(57)【要約】【課題】絶縁性基板、その上に形成された作用電極および対向電極から成る電極系、さらにその上に少なくとも乳酸酸化酵素を含む試薬層により構成される乳酸測定用センサの反応性を高める。より具体的には、計測シグナルとなる電流値を高める。【解決手段】試薬層にイノシトール、サルコシン、ベタイン、グリシルグリシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、フタル酸、γ−アミノ酪酸、マロン酸より選ばれる添加剤の少なくともひとつを含有させることにより、計測シグナルとなる電流値を高め、乳酸をより高感度且つ正確に測定し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の乳酸濃度を測定する方法であって、
下記の（１）および（２）の要件を満たすセンサに試料を加えた後、センサの作用電極と対向電極の間に電圧を印加して作用電極における電流を測定し、測定値から乳酸量を算出する工程を含む、乳酸濃度測定方法。
（１）該センサが、絶縁性基板、その上に形成された作用電極および対向電極から成る電極系、さらにその上に少なくとも乳酸酸化酵素を含む試薬層を含む。
（２）該試薬層にイノシトール、サルコシン、ベタイン、グリシルグリシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、フタル酸、γ−アミノ酪酸およびマロン酸からなる群より選ばれる添加剤の少なくともひとつを含有する。
【請求項２】
電極系に、さらに参照電極が設けられている、請求項１記載の乳酸濃度測定方法。
【請求項３】
試薬層に、さらに酸化状態である電子伝達物質が含まれている、請求項１〜２のいずれかに記載の乳酸濃度測定方法。
【請求項４】
酸化状態である電子伝達物質がフェリシアン化合物である、請求項３記載の乳酸濃度測定方法。
【請求項５】
試薬層の全酵素単位０．０５ユニットに対し、含有する添加剤の量が、０．００１〜０．０２μｍｏｌである請求項１〜４のいずれかに記載の乳酸濃度測定方法。
【請求項６】
試薬層に含まれる乳酸酸化酵素が、ラクトコッカス属細菌由来である請求項１〜５のいずれかに記載の乳酸濃度測定方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の乳酸濃度測定方法に用いるためのセンサであって、下記の（１）および（２）の要件を満たすセンサ。
（１）該センサが、絶縁性基板、その上に形成された作用電極および対向電極から成る電極系、さらにその上に少なくとも乳酸酸化酵素を含む試薬層を含む。
（２）該試薬層にイノシトール、サルコシン、ベタイン、グリシルグリシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、フタル酸、γ−アミノ酪酸およびマロン酸からなる群より選ばれる添加剤の少なくともひとつを含有する。
【請求項８】
試料中の乳酸濃度を測定するためのシステムであって、請求項７記載のセンサ、センサの作用電極と対向電極の間に酵素の酸化反応で生じた電子の伝達を起こすのに十分な電圧を印加する手段、および作用電極における電流を測定する手段を含む乳酸濃度測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来より反応性の高い乳酸センサ、該乳酸センサを使用した乳酸測定方法、および該乳酸センサを利用した乳酸測定システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸酸化酵素はＬ−乳酸の酸化反応を触媒し、乳酸センサ用酵素として利用されている。乳酸酸化酵素は古くから知られており（特許文献１〜７）、乳酸酸化酵素を用いた電極センサも、乳酸濃度を定量する方法として特許文献８〜９などに詳しく報告されている。既報のセンサは、絶縁性基板上に形成した作用電極と対向電極からなる電極上に乳酸酸化酵素、電子伝達物質などを含む試薬層を形成し、スペーサーとカバーを貼付したものである。このタイプのセンサは小型であるため、試料の液量が１〜５μＬといった極微量でも測定可能である。また、試料をセンサのサンプル吸入口に接することにより、毛管現象によってすばやく自動的に試薬層の全体に吸引することができるため、測定ミスも生じ難いものとなっている。
【０００３】
一般的な酵素電極センサによる乳酸濃度の測定原理は、以下の通りである。
乳酸が乳酸酸化酵素によって酸化されると、酵素が酸化型から還元型に変化する。還元型酵素は酸化状態の電子伝達物質に電子を供与し、電子伝達物質は還元型となると共に酵素が酸化型に変化する。同時に作用電極上で適当な印加電圧によって還元型の電子伝達物質は電解され、この時に得られる酸化電流を測定することにより乳酸濃度が測定できる。
酸化還元酵素を用いた酵素電極センサの基本仕様は共通しており、その利便性から最も実用的なバイオセンサとして普及しているため、乳酸濃度測定に使用可能な種々のセンサの研究開発が活発に進められている（特許文献１０〜１２，非特許文献１）。また、このような乳酸センサは既に幾つか市販され、トレーニング効果やトレーニング状態の把握、糖尿病、肝不全などのマーカーとして乳酸量を測定する際に使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−２４８５７４号公報
【特許文献２】特開２００５−１２４４１１号公報
【特許文献３】特許第３４５８７９１号公報
【特許文献４】特許第２６２４２１７号公報
【特許文献５】特許第２９４２５６４号公報
【特許文献６】特開昭６１−２８３８６号公報
【特許文献７】特公昭５９−１０１９０号公報
【特許文献８】特許第３１２７５９９号公報
【特許文献９】特許第３４９８１０５号公報
【特許文献１０】特開２００９−２５３１８号公報
【特許文献１１】特開２００７−９３６１３号公報
【特許文献１２】特表２００７−５０９３５５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４，１４２５−１４３０（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
解決しようとする問題点は、乳酸オキシダーゼを用いた乳酸センサにおいて、計測シグナルとなる電流値が低い点である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、乳酸酸化酵素を用いた有用な乳酸の電気化学的な測定方法を確立する上で、電気化学的な反応性を高めることが極めて重要であり、計測シグナルである電流値を増加せしめる添加剤の使用が特に有用であることを見出し、本発明に到達した。
具体的に本発明は、乳酸センサの反応性を高めるため、より具体的には計測シグナルとなる電流値を高めるため、センサの試薬層にイノシトール、サルコシン、ベタイン、グリシルグリシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、フタル酸、γ−アミノ酪酸、マロン酸より選ばれる添加剤の少なくともひとつを含有させることを最も主要な特徴とする。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
試料中の乳酸濃度を測定する方法であって、
下記の（１）および（２）の要件を満たすセンサに試料を加えた後、センサの作用電極と対向電極の間に電圧を印加して作用電極における電流を測定し、測定値から乳酸量を算出する工程を含む、乳酸濃度測定方法。
（１）該センサが、絶縁性基板、その上に形成された作用電極および対向電極から成る電極系、さらにその上に少なくとも乳酸酸化酵素を含む試薬層を含む。
（２）該試薬層にイノシトール、サルコシン、ベタイン、グリシルグリシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、フタル酸、γ−アミノ酪酸およびマロン酸からなる群より選ばれる添加剤の少なくともひとつを含有する。
項２．
電極系に、さらに参照電極が設けられている、項１記載の乳酸濃度測定方法。
項３．
試薬層に、さらに酸化状態である電子伝達物質が含まれている、項１〜２のいずれかに記載の乳酸濃度測定方法。
項４．
酸化状態である電子伝達物質がフェリシアン化合物である、項３記載の乳酸濃度測定方法。
項５．
試薬層の全酵素単位０．０５ユニットに対し、含有する添加剤の量が、０．００１〜０．０２μｍｏｌである項１〜４のいずれかに記載の乳酸濃度測定方法。
項６．
試薬層に含まれる乳酸酸化酵素が、ラクトコッカス属細菌由来である項１〜５のいずれかに記載の乳酸濃度測定方法。
項７．
項１〜６のいずれかに記載の乳酸濃度測定方法に用いるためのセンサであって、下記の（１）および（２）の要件を満たすセンサ。
（１）該センサが、絶縁性基板、その上に形成された作用電極および対向電極から成る電極系、さらにその上に少なくとも乳酸酸化酵素を含む試薬層を含む。
（２）該試薬層にイノシトール、サルコシン、ベタイン、グリシルグリシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、フタル酸、γ−アミノ酪酸およびマロン酸からなる群より選ばれる添加剤の少なくともひとつを含有する。
項８．
試料中の乳酸濃度を測定するためのシステムであって、請求項７記載のセンサ、センサの作用電極と対向電極の間に酵素の酸化反応で生じた電子の伝達を起こすのに十分な電圧を印加する手段、および作用電極における電流を測定する手段を含む乳酸濃度測定システム。
【０００９】
なお、本発明の添加剤は特定の基本構造や共通の構造的特徴を有していない。あえていえば、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、２−ケトグルタル酸はジカルボン酸に属する。しかしながら、後述する実施例の結果からも分かるように、各ジカルボン酸の効果については、全く予測できない。例えば、後述の実施例では、幾何異性体であるマレイン酸（シス型）とフマル酸（トランス型）とで効果が大きく異なっており、ジカルボン酸が本発明の添加剤に十分な要件とはいえない。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の乳酸センサは、計測シグナルとなる電流値が高く、乳酸をより高感度且つ正確に測定し得るという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は乳酸センサの一例を示す図である。（実施例１）
【図２】図２は添加剤の量と電流値の関係を示す図である。○は計測開始５秒後の電流値、●は計測開始１０秒後の電流値をそれぞれ示す。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施形態のひとつは、試料中の乳酸濃度を測定する方法であって、
下記の（１）および（２）の要件を満たすセンサに試料を加えた後、センサの作用電極と対向電極の間に電圧を印加して作用電極における電流を測定し、測定値から乳酸量を算出する工程を含む、乳酸濃度測定方法である。
（１）該センサが、絶縁性基板、その上に形成された作用電極および対向電極から成る電極系、さらにその上に少なくとも乳酸酸化酵素を含む試薬層を含む。
（２）該試薬層にイノシトール、サルコシン、ベタイン、グリシルグリシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、フタル酸、γ−アミノ酪酸およびマロン酸からなる群より選ばれる添加剤の少なくともひとつを含有する。
上記の乳酸濃度測定方法に用いるためのセンサ、および、上記の乳酸濃度測定方法に用いるためのシステムもまた、それぞれ本発明の実施形態のひとつである。
【００１３】
（１）本発明の乳酸濃度測定方法に適用する電気化学的測定法
本発明の乳酸濃度測定方法に適用する電気化学的測定法は、特に限定されるものではないが、一般的なポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法を適用することができる。具体的な測定手法としては、アンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられるが、アンペロメトリーにより、還元された電子伝達物質を印加により酸化される際に生ずる電流値を測定する方法が特に好ましい。この場合の印加電圧としては、１０〜７００ｍＶが好ましく、５０〜５００ｍＶがより好ましく、１００〜４００ｍＶが更に好ましい。
【００１４】
本発明の乳酸濃度測定方法に用いる測定システム（電極系）は、二電極であっても三電極系であってもよい。
作用電極にはカーボン電極を用いてもよいし、白金、金、銀、ニッケル、パラジウムなどの金属電極を用いてもよい。カーボン電極の場合、パイロロティックグラファイトカーボン、グラッシーカーボン（ＧＣ）、カーボンペースト、ＰＦＣ（ｐｌａｓｔｉｃ  ｆｏｒｍｅｄ  ｃａｒｂｏｎ）などが挙げられる。金属電極の場合、金が特に好ましい。通常は、作用電極上に乳酸酸化酵素が担持されてなる。
酵素の固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどが挙げられる。あるいはフェリシアン化物、フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子伝達物質と共にポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、乳酸酸化酵素をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする方法である。
参照電極としては、特に限定されるものではなく、電気化学実験において一般的なものを適用することができるが、例えば飽和カロメル電極、銀−塩化銀などが挙げられる。
【００１５】
乳酸濃度の測定は、例えば以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。電子伝達物質としては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として乳酸酸化酵素を固定化した電極を用い、対向電極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、乳酸を含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度の乳酸溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中の乳酸濃度を計算することができる。
【００１６】
しかしながら、上述のような方法では、測定に必要な溶液の量が多くなるため、小スケールで簡便に測定するためには、印刷電極を用いる方が好ましい。この場合、電極は絶縁性基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、ガラスエポキシ、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリイミドなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
【００１７】
電極の形状は特に限定されるものではなく、円形、楕円形、四角形などの形状が挙げられる。例えば、円形の形状である場合、その半径は３ｍｍ以下であることが好ましく、２．５ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。試薬層を形成する溶液の容量としては１〜５μＬ程度で十分であり、１〜３μＬ程度の量で行うのがより好ましい。溶液をマウントした後の固定化反応は、湿潤条件下で静置して行うのが好ましい。
【００１８】
（２）本発明の乳酸濃度測定方法に用いるセンサ
本発明の乳酸濃度測定方法に用いるセンサは、上述のとおり、絶縁性基板、その上に形成された作用電極および対向電極から成る電極系を含み、さらにその上に「少なくとも乳酸酸化酵素を含む試薬層」を含む。
【００１９】
本発明において用いられる乳酸酸化酵素は、Ｌ−乳酸の水酸基を酸化してピルビン酸を生成する反応を触媒する。
乳酸のセンシングに関するスキームの一例として、乳酸酸化酵素が乳酸に作用すると、酵素は還元型となるが、電子伝達物質としてフェリシアン化物（例えば、「Ｆｅ（ＣＮ）６」３−）を存在させると、還元型酵素はこれをフェロシアン化物（この場合、「Ｆｅ（ＣＮ）６」４−）へと変換し、自らは酸化型酵素へと戻る。フェロシアン化物は電位を与えると、電子を電極に渡してフェリシアン化物へと戻るので、こうした電子伝達物質をメディエーターとすることにより、電気化学的なシグナル検出が可能になる。
【００２０】
本発明において用いられる乳酸酸化酵素の起源は特に限定されるものではなく、市販の酵素や公知の方法で得られた酵素を用いることができる。
たとえば市販の酵素としては、ＬＯＸＩＩ（旭化成ファーマ株式会社：東京）が挙げられる。
公知の酵素としては、特許文献１〜７の酵素が挙げられる。
この中で好ましいものとして、特許文献１記載のラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属由来乳酸酸化酵素が挙げられる。本発明の実施例においてはラクトコッカス乳酸酸化酵素が用いられた。
【００２１】
本発明の乳酸濃度測定方法に用いるセンサは、さらに該試薬層に、イノシトール、サルコシン、ベタイン、グリシルグリシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、フタル酸、γ−アミノ酪酸およびマロン酸からなる群より選ばれる添加剤の少なくともひとつを含有する。
これらの中でも、グリシルグリシン、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、γ−アミノ酪酸が好適である。中でもマレイン酸が特に好ましい。
【００２２】
試薬層に含有する添加剤の量は特に限定されるものではないが、試薬層の全酵素単位０．０５ユニットに対し、好ましい下限は０．００１μｍｏｌである。さらに好ましい下限は０．００５μｍｏｌ、さらに好ましい下限は０．０１μｍｏｌである。一方好ましい上限は０．０２μｍｏｌである。
【００２３】
本発明の乳酸濃度測定方法に用いるセンサの試薬層の組成は、上記の要件を満たしていれば特に限定されるものではないが、さらに、乳酸濃度測定性能を向上させる目的で、種々の物質を共存させてよい。
【００２４】
たとえば、酵素反応と電極間の電子移動を仲介するための電子伝達物質（メディエーターともいう）を用いることが効果的である。
適用できるメディエーターの種類は特に限定されるものではないが、キノン類、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセンおよびその誘導体等が例示される。より具体的には、ベンゾキノン／ハイドロキノン、フェリシアン／フェロシアン化物（カリウムもしくはナトリウム塩）、フェリシニウム／フェロセンなどが挙げられる。フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールなどを用いてもよい。その他にも、オスミウム、コバルト、ルテニウムなどの金属錯体を用いることも可能である。
水溶性の低い化合物をメディエーターとして用いる場合、有機溶媒を用いると、酵素自体の安定性を損なったり、酵素活性を失活させたりする可能性がある。そこで、水溶性を高めるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子により修飾されたものを用いてもよい。反応系におけるメディエーター濃度は、１ｍＭ〜１Ｍ程度の範囲が好ましく、５〜５００ｍＭがより好ましく、１０〜３００ｍＭが更に好ましい。またメディエ−ターについても種々の官能基による修飾体を用いるなどして、酵素とともに電極上に固定化させて用いてもよい。
【００２５】
一方、緩衝材としては、リン酸塩のほか、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝材などが例示される。緩衝液のｐＨとしては４．０〜９．０程度に調整されることが好ましく、より好ましくは５．０〜８．０程度、更に好ましくは５．５〜７．５程度である。更には、上述したようなメディエーターである物質も組成物中に共存して含まれていてもよい。
【００２６】
（３）本発明の乳酸濃度測定方法
酵素反応は、所望の容量の反応溶液中に、所望の量の酵素とメディエーターを加えて混合された状態において、基質を含有する試料溶液、例えば血液を所定量加えると同時に測定を開始する。
電気化学的な検出とは、特に限定されるものではないが、酵素反応が進行するとメディエーターを介在した電子の移動に伴って生ずる電流の変化をシグナルとして測定することが好ましい。
測定に供する試料の種類は特に制約されるものではなく、酵素の基質を成分として含有する化含有する可能性のある水溶液はもとより、血液、体液、尿などの生体試料であってもよい。また、測定に際しては、可能な範囲で反応温度を一定にして行ってもよい。また、マイクロ流路デバイス等を用いた微量解析に展開することも可能である。
【００２７】
なお、本発明は上記の各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例１】
【００２８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク株式会社（京都市）より購入したものを用いた。また、実施例における乳酸センサによる乳酸測定条件を以下に示した。
（電極センサを用いた乳酸測定法）
絶縁性基板に作用電極、対向電極、および参照電極を配した電極センサを、有限会社バイオデバイステクノロジー社（石川県能美市）より入手した。本電極センサは、４．０ｍｍ×１７ｍｍの基板に電極が印刷されている。このセンサの作用電極（面積約１．３ｍｍ２）上に試薬層となる水溶液を１μＬ分注し、３０℃、１０分間乾燥させて吸着固定した。試薬層となる水溶液には、下記の組成が含まれる。
・ラクトコッカス属由来乳酸酸化酵素（特許文献１記載の方法により調製したもの）
・フェリシアン化カリウム
・ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．０）
・各種添加剤
結果として、作用電極上の試薬層には、乳酸酸化酵素が０．０５２Ｕ、フェリシアン化カリウムが０．０９５μｍｏｌ、ＰＢＳバッファーが０．００１３μｍｏｌ、各種添加剤が０．０２０μｍｏｌ、それぞれ含まれる。
試薬層を作成した後、絶縁性基板と同じサイズのポリエチレンテレフタレートフィルムを電極上に接着テープにて積層し、図１に示す乳酸センサを完成した。本乳酸センサは、積層により電極とポリエチレンテレフタレートフィルムとの間に約１．３ｍｍ３の空間ができており、作用電極近傍の側面をサンプル吸入口（幅約２ｍｍ）とすることができる。試料をセンサのサンプル吸入口に接することにより、毛管現象によってすばやく自動的に試薬層の全体に約１．３μＬ吸引することができる。
乳酸測定は、乳酸センサにポテンシオスタットにて０．３Ｖの電圧を印加し、約１０秒後に試料を吸入することにより行った。計測開始は、試料吸入直後より実施した。試料は、１０ｍＭのＬ-乳酸溶液(５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）に溶解）を用いた。各添加剤に起因するブランクについては、Ｌ−乳酸を含まない試料にて、それぞれ問題無いことを確認した。
様々な添加剤について、上記の測定方法で電流値の増加を調査し、効果が認められるものを選抜した。表１に、効果をもたらした添加剤と、それらの添加剤を使用した測定条件での電流値を添加剤の無い測定条件での電流値に対する相対電流値として示す。イノシトール、サルコシン、ベタイン、グリシルグリシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、フタル酸、γ−アミノ酪酸、マロン酸の計１４種の添加剤について、計測開始後５〜１０秒という短時間で電流値増加の十分な効果を得られることが判明した。
効果の見られた化合物の特徴として、カルボン酸を含む化合物、特にジカルボン酸やトリカルボン酸化合物が多く見られる。しかしながら、電流値増加の機構については、現時点で全く予測できないものであった。例えば、幾何異性体であるマレイン酸とフマル酸はどちらも効果が認められるものの、相対電流値はマレイン酸の方がかなり高値であった。
【００２９】
【表１】
2010271154.tif 000002
【実施例２】
【００３０】
実施例１で示した添加剤のうち、電流値増加効果の高いマレイン酸、クエン酸、γ−アミノ酪酸について、量依存性を確認した。実施例１と同じ乳酸測定法にて、添加剤量０．００１〜０．０２μｍｏｌの乳酸センサを作成し、１０ｍＭのＬ-乳酸溶液を試料として測定を行った。結果を図２に示す。試薬層の全酵素単位０．０５ユニットに対し、添加剤量０．００１〜０．０２μｍｏｌでいずれの添加剤も電流値増加効果が見られたが、その効果にはそれぞれ特有の量依存性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
添加剤を加えるという簡単な操作で、乳酸センサにおける計測シグナルである電流値を高めることができる。これにより、測定感度、測定の正確性をも高めることが可能である。
【図１】
2010271154.tif 000003
【図２】
2010271154.tif 000004