(57)【要約】【課題】複数のポリヌクレオチドの順序を変更した連結体を簡便に構築できるポリヌクレオチドセットおよび複数のポリヌクレオチドの連結体作製方法を提供する。【解決手段】以下の配列（ａ）〜（ｄ）を有するポリヌクレオチドセット。（ａ）第一ポリヌクレオチドＡの３’末端の塩基配列２および第二ポリヌクレオチドＢの５’末端の塩基配列３が同一或いは互いにコンパチブルな制限酵素認識配列（ｂ）第二ポリヌクレオチドＢの３’末端の塩基配列４および第三ポリヌクレオチドＣの５’末端の塩基配列５が同一或いは互いにコンパチブルな制限酵素認識配列（ｃ）第一ポリヌクレオチドＡの５’末端の塩基配列１および第二ポリヌクレオチドＢの３’末端の塩基配列４が互いにコンパチブルな制限酵素認識配列（ｄ）第二ポリヌクレオチドＢの５’末端の塩基配列３および第三ポリヌクレオチドＣの３’末端の塩基配列６が互いにコンパチブルな制限酵素認識配列【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一ポリヌクレオチド、第二ポリヌクレオチド、第三ポリヌクレオチドを連結した連結体を形成すべく、前記各ポリヌクレオチドが以下の配列（ａ）〜（ｄ）を有するポリヌクレオチドセット。
（ａ）前記第一ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列および前記第二ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が同一配列、或いは、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
（ｂ）前記第二ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列および前記第三ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が同一配列、或いは、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
（ｃ）前記第一ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列および前記第二ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列が、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
（ｄ）前記第二ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列および前記第三ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列が、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
【請求項２】
前記同一配列が、制限酵素ＡｐａＩ認識配列および制限酵素ＸｈｏＩ認識配列の何れか
である請求項１に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項３】
前記互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列となる制限酵素のペアが、制限酵素ＰｓｐＯＭＩおよび制限酵素ＥａｇＩ、或いは、制限酵素ＸｈｏＩおよび制限酵
素ＳａｌＩである請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項４】
（ａ）前記第一ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列および前記第二ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が制限酵素ＡｐａＩ認識配列
（ｂ）前記第二ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列および前記第三ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が制限酵素ＸｈｏＩ認識配列
（ｃ）前記第一ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が制限酵素ＳａｌＩ認識配列、前
記第二ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列が制限酵素ＸｈｏＩ認識配列
（ｄ）前記第二ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が制限酵素ＰｓｐＯＭＩ認識配列
、前記第三ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列が制限酵素ＥａｇＩ認識配列
である請求項３に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項５】
前記第一ポリヌクレオチドが抗体重鎖可変領域遺伝子断片であり、前記第二ポリヌクレオチドがリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、前記第三ポリヌクレオチドが抗体軽鎖可変領域遺伝子断片である請求項１〜４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドセットを使用して各ポリヌクレオチドを連結するに際し、
上流から前記第一ポリヌクレオチド、前記第二ポリヌクレオチド、前記第三ポリヌクレオチドの順に配置した第一連結体を作製する工程として、
（ｉ）前記第一ポリヌクレオチドおよび前記第二ポリヌクレオチドを制限酵素ＡｐａＩで
消化してライゲーションするプロセス
（ｉｉ）上記（ｉ）のプロセスで得られたライゲーション産物および前記第三ポリヌクレ
オチドを制限酵素ＸｈｏＩで消化してライゲーションするプロセス
を有し、
上流から前記第三ポリヌクレオチド、前記第二ポリヌクレオチド、前記第一ポリヌクレオチドの順に配置した第二連結体を作製する工程として、
（ｉｉｉ）前記第二ポリヌクレオチドを制限酵素ＰｓｐＯＭＩ、前記第三ポリヌクレオチ
ドを制限酵素ＥａｇＩでそれぞれ消化してライゲーションするプロセス
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）のプロセスで得られたライゲーション産物を制限酵素ＸｈｏＩ、
前記第一ポリヌクレオチドを制限酵素ＳａｌＩでそれぞれ消化してライゲーションするプ
ロセス
を有する複数のポリヌクレオチドの連結体作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第一ポリヌクレオチド、第二ポリヌクレオチド、第三ポリヌクレオチドを連結した連結体を形成するためのポリヌクレオチドセット、および、複数のポリヌクレオチドの連結体作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）とそれがコードするタンパク質を１対１で結合させ、タンパク質をスクリーニングすると共にその遺伝子も同時に取得出来る技術として、ファージ抗体法、インビトロウイルス（ＩＶＶ）法などが研究されている（非特許文献１，２）。
【０００３】
非特許文献１には、内部に抗体遺伝子を持ち、それがコードする抗体が融合した外殻タンパク質を持つ繊維状ファージを作製してスクリーニングに使用する技術が記載してある。非特許文献２には、ｍＲＮＡとそれがコードするタンパク質を無細胞タンパク質合成系でピューロマイシン（puromycin）を使用して結合させる技術が記載してある。
【０００４】
例えばファージ抗体法は、抗原に対し、Ｂ細胞で産生された抗体が重鎖−軽鎖の四量体として達成していた親和性及び特異性を試験管内で再構築する方法である。詳しくは、Ｂ細胞で発現する重鎖及び軽鎖抗体遺伝子の可変領域のみをそれぞれＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いてクローニングし、両遺伝子を人為的に結合し、線維状バクテリオファージＭ１３の外殻蛋白ｇ３ｐとの融合蛋白として発現させる。多種多様なソースのＢ細胞から作製が可能である。ある抗原と特異的に結合するクローンを得るためにライブラリーと呼ばれる多種類の遺伝子配列／組み合わせをもつ母集団を作出し、この中から目的とするものを選抜する。
【０００５】
一本鎖化可変領域断片（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）は、抗体における重鎖および軽鎖をリンカーペプチド接続したものである。
非特許文献３には、抗リゾチームモノクローナル抗体のＦＶフラグメントに関して、重鎖−リンカーペプチド−軽鎖、および、軽鎖−リンカーペプチド−重鎖の配列を有するｓｃＦｖをそれぞれ構築したことが記載してある。
特許文献１には、重鎖−リンカーペプチド断片−制限酵素ＸｂａＩ認識配列、および、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−リンカーペプチド断片-軽鎖をライゲーションすることで効率的にｓｃＦｖを作製することが記載してある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２４５６０１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】GEヘルスケア  Recombinant Phage Antibody System Manual
【非特許文献２】"In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro."Nemoto, N., Miyamoto-Sano, E., Husimi, Y., Yanagawa, H., FEBS Lett., 414, 405-408 (1997)
【非特許文献３】"Effect of the order of antibody variable regions on the expression of the single-chain HyHEL10 Fv fragment in E. coli and the thermodynamic analysis of its antigen-binding properties."Tsumoto K, Nakaoki Y, Ueda Y, Ogasahara K, Yutani K, Watanabe K, Kumagai I.,Biochem Biophys Res Commun. 1994 Jun 15;201(2):546-51.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１、特許文献１に記載のｓｃＦｖでは、重鎖と軽鎖との並び順としては、重鎖−リンカーペプチド−軽鎖の順序のみが記載してある。
【０００９】
ｓｃＦｖでは、重鎖と軽鎖との間に人工的なリンカーを挿入する。非特許文献３において、重鎖と軽鎖との順序を変更したｓｃＦｖを構築してその発現を確認したところ、重鎖−リンカーペプチド−軽鎖の並び順では発現しなかったが、軽鎖−リンカーペプチド−重鎖の並び順では発現したことが記載してある。このように人工的なリンカーを挿入することで一方の並び順でしか機能しない抗体の例があるため、ｓｃＦｖを構築するに際しては重鎖と軽鎖との並び順を考慮する必要があった。仮に両方の並び順で発現させてそれらの機能を確認するには、予め両方の並び順で構築したｓｃＦｖを準備する必要がある。この際、例えば非特許文献３に記載のように、部位特異的変異処理（site-directed mutagenesis）などの処理を行って重鎖および軽鎖をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）を両方の並び順で構築したポリヌクレオチドの連結体を別異に作製し、それぞれの連結体について、発現ベクターに導入し、形質転換した大腸菌によって産生されるｓｃＦｖを精製する実験系を別個に実施する必要がある。このように、煩雑な実験系を二つ実施する必要があった。
【００１０】
従って、本発明の目的は、複数のポリヌクレオチドの順序を変更した連結体を簡便に構築できるポリヌクレオチドセットおよび複数のポリヌクレオチドの連結体作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［６］に示す発明を提供する。
［１］第一ポリヌクレオチド、第二ポリヌクレオチド、第三ポリヌクレオチドを連結した連結体を形成すべく、前記各ポリヌクレオチドが以下の配列（ａ）〜（ｄ）を有するポリヌクレオチドセット。
（ａ）前記第一ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列および前記第二ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が同一配列、或いは、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
（ｂ）前記第二ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列および前記第三ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が同一配列、或いは、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
（ｃ）前記第一ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列および前記第二ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列が、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
（ｄ）前記第二ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列および前記第三ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列が、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
［２］前記同一配列が、制限酵素ＡｐａＩ認識配列および制限酵素ＸｈｏＩ認識配列の何
れかである上記［１］に記載のポリヌクレオチドセット。
［３］前記互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列となる制限酵素のペアが、制限酵素ＰｓｐＯＭＩおよび制限酵素ＥａｇＩ、或いは、制限酵素ＸｈｏＩおよび制
限酵素ＳａｌＩである上記［１］又は［２］に記載のポリヌクレオチドセット。
［４］（ａ）前記第一ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列および前記第二ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が制限酵素ＡｐａＩ認識配列
（ｂ）前記第二ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列および前記第三ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が制限酵素ＸｈｏＩ認識配列
（ｃ）前記第一ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が制限酵素ＳａｌＩ認識配列、前
記第二ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列が制限酵素ＸｈｏＩ認識配列
（ｄ）前記第二ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列が制限酵素ＰｓｐＯＭＩ認識配列
、前記第三ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列が制限酵素ＥａｇＩ認識配列
である上記［３］に記載のポリヌクレオチドセット。
［５］前記第一ポリヌクレオチドが抗体重鎖可変領域遺伝子断片であり、前記第二ポリヌクレオチドがリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、前記第三ポリヌクレオチドが抗体軽鎖可変領域遺伝子断片である上記［１］〜［４］の何れか一項に記載のポリヌクレオチドセット。
【００１２】
上記［１］〜［５］の構成によれば、各ポリヌクレオチドを所定の制限酵素で切断した場合、第二ポリヌクレオチドの５’末端は、第一ポリヌクレオチドの３’末端および第三ポリヌクレオチドの３’末端の何れとも結合でき、また、第二ポリヌクレオチドの３’末端は、第一ポリヌクレオチドの５’末端および第三ポリヌクレオチドの５’末端の何れとも結合できる。従って、構成（ａ）（ｂ）によって上流から第一ポリヌクレオチド・第二ポリヌクレオチド・第三ポリヌクレオチドの順に配置した連結体を作製でき、構成（ｃ）（ｄ）によって上流から第三ポリヌクレオチド・第二ポリヌクレオチド・第一ポリヌクレオチドの順に配置した連結体を作製できる。これら連結体は、制限酵素処理・ライゲーションといった処理によって容易に作製することができる。従って、本発明のポリヌクレオチドセットは、複数のポリヌクレオチドの順序を変更した連結体を簡便に構築できる。
【００１３】
「同一配列」とは、両者の制限酵素認識配列が完全に同一な配列となるものをいう。例えば切断形状が平滑末端および粘着末端の何れかとなる制限酵素が認識する配列とすればよい。
「互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列」とは、二つの制限酵素認識配列において同一な配列ではないが、一方の制限酵素認識配列を所定の制限酵素で処理した切断末端と、他方の制限酵素認識配列を異なる制限酵素で処理した切断末端とが同一となる関係を有するものをいう。
【００１４】
制限酵素ＡｐａＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＥａｇＩ、ＳａｌＩは、一般的に使用さ
れる制限酵素であるため、入手は容易である。
【００１５】
本発明では、特に第一ポリヌクレオチドを抗体重鎖可変領域遺伝子断片とし、第二ポリヌクレオチドをリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドとし、第三ポリヌクレオチドを抗体軽鎖可変領域遺伝子断片とすれば、ｓｃＦｖを構築することができる。ｓｃＦｖを構築するに際しては、発現の有無を確認するためには重鎖と軽鎖との並び順を考慮する必要があるが、本発明のポリヌクレオチドのセットでは、重鎖と軽鎖との並び順を入れ替えた連結体を簡便に作製することができるため、発現の有無を迅速に確認することができる。
尚、上記抗体遺伝子に関連する態様に限らず、３種類のポリヌクレオチドの並び順を試みる他の態様においても、簡便に異なった並び順を供することができる。
【００１６】
［６］上記［４］に記載のポリヌクレオチドセットを使用して各ポリヌクレオチドを連結するに際し、
上流から前記第一ポリヌクレオチド、前記第二ポリヌクレオチド、前記第三ポリヌクレオチドの順に配置した第一連結体を作製する工程として、
（ｉ）前記第一ポリヌクレオチドおよび前記第二ポリヌクレオチドを制限酵素ＡｐａＩで
消化してライゲーションするプロセス
（ｉｉ）上記（ｉ）のプロセスで得られたライゲーション産物および前記第三ポリヌクレ
オチドを制限酵素ＸｈｏＩで消化してライゲーションするプロセス
を有し、
上流から前記第三ポリヌクレオチド、前記第二ポリヌクレオチド、前記第一ポリヌクレオチドの順に配置した第二連結体を作製する工程として、
（ｉｉｉ）前記第二ポリヌクレオチドを制限酵素ＰｓｐＯＭＩ、前記第三ポリヌクレオチ
ドを制限酵素ＥａｇＩでそれぞれ消化してライゲーションするプロセス
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）のプロセスで得られたライゲーション産物を制限酵素ＸｈｏＩ、
前記第一ポリヌクレオチドを制限酵素ＳａｌＩでそれぞれ消化してライゲーションするプ
ロセス
を有する複数のポリヌクレオチドの連結体作製方法。
【００１７】
上記［６］の構成によれば、上流から第一ポリヌクレオチド・第二ポリヌクレオチド・第三ポリヌクレオチドの順に配置した第一連結体、および、上流から第三ポリヌクレオチド・第二ポリヌクレオチド・第一ポリヌクレオチドの順に配置した第二連結体を、制限酵素処理・ライゲーションといった処理によって容易に作製することができる連結体作製方法となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のポリヌクレオチドセットの概要を示す図である。
【図２】上流から第一ポリヌクレオチド、第二ポリヌクレオチド、第三ポリヌクレオチドの順に配置した第一連結体を作製する概要を示す図である。
【図３】上流から第三ポリヌクレオチド、第二ポリヌクレオチド、第一ポリヌクレオチドの順に配置した第二連結体を作製する概要を示す図である。
【図４】ｐＰｅｌＢＧ４Ｓｇ３Ｄの構成を模式的に示した図である。
【図５】ｐＰｅｌＢＧ４Ｓｇ３Ｄに上流から順に抗体重鎖可変領域断片（第一ポリヌクレオチド）、リンカー（第二ポリヌクレオチド）、抗体軽鎖可変領域断片（第三ポリヌクレオチド）を挿入した場合の構成を模式的に示した図である。
【図６】ｐＰｅｌＢＧ４Ｓｇ３Ｄに上流から順に抗体軽鎖可変領域断片（第三ポリヌクレオチド）、リンカー（第二ポリヌクレオチド）、抗体重鎖可変領域断片（第一ポリヌクレオチド）を挿入した場合の構成を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、第一ポリヌクレオチド、第二ポリヌクレオチド、第三ポリヌクレオチドを連結した連結体を形成するためのポリヌクレオチドセット、および、複数のポリヌクレオチドの連結体作製方法である。
【００２０】
各ポリヌクレオチドは、それらの末端の塩基配列を以下のように構成する（図１）。
（ａ）第一ポリヌクレオチドＡの３’末端の塩基配列２および第二ポリヌクレオチドＢの５’末端の塩基配列３が同一配列、或いは、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
（ｂ）第二ポリヌクレオチドＢの３’末端の塩基配列４および第三ポリヌクレオチドＣの５’末端の塩基配列５が同一配列、或いは、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
（ｃ）第一ポリヌクレオチドＡの５’末端の塩基配列１および第二ポリヌクレオチドＢの３’末端の塩基配列４が、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
（ｄ）第二ポリヌクレオチドＢの５’末端の塩基配列３および第三ポリヌクレオチドＣの３’末端の塩基配列６が、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列
【００２１】
このような配列を有するポリヌクレオチドをセットにすることで、構成（ａ）（ｂ）によって上流から第一ポリヌクレオチドＡ・第二ポリヌクレオチドＢ・第三ポリヌクレオチドＣの順に配置した連結体を作製でき、構成（ｃ）（ｄ）によって、上流から第三ポリヌクレオチドＣ・第二ポリヌクレオチドＢ・第一ポリヌクレオチドＡの順に配置した連結体を作製できる。
【００２２】
本発明で使用するポリヌクレオチドとは、ヌクレオチドが鎖状に重合したものである。ポリヌクレオチドを構成する核酸はデオキシリボ核酸およびリボ核酸の何れであってもよい。本発明に使用するポリヌクレオチドは、その両端に制限酵素認識配列を備え、これら両端の制限酵素認識配列の間に、適当な長さのヌクレオチド配列を有する。この条件を満たす限り、本発明に使用するポリヌクレオチドの長さは特に限定されるものではない。
【００２３】
ポリヌクレオチドとしては、抗体遺伝子の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子断片や抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子断片、および、これらを接続するリンカーが好適に例示される。例えば、第一ポリヌクレオチドＡを抗体重鎖可変領域遺伝子断片、第二ポリヌクレオチドＢをリンカー、第三ポリヌクレオチドＣを抗体軽鎖可変領域遺伝子断片とした場合、Ａ−Ｂ−ＣまたはＣ−Ｂ−Ａの何れかの並び順で連結体を形成することにより、ｓｃＦｖを構築することができる。このとき、第一ポリヌクレオチドＡを抗体軽鎖可変領域遺伝子断片とし、第三ポリヌクレオチドＣを抗体重鎖可変領域遺伝子断片としてもかまわない。
【００２４】
しかし、このような実施態様に限定されるものではなく、３種類のポリヌクレオチドＡ，Ｂ，ＣにおいてＡ−Ｂ−ＣまたはＣ−Ｂ−Ａの何れの並び順が有効であるかを確認する態様、或いは、これら両方の並び順を有するそれぞれの連結体を構築する態様であれば、本発明を適用することができる。よって、上記抗体遺伝子を他の遺伝子に置き換えて実施してもよい。
【００２５】
例えば３種類のポリヌクレオチドにおいて何れの並び順が有効であるかを確認するには、ポリヌクレオチド鎖である連結体を適当な発現ベクターに挿入して目的の機能を有するタンパク質を発現させ得るか否かの実験を行なえばよい。
本発明で使用する各ポリヌクレオチドを発現ベクターへ挿入するには、例えば、後述する制限酵素で各ポリヌクレオチドを処理し、発現ベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位等に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、ＤＮＡリガーゼを用いる方法等、公知の方法を利用できる。
発現ベクターとしては、上記連結体（ポリヌクレオチド鎖）を組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はなく、例えばプラスミドベクター・ファージベクター・コスミドベクター・ウイルスベクター等を利用できる。得られた組換えベクターは適切な宿主細胞に導入して形質転換体を得る。当該形質転換体を培養すれば、当該形質転換体に目的の機能を有するタンパク質を発現させることができる。
宿主細胞としては、発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、当該タンパク質を効率的に発現できる細胞であればよい。大腸菌・枯草菌・バシラス属細菌・シュードモナス属細菌等が利用できる。
形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法・エレクトロポーレーション法・リン酸カルシウム沈殿法・リポソーム法・マイクロインジェクション法などの公知の手法によって行なうことができる。
形質転換体の培養は、ポリペプトン−酵母エキス培地などの公知の栄養培地で培養し、必要ならば発現ベクターおよび宿主の組み合わせに応じてＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクシド）等による発現誘導を実施して、上記タンパク質を産生させればよい。
【００２６】
本明細書では、３種類のポリヌクレオチドとして、上記抗体遺伝子に関連する態様について説明するが、３種類のポリヌクレオチドの並び順を試みる他の態様として、例えばエクソンシャッフリングによる人工分子進化や、ペプチドタグの種類・位置のスクリーニングなどが例示される。
【００２７】
第二ポリヌクレオチドＢとして例示したリンカーとしては、リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドが好適に例示される。当該リンカーペプチドは、１又は２残基以上のアミノ酸が鎖状に結合したものであり、好ましくは５〜２０残基程度である。具体的には、前記アミノ酸がグリシンおよびセリンを含むＧＳ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカーであるＧＧＧＳ、（ＧＧＧＳ）2、（ＧＧＧＧＳ）4が好ましく例示されるがこれらに限られるものではなく、２以上のアラニン残基を含んでなる配列、水溶性を上げるためアルギニンを導入したものなど様々な公知のリンカーペプチド利用できる。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドセットには、上記３つのポリヌクレオチド以外の配列を含ませてもよい。例えば、上記３つのポリヌクレオチドを配置した連結体の両側に、当該連結体を発現ベクターに組み込んだときに遺伝子として発現させるためのシグナル配列（ompA、ompT、ompF、ompC、β-ラクタマーゼ、pelB、phoA、cek2など）や、挿入されたポリヌクレオチドの発現を促すプロモーターやエンハンサー、ファージ外殻タンパク質遺伝子などを有する構成とすることが可能である。
【００２９】
本発明で使用する制限酵素とは、特定の塩基配列を識別して二本鎖を切断するエンドヌクレアーゼである。制限酵素は、制限酵素認識配列の配列内あるいはその付近でポリヌクレオチド鎖を切断する。本発明で使用する制限酵素は、Ｉ型制限酵素・ＩＩ型制限
酵素・ＩＩＩ型制限酵素の何れであってもよい。本実施形態では、パリンドロ
ームを認識して特定の位置で切断する酵素であるＩＩ型制限酵素を例示する。制限酵素に
よって切断された二本鎖ポリヌクレオチドの末端は、平滑末端および粘着末端の何れかを呈する。
【００３０】
例えば「第一ポリヌクレオチドＡの３’末端の塩基配列２および第二ポリヌクレオチドＢの５’末端の塩基配列３が同一配列」の場合、当該同一配列は、両者の制限酵素認識配列が完全に同一な配列であり、切断形状が平滑末端および粘着末端の何れかとなる制限酵素が認識する配列とすればよい。
前記同一配列は、例えば制限酵素ＡｐａＩ認識配列および制限酵素ＸｈｏＩ認識配列の
何れかを選択する。
【００３１】
一方「第一ポリヌクレオチドＡの３’末端の塩基配列２および第二ポリヌクレオチドＢの５’末端の塩基配列３が、互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列」の場合、当該制限酵素認識配列は、切断形状が粘着末端となる制限酵素が認識する配列とすればよい。「互いにコンパチブルな粘着末端を残す制限酵素認識配列」とは、二つの制限酵素認識配列において同一な配列ではないが、一方の制限酵素認識配列を所定の制限酵素で処理した切断末端と、他方の制限酵素認識配列を異なる制限酵素で処理した切断末端とが同一となる関係を有するものをいう。このような関係を有する制限酵素のペアは、例えばＰｓｐＯＭＩとＥａｇＩ、ＸｈｏＩとＳａｌＩ、ＸｂａＩとＳｐｅＩ、Ｍｌ
ｕＩとＢｓｓＨＩＩ、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩ、ＸｂａＩとＮｈｅＩなどがある。
【００３２】
ポリヌクレオチドセットを、上述した抗体遺伝子（重鎖、軽鎖）およびリンカーとした場合、各ポリヌクレオチドが以下の配列（ａ）〜（ｄ）を有するように構成するとよい。
（ａ）第一ポリヌクレオチドＡの３’末端の塩基配列２および第二ポリヌクレオチドＢの５’末端の塩基配列３が制限酵素ＡｐａＩ認識配列
（ｂ）第二ポリヌクレオチドＢの３’末端の塩基配列４および第三ポリヌクレオチドＣの５’末端の塩基配列５が制限酵素ＸｈｏＩ認識配列
（ｃ）第一ポリヌクレオチドＡの５’末端の塩基配列１が制限酵素ＳａｌＩ認識配列、第
二ポリヌクレオチドＢの３’末端の塩基配列４が制限酵素ＸｈｏＩ認識配列
（ｄ）第二ポリヌクレオチドＢの５’末端の塩基配列３が制限酵素ＰｓｐＯＭＩ認識配列
、第三ポリヌクレオチドＣの３’末端の塩基配列６が制限酵素ＥａｇＩ認識配列
【００３３】
各ポリヌクレオチドの両末端配列は、それぞれを上記制限酵素で消化して所望の末端配列を有するようにするか、或いは、各ポリヌクレオチドに所望の末端配列をライゲーションして構成するとよい。
【００３４】
上記ポリヌクレオチドセットを使用して各ポリヌクレオチドを連結するに際し、上流から第一ポリヌクレオチドＡ、第二ポリヌクレオチドＢ、第三ポリヌクレオチドＣの順に配置した第一連結体１０を作製する工程として、以下のプロセスを行なう（図２）。
（ｉ）第一ポリヌクレオチドＡおよび第二ポリヌクレオチドＢを制限酵素ＡｐａＩで消化
してライゲーションするプロセス
（ｉｉ）上記（ｉ）のプロセスで得られたライゲーション産物および第三ポリヌクレオチ
ドＣを制限酵素ＸｈｏＩで消化してライゲーションするプロセス
【００３５】
第一連結体１０は、上記（ｉ），（ｉｉ）の順序を入れ替えて、以下のように実施して
もよい。
（ｉ）’第二ポリヌクレオチドＢおよび第三ポリヌクレオチドＣを制限酵素ＸｈｏＩで消
化してライゲーションするプロセス
（ｉｉ）’上記（ｉ）’のプロセスで得られたライゲーション産物および第一ポリヌクレ
オチドＡを制限酵素ＡｐａＩで消化してライゲーションするプロセス
【００３６】
一方、上流から第三ポリヌクレオチドＣ、第二ポリヌクレオチドＢ、第一ポリヌクレオチドＡの順に配置した第二連結体２０を作製する工程として、以下のプロセスを行なう（図３）。
（ｉｉｉ）第二ポリヌクレオチドＢを制限酵素ＰｓｐＯＭＩ、第三ポリヌクレオチドＣを
制限酵素ＥａｇＩでそれぞれ消化してライゲーションするプロセス
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）のプロセスで得られたライゲーション産物を制限酵素ＸｈｏＩ、
第一ポリヌクレオチドＡを制限酵素ＳａｌＩでそれぞれ消化してライゲーションするプロ
セス
【００３７】
第二連結体２０は、上記（ｉｉｉ），（ｉｖ）の順序を入れ替えて、以下のように実施
してもよい。
（ｉｉｉ）’第一ポリヌクレオチドＡを制限酵素ＳａｌＩ、第二ポリヌクレオチドＢを制
限酵素ＸｈｏＩでそれぞれ消化してライゲーションするプロセス
（ｉｖ）’上記（ｉｉｉ）’のプロセスで得られたライゲーション産物を制限酵素Ｐｓｐ
ＯＭＩ、第三ポリヌクレオチドＣを制限酵素ＥａｇＩでそれぞれ消化してライゲーション
するプロセス
【００３８】
これにより、上流から第一ポリヌクレオチドＡ・第二ポリヌクレオチドＢ・第三ポリヌクレオチドＣの順に配置した第一連結体１０、および、上流から第三ポリヌクレオチドＣ・第二ポリヌクレオチドＢ・第一ポリヌクレオチドＡの順に配置した第二連結体２０を、制限酵素処理・ライゲーションといった処理によって容易に作製することができる。
【００３９】
尚、第一連結体１０および第二連結体２０を作製するに際して、ライゲーションプロセスをそれぞれ一度だけ行なうようにすることもできる。この場合、第一連結体１０および第二連結体２０は以下の（ｖ），（ｖｉ）によって作製することができる。
（ｖ）第一ポリヌクレオチドＡおよび第二ポリヌクレオチドＢを制限酵素ＡｐａＩ、第二
ポリヌクレオチドＢおよび第三ポリヌクレオチドＣを制限酵素ＸｈｏＩでそれぞれ消化し
てライゲーションするプロセス
（ｖｉ）第一ポリヌクレオチドＡを制限酵素ＳａｌＩ、第二ポリヌクレオチドＢを制限酵
素ＰｓｐＯＭＩおよびＸｈｏＩ、第三ポリヌクレオチドＣを制限酵素ＥａｇＩでそれぞれ
消化してライゲーションするプロセス
【００４０】
また、上述した実施態様において、最初のプロセスを実施した直後に次のプロセスを実施してもよいが、最初のプロセスを実施した後、得られたライゲーション産物を適当なベクターに挿入して宿主細胞を形質転換あるいはＰＣＲなどによって連結体作製途中のポリヌクレオチドを増幅してから、次のプロセスを実施してもよい。また、各プロセスの実施と同時に適当なベクターにライゲーションしてもよい。
【実施例】
【００４１】
〔実施例１〕
（遺伝子クローニング用ベクターの作製）
タンパク質分泌のためのシグナル配列として使用される分泌シグナル配列ｐｅｌＢの合成を行った。使用したオリゴＤＮＡプライマーを以下に示す。下線は相補部分を示す。
【００４２】
5'-GTCTGTCATGAAATACCTGTTGCCTACGGCAGCCGCTGGCTTGC-3'（ｐｅｌＢｂａｃｋ：配列番号１）
5'-GTCTGTGTCGACGGCCATCGCTGGCTGGGCAGCGAGTAACAGCAAGCCAGC-3'（ｐｅｌＢｆｏｒ：配列番号２）
【００４３】
これらオリゴＤＮＡをプライマーエクステンションにより伸長して分泌シグナル配列ｐｅｌＢの二本鎖ＤＮＡを得た。反応液の組成を以下に示す。全量を滅菌水で２５μＬにメスアップし、１４℃，２時間の伸長反応を行なった後、８０℃，３分でクレノウフラグメントを失活させた。
【００４４】
【表１】
2010279261.tif 000003
【００４５】
合成した二本鎖ＤＮＡの全量をＳａｌＩ、ＢｓｐＨＩで順次消化した（３７℃，２時間）。発現ベクターｐＴＶ１１８Ｎ（製品コードＴＫＲ−３３２８、タカラバイオ株式会社製）も同様にＳａｌＩ、ＮｃｏＩで順次消化した（３７℃，２時間）。ステップ毎にMinElute Reaction Cleanup kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。精製後、二本鎖ＤＮＡ消化物８μＬ（全量）、ベクター消化物２μＬ（約０．１μｇ、０．０４ｐｍｏｌｅ）、タカラライゲーションキットＶｅｒ．２．０  Ｉ液１０μＬを混合して１６℃、３０分の条件でライゲーションを行った。その後、ライゲーション済液１０μＬをコンピテントセルである大腸菌ＥＣＯＳ  ＤＨ５α  １００μＬ（株式会社ニッポンジーン製）に添加し、製造業者の指示に従って形質転換した。形質転換した大腸菌をＬＢ寒天培地／アンピシリン５０μｇ／ｍＬ、Ｘ−Ｇａｌ４０μｇ／ｍｌに塗抹し、３７℃でオーバーナイト培養した。
白色コロニーを選抜し、選抜した大腸菌を培養した後、ベクターをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で抽出し、インサート部分の塩基配列を調べ、ｐｅｌＢが挿入されたベクターを選択した。シーケンスは定法に従って行なった。以下、ｐｅｌＢ配列挿入ベクターをｐＰｅｌＢとする。
【００４６】
次に、繊維状ファージ外殻タンパク質遺伝子ｇｅｎｅ３の一部（アミノ酸Ｎｏ．２００〜４１０）をＰＣＲにより取得した。
使用したオリゴＤＮＡプライマーを以下に示す。下線は付加した制限酵素認識配列を示す。
【００４７】
5'-GTCTGTGCATGCGGCCGAAGATCCATTCGTTTGTG-3'（Ｍ１３ｇ３Ｄｂａｃｋ：配列番号３）
5'-GTCTGAAGCTTAAGACTCCTTATTACGCAG-3'（Ｍ１３ｇ３Ｄｆｏｒ：配列番号４）
【００４８】
ＰＣＲの鋳型としてヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（２７−１５２４−０１：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）、ポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（ＫＯＤ−２０１、東洋紡績株式会社製）を使用し、ＰＣＲを実施した。反応液の組成を以下に示す。全量を滅菌水で５０μＬにメスアップし、９４℃２分の熱変性反応後、９４℃１５秒の熱変性反応、５３℃３０秒のアニーリング反応、６８℃４０秒の伸長反応を２５サイクル行なった。
【００４９】
【表２】
2010279261.tif 000004
【００５０】
ＰＣＲ産物は、MinElute PCR Purification Kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。
ＰＣＲ産物とベクターｐＰｅｌＢをＳｐｈＩ、ＨｉｎｄIIIで順次消化した（３７℃，２時間）。ステップ毎にMinElute Reaction Cleanup kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。精製後、ＰＣＲ産物消化物８μＬ、ｐＰｅｌＢ消化物２μＬ、タカラライゲーションキットＶｅｒ．２．０  Ｉ液１０μＬを混合して１６℃、３０分の条件でライゲーションを行った。その後、ライゲーション済液１０μＬをコンピテントセルである大腸菌ＥＣＯＳ  ＤＨ５α  １００μＬ（株式会社ニッポンジーン製）に添加し、製造業者の指示に従って形質転換した。形質転換した大腸菌をＬＢ寒天培地／アンピシリン５０μｇ／ｍＬに塗抹し、３７℃でオーバーナイト培養した。
【００５１】
得られたコロニーから大腸菌を培養した後、ベクターをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で抽出し、インサート部分の塩基配列を調べ、ｇｅｎｅ３の一部が挿入されたベクターを選択した。シーケンスは定法に従って行なった。以下、ｐｅｌＢ配列とｇｅｎｅ３配列挿入ベクターをｐＰｅｌＢｇ３Ｄとする。
【００５２】
最後にリンカーペプチド配列（第二ポリヌクレオチドＢ）の合成を行った。使用したオリゴＤＮＡプライマーを以下に示す。下線は相補部分を示す。
【００５３】
5'-CAGAGTCGACGAATTCGGGCCCTTGGTGG-3'（Ｇ４Ｓｐｌｕｓｂａｃｋ：配列番号５）
5'-GGGCCCTTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGCGGTTCTCTCGAGT-3'（Ｇ４Ｓｂａｃｋ：配列番号６）
5'-GTCTGCATGCCGGCCGTCTAGACTCGAGAGAACCGCC-3'（Ｇ４ＳＰｌｕｓｆｏｒ：配列番号７）
【００５４】
反応液の組成を以下に示す。ポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（ＫＯＤ−２０１、東洋紡績株式会社製）を使用した。全量を滅菌水で５０μＬにメスアップし、９４℃２分の熱変性反応後、９４℃１５秒の熱変性反応、５９℃３０秒のアニーリング反応、６８℃１５秒の伸長反応を１５サイクル行ない、ＰＣＲを実施した。
【００５５】
【表３】
2010279261.tif 000005
【００５６】
ＰＣＲ産物は、MinElute PCR Purification Kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。
【００５７】
ＰＣＲ産物とｐＰｅｌＢｇ３ＤをＳａｌＩ、ＳｐｈＩで同時消化し（３７℃，２時間、Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒを使用）、MinElute Reaction Cleanup kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。精製後、ＰＣＲ産物消化物４．５μＬ、ｐＰｅｌＢｇ３Ｄ消化物０．５μＬ、タカラライゲーションキットＶｅｒ．２．０  Ｉ液５μＬを混合して１６℃、３０分の条件でライゲーションを行った。その後、ライゲーション済液５μＬをコンピテントセルである大腸菌ＥＣＯＳ  ＤＨ５α  １００μＬ（株式会社ニッポンジーン製）に添加し、製造業者の指示に従って形質転換した。形質転換した大腸菌をＬＢ寒天培地／アンピシリン５０μｇ／ｍＬに塗抹、３７℃でオーバーナイト培養した。
【００５８】
得られたコロニーから大腸菌を培養した後、ベクターをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で抽出し、インサート部分の塩基配列を調べ、リンカーペプチド配列が挿入されたベクターを選択した。以下、ｐｅｌＢ配列、リンカーペプチド配列（第二ポリヌクレオチドＢ）、ｇｅｎｅ３配列が挿入されたベクターをｐＰｅｌＢＧ４Ｓｇ３Ｄとする（図４）。
【００５９】
上述の実施例で得られたｐＰｅｌＢＧ４Ｓｇ３Ｄは、分泌シグナル配列ｐｅｌＢ−ＧＴＣＧＡＣ（ＳａｌＩ認識配列）−ＧＧＧＣＣＣ（ＡｐａＩ、ＰｓｐＯＭＩ認識配列）−リンカーペプチド−ＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩ認識配列）−ＣＧＧＣＣＧ（ＥａｇＩ認識配列）−繊維状ファージ外殻タンパク質遺伝子ｇｅｎｅ３の一部、の順に並ぶ塩基配列を持つ。
【００６０】
〔実施例２〕
（抗体重鎖・軽鎖の可変領域断片遺伝子調製）
マウス（ＢＡＬＢ/ｃ種、メス）の脾臓を摘出し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（１５５９６−０２６：インビトロジェン株式会社製）を使用して製品添付のプロトコルに従い全ＲＮＡを抽出し、約２００μｇの全ＲＮＡを得た。全ＲＮＡからOrient Express Oligo(dT) cDNA Synthesis kit（６９９９３−３、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使用して製品添付のプロトコルに従いｃＤＮＡを合成した。
【００６１】
このｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型とし、増幅の特異性を上げるためにＮｅｓｔｅｄＰＣＲを実施した。一段階目のＰＣＲは、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（６９８３１−３、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使用して製品添付のプロトコルに従って実施した。二段階目のＰＣＲは、「Krebber A, et al, J Immunol Methods. 1997 Feb 14;201(1):35-55.」に基づき、以下のＰＣＲ用オリゴＤＮＡプライマーを合成した。下線は付加した制限酵素認識配列を示す。便宜上、遺伝子クローニング用ベクターとライゲーションするための制限酵素認識配列およびＰＣＲ後に制限酵素で効率よく消化するために末端に付加した塩基は小文字で、抗体可変領域遺伝子と相補的な部分は大文字で記載してある。
【００６２】
表の右端の数字はプライマーミックスを作製する場合の各液量を示す。重鎖増幅用ＨＢプライマーミックスは、表４に記載した配列番号８〜２６のプライマーを表４の右端に記載の各液量で混合して作製した。同様に、重鎖増幅用ＨＦプライマーミックスは表５、軽鎖増幅用ＬＢプライマーミックスは表６、軽鎖増幅用ＬＦプライマーミックスは表７に記載したプライマーをそれぞれ各表の右端に記載の各液量で混合して作製した。
尚、表４〜７では、混合塩基についてはＩＵＰＡＣ表記（Ｒ：Ａ＋Ｇ，Ｙ：Ｃ＋Ｔ，Ｍ：Ａ＋Ｃ，Ｋ：Ｔ＋Ｇ，Ｓ：Ｃ＋Ｇ，Ｗ：Ａ＋Ｔ，Ｈ：Ａ＋Ｔ＋Ｃ，Ｂ：Ｔ＋Ｃ＋Ｇ，Ｖ：Ａ＋Ｃ＋Ｇ，Ｄ：Ａ＋Ｔ＋Ｇ，Ｎ：Ａ＋Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）を用いた。
【００６３】
【表４】
2010279261.tif 000006
【００６４】
【表５】
2010279261.tif 000007
【００６５】
【表６】
2010279261.tif 000008
【００６６】
【表７】
2010279261.tif 000009
【００６７】
ＰＣＲ反応液の組成を以下に示す（重鎖増幅用：表８、軽鎖増幅用：表９）。全量を滅菌水で５０μＬにメスアップし、９４℃２分の熱変性反応後、９４℃１分の熱変性反応、６３℃３０秒（５８℃５０秒）のアニーリング反応、６８℃１分の伸長反応を７サイクル行なった後、９４℃１分の熱変性反応、６３℃３０秒のアニーリング反応、６８℃１分の伸長反応を２３サイクル行なった。その後、６８℃で６分間の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
【００６８】
【表８】
2010279261.tif 000010
【００６９】
【表９】
2010279261.tif 000011
【００７０】
〔実施例３〕
（抗体重鎖可変領域断片遺伝子・リンカー・抗体軽鎖可変領域断片遺伝子の順でのベクターへの挿入）
抗体重鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物をＳａｌI、ＡｐａIで順次消化した（ＳａｌIは３７℃、ＡｐａIは２５℃でそれぞれオーバーナイト処理）。ステップ毎にMinElute Reaction Cleanup kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。またベクターｐＰｅｌＢＧ４Ｓｇ３ＤはＳａｌIで消化（３７℃でオーバーナイト処理）し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製し、さらにＡｐａIで消化（２５℃でオーバーナイト処理）した後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。その後、アガロースゲルからMinElute Gel Extraction kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で切り出し精製した。精製後、ＰＣＲ消化物４．５μＬ、ベクター消化物０．５μＬ、カラライゲーションキットＶｅｒ．２．０  Ｉ液５μＬを混合して１６℃、３０分の条件でライゲーションを行った。その後、ライゲーション済液５μＬをコンピテントセルである大腸菌ＥＣＯＳ  ＤＨ５α  １００μＬ（株式会社ニッポンジーン製）に添加し、製造業者の指示に従って形質転換した。形質転換した大腸菌をＬＢ寒天培地／アンピシリン５０μｇ／ｍＬに塗抹し、３７℃でオーバーナイト培養した。
【００７１】
得られたコロニーから大腸菌を培養した後、ベクターをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で抽出し、インサート部分の塩基配列を調べ、抗体重鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物が挿入されたベクターを選択した。シーケンスは定法に従って行なった。当該ベクターと抗体軽鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物とをＸｈｏＩ、ＥａｇＩで順次消化した（３７℃でオーバーナイト処理）。上記手法で、精製・ライゲーション・形質転換し、培養を行なった。得られたコロニーから大腸菌を培養した後、ベクターをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で抽出し、インサート部分の塩基配列を調べ、両ＰＣＲ産物である抗体重鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物（第一ポリヌクレオチドＡ）、リンカー（第二ポリヌクレオチド）、抗体軽鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物（第三ポリヌクレオチドＣ）が上流からこの順で挿入されたベクターを確認した（図５）。
【００７２】
〔実施例４〕
（抗体軽鎖可変領域断片遺伝子・リンカー・抗体重鎖可変領域断片遺伝子の順でのベクターへの挿入）
抗体軽鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ、ＥａｇＩで順次消化した
（３７℃でオーバーナイト処理）。ステップ毎にMinElute Reaction Cleanup kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。ベクターｐＰｅｌＢＧ４Ｓｇ３ＤはＳａｌＩで消化し（３７℃でオーバーナイト処理）、MinElute Reaction Cleanup kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。その後、ＰｓｐＯＭＩで消化し（３７℃でオーバーナイト処理）、１％アガロースゲル電気泳動を行った後、アガロースゲルからMinElute Gel Extraction kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）で切り出し精製した。精製後、ＰＣＲ消化物４．５μＬ、ベクター消化物０．５μＬ、カラライゲーションキットＶｅｒ．２．０  Ｉ液５μＬを混合して１６℃、３０分の条件でライゲーションを行った。その後、ライゲーション済液５μＬをコンピテントセルである大腸菌ＥＣＯＳ  ＤＨ５α  １００μＬ（株式会社ニッポンジーン製）に添加し、製造業者の指示に従って形質転換した。形質転換した大腸菌をＬＢ寒天培地／アンピシリン５０μｇ／ｍＬに塗抹し、３７℃でオーバーナイト培養した。
【００７３】
得られたコロニーから大腸菌を培養した後、ベクターをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で抽出し、インサート部分の塩基配列を調べ、抗体軽鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物が挿入されたベクターを選択した。シーケンスは定法に従って行なった。当該ベクターをＸｈｏＩ、ＥａｇＩで順次消化（３７℃でオーバーナイト処理）、抗体重鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物をＳａｌＩ、ＰｓｐＯＭＩで順次消化した（３７℃でオーバーナイト処理）。上記手法で、精製・ライゲーション・形質転換し、培養を行なった。得られたコロニーから、大腸菌を培養した後、ベクターをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で抽出し、インサート部分の塩基配列を調べ、両ＰＣＲ産物である抗体軽鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物（第三ポリヌクレオチドＣ）、リンカー（第二ポリヌクレオチド）、抗体重鎖可変領域断片遺伝子ＰＣＲ産物（第一ポリヌクレオチドＡ）が上流からこの順で挿入されたベクターを確認した（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明のポリヌクレオチドセット、および、複数のポリヌクレオチドの連結体作製方法は、上流から第一ポリヌクレオチド・第二ポリヌクレオチド・第三ポリヌクレオチドの順に配置した連結体、および、上流から第三ポリヌクレオチド・第二ポリヌクレオチド・第一ポリヌクレオチドの順に配置した連結体を作製するために利用できる。
【符号の説明】
【００７５】
Ａ        第一ポリヌクレオチド
Ｂ        第二ポリヌクレオチド
Ｃ        第三ポリヌクレオチド
１        第一ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列
２        第一ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列
３        第二ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列
４        第二ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列
５        第三ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列
６        第三ポリヌクレオチドの３’末端の塩基配列
１０      第一連結体
２０      第二連結体
【図１】
2010279261.tif 000012
【図２】
2010279261.tif 000013
【図３】
2010279261.tif 000014
【図４】
2010279261.tif 000015
【図５】
2010279261.tif 000016
【図６】
2010279261.tif 000017
【配列表】
2010279261000001.app