(57)【要約】      （修正有）【課題】インフルエンザウイルスの感染を診断および処置するために使用することができる組成物の提供。【解決手段】細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸アプタマー分子。特定のアミノ酸配列によって規定される血球凝集素の領域と結合する単離された核酸アプタマー分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸アプタマー分子であって、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸位置９１〜２６１によって規定される血球凝集素の領域と結合する単離された核酸アプタマー分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される請求項１に記載の単離された核酸アプタマー分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチド配列は一本鎖である請求項１に記載の単離された核酸アプタマー分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド配列はＤＮＡである請求項１に記載の単離された核酸アプタマー分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである請求項１に記載の単離された核酸アプタマー分子。
【請求項６】
検出可能な標識をさらに含む請求項１に記載の単離された核酸アプタマー分子。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド配列は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む請求項１に記載の単離された核酸アプタマー分子。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド配列は１０ヌクレオチド〜３５ヌクレオチドの間の長さを有するポリヌクレオチド配列から選択される請求項１に記載の単離された核酸アプタマー分子。
【請求項９】
請求項１に記載の単離された核酸アプタマー分子を作製する方法であって、以下のステップを含む方法：
（ａ）複数の核酸分子を、請求項１に記載の血球凝集素と接触させること；
（ｂ）前記血球凝集素と特異的に結合することができる少なくとも１つの核酸分子を前記複数の核酸分子から同定すること；および
（ｃ）前記血球凝集素と結合することができる少なくとも１つの核酸分子を単離し、それにより、インフルエンザウイルス感染を阻害することができる単離された核酸アプタマー分子を作製すること。
【請求項１０】
前記複数の核酸分子は一本鎖である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の核酸分子はＤＮＡ分子である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の核酸分子はＲＮＡ分子である請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の核酸分子の各々は検出可能な標識をさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の核酸分子の各々は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の核酸分子は１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの間の長さを有するポリヌクレオチド配列から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の核酸分子は１０ヌクレオチド〜３５ヌクレオチドの間の長さを有するポリヌクレオチド配列から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）に先だって、コンビナトリアル合成法を使用して前記複数の核酸分子を作製することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）の前、またはステップ（ｃ）の後で、前記複数の核酸分子を修飾することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）〜ステップ（ｃ）を繰り返すことをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された核酸アプタマー分子と、生理学的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項２１】
前記単離された核酸アプタマー分子はそこに結合された抗ウイルス剤を含む請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
包装材と、前記包装材に含有される、インフルエンザ感染を処置または防止するために特定された請求項２０または２１に記載の医薬組成物とを含む製造物。
【請求項２３】
インフルエンザウイルス感染を処置または防止するための医薬の製造のための請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された核酸アプタマー分子の使用。
【請求項２４】
生物学的サンプルにおけるインフルエンザウイルスを同定する方法であって、以下のステップを含む方法：
（ａ）生物学的サンプルを、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された核酸アプタマー分子と接触させること；および
（ｂ）生物学的サンプル中の前記インフルエンザウイルスポリペプチドに結合した前記単離された核酸アプタマー分子を検出し、それにより、インフルエンザ感染を同定すること。
【請求項２５】
インフルエンザ感染を処置するために特定された医薬の製造のための、抗ウイルス剤にコンジュゲート化された請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された核酸アプタマー分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊椎動物（例えば、鳥類、ブタおよびヒトなど）におけるインフルエンザウイルス感染を処置および検出するために利用することができる核酸分子、ポリペプチド、抗体、およびそれらを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは現在まで、記録された歴史を通して人類における主要な死因および疾病原因の１つである。インフルエンザの流行が一定の間隔で発生しており、さらにインフルエンザの流行は重篤度が大きく異なっている。しかし、最も高頻度には高齢者においてではあるが、著しい死亡数および罹患者を常に生じさせている。インフルエンザの感染は、頭痛、咳、発熱および全身的倦怠感を含む一群の急性症状をもたらす。以前から存在する肺疾患または心臓血管疾患を伴う重症例または重篤な状況では、入院が必要となる。直接的なウイルス感染による肺炎、または二次的な細菌侵入もしくはウイルス侵入による肺炎は、最も頻発する合併症である。インフルエンザウイルス感染の臨床的局面についての総説については、Ｄｏｕｇｌａｓ（１９９０）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３２２：４４３〜４５０を参照のこと。
【０００３】
インフルエンザウイルスは現在、内部の抗原性タンパク質の違いに基づいて、Ａ型、Ｂ型およびＣ型の３つのタイプに分けられる：Ａ型およびＢ型は近い関係にあり、ほとんどの感染を占める一方で、Ｃ型インフルエンザウイルスは、疾患を引き起こす潜在的可能性においては関連性の低い第３のウイルスであり、おそらくは公衆衛生ではほとんど問題とならない。全体的な遺伝子相同性はＡ型およびＢ型の間で３０％未満であるが、これらのウイルスは共通の祖先を有し、マイナス鎖センス極性の８個のＲＮＡを含む。血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）が、脂質を含有するウイルス粒子の表面に発現し、インフルエンザウイルスにおいて観測される抗原性変化に主に関わっている。
【０００４】
抗原ドリフトにより生じるインフルエンザの新しい株が、一定の頻度で、通常的には毎年現れ、感染サイクルを開始し、世界中に広がる。個々の発生がどのように開始されるかについてはほとんど知られていない。多くの新しいサブタイプのインフルエンザがあまり大きくない頻度で現れるが、大流行をもたらし得る。
【０００５】
人口の２０％までがインフルエンザ感染をある年には発症することがあり、また、インフルエンザの流行は、合衆国では毎年、２００００名の死者の原因となっていることが理解される［Ｐａｌｅｓｅ（２００２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１０：９〜１３］。過去１００年の間におけるインフルエンザのこれまでにない最悪の影響が１９１８年の大発生であった。これにより、合衆国では５０００００人以上が犠牲になり、平均寿命がほぼ１０年低下した［Ｈｅｉｌｍａｎ（１９９０）、Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、３７：６６９〜６８８］。
【０００６】
個人および社会に対するインフルエンザの影響を考えた場合、現在の課題は、感染の危険性が相当に高い対象（例えば、若年小児および高齢者など）におけるインフルエンザ感染を防止するために使用することができる非常に強力な予防ツールを作製することである。
【０００７】
いくつかの取り組みが、新規な抗インフルエンザ剤を発見するために着手されている。
【０００８】
不活性化インフルエンザウイルスワクチン−重篤な合併症の危険性がある集団についてインフルエンザウイルスに対処するための最も効果的な方法は予防によるものである。効果的であるために、現行のワクチンは、Ａ型ウイルス成分、Ｂ型ウイルス成分、および好ましくはＣ型ウイルス成分を含有しなければならない。ワクチンを調製するために、それらのウイルス株が孵化卵において成長させられ、その後、ウイルスが精製され、化学的不活性化によって非感染性にされる。利用可能なインフルエンザワクチンの使用は、集団における死亡数を低下させるための効果的な方法である。しかしながら、ウイルスの常に変化し続ける性質のために、現在広まっているウイルス株から保護するための適切な組成を有するワクチンの開発は複雑であり、費用がかかる。そのうえ、ワクチンを受ける際の患者の協力は一般に非常に低い。従って、インフルエンザウイルスからの重篤な合併症の危険性がある非常に多数の患者が保護されないでいる。
【０００９】
低温適合化インフルエンザウイルスワクチン−温度感受性インフルエンザウイルスを生ワクチンとして作製することが、動物および哺乳動物における病原性が著しく弱められるので試みられている［Ｗａｒｅｉｎｇ（２００１）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：３３２０〜３３３０；Ｍａａｓａｂ（１９９０）、Ａｄｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、１４：２０３〜２４２］。典型的には、低温適合化ウイルスを作製するために、インフルエンザウイルスは、その成長を２５℃で適合させるために、ニワトリ腎臓細胞および孵化卵において継代培養される。従って、毎年適合したワクチン配合物を、現在の株に見出される抗原を反映する主要なウイルス表面抗原（すなわち、ＨＡおよびＮＡ）をコードする２つの遺伝子を含むために遺伝子操作することができ、これに対して、残る６個の遺伝子は低温適合化親株に由来する。そのような生ウイルスワクチンは、化学的に不活性化されたウイルス調製物によって誘発されるよりも長く持続する交差反応的免疫性に関連し得る局所的な中和免疫性および細胞媒介の免疫応答を誘導することができる。しかしながら、生ワクチンの使用では、毒性の復帰変異体の拡大から生じるかもしれない予期されない合併症に対する広範囲のモニターリングが要求され、このことは、本質的には、合衆国ではそのような治療のための免許交付がないことを明らかにしている。
【００１０】
遺伝子操作された生インフルエンザウイルスワクチン−ＲＮＡウイルスのゲノムにおける部位特異的な変化を操作するための様々な技術の出現は、新しいワクチン法を開発することを可能にした［Ｅｎａｍｉ（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：３８０２〜３８０５；Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：２３０〜２３５］。従って、１回だけの複製サイクルを受けるウイルス粒子の作製がＷａｔａｎｂｅおよび共同研究者［（２００２）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７６：７６７〜７７３］によって明らかにされている。ＮＥＰ発現遺伝子（ＮＳ２）を有しないウイルス粒子の調製物による細胞の感染はウイルスタンパク質の産生をもたらすが、感染性粒子の形成を生じさせない。従って、このような調製物は、感染性ウイルスの複製を可能にすることなく、保護的な抗体応答を誘導し、かつ強力な細胞媒介の免疫応答を刺激する。ウイルス弱毒化のための別の方法は、Ｍ２遺伝子が除去されている複製欠陥株の作製である。そのような欠失変異体は組織培養で効率的に成長するが、マウスにおいて不良に成長するだけであり、従って、潜在的な生ウイルスワクチン候補となる［Ｗａｔａｎｂｅ（２００１）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５：５６５６〜５６６２］。しかしながら、高頻度ではあるが、そのような操作されたウイルスの感染力価は低すぎて、臨床的状況では有用になり得ない。
【００１１】
ＤＮＡワクチン接種−この方法では、１つまたは複数のインフルエンザタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの局所的な投与または注射による投与が伴う。しかしながら、今日まで、インフルエンザに対するＤＮＡワクチン接種に関する報告は動物モデルにおける研究に限られており、治療効力はヒト対象では明らかにされていない［Ｄｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、１：５８３〜５８７；Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ（２０００）、２６８：２４４〜２５−；Ｋｏｄｉｈａｌｌｉ（２０００）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８：２５９２〜２５９９］。
【００１２】
抗ウイルス剤−４つの抗ウイルス剤が現在、合衆国では承認されている：アマンタジンおよびリマンチジンは、ウイルスの脱外被に関与するイオンチャネルＭ２タンパク質の化学的に関連する阻害剤であり［Ｈａｙ（１９８５）、ＥＭＢＯ  Ｊ、４：３０２１〜３０２４］、ザナミビルおよびオセルタミビルはＮＡ阻害剤であり［Ｐａｌｅｓｅ（１９７６）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３３：１５９〜６３］、細胞質膜からのインフルエンザウイルス粒子の正確な放出を妨げる。これらの抗ウイルス薬は、インフルエンザに対する何らかの医学的介入のための重要な補助であり、ウイルスに対する予防において使用することができる（未だ承認されてないザナミビルを除く）。さらに、これらの薬剤は、ワクチンが開発されていない新しい大発生株が出現した場合には非常に貴重であり得る。
【００１３】
全体的な利点にもかかわらず、現在利用可能な抗ウイルス剤の広範囲に及ぶ使用は、副作用、患者の協力、および薬剤耐性変化体の起こり得る出現に関する問題によって制限されている。
【００１４】
アンチセンス−アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するインフルエンザウイルスの阻害への試みが報告されている。Ｌｅｉｔｅｒおよび共同研究者はホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオアートオリゴヌクレオチドをＡ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスに対して標的化している。Ｌｅｉｔｅｒ，Ｊ．、Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．、Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．＆Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：３４３０〜３４３４（１９９０）。この研究において、ポリメラーゼＰＢ１の遺伝子およびｍＲＮＡがｖＲＮＡの３’領域およびｍＲＮＡの５’領域においてそれぞれ標的化された。Ａ型インフルエンザの配列特異的な阻害は観測されなかったが、Ｃ型インフルエンザのある程度の特異的な阻害が認められた。他のインフルエンザウイルスセグメントまたはｍＲＮＡは標的化されなかった。
【００１５】
従って、上記の制限を有しない、インフルエンザウイルスの感染を診断および処置するために使用することができる組成物が必要であることが広く認識されており、そのような組成物を有することは非常に好都合である。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の１つの局面によれば、細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００１７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される。
【００１８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリペプチドはインフルエンザウイルスのポリペプチドである。
【００１９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸位置９１〜２６１によって規定される血球凝集素の領域と結合することができる。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリペプチドは宿主細胞のポリペプチドである。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、宿主細胞のポリペプチドはシアル酸受容体である。
【００２２】
本発明の別の局面によれば、インフルエンザウイルス感染を阻害することができる分子を作製する方法が提供され、この方法は、（ａ）複数の核酸分子を、細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと接触させること；（ｂ）前記ポリペプチドと特異的に結合することができる少なくとも１つの核酸分子を前記複数の核酸分子から同定すること；および（ｃ）前記ポリペプチドと特異的に結合することができる少なくとも１つの核酸分子を単離し、それにより、インフルエンザウイルス感染を阻害することができる分子を作製することを含む。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この方法はさらに、（ａ）に先だって、コンビナトリアル合成法を使用して複数の核酸分子を作製することを含む。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この方法はさらに、（ａ）の前、または（ｃ）の後で、複数の核酸分子を修飾することを含む。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この方法はさらに、ステップ（ａ）〜ステップ（ｃ）を繰り返すことを含む。
【００２６】
本発明のなお別の局面によれば、細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子と、生理学的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００２７】
本発明のさらに別の局面によれば、包装材と、前記包装材に含有される、インフルエンザ感染を処置または防止するために特定された医薬組成物とを含む製造物が提供され、この場合、医薬組成物は、細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を有効成分として含む。
【００２８】
本発明のさらなる局面によれば、インフルエンザウイルス感染を処置または防止する方法が提供され、この方法は、その必要性のある対象に、細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子の治療効果的な量を与え、それにより、インフルエンザウイルス感染を処置または防止することを含む。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、与えることは、（ｉ）前記核酸分子の投与；および／または（ｉｉ）前記核酸分子を発現するポリヌクレオチドを投与することによって行われる。
【００３０】
本発明のなおさらなる局面によれば、生物学的サンプルにおけるインフルエンザウイルスを同定する方法が提供され、この方法は、（ａ）生物学的サンプルを、インフルエンザウイルスのポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子と接触させること；および（ｂ）生物学的サンプル中のインフルエンザウイルスポリペプチドに結合した前記核酸分子を検出し、それにより、インフルエンザ感染を同定することを含む。
【００３１】
本発明のさらにさらなる局面によれば、抗ウイルス剤をインフルエンザウイルス感染組織に標的化する方法が提供され、この方法は、その必要性のある対象に、インフルエンザウイルスのポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子にコンジュゲート化された抗ウイルス剤の治療効果的な量を投与し、それにより、抗ウイルス剤をインフルエンザ感染組織に標的化することを含む。
【００３２】
本発明のさらなる局面によれば、細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子にコンジュゲート化された抗ウイルス剤を含む組成物が提供される。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリペプチドはインフルエンザウイルスのポリペプチドである。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリペプチドは、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、ＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質、Ｍ１マトリックスタンパク質、Ｍ２マトリックスタンパク質およびＮＳタンパク質からなる群から選択される。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸位置９１〜２６１によって規定される血球凝集素の領域と結合することができる。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリペプチドは宿主細胞のポリペプチドである。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、宿主細胞のポリペプチドはシアル酸受容体である。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチド配列は一本鎖である。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチド配列はＤＮＡである。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、核酸分子はさらに、検出可能な標識を含む。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチド配列は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、１０ヌクレオチド〜３５ヌクレオチドの間の長さを有するポリヌクレオチド配列が選択される。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、医薬組成物はさらに薬剤を含む。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、薬剤は、免疫調節剤、抗生物質、抗ウイルス剤、アンチセンス分子およびリボザイムからなる群から選択される。
【００４６】
本発明のなおさらなる局面によれば、インフルエンザウイルスに対するワクチン接種のために有用なポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性であるアミノ酸配列を含む（ただし、このポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない）。
【００４７】
本発明のさらにさらなる局面によれば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ただし、このポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない）と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。
【００４８】
本発明のさらにさらなる局面によれば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ただし、このポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない）を特異的に認識する抗原結合部位を含む抗体または抗体フラグメントが提供される。
【００４９】
本発明のさらにさらなる局面によれば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ただし、このポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない）をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００５０】
本発明のさらにさらなる局面によれば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ただし、このポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない）をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【００５１】
本発明のさらにさらなる局面によれば、前記核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。
【００５２】
本発明のさらにさらなる局面によれば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ただし、このポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない）をコードするポリヌクレオチドと、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。
【００５３】
本発明のさらにさらなる局面によれば、インフルエンザウイルス感染を処置または防止する方法が提供され、この方法は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ただし、このポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない）の治療効果的な量を、その必要性のある対象に与えることを含む。
【００５４】
本発明のさらにさらなる局面によれば、インフルエンザウイルス感染を処置または防止する方法が提供され、この方法は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ただし、このポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない）を特異的に認識する抗原結合部位を含む抗体または抗体フラグメントの治療効果的な量を、その必要性のある対象に与えることを含む。
【００５５】
本発明のさらにさらなる局面によれば、生物学的サンプルにおけるインフルエンザウイルスを同定する方法が提供され、この方法は、（ａ）生物学的サンプルを、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ただし、このポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない）を特異的に認識する抗原結合部位を含む抗体または抗体フラグメントと接触させること；および（ｂ）生物学的サンプルにおける前記抗体または抗体フラグメントを含む免疫複合体を検出し、それにより、生物学的サンプルにおけるインフルエンザウイルスを同定することを含む。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリペプチドは配列番号１３〜配列番号１５に示される通りである。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号１３〜配列番号１５に示される通りである。
【００５８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸位置９１〜２６１によって規定される。
【００５９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸位置１１６〜２６１によって規定される。
【００６０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸位置１１６〜２４５によって規定される。
【００６１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、抗体または抗体フラグメントはさらに標識を含む。
【００６２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、免疫複合体を検出することは、（ｂ）の後で標識の強度を定量することによって行われる。
【００６３】
本発明のさらにさらなる局面によれば、配列番号１１または配列番号１２に示されるような核酸分子が提供される。
【００６４】
本発明は、インフルエンザウイルス感染を診断および処置するために使用することができる核酸分子、ポリペプチド、それに対して作製された抗体、およびそれらを含有する組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００６５】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
本発明は、例としてだけであるが、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている細目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけのものであり、従って、本発明の原理および概念的局面の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
【図１ａ】図１ａは、本発明の核酸分子に取り込むことができる核酸の修飾を表す、Ｅａｔｏｎ（１９９７）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１：１０〜１６から改変された概略図であり、５位が修飾された２’−デオキシウリジンおよびウリジンを示す。
【図１ｂ】図１ｂは、本発明の核酸分子に取り込むことができる核酸の修飾を表す、Ｅａｔｏｎ（１９９７）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１：１０〜１６から改変された概略図であり、８位が修飾された２’−デオキシアデニン、アデニンおよびグアノシンを示す。
【図１ｃ】図１ｃは、本発明の核酸分子に取り込むことができる核酸の修飾を表す、Ｅａｔｏｎ（１９９７）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１：１０〜１６から改変された概略図であり、２’−修飾ウリジンを示す。
【図２】図２ａ〜図２ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定されたときの、本発明の教示に従って作製されたインフルエンザ特異的アプタマー（Ａ２１およびＡ２２）およびコントロールの一本鎖アプタマーの完全なインフルエンザウイルスまたはＨＡ９１〜２６１ペプチドに対する結合レベルを表すヒストグラムである。コントロール核酸と比較した場合、ウイルスペプチドに対するＡ２１およびＡ２２の著しい結合（それぞれ、ｐ＝０．０４２およびｐ＝０．０００８）、ならびに、Ａ２２アプタマーと比較した場合、完全なウイルスに対するＡ２１の結合の著しい低下（ｐ＝０．０１７）に留意すること。図２ｃ〜図２ｅは、ＤＮＡｄｒａｗソフトウエア（１８）によって作製されるような、Ａ２２アプタマーの提案される二次構造（図２ｃ）、Ａ２１アプタマーの提案される二次構造（図２ｄ）、および、ＮＰ１４７〜１５８をコードするコントロールオリゴヌクレオチドの提案される二次構造（図２ｅ）の概略図である。
【図３ａ−ｂ】図３ａは、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用して測定されたときの、インフルエンザウイルスで処理されたＭＤＣＫ細胞の生存性に対する本発明のＡ２２アプタマーの効果を示す用量応答曲線である。最も大きな保護効果が、Ａ２２を５０ｐｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌの濃度範囲で使用して達成されたことに留意すること。図３ｂは、Ｈ３Ｎ２感染ＭＤＣＫ細胞およびＨ２Ｎ２感染ＭＤＣＫ細胞に対する本発明の（それぞれ５０ｐｍｏｌでの）Ａ２１アプタマーおよびＡ２２アプタマーの保護効果を表すヒストグラム表示である。
【図３ｃ−ｄ】図３ｃは、ＭＴＴアッセイによって測定されたときの、宿主細胞タンパク質とは無関係なＡ２２の細胞保護効果を図示するヒストグラム表示である。ＭＤＣＫ細胞を、示された時間について５０ｐｍｏｌのＡ２２による処理の後６０分間、インフルエンザウイルスとインキュベーションした。処理群およびコントロール群の間に大きな差がないことに留意すること（３０分についてはｐ＝０．２３７、６０分についてはｐ＝０．０９）。同様に、細胞生存性における大きな差がないことが２つのインキュベーション時間の間において明らかであった（ｐ＞０．０５）。図３ｄは、ＭＴＴアッセイによって測定されたときの、感染ＭＤＣＫ細胞に対するＡ２２の保護効果を図示するヒストグラムである。ＭＤＣＫ細胞を、５０ｐｍｏｌのＡ２２による６０分間の処置の前の３０分間または６０分間、インフルエンザウイルスとインキュベーションした。非感染細胞と比較したとき、６０分のウイルス処置ＭＤＣＫ細胞に対するＡ２２の大きくない効果が明らかであったが、３０分のウイルス処置ＭＤＣＫ細胞に対するＡ２２の著しい保護効果が認められたことに留意すること。
【図４】図４は、インフルエンザによる細胞の感染に対するＡ２２の効果を表す顕微鏡写真である（図４ａ〜図４ｆ）。図４ａ〜図４ｃは、インフルエンザによる感染後のＭＤＣＫ細胞（図４ａ）、Ａ２２による前処理の後のＭＤＣＫ細胞（図４ｂ）、または非感染ＭＤＣＫ細胞の光学顕微鏡画像である。図４ｄ〜図４ｆは、インフルエンザウイルスとの２日間のインキュベーションの後（図４ｄ）、インフルエンザウイルスおよびＡ２２との２日間のインキュベーションの後（図４ｅ）、またはＡ２２単独との２日間のインキュベーションの後（図４ｆ）におけるＭＤＣＫ細胞の免疫蛍光画像である。
【図５】図５は、Ａ２２の存在下または非存在下でのインフルエンザウイルス感染ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺切片を示す顕微鏡写真である（図５ａ〜図５ｆ）。様々な処置群におけるマウスを、インフルエンザウイルスを鼻腔内接種した６日後に屠殺し、その肺の小さい一部を取り出し、組織学的検査のために緩衝化された１０％中性ホルマリンに入れた。染色を、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて行った。図５ａ−非感染マウスから得られた肺切片；図５ｂ−インフルエンザウイルス感染マウスから得られた肺切片；図５ｃ−ウイルス感染の１日前にＡ２２アプタマーで処置された「−１日」群のマウスから得られた肺切片；図５ｄ−ウイルス感染と同時にＡ２２で処置された「０日」群のマウス肺切片；図５ｅ〜図５ｆ−感染後２日目にＡ２２で処置された「＋２日」群の肺から得られた２つの異なる切片である。マウスの肺の約６０％が、図５ｆでは、非感染コントロールの組織学と類似するパターンに対応し、これに対して、肺の４０％が単核細胞の大量の拡大を含有した（図５ｅ）ことが推定される。
【図６ａ】図６ａは、体重によって測定されたときのインフルエンザウイルス感染マウスに対するＡ２２の保護効果を図示するグラフである。マウスに１００ＨＡＵのＡ／Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３を鼻腔内接種によって感染させた。−１日群−ウイルス接種の１日前に２．５ｎｍｏｌのＡ２２で処置されたマウス；＋２日群−ウイルス接種後２日目に２．５ｎｍｏｌのＡ２２で処置されたマウス；０日群−ウイルス接種と同時にＡ２２で処置されたマウス。感染させた非処置マウスの体重が、それぞれの時間間隔について、Ａ２２で処置されたマウスの体重と比較された（図６ａ）。
【図６ｂ】図６ｂは、肺のウイルス負荷量によって測定されたときのインフルエンザウイルス感染マウスに対するＡ２２の保護効果を図示するグラフである。マウスに１００ＨＡＵのＡ／Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３を鼻腔内接種によって感染させた。−１日群−ウイルス接種の１日前に２．５ｎｍｏｌのＡ２２で処置されたマウス；＋２日群−ウイルス接種後２日目に２．５ｎｍｏｌのＡ２２で処置されたマウス；０日群−ウイルス接種と同時にＡ２２で処置されたマウス。Ａ２２の保護能力を、肺のウイルス負荷量を測定することによって調べた（図６ｂ）
【図７】図７ａは、Ａ２２アプタマーを使用したときの、インフルエンザのいくつかの株を（それぞれ１０ＨＡＵで）用いたマウス感染の阻害を表すグラフである。図７ｂは、本発明のＡ２１アプタマーおよびＡ２２アプタマー、ならびにコントロールのオリゴヌクレオチドおよび抗インフルエンザ薬オセルタミビルを使用したときの、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７インフルエンザ株によるマウス感染の阻害を表すグラフである。
【図８ａ−ｄ】図８ａ−ｄは、ＥＬＩＳＡによって測定されたときの、組換えＨＡ９１〜２６１フラグメントに対する抗体と様々なインフルエンザウイルス株との交差反応効果を図示するグラフである（図８ａ〜図８ｄ）。ＩｇＧレベルが免疫化マウス（黒記号）および非免疫化マウス（白記号）の血清サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって測定された。図８ａ−Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒａｓ／１／７３感染マウス；図８ｂ−ＰＲ／８／３４感染マウス；図８ｃ−Ｔｅｘａｓ／１／７７感染マウス；および、図８ｄ−Ｊａｐａｎｅｓｅ／５７感染マウス。
【図８ｅ】図８ｅは、ＥＬＩＳＡによって測定されたときの、組換えＨＡ９１〜２６１フラグメントに対する抗体と様々なインフルエンザウイルス株との交差反応効果を図示するグラフであり、完全なＡ／Ｔｅｘａｓ／１／７７ウイルス（ひし形）、Ａ／Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３ウイルス（三角）、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス（丸）およびＡ／Ｊａｐａｎｅｓｅ／５７ウイルス（十字）によって誘導される株特異的な免疫応答を図示する。
【図９】図９ａは、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによって精製されたＨＡ９１〜１０８ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表す顕微鏡写真である。Ｍ−分子量マーカー；１−１０μｇのＨＡ９１〜１０８ペプチド；２−２０μｇのＨＡ９１〜１０８ペプチド。図９ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたときのＨＡ９１〜１０８ペプチドの抗原性を表すグラフである。ＨＡ９１〜２６１ペプチドをＥＬＩＳＡプレートに被覆し、ＨＡ９１〜１０８ペプチドに対するウサギ抗血清（黒四角）または完全なＡ／Ｔｅｘａｓ／７７インフルエンザウイルスに対するウサギ抗血清（白丸）と反応させた。コントロールの血清なしがアスタリスクによって示される。
【図１０】図１０ａ〜図１０ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたときの本発明のＨＡ９１〜２６１ペプチドの免疫原性を表すグラフ表示である。鼻腔内（三角）または肉趾（ひし形）のいずれかによりＨＡ９１〜２６１ペプチドで免疫化されたマウス、あるいはペプチドに対応するＤＮＡワクチン（黒丸）で免疫化されたマウスからの示された血清希釈物を、ＨＡ９１〜２６１ペプチド（図１０ａ）または完全なウイルス（図１０ｂ）で被覆されたマイクロタイタープレートと接触させ、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＤＮＡプライミング−タンパク質追加抗原刺激によって免疫化されたマウスからの血清が黒四角によって示され、また、非免疫化マウスからの血清がアスタリスクによって示される。コントロールの空ベクターｐＣＤＮＡ３．１で免疫化されたマウスからの血清が白丸で示される。図１０ｃは、抗ＨＡ９１〜２６１ペプチドと多数のインフルエンザウイルス株との交差反応性を表すヒストグラムである。
【図１１】図１１は、肺ホモジネート物のＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたときの、ＨＡ９１〜２６１ペプチド（黒三角）またはＤＮＡワクチン（黒四角）によるマウスの鼻腔内免疫化の後における本発明のＨＡ９１〜２６１ペプチド（図１１ａ）またはＡ／Ｔｅｘａｓ／７７ウイルス（図１１ｂ）との反応性を有するＩｇＡ抗体の産生を図示するグラフである（図１１ａ〜図１１ｂ）。一緒にされたＤＮＡプライミング−タンパク質フラグメント追加抗原刺激が黒四角によって示され、非免疫化コントロールマウスがアスタリスクによって示される。ベクターｐＣＤＮＡ３．１で免疫化コントロールが白四角によって示される。
【図１２】図１２は、ＨＡ９１〜２６１ペプチド（図１２ａ）またはウイルス粒子（図１２ｂ）によるインビトロ刺激に応答したＨＡ９１〜２６１ＤＮＡおよび／またはＨＡ９１〜２６１ペプチドによる免疫刺激マウスから得られた脾臓細胞の増殖を表すヒストグラムである。増殖がチミジン取り込みによってモニターされ、培地コントロールと比較して刺激指数として表された。
【図１３】図１３は、インフルエンザウイルス刺激に応答した脾臓細胞によるサイトカイン分泌を表すヒストグラムである（図１３ａ〜図１３ｂ）。マウスを３週間の間隔で３回免疫化し、取り出したその脾臓細胞を不活性化インフルエンザウイルスによりインビトロで刺激した。精製サイトカインの標準曲線との比較により定量された平均サイトカイン濃度が示される。
【図１４】図１４は、本発明のペプチドワクチンおよび／またはＤＮＡワクチンで免疫化されたマウスにおけるＣＴＬ応答を表すヒストグラムである（図１４ａ〜図１４ｂ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスをｐＨＡ９１〜２６１ＤＮＡまたはペプチドで免疫化し、脾臓細胞をウイルス特異的ＣＴＬ活性についてアッセイした。それぞれの群についてのデータは、２０：１（図１４ａ）および５０：１（図１４ｂ）のエフェクター対標的比での５１Ｃｒ標識された標的細胞の溶解によって表される。
【図１５】図１５は、本発明のｐＨＡ９１〜２６１ＤＮＡ構築物またはペプチド構築物で免疫化されたマウスにおける致死量未満のインフルエンザウイルス抗原投与感染に対する保護を表すヒストグラムである（図１５ａ〜図１５ｂ）。マウスは最後の免疫化の４週間後に抗原投与され、５日後に屠殺された。それぞれの群から得られた肺ホモジネートの１０−８希釈物を赤血球凝集アッセイによってウイルスの存在についてアッセイした。結果が、１０−８のホモジネート希釈度での各群におけるウイルス陽性肺の百分率として表され（図１５ａ）、そしてまたＬｏｇＥＩＤ５０として表される（図１５ｂ）。アスタリスクは統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明は、脊椎動物（例えば、鳥類、ブタおよびヒトなど）におけるインフルエンザウイルス感染を処置および検出するために使用することができる核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および医薬組成物に関する。
【００６８】
本発明の原理および操作は、図面および付随する記述を参照してより良く理解することができる。
【００６９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することが可能であり、または様々な方法で実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、限定であるとして見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００７０】
インフルエンザは、臨床的な病的状態、死亡者および大きい経済的損失を発生の毎年に引き起こす主要な公衆衛生問題である。今日まで、ワクチン接種法は、インフルエンザ抑制の基礎となっているが、危険性が高い集団群における罹患者および死亡者を防止することに向けられてきている。しかしながら、インフルエンザウイルスの表面タンパク質（すなわち、血球凝集素およびノイラミニダーゼ）の迅速かつ予測できない変化のために、新しいウイルス株が出現するので、効果的なワクチンの開発は複雑であり、費用がかかる。
【００７１】
現在、利用可能な抗ウイルス薬には、ウイルスＭ２イオンチャネル遮断剤のアマンタジンおよびリマンタジン、ならびにノイラミニダーゼ遮断剤のザナミビル（Ｒｅｌｅｎｚａ（商標））およびオセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ（商標））が含まれ、これらはウイルス粒子の放出および出芽を妨げている。Ｍ２イオンチャネル遮断剤は、Ｍ２タンパク質をコードしないＢ型インフルエンザウイルスに対しては効果がなく、また、重篤な副作用および獲得された耐性によって制限される一方で、ザナミビルの使用は気道抵抗を伴い、オセルタミビルの使用は非常に費用がかかる。
【００７２】
本明細書中上記に記載されるように、インフルエンザウイルスは２つの表面抗原［ノイラミニダーゼおよび血球凝集素（ＨＡ）］をコードしており、これらはゆっくりした変化（すなわち、抗原シフトおよび抗原ドリフト）を受け、インフルエンザにおける大きな抗原性変化を生じさせている。ＨＡ分子（７５ｋＤ〜８０ｋＤ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０９２０６２、配列番号１）は、種々のウイルス株の血清学的特異性を規定する際の最も重要な抗原であり、これには、複数の抗原決定基が含まれており、そのいくつかが、異なる株において配列変化を受ける領域に存在し（すなわち、株特異的な決定基）、他の決定基が、多くのＨＡ分子に共通する領域に存在する（すなわち、共通決定基）。
【００７３】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ＨＡポリペプチドにおける保存された配列と結合するように設計されたオリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）は、宿主細胞に対するウイルス結合を防止するために利用できることを発見している。本明細書中下記および下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、入念な実験によって、インフルエンザウイルス感染を診断および処置するために使用することができるアプタマー核酸分子を始めて提供している。そのようなアプタマー分子はウイルス交差反応性を示し、そのため、インフルエンザウイルスに対する万能的なワクチンとして使用することができる。
【００７４】
アプタマーは、目的とするポリペプチドと特異的に結合し、その指定された機能を阻害するために選択される、三次構造を有する核酸配列である。アプタマーおよびその作用機構のさらなる記載が、Ｏｓｂｏｒｎｅ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１９９７、１（１）：５〜９；およびＰａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、Ｊｕｎ．１９９７、１（１）：３２〜４６によって示される。
【００７５】
従って、本発明の１つの局面によれば、細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００７６】
細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチドと特異的に結合する本発明のこの局面の核酸分子の能力は、インフルエンザウイルス感染の治療および診断におけるその使用を可能にする。
【００７７】
本明細書中で使用される「細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチド」は、Ａ型〜Ｃ型のインフルエンザウイルス株を含むオルトミクソウイルス科ウイルスによってコードされるポリペプチド、宿主細胞のポリペプチド、またはそれらのペプチドフラグメントを示す。
【００７８】
細胞のウイルス感染に関係するインフルエンザウイルスポリペプチドの例には、限定されないが、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、ＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡを含む）、Ｍ１マトリックスタンパク質およびＭ２マトリックスタンパク質、ならびにＮＳタンパク質が含まれる。
【００７９】
インフルエンザウイルス感染に関係する宿主細胞ポリペプチドの例には、限定されないが、末端のＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ＝シアル酸）基を含有するムコタンパク質、ＨＬＡタンパク質およびエンドサイトーシスタンパク質、シアル酸含有のグリカンおよび粘膜糖タンパク質が含まれる。
【００８０】
本発明のこの局面のポリペプチド標的は、本発明の核酸分子の特異性を最大にし、かつ、その細胞毒性を低下させるために、好ましくはウイルス性であることが理解される。従って、好ましいポリペプチド標的配列は、Ａ型〜Ｃ型のインフルエンザウイルスによって共有される保存されたアミノ酸配列を含む。そのような配列と結合するように作製された核酸分子は万能的なワクチンとして使用することができる。
【００８１】
保存されたウイルスペプチド標的の例を下記の表１に示す。
【表１】
2010279385.tif 000002
【００８２】
本発明のこの局面の核酸分子は、本明細書中上記で記載されたポリペプチド標的と特異的に結合することができる一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子あるいはそれらの任意の修飾体を示す。本発明のこの局面の核酸分子は交換可能に「アプタマー」として示される。
【００８３】
典型的には、本発明のこの局面による核酸分子は、１０塩基〜１００塩基などの様々な長さを有する。しかし、短い核酸分子（例えば、１０塩基〜３５塩基）が、生物利用能（すなわち、分解に対する抵抗性、および増大した細胞取り込み）などの、経済的な事情、製造上の事情および治療的な事情のために好ましくは使用されることが理解される。
【００８４】
本発明のこの局面の現在知られている実施形態によれば、核酸分子は、好ましくは、配列番号１１および配列番号１２に示される核酸分子（すなわち、Ａ２１およびＡ２２）である。
【００８５】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のこの局面による核酸分子は、好ましくは、標的ポリペプチドに対する高まった生物利用能および改善された効力を得るために修飾される。修飾には、核酸塩基または分子全体に対するさらなる電荷、分極性、水素結合、静電的相互作用および可動性を組み込む様々な化学基が含まれるが、これらに限定されない。付加または修飾される化学基は、ポリペプチド標的のトポロジーに一致する立体配座的に柔軟な連結を含むように選択される。また、本発明のこの局面の核酸分子を修飾するための化学がトリホスファート（ＮＴＰ）合成またはホスホルアミダイト合成のいずれかについて可能にする対策が取られる。
【００８６】
従って、例えば、本発明のこの局面の核酸分子は、好ましくは、標的ポリペプチドに対する特異的な架橋を可能にし、それにより高親和性の化合物を形成する修飾を含む。
【００８７】
付加される架橋基は、疎水性の機能性、親水性の機能性、または荷電した機能性を含有することができる。架橋は、イミン、アセタール、エステルおよびジスルフィド連結の形成によって、そして同様に、α，β−不飽和カルボニルリンカーへの共役付加によって達成することができる。ホスホルアミダイト合成のために好適である２’−デオキシウリジンヌクレオシドの様々な例が図１ａに示され、これらは、小さい疎水性官能基（例えば、ビニル（群１、図１ａ）など）、大きい疎水性官能基（例えば、プレニル（群１３〜群１４、図１ａ）など）、および、様々な程度の側鎖疎水性を有するカルボニル化合物（群３、群６〜群１１、図１ａ）を含む。
【００８８】
ピリミジン塩基の修飾（例えば、５位におけるＲＮＡウリジンヌクレオシド修飾など）は、ケトンの形態でコンジュゲート化することができる疎水性基［群１７、群１８、図１ａ、Ｃｒｏｕｃｈ（１９９４）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１３：９３９〜９４４］、アミドの形態でコンジュゲート化することができる疎水性基［群２４、群２７、図１ａ、Ｄｅｗｅｙ（１９９５）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１７：８４７４〜８４７５］などを含み、これらはＤＮＡ核酸分子またはＲＮＡ核酸分子のいずれにも結合することができる。アミドは水素結合能をアプタマーに付与することができることが理解される。いずれの場合でも、本明細書中上記に記載されるように、架橋カルボニル基をウリジンの５位に結合することができる（群１５〜群１８、図１ａ）。しかし、カルボニルリンカーの予想される反応性は、標的ポリペプチドの境界に依存して著しく異なり得ることが理解される。
【００８９】
プリン修飾の様々な例が図１ｂに示される。例えば、疎水性の置換基をＲＮＡまたはＤＮＡのプリンヌクレオシドの８位において結合することができる（群２８〜群３０、図１ｂ）。立体的障害の程度をアミド連結によって変化させることができる（群３１、群３３、群３４、群３７および群３８、図１ｂ）。親水性の基（群３５、図１ｂ）および荷電した基（群３６および群３９、図１ｂ）をプリンヌクレオシドの８位に取り付けることができる。標的ポリペプチドに対する既知の親和性を有する官能基をプリン塩基の８位に結合することができることが理解される（例えば、ビオチン化ヌクレオシド（群４０、図１ｂ）など）。
【００９０】
修飾のためのさらなる部位には、ＲＮＡの２’位、ならびに、ＲＮＡおよびＤＮＡのホスホジエステル酸素が含まれるが、これらに限定されない。２’位のピリミジンヌクレオシド修飾を、Ｓｅｂｅｓｔａ（１９９６）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５２：１４３８５〜１４４０２；ＭｃＧｅｅ（１９９６）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、Ｌｅｔｔ．、３７：１９９５〜１９９８；ＭｃＧｅｅ（１９９６）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６１：７８１〜７８５に従って行うことができる。本質的には、アミンリンカー（例えば、ヒドロキシルアミンリンカーなど）を使用して、異なるトポロジーを有する疎水性基（群４１〜群４３、群４６および群４９、図１ｃ）、親水性基（群４５および群４７、図１ｃ）、および標的ポリペプチドに対する特異的な親和性を示す基（群４５、図１ｃ）を結合することができる。
【００９１】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のこの局面の核酸分子はまた、その生物利用能を増大させるために修飾することができる。下記には、そのような修飾に対する非限定的な例が例示される。
【００９２】
本発明のこの局面の核酸分子は、３’から５’へのホスホジエステル連結で結合したプリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環ヌクレオシドを含むことができる。
【００９３】
好ましく使用される核酸分子は、本明細書中下記において概略的に記載されるように、骨格、ヌクレオシド間連結または塩基のいずれかにおいて修飾された核酸分子である。そのような修飾は、しばしば、オリゴヌクレオチドの取り込みおよび細胞内条件に対する抵抗性を促進させることができる。
【００９４】
一連の合成化学を、ＮＴＰまたはホスホルアミダイト試薬のいずれかに変換することができるヌクレオシドの修飾のために利用することができる。さらなる詳細については、ＥａｔｏｎおよびＰｉｅｋｅｎ（１９９５）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４：８３７〜８６３を参照のこと。
【００９５】
本発明のこの局面に従って有用である核酸分子の具体的な例には、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、米国特許第６８７８０８号、同第４４６９８６３号、同第４４７６３０１号、同第５０２３２４３号、同第５１７７１９６号、同第５１８８８９７号、同第５２６４４２３号、同第５２７６０１９号、同第５２７８３０２号、同第５２８６７１７号、同第５３２１１３１号、同第５３９９６７６号、同第５４０５９３９号、同第５４５３４９６号、同第５４５５２３３号、同第５４６６６７７号、同第５４７６９２５号、同第５５１９１２６号、同第５５３６８２１号、同第５５４１３０６号、同第５５５０１１１号、同第５５６３２５３号、同第５５７１７９９号、同第５５８７３６１号および同第５６２５０５０号に開示されるように、骨格内にリン原子を保持するものが含まれる。
【００９６】
好ましい修飾された核酸骨格には、例えば、ホスホロチオアート、キラルなホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホナートおよび他のアルキルホスホナート（３’−アルキレンホスホナートおよびキラルなホスホナートを含む）、ホスフィナート、ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに、通常の３’−５’連結を有するボラノホスファート、これらの２’−５’連結したアナログ、ならびに、反転した極性を有するもの（この場合、ヌクレオシドユニットの隣接対は３’−５’から５’−３’に連結するか、または２’−５’から５’−２’に連結する）が含まれる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた使用することができる。
【００９７】
あるいは、リン原子をその中に含まない修飾された核酸骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルの混合型ヌクレオシド間連結、あるいは、１つまたは複数の短鎖のヘテロ原子または複素環でのヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらには、米国特許第５０３４５０６号、同第５１６６３１５号、同第５１８５４４４号、同第５２１４１３４号、同第５２１６１４１号、同第５２３５０３３号、同第５２６４５６２号、同第５２６４５６４号、同第５４０５９３８号、同第５４３４２５７号、同第５４６６６７７号、同第５４７０９６７号、同第５４８９６７７号、同第５５４１３０７号、同第５５６１２２５号、同第５５９６０８６号、同第５６０２２４０号、同第５６１０２８９号、同第５６０２２４０号、同第５６０８０４６号、同第５６１０２８９号、同第５６１８７０４号、同第５６２３０７０号、同第５６６３３１２号、同第５６３３３６０号、同第５６７７４３７号および同第５６７７４３９号に開示されるように、モルホリノ連結（これはヌクレオシドの糖部分から一部が形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびメチレンチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミン骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合した構成要素部を有する他の骨格が含まれる。
【００９８】
本発明に従って使用することができる他の核酸分子は、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間連結の両方（すなわち、骨格）において修飾された核酸分子であり、新規な基で置換される。塩基ユニットは、適切なポリヌクレオチド標的との相補のために保持される。そのような核酸配列模倣体に対する一例として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、糖−骨格がアミド含有骨格（特に、アミノエチルグリシン骨格）で置換されるオリゴヌクレオチドを示す。塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する米国特許には、限定されないが、米国特許第５５３９０８２号、同第５７１４３３１号および同第５７１９２６２号（これらのそれぞれが参考として本明細書中に組み込まれる）が含まれる。本発明において使用することができる他の骨格修飾が米国特許第６３０３３７４号に開示される。
【００９９】
本発明の核酸分子はまた、塩基修飾または塩基置換を含むことができる。本明細書中で使用される「非修飾」または「天然」の塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾塩基には、他の合成された塩基および天然の塩基が含まれ、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換されたアデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換されたウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどが含まれる。さらなる塩基には、米国特許第３６８７８０８号に開示される塩基、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（８５８頁〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０）に開示される塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ他（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３）によって開示される塩基、および、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．（第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９頁〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３）によって開示される塩基が含まれる。そのような塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン類、ならびに、Ｎ−２置換、Ｎ−６置換およびＯ−６置換のプリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５−メチルシトシンの様々な置換は、核酸二重鎖安定性を０．６Ｃ〜１．２Ｃ増大させることが示されており［Ｓａｎｇｈｖｉ  ＹＳ他（１９９３）、Ａｎｔｉｓｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、２７６〜２７８］、さらにより具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされたときには、現時点で好ましい塩基置換である。
【０１００】
本発明の核酸分子の別の修飾では、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを高める１つまたは複数の成分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結することが含まれる。そのような成分には、米国特許第６３０３３７４号に開示されるように、脂質成分、例えば、コレステロール成分、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート）、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、あるいはオクタデシルアミン成分またはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
所与のオリゴヌクレオチド分子におけるすべての位置が均一に修飾されることは必ずしも必要でなく、実際、上記修飾の１つ以上を１つの化合物に取り込むことができ、またはオリゴヌクレオチド内の１つだけのヌクレオシドにおいてさえ取り込むことができる。
【０１０２】
下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、結論として、本発明の核酸分子はインビトロおよびインビボで細胞のインフルエンザウイルス感染を防止することができることを示している。さらに、ウイルス抗原投与後のウイルスの拡大を阻害する本発明の核酸分子の能力は、抗インフルエンザ予防および抗インフルエンザ治療の適用における本発明の核酸分子の使用を示唆している。
【０１０３】
従って、本発明の別の局面によれば、インフルエンザウイルス感染を処置する方法が提供される。
【０１０４】
本明細書中で使用される用語「処置する」は、インフルエンザウイルス感染を妨げること、または、インフルエンザウイルス感染に関連する症状を実質的に減少（すなわち、軽減または低下）させることを示す。
【０１０５】
この方法は、その必要性のある対象に本明細書中上記で記載される本発明の核酸分子の治療効果的な量を与えることによって行われる。
【０１０６】
本明細書中で使用される「その必要性のある対象」は、インフルエンザウイルスに関連する症状に罹っている対象、または、インフルエンザに罹る危険性がある対象を示す。そのような対象の例には、６５歳以上の人々；心臓、肺もしくは腎臓の慢性的疾患、糖尿病、免疫抑制、または貧血の重篤な形態を有する人々、療養施設および長期養護施設の居住者、アスピリン治療を受けている、従って、インフルエンザに感染した後でライ症候群を発症することについて危険性を有し得る小児および十代、および、危険性が高い人との接触が緊密であるか、または頻繁である人々が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
好ましくは、本発明の核酸分子は、０．１μｇ／Ｋｇ体重〜１５０μｇ／Ｋｇ体重（好ましくは１μｇ／Ｋｇ体重〜１００μｇ／Ｋｇ体重、より好ましくは１μｇ／Ｋｇ体重〜５０μｇ／Ｋｇ体重、さらにより好ましくは１μｇ／Ｋｇ体重〜１５μｇ／Ｋｇ体重）の間の濃度で与えられる。
【０１０８】
本発明の核酸分子（すなわち、有効成分）は、そのものとして、または、医薬的に許容され得るキャリアと混合される医薬組成物の一部として対象に与えることができる。
【０１０９】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１１０】
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができる調製物を示す。
【０１１１】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【０１１２】
アプタマーの活性はその分子量と直接的に相関するので、本発明の核酸分子を高分子量のキャリアにコンジュゲート化するための対策が取られる。そのような高分子量キャリアには、限定されないが、ポリアルキレングリコールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ、これらは、有機媒体および水性媒体の両方における広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーである（Ｍｕｔｔｅｒ他（１９７９））。
【０１１３】
あるいは、マイクロ粒子、例えば、マイクロカプセルまたはカチオン性脂質などが、本発明のこの局面の医薬的に許容され得るキャリアとして役立ち得る。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、マイクロ粒子には、合成ポリマーおよび／または天然ポリマーから形成されるリポソーム、ビロソーム、ミクロスフィアおよびマイクロカプセルが含まれる。マイクロカプセルおよびミクロスフィアを作製するための様々な方法が当業者には知られており、これらには、溶媒蒸発、溶液流延、噴霧乾燥および溶媒伸長が含まれる。様々なマイクロ粒子に取り込むことができる有用なポリマーの例には、多糖、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシド、ならびにタンパク質およびペプチドが含まれる。
【０１１５】
様々なリポソームを、Ｋｉｍ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、７２８：３３９〜３４８（１９８３）；Ｌｉｕ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１１０４：９５〜１０１（１９９２）；Ｌｅｅ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１１０３：１８５〜１９７（１９９２）；Ｗａｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８：９５０８〜９５１４（１９８９）によって報告される方法などのこの分野で広く知られている方法によって作製することができる。あるいは、本発明のこの局面の核酸分子はマイクロ粒子に取り込むことができ、または、マイクロ粒子の外側にイオン的もしくは共有結合的のいずれかで結合させることができる。
【０１１６】
カチオン性のリポソームまたはマイクロカプセルは、本発明のこの局面の核酸分子などの負に荷電した化合物（これらのリポソームの正に荷電した外側表面にイオン的に結合することができる）を送達するために特に有用なマイクロ粒子である。様々なカチオン性リポソームが、Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７（１９８７）；Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５：１６３〜１８７（１９９０）；Ｃｌａｒｅｎｃ他、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、８：８１〜９４（１９９３）によって報告されるように、核酸または核酸−タンパク質複合体をインビトロおよびインビボの両方で細胞に送達することにおいて非常に効果的であることが知られている。カチオン性のリポソームまたはマイクロカプセルは、その混合物から形成されるリポソームまたはマイクロカプセルが、負に荷電した化合物とイオン的に結合する正味の正荷電を有するように、カチオン性側鎖基を十分な量で含有する１つまたは複数の脂質を含む混合物を使用して作製することができる。カチオン性リポソームを製造するために使用することができる正に荷電した脂質の例には、アミノ脂質のジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（これは正荷電の第一級アミノ頭部基を有する）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（これは、第一級アミンでない正荷電の頭部基を有する）、およびＮ［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（「ＤＯＴＭＡ」、Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７（１９８７）；Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：３８７〜３８８（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５：１６３〜１８７（１９９０）を参照のこと）が含まれる。
【０１１７】
上述の通り、本発明のこの局面の医薬組成物は賦形剤をさらに含んでもよい。本明細書中では、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１１８】
薬剤の処方および投与技術は“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見出すことができ、これは参照によってここに組み入れられる。
【０１１９】
好適な投与経路は例えば経口、経腸、経粘膜、特に経鼻、経小腸内または筋肉間、皮下および骨髄内注射を含む非経口送達、ならびに鞘内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内または腸内注射を含むことができる。
【０１２０】
代わりに、調製物は全身的な様式よりも、例えば患者の体の特定の領域中に調整物を直接注射することによって局所投与されることができる。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている方法によって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１２２】
従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性な化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアを使用して従来の様式で配合することができる。適切な配合は、選ばれる投与経路に依存する。
【０１２３】
注射の場合、本発明の化合物は、好ましくは、生理学的に適合し得る緩衝液（ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的食塩水緩衝液など）における水溶液で配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透させられるバリアに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤は、この分野では広く知られている。
【０１２４】
経口投与の場合、化合物は、活性な化合物を、この分野で十分に知られている医薬的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に配合することができる。そのようなキャリアにより、本発明の化合物は、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される医薬調製物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーである。所望する場合には、架橋型ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１２５】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１２６】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟密閉カプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、活性な化合物を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路に好適な投薬形態でなければならない。
【０１２７】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１２８】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用される化合物は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器で使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１２９】
ここで記述される調製物は非経口投与のために、例えばボーラス注射又は連続注入のために処方されることができる。注射のための処方は単位投薬形態、例えばアンプル又は多用量容器の形態で、所望により保存剤を添加された状態で提示されることができる。組成物は油性または水性媒体中の懸濁液またはエマルションであることができ、懸濁、安定化および／または分散剤の如き処方薬剤を含むことができる。
【０１３０】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態における活性な調製物の水溶液が含まれる。さらに、活性な化合物の懸濁物を、適切なオイル状の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有し得る。場合により、懸濁物はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために化合物の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有し得る。
【０１３１】
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水）を用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１３２】
本発明の化合物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物で配合することができる。
【０１３３】
本発明に関連して使用される好適な医薬組成物には、意図された目的を達成するために効果的な量で有効成分が含有される組成物が含まれる。より詳細には、治療効果的な量は、疾患の症状を防止もしくは緩和もしくは改善するために、または処置されている患者の生存を延ばすために効果的な抗酸化性調製物の量を意味する。
【０１３４】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に示される詳細な開示を考慮に入れて十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１３５】
本発明の方法で用いられるいかなる調製物についても治療効果的な量又は用量はインビトロでのアッセイから最初に推定されることができる。例えば、用量は動物モデルで処方されることができ、かかる情報はヒトにおける有用な用量を一層正確に決定するために用いられることができる。
【０１３６】
本明細書中に記載される化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば、対象とする化合物についてＩＣ５０およびＬＤ５０（試験動物の５０％に死をもたらす致死量）を測定することによって明らかにすることができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる。例えば、（５４）を参照のこと。
【０１３７】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬はまた、徐放性組成物の単回投与で行うことができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１３８】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている患者、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１３９】
適合し得る薬学的キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、適用される状態の処置のために、調製され、適切な容器に入れられ、表示され得る。
【０１４０】
本発明の医薬組成物は、所望される場合には、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。
【０１４１】
本発明の核酸分子はまた、本明細書中上記で記載された任意の好適な投与様式を用いて個々の対象に投与された核酸構築物から発現させることができることが理解される。あるいは、核酸構築物は、適切な送達ビヒクル／方法（トランスフェクションおよび形質導入など）および必要に応じた発現システムによって好適な細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大培養され、個体に戻される。
【０１４２】
本発明のＲＮＡ核酸分子の細胞発現を可能にするために、本発明の核酸構築物はさらに、少なくとも１つのシス作用調節エレメントを含む。本明細書中で使用される表現「シス作用調節エレメント」は、トランス作用の調節因子と結合し、その下流に存在するコード配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列（好ましくはプロモーター）を示す。
【０１４３】
任意の利用可能なプロモーターを本方法論によって使用することができる。アプタマー発現ベクターにおいて使用される好ましいプロモーターには、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、ヒトの小核Ｕ６遺伝子プロモーターおよびｔＲＮＡ遺伝子プロモーターなどが含まれる。短いＲＮＡ分子をインビボで産生させるためのＵ６遺伝子転写シグナルの使用がＮｏｏｎｂｅｒｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：２８３０〜２８３６（１９９４）によって記載され、ｔＲＮＡ転写シグナルの使用がＴｈｏｍｐｓｏｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３：２２５９〜２２６８（１９９５）によって記載される。
【０１４４】
多くのｐｏｌＩＩＩプロモーターは内在的であり、ｐｏｌＩＩＩ転写物がプロモーター配列を含むように転写ユニットの内部に配置されることが理解される。アプタマー分子を発現させるために有用であるためには、これらのプロモーター配列はアプタマーの構造または機能を妨害してはならない。従って、好ましいＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ  ＲＮＡプロモーターは、内在的でないＵ６遺伝子プロモーターである［ＫｕｎｋｅｌおよびＰｅｄｅｒｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１７：７３７１〜７３７９（１９８９）；Ｋｕｎｋｅｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：８５７５〜８５７９（１９８６）；Ｒｅｄｄｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：７５〜８１（１９８７）］。アプタマー分子を発現させるために有用である好適なｐｏｌＩＩＩプロモーターシステムが、Ｈａｌｌ他、Ｃｅｌｌ、２９：３〜５（１９８２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１：３６３１〜３６３６（１９９３）；ＦｏｗｌｋｅｓおよびＳｈｅｎｋ、Ｃｅｌｌ、２２：４０５〜４１３（１９８０）；ＧｕｐｔａおよびＲｅｄｄｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：２０７３〜２０７５（１９９１）；Ｋｉｃｈｈｏｅｆｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：７８６８〜７８７３（１９９３）；ＲｏｍｅｒｏおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ、Ｃｅｌｌ、６７：３４３〜３５３（１９９１）によって記載される。ＲＮＡ分子を発現させるためのｐｏｌＩＩＩプロモーターの使用はまた、Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって国際特許出願公開ＷＯ９５／２３２２５に記載される。
【０１４５】
本発明のアプタマーを発現させるために有用な他のプロモーターには、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルス）のゲノム、または異種哺乳動物プロモーターに由来するもの（例えば、ベータアクチンプロモーター）が含まれる。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターを、ＳＶ４０のウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限フラグメントとして得ることができる［Ｆｉｅｒｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８）］。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターをＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして得ることができる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．他、Ｇｅｎｅ、１８：３５５〜３６０（１９８２））。宿主細胞または近縁種に由来するプロモーターもまた使用できることが理解される。
【０１４６】
本発明の方法の構築物は好ましくはさらに、適切な選択マーカーおよび／または複製起点を含む。好ましくは、利用される構築物はシャトルベクターであり、これは大腸菌において増殖することができ（この場合、構築物は適切な選択マーカーおよび複製起点を含む）、かつ、細胞内での増殖または選ばれた組織における組み込みのために適合し得る。本発明による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体であり得る。
【０１４７】
現在好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、および脂質に基づくシステムなど）を用いたトランスフェクションが含まれる。脂質媒介移入のための有用な脂質が、Ｌａｓｉｃ  Ｄ．、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９３によって記載される。
【０１４８】
好ましくは、カチオン性脂質が、本明細書中上記で記載されるように、等モル量での中性脂質との組合せで使用される。トランスフェクション複合体における有用な中性脂質には、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Ｈｕｉ他、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、（７１）５９０〜５９９（１９９６））；コレステロール（Ｌｉｕ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：１６７〜１７３（１９９７））が含まれる。
【０１４９】
典型的には、脂質混合物はクロロホルム中で調製され、乾燥され、そして、例えば、５％デキストロース水溶液または生理学的緩衝液において再水和され、リポソームを形成させる。得られるリポソームは一定の撹拌とともに核酸溶液と混合されて、カチオン性脂質−核酸のトランスフェクション複合体を形成させる。静脈内投与のための好ましいトランスフェクション複合体サイズは５０ｎｍ〜５０００ｎｍであり、最も好ましくは１００ｎｍ〜４００ｎｍである。
【０１５０】
ＤＮＡ／脂質複合体は好ましくは、約０．６２５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度で調製され得ることが理解される。送達用量は体重１グラムあたり約１０．ｍｕ．ｇ〜約２ｍｇである。反復用量を約２日〜約２ヶ月の間隔で送達することができる。
【０１５１】
現在知られている実施形態によるインビボ使用のための最も好ましい構築物はウイルス（最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルス）である。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物など）は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント、あるいは、遺伝子発現を他の手段（例えば、選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、またはメッセンジャーの翻訳後修飾など）によって制御する他のエレメントを含む。そのようなベクター構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在しない限り、パッキングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに、使用されるウイルスに対して適切なプラス鎖プライマー結合部位およびマイナス鎖プライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は、典型的には、ペプチドまたは抗体を、構築物が置かれる宿主細胞から分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列である。場合により、構築物はまた、ポリアデニル化を行わせるシグナル、ならびに、１つまたは複数の制限部位、および翻訳終結配列を含むことができる。例として、そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッキングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲまたはその一部を含む。
【０１５２】
インビボ核酸送達プロトコルのための好ましい様式が下記に示される：ＳｏｍｉａおよびＶｅｒｍａ（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１：９１〜９９；Ｉｓｎｅｒ（２００２）、心筋遺伝子治療、Ｎａｔｕｒｅ、４１５：２３４〜２３９；Ｈｉｇｈ（２００１）、遺伝子治療：２００１年の展望、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ、７：２３〜２７；ＨａｍｍｏｎｄおよびＭｃＫｉｒｎａｎ（２００１）、心臓疾患のための血管形成遺伝子治療：動物研究および臨床試験の再検討、４９：５６１〜５６７。
【０１５３】
本発明の核酸分子を与える前に、または本発明の核酸分子を与えるのと同時に、または本発明の核酸分子を与えた後、薬剤を対象に与えることができる。
【０１５４】
薬剤は、インフルエンザ感染またはインフルエンザ感染に関する臨床的状態（例えば、肺炎など）の防止または処置を容易にする分子であり得る。薬剤の例には、本発明のこの局面によれば、免疫調節剤（例えば、抗体）、抗生物質、抗ウイルス剤（例えば、アマンタジン）、アンチセンス分子およびリボザイムなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
本発明の核酸分子の抗体様の性質（すなわち、ポリペプチド標的に対する特異的な結合）は、本明細書中上記で記載された薬剤が、投与された核酸分子または核酸分子を含有する脂質キャリアに結合しているとき、感染性組織に特異的に標的化されることを可能にする。
【０１５６】
例えば、インフルエンザウイルスのポリペプチド（背景の節においてさらに記載されている）に向けられたアンチセンス分子は、本発明のアプタマー配列を使用して標的化することができる。「キメラ」なアンチセンス分子は、それぞれが少なくとも１つのヌクレオチドから構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの増大した抵抗性、増大した細胞取り込み、および／または、標的ポリヌクレオチドに対する増大した結合親和性を付与するようにオリゴヌクレオチドが改変される少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として役立ち得る。そのような酵素の一例として、ＲＮａｓｅＨ（これは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである）が挙げられる。従って、ＲＮａｓｅＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく高める。その結果、同じ標的領域にハイブリダイゼーションするホスホロチオアートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、多くの場合、匹敵する結果を、キメラなオリゴヌクレオチドが使用されたとき、より短いオリゴヌクレオチドを用いて得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および、必要ならば、この分野で知られている会合核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出することができる。
【０１５７】
本発明のキメラなアンチセンス分子は、上記で記載されるように、２つ以上のオリゴヌクレオチド（修飾オリゴヌクレオチド）の複合構造として形成され得る。そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第５０１３８３０号、同第５１４９７９７号、同第５２２０００７号、同第５２５６７７５号、同第５３６６８７８号、同第５４０３７１１号、同第５４９１１３３号、同第５５６５３５０号、同第５６２３０６５号、同第５６５２３５５号、同第５６５２３５６号および同第５７００９２２号（これらはそれぞれが参考として本明細書中に全体が組み込まれる）が含まれる。
【０１５８】
あるいは、リボザイム配列を、本発明の核酸分子を使用して標的化することができる。リボザイムは、ｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的な阻害のためにますます使用されている。数個のリボザイム配列を本発明のオリゴヌクレオチドに融合することができる。これらの配列には、血管形成経路における重要な成分であるＶＥＧＦ−Ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害するＡＮＧＩＯＺＹＭＥ、およびＨＥＰＴＡＺＹＭＥ（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するために設計されたリボザイム）（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
場合により、「ＤＮＡザイム」を、本発明の方法を使用して標的化することができる［Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．およびＪｏｙｃｅ，Ｇ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）、２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４３：４２６２］。ＤＮＡザイムは一本鎖であり、両方のＲＮＡを切断する。ＤＮＡザイムに対する一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡザイムは、それぞれが７個〜９個のデオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインによって挟まれた１５デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。このタイプのＤＮＡザイムはその基質ＲＮＡをプリン：ピリミジン接合部において効果的に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９；ＤＮＡザイムの総説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００２、４：１１９〜２１を参照のこと）。
【０１６０】
一本鎖および二本鎖の標的切断部位を認識する操作された合成ＤＮＡザイムの構築および増幅の様々な例が米国特許第６３２６１７４号（Ｊｏｙｃｅ他）に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に対して向けられた類似する設計のＤＮＡザイムが最近、ウロキナーゼ受容体の発現を阻害し、また、結腸ガン細胞の転移をインビボで首尾よく阻害することが観測された（Ｉｔｏｈ他、２０００２、アブストラクト４０９、Ａｎｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ、ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の適用において、ｂｃｒ−ａｂｌガン遺伝子に対して相補的なＤＮＡザイムは、白血病細胞におけるガン遺伝子の発現を阻害し、そして、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合において自家骨髄移植における再発率を低下させることに成功した。
【０１６１】
核酸−脂質カップリングの様々な方法がこの分野では広く知られており、米国特許第５７５６２９１号に記載される。
【０１６２】
例えば、Ａｓｓｅｌｉｎｅ，Ｕ．他［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、８１、３２９７〜３３０１（１９８４）］は、３’−リン酸基を介したポリメチレンリンカーによるインターカレート剤の共有結合的結合を記載する。Ｍｏｒｉ，Ｋ．他（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４９、２１３〜２１８（１９８９））は、オリゴヌクレオチドの５’末端におけるメチレンリンカーによる様々な基の共有結合的結合を記載する。ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８９／０５８５３（１９８９年６月２９日公開；その開示全体は本明細書により参考として組み込まれる）には、ヌクレオチド配列とキレート化剤とのコンジュゲートを形成させるための様々な方法が記載され、この場合、キレート化剤は、共有結合による結合または多価官能基由来の結合ユニットのいずれかによってヌクレオチド配列に結合される。
【０１６３】
従って、本発明のアプタマーまたは修飾アプタマーは単独で治療的適用において使用することができ、あるいは、薬剤を標的化して、医薬品またはトキシンを所望する標的に送達するために使用することができる。
【０１６４】
インフルエンザウイルスのポリペプチドと特異的に結合する本発明の核酸分子の能力は診断的適用におけるその使用を可能にする。
【０１６５】
今日まで、数多くの検査をＡ型インフルエンザおよびＢ型インフルエンザの診断のために利用することができる。生物学的サンプルにおけるインフルエンザウイルスを同定するための従来の方法では、細胞を培養することが伴い、それにより、ウイルス感染の非常に高感度かつ特異的な検出をもたらしている。しかしながら、この方法は、細胞培養のために要求される時間によって著しく制限され、インフルエンザウイルスの同定は２日〜１０日に及ぶことがあり、従って、医師を適切な治療に導くことにおいて効果的になっていない。インフルエンザウイルス感染は通常、自己に限定されるので、治療が効果的となるならば、診断は迅速でなければならない。従って、細胞培養法は、遡及的疫学的情報を提供するためにだけ使用される。
【０１６６】
他のインフルエンザ診断方法では、モノクローナル免疫蛍光アッセイ［Ｓｐａｄａ，Ｂ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、（１９９１）３３：３０５］および酵素結合免疫アッセイ［ＥＩＡ、Ｒｙａｎ−Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｋ．Ａ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（１９９２）３０：１０７２］の使用が含まれる。しかしながら、これらの方法は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染の同定に限定されるだけでなく、相当の技術的専門知識を要求し、また、高レベルの偽陽性をもたらしている。
【０１６７】
従って、本発明のなお別の局面によれば、生物学的サンプルにおけるインフルエンザウイルスを同定する方法が提供される。
【０１６８】
本明細書中で使用される場合、生物学的サンプルは、血液、脊髄液、胸膜液、呼吸器液および鼻腔吸引物などの任意の身体サンプルを示す。体液を脊椎動物から得る様々な方法がこの分野で広く知られている。例えば、鼻腔洗浄物を、Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ、Ｊ．Ｖｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４６：１８９〜２０６、１９９４、またはＨａｌｌおよびＤｏｕｇｌａｓ、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１３１：１〜５、１９７５に記載されるように得ることができる。
【０１６９】
この方法は、生物学的サンプルを、本明細書中上記に記載される、インフルエンザウイルスのポリペプチドと特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子と接触させることによって行われる。
【０１７０】
本発明の核酸分子は、例えば、本明細書中下記に記載されるように、固体の基質に結合させることができる。
【０１７１】
接触させることは、ポリペプチド−核酸分子の二重鎖の形成を可能にする条件のもとで行われる。
【０１７２】
二重鎖は、好ましくは、何らかの非特異的に結合したポリペプチドを除くために洗浄され、これにより、複合体内において特異的に結合したそのような核酸分子のみを検出することが可能になる。
【０１７３】
生物学的サンプルにおける、ポリペプチドと結合した核酸分子が検出され、それにより、インフルエンザ感染が同定される。
【０１７４】
一般に、ポリペプチド−核酸分子複合体のモニターリングはこの分野で広く知られており、本明細書中上記に記載されるように行うことができる。これらの方法は、一般には、例えば、本明細書中下記に記載されるように、標識またはマーカーを検出することに基づく。
【０１７５】
好ましくは、感染サンプルの検出は、インフルエンザウイルスに感染していない正常なサンプルとの比較によって行われる。
【０１７６】
本発明の核酸分子を作製するために、影響を受けにくい選択法が好ましくは用いられる。
【０１７７】
従って、本発明のさらなる局面によれば、細胞のインフルエンザウイルス感染を阻害することができる核酸分子を得る方法が提供される。
【０１７８】
この方法は下記のように行われる。
【０１７９】
最初に、複数の核酸分子が、本明細書中上記で記載されたように細胞のインフルエンザウイルス感染に関係するポリペプチド標的と接触させられる。
【０１８０】
二重鎖形成（すなわち、ポリペプチド標的と核酸分子との間での非ワトソン・クリック相補）の後、ポリペプチドと特異的に結合することができる、複数の核酸分子のうちの少なくとも１つの核酸分子が同定される。
【０１８１】
最後に、ポリペプチドと結合した核酸分子が単離され、それにより、インフルエンザウイルス感染を阻害することができる分子を得る。
【０１８２】
二本鎖ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマー結合のために使用することができる２つの規定されたヌクレオチド配列によって挟まれたランダム化ポリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列のライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、二本鎖のＰＣＲ生成物を生じさせるために増幅される［Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５０（４９８３）：９９７〜１０００］。ランダム化配列は完全にランダム化され得る（すなわち、任意の位置において塩基を見出す確率が１：４である）か、または、部分的にランダム化され得る（任意の位置において塩基を見出す確率が０〜１００％の間の任意のレベルで選択される）。
【０１８３】
一本鎖アプタマーを調製する場合、下流側のプライマーが５’末端においてビオチン化され、ＰＣＲ生成物がアビジンアガロースカラムに加えられる。一本鎖ＤＮＡ配列が、弱塩基性緩衝液による溶出によって回収される。
【０１８４】
一本鎖ＲＮＡ分子を、Ｔ７バクテリオファージのポリメラーゼプロモーター部位を含有する二本鎖ＰＣＲ生成物を生じさせるために増幅されるオリゴヌクレオチド配列ライブラリーから得ることができる。その後、ＲＮＡ分子を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって作製することができる。
【０１８５】
本発明のこの局面の核酸分子は、天然に存在する核酸またはそのフラグメント、化学合成された核酸、酵素合成された核酸、あるいは前記技術の組合せによって作製された核酸分子から作製することができる。
【０１８６】
本発明のこの局面のライブラリーは、本明細書中上記で記載される選択された核酸修飾の構造的適用範囲および化学的適用範囲を提供するために十分に大きく作製される。
【０１８７】
典型的には、本発明のこの局面によるランダム化核酸配列ライブラリーは少なくとも１０１４個の配列変化体を含む。
【０１８８】
核酸修飾を標的ポリペプチドとのインキュベーションの前に行うことができる。この場合、スクリーニングは最終的な修飾アプタマーに対して行われるが、修飾は、スクリーニング中に行われる、酵素プロセス（例えば、転写）などの何らかのプロセスを妨害しないように制限される。
【０１８９】
あるいは、核酸分子は選択（すなわち、ポリペプチドと結合した核酸分子の単離）の後に修飾することができる。従って、広範囲の官能基を同時に使用することができる。この場合、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を、正確な官能基を解明するために使用することができる［Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ（１９９６）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６８：１９８９〜１９９９］。
【０１９０】
いずれの場合でも、核酸分子が得られると、核酸分子は、本明細書中上記で述べられたように、ポリペプチド標的と接触させられる。
【０１９１】
核酸分子と本発明のこの局面の標的ポリペプチドとのインキュベーションは、好ましくは、生理学的な条件のもとで行われる。本明細書中で使用される表現「生理学的な条件」は水溶液における塩濃度およびイオン強度を示し、これらは、インフルエンザウイルスが感染し得る脊椎動物対象の代謝において見出される流体（生理学的緩衝液または生理学的生理的食塩水とも呼ばれる）を特徴づける。例えば、ヒト対象における生理学的流体は、７．１の細胞内ｐＨ、および、細胞内塩濃度（ｍＭ単位）が３〜１５のナトリウム；１４０のカリウム；６．３のマグネシウム；１０−４のカルシウム；３〜１５の塩化物、ならびに７．４の細胞外ｐＨ、および、細胞外塩濃度（ｍＭ単位）が１４５のナトリウム；３のカリウム；１〜２のマグネシウム；１〜２のカルシウム、そして１１０の塩化物によって表される。
【０１９２】
核酸分子は、溶液中または固体基質に結合したときのいずれでも、標的ポリペプチドとインキュベーションすることができる。
【０１９３】
上記の塩基修飾体のいくつかは、核酸分子を固体基質に結合するための中間体として使用できることが理解される。例えば、図１ｃの群４８に示される修飾ウリジンは、固相合成において使用されるホスホルアミダイト試薬としての活性化の前に、イミダゾールを広範囲の疎水性基、親水性基、荷電基および架橋基で置換することによってさらに修飾することができる一般的な中間体として役立ち得る。
【０１９４】
核酸分子を固体基質に結合するための様々な方法がこの分野で知られており、これらには、ガラス印刷（これは、Ｓｃｈｅｎａ他、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４６７〜４７によって一般的に記載される）、フォトリソグラフィー技術［Ｆｏｄｏｒ他（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７〜７７３］、インクジェット印刷およびマスキングなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９５】
典型的には、コントロールサンプルが、固体支持体および／または非標的エピトープなどの標的以外の物質に結合する核酸分子を選択しないために含められる。
【０１９６】
結合していない核酸分子の分離、および結合した核酸配列の同定は、この分野で広く知られている方法を使用して行うことができる。例として、特に限定されないが、選択的溶出、ろ過および電気泳動などを含む（米国特許第５７５６２９１号を参照のこと）。
【０１９７】
あるいは、結合したアプタマー分子を画像化によって同定することができる。例えば、明視野、エピ蛍光または共焦点法を使用する光学顕微鏡観察、または走査プローブ顕微鏡観察を、ポリペプチドと結合した核酸分子を同定するために使用することができる（米国特許第６２８７７６５号を参照のこと）。可視化を容易にするために、核酸分子またはポリペプチドは、好ましくは、この分野において標準的に使用される任意の放射性、蛍光性、生物学的または酵素的なタグまたは標識を使用して標識される。
【０１９８】
下記には、本発明における使用のために好適な多数の標識化方法が例示される。例えば、本発明の核酸分子は、合成後、ビオチン化ｄＮＴＰもしくはビオチン化ｒＮＴＰを取り込むことまたはいくつかの類似する手段（例えば、ビオチンのプソラレン誘導体をＲＮＡに光架橋すること）、その後、標識されたストレプトアビジン（例えば、フィコエリトリンにコンジュゲート化されたストレプトアビジン）または同等物を加えることによって標識することができる。あるいは、蛍光成分が使用される。これには、フルオレセイン、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびその他［例えば、Ｋｒｉｃｋａ他（１９９２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ］が含まれる。あるいは、放射性標識が使用される［Ｚｈａｏ他（１９９５）、Ｇｅｎｅ、１５６：２０７］。しかしながら、放射性粒子の散乱、および、その結果としての、広く離れた結合部位のための要求のために、放射性同位体よりも、蛍光団の使用がより好まれる。
【０１９９】
本明細書中上記に記載される検出方法のいずれかにおける生じたシグナルの強度が、手作業により、または、そのような目的のために適するソフトウエアアプリケーションおよびハードウエアを使用して分析され得ることが理解される。
【０２００】
アプタマー配列（すなわち、ポリペプチドと結合した核酸）の単離は、典型的には、ＰＣＲなどによる配列増幅を伴う。増幅を、標的ポリペプチドから分離する前に、または、標的ポリペプチドから分離するのと同時に、または標的ポリペプチドから分離した後に行うことができる。ＰＣＲ法はこの分野では広く知られており、例えば、米国特許第４６８３１９５号および同第４６８３２０２号および同第４８００１５９号、ならびに、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）、１５５：３３５〜３５０に記載される。ＲＮＡ分子が使用される場合、増幅されたＤＮＡ配列がＲＮＡに転写されることが理解される。
【０２０１】
他の増幅方法を用いることができ、これには、標準的なクローニングおよびリガーゼ連鎖反応などが含まれる（米国特許第４９５７８５８号を参照のこと）。例えば、アプタマーが同定されると、リンカーを、標準的なベクターへのクローニングを容易にするために両端に結合することができる。一本鎖アプタマーまたは二本鎖アプタマーをクローン化し、回収することができる。
【０２０２】
回収された核酸分子は、元の一本鎖形態または二重鎖形態であっても、その後、選択および増幅（すなわち、標的ポリペプチド結合）の繰り返される処理のために使用することができる。典型的には、３回〜６回の選択／増幅の後、ｎＭ〜Ｍの範囲の好ましい親和性で結合する核酸分子を得ることができる。
【０２０３】
ポリペプチド標的と特異的に結合することができる核酸分子を同定するための様々な方法がこの分野では知られていることが理解される［例えば、米国特許第５２７０１６３号；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：８１８〜８２２；Ｂｏｃｋ他（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ、２５５：５６４〜５６６；Ｗａｎｇ他（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：１８９９〜１９０４；Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ他（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５０：９９７〜１０００］。例えば、米国特許第５２７０１６３号には、下記のように核酸リガンドを同定するためのＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：指数的濃縮によるリガンドの系統的進化）と呼ばれる方法が開示される。ランダム化配列の領域を有する一本鎖核酸の候補混合物が標的化合物と接触させられ、標的に対する増大した親和性を有するそのような核酸が候補混合物の残りから分配される。分配された核酸は、リガンド濃縮された混合物を得るために増幅される。Ｂｏｃｋおよび共同研究者は、支持体に結合した標的分子と、ランダム配列、およびＰＣＲのためのプライマーとして役立ち得る配列を含有するオリゴヌクレオチドの混合物との複合体化を伴う、標的生体分子と特異的に結合するオリゴマー配列を同定するための方法を記載する［Ｂｏｃｋ他（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ、２５５：５６４〜５６６］。その後、標的−オリゴヌクレオチド複合体が支持体および複合体を形成していないオリゴヌクレオチドから分離され、複合体を形成したオリゴヌクレオチドが回収され、続いてＰＣＲを使用して増幅される。回収されたオリゴヌクレオチドは配列決定することができ、また、複合体化を使用する選択、分離、増幅および回収の一連の処理に供することができる。
【０２０４】
あるいは、本発明の核酸配列は合理的薬物設計によって作製することができる。
【０２０５】
合理的薬物設計は、酵素阻害剤を同定する強力な手段であり、これは、例えば、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）により引き起こされるヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、およびヒトガン（慢性骨髄性白血病）に対する最初の効果的な薬理学的治療を提供するためにそれぞれ使用されるＨＩＶプロテアーゼ阻害剤（Ｌａｍ他、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３、３８０；Ｗｌｏｄａｗｅｒ他、１９９３、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２、５４３；Ａｐｐｌｅｔ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ、１、２３；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ、１、１０９）およびｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤（Ｍａｕｒｏ  ＭＪ他、２００２、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、２０、３２５〜３４）を同定するためにとりわけ使用されている。
【０２０６】
核酸配列構造データベース（「３Ｄデータベース」）をスクリーニングすることによって合理的薬物設計による推定的なアプタマー配列を同定するために、「スキャナー」型のアルゴリズムを用いるソフトウエアでは、インフルエンザの血球凝集素ポリペプチドのシアル酸受容体結合ポケット（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０９２０６２のアミノ酸位置１１６〜２６１）などの分子の結合ポケットの三次元構造を規定する原子の座標、および、アプタマー構造との結合ポケットの結合を適格化するように、結合ポケットとのスクリーニングされたアプタマー構造の「ドッキング」をコンピューターモデル化するためにデータベースに蓄えられている核酸配列構造の三次元構造を規定する原子の座標が用いられる。従って、このプロセスを、データベースに蓄えられている複数の仮想的なアプタマー構造のそれぞれを用いて繰り返すことにより、結合ポケットとの所望する結合相互作用を潜在的に有する化学構造、従って、仮想的な阻害剤を同定するために、そのような複数のものをコンピューターによりスクリーニングすることが可能になる。
【０２０７】
本発明の核酸分子を同定するための核酸構造データベースの例には、ＲＮＡ構造データベース（ｗｗｗ．ＲＮＡＢａｓｅ．ｏｒｇ）およびＮＤＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／／ｗｗｗ．ｉｍｂ−ｊｅｎａ．ｄｅ／ＲＮＡ．ｈｔｍｌ＃Ｄａｔａｂａｓｅｓ）が含まれる。
【０２０８】
あるいは、精緻化されたアプタマー配列を、精緻化されたアプタマーをコンピューターにより組み立てるために、結合ポケットの三次元構造および基本アプタマー（例えば、Ａ２２）の三次元構造を規定する１組の原子座標を利用する「ビルダー」型のアルゴリズムを含むソフトウエアを使用して既知のアプタマー構造（例えば、Ａ２２、配列番号１２）を改変することによって解明することができる。そのような「スキャナー」型アルゴリズムおよび「ビルダー」型アルゴリズムを用いるソフトウエアによる合理的薬物設計を行うための十分な指針をこの分野の文献において得ることができ（例えば、Ｈａｌｐｅｒｉｎ  Ｉ．他、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、４７、４０９〜４３；Ｇｏｈｌｋｅ  Ｈ．およびＫｌｅｂｅ  Ｇ．、２００１、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．、１１、２３１〜５；Ｚｅｎｇ  Ｊ．、２０００、Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．、３、３５５〜６２；ＲＡＣＨＥＬ：Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｗｄｒｕｇｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／Ｒａｃｈｅｌ＿Ｔｈｅｏｒｙ．ｈｔｍ＃Ｓｏｆｔｗａｒｅを参照のこと）、さらに詳しくは本明細書中下記に記載される。
【０２０９】
スクリーニングされたアプタマー構造の結合ポケットとの結合を適格化するために合理的薬物設計において使用されるソフトウエアプログラムによって用いられる基準には、ギャップ間隔、水素結合、静電的相互作用、ファンデルワールス力、疎水性／親水性などが含まれる。一般に、スクリーニングされた分子とポリペプチド結合領域との接触面積が大きいほど、立体的障害が小さくなり、「ギャップ間隔」が低くなり、水素結合の数が多くなり、そして、スクリーニングされた分子とポリペプチド結合領域との間でのファンデルワールス力の総数が多くなるほど、標的ポリペプチドと結合するスクリーニングされた分子の能力が大きくなる。「ギャップ間隔」は、結合ポケット内に存在するスクリーニングされた分子のファンデルワールス表面と、結合ポケットにおけるアミノ酸残基により規定される結合ポケットの表面との間における非占有空間を示す。ギャップ間隔は、例えば、使用者が規定する格子間隔とともに、ドッキングされた分子の周りの一連の立体格子に基づくアルゴリズムを使用して同定することができ、ポリペプチド標的の結合領域の内部に存在するドッキングされたアプタマーを改変することによって都合よく占めることができる体積を表す。
【０２１０】
化合物間の接触面積は、ＭＳプログラム（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ＭＬ．、１９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２１、７０９〜７１３）を使用して、ドッキングされた立体配座における化合物の座標から直接に計算することができる。
【０２１１】
「スキャナー」型アルゴリズムを用いる好適なソフトウエアには、例えば、ドッキングソフトウエア、例えば、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫまたはＡＵＴＯＤＯＣＫ（これらは、Ｄｕｎｂｒａｃｋ他、１９９７、Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ、２、２７に総説される）、ＩＮＳＩＧＨＴＩＩパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、１９９６、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）のＡＦＦＩＮＩＴＹソフトウエア、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ  ＰＪ．、１９８５、「生物学的に重要な高分子の表面におけるエネルギー的に有利な結合部位を決定するためのコンピューター手法」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２８、８４９〜８５７；ＧＲＩＤはオックスフォード大学（Ｏｘｆｏｒｄ、英国）から入手することができる）、およびＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ  Ａ．およびＫａｒｐｌｕｓ  Ｍ．、１９９１、「結合部位の機能性マップ：多コピー同時検索法」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１、２９〜３４；ＭＣＳＳはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）から入手することができる）が含まれる。
【０２１２】
ＡＵＴＯＤＯＣＫプログラム（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ  ＤＳ．およびＯｌｓｏｎ  ＡＪ．、１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｅｔ．、８、１９５〜２０２；これはＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）から入手することができる）は、スクリーニングされた分子を、モンテカルロ・シミュレーションによるアニーリング法を使用して柔軟な様式で結合ポケットにドッキングすることを助ける。この手法は、研究者により持ち込まれる偏りを伴わない検索を可能にする。このような偏りは、標的化された結合ポケットにおけるスクリーニングされた分子の配向および立体配座に影響を及ぼし得る。
【０２１３】
ＤＯＣＫプログラム（Ｋｕｎｔｚ  ＩＤ．他、１９８２、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、１６１、２６９〜２８８；これはカリフォルニア大学（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）から入手することができる）は結合ポケットの空間充填表示のネガティブ画像の記述に基づいており、エネルギー評価のための力場、制限された立体配座的柔軟性、およびエネルギー評価における疎水性の検討を含む。
【０２１４】
モデル化またはドッキングの後、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ  ＢＲ．他、１９８３、Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｃｈｅｍ．、４、１８７〜２１７）またはＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ  ＳＪ．他、１９８４、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．、１０６、７６５〜７８４）などのプログラムを用いた標準的な分子力学的力場によるエネルギー最小化または動力学を行うことができる。
【０２１５】
本明細書中で使用される「エネルギーの最小化」は、原子の幾何学的形状の何らかのさらなる小さい摂動により、分子力学的力場によって測定されるような系の総エネルギーを増大させることが生じるように、系統的な変化によって化学構造を有する原子の幾何学的形状を達成することを意味する。最小化および分子力学的力場はコンピューター化学では十分に理解されている（例えば、Ｂｕｒｋｅｒｔ  Ｕ．およびＡｌｌｉｎｇｅｒ  ＮＬ．、「分子力学」、ＡＣＳモノグラフ１７７、５９頁〜７８頁、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８２）を参照のこと）。
【０２１６】
「ビルダー」型アルゴリズムを用いるプログラムには、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ  Ｙ．およびＩｔａｉ  Ａ．、１９９１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４７、８９８５；これはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）から入手することができる）、ＬＥＡＰＦＲＯＧ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，ＰＡ．他、１９８９、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ  Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．、７８、１８２〜１９６；これはカリフォルニア大学（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）から入手することができる）、ＨＯＯＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）およびＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ  ＨＪ．、１９９２、Ｊ．Ｃｏｍｐ  Ａｉｄ  Ｍｏｌｅｃ  Ｄｅｓｉｇｎ、６、６１〜７８；これはＢｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から入手することができる）が含まれる。
【０２１７】
ＣＡＶＥＡＴプログラムは、所望する結合ベクトルに基づく結合性分子を示唆する。ＨＯＯＫプログラムは、多数コピーの官能基を同時検索において使用することによってドッキング部位を提案する。ＬＵＤＩは、記述子に基づくのではなく、フラグメントに基づくプログラムであり、結合ポケットと一致させるために少しより大きいフラグメントが提案され、その的中が、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＳＤ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から採用された幾何学的基準、および結合データに基づく基準に基づいてスコア化される。ＬＵＤＩは、ドッキングされた化学構造の阻害定数を計算するために都合よく用いることができる。最終的なドッキング位置における化合物の阻害定数（Ｋｉ値）を、ＬＵＤＩソフトウエアを使用して計算することができる。
【０２１８】
合理的薬物設計の途中またはその後で、中間的な化学構造または推定的なアプタマーの結合ポケットとのドッキングを、コンピュータースクリーンに表示されるその三次元モデルなどのその構造モデルによって可視化することができ、その結果、合理的薬物設計の途中での使用者の介入により化学構造を最適化することが都合よくできるようになる。
【０２１９】
そのような三次元構造モデルを表示するために有用なソフトウエアプログラムには、ＲＩＢＢＯＮＳ（Ｃａｒｓｏｎ，Ｍ．、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２７、２５）、Ｏ（Ｊｏｎｅｓ，ＴＡ．他、１９９１、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７、１１０）、ＤＩＮＯ（ＤＩＮＯ：Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉｎｏ３ｄ．ｏｒｇ）；ならびに、ＱＵＡＮＴＡ、ＩＮＳＩＧＨＴ、ＳＹＢＹＬ、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥ、ＩＣＭ、ＭＯＬＭＯＬ、ＲＡＳＭＯＬおよびＧＲＡＳＰ（これらは、Ｋｒａｕｌｉｓ、Ｊ．、１９９１、Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、２４、９４６に総説される）が含まれる。
【０２２０】
他の分子モデル化技術もまた本発明に従って用いることができる（例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＮＣ．他、１９９０、「医薬品化学のための分子モデル化ソフトウエアおよび方法」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３３：８８３〜８９４；Ｎａｖｉａ  Ｍ．Ａ．およびＭｕｒｃｋｏ  Ｍ．Ａ．、１９９２、「薬物設計における構造情報の使用」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２、２０２〜２１０）。例えば、試験化合物の構造が知られている場合、試験化合物のモデルを本発明の構造のモデルに重ねることができる。無数の方法および技術が、このステップを行うためにこの分野では知られており、それらはいずれも使用することができる（例えば、下記を参照のこと：Ｆａｒｍｅｒ  Ｐ．Ｓ．、「薬物設計」、Ａｒｉｅｎｓ  ＥＪ（編）、第１０巻、１１９頁〜１４３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０）；米国特許第５３３１５７３号；米国特許第５５００８０７号；Ｖｅｒｌｉｎｄｅ  Ｃ．、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２、５７７〜５８７；Ｋｕｎｔｚ  ＩＤ．、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７、１０７８〜１０８）。
【０２２１】
いずれの場合でも、仮想的なアプタマー配列が同定されると、その仮想的なアプタマー配列は、標的ポリペプチドに対する特異的な結合について調べられる。これは、バンドシフトアッセイ（米国特許第５７５６２９１号）およびアフィニティークロマトグラフィー［Ｓｃｈｏｔｔ、Ｈ．、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１）］などの、この分野で知られている数多くの生化学的方法を使用して行うことができる。
【０２２２】
あるいは、またはさらに、本発明の核酸配列は、下記の実施例の節の実施例２（インビトロ）および実施例３（インビボ）においてさらに記載されるように、ＭＤＣＫ培養細胞株などにおいてインビトロで、またはインビボでインフルエンザウイルス感染の阻害について調べることができる。
【０２２３】
本明細書中上記で記載されるように、アプタマー設計における重要な構成要素はポリペプチド標的の選択である。本発明のアプタマー分子を選択するために使用されるペプチドは、インフルエンザ関連の治療的適用および診断的適用における強力なツールとして使用することができることが理解される（１３）。
【０２２４】
従って、本発明のなおさらなる局面によれば、インフルエンザウイルス（すなわち、オルトミクソウイルス）に対するワクチン接種のために有用なポリペプチドが提供される。
【０２２５】
本発明のこの局面のポリペプチドは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき（この場合、様々なインフルエンザ株の間におけるポリペプチドの保存を反映し、また、機能的なホモログを同様に含めて、ギャップ生成ペナルティーが８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しい）、配列番号１３に対して好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％またはそれ以上、例えば、９５％〜１００％の相同性であるアミノ酸配列を含む。
【０２２６】
本発明のこの局面のポリペプチドはインフルエンザウイルスのＨＡ２ドメインを含まない。
【０２２７】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、シアル酸受容体などの宿主細胞決定基に対する結合を媒介するインフルエンザＨＡの球状領域を包含する、配列番号１４のアミノ酸位置１１６〜２６１によって規定されるアミノ酸配列を含む。
【０２２８】
より好ましくは、本発明のポリペプチドは、インフルエンザＨＡのさらなる最小限の球状領域を包含する、配列番号１５のアミノ酸位置１１６〜２４５によって規定されるアミノ酸配列を含む。
【０２２９】
インフルエンザＨＡポリペプチドの受容体結合ポケットは、立体配座的制限により免疫系に大部分がさらされないので、本発明のこの局面のポリペプチドは好ましくはさらに、例えば、配列番号１のアミノ酸位置９１〜２６１によって規定されるようなさらなる抗原性エピトープを含む［ＭｃＥｗｅｎ（１９９２）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０：４０５〜４１１；Ｍｕｌｌｅｒ（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：５６９〜５７３；Ｓｈａｐｉｒａ（１９８５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、７：７１９〜７２３］。
【０２３０】
他の抗原性エピトープ（これは好ましくは保存されている）が、例えば、本明細書中上記の表１に示されるような本発明のポリペプチドに含められ得ることが理解される。
【０２３１】
好ましくは、本発明のこの局面のポリペプチドは、配列番号１３〜１５に示される通りである。
【０２３２】
あるいは、本発明のこの局面のポリペプチドは、配列番号１３〜１５に示されるアミノ酸配列を含む。
【０２３３】
本明細書中および請求項の節で使用される用語「ポリペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【０２３４】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ｏ−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【０２３５】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【０２３６】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、ＴＩＣ、ナフチル（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【０２３７】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【０２３８】
従って、本明細書中および請求項の節で使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【０２３９】
下記の表２〜表３には、天然に存在するアミノ酸のすべて（表２）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表３）が示される。
【表２】
2010279385.tif 000003
【表３】
2010279385.tif 000004
2010279385.tif 000005
2010279385.tif 000006
【０２４０】
本発明のペプチドは、好ましくは、線状形態で利用される。しかし、環化がペプチドの特性をひどく妨害しない場合、ペプチドの環状形態もまた利用できることが理解される。
【０２４１】
本発明者らは、結論として、本発明の教示に従って作製されたポリペプチドが体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘発し得ることを示している（実施例の節の実施例７〜実施例８を参照のこと）。
【０２４２】
ＤＮＡ免疫化は、ペプチド免疫化と比較した場合、多くのウイルス剤に対するより良好な細胞性免疫応答を生じさせることが広く理解されている。
【０２４３】
従って、本発明のさらにさらなる局面によれば、本明細書中上記に記載される本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【０２４４】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするゲノムポリヌクレオチド配列、相補的ポリヌクレオチド配列または複合ポリヌクレオチド配列を構成し得る。
【０２４５】
本明細書中で使用される表現「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、最初はメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を包含する。そのような配列は続いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅することができる。
【０２４６】
本明細書中で使用される表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、最初は染色体に由来し、染色体の連続した一部分を反映する配列を包含する。
【０２４７】
本明細書中で使用される表現「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも一部が相補的であり、かつ、少なくとも一部がゲノム性である配列を包含する。複合配列は、ＨＡの球状領域をコードするために要求されるいくつかのエクソン配列、グリコシル化コンセンサス部位、ならびに、それらの間に置かれたいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は、他の遺伝子を含む任意の供給源のものが可能であり、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列はさらに、シス作用の発現調節エレメントを含むことができる。イントロン配列はまた、翻訳されたタンパク質にも寄与し得る。
【０２４８】
下記の実施例の節の実施例７において示されるように、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対して作製された抗体は多数のインフルエンザ株種と交差反応し、そのため、様々な臨床的適用において使用することができる。
【０２４９】
従って、本発明のさらなる局面によれば、上述の本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗原結合部位を含む抗体または抗体フラグメントが提供される。
【０２５０】
本発明において使用される用語「抗体」は、完全な抗体分子を意味し、句「抗体フラグメント」はその機能的なフラグメント、例えば、マクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを意味する。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される。：（ｉ）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な分子を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる。（ｉｉ）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである。２つのＦａｂフラグメントが１つの抗体分子あたり得られる。（ｉｉｉ）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な分子を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである。（ｉｖ）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される。（ｖ）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である。（ｖｉ）ペプチドは単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする。
【０２５１】
抗体（即ちモノクローナル及びポリクローナル抗体）を作成する方法は当該技術分野では周知である。抗体は当該技術分野で知られたいくつかの方法のいずれか一つを介して作成されることができ、これらの方法（Ｏｒｌａｎｄｉ  Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３−３８３７，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９）に開示されるように抗体分子のインビボ生成の誘導、免疫グロブリンライブラリーまたは極めて特異的に結合する試薬のパネルのスクリーニングを用いることができるかまたは培養中の連続細胞系によるモノクローナル抗体分子の生成を用いることができる。これらはハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ−Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２，Ｃｏｔｅ  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０，Ｃｏｌｅ  Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０）を含むがこれらに限定されない。
【０２５２】
そのような抗体フラグメントを製造する様々な方法がこの技術においては知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）を参照のこと：これは参照により本明細書中に組み込まれる）。例えば、本発明による抗体フラグメントは、フラグメントをコードするＤＮＡを大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現システム）において発現させることによって調製することができる。
【０２５３】
抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを得ることによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤、および場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接的に得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびにそれらに含まれる参考文献に記載されている（それらの特許は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６、１９５６も参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。
【０２５４】
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、１９７２に記載されているように非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、グルタルアルデヒドなどの化学剤によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによりつながれたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに導入され、続いて、発現ベクターは大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを製造するための様々な方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、１９９１；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、１９９３；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号（これは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。
【０２５５】
ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０、１９９１を参照のこと。
【０２５６】
ヒトの治療または診断のためにはヒト化された抗体を用いることが好ましいことは理解されるであろう。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性の部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望する特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは取り込まれたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にはすべての可変ドメインまたは１つ以上の（典型的には２つ）可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部を、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
【０２５７】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術においては広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、輸入残基と呼ばれており、この輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインに由来する。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って本質的には行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この場合、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。
【０２５８】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
【０２５９】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のポリペプチドおよび核酸配列は、インフルエンザウイルス感染を処置するために使用することができる。
【０２６０】
従って、本発明のなおさらなる局面によれば、インフルエンザウイルス感染を処置する方法が提供される。
【０２６１】
この方法は、本明細書中上記で記載される本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または抗体の治療効果的な量をその必要性のある対象に与えることによって行われる。
【０２６２】
好ましい投与経路および医薬組成物が本明細書中上記に記載される。
【０２６３】
本発明の教示に従って作製された抗体は、生物学的サンプルにおけるインフルエンザウイルスを同定するためにもまた使用することができることが理解される。
【０２６４】
この方法は、本明細書中上記に記載されるような生物学的サンプルを本発明の抗体または抗体フラグメントと接触させることによって行うことができる。
【０２６５】
その後、生物学的サンプルにおける抗体または抗体フラグメントを含む免疫複合体が検出され、それにより、生物学的サンプルにおけるインフルエンザウイルスを同定する。
【０２６６】
好ましくは、免疫複合体は、何らかの非特異的に結合した抗体を除くために、検出に先だって洗浄され、これにより、一次免疫複合体内における特異的に結合したそのような抗体のみを検出することが可能になる。
【０２６７】
一般に、免疫複合体形成の検出はこの分野では広く知られており、いくつかの適切な方法のいずれか１つによって達成することができる。これらの方法は一般に、例えば、本明細書中上記で記載されたように、標識またはマーカーの検出に基づいている。
【０２６８】
本発明の教示に従って作製された核酸分子、そのコンジュゲート、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体は診断キットまたは治療キットに含めることができる。これらの試薬は、適切な緩衝液および保存剤とともに１つまたは複数の容器に詰めることができ、また、診断のために、または治療的処置を導くために使用することができる。
【０２６９】
従って、核酸分子およびそのコンジュゲートはそれぞれを１つの容器において混合することができ、または個々の容器に入れることができる。好ましくは、容器はラベルを含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。
【０２７０】
また、安定化剤、緩衝剤および阻止剤などの他の添加剤もまた加えることができる。そのようなキットの核酸分子およびそのコンジュゲートはまた、記載されたように固体支持体に結合することができ、診断目的のために使用することができる。キットはまた、試験された対象がインフルエンザウイルス感染に罹患しているか、またはインフルエンザウイルス感染を発症する危険性を有するかどうかを明らかにするための説明書を含むことができる。
【０２７１】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なお、これら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０２７２】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０２７３】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ���ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２７４】
実施例１
血球凝集素特異的アプタマー−理論的根拠および設計
指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）と結合するアプタマーオリゴヌクレオチドを同定するために行った。
【０２７５】
材料および実験手順
ライブラリー作製：共通する５’配列ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ（配列番号１６、Ｔ３として示される；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ）および共通する３’配列５’−ＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＴＡＡＧＴＴＡＡ−３’（配列番号１７）によって挟まれた３０ヌクレオチドのランダム化配列を中央部に含有するアプタマーライブラリーを３８０Ｂ  ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において合成した。ライブラリーは、１０１６個の分子のすべてについて、製造者の説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って作製された３０ヌクレオチドのランダムセグメントを含んだ。
【０２７６】
ＳＥＬＥＸ−ｓｓＤＮＡアプタマーを８０℃で１０分間変性し、その後、氷上で１０分間冷却した。アプタマー（３０ｎｍｏｌ）を、５００μｌの選択緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｔＲＮＡ、０．２％ＢＳＡ）において３７℃で３０分間、２５μｇのＨＡ９１〜２６１ペプチド（さらには本明細書中下記に記載される）と混合した。アプタマー−ペプチド複合体を、２５μｌのＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を加えることによって精製し、アプタマーライブラリーにおける共通配列に対するプライマー［すなわち、５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１８（Ｔ３））および３’プラマイマー５’ＴＴＡＡＣＴＴＡＴＴＣＧＡＣＣＡＴＡ−３’（配列番号１９）］を使用するＰＣＲによって増幅した。ＳＥＬＥＸを３回繰り返し、その後、増幅されたヌクレオチドを大腸菌に形質転換した。ＳＥＬＥＸについてのＰＣＲ条件は、９５℃で５分間／９５℃で１分間／５５℃で１分間／７２℃で１分間／７２℃で１０分間および１００ｐｍｏｌの各プライマーを含んだ。
【０２７７】
アプタマーの逆スクリーニング−それぞれの個々のクローンに由来する選択されたｓｓＤＮＡ分子を、５’プライマー（Ｔ３プライマー）に関して同じ配列であるＢ−Ｔ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）およびクレノウフラグメント（２ユニット／ｍｌ）を使用してビオチン化した。一本鎖のビオチンコンジュゲート化Ａ２２アプタマーを逆スクリーニングのために調製するために、Ｔ３プライマー（配列番号１８）をビオチン標識した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。
【０２７８】
９６ウエル平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）を、各ウエルを０．１ＭのＮａＨＣＯ３に希釈された１００μｌのストレプトアビジン（１００μｇ／ｍｌ）で被覆し、その後、３７℃で一晩インキュベーションすることによって調製した。ＰＢＳで数回洗浄した後、ウエルを、１％ＢＳＡを含有する２００μｌのＰＢＳにより室温で２時間ブロッキング処理し、続いて、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、１００μｌの２．５ｐｍｏｌ／１００μｌのビオチン化ｓｓＤＮＡをウエルに加え、３７℃で２時間インキュベーションし、その後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。Ｔ３プライマーを陰性コントロールとして使用した（配列番号１８）。洗浄後、１００μｌの１０血球凝集素ユニット（ＨＡＵ）のインフルエンザウイルスまたは２μｇのヒスチジン標識されたＨＡ９１〜２６１ペプチドを示されたウエルに加え、３７℃で２時間インキュベーションした。その後、ウエルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、抗ヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）および抗ウイルス抗体（組換えＨＡ９１〜２６１で免疫化されたマウスから得られた血清サンプル）を対応のウエルに加えた。逆スクリーニングアッセイをＥＬＩＳＡによって完了させた。
【０２７９】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）−高結合能ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ、Ｎｕｎｃ、デンマーク）を、４℃で一晩インキュベーションすることによって、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に希釈された１００ＨＡＵ／ｍｌの様々なインフルエンザウイルス株を含有する１００μｌの尿膜液で被覆した。ＰＢＳによる数回の洗浄工程の後、ウエルを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する２００μｌのＰＢＳでブロッキング処理し、室温で９０分間インキュベーションした。その後、プレートを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。その後、各ウエルに１００μｌの連続希釈された血清サンプルを加えて、ウエルを３７℃で２時間インキュベーションした。このインキュベーション期間の後、プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識のヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲート（ＨＲＰ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して検出した。免疫複合体を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、Ｚｙｍｅｄ）と室温で３０分間インキュベーションすることによって可視化した。反応を５０μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、プレートをマルチチャンネル分光光度計（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＣＣ／３４０  ＭＫ  ＩＩ、Ｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍ、フィンランド）で読み取った。
【０２８０】
結果
ＨＡ分子のアミノ酸９１〜２６１に結合するオリゴヌクレオチドを同定するために、保存されたリンカーの間にランダムな３０ヌクレオチドを含有するヌクレオチドライブラリーを合成した。ライブラリーは１０１８タイプの異なるｓｓＤＮＡを含み、これらをＨＡ９１〜２６１ペプチドにハイブリダイゼーションさせ、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂によって精製した。精製後、ｓｓＤＮＡを、リンカー配列を使用するＰＣＲによって増幅した。このプロセスを４回繰り返し、ＨＡ９１〜２６１結合体の再スクリーニングをＥＬＩＳＡによって行った。
【０２８１】
この逆スクリーニングプロセスにより、「Ａ２１」および「Ａ２２」（それぞれ、配列番号１１および配列番号１２）として示される２つのオリゴヌクレオチドアプタマーが得られた。Ａ２１およびＡ２２はＨＡ９１〜２６１に対する同じ結合能を示し、しかしながら、完全なウイルスとの結合における著しい差が明らかであった（図２ａ〜図２ｂ）。従って、Ａ２２オリゴヌクレオチドの構造的および機能的な分析のみをさらに行った。Ａ２２、Ａ２１およびコントロールオリゴヌクレオチドについてのＤＮＡｄｒａｗプログラム（１８）を使用して提案される二次構造が図２ｃ〜図２ｅに示される。
【０２８２】
実施例２
インフルエンザ感染からのインビトロでのアプタマーによる保護
インフルエンザ感染（Ｈ３Ｎ２  Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ株）に対するＡ２２アプタマーの保護効果を、ＭＤＣＫ細胞を使用してインビトロで調べた（１９）。
【０２８３】
材料および実験手順
ウイルス−Ａ／Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７（Ｈ３Ｎ２）、ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）およびＪａｐａｎｅｓｅ／５７（Ｈ２Ｎ２）のインフルエンザ株を１１日目の孵化ニワトリ卵（Ｂａｒ  Ｏｎ  Ｈａｔｃｈｅｒｙ、Ｈｏｄ  Ｈａｓｈａｒｏｎ，イスラエル）の尿膜腔において成長させた。ウイルスの成長および精製を、ＢａｒｒｅｔおよびＩｎｇｌｉｓ（２３）によって記載される標準的な方法に従って行った。尿膜液におけるウイルスの力価測定を血球凝集アッセイによって行った。
【０２８４】
細胞−Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ３４）を、熱不活性化１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において維持した。
【０２８５】
ＭＴＴアッセイ−ＭＤＣＫ細胞をアッセイの１日前に９６ウエルプレートに入れた（７ｘ１０４個／ウエル）。細胞をダルベッコリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＤＰＢＳ）で２回洗浄し、その後、示されたアプタマー濃度の存在下または非存在下で１０ＨＡＵのＰｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３（Ｈ３Ｎ２）または１０ＨＡＵのＪａｐａｎ（Ｈ２Ｎ２）を含む、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび４ｍＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ７．３）が補充されたハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）との１時間のインキュベーションを行った。感染後、細胞を成長培地において３７℃で７２時間インキュベーションした。ＭＴＴアッセイを、ＰＢＳに溶解された４ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）を細胞培養物に加え、３７℃で３時間インキュベーションすることによって行った。その後、プレートを８００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引し、ホルマザン色素を１５０μｌ／ウエルのイソプロピルアルコール（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）に溶解し、Ｏ．Ｄ．値をＥＬＩＳＡリーダーにより５４０ｎｍで測定した。
【０２８６】
ウイルス感染前のインビトロでのウイルスからの保護−ＭＤＣＫ細胞を実験の２４時間前に９６ウエルプレートに置床した（７ｘ１０４個／ウエル）。各ウエルをＤＰＢＳで２回洗浄し、その後、細胞を５０ｐｍｏｌのＡ２２で３７℃において示された時点について処理した。その後、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、富化ＨＢＳＳにおいて１０ＨＡＵのＨ３Ｎ２を１時間感染させた。インキュベーション後、細胞を成長培地に移し、３７℃で７２時間インキュベーションした。その後、ＭＴＴアッセイを記載のように行った。
【０２８７】
ウイルス感染後のインビトロでのウイルスからの保護−ＭＤＣＫ細胞をウイルス感染の２４時間前に９６ウエルプレートに置床した（７ｘ１０４個／ウエル）。ウイルス感染を上記のように行った。感染細胞をＤＰＢＳで穏やかに３回洗浄した。その後、細胞を５０ｐｍｏｌのＡ２２で３７℃において１時間処理した。インキュベーション後、細胞を成長培地に移し、３７℃で７２時間インキュベーションした。その後、ＭＴＴアッセイを記載のように行った。
【０２８８】
免疫染色−５ｘ１０５個のＭＤＣＫ細胞をガラス製カバーガラスに置いた。２４時間後、インフルエンザウイルス（Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３、Ｈ３Ｎ２）を、Ａ２２との１時間のプレインキュベーションとともに、またはプレインキュベーションを行うことなく加えた。さらに４８時間後、細胞を、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する３％パラホルムアルデヒドで透過処理し、続いて、新しく調製した３％パラホルムアルデヒドにおいて固定処理した。インフルエンザ表面抗原の血球凝集素を、培養物をインフルエンザ血球凝集素に対して特異的なマウスモノクローナル抗体（１：１００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）とインキュベーションすることによって検出した。抗体とのインキュベーションはすべてが加湿チャンバーにおいて室温で１時間行われ、その後、ＰＢＳにおける３回洗浄が行われた。一次抗体を、Ｃｙ３コンジュゲート化ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）二次抗体を用いて検出した。核を、２μｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ、イスラエル）で染色することによって可視化した。免疫蛍光顕微鏡観察を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡を使用して行った。写真を、Ｓｐｏｔソフトウエアプログラムを使用することによって撮影した。画像を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて処理した。
【０２８９】
結果
細胞をインフルエンザウイルス感染からインビトロで保護するアプタマーの能力を調べた。図３ａに示されるように、ウイルス感染（Ｈ２Ｎ２）の前にアプタマーＡ２２で処理された細胞は、ウイルスに関連した細胞死の著しい減少を明らかにした。興味深いことに、保護効果は、おそらくは非感染細胞での高い濃度のために、Ａ２２の５０ｐｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌの間の濃度で最大であった（図３ｂ）。従って、さらなるウイルス株Ｈ３Ｎ２の感染に対する５０ｐｍｏｌのＡ２２の効果を調べた。図３ｂに示されるように、Ａ２２は、非感染ＭＤＣＫ細胞と比較した時、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２による細胞の感染に対して約６０％および約７０％の保護をそれぞれ誘発した。興味深いことに、図３ｂにもまた示されるように、Ａ２１アプタマーはまた、細胞死を全く低下させなかった非関連のオリゴヌクレオチドコントロールと比較した場合、ウイルスのインビトロ感染性を低下させることができた。
【０２９０】
宿主タンパク質と結合するＡ２２アプタマーの能力を次に明らかにした。ウイルス感染の前に、ＭＤＣＫ細胞をＡ２２（５０ｐｍｏｌ）と３０分間または６０分間インキュベーションし、その後、洗浄を繰り返した。図３ｃに示されるように、非処置細胞および処置細胞の生存率の間には著しい差がないことが明らかであり、また、Ａ２２に対する細胞の２つの暴露（すなわち、ウイルス感染の前およびウイルス感染の後）の間における何らかの差を検出することができなかった。これらの結果は、Ａ２２の阻害活性が宿主細胞上のシアル酸含有受容体を直接的に阻止することに起因しないことを示唆している。
【０２９１】
宿主細胞受容体にウイルスが結合した後に加えられた場合、Ａ２２が依然として保護的であるどうかを調べるために、ＭＤＣＫ細胞を１０ＨＡＵのＨ３Ｎ２ウイルスと３０分間または６０分間インキュベーションし、その後、５０ｐｍｏｌのＡ２２による処理を行った。図３ｄに示されるように、ウイルスとの６０分のインキュベーションの後では、Ａ２２の効果は大きくなかった。対照的に、非感染細胞と、ウイルスと６０分間インキュベーションされた細胞との間における差は著しかった（ｐ＝０．００２８）。とりわけ、非常に大きい差が、感染細胞と、Ａ２２による処置の前に３０分間だけウイルスとインキュベーションされた細胞との間において観測された。従って、これらの結果は、ウイルス−宿主細胞受容体の相互作用がその最適条件に達すると、Ａ２２は細胞死を防止することができないことを示唆している。
【０２９２】
細胞に対するウイルスの結合および進入を防止することにおけるＡ２２の効果もまた、顕微鏡観察分析によって明らかにされた。光学顕微鏡観察を使用した図４ａ〜図４ｃにおいて見られるように、ＭＤＣＫ細胞の全体的な形態はウイルス感染により損傷を受けた（図４ａ）。比較において、Ａ２２の存在下では、破壊が阻害され、細胞形態はほとんどが保存された（図４ｂ）。さらに、Ａ２２による単なる処理は細胞の形態に影響を及ぼさなかった（図４ｃ）。このことは、損傷がウイルスによってのみ引き起こされたことを示す。これらの知見はさらに、Ｃｙ３標識された特異的な抗ＨＡモノクローナル抗体を使用してウイルスの存在をモニターする免疫蛍光によって立証された。示されるように、ウイルスの存在が感染細胞において明瞭に現れる（図４ｄ）が、ウイルスの存在はＡ２２の添加によってほぼ完全に防止される（図４ｅ）。処理されていない細胞は、Ａ２２で処理された細胞と一致するようであった。
【０２９３】
実施例３
インフルエンザ感染からのインビボでのアプタマーによる保護
インフルエンザ感染（Ｈ３Ｎ２  Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ株）に対するＡ２２アプタマーの保護効果を感染マウスにおいて調べた。
【０２９４】
材料および実験手順
マウス−１０週齢〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）から購入した。
【０２９５】
動物感染−マウスに、２．５ｎｍｏｌのＡ２２アプタマーとともに、またはＡ２２アプタマーを伴うことなく、種々の時間間隔について、１００ＨＡＵのＰｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを含有する致死量未満の感染性尿膜液を鼻腔内に接種した。マウスの体重を２週間にわたってモニターした。肺におけるウイルス力価を卵力価測定法（１９）によって測定した。簡単に記載すると、マウスをウイルス接種後６日目に屠殺し、肺を取り出し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（１０％ｗ／ｖ）中でホモジネートした。ホモジネーション後、サンプルを遠心分離して、破砕物を除き、−７０℃で貯蔵した。実験当日、解凍した肺ホモジネートを９日目〜１１日目の孵化卵の尿膜腔に注入した（１０倍連続希釈物の１００μｌ）。３７℃で４８時間のインキュベーションおよび４℃で一晩のインキュベーションの後、尿膜液を取り出し、ウイルスの存在を血球凝集アッセイにより測定した。これらのアッセイの結果をｌｏｇＥＩＤ５０として表した（２６）。
【０２９６】
血球凝集アッセイ−ニワトリの赤血球（ＣＲＢＣ）をＡｌｓｅｖｉｅｒ溶液で希釈し、０．５％の最終濃度にした。アッセイを、５０μｌのサンプルおよび５０μｌの０．５％ＣＲＢＣを含有するマイクロタイタープレートにおいて行った。アッセイの結果を、９０分のインキュベーションが終了したときのＬｏｇＥＩＤ５０として表した。
【０２９７】
組織学−肺の組織学のために、マウスを７日目に屠殺し、肺を取り出して１０％中性緩衝化ホルマリン（ｐＨ７．０）に入れた。その後、肺を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。スライドは、何も知らせていない観察者により検鏡された。
【０２９８】
統計学的分析−統計学的分析を、スチューデントｔ検定を使用することによって行い、ｐ＜０．０５を統計学的に有意であると見なした。
【０２９９】
結果−Ａ２２の抗ウイルス性をウイルス感染の前および後におけるインビボで明らかにした。簡単に記載すると、マウスを、「非処理」、「０日」、「−１日」および「＋２日」と呼ばれる４つの群に分けた。各マウスには１００ＨＡＵのインフルエンザＡ／Ｔｅｘａｓ／１／７７ウイルスが抗原投与された。「０日」群におけるマウスには、ウイルスおよび２．５ｎｍｏｌ／ｍｌのＡ２２の混合物が鼻腔内（ｉ．ｎ．）接種された。「−１日」群および「＋２日」群におけるマウスには、２．５ｎｍｏｌ／ｍｌのＡ２２がウイルス感染の１日前およびウイルス感染の２日後にそれぞれｉ．ｎ．接種された。インフルエンザ感染を、（ｉ）ウイルス処置後１６日間の体重減少；（ｉｉ）肺のウイルス力価；（ｉｉｉ）肺の組織学的検査（切片はウイルス接種後７日目に採取された）を含む３つのパラメーターによってモニターした。
【０３００】
非感染マウス（図５ａ）とは対照的に、感染マウスは、単核細胞および崩壊領域の大きな拡大を含む典型的な病理学を示した（図５ｂ）。比較において、Ａ２２処置マウスの肺において、特に「０日」群および「−１日」群（それぞれ、図５ｃおよび図５ｄ）では、はるかに少ない単核細胞浸潤が明らかであり、また、肺胞のほとんどが開いたままであった。興味深いことに、「＋２日」群では、損傷部位および非損傷部位の両方を認めることができた（図５ｅ〜図５ｆ）。これらの知見は、Ａ２２の投与が肺における炎症領域を減少させることを示唆している。さらに、コントロール群と比較した場合、処置群（＋２日、０日および−１日）は、著しくより少ない体重低下および増強された回復を示した（図６ａ）。
【０３０１】
Ａ２２の保護能力もまた、マウスの肺におけるウイルス負荷量を測定する全卵力価測定法（２０）を使用して調べた。図６ｂに示されるように、異なる時間間隔について２．５ｎｍｏｌ／ｍｌのＡ２２（１２５ｐｍｏｌ／マウス）で処置されたマウスは、非処置マウスと比較した場合、ウイルス攻撃に対する保護効果を明らかにした。「０日群」における保護効果は最も顕著であり、非処置群と比較した場合、肺のウイルス力価において２以上のｌｏｇ差（これは９９％を越える保護に等しい）で発現した。「＋２日」群および「−１日」群の間におけるＡ２２保護効果の大きな差は認められなかった。
【０３０２】
これらの結果は、Ａ２２が、感染前において、また、感染後数日でさえも効果的であることを示唆している。Ａ２２の低い濃度のみがこの保護実験では使用された（ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度）ので、Ａ２２の保護効果はさらに増大し得ることが考えられることが理解される。
【０３０３】
実施例４
アプタマー処置は様々なインフルエンザ株による感染に対する保護をもたらす
ＨＡの受容体結合領域は非常に保存された領域であるので、Ａ２２の保護効果が他のインフルエンザ株による感染に対してもまた発現するかどうかを調べることは興味深いことであった。アプタマーの効果を、現在利用することができる抗インフルエンザ治療、すなわち、ノイラミニダーゼ阻害剤（オセルタミビル）の効果と比較することもまた興味深いことであった。
【０３０４】
材料および実験手順
材料−オセルタミビルをＲｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ、スイス）から購入した。
【０３０５】
動物および感染手順−本明細書中上記に記載されるように行った。
【０３０６】
結果
結果が図７ａに示される。図７ａは、感染当日でのＡ２２による処置の結果として、３つのインフルエンザ株に感染したマウスにおける肺のウイルス力価の減少を明らかにしている。Ａ２２が、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｊａｐａｎｅｓｅ／３７（Ｈ２Ｎ２）、ならびにＡ／Ｔｅｘａｓ／１／７７（Ｈ３Ｎ２）のすべての試験された株による感染を防止することにおいて効率的であることは注目に値する。これらの知見は、図３ｂに示されたインビトロアッセイの結果を裏付けている。Ａ２２とは対照的に、インフルエンザの核タンパク質領域ＮＰ１４７〜１５８をコードするコントロールの無関係なヌクレオチド（配列番号２２）はウイルス力価の大きな変化をもたらさなかった。アプタマーＡ２１が、Ａ２２よりも効果が小さいが、依然としてＡ／Ｔｅｘａｓ／１／７７（Ｈ３Ｎ２）の肺ウイルス力価を低下させることができたことは興味深いことである（図７ｂを参照のこと）。
【０３０７】
インフルエンザ感染を阻害するＡ２２アプタマーの能力もまた、現在利用することができる抗インフルエンザ薬の１つ（ノイラミニダーゼ阻害剤オセルタミビル）の能力と比較した。この目的のために、Ａ２２およびオセルタミビルの両方を、鼻腔内経路を使用してウイルスとともに１回投与した。下記の表４に示されるように、２０μｇ／マウスのオセルタミビル（１ｍｇ／ｋｇ体重）の用量はウイルス力価を０．６２ｌｏｇＥＩＤ５０ほど減少させた。このことはウイルス負荷量における４．１７倍の減少を表している。これは、この特定の実験におけるＡ２２により影響される１．１ｌｏｇＥＩＤ５０ほどの減少（ウイルス負荷量における１０倍越える減少）と対比される。
【表４】
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【０３０８】
これらの結果は、本発明のアプタマー配列についての作用機構、本質的には、ウイルス細胞表面上のＨＡの受容体結合領域に対する直接的な結合、それにより、宿主細胞に対するウイルスの結合を妨げ、そして、その結果として、宿主細胞へのウイルス進入を妨げることを示唆している。
【０３０９】
実施例５
多数のインフルエンザ株とのアプタマーの交差反応性
多数のインフルエンザ株に対する本発明のＡ２２アプタマーの交差反応性を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。
【０３１０】
材料および実験手順−実施例１に記載される通りに行った。
【０３１１】
結果
本発明のＤＮＡアプタマーはＨＡ９１〜２６１の保存された配列に基づいて設計されたので、ＨＡ９１〜２６１と様々なインフルエンザ株との間での交差反応がＥＬＩＳＡによって明らかにされた。図８ａ〜図８ｅに示されるように、この保存されたペプチドに対して作製された抗体は検討中のすべてのインフルエンザ株と交差反応した。従って、このことは、このペプチドが保存されていることを立証しており、また、本発明のアプタマー薬物の広範囲の潜在的可能性を裏付けている。
【０３１２】
実施例６
組換えＨＡ９１〜２６１ペプチドの作製および特長づけ
実験的手順
ＲＴ−ＰＣＲによるＨＡ９１〜２６１ペプチドの作製−インフルエンザ株Ａ／Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３の総ＲＮＡを単離し、ＨＡタンパク質の残基９１〜９７および残基２５５〜２６１に対応する２つのプライマー（それぞれ、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２０）および５’−ＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＣＣＣ−３’（配列番号２１））、ならびにＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いる逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲのために使用した。得られたＰＣＲ生成物（これはＨＡタンパク質の球状領域の一部（９１〜２６１のアミノ酸）をコードする）をＤＮＡ配列分析によって確認した。その後、ＰＣＲ生成物を遺伝子産物の大腸菌における過剰発現のためにｐＱＥ３０プラスミド（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）にクローン化した。５時間のＩＰＴＧ誘導によって得られた過剰発現ペプチドを、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＰＣＲ生成物はさらに、マウスの筋肉における注射のために、ｐＣＤＮＡ３．１ＨｉｓＣプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローン化された。免疫化研究のために、プラスミドＤＮＡを、Ｅｎｄｏｆｒｅｅプラスミドギガキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して増幅した。
【０３１３】
結果
インフルエンザウイルスＲＮＡのＨＡ９１〜２６１領域をコードするＤＮＡ構築物を哺乳動物発現および細菌発現のために作製した。この目的のために、ＨＡ９１〜２６１配列をコードするｃＤＮＡフラグメントを、インフルエンザＨＡのアミノ酸残基９１〜９７およびアミノ酸残基２５５〜２６１（それぞれ配列番号２０及び２１）に対応するプライマーを使用してＡ型インフルエンザウイルス（すなわち、Ｈ３Ｎ２）からＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ生成物をｐＱＥ３０プラスミドにクローン化し、そのＮ末端部分を、精製のために、読み枠を一致させて６個のＨｉｓ残基で修飾した。過剰発現させ、精製したＨＡ９１〜２６１タンパク質フラグメントは、図９ａに示されるように、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２５ｋＤａのバンドとして移動した。
【０３１４】
ＨＡ９１〜２６１の抗原性を、ＨＡ９１〜１０８ペプチドに対して惹起された特異的なウサギ抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイ、または、インフルエンザウイルスに対するウサギ抗血清を用いたＥＬＩＳＡアッセイによって確認した（図９ｂ）。
【０３１５】
ＤＮＡワクチン接種のために、ＨＡ９１〜２６１ペプチドをコードするＰＣＲ生成物をｐＨＡ９１〜２６１哺乳動物発現ベクターにクローン化し、ＣＭＶプロモーターのもとでマウス細胞において発現させた。ＰＣＲ生成物のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメントをＤＮＡ配列決定分析によって確認し、その後、読み枠を一致させたＡＴＧ開始コドンおよびＮ末端の６個のＨｉｓ残基のもとでｐＣＤＮＡ３．１ＨｉｓＣベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。
【０３１６】
実施例７
ペプチドおよびＤＮＡのワクチン接種により生じる体液性免疫応答
材料および実験手順
免疫化手順および感染手順−８匹〜１０匹のマウスからなる群を、ＨＡ９１〜２６１をコードするプラスミドＤＮＡの１００μｇで筋肉内（ｉ．ｍ．）に免疫化した。マウスに、最初の免疫化のために使用されたのと同じ量の抗原を使用して、３週間間隔で２回の追加抗原刺激を行った。
【０３１７】
ＨＡ９１〜２６１ペプチドに対する免疫化のために、５０μｌのＰＢＳにおいて動物あたり５０μｇのペプチドを、エーテルで軽く麻酔したマウスの鼻孔に（ｉ．ｎ．）投与し、または、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）における同じペプチドで肉趾において注射した。ペプチドワクチンおよびＤＮＡワクチンの混合使用（組み合わされたＤＮＡプライミング−タンパク質追加抗原刺激）のために、マウスには、２回のｉ．ｍ．注射がプラスミドｐＨＡ９１〜２６１を使用して行われ、次いで、ＨＡ９１〜２６１ペプチドによる鼻腔内への追加抗原刺激が行われた。
【０３１８】
マウスの感染を、マウスあたり１ＨＡＵのインフルエンザウイルスを含有する感染性尿膜液の、軽いエーテル麻酔のもとでの鼻腔内接種によって最後の追加抗原刺激の１ヶ月後に行った。
【０３１９】
血清および肺ホモジネートの調製−免疫化マウスにおける特異的な抗インフルエンザ抗体の産生を測定するために、ＩｇＧアッセイ用の血清を、２回目および３回目の免疫化の３週間後に集められた血液から作製した。（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁された）肺ホモジネートに由来する上清液をＩｇＡアッセイおよび肺ウイルス力価の測定のために集めた。
【０３２０】
統計学的分析−統計学的分析を、Ｓｔａｔ−ＶｉｅｗＩＩソフトウエア（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を使用して行った。フィッシャーＰＬＳＤ検定を、確率（ｐ）値を計算するために利用した。結果が、少なくとも２回の繰り返された独立した実験の平均および標準誤差として表される。
【０３２１】
結果
異なるワクチン接種法により誘導される体液性免疫応答−本明細書中上記に記載されるＨＡ９１〜２６１のペプチド調製物およびＤＮＡ調製物を、抗体を誘導するその能力を測定するためにマウスに投与した。
【０３２２】
最後の免疫化の２週間後、ＨＡ９１〜２６１ペプチドまたはプラスミドｐＨＡ９１〜２６１のいずれかで免疫化されたマウス（群あたり２匹のマウス）に由来する肺ホモジネートをＩｇＡレベルの測定のために集めた。免疫化マウスにおけるＩｇＧレベルを測定するために、ＩｇＧアッセイを行った。簡単に記載すると、血清を３回目の免疫化の３週間後に集められた血液から調製した。各群のサンプルを一緒にプールし、完全なウイルスを認識する抗体だけでなく、ＨＡ９１〜２６１ペプチドと反応し得る抗体の存在についてＥＬＩＳＡによって分析した。図１０ａに示されるように、ＨＡ９１〜２６１ペプチドを用いた肉趾による免疫化のみがＩｇＧ抗体を誘発させ、その一方で、ＨＡ９１〜２６１ペプチドを認識する検出可能なＩｇＧ抗体は鼻腔内免疫化の後では認められなかった。しかしながら、完全なウイルスを認識する著しいレベルのＩｇＧ抗体（図１０ｂ）が、アジュバントを何ら伴わないＨＡ９１〜２６１ペプチドを用いた鼻腔内免疫化の後において依然として認められた。
【０３２３】
図１０ｃに示されるように、ＨＡ９１〜２６１ペプチドによって誘導される抗体は、Ｈ１Ｎ１（ＰＲ／８／３４）およびＨ２Ｎ２（Ｊａｐａｎｅｓｅ／５７）を含む異なるインフルエンザウイルス株との交差反応性を示した。
【０３２４】
興味深いことに、ＤＮＡプラスミドｐＨＡ９１〜２６１を用いた免疫化は抗体応答を誘発しなかった（図１０ａ）。
【０３２５】
図１１ａに示されるように、ＨＡ９１〜２６１ペプチドまたはｐＨＡ９１〜２６１プラスミドのいずれも、このペプチドフラグメントを認識するＩｇＡ抗体の産生を誘発することができなかった。しかしながら、ＨＡ９１〜２６１ペプチドで免疫化されたマウスは、完全なウイルスを認識する著しいレベルのＩｇＡ抗体を産生した（図１１ｂ）。対照的に、ＩｇＡ応答が、ｐＨＡ９１〜２６１プラスミドで免疫化されたマウスでは検出されなかった。
【０３２６】
その後、相乗的または付加的な抗体応答をもたらすＨＡ９１〜２６１ペプチドおよびＤＮＡの両方の能力を検討した。この目的のために、ＤＮＡプライミングおよびその後のタンパク質追加抗原刺激による免疫化法を行った。図１０ａ〜図１０ｃおよび図１１ａ〜図１１ｂに示されるように、ＤＮＡおよびペプチドワクチンの組み合わせられた注射は、完全なウイルスに対する著しいレベルのＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体を誘発した。しかしながら、ＨＡ９１〜２６１タンパク質フラグメント単独での注射と比較した場合、明らかな付加的な効果はなかった。
【０３２７】
従って、これらの結果は、本発明の教示に従って作製されたペプチドワクチンおよびＤＮＡワクチンはともに体液性免疫応答を誘導することを示しており、しかし、それをコードするＤＮＡと比較した場合、著しくより大きい抗体産生がペプチドによる免疫化のときに明らかであったことを示している。
【０３２８】
さらに、異なるインフルエンザ株とのＩｇＧ抗体の交差反応性は、ＨＡ分子のＨＡ９１〜２６１球状領域が万能的なワクチン接種をもたらし得ることを示唆している。
【０３２９】
ＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体を誘導する本発明のワクチンの能力は特に重要である。これは、ＩｇＧは血清中に産生されると考えられる一方で、ＩｇＡ抗体は、重要な局所的抗インフルエンザ効果を発揮し得る肺において主に産生されるからである。これらの結果は、気道疾患では、ワクチン保護が気道分泌ＩｇＡの増大と相関するという知見［Ｌｕｅ（１９８８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：３７９３〜３８００；Ｎｅｄｒｕｄ（１９８７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９：３４８４〜３４９２］に照らしてさらに強められる。
【０３３０】
実施例８
ペプチドおよびＤＮＡのワクチン接種により生じる細胞性免疫応答
材料および実験手順
脾臓細胞増殖アッセイ−ＢＡＬＢ／ｃマウスを、上記で記載されたように３週間の間隔で、アジュバントを伴うことなく５０μｇ／５０μｌのＨＡ９１〜２６１ペプチドで（ｉ．ｎ．）免疫化し、または、ＰＢＳにおける１００μｇのｐＨＡ９１〜２６１プラスミドで（ｉ．ｍ．）免疫化した。脾臓を３回目の免疫化の１４日後に解剖し、ＨＡ９１〜２６１ペプチドに対する増殖応答を調べた。細胞を、５ｘ１０５細胞／ウエルをＲＰＭＩ−ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）に含有する０．２ｍｌの培養物の三連を使用して、９６ウエル平底プレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）において培養した。脾臓細胞を示された濃度のＨＡ９１〜２６１ペプチドまたは不活性化された精製ウイルスで刺激し、４８時間培養した。細胞を１ｍＣｉ（３７Ｂｑ）の［３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａｃｉａ、英国）で一晩パルス処理した。チミジン取り込みをＰａｃｋａｒｄβ−カウンターで測定した。
【０３３１】
サイトカインアッセイ−抗体および精製サイトカインをＰｈａｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た。精製された抗サイトカイン捕獲ｍＡｂを、炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２）において２μｇ／ｍｌ（ラット抗マウスＩＬ−４）または４μｇ／ｍｌ（ラット抗マウスＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ）に希釈して、ＥＬＩＳＡプレートに被覆し、４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ）で洗浄した後、プレートを、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を含むＰＢＳを用いて、ウエルあたり２００μｌで室温で２時間でブロッキング処理した。標準サンプルおよび希釈サンプルをウエルに加え、４℃で一晩インキュベーションした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ／１０％血清におけるビオチン化抗サイトカイン検出ｍＡｂを各ウエルに１時間加えた。その後、ペルオキシダーゼコンジュゲート化アビジンを加え、アッセイを、ＥＬＩＳＡについて記載された工程と同じ工程を使用して進めた。サイトカインを、上記のように捕捉および検出された精製サイトカインの標準曲線との比較によって定量した。
【０３３２】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ−ＣＴＬ殺傷アッセイを、本質的には、Ｚｗｅｅｒｉｎｋ他（１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：６３０〜６３５）によって記載されるように行った。簡単に記載すると、ＨＡ９１〜２６１ペプチドおよび／またはｐＨＡ９１〜２６１ＤＮＡで免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞を、インフルエンザＡ／Ｔｅｘａｓ／７７ウイルスをインビトロ感染させた同系の実験未使用の脾臓細胞で５日間刺激した。Ｐ８１５標的細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ６４）を、ＲＰＭＩ＋ＨＥＰＥＳ（ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンｎ’−（２−エタンスルホン酸））において、３７℃、５％ＣＯ２で、放射性クロム酸ナトリウム（５１Ｃｒ、１０６個の細胞に対して５μＣｉ）およびインフルエンザウイルスと９０分間インキュベーションした。エフェクター脾臓細胞を集め、洗浄し、徹底的に洗浄された標的細胞と様々なキラー対標的比で３７℃において５時間インキュベーションした。標的細胞の溶解を培地への５１Ｃｒ放出によってモニターし、自然放出についての補正の後の総放出（これは１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）による標的細胞の溶解によって測定される）の百分率として表した。
【０３３３】
結果
ＨＡ９１〜２６１による増殖性脾臓細胞応答の誘導−Ｔヘルパー活性を生じさせる際の効率を評価するために、免疫化マウスの脾臓における細胞性免疫応答をチミジン取り込みにより調べた。図１２ａに示されるように、ペプチド免疫化マウスから得られた脾臓細胞は、ＨＡ９１〜２６１ペプチドと同時インキュベーションされたとき、非常に増殖した。興味深いことに、ＨＡ９１〜２６１ペプチドに対するこの細胞応答は、示された濃度のＨＡ９１〜２６１ペプチド（すなわち、５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ、ならびに３．１／５μｇ、４．７／１０μｇおよび６．２／２０μｇの刺激）との相互作用によって示されるように用量依存的であった。ＨＡ９１〜２６１ペプチドで免疫化されたマウスはまた、完全なウイルスに対する正の増殖応答を示した（図１２ｂ）。対照的に、ＤＮＡフラグメントで免疫化されたマウスから得られた脾臓細胞において観測された増殖応答はほとんど検出できなかった。組み合わされたＤＮＡプライミング−タンパク質追加抗原刺激のとき、正の応答を完全なウイルスに対してのみ認めることができ、そして、この場合でさえも、その応答は、ＨＡ９１〜２６１ペプチド単独で得られた応答よりも大きくなかった（図１２ｂ）。
【０３３４】
ＨＡ９１〜２６１ペプチドによる免疫化の後で産生されたＴ細胞サブタイプを特徴づけるために、サイトカイン放出プロフィールを明らかにした。図１３ａ〜図１３ｂに示されるように、ＨＡ９１〜２６１で免疫化されたマウスから得られた脾臓細胞のみが、精製ペプチドおよび完全なインフルエンザウイルスの両方に応答して著しいレベルのＩＬ−２（図１３ａ）およびＩＦＮ−γ（図１３ｂ）を分泌した。このことは、これらのリンパ球がＴｈ１サブタイプに属することを示す。この細胞サブタイプは抗体依存的な細胞媒介型細胞傷害性および感染細胞のクリアランスに関係づけられる。対照的に、Ｔｈ２応答を表すＩＬ−４およびＩＬ−１０は検出することができなかった（データは示されず）。サイトカイン分泌が、ＤＮＡまたはそのペプチドの組合せで免疫化されたマウスから得られた細胞によって全く観測されなかった。
【０３３５】
ｐＨＡ９１〜２６１ＤＮＡ免疫化によるＣＴＬ応答の誘導−ＣＴＬ記憶細胞を活性化するために、ｐＨＡ９１〜２６１ＤＮＡ構築物またはＨＡ９１〜２６１ペプチドで免疫化されたマウスから得られた脾臓細胞を、インフルエンザウイルスを感染させた抗原呈示細胞で刺激した。得られたエフェクター細胞を、非処置であるか、または様々なエフェクター対標的細胞比でウイルスを感染させた５１Ｃｒ標識のＰ８１５標的細胞とインビトロで同時インキュベーションした。
【０３３６】
図１４ａ〜図１４ｂに示されるように、ＣＴＬが、ＤＮＡ構築物で免疫化されたマウスにおいてウイルス刺激の後でのみ明らかであり、そのような刺激は、ウイルス感染した標的細胞の特異的な溶解をもたらした。そのような応答は、ＨＡ９１〜２６１ペプチドまたは組み合わされたＤＮＡプライミング−タンパク質追加抗原刺激で免疫化されたマウスでは観測されなかった。
【０３３７】
ＤＮＡワクチン接種により誘導されるＣＴＬ活性は、ＤＮＡワクチン接種後におけるウイルス抗原に対する好ましいＣＴＬ応答を立証する以前の知見［Ｒａｚ（１９９６）、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：５１４１〜５１４５；Ｕｌｍｅｒ（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：１７４５〜１７４９］と一致している。例えば、異種ウイルスの攻撃に対するマウスのクラスＩ限定ＣＴＬおよび保護の誘導が、ＮＰまたはＨＡをコードするプラスミドＤＮＡに関して明らかにされている［Ｊｏｈｎｓｏｎ（２０００）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８１：１７３７〜１７４５］。
【０３３８】
しかし、これらの結果は、ＨＡ分子の同じ領域に対応するＤＮＡフラグメントおよびペプチドフラグメントにより誘発される免疫応答経路の違いを示唆している。
【０３３９】
実施例９
ＨＡペプチド免疫化はインフルエンザウイルス感染から保護する
材料および実験手順
ウイルス抗原投与に対する保護アッセイ−免疫化後１ヶ月目に、免疫化マウスに、１ＨＡＵ／マウスを含有する感染性尿膜液のｉ．ｎ．接種物を投与した。５日後、（上記で記載されたように）マウスを屠殺し、肺および血液サンプルを取り出し、−７０℃で保存した。アッセイの直前に、肺を解凍し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（１０％ｗ／ｖ）中でホモジネートし、破砕物を除くために遠心分離した。ウイルス力価を全卵力価測定法［Ｆａｙｏｌｌｅ（１９９１）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：４０６９〜４０７３］によって測定した。肺ホモジネート（１００μｌの１０倍連続希釈物）を９日目〜１１日目の孵化卵の尿膜腔に注入した。３７℃で４８時間のインキュベーションおよび４℃で一晩のインキュベーションの後、尿膜液を取り出し、ウイルスの存在を、５０μｌの尿膜液と、生理的食塩水における０．５％ニワトリ赤血球の５０μｌとを含有するマイクロタイタープレートにおいて、赤血球凝集によって測定した。結果が、特定のホモジネート希釈度（１０−８）における陽性肺の百分率、ならびにＬｏｇＥＩＤ５０（２０）として表される。
【０３４０】
結果
ＨＡ９１〜２６１ペプチドおよび対応するＤＮＡフラグメントｐＨＡ９１〜２６１の両方によって誘導される正の体液性免疫応答および細胞性免疫応答に照らして、ウイルス抗原投与に対する保護免疫性をもたらすこれらの薬剤の能力を検討した。ペプチドまたはＤＮＡ構築物による鼻腔内免疫化または筋肉内免疫化（３週間の間隔での３回の投与）をそれぞれ行った後、マウスを最後の追加抗原刺激の１ヶ月後に１ＨＡＵのインフルエンザＡ／Ｔｅｘａｓ／１／７７ウイルスで抗原投与した。５日後、動物を屠殺し、肺における感染性ウイルスの存在を測定した。図１５ａ〜図１５ｂに示されるように、ＤＮＡ構築物またはＨＡ９１〜２６１ペプチドのいずれかで免疫化されたマウスは、非免疫化マウスと比較して、ウイルス抗原投与に対する著しいレベルの保護（８０％に近い）を明らかにした。しかしながら、ＤＮＡおよびペプチドの組み合わされたワクチン接種は、完全なウイルスに対する著しい細胞性免疫応答を誘発したとしても、保護を誘導しなかった。
【０３４１】
これらの結果は、本発明の教示に従って作製されたペプチドワクチン接種およびＤＮＡワクチン接種はともにウイルス感染に対して動物を保護することを示している。
【０３４２】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの変形と変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような変形と変更をすべて含むものである。本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び特許願は、あたかも、個々の刊行物、特許又は特許願各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
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【配列表フリーテキスト】
【０３４３】
配列番号２〜１０，１３，１４および１５は合成ペプチドの配列である。配列番号１１，１２および２３は合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号１６〜２２は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図３ａ−ｂ】
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【図３ｃ−ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ−ｄ】
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【図８ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【配列表】
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