(57)【要約】【課題】細胞群を効率的に洗浄して不要成分が除去された細胞群を回収する。【解決手段】細胞懸濁液Ａを収容する先細の底部２ａを有する遠心容器２と、該遠心容器２の底部２ａが半径方向外方に向かうように回転させる回転装置と、遠心容器２の底部２ａ近傍に吐出口３ａを配置し、洗浄液を吐出する洗浄液供給管３と、遠心容器２内の空間を軸方向に先端側から第１の空間Ｘと第２の空間Ｙとに区画し、吐出口３ａを第１の空間Ｘに配する第１の位置と、吐出口３ａを第２の空間Ｙに配する第２の位置との間で移動可能に設けられた区画部材５と、該区画部材５を回転装置による所定以上の遠心力によって第２の位置に配置し、それより小さい遠心力によって第１の位置に配置するよう駆動する駆動手段とを備える細胞処理装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液を収容する先細の底部を有する遠心容器と、
該遠心容器の前記底部が半径方向外方に向かうように回転させる回転装置と、
前記遠心容器の底部近傍に吐出口を配置し、洗浄液を吐出する洗浄液供給管と、
前記遠心容器内の空間を軸方向に先端側から第１の空間と第２の空間とに区画し、前記吐出口を前記第１の空間に配する第１の位置と、前記吐出口を第２の空間に配する第２の位置との間で移動可能に設けられた区画部材と、
該区画部材を回転装置による所定以上の遠心力によって第２の位置に配置し、それより小さい遠心力によって第１の位置に配置するよう駆動する駆動手段とを備える細胞処理装置。
【請求項２】
前記遠心容器の前記第２の空間に吸引口を配置し、遠心分離された上清を吸引する上清吸引管を備える請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項３】
前記駆動手段が、前記区画部材を第２の空間側に付勢する付勢部材である請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項４】
底部に洗浄液の吐出口を有する遠心容器に細胞懸濁液を収容し、前記底部が半径方向外方に向かうように回転させて細胞を底部に遠心分離する第１の遠心分離工程と、
該遠心分離工程において遠心分離された上清を排出する上清排出工程と、
遠心分離された細胞を前記吐出口に接触しない位置に移動させて、前記吐出口から洗浄液を吐出する予備吐出工程と、
前記遠心容器を回転させた状態で、前記吐出口から洗浄液を吐出する洗浄工程と、
洗浄液により再懸濁された細胞懸濁液を収容した遠心容器を、前記底部が半径方向外方に向かうように回転させて細胞を底部に遠心分離する第２の遠心分離工程とを含む細胞処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞処理装置および細胞処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、脂肪組織を分解して脂肪由来細胞を単離させた細胞懸濁液を収容した遠心分離容器を、該遠心分離容器から離れた軸線回りに回転させることにより、細胞懸濁液内に含有されている成分を比重により分離する遠心分離装置が知られている（特許文献１参照。）。
遠心分離容器は、一端を閉塞された略円筒状に形成され、その閉塞端を半径方向外方に向けるように回転させられることにより、閉塞端に向けて比重の大きい成分が移動し、閉塞端側から比重の大きい順に並んで分離されるようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２４８０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞懸濁液を遠心分離することにより遠心分離容器の底部に分離された細胞群は遠心力によって押し固められた固形のペレット状に形成されてしまうという不都合がある。すなわち、細胞群がペレット状に形成されてしまうと、遠心分離後の細胞群を吸引により遠心分離容器内から取り出すことが困難になる。また、遠心分離時に細胞群の中にタンパク質分解酵素や脂肪分のような不要成分が取り込まれたままペレット状に形成されてしまうことがあり、不要成分を除去することが困難となる。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞群を効率的に洗浄して不要成分が除去された細胞群を回収することができる遠心洗浄方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞懸濁液を収容する先細の底面を有する遠心容器と、該遠心容器の前記底部が半径方向外方に向かうように回転させる回転装置と、前記遠心容器の底部近傍に吐出口を配置し、洗浄液を吐出する洗浄液供給管と、前記遠心容器内の空間を軸方向に先端側から第１の空間と第２の空間とに区画し、前記吐出口を前記第１の空間に配する第１の位置と、前記吐出口を第２の空間に配する第２の位置との間で移動可能に設けられた区画部材と、該区画部材を回転装置による所定以上の遠心力によって第２の位置に配置し、それより小さい遠心力によって第１の位置に配置するよう駆動する駆動手段とを備える細胞処理装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、遠心容器に細胞懸濁液を収容して回転装置の作動により遠心容器を所定以上の遠心力によって回転させると、遠心容器内において区画部材が第２の位置に配置され洗浄液供給管の吐出口が第２の空間に配置される。また、細胞懸濁液内に含有されている成分が比重により分離され、区画部材の表面には、比重の大きな細胞群が集められ、その上層には血漿等の上清が集められる。細胞群は遠心力によって押し固められてペレット状に構成される。
【０００８】
ここで、遠心容器に加えていた遠心力を一旦低下させると、底部が下側に向かうようになるとともに、区画部材が、その表面にペレット状に形成されている細胞群とともに、底部から離れる方向に移動して第１の位置に配置され、洗浄液供給管の吐出口が第１の空間に配置される。この状態で、洗浄液供給管の吐出口から洗浄液を吐出すると、供給初期において洗浄液供給管内に気泡が存在していた場合には、その気泡が第１の空間に吐出される。区画部材が移動することにより第１の空間には細胞群が存在していないので、気泡を含む洗浄液が直接細胞群に当たることが防止される。その結果、気泡によって断続される洗浄液から受ける衝撃等により、細胞がダメージを受ける不都合の発生を防止して、細胞の健全性を維持することができる。
【０００９】
そして、このようにして洗浄液供給管内の気泡が吐出され尽くした状態で、遠心容器に加える遠心力を増大させて所定の遠心力以上で回転させると、区画部材が第２の位置に配置され、吐出口が第２の空間に配置されるので、洗浄液供給管から洗浄液を吐出すると、ペレット状に形成されている細胞群が洗浄液によって解されて、分散させられる。このとき、遠心容器を回転させながら細胞群に洗浄液が吹き付けるので、遠心力を受けた細胞群を遠心容器の底部に集めつつ洗浄液を吹き付けることができる。これにより、吐出される洗浄液によってペレット状の細胞群が舞い上がってしまわないように、底部に保持しながら洗浄液を供給することができ、より確実に、ペレット状の細胞群を崩壊させて、内部に取り込まれている不要成分を放出させることができる。
【００１０】
上記発明においては、前記遠心容器の前記第２の空間に吸引口を配置し、遠心分離された上清を吸引する上清吸引管を備えていてもよい。
このようにすることで、細胞懸濁液を遠心力によって比重により分離した状態で、遠心容器の回転を停止して、底部が下側となるように鉛直方向に沿って配置し、上清吸引管の吸引口から上清を吸引することにより遠心容器の底部に細胞群のペレットを残して上清を容器本体外に排出することができる。これにより、遠心分離された細胞群から上清を除去することができ、その後の洗浄液の供給による洗浄効率を向上することができる。
また、遠心容器を回転させた状態で上清吸引管の吸引口から上清を吸引し、遠心容器の底部に細胞群のペレットを残して上清を容器本体外に排出することも可能である。
【００１１】
また、上記発明においては、前記駆動手段が、前記区画部材を第２の空間側に付勢する付勢部材であってもよい。
このようにすることで、付勢部材による付勢力を越える遠心力を加えることで、区画部材を第１の空間側に移動させ、それより低い遠心力を加えることで第２の空間側に容易に移動させることができる。
【００１２】
また、本発明は、底部に洗浄液の吐出口を有する遠心容器に細胞懸濁液を収容し、前記底部が半径方向外方に向かうように回転させて細胞を底部に遠心分離する第１の遠心分離工程と、該遠心分離工程において遠心分離された上清を排出する上清排出工程と、遠心分離された細胞を前記吐出口に接触しない位置に移動させて、前記吐出口から洗浄液を吐出する予備吐出工程と、前記遠心容器を回転させた状態で、前記吐出口から洗浄液を吐出する洗浄工程と、洗浄液により再懸濁された細胞懸濁液を収容した遠心容器を、前記底部が半径方向外方に向かうように回転させて細胞を底部に遠心分離する第２の遠心分離工程とを含む細胞処理方法を提供する。
【００１３】
本発明によれば、第１の遠心分離工程において遠心容器に細胞懸濁液を収容して回転装置の作動により遠心容器を回転させると、細胞懸濁液内に含有されている成分が比重により分離され、遠心容器の底部には、比重の大きな細胞群が集められ、その上層には血漿等の上清が集められる。細胞群は遠心力によって押し固められてペレット状に構成される。
この状態で、遠心容器を、底部が下側となるように鉛直方向に沿って配置し、上清排出工程によって上清を吸引することにより遠心容器の底部に細胞群のペレットを残して上清を容器本体外に排出することができる。
また、遠心容器を回転させた状態で上清吸引管の吸引口から上清を吸引し、遠心容器の底部に細胞群のペレットを残して上清を容器本体外に排出することもできる。
【００１４】
ここで、予備吐出工程において、例えば、遠心運動を停止した状態の遠心容器をその軸線が略水平となるように移動させると、底部に配置されていた細胞群のペレットを遠心容器の側壁側に移動させ、洗浄液供給管の吐出口から離れた位置に配置することができる。そして、この状態で、洗浄液を吐出することにより、供給初期において洗浄液供給管内に気泡が存在していた場合には、その気泡を含む洗浄液が直接細胞群に当たらないように吐出される。その結果、気泡により断続される洗浄液から受ける衝撃等により、細胞がダメージを受ける不都合の発生を防止して、細胞の健全性を維持することができる。
【００１５】
そして、この後に、洗浄工程において、遠心容器を遠心運動させながら底部に集められた細胞群に対して気泡が吐出され尽くした状態の洗浄液を吐出することにより、ペレット状に形成されている細胞群が洗浄液によって解されて、分散させられる。このとき、遠心容器を回転させながら細胞群に洗浄液が吹き付けるので、遠心力を受けた細胞群を遠心容器の底部に集めつつ洗浄液を吹き付けることができる。これにより、吐出される洗浄液によってペレット状の細胞群が舞い上がってしまわないように、底部に保持しながら洗浄液を供給することができ、より確実に、ペレット状の細胞群を崩壊させて、内部に取り込まれている不要成分を放出させることができる。そして、洗浄液により再懸濁された細胞懸濁液を第２の遠心分離工程において遠心分離することにより、不要成分を含まない細胞群をペレット状に再構成することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、細胞群を効率的に洗浄して不要成分が除去された細胞群を回収することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞処理装置を示す縦断面図である。
【図２】図１の細胞処理装置において、区画壁を第１の位置に配置した状態を示す縦断面図である。
【図３】図１の細胞処理装置において、区画壁を第２の位置に配置した状態を示す縦断面図である。
【図４】図１の細胞処理装置による細胞処理方法を示すフローチャートである。
【図５】遠心運動をさせずに洗浄した場合との対比において、異なる遠心加速度で遠心運動させた場合の残留酵素濃度を示すグラフである。
【図６】洗浄液の吐出速度を異ならせて測定した、回収されたペレット状の細胞群内の生存している細胞数を示すグラフである。
【図７】遠心加速度を異ならせて測定した、回収されたペレット状の細胞群内の生存している細胞数を示すグラフである。
【図８】図１の細胞処理装置の第１の変形例を示す縦断面図である。
【図９】図４の細胞処理方法の変形例における（ａ）遠心分離工程、（ｂ）予備吐出工程をそれぞれ示す縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一実施形態に係る細胞処理装置および細胞処理方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞処理装置１は、図１から図３に示されるように、先端に向かって先細になる底部２ａを有する容器本体（遠心容器）２と、該容器本体２内の底部２ａ近傍に吐出吸引口３ａを配置した吐出吸引管３と、吐出吸引口３ａから軸方向に離れた位置に吸引口４ａを配置した上清吸引管４と、該吸引口４ａと底部２ａとの間に配置され、容器本体２内を軸方向に、底部２ａ側から第１、第２の２つの空間Ｘ，Ｙに区画する区画部材５と、該区画部材５を容器本体２の底部２ａから離れる方向に付勢するコイルスプリング６とを備えている。
【００１９】
区画部材５は、容器本体２の底部２ａ内面にほぼ密着可能な外面形状を有する傘状に形成され、中央に前記吐出吸引管３を貫通させる貫通穴５ａを備えている。これにより、図１に示されるように容器本体２が直立した状態では、区画部材５が、コイルスプリング６の付勢力によって容器本体２の細胞懸濁液Ａ内において浮上した第１の位置に配置され、吐出供給管３の吐出吸引口３ａを第１の空間Ｘに露出させるようになっている。
【００２０】
一方、容器本体２を、その底部２ａが半径方向外方に向かうように回転させることにより、所定の大きさ以上の遠心力が加わった場合には、図２に示されるように区画部材５が容器本体２内において、コイルスプリング６の付勢力に抗して底部２ａ側に向かって移動して第２の位置に配置され、吐出供給管３の吐出吸引口３ａを第２の空間Ｙに露出させるようになっている。
【００２１】
このように構成された本実施形態に係る細胞処理装置１を用いた細胞処理方法について、次に説明する。
本実施形態に係る細胞処理方法は、細胞を洗浄する方法であって、図４に示されるように、容器本体２内に細胞懸濁液Ａを収容した状態で、底部２が半径方向外方に向かうように回転させることにより、細胞懸濁液Ａを比重によって上清Ｂと細胞群Ｃとに遠心分離する第１の遠心分離工程Ｓ１と、上清吸引管４の吸引口４ａから吸引することにより、第１の遠心分離工程Ｓ１において遠心分離された上清Ｂを容器本体２の外部に排出する第１の上清排出工程Ｓ２と、区画部材５を第１の位置に移動させて、吐出吸引口３ａから洗浄液を吐出する予備吐出工程Ｓ３と、容器本体２を回転させることで区画部材５を第２の位置に保持しながら吐出吸引口３ａから洗浄液を吐出して再懸濁する洗浄工程Ｓ４と、該洗浄工程Ｓ４において洗浄液を供給することにより再懸濁された細胞懸濁液Ａを遠心分離することにより上清Ｂと細胞群Ｃとに分離する第２の遠心分離工程Ｓ５と、上清吸引管４の吸引口４ａから吸引することにより、第２の遠心分離工程Ｓ５において遠心分離された上清Ｂを容器本体２の外部に排出する第２の上清排出工程Ｓ６とを含んでいる。
【００２２】
第１の遠心分離工程Ｓ１において、所定以上の回転数で容器本体２を遠心運動させると、容器本体２内に収容されている細胞懸濁液Ａおよび区画部材５には所定以上の遠心力が作用し、区画部材５が第２の位置に移動する。そして、細胞懸濁液Ａは、図２に示されるように、上清Ｂと細胞群Ｃとに遠心分離されて、細胞懸濁液Ａに含まれている消化酵素液や塵埃等の不要成分が細胞間に取り込まれてペレット状に形成された細胞群Ｃが区画部材５の表面に形成される。
【００２３】
この状態で上清排出工程Ｓ２により、容器本体２を直立状態に停止させて、上清吸引管４の吸引口４ａから上清Ｂを排出することにより、容器本体２内の区画部材５上にペレット状の細胞群Ｃを残すことができる。このとき、容器本体２内の区画部材５は、図３に示されるように、コイルスプリング６の付勢力によって容器本体２内において浮上して第１の位置に配置されている。遠心運動後に得られる細胞群Ｃのおよその量が決まっていることから、吐出供給管３の吐出吸引口３ａから細胞群Ｃが遠ざけられた位置に配置されるよう、第１の位置は設定されている。
【００２４】
この状態で、予備吐出工程Ｓ３において洗浄液を吐出吸引口３ａから吐出させると、洗浄液は細胞群Ｃに直接当たることなく容器本体２内に供給される。したがって、供給初期において吐出供給管３内に気泡が含まれていても、その気泡によって断続する洗浄液が細胞群Ｃに浴びせられることが防止され、細胞群Ｃにダメージを与えずにすむという利点がある。
【００２５】
吐出供給管３内の気泡を含む洗浄液が吐出し尽くされた時点で、洗浄工程Ｓ４において、容器本体２を遠心運動させて、所定以上の遠心力を与えることにより、図２に示されるように、区画部材５を第２の位置に配置した状態で、底部２ａに対向した吐出吸引管３の吐出吸引口３ａからペレット状の細胞群Ｃに対し洗浄液を連続的に供給することで、細胞群Ｃが再懸濁されて洗浄され細胞群Ｃに取り込まれていた不要成分が解放される。
【００２６】
この場合において、本実施形態によれば、洗浄工程Ｓ４において、容器本体２を回転させて遠心運動させながら、容器本体２の底部２ａに向けて洗浄液を吐出することにより、遠心力を受けた細胞群Ｃを容器本体２の底部２ａに集めつつ洗浄液を供給することができる。これにより、吐出される洗浄液によってペレット状の細胞群Ｃが舞い上がってしまわないように、底部２ａに保持しながら洗浄液を供給することができ、より確実に、ペレット状の細胞群Ｃを崩壊させて、内部に取り込まれている不要成分を放出させることができる。
【００２７】
そして、この洗浄工程Ｓ４において細胞群Ｃを崩壊させて生成された細胞懸濁液Ａを、その後の第２の遠心分離工程Ｓ５によって、上清Ｂとペレット状の細胞群Ｃとに遠心分離し、第２の上清排出工程Ｓ６によって、上清Ｂを排出することにより、再度、ペレット状の細胞群Ｃを得ることができる。このようにして得られた細胞群Ｃに含有される不要成分の濃度は、最初に得られた細胞群Ｃよりも十分に低下させられている。
【００２８】
図５に、容器本体２を２０Ｇおよび１３０Ｇの遠心加速度で遠心運動させながら吐出吸引口３ａから、１００ｍＬ／ｍｉｎの吐出速度で洗浄液を吐出した場合に、得られたペレット状の細胞群Ｃ内に残留する消化酵素の濃度をそれぞれ示す。図５には、比較のために遠心運動させることなく１００ｍＬ／ｍｉｎの吐出速度で洗浄液を吐出した場合の残留消化酵素の濃度も示している。
【００２９】
図５によれば、遠心加速度の如何に関わらず、容器本体２を遠心運動させながら洗浄液を細胞群Ｃに吐出した場合に得られるペレット状の細胞群Ｃ内の残留消化酵素濃度は、遠心運動させることなく洗浄液を吐出した場合と比較して大幅に低減していることがわかる。
また、このようにして得られたペレット状の細胞群Ｃに含まれる生存している細胞数は、図６および図７に示されるように、洗浄工程Ｓ４における遠心加速度および洗浄液の供給速度に依存することなく得ることができることがわかる。図６は、遠心加速度を２０Ｇに固定して、洗浄液の吐出速度を１００〜３００ｍＬ／ｍｉｎに変化させたときの細胞数、図７は、吐出速度を２００ｍＬ／ｍｉｎに固定して、遠心加速度を２０〜１３０Ｇに変化させたときの細胞数をそれぞれ示している。
【００３０】
このように、本実施形態に係る細胞洗浄方法によれば、残留する不要成分の濃度を十分に抑えた細胞群Ｃを得ることができ、不要成分としての消化酵素の濃度が低いので、細胞にダメージを与えることが抑制され、また、移植される細胞群Ｃから不要成分を除去して、生体親和性の高い細胞群Ｃを得ることができるという利点がある。
また、洗浄液の吐出に際して細胞にダメージを与えずに済むので、細胞の健全性を維持することができる。
また、吐出吸引管３の吐出口３ａから若干の洗浄液を供給して再懸濁した後、吐出吸引管３の吐出口３ａから細胞懸濁液Ａを容器本体２の外部に回収することにしてもよい。
【００３１】
また、遠心力が小さいときに、区画部材５を第１の位置に駆動する駆動手段としては、図８に示されるように、区画部材５を磁石によって構成し、予備吐出が行われる位置において容器本体２の底面２ａに対向する位置に、該区画部材５との間に磁気反発力を発生させる電磁石７を配置することにしてもよい。この場合には、電磁石７によって磁気反発力を発生させて区画部材５を第１の位置に配置した状態で予備吐出工程Ｓ３を行い、電磁石７による磁気反発力を停止させて区画部材５を第２の位置に配置した状態で洗浄工程Ｓ４を行うことにすればよい。
【００３２】
また、本実施形態に係る細胞処理方法においては、区画部材５を移動させることで、ペレット状の細胞群Ｃを移動させ、吐出吸引口３ａから遠ざけた状態で気泡を含む洗浄液を吐出させることとした。しかしながら、これに代えて、図９に示されるように、（ａ）遠心運動を停止した状態の容器本体２に外力を加えて、（ｂ）容器本体２の底部２ａが横方向に向かうように傾斜させることにより、容器本体２の底部２ａに堆積されていたペレット状の細胞群Ｃを容器本体２の側壁に移動させて、吐出吸引口３ａから遠ざけることにしてもよい。
【００３３】
このようにすることで、図９（ｂ）の状態で吐出吸引口３ａから気泡を含む洗浄液を吐出して、断続する洗浄液によって細胞群Ｃが衝撃を受けないようにすることができ、細胞の健全性を維持することができる。
【符号の説明】
【００３４】
１  細胞処理装置
Ａ  細胞懸濁液
Ｂ  上清
Ｘ  第１の空間
Ｙ  第２の空間
２  容器本体（遠心容器）
２ａ  底部
３  洗浄液供給管
３ａ  吐出吸引口（吐出口）
４  上清吸引管
４ａ  吸引口
５  区画部材
６  コイルスプリング（付勢部材：駆動手段）
７  電磁石（駆動手段）
Ｓ１  第１の遠心分離工程
Ｓ２  上清排出工程
Ｓ３  予備吐出工程
Ｓ４  洗浄工程
Ｓ５  第２の遠心分離工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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