(57)【要約】【課題】細胞操作装置に装着され、遺伝子あるいはタンパク質等の物質を固定化して、細胞に導入、保持するための針状体において、細胞に対する挿入効率を低下させることなく、耐久性を高め、細胞操作の操作性、効率を向上させる。【解決手段】細胞層作用部材としての針状体の形状を、先端直径200〜400 nm、根本直径300〜1500nmで、且つ、「長さ／根元直径」で表されるアスペクト比が１０〜２０であるテーパー形状とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
先端直径200〜400 nm、根本直径300〜1500nmで、且つ、「長さ／根元直径」で表されるアスペクト比が１０〜２０であるテーパー状針状体からなるか、あるいは該針状体を有する細胞操作用部材。
【請求項２】
アスペクト比が１０〜１５であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞操作用部材。
【請求項３】
細胞が、動物細胞であることを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞操作用部材。
【請求項４】
動物細胞が、間葉系幹細胞、メラノサイト、乳ガン細胞、子宮頸ガン細胞、繊維芽細胞であることを特徴とする請求項３に記載の細胞操作用部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に遺伝子等を挿入し細胞操作を行う細胞操作用部材に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明者らは、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質を、針状体に固定化して細胞内に挿入し、上記遺伝子を針状体に固定化した状態で細胞内に保持し機能発現を行う細胞操作装置をすでに開発している（特許文献１）。この細胞操作装置は、少なくとも遺伝子等を固定化する針状体、該針状体の移動手段、該針状体の位置制御手段及び針状体の細胞内へ挿入検知手段を有し、該検知手段は、針状体の細胞に対する接触、穿刺、及び引き抜きの各状態における、細胞が針状体に及ぼす微少な力を検知する手段であって、このような微少な力の検知は、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、分子間力顕微鏡のカンチレバー及び該カンチレバーの変位検出手段が利用できる（図１）。このような細胞操作装置によれば、針状体に固定化された遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質が、細胞に、導入、保持されている状態を確実に検知でき、また、上記固定化された遺伝子等は細胞内から引き抜き除去可能である。これらにより、遺伝子の発現状況あるいはその影響等を蛍光顕微鏡等によりリアルタイムで検出可能となる。本発明者らは、この細胞操作装置を用いて様々な細胞操作実験を行ってきたが、その際、用いてきた直径数１００ナノメートルの円筒状針状体は、動物細胞に対する挿入効率が高い反面、水平方向のずり応力に弱く、破損しやすいことが判明した。この傾向は、ダイヤモンドのような破壊靱性の高い材料においても共通に見られた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４０５１４４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、上記細胞操作装置の問題点を解消し、細胞挿入効率が高く、かつ遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質を固定化するための針状体の破損を防止するための有効な手段を見いだすことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記改題を解決すべく、針状体の材質、構造あるいは取り扱い手法の検討等様々な手段を講じてきたが、結局、針状体の形状を特定のテーパー形状とすることにより、細胞挿入効率を特に低下させることなく、その破損を防止しうることを見いだすとともに、細胞挿入効率は、動物細胞の種類に依存することを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。
すなわち本発明は以下のとおりである。
【０００６】
（１）先端直径200〜400 nm、根本直径300〜1500nmで、且つ、「長さ／根元直径」で表されるアスペクト比が１０〜２０であるテーパー状針状体からなるか、あるいは該針状体を有する細胞操作用部材。
（２）アスペクト比が１０〜１５であることを特徴とする、上記（１）に記載の細胞操作用部材。
（３）細胞が、動物細胞であることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載の細胞操作用部材。
（４）動物細胞が、間葉系幹細胞、メラノサイト、乳ガン細胞、子宮頸ガン細胞であることを特徴とする上記（３）に記載の細胞操作用部材。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞操作用部材は、細胞操作装置に装着され、遺伝子、タンパク質等の物質を固定化して、細胞に導入、保持するための細胞操作用を行う針状体の形状を、特定のテーパー形状に設定した点に特徴を有し、これにより、針状体の細胞への挿入効率を低下させずに、針状体の破損を防止し、耐久性を高めることができる。
一方、上記細胞操作装置は、遺伝子あるいはタンパク質等の様々な物質を固定化して、細胞に導入することで、これらの細胞に対する影響をリアルタイムで観察可能であり、種々の細胞実験に使用でき、特にiPS細胞作成のための、分化細胞の初期化実験への使用が期待できる。したがって、本発明の細胞操作用部材における挿入効率と針状体の耐久性の両立は、このような実験の操作性、効率を大いに高めるものであって、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】細胞操作装置における針状体を細胞に挿入したとき、カンチレバーに係る力応答を示す図。
【図２】実施例の実験に供した各種針状体の形状を示すSEM像。
【図３】各種細胞に対する、アスペクト比が異なる針状体の挿入効率を示す図。
【図４】HEK293細胞に対するアスペクト比10の針状体を挿入したとき得られた共焦点蛍光顕微鏡像とフォースカーブを示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の細胞操作用部材は、特定形状のテーパー状針状体からなるか、あるいは該針状体を有する部材からなり、上記先行技術文献に示される細胞操作装置に装着して用いられる。
このテーパー状針状体は、例えば、原子間力顕微鏡、分子間力顕微鏡のカンチレバー先端部のプローブに固定してもよく、あるいはこれら顕微鏡のカンチレバー先端部のプローブ自体を加工して特定テーパー形状の針状体を形成してもよい。
【００１０】
すなわち、針状体の材質としては、例えば、シリコン結晶、窒化シリコン、ダイヤモンド等の炭素結晶、チタン、ジルコニウム等の金属結晶、ＺｎＯ等の金属酸化物等が挙げられる。これら針状体は接着剤による接着や金属接合によってカンチレバーに固定化する。
また、原子間力顕微鏡のカンチレバー先端のプローブを加工する場合は、単結晶シリコン製の場合、例えば、集束イオンビーム加工装置を用いてエッチングにより上記特定テーパー形状に加工することができる。
【００１１】
針状体の形状は、先端直径200〜400 nm、根本直径300〜1200nmで、且つ、「長さ／根元直径」で表されるアスペクト比（針状体長さ／根本直径）が１０〜２０であり、好ましくは、アスペクト比が１０〜１５である。長さについては、上記アスペプト比と根本直径から自ずと定まり、特に限定されるものではないが、２〜２０μｍの範囲が好ましい。
アスペクト比は特に重要で、アスペクト比が１０を切ると、細胞への挿入効率が大幅に低下する。
【００１２】
本明細書において、細胞への挿入効率は以下の式で表される。
挿入効率＝斥力ドロップを含むフォースカーブの数／接触回数
上記式中、斤力ドロップとは、針状体の細胞への挿入過程において、針状体先端が細胞膜を通過（穿刺）したときに、検知される力応答で、例えば、ＡＦＭカンチレバー先端の針状体が細胞に接触した後、穿刺に成功すれば、細胞が針状体に及ぼす力（斤力）は急激に減少し、この力はカンチレバーのたわみの解消となって検出される。このような針状体と細胞との力応答は、一回の細胞操作毎に１つのフォースカーブとして得られるが、上記針状体の細胞に対する穿刺状態は、図１に示すように、フォースカーブ上に明瞭な斥力の減少が観察され、これを斥力ドロップと呼ぶ。上記細胞挿入効率とは、針状体を、細胞に挿入するため接触させた回数に対する、斤力ドロップが観察されたフォースカーブの数の割合であって、いわば、針状体の穿刺の成功率をいうものである。
【００１３】
一方、アスペクト比が高い程、破損割合が増加し、特にアスペクト比が２０を超えると、針状体の破損割合が急速に増加し、耐久性の問題が生ずる。しかし、上記細胞に対する挿入効率は、アスペクト比が、例えば１０と２０の場合とではそれほど変わらず、装入効率破損割合の両者を勘案すると、アスペクト比は１０〜１５に設定するのが好ましい。
【００１４】
また、本発明の細胞操作用部材におけるテーパー状針状体の細胞への挿入効率は、動物細胞であってもその種類により異なる。例えば、後記する実施例の実験によれば、ヒト胎児腎細胞では、本発明のテーパー状針状体は、テーパー形状を有しない円筒形の針状体に比較して、劣ることが明らかであるが、他の細胞（間葉系幹細胞、メラノサイト、乳ガン細胞、子宮頸ガン細胞、繊維芽細胞）に対しては挿入効率はそれ程変わらず、耐久性の問題を含めて考察すると、全般的に本発明の細胞操作用部材の有利性は明らかである。
【００１５】
本発明の細胞操作用部材における針状体は、上記先行技術文献に示したように、様々な遺伝子あるいはタンパク質等の物質を固定化した状態で細胞内に導入、保持されるが、上記先行技術に示したように、このような細胞内に導入、保持した物質を細胞から取り出すことが可能であり、遺伝子組み換え体を作らない。また、固定化した遺伝子発現、タンパク質等様々な物質による細胞に対する影響をリアルタイムで観察することができる。
この際、本発明における針状体は形状がテーパー状であるため、先端直径が同じ場合、形が円筒形状の針状体よりも表面積が大きく、細胞への物質導入量を増加させることができるため、物質導入の影響を観察する上で有利である。
【００１６】
本発明の細胞操作用部材の針状体に固定化される物質としては、例えば、細胞分化に関連する物質、ガン細胞等の増殖、抑制の指標となるマーカー遺伝子、転写に関連する遺伝子、タンパク質因子、多能性幹細胞（ｉＰＳ）作成のための初期化遺伝子、初期化因子、あるいは初期化マーカを特異的に認識する抗体等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
実施例１
各種テーパー形状の針状体を用いた様々な細胞に対する挿入操作を行い、挿入に最適なテーパー状針状体のアスペクト比の検討を行った。単結晶シリコン製AFM探針を、集束イオンビームを用いて、長さ10μm、先端直径200nｍ、根本直径0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μmのテーパー針状体を作製した。それぞれのアスペクト比は20、10、5、3.3、2.5である。作製したテーパー針状体のSEM像を図２に示す。
これらテーパー状針状体の7種の動物細胞への挿入効率を求めた。比較として、上記テーパー針状体とともに、長さ10μm、直径200nmの同時に円筒形のナノ針（アスペクト比；５０）、及び先端を200 nmに削った長さ15μmの通常AFM探針（アスペクト比2.5）を用いた場合の挿入効率も求めた。
【００１８】
7種の細胞はマウス繊維芽細胞（C3H10T1/2）、ヒト子宮頸部癌細胞（HeLa）、ヒト胎児腎細胞（HEK293）、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）、正常ヒトメラノサイト（melanocyte）、ヒト乳がん細胞（MCF-7）、ラット副腎髄質由来褐色細胞腫（PC12）である。
MCF-7は10%FBS添加RPMI1640、melanocyteはM254、hMSCは10%FBS添加a-MEM、HEK293とPC12は10%FCS添加DMEMを用いた。培養は37℃、5% CO2条件下で行った。図３に示すように、挿入効率は細胞種類によって54％〜95％と様々であった。HEK293の場合、アスペクト比10,20のテーパー状針状体の挿入効率は、円筒形ナノ針の挿入効率と比較して低かったが、全般的にみて、アスペクト比10,20の針状体の挿入効率は、円筒形ナノ針に比べて少し低いものの大きな差は見られなかった。
【００１９】
また、アスペクト比10，20のものは、アスペクト比5以下のものと比べ極めて高い挿入効率を示し、このことから、アスペクト比10と５の間に、挿入効率上の境界があることが伺える。
【００２０】
一方、テーパー状針状体の挿入の成功を確認するために、共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM）を用いて細胞挿入時の蛍光観察を行い、挿入成否を評価した。IC3-PE-maleimideを修飾した上記アスペクト比10の針をDiOで染色したHEK293に挿入し、斥力ドロップが観察された際に、蛍光撮影を行った結果、蛍光修飾アスペクト比10の針はDiO染色細胞に完全に貫通しており、スムースな細胞挿入が達成されていることが確認された（図４）。
【００２１】
また、針挿入によるカルシウムイオンの流入を観察することで侵襲性を評価するために、細胞内蛍光プローブFluo-4 AMをHEK293に取りこませ、カルシウムイオンの流入を観察した。通常AFM探針及びアスペクト比10の針を用いてHEK293に圧入し、30 nNに達した時点で20秒間保持し、カルシウムイオンの流入を観察した。結果、通常のAFM探針の場合、25%（8細胞中2細胞）の確率で機械刺激による非常に迅速なカルシウムイオンの流入が観察され、アスペクト比10の針を挿入した場合には、8細胞に同様の操作を行ってもカルシウムイオンの流入は全く起こらなかった。アスペクト比10のテーパー状針状体の挿入による細胞操作は、機械的な刺激が小さく細胞のネイティブな状態を維持したまま行うことが可能であり、正確な細胞の状態解析を行うことが可能であることが確認された。
【００２２】
このように、様々なアスペクト比のテーパー状針状体の細胞に対する挿入効率は、基本的に細胞の種類に依存しており、細胞の種類によって挿入操作に適しているアスペクト比の針状体を用いることが好ましいが、結論として、アスペクト比10以上（長さ10μmの時、根元直径1μm以下）であれば、ほとんどの細胞で高い挿入効率が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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