(57)【要約】【課題】分析チップ用の検出装置において、従来の検出範囲よりも広い検出範囲をもつ高感度なＤＮＡチップに対応可能なデータ処理方法を提供する。【解決手段】複数の検出用プローブを有する分析チップの各検出用プローブの光強度を検出して各検出用プローブに対応する出力数値を得るデータ処理方法であって、複数の異なる検出感度で検出して複数の検出数値セットを得る工程Ａ、工程Ａで得られた各検出用プローブの検出数値セットにおいて、検出範囲外の検出数値を除外する工程Ｂ、工程Ｂの後に得られた検出範囲内の検出数値を使用して、各検出数値セット間の線形近似式を得る工程Ｃ、工程Ｃで得られた全ての線形近似式の切片が０、傾きが１になるように各検出数値セットにおける検出数値を補正する工程Ｄ、工程Ｄで補正した後の各検出用プローブの検出数値から、その代表値を決定して出力数値とする工程Ｅ、を含む、データ処理方法、ならびに、検出装置。【選択図】図３
2010233528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の検出用プローブを有する分析チップの各検出用プローブの光強度を検出して各検出用プローブに対応する出力数値を得るデータ処理方法であって、
複数の異なる検出感度で検出して複数の検出数値セットを得る工程Ａ、
工程Ａで得られた各検出用プローブの検出数値セットにおいて、検出範囲外の検出数値を除外する工程Ｂ、
工程Ｂの後に得られた検出範囲内の検出数値を使用して、各検出数値セット間の線形近似式を得る工程Ｃ、
工程Ｃで得られた全ての線形近似式の切片が０、傾きが１になるように各検出数値セットにおける検出数値を補正する工程Ｄ、
工程Ｄで補正した後の各検出用プローブの検出数値から、その代表値を決定して出力数値とする工程Ｅ、
を含む、データ処理方法。
【請求項２】
前記工程Ａにおいて、検出する回数が３回以上である、請求項１に記載のデータ処理方法。
【請求項３】
前記工程Ａにおいて、分析チップの光強度の検出を光電子増倍管で行う、請求項１または２に記載のデータ処理方法。
【請求項４】
前記工程Ｂにおいて、除外する検出範囲外の検出数値が、光強度が飽和している検出数値である、請求項１〜３のいずれかに記載のデータ処理方法。
【請求項５】
前記工程Ｂにおいて、除外する検出範囲外の検出数値が、バックグラウンド以下の検出数値である、請求項１〜４のいずれかに記載のデータ処理方法。
【請求項６】
前記工程Ｂにおいて、除外する光強度が飽和している検出数値の個数の割合が該数値セットの１％以下である、請求項４に記載のデータ処理方法。
【請求項７】
前記工程Ｂにおいて、除外するバックグラウンド以下の検出数値の個数の割合が該数値セットの４０％以下である、請求項５に記載のデータ処理方法。
【請求項８】
前記工程Ｃにおいて、各検出数値セット間の線形近似式が、一つの検出数値セットと、その他の全ての検出数値セットとの間で得られる線形近似式である、請求項１〜７のいずれかに記載のデータ処理方法。
【請求項９】
前記工程Ｅにおいて、代表値が補正後の各検出用プローブの検出数値の平均値である、請求項１〜８のいずれかに記載のデータ処理方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の検出用プローブは、核酸、蛋白質および糖の群から選択されるものである、請求項１〜９のいずれかに記載のデータ処理方法。
【請求項１１】
複数の検出用プローブを有する分析チップの各検出用プローブの光強度を検出して各検出用プローブに対応する出力数値を得る検出装置であって、
複数の異なる検出感度で各検出用プローブの光強度を検出する検出部と、
複数の検出数値セットから検出範囲外の検出数値を除外し、検出範囲内の検出数値を使用して各検出数値セット間の線形近似式を算出し、この全ての線形近似式の切片が０、傾きが１になるように各検出数値セットにおける検出数値を補正し、および各検出用プローブの検出数値の代表値を決定して出力数値を算出する、データ処理部と、
を含む検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析チップ、特にＤＮＡチップなどの複数の検出用プローブを持つ分析チップの光強度を検出して各検出用プローブに対応する出力数値を得るデータ処理方法ならびに該データの処理方法を利用する検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのように、各種の核酸／核酸間の相補性を利用した方法により、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。一方、蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡチップ法（ＤＮＡマイクロアレイ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。ＤＮＡチップは、数百〜数万という多数の遺伝子発現を同時に測定するための小型装置であり、数百から数十万に上る網羅的な遺伝子解析を、少量の検体量と比較的短時間で可能とすることから様々な研究分野で活用されている。ＤＮＡチップはガラスや樹脂などの基板上に、数百〜数万種類のＤＮＡ断片（検出用プローブ）を高密度に並べたものであり、検体サンプル中のＤＮＡやＲＮＡといった核酸ターゲットをＤＮＡチップ上でＤＮＡ断片（検出用プローブ）ハイブリダイゼーションさせることによって、そのターゲットに含まれる塩基配列の決定、遺伝子変異の解析、遺伝子の発現量・コピー数の測定、およびメチル化状態の解析といったＤＮＡ、ＲＮＡの多様な状態を解析することが出来る。また、核酸ターゲットの調製方法次第では様々な核酸分子を検出できるため、多様な生体現象を分析することが可能である。
【０００４】
最初に開発され、現在でも多く市販されているＤＮＡチップは、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の発現量を網羅的に検出することができるものであり、ｍＲＮＡを調べることによって、その環境下において特異的に発現する遺伝子や、疾患関連遺伝子の検出や選択をすることができる。検査・診断用に選択した遺伝子を用いることにより、検体の状態の判別（がん／非がんなどといった疾患の診断、生体状態のモニタリングなど）が可能となっている。
【０００５】
ＤＮＡチップには、大きく分けて、ｃＤＮＡチップ、オリゴＤＮＡチップ、ＢＡＣクローンチップなどがあるが、その測定対象が通常、数百から数万という大量の遺伝子種などを対象とするため、膨大な量の数値データを解析する必要があり、その解析方法はこれまでに様々な工夫がなされてきている。例えば上記のような検体の状態の判別には、検定などの統計的な解析を始めとして、変動分析、クラスター解析、主成分分析、分散分析、ＳＶＭ（サポートベクターマシーン）などの解析方法が用いられているが、それらの解析を行うにはその解析の基となるＤＮＡチップから得られるデータが非常に重要となる。
【０００６】
通常、ＤＮＡチップから得られるデータは測定対象となるＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子産物を蛍光色素で標識し、これをＤＮＡチップにハイブリダイズさせることにより、ターゲットの蛍光強度等の光強度を検出することにより遺伝子産物の量を測定する。
【０００７】
これらの検出数値（光強度）をＤＮＡチップから読み取るためには通常はスキャナーと呼ばれる蛍光検出装置を使用する。スキャナーは非共焦点レーザー方式、共焦点レーザー方式、ＣＣＤカメラ方式など様々な方式があるが、レーザーなどで蛍光色素を励起させて、光電子増幅管（ＰＭＴ）で増倍させて蛍光強度の検出を行う。
【０００８】
しかしながら、これらスキャナーによる検出の際には、レーザーの出力が常に一定であるわけではなく、さらにスキャナーをとりまく環境要因も常に変化するなど、検出の際の条件、状態が厳密には一定ではないことから、同一の分析チップを複数回スキャニングしても検出数値にバラツキが出ることが多く、さらに色素の性質上の要因あるいはスキャナーの構造的な要因から検出数値に対してノイズの影響が出るのが通常である。
【０００９】
ここにおいて、ＤＮＡチップを読み取ってデータを取得する場合、通常ＤＮＡチップを１回スキャニングして出力数値を得てデータとするが、上記のような問題のため、１回のスキャニングだけではノイズの影響が大きく、データのばらつき、誤差の問題があるため、信頼性、再現性、精度が低いデータしか得られないという問題がある。
【００１０】
また、複数回同じラインを積算方式でスキャニングして検出数値（光強度）の平均値を算出してデータとするスキャニング方式を採用する場合もあるが、この場合、出力数値のばらつきは低減し、ノイズの少ないデータを得ることができるが、通常スキャナーが測定できる蛍光強度の検出範囲（ダイナミックレンジ）は１００００ぐらいであり、例えば感度が高いＤＮＡチップ（例えば、特許文献１、２、非特許文献１参照）においては、同じレーザーパワーあるいは同じＰＭＴゲイン（光電子増倍管の感度）のスキャニングでは低い検出数値領域から高い検出数値領域まで検出が出来ず、また検出範囲（ダイナミックレンジ）外の領域での蛍光強度を精確に得ることが出来ないため、低い検出数値領域あるいは高い検出数値領域の遺伝子の発現情報を精確に得ることが出来ないという感度の問題があった。
【００１１】
このような問題に対して、例えば、非特許文献２では複数回のスキャニングで検出範囲を広げる工夫をしているが、単に検出範囲外の検出数値だけを補正してデータとして結合させるだけであり、信頼性、精度が高いデータを提供できるような方法ではなかった。また、例えば特許文献３では、検出範囲を広げるためにＰＭＴ感度を段階的に変化させながら得たデータを基に画像を形成させる画像処理方法が開示されているが、検出範囲外となる画像データを合算させるだけの方法であり、この方法も信頼性、精度が高いデータを得ることは出来ないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００５−２７４７０２号公報
【特許文献２】特開２００４−２６４２８９号公報
【特許文献３】特開２００４−３１７３６６号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】バイオテクノロジージャーナル：２００５年、５巻、４号、４１８−４２０頁
【非特許文献２】ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００４年  ５巻  １０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
これまで分析チップ、特にＤＮＡチップを読み取って得られるデータはノイズの影響が大きく、データのばらつき、誤差の問題があるため、信頼性、再現性、精度が低いデータしか得られないという問題があった。さらに、分析チップの検出装置の検出範囲（ダイナミックレンジ）が狭いために、検出装置の検出範囲よりも広い検出範囲を持つ高感度なＤＮＡチップに対応できないという感度の問題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、上記の課題を解決するものである。具体的に、本発明は、以下の特徴を有する。
（１）複数の検出用プローブを有する分析チップの各検出用プローブの光強度を検出して各検出用プローブに対応する出力数値を得るデータ処理方法であって、
複数の異なる検出感度で検出して複数の検出数値セットを得る工程Ａ、
工程Ａで得られた各検出用プローブの検出数値セットにおいて、検出範囲外の検出数値を除外する工程Ｂ、
工程Ｂの後に得られた検出範囲内の検出数値を使用して、各検出数値セット間の線形近似式を得る工程Ｃ、
工程Ｃで得られた全ての線形近似式の切片が０、傾きが１になるように各検出数値セットにおける検出数値を補正する工程Ｄ、
工程Ｄで補正した後の各検出用プローブの検出数値から、その代表値を決定して出力数値とする工程Ｅ、
を含む、データ処理方法。
（２）前記工程Ａにおいて、検出する回数が３回以上である、前記（１）に記載のデータ処理方法。
（３）前記工程Ａにおいて、分析チップの光強度の検出を光電子増倍管で行う、前記（１）または（２）に記載のデータ処理方法。
（４）前記工程Ｂにおいて、除外する検出範囲外の検出数値が、光強度が飽和している検出数値である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のデータ処理方法。
（５）前記工程Ｂにおいて、除外する検出範囲外の検出数値が、バックグラウンド以下の検出数値である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のデータ処理方法。
（６）前記工程Ｂにおいて、除外する光強度が飽和している検出数値の個数の割合が該数値セットの１％以下である、前記（４）に記載のデータ処理方法。
（７）前記工程Ｂにおいて、除外するバックグラウンド以下の検出数値の個数の割合が該数値セットの４０％以下である、前記（５）に記載のデータ処理方法。
（８）前記工程Ｃにおいて、各検出数値セット間の線形近似式が、一つの検出数値セットと、その他の全ての検出数値セットとの間で得られる線形近似式である、前記（１）〜（７）のいずれかに記載のデータ処理方法。
（９）前記工程Ｅにおいて、代表値が補正後の各検出用プローブの検出数値の平均値である、前記（１）〜（８）のいずれかに記載のデータ処理方法。
（１０）少なくとも１種の検出用プローブは、核酸、蛋白質および糖の群から選択されるものである、前期（１）〜（９）のいずれかに記載のデータ処理方法。
（１１）複数の検出用プローブを有する分析チップの各検出用プローブの光強度を検出して各検出用プローブに対応する出力数値を得る検出装置であって、
複数の異なる検出感度で各検出用プローブの光強度を検出する検出部と、
複数の検出数値セットから検出範囲外の検出数値を除外し、検出範囲内の検出数値を使用して各検出数値セット間の線形近似式を算出し、この全ての線形近似式の切片が０、傾きが１になるように各検出数値セットにおける検出数値を補正し、および各検出用プローブの検出数値の代表値を決定して出力数値を算出する、データ処理部と、
を含む検出装置。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、複数の検出用プローブを有する分析チップを読み取って各検出用プローブに対応する出力数値を得るためのデータ処理方法において、検出範囲が従来より広いデータ（出力数値）が得られ、さらに複数回検出を行った検出数値を統合することにより、信頼性および精度が高いデータを取得することができる。このため、その後の解析を適切に行うことが出来るようになり、検査、診断などに対して良好な結果を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＤＮＡチップ「３Ｄ−Ｇｅｎｅ」（東レ）上でＨｅｐＧ２細胞由来の核酸を検出するに際し、ＰＭＴのゲインを５０（測定条件１）、５５（測定条件２）、６０（測定条件３）にセットしてＣｙ５蛍光強度をＤＮＡチップ用スキャナーを用いて測定したときの元データの結果及び検出範囲外（検出数値１００以下および５０，０００以上）のデータを除外したあとの結果（データの一部、すなわち検出数値１００より大きく５０，０００より小さい）をそれぞれ示す表である。
【図２】図１の表を基にして作成した、補正前の測定条件１（Ｘ軸）と測定条件２（Ｙ軸）のスキャッタープロットと、グラフの線形近似式を示す。
【図３】補正後の測定条件１（Ｘ軸）と測定条件２（Ｙ軸）のスキャッタープロット（図４の表参照）と、グラフの線形近似式を示す。
【図４】データの代表値の算出結果（データの一部）を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、
複数の検出用プローブを有する分析チップを読み取って各検出用プローブに対応する出力数値を得る際に、検出範囲として低い検出数値（シグナル）から高い検出数値（シグナル）のデータを高精度に得る方法として、複数の検出用プローブを有する分析チップの各検出用プローブの光強度を検出して各検出用プローブに対応する出力数値を得るデータ処理方法であって、
複数の異なる検出感度で検出して複数の検出数値セットを得る工程Ａ、
工程Ａで得られた各検出用プローブの検出数値セットにおいて、検出範囲外の検出数値を除外する工程Ｂ、
工程Ｂの後に得られた検出範囲内の検出数値を使用して、各検出数値セット間の線形近似式を得る工程Ｃ、
工程Ｃで得られた全ての線形近似式の切片が０、傾きが１になるように各検出数値セットにおける検出数値を補正する工程Ｄ、
工程Ｄで補正した後の各検出用プローブの検出数値から、その代表値を決定して出力数値とする工程Ｅ、
を含む、データ処理方法、
である。
【００１９】
本発明の方法により、分析チップの低い検出数値（シグナル）から高い検出数値（シグナル）までの広域の検出範囲におけるデータを、５％以下の低い変動係数（ＣＶ）で提供できる。このような広域の検出範囲は、例えば出力数値として約１００より大きく約５０，０００より小さい値として得ることができる。
【００２０】
以下に、本発明で用いるのに好適な分析チップ、特にＤＮＡチップについて具体的に説明するがこれらに限定されない。
本発明で使用可能な好ましい分析チップは、例えば本出願人による特許文献２や非特許文献１などに記載されたものであり、分析チップの担体は、材質としては、例えば、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴムなどのポリマーを挙げることができる。好ましくは、成形が容易な合成ポリマー、例えばＰＭＭＡである。
【００２１】
またその形状として微細な凹凸構造を有することができる。凹部及び凸部の形状は特に限定されないが、特に凸部は角柱、円柱、円錐台などの柱状構造が好ましい。また凸部の上面の形状は、円形又は三〜八角形などの角形が好ましい。凹部又は凸部は完全に又は実質的に同一の構造を有しており、また交互に規則的に配列していることが好ましい。このような規則的な配列の場合、凸部の形状に応じて凹部の形状が決まる。
【００２２】
担体の成形としては、ポリマーの場合、射出成形法、ホットエンボス法などの方法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法などの方法、シリコンの場合、公知の半導体プロセスで使用される方法が挙げられる。
【００２３】
担体は、その全体又は一部を黒色にすることができる。黒色とは、可視光範囲（波長４００〜８００ｎｍ）において、担体の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値、好ましくは７％以下であり、かつ、黒色部分の分光透過率も特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値、好ましくは２％以下であることを意味する。基板の少なくとも一部を黒色にすることによって、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。黒色にする手段として、担体材料又は絶縁材料に黒色物質、例えばカーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、金属（Ｒｕ，Ｍｎ，Ｎｉ，Ｃｒ，  Ｆｅ，Ｃｏ，Ｃｕなど）の酸化物、Ｓｉ，Ｔｉ，Ｔａ，Ｚｒ，Ｃｒの炭化物を混入させることにより達成される。
【００２４】
凸部のサイズは、例えば高さ約１０〜約２００μｍ、幅約５０〜約１５０μｍであるが、このような範囲に限定されない。凸部と凸部の間隔は、例えば約５０〜約６００μｍであるが、好ましくは複数の微粒子が入ることが可能なサイズである。また、特開２００４−２６４２８９（特許文献２）に示す理由から、凸部の高さについては、その周りの平坦部と同じ高さであることが好ましい。
【００２５】
以上のような形状の分析チップを分析チップはバックグラウンドノイズを低減することが可能であり、１ａｔｔｏ  ｍｏｌ程度の蛍光標識分子も検出することができる。
また、このような形状の分析チップにおいては凸部の上面に検出用プローブとして、核酸および／または蛋白質および／または糖が固定化される。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などを含む。蛋白質は抗体、サイトカイン、レセプター、リガンドなど生体内で相互作用を行うタンパク質を含む。糖は、単糖、オリゴ糖、糖鎖、糖脂質、糖タンパク、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンを含む。
【００２６】
担体の凸部の上面に核酸などの検出用プローブを固定化するために、凸部の上面は、検出用プローブと結合可能な官能基（例えばアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基など）を含むことができる。このような官能基を導入するために、例えば該表面にプラズマ処理や放射線処理（例えばγ線、電子線など）を施し、この後さらにグラフト重合処理することによって極性基を導入したり、ポリカチオン（例えばポリ−Ｌ−リシン、シランカップリング剤など）をコートしたりすることができる。
【００２７】
このような担体においては、担体とカバー部材の間に凹凸構造により形成される空隙部を設け、その空隙部分に微粒子を含むことができる。微粒子が存在することによって、検体サンプルと検出用プローブとをハイブリダイゼーションさせる際に検体溶液を効率よく攪拌することが可能となり、その結果、ハイブリダイゼーションの反応促進効果がもたらされる。ハイブリダイゼーションを再現性良く、安定して行うことが可能となる。
【００２８】
以上のような分析チップ、特に核酸を検出用プローブとして固定したＤＮＡチップに対して、分析対象となる核酸断片、例えば生物の細胞又は組織などの検体から得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡなどの遺伝子産物を合成し、これをＣｙＤｙｅやＡｌｅｘａなどの蛍光色素などで標識したのち、これら色素標識された分析対象の核酸断片とＤＮＡチップの担体上に固定化された核酸との結合を検出することにより測定を行う。測定はＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション又はＲＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションに基づく。この際の反応温度、時間、バッファーなどの条件は、ハイブリダイズさせる核酸の種類や鎖長などに応じて適宜選択される。また、ハイブリダイゼーションは、一般にはストリンジェントな条件下で行われる。そのような条件は特に限定されないが、例えば３０〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液による洗浄を含むことができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液（ｐＨ７．２）である。
【００２９】
本発明の工程Ａにおいては、異なる検出感度条件で分析チップを複数回検出して複数の検出数値セットを得る。
分析チップを検出する際には、上記のハイブリダイゼーション反応を行った後、分析チップを読み取って検出を行うが、通常スキャナーと呼ばれる蛍光等の光強度を検出して画像データとする装置で検出を行い、標識が発する光強度又は存在を測定する。
【００３０】
例えば、蛍光強度を検出するスキャナーは、ＤＮＡチップ上にハイブリダイズした核酸に標識された色素をレーザーなどで励起し、これによって発光された蛍光強度又は存在位置を検出する装置である。本発明ではデータ処理前の複数の検出数値セットを得るために、スキャナーを用いて異なる検出感度条件で複数回スキャンニングした検出数値セットを得る。
【００３１】
スキャニングにより検出される蛍光強度は、蛍光を励起するレーザーの出力およびスキャナーにおけるＰＭＴ（光電子増倍管）のゲイン（感度）に依存する。レーザーの出力を上げれば検出される蛍光強度は大きくなるが、色素の劣化を引き起こしやすくなる。また、ＰＭＴのゲインを上げれば光電子が増倍されるため検出される蛍光強度は高くなるが、ノイズを拾いやすくなる傾向がある。このため、スキャニングを行う際はレーザー出力とＰＭＴゲインを適度に調整しながらスキャニングを行うが、また、検出の際のレーザー出力はレーザー出力を大きくしたほうがシグナルとノイズの比率（Ｓ／Ｎ比）が大きくなるため、最大値で設定することが好ましく、さらに異なる光電子増倍管ゲインを設定して複数回スキャニングして複数の検出数値セットを得ることが好ましい。
【００３２】
複数の検出用プローブを有する分析チップをスキャニングして得られた画像を利用してデータ解析ソフトを使用して各検出用プローブに対応する検出数値を得る。この際得られる検出数値は、各検出用プローブ（各プローブは目的とするある検出物質、例えば遺伝子と対応する）に対して発現強度に相当する代表値、例えば、平均値、中央値、最大値または最小値などを採用することができる。この中でも中央値を採用することが、外れ値などの影響を除外する観点から好ましい。
【００３３】
この際の複数の検出感度条件に関しては、例えば、最も強い光強度の検出数値が飽和（サチュレーション）する程度になるようにレーザー出力とＰＭＴゲインを設定する、あるいは最も弱い光強度の検出数値がバックグラウンドとして検出される値よりも大きくなるようにレーザー出力とＰＭＴゲインを設定することが好ましい。この際のバックグラウンドは、蛍光を検出する場合には、蛍光色素が発する蛍光が存在していない領域での検出数値を示す。飽和した光強度の検出数値はその後のデータ処理において重要ではないため、設定した複数の光電子増倍管ゲインの内一つの設定でスキャニングすることにより得られた検出数値セットにおいて、得られた検出数値のうち飽和した検出数値の割合が１％以下であることが好ましく、０．１％以下であることがより好ましい。
【００３４】
また、複数の検出数値セットを取得してデータを処理するほうがデータのノイズが平均化され、データの信頼性、精確性が向上するため、複数の異なる検出感度条件で分析チップを複数回検出して複数の検出数値セットを得る工程において、複数回検出する回数が３回以上であることが望ましい。
【００３５】
また、本発明の工程Ｂにおいては各検出数値セットにおいて検出範囲外の検出数値を除外する。この工程を行うことにより、その後の工程に対して適切な検出範囲に対応した良質な検出数値を提供することが出来る。
【００３６】
検出範囲外の検出数値を除外する工程とは、異なる検出感度条件で分析チップを複数回検出して得られた複数の検出数値セットから、その後のデータ処理で不要となる検出数値を除外し、必要となる検出数値を選択する工程である。例えば、基準値を定めてその値以上あるいは以下の値を削除する。また、スキャニングした際の画像データに基づき、分析チップに汚れがついていた場合などは汚れがついていた検出用プローブ位置に対応する検出数値を削除するなどする。
【００３７】
例えば、通常蛍光を測定するスキャナーは、光増倍管の設定の都合から、検出数値の上限は２の１６乗（６５，５３６）であり、５０，０００程度の値で検出数値がサチュレーションした、すなわち蛍光強度が飽和した状態となる。このサチュレーションした検出数値は精確な蛍光強度を示していないために、その後のデータ処理には必要がない。このため、このサチュレーションする蛍光強度以上の検出数値を削除してその後のデータ処理工程を行うことが好ましい。検出数値がサチュレーションする原因として、このような検出システム上の検出数値の飽和状態以外に、分析チップ上の検出プローブの固定量以上に検出目的物が結合する場合に検出数値がサチュレーションする場合がある。
【００３８】
このようなサチュレーションしたと判断する蛍光強度の検出数値の基準値を設定する方法としては、上記のシステム上や固定プローブ量の限界理論値から基準値を設定する方法や、例えば、複数のＰＭＴ条件でスキャニングして得た検出数値セット間で線形近似直線を得て、その直線から検出値が大きく外れる数値を基準値（閾値）として設定する方法がある。サチュレーションした値としてその基準値以上の値を削除するなどする。
【００３９】
また、分析チップのバックグラウンド以下の数値は、実際には光強度が検出されていないため、バックグラウンド以下の検出数値を削除することがその後のデータ処理工程にとって好ましい。バックグラウンド以下と判断する蛍光強度の検出数値の基準値は、例えば蛍光が存在していない位置の検出数値を複数選び出し、例えば平均値や標準偏差を算出し、その平均値自体あるいは平均値に標準偏差を加算するなどして得られる値を基準値として設定することができる。
【００４０】
各検出数値セットにおいて検出範囲外の検出数値を除外した結果、検出用プローブに対応する検出数値が１つしか存在しない場合は、データの精度を低下させる可能性がある。このため、複数の検出数値セットにおいて、検出範囲外の検出数値を除外した結果、検出用プローブに対応する検出数値が１つしか存在しない検出用プローブの割合が、分析チップに搭載されている検出用プローブの総数に対して４０％以下であること好ましく、より好ましくは３０％以下であることが好ましい。
【００４１】
検出感度条件は、サチュレーションしているとして除外される検出数値をできるだけ少なく抑えるために、サチュレーションの基準値を検出感度の上限と合わせるように設定することが好ましい。複数の異なる検出感度条件で分析チップを複数回検出して複数の検出数値セットを得る工程において、得られたある一つの検出数値セットに含まれるサチュレーションしている検出数値の個数の割合が検出数値セットの中で１％以下であることが好ましく、０．１％以下であることがより好ましい。
【００４２】
本発明の工程Ｃにおいては、除外された以外の全ての検出数値、すなわち工程Ｂの結果として得られて検出数値を使用して検出数値セット間の線形近似式を得る。
【００４３】
上記工程Ｂにおいて除外された以外の全ての検出数値を使用して、ある検出数値セットをＸ軸、ある検出数値セットをＹ軸として検出数値セット間のスキャッタープロットを得て、そのスキャッタープロットに対して線形近似式を算出する。該スキャッタープロットに対する線形近似式は、通常２乗誤差が最小になる最小二乗法を適用して求めることができ、この場合Ｙ＝ｐＸ＋ｑの式で表される。
【００４４】
このような線形近似式を得る工程において、ｎ個の検出数値セットを得た場合、理論的には最大でｎ（ｎ−１）／２個の組み合わせの線形近似式を得ることができるが、全ての検出数値セットが少なくともいずれかの組合せに必ず含まれ、ある一つの検出数値セットに関連づけられるような組み合わせで線形近似式を算出すればよく、最少の組み合わせの場合はｎ−１個の線形近似式を求めることになる。中でも、線形近似式が一つの検出数値セットを基準にして、これが全てのセットに含まれるように他の残る全ての検出数値セットと組み合わせてｎ−１個の線形近似式を得ることが、その後の工程を単純化するためにもより好ましい。すなわち、検出感度条件として条件（１）、条件（２）、条件（３）で検出を行った場合、条件（１）を基準にして条件（１）−条件（２）間、条件（１）−条件（３）間でそれぞれＸ軸、Ｙ軸として線形近似式を二つ求めることが好ましい。
【００４５】
本発明の工程Ｄは、工程Ｃで算出された全ての線形近似式が同一式になるように検出数値データを補正する工程であって、工程Ｃで得られた全ての線形近似式が切片０、傾きが１になるように各検出数値セットにおける検出数値の補正を行う。
【００４６】
例えば、上記の通り条件（１）−条件（２）間、条件（１）−条件（３）間で求めた線形近似式がＹ＝ｐ１Ｘ＋ｑ１とＹ＝ｐ２Ｘ＋ｑ２であった場合、ｐ１＝ｐ２＝１として線形近似式の傾きを１，ｑ１＝ｑ２＝０として線形近似式の切片を０となるように検出数値を補正する。ある一つの条件を基準にすることにより、その後のデータ間の代表値を算出することが容易になる。例えば補正の際に上記の３条件の場合、条件（１）の検出数値セットを基準にして条件（２）、条件（３）の検出数値セットを補正することにより条件（２）、条件（３）のデータが条件（１）のデータと線形近似式として同一（Ｙ＝Ｘ）であるデータとして補正することが可能となる。
【００４７】
本発明の工程Ｅにおいては、工程Ｄで補正した後の各検出用プローブの検出数値から、その代表値を決定して出力数値とする。
工程Ｅで用いる代表値としては、例えば平均値、中央値、最大値、最小値などがあるが、ノイズなどの影響を平均化する観点から、平均値を使用することが好ましい。
【００４８】
本発明の別の態様は、複数の検出用プローブを有する分析チップの各検出用プローブの光強度を検出して各検出用プローブに対応する出力数値を得る検出装置であって、
複数の異なる検出感度で各検出用プローブの光強度を検出する検出部と、
複数の検出数値セットから検出範囲外の検出数値を除外し、検出範囲内の検出数値を使用して各検出数値セット間の線形近似式を算出し、この全ての線形近似式の切片が０、傾きが１になるように各検出数値セットにおける検出数値を補正し、および各検出用プローブの検出数値の代表値を決定して出力数値を算出する、データ処理部と、
を有する検出装置である。
【００４９】
本発明の検出装置には、分析チップの光強度を読み取るスキャナーや、分析チップに被検物質を反応させるための手段や、スキャンしたデータを画像解析処理するためのコンピューターなどの演算手段も具備することができる。該装置はさらに、データ処理部で処理した結果を表示する表示部を含むことができる。
【００５０】
本発明のデータ処理方法あるいは本発明の検出装置により、検出範囲が広く、さらに信頼性および精度が高いデータを取得することができる。そのため、例えば遺伝子の発現プロファイリングや病態遺伝子の発現解析において、低発現から高発現までの広範な被検物質の発現状態を感度良く検出でき、また再現性の良い精確なデータを得ることが出来る。
【００５１】
本発明のデータ処理方法について具体的な例をあげて説明するがこの方法に限定されるものではない。
例えばヒトの全遺伝子を検出できるプローブ約２５，０００種類を搭載したＤＮＡチップを検出する場合、このＤＮＡチップに蛍光色素標識したｍＲＮＡの増幅産物をＤＮＡチップにハイブリダイズさせた後、検出操作を行う。検出はＤＮＡチップを読み取ってＤＮＡチップ上の蛍光強度を画像データとして得ることができるスキャナーと呼ばれる装置を使用する。スキャナーは蛍光を励起するレーザーとＰＭＴ（光電子増倍管）を具備しており、レーザーパワーとＰＭＴの感度（ゲイン）を調整することにより、様々な検出範囲でＤＮＡチップ上の蛍光強度を画像データとして得ることができる。このため、スキャニングして画像データを得るために、例えば、レーザーパワーを最大にして、サチュレーション値以上として検出されるプローブの個数が全プローブの１％以下になるようにＰＭＴを調整してまず１条件目のスキャニングを行う。その後ＰＭＴの感度を上げ、違う検出範囲条件で検出画像を得る。この際にＰＭＴ感度条件を様々に調整することにより、検出範囲を広げて高シグナル（輝度）から低シグナル（輝度）のデータを持つ複数の画像データを得ることができる。得られた複数の画像データ、例えば条件（１）、条件（２）、条件（３）で得られた画像データからは、画像データを解析して数値化するソフトにより、それぞれの検出プローブに対応する検出数値（検出数値セット）が算出される。
【００５２】
つまり、条件（１）、条件（２）、条件（３）で得られた画像データからそれぞれ、遺伝子発現を出するプローブ、例えばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、・・・・・・・に対する検出数値が算出される。例えば、
条件（１）の検出数値セット
［Ａ１，Ｂ１，Ｃ１，Ｄ１，Ｅ１，Ｆ１，Ｇ１，Ｈ１，Ｉ１，Ｊ１，Ｋ１・・・・］
条件（２）の検出数値セット
［Ａ２，Ｂ２，Ｃ２，Ｄ２，Ｅ２，Ｆ２，Ｇ２，Ｈ２，Ｉ２，Ｊ２，Ｋ２・・・・］
条件（３）の検出数値セット
［Ａ３，Ｂ３，Ｃ３，Ｄ３，Ｅ３，Ｆ３，Ｇ３，Ｈ３，Ｉ３，Ｊ３，Ｋ３・・・・］
という３条件に対応する検出数値セットが得られる。
【００５３】
ここにおいて、検出範囲外のサチュレーションしている数値やバックグラウンド以下の数値などはこの後のデータ処理の精度を落とすために削除する。
例えば、削除後は、
条件（１）の検出数値セット
［Ａ１，Ｂ１，    ，Ｄ１，Ｅ１，Ｆ１，Ｇ１，Ｈ１，    ，Ｊ１，Ｋ１，・・・・］
条件（２）の検出数値セット
［Ａ２，Ｂ２，Ｃ２，Ｄ２，    ，Ｆ２，Ｇ２，Ｈ２，Ｉ２，Ｊ２，    ，・・・・］
条件（３）の検出数値セット
［Ａ３，Ｂ３，Ｃ３，Ｄ３，Ｅ３，Ｆ３，Ｇ３，    ，Ｉ３，Ｊ３，    ，・・・・］
という検出数値セットが得られる。
【００５４】
次にこの３条件の検出セット間で線形近似式を得るが、例えば、条件（１）を基準にして条件（１）と条件（２）、条件（１）と条件（３）の間の線形近似式Ｙ＝ｐＸ＋ｑを得る。線形近似式は最小２乗法によって求められるが、具体的には、条件（１）をＸ、条件（２）Ｙとして、得られたそれぞれのプローブに対応する検出数値のペア（Ｘｉ，Ｙｉ）＝（Ａ１，Ａ２）（Ｂ１，Ｂ２）・・・をＸ軸、Ｙ軸の２次元のグラフにプロットする。この際上記の削除された検出数値があるペアはプロットされない。すべてのプローブに対応する検出数値をプロットした後、
【数１】
2010233528.tif 000003
が最小になるようにｐ、ｑを求める。
【００５５】
同様に条件（１）と条件（３）でも線形近似式を求めることにより２つの線形近似式、例えば、
条件（１）と条件（２）間：Ｙ＝ｐ１Ｘ＋ｑ１
条件（１）と条件（３）間：Ｙ＝ｐ２Ｘ＋ｑ２
を得ることができる。
【００５６】
次に、得られた全ての線形近似式が切片０、傾きが１になるように検出数値を補正する。すなわち、条件（２）の検出数値セットについて、
［Ａ２，Ｂ２，Ｃ２，Ｄ２，    ，Ｆ２，Ｇ２，Ｈ２，Ｉ２，Ｊ２，    ，・・・・］
の各検出数値からｑ１をひいてｐ１で割る。すなわち、
［（Ａ２−ｑ１）／ｐ１，（Ｂ２−ｑ１）／ｐ１，（Ｃ２−ｑ１）／ｐ１（Ｄ２−ｑ１）／ｐ１，  ，（Ｆ２−ｑ１）／ｐ１，（Ｇ２−ｑ１）／ｐ１，（Ｈ２−ｑ１）／ｐ１，（Ｉ２−ｑ１）／ｐ１，
（Ｊ２−ｑ１）／ｐ１，    ，・・・・・・］
の数値に補正する。
【００５７】
条件（３）の検出数値セットについても同様に、
［Ａ３，Ｂ３，Ｃ３，Ｄ３，Ｅ３，Ｆ３，Ｇ３，    ，Ｉ３，Ｊ３，    ，・・・・］
の各検出数値からｑ２をひいてｐ２で割る。すなわち
［（Ａ３−ｑ２）／ｐ２，（Ｂ３−ｑ２）／ｐ２，（Ｃ３−ｑ２）／ｐ２，（Ｄ３−ｑ２）／ｐ２，
（Ｅ３−ｑ２）／ｐ２，（Ｆ３−ｑ２）／ｐ２，（Ｇ３−ｑ２）／ｐ２，    ，（Ｉ３−ｑ２）／ｐ２，（Ｊ３−ｑ２）／ｐ２，    ，・・・・・］
の数値に補正する。
【００５８】
上記の補正後の数値を、
条件（１）の検出数値セット
［Ａ１，Ｂ１，    ，Ｄ１，Ｅ１，Ｆ１，Ｇ１，Ｈ１，    ，Ｊ１，Ｋ１・・・・］
条件（２）の検出数値セット
［Ａ２’，Ｂ２’，Ｃ２’，Ｄ２’，  ，Ｆ２’，Ｇ２’，Ｈ２’，Ｉ２’，Ｊ２’，・・・・］
条件（３）の検出数値セット
［Ａ３’，Ｂ３’，Ｃ３’，Ｄ３’，Ｅ３’，Ｆ３’，Ｇ３’，  ，Ｉ３’，Ｊ３’，・・・・］
とする。
【００５９】
最後に補正した後の検出数値セット間で各検出用プローブに対応する検出数値の代表値を決定して出力数値とする。代表値としては平均値が好ましく、例えば、
［（Ａ１＋Ａ２’＋Ａ３’）／３，（Ｂ１＋Ｂ２’＋Ｂ３’）／３，（Ｃ２’＋Ｃ３’）／２，（Ｄ１＋Ｄ２’＋Ｄ３’）／３，（Ｅ１＋Ｅ３’）／２，（Ｆ１＋Ｆ２’＋Ｆ３’）／３，（Ｇ１＋Ｇ２’＋Ｇ３’）／３，（Ｈ１＋Ｈ２’）／２，（Ｉ２’＋Ｉ３’）／２，（Ｊ１＋Ｊ２’＋Ｊ３’）／３，Ｋ１，・・・・・・］
を算出して、これを各プローブに対する出力数値としてデータ処理する。
【実施例】
【００６０】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（ＤＮＡチップ）
“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”ヒト全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社製）を使用した。このＤＮＡチップはヒトの全遺伝子約２５０００種が検出できるＤＮＡチップである。
【００６１】
（サンプルの調製）
ＨｅｐＧ２細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン社）でＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、該Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＡｍｉｎｏ  Ａｌｌｙｌ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐII  ａＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）  でａＲＮＡ増幅した後、Ｃｙ５標識を行った後、Ｃｙ５標識ａＲＮＡサンプルを“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”ヒト全遺伝子型ＤＮＡチップにアプライし、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後洗浄を行い、ハイブリダイゼーションしていないａＲＮＡを除去した。
【００６２】
［実施例１］
（蛍光強度の測定：工程Ａ）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（株式会社パーキンエルマー社製  Ｓｃａｎａｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）に上記処理後の基板をセットし、レーザー出力１００％、ＰＭＴのゲインを５０（測定条件１）、５５（測定条件２）、６０（測定条件３）にした状態でＣｙ５蛍光強度の測定を行った。ここで、蛍光強度とはスポット内の蛍光強度の中央値であり、バックグラウンドノイズとは、プローブＤＮＡを固定化していない凸部の蛍光強度である。
【００６３】
（データの決定：工程Ｂ）
図１に示すように、測定条件１〜３で得られた各遺伝子に対するＣｙ５蛍光強度に対して、蛍光強度が、バックグラウンド以下の検出数値の基準値として１００以下及びサチュレーションした検出数値の基準値として５０，０００以上の値を除去した。
【００６４】
（線形近似式の算出、データの補正：工程Ｃ、Ｄ）
図２に示すように、データの決定工程１で得られたデータに対して、測定条件１をＸ軸、測定条件２をＹ軸にして各遺伝子のＣｙ５蛍光強度をスキャッタープロットを作成し、線形近似式を算出したところ、Ｙ＝０．５３０４Ｘ＋４２．０６となった。これに基づき、図３に示すように、線形近似式が傾きを１、切片を０になるように測定条件２の各遺伝子強度を補正した。
同様に測定条件１と測定条件３についてデータ補正を行い、測定条件３のデータを補正した。
【００６５】
（出力数値の算出：工程Ｅ）
図４に示すように、データ統合工程３で得られた各測定条件における各遺伝子のＣｙ５蛍光強度の平均値を計算して各遺伝子のＣｙ５蛍光強度のデータ処理値（出力数値）とした。
【００６６】
以上の測定およびデータ処理を同じチップに対して３回行った。その結果、蛍光強度が得られた遺伝子数の３回の平均は１５，６３１個であった。また、３回のデータの各遺伝子のＣＶ値を検出し、その平均を算出したところ４．８％であった。
【００６７】
［比較例１］
実施例１と同じＤＮＡチップを用いて、実施例１とは異なり、同一の測定条件１で３回スキャニングを行い、３セットのデータを得た。該データに関して、実施例１と同様に蛍光強度が１００以下あるいは５０，０００以上の値を除去してデータを得たところ、蛍光強度が得られた遺伝子数の３回の平均は１４，２５３個であり、実施例１と比べたかなり少なかった。また、３回のデータの各遺伝子のＣＶ値を検出し、その平均を算出したところ９．７％で、実施例１よりも大きかった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、複数の検出用プローブを有する分析チップにおいて、検出範囲が従来より広いデータ（出力数値）が得られ、さらに複数回検出を行った検出数値を統合することにより、信頼性および精度が高いデータを取得することができる。このためその後の解析を適切に行うことができるようになり、例えば医療分野の疾患の検査、診断などに対して良好な結果を提供することができるため、産業上有用である。
【図１】
2010233528.tif 000004
【図２】
2010233528.tif 000005
【図３】
2010233528.tif 000006
【図４】
2010233528.tif 000007