(57)【要約】【課題】本発明は、新規なＤ−乳酸生産菌、及び当該Ｄ−乳酸生産菌を用いてＤ−乳酸を生産する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明により、新規なＤ−乳酸生産菌であるラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株が提供された。本発明の微生物株は高い光学純度のＤ−乳酸を効率良く生産することを可能とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）グルコースを基質として９９％以上の光学純度でＤ−乳酸を生産可能であり、かつ
（２）グルコース濃度が２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０の条件で開始し、４３℃の温度で１２時間培養したときに、１２．０ｇ／Ｌ以上、好ましくは１６．０ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは２０．０ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を生産可能である、
ラクトバシラス・デルブリッキーに属する乳酸菌。
【請求項２】
さらに、
（３）４９℃の温度でＤ−乳酸を生産可能である、
請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
下記の菌学的性質を有する、請求項１記載の乳酸菌：
１．形態：桿菌、
２．生化学的性質：カタラーゼ陰性、
３．運動性：なし、
４．酸素要求性：通性嫌気性、
５．グルコースを基質としてホモ乳酸発酵によりＤ−乳酸を産生する、及び
６．グルコース、フルクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースを資化することができ、キシロース、アラビノースは資化することができない。
【請求項４】
下記のいずれかの配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１記載の乳酸菌：
（ａ）配列表の配列番号：１で示されるヌクレオチド配列、又はそれと９９．７％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号：２で示されるヌクレオチド配列、又はそれと９９．７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号：３で示されるヌクレオチド配列、又はそれと９９．８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
【請求項５】
ＮＩＴＥ  Ｐ−６７９の受託番号で寄託されたラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の乳酸菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の乳酸菌を培養する工程を含む、乳酸を製造する方法。
【請求項７】
乳酸が、Ｄ−乳酸を９９％以上の光学純度で含む、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なＤ−乳酸生産菌に関し、特にラクトバシラス・デルブリッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＱＵ４１株に関する。さらに本発明は、当該Ｄ−乳酸生産菌を用いてＤ−乳酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在地球温暖化などの環境問題が深刻化することにより、植物バイオマスを原料とした生分解性プラスチックであるポリＬ−乳酸が注目されている。ポリＬ−乳酸は引っ張り強度などが汎用されているプラスチックと同程度であり、結晶性でありながら透明であるという長所を有するために、ポリプロピレンやポリスチレンなどの代替物としての利用が可能である。ポリＬ−乳酸を作製する際に、その強度、耐熱性などの性質は原料であるＬ−乳酸のモノマーの光学純度に大きく依存するために、一般的に光学純度９９％以上の乳酸モノマーが必要となる。
【０００３】
一方、ポリＬ−乳酸は強度が高く、生分解性を有するという利点を有するが、耐熱性が１７０℃と低いことが普及の妨げとなっている。この問題の解決策として、ポリＬ−乳酸とポリＤ−乳酸とをブレンドし、２２０℃まで耐熱性を向上させることが可能なステレオコンプレックスポリ乳酸が注目されている。
【０００４】
ポリＤ−乳酸生産のためのＤ−乳酸モノマーは、乳酸菌を用いて生産する技術の研究が行われてきた。乳酸菌はグラム陽性の球菌又は桿菌であり、カタラーゼ陰性で、糖類を資化して５０％以上の収率で乳酸を生産し、胞子を形成しない細菌であると定義されている。
【０００５】
これまでＬ−乳酸は需要が高かったことから、Ｌ−乳酸の発酵生産に関する研究は盛んに行われてきた。一方Ｄ−乳酸に関しては、これまで需要が低かったことから、その発酵生産に関する報告は少なかった。以下にＤ−乳酸の発酵生産に関する知見の例を示す。
【０００６】
特開昭６２−４４１８８号公報では、スポルトラクトバシルス・イヌリヌス  ＡＴＣＣ  １５５３８株を用いてＤ−乳酸を生産することが報告されている。炭酸カルシウムでｐＨを中和した培地中で、スポルトラクトバシルス・イヌリヌス  ＡＴＣＣ  １５５３８株は、１００ｇ／Ｌのグルコースの存在下、３７℃で４０時間培養することにより、約９９．５％の光学純度で１０１ｇ／ＬのＤ−乳酸を産生する。
【０００７】
特開平２−７６５９２号公報では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＡＴＣＣ  １２３１４株を用いてＤ−乳酸を生産することが報告されている。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＡＴＣＣ  １２３１４株は、コムギ澱粉のアミラーゼ分解物を炭素源とし炭酸カルシウムでｐＨを中和した培地中で、４０℃で４５時間培養することにより、１２３．３ｇ／ＬのＤ−乳酸を産生する。
【０００８】
特開２００７−２１５４２７号公報では、ラクトバシラス・デルブリッキー  ＩＦＯ  ３２０２株を用いてＤ−乳酸を生産することが報告されている。ｐＨ７の培地中で、ラクトバシラス・デルブリッキー  ＩＦＯ  ３２０２株は１００ｇ／Ｌのグルコースの存在下、３７℃で９６時間培養することにより、１０６．９ｇ／ＬのＤ−乳酸を産生する。なお特開２００７−２１５４２７号においては培養を開始して２４時間以降は、アンモニアを添加してｐＨを制御している。よって特開２００７−２１５４２７号の方法では、ｐＨの調節を行なわない第１段階とｐＨの調節を行なう第２段階からなる、２段階の培養を行っている。
【０００９】
Ｌｅｅは、ラクトバシラス・デルブリッキーの標準株（ＡＴＣＣ  １２３１５）を用いてＭＲＳ培地中で培地する際にバッチ培養を繰り返し、その間に当該菌株を次第に酸性条件に適応させることにより、Ｄ−乳酸が生産性を向上することを報告している。ラクトバシラス・デルブリッキーの標準株を、１００ｇ／Ｌのグルコースの存在下４２℃で４８時間培養してＤ−乳酸の生産性の改善を検討したところ、最初のバッチでのＤ−乳酸の産生量は７１．７ｇ／Ｌであるが、８回目のバッチでのＤ−乳酸の産生量は９０ｇ／ＬのＤ−乳酸である。
【００１０】
Ｃａｌａｂｉａらは、ラクトバシラス・デルブリッキー  ＪＣＭ  １１４８株を用いてＤ−乳酸を生産することを報告している。ラクトバシラス・デルブリッキー  ＪＣＭ  １１４８株は４０℃で７２時間培養することにより、コウモロコシのジュース（当初の糖類１３３ｇ／Ｌ）から１１８ｇ／ＬのＤ−乳酸と２ｇ／ＬのＬ−乳酸を産生する（Ｄ−乳酸の光学純度：９８．３％）。
【００１１】
さらにＸｕらは、低エネルギーのイオンビーム・インプランテーションにより突然変異したスポロラクトバチルス・ｓｐ．ＤＸ１２株が、Ｄ−乳酸を高産生することを報告している。この変異株は炭酸カルシウムで中和した培地中で７日間培養することにより、１５０ｇ／Ｌのグルコースのから１４３．６ｇ/ＬのＬ−乳酸を、９９．０８％の光学純度で産生する。
【００１２】
さらにＯｋｉｎｏらは、コリネバクテリウム・グルタミカムにラクトバシラス・デルブリッキー由来のＤ−ラクテート・デヒドロゲナーゼの遺伝子を導入する遺伝子改変を行い、変異体株を得たことを報告している。当該変異体株は、間歇的なグルコース添加の条件下、３０時間の培養で１２０ｇ／ＬのＤ−乳酸を、９９．９％の光学純度で産生する。
【００１３】
しかしこれらにおいて報告されたＤ−乳酸の発酵生産の効率や光学純度は必ずしも高くなく、Ｌ−乳酸と比較するとＤ−乳酸の発酵生産量は少ない。よってより効率的に光学純度が高いＤ−乳酸を生産するために、Ｄ−乳酸を高生産する菌株、及び当該菌株を用いてＤ−乳酸を生産する技術が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開昭６２−４４１８８号公報
【特許文献２】特開平２−７６５９２号公報
【特許文献３】特開２００７−２１５４２７号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｌｅｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）  ２３：１３１７−１３２０
【非特許文献２】Ｃａｌａｂｉａ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００７）２９：１３２９−１３３２
【非特許文献３】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１２０１０−００８−８２７４−４
【非特許文献４】Ｏｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）７８：４４９−４５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明はＤ−乳酸を得るために、新規なＤ−乳酸生産菌、及び当該Ｄ−乳酸生産菌を用いて高い光学純度のＤ−乳酸を効率的に生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究に努めた結果、新規なＤ−乳酸生産菌、特にラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株を分離して得て、本発明を完成するに至った。本発明のＤ−乳酸生産菌を用いて高い光学純度のＤ−乳酸を効率良く生産することができる。
【００１８】
本発明は以下を提供する：
１）（１）グルコースを基質として９９％以上の光学純度でＤ−乳酸を生産可能であり、かつ
（２）グルコース濃度が２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０の条件で開始し、４３℃の温度で１２時間培養したときに、１２．０ｇ／Ｌ以上、好ましくは１６．０ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは２０．０ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を生産可能である、
ラクトバシラス・デルブリッキーに属する乳酸菌。
２）さらに、
（３）４９℃の温度でＤ−乳酸を生産可能である、１）に記載の乳酸菌。 
３）下記の菌学的性質を有する、１）又は２）記載の乳酸菌：
１．形態：桿菌、
２．生化学的性質：カタラーゼ陰性、
３．運動性：なし、
４．酸素要求性：通性嫌気性、
５．グルコースを基質としてホモ乳酸発酵によりＤ−乳酸を産生する、及び
６．グルコース、フルクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースを資化することができ、キシロース、アラビノースは資化することができない。
４）下記のいずれかの配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、１）〜３）記載の乳酸菌：
（ａ）配列表の配列番号：１で示されるヌクレオチド配列、又はそれと９９．７％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号：２で示されるヌクレオチド配列、又はそれと９９．７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号：３で示されるヌクレオチド配列、又はそれと９９．８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
５）ＮＩＴＥ  Ｐ−６７９の受託番号で寄託されたラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株である、１）〜４）のいずれか１に記載の乳酸菌。
６）１）〜５）のいずれか１に記載の乳酸菌を培養する工程を含む、乳酸を製造する方法。
７）乳酸が、Ｄ−乳酸を９９％以上の光学純度で含む、６）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、新規なＤ−乳酸生産菌であるラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株が提供された。本発明の微生物株はＤ−乳酸の効率良い生産を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＱＵ４１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】図２は、ＱＵ４２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。
【図３】図３は、ＱＵ４１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】図４は、ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株を試験管培養した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、培養の温度がＱＵ４１株のＤ−乳酸生産能に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、培養のｐＨがＱＵ４１株のＤ−乳酸生産能に及ぼす影響を示すグラフである。
【図７】図７は、初発グルコース濃度がＱＵ４１株のＤ−乳酸生産能に及ぼす影響を示すグラフである。
【図８】図８は、Ｄ−乳酸生産能を、ＱＵ４１株、ＪＣＭ１１６６株、ＪＣＭ１２４６株において比較したグラフである。
【図９】図９は、培地の中和剤の影響を、ＮａＯＨを用いた場合とＮＨ４ＯＨを用いた場合とで比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の詳細、並びにその他の特徴及び利点について、形態に基づいて詳しく説明する。
１．新規乳酸菌
本発明の乳酸菌は、初発グルコース濃度が２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０の条件下で、グルコースを基質として、至適な温度（具体的には、４３℃）の温度で、８〜１２時間培養したときに、１２．０ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を９９％以上の光学純度で生産することができる。上記の性質を有し、遺伝学的にラクトバシラス・デルブリッキーに属する乳酸菌は本発明の範囲内である。なお本発明の乳酸菌は、上記の条件下で、好ましくは１６．０ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは２０．０ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を生産することができる。このような乳酸菌は、高い光学純度のＤ−乳酸を効率的に生産する目的に適している。また本発明の乳酸菌はＤ−乳酸を、９９％以上の光学純度、好ましくは９９．５％以上の光学純度、さらに好ましくは９９．９％以上の光学純度で生産することができる。
【００２２】
本発明の乳酸菌は、蒸留水１Ｌ中に、ペプトンを１０ｇ、牛肉エキスを８ｇ、酵母エキスを４ｇ、グルコースを２０ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４を２ｇ、酢酸ナトリウム三水和物を５ｇ、クエン酸水素二アンモニウムを２ｇ、ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏを０．２ｇ、ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏを０．０５ｇ含むＭＲＳ−グルコース培地中で、少なくとも３０℃から４９℃の範囲の温度で静置培養することにより、良好に培養することができる。しかし本発明の乳酸菌の培養に使用する培地はＭＲＳ−グルコース培地に限定されるものではなく、ＭＲＳ−グルコース培地を適宜改変することも可能であり、当該菌が良好に増殖してＤ−乳酸を産生する限り如何なる組成の培地であっても良い。
【００２３】
本発明における最も好適な乳酸菌の一つは、九州大学構内の排水溝から分離されたラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株である。なおラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株は新規な菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、ＮＩＴＥ  Ｐ−６７９として２００９年１月１９日に寄託されている。
【００２４】
ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株の菌学的性質は以下の通りである。
１．形態：桿菌である。
２．生化学的性質：カタラーゼ陰性である。
３．運動性：なし
４．酸素要求性：通性嫌気性である。
５．グルコースを基質としてホモ乳酸発酵によりＤ−乳酸を産生する。
６．グルコース、フルクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースを資化することができ、キシロース、アラビノースは資化することができない。
【００２５】
本発明の乳酸菌には、ラクトバシラス・デルブリッキーに属し、ＱＵ４１株と同じ菌学的性質を有する乳酸菌も含まれる。本発明の他の好適な菌株として、ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４２株及びラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４３株を挙げることができる。ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４２株、ＱＵ４３株もまた新規な菌株であり、高い効率でＤ−乳酸を産生能することができる。なお本発明の菌株は、ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株に限定されるものではなく、グルコースを基質として９９％以上の光学純度でＤ−乳酸を生産可能であり、かつグルコース濃度が２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０の条件で開始し、４３℃の温度で１２時間培養したときに、１２．０ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を生産可能であるかぎり、本発明の範囲内である。
【００２６】
ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株、ＱＵ４２株及びＱＵ４３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列をそれぞれ、配列表の配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３に示す。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析において、ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株、ＱＵ４２株、ＱＵ４３株は高い同一性を示した。すなわち本発明は、下記の何れかの配列からなる表の配列番号１で示される配列と９９．５％以上の同一性を有する配列を含んでなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、ラクトバシラス・デルブリッキーを提供する：
（ａ）配列表の配列番号：１で示されるヌクレオチド配列、又はそれと９９．７％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号：２で示されるヌクレオチド配列、又はそれと９９．７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号：３で示されるヌクレオチド配列、又はそれと９９．８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
本明細書において核酸配列の同一性は、例えば汎用されているＢＬＡＳＴなどのプログラム用いて決定することができるが、それに限定されるものではなく、他のプログラムを用いて核酸配列の同一性を決定することもできる。
【００２７】
またＡＰＩ５０ＣＨＬ糖類資化試験において、それらの３株は同一の糖発酵性パターンを示した。そのように、ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株は、遺伝学的にも生化学的性質も相互に非常に類似しているために、これら３つの菌株は異なった菌株であっても、Ｄ−乳酸の産生能を含む多くの性質が類似又は同一であることが予想される。
【００２８】
本発明の乳酸菌は少なくとも３０℃から４９℃の範囲の温度で、増殖及びＤ−乳酸の産生が可能である。当該菌株の増殖及びＤ−乳酸の産生において好ましい温度は３７℃から４３℃であり、特に好ましい温度は４３℃である。
【００２９】
本発明の乳酸菌は、４９℃においてもＤ−乳酸を生産可能である。４９℃は乳酸菌にとってかなり高い温度である。４９℃での乳酸発酵により、雑菌汚染を低減することができ、また発酵熱による冷却の必要性を低減することができる。なお、本発明で乳酸を「生産可能」というときは、産業上有効なレベルでＤ−乳酸が生産できることをいい、グルコース濃度が２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０の条件で開始し、１２時間培養したときに、１２．０ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を生産することができれば、「生産可能」といえる。本発明の乳酸菌は、４９℃の高温培養でも、グルコース１００ｇ／ＬからＤ−乳酸を約１００ｇ／Ｌ産生することができる。
【００３０】
本発明のラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株は少なくとも５．５から６．５のｐＨの範囲で、増殖及びＤ−乳酸の産生が可能である。当該菌株の増殖及びＤ−乳酸の産生において特に好ましいｐＨは６．０である。
【００３１】
本発明のラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株は、培地中の初発グルコース濃度が増加すると増殖及びＤ−乳酸の産生性が高くなる。その一方、初発グルコース濃度の増加に伴う最大菌体増殖速度の低下と、長時間の培養における乳酸生産速度の低下が起こる。このために、当該菌株を用いてＤ−乳酸を効率的に産生する場合には、回分培養は適さない。
２．Ｄ−乳酸を産生する方法
また本発明のラクトバシラス・デルブリッキー株を培養することにより乳酸を製造する方法も、本発明の範囲内である。ＭＲＳ−グルコース培地など、本発明のラクトバシラス・デルブリッキー株が増殖して乳酸を産生することができる培地を用いて、当該菌株を、それの増殖及び乳酸の産生に適した条件下（温度やｐＨ）で培養することにより、乳酸を製造することができる。
【００３２】
本発明の方法によれば、高い光学純度でＤ−乳酸を産生することができる。具体的には本発明の方法によれば、Ｄ−乳酸を９９％以上の光学純度、好ましくは９９．５％以上の光学純度、さらに好ましくは９９．９％以上の光学純度で製造することができる。
【００３３】
本発明により得られる乳酸の濃度は、本技術分野で一般的に知られた技術により測定することができる。例えば、本発明のラクトバシラス・デルブリッキー株の培養液を遠心分離して上清を得、その上清をフィルターで濾過した後に、カラムクロマトグラフィー（例えば、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  Ｓシリーズなどの糖分析用配意子交換カラム）により乳酸量を測定することができ、また示唆屈折計により乳酸を検出することにより、生産された乳酸の濃度を測定することができる。
【００３４】
また、Ｄ−乳酸の光学純度は、本技術分野で知られた種々の手段を用いることができる。例えば、バイオセンサー（例えば酵素電極式バイオセンサーＢＦ−５）によりＬ−乳酸の濃度を測定することができ、そして測定したＬ−乳酸の濃度と全乳酸の濃度の値から、Ｄ−乳酸の光学純度を算出することができる。本発明でＤ−乳酸の光学純度をいうときは、特に示した場合を除き、下記の式により算出した値をいう。
【００３５】
【数１】
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【００３６】
本発明の乳酸を製造する方法は、好ましくは、グルコースを含有する培地中で本発明のラクトバシラス・デルブリッキー株を、ｐＨ５．５からｐＨ６．５、温度３７℃から４３℃の条件下で、１２時間から７２時間培養して培養液を調製する工程、及び、上記培養液を遠心分離して上清を採取する工程からなる。本発明のラクトバシラス・デルブリッキー株を培養するのに適した培地は、それに限定されるものではないが、好ましくは上記で述べたＭＲＳ−グルコース培地である。しかし本発明の方法で使用される培地はそれに限定されるものではなく、適宜改変することができる。また培地のｐＨ、培養温度、培養時間などの条件もまた、本発明のラクトバシラス・デルブリッキー株が増殖し、Ｄ−乳酸を産生することができる限り、適宜改変することができる。
【００３７】
また遠心分離して得た上清から純粋なＤ−乳酸を得るために、例えばフィルターによる濾過やクロマトグラフィーによる精製にかけることも、本発明の好適な態様である。
【００３８】
本発明の方法において用いられる最も好適な菌株はラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株である。その他に、ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４２株、ＱＵ４３株を用いても、本発明の方法を実施することができる。
３．用途
本発明の方法を用いて産生したＤ−乳酸を、例えば、ポリＬ−乳酸とポリＤ−乳酸とのステレオコンプレックスを製造するための原料として使用することができる。上記で述べたようにポリＬ−乳酸とポリＤ−乳酸とのステレオコンプレックスは、耐熱性が高い生分解性プラスチックとなり得る。しかしＤ−乳酸の用途はポリＬ−乳酸とのステレオコンプレックスに限定されるものではない。なおＤ−乳酸には、農業中間体としての用途もあることが知られている。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１  新規Ｄ−乳酸生産菌の分離及び同定
（１）新規Ｄ−乳酸生産菌の分離
植物、動物、土壌、昆虫など１３７の分離源から、ＭＲＳ−グルコース培地及びＭＲＳ−グルコース寒天培地を用いてＤ−乳酸生産菌を単離した。分離条件として、酸生成菌を優先的に取得するため、プレーティングを行う前に集積培養を行った。また、原核生物を優先的に取得するため、真核生物の生育を阻害するアジ化ナトリウム、シクロヘキシミドを集積培地に添加した。この集積培養用培地は、上記で述べた組成のＭＲＳ−グルコース培地、１００ｐｐｍアジ化ナトリウム、１００ｐｐｍシクロヘキシミドを加え、蒸留水に溶解し、ｐＨを５．５と６．５に調整し、褐色反応を防ぐために１１５℃、１５分間オートクレーブ滅菌を行ったものである。またＭＲＳ−グルコース寒天培地は、集積培養用培地に１．５％寒天と０．５％ＣａＣＯ２を加え蒸留水に溶解し、ｐＨを６．５に調整し、１１５℃、１５分間オートクレーブ滅菌を行った後、滅菌シャーレに注いで作製したものである。
【００４１】
単離の際の培養条件は、温度が３０℃、３７℃、４３℃であり、当初ｐＨが５．５と６．５である。この条件下で嫌気的に菌を培養・単離し、再度ＭＲＳ培地で培養した後、上清を分析し、ホモ発酵により光学純度の高いＤ−乳酸を生産する菌を分離した。
【００４２】
その結果、約３５０株の乳酸生産菌を分離した。得られたＤ−乳酸生産菌のうち殆どはヘテロ発酵型の菌であったが、４０の菌株が９９％以上の光学純度でＤ−乳酸を生産した。とりわけ九州大学構内の排水溝から分離されたＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株が、収率約１００％、光学純度９９．９％以上でＤ−乳酸を生産したので、以下でさらに検討を行った。
【００４３】
（２）得られたＤ−乳酸生産菌の同定
ＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株につき、分離した株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のポジション２８−１４９１について解析した。ゲノム抽出キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ）を用いて分離株のＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてプライマーとＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、精製キット（Ｈｉｇｈ  ｐｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。定法に従って、それをベクター（ｐＧＥＭ-Ｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αにクローニングした後、シークエンス解析を行った。データベース（ＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で、得られた配列について相同性検索を行った。
【００４４】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列解析の結果、それらの菌株はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ（基準株）と最も高い同一性を示した。ＱＵ４１株、ＱＵ４２株、ＱＵ４３株と、基準株の間の同一性はそれぞれ、９９．５９６％（全長１４８６ｂｐにおいて、６塩基異なる）、９９．６６４％（５塩基異なる）、９９．８０％（３塩基異なる）であった。また、ＱＵ４１株とＱＵ４２株の間の同一性は９９．６６４％（５塩基異なる）、ＱＵ４１株とＱＵ４３株の間の同一性は９９．５９６％（６塩基異なる）、ＱＵ４２株とＱＵ４３株の間の同一性は９９．６６４％（５塩基異なる）であった。さらにＱＵ４２株とＱＵ４３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列間の同一性は、９９．６６４％（５塩基異なる）であった。
【００４５】
なおＱＵ４１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を、配列表の配列番号：１と図１に示す。ＱＵ４２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を、配列表の配列番号：２と図２に示す。ＱＵ４３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を、配列表の配列番号：３と図３に示す。
【００４６】
さらにＡＰＩ５０ＣＨキット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いて、糖類資化性試験を行なった。詳細は本キットのマニュアルに従った。２４時間と４８時間培養後の糖類資化性パターンをアピウェブサイトにて解析した（https://apiweb.biomerieux.com）。
【００４７】
ＡＰＩ５０ＣＨキットを用いた糖類資化性試験の結果を、表１に示す。比較対象として、ＡＰＩ５０ＣＨキットに記載のあるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓの糖類資化性のパターンも併せて、表１に示す。
【００４８】
表１において各数字は、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社が保有する菌株のうち、資化能を有する菌株の割合を示す。同一種でも、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ１，２のように、糖類資化性をグループ化しているものもある。
【００４９】
この試験においてＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株は同一の糖発酵性パターンを示した。すなわちこれらの菌株は、グルコース、フルクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースを資化したが、五単糖であるキシロース、アラビノースは資化できなかった。その糖発酵性パターンと最も一致するのは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｓｐ  ｌａｃｔｉｓであった。
【００５０】
よってこれらの結果から、ＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株の３株ともラクトバシラス・デルブリッキーであると同定された。
【００５１】
【表１】
2010279332.tif 000003
【００５２】
（３）試験管培養
ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株の３つの菌株を、１０ｍｌのＭＲＳ−グルコース培地中で、嫌気条件下、３７℃で培養を行った。図４（ａ）はＱＵ４１株で検討を行なった結果であり、図４（ｂ）はＱＵ４１株で検討を行なった結果であり、図４（ｃ）はＱＵ４１株で検討を行なった結果である。図４において左の縦軸はグルコース、乳酸、酢酸の濃度を示し、右軸がＯＤを示し、横軸が時間を示す。図４のプロットにおいて、黒丸がグルコース濃度、白丸が乳酸濃度であり、白三角がＯＤである。さらに３つの株における試験官培養の結果を比較した数値データを、下の表２に示す。
【００５３】
図４と表２に示されるように、ＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株の３つの菌株は、ＭＲＳ培地での培養において、類似した発酵挙動を示した。ＱＵ４１株は７２時間目においてＤ−乳酸生産量が１６．８ｇ／Ｌであり、最も高い値を示した。
【００５４】
試験管培養において、ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株、ＱＵ４２株、及びＱＵ４３株の３株が収率や生産速度などの点で極めて類似した発酵特性を示したことから、ＱＵ４１株を代表株として用いて、以下に述べるＤ−乳酸生産における最適条件の検討を行なった。
【００５５】
【表２】
2010279332.tif 000004
【００５６】
実施例２  最適条件の検討
（１）最適温度の検討
ＱＵ４１株について、グルコース２０ｇ／ＬのＭＲＳ培地を用いて、３０℃、３７℃、４３℃、及び４９℃におけるＤ−乳酸生産能を検討した。なお１０規定のＮａＯＨによりｐＨを５．５に調整し、窒素ガス置換により嫌気的状態で実験を行った。培養は前培養を４０ｍｌスケールで６時間、主培養を４００ｍｌスケールで１２時間行った。
【００５７】
その結果を図５に示す。図５（ａ）は３０℃で検討を行なった結果であり、図５（ｂ）は３７℃で検討を行なった結果であり、図５（ｃ）は４３℃で検討を行なった結果であり、図５（ｄ）は４９℃で検討を行なった結果である。図５において左の縦軸はグルコース、乳酸、酢酸の濃度を示し、右の縦軸がＯＤを示し、横軸が時間を示す。また図５のプロットにおいて、黒丸がグルコース濃度、白丸が乳酸濃度、黒三角が酢酸の濃度であり、白三角がＯＤである。
【００５８】
この結果から得た培養のパラメーターの値を、下の表３に示す。表３において左から、最大菌体増殖速度、Ｄ−乳酸生産量、最大収率、最大生産量、Ｄ−乳酸光学純度の値をそれぞれ示す。表３に示すように、４３℃の時に最も高い最大増殖速度と最大生産速度を示し、ＱＵ４１株の増殖とＤ−乳酸生産の最適温度は４３℃であった。なおこのデータには示さないが、ＱＵ４１株は５５℃でも増殖及びＤ−乳酸の産生が可能であった。
【００５９】
【表３】
2010279332.tif 000005
【００６０】
（２）最適ｐＨの検討
最適温度を４３℃として、ＱＵ４１株のＤ−乳酸生産へｐＨが及ぼす影響を４つのｐＨ（ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５）で検討した。ｐＨを変えた以外は、上記の最適温度の検討と同じ条件で実験を行った。
【００６１】
その結果を図６に示す。なお図６（ａ）はｐＨ５．０で検討を行なった結果であり、図６（ｂ）はｐＨ５．５で検討を行なった結果であり、図６（ｃ）はｐＨ６．０で検討を行なった結果であり、図６（ｄ）はｐＨ６．５で検討を行なった結果である。図６において左の縦軸はグルコース、乳酸、酢酸の濃度を示し、右の縦軸がＯＤを示し、横軸が時間を示す。また図６のプロットにおいて、黒丸がグルコース濃度、白丸が乳酸濃度、黒三角が酢酸の濃度であり、白三角がＯＤである。
【００６２】
この結果から得た培養のパラメーターの値を、下の表４に示す。表４において左から、最大菌体増殖速度、Ｄ−乳酸生産量、最大収率、最大生産量、Ｄ−乳酸光学純度の値をそれぞれ示す。ｐＨ６．０の時に１２時間で培養が終了し、且つ最大の菌体増殖速度と乳酸生産量を示したので、最適ｐＨは６．０であった。
【００６３】
【表４】
2010279332.tif 000006
【００６４】
実施例３  初発グルコース濃度が及ぼす影響の検討
温度が４３℃、ｐＨ６．０の条件下で、ＱＵ４１株のＤ−乳酸生産能にグルコース濃度が及ぼす影響を検討した。ｐＨを変えた以外は、最適温度及び最適ｐＨの検討と同じ条件で実験を行った。
【００６５】
培養開始時に添加したグルコースの濃度、即ち初発グルコース濃度を２０、５０、１００ｇ／Ｌとして検討を行なった結果を図７に示す。なお図７（ａ）は初発グルコース濃度が２０ｇ／Ｌのデータであり、図７（ｂ）は初発グルコース濃度が５０ｇ／Ｌのデータ（ｂ）であり、図７（ｃ）は初発グルコース濃度が１００ｇ／Ｌのデータである。図７において左の縦軸はグルコース、乳酸、酢酸の濃度を示し、右の縦軸がＯＤを示し、横軸が時間を示す。また図７のプロットにおいて、黒丸がグルコース濃度、白丸が乳酸濃度、黒三角が酢酸の濃度であり、白三角がＯＤである。
【００６６】
この結果から得た培養のパラメーターの値を、下の表５に示す。表５において左から、最大菌体増殖速度、Ｄ−乳酸生産量、最大収率、最大生産量、Ｄ−乳酸光学純度の値をそれぞれ示す。初発グルコース濃度の増加に伴い、最大ＯＤや乳酸生産性は高まったが、一方、最大菌体増殖速度は低下し、培養時間経過に伴って乳酸生産速度も低下した。この結果から、ＱＵ４１は高濃度のグルコースや、乳酸により阻害を受けるので、細菌の増殖に伴う培地環境の変化に影響される回分培養では、効率的にＤ−乳酸を生産できないことが判った。
【００６７】
【表５】
2010279332.tif 000007
【００６８】
実施例４  ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株と既存のＤ−乳酸生産菌の比較
ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株と、既存のＤ−乳酸生産菌であるＪＣＭ１１６６及びＪＣＭ１２４８の間で、Ｄ−乳酸生産量の比較を行った。図８に結果を示す。図８（ａ）は３７℃で測定したデータであり、図８（ｂ）は４３℃で測定したデータであり、図８（ｃ）は５０℃で測定したデータである。図８において左の縦軸は乳酸の濃度を示し、右の縦軸はＯＤを示し、横軸は時間を示す。
【００６９】
ラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株のみ、図８（ｄ）に示すように、５５℃においても測定を行なった。なお右カラムは培養後２４時間におけるＤ−乳酸生産量であり、左カラムは培養後４８時間におけるＤ−乳酸生産量である。さらに、この結果から得た３つの菌株のＤ−乳酸生産量の値を表６に示す。
【００７０】
図８と表６から判るように、各温度でラクトバシラス・デルブリッキーＱＵ４１株は、既存のＤ−乳酸生産菌よりも高いＤ−乳酸生産能を示した。
【００７１】
【表６】
2010279332.tif 000008
【００７２】
実施例５  培地の中和剤の検討
ＱＵ４１株の培養に用いる培地の中和剤として、ＮａＯＨを用いた場合とＮＨ４ＯＨを用いた場合の比較を行なった。結果を図９に示す。なお図９（ａ）は中和剤としてＮａＯＨを用いた場合のデータであり、図９（ｂ）は中和剤としてＮＨ４ＯＨを用いた場合のデータである。図９において左の縦軸は乳酸の濃度を示し、右の縦軸がＯＤを示し、横軸が時間を示す。また図９のプロットにおいて、黒丸がグルコース濃度、白丸が乳酸濃度、黒三角が酢酸の濃度であり、白三角がＯＤである。
【００７３】
この結果から得た培養のパラメーターの値を、下の表７に示す。表７において左から、最大菌体増殖速度、Ｄ−乳酸生産量、最大収率、最大生産量、Ｄ−乳酸光学純度の値をそれぞれ示す。
【００７４】
ＯＤと菌体増殖速度に関しては、ＮＨ４ＯＨを用いた場合とＮａＯＨを用いた場合において、同程度の結果であった。一方Ｄ−乳酸生産量と最大Ｄ−乳酸生産速度については培養後８時間において、ＮＨ４ＯＨを用いた場合には、ＮａＯＨを用いた場合と比較して高い値を示した。
【００７５】
これまでＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを用いたＤ−乳酸生産において、中和剤にＮＨ４ＯＨ、ＮａＯＨを用いた場合と比較して炭酸カルシウムを用いた方が、Ｄ−乳酸産生量が高いことが報告されている。しかし中和剤にＮＨ４ＯＨを用いるＮＨ３回収−ブチルエステル化プロセス（ＢＵＬ）精製法は、炭酸カルシウムによる中和と比較して、廃棄物の発生が少なく、中和剤の回収も可能であるといった長所を有している。この結果から判るようにＱＵ４１株はアンモニアによる乳酸発酵への悪影響が見られなかったので、ＢＵＬ精製法と組み合わせることにより環境に対する負荷が低い乳酸発酵が可能となる。
【００７６】
【表７】
2010279332.tif 000009
【図１】
2010279332.tif 000010
【図２】
2010279332.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010279332.tif 000016
【図８】
2010279332.tif 000017
【図９】
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【配列表】
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