(57)【要約】      （修正有）【課題】鬱血性心不全のごとき高血圧性終末器官損傷を発症する危険性のある対象を同定する方法の提供。【解決手段】高血圧性終末器官損傷を発症する危険性がある患者の末梢血漿試料について、非筋細胞マーカーであるガレクチン−３またはトロンボスポンジン−２のレベルを、ｍＲＮＡまたは蛋白レベルで測定する方法。また、該疾患の予防・治療用医薬の製造のための、ガレクチン−３またはトロンボスポンジン−２の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）高血圧性終末器官損傷を発症する危険性がある対象の生体試料を採取し、
（ｂ）該試料中の少なくとも１つの非筋細胞マーカーのレベルを定量し、ここに、該非筋細胞マーカーはガレクチン−３およびトロンボスポンジン−２よりなる群から選択され；
（ｃ）該マーカーのレベルを標準のレベルと比較し、次いで、
（ｄ）該マーカーのレベルが高血圧性終末器官損傷を発症する危険性を示すか否かを決定する；
ことを特徴とする、高血圧性終末器官損傷の危険がある対象を同定する方法。
【請求項２】
該生体試料が末梢血液に由来する血漿試料である請求項１記載の方法。
【請求項３】
マーカーのレベルが酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
高血圧性終末器官損傷を発症する危険性がある対象を同定するための１以上の非筋細胞マーカーの使用であって、該非細胞マーカーはガレクチン−３およびトロンボスポンジン−２よりなる群から選択される使用。
【請求項５】
鬱血性心不全および高血圧性終末器官損傷の予防およびまたは治療用の医薬の製造のためのガレクチン−３の使用。
【請求項６】
鬱血性心不全および高血圧性終末器官損傷の予防およびまたは治療用の医薬の製造のためのトロンボスポンジン−２の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鬱血性心不全のごとき高血圧性終末器官損傷を発症する危険性のある対象を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鬱血性心不全（heart failure; HF）は一般的であるが、特に、高齢者において、重篤かつ複雑な臨床症例であり、低下した心収縮機能および減少した運動耐性で特徴付けられ、しばしば心臓血管致死に至る患者の漸進的衰退をもたらす。かくして、大勢の患者が、診断後１から５年以内に死亡している。しかしながら、深刻な人数の患者が生命を脅かす合併症の発症まで進行しているのに、他の者は長期間安定している。
【０００３】
心不全のごとき高血圧性終末器官損傷を発症する危険にある患者の早期同定は急性進行を防止するかもしれないので、心不全を発症しそうな患者を、それが発症する前に、同定することが可能であることが好ましい。また、心不全に罹患し、重篤な合併症を発症する危険にある患者を同定することができることが好ましい。
【０００４】
現行の方法は、心不全を信頼性よく排除するが、心不全の存在を信頼性よく証明することや、すでに発症した心不全の成り行きを予想することもできず、あるいは、高価な機器および特訓された人を必要とする。
【０００５】
それゆえ、心不全が開始する可能性を予想し、すでに発症した心不全の成り行きを予想するための単純かつ信頼性のある方法に対する要求が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、心不全のごとき終末器官損傷を発症する特別な危険にあるか、または、心不全の合併症を発症する特別な危険にある患者を同定できる方法を提供することにある。同定後、それらの患者は、例えば、心不全またはその合併症が発症する前に処置することができ、それは臨床的に非常に重要である。
【０００７】
これは、高血圧性終末器官損傷を発症する危険にある対象を同定する方法を提供する本発明により達成され、その方法は、以下の：
（ａ）対象の生体試料を採取し；
（ｂ）該試料中の少なくとも１の非筋細胞マーカーのレベルを定量し；
（ｃ）該マーカーのレベルを標準レベルと比較し；
（ｄ）該マーカーのレベルが高血圧性終末器官損傷を発症する危険を示すか否かを決定するステップを含む。
【０００８】
本発明にいたる調査において、肥大した心臓が不全となりそうであるかを予想するのに用いることができる特定のマーカーが同定された。
【０００９】
高血圧症が心臓肥大を引き起こし、それが心不全の最も重大な危険因子であることは一般的に知られている。しかしながら、全ての肥大心臓が最終的に不全となるわけではない。これらの観察は、代償された心肥大から不全にいたる進行の間に、肥大を引き起こすメカニズムに加えて、さらなるメカニズムが参画していることを示唆する。最近の研究は、心肥大に内在する多くの分子または細胞変化を報告するが［Lorell BH et al., Circulation 102: 470-479, 2000; Panidis et al., J Am Coll Cardiol. 3: 1309-1320, 1984］、心不全に寄与するさらなる因子が今でも依然として不明のまま残されている。
【００１０】
Ｂｏｌｕｙｔらは、例えば、心不全の自発性高血圧ラット（spontaneously hypertensive rat; SHR）において細胞外基質（extracellular matrix; ECM）成分をコードする遺伝子のアップレギュレーションを立証した［Boluyt et al., Casrdiovasc Res. 46: 2399-249, 2000; Hypertension 30: 1362-1368, 1997; Cardiovasc Res. 30: 836-840, 1995; Eur Heart J. 16 suppl. N: 19-30, 1995］。しかしながら、これらの遺伝子の過剰発現が心不全の顕在的な臨床的症状に先行していたのかどうか、また、それらの過剰発現がすでに発症した能動的不全の過程の結果であったのかどうかは明らかではない。
【００１１】
いくつかの他のバイアスされていない手法も採用され、心不全に特異的なメカニズムが同定されている［Korstin S et al., Circ Res. 92: 715-724, 2003; Hein S et al., Circulation 107: 984-991, 2003］。
【００１２】
しかしながら、これらの以前の研究は、しばしば、最終段階かつ薬物治療した心筋と正常心筋とを比較する。それゆえ、得られた差異は、不全およびその治療に対して二次的なものであり、その研究は、代償された肥大心臓の不全をもたらし、危険にある患者を同定するためのマーカーとして用いることができる因子を同定しない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明にいたる調査において、不全となりつつある肥大心臓由来の多数の遺伝子の遺伝子発現プロファイルが代償されている肥大心臓と比較された。かくして、遺伝子は、不全となりつつある肥大心臓対代償されたものとで、異なって発現された。特に、本発明は、特定の非心筋遺伝子が疾患心臓組織において異常発現されるという発見に基づく（実施例１および２）。
【００１４】
本発明によれば、非心筋性マーカーを使用する。すなわち、心筋以外の細胞由来のマーカーである。これは、本発明の方法が、ストレスを受けた心筋において生じる既知の心筋変化の他のプロセスを「プローブ」するという利点を有する。これは、心不全を診断のみならず、既知の心不全の患者を連続的にモニターする、すなわち、主たる不利なイベントを告知するであろう不利な非心筋プロセス（例えば、炎症、瘢痕等）が生じるかどうかをモニターする機会も開く。
【００１５】
本発明の方法によれば、生体試料を個々の患者から採取する。引き続き、その試料中の１以上のマーカーのレベルをよく知られた方法で測定する。典型的に、そのレベルを標準レベルと比較して、そのマーカーのレベルがその個人が心不全に進行する可能性を示すかどうかを決定する。この標準レベルは、健康な対象におけるそのマーカーのレベルに基づく。そのマーカーのレベルが標準レベルよりも上昇していれば、その対象はＣＦＨを発症するかまたは心不全の合併症を発症する危険にある。
【００１６】
生体試料は、血液、血漿、血清、尿等のごとき体液、または、心臓バイオプシーのごとき組織試料のいずれかの試料である。しかしながら、本発明の好ましい具体例によれば、生体試料は末梢血由来の血漿試料である。末梢血試料は患者から簡単に採取でき、カテーテル法のごとき複雑な非浸襲性手順も必要ない。生体試料は、よく知られた技術に準じてプロセスされて試験用試料が調製される。
【００１７】
本発明の好ましい具体例によれば、マーカーは蛋白質である。蛋白質のレベルは、当該蛋白質に対する特異的抗体を用いる免疫学的方法のごとき単純かつ信頼性ある方法によって容易に定量できる。
【００１８】
好ましくは、蛋白質は、ガレクチン−３である。ガレクチン−３のレベルは不全しそうな心臓において早期かつ特異的に発現されることが立証されているからである。
【００１９】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、蛋白質はトロンボスポンジン−２である。ＴＳＰ２の増大した心臓発現が、明らかな心不全に進行しそうな肥大心臓を同定することが立証されている。
【００２０】
それらのマーカーのレベルはいずれかのよく知られた適当な方法によって定量することができる。好ましくは、マーカーのレベルは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定し、かくして、単純で、再現性があり、かつ、信頼性のある方法を提供する。
【００２１】
本発明は、さらに、鬱血性心不全のごとき高血圧性終末器官損傷を発症する危険にある対象を同定するための１以上の非心筋マーカーの使用に関する。いくつかの非心筋マーカーを本発明により用いる。好ましくは、マーカーは、ガレクチン−３および／またはトロンボスポンジン−２である。
【００２２】
本発明により同定されたマーカーは、さらに、本発明、および／または高血圧性終末器官損傷の治療、特に鬱血性心不全の予防および／または治療に用いることができる。例えば、ガラクチン−３の例えば抗体による阻害、および／または、ＴＳＰ−２の適当なモジュレーターによる活性化が、心不全の発生を防ぐのに有益であろう。それゆえ、本発明は、さらに、高血圧性終末器官損傷の予防および／または治療用の医薬の製造のためのガラクチン−３および／またはそのモジュレーターの使用に関する。本発明は、さらに、高血圧性終末器官損傷の予防および／または治療用の医薬の製造のためのトロンボスポンジン−２の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、以前報告された統計的プロトコルの実行およびデータマイニングのための包括的カットオフのステップを示すフローチャートである。
【図２】図２は、１０週齢のラットから採取した心筋バイオプシーにおける４つの選択した遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現を定量するリアルタイムＰＣＲの結果を示す。（ａ）ＴＳＰ２は、１７週間の実験期間中代償されたままのラットと比較して、後に急性心臓代償不全になるラットにおいて著しく過剰発現されている。（ｂ）オステオアクチビン発現である。（ｃ）コラーゲンＶＩ発現である。（ｄ）脳内ナトリウム排泄増加ペプチドの発現レベルである。これらのデータは、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。Ｃｏｍｐ、代償；Ｄｅｃｏｍ、代償不全。＊、ｐ＜０．０１  代償対代償不全群；＃、ｐ＜０．０５  ＳＤ対Ｒｅｎ−２ラット；各群  ｎ＝４。
【図３】図３は、心筋梗塞の誘発後のマウスの生存率を示す。術後、ＴＳＰ−２不存在マウス（点線）は７２時間以内に全て死亡した。手術直後の死亡を除けば、野生型マウス（実線）では死亡は観察されなかった（ｎ＝２２）。
【図４】図４は、第０日およびＭＩ４８時間後の心筋コラーゲン含有量の濃度分析の結果を示す棒グラフである（１切片あたり１０箇所の無作為視野）。ＴＳＰ−２不存在マウスは、野生型マウスと比較して、ＭＩ４８時間後、反応性線維症形成の増加がなかった。＊、ｐ＜０．０１、Ｍｉ４８時間後の野生型対不存在型株；野生型マウスにおける第０日目対ＭＩ４８時間後。
【図５】図５は、心筋梗塞を起こした左心室壁の写真および電子顕微鏡像を示す。血管周辺の無傷のマトリックスを示すヘマトキシリン(Haematoxyline)／エオシン(Eosin)染色切片であり、野生型マウスでは間質性出血の証拠はない（ａ）。ＴＳＰ−／−マウスにおける、広範囲にわたる組織破壊と出血（＊）（ｂ）。心筋梗塞を起こした左心室壁（野生型株）の電子顕微鏡像（ｃ）。かなり良好に維持された血管およびマトリックス構造に注目。ＴＳＰ−２不存在マウスからの切片は間質領域において心筋マトリックスの広がった損傷および出血（＊）を示した（ｄ）。
【図６】図６は、ＨＦ−Ｓ、ＨＦ−ＲおよびＡＲＢ処理ラットの血流力学パラメータを示す。ＡＲＢ投与（７〜１１週からカンデサルタン０．０５ｍｇ／ｋｇ／日）有無のＲｅｎ−２トランスジェニックラットの血流力学評価。Ａ、ＬＶＷ／ＢＷ（％）、左心室肥大の代表値。Ｂ、ＬＷ／ＢＷ（％）、鬱血性心不全の発症を示す。Ｃ、ＬＶＥＤＰは拡張期機能障害の程度を示す。ＨＦ−ＳおよびＨＦ−Ｒ動物の双方は、左心室肥大を有していた。高線維症形成スコアの動物は高めのＬＷ／ＢＷおよびＬＶＥＤＰを有していた。これらのパラメータは犠牲前に測定した。ＨＦ−ＳおよびＨＦ−Ｒにつき各々Ｎ＝４、ＡＲＢにつき８。＊、ＨＦ−Ｓ対ＨＦ−ＲおよびＡＲＢにおいて、Ｐ＜０．０５。
【図７】図７は、ラット心筋のピクロシリアス赤色染色切片の左心室コラーゲン体積フラクション分析の結果を示す。棒グラフは、ＬＶ間質性コラーゲンの定量を示す。１、対象；２、ＨＦ−Ｒ；３、ＨＦ−Ｓ；４、ＡＲＢ。各群、Ｎ＝４〜６；＃、Ｐ＜０．０１  対対象；＊、Ｐ＜０．０５  ＨＦ−Ｓ対ＨＦ−Ｒ；＊＊、Ｐ＜０．０５  ＨＦ−Ｒ対ＳＤ。
【図８】図８は、Ｒｅｎ−２ラットにおいて異なって発現された遺伝子のドットブロットを示す。ガレクチン−３  ｍＲＮＡレベルをラットのＨＦ−Ｓ、ＨＦ−ＲおよびＡＲＢ処理群と比較した。ドットの濃度および直径が、ＳＤ対象と比較した遺伝子発現のレベルに直接対応する。Ａ、ホスホ−イメージャーは、ＨＦ−Ｓ、ＨＦ−ＲおよびＡＲＢ処理ラットからのイメージを走査した。丸印をつけたドットはガレクチン−３  ｍＲＮＡ発現を表す。Ｂ、棒グラフは、濃度測定単位での定量したガレクチン−３の量を示す。各群、Ｎ＝２であり、各試料を２回スポットした。
【図９】図９は、ガレクチン−３、サイクリンＤ１およびＥ２Ｆ−１の免疫ブロットである。ガレクチン−３のラット心筋ホモジネートにおける発現レベル：Ａ１、代表的ブロット；Ａ２、ＧＡＰＤＨに対して正規化した濃度測定単位での定量；サイクリンＤ１：Ｂ１、代表的ブロット；Ｂ２、ＧＡＰＤＨに対して正規化した濃度測定単位での定量。
【図１０】図１０は、ガレクチン−３、マクロファージおよびＭＨＣ−ＩＩの免疫組織化学共局在化を立証する。ＨＦ−Ｓラットの心筋から得られた平行切片は、Ａ、ヘマトキシリンで反対染色された抗−ガレクチン−３マウスモノクローナル抗体；Ｂ、マクロファージ特異的抗ＣＤ６８マウスモノクローナル抗体；Ｃ、ＭＨＣＩＩ抗原に対するＯＸ−６マウスモノクローナル抗体で染色された。別の微視的視野は、マクロファージの濃厚浸潤を示す、Ｄ。ＨＦ−Ｒ動物におけるマクロファージ浸潤は散在して見られ（Ｅ）、ＳＤ対象において、よく保存された心筋モルホロジーが見られた、Ｆ。
【図１１】図１１は、ヒト対象におけるＬＶＨおよびＨＦの電気およびエコー心電図評価ならびに心筋ガレクチン−３遺伝子発現を評価する定量的リアルタイムＰＣＲである。  Ａ、ＳｋｏｗｌｏｗおよびＬｙｏｎ評価基準（ＳＶ１＋ＲＶ５＞３５ｍｍ）によって評価された左心室肥大。５５％より低いＥＦは代償不全状態にあるとみなされる。Ｂ、ヒトガレクチン−３プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ。ガレクチン−３遺伝子発現がヒト心筋バイオプシーにおいてプロファイルされた。結果は、ハウスキーピング遺伝子、サイクロフィリンに対して正規化した。Ｎ＝６、＊、Ｐ＜０．０５  ＨＦ対ＬＶＨ。
【図１２】図１２は、１０週間バイオプシーにおけるガレクチン−３  ｍＲＮＡ発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、以下の実施例および図面によってさらに例示される。
【実施例】
【００２５】
実施例１
トロンボスポンジン−２：増大した発現は不全となりそうな心肥大を同定する
心肥大は心不全（ＨＦ）の危険を増大するが、いままでのところ、どの肥大心筋が急速にＨＦに進行するかを予想するのは困難であった。本発明によれば、肥大関連遺伝子から離れ、個別の不全関連遺伝子を不全が明確になる前に発現し、かくして、不全しがちな肥大心臓の分子予測を可能とすることが考え出された。１２〜１４週齢でＨＦに進行する高血圧性ホモ接合レニン過剰発現（Ｒｅｎ−２）ラットの心遺伝子発現（１２,３３６クローン）は１７週間代償されたままの同腹仔による発現と比較した。代償された肥大（１０週齢）の段階で採取された心臓バイオプシーは、発明者らが、同定した遺伝子の変化した発現が後のＨＦへの進行に先行するかどうかを試験することを可能にした。ＨＦラットの心筋において過剰発現した４９遺伝子を同定し、それらのマトリックス遺伝子は最大群を構成した。トロンボスポンジン−２（ＴＳＰ２）は、後にＨＦに進行したラットからのバイオプシーにおいてのみ選択的に過剰発現し、一方、脳内ナトリウム排泄増大ペプチド（ＢＮＰ）は、この初期段階で、全てのラットにおいて上昇した。心臓マトリックスに対するＴＳＰ２の不存在の影響を試験するため、心筋梗塞（ＭＩ）をＴＳＰ２−不存在マウスにおいて誘発させた；この手順は全てのＴＳＰ２不存在マウスにおいて心臓破裂を生じたが、野生型（ＷＴ）マウスには全く見られなかった。結論として、ＴＳＰ２は心臓マトリックスの剛直性の新規かつ重要なレギュレータであると同定された。
【００２６】
原料および方法
トランスジェニックラットおよび血流力学実験
ホモ接合Ｒｅｎ−２ラットは、Max-Delbruck-Zentrum fur Molekular Medizin, Berlin, Germanyから入手した。Sprague Dawley (SD)バックグラウンド上の３０匹の雄Ｒｅｎ−２ラットおよび、対象として、９匹の齢適合ＳＤラットを実験した。３０匹のＲｅｎ−２ラットのうち、８匹を１０週齢で犠牲にし、８匹を、７〜１３週齢から、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日のカンデサルタン、アンジオテンシンＩＩ受容体Ｉ型ブロッカー（ＡＲＢ）、で処理した。残りの１４匹の未処理ラットのうち、６匹を、心不全の臨床的徴候の発症から１３週で犠牲にし、ＨＦ−Ｓラットと命名した。残りの８匹のＲｅｎ−２ラットを綿密にモニターし、不全の臨床的徴候がまだ表れていない１７週で犠牲にした。これらのラットをＨＦ−Ｒラットと命名した。犠牲前に血流力学パラメータを定量し、犠牲後に心臓、肺および体重を測定した。動物の世話および処理は動物実験委員会に承認された。
【００２７】
１０週齢のＲｅｎ−２ラットからのバイオプシー
１２匹のＲｅｎ−２および４匹のＳＤラットからなる第２群を麻酔し、前胸部を胸骨にて剃毛した。ラットを自作ループの助けを借りて、保温パッド上の堅い板に固定した。先の丸い２０ゲージ針を気管に入れて気管カニューレとして機能させた。このカニューレを、室内空気で２．５ないし３ｍｌの周期体積および８０呼吸／分の呼吸レートの従量式齧歯類呼吸器（model 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA）に連結した。さらなる手順は、マイクロ手術用顕微鏡の視覚的な助けを借りて行った。左の第４肋間に５ｍｍの切開をして、胸郭に接近した。心臓の明瞭な視界を得た後、ゆっくりと回転するドリルに連結した特注の０．３５ｍｍ針を用いてバイオプシーを採取した。全手順は、約１５分間続いた。手術で生き延びた９匹のＲｅｎ−２ラットのうち、５匹は１２〜１４週齢の間に心不全を発症し、一方、残りの４匹のラットは１７週間代償されたままでいた。
【００２８】
ＲＮＡの単離および逆転写
RNeasy Protocol (QIAGEN, Hilden, Germany) に準じて、RNeasy Mini Kitで、ＲＮＡを左心室から単離し、−８０℃で保存した。抽出物の品質は、2100 Bioanalyser (Agilent Technologies, Amstelveen, The Netherlands)で、真核生物全ＲＮＡナノアッセイを用いて測定した。ＲＮＡは、PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus, CA, USA)で、製造者の指示書に準じて、１０週齢ラットの心臓バイオプシーから単離した。ＲＮＡは、リバーストランスクリプターゼでｃＤＮＡに転写し、２５０ｍｇのランダムプライマー (Invitrogen Life Technologies, Breda, The Netherlands)を用いた。
【００２９】
ｃＤＮＡマイクロアッセイ
Ｉｎｃｙｔｅ ＧＥＭ−２／ＧＥＭ−３ラットｃＤＮＡライブラリー（全１２,３３６遺伝子）を用いるマイクロアレイ上の分析のため、正規化ラットｃＤＮＡライブラリーから単離したｃＤＮＡクローンを選んだ。各ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅インサートを処理ガラス面上に印刷して高密度アレイとした。これらのアレイ素子上で、２匹のＳＤおよび６匹のＲｅｎ−２ラットの心筋ｍＲＮＡを用いて、３つの異なる時点で、重複ハイブリダイゼーションを行った。数値の対数変換を行って、データを均質にし、＞１．７倍の発現差のみが異なって発現されると考えられた。すでに詳細に記載されたように［Tan et al., Proc Natl Acad Sci. 99: 11387-11392, 2002; Bandman et al., Ann NY Acad Sci., 975: 77-90, 2002］、データマイニングおよびバリデーションのプロトコルを採用した。
【００３０】
配列決定、膜スポッティング、およびマクロアレイ用ｃＤＮＡハイブリダイゼーション
マイクロアレイによって同定された異なって発現された遺伝子のクローンをＩｎｃｙｔｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓから入手し、5'-GGTGAGACTATAGAAGAGC-3' プライマー(Eurotgentec, Seraing, Belgium)で配列決定した。配列決定によって同一性が確認された後、プラスミドインサートを、5'-ACCATGATTACGCCAAGCTC-3'よび3'-ACGACGGCCAGTGAATTGAA-5'プライマーとのＰＣＲ反応によって増幅した。次いで、各クローンをナイロン膜（マクロアレイ）上に重複してスポットした。ドットブロットをパーソナルｆｘ−ホスホイメージャー (Cyclone System Packard, Meriden, CO, USA) で走査した。個々のハイブリダイゼーションシグナルを同定し、Quantity One, Version 4.2.3ソフトウェア(BioRad, Munich, Geramany)を用いて、密度測定で定量した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をブロットの内部標準用のハウスキーピング遺伝子として選択した。
【００３１】
バイオインフォマティック分析
マイクロアレイ分析および多段階データマイニングストラテジーから選択された４９のＨＦ−特異的候補遺伝子から転写された蛋白質配列のバイオインフォマティック分析を行った。それらの生物学的機能の注釈に基づき、以前は心筋内で同定されず、マトリックス関連蛋白質をコードする３つの候補遺伝子をリアルタイムＰＣＲによるさらなる試験用に選択した。
【００３２】
プライマー、プローブおよびリアルタイムＰＣＲ
プライマーおよびプローブは、Primer Express Software (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いてＧｅｎＢａｎｋＴＭで入手可能なラット配列から設計した。プローブは、Ensembl-Mouse Genome Sequencing Consortium and Ensembl-Human Genome Browserから誘導された保存されたエクソンスプライス部位から設計し、かくして、いずれの潜在的に汚染するゲノムＤＮＡ（表１）のアッセイによる認識を防止する。最適ＰＣＲ条件は、２ｍｌの全量中、１２．５ｍｌ  ２×ＴａｑｍａｎＴＭアッセイ用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、最終濃度５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭプローブ、および１０ｎｇ ｃＤＮＡ鋳型であることが分かった。増幅および検出は、ABI Prism 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて行った。ＰＣＲデータは、ハウスキーピング遺伝子シクロフィリンＡの発現レベルの相対で報告された。
【００３３】
ＴＳＰ２−／−マウスにおける実験的ＭＩおよびモルホメトリー
２２匹の野生型（１２９  ＳｖＪ株）および１６匹のＴＳＰ２不存在変異体（ＴＳＰ２−／−）において、左腹側下行冠状動脈を結索することによって心筋梗塞を誘発させた。２匹の擬手術マウスを対照として用いた。エーテル麻酔後、１ｍｌの０．１Ｍ ＣｄＣｌ２を大静脈に注射することによって、これらのマウスを殺した。心臓を１０分間５％バッファー化ホルマリンで潅流固定し、１０％バッファー化ホルマリン中で一晩浸漬固定した。標準電子顕微鏡技術を用いて、野生型およびＴＳＰ２−／−マウスの組織標本を評価した。線維症形成の程度を定量するために、コンピュータ化面積測定を、１切片あたり７カ所の無作為に選んだ視野で行った。各視野は４００μｍ２の面積であった。コラーゲン面積を、末梢血管および心外膜コラーゲンを除外し、選択的に左心室間質から定量した。コラーゲン面積フラクションは、１視野あたり、全心筋面積に対するピクロシリウス−レッド染色した面積の比率として計算した。この手順の詳細は以前に報告されている［Cherayil et al., Proc Acad Sci USA, 87: 7324-7328, 1990; Cleutjens et al., Am J pathol., 147: 325-338, 1995］。
【００３４】
統計分析
データは平均±ＳＥＭで表す。ワンウェイ分散分析（ＡＮＯＶＡ）をDunnett ポストホック分析と組み合わせて用いて、各実験群（カンデサルタン処理および２群の未処理レニン−トランスジェニックラット）のデータを比較して、多重比較のために補正した。ＳＤラットを内部対照コホートとして用いた。分析は統計パッケージＳＰＳＳ１０．０(Chicago, IL, USA)を用いて行った。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であるとみなした。
【００３５】
結果
Ｒｅｎ−２ラットのサブセットの顕在的な心不全および死亡への急展開
左右の心室の肥大が、１０週目に犠牲にした８匹のラットおよびそれよりも遅い日に犠牲にした他の未処理ラットにも見られた。ＳＤ対照にはＬＶＨは見られなかった。プラセボの１４匹のラットのうち６匹が１２ないし１４週齢の間に顕在的な臨床ＨＦに急展開し、１７週間の観察期間中代償されたままの８匹のラットと比較して抑制された心機能インデックスを有していた。胸膜滲出液およびｄＰ／ｄｔｍａｘにおける急下降がＨＦ−Ｓラットに見られ；これらの変化はＨＦ−Ｒラットには見られなかった（表２）。アンジオテンシンＩＩブロックは、１３週で犠牲にした動物を評価したとき、心臓の肥大および不全の発症を完全に防止した（ＬＶ  重量／体重％、２．５２±０．３６、ｄＰ／ｄｔｍａｘ、８４００±２０２）。
【００３６】
マイクロアレイは心不全の疑いのあるラットにおいて過剰発現した４９の遺伝子を明らかにした。
マイクロアレイ分析について、本発明者らは、まず、ＨＦ−ＳおよびＨＦＲ群の間で、遺伝子発現における生態多様性を調査した。ＨＦ−ＳおよびＨＦ−Ｒの２つの群におけるほとんどの遺伝子の発現レベルは非常に似通っていた。発現用にプロファイルした総数１２,３３６の遺伝子から、４９の遺伝子のみが多段階データマイニングストラテジーを生き残り（図１）、ＨＦ−Ｓラットにおいて過剰発現した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）トランスハイドロゲナーゼが、心筋欠如で低下した発現を示した唯一の遺伝子であった。特に、オステオアクチジン、ＴＳＰ２、いくつかのプロコラーゲンおよびトロンボスポンジン−１が増加した。同定された遺伝子の多くが既知の機能を持つ蛋白質をコードし、一方、それ以外は、未知の機能の遺伝子に対応し、新規遺伝子および心臓で今まで見出されていない遺伝子を含む。
【００３７】
バイオインフォマティック分析は、３つの心臓マトリクス関連遺伝子に指向した。
ＨＦにおける過剰発現遺伝子の多くの機能に関して情報が入手できなかったので、本発明者らは、４９の遺伝子全てをバイオインフォマティック分析にかけた。最初、本発明者らは、いくつかの調査／整列ツールを組み合わせて急速かつ正確に遺伝子ファミリーを提供するＧｅｎｅＦＩＮＤ (Gene Family Identification Network Design) システム（htpp://www-nbrf.georgetown.edu）を用いて、ＨＦの疑いのある遺伝子の広い機能的分類を行った。このストラテジーは、ほとんどの過剰発現遺伝子がマトリクス関連蛋白質をコードすることを示した。特に、選択された３つの疑いのある遺伝子（オステオアクチビン、トロンポスポンディン−２およびコラーゲンＶＩ）の機能は、今まで、心筋において報告されていない。
【００３８】
マクロアレイはアンジオテンシンＩＩブロックによるＨＦの疑いのある遺伝子の正常化を示した。
このアンジオテンシン主導型心不全モデルにおけるレニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）活性化の役割を確かめるために、本発明者らは、７ないし１３週齢のＲｅｎ−２ラットのサブグループを(プレッサー下用量)のカンデサルタンで処理した後マイクロアレイによって同定された標的遺伝子の発現を再評価した。血流力学の向上に加えて、ＡＲＢ処理は全てのＨＦ関連候補遺伝子の過剰発現を防止した（データ示さず）。
【００３９】
１０週間の心筋バイオプシーは後にＨＦに急進行するラットにおいてＴＳＰ−２アップレギュレーションを示した。
ＨＦが血流力学的および臨床的に顕在化する前に心筋における３つのマトリクス関連遺伝子の発現状態を評価するために、本発明者らは、自発鼓動するラット心臓の心臓バイオプシーを得る技術を開発した。バイオプシー後、ラットを回復させて、それが心不全に対して耐性または感受性であることを証明するかどうかを決定した。この新規アプローチは、われわれが、不全が顕在化する前に遺伝子発現のレベルを立証することを可能とした。ＴＳＰ２発現は、１２〜１４週以内に急性心臓代償不全を起こしたラットにおいてのみ、早期肥大段階（１０週間）にて著しく増大したが（図２ａ）、その後も代償されたままのラット心臓でも非トランスジェニック対照ラット心臓でも、この段階ではアップレギュレートされなかった。オステオアクチビン（図２ｂ）およびコラーゲンＶＩ（図２ｃ）のごとき、他のＨＦ関連遺伝子の発現レベルは、後に不全を起こすラットおよび対照と比較して代償されたままのラットの双方において、早期肥大段階で増大した。重要なことに、心臓の肥大および不全の広汎に用いられるマーカーは、後の代償または不全にかかわりなく、全てのラットにおいて１０週バイオプシーでアップレギュレートし、それゆえ、不全耐性ラットから不全感受性ラットを識別できなかった（図２ｄ）。本発明者らによる初期のマイクロアレイ実験によれば、これら３つの遺伝子の発現は、心不全の進行によって、１０週発現レベルの２倍以上にまでさらに増大した。代償ラットは、１０週にて高いオステオアクチビン、コラーゲンＶＩおよびＢＮＰを有するにもかかわらず、１７週にて犠牲にした時点でこれら遺伝子の発現レベルにさらなる著しい増大は見られなかった（データ示さず）。
【００４０】
ＴＳＰ−２ノックアウト（ＴＳＰ−／−）マウスは急性心筋梗塞で生き残れなかった。
心不全の様々なラットモデルに反して、丹念に記録された過負荷に応答して確実に心不全を発症するラットモデルはない。それゆえ、本発明者らは、２２匹の野生型ラットおよび１６匹のＴＳＰ２−／−マウスにおいて腹側心筋を梗塞させて、急性の心筋構造損傷およびその結果の急速心臓再構築におけるＴＳＰ２の生物学的役割の解決に努力した。梗塞はＴＳＰ２なしマウスには耐えられなかった。全てのマウスがＭＩの最初７２時間以内に死亡したからである。一方、手術直後の合併症により死亡しなかった野生型マウスの１００％が生き残った（図３）。ＭＩの４８時間後のコンピュータ化モルフォメトリーは、野生型マウスと比較してＴＳＰ２なしマウスにおいて、心筋コラーゲンの反応性増大が完全に欠如していることを示した（各々、０．３８±０．０５％および０．７０±０．０４％；ｐ＜０．０５）（図４）。光電子顕微鏡はＴＳＰ２なしマウスにおいて心筋マトリクスの広範囲にわたる分裂を明らかにした。野生型マウスは一匹もこの発現型を示さなかった（図５）。
【００４１】
考察
この実験で、ＴＳＰ２の増大した心発現は顕在化した心不全に進行しがちな肥大心臓を同定することが立証された。さらに、ＴＳＰ２は急速心負荷(acute cardiac loading)に対する効果的な応答を行うのに必要とされることが示された。その反対に、肥大様ＢＮＰの既知のマーカーは、全ての形態の心肥大において例外なく増大し、それゆえ、不全感受性および不全耐性の肥大を区別できなかった。
【００４２】
トロンボスポンジンのファミリーは、血管および血栓の疾患において広汎に研究されているが、心不全におけるトロンボスポンジンについて重要な役割を実現させる報告はない。本発明者らの発見は、ＴＳＰ２は、直接的または間接的に、心臓マトリクス生物学における重要な機能を行うのであろうことを示唆する。
【００４３】
ＴＳＰ２は、その機能が多様であり完全には理解されていない分泌性マトリックス細胞間蛋白質(a secreted matricellular protein)である。ＴＳＰ２に近接した相同体は、線虫(Caenorhabditis elegans)またはショウジョウバエ(Drosophila)のゲノムには見つかっていないので、この蛋白質は、脊椎動物における細胞マトリクス相互作用の増大した複雑性を対処するために進化したようである。
【００４４】
細胞外マトリックスの組織化におけるＴＳＰ２の役割についての証拠として、ＴＳＰ２−不存在マウスにおける以前の研究は、ＴＳＰ２発現の喪失の結果、不規則な輪郭を持つ異常に大きなコラーゲルフィブリルが得られることを示している、さらに、ＴＳＰ２−不存在マウスの皮膚はもろく、低下した聴力を有する。ＴＳＰ２−ふそん剤の皮膚線維芽細胞は、基底へのその付着に欠陥があり、それらの培養において増大したレベルのマトリックスのメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）を有する。現在の研究は、心筋におけるＴＳＰ２に対して２つの明らかに矛盾する機能を同定する。Ｒｅｎ−２ラットにおける慢性高血圧症において、ＴＳＰ２の増大した心臓発現は、心不全の傾向がある動物を同定する。この応答は、ＴＳＰ２の発現が有害であることを示すようであるが、該応答が、延長された期間の間、以前として代償されるラットにおける応答と比較して、後に明白な不全に進行するラットにおける強調された従前に活性化された負傷応答を反映するようである。ＴＳＰ２の発現は成体動物における負傷に対する応答に特徴的であることがよく確立されている。他方、マウスにおける実験的心筋梗塞においては、ＴＳＰ２の存在は心臓破裂に対して明らかに保護する。２つの実験系は異なる種が関連し、ＴＳＰ２−不存在マウスの場合には複雑な代償変化が存在しそうな故に比較するのが困難であるが、結果の双方の組は、代償後における十分に機能的な細胞該マトリックスを生じさせるにおいて、ＴＳＰ２に対する重要な役割に合致する。ＴＳＰ２−不存在マウスにおける切開皮膚創傷治癒の場合には、ＴＳＰ２の不存在は有利であるようにも見える。なぜなら、創傷治癒のその特別な形態においては、脈管形成およびＭＭＰ−２における得られた増加は、この組織に存在することが知られているコラーゲン線維の予め存在する構造的変化にもかかわらず治癒を加速するからである。しかしながら、心臓組織の以前の固有の弱点が、心筋のマトリックスにおける同様な異常性のため、梗塞後に心臓破裂に対する素因があることが示唆されている。
【００４５】
本データは、不全への進行に対してＴＳＰ２の増大した心臓発現が先行することを示唆している。トロンボスポンジンはインテグリンに結合できることが知られているので、ＴＳＰ２はインデグリンシグナリングを介してプロ−線維症効果を媒介する可能性がある。最近、Zhang et al.(J Clin Invest 111: 833-841, 2003)は、アダプター蛋白質遺伝子Ｇｒｂ２のハプロ不全を持つマウスが圧力過剰負荷に応答する心臓線維症に対する抵抗性であると報告している。Ｇｒｂ２は、機械的なストレスに由来し得る病巣接着キナーゼのインテグリン−媒介活性化で補充される。我々の研究においては、我々は、β１インテグリンが、その発現が高血圧Ｒｅｎラットの心臓で明らかに増加しており、かつ不全心臓においてさらに増大した遺伝子の中にあることを見出した。この知見が、イン・ビトロでの心臓線維芽細胞の伸長がβ１インデグリンの蛋白質レベルを増加させたという我々の最近の観察によって実質化された(S. Pokharel and Y.M.Pinto,未公表データ)。
【００４６】
コラーゲンの定量のためのピクロシリウス（picrosirius)赤色染色技術は、オレンジ色−赤色の目に見える偏光を示すコラーゲン線維のサイズ、整列、およびパッキングに依拠することに注意すべきである。ＴＳＰ２−不存在マウスは、異常なコラーゲンフィブリルおよび線維構造、特にあまり組織化されていない線維および不規則かつより大きなフィブリルを有するので、測定された複屈折はこれらの変化によって影響された。
【００４７】
結論として、本発明によると、ＴＳＰ２が心臓マトリックスの一体性の非常に重要なレギュレーターとして機能することが提唱される。増大した細胞外マトリックス形成は、圧力過剰負荷−誘導心不全の実験的および臨床的形態を共に特徴付けるので、ＴＳＰ２の初期の発現は、代償された肥大から心不全への転移で非常に重要であるマトリックス応答を反映するであろう。これらの観察は、ＴＳＰ２の心臓過剰発現の初期の検出が、心不全にかかりやすい肥大心臓を同定でき、心不全に進行する傾向がある患者の初期同定およびおそらくは該患者の治療を促進することであろうことを示している。
【００４８】
実施例２
ガレクチン−３は不全にかかりやすい肥大心臓における活性化されたマクロファージをマークする。
マクロファージ化学誘因蛋白質および種々のサイトカインの増大した心筋発現は、マクロファージが心不全（ＨＦ）に関与することを示唆した。しかしながら、マクロファージが既に確立された負傷に単に応答するのか、あるいはＨＦの初期段階に積極的に関与するのかは明らかではない。高血圧（ＨＦ）におけるこれらのメカニズムを調べるために本発明者らは、ホモ接合性高血圧ＴＧＲ（ｍＲｅｎ２）２７（Ｒｅｎ−２）ラットを使用した。これらのラットは１０週齢までに不変的に心臓肥大を発生し、その後、いくらかは１７週までに代償され、他方、他は１２ないし１４週齢程度までに不全および死亡まで進行する。この研究は、心臓ガレクチン−３の発現が不全へ進行する傾向がある肥大心臓を特異的にマークする。マクロファージは不全の傾向がある肥大心臓において初期にかつ特異的に活性化されるように見え、マクロファージ由来メディエーター様ガレクチン−３は心臓線維症の発生およびＨＦに向けての進行に寄与するであろう。
【００４９】
材料および方法
トランスジェニックラットおよび血流力学的研究
ホモ接合性Ｒｅｎ−２ラットはMax-Delbruck-Zentrum fur Molekulare Medizin, Berlin, Germanyから入手した。我々は、非−トランスジェニックバックグラウンドでSprague Dawley (SD)ラットからの１６匹の雄Ｒｅｎ−２ラットおよび８匹の年齢が合致した対照を実験した。１６匹のＲｅｎ−２ラットのうち、８匹を、７ないし１３週齢から、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日のカンデサルタン、アンジオテンシンＩＩ受容体Ｉ型ブロッカー（ＡＲＤ）で処理した。８匹の未処理Ｒｅｎ−２ラット内では、ＨＦの発生に際して４匹を１３週において犠牲にした。残りの４匹のＲｅｎ−２ラットをモニターし、１７週において犠牲にし、その時、臨床的不全の兆候は出現しなかった。血流力学を１０週において、および犠牲にする前に取った。心臓、肺および体重を犠牲にした後に測定した。動物のケアおよび治療の手法は、動物愛護協会によって認められたものであった。
【００５０】
１０週齢Ｒｅｎ−２ラットからの心筋バイオプシー
１２匹のＲｅｎ−２および４匹のＳＤラットの第２の群を麻酔し、平滑な２０−ゲージ針を気管に入れて、気管カニューレとして供し、これを２．５ないし３ｍｌの周期体積容量および８０呼吸／分の呼吸速度にて部屋内の空気中の周期体積齧歯類呼吸器(model 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA)に連結した。ミクロ−切開顕微鏡の視覚的助けを借りて、左第４肋間空間において５ｍｎの切開を行って、胸部にアクセスした。特注の０．３５ｍｎ針を用いてバイオプシーを採取した。
【００５１】
ｃＤＮＡマイクロアレイ
正規化されたラットｃＤＮＡライブラリー（合計１２，３３６遺伝子）から単離されたｃＤＮＡクローンを、マイクロアレイ(Incyte Genomics, CA, USA, ラット GEM-2/3)での分析ように選択した。各ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅インサートをガラス表面上の高密度アレイとして印刷した。２匹のＳＤおよび６匹のＲｅｎ−２ラット心筋ｍＲＮＡを含む３つのガラスチップにて３つの異なる時点で２連ハイブリダイゼーションを行った。ＨＦ−Ｓ群における少なくとも２倍の過剰発現を伴う発現の統計学的に有意な（Ｐ＜０．００１）変化を示した標的遺伝子を、該遺伝子が独立して４回評価して、信頼性のレベルを改善するように、さらなる分析用のサブ−アレイに再度印刷した。データのマイニング(Tan FL et al., Proc Natl Acad Sci., 99: 11387-11392, 2002)および確証のためのプロトコルを、従前に詳細に記載されているように採用した(Bandman O et al., Ann NY Acad Sci. 975: 77-90, 2002)。
【００５２】
プライマーおよびプローブ
ガレクチン−３に対して特異的なプライマー（順方向、5'-CCCGACTGGACCACTGACA-3',逆方向、5'-CAGCATGCGAGGCATGACT-3'およびプローブ、5'-TGCCCTACGATATGCCCTTGCCTG-3')をPrimer Express Software (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いるGenBankTMで入手可能な配列から設計した。
【００５３】
ＲＮＡ単離およびリアルタイムＰＣＲ
RNeasy Mini Protocol (QIAGEN, Hilden, Germany)に従ったＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ Ｋｉｔで、ＲＮＡをラット左心室から単離し、−８０℃で貯蔵した。製造業者の指示に従って、PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus, CA, USA)でラット心臓パイオプシーからＲＮＡを単離した。最適なＰＣＲ条件は、２５μｌの合計容量中の、最終濃度５Ｍ  ＭｇＣｌ２を含むＴａｑｍａｎＴＭアッセイ用の１２．５μｍ  ２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、３００ｎＭの各プライマー２３０ｎＭのプローブおよび10 ｎｇ  ｃＤＮＡ鋳型であることが判明した。
【００５４】
マクロアッセイのための配列決定、膜スポッティングおよびｃＤＮＡハイブリダイゼーション
マイクロアレイによって同定された異なって発現された遺伝子のクローンはＩｎｃｙｔｅ  genomicsから入手され、5'-GGTGACACTATAGAAGAGC-3'プライマー (Eurogentec, Seraing, Belgium)で配列決定した。同一性を確認した後、プラスミドインサートは5'-ACCATGATTACGCCAAGCTC-3'および3'-ACGACGGCCAGTGAATTGAA-5'プライマーでのＰＣＲ反応によって増幅した。次いで、各クローンをナイロン膜（マイクロアレイ）に二連でスポットした。ドットブロットをパーソナルｆｘ−ｐｈｐｓｐｈｏイメージャー(Cyclone System Packard, Meriden, CO, USA)でスキャンした。
【００５５】
蛋白質の単離およびウエスタンブロッティング
蛋白質の単離およびウエスタンブロッティングは、従前に記載されているように行った、一次抗体（ガレクチン−３）生物試薬；ＥＤ−１およびＯＸ−６，Dr. M. de Winther, Department of Molecular Genetics, University of Maastricht, The Netherlands)からの親切な贈り物）をＴＷＥＥＮ−２０を含むトリス−緩衝生理食塩水で１／１０００希釈した(TBS-T)。二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲーテッドＩｇＧ，Cell Signaling Technology）をＴＢＳ−Ｔに１／２０００希釈した。製造業者の指示に従って増強されたケミルミネセンス(ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, USA)によって蛋白質バンドを可視化した。
【００５６】
免疫組織化学、ガレクチン細胞化学および共焦点顕微鏡
ガレクチン−３および接近可能な結合部位の発現は、従前に記載されているように特異的抗−ガレクチン−３モノクローナル抗体およびビオチニル化ガレクチン−３によって可視化された(Gabius et al., Anal Biochem.: 189: 91-94, 1990)。他の文献に詳細に記載されているように、(Andre et al., Chembiochem. 2: 822-830, 2001)、ガレクチン−３を活性−維持条件下でビオチニル化した。共焦点レーザー走査型顕微鏡において、ガレクチン結合部位がＦＩＴＣ−標識アビジンによって検出された。テキサスレッド標識二次抗体を用いて、増殖する核抗原（ＰＣＮＡ）を免疫細胞化学的に可視化した。該手法についてのさらなる詳細は他の文献で入手できる(Broers et al., J Cell Sci.: 112 (Pt 20): 3463-3475, 1999)。
【００５７】
心臓線維芽細胞増殖およびプロリン取り込みアッセイ
ラット心臓線維芽細胞は従前に記載されているように２日齢新生Sprague-Dawleyから単離した(Pokharel et al., Hypertension, 40: 155-161, 2002)。１％Ｌ−グルタメート、５０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｇ／ｍＬストレプトマイシンと共に１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補足したイーグル培地（ＤＭＥＭ）のダルベッコウ修飾培地中で細胞を培養し、湿潤化５％ＣＯ２雰囲気中にて３７℃でインキュベートした。接種から２４時間後に０．５％ＦＢＳを含有する培地との２４時間のインキュベーションによって細胞を休止させた。次いで、細胞をネズミ組換えガレクチン−３（対照，１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。分裂する細胞の数を放射線標識メチル−［３Ｈ］チミジン取り込み（ウエル当たり０．５μＣｉ）沸性によって測定した。放射能は、ＬＫＤ−Ｗａｌｌａｃｅベータカウンタ(FSA Laboratory Supplies, Loughborough, UK)を用いて線維芽細胞およびシンチレーション液体中で測定した。分泌したコラーゲンを、［３Ｈ］プロリン取り込みアッセイを用いて測定した。簡単に述べれば、心臓線維芽細胞を９０ないし１００％密集にて６−ウエルプレート中に接種した。インキュベーションの最後の２４時間の間に１５Ｃｉ／ｍｌ  Ｌ−［３Ｈ］プロリンを加えた。条件培地から取り込まれた［３Ｈ］プロリンを１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させ、シンチレーションカウンタでカウントした。
【００５８】
統計学的解析
データは平均±ＳＥＭとして表す。各実験についてのデータをDunnettのポスト−ｈｏｃ分析と組み合わせて、ワン−ウェイ偏差分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較して、内部対照コホルトとしてＳＤラットを用いて複数の比較につき修正した。統計学的パッケージＳＰＳＳ１０．０（Chicago， IL, USA）を用いて解析を行った。Ｐ−値＜０．０５は統計学的に有意であると考えられている。
【００５９】
結果
ＨＦ−Ｓラットにおける損なわれた心機能および心臓線維症
８匹のプラセボ処理ラットにおける肥大した左および右心室を観察した。対照的に、カンデサルタン処理ラットおよび非−トランスジェニック対照においてＬＶの増加はなかった。処理無しの８匹のラットのうち、４匹は１２ないし１４週齢の間に明白な臨床的ＨＦを発症し、これには機能低下した心臓機能の支障が伴った。残りの４匹のラットは１７週間の実験期間の間に代償されたままであった。胸膜滲出を持つ明白なＨＦ（肺重量／体重％ ＨＦ−Ｓ，  １０．６１±０．７  ｖｓＨＦ−Ｒ，  ４．９７±０．２，  Ｐ  ＜０．００１）および上昇した左心室終末／弛緩期圧力（ＬＶＥＤＴ）は、ＨＦラットにおいて明らかである。これはＨＦ−Ｒおよび／またはＡＲＢ処理ラットには存在しなかった（図６ａ、ｂおよびｃ）。１０週において、全てのプラセボ−処理Ｒｅｎ−２ラットはＬＶＨを有したが、代償不全に対する血流力学的証拠は有しなかった。（ＬＶ重量／体重％：Ｒｅｎ−２，３．８８±０．０８ｖｓ非トランスジェニック対照２．１５±０．２、およびｄＰ／ｄｔｍａｘ：Ｒｅｎ−２，８５５６±２９６ｖｓ非−トランスジェニック対照８７８０±３７３）。コンピューター援助電子トメトリーによって測定された心筋コラーゲン含有量は、ＨＦ−Ｒラットと比較してＨＦ−Ｓラットにおけるより高度な心臓線維症を明らかにした。ＡＲＢは、それが正常血圧バックラウンド株のそれと匹敵したままであるように、ＬＶＨおよび心筋コラーゲン含有量を正規化した（図７）。
【００６０】
マイクロアレイはＨＦ罹患性ラットにおける免疫−関連遺伝子の豊富さを明らかにする。
まず、我々はＨＦ−ＳおよびＨＦ−Ｒ群の間の遺伝子発現の生物学的変動を調べた。双方の群からの試料の対の間のほとんどの遺伝子の発現レベルは高度に相関した。我々は、不全および非−不全肥大心臓の間の異なって発現された遺伝に焦点を当てた。
該値のＬｏｇ変換を行い、２倍閾値を超える発現レベルの統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）差のみが異なって発現されたと考えられた。ガレクチン−３は最も顕著に過剰発現された遺伝子として出現し、ＨＦラットにおいて、５倍を超える上昇であった（表３）。興味深いことには、主要組織適合性複合体抗原ＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）および免疫グロブリン受容体遺伝子はこれらの過剰発現された遺伝子内にあった。
【００６１】
マイクロアレイは、アンジオテンシンＩＩ遮断によるＨＦ罹患性遺伝子の正規化を明らかにする。
ＨＦにおいて、異なって発現された遺伝子を確認するために、我々は、まず、配列決定によってクローンの同一性を確認し、その結果、別々の生体試料における反復ハイブリダイゼーションのためにこれらの遺伝子をナイロン膜マイクロアレイ上に再度スポットした。これにより、最初にマイクロアレイによって同定された７つの主な指標遺伝子の過剰発現が得られた。ＨＦのこのアンジオテンシン駆動モデルにおけるレイン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）活性化の役割を確認するために、我々は、Ｒｅｎ−２ラットのサブ群を７週齢から１３週齢までにサブプレッサー用量のカンデサルタンで処理した後に、マイクロアレイによって同定された標的遺伝子の発現を再度評価した。アンジオテンシンＩＩ遮断は、心臓の肥大および不全の活性を完全に妨げた。遺伝子発現のレベルにおいては、それは全てもＨＦ−関連候補遺伝子の過剰発現を妨げた。顕著にはガレクタン−３遺伝子の発現も妨げられた。
【００６２】
ウエスタンブロッティングは不全心筋層において高いガレクチン−３発現を示す。
ガレクチン−３の頑強なトランスクリプトマル増加を仮定し、我々は心筋層におけるその蛋白質レベルに焦点を当てた。ミクロ／マクロアレイで得られた結果と匹敵して、ガレクチン−３発現の最高レベルが、最高程度の心臓線維症を有し、１３週までに心臓代償不全を迅速に発生した動物の同一群で観察された（ＨＦ−Ｓ，９４．６±８．９；ＨＦ−Ｒ，３５±５．６；Ｐ＜０．０１）（図８ａおよびｂ）。
【００６３】
ＣＤ６８陽性、ＭＨＣＩＩ抗原およびガレクチン−３の共−局所化
我々は、免疫組織化学によってラット心筋層におけるガレクチン−３の分布をモニターした。組織学的には、ＨＦ罹患性ラットは線維症のパッチ領域を明らかにした。非−患部領域における組織の人工物がよく保存されていた。対照的に、高線維症のこれらの領域はＡＲＢ処理およびＳＤラットでは観察されず、また、肥大した非−不全ＨＲ−Ｒラットでも観察されなかった。重要なことには、ガレクチン−３陽性領域は、顕著な組織損傷および高レベルの線維症を示した。形態学的には、ガレクチン−３陽性細胞はかなり大きかった。これらの細胞はマクロファージであるという仮定を確認するために、我々は、マクロファージ特異的抗体（ＥＤ−１）で系列的切片を分析した。ガレクチン−３陽性領域はマクロファージ特異的染色と共−局所化された。これらのマクロファージはＭＨＣ−ＩＩ抗原もまた強く発現し、これは、抗原提示におけるこれらの細胞の能動的な役割を示す。これらの特徴はＨＦ−Ｒラットおよび非−トランスジェニック対照においては明らかでなかった。
【００６４】
心臓線維芽細胞におけるガレクチン−３結合部位
マクロファージにおけるガレクチン−３の強い発現を定義し、我々は、ガレクチン−３が心臓線維芽細胞に結合するか否かを決定した。我々は、ビオチニル化ガレクチン−３を用いて心臓線維芽細胞上のガレクチン−３の結合部位を可視化した。０．１％トリトン−浸透において、ガレクチン−３結合部位の存在の結果、散漫な細胞質ならびに周辺染色が休止細胞において生じた（図１０ａ）。対照的に、増殖する線維芽細胞は核の周りに増強された染色を示し、これは、染色プロフィールにおける有糸分裂−関連改変を明らかとする（図１０ｂ）。このパターンは、共焦点顕微鏡によって独立してモニターされた。事実、これらの実験は、ガレクチン−３が過剰発現された状態での反映する細胞周期活性化を喚起する増殖する（すなわち、ＰＣＮＡ陽性）心臓線維芽細胞における核の周りでの接近可能なガレクチン−３リガンドのコンパクトな存在を確認した（図１０ｃ、ｄおよびｅ）。
【００６５】
ガレクチン−３は線維芽細胞の増殖およびコラーゲンの生産を誘導した。
心臓線維芽細胞における接近可能な部位の存在に対する証拠をそのようにして提供し、我々は、ガレクチン−３が心臓線維芽細胞の増殖を刺激するか否かを決定した。組換えガレクチン−３を用い、我々は増殖アッセイを行った。ガレクチン−３は血清を豊富化するまたは豊富化することなく異なる濃度で加えた（０、１０および３０μｇ／ｍｌ）。我々は、２４時間にわたって１０および３０μｇ／ｍｌ外因性ガレクチン−３での心臓線維芽細胞増殖の有意な増加を観察した（３０μｇ／ｍｌにおけるガレクチン−３、１分あたり３４７±１７．５カウント（ｃｐｍ）；１０μｇ／ｍｌにおけるガレクチン−３  ３０９±４．８ｃｐｍ；対照、１４５±４．８；ｐ＜０．０１）。次いで、我々は、放射性プロリン−取り込みアッセイを用いて、外因性ガレクチン−３を添加した心臓線維芽細胞によるコラーゲン生産をモニターした。培地中３０μｇ／ｍｌのガレクチン−３にて、プロリン取り込みはほぼ６６％だけ増加した（３０μｇ／ｍｌにおけるガレクチン−３、１０６６±５６ｃｐｍ；対照、７０７±５２．８ｃｐｍ；ｐ＜０．０５）。より低い濃度のガレクチン−３は有意な効果を生じなかった（１０μｇ／ｍｌにおけるガレクチン−３、９９２±７２ｃｐｍ；ｐ＝０．１３）。
１０週における心筋層バイオプシーは、後に迅速にＨＦまで進行したラットにおいて高いガレクチン−３発現を示した。
【００６６】
ＨＦは血流力学的かつ臨床的に明らかとなる前に（すなわち、１０週齢）心筋層におけるガレクチン−３の発現状態を評価するために、我々は、自然発生拍動ラット心臓において心臓バイオプシーを得るための技術を開発した。バイオプシーの後、ラットを回復させ、それがＨＦに対して回復性であるか、またはむしろ罹患性であるかを決定した。リアルタイムＴＣＲによって測定して、ガレクチン−３遺伝子の心筋発現は後にＨＦまで進行したラットにおいてのみ増加し（任意単位、５．８±０．１７）、他方、引き続いて代償されたラットにおいては比較的低いレベルで発現され（３．４±０．２）、および非−トランスジェニック対照ラット心臓においてもそうであった（２．５±０．０３３）（図１２）。
【００６７】
考察
本実験は、肥大した心室において特異的に補充されたメカニズムが不全に至ることを突き止めることを目的としたものであった。我々は、ガレクチン−３、マクロファージ発現蛋白質が、不全−傾向がある肥大した心臓で初期においてかつ特異的に発現されることを証明した。さらに、我々は、ガレクチン−３が心臓線維芽細胞において細胞内結合部位に結合し、心臓線維芽細胞の増殖およびコラーゲンの生産を活性化することを確立し、これは、これが心筋の強さおよびおそらくはＨＦへの進行に寄与し得ることを示唆する。
以前の実験は、ＨＦにおけるマクロファージおよび炎症応答に対する役割を提唱した。しかしながら、これらの実験は、マクロファージの活性化がＨＦに先行するか、または単にそれに伴うものであるかという答えられていない疑問を残した。さらに、マクロファージを心臓線維症に結びつける特異的なメカニズムに対する説明は未だなされていない。
腹膜マクロファージの表面上の抗原として最初に同定され、ガレクチン−３はガレクチンファミリーの唯一のキメラ−タイプのメンバーである。それは、β−ガラクトシドならびに蛋白質に対するカルシウム−依存性特異性を有するレクチン基を有し、マクロファージの食作用カップおよびファゴソームに位置する。その抗−アポトーシスおよび成長促進作用以外に、ガレクチン−３は単球化学走性、ケモキネシスを調節し、サイトカインの利用性を変調する。さらに、最近の研究は、ガレクチン−３が、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）によって架橋された場合に、マクロファージによるファゴサイトーシスにおいて非常に重要な役割を演じることも検証している。
【００６８】
興味深いことに、我々は、我々のＨＦモデルにおいてＦｃγＲの過剰発現も観察した（表３）。
１０週齢ラットから得られたバイオプシーが、迅速な不全に移行したラットにおいてのみ増大したガレクチン−３発現を示した。ガレクチン−３のプロ−炎症および線維芽細胞増殖促進作用を仮定すれば、この段階における増大した発現は不全に誘導する環境に寄与し得る。我々の知見によれば、マクロファージ（すなわち、クッパー細胞）の肝臓−アナログによって発現されたガレクチン−３は、肝臓における過剰なフィブリル−形成コラーゲンの合成を誘導することに関連付けられている。これは、ガレクチン−３がマクロファージ関連プロ−線維症メディエーターであり、マクロファージ浸潤によって特徴付けられる条件における心臓再形成に影響する能力を持つなおもう１つの炎症浸潤サイトカインであることを示唆する。どのようにしてガレクチン−３がＨＦに向けての進行に加わるかについての別の仮定は、コラーゲン架橋および心筋層の固さにおいて非常に重要な役割を有する進歩したグリコシル化最終産物（ＲＡＧＥ−３）に対する第３の受容体としてのガレクチン−３の発見から現れるものである。
【００６９】
我々は、また、ガレクチン−３が細胞内受容体に結合し、心臓線維芽細胞の増殖を誘導し、コラーゲンの生産を強めることを記載する。炭水化物結合性蛋白質として元来は発見されたが、ガレクチン−３がグリココンジュゲート以外に細胞内標的と特異的に相互作用することが知られている。以前の研究は、Ｍａｃ−２結合蛋白質、およびラミニンを含めたガレクチン−３結合部位としていくつかの分子を提案している。しかしながら、何が増殖する細胞におけるガレクチン−３結合エレメントの迅速な核周囲の移動を誘導するかは依然として知られていない。それが分裂する核からのガレクチン−３結合部位の輸出である（遠心移動）か、あるいはそれがこれらの受容体の核転移に対する細胞質に向けられているか（求心移動）はさらに探求する必要がある。
現在の研究は、ＨＦに対する左心室肥大からの進行において免疫系活性化およびガレクチン−３の生産に対して鍵となる役割を示唆しており、およびプロ−免疫およびプロ−線維症因子の間のリンクを証明する。Ｆに先行するガレクチン−３の増大した発現は、肥大した不全心室におけるマクロファージの初期の異常な活性化を反映し得る。ガレクチン−３は、今度は、活性化されたマクロファージから心臓線維芽細胞へのシグナルをリレーすることができる。ガレクチン−３の末梢検出は、ＨＦのプレディクター、およびガレクチン−３の作用の治療的阻害として働くことができ、過剰な心臓線維症に逆作用する新規な治療的標的となることができる。
【００７０】
実施例３
ヒト血清におけるガレクチン−３の評価
ガレクチン−３のレベルを、心血管病を持つ患者の血清で測定した。ＥＬＩＳＡによってガレクチン−３を測定するための商業的に入手可能なキットを使用した。結果を表４ないし６にまとめる。ガレクチン−３は心不全、ＬＶＨのような心血管病を持つ患者の血清で有意に上昇した。さらに、健康なコントロール対象におけるガレクチン−３レベルに対する上限が見出されており、これはほとんどのＣＨＦ患者において顕著である。
本発明によると、ヒト対象の血清中のガレクチン−３の測定は、信頼性よく、非−病気の対象から病気を区別し、従って、既知の筋肉細胞マーカー（ＢＮＰ）と組み合わせて、非筋肉細胞病プロセスについてのさらなる情報を最初に提供した。
データテーブル：
ＬＶＨ＝高血圧症、肥大
ＣＨＦ＝心不全
Ｉｎｆｌ＝炎症性血管病
Ｐｏｓｃｏｎ＝病気の混合した群
Ｉｎｆａｒｃｔ＝梗塞患者
Ｈｅａｌｔｈｙ＝健康なコントロール
【００７１】
【表１】
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【００７２】
プローブは５’および３’の位置を、各々、６−カルボキシフルオレセインレポーターおよび６−カルボキシテトラメチルローダミンクエンチャーで標識した。プライマーおよびプローブの位置はＧｅｎｂａｎｋからの配列に従って注記した。（かっこに受託番号を入れる）。Ｆｗｄ、順方向；Ｒｅｖ、逆方向。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
【表３】
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【００７５】
プローブは５’および３’の位置を、各々、６−カルボキシフルオレセインレポーターおよび６−カルボキシテトラメチルローダミンクエンチャーで標識した。プライマーおよびプローブの位置はＧｅｎｂａｎｋからの配列に従って注記した。（かっこに受託番号を入れる）。Ｆｗｄ、順方向；Ｒｅｖ、逆方向。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
【表５】
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【００７８】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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