝子の発現変調」とは、Pmch遺伝子の発現増加を意味し、例えば、生体試料中のMCHタンパク質量が、健常者のそれと比較して10％以上、詳しくは30％以上、さらに詳しくは50％以上、特に詳しくは70％以上、最も詳しくは90％以上まで増加していることを意味する。
【００２０】
また、前記の発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、被験者から単離した生体試料（例えば、血漿）を対象として、そのPmch遺伝子の発現変調を確認することによって、被験者が注意欠陥多動性障害の状態にあるか否か、あるいは注意欠陥多動性障害を発症する危険性が高いか否かを簡便にかつ正確に評価することが可能となる。これによって、注意欠陥多動性障害の状態にある被験者またはそのハイリスク者に対して適切かつ有効な治療法等を選択することが可能となる。
【００２２】
また本発明によれば、Pmch遺伝子の発現変調を指標として、注意欠陥多動性障害の原因因子が特定される。これによって特定された原因因子は、注意欠陥多動性障害の予防や症状の進行を抑制するための処置を効果的に行うことを可能とする。
【００２３】
さらに本願発明によれば、注意欠陥多動性障害の治療薬成分が特定され、注意欠陥多動性障害の有効な治療薬の開発に大きく貢献する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の注意欠陥多動性障害評価方法は、被験者から単離した生体試料（例えば、血漿）を対象として、そのPmch遺伝子の発現変調を確認することによって、被験者が注意欠陥多動性障害の状態にあるか否か、あるいは注意欠陥多動性障害を発症する危険性があるか否かを評価する。なお、生体試料（例えば、血漿）におけるPmch遺伝子の発現は、通常の血液検査技術を有する者であれば容易に実施可能であり、またその発現についての判定も、医療従事者の関与を必要としない。
【００２５】
Pmch遺伝子の発現変調は、具体的には、Pmch遺伝子の転写産物を測定することによって判定するができる。Pmch遺伝子の転写産物としてmRNAを測定する場合には、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定の遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えばin situ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、RNaseプロテクションアッセイ、RT-PCR、Real-Time PCR（Journal of Molecular Endocrinology, 25, 169-193(2000)およびそこで引用されている文献）、DNA アレイ解析法（Mark Shena編、"Microarray Biochip Technology", Eaton Publishing, 2000）などによってKLF5 mRNA発現量を検知・測定して実施することができる。
【００２６】
例えば、オリゴヌクレオチドプローブを用いてPmch遺伝子のmRNA量を検出する方法（ノーザンブロット分析法の場合には、少なくとも以下の工程：
(a)被験者の生体試料よりRNAを調製する工程；
(b)工程(a)で調製されたRNAを電気泳動分離する工程；
(c)工程(b)で分離されたRNAをオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程；
(d)工程(e)でRNAにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの標識量をPmch mRNA発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
(e)正常生体試料と比較して高いPmch mRNA発現量を、注意欠陥多動性障害を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
【００２７】
オリゴヌクレオチドプローブは、Pmch mRNAとストリンジェントな条件（例えば特表平10-508186号公報、特表平9-511236号公報に記載された条件）でハイブリダイズするため、mRNAの任意領域と正確に相補的な配列からなるDNA配列を用いる。このようなDNA配列は、例えばPmch cDNAを適当な制限酵素で切断することによっても得ることができる。あるいは、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。
【００２８】
また、オリゴヌクレオチドプローブはラジオアイソトープ（RI）法または非RI法によって標識するが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Cy Dye TMシリーズのCy3、Cy5等）、ローダミン6G試薬、N-アセトキシ-N2-アセチルアミノフルオレン（AAF）、AAIF（AAFのヨウ素誘導体）などを使用することができる。また標識法としては、当該分野で知られた方法（例えばランダムプライム法、ニック・トランスレーション法、PCRによるDNAの増幅、ラベリング／テイリング法、in vitro transcription法等）を適宜選択して使用できる。例えば、HRFオリゴヌクレオチドに官能基（例えば、第一級脂肪族アミノ基、SH基など）を導入し、こうした官能基に前記の標識を結合して標識化オリゴヌクレオチドプローブを作成することができる。
【００２９】
また、DNAマイクロアレイを使用することによってもPmch mRNA量を測定することができる。この方法は、少なくとも以下の工程：
(a)被験者の生体試料よりRNAを調製する工程；
(b)工程(a)で調製したRNAから、標識cDNAを調製する工程、
(c)工程(b)で調製した標識cDNAをDNAマイクロアレイに接触させる工程；
(d)工程(c)でDNAマイクロアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズした標識cDNAの標識量をPmch mRNA量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
(e)正常生体試料と比較して高いPmch mRNA量を、注意欠陥多動性障害の指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３０】
マイクロアレイを使用してPmch mRNA量を測定する場合には、例えば被験者の生体試料から単離したmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、PCR増幅する。その際に、標識dNTPを取り込ませて標識cDNAとする。この標識cDNAをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズしたcDNAを検出する。ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注して標識cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、1〜100nl程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃の温度範囲で、6〜20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識cDNAを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００３１】
またさらに、Pmch mRNA量はRT-PCT法によっても測定することができる。この方法は、少なくとも以下の工程：
(a)被験者の生体試料よりRNAを調製する工程；
(b)工程(a)で調製したRNAを鋳型とし、プライマーセットを用いてcDNAを合成する工程；
(c)工程(b)で合成されたcDNA量をPmch mRNA量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
(d)正常生体試料と比較して高いPmch mRNA量を、注意欠陥多動性障害を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３２】
使用するプライマーセットの設計には、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００３３】
以上のヒトを対象とする注意欠陥多動性障害の評価方法に使用するプローブやプライマーは、ラットPmch DNA配列（GenBank/NM_012625）に基づき設計、合成して使用することができる。また、公知のラットPmch配列に基づいて作成したプローブを用いてヒトcDNAライブラリーをスクリーニングする方法や、プライマーセットを用いてヒトRNAを鋳型とするRT-PCRによって、ラットPmch遺伝子のヒトホモログを取得し、このヒト遺伝子の配列からプローブやプライマーを作成することもできる。
【００３４】
Pmch遺伝子の発現変調を判定するための別の方法は、Pmch遺伝子の発現産物MCH量を定量することである。このようなタンパク質の定量は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定のタンパク質量を検知測定するために知られた手法、例えばin situ ハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティング、各種の免疫組織学的方法などによって実施することができる。
【００３５】
具体的には、MCHを特異的に認識する抗体を用いて実施することができる。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれMCHのエピトープに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、タンパク質やその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、Pmch遺伝子を組込んだ真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。
【００３６】
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。
【００３７】
これらの抗体は、標識物質によって標識化して使用する。標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。
【００３８】
このような抗体を使用する方法は、例えば免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ルミネッセント免疫測定法（LIA）、酵素免疫測定法（EIA）、ELISAなどを用いることができ、B-F分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはRIA、EIA、FIA、LIAであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。サンドイッチ型アッセイには、同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（forward）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどであってもよい。
【００３９】
このような抗体を用いた診断方法における一つの態様は、抗体とMCHとの結合を液相系において検出する方法である。例えば、標識化抗体と生体試料（例えば血漿）とを接触させて標識化抗体とMCHを結合させ、この結合体を分離する。分離は、公知の分離手段（クロマト法、固相法等）によって行うことができる。また公知のウエスタンブロット法に準じた方法を採用することもできる。標識シグナルの測定は、標識として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
【００４０】
液相系での診断の別の方法は、一次抗体と生体試料（例えば、血漿）とを接触させて一次抗体とMCHを結合させ、この結合体に標識化二次抗体を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず一次抗体＋MCH結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Fc領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記と同様とすることができる。
【００４１】
抗体を用いる場合のさらに別の態様は、抗体とMCHとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量のMCHの検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、抗体を樹脂プレートまたはメンブレン等に固定化し、この固定化抗体に被験者の血漿を接触させ、非結合タンパク質を洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋MCH結合体に標識化抗抗体を結合させて、この標識化抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）」として広く用いられている方法である。2種類の抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、いずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。
【００４２】
なお本発明の評価方法においては、以上に例示した各方法の２以上を組み合わせて行うことによって、より精度の高い診断方法とすることもできる。
【００４３】
次に、本発明の注意欠陥多動性障害の原因因子スクリーニング方法は、Pmch遺伝子を正常に発現する細胞に候補因子を作用させ、Pmch遺伝子の発現変調を生じさせる因子を注意欠陥多動性障害の原因因子として特定する。
【００４４】
この方法において、「Pmch遺伝子を正常に発現する細胞」とは、例えば、正常動物（ラット、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ等の実験用動物）の体内に存在する細胞、あるいはこれらの動物から単離して培養条件化に維持された細胞である。好ましくは、動物の脳組織（大脳皮質、線状体、中脳など）の細胞を対象とする。
【００４５】
また、「候補因子」としては、注意欠陥多動性障害の原因因子として想定される薬剤や化合物、飲食用の素材、各種のストレスなどである。また、飲食用の素材やストレスを候補因子とする場合は、動物個体を対象として、その細胞あるいは動物から単離した血漿におけるPmch遺伝子の発現変調を確認することによって、注意欠陥多動性障害の原因因子を特定することができる。Pmch遺伝子の発現変調は、前記の評価方法において採用する手段と同一とすることができる。
【００４６】
本発明の注意欠陥多動性障害の薬剤成分スクリーニング方法は、Pmch遺伝子の発現変調を示す細胞に候補物質を作用させ、Pmch遺伝子の発現変調を改善させる物質を目的物質として特定する。
【００４７】
このスクリーニング方法における「Pmch遺伝子の発現変調を示す細胞」とは、例えば、実施例に示したような多動性障害モデルラット（特許文献１６）の脳（特に、中脳）の細胞、あるいは前記の注意欠陥多動性障害の原因因子スクリーニング方法で特定された原因因子によって処理された動物の細胞などである。これらの細胞は、動物個体内に存在する状態で候補物質を作用させてもよく、あるいは動物個体から単離した状態で候補物質を作用させてもよい。動物個体内の細胞に候補物質を作用させる場合には、動物に候補物質を注射するか、あるいは摂取させる。培養条件下の細胞に候補物質を作用させる場合には、細胞の培地に候補物質を添加するなどの方法を採用することができる。
【００４８】
このスクリーニング方法に使用する候補物質には、例えば、有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が公知のものであって未知のものであってもよい。あるいは「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための候補物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学合成または生物学的合成により、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」を結びつけることにより生成される種々の化学組成物のコレクションである。例えば、ペプチドライブラリーなどの直線的なコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ビルディングブロック（アミノ酸）のセットを、所与の化合物の長さ（すなわちペプチドのサイズ）について可能なすべての方法で結びつけることにより形成される。化学的なビルディングブロックについてのこのようなコンビナトリアルミキシングを通して、多数の化学組成物を合成することが可能である。例えば、100の可換的な化学的ビルディングブロックについての系統的なコンビナトリアルミキシングは、結果として１億個の4量体化合物または100億個の5量体化合物を生じる（例えば、Gallop et al.,（1994）37（9）:1233-1250参照）。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第6,004,617号；5,985,365号を参照）。また各種の市販ライブラリーを使用することもできる。
【００４９】
以下、実施例として、注意欠陥多動性障害とPmch遺伝子の発現との関係を確認した実験データを示して本発明の実施可能性等を説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
多動性障害モデルラットの脳と正常ラットの脳でのPmch遺伝子発現量の比較
4週齢の多動性障害モデルラット各3個体から摘出した大脳皮質、線条体、中脳サンプル（北海道大学実験生物センターから入手）、多動性障害病態を示さない4週齢のWKAHラット各3個体から摘出した大脳皮質、線条体、中脳サンプルからそれぞれtotal RNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析による遺伝子発現解析を行った。
【００５１】
3個体分の大脳皮質を合わせ、液体窒素中で粉末化し、約100mgほどをtotal RNA抽出用に分けた。線条体および中脳も同様に行った。
【００５２】
total RNAの調製は、RNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用いて付属のプロトコールに従って行った。抽出したtotal RNAはゲル電気泳動や吸光度測定でDNAマイクロアレイ解析に用いられる品質であるかどうかを確認した。 DNAマイクロアレイ解析には大脳皮質、線条体、中脳サンプルから抽出したtotal RNAを各150ngずつ混合して解析に供し、多動性障害モデルラットと正常ラットの比較を行った。
【００５３】
DNAマイクロアレイ解析は、ラベリング、ハイブリダイズ、スキャンの３つの作業に分けられる。まず、前述のtotal RNA 450ng（大脳皮質、線条体、中脳サンプルから抽出したtotal RNAを各150ngずつ混合）からLow RNA Input Linear Amp Kit（Agilent Technologiest社製）を用いcDNAを合成した。さらにcDNAからCy3-dCTP（PerkinElmer社製）を添加してラベル化cRNAを調整した。次にラベル化cRNAをフラグメント化し、フラグメント化したラベル化cRNAとチップ（Whole Rat Genome Oligo Microarray Kit G4131F、Agilent Technologiest社製）上のプローブとのハイブリダイズを行った。さらに、チップを洗浄し、マイクロアレイスキャナー(G2565BA、Agilent Technologiest社製）及びGeneSpring ver 7.3を使用した遺伝子発現解析を行った。蛍光ラベルとしてCy5-dCTPを用いた場合でも同様の方法でcRNAのラベリングを行った。
【００５４】
DNAマイクロアレイ解析から得られた多動性障害モデルラットと正常ラットの脳（大脳皮質、線条体、中脳）でのPmch遺伝子の発現量（Signal値）を図1に示す。正常ラットをCy3-dCTPでラベルし、多動性障害モデルラットをCy5-dCTP でラベルした場合のものと、反対に、正常ラットをCy5-dCTPでラベルし、多動性障害モデルラットをCy3-dCTP でラベルした場合のものの２つの結果を示している。どちらの蛍光ラベルを使用してもPmch遺伝子の発現量は、正常ラットにおける発現量よりも約2から5倍に増加することが確認できた。
【００５５】
図１の結果からわかるように、Pmch遺伝子は、正常なラットの脳より、多動性障害モデルラットの脳での発現が増加しているため、ADHDに関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。
【実施例２】
【００５６】
多動性障害モデルラットと正常ラットの大脳皮質、線条体、中脳でのPmch遺伝子発現量のRT-PCRによる比較
実施例１で抽出した大脳皮質、線条体、中脳の各total RNAを使用し、RT-PCR解析を行った。まず、total RNA各 1ngからAffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を用い大脳皮質、線条体、中脳それぞれのcDNAを合成した。
【００５７】
Pmch遺伝子に対して特異的なプライマーを設計した。プライマーデザインは以下に示してある通りである。プライマー合成は北海道システムサイエンスに依頼した。
Pmch-1(Rat)
Forward Primer:5'-gccttttctttgttttctcacg-3'（配列番号１）
Reverse Primer:5'-aagactgctggtcctttcagag-3'（配列番号２）
上記プライマーを用いて、大脳皮質、線条体、中脳の各cDNAを鋳型として、Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa社製)を使用し、添付プロトコールに従いPCR反応を行った。PCR反応は27サイクル繰り返した。
【００５８】
PCR反応後、1.8%アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色で目的遺伝子の検出をした。検出にはUVトランスイルミネーター(ATTO)を用い、遺伝子バンドの強度を測定した。
【００５９】
RT-PCR解析で得られた結果を図2に示す。各バンドの強度の数値からわかるように、Pmch遺伝子は多動性障害モデルラットの中脳において発現が増加していることがわかった。
【００６０】
図2の結果からわかるように、Pmch遺伝子は、正常なラットの中脳より、多動性障害モデルラットの中脳での発現が増加しているため、ADHDに関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。
【実施例３】
【００６１】
Pmch遺伝子の血漿中での発現解析
正常ラットより血液を採取し、遠心分離により血漿と血清にわけ、それぞれを-80℃に保存した。凍結血漿を溶解し、約500μlを新しいチューブに移し、SolutionD （5.5M Guanidium thiocyanate、25mM Sodium citrate、0.5% Lauryl sarcosine、0.1M 2-Mercaptoethanol）を500μl添加して混合した後、フェノール溶液 (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1))を500μl添加してよく混合した。遠心分離により、上清を回収し、この上清に20μlの3M Sodium Acetate (pH5.5) を添加し、さらに500μlのTE飽和フェノールと100μlのクロロホルムを加え、良く混合した後に0℃で15分間放置した。遠心分離により、上清を回収し、この上清に等量の2-propanolを加え、良く混合した後に0℃で15分間放置し、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿に100μlの滅菌水を加え、溶解した後にRNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用いて、添付説明書に従いtotal RNAの精製を行った。
【００６２】
抽出したtotal RNAはゲル電気泳動や吸光度測定でRT-PCR解析に用いられる品質であるかどうかを確認した。
【００６３】
次に、total RNA各 1ngからAffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を用い血漿のcDNAを合成した。
【００６４】
Pmch遺伝子に対して特異的なプライマーを設計した。プライマーデザインは以下に示してある通りである。プライマー合成は北海道システムサイエンスに依頼した。
Pmch-1(Rat)
Forward Primer:5'-gccttttctttgttttctcacg-3'（配列番号１）
Reverse Primer:5'-aagactgctggtcctttcagag-3'（配列番号２）
Pmch-2(Rat)
Forward Primer:5'-tacggagcagcaaacaggatggcgaagatg-3'（配列番号３）
Reverse Primer:5'-ttcttctgaaaggatgttgtggaccagcag-3'（配列番号４）
上記のプライマーを用いて、血漿cDNAを鋳型として、Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa社製)を使用し、添付プロトコールに従いPCR反応を行った。PCR反応は38サイクル繰り返した。
【００６５】
PCR反応後、1.8%アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色で目的遺伝子の検出をした。検出にはUVトランスイルミネーター(ATTO)を用い、遺伝子バンドの強度を測定した。
【００６６】
RT-PCR解析で得られた結果を図3に示す。Pmch- 1 primerは脳のcDNAの時に使用したプライマーだが、血漿のcDNAを鋳型としたRT-PCR解析では目的のDNAバンドが検出できなかった。しかし、プライマーデザインを変更し検討したところ、Pmch- 2 primerのプライマーであれば、Pmch遺伝子は血漿中でも検出できることがわかった。
【００６７】
図3の結果からわかるように、Pmch遺伝子は、採取が簡単な血漿においても検出できることがわかったことから、精神疾患に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】DNAマイクロアレイ解析から得られた多動性障害モデルラットと正常ラットの脳（大脳皮質、線条体、中脳）でのPmch遺伝子の発現量（Signal値）を示したものである。
【図２】RT-PCR解析による多動性障害モデルラットと正常ラットの大脳皮質、線条体、中脳でのPmch遺伝子発現を示したものである。
【図３】RT-PCR解析による血漿中のPmch遺伝子発現を示したものである。
【図１】
2010004848.tif 000002
【図２】
2010004848.tif 000003
【図３】
2010004848.tif 000004
【配列表】
2010004848000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月18日(2009.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010004848000001.app