(57)【要約】【課題】特殊なプローブを必要とせず、通常のＰＣＲ反応のみでＥＧＦＲ遺伝子変異を検出可能とする。【解決手段】哺乳動物のＥＧＦＲ変異を検出するプライマーセットであって、哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるゲフィニチブ感受性の欠失変異を検出する第一のプライマーセットと、哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるゲフィニチブ感受性の点変異を検出する第二のプライマーセットと、哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のゲフィニチブ耐性の点変異を検出する第三のプライマーセットと、からなる群から選ばれる１種以上のプライマーセットを含む、ＥＧＦＲ変異検出用プライマーセット。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のＥＧＦＲ変異を検出するプライマーセットであって、
前記プライマーセットは、
前記哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるゲフィニチブ感受性のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を検出する第一のプライマーセットと、
前記哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるゲフィニチブ感受性のＬ８５８Ｒ点変異を検出する第二のプライマーセットと、
前記哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のゲフィニチブ耐性のＴ７９０Ｍ点変異を検出する第三のプライマーセットと、
からなる群から選ばれる１種以上のプライマーセットを含む、
ＥＧＦＲ変異検出用プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のＥＥＧＦＲ変異検出用プライマーセットにおいて、
前記第一のプライマーセットが、
（ｉ）配列番号：１で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せ、
（ｉｉ）配列番号：１で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せ、または、
（ｉｉｉ）配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるフォワードプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるリバースプライマーとの組合せ、
のいずれかを含む、ＥＧＦＲ変異検出用プライマーセット。
【請求項３】
請求項１に記載のＥＧＦＲ変異検出用プライマーセットにおいて、
前記第二のプライマーセットが、
（ｉｖ）配列番号：３で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せ、
（ｖ）配列番号：３で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せ、または、
（ｖｉ）配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるフォワードプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるリバースプライマーとの組合せ、
のいずれかを含む、ＥＧＦＲ変異検出用プライマーセット。
【請求項４】
請求項１に記載のＥＧＦＲ変異検出用プライマーセットにおいて、
前記第三のプライマーセットが、
（ｖｉｉ）配列番号：５で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：６で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せ、
（ｖｉｉｉ）配列番号：５で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：６で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せ、または、
（ｉｘ）配列番号：５で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるフォワードプライマーと、配列番号：６で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるリバースプライマーとの組合せ、
のいずれかを含む、ＥＧＦＲ変異検出用プライマーセット。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載のＥＧＦＲ変異検出用プライマーセットにおいて、
前記プライマーが、いずれも１５塩基以上の長さである、
ＥＧＦＲ変異検出用プライマーセット。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載のＥＧＦＲ変異検出用プライマーセットと、
さらに、ＤＮＡポリメラーゼと、
ヌクレオチドと、
を含む、
ＥＧＦＲ変異検出用キット。
【請求項７】
請求項１乃至５記載のＥＧＦＲ変異検出用プライマーセットを用いてＥＧＦＲ変異検出を検出するための核酸増幅装置であって、
核酸増幅に必要な熱源と、
核酸増幅反応容器と、
前記熱源が前記核酸増幅反応容器の反応部を圧接するための圧接部と、
を備える、
核酸増幅装置。
【請求項８】
請求項７記載の核酸増幅装置において、
前記核酸増幅反応容器は、核酸増幅反応が行われる平板部を有し、
前記熱源は複数あって、該複数の熱源は、それぞれＰＣＲ反応に必要な少なくとも２つの温度にあらかじめ設定されており、
さらに、前記核酸増幅装置が、前記平板部を前記複数の熱源に順次接触させることで反応液に熱サイクルを与えるための駆動機構を有する、
核酸増幅装置。
【請求項９】
請求項７記載の核酸増幅装置において、
前記熱源が前記反応容器を圧接することで該反応容器の反応部分の厚さを０．９ｍｍ以下に保持した上で熱反応を行うように構成されている、
核酸増幅装置。
【請求項１０】
請求項７記載の核酸増幅装置において、
前記核酸増幅反応容器は、核酸増幅反応が行われる厚さが０．９ｍｍ以下の平板部を有する円盤であり、
前記熱源は複数あって、該複数の熱源は、
それぞれＰＣＲ反応に必要な少なくとも２つの温度にあらかじめ設定されており、
さらに、前記平板部を回転することで、前記複数の熱源に順次接触させることで反応液に熱サイクルを与えるための回転機構を有する、
核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子変異検出プライマーセット、それを含むＥＧＦＲ遺伝子変異検出キット、およびそれを用いてＥＧＦＲ遺伝子変異検出を行うための核酸増幅装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は癌死亡原因の１位を占める難治性疾患であるが、近年癌細胞の重要分子を標的としてこれを特異的に阻害する「分子標的治療薬」の開発がさかんになっている。なかでもゲフィチニブ（商品名：イレッサ）は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の特異的な阻害剤であり２００２年７月本邦で世界に先駆けて本邦で認可された分子標的治療薬である。本薬は臨床的には投与開始後１ヶ月以内にドラマチックな臨床所見や画像の改善が得られる症例がある一方で、全く反応しない症例や、致命的な肺障害をおこす症例が存在する。
【０００３】
したがってどの症例に投与すべきかの感受性予測因子が強く求められてきたが、２００４年４月ボストンの２グループによりＥＧＦＲ遺伝子変異が有力な効果予測因子であることが報告された。このＥＧＦＲ遺伝子変異はＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインのエクソン１８〜２１に集中しており、ことにｅｘｏｎ１９のｄｅｌｅｔｉｏｎ変異とｅｘｏｎ  ２１のｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ変異の頻度が高い（図１）。ことにイレッサ感受性症例の多い本邦ではこの２つの変異が６０％以上（文献によっては９０％以上）占めることが知られるようになっている（表１）。
【０００４】
【表１】
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【０００５】
従ってこれら２つの変異を検出するだけでおおかたのイレッサ感受性患者を選択できることになる。そこで最近では個々の症例でこの遺伝子変異を解析して、遺伝子変異がある症例のみにイレッサを使用すること行われるようになっている。その解析方法として現在までリアルタイムＰＣＲとプローブを用いたいくつかの方法が開発され、実用化されている（特許文献１〜４、非特許文献１〜２）。
【０００６】
【表２】
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【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２８８３５３号公報
【特許文献２】特開２００７−９７４８６号公報
【特許文献３】特開２００７−２５２３１２号公報
【特許文献４】特表２００８−５０２３２８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒを用いた上皮成長因子受容体遺伝子変異検出の試み」、佐々木  秀文、名市大医誌、５７巻、３号、２００６、ｐ．６７〜７１
【非特許文献２】「ＥＧＦＲ遺伝子変異検出とその実用化」、萩原  弘一、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  呼吸器、２００８、ｐ．１８３〜１８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記文献記載の従来技術には、Ｔａｑｍａｎプローブなどの高価なプローブやリアルタイムＰＣＲ装置が必要で、しかも現在のＰＣＲには１時間上を要することから、診察中に患者に検査結果を伝えることは断念し、外部の検査機関に検査依頼をだし、結果を得るまで７日以上を要しているのが現状である。これは肺癌治療の使用薬剤の決定における隘路となっている。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、これらＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットを提供することを目的とする。また、本発明の別の目的は、このようなプライマーセットを含むＥＧＦＲ遺伝子変異検出のためのキットを用いることで、特殊なプローブを必要とせず、通常のＰＣＲ反応のみでＥＧＦＲ遺伝子変異を検出可能とすることである。さらに、本発明のもう一つの目的は、このようなプライマーセットを用いて迅速かつ正確なＥＧＦＲ遺伝子変異検出を可能にする核酸増幅装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、哺乳動物のＥＧＦＲ変異を検出するプライマーセットが提供される。このプライマーセットは、哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるゲフィニチブ感受性のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を検出する第一のプライマーセットと、哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるゲフィニチブ感受性のＬ８５８Ｒ点変異を検出する第二のプライマーセットと、哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のゲフィニチブ耐性のＴ７９０Ｍ点変異を検出する第三のプライマーセットと、からなる群から選ばれる１種以上のプライマーセットを含む。
【００１２】
このプライマーセットによれば、ＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットを用いているため、特殊なプローブを必要とせず、通常の核酸増幅反応のみでＥＧＦＲ遺伝子変異を検出可能であり、肺癌治療方針決定のうえで今や必須の検査となっているＥＧＦＲ遺伝子変異検出が安価かつ迅速にどこでも実行可能なものとなる。そのため、現在問題となっている外部検査機関への依頼による診断の遅れを解決するために、病院のベッドサイドまたは市中の無床診療所などでのＥＧＦＲ遺伝子変異検出が可能となり、その肺癌臨床への恩恵はきわめて高い。
【００１３】
また、本発明によれば、上記のＥＧＦＲ変異検出用プライマーセットと、さらに、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、を含む、ＥＧＦＲ変異検出用キットが提供される。
【００１４】
このＥＧＦＲ変異検出用キットによれば、ＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットを含んでいるため、特殊なプローブを必要とせず、同様にＥＧＦＲ変異検出用キットに含まれているＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、を用いて、通常の核酸増幅反応のみでＥＧＦＲ遺伝子変異を検出可能であり、肺癌治療方針決定のうえで今や必須の検査となっているＥＧＦＲ遺伝子変異検出が安価かつ迅速にどこでも実行可能なものとなる。そのため、現在問題となっている外部検査機関への依頼による診断の遅れを解決するために、病院のベッドサイドまたは市中の無床診療所などでのＥＧＦＲ遺伝子変異検出が可能となり、その肺癌臨床への恩恵はきわめて高い。
【００１５】
また、本発明によれば、上記のＥＧＦＲ変異検出用プライマーセットを用いてＥＧＦＲ変異検出を検出するための核酸増幅装置であって、核酸増幅に必要な熱源と、核酸増幅反応容器と、熱源が前記核酸増幅反応容器の反応部を圧接するための圧接部と、を備える、核酸増幅装置が提供される。
【００１６】
この核酸増幅装置によれば、核酸増幅に必要な熱源と、核酸増幅反応容器と、熱源が前記核酸増幅反応容器の反応部を圧接するための圧接部と、を備えるため、通常の核酸増幅装置の場合に比べて遙かに高速に、ＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットを用いて、ＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出できるため、肺癌治療方針決定のうえで今や必須の検査となっているＥＧＦＲ遺伝子変異検出が安価かつ迅速にどこでも実行可能なものとなる。そのため、現在問題となっている外部検査機関への依頼による診断の遅れを解決するために、病院のベッドサイドまたは市中の無床診療所などでのＥＧＦＲ遺伝子変異検出が可能となり、その肺癌臨床への恩恵はきわめて高い。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットを用いているため、特殊なプローブを必要とせず、通常のＰＣＲ反応のみで哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子変異を検出可能である。そのため、肺癌治療方針決定のうえで今や必須の検査となっているＥＧＦＲ遺伝子変異検出が安価にどこでも実行可能なものとなる。その結果、病院のベッドサイドまたは市中の無床診療所などでのＥＧＦＲ遺伝子変異検出が可能となり、その肺癌臨床への恩恵はきわめて高い。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインのエクソン１８〜２１の構造を示した概念図である。
【図２】実施例におけるｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ検出プライマーの設計方針（Ａ）と通常ＰＣＲ装置での温度条件（Ｂ）を示すＤｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ検出プライマーの設計図である。
【図３】実施例において設計したＤｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ検出プライマーの特異性を示すための電気泳動写真である。
【図４】実施例において設計したＤｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ検出プライマーの感度を示すための電気泳動写真である。
【図５】実施例におけるｅｘｏｎ２１  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ検出プライマーの設計方針である。
【図６】実施例において設計したｅｘｏｎ２１  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ検出プライマーの特異性および感度を示すための電気泳動写真である。
【図７】実施例において用いた超高速ＰＣＲに最適化した反応液組成および温度条件について説明するための図である。
【図８】実施例において用いたｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  検出  ｐｒｉｍｅｒによる検出結果の特異性を説明するためのグラフである。
【図９】実施例において用いたｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  検出  ｐｒｉｍｅｒによる検出結果の感度を説明するためのグラフである。
【図１０】実施例において用いたｅｘｏｎ２１  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ検出プライマーの検出結果の特異性を説明するためのグラフである。
【図１１】実施例において用いたマルチプレックスＰＣＲ法の条件について、通常のＰＣＲ法の条件と比較して説明するための概念図である。
【図１２】通常のＰＣＲ法による検出結果を示す電気泳動図である。
【図１３】３種類のプライマーにて同時にマルチプレックスＰＣＲ法による増幅を行った結果を示す電気泳動図である。
【図１４】実施例において用いたＰＣＲ装置の概略構成を示す図である。
【図１５】実施例において用いたＰＣＲ装置が備えるヒートブロックの構造を模式的に示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
〔用語の説明〕
本実施形態において、「上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＥＧＦＲとも記載する）」とは、上皮成長因子（ＥＧＦ）の受容体を意味する。このＥＧＦＲは、チロシンキナーゼ型受容体であり、細胞膜を貫通して存在する分子量１７０ｋＤａの糖タンパクである。このＥＧＦＲは、ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１とも呼ばれる。
【００２０】
本実施形態において、「ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）」とは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼを選択的に阻害する内服抗がん剤を意味する。ゲフィチニブは、癌の増殖などに関係する特定の分子を狙い撃ちする分子標的治療薬の一種である。ゲフィチニブは、白色？黄白色の粉末で、ＩＵＰＡＣ命名法ではＮ−（３−ｃｈｌｏｒｏ−４−ｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｅｎｙｌ）−７−ｍｅｔｈｏｘｙ−６−（３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ−４−ｙｌｐｒｏｐｏｘｙ）ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ−４−ａｍｉｎｅ、ＣＡＳ登録番号は１８４４７５−３５−２、化学式はＣ２２Ｈ２４ＣｌＦＮ４Ｏ３、分子量は４４６．９０２ｇ／ｍｏｌである。ゲフィチニブ製剤は、手術不能又は再発した非小細胞肺癌に対する治療薬として用いられ、製造・販売元はアストラゼネカ株式会社であり、商品名は「イレッサＲ  （Ｉｒｅｓｓａ（Ｒ））」という。
【００２１】
また、本実施形態における「ヌクレオチド」もしくは「核酸」とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシド（ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む）のことをいい、そのオリゴマー（オリゴヌクレオチド、例えば、２から１００塩基程度）及びポリマー（ポリヌクレオチド、例えば、１００塩基以上）を含む総称である。本実施形態に係るヌクレオチドもしくは核酸は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子等や放射性同位体で標識されたモノマー、あるいはこれらを含むオリゴマー又はポリマーを含む。
【００２２】
また、本実施形態における「プライマー」とは、核酸増幅反応において、鋳型とハイブリダイズし、核酸増幅反応を開始するのに必要なヌクレオチドのことをいう。核酸増幅反応において増幅を所望する鋳型を基に、その鋳型とハイブリダイズし、核酸増幅反応を行えるように、例えば、特異的なＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法等での生成物（鎖長あるいは配列において）を生成可能なように、好ましくはプライマー自身がその鋳型特異的な配列を含むように、設計される。また、一般的なプライマーは、これに限られないが、通常、１５塩基−１００塩基、好ましくは１５塩基−３５塩基の鎖長を有するように設計される。
【００２３】
プライマーの３’側の領域は鋳型鎖に対し相補的であることが好ましいが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどの機能的な配列を付加することも可能である。また、後述するように、例えば核酸増幅法としてＩＣＡＮ法を用いる場合などにおいては、プライマーはＤＮＡだけでなくＲＮＡを含むか、あるいは必要に応じてＲＮＡのみで構成されていてもよい。特に本実施形態に好適なプライマーについては、後述する。ＰＣＲ法又はその他の協奏的核酸増幅反応においては、一般に、フォワードプライマー（センスプライマー）とリバースプライマー（アンチセンスプライマー）とからなる一組、あるいはそれ以上のプライマーを含むプライマーセットが用いられる。
【００２４】
また、本実施形態において、「特異的にハイブリダイズする」とは、あるヌクレオチドに対し、別のヌクレオチドが水素結合等を介し、相補的に結合し、比較対照とすべきヌクレオチドには同条件では結合しない状態をいう。必ずしも、他の全てのヌクレオチドに対して特異的である必要は無く、使用目的に応じた特異性を有していればよい。例えば、で哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のゲフィニチブ耐性のＴ７９０Ｍ点変異を検出するためには、Ｔ７９０Ｍ点変異を含む領域以外のゲノムＤＮＡのヌクレオチドに対して結合しなければ、「特異的にハイブリダイズする」といってもよい。
【００２５】
ハイブリダイズの条件は、そのヌクレオチドの使用目的に応じて選択することができる。例えば、ＰＣＲ法に用いるプライマーとしてのヌクレオチドであれば、ＰＣＲ法でのアニーリング時の条件でハイブリダイズするように選択される。また、核酸プローブとして用いられる時には、そのハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズするように選択される。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするものが選択される。
【００２６】
また、本実施形態における「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を含む条件、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるものや、その適宜改変したものが挙げられるが、これに限られない。また、ハイブリダイゼーション条件の温度については、用いる核酸増幅反応あるいはハイブリダイズ反応に応じて定めることができるが、例えば、４２℃、４３℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、６８℃、７０℃、７２℃である。
【００２７】
また、本実施形態において、「核酸増幅」法としては、標的の核酸を増幅させる方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよいが、プライマー及びプライマーセットを用いる方法として、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法あるいは他の核酸の協奏的核酸増幅方法が用いられる。
【００２８】
また、本実施形態において、増幅産物の検出法としては、核酸を検出するための方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよい。例えば、増幅後の核酸を電気泳動して検出しても、検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法を用いて検出してもよいが、多数検体処理、自動化、再現性や二次汚染等の点で有利な、以下に記す方法を用いてもよい。
【００２９】
たとえば、簡便にＤＮＡを検出する方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを用いることができる。このようなプローブを用いた検出方法は、標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分がその相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、核酸増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、この方法により一定温度、一段階かつ密閉容器内で核酸増幅および検出（測定）を同時かつ迅速・簡便に実施することが可能となる。
【００３０】
増幅核酸の検出方法は、上記に限られず、例えば、ＬＡＭＰ法では、副産物のピロリン酸マグネシウムによる白濁を指標に検出してもよく、増幅核酸を直接測定しない方法等であっても、それぞれの核酸増幅方法に適用可能な公知の増幅産物検出方法であれば、何れの方法でも用いることができる。
【００３１】
また、本実施形態において、「標識される」とは、生物学及び医学の分野で用いることのできる任意のシグナル生成手段で標識されていることをいう。このような検出可能なシグナル生成手段による標識としては、例えば、α−３３Ｐなどの放射性標識、蛍光性のインターカレーターなどによる蛍光色素標識、有色化合物などによる色素標識、あるいはＨＲＰやＡＰなどの酵素標識が挙げられるが、好ましくは蛍光色素標識である。また、相補的二本鎖を形成することで標識の特性が変化するものがより好ましく、更に好ましくは、相補的二本鎖を形成することで蛍光特性の変化するインターカレーター性蛍光色素標識である。当業者であれば、各種標識試薬・キットの使用法又は常法に従い、これらの標識を行うことは容易に可能である。
【００３２】
また、本実施形態における「相同性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合は間隙を導入した上で、目的の塩基と同一である候補配列中の核酸塩基数のパーセントとして定義される。この際に、同一の塩基（チミンとウラシルも同一とみなす）を有するＤＮＡとＲＮＡとは結合特性が非常に近いため、同一の核酸塩基として定義される。相同性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の提供するｂｌａｓｔ、ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ又はＡＬＩＧＮのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能であるが、ｂｌａｓｔ２ｓｅｑにおいて標準的な初期パラメーターを用いて計算された値などを用いることもできる。
【００３３】
なお、核酸増幅のためのプライマーやその他のプローブなどにおいては、ある塩基配列の代わりに、その塩基配列と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上あるいは９８％以上（１００％以下）の相同性を有する塩基配列、あるいは、その塩基配列に対し、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、又は数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を用いることもできる（相同性の定義の際と同様に、同一の塩基を有するＲＮＡとＤＮＡの置換は、ここでの置換・欠失・挿入には含まれない）。
【００３４】
〔実施形態１〕
以下、本発明の第１の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００３５】
本実施形態に係るＥＧＦＲ変異検出システムは、高速の核酸増幅装置と、哺乳動物のＥＧＦＲ変異を検出するプライマーセットと、を有する哺乳動物のＥＧＦＲ変異を検出するシステムである。すなわち、本実施形態に係るＥＧＦＲ変異検出システムは、（１）高速の核酸増幅装置という機械的な側面の構成と、（２）乳動物のＥＧＦＲ変異を検出するプライマーセットという生物・化学的な側面の構成と、をともに有する融合技術分野の発明であると言うことができる。
【００３６】
（１）機械的な側面の構成について
そこで、まずは、本実施形態に係るＥＧＦＲ変異検出システムのうち、（１）高速の核酸増幅装置という機械的な側面の構成について説明をする。図１４は、本実施形態において用いる核酸増幅装置の概略構成を示す図である。図１５は、本実施形態において用いる核酸増幅装置が備えるヒートブロックの構造を模式的に示す図である。本実施形態において用いる核酸増幅装置１は、複数の温度領域３ａ、３ｂを有する加熱板２と、加熱板２の加熱面上で摺動しながら回転するディスクチップ１０と、を備えている。また、この核酸増幅装置１は、ディスクチップ１０に設けられている複数のサンプルウェル１３と、加熱板２の複数の温度領域３ａ、３ｂの温度を制御する温度制御部４と、ディスクチップの回転数を制御する回転制御部５と、を備えている。また、このＥＧＦＲ変異検出システムには、さらに、プライマーに付加された各種標識（たとえば蛍光標識）を検出するための検出器６が備えられている。
【００３７】
このように、この核酸増幅装置１によれば、それぞれ異なる温度に調整された複数の温度領域３ａ、３ｂを形成することができる。例えば、解離反応やアニーリング反応等のための反応温度に調整された、複数の温度領域３ａ、３ｂを一つの核酸増幅装置１中に形成することができる。そのため、この核酸増幅装置１では、ディスクチップ１０を、当該ディスクチップ１０全体を複数の温度領域３ａ、３ｂで同時に加温する状態で搭載することができる。これにより、当該状態を維持したまま、ディスクチップ１０の中の核酸増幅反応液を貯留した複数のサンプルウェル１３を、順次それぞれの上記温度領域３ａ、３ｂ中に配置することができる。つまり、異なる温度に調整された少なくとも二つ以上の温度領域３ａ、３ｂによってディスクチップ１０全体を加温する状態を維持しながら、核酸増幅反応液をそれぞれの上記温度領域３ａ、３ｂで順次加温させることで、解離反応からアニーリング反応等のように、順次反応を移行させることができる。これにより、核酸増幅反応液の加温効率を向上させることができる。
【００３８】
また、この核酸増幅装置で用いるディスクチップ１０のＰＣＲ反応用サンプルウェルは、ＰＣＲ反応液が０．９ｍｍ以下の液膜になるように構成されるのが好ましく、後述の実施例では、液厚さ０．６ｍｍの膜状にＰＣＲ反応液を充填し、厚さ０．１ｍｍのフッソ樹脂製の耐熱かつやわらかいフィルムでシールしたものを用いている。
【００３９】
ここで、本実施形態によって核酸増幅反応液の加温効率を向上させることができる理由を、９５℃の解離反応の後、６５℃に冷却してアニーリング反応及び伸長反応を行ない、ディスクチップ１０全体を９５℃の温度領域３ａ及び６５℃の温度領域３ｂによって同時に加温する場合を例にして説明する。
【００４０】
まず、解離反応時、核酸増幅反応液を貯留したサンプルウェル１３及びその周囲は９５℃に加温される。上記の構成によれば、ディスクチップ１０には６５℃で加温されている領域も存在する。そのため、当該ディスクチップ１０を９５℃のみで加温する場合に比べて、核酸増幅反応液を貯留したサンプルウェル１３周囲に形成される９５℃の領域は少なくなる。つまり、当該ディスクチップ１０上には６５℃又はこれに近い温度の領域が増える。これにより、アニーリング反応時には、冷却すべき領域も狭く、また、冷却のために吸収すべき熱量も低減できる。そのため迅速に核酸増幅反応液を６５℃に調整することができる。このように、ディスクチップ１０全体を、複数の温度領域３ａ、３ｂで加温する状態を維持することで、次の反応のために核酸増幅反応液を加温するとき、前回核酸増幅反応液に加温した温度による影響を抑えることができる。これにより、核酸増幅反応液の温度調整に必要な熱量を少なくすることができ、迅速に温度調整を行なうことができる。
【００４１】
そして、このようなサーマルサイクルによって核酸増幅された核酸断片は、上記のプライマーセットに蛍光標識などの各種標識が付加されている場合などには、その蛍光を検出するための検出器６がリアルタイムにその標識を検出し、核酸増幅の様子を記録するしくになっている。そのため、この核酸増幅装置１によれば、非常に短時間に核酸増幅の様子が検出できることになる。
【００４２】
この構成における核酸増幅装置がＰＣＲ装置の場合は、ＥＧＦＲ変異を迅速に検出する観点から、反応液の温度をＰＣＲ反応に必要なアニーリング温度・伸長温度・乖離温度という３温度に迅速に変化させるための少なくとも二つのあらかじめ必要な温度に設定された熱源に繰り返し接触させる方式か、厚さ０．９ｍｍ以下の薄い液膜状の反応部でＰＣＲ反応を行う方式か、あるいはその両方式を備えた装置であることが好ましい。ＰＣＲ反応は、反応液の温度を５０度程度のアニーリング温度と７０度程度の伸長温度と９５度程度の乖離温度（時としてアニーリング温度と伸長温度を同じく設定する場合がある）の間の昇温と冷却を数十回繰り返すことで、反応液に添加されたプライマーによって特定の配列の遺伝子を増幅するものである。通常のＰＣＲ装置は、この反応に１時間以上を要し前述のようにこの遅さが肺がん患者への抗がん剤処方適否を診察室に居る間に判断するＰＯＣの実施を困難にしている。
【００４３】
反応速度で見るとＰＣＲ法は、ほんの数分で完了するだけの反応速度であるが、従来のＰＣＲ法では実際に１時間以上を要している。本発明者らは、これはＰＣＲ方式に次の二つの原因があると気づいた。まずひとつは、ＰＣＲ装置にＰＣＲ用の大きな熱源がありこの熱源をＰＣＲに必要な３温度に上下させているため、熱源の熱容量が大きくＰＣＲに必要な時間より、ＰＣＲに必要な熱源温度の上げ下げに多くのムダ時間を消費しているということである。もうひとつの原因は、ＰＣＲ反応液が通常はいわゆる試験管状などの容器に入っており、厚さ数ｍｍ以上の液溜りとなっており、液溜りの中での伝熱に時間が掛かるということである。
【００４４】
本発明者らは、この対策としてアニーリング温度や乖離温度にあらかじめ調整しておいた熱源にＰＣＲ反応液を接触させて熱サイクルを行うことで、ＰＣＲに必要な熱源温度の上げ下げに要するムダ時間を排除することに成功した。
【００４５】
また反応液を０．９ｍｍ以下の薄膜に閉じ込める形の反応容器を用いることでＰＣＲ反応液の液溜り内部の伝熱によるロス時間の問題を解決した。この場合、反応容器の形状は平板部を有する板状反応容器を用いても良いし、反応容器自体は大きさは問わず柔らかいチュウブ状の部分に反応液を収容し、熱源を圧接することで０．９ｍｍ以下に薄くできるものであれば同じ効果が得られる。
【００４６】
これらの処置はそれぞれ単独でも大きな効果はあるが、両方式を組み合わせればさらなる効果があることから、反応液を０．９ｍｍ以下の薄膜に閉じ込める形の反応容器として薄い円盤を用い、その円盤をアニーリング温度と乖離温度にあらかじめ設定した熱源の間を接触して回転させる方式を考案した。この方式により従来１時間ほど掛かっていたＰＣＲ反応を３〜５分まで短縮が可能である事を見出した。
【００４７】
なお、本実施形態のＥＧＦＲ変異を迅速に検出するシステムとして、円盤状の反応容器を用いる例を後述の実施例で示しているが、本発明の核酸増幅装置の機構としてはこれに限定されるものではない。
【００４８】
（２）生物・化学的な側面の構成について
次いで、本実施形態に係るＥＧＦＲ変異検出システムのうち、（２）乳動物のＥＧＦＲ変異を検出するプライマーセットという生物・化学的な側面の構成について説明する。図１は、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインのエクソン１８〜２１の構造を示した概念図である。本実施形態で用いるプライマーセットは、哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるゲフィニチブ感受性の欠失変異を検出する第一のプライマーセットと、哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるゲフィニチブ感受性の点変異を検出する第二のプライマーセットと、哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のゲフィニチブ耐性の点変異を検出する第三のプライマーセットと、からなる群から選ばれる１種以上のプライマーセットを含む、ＥＧＦＲ変異検出システムである。
【００４９】
本実施形態では、このようにＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットを用いているため、特殊なプローブを必要とせず、通常のＰＣＲ反応のみでＥＧＦＲ遺伝子変異を検出可能であり、コンパクトかつ超高速な回転型のＰＣＲ装置とあわせて用いることによって、肺癌治療方針決定のうえで今や必須の検査となっているＥＧＦＲ遺伝子変異検出が安価にどこでも実行可能なものとなる。そのため、病院のベッドサイドまたは市中の無床診療所などでのＥＧＦＲ遺伝子変異検出が可能となり、その肺癌臨床への恩恵はきわめて高い。
【００５０】
なお、上記の哺乳動物は、特にヒトに限定するものではなく、本実施形態に係るＥＧＦＲ変異検出システムは、ヒト以外の哺乳動物に用いられてもよい。たとえば、獣医学などの分野において、ヒト以外の哺乳動物である、家畜として飼育されるウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど、またはペットとして飼育されるイヌ、ネコ、ネズミなどのＥＧＦＲ変異を検出するために用いることもできる。あるいは、ヒト向けの医薬品の開発、あるいはヒト以外の哺乳動物向けの動物薬の開発のために用いられる実験動物である、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、ネズミ（ラットおよびマウスを含む）などのＥＧＦＲ変異を検出するために用いることもできる。
【００５１】
もっとも、上記の哺乳動物としては、医薬品（診断薬、治療薬および予防薬）としての市場の大きさを考えれば、やはりヒトであることが好ましい。また、上記の第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットが、後述するように、いずれもヒトのゲノム上のＥＧＦＲ遺伝子変異を検出の直接のターゲットとしていることからも、やはりヒトであることが好ましい。さらに、背景技術の項目で説明したように、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の特異的な阻害剤であるゲフィチニブ（商品名：イレッサ）のどのような症例に投与すべきかの感受性予測因子が医学界において強く求められていることからも、やはりヒトであることが好ましい。
【００５２】
また、上記の哺乳動物としては、ヒトの中でも日本民族に分類されるヒトであることが好ましい。なぜなら、イレッサ感受性症例の多い日本民族では、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるゲフィニチブ感受性の欠失変異およびＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるゲフィニチブ感受性の点変異という２つの変異が６０％以上（文献によっては９０％以上）占めることが知られるようになっているためである。すなわち、日本民族にイレッサを投与すべきかどうか判断する上では、これら２つの変異を検出するだけで、おおかたのイレッサ感受性患者を選択できることになるためである。
【００５３】
（２−１）第一のプライマーセットについて
図２は、第一のプライマーセットを作成する際におけるｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ検出プライマーの設計方針（Ａ）と通常ＰＣＲ装置での温度条件（Ｂ）を示すＤｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ検出プライマーの設計図である。図２に示すように、第一のプライマーセットを設計する際には、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるゲフィニチブ感受性の欠失変異を特異的に検出できるように、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における欠失箇所を挟み込むように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計した。具体的には、第一のプライマーセットが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を挟み込むように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計した。この際、図２に示すように、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における欠失箇所の上流領域に相当する塩基配列ができるだけ短くなるように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計して特異性を高めるようにした。
【００５４】
さらに具体的には、このようにして設計される第一のプライマーセットは、配列番号：１で示される塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せ、を含むことが好ましい。
【００５５】
配列番号１：５’−ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＴＣ−３’（ＤｅｌＥ７４６−Ａ７５０  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号２：５’−ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＴＧ−３’（ＤｅｌＥ７４６−Ａ７５０  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）
【００５６】
この配列によれば、後述する実施例で示すように、本発明者らがＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における欠失を検出するために有用であることを発見した、上記の配列番号：１で示される塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列を含むリバースプライマーと、を含むプライマーの組合せを用いているため、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を効率的に検出できる。
【００５７】
なぜなら、後述する実施例の図３で示すように、配列番号：１で示される塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセットを用いて、上述の装置を使用してＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことを確認しているからである。
【００５８】
そのため、当然のことではあるが、配列番号：１で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様に上述の装置を用いてＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。
【００５９】
もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：１〜２で示される塩基配列に対して、それぞれ８０％以上の相同性を有することが好ましいが、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を有していれば、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有する被験者のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００６０】
また、当然のことではあるが、配列番号：１で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様に上述の装置を使用してＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。
【００６１】
もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：１〜２で示される塩基配列に対して、それぞれ１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むことが好ましいが、１塩基のみ欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む場合には、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有する被験者のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００６２】
さらに、当然のことではあるが、配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるフォワードプライマーと、配列番号：２で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様に上述の装置を使用してＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。なお、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするという用語の意味については、既に〔用語の説明〕の項目で説明しているため、煩雑をさけるため説明を繰り返さない。
【００６３】
（２−２）第二のプライマーセットについて
図５は、第二のプライマーセットを作成する際におけるｅｘｏｎ２１  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ検出プライマーの設計方針を示す。図５に示すように、第二のプライマーセットを設計する際には、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるゲフィニチブ感受性の点変異を特異的に検出できるように、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１における点変異を挟み込むように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計した。具体的には、第二のプライマーセットが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を挟み込むように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計した。この際、図５に示すように、ＡＲＭＳ法などの一般的な方法によって、各種プライマーを作成した後、ＰＣＲ法などによる核酸増幅を行い、もっとも適切なプライマーを選ぶことが好ましい。
【００６４】
ここで、ＡＲＭＳ法とは、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの略で、ＰＣＲのプライマー部位にミスマッチがあると、プライマーのアニーリングがうまくできなくなり、ＰＣＲで増幅ができなくなることを利用した方法である。一般的に、ＰＣＲの成否に大きな影響を及ぼすプライマーのミスマッチは、３’末端のものである。したがって、この方法では３’末端に変異部位がくるようにプライマーを設計する。そして、ＰＣＲのプライマーとしての働きが、１塩基のみのミスマッチでは悪くないため、変異部位に１または２、塩基５’側にミスマッチを加えることが多い。このようにプライマーに２か所のミスマッチがあると、一定条件下ではＰＣＲのプライマーとしては働かないことが多い。このようにして、正常用と変異用の２とおりのプライマーを作成してＰＣＲ反応を行い、生成産物をアガロース電気泳動で調べたとき、正常用プライマーでＰＣＲ産物がなく、変異用プライマーでＰＣＲ産物があれば、そこのＤＮＡ上に変異があることになる。ＡＲＭＳ法では、ハイブリダイゼーションや制限酵素処理をしなくてもよいため、非常に優れた簡便な方法であり、各種の遺伝子変異の検出に利用されている。
【００６５】
話を元に戻すと、さらに具体的には、このようにして設計される第二のプライマーセットは、配列番号：３で示される塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せ、を含むことが好ましい。
【００６６】
配列番号３：５’−ＴＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴ−３’（Ｌ８５８Ｒ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号４：５’−ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＴＣＣ−３’（Ｌ８５８Ｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）
【００６７】
この配列によれば、後述する実施例で示すように、本発明者らがＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１における点変異を検出するために有用であることを発見した、上記の配列番号：３で示される塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列を含むリバースプライマーと、を含むプライマーの組合せを用いているため、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を効率的に検出することができる。
【００６８】
なぜなら、後述する実施例の図６で示すように、配列番号：３で示される塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセットによって、上述の装置を使用してＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅され、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異における欠失変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことを確認しているからである。
【００６９】
そのため、当然のことではあるが、配列番号：３で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様に上述の装置を用いてＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。
【００７０】
もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：３〜４で示される塩基配列に対して、それぞれ８０％以上の相同性を有することが好ましいが、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を有していれば、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を有する被験者のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００７１】
また、当然のことではあるが、配列番号：３で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様に上述の装置を使用してＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。
【００７２】
もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：３〜４で示される塩基配列に対して、それぞれ１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むことが好ましいが、１塩基のみ欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む場合には、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を有する被験者のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００７３】
さらに、当然のことではあるが、配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるフォワードプライマーと、配列番号：４で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様に上述の装置を使用してＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。なお、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするという用語の意味については、既に〔用語の説明〕の項目で説明しているため、煩雑をさけるため説明を繰り返さない。
【００７４】
（２−３）第三のプライマーセットについて
第三のプライマーセットを設計する際には、原則としては、第二のプライマーセットの設計方針と同様の方針を採用することができる。すなわち、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるゲフィニチブ耐性の点変異を特異的に検出できるように、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１における点変異を挟み込むように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計した。具体的には、第二のプライマーセットが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のゲフィニチブ耐性のＴ７９０Ｍ点変異を挟み込むように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計すればよい。この際、第二のプライマーセットの設計方針と同様に、各種プライマーを作成した後、ＰＣＲ法などによる核酸増幅を行い、もっとも適切なプライマーを選ぶことが好ましい。
【００７５】
さらに具体的には、このようにして設計される第三のプライマーセットは、配列番号：５で示される塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：６で示される塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せ、を含むことが好ましい。
【００７６】
配列番号５：５’−ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＴＧＡ  ＴＧＧ−３’（  Ｔ７９０Ｍ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号６：５’−ＧＡＡ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡ−３’（  Ｔ７９０Ｍ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）
【００７７】
この配列によれば、後述する実施例で示すように、本発明者らがＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を検出するために有用であることを発見した、上記の配列番号：５で示される塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：６で示される塩基配列を含むリバースプライマーと、を含むプライマーの組合せを用いているため、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を効率的に検出することができる。
【００７８】
なぜなら、後述する実施例で示すように、配列番号：５で示される塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：６で示される塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセットによって、上述の装置を使用してＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅され、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異における欠失変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことを確認しているからである。
【００７９】
そのため、当然のことではあるが、配列番号：５で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：６で示される塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様に上述の装置を用いてＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。
【００８０】
もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：５〜６で示される塩基配列に対して、それぞれ８０％以上の相同性を有することが好ましいが、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を有していれば、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を有する被験者のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００８１】
また、当然のことではあるが、配列番号：５で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号：６で示される塩基配列のうち１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様に上述の装置を使用してＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。
【００８２】
もっとも、これらのプライマーの塩基配列は、配列番号：５〜６で示される塩基配列に対して、それぞれ１塩基または２塩基を欠失、置換、付加してなる塩基配列を含むことが好ましいが、１塩基のみ欠失、置換、付加してなる塩基配列を含む場合には、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を有する被験者のゲノムＤＮＡにさらに特異的に結合するようになるためより一層好ましい。
【００８３】
さらに、当然のことではあるが、配列番号：５で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるフォワードプライマーと、配列番号：６で示される塩基配列の核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸からなるリバースプライマーとの組合せからなるプライマーセット用いた場合にも、同様に上述の装置を使用してＰＣＲ法などによる核酸増幅を行った場合、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を有する場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されるが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のＴ７９０Ｍ点変異を有さない場合には、これらのプライマーに挟まれたゲノムＤＮＡの塩基配列が増幅されないことについては、当業者であれば容易に理解できることである。なお、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするという用語の意味については、既に〔用語の説明〕の項目で説明しているため、煩雑をさけるため説明を繰り返さない。
【００８４】
（２−４）いずれのプライマーセットにも共通する性質について
なお、これらのフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、いずれも１５塩基以上の長さからなることが好ましい。なぜなら、一般的なＰＣＲ法などの核酸増幅法に適したプライマーは、ＰＣＲサイクルにおいて、それぞれのステップで鋳型ＤＮＡに対して結合・解離がスムーズに進行するようにするために、１５塩基−１００塩基、好ましくは１５塩基−３５塩基の鎖長を有するように設計されることが多いためである。
【００８５】
また、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも一方が標識されていてもよい。このとき、標識の種類は特に限定されず、α−３３Ｐなどの放射性標識、蛍光性のインターカレーターなどによる蛍光色素標識、有色化合物などによる色素標識、あるいはＨＲＰやＡＰなどの酵素標識が挙げられるが、安全性および使い勝手のよい蛍光色素標識を用いることが好ましい。このように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも一方が標識されていれば、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異、またはＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０におけるＴ７９０Ｍ点変異のいずれかの変異を有する被験者のゲノムＤＮＡのうち、これらのプライマーセットに挟まれた領域の増幅を容易に検出することができる利点がある。
【００８６】
このような蛍光性のインターカレーターなどによる蛍光色素標識としては、特に限定するものではないが、たとえば、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒ））と呼ばれる色素は、分子生物学で核酸の染色に用いられる一般的なシアニン系色素であり、使い勝手がよいために好ましい。サイバーグリーンは、二重らせんを組んでいるＤＮＡと特異的に結合し、ＤＮＡと結合することで青色光（λ＝４８８ｎｍ）を吸収し、緑色光（λ＝５２２ｎｍ）の蛍光を発するようになる。このため、サイバーグリーンは、核酸染色色素として用いられ、強い発癌性物質として知られる臭化エチジウムの代替物質として用いることができ、安全性が高いため好ましい。もっとも、蛍光性のインターカレーターなどによる蛍光色素標識を行う際には、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを事前に標識しておく必要はなく、核酸増幅反応後に電気泳動を行った際に蛍光性のインターカレーターなどによる蛍光色素標識を行って、蛍光を発する増幅断片を検出してもよい。
【００８７】
（２−５）三種のプライマーセットの組み合わせについて
ここで、本実施形態のＥＧＦＲ変異検出システムにおいては、上記の第一〜第三のプライマーセットが、ディスクチップ１０に設けられている複数のサンプルウェル１３のうち別々のウェルに分けて注入される形で用いられてもよい。このようにすれば、上記の第一〜第三のプライマーセットによって、それぞれ別のサンプルウェル１３中で、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異、またはＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０におけるＴ７９０Ｍ点変異が、互いに干渉しあうことなく別々に検出されるため、検出精度を高く維持することができるメリットがある。
【００８８】
一方、本実施形態のＥＧＦＲ変異検出システムにおいては、上記の第一〜第三のプライマーセットが、ディスクチップ１０に設けられている複数のサンプルウェル１３のうち同じウェルに混合して注入される形で用いられてもよい。このように、上記の第一〜第三のプライマーセットによって、それぞれ同じサンプルウェル１３中で、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異、およびＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０におけるＴ７９０Ｍ点変異について、単一のウェルごとに一度にまとめて検出してもよい。
【００８９】
このような手法は、一般的にマルチプレックス法と呼ばれており、一つの核酸増幅反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。このようにマルチプレックス核酸増幅法を行うことで、試薬や機材の節約による経済性、同時検出による迅速性でのメリットに加え、貴重なサンプルの有効利用も可能である。
【００９０】
しかし、マルチプレックス核酸増幅法を行う際には、それぞれのターゲットの増幅が一つのＰＣＲ反応系で良好に行えるように、使用するプライマーの設定、反応条件の検討を行わなければならず、煩雑な作業が必要となることが多い。これに対して、本実施形態で説明した上記の第一〜第三のプライマーセットについては、そのような煩雑な作業を必要とせず、最小限の条件設定でマルチプレックス核酸増幅法を行うことができることを、後述する実施例で示すように、本発明者らは確認している。よって、本実施形態で説明した上記の第一〜第三のプライマーセットは、マルチプレックス核酸増幅法を行うに適したプライマーセットであることが明らかである。
【００９１】
なお、このようにマルチプレックス核酸増幅法を行う際には、第一〜第三のプライマーセットが、それぞれのプライマーセットごとに異なる種類の標識が付加されていれば、第一〜第三のプライマーセットによって増幅された断片が、断片のサイズなどにかかわらず標識の種類によって容易に区別できるため好ましい。
【００９２】
たとえば、蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法において、マルチプレックス法を行う場合には、プローブの種類だけでなく蛍光色素の種類も重要である。ほとんどの蛍光標識プローブでは、蛍光物質とクエンチャーを組み合わせ、ＦＲＥＴの原理を利用して検出しているが、蛍光物質とクエンチャーにはさまざまな種類があり、使用するリアルタイムＰＣＲ法で用いる装置の励起および検出波長に合ったものを選択することが好ましい。そのため、マルチプレックスのリアルタイムＰＣＲ法を行う際には、各蛍光がクロストークしないように組み合わせに留意することが好ましい。
【００９３】
（２−６）その他の試薬
本実施形態のＥＧＦＲ変異検出システムは、上述のプライマーセットにくわえて、さらにＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、組み合わせることによって、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異、またはＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０におけるＴ７９０Ｍ点変異を検出するための検出キットとして好適に用いることができる。
【００９４】
このように、上述のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、を組み合わせて提供すれば、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異、またはＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０におけるＴ７９０Ｍ点変異を検出するための検出に必要な試薬が一度に入手できるために、試験を行う研究者の手間が省ける利点がある。
【００９５】
また、あらかじめ上述のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、の組み合わせによって、うまくＰＣＲサイクルが進行して、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異、またはＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０におけるＴ７９０Ｍ点変異を検出することができる条件を設定して、キットの説明書に詳細に記載しておけば、やはり試験を行う研究者の手間が省ける利点がある。さらに、第一〜第三のプライマーがいずれも標識されていなくても、これらのキットに含まれるヌクレオチド自体があらかじめ標識されていれば、やはり試験を行う研究者がプライマーの標識を行わずに済むために手間が省ける利点がある。
【００９６】
なお、本実施形態に係るＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９におけるＥ７４６−Ａ７５０欠失変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ点変異、またはＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０におけるＴ７９０Ｍ点変異を検出するための検出キットに含まれるＤＮＡポリメラーゼは、１本鎖のＤＮＡを鋳型として、それに相補的な塩基配列を持つＤＮＡ鎖を合成する酵素であればよく、特に限定するものではないが、たとえば、ＰＣＲ法による核酸増幅を行うのであれば、Ｔａｑポリメラーゼあるいは超高熱アーキア由来の耐熱性ポリメラーゼ（たとえばＫＯＤやＰｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ）などの耐熱性を持つＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。ここで、Ｔａｑポリメラーゼとは、好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（下線はイタリックであることを示す）が産生するＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ．２．７．７．７）であり、９０℃以上の高温でも比較的安定である（ＤＮＡポリメラーゼ活性は低下する）ため、ＰＣＲに利用されている。なお、もちろん、本実施形態で用いるＴａｑポリメラーゼは、天然のＴａｑポリメラーゼに限らず、各種特性を調整するために人工的に改変されたＴａｑポリメラーゼ（例えば、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（Ｒ）、Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｒ）など）を用いてもよい。
【００９７】
（２−７）プレセッティング済みのディスクチップ
なお、本実施形態のＥＧＦＲ変異検出システムに用いるディスクチップ１０は、上記のいずれかのプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、を、内部に塗布乾燥してなる複数のサンプルウェル１３を有していてもよい。
【００９８】
このディスクチップ１０によれば、ＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットが、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、組み合わさってサンプルウェル１３の内部に塗布乾燥されているため、上述のＥＧＦＲ変異検出システムに用いた場合には、特殊なプローブを必要とせず、通常のＰＣＲ反応のみで哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出可能である。また、あらかじめ必要な試薬等がすべてサンプルウェル１３の内部に塗布乾燥されているため、基礎医学分野の研究者・臨床医・看護師・臨床検査技師などの医療分野の研究・臨床に携わるスペシャリストにとっては、実験・検査の手間が大きく省け、また実験・検査の際の測定誤差が低減されるというメリットがある。
【００９９】
すなわち、このディスクチップによれば、ＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットを、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、組み合わせてサンプルウェルの内部に塗布乾燥しているため、上述のＥＧＦＲ変異検出システムに用いた場合には、特殊なプローブを必要とせず、通常のＰＣＲ反応のみで哺乳動物のＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出可能である。そのため、このディスクチップを、上述のＥＧＦＲ変異検出システムとあわせて用いることによって、肺癌治療方針決定のうえで今や必須の検査となっているＥＧＦＲ遺伝子変異検出が安価にどこでも実行可能なものとなる。そのため、病院のベッドサイドまたは市中の無床診療所などでのＥＧＦＲ遺伝子変異検出が可能となり、その肺癌臨床への恩恵はきわめて高い。
【０１００】
〔作用効果〕
以下、本実施形態のＥＧＦＲ変異検出システムの作用効果について、従来技術と対比しながら再度まとめて説明する。
【０１０１】
本実施形態のＥＧＦＲ変異検出システムによれば、上記のようなＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットを用いているため、特殊なプローブを必要とせず、通常のＰＣＲ反応のみでＥＧＦＲ遺伝子変異を検出可能であり、コンパクトかつ超高速な回転型のＰＣＲ装置とあわせて用いることによって、肺癌治療方針決定のうえで今や必須の検査となっているＥＧＦＲ遺伝子変異検出が安価にどこでも実行可能なものとなる。そのため、病院のベッドサイドまたは市中の無床診療所などでのＥＧＦＲ遺伝子変異検出が可能となり、その肺癌臨床への恩恵はきわめて高い。
【０１０２】
一方、標準的な遺伝子変異検出法としてＰＣＲ−ダイレクトシークエンス法があるが、これは感度があまりよくなく、検体中に変異遺伝子が２０％以上あるような「ほぼ癌細胞」である組織にしか適応できない。したがって、ほぼ大部分が正常細胞で、変異遺伝子をもつ癌細胞が数％以下であるような通常の生検検体から遺伝子変異を検出するためには、変異遺伝子のみを特異的に増幅する以下のＰＣＲベースの方法が開発されている。
【０１０３】
具体的に現在開発済みのものは、
（１）ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ  ｃｌａｍｐ法（三菱メディエンス）
（２）ＰＣＲ−Ｉｎｖａｄｅｒ法（ビーエムエル）
（３）Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ＡＲＭＳ法（ＤｘＳ社）
（４）Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ法
（５）Ｍｕｔａｎｔ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ＰＣＲ法（ＡＶＳＳ社）
（６）ＳＭＡＰ法（ダナフォーム、理化学研究所）
である。（現在国内で保険収載されているものは（１）と（２）：背景技術の項目の表２参照）
【０１０４】
上記の内、（１）、（２）、（３）、（４）は、プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ法を基本としており、プローブが高価であり、且つライトサイクラーなどの高価なリアルタイムＰＣＲ装置を必要とする。（５）はＰＣＲ後の制限酵素処理を必要とし、手技が煩雑で、結果を得るのに長時間を要する。（６）は特殊酵素を用いた等温ＰＣＲであるが、迅速性に問題がある。このように従来開発済みの方法では、迅速性、簡便性、経済性を同時にみたすものは存在しない。
【０１０５】
本実施形態のＥＧＦＲ変異検出システムは、それに対して、特別なプライマーセットを用いるために、簡便性、経済性を同時に満たす。なお、本実施形態の特別なプライマーセットを、従来型のＰＣＲ装置に用いる場合においても、高速な温度条件を用いれば、１０−１５分以内の検出と十分な迅速性をもたらすが、さらに高速な上述の回転型のＰＣＲ装置と組み合わせた場合、５分以内の検出という、世界最高速のＥＧＦＲ遺伝子変異検出を可能とすることができる。
【０１０６】
本実施形態のＥＧＦＲ変異検出システムは、いわゆるアリル特異的ＰＣＲ法を基本原理として発想されたものである。基本原理はすでに存在するものではあるが、発想されたプライマー配列自体は従来にないもので、本発明により上記のような新たな応用分野が開拓される可能性を持つものである。
【０１０７】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【０１０８】
例えば、上記実施の形態では、３種類のプライマーセットを組み合わせたマルチプレックスＰＣＲ法について説明したが、特にこれらの３種類に限定されるわけではなく、将来的に他の種類のプライマーセットも、ＥＧＦＲ遺伝子のゲフィニチブ感受性またはゲフィニチブ耐性の変異を有する被験者のゲノムを検出するために有用であることが明らかになれば、５種類、６種類のプライマーセットを組み合わせたマルチプレックスＰＣＲ法としてもよい。このようにすれば、さらにＥＧＦＲ遺伝子のゲフィニチブ感受性またはゲフィニチブ耐性の変異を有する被験者のゲノムを検出する精度が向上する。
【０１０９】
一方、上記実施の形態では、３種類のプライマーセットを組み合わせたマルチプレックスＰＣＲ法について説明したが、特にこれらの３種類をすべて用いなければいけないわけではなく、これらのうちの２種類のみを組み合わせたマルチプレックスＰＣＲ法を行ってもかまわない。この場合にも、ＥＧＦＲ遺伝子のゲフィニチブ感受性またはゲフィニチブ耐性の変異を有する被験者のゲノムを検出することができることには変わりがないからである。
【実施例】
【０１１０】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１１】
＜実験材料および試薬＞
作成したプライマー
配列番号１：５’−ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＴＣ−３’（ＤｅｌＥ７４６−Ａ７５０  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号２：５’−ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＴＧ−３’（ＤｅｌＥ７４６−Ａ７５０  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号３：５’−ＴＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴ−３’（Ｌ８５８Ｒ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号４：５’−ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＴＣＣ−３’（Ｌ８５８Ｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号５：５’−ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＴＧＡ  ＴＧＧ−３’（  Ｔ７９０Ｍ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号６：５’−ＧＡＡ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡ−３’（  Ｔ７９０Ｍ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）
【０１１２】
ＰＣＲ法に用いた試薬                                                    ＤＮＡａｓｅ
ＲＮＡａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（ＧＩＢＣＯ）
Ｓｐｅｅｄ  ＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）
１０ｘＦａｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  １（ＴＡＫＡＲＡ；上記酵素に付属）
２．５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＴＡＫＡＲＡ；上記酵素に付属）
【０１１３】
電気泳動に用いた試薬                                                    １  ｘ  ＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒ                                            Ａｇａｒｏｓｅ−Ｓ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）
１０ｍｇ／ｍｌ  Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）
６  ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）
【０１１４】
増幅断片の検出に用いた試薬                                              ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔｅｉｎ  （Ｔａｋａｒａ）
【０１１５】
＜実験方法＞
プライマーの作成
配列に示したオリゴヌクレオチドをＳＩＧＭＡ  ｇｅｎｏｓｙｓ  社（北海道）へ依頼し、０．０２μｍｏｌスケールで合成、脱塩精製したものを用いた。
【０１１６】
ＰＣＲ法                                                                各サンプルあたり、ｗａｔｅｒ  ８．７２μｌ、１０ｘＦａｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  １  １．６μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  １．２８μｌ、１０μＭ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．８μｌ、１０μＭ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．８μｌ、１／２０００  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  １．６μｌ、５０Ｕ／μｌ  Ｓｐｅｅｄ  ＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．２μｌ、ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ  １μｌ（３０ｎｇ）を混合し１６μｌとしたものを用いた。ＰＣＲの温度条件は９４℃  １分ののち、９８℃  １．３秒、５５℃  ５秒、７２℃  ３秒を３５サイクル行った。または  ９５℃  １分ののち、９８℃  １．３秒、６４℃１．４５秒、７３℃２秒を３５サイクル行ってもよい。
【０１１７】
電気泳動                                                                Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅを含有した２％アガロースに１レーンあたり、ＰＣＲ産物５μｌと６ｘＬｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ  １μｌを混じたものをアプライし、１ＸＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒで１００Ｖ  ３０分電気泳動した。
【０１１８】
増幅断片の検出
増幅断片にインターカレートしたＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの蛍光量を本装置によりリアルタイムに検出することにより、ＰＣＲによる増幅断片量をモニターした。また、この増幅断片の確認のために、増幅後のサンプルを電気泳動し、ＵＶライト下で増幅バンドとして検出した。
【０１１９】
＜実施例１＞
ｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  検出  ｐｒｉｍｅｒの設計とその検討
図２にｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ検出プライマーの設計方針（Ａ）と通常ＰＣＲ装置での温度条件（Ｂ）を示す。図３にこれを用いて行ったＰＣＲ結果を示す。本プライマーセット（上述の配列番号：１および配列番号：２のプライマーセット）は、ｅｘｏｎ１９のｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔを特異的に検出することがわかった。しかしながら実際の臨床検体（気管支洗浄液など）はこのようなｐｕｒｅな細胞集団ではなく、正常細胞にごく少量の癌細胞（ｄｅｌｅｔｉｏｎ＋細胞）がまじったものである。そこで、次に本プライマーセットの臨床的感度を検討するためにｄｅｌｅｔｉｏｎ陽性細胞（Ｍａ１）とｄｅｌｅｔｉｏｎ陰性細胞（Ａ５４９）を任意の比率で混合し、本ＰＣＲ法により正常細胞のなかにどのくらいの比率でｄｅｌｅｔｉｏｎ陽性細胞が混在していると検出できるかを検討した。図４に示すように本ＰＣＲは検体の１％に異常細胞が含まれれば十分に検出できることが示された。この検出感度はすでに臨床に供されているＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ  ｃｌａｍｐ法、ＰＣＲ−Ｉｎｖａｄｅｒ法と同等である。
【０１２０】
＜実施例２＞
ｅｘｏｎ２１  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  検出  ｐｒｉｍｅｒの設計とその検討
図５にｅｘｏｎ２１  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ検出プライマーの設計方針を示す。ここに示す各種プライマーを作成した後、ＰＣＲを行い、もっとも適切なプライマー（ＡＲＭＳ３（上述の配列番号：３および配列番号：４のプライマーセット））を選んだ。他のプライマーではｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎの検出（特異バンド）の出現を認めなかった。
【０１２１】
図６に、上述の最適なプライマーであったＡＲＭＳ３（上述の配列番号：３および配列番号：４のプライマーセット））を用いたＰＣＲ結果を示す。Ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎありの細胞（１１−１８）と無しの細胞（Ｍａ１）でアニーリング温度を変えＰＣＲを行った。図６上段に示すように、どのアニーリング温度でも本プライマーセットは１６６ｂｐの陽性バンドを認め、６１．８℃以上にアニーリング温度をあげると特異増幅のみとなった。一方下段のｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ陰性細胞では、どのアニーリング温度でも目的のバンドは認めなかった本プライマーの検出感度も検体の１％の異常細胞を検出するものであった。
【０１２２】
＜実施例３＞
超高速ＰＣＲマシンによる検出結果
本発明者らが試作した図１４〜図１５に示す基本構造を有する超高速ＰＣＲマシンは増幅時間３−５分の世界最高スピードを実現している。そこで、本ＰＣＲプライマーセット（上述の配列番号：１および配列番号：２のプライマーセット）と、この超高速ＰＣＲマシンとで、癌細胞からの遺伝子変異検出を試みた。このために、図７に示す最適反応条件を決定した。
【０１２３】
本ＰＣＲプライマーセット（上述の配列番号：１および配列番号：２のプライマーセット）と、この超高速ＰＣＲマシンと、で、癌細胞からの遺伝子変異検出した結果を図８に示す。その結果、図８に示すようにｄｅｌｅｔｉｏｎ変異をもつＭａ１のみが増幅し、その特異性が確認できた。
【０１２４】
なお、図８において、各記号は、以下のとおりの意味であるものとする。
ａ：  ＤＤＷ
ｂ：  Ｍａ１（３０ｎｇ）ｄｅｌｅｔｉｏｎ（＋）
ｃ：  １１−１８（３０ｎｇ）  ｄｅｌｅｔｉｏｎ（−）
ｄ：  Ａ５４９（３０ｎｇ）  ｄｅｌｅｔｉｏｎ（−）
ｅ−ｈ：  ｂｌａｎｋ
【０１２５】
次にこのｄｅｌｅｔｉｏｎ変異をもつＭａ１細胞のＤＮＡの希釈系列を作成し、本ＰＣＲの検出感度を検討した。その結果を、図９に示す。
【０１２６】
なお、図９において、各記号は、以下のとおりの意味であるものとする。
Ａ：  ＤＤＷ
ｂ：  Ｍａ１  （３０ｎｇ）
ｃ：  Ｍａ１  （３ｎｇ）
ｄ−ｈ：  ｂｌａｎｋ
【０１２７】
その結果、図９に示すようにＭａ１細胞のＤＮＡが最小３ｎｇの場合までｄｅｌｅｔｉｏｎの検出が可能であることが分かった。
【０１２８】
＜実施例４＞
ＥＧＦＲ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  検出  ｐｒｉｍｅｒの検討
ＥＧＦＲ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  検出  ｐｒｉｍｅｒ（上述の配列番号：３および配列番号：４のプライマーセット）の特異性を検討するために、ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎのある細胞（Ｍａ１）と、ない細胞（１１−１８，  Ａ５４９）から抽出したＤＮＡを用いて、本発明者らが試作した超高速ＰＣＲマシンによる超高速ＰＣＲを行った。その結果を図１０に示す。
【０１２９】
なお、図１０において、各記号は、以下のとおりの意味であるものとする。
ａ：  ＤＤＷ
ｂ：  Ｍａ１  （３０ｎｇ）  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｉｏｎ（−）
ｃ：  １１−１８（３０ｎｇ）  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｉｏｎ（＋）
ｄ：  Ａ５４９（３０ｎｇ）  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｉｏｎ（−）
ｅ−ｈ：  ｂｌａｎｋ
【０１３０】
その結果、図１０に示すｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ変異をもつカラム１１−１８のみが特異的に増幅しており、その特異性が確認できた。
【０１３１】
次に、このｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎをもつ１１−１８細胞ＤＮＡの希釈系列を用いて検出感度を検討した。その結果、１１−１８細胞ＤＮＡが最小３０ｎｇまでｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎが検出可能であった。
【０１３２】
＜実施例５＞
ＥＧＦＲ  特異的  ｐｒｉｍｅｒ  マルチプレックス法の検討
３種類のプライマーセット（配列番号：１および配列番号：２のプライマーセット、配列番号：３および配列番号：４のプライマーセット、配列番号：５および配列番号：６のプライマーセット）を用いたＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ法の有効性を検討するために、以下の実験を行った。
【０１３３】
１９ＤＦ／ＤＲ３  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ（配列番号：１および配列番号：２のプライマーセット）
２１Ｆ２Ｆ／ＡＲＭＳ３  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ（配列番号：３および配列番号：４のプライマーセット）
Ｔ７９０Ｍ  Ｆ／Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ（配列番号：５および配列番号：６のプライマーセット）
これらの３種のｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔを混合し、これらの遺伝子変異を一つの細胞につき、一度に検出する方法を試みた。
【０１３４】
ここで、ＰＣＲ  条件としてはたとえば、１９ＤＦ／ＤＲ３  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔにて増幅する場合には、図１１の左側の条件で行うところ、３種類のｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔを用いたＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ法を行うにあたり、ＰＣＲ  条件を図１１の右側の条件に変更して実験を行った。
【０１３５】
その結果、図１２および図１３に示すように、３種類のｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔを用いたＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ法において、どのような変異の組み合わせを有する細胞株においても、いずれの変異に対応する増幅断片のバンドも互いに干渉しあうことなく別々に検出することができた。すなわち、これらの結果から、３種類のｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔを用いたＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ法によって、３種類の遺伝子変異を一つの細胞につき、一度に検出することが可能であることが明らかになった。
【０１３６】
＜結果の考察＞
上記の実施例１〜５の実験結果から、本研究において肺癌の分子標的治療薬イレッサ感受性患者を検出するための好適なＰＣＲ法が開発されたことが明らかである。このＰＣＲ法による遺伝子変異検出は、感度が高く、実際の臨床場面で想定される多くの正常細胞遺伝子の中に含有される小数の変異遺伝子を検出するのに最も適している。
【０１３７】
これまでにもいくつかのＰＣＲベースの方法が発表されたが、それらの方法における変異の検出には、制限酵素による消化や特殊な蛍光プローブとリアルタイムＰＣＲマシンを必要とし、時間的、費用的に問題があるものがほとんどであった。今回のＥＧＦＲ変異に特異的な核酸増幅プライマーを用いる方法は特殊なプローブや制限酵素を必要としない検出系であることから高額なリアルタイムＰＣＲマシンも不要であり、ＥＧＦＲ変異の簡便、安価、迅速な検出系が可能となった。
【０１３８】
今回のＥＧＦＲ変異に特異的な核酸増幅プライマーを用い、ＰＣＲ法による核酸増幅に際し、ＰＣＲに必要な少なくとも２つのあらかじめ温度が設定された熱源に、薄膜状の反応液部分を順次接触させてＰＣＲサイクルを行う方式か、ＰＣＲ反応液膜を厚さ０．９ｍｍ以下にして反応液内部の伝熱を高速化するかいずれかの方式を取ることで、更に迅速なＥＧＦＲ変異の簡便、安価、迅速な検出系を可能とした。
【０１３９】
さらに、今回のＥＧＦＲ変異に特異的な核酸増幅プライマーを用いる方法は、ＰＣＲに必要な少なくとも２つのあらかじめ温度が設定された熱源に、薄膜状の反応液部分を順次接触させてＰＣＲサイクルを行う方式と、ＰＣＲ反応液膜を厚さ０．９ｍｍ以下にして反応液内部の伝熱を高速化する方式と、の両方を組み合わせた装置である本発明者らが試作した超高速ＰＣＲマシンに対して組み合わせることのできる、現在のところ唯一の検出系であり、この組み合わせにより簡便、安価、迅速な検出系を初めて可能としたものである。
【０１４０】
上記の実施例１〜５の実験結果を踏まえて、上述の設計したプライマーセットを含む反応試薬を乾燥封入したディスク、ならびに最適の温度、時間、サイクル条件のプログラムをセットとしたキットとしての実用化が考えられる。このキットを用いて、ユーザーは専用ディスクに液状のサンプルを注入し、上述の装置で専用プログラムを選んで反応を行うことができる。このキットを「イレッサ感受性予測チップ」として、超高速ＰＣＲ装置向けに実用化したいと考えている。
【０１４１】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
以上のように、本発明にかかるプライマーセットはこれらＥＧＦＲ遺伝子変異検出のための配列を工夫したプライマーセットであり、これを用いることでプローブを必要とせず、通常のＰＣＲ反応のみでＥＧＦＲ遺伝子変異を検出可能とする。本発明により肺癌治療方針決定のうえで今や必須の検査となっているＥＧＦＲ遺伝子変異検出が安価にどこでも実行可能なものとなる。
【０１４３】
さらに加えて、本発明にかかるプライマーセットは、それに最適化した温度条件、反応液組成を用いることによって、回転型の超高速ＰＣＲ装置にも適応可能であり、５分以内という短時間でのＰＣＲを可能とする。この回転型の超高速ＰＣＲ装置は、コンパクト且つ超高速なＰＣＲ装置として既に開発完了しており、本発明にかかるプライマーセットと同ＰＣＲ装置との組み合わせにより、ベッドサイドでのＥＧＦＲ遺伝子変異検出が可能となる可能性があり、その肺癌臨床への恩恵はきわめて高い。
【符号の説明】
【０１４４】
１    ＰＣＲ装置
２    ヒートブロック
２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ    加温部
３    ヒートブロック
４    ディスク駆動部
５    回転部
６    蛍光検出部
９ａ、９ｂ    蛍光透過部
１０    ＰＣＲ用ディスク
１１、２１    反応液注入部
１２、２２    流路
１３、２３    反応液貯留部
１４、２４    基板
２０    ＰＣＲ用チップ
Ａ    直線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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