(57)【要約】      （修正有）【課題】小胞体膜貫通グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の活性を調節することによって、アポトーシスを調節する組成物および方法の提供。【解決手段】アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）の相互作用を調節する薬剤に、ＧＲＰを接触させることを含む方法。前記ＧＲＰが小胞体に局在する、方法。前記ＧＲＰがＧＲＰ９４またはＧＲＰ７８である、方法。前記アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分がカスパーゼである、方法。【選択図】図１
2010233569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のアポトーシスを調節する方法であって、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）の相互作用を調節する薬剤に、ＧＲＰを接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記ＧＲＰが小胞体に局在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＧＲＰがＧＲＰ９４またはＧＲＰ７８である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＧＲＰがＧＲＰ７８である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分がカスパーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記カスパーゼが、Ｃｅｄ−３、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、およびカスパーゼ１１〜１４からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記カスパーゼがカスパーゼ−７である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞質ゾル成分がポリペプチドの複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記調節がアポトーシスの抑制による、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＲＰタンパク質またはその機能性断片をコードする核酸に、細胞を接触させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＲＰタンパク質がＧＲＰ７８である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸が発現ベクターに含有されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸が制御エレメントに作用可能に連結している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記制御エレメントがプロモータである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＲＰ７８断片が、細胞質ゾル成分と相互作用するＧＲＰ７８の可溶性断片を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記調節がアポトーシスの促進による、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記調節が、前記細胞質ゾル成分とのＧＲＰの相互作用を抑制すること、またはＧＲＰの産生を抑制することによる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、小分子、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸分子、またはこれらの組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤が小分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が、ヴァーシペロスタチン（ＶＳＴ）、ｄＡＴＰ、またはこれらの組合せである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が前記タンパク質のＡＴＰ結合ドメインと相互作用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、ＡＴＰ、または、前記タンパク質のＡＴＰ結合ドメインに結合するＡＴＰ誘導体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＡＴＰ結合ドメインが配列番号２のアミノ酸１２５〜２７５を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤が配列番号２のアミノ酸１５０〜２５０と相互作用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が配列番号２のアミノ酸１７５〜２０１と相互作用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸が、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、またはこれらの組合せである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記アンチセンス分子がＧＲＰ７８ポリヌクレオチドと相互作用する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｓｉＲＮＡがＧＲＰ７８ポリヌクレオチドと相互作用する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記アンチセンス分子が配列番号１と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記アンチセンス分子は配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アンチセンス分子は配列番号３を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記アンチセンス分子が配列番号３からなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号４と約９０％同一である配列およびその相補配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号４と約９５％同一である配列およびその相補配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号４およびその相補配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号４およびその相補配列からなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸がベクター中で細胞に送達される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞との接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞との接触がｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記アポトーシスが、脳卒中、心発作、低酸素、低血糖、脳もしくは脊髄虚血、脳もしくは脊髄損傷に関連した疾患または障害の結果起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項４２】
前記調節がアポトーシスの促進であり、前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項４４】
細胞のアポトーシスを促進する方法であって、（ｉ）ＧＲＰ７８が細胞質ゾルタンパク質と相互作用する機能を抑制または防止する薬剤、および／または（ｉｉ）ＧＲＰ７８の産生を抑制する薬剤でグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）を抑制することを含む方法。
【請求項４５】
前記薬剤がポリペプチドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記薬剤が小分子である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記薬剤が、前記タンパク質の疎水性膜貫通ドメインＩＩＩ（配列番号１または２のアミノ酸２１０〜２６０）またはドメインＩＶ（配列番号１または２のアミノ酸４００〜４５０）と相互作用する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法であって、
ａ）内在的に膜に結合しているグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）を準備するステップと、
ｂ）少なくとも１種類のカスパーゼを含む細胞質ゾル成分を準備するステップと、
ｃ）薬剤を準備するステップと、
ｄ）ａ）のタンパク質を、ｂ）の成分およびｃ）の薬剤に、同時に、または順番に接触させるステップと、
ｅ）対照と比較した、前記タンパク質と前記成分との相互作用に対する薬剤の作用を決定するステップと
を含む方法。
【請求項５０】
前記カスパーゼがカスパーゼ−７である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記内在的に膜に結合しているグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）がミクロソーム複合体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記薬剤の作用が、前記タンパク質と前記成分との相互作用を抑制することである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記アッセイが、ある細胞で行われる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞をエトポシドと接触させることをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記決定が、前記薬剤の存在下および非存在下における細胞の生存率を測定することによる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）ポリヌクレオチドと相互作用する核酸を含むグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）抑制核酸分子。
【請求項５７】
前記核酸がアンチセンス分子である、請求項５６に記載のＧＲＰ抑制核酸分子。
【請求項５８】
（ａ）配列番号３と少なくとも８０％同一であり、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する配列を含む核酸または断片、
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％同一であり、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する配列を含む核酸または断片、
（ｃ）配列番号３と少なくとも９５％同一であり、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する配列を含む核酸または断片、
（ｄ）配列番号３に記載の配列を含む核酸、および
（ｅ）配列番号３に記載の配列からなる核酸
からなる群から選択される、請求項５７に記載のアンチセンス分子。
【請求項５９】
前記ＧＲＰポリヌクレオチドがＧＲＰ７８ポリヌクレオチドである、請求項５７に記載のアンチセンス分子。
【請求項６０】
前記核酸が短鎖抑制核酸（ｓｉＮＡ）分子である、請求項５６に記載のＧＲＰ抑制核酸分子。
【請求項６１】
前記ｓｉＮＡ分子が、
（ａ）配列番号４と少なくとも９０％同一である配列およびその相補配列を含み、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する核酸、
（ｂ）配列番号４と少なくとも９５％同一である配列およびその相補配列を含み、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する核酸、
（ｃ）配列番号４に記載の配列およびその相補配列を含む核酸、および
（ｄ）配列番号４に記載の配列およびその相補配列からなる核酸配列
からなる群から選択される、請求項６０に記載のＧＲＰ抑制核酸分子。
【請求項６２】
ＧＲＰタンパク質の可溶性ドメインを含む、グルコース調節タンパク質を調節する薬剤。
【請求項６３】
アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）のＡＴＰ結合ドメインを含むポリペプチドを準備するステップと、
（ｂ）少なくとも１種類のカスパーゼを含む細胞質ゾル成分を準備するステップと、
（ｃ）薬剤を準備するステップと、
（ｄ）（ａ）のポリペプチドを、（ｂ）の成分および（ｃ）の薬剤に、同時に、または順番に接触させるステップと、
（ｅ）対照と比較した、前記ポリペプチドおよび前記成分の相互作用に対する前記薬剤の作用を決定するステップと
を含む方法。
【請求項６４】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸１２５〜２７５を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸１５０〜２５０を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリペプチドが配列番号１または２のアミノ酸１７５〜２０１を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
膜とのグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）のタンパク質の疎水性膜貫通ドメインＩＩＩ（配列番号１または２のアミノ酸２１０〜２６０）および／またはドメインＩＶ（配列番号１または２のアミノ酸４００〜４５０）を含むポリペプチドを準備するステップと、
（ｂ）薬剤を準備するステップと、
（ｃ）ａ）のポリペプチドをｂ）の薬剤と同時に、または順番に接触させるステップと、
（ｄ）対照と比較した、前記膜との前記ポリペプチドの相互作用に対する前記薬剤の作用を決定するステップと
を含む方法。
【請求項６８】
カスパーゼポリペプチドを含む細胞を、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）小胞体膜貫通タンパク質との前記ポリペプチドの相互作用を調節する薬剤と接触させることを含む、アポトーシスを調節する方法。
【請求項６９】
前記カスパーゼが、Ｃｅｄ−３、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、およびカスパーゼ１１〜１４からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記カスパーゼがカスパーゼ−７である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記調節がアポトーシスの促進による、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記調節がアポトーシスの抑制による、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記薬剤がポリペプチドである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記薬剤が小分子である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリペプチドが、配列番号２からなるポリペプチドの断片である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記断片が、配列番号２を含むポリペプチドの可溶性ドメインを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記薬剤が核酸分子である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
前記核酸が、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、またはこれらの組合せである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記アンチセンス分子がＧＲＰ７８ポリヌクレオチドと相互作用する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ｓｉＲＮＡがＧＲＰ７８ポリヌクレオチドと相互作用する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記アンチセンス分子が、配列番号３と少なくとも８０％同一である配列を含み、配列番号１を含むポリヌクレオチドと特異的に相互作用する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記アンチセンス分子が、配列番号３と少なくとも９０％同一である配列を含み、配列番号１を含むポリヌクレオチドと特異的に相互作用する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記アンチセンス分子が配列番号３を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記アンチセンス分子が配列番号３からなる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号４と約９０％同一である配列およびその相補配列を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号４と約９５％同一である配列およびその相補配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号４およびその相補配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号４およびその相補配列からなる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞を化学療法薬と接触させることをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９０】
グルコース調節タンパク質９４（ＧＲＰ９４）小胞体膜貫通タンパク質を含む細胞を、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分との膜貫通タンパク質の相互作用を調節する薬剤と接触させることを含む、アポトーシスを調節する方法。
【請求項９１】
標的組織のアポトーシスを抑制する方法であって、前記組織でＧＲＰ７８またはＧＲＰ９４を過剰発現することを含む方法。
【請求項９２】
前記組織がニューロン組織である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記組織が血管組織である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記組織が心臓組織である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質９４（ＧＲＰ９４）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）グルコース調節タンパク質９４（ＧＲＰ９４）を準備するステップと、
（ｂ）少なくとも１種類のカスパーゼを含む細胞質ゾル成分を準備するステップと、
（ｃ）薬剤を準備するステップと、
（ｄ）（ａ）のタンパク質を、（ｂ）の成分および（ｃ）の薬剤に、同時に、または順番に接触させるステップと、
（ｅ）対照と比較した、前記タンパク質と前記成分との相互作用に対する前記薬剤の作用を決定するするステップと
を含む方法。
【請求項９６】
発現制御エレメントに作用可能に連結したグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）抑制核酸分子を含む核酸コンストラクト。
【請求項９７】
前記核酸がアンチセンス分子である、請求項９６に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９８】
前記アンチセンス分子が、
（ａ）配列番号３と少なくとも８０％同一であり、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する配列を含む核酸または断片、
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％同一であり、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する配列を含む核酸または断片、
（ｃ）配列番号３と少なくとも９５％同一であり、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する配列を含む核酸または断片、
（ｄ）配列番号３に記載の配列を含む核酸、および
（ｅ）配列番号３に記載の配列からなる核酸
からなる群から選択される、請求項９７に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９９】
前記抑制核酸分子が短鎖抑制核酸（ｓｉＮＡ）分子である、請求項９６に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１００】
前記ｓｉＮＡ分子が、
（ａ）配列番号４と少なくとも９０％同一である配列およびその相補配列を含み、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する核酸、
（ｂ）配列番号４と少なくとも９５％同一である配列およびその相補配列を含み、ＧＲＰポリヌクレオチドと特異的に相互作用する核酸、
（ｃ）配列番号４に記載の配列およびその相補配列を含む核酸、ならびに
（ｄ）配列番号４に記載の配列およびその相補配列からなる核酸
からなる群から選択される、請求項９９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１０１】
前記発現制御エレメントがグルコース応答タンパク質７８（ｇｒｐ７８）プロモータ配列を含む、請求項９６に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１０２】
前記ｇｒｐ７８プロモータ配列が、ｇｒｐ７８コード配列の転写開始部位の約３０００の塩基対５’側から、ｇｒｐ７８コード配列の開始部位の２００塩基対３’側までの配列を含む、請求項１０１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１０３】
前記ｓｉＮＡ分子が内在性ＧＲＰポリヌクレオチドの発現を破壊する、請求項９９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１０４】
前記内在性ＧＲＰポリヌクレオチドがＧＲＰ７８ポリヌクレオチドである、請求項１０３に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１０５】
請求項９６に記載の核酸コンストラクトを含む組換え体ベクター。
【請求項１０６】
前記ベクターが動物細胞発現ベクターである、請求項１０５に記載の組換え体ベクター。
【請求項１０７】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１０５に記載の組換え体ベクター。
【請求項１０８】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１０７に記載の組換え体ベクター。
【請求項１０９】
請求項９６に記載の核酸コンストラクトを、薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
【請求項１１０】
細胞増殖障害を有する標的細胞を、請求項９６に記載の核酸コンストラクトと接触させることを含む、細胞増殖を抑制する方法。
【請求項１１１】
請求項９６に記載の核酸コンストラクトを対象に投与することを含む、対象の細胞増殖障害を治療する方法。
【請求項１１２】
前記対象が哺乳動物である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記投与が、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ投与が全身投与、局部投与、または局所投与である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記投与がｅｘ  ｖｉｖｏ投与である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１７】
前記細胞増殖障害が腫瘍性障害である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１８】
前記腫瘍性障害が、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、尿路癌、子宮癌リンパ腫、口腔癌、膵臓癌、白血病、黒色腫、胃癌、甲状腺癌、肝臓癌、脳腫瘍、および卵巣癌からなる群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
発現制御エレメントに作用可能に連結したグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト。
【請求項１２０】
前記発現制御エレメントがグルコース応答タンパク質７８（ｇｒｐ７８）プロモータ配列を含む、請求項１１９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１２１】
前記ＧＲＰポリヌクレオチドがＧＲＰ７８ポリヌクレオチドおよび／またはＧＲＰ９４ポリヌクレオチドを含む、請求項１１９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１２２】
前記ＧＲＰポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１と少なくとも８０％同一である配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドから生成されたポリペプチドがアポトーシスを抑制する、ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドから生成されたポリペプチドがアポトーシスを抑制する、ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドから生成されたポリペプチドがアポトーシスを抑制する、ポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号１の断片を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドから生成されたポリペプチドがアポトーシスを抑制する、ポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項１２１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１２３】
前記ｇｒｐ７８プロモータ配列が、ｇｒｐ７８コード配列の転写開始部位の約３０００の塩基対５’側から、ｇｒｐ７８コード配列の開始部位の２００塩基対３’側までの配列を含む、請求項１２０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１２４】
請求項１１９に記載の核酸コンストラクトを含む組換え体ベクター。
【請求項１２５】
前記ベクターが動物細胞発現ベクターである、請求項１２４に記載の組換え体ベクター。
【請求項１２６】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１２４に記載の組換え体ベクター。
【請求項１２７】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１２６に記載の組換え体ベクター。
【請求項１２８】
請求項１１９に記載の核酸コンストラクトを、薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
【請求項１２９】
虚血に感受性の細胞を有する標的細胞を、請求項１１９に記載の核酸コンストラクトと接触させることを含む、虚血による組織損傷を抑制する方法。
【請求項１３０】
請求項１１９に記載の核酸コンストラクトを対象に投与することを含む、対象の虚血組織傷害を治療する方法。
【請求項１３１】
前記対象が哺乳動物である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記投与がｉｎ  ｖｉｖｏ投与である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ投与が全身投与、局部投与、または局所投与である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記投与がｅｘ  ｖｉｖｏ投与による、請求項１３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]この出願は、参照により本明細書に援用する２００３年１０月２７日出願の米国特許仮出願第６０／５１４６６１号に基づく優先権を、米国特許法第１１９条の下に主張する。
【米国政府の資金助成を受けた研究に関する記載】
【０００２】
[0002]本明細書に記載の発明は、部分的に、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の助成金番号ＣＡ２０６０７およびＡＩ４２３９４からの資金を用いて行われたものであり、米国特許法第２０２条に従い、米国政府が本発明に特定の権利を有することを承認する。
【技術分野】
【０００３】
[0003]本発明は、選択的にグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）を標的とすることによって、アポトーシスを調節する方法および組成物に関し、より詳細には、ＧＲＰ７８およびプロカスパーゼの活性および／または相互作用を調節することに関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]化学療法に対する耐性は依然として癌治療の主要な障害である。ヒト癌における薬物耐性の複雑さは、複数の経路が関与していることを示唆する。１つの機構は癌細胞中での遺伝子変化の結果であり、これは内因性のものと後天性のものとの両方がある。別の機構は、固形腫瘍で自然に生じる環境条件の結果でありうる。血管新生が乏しいため、固形腫瘍は、グルコース飢餓および低酸素を起こしている領域を通常含有し、この結果、アシドーシス、および細胞代謝の変化が起きている。低酸素、および栄養物の枯渇は、分化の進んだ、成長の遅い、非転移性の腫瘍でも、成長の速い攻撃的な未分化の悪性腫瘍でも起こる。
【０００５】
[0005]グルコース飢餓など、細胞培養でのストレス状態は、通常、グルコースで調節されたストレス応答を引き起こすが、これは非折りたたみタンパク質反応（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）と呼ばれる一般的な細胞防御機構の一部である。ＵＰＲの特徴の１つは、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）と呼ばれる、小胞体（ＥＲ）に局在するストレスタンパク質を誘導することである。ＧＲＰは、防御的な特性を有するＣａ２＋結合シャペロンタンパク質である。最もよく特徴付けされているＧＲＰはＧＲＰ７８であり、これはＢｉＰとも呼ばれる７８ｋＤａタンパク質である。タンパク質シャペロンとして、ＧＲＰ７８は、ＥＲを通してプロセシングされた異種タンパク質と複合体を形成することが知られている。
【０００６】
[0006]グルコース調節タンパク質、すなわちＧＲＰ（ＧＲＰ７４、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０、ＥＲｐ７２、ＰＤＩ、カルレティキュリン、およびＧＲＰ５８（別名ＥＲｐ５７））は、タンパク質の折りたたみおよび組み立てを補助するＥＲ分子シャペロンである。ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＥＲｐ７２、およびカルレティキュリンはＣａ２＋結合タンパク質でもある。ＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４は、熱ショックタンパク質と配列相同性を共有する。ＧＲＰファミリーのタンパク質は、グルコース飢餓、低酸素、細胞内カルシウムの変化、およびグリコシル化阻害剤への曝露によって協調的に誘導され、また、ＰＤＴ媒介の酸化ストレスによっても誘導される（Ｇｏｍｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６５７４−７９、１９９１年；およびＬｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １５３：５７５−８２、１９９２年）。７８０００  ＧＲＰ（すなわち、ＧＲＰ７８）は、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質と配列が同一であり、ＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４は両方ともＥＲに局在している。
【０００７】
[0007]エトポシドなど、トポイソメラーゼ阻害剤を含めた多数の細胞毒性薬物がプログラム細胞死の開始を行う。エトポシドなどのＤＮＡ損傷薬は、ｐ５３の媒介によるカスパーゼ細胞死シグナルカスケードを介した細胞死を引き起こすことができ、その結果、チトクロームｃの遊離およびカスパーゼ−３の活性化をもたらす。カスパーゼ−３、−６、および−７は、カスパーゼにおけるアポトーシス遂行グループのメンバーであり、カスパーゼ−７が構造的に、そして機能的に最もカスパーゼ−３に類似している。活性のカスパーゼ−７は、ミトコンドリアおよびＥＲの膜に結合していることが示されているが、カスパーゼ−３は細胞質ゾル中に残留する。これらの観測は、類似のアポトーシス遂行タンパク質が異なった細胞コンパートメントで機能し、かつ別個の基質に作用することを示唆するが、アポトーシス過程における、ＥＲなどの細胞小器官の寄与については情報が限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0008]したがって、アポトーシス経路に関与するタンパク質相互の主要な相互作用を同定し、さらにそれらの相互作用を調節する必要性が当技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[0009]細胞システムでの過剰発現およびアンチセンスアプローチは、ＧＲＰ７８が、ＥＲ恒常性の撹乱によって引き起こされた細胞死から細胞を防御できることを示す。ＧＲＰ７８の過剰発現は、ＥＲストレスにさらされた正常な組織および臓器の損傷を制限するかもしれないが、ＧＲＰ７８の抗アポトーシス機能は、それが腫瘍細胞で自然に誘導されることによって、癌の進行および薬物耐性を導くかもしれないことを予測する。様々な癌細胞系、固形腫瘍、およびヒト癌生検試料中でＧＲＰ７８レベルが高く、悪性腫瘍との相関性を示している。グルコース調節されたストレス応答の結果に、ＧＲＰ７８、および細胞の薬物耐性と相関関係のある他の協調的に調節されたＧＲＰ遺伝子が誘導されることを、多数のストレス誘発研究が、ヒト癌および他の細胞系を用いて示している。それにもかかわらず、薬物耐性付与におけるＧＲＰの直接的役割は立証されていない。これは、ＧＲＰを誘導するのに、ストレス誘発剤、または、ある特定の細胞機能の欠損を使用することに伴う固有の問題のためであるが、これは誘導条件によって他の未知の多面的効果が作用するかもしれず、場合によっては複数の細胞経路に影響を与えるからである。加えて、薬剤耐性におけるＥＲ局在ＧＲＰの防御機能の機構も理解に至っていない。
【００１０】
[0010]細胞における、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分との、グルコース応答タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の物理的および機能的相互作用を調節することによってアポトーシスを調節する方法および組成物を提供する。これらの方法および組成物は、細胞増殖障害を治療するために、アポトーシス誘導性の治療用化合物と併せて使用できる薬剤を同定するのに特によく適している。したがって、この開示は、例えば細胞増殖障害など、対象の疾患を治療、予防、および／または遅延させるための医薬組成物の調製に関する。
【００１１】
[0011]したがって一実施形態では、本発明は、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分との膜貫通タンパク質の相互作用を調節する薬剤に、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）小胞体膜貫通タンパク質を接触させることによってアポトーシスを調節する方法を提供する。一態様では、上記細胞質ゾル成分がカスパーゼである。上記カスパーゼは、例えば、カスパーゼ−７でありうる。一般的には、この方法は、アポトーシスを促進または抑制するのに使用できる。上記薬剤は、例えば、ポリペプチド、抗体、または小分子でありうる。一態様では、上記薬剤が、ＧＲＰ７８のＡＴＰ結合ドメインと相互作用する。
【００１２】
[0012]別の実施形態では、本発明は、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）を、このタンパク質が小胞体膜に貫入する能力を抑制または防止する薬剤と接触させることによってアポトーシスを調節する方法を提供する。一態様では、上記薬剤は、ＧＲＰ７８の疎水性膜貫通ドメインＩＩＩ（配列番号２のアミノ酸２１０〜２６０）またはドメインＩＶ（配列番号２のアミノ酸４００〜４５０）と相互作用する。
【００１３】
[0013]別の実施形態では、本発明は、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、内在的に膜に結合しているグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）を準備するステップと、少なくとも１種類のカスパーゼを含む細胞質ゾル成分を準備するステップと、薬剤を準備するステップと、上記タンパク質を上記成分および上記薬剤に、同時に、または順番に接触させるステップと、対照と比較した、上記タンパク質および上記成分の相互作用に対する上記薬剤の作用を決定するするステップとを含む。
【００１４】
[0014]別の実施形態では、本発明は、膜とのグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）のタンパク質の疎水性膜貫通ドメインＩＩＩ（配列番号２のアミノ酸２１０〜２６０）および／またはドメインＩＶ（配列番号２のアミノ酸４００〜４５０）を含むポリペプチドを準備するステップと、薬剤を準備するステップと、上記ポリペプチドを上記薬剤と接触させるステップと、対照と比較した、上記ポリペプチドが膜に貫入する能力に対する上記薬剤の作用を決定するステップとを含む。
【００１５】
[0015]さらに別の実施形態では、本発明は、標的組織のアポトーシスを、前記組織でＧＲＰ７８またはＧＲＰ９４を過剰発現させることによって抑制する方法を提供する。例示的な組織には、ニューロン組織、血管組織、および心臓組織が含まれる。
【００１６】
[0016]本発明は、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）の相互作用を調節する薬剤に、ＧＲＰを接触させることを含む、細胞のアポトーシスを調節する方法を提供する。
【００１７】
[0017]本発明は、（ｉ）ＧＲＰ７８が細胞質ゾルタンパク質と相互作用する能力を抑制または防止する薬剤、および／または（ｉｉ）ＧＲＰ７８の産生を抑制する薬剤でグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）を抑制することを含む、細胞のアポトーシスを促進する方法も提供する。
【００１８】
[0018]本発明は、さらに、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）内在的に膜に結合しているグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）を準備するステップと、（ｂ）少なくとも１種類のカスパーゼを含む細胞質ゾル成分を準備するステップと、（ｃ）薬剤を準備するステップと、（ｄ）ａ）のタンパク質を、（ｂ）の成分およびｃ）の薬剤に、同時に、または順番に接触させるステップと、（ｅ）対照と比較した、前記タンパク質と前記成分との相互作用に対する前記薬剤の作用を決定するするステップとを含む。
【００１９】
[0019]本発明は、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）ポリヌクレオチドと相互作用する核酸を含むグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）抑制核酸分子を提供する。一態様では、上記抑制核酸がアンチセンス分子である。別の態様では、上記核酸が短鎖抑制核酸（ｓｉＮＡ）分子である。
【００２０】
[0020]本発明は、ＧＲＰタンパク質の可溶性ドメインを含むグルコース調節タンパク質調節薬剤も提供する。
【００２１】
[0021]本発明は、さらに、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）のＡＴＰ結合ドメインを含むポリペプチドを準備するステップと、（ｂ）少なくとも１種類のカスパーゼを含む細胞質ゾル成分を準備するステップと、（ｃ）薬剤を準備するステップと、（ｄ）（ａ）のポリペプチドを、（ｂ）の成分および（ｃ）の薬剤に、同時に、または順番に接触させるステップと、（ｅ）対照と比較した、上記ポリペプチドおよび上記成分の相互作用に対する上記薬剤の作用を決定するステップとを含む。
【００２２】
[0022]本発明は、さらになお、膜とのグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）のタンパク質の疎水性膜貫通ドメインＩＩＩ（配列番号１または２のアミノ酸２１０〜２６０）および／またはドメインＩＶ（配列番号１または２のアミノ酸４００〜４５０）を含むポリペプチドを準備するステップと、（ｂ）薬剤を準備するステップと、（ｃ）ａ）のポリペプチドをｂ）の薬剤に、同時に、または順番に接触させるステップと、（ｄ）対照と比較した、上記膜との上記ポリペプチドの相互作用に対する上記薬剤の作用を決定するステップとを含む。
【００２３】
[0023]本発明は、カスパーゼポリペプチドを含む細胞を、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）小胞体膜貫通タンパク質との上記ポリペプチドの相互作用を調節する薬剤と接触させることを含む、アポトーシスを調節する方法を提供する。
【００２４】
[0024]本発明は、グルコース調節タンパク質９４（ＧＲＰ９４）小胞体膜貫通タンパク質を含む細胞を、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分との膜貫通タンパク質の相互作用を調節する薬剤と接触させることを含む、アポトーシスを調節する方法も提供する。
【００２５】
[0025]本発明は、さらに、標的組織のアポトーシスを抑制する方法を提供し、この方法は、上記組織でＧＲＰ７８またはＧＲＰ９４を過剰発現することを含む。
【００２６】
[0026]本発明は、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのグルコース調節タンパク質９４（ＧＲＰ９４）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）グルコース調節タンパク質９４（ＧＲＰ９４）を準備するステップと、（ｂ）少なくとも１種類のカスパーゼを含む細胞質ゾル成分を準備するステップと、（ｃ）薬剤を準備するステップと、（ｄ）（ａ）のタンパク質を、（ｂ）の成分および（ｃ）の薬剤に、同時に、または順番に接触させるステップと、（ｅ）対照と比較した、上記タンパク質および上記成分の相互作用に対する上記薬剤の作用を決定するステップとを含む。
【００２７】
[0027]本発明によって、発現制御エレメントに作用可能に連結したグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）抑制核酸分子を含む核酸コンストラクトも提供される。
【００２８】
[0028]別の態様では、本発明は、発現制御エレメントに作用可能に連結したグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）抑制核酸分子を含む核酸コンストラクトを含む組換え体ベクターを提供する。
【００２９】
[0029]本発明は、本発明の核酸コンストラクトを、薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
[0030]細胞増殖を抑制する方法も、本発明によって提供される。この方法は、細胞増殖障害を有する標的細胞を、本発明の核酸コンストラクトと接触させることを含む。
【００３１】
[0031]さらに別の態様では、本発明は、本発明の核酸コンストラクトを対象に投与することを含む、対象の細胞増殖障害を治療する方法を提供する。
【００３２】
[0032]本発明は、発現制御エレメントに作用可能に連結したグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを提供する。
【００３３】
[0033]本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付図面および以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Ａは、親であるＣＨＯ細胞系と、それに派生するＣ．１とにおけるＧＲＰ７８タンパク質レベルの比較を示す図である。総タンパク質溶解物（２５および５０μｇ／レーン）を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、およびタンパク質Ｘのレベルを、抗ＫＤＥＬ抗体を用いた免疫ブロッティングによって測定した。Ｂは、ＧＲＰ７８局在を免疫蛍光法によって示す図である。ＧＲＰ７８の細胞内分布は、主として核周囲であり、これはＥＲ局在性を示す。Ｃは、ＥＲにおけるＧＲＰ７８およびカスパーゼ−７の共局在性を示す図である。緑色蛍光はカスパーゼ−７を示し、赤色はＧＲＰ７８を示し、紫色染色は核を表す。複合イメージでは、黄色染色が共局在性を示す。
【図２】Ａは、様々な濃度のエトポシドに６ｈさらされたＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞のクローン原性生存試験を示す図である。Ｂは、様々な濃度のアドリアマイシンに１ｈさらされたＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞のクローン原性生存試験を示す図である。Ｃは、様々な濃度のカンプトテシンに２４ｈさらされたＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞のクローン原性生存試験を示す図である。
【図３】Ａは、ＧＲＰ７８過剰発現が、エトポシドによって誘導されたアポトーシスから細胞を防御することを示す図である。Ｃ．１細胞およびＣＨＯ細胞は、無処理（Ｃｔｒｌ）であるか、あるいは３０μＭのエトポシド（Ｅｔｏｐ）で６ｈ処理されている。生存細胞は、アネキシン染色が低レベルであるか無染色、かつＰＩ染色を有する細胞である（左下のパネル）。初期アポトーシス細胞は、高レベルのアネキシン染色および低レベルのＰＩ染色によって表され（右下のパネル）、さらに後期のアポトーシス細胞は、高レベルのアネキシン染色および高レベルのＰＩ染色によって表され（右上のパネル）、そして、壊死は、高レベルのＰＩ染色および低レベルのアネキシン染色を有する細胞によって表される（左上のパネル）。Ｂは、エトポシド処理の後の、ＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞のＤＮＡ断片化パターンを示す図である。
【図４】Ａは、ＧＲＰ７８の過剰発現が、ヒト膀胱癌Ｔ２４／８３細胞にエトポシド耐性を付与することを示す図である。空のベクターであるｐｃＤＮＡ（Ｔ２４／８３−ｐｃＤＮＡ）または野生型ＧＲＰ７８を発現するベクター（Ｔ２４／８３−ＧＲＰ７８）で安定に形質移入されたＴ２４／８３細胞系が確立された。２つの細胞系でのＧＲＰ７８タンパク質レベルの免疫ブロット分析を示す（挿入図）。Ｂは、ＧＲＰ７８を発現するＴ２４／８３細胞の免疫蛍光イメージを示す図である。ＧＲＰ７８の局在は核周囲である。Ｃは、エトポシドによって誘導されたアポトーシスに対するＧＲＰ７８の過剰発現の影響を示す図である。Ｔ２４／８３−ｐｃＤＮＡ細胞およびＴ２４／８３−ＧＲＰ７８細胞は、無処理（Ｃｔｒｌ）であるか、あるいはエトポシドで処理されている（Ｅｔｏｐ）。
【図５】Ａは、トポイソメラーゼＩＩ発現およびカスパーゼ−７活性化に対するＧＲＰ７８の過剰発現の影響を示す図である。総タンパク質溶解物は、無処理（Ｃｔｒｌ）またはエトポシド処理（Ｅｔｏｐ）のＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞から調製された。Ｂは、ＧＲＰ７８の過剰発現を、カスパーゼ−７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化抑制として示す図である。Ｃは、１０μＭチトクロームｃの存在下（＋）または非存在下（−）で、示されている通りの様々な量のｄＡＴＰ（ｍＭ）とインキュベートされたＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞から調製された細胞質抽出物を示す図である。
【図６】Ａは、抗カスパーゼ−７抗体（レーン１および２）または抗カスパーゼ−３抗体（レーン３および４）で免疫沈降された、ＣＨＯ細胞またはＣ．１細胞から得られた細胞溶解物を示す図である。Ｂは、抗カスパターゼ−７抗体で免疫沈降された、ＣＨＯ細胞およびＡＤ１細胞から得られた抽出緩衝液中の細胞溶解物を示す図である（レーン１および２）。平行して、ＣＨＯ細胞およびＡＤ１細胞から得られた全細胞抽出物（ＷＣＥ）の免疫沈降を行った（レーン３および４）。ＧＲＰ７８、プロカスパーゼ−７、および欠失変異型ＧＲＰ７８（Δ７８）の位置が示されている。Ｃは、シグナル配列（Ｓ）、ＡＴＰ結合ドメイン、およびアミノ酸１７５〜２０１にまたがるＡＤ−１の欠失の位置を示す、野生型（ｗｔ）ＧＲＰ７８およびＡＤ−１の概略図を示す図である。
【図７】Ａは、ウインドウサイズ１７を用いたＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法を使用して作成されたＧＲＰ７８の疎水性プロットを示す図である。４つの推定上の疎水性ドメイン（Ｉ−ＩＶ）が同定されている。下部は、成熟したＧＲＰ７８タンパク質の概略図を表し、ここでは、疎水性ドメインＩＶおよびＩＩＩが、推定上の膜貫通ドメインとして、トリプシン耐性を有する３５−ｋＤａおよび５０−ｋＤａのカルボキシル断片を形成する。Ｂは、限定的トリプシン消化を示す図である。Ｃ．１細胞から単離されたミクロソームは、無処理（レーン１）であるか、あるいは０．０１％（レーン２）または０．０５％（レーン２）の濃度のトリプシンで消化された。反応の終わりに、カルボキシル末端を認識する抗ＧＲＰ７８ウサギポリクローナル抗体（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ社、Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｃａｎａｄａ）を用いたウェスタンブロットによってＧＲＰ７８の量を検出した（左のパネル）。完全長ＧＲＰ７８のバンドは、塗りつぶした矢印で示されており、３５−ｋＤａおよび５０−ｋＤａのタンパク質分解産物は、星印で強調された白抜きの矢印によって示されている。同一の膜をストリッピングし、抗カルレティキュリン（ＣＲＴ）ウサギポリクローナル抗体（中央パネル）、または、カルネキシンのアミノ末端を認識する抗カルネキシンウサギポリクローナル抗体で再度プロービングした（右のパネル）。完全長のＣＲＴおよびカルネキシンは、塗りつぶした矢印によって示されており、カルネキシンの７０−ｋＤａタンパク質分解産物は、星印で強調された白抜きの矢印によって示されている。Ｃは、炭酸ナトリウム抽出を示す図である。ミクロソーム（Ｍ）画分は、無処理（レーン１）であるか、あるいは１００ｍＭ炭酸ナトリウムで処理されて、さらにペレット（Ｐ）画分および上清（Ｓ）画分（それぞれレーン２および３）に分離した。各画分からのタンパク質試料は、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、抗ＧＲＰ７８ウサギ抗体（左のパネル）、抗カルレティキュリンウサギ抗体（中央パネル）、および抗カルネキシンウサギ抗体（右のパネル）を用いたウェスタンブロットに用いた。
【図８】Ａは、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、抗カスパターゼ−７抗体を用いて免疫沈降された、無処理（Ｃｔｒｌ）またはエトポシド処理（Ｅｔｏｐ）のＡＤ−１細胞およびＣ．１細胞から調製された細胞質抽出物（５０μｇ／レーン）を示す図である。Ｂは、エトポシド処理の後におけるＣ．１細胞およびＡＤ−１細胞のＤＮＡ断片化パターンを示す図である。Ｃは、ＧＲＰ７８のＡＴＰ結合ドメインが、エトポシドによって誘導される細胞死に対する防御に必要であることを示す細胞死アッセイを示す図である。Ｓ．Ｄ．が示されている。
【図９】ＧＲＰ−７８の相対的細胞周期分布を示す図である。Ｇ１、Ｇ２、およびＳ期の細胞の割合を測定した。
【図１０】３２０ｂｐのｇｒｐ７８エキソン１断片のサブクローニングを示す概略図である。
【図１１Ａ】サブクローニングに用いたスキームを示す図である。（Ａ）は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＣＭＶアデノウイルスへのＨｉｓタグ付き完全長ＧＲＰ７８のサブクローニングのスキームを示す。
【図１１Ｂ】サブクローニングに用いたスキームを示す図である。（Ｂ）は、Ｈｉｓタグ付き完全長アンチセンス（ＡＳ）ＧＲＰ７８のサブクローニングのスキームを示す。
【図１１Ｃ】サブクローニングに用いたスキームを示す図である。（Ｃ）は、ＰＳｈｕｔｔｌｅ  ＣＭＶアデノウイルスへのアンチセンス（ＡＳ）ＧＲＰ７８（３２０ＢＰ）のサブクローニングに用いたスキームを示す。
【図１２】アデノウイルスに感染した２９３Ｔ細胞における、Ｈｉｓタグ付きＧＲＰ７８、ＧＲＰ７８（ＡＳ）、および３２０（ＡＳ）の発現を示す図である。
【図１３】ＡおよびＢは、３２０（ＡＳ）の存在下および非存在下においてエトポシドで処理された形質導入ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の結果を示す図である。
【図１４】２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットを示す図である。使用されたｓｉＲＮＡ  Ｇｒｐ７８ＩＩの濃度を最上部に示す。
【図１５】ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のウェスタンブロットを示す図である。使用されたｓｉＲＮＡ  Ｇｒｐ７８ＩＩの濃度を最上部に示す。
【図１６】ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによるＧＲＰ７８抑制の結果、エトポシドによって誘導された細胞死に対する乳癌細胞の感受性が増大することを示す図である。
【図１７】ＧＲＰ−ＢｌＫ間の物理的相互作用および機能的相互作用を示す図である。（Ａ）２９３Ｔ細胞は、無処理（レーン１、２）であるか、あるいは５０μＭエトポシドで２４時間処理された（レーン３）。細胞を採取し、細胞溶解物をヤギＩｇＧ（レーン１）または抗ＢｌＫヤギ抗体（レーン２、３）のいずれかで免疫沈降した。抗ＢｌＫ抗体および抗ＧＲＰ７８抗体を用いたウェスタンブロットは、ＢｌＫとの内在性ＧＲＰ７８の免疫共沈降を示す。（Ｂ）ｐｃＤＮＡ、Ｈｉｓタグ付きＧＲＰ７８のＣＭＶプロモータ駆動発現ベクター、Ｆｌａｇタグ付きＧｌｋ−ｂ５ＴＭ発現ベクター単独、または、示されている通りの組合せを用いて２９３Ｔ細胞に一時的な形質移入を行った。４８時間後に、トリパンブルー排除アッセイによって細胞死を測定した。ｐｃＤＮＡ３で形質移入された細胞で観測されたアポトーシスのレベルを１とした。結果は、ＧＲＰ７８の過剰発現が、ＥＲを標的とするＢｌＫ−ｂ５ｔＭの一時的形質移入によって誘導された細胞死から、２９３Ｔ細胞を防御することを示した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
[0066]固形腫瘍の微環境では、独特のストレス状態がＧＲＰの誘導を導くことがある。本明細書に記載のデータおよび発明は、ＧＲＰが抗アポトーシスタンパク質として作用することを示す。ＧＲＰに媒介された防御では、アポトーシスのエフェクターとのＧＲＰの相互作用が関与し、それによって、薬物療法によって誘導された細胞死の抑制が導かれる。
【００３６】
[0067]したがって、本発明によれば、ＧＲＰ（例えば、ＧＲＰ７４、ＧＲＰ７８、およびＧＲＰ９４）は、癌などの細胞増殖疾患の治療に関連した化学療法薬、免疫療法薬、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、およびワクチンの合理的な標的を代表するものである。それらの分子シャペロンとしての機能に鑑みて、ＧＲＰ（例えばＧＲＰ７８および９４）は、限定されるものではないが、臓器（腎臓、心臓、肺、肝臓）移殖、卒中発作、および心筋梗塞を含めた虚血性損傷で生じることのあるものなど、組織の損傷およびストレスの治療薬を開発するための合理的な標的をさらに代表するものである。アポトーシスを調節する方法および組成物を提供する。
【００３７】
[0068]本発明は、細胞、組織、および／または対象のアポトーシスを調節するのに有用な方法および組成物を提供する。「アポトーシス」は、積極的な生理過程によって起こるプログラム細胞死を意味する。アポトーシスは、形態形成、免疫系の成熟、および組織恒常性を含めた発生過程で重要な役割を果たし、組織恒常性は、細胞分裂によって間断なく再生する組織中の細胞数を制限する。アポトーシスは、腫瘍形成に対する、細胞の重要な防御機能である。アポトーシス細胞、または「プログラム細胞死」の過程にある細胞は、時間的に調節された細胞死または特定の標的の細胞死に伴う１つまたは複数の特徴を示す。それらの特徴には、細胞の生存、成長、死、または分化の抑制、タンパク質／核酸の切断／断片化、クロマチン凝集、膜断片化、および１つまたは複数の、アポトーシスを促進するタンパク質またはアポトーシスを抑制するタンパク質の発現または活性の変化が含まれる。
【００３８】
[0069]アポトーシスの「調節」は、本明細書に記載されているか、当技術分野で知られているプログラム細胞死の１つまたは複数の特徴を増強、刺激、または誘導すること、あるいは、低減、抑制、阻止、または防止（例えば予防）することを意味する。例えば、この開示の方法および組成物は、ＧＲＰの活性または産生を抑制することによって、アポトーシスを増強、刺激、または誘導する薬剤（例えば、アンチセンス分子、リボザイム、ポリペプチド、小分子、および同様のもの）を含む。この開示は、虚血および同様のものによる損傷を受けた組織または細胞のアポトーシスを抑制するために、ＧＲＰの活性または産生を増強する薬剤および方法も含む。
【００３９】
[0070]ＧＲＰ７８は、新生タンパク質、分泌タンパク質、および膜貫通タンパク質に一時的結合し、ＥＲ中で異常な折りたたみまたはプロセシングを受けたタンパク質に恒久的に結合する。ＧＲＰ７８は、ＥＲでのタンパク質プロセシングが乱された場合に、細胞ストレスの最中および後における防御機能を有すると考えられている。ＧＲＰ７８は、いくつかの制癌剤、主としてラディシコールおよびゲルダナマイシンの潜在的な標的であると提案された（ＳｃｈｅｉｂｅｌおよびＢｕｃｋｎｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  ５６：６７５−８２、１９９８年）。
【００４０】
[0071]虚血においてＧＲＰ９４が有する潜在的で未だに特徴付けされていない防護的役割は、ニューロン死に至ることが知られている時間にわたる一過性前脳虚血の後で、ＧＲＰ９４の発現が海馬で促進されるという観測が支持している（Ｙａｇｉｔａら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７２：１５４４−１５５１、１９９９年）。ＧＲＰ９４は、急性腎臓虚血の後にも同様に誘導される（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：８５８４−８５８９、１９９６年）。比較すると、ＨＳＰ９０を含めた熱ショックタンパク質は、通常、虚血の後の再潅流の酸化ストレスの最中に過剰発現される。例えば、成体動物のレベルと比較して、未成熟ラット脳におけるＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４のレベルが高いことは、未成熟ラットが発作に対してより高い耐性を有することを説明するものである。加えて、発作に続く、成体ラット脳の歯状回領域でのこれらのＧＲＰの特異的誘導は、神経保護効果と関連している。早期発生の家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）では、変異体プレセニリン−１（ＰＳ１）タンパク質を発現する神経芽細胞腫細胞でのＧＲＰ７８の過剰発現が、ＥＲストレスに対する耐性を回復することが報告された。
【００４１】
[0072]ＧＲＰ７８の発現は、プリオン病および伝染性海綿状脳症などの神経変性障害と関係づけられている変異体プリオンタンパク質の凝集も防止し、そのプロテオソーム分解を促進する。ＧＲＰ７８の誘導は、高ホモシステイン血症によって引き起こされた還元ストレスによって損傷した内皮細胞でも観測されている。高ホモシステイン血症は、遺伝コンポーネントおよび環境コンポーネントと共に、早発性動脈硬化、脳卒中、心筋梗塞、血栓症などの血栓性血管イベントの一般的危険因子である。したがって、ＧＲＰの誘導は、ストレス誘導性の細胞死から内皮細胞を防御するために哺乳類で進化した適応反応であるかもしれない。
【００４２】
[0073]アポトーシスは、様々なシグナルと、細胞遺伝子産物の複雑な相互作用とによって媒介されるが、これらの相互作用の結果は、最終的には、ヒトと無セキツイ動物との間で進化的に保存されている細胞死経路に入る。この経路それ自体は、血液凝固カスケードのものに類似したタンパク分解性イベントのカスケードである。
【００４３】
[0074]アポトーシス経路に関与するいくつかの遺伝子ファミリーおよび遺伝子産物が同定されている。アポトーシスプログラムの主要要素は、カスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼファミリーである。ヒトカスパーゼファミリーには、Ｃｅｄ−３、ヒトＩＣＥ（インターロイキン−１ベータ転換酵素）（カスパーゼ−１）、ＩＣＨ−Ｉ（カスパーゼ−２）、ＣＰＰ３２（カスパーゼ−３）、ＩＣＥｒｅｌＩＩ（カスパーゼ−４）、ＩＣＥｒｅｌＩＩ（カスパーゼ−５）、Ｍｃｈ２（カスパーゼ−６）、ＩＣＥ−ＬＡＰ３（カスパーゼ−７）、Ｍｃｈ５（カスパーゼ−８）、ＩＣＥ−ＬＡＰ６（カスパーゼ−９）、Ｍｃｈ４（カスパーゼ−１０）、カスパーゼ１１〜１４、および他のものが含まれる。
【００４４】
[0075]カスパーゼは、アポトーシスが起こるのに必要であることが実証されている。さらに、カスパーゼは、古典的なアポトーシスの特徴である正確かつ限定的なタンパク分解性イベントに必要と思われる（ＳａｌｖｅｓｅｎおよびＤｉｘｉｔ、Ｃｅｌｌ  ９１：４４３−４４６、１９９７年）。アポトーシス中、イニシエーターカスパーゼのチモーゲンが、自己触媒切断によって活性化し、これが次に、エフェクターカスパーゼの不活性チモーゲンを切断することによって、エフェクターカスパーゼを活性化する（ＳａｌｖｅｓｅｎおよびＤｉｘｉｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１０９６４−１０９６７、１９９９年；Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １：９４９−９５７、１９９８年）。エフェクターは、多くの細胞タンパク質のタンパク分解性切断の原因であり、これらは、しばしばアポトーシスに伴う独特の形態変化およびＤＮＡ断片化を導く（Ｃｏｈｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：１−１６、１９９７年；Ｈｅｎｋａｒｔ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４：１９５−２０１、１９９６年；ＭａｒｔｉｎおよびＧｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ  ８２：３４９−３５２、１９９５年；ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＴｈｏｍｂｅｒｒｙ、ＴＩＢＳ  ２５７：２９９−３０６、１９９７年；Ｐｏｒｔｅｒら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １９：５０１−５０７、１９９７年；ならびにＳａｌｖｅｓｅｎおよびＤｉｘｉｔ、Ｃｅｌｌ  ９１：４４３−４４６、１９９７年に概説されている）。
【００４５】
[0076]エクゼキューターカスパーゼのうち、カスパーゼ−７はＥＲに関連することが報告されている。アポトーシスの誘導の際に、プロカスパーゼ−７（３５ｋＤａ）が最初に３２ｋＤａの中間体に変換され、これがさらに、活性の２０−ｋＤａおよび１１−ｋＤａのサブユニットにプロセシングされる。本明細書に示すウェスタンブロットのデータは、ＣＨＯ細胞をエトポシドで処理することによって、カスパーゼ−７が活性化され、３２−ｋＤａの中間体形態が生じることを示す（図５、パネルＡ）。オートラジオグラムでさらに長い露出を行うと、エトポシドで処理された細胞での、活性の２０−ｋＤａ形態および１１−ｋＤａ形態が明らかとなった。ＧＲＰ７８を過剰発現した際には、無処理の細胞と、エトポシドで処理された細胞との両方で、カスパーゼ−７の、低レベルの活性化が検出された。これらのデータは、ＧＲＰ７８が、カスパーゼ−７の活性化をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制し、それによってアポトーシスを抑制できることを示す。加えて、チトクロームｃを添加した際に、ＣＨＯ細胞でのカスパーゼ−７活性化がＣ．１細胞より高かったが、これは、ＣＨＯ試料における活性の２０−ｋＤａ形態および１１−ｋＤａ形態が、Ｃ．１試料と比較して増加していることによって証明された。チトクロームｃおよびｄＡＴＰ両方の存在下では、Ｃ．１試料の抑制効果が逆に戻された。１ｍＭ  ｄＡＴＰでは、両細胞系が等量の３２−ｋＤａ形態および２０−ｋＤａ形態を示し、これは、ｄＡＴＰがプロカスパーゼ−７をＧＲＰ７８から遊離させ、その活性化をもたらすことを示す。
【００４６】
[0077]本発明は、組織培養系でのＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、およびａｄａｐｔ７８の過剰発現によって、細胞を細胞死から防御できることを実証する。本発明は、ＧＲＰ活性の発現阻害剤（例えばアンチセンスおよびＲＮＡｉ）または阻害剤が、組織培養系でアポトーシスを誘導できることを実証する。したがって、ＧＲＰの防御機能は、組織または臓器の損傷を伴う状況においては有用かつ有益である。癌では、この同じ防御機能が癌細胞のアポトーシスを防止することによって有害となっている。
【００４７】
[0078]本明細書で実証するように、ＧＲＰの上方制御および／または過剰発現は、ストレスにさらされた臓器の損傷を制限するのに有用である。しかし、ＧＲＰの抗アポトーシス機能は、腫瘍細胞および細胞増殖障害においてそれらが誘導されると、癌の進行および薬物耐性が導かれるかもしれないことを示す。様々な癌細胞系、固形腫瘍、およびヒト癌生検試料で、ＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４のレベルが高く、悪性腫瘍との相関性を示している。加えて、ＧＲＰ７８の誘導は、癌細胞を免疫監視から防御し、一方、ストレスに媒介されたＧＲＰ７８の誘導は、アポトーシスを促進し、腫瘍の成長を抑制し、慢性低酸素細胞の細胞毒性を増強した。
【００４８】
[0079]したがって、本発明は、癌治療への新規のアプローチとして、癌細胞におけるＧＲＰの発現または機能の選択的抑制に有用な方法および組成物を提供する。例えば、ゲニステインは、ＧＲＰおよび熱ショック反応の両方を抑制するが、これは、発癌性物質で誘発された、ラットの腫瘍、およびマウスに移植されたヒト白血病細胞の腫瘍の成長を抑制する。別の例では、ＧＲＰ９４がｐ１８５／ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕとも呼ばれる）と会合して安定化することが示されている。ｐ１８５／ｅｒｂＢ２は、乳癌で一般的に過剰発現され、予後不良と関連している。乳癌細胞を、抗増殖薬であるゲルダナマイシンで処理すると、ＧＲＰ９４−ｐ１８５複合体が破壊され、それによって、乳癌細胞中のｐ１８５の分解が可能となる。
【００４９】
[0080]ＧＲＰの事前誘導は、様々なヒト癌細胞系で、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤（例えば、エトポシド）に対する耐性を与えるが、シスプラチンなどのＤＮＡ架橋結合薬に対する感受性を増大させる。アンチセンスノックダウンストラテジーによるＧＲＰ９４レベルの直接的抑制は、エトポシドで誘導された細胞死に対する感受性の増大をもたらす。
【００５０】
[0081]したがって、本発明は、ＧＲＰの抗アポトーシス効果の低減、化学療法薬に対する癌細胞の感受性の増大、および腫瘍細胞のアポトーシスの促進に有用な方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物は、腫瘍性の細胞（例えば、癌細胞）および組織におけるＧＲＰの産生または活性を抑制する。
【００５１】
[0082]以下に論じるように、本発明は、一群のＧＲＰが小胞体膜に内在的に結合していることの最初の証拠を提供する。これらのＧＲＰは、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分と相互作用する。本明細書で使用する場合、「アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分」は、アポトーシスの開始または促進に協同的に働く任意のポリペプチド、またはポリペプチドの任意の一群である。例えば、ＧＲＰ７８とカスパーゼ−７との相互作用、および／または、ＧＲＰ９４とｐ１８５／ｅｒｂＢ２との相互作用が、ＧＲＰの、アポトーシスを調節する能力と関係している。これらの相互作用は、例えば、カスパーゼ−７との個別のものである場合も、アポトーシス経路に関与する他のポリペプチドの一群の一部としてのものである場合もある。
【００５２】
[0083]本発明はさらに、内在性ＧＲＰ７８とカスパーゼ−７との間の複合体形成が小胞体と関連して起こることの最初の証拠を提供する。本明細書で提供するデータは、ＧＲＰ７８およびカスパーゼ−７が相互作用することを示すが、本発明は、これら２つのタンパク質の間での直接的な相互作用に限定されない。本発明は、カスパーゼ−７を含むポリペプチド複合体である細胞質ゾル成分も、個別にカスパーゼ−７も包含すると理解される。カスパーゼ−７とのＧＲＰ７８の相互作用を防止することによって、薬剤は、アポトーシスを促進することにより、アポトーシスを調節する。別法では、カスパーゼ−７とのＧＲＰ７８の相互作用を促進することによって、薬剤は、アポトーシスを抑制することにより、アポトーシスを調節するであろう。
【００５３】
[0084]一実施形態では、本発明は、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのＧＲＰタンパク質の相互作用を調節する薬剤に、ＧＲＰ（例えば、ＧＲＰ７４、７８、および／または９４）を接触させることによって、アポトーシスを調節する方法を提供する。本明細書で使用する場合、「相互作用する」という用語には、分子間におけるいかなる検出可能な相互作用も含まれる。「相互作用する」という用語は、分子間の「結合性」相互作用も含まれるものとする。例えば、相互作用には、水素結合相互作用、共有結合相互作用、および同様のものを含めた、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、および核酸−核酸の性質のものが含まれる。
【００５４】
[0085]「薬剤」は、本明細書で使用する場合、例えば、ポリペプチド、抗体、核酸（例えば、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、または同様のもの）、または小分子を含めた任意の分子でありうる。薬剤は、抗腫瘍薬および抗炎症薬を含めた、細胞増殖に関連した障害の治療に有用な「治療薬」でありうる。
【００５５】
[0086]本発明は、ＧＲＰ（例えばＧＲＰ７８）の抗アポトーシス効果を抑制する薬剤を含むアポトーシス薬（例えばＧＲＰアンタゴニスト）を提供する。本発明の一態様では、カスパーゼ−７とのＧＲＰ７８の相互作用を防止および／または破壊して、それによって、ＧＲＰ７８の抗アポトーシス活性を抑制するのに、ｄＡＴＰなどの小分子を用いる。別の態様では、ＧＲＰ（例えばＧＲＰ７８）遺伝子からの転写を抑制する薬剤を提供する。例えば、ヴァーシペロスタチン（ＶＳＴ）は、ＧＲＰ７８からの転写を抑制するのに有用である（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．、９６（１７）：１３００−１３１０、２００４年；この開示を参照により本明細書に援用する）。別の態様では、抑制核酸分子（例えば、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）を、ＧＲＰ（例えばＧＲＰ７８）の産生を抑制するのに用いる。一態様では、上記アポトーシス薬は、ＧＲＰ７８の産生を抑制し、それによって細胞におけるＧＲＰ７８の抗アポトーシス効果を抑制することによってアポトーシスを誘導する方法を提供する。本発明のアポトーシス薬は、ＧＲＰ７８などのＧＲＰを発現する細胞でアポトーシスを促進することによって腫瘍性障害および癌障害を治療するのに有用である。
【００５６】
[0087]アポトーシスが所望される実施形態では、ＧＲＰの発現／活性を直接的に低減する薬剤が、ＧＲＰの発現を低減する核酸でありうる。抗アポトーシス活性が所望される実施形態では、上記核酸はＧＲＰタンパク質をコードするセンス核酸でありうる（例えば、細胞内に導入することによって、細胞のＧＲＰ活性を増大できる）。
【００５７】
[0088]アポトーシス活性が所望される一実施形態では、ＧＲＰアンタゴニストなどのアポトーシス薬が使用される。一態様では、アポトーシス核酸薬が使用される。アポトーシス核酸薬は、ＧＲＰをコードするｍＲＮＡにハイブリッド形成するアンチセンス核酸でありうる。本発明での使用に供するアンチセンス核酸分子は、細胞状態下において、ＧＲＰタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリッド形成するものであり、このハイブリッド形成は、ＧＲＰタンパク質の発現を、例えば、転写および／または翻訳を抑制することによって抑制する様式のものである。この結合は、従来の塩基対相補性によるものでも、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合する場合に、二重らせんの主溝における特異的相互作用によるものでもよい。
【００５８】
[0089]アンチセンスコンストラクトは、発現プラスミドとして送達することができ、この発現プラスミドは、細胞内で転写された際に、ＧＲＰタンパク質をコードするｍＲＮＡおよび／または内在性遺伝子における少なくとも特有の部分に相補的なＲＮＡを生成する。別法では、アンチセンスコンストラクトは、ｅｘ  ｖｉｖｏ生成されたオリゴヌクレオチドプローブの形態を取ることができ、このオリゴヌクレオチドプローブは、ＧＲＰタンパク質を発現する細胞に導入された際に、ＧＲＰタンパク質をコードするｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリッド形成することによって、ＧＲＰタンパク質発現の抑制を引き起こす。そのようなアンチセンス分子は、内在性のヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに対して耐性を有し、それによってｉｎ  ｖｉｖｏで安定な修飾ヌクレオチドを含みうる。加えて、アンチセンス治療に有用なオリゴマーを構築する一般的なアプローチが、例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５８−９７６、１９８８年；およびＳｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４８：２６５９−２６６８、１９８８年によって概説されている。
【００５９】
[0090]アンチセンスアプローチは、ＧＲＰをコードする核酸に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの修飾形態）の設計を必要とする。アンチセンス分子は、ＧＲＰのｍＲＮＡ転写物に結合して翻訳を防止するか、あるいは、内在性遺伝子に結合して転写を防止するであろう。絶対的な相補性は必要でない。ハイブリッド形成する機能性は、相補性の程度と、アンチセンス核酸の長さとの両方に依存するであろう。通常、ハイブリッド形成する核酸が長いほど、その分子は、より多くの塩基ミスマッチを含有してもなおかつ安定した二本鎖（あるいは、場合によっては三本鎖）を形成することができる。当業者ならば、ハイブリッド形成した複合体の融点を判定する標準的な方法の使用によって、許容できるミスマッチの程度を確かめることができる。
【００６０】
[0091]翻訳の抑制には、ｍＲＮＡの５’末端に相補的なアンチセンス核酸分子、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの５’非翻訳配列とＡＵＧ開始コドンとを含めた配列が最も効果的に作用するであろう。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に相補的な配列も、ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに効果的であることが示されている（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３３３、１９９４年）。したがって、内在性ＧＲＰ遺伝子またはｍＲＮＡの、それぞれ、転写および／または翻訳を抑制するアンチセンスアプローチに、ＧＲＰ  ｍＲＮＡまたは遺伝子の５’または３’非翻訳、非コード領域に相補的なアンチセンス分子を用いることができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補配列を含むべきである。
【００６１】
[0092]ＧＲＰのコード鎖配列は公知である。例えば、表１は、一部のＧＲＰおよび近縁の分子シャペロンのコード配列を提供する。他の配列は、ＧｅｎＢａｎｋを介して容易に明らかとなり、また利用できるだろう。
【００６２】
【表１】
2010233569.tif 000003
【００６３】
各アクセッション番号とそれらの内容とを参照により本明細書に援用する。例えばＧＲＰ７８をコードするコード鎖配列を所与として、ＷａｔｓｏｎとＣｒｉｃｋの塩基対合の規則に従ってアンチセンス核酸を設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＧＲＰポリヌクレオチド（例えば、ＧＲＰ７８  ｍＲＮＡ）の全コード領域に相補的なものであることもあるし、または、オリゴヌクレオチドである場合があり、オリゴヌクレオチドはＧＲＰのコード領域または非コード領域の一部分に対してのみアンチセンスである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＲＰ  ｍＲＮＡの転写または翻訳開始部位周辺の領域に相補的なものでありうる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約１０、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド、またはそれより長いものでありうる。アンチセンス核酸分子は、当技術分野で知られている操作法を用いた、化学合成および酵素連結を用いて構築できる。本発明のアンチセンス核酸分子は、当技術分野で知られている標準法によって、例えばＤＮＡ自動合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入可能）の使用によって合成できる。例として、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：３２０９、１９８８年の方法によってホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成することができ；また、調整細孔ガラス重合体担体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１、１９８８年）の使用によってメチルホスホン酸エステルオリゴヌクレオチドを調製することができる。アンチセンス核酸分子は、天然存在のヌクレオチドを用いて、あるいは、分子の生物学的安定性が増大するように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二本鎖分子の物理的安定性が増大するように設計された、様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができる。
【００６４】
[0093]本発明はアンチセンス核酸分子を含み、これは、ＧＲＰをコードする配列を含むポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成する。利用されるアンチセンス分子は、無修飾のものでも、修飾されているものでも、ＲＮＡ分子でも、ＤＮＡ分子でもよい。適当な修飾には、参照によりその開示を本明細書に援用する米国特許第４４６９８６３号明細書に開示されているエチルホスホナートまたはメチルホスホナート修飾、ならびにＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４：９０８１によって、そして、Ｓｔｅｃら、１９８４年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．、１０６：６０７７によって記述されたデオキシヌクレオチドへのホスホロチオエート修飾が含まれるが、これらに限定されない。アンチセンスオリゴヌクレオチドへの修飾は、典型的には、５’または３’領域での端末修飾である。別法では、アンチセンス分子は、異なった方法で修飾された２種類以上の修飾核酸塩基のキメラバックボーンを有するものでありうる。そのような方法には、例えば、Ｋ．ＲａｍａｓａｍｙおよびＷ．Ｓｅｉｆｅｒｔ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、６（１５）：１７９９−１８０４（１９９６年））によって記述されたアミノ酸修飾または核酸修飾、あるいは、Ｇ．ＷａｎｇおよびＷ．Ｓｅｉｆｅｒｔ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３７（３６）：６５１５−６５１８（１９９６年））によって記述された４’糖置換オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００６５】
[0094]ホスホジエステル結合のオリゴヌクレオチドは、血清中または細胞内でヌクレアーゼの作用を特に受けやすく、したがって、一実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性であることが示されているホスホロチオエート結合類似体またはメチルホスホナート結合類似体である。本発明のために想定されている一部のアンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の例は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖のヘテロ分子もしくは複素環式糖間（「バックボーン」）結合を含有しうる。典型的なものは、ホスホロチオエート、ならびにＣＨ２ＮＨＯＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＯＣＨ２、ＣＨ２ＯＮ（ＣＨ３）ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２、およびＯＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２バックボーンを有するものである（一方ホスホジエステルはＯＰＯＣＨ２である）。モルフォリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチド（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５０３４５０６号明細書）も典型的である。他の実施形態では、２’−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：６１３１、１９８７年）およびＲＮＡ−ＤＮＡ類似体複合のキメラオリゴヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、２１５：３２７、１９８７年）も本明細書に記載の目的に使用できる。最後に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのＤＮＡ類似体も含まれ（Ｅｇｈｏｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６、１９９３年；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１４９７、１９９１年）、本発明に従って使用することができる。他のオリゴヌクレオチドは、以下のものを２’の位置に含む、アルキルおよびハロゲン置換された糖残基を含有しうる。すなわち、ｎを１〜約１０として、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ３、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、またはアラルキル、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ、Ｓ、またはＮ−アルキル、Ｏ、Ｓ、またはＮアルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、コレステリル基、抱合体、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、あるいは、オリゴヌクレオチドおよび類似の特性を有する他の置換物の薬力学的性質を改善する基である。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖ミメティックを有するものでもよい。他の実施形態は、少なくとも１つの修飾塩基形態、または、イノシンなどの「普遍的塩基」を含みうる。塩基修飾ヌクレオシドの調製、および前記塩基修飾ヌクレオシドを前駆体として用いた修飾オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、米国特許第４９４８８８２号および第５０９３２３２号明細書に記載されている。これらの塩基修飾ヌクレオシドは、化学合成によってそれらをオリゴヌクレオチドの端末または内部の位置に組み込むことができるように設計される。オリゴヌクレオチドの端末または内部の位置に存在するそのような塩基修飾ヌクレオシドは、ペプチドまたは他の抗原の結合部位として機能する。それらの糖残基が修飾されたヌクレオシドについても記載されており（例えば、米国特許第５１１８８０２号および米国特許第５６８１９４０号明細書、これらの両方を参照により本明細書に援用する）、これらも同様に使用することができる。当技術分野の当業者ならば、本発明で使用するための他の結合を選択することができるであろう。これらの修飾も、オリゴヌクレオチドの細胞内取込みおよび安定性を改善するように設計できる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与経路または投与形態に応じて、修飾または修飾部位が異なるであろうと理解されている（例えば、５’または３’修飾）。当業者ならば過度の実験をしなくても、適切な修飾を容易に判定することができる。
【００６６】
[0095]アンチセンス分子を生成するのに使用できる修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。別法では、アンチセンス分子は、ＧＲＰポリヌクレオチドまたはその断片がその中にアンチセンス方向にサブクローニングされている（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡが、対象の標的核酸に対してアンチセンスの方向のとなるであろう）発現ベクターを用いることで、生物学的に産生することができる。
【００６７】
[0096]特定の実施形態では、アンチセンス分子は、配列番号３に記載の配列またはその断片を含む。したがって、一態様では、アンチセンス分子は、（ｉ）配列番号３、（ｉｉ）ＧＲＰ７８の産生を抑制する配列番号３の断片、（ｉｉｉ）ＴがＵに置換されている、配列番号３またはその断片、（ｉｖ）修飾バックボーンを有する配列番号３、および（ｖ）ＧＲＰ７８をコードするポリヌクレオチドと相互作用することができる（ｉ）〜（ｉｖ）のうちのいずれかが含まれる。他の特定のアンチセンス分子には、ＧＲＰをコードする核酸のアンチセンス断片が含まれる（例えば、配列番号３の断片、ＧＲＰ９４のアンチセンス断片、および同様のもの、表１を参照）。
【００６８】
[0097]ＧＲＰのサイレンシングを行うことのできる短鎖二本鎖核酸分子も、本発明の一部として提供される。短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、ＲＮＡの転写を妨害するものとして提供される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、転写後遺伝子サイレンシングの機構であり、その際には、対象の遺伝子（またはコード領域）に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞または生物に導入し、それによって、対応するｍＲＮＡの分解をもたらす。ＲＮＡｉ効果は、何回もの細胞分裂の間持続し、その後、遺伝子発現が回復する。したがって、ＲＮＡｉは、標的ノックアウトまたは「ノックダウン」をＲＮＡレベルで作製する非常に強力な方法である。ＲＮＡｉは、ヒト胚腎臓およびＨｅＬａ細胞を含めたヒト細胞で成功している（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１（６８３６）：４９４−８、２００１年参照）。一実施形態では、ＲＮＡヘアピンの内在的発現を強制することによって、哺乳類細胞でＧＲＰ（例えば、ＧＰＲ７８）サイレンシングを誘導することができる（Ｐａｄｄｉｓｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９９：１４４３−１４４８、２００２年を参照）。別の実施形態では、短鎖（２１〜２３ｎｔ）ｄｓＲＮＡを用いた形質移入によって遺伝子発現の特異的な抑制を行う（Ｃａｐｌｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：４９−５１、２００２年で概説されている）。
【００６９】
[0098]簡潔には、サイレンシングするべきＧＲＰ遺伝子の一部に対応するｄｓＲＮＡを細胞内に導入する。ｄｓＲＮＡは、後で、消化されて２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、すなわち短鎖干渉ＲＮＡになる比較的長い配列である場合も、あるいは、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ分子を細胞に直接導入することもある。ｓｉＲＮＡ二本鎖分子は、ヌクレアーゼ複合体に結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体またはＲＩＳＣとして知られるものを形成する。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ鎖の一方と、内在性ｍＲＮＡとの塩基対合相互作用によって、相同的な転写産物を標的とし、次に、ｓｉＲＮＡの３’末端から約１２ヌクレオチドのところで、そのｍＲＮＡを切断する（Ｓｈａｒｐら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：４８５−４９０、２００１年；およびＨａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎ  ２：１１０−１１９、２００１年に概説されている）。
【００７０】
[0099]遺伝子サイレンシングにおけるＲＮＡｉ技法は、標準的な分子生物学的方法を利用するものである。不活性化するべき標的遺伝子の配列に対応するｄｓＲＮＡは、標準法によって、例えば、鋳型ＤＮＡ（標的配列に対応する）の両鎖をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼで同時に転写させることによって生成することができる。ＲＮＡｉで使用するためのｄｓＲＮＡを産生するためのキットを、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．社から購入することができる。ｄｓＲＮＡを生成させるために構築されたｄｓＲＮＡまたはプラスミドによる形質移入の方法は、当技術分野で日常的なものである。
【００７１】
[00100]ＲＮＡｉの遺伝子サイレンシング効果と同様の効果が、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドコンストラクトで形質移入された哺乳類細胞で報告されており（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２８１（３）：６３９−４４、２００１年）、これは、遺伝子サイレンシングのさらに別のストラテジーを提供するものである。
【００７２】
[00101]したがって、本発明は、ＧＲＰをコードするポリヌクレオチドと相互作用する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を提供する。一態様では、本発明は、（ｉ）長さが２１〜２３ヌクレオチドであり、５’末端にＡＡジヌクレオチドを含み、ＧＣ含量が３０〜５０％である、表１に記載の配列番号１、５、７、９、１１、１３、または１５に記載の配列およびそれらの相補配列；（ｉｉ）５’−ＡＡＧＧＴＴＡＣＣＣＡＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴ−３’（配列番号４）およびその相補配列を含む二本鎖核酸、（ｉｉｉ）ＴがＵに置換されている、配列番号４に記載の配列およびその相補配列；ならびにｓｉＮＡが上記の修飾バックボーンを有する（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれかを含むｓｉＮＡを提供する。
【００７３】
[00102]ＧＲＰ  ｍＲＮＡの翻訳およびＧＲＰタンパク質の発現を防止するために、ＧＲＰ  ｍＲＮＡの転写産物を触媒作用によって切断するように設計されたリボザイム分子を用いることもできる（例えば、１９９０年１０月４日発行のＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／１１３６４号パンフレット；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５、１９９０年、および米国特許第５０９３２４６号明細書を参照）。ＧＲＰ  ｍＲＮＡを破壊するのに、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを用いることもできるが、典型的なのはハンマーヘッド型リボザイムの使用である。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡとの相補的塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが、５’−ＵＧ−３’という２塩基配列を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は、当技術分野で周知であり、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１、１９８８年によって十全な記載がなされている。通常、リボザイムは、切断認識部位がＧＲＰ  ｍＲＮＡの５’末端近傍に位置するように、すなわち、効率が増大し、非機能的なｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積が最小となるように構築する。本発明におけるリボザイムは、ベクターを用いて細胞に送達することができる。
【００７４】
[00103]内在性ＧＲＰ遺伝子の発現の低減は、標的相同組換えを用いて、ＧＲＰ遺伝子またはそのプロモータを不活性化または「ノックアウト」することによって行うこともできる。例えば、Ｋｅｍｐｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８９：８０２（１９９７年）；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３１７：２３０−２３４、１９８５年；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、５１：５０３−５１２、１９８７年；およびＴｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、５：３１３−３２１、１９８９年を参照のこと。例えば、内在性ＧＲＰ遺伝子（ＧＲＰ遺伝子のコード領域または調節領域）に相同的なＤＮＡが隣接した変異型の非機能的なＧＲＰ遺伝子変種（または、全く無関係なＤＮＡ配列）を使用して、選択マーカーおよび／または負の選択マーカーを用いて、あるいは用いずに、ＧＲＰタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで発現する細胞に形質移入することができる。
【００７５】
[00104]本発明で使用される核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ、および三重らせん分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を合成するための、当技術分野で知られている任意の方法で調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホラミド化学合成など、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学合成するための、当技術分野で周知の技法が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子は、その核酸分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ転写によって生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、広範なベクターに組み入れることができ、ベクターは、適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを包含する。別法では、使用されるプロモータに応じて、アンチセンスＲＮＡを構成的に、あるいは誘導によって合成するアンチセンスｃＤＮＡコンストラクトを、細胞系に安定的に導入することができる。
【００７６】
[00105]さらに別の態様では、本発明は、ＧＲＰ活性のポリペプチドアンタゴニストを提供する。そのようなポリペプチドには、抗体、ＧＲＰの可溶性ドメイン、および細胞膜へのＧＲＰの貫入を防止する、ＧＲＰの膜貫通ドメインと相互作用するポリペプチドが含まれる。例えば、本明細書に記載の通り、ＧＲＰ７８は細胞質ゾルドメインおよび膜貫通ドメインを含む。この細胞質ゾルドメイン（例えば可溶性ドメイン）は、アポトーシスを誘導する細胞質ゾルタンパク質と相互作用する。アポトーシスを誘導する細胞質ゾルタンパク質とのＧＲＰの相互作用を抑制することによって、ＧＲＰの抗アポトーシス効果を抑制することができる。さらに、ＧＲＰ（例えばＧＲＰ７８）は疎水性膜貫通ドメインを含む。例えば、ＧＲＰ７８タンパク質の疎水性膜貫通ドメインＩＩＩ（配列番号２のアミノ酸２１０〜２６０）および／またはドメインＩＶ（配列番号２のアミノ酸４００〜４５０）は有用な標的である。ＧＲＰポリペプチドが膜に貫入する能力を調節するポリペプチド薬剤は、アポトーシス調節の候補薬である。例えば、ＧＲＰ７８が膜に貫入する能力を抑制するポリペプチド薬剤もアポトーシスを促進することができるであろう。なぜなら、それは、ＧＲＰ７８が、アポトーシスを促進するのに必要な細胞質ゾル成分と相互作用するのを防止するであろうからである。したがって、ＧＲＰタンパク質の変種および断片（例えば、天然のＧＲＰタンパク質の断片、類似体、および誘導体）も、ＧＲＰ（例えば、ＧＲＰアンタゴニスト）の抗アポトーシス活性を抑制する本発明の方法で使用することがある。
【００７７】
[00106]上記に論じたように、ＧＲＰ７８のトポロジーは、ＧＲＰ７８の一部が細胞質ゾルに露出していて、細胞質ゾル成分との相互作用が可能になっていることを示す。したがって別の実施形態では、本発明は、ＧＲＰ７８を、このタンパク質が小胞体膜に貫入する能力を抑制または防止する薬剤と接触させることによって、アポトーシスを調節する方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ＧＲＰ７８タンパク質の疎水性膜貫通ドメインＩＩＩ（配列番号２のアミノ酸２１０〜２６０）および／またはドメインＩＶ（配列番号２のアミノ酸４００〜４５０）を含むポリペプチドを準備することによって、膜とのＧＲＰ７８の相互作用を調節する薬剤を同定する方法を提供する。このポリペプチドを薬剤と接触させることができ、上記相互作用に対するこの薬剤の作用を決定することができる。上記ポリペプチドが膜に貫入する能力を調節する薬剤は、アポトーシス調節の候補薬である。例えば、ＧＲＰ７８が膜に貫入する能力を抑制する薬剤は、アポトーシスの促進もできるであろう。なぜならそれは、ＧＲＰ７８が、アポトーシスを促進するのに必要な細胞質ゾル成分と相互作用するのを防止するであろうからである。したがって、本発明の方法は、ＥＲ膜に結合した（すなわち、内在的に結合した）ＧＲＰ７８と、例えばカスパーゼ−７を含むタンパク質複合体など、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分との相互作用を調節することによって、アポトーシスを調節することを含む。
【００７８】
[00107]別の実施形態では、本発明は、アポトーシスを媒介する細胞質ゾル成分とのＧＲＰ７８の相互作用を調節する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、膜に内在的に結合したＧＲＰ７８を準備するステップと、少なくとも１種類のカスパーゼを含む細胞質ゾル成分を準備するステップと、薬剤を準備するステップと、上記タンパク質を上記成分および上記薬剤に、同時に、または順番に接触させるステップと、対照と比較した、前記タンパク質と前記成分との相互作用に対する前記薬剤の作用を決定するするステップとを含む。
【００７９】
[00108]本発明は、ＧＲＰ（例えばＧＲＰ７８）の抗アポトーシス活性を抑制する薬剤に、組織または細胞を接触させることを含む、組織または細胞のアポトーシスを促進するのに有用な方法および組成物を提供する。これらの方法および組成物は、癌および腫瘍増殖を含めた腫瘍性障害の治療に有用である。これらの方法および組成物は、単独で用いることも、他の腫瘍／癌治療と組み合わせて用いることもできる。例えば、本発明の方法および組成物は、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、タキソール、およびアルキル化剤などの化学療法薬と組み合わせて用いることができる。さらに、核酸阻害剤の組合せ（例えば、配列番号３および配列番号４の組合せ）を用いることもできる。
【００８０】
[00109]別の態様では、ＧＲＰタンパク質の変種および断片（例えば、天然のＧＲＰタンパク質の断片、類似体、および誘導体）を、本発明の方法で用いることができる。そのような変種には、例えば、天然のＧＲＰポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変種によってコードされたポリペプチド、天然のＧＲＰポリヌクレオチドの選択的スプライシング形態によってコードされたポリペプチド、天然のＧＲＰポリヌクレオチドの相同体によってコードされたポリペプチド、および天然のＧＲＰポリヌクレオチドの天然には存在しない変種によってコードされたポリペプチドが含まれる。
【００８１】
[00110]ＧＲＰタンパク質変種は、天然のＧＲＰタンパク質とは１つまたは複数のアミノ酸が異なるポリペプチド配列を有する。そのような変種のペプチド配列は、天然のＧＲＰポリペプチドにおける１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、または置換を特徴としうる。アミノ酸挿入は通常、連続した約１〜４アミノ酸の挿入であり、欠失は、好ましくは連続した約１〜１０アミノ酸の欠失である。一部の適用では、変種ＧＲＰタンパク質は、天然のＧＲＰタンパク質の機能活性（例えば、抗アポトーシス活性を媒介する能力、カスパーゼ−７に結合する能力、および同様のもの、アゴニストである）を実質的に維持する。そのような機能性の変種は、アポトーシスの軽減が望ましい、アポトーシスに関連した障害、例えば虚血および同様のものを治療するのに有用である。他の適用では、変種ＧＲＰタンパク質は、ＧＲＰタンパク質の機能活性を欠失しているか、あるいは有意な低減を特徴とする。天然のＧＲＰタンパク質の機能活性を保持していることが望ましい場合、ＧＲＰタンパク質変種の生成は、サイレントまたは保存的な変化を特徴とする核酸分子を発現することによって行うことができる。機能活性にかなりの変化を伴う変種ＧＲＰタンパク質の生成は、保存的な変化でないことを特徴とする核酸分子を発現することによって行うことができる。
【００８２】
[00111]１つまたは複数の特定のモチーフおよび／またはドメイン、あるいは任意の大きさ、例えば、少なくとも５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、または１７５アミノ酸の長さに対応するＧＲＰタンパク質断片を本発明の方法で用いることができる。加えて、従来の固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学など、当技術分野で知られている技法を用いて、断片を化学的に合成することもできる。例えば、本発明の方法で使用されるＧＲＰタンパク質は、任意に、断片相互のオーバーラップがない所望の長さの断片に分割しても、あるいはオーバーラップを有する所望の長さの断片に分割してもよい。それらの断片は、生成して（組換えによって、または化学合成によって）、天然のＧＲＰタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして機能しうる断片を同定するために試験することができる。
【００８３】
[00112]本発明の方法は、ＧＲＰタンパク質の組換え体形態を用いることもある。天然のＧＲＰタンパク質に加えて、組換え体ポリペプチドは、天然のＧＲＰ核酸配列と少なくとも８５％（例えば、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）の配列同一性を有する核酸によってコードされる。一実施形態では、変種ＧＲＰタンパク質は、天然のＧＲＰタンパク質の１つまたは複数の機能活性を欠失している。
【００８４】
[00113]当技術分野で知られている様々な技法によって、ＧＲＰタンパク質変種は生成することができる。例えば、ＧＲＰタンパク質変種は、個別の点突然変異を導入すること、またはトランケーションなど、変異導入によって生成することができる。変異によって、天然のＧＲＰタンパク質の機能活性と実質的に同一のものを有するＧＲＰタンパク質変種も、そのサブセットのみを有するＧＲＰタンパク質変種も生成できる。別法では、ＧＲＰタンパク質と相互作用する別の分子に競合的に結合する（例えば、ＧＲＰ７８とカスパーゼ−７との相互作用を妨げる）ものなど、このタンパク質の天然存在の形態の機能を抑制できる、このタンパク質のアンタゴニスト形態を生成することができる。加えて、１つまたは複数のＧＲＰの機能活性を構成的に発現するタンパク質のアゴニスト形態も生成できる。生成できる他のＧＲＰタンパク質変種には、例えばプロテアーゼの標的配列を改変する変異による、タンパク分解性切断に対する耐性を有するものが含まれる。ペプチドのアミノ酸配列における変化が、天然のＧＲＰタンパク質の１つまたは複数の機能活性を有するＧＲＰタンパク質変種をもたらすものかどうかは、その変種が天然のＧＲＰタンパク質の機能活性を有するかどうか試験することによって、容易に判定できる。
【００８５】
[00114]ＧＲＰ融合タンパク質をコードする核酸分子を本発明の方法で用いることもできる。そのような核酸は、適当な宿主に導入された際にＧＲＰ融合タンパク質を発現するコンストラクト（例えば発現ベクター）を調製することによって作製できる。例えば、そのようなコンストラクトは、別のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドにインフレームで融合した、ＧＲＰタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを、適当な発現システムでそのコンストラクトを発現すると融合タンパク質が産生されるように連結することによって作製できる。
【００８６】
[00115]別の例では、縮重オリゴヌクレオチド配列からＧＲＰタンパク質変種を生成することができる。縮重ポリヌクレオチド配列の化学合成は、ＤＮＡ自動合成機で行うことができ、その後、合成ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに連結する。縮重を有する１セットのポリヌクレオチドを用いる目的は、１セットの所望の潜在的ＧＲＰタンパク質配列をコードする配列すべてを１つの混合物中に提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９：３，１９８３年；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ  ３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編集、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社、２７３〜２８９ページ、１９８１年；Ｉｔａｋｕｒａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３：３２３、１９８４年；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８：１０５６，１９８４年；およびＩｋｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１：４７７、１９８３年を参照のこと）。そのような技法は、他のタンパク質の指向性進化において利用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６−３９０、１９９０年；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２４２９−２４３３、１９９２年；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６、１９９０年；およびＣｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８−６３８２、１９９０年；ならびに米国特許第５２２３４０９号；第５１９８３４６号；および第５０９６８１５号明細書を参照のこと）。
【００８７】
[00116]同様に、スクリーニング、およびそれに続く、１つまたは複数のＧＲＰアゴニスト（例えば抗アポトーシス）活性またはアンタゴニスト（例えばアポトーシス）活性を有する断片の選択に用いる、多様化されたＧＲＰポリペプチド断片の集合を生成するために、ＧＲＰクローンのコード配列断片のライブラリーを準備することができる。化学合成を含めた、そのようなライブラリーを生成するための様々な技法が当技術分野で知られている。一実施形態では、（ｉ）ＧＲＰポリヌクレオチドコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが１分子内で約１回のみ起こるようにヌクレアーゼで処理すること、（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡを変性させること、（ｉｉｉ）異なったニッキング産物のセンス／アンチセンス対を含みうる二本鎖ＤＮＡが形成されるようにＤＮＡを再生させること、（ｉｖ）Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによって再生された二本鎖分子から一本鎖部分を除去すること、および（ｖ）この結果得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結することによって、コード配列断片のライブラリーを生成することができる。この例示的方法によって、様々な大きさのＮ末端断片、Ｃ末端断片、および内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【００８８】
[00117]点突然変異またはトランケーションで生成されたコンビナトリアルライブラリーの産物をスクリーニングするため、あるいは、ある特定の特性を有する産物を求めてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技法が当技術分野で知られている。そのような技法は、概ね、ＧＲＰポリヌクレオチド変種のコンビナトリアル変異生成によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能であろう。大きなライブラリーをスクリーニングする最も広範に使用されている技法は、複製可能な発現ベクターにライブラリーをクローニングすること、この結果得られたベクターライブラリーで適当な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出によって、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離が促進される条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現することを通常含む。抗アポトーシス効果およびアポトーシス効果を測定する有用なスクリーニング技法の１つは、エトポシドの存在下で細胞生存率を測定することを含む。天然のＧＲＰの機能を抑制する（例えば、そのアゴニストである）組換え体産物は、エトポシドの存在下で細胞死の増大を示し、一方、ＧＲＰの機能を促進する（例えば、そのアゴニストである）産物は、対照と比較して、細胞死の減少を示すであろう。したがって、本発明は、遺伝子産物の変異生成およびスクリーニングを行って、ＧＲＰ活性に対するそれらのアゴニスト作用および／またはアンタゴニスト作用を測定する方法を提供する。アゴニスト作用を有する薬剤は、虚血、および好ましくない細胞死を引き起こす関連障害を治療するのに有用である。アンタゴニスト作用を有する薬剤は、好ましくない細胞増殖を有する疾患および障害（例えば、癌および同様のものに関連した細胞増殖障害）を治療するのに有用である。
【００８９】
[00118]本発明の方法は、天然のＧＲＰタンパク質が相互作用する他のタンパク質または分子（例えば、カスパーゼ−７）とのＧＲＰタンパク質の結合を破壊できるミメティック、例えばペプチドまたは非ペプチド薬剤を利用しうる。したがって、ここに記載した変異生成技法は、ＧＲＰタンパク質のどの決定部位が分子間相互作用に参加するか、例えば、アポトーシスを遂行するのに機能する他のタンパク質へのＧＲＰタンパク質の結合に関与するかをマッピングするのに用いることができる。ここまで記載した発明は、抗アポトーシス性のＧＲＰを抑制することによってアポトーシスを促進するのに有用な方法および組成物に焦点を合わせたが、本発明は、抗アポトーシス活性を促進する（例えば、虚血性損傷および同様のものに応答して）方法および組成物も含む。
【００９０】
[00119]本発明は、ＧＲＰ（例えば、ＧＲＰ７８および９４）の抗アポトーシス活性を促進する方法および組成物も提供する。本発明のこの態様における組成物および方法は、例えば、脳卒中、心発作、低酸素、低血糖、脳もしくは脊髄虚血、または脳もしくは脊髄損傷の結果生じた組織損傷、または、細胞もしくは組織に対する潜在的な損傷を治療するのに有用である。この方法は、ＧＲＰ活性、ＧＲＰ発現、ＧＲＰ産生、および／または、アポトーシスの抑制をもたらすポリペプチドとのＧＲＰの結合を促進する薬剤（例えば、小分子、ポリペプチド、ペプチド、および核酸が含まれる）を用いる。
【００９１】
[00120]本発明は、細胞におけるＧＲＰ発現および／またはＧＲＰ活性を調節する方法および組成物を提供する。細胞における、ＧＲＰなどの細胞内タンパク質の発現／活性を調節する薬剤が多数知られている。使用される特定のシステムに適したものなら、これらのうちのいずれを用いてもよい。ＧＲＰ活性を促進する（例えば、アゴニストである）典型的な薬剤には、変異体／変種ＧＲＰポリペプチドまたはその断片、機能性ＧＲＰポリペプチドまたは変種をコードする核酸、および有機または無機の小分子が含まれる。
【００９２】
[00121]細胞におけるＧＲＰ発現および／または活性を調節できるタンパク質の例には、天然のＧＲＰタンパク質（例えば活性を上方制御するため）、または、カスパーゼなど、その結合リガンドに対して天然のＧＲＰタンパク質と競合できるその変種（例えばアポトーシスを下方制御するため）が含まれる。そのようなタンパク質変種は、本明細書に記載の通り、当技術分野で知られている様々な技法を介して生成することができる。例えば、ＧＲＰタンパク質変種は、個別の点突然変異を導入すること、またはトランケーション（例えば、膜貫通量領域のトランケーション）など、変異導入によって生成することができる。変異によって、天然のＧＲＰタンパク質の機能活性と実質的に同一の機能活性を有するＧＲＰ変種または断片も、改善された機能活性を有するものも、それら機能活性のサブセットのみを有するものも生成できる。１つまたは複数のＧＲＰ機能活性を構成的に発現する、ＧＲＰタンパク質のアゴニスト（またはスーパーアゴニスト）形態を生成しうる。生成できる他のＧＲＰポリペプチド変種には、例えばプロテアーゼの標的配列を改変する変異による、タンパク分解性切断に対する耐性を有するものが含まれる。ペプチドのアミノ酸配列における変化が、天然のＧＲＰタンパク質の１つまたは複数の機能活性を有するＧＲＰタンパク質変種をもたらすものかどうかは、その変種が天然のＧＲＰタンパク質の機能活性（例えばアポトーシスを調節する活性）を有するかどうか試験することによって、容易に判定できる。
【００９３】
[00122]前述の通り、本発明は、標的組織でＧＲＰ７８および／またはＧＲＰ９４を過剰発現することによって、組織のアポトーシスを抑制する方法を提供する。標的組織におけるポリペプチドの過剰発現は、当業者に知られている任意の方法で行うことができる。例えば、ＧＲＰ７８および／またはＧＲＰ９４をコードする核酸配列を、標的組織での発現に適した核酸コンストラクトに組み込むことができる。コンストラクトは、通常、標的組織での発現に適した調節配列を有するであろう。
【００９４】
[00123]本発明は、細胞でのＧＲＰレベルの調節を含む方法を提供する。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも、ｉｎ  ｖｉｖｏでもよい。細胞がｉｎ  ｖｉｖｏである場合、それは、ヒト、ラット、ネズミ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、類人猿、ウサギ、ウシ、および同様のものを含めた任意の哺乳動物など、動物対象の体内に存在しうる。動物対象は、成体、幼若動物、および新生児を含めた、発生の任意のステージのものでありうる。動物対象には、発生における胎児ステージのものも含まれる。標的組織は、肝臓、腎臓、心臓（例えば心筋細胞）、肺、胃腸管の構成要素、膵臓、胆嚢、膀胱、骨格筋、脳を含めた中枢神経系、眼、皮膚、骨、および同様のものなど、動物対象の体内にある任意のものでありうる。
【００９５】
[00124]ウイルスベクターを用いた、ＧＲＰ核酸（例えば、アンチセンス分子またはＧＲＰ変種などの抑制核酸）を細胞内に導入にする様々な技法を、本発明の方法で用いることができる。本発明での使用に供するウイルスベクターは、宿主細胞に対して低い毒性を示し、かつ、治療上有用な量のＧＲＰタンパク質あるいはアンチセンスおよび／またはＲＮＡｉ核酸を、組織特異的な方法で誘導する。本発明で使用できるウイルスベクターの方法およびプロトコールは、Ｋａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７：３３−４０、２００１年に概説されている。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスに基づくものを含めた、特定のベクターの使用に関しては、下記により詳細に記述する。
【００９６】
[00125]遺伝子療法ベクターとしての組換え体アデノウイルスの使用に関しては、Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８１：２５７３−２６０４、２０００年、およびＢｒａｎｓｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６：５９０−５９５、１９９５年に論じられている。本発明ではアデノウイルスベクターが有用であるが、それは、（１）標的細胞での効率の高い遺伝子発現を行うことができ、そして、（２）比較的多量の異種（非ウイルス性）ＤＮＡを収容することができるからである。組換え体アデノウイルスの典型的な形態は、「ヘルパー依存的な」アデノウイルスベクターである。そのようなベクターは、例えば、（１）すべてもしくはほとんどのウイルス性コード配列（ウイルスタンパク質をコードする配列）の欠失、（２）ウイルスＤＮＡの複製に必要な配列であるウイルス性逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（３）２８〜３２ｋｂまでの「外来性」または「異種」配列（例えば、ＧＲＰタンパク質、ＧＲＰ変種、アンチセンス分子、またはＲＮＡｉ分子をコードする配列）、および（４）感染性キャプシドへのウイルスゲノムのパッケージングに必要なウイルスＤＮＡパッケージ配列を特徴とする。
【００９７】
[00126]本発明で使用されるかもしれない他のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターである。ＡＡＶベースのベクターは、標的細胞への高い効率での形質導入を示し、部位特異的な方法で宿主ゲノム中に組み入れることができるので有利である。組換え体ＡＡＶベクターの使用に関しては、Ｔａｌ，Ｊ．、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ、７：２７９−２９１、２０００年、ならびにＭｏｎａｈａｎおよびＳａｍｕｌｓｋｉ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７：２４−３０、２０００年に詳細に論じられている。典型的なＡＡＶベクターは、ＧＲＰ核酸に作用可能に連結した組織（例えば心臓）または細胞（例えば心筋細胞）特異的なプロモータを含有する少なくとも１つのカセットを挟んだ１対のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ、プロモータ、およびＧＲＰ遺伝子を含むＡＡＶベクターのＤＮＡ配列は、宿主ゲノム中に組み込むことができる。
【００９８】
[00127]単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースのベクターの使用については、ＣｏｔｔｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｅｌ．Ｔｈｅｒ．１：６３３−６４４、１９９９年に詳細に論じられている。１つまたは複数の前初期遺伝子（ＩＥ）が除去されているＨＳＶベクターは、それらが、概ね非細胞毒性であり、宿主細胞中で潜伏に類似した状態で持続的に存在し、宿主細胞の効率的な形質導入をもたらすので有利である。組換え体ＨＳＶベクターは、約３０ｋｂの異種核酸を組み込むことができる。典型的なＨＳＶベクターは、（１）ＨＳＶ１型から構築されており、（２）そのＩＥ遺伝子が除去されており、そして、（３）ＧＲＰ核酸（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、ＧＲＰ変種）に作用可能に連結した組織特異的プロモータを含有するものである。ＨＳＶアンプリコンベクターも、本発明の様々な方法で有用でありうる。ＨＳＶアンプリコンベクターは、通常、長さが約１５ｋｂであり、ウイルス性複製起点およびパッケージ配列を有する。
【００９９】
[00128]Ｃ型レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのレトロウイルスも本発明で有用である。例えば、レトロウイルスベクターはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づいたものでよい。例えば、ＨｕおよびＰａｔｈａｋ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．、５２：４９３−５１１、２０００年、およびＦｏｎｇら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、１７：１−６０、２０００年を参照のこと。ＭＬＶベースのベクターは、最大８ｋｂの異種核酸をウイルス遺伝子の代わりに含有しうる。この異種核酸は、通常、組織特異的プロモータおよびＧＲＰ核酸を含む。
【０１００】
[00129]使用されるかもしれない他のレトロウイルスベクターには、ヒト免疫不全（ＨＩＶ）ベースのベクターを含めた複製欠損のレンチウイルスベースのベクターがある。例えば、ＶｉｇｎａおよびＮａｌｄｉｎｉ、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．５：３０８−３１６、２０００年、およびＭｉｙｏｓｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：８１５０−８１５７、１９９８年を参照のこと。レンチウイルスベクターは、それらが、活発に分裂している細胞と、分裂していない細胞との両方に感染できる点で有利である。それらは、ヒト上皮細胞の形質導入も高い効率で行う。本発明での使用に供するレンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルス由来でも、非ヒト（ＳＵＶを含める）レンチウイルス由来でもよい。典型的なレンチウイルスベクターは、ベクター増幅に必要な核酸配列と、ＧＲＰ核酸に作用可能に連結した組織特異的プロモータとを含む。
【０１０１】
[00130]レンチウイルスベクターは、任意の適当なレンチウイルスキャプシドにパッケージングすることができる。ある粒子タンパク質を、異なるウイルス由来の別のもので置換することを「シュードタイピング」と呼ぶ。ベクターキャプシドは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＡ）または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含めた他のウイルス由来のウイルスエンベロープタンパク質を含有しうる。ＶＳＶ  Ｇタンパク質の使用は、高いベクター力価を与え、かつ、ベクターウイルス粒子のより高い安定性をもたらす。
【０１０２】
[00131]セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）から作製されたものなど、アルファウイルスベースのベクターも、本発明で使用されるかもしれない。アルファウイルスの使用については、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ、Ｋ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、４３：２４７−２５７、２０００年、およびＰｅｒｒｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４：９８０２−９８０７、２０００年に記載されている。アルファウイルスベクターは、通常、レプリコンとして知られている形態で構築される。レプリコンは、（１）ＲＮＡ複製に必要なアルファウイルス遺伝子エレメント、および（２）ＧＲＰ核酸をコードするものなどの異種核酸を含有しうる。
【０１０３】
[00132]組換え体複製欠損アルファウイルスベクターは、それらが、高いレベルでの遺伝子発現を行い、広範囲の宿主細胞を感染できるので有利である。アルファウイルスレプリコンは、認識される結合パートナーを発現する標的細胞への選択的結合を可能にするであろう機能性リガンドまたは結合ドメインをそれらのビリオン表面に提示することによって、特定の細胞型を標的にすることができる。アルファウイルスレプリコンは、宿主細胞内で潜伏し、それによって、長期の異種核酸発現を確立することができる。レプリコンは、宿主細胞内で一過性の異種核酸発現を行うこともできる。このウイルスの組織選択性を増大させて危険性を低減するために、そのようなウイルスは、そのビリオン表面に標的リガンドをもつことができるだけでなく、異種核酸（例えばＧＲＰ核酸）を組織特異的プロモータに作用可能に連結することができる。
【０１０４】
[00133]ウイルスベクタベースの方法に加えて、非ウイルス性の方法も、ＧＲＰ核酸を宿主細胞に導入するのに用いることができる。非ウイルス性の遺伝子送達方法の概説は、ＮｉｓｈｉｋａｗａおよびＨｕａｎｇ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１２：８６１−８７０、２００１年に提供されている。本発明による非ウイルス性の遺伝子送達方法は、ＧＲＰ核酸を細胞に導入するのにプラスミドＤＮＡを利用する。プラスミドベースの遺伝子送達方法は、当技術分野で一般的に知られており、Ｉｌａｎ，Ｙ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１：１１６−１２０、１９９９年、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄ．、７：３１４−３１８、１９９７年、およびＡｒｚｔｌ，Ｚ．、Ｆｏｒｔｂｉｌｄ  Ｑｕａｌｉｔａｔｓｓｉｃｈ、９２：６８１−６８３、１９９８年などの参考文献に記載されている。
【０１０５】
[00134]ＧＲＰ核酸を宿主細胞に導入する物理的技法を用いた方法を、本発明での使用に適合させることができる。例えば、微粒子銃遺伝子導入法は、Ａｃｃｅｌｌ装置（遺伝子銃）を用いて、ＤＮＡコーティングされた金の微小粒子を標的組織、例えば癌組織に向けて加速する。例えば、Ｙａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ、２：４７６−４８１、１９９６年、およびＤａｖｉｄｓｏｎら、Ｒｅｖ．Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．、６：４５２−４５９、２０００年を参照のこと。別の例として、ＧＲＰ核酸を細胞内に送達するために細胞電気透過化法（ｃｅｌｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（細胞電気穿孔法とも呼ばれる）を用いることもできる。例えば、Ｐｒｅａｔ，Ｖ．、Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｆｒ．、５９：２３９−２４４、２００１年を参照のこと。
【０１０６】
[00135]プラスミドＤＮＡと共に凝集した多量体を形成するように、合成遺伝子送達分子を設計することができる。これらの凝集体は、エンドサイトーシスおよびエンドソーム膜破壊の引き金となるような方法で、標的細胞表面に結合するように設計することができる。リポポリアミンおよび陽イオン性脂質を含めた陽イオン性両親媒性試薬を用いて、標的細胞への受容体非依存性のＧＲＰ核酸送達を提供することができる。加えて、あらかじめ調製された陽イオン性リポソームまたは陽イオン性脂質をプラスミドＤＮＡと混合して、細胞形質移入複合体を生成することもできる。陽イオン性脂質調合物を用いた方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７７２：１２６−１３９、１９９５年、ならびにＬａｓｉｃおよびＴｅｍｐｌｅｔｏｎ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．、２０：２２１−２６６、１９９６年に概説されている。遺伝子送達には、ＤＮＡを両親媒性陽イオン性ペプチドと結合させることもできる（Ｆｏｍｉｎａｙａら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、２：４５５−４６４、２０００年）。
【０１０７】
[00136]ＧＲＰ核酸の送達を促進するのに、ＤＮＡマイクロカプセル化を用いることもできる。マイクロカプセル化された遺伝子送達媒体は、適当な非溶媒が添加された際に、断片化された球形重合体粒子に強制的に相反転させられる低粘度重合体の水溶液から構築することができる。マイクロ粒子を用いた方法に関しては、Ｈｓｕら、Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ、７：３１３−３２３、１９９９年、およびＣａｐａｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１６：５０９−５１３、１９９９年に論じられている。
【０１０８】
[00137]タンパク質導入法は、治療用タンパク質を標的細胞内に送達のための、遺伝子療法に代わる手段を提供するものであり、タンパク質形質導入を用いた方法も本発明の範囲内にある。タンパク質導入法は、外部環境から宿主細胞内へのタンパク質の取込みである。取込み過程は、細胞膜を透過できるタンパク質またはペプチドに依存する。この能力を通常は非導入性（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）のタンパク質に付与するため、非導入性タンパク質を、アンテナペディアペプチド、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質導入ドメイン、または単純ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質などの導入媒介タンパク質（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に融合することができる。Ｆｏｒｄら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８：１−４、２００１年を参照のこと。
【０１０９】
[00138]核酸（任意選択でベクター中に含有される）を対象の細胞内に入れるには、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの２つの主要なアプローチがある。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達では、核酸を対象に、直接、通常はその核酸を必要とする部位に注入する。ｅｘ  ｖｉｖｏ処置では、対象の細胞を取り出して、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、改変された細胞を対象に直接投与するか、あるいは、例えば、多孔性膜に封入して、これを対象に移植する（例えば、米国特許第４８９２５３８号および第５２８３１８７号明細書を参照）。生存細胞に核酸を導入する様々な技法が利用可能である。これらの技法は、核酸を培養細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入するのか、あるいは、意図された宿主の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで導入するのかによって異なる。哺乳類細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を導入する適当な技法には、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、ウイルスベクター、および同様のものの使用が含まれる。ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達に一般的に使用されるベクターは、上記に論じた通りウイルスベクターである。
【０１１０】
[00139]宿主細胞は、本明細書に記載の発現ベクターまたはクローニングベクターで、形質移入または形質転換して、プロモータの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする核酸の増幅に適した改変を有する従来の栄養物培地で培養することができる。培地などの培養条件（温度、ｐＨ、および同様のもの）は、当業者ならば、過度の実験をしないでも選択できる。一般的に、細胞培養の生産性を最大にするための原則、プロトコール、および実践的技術は、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編集、（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社、１９９１年）、およびＳａｍｂｒｏｏｋらに見出すことができる。
【０１１１】
[00140]真核細胞の形質移入および原核細胞の形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介法、電気穿孔法は当業者に知られている。形質転換は、使用される宿主細胞に応じて、そのような細胞に適切な標準的な技法を用いて行う。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上に記載の通り、原核生物には、通常、塩化カルシウムを用いたカルシウム処置または電気穿孔法が使用される。Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ、２３：３１５（１９８３年）、および１９８９年６月２９日公開の国際公開第８９／０５８５９号パンフレットに記載の通り、アグロバクテリウムツメファシエンスを用いた感染は、ある特定の植物細胞の形質転換に使用される。そのような細胞壁のない哺乳類細胞には、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４５７（１９７８年））のリン酸カルシウム沈殿法を利用することができる。哺乳類宿主細胞系への形質移入に関する一般的側面は、米国特許第４３９９２１６号明細書に記載されている。酵母の形質転換は、通常、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ、１３０：９４６（１９７７年）、およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、７６：３８２９（１９７９年）の方法に従って行われる。しかし、核マイクロインジェクション法、電気穿孔法、無傷細胞を用いた細菌プロトプラスト融合、または、ポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンによるものなど、細胞にＤＮＡを導入する他の方法も用いることができる。哺乳類細胞を形質転換する様々な技法に関しては、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７−５３７（１９９０年）、およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８−３５２（１９８８年）を参照のこと。
【０１１２】
[00141]本明細書に記載のベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞には、原核生物、酵母、または、高等真核生物の細胞が含まれる。適当な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性な生物などの真正細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの腸内細菌が含まれるが、これらに限定されない。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）；およびＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ  ５３６３５）などの様々な大腸菌株は公的に入手可能である。他の適当な原核細胞宿主細胞には、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属、例えば、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｘｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、および赤痢菌属、ならびに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびリケニホルミス菌（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば１９８９年４月１２日公開の独国特許第２６６７１０号に開示されたリケニホルミス菌４１Ｐ）などの桿菌緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属、およびストレプトミセス属が含まれる。これらの例は限定的なものではなく、例示的でものある。
【０１１３】
[00142]原核生物に加えて、糸状真菌または酵母などの真核細胞微生物も、クローニング用または発現用の適当な宿主である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般的に使用される低級真核細胞宿主微生物である。他には、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのクルイフェロミケス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤルロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）；ピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；カンジダ属；トリコデルマリージア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミケス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉａｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミケス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；ならびに例えば、アカパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ならびに偽巣性コウジ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびクロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属宿主などの糸状真菌が含まれる。本明細書ではメチロトローフの酵母が適しており、それらには、ハンゼヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア属、サッカロミケス属、トルロプシス属、およびロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属選択されたメタノールで成長できる酵母が含まれるが、これらに限定されない。このクラスの酵母を例示する特定の種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ、「Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ」、２６９（１９８２年）に見出すことができる。
【０１１４】
[00143]有用な哺乳類宿主細胞系の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓系（２９３または浮遊培養での成長用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、３６：５９、１９７７年）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０年）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３−２５１、１９８０年）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＭＩＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＧＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ、７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４−６８、１９８２年）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌細胞系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１１５】
[00144]宿主細胞は、上記のＧＲＰ核酸発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換し、プロモータの誘導、形質転換体の選択、または、所望の配列をコードする核酸の増幅に適した改変を有する従来の栄養培地中で培養する。
【０１１６】
[00145]ＧＲＰ核酸（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、リボザイム、変種、コード配列、および同様のもの）はクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入することができる。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態でありうる。適切な核酸配列は、様々な操作法によってベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡは、当技術分野で知られている技法を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクターの構成要素には、通常、１つまたは複数のシグナル配列、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモータ、および転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。１つまたは複数のこれらの構成要素を含有する適当なベクターの構築は、当業者に知られている標準的な連結技法を用いて行われる。
【０１１７】
[00146]発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を通常含有する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするもの、（ｂ）栄養要求性を補完するタンパク質をコードするもの、または、（ｃ）複合培地からは取得できない重要栄養物を供給するタンパク質をコードするもの、例えば、桿菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【０１１８】
[00147]哺乳類細胞の適当な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼなど、ＢＤＢオリゴペプチドをコードする核酸を取り込むことのできる細胞の同定を可能にするものである。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合、適当な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０年に記載されている通りに調製および増殖された、ＤＨＦＲ活性欠損のＣＨＯ細胞系である。酵母での使用に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９、１９７９年；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７：１４１、１９７９年；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１０：１５７、１９８０年）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠失した、酵母の突然変異株のための選択マーカーを提供する。
【０１１９】
[00148]例えばＧＲＰ７８および／またはカスパーゼ−７に特異的に結合して、それらの相互作用を調節するポリペプチドを同定するのに、様々な周知の技法を用いることができる。例示的な技法には、移動度シフトＤＮＡ結合アッセイ、メチル化およびウラシル干渉アッセイ、ＤＮアーゼおよびヒドロキシラジカルフットプリント分析、蛍光偏光、ならびにＷ架橋または化学架橋法が含まれる。概説には、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（第１２章、「ＤＮＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」）を参照のこと。さらに、そのような薬剤のアゴニスト作用およびアンタゴニスト作用を測定する生物学的アッセイも提供する。
【０１２０】
[00149]例えば、本発明は、薬剤が細胞に与えうるＧＲＰアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を測定するスクリーニングアッセイを提供する。このアッセイは、ＧＲＰアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有すると考えられる薬剤に、ＧＲＰを発現する細胞を接触させることを含む。細胞を化学療法薬（例えば、エトポシド）と接触させ、それらの細胞または培養された細胞の生存率を測定する。対照と比較して、細胞生存率が増大している場合、その薬剤はアゴニスト活性を有し、細胞生存率が低下している場合、その薬剤はアゴニスト活性を有する。
【０１２１】
[00150]別の実施形態では、本発明は、細胞増殖障害の治療における、本発明の方法で同定された薬剤を含む医薬組成物と、その薬剤を使用するための指示とを提供する。例えば、ＧＲＰ７８と細胞質ゾル成分との相互作用を調節するものとして同定された薬剤、または、ＧＲＰ７８がＥＲ膜などの膜に貫入する能力を調節する薬剤を、細胞増殖障害を治療するための医薬組成物に含めることができる。この治療は、アポトーシスの促進またはアポトーシスの抑制による障害の抑制を包含しうる。例えば、本発明の方法は、分裂している細胞がさらに複製するのをアポトーシスの促進によって防止するか、あるいは、分裂していない細胞が破壊されるのをアポトーシスの抑制によって防止するための使用に適している。
【０１２２】
[00151]本発明は、細胞増殖障害を有する対象を治療する方法および組成物を提供する。対象は、任意の哺乳動物でありうるが、好ましくはヒトである。接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでありうる。医薬組成物を投与する方法は、当技術分野で知られており、それらには、例えば、全身投与、局所投与、腹腔内投与、筋肉内投与、腫瘍または細胞増殖障害の部位での直接投与、および当技術分野で知られている他の投与経路が含まれる。
【０１２３】
[00152]本発明による医薬組成物は、局所投与しても、全身投与してもよい。「治療上有効な用量」は、疾患の症候およびその合併症を防止するか、治癒させるか、あるいは少なくとも部分的に停止させるのに必要な、本発明による化合物の量を意味する。この使用に有効な量は、当然ながら、疾患の重度、ならびに対象の体重および全身状態に依存するであろう。通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用された用量は、その医薬組成物のｉｎ  ｓｉｔｕ投与で有用な量に関する有用な手引きを提供しうる。さらに、特定の障害の治療に有効な用量を決定するのに動物モデルを用いることができる。考慮すべき様々な要件は、例えば、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７、（１９９０年）；Ｇｉｌｍａｎら（編集）（１９９０年）に記載されており、これらのそれぞれを参照により本明細書に援用する。
【０１２４】
[00153]本明細書で使用する場合、「治療上有効な量を投与すること」は、本発明の医薬組成物を、その組成物が、意図された治療機能を行えるように、対象に与えるか、または適用する方法を含むものとする。治療上有効な量は、対象における感染の程度、ならびに個体の年齢、性別、および体重などの因子によって異なるであろう。投与計画は、最適な治療反応が得られるように調整することができる。例えば、いくつかの分割量を毎日投与することもできるし、あるいは、治療状況の緊急性による指示と比例して用量を減少させることもできる。
【０１２５】
[00154]本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤、ならびに同様のものを含むものとする。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤は、いかなるものでも、上記医薬組成物と非適合的でない限り、上記治療用組成物および治療方法におけるそれらの使用が企図されるものである。補完的な活性化合物も上記組成物に組み入れることができる。
【０１２６】
[00155]主要医薬組成物は、許容できる用量単位で、薬学的に許容される適当な担体と共に、有効な量で、好都合かつ効果的に投与されるように合成される。補完的な活性成分を含有する組成物の場合、前記成分の投与における通常の用量および方法を参照して用量を決定する。
【０１２７】
[00156]さらに、本発明の方法は、単独で行うことも、細胞増殖障害を治療するのに現在利用可能な標準的な医療と併せて行うこともできる。例えば、腫瘍を治療する場合には、腫瘍を構成する細胞に本発明のコンストラクトを導入する前に、手術または放射線照射によって腫瘍の大部分を除去することが望ましい場合がある。
【０１２８】
[00157]「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、いかなるアミノ酸の鎖をも記述する。したがって、この用語は、アミノ酸残基の重合体を言及するのに、本明細書で互換性をもって使用される。この用語は、その中で、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然存在のアミノ酸の人工的な化学ミメティックであるアミノ酸ポリマーにも適用される。したがって、「ポリペプチド」という用語には、完全長の、天然存在のタンパク質だけでなく、完全長の、天然存在のタンパク質、または、天然存在のタンパク質の特定のドメインまたは部分に対応する、組換えまたは合成によって生成されたポリペプチドも含まれる。この用語は、原核細胞での発現を促進するために添加された、アミノ末端のメチオニンを有する成熟タンパク質も包含する。
【０１２９】
[00158]ポリペプチドおよびペプチドは、既知の技法を用いて化学的に合成するか、既知の分子生物学技法を用いて産生することができる。ポリペプチドおよびタンパク質は、生物のゲノム中で、場合によっては「遺伝子」と呼ばれる、個別の機能単位の中の核酸によってコードされる。しかし、核酸分子は、それらが天然に存在する環境から取り出し、単離して、分子生物学技術を用いて加工および操作することができる。「単離された」という用語は、それの自然な状態から「人間の手」によって改変されていること、すなわち、それが天然に存在する場合には、元の環境から変えられているか、もしくは取り出されていること、またはそれらの両方を意味する。この用語を本明細書で用いる場合、例えば、生きている動物の体内でそれの自然状態で自然に存在する天然存在の核酸分子またはポリペプチドは「単離されて」いないが、それの自然な状態における共存物質から分離された同じ核酸またはポリペプチドは「単離されて」いる。
【０１３０】
[00159]「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、長さが少なくとも１０塩基の重合体形態のヌクレオチドを指す。「単離された核酸」によって、それが由来する生物の天然存在のゲノムにおいて、それが直ちに連続しているコード配列（５’末端のものおよび３’末端のもの）のいずれかと直ちに連続していないポリヌクレオチドを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスに、または、原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み入れられた組換え体ＤＮＡ、あるいは、他の配列とは独立して別々の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する組換え体ＤＮＡが含まれる。本発明の核酸分子は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾形態を含みうる。この用語には、一本鎖形態および二本鎖形態が含まれる。
【０１３１】
[00160]核酸分子またはポリヌクレオチドという用語は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを全般的に指し、それは、無修飾のＲＮＡまたはＤＮＡである場合も、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡである場合もある。したがって、本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、例えば、とりわけ、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡを含む混成分子を指し、これらの混成分子は、一本鎖であることもあるが、より典型的な場合、二本鎖であるか、もしくは一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であることもある。
【０１３２】
[00161]加えて、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を示す。そのような領域の鎖は、同じ分子からのものである場合も、異なる分子からのものである場合もある。この領域は、これら１つまたは複数の分子のすべてを含む場合もあるが、より典型的には、一部の分子のある一領域のみを含む。三本鎖領域の分子のうち１つは、オリゴヌクレオチドである場合が多い。
【０１３３】
[00162]本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドという用語には、１つまたは複数の修飾塩基を含有する上述のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。したがって、安定性または他の理由で修飾されているバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図される場合、「核酸分子」である。
【０１３４】
[00163]本明細書に開示するアンチセンス分子もしくはｓｉＲＮＡ分子を含む核酸分子、またはＧＲＰポリペプチドをコードする核酸分子、および同様のものは、発現制御エレメントに作用可能に連結することができる。「作用可能に連結した」とは、そのように記述された構成要素が、それらに意図されている様式で機能するのを可能にする関係にある、近接した並列を意味する。本発明の核酸分子に作用可能に連結した発現制御エレメントは、その発現制御エレメントと適合した条件下でその核酸分子の転写が実現するように連結されている。本明細書で使用する場合、「発現制御エレメント」という用語は、それが作用可能に連結している核酸分子の発現を調節する制御領域を指す。発現制御エレメントが核酸分子の転写と、必要に応じてその翻訳とを制御および調節する場合に、その発現制御エレメントは、その核酸分子に作用可能に連結している。したがって、発現制御エレメントには、適切なプロモータ、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする核酸の前のスタートコドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および停止コドンが含まれる場合がある。「制御エレメント」という用語は、その存在が発現に影響を及ぼしうる最小の構成要素を含むことが意図されており、さらに、その存在が有利である追加の構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含みうる。発現制御エレメントは、プロモータを含みうる。
【０１３５】
[00164]「プロモータ」によって、転写を指示するのに十分な最小の核酸ドメインを意味する。細胞型特異的に、組織特異的に、あるいは外部シグナルまたは薬剤によって制御可能な、プロモータ依存的な遺伝子発現を付与するのに十分なプロモータエレメントも本発明に含まれる。そのようなエレメントは遺伝子の５’領域に位置しても、あるいは３’領域に位置してもよい。構成的なプロモータと誘導性のプロモータとの両方が本発明に含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５１６−５４４、１９８７年を参照のこと）。例えば、細菌システムにクローニングする場合には、バクテリオファージ−γのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃ混成プロモータ）、および同様のものなどの誘導性プロモータを使用できる。哺乳類細胞系にクローニングする場合には、哺乳類細胞ゲノム由来（例えばメタロチオネインプロモータ）、または哺乳類ウイルス由来（例えばレトロウイルスロの長末端反復；アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）のプロモータを使用できる。組換えＤＮＡ技法または合成技法によって生成されたプロモータも、本発明の核酸の転写を得るために使用できる。
【０１３６】
[00165]核酸分子は、所望の条件下において標的ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに選択的にハイブリッド形成するように設計することができる。「選択的に（特異的に）ハイブリッド形成する」という句は、特定のヌクレオチド配列が複雑な混合物中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、そのヌクレオチド配列の分子のみに結合、二本鎖形成、またはハイブリッド形成することを意味する。
【０１３７】
[00166]「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、通常は複雑な核酸混合物中で、核酸分子が標的相補配列にハイブリッド形成するが、他の配列には結合しない条件を指す。本発明のコンテクストでは、ストリンジェントな条件は、相互に少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列が、通常、相互にハイブリッド形成した状態で残る、洗浄およびハイブリダイゼーションを含む。通常、この条件は、相互に少なくとも６５％〜７０％または７５％以上相同性を有する配列が、通常、相互にハイブリッド形成した状態で残るような条件である。
【０１３８】
[00167]一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低い条件が選択される。Ｔｍは、平衡状態において、標的に相補的な核酸分子の５０％が標的配列にハイブリッド形成する温度（特定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）である（標的配列が過剰で存在する場合、Ｔｍでは、平衡状態において、プローブの５０％が結合している）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、通常、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩類）、そして、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃となる条件であろう。ストリンジェントな条件は、不安定化物質、例えばホルムアミドの添加によって実現することもできる。
【０１３９】
[00168]高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は次の通りでありうる。すなわち、例えば、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％  ＳＤＳにおける４２℃でのインキュベーション、または、５ｘＳＳＣ、および１％  ＳＤＳにおける６５℃でのインキュベーション、そして、これに０．２ｘＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳにおける６５℃での洗浄が伴う。代わりの条件には、例えば、少なくとも、６８℃で２０時間のハイブリダイゼーション、それに続く、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５５℃での洗浄３０分間を２回、そして、６０℃で１５分間を３回と同程度にストリンジェントな条件が含まれる。もう１セットの代わりの条件は、６ｘＳＳＣにおける約４５℃でのハイブリダイゼーション、そして、それに続く、０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおける５０〜６５℃での洗浄１回以上である。例示的な中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、そして、１ｘＳＳＣにおける４５℃での洗浄が含まれる。
【０１４０】
[00169]「治療する」、「治療」、または「軽減」は、治療上の処置と、予防または防止手段の両方を意味し、これらは、標的である疾患状態または障害を防止または減速（軽減）することを目的とする。治療を必要とするものには、既に障害を有するものだけでなく、障害をもつ傾向のあるもの、または、障害が防止されるべきものも含まれる。治療用量のＧＲＰアンタゴニストを与えられた後に、次の項目のうち１つまたは複数において、対象が観察可能および／または測定可能な低減または不在を示す場合に、対象または哺乳動物の腫瘍性障害／癌が良好に「治療」されたことになる。すなわち、癌細胞数の減少または癌細胞の不在；腫瘍サイズの減少；軟部組織および骨への癌の拡散を含めた周辺器官への癌細胞の浸潤の抑制（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは停止）；腫瘍転移の抑制（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の抑制；および／または、特定の癌に関連した１つまたは複数の症候のある程度の鎮静；罹患率および死亡率の低下、およびクオリティオブライフ問題の改善である。
【０１４１】
[00170]「分裂していない」細胞は、有糸核分裂を行っていない細胞を指す。分裂していない細胞は、その細胞が活発に分裂していない限り、細胞周期のいかなる時点（例えば、Ｇ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ、Ｇ２／Ｍ）で停止していてもよい。体内における既存の分裂していない細胞には、ニューロン、筋、肝臓、皮膚、心臓、肺、および骨髄細胞、ならびにそれらの派生物が含まれる。
【０１４２】
[00171]「分裂している」は、活発な有糸核分裂または減数分裂を行っている細胞を意味する。そのような分裂している細胞には、幹細胞、皮膚細胞（例えば、繊維芽細胞および角質細胞）、生殖細胞、および当技術分野で知られている他の分裂している細胞が含まれる。特別に注目され、かつ分裂している細胞という用語に包含されるのが、腫瘍細胞などの細胞増殖障害を有する細胞である。「細胞増殖障害」という用語は、異常な数の細胞によって特徴付けられる状態を意味する。この状態は、肥厚性の細胞増殖（組織内の細胞集団の肥大をもたらす継続的な細胞増殖）および発育不全の細胞増殖（組織内の細胞の欠失または欠乏）の両方、または身体のある領域への細胞の過度の流入もしくは移動を含みうる。これらの細胞集団は、必ずしも形質転換細胞、腫瘍原性細胞、または悪性細胞である必要はなく、正常な細胞も含みうる。
【０１４３】
[00172]細胞増殖障害には、強皮症、関節炎、および肝硬変を含めた様々な線維性状態など、結合組織の肥大に関連した障害が含まれる。細胞増殖障害は、頭頚部癌などの腫瘍障害が含まれる。頭頚部癌には、例えば、口、食道、のど、喉頭、甲状腺、舌、口唇、唾液腺、鼻、副鼻腔、鼻咽頭の癌腫、上部鼻蓋および静脈洞炎腫瘍、鼻腔神経芽細胞腫、扁平上皮癌、悪性黒色腫、副鼻腔未分化癌腫（ＳＮＵＣ）、または血液腫瘍が含まれるであろう。頚部リンパ節、喉頭前リンパ節、肺食道傍リンパ節、および顎下リンパ節を含めた局部リンパ節の癌腫も含まれる（「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編集、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．社、第１３版、１８５０〜１８５３ページ、１９９４年）。他のタイプ癌には、肺癌、大腸−直腸癌、乳癌、前立腺癌、尿路癌、子宮癌、リンパ腫、口腔癌、膵臓癌、白血病、黒色腫、胃癌、および卵巣癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
[00173]従来の分子生物学技法を用いた方法は、本明細書に記載されている。そのような技法は、当技術分野で一般的に知られており、「[Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、第１〜３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８９年；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌ  ら編集、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年（および定期的アップデート）などの方法論に関する論文に詳細に説明されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた様々な技法は、例えば、Ｉｎｎｉｓら、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９０年に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、それを目的としたコンピュータプログラムを用いるな、既知の技法によって既知の配列から得ることができる（例えば、プライマー、バージョン０．５、８１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）。核酸を化学合成する方法は、例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２、１９８１年、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５、１９８１年に論じられている。核酸の化学合成は、例えば、市販のオリゴヌクレオチド自動合成機で行うことができる。免疫学的方法（例えば、抗原特異的抗体の調製、免疫沈降反応、およびイムノブロッティング）は、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｏｌｉｇａｎら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年に記載されている。遺伝子導入および遺伝子療法の在来法も、本発明での使用に適合させることができる。例えば、「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｔ．Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ社、１９９９年；「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、Ｐ．Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ社、１９９７年；および「Ｒｅｔｒｏ−ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃ．Ｐ．Ｈｏｄｇｓｏｎ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ社、１９９６年を参照のこと。
【０１４５】
[00174]少数の疾患および障害（例えば、虚血および腫瘍障害）について言及した。しかし、様々な疾患および変性障害が異常または脱調節されたアポトーシスに関与し、不適切もしくは時期尚早な細胞死または不適切な細胞増殖をもたらすことを当業者は認めるであろう。例えば、細胞死の抑制は、自己反応性のＢ細胞およびＴ細胞の存続を可能にすることによって、自己免疫疾患に導き、免疫系の疾患に寄与しうる。さらに、特定のウイルスによる感染は、抗アポトーシスウイルス遺伝子産物による宿主細胞死の抑制に依存することがあり、アポトーシスの抑制はウイルス感染の経路（溶菌対潜伏）を改変しうる。
【実施例】
【０１４６】
[00175]本発明は、ＧＲＰ（例えばＧＲＰ７８）が、薬物誘導性アポトーシスに対する防御を介してトポイソメラーゼ阻害剤に対する耐性を付与するという発見に一部基づいている。親のＣＨＯ細胞が比較された図１、パネルＡに示すように、全細胞抽出物の免疫ブロットの定量化は、Ｃ．１細胞におけるＧＲＰ７８レベルが、親であるＣＨＯ細胞より５倍高いことを示し、一方、同じくＥＲ局在性のシャペロンタンパク質であるＧＲＰ９４、および抗ＫＤＥＬ抗体で認識可能な４５−ｋＤａ未確認のタンパク質（Ｘ）は、両細胞系で比較的一定であった。抗ＧＲＰ７８抗体を用いたｉｎ  ｓｉｔｕ免疫蛍光法イメージングは、ＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞の両方で、ＧＲＰ７８の大部分が核周囲領域に濃縮されていることをさらに明らかにしたが、これはそのＥＲ局在性と一致する（図１、パネルＢ）。ＧＲＰ７８の免疫蛍光シグナルの強度は、ＣＨＯ細胞と比較して、Ｃ．１細胞の大部分でより強かった。
【０１４７】
[00176]免疫蛍光法を用いて、ＧＲＰ７８およびカスパーゼ−７分布をｉｎ  ｓｉｔｕで検査したところ、カスパーゼ−７は、ＥＲ局在性を示す核周囲パターンを示した（図１、パネルＣ）。共焦点顕微鏡法によって、カスパーゼ−７がＧＲＰ７８のサブ分画に極めて接近していることがさらに明らかになった。ＧＲＰ７８およびカスパーゼ−７の共局在性は、主として、核周囲／ＥＲ領域で検出された。
【０１４８】
[00177]ＧＲＰ７８との内在性カスパーゼ−７の物理的相互作用を、ＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞から調製された全細胞抽出を用いてさらに確認した。共焦点顕微鏡から得られた共局在性の結果に一致して、プロカスパーゼ−７は、Ｃ．１細胞において、高レベルのＧＲＰ７８と複合体を形成する（図６、パネルＡ、レーン２）。ＣＨＯ細胞では、ＧＲＰ７８は、抗ＫＤＥＬ抗体を用いた抗カスパーゼ−７免疫沈降中でかすかなバンドとして検出され（図６、パネルＡ、レーン１）、抗ハムスターＧＲＰ７８抗体をウェスタンブロットに用いた際には、ＧＲＰ７８のシグナルが強く促進された（図６、パネルＢ、レーン１）。免疫沈降抗体として抗カスパーゼ−３を用いた場合には、ＧＲＰ７８は、ウェスタンブロットでプロカスパーゼ−３に付随して検出されなかった（図６、パネルＡ、レーン３および４）。したがって、内在性ＧＲＰ７８構成的にプロカスパーゼ−７と結合する。本明細書に提示するデータはＧＲＰ７８およびカスパーゼ−７が相互作用することを示すものであるが、本発明は、これら２つのタンパク質の直接的相互作用に限定されない。本発明は、カスパーゼ−７を含むポリペプチド複合体、または、個別のカスパーゼ−７である細胞質ゾル成分を包含するものと理解される。カスパーゼとのＧＲＰ７８の相互作用を防止することによって、薬剤は、アポトーシスの促進によりアポトーシスを調節する。別法では、カスパーゼ−７とのＧＲＰ７８の相互作用を促進することによって、薬剤は、アポトーシスの抑制によりアポトーシスを調節するであろう。
【０１４９】
[00178]図７、パネルＡに示すように、低用量のトリプシン消化では、耐性のある３５ｋＤａカルボキシルバンドが検出された。より高用量のトリプシンでは、３５−ｋＤａバンドの強度がさらに強くなっており、約５０−ｋＤａの弱いバンドも目に見えた。ＣＨＯ細胞の消化パターンも同じであったが、ＧＲＰ７８の過剰発現と相関して、耐性のバンドはＣ．１細胞でより明らかであった。カルレティキュリン対照によって確認されたように、トリプシン処理は小胞体内腔に局在するＥＲタンパク質を消化しなかった（図７、パネルＢ）。
【０１５０】
[00179]加えて、ミクロソーム膜分画の炭酸ナトリウム抽出は、ＧＲＰ７８が膜および内腔の両方に局在していることを示す（図７、パネルＣ）。これらの結果は、ＧＲＰ７８がもっぱらＥＲ内腔タンパク質であるわけではなく、その亜集団は膜貫通タンパク質として存在することを示す。これは、ドメインＩＩＩおよびＩＶが推定上の膜貫通ドメインとして機能し、カルボキシル断片がＥＲ内腔に位置して、それによって、それらにトリプシン消化に対する耐性を与えているということと一致している（図７、パネルＡ）。このトポロジーは、ＧＲＰ７８の一部が細胞質ゾルに露出しており、それと細胞質ゾル成分との相互作用が可能となっていることをさらに示す。したがって、別の実施形態では、本発明は、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）を、このタンパク質が小胞体の膜に貫入する能力を抑制または防止する薬剤と接触させることによってアポトーシスを調節する方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、グルコース調節タンパク質７８のタンパク質の疎水性膜貫通ドメインＩＩＩ（配列番号１または２のアミノ酸２１０〜２６０）および／またはドメインＩＶ（配列番号１または２のアミノ酸４００〜４５０）を含むポリペプチドを準備することによって、膜とのグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の相互作用を調節する薬剤を同定する方法を提供する。このポリペプチドを薬剤と接触させることができ、そして、この相互作用に対する薬剤の作用を測定することができる。このポリペプチドが膜に貫入する能力を調節する薬剤は、アポトーシス調節の候補薬である。例えば、ＧＲＰ７８が膜に貫入する能力を抑制する薬剤は、ＧＲＰ７８が、アポトーシスを促進するのに必要な細胞質ゾル成分と相互作用するのを防止するであろうから、それはアポトーシスを促進することもできるであろう。
【０１５１】
[00180]さらに、ＧＲＰ７８のＡＴＰ結合ドメインが細胞質ゾル成分との相互作用に必要であることを決定した。ＡＴＰ結合領域は、ＧＲＰ７８のアミノ部分に存在する（図６、パネルＣ）。本発明はさらに、ＡＴＰ結合ドメインを含有するＧＲＰ７８断片の、本発明の方法における使用を包含する。例えば、配列番号１または２のアミノ酸１２５〜２７５、配列番号１または２のアミノ酸１５０〜２５０、あるいは配列番号１または２のアミノ酸１７５〜２０１を含むポリペプチドを、ＧＲＰ７８および細胞質ゾル成分の相互作用を調節する薬剤を同定する方法で用いることができる。
【０１５２】
[00181]カスパーゼに結合するのにＧＲＰ７８のＡＴＰ結合領域が必要であることを決定するために、欠失形態のＧＲＰ７８を安定に発現するＣＨＯ細胞系ＡＤ−１（図６、パネルＣ）を用いた。欠失は、ＡＴＰ結合ドメイン中の残基１７５〜２０１にまたがっており、ＡＴＰアーゼ活性の欠損をもたらす。ＣＨＯ細胞およびＡＤ１細胞から調製された全細胞抽出物のウェスタンブロット分析は、内在性の野生型ＧＲＰ７８に加えて、欠失形態のＧＲＰ７８の発現をＡＤ１細胞で確認した（図６Ｂ、レーン３および４）。
【０１５３】
[00182]抗カスパーゼ７抗体を用いた免疫沈降は、プロカスパーゼ−７が野生型ＧＲＰ７８とは複合体を形成できるが、残基１７５〜２０１の欠失によって、プロカスパーゼ−７と結合する能力が破壊されることを示した（図６、パネルＢ、レーン１および２）。エトポシド処理をすると、ＡＤ１細胞は、野生型タンパク質を過剰発現するＣ．１細胞と比較して、より強いカスパーゼ−７の活性化をｉｎ  ｖｉｖｏで示し、また、より大規模のＤＮＡ断片化を示した（図８、パネルＡおよびＢ）。親であるＣＨＯ細胞と比較して、ＡＤ１細胞で行ったアネキシン標識およびクローン原性生存試験は、エトポシド処理に対する防御が存在しないことをさらに示した。
【０１５４】
[00183]一過性形質移入細胞死アッセイは、ＧＲＰ７８によるアポトーシスの抑制がＧＲＰ７８とカスパーゼとの相互作用に依存していることをさらに示した。細胞生存率は、薬物で処理した後の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の保持によって定量的に測定した。図８に示すように、野生型ＧＲＰ７８の発現ベクターで形質移入された細胞はエトポシド処理に対して防御を与えた。ＧＲＰ７８のＡＴＰ結合機能がＧＲＰ７８の防御作用に必要であることを確認するために、野生型ＧＲＰ７８または変異体ＧＲＰ７８（Ｇ２２７Ｄ）のいずれかを発現するベクターで細胞を形質移入した。変異体ＧＲＰ７８（Ｇ２２７Ｄ）は、位置２２７にアミノ酸置換を有し、ＡＴＰ結合能が破壊されている。図８、パネルＣに示すように、変異体型ＧＲＰ７８では防御作用が失われていた。
【０１５５】
[00184]化学療法薬に対するＧＲＰ７８の作用を調べるために実験を行った。ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶと呼ばれる詳細に特徴付けされているアデノウイルスベクターのコンテクストにおいて、強力な細胞性プロモータ（ＣＭＶ）を、ＧＲＰ７８の発現を駆動するのに用いた。ＧＲＰ７８の過剰発現機能および抑制機能を果たす、センス方向およびアンチセンス方向両方のＧＲＰ７８を構築した。ＣＭＶプロモータでアンチセンス（ＡＳ）Ｇｒｐ７８を駆動する２つのバージョンのアデノウイルスを構築した（図１１Ａ〜Ｃを参照）。完全長ＡＳコンストラクトの構築スキームを図１１に示す。ｇｒｐ７８エキソンＩの３２０ｂｐ断片を含む部分長ＡＳを発現するアデノウイルスコンストラクトを、ＣＭＶプロモータに対して逆方向にクローニングした（図１１Ｃを参照）。このより短い断片はＡＵＧ開始コドンを標的としており、完全長アンチセンス分子より効果的でありうる。
【０１５６】
[00185]ヒト２９３Ｔ組織培養試験システムで、Ｈｉｓタグ付きＧＲＰ７８の過剰発現を行った。この細胞系は、アデノウイルスで極めて効率的に感染させることができるので用いた。この目的では、Ｈｉｓタグ付きＧＲＰ７８を発現するアデノウイルスを様々な用量で２９３Ｔ細胞に感染させた。７２時間後に細胞溶解液を調製し、Ｈｉｓタグ付きＧＲＰ７８のレベルを検出するために、アデノウイルスで発現されたタンパク質に特異的な、Ｈｉｓタグに対する抗体を用いて免疫ブロットを行った。結果は、Ｈｉｓタグ付きＧＲＰ７８が高レベルで用量依存的に発現されたことを示した（図１２、レーン４、５、および６）。これは、完全長ＧＲＰ７８を発現するアデノウイルスコンストラクトが成功していることを証明する。次のステップは、これらの実験をＭＤＡ細胞およびＭＣＦ−７細胞で反復することである。これらの細胞は培養するがさらに難しく、感染させるのがより困難であるため、このステップはさらに困難なものである。
【０１５７】
[00186]原則の証明として、２つのアンチセンス（ＡＳ）コンストラクトを試験して、ヒト２９３Ｔ組織培養試験システムにおいて、それらがＨｉｓタグ付きＧＲＰ７８を抑制する能力を測定した。この目的では、完全長ＡＳまたは３２０ｂｐのＡＳを発現する様々な用量のアデノウイルスを、Ｈｉｓタグ付きＧＲＰ７８を発現するアデノウイルスと共に、２９３Ｔ細胞に同時感染させた。７２時間後に細胞溶解液を調製し、Ｈｉｓタグ付きＧＲＰ７８のレベルを検出するために、アデノウイルスで発現されたタンパク質に特異的な、Ｈｉｓタグに対する抗体を用いて免疫ブロットを行った。結果は、完全長ＡＳ（図１２、レーン７、８、および９）、および３２０ｂｐのＡＳ（図１２、レーン１、２、および３）は両方とも、用量依存的にＨｉｓタグ付きＧＲＰ７８の発現を抑制できることを示した。これは、アンチセンスＧＲＰ７８を発現するアデノウイルスコンストラクトが成功していることを証明する。最も急激な減少は３２０ｂｐのＡＳで得られた（図１２、レーン１）。
【０１５８】
[00187]次に、３２０ｂｐのＡＳを発現するアデノウイルスを、化学療法薬であるエトポシドによる処理の存在下または非存在下で、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に感染させた。同じ細胞をＧＦＰネガティブコントロールアデノウイルスで感染させた。結果は、模擬感染細胞（ｍｏｃｋ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）では、エトポシド処理それ自体によって内在性ＧＲＰ７８の量が約４０％減少したことを示した（図１３、レーン１および２）。重要なことに、３２０ｂｐのＡＳコンストラクトによって、ＧＲＰ７８レベルがさらに、有意に減少し、とりわけ、エトポシドで処理された細胞では、最終レベルが１０％未満であった（図１３、レーン３および４）。したがって、ＧＲＰ７８を標的とした完全長バージョンおよび３２０ｂｐバージョン両方のコンストラクトが、２９３Ｔ試験システムでＧＲＰ７８の発現を阻止した。これをヒト肺癌細胞で反復して、これらのＡＳアデノウイルスが内在性ＧＲＰ７８発現を抑制できることを示した。
【０１５９】
[00188]ＧＲＰ７８の過剰発現によって付与される抗アポトーシス作用を測定する実験も行った。この課題は完遂した。ＧＲＰ７８の過剰発現は、４つの薬物（シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、およびカンプトテシン）すべてに対して耐性を与えた。結果を表２にまとめる。
【０１６０】
【表２】
2010233569.tif 000004
【０１６１】
[00189]上記のアンチセンスアプローチを、ｓｉＲＮＡアプローチに替えた。Ｇｒｐ７８  ｓｉＲＮＡ配列は、次の通りである。
５’  ＡＡＧＧＴＴＡＣＣＣＡＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴ  ３’  （配列番号４）
３’  ＴＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＡＣＧＴＣＡＡＣＡＡ  ５’  （配列番号１７）
ヒトゲノム配列に対してＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、この配列は独特であり、原則として、他のいかなるヒト遺伝子にも影響を与えないはずである。これを立証するために、ヒト２９３Ｔ細胞における、ＧＲＰ７８、ならびに近縁のストレスタンパク質であるＧＲＰ９４およびＨＳＰ７０の発現に対するこのｓｉＲＮＡの影響を試験する実験を行った。β−アクチンのレベルをローディング対照として用いた。図１４に示すように、ＧＲＰ７８レベルのみが抑制され、このｓｉＲＮＡがＧＲＰ７８に特異的であることを確認した。
【０１６２】
[00190]８０ｎM以上のＧｒｐ７８（ＩＩ）ｓｉＲＮＡで、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＧＲＰ７８レベルを有意に抑制できることを、実験によってさらに示した（図１５）。これによって、関係ない緑色蛍光タンパク質を標的とした対照ｓｉＲＮＡより多くの細胞が、Ｇｒｐ７８（ＩＩ）ｓｉＲＮＡで処理された細胞で死亡することとなる（図１６）。
【０１６３】
[00191]ＧＲＰ７８作用の標的候補の１つはＢｌＫであるが、これは、ＤＮＡ損傷に反応して誘導されるＢＨ３のみにおけるタンパク質であり、ＥＲと、ミトコンドリアとに局在する。際だったことに、ＥＲ標的としたＢｌＫは、チトクロームｃの遊離を誘導することができ、ＥＲ部位に作用して、平行する細胞死経路を開始ができることを示唆する（Ｇｅｒｍａｉｎら、２００２年）。ミトコンドリアからのチトクロームｃの遊離を制御する向アポトーシス分子の作用を、ＧＲＰ７８が、分子シャペロンとして、直接的または間接的に阻止ができるかどうかを試験する実験を行った。エトポシド処理および内在性ＢｌＫとのＧＲＰ７８の免疫共沈降の後にＢｌＫレベルが増大していることを、２９３Ｔをモデル系として用いて観測した（図１７Ａ）。これらの結果は、ＧＲＰ７８の過剰発現によって、ＥＲを標的としたＢｌＫによって媒介された細胞死から細胞を保護ができることを示唆する（図１７Ｂ）。これらの新知見は、エトポシドで処理された細胞において、ＢｌＫおよびＧＰＰ７８の物理的相互作用および機能的相互作用の両方があることを意味する。したがって、これは、エトポシドで誘導された細胞死に対するＧＲＰ７８の防御作用に部分的に寄与することができる。
【０１６４】
[00192]細胞培養条件−ＣＨＯ細胞は、１０％透析ウシ胎児血清、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗生物質で補充した、ヌクレオシドを含む最小イーグル培地で維持した。Ｃ．１細胞およびＡＤ１細胞は、０．１μｇ／ｍｌメトトレキサート存在下における上記条件で、ヌクレオシドを添加せずに維持した。ヒトＧＲＰ７８を過剰発現するか、または空の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）で形質移入された、安定な一時的Ｔ２４／８３ヒト膀胱癌細胞系の確立については既に記載されている。Ｔ２４／８３細胞系は、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗生物質および２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有する、１０％ウシ胎児血清で補充したＭ１９９培地で維持した。ヒト急性Ｔ細胞白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗生物質を含有する、１０％ウシ胎児血清で補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で維持した。すべての細胞は３７℃、５％  ＣＯ２／９５％大気の加湿雰囲気中で維持した。
【０１６５】
[00193]試薬−エトポシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）は、Ｍｅ２ＳＯで濃度３０ｍＭに溶解して、−２０℃で保存した。メトトレキサート（Ｓｉｇｍａ社）は、最小量の１Ｍ  ＮａＯＨで溶解して、水で１μｇ／ｍｌに希釈し、−２０℃で保存した。２  ｍｇ／ｍｌのドキソルビシン（Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＯＨ）、および２０ｍｇ／ｍｌのカンプトテシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）は、等張液として入手した。
【０１６６】
[00194]細胞周期分析−播種の後、指数関数的に増殖している細胞を、様々な日にトリプシン処理して、７０％エタノール中で固定した。固定した細胞を、０．１％トリトンＸ−１００、０．２ｍｇ／ｍｌ（ｖ／ｖ）ＤＮアーゼフリーＲＮアーゼ、および２０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有するＰＢＳで、３０分間、室温で処理した。細胞周期分布は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析（ＦＡＣｓｔａｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって分析した。細胞周期分布の測定は、３〜４回反復した。
【０１６７】
[00195]クローン原性生存試験−直径１０ｃｍの培養皿に４０００細胞を播種した。播種の２日後に、細胞を、エトポシドで６ｈ、ドキソルビシンで１ｈ、またはカンプトテシンで２４ｈ、示されている様々な濃度で処理した。薬物処理の後、細胞を１０〜１４日間、新しい培地中で培養した。コロニーを氷冷ＰＢＳで洗浄し、メタノールで固定し、１０％ギムザ染色溶液で染色した。生存率は、薬物で処理された細胞の中で生き残っているコロニーの数を、処理されていない対照群のコロニー数で割ることによって決定した。
【０１６８】
[00196]アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析−ＣＨＯ細胞、Ｃ．１細胞、およびＴ２４／８３細胞をトリプシン処理し、ｐＨ７．４の氷冷ＰＢＳで洗浄し、１μ結合緩衝液に再懸濁した（ｐＨ７．４の１０ｍＭヘペス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、細胞密度１×１０５細胞／ｍｌ）。１００μｌの細胞懸濁液を５ｍｌプラスチックチューブに移し、５μｌのアネキシンＶ−フルオレセインイソチオシアネート（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）、および０．５ｍｇ／ｍｌのＰＩ  ４μｌを添加した。細胞を穏やかにボルテックスし、暗中、室温で、２０分間、インキュベートした。各チューブに４００μｌの結合緩衝液を添加し、１ｈ以内に、フローサイトメトリーによってアネキシンＶ染色を分析した。ＰＩおよびアネキシンＶ染色の両方に関して陰性の細胞が生存細胞であり、アネキシンＶ染色陽性の細胞は早期アポトーシス細胞であり、ＰＩ陽性かつアネキシンＶ染色陽性の細胞は、主としてアポトーシス後期ステージの細胞である。
【０１６９】
[00197]カスパーゼ−７活性化アッセイ、−細胞は無処理か、または１００μＭのエトポシドで６ｈ処理され、２４ｈ後に採取された。細胞は、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、ペプスタチン、およびアプロチニンプロテアーゼ阻害剤の存在下で、５倍容積の低張緩衝液（ｐＨ７．４の５ｍＭトリス−塩酸、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０の０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および１ｍＭジチオトレイトール）に懸濁した。氷上で２０分間、インキュベーションした後、最終濃度２５０ｍＭとなるようにショ糖を添加し、１ｍｌのドウンス型ウィートンホモジナイザー中で８回上下することによって細胞を破砕した。ホモジネートを７５０μ  ｇで、１０分間、２回遠心した。上清を、１６０００×ｇ、４℃で、１５分間遠心して透明にし、細胞質画分と名付けた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのカスパーゼ−７活性化アッセイには、１５０μｇの無細胞抽出物を様々な量のチトクロームｃおよびｄＡＴＰと、３７℃で、１ｈインキュベートした。等量の総タンパク質を分離して、カスパーゼ−７に対するウェスタンブロットを行った。
【０１７０】
[00198]ウェスタンブロッティング−細胞溶解液を、放射免疫沈殿アッセイ緩衝液中に調製し、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、トポイソメラーゼＩＩ、カスパーゼ−７、およびα−アクチンに対する抗体で免疫ブロットを上記の通りに行った。転写されたタンパク質を含有するニトロセルロース膜を、５％無脂粉乳、および０．１％トゥイーン２０を含有するトリス緩衝生理食塩水で、１ｈ、室温でブロッキングし、それぞれの一次抗体でプロービングした。ＧＲＰ７８には、抗ＫＤＥＬマウスモノクローナル抗体（ＳＰＡ−８２７）、ラットＧＲＰ７８のカルボキシル末端１０アミノ酸に対する抗ＧＲＰ７８ウサギポリクローナル抗体（ＳＰＡ−８２６）（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ社、Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｃａｎａｄａ）、または抗ハムスターＧＲＰ７８ウサギポリクローナル抗体を、それぞれ、１：３０００、１：２０００、および１：５０００の希釈率で用いた。他の一次抗体の希釈率は次の通りである。すなわち、抗カルネキシンウサギポリクローナル抗体（ＳＰＡ−８６５）（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ社）は１：２０００、抗カルレティキュリンウサギポリクローナル抗体（ＳＰＡ−６００）（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ社）は１：３０００、抗β−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社）は１：５０００、抗カスパーゼ−７マウスモノクローナル抗体（１０−１−６２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）は１：１０００、抗カスパーゼ−３ウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）は１：１０００、そして、抗トポイソメラーゼＩＩマウスモノクローナル抗体（ＳＷＴ３Ｄ１）（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は１：１０００である。それぞれに対応するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用し、ＥＣＬ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によってタンパク質バンドを可視化した。
【０１７１】
[00199]一過性形質移入死亡アッセイ−簡潔には、ＣＭＶ−ｎｅｏ−Ｂｃｌ２ベクター、または野生型ハムスターＧＲＰ７８もしくはＧＲＰ７８  ＡＴＰ結合部位変異体Ｇ２２７Ｄの発現ベクターでＪｕｒｋａｔ細胞に一時的に形質移入した。薬物で処理した後、細胞溶解液を調製して、生存細胞に残留しているβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。細胞毒性パーセントは、以前に記載されている通りに計算した。
【０１７２】
[00200]ＤＮＡ断片化アッセイ−細胞は無処理か、または１００μＭのエトポシドで１２ｈ処理し、４８ｈ後に採取した。ＤＮＡ断片化アッセイは、製造会社の説明書に従ってアポトーシスＤＮＡラダーキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を使用して行った。
【０１７３】
[00201]蛍光抗体法および像解析−ＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞をチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）中で６０％の集密度まで増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１０分間、固定した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１％トリトンＸ−１００および５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で、３０分間、透過処理した。ＧＲＰ７８の検出には、１：１０００希釈の抗ＧＲＰ７８（Ｃ−２０）ヤギポリクロナール抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．社、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）と、１：５００希釈のテキサスレッド結合抗ヤギ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とで細胞を染色した。カスパーゼ−７の検出には、１：５００希釈の抗カスパーゼ−７マウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と、１：５００希釈のフルオレセインイソチオシアネート結合抗マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社）で細胞を染色した。ＤＡＰＩ封入剤を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社）中に細胞を封入し、Ｚｅｉｓｓ社製ＬＳＭ５１０二光子共焦点顕微鏡で可視化した。Ｔ２４／８３細胞は、ＣＨＯ細胞について記述したのと同じ抗ＧＲＰ７８ポリクロナール抗体とインキュベートした。全細胞イメージは、後で、ノーザン露出イメージ分析／記録保管ソフトウェア（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ社、Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて捕捉し、分析した。
【０１７４】
[00202]免疫共沈降反応アッセイ−４００μｌの抽出緩衝液（プロテアーゼ阻害錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を含有する、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ノニデット  Ｐ−４０、および０．５％デオキシコール酸）中で２×１０６細胞を溶解させ、凍結融解処置を３回行った。各試料から得た５００μｇの総タンパク質を、５０μｌのプロテインＡセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ社）で、１ｈ、４℃で前処置し、その後、抗カスパーゼ−７マウスモノクローナル抗体または抗カスパーゼ−３抗体のいずれか５μｇで２ｈインキュベートした。インキュベーション時間の後、５０μｌのプロテインＡセファロースビーズを添加し、混合物を終夜、４℃で回転させた。その後、抽出緩衝液でビーズを５回洗浄した。免疫沈降は、３０μｌの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料添加緩衝液（ｐＨ６．８の５０ｍＭトリス−塩酸、１００ｍＭジチオトレイトール、２％  ＳＤＳ、０．１％ブロムフェノールブルー、１０％グリセロール）を添加して、その後、１００℃で１０分間、加熱することによって、洗浄されたビーズから遊離させた。遠心法の後に得られた上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ウェスタンブロット分析を行って、免疫共沈降したタンパク質の検出を行った。
【０１７５】
[00203]ミクロソームの単離およびプロテアーゼ消化−細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳで洗浄した後、１０倍容積の冷低張緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４）でのインキュベーションと、それに続くドウンスホモジナイゼーションとによって細胞を溶解させた。溶解物を直ちに、０．２５Ｍショ糖、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２に調整し、１０００×ｇ、４℃で１０分間、遠心して核および細胞破片を除去した。上清を１００，０００×ｇで９０分間、さらに遠心した。ミクロソームに相当するペレットを、冷水で短時間すすぎ、ｐＨ７．４の５０ｍＭトリス−塩酸に再懸濁し、タンパク質分解検査および炭酸ナトリウム抽出検査に使用した。
【０１７６】
[00204]炭酸ナトリウム抽出−内腔タンパク質からのＥＲ膜の単離には、ミクロソームペレットはｐＨ１１．５の１００ｍＭ炭酸ナトリウム５０倍容積に再懸濁し、氷上で１ｈインキュベートした。その後、懸濁液を２４００００×ｇ、４℃で１ｈ遠心した。ペレット（ＥＲ膜に相当する）を冷水ですすぎ、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料添加緩衝液に再懸濁して、ウェスタンブロットによって分析した。小胞体内腔に存在するタンパク質は、トリクロロ酢酸を最終濃度１０％になるように添加することによって、上清から回収した。ペレットをアセトンで３回洗浄し、空気乾燥させ、１ｍｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料添加緩衝液中に可溶化させ、ウェスタンブロットによって分析した。
【０１７７】
[00205]ミクロゾームタンパク質の限定トリプシン消化−トリプシン消化反応には、ミクロソームをトリプシン（０．０１％または０．０５％）と、３０分間、室温でインキュベートした。タンパク分解性切断反応は、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料添加緩衝液を添加して、１００℃で５分間、煮沸させることによって終了させた。各反応から得た１０〜２０μｇの総タンパク質をウェスタンブロットによって分析した。
【０１７８】
[00206]ＧＲＰ７８の特異的な過剰発現が薬物耐性の発生を直接導くことができるかどうか検査するために、ＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞を様々な薬物に曝露し、クローン原性生存試験を用いて細胞生存率を測定した。様々な用量のエトポシド（ＶＰ１６とも呼ばれる）、アドリアマイシン（ドキソルビシンとも呼ばれる）およびカンプトテシンを試験した。エトポシドおよびアドリアマイシンは両方ともトポイソメラーゼＩＩの阻害剤であり、カンプトテシンはトポイソメラーゼＩの阻害剤である。試験された各薬物の結果を図２に示す。ＧＲＰ７８を過剰発現するＣ．１細胞は、これら３つの薬物すべてでＣＨＯ細胞より高い耐性を与えた。これらのデータは、ＧＲＰ７８の特異的な過剰発現が、ＵＰＲの非存在下において、トポイソメラーゼＩおよびＩＩの阻害剤に対する耐性をＣＨＯ細胞に付与するのに十分であることを確立するものである。
【０１７９】
[00207]ＧＲＰ７８が、エトポシドによって誘導されたアポトーシスから細胞を防御するかどうかを決定するため、ＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞を、無処理とするか、あるいはエトポシドで処理して、アネキシンＶおよびＰｌで標識した。アポトーシス細胞はアネキシンＶ標識によって同定した。ＣＨＯ細胞では、エトポシド処理によって、アポトーシス細胞の割合が１０倍（９％から９０％）に増大したが、Ｃ．１細胞では、４．７倍の増大であった（１５％から７０％）（図３Ａ）。エトポシド処理されたＣＨＯ細胞では、より大規模なＤＮＡ断片化も検出されたが、Ｃ．１細胞では検出されなかった（図、パネルＢ）。
【０１８０】
[00208]同一条件下で選択および培養された、一対の、安定に形質移入された一時的ヒト膀胱癌Ｔ２４／８３細胞系を用いて、腫瘍細胞に対するＧＲＰ過剰発現の影響を測定した。Ｔ２４／８３−ＧＲＰ７８と呼ばれる細胞系は、ヒトＧＲＰ７８を過剰発現し、Ｔ２４／８３−ｐｃＤＮＡと呼ばれるもう一方の細胞系は、空の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ（２８）で安定に形質移入されている。免疫ブロット分析を行い、その後、α−アクチンに対して正規化を行ったところ、Ｔ２４／８３−ＧＲＰ７８細胞では、Ｔ２４／８３−ｐｃＤＮＡ細胞と比較して、ＧＲＰ７８発現レベルに３倍の増大があった（図４Ａ、挿入図）。Ｔ２４／８３−ＧＲＰ７８細胞におけるＧＲＰ７８の過剰発現は、ＥＲシャペロンタンパク質である、ＧＲＰ９４、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、およびカルレティキュリン、または熱ショックタンパク質であるＨＳＰ４７の発現レベルには影響を与えなかった（図４、パネルＡ）。全細胞イメージは、Ｔ２４／８３−ＧＲＰ７８細胞のＧＲＰ７８免疫蛍光がはるかに強いことを明らかにし、免疫ブロットの結果を確認する（図４、パネルＢ）。
【０１８１】
[00209]ＣＨＯ細胞系と一致して、ＧＲＰ７８を過剰発現するＴ２４／８３細胞は、エトポシドに対してより強い耐性をクローン原性生存試験で示した（図４Ａ、パネルＡ）。アドリアマイシンおよびカンプトテシンに対しても、同様の防御が観測された。Ｔ２４／８３−ｃＤＮＡ細胞では、エトポシド処理によって、アネキシンＶ標識された細胞の割合が２．７倍（７％から１９％に）増大し、これと比較して、Ｔ２４／８３−ＧＲＰ７８細胞では１．４倍（８％から１１％に）の増大であった（図４Ｃ）。
【０１８２】
[00210]ＧＲＰ７８を過剰発現する細胞系が利用可能となったので、ＵＰＲの非存在下における、トポイソメラーゼＩＩレベルに対するＧＲＰ７８過剰発現の影響を測定した。ＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞を、無処理とするか、あるいはエトポシドで処理し、トポイソメラーゼＩＩのレベルを免疫ブロッティングによって測定した（図５、パネルＡ）。データは、ＧＲＰ７８の特異的な過剰発現が、トポイソメラーゼＩＩタンパク質のレベルには影響しないことを示す。
【０１８３】
[00211]指数関数的に増殖している細胞の細胞周期分布の分析は、ＣＨＯ細胞およびＣ．１細胞が同様のＧ１、Ｓ、およびＧ２分布プロファイルを有することを示した（図９）。対照的に、共に標準的なＵＰＲ誘発剤であるツニカマイシンまたはタプシガルジンで処理されたＣＨＯ細胞は、より多くのＧ１期細胞を示し、また、Ｓ期の細胞の劇的な減少を示した。指数関数的に増殖しているＴ２４／８３細胞でも同様のパターンが観測された。ベクターで形質移入された細胞でも、ＧＲＰ７８を過剰発現する細胞でも、両方ともＧ１、Ｓ、およびＧ２細胞の割合は同様であった。ツニカマイシンまたはタプシガルジンで処理された細胞は、高い割合のＧ１細胞と、低い割合のＳ期細胞とを示した（図９）。これらの結果は、併せると、ＵＰＲとは対照的に、ＧＲＰ７８の特異的な過剰発現は細胞周期の分布を変化させないことを示す。
【０１８４】
[00212]本発明の多くの実施形態について記載した。それにもかかわらず、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、様々な改変を加えうることが理解されよう。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲に包含される。
【図１】
2010233569.tif 000005
【図２】
2010233569.tif 000006
【図３】
2010233569.tif 000007
【図４】
2010233569.tif 000008
【図５】
2010233569.tif 000009
【図６】
2010233569.tif 000010
【図７】
2010233569.tif 000011
【図８】
2010233569.tif 000012
【図９】
2010233569.tif 000013
【図１０】
2010233569.tif 000014
【図１１Ａ】
2010233569.tif 000015
【図１１Ｂ】
2010233569.tif 000016
【図１１Ｃ】
2010233569.tif 000017
【図１２】
2010233569.tif 000018
【図１３】
2010233569.tif 000019
【図１４】
2010233569.tif 000020
【図１５】
2010233569.tif 000021
【図１６】
2010233569.tif 000022
【図１７】
2010233569.tif 000023
【配列表】
2010233569000001.app