(57)【要約】      （修正有）【課題】リボヌクレオシド誘導体の２’水酸基へ効率よく導入できるとともに、縮合反応において立体障害となることがなく、さらに、５’水酸基の保護基の除去、リン酸ジエステルの保護基の除去、核酸塩基の保護基の除去、ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の条件下では安定して存在するが、これらの条件とは異なる条件下において短時間に除去できる保護基によって２’水酸基が保護されたリボヌクレオチド誘導体を利用して、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体を製造する方法の提供。【解決手段】リボヌクレオシドの２’水酸基を化合物（Ｃ）で保護する。2010265304.tif 000031保護したリボヌクレオチド誘導体を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理した後、中性条件又は酸性条件下で加水分解することにより脱保護する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（II）：
【化１】
2010265304.tif 000025
［式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を表し、Ｘはオキソアニオン又はチオアニオンを表し、Ｙ及びＺは互いに独立して水素原子、固相担体又は水酸基の保護基を表し、Ｒ1は水素原子又は置換基を有していてもよいトリチル基若しくは９−フェニルキサンテニル基を表し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は互いに独立して水素原子、ハロゲン原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルキルチオカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アリールチオカルボニル基、アラルキルチオカルボニル基、アリールオキシチオカルボニル基若しくはアラルキルオキシチオカルボニル基を表し、Ｒ5は電子吸引基を表し、ｎは１以上の整数を表す。］
で表されるリボヌクレオチド誘導体（II）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理した後、中性条件又は酸性条件下で加水分解することにより、
次式（Ｉ）：
【化２】
2010265304.tif 000026
［式中、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ1及びｎは前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）を製造する工程を含む、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）の製造方法。
【請求項２】
前記第３級アミンとして１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンを用いる請求項１記載の方法。
【請求項３】
次式（III）：
【化３】
2010265304.tif 000027
［式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を表し、Ｗは酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｙ及びＺは互いに独立して水素原子、固相担体又は水酸基の保護基を表し、Ｒ1は水素原子又は置換基を有していてもよいトリチル基若しくは９−フェニルキサンテニル基を表し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は互いに独立して水素原子、ハロゲン原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルキルチオカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アリールチオカルボニル基、アラルキルチオカルボニル基、アリールオキシチオカルボニル基若しくはアラルキルオキシチオカルボニル基を表し、Ｒ5は電子吸引基を表し、Ｒ6はリン酸保護基を表し、ｎは１以上の整数を表す。］
で表されるリボヌクレオチド誘導体（III）をアンモニア処理又は第１級アミン処理することにより、前記リボヌクレオチド誘導体（II）を製造する工程を含む、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記式（III）においてＢで表される核酸塩基が、次式：
【化４】
2010265304.tif 000028
［式中、Ｒ7はフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、Ｒ8はイソブチリル基又はベンゾイル基を表し、Ｒ9はフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、Ｒ10は２−シアノエチル基を表し、Ｒ11はベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基又は４−メチルベンゾイル基を表し、Ｒ12はジメチルアミノメチレン基を表す。］
で表される保護基を有する核酸塩基である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
酸処理によりＲ1で表される５’水酸基の保護基を除去する工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
次式（III）：
【化５】
2010265304.tif 000029
［式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を表し、Ｗは酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｙ及びＺは互いに独立して水素原子、固相担体又は水酸基の保護基を表し、Ｒ1は水素原子又は置換基を有していてもよいトリチル基若しくは９−フェニルキサンテニル基を表し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は互いに独立して水素原子、ハロゲン原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルキルチオカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アリールチオカルボニル基、アラルキルチオカルボニル基、アリールオキシチオカルボニル基若しくはアラルキルオキシチオカルボニル基を表し、Ｒ5は電子吸引基を表し、Ｒ6はリン酸保護基を表し、ｎは１以上の整数を表す。］
で表されるリボヌクレオチド誘導体（III）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理した後、中性条件又は酸性条件下で加水分解することにより、
次式（Ｉ）：
【化６】
2010265304.tif 000030
［式中、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ1及びｎは前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）を製造する工程を含む、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）の製造方法。
【請求項７】
前記第３級アミンとして１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンを用いる請求項６記載の方法。
【請求項８】
酸処理によりＲ1で表される５’水酸基の保護基を除去する工程を含む、請求項６又は７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子クローニングのプローブ、遺伝子発現解析用プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ等の様々な用途に用いられるオリゴリボ核酸（オリゴＲＮＡ）は、ホスホロアミダイト法によって化学合成することができる。
【０００３】
ホスホロアミダイト法においては、３'−５'インターヌクレオチド結合の２'−５'結合への転位やヌクレオチド鎖の切断を防止するために、ホスホロアミダイトユニット（モノマーユニット）の２’位の水酸基（２’水酸基）を適切な保護基を用いて保護することが重要であり、２'水酸基の保護基には、５’位の水酸基（５’水酸基）の保護基の除去、リン酸ジエステルの保護基の除去、核酸塩基の保護基の除去、ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の条件下では安定して存在するが、これらの条件とは異なる条件下において短時間に除去できるという特性が求められる。
【０００４】
従来、２’水酸基の保護基としては、例えば、アセタール系保護基、シリル系保護基等が知られている。
しかしながら、これまでのアセタール系保護基は、５’水酸基の保護基の除去、リン酸ジエステルの保護基の除去、核酸塩基の保護基の除去、ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の条件下において安定して存在することができなかったため、３'−５'インターヌクレオチド結合の２'−５’結合への転位やヌクレオチド鎖の切断を防止することができなかった。例えば、５’水酸基の保護基として一般的に用いられる４，４'−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）は酸処理により除去可能であるが、これまでのアセタール系保護基も酸処理により除去可能であったため、アセタール系保護基とＤＭＴｒ基とを組み合わせて用いると、ＤＭＴｒ基の脱離とともにアセタール系保護基の脱離が生じ、３'−５'インターヌクレオチド結合の２'−５'結合への転位やヌクレオチド鎖の切断を防止することができなかった。一方、酸に対して安定であるアセタール系保護基として２'−Ｏ−１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ基）が知られていたが（Wolfgang Pfleiderer等，HELVETICA CHIMICA ACTA，第81巻，1545-1566頁，1998年；特開平７−１９６６８３号公報）、このアセタール系保護基は酸に対する安定性が高過ぎるため、ＲＮＡを分解しないような酸性条件下では除去することができず、２’水酸基の保護基としては不適当であると考えられていた。
【０００５】
このため、現在、２’水酸基の保護基としては、ＴＢＤＭＳ等のシリル系の保護基が一般的に用いられている。また、ＤＭＴｒ基の脱保護条件では安定であって、ＤＭＴｒ基の脱保護条件とは異なる酸性条件で除去できるアセタール系保護基として、１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ）基や、１−（４−クロロフェニル）−４−エトキシピペリジン−４−イル（Ｃｐｅｐ）基が開発されている。
しかしながら、ＴＢＤＭＳ等のシリル系保護基は、２’水酸基への導入効率が低い、分子が嵩高いため立体障害となり縮合反応効率が低い等の問題点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、２’水酸基へ効率よく導入できるとともに、縮合反応において立体障害となることがなく、さらに、５’水酸基の保護基の除去、リン酸ジエステルの保護基の除去、核酸塩基の保護基の除去、ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の条件下では安定して存在するが、これらの条件とは異なる条件下において短時間に除去できる保護基によって２’水酸基が保護されたリボヌクレオチド誘導体を利用して、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明は、以下のリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法を提供する。
【０００８】
（１）次式（II）：
【化１】
2010265304.tif 000002
［式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を表し、Ｘはオキソアニオン又はチオアニオンを表し、Ｙ及びＺは互いに独立して水素原子、固相担体又は水酸基の保護基を表し、Ｒ1は水素原子又は置換基を有していてもよいトリチル基若しくは９−フェニルキサンテニル基を表し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は互いに独立して水素原子、ハロゲン原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルキルチオカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アリールチオカルボニル基、アラルキルチオカルボニル基、アリールオキシチオカルボニル基若しくはアラルキルオキシチオカルボニル基を表し、Ｒ5は電子吸引基を表し、ｎは１以上の整数を表す。］
で表されるリボヌクレオチド誘導体（II）をフッ化物処理することにより、
次式（Ｉ）：
【化２】
2010265304.tif 000003
［式中、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ1及びｎは前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）を製造する工程を含む、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）の製造方法。
【０００９】
（２）前記フッ化物としてテトラブチルアンモニウムフルオリドを用いる前記（１）記載の製造方法。
【００１０】
（３）次式（II）：
【化３】
2010265304.tif 000004
［式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を表し、Ｘはオキソアニオン又はチオアニオンを表し、Ｙ及びＺは互いに独立して水素原子、固相担体又は水酸基の保護基を表し、Ｒ1は水素原子又は置換基を有していてもよいトリチル基若しくは９−フェニルキサンテニル基を表し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は互いに独立して水素原子、ハロゲン原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルキルチオカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アリールチオカルボニル基、アラルキルチオカルボニル基、アリールオキシチオカルボニル基若しくはアラルキルオキシチオカルボニル基を表し、Ｒ5は電子吸引基を表し、ｎは１以上の整数を表す。］
で表されるリボヌクレオチド誘導体（II）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理した後、中性条件又は酸性条件下で加水分解することにより、
次式（Ｉ）：
【化４】
2010265304.tif 000005
［式中、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ1及びｎは前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）を製造する工程を含む、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）の製造方法。
【００１１】
（４）前記第３級アミンとして１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンを用いる前記（３）記載の方法。
【００１２】
（５）次式（III）：
【化５】
2010265304.tif 000006
［式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を表し、Ｗは酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｙ及びＺは互いに独立して水素原子、固相担体又は水酸基の保護基を表し、Ｒ1は水素原子又は置換基を有していてもよいトリチル基若しくは９−フェニルキサンテニル基を表し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は互いに独立して水素原子、ハロゲン原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルキルチオカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アリールチオカルボニル基、アラルキルチオカルボニル基、アリールオキシチオカルボニル基若しくはアラルキルオキシチオカルボニル基を表し、Ｒ5は電子吸引基を表し、Ｒ6はリン酸保護基を表し、ｎは１以上の整数を表す。］
で表されるリボヌクレオチド誘導体（III）をアンモニア処理又は第１級アミン処理することにより、前記リボヌクレオチド誘導体（II）を製造する工程を含む、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
【００１３】
（６）前記式（III）においてＢで表される核酸塩基が、次式：
【化６】
2010265304.tif 000007
［式中、Ｒ7はフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、Ｒ8はイソブチリル基又はベンゾイル基を表し、Ｒ9はフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、Ｒ10は２−シアノエチル基を表し、Ｒ11はベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基又は４−メチルベンゾイル基を表し、Ｒ12はジメチルアミノメチレン基を表す。］
で表される保護基を有する核酸塩基である前記（５）記載の製造方法。
【００１４】
（７）酸処理によりＲ1で表される５’水酸基の保護基を除去する工程を含む、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
【００１５】
（８）次式（III）：
【化７】
2010265304.tif 000008
［式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を表し、Ｗは酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｙ及びＺは互いに独立して水素原子、固相担体又は水酸基の保護基を表し、Ｒ1は水素原子又は置換基を有していてもよいトリチル基若しくは９−フェニルキサンテニル基を表し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は互いに独立して水素原子、ハロゲン原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルキルチオカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アリールチオカルボニル基、アラルキルチオカルボニル基、アリールオキシチオカルボニル基若しくはアラルキルオキシチオカルボニル基を表し、Ｒ5は電子吸引基を表し、Ｒ6はリン酸保護基を表し、ｎは１以上の整数を表す。］
で表されるリボヌクレオチド誘導体（III）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理した後、中性条件又は酸性条件下で加水分解することにより、
次式（Ｉ）：
【化８】
2010265304.tif 000009
［式中、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ1及びｎは前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）を製造する工程を含む、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）の製造方法。
【００１６】
（９）前記第３級アミンとして１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンを用いる前記（８）記載の方法。
【００１７】
（１０）酸処理によりＲ1で表される５’水酸基の保護基を除去する工程を含む、前記（８）又は（９）記載の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-１,3-ジイル)ウリジン(2)の合成工程、及び2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-ウリジン(4)の合成工程を示す図である。
【図２】図２は、2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-ウリジン-3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)(5)の合成工程を示す図である。
【図３】図３は、液相法による保護されたウリジル酸２量体の合成工程を示す図である。
【図４】図４は、ウリジル酸２量体の脱保護工程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
上記式（Ｉ）、（II）又は（III）において、Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体は特に限定されるものではなく、核酸塩基としては、例えば、シトシン、ウラシル等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基が挙げられ、核酸塩基の誘導体としては、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−フルオロウラシル、チオウラシル、６−アザウラシル、５−ヒドロキシウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザアデニン、アザグアニン、イソグアニン等の塩基アナログが挙げられる。核酸塩基又はその誘導体は、例えば、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノオキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基、シアノ基等の置換基を有していてもよい。核酸塩基又はその誘導体は保護基を有していてもよく、アミノ基の保護基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基等の脂肪族アシル基；ベンゾイル基、４−メチルベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４−tert−ブチルフェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基等の芳香族アシル基；ハロゲン原子、アルキル基、アルキルオキシ基等の置換基を有する脂肪族アシル基又は芳香族アシル基；２−シアノエチル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル基、２−（ベンゼンスルホニル）エチル基等のβ脱離による除去が可能な、電子吸引基を有するエチル基；ジメチルアミノメチレン基、ジブチルアミノメチレン基等のジアルキルアミノメチレン基；２−シアノエトキシカルボニル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基、２−（ベンゼンスルホニル）エトキシカルボニル基等のβ脱離による除去が可能な、電子吸引基を有するアルコキシカルボニル基等が挙げられる。
【００２０】
リボヌクレオチド誘導体（III）が有する２’水酸基の保護基は、核酸塩基又はその誘導体が有する保護基の除去、Ｒ6で表されるリン酸保護基の除去、ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の際に一般的に用いられるアンモニア又は第１級アミンに対して安定であるが、アンモニア又は第１級アミンによる処理時間が長時間であると若干脱離するおそれがある。したがって、上記式（III）においてＢで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基を有する場合、当該保護基は、ヌクレオチド誘導体（III）のアンモニア処理又は第１級アミン処理により、Ｒ6で表されるリン酸保護基とともに短時間で除去できることが好ましい。このような保護基としては、例えば、上記のような脂肪族アシル基、芳香族アシル基、置換基を有する脂肪族アシル基又は芳香族アシル基、β脱離による除去が
可能な、電子吸引基を有するエチル基、ジアルキルアミノメチレン基等が挙げられる。このような保護基を有する核酸塩基又はその誘導体を以下に例示する。
【００２１】
【化９】
2010265304.tif 000010
［式中、Ｒ7はフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、Ｒ8はイソブチリル基又はベンゾイル基を表し、Ｒ9はフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、Ｒ10は２−シアノエチル基を表し、Ｒ11はベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基又は４−メチルベンゾイル基を表し、Ｒ12はジメチルアミノメチレン基を表す。］
【００２２】
ウラシル又はその誘導体に関しては通常保護基を必要としないが、ベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基又は４−メチルベンゾイル基を導入することにより、合成中間体の脂溶性及び結晶性が向上し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製や結晶化が容易になる。
【００２３】
Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基として上記のような脂肪族アシル基、芳香族アシル基、置換基を有する脂肪族アシル基又は芳香族アシル基、β脱離による除去が
可能な、電子吸引基を有するエチル基、ジアルキルアミノメチレン基等を有する場合、当該保護基は、アンモニア処理又は第１級アミン処理により除去することができる。また、Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基としてジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等のトリチル基を有する場合、当該保護基は、酸処理により除去することができる。また、Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基として上記のようなβ脱離による除去が可能な電子吸引基を有するアルコキシカルボニル基を有する場合、当該保護基は、第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理により除去することができる。
【００２４】
上記式（Ｉ）、（II）又は（III）には、Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体が複数個含まれているが、これらは同一の種類であってもよいし、異なる種類であってもよい。
【００２５】
上記式（Ｉ）、（II）又は（III）において、Ｒ1で表されるトリチル基又は９−フェニルキサンテニル基は置換基を有していてもよいし、置換基を有していなくてもよい。なお、Ｒ1で表されるトリチル基又は９−フェニルキサンテニル基は５’水酸基の保護基であり、当該保護基は、酸処理により除去することができる。
【００２６】
トリチル基は、３個のフェニル基のうち１個以上に置換基を有することができる。トリチル基又は９−フェニルキサンテニル基は、フェニル基の２位、３位又は４位のいずれか１以上に置換基を有することができる。トリチル基又は９−フェニルキサンテニル基が複数の置換基を有する場合、置換基の種類は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００２７】
トリチル基又は９−フェニルキサンテニル基が有する置換基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基等のアルキル基；メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基等のアルコシキ基等が挙げられる。
【００２８】
置換基を有するトリチル基としては、例えば、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、４，４’，４’’−トリメトキシトリチル基、４−メチルトリチル基、４，４’−ジメチルトリチル基等が挙げられるが、これらのうち、４，４’−ジメトキシトリチル基が好ましい。
【００２９】
置換基を有する９−フェニルキサンテニル基としては、例えば、９−（４’−メトキシフェニル）キサンテニル基、９−（４’−メチルフェニル）キサンテニル基等が挙げられるが、これらのうち、９−（４’−メトキシフェニル）キサンテニル基が好ましい。
【００３０】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるハロゲン原子は特に限定されるものではなく、その具体例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
【００３１】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアルキル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基等の炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。
【００３２】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアルケニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ビニル基、アリル基、クロチル（２−ブテニル）基、イソプロペニル（１−メチルビニル）基等の炭素数２〜５のアルケニル基が挙げられる。
【００３３】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアルキニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、エチニル基、１−プロピニル基、プロパルギル基等の炭素数２〜５のアルキニル基が挙げられる。
【００３４】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるシクロアルキル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等の炭素数３〜６のシクロアルキル基が挙げられる。
【００３５】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるシクロアルケニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等の炭素数５〜６のシクロアルケニル基が挙げられる。
【００３６】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアリール基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、フェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、３，５−ジメトキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、３，５−ジメチルフェニル基、２，４，６−トリメチルフェニル基、ナフチル基等の置換又は非置換の芳香族炭化水素基；フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラリジニル基、キノリル基、イソキノリル基等の置換又は非置換の芳香族複素環基が挙げられる。
【００３７】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアラルキル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ベンジル基、α-メチルベンジル基、フェネチル基等のアラルキル基が挙げられる。
【００３８】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアシル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、アセチル基、トリフルオロアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ピバロイル基等の炭素数１〜５の脂肪族アシル基；ベンゾイル基、３，５−ジメチルベンゾイル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル基、２，６−ジメトキシベンゾイル基、２，４，６−トリメトキシベンゾイル基、２，６−ジイソプロポキシベンゾイル基、ナフチルカルボニル基、アントリルカルボニル基等の芳香族アシル基が挙げられる。
【００３９】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアルコキシ基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基等の炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基が挙げられる。
【００４０】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアリールオキシ基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等のアリールオキシ基が挙げられる。
【００４１】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアラルキルオキシ基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基等のアラルキルオキシ基が挙げられる。
【００４２】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアルコキシカルボニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｎ−オクチルオキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基が挙げられる。
【００４３】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアリールオキシカルボニル基は特に限定されるものではなく、その具体例しては、フェノキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基等のアリールオキシカルボニル基が挙げられる。
【００４４】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアラルキルオキシカルボニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ベンジルオキシカルボニル基、フェネチルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００４５】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアルキルチオカルボニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、メチルチオカルボニル基、エチルチオカルボニル基、ｎ−ブチルチオカルボニル基、ｎ−オクチルチオカルボニル基等のアルキルチオカルボニル基が挙げられる。
【００４６】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアルコキシチオカルボニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、メトキシチオカルボニル基、エトキシチオカルボニル基、ｎ−ブトキシチオカルボニル基、ｎ−オクチルオキシチオカルボニル基等のアルコキシチオカルボニル基が挙げられる。
【００４７】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアリールチオカルボニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、フェニルチオカルボニル基、ナフチルチオカルボニル基等のアリールチオカルボニル基が挙げられる。
【００４８】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアラルキルチオカルボニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ベンジルチオカルボニル基、フェネチルチオカルボニル基等のアラルキルチオカルボニル基が挙げられる。
【００４９】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアリールオキシチオカルボニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、フェノキシチオカルボニル基、ナフチルオキシチオカルボニル基等のアリールオキシチオカルボニル基が挙げられる。
【００５０】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアラルキルオキシチオカルボニル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ベンジルオキシチオカルボニル基、フェネチルオキシチオカルボニル基等のアラルキルオキシチオカルボニル基が挙げられる。
【００５１】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4で表されるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルキルチオカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アリールチオカルボニル基、アラルキルチオカルボニル基、アリールオキシチオカルボニル基又はアラルキルオキシチオカルボニル基は、置換基を有していてもよいし、置換基を有していなくてもよい。
【００５２】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ2（又はＲ3）とＲ4とは、相互に連結して、Ｒ2（又はＲ3）及びＲ4がそれぞれ結合している炭素原子と共同して環を形成してもよい。
【００５３】
上記式（II）又は（III）において、Ｒ5で表される電子吸引基（電子求引基）は特に限定されるものではなく、その具体例としては、シアノ基、ニトロ基、ｐ−ニトロフェニル基、アルキルスルホニル基（例えば、メチルスルホニル基、トリフルオロメチルスルホニル基、エチルスルホニル基等）、アリールスルホニル基（例えば、フェニルスルホニル等）、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アルコキシカルボニル（例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル等）、ヒドロキシカルボニル、アリールオキシカルボニル（例えば、フェノキシカルボニル等）等が挙げられるが、シアノ基であることが好ましい。
【００５４】
上記式（III）において、Ｒ6で表されるリン酸保護基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、メチル基、２−シアノエチル基、２−（トリメチルシリル）エチル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル基等が挙げられるが、これらのうち、メチル基又は２−シアノエチル基が好ましい。
【００５５】
上記式（Ｉ）又は（II）には、Ｘで表されるオキソアニオン（Ｏ-）又はチオアニオン（Ｓ-）が複数個含まれているが、これらは同一種類のアニオンであってもよいし、異なる種類のアニオンであってもよい。
【００５６】
上記式（III）には、Ｗで表される酸素原子又は硫黄原子が複数個含まれているが、これらは同一種類の原子であってもよいし、異なる種類の原子であってもよい。
【００５７】
上記式（Ｉ）、（II）又は（III）において、Ｙ及びＺで表される水酸基の保護基は、Ｒ1で表される５’水酸基の保護基が除去される条件下で除去されない限り特に限定されるものではないが、その具体例としては、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリル基；レブリニル基、アセチル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、ブチリル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等のアシル基；テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等の環状保護基；イソプロピリデン基、メトキシメチリデン基、ベンジリデン基等の２’３’−環状アセタール型保護基等が挙げられるが、これらのうち、フェノキシアセチル基又はｔ−ブチルジフェニルシリル基が好ましい。Ｙ及びＺがともに水酸基の保護基を表す場合、Ｙ及びＺで表される水酸基の保護基は同一種類であってもよいし、異なる種類であってもよい。
【００５８】
Ｙ及びＺで表される水酸基の保護基が上記のようなアシル基である場合、当該保護基は、アンモニア処理又は第１級アミン処理により除去することができる。また、Ｙ及びＺで表される水酸基の保護基が上記のような環状保護基、２’３’−環状アセタール型保護基等である場合、ギ酸等の酸処理によって除去することができる。また、Ｙ及びＺで表される水酸基の保護基が上記のようなシリル基である場合、当該保護基は、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）等のフッ化物処理により除去することができる。
【００５９】
上記式（Ｉ）、（II）又は（III）において、Ｙ及びＺで表される固相担体は特に限定されるものではないが、その具体例としては、アミノアルキル化された高分子担体（例えばポリスチレン）、多孔性の球状グラスビーズ（controlled pore glass：ＣＰＧ）、ポリエチレングリコール等が挙げられる。ヌクレオチドの水酸基とＹ及びＺで表される固相担体とは、直接結合していてもよいし、コハク酸エステル、シュウ酸エステル、フタル酸エステル、４−カルボキシフェニル（ジイソプロピル）シリル基（A. Kobori, et al. Chem. Lett., 16-17 (2002)）等のスペーサー（リンカー）を介して結合していてもよい。Ｙ及びＺがともに固相担体を表す場合、Ｙ及びＺで表される固相担体は同一種類であってもよいし、異なる種類であってもよい。
【００６０】
Ｙ及びＺで表される固相担体がコハク酸エステル、シュウ酸エステル、フタル酸エステル等のスペーサーを介して水酸基と結合している場合、当該固相担体は、アンモニア処理又は第１級アミン処理により除去することができる。
【００６１】
Ｙ及びＺで表される固相担体が４−カルボキシフェニル（ジイソプロピル）シリル基を介して水酸基と結合している場合、当該固相担体は、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）等のフッ化物処理により除去することができる。
【００６２】
上記式（Ｉ）、（II）又は（III）において、ｎは１以上の整数である限り特に限定されないが、通常は１〜１００の整数であり、好ましくは１〜３０の整数である。
【００６３】
以下、Ｒ1が置換基を有していてもよいトリチル基若しくは９−フェニルキサンテニル基であるリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）、（II）又は（III）をそれぞれ「リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）」、「リボヌクレオチド誘導体（II−１）」又は「リボヌクレオチド誘導体（III−１）」といい、Ｒ1が水素原子であるリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）、（II）又は（III）をそれぞれ「リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−２）」、「リボヌクレオチド誘導体（II−２）」又は「リボヌクレオチド誘導体（III−２）」という。
【００６４】
〔リボ核酸合成モノマーの製造〕
次式（ａ）：
【化１０】
2010265304.tif 000011
［式中、Ｂは前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオシド又はリボヌクレオシド誘導体（ａ）をピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等の有機溶媒に溶解し、これに１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン、ジ−tert−ブチルジクロロシラン又はジ−tert−ブチルシリルビス（トリフルオロメタンスルホン酸）を添加するとともに、発生する塩化水素やトリフルオロメタンスルホン酸の捕捉剤としてピリジン、トリエチルアミン等を添加して反応させることにより、次式（ｂ）：
【化１１】
2010265304.tif 000012
［式中、Ｂは前記と同義であり、Ｒ13は１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル基又はジ−tert−ブチルシランジイル基を表す。］
で表されるリボヌクレオシド誘導体（ｂ）を製造することができる。この際の反応温度は通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、反応時間は通常１〜１２時間、好ましくは４〜８時間である。また、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン、ジ−tert−ブチルジクロロシラン又はジ−tert−ブチルシリルビス（トリフルオロメタンスルホン酸）の添加量は、リボヌクレオシド又はリボヌクレオシド誘導体（ａ）に対して通常１〜２モル当量、好ましくは１〜１.２モル当量であり、捕捉剤の添加量は、リボヌクレオシド又はリボヌクレオシド誘導体（ａ）に対して通常１〜２モル当量、好ましくは１〜１.２モル当量である。
【００６５】
次いで、リボヌクレオシド誘導体（ｂ）を１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、トルエン、アセトニトリル等の有機溶媒に溶解し、これに次式（ｃ）：
【化１２】
2010265304.tif 000013
［式中、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は前記と同義である。］
で表される化合物（ｃ）を添加するとともに、触媒としてｐ−トルエンスルホン酸水和物、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム塩、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、塩化水素、硫酸等を添加して反応させることにより、次式（ｄ）：
【化１３】
2010265304.tif 000014
［式中、Ｂ、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ13は前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオシド誘導体（ｄ）を製造することができる。この際の反応温度は通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、反応時間は通常１０分間〜１時間、好ましくは１０〜２０である。また、化合物（ｃ）の添加量は、リボヌクレオシド誘導体（ｂ）に対して通常１.１〜１０モル当量、好ましくは１.１〜５モル当量であり、触媒の添加量は、リボヌクレオシド誘導体（ｂ）に対して通常０.１〜１０モル当量、好ましくは１.１〜５モル当量である。
【００６６】
次いで、リボヌクレオシド誘導体（ｄ）をテトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジクロロメタン、アセトニトリル等の有機溶媒に溶解し、フッ素化剤（例えば、テトラブチルアンモニウムフルオリド、トリエチルアミントリハイドロフルオリド、フッ化水素ピリジン等）と酸（例えば、酢酸、塩酸、硫酸）とを任意の混合比の混合試薬として反応させることにより、次式（ｅ）：
【化１４】
2010265304.tif 000015
［式中、Ｂ、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオシド誘導体（ｅ）を製造することができる。この際の反応温度は通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、反応時間は通常１５〜２０時間、好ましくは１６〜１８時間である。また、混合試薬におけるフッ素化剤と酸との混合比は、通常１：１〜１：２、好ましくは１：１〜１：１.５であり、混合試薬の添加量は、リボヌクレオシド誘導体（ｄ）に対して通常２〜１０モル当量、好ましくは３〜５モル当量である。
【００６７】
次いで、リボヌクレオシド誘導体（ｅ）を、ピリジン等の有機溶媒に溶解し、これにＲ1a−Ｃｌ［式中、Ｒ1aは置換基を有していてもよいトリチル基若しくは９−フェニルキサンテニル基を表す。］を添加して反応させることにより、次式（ｆ）：
【化１５】
2010265304.tif 000016
［式中、Ｒ1a、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオシド誘導体（ｆ）を製造することができる。この際の反応温度は通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、反応時間は通常４〜１２時間、好ましくは６〜８時間である。また、Ｒ1a−Ｃｌの添加量は、リボヌクレオシド誘導体（ｅ）に対して通常１〜２モル当量、好ましくは１〜１.１モル当量である。
こうして製造されたリボヌクレオシド誘導体（ｆ）は、リボ核酸合成モノマーであるリボヌクレオシド誘導体（ｈ）を製造するにあたっての中間体である。
【００６８】
次いで、リボヌクレオシド誘導体（ｆ）を、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジクロロメタン、アセトニトリル等の有機溶媒に溶解し、これに次式（ｇ）：
【化１６】
2010265304.tif 000017
［式中、Ｒ6は前記と同義であり、Ｒ14及びＲ15は同一の又は異なるアルキル基を表す。］
で表される化合物（ｇ）及び亜リン酸化剤（例えば、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダイト、メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダイト等）を添加して反応させることにより、次式（ｈ）：
【化１７】
2010265304.tif 000018
［式中、Ｒ1a、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ14及びＲ15は前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオシド誘導体（ｈ）を製造することができる。この際の反応温度は通常０〜２５℃、好ましくは１５〜２５℃であり、反応時間は通常１〜３時間、好ましくは２〜３時間である。また、化合物（ｇ）の添加量は、リボヌクレオシド誘導体（ｆ）に対して通常１〜２モル当量、好ましくは１〜１.１モル当量であり、亜リン酸化剤の添加量は、リボヌクレオシド誘導体（ｆ）に対して通常１〜２モル当量、好ましくは１〜１.１モル当量である。
【００６９】
上記式（ｇ）及び（ｈ）において、Ｒ14及びＲ15で表されるアルキル基は特に限定されるものではなく、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基等の炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられるが、これらのうち、エチル基又はイソプロピル基が好ましい。Ｒ14及びＲ15で表されるアルキル基は同一であってもよいし、異なっていてもよい。また、Ｒ14及びＲ15で表されるアルキル基が一体となって環を形成していてもよい。
こうして製造されたリボヌクレオシド誘導体（ｈ）は、リボ核酸合成のモノマーとなる。
【００７０】
〔リボヌクレオチド誘導体（III−１）の製造〕
（工程１）５’水酸基の脱保護
常法に従って得られる次式（ｉ）：
【化１８】
2010265304.tif 000019
［式中、Ｂ、Ｒ1a、Ｙ及びＺは前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオシド誘導体（ｉ）を酸処理することにより、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基を除去し、５'水酸基の脱保護を行う。この際、酸処理は、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸等を１〜５％の濃度になるようにジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解した溶液を用いて行うことができる。当該溶液を用いた処理温度は通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、処理時間は通常０.５〜１０分、好ましくは０.５〜１分である。
【００７１】
（工程２）ホスホロアミダイト体の活性化及び縮合反応による鎖伸長
リボヌクレオシド誘導体（ｈ）にプロトンを与えて活性化させ、５'水酸基を脱保護したリボヌクレオシド誘導体（ｉ）と縮合反応させる。この際、反応溶媒としては、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン等を用いることができ、活性化剤としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−ベンジルチオテトラゾール、５−ニトロフェニルテトラゾール、３，４−ジシアノイミダゾール、３，４−ジクロロイミダゾール、３，４−ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、Ｎ−シアノメチルアンモニウム塩等を用いることができる。また、反応温度は通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、反応時間は通常５〜１５分、好ましくは３〜５分である。
【００７２】
縮合反応における活性化剤としては１Ｈ−テトラゾールが一般的に用いられる。但し、縮合反応では２’水酸基の保護基の立体障害による縮合反応速度及び縮合反応収率の低下が問題となるので、１Ｈ−テトラゾールと比較して，縮合反応速度及び縮合反応収率の向上が期待できる活性化剤（例えば、５−エチルチオテトラゾール、５−ベンジルチオテトラゾール、５−ニトロフェニルテトラゾール、３，４−ジシアノイミダゾール、３，４−ジクロロイミダゾール、３，４−ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、Ｎ−シアノメチルアンモニウム塩等）を用いることが好ましい。Ｎ−シアノメチルアンモニウム塩としては、例えば、Ｎ−シアノメチルジメチルアンモニウムテトラフルオロホウ酸、Ｎ−シアノメチルジメチルアンモニウムヘキサフルオロリン酸、Ｎ−シアノメチルジメチルアンモニウムトリフルオロメタンスルホン酸、Ｎ−シアノメチルジメチルアンモニウムビストリフルオロメタンスルホンイミド、Ｎ−シアノメチルジメチル過塩素酸、Ｎ−シアノメチルピロリジンテトラフルオロホウ酸、Ｎ−ヘキサフルオロリン酸、Ｎ−シアノメチルピロリジントリフルオロメタンスルホン酸、Ｎ−シアノメチルピロリジントリフルオロメタンスルホンイミド、Ｎ−シアノメチルピロリジン過塩素酸、Ｎ−シアノメチルピペリジンテトラフルオロホウ酸、Ｎ−シアノメチルピペリジンヘキサフルオロリン酸、Ｎ−シアノメチルピペリジントリフルオロメタンスルホン酸、Ｎ−シアノメチルピペリジントリフルオロメタンスルホンイミド、Ｎ−シアノメチルピペリジン過塩素酸、Ｎ−シアノメチルジイソプロピルアンモニウムテトラフルオロホウ酸、Ｎ−シアノメチルジイソプロピルアンモニウムヘキサフルオロリン酸、Ｎ−シアノメチルジイソプロピルアンモニウムトリフルオロメタンスルホン酸、Ｎ−シアノメチルジイソプロピルアンモニウムトリフルオロメタンスルホンイミド、Ｎ−シアノメチルジイソプロピルアンモニウム過塩素酸等を用いることができる。
【００７３】
次いで、必要に応じて、未反応物の水酸基をキャッピングする。この際、キャップ化試薬としては、４−ジメチルアミノピリジンやＮ−メチルイミダゾールをピリジン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等の任意の混合溶媒に０．０５〜１Ｍの濃度になるように溶解した溶液と、無水酢酸、無水メトキシ酢酸等とを適当な混合比（例えば９：１〜１９：１）で混合した溶液を用いることができる。当該溶液を用いた反応時間は通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、反応時間は通常０.５〜５分、好ましくは０.５〜１分である。
【００７４】
（工程３）亜リン酸結合のリン酸トリエステル結合への酸化
亜リン酸結合のリン酸トリエステル結合への酸化は、例えば、ヨウ素をピリジン、水、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等の無機溶媒、有機溶媒又はそれらの任意の混合溶媒に０．０５〜２Ｍの濃度になるように溶解した溶液や、過酸化ｔ−ブチルアルコールをメチレンクロライド、トルエン等に溶解した溶液を用いて行うことができる。当該溶液を用いた反応時間は通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、反応時間は通常０.５〜５分、好ましくは０.５〜１分である。
【００７５】
亜リン酸結合のリン酸トリエステル結合への酸化は、酸化反応時に生じる中間体の加水分解、溶媒中のＨ2Ｏによる縮合反応効率の低下等を防止するために、無水溶媒中で行うことが好ましい。亜リン酸結合を無水溶媒中でリン酸トリエステル結合へ酸化できる試薬としては、例えば、過酸化ｔ−ブチルアルコール、２−（フェニルスルホニル）−３−（３−ニトロフェニル）オキサジリジン、２−（フェニルスルホニル）−３−フェニルオキサジリジン、（１Ｓ）−（＋）−カンファースルフォニルオキサジリジン、（１Ｓ）−（＋）−８，８−ジクロロカンファースルフォニルオキサジリジン等を用いることができる。
【００７６】
上記工程１〜３により、次式（ｊ−１）：
【化１９】
2010265304.tif 000020
［式中、Ｂ、Ｒ1a、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｙ及びＺは前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオチド誘導体（ｊ−１）（ダイマー）を製造することができる。
【００７７】
また、上記工程３において、酸化反応の代わりに硫化反応を行うことにより、次式（ｊ−２）：
【化２０】
2010265304.tif 000021
［式中、Ｂ、Ｒ1a、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｙ及びＺは前記と同義である。］
で表されるリボヌクレオチド誘導体（ｊ−２）（ダイマー）を製造することができる。硫化反応は、例えば、硫黄、Beaucage試薬（３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド）等を用いて行うことができる。
【００７８】
次いで、上記工程１〜３に従って、リボヌクレオチド誘導体（ｊ−１）又は（ｊ−２）（ダイマー）とリボヌクレオシド誘導体（ｈ）（モノマー）とを反応させることにより、次式（ｋ）：
【化２１】
2010265304.tif 000022
［式中、Ｂ、Ｒ1a、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｗ、Ｙ及びＺは前記と同義である。]
で表されるリボヌクレオチド誘導体（ｋ）（トリマー）を製造することができる。
同様にして上記工程１〜３を繰り返すことにより、リボヌクレオチド誘導体（III−１）（オリゴマー）を製造することができる。
上記工程１〜３は、市販の核酸合成機を用いて行ってもよい。
【００７９】
〔リボヌクレオチド誘導体（III−２）の製造〕
リボヌクレオチド誘導体（III−２）は、リボヌクレオチド誘導体（III−１）を酸処理し、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸等を用いることができるが、ジクロロ酢酸を用いることが好ましい。酸処理は、具体的には、上記酸をジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等に濃度が１〜５％となるように溶解した溶液を用いて行うことができる。当該溶液を用いた処理温度は通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、処理時間は通常０.５〜５分、好ましくは０.５〜１分である。
【００８０】
リボヌクレオチド誘導体（III−１）において、Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基としてジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等のトリチル基を有する場合、当該保護基は、ヌクレオチド誘導体（III−１）の酸処理により、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基とともに除去される。
【００８１】
〔リボヌクレオチド誘導体（II−１）の製造〕
リボヌクレオチド誘導体（II−１）は、リボヌクレオチド誘導体（III−１）を塩基処理し、Ｒ6で表されるリン酸保護基を除去することにより製造することができる。塩基としては、Ｒ6で表されるリン酸保護基は除去するが２’水酸基の保護基は除去しない塩基を用いることができる。このような塩基としては、例えば、アンモニア、第１級アミン等が用いることができ、第１級アミンとしては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン等の第１級アルキルアミンを用いることができる。塩基処理は、具体的には、上記塩基を水、エタノールに濃度が１５〜３０％となるように溶解した溶液を用いて行うことができる。当該溶液を用いた処理温度は通常０〜５０℃、好ましくは１０〜２５℃であり、処理時間は通常１〜８時間、好ましくは１〜２時間である。
【００８２】
リボヌクレオチド誘導体（III−１）において、Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基としてアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基等の脂肪族アシル基；ベンゾイル基、４−メチルベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４−tert−ブチルフェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基等の芳香族アシル基；ハロゲン原子、アルキル基、アルキルオキシ基等の置換基を有する脂肪族アシル基又は芳香族アシル基；２−シアノエチル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル基、２−（ベンゼンスルホニル）エチル基等のβ脱離による除去が可能な、電子吸引基を有するエチル基；ジメチルアミノメチレン基、ジブチルアミノメチレン基等のジアルキルアミノメチレン基を有する場合、当該保護基は、ヌクレオチド誘導体（III−１）のアンモニア処理又は第１級アミン処理により、Ｒ6で表されるリン酸保護基とともに除去される。
【００８３】
リボヌクレオチド誘導体（III−１）において、Ｙ及びＺで表される水酸基の保護基がレブリニル基、アセチル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、ブチリル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等のアシル基である場合、当該保護基は、ヌクレオチド誘導体（III−１）のアンモニア処理又は第１級アミン処理により、Ｒ6で表されるリン酸保護基とともに除去される。
【００８４】
リボヌクレオチド誘導体（III−１）において、Ｙ及びＺで表される固相担体がコハク酸エステル、シュウ酸エステル、フタル酸エステル等のスペーサーを介して水酸基と結合している場合、当該固相担体は、リボヌクレオチド誘導体（III−１）のアンモニア処理又は第１級アミン処理により、Ｒ6で表されるリン酸保護基とともに除去される。
【００８５】
〔リボヌクレオチド誘導体（II−２）の製造〕
（１）第１の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（II−２）は、リボヌクレオチド誘導体（III−２）を塩基処理し、Ｒ6で表されるリン酸保護基を除去することにより製造することができる。塩基処理は、〔リボヌクレオチド誘導体（II−１）の製造〕と同様に行うことができる。
【００８６】
リボヌクレオチド誘導体（III−２）において、Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体がアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基等の脂肪族アシル基；ベンゾイル基、４−メチルベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４−tert−ブチルフェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基等の芳香族アシル基；ハロゲン原子、アルキル基、アルキルオキシ基等の置換基を有する脂肪族アシル基又は芳香族アシル基；２−シアノエチル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル基、２−（ベンゼンスルホニル）エチル基等のβ脱離による除去
が可能な、電子吸引基を有するエチル基；ジメチルアミノメチレン基、ジブチルアミノメチレン基等のジアルキルアミノメチレン基を有する場合、当該保護基は、ヌクレオチド誘導体（III−２）のアンモニア処理又は第１級アミン処理により、Ｒ6で表されるリン酸保護基とともに除去される。
【００８７】
リボヌクレオチド誘導体（III−２）において、Ｙ及びＺで表される水酸基の保護基がレブリニル基、アセチル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、ブチリル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等のアシル基である場合、当該保護基は、ヌクレオチド誘導体（III−２）のアンモニア処理又は第１級アミン処理により、Ｒ6で表されるリン酸保護基とともに除去される。
【００８８】
リボヌクレオチド誘導体（III−２）において、Ｙ及びＺで表される固相担体がコハク酸エステル、シュウ酸エステル、フタル酸エステル等のスペーサーを介して水酸基と結合している場合、当該固相担体は、リボヌクレオチド誘導体（III−２）のアンモニア処理又は第１級アミン処理により、Ｒ6で表されるリン酸保護基とともに除去される。
【００８９】
（２）第２の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（II−２）は、リボヌクレオチド誘導体（II−１）を酸処理し、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。酸処理は、〔リボヌクレオチド誘導体（III−２）の製造〕と同様にして行うことができる。
リボヌクレオチド誘導体（II−１）において、Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基としてジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等のトリチル基を有する場合、当該保護基は、リボヌクレオチド誘導体（II−１）の酸処理により、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基とともに除去される。
【００９０】
〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕
（１）第１の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）は、リボヌクレオチド誘導体（II−１）をフッ化物処理し、２’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。フッ化物としては、例えば、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、フッ化カリウムと１８−クラウン−６との混合試薬等を用いることができるが、ＴＢＡＦを用いることが好ましい。ＴＢＡＦを用いると２’水酸基の保護基を短時間で除去することができるからである。フッ化カリウムと１８−クラウン−６との混合試薬を用いる場合、クラウンエーテルによりカリウムイオンが捕捉されてフッ化物イオンが遊離し、遊離したフッ化物イオンが、ＴＢＡＦの場合と同様に２’水酸基の保護基を除去することができる。フッ化物処理は、具体的には、ＴＢＡＦをテトラヒドロフラン等に濃度が０．５〜１Ｍとなるように溶解した溶液等を用いて行うことができる。当該溶液を用いた処理温度は通常０〜６０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、処理時間は通常０.１〜３０時間、好ましくは０.２〜０.５時間である。
【００９１】
リボヌクレオチド誘導体（II−１）において、Ｙ及びＺで表される水酸基の保護基がｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリル基である場合、当該保護基は、リボヌクレオチド誘導体（II−１）のフッ化物処理により、２’水酸基の保護基とともに除去される。
【００９２】
リボヌクレオチド誘導体（II−１）において、Ｙ及びＺで表される固相担体が４−カルボキシフェニル（ジイソプロピル）シリル基を介して水酸基と結合している場合、当該固相担体は、リボヌクレオチド誘導体（II−１）のフッ化物処理により、２’水酸基の保護基とともに除される。
【００９３】
（２）第２の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）は、リボヌクレオチド誘導体（II−１）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で塩基処理した後、中性条件下で加水分解し、２’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。塩基としては、例えば、第３級アミン等の有機塩基、ホスファゼン塩基（Schwesinger塩基）等を用いることができる。なお、第１級アミン又は第２級アミンとシリル化剤とを併用すると、対応するシリルアミンへと変換され、第１級アミン又は第２級アミンの塩基性が極端に減少するため有効ではないと考えられる。第３級アミンとしては、例えば、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルピペリジン等を用いることができるが、ＤＢＵを用いることが好ましい。ＤＢＵを用いると２’水酸基の保護基を短時間で除去することができるからである。ホスファゼン塩基としては、例えば、２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチル−１，３，２−ジアザホスホリナン、（ｔｅｒｔ−ブチルイミノ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン、ｔｅｒｔ−ブチルトリス［トリス（ジメチルアミノ）ホスホラニリデン］ホスホリミディックトリアミド等を用いることができる。シリル化剤としては、例えば、Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド、Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルトリフルオロアセトアミド、Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルベンズアミド等のトリメチルシリル化剤を用いることができる。無水溶媒としては、例えば、アセトニトリル、ニトロメタン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド等を用いることができる。塩基処理は、具体的には、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）をアセトニトリル等に濃度が０．５〜１Ｍとなるように溶解した溶液等を用いて行うことができる。当該溶液を用いた処理温度は通常０〜６０℃、好ましくは１５〜２５℃であり、処理時間は通常０.１〜３０時間、好ましくは０.２〜０.５時間である。加水分解は、塩基処理の後、中性条件下で行う。加水分解は、例えば、塩基処理後の反応溶媒に酸を加えて中和し、反応溶媒中に残存する塩基を除去した後に行うことができる。酸は特に限定されるものではないが、例えば、酢酸のアセトニトリル溶液、塩化水素のアセトニトリル溶液等を用いることができる。酸による残存塩基の中和は無水条件下で行う必要がある。
【００９４】
シリル化剤の不存在下で塩基処理を行うと、脱保護された２’水酸基がリン酸エステルのリン原子を求核攻撃し、ヌクレオチド鎖の分解が生じる。そこで、シリル化剤存在下で塩基処理を行う。シリル化剤は、２'水酸基又は脱保護反応の中間体として生成する２'−Ｏ−２−ヒドロキシエチル基をシリル化することにより、水酸基の隣接リン原子への攻撃を抑制するので、ヌクレオチド鎖の分解が防止される。
【００９５】
リボヌクレオチド誘導体（II−１）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で塩基処理することにより、リン酸エステルはリン酸シリルエステルへと変換されるとともに、２'水酸基又は脱保護反応の中間体として生成する２'−Ｏ−２−ヒドロキシエチル基はシリル化される。リン酸シリルエステルは、水を加えると、直ちに加水分解されて遊離のリン酸エステルに変換される。シリル化された２’水酸基は、水を加えると、隣接する遊離したリン酸の分子内酸触媒作用で速やかに加水分解され、遊離の２’水酸基に変換される。脱保護反応の中間体として生成する２‘−Ｏ−２−ヒドロキシエチル基がシリル化されて２−トリメチルシロキシエチル基に変換されている場合、当該シリルエーテルは極めて不安定なため、水を加えると、直ちに加水分解され、不安定な２−ヒドロキシエチル基に変換された後、直ちにアセトアルデヒドの脱離を伴って分解し、遊離の２’水酸基に変換される。なお、加水分解処理は酸性条件下で行うこともできるが、酸性条件下で加水分解処理を行うとＲ1aで表される５'水酸基の保護基が除去されるので、リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造方法では中性条件下で加水分解処理を行う。中性条件は通常ｐＨ７．０であり、酸性条件は通常ｐＨ２．０−６．９である。
【００９６】
リボヌクレオチド誘導体（II−１）において、Ｂで表される核酸又はその誘導体が有する保護基が２−シアノエトキシカルボニル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基、２−（ベンゼンスルホニル）エトキシカルボニル基等のβ脱離による除去が可能な、電子吸引基を有するアルコキシカルボニル基である場合、当該保護基は、リボヌクレオチド誘導体（II−１）の第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理により除去される。
【００９７】
（３）第３の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）は、リボヌクレオチド誘導体（III−１）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で塩基処理した後、中性条件下で加水分解し、Ｒ6で表されるリン酸保護基及び２’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。無水溶媒中におけるシリル化剤存在下での塩基処理及び中性条件下での加水分解処理は、上記第２の製造方法と同様に行うことができる。
【００９８】
リボヌクレオチド誘導体（III−１）において、Ｂで表される核酸又はその誘導体が有する保護基が２−シアノエトキシカルボニル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基、２−（ベンゼンスルホニル）エトキシカルボニル基等のβ脱離による除去が可能な、電子吸引基を有するアルコキシカルボニル基である場合、当該保護基は、リボヌクレオチド誘導体（III−１）の第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理により除去される。
【００９９】
〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−２）の製造〕
（１）第１の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−２）は、リボヌクレオチド誘導体（II−２）をフッ化物処理し、２’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。フッ化物処理は、〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕と同様にして行うことができる。
【０１００】
リボヌクレオチド誘導体（II−２）において、Ｙ及びＺで表される水酸基の保護基がｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリル基である場合、当該保護基は、リボヌクレオチド誘導体（II−２）のフッ化物処理により、２’水酸基の保護基とともに除去される。
【０１０１】
リボヌクレオチド誘導体（II−２）において、Ｙ及びＺで表される固相担体が４−カルボキシフェニル（ジイソプロピル）シリル基を介して水酸基と結合している場合、当該固相担体は、リボヌクレオチド誘導体（II−２）のフッ化物処理により、２’水酸基の保護基とともに除去される。
【０１０２】
（２）第２の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−２）は、リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）を酸処理し、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。この際、ヌクレオチド鎖を分解しないように酸処理を行うことが好ましく、このような酸処理は、例えば、酢酸等を水に濃度が８０％となるように溶解した水溶液、ｐＨ１．５〜２．５（好ましくはｐＨ２．０）の水溶液（例えば、塩酸水溶液−ジオキサン混合溶液）等を用いて行うことができる。当該溶液を用いた処理温度は通常０〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、処理時間は通常１０〜１２０分、好ましくは２０〜４０分である。
【０１０３】
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）において、Ｂで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基としてジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等のトリチル基を有する場合、当該保護基は、リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の酸処理により、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基とともに除去される。
【０１０４】
（３）第３の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−２）は、リボヌクレオチド誘導体（II−２）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で塩基処理した後、中性条件又は酸性条件下で加水分解し、２’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。無水溶媒中におけるシリル化剤存在下での塩基処理は、〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕と同様に行うことができる。また、加水分解処理は、中性条件又は酸性条件下で加水分解処理を行う点を除き、〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕と同様に行うことができる。
【０１０５】
ヌクレオチド鎖の３'末端の２’水酸基又は３’水酸基がシリル化されている場合、リン酸の隣接基の関与がないので、中性条件下における加水分解反応は遅いと考えられる。したがって、この場合には酸性条件下で加水分解することが好ましい。
【０１０６】
リボヌクレオチド誘導体（II−２）において、Ｂで表される核酸又はその誘導体が有する保護基が２−シアノエトキシカルボニル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基、２−（ベンゼンスルホニル）エトキシカルボニル基等のβ脱離による除去が可能な、電子吸引基を有するアルコキシカルボニル基である場合、当該保護基は、リボヌクレオチド誘導体（II−２）の第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理により除去される。
【０１０７】
（４）第４の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−２）は、リボヌクレオチド誘導体（II−１）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で塩基処理した後、酸性条件下で加水分解し、２’水酸基の保護基及びＲ1aで表される５’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。無水溶媒中におけるシリル化剤存在下での塩基処理は、〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕と同様に行うことができる。また、加水分解処理は、酸性条件下で加水分解処理を行う点を除き、〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕と同様に行うことができる。
【０１０８】
リボヌクレオチド誘導体（II−１）において、Ｂで表される核酸又はその誘導体が有する保護基が２−シアノエトキシカルボニル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基、２−（ベンゼンスルホニル）エトキシカルボニル基等のβ脱離による除去が可能な、電子吸引基を有するアルコキシカルボニル基である場合、当該保護基は、ヌクレオチド誘導体（II−１）の第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理により除去される。
【０１０９】
（５）第５の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−２）は、リボヌクレオチド誘導体（III−２）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で塩基処理した後、中性条件又は酸性条件下で加水分解し、Ｒ6で表されるリン酸保護基及び２’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。無水溶媒中におけるシリル化剤存在下での塩基処理は、〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕と同様に行うことができる。また、加水分解処理は、中性条件又は酸性条件下で加水分解処理を行う点を除き、〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕と同様に行うことができる。
【０１１０】
リボヌクレオチド誘導体（III−２）において、Ｂで表される核酸又はその誘導体が有する保護基が２−シアノエトキシカルボニル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基、２−（ベンゼンスルホニル）エトキシカルボニル基等のβ脱離による除去が可能な、電子吸引基を有するアルコキシカルボニル基である場合、当該保護基は、リボヌクレオチド誘導体（III−２）の第３級アミン処理又はホスファゼン塩基により除去される。
【０１１１】
（６）第６の製造方法
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−２）は、リボヌクレオチド誘導体（III−１）を、無水溶媒中、シリル化剤存在下で塩基処理した後、酸性条件下で加水分解し、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基、Ｒ6で表されるリン酸保護基及び２’水酸基の保護基を除去することにより製造することができる。無水溶媒中におけるシリル化剤存在下での塩基処理は、〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕と同様に行うことができる。また、加水分解処理は、酸性条件下で加水分解処理を行う点を除き、〔リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）の製造〕と同様に行うことができる。
【０１１２】
リボヌクレオチド誘導体（III−１）において、Ｂで表される核酸又はその誘導体が有する保護基が２−シアノエトキシカルボニル基、２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基、２−（ベンゼンスルホニル）エトキシカルボニル基等のβ脱離による除去が可能な、電子吸引基を有するアルコキシカルボニル基である場合、当該保護基は、リボヌクレオチド誘導体（III−１）の第３級アミン処理又はホスファゼン塩基処理により除去される。
【０１１３】
リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）の製造にあたり、核酸塩基又はその誘導体の保護基、Ｒ6で表されるリン酸保護基及び２’水酸基の保護基が除去されたヌクレオチド鎖が塩基性条件下に置かれると、ヌクレオチド鎖が分解してしまう。核酸塩基又はその誘導体の保護基、ヌクレオチド鎖の３’末端の２’水酸基又は３’水酸基の保護基及びＲ6で表されるリン酸保護基の除去が塩基処理により行われる場合、核酸塩基又はその誘導体の保護基、ヌクレオチド鎖の３’末端の２’水酸基又は３’水酸基の保護基及びＲ6で表されるリン酸保護基の除去を２’水酸基の保護基の除去よりも後に行うと、核酸塩基又はその誘導体の保護基、Ｒ6で表されるリン酸保護基及び２’水酸基の保護基が除去されたヌクレオチド鎖が塩基性条件下に置かれることになり、ヌクレオチド鎖が分解してしまう。したがって、核酸塩基又はその誘導体の保護基、ヌクレオチド鎖の３’末端の２’水酸基又は３’水酸基の保護基及びＲ6で表されるリン酸保護基の除去が塩基処理により行われる場合、当該塩基処理は、２’水酸基の保護基の除去よりも前に行うことが好ましい。上記の製造方法によれば、核酸塩基又はその誘導体の保護基、ヌクレオチド鎖の３’末端の２’水酸基又は３’水酸基の保護基及びＲ6で表されるリン酸保護基の除去を、２’水酸基の保護基の除去よりも前に行うことができるので、ヌクレオチド鎖は分解されず、リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）を効率よく製造することができる。
【０１１４】
Ｒ6で表されるリン酸保護基及び２’水酸基の保護基は、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基の除去条件（酸性条件）下では安定して存在することができる。したがって、リボヌクレオチド誘導体（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）の製造にあたり、Ｒ1aで表される５’水酸基の保護基の除去を行う時点は特に限定されるものではなく、核酸塩基又はその誘導体の保護基、ヌクレオチド鎖の３’末端の２’水酸基又は３’水酸基の保護基、Ｒ6で表されるリン酸保護基及び２’水酸基の保護基の除去を行う前であってもよいし、これらの除去を行った後であってもよいし、これらの除去を行う間であってもよいが、核酸塩基又はその誘導体の保護基、ヌクレオチド鎖の３’末端の２’水酸基又は３’水酸基の保護基及びＲ6で表されるリン酸保護基の除去を行う前であることが好ましい。Ｒ1aで表される５'水酸基の保護基の除去により脱保護された５’水酸基がリン酸エステル結合を攻撃し、ヌクレオチド鎖が切断されることを防止するためである。
【０１１５】
リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の精製は、Ｃ８〜Ｃ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、Ｃ８〜Ｃ１８逆相カートリッジカラム、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー等の方法を単独で用いることにより、又は高速液体クロマトグラフィー装置と組み合わせて用いることにより行うことができる。
【実施例】
【０１１６】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。
〔実施例１〕2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-１,3-ジイル)ウリジン(2)の合成
本実施例の合成工程を図１に示す。
45mlの1,4-ジオキサンに溶解させた3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)ウリジン(1)(1.41g, 3mmol)に対し、ビニルオキシプロパンニトリル(9.92g, 30mmol)、p-トルエンスルホン酸-水和物(630mg, 3.3mmol)を加え撹拌した。反応は10分で完結し、過剰量のピリジンを加え反応を終了させた。反応系を濃縮後ジクロロメタンで希釈し有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、シリカゲルカラム（塩化メチレン、メタノール）にて精製した。目的物(2)(1.60g, 2.8mmol)は2種類のジアステレオマーの混合物であり、収率94%で得られた。なお、核酸塩基として、ウリジンの代わりにアセチル化アデニン、アセチル化シトシン、アセチル化グアニンを用いた場合の収率は、それぞれ96%、97%、65%であった。
1H NMR (CDCl3) δ8.84 (1H, br. s, H-N(3)); 7.92(1H, d, H-C(6)); 5.72(1H, d, H-C(5)); 5.67(1H, d, H-C(1')); 5.13(1H, m, MeCH(O)2); 4.30-3.71(7H, m, CH2CH2O, H-C(2'), H-C(3'), H-C(4'), H-C(5'); 2.65(2H, m, CH2CH2O); 1.44(3H, d, MeCH(O)2); 1.10-0.86(28H, m, 4 Me2CH)。
【０１１７】
〔実施例２〕2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-ウリジン(4)の合成
本実施例の合成工程を図１に示す。
2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)ウリジン(2)(568mg, 1mmol)を5mlのテトラヒドロフランに溶解させ、そこへ1Mテトラブチルアンモニウムフルオリド及び1.2M酢酸のテトラヒドロフラン溶液を5ml加えて17時間室温で反応を行った。反応溶液を減圧濃縮したオイル状の残渣を少量の塩化メチレンに溶解させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン、メタノール）によって精製し副生したテトラブチルアンモニウム酢酸塩を取り除いた。溶出してきた2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]ウリジン(3)を濃縮した後、ピリジンによって共沸乾燥し、さらに15mlのピリジンを加えた。そこへ、4,4'-O-ジメトキシトリチルクロリド(367mg, 1.1mmol)を加え、反応を開始した。8時間室温で反応させた溶液に水を加え反応を終了した。反応後の溶液を減圧濃縮し、ジクロロメタンに溶解させた。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過して取り除き、ろ液を減圧濃縮した。さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー(1%ピリジン、塩化メチレン、メタノール)によって精製を行い、目的の2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-ウリジン(4)(543mg, 0.85mmol)を2種類のジアステレオマーの混合物として収率85%で得た。なお、核酸塩基として、ウリジンの代わりにアセチル化アデニン、アセチル化シトシン、アセチル化グアニンを用いた場合の収率は、それぞれ96%、90%、93%であった。
1H NMR (CDCl3) δ8.63 (1H, br. s, H-N(3)); 8.00(1H, d, H-C(6)); 7.40-6.83 (13H, m, DMTr ) 5.96(1H, d, H-C(1')); 5.32-5.27(1H, d, H-C(5)); 5.20-5.05(1H, m, MeCH(O)2); 4.49-4.43(1H, m, H-C(2')): 4.39-4.23(1H, m, H-C(3') 4.07-4.05(1H, m, H-C(4')); 3.96-3.71(8H, m, H-C(5'), MeO); 2.66-2.57(2H, m, CH2CH2O); 1.43(3H, d, MeCH(O)2)。
【０１１８】
〔実施例３〕2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-ウリジン-3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)(5)の合成
本実施例の合成工程を図２に示す。
2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-ウリジン(4)(644mg, 1mmol)をピリジン及びトルエンで3回ずつ共沸を行い乾燥させた。5mlのジクロロメタンに溶解させ0℃に冷却した。そこへジイソプロピルエチルアミン及び亜リン酸化剤である2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロクロリダイトのジクロロメタン溶液(447μl, 2mmol/5ml)を滴下した。滴下後の反応溶液を室温に戻し、1時間反応を行った。乾燥したエタノールで反応を止め、反応混合物をジクロロメタンで希釈した。有機層をリン酸緩衝溶液(pH 7.0)で５回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、さらに減圧濃縮を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行い。目的物(5)(692mg, 0.82mmol)は4種類のジアステレオマーの混合物として収率82%で得られた。
1H NMR (CDCl3) δ8.65 (1H, br. s, H-N(3)); 8.04-7.97(1H, m, H-C(6)); 7.40-6.80 (13H, m, DMTr) 5.96-5.93(1H, m, H-C(1')); 5.27-5.06 (2H, m, MeCH(O)2, H-C(5)); 4.60-3.41 (12H, m, H-C(2') H-C(3')) H-C(4') H-C(5'), MeO, CH2CH2O, CH2CH2OP); 2.69-2.55(4H, m, CH2CH2O, CH2CH2OP); 1.44-1.35 (3H, m, MeCH(O)2); 1.188-1.13 (12H, m, (CH3)2CH); 1.04-1.00 (2H, m, (CH3)2CH));
31P NMR (CDCl3) δ150.78, 150.22, 149.54, 148.97
【０１１９】
〔実施例４〕液相法による保護されたウリジル酸2量体の合成
本実施例の合成工程を図３に示す。
デシケーター中で乾燥させた2',3'-O-ビスフェノキシアセチルウリジン(7)(24.4mg, 48μmol)及び2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-ウリジン-3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)(5)(47.4mg, 56μmol)をアセトニトリルに溶解させ、そこへ0.5M 1-Hテトラゾールのアセトニトリル溶液(114μmol/228μl)を加えて室温で3時間反応させた。35.7μlの反応溶液に過酸化t-ブチルアルコールの水溶液(80wt%)を加え30分間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥を行った。硫酸ナトリウムを濾過によって取り除き、濃縮乾燥した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(1%ピリジンを含む、ジクロロメタン、メタノール)によって精製を行い目的の保護されたウリジン2量体(8)(60.5mg, 48μmol)を4種類のジアステレオマーの混合物として定量的に得た。
1H NMR (CDCl3) δ9.88-9.70 (2H, br. m, H-N(3)(up and low)); 7.85-7.69 (2H, m, H-C(6)(up and low)); 7.38-6.78 (23H, m, DMTr, PheO) 606-5.91(2H, m, H-C(5)（up and low）); 5.76-5.48 (3H, m, MeCH(O)2, H-C(1')(up and low)); 4.60-3.41 (24H, m, H-C(2') H-C(3')) H-C(4') H-C(5')(up and low), MeO, CH2CH2O, CH2CH2OP, PheOAc); 2.69-2.55(4H, m, CH2CH2O, CH2CH2OP); 1.42-1.25 (3H, m, MeCH(O)2);
31P NMR (CDCl3) δ-1.73, -1.99, -2.10, -2.13
【０１２０】
〔実施例５〕ウリジル酸2量体の脱保護
本実施例の脱保護工程を図４に示す。
保護されたウリジン2量体をジクロロメタンに溶解させ、そこへジクロロ酢酸（最終濃度：3%）を加え、1分間反応を行った。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で反応を止め、さらにジクロロメタン層を炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を濃縮乾固後、25%アンモニア水とエタノールとの混合溶媒（混合比 3：1）を加え室温で1時間撹拌を行った。反応溶液を濃縮、凍結乾燥させた。そこへ、1M テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液を加え、室温で2時間反応を行った。反応溶液に酢酸アンモニウム緩衝溶液を加え、反応を終結させた。反応混合物を水で希釈した後、水相をジクロロメタンで、5回洗浄を行った。水相を濃縮乾燥させ、残渣を少量の酢酸アンモニウム緩衝溶液に溶解させ逆相のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行い、目的のウリジン2量体を得た。
【０１２１】
〔実施例６〕固相法によるオリゴリボ核酸の合成
一般的なホスホロアミダイト法によるオリゴマーの合成法に準じて、オリゴリボ核酸の合成を行った。2'位又は3'位の水酸基のうち、一方をサクシニルリンカーを介して固相担体(CPG)に担持し、他方をアセチル基で保護したウリジン（１μmol）に対し、0.1M ウリジンのモノマーユニットのアセトニトリル溶液 0.2ml、活性化剤として0.5M テトラゾールのアセトニトリル溶液 0.2mlを加え、反応時間5分の条件で縮合させた。さらに、（i）ヨウ素（2%）、水（2%）、ピリジン（20%）のテトラヒドロフラン溶液による酸化、（ii）無水酢酸、2, 6-ルチジン（10%）のテトラヒドロフラン溶液、及び1-メチル-1-H-イミダゾール（20%）のテトラヒドロフラン溶液によるキャップ化、（iii）ジクロロ酢酸(3%(v/v))のジクロロメタン溶液による5'水酸基の脱保護のサイクルを9回繰り返した。平均の縮合反応の収率は、4,4'-ジメトキシトリチルカチオンによる定量によって行い、99.5％であった。28％アンモニア水とエタノール(3:1)の混合溶液によって、固相担体からの切り出し、及びリン原子上の脱保護を行った。目的物の溶液を凍結乾燥させ、1M テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液を加え2'水酸基の脱保護を行った。HPLCによって精製を行い、脱保護されたウリジンの10量体を95％の収率で得ることができた。
【０１２２】
〔実施例７〕2'-O-1-(2-シアノエトキシ)エチル基(CEE基)の脱保護条件及び安定性の検討
2'-O-[1-(2-シアノエトキシ)エチル]]-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-ウリジン(4)におけるCEE基の脱保護条件及び安定性を検討した。
【化２２】
2010265304.tif 000023
【０１２３】
CEE基の脱保護条件及び安定性は、試薬（塩基）として、0.5M 1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)を含有するアセトニトリル溶液（0.5M DBU/MeCN）、0.5M 1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)及び0.5M N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド（BSA）を含有するアセトニトリル溶液（0.5M DBU, 0.5M BSA/MeCN）、0.5M テトラブチルアンモニウムフルオリド(TBAF)のテトラヒドロフラン溶液(0.5M TBAF/THF)、25% NH3水溶液、25% NH3水溶液とエタノールの混合溶液(3:1,v/v)（25% NH3水溶液-EtOH (3:1,v/v)）、2M NH3のエタノール溶液（2M NH3/EtOH）を用いて、室温又は55℃における半減期（分）を求めることにより測定した。なお、反応混合物を薄層シリカゲル板(Merck F254)にキャピラリを用いてスポットし、ジクロロメタン−メタノール（9:1, v/v）で展開した後、紫外線照射下で出発物質と生成物のスポットの紫外吸収強度を比較して、両者が等しくなる時間を半減期とした。
結果を表１に示す。
【０１２４】
【表１】
2010265304.tif 000024
【０１２５】
表１に示すように、CEE基は、リン酸ジエステルの保護基の除去、核酸塩基の保護基の除去、ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の際に用いられる25% NH3水溶液、25% NH3水溶液-EtOH (3:1,v/v)、2M NH3/EtOHに対しては安定であるが、0.5M DBU/MeCN、0.5M TBAF/THFにより容易に除去できた。特に0.5M TBAF/THFにより短時間に除去できた。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
リボヌクレオチド誘導体（II）又は（III）における２’水酸基の保護基は、２’水酸基へ効率よく導入できるとともに、縮合反応において立体障害となることがなく、さらに、５’水酸基の保護基の除去、リン酸ジエステルの保護基の除去、核酸塩基の保護基の除去、ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の条件下では安定して存在するが、これらの条件とは異なる条件下において短時間に除去することができるので、リボヌクレオチド誘導体（II）又は（III）を利用することによりリボヌクレオチド誘導体（Ｉ）を効率よく製造することができる。
【図１】
2010265304.tif 000032
【図２】
2010265304.tif 000033
【図３】
2010265304.tif 000034
【図４】
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