(57)【要約】【課題】凝固第ＸＩＩＩａ因子に対する反応性が低く、フィブロネクチンおよびフィブリンへの架橋および不可逆的結合を効果的に阻害する改変型のＦｎｂを提供する。【解決手段】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の単離された改変型フィブロネクチン結合タンパク質（Ｆｎｂ）であって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に相当する残基から選択されるアミノ酸に少なくとも１つの変異を有するＦｎｂが、記載される。フィブロネクチン結合タンパク質中のこれらの反応性残基を置換することにより、このタンパク質は、野生型のＦｎｂよりもフィブロネクチンおよびフィブリンを共有結合的に架橋する能力が低下する。【選択図】図７
2010279391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、凝固第ＸＩＩＩａ因子に対する反応性が低下した、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ）の改変型フィブロネクチン結合タンパク質に関する。この改変型フィブロネクチン結合タンパク質を含む免疫原性組成物は、改善された抗原性特性をもち、より安全に使用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のフィブロネクチン結合タンパク質（Ｆｎｂ）は、フィブロネクチン、フィブリン、およびフィブリノゲンのようなヒトタンパク質への特異的可逆的結合に関与する表面結合型多機能性レセプターである。このような結合によって、微生物は、手術や血管損傷などの間にヒト宿主に効果的に付着し、その後、侵入して定住できるようになる。Ｆｎｂは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を防ぐための免疫原性組成物中の含有のための有力な候補物質として評価されてきた。組み換えＦｎｂで免疫化し、かつ、このタンパク質に対する機能的に活性な抗体を作製することは、ヒト組織に対するＳ．ａｕｒｅｕｓの初期付着を防ぎ得、それによって、感染を防止し得る可能性がある。しかし、最近の研究は、マウス、ウサギ、およびヒトで生成された抗体は、野生型Ｆｎｂがヒトのフィブロネクチンおよびフィブリンに結合することを阻害しないことを示している。それどころか、これらの抗体は、これらのヒトタンパク質にＦｎｂが結合するのを誘導して、細菌が宿主組織に接着するのを促進する。このことは、ヒトタンパク質への可逆的結合は、宿主組織へのブドウ球菌接着の過程における初期段階としてのみ機能していることを示している。
【０００３】
最近の研究では、ブドウ球菌のフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ＦｎｂＡ）は、血漿トランスグルタミナーゼと呼ばれるヒト酵素に対する基質として機能することが実証された（非特許文献１）。これは、ＦｎｂＡについて、これまで知られていなかった新たな機能である。血漿トランスグルタミナーゼ（第ＸＩＩＩａ因子としても知られる）は、非常に限定された数のヒトタンパク質（表１）の（非可逆的）共有結合架橋を触媒する酵素であり、高分子量のホモポリマーおよびヘテロポリマーの形成をもたらす。第ＸＩＩＩ因子は、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間におけるイソペプチド結合の形成を触媒するトランスグルタミナーゼファミリーの酵素の一員である。第ＸＩＩＩ因子は血液中を循環しており、従って、細胞外酵素と考えられているが、組織トランスグルタミナーゼ（ＴＧ）（例えば、肝臓ＴＧ、ケラチノサイトＴＧ、表皮ＴＧ、前立腺ＴＧ、および赤血球ＴＧ）は、細胞の内側に存在しており、従って、細胞内酵素として作用する（非特許文献２）。別のトランスグルタミナーゼは、同じタンパク質を基質として認識するが、しばしば、異なったアフィニティーおよび／または特異性で認識する。概して、第ＸＩＩＩａ因子に対する基質特異性は、組織トランスグルタミナーゼに対するよりも厳密である（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【０００４】
第ＸＩＩＩａ因子によって触媒される架橋反応は、血液凝固、創傷治癒、および線維素溶解を含む多様な正常な生理学的反応において重要な段階である。第ＸＩＩＩａ因子に触媒されるタンパク質架橋は、グルタミン（Ｇｌｎ）アミノ酸残基とリジン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基との間に特異的な共有結合を形成することによって起こる。ＦｎｂＡは、第ＸＩＩＩａ因子によって簡単にヒトフィブロネクチンおよびヒトフィブリンに架橋されえることが実証されている（非特許文献１）。したがって、ＦｎｂＡで免疫化すると、ＦｎｂＡ
は、直ちにフィブロネクチンおよびフィブリンに対する共有結合的（不可逆的な）架橋を行う。この抗原とヒトタンパク質との不可逆的複合体の形成は、免疫反応を低下させる可能性、および阻害／中和活性を持たない抗体の産生をもたらす可能性が非常に高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｋａら，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｒｖｅｓ  ａｓ  ａ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩａ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩａ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｔｏ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎ．」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３年，第４２巻，ｐ．１４６４３−１４６５２
【非特許文献２】Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ  Ｄ．およびＰａｕｌｓｓｏｎ  Ｍ．，「Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｆｌｕｉｄｓ．」，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１９９４年，第７１巻，ｐ．４０２−４１５
【非特許文献３】Ｇｏｒｍａｎ  Ｊ．Ｊ．およびＦｏｌｋ  Ｊ．Ｅ．「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩａ  ａｎｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｏｗａｒｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ．」，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，１９８１年，第２５６巻，ｐ．２７１２−２７１５
【非特許文献４】Ｇｏｒｍａｎ  Ｊ．Ｊ．およびＦｏｌｋ  Ｊ．Ｅ．「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩａ  ａｎｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ  ｅｎｚｙｍｅ．」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８４年，第２５９巻，９００７−９０１０
【非特許文献５】Ｆｅｓｕｓ  Ｌ．，Ｍｅｔｓｉｓ  Ｍ．Ｌ．，Ｍｕｓｚｂｅｋ  Ｌ．およびＫｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ，Ｖ．Ｅ．，「Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｉｔｓ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６年，第１５４巻，ｐ．３７１−３７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、第ＸＩＩＩａ因子によって触媒されるヒトタンパク質との共有結合架橋に直接関与する、野生型のブドウ球菌フィブロネクチン結合タンパク質の内部にある特異的反応性アミノ酸残基（ＧｌｎおよびＬｙｓ）を同定し、それらの残基を置換して、凝固第ＸＩＩＩａ因子に対する反応性が低く、フィブロネクチンおよびフィブリンへの架橋および不可逆的結合を効果的に阻害する改変型のＦｎｂを作製する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
このように、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の単離された改変型フィブロネクチン結合タンパク質（Ｆｎｂ）に関し、この改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１０３、Ｇｌｎ１０５、リジン（Ｌｙｓ）１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に相当する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミ
ノ酸の変異であり、この改変型Ｆｎｂは、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択される。１つの実施態様においては、これらのアミノ酸はアラニンに変異する。さらなる実施態様においては、単離された改変型ＦｎｂはＦｎｂＡまたはＦｎｂＢに由来する。
【０００８】
また、本発明は、上記記載の改変型Ｆｎｂであって、その改変がアミノ酸Ｌｙｓ７０２の変異であるものにも関する。
【０００９】
また、本発明は、上記記載の改変型Ｆｎｂであって、その改変が、以下に記載のタンパク質および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である改変型Ｆｎｂにも関する。
【００１０】
【表１−１】
2010279391.tif 000003
また、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型フィブロネクチン結合タンパク質をコードする単離された核酸分子核酸分子にも関し、その改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５由来のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に相当する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、ここでこの改変型フィブロネクチン結合タンパク質は、免疫原性を保持しており、かつ免疫原性組成物に取り込まれて脊椎動物に投与される場合、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合架橋する能力が、野生型Ｆｎｂよりも低くなっており、そしてこのヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択される。
【００１１】
また、本発明は、上記記載の単離された核酸分子であって、その改変がアミノ酸Ｌｙｓ７０２の変異である単離された核酸分子にも関する。
【００１２】
また、本発明は、調節配列に作動できるように連結された、本明細書記載の単離核酸分子を含む核酸構築物にも関連する。
【００１３】
また、本発明は、本明細書記載の核酸構築物を含む組み換え宿主細胞、および本明細書記載の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型フィブロネクチン結合タンパク質を産生する方法にも関し、この方法は、本発明の組み換え宿主細胞を、改変型フィブロネクチン結合タンパク質を発現させるために適した条件下で維持することを包含する。
【００１４】
また、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を引き起こす免疫原性組成物を調製するために改変型フィブロネクチン結合タンパク質、またはそれを発現する組み換え宿主細胞を使用することにも関連する。
【００１５】
さらに、本発明は、生理学的に受容可能なビヒクルと、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型フィブロネクチン結合タンパク質とを含む免疫原性組成物に関し、このＦｎｂタンパク質は、免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に取り込まれて脊椎動物に投与されると、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質（例えば、フィブロネクチンおよびフィブリン）と共有結合架橋する能力が、野生型Ｆｎｂよりも低くなっている。改変型Ｆｎｂは、後に脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染する際に野生型Ｆｎｂがフィブロネクチンおよびフィブリンに結合することを促進しない。この改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に相当する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である。この免疫原性組成物はまた、アジュバントも含み得る。
【００１６】
本発明は、また、生理学的に受容可能なビヒクル、および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂをコードする核酸分子を含む免疫原性組成物にも関する。ここで、この改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に相当する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、この改変型Ｆｎｂは免疫原性を保持しており、また、免疫原性組成物に取り込まれて脊椎動物に投与される場合、この改変型Ｆｎｂは、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質（フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択される）と共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、かつ、後にこの脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染する際に、野生型Ｆｎｂがフィブロネクチンおよびフィブリンに結合することを促進しない。
【００１７】
また、本発明は、改変がアミノ酸Ｌｙｓ７０２の変異である、上記のような免疫原性組成物にも関連する。
【００１８】
また、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して脊椎動物を免疫化する方法にも関連し、この方法は、生理学的に受容可能なビヒクル、および免疫学的に有効な量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）改変型フィブロネクチン結合タンパク質を含む組成物を脊椎動物に投与する工程を包含し、ここでこの改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に相当する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、この改変型フィブロネクチン結合タンパク質は、免疫原性を保持しており、かつ、免疫原性組成物に取り込まれて脊椎動物に投与されると、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質（例えば、フィブロネクチンおよびフィブリン）に共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、また、後に脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染する際に、野生型フィブロネクチン結合タンパク質がこのヒトタンパク質に結合することを促進しない。
【００１９】
さらに、本発明は、生理学的に受容可能なビヒクル、および改変型黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）フィブロネクチン結合タンパク質をコードする、免疫学的に有効な量の核酸分子を、場合によってはトランスフェクション促進因子とともに含む組成物を脊椎動物に投与する工程を包含する、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して脊椎動物を免疫化する方法に関連し、この改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に相当する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、この改変型フィブロネクチン結合タンパク質は、免疫原性を保持しており、かつ、免疫原性組成物に取り込まれて脊椎動物に投与される場合、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質（例えば、フィブロネクチンおよびフィブリン）に共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、また、後に脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染する際に、野生型フィブロネクチン結合タンパク質がこのヒトタンパク質に結合することを促進しない。
【００２０】
一つの実施態様において、脊椎動物は血清反応陰性のヒトである。
【００２１】
また、本発明は、上記したような免疫化の方法であって、改変がアミノ酸Ｌｙｓ７０２の変異である方法にも関連する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の単離された改変型フィブロネクチン結合タンパク質（Ｆｎｂ）であって、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１０３、Ｇｌｎ１０５、リジン（Ｌｙｓ）１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、ここで該改変型Ｆｎｂは、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合により架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択される、単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目２）
ＦｎｂＡまたはＦｎｂＢに由来する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３）
上記変異がＧｌｎ１０３に存在する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目４）
上記変異が、グルタミンからアラニンへである、項目３に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目５）
上記変異がＧｌｎ１０５に存在する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目６）
上記変異がグルタミンからアラニンへである、項目５に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目７）
上記変異がＬｙｓ１５７に存在する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目８）
上記変異がリジンからアラニンへである、項目７に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目９）
上記変異がＬｙｓ５０３に存在する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１０）
上記変異がリジンからアラニンへである、項目９に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１１）
上記変異がＬｙｓ６２０に存在する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１２）
上記変異がリジンからアラニンへである、項目１１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１３）
上記変異がＬｙｓ７６２に存在する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１４）
上記変異がリジンからアラニンへである、項目１３に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１５）
上記変異がＧｌｎ７８３に存在する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１６）
上記変異がグルタミンからアラニンへである、項目１５に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１７）
上記変異がＧｌｎ８３０に存在する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１８）
上記変異がグルタミンからアラニンへである、項目１７に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目１９）
上記変異が、Ｇｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０の各残基に存在する、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目２０）
Ｇｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０における各残基の変異が、Ａｌａへの変異である、項目１９に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目２１）
Ｇｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０のいずれか１つの残基の変異が、Ａｌａへの変異である、項目１９に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目２２）
生理学的に受容可能なキャリアと、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型フィブロネクチン結合タンパク質（Ｆｎｂ）とを含む免疫原性組成物であって、該改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１０３、Ｇｌｎ１０５、リジン（Ｌｙｓ）１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは、免疫原性を保持しており、該免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、該改変型Ｆｎｂは、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、該改変型Ｆｎｂは、その後に該脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンおよびフィブリンへの結合を促進しない、免疫原性組成物。
（項目２３）
アジュバントをさらに含む、項目２２に記載の免疫原性組成物。
（項目２４）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して脊椎動物を免疫化する方法であって、該方法は、生理学的に受容可能なビヒクルおよび免疫学的に有効な量の単離された改変型黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｆｎｂを含む組成物を、該脊椎動物に投与する工程を包含し、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは、免疫原性を保持しており、かつ、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質に共有結合架橋する能力が、野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、そして該単離された改変型Ｆｎｂは、その後に該脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンおよびフィブリンへの結合を促進しない、方法。
（項目２５）
脊椎動物がセロネガティブのヒトである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｍｕ５０のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１３４、Ｇｌｎ１３６、リジン（Ｌｙｓ）１８８、Ｌｙｓ５３４、Ｌｙｓ６５１、Ｌｙｓ７９３、Ｇｌｎ８１４、およびＧｌｎ８６１の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目２７）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｎ３１５のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１３４、Ｇｌｎ１３６、リジン（Ｌｙｓ）１８８、Ｌｙｓ５３４、Ｌｙｓ６５１、Ｌｙｓ７９３、Ｇｌｎ８１４、およびＧｌｎ８６１の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目２８）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＭＷ２のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１３９、Ｇｌｎ１４１、リジン（Ｌｙｓ）５３９、Ｌｙｓ６５６、Ｌｙｓ７９８、Ｌｙｓ８１９、およびＧｌｎ８６６の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目２９）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＭＳＳＡ−４７６のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１４７、Ｇｌｎ１４９、リジン（Ｌｙｓ）５４７、Ｌｙｓ６６４、Ｌｙｓ８０６、Ｇｌｎ８２７、およびＧｌｎ８７４の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３０）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＣＯＬのＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１３９、Ｇｌｎ１４１、リジン（Ｌｙｓ）６５５、Ｌｙｓ７９７、およびＧｌｎ８６５の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３１）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株８３２５−４のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１３９、Ｇｌｎ１４１、リジン（Ｌｙｓ）６５５、Ｌｙｓ７９７、およびＧｌｎ８６５の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３２）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＥＭＲＳＡ−１６のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１４７、Ｇｌｎ１４９、リジン（Ｌｙｓ）５４９、Ｌｙｓ６６６、Ｇｌｎ７９１、およびＧｌｎ８３８の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３３）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｍｕ５０のＦｎｂＢのグルタミン（Ｇｌｎ）１１１、リジン（Ｌｙｓ）６０２、Ｇｌｎ７６５、およびＧｌｎ８１２の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３４）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｎ３１５のＦｎｂＢのグルタミン（Ｇｌｎ）１１１、リジン（Ｌｙｓ）６０２、Ｇｌｎ７６５、およびＧｌｎ８１２の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３５）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＭＷ２のＦｎｂＢのリジン（Ｌｙｓ）５９８、Ｌｙｓ７４０、およびグルタミン（Ｇｌｎ）８０８の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３６）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＭＳＳＡ−４７６のＦｎｂＢのリジン（Ｌｙｓ）５９８、Ｌｙｓ７４０、およびグルタミン（Ｇｌｎ）８０８の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３７）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＣＯＬのＦｎｂＢのリジン（Ｌｙｓ）５９１、Ｌｙｓ７３３、およびグルタミン（Ｇｌｎ）８０１の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３８）
上記改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株８３２５−４のＦｎｂＢのリジン（Ｌｙｓ）５９１、Ｌｙｓ７３３、およびグルタミン（Ｇｌｎ）８０１の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異である、項目１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目３９）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂをコードする単離された核酸分子であって、該改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１０３、Ｇｌｎ１０５、リジン（Ｌｙｓ）１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合架橋する能力が、野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択される、核酸分子。
（項目４０）
制御配列に制御可能に連結された項目３９に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目４１）
項目４０に記載の発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞。
（項目４２）
改変型Ｆｎｂを産生する方法であって、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１０３、Ｇｌｎ１０５、リジン（Ｌｙｓ）１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは、免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質となるヒトタンパク質に共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、該方法は、項目４１に記載の組み換え宿主細胞を、改変型Ｆｎｂの発現に適した条件下で維持する工程を包含する、方法。
（項目４３）
生理学的に受容可能なビヒクルと、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂをコードする単離核酸分子とを含む免疫原性組成物であって、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、該改変型Ｆｎｂは、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合架橋する能力が、野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、そして該改変型Ｆｎｂは、その後に該脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンおよびフィブリンへの結合を促進しない、免疫原性組成物。
（項目４４）
形質転換促進剤をさらに含む、項目４３に記載の免疫原性組成物。
（項目４５）
脊椎動物において免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、該脊椎動物に項目４３に記載の免疫原性組成物を、免疫応答を誘導するのに有効な量投与する工程を包含する、方法。
（項目４６）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して脊椎動物を免疫化する方法であって、該方法は、生理学的に受容可能なキャリアと、免疫学的に有効な量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂをコードする核酸分子とを含む組成物を、該脊椎動物に投与する工程を包含し、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは、免疫原性を保持しており、かつ、免疫原性組成物に取り込まれて脊椎動物に投与される場合に、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質に共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、そして該改変型Ｆｎｂが、その後に該脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンおよびフィブリンへの結合を促進しない、方法。
（項目４７）
上記脊椎動物がセロネガティブのヒトである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の単離された改変型フィブロネクチン結合タンパク質（Ｆｎｂ）であって、該改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１０３、Ｇｌｎ１０５、リジン（Ｌｙｓ）１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂが、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合架橋する能力が、野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択される、単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目４９）
上記変異がＬｙｓ７０２に存在する、項目４８に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目５０）
上記変異がリジンからアラニンへである、項目４９に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目５１）
上記変異が、Ｇｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０の各残基に存在する、項目４８に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目５２）
Ｇｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０の各残基の変異がＡｌａへの変異である、項目５１に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目５３）
Ｇｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０のいずれか１つの残基の変異がＡｌａへの変異である、項目４８に記載の単離された改変型Ｆｎｂ。
（項目５４）
生理学的に受容可能なビヒクルと、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の単離された改変型フィブロネクチン結合タンパク質（Ｆｎｂ）とを含む免疫原性組成物であって、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１０３、Ｇｌｎ１０５、リジン（Ｌｙｓ）１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは、免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に取り込まれて脊椎動物に投与される場合に、該改変型Ｆｎｂは、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合架橋する能力が、野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、そして該改変型Ｆｎｂは、その後に該脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンおよびフィブリンへの結合を促進しない、免疫原性組成物。
（項目５５）
さらにアジュバントを含む、項目５４に記載の免疫原性組成物。
（項目５６）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して脊椎動物を免疫化する方法であって、該方法は、生理学的に受容可能なキャリアと、免疫学的に有効な量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の単離された改変型Ｆｎｂとを含む組成物を該脊椎動物に投与する工程を包含し、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは、免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質に共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、該単離された改変型Ｆｎｂは、その後に該脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染する際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンおよびフィブリンへの結合を促進しない、方法。
（項目５７）
上記脊椎動物がセロネガティブのヒトである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型フィブロネクチン結合タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、該改変が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５由来のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１０３、Ｇｌｎ１０５、リジン（Ｌｙｓ）１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合架橋する能力が、野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択される、核酸分子。
（項目５９）
制御配列に操作可能に連結された項目５８に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目６０）
項目５９に記載の発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞。
（項目６１）
改変型Ｆｎｂを産生する方法であって、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのグルタミン（Ｇｌｎ）１０３、Ｇｌｎ１０５、リジン（Ｌｙｓ）１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは、免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質に共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、該方法は、項目６０に記載の組み換え宿主細胞を、該改変型Ｆｎｂの発現に適した条件下で維持する工程を包含する、方法。
（項目６２）
生理学的に受容可能なビヒクルと、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂをコードする単離核酸分子とを含む免疫原性組成物であって、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与されると、該改変型Ｆｎｂは、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質と共有結合架橋する能力が、野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、そして該改変型Ｆｎｂは、その後に該脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンおよびフィブリンへの結合を促進しない、免疫原性組成物。
（項目６３）
形質転換促進剤をさらに含む、項目６２に記載の免疫原性組成物。
（項目６４）
脊椎動物において免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、該脊椎動物に項目６２に記載の免疫原性組成物を、免疫応答を誘導するのに有効な量投与する工程を包含する、方法。
（項目６５）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して脊椎動物を免疫化する方法であって、該方法は、生理学的に受容可能なビヒクルと、免疫学的に有効な量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂをコードする核酸分子とを含む組成物を、該脊椎動物に投与する工程を包含し、該改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７０２、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異であり、該改変型Ｆｎｂは、免疫原性を保持しており、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、または組織トランスグルタミナーゼに対する基質として機能するヒトタンパク質に共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低く、該ヒトタンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリンからなる群より選択され、そして該改変型Ｆｎｂは、その後に該脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンおよびフィブリンへの結合を促進しない、方法。
（項目６６）
上記脊椎動物がセロネガティブのヒトである、項目６５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、第ＸＩＩＩａ因子触媒によるダンシルカダベリンプローブ（パネルＡおよびＣ）およびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブ（パネルＢおよびＤ）のｒＦｎｂＡへの取り込みを示す。修飾反応を４時間および１８時間行った。４時間（レーン１）および１８時間（レーン３）にわたって修飾された未反応のプローブを除去した後、ｒＦｎｂＡサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。あるいは、４時間および１８時間にわたって修飾されたｒＦｎｂＡサンプルを、トロンビンによりタンパク質限定分解供してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（レーン２および４）。電気泳動後、紫外光下でゲルを撮影し（パネルＣおよびＤ）、その後クーマシーブリリアントブルーで染色した（パネルＡおよびＢ）。矢印は、プローブ修飾されたｒＦｎｂＡ、およびトロンビンによって生成したそのフラグメントの位置を示している。各パネルの第５レーンは、表示されている通りの分子量標準を含む。
【図２】図２は、第ＸＩＩＩａ因子で修飾されたｒＦｎｂＡのトリプシン分解物からの、ダンシルカダベリンで標識されたペプチドのＨＰＬＣ分離を示す。第ＸＩＩＩａ因子触媒によるｒＦｎｂＡへのダンシルカダベリンの取り込みを、４時間（パネルＡおよびＢ）および１８時間（パネルＣおよびＤ）行った。ダンシルカダベリンで標識されたｒＦｎｂＡ調製物をトリプシンで分解し、ペプチドをＡｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００  Ｃ８逆相カラム上で分離した。溶出液を２１０ｎｍの吸光度および５５０ｎｍの蛍光によりモニタリングした。蛍光ピークの１（パネルＢおよびＤ）、２、および３（パネルＤ）を回収して、２回目の逆相クロマトグラフィーを行った後、ＮＨ２−末端配列分析および質量スペクトル解析に供した。
【図３】図３は、第ＸＩＩＩａ因子で修飾されたｒＦｎｂＡのＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ分解物からの、ダンシルカダベリンで標識されたペプチドのＨＰＬＣ分離を示す。第ＸＩＩＩａ因子触媒によるｒＦｎｂＡへのダンシルカダベリンの取り込みを、４時間（パネルＡおよびＢ）および１８時間（パネルＣおよびＤ）行った。ダンシルカダベリンで標識されたｒＦｎｂＡ調製物をＧｌｕ−Ｃプロテアーゼで分解し、ペプチドをＡｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００  Ｃ８逆相カラム上で分離した。溶出液を２１０ｎｍの吸光度および５５０ｎｍの蛍光によりモニタリングした。蛍光ピークの１（パネルＢおよびＤ）、２、３、４、５、６、および７（パネルＤ）を回収して、２回目の逆相クロマトグラフィーを行った後、ＮＨ２−末端配列分析および質量スペクトル分析に供した。
【図４】図４は、第ＸＩＩＩａ因子で修飾されたｒＦｎｂＡのＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ分解物からの、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶで標識されたペプチドのＨＰＬＣ分離を示す。第ＸＩＩＩａ因子触媒によるｒＦｎｂＡへのダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶの取り込みは、４時間（パネルＡおよびＢ）および１８時間（パネルＣおよびＤ）行った。ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶで標識されたｒＦｎｂＡ調製物をＧｌｕ−Ｃプロテアーゼで分解し、ペプチドをＡｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００  Ｃ８逆相カラム上で分離した。溶出液を２１０ｎｍの吸光度および５５０ｎｍの蛍光によりモニタリングした。アスタリスクで示された蛍光ピーク（パネルＢおよびＤ）およびピーク１、２、３、４、５、６、および７（パネルＤ）を回収して、２回目の逆相クロマトグラフィーを行った後、ＮＨ２−末端配列分析および質量スペクトル解析に供した。
【図５】図５は、野生型ＦｎｂＡのアミノ酸配列内における第ＸＩＩＩａ因子反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基の位置を示している。これは、本研究で使用した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のｒＦｎｂＡ（Ａｌａ１〜Ｐｒｏ８３９残基）の構造的構成の概要図（上図）およびそのアミノ酸配列（下図）（配列番号１）である。図５には以下の主な領域の位置が示されている：Ａ−フィブリノゲン結合領域；機能不明のＢ１−相同反復配列およびＢ２−相同反復配列；Ｄｕ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４−フィブロネクチン結合反復配列。矢印は、ＦｎｂＡのＡ、Ｄｕ、Ｄ２、およびＤ４領域内にある、第ＸＩＩＩａ因子反応性Ｇｌｎ残基（１０３、１０５、７８３、および８３０）およびＬｙｓ残基（１５７、５０３、６２０、および７６２）の位置を示す。太字は、ＦｎｂＡの一次配列における同一の第ＸＩＩＩａ因子反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基を表している。下線を引いた文字は、トロンビン分断推定部位Ａｒｇ２０２−Ｇｌｙ２０３の位置を示している。
【図６Ａ】図６は、さまざまな黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株のＦｎｂＡおよびＦｎｂＢの分子種のアミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号１〜配列番号１４）。第ＸＩＩＩａ因子反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基の周辺領域を示す。一番上で特定されている反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基の位置は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡでの位置に対応している。ＦｎｂＡ種およびＦｎｂＢ種の一次配列中の太字は、第ＸＩＩＩａ因子反応性のＧｌｎ受容体およびＬｙｓ供与体の保存された部位を強調している。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８１）プログラムを用いた多重配列アラインメントを行った。
【図６Ｂ】図６は、さまざまな黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株のＦｎｂＡおよびＦｎｂＢの分子種のアミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号１〜配列番号１４）。第ＸＩＩＩａ因子反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基の周辺領域を示す。一番上で特定されている反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基の位置は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡでの位置に対応している。ＦｎｂＡ種およびＦｎｂＢ種の一次配列中の太字は、第ＸＩＩＩａ因子反応性のＧｌｎ受容体およびＬｙｓ供与体の保存された部位を強調している。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８１）プログラムを用いた多重配列アラインメントを行った。
【図７】図７は、本研究で使用した野生型および変異型のＦｎｂＡ種の略図（上図）と、単離されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（下図）とを示す。この図は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５由来のＦｎｂＡ中の以下の主な領域の位置が示されている：Ａ−フィブリン（フィブリノゲン）結合領域；機能不明のＢ１−相同反復配列およびＢ２−相同反復配列；ならびにＤｕ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４−フィブロネクチン結合反復配列。反応性Ｇｌｎ残基および導入されたＧｌｎ→Ａｌａ変異の位置を黒い三角形で示し、一方、反応性Ｌｙｓ残基および導入されたＬｙｓ→Ａｌａ変異の位置を白いひし形で示す。ＦｎｂＡ種の略図、および精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ゲル）解析を以下の順に示す：１−野生型ＦｎｂＡ；２−１Ｑ  ＦｎｂＡ変異型；３−４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異型。ゲルの外側のレーンは、図示されているとおりの分子量標準を含む。
【図８】図８は、第ＸＩＩＩａ因子触媒によるダンシルカダベリン（Ａ）およびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブ（Ｂ）の野生型および変異型のＦｎｂＡへの取り込みを示す。ダンシルカダベリンの取り込みは、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＣａＣｌ２の中で行われたが、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶの取り込みは、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、１５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＣａＣｌ２の中で行われた。対照反応も、２ｍＭのＥＤＴＡを含む同じバッファー内で行った。指定された時点でアリコートを取り出し、ＳＤＳと混合し、加熱して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４〜２０勾配ゲル上で解析した。６０分（Ａ）および１２０分（Ｂ）後に対照反応から取り出されたアリコートにアスタリスクで印をつけた。電気泳動後、紫外光下でゲルを撮影し（パネルＡおよびＢ、下図）、その後クーマシーブリリアントブルーで染色した（パネルＡおよびＢ、上図）。ゲルの外側のレーンは、図示されているとおりの分子量標準を含む。
【図９Ａ】図９は、第ＸＩＩＩａ因子触媒による、野生型および変異型のＦｎｂＡのフィブリンへの架橋を示す。表示された時点で、反応を終了させ、還元条件下、３〜８％の勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ゲルを電気泳動した後、クーマシーブリリアントブルーで染色するか（Ａ）、または、ニトロセルロース膜への転移に供した後、抗ＦｎｂＡ抗体（Ｂ）および抗フィブリノゲンα鎖抗体（Ｃ）による免疫染色を行った。矢印は、ＦｎｂＡ、およびフィブリンのα鎖、β鎖、γ鎖、ならびにフィブリンの架橋したγγ鎖の位置を示す。ＦｎｂＡおよびフィブリンα鎖の間の主な高移動性架橋産物をａと名づけ、架橋産物の低移動性産物をｂ、ｃ、およびｄとして図示している。各パネル内の左側のレーンは、上から下へ以下のＭｒ値を有する分子量標準を含む：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、および３７ｋＤａ。
【図９Ｂ】図９は、第ＸＩＩＩａ因子触媒による、野生型および変異型のＦｎｂＡのフィブリンへの架橋を示す。表示された時点で、反応を終了させ、還元条件下、３〜８％の勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ゲルを電気泳動した後、クーマシーブリリアントブルーで染色するか（Ａ）、または、ニトロセルロース膜への転移に供した後、抗ＦｎｂＡ抗体（Ｂ）および抗フィブリノゲンα鎖抗体（Ｃ）による免疫染色を行った。矢印は、ＦｎｂＡ、およびフィブリンのα鎖、β鎖、γ鎖、ならびにフィブリンの架橋したγγ鎖の位置を示す。ＦｎｂＡおよびフィブリンα鎖の間の主な高移動性架橋産物をａと名づけ、架橋産物の低移動性産物をｂ、ｃ、およびｄとして図示している。各パネル内の左側のレーンは、上から下へ以下のＭｒ値を有する分子量標準を含む：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、および３７ｋＤａ。
【図９Ｃ】図９は、第ＸＩＩＩａ因子触媒による、野生型および変異型のＦｎｂＡのフィブリンへの架橋を示す。表示された時点で、反応を終了させ、還元条件下、３〜８％の勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ゲルを電気泳動した後、クーマシーブリリアントブルーで染色するか（Ａ）、または、ニトロセルロース膜への転移に供した後、抗ＦｎｂＡ抗体（Ｂ）および抗フィブリノゲンα鎖抗体（Ｃ）による免疫染色を行った。矢印は、ＦｎｂＡ、およびフィブリンのα鎖、β鎖、γ鎖、ならびにフィブリンの架橋したγγ鎖の位置を示す。ＦｎｂＡおよびフィブリンα鎖の間の主な高移動性架橋産物をａと名づけ、架橋産物の低移動性産物をｂ、ｃ、およびｄとして図示している。各パネル内の左側のレーンは、上から下へ以下のＭｒ値を有する分子量標準を含む：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、および３７ｋＤａ。
【図１０】図１０は、第ＸＩＩＩａ因子触媒による、野生型および変異型のＦｎｂＡのフィブリンのα鎖への架橋速度を示す。残存する単量体（未架橋）の野生型ＦｎｂＡ（黒丸）、１Ｑ  ＦｎｂＡ（白丸）、および４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ（黒三角）の量を、「材料と方法」に記載されるようにアッセイして、時間の関数としてプロットした。
【図１１Ａ】図１１は、第ＸＩＩＩａ因子触媒による、野生型および変異型のＦｎｂＡのフィブロネクチンへの架橋を示す。表示された時点で、反応を終了させ、還元条件下、４〜２０％の勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ゲルを電気泳動した後、クーマシーブリリアントブルーで染色するか（Ａ）、または、ニトロセルロース膜への転移に供した後、抗ＦｎｂＡ抗体（Ｂ）および抗フィブロネクチン抗体（Ｃ）による免疫染色を行った。矢印は、ＦｎｂＡおよびフィブロネクチンの位置を示す。ＦｎｂＡとフィブロネクチンとの間の架橋産物はａ、ｂ、ｃ、およびｄとして示されている。各パネル内の左側のレーンは、上から下へ以下のＭｒ値を有する分子量標準を含む：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、および５０ｋＤａ。
【図１１Ｂ】図１１は、第ＸＩＩＩａ因子触媒による、野生型および変異型のＦｎｂＡのフィブロネクチンへの架橋を示す。表示された時点で、反応を終了させ、還元条件下、４〜２０％の勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ゲルを電気泳動した後、クーマシーブリリアントブルーで染色するか（Ａ）、または、ニトロセルロース膜への転移に供した後、抗ＦｎｂＡ抗体（Ｂ）および抗フィブロネクチン抗体（Ｃ）による免疫染色を行った。矢印は、ＦｎｂＡおよびフィブロネクチンの位置を示す。ＦｎｂＡとフィブロネクチンとの間の架橋産物はａ、ｂ、ｃ、およびｄとして示されている。各パネル内の左側のレーンは、上から下へ以下のＭｒ値を有する分子量標準を含む：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、および５０ｋＤａ。
【図１１Ｃ】図１１は、第ＸＩＩＩａ因子触媒による、野生型および変異型のＦｎｂＡのフィブロネクチンへの架橋を示す。表示された時点で、反応を終了させ、還元条件下、４〜２０％の勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ゲルを電気泳動した後、クーマシーブリリアントブルーで染色するか（Ａ）、または、ニトロセルロース膜への転移に供した後、抗ＦｎｂＡ抗体（Ｂ）および抗フィブロネクチン抗体（Ｃ）による免疫染色を行った。矢印は、ＦｎｂＡおよびフィブロネクチンの位置を示す。ＦｎｂＡとフィブロネクチンとの間の架橋産物はａ、ｂ、ｃ、およびｄとして示されている。各パネル内の左側のレーンは、上から下へ以下のＭｒ値を有する分子量標準を含む：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、および５０ｋＤａ。
【図１２】図１２は、第ＸＩＩＩａ因子触媒による、野生型および変異型のＦｎｂＡのフィブロネクチンへの架橋速度を示す。残存する単量体（未架橋）の野生型ＦｎｂＡ（黒丸）、１Ｑ  ＦｎｂＡ（白丸）、および４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ（黒三角）の量を、「材料と方法」に記載されるようにアッセイして、時間の関数としてプロットした。
【図１３】図１３は、第ＸＩＩＩａ因子により修飾された野生型ＦｎｂＡのＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ分解物からの単離されたダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ標識ペプチド（蛍光ピーク３（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００４））のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。
【図１４】図１４は、さまざまな黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株由来のＦｎｂＡ種およびＦｎｂＢ種のアミノ酸配列のアラインメントを示す。第ＸＩＩＩａ因子反応性Ｌｙｓ７０２の周辺領域を示す。一番上で特定されている反応性Ｌｙｓ残基の位置は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５由来のＦｎｂＡでの位置に対応している。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８１）プログラムを用いて多重配列アラインメントを行った（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９４）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
ＦｎｂＡは、第ＸＩＩＩａ因子のトランスグルタミナーゼ作用によって、フィブロネクチンまたはフィブリンに共有結合架橋しており、レセプター−リガンドのホモポリマーまたはヘテロポリマーの形成をもたらす。凝固第ＸＩＩＩａ因子または血漿トランスグルタミナーゼ（ＥＣ２．３．２．１３）は、分子間ε−（γ−グルタミル）リジンのイソペプチド結合の形成を介して、特異的なタンパク質基質の共有結合架橋を触媒する酵素のトランスアミダーゼという分類級に属する。架橋は、グルタミンのγカルボキシアミド基がアシル供与体（アミン受容体）として働き、リジンのε−アミノ基がアシル受容体（アミン供与体）として働くアシル転移反応を介して起きる（Ｈｅｎｓｃｈｅｎ  ａｎｄ  ＭｃＤｏｎａｇｈ  １９８６；Ｌｏｒａｎｄ  ２００１）。
【００２４】
第ＸＩＩＩ因子は、２つの触媒Ａサブユニットと２つの調節Ｂサブユニットとからなる非活性型テトラマー前駆体Ａ２Ｂ２として血液中を循環している。トロンビンに曝露された後、第ＸＩＩＩ因子チモーゲンはＣａ２＋依存型の活性化を受けて第ＸＩＩＩａ因子（活性化された第ＸＩＩＩ因子：Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）となり、その後フィブリン塊とγ鎖との間、およびフィブリン塊とα鎖との間における共有結合架橋の形成を触媒する。この反応は、血液凝固カスケードの最終事象に相当し、正常な止血に必須のものである。また、第ＸＩＩＩａ因子は、同様のメカニズムによって、いくつか異なるヒトタンパク質をフィブリン塊の中に共有結合的に取り込むことにも関与している。表１参照。それらの中には、血塊への架橋が創傷治癒および線維素溶解に重要な役割を果たす、フィブロネクチンおよびα２−抗プラスミンがある。
【００２５】
第ＸＩＩＩａ因子により触媒されるタンパク質−タンパク質の架橋反応は２段階のプロセスを示す。まず、タンパク質同士が互いに特異的に結合して可逆的（非共有結合的）複合体を形成し、次に、第ＸＩＩＩａ因子によって共有結合的に架橋される。通常、第ＸＩＩＩａ因子によって触媒されるタンパク質の架橋は、多くの生理学的反応において重要な役割を果たすさまざまな融合型のホモ重合体構造およびヘテロ重合体構造を生み出す（Ｌｏｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ  ２００３）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）がヒトの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子に接着するためにトランスグルタミナーゼ活性を利用できるという最近の知見（Ｍａｔｓｕｋａら，  ２００３）は、タンパク質架橋が、細菌感染に伴う病理反応に関与することを示す。
【００２６】
ほとんどの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株は、異なってはいるが非常に近縁の２つの遺伝子によってコードされている、１つ（ＦｎｂＡ）または２つ（ＦｎｂＡおよびＦｎｂＢ）のフィブロネクチン結合タンパク質を発現する（Ｓｉｇｎａｓ，Ｒａｕｃｃｉら，１９８９；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｓｉｇｎａｓら，１９９１）。成熟型フィブロネクチン結合タンパク質のＮＨ２末端領域は、レセプターのフィブリノゲン／フィブリン結合活性に関与する、約５００残基長のＡ領域によって形成されている。ＦｎｂＡのＡ領域は、このタンパク質のＦｎｂＢ型には存在しない、機能未知の３０残基長の反復配列であるＢ１−Ｂ２二重コピーを含む。フィブロネクチン結合タンパク質のＣＯＯＨ末端領域は、レセプターのフィブロネクチン結合領域を形成するＤｕ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４という、５つの約４０残基長の保存的反復配列を含む。フィブロネクチン結合タンパク質のＣＯＯＨ末端領域は、ソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）のトランスペプチダーゼ活性により細胞壁ペプチドグリカンに共有結合的に結合している（Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，Ｆｏｗｌｅｒら，１９９５）。フィブロネクチンまたはフィブリンに対するＦｎｂＡの可逆的結合が、効率的な分子間共有結合架橋には必須である。ＦｎｂＡのフィブロネクチンまたはフィブリンとの結合は、その後第ＸＩＩＩａ因子によって架橋される供与体リジン残基と受容体グルタミン残基とを適当に配置させる。また、第ＸＩＩＩａ因子は、ペプチドに結合した反応性グルタミン残基のγ−カルボキサミド基と、さまざまな一級アミン（例えば、プトレシン一級アミン、スペルミジン一級アミン、およびカダベリン一級アミン）のアミノ基との間のイソペプチド結合の形成も触媒する（Ｌｏｒａｎｄ，Ｒｕｌｅら，１９６８；Ｌｏｒａｎｄ，Ｓｉｅｆｒｉｎｇら，１９７９）。別のアミン供与体の取り込みは、タンパク質架橋を阻害し、受容体タンパク質において関与グルタミン残基の酵素指向性で部位特異的な標識をもたらす（Ｌｏｒａｎｄ，２００１）。同様に、反応性グルタミン残基を含む、フィブロネクチンまたはα２−抗プラスミンのＮ末端配列を模倣したペプチドを利用することによって、供与体タンパク質中の関与リジン残基の特異的標識が達成され得る（Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ，Ｖｅｌａｓｃｏら，１９９０；Ｌｏｒａｎｄ，Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎら，１９９２；ＳｏｂｅｌおよびＧａｗｉｎｏｗｉｃｚ，１９９６）。最近になって、第ＸＩＩＩａ因子存在下で、ブドウ球菌ｒＦｎｂＡが、アミン供与体である合成プローブのダンシルカダベリンと、アミン受容体プローブとして作用する、フィブロネクチンのＮ末端配列を模倣したダンシル化ペプチドとによって修飾され得ることが分かった（Ｍａｔｓｕｋａら，２００３）。
【００２７】
本願発明において、ブドウ球菌ＦｎｂＡの中にヒト凝固第ＸＩＩＩａ因子または組織トランスグルタミナーゼにより標的化される反応性のＧｌｎ残基とＬｙｓ残基とがあることが同定されている。これは、細菌のタンパク質において第ＸＩＩＩａ因子反応性のアミン受容体および供与体の部位が局在することに関する最初の報告である。蛍光性リジンアナログであるダンシルカダベリンを用いて、第ＸＩＩＩａ因子反応性グルタミンの部位特異的標識を行った（Ｌｏｒａｎｄ，Ｒｕｌｅら，１９６８；Ｌｏｒａｎｄ，Ｓｉｅｆｒｉｎｇら，１９７９）。第ＸＩＩＩａ因子は、ｒＦｎｂＡレセプターに存在する４８個のＧｌｎ残基のうち４個とだけ反応した。ＦｎｂＡをダンシルカダベリンおよび凝固第ＸＩＩＩａ因子とともにインキュベートする場合、Ｇｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０残基が、ＦｎｂＡにおいてアミン受容体部位として働く。Ｇｌｎ１０３のダンシルカダベリン修飾の速度および程度は、Ｇｌｎ１０５、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０のそれよりも有意に大きかった（図２、Ｂ、Ｄおよび図３、Ｂ、Ｄ）が、これは、Ｇｌｎ１０３が主要なアミン受容体部位として作用することを示唆している。反応性残基Ｇｌｎ１０３およびＧｌｎ１０５は、ＦｎｂＡレセプターのＮＨ２末端のＡ領域の内部に位置する（図５）が、Ｇｌｎ７８３およびＧｌｎ８３０残基は、この分子のＣＯＯＨ末端部分に位置し、それぞれＤ１反復配列およびＤ４反復配列に属している。Ｇｌｎ１０３をＦｎｂＡの主要なアミン受容体部位として同定することは、タンパク質限定分解実験の結果と整合する。ダンシルカダベリン修飾されたｒＦｎｂＡのトロンビンによる切断は低分子量のＮＨ２末端フラグメントの遊離をもたらすが、主要なＧｌｎ１０３受容体部位が存在することに起因して、ＵＶ照射の際に高い強度の蛍光を示した。ＣＯＯＨ末端側フラグメントに相当し、副次的なＧｌｎ７８３部位とＧｌｎ８３０部位とを含む高分子量バンド（図５）は、小さな発光シグナルを生じた（図１ＡおよびＣ）。このように、ダンシルカダベリン修飾されたｒＦｎｂＡについて得られたタンパク質限定分解およびＳＤＳ−ＰＡＧＥのデータは、同定された受容体部位のさまざまな程度の反応性を示唆する別の一連の証拠を提示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析において、トロンビン生成されたｒＦｎｂＡフラグメントと、親ｒＦｎｂＡとは、予想したよりも低い電気泳動移動度を示した。たぶん、これは、ＳＤＳの結合能力が低下するために電気泳動移動度が低くなることが知られている荷電残基のＦｎｂＡにおける高い含有率によって生じる。ｒＦｎｂＡ試料を質量スペクトル解析に供したところ、その実験的に測定された分子量値は、計算された値と本質的には区別できなかった。
【００２８】
反応性グルタミン残基を含む、フィブロネクチンのＮＨ２末端配列を模倣したダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶペプチドプローブを、第ＸＩＩＩａ因子反応性リジン残基を標識するために利用した（Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ，Ｖｅｌａｓｃｏら，１９９０；Ｌｏｒａｎｄ，Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎら，１９９２）。標識処理は、ｒＦｎｂＡ内部にある５６個の潜在的リジン供与体残基のうち４個がペプチドプローブを取り込むことを明らかにした。これらの残基はＬｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、およびＬｙｓ７６２である。同定された第ＸＩＩＩａ因子反応性のリジン部位は、フィブリン（フィブリノゲン）結合領域Ａと、フィブロネクチン結合Ｄ反復配列との間に分布している。Ｌｙｓ１５７は、Ａ領域のＮＨ２末端部分内に位置するが、Ｌｙｓ５０３は、Ｂ１Ｂ２反復配列に隣接するそのＣＯＯＨ末端セグメントに位置する。フィブロネクチン結合ＤｕおよびＤ２反復配列は、それぞれ、第ＸＩＩＩａ因子反応性のＬｙｓ６２０部位およびＬｙｓ７６２部位を含む（図５）。興味深いことに、反応性Ｌｙｓ１５７がＮＨ２末端に位置するのにもかかわらず、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶによって修飾されたｒＦｎｂＡをトロンビンで切断しても、蛍光性の低分子量フラグメントを生じなかった（図１Ｄ、レーン２および４）。クーマシーブリリアントブルーによってゲルを染色しても、低分子量フラグメントを検出することができなかった（図１Ｂ、レーン２および４）。これらの観察結果は、Ｌｙｓ１５７のダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブでの修飾は、ＦｎｂＡのＮＨ２末端領域のトロンビン攻撃に対するより高い感受性を誘導し得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは検出できない小さなペプチドの生成をもたらし得ることを示している。
【００２９】
全体的に見ると、同定された反応性Ｇｌｎ受容体残基およびＬｙｓ供与体残基はすべて、フィブリン（フィブリノゲン）結合部位およびフィブロネクチン結合部位を形成する、ＦｎｂＡのＮＨ２末端領域およびＣＯＯＨの末端領域にかたまって存在する傾向をもつ。しかし、ピーク２（図２Ｄ）、ピーク２、３、５（図３Ｄ）、およびピーク３（図４Ｄ）に相当するペプチドを含む蛍光トレーサーが明確には同定されなかったため、ブドウ球菌ＦｎｂＡレセプター内のさらなるＧｌｎ受容体残基およびＬｙｓ供与体残基の存在を排除できない。それにもかかわらず、部位特異的な標識によって、第ＸＩＩＩａ因子に触媒される、ＦｎｂＡと、フィブロネクチン、フィブリン、および、場合によっては他のヒト宿主タンパク質との架橋反応に関与する反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基の正確な位置を決めることが可能になる。配列決定において、いくつかのピークが、各サイクルにおいて１つよりも多い残基を生じ、ＨＰＬＣ画分が不均一であることを示した。これら試料の不均質性は、質量スペクトル解析の結果からも明らかであった。各サイクルにおける残基の、ＦｎｂＡの既知の配列、およびトリプシンまたはＧｌｕ−Ｃプロテイナーゼによって生じる予測された切断部位をもつ利用可能なマップに対する比較は、個々の配列のほとんどの同定を可能にした。本研究におけるＮＨ２末端配列解析の結果は、予測されたプローブ修飾ペプチドに対応するシグナルの存在を示した質量スペクトルデータと常に相関していた。
【００３０】
今までのところ、凝固第ＸＩＩＩａ因子に対し１ダースそこそこのタンパク質基質が同定されているにすぎない。第ＸＩＩＩａ因子に対する既知のグルタミン含有基質には、配列相同性がほとんどないため、反応性を予測することは不可能ではないにしても困難である。同定された反応性グルタミンは、大抵、溶媒露出表面領域または可動的伸長部（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）に位置している（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，Ｓｔｒｏｎｇら，１９７９；ＭｃＤｏｎａｇｈ，ＭｃＤｏｎａｇｈら，１９８１；Ｍａｔｓｕｋａ，Ｍｅｄｖｅｄら，１９９６）。理論に捉われることなく言えば、タンパク質の一次構造と立体構造の両方が、グルタミン残基が反応性であるか否かを決定することができると考えられる。これらの観察結果は、本明細書においてブドウ球菌ＦｎｂＡレセプターについて示したデータと整合している。
【００３１】
反応性のＧｌｎ７８３受容体部位およびＧｌｎ８３０受容体部位は、いくつかの報告によれば、コンパクトな構造を持たず、どちらかといえば折り畳まれていない状態で存在するＤ２およびＤ４のフィブロネクチン結合反復配列の中に存在する（Ｈｏｕｓｅ−Ｐｏｍｐｅｏ，Ｘｕら，１９９６；Ｐｅｎｋｅｔｔ，Ｒｅｄｆｉｅｌｄら，１９９７；Ｐｅｎｋｅｔｔ，Ｒｅｄｆｉｅｌｄら，１９９８）。反応性のＧｌｎ１０３部位およびＧｌｎ１０５部位は、タンパク質分解に対して感受性があるとみられ、そのため、秩序ある構造を欠くことがここでも示され得るＦｎｂＡのＮＨ２末端領域の中に位置する。タンパク質におけるアミン供与体であるリジン残基に対する第ＸＩＩＩａ因子の選択性もまた、十分に理解されてはいない。第ＸＩＩＩａ因子は、リジン残基に対する選択性がグルタミン残基に対するよりも低いという一般概念にもかかわらず、限られた数のアミン供与体部位だけが、特定のタンパク質−タンパク質架橋反応に関与することができ、ペプチドプローブによる修飾を受けることができる。第ＸＩＩＩａ因子は、タンパク質基質において、広範ではあるが、アミン供与体であるリジンの前にある残基に関して明らかに異なる寛容を示すことが示された。第ＸＩＩＩａ因子または組織トランスグルタミナーゼに対するタンパク質基質の解析は、アミン供与体部位の直前にある残基は、非荷電性残基、および塩基性で極性の残基、ならびに低分子の脂肪族残基を含むことを明らかにした（Ｇｒｏｏｔｊａｎｓ，Ｇｒｏｅｎｅｎら，１９９５）。本明細書で開示されているブドウ球菌ＦｎｂＡレセプターに関するデータは、さらにこれらの観察結果を裏付けている。４つの同定された第ＸＩＩＩａ因子反応性リジンにおいては、Ｌｙｓ１５７の前はＶａｌであり、Ｌｙｓ５０３の前はＡｌａであり、また、Ｌｙｓ６２０の前はＴｈｒである。唯一の例外は、ＧｌｕがＬｙｓ７６２の前にあることである（図５）。
【００３２】
同定された第ＸＩＩＩａ因子反応部位が、異なったブドウ球菌株に由来する他のフィブロネクチン結合タンパク質の間で保存されているか否かを調べるために、多重配列アラインメントを用いてそれらのアミノ酸配列を解析した。ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのアミノ酸配列（配列番号１）を、以下の菌株のＦｎｂＡおよびＦｎｂＢの配列と比較した：菌株８３２５−４（配列番号７および配列番号１４）（Ｓｉｇｎａｓ，Ｒａｕｃｉら，１９８９；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｓｉｇｎａｓら，１９９１）、ＭＷ２（配列番号４および配列番号１１）（Ｂａｂａ，Ｔａｋｅｕｃｈｉら，２００２）、ＥＭＲＳＡ−１６（配列番号８）、ＭＳＳＡ−４７６（配列番号５および配列番号１２）、ＣＯＬ（配列番号６および配列番号１３）、Ｍｕ５０（配列番号２および配列番号９）、およびＮ３１５（配列番号３および配列番号１０）（Ｋｕｒｏｄａ，Ｏｈｔａ，ら，２００１）。菌株ＥＭＲＳＡ−１６およびＭＳＳＡ−４７６のＦｎｂＡおよびＦｎｂＢのアミノ酸配列は、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。ブドウ球菌ＣＯＬの配列は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。多重配列アラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８１）プログラムを用いて実施した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｈｉｇｇｉｎｓら，１９９４）。
【００３３】
図６は、ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡにおいて同定された反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基の周辺領域のアミノ酸配列アラインメントを示している。多重アラインメントは、反応性のＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｇｌｎ８３０、およびＬｙｓ６２０という残基が、すべての解析されたＦｎｂＡ配列においては保存されていることを明らかにした。菌株ＭＷ２、ＭＳＳＡ−４７６、ＣＯＬ、８３２５−４、およびＥＭＲＳＡ−１６のＦｎｂＡでは、反応性Ｌｙｓ１５７がＴｈｒ残基で置換されている。菌株のＣＯＬおよび８３２５−４では、反応性Ｌｙｓ５０３がＡｓｎ残基で置換されている。ＥＭＲＳＡ−１６株のＦｎｂＡ配列では、反応性Ｌｙｓ７６２を含むポリペプチド鎖のセグメントが失われており、ＣＯＬ株および８３２５−４株では、反応性Ｇｌｎ７８３がＨｉｓに置換されている（図６）。この観察結果は、第ＸＩＩＩａ因子のトランスグルタミナーゼ作用に対するさまざまなブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｓ）株のＦｎｂＡの反応性は異なり得ることを示している。
【００３４】
また、第ＸＩＩＩａ因子反応性の受容体部位および供与体部位は、レセプターのＦｎｂＢファミリー内ではあまり保存されていないように見える。解析されたＦｎｂＢ配列はいずれも、反応性のＧｌｎ１０３、Ｌｙｓ１５７、およびＬｙｓ５０３を有しておらず、一方、Ｍｕ５０株およびＮ３１５株ではＬｙｓ７６２が失われている。菌株ＭＷ２、ＭＳＳＡ−４７６、ＣＯＬ、および８３２５−４のＦｎｂＢ配列では、反応性のＧｌｎ１０５およびＧｌｎ７８３は保存されていない。同定された第ＸＩＩＩａ因子反応性部位のすべての中で、Ｌｙｓ６２０残基およびＧｌｎ８３０残基のみが高度に保存されており、解析したすべてのＦｎｂＡ配列およびＦｎｂＢ配列に存在する（図６）。
【００３５】
興味深いことに、ＦｎｂＡを第ＸＩＩＩａ因子で処理すると、保存されている反応性Ｌｙｓ６２０残基は一貫してダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブに対して最も高い反応性を示した（図４Ｂのピーク＊、および図４Ｄのピーク５、表３）。これは、さらに、６２０位におけるＬｙｓ供与体部位の生理学的な重要性を示している。主要なＧｌｎ１０３受容体部位が、Ｌｙｓ１５７およびＬｙｓ５０３の供与体部位とともに、すべての調べられたＦｎｂＢ配列に存在しないという事実は、フィブロネクチン結合タンパク質のＢ型が、第ＸＩＩＩａ因子に触媒される架橋反応においてあまり顕著な役割を果たしていないことを示唆している。また、これらの違いは、フィブロネクチン結合タンパク質のＡ型およびＢ型が、それらのヒト宿主タンパク質の架橋相手に対して異なった選択性を示すことを示している。
【００３６】
ブドウ球菌ＦｎｂＡレセプター以外、現在知られているすべての第ＸＩＩＩａ因子のタンパク質基質は、血液凝固、線維素溶解、細胞外マトリックスの集合、および創傷治癒反応に関与している。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＦｎｂＡが、第ＸＩＩＩａ因子の二機能性基質として作用し、フィブロネクチンまたはフィブリンに架橋されるという本発明者らの発見（Ｍａｔｓｕｋａら，２００３）は、凝固第ＸＩＩＩａ因子も、分子生物学的病原機構において重要な役割を果たしていることを示唆している。病原性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）がヒト宿主分子に共有結合するために第ＸＩＩＩａ因子のトランスグルタミナーゼ活性を利用可能である、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の能力が、組織損傷において非常に高い効率での細菌コロニー形成を説明する。損傷後、血塊の形成は、血管を完全な状態に戻すため、および創傷修復を開始するための一時的なマトリックスを提供するために役立つ（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ  １９９２）。血塊の主なタンパク質成分であるフィブリンおよび血漿フィブロネクチンは、これらの機能に不可欠である。フィブリンおよびフィブロネクチンは、どちらも黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の表面結合型ＦｎｂＡレセプターに対するリガンドとして作用するため、細菌の創傷部位への結合に関与する。血塊が成熟するにつれて、凝固第ＸＩＩＩａ因子は、フィブリン分子間、ならびにフィブリンとフィブロネクチンとの間における分子間架橋の触媒を開始する。フィブリン分子間における共有結合架橋は、血塊の構造的安定性を高める（ＨｅｎｓｃｈｅｎおよびＭｃＤｏｎａｇｈ  １９８６）が、フィブロネクチンのフィブリンへの架橋は、創傷治癒過程に必要とされる細胞接着および細胞移動という事象にとって重要である（Ｇｒｉｎｎｅｌ，Ｆｅｌｄら，１９８０；Ｋｎｏｘ，Ｃｒｏｏｋｓら，１９８６；Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｌｅｅら，１９９７）。この段階でフィブリンまたはフィブロネクチンに可逆的に結合しているブドウ球菌ＦｎｂＡレセプターは、第ＸＩＩＩａ因子によってそのリガンドに共有結合架橋され得る。ＦｎｂＡを共有結合によってフィブリンまたはフィブロネクチンに取り込むと、ブドウ球菌のコロニー形成および感染成立の確率が増加する。それは、また、フィブリン−フィブリンおよびフィブリン−フィブロネクチンの架橋反応とも競合する（Ｍａｔｓｕｋａ，Ｍｅｄｖｅｄら，１９９４；Ｍａｔｓｕｋａ，Ｍｉｇｌｉｏｒｉｎｉら，１９９７）（Ｍａｔｓｕｋａら，２００３）ため、血塊の構造的完全性に影響を与え、創傷治癒反応を阻害する。第ＸＩＩＩａ因子が触媒するブドウ球菌ＦｎｂＡのヒト細胞外マトリックスタンパク質への架橋のこのような影響は、ＦｎｂＡレセプターの分子進化に対する原動力として寄与し得、その結果、ついには新しく有用な性質を獲得する可能性が最も高い。第ＸＩＩＩａ因子に対するＦｎｂＡの進化した反応性は、宿主のコロニー形成において顕著な利益を与え、そのため、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の生存率に対してプラスの影響を与えてきた。
【００３７】
本明細書記載の第ＸＩＩＩａ因子触媒による共有結合架橋反応に直接関与する野生型ブドウ球菌ＦｎｂＡの中で反応性アミノ酸残基（ＧｌｎおよびＬｙｓ）を同定することに加え、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染後、フィブロネクチンおよびフィブリンに共有結合架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低い、Ｆｎｂに由来するタンパク質の合成に関係する。具体的には、本明細書に記載した研究は、改変されたフィブロネクチン結合性のタンパク質またはポリペプチドを含む、タンパク質および／またはポリペプチドを調製する組成物および方法を目的とし、これは、免疫原性組成物製剤（多価免疫原組成物を含む）における免疫原として使用することができ、能動的免疫化に使用することができる。この方法は、Ｆｎｂ配列における１個以上のアミノ酸を改変して、後に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際に野生型Ｆｎｂがフィブロネクチンおよびフィブリンに結合することを促進させることなくして免疫原性であるＦｎｂに由来するタンパク質またはポリペプチドを生じさせることを含む。本明細書において同定されている２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸残基の変異は本発明の範囲に含まれる。
【００３８】
Ｆｎｂの野生型（天然型）のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は当技術分野において既知である（米国特許第５，３２０，９５１号、第５，５７１，５１４号、第５，１７５，０９６号、第５，６５２，２１７号など）。本明細書において使用される場合、「改変」およびその派生語は、野生型配列とは異なるアミノ酸配列、および、野生型のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意味するものである。改変には、ヌクレオチドまたはアミノ酸の１個以上の挿入、欠失、および／または置換が含まれる。
【００３９】
例えば、改変は、フレームシフト変異をもたらす、１個のヌクレオチド、または１個よりも多いヌクレオチドの挿入または欠失であるかもしれない；コードされたアミノ酸の１個以上の変化をもたらす、少なくとも１個のヌクレオチドの変化であるかもしれない；未成熟終止コドンの生成をもたらす少なくとも１個のヌクレオチドの変化であるかもしれない；いくつかのヌクレオチドの欠失であって、そのヌクレオチドにコードされている１個以上のアミノ酸の欠失をもたらすものかもしれない；遺伝子のコード配列の中断をもたらす１個またはいくつかのヌクレオチドの挿入であるかもしれない；遺伝子のすべてまたは一部の重複であるかもしれない；遺伝子のすべてまたは一部の転位であるかもしれない；または、遺伝子のすべてまたは一部の再配列であるかもしれない。このような変異の１つ以上が１個の遺伝子に存在することも可能である。このような配列の変化は、その遺伝子によってコードされたＦｎｂの改変を生じる。例えば、改変がフレームシフト変異であれば、このフレームシフトは、コードされたアミノ酸に変化を生じさせるか、および／または未成熟終止コドンの生成をもたらし、短縮タンパク質の生成をもたらす可能性がある。
【００４０】
例えば、改変は、好ましくは、天然型Ｆｎｂの３次元立体構造を保存するものである。さらに、Ｆｎｂの機能、特に免疫原性に不可欠のアミノ酸を、当技術分野において既知の方法によって同定することができる。特に有用な方法としては、保存されたアミノ酸の同定法、部位特異的変異誘発法、およびアラニンスキャニング変異法（例えば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ  １９８９）、結晶および核磁気共鳴法などが挙げられる。これらの方法によって作成された改変型ポリペプチドは、免疫原性および抗原性を含む、具体的な生物活性についてテストされ得る。
【００４１】
具体的には、疎水性、塩基性または酸性という特徴、電荷、極性、大きさ、官能基（例、−ＳＨまたはグリコシル化部位）の有無、および芳香族特性を含む、いくかの基準に基づいて適当なアミノ酸改変が行われ得る。上記の性質に基づいて、さまざまなアミノ酸を類似したグループに割り当てることは、当業者に容易に分かることであり、さらに適当なアミノ酸の変化については、Ｂｏｗｉｅら，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０））に記載されている。
【００４２】
例えば、改変は、防御免疫反応に関与するＦｎｂＡの領域の特性は維持するが、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の刺激に関与するエピトープを欠失または変更させる、グルタミン残基およびリジン残基の保存的な（例えば、アラニンに対しグリシン；イソロイシンに対しバリン、リジンに対しヒスチジン、グルタミンに対しアスパラギン）部位特異的突然変異の形（図６）をとることも可能である（すなわち生物学的等価体）。また、改変は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を悪化させるような刺激を低減または除去する非保存的変異（例えば、スレオニンに対しリジン；リジンに対しアラニン、グルタミンに対しアラニン）という形をとることも可能である。また、改変は、残りのＦｎｂに由来する部分を引き続き利用しつつ、本明細書において同定されたグルタミン残基またはリジン残基の任意のものを完全に欠失させた形をとることも可能である。欠失部位は、最適な翻訳および／または免疫原性のために残りのＦｎｂまたはポリペプチドの空間性を維持するリンカー領域によって置換することができる。改変は、任意の標準的な変異原または変異誘発法（例えば、ファージを含む部位特異的変異誘発法、合成オリゴヌクレオチドを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術の使用）を用いて行うことができる。
【００４３】
したがって、本発明は、免疫原性を保持する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂまたはその一部をコードする単離されたヌクレオチド配列に関係する。本明細書において使用される場合、「改変型Ｆｎｂ」という用語は、免疫原性を保持し、かつ、免疫原組成物に取り込まれて脊椎動物に投与されると、その後黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染してもフィブロネクチンまたはフィブリンへの結合を促進しない黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＦｎｂ（またはその一部）を意味することを意図される。具体的な実施態様において、改変型Ｆｎｂは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に相当する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異を含む。一つの実施態様において、これらのアミノ酸はアラニンに変異している。
【００４４】
本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に相当するアミノ酸との関係で具体的に記載されているが、これらの残基を同定するために使用された本明細書記載の方法を、野生型Ｆｎｂのさらなる残基に適用して、さらなる改変のための残基を同定することができる。
【００４５】
必要に応じて、本発明の核酸分子は、例えばｍＲＮＡのようなＲＮＡ、またはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡなどのＤＮＡであってもよい。ＤＮＡ分子は２本鎖または１本鎖であってよく、１本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、コード鎖またはセンス鎖、あるいは非コード鎖またはアンチセンス鎖であってもよい。１つの実施態様において、核酸分子は、少なくとも約１４のヌクレオチドを含み、別の実施態様においては、少なくとも約５０のヌクレオチドを含み、さらに別に実施態様においては、少なくとも２００のヌクレオチドを含む。ヌクレオチド配列は、改変型Ｆｎｂのアミノ酸配列の少なくともフラグメントをコードするものにすぎなくてよく、あるいは、このヌクレオチド配列は、少なくとも改変型Ｆｎｂアミノ酸をコードする配列のフラグメントを、イントロン、および非コード３’および５’配列（例えば、調節配列を含む）のような付加的な非コード配列とともに含むことができる。さらに、ヌクレオチド配列は、マーカー配列、例えば、ポリペプチドの単離または精製に役に立つようなポリペプチドをコードする配列などに融合され得る。
【００４６】
「ヌクレオチド配列」という用語は、化学的にまたは組み換え手段によって合成されるヌクレオチド配列を含むことができる。したがって、ベクターに含まれる組み換えＤＮＡは、本発明に包含される。また、ヌクレオチド配列は、異種の宿主細胞中の組み換えＤＮＡ分子、および部分的または実質的に精製された、溶液中のＤＮＡ分子を含む。本発明のＤＮＡ分子のインビボおよびインビトロにおけるＲＮＡ転写物も、本発明のヌクレオチド配列に含まれる。このようなヌクレオチド配列は、例えば、コードされた改変型Ｆｎｂを製造する場合に有用である。
【００４７】
改変型Ｆｎｂの一部、アナログまたは誘導体をコードするもののような、本発明のヌクレオチド配列のバリエーションも、その一部、アナログまたは誘導体が改変型Ｆｎｂを含んでいれば、本発明に包含される。このようなバリエーションは、対立遺伝子バリエーションの場合のように、ヌクレオチド配列の非改変部分に天然に生じるバリエーションであってよく、または、さまざまな突然変異原および突然変異誘発処理によって誘導されるものなど、非天然に生じるものであってもよい。対象となるバリエーションとしては、付加および欠失を含む保存型または非保存型のアミノ酸変化をもたらすことができる、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失および置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書記載の発明は、上記の核酸分子のフラグメントにも関する。「フラグメント」という用語は、フラグメントが改変型Ｆｎｂポリペプチドをコードし、すなわち、フラグメントがプライマーとして有用であるならば、長さが少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドから少なくとも約５０個の連続した以上のヌクレオチドまでである、本明細書記載のヌクレオチド配列の一部を包含することを意図される。一定のプライマーおよびプローブは、本明細書に記載されている改変型Ｆｎｂをコードする核酸分子と選択的にハイブリダイズする。例えば、本明細書記載の改変型Ｆｎｂの抗原部分をコードするフラグメントは有用である。
【００４９】
本発明は、中度および高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、選択的ハイブリダイゼーションのための条件）下で、本明細書記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列にも関係する。適当なストリンジェンシー条件は当業者に知られているか、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６のような標準的な教科書に記載されている。
【００５０】
したがって、本発明は、本明細書記載の改変型のヌクレオチド配列に実質的に同一である、例えば、これらの配列に少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるようなヌクレオチド配列に関連する。特定のヌクレオチド配列は、本明細書記載の改変型Ｆｎｂとして、実質的に類似した抗原活性をもつポリペプチドをコードする。
【００５１】
また、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂ、または、そのポリペプチドにも関連する。改変型Ｆｎｂまたはポリペプチドは、免疫原性を保持し、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与されると、その後黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際、フィブロネクチンおよびフィブリンと架橋する能力が野生型Ｆｎｂよりも低くなっている、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＦｎｂ（またはその一部）である。具体的な実施態様において、改変型Ｆｎｂは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５のＦｎｂＡのＧｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０に対応する残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸の変異を含む。本発明の改変型Ｆｎｂは、実質的に精製されており（例えば、均質になるまで精製されている）、他のタンパク質を実質的に含まない。
【００５２】
また、本発明は、少なくとも１つの調節配列と作動できるように結合している、改変型Ｆｎｂまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含む、発現ベクター（例えば、プラスミドおよびコスミドのような核酸構築物）も提供する。このような多くベクターの多くは市販されており、当業者は他の適当なベクターを容易に調製することができる。「作動できるように結合する」とは、核酸配列の発現を可能にする態様で、ヌクレオチド配列が調節配列に結合していることを意味し、この用語は、直接の物理的結合、およびリンカーまたは介在配列による連結の両方を含むことを意図される。調節配列は当業者に知られており、改変型Ｆｎｂまたはポリペプチドであるポリペプチドを産生するために選択される。したがって、「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている他の発現制御要素を含む。例えば、固有の調節配列、または形質転換宿主細胞に固有の調節配列が用いられ得る。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、および／または発現を所望されるタンパク質のタイプなどの要素に依存し得ることが理解される。
【００５３】
例えば、本発明の改変型Ｆｎｂおよびポリペプチドは、核酸分子、またはその一部を、原核細胞、真核細胞またはその両方で発現させるのに適したベクターの中にライゲーションすることによって産生され得る（例えば、Ｂｒｏａｃｈら，，１９８３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，，１９８９参照）。
【００５４】
記載されたベクターによって形質導入された原核生物および真核生物の宿主細胞も、本発明によって提供される。例えば，本発明の発現ベクターで形質転換、形質導入または感染され得る細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌株）のような細菌細胞、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞、Ｓｆ９細胞、およびＳｆ２１細胞を含む昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母菌などの真菌細胞、植物細胞、および胸腺細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥｐ−２細胞、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞およびコス（ＣＯＳ）細胞のような哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
したがって、本明細書記載の改変型Ｆｎｂをコードするヌクレオチド配列は、微生物または真核細胞による処理を介して組み換え型タンパク質を産生するために使用され得る。発現ベクターのような遺伝子構築物にポリヌクレオチド配列をライゲーションして、真核生物（酵母、鳥類、昆虫、植物または哺乳動物）または原核生物（細菌細胞）の宿主に形質転換または形質移入することは、他の周知のタンパク質の生産に用いられる標準的な処理法である。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス、シンドビズウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスなどのアルファウイルス、ならびに、はしかウイルス、おたふくかぜウイルス、および水疱性口内炎ウイルスのような非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスなどであるが、これらに限定されないウイルス性ベクターを使用することもできる。したがって、本発明は組み換え技術による改変型Ｆｎｂの産生に関する。
【００５６】
本発明の改変型Ｆｎｂがインビトロで産生される上記宿主細胞系に加え、多様な系が、このような改変型Ｆｎｂをインビボで発現させ、送達するのに適している。これらの系は、細菌またはウイルスなどの弱毒化した病原体を送達因子として利用する。これらの生きた弱毒化病原体は、異種核酸セグメントとして、それらの内部に、本発明の所望の改変型Ｆｎｂをコードする核酸配列を挿入されている。これらの系を用いると、脊椎動物の体内で、生きている弱毒化された細菌またはウイルスによって、所望の改変型Ｆｎｂが発現される。
【００５７】
本発明のタンパク質は、多様な方法によって、組み換え細胞培養物から単離または（例えば、均質になるまで）精製され得る。これらは、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿法、アフィニティークロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含むが、これらに限定されない。用いられる具体的な方法は、ポリペプチドの性質および宿主細胞の選択に依存し、適当な方法が、当業者には容易に理解される。
【００５８】
本発明は、本明細書に記載された改変型Ｆｎｂを含む免疫原性組成物にも関連する。例えば、本発明の改変型Ｆｎｂを、生理学的に受容可能なビヒクルとともに処方して、免疫原性組成物を調製し得る。具体的な生理的ビヒクルは、水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、およびブドウ糖溶液を含むが、これらに限定されない。選ばれたビヒクルの活性成分の最適濃度は、所望の最終的薬学的処方物に依存する、周知の方法に従って実験的に決定され得る。
【００５９】
改変型Ｆｎｂは、哺乳動物宿主のような脊椎動物の中の抗原に対する免疫反応を誘導する抗原として使用され得る。
【００６０】
本発明の方法は、改変型Ｆｎｂと任意の適当なアジュバントとの混合物を含む免疫原性組成物の免疫学的に有効な投与量を脊椎動物に投与する工程を包含する。本明細書において使用される場合、「アジュバント」は、抗原に対する免疫反応を促進するか、または変更するのに十分な任意の薬剤を意味することが意図される。本明細書において使用される場合、免疫原性組成物の「免疫学的に有効な」投与量は、免疫反応を誘導するのに適切な投与量である。具体的な投与量は、処理を受ける脊椎動物の年齢、体重および病状、ならびに投与法に依存する。当業者は、容易に適切な投与量を決定する。免疫原性組成物は、必要に応じて、生理的食塩水またはエタノールポリオール（グリセロールもしくはプロピレングリコール）のような、薬学的および生理学的に受容可能なビヒクル中で投与され得る。
【００６１】
組成物の効力を促進する適当なアジュバントとしては以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）；
（２）例えば、以下のような、水中油型エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁成分など、他の特異的免疫促進因子の有無に関わらない）：
（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含み（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む（必要とはされないが、下記を参照のこと））、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙのようなマイクロ流動化装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を使用して極微粒子に処方されたＭＦ５９（ＰＣＴ公報ＷＯ９０／１４８３７号）、
（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照）を含み、極微粒子にマイクロ流動体化されているか、またはボルテックス処理されてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じているかのいずれかである、ＳＡＦ、ならびに
（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および米国特許第４，９１２，０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載された３−Ｏ−脱アシル化（ｄｅａｙｌａｔｅｄ）モノホスホリルリピドＡ（３−Ｏ−ｄｅａｙｌａｔｅｄ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ  Ａ）（ＭＰＬＴＭ）、トレハロースジミコール酸（ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）もしくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなるグループに由来する、１つ以上の細菌細胞壁組成を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；
（３）Ｑｕｉｌ  ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮＴＭ  ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）（米国特許第５，０５７，５４０号）などのサポニンアジュバント、またはそれらから生じた、ＩＳＣＯＭ（免疫促進複合体）などの粒子を用いることができる；
（４）細菌のリポポリサッカライド、アミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）、または、その誘導体もしくはアナログなどの合成リピドＡアナログ。これらはＣｏｒｉｘａから購入可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている；このようなＡＧＰの１つが、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、５２９としても知られており（以前はＲＣ５２９として知られていた）、これは水性形態としてか、または安定したエマルジョンとして書法され、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの、サイトカイン；
（６）例えば、国際特許出願公報ＷＯ００／１８４３４号（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照）に従って、２９位のアミノ酸のグルタミン酸が別のアミノ酸（好ましくはヒスチジン）に置換されている、野生型または変異型いずれかのコレラ毒（ＣＴ）のような細菌性ＡＤＰリボシル化毒素の無毒化変異体、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、具体的にはＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５参照）、および
（７）免疫促進因子として作用して、上記組成物の効力を増大させる他の物質。
【００６２】
上記のように、ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明の組成物は、非経口経路、動脈内経路、内皮経路、（徐放性ポリマーの使用による）経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、経口経路および鼻腔内経路による投与など、種々の経路で、ヒトまたは非ヒト脊椎動物に投与され得る。このような組成物に用いられるＦｎｂの量は、投与経路および被験体脊椎動物の身体的特徴に依存して変動する。従来型キャリア抗原とともに用いられる、確立された投与量の範囲を調整および操作することは、当業者が適宜なしうることである。本発明の組成物は、未成熟および成熟した脊椎動物、特にヒトの処置における使用が意図される。
【００６４】
改変型Ｆｎｂは、さらなる免疫原と一緒に投与され得る；この改変型Ｆｎｂは、さらなる免疫原と、別個にか、連続的にか、または同時に投与され得る。
【００６５】
本発明の改変型Ｆｎｂは、免疫反応を調節または促進するために、キャリア分子と結合することができる。適切なキャリアタンパク質は、脊椎動物に安全に投与でき、キャリアとして免疫学的に有効な細菌性毒素を含む。例としては、百日咳、ジフテリア、および破傷風のトキソイド、ならびにジフテリアトキソイドの非毒性変異体であるＣＲＭ１９７などの非毒性変異タンパク質（交差反応性物質（ＣＲＭ））などがある。天然の毒素またはトキソイドのフラグメントであって、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むものもまた、抗原のキャリアとして有用である。抗原の結合体およびキャリア分子を調製する方法は、当該分野において周知である（Ｗｏｎｇ  １９９１；  Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｅｄａ  １９８６；  Ｆｒｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６；  Ｂｏｅｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）。
【００６６】
さらに、特定のペプチド領域が欠失している場合には、二価ワクチンを作成するために、別の生物の抗原に由来する１つ以上のエピトープを、その欠失領域に挿入することができる。
【００６７】
本発明はまた、生理学的に受容可能なキャリアと、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂをコードする核酸分子とを含む免疫原性組成物に関連し、この改変型Ｆｎｂは、免疫原性を保ち、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、その後その脊椎動物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した際に、野生型Ｆｎｂの結合を促進しない。このような免疫原性組成物は、本明細書において、核酸免疫原性組成物またはＤＮＡ免疫原性組成物と称され、脊椎動物を免疫化するのに有用である。
【００６８】
本明細書において、「遺伝子による免疫化」という用語は、脊椎動物による黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫反応の創出をもたらす、脊椎動物（具体的には哺乳動物）への、病原体（具体的には黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））に対する核酸免疫原性組成物の接種を意味する。本明細書で用いられる「核酸免疫原性組成物」または「ＤＮＡ免疫原性組成物」は、ポリペプチド抗原、具体的には本明細書記載の黄色ブドウ球菌の改変型Ｆｎｂをコードする核酸分子を含む核酸構築物である。この核酸構築物は、転写プロモーター因子、エンハンサー因子、スプライシングシグナル、終結シグナルおよびポリアデニル化シグナル、ならびに他の核酸配列を含むこともできる。核酸免疫原性組成物は、後に脊椎動物が黄色ブドウ球菌に感染した際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンまたはフィブロンへの結合を促進しない。
【００６９】
核酸免疫原性組成物は、標準的な方法によって作成される。例えば、既知の方法を用いて、黄色ブドウ球菌の改変型Ｆｎｂをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を発現ベクターに挿入し、核酸免疫原性組成物を構築する（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。
【００７０】
個々の脊椎動物を、標準的な方法を用いて核酸免疫原性組成物で免疫化する。脊椎動物は、皮下的、静脈内、腹腔内、皮内、筋内、局所的、経口、直腸内、鼻内、頬内、膣内、吸入噴霧によるか、または従来型の非毒性で生理学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルを含む投薬処方物中のインプラントリザーバーを介して免疫化される（すなわち、その組成物が投与される）。あるいは、粒子加速装置（「遺伝子銃」）を使って、脊椎動物に核酸免疫原性組成物を接種する。投与形態（例えば、カプセル、錠剤、溶液、エマルジョン）は、投与経路に部分的に依存する。例えば、粘膜投与には、点鼻薬、吸入または坐薬を用いることができる。
【００７１】
核酸免疫原性組成物は、上記したような任意の適当なアジュバントとともに投与することができる。このアジュバントは十分な量で投与されるが、その量とは、組成物に対するより強い免疫反応を生じさせるのに十分な量のことである。アジュバントは、核酸免疫原性組成物を接種する前にか、同時にか、同時に（一斉に）か、またはその後に、投与することができる。アジュバントは、１回以上投与することもできる。アジュバントおよび核酸免疫原性組成物は、脊椎動物のほぼ同じ場所に投与することができる；例えば、両者を脊椎動物の肢の標識部位に投与する。
【００７２】
具体的な実施態様において、核酸構築物は、形質導入促進因子とともに同時投与される。１つの実施態様において、形質導入促進因子はジオクチルグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）である（ＰＣＴ公開出願WＯ  ９６／２１３５６号）。別の実施態様において、形質導入促進因子は、ブピバカインのような局部麻酔薬である（米国特許第５，５９３，９７２号）。
【００７３】
本発明はまた、脊椎動物（例えば、黄色ブドウ球菌セロネガティブのヒト）を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して免疫化する方法も提供する。この方法は、上記の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の改変型Ｆｎｂの免疫学的に有効な量を含む組成物を、その脊椎動物に投与する工程を包含する。あるいは、この組成物は、免疫原性を保持しており、かつ、免疫原性組成物に組み込まれて脊椎動物に投与される場合に、フィブロネクチンおよびフィブリンと架橋する能力が低下して、後に脊椎動物が黄色ブドウ球菌に感染した際に、野生型Ｆｎｂのフィブロネクチンおよびフィブリンへの結合を促進しない、免疫学的な有効量の改変型Ｆｎｂをコードする核酸分子を含む。
【００７４】
ヒトに投与する前に、本発明の免疫原性組成物を動物モデルにおいて評価する。ここで、代表的な非限定的動物モデルを以下に説明する。
【００７５】
マウス腎盂腎炎モデルにおいて、４週齢の雌性ＣＤ−１マウスに、０週、３週、および６週に、適切なアジュバント中の改変型Ｆｎｂを、皮下注射によって接種する。これらのマウスから、初回接種の前と８週目に採血する。最後の採血の２日後、コロンビア塩寒天培地（１×コロンビア寒天、０．１％グルコース、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）上で一晩増殖させた３×１０８ｃｆｕの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）レイノルズを、腹腔内注射によってマウスに投与する。投与の４８時間後、マウスを屠殺して、腎臓内の細菌数を数える。
【００７６】
ラット心内膜炎モデルでは、３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラットに、０週、２週、および４週目に、適切なアジュバント中の改変型Ｆｎｂを筋肉内注射によって接種する。これらのラットから、初回接種前に採血する。６週目に、ラットから採血し、手術を行って、頚動脈および大動脈弓を介して、心臓の左心室にポリエチレン製カテーテルを設置する。カテーテルは、絹縫合糸で適所に保たれ、無菌的な植生（ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ）形成を引き起こす。細菌の投与の際に、この植生は、細菌が付着および感染するための基質として作用する。手術の２日後、トリプティックソイブロス中で中期対数増殖期まで増殖させた１×１０５ｃｆｕの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）レイノルズを、静脈注射によってラットに投与する。投与の４８時間後、ラットを屠殺して、心臓内の細菌数を数える。
【実施例】
【００７７】
上記の開示は、本発明を一般的に説明する。以下の具体的な実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単に例示的に説明する目的で記載するものであって、発明の範囲を制限することを意図したものではない。
【００７８】
（略語）
ＨＰＬＣ                  高速液体クロマトグラフィー；
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法；
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ          ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；
ＤＴＴ                    ジチオスレイトール
ＴＣＡ                    トリクロロ酢酸；
Ｄａｎｓｙｌ              ５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル；  
ＰＴＨ                    フェニルチオヒダントイン；
ＥＣＭ                    細胞外マトリックスタンパク質
ＴＢＳ                    ＴＲＩＳ緩衝食塩水
ＰＢＳ                    リン酸ナトリウム緩衝食塩水
ＦＸＩＩＩ                第ＸＩＩＩ因子または血漿トランスグルタミナーゼ
ＥＤＴＡ                  エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩
１Ｑ  ｒＦｎｂＡ          組み換えＧｌｎ１０３Ａｌａ型ＦｎｂＡ変異体  
４Ｑ４Ｋ  ｒＦｎｂＡ      組み換えＧｌｎ１０３Ａｌａ，Ｇｌｎ１０５Ａｌａ，Ｇｌｎ７８３Ａｌａ，Ｇｌｎ８３０Ａｌａ，Ｌｙｓ１５７Ａｌａ，Ｌｙｓ５０３Ａｌａ，Ｌｙｓ６２０Ａｌａ，およびＬｙｓ７６２Ａｌａ型変異体  
ｗｔ  ＦｎｂＡ            野生型ＦｎｂＡ。
【００７９】
（材料および方法）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）フィブロネクチン結合タンパク質。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５由来のＡｌａ１からＰｒｏ８３９までの残基を含む組み換えフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｒＦｎｂＡ）を大腸菌で産生させ、既述されたとおり（Ｍａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）細胞溶解物の可溶性画分から単離した。簡単に言うと、ＦｎｂＡアミノ酸残基の１〜８３９をコードするｆｎｂＡ遺伝子を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５の染色体ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅法により作成した。単離されたｒＦｎｂＡの同一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、およびＮＨ２末端配列の解析を用いて確認した。すべての実験におけるタンパク質濃度は、使用説明書（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に従ってビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ法を用いて測定した。
【００８０】
第ＸＩＩＩａ因子により触媒されるダンシルカダベリン（ｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）およびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブのｒＦｎｂＡへの取り込み。ダンシルカダベリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｉｎｃ．，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＭＡによって特注合成）をｒＦｎｂＡに取り込ませるために、予め活性化した第ＸＩＩＩ因子を用いた。このために、５００μｇ／ｍｌの第ＸＩＩＩ因子（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＶＴ）を、１０ｍＭのジチオスレイトールおよび２０ｍＭのＣａＣ１２を含むＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、０．２５Ｕ／ｍｌのトロンビン（Ｓｉｇｍａ）で処理して活性化した。３７℃で２０分間インキュベートした後、ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）を加えてトロンビンを不活性化して、この混合液を第ＸＩＩＩａ因子として使用した（Ｔａｋａｇｉ，Ａｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。ｒＦｎｂＡ内にある反応性グルタミン残基の第ＸＩＩＩａ因子触媒による標識は、１〜２ｍｇのｒＦｎｂＡを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＣａＣ１２の緩衝液中で、２．５ｍＭのダンシルカダベリンおよび第ＸＩＩＩａ因子（３０μｇ／ｍｌ）とともに、３７℃で４時間または１８時間インキュベートして実施した。第ＸＩＩＩａ因子反応性リジン残基の標識は、１〜２ｍｇのｒＦｎｂＡを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、１５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＣａＣ１２の緩衝液中で、２ｍＭのダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶおよび第ＸＩＩＩａ因子（３０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で４時間または１８時間インキュベートして実施した。いずれの場合でも、反応混合液の全容量は０．３ｍｌであった。保温時間の最後に、７％ＴＣＡでタンパク質を沈殿させ、遠心分離（１４，０００×ｇで５分間）によって回収し、未処理のダンシルカダベリンを除去するために１ｍｌのエタノール：エーテル（１：１容量／容量）で、または、未処理のダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブを除去するために、１％Ｎ−メチルモルフォリンおよび５％Ｈ２Ｏを含む１ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで、沈殿物を反復（８回）抽出した（Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｖｅｌａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【００８１】
ダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶで標識されたｒＦｎｂＡのトロンビンによるフラグメント化。ダンシルカダベリンまたはダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶで修飾されたｒＦｎｂＡのタンパク質分解によるフラグメント化を、トロンビン（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。未処理のダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブを除去した後、修飾されたｒＦｎｂＡの沈殿物を５ｍＭのＣａＣ１２を含む０．５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた。修飾されたｒＦｎｂＡをトロンビンとともに、１：２００（ｗ／ｗ）の酵素／基質比で２５℃で１時間インキュベートして、タンパク質限定分解を行った。２％ＳＤＳ存在下において、９５℃で加熱して反応を停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った。
【００８２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。ダンシルカダベリンまたはダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶで修飾されたｒＦｎｂＡ調製物、およびそれらのトロンビン生成フラグメントを、既製の４〜２０％勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。本研究におけるＳＤＳポリアクリルアミドゲルはすべて、紫外光線下で試験した後、クーマシーブリリアントブルーＲ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した。
【００８３】
ダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶで標識されたｒＦｎｂＡの分解。ダンシルカダベリンで修飾されたｒＦｎｂＡの酵素的加水分解を、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｖ−８）プロテアーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）およびＬ−（トシルアミド２−フェニル）エチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）によって処理して行った。ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ修飾されたｒＦｎｂＡの加水分解は、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼのみを用いて行った。ＴＣＡ沈殿および抽出後、修飾されたｒＦｎｂＡの沈殿物を、トリプシンで切断するためには０．３ｍｌのＴＢＳ（ｐＨ７．４）に、または、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼで切断するためには０．３ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．８）に溶解した。修飾されたｒＦｎｂＡを、トリプシンまたはＧｌｕ−Ｃプロテアーゼとともに、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素／基質比で３７℃で１６時間インキュベートして酵素切断を実施した。この反応混合液にさらなる量のトリプシンまたはＧｌｕ−Ｃプロテアーゼを加えて、最終の酵素／基質比を１：１０（ｗ／ｗ）とし、さらに３７℃で８時間分解を継続させた。この分解混合液を、０．２％のトリフルオロ酢酸で１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈し、１４，０００×ｇで５分間遠心分離して、上清に対して逆相ＨＰＬＣを行った。
【００８４】
ダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶで標識されたペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分離。ダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶで標識されたペプチドを、０．１％のトリフルオロ酢酸中のアセトニトリルによる勾配溶離によってＡｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００  Ｃ８カラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  Ｌａｂｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上で分離した。分離は、ＰｒｏＳｔａｒ蛍光検出装置（Ｖａｒｉａｎ，Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）を備えたＤｙｎａｍａｘ  ＨＰＬＣ装置（ｓｔａｔｉｏｎ）を用いて実施した。ペプチドを、アセトニトリルの０〜５０％の直線的勾配で流速０．５ｍｌ／分で９０分間にわたり溶離させた。２１０ｎｍにおける吸光度、および３５０ｎｍで励起したときの５５０ｎｍにおける蛍光を観測してペプチドの溶離を検出した。この蛍光トレーサーのピークを回収して、より小さな容量（５０〜２００μｌ）に濃縮した後、同じカラムに再注入した。溶離の第２回目を、アセトニトリルの１０〜２０％または２０〜３５％の直線的勾配を用いて流速０．５ｍｌ／分で６０分間隔にわたって行った。単離されたダンシルカダベリンまたはダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶによって標識されたペプチドに質量分析およびＮＨ２末端配列の解析を行った。
【００８５】
配列解析。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ４９０配列解析装置を用いて、ＮＨ２末端配列の解析を行った。また、選択されたサンプルを、Ｍ−Ｓｃａｎ  Ｉｎｃ．のサービス解析にも供した。これらのサンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ４７７Ａ配列解析装置を用いて解析した。最高１８サイクルまで配列決定し、単離されたペプチドのＮＨ２末端を決定した。
【００８６】
ペプチドの分子量の理論計算。既知のブドウ球菌ｒＦｎｂＡの一次配列から、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  Ｖ１．２５ソフトウエアを用いて、トリプシンおよびＧｌｕ−Ｃプロテイナーゼによって生じたペプチドの分子量の計算を行った。ダンシルカダベリン（３３５．５０Ｄａ）またはダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ（９３２．００Ｄａ）による修飾がペプチドの質量に対して与える効果を、プローブの分子量を加えて計算した。各ε−（γ−グルタミル）リジンのイソペプチド結合の形成は、１個のアンモニア（１７．０４Ｄａ）を放出を伴うため、それに従って最終的な分子量値を調整した。
【００８７】
質量スペクトル解析。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ  （Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、単離されたペプチドの分子量の決定を行った。３３７ｎｍでレーザー脱離（Ｎ２レーザー）によって形成されたイオンを、反射方式における２０ｋＶの加圧電圧にして記録した。通常、２００個の単一のスペクトルを、その単一／ノイズ比を向上させるために蓄積して、質量分析計に同梱されていたＤａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅソフトウエアを用いて解析した。α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を紫外光吸着基質として用いた。７０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中１０ｍｇ／ｍｌの基質化合物溶液の１μｌを、１μｌのペプチド溶液（５〜１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）と混合した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのため、１μｌのこの混合液をステンレス鋼のサンプル標的の上にスポットして、室温で乾燥させた。以下の外部標準を用いて質量スペクトルを較正した：ウシ血清アルブミン、ヒトＧｌｕ１−フィブリノペプチドＢ、ヒトアンギオテンシンＩ、および合成ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ブラジキニン。質量の精度は０．１％の範囲内である。
【００８８】
（実施例１）
（第ＸＩＩＩａ因子によるダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶのｒＦｎｂＡへの取り込みと、プローブ修飾されたタンパク質のトロンビンによるフラグメント化）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５由来のフィブロネクチン結合タンパク質Ａは、反応性のＧｌｎおよびＬｙｓの両残基を含む、凝固第ＸＩＩＩａ因子に対する二機能性基質として働く（Ｍａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）ことが報告されている。反応性のＧｌｎおよびＬｙｓ残基のＦｎｂＡ内での位置を評価するため、第ＸＩＩＩａ因子の触媒作用によって、アミン供与体（ダンシルカダベリン）またはアミン受容体（ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ）の蛍光プローブをｒＦｎｂＡに取り込ませた。反応を４時間または８時間実施した後、未反応のプローブを除去して、トロンビンにより蛍光トレーサー標識ｒＦｎｂＡのフラグメント化を行った。トロンビン攻撃に対して感受性である、ＦｎｂＡ内にある単一のＡｒｇ２０２−Ｇｌｙ２０３ペプチド結合が存在することによって、ｒＦｎｂＡのＮ末端およびＣ末端の部位に相当する、理論的に計算されたそれぞれの分子量が２２ｋＤａおよび７０．７ｋＤａである２つのフラグメントの生成が可能になる。ｒＦｎｂＡのトロンビン媒介性切断の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、その後、クーマシーブリリアントブルー染色の前にＵＶ光下でゲルを調べることによって評価した（図１）。ダンシルカダベリンまたはダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶによって修飾されたｒＦｎｂＡをトロンビンとインキュベートしたところ、２つの別々のフラグメントが出現し、このことは、１つのペプチド結合を加水分解したことと整合した。トロンビンによって生じた低分子量および高分子量のフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動度は、２２ｋＤａおよび７０．７ｋＤａのフラグメントについて予想されたものよりもやや低かった。しかし、この観察結果は、１２０ｋＤａおよび２０３ｋＤａの標準の中間で移動する親ｒＦｎｂＡ（未修飾のもの、および蛍光プローブ修飾されたものの両方）に対応するバンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での全体的に低い移動度と整合している。質量スペクトル解析を用いてｒＦｎｂＡについて得られた分子量は、一次配列から算定された値（９２．６５６ｋＤａ）に非常に近似しており、したがって、ｒＦｎｂＡおよびそのフラグメントがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で異常に低い移動度になることが示唆された。
【００８９】
第ＸＩＩＩａ因子によって４時間触媒された、ダンシルカダベリンによるｒＦｎｂＡの修飾は、単量体ｒＦｎｂＡに相当するバンドが蛍光を発する結果をもたらした（図１Ａおよび図１Ｃ、レーン１）。トロンビンによって生じた、ダンシルカダベリン修飾されたｒＦｎｂＡの切断、およびその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる反応混合物の解析によって、蛍光が低分子質量フラグメントの中にほぼ完全に局在していることが明らかになった。顕著な高分子量フラグメントに相当するバンドは、総ダンシルカダベリン蛍光の僅かな部分しか提供されなかった（図１Ａおよび図１Ｃ、レーン２）。同様の結果が、ダンシルカダベリンでさらに長い時間、すなわち１８時間にわたって修飾されたｒＦｎｂＡでも観察された（図１Ａおよび図１Ｃ、レーン３および４）。ｒＦｎｂＡをダンシルカダベリンおよび第ＸＩＩＩａ因子とより長い時間インキュベートしても、ｒＦｎｂＡ二量体に相当する副次的な高分子量バンドが出現する結果となった（図１Ａおよび図１Ｃ、レーン３）。ｒＦｎｂＡを第ＸＩＩＩａ因子およびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶペプチド存在下で４時間または１８時間インキュベートすると、単量体のｒＦｎｂＡにプローブが取り込まれるとともに、二量体および高分子量ポリマーに相当するバンドが出現する結果となった（図１Ｂおよび図１Ｄ）。それにもかかわらず、用いられた実験条件下では、タンパク質の架橋がほぼ完全に阻害され、また、ダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブの取り込みが主にｒＦｎｂＡの単量体型で起きることが明らかである。ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ修飾されたｒＦｎｂＡをトロンビン触媒によって切断すると、高分子量フラグメントだけが、ＵＶ照射の際に蛍光を呈した（図１Ｂおよび図１Ｄ、レーン２および４）。このように、タンパク質限定分解データによって、主要なグルタミン受容体部位およびリジン供与体部位が、ｒＦｎｂＡ分子のポリペプチド鎖の中で空間的に分離されていて、それぞれＮ末端領域およびＣ末端領域に位置していることが明らかになった。
【００９０】
（実施例２）
（第ＸＩＩＩａ因子の架橋反応に関与する、ｒＦｎｂＡのグルタミン受容体部位の同定）
ｒＦｎｂＡの内部における特異的反応性Ｇｌｎ残基を同定するために、ｒＦｎｂＡを、第ＸＩＩＩａ因子およびモル過剰の蛍光プローブダンシルカダベリン存在下で４時間および１８時間インキュベートした。ダンシルカダベリン標識反応の後、修飾されたｒＦｎｂＡ調製物を未反応のプローブから洗い出して、トリプシンで分解した。第ＸＩＩＩａ因子触媒によるダンシルカダベリンのｒＦｎｂＡへの取り込みを４時間行って産生されたトリプシンペプチドをＨＰＬＣで分離することにより、２１０ｎｍにおける複雑なプロフィールが明らかになった（図２Ａ）。これに対し、同じサンプルで５５０ｎｍにおける蛍光を観察したところ、約４４分間の保持時間では、たった１つの主要ピークが検出された（図２Ｂ、ピーク１）。第ＸＩＩＩａ因子およびダンシルカダベリン存在下でのｒＦｎｂＡのインキュベート時間を４時間から１８時間に延長して、その後トリプシンで分解すると、２１０ｎｍにおける溶離プロフィール（図２Ｃ）にも、主要な蛍光ピークの強度および保持時間（図２Ｄ、ピーク１）にも影響を与えることはなかった。同時に、ダンシルカダベリンがｒＦｎｂＡに取り込まれる時間を延長すると、２および３として図示されている２つの副次的な蛍光ピーク（図２Ｄ）の強度が増した。ピーク１として（図２Ｂ）、およびピーク１、２、３（図２Ｄ）として標識されている、蛍光トレーサーで修飾されたペプチドを回収し、Ｃ８カラムに２回通した後、ＮＨ２末端配列および質量スペクトルの解析によって特徴を調べた（表２）。主要な蛍光ピーク１に由来するペプチドの配列解析によって、ピーク１は、ｒＦｎｂＡのＮＨ２末端部位に由来する１３マーのフラグメントに対応することが明らかにされた。エドマン分解の過程で、１２サイクル目には残基を検出することができなかったが、次の１３サイクル目では正しい配列決定に戻った。１２番目の残基は、通常認識されるアミノ酸をエドマン処理で得ることができなかったが、Ｇｌｎ１０３に相当し、このことから、このＧｌｎ１０３が修飾されていることを示唆している。このペプチドに存在する２つの別のＧｌｎ残基（Ｇｌｎ９５およびＧｌｎ９７）は、ＰＴＨ（フェニルチオヒダントイン）誘導体として、それぞれ４サイクル目と６サイクル目に遊離した。トリプシン１３マーペプチド（ピーク１）について得られた配列解析データは、さらに、質量スペクトル解析の結果によって裏付けられている。このペプチドの測定された質量はｍ／ｚ１７８３．８３を示し、１個のダンシルカダベリン修飾を含むペプチドの計算上の質量である１７８３．０７に対応する（表２）。図２Ｄにおける副次的な蛍光ピーク３に由来するトリプシンペプチドの配列および質量スペクトルの解析によって、このペプチドもまた、ＦｎｂＡ分子のＮＨ２末端領域に由来していることが示された。配列を決定する際、１サイクル目には１つのＧｌｎ残基（Ｇｌｎ１０５）が検出されなかったが、表２に示す残基のＰＨＴ誘導体の記録は、それ以降のサイクルで再開されたことから、Ｇｌｎ１０５がもう一つの受容体部位として同定され得ることを示唆している。観察されたこのペプチドの分子量は、１つのダンシルカダベリン修飾部位をもつ理論値と一致していた（表２）。ピーク２の物質は、さらにＣ８逆相カラムに通しても、ＮＨ２末端配列決定を行えるほど均質ではなかったため、エドマン分解によって明確には同定できなかった。
【００９１】
予測されたトリプシンペプチドのいくつかは、どちらかといえば大きかった（特に、このタンパク質のＣＯＯＨ末端部位に由来するペプチド）ため、Ｇｌｕ−Ｃプロテイナーゼを用いて、ダンシルカダベリン修飾されたｒＦｎｂＡの分解も行ったところ、より小さく扱いやすいペプチドが生成された。「材料と方法」に記載されているように、ｒＦｎｂＡおよび第ＸＩＩＩａ因子をダンシルカダベリン存在下でインキュベートし、Ｇｌｕ−Ｃプロテイナーゼで分解した。ｒＦｎｂＡを４時間にわたってダンシルカダベリンで修飾した後では、Ｇｌｕ−Ｃプロテイナーゼ分解混合物において４６分間の保持時間をもつ単一の蛍光ピークが繰り返し観測された（図３Ｂ、ピーク１）。延長して１８時間ダンシルカダベリンをｒＦｎｂＡに取り込ませた後でＧｌｕ−Ｃ分解すると、同一の主要ピーク１と、２、３、４、５、６、および７と名づけられた複数の副次的なピークが生じた（図３Ｄ）。表２に示すように、４つのペプチドがＧｌｕ−Ｃプロテイナーゼ分解混合物から回収され、明確に同定された。ピーク１および７のペプチドは、トリプシン分解で同定されたものと同じ反応性のＧｌｎ１０３残基およびＧｌｎ１０５残基を含んでいた。どちらのペプチドも、９３から１０７までの配列に相当し、ダンシルカダベリン修飾の数が異なっているだけであった。主要蛍光ピーク１由来のペプチドは、修飾されたＧｌｎ１０３残基を１つ含むが、ピーク７のペプチドでは、Ｇｌｎ１０３およびＧｌｎ１０５の両方が修飾されている。Ｇｌｕ−Ｃプロテイナーゼ分解も、ｒＦｎｂＡのＣＯＯＨ末端部位に由来する２つの蛍光性ペプチドを生じさせた。ピーク４および６のペプチドは、それぞれ修飾されたＧｌｎ８３０およびＧｌｎ７８３の残基を含んでいた（表２）。
【００９２】
いくつか別々のダンシルカダベリン標識実験を４時間および１８時間にわたって行ない、その後トリプシンまたはＧｌｕ−Ｃプロテイナーゼで分解した解析により、Ｇｌｎ１０３が、ｒＦｎｂＡにおいて第ＸＩＩＩａ因子に対する主要なアミン受容体部位として機能していることを示唆した。Ｇｌｎ１０３部位の高い反応性が、トリプシンペプチドＥＴＴＱＳＱＤＮＳＧＤＱ１０３Ｒ（図２Ｂ）またはＧｌｕ−Ｃプロテイナーゼによって生じるＴＴＱＳＱＤＮＳＧＤＱ１０３ＲＱＶＤペプチド（図３Ｂ）のいずれかに相当する単一の主要蛍光ピークの起源に関与している。Ｇｌｎ１０３の修飾は、反応の４時間後（またはそれよりも早く）に完全に完了した。なぜなら、第ＸＩＩＩａ因子とさらにインキュベートしてもピーク１の強度に影響しなかったからである（図２Ｄおよび３Ｄ）。これに対し、トリプシン分解混合物（ピーク２、３）およびＧｌｕ−Ｃプロテイナーゼ分解混合物（ピーク４、６、および７）から得られたさらに別の蛍光性ペプチドの回収は、第ＸＩＩＩａ因子による処理を延長した場合にだけ得られた。これらの蛍光ピークの強度は、主要ピーク１の強度と比較すると、それでもなお顕著に低く、このことは、１０５位、７８３位、および８３０位の反応性Ｇｌｎ残基の画分だけが修飾を受けたことを示している。このように、ダンシルカダベリンによる修飾実験は、ｒＦｎｂＡが１つの主要な（Ｇｌｎ１０３）、また３つの副次的な（Ｇｌｎ１０５、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０）第ＸＩＩＩａ因子反応性アミン受容体部位を含むことを明らかにした。
【００９３】
（実施例３）
（第ＸＩＩＩａ因子の架橋反応に関与する、ｒＦｎｂＡのリジン供与体部位の同定）
第ＸＩＩＩａ因子媒介によるｒＦｎｂＡのリジン側鎖の滴定を、フィブロネクチンのＮ末端配列を模倣したダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶペプチドを用いて行った。第ＸＩＩＩａ因子およびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブ存在下でこのｒＦｎｂＡを４時間インキュベートした後、Ｇｌｕ−Ｃプロテイナーゼで分解した。Ｇｌｕ−Ｃプロテイナーゼにより生成されたペプチドをＨＰＬＣで分離させると、２１０ｎｍで検出される複数のピークとわずかに数個の蛍光ピークが約６０分間の間に溶離されることが再び明らかになった（図４Ａおよび図４Ｂ）。しかし、アスタリスクで示されたピーク（図４Ｂ）以外には、プローブ修飾されたペプチドの標識の程度ひいてはその精製度が、必要な配列解析を行うには十分でなかった。ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ修飾ペプチドの回収を向上させるために、ｒＦｎｂＡを第ＸＩＩＩａ因子およびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ修飾ペプチドとともに１８時間インキュベートして、「材料と方法」の項に記載されているようにＧｌｕ−Ｃプロテイナーゼで分解した。この分解混合物をＨＰＬＣで分離すると、全部で７つの蛍光ピークが生じた（図４Ｄ）。蛍光ピーク１〜７の溶離プロフィール（図４Ｄ）は、ｒＦｎｂＡ修飾の４時間後に生成された分解混合物の溶離プロフィール（図４Ｂ）に類似しており、より標識程度の高い同一のペプチドが産生されたことを示していた。これらの蛍光ピーク（図４Ｂのアスタリスクで示されたピーク、および図４Ｄのピーク１〜７）のそれぞれを、逆相Ｃ８カラムでさらに精製してから、質量スペクトルおよび配列解析により評価を行った。行われた解析の結果を表３にまとめた。全部で６つの修飾されたペプチドを、質量スペクトルおよび配列の解析を用いて明確に同定した。ピーク４、５、および７の画分について信頼性の高い配列が得られ、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ６２０、およびＬｙｓ５０３が、明確にプローブ修飾された残基であると同定された（表３）。エドマン分解の過程で、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ修飾されたＬｙｓ残基は、通常のＰＴＨ誘導体としては認識されないため、検出することができない。ピーク４を配列決定したところ、２サイクル目でこの結果が観察されたが、一方、１サイクル目ではＶａｌ残基がＰＴＨ誘導体として遊離した。次の３サイクル目では配列が回復し、中断することなく続いた。９サイクル目で得られたＬｙｓ残基は、修飾されたリジン（Ｌｙｓ１５７）が２サイクル目に存在したという結論をさらに補強した。ピーク５および７由来のペプチド解析によって、それぞれ３サイクル目と２サイクル目で配列決定の中断が起きることが明らかになった。ここでも、これらのデータは、Ｌｙｓ６２０（ペプチド５の３サイクル目）およびＬｙｓ５０３（ペプチド７の２サイクル目）が第ＸＩＩＩａ因子によって修飾されたことを示唆している。表３から分かるように、ピーク４、５、および７に対して得られたＮＨ２末端配列解析の結果は、測定されたｍ／ｚ値と整合している。これらのプローブ修飾された画分のそれぞれは、単一のダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ修飾を含む各ペプチドの算定分子量と正確に一致したｍ／ｚ値を示した（表３）。蛍光ピーク１および２のそれぞれは、本質的には等量で存在する２つの標識ペプチドと非標識ペプチドの混合物に相当した。ＦｎｂＡの既知の一次配列、および予測切断部位のマップを利用して、この２重配列の確実な読み取りを行った。同様に、蛍光ピーク６について得られた配列の読み取りも、ＦｎｂＡのアミノ酸配列と、Ｇｌｕ−Ｃプロテイナーゼによって触媒される予測切断部位の位置とを知ることによって行われた。単離された画分の分析によって、いくつかのダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ標識ペプチドが、ポリペプチド鎖の同一の領域に由来することが明らかになった。Ａｓｐ１６０−Ｖａｌ１６１のペプチド結合をＧｌｕ−Ｃプロテイナーゼによって部分的に加水分解したところ、プローブ修飾されたペプチド１（フラグメント１５６〜１６０）のより短いもの、およびより長いペプチド４（フラグメント１５６〜１６８）が得られた。同様に、Ａｓｐ６２９−Ｈｉｓ６３０のペプチド結合を不完全加水分解したところ、ペプチド５（フラグメント６１８〜６２９）およびペプチド６（フラグメント６１８〜６３４）が生成される結果となった（表３）。このように、ここでもＬｙｓ１５７およびＬｙｓ６２０は、それぞれ蛍光ピーク１および６におけるプローブ修飾された残基であると同定された。Ｌｙｓ７６２の第ＸＩＩＩａ因子触媒による修飾が、蛍光ピーク２に相当する画分の配列決定によって実証された。画分１、２、および６の質量スペクトル解析によって、ＮＨ２末端配列決定の結果を裏付ける別の証拠が提供された。ｍ／ｚが１４３２．３７、１８２０．２２、および２６１４．８３における質量ピークは、それぞれ画分１、２、および６に存在した。蛍光ピーク１、２、および６について得られた測定分子量は、各単一ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ修飾による理論値と一致していた（表３）。アスタリスクで示された蛍光ピーク（図４Ｂ）は、２つのペプチドの混合物に相当する。ＦｎｂＡの一次配列を知ることによって、また、この画分の読み取りを行った。非標識ペプチドをフラグメント２６６〜２８０と同定した（図５）一方で、トレーサーを含むペプチドは、図４Ｄ上のピーク５と一致し、単一プローブ修飾Ｌｙｓ６２０を含んでいた（表３）。ピーク３に対応する画分（図４Ｄ）は、それらの配列がエドマン分解では分析できなかった、いくつかのペプチドの混合物と考えられる。このように、ｒＦｎｂＡを第ＸＩＩＩａ因子によって、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブ存在下で処理すると、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、およびＬｙｓ７６２の特異的修飾をもたらし、これらの残基がアミン供与体部位として働くことを示唆している。
【００９４】
（実施例４）
（同定された第ＸＩＩＩａ因子反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基の部位特異的変異誘発法を用いた置換）
同定された反応性のＧｌｎ残基およびＬｙｓ残基の置換を、各変異を別々に導入して行った。この目的ため、所望のコード領域にわたる合成オリゴヌクレオチド（ＧｌｎからＡｌａ、またはＬｙｓからＡｌａへの変化を含む）をｒＦｎｂＡ遺伝子のＰＣＲ増幅に利用した。この２５２０ｂｐの遺伝子の特異的なサブクローン（例えば、Ｇｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、およびＬｙｓ１５７にわたるサブクローン、ならびにＧｌｎ５０３、Ｌｙｓ６２０、Ｌｙｓ７６２、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０にわたるサブクローン）を利用することによって、８個全部の変異を含む改変型遺伝子を「モジュール毎（ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ）」に再構築することが簡便化された。いずれの場合においても、再構築された遺伝子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターにサブクローニングされたら、変異ｒＦｎｂＡ遺伝子の配列を決定して、所望の変異が存在することを確認した。例えば、合成オリゴヌクレオチド
【００９５】
【化１】
2010279391.tif 000004
（およびその相補配列）を用いて、野生型ｆｎｂＡ遺伝子の５’側のほぼ半分に相当するヌクレオチドを含むプラスミドｐＬＰ１１４３にアニールさせて、ＦｎｂＡのＧｌｎ１０３残基をＡｌａに変えた。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用いてこのプライマーを伸長させ、ｆｎｂＡ遺伝子の改変された領域（Ｇｌｎ１０３Ａｌａ）の多数の非メチル化コピーを産生した。メチル化されている鋳型ＤＮＡをＤｐｎ１で分解した後、上記反応産物で大腸菌を形質転換すると、元のメチル化（野生型）コピーの回収率が低下する。次いで、形質転換混合物から回収したプラスミドを、クローニングされたｆｎｂＡ領域の一部にわたって配列決定して、プラスミドｆｎｂＡ１０３Ａにおける本来のコドンであるＧｌｎ（ＣＣＡ）がアラニンに置換されているコドンＧＣＡ（下線部）を有する以下の所望の配列が存在することを確認した：
【００９６】
【化２】
2010279391.tif 000005
全長ｆｎｂＡのコード配列を得るため、Ｎｃｏ１およびＫｐｎ１を用いて、プラスミドｆｎｂＡ１０３Ａに含まれている変異型Ｇｌｎ１０３Ａｌａ  ｆｎｂＡ遺伝子の５’側半分を切り出した。そして、得られたＤＮＡフラグメントをｐＬＰ１１２５（全長の野生型ｆｎｂＡを含む）のＮｃｏ１−Ｋｐｎ１部位にクローニングした。このライゲーションの産物（ｐＬＰ１１４９）は、全部で２．５１７ｋｂのｆｎｂＡ遺伝子のＤＮＡ配列解析によれば、全長ｆｎｂＡ遺伝子の中にＧｌｎ１０３Ａｌａ変異を含んでいる。
【００９７】
同様にして、Ｌｙｓに対するコドン（ＡＡＡ）がＡｌａに対するコドン（ＧＣＡ、下線部）に置換されている合成オリゴヌクレオチド
【００９８】
【化３】
2010279391.tif 000006
を用いて野生型ＦｎｂＡのＬｙｓ７６２をＡｌａによって置換させた。このプライマーを用いて、野生型ｆｎｂＡ遺伝子の３’側のほぼ半分に相当するヌクレオチドを含むプラスミドｐＬＰ１１４４にアニールした。プライマー伸長および大腸菌宿主の形質転換の後、上記したように、プラスミドｆｎｂＡ７６２ＡにおいてＬｙｓコドン（ＡＡＡ）が、Ａｌａに対するコドン（ＧＣＡ、下線部）で置換されていることを示すＤＮＡ配列解析によって変異領域の存在を確認した。プラスミドｆｎｂＡ７６２ＡをＳｐｅ１およびＮｏｔ１で分解し、同じ酵素で切断したｐＬＰ１１２５の中に得られたフラグメントをライゲーションして、プラスミドｆｎｂＡ７６２Ａに含まれているＬｙｓ７６２Ａｌａ変異を全長ｆｎｂＡに導入した。ｆｎｂＡ遺伝子全部のＤＮＡ配列決定によれば、得られた組み換えプラスミドｐＬＰ１１５０は、Ｌｙｓ７６２Ａｌａ変異を含んでいる。
【００９９】
Ｇｌｎ１０３Ａｌａ変異（イタリック体）に加えてＡｌａ１０５に対するコドン（ＧＣＡ、下線部）を含む合成オリゴヌクレオチド配列：
【０１００】
【化４】
2010279391.tif 000007
を用いて、二重変異
【０１０１】
【化５】
2010279391.tif 000008
（１０３位および１０５位のＧｌｎがＡｌａで置換されている）を構築した。このプライマーをｐＬＰ１１４９（ｆｎｂＡＱ１０３Ａ）にアニールし、この変異を含む遺伝子部分の全域にわたって伸長産物（プラスミド５’１０３Ａ＋５’１０５Ａ）の配列を決定した。そして、この二重変異を含むＮｃｏ１，Ｋｐｎ１フラグメントを用いて、ｐＬＰ１１２５の野生型配列を置換してｐＬＰ１１５５を産生した。ｐＬＰ１１５５に含まれる全ｆｎｂＡ遺伝子を配列決定して、二重変異が存在することを確認した。鋳型であるプラスミドｐＬＰ１１５０を用いたＤＮＡ合成を開始させるためにオリゴヌクレオチド
【０１０２】
【化６】
2010279391.tif 000009
を用いて、この二重変異Ｌｙｓ６２０Ａｌａ，Ｌｙｓ７６２Ａｌａを構築した。このオリゴヌクレオチドは、野生型Ｌｙｓ６２０コドンの代わりにＡｌａ６２０（下線部）に対するＧＣＡコドンを含んでいた。ＤＮＡ配列決定したところによれば、得られたプラスミドは、ｐＬＰ１１５０本来のＬｙｓ７６２Ａｌａ変異に加えてＬｙｓ６２０Ａｌａ変異を含んでいた。野生型配列を置換している二重変異体のＳｐｅ１，Ｎｏｔ１  ＤＮＡフラグメントを用いて、ｐＬＰ１１２５に二重変異領域をサブクローニングした。得られたプラスミドｐＬＰ１１５６を全ｆｎｂＡ遺伝子にわたって配列決定して、Ｌｙｓ６２０Ａｌａ，Ｌｙｓ７６２Ａｌａ変異の存在を確認した。すべての変異が、ｆｎｂＡ遺伝子を２つの部分に分けたものに構築されるまでこの処理を繰り返す。上記した産物クローニング処理法によって各セットの変異を組み合わせると、８個すべての変異を含むｆｎｂＡ遺伝子が得られる。
【０１０３】
（実施例５）
（ｒＦｎｂＡ変異体の架橋特性の評価）
第ＸＩＩＩａ因子に対する変異型ｒＦｎｂＡの反応性の低下が、さまざまな方法を用いて示される。蛍光性低分子プローブであるダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶを、変異型ｒＦｎｂＡのトランスグルタミナーゼ反応性を評価するために利用する。第ＸＩＩＩａ因子による上記プローブの変異型ｒＦｎｂＡへの取り込みがないことは、反応性Ｇｌｎ残基およびＬｙｓ残基が存在しないことを示す。第ＸＩＩＩａ因子に対する変異型ｒＦｎｂＡの反応性が低下または消失していることの実証は、第ＸＩＩＩａ因子に触媒されるヒトフィブロネクチンおよびフィブリンへの架橋を受ける能力を評価することによっても行われる。第ＸＩＩＩａ因子触媒による蛍光プローブの取り込み、およびフィブロネクチンおよびフィブリンへとの架橋反応も、野生型ｒＦｎｂＡを陽性対照として行われる。
【０１０４】
以下の例では、部位特異的変異誘発法を用いて、同定された反応性のＧｌｎ部位およびＬｙｓ部位をＡｌａ残基で置換し、これらの変異の効果を、ＦｎｂＡ−フィブリンおよびＦｎｂＡ−フィブロネクチンの架橋反応で評価した。単一残基ＦｎｂＡ変異体では、主要な反応性Ｇｌｎ１０３部位をＡｌａ残基で置換し、１ＱＦｎｂＡと名づけた。ＦｎｂＡ変異体において、同定されたＧｌｎ１０３、１０５、７８３、８３０、およびＬｙｓ１５７、５０３、６２０、７６２の部位のすべてをＡｌａ残基で置換して、４Ｑ４ＫＦｎｂＡと名づけた。１ＱＦｎｂＡ変異体および４Ｑ４ＫＦｎｂＡ変異体の第ＸＩＩＩａ因子反応性を、野生型ＦｎｂＡレセプターのそれと比較し、その結果を、ブドウ球菌の接着およびコロニー形成における宿主のトランスグルタミナーゼの役割に関して検討する。
【０１０５】
（実施例６）
（１ＱＦｎｂＡ変異体の生成（Ｑ１０３Ａ変異））
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５由来の染色体ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅によって、ブドウ球菌ＦｎｂＡのＮＨ２末端Ａ領域（残基１〜５１１）をコードするｆｎｂＡ遺伝子の１５３３領域を産生した。以下の
【０１０６】
【化７】
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のＰＣＲプライマーを用いて増幅を行った。順方向プライマーは、成熟配列のコード領域の直前にＮｃｏ１制限酵素部位（下線部）およびＡＴＧ開始コドンを取り込んでいた。逆方向プライマーは、コードセグメントの直後にＴＡＡ終止コドン、その後にＢａｍＨＩ部位（下線部）を含んでいた。増幅されたＤＮＡフラグメントを単離し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で処理し、その後ｐＥＴ−２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にライゲーションした。ｆｎｂＡ遺伝子の変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行った。変異体ＤＮＡ鎖を合成するために、本発明者らは、１５３３ｂｐのｆｎｂＡ遺伝子フラグメントを含むｐＥＴ−２８ａベクターを鋳型として用いた。合成オリゴヌクレオチド
【０１０７】
【化８】
2010279391.tif 000011
およびその相補鎖を、変異原プライマーとして利用した。変異原プライマーは、１０３位で所望のＧｌｎ→Ａｌａ変異を生成するためにＣＡＡに代わってＧＣＡコドンを含む。温度サイクリング、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー伸長、およびエンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）による（ヘミ）メチル化された鋳型の分解を、製造業者の指示に従って行った。変異したＤＮＡを、ニック修復させるために形質転換受容性ＸＬ  １０−Ｇｏｌｄ大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中に形質転換した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素のＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで分解して、ＣＡＡ→ＧＣＡ変異を含むｆｎｂＡ遺伝子の６８０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、野生型ｆｎｂＡ遺伝子（ＦｎｂＡ残基１〜８３９）を含むｐＥＴ−２８ａベクターの中にサブクローニングした（Ｍａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。制限酵素のＮｃｏＩおよびＫｐｎＩを用いて、ｐＥＴ−２８ａ／ｆｎｂＡ遺伝子ベクターの中に変異した６８０ｂｐのＤＮＡフラグメントをライゲーションした結果、変異型ＦｎｂＡ（Ｑ１０３Ａ  ＦｎｂＡ）をコードする２５１７ｂｐのｆｎｂＡ遺伝子の回復が得られた。タンパク質発現のため、得られたｐＥＴ−２８ａプラスミド（Ｑ１０３Ａ  ＦｎｂＡ変異体）を、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に形質転換した。所望のＱ１０３Ａ変異が存在することを、ｆｎｂＡ遺伝子の変異領域を配列決定して確認した。
【０１０８】
（実施例７）
（４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体の作出（Ｇｌｎ１０３Ａｌａ、Ｇｌｎ１０５Ａｌａ、Ｇｌｎ７８３Ａｌａ、Ｇｌｎ８３０Ａｌａ、Ｌｙｓ１５７Ａｌａ、Ｌｙｓ５０３Ａｌａ、Ｌｙｓ６２０Ａｌａ、およびＬｙｓ７６２Ａｌａ変異））
Ｋ７６２Ａ変異の導入。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＡＴＣＣ４９５２５由来の染色体ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅によって、ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＦｎｂＡのＣＯＯＨ末端領域（残基５１２〜８３９）をコードするｆｎｂＡ遺伝子の領域を産生した。以下の
【０１０９】
【化９】
2010279391.tif 000012
のＰＣＲプライマーを用いて増幅を行った。順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、それぞれＮｃｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位（下線部）を取り込んでいた。増幅されたＤＮＡフラグメントを単離し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で処理して、ｐＥＴ−２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にライゲーションした。ｆｎｂＡ遺伝子の９８４ｂｐのフラグメントを含むｐＥＴ−２８ａベクターを鋳型として、そして合成オリゴヌクレオチド
【０１１０】
【化１０】
2010279391.tif 000013
およびその相補鎖を変異原プライマーとして用いて、変異ＤＮＡ鎖の合成を行った。変異原プライマーは、７６２位で所望のＬｙｓ→Ａｌａ変異を作出するためにＡＡＡに代わってＧＣＡコドンを含んでいた。変異したＤＮＡを、形質転換受容性ＸＬ  １０−Ｇｏｌｄ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の中に形質転換した。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断し、６１２ｂｐの変異ＤＮＡフラグメントを、全長の野生型ｆｎｂＡ遺伝子（ＦｎｂＡ残基１〜８３９）を含むｐＥＴ−２８ａベクターの中にサブクローニングした。
【０１１１】
Ｑ１０５Ａ変異およびＫ１５７Ａ変異の導入。単一変異（Ｑ１０３Ａ）および二重変異（Ｑ１０３Ａ、Ｑ１０５Ａ）をそれぞれｆｎｂＡ遺伝子に含むｐＥＴ−２８ａ鋳型を用いて、連続的にＱ１０５Ａ変異およびＫ１５７Ａ変異を生成した。合成オリゴヌクレオチド
【０１１２】
【化１１】
2010279391.tif 000014
およびその相補鎖を、Ｑ１０５Ａ変異の変異原プライマーとして採用し、一方、
【０１１３】
【化１２】
2010279391.tif 000015
およびこの相補鎖を、Ｋ１５７Ａ変異を導入するために利用した。３つ（Ｑ１０３Ａ、Ｑ１０５Ａ、およびＫ１５７Ａ）の変異を含む変異ＤＮＡを形質転換受容性ＤＨ  １０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。得られたプラスミドをＮｃｏＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で切断し、その後ｐＥＴ−２８ａベクターの中にサブクローニングするために６８０ｂｐの変異ＤＮＡフラグメントを単離した。
【０１１４】
Ｋ６２０Ａ変異の導入。単一変異（Ｋ７６２Ａ）をｆｎｂＡ遺伝子に含むｐＥＴ−２８ａ鋳型を用いてＫ６２０Ａ変異を生成した。これは、変異原オリゴヌクレオチド
【０１１５】
【化１３】
2010279391.tif 000016
およびその相補鎖を用いて行われた。２つ（Ｋ６２０ＡおよびＫ７６２Ａ）の変異を含む変異ＤＮＡを形質転換受容性ＤＨ  １０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。得られたプラスミドをＢｓｒＧＩおよびＳｐｅＩ制限酵素で切断し、１１１９ｂｐの変異ＤＮＡフラグメントを単離して、単一のＫ７６２Ａ変異を有するｆｎｂＡ遺伝子を含むｐＥＴ−２８ａベクターの中にサブクローニングした。
【０１１６】
Ｋ５０３Ａ変異の導入。ｆｎｂＡ遺伝子に二重変異（Ｋ６２０Ａ、Ｋ７６２Ａ）を含むｐＥＴ−２８ａ鋳型を用いてＫ５０３Ａ変異を作出した。合成オリゴヌクレオチド
【０１１７】
【化１４】
2010279391.tif 000017
およびその相補鎖を変異原プライマーとして利用した。変異ＤＮＡを形質転換受容性ＤＨ
１０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。得られたプラスミドをＫｐｎＩおよびＳｐｅＩ制限酵素で切断し、Ｋ５０３Ａ変異およびＫ６２０Ａ変異を含む１２５６ｂｐの変異ＤＮＡフラグメントを、引き続きｐＥＴ−２８ａベクターの中にサブクローニングするために単離した。
【０１１８】
Ｑ７８３Ａ変異の導入。ｆｎｂＡ遺伝子に二重変異（Ｋ６２０Ａ、Ｋ７６２Ａ）を含むｐＥＴ−２８ａ鋳型を用いてＱ７８３Ａ変異を生成した。合成オリゴヌクレオチド
【０１１９】
【化１５】
2010279391.tif 000018
およびその相補鎖を変異原プライマーとして利用した。変異ＤＮＡを形質転換受容性ＤＨ
１０Ｂ大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断し、２つ（Ｋ７６２ＡおよびＱ７８３Ａ）の変異を含む６１２ｂｐの変異ＤＮＡフラグメントを、引き続きｐＥＴ−２８ａベクターの中にサブクローニングするために単離した。
【０１２０】
７つの変異（６８０ｂｐ−Ｑ１０３Ａ、Ｑ１０５Ａ、Ｋ１５７Ａ；１２６５ｂｐ−Ｋ５０３Ａ、Ｋ６２０Ａ；および６１２ｂｐ−Ｋ７６２Ａ、Ｑ７８３Ａ）を含む３つのＤＮＡフラグメントを、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断したｐＥＴ−２８ａベクターの中にライゲーションした結果、Ｑ１０３Ａ、Ｑ１０５Ａ、Ｋ１５７Ａ、Ｋ５０３Ａ、Ｋ６２０Ａ、Ｋ７６２Ａ、Ｑ７８３Ａ  ＦｎｂＡ変異体をコードする、２５１６ｂｐのｆｎｂＡ遺伝子の回復が得られた。
【０１２１】
Ｑ８３０Ａ変異の導入。ｆｎｂＡ遺伝子に３つ（Ｋ６２０Ａ、Ｋ７６２ＡおよびＱ７８３Ａ）を含むｐＥＴ−２８ａ鋳型を用いてＱ８３０Ａ変異を作出した。合成オリゴヌクレオチド
【０１２２】
【化１６】
2010279391.tif 000019
およびその相補鎖を変異原プライマーとして利用した。変異ＤＮＡを形質転換受容性ＤＨ
１０Ｂ大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断し、Ｋ７６２Ａ、Ｑ７８３ＡおよびＱ８３０Ａの変異を含む６１２ｂｐの変異ＤＮＡフラグメントを、ｐＥＴ−２８ａベクターの中にサブクローニングするために単離した。この結果、Ｑ１０３Ａ、Ｑ１０５Ａ、Ｋ１５７Ａ、Ｋ５０３Ａ、Ｋ６２０Ａ、Ｋ７６２Ａ、Ｑ７８３Ａ、およびＱ８３０Ａという全部で８個の変異を含むＦｎｂＡをコードするｆｎｂＡ遺伝子の回復が得られた。
【０１２３】
得られたプラスミドＤＮＡを、タンパク質発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に形質転換した。ｐＥＴ−２８ａベクターにサブクローニングする前に特異的変異を含む各生成ＤＮＡフラグメントを配列決定した。回復された変異ｆｎｂＡ遺伝子をもう一度配列決定して、所望の変異が存在すること、および全コード領域の完全性を確認した。
【０１２４】
タンパク質。野生型ＦｎｂＡ、ならびに１Ｑ  ＦｎｂＡ変異体および４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体の発現および精製を、他で記載されたように（Ｍａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）実施した。単離されたＦｎｂＡ調製物を、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌに対して透析し、アリコート化し、そして−２０℃で凍結保存した。
【０１２５】
抗体。既述した通りに、ウサギにおいて抗ｒＦｎｂＡポリクローナル抗体を作製した（Ｍａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。マウスモノクローナル抗フィブリノゲンＡα鎖（Ａα  ５２９〜５３９、クローン１Ｃ２−２）抗体は、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）から購入した。マウスモノクローナル抗フィブロネクチン抗体（クローン２Ｂ６−Ｆ９）は、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。ヤギの抗ウサギおよび抗マウスのＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。
【０１２６】
ペプチドの分子量の理論的推定。Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  Ｖ１．２５ソフトウエア（ＣＳＰＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、ブドウ球菌ｒＦｎｂＡの既知の配列から、Ｇｌｕ−Ｃプロテイナーゼによって生じるペプチドの分子量の計算を行った。ペプチドの分子量に対するダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ（９３０．４４Ｄａ）修飾の効果を、プローブによる質量増加を考慮して計算した。各ε−（γ−グルタミル）リジンのイソペプチド結合は、１個のアンモニア（１７．０３Ｄａ）の遊離を伴うため、それに従って最終分子量値を調整した。
【０１２７】
ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ標識ペプチドの逆相ＨＰＬＣ分離。Ａｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００  Ｃ８カラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  Ｌａｂｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）上で、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルを用いた勾配溶離によってダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ標識ペプチドを分離した。分離は、ＰｒｏＳｔａｒ蛍光検出装置（Ｖａｒｉａｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を装備したＤｙｎａｍａｘ  ＨＰＬＣ装置を用いて実施した。ペプチドを、アセトニトリルの０〜５０％の直線的勾配で流速０．５ｍｌ／分で９０分間にわたり溶離させた。２１０ｎｍにおける吸光度、および３５０ｎｍで励起したときの５５０ｎｍにおける蛍光を観測してペプチドの溶離を検出した。この蛍光トレーサーのピークを回収して、より小さな容量（５０〜２００μｌ）に濃縮した後、同じカラムに再注入した。第２回目の溶離を、アセトニトリルの１０〜２０％または２０〜３５％の直線的勾配を用いて流速０．５ｍｌ／分で６０分間にわたって行った。単離されたダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶによって標識されたペプチドを、質量分析に供した。
【０１２８】
質量スペクトル解析。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ  （Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、単離されたペプチドの分子量の決定を行った。３３７ｎｍでのレーザー脱離（Ｎ２レーザー）によって形成されたイオンを、反射方式における２０ｋＶの加圧電圧にして記録した。通常、２００個の単一のスペクトルを、その単一／ノイズ比を向上させるために蓄積して、Ｄａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅソフトウエアを用いて解析した。α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を基質として用いた。７０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中１０ｍｇ／ｍｌの基質化合物溶液の１μｌを、１μｌのペプチド溶液（５〜１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）と混合した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのため、１μｌのこの混合液をステンレス鋼のサンプル標的の上にスポットして、室温で乾燥させた。ヒトＧｌｕ１−フィブリノペプチドＢ、ヒトアンギオテンシンＩ、および合成ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ブラジキニンを用いて、質量スペクトルを外部的に較正した。
【０１２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、既製の３〜８％Ｔｒｉｓ−酢酸勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて実施した。本研究におけるＳＤＳポリアクリルアミドゲルはすべて、クーマシーブリリアントブルーＲ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で染色した。ウエスタンブロット解析には、タンパク質サンプルをニトロセルロース膜に電気ブロットして、対応するウサギポリクローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体によって免疫染色した。膜をヤギの抗ウサギまたは抗マウスのアルカリホスファターゼ結合二次抗体で処理し、アルカリホスファターゼ活性を、アルカリホスファターゼ結合基質（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で現像した。
【０１３０】
第ＸＩＩＩ因子の活性化。５００μｇ／ｍｌの第ＸＩＩＩ因子（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＶＴ）を、１０ｍＭのジチオスレイトールおよび２０ｍＭのＣａＣ１２を含むＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、０．２５Ｕ／ｍｌのトロンビン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理して活性化した。３７℃で２０分間インキュベートした後、モル過剰のヒルジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えてトロンビンを不活性化し、この混合液を第ＸＩＩＩａ因子として使用した（Ｔａｋａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９５）。
【０１３１】
ダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブの取り込み。活性化された第ＸＩＩＩ因子を用いてダンシルカダベリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｉｎｃ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，ＭＡ）をＦｎｂＡ分子種に取り込ませた。ダンシルカダベリンを利用して、第ＸＩＩＩａ因子反応性グルタミンを探査し、ペプチドであるダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶを用いて、反応性リジンを探査した。取り込みは、２μＭの野生型または変異型のｒＦｎｂＡを３０μｇ／ｍｌの第ＸＩＩＩａ因子とともに、２ｍＭのダンシルカダベリンまたは２ｍＭのダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶのいずれかの存在下で、それぞれ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＣａＣ１２中か、または２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、１５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＣａＣ１２中で、３℃でインキュベートすることにより実施した。対照反応も、２ｍＭのＥＤＴＡを含む同じ緩衝液中で行った。種々の時点で、２％ＳＤＳおよび１０％β−メルカプトエタノールを加えて反応を停止させ、９５℃で加熱してＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。紫外光下でゲルを試験し、次いでクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【０１３２】
フィブリンへの架橋。２μＭの野生型または変異型のＦｎｂＡの存在下または不在下で、５μＭのヒトフィブリノゲン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および１５μｇ／ｍｌの第ＸＩＩＩ因子を含む溶液に、０．５Ｕ／ｍｌのトロンビンを加えて、フィブリン重合および第ＸＩＩＩａ因子触媒によるフィブリンの架橋を開始させた。架橋反応は、５ｍＭのＣａＣ１２を含むＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、３７℃で実施した。種々の時点で、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、９Ｍ尿素、４０ｍＭジチオスレイトール、２％ＳＤＳを加えて反応を停止させた。血塊を３７℃で３０分間溶解させ、９５℃で加熱し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットで解析した。
【０１３３】
フィブロネクチンへの架橋。１μＭの野生型または変異型のＦｎｂＡ、および２μＭのヒト血漿フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む溶液に、１５μｇ／ｍｌの活性化第ＸＩＩＩ因子を加えて、フィブロネクチンとの架橋反応を開始させた。この反応は、５ｍＭのＣａＣ１２を含むＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、３７℃で実施した。その後さまざまな時点で、２％ＳＤＳおよび１０％β−メルカプトエタノールを加えて架橋反応を停止させ、９５℃で加熱し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットで解析した。
【０１３４】
架橋の反応速度論。第ＸＩＩＩａ因子媒介性のＦｎｂＡ分子種のフィブリンおよびフィブロネクチンへの架橋の反応速度論を、クーマシーブリリアントブルーで染色されたゲルのデンシトメトリー解析によって調べた。パーソナル・デンシトメーターＳ１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、レーザーによる濃度測定を行った。各ゲルをスキャンし、生成された画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ５．２ソフトウエアを用いて解析した。ＦｎｂＡがフィブリンまたはフィブロネクチンに架橋したときのＦｎｂＡの減少によって反応速度を推定した。ＦｎｂＡバンドに相当するピークの下にある領域を用いて、反応混合液におけるＦｎｂＡの相対量を測定してから、時間の関数としてプロットした。
【０１３５】
（結果）
ダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブの取り込み。残基Ａｌａ１からＰｒｏ８３９までを含む、ＦｎｂＡの野生型および変異型（１Ｑ、４Ｑ４Ｋ）（図７Ａ）を、以前記載されたように（Ｍａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、ｐＥＴ−２８ａ発現ベクターを用いて大腸菌の中で産生させ、細菌溶解物の可溶性画分から単離した。単離されたタンパク質のそれぞれが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一のバンドを示し（図７Ｂ）、ＡＳＥＱＫＴＴＴＶＥで始まる単一のＮＨ２末端配列を示した。同定されたＧｌｎおよびＬｙｓ部位のＡｌａ残基による置換が、第ＸＩＩＩａ因子に対するＦｎｂＡの反応性に影響するか否かを調べるために、ＦｎｂＡの野生型および変異型（１Ｑ、４Ｑ４Ｋ）を第ＸＩＩＩａ因子の基質として試験する一連の実験を設計した。ダンシルカダベリンおよびダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブを用いて、野生型ＦｎｂＡの第ＸＩＩＩａ因子反応性と、１Ｑおよび４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体の当該反応性との比較を最初に行った（図８）。種々の時点で、ダンシルカダベリンまたはダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶとの反応混合液のアリコートを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析して、クーマシーブルーで染色する前に紫外光下で調べた。第ＸＩＩＩａ因子およびモル過剰のダンシルカダベリンの存在下では、野生型ＦｎｂＡに相当するバンドでは、プローブの分子を増加させる酵素結合を反映する蛍光の増加が継続した（図８Ａ）。同じ実験条件下において、１ＱＦｎｂＡ変異体へのダンシルカダベリンの取り込みは劇的に低下し、このことは、１０３位のＧｌｎが、ＦｎｂＡにおける主要な反応性Ｇｌｎ部位として実際に作用していることを示唆した。さらなる蛍光強度の低下が、４つの同定された反応性Ｇｌｎ残基（Ｇｌｎ１０３、Ｇｌｎ１０５、Ｇｌｎ７８３、およびＧｌｎ８３０）のすべてがＡｌａに置換されている４Ｑ４Ｋ
ｒＦｎｂＡ変異体で観察された（図８Ａ）。しかし、４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体をダンシルカダベリンおよび第ＸＩＩＩａ因子とともに６０分間インキュベートすると、微弱ではあるが検出可能なプローブの取り込みが起きた（図８Ａ）。ダンシルカダベリンとの反応で観察された４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体の残留反応性は、ＦｎｂＡにさらに別の副次的な反応性Ｇｌｎ部位が存在することを示している可能性がある。
【０１３６】
第ＸＩＩＩａ因子触媒によるダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブの野生型ＦｎｂＡへの取り込みが図８Ｂに示されている。１Ｑ  ＦｎｂＡ変異体を同じ反応でアッセイしたところ、そのタンパク質バンドは、野生型ＦｎｂＡと比較すると僅かに高い蛍光強度を示した（図８）。この結果は、主要な反応性Ｇｌｎ１０３をＡｌａで置換すると、１Ｑ  ＦｎｂＡ変異体の中にあるＬｙｓ部位のより効率的なダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ標識が得られたことを示唆している。この効果は、分子内および／または分子間におけるタンパク質架橋に関与することによって、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶペプチドプローブと効果的に競合し得る、Ｇｌｎ１０３部位の強い反応性によるものである。ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブを野生型ＦｎｂＡの取り込む際にタンパク質架橋が起きることは、紫外光下で、およびクーマシーブルー染色したときに検出できる低移動度バンドの存在によって裏付けられている（図８Ｂ）。第ＸＩＩＩａ因子は、低速度かつ低効率でダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブを４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体に取り込まれたが、このことは、変異したＬｙｓ１５７、Ｌｙｓ５０３、Ｌｙｓ６２０、およびＬｙｓ７６２がアミン供与体部位として作用することを示唆している。しかし、４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体で見られる、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブに対する第ＸＩＩＩａ因子反応性の全体的な低下が、ダンシルカダベリンに対するほど顕著ではなかったことは明らかである。これは、さらに別の反応性Ｌｙｓ部位が、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブによる酵素的修飾に利用可能なままであることを示している。
【０１３７】
第ＸＩＩＩａ因子介在によるフィブリンへの架橋。１Ｑ  ＦｎｂＡ変異体および４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体の第ＸＩＩＩａ因子反応性を、フィブリン架橋反応において評価した。対照反応では、野生型ＦｎｂＡが、高分子量ヘテロ複合体の形成をもたらすフィブリンのα鎖に架橋された（Ｍａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。架橋は、野生型ＦｎｂＡに相当するバンドの減弱と、ＦｎｂＡ−α鎖ヘテロダイマーに相当する見かけの分子量をもつ顕著なバンドの出現とを伴っていた（図９Ａ、Ｂ、およびＣ、バンドａ）。架橋反応の産物（バンドａ、ｂ、ｃ、およびｄ）は、抗ＦｎｂＡポリクローナル抗体および抗フィブリノゲンα鎖モノクローナル抗体の両方と反応し（図９ＢおよびＣ）、これらの複合体がＦｎｂＡとフィブリンα鎖との共有結合から構成されていることを示唆している。同じ実験条件下で、２つのＦｎｂＡ変異体（１Ｑおよび４Ｑ４Ｋ）が、極めて低い第ＸＩＩＩａ因子架橋反応を示した。クーマシーブルー染色（図９Ａ）、または抗ＦｎｂＡポリクローナル抗体（図９Ｂ）および抗フィブリノゲンα鎖モノクローナル抗体（図９Ｃ）による免疫染色を行うと、ほんの微量のＦｎｂＡ変異体−αフィブリン鎖ヘテロダイマーが検出された。フィブリンおよび第ＸＩＩＩａ因子とインキュベートしたときの野生型および変異型のＦｎｂＡ分子種の消費を、デンシトメトリー解析を用いて調べた（図１０）。図１０に示されているように、野生型のＦｎｂＡは、１Ｑまたは４Ｑ４ＫのＦｎｂＡ変異体よりもずっと速い速度で反応した。１２０分間インキュベートした後に、残っている遊離した（架橋されていない）１Ｑまたは４Ｑ４ＫのＦｎｂＡ変異体の量は、野生型ＦｎｂＡと比較すると約８５％多かった。これらのデータは、１０３位のＧｌｎ部位が、第ＸＩＩＩａ因子触媒によるＦｎｂＡのフィブリンα鎖への結合にもっとも関与していることを示唆している。また、得られたデータは、１Ｑおよび４Ｑ４Ｋの両ＦｎｂＡ変異体が、フィブリンとの架橋反応において約８５％の反応性の低下を示すことも示している。
【０１３８】
第ＸＩＩＩａ因子介在によるフィブロネクチンへの架橋。また、１Ｑまたは４Ｑ４ＫのＦｎｂＡ変異体の反応性も、血漿フィブロネクチンとの反応でテストした。このために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析をまた利用して、ＦｎｂＡ変異体の反応性をアッセイした。フィブロネクチンとインキュベートとすると、野生型または変異型のＦｎｂＡに相当するバンドは、タンパク質が高分子量ヘテロ複合体の中に架橋されていくにつれて徐々に減弱した（図１１Ａ、Ｂ、およびＣ）。野生型ＦｎｂＡまたは変異型ＦｎｂＡとフィブロネクチンとからなる共有結合架橋高分子量複合体が形成されたことは、抗ＦｎｂＡポリクローナル抗体（図１１Ｂ）および抗フィブロネクチンモノクローナル抗体（図１１Ｃ）を用いたウエスタンブロット解析の結果から明らかであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットはともに、野生型および変異型のＦｎｂＡ分子種の反応性の間に殆ど違いがないことを明らかにした（図１１）。しかし、デンシトメトリー解析を用いて、反応速度を測定したところ、架橋速度の違いが明らかになった（図１２）。１Ｑ
ＦｎｂＡ変異体は、野生型ＦｎｂＡに近似した速度で反応したが、４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体は、より遅い架橋速度を示した。３６０分間インキュベートした後、残っている遊離した（架橋されていない）４Ｑ４Ｋ  ＦｎｂＡ変異体の量は、野生型ＦｎｂＡまたは１Ｑ  ＦｎｂＡ変異体の量と比較すると約３５％少なかった。これらのデータは、１５７位、５０３位、６２０位、および７６２位のＬｙｓ部位が、第ＸＩＩＩａ因子媒介性ＦｎｂＡとフィブロネクチンとの架橋に関与し、全部で約３５％のＦｎｂＡの反応性に寄与することを示唆している。また、これらのデータは、ＦｎｂＡのさらに別の未同定の反応性Ｌｙｓ部位が、フィブロネクチンとの架橋に関与していることも示唆している。
【０１３９】
ＦｎｂＡにおけるさらなる反応性部位としてのＬｙｓ７０２の同定。ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブによる標識実験、およびフィブロネクチンとの架橋の結果は、４Ｑ４Ｋ
ＦｎｂＡ変異体において第ＸＩＩＩａ因子にとって利用可能なさらに別の反応性Ｌｙｓ部位があることを示唆している。第ＸＩＩＩａ因子反応性Ｌｙｓ部位の同定について以前報告されたように（米国特許出願第６０／５７３，７２４号、およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶでＦｎｂＡを標識することを利用した方法が採用された（Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９０；Ｌｏｒａｎｄ
ｅｔ  ａｌ．（１９９２））。蛍光トレーサーとしてダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶを用い、本発明者らは、ＦｎｂＡをプローブで標識し、修飾されたタンパク質をＧｌｕ−Ｃプロテイナーゼで切断して、標識されたＦｎｂＡペプチドのＨＰＬＣ分離を行った。その後、単離された蛍光ピーク（トレーサーを含むペプチド）の質量スペクトルおよびＮＨ２末端配列の解析を行ったところ、１つ（ピーク３と名づけられている）を除くすべてのピークの同定ができた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。ＦｎｂＡにおけるさらに別の反応性Ｌｙｓ部位を同定するために、逆相ＨＰＬＣを用いて蛍光ピーク３に相当する物質をさらに精製した後、質量スペクトル解析を行った。ピーク３に由来するプローブ修飾された物質を解析したところ、測定質量［Ｍ＋Ｈ］＋が１９４１．９８であるペプチドの存在を明らかにした（図１３）。この値は、１つのダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶ修飾を含む９重合体ＮＳＨＶＤＩＫＳＥペプチドの算定質量と一致する（表４）。このＮＳＨＶＤＩＫＳＥペプチドは、ＦｎｂＡのＣＯＯＨ末端領域に由来しており、７０２位に１個のＬｙｓ残基を含む。したがって、Ｌｙｓ７０２が、第ＸＩＩＩａ因子によって標的とされるプローブ修飾された残基として同定された。さまざまな黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株に由来する既知のＦｎｂＡおよびＦｎｂＢ分子種の多重配列アラインメントによって、Ｌｙｓ７０２が極めてよく保存されていて、解析されたすべての配列に存在することが明らかになった（図１４）。Ｌｙｓ７０２部位は、ＦｎｂＡのＤｕおよびＤ１のフィブロネクチン結合反復配列の間に位置する領域に存在する（図７）ため、フィブロネクチンをＧｌｎ３と架橋するために容易に利用できるはずである。さらに、新たに同定されたＬｙｓ７０２は、反応性Ｌｙｓ６２０（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）とともに、解析されたＦｎｂＡおよびＦｎｂＢのすべての配列に存在するただ２つのＬｙｓ部位である。また、Ｌｙｓ６２０（蛍光ピーク５、図１１Ｄ［７］）およびＬｙｓ７０２（蛍光ピーク３、図１１Ｄ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４））の両部位は、ダンシル−ＰＧＧＱＱＩＶプローブに対して最も高い反応性を示した。新たに同定されたＬｙｓ７０２で観察された高い反応性をもつこと、およびそれがＦｎｂＡおよびＦｎｂＢの配列で高度に保存されていることは、この部位が、第ＸＩＩＩａ因子が触媒する架橋反応にとって重要であることを示唆している。
【０１４０】
上記考察および実施例は、特定の実施態様の詳細な説明を提示するにすぎないことが、理解されるべきである。したがって、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、さまざまな改変および等価なことがなされ得ることは、当業者にとって明白なはずである。
【０１４１】
本特許出願において特定されている、すべての雑誌論文、その他の参考文献、特許および特許出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１４２】
【数１】
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【０１４３】
【数２】
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【０１４４】
【数３】
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【０１４５】
【数４】
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【０１４６】
【数５】
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【０１４７】
【数６】
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【０１４８】
【表１−２】
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【０１４９】
【表２】
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【０１５０】
【表３】
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【０１５１】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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