(57)【要約】【課題】哺乳動物宿主において血管の外傷後の狭窄または再狭窄を抑制する為の又は血管の外傷後の血管の改造を抑制または減少する為の医薬組成物及びキットを提供する。【解決手段】外傷を受けた血管を生物学的にステントするために治療的に有効な投与量の静細胞剤および／または細胞骨格インヒビターを哺乳動物宿主に投与することからなる、哺乳動物宿主における血管の外傷後の狭窄または再狭窄を抑制する方法が提供される。また、有効量の細胞骨格インヒビターを投与することからなる、血管の外傷後の血管の改造を抑制または減少する方法が提供される。さらに、本発明の治療剤からなる医薬組成物およびキットが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の血管の管腔面積の縮小を抑制または減少するために有効な細胞骨格インヒビターを含んでなる投与形態を哺乳動物の血管に投与することからなる方法であって、前記細胞骨格インヒビターは実質的に結晶の形態であり、そして前記結晶の大きさは前記細胞骨格インヒビターの持続放出性を生ずる大きさである、前記方法。
【請求項２】
前記結晶が微結晶である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結晶の大きさが約０．１ミクロン〜約１ｍｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞骨格インヒビターが、タキソール、サイトカラシン、またはそれらの類似体からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢの類似体からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢからなる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記サイトカラシンＢが前記投与形態の約５〜約４０重量％を構成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞骨格インヒビターがタキソールの類似体からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞骨格インヒビターがタキソールからなる、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記タキソールが投与形態の約３〜約５０重量％を構成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞骨格インヒビターを移植可能な装置を介して投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞骨格インヒビターが放出可能に前記移植可能な装置の中に埋め込まれているか、その上に被覆されているか、あるいは前記移植可能な装置の中に埋め込まれているか、その上に被覆されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞骨格インヒビターが放出可能に微小粒子、ナノ粒子、またはそれらの混合物の中に埋め込まれている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記微小粒子またはナノ粒子が放出可能に前記移植可能な装置の中に埋め込まれているか、その上に被覆されているか、あるいは前記移植可能な装置の中に埋め込まれているか、その上に被覆されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記装置が外膜ラップ、人工移植片、ステントまたはシャントである、請求項１２または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞骨格インヒビターが放出可能に非液体のマトリックスの中に埋め込まれているか、その上に被覆されているか、あるいは前記非液体のマトリックスの中に埋め込まれているか、その上に被覆されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記結晶形態が液体のベヒクルの中に分散されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記分散した結晶形態がカテーテルにより投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が処置による血管の外傷の前、間または後、またはそれらの任意の組合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
血管が血管形成術、ステントの配置、シャントの配置、または天然の移植片、またはそれらの任意の組合わせにより外傷を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
投与が局所的である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記血管が処置的に外傷を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物の血管の管腔面積の縮小を抑制または減少するために有効なタキソールまたはその類似体からなる微小粒子またはナノ粒子を含んでなる持続放出性投与形態を、処置的に外傷を受けた哺乳動物の血管に投与することからなる治療方法。
【請求項２４】
前記持続放出性投与形態が約２〜約５０ミクロンの大きさの微小粒子を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記持続放出性投与形態が約０．５〜約１００ミクロンの大きさの微小粒子を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記持続放出性投与形態が約５０〜約２００ナノメートルの大きさのナノ粒子を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記持続放出性投与形態が約０．１〜約１０００ナノメートルの大きさのナノ粒子を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記持続放出性投与形態を移植可能な装置を介して投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記持続放出性投与形態が放出可能に前記移植可能な装置の中に埋め込まれているか、その上に被覆されているか、あるいは前記移植可能な装置の中に埋め込まれているか、その上に被覆されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記装置が外膜ラップ、人工移植片、ステントまたはシャントである、請求項１２または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記持続放出性投与形態が放出可能に非液体のマトリックスの中に埋め込まれているか、その上に被覆されているか、あるいは前記非液体のマトリックスの中に埋め込まれているか、その上に被覆されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記持続放出性投与形態が生物分解性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与が処置による血管の外傷の前、間または後、またはそれらの任意の組合わせである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記血管が血管形成術、ステントの配置、シャントの配置、または天然の移植片、またはそれらの任意の組合わせにより外傷を受けている、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記微小粒子またはナノ粒子が前記移植可能な装置を介して溶液で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記装置がカテーテルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
非液体のマトリックス中に哺乳動物の血管の管腔面積の縮小を抑制または減少するために有効なサイトカラシンまたはその類似体を含んでなる投与形態を哺乳動物の血管に投与することからなる治療方法。
【請求項３８】
前記投与形態がサイトカラシンまたはその類似体からなる微小粒子またはナノ粒子を含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与形態がサイトカラシンまたはその類似体の結晶または微結晶を含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記マトリックスがゲル、膜またはペーストからなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記サイトカラシンがサイトカラシンＢの類似体からなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記サイトカラシンがサイトカラシンＢからなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記サイトカラシンまたはその類似体が移植可能な装置を介して投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記サイトカラシンまたはその類似体が放出可能に移植可能な装置、マトリックス、または双方の中に埋め込まれているか、その上に被覆されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記装置が外膜ラップ、人工移植片、ステントまたはシャントである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＤまたはサイトカラシンＡからなる、請求項４または３７に記載の方法。
【請求項４７】
外傷を受けた哺乳動物の血管の管腔中のある部位に少なくとも１種の治療剤の送出に適合した移植可能な装置と、薬学上許容される液体の担体の中に提供されたタキソールまたはその類似体からなる、ある量の微小粒子またはナノ粒子を含んでなる単位投与形態とからなり、ここで前記単位投与形態の少なくとも一部分が前記血管の管腔直径の縮小を抑制または減少するために有効である、キット。
【請求項４８】
前記装置がカテーテルである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
移植可能な装置を介する送出に適当であり、
（ａ）外科的処置により外傷を受けた哺乳動物の血管の狭窄または再狭窄を抑制または減少するために有効である量のサイトカラシンまたはその類似体と、
（ｂ）前記サイトカラシンのための薬学上許容される非液体の放出マトリックスと、を含んでなる医薬組成物。
【請求項５０】
前記組成物が前記装置上に被覆されている、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記放出マトリックスがゲル、透過性膜またはペーストからなる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記放出マトリックスがサイトカラシンまたはその類似体からなる微小粒子またはナノ粒子を含んでなる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５３】
前記サイトカラシンが、サイトカラシンＢ、サイトカラシンＤ、サイトカラシンＡ、サイトカラシンＢまたはサイトカラシンＢの類似体からなる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５４】
メッシュの中に含有されている、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５５】
前記装置がシャント、ステント、人工移植片または外膜ラップである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５６】
治療用シャントの配置後の狭窄または再狭窄を抑制または減少するために有効である量の細胞骨格インヒビターを含んでなる治療用シャント。
【請求項５７】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシン、タキソール、またはそれらの類似体からなる、請求項５６に記載の治療用シャント。
【請求項５８】
治療用ラップの配置後の狭窄または再狭窄を抑制または減少するために有効である量の細胞骨格インヒビターを含んでなる治療用外膜ラップ。
【請求項５９】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシン、タキソール、またはそれらの類似体からなる、請求項５８に記載の治療用シャント。
【請求項６０】
治療用移植片の配置後の狭窄または再狭窄を抑制または減少するために有効である量のサイトカラシンまたはその類似体を含んでなる治療用外膜移植片。
【請求項６１】
前記血管が処置的に外傷を受けている、請求項３７に記載の方法。
【請求項６２】
液体のベヒクル中の外傷を受けた哺乳動物の血管を生物学的にステントするために有効な量のサイトカラシンではない細胞骨格インヒビターを前記血管に投与することからなる、前記血管を生物学的にステントする方法。
【請求項６３】
液体のベヒクル中の外傷を受けた哺乳動物の血管を生物学的にステントするために有効な量のサイトカラシンまたはその類似体を前記血管に投与することからなり、ここで約４〜約２５ｍｌを送出す移植可能な装置を介して前記投与を行う、前記血管を生物学的にステントする方法。
【請求項６４】
前記細胞骨格インヒビターがタキソールまたはその類似体からなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記サイトカラシンがサイトカラシンＡ、サイトカラシンＤ、サイトカラシンＢまたはサイトカラシンＢの類似体からなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
投与された量の少なくとも一部分が前記血管の内側の中膜の少なくとも約６〜９層に浸透する、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記投与が移植可能な装置を介する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記移植可能な装置が約４〜約２５ｍｌの単位投与形態を送出すカテーテルである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記投与が約０．３気圧〜約８気圧において約１〜約５分間である、請求項６３または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記カテーテルの孔大きさが約０．１ミクロン〜約８ミクロンの直径である、請求項６３または６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記量が血管の平滑筋細胞の増殖を抑制する、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項７２】
前記サイトカラシンが液体のベヒクルの１ｍｌ当たり約０．０１〜約１０μｇである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項７３】
前記サイトカラシンが液体のベヒクルの１ｍｌ当たり約１．０〜約１０μｇである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項７４】
外傷を受けた哺乳動物の血管の管腔中のある部位に少なくとも１種の治療剤を送出すのに適合した移植可能な装置と、液体のベヒクル中の少なくとも１種の細胞骨格インヒビターを含んでなる単位投与形態とからなり、ここで前記血管への前記単位投与形態の少なくとも一部分の投与が前記血管を生物学的にステントするために有効である、キット。
【請求項７５】
前記投与は前記投与単位形態の少なくとも一部分が前記血管の内側の中膜の少なくとも約６〜９層に浸透するために十分である、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール、サイトカラシン、またはそれらの類似体である、請求項７４に記載のキット。
【請求項７７】
前記細胞骨格インヒビターがタキソールまたはその類似体である、請求項７４に記載のキット。
【請求項７８】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＡ、サイトカラシンＤ、サイトカラシン、またはサイトカラシンＢの類似体である、請求項７６に記載のキット。
【請求項７９】
前記サイトカラシンが液体のベヒクルの１ｍｌ当たり約０．０１〜約１０μｇである、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
前記サイトカラシンが液体のベヒクルの１ｍｌ当たり約１．０〜約１０μｇである、請求項７８に記載のキット。
【請求項８１】
前記ベヒクルが水性である、請求項７８に記載のキット。
【請求項８２】
前記移植可能な装置がカテーテルである、請求項７８に記載のキット。
【請求項８３】
前記移植可能な装置が約４〜約２５ｍｌの単位投与形態を送出すカテーテルである、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
前記投与が約０．３気圧〜約８気圧において約１〜約５分間である、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
前記カテーテルの孔大きさが約０．１ミクロン〜約８ミクロンの直径である、請求項８２に記載のキット。
【請求項８６】
前記投与形態が液体のベヒクルの１ｍｌ当たり約０．０１〜約１０μｇのサイトカラシンの約１０〜約３０ｍｌを含むバイアルからなる、請求項７８に記載のキット。
【請求項８７】
前記バイアルが狭窄または再狭窄の治療または抑制において使用するために標識されている、請求項７２に記載のキット。
【請求項８８】
液体のベヒクルの１ｍｌ当たり約０．００１〜約２５μｇのサイトカラシンまたはまたはその類似体の約１０〜約３０ｍｌを含むバイアルからなり、移植可能な装置を介する送出に適合した単位投与形態。
【請求項８９】
薬学上許容される液体のベヒクルの中に静細胞量のサイトカラシンまたはその類似体からなるバイアルを含んでなる単位投与形態。
【請求項９０】
前記サイトカラシンがサイトカラシンＢ、サイトカラシンＤまたはサイトカラシンＡからなる、請求項８８または８９に記載の単位投与形態。
【請求項９１】
前記サイトカラシンがサイトカラシンＢの類似体からなる、請求項８８または８９に記載の単位投与形態。
【請求項９２】
前記バイアルがサイトカラシンまたはその類似体を含む約１０〜約３０ｍｌのベヒクルからなる、請求項８８、８９または９１に記載の単位投与形態。
【請求項９３】
前記バイアルが約０．０１〜約１０μｇの類似体からなる、請求項９１に記載の単位投与形態。
【請求項９４】
細胞骨格インヒビターを移植可能な装置を介して投与し、そして前記移植可能な装置はカテーテルではなく、第１および第２の膨張可能な部材を有し、これらの部材は治療すべき外傷を受けた血管の部分の対向する側に配置されて、細胞骨格インヒビターの投与前に治療すべき外傷を受けた血管の部分を隔離する、前記細胞骨格インヒビターを含んでなる投与形態の有効量を哺乳動物の外傷を受けた血管に投与することによって血管の管腔の直径の縮小を抑制することからなる方法。
【請求項９５】
細胞骨格インヒビターの投与前に、治療すべき外傷を受けた血管の隔離された部分を洗浄しないで血液を除去する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール、サイトカラシン、またはそれらの類似体からなる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞骨格インヒビターがタキソールからなる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞骨格インヒビターがタキソールの類似体からなる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢの類似体からなる、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＤ、サイトカラシンＡまたはサイトカラシンＢからなる、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記有効量が狭窄または再狭窄を抑制または減少する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０２】
前記装置がカテーテルである、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０３】
前記投与形態が持続放出性投与形態ある、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０４】
前記持続放出性投与形態が細胞骨格インヒビターを含んでなる微小粒子またはナノ粒子からなる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞骨格インヒビターを液体のベヒクルと組合わせて投与する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記バイアルを狭窄または再狭窄の治療または抑制において使用するために標識する、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項１０７】
静細胞量の実質的な細胞障害性を示さない治療剤を含んでなる投与形態を血管に投与するからなり、ここで前記治療剤は細胞骨格インヒビターであり、そして前記量は前記血管の脈管改造を抑制または減少する、血管の外傷後の管腔面積を維持する方法。
【請求項１０８】
前記量が血管を生物学的にステントする、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシン、タキソール、またはそれらの類似体である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記投与形態が持続放出性投与形態である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
外傷を受けた血管の血管の改造を抑制または減少するために有効な静細胞量の細胞骨格インヒビターを血管に投与することからなり、ここで血管の改造が血管の内部の管腔直径または面積の収縮により特徴づけられる、外傷を受けた哺乳動物の血管の血管の改造を抑制または減少する方法。
【請求項１１２】
人工移植片が上に横たわるステントからなる治療装置であって、ここで前記治療装置の配置後の狭窄または再狭窄を抑制または減少するために有効な量の細胞骨格インヒビターからなる、前記治療装置。
【請求項１１３】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシン、タキソール、またはそれらの類似体からなる、請求項１１５に記載の治療装置。
【請求項１１４】
治療装置の配置後の狭窄または再狭窄を抑制または減少するために有効な量のサイトカラシンまたはその類似体を含んでなる治療用人工移植片。
【請求項１１５】
前記血管が処置的に外傷を受けている、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
冠状動脈疾患をもつ数多くの患者において、一次治療様式として経皮的経管腔冠状血管形成術（PTCA）が広く用いられている。PTCAは、管腔閉塞を緩和し冠状血流を改善することによって冠状動脈疾患をもっ患者における心筋虚血を緩和することができる。この外科的措置の使用は、急速に成長してきており、１９８３年には39,000例、１９８７年にはほぼ150,000例、１９８８年には200,000例、１９８９年には250,000例の手術が行なわれ、１９９４年までには年間500,000例以上のPTCAが見込まれている（Popma et al.，Amer．J．Med．８８：16N-24N(1990)；Fanelli et al．Amer．Heart Jour.１１９：357-368(1990)；Johnson et al.，Circulation.７８(Suppl．II)：11-82(1988)）。PTCA後の狭窄は、大きな問題であり続けており、２５％〜３５％の患者が１〜３カ月以内に再狭窄を発生させている。再狭窄は著しい罹病率と死亡率を結果としてもらたし、反復的な血管形成術又は冠状動脈バイパス手術といったようなさらなる介人を必要とすることが多い。１９９３年現在で、いかなる外科的介入も手術後の処置も再狭窄を予防する上で有効であると証明されていない。
【背景技術】
【０００２】
PTCA後の狭窄の原因となる過程は完全に理解されていないが、複数の異なる生物学的作用物質と経路の間での複雑な相互作用の結果である可能性がある。組織学的切片で見たところ、再狭窄患部は、血管の内膜層内の平滑筋細胞の過形成を有する可能性がある（Johnson et al.，Circulation(循環)７８(Suppl．II)：11-82（1988））。PTCAの後の平滑筋細胞増殖について考えられるメカニズムがいくつか示唆されてきた（Popma et al.，Amer，J．Med．88：16N-24N（1990）；Fanelli et al.Amer．Heart Jour．１１９：357-368(1990)；Liu et al.，Circulation 79：1374-1387(1989)；Clowes et al.，Circ Res.５６：139-145(1985)）。
【０００３】
インビトロでの平滑筋増殖を抑制すると言われている化合物(Liu et al.，Circulation，79：1374-1387(1989)；Goldman et al.，Atherosclerosis(アテローム硬化症)，65：215-225(1987)；Wolinsky et al.,JACC，15（2）：475-481(1990))は、インビボで使用したとき、望ましくない薬学的副作用を有する可能性がある。このような化合物の一例としてはヘパリンがあり、これは、インビトロでは平滑筋増殖を阻害すると言われているが、インビボで使用したとき、凝血を阻害するという不利な副作用の可能性を有している。ヘパリンペプチドは、抗凝血作用は緩和されているものの、薬学的半減期が短かいという望ましくない薬学的特性を有する。血管形成術部位における治療用作用物質の局所的送達のために２重バルーンカテーテルを使用することにより（例えばNabel et al.，Science．244：1342-1344(1989)；米国特許No．4,824,436），及び薬物が含浸された生物分解性材料を用いて、すなわち短かい半減期の問題を補償するようにすることによって（例えばMiddlebrook et al.，Biochem．Pharm,３８（18）;3101-3110(1989)；米国特許No．4,929,602）このような問題を解決する試みがなされてきた。
【０００４】
少なくとも５つの考慮事項が表面上、平滑筋細胞の過形成の結果生じる狭窄を予防するための阻害性薬物の使用を排除することになる。すなわちまず第１に、阻害性物質は、心血管疾患をもつ患者にとって受容し難いレベルの危険性を作り出す可能性のある全身的毒性を有することがある。第２に、阻害性物質は、外科手術後の血管創傷治ゆと干渉する可能性があり、それは治ゆを遅らせ新たに治ゆされた血管壁の構造又は弾性を弱くさせる可能性がある。第３に、平滑筋細胞を殺す阻害性物質は、周囲の内皮及び／又はその他の内側平滑筋細胞に損傷を与える可能性がある。死枯した及び死枯しつつある細胞は同様に、付加的な平滑筋細胞の増殖を刺激し狭窄を再燃させるかもしれない分裂促進作用物質を放出する。
【０００５】
第４に、阻害性作用物質を治療上有効なレベルで送達することは、複数の観点からみて問題の多いものである：すなわちａ）治療的有効量の分子が細胞膜を横断することができるようにするための有利な条件を確立するために、平滑筋細胞間の細胞間空間内への多数の分子の送達が必要となりうる；ｂ）適切な細胞内区画内すなわちその作用が及ぼされる場所へと阻害性薬物を導くことは、制御の困難なことである；ｃ）例えば隣接する細胞への薬物の細胞間再分配を最小限におさえながら、例えばリボソームといったその細胞内標的との阻害性作用物質の会合を最適化することは、困難でありうる。第５に、平滑筋細胞増殖は数週間にわたって起こることから、先験的に、阻害性薬物も又、有益な効果を作り出すべく、数週間にわたり、恐らくは連続的に投与されるべきであると思われる。
【０００６】
以上のことから、平滑筋細胞の増殖を有効に処置するために阻害性薬物を使用することには、解決すべき数多くの問題が残っている。
【０００７】
かくして、血管外科手術中に発生するような血管に対する外傷性障害の後の血管平滑筋細胞の増殖に由来する狭窄を阻害し又は緩和するための方法に対する必要性が存在する。同様に、長時間にわたり阻害効果を及ぼす化合物を血管平滑筋細胞に送達する必要性も存在する。
【発明の概要】
【０００８】
（発明の要約）
本発明は、例えば血管形成術によって手術上の外傷を受けた哺乳動物の血管に対して少なくとも１つの治療用作用物質を投与することを含んで成る治療方法を提供する。好ましくは、治療用物質は、細胞骨格阻害物質である。本発明の実施において好ましい細胞骨格阻害物質としては例えば、タキソール及び例えばタキソテールといったその類似体又は誘導体、サイトカラシン例えばサイトカラシンＢ，サイトカラシンＣ，サイトカラシンＤ又はその類似体又は誘導体が含まれる。本発明の治療用作用物質の投与は、血管を生物学的にステントし、血管の再生を阻害又は緩和し、血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は緩和するか又はこれらの効果を組合わせた形で得るために有効である。治療用作用物質の投与は、好ましくは、例えば血管形成術又はその他の血管外科手術の間といった、血管に外傷を与える処置の間に行なわれる。本発明は同様に、当該方法における使用に適合された治療用組成物及び剤形ならびにそれらを収納するキットを提供する。
【０００９】
かくして、本発明の第１の実施形態は、外傷を受けた哺乳動物の血管を生物学的にステントするための方法を提供する。本書で使用されている「生物学的にステントする」という語は、膨張状態の血管管腔をその最大収縮直径近くで固定することを意味する。この方法には、血管への細胞骨格阻害物質の有効量投与が含まれる。好ましくは細胞骨格阻害物質は、ビヒクル１ｍｌあたりサイトカラシンＢについては約０．１〜約１０μｇといった薬学的に受容可能な液体担体内に分散させられ、好ましくは、カテーテルを介して局所的に投与される。好ましくは、投与された量の１部分は、血管の内部中膜の少なくとも約６〜９層の細胞層に浸透し、従って血管を生物学的にステントするのに有効である。本発明のもう１つの好ましい実施形態は、水性ビヒクル１ｍｌにつき約０．００１〜約２５μｇの割合で薬学的に受容可能な液体担体中に分散されるサイトカラシン又はその類似体である。
【００１０】
好ましいカテーテル投与条件には、薬学的に受容可能な液体ビヒクル内に分散又は溶解させられた細胞骨格阻害物質を含む組成物を約４〜約２５ｍｌ送達するために１本のカテーテルを利用することが含まれている。細胞骨格阻害物質は、約０．５〜約５分間、より好ましくは約０．７〜約３分間、約３〜約８atm，より好ましくは約４〜５atmのハブ圧力で送達される。カテーテル投与のための好ましい静水頭圧としては、約０．３〜約１．０atm，より好ましくは約０．５〜約０．７５atmが含まれる。治療用作用物質の量は、血管平滑筋細胞が、小さな細胞外傷を修復するのに必要とされるタンパク質を合成し続け、間質マトリックスを分泌して、その最大収縮直径近くで膨張状態にある血管管腔を容易に固定できるようにする、すなわち血管の生物学的ステントを提供することができるように制御される。好ましくは、治療用作用物質は、血管平滑筋組織の外傷を受けた部域に直接又は実質的に直接投与される。
【００１１】
本発明はさらに、有効量の細胞骨格阻害物質を外傷を受けた血管に投与することによって、外傷を受けた哺乳動物の血管の再生を阻害又は緩和するための方法を提供する。
【００１２】
以下で詳述する通り、用量応答研究によると、サイトカラシンＢは２つの対数的治療指数（ＴＩ）を有していた。大治療指数は、システムの出口ポートに直接隣接する細胞に対する毒性無く、例えば移植可能な装置といった送達システムからの治療的レベルの作用物質の拡散を可能にする。その上、液体ビヒクル中のサイトカラシンの最大濃度においてさえ、送達システムに隣接する細胞内には、ほとんど又は全く毒性が見られなかった。同様に、サイトカラシンＢ及びタキソールは共に、処置に由来する血管外傷を受けた血管内の内膜増殖を阻害する。この阻害の結果、外傷後の血管壁はより迅速かつ完全に内皮化される。
【００１３】
かくして、本発明はさらに、処置による外傷を受けた哺乳動物の血管内の血管管腔容積の減少を阻害又は緩和するための方法をも提供している。この方法には、有効量の細胞骨格阻害物質を血管に投与する段階が含まれ、ここで細胞骨格阻害物質は、実質的に純粋で実質的に結晶質の形態をしており、ここで結晶は、細胞骨格阻害物質の持続放出をもたらすようなサイズを有する。好ましくは、結晶のサイズは、約０．１ミクロン〜約１０mm，好ましくは約１ミクロン〜約２５ミクロンである。持続放出に有用な結晶サイズを決定する方法は、当該技術分野において周知のものである。好ましくは、細胞骨格阻害物質は、移植可能な装置を用いて、インサイチュで投与され、ここで細胞骨格阻害物質は、この移植可能な装置に放出可能な形で包埋されるか、その上にコーティングされるか、或いは又包埋されコーティングされる。好ましくは結晶質細胞骨格阻害物質は、例えばシリコン膜といった外膜ラップ内に放出可能な形で包埋されるか又は分散させられる。例えは、本発明の好ましい治療用移植可能装置は、外膜ラップ１重量パーセントあたり約５〜約７０，好ましくは約７〜約５０，より好ましくは約１０〜約３０重量パーセントのサイトカラシン、例えばサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る。
【００１４】
本発明のもう１つの好ましい治療用移植可能装置は、外膜ラップ１重量パーセントあたり約１〜約７０，好ましくは約２〜約５０，より好ましくは約３〜約１０重量パーセントのタキソールを含む。代替的には、本発明の好ましい治療用移植可能装置は、外膜ラップ１重量パーセントあたり約３０〜約７０，好ましくは約３０〜約６０，より好ましくは約３０〜約５０重量パーセントのタキソールを含む。代替的には、結晶質細胞骨格阻害物質を、結晶を含む溶液を生み出すビヒクル内に懸濁させることができる。すなわちこれは飽和溶液である。
【００１５】
本発明は同様に、処置による外傷を受けた哺乳動物の血管内で血管管腔容積の減少を阻害又は緩和するための方法をも提供している。この方法は、細胞骨格阻害物質を含むエマルジョン又はマイクロエマルジョンを血管に投与する段階を含んで成る。細胞骨格阻害物質の量は、哺乳動物の血管の血管管腔面積の減少を阻害又は緩和するのに有効なものである。好ましくは、エマルジョン又はマイクロエマルジョンは、持続放出剤形をもつ。好ましくは、マイクロエマルジョンは、約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ，より好ましくは、約３０ｎｍ〜約３００ｎｍの直径をもつ。
【００１６】
本発明はさらに、１つの治療方法を提供している。この方法は、細胞骨格阻害物質例えばサイトカラシン、タキソール又はその類似体を含むマイクロ粒子又はナノ粒子を含む持続放出剤形を、処置による外傷を受けた哺乳動物の血管に対し投与する段階を含んで成る。持続放出剤形は、カテーテルではない。つまり好ましくは非観血的血管形成術を行なうのに用いられるカテーテルではない移植可能装置を介して投与される。投与される量は、哺乳動物の血管の血管管腔面積の減少を阻害又は緩和するのに有効である。持続放出剤形は、好ましくは、直径が４〜約５０ミクロンのマイクロ粒子を含む。持続放出剤形は同様に、好ましくは、約２〜約５０、より好ましくは３ミクロン以上１０ミクロン未満の直径を含むことができる。ナノ粒子については、好ましいサイズには、約１０〜約５０００、より好ましくは約２０〜約５００、さらに好ましくは約５０〜約２００ナノメートルが含まれる。
【００１７】
同様に提供されているのは、哺乳動物の血管の血管管腔面積の減少を阻害又は緩和するために有効な実質的に純粋でかつ実質的に固体の形態のサイトカラシン又はその類似体を、処置による外傷を受けた哺乳動物の血管に投与する段階を含む方法である。好ましい固体形態には、サイトカラシン又はその類似体を含むマイクロ粒子又はナノ粒子、サイトカラシン又はその類似体の結晶又は微結晶、サイトカラシン又はその類似体の結晶又は微結晶を含むマイクロ粒子又はナノ粒子、又はサイトカラシン又はその類似体を含むゲル又はペーストが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００１８】
同様に、提供されているのは、外傷を受けた哺乳動物の血管の管腔内の１部位に対し少なくとも１つの細胞骨格阻害物質をインサイチュで送達する好ましくは局所的に送達するために適合させられた少なくとも１つの移植可能な装置、及びこの装置による送達のために適合された少なくとも一単位剤形の細胞骨格阻害物質を、別々に包装された形で含むキットである。装置を介しての外傷を受けた血管に対する単位剤形の送達は、血管を生物学的にステントし、血管の再生を阻害又は緩和し、血管平滑筋細胞増殖を阻害又は緩和するため、又はこれらの効果を任意に組合せて得るために有効である。
【００１９】
さらに提供されているのは、外傷を受けた哺乳動物の血管の管腔内の部位に対して少なくとも１つの治療用作用物質を送達するのに適合された移植可能装置、及び少なくとも１つの細胞骨格阻害物質を含むエマルジョン又はマイクロエマルジョンを含む単位剤形を、別々に包装された形で含むキットである。外傷を受けた哺乳動物の血管に対する単位用量の装置を介した送達は、血管内の血管管腔直径の減少を阻害又は緩和するために有効である。
【００２０】
本発明は同様に、外傷を受けた哺乳動物の血管の管腔内の部位に対して少なくとも１つの治療用作用物質を送達するのに適合された移植可能装置、及びタキソール又はその類似体を含むマイクロ粒子又はナノ粒子を一定量含む単位剤形を、別々に包装された形で含むキットを提供する。好ましくは、キットは、送達前に前記マイクロ粒子又はナノ粒子を分散させるために薬学的に受容可能な液体担体ビヒクルを含む、第２の単位剤形をも含んで成る。分散したマイクロ粒子又はナノ粒子の、外傷を受けた哺乳動物の血管への送達は、血管内の血管管腔直径の減少を阻害又は緩和するために有効である。
【００２１】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、移植可能な装置を用いた投与に適した薬学組成物である。組成物は、外科的処置により外傷を受けた哺乳動物の血管の狭窄又は再狭窄を阻害又は緩和するのに有効な量の実質的に純粋な固体サイトカラシン；及び前記サイトカラシン又はその類似体のための薬学的に受容可能な放出マトリックスを含んで成る。好ましくは、放出マトリックスは、ゲル、ペースト又は膜、例えばシリコーン膜を含んで成る。
【００２２】
本発明は同様に、外科的処置により外傷を受けた哺乳動物の血管の狭窄又は再狭窄を阻害又は緩和するのに有効な量の実質的に純粋な固体サイトカラシン又はその類似体を含む薬学組成物をも提供する。好ましくは、サイトカラシン又はその類似体は、結晶質形態をもっ。
【００２３】
さらに提供されているのは、外科的処置により外傷を受けた哺乳動物の血管の狭窄又は再狭窄を阻害又は緩和するのに有効な量のサイトカラシン又はその類似体を含むエマルジョン又はマイクロエマルジョンを含む薬学組成物である。
本発明は同様に、治療用装置も提供する。本発明の１実施形態は、設置後の狭窄を阻害するか又は再狭窄を緩和するのに有効な量の細胞骨格阻害物質を含む治療用シャントを含んで成る。本発明のもう１つの実施形態は、設置後の狭窄を阻害し又は再狭窄を緩和するための一定量のサイトカラシン又はその類似体を含む、治療用人工移植片を含んで成る。本発明のさらにもう１つの実施形態は、設置後の狭窄を阻害するか又は再狭窄を緩和するのに有効な量の細胞骨格阻害物質を含む治療用外膜ラップを含んで成る。
【００２４】
本発明は同様に、有効量の細胞骨格阻害物質を外傷を受けた哺乳動物の血管に投与することによって血管管腔直径の減少を阻害する段階を含む治療方法をも提供する。細胞骨格阻害物質は、第１及び第２の拡張性の部材すなわち細胞骨格阻害物質の投与に先立ち治療すべき管腔の部分を隔離するべく治療すべき血管部域の相対する側に配置されたバルーンを有するカテーテルではない移植可能装置を介して投与される。好ましくは、血管の隔離された部分は、細胞骨格阻害物質の投与に先立ち、血液を除去するために洗浄されない（「非観血的血管形成術」）。以上で使用した「隔離された」という語は、カテーテルバルーンによる実際の治療部域の閉塞的接触を意味しておらず、本発明の実施においては好ましいものである。その上、Slepianの米国特許第５，３２８，４７１号中で記述されているような、すなわち治療すべき領域が洗浄される非観血的血管形成術は、血管に対し外傷又はさらなる外傷をもたらす可能性があり、合併症の可能性を増大させる可能性があり、有益な効果を達成するのに必要ではない。
【００２５】
同様に提供されているのは、哺乳動物の血管の管腔面積の減少を阻害又は緩和するのに有効な非液体ビヒクル又はマトリックス中のサイトカラシン又はその類似体の剤形を、哺乳動物の血管に対し投与する段階を含む方法である。好ましくは、剤形は、実質的に固体の剤形である。非液体ビヒクル又はマトリックスは、好ましくはゲル、ペースト又は膜を内含するもののこれらに制限されないが、サイトカラシン又はその類似体を含むマイクロ粒子、ナノ粒子などは含まない。
さらに提供されているのは、外傷を受けた哺乳動物の血管の管腔内の部位に対して少なくとも１つの治療用作用物質を送達するのに適合された移植可能装置及び少なくとも１つの細胞骨格阻害物質を含む単位剤形を別々に包装された形で含むキットにおいて、単位剤形の少なくとも一部分の投与が、血管の管腔直径の減少を阻害又は緩和するのに有効であるキットである。この装置は、投与に先立って治療すべき血管の一部分を隔離するべく治療すべき領域の相対する側に配置された第１及び第２の拡張性部材を含み、血管の隔離された部分が投与に先立ち血液を除去するように洗浄されない、カテーテルではない。
【００２６】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、移植可能な装置による投与のために適した薬学組成物である。この組成物は、外科的処置による外傷を受けた哺乳動物の血管の狭窄又は再狭窄を阻害するか又は緩和するのに有効な量のサイトカラシン又はその類似体及び、このサイトカラシンのための薬学的に受容可能な非液体放出マトリックスを含んで成る。好ましくは、放出マトリックスは、ゲル、ペースト又は膜を含んで成る。
【００２７】
同様に提供されているのは、単位剤形である。この単位剤形は、液体ビヒクル１ｍｌにつき約０．００１μｇ〜約２５μｇの細胞骨格阻害物質好ましくはサイトカラシンが約１０〜約３０ｍｌ入ったバイアルを含み、ここで単位剤形は、移植可能な装置を介した送達のために適合されており、バイアルは、狭窄又は再狭窄を治療又は阻害する上で使用するためラベルづけされている。好ましくは、単位剤形は、液体ビヒクル１ｍｌにつき約０．０１μｇ〜約１０μｇのサイトカラシンＢが約１０〜約３０ｍｌ入ったバイアルを含んで成る。かくして１本のバイアル内に存在する体積は、移植可能な装置内に存在する体積より大きくてもよいし又はほぼ同じであってもよい。同様にして、移植可能な装置内に存在する体積は、投与される体積より大きくてもよいし或いは又それとほぼ同じであってもよい。同様にして、投与される体積は、有益な効果をもつ体積より大きくてもよいし又はそれとほぼ同じであってもよい。
【００２８】
さらに提供されているのは、薬学的に受容可能な液体ビヒクル中に細胞骨格阻害物質が細胞増殖抑制量だけ入ったバイアルを含む単位用量である。好ましくは細胞骨格阻害物質は、サイトカラシン、タキソール又はその類似体を含んで成る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】図１Ａは、２４才の男性患者の血管平滑筋細胞の顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、血管平滑筋結合タンパク質が細胞表面及び膜に結合した状態の、２４才の男性患者の動脈中の血管平滑筋細胞の顕微鏡写真である。この患者は、組織学用に動脈組織が調製される４日前にi.v.(静脈内投与)により血管平滑筋結合タンパク質を受けた。
【図２】図２は、血管平滑筋結合タンパク質に対する治療用作用物質の化学的カップリングのための第１のスキームを描いている。
【図３】図３は、血管平滑筋結合タンパク質に対する治療用作用物質の化学的カップリングのための第２のスキームを描いている。
【図４Ａ】図４Ａは、インビトロでのマーカー陽性テスト細胞に対する血管平滑筋結合タンパク質の急速な結合を示す実験データをグラフに描いている。
【図４Ｂ】図４Ｂは、インビトロでの血管平滑筋細胞に対する血管平滑筋結合タンパク質の急速な結合を示す実験データをグラフで描いている。
【図５Ａ】図５Ａは、血管平滑筋細胞を２４時間インビトロで処理した場合のさらに低いレベルの治療用接合体(すなわちRA-NR-AN-01)及び遊離ＲＡ治療用作用物質の望ましくない細胞毒性を示す実験データをグラフで示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、マーカー陽性及びマーカー陰性細胞の代謝活性に対するRA-NR-AN-01治療用接合体の効果を示す実験的データをグラフで示している。このデータは、インビトロでの２４時間の処理におけるこれらの細胞全てについての接合体の望ましくない非特異的細胞毒性を示している。この非特異性は、テスト対象細胞を遊離薬物に暴露するカップリングリガンドの細胞外加水分解の結果もたらされるものである。
【図６Ａ】図６Ａは、２４時間の処理後に代謝活性のテストに先立ち一晩の回復期間があったにもかかわらず、インビトロでの２４時間の処理後のマーカー陽性及びマーカー陰性テスト細胞についてのPE-NR-AN-01治療用接合体の望ましくない非特異的細胞毒性を示す実験データをグラフで描いている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、インビトロでの２４時間の治療後のマーカー陽性及びマーカー陰性テスト細胞に対する遊離ＰＥ治療用作用物質の非特異的細胞毒性を示す実験データを描いている。
【図７Ａ】図７Ａは、２４時間ではなく短かい５分間の「パルス」処理とそれに続く〔3Ｈ〕ロイシンに対する暴露において、遊離ＲＡ治療用作用物質が、対照のＨＴ２９マーカー陰性細胞について非特異的に細胞毒性を有するのに対し、RA-NR-AN-01治療用接合体がこの「パルス」処理において細胞毒性をもたないことを示す実験データをグラフで示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、５分の「パルス」処理とそれに続く〔3Ｈ〕ロイシン暴露前の２４時間の回復期間においてさえ、遊離ＲＡ治療用作用物質が対照ＨＴ２９マーカー陽性細胞に対して非特異的な細胞毒性を有するものの、これに対しRA-NR-AN-01治療用接合体が細胞に対し細胞毒性をもたないことを示す実験データをグラフで示している。
【図７Ｃ】図７Ｃは、RA-NR-AN-01治療用接合体を用いたインビトロでの細胞の「パルス」処理が、タンパク質合成により測定されるように、マーカー陽性Ａ３７５細胞内での細胞活性を阻害することを示す実験結果をグラフで示している。
【図７Ｄ】図７Ｄは、インビトロでのテストに先立ち細胞が一晩の回復期間放置された場合にＡ３７５細胞内のタンパク質合成が阻害されなかったことから、RA-NR-AN-01治療用接合体を用いたインビトロでの細胞の「パルス」処理が、マーカー陽性細胞内の細胞活性に対し長く持続する阻害効果を及ぼさなかったことを示す実験データをグラフで示している。
【図８Ａ】図８Ａは、遊離ＲＡ治療用作用物質を用いたインビトロでの細胞の「パルス」処理が非特異的な細胞毒性を有していたものの、テストに先立ち４８時間の回復期間放置されたＢＯ５４細胞内の代謝活性によって立証される通り、RA-NR-AN-01治療用接合体は、血管平滑筋細胞内での細胞活性に対し長く持続する阻害効果を及ぼさなかったということを示す実験データをグラフで示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、上述の図８Ａにおいて示されたものと類似の実験データをグラフで描いているが、ここでは第２のマーカー陽性細胞型、すなわちＡ３７５が用いられており、データは、テストに先立ち４８時間の回復期間放置されたＡ３７５細胞内での代謝活性により測定されるように、RA-NR-AN-01治療用接合体を用いた「パルス」処理が、細胞活性に対し長く持続する阻害効果を及ぼさなかったことを示している。
【図８Ｃ】図８Ｃは、上述の図８Ａ及び図８Ｂにおいて示されたものと類似の結果を描いているが、ここでは、マーカー陰性対照細胞型すなわちＨＴ２９が用いられている。結果は、テストに先立ち４８時間の回復期間放置されたＨＴ２９細胞内での代謝活性により測定されるように、RA-NR-AN-01治療用接合体を用いた「パルス」処理が、マーカー陰性対照細胞の細胞活性に対し長く持続する阻害効果を及ぼさなかったことを示している。
【図９Ａ】図９Ａは、動物モデルにおける血管形成術から５週間後の未治療の動脈の組織学切片内の内膜平滑筋細胞の増殖に起因する狭窄を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、動物モデル内で血管形成術から５週間後に、治療用接合体で治療された動脈の組織学切片における狭窄の阻害を示している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、血管平滑筋細胞との関係において、スラミンがもつタンパク質合成及びＤＮＡ合成阻害能力を比較する実験データをグラフで描いている。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、血管平滑筋細胞との関係において、スタウロスポリンがもつタンパク質合成及びＤＮＡ合成阻害能力を比較する実験データをグラフで描いている。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、血管平滑筋細胞との関係において、ニトログリセリンがもつタンパク質合成及びＤＮＡ合成阻害能力を比較する実験データをグラフで描いている。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、血管平滑筋細胞との関係において、サイトカラシンＢがもつタンパク質合成及びＤＮＡ合成阻害能力を比較する実験データをグラフで描いている。
【図１１】図１１は、62,500倍に拡大され、インビトロで細胞により内在化される過程において抗体コーティングされた金球を含むものをいくつか含む数多くの細胞内小胞により特徴づけされる平滑筋細胞の内部表面に対して平行な接線方向断面を示す。
【図１２】図１２は、62500倍に拡大され、インビトロでの球に対する露呈から２４時間後のリソゾーム中の金球の著しい蓄積によって特徴づけされた平滑筋細胞を示す。
【図１３】図１３は、62500倍に拡大され、インビボでリソゾーム内の金球の蓄積によって特徴づけされた平滑筋細胞を示す。
【図１４】図１４は、ブタの大腿動脈の管腔部域上のサイトカラシンＢの効果のインビボ用量応答研究を描いている。
【図１５】図１５は、シリコーンラップ（ＳＷ）内で投与されたサイトカラシンＢ（ＣＢ）又はタキソール（ＴＡＸ）による外傷を受けた血管内の平滑筋細胞増殖の経時的な阻害を表わすグラフである。
【図１６】図１６は、ＳＷ中の１０％又は３０％ wt/wtのＣＢ又はＳＷ中の５％wt/wtのＴＡＸによる、外傷を受けた血管内の平滑筋細胞増殖の経時的な阻害を表わすグラフである。
【図１７】図１７は、シリコーン中のＣＢ又はＴＡＸ，ウシコラーゲンメッシュ(CG-CM)により支持されたコラーゲンゲル内のＣＢ又は、ウシコラーゲンメッシュ(PG-CW)により支持されたプルロニックゲル内のＣＢによる、外傷を受けた血管内の平滑筋細胞増殖の経時的な阻害を表わすグラフである。
【００３０】
発明の詳細な説明
（定義）
「治療用接合体」というのは、治療用作用物質に（例えば任意にはリンカー半分を通して）カップリングされた間質マトリックス結合タンパク質又は血管平滑筋を意味する。本発明の治療用接合体は、治療用接合体に対し血管平滑筋結合タンパク質をカップリングすることにより得られる。治療用接合体内で、血管平滑筋結合タンパク質は、血管平滑筋細胞又は周細胞に対し治療用接合体をターゲティングする機能を行ない、治療用作用物質は、平滑筋細胞又は周細胞の細胞活性又は増殖を阻害する機能を行なう。
【００３１】
「治療用作用物質」は、当該方法において、治療的又は予防的効果を及ぼすことができるあらゆる半分を内含する。
「標的」及び「マーカー」は、血管平滑筋細胞又はマトリックス構造の細胞表面膜上で発現される、例えば抗原、ポリペプチド抗原又は細胞表面炭水化物（例えば糖脂質、糖タンパク質又はプロテオグリカン）といったマトリックス又は血管平滑筋結合タンパク質によって特異的に認識された分子を意味するよう、当該接合体を記述する上で互換的に使用されている。
「エピトープ」は、３つ以上のアミノ酸又は糖類の配列といったマトリックス又は平滑筋結合タンパク質により結合される「標的」分子内の特異的部位のことを意味するように用いられる。
「カップリングされた」という語は、キレート化によるものを含む、治療用作用物質とマトリックス又は血管平滑筋結合タンパク質の共有結合又は非共有結合による化学的会合（すなわち、ファンデルワールス力又は電荷−電荷相互作用を通してといったような疎水性会合）を意味するのに用いられる。好ましくは、結合タンパク質は、共有結合を用いて治療用作用物質と会合させられる。
「リンカー」というのは、例えば有機化学カップリング剤から誘導されるような、治療用作用物質に対しマトリックス又は平滑筋結合タンパク質を結合する半分のことである。
【００３２】
本書で使用されているように、「実質的に」純粋というのは、当該技術分野において慣習的に用いられる方法によって検定された時点で、少なくとも約９０％，好ましくは少なくとも約９８％，より好ましくは少なくとも約９９％汚染物質を含まない状態のことを言う。
【００３３】
本書で用いられている「実質的に」固体又は結晶質という語は、当該技術分野において慣習的に用いられる方法によって検定された時に少なくとも約９０％，好ましくは少なくとも約９８％，より好ましくは少なくとも約９９％，非固体又は非結晶質形態又は相を含まない状態のことを意味する。
【００３４】
平滑筋細胞の「遊走」というのは、（例えば、経時的な組織培養中の規定の部域から外への平滑筋細胞の遊走の、微速度撮影又はビデオレコーダ及び手動計数を用いて１つの場所からもう１つの場所への細胞の運動を追従することによりインビトロで研究することもできる、血管の内側層から内膜内へのインビボでのこれらの細胞の動きを意味する。
【００３５】
「増殖」というのは、細胞の有糸分裂による細胞数の増大を意味する。本書で使用されているように、「平滑筋細胞」は、新生物性の平滑筋細胞すなわちガン細胞を意味しない。
【００３６】
「移植可能な装置」というのは、哺乳動物の血管に対し、制御された形でインサイチュで送達する目的で、治療用作用物質を保持し放出することのできるあらゆる材料を意味する。移植可能な装置には、血管の管腔内に設置される装置、例えば留置カテーテル又はステント又は、血管の外側に設置されるもの、例えば外膜ラップ、メッシュ又はカバリング、又は例えば罹患した又は外傷を受けた血管の一部分に置換するべく血管自体の一部となるもの、例えば合成移植片が含まれる。移植可能な装置には、装置内に放出可能な形で包埋されかつ／又は装置上にコーティングされている形の治療用作用物質が含まれていてよい。治療用作用物質は、装置に塗布されかつ／又は装置内に包埋されうるか又は直接血管に投与されうる薬学的に受容可能な放出担体マトリックス内に包埋されかつ／又はその上にコーティングされていてもよい。例えば、本発明の実践において有用なマトリックスとしては、マイクロ粒子、ナノ粒子、ゲル、ペースト又は透過性膜があるが、これらに制限されるわけではない。移植可能な装置は、例えば、治療用作用物質のカテーテル又は輸液針といったように制限された時間、又は、ステント又は移植片といったように長期間にわたり、移植することができる。本発明の移植可能な装置を挿入することのできる血管には、冠状動脈、大腿動脈、頸動脈及び末梢血管が含まれるが、これらに限られるわけではない。
【００３７】
活性及び増殖に関して「異常又は病的な又は不適切な」という語は、正常に機能する同じタイプの細胞内又は健康な組織内では見られない病巣内で標準的に発生するよりもさらに急速に又ははるかに大きな範囲で発生する細胞（ただしガン細胞ではない）の分裂、成長又は遊走を意味する。
「発現された」という語は、例えば、血管平滑筋細胞又は周細胞によって合成されるＣＳＰＧといったような、細胞によるポリペプチドの合成、グリコシル化及び／又は分泌を結果として伴うｍＲＮＡの転写及び翻訳を意味する。
【００３８】
「血管の再生」というのは、新内膜肥厚又は平滑筋細胞増殖の結果ではなく、一般に処置による血管外傷の後に発生する、血管管腔の容積、直径又は面積の減少である。かくして、多大な量の新内膜形成の無い内部弾性薄片又は膜（ＩＥＬ）により制限された面積の減少（「狭窄」）が「血管の再生」と呼ばれる。Isner,Circ．89 2937(1994)を参照のこと。血管の管腔横断面積は、直接的面積計測定によってつまり例えば血管内超音波（ＩＶＵＳ）によって又は剖検において測定することができる。ここで使用される「血管の再生」という語は、内膜増大に対処するべく新内膜増殖に付随する血管の代償性拡大を含むものではない。この代償性拡大は同様に、「正の」血管再生とも呼ばれてきた。
【００３９】
「持続放出」というのは、約０．０００５〜約１８０日、好ましくは約１〜３乃至約１５０日、より好ましくは約３０〜約１２０日の期間、そこから治療用作用物質を放出するように設計された剤形を意味する。さらに長い期間にわたる放出も、本発明の状況下では「持続放出」として考えられている。さらに、本発明は、局所的又は全身的に投与される持続放出剤形で実施することも考えられる。
【００４０】
「剤形」には、遊離した（ターゲティングされていない又は結合パートナに会合されていない）治療用作用物質を含む製剤、ならびに治療用作用物質を含む持続放出製剤が内含される。例えば持続放出製剤は、中に分散された治療用作用物質ならびに結晶質形態の治療用作用物質を含むマイクロ粒子又はナノ粒子、マイクロエマルジョン、生物分解性又は非生物分解性重合体材料又はそれらの任意の組合せを含みうる。本発明のターゲティングされた又は結合パートナと会合された剤形には、マイクロ粒子又はナノ粒子、マイクロエマルジョン及び／又は生物分解性又は非生物分解性の重合体材料を含む持続放出治療用製剤が含まれる。持続放出−剤形は、結合タンパク質又はペプチドに結合する標的細胞個体群に対し、その中に分散された治療用作用物質を送達する目的で、単数又は複数の結合タンパク質又はペプチドにリンクされる。
【００４１】
「サイトカラシン」は、血管平滑筋細胞の収縮又は遊走の予防を含む、標的細胞代謝に対する阻害効果を示す真菌代謝産物を含む。好ましくは、サイトカラシンは、重合体形態（Ｆ−アクチン）に対する単量体アクチン（Ｇ−アクチン）の重合を阻害し、かくして細胞質マイクロフィラメントを必要とする細胞機能を阻害する。サイトカラシンは標準的に、フェニルアラニン（サイトカラシン）、トリプトファン（ケトグロボシン）又はロイシン（アスポカラシン）から誘導され、結果として、置換されたペルヒドロイソインドール−１−１半分（構造式Ｉ又はII）の位置Ｃ−３において、それぞれベンジル、インドール−３−イルメチル又はイソブチル基をもたらす。
【化１】
2010029703.tif 000002
【００４２】
一方、ペルヒドロイソインドール半分自体は、Ｃ−８及びＣ−９の位置にリンクされた１１−，１３−又は１４−原子の環状炭素又は含酸素環を含んでいる。
天然に発生するサイトカラシンは全て、Ｃ−５にメチル基を、Ｃ−１２にメチル又はメチレン基を、そしてＣ−１４又はＣ−１６にメチル基を含む。サイトカラシンの例としては、サイトカラシンＡ，サイトカラシンＢ，サイトカラシンＣ，サイトカラシンＤ，サイトカラシンＥ，サイトカラシンＦ，サイトカラシンＧ，サイトカラシンＨ，サイトカラシンＪ，サイトカラシンＫ，サイトカラシンＬ，サイトカラシンＭ，サイトカラシンＮ，サイトカラシンＯ，サイトカラシンＰ，サイトカラシンＱ，サイトカラシンＲ，サイトカラシンＳ，キトグロボシンＡ，キトグロボシンＢ，キトグロボシンＣ，キトグロボシンＤ，キトグロボシンＥ，キトグロボシンＦ，キトグロボシンＧ，キトグロボシンＪ，キトグロボシンＫ，デオキサフォミン、プロキシフォミン、プロトフォミン、ジゴスポリンＤ，ジゴスポリンＥ，ジゴスポリンＦ，ジゴスポリンＧ，アスポカラシンＢ，アスポカラシンＣ，アスポカラシンＤならびにそれらの機能的等価物及び誘導体が含まれる。いくつかのサイトカラシン誘導体が、日本特許No．7,201,925；7,214,219；7,208,533；7,223,394；7,201,924；及び7,204,164中に記されている。本明細書では、標準的サイトとしてサイトＢが使用される。
本書で言及する「タキソール」には、タキソールならびにその機能的類似体、等価物又はその誘導体が含まれる。例えば、タキソールの誘導体及び類似体には、タキソテール、バッカチン、１０−デカセチルタキソール、７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール、セファロマンニン及び、本書に参考として内含されているKingston et al.(New Trends in Nat．Prod．Chem，26．219(1986))。
Bringli et al．(WO93/17121)，Golik et al．(EPA639577)，Kelly et al．(WO95/20582)，及びCassady and Dourous（eds.，「天然産物モデルに基づく抗ガン剤」中、Academic Press，NY（1980）の中で開示されているその類似体又は誘導体が含まれるが、これらに制限されるわけではない。タキソール及びその数多くの類似体及び誘導体を調製するための方法は、当該技術分野において周知のものである。
【００４３】
「大環状トリコテセン」は、いくつかの真菌種により産生され、例えば土壌真菌Myrothecium verrucaria及びMyrothecium roridium内の二次代謝の産物であるベルカリン及びロリディンといった１２，１３−エポキシトリコテ−９−セン塩基性構造によって特徴づけられる、構造的に関連性をもつセスキテルペノイド大環状マイコトキシンのグループの中のいずれか１つを意味するよう意図されたものである。
【００４４】
トリコテセンには大きく分けて２つのクラスが存在する：すなわち、中央セスキテルペノイド構造のみを有するもの及び付加的な大環状環（それぞれ単純及び大環状トリコテセン）を有するものである。単純トリコテセンは、（本書に参考として内含される）米国特許第4744981及び4906452号に記述されているように３つのグループ（すなわちグループＡ，Ｂ及びＣ）に細分することができる。グループＡの単純トリコテセンの代表例としては、スキルペン、ロリジンＣ，ジヒドロトリコテセン、スキルペン−４，８−ジオール、ベルカロール、スキルペントリオール、Ｔ−２テントラオール、ペンタヒドロキシスキルペン、４−デアセチルネオソラニオール、トリコデルミン、デアセチルカロネクトリン、カロネクトリン、ジアセチルベルカロール、４−モノアセトキシスキルペノール、４，１５−ジアセトキシスキルペノール、７−ヒドロキシジアセトキシスキルペノール、８−ヒドロキシジアセトキシン−スキルペノール（ネオソラニオール）、７，８−ジヒドロキシジアセトキシスキルペノール、７−ヒドロキシ−８−アセチルジアセトキシスキルペノール、８−アセチルネオソラニオール、ＮＴ−１、ＮＴ−２、ＨＴ−２、Ｔ−２及びアセチルＴ−２トキシン、が含まれる。
グループＢ単純トリコテセンの代表例には、トリコテコロン、トリコテシン、デオキシニヴァレノール、３−アセチルデオキシニヴァレノール、５−アセチルデオキシニヴァレノール、３，１５−ジアセチルデオキシニヴァレノール、ニヴァレノール、４−アセチルニヴァレノール（フサレノン−Ｘ）、４，１５−イダセチルニヴァレノール、４，７，１５−トリアセチルニヴァレノール及びテトラ−アセチルニヴァレノールが含まれる。グループＣ単純トリコテセンの代表例としては、クロトリコロール及びコロトシンが含まれる。大環状トリコテセンの代表としては、ヴェルカリンＡ、ヴェルカリンＢ、ヴェルカリンＪ（サトラトキシンＣ）、ロリジンＡ、ロリジンＤ、ロリジンＥ（サトラトキシンＤ）、ロリジンＨ、サトラトキシンＦ、サトラトキシンＧ、サトラトキシンＨ、ベルチスポリン、マイトキシンＡ、マイトキシンＣ、マイトキシンＢ）ミロトキシンＡ、ミロトキシンＢ、ミロトキシンＣ、ミロトキシンＤ、ロリトキシンＡ、ロリトキシンＢ、及びロリトキシンＤが含まれる。さらに、一般的「トリコテセン」セスキテルペノイド環構造は又、高等植物Baccharis megapotamicaから分離された「バッカリン」と呼ばれる化合物の中にも存在し、これらは、例えばJarvis et al．(アレロパシーの化学、ＡＣＳシンポジウムNo.２６８；ed．A.C．Thompson，1984，pp．149-159)及びJarvis & Mazzola（Acc．Chem．Res．15；338-395,1982）により開示されているように、文献中に記述されている。トリコテセンは同様に、Fungi imperfectiクラスの土壌真菌によっても産生される(Bamburg，J.R．Proc．Molec．Subeell Biol．8：41-110，1983)。
「スタウロスポリン」は、以下の構造式(III)をもつタンパク質キナーゼ（阻害物質であるスタウロスポリン：
【化２】
2010029703.tif 000003
ならびに以下の構造のうちの１つをもつジイドロアルカロイドを内含する：
【化３】
2010029703.tif 000004
【００４５】
より特定的に言うと、「スタウロスポリン」という語は、Ｋ−２５２（例えば、日本特許出願No．62164626を参照）、BMY-41950（米国特許No．5,015,578）、UCN-01（米国特許No．4,935,415）、TAN-999(日本特許出願No．01,149,791)、TAN-1030A(日本特許出願No．01,246,288)、RK-286C(日本特許出願No．02,258,724)及び機能的等化物及びその誘導体を内含する。スタウロスポリンの誘導体としては、日本出願Nos．03,72,485；01,143,877；02,09,819及び03,220,194、ならびにＰＣＴ国際出願Nos．WO8907,105及びWO9109,034及び欧州特許出願Nos．EP410,389及びEP296,110が含まれる。天然の産物であるＫ−２５２の誘導体は既知のものである。例えば日本特許出願Nos．63,295,988：62,240,689；61,268,687；62,155,284：62,155,285：62,120,388及び63,295,589ならびにＰＣＴ国際出願No．WO8807,045及び欧州特許出願No．EP323,171を参照のこと。
【００４６】
本書で言及されているように、平滑筋細胞及び周細胞は、PTCA中にひき起こされるもののような損傷の後に内膜増殖性部位内で増殖する外膜血管及び血管の内側層から誘導される細胞を内含する。平滑筋細胞の特性には、筋形質内の筋原繊維及び核小体が存在する状態で細胞内中央にある細長い核を伴う紡錘体形の組織学的形態（光学顕微鏡検査に基づく）が含まれる。電子顕微鏡検査によると、平滑筋細胞は、傍核筋形質内の長く細いミトコンドリア、粗面小胞体のいくつかの管状要素及び遊離リボソームの数多くのクラスタを有する。核の１つの極近くには、小さなゴルジ複合体も存在しうる。
【００４７】
筋形質の大部分は、そのほとんどが筋細胞の長軸に配向されている可能性のある薄く平行な筋フィラメントにより占有されている。これらのアクチン含有筋原繊維は、ミトコンドリアが中に散在させられた状態で束の形で配置されていてよい。細胞の収縮性物質を通して散乱させられているのは、原形質膜の内部面に沿って間隔をとって分布させられた類似の密な部域を伴う印形の密な部域でもありうる。
【００４８】
周細胞の特性としては、不規則な細胞形状によって特徴づけられる組織学的形態（光学顕微鏡検査に基づく）がある。周細胞は、血管内皮細胞をとり囲む基底膜内に見い出され、その同一性は、アルファ平滑筋アクチンに特異的な抗体（例えば抗−アルファ・sml，Bio-makor，Rehovot,イスラエル）、HMW-MAA及び周細胞ガングリオシド抗原例えばMAb3G5(Schlingemann et al.，Am I.Pathol，136．1393-1405(1990))を用いた正の免疫染色；及びサイトケラチンに対する抗体（例えば上皮及び繊維芽細胞マーカー）及びフォン・ウィルブランド因子（すなわち上皮マーカー）を用いた負の免疫染色によって確認することができる。血管平滑筋細胞も周細胞も共に、ＮＲ−ＡＮ−０１モノクローナル抗体での免疫染色法によると陽性である。
【００４９】
本書で使用する「処置上の血管外傷」には、哺乳動物の脈管構造内への外科的／機械的介入の効果が含まれるが、有機血管病理すなわち疾病及び感染に起因する血管外傷は含まれない。
かくして、当該治療方法の範囲内の処置上の血管外傷には、（１）例えば血管吻合が関与する心臓、腎臓、肝臓などといった器官移植術；（２）例えば、冠状動脈バイパス手術、生検、心臓弁交換、アテローム切除術、血栓切除術などの血管手術；（３）例えばレーザー血管形成手術といった血管形成術及び、バルーンカテーテル及び留置カテーテルを使用するPTCA処置を含む、経カテーテル血管療法（ＴＶＴ）；（４）伏在静脈冠状バイパス移植片、末梢動脈再構築のために用いられる静脈移植片及びダクロンなどといった天然又は合成材料を用いた血管移植；（５）例えば動静脈連絡のために用いられるＰＴＦＥ血液透析シャントといった機械的シャントの設置；及び（６）金属製、プラスチック製又は生物分解性重合体でありうる血管内ステントの設置が含まれる。本書に参考として内含されている、１９９５年２月１５日提出の米国特許出願第08/389,712号を参照のこと。移植可能な装置及びそれらを形成できる生体材料の一般的論述については、本書にその開示が参考として内含されているH.Kambic et al，「人工器官における体材料」Chem．Eng．News．30（1986年４月14日）を参照のこと。
【００５０】
発明の範囲内に入る治療用作用物質 発明の実施において有用な治療用作用物質としては、血管を生物学的にステントし、かつ／又は血管再生を緩和又は阻害し、又は処置上の血管外傷の後の血管平滑筋細胞増殖を阻害又は緩和する作用物質が含まれる。本発明の治療用作用物質は、血管平滑筋細胞の細胞活性、例えば増殖、遊走、細胞体積の増加、細胞外マトリックス合成の増加（例えばコラーゲン、プロテオグリカンなど）又は細胞による細胞外マトリックス材料の分泌を阻害するように選択される。
【００５１】
好ましくは、治療用作用物質はａ）ＤＮＡの複製を阻害し又は紡錘糸形成などを阻害することによって増殖細胞内の細胞分裂を予防又は遅延させるように作用する「細胞増殖抑制性作用物質」；ｂ）内側壁から内膜への血管平滑筋細胞遊走の阻害物質例えば「抗遊走性作用物質」例えばサイトカラシン；ｃ）細胞体積の細胞内増加の阻害物質（すなわち細胞により占有される組織体積；「細胞骨格阻害物質」）；ｄ）細胞タンパク質合成及び／又は細胞外マトリックスの組織を遮断する阻害物質（すなわち「抗マトリックス作用物質」）：又はそれらの任意の組合せである。
【００５２】
「細胞増殖抑制性作用物質の代表例としては、例えは、修飾されたトキシン、メトトレキセート、アドリアマイシン、放射性核種（例えばFritzberg et al.,米国特許No．4897，255号）、タンパク質キナーゼ阻害物質（例えばスタウロスポリン）、タキソール又はその類似体（例えばタキソテール）、特異的酵素の阻害物質（例えば核酵素ＤＮＡトポイソメラーゼII及びＤＮＡホリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、アデニルグアニルシクラーゼ）、スーパーオキサイドジスムターゼ阻害物質、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、逆トランスクリプターゼ、平滑筋細胞増殖を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれ、これらは適切な用量で細胞区画内に送達されたとき、細胞を殺すことなく平滑筋細胞又は周細胞の増殖を損なうように作用することになる。
【００５３】
「抗遊走性作用物質の代表例としては、走化性因子及びそのレセプタ（例えばＣ５ａ，Ｃ５ａ desarg又はＣ４ａといった補体ケモトキシン；細胞外マトリックス因子例えばコラーゲン分解フラグメント）又は移動運動に関与する細胞内細胞骨格タンパク質（例えば、アクチン、細胞骨格要素及び移動運動に関与するホスファターゼ及びキナーゼ）の阻害物質（例えばアゴニスト及びアンタゴニスト、及び競合的又は非競合的阻害物質）が含まれる。このカテゴリ内の有用な治療用作用物質の代表例としては、カフェー酸誘導体及びニルヴジピン（カルシウムアンタゴニスト）及びステロイドホルモンが含まれる。好ましい抗遊走性治療用作用物質はサイトカラシンである。
【００５４】
細胞増殖抑制性作用物質のサブセットである「細胞骨格阻害物質」の代表例としては、細胞内で微小管及びマイクロフィラメント網に対し作用するコルチシン、ヴィンブラスチン、サイトカラシン、タキソール又はその類似体又は誘導体が含まれる。好ましい細胞骨格阻害物質には、サイトカラシンＢ及びタキソールが含まれる。
【００５５】
「抗マトリックス作用物質」の代表例としては、マトリックス合成、分泌及び組立て、組織的架橋（例えばトランスグルタミナーゼ架橋コラーゲン）及びマトリックス再生（例えば創傷治ゆ後の）の阻害物質（すなわちアゴニスト及びアンタゴニスト及び競合的及び非競合的阻害物質）が含まれる。このカテゴリの抗マトリックス作用物質内の有用な治療用作用物質の代表例は、細胞外マトリックスの分泌の阻害物質であるコルチシンである。もう１つの例は、血液形成術後の平滑筋細胞増殖を組織しかつ／又は安定化させならびに減少させるその能力に関しての証拠が存在するタモキシフェンである。組織又は安定化は、病理学的に増残する形態への血管平滑筋細胞の成熟の遮断に由来する可能性がある。
【００５６】
発明の実施において有用な治療用作用物質の同定 本発明の実施において有用な治療用作用物質の同一性は、当該技術分野で周知の方法により決定可能である。例えば、本発明の範囲内に入る治療用作用物質は、以下の特性のうちの単数又は複数のものを示す。つまりこの作用物質は、（ｉ） 血管形成術（例えばPTCA、経皮的経管腔血管形成術(PTA)など）又はアテローム切除術（ロトブレータ、レーザなど）、冠状動脈バイパス処置などを含むその他の外傷の後の、拡張した管腔断面積、直径又は容積の保持を結果としてもたらす；（ii） 管腔の慢性的狭窄を結果としてもたらす又は強調することのない管腔断面積、直径又は容積の初期増大を容易にする：（iii） 標的細胞の収縮又は遊走を阻害する及び（iv） 細胞増殖抑制性をもつ。
【００５７】
管腔断面積、容積又は直径を測定する方法には、血管造影法、超音波評価、Ｘ線透視撮像法、光ファイバ内視鏡検査又は生検及び組織学がある。
好ましくは、ここで利用される治療用作用物質は、４つの特性全てを有することになる。しかしながら、本発明の実施のためには、第１及び第３の特性が第２及び第４の特性よりもさらに重要である。サイトカラシンＢの投与が生物学的ステント効果を結果としてもたらしうるということが発見された。生物学的ステント効果は、約０．１マイクログラム／ｍｌ〜約１０．０マイクログラム／ｍｌの範囲の用量濃度で血管壁の外傷を受けた領域内に治療用作用物質を一回輸注することによって達成できる（例１６）。
【００５８】
抗遊走性又は抗マトリックス治療用作用物質を含有する剤形又は治療用作用物質の場合、インビトロ検定における細胞遊走及び細胞粘着がそれぞれ、輸液カテーテルにより作り出される血管壁内の流体空間内で治療上有効な用量が達成されることになる濃度を決定するために使用されうる。
本発明の持続放出実施形態において有用な作用物質は、以下の特性のうちの単数又は複数のものを示す。作用物質は、（ｉ） 血管形成術（例えばPTCA、経皮的経管腔血管形成術(PTA)など）又はアテローム切除術（ロトブレータ、レーザなど）、冠状動脈バイパス処置などを含むその他の外傷の後の、拡張した管腔直径又は断面積の保持をひきおこす；（ii） 標的細胞増殖を阻害する（例えば、５分及び２４時間作用物質に露呈した後、インビトロ血管平滑筋組織培養は、3Ｈ−チミジン摂取の阻害レベルを実証し、好ましくは3Ｈ−ロイシン摂取の比較的低い阻害を表示する）；（iii） ＤＮＡ合成を阻害するのに充分な用量で、弱乃至は中の（例えば以下で記述する検定においてグレード２又は３）形態学的細胞毒性効果しか生み出さない；（iv） 標的細胞収縮を阻害する；及び（v） 細胞増殖抑制性をもつ。
【００５９】
前述の特性のうちの単数又は複数のものを示す治療用作用物質を同定した時点で、作用物質は、治療用作用物質に対する血管平滑筋細胞（VSMC）のより長時間の露呈が関与する第２のテストプロトコルに付される。例えば、本発明の持続放出実施形態において有用な作用物質は、同様に以下の特徴をも示す：すなわち、（ｉ） 長時間（例えば５日間）の露呈時点で作用物質は、５分及び２４時間の露呈について上述したものと同じ又は類似のインビトロ効果を血管平滑筋組織培養ＤＮＡ合成及びタンパク質合成に対して生み出す；及び（ii） ＤＮＡ合成阻害についての長期インビトロ検定で有効用量で、作用物質は、より長い時間にわたり（例えば１０日間）弱乃至は中の形態学的細胞毒性効果を示す。
潜在的に有用な抗増殖性作用物質のさらなる評価は、インビボでのバルーン外傷を受けたブタの大腿動脈モデルにおいて行なわれる。好ましくは、これらの作用物質は、組織収集及び組織学的評価に先立つ１時間の「BRDUフラッシュラベリング」により指示されるように、中膜血管平滑筋細胞内の細胞増殖の５０％以上の阻害を実証している（例１３）。作用物質がこの検定において、１回の露呈で５０％以上内膜平滑筋増殖を阻害するのに有効である場合、この作用物質は、持続放出剤形での投与を必要としない。
【００６０】
全身的毒性及び潜在的治療指数が、５０％の阻害しきい値を達成するために静脈内投与を許容するものであると思われる場合、又はその作用物質が有効な抗増殖性用量での持続放出を介した血管平滑筋細胞への局所的送達に従うことのできるものである場合、作用物質は持続放出について評価される。作用物質は、用量最適化及び効能研究のため、持続放出剤形において評価される。好ましくは、本発明の実施において有用な抗増殖性作用物質は、バルーン外傷を受けたブタの大腿動脈中で５０％だけ血管狭窄を減少させ、より好ましくは、ブタの冠状動脈内で類似の程度まで血管狭窄を減少させる。
【００６１】
細胞増殖（すなわちＤＮＡ合成）の阻害が、持続放出剤形で有用な作用物質の主たる特徴である。例えば、好ましい治療用作用物質は、それを細胞増殖抑制用量で投与できるように、3Ｈ−ロイシンと3Ｈ−チミジン摂取の間の格差を示す。
その上、細胞毒性研究は、治療用作用物質に対する長時間の露呈が標的細胞に不利な影響を及ぼさないということを示すはずである。さらに、BRDUパルス処理は、この治療用作用物質が、標的細胞増殖を阻害するのに有効であることを示すはずである。しかしながら細胞増殖を阻害するための作用物質の能力を評価するためのあらゆる便利な方法を代替的に利用することが可能である。
【００６２】
持続放出剤形
本発明の持続放出剤形は、中に分散させられた治療用作用物質をもつマイクロ粒子、ナノ粒子又はマイクロエマルジョンを含んでいてもよいし或いは又、純粋で好ましくは結晶質の固体形態での治療用作用物質を含むこともできる。持続放出投与のためには、純粋で好ましくは結晶質の治療用作用物質を含むマイクロ粒子剤形が好まれる。本発明のこの態様の治療用剤形は、持続放出に適したあらゆる形態のものであってよい。好ましい持続放出治療用剤形は、以下の特徴のうちの単数又は複数のものを示す：
− マイクロ粒子（例えば、直径約０．０１マイクロメートル〜約２００マイクロメートル、好ましくは約０．５〜約５０マイクロメートル、より好ましくは約２〜約１５マイクロメートル）又はナノ粒子（例えば直径約０．０１ナノメートル〜約１０００ナノメートル、好ましくは約５０〜約２００ナノメートル）、の自由流動粉末構造；
− 約０．５〜約１８０日、好ましくは約１〜３日乃至約１５０日の期間にわたり生物分解するように設計された生物分解構造、又は、約０．５〜約１８０日、より好ましくは約３０〜約１２０日の期間全体にわたり治療用作用物質拡散を発生させうる非生物分解構造；
− 生体適合性ある生物分解産物を生成すること含め、この剤形を投与すべき局所的生理環境及び標的組織と生体適合性をもつ；
− 活性治療用作用物質の放出が（１）（治療用作用物質が剤形の寸法を規定する成形された重合体又は重合体混合物中で可溶である場合の）剤形を通しての治療用作用物質の拡散、又は（２）剤形が生物分解するにつれての治療用作用物質の放出、という２つの経路のうちのいずれか１方又は両方の経路により発生する状態で、好ましくは治療用作用物質−重合体マトリックスを形成するべく、その中の治療用作用物質の安定したかつ再現性ある分散を容易にする；及び／又は − ターゲティングされた剤形については、好ましくは剤形結合に対する約１〜約１００００の結合タンパク質／ペプチド、そしてより好ましくは粒子表面積１５０平方オングストロームあたり剤形結合に対し最大約１個の結合ペプチドを有する。剤形結合に対する結合タンパク質／ペプチドの合計数は、使用される粒度によって左右される。結合タンパク質又はペプチドは、本書で記すとおり、共有結合リガンドサンドイッチ又は非共有結合様式を通して、治療用剤形の粒子にカップリングすることができる。
【００６３】
ナノ粒子持続放出治療的剤形は、好ましくは生物分解性をもち、任意には、血管平滑筋細胞に結合し、これらの細胞内にまず第１にエンドサイトーシスにより進入する。プレリソソーム小胞及びリソソーム内で経時的（例えば３０〜１２０日）に、ナノ粒子の生物分解が起こる。本発明の好ましいより大きなマイクロ粒子治療用剤形は、より小さなマイクロ粒子のいくつかだけが食作用によって細胞内に入っていく状態で、その後の標的細胞摂取のため、治療用作用物質を放出する。当業者であれば、標的細胞が本発明の剤形を同化し代謝する精確なメカニズムが、これらの細胞の形態学、生理学、及び代謝プロセスによって左右されるということがわかるだろう。粒子持続放出治療的剤形のサイズも同様に、細胞同化様式に関し重要である。例えば、小さい方のナノ粒子は、間質液と共に細胞間を流れ、輸注された組織の中に浸透することができる。大きい方のマイクロ粒子は、輸注された一次組織内で間質にさらに容易に捕捉される傾向をもち、かくして抗増殖性治療用作用物質を送達するのに有用である。
代替的には、本発明の持続放出剤形は、中に分散した治療用作用物質を有するエマルジョン又はマイクロエマルジョンを含むことができる。マイクロエマルジョンは一般に、表面活性分子の界面フィルムによって安定化された２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方性の透明な分散として定義づけされる。マイクロエマルジョンは、自然発生的に形成できる。マイクロエマルジョンの形成には通常、３〜５個の成分すなわち、油、水、界面活性剤、助界面活性剤及び電解質の組合せが関与する。一般に、非経口投与向けに設計された全ての薬学的エマルジョンは、水中油（ｏ／ｗ）型である。
【００６４】
非経口薬物マイクロエマルジョンは、水溶性の低い薬物の送達、加水分解可能な化合物の安定化、静脈内投与された薬物による刺激又はその毒性の減少、持続放出剤形の調製及びさまざまな器官への薬物の指向性送達のために有用でありうる。
【００６５】
油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）のいずれかのマイクロエマルジョンを形成する傾向は、油及び界面活性剤の特性により影響される。界面活性剤は、１〜２０までの親水性−親油性平衡（ＨＬＢ）として知られる経験的尺度に基づいて適切に分類される。界面活性剤のＨＬＢ値の概念及び界面活性剤のためのその決定については、Milton J．Rosenにより「界面活性剤及び界面現象」，J．Wiley & Sons，News York NY，1978，p242-245内で、又はKirk-Othmer、化学技術百科辞典、第３版、第８巻、1979年、p910-915により開示されている。
【００６６】
一般に、（ｗ／ｏ）マイクロエマルジョンは、約３〜６の範囲内のＨＬＢ値をもつ界面活性剤（又は乳化剤）用いて形成され、一方（ｏ／ｗ）マイクロエマルジョンは、約８〜１８の範囲内のＨＬＢ値をもつ界面活性剤を用いて形成される。低い界面張力がマイクロエマルジョンの熱力学安定性に寄与するということが長い間認知されてきた。これを達成するには、界面活性剤は好ましくは、油及び水の両方の相中で低い可溶性を示し、界面張力の付随した低下を伴って水一油界面で優先的に吸収される。界面張力が２×１０-2dyn/cmより小さい場合、安定したマイクロエマルジョンが形成され得る。マイクロエマルジョンの一般的再考は、Bhargava et al.,Pharm Tech，４６−５３，１９８７年３月及びKahlweit,Science，240．610-621，1988年によって提供されている。
【００６７】
マイクロエマルジョンは標準的には光学顕微鏡手段で見たとき実質的に不透明でない、すなわち、透明か又は乳光色である。混乱を受けていない状態で、これらは、偏光下で検査したとき、光学的に等方性（非複屈折）である。分散相は、標準的に、サイズが５〜２００ｎｍの間の粒子又は液滴を含み、これがその光学的透明性を生じさせる。これらの粒子は、球状でありうるが、その他の構造も実施可能である。
【００６８】
通常は、短鎖アルコールである助界面活性剤の役割は、界面活性剤フィルムに貫入しその結果界面活性剤分子の間の空隙空間に由来する乱れたフィルムを作り上げることによって界面流動性を増大させることにある。しかしながらマイクロエマルジョン中での助界面活性剤の使用は、任意であり、アルコールを含まない自己乳化性エマルジョン及びマイクロエマルジョンについて記述がなされてきた（例えば、Ponton et al.,Int．Journal of Pharmaceutics，27．335-348，1985及びOsborne et al.,J．Disp．Sci．Tech．9，415-423，1988を参照）。
【００６９】
従来のエマルジョン（又はマクロエマルジョン）に比べ、薬物輸送（送達）のためにマイクロエマルジョンを使用することには、数多くの利点がある。マイクロエマルジョンは、高いエネルギー入力の必要なく自然発生的に形成でき、従って調製及び商業的利用分野へのスケールアップが容易である。これらは、その小さな粒度のため熱力学安定性をもち、従って長い貯蔵寿命を有する。これらは、等方性で透明な外観をもち、従って顕微鏡手段により監視されうる。これらは比較的低い粘度をもち、従って輸送及び混合が容易である。これらは同様に、表面反応を加速する大きな界面面積をもつ。これらは、融通性ある高い浸透力を可能にする低い界面張力を有する。同様にこれらは、改善された薬物可溶化及び酵素加水分解に対する防御の可能性を提供する。さらに、マイクロエマルジョンは、過剰の分散相の添加時点で又は温度変化に応答して、相逆転を受ける可能性があり、これが、インビトロとインビボの両方でのマイクロエマルジョンからの薬物放出に影響を及ぼすことのできるこれらの系の１つの特性である。
【００７０】
「油」という語は、本書では、一般的な意味で、薬学的に受容可能なものであるかぎり、鉱物油、植物油、動物油、精油、合成油又は食用油のいかなる由来のものであれ広範な物質クラスを識別するものとして用いられている。例えば、約９〜８３，より好ましくは約２１〜６０そしてより好ましくは約２１〜４５個の炭素原子をもつグリセロールの三脂肪酸エステルが、マイクロエマルジョンを調製するのに有用な油である。好ましいトリグリセリドは、短鎖（９〜１５個の炭素原子）及び中鎖（２１〜４５個の炭素原子）のトリグリセリドである。かくして、グリセロールトリエステルは、天然の食用油例えばカノーラ油、コーン油、オリーブ油、ヒマワリ油及びココナッツ油、デカン酸エステル及び化学合成油例えばトリアセチン、１−オレイル−２，３−ジアセチルグリセロールなどを内含する。
【００７１】
マイクロエマルジョン内で有用なアルコールとしては、エタノール；プロピレングリコール（例えばCH2OH-CH2-CH2OH及び／又はCH3-CHOH-CH2OH）；グリセロール；Ｃ5Ｃ12単糖及び２糖類；例えば純粋形態又はその他の形態のデキストロース、スクロース、フルクトース、例えば糖みつ、粗糖、転化糖、精製シロップ、コーンシロップ；及びソルビトール、キシリトール及びマンニトールといった糖アルコールが含まれるがこれらに制限されるわけではない。アルコールは、個別でも又そのうちの２つ以上のものの混合物の形ででも使用できる。その上、これらのアルコールは、それらと共に使用される油の中でではなくむしろ水中で優先的に可溶である。
【００７２】
マイクロエマルジョンを調製するために有用でありうる界面活性剤には、例えば食料、飲料、糖剤、調合薬及び練り歯みがきにおいて使用することを意図された経口摂取可能な製品において有用である全てのイオン及び非イオン界面活性剤が含まれる。特定の油と共に使用するための界面活性剤の選択は、界面活性剤のＨＬＢ（親水性−親油性平衡）値により左右される。
【００７３】
さまざまなイオン（アニオン）界面活性剤には、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ジアセチル酒石酸のモノグリセリドエステル、ジアセチル酒石酸のジグリセリドエステル、クエン酸のモノグリセリドエステル及びその塩、クエン酸のジグリセリドエステル、乳酸のモノグリセリドエステル、乳酸のジグリセリドエステル、スルホこはく酸ジオクチルナトリウム、リン酸のモノグリセリドエステル、リン酸のジグリセリドエステル、レシチン、水酸化レシチンが含まれる。さまざまな非イオン界面活性剤としては、ポリソルペート、ミリスチン酸のソルビタンエステル、パルミチン酸のソルビタンエステル、ステアリン酸のソルピタンエステル、オレイン酸のソルビタンエステル，ミリスチン酸のポリグリセロースエステル、パルミチン酸のポリグリセロールエステル、ステアリン酸のポリグリセロールエステル、オレイン酸のポリグリセロールエステル、ミリスチン酸のモノグリセリドエステル、パルミチン酸のモノグリセリドエステル、ステアリン酸のモノグリセリドエステル、オレイン酸のモノグリセリドエステル、ミリスチン酸のジグリセリドエステル、パルミチン酸のジグリセリドエステル、ステアリン酸のジグリセリドエステル、オレイン酸のジグリセリドエステル、ミリスチン酸の（エトキシ）nモノグリセリド、パルミチン酸の（エトキシ）nモノグリセリド、ステアリン酸の（エトキシ）nモノグリセリド、オレイン酸の（エトキシ）nモノグリセリド（なおここでｎは１０〜３０の整数である）、ミリスチン酸の（エトキシ）nジグリセリド、パルミチン酸の（エトキシ）nジグリセリド、ステアリン酸の（エトキシ）nジグリセリド、オレイン酸の（エトキシ）nジグリセリド（なおここでｎは１０〜３０の整数である）、ミリスチン酸のスクロースエステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、オレイン酸エステル、ミリスチン酸のプロピレングリコールエステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、及びオレイン酸エステルが含まれる。
その上、当然のことながらそれが薬学的に受容可能なものであることを条件として、従来の塩又は表面活性誘導体のいずれでも使用することができる。当業者であれば、必要とあらば日常的テストを行なうことによって特定の塩又は誘導体を選択することができる。特に、アルカリ金属塩及びタウロコール酸誘導体がこのような化合物の標準的なものである。
【００７４】
非イオン界面活性剤は、好ましくは、単数又は複数のヒドロキシル基を含有する有機化合物のアルカリ性酸化物の縮合物を内含する。例えば、エトキシル化及び／又はプロポキシル化アルコール又はそのエステル又は混合物は、一般に利用可能であり、当業者にとって周知のものである。適切な界面活性剤には、TYLOXAPOL；POLOXAMER4070；POLOXAMER188；POLYOXYL40ステアリン酸塩；POLYSORBATE80及びPOLYSORBATE20ならびにTWEEN(ICI America．Inc.，Wilmington，Del.，U.S.A)．及びPLURONICF-68（ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンの共重合体に対するドイツ、LudwigshafenのBASF社の商品名）という商品名で販売されているさまざまな化合物が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００７５】
本発明において有利な界面活性剤のいくつかの特定的例としては、胆汁酸塩、コール酸ナトリウム、８０重量％のエチレングリコール１０００モノセチルエーテル及び２０重量％のエチレングリコール４００の混合物及びポリオキシエチレンエーテルが含まれる。本発明における界面活性剤の量は、容器材料及びカプセル材料の合計量の５〜１０重量％である。界面活性剤の量が０．５重量％未満である場合、エマルジョンを形成することはできない。
【００７６】
マイクロエマルジョンを含む薬学組成物は、好ましくは防腐剤すなわち例えば非経口投与のために医学的に受容されているメチル、エチル、プロピル及びブチルパラベンをも含んでいる。しかしながら、組成物をその安定性を基本的に減少させることなくオートクレーブ処理により滅菌できるのであれば、防腐剤は必要でないかもしれない。望まれる場合、本発明の薬学組成物は、マンニトール又はグリセリンといったような浸透圧調節物質を含んでいてもよく、非経口投与のためにはグリセリンが、又経口投与のためにはマンニトールが好まれる。本発明の組成物は、同様に、例えばα−トコフェロールといった抗酸化剤を含んでいてもよい。
【００７７】
マイクロエマルジョンの調製は、当該技術分野において周知のものである。例えば、その開示が本書に参考として内含されている、Wolf et al.(米国特許No．4,835,002)；Lee et al．(米国特許No．5,362,424)；Benita et al.(米国特許No．5,364,632)；Owen et al.(WO94/08604)：Constantinides（WO94/08605）；Constantinides et al．(WO94/19000)；Constantinides et al．(WO94/190001)；及びConstantinides et al．(WO94/19003)を参照のこと。
【００７８】
本発明で使用するための好ましいマイクロエマルジョンは、その開示が本書に参考として内含されている米国特許No．5,478,860、米国特許No．4,389,330及び米国特許No．5,407,609を参照のこと。
【００７９】
本発明の好ましい持続放出剤形には、生物分解性マイクロ粒子又はナノ粒子が含まれている。より好ましくは、生物分解性マイクロ粒子又はナノ粒子は、治療用作用物質を放出しかくして粒状構造内に孔を形成するランダムな非酵素的加水分解分裂により生物分解するマトリックスを含有する重合体で形成されている。
アルファ水酸化カルボン酸及び関連するラクトンの縮合から誘導された重合体が、本発明における使用のためには好ましい。特に好ましい半分は、熱可塑性ポリエステル（例えばポリアクチド又はポリグリコリド）の混合物又はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）といったラクチド及びグリコリド成分の共重合体で形成されている。１つの構造例であるランダムポリ(ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）が以下で示されているが、ここで、ｘ及びｙの値は望ましいマイクロ粒子又はナノ粒子特性を達成するべく、当業者の医師が操作できるものである。
【化４】
2010029703.tif 000005
【００８０】
本発明の粒状剤形を形成するのに適したその他の作用物としては、ポリオルトエステル及びポリアセタール（Polymer Letters，18；293（1980）及びポリオルトカーボネート（米国特許No．4093709）などが含まれる。
本発明のマトリックス粒子を含有する好ましい乳酸重合体が、修正済み溶媒抽出プロセスを構成するエマルジョンベースのプロセスによって調製される。例えば、Cowsar et al.，「ステロイドの制御された放出のためのポリ（ラクチド−コ−グリコリド）マイクロカプセル」、Methods Enzymology，112：101-116，1985（マイクロ粒子中のステロイドエントラップメント）；Eldridge et al.，「毒素中和抗体レベルを増強するブドウ球菌腸毒素Ｂトキソイドのためのアジュバントとしての生物分解性及び生体適合性をもつポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）マイクロスフェア」Infection and Immunity（感染と免疫）．59：2978-2986，1991（トキソイドエントラップメント）：Cohen et al．「ポリ（乳酸／グリコール酸）マイクロスフェアに基づくタンパク質のための制御された送達系」、Pharmaceutical Research（薬学研究）．8（6）:713-720，1991（酵素エントラップメント）；及びSanders et al.，「ポリ（Ｄ．Ｌ−ラクチド−Co−グリコリド）マイクロスフェアからの黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体の制御された放出」J．Pharmaceutical Science．73（9）;1294-1297，1984（ペプチドエントラップメント）により記述されているプロセスを参照のこと。
一般に、本発明の粒子剤形を形成するための手順には、ハロゲン化された炭化水素溶媒内で重合体を溶解させる段階、その中で（好ましくは水性の）治療用作用物質溶液を分散させる段階、及び重合体のためではなくハロゲン化炭化水素のための溶媒として作用する付加的作用物質を添加する段階が関与する。重合体は、重合体−ハロゲン炭化水素溶液から、溶液を含有する治療用作用物質の液滴上に沈殿し、治療用作用物質をエントラップする。好ましくは、治療用作用物質は、本発明の持続放出剤形内で実質的に均等に分散されている。粒子形成の後、これらは、有機溶媒で洗浄され硬化される。真空下で室温での乾燥に先立ち、水洗い及び水性非イオン界面活性剤洗浄段階が続いて行なわれる。
【００８１】
生体適合性を目的として、粒子のマトリックスの中に分散された治療用作用物質によって特徴づけされる粒状剤形は、包装、貯蔵又は投与に先立ち滅菌される。滅菌は、そのためのあらゆる適切な要領で行なうことができる。例えば、その放射線露呈が治療用作用物質−重合体マトリックスの中に分散した治療用作用物質又はそれに付着した結合タンパク質／ペプチドの構造又は機能に不利な影響を与えないことを条件として、粒子にガンマ放射線を照射することができる。治療用作用物質又は結合タンパク質／ペプチドがそのように不利な影響を受けた場合、粒子剤形を滅菌条件下で産生させることができる。
【００８２】
本発明の粒子剤形からの治療用作用物質の放出は、拡散及び粒子マトリックスの侵食の結果として起こりうる。生物分解速度は、治療用作用物質放出の反応速度に直接影響を及ぼす。生物分解速度は、持続放出剤形の組成又は構造の変更により調節可能である。例えば、本発明の好ましい剤形内のラクチド／グリコリド比の変更は、Tice et al.，「生物分解性制御放出非経口系」Pharmaceutical Technology，p26-35，1984で記述されているように；Kent et al.，「水溶性活性ペプチドのマイクロ被包」米国特許No．4675189により記述されている通りにクエン酸及び炭酸ナトリウムといった重合体加水分解の速度を変更する作用物質の包含によって；コア装荷を変更するべく異なる効力を示す治療用作用物質の一般的グループの適切な類似体を賢明に選択することによって、中に含有された治療用作用物質の量に分解速度が反比例することからラクチド／グリコリド重合体の治療用作用物質の負荷を変えることによって；及びBeck et al.，「ポリ（ＤＬ−ラクチド−Ｃｏ−グリコリド）／ノレチステロンマイクロカプセル：注射式生物分解性避妊薬」Biol．Reprod．28：186-195，1983によって、行なうことができる。生物分解速度を調節する前述の方法は全て、重合体含有マトリックスの固有の粘度に影響を与え、かくしてその水和速度を変更する。
【００８３】
好ましいラクチド／グリコシド構造は、哺乳動物生理学環境と生体適合性をもつ。同様にこれらの好ましい持続放出剤形は、その生物分解が共に哺乳動物の正常な代謝産物である乳酸とグリコール酸を形成するという利点をもつ。
【００８４】
粒子剤形に対するタンパク質／ペプチドの結合のために必要とされる官能基は、任意には粒子マトリックス内又はその上に内含され、非分解性又は生物分解性の重合体単位に付着される。この目的で有用である官能基としては、ペプチド例えば、カルボキシル基、アミン基、スルフヒドリル基などと反応性をもつものが含まれる。好ましい結合増強半分は、好ましい（ラクチド−グリコリド）重合体含有マトリックスなどの末端カルボキシル基を内含する。
【００８５】
本発明の持続放出剤形において有用な治療用作用物質は、好ましくは細胞を殺すことなく血管平滑筋細胞活性を阻害するものである（すなわち細胞増殖抑制性治療用作用物質）。細胞増殖抑制性作用物質は、治療上の有益性を達成するのに充分な時間、標的細胞の単数又は複数の病理活性を阻害することのできる半分として定義つけることもできる。かくして好ましい治療用作用物質は、タンパク質合成阻害に先立つＤＮＡ合成の阻害又は内膜内への血管平滑筋細胞の遊走の阻害という能力のうちの１つ又は複数のものを示す。これらの治療用作用物質は、タンパク質合成を著しく阻害せず（すなわち標的細胞を殺さない）、従って細胞修復及びマトリックス産生を容易にし、このことが今度は、平滑筋細胞を削減することによって、血管形成術によりひき起こされる血管壁病巣を安定化するように作用する。
【００８６】
好ましい治療用作用物質は、スタウロスポリンといったタンパク質キナーゼ阻害物質（スタウロスポリンは、Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouriから入手可能である）、及びサイトカラシンといった細胞骨格阻害物質，例えばサイトカラシンＢ(SigmaChemical Co.,)及びタキソール、又はそれらの類似体又は機能的等価物である。これらの化合物は、細胞増殖抑制性をもち、有意なＤＮＡ合成阻害が発生する濃度で最小のタンパク質合成阻害及び細胞毒性を及ぼすことが示されてきた（例８及び図１０Ａ〜１０Ｄ参照）。本発明の持続放出剤形実施形態で有用な治療用作用物質を同定するための有用なプロトコルが、例えば例８に記されている。
【００８７】
本発明の１実施形態を調製するためには、生物分解性ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）マイクロ粒子又はナノ粒子の中に、例えばサイトカラシンＢといった細胞骨格阻害物質が取り込まれる。マイクロ粒子の直径は約１〜約５０μ，好ましくは４μ〜約１５μ，より好ましくは約２〜１５μである。ナノ粒子の直径は約５〜約５００ナノメートル、好ましくは約１０〜約２５０ナノメートル，より好ましくは約５０〜約２００ナノメートルである。治療用作用物質を含むマイクロ粒子又はナノ粒子はさらに、移植可能な装置内又はその上、例えばステントコーティング内に包埋されてもよいし、或いは又移植可能な装置により、例えば輸注カテーテルを介して適切な液体ビヒクル内に送達されうる。好ましくは、持続放出剤形は生物分解性を有し、好ましくは約３０〜１２０日間にわたり生物分解する。持続放出剤形は好ましくは、処置上の血管外傷中に投与される。
本発明の好ましい持続放出剤形は、組織適合性がありかつ針輸注カテーテル又は微量輸注カテーテルといった移植可能な装置と物理的に適合性のある、好ましくは直径が約２〜約１５μの生物分解性マイクロ粒子を含む。本発明のもう１つの好ましい持続放出剤形は、組織適合性がありかつ針輸注カテーテル又は微量輸注カテーテルといった移植可能な装置と物理的に適合性のある、好ましくは直径が約５０〜約２００ナノメートルの生物分解性ナノ粒子を含む。カテーテルにより持続放出剤形を送達するため、カテーテルの孔又は穴のサイズは、直径が好ましくは約０．１〜約８ミクロン、より好ましくは約０．２〜約０．８ミクロンである。
【００８８】
治療対象の血管の中膜及び／又は内膜内で達成される細胞骨格阻害物質の細胞濃度は、ＶＳＭＳの増殖及び遊走を阻害するのに有効なものであり、例えば少なくとも約０．１μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢの細胞濃度が達成される。平滑筋細胞の阻害は、例えばステントの介入的設置といった処置上の血管外傷の後のより急速で完全な再内皮化を結果としてもたらす。再内皮化の速度の増大は、管腔断面積又は直径の損失を緩和し、血液流の減少を緩和する。
【００８９】
本発明のもう１つの好ましい持続放出剤形は、好ましくは細胞骨格阻害物質の治療用作用物質の純粋な固体結晶形態を含む。本発明の持続放出剤形のこの実施形態は、好ましくはさらに、結晶のための支持構造を提供する組織適合性のある薬学的に受容可能なマトリックス担体、例えばシリコーン成形体、コラーゲンメッシュ内に保持されたコラーゲンゲル、コラーゲンメッシュ内に保持されたプルロニックゲル又はシリコーン成形体の中に保持されたマンニトールを含む。かくして例えば、サイトカラシンＢ及び薬学的マトリックス担体を含む持続放出剤形は、好ましくは合計マトリックス担体−ＴＡ持続放出剤形の重量パーセントであたり約５〜約７０％、より好ましくは約７〜約４０％，さらに好ましくは約５〜約３０重量％のサイトカラシンＢを含む。タキソール及び薬学的マトリックス担体を含む持続放出剤形は、好ましくは合計マトリックス担体−ＴＡ持続放出剤形の重量パーセントあたり約１〜約７０％，より好ましくは約２〜約５０％，さらに好ましくは約３〜約８重量％のタキソールを含む。
【００９０】
本発明の実施において有用なターゲティングされた剤形の同定と調製
本発明に有用な血管平滑筋細胞結合タンパク質は、血管平滑筋細胞の表面上の標的に結合する。有用な血管平滑筋結合タンパク質は、無傷の又は分断された血管平滑筋細胞の表面成分上の標的又はマーカーに結合することのできるポリペプチド、ペプチド又は模倣化合物（以下で記述するようなもの）である。このような結合は、直接的な間質マトリックス内での細胞外治療用作用物質放出とそれに続く残りの無傷平滑筋細胞内への作用物質の拡散、及び／又は完全なターゲティングされた生物分解性半分の細胞内区画内への細胞による内在化のいずれかを可能にし、かくしてそれに対する治療用作用物質の送達が可能となる。血管平滑筋細胞の細胞膜と会合させられる例えばポリペプチド又は炭水化物、プロテオグリカンなどの特異的標的が、適切に特異的な血管平滑筋結合タンパク質を（例えばクローニングによって）選択するか又は（例えば遺伝子工学又は化学合成により）構築するために有用であることが認識できるだろう。特に有用な「標的」は、平滑筋細胞により、例えば膜成分抗原の回転置換が更新において発生するにつれて、内在化される。細胞による内在化は同様に、ファゴリソソーム、クラスリン−コーティングされた膜孔、レセプタ媒介再分配又はエンドサイトーシスなどが関与するメカニズムによっても起こりうる。
【００９１】
有用な血管平滑筋結合タンパク質の代表例としては、抗体（例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体）、Ｆ(ab'）2，Fab’，Fab及びFvフラグメント及び／又はこれらの抗体又はその機能的等価物（例えば結合ペプチドなど）の相補性決定領域(CDR)；成長因子、サイトカイン及びポリペプチドホルモンなど；及び細胞外マトリックスレセプタ（例えばインテグリン及びフィブロネクチンレセプタなど）が含まれる。
【００９２】
好ましい実施形態においては、例えば「標的」が、血管平滑筋細胞及び周細胞によって合成されたコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）により例示され、約２５０ｋＤの見かけの分子量をもつCSPG分子の離散的部分（ここではエピトープと呼ぶ）が特に標的として好まれる。２５０ｋＤの標的は、より大きな４００ｋＤのプロテオグリカン複合体の一成分であるＮ−リンクされた糖タンパク質である（Bumol et al.，PNAS USA 79：1245-1249(1982)）。本発明の現在好まれている１つの実施形態においては、血管平滑筋CSPG標的分子内のエピトープに結合するNR-AN-01モノクローナル抗体（NR-ML-05の下位培養）によって、血管平滑筋結合タンパク質が提供される。NR-ML-05と呼ばれるモノクローナル抗体は、黒色腫細胞により合成される２５０ｋＤのCSPGを結合すると言われている(Morgan et al.,米国特許No．4897,255)。
【００９３】
平滑筋細胞及び周細胞は同様に、２５０ｋＤのCSPGならびにその他のCSPG（Schlingeman et al.，上述）を合成すると言われている。平滑筋細胞に結合するＮＲ−ＭＣ−０５が開示された(Fritzberg et al.，米国特許No．4879,225)。４００ｋＤのCSPGに結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマNR-ML-05は、American Type Culture Collection，Rockville,ＭＤに寄託され、受入れ番号９３５０を受けている。NR-ML-05は、本書に開示されているサブクローンNR-AN-01の親であり、構造的にかつ機能的にこれと等価である。
【００９４】
NR-AN-01が、４００ｋＤのCSPG標的と特異的に会合する血管平滑筋結合タンパク質の一例にすぎないこと、そして本発明の治療用接合体及び方法においては、この標的及びこの標的上のその他のエピトープと会合するその他の結合タンパク質（Bumol et al.，PNAS USA．79：1245-1249(1982)）も同様に有用であることが認識されることだろう。例えばPTCAといった血管外科処置の後の狭窄を治療するために、本発明の実施において使用するための好ましい結合タンパク質例えば抗体又はフラグメントは、血管平滑筋２５０ｋＤのCSPGに対する１０4リットル／モルより大きな結合親和性、及び平滑筋細胞又は周細胞に結合されかつそれにより内在化させられる能力を有する。
【００９５】
さらに、CSPGマーカー抗原エピトープ（すなわち、相補性決定領域を構成するアミノ酸）とNR-AN-01モノクローナル抗体の多点連動性会合に関与するアミノ酸残基は、コンピュータ援用分子モデリングによって及び変化した抗体結合親和性をもつ突然変異体を使用することによって決定できる、ということが認識されることだろう。結合部位アミノ酸及びNR-AN-01抗原結合部位の３次元モデルは、血管平滑筋細胞及び周細胞によって合成されたCSPGに対する結合親和性をもつ例えば短ポリペプチド（「最小ポリペプチド」）といった機能的等価物を構築するための分子モデルとして役立つことができる。
【００９６】
３次元モデルは同様に、例えばCSPG標的抗原内のそのエピトープに対するNR-AN-01結合の３次元面を模倣する「模倣」化学化合物といった、その抗原エピトープに対するNR-AN-01の結合を模倣するその他の機能的等価物を構築するためにも有用である。本書で使用されている「最小ポリペプチド」というのは、長さが少なくとも６アミノ酸であるアミノ酸配列のことを意味する。ここで使用されている通り、「模倣」という語は、例えば、血管平滑筋細胞又は周細胞により合成されたNR-AN-01のCSPG標的のアミノ酸に結合するための適切な間隔どりを達成するために構築された有機化学オリゴマ又は重合体を意味する。
【００９７】
血管平滑筋結合タンパク質に結合するヒトモノクローナル抗体又は「ヒト化された」マウス抗体が、本発明の治療用接合体において有用であるということも想像できる。例えば、マウスのモノクローナル抗体は、例えば欧州特許出願第411,893号内で開示されているものと類似の要領で、ヒト定常ドメイン領域をコードするヌクレオチド配列で、マウスＦv領域（すなわち抗原結合部位を含有する領域）をコードするヌクレオチド配列を遺伝子組換えすることによって、「キメラ化」することができる。いくつかのマウス残基は、適切な標的部位結合特性を確保するためヒト可変領域枠組み構造ドメイン内に保持することもできる。ヒト化された血管平滑筋結合パートナは、宿主受容体内の抗体又はポリペプチドの免疫活性を減少させるという利点をもつことが認識され、インビボでの半減期を増大させ、接合体に対する不利な免疫反応の可能性を減少させるために有用である可能性がある。
【００９８】
再狭窄治療に適合された持続放出剤形のための有用な結合ペプチドとして同様に考慮されているのは、血管平滑筋細胞の間及び中に位置設定された細胞内支質及びマトリックスに局在化する結合ペプチドである。このような結合ペプチドは、標的細胞間の間質空間に治療用作用物質を送達することができる。治療用作用物質は、その後血管平滑筋細胞により摂取されるよう、間質空間内に放出される。このタイプの好ましい結合ペプチドは、コラーゲン、細胞多糖タンパク質例えばテナスシン、網状質及び弾性繊維、サイトケラチン及びその他の細胞間マトリックス成分上のエピトープと会合させられる。細胞内支質及びマトリックスに局在化する最小ペプチド、模倣有機化学化合物、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体なとも同様に、本発明のこの実施形態における結合ペプチドとして有用である。これらの結合ペプチドは、既知の技術に従って同定及び構築又は分離され得る。本発明の好ましい実施形態においては、間質マトリックス結合タンパク質は、少なくとも約１０-4Ｍの会合定数で標的エピトープに結合する。
【００９９】
血管平滑筋結合タンパク質に対する共有結合又は非共有結合を通して治療用作用物質をリンクするための代表的「カップリング」方法には、治療用作用物質内の反応基（例えばヒドロキシ、アミノ、アミド又はスルフヒドリル基）と血管平滑筋結合タンパク質内のその他の反応基（類似の性質の）の間の結合を形成するように反応する化学的架橋剤及び異種２機能型架橋化合物（すなわち「リンカー」）が含まれる。この結合は、例えば、ペプチド結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、アミド結合、チオエーテル結合などであってよい。
【０１００】
１つの例においては、薬物とモノクローナル抗体の接合体が、Morgan及びFoonによって(ガンに対するモノクローナル抗体療法：臨床前モデル及び調査。Basic and Clinical Tumor Immunology（基本及び臨床腫瘍免疫学）第２巻、Kluwer Academic Publishers，Hingham，MA)及びUhr，(J．of Immunol．133：i-vii，1984)によって要約されている。接合体が放射線核種細胞骨格治療用作用物質を含有するもう１つの例においては、本書に参考として内含されている米国特許No．4897,225，Fritzberg et al.,が、当該接合体を作るのに使用しうるカップリング方法を例示している。
【０１０１】
カップリング方法の選択は、血管平滑筋結合タンパク質又はペプチド、間質マトリックス結合タンパク質又はペプチド及び治療用作用物質の選択によってと同様、例えば貯蔵寿命安定性といった物理的特性及び／又は生物学的特性例えば細胞及び血液中の半減期、細胞間区画経路などによっても影響されることになる。
本発明の持続放出剤形の物理的及び化学的性質は、結合タンパク質又はペプチドに対する剤形の付着のいくつかの代替的様式を可能にする。本発明の剤形（持続放出タイプ）は、例えば共有結合リンカー、中間リガンドサンドイッチ付着、又は非共有結合吸着又は部分的エントラップメントを通して結合タンパク質／ペプチドに結合することができる。好ましいポリ乳酸／グリコール酸粒子が、中に治療用作用物質が分散した状態で形成される場合、負荷されていない重合体バックボーンは、（中に準親油性治療用作用物質が含有されている状態で）内向きにと同時に外向きにも、大部分の末端カルボキシ基に沿って配向されている。これらの表面カルボキシ基は（例えば、カルボジイミドなどによって活性化された時点で）、結合タンパク質／ペプチドの親核基のための共有結合付着部位として役立ちうる。このような親核基としては、リシンイプシロン−アミノ基（アミノリンケージ）、セリンヒドロキシ基（エステルリンケージ）又はシステインメルカプタン基（チオエステルリンケージ）が含まれる。特定の基との反応は、反応条件のｐＨ及び還元状態によって左右される。
【０１０２】
例えば、末端カルボン酸基をもつポリ乳酸／グリコール酸粒子を、構造式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’（なお式中、Ｒは３−ジメチルアミノプロピル基などでありＲ’はエチル基などである）の水溶性カルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールと反応させることができる。ベンズトリアゾールで誘導体化された粒子（すなわち活性化されたイミデートを支持する半分）は次に、利用可能なイプシロン−アミノ半分といったタンパク質／ペプチド親核性半分と反応させられる。代替的には、カルボジイミドの存在下でポリ乳酸／グリコール酸粒子の末端カルボキシ基と活性エステルを形成するには、ｐ−ニトロフェノール、テトラフルオロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドなどの分子が有用である。その他の結合タンパク質／ペプチド親核性半分には、セリンのヒドロキシ基、システィンの内因性遊離チオール、その目的で一般に用いられる還元剤（例えばシステイン、ジチオトレイトール、メルカプトエタノールなど）を用いた結合タンパク質／ペプチドジスルフィド架橋の還元の結果得られるチオール基などが含まれる。さらに、塩化アシルで誘導体化された半分を形成するため塩化チオニルとの反応により、ポリ−乳酸／グリコール酸粒子の末端シルボキシ基を活性化することが可能である。誘導体化された粒子は次に、本発明のターゲティングされた剤形を形成するべく、結合ペプチド／タンパク質親核基と反応させられる。
【０１０３】
結合タンパク質又はペプチドに対する持続放出剤形の直接的接合は、標的細胞の結合タンパク質／ペプチド認識を分断することができる。結合タンパク質／ペプチドに対する持続放出剤形付着を達成するためには、リガンドサンドイッチ付着技術が有用な代替案である。これらの技術は、標的細胞の個体群に結合しないタンパク質を用いた一次ペプチド又はタンパク質外皮の形成が関与する。結合タンパク質／ペプチドは次に一次ペプチド又はタンパク質外皮に結合され、機能的結合タンパク質／ペプチドを伴う粒子を結果として提供する。リガンドサンドイッチアプローチの例には、「直接」結合アプローチとの関係における上述のとおりの官能基を通しての粒子に対するアビジン又はストレプトアビジンの共有結合付着が関与する。結合タンパク質又はペプチドは、好ましくは最低限、機能化されたビオチンを介して（例えば、活性エステル、ヒドラジド、ヨードアセタル、マレイミジルなどの官能基を通して）誘導体化される。アビジン／ストレプトアビジン一次タンパク質外皮の利用可能な結合部位に対するリガンド（すなわち結合ペプチド又はタンパク質／機能化ビオチン）の付着は、飽和量のビオチニル化タンパク質／ペプチドを使用することによって発生する。
【０１０４】
例えば、末端カルボキシル酸基をもつポリ乳酸／グリコール酸粒子はカルボジイミドによって活性化されその後アビジン又はストレプトアビジンと反応させられる。結合タンパク質又はペプチドは、ビオチニル化結合タンパク質／ペプチドを形成するための結合タンパク質／ペプチドに対するビオチン含有化合物の１−３モル提供で、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルと反応させられる。ビオチニル化された結合タンパク質／ペプチドのモル余剰分が、アジジンで誘導体化された粒子を用いてインキュベートされ、本発明のターゲティングされた剤形を形成する。
【０１０５】
代替的には、粒子カルボキシ基は（例えばカルボキシ基のカルボジイミド活性化とその後のアミノアルキルビオチンアミドとの反応を通して）ビオチニル化される。ビオチニル化された粒子は、次にアビジン又はストレプトアビジンの飽和濃度（すなわちモル余剰分）を用いてインキュベートされ、遊離ビオチン結合部位をもつタンパク質コーティングされた粒子を形成する。これらのコーティングされた粒子はこのとき、上述の通りに形成されたビオチニル化結合タンパク質のモル余剰分と反応することができる。もう１つのオプションには、ビオチニル化された粒子に対する、ＡＯＳＡと結合した結合ペプチド又はタンパク質付着が関与する。
【０１０６】
さらに、結合タンパク質／ペプチド粒子付着は、粒子の部分的に露呈された重合体バックボーンの非イオン特性に由来する、粒子に対する結合ペプチドの吸着によっても達成できる。高いイオン強度条件（例えば、１．０モルNaCl）下では、水素及び疎水性粒子−結合タンパク質／ペプチドの結合が有利になる。
【０１０７】
その上、結合タンパク質／ペプチドは、その形成時点で粒子重合体マトリックスの中に部分的にエントラップされうる。これらの状況下で、かかるエントラップされた結合タンパク質／ペプチドは、粒子に対し残留選択的結合特性を提供する。例えば、Cohen et al．，Pharmaceutical Research 8：713-720(1991)によって利用されるもののような弱粒子形成条件が、マトリックス内にタンパク質又はペプチドをエントラップするために好まれる。エントラップされた結合タンパク質は同様に、エキソサイトーシスを受けた部分的に分解した粒子の標的細胞再付着においても有用である。結合タンパク質／ペプチドは、上述の原理に従って異なる露呈官能基をもつその他の重合体粒子剤形（例えば非生物分解性剤形）に結合されうる。
【０１０８】
本発明の実施において役立つ非生物分解性重合体は、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレンアクリル酸及びアクリレート共重合体などである。このような非生物分解性重合体は、カルボン酸基、脂肪族第１アミノ基、芳香族アミノ基及びヒドロキシル基を含む結合タンパク質／ペプチドの付着のための官能基を取込んでいるか、又は取込むべく誘導体化されうる。
【０１０９】
カルボン酸官能基は、例えばポリ乳酸／グリコール酸生物分解性重合体粒子剤形について上述した反応メカニズムを使用して、結合タンパク質又はペプチドにカップリングされる。第１アミノ官能基は、例えばそれとコハク酸無水物との反応によりカップリングされて、上述のとおり結合タンパク質／ペプチドに結合しうる末端カルボキシ半分を形成する。さらに、第１アミノ基を臭化シアンで活性化させ、結合タンパク質／ペプチド第１アミノ基とのグアニジンリンケージを形成させることができる。芳香族アミノ官能基は、例えば、亜硫酸でジアゾ化され、結合タンパク質／ペプチドチロシンと反応して非生物分解性粒子と結合タンパク質／ペプチドの間にジアゾ結合を産生するジアゾニウム半分を形成することができる。ヒドロキシル官能基は、例えば、末端カルボン酸官能基を含む半分にヒドロキシル半分を変換することによって、結合タンパク質／ペプチド第１アミノ基にカップリングさせられる。この変換は、クロロ酢酸との反応とそれに続くカルボジイミドとの反応を通して達成できる。生物分解性粒子との関係において上述したサンドイッチ、吸着及びエントラップメント技術は、非生物分解性粒子−結合タンパク質／ペプチドの付加にも類似の形で応用可能である。
【０１１０】
治療用作用物質の用量、製剤及び投与経路
投与される治療用作用物質の量は、重症度の異なる血管外傷を治療するべく調整される。例えば、移植片又は移植体の後の血管拒絶を予防するためといったような、比較的小さい血管外傷を治療するには比較的少ない用量で充分であるが、例えば血管形成術の後の再狭窄の治療といったように、比較的広範な血管外傷を治療するには、比較的多い用量でなければ充分でない。かくして、外傷を受けた血管を生物学的にステントするためには、ビヒクル１ｍｌあたり約０．０１〜約１０μｇ，好ましくは約０．１〜約１０μｇ、より好ましくは約０．１〜約８．０μｇのサイトカラシンＢの割合で、約１〜約２４ｍｌ好ましくは約１〜約４ｍｌの全身的合計用量で、サイトカラシンＢといったような細胞骨格阻害物質が投与されるが、その他の用量でも有益であることが実証される可能性もある。特に、非水性溶媒がビヒクルとして利用される場合、さらに低い濃度のサイトカラシンが治療的効果を及ぼしうる。全身用量のサイトカラシンＢの投与は、約５〜約４０，好ましくは約８〜約３０ラムダのサイトカラシンＢの含有溶液が中膜の細胞をとり囲む間質空間に入り、約０．０１〜約４，好ましくは約０．０５〜約３ｍｌの溶液が、外膜への溶液輸送により血管の壁に露呈されるという結果をもたらす。その上、これらの用量は同様に抗増殖効果をも示し得る。
【０１１１】
本発明に従った治療用作用物質の投与は、その目的が治療又は予防のいずれにあるにせよ、例えば受容体の生理的状態及び当業者にとっては既知のその他の要因に応じて、連続的でも間欠的でもありうる。本発明の作用物質の投与は、基本的に、予め選択された期間にわたり連続的であってよく、そうでなければ例えば、処置上の血管外傷の前、間又は後のいずれか、その前と間、前と後、間と後、又は前、間及び後といった一連の間隔どりされた用量で行なわれてもよい。その上、治療用作用物質の投与は、外傷を受けた血管をさらに損傷しないように選択される。
【０１１２】
持続放出向けに製剤できる本発明の治療用作用物質を含む単数又は複数の単位剤形は、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋内、肺内及び鼻腔内経路を含む非経口又は経口を含めたさまざまな経路で投与できる。本発明の治療用作用物質が経口投与向けに調製される場合、これらは、好ましくは単位剤形内の薬学的製剤を形成するべく、好ましくは薬学的に受容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組合わせられる。これらの製剤内の全有効成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％を構成することができる。「薬学的に受容可能な」というのは、その担体、希釈剤、賦形剤及び／又は塩が、その製剤のその他の成分と適合性をもち、その受容体にとって有害でないものでなくてはならないことを意味している。
【０１１３】
本発明の治療用作用物質を含有する薬学製剤は、周知の又は容易に入手可能な成分を用いて、当該技術分野において既知の手順によって調製され得る。例えば、サイトカラシンは、一般的な賦形剤、希釈剤又は担体を用いて製剤でき、錠剤、カプセル、懸濁液、粉末などに成形できる。このような製剤に適した賦形剤、希釈剤及び担体の例としては、例えばでんぷん、糖、マンニトール及びシリカ誘導体といった充てん材及び増量剤；例えばカルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣ及びその他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニル−ピロリドンといった結合剤；
グリセロールといった加湿剤；例えば炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウムといった壊変剤；例えばパラフィンといった溶解を遅延させるための作用物質；第４アンモニウム化合物といった再吸収促進剤；セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールといった表面活性剤；カオリン及びベントナイトといった吸着担体；及び例えばタルク、ステアリン酸カルシウム及びマグネシウム及び固体ポリエチルグリコールといった潤滑剤が含まれる。本書にその開示が参考として内含されているFondy et al（WO88/10259）を参照のこと。
【０１１４】
例えは、本発明の治療用作用物質を含有する錠剤又はキャプレットは、例えば炭酸カルシウム、酸化マグネシウム及び炭酸マグネシウムといった緩衝剤を内含することができる。キャプレット及び錠剤は、同様に、セルロース、予備のり化でんぷん、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、でんぷん、タルク、二酸化チタン、安息香酸、くえん酸、コーンスターチ、鉱油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウム及びステアリン酸亜鉛などといった不活性成分を内含することもできる。
本発明の治療用作用物質を含有する硬質又は軟質ゼラチンカプセルは、例えばゼラチン、微結晶性セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、でんぷん、タルク及び二酸化チタンなどの不活性成分、ならびにポリエチレングリコール(PEG)及び植物油といった液体賦形剤を含有することができる。
【０１１５】
本発明の治療用作用物質は同様に、適切な経口投与のためエリキシル又は溶液として又は、筋内、皮下又は静脈内経路による非経口投与に適した溶液として、製剤することもできる。本発明の或る種の実施形態の実施においては、治療用作用物質は、液相にある薬学的に受容可能な担体の中に分散させられ、例えばカテーテルといった移植可能な装置を介して送達される。これらの目的のための有用な薬学的に受容可能な担体としては、リン酸緩衝液、水、エマルジョン（例えば水中油及び油中水形エマルジョン）及びさまざまなタイプの湿潤剤が含まれている。
【０１１６】
本発明の治療用作用物質の薬学的製剤は、水性又は無水溶液又は分散の形、又代替的にはエマルジョン又は懸濁液の形をとることができる。本書にその開示が参考として内含されている。Fondy et al.（WO90/13293）を参照のこと。
これらの製剤は、先行技術において周知である薬学的に受容可能なビヒクル及びアジュバントを含有できる。例えば、水に加えて溶媒例えばアセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、グリコールエーテル、例えば「Dowanol」という名前で販売されている製品、ポリグリコール及びポリエチングリコール、短鎖酸のＣ1−Ｃ4アルキルエステル、好ましくは乳酸エチル又はイソプロピル、例えば「Migloyl」という名前で市販されている製品のような脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物、鉱物、及び植物性油及びポリシロキサンの中から選ばれる、生理学的見地からみて受容できる単数又は複数の有機溶媒を用いて、溶液を調製することが可能である。
【０１１７】
本発明に従った組成物は、セルロース及び／又はセルロース誘導体といった増粘剤を含有することもできる。これらは同様に、ゴム例えばキサンタンゴム、グアールゴム、炭素ゴム又はアラビアゴム又は代替的にはポリエチレングリコール、bentone、モンモリロナイトなどを含有することもできる。
【０１１８】
必要とあらば、酸化防止剤、界面活性剤、その他の防腐剤、薄膜形成剤、角質分解剤又はコメド分解剤、着香剤及び着色剤の中から選ばれたアジュバントを添加することが可能である。同様にして、記述された条件又はその他の何らかの条件のいずれのためであれ、その他の有効成分を添加することもできる。
【０１１９】
例えば、酸化防止剤の中では、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化水酸化アンソール、ブチル化水酸化トルエン及びα−トコフェロール及びその誘導体を挙げることができる。局所適用向けに主として包装されたガレン剤は、クリーム、乳液、ジェル、分散又はマイクロエマルジョン，多少の差こそあれ増粘されたローション、含浸パッド、軟こう又はスティックの形をとるか又は代替的に、スプレー又はフォーム形態のエアゾル製剤の形又、代替的に固形石鹸の形をとる。
【０１２０】
さらに、治療用作用物質は、持続放出剤形などとしての製剤にもうまく適合している。製剤は、腸管の特定の部分の中のみ又は好ましくはその中で例えば一定の時間有効成分を放出するような形で構成されうる。コーティング、外被及び保護マトリックスは、例えば重合体物質又はワックスから作ることができる。
【０１２１】
本発明の治療用作用物質の局所的送達は、外傷を受けた血管部位又はその近くで作用物質を投与するさまざまな技術によるものでありうる。部位特異的又はターゲティングされた局所的送達技術の例は、制限的な意味をもつものではなく、利用可能な技術を例示するにすぎないものである。例としては、輸注カテーテル、留置カテーテル又はニードルカテーテルといった局所送達カテーテル、stet、合成移植片、外膜ラップ、シャント及びステント又はその他の移植可能な装置、部位特異的担体、直接注射又は直接塗布が含まれる。
【０１２２】
インプラントの局所的送達は、治療用作用物質を含むマトリックスを病巣又は外傷を受けた部域内に入れることを意味する。インプラントを受けたマトリックスは、拡散、化学的反応、又は溶媒活性化剤により、治療用作用物質を放出する。例えばLange，Science 249．1527(1990)を参照のこと。
【０１２３】
インプラントによるターゲティングされた局所的送達の例としては、ステントの使用がある。ステントは、冠状動脈又はその他の血管の虚脱及び再閉塞を機械的に防ぐように設計される。ステント内への治療用作用物質の取込みは、病巣への治療用作用物質の直接的送達を可能にする。この技術による作用物質の局所的送達については、Koh,Pharmaceutical Technology（1990年10月）に記述されている。
【０１２４】
例えば、治療用作用物質を含む金属、プラスチック、又は生物分解性血管内ステントが利用される。ステントは好ましくは、治療用作用物質を含む生物分解性コーティング、多孔質又は浸透性の非生物分解性コーティング又は生物分解性又は非生物分解性膜又は合成移植片鞘膜様コーティング例えばPTFEを含む。本発明のより好ましい実施形態は、コーティングが治療用作用物質の持続放出剤形を含んでいる、コーティングされたステントである。一変形実施形態においては、生物分解性ステントは、その中つまりステントマトリックス内に含浸された治療用作用物質を有することもできる。
【０１２５】
中に含浸された治療用作用物質を伴う生物分解性ステントにはさらに、中に分散された形で治療用作用物質の持続放出剤形を有する多孔質非生物分解性コーティング又は生物分解性コーティングを施すこともできる。このステントは治療用作用物質の異なる放出速度を提供することができる。すなわち、まず最初にコーティングからの治療用作用物質の最初のより急速な放出速度が存在しそれに続いて、ステントマトリックスの分解時点でステントマトリックス内に含浸された治療用作用物質の遅延放出がある。血管内ステントは同様に、血管の管腔面積の増加を提供する機械的手段をも提供する。その上、平滑筋細胞増殖の阻害物である治療用作用物質を含む血管内ステントの設置は、内膜増殖を減少又は防止することもできる。平滑筋及び周細胞により産生された内膜平滑筋細胞のその阻害は、血管ステントの介入的設置に続くより急速で完全な再内皮化を導きうる。ステント設置に続く血管壁の再内皮化及び安定化の速度上昇は、血管ステント故障の主たる原因の１つである血管平滑筋細胞増殖に起因する血流減少及び管腔面積の損失を緩和することができる。
【０１２６】
インプラントによるターゲティングされた局所送達のもう１つの例は、外膜ラップの使用である。このラップは、中に治療用作用物質が入った遊離した又はコラーゲンメッシュにより封じ込められたプルロニックゲルといった薬学的に受容可能な担体マトリックスを含む。本発明の１実施形態は、４℃で可溶であるものの３７℃，例えば人体内で流体又は組織と接触した時点で固化するプルロニックゲル（F-127,BASF）である。ラップを含むプルロニックゲルを調製するには、１ｇのプルロニックゲルに、４ｍｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．０（Circ.Res.,第76巻、1995年４月）を加え、これを一晩４℃で混合した。局所的塗布に先立ち混合物に治療用作用物質を添加した。混合物は、外科的に露呈された動脈壁に対し直接塗布することもできるし、或いは又、動脈のまわにりまきつけられて縁部が縫合されることになるウシコラーゲンマット(BioCore，Inc.，Tapeka，KS)の表面上に塗布してもよい。
【０１２７】
本発明のもう１つの実施形態は、金属又は生物分解性又は非生物分解性重合体を含む、管腔間血管ステントの内部又は外部表面をとり囲むか又はその上に設置されうる。PTFE（Impra．Inc.，Tempe．AZ）血管移植片様膜の拡張した結節空間内への治療用作用物質の取込みである。治療用作用物質又はその持続放出剤形は、PTFE膜壁の結節空間を充てんしかつ／又は膜の内部及ひ／又は外部表面をコーティングする。
【０１２８】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、ウシコラーゲンゲル（Bio Core，Inc.，Topeka，KS）中の治療用作用物質の結晶質形態の混合物である。結晶のサイズは約０．１ミクロンから約１ｍｍまで変動した。一般に結晶は、よりサイズの小さい結晶を生成するべく粉砕された。この混合物を、動脈表面に直接塗布し、周囲の皮下組織を血管のまわりで縫合し、皮ふを閉じる。ウシコラーゲン(Bio Core，Inc.，Topeka KS)を、無菌食塩水（１：１）中に溶解させ、結晶質の治療用作用物質を添加する。代替的には、ウシコラーゲンメッシュにコラーゲンゲルを塗布し、次にこのメッシュを血管のまわりに巻きつけ、メッシュを所定の位置に保持するべく縁部を縫合する。ウシコラーゲンメッシュ（Bio Core，Inc.）は、例えば１cm×1cmといったサイズに切断し、メッシュの表面に治療用作用物質−コラーゲンゲルの混合物を塗布する。
【０１２９】
本発明のもう１つの実施形態は、厚み約０．１〜約３，好ましくは約０．５〜約０．７mmのシリコーン膜、例えばシリコーン重合体Ｑ−7 4840（Dow Corning，Midland，MI）内への結晶質治療用作用物質のエントラップメントを含んで成る。重合体はスパチュラを用いて混合される（部分Ａ及びＢ，１：１）。例えばマンニトールといった不活性充てん剤を粉にし、５３〜７５のメッシュサイズの分画になるまでふるい分ける。マンニトール及び治療用作用物質を予め定められた割合で混合し、次に重合体と共にすりつぶし複合体を形成する。この複合体を薄板金型内に充てんし5000psiまで圧縮する。次に複合体を２時間８０℃で硬化させる。その後、複合体膜を一定のサイズ例えば１cm×１cmにカットし、動脈のまわりに巻きつけ、膜縁部を縫合させることによって所定の場所に保持する。
治療用作用物質はラップの外側にもコーティングすることができる。ラップ及び／又はコーティングは好ましくは生物分解性である。治療用作用物質が持続放出剤形であることが好ましい。
【０１３０】
もう１つの例は、治療用作用物質を含有する重合体が液体形状で病巣の部域内に注射されるような送達システムである。その後、重合体は固化し硬化して、インサイチュで保持されるインプラントを形成する。この技術はPCT WO90/03768(Donn，Apr．19．1990)内で記述されている。
【０１３１】
もう１つの例は、重合体管腔内密封による治療用作用物質の送達である。この技術は、管腔の内部表面に重合体インプラントを塗布するためカテーテルを使用する。治療用作用物質は、生物分解性重合体インプラント内に取込まれ、かくして外科手術部位で放出される。この技術は、本書にその開示が参考として内含されているPCT WO90/01969（Schindler，1989年８月23日）の中で記述されている。
【０１３２】
局所的送達のさらにもう１つの例は、病巣及びそれに隣接する動脈壁の中に小胞又はマイクロ粒子を直接注入することによるものである。これらのマイクロ粒子は、タンパク質、脂質、炭水化物又は合成重合体といった物質で構成されていてよい。これらのマイクロ粒子は、その内部全体に取込まれた又はコーティングとしてその上に取込まれた治療用作用物質を有する。マイクロ粒子を取込んだ送達システムについては、Lange,Science,２４９．1527（1990）及びMathiowitz et al.，J．App．Poly．Sci．26．809（1981）内で記述されている。
【０１３３】
局所投与のためには、治療用作用物質は、標的部域に対する直接的塗布のため当該技術分野において既知のとおりに製剤することができる。この目的のための従来の形態としては、創傷包帯剤、コーティングされた包帯又はその他の重合体カバリング、軟こう、ローション、ペースト、ゼリー、スプレー及びエアゾルが含まれる。局所薬製剤中に存在する本発明の治療用作用物質の重量パーセントはさまざまな要因により左右されるが、一般には、製剤合計重量の０．００５％〜９５％，標準的には１〜２５重量％となる。
【０１３４】
発明の方法による治療に導きうる条件
本発明の治療用作用物質及び剤形は、処置上の血管外傷に付随する血管管腔容積、面積及び／又は直径の減少を治療又は阻害するのに有用である。本書で使用される「血管」という語には、哺乳動物の血管例えば冠状動脈ならびに末梢、大腿及び頸動脈が含まれる。本発明の治療用作用物質及び剤形（自由放出及び持続放出の両方）が、血管形成術後の療法としての使用に制限されるものでないということが認められることだろう：むしろ、治療用作用物質及び剤形の有用性は、血管壁内の平滑筋細胞及び周細胞の細胞活性を阻害するその能力によって規制されることになる。かくして、血管外傷は、血管形成術、ステント、シャント、stet，合成又は天然移植片、外膜ラップ、留置カテーテル又はその他のＩＭＯの設置といったような介入的処置に付随する外傷を含むものの、これらに制限されるわけではない。移植片は、合成の治療用作用物質処置された移植片、例えば含浸又はコーティングの施された移植片を内含する。
【０１３５】
本発明の治療用作用物質及び剤形は又、損傷を受けた血管組織内及び上皮創傷を含むその他の創傷部位内の内皮細胞の再成長を高めるための治療様式においても有用である。これらの治療様式においては、本発明の治療用作用物質，接合体及び剤形は、平滑筋細胞又は周細胞の遊走及び／又は増殖を阻害する上で有用である。平滑筋細胞及び周細胞は、内皮細胞増殖を阻害するインビトロ因子の産生に関与してきており、その増殖は同様に連続する内皮を確立する上で物理的障害を結果としてもたらしうる。かくして、本発明の治療用作用物質，接合体及び剤形は、例えば創傷ゆ合、血管移植及びそれに続く血管外科手術中の、新血管形成及び再内皮化の増加を促進する上で有用である。これらの剤形は同様に、損傷を受けた血管壁の再内皮化を刺激するか又は促進する治療様式を放出することができる。
【０１３６】
本発明の１実施形態には、血管平滑筋細胞の収縮能力を阻害することのできる治療用作用物質の投与が関与する。本発明のこの態様の実施において有用な作用物質の例としては、正常な血管静水圧（すなわち血圧）が弛緩性血管をその生理的最大直径又はその近くまで拡張させるような形で、外傷を受けた動脈に血管緊張を失なわせることのできる作用物質である。血管緊張の喪失は、収縮性タンパク質（例えばアクチン、ミオシン、トロポミオシン、カルデスモン、カルポニンなど）の形成又は機能と干渉する作用物質により引き起こすことができる。この干渉は、例えば血管平滑筋細胞の収縮に関与するカルシウム変調、リン酸化又はその他の代謝経路の阻害を通して直接的に又は間接的に起こることができる。
【０１３７】
細胞収縮の阻害（すなわち血管緊張の喪失）は、血管狭窄の度合を低下させるべく２つのメカニズムを通して作用しうる。まず第１に、長期間にわたる細胞収縮は、その肥厚が血管管腔狭窄という結果をもたらす内膜内へと中膜から遊走する平滑筋細胞の数を制限する。第２に、細胞収縮の阻害により、平滑筋壁は正常な血管静水圧（すなわち血圧）下で弛緩し膨張することになる。例えばサイトカラシンといった治療用作用物質は、外傷を受けた血管形成後の又はその他の外科手術又は疾病で損傷を受けた平滑筋細胞が自ら修復するのに必要なタンパク質合成を完全に破壊することなく平滑筋細胞の収縮を阻害する。血管病巣が安定するにつれて管腔をその最大収縮直径に近い状態に固定又は保持する（すなわち生物学的に誘発されたステン効果）マトリックスを平滑筋細胞が分泌するのにも、タンパク質合成が必要である。
【０１３８】
この生物学的ステント効果は、血管管腔の断面積又は直径の拡張及び血管内の血液流量の増加という結果をもたらすのみならず、血管形成術後の弾性的跳ね返りを著しく減少させる。弾性的跳ね返りは、血管形成術中のバルーンカテーテルによる過度の伸長の結果としてもたらされる外傷性ショックに起因する、筋肉壁の早期弛緩又は血管けいれんに付随する血管の急性閉鎖である。管腔断面積の減，少を導く中膜のこのけいれんは、血管筋肉壁の緊張の回復が起こるにつれて、バルーン膨張から数時間、数日または数週間以内に発生しうる。
【０１３９】
アテローム切除標本の顕微鏡検査中の最近の観察事実は弾性跳ね返りが、初期処置後血管造影図に基づき、成功として分類された血管形成処置の最高２５％において発生しうるということを示唆している。生物学的ステント処置は、バルーン血管形成術の後動脈壁を弛緩させることから、臨床医は、血管けいれん又は弾性跳ね返りを削減又は遅延させる１つの方法として過剰鼓張及びその結果として外傷性ショックを削除することができる。過剰鼓張の減少又は削除は、血管の筋肉壁に対する外傷を減少させ、かくして内膜内の平滑筋細胞増殖の決定因子を削減し、従って再狭窄の発生率又は重症度を緩和する。
【０１４０】
生物学的ステントは、同様に血栓形成の発生率を低下させる。例えばサイトカラシンＢで治療されたブタの大腿動脈においては、壁在微小血栓の発生率は、治療用作用物質で処理されなかったバルーン外傷を受けた動脈に比べて減少した。この現象は、外傷を受けた血管を通しての血液流の増大の結果得られる二次的な恩恵であり、この恩恵は、本発明の実践を通して得られる。サイトカラシンＢの持続放出剤形で治療された動脈においては、サイトカラシンＢは同様に、血栓形成に必要とされる血小板の組織及び収縮をも防止することができる。
サイトカラシンは、血管平滑筋細胞に対する生物学的ステント効果を生成することのできる治療用作用物質の一例である。サイトカラシンは、アクチンと相互作用することにより血管平滑筋細胞の遊走及び収縮の両方を阻害するものと考えられている。サイトカラシンは、アクチンフィラメントの伸長を阻害するべく繊維状アクチンの端部と相互作用する。低用量のサイトカラシン（例えばサイトカラシンＢ）は、同様に、アクチンのマイクロフィラメント網を分断する。インビトロデータは、血管平滑筋細胞がサイトカラシンを一掃した後、細胞は約２４時間以内に遊走を再開するのに充分な重合済みアクチンを再生するということを示している。管腔の直径固定及び生物学的ステント効果が発生するのは、この回復期間中である。
【０１４１】
治療用作用物質をターゲティングすることもできるが、好ましくは、血管形成術又はその他の外傷性事象の前、間又は後に、外傷を受けた血管に直接これを投与する。例えば、サイトカラシンＢの生物学的ステント効果は、ビヒクル１ｍｌあたり約０．１〜約１０．０マイクログラムの治療用作用物質の用量濃度範囲で、血管壁の外傷を受けた領域内に約１〜約２４ｍｌ，好ましくは約５〜約１５ｍｌのビヒクルと治療用作用物質を一回輸注することによって達成できる。
【０１４２】
（中膜から内膜への）血管平滑筋細胞の遊走の阻害が、同じ用量範囲内で実証された（例１１）；しかしながら、これらの抗遊走性効果を最大にするためには、治療用作用物質に対する血管の持続的露呈が好ましい。血管平滑筋細胞が内膜内に遊走できない場合、これらはそこで増殖できない。血管平滑筋細胞が万一内膜へと遊走したならば、その後投与された抗増殖性持続放出剤形は、内膜増殖することができる。その結果、サイトカラシン又はその他の抗増殖性作用物質を取込んだ本発明の持続放出剤形は、好ましくは細胞骨格阻害物質である遊離治療用作用物質と組合わせた形で投与することができる。このようにして、生物学的ステント効果ならびに抗増殖性又は抗遊走性効果を、単一の用量プロトコルにおいて達成することができる。
【０１４３】
発明の方法 本発明は、例えば血管の狭窄又は再狭窄といった血管管腔の容積、面積又は直径の減少をこうむっている又はその危険性がある哺乳動物を治療する方法を提供する。この方法は、血管を生物学的にステントし、血管の再生を阻害又は緩和させ、血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は緩和するか又はこれらの効果の何らかの組合せを得るのに有効な量で少なくとも１つの治療用作用物質を投与することを含んで成る。
【０１４４】
処置上の血管外傷に付随する血管管腔減少の防止のためには、治療用作用物質を、処置の前、間及び／又は後、又はこれを任意の組合せた形で投与することができる。例えば再狭窄の予防のためには、任意には持続放出剤形での治療用作用物質の一連の間隔どりされた用量が、好ましくは、外傷性処置（例えば血管形成術）の前、間及び／又は後に投与される。この用量は、例えば処置の間対象血管内に導入されるカテーテルといった移植可能な装置を介して局所的に送達することができる。好ましくは、外傷性処置の間、移植可能な装置を介して持続放出剤形が投与される。外傷性処置が行なわれた後、再狭窄の危険性を実質的に緩和するか又はこれを防止するのに充分な時間、好ましくは持続放出剤形で経時的に、一連の追従用量を投与することができる。この目的で好ましい治療用プロトコルの持続時間には、血管形成後約３〜約２６週間の投与が関与している。
【０１４５】
当業者であれば、治療用作用物質及び剤形の治療／予防有効用量が、例えば、ａ）該当する場合、剤形での血管平滑筋結合タンパク質の結合親和性；ｂ）大気圧及び輸注中に加えられる圧力の持続時間；ｃ）治療用作用物質又は投与された剤形が血管部位に滞留する時間；ｄ）利用される治療用作用物質の性質；ｅ）血管外傷と望まれる療法の性質；ｆ）持続放出剤形については、剤形からの治療用作用物質の放出速度及び／又はｇ）持続放出剤形については、剤形の細胞間及び／又は細胞内局在化を含む複数の要因により左右されることになるということを認識するだろう。（例えば薬物レベルを監視し患者体内の臨床効果を観察することにより）治療上有効な用量で薬物を送達するよう訓練された熟練した医者は、経験又は専門的判断に基づいて個々の患者についての最適な用量を決定することになる。当業者であれば、外傷を受けた血管壁の内膜内への自由な又は持続放出形の剤形での治療用作用物質の浸潤が変動するものであり、個々のベースで決定される必要があることを認識することだろう。
【０１４６】
治療用作用物質の治療上有効な用量は、カテーテルのバルーン間における流体空間内の治療用作用物質の濃度が約１０-3〜１０-12Ｍの範囲内にあるときに標準的に達成されることになる。ここで提供されている例から、本発明の治療用作用物質及び剤形は、管腔をライニングしている中膜細胞の内部１０％，好ましくは内部２０％，より好ましくは内部９９％を露呈するのに充分な抗増殖性治療用量で送達する必要しかない可能性があるということがわかるだろう。この用量は、例えばａ）（以下の例で示されているように）適当な動物モデル系から血管に輸注を行ない作用物質及びその効果を検出するべく免疫組織学的方法、螢光方法又は電子顕微鏡方法を用いること及びｂ）適切なインビトロ研究を行なうこと（例えば以下の例３，４及び５を参照）によって経験的に決定することができる。
例えば、カテーテル送達に関しては、当業者であれば、治療的／予防的有効量の治療用作用物質及び剤形か、ａ）輸液中に適用された大気圧；ｂ）投与された作用物質が血管部位に滞留する時間；ｃ）利用された治療又は予防用作用物質の形態及び／又はｄ）血管外傷及び望まれる療法の性質を含む要因によって左右されることになるということを認識することだろう。本発明の実施において有用でありうるカテーテルとしては、本書に参考としてその開示が内含されている、Just et al.(米国特許No．5,232,444)，Abusio et al.(米国特許No．5,213,576)．Shapland et al.(米国特許No．5,282,785)．Racchini et al.(米国特許No．5,458,568)，Wolinsky（米国特許No．4,824,436）．Spears（米国特許No．4,512,762）及びShaffer et al.(米国特許No．5,049,132)内で開示されているようなカテーテルが含まれる。
【０１４７】
治療上有効な用量は、一般に、平滑筋細胞組織培養中の細胞周囲の作用物質用量すなわち、連続的露呈の結果毒性用量と最小有効用量の間の治療効果をもたらすような用量である。この治療的レベルは、インビボで、サイズ、数及び治療用作用物質濃度及び動脈壁の平滑筋細胞の間に輸注された粒子がこの細胞周囲の治療的用量を維持するのに必要とされる放出速度を決定することによって得られる。剤形は、次のような治療用作用物質例の細胞周囲作用物質を近似する速度で治療用作用物質を放出すべきである：すなわち約０．０１〜約１００マイクログラム／ｍｌのニトログリセリン、約１．０〜約１０００マイクログラム／ｍｌのスラミン、約０．００１〜約１００マイクログラム／ｍｌのサイトカラシン及び約０．０１〜約１０5ナノグラム／ｍｌのスタウロポリンならびに約０．００１〜約１００マイクログラム／ｍｌのタキソール。かくして、サイトカラシンＢについては、全身的容量の結果として、約５〜約４０，好ましくは約８〜約３０ランダムの溶液が中膜の細胞をとり囲む間質空間に入り、約０．０１〜約４，好ましくは約０．０５〜約３ｍｌの溶液が外膜を経由して血管壁に送達されることになる。
【０１４８】
例えばサイトカラシンＢなどの細胞治療用量のバルーン膨張外傷後の血管平滑筋細胞への投与は、生物ステント効果を生成するべく治療用作用物質で中膜の全量を置換することによって達成されうる。つまり全ての細胞は、血管を生物学的にステントするのに有効な治療用作用物質の濃度に露呈される。例えば、ブタの大腿動脈を利用した用量応答研究は、ビヒクル１ｍｌあたり約０．１μ〜１０．０μｇの範囲内のサイトカラシンＢで輸注カテーテルを用いて中膜全体を輸注した場合に、バイオステント効果が結果としてもたらされたということを示していた。すなわち、膨張するバルーンにより生成された動脈管腔サイズとの関係において、動脈管腔サイズ（直径又は断面積）のさらに広範な保持が見られた。治療的効果は、０．１μｇ／ｍｌサイトカラシンＢというしきい値レベルを有し、この用量以下ではいかなる効果もなく、最高約１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢまでは治療的効果は全くなかった。かくして、サイトカラシンＢは、約０．１〜約１０μｇ／ｍｌの範囲の広い治療指数を有し、１０μｇ／ｍｌでは毒性の徴候は全くなかった。１０μｇ／ｍｌというのが、食塩水中のサイトカラシンＢの最大飽和濃度である。サイトカラシンＢの投与によって生成される治療的効果は、バルーン外傷後３〜８週間にわたりさらに明らかなものとなった。
【０１４９】
バイオステント効果を生成するための細胞治療用量すなわち、中膜の各細胞が治療的濃度範囲例えば約０．１μｇ／ｍｌ〜約８．０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢに露呈される用量を達成するためには、カテーテル例えばMIC2又はMIC3カテーテルが一定体積の溶解状態の治療用作用物質で満たされ、血管を損傷しないハブ圧力で送達される。例えば、合計９０秒の輸注時間、４〜５大気圧のハブ圧で、８．０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ溶液９〜２４ｍｌ（MIC2）又は５〜１０ｍｌ（MIC3）が送達される。これらの条件下での中膜へのNR-ML-05モノクローナル抗体の送達は、ブタの大腿動脈及び冠状動脈モデルの両方で達成された。ハブ圧及び露出時間を一定に保った状態では、流量ははめ合せ締め度によって決定されることから、輸注される溶液量は変動しうる。流量が推奨された範囲より低い場合、はめ合せは均一の静水頭を樹立するには締まりすぎており、従って血管壁のまわりに均等な用量が存在しなくなる。流量が推奨された範囲より多い場合、はめ合せは、中膜の間質領域内に溶液を強制するのに必要とされる水頭圧を樹立するにはゆるすぎ、個々の細胞への用量は、必要とされる治療的レベルより低い。
【０１５０】
中膜及び外膜に対する治療用作用物質のカテーテル投与が、PTCA処置によって生成された切開を噴出させるか又は強調させることで血管壁に対し最少限しか又は全く損傷を加えないことも同様に好ましい。さらに、輸注バルーンと血管壁の界面での静水頭圧が約０．３〜約１．５，好ましくは約０．４〜約０．８，より好ましくは約０．５〜約０．７５大気圧の間にあり、かくしてその起源が静水頭に露呈されている外膜内の小さな血管を破裂させることなく中膜間質空間内に治療用作用物質を含有する溶液を急速に強制することが好ましい。
好ましくは、治療用作用物質の投与は、中膜への治療用作用物質の均等な送達を結果としてもたらす。その上、治療用作用物質のカテーテル投与は、脈管の脈管を介して外膜へならびに中膜に有効量の作用物質を送達する結果となる。好ましくは、治療用作用物質は同様に、外膜にも均等に分配される。例えば約８．０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ約４〜約２４ｍｌといった治療用作用物質のカテーテル投与は、中膜の少なくとも内部に約１０％，より好ましくは少なくとも内部に約２０％，さらに好ましくは内部１００％までの侵入深度で、治療用作用物質送達の均等なパターンを結果としてもたらす。ブタ冠状動脈研究において治療用作用物質が中膜の内部１０％からその外側限界に至るまで拡散されてしまうまでに、外側限界にある細胞が治療的用量に露呈されることがわかった。
好ましい形態の治療用作用物質としては、単一の病巣を治療するのに必要とされる上述の好ましい細胞治療用量を送達するはずである、３０ｍｌのバイアル中の約８．０μｇ／ｍｌの濃度の無菌食塩水中のサイトカラシンＢがある。好ましくは、この量は、中膜の内部２０％に均等に分配されかつ外膜に均等に分配される。
【０１５１】
本発明のもう１つの実施形態においては、治療用作用物質の溶液が、血管移植片のために使用されるべき分離された血管（動脈又は静脈）の壁の中に、インビボ又はエックスビボで輸注される。本発明のこの形態においては、移植片として役立つべき血管は切除されるか又は分離され、その後、治療用作用物質の溶液の輸注により広げられる。好ましくは、輸注は、約１〜約４分、好ましくは約１分〜約２分の時間、約４〜約５atmのハブ圧で達成される。この輸注形態は、結果として、血管壁の平滑筋細胞への治療用作用物質の効能のある用量の浸透をもたらす。好ましくは、治療用作用物質は輸注液１ｍｌあたり約０．１μｇ／ｍｌから約８．０の濃度となる。好ましくは治療用作用物質はサイトカラシンであり、より好ましくは利用される治療用作用物質はサイトカラシンＢ，又はその機能的に等価な類似体となる。
【０１５２】
当業者にとっては、その他の末梢部位内で使用される血管移植片として、又は冠状動脈バイパス移植片内で使用される末梢血管が、往々にして手術後狭窄に起因して作動しなくなることは既知の事実である。サイトカラシンＢ輸液は、その生物学的ステント活性のため外科手術による外傷を受けた血管中で血管管腔面積を維持することから、このプロセスにおけるその投与は、血管の収縮能力を遅延させ、より大きな管腔直径又は断面積を結果としてもたらす。さらに、この要領でのサイトカラシンＢの投与は、血管移植片がその近位及び遠位の両方の場所に吻合された後に往々にして発生し、血管移植片の完全な作動不能といわないまでもその機能を損なうことになりうるくびれつまり狭窄を予防することができる、というのが本発明のこの実施形態の利点である。かくして、サイトカラシンにより作り出される血管ステントは移植処置の後数日から数カ月で起こりうる狭窄の発生率を低下させるはずである。
【０１５３】
例えば、本発明のもう１つの実施形態においては、血管内ステント又はシャント又はその他の移植可能な装置の挿入を必要とする状況といったような、遮断された血管を開くのに血管形成が充分でない状況において、治療用作用物質及び剤形を使用することができる。かくして、本発明は同様に、治療用作用物質を含むステント、stet，外膜ラップ、留置カテーテル、合成移植片又はシャントを提供する。本発明のこの実施形態における有用な治療用作用物質には、抗増殖性作用物質、例えば細胞骨格阻害物質が含まれる。好ましい細胞骨格阻害物質はサイトカラシン、例えばサイトカラシンＢ又は、サイトカラシンＢの機能的等価物であるその類似体である。本発明のもう１つの好ましい細胞骨格阻害物質は、タキソールの機能的等価物であるタキソール類似体である。
好ましくは、抗増殖性作用物質は持続放出剤形である。
【０１５４】
かくして例えば血管内ステント又はシャントといった移植可能な装置は、中に放出可能な形で包埋されているか又は介入的処置の間に溶液又は懸濁液中で投与されるサイトカラシンＢ又はタキソールといった細胞骨格阻害物質の生物学的ステント作用及び／又は抗増殖性活性を介して提供されるものに加えて、血管の管腔直径の増加を提供する機械的手段を提供する。その上、平滑筋細胞増殖の阻害物である治療用作用物質を含む移植可能な装置の設置は、内膜増殖を減少又は防止することにより増大した効能を提供する。内膜平滑筋細胞及び平滑筋により生成される狭窄のこの阻害は、装置の介入的設置の後のより急速かつ完全な再内皮化を可能にする。
【０１５５】
本発明の移植可能な送達装置及び少なくとも１つの治療用作用物質を含むキット
本発明は、別々に包装された形で、例えばカテーテル、外膜ラップ、バルブ、ステント、stet，シャント又は合成移植片といった治療用作用物質送達用に適合された少なくとも１つの移植可能な装置及び治療用作用物質を含む少なくとも１つの単位剤形ならびに当該方法に従ったそれらの使用のための説明手段を内含するパッキン材料を含んだキットを提供する。この単位剤形は、局所的及び／又は全身的に送達された時点で本書で記述した治療的結果を達成するのに有効な当該治療用作用物質のうちの少なくとも１つを一定量含みうる。本発明の好ましい実施形態は、哺乳動物の血管の管腔内の１つの部位への少なくとも１つの治療用作用物質の局所的送達のために適合されたカテーテルを、本発明に従ったその使用を指導する説明手段と共に含むキットである。好ましい一態様においては、輸注カテーテルは、有利には浸透性膜を伴う２重バルーン又は４重バルーンカテーテルであってよい。好ましくは治療用作用物質は細胞骨格阻害物質を含む。
【０１５６】
同様に、本発明のキットが全身的又は局所的送達のため例えば外膜ラップ、バルブ、stet，ステント又はシャントといったカテーテル以外の送達装置を含んで成ることも考えられる。本発明の方法において有用なバルブ、ステント、ラップ又はシャントは、本発明の単数又は複数の治療用作用物質，好ましくは治療用作用物質の持続放出剤形を中に分散された形で有する、例えばＰＴＦＥ膜といった生物分解性コーティング又は多孔質非生物分解性コーティングを含むことができる。
【０１５７】
本発明のもう１つの実施形態は、少なくとも２つの治療用作用物質の局所的送達用に適合させられた装置、第１の治療用作用物質の単位用量、及び第２の治療用作用物質の単位用量を、本発明に従ったその使用を指導する説明手段と共に含むキットである。第１及び第２の作用物質の単位剤形は、カテーテルの別個の管腔を介して導入してもよいし、又はカテーテルの単一の管腔内へ導入される前に混合してもよい。単位剤形がカテーテルの別個の管腔内に導入される場合、血管への作用物質の送達は同時に又は逐次的に起こりうる。その上、１つの作用物質の単位剤形を送達するために、単一管腔カテーテルを利用し、その後管腔にもう１つの作用物質を再投入し、血管管腔にその他の作用物質を送達することもできる。標的部位における血管管腔直径の減少を緩和するために、いずれかの又は両方の単位用量が作用できる。
【０１５８】
代替的には、もう１つの治療用作用物質が例えば経口投与により全身的に１投与される一方で、治療用作用物質の１つの単位用量を局所的に、例えばカテーテルを介して投与することもできる。
本発明は、以下の特定的な例を参照することによってより良く理解されることだろう。
【発明を実施するための形態】
【０１５９】
例１
インビボでの血管壁内の血管平滑筋細胞に対する結合
図１Ｂは、２４才の男性患者の動脈の血管壁内での、NR-AN-01のi.v.(静脈内)投与から４日目の、平滑筋細胞に対するNR-AN-01（マウスIgG2bMAb）の結合を例示している。図１Ｂは、HRP接合されたヤギの抗マウスＩｇＧとエクスビボで切片が反応させられた、NR-AN-01投与後の患者の動脈壁の内側領域を通して取られた組織学的切片の顕微鏡写真である。HRP接合体とNR-AN-01 MAbの反応は、ペルオキシダーゼ基質（色原体）として４−クロロ−１−ナフトール又は３．３’−ジアミノベンチジンテトラヒドロクロリドを添加することによって視覚化された。基質の反応生成物は、反応部位（図１Ｂ，＃２に示されている）で不溶性の紫色又は暗褐色の沈殿物を形成する。コラーゲン質の細胞外マトリックス材料（図１Ｂ，＃２で示されている）又は細胞核（図１Ｂ，＃１で示されている）を視覚化するために、対比染色を用いた。顕微鏡検査では、平滑筋細胞が紫色に染色された細胞として視覚化された（図１Ａ及び図１Ｂ）。この顕微鏡写真（図１Ｂ）は、インビボでヒト血管平滑筋に特異的に結合し細胞により内在化され、長期間にわたり細胞内にとどまるＭＡｂの能力を実証している。
【０１６０】
例２
トリコテセン治療用作用物質を含有する治療用接合体
NR-AN-01と呼称されるモノクローナル抗体に対し（以下で記述するように）トリコテセン細胞毒素のヘミこはく酸誘導体を化学的にカップリングすることにより、NR-AN-01及びロリジンＡの接合体を構築した。ロリジンＡの２’位置でカップリングされるものと１３’位置でカップリングされるものという２つの接合体を調製した。図２及び３で描いたように、この合成では２つのスキームが使用された。その後、PD 10 SEPHAROSE(登録商標)カラムクロマトグラフィ（Pharmacia；Piscataway，NJ）により未反応のロリジンＡから接合体を精製し、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィによりこれを分析し、カラム分画を以下で記述するようにＳＤＳ−薬学的に受容可能なＧＥ及び等電電気泳動（ＴＥＦ）により特徴づけした。
【０１６１】
図２は、室温（RT）でジクロロメタン（CH2Cl2）中に存在するジメチルアミノピリジン（DMAP）及びトリエチルアミン（NEt3）、こはく酸無水物；及び同じくRTでCH2Cl2中のＮ−ヒドロキシスクシニミド(NHS)及びジシクロエチルカルボジイミド(DCC)試薬という試薬を用いて、２段階プロセスを通した、ロリジンＡヘミスクシニルスクシニミデート(RA-HS-NHS)の合成のための第１の反応スキームを概略的に示す。
【０１６２】
図３は、室温（RT）でジメチルホルムアミド(DMF)中のイミダゾール及びｔ−ブチルジメチルシリルクロリド(TBMS-Cl)；RTでジクロロメタン（CH2Cl2）中のジエチルアミノピリジン、酢酸無水物、及びトリエチルアミン（TEA）；RTで（CH2Cl2）中のジメチルアミノピリジン（DMAP），トリエチルアミン(TEA)及びこはく酸無水物；及びＮ−ヒドロキシスクシニミド(NHS)及びジシクロヘキシルカルボジミド(DCC)試薬という試薬を用いた５段階プロセスを通した、ロリジンＡヘミスクシニルスクシニミデート(RA-HS-NSH)の合成のための第２の反応スキームを概略的に示す。
【０１６３】
２’ロリジン−Ａヘミこはく酸（２）の合成
０．５ｇ（０．９４mmol）のロリジンＡに対して、１５ｍｌのジクロロメタンを添加した。撹拌しながらこの溶液に対し０．１０４ｇ（１．０４mmol）のこはく酸無水物を添加した。反応混合物に、５ｍｌのジクロロメタン中の０．２ｍｌのトリエチルアミンを添加した。均質な反応混合物に対し、触媒量のジメチルアミノピリジンを添加し、１５時間室温で撹拌した。反応の完了に続き、薄層クロマトグラフィ（CH2Cl2；CH3OH=9.7：0.3と数滴の酢酸）を行なった。反応の終了時点で、０．３ｍｌの氷酢酸を添加し、減圧下で溶媒を除去した。
乾燥した粗製残渣を水と塩化メチレンの間で区分した。無水硫酸ナトリウム上で、組合わせた塩化メチレン抽出物（３×５０ｍｌ）を乾燥させ、真空下で溶媒を除去し、これを乾燥させて３つの化合物の粗製混合物を０．５７５ｇ（９６％）得た。２％の酢酸を伴う５０％のアセトニトリル−水中の粗製混合物の予備的C18HPLC分離は、白色固体として０．３６ｇ（６０％）を生成した。
【０１６４】
スクシニミジル２’−ロリジンＡヘミスクシネート（３）の合成
３０ｍｌのジクロロメタン中の０．３ｇ（０．４７６mmol）の２’ロリジンＡヘミこはく酸に対して０．０５５ｇ（０．４７８mmol）のＮ−ヒドロキシスクシニミドを添加した。透明な反応混合物に対して、０．１０８ｇ（０．５２４mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。反応混合物を６時間室温で撹拌した。反応の完了後、TLC（CH2Cl2：CH3OH=9.7：0.3と顕色用溶媒としての数滴の酢酸）を行なった。反応混合物に対し数滴の氷酢酸を添加し、減圧下で溶媒を除去した。乾燥した残渣に対しジクロロメタンを添加し、沈殿させたDCUをろ過した。ろ液からの溶媒を減圧下で除去し、白色固体を生成した。粗製生成物から、０．２０８ｇ（６０％）の３を、２％酢酸を流動相として用いた５０％アセトニトリル中の予備的HPLCによって精製した。
【０１６５】
１３’−ｔ−ブチルジメチルシリルロリジンＡ（４）の合成
０．５ｍｌのジメチルホルムアミド溶液中の７２．３ｍｇ（０．１３６mmol）のロリジンＡに対して、０．０５５ｇ（０．３６７mmol）のｔ−ブチルジメチルシリルクロリド及び０．０２５ｇ（０．３６８mmol）のイミダゾールを添加した。室温で１５時間、反応混合物を撹拌した。反応の完了の後、顕色用溶媒として１％のＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ3を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィを行なった。反応混合物からの溶媒を真空中で除去し、これを乾燥させた。粗製生成物を水と塩化メチレンの間で区分した。組合せた塩化メチレン抽出物からの溶媒を減圧下で除去し乾燥した。溶離用溶媒としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：３）を用いてフラッシュクロマトグラフィにより粗製生成物を精製した。溶離剤からの溶媒を減圧下で除去して、固体として０．６６ｇ（７５％）の４を得た。
【０１６６】
１３’−ｔ−ブチルジメチルシリル２’アセチルロリジンＡ（５）の合成：
１０ｍｌのジクロロメタン中の１３’−ｔ−ブチルジメチルシリルロリジンＡ０．１ｇ（０．１５５）mmolに対して、０．３ｍｌの無水酢酸、０．２ｍｌのトリエチルアミン及び数個のジメチルアミノピリジン結晶を添加し、２時間室温で保管した。反応完了後、顕色用溶媒としての１％のメタノール−塩化メチレン中のＴＬＣを行なった。減圧下で溶媒を除去し、溶離溶媒として１％のメタノール−クロロホルムを用いてシリカゲルカラムによりこれを精製した。溶離剤からの溶媒を真空下で除去して、固体として０．０８５ｇ（８０％）の５を得た。
【０１６７】
２’アセチルロリジンＡ（６）の合成
５ｍｌのテトラヒドロフラン中の２’アセチル１３’−ｔ−ブチルジメチルシリルロリジンＡ０．０５ｇ（０．０７３mmol）に対して、THF中の１Ｍのテトラブチル−フッ化アンモニウム溶液０．３ｍｌを添加した。室温で２時間、反応混合物を撹拌した。反応完了後、顕色用溶媒として１％のMeOH-CHCl3を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィを実施した。反応混合物からの溶媒を減圧下で除去し乾燥させた。溶離用溶媒として１％のCH3OH-CHCl3を用いてシリカゲルカラム上で粗製生成物を精製した。組合わせた溶離剤からの溶媒を真空下で除去し、固体として０．０２０ｇ（４８％）の６を得た。
【０１６８】
２’−アセチル１３’−ヘミスクシニルロリジンＡ（７）の合成
１ｍｌのジクロロメタン中の２’−アセチルロリジンＡ０．０５ｇ（０．０８７mmol）に対して、０．０２５ｇ（０．２５mmol）クエン酸無水物及び３５ｍｌのトリエチルアミンを添加した。触媒として、数個のメチルアミノピリジン結晶を添加した。反応混合物を２４時間室温で撹拌した。反応完了の後、顕色用溶剤として５％のＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2を用いて薄層クロマトグラフィを実施した。
反応の終了時点で、３０ｍｌの氷酢酸を添加した。反応混合物からの溶媒を減圧下で除去し乾燥させた。粗製生成物を、水と酢酸エチルの間で区分した。組合わせた酢酸エチル分画からの溶媒を減圧下で除去した。シリカゲルカラムを通すことにより粗製生成物を精製し、０．０３９ｇ（６６％）の７を白色固体として得た。
【０１６９】
スクシニミジル２’−アセチル１３’−ロリジンＡヘミスクシネート（８）の合成
２ｍｌのジクロロメタン中の０．０３６ｇ（０．００５０mmol）の２’アセチル１３’−ロリジンＡヘミくえん酸に対して、０．００９ｇ(０．０９mmol)のＮ−ヒドロキシスクシニミドを添加した。撹拌した溶液に対し、０．０１２ｇ(０．０５９mmol)のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。反応混合物を８時間室温で撹拌した。反応完了後、顕色用溶媒として５％のMeOH-CH2Cl2を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィを実施した。反応混合物に数滴の氷酢酸を添加した。反応混合物からの溶媒を減圧下で除去し乾燥させた。溶離用溶媒として５％のMeOH-CH2Cl2を用いてシリカゲルカラム上で粗製生成物を精製した。組合わせた溶離剤からの溶媒を真空下で除去し、白色固体として０．０２５ｇ（６１％）の８を得た。
【０１７０】
NRAN-01全抗体(MAb)に対するスクシニミジル２’−ロリジンＡヘミスクシネー ト（３）及びスクシニミジル２’−Ａセチル１３’ロリジンＡヘミスクシネー ト（８）の接合：
ゲル浸透クロマトグラフィによる精製に先立ち４５分間穏やかに混合しながら室温で２５％のジメチルスルフォキシド（DMSO）溶媒の存在下でホウ酸塩緩衝液中ｐＨ８．０で接合反応を実施した。トリコテセン薬物前駆体体抗体のモル提供は、２’及び１３’ロリジンＡ類似体（３及び８）についてそれぞれ２５：１及び４０：１であった。抗体濃度は、接合反応中０．９〜１．０ｍｇ／ｍｌであった。
２５ｍｇの抗体での標準的な２’類似体（３）反応は以下のとおりであった： リン酸緩衝液（すなわちPBS：１５０ｍＭのNaCl，６．７ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．３）中の４．７ｍｌの５．３ｍｇのＡｂ／ｍｌに対して、１０ｍｌのPBS及び５ｍｌのホウ酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ８．０）を添加した。穏やかに撹拌しながら、反応混合物に対して次に、１５秒の期間にわたり滴下式で、１．３７ｍｇのスクシニミジル２’ロリジンＡヘミスクシネート（３）を含有する６．３ｍｌのDMSOを添加した。
【０１７１】
精製：
精製するためには、ＰＢＳ中で平衡化したPharmacia PD-10セファロース（登録商標）カラムに対し１ｍｌの反応アリコートを適用した。溶離した接合体を２．４〜４．８ｍｌの分画中で収集した。次に、ＰＤ−１０精製済み接合体アリコートをプールし、Amicon PM-10 DiAflo（登録商標）濃縮器上で、１．５〜２．０ｍｇのAb/ｍｌまで濃縮し、０．２μのGelman Acrodise（登録商標）を通して無菌ろ過し、５ｍｌの堆積で無菌ガラスバイアル中に充てんした。
２’の接合体を液体窒素中で急速凍結させ、次に使用するまで−７０℃で保管した。１３’のロリジンA NR-AN-01接合体を凍結状態で保管するか又は冷蔵（すなわち５〜１０℃）した。
【０１７２】
接合体の特徴づけ：
タンパク質濃度は、銅試薬方法を用いてBCA検定により決定した。
まず最初に０．２Ｍの炭酸塩、ｐＨ１０．３中で４時間（２’接合体については室温で、又は１３’接合体については３７℃で）接合体アリコートを加水分解し、その後PM-30膜を通してろ過を行なうことにより、抗体誘導体化度の査定を行なった。次に、それぞれ５０：４８：２の比のCH3CN：H2O：HOACの流動相を用いて、C-18は逆相HPLC上でロリジンＡについてろ液を検定した。１３’接合体の加水分解の間に極性生成物を与える並列大環状環分解について補正するべく、１．３２の補正係数を使用した。Du Pont Zorbax(登録商標) HPLC上でのサイズ排除クロマトグラフィ及びServa（登録商標）ゲル平板（pH3〜10）を用いた等電電気泳動も同様に実施された。HPLCでは、凝集の兆しが全く観察されなかった。
ロリジンＡ−抗体接合体の免疫検定を、ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ検出を伴うビオチニル化されたＡｂを用いた競合的ELISAか又は125Ｉ−標識づけされた抗体を用いた競合的細胞結合検定のいずれかによって行なった。代替的には、抗体がまず最初にクロルアミンＴ方法によりI-125で追跡標識づけされその後２’及び１３’ロリジンＡ前駆体で誘導体化された細胞結合検定において、抗原飽和条件下で免疫活性が測定れた。
【０１７３】
例３
平滑筋細胞に対する結合の反応速度
ｉ．ｖ（静脈内）カテーテルによる投与のためには、本発明の治療用接合体が３〜５分未満で投与され、かくして患者の体内で血流が再度樹立され得るようにすることが望ましい。従って、１０9リットル／モルを上回るＫａで平滑筋結合タンパク質の結合反応速度を決定するための研究が行なわれた。ヒトの血管平滑筋細胞は、培養中で緩慢に成長し、ヒヒの平滑筋細胞はヒトCSPG細胞表面マーカーを発現することがわかっていたため、以下の例で記述する研究の多くにおいて、CSPG表面マーカーを支持するB054ヒヒ動脈平滑筋細胞及びヒトA375M/M（黒色腫：ATCC#CRL1619）細胞が使用された。
反応速度上の結合研究では、２５００細胞／ウェルの割合で、無菌９６ウェル内に、A375M/M及びB054細胞を播種した。平板をアルミホイル内に包み、５％ＣＯ2／９５％空気の加湿された大気中で３７℃で一晩インキュベートした。約１８時間後、インキュベーション平板を除去し、膜の回転置換を防ぐため５分間０．０５％のグルタルアルデヒドで細胞を固定した。固定後、０．５％のTween−20（登録商標）を含むPBSで平板を徹底的に洗浄した。10ｍｇ/ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ロリジンＡを含有するＮＲ−ＡＮ−０１治療用接合体の２倍段階希釈液を１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌのタンパク質濃度で調製し、各々の希釈液を２つのウェルにアリコートした。５，１５，３０及び６０分間、ＮＲ−ＡＮ−０１を用いて４℃で平板をインキュベートし、その後、吸引により未結合タンパク質を除去し、１００ｍｌの細胞骨格緩衝液を（PBS中５％のニワトリ血清/０．５％のTween-２０（登録商標））、各ウェルに添加した。細胞骨格緩衝液を除去し、各ウェルに１００ｍｌのHRP接合されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)を添加し；１時間４℃でインキュベートし；未結合ヤギＩｇGを除去するべく、PBS/０．０５％Tween（登録商標）で洗浄し２．２’−アジノービス（３−エチルベンズモアゾリン−６−スルフォン酸（ABTS）色原体基質（すなわちHRP用）を添加することによって、細胞に対し結合されたNR-AN-01治療用接合体を視覚化した。３０分間インキュベートした後、細胞に結合したNR-AN-01の量を、Compaqコンピュータによるデータ収集のために装備されたＥＬＩＳＡ平板読取り装置を用いて４１５ｎｍ及び４９０ｎｍでの吸収率を測定することによって、定量した。
【０１７４】
図４Ａは、異なる濃度のNR-AN-01（NRANO １μｇ／ｍｌ）で、（膜の回転置換を防ぐため）４℃で５分間（図４Ａ，白色正方形）、１５分間（図４Ａ，黒色菱形）、３０分間（図４Ａ，黒色正方形）又は６０分間（図４Ａ，白色菱形）、Ａ３７５ｍ／ｍマーカー陽性細胞を保持したインビトロ研究の結果をグラフで表わしている。Ａ３７５細胞に対するNR-AN-01 MAbの結合は、未結合抗体を除去するべく洗浄し、細胞結合したＭＡｂと反応させるべくＨＲＰ接合したヤギ抗マウスＩｇＧを添加し、未結合のヤキ第２抗体を除去するべく洗浄し、ペルオキシダーゼのための２．２’−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）基板を添加することにより、定量した。４１５ｎｍと４９０ｎｍの両方で３０分後に顕色を監視した(ABS415，490)。
【０１７５】
図４Ｂは、図４Ａに関し前述したものと類似の要領で、ただしＡ３７５ｍ／ｍ細胞ではなくＢ０５４マーカー陽性平滑筋細胞を使用して行なわれたインビトロ研究の結果をグラフで表わしている。
図４Ａ及び図４Ｂで示された結果は、２０ｎｇ／ｍｌという最低用量においてさえ４℃で５分以内に、Ａ３７５及びＢ０５４細胞に対するNR-AN-01の著しい結合を示している。
【０１７６】
例４
ロリジンＡ及びRA-NR-AN-01接合体の効果
以下の例５及び例６で詳述する実験において、細胞タンパク質合成（すなわち3Ｈ−ロイシン取込みによる）及び代謝活性（すなわちミトコンドリアMTT検定による）に対するロリジンＡ（RA）及びRA-NR-AN-01接合体の効果をテストした。
例４中の研究には、作用物質による長時間（すなわち２４時間）の治療の効果を決定するための実験が含まれている。例５の研究には、細胞に対する「パルス」（すなわち５分間）処理の効果を見極めるための実験が含まれている。両方の研究において、効果の細胞特異性は、「標的」細胞（すなわちCSPG「マーカー」を支持する細胞）及び非標的細胞を内含させることにより評価された。比較を目的として、遊離ＲＡ（すなわちカップリングされていないRA）も研究に内含された。細胞タンパク質合成又は代謝活性に対する効果は、治療の直後に評価されるか又は、細胞個体群に対する作用物質の長時間効果を見極めるため「回復期間」が与えれらた（すなわち３７℃で一晩の細胞のインキュベーションが関与した）。
【０１７７】
２４時間の露呈後の代謝効果
モノクローナル抗体−薬物接合体は、インビボで利用されたときマーカー抗原を支持する細胞に対する一定の特異性度を有する可能性があることが知られているものの、数多くの系において、とくに親油性ある化合物との作用の特異性をインビトロで実証することはより困難であることが実証されてきた。従って、２４時間にわたり標的及び非標的細胞について、NR-AN-01−ロリジンＡ接合体の阻害効果がテストされる当該実験が実施された。RA-NR-AN-01についての結果を、同じ２４時間にわたる遊離ロリジンＡの効果と比較した。細胞代謝活性を決定するため、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物(Sigma)と共に、修正されたメチル−テトラゾリウムブルー(MTT)検定が利用された。この検定は、細胞ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を測定するものと思われている。これらの研究のいくつかについては、マーカー陽性標的細胞として、Ｍ１４（黒色腫）及びB054（平滑筋）細胞系統が用いられ、非標的特異性対照としてＨＴ２９細胞（結腸ガン；ATCC#HTB38）が使用された。その他の研究では、マーカー陽性細胞としてA375が使用された。HT29及びM14細胞を、５．０×１０3細胞ウェルの濃度で９６ウェルのマイクロタイター平板内に播種し、２．５×１０3細胞／ウェル濃度でB054細胞を播種した。遊離ロリドン、Ａ及び2’RA-HS-NR-AN-01（すなわち、ＮＲ−ＡＮ−０１に対し２’の位置でヘミスクシネート（HS）カップリング剤を通してカップリングされたロリジンＡ）の２倍段階希釈液を、２０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｐｇ／ｍｌのタンパク質濃度範囲にわたりDMEM中で調製した。マイクロタイターウェル（１００ｍｌ／ウェル）に対しテスト作用物質を（全く同一に）添加し、平板をアルミホイル内に包み込み、２４時間５％のＣＯ2／９５％の空気から成る加湿された大気内で３７℃でインキュベートした。２４時間後に、培地を（吸引により）除去し、新鮮なDMEMを添加し（１００ｍｌ／ウェル）、さらに一晩（すなわち１６〜１８時間）の「回復期間」インキュベートするべく細胞を戻した。「回復期間」の終了時点で、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに２０ｍｌ添加することによって、細胞代謝活性を決定した。平板をカバーし、４時間３７℃でインキュベートし、１０％のSDS/0.1N HClを１ウェルにつき１００ｍｌを添加することによって反応を顕色させた。１６〜１８時間後室温で、ダークブルーの可溶化されたホルマザン反応生成物を顕色させ、５７０ｎｍの吸光度でＥＬＩＳＡマイクロタイタ平板読取り装置を用いて定量した。
【０１７８】
図５は、２４時間、異なる濃度のRA-NR-AN-01（NRAN01-RA；図５Ａ，白色正方形）又は遊離ロリジンＡ（遊離ＲＡ；図５Ａ，黒色菱形）を用いてＢ０５４マーカー陽性平滑筋細胞がインキュベートされ、洗浄され、次にＭＴＴ検定において代謝活性を試験する前にさらに１６〜１８時間の一晩（ｏ／ｎ）の回復期間だけ培養に戻される、インビトロ研究の結果をグラフで描いている。遊離ＲＡ及びRA-NR-AN-01の濃度は、（検定中のNR-AN-01タンパク質の合計ｍｇ／ｍｌではなくむしろ）検定中のロリジンＡの計算上の濃度（対数尺度でプロットされたｍｇ／ｍｌ単位）として表現され、従って直接的比較を行なうことが可能になっている。ＭＴＴ検定中の細胞の代謝活性は、細胞の対照未処理培養内で測定された代謝活性の百分率として提示される。
【０１７９】
図５Ｂは、図５Ａに関して前述したものと類似の要領で行なわれた。ただし３つの異なる細胞系統すなわちB054マーカー陽性平滑筋細胞（B054-NRAN01-RA；図５Ｂ，白色正方形）；HT29マーカー陰性対照細胞（HT29-NRAN01-RA；図５Ｂ，黒色菱形）及びM14マーカー陽性細胞（M14-NRAN01-RA，図５Ｂ，黒色正方形）に対するRA-NR-AN-01（NRAN01-RA）のみの効果を比較する、インビトロ研究の結果をグラフで描いている。図５Ａに関して前述した通り、当該実験における濃度は、ロリジンＡのμｇ／ｍｌ単位で表わされる。細胞の代謝活性は、図５Ａの場合と類似の要領で、すなわち未処理の対照細胞培養中で測定された活性百分率（対照％）として表わされている。
【０１８０】
図５Ａ及び図５Ｂに示されている結果は、MTT検定で測定された代謝活性が遊離ロリジンＡ又は2'又は13’RA-NR-AN-01接合体のいずれかにおいて２４時間のインキュベーションから１６〜１８時間後でさえ、テスト細胞の全ての個体群中で著しく減少したことを示している。RA-NR-AN-01接合体の効果は、標的(B054及びM14)及び非標的（HT29）細胞（図５Ａ及び５Ｂ）の両方について非特異的に阻害性を有するように思われた。阻害効果は、１０ｎｇ／ｍｌより高い遊離ロリジンＡ又はＲＡ接合体において観察された。
【０１８１】
比較目的で、類似のプロトコルで細胞に対するPseudomonas外毒素（PE）接合体の効果が評価される第２の研究が実施された。これらの研究においては、２４時間、PE又はPE-NR-AN-01で標的及び非標的細胞が処理され、その後、MTT検定で代謝活性がテストされる前に「回復期間」（上述の通り）が与えられた。
図６Ａは、図５に関して上述したものと類似の要領で行なわれたものの、RA-NR-AN-01ではなくむしろ細胞に対するPE-NR-AN-01（NRAN01-PE）の代謝効果を研究するように設計されたインビトロ研究の結果をグラフで描いている。３つの異なる細胞系統すなわち、B054マーカー陽性平滑筋細胞（B054；図６Ａ，白色正方形）；HT29マーカー陽性平滑筋細胞（B054；図６Ａ，白色正方形）；HT29マーカー陰性対照細胞（HT29；図６Ａ，黒色菱形）及びM14マーカー陽性細胞（MT14；図６Ａ，黒色正方形）が利用された。この研究においては、接合体濃度は、NR-AN-01タンパク質のμｇ／ｍｌ（対数尺度上でプロットされたもの）単位で表現され、代謝活性は、未処理の対照培養中で測定されたMTT活性の百分率（対照％）として表現されている。
【０１８２】
図６Ｂは、図６Ａに関して上述したものと類似の要領で行なわれた、ただし遊離ＰＥ（PE）で得られた効果をPE-NR-AN-01で上でつまり図６Ａ内で得られたものと比較するように設計されたインビトロ研究の結果をグラフで描いている。細胞、培養条件、計算及び結果の体裁は、上述の図６Ａの場合と同じである。
図６Ａ及び６Ｂに示された結果は、PE-NR-AN-01又は遊離PEに対する２４時間の露呈が、１００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で、細胞に対し非特異的な阻害性を有していたことを示している。
このタイプの非特異的阻害は、生物学的アテローム切除術にとって潜在的価値をもつものであると判断されたものの、死枯した又は死枯しつつある細胞が平滑筋増殖を刺激する因子を放出する可能性のある血管形成術の後の再狭窄の治療のためには望ましいものとみなされなかった。
【０１８３】
例５
細胞活性に対するパルス処理の効果
細胞に対するロリジンＡ含有治療用接合体に対する短時間すなわち５分間の露呈の効果を評価するため、付加的な研究が行なわれた。これらの研究においては、代謝活性（ＭＴＴ検定で測定されたもの）及び細胞タンパク質合成（3Ｈ−ロイシン取込みにより測定されたもの）が両方共評価された。
５分間の露呈の後の効果：タンパク質合成 遊離ロリジンＡ（RA）又は治療用接合体に対する５分の露呈の効果が評価された。２’の位置(2’RA-HS-NR-AN-01)又は１３’の位置（13’RA-HS-NR-AN-01）のいずかにおいてヘミスクシニル（ＨＳ）を通してカップリングされたロリジンA-NR-AN-01が利用された。（13’RA-HS-NR-AN-01の場合、ロリジンＡの２’位置は同様にアセチル化された。）RA、2'又は13’RA-NR-AN-01接合体は、４００ｍｇ／ｍｌ〜７８０ｐｇ／ｍｌのロリジンＡの濃度範囲にわたり無菌ＤＭＥＭ中で２倍に希釈された。（テスト試料は、匹敵する用量で効果について直接比較が行なえるように全てロリジンＡに標準化された）。試料を、１００ｍｌ／ウェルの割合で複製のマイクロタイター平板内に（全く同一に）アリコートし、５分間室温でインキュベートした。
【０１８４】
マーカー陽性Ａ３７５及びマーカー陰性ＨＴ２９細胞に対するテスト試料の短期及び長期の両方の効果を決定した。短期効果を研究するため、接合体（又はＲＡ）での５分の処置の直後に１ウェルあたり１００ｍｌの〔3Ｈ〕−ロイシン（０．５ｍＣｉ／ｍｌ）を添加し、４時間にわたりタンパク質合成を評価した。長期効果を見極めるため、細胞を５分間処理し、洗浄し、次に、５％のNBS／５％のSerum Plus（登録商標）（すなわちA３７５又はHT２９細胞用）又は１０％のFBS（すなわちB054細胞用）のいずれかを含有するＤＭＥＭ培地内での２４時間の「回復」期間の培養に戻した。「回復」期間の終りで、インキュベーション培地を除去し（吸引により）上述の通り3Ｈ−ロイシンを添加した。両方のケースにおいて（すなわち短期間であれ長期間であれ）、細胞のタンパク質合成は、（上述の通り）加湿チャンバ内で３７℃で４時間3Ｈ−ロイシンで細胞をインキュベートすることにより評価され、全ての結果は、未処理細胞（すなわち１００％対照）との比較によって計算される。４時間後、3Ｈ−ロイシンを除去し、細胞をトリプシン処理により基層から除去し（ＰＨＤTM細胞収獲装置(Cambridge Technology，Inc.，Cambridge，MA)を用いて）吸引し、グラスファイバフィルタ上でのろ過により収集した。グラスファイバフィルタを乾燥させ、Backman液体シンチレーション計数器内での液体シンチレーション分光法により放射能を定量した。
【０１８５】
図７Ａは、異なる濃度のロリジンＡ（遊離ＲＡ；図７Ａ，白色正方形）又は2’RA-NR-AN-01（2’RA-NRAN01，図７Ａ，黒色正方形）又は13’RA-NR-AN-01（13’RA-NRAN01；図７Ａ，黒色三角形）接合体に対する５分間の露呈が対照ＨＴ２９マーカー陰性細胞に対してもつ効果を調査するために行なわれたインビトロ研究の結果をグラフで表わしている。結果を直接比較できるように、遊離RA，2’RA-NR-NR-AN-01又は13’NR-AN-01の濃度は、NR-AN-01タンパク質の合計μｇ／ｍｌではなくむしろ、検定中のロリジンＡの計算上の濃度（対数尺度上にプロットされたμｇ／ｍｌ単位）として表現されている。これらの研究のためには、細胞を５分間処理し、洗浄し、４時間の培養に戻し、この時間中、培地に０．５ｍＣｉ／ｍｌの3Ｈ−ロイシンを添加することにより、細胞タンパク質合成を評価した。４時間の期間の終了時点で、細胞タンパク質を収集し、放射能を決定した。結果は、対照の（未処理）ＨＴ２９細胞培養中で記録された放射能の百分率（すなわち対照％）として表現されている。
【０１８６】
図７Ｂは、図７Ａに関して前述した通り、異なる濃度の遊離ＲＡ（図７Ｂ，白色正方形）、2’RA-NRAN01（図７Ｂ，黒色正方形）又は13’RA-NRAN01（図７Ｂ，黒色三角形）に対する５分間の露呈が対照ＨＴ２９マーカー陰性細胞に与える効果を調査するインビトロ研究の結果をグラフで描いているが、この実験においては、細胞は、４時間の3Ｈ−ロイシンタンパク質合成検定においてタンパク質合成をテストするに先立ち、１６〜１８時間の回復期間（すなわち一晩：０／ｎ）インキュベートされた。結果は、図７Ａで上述したものと類似の要領で提示されている。
【０１８７】
図７Ａ及び図７Ｂに示されている結果は、それぞれ、HT29対照細胞によるタンパク質合成に対するRA，2’RA-HS-NR-AN-01及び13’RA-HS-NR-AN-01の短期及び長期効果を示す。これらの結果は、HT29細胞内での、RA-NR-AN-01によってではなく遊離ロリジンによる細胞タンパク質合成の用量応答阻害を示す。５分間のインキュベーション中RAにより誘発された阻害は、１６〜１８時間の回復期間後もなおも明白であった（図７Ｂ）。これとは対照的に、2’RA-HS-NR-AN-01又は13’RA-HS-NR-AN-01での非標的HT29細胞の処置は、タンパク質合成の検出可能な阻害を結果としてもたらさなかった。かくして、これらの結果は（２４時間にわたり以上で得られたものとは対照的に）、処置が５分の「パルス」で送達された場合のNR-AN-01接合体のインビトロ作用に対する驚くべき特異度を示唆していると思われる。しかしながら、NR-AN-01接合体が不活性であったことも考えられるため、標的細胞に対する接合体の効果を評価するべく付加的な実験が行なわれた。
【０１８８】
図７Ｃは、図７Ａに関して前述した通り、異なる濃度の遊離ＲＡ（図７Ｃ，白色正方形）、2’RA-NR-AN-01（図７Ｃ，黒色正方形）又は13’RA-NR-AN-01（図７Ｃ，黒色三角形）に対する５分間の露呈がＡ３７５ｍ／ｍマーカー陽性細胞に与える効果を調査するインビトロ研究の結果をグラフで描いている。この研究においては、Ａ３７５細胞は、テスト作用物質中で５分間インキュベートされ、培地に０．５ｍＣｉ／ｍｌ 3Ｈ−ロイシンを添加することによりその後４時間にわたりタンパク質合成についてテストされた。実験の結果は、図７Ａに関して上述のものに類似した要領でプロットされた。
【０１８９】
図７Ｄは、図７Ｂに関して前述した通り、異なる濃度の遊離ＲＡ（図７Ｄ，白色正方形），2’RA-NRAN01（図７Ｄ，黒色正方形）又は13’RA-NRAN01（図７Ｄ，黒色三角形）に対する５分間の露呈がＡ３７５ｍ／ｍｌのマーカー陽性細胞に与える効果を調査するインビトロ研究の結果をグラフで描いている。この研究においては、Ａ３７５細胞は、テスト作用物質中で５分間インキュベートされ、１６〜１８時間の回復期間（すなわち一晩；Ｏ／ｎ回復）培養に戻され、その後、タンパク質合成が４時間の3Ｈ−ロイシンタンパク質合成検定中に評価された。
【０１９０】
実験の結果は、図７Ａに関して上述のものに類似した要領でプロットされている。
図７Ｃ及び図７Ｄで示されている結果は、A375標的細胞によるタンパク質合成に対するRA，2’RA-HS-NR-AN-01及び13'-RA-HS-NR-AN-01のそれぞれの短期及び長期効果を示す。2'又は13’RA-NR-AN-01治療用接合体のいずれかを用いた標的細胞の処理は、結果として、５分間のパルス処理の直後に観察されるタンパク質合成の短期阻害をもたらした（図７Ｃ）。これらの発見事実は、上述の図７Ａ及び図７Ｂにおける発見事実と組合わせたとき、RA-NR-AN-01接合体が活性であったこと及びそれらが、標的細胞について特異的に阻害性を有するが非標的細胞についてはそうでなかったことを示唆している。興味深いことに、「パルス」処理された標的細胞が培養に戻されたとき、長期間にわたる阻害効果は全く観察されなかった（図７Ｄ）。図７Ｃ及び図７Ｄに示されている結果は、ロリジンＡがテスト細胞に対して非特異的に阻害性を有すること（すなわち上述の図７Ａ及び図７Ｂに類似した要領で）、及び細胞に対するその効果が１６〜１８時間の回復期間後でさえ明白であることを再度示している。従って、「パルス」処理中の標的細胞に対するRA-NR-AN-01接合体の特異的効果は、NR-AN-01結合タンパク質の特性であると思われる。
【０１９１】
Ｂ０５４動脈平滑筋細胞で得られた結果は、上述のＡ３７５細胞で得られたものと類似であった。すなわち、遊離ロリジンＡは、２００ｎｇ／ｍｌ，１００ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌで対照の６０％，６６％及び９０％に等しいとされる短期間でのタンパク質合成の用量応答阻害を示し、長期では、タンパク質合成に対する効果は、同じ用量で２７％，４６％及び９８％に等しいとされた。これとは対照的に、2'又は13’RA-NR-AN-01は、タンパク質合成に対する短期又は長期効果についてわずか１０〜２０％の阻害（すなわち対照の８０％以上）しか示さなかった。
【０１９２】
かくして、結果は、「パルス」処理として送達されたときの標的細胞に対するロリジン−Ａ接合したNR-AN-01の短期特異的可逆効果を示している。しかしながら、これらの実験においてはタンパク質合成のみが評価されたことから、細胞代謝活性が「パルス」処理の結果として細胞内で影響を受ける可能性も考えられた。従って、「パルス」処理の後に細胞代謝活性を評価する付加的な研究が行なわれた。
【０１９３】
５分間の露呈後の効果：代謝活性
RA又はRA-NR-AN-01接合体に対する標的及び非標的細胞の５分間の露呈から４８時間後にＭＴＴ検定を行なった。これらの研究における標的細胞は、B054及びA375を内含し、非標的細胞は、ＨＴ２９細胞を内含していた。２５００細胞／ウェルの割合で、無菌の９６ウェルマイクロタイター平板に播種を行ない、これをアルミホイルで包み、１６〜１８時間、ＣＯ2５％／空気９５％を含有する加湿されたチャンバ内でインキュベートした。４００ｎｇ／ｍｌ〜７８０ｐｇ／ｍｌで、ロリジンＡ（ＲＡ），2’RA-HS-NR-AN-01及び13’RA-HS-NR-AN-01の２倍階段希釈液を調製し、希釈液の１００ｍｌアリコートを、複製ウェル内に送り出した。テスト試料に対する５分の露呈後、試料を除去するため細胞を洗浄し、新鮮培地を添加した。テストに先立ち、細胞を４８時間回復させた：すなわち、平板を４８時間インキュベートし、次に５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を１ウェルあたり２０ｍｌ添加することにより、細胞の代謝活性を決定した。平板をカバーし、３７℃で４時間インキュベートし、その後反応を上述のとおりに顕色させた（上述の例４を参照のこと）。１６〜１８時間のインキュベーションの後、室温でダークブルーの可溶化されたホルマザン反応生成物を顕色させた。５７０ｎｍの吸光度でＥＬＩＳＡマイクロタイター平板読取り装置を用いて試料を定量した。
【０１９４】
図８Ａは、異なる濃度のロリジンＡ（図８Ａ，白色正方形），2’RA-NR-AN-01（NRAN01-2’RA；図８Ａ，黒色菱形）又は13’RA-NR-AN-01（NRAN01-13’RA；図８Ａ，黒色正方形）に対する５分間の露呈がB054マーカー陽性平滑筋細胞に対してもつ効果を調査するインビトロ研究の結果をグラフで描いている。実験は、図７Ｂに関して前述したものに類似した要領で行なわれたが、代謝活性は、図７Ｂの場合のようにタンパク質合成ではなくむしろＭＴＴ検定により検定され、細胞には同様に４８時間（図７Ｂの場合のように２４時間ではなく）の回復時間が与えられた。実験結果は、図７Ａに関して（以上で）記述されたものに類似した要領でプロットされている。
【０１９５】
図８Ｂは、異なる濃度のロリジンＡ（図８Ｂ，白色正方形），2’RA-NR-AN-01（NRAN01-2’RA；図８Ｂ，黒色菱形），13’RA-NR-AN-01（NRAN01-13’RA；図８Ｂ，黒色菱形），１３’ＲＡ−ＮＲ−ＡＮ−０１（ＮＲＡＮ０１−１３’ＲＡ；図８Ｂ，黒色正方形）に対する５分間の露呈がＡ３７５ｍ／ｍマーカー陽性細胞に対してもつ効果を調査するインビトロ研究の結果をグラフで描いている。実験は、図８Ａに関して前述したものに類似した要領で行なわれ（そして結果がプロットされ）た。
【０１９６】
図８Ｃは、異なる濃度のロリジンＡ（図８Ｃ，白色正方形）2’RA-NR-AN-01（NRAN01-2’RA；図８Ｃ，黒色菱形），13’RA-NR-AN-01（NRAN01-13’RA；図８Ｃ，黒色正方形）に対する５分間の露呈がＨＴ２９マーカー陰性細胞に対してもつ効果を調査するインビトロ研究の結果をグラフで描いている。実験は、図８Ａに関して前述したものに類似した要領で行なわれ（そして結果がプロットされ）た。
【０１９７】
図８Ａ−８Ｃに示された結果は、最高の用量での異なるRA-NR-AN-01接合体間のわずかな差異を示すが、さらに低い用量では、2'及び13’RA-NR-AN-01は、長期にわたる（すなわち４８時間）標的細胞（すなわちB054及びA375）又は非標的細胞（すなわちHT29）代謝活性を著しく阻害しなかった。かくして、結果は、標的細胞タンパク質合成（上述の図７Ｃ−７Ｄ）の短期阻害が、MTT検定で測定できるように、細胞に対する長期代謝効果を結果としてもたらさないことを示唆している。５分間の露呈の結果もたらされる細胞内の代謝的変化をこれらの検定が検出できたという事実は、遊離ロリジンＡで得られた結果により実証されている。この場合、遊離ロリジンＡは、細胞がわずか５分間だけ作用物質に露呈され次に４８時間の回復期間の培養に戻された場合でさえ、標的及び非標的細胞型に対し非特異的阻害性を有していた（図８Ａ−８Ｃ）。
【０１９８】
かくして、遊離ロリジンＡでの発見事実は、MTT検定が、５分間の露呈中に誘発された代謝変更を検出することができたことを示唆している。これらの発見事実を合わせて考えると、RA-NR-AN-01接合体は、「パルス」処理で投与された場合、RA-NR-AN-01接合体が特異的に標的細胞活性（すなわちタンパク質合成）を抑制できること、そしてタンパク質合成又は（ＭＴＴ検定において測定されるような）細胞代謝活性のいずれかに対する有意な長期効果なくこれらの効果が可逆的であったことを示唆している。RA-NR-AN-01接合体のこれらのインビトロ特性は、インビボでの平滑筋細胞活性の阻害のためにきわめて有用であると判断された。従って、これらの治療用接合体の効果をインビボで評価するため動物モデル研究を次に行なった。
【０１９９】
例６
動物モデルにおける輸注条件の決定
本発明の治療用接合体は、血管外傷又は疾病の後の狭窄を阻害するために有用である。実施例においては、血管形成中に誘発された血管外傷は、血管形成を行なうのに用いられたカテーテルを除去し血管内にバルーン輸注カテーテルを挿入することによって外科的処置中に治療される。輸注カテーテルは、血管の外傷を受けた部域内で点滴注入ポート（又は代替的には浸透性膜領域）と共に位置づけされ、次に治療用接合体を導入するべく圧力が加えられる。例えば２つのバールンを伴う輸注カテーテルが使用され、外傷部位のいずれかの側で１つのバルーンが膨らまされた時点で、治療用接合体を含有する適当な輸注流体で充てんされうる流体空間が作り出される。以前に、イヌ又はヒトの冠状動脈内で４５秒以上３００ｍｍＨｇの圧力でホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)マーカー酵素を輸注した結果、血管壁内にHRPが浸透したということが報告された（Goldman et al.，前出）。しかしながら、HRPは、NR-AN-01よりも小さい分子であり、ヒト及びイヌの冠状動脈も同様に、当該家畜ブタモデル系において頸動脈又は大腿動脈よりもはるかに小さいものである。従って、家畜ブタモデル系において、頸動脈及び大腿動脈中の血管平滑筋細胞に対する治療用接合体の送達に適した輸注条件を決定するための実験が行なわれた。血管壁内への治療用接合体の浸透及び血管壁中の血管平滑筋細胞に対する作用物質の特異的結合を評価することによって、送達条件を監視した。
【０２００】
輸注カテーテルを用いて、家畜ブタ又はヒト以外の霊長類の冠状動脈及び大腿動脈に、約０．４気圧（３００ｍｍＨｇ）〜３気圧の範囲内の複数の圧力で、４５秒〜３分の間、NR-AN-01を輸注した。
輸注の後、血管を無菌食塩水で洗い流し、血管壁内のNR-AN-01マウスIgGを検出するべく、HRP接合されたヤギ抗マウスＩｇＧを用いた免疫組織化学のために準備した。３分後３気圧の圧力でこれらの血管壁内へのNR-AN-01の完全な浸透が達成されたことが見極められた。
【０２０１】
どの動物モデル系がNR-AN-01に対する標的抗原を発現したかを決定するために、免疫組織学も利用された。容易に入手可能な実験動物種からの血管組織切片を、NR-AN-01に露呈し、洗浄し、HRP接合されたヤギ抗マウスＩｇＧと反応させた。ヒト以外の霊長類及びブタのみが、人間と２５０ｋＤのNR-AN-01標的抗原を共有することが発見された。
NR-AN-01が特異的な形でその抗原にインビボで結合しうるか否かを見極めるため、輸注カテーテルを用いて治療用接合体を家畜ブタの冠状及び大腿動脈に輸注し、輸注部位を無菌食塩水で洗い流し、次に外科手術部位を閉鎖し、動物をさらに３〜５日間維持した。この期間の最後に、血管輸注部位を切除し、NR-AN-01を同定するべくヤギ抗マウスＩｇＧ再び用いて免疫組織学用に準備した。NR-AN-01を、外科手術から３〜５日後に、ブタ冠状及び大腿動脈の血管内で同定し、NR-AN-01は、血管平滑筋細胞とだけ会合するように思われた。これらの発見事実は、NR-AN-01がインビボでその標的抗原に特異的に結合する能力を有することを示唆している。
【０２０２】
例７
インビボでの血管平滑筋細胞の阻害
バルーンカテーテルにより誘発された外傷に続く内膜平滑筋増殖は、血管形成術の後の再狭窄を含む血管外傷に応答して平滑筋細胞活性をインビボで阻害することに関する接合体の治療的効力を評価するための１つの良いモデルである。NR-AN-01（これらの研究では血管平滑筋結合タンパク質又は単にＶＳＭＢＰと呼ばれる；又ロリジンＡを伴う治療用接合体は、VSMBP-RAと呼ばれる）の効果を研究するために、家畜のブタが使用された。通常ブタの動脈中のバルーン血管形成術に続く事象は、以前に記述されてきた（Steele et al.,Cire Res.,57：105-112(1985)。これらの研究においては、過度に大きいバルーン（バルーン対動脈比、約１．５：１）を用いた頸動脈の膨張は結果として、長さ１．５〜２cmの部域全体にわたる完全な内皮裸出をもたらした。血栓症を最小限におさえるようにこの外傷損傷長さが選択されたが、それでもなお著しい血小板被着及び血栓形成が存在した。この処置は、同様に、内部弾性層を通して動脈中膜内への切開及び内側平滑筋細胞の壊死をも結果としてもたらした。平滑筋増殖に起因する内膜肥厚は、損傷から７日目に明らかとなり、１４日目で８５mmの平均最大厚みに達した。この新生内膜の組織学的外観は、ヒトの再狭窄の増殖性新生内膜組織に非常に類似している（Schwartz et al.,Circ 82：2190-2200(1990)）。
【０２０３】
NR-AN-01−ロリジンＡ接合体を用いて家畜のブタにおいて単一用量テストプロトコルが行なわれた。一時的滑り結紮により局限された外傷を受けた血管の領域内への、カテーテルを通したテスト接合体の局所的投与は、標的平滑筋細胞のための高い露呈レベルを提供しながら全身的毒性を減少するように設計された。動物モデル研究におけるこの動脈内投与経路は、ヒトの冠状動脈中の提案された経路をシミュレートする。テストプロトコルは、細動脈内の部位特異的なカテーテル投与された血管平滑筋結合タンパク質（ＶＳＭＢＰ）接合体の初期インビボスクリーニングとして設計された。
【０２０４】
遊離薬物の毒性も、細動脈の平滑筋細胞に対する病理生物学的効果について評価された。ロリジンA-NR-AN-01接合体の治療上有効な用量は、インビトロ研究により決定され、適切な細動脈内投与圧力は、例７で上述した通り、動物に対し遊離ＭＡｂ及びＭＡｂ接合体を投与することによって決定された。
体重がおよそ３０ポンドの６匹の家畜交雑種ブタ（Durox Ｘ）の離乳子畜ブタを実験で使用した。動物は、以下の治療養生法に対し無作為に割当てられた。ここで、各々のブタは、右及び左の頸動脈及び大腿動脈の間で分割され、そのうちの１つがＰＢＳ対照である（下表１〜３）。
【表１】
2010029703.tif 000006
【０２０５】
外科的処置：
テスト接合体及び対照化合物は、バルーンカテーテルによって誘発された内皮裸出及び外傷の部位において一回の動脈内部輸注として投与された。頸動脈及び大腿動脈は両方共、わずかな抵抗を生成するべく食塩水で充分に広げられた２３cmのサイズ３（大腿動脈）及びサイズ４（頸動脈）のUresil  Vascu-Plo（登録商標）シリコーン閉塞バルーンカテーテル（Uresil Technology Center，Skokie，IL）の管腔内通過によって内皮１cm〜２cmにわたりすり減らされた。この技術は、動脈のわずかな広がりを生み出した。この処理の後、すり減った領域の端部近くに３〜０シルクの近位及び遠位滑り結紮を設置し、Inflation Pro （登録商標）（USCI, C. R. Bard, Inc., Billerica, MA）圧力注射にとりつけられたサイズ８のフランス式小児補給用カテーテル（Cutter-Resiflex，Berkeley，（Ａ）を用いて、３分間３大気圧で裸出された体節に直接、テスト接合体及び対照化合物を投与した。３分間の露呈期間の後、滑り結紮を除去し、動脈血液流を再度樹立した。これらの研究においては、処理済み領域内での加圧下の輸注を達成するのに必要とされる通りに、００シルク縫合を用いて大腿又は頸動脈の分岐を結紮した。大腿動脈の最大の遠位分岐（伏在動脈）を切開し、その後主大腿動脈内へ通されるカテーテルのための進入部位としてこれを用いた。主大腿動脈内のこのカテーテル法処置の後、二次的分岐を結紮した。これらのケースにおいては、カテーテルの進入を可能にするため結紮又は切開が用いられ、その後、５−０モノシラメンポリブエステル（Novafil，B & G Monofil Inc.，Monati，PR）の３〜４縫合で開口部が閉じられた。
【０２０６】
追従処置
外科手術の後、ブタを、検疫及び外科手術回復期間中、セメント床を伴う３×５フィートの屋内飼養場の中に保持した。次にこれらのブタを、組織学用の組織の収集に先立つ５週間の治ゆ期間のうちの残りの期間中、屋内／屋外畜舎に移した。
動物は、外科手術から正常に回復し、外科手術部位での出血又は炎症の兆候は全く見られなかった。ドップラ聴診器を用い治療から５〜６日後に６匹の動物を検査し、各々の動物の体内の全ての動脈は開通していた。治療後、全ての動物は、正常な食欲、活動性及び体重増加を示した。
【０２０７】
肉眼による病理及び組織学的評価
動脈の外傷化及び治療から５週間後に、動物を、体重３０ポンドあたり０．６ｍｌのTelazol(登録商標)（チレタミン塩酸塩：A. H. Robins Co.，Richmond，VA）及び０．５ｍｌのキシラジン（Lloyd Laboratories，Shenandoah，IA）で鎮静し、ヘパリン化し（静脈内２ｍｌのナトリウムヘパリン，１０００単位／ｍｌ）、静脈内ペントバルビトールにより安楽死させた。治療された体節に対し遠位及び近位の両方で正常な血管が含まれた状態で、右及び左の頸動脈及び大腿動脈を除去した。動脈が測定され、結紮及び肉眼的な異常の場所が指摘された。動脈を２mmの間隔で離断し、O.C.T.（最適切断温度）化合物（Tissue Tek（登録商標）. Miles Laborotories Inc., ElKhart. IN）を用いて低温鋳型内に順序よく配置し、液体窒素内で冷凍した。ブロックを５ミクロンで細分し、形態学的研究のためＨ＆Ｅ，Massonsトリクローム及びMovatsペンタクロームで染色した。血管平滑筋の免疫組織学的染色のためにも切片が用いられた。
【０２０８】
動脈の段階的切片の組織学的検査は、外傷を受けRA-NR-AN-01接合体で治療した領域内の内膜平滑筋増殖の顕著な阻害を明らかにした（表２）。この阻害は、血管の亜肉眼的評価でさえ明白であった。動脈壁内の平滑筋細胞の死枯の徴候が最小限しか又は全く無い状態で、内膜平滑筋細胞増殖の阻害が生み出された。このような外傷を受けた動脈の横断面が、図９Ａ及び９Ｂに示されている。
【表２】
2010029703.tif 000007
【０２０９】
図９Ａに示された結果は、血管形成術から５週間後の未処理の動脈の横断面を（１６０倍の倍率で）示している。動脈の優勢な組織学的特長としては、明らかに内膜平滑筋増殖に起因する（図９Ａ＃３参照）内部弾性層（図９Ａ＃２参照）から離れる方向への内皮の移動が含まれる。
図９Ｂに示された結果は、血管形成術及びRA-NR-AN-01治療用接合体の輸注から５週間後の処理済み動脈の横断面を（１６０倍の倍率で）示している。この切片内の血管は、図９Ａに示された血管よりも大きい機械的応力を受け、数多くの部位で外部弾性膜が破断し、中膜の外部層内の付随する平滑筋細胞増殖が観察された（すなわち、図９Ｂ中＃４を参照のこと）。内部弾性層（図９Ｂ，＃２参照）からの内皮（図９Ｂ，＃１参照）の移動が欠如していることによって立証されているように、治療用接合体での処理は内膜肥厚を阻害した。驚くべきことに、内膜平滑筋細胞に対するこの阻害効果は、外部弾性膜が破断された部域（図９Ｂ，＃４参照）内の内側平滑筋細胞の肥厚を阻害することなく達成された。
創傷の治ゆは、内膜肥厚及び狭窄又は中膜内の平滑筋細胞の壊死といった不利な影響無く、治療された血管内で進行することから、これは、きわめて幸運な結果である。
【０２１０】
これらの組織学的研究では、２’及び１３’の両方のロリジンＡ接合体の有効性についての比較も行なわれ、２’接合体(すなわち2’RA-HS-NR-AN-01)に比べ１３’接合体（すなわち13’RA-HS-NR-AN-01）が平滑筋細胞の内膜肥厚を阻害する上でより活性が高いと思われる、ということが発見された。この研究においては、１３’接合体の低圧輸注が高圧に比べより有効に平滑筋増殖を阻害すると思われ、１３’接合体は同様に２’接合体よりもさらに有効であると思われた。
【０２１１】
図９Ｂにおいては、血管形成術の後の部位において投与された治療用接合体が、未治療の血管の管腔を制限する平滑筋の肥厚の約９５％を阻害するという結果をもたらした（図９Ａ）。有意なことに、治療用接合体は、いずれの内皮にも影響を及ぼさず又は動脈壁の内側層内の平滑筋細胞中にいかなる壊死（すなわち細胞の死枯）の兆候も生成することなく、平滑筋細胞が内側平滑筋層から内膜内へと遊走するのに対してその効果を発揮した。研究では、血管壁に対する有毒効果の結果もたらされうるような単核浸潤又は繊維増多の何らかの組織学的兆候を示すことができなかった。同様に、治療された血管の内膜層内では、内皮の再成長すなわち内皮と内部弾性層（すなわち図９Ｂの＃１と＃２）の間に存在する内膜内で薄い平滑筋細胞全体にわたり成長する内部細胞がみられると共に、目に見える治ゆの兆候が観察された。これらの組織学的観察と組合わせると、血管の内膜層内の平滑筋肥厚を阻害する治療用接合体での治療の後の、創傷治ゆ、内皮再成長及び血管強度の改善といったきわめて望ましい特長が示唆されている。
【０２１２】
例８
血管平滑筋細胞インビトロＤＮＡ及びタンパク質合成阻害
血管平滑筋細胞内のＤＮＡ合成及びタンパク質合成を阻害するさまざまな治療用作用物質の能力をテストした。3Ｈ−ロイシン及び3Ｈ−チミジン摂取及び細胞毒性検定は、以下のプロトコルに従って行なった。
５分の露呈；3Ｈ−ロイシンの摂取：１ｍｌ／ウェルの割合で、無菌の２４ウェルの平板の中に、４００００細胞／ｍｌの割合で血管平滑筋細胞を播種した。
平板を一晩、加湿した大気（飽和）中５％のＣＯ2、９５％の空気で３７℃インキュベートした。５分間又は２４時間、血管平滑筋細胞を用いて、問題の治療用作用物質の対数希釈液をインキュベートした。治療用作用物質の試料を、５％の胎児ウシ血清（FBS，Gibco BRL，Gaithersburg，MD）及び５％のSerum Plus (登録商標)（JRH Biosciences Lenexa, KS）と共に、DMEM：F-１２培地（Whittaker Bioproducts，Walkersuille，Maryland）中で希釈させた。
治療用作用物質のインキュベーションの後、溶液を吸引し、５％のSerum Plus (登録商標)を伴うロイシン無しのDMEM（ダルベッコ修正イーグル培地）中の０．５マイクロキュリー／ｍｌの3Ｈ−ロイシンを１ウェルあたり１ｍｌ添加した。平板を、加湿大気中５％のＣＯ2で３７℃で一晩再度インキュベートした。生存度及び細胞数を決定するため、評点目盛を用いる倒立顕微鏡を使用して視覚的に、細胞をグレード付けした。１〜３のグレードは、３＝１００％，２＝７０％〜１００％及び１＝０％〜７％で、対照ウェルと比較した細胞生存度及び細胞数のパーセントに基づいている。この評点の記録は、治療用作用物質の直接的細胞毒性効果を決定する上で一助となった。次に、培地を吸引し、低温の５％ TCAで２回細胞を洗浄した。１ウェルにつき４００マイクロリットルの０．２ＭのNaOHを添加し、平板を回転プラットフォーム上で室温で２時間インキュベートした。１ウェルあたり２００マイクロリットルの細胞溶液をプラスチックのシンチレーションバイアル（Bio-Rad Laboratories) 内に移し、渦流付加の前に４ミリリットルのBio-Safe(登録商標) II 液体シンチレーション液（Research Products InterCorp，Mount Prospect, IL)を添加した。Lotus１−２−３（登録商標）ファイルへの変換及びLotus１−２−３（登録商標）を用いた解析の為Beckman 「データ補足」ソフトウェアとインタフェースされたBeckman LS 2800液体シンチレーション計数器でバイアルを計数した。
【０２１３】
５分間の暴露：3Ｈ−チミジンの摂取：
無菌２４ウェル平板内で加湿された５％のＣＯ2の環境の中で３７℃で一晩、５％のFBS（Gibco）を伴う完全培地中で、血管平滑筋細胞をインキュベートした。ウェルから培地を吸引し、成長因子を補足した血清遊離培地〔DMEM：Sigma Chemical，St.Louis，Missouriから入手可能なインシュリン（５マイクログラム／ｍｌ），トランスフェリン（５マイクログラム／ｍｌ）及び亜セレン酸ナトリウム（５ナノグラム／ｍｌ）を含有する成長因子カクテル、カタログ番号I1884を補足したＦ−１２塩基性培地〕を添加した。この培地中で細胞を２４時間インキュベートした。５分の治療用接合体露呈中、治療用作用物質の対数希釈液を完全培地中で細胞と共にインキュベートした。５分後でかつ培地を吸引した後、完全培地内に分散された１．０マイクロキュリー／ｍｌの3Ｈ−チミジンを１ウェルあたり１ｍｌ添加した。２４時間の露呈には、完全培地中に分散させた１．０マイクロキュリ／ｍｌの3Ｈ−チミジン１ｍｌ／ウェル及びテスト中の治療用作用物質の対数希釈液を用いた細胞のインキュベーションが関与していた。両方の露呈試行において、次に細胞を、加湿した５％ＣＯ2の環境中で３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、生存度及び細胞数について視覚的に評点した。細胞を洗浄し、3Ｈ−ロイシンプロトコルについて記述したとおり、プラスチックシンチレーションバイアル内への移送のため準備した。Lotus１−２−３（登録商標）ファイルへの変換及びLotus１−２−３（登録商標を用いた解析のためBeckman 「データ補足」ソフトウェアとインタフェースされたBeckman LS2800液体シンチレーション計数器でバイアルを計数した。
【０２１４】
これらのプロトコルは、その他の標的細胞個体群特に付着性単層細胞型について使用できるものである 形態学的細胞毒性評価−パルス暴露：商業的に調製された４ウェルスライド（Nunc．Inc.，Naperville，Illinois）上に１ウェルあたり１ｍｌ培地につき４．０×１０4個の細胞の割合で血管平滑筋細胞を播種した。２回のパルス暴露長（５分及び２４時間）及び規定の増分評価点（２４時間〜１２８時間）に対応するよう、充分なスライドを播種した。全てのスライドは、検定異常があった場合にそれを明らかにするべく、全く同一に作業された。治療用作用物質は、3Ｈ−ロイシン及び3Ｈ−チミジン検定内で使用されたものと同じ培地中で希釈した。各々の４ウェルスライドの濃度について、上述の3Ｈ−ロイシン及び3Ｈ−チミジン検定により決定されるように、最小有効濃度（ウェル「Ｃ」）より１ログ高い濃度（ウェル「Ｂ」），１ログ低い濃度（ウェル「Ｄ」）に見積り限界を定めた。
【０２１５】
正常な形態学の対照として、１つのウェル（ウェル「Ａ」は未処理のまま放置した（培地のみ）。３７℃、５％ＣＯ2の加湿したインキュベータ中でインキュベーションを行った。２つの（５分及び２４時間）露呈点の各々の後、治療用作用物質培地を、未処理ウェルを含めた各ウェルから吸引した。次に、吸引した培地の代わりに新鮮な培地を１ミリリットル添加した。増分された評価点の各々に達するまで、再インキュベーションを続けた。これらの点において、培地を吸引しその後１ｍｌの１０％中性緩衝ホルマリンで一時間置換し、適切に定着させた。これらの定着したスライドを、形態学的評価及びグレード付けのためヘマトキシリン（核）及びエオシン（細胞質）で染色した。
【０２１６】
結果：
２４時間の3Ｈ−ロイシンタンパク質阻害検定及び２４時間の3Ｈ−チミジンＤＮＡ合成阻害検定の結果は、それぞれスマリン、スタウロスポリン、ニトログリセリン及びサイトカラシンＢについて、図１０Ａ−１０Ｄに示されている。テストされた化合物は全て、利用可能な治療範囲（3Ｈ−ロイシン検定の曲線の下の面積は、3Ｈ−チミジン検定から結果として得られるものよりも大きい）を示し、本発明の持続放出剤形の実施形態における実用的な有用性を表わしていた。より特定的に言うと、化合物は、血管平滑筋細胞のタンパク質合成を阻害するよりも高い程度まで、５％のＦＢＳの存在下でＤＮＡ合成を受ける血管平滑筋細胞の能力を阻害した。５分間及び２４時間のパルス露呈の間のスラミン、スタウロスポリン、ニトログリセリン及びサイトカラシンＢのタンパク質及びＤＮＡ合成阻害効果は、それぞれ図１０Ａ−Ｄに示されている。
【０２１７】
例９
血管平滑筋細胞によるターゲティングされた粒子の特異的結合及び内在化
結合タンパク質又はペプチドでコーティングされた粒子を結合し内在化させる血管平滑筋細胞の能力を、インビトロ及びインビボの両方でモノクローナル抗体（ＮＲ−ＡＮ−０１）でコーティングされた金球を用いて実証した。
血管平滑筋細胞組織培養（B054），抗原陽性対照細胞系統（A375）及び抗原陰性対照細胞系統（HT29）を、NR-AN-01でコーティングされた１グループ及び第２の未コーティング対照グループを含めて、１０ｎｍの金球を用いてインキュベートした。細胞を、単層及び細胞懸濁培養として球に暴露させ、電子顕微鏡により結合及び内在化について６つの時点（すなわち１分，５分，１５分，３０分，６０分及び２４時間）で検査した。
【０２１８】
表３は、細胞表面に対する結合が特異的であることを表わす、実験の結果を示す。表３全体を通して使用された相対的グレード付けシステムは、粒子結合の主観的査定を表わし、ここで０＝無；１＝最小；２＝弱；４＝強である。平滑筋細胞及び対照細胞の両方の単層表面上に粒子の集合体が沈降した場合、粒子はマクロ食作用及びミクロ食作用により非特異的に内在化させられた。細胞が細胞懸濁液中に維持されたとき、非特異的内在化は最小又は不在であった。HT29細胞により産生された表面ムチンに対するNR-AN-01の無い金球の非特異的付着が観察され、その弱い非特異的内在化を結果としてもたらした。NR-AN-01ターゲティングされた金球の血管平滑筋細胞摂取は、細胞懸濁培養中で非常に特異的であった。
【表３−１】
2010029703.tif 000008
【表３−２】
2010029703.tif 000009
【表３−３】
2010029703.tif 000010
【表３−４】
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【表３−５】
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【０２１９】
実施例１０
スタウオスポリンおよびサイトカラシンによる血管平滑筋のin vitro DNAおよびタンパク質合成の阻害
血管平滑筋におけるin vitroのＤＮＡおよびタンパク質の合成を阻害するスタウオスポリンおよびサイトカラシンの能力を試験した。下記のプロトコールに従い、3Ｈ−ロイシンおよび3Ｈ−チミジンの吸収および細胞障害性のアッセイを実施した。
培養した細胞：
B054細胞（ヒヒの平滑筋細胞）をヒヒの大動脈平滑筋細胞の外植片から誘導した。５％の胎仔ウシ血清（FBS、Gibco）および５％の血清プラス（Serum PlusR）（JRH Biologicals）（「完全培地」）を含むDMEM（ダルベッコの変性イーグル培地）：Ｆ−１２培地（Whittaker Bioproducts、マリイランド州ウォーカーズヴィレ）中で細胞を拡大し、そして継代７における将来の使用のために細胞の種子ロットを液体窒素中で凍結させた。
【０２２０】
５分の暴露；タンパク質合成アッセイ：
実施例８、「５分の暴露；3Ｈ−ロイシンの吸収」に記載するように、血管平滑筋の細胞を40,000〜50,000細胞／ｍｌにおいて接種し、プロセスした。スタウロスポリンの対数希釈物（２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌおよび０．０２ｎｇ／ｍｌ）を完全培地の中に分散させた。サイトカラシンＢについて、２０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌおよび０．００２μｇ／ｍｌにおける対数希釈物を完全培地の中に分散させた。次いで完全培地を対照ウェルに添加した。１ｍｌ／ウェルの各治療剤希釈物を四重反復実験のウェルに添加し、そして問題の治療剤を血管平滑筋の細胞と室温において無菌の通気フード中で５分間インキュベートした。治療剤のインキュベーション後、実施例８、「５分の暴露；3Ｈ−ロイシンの吸収」に記載するように、ウェルを引き続いて処理した。
【０２２１】
５分の暴露；ＤＮＡ合成アッセイ：
「５分の暴露；タンパク質合成アッセイ」に前述したように、血管平滑筋（B054）細胞を２４ウェルのプレートに接種し、プロセスした。被験治療剤と５分間インキュベートした後、培地を吸引し、完全培地中に分散させた１ｍｌ／ウェルの１．０μＣｉ／ｍｌの3Ｈ−チミジン（3Ｈ−ロイシンよりむしろ）を添加した。次いで細胞を加湿した５％ＣＯ2の環境中で３７℃において一夜インキュベートした。次いで前述のタンパク質合成アッセイに記載するように、治療剤の毒性作用を測定した。
【０２２２】
２４および１２０時間の暴露；タンパク質合成アッセイ：
血管平滑筋（B054）細胞を20,000細胞／ｍｌにおいて無菌の２４ウェルのプレートの中に接種し、完全培地（１ｍｌ／ウェル）中で一夜３７℃、５％ＣＯ2、９５％の空気において加湿した雰囲気（飽和）中でインキュベートした。スタウロスポリンの対数希釈物（１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌおよび０．０１ｎｇ／ｍｌ）を、前述したように、２つの培地の中に順次に分散させた。サイトカラシンＢについて、後述するように、１０μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの希釈物を２つの培地の中に順次に分散させた：培地（１）＝完全培地；および培地（２）＝０．５μＣｉ／ｍｌの3Ｈ−ロイシンを含むDMEM（無ロイシン）。培地（２）を実験の最終の２４時間のインキュベーション期間の間使用する。
さらに詳しくは、２４時間のアッセイにおいて、各治療剤を、前述したように、培地（２）の中に希釈した。培地（１）をウェルから吸引し、そして培地（２）中の治療剤の希釈物のアリコートを四重反復実験において適当なウェルに添加した。次いで培地（２）を対照ウェルに添加した。
【０２２３】
１２０時間のアッセイにおいて、各治療剤を、前述したように、培地（１）の中に希釈した。培地（１）をウェルから吸引し、そして培地（１）中の治療剤の希釈物のアリコートを四重反復実験において適当なウェルに添加した。次いで培地（１）を対照ウェルに添加した。培地を２４時間毎に交換し、新鮮な治療剤を被験ウェルに添加した。９６時間（すなわち、第４日）に、前述したように、各治療剤を培地（２）の中に希釈した。培地（１）をウェルから吸引し、そして培地（２）中の治療剤の希釈物のアリコートを四重反復実験において適当なウェルに添加した。次いで培地（２）を対照ウェルに添加した。
【０２２４】
3Ｈ−ロイシン（対照）中の被験治療剤を加湿した雰囲気中で３７℃、５％ＣＯ2において一夜インキュベートした。次いで前述の５分の暴露：タンパク質合成アッセイに記載するように、治療剤の毒性作用を測定した。さらに、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡（Zeiss、西ドイツ）を使用して３２０×で、各希釈物中の細胞の変化を写真撮影した。次いで培地を吸引し、前述したように、細胞をＴＣＡでプロセスした。
【０２２５】
２４および１２０時間の暴露；ＤＮＡ合成アッセイ：
このアッセイは「２４および１２０時間の暴露；タンパク質合成アッセイ」について記載した手順に従い実施したが、ただしこの２４および１２０時間の暴露；ＤＮＡ合成アッセイにおける培地（２）は次の通りである： 培地（２）＝１．０μＣｉ／ｍｌの3Ｈ−チミジンを含む完全培地。培地（２）を実験の最終の２４時間のインキュベーションにおいて使用する。
これらのタンパク質およびＤＮＡの合成アッセイは、他の標的細胞集団、特に付着性単層細胞型とともに使用できる。
【０２２６】
結果：
培地で処理した対照の百分率として、各治療剤の最小有効投与量（MED）を決定した；対照値の５０％を細胞障害性基準として選択した。５分の暴露において、スタウロスポリンはタンパク質合成アッセイにおいて１００ｎｇ／ｍｌのMEDを示し、そしてＤＮＡアッセイにおいて１ｎｇ／ｍｌのMEDを示した。スタウロスポリンについての２４時間のMEDはタンパク質合成アッセイにおいて１０ｎｇ／ｍｌであり、そしてＤＮＡ合成アッセイにおいて１ｎｇ／ｍｌであった。双方のアッセイはスタウロスポリンの１２０時間の暴露について１ｎｇ／ｍｌのMEDを与えた。
【０２２７】
５分の暴露において、サイトカラシンＢはタンパク質合成アッセイならびにＤＮＡアッセイにおいて１０μｇ／ｍｌのMEDを示した。サイトカラシンＢについて２４時間のMEDはタンパク質合成アッセイにおいて１．０μｇ／ｍｌであり、そしてＤＮＡ合成アッセイにおいて０．１μｇ／ｍｌであった。双方のアッセイは、スタウロスポリンの１２０時間の暴露について、ほぼ０．１μｇ／ｍｌのMEDを与えた。
【０２２８】
前述のサイトカラシンＢについて記載したのと同一の希釈物を使用して、サイトカラシンＣおよびサイトカラシンＤの治療剤を２４および４８時間の暴露において試験した。２４時間において、サイトカラシンＣはタンパク質合成アッセイにおいて１．０μｇ／ｍｌのMEDを示し、そしてＤＮＡ合成アッセイにおいて０．０１μｇ／ｍｌのMEDを示した。４８時間において、サイトカラシンＣはタンパク質合成アッセイおいて０．１μｇ／ｍｌのMEDを示し、そしてＤＮＡ合成アッセイにおいて０．０１μｇ／ｍｌのMEDを示した。サイトカラシンＤは２４時間のタンパク質合成アッセイにおいて１．０μｇ／ｍｌのMEDおよびＤＮＡ合成アッセイにおいて０．１μｇ／ｍｌのMEDを示した。サイトカラシンＤに対する４８時間の暴露は、タンパク質合成アッセイおよびＤＮＡ合成アッセイの双方において０．１〜０．０１μｇ／ｍｌの範囲のMEDを与えた。
【０２２９】
実施例１１
血管平滑筋の細胞の移動の阻害
下記のプロトコールに従い、サイトカラシンＢによる平滑筋細胞の移動の程度を測定する引掻きアッセイを実施した： 実施例１０に記載するように、血管平滑筋の細胞（B054）をヒヒの大動脈の平滑筋細胞の外植片から誘導した。約５ｍｌの培地を保持する、平らな底の６ウェルの組織培養プレート中で細胞を成長させた。血管平滑筋の細胞を200,000細胞／ウェルにおいてプレートし、３７℃において加湿した５％ＣＯ2のインキュベーターの中に入れた。次いでクランプまたはプライヤーにより保持した片刃のレーザーブレードの無菌の部分でウェルを引掻き、ウェルの底と９０°の角度で無菌的に接触させた。レーザーブレードをウェルの底と接触させたまま、引掻きに沿った小さい区域からの細胞を無菌の綿の先端のアプリケーターにより除去した。インキュベーション後、「引掻いた」区域における細胞の存在は引掻き線を横切る細胞の移動を示す。対照のインキュベーションは有意な細胞の移動を示し、そして治療剤に暴露した細胞の移動を比較する標準として働く。
【０２３０】
簡単に述べると、１ｍｇ／ｍｌのジメチルスルホキシド（DMSO）中のサイトカラシンＢ（Sigma Chemical Co.）の原溶液を調製した。サイトカラシンＢの被験希釈物および対照培地を添加した。各実験を２組のプレートを含んだ：
Ａ組：１、３、６、８および１０日間のみの被験治療剤の暴露；および
Ｂ組：１、３、６、８および１０日間のみの被験治療剤の暴露、および引き続く対照培地を使用する７日の回復時間。
双方の組のプレートを固定し（PBS中の１０％のホルマリン）時限暴露の終わりにおいて染色した（０．０２％のクリスタルバイオレット）。サイトカラシンＢの試験濃度は１、０．１および０．０１μｇ／ｍｌであり、そして陰性の培地の対照を含めた。新鮮な培地および薬剤を３回／週において供給した。
【０２３１】
これらの実験の結果を表４に示す。この表において、「Ｍ」は移動の等級を示し、ここで引掻きに隣接するきれいにされた区域の中への血管平滑筋の細胞の移動について、−＝移動なし；＋１＝最小；＋２＝軽度；＋３＝中程度；および＋４＝顕著（最大の密度；細胞の接触の阻害の限界）。この表において、「Ｔ」は形態学的等級を表し、ここで−＝毒性なし；＋１＝最小；＋２＝軽度；＋３＝中程度；および＋４＝顕著な毒性。移動の結果を、「ウェルのきれいにされた区域における等級／ウェルの未分布の領域における等級」として表す。毒性の値は、各ウェルにおけるすべての細胞についての等級を表す。
【０２３２】
データが示すように、サイトカラシンＢは０．１μｇ／ｍｌの投与量でわずかに（−〜＋１）形態学的毒性で引掻きに隣接するきれいにされた区域の中への血管平滑筋の細胞の移動（＋１〜＋２）を阻害する。また、データが示すように、処理された細胞（０．１μｇ／ｍｌ）は、治療剤への１０日の連続的暴露後においてさえ、治療剤の除去後に移動する（＋３〜＋４）能力を回復する。
【表４】
2010029703.tif 000013
【０２３３】
実施例１２
血管平滑筋の細胞に対する治療剤の細胞障害性作用−パルスおよび連続的暴露
血管平滑筋の細胞を２つの実験の１つにおいて治療剤に実験した：パルス暴露：
パルス暴露のプロトコールは上の実施例８に記載されている（「形態学的細胞障害性の評価−パルス暴露」参照）。
連続的暴露：
パルス暴露と同一の方法を連続的暴露の形態学的細胞障害性の評価に使用するが、ただし被験ウェルを暴露期間の間に培地中の治療剤に暴露する。培地および治療剤を毎日、未処理対照ウェルを含む、各ウェルから吸引し、１ｍｌの新鮮な培地および治療剤（または対照ウェルについて培地単独）と置換する。長期間の連続的暴露プロトコールの増分的評価時点の各々が達成されるまで、再インキュベーションを実施した。これらの増分的評価時点は、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、２１６および２６４時間であった。表示した期間において、パルス暴露プロトコールにおけるように、適当な細胞を固定し、染色し、評価した。連続的暴露実験の結果を、スラミン、スタウロスポリンおよびサイトカラシンＢについて表５に示す。表５に表す５分および２４時間のデータは、第１０Ａ図、第１０Ｂ図および第１０Ｃ図の中に含有されているデータと相関する。
【表５】
2010029703.tif 000014
【０２３４】
in vitroの有効投与量において、サイトカラシンＢ（１μｇ／ｍｌ；抗移動／収縮有効投与量）およびスタウロスポリン（１ｎｇ／ｍｌ；抗増殖有効投与量）は、それぞれ、１（最小）および２（軽度）の細胞障害性等級を示した。独立の研究は、３（中程度）以下の等級が本発明の静細胞、抗増殖剤について好ましいことを示した。
【０２３５】
実施例１３
in vivo BRDUアッセイ：血管平滑筋の細胞の増殖の阻害
BRDUアッセイ：
細胞のＤＮＡ合成および増殖の間のＤＮＡの中への基剤類似体の５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（BRDU、Sigma Chemical Co．から入手可能である）の取込みを測定することによって、in vivo血管平滑筋の増殖を定量した。１時間のパルス標識化は、パルス期間の間の分割する細胞の数の評価を可能とする。
【０２３６】
in vivoブタの血管の研究とともに標準的評価技術として、前述のBRDUパルスの標識化プロトコールを使用する。外科的および治療的手順（例えば、本明細書における実施例７および１１において論じられている）後および外科的回復期間後、ブタを鎮静させ、組織の収集の１時間前に、BRDUでパルスした。
【０２３７】
簡単に述べると、ブタを筋肉内注射によりチレタミン塩酸塩およびキシラジン（実施例７、「総病理学的および組織学的評価」におけるように）で鎮静させた。次いで横の耳の静脈を介してBRDUを静脈内投与した。２ｍｌのBRDUを５０ｍｇ／ｍｌの濃度において各３０〜４０ポンドのブタに投与した。１時間後、ペントバルビタールの静脈内投与により、ブタを殺した。次いで被験動脈を取出した（セグメントは処理した動脈セグメントに関して近位に位置する正常の血管および、可能ならば、遠位に位置する正常の血管を含んだ）。動脈セグメントを２ｍｍの間隔で離断し、O.C.T.（最適な切断温度の）化合物（Tissue TekR、Miles Laboratories,Inc．、インジアナ州エルクハート）とともにクライオモルド（cryomolds）の中に順序正しく配置し、液体窒素中で凍結した。ブロックを５ミクロンで切断し、下記の手順を使用して免疫組織学的に染色してBRDUを検出した。
【０２３８】
BRDU標識化細胞の検出：
BRDU（１７ｍｌの無菌の水および３ｍｌの１ＮのNaOH中で希釈した１ｇのBRDU）のパルス標識化および被験動脈セグメントの取出しおよび切断（前述した）後、抗BRDUモノクローナル抗体を使用する免疫組織学的染色は、特定した期間にわたる有糸分裂指数を測定する視的手段を提供する。免疫組織学的染色法を次のようにして実施した：
１） 被験動脈の５μｍの切片を冷アセトン（−２０℃）中で１０分間脱水した；
２） 切片を顕微鏡のガラスのスライド上のマウントし、スライドを３７℃の炉内で１０分間乾燥した；
３） スライドをＰＢＳ中で１０分間再水和させた；
４） １ＮのＨＣｌを使用してスライドをフォイルゲン酸加水分解し、ここで１ＮのＨＣｌの２つのアリコートを進行前に３７℃および６０℃に予熱した；
５） スライドを１ｍｌの１ＮのＨＣｌで３７℃において１分間すすいだ；
６） スライドを６０℃の１ＮのＨＣｌに１５分間移した；
７） スライドを１ｍｌの１ＮのＨＣｌで３７℃において１分間すすいだ；
８） スライドを室温のＰＢＳで洗浄し、５分の間隔でＰＢＳを３回交換した；
９） 切片上の内因性、交差反応性部位を正常のヤギ血清（１：２５、ＰＢＳ中）で２０分間ブロックした；
１０）工程８におけるように、スライドをＰＢＳで洗浄した；
１１）切片をマウス抗BRDU抗体（DAKO Corporation、カリフォルニア州カーピンテリア）を１０μｇ／ｍｌにおいて３０分間インキュベートした；
１２）工程８におけるように、スライドをＰＢＳで洗浄した；
１３）切片をセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化（HRPOギ抗マウスIgG1(Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc.、ペンシルベニア州ウェストグローブ；ＰＢＳ中で１：２０に希釈した）および４％のヒトＡＢ血清と３０分間インキュベートした；
１４）工程８におけるように、スライドをＰＢＳで洗浄した；
１５）切片をクロモーゲン（３，３’−ジアミノベンジジン(DAB；Sigma)２００ｍｌのＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌ）および２００μｌの３０％Ｈ2Ｏ2と１０分間インキュベートした；
１６）工程８におけるように、スライドをＰＢＳで洗浄した；
１７）試料をギル（Gill）Ｉヘマトキシリン（Gill I Lerner Laboratories、ペンシルベニア州ピッツバーグ；３０滴）で対比染色した；
１８）工程８におけるように、スライドをＰＢＳで洗浄し；青色化溶液（５００ｍｌの脱イオンＨ2Ｏ中の１ｇの炭酸リチウム）ですすぎ；脱イオン水で洗浄した；そして １９）次いで被験試料を脱水し、清浄にし、カバーガラスをした
この手順の結論として、陽性の免疫組織学的染色は１または２以上の反応性部位において褐色を示す。
細胞破壊剤はＰＢＳ対照に関してBRDUの吸収阻害した；しかしながら、サイトカラシンＢおよびスタウロスポリンは血管平滑筋の細胞を殺さないでBRDUの吸収（すなわち、細胞の増殖）を阻害した。BRDUで標識化された血管平滑筋の細胞の数を、次のようにして４００×の倍率で等級づけた： １＝≦／高い力の場（ＨＰＦ）；２＝２〜５／ＨＰＦ；３＝＞５〜≦１０／ＨＰＦ；および ４＝＞１０／ＨＰＦ。
【０２３９】
サイトカラシンＢおよびスタウロスポリンの双方はバルーン外傷後２４時間の間増殖を阻害し（等級１）、外傷前の基線のそれに等しいBRDU標識化の等級を生じた（等級１）。ＰＢＳおよびモノクローナル抗体の対照は、同一の期間の間に２．５〜４のBRDU標識化の等級を示した。外傷後４日において、サイトカラシンＢまたはスタウロスポリン、ならびにＰＢＳおよびモノクローナル抗体の対照で処理した動脈は４のBRDU標識化の等級を示した。サイトカラシンＢおよびスタウロスポリンの抗増殖、非細胞破壊性質は、これらの治療剤を血管の狭窄の減少のための持続放出性投与処方物とすることができることを示唆する。
【０２４０】
実施例１４
ラテックス粒子のカルボン酸官能基に対するＮＲ−ＡＮ−０１抗体の直接的結合
下記の無菌的技術により、抗体を被覆したラテックス粒子（抗体被覆した、持続放出性投与形態のモデル）と調製することができる：結合：
４ｍｌの０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０R（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ）を含有する０．０５Ｍのホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５、に、０．５ｍｌの５ｍｇのＮＲ−ＡＮ−０１モノクローナル抗体を含有するＰＢＳを添加する。室温において、この溶液に、渦形成しながら、２．５ｍｌの５０ｍｇの１μｍの直径のカルボキシレート化ラテックス粒子を含有する水性懸濁液を添加する。その直後、０．５０ｍｌの１００ｍｇの新しく溶解した１（３−ジメチル−アミノプロピル）３−エチルカーボジイミドＨＣｌ含有する水を渦形成しながら添加する。次いでこの溶液を震盪しながら室温において１〜２時間インキュベートする。次いで反応混合物を５０ｍｌの０．２％のゼラチン安定剤（リン酸塩／ゼラチン緩衝剤）を含有する５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．６、で希釈する。この混合物を４〜１０℃において４０，０００×ｇで２時間遠心する。上清をデカントし、ペレットを低いレベルの超音波処理を使用して１０秒間５０ｍｌのリン酸塩／ゼラチン緩衝液の中に再懸濁させる。遠心を反復し、ペレットを２回再懸濁させ、次いでリン酸塩／ゼラチン緩衝液の中に再懸濁させる。次いで、標準的プロトコールおよびソルビトール賦形剤を使用して、結合した粒子を凍結乾燥する。
【０２４１】
特性決定：
（ａ）選別：
レーザー異方性により、または、１μｍより大きい粒子について、顕微鏡検査により、粒度の均質性を評価する。
（ｂ）比結合評価：
インキュベーション混合物の中に含有されるブロッカーのタンパク質／ペプチドを含むか、あるいは含まない、タンパク質／ペプチド複合体を結合粒子とインキュベーションした後、組織または細胞ペレットのマイクロトームスライスの血液学的検査により、平滑筋細胞への比結合を測定する。好ましい検出技術は、第２抗体アッセイ（すなわち、抗マウスＩｇ）または競合アッセイ（すなわち、放射性同位元素で標識化したタンパク質／ペプチド複合体と組合わせたラジオシンチグラフ検出）を包含する。
（ｃ）タンパク質／ペプチドの誘導化の程度の評価：
ラテックス粒子を放射性同位元素標識化抗体で被覆し、次いで被覆された粒子に関連する放射能を検出することによって、この測定を実施する。
【０２４２】
抗体で被覆された粒子の特性決定を表６に記載する。
【表６】
2010029703.tif 000015
【０２４３】
抗体複合化の間のｐＨの粒子凝集効果を表７に表す。
【表７】
2010029703.tif 000016
【０２４４】
これらのデータが示唆するように、タンパク質またはペプチドを本発明の持続放出性投与形態に結合させることができる。さらに詳しくは、本明細書において記載する手順に従いまたはこの明細書に記載する別の手順に従い、末端のカルボン酸基を有するポリ乳酸／グリコール酸粒子を結合する。
【０２４５】
実施例１５
サイトカラシンＢのｉｎ ｖｉｖｏ研究サイトカラシンＢの生物分布：
サイトカラシンＢの生物分布を測定するために、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのサイトカラシンＢを注射（ｉ．ｐ．）した。対照マウスにDMSO／Tween20／カルボキシメチルセルロース（「ベヒクル」）を注射する。サイトカラシンＢまたはベヒクルの投与後３、１２、２４および７２時間に、マウスを殺した。器官を取出し、均質化し、抽出し、組織中のサイトカラシンＢの量をHPLCにより定量した。
サイトカラシンＢの約７５％が腹腔の中に、または注射部位において残留した。
試験した器官のうちで、最高の量のサイトカラシンＢが肝臓の中に見出された。
引き続く分析において、サイトカラシンＢの最大の許容される投与量は５０ｍｇ／ｋｇであることが示され、そしてこの投与量を２日毎に投与することができる。
【０２４６】
サイトカラシンＢを、また、マウスに３．５ｍｇ／ｋｇ（メタノールまたはTween20／カルボキシメチルセルロース中の）で静脈内に投与した。サイトカラシンＢ投与後２分、１５分、３０分、３時間および１２時間にマウスを殺し、そして組織の抽出物をＴＬＣによりサイトカラシンについて分析した。組織の抽出物からのサイトカラシンＢの最大の回収率は３２％であった。データが示すように、サイトカラシンＢは肺および注射部位に局在化し、そして３．５ｍｇ／ｋｇのサイトカラシンＢは急性毒性を生じなかった。投与後１２時間まで、組織の中に非常に低いレベルのサイトカラシンＢが存在した。
【０２４７】
外部に結合した膀胱を有するＢＡＬＢ／Ｃマウスに、3Ｈ−サイトカラシンＢ（２μｇ；３０μＣｉ／μｇ）をｉ．ｖ．注射した。注射後１５分、３０分、２時間または１６時間に動物を殺した。器官を取出し、吸い取り、秤量し、空気乾燥し、反応性についてアッセイした。全注射投与量の５０〜７３％がサンプリングした組織（血液、心臓、脳、筋肉、骨、肺、肝臓、脾臓、胃、腎臓、腸、および膀胱）の中に存在した。血液の3Ｈ−サイトカラシンＢのクリアランスは極めて急速であり、１５分までに循環する注射投与量は１％より少なかった。肝臓の骨格筋肉および腸のみが3Ｈ活性の有意な保持を示した。すべての組織は、１６時間までに組織の１ｇ当たり注射投与量の１．５％より少ない3Ｈ活性のクリアランスを有した。
【０２４８】
サイトカラシンＢの代謝：
3Ｈ−サイトカラシンＢを１．５または８μｇ／ｍｌの投与量において生存可能なまたは非生存可能なヒトの肝臓スライスおよび培地と混合し、そして培地または組織中の3Ｈ−サイトカラシンＢの量をHPLCにより評価した（表８および９）。
また、被験治療剤にヒト肝臓スライスを２４時間暴露した後、３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）をモニターしてミトコンドリアの機能の投与量依存的変化を評価することによって、3Ｈ−サイトカラシンＢおよびその引き続く代謝物の細胞障害性を評価した（表１０）。
【表８】
2010029703.tif 000017
【表９】
2010029703.tif 000018
【表１０】
2010029703.tif 000019
2010029703.tif 000020
【０２４９】
表８〜９中の結果が示すように、3Ｈ−サイトカラシンＢの９８％は投与の２４時間以内に代謝され、全反応性の８０％より大は培地の中に存在し、そして２０％より小は組織の中に存在した。表１０中の結果が示すように、3Ｈ−サイトカラシンＢまたはその引き続く代謝物は細胞障害性ではなかった。
ヒト血液中の3Ｈ−サイトカラシンＢの代謝を測定するために、3Ｈ−サイトカラシンＢ（８μｇ／ｍｌ）を生理食塩水中；生理食塩水およびヒト血漿の１：１希釈物；または生理食塩水およびヒト全血の１：１希釈物中に溶解した。混合物を３７℃において２０時間インキュベートし、次いでＨＰＬＣにより安定性および代謝について分析した。3Ｈ−サイトカラシンＢは、生理食塩水または血漿と混合したとき、代謝されなかった。3Ｈ−サイトカラシンＢはヒト全血により代謝され、代謝物はヒト肝臓スライスのアッセイにおいて見られたもの（上を参照）と一致するＨＰＬＣ保持時間を有した。
【０２５０】
毒性の研究：
サイトカラシンＢの毒性を測定するために、ラット（４匹の雄および４匹の雌）に１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを４回／日７日間注射した（表１１）。
体重、食物消費、食物効率、血液学的パラメーター、血清化学的パラメーター、および総壊死の結果に関するデータを収集した。サイトカラシンＢ投与の悪い作用を示唆したパラメーターのみは、処置した雌の動物における平均相対心臓重量の増加であった。増加を説明する心臓において検出された総体的または顕微鏡的変化は存在しなかった。したがって、８００μｇ／ｋｇの投与量におけるラットへのサイトカラシンＢの毎日の投与（５６００μｇ／ｋｇの全注射投与量について）は、雌（雄ではない）のラットの心臓重量に対して作用を有することがある。しかしながら、心臓を秤量する前に心臓の管腔から凝固した血液を日常的に除去しなかった。
【表１１】
2010029703.tif 000021
【０２５１】
慢性サイトカラシンＢ投与の毒性を測定するために、サイトカラシンＢをＳＤラットに７日間静脈内投与した（表１２）。食物消費、体重、血液学的パラメーター、臨床的化学的パラメーター、凝固プロファイル、器官の重量、臨床的観察、総壊死の結果および組織病理学に関するデータを収集した。６００μｇ／ｋｇ／日までのサイトカラシンＢの慢性静脈内投与は悪い作用または毒性の指示を生じないことが見出された。
【表１２】
2010029703.tif 000022
【０２５２】
イヌにおいて同様な研究（表１３）は、食物消費、体重、血液学的パラメーター、臨床的化学的パラメーター、凝固プロファイル、器官の重量、臨床的観察、胸腔聴診、眼の検査、尿検査、総壊死の結果および組織病理学（高い投与量の群）に関するデータを収集し、６４８μｇ／ｋｇ／日までの投与量（４，５３６μｇ／ｋｇの累積投与量）におけるビーグル犬に対する連続７日間のサイトカラシンＢの静脈内投与が悪い作用または毒性の指示を生じないことを見出した。
【表１３】
2010029703.tif 000023
【０２５３】
実施例１６
バルーン外傷を受けたブタ動脈の生物学的ステント
ブタの大腿動脈に実施例７に記載するように外傷を起こさせ、次いでサイトカラシンＢで治療した。結紮により他の部分から分離した動脈の部分の中に、約１．５〜約２ｍｌのサイトカラシンＢを０．１μｇ／ｍｌにおいて注入した。次いで動脈を３分間加圧し、流体を吸引した。中膜中の細胞を取り囲む腸空間の中に、ほぼ８〜抗体３０ラムダの溶液が保持された。次いで１０の大腿動脈（実施例７に記載する単一投与のプロトコールに従い治療した５匹のブタの各々から２つの動脈を得た）を、サイトカラシンＢの投与後、４日または３週に組織学的に評価した。ＢＱシステムＩＶコンピューター化生物形態計測分析システム（R & M Biometrics，Inc.、テネシーナシュビレ）により、ディジタル化顕微鏡画像から、各動脈の最大管腔面積を測定し、計算した。５匹の追加のブタ（２つの動脈／ブタ；サイトカラシンＢの投与量＝０．１μｇ／ｍｌ、１気圧の圧力において３分間適用した；同一の時点）を使用して、この実験を反復した。２つの実験から得られたデータを組合わせた。サイトカラシンＢで処理したバルーン外傷を受けたブタ動脈は、他の試験治療剤または対照で処理された動脈に比較して、処理時点後４日または３週に大きい管腔面積を表示した。
【０２５４】
動脈の外傷を受け、サイトカラシンＢ処理されたセグメントの管腔面積を、また、試験区域に近位の大腿動脈の正常の、未処理の範囲と比較した。被験範囲における管腔面積は、同一の動脈の正常の対照セグメントの面積よりもほぼ２倍大きいことを結果は示した。陰性の対照剤、ＰＢＳおよびモノクローナル抗体ＮＲ−ＡＮ−０１は、同一の動脈の正常の対照セグメントの面積に比較して、管腔面積の増加を示さないか、あるいはわずかの増加を示した。
次いで、実施例７に記載する実験のプロトコールに従い、サイトカラシンＢ投与量の応答の研究を１０匹のブタについて実施した。簡単に述べると、２匹のブタの各々における双方の大腿動脈を、前述したように、下記の投与量のサイトカラシンＢの１つで処理した：０．０μｇ／ｍｌ（すなわち、ＰＢＳの陰性の対照）；０．０１μｇ／ｍｌ；０．１０μｇ／ｍｌ；１．０μｇ／ｍｌ；および１０．０μｇ／ｍｌ。治療剤を管腔内カテーテルにより１気圧において３分間送出し、そして３週後前述の形態学的分析システムにより評価した。処理した動脈管腔面積／近位の正常動脈管腔面積の比を処理区域／正常区域、または処理した動脈／外傷を受けたが、未処理の動脈の動脈管腔大きさ（直径または断面積）における百分率の変化として決定した。０．１μｇ／ｍｌ（約１４０％の増加）〜１．０μｇ／ｍｌの投与量において、有意な閾値効果が観測された（第１４図）。閾下の投与量（０．０１μｇ／ｍｌ）および陰性の対照は、約±２０％の管腔面積の変化を示した。
【０２５５】
電子顕微鏡写真は、１時間以内のバルーン外傷において、収縮性オルガネラである、外傷を受けた血管中の筋フィラメントの解重合が存在したことを明らかにした。筋フィラメントの解重合は外傷に対する血管平滑筋の細胞の正常の生理学的応答であり、そして収縮から分泌および移動細胞への筋フィラメントの形質転換における第１ステップである。外傷を受けたブタ動脈の約０．１〜約１０．０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢの処理は、筋源繊維の解重合速度を増加させないか、あるいはいっそう広範な解重合を生じなかった。しかしながら、電子顕微鏡写真は筋フィラメントの再形成が遅延されることを示した。血管直径の持続的増加に基づいて、正常の血管収縮への復帰は、正常の形態学への復帰の遅延により示唆されるよりも、いっそう広範に遅くされることがある。
動脈の外傷を受け、処理された区域は、ブタにおける疑似対照において通常起こり、そしてＰＴＣＡ後に、人間において記載された、収縮または慢性の幾何学的（血管の）改造を行わなかった。動脈の断面は、外傷を受けたが、サイトカラシンＢで処理されない動脈に比較して、大きい全血管の断面積を示し、ここで断面積は処理された区域の外部の弾性管腔(EEL)の内側の血管面積／同一動脈の近位および遠位の範囲の全血管面積の平均の比を測定することによって得られた。中膜を引裂かないで血管壁を損傷するトルクを加えることができるバルーンで外傷を受けた動脈において、いっそう均一な内膜の増殖が存在し、そしてより大きい血管大きさ(EELの内側の面積)は管腔断面積を大きくしかつ再狭窄を有意に減少させた。血管を広範に損傷させ、そして中膜を引裂いたとき、高度に生存可能な内膜の増殖を生ずる、広範な増殖および血栓の改造が存在した。
【０２５６】
したがって、バルーン拡張の外傷後の注入カテーテルによるブタの血管平滑筋の細胞へのサイトカラシンＢの投与は、バルーンを拡張することによって生成したよりも、いっそう広範な動脈管腔大きさの保持を生じた。中膜の細胞の間の全体の腸流体体積を治療剤で置換することによって、この効果は達成された。
【０２５７】
そのうえ、サイトカラシンＢは約０．１〜１０μｇ／ｍｌの範囲の広い治療指数を有し、１０μｇ／ｍｌにおいて毒性の証拠は存在しなかった。１０μｇ／ｍｌは生理食塩水中のサイトカラシンＢの最大飽和濃度である。さらに、サイトカラシンＢ投与により生成した作用は、バルーン外傷後３〜８週にわたって、いっそう明らかとなった。これらのデータが示唆するように、外傷を受けた動脈に送出されるとき、サイトカラシンＢは「生物学的ステント」として作用する。
【０２５８】
対照および処理（０．１μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ）からのバルーン外傷を受けたブタ大腿動脈を、関与後１、４、７、１４または２１日に評価した。動脈の凍結した血液学的切片についての生物形態計測的分析において、サイトカラシンＢで処理された動脈は、第７日〜第２１日の間で非常にわずかの変化を示す、持続した拡張状態に到達することが示された。変量の２つの分析方法は、サイトカラシンＢ処理群および希釈剤対照群の間において３週にわたって動脈管腔面積の統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示した。
【０２５９】
バルーン外傷を受けたブタ冠状動脈の投与量応答の研究において、０．１、１．５または１０．０μｇ／ｍｌにおいてサイトカラシンＢを使用する処理（表１４、「バイオステント（Biostent」）は、関与後３週において、冠状管腔の持続した動脈の拡張を生ずることが示された。そのうえ、サイトカラシンＢ投与は、組織学的に評価して、サイトカラシンＢに帰属される心筋または動脈の病変を生じなかった。臨床化学的パラメーター、血液学的パラメーター、体重、血圧または心電計において、サイトカラシンＢに帰属可能な統計的および生物学的に有意な変化は見られなかった。
【表１４】
2010029703.tif 000024
【０２６０】
また、ブタの冠状動脈を塞栓切除または過大のPTCAバルーンにより外傷を起こさせ、次いで８〜１６ｍｌのサイトカラシンＢを８．０μｇ／ｍｌにおいてＭＩＣカテーテルで動脈壁の中に注入して治療的投与量を達成した。対照は希釈剤の対照および外傷を受けた、未処理の対照を含み、そしてすべての動物は関与後４週に殺し、冠状動脈を灌流により固定した。冠状動脈の近位の、処理されたセグメントおよび遠位のセグメントから選択した切片について、生物形態計測を実施した（表１５）。
【表１５】
2010029703.tif 000025
【０２６１】
表１５に示すデータは、前の研究と対照的に、サイトカラシンＢの局所的送出が管腔面積の統計的に有意な増加を生じないことを明らかにしたが、データが示すように、対照のいずれかと比較したとき、サイトカラシンＢ処理動脈において外部の弾性管腔により境界された、より大きい動脈面積により証明されるように、有益な動脈の改造に向かう傾向が存在した。動脈のEELの直径またはその内部の面積を、血管の改造度のインジケーターとして、対照と比較することができる。管腔面積の統計的に有意な増加の欠如は、試料の生活能力の増加、新内膜形成の増加および／または外傷の程度の増加のためであることがある。
要約すると、これらの研究が証明するように、細胞骨格インヒビター、例えば、サイトカラシンＢを、外傷を受けた血管を生物学的にできる量で投与することは、血管平滑筋の細胞の増殖を抑制または減少するために有効である。
【０２６２】
実施例１７
サイトカラシンＢおよびタキソールの持続放出性処方物
再狭窄を抑制するサイトカラシンＢまたはタキソールの局所的、持続放出性投与形態の効能を測定するために、支持構造物、例えば、ラップ中のサイトカラシンＢまたはタキソールを、バルーン外傷を受けたウサギ顆動脈（群１〜１１）免疫応答バルーン外傷を受けたブタ大腿動脈（群１２）を取り囲む外膜組織に適用した（表１６）。
ウシのコラーゲンのメッシュのラップ（Skin Temp-Biosynthetic Skin Dressing、BioCore,Inc.、カンサス州トペカ）により支持されているか、あるいはその中に包まれた、ウシのコラーゲンゲル（BioCore,Inc.、カンサス州トペカ）の１ｇの中の２０ｍｇのサイトカラシンＢで、群１ａおよび１ｂの動物における動脈を処理した。処理後１週において、動物1233におけるサイトカラシンＢ処理した動脈は内膜または外膜の増殖を示さなかった。中膜の外側ゾーンにおいて顕著な細胞の死が存在し、異種親和性物質が中膜を浸潤していた。異種親和性物質はラップの外側に存在したが、サイトカラシンＢは異種親和性物質およびマクロファージがラップを浸潤するのを抑制した。対照（1249）動物の動脈は中程度の内膜の増殖を有し、そして異種親和性物質および組織球はラップの中に浸潤していた。中膜における細胞の死は最小であった。
【０２６３】
処理後２週において、動脈（動物1224）のサイトカラシンＢ処理区域における内膜および外膜の増殖は最小であった。内膜はゆるく配置し、異種親和性物質の浸潤は最小であった。シンシチウム巨大細胞が存在した。対照ラップ動物（動物1222）の動脈において、中程度の内膜の増殖が存在し、異種親和性物質およびマクロファージがラップ区域に存在した。これらの細胞は中膜において可視であった。
【０２６４】
処理後３週において、動脈（動物1244）のサイトカラシンＢ処理区域において内膜の増殖は観察されなかった。ラップの回りに異種親和性物質およびシンシチウム巨大細胞が存在した。中膜における細胞の有意な壊死が存在し、異種親和性物質およびマクロファージが浸潤していた。内皮は存在しなかった。対照（動物1232）において、顕著な内膜の増殖が存在し、よく構築された外膜および脈管周囲組織が存在した。異種親和性物質およびマクロファージはラップを浸潤していた。中膜における細胞は生存可能であり、そして血管管腔の中に壁性血栓が存在した。したがって、サイトカラシンＢで処理した群１ａおよび１ｂの動脈において内膜の増殖が存在したが、ラップ材料に対する有意な反応が存在した。
群２ａおよび２ｂにおける動物の動脈を、シリコーンラップ（Q-7 4840、Dow Cornig、ミシガン州ミドランド）中のサイトカラシンＢ（３０％ｗ／ｗ；３００ｍｇのサイトカラシンＢ／ｇのシリコーン）で処理した。外傷後１週において、平滑筋細胞(SMC)または間充織組織（動物1229）の有意な内膜または外膜の増殖は存在しなかった。中膜の外側ゾーンにおいて、SMCの有意な壊死が存在した。
【０２６５】
トルクを加えることができるバルーンにより外傷が最小であるように見える区域において、細胞の壊死は最小であるか、あるいは存在しなかった。これにより示されるように、外傷を受けた細胞は、この投与量のサイトカラシンＢに暴露されたとき、死亡する傾向がいっそう強いが、この投与量は外傷が最小であるか、あるいは正常のSMCに対して細胞破壊性ではなかった。中膜の中への単核および多形核細胞の浸潤は最小であった。わずかの異種親和性物質が血管管腔から浸潤しているのが見えた。
【０２６６】
対照動物（1228）において、中膜における細胞の壊死はより少なく、そして存在する壊死は動脈壁の外側ゾーンよりむしろ内側ゾーンに位置した。したがって、細胞の修復のサイトカラシンＢの阻害は中膜の壊死を増加させるように思われる。対照は、また、中膜または外膜の増殖および脈管周囲の凝固の構築を欠如した。いずれの区域においても細胞の浸潤は最小であった。
サイトカラシンＢ処理のを開始後２週において、内膜の増殖の完全な抑制が存在し、そして間充織の増殖ではなく、主としてフィブリンの形成のためである、わずかに最小の脈管周囲の凝固の構築が存在した（動物1227）。多形核細胞の軽度の浸潤および中膜および外膜の中への単核細胞の最小の浸潤が存在した。わずかの小さい隔離されたフォーカスを除外して、ラップ区域に内皮は存在しなかった。内皮の増殖のフォーカスは、サイトカラシンＢ処理区域に比較して、対照動物において、より大きくかついっそう広範であった。
【０２６７】
シリコーンラップ中のサイトカラシンＢに３週間暴露（動物1212）したとき、血管は中膜において顕著な細胞の喪失を示し、これは外側ゾーンにおいて最もひどかった。中膜および外膜における細胞の浸潤は最小であり、そして内皮化はわずかのフォーカス区域においてのみ存在した。中程度の、不規則な内膜の増殖が存在したが、内膜細胞および存在するわずかの内皮細胞は未構築であり、極性を欠如した。サイトカラシンＢによる移動の阻害は、この構築または極性の喪失を生じた。対照組織（1230）において、内膜の増殖はまた軽度であったが、内膜はよく構築され、そしてほとんど完全に内皮化していた。中膜からの細胞の喪失は最小であった。したがって、群２の処理された動物において最初の２週において、有意な内膜の抑制が見られた。
【０２６８】
１ｃｍ×１ｃｍのウシのコラーゲンのメッシュのラップで支持された１００ｍｇのプルロニックゲル（pluronic gel）(F-127、BASF)中の８ｍｇのサイトカラシンＢで、群３ａおよび３ｂにおける動物の血管を処理した。処理後１週において、動物1250のサイトカラシンＢ処理動脈は、厚さが不規則である、軽度の内膜の増殖を有した。ほぼ３０％の再内皮化が存在し、中膜細胞は生存可能であり、中膜の内側ゾーンにおいて最も有意な喪失（軽度）が存在した。脈管周囲および外膜範囲においてプルロニックゲルに対する、顕著な膿肉芽腫性反応が存在した。動物1261からの対照動脈の完全な血栓症はその評価を妨げた。
【０２６９】
２週において、プルロニックゲルとサイトカラシンＢとの組合わせは，外膜および脈管周囲組織における顕著な膿肉芽腫性反応を刺激した。軽度の、不規則の内膜の増殖および完全な内皮化が存在した。中膜細胞は生存可能であった。中膜の内側ゾーンからの軽度の細胞喪失が存在するように思われた。対照動物（1247）の動脈は軽度の、不規則の内膜の増殖、完全な内皮化が存在し、豊かな内皮細胞および生存可能な細胞が中膜の中に存在した。プルロニックゲルの残部に対する顕著な膿肉芽腫性炎症反応が存在した。
【０２７０】
３週において、動物1248および1246の動脈はコラーゲンラップの残部を示したが、ラップは対照（1246）においてよりもサイトカラシンＢ処理動物（1248）において溶解の程度が低かった。このラップの吸収の遅延は、マクロファージの移動および機能のサイトカラシンＢにより阻害から生ずることがある。処理および対照の双方は３週において中程度の量の内膜の形成不全を有したので、プルロニックゲルとともにサイトカラシンＢを投与したとき、サイトカラシンＢによる有意な量の内膜阻害は存在しなかった。サイトカラシンＢ処理動脈において、ジストロフィー性ミネラル化のフォーカスが見られた。したがって、処理の開始後１、２または３週に、これらの動物（群３）において、内膜に対する阻害作用は観察されなかった。
【０２７１】
１ｇのシリコーンラップ中の１００ｍｇのサイトカラシンＢ（１０％ｗ／ｗ）で処理した群４ａおよびｂの動物の動脈は、すべての時点において内膜の増殖の有意な抑制を有した。動物1259のサイトカラシンＢラップ処理した動脈において、処理後１週に内膜の増殖または外膜の線維形成は存在しなかった。拡張性血管が外膜の中に存在し、そして脈管周囲の凝固は未構築であり、フィブリンのみから構成されていた。中膜からの顕著な細胞喪失が、特に外側ゾーンにおいて、存在した。異種親和性物質が中膜を浸潤することが見られた。対照動脈（1206）において、１週に内膜増殖は存在しなかったが、脈管周囲の凝固の初期の線維の構築が存在した。中膜からの細胞喪失は、外側ゾーンにおいて最も高度であったサイトカラシンＢラップにおけるよりも、いっそう拡散性であった。
【０２７２】
動物1253のサイトカラシンＢラップ処理した動脈は、最大の内膜増殖を有する対照（1258）ラップ処理した動脈に比較して、２週において最小内膜増殖を有した。サイトカラシンＢラップ処理した動脈における内膜増殖は不規則であり、浸潤するSMCによる壁性血栓の構築の結果であるように見えた。サイトカラシンＢラップ処理した動脈において血小板のゆるい薄い層のみが存在し、異種親和性物質が移動していた。サイトカラシンＢラップ処理した動脈において内皮化は存在せず、そして対照動脈において＜２０％の内皮化が存在した。サイトカラシンＢラップ処理した動脈において脈管周囲の凝固は未構築であり、フィブリン質に止まり、そして対照動脈においてより構築されていた。対照動脈は中膜からの細胞喪失が最小であったが、サイトカラシンＢラップ処理した動脈は細胞喪失が顕著であった。
【０２７３】
３週において、サイトカラシンＢラップ処理した動脈（1251）は最小の内膜増殖を示すか、あるいはそれを示さなかった。内膜増殖は、中膜からの細胞喪失がより少ない場所で起こるように見えた。
【０２７４】
サイトカラシンＢラップ処理した動脈において初期の再内皮化が存在したが、細胞あしばしば丸く、ゆるく結合し、そしてわずかの散乱したフォーカスが存在したのみであった（＜１０％）。サイトカラシンＢラップ処理した動脈における脈管周囲の凝固は未構築であり、なおフィブリンから成っていたが、対照動脈はよく構築されており、線維芽細胞およびコラーゲンのマトリックスが存在した。対照動脈は完全に血栓化されており、完全には構築されない、血栓の遠位の区域において、顕著な内膜の産生が存在した。
【０２７５】
群５ａおよびｂの動物における動脈を１ｇのシリコーンラップ中の５０ｍｇのタキソールで処理した（５％ｗ／ｗ）。この処理は、すべての時点において内膜増殖の顕著な抑制を示した。タキソールラップ処理した動脈（動物1278、１週）は内膜または外膜の増殖をもたず、そして脈管周囲の凝固はフィブリン質であり、未構築であった。中膜細胞の顕著な喪失が存在し、内皮のライニングは存在しなかった。対照（1279）は軽度の内膜増殖を有し、フィブリン質の脈管周囲の凝固の非常に初期の線維形成が存在した。管腔はほぼ８５％再内皮化していた。処理動脈および対照動脈の双方は、中膜および外膜の中への軽度の異種親和性物質の浸潤を有した。
【０２７６】
動物1281からの動脈は、２週間タキソールで処理し、内膜増殖をもたず、最小の外膜線維形成を有し、そして中膜において顕著な細胞壊死を有し、軽度の異種親和性物質の浸潤が存在した。壊死およびジストロフィー性ミネラル化のフォーカス区域が、外膜および脈管周囲の凝固組織の中に存在した。対照動物（1280）からの動脈は中程度の内膜増殖を有し、外膜および脈管周囲の凝固の顕著な構築が存在した。管腔は１００％再内皮化し、そして中膜のカルボキシメチルセルロースは対照動脈において生存可能であった。
【０２７７】
３週において、タキソールラップ処理した動脈（1242）は内膜増殖をもたず、５０％再内皮化し、豊かに見える内皮細胞が存在した。脈管周囲の凝固の最小の構築および中膜からの顕著な細胞喪失が存在した。中膜の中への異種親和性物質の軽度の浸潤および血管管腔表面上の移動が存在した。対照動脈（1234）は顕著な内膜増殖および外膜および脈管周囲の凝固の線維形成を有した。
膜中の細胞は生存可能であった。
【０２７８】
群６ａおよび６ｂにおいて、ラップを除去した後２週に、タキソール処理した動脈はまた顕著な抑制を有した。動物1276は２週間タキソールを有し、次いでラップを除去し、３週後に動物を殺した。タキソールラップ除去から３週の回復期間後（1276）この動脈において、壁性血栓のＳＭＣ構築のために厚くなったように見える、わずかのフォーカス区域を除外して、最小の内膜増殖のみが存在した。外膜はよく構築され、中膜において有意な細胞喪失が存在したが、存在する細胞は生存可能であった。管腔はほぼ９０％再内皮化した。対照（1277）動脈は顕著な内膜増殖、よく構築された脈管周囲および外膜組織を有し、そして１００％再内皮化した。
【０２７９】
群７ａの動物について観察され結果が証明するように、サイトカラシンＢ処理した動脈（１０％ｗ／ｗ）は２週間内膜増殖を示さなかった。しかしながら、サイトカラシンＢの放出速度の減少は、ラップ配置後３週までに軽度の内膜増殖を生じた。１週において（1257）、動脈は内膜増殖を示さず、そして中膜ＳＭＣの顕著な壊死を示し、中程度の異種親和性物質の浸潤が存在した。内皮は存在せず、そして異種親和性物質およびマクロファージは管腔表面に沿って移動した。そのうえ、血管壁に付着する血小板の凝集物の証拠は存在しなかった。２週において（1265）、動脈は形態学的に１週の動脈に類似した。３週まで（1266）、動脈は軽度の不規則の内膜増殖を示した。さらに、異種親和性物質は中膜において稀であり、管腔は７０％再内皮化し、処理された動脈中の、外膜において初期の線維形成が存在し、未構築の脈管周囲の凝固がなお存在した。これにより示されるように、３週まで、治療剤のレベルは動脈壁内で治療レベルよりも下に低下したが、ラップに直ぐに隣接する凝固の構築に対して阻害作用を示すために十分な薬剤がなお存在した。
【０２８０】
群８ａの動物の動脈を１０％のサイトカラシンＢで２週間処理し、次いでラップを除去し、血管を２週後に評価した。これらの動脈は動物内および動物間で変動する内膜増殖を有した。動物1254の動脈はゼロから軽度の範囲の変動する内膜増殖、よく発達した外膜線維形成、中膜における顕著な細胞喪失、および外側の中膜および外膜におけるジストロフィー性ミネラル化のフォーカス区域を有した。軽度の内膜増殖がラップ区域の終わりに存在し、隣接する未処理動脈領域からの浸潤を示唆した。管腔はほぼ６０％再内皮化した。動物1255の動脈は軽度〜中程度の内膜増殖、中膜における生存可能な細胞、および外膜においてよく構築された組織を有した。管腔は１００％再内皮化された。動物1256における動脈は完全に血栓化した。ラップの区域における慢性血栓に近位に、急性の血栓が存在し、中程度の内膜増殖が存在した。
【０２８１】
いくつかの動物の動脈において中程度の内膜増殖が存在したが、これらの動脈における増殖は群９ｂにおけるなお少なかった。マンニトールの対照シリコーンのラップをバルーン外傷後２週間動脈上に存在させ、次いで除去し、動物を剖検し、そしてラップの除去後１週に、動脈を組織学的に評価した。動脈の２つ（1267および1268）は中程度の内膜増殖を有し、１００％再内皮化し、そして１つは最大の増殖を有した。最大の内膜増殖を有する動脈には、急性の閉塞性血栓か存在した。
【０２８２】
群１０および１１の動物における動脈を１ｇのシリコーンラップ中に負荷した１０ｍｇのサイトカラシンＢで処理し（１％ｗ／ｗ）、動脈に２週間適用し、動脈を外科的に取出し、それぞれ、２または４週後に組織学的に評価した。被験動物と対照動物との間において、定性的評価により有意差は見られなかった。動物1304および1305はサイトカラシンＢ（１％）のラップを２週間有し、次いでこれを除去した。除去後２週に、動物を殺した。動物1304からの動脈はラップの大部分の区域において中程度の内膜増殖を示し、顕著な中膜細胞の壊死および壁のジストロフィー性ミネラル化の区域において、増殖は軽度であった。
【０２８３】
１００％の再内皮化が存在し、内膜または中膜の中に異種親和性物質は存在しなかった。外膜および脈管周囲の凝固はよく構築されていた。動物（1305）からの動脈は、形態学的に動物1304からの動脈に類似した。動物1306からの動脈は、顕著な内膜増殖を示し、内膜または膜中の浸潤性異種親和性物質を示さず、１００％再内皮化した。
【０２８４】
動物1307、1308および1309をサイトカラシンＢ（１％）ラップに２週間暴露させ、次いでラップを除去した。除去後４週に、動物を殺した。動物1307からの動脈は中程度の内膜増殖を有し、SMCによる壁性血栓のために厚くなったフォーカス区域が存在した。中膜からの有意な細胞喪失が存在し、そして弾性薄板がつぶれるてように見えた。外膜の中にわずかの異種親和性物質が存在した。ラップ区域の中に内膜増殖が最小である区域または区画が存在した。動物1308からの動脈は中程度の内膜増殖を示し、中膜の中に顕著な細胞喪失の区域が存在し、そして中膜の外側ゾーンにジストロフィー性ミネラル化が存在した。血管は１００％再内皮化した。動物1309からの動脈は顕著な内膜増殖を有し、よく構築された外膜および脈管周囲領域が存在した。動物1311は血栓のために評価しなかった。動物1312からの動脈の結果は非常に変動性であり、軽度〜中程度の内膜増殖の範囲を示す区画が存在した。内皮化はこれらの動脈において完全であるように見えた。
【０２８５】
３０％ｗ／ｗのサイトカラシンＢを負荷したシリコーンラップで処理した群１２の動物からの動脈（ブタの大腿動脈）は、最初の２週の間有意に抑制された増殖を示した。３週後に動脈の中に内膜増殖が存在したが、増殖は対照について観察された増殖よりなお少なかった。
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【０２８６】
要約すると、外傷を受けたブタの動脈の内膜増殖は持続放出性投与形態のサイトカラシンＢおよびタキソールの双方により有意に抑制された。シリコーンからなる外膜ラップ材料を使用して、二次的炎症反応を刺激しない、治療剤の最良のコントロールされた持続放出性が得られた。シリコーンラップはサイトカラシンＢの３０％および１０％の負荷で内膜増殖を抑制した。しかしながら、２〜３週の間に放出レベルが低下するとき、内膜増殖の抑制が存在した。ラップを２週間所定位置に配置し、次いで外科的に除去し、１〜４週後に動脈を検査したとき、内膜増殖の跳ね返り効果が存在するように思われた。治療剤で処理した動脈の内膜増殖が、対照動脈における内膜増殖に近づくが、なおそれより低いとき、跳ね返り効果が起こった。タキソールで処理した動物は、サイトカラシンＢで処理した動脈よりも低い跳ね返り効果を有するように見えた。
【０２８７】
実施例１８
結晶質サイトカラシンＢまたはタキソールの送出
結晶質の形態で投与したサイトカラシンＢのin vivo組織の分布を、局所的送出後にブタのバルーン外傷を受けた大腿動脈において評価した。Vascu-FloTMシリコーン塞栓切除カテーテルのオーバーインフレーションおよび回転により、ヨークシャー交雑育種のブタの大腿動脈にバルーンで外傷を与えた。バルーン外傷の直後に、生理食塩水中の１０μｇ／ｍｌの3Ｈ−サイトカラシンＢ結晶（Sigma Chemical Co．ミゾリー州セントルイス）を静脈内に１気圧において３分間送出した。動脈において血流を５分間回復させた後、動物を殺した。3Ｈ−サイトカラシンＢの組織の分布を分析すると、この方法は３１μｇの3Ｈ−サイトカラシンＢの送出において有効であり、3Ｈ−サイトカラシンＢは主として外膜に局在化した。オートラジオグラフィーの乳濁液中の銀粒子の存在により、3Ｈ−サイトカラシンＢを可視化した。したがって、これらの結果が示すように、結晶質サイトカラシンＢをin vivoで血管壁に局所的に送出すことができる。
【０２８８】
他の研究において、２０匹の雄のＳＤラットを使用した。ラットをそれらの頸動脈においてバルーン外傷を受けさせ、次いで３００ｍｌのベヒクル（０．５％のCremophorを含むハンクス無菌塩溶液）中に１ｍｇのサイトカラシンＢを含有する溶液または希釈剤（生理食塩水）対照を動脈内に注入した。注入直後、外傷および注入後２、４、７および１４日に分析を殺した。殺した後、左および右（対照）の頸動脈を取出した。酸化およびシンチレーションカウンティングにより3Ｈ−サイトカラシンＢの定量、組織病理学、オートラジオグラフィーおよび血管生物形態計測のために、動脈の試料を得た。組織病理学は、左頚動脈の動脈壁中の均一な、周囲のバルーン外傷を証明した。
【０２８９】
オートラジオグラフィー的に、サイトカラシンＢ結晶は管腔内のフィブリン凝固の中に第０日に存在し、内膜に付着したが、外膜の中に稀に存在した。第２日までに、減少した結晶の数を第０日と比較し、そして第４日までに、結晶はオートラジオグラフィーで検出不可能であった。オートラジオグラフィーの結果は酸化およびシンチレーションカウンティングにより3Ｈ−サイトカラシンＢの定量評価と密接に相関し、ここでほぼ８μｇのサイトカラシンＢは第０日に動脈の処理した長さにわたって存在し、そして第２日までに２ｎｇよりわずかに少ないサイトカラシンＢが存在した。しかしながら、第４日に殺した２匹の動物の一方はバックグラウンドより上のサイトカラシンＢレベルをなお有した。希釈剤で処理したラットに比較した結晶質サイトカラシンＢで処理したラットの左頸動脈の生物形態計測的分析は、新内膜の形成の統計的に有意である減少を示さなかった。しかしながら、５匹の処理したラットは、希釈剤で処理した対照よりも、高い平均管腔面積および小さい新内膜面積を有した。
【０２９０】
サイトカラシンＢおよびタキソールを外膜周囲に投与した。７匹の成体の雄ラットの３群を左頸動脈のバルーン外傷に付した直後に、サイトカラシンＢ結晶（７．８〜１１．８ｍｇ／ラット）、タキソール結晶（３．４〜６．５ｍｇ／ラット）、または無薬剤（対照）を外膜周囲に配置した。サイトカラシンＢおよびタキソールを均一なパターンで配置し、頸動脈の外科的に露出された表面を被覆し、次いで取り囲む皮下の皮膚および組織を縫合糸により閉じた。１５日後、ラットを殺し、それらの頸動脈を組織学的および生物形態計測的分析のためのプロセシングした。
【０２９１】
２匹のサイトカラシンＢで処理した動物は、第１４日の殺しの時点の前に外科部位における急性出血および循環血液量減少性ショックのために死亡した。２匹の追加のサイトカラシンＢで処理した動物および１匹のタキソールで処理した動物を、第１４日の殺しの時点の前に外科部位における、急速な拡大皮下膨張および出血で殺した。サイトカラシンＢまたはタキソールで処理した、すべての動物は、外科部位において有意な毒性を有し、これらは出血の程度の変化、血管壁の壊死、隣接する骨格筋の壊死および炎症により特徴づけられた。さらに、タキソールおよびサイトカラシンＢの双方で処理した動物は外科後の体重増加が遅延した。
【０２９２】
第１４日まで生存した３匹のサイトカラシンＢで処理した動物、６匹のタキソールで処理した動物および７匹の対照動物を生物形態計測的に評価した。タキソールで処理した動物は、両側ｔ検定においてｐ，０．０５で、バルーン外傷を受けた、未処理の対照動物と比較したとき、統計的に有意な、より大きい管腔面積を有し、新内膜形成をもたなかった。サイトカラシンＢで処理した動物は、管腔面積、新内膜面積、中膜面積、内部および外部の弾性薄板により境界される区域または内膜／中膜の比において、対照と統計的差を示さなかった。
【０２９３】
ラットにおける新内膜形成を阻害する結晶タキソールの効能をさらに評価するために、５〜６匹の成体の雄のラットの４群を左頸動脈のバルーン外傷に付し、その直後にゲルマトリックス中の５００ｍｇのプルロニックポリマー中の１、０．１、０．０１または０ｍｇを外膜周囲に送出した。１４日後、ラットを殺し、血清を集め、それらの頸動脈を組織学的および生物形態計測的分析のためのプロセシングした。
【０２９４】
技術的困難のために、５匹の動物（３〜１ｍｇおよび２〜０．０１ｍｇ）は外科後に死亡した。総体的に、隣接する骨格筋の筋壊死（筋系の薄い白色領域）が、それぞれ、１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．０１ｍｇおよび対照の群における３／３、１／５、０／４および０／５動物の中に存在した。組織学的に、１ｍｇの処理群における左頸動脈の隣接する骨格筋においておよび中膜のいくつかの領域において、筋壊死が確証された。生物形態計測的に、エクセル（ｅｘｃｅｌｌ）データ分析のソフトウェアパッケージを使用する変数の分析により、薄板面積、新内膜面積、内部の弾性薄板により境界された面積、中膜の面積、外部の弾性薄板により境界された面積、または新内膜／中膜の比において、統計的意味は存在しなかった。
【０２９５】
５００ｍｇのプルロニックゲル中の１ｍｇのタキソール結晶を使用するラット頸動脈の外膜周囲処理は、隣接する筋系の総筋壊死を生じた。この群における生存する動物の数は新内膜形成の減少における統計的意味について評価するためには低過ぎたが、新内膜面積は対照動物のそれよりも３８％少なかった。
【０２９６】
０．１および０．０１ｍｇのタキソールで処理した動物について、対照と比較したとき、それらの新内膜面積および新内膜／中膜の比の減少が観測されたが、これは小さい数動物／群が与えられているので統計的意味に到達しなかった。そのうえ、より少ない投与量の群における動物は毒性を示さない（０．０１ｍｇ）か、あるいは最小（０．１ｍｇ）または制限された（１．０ｍｇ）毒性を示し、より少ない投与量は有効であり、１．０ｍｇより大きい投与量よりも、よりわずかの悪い副作用を示すことを証明した。
【０２９７】
すべての刊行物および特許は引用することによって本明細書の一部とされるが、開示と一致するかぎり、個々に引用することによって本明細書の一部とされる。本発明は、正確に示し、詳細に説明されたものに限定されず、請求の範囲により規定された本発明の精神および範囲内において、多数の変更および修飾を行うことができることを理解すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月10日(2009.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の血管の管腔面積の縮小を抑制または減少するために有効な細胞骨格インヒビタ-を含んでなる持続放出性投与形態の、哺乳動物の血管に投与するための医薬組成物であって、前記細胞骨格インヒビタ-はパクリタキセル又はその類似体又はサイトカラシンから選択され、
前記パクリタキセルの類似体がタキソテ-ル、バッカチン、10-デアセチルタキソ-ル、7-キシロシル-10-デアセチルタキソ-ル、セファロマンニン、10-デアセチル-7-エピタキソ-ル、7-エピタキソ-ル、10-デアセチルバッカチン III又は10-デアセチルセファロマンニンから選択され、
前記細胞骨格インヒビタ-は結晶の形態であり、そして前記結晶の大きさは0.1ミクロン-1ｍｍであり、前記細胞骨格インヒビタ-の持続放出性を生ずる大きさである、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記サイトカラシンがサイトカラシンＢである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記持続放出性投与形態が、さらに結晶のための支持構造を提供する組織適合性のある薬学的に受容可能なマトリックス担体を含む、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記サイトカラシンが前記持続放出性投与形態の5-70重量％を構成する、請求項4に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記パクリタキセル又はその誘導体が持続放出性投与形態の1-70重量％を構成する、請求項1に記載の医薬組成物
【請求項６】
前記細胞骨格インヒビタ-が、移植可能な装置の中に放出可能に埋め込まれているか、その上に被覆されているか、あるいは埋め込まれているか、その上に被覆されている、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記装置が外膜ラップ、人工移植片、ステントまたはシャントである、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記細胞骨格阻害剤がカテ-テルにより投与される、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記投与が処置による血管の外傷の前、間または後、またはそれらの任意の組合わせである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
血管が血管形成術、ステントの配置、シャントの配置、または天然の移植片、またはそれらの任意の組合わせにより外傷を受けている、請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
細胞骨格阻害剤が固体の形態である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
哺乳動物の血管の管腔面積の縮小を抑制または減少するために有効なパクリタキセルまたはその類似体からなる微小粒子またはナノ粒子を含んでなる持続放出性投与形態の、処置的に外傷を受けた哺乳動物の血管に投与するための医薬組成物であって、
前記パクリタキセルの類似体がタキソテ-ル、バッカチン、10-デアセチルタキソ-ル、7-キシロシル-10-デアセチルタキソ-ル、セファロマンニン、10-デアセチル-7-エピタキソ-ル、7-エピタキソ-ル、10-デアセチルバッカチン III又は10-デアセチルセファロマンニンから選択され、
前記パクリタキセル又はその類似体が結晶の形態であり、そして前記結晶の大きさは0.1ミクロン-1ｍｍであり、前記パクリタキセル又はその類似体の持続放出性を生ずる大きさである、
前記医薬組成物。
【請求項１３】
前記持続放出性投与形態が生物分解性である、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記持続放出性投与形態が、外膜ラップ、人工移植片、ステントまたはシャントから選択される移植可能な装置の中に放出可能に埋め込まれているか、その上に被覆されているか、あるいは埋め込まれているか、その上に被覆されている、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記持続放出性投与形態がカテ-テルにより投与される、請求項12に記載の医薬組成物。