(57)【要約】【課題】  光照射による皮膚に対するラジカルの影響を評価する。【解決手段】  （１）  試験動物にスピンプローブ剤を投与する工程と、（工程２）所定の波長領域の光を所定の強度で前記試験動物の皮膚に照射しつつ、ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｌ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ  画像法を用いて試験部位の皮膚を画像化する工程と、（工程３）投与した電子スピンプローブ剤の減衰速度より、当該所定の強度で皮膚に照射した所定の波長領域の光によるラジカルの発生状況を評価する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（工程１）  試験動物にスピンプローブ剤を投与する工程と、
（工程２）  所定の波長領域の光を所定の強度で前記試験動物の皮膚に照射しつつ、ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｌ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ  画像法を用いて試験部位の皮膚を画像化する工程と、
（工程３）  投与したスピンプローブ剤の減衰速度より、当該所定の強度で皮膚に照射した所定の波長領域の光によるラジカルの発生状況を評価する
ことを特徴とする、光照射による皮膚のラジカル発生状況の評価方法。
【請求項２】
前記（工程１）において、試験動物に予め評価する物質を塗布または投与し、投与しない対象で得られた減衰速度と比較することにより評価物質の塗布または投与による影響を評価することを特徴とする請求項１に記載の光照射による皮膚のラジカル発生状況の評価方法。
【請求項３】
前記（工程２）において、照射する光の強度または波長領域を変化させ、前記（工程３）において、光の強度の変化によるラジカルの発生状況を評価する
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の光照射による皮膚のラジカル発生状況の評価方法。
【請求項４】
前記照射する光の波長は、ＵＶ領域、ＵＶ−Ａ領域、ＵＶ−Ｂ領域またはこれらの組み合わせでることを特徴とする請求項３に記載の光照射による皮膚のラジカル発生状況の評価方法。
【請求項５】
前記試験動物のＥＳＲに先立って予め所定波長領域での所定強度の光の照射によるラジカル発生状況をスピンプローブ剤と照射するは光信号強度を１００％として評価することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の光照射による皮膚のラジカル発生状況の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光照射による皮膚のラジカル発生状況の評価方法に関する。より詳しく述べると、Ｌ−バンドＥＳＲ装置を用いた光照射による皮膚のラジカル発生状況の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線領域の波長領域とその特徴は、以下の通りである。
近紫外線  （波長  ３８０−２００ｎｍ）
ＵＶ−Ａ  （波長３１５ｎｍ−３８０ｎｍ）
（太陽光線の内５．６％通過）皮膚の真皮層に作用し蛋白質を変性させる。細胞の物質交代の進行に関係しており、細胞の機能を活性化させる。また、ＵＶ−Ｂによって生成されたメラニン色素を酸化させて褐色に変化させる「サンタン（ｓｕｎｔａｎ）」。
ＵＶ−Ｂ  （波長２８０ｎｍ−３１５ｎｍ）
（太陽光線の内０．５％通過）表皮層に作用するが、色素細胞がメラニンを生成し防御反応を取る。これがいわゆる日焼けである。また  ＵＶ−Ｂ  には発癌性が指摘されるが発癌するのは高齢者、しかも肌の露出した部分のみというケースが多い「サンバーン（ｓｕｎｂｕｒｎ）」。
ＵＶ−Ｃ  （波長２００ｎｍ−２８０ｎｍ）
オゾン層で守られている地表には今のところ到達しない。強い殺菌作用があり、生体に対する破壊性が最も強い。
遠紫外線、真空紫外線  （ＶＵＶ）  （波長  ２００ｎｍ−１０ｎｍ）
酸素分子や窒素分子によって吸収されるため、通常は地表には到達しない。真空中でないと進行しないため「真空紫外線」  （Ｖａｃｕｕｍ  Ｕｌｔｒａ  Ｖｉｏｌｅｔ）と呼ばれる。
極端紫外線  （波長１０ｎｍ以下）。
【０００３】
これらのうち太陽からの紫外線のうち地表に達するものは、ＵＶＡとＵＶＢである。このうち皮膚に対して日焼け、光老化や皮膚がんを起こす作用の強いのはＵＶＢである。ＵＶＢの大部分はオゾン層により遮られているが、近年のオゾンホールの拡大でＵＶＢ照射量の増加とそれに伴う皮膚がん等のリスクの増加が問題視されている。
【０００４】
紫外線による光老化や皮膚がんには活性酸素やフリーラジカルが関わっていると言われているが、これまで紫外線照射中に生きている動物の皮膚組織内でこれらが生成されることを実証した例は無い。活性酸素やフリーラジカルは他の生体分子と反応する性質が強く、寿命が極めて短い［生体内ではナノ秒（１／１０９秒）からマイクロ秒（１／１０６秒）のオーダーと推定される］ため、一般の物質のように体外に取り出して測定することはできない。
【０００５】
そのため活性酸素やフリーラジカルは体内でできたときに速やかに測定する必要がある。しかしながら、このような紫外線に照射よる皮膚に対するフリーラジカル量を測定手段はなかった。
【０００６】
ところで、現在、紫外線対策用の各種化粧品が市販されているが、紫外線防止能力については記載されているが、フリーラジカルに対する消去能については全く証明されていない。
【０００７】
紫外線照射に対する防御として、人間の体は茶色の色素のメラニンを分泌し、日焼けすることにより、紫外線の平均レベル（人種により異なる）を下げようとする。この色素は紫外線の侵入を阻害し、より深い部分の皮膚組織へのダメージを減らす。また、市販の日焼け止めローション、クリームも紫外線の侵入を防ぐ。これらの製品では、「ＳＰＦ値」「ＰＡ」と呼ばれる紫外線防御効果が記載されている。
【０００８】
ＳＰＦ値はＳｕｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒの略で主に日焼けの原因であるＵＶＢの遮断率を表している。ＳＰＦ２５の場合は、無対策の場合と比較して紫外線が１／２５になり、ＳＰＦ１００は１／１００になる。ＰＡはＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＵＶＡの略で、ＵＶＡの遮断に対する効果を表している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】（ｈｔｔｐ：／／ｊａ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／％Ｅ７％Ｂ４％ＡＢ％Ｅ５％Ａ４％９６％Ｅ７％Ｂ７％９Ａ、平成２１年５月１８日検索）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の課題は、紫外線に対するフリーラジカル量の影響を直接評価できるシステムを提供することである。
【００１１】
本発明の他の課題は、化粧品などの紫外線防止用に塗布する組成物のフリーラジカル防止能を評価するシステムを確立することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決する本発明は、下記工程：
（工程１）  試験動物にスピンプローブ剤を投与する工程と、
（工程２）  所定の波長領域の光を所定の強度で前記試験動物の皮膚に照射しつつ、ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｌ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ  画像法を用いて試験部位の皮膚を画像化する工程と、
（工程３）  投与したスピンプローブ剤の減衰速度より、当該所定の強度で皮膚に照射した所定の波長領域の光によるラジカルの発生状況を評価することを特徴とする、光照射による皮膚のラジカル発生状況の評価方法に関する。
【００１３】
本発明の評価方法において、前記（工程１）において、試験動物に予め評価する物質を塗布または投与し、投与しない対象で得られた減衰速度と比較することにより評価物質の塗布または投与による影響を評価することができる。
【００１４】
また、本発明の評価方法において、前記（工程２）において、照射する光の強度または波長領域を変化させ、前記（工程３）において、光の強度の変化によるラジカルの発生状況を評価することができる。
【００１５】
さらに、本発明の評価方法において、前記照射する光の波長は、ＵＶ領域、ＵＶ−Ａ領域、ＵＶ−Ｂ領域またはこれらの組み合わせでることができる。
【００１６】
また、前記試験動物のＥＳＲに先立って予め所定波長領域での所定強度の光の照射によるラジカル発生状況をスピンプローブ剤と照射するは光信号強度を１００％として評価す
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、紫外線に対するフリーラジカル量の影響を直接評価できるシステムが提供でき、このシステムにより、化粧品などの紫外線防止用に塗布したり、健康食品・サプリメント等の投与する組成物のフリーラジカル防止能を評価するシステムを確立することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明で使用するＥＳＲ装置の一例を示す図面。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明する。
図１は、本発明で使用するＥＳＲ装置の説明図である。
図１に示すＥＳＲイメージング装置は、以下のような構成を有している。
高周波発振器１から発振された高周波を、ステップアッテネータ２で適切な電力に減衰した後、サーキュレータ３と高周波線路４とを介して、静磁場コイル６と勾配磁場コイル７から発生した磁場が重畳された磁極間隙に配置されたループギャップ共振器５に供給する。
【００２０】
前記ループギャップ共振器５の共振器軸は、静磁場方向（２軸方向）と直交する方向（すなわち、ｘ軸方向）に配置され、高周波磁場と静磁場が互いに直交する構成になっている。ループギャップ共振器５内部は、本発明で使用する被験動物を測定対象物として載置するための試料台９を、前記ループギャップ共振器５の共振器軸に沿って挿入されている構成を有している。
【００２１】
ループギャップ共振器５に供給された高周波は、移動式のカップラー１０によって反射波のない状態に結合を調整されている。もし、測定対象物８がＥＳＲ現象によって高周波の吸収を引き起こせば、ループギャップ共振器５と高周波線路４との結合がずれてループギャップ共振器５から反射波を生じる。この反射波を、サーキュレータ３を介して取り出し、高周波検出器１１に送り、高周波検出器１１で検波した結果をデータ処理装置１２で画像データに変換している。
【００２２】
尚、高周波検出器１１に適当なバイアスをかけるため、高周波発振器１から発振された高周波の一部を方向性結合器１３によって分岐させ、移相器１４で位相を調節した後、再び方向性結合器１５で合流させる操作を加えている。
【００２３】
本発明は、このようなＥＳＲ装置を用いて、光照射の皮膚に対する影響を評価する。工程１において、試験動物、例えば、マウス、より一般的にはへアレスマウスにスピンプローブ剤と投与する。
【００２４】
本発明において使用可能なスピンプローブは、ＥＳＲ装置に従来使用されているスピンプローブから測定部位を考慮して適宜選択することが可能である。本発明で使用可能なスピンプローブの代表例として、３−カルボキシル−２，２，５，５−テトラメチル−ピロリジン−１−イルオキシ（カルバモイルＰＲＯＸＹＬ）（顎顔面部位、心臟、膀胱、肝臓、脾臓等）、３−メトキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−イルオキシ（ＭＣ−ＰＲＯＸＹＬ）（脳）が挙げられるが、本発明は、これらに限定されるものではない。なお、本発明において複数の異なる部位を同時に測定する場合、異なるスピンプローブ、例えばカルバモイルＰＲＯＸＹＬとＭＣ−ＰＲＯＸＹＬとを同時に投与してもよい。試験動物にスピンプローブを投与する方法についても、従来公知の方法、例えば試験動物への静脈内接種により投与することができる。
【００２５】
この際に、コントロール用の評価物質未処理のものと、評価用の評価する物質の塗布（測定箇所）または投与したものとを別個に試験を行い、両者間の差により評価用の物質のラジカル発生／抑制力を評価することができる。
【００２６】
次に工程２において、対象用および試験用のマウスを測定条件の光の照射下で、ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｌ−ｂａｎｄ  ＥＳＲにより評価を行う。
この際に、使用する光源は、所定の波長領域を持った光、例えば紫外線領域、ＵＶ−Ａ、Ｖ−Ｂ領域などの所定波長領域の光を照射するものであれば特に限定されない。また、所望に応じて、所定波長領域以外の領域の光をカットするフィルタなどを用いて光源とすることができる。
【００２７】
なお、本発明において、異なる波長領域の光で比較実験を行うことにより評価用の物質の特定の波長領域の光の照射による皮膚でのラジカル発生の状況を比較評価することができる。
【００２８】
同様にして、光の強度を変更することによって（照射距離を変化させることによって実現）、所定波長の光の強度による影響を比較評価することも可能である（例えば、冬場の紫外線強度の弱い場合と夏場の紫外線強度の強い場合などの評価）。
【００２９】
このようにして、本発明により光照射により皮膚において発生するラジカルの状況については評価することが可能となる。
【００３０】
なお、予備実験として、測定環境における光（強度及び波長帯域）のラジカル発生状況をＸバンドＥＳＲにより予め実施することが好ましい。すなわち、本発明の評価条件における光照射によりスピンプローブと反応するラジカル種を予め同定しておくことが好ましい。
【実施例】
【００３１】
雌ヘアレスマウス  （ＨＯＳ：ＨＲ−１）  を  ＵＶ−Ｂ  照射群  （ＵＶ−Ｂ  群）  と、抗酸化剤投与群  （アスコルビン酸  （Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ；  ＡＳＡ  群）、アスコルビン酸二リン酸  （Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  ２−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；  ＡＡ２Ｐ  群））  に分類し、スピンプローブとして３−Ｃａｒｂａｍｏｙｌ−２，２，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−３−ｐｙｒｒｏｌｉｎ−１−ｙｌｏｘｙ  （Ｃａｒｂａｍｏｎｙｌ−Ｐｒｏｘｙｌ；  Ｃ−ＰＲＯＸＹＬ、１４０  ｍＭ）  を尾静脈から投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｌ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ  画像法を用いて頭頚頸部皮膚の画像化と、Ｃ−ＰＲＯＸＹＬ  の減衰速度により  ＵＶ  による酸化ストレス評価をおこなった。
【００３２】
（予備実験）  生体外評価）
予備実験としてＸバンドＥＳＲ装置により本実施例の条件でスピンプローブ剤と反応するラジカル種を調査した。結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2010271056.tif 000002
【００３４】
これらの結果から、本実施例における実験系ではＯＨ・、ＲＯＯ・が優位に発生するものと推察できる。
【００３５】
これらの結果から、インビボ実験を行ったところ、ＲＯＯ・がＵＶＢ照射した際に発生することが判り、テストしたフリーラジカル清掃剤により抑制できることが判った。
【００３６】
インビボ実験の条件を表２に示す。
【００３７】
【表２】
2010271056.tif 000003
【００３８】
すなわち、Ｃ−ＰＲＯＸＹＬ  減衰画像を  ＥＳＲ  画像法により確認し、ＵＶ−Ｂ  群において減衰速度の有意な亢進がみられた。また  抗酸化剤投与群いずれも  ＵＶ−Ｂ  群に比べ、Ｃ−ＰＲＯＸＹＬ  減衰速度の亢進が抑制された。今回の結果から、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＥＳＲ  法により、ＵＶ  による頭頚部皮膚領域の酸化ストレスを非侵襲的に評価することが可能となったことが判る。
【符号の説明】
【００３９】
１    高周波発信器
２    ステップアッテネータ
３    サーキュレータ
４    高周波線路
５    ルーフギャップ共振器
６    静磁場コイル
【図１】
2010271056.tif 000004