(57)【要約】【課題】持続性作用または長期間作用を有しているガストリン化合物を含む組成物が必要とされている。【解決手段】本明細書中で提供される本発明の１つの実施形態は、自然界に存在しているガストリンと比較して被験体に投与した際に長い間活性を有するガストリン化合物を含む薬学的組成物である。ガストリン／ＣＣＫ受容体、種々のキャリア部分に結合する機能的な能力を有しているガストリンのアミノ酸配列の部分を結合させる方法が提供され、この方法には、アミノ酸スペーサー領域の使用、および二官能性架橋試薬の使用が含まれる。この組成物を用いて糖尿病患者を処置する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端からＺ−Ｙｍ−Ｘ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６を含むアミノ酸配列を含むガストリン化合物であって、ここで、ＡＡ１はＴｙｒであり、ＡＡ２はＧｌｙであり、ＡＡ３はＴｒｐであり、ＡＡ４はＬｅｕであり、ＡＡ５はＡｓｐであり、ＡＡ６はＰｈｅであり、該ＡＡ６はアミド化されており；ここで、Ｚはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）から選択されるポリマーであり；Ｙｍは存在しないか、またはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａスペーサーであり、Ｘは配列番号４のアミノ酸残基１〜１１であり；但し、該ガストリン化合物は、ガストリン／ＣＣＫレセプターに結合する、ガストリン化合物。
【請求項２】
Ｘが配列番号４の２位から１１位の配列である、請求項１記載のガストリン化合物。
【請求項３】
Ｘのアミノ末端にてシステイン残基をさらに含む、請求項２記載のガストリン化合物。
【請求項４】
Ｘのアミノ末端にてリジン残基をさらに含む、請求項２記載のガストリン化合物。
【請求項５】
Ｚがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のガストリン化合物。
【請求項６】
Ｚがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のガストリン化合物。
【請求項７】
構造Ｃ−Ｙ−Ｘを含むガストリン化合物であって、Ｃがシステインまたはリジンであり、Ｙが存在しないか、またはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａスペーサーであり、Ｘがポリエチレングリコールにコンジュゲートしたガストリン１７（配列番号３および４）のアミノ酸残基２〜１１である、ガストリン化合物。
【請求項８】
糖尿病を処置するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のガストリン化合物。
【請求項９】
ガストリンのアミノ酸配列を有するペプチドの血清レベルと比較してガストリン血清レベルの増加の期間を延長するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のガストリン化合物。
【請求項１０】
糖尿病を処置するための医薬の調製のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のガストリン化合物の使用。
【請求項１１】
ガストリンのアミノ酸配列を有するペプチドの血清レベルと比較して、ガストリン血清レベルの増加の期間を延長するための医薬の調製のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のガストリン化合物の使用。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のガストリン化合物および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも１種のガストリン化合物の有効用量を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の実施形態において、ガストリンペプチドよりも生体内で長い間活性な機能を有するガストリン組成物、および糖尿病の処置のためのガストリン組成物を作成し、使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
疾患の処置に使用されるペプチドおよび低分子量のタンパク質のような治療薬には、かなりの制限がある。これらの薬剤は、多くの場合、短時間のうちに腎臓によって排出されるか、またはプロテアーゼによって分解され、したがってその生体利用性には限界があり、その結果として有効であるために必要とされるよりも短い血漿半減期および低い薬剤濃度となっている。治療薬の高いクリアランスは、最大効力を得るためには長い期間にわたって高い血清濃度を維持することが望ましい場合には最適ではない。高用量または高い投与頻度により、多くの場合は高い治療効力が得られるが、副作用のリスクもかなり高く、これにより投与することができる用量または頻度が制限されている。
【０００３】
多くのペプチドホルモンは血流中では極めて短い半減期を有しており、これによって投与後間もなく生物学的活性が失われる。ガストリンは糖尿病の処置に有効な他の成長因子との組み合わせが示されているペプチドホルモンである。しかし、ガストリンを単独で投与した場合には、ごく限られた効力しか得られない。さらに、ガストリンは比較的半減期が短いことが明らかにされている。ガストリン−１７は、例えば、約５〜９分の血液循環中での半減期を有しており、一方で、ガストリン−３４は約３５分の血液循環中での半減期を有している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
持続性作用または長期間作用を有しているガストリン化合物を含む組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の特徴的な実施形態では、自然界に存在しているガストリンと比較して、被験体に投与した際に長い間活性を有するガストリン化合物を含む薬学的組成物が提供される。この実施形態のガストリン成分は、配列番号１の２９位〜３４位；配列番号２の２９位〜３４位；配列番号３の１２位〜１７位；および配列番号４の１２位〜１７位の群より選択される少なくとも複数のアミノ酸を含み、そしてガストリンはさらに、タンパク質、高分子、脂質、または炭水化物に結合させられる。
【０００６】
別の特徴的な実施形態では、Ｚ−Ｙｍ−Ｘｎ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６を含むガストリン化合物が提供される。式中、ＡＡ１はＴｙｒまたはＰｈｅであり、ＡＡ２はＧｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒであり、ＡＡ３はＴｒｐ、Ｖａｌ、またはＩｌｅであり、ＡＡ４は、ＭｅｔまたはＬｅｕであり、ＡＡ５はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ＡＡ６はＰｈｅまたはＴｙｒであり、ＡＡ６はアミド化されている。Ｚは高分子であり、高分子がタンパク質である場合にはＺはタンパク質のアミノ酸配列であり；Ｙｍは小さい中性アミノ酸のｍ個のアミノ酸残基を含む任意的なスペーサー領域であり、Ｘは、ガストリン化合物がガストリン／ＣＣＫ受容体に結合するという条件で、配列番号１の残基１〜２８、配列番号２の残基１〜２８、配列番号３の残基１〜１１、および配列番号４の残基１〜１１の任意の連続する部分から選択される。ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６は、例えば、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅである。あるいは。ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６が、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅである。この式では、Ｚはタンパク質であることができ、例えば、Ｚはヒトの血清アルブミンである。
【０００７】
Ｙｍはグリシンとアラニンを交互に、例えば、［Ｇｌｙ−Ａｌａ］５を有しているか、またはグリシンおよびアラニンのランダムな配列を有しているｍ個の残基を含むアミノ酸配列であることができる。ガストリン化合物はさらに、ｍが１以上である場合はＹのアミノ末端に、またｍが０である場合にはＸのアミノ末端に、システイン残基を有することができる。ガストリン化合物はさらに、Ｚへの結合のための二官能性架橋剤を含むことができる。一般的には、ｍは０から約２０残基である。特定の実施形態では、ｍが０である場合は、Ｘｎ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６は、Ｚの結合のための二官能性架橋剤をさらに含む。
【０００８】
Ｘは、特定の実施形態では、配列番号３の１位から１１位；配列番号４の１位から１１位；配列番号３の２位から１１位；および配列番号４の２位から１１位の配列の群より選択される。Ｚがタンパク質であるガストリン化合物は、組み換えによって生産することができる。
【０００９】
本明細書中に提供される別の実施形態は、Ｚがタンパク質であるガストリン化合物をコードするヌクレオチド配列である。このヌクレオチド配列を有している細胞がさらに提供される。細胞は、細菌または酵母細胞である。細胞が細菌細胞である場合は、これは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、および放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種の細胞であることができる。細胞が酵母細胞である場合は、これは、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリュイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の種の細胞であることができる。
【００１０】
ガストリン化合物は、一般に、配列番号２の２９位〜３４位、または配列番号４の１２位〜１７位の少なくとも複数のアミノ酸である、最小ガストリン成分を含む。これらは、血液循環中に存在しているガストリンのカルボキシ末端に存在し、種々の実施形態では、例えばガストリンに由来する別のアミノ酸を存在させることができる。
【００１１】
高分子成分は必ずしもタンパク質には限定されず、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはデキストランのような合成の化学的な高分子であってもよい。高分子がタンパク質である場合は、種々の実施形態において、これは血清タンパク質、例えば、血清アルブミン（例えば、ヒトの血清アルブミン）であることができる。
【００１２】
本明細書中で提供されるガストリン化合物の別の実施形態は、構造Ｃ−Ｙｍ−Ｘを含む。式中、ＣはＣｙｓまたはＬｙｓであり、Ｙｍは小さい中性アミノ酸のｍ個のアミノ酸残基を含む任意的なスペーサー領域であり、Ｘは、ガストリン−１７の少なくとも１２位〜１７位（配列番号３および４）、およびガストリン−３４の少なくとも２９位〜３４位（配列番号１および２）から選択される配列を有する少なくとも６個のアミノ酸残基である。ガストリン化合物は、さらに高分子に、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはデキストランに結合させられる。ガストリン化合物はさらに、タンパク質に別の方法で結合させられる。特定の実施形態では、ガストリン化合物は、さらに二官能性架橋剤を含む。ここでは、架橋剤の第１の反応性末端がＣに共有結合させられる。架橋剤の第２の反応性末端は高分子またはタンパク質に共有結合させられている。Ｃ−Ｙｍ−Ｘは組み換えによって生産することができ、また、ペプチド合成によって合成することもできる。
【００１３】
本明細書中で提供される任意のガストリン化合物は、特定の実施形態では、有効用量で提供される。本明細書中で提供されるガストリン化合物はさらに、免疫抑制のための薬剤を含むことができる。本明細書中で提供されるガストリン化合物はさらに、血糖降下剤を含むことができる。本明細書中で提供されるガストリン化合物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含むことができる。本明細書中で提供されるガストリン化合物はさらに、成長因子を含むことができる。例えば、特定の実施形態では、成長因子はグルカゴン様ペプチド１受容体リガンドである。あるいは、特定の実施形態では、成長因子はＥＧＦ受容体リガンドである。
【００１４】
糖尿病の被験体を処置するための医薬品の製造方法を含む本発明の実施形態もまた、本明細書中で提供される。この方法には、本明細書中に記載されるもののいずれかになるようにガストリン化合物を処方する段階、およびガストリン化合物を被験体に投与する段階が含まれる。この方法の特定の実施形態では、ガストリン化合物の投与頻度は、自然界に存在しているガストリンの投与頻度よりも少ない。この方法にはさらに、島新生の生理学的指標を測定する段階、例えば、空腹時血糖（ＦＢＧ）を測定する段階が含まれる。この方法には、インシュリン依存性を軽減することも含まれる場合がある。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態では、ガストリン化合物を作成する方法が提供される。この方法は、ガストリンのアミノ酸配列をキャリア組成物と結合させることである。したがって、ガストリンをキャリアと結合させる前に、ガストリンは、システイン置換または別のシステイン残基を含むように修飾される。システイン置換はピログルタミン酸の置換である。ガストリンのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列の残基２９〜３４；配列番号２のアミノ酸配列の残基２９〜３４；配列番号３のアミノ酸配列の残基１２〜１７；および配列番号４のアミノ酸配列の残基１２〜１７の群より選択される部分を少なくとも含む。特定の実施形態では、システインは、ガストリンのアミノ末端にある。あるいは、この方法には、ガストリンをキャリアに結合させる前に、ガストリンを二官能性架橋剤をさらに含むように修飾する段階が含まれる。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、糖尿病患者を処置するための医薬品の製造方法が提供される。この方法には、血清タンパク質と共有結合により反応することができる修飾されたガストリン化合物を処方する段階、および修飾されたガストリンを患者に投与する段階が含まれる。修飾されたガストリンは、ガストリン／ＣＣＫ受容体に結合することができる自然界に存在しているガストリンの配列と、アミノ末端のシステインまたはリジンを含む。したがって、自然界に存在しているガストリンの配列は、配列番号１のアミノ酸配列の残基２９〜３４；配列番号２のアミノ酸配列の残基２９〜３４；配列番号３のアミノ酸配列の残基１２〜１７；および配列番号４のアミノ酸配列の残基１２〜１７の群より選択される。
【００１７】
ガストリンのアミノ酸配列を有しているペプチドの血清濃度と比較して高いガストリンの血清濃度をより長い期間保つための医薬品の製造方法もまた、本明細書中で提供される。この方法には、上記ガストリン化合物を処方する段階、およびガストリン化合物を投与する段階が含まれる。
【００１８】
本明細書中に記載されるガストリン化合物の少なくとも１つの有効用量を含むキットもまた、本明細書中で提供される。
【００１９】
長期間作用するガストリン化合物を使用することにより、ガストリンのクリアランスを減少させることができるか、または酵素によるガストリンの分解を少なくすることができ、それによって、高濃度の血漿ガストリンを長い間維持し、そして／またはガストリンの半減期を長くして、結果として効率を高めることができる。用量レジュメは、糖尿病患者に対して、低い用量を使用するか、および／またはガストリンの投与頻度を少なくすることによって改良することができる。さらに、ガストリンをキャリアに結合させることを用いて、一部のキャリアは免疫系からガストリンを隠すことができ、それによってガストリンが免疫反応を誘発することを減少させるか、またはそれを防ぐことができ、さらに、血清ガストリンの半減期を長くし、そして／または高い血清ガストリン濃度を維持することもできる。
【００２０】
本発明は、一般的な実施形態において、本明細書中でガストリン化合物と呼ばれる、ガストリン様の活性を有している組成物を提供する。用語「ガストリン化合物」は、本明細書中で使用される場合は、ガストリン／ＣＣＫ受容体に結合する、それと相互作用する、またはそれを刺激する試薬を意味する。ガストリン化合物として、ガストリン誘導体および結合体、ならびにガストリン／ＣＣＫ受容体と相互作用することができるペプチド相同体が挙げられる。用語「誘導体」および「結合体」は、本明細書中で使用される場合は、同等の語句であり、化学的に関係している組成物を示すために使用され、合成手段、生物学的手段、組み換え手段、または化学的手段によって調製することができる。
【００２１】
種々の実施形態では、「修飾された」ガストリンを調製して、糖尿病を有している患者を処置するために使用することができる。用語「糖尿病」は、本明細書中で使用される場合は、インシュリンが不足している、インシュリンに対する抗体を生産している、または血糖値が高すぎる、あるいは実験用動物モデルを含む任意の哺乳動物の糖尿病の症状のいずれかを発症している生理的な適応症を意味し、これには、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病のようなヒトでの形態、初期糖尿病、およびインシュリンが少し少ないかもしくは血糖値が少し高いことによって特徴付けられる前糖尿病の症状が含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「哺乳動物」は、哺乳動物のあらゆるメンバーの通常の意味を有しており、これにはヒトが含まれる。
【００２２】
修飾されたガストリンは、６個のアミノ酸の最小配列（Ｃ末端に由来する）を含み、さらに、別の反応を受けることができるシステイン残基のような反応基が付加されている、ガストリン誘導体または類似体であり得る（配列番号１〜４を参照）。種々の実施形態では、ガストリンは３４アミノ酸（「大きな」ガストリンまたはガストリン−３４）までの長さであることができ、ここでは、システイン残基またはリジン残基のような少なくとも１つの反応性アミノ酸がＮ末端に付加されているか、またはＮ末端で置換されている。システインのような反応性アミノ酸の付加は末端領域で行うことができ、関連する実施形態では、スペーサー領域を、必要に応じて、付加される反応性アミノ酸の前に存在させることができる。例えば、スペーサーは、ガストリンアミノ酸配列の一部として生物学的に合成することができ、またガストリンアミノ酸配列に化学的に結合させて、ガストリン配列−スペーサー−システインを有する構造を形成させることもできる。例えば、スペーサー領域は、アラニンまたはグリシンのようないくつかのアミノ酸の配列であり得る。アミノ酸の配列は、交互アミノ酸（例えば、グリシン／アラニン）であってもよく、また交互ではなくてもよい、すなわち、ランダムな配列もしくは特定の配列であってもよい。配列は、少なくとも１つのアミノ酸から構成され得る。
【００２３】
別の実施形態では、反応性の成分である二官能性架橋剤が、修飾されたガストリンに、特に、アミノ末端に反応基（例えば、システイン）が付加されているガストリンに対して、またはスペーサーを有している修飾されたガストリンに対して、架橋基のホモ二官能性部分もしくはヘテロ二官能性部分を介して、一方の末端にチオールもしくはアミノ基のような反応基を有している修飾されたガストリンを生じるように（例えば、カルボキシ末端、ガストリン−スペーサー−ｃｙｓ−架橋基−キャリア；ガストリン−ｃｙｓ−架橋基−キャリア；ガストリン−スペーサー−ｃｙｓ／−露出させられている反応基を有している架橋基、およびガストリン−ｃｙｓ−露出させられている反応基を有している架橋基によって列挙されるものを形成するように）付加される。
【００２４】
修飾されたガストリンは、その後、この状態で患者に注射されるか、または患者から得られた全血清もしくは血清画分のような１つ以上の血漿成分；アルブミン、トランスフェリン、もしくは免疫グロブリンのような１つ以上の精製された血清タンパク質（単数または複数）；脂質／脂溶性部分／疎水性部分；またはデキストランもしくはＰＥＧのような重合性のキャリアに対して、注射の前に生体外でさらに結合させられるかのいずれかが行われる。用語「高分子」には、本明細書中および特許請求の範囲で使用される場合は、アミノ酸、糖、ヌクレオシドの高分子、合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、およびそれらの混合物が含まれる。高分子は、例えば、結合の前に、二官能性架橋基を用いて、または他の化学的手段によって活性化することができる。活性化されたガストリン化合物またはガストリン結合体の投与により、自然界に存在しているガストリンの投与と比較して、長い血清半減期が生じ、そして／または高い血漿ガストリン濃度が長期間にわたって維持される。
【００２５】
本発明では、一般的な実施形態において、ガストリン化合物であり、共有結合によってではなく、または共有結合体としてのいずれかで、あるいはアミノ酸配列を有している別のペプチド性化合物に対する融合タンパク質として、ポリマーのような大きな分子と結合させることができる部分を有している、ガストリン組成物が提供される。本明細書中で提供されるガストリン化合物は、自然界に存在している形態のガストリンと比較して、被験動物または患者の血液循環においてより長い半減期を有しており、そして／または長い期間にわたって生体内でより高い濃度でガストリン化合物を維持する。さらに、本発明では、他の実施形態において、ガストリン化合物を作成し、使用する組成物および方法が提供される。これは、患者に対して、単独で、または糖尿病の処置のための少なくとも１つの成長因子と、血糖降下剤と、または免疫抑制剤と組み合わせてのいずれかで投与される。成長因子の例としては、ＥＧＦのようなＥＧＦ受容体リガンド、ＧＬＰ−１のようなＧＬＰ−１受容体リガンド、プロラクチンのようなプロラクチン受容体リガンド、および成長ホルモンのような成長ホルモン受容体リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制剤の例としては、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、およびダシリツマブが挙げられるがこれらに限定されない。血糖降下剤の限定的ではない例としては、スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアニド、チアゾリジンジオン、およびα−グルコシダーゼ阻害因子が挙げられる。
【００２６】
１つの実施形態では、ガストリン化合物は、血液中で比較的大きな構造、または複数の構造に結合することができ、なおも標的タンパク質、すなわち、ガストリン／ＣＣＫ受容体に結合するその能力を保持することができる。通常は、そうでなければ体内で迅速に分解されるガストリンは、キャリアタンパク質に結合させられる。この組成物を使用して、長期間にわたる薬剤の効力を得ることができる。あるいは、ガストリン化合物を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはデキストランのような重合性のキャリアに結合させて、同様の目的を達成することもできる。
【００２７】
特定の実施形態では、ガストリンの化学的修飾を使用して、生体外（体外）または生体内のいずれかでキャリアタンパク質または重合性キャリアに対して共有的または非共有的に反応する化合物が提供される。関連する実施形態では、非共有的な相互作用は静電気相互作用または疎水性相互作用である。関連する実施形態では、キャリアへの修飾されたガストリンの結合は、注射の前に行われる。他の実施形態では、ガストリンは、注射された際に、血流中でキャリアに対して高い親和性を有するような様式に修飾される。別の実施形態では、長期間作用するガストリン化合物は、生体内または体外のいずれかで、キャリアタンパク質を必要としない化学的な修飾によって得られる。
【００２８】
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は血漿タンパク質である。関連する実施形態では、血漿タンパク質はアルブミンまたは免疫グロブリン、あるいは免疫グロブリンの複数の構成要素である。免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの複数の構成要素は、結合の前に修飾することができるか、または一部を欠失させることができる。特定の実施形態では、重合性キャリアはポリエチレングリコールまたはデキストランである。例えば、活性化されたＰＥＧは、ガストリン化合物中のアミノ基を通じてガストリン化合物に結合させることができる（Ｖｅｒｎｏｎｅｓｅ，ＦＭ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２（２００１）−４０５−４１７）。
【００２９】
他の実施形態では、アミノ酸の配列であるガストリン化合物は、これもまたアミノ酸の配列であるキャリアタンパク質と、標準的な組み換え遺伝子技術を用いて、注射の前に遺伝子融合させられる。ガストリンは、例えば、小さい中性の電荷を有していないアミノ酸の配列を含む、リンカー／スペーサーを用いて、またはそのようなリンカー／スペーサーを用いることなく、キャリアタンパク質と組み換えによって融合させることができる。ガストリンをコードする核酸は、キャリアタンパク質の一部または全体に対する融合体として、組み換えによって融合させることができるか、または直接合成することができ、核酸構築物または融合タンパク質は、２つのタンパク質の間のスペーサーとして働く複数の別のアミノ酸をコードするか、または組み込むことができる。組み換え融合タンパク質は、酵母（サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））、または標準的な細菌システムにおいて発現させることができ、また、哺乳動物もしくは昆虫細胞システムを使用することもできる。発現および／または精製のための標準的な手順の後に、融合タンパク質を治療的に使用することができる。ガストリン化合物のポリペプチドの配列に対する修飾を、必要な場合には、融合タンパク質の構築の間に導入することができる。
【００３０】
１つの実施形態では、キャリアタンパク質またはキャリアである非タンパク質性の高分子のような別の化合物とのさらなる接触の際に反応基がキャリアタンパク質または高分子と共有結合による相互作用を形成することができるように、リジンまたはシステインのようなアミノ酸上に存在する反応基のような反応基が導入されるようにガストリン化合物が修飾される。例えば、反応性チオール基を、例えば、スクシンイミジル３−２−ピリジルジチオプロピオン酸（ＳＰＤＰ）を使用して、リジン上のアミノ基を通じてガストリン分子に付加することができ、その後、ＤＴＴで還元して活性なチオール基を遊離させることができる（「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ，ａ  ｎｅｗ  ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ．」Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ｊ、Ｄｒｅｖｉｎ  Ｈ，Ａｘｅｎ  Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １７３，７２３−７３７（１９７８））。さらに、二官能性基を、システインまたはリジンを付加した後に付加することができ、その結果、架橋剤の一方の反応性末端はシステイン／リジンと反応し、他方の末端の反応性末端は露出させられたままであるか、またはキャリアに結合させられる。
【００３１】
チオールをまた、ＥＤＡＣ媒介性のシスタミンとの反応によってカルボン酸基に組み込み、その後ＤＴＴでジスルフィドを還元することができる（「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｔ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｓｉｔｅｓ．」Ｌｉｎ  ＣＭ，Ｍｉｈａｌ  ＫＡ，Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＲＪ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １０３８，３８２−３８５（１９９０））。限定的ではない例において、ガストリンのリジン残基上のアミノ基のスクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸との反応（「Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ａｎｄ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｎ−（４−ｃａｒｂｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｍｅｔｈｙｌ）−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ．」Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  Ｓ，Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｅ，Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ  Ｒ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０１，３９５−３９９（１９７９））により、ガストリンのアミノ部位に、キャリアタンパク質のシステイン残基または活性化された高分子上の遊離のチオール基とその後に反応することができる、チオール反応基が導入される。
【００３２】
ガストリン化合物−キャリア複合体は、ガストリン化合物−キャリア複合体の調製もしくは単離を容易にするか、またはガストリン化合物の機能的活性を高めるかもしくは維持することができる、スペーサーアームまたはエレメントまたは他の成分を含む、さらなる調節成分を含むことができる。スペーサーアームは、１つ以上のアミノ酸、ペプチド、ペプチド模倣物、または小さい有機分子であり得、ホモ二官能性もしくはヘテロ二官能性架橋試薬、またはキチンオリゴマーもしくはポリエチレングリコールまたは関連する高分子を含むことができる。
【００３３】
別の実施形態では、キャリアとガストリン化合物とは、スペーサーアームを伴って、またはスペーサーアームを伴うことなく共有結合することができる。スペーサーアームを含まない（ゼロ長架橋）例として、ＥＤＣが挙げられる。スペーサーアームを形成するホモ二官能性架橋基は、例えば、ジスクシンイミジルスベレートであり得、スペーサーアームを形成するヘテロ二官能性架橋基は、例えば、２−イミノチオラン、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）および４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）であり得る。
【００３４】
種々の実施形態において、ガストリン化合物は、高分子、例えば、タンパク質のような大きなキャリア部分と結合させられる。結合が共有結合または非共有結合である場合は、タンパク質はキャリアタンパク質と考えることができる。複数のクラスのキャリアタンパク質は、抗原性ではない、すなわち、自然界に存在しているヒトのタンパク質であるという性質を有することができ、血液循環において保たれ得る。理想的なキャリアタンパク質は、ヒトの血液循環系において通常見ることができるタンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、処置の１４日後の、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスの空腹時血糖値に対する未修飾のガストリンの効果を示す。
【図２】図２は、処置の１４日後の、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスの膵臓でのインシュリン濃度に対する未修飾のガストリンの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書中で使用される場合は、用語「ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド」には、ガストリン／ＣＣＫ受容体に結合する、それと相互作用する、またはそれを刺激するあらゆる化合物が含まれる。このようなガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドの例は、２００１年９月１１日に発行された米国特許第６２８８３０１号に示されており、これには、ガストリン３４（大きなガストリン）、ガストリン１７（短い（ｌｉｔｔｌｅ）ガストリンまたは小さい（ｓｍａｌｌ）ガストリン）、ガストリン１４、ガストリン１３、ガストリン−１０、およびガストリン８、ペンタガストリン、テトラガストリンのような種々の形態のガストリン；ＣＣＫ５８、ＣＣＫ３３、ＣＣＫ２２、ＣＣＫ１２、およびＣＣＫ８のような種々の形態のコレシストキニン；ならびに他のガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドが含まれる。一般的には、ガストリン／ＣＣＬ受容体リガンドは、カルボキシ末端のアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−アミドを共通して有している。上記のメチオニン（Ｍｅｔ）はロイシンで置き換えることができる。上記の活性な類似体、断片、および他の修飾体（ガストリン／ＣＣＫ受容体のペプチドアゴニストおよび非ペプチドアゴニストの両方、または部分的なアゴニスト、例えば、Ａ７１３７８を含む）も想定される（Ｌｉｎ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８（４  Ｐｔ  １）：Ｇ６４８，１９９０）。
【００３７】
ガストリン１７のようなガストリンの小さい形態は、ペプチド合成によって経済効率よく調製されており、合成ペプチドが市販されている。１５位にメチオニンまたはロイシンを有しているヒトガストリンのような、合成のヒトガストリン１７はまた、Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから、およびＲｅｓｅａｒｃｈｐｌｕｓから入手することもできる。自然界において見出されているガストリンペプチドは、カルボキシル末端がアミド化されたペプチドであり、カルボキシル末端アミノ酸のアミド化は本明細書中のガストリン化合物の範囲内に含まれる。
【００３８】
ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドには、上記リガンドの活性な類似体、断片、および他の修飾体も含まれる。これらは、例えば、内因性の哺乳動物のガストリンと、共通のアミノ酸配列を有しており、例えば、６０％の配列同一性、または７０％の同一性、または８０％の同一性を共有している。このようなリガンドには、内因性のガストリン、コレシストキニン、または組織保存の部位に由来する同様の活性なペプチドの分泌を増大させる化合物が含まれる。これらの例としては、胃酸の分泌を阻害するガストリン放出ペプチドであるオメプラゾール、ＣＣＫの刺激を増大させるダイズトリプシン阻害因子がある。
【００３９】
大きなガストリン−３４と小さいガストリン−１７の配列が本明細書中に示される。大きなガストリン−３４は、本質的には、小さいガストリン−１７の伸張形態であり、Ｎ末端にさらにアミノ酸配列を有している。大きなガストリンは、生体内で切断されて小さいガストリン−１７を遊離させる。Ｎ末端の記号「Ｇｌｐ」はピログルタミン酸残基であり、これはグルタミン酸の自然に生じる環状形態である。種々の実施形態において、Ｎ末端にピログルタミン酸残基を有しているガストリンは、グルタミン酸またはグルタミンでピログルタミン酸を置換すること、あるいはプログルタミン酸を欠失させることのいずれかによって、Ｎ末端にシステインまたはリジン残基を含むように修飾される。さらに、ガストリン３４とガストリン−１７のそれぞれは、配列番号１〜２において本明細書中にそれぞれ示されるように３２位に、または配列番号３〜４にそれぞれ示されるように１５位に、メチオニンまたはロイシンを有する修飾された形態で使用することができる。
【００４０】
Ｎ末端Ｇｌｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号１）
Ｎ末端Ｇｌｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号２）
Ｎ末端Ｇｌｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号３）
Ｎ末端Ｇｌｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号４）
特定の実施形態では、例えば、ガストリン配列のアミノ末端にアミノ酸の任意的なスペーサーを有しているガストリンアミノ酸配列の融合体であり、タンパク質キャリアを有しているガストリン化合物を、被験体に対してトランスジェニックによって提供することができる。このような融合タンパク質のトランスジェニック発現のための核酸構築物の１つの実施形態では、ヒトプレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子が、キャリアタンパク質をコードする遺伝子に対して、スペーサーを伴って、またはスペーサーを伴うことなく、米国特許第５８８５９５６号に示されている技術と同様の技術によって融合させられる。
【００４１】
糖尿病を処置する必要がある個体において糖尿病を処置するための方法には、ガストリン化合物と、ＥＧＦ、ＧＬＰ−１、プロラクチン、および成長ホルモンのようなＦＡＣＧＩＮＴを提供する組成物を個体に投与する段階が含まれる。これらのＦＡＣＧＩＮＴの誘導体、類似体、および結合体が含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「ＦＡＣＧＩＮＴ」は、島新生療法についてガストリンを補足する因子を意味する。語句「ＦＡＣＧＩＮＴ」はまた、本明細書中で使用される場合には、「１つ以上のＦＡＣＧＩＮＴ」または「少なくとも１つのＦＡＣＧＩＮＴ」を意味する場合もある。
【００４２】
用語「ＦＡＣＧＩＮＴ」には、これらの用語が通常理解されているように、多くの種々の成長因子および成長ホルモン、１つ以上の成長ホルモンを修飾する試薬、ならびにこれらの成長ホルモンおよび成長因子の結合に関与している１つ以上の受容体についてのリガンドおよびエフェクターが含まれ、例として、ＥＧＦ受容体リガンド、ＰＴＨｒＰのようなＰＴＨ関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）受容体リガンド（ＰＴＨｒＰ；Ｇａｒｃｉａ−Ｏｃａｎａ，Ａ等，２００１，Ｊ．ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．８６：９８４−９８８）；ＨＧＦのような肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体リガンド（ＨＧＦ；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．等，１９９９、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７７：６２−６６）；ＦＧＦのような線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＫＧＦのような角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）受容体リガンド；ＮＧＦのような神経成長因子（ＮＧＦ）受容体リガンド；ＧＩＰのような胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）受容体；ＴＧＦβのようなトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）受容体（２００２年６月１３日に公開された米国特許出願番号第２００２／００７２１１５）、ラミニン−１のようなラミニン受容体リガンド；ＩＮＧＡＰのような島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）受容体リガンド；ＢＭＰ−２のような骨形成因子（ＢＭＰ）受容体リガンド；ＶＩＰのような血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）受容体リガンド；ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４のようなグルカゴン様ペプチド１受容体リガンド、ＧＬＰ−２のようなグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）受容体リガンド、ならびにその完全性に関与している酵素を阻害することによりＧＬＰ−１のレベルに間接的に影響を与える、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害因子（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｔ．等，２００２，Ａｍ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２７２−ｏｒ）；ＲＥＧタンパク質のようなＲＥＧ受容体リガンド；ＧＨのような成長ホルモン（ＧＨ）受容体リガンド、ＰＲＬおよび胎盤性ラクトゲン（ＰＬ）のようなプロラクチン（ＰＲＬ）受容体リガンド；ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のようなインシュリン様成長因子（１型および２型）受容体リガンド；ＥＰＯのようなエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体リガンド（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｉｎｅｔ．ｏｒｇ／ｈｔｍｌ／ａｕｇｕｓｔ＿２００２＿．ｈｔｍ）；ベータセルリン（ＥＧＦファミリーのメンバーとも考えられる）；アクチビン−Ａのようなアクチビン−Ａ受容体リガンド；ＶＥＧＦのような血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体リガンド；ＢＭＰ−２のような骨形成因子（ＢＭＰ）受容体リガンド；ＶＩＰのような血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）受容体リガンド；ＶＥＧＦのような血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体リガンド；ＰＡＣＡＰのような下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）受容体リガンド；Ｇ−ＣＳＦのような顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体リガンド；ＧＭ−ＣＳＨのような顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体リガンド；ＰＤＧＦのような血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体リガンド；ならびに、セクレチンのようなセクレチン受容体リガンドが挙げられるが、これらに���定されない。
【００４３】
例示的なＦＡＣＧＩＮＴであると示される本明細書中の成長因子、酵素、酵素阻害因子、ペプチド、タンパク質、およびホルモン化合物の全てについての、全ての既知の類似体および誘導体は、自然界に存在しているものであるか、または突然変異誘発によって作成されたものであるか、または設計され合成されたものであるかにはかかわらず、そのようなＦＡＣＧＩＮＴと同等であると考えられるべきである。結合体、すなわち、１つ以上の化学基およびそれらの混合物の付加によって誘導された組成物もまた、これらの等価物と考えられる。コード遺伝子は、例えば、ヒトの組み換え類似体のようなそのＦＡＣＧＩＮＴ類似体を生じるように、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって変更することができる。さらに、１つ以上のアミノ酸残基の同一性および位置を、標的化突然変異誘発によって変化させることもできる。タンパク質の一次アミノ酸配列は、グリコシル化、アシル化によって、または任意の他の補助的な分子（例えば、脂質、リン酸塩、硫酸塩、および／またはアセチル基）の付加によるような結合によって、拡大させることもできる。さらに、鎖の中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導によって修飾することができる。ＦＡＣＧＩＮＴは、活性を保持している任意の断片が得られるように切断することもできる。ＦＡＣＧＩＮＴのプロドラッグまたは代謝産物は、ＦＡＣＧＩＮＴと同等である。ポリペプチドもしくはタンパク質全体、または任意の断片を免疫グロブリンおよび他のサイトカインのような任意の他のペプチドまたはタンパク質と融合させることができる。結合体として、例えば、ポリエチレングリコール部分を含む自然界には存在しない高分子に結合させたＦＡＣＧＩＮＴを含む組成物を挙げることができる。この用語には、もとのペプチドの１つ以上のアミノ酸残基を、例えば、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成によって化学的に修飾することによって得られる誘導体も含まれる。あるいは、ＦＡＣＧＩＮＴの合成を誘導するか、またはＦＡＣＧＩＮＴの作用を模倣する試薬が、同等の化合物と考えられる。単数形「ＦＡＣＧＩＮＴ」は、本明細書中に示される例示的なＦＡＣＧＩＮＴに由来する任意の１つ以上の化合物を意味する場合がある。用語「誘導体」および「結合体」は、本明細書中で使用される場合は同じものであり、化学的に関係している組成物を示すために使用され、合成手段、生物学的手段、または組み換え手段、または化学的手段によって調製することができる。
【００４４】
用語「受容体リガンド」は、特定のリガンドについての受容体と組み合わせて本明細書中で使用される場合は、その受容体に結合する、それと相互作用する、またはそれを刺激する任意の組成物を意味する。
【００４５】
受容体リガンドには、定義される範囲内に、アゴニストがＦＡＣＧＩＮＴと構造的に関係しているかどうかにはかかわらず、任意の特定のＦＡＣＧＩＮＴについての受容体に対する受容体アゴニストが含まれる。
【００４６】
用語「プロラクチン」は、本明細書中で使用される場合は、この用語についてタンパク質因子（例えば、ヒトプロラクチン）の分野で知られているように、内因性の哺乳動物プロラクチンと実質的な配列類似性を共有しており、プロラクチン活性を有するあらゆるポリペプチドを意味する。内因性のヒトプロラクチンは、下垂体によって生産される１９９アミノ酸のポリペプチドである。この用語には、内因性プロラクチンの欠失変異体、挿入変異体、または置換変異体であり、活性を保っているプロラクチン類似体が含まれ、これには、他の種に由来するプロラクチンおよび自然界に存在している変異体が含まれる。プロラクチンの機能としては、米国特許第６３３３０３１号（活性のあるアミノ酸配列）および同第６４１３９５２号（金属錯体を形成したレセプターリガンドアンタゴニスト）に開示されているような、プロラクチン受容体に対してアゴニスト活性を有している組成物、ならびにプロラクチンアゴニストとして作用するヒト成長ホルモンの類似体であるＧ１２０ＲｈＧＨ（Ｍｏｄｅ等，１９６６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３７（２）：４４７−４５４）、ならびに米国特許第５５０６１０７号および同第５８３７４６０号に記載されているようなプロラクチン受容体のリガンドが挙げられる。
【００４７】
ＰＲＬ、ＧＨ、およびＰＬは、共通の構造、免疫学的機能および生物学的機能を有しているポリペプチドホルモンのファミリーのメンバーであり（「Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」，Ｎ．Ｓａｒｖｅｔｎｉｃｋ編，Ｃｈ．１．Ｂｒｅｊｉｅ，Ｔ．等，１９９７に概説されている）、したがって、本明細書中ではＰＲＬ／ＧＨ／ＰＬファミリーと呼ばれる。ＰＲＬおよびＧＨは、脊椎動物の下垂体前葉によって分泌される。ＰＲＬは、浸透調節、再生、乳の分泌、および免疫調節を含む広い範囲の生物学的機能に関与している。ＧＨは、成長および形態形成に関係している生理学的プロセスに関係している。関連する受容体リガンドは、「ＰＲＬ／ＧＨ／ＰＬ」受容体リガンドと呼ばれる。ＦＡＣＧＩＮＴは、ペプチドおよびタンパク質の構造の類似性、ガストリンを補足することに関する機能的類似性、１つ以上の受容体の結合に関する機能的類似性に基づいて種々の群に分類することができ、これらの群は、それぞれが本発明の種々の実施形態の範囲に含まれる。
【００４８】
グルカゴン様ペプチド−１は、アミドである分子形態ＧＬＰ−１（７位〜３６位と通常示される残基を有する）として小腸の内分泌細胞で合成され、ＧＬＰ−１（７−３７）と類似している。ＧＬＰ−１の生物学的活性についての最初の研究では、ＧＬＰ−１の全長のＮ末端が伸張された形態（１−３７および１−３６、後者はアミドである）が利用された。より大きなＧＬＰ−１分子は、通常は生物学的活性を欠失している。後に、最初の６個のアミノ酸の除去により、実質的に高い生物学的活性を有しているＧＬＰ−１分子のより短いバージョンが得られることが見出された。
【００４９】
血液循環中にある生物学的に活性なＧＬＰ−１の大部分は、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド形態であることが見出されており、それより少ない量の生物学的に活性なＧＬＰ−１（７−３７）形態も検出することができる。Ｏｒｓｋｏｖ，Ｃ．等，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９４，４３：３３５−３３９を参照。いずれのペプチドも、ほぼ同量の生物学的機能を示す。ＧＬＰ−１は、栄養摂取に応答して腸の内分泌細胞から分泌され、栄養吸収後の代謝系の恒常性において複数の役割を果たす。ＧＬＰ−１の調節は、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって媒介される２位のアラニン残基での切断によるペプチドのＮ末端分解によって生じる。概要については、ＤＰＰ−ＩＶを参照。ＧＬＰ−１の生物学的活性としては、グルコース依存性のインシュリン分泌およびインシュリンの生合成の刺激、グルカゴンの分泌および胃内容排出の阻害、ならびに食物摂取の阻害が挙げられる。ＧＬＰ−１は、Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  １４２：５２１−５２７，２００１に概説されているように、ＧＩ菅および中枢神経系において多数のさらに別の作用を有しているようである。例示的なＧＬＰ−１組成物としては、以下が挙げられる：ＢＩＭ  ５１０７７（ＤＰＰ−ＩＶ消化に抵抗性であるＧＬＰ−１類似体、Ｂｅａｕｆｏｕｒ  Ｉｐｓｅｎから入手可能）；ＡＣ２５９２（ＧＬＰ−１、Ａｍｙｌｉｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡによる）；ＴｈＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１，修飾されたアミノ酸および脂肪酸結合体、Ｔｈｅｒａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｉｎｔ−Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａによる）；ＤＡＣ：ＧＬＰ−１（Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）；ＣＪＣ−１１３１またはＤＡＣ（登録商標）：ＧＬＰ−１（アルブミンに共有結合するように操作されたＧＬＰ−１類似体、Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ）、ＬＹ３１５９０２および徐放性ＬＹ３１５９０２（ＤＤＰ−ＩＶ抵抗性ＧＬＰ−１類似体、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮによる）；低分子量ＧＬＰ−１模倣物、アルブゴン（Ａｌｂｕｇｏｎ）（アルブミン：ＧＬＰ−１融合ペプチド、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤによる）；ＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅまたはＮＮ２２１１（ＧＬＰ−１分子のアシル化によって得られる長期作用性ＧＬＰ−１誘導体、これは血流中に侵入すると広い範囲でアルブミンに結合して、アルブミンがＤＰＰＩＶによって分解されるのを保護し、腎臓でのクリアランスを減少させる；Ｅｌｂｒｏｎｄ等，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００２  Ａｕｇ  ２５（８）：１３９８−４０４）。
【００５０】
エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）（Ｇｉｌａ  ｍｏｎｓｔｅｒ）の毒液に由来する新規のペプチドであり、これは、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドに対して５３％の相同性を有している。これは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体の長期作用性の強力なアゴニストとして作用する。なぜなら、これはＤＤＰ−ＩＶによる分解に対して抵抗性であるからである。エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１に類似する特性を有しており、胃内容排出、インシュリンの分泌、食物摂取、およびグルカゴン（ｓｌｕｃａｇｏｎ）の分泌を調節する。エキセンディン−４の例としては、エキセンディン（ＡＣ２９９３としても知られている合成の形態、Ａｍｙｌｉｎ）；エクセナチドＬＡＲ（長期作用性の形態）；ＺＰ１０（６個のリジン残基が付加されている修飾されたエキセンディン−４、Ａｖｅｎｔｉｓ／Ｚｅａｌａｎｄ  Ｐｈａｒｍａ）；およびＡＰ１０（長期作用性処方物、Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）が挙げられる。生理学的研究は、トランスジェニック哺乳動物でのエキセンディン−４の持続的な発現によっては、グルコースの恒常性、細胞量、または食物摂取が乱されることはないことを示している（Ｂｉａｇｇｉｏ，Ｌ．等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３４４７２−３４４７７，２０００）。つまり、エキセンディン−４の生理学的作用は完全には理解されていない。
【００５１】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害因子とは、７６６アミノ酸の膜結合ペプチダーゼであるＤＰＰ−ＩＶの活性を阻害する化合物をいい、これには、その基質であるＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、およびＧＩＰが含まれる。ＤＰＰ−ＩＶによって媒介されるＧＬＰ−１の不活化は、生体内でのＧＬＰ−１の生体活性の決定要因である。ＤＰＰ−ＩＶ阻害因子の例として、イソロイシンチアゾリジド、バリン−プロリジド、ＮＶＰ−ＤＰＰ７３８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＬＡＦ２３７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｐ３２／９８（Ｐｒｏｂｉｏｄｒｕｇ  ＡＧ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＰ９３／０１（Ｐｒｏｂｉｏｄｒｕｇ）が挙げられる。
【００５２】
本明細書中で使用される場合は、用語「ＥＧＦ受容体リガンド」には、ＥＧＦ受容体を刺激し、その結果、同じもしくは隣接する組織中の、または同じ個体中のガストリン／ＣＣＫ受容体もまた刺激されると、インシュリンを生産する膵島細胞の新生が誘導される化合物が含まれる。このようなＥＧＦ受容体リガンドの例として、ＥＧＦ１−５３である全長のＥＧＦが含まれ、さらに、ＥＧＦ１−４８、ＥＧＦ１−４９、ＥＧＦ１−５２、ならびにそれらの断片および活性な類似体が含まれる。ＥＧＦ受容体リガンドの他の例は、１−４８、１−４７、１−５１を含むＴＧＦαの複数の形態、およびアンフィレグリン、およびポックスウイルス増殖因子、ならびにガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドと同じ相乗的活性を示すあらゆるＥＧＦレセプターリガンドである。これらには、上記の活性な類似体、断片、および修飾体が含まれる。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（Ｓｐｏｒｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９９０もまた参照のこと。
【００５３】
ＥＧＦ受容体リガンドを含む化合物の群には、さらに、正常なまたは野生型のＥＧＦの変異体を含む「修飾されたＥＧＦ」が含まれる。修飾は、ＥＧＦのクリアランス速度のような１つ以上の生物学的活性に影響を与えることが示されている。この用語には、ヒトＥＧＦのアミノ酸配列と実質的に類似しているアミノ酸配列を有しているペプチドが含まれ、例えば、これらには、種々の残基位置で、１つまたは数個のアミノ酸の置換が含まれている。
【００５４】
組み換えＥＧＦ形態は、構造および活性に変化が生じるように遺伝子操作されている。例えば、２１位のメチオニンがロイシン残基で置換されたＥＧＦが記載されている（米国特許第４７６００２３号）。５１個の残基を有している組み換えヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）（すなわち、ｈＥＧＦの５２位および５３位の２つのＣ末端残基を欠失しており、５１位に中性のアミノ酸置換を有している）は、ＥＧＦ活性を保持しており、微生物による生産プロセスおよびその後の被験体への投与の間の、プロテアーゼによる分解に対してより抵抗性がある。ＥＧＦおよびＴＧＦαに対して顕著な類似性を有しているタンパク質のファミリーをコードする核酸分子のシリーズが記載されている（国際公開番号ＷＯ００／２９４３８）。１６位の残基のヒスチジンが中性または酸性アミノ酸で置換されているＥＧＦ突然変異タンパク質（変異したＥＧＦ）が記載されており（国際公開番号ＷＯ９３／０３７５７）、このような形態は、低いｐＨ値で活性を保持している。ＥＧＦおよびＴＧＦαの化学的類似体および断片は、ＥＧＦ受容体ファミリーの種々のメンバーに結合する能力を保持している（米国特許第４６８６２８３号）。ＥＧＦまたはＴＧＦαの種々の修飾により、生体外および生体内での安定性、さらには生体内での活性において、１つ以上の組み換えタンパク質の生産に影響を与える有利な特性が付与される。本明細書の実施例において使用される例示的な組み換え修飾されたＥＧＦ受容体リガンドは、５１位にアスパラギンを有している５１アミノ酸の長さのヒトＥＧＦのＣ末端が欠失した形態（本明細書中では、ＥＧＦ５１Ｎと呼ばれる）であり、これは、実質的に全長のＩ．Ｎ．Ｔ．（登録商標）活性を保持しており、生体内および／または生体外で、正常なまたは野生型のｈＥＧＦと少なくとも同程度またはそれよりも大きい安定性を有している（Ｓ．Ｍａｇｉｌ等，２００３年５月１５日にＰＣＴ／ＵＳ０２／３３９０７として公開され、その全体が引用により本明細書中に組み込まれる）。
【００５５】
用語「成長ホルモン」には、本明細書中で使用される場合は、内因性の哺乳動物の成長ホルモンと実質的に同一のアミノ酸配列を有しており、哺乳動物の成長ホルモンの生物学的活性を有しているあらゆるペプチドが含まれる。ヒトの成長ホルモンは、単鎖の１９１個のアミノ酸を含み、約２２ｋＤａｌの分子量を有しているポリペプチドである（Ｇｏｅｄｄｅｌ等，１９７９、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４−５４８；Ｇｒａｙ等，１９８５，Ｇｅｎｅ  ３９：２４７−２５４）。この用語には、欠失、挿入、または置換を有している類似体、および他の種に由来する成長ホルモン、ならびに自然界に存在している変異体が含まれる。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ等，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３０−１３３６，および１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５；ならびに国際公開番号ＷＯ９０／０５１８５、および米国特許第５５０６１０７号を参照のこと。
【００５６】
用語「処置する」または「改善する」は、本明細書中で使用される場合は、１つ以上の糖尿病の症状を軽減するまたは排除することを意味する。用語「糖尿病」は、本明細書中で使用される場合は、インシュリンが不足している、インシュリンに対する抗体を生産している、または血糖値が高すぎる、あるいは実験用動物モデルを含む任意の哺乳動物の糖尿病の症状のいずれかを発症している生理的な適応症を意味し、これには、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病のようなヒトでの形態、初期糖尿病、およびインシュリンが少し少ないかもしくは血糖値が少し高いことによって特徴付けられる前糖尿病の症状が含まれる。「前糖尿病の症状」は、糖尿病または関連する症状を有している疑いのある哺乳動物、例えば、正式には糖尿病とは診断されていないが、インシュリンまたは血糖値に関して兆候を示している哺乳動物、および家族の病歴、遺伝的素因、またはＩＩ型糖尿病の場合には肥満によって糖尿病または関連する症状にかかりやすい哺乳動物、あるいは、糖尿病または関連する症状を以前有しており、再発のリスクがある被験体を記載する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合は、用語「免疫抑制剤」または「免疫抑制のための薬剤」は、免疫応答を抑制するあらゆる試薬を意味する。例示的な免疫抑制剤が表１に示され、これらの試薬の任意の誘導体、または機能的に同等なものは、本明細書中および特許請求の範囲に記載されるような本発明の実施形態に適切であると考えられる。表１の免疫抑制剤または他の同等の薬剤は、製造業者によって供給され、薬理学の分野の当業者に公知であるように被験体の体重に対して標準化されて投与される。例えば、タクロリムスは、通常、注射または経口で投与され、シロリムスは通常、経口投与される。
【００５８】
【表１−１】
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【００５９】
【表１−２】
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【００６０】
【表１−３】
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【００６１】
【表１−４】
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【００６２】
【表１−５】
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【００６３】
【表１−６】
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血糖降下剤または血糖降下薬は、インシュリン応答性のエンハンサーであり得、通常は、糖尿病患者の血糖を制御するためのものとして使用される。これらの薬剤として、スルホニル尿素（例えば、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トラザミド、トルブタミド、グリブリド、グリピジド、グリメピリド）、メグリチニド（例えば、レパグリニド、ナテグリニド）、ビグアニド（例えば、メトフォルミン）、チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン）、α−グルコシダーゼ阻害因子（例えば、ミグリトール）、グルカゴンアンタゴニスト、カリウムチャンネルオープナー、インシュリン増感剤、肝酵素阻害因子、グルコース摂取調節因子、脂質代謝を変化させる化合物、および食物摂取を減少させる化合物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの複数の薬剤の組み合わせを、本明細書中で提供されるガストリン化合物とともに使用することができる。
【００６４】
本明細書中で使用される場合は、用語「哺乳動物」は、ヒト、サルのような哺乳動物、マウス、またはラットのような齧歯動物、イヌ、ネコ、農業上重要である動物、またはブタ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウマ、あるいはゴリラもしくはチンパンジーのような類人猿のあらゆるメンバーが含まれるが、これらに限定されない。個々の哺乳動物は、本明細書中に記載されるように、糖尿病ではなくてもよく、前糖尿病であってもよく、また、糖尿病であってもよい。
【００６５】
全身投与の態様としては、経皮、髄腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、および経口による経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物は、任意の一般的な経路によって、例えば、注入または注射（ｂｏｌｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって、表皮もしくは皮膚粘膜の内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、膣粘膜、鼻腔粘膜、および腸粘膜など）を介する吸収によって投与することができ、他の生物学的活性のある薬剤とともに投与することもできる。例示的な投与経路は、例えば、皮下注射による全身投与である。ガストリン化合物は、ＦＡＣＧＩＮＴまたは免疫抑制剤または血糖降下剤とともに投与される場合は、１つの混合用量で投与することができ、また、複数の成分を任意の順序で別々に投与することもできる。
【００６６】
（組成物の調製方法）
（ガストリンペプチドの合成）
ガストリンペプチドは、組み換え宿主細胞中での発現または化学合成のような任意の適切な手段によって生産することができる。後者の場合には、ガストリンペプチドは、例えば、固相Ｆｍｏｃペプチド合成を使用して、ポリジメチルアクリルアミドゲル樹脂上で合成することができる。その後、ポリペプチドは標準的な方法によって精製される。
【００６７】
（結合パートナー／キャリア）
結合パートナー／キャリアとしては、患者から得られた血清のような血漿成分、アルブミン、トランスフェリン、または免疫グロブリンのような精製された血清タンパク質（単数または複数）、グリコホリンＡおよびＡＥ−１のような赤血球タンパク質、レクチン、不活化酵素、リン酸および硫酸結合タンパク質、コール酸、脂質結合タンパク質、脂質／脂溶性部分／疎水性部分のような糖結合タンパク質；デキストランまたはポリエチレングリコールのような重合性キャリアが挙げられる。ガストリンを脂質／脂溶性部分に結合させる場合には、一旦注射したこれらの結合体を、脂肪酸、または例えば、血清中の脂質結合タンパク質に結合することが知られているアルブミンのような血清タンパク質と、非共有的または共有的のいずれかで相互作用させることができる。本明細書中の組成物および方法の目的については、血清および血漿は同義的に使用することができる。ガストリンをキャリアに結合させるためには、キャリアを、最初に、反応基の導入によって活性化する必要がある。いくつかの場合には、キャリアはすでに少なくとも１つの反応基、例えば、アルブミン上のシステイン３４を含んでいる。キャリアの活性化（必要な場合）の後、キャリアはガストリン化合物に結合させられる。通常は、キャリアは、タンパク質鎖中の反応基、例えば、チオール基、αおよびεアミノ基、カルボキシル基、または芳香環を介してタンパク質に共有結合することができる。このような反応基の全てがすでに存在している場合があり、また、タンパク質の事前の化学的修飾によって付加することもでき、化学合成の間に、または既存のガストリンペプチドを化学的に修飾することによって、あるいは公知の分子生物学的方法を使用してタンパク質のアミノ酸配列を修飾することのいずれかによって、組み込むこともできる。例えば、キャリアは、リジン残基中のタンパク質のεアミノ基に、またはＮ末端に存在するシステイン残基上のチオール基に結合させることができる。あるいは、キャリアは、ヘテロ二官能性またはホモ二官能性架橋剤を介してタンパク質に結合させることもできる。
【００６８】
（血漿タンパク質）
血漿タンパク質の結合は、ガストリンのようなそうでなければ長くは存在できない分子の薬物動態特性を改善する有効な手段であり得る。血漿タンパク質の他の特徴は、腎臓浸潤のカットオフ（約４５ｋＤａ）よりも大きい自然な状態での分子量であり、これにより血漿中での持続時間が延長させられる。血漿タンパク質としては、アルブミン、α−１酸性糖タンパク質、α−１抗キモトリプシン、α−１抗トリプシン、α−２−抗プラスミン、α−２−ＨＳ−糖タンパク質、α−２−マクログロブリン、アンギオテンシノゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質ＡＩ（ＨＤＬ）、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＨＤＬ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＬＤＬ）、アポリポタンパク質ＣＩ（ＶＬＤＬ）、アポリポタンパク質ＣＩＩ（ＶＬＤＬ）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＶＬＤＬ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＶＬＤＬ）、アポトランスフェリン、Ｃ１エステラーゼ阻害因子、セルロプラスミン、フェリチン、フィブリノーゲン、ＧＣグロブリン、ヘプトグロビン（混合型）、ヘモグロビン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＡ１、免疫グロブリンＡ１、免疫グロブリンＡ２、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、Ｆａｂ断片、免疫グロブリンＧ，Ｆｃ断片、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＧ１、免疫グロブリンＧ２、免疫グロブリンＧ３、免疫グロブリンＧ４、免疫グロブリンＭ、μ鎖、免疫グロブリンＭ、Ｆｃ５μ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリン重鎖（Ｈ）、免疫グロブリン軽鎖（Ｌ）−Ｋ−軽鎖、γ−軽鎖、免疫グロブリンのＦａｂ断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ラクトフェリン、リポタンパク質ａ、［Ｌｐ（ａ）］、リポタンパク質（高密度）、リポタンパク質（低密度、）リポタンパク質（超低密度）、プレアルブミン、プロトロンビン、プロチモシン−α、リウマトイド因子、ステロイド結合タンパク質、トランスコルチン、チロキシン結合グロブリン、トランスフェリンおよびα−フェトプロテインが挙げられるが、これらに限定されない。血漿タンパク質のリストは、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００２，１．１１：８４５に見ることができる。
【００６９】
ヒトの血清アルブミンは、約６７ｋＤａの分子量、血液循環においては１９日の半減期を有し、ヒトの血漿中に最も多く存在するタンパク質である。アルブミンは、単鎖のポリペプチドを形成する５８５個のアミノ酸から構成される。アルブミンは、長鎖脂肪酸、ワルファリンおよびバルプロエートのような特定の治療薬、およびカルシウムのような無機リガンドのような、生理学的リガンドを含む多数の化合物と相互作用する。
【００７０】
抗体／免疫グロブリンには、完全な免疫グロブリンまたはそれらの断片を含めることができ、免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ，ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３、ＩｇＭなどのような種々のクラスおよびイソ型が含まれる。それらの断片としては、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられる。さらに、免疫グロブリンの断片、凝集物、ポリマー、または結合体を、適切である場合には使用することができる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得、宿主の免疫化、血清（ポリクローナル）の回収のような通常使用される技術によって、あるいは持続性のハイブリッド細胞株を調製し、分泌されたタンパク質（モノクローナル）を回収することによって、あるいは、ヌクレオチド配列または自然界に存在している抗体の特異的な結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするその変異させたバージョンをクローニングし、発現させることによって、調製することができる。
【００７１】
（重合性キャリア）
結合パートナーには高分子もまた含まれる。種々の実施形態では、高分子は、自然界に存在しているものである場合も、合成のものである場合もある。高分子の例として、タンパク質、糖ペプチド、アミノデキストランまたはカルボキシメチルデキストランのようなデキストランのような多糖類、およびデキストラン硫酸のようなデキストランの生体高分子誘導体、ヒドロキシエチル澱粉、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む）、澱粉および澱粉誘導体、インシュリン、ヘパリン、ヘパリン断片；ＰＥＧおよびその誘導体のようなポリアルキルグリコール（ＰＡＧ）、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）のようなポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＰ）、ポリトリメチレングリコール（ＰＴＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアミノ酸、ポリウレタンおよびポリホスファゼン、ポリ（乳酸−コ−エチレングリコールＰＬＡ−ＰＥＧ、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸ＰＬＧＡ、ポリ（オルトエステル）、ポリ（乳酸−コ−グリセリド）−ブロック−ポリ（エチレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、およびポリウレタン  オール）−ブロック−ポリ（乳酸−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ヒドラゾンの合成共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体の共重合体、ポリビニルエチルエーテル、およびα、β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）（ＰａｃＭ）のような合成高分子が挙げられる。通常は、合成高分子は、直鎖状または分岐状、置換または未置換、ホモ重合性、または２つ以上の異なる合成単量体の共重合体であり得る。
【００７２】
ペプチドおよびタンパク質のペグ化により、生物学的機能を保持している高い治療特性を得ることができる。分子量を大きくすることによるＰＥＧ（またはデキストランのような他の高分子）との結合により、腎臓での浸潤、免疫応答、およびタンパク質分解性酵素による分解のプロセスを減少させることができる。これらの全ては、生体内での安定性を高めるように作用する。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）は、単量体を繰り返す直鎖であり、これは、末端の遊離のヒドロキシル基で化学的に活性化することができる。このような活性化により、スルフヒドリル基およびアミノ基を含む多数の官能基に対する反応性を得ることができる。架橋を防ぐために、１つまたは２つの末端ヒドロキシル基がメトキシ基（ｍＰＥＧ）で覆われる場合がある。複数のフォーク状構造または分岐を有しているＰＥＧもまた合成することができ、これにより、個々のＰＥＧ分子上の複数の点にペプチドを結合させることができる。
【００７３】
遊離のスルフヒドリル基（例えば、システイン（３文字のアミノ酸表記を使用してＣｙｓと略される））を含むペプチドは、容易に、マレイミドで修飾された少なくとも１つのｍＰＥＧとのアルキル化反応をうけ、安定なチオエステル結合を形成する。ガストリンの場合には、その生物学的活性には必要ではないペプチドの領域（例えば、そのＮ末端）中にシステイン残基が導入されている合成されたガストリン化合物を使用することができる。
【００７４】
遊離のアミン（例えば、リジンまたはＮ末端アミノ基）を含むペプチドは、スクシンイミジルエステルで修飾されたＰＥＧと反応して、安定なアミド結合を形成することができる。化学的な反応の特異性がないことが原因で、例えば、３個のリジン残基を含むガストリン−３４の場合には、任意の１つまたはそれ以上のリジン残基が修飾されたＰＥＧと反応して、化学的に、そしておそらくは機能的にもそうである、結合されたペプチドの異種混合物を生じる場合がある。その精製は容易ではない。特定のリジン残基の部位特異的ＰＥＧ化は、ペプチド合成の間に、ＰＥＧがすでにε−アミノ側鎖に結合させられているリジン残基を導入することによって容易に行うことができる（Ｆｅｌｉｘ（１９９７）に記載されているように）。Ｆｅｌｉｘ，Ａ．Ｍ．（１９９７）  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｉｎ「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．＆  Ｚａｌｉｐｓｋｙ  Ｓ．編。
【００７５】
「活性化されたＰＥＧ」（または「ペグ化剤」）とは、タンパク質修飾因子として使用することができる任意のＰＥＧ誘導体である。なぜなら、これは、タンパク質／ペプチド中のいくつかの官能基と反応して、ＰＥＧ−タンパク質／ペプチド結合体を生じることができる官能基を含むからである。活性化されたＰＥＧとして、アルキル化ＰＥＧ、アシル化ＰＥＧ、およびアミノ酸アームを有しているＰＥＧを挙げることができる。また、ＰＥＧマレイミド（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬによるｍＰＥＧ−マレイミド−２００００）を使用することにより、システイン残基をペグ化することもできる。アミノＰＥＧはカルボキシル基をペグ化するために使用することができる。活性なＰＥＧの例として、メトキシポリエチレングリコール、ジアミノメトキシ−ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール−ｐ−ニトロ−フェニルカルボン酸、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネート、メトキシポリエチレングリコールトレシレート、メトキシ−ポリオキシエチレンアミン（アミノＰＥＧ）、メトキシポリオキシエチレン−カルボン酸、モノメトキシ−ＰＥＧ  ｐ−ニトロフェニルカルボン酸、Ｎ−Ｎ’−カルボニルジイミダゾール活性化ＰＥＧ、およびメトキシポリオキシエチレンイミダゾール−カルボニルが挙げられる。種々の分子量のＰＥＧが市販されている。反応剤であるＰＥＧの平均分子量は、約５０００から約１０００００ダルトンの間の範囲であり得る。結合方法は重要ではないが、生物学的に活性な分子の活性を変化させないか、または最小限にのみ変化させることが好ましい。好ましい結合方法は、ポリペプチドへのＮ末端結合による方法である。ＰＥＧについての種々の活性化方法論の概要については、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２
（５）：４０５（２００１）を参照のこと。あるいは、ＰＥＧを、結合の前に最初に糖分子を用いてガストリンを誘導することによる糖ペグ化（ｇｌｙｃｏｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）によって、ペプチド／タンパク質に結合させることができる（すなわち、例えば、ＮｅｏｓｅのＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ技術を使用する糖ペグ化手法）。
【００７６】
デキストランは、グリコシド結合によって互いに連結されたＤ−グルコース単位の反復である直鎖の多糖によって主に構成されている、自然界に存在している高分子である。分岐点がデキストラン高分子中に存在する場合があり、分岐の型および分岐の程度は種によって様々である。デキストランは、ガストリン化合物に結合させるために本明細書中で使用することができる。可溶性デキストランの平均分子量は、約１００００から約５０００００ダルトンの範囲内であり得る。デキストラン高分子は、それぞれのグルコース単量体上に隣接してヒドロキシル基を含み、これは、過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化されて官能性アルデヒド基を生じ、これはその後、アミノ基と反応することができる。ポリアルデヒドデキストランは、シッフ塩基の形成、それに続く安定な結合を生じるための還元的アミノ化によって、アミノ基、例えば、リジン残基上のεアミノ基に結合することができる。デキストランをモノクロロ酢酸との反応によってカルボキシメチル化して、カルボキシメチルデキストランを生じさせることができる。これは、カルボニル基またはアルデヒド基と反応するヒドラジンとの縮合の際にデキストラン−ヒドラジドを形成することができる。スルヒドリル反応性デキストラン誘導体は、例えば、一方の末端にピリジルジスルフィド、マレイミド、またはヨードアセチル基を含むヘテロ二官能性架橋剤の使用によって、スルヒドリル基と結合反応するように調製することができる。
【００７７】
（脂溶性部分への結合）
脂溶性置換基を、ガストリンペプチドのＮ末端のアミノ酸の反応基に、または状況に応じて、ヘテロ二官能性もしくはホモ二官能性架橋基を介して作成した反応基に、結合させることができる。例えば、脂溶性置換基のカルボキシル基は、リジン上のアミノ基と反応することができる。例えば、脂溶性置換基は、具体的には、例えば、８〜４０個の炭素原子を含む、長鎖の基である。例えば、脂溶性置換基は、直鎖または分岐したアルキル基、直鎖または分岐した脂肪酸のアシル基、直鎖または分岐したアルカン、α，ω−ジカルボン酸のアシル基であり得る。例えば、ガストリンの脂溶性誘導体は、ラウリン酸（ｎ−ドデカン酸）、ミリスチン酸（ｎ−テトラデカン酸）、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、パルミトレイン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン酸）、オレイン酸（ｎ−オクタデセン酸）、酢酸、リノール酸、およびアラキドン酸を含む種々の脂肪酸との例えばＮ末端のアミノ基への化学結合によって、合成することできる。
【００７８】
あるいは、立体配座的に堅い（すなわち、二重結合、三重結合、または飽和もしくは不飽和環が存在している）疎水性部分を、ガストリンペプチドに結合させることができる。例えば、カルボキシル基を含む長鎖脂肪酸を、例えば、リジン残基上に見られるアミノ基に結合させることができる。
【００７９】
（二官能性架橋剤）
架橋剤の例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：
アミノ基に特異的であるホモ二官能性架橋試薬としては：ビスイミドエステル（ビスイミデート）、例えば、メチルアセトイミデート−ＨＣｌ、ジメチルスベルイミデート−２ＨＣｌ；ビス−Ｎ−スクシンイミジル誘導体、例えば、ビス（スルホスクシンイミジル−スベレート（ＢＳＳＳ）、スクシネートビス−（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル）；二官能性ハロゲン化アリール、例えば、１，５−ジクロロ−２，４−ジニトロベンゼン；ジイソシアネートおよびジイソチオシアネート（例えば、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート）のような二官能性アシル化剤；二官能性ハロゲン化スルホニル、例えば、フェノール−２，４−ジスルホニル−クロライド；ビス−ニトロフェノールエステル、例えば、カルボン酸のビス−（ｐ−ニトロフェニルエステル）；ならびに、二官能性アシルアジド、例えば、タータリルジアジド；ジアルデヒド、例えば、グルタルアルデヒド；ジケトン、例えば、２，５−ヘキサンジオン；ならびに他のもの、例えば、ベンゾキノン、２−イミノチオラン、エリスレイトールビスカルボネート、ムコブロム酸、ムコクロル酸、エチルクロロホルメート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン、およびスクシンイミジル４−ホルミル安息香酸（例えば、最初にヒドラジンリンカーでアミンを修飾し、次に、アミンをアルデヒドリンカーに修飾し、これを次いで、互いに架橋させることができる）。
【００８０】
二官能性架橋剤の別の群は、スルフヒドリル基に特異的なホモ二官能性架橋基である。これには：Ｍｅｒｃｕｒｉａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ、例えば、１，４−ビス（ブロモマーキュリー）ブタン；ジスルフィド形成試薬、例えば、ポリメチレンビス（メタンチオスルフォネート）；ビスマレイミド、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスマレイミド、ビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテル、ビス−マレイミドエタン、１，４−ビス−マレイミドブタン、１，４−ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン、ビス−マレイミドへキサン、１，８−ビス−マレイミドトリエチレングリコールが含まれる。さらに別の群は、ビオ−ハロアセチル誘導体、例えば、１，３−ジブロモアセトン；ハロゲン化ジアルキル、例えば、ジ（２−クロロエチル）スルフィド；Ｓ−トリアジン、例えば、２，４−ジクロロ−６−メトキシ−ｓ−トリアジン；アジリジン、例えば、２，３，４−トリ（エチレンイミノ）−ｓ−トリアジン；およびビス−エポキシド、例えば、１，２，３，４−ジエポキシブタン；ならびに他のもの、例えば、ジビニルスルフォンのようなアルキル化剤である。
【００８１】
他の基に対して特異的なホモ二官能性架橋剤は、化学的架橋の分野で公知であり、例えば、カルボキシル基に特異的な試薬、例えば、ビスジアゾヘキサン；フェノレート、およびイミダゾリル基に特異的な試薬、例えば、ビス−ベンジジン；アルギニン試薬、例えば、ｐ−フェニレンジグリオキサール；および他のもの、例えば、シス−ジクロロジアミノ白金（ＩＩ）（α２−マクログロブリンを１つ以上のメチオニン残基と、認識部位またはその付近で架橋するために使用され、ＤＮＡアジピン酸（ａｄｉｐｉｄ  ａｃｉｄ）ジヒドラジドの相補鎖を架橋し、さらに糖タンパク質、過リン酸塩、およびインベルターゼを架橋することができる）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｂ−アミノエチル）−タータルアミド（ｔａｒｔｒａｍｉｄｅ）である。
【００８２】
基選択的なヘテロ二官能性架橋剤もまた当該分野で知られており、これには：アミノ基およびスルフヒドリル基に特異的な二官能性試薬、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオプロピオネート）（ＳＰＤＰ）およびその類似体（ＬＣ−ＳＰＤＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）およびその類似体であるスルフォスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサン酸（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）およびその類似体であるスルフォスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル−シクロヘキサン−１−カルボン酸（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＭＢＳ）およびその類似体であるｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミド安息香酸（ＳＩＡＢ）およびその類似体であるスルフォ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル−アミノ安息香酸）（ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸（ＳＭＢＰ）およびその類似体であるスルフォスクシンイミジル−４（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）およびその類似体（Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル６−［（ヨードアセチル）−アミノ］ヘキサン酸（ＳＩＡＸ）およびその類似体であるスクシンイミジル６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）−ヘキサノイル）アミノ］ヘキサン酸（ＳＩＡＸＸ）、スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＩＡＣ）およびその類似体であるスクシンイミジル６−（（（（４−（ヨードアセチル）アミノ）メチル）−シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサン酸（ＳＩＡＣＸ）、Ｎ−スクシンイミジル４−マレイミド酪酸；カルボキシルと、スルヒドリル基またはアミノ基のいずれかに特異的である二官能性試薬、例えば、ｐ−ニトロフェニルジアゾ酢酸；カルボニルとスルフヒドリル基に特異的な二官能性試薬、例えば、１−（アミノオキシ）−４−［（３−ニトロ−２−ピリジル）ジチオ］ブタン；４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸塩酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）および他のもの、例えば、２−メチル−Ｎ’−ベンゼンスルフォニル−Ｎ４−ブロモアセチルキノンジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−ｐ−ホルミル安息香酸、メチル−４−（６−ホルミル−３−アジド−フェノキシ）ブチルイミデートＨＣｌ、アクロレインが含まれる。
【００８３】
適切な架橋試薬の実施形態には、さらに、ゼロ長（Ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ）架橋試薬の群が含まれる。これには、カルボジイミドのようなカルボキシル基を活性化する試薬、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ）（カルボキシル基を活性化し、次いでこれがＮＨ２基と架橋することができる）；イソオキサゾリウム誘導体；クロロホルメート；カルボニルジイミダゾール；およびＮ−カルボアルコキシジヒドロキノリン；ジスルフィド形成試薬、例えば、第二銅ジ（１，１０−フェナントロリン）；酵素、例えば、トランスグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ（リジン残基の間）、キサンチンオキシダーゼ（ジスルフィド結合を形成する）；および他のもの、例えば、ピロロキノリンキノン（リジンをセミアルデヒドに変換し、次いでこれは他のリジン残基と反応することができる）が含まれる。
【００８４】
（薬学的組成物）
本発明では、種々の実施形態において、治療有効量の、ガストリン化合物のみの組み合わせ、またはＦＡＣＧＩＮＴまたは血糖降下剤とガストリン化合物との組み合わせを含む薬学的組成物が提供される。本明細書中に記載される全ての薬学的組成物は、免疫抑制のための薬剤とともに、またはそれらを伴わずに、徐放、局所もしくは全身的送達のための成分またはデバイスとともに、またはそれらを伴わずに、処方することができる。薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を添加することができる。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方を、投与形式に合わせることができるはずである。「有効量」は、この用語が本明細書中で使用される場合は、認識される医学的な目的、この場合は、糖尿病の症状の改善を達成するために十分な治療薬または治療薬の組み合わせの量である。有効量は、本明細書中に記載されるように、確立されている関連するパラメーターの測定方法に従って、当業者が経験的に決定することができる。
【００８５】
本明細書中の組成物はさらに、湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤を含むことができる。組成物は、液状の溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放処方物、または散剤であり得る。組成物は、坐剤として、一般的な結合剤またはトリグリセリドのようなキャリアとともに処方することができる。経口処方物には、薬学的等級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的なキャリアを含めることができる。種々の投与システムが公知であり、本発明の組成物、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなどに封入して、投与するために使用することができる。
【００８６】
例示的な実施形態では、本明細書中の組成物は、例えば、ヒトへの皮下投与のために適応させられた薬学的組成物として、日常的な手順にしたがって処方される。通常は、皮下投与のための組成物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合は、組成物には、溶解補助剤、および注射部位の痛みを緩和するための局所麻酔を含めることもできる。一般的には、これらの成分は、単位投与量形態で、別々に、または共に混合されているかのいずれかで、例えば、アンプルまたは小袋のような密閉してシールされた容器中に、乾燥粉末、凍結乾燥粉末、または水を含まない濃縮物として提供され、例えば、これにより一定量の活性のある試薬を示す。組成物が注入により投与される場合は、組成物を、滅菌された薬学的等級の水、緩衝液、または生理食塩水を含む注入ボトルに分散させることができる。組成物を注射によって投与する場合には、投与前に複数の成分を混合することができるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。本明細書中の組成物は、その種々の成分において、坐剤として処方することができる。これは、約０．５重量％から約１０重量％の範囲の有効成分を含み；経口処方物は好ましくは、約１０重量％から９５重量％の有効成分を含む。一日の用量は、１回の用量として投与されるか、または１日の間に数回投与される、複数のさらに小さく分けられた用量に分けられる。
【００８７】
本明細書中で使用される場合は、投与スケジュールとは、例えば、本明細書中に提供されるような修飾されたガストリン化合物、あるいは、同時に、または互いに特定の間隔をあけて（例えば、互いに１日以内に）投与されるか、または混合調製物として、または別々に、ＦＡＣＧＩＮＴともしくは血糖降下剤と、および／または免疫抑制剤と、それぞれの有効量を組み合わせて修飾されたガストリン化合物を含む組成物のいずれかを投与するためのプロトコールをいう。これには、例えば、１日あたり、およびそれぞれの組成物が投与される期間もしくは時間のような、単位時間あたりに投与される組成物の量が含まれる。
【００８８】
１つの態様では、本発明では、糖尿病を予防または処置するための方法が提供される。この方法は、ガストリン化合物の組成物を単独、またはＦＡＣＧＩＮＴと、もしくは血糖降下剤と、および／または免疫抑制剤と、それぞれを哺乳動物の膵臓のインシュリンを分泌するβ細胞の数を増加させるために十分な量で組み合わせた組成物を、その必要がある哺乳動物に投与する段階；島新生の量を決定し、それによって糖尿病を処置または予防する段階が含まれる。島新生の量の決定は、血糖、血清グルコース、血中のグリコシル化血色素、膵臓β細胞の量、血清インシュリン、および膵臓のインシュリン含量の群より選択されるパラメーターを測定することである。本明細書中に記載される組成物の投与により、組成物の投与前にアッセイした血糖と比較して血糖は減少する。例えば、組成物の投与により、血糖は、組成物の投与前にアッセイした血糖と比較して、約５０％、または約７０％減少する。グリコシル化血色素濃度は、組成物の投与前にアッセイした哺乳動物中のグリコシル化血色素濃度と比較して、減少する。血清インシュリン濃度は、組成物の投与前にアッセイした哺乳動物中の血清インシュリン濃度と比較して、上昇する。膵臓のインシュリン濃度は、組成物の投与前にアッセイした哺乳動物中の膵臓のインシュリン濃度と比較して、上昇する。
【００８９】
本発明の組成物は、中性型または塩の形態で処方することができる。薬学的に受容可能な塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される遊離のアミノ基のような遊離のアミノ基とともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される遊離のカルボキシル基のような遊離のカルボキシル基とともに形成される塩が挙げられる。
【００９０】
特定の障害または症状の処置に有効である本発明の治療薬の量は、障害または症状の性質に応じて変化し、標準的な臨床的技術によって決定することができる。処方物において使用される正確な用量はまた、投与経路、疾患および障害の重篤度によっても異なり、医師の判断と、それぞれの患者の状況に従って決定されるべきである。血中インシュリン濃度または血中Ｃペプチド濃度、ならびに空腹時血糖値またはグルコースチャレンジの定期的な測定は、当業者によって決定される。有効用量は、生体外または動物モデル試験システムから導かれた用量応答曲線から、薬理学の当業者が推測することができる。被験体に投与される組成物の投与量は、吸収、分布、血液循環中での半減速度、代謝、分泌、および本明細書中の実施形態の受容体リガンドの毒性についての規準を含む標準的なデータを使用して、種ごとに知られている変量について調整される。適切な投与量範囲は、通常、個々の活性のある化合物について、体重１キログラムあたり１日に、約０．０１μｇから約１００００μｇ、例えば、約０．０１μｇ／ｋｇから約１μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇから約１０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇ、または、約１０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。したがって、適切な投与量範囲は、通常、約０．０１μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００９１】
本発明では、他の実施形態において、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分が充填された１つ以上の容器を含む、薬学的なパックまたはキットが提供される。このようなパックまたはキットの中には、幅広い用途のガストリン化合物の単位投与量を有している容器を見ることができる。このような容器（単数または複数）には、使用のための説明書、または薬学的または生物学的製品の製造、使用、または安全性を管理する政府機関により定められた形式の注意書き（この注意書きは、ヒトへの投与に関する製造、使用、または安全性についての政府機関による承認を反映する）のような、種々の資料が含まれる場合がある。
【００９２】
特に断りのない限りは、本明細書中の全ての教示および科学的用語は、本発明が関係している分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似するかまたは同等の方法および材料を、本発明の実施において使用することができる。本発明は、種々の実施形態においてここで完全に記載され、さらなる実施形態は、以下の実施例および特許請求の範囲によって説明される。これらは、さらなる限定と解釈される意図のものではない。全ての引用される参考文献の内容は、それらの全体が、引用により本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【００９３】
（実施例１．雄性のカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）への静脈内注射による投与後の、未修飾のガストリンの薬物動態の例）
本実施例は、雄性のカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）に１回の静脈内注射により投与した後の、未修飾のガストリン（本明細書中では化合物Ｂという；表３を参照）の薬物動態（ＰＫ）プロフィールを評価するために行った。使用した１７アミノ酸のガストリン類似体は、１５位に１アミノ酸の変化を有しており、メチオニンがロイシンで置換されている。したがって化合物Ｂは自然界に存在しているガストリンと同一ではないが、得られた証拠の全てが、これがガストリンと機能的に同等であることを示している。
ＰＫの分析に関する用語を以下のように定義する：
Ｃｍａｘ−観察された最大血漿濃度
ｔｍａｘ−最大濃度に達するまでの時間
ＡＵＣ−曲線下の面積、一定期間での薬物に対する全暴露の測定
血漿ｔ１／２−血中に薬物がとどまることができる長さの測定、血漿濃度が５０％に下がるまでに要する時間
（ガストリンの投与）
雄性動物を実施例で使用した。それぞれの動物に、ガストリンを静脈内投与によって投与した（３μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、および３０μｇ／ｋｇ）。静脈内注射のための投与溶液を、１ｍＬ／ｋｇの用量で伏在静脈から１回の注射として投与した。０．２ｍＬの生理食塩水フラッシュを、用量の全量を確実に投与するために、投与後に投与した。それぞれの動物に投与した正確な容量は、動物の最も最近の体重に基づいた。
【００９４】
（血液の採取）
段階的な血液試料（１つの時点についておよそ０．５ｍｌ）を、以下の時点で上腕静脈または大腿静脈から採取した：０（投与前）、投与後、１、３、５、１０、１５、３０分、１、２、および４時間。
【００９５】
それぞれの試料を、ＥＤＴＡを含むチューブに採取し、遠心分離するまで氷水の上で保った。試料を、１５００ｇ（ＲＣＦ）で最短で１０分間、冷却下で遠心分離し、得られた血漿を２つのチューブに移し、氷上においた。全ての試料を、以下に記載するようなＰＫ分析のために凍結保存した。
【００９６】
（ガストリン濃度の分析）
血漿試料中のガストリンを、十分に確立された競合放射免疫測定を用いて、ガストリンの定量的決定のために測定した（Ｒｕｓｓｅｌｌ等，Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５２：６４５，１９７６）。アッセイで使用した抗体は、ウシの血清アルブミンに対してカルボジイミドを用いて結合させた合成のヒトガストリンＩに対して、ウサギの中で惹起させた。抗原を１２５Ｉで標識し、抗原：抗体反応の存在を、ガンマカウンターを使用して検出した。
【００９７】
（薬物動態分析）
薬物動態パラメーターを計算するために、個々の動物についてのそれぞれの時点でのガストリンの血中濃度を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ，＿ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）に入力した。
【００９８】
【表２】
2010265294.tif 000008
表２のデータは、化合物Ｂの比較的短い血漿ｔ１／２を示している。これは、３つの用量の群のそれぞれについて、平均しておよそ４〜５分である。化合物Ｂは、１回の注射による投与の後、霊長類の血流から迅速にクリアランスされるようである。化合物Ｂの静脈内投与の用量を増加させると、ＣｍａｘおよびＡＵＣの値の増大が観察されたが、用量の増加でｔ１／２値には影響はないようであった。これらのデータは、より多量の化合物Ｂの投与によっても、このペプチドの血液循環中での短い半減期を長くすることはできないことを示している。まとめると、これらのデータは、ガストリンが数分のうちに血流からクリアランスされることを示している。したがって、血清中の生物学的活性のある化合物の存在は、血清からのガストリンの迅速なクリアランスによって制限される。
【００９９】
（実施例２．最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスでの空腹時血糖値および膵臓のインシュリン含量に対する未修飾のガストリンの効果）
肥満体ではない糖尿病（ＮＯＤ）の雌性マウスを、６．６ｍｍｏｌ／ｌを上回る空腹時血糖（ＦＢＧ）値によって決定される、糖尿病の発症についてモニターした。糖尿病の発症後、マウスを、（ｉ）ビヒクル（ｎ＝４）；または（ｉｉ）３μｇ／ｋｇ／日の量のガストリン（表３に示す化合物Ｂ）で、１４日間にわたって１日１回（ｎ＝５）のｉ．ｐ．の投与によって処置した。マウスには、インシュリン置換療法を行わなかった。空腹時血糖値および膵臓のインシュリン含量を、０日目および３５日目（処置の終了後２１日目）の両方で２つの処置群について評価した。
【０１００】
図１は、ビヒクルで処置した対照動物では、空腹時血糖（ＦＢＧ）値が、３５日後に２倍になったことを示す。対照的に、ガストリンでの処置では、糖尿病のＮＯＤマウスにおいて血糖値が上昇することがある程度妨げられたが、ＦＢＧ値は、正常なマウスにおいて観察される（約３〜７ｍＭ）よりも明らかに高いままであった。これらのデータは、正常なレベルにまで血糖値を下げるためには、ガストリンの効力を高めることが必要であることを示している。
【０１０１】
膵臓でのインシュリン濃度は、ビヒクルで処置した群については、β細胞の崩壊が原因で３５日目に低下したが、ガストリンで処置した動物は、処置前の値と比較して、明らかに上昇した膵臓のインシュリン濃度を示した。図２を参照のこと。しかし、化合物Ｂでの処置後の、約０．６μｇのインシュリン／膵臓にまでの膵臓のインシュリン濃度の上昇は、正常なマウスの濃度（約１２μｇ／膵臓）よりもなお有意に低い。これらのデータは、実施例１の薬物動態分析と合わせて、未修飾のガストリンを用いた糖尿病のＮＯＤマウスの処置効率が、血漿ガストリンの比較的短い半減期（約５分）によって制限されてしまうことを示唆している。したがって、さらに長期間作用するガストリンを使用することが、島細胞新生を刺激し、膵臓のインシュリンを増加させ、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の進行を防ぐことにおいてより効率的であり得る。
【０１０２】
（実施例３．ガストリンペプチドのペプチド合成）
ガストリンペプチドは、固相ペプチド合成についての標準的な技術を使用して、例えば、Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．（１９８４）「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第２版，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されているように、当業者が容易に合成することができる。ガストリンペプチドの精製は、標準的な技術を使用して、例えば、Ｈ２Ｏ中の０．１％のＴＦＡ、およびアセトニトリル中の０．１％のＴＦＡから構成される揮発性二成分勾配システムを用いる逆相ＨＰＬＣを使用して、行うことができる。ＵＶ吸収により溶出をモニターすることによって、精製されたペプチドを回収することができ、これはその後、凍結乾燥させられ、続いて投与および試験のために溶解させられるか、または必要である場合には、さらに結合反応させられる。
【０１０３】
配列番号１もしくは２の残基２９〜３４に加えて残基１〜２８の任意の連続する部分を含むか、または、配列番号３もしくは４の残基１２〜１７に加えて残基１〜１１の任意の連続する部分を含む、ガストリン合成ペプチドを合成することができる。さらに、ＧｌｙおよびＡｌａのような小さい中性のアミノ酸残基から構成されるスペーサー領域をＮ末端に有しているガストリンペプチドを合成することもできる。スペーサー領域を含むかまたは含まないガストリン合成ペプチドを、Ｎ末端にＣｙｓ残基を有するように合成することもできる。
【０１０４】
本明細書中でのガストリン組成物の使用のために合成されるいくつかのガストリンペプチドをまとめて、表３に列挙する（化合物ＡからＨ）。これには、「大きな」ガストリン−３４（Ａ）、「短い（ｌｉｔｔｌｅ）または小さい（ｓｍａｌｌ）」ガストリン−１７（Ｂ）およびガストリン−１３（Ｃ）も含まれる。
【０１０５】
【表３】
2010265294.tif 000009
（実施例４．ＰＥＧ−２００００とのガストリンの結合）
Ｎ末端にＣｙｓを有するように修飾したガストリンペプチドを（表３の化合物Ｄ、Ｅ、Ｆ，Ｇ、およびＨ）、ほぼ中性の条件（ｐＨ６．５〜７．５に緩衝化）で約３０分間、モル過剰のトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ；マレイミド部分との反応性がない還元剤）とともにインキュベートして、Ｃｙｓ残基を確実に還元状態として、反応に利用できるようにした。
【０１０６】
モル過剰のｍＰＥＧ−マレイミド−２００００（平均ＭＷ２００００；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  ＡＬ，ＵＳＡから入手した）を混合しながら段階的に添加して溶解させ、完全に溶解したら、溶液をさらに１から４時間混合して、結合反応を完了させた。結合体の精製は、陰イオン交換体、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、結合体とすべての遊離している未反応のガストリンがそれに対して強く結合する中性のｐＨで使用して行うことができる。なぜなら、ガストリンの理論上の等電点（ｐＩ）は３．４であり、一方、中性の未反応のｍＰＥＧ−マレイミドは結合しないからである。さらなる精製のために、結合体は、それらの分子量の大きな差に基づいて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を使用し、ＰＢＳのような治療用途に適切な緩衝液を使用して、未反応のガストリンから容易に分けられる。
【０１０７】
これらの反応により、表３の化合物Ｉ，Ｊ、Ｋ、Ｌ、およびＭを生産した。結合反応が成功したことを、ペプチド含量についてはビウレット反応を、ＰＥＧ含量については比色法（Ｈａｂｅｅｂ，Ａ．Ｆ．Ｓ．Ａ．（１９６６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：３２８−３３６）を、そして結合体の全ＭＷを決定するためにはエレクトロスプレー質量スペクトル分析を使用して確認した。
【０１０８】
（実施例５．ヒトの血清アルブミンとの結合）
血清アルブミンは、１つの利用することができる還元されたシステイン残基（Ｃｙｓ−３４）を含む。これは、ヒトの血漿タンパク質のなかで最も反応性が高いチオール基である（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ等（１９８０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６：２９１−２９５）。この特性により、ペプチドを含むリガンドを血清アルブミンに特異的に結合させることができる。
【０１０９】
ヒトの血清アルブミンを、ほぼ中性の条件（ｐＨ６．５〜７．５に緩衝化）で約３０分間、モル過剰のトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ；マレイミド部分との反応性がない還元剤）とともにインキュベートして、Ｃｙｓ−３４残基を確実に還元状態として、反応に利用できるようにした。モル過剰のビス−マレイミドエタン（短いスペーサーを有し、スルフヒドリル基に対する反応性を有しているホモ二官能性架橋剤）を、Ｃｙｓ−３４を活性化させるために添加した。別の反応において、Ｎ末端にＣｙｓを有するように修飾したガストリンペプチド（表３の化合物Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）を添加し、得られた溶液をさらに１から４時間混合して、結合反応を完了させた。結合体を、それらの分子量の大きな差に基づいて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、例えば、ＰＢＳのような治療用途に適切な緩衝液を使用して、未反応のガストリン（および形成された全てのガストリン二量体）から容易に分けられる。未反応のＨＳＡはそれ以上は、ガストリンペプチドと結合したＨＳＡから分離しなかった。
【０１１０】
これらの反応によって、表３の化合物Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、およびＲを生産した。結合反応が成功したことは、結合体の全ＭＷを測定するためのエレクトロスプレー質量スペクトル分析を使用して確認した。
【０１１１】
（実施例６．ウィスター系ラット（Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ）への静脈内注射による投与後の未修飾のガストリン化合物と修飾されたガストリン化合物の薬物動態の比較）
本実施例は、ウィスター系ラット（Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ）へのｉｖ注射後の未修飾のガストリン誘導体／結合体と修飾されたガストリン誘導体／結合体の薬物動態プロフィールを評価するために行った。
【０１１２】
（ガストリンの投与）
ラット（３匹の動物の群）に、ｉｖ投与によって１０μｇ／ｋｇのガストリン等量の用量レベルで、実施例３で合成した種々の試験化合物を投与した。以下で使用した試験化合物は、上記の表３に列挙した全ての化合物である。詳細については表３を参照のこと。
【０１１３】
（血液の採取）
段階的な血液試料（１つの時点についておよそ０．４ｍｌ）を、以下の時点で採取した：全ての動物について注射後５、６０、１８０、４８０分。各時点で、血液を１つのグループについて３匹の動物から採取した。
【０１１４】
それぞれの試料を、ＥＤＴＡを含むチューブに採取し、遠心分離するまで氷水の上で保った。試料を、１５００ｇ（ＲＣＦ）で最短で１０分間、冷却下で遠心分離し、得られた血漿を２つのチューブに移し、氷上においた。全ての試料を、ＰＫ分析のために凍結保存した。
【０１１５】
（ガストリン濃度の分析）
Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＤＥ３４００によるヒトガストリン１（Ｇ−１７）免疫アッセイキットを使用して、ＥＬＩＳＡ法を使用して血漿中の化合物Ｂ濃度を測定した。このアッセイは、試料中に存在するガストリンＩがウサギポリクローナル抗体の複数の部位について固定量のアルカリホスファターゼで標識したガストリンＩと競合する、競合結合技術に基づく。インキュベーションの間に、抗体は、マイクロプレート上にコーティングされたヤギ坑ウサギ抗体に結合する。過剰な結合体と結合していない試料を除去するための洗浄の後、基質溶液をウェルに添加して、結合した酵素活性を決定した。発色の直後、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。色の強さは、試料中のガストリンＩの濃度に反比例する。
【０１１６】
（薬物動態分析）
ガストリン（化合物Ｂ）とその種々の誘導体／結合体の血漿濃度を、ＰＫ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）  Ｅｘｃｅｌ（Ｕｓａｎｓｋｙ  ＪＩ，Ｄｅｓａｉ  Ａ，Ｔａｎｇ−Ｌｉｕ  Ｄ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して分析した。ＰＫプロフィールを評価するために、種々の試験化合物および以下のＰＫ値を計算した：Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、ＡＵＣ、およびｔ１／２。
【０１１７】
ガストリン（例えば、化合物Ｂ）は自然な状態で血液中に検出できる濃度で存在するので、投与前に得られた基底値を、化合物Ｂの投与後に得られた血漿濃度から引き算した。データを平均±ＳＤとして示す。
【０１１８】
データは、Ｎ末端に官能基としてシステインを有する修飾されたガストリン化合物、またはＮ末端でＰＥＧまたはＨＳＡに結合させた修飾されたガストリン化合物が、自然界に存在しているガストリンと比較して明らかに長い半減期を有していることを示している。修飾されたガストリン化合物／結合体は、自然界に存在しているガストリン１７またはガストリン３４の投与と比較して、より長い期間、より高い濃度で血清中に存在する。これらのデータはまた、ＡＵＣもまたガストリン分子の化学的修飾によって増大することを示している。修飾されたガストリン誘導体／結合体が、より長い期間より高い濃度を提供し、糖尿病の動物における島細胞新生および血糖値の調節に必要な効力について最も高い可能性を有していると予想される。
【０１１９】
（実施例７．最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスの糖尿病の進行を防ぐことにおける修飾されたガストリン化合物と未修飾のガストリンとの比較）
本実施例では、未修飾のガストリンと修飾されたガストリン化合物／結合体による処置の効果を、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて試験して、種々の修飾されたガストリン誘導体／結合体の投与が、未修飾のガストリンと比較して、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて重篤な高血糖症を予防することにおいて、さらには膵臓のインシュリン含量を増大させることにおいてより有効であるかどうかを決定した。使用した修飾されたガストリン化合物／結合体は以下のとおりである（さらなる詳細については表３を参照）：化合物Ｂ（これは、アミノ酸１５位にＬｅｕ残基を有する１７アミノ酸残基の合成のヒトガストリンＩとして調製されたガストリンである）、化合物Ｅ、化合物Ｇ、化合物Ｊ、化合物Ｌ、化合物Ｏ、および化合物Ｑ。
【０１２０】
肥満体ではない糖尿病（ＮＯＤ）の雌性マウス（１２〜１４週齢）を糖尿病の発症についてモニターし（８．０から１５ｍｍｏｌ／ｌを上回る空腹時血糖）、症状の発症後４８時間以内に、種々の群のマウスをそれぞれ、３または１０μｇ／ｋｇ／日のガストリン等量で処置した。それぞれの処置では、毎日静脈内経路によって投与した。
【０１２１】
処置は１４日間の投与である。動物を空腹時血糖（ＦＢＧ）値について毎週モニターした。ＦＢＧ値を、餌を引き上げた後約１２時間で、そして最後のペプチドまたはビヒクルの注射後２４時間で測定した。治療が終了すると、全てのマウスを、その後４週間（２〜６週）にわたってＦＢＧ値についてモニターして、治療的処置の終了後に高血糖症の予防が持続するかどうかを決定した。１４日目に処置を停止した。
【０１２２】
このプロトコールには、６週間で再びデータを得るためにこれらのマウスをサンプリングし、ＦＢＧおよび血漿Ｃペプチドのアッセイのために血液を採取し、マウスを膵臓のインシュリンの決定のために屠殺し、島の炎症（膵島炎）をスコアする段階が含まれる。処置の開始から、マウスには、インシュリン置換療法も免疫抑制も行わなかった。以下のパラメーターを評価した：生存率、膵臓のインシュリン濃度、島の炎症の存在、および空腹時血糖値。
【０１２３】
データは、より長い半減期およびＡＵＣを有している修飾されたガストリン誘導体／結合体は、糖尿病のＮＯＤマウスの高血糖症を予防することにおいてより有効であることを示している。いくつかの場合には、修飾されたガストリン化合物／結合体は、血糖値を正常な濃度にまで完全に戻し、このことは、このモデルにおける島新生の有意なレベルの刺激を示している。
【０１２４】
（実施例８．最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスの糖尿病の進行を予防することにおける、ＧＬＰ−１と組み合わせた修飾されたガストリン化合物／結合体と未修飾のガストリンの比較）
本実施例では、ＧＬＰ−１と未修飾のガストリンの組み合わせ、およびＧＬＰ−１と修飾されたガストリン化合物／結合体の組み合わせによる処置の効果を、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて試験し、ＧＬＰ−１とガストリンの両方の投与により最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて重篤な高血糖症を予防し、さらには膵臓のインシュリン含量を増大させることができるかどうかを決定した。使用したＧＬＰ−１は、ヒト／マウスＧＬＰ−１の生物学的に活性な断片（この断片がプロセシングされる前駆体と比較して７位〜３６位の残基を有している；Ｂａｃｈｅｍ  Ｈ６７９５から入手した）であるＧＬＰ−１である。使用した修飾されたガストリン化合物／結合体は以下の通りである：化合物Ｂ（ＣＯＭＰＯＵＮＤ  Ｂ）−アミノ酸１５位にＬｅｕ残基を有している１７個のアミノ酸残基を有している合成のヒトガストリンＩとしてのガストリン、化合物Ｅ、化合物Ｑ。
【０１２５】
肥満体ではない糖尿病（ＮＯＤ）の雌性マウス（１２〜１４週齢）を糖尿病の発症についてモニターし（８．０から１５ｍｍｏｌ／ｌを上回る空腹時血糖）、症状の発症後４８時間以内に、４つの群のマウスをそれぞれ以下のように処置した：１つの群は、ビヒクルのみで処置した；他の群には、１００μｇ／ｋｇ／日のＧＬＰ−１を投与し、残りの群は、ＧＬＰ−１（１００μｇ／ｋｇ／日）とガストリン化合物（３μｇ／ｋｇ／日のガストリン等量）の組み合わせで処置した。それぞれの処置では、毎日静脈内経路によって投与した。
【０１２６】
処置は１４日間の投与である。動物を空腹時血糖（ＦＢＧ）値について毎週モニターした。ＦＢＧ値を、餌を引き上げた後約１２時間で、そして最後のペプチドまたはビヒクルの注射後２４時間で測定した。治療が終了すると、全てのマウスを、その後４週間（２〜６週）にわたってＦＢＧ値についてモニターして、治療的処置の終了後に高血糖症の予防が持続するかどうかを決定した。１４日目に処置を停止した。
【０１２７】
このプロトコールには、６週間で再びデータを得るためにこれらのマウスをサンプリングし、ＦＢＧおよび血漿Ｃペプチドのアッセイのために血液を採取し、マウスを膵臓のインシュリンの決定のために屠殺し、島の炎症（膵島炎）をスコアする段階が含まれる。処置の開始から、マウスには、インシュリン置換療法も免疫抑制も行わなかった。以下のパラメーターを評価した：生存率、膵臓のインシュリン濃度、島の炎症の存在、および空腹時血糖値。
【０１２８】
データは、より長い半減期を有している修飾されたガストリン化合物／結合体（化合物ＥまたはＱ）と組み合わせたＧＬＰ−１が、自然界に存在しているガストリン（化合物Ｂ）を伴ったＧＬＰ−１と比較して、糖尿病の動物の血糖値を下げることにおいてより有効であることを示している。これらのデータは、長期作用性の修飾されたガストリン化合物／結合体をＧＬＰ−１または他の成長因子と共に使用することをサポートしている。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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