(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞核セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（細胞核Ｄｂｆ２関連キナーゼ）のリン酸化形態ならびにＮｄｒキナーゼ活性のモジュレーターを同定するための分析および材料を提供。また、分子生物学、化学、薬理学およびスクリーニング技術を提供する。【解決手段】ヒト由来の特定のアミノ酸配列に規定される細胞核Ｄｂｆ２関連（Ｎｄｒ）キナーゼ、該アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するその相同体および該アミノ酸配列中の少なくとも５つの連続したアミノ酸配列を含むそのフラグメントからなる群から選択される単離されたポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列に規定される細胞核Ｄｂｆ２関連（Ｎｄｒ）キナーゼ、（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するその相同体および（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列中の少なくとも５つの連続したアミノ酸配列を含むそのフラグメントからなる群から選択される単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、特定のアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ／Ｔｈｒを有しており、Ｘが、Ｎｄｒキナーゼ１（配列番号：２）のＴｈｒ−７４または該Ｔｈｒ−７４に対応する位置に存在するアミノ酸であり、そして該Ｔｈｒ−７４または該アミノ酸がリン酸化されているか、または該Ｔｈｒ−７４または該アミノ酸が酸性アミノ酸残基で置換されており、ここで、該ポリペプチド中に存在すべき５つの連続したアミノ酸配列が、上記した特定のアミノ酸配列と同一である、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞核セリン／スレオニン タンパク質キナーゼ（細胞核Ｄｂｆ２関連キナーゼ（nuclear Dbf2−related kinase (Ndr)）と呼称される）のリン酸化形態に関し、そしてＮｄｒキナーゼ活性のモジュレーターを同定するための分析および材料を提供する。本発明は、分子生物学、化学、薬理学およびスクリーニング技術の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
可逆的タンパク質リン酸化は、代謝、増殖および分化を含む、真核生物における多くの基本的な細胞機能の協調的制御のための主要な作用機序である。特定の標的タンパク質のリン酸化状態およびその結果としての活性は、タンパク質キナーゼおよびタンパク質ホスファターゼの拮抗する作用により制御される。一般的に、いくつかの二重特異性（dual specificity）のキナーゼおよびホスファターゼが、既に記載されているが、これらの酵素は、セリン／スレオニン ホスホアクセプター（phosphoacceptor）か、またはチロシン ホスホアクセプターのどちらかに特異的である。多くのキナーゼ、ホスファターゼの発見、およびそれらが関与するシグナル伝達経路が進化の過程で高度に保存されていることの発見により、リン酸化カスケードの重要性が示されている。近年、細胞周期の制御におけるタンパク質リン酸化の役割に興味が集まっている；多くの細胞性プロトオンコジーンがセリン／スレオニン キナーゼ ファミリーのメンバーをエンコードしており、そして細胞周期制御ネットワークの主要な構成成分として機能するいくつかのセリン／スレオニン キナーゼが次第に明らかとなった。故に、これらの経路の完全な描写が、腫瘍形成および腫瘍進行を理解するために重要である。
【０００３】
Ｎｄｒタンパク質キナーゼ（Ｐｕｎキナーゼとしても周知）は、身体のほとんどすべての細胞形で発現される細胞核セリン／スレオニン タンパク質キナーゼである（Millward, T.ら(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5022−5026）。ＷＯ９６／１９５７９には、Ｎｄｒキナーゼの同定、Ｎｄｒキナーゼのインビトロ自己リン酸化形態、Ｎｄｒキナーゼに特異的な抗体、Ｎｄｒキナーゼの作製および使用のための有用な方法、ならびにＮｄｒキナーゼの他の関連する局面が記載されている。
【０００４】
タンパク質キナーゼのＮＤＲファミリーには、オーソロガス(orthologous)なタンパク質、例えばキイロショウジョウバエ由来のTricornered(trc)、線虫由来のSax-1、およびいくつかの密接に関連するキナーゼ、例えば哺乳動物、キイロショウジョウバエおよび線虫由来のWts/Latsキナーゼ、酵母由来のCbk1、Dbf2、Dbf20、分裂酵母由来のOrb6、担子菌酵母（U. maydis）由来のUkc1、および糸状菌（N. crassa）由来のCot-1が含まれる（Stegert, M.R. ら(2001) NATO ASI Series: Protein Modules in Cellular Signalling 318, 68−80に概説）。これらのキナーゼは、その触媒ドメイン内、ならびにその制御ドメイン内の保存領域にて４０−６０％のアミノ酸同一性を共有している。前記キナーゼのＮｄｒサブファミリーは、細胞増殖、細胞分裂および細胞形態の調節に関与している。
【０００５】
例えば、ＬＡＴＳ（Ｗｔｓとも呼称）は元来、それを欠損した場合に、ショウジョウバエにおける異常増殖（overgrowth）表現型の原因となる遺伝子として発見され、それ故、腫瘍抑制遺伝子であると提案された（Justice, R. W.ら(1995) Genes Dev. 9, 534-546; Xu, T.ら(1995) Development 121, 1053−1063）。近年、哺乳動物のＬＡＴＳ相同体がクローニングされ、その腫瘍抑制機能が確認された。マウスにおけるＬＡＴＳ相同体のホモ接合体欠失は、軟部組織肉腫および卵巣間質細胞腫瘍の発達の原因となる（St. John, M. A.ら(1999) Nat. Genet. 21, 182−186）。
【０００６】
Ｎｄｒキナーゼファミリーの他のメンバーは、細胞分裂に重要であることが実証されている。分裂酵母にて、Ｏｒｂ６は、細胞極性の形成に必要とされ、かつＣｄｃ２のインヒビターのような作用も示すようである（Verde, F. ら(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7526−7531）。Ｏｒｂ６と同じく、アカパンカビ由来のＣｏｔ−１もまた、極性のある細胞増殖に必要とされる（Yarden, O.ら(1992) EMBO J. 11, 2159−2166）。最後に、Ｄｂｆ２は、出芽酵母の有糸分裂の終期におけるＣｄｃ２８−サイクリン Ｂキナーゼ活性の下方制御に必要とされる経路の一部を成す（Jaspersen, S. L.ら(1998) Mol. Biol. Cell. 9, 2803−2817）。
【０００７】
前記Ｎｄｒキナーゼ・サブファミリーは、細胞増殖制御に重要であることが明らかであるが、それぞれのキナーゼがどのように制御されているのかについては知られていない。Ｎｄｒキナーゼファミリーのいくつかのメンバーが、リンタンパク質として周知である（Toyn, J. H.およびJohnston, L. H. (1994) EMBO J. 13, 1103−1113; Taoら(1999) Nature Genetics 21, 177−181）。また、ＮＤＲ１は、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）インヒビター・オカダ酸（ＯＡ）で細胞を処理することにより強力に活性化され、ＮＤＲ１活性の制御におけるセリン残基および／またはスレオニン残基のリン酸化に関与することが示されている。前記活性化は、活性化断片（Ｔ−ループ）のＳｅｒ２８１とカルボキシル末端部分に位置する疎水性モチーフのＴｈｒ４４４の２つの制御残基のリン酸化を伴う（Millward, T.A.ら(1999) J. Biol. Chem. 274, 33847−33850; EP1097989、題名「Ndr phosphokinase」）。ＮＤＲ１のインビトロにおける活性化はまた、ＮＤＲ１自己リン酸化を増大する、ＥＦハンド Ｃａ２＋結合タンパク質Ｓ１００Ｂとの直接的な相互作用を介しても示される（Millward, T.A.ら(1998) EMBO J. 17, 5913−5922）。上記にもかかわらず、依然として、さらなるＮｄｒキナーゼ シグナル伝達の説明および前記経路における成分の同定の必要がある。
【０００８】
関連文献
1.  Millward, T., Cron, P., and Hemmings, B. A. (1995) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92, 5022−5026
2.  Tripodis, N., Palmer, S., Phillips, S., Milne, S., Beck, S., and Ragoussis, J. (2000) Genome Res. 10, 454−472
3.  Stegert, M. R., Bichsel, S. J., and Hemmings, B. A. (2001) NATO ASI Series: Protein Modules in cellular signalling 318, 68−80
4.  Geng, W., He, B., Wang, M., and Adler, P. N. (2000) Genetics 156, 1817−1828
5.  Zallen, J. A., Peckol, E. L., Tobin, D. M., and Bargmann, C. I. (2000) Mol.Biol.Cell 11, 3177−3190
6.  Yarden, O., Plamann, M., Ebbole, D. J., and Yanofsky, C. (1992) EMBO J. 11, 2159−2166
7.  Racki, W. J., Becam, A. M., Nasr, F., and Herbert, C. J. (2000) EMBO J. 19, 4524−4532
8.  Durrenberger, F. and Kronstad, J. (1999) Mol.Gen.Genet. 261, 281−289
9.  Verde, F., Wiley, D. J., and Nurse, P. (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95, 7526−7531
10.  Johnston, L. H., Eberly, S. L., Chapman, J. W., Araki, H., and Sugino, A. (1990) Mol.Cell Biol. 10, 1358−1366
11.  Hanks, S. K., Quinn, A. M., and Hunter, T. (1988) Science 241, 42−52
12.  Millward, T. A., Heizmann, C. W., Schaufer, B. W., and Hemmings, B. A. (1998) EMBO J. 17, 5913−5922
13.  Millward, T. A., Hess, D., and Hemmings, B. A. (1999) J.Biol.Chem. 274, 33847−33850
14.  Ilg, E. C., Schafer, B. W., and Heizmann, C. W. (1996) Int.J.Cancer 68, 325−332
15.  Wilm, M. and Mann, M. (1996) Anal.Chem. 68, 1−8
16.  Carr, S. A., Huddleston, M. J., and Annan, R. S. (1996) Anal.Biochem. 239, 180−192
17.  Wilm, M., Neubauer, G., and Mann, M. (1996) Anal.Chem. 68, 527−533
18.  Newton, A. C. (2001) Chem.Rev. 101, 2353−2364
19.  Taylor, C. W. and Broad, L. M. (1998) Trends Pharmacol.Sci. 19, 370−375
20.  Treiman, M., Caspersen, C., and Christensen, S. B. (1998) Trends Pharmacol.Sci. 19, 131−135
21.  Peterson, R. T. and Schreiber, S. L. (1999) Curr.Biol. 9, R521−R524
22.  Parker, P. J. and Parkinson, S. J. (2001) Biochem.Soc.Trans. 29, 860−863
23.  Knighton, D. R., Zheng, J. H., Ten Eyck, L. F., Ashford, V. A., Xuong, N. H., Taylor, S. S., and Sowadski, J. M. (1991) Science 253, 407−414
24.  Yang, J., Cron, P., Thompson, V., Good, V. M., Hess, D., Hemmings, B. A., and Barford, D. (2002) Mol.Cell 9, 1227−1240
25.  Fujisawa, H. (2001) J.Biochem.(Tokyo) 129, 193−199
26.  Heierhorst, J., Kobe, B., Feil, S. C., Parker, M. W., Benian, G. M., Weiss, K. R., and Kemp, B. E. (1996) Nature 380, 636−639
27.  Yamasaki, R., Berri, M., Wu, Y., Trombitas, K., McNabb, M., Kellermayer, M. S., Witt, C., Labeit, D., Labeit, S., Greaser, M., and Granzier, H. (2001) Biophys.J. 81, 2297−2313
28.  Belham, C., Wu, S., and Avruch, J. (1999) Curr.Biol. 9, R93−R96
29.  Leslie, N. R., Biondi, R. M., and Alessi, D. R. (2001) Chem.Rev. 101, 2365−2380
30.  Williams, M. R., Arthur, J. S., Balendran, A., van der, K. J., Poli, V., Cohen, P., and Alessi, D. R. (2000) Curr.Biol. 10, 439−448
31.  Balendran, A., Hare, G. R., Kieloch, A., Williams, M. R., and Alessi, D. R. (2000) FEBS Lett. 484, 217−223
32.  Yonemoto, W., McGlone, M. L., Grant, B., and Taylor, S. S. (1997) Protein Eng 10, 915−925
33.  Le Good, J. A., Ziegler, W. H., Parekh, D. B., Alessi, D. R., Cohen, P., and Parker, P. J. (1998) Science 281, 2042−2045
34.  Hill, M. M., Andjelkovic, M., Brazil, D. P., Ferrari, S., Fabbro, D., and Hemmings, B. A. (2001) J.Biol.Chem. 276, 25643−25646
35.  Hill, M., Feng, J., and Hemmings, B. (2002) Curr.Biol. 12, 1251
36.  Delcommenne, M., Tan, C., Gray, V., Rue, L., Woodgett, J., and Dedhar, S. (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95, 11211−11216
37.  Alessi, D. R., Andjelkovic, M., Caudwell, B., Cron, P., Morrice, N., Cohen, P., and Hemmings, B. A. (1996) EMBO J. 15, 6541−6551
38.  Lynch, D. K., Ellis, C. A., Edwards, P. A., and Hiles, I. D. (1999) Oncogene  18, 8024−8032
39.  Shaw, M., Cohen, P., and Alessi, D. R. (1998) Biochem.J. 336, 241−246
40.  Ziegler, W. H., Parekh, D. B., Le Good, J. A., Whelan, R. D., Kelly, J. J., Frech, M., Hemmings, B. A., and Parker, P. J. (1999) Curr.Biol. 9, 522−529
41.  Romanelli, A., Martin, K. A., Toker, A., and Blenis, J. (1999) Mol.Cell Biol. 19, 2921−2928
42.  Akimoto, K., Nakaya, M., Yamanaka, T., Tanaka, J., Matsuda, S., Weng, Q. P., Avruch, J., and Ohno, S. (1998) Biochem.J. 335, 417−424
43.  Behn−Krappa, A. and Newton, A. C. (1999) Curr.Biol. 9, 728−737
44.  Haby, C., Larsson, O., Islam, M. S., Aunis, D., Berggren, P. O., and Zwiller, J. (1994) Biochem.J. 298, 341−346
45.  Hepworth, T. J., Lawrie, A. M., and Simpson, A. W. (1997) Cell Calcium 21, 461−467
46.  Berridge, M. J., Lipp, P., and Bootman, M. D. (2000) Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 1, 11−21
【０００９】
配列表の簡単な説明
配列番号：１は、ヒトＮＤＲ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
配列番号：３は、ヒトＮＤＲ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
配列番号：５は、ヒトＭＯＢ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
配列番号：７は、マウスＮＤＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号：８は、マウスＮＤＲ２ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号：９は、ヒトＮＤＲ２ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本発明は、細胞核Ｄｂｆ２関連（Ｎｄｒ）ホスホキナーゼ、その機能的相同体またはそのフラグメントに関し、ここで前記ポリペプチドは、Ｎｄｒタンパク質キナーゼ１（配列番号：１）のアミノ酸Ｔｈｒ−７４またはアミノ酸Ｔｈｒ−７４に対応するアミノ酸にてリン酸化されているか、または該アミノ酸が、酸性アミノ酸残基により置換されている。前記ポリペプチドはさらに、Ｓｅｒ−２８１および／またはＴｈｒ−４４４にてリン酸化されていてよい。前記相同体は典型的に、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有する配列、および配列：−Ｋ−Ｅ−Ｓ／Ｔ−Ｅ−Ｆ／Ｙ−で定義される少なくとも１つのペプチドを含む。
【００１１】
さらに、本発明は、Ｎｄｒキナーゼまたはその機能的相同体に特異的に結合する抗体に関し、ここで前記ポリペプチドは、Ｎｄｒタンパク質キナーゼ１（配列番号：１）のアミノ酸Ｔｈｒ−７４またはアミノ酸Ｔｈｒ−７４に対応するアミノ酸にてリン酸化されており、そして前記抗体は、リン酸化アミノ酸を含むエピトープを認識する。前記抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであるか、もしくは一般的に遺伝子工学的に作製される。本発明にはまた、Ｎｄｒポリペプチドもしくはその相同体を検出または単離するための、または診断用もしくは治療用として、特に細胞増殖における異常を処置するための、本発明の抗体の使用も包含される。
【００１２】
本発明はまた、細胞核Ｄｂｆ２関連（Ｎｄｒ）キナーゼ、その機能的相同体またはそのフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドを、前記ポリペプチドを本発明の抗体と接触させ、混入物質を除去することにより単離する方法に関し、ここで前記ポリペプチドは、Ｎｄｒタンパク質キナーゼ１（配列番号：１）のＴｈｒ−７４またはアミノ酸Ｔｈｒ−７４に対応するアミノ酸にてリン酸化されている。所望により、前記方法はさらに、ポリペプチドをエンコードする核酸と一緒にオカダ酸を含む細胞を処理し、細胞がポリペプチドを発現するのを可能とし、そして細胞から細胞抽出物を調製することを含む。
【００１３】
他の局面にて、本発明は、Ｎｄｒキナーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストの同定を目的とした本発明のポリペプチドの使用に関する。
さらなる局面にて、本発明は、医薬としての使用を目的とした本発明のポリペプチドに関する。
またさらなる局面にて、本発明は、細胞増殖における異常の処置のための医薬の製造を目的とした本発明のポリペプチドの使用に関する。
【００１４】
他の局面にて、本発明は、本発明のポリペプチドと一緒にＭＯＢ１を含む複合体に関し、ここで所望により、１以上の前記タンパク質が、標識、例えば蛍光標識されていてもよい。
他の局面にて、本発明は、Ｎｄｒキナーゼ活性の、可能性のあるモジュレーターをスクリーニングする方法に関し、該方法は、ａ）本発明のポリペプチドと一緒に、可能性のあるモジュレーターをインキュベートする工程、およびｂ）前記モジュレーターと前記ポリペプチド間の相互作用を検出する工程を含む。
【００１５】
本発明はまた、Ｎｄｒキナーゼ活性の、可能性のあるモジュレーターをスクリーニングする方法に関し、該方法は、ａ）本発明のポリペプチドと一緒に、可能性のあるモジュレーターをインキュベートする工程、およびｂ）Ｎｄｒタンパク質キナーゼ１のＴｈｒ７４またはアミノ酸Ｔｈｒ−７４に対応するアミノ酸におけるポリペプチドのリン酸化の変化を検出する工程を含む。この態様にて、前記可能性のあるモジュレーターは、例えば、シグナル経路のキナーゼであり得る。
【００１６】
本発明はまた、Ｎｄｒキナーゼ活性の、可能性のあるモジュレーターをスクリーニングするための方法を提供し、該方法は、ａ）本発明の複合体と一緒に、可能性のあるモジュレーターをインキュベートする工程、およびｂ）ＭＯＢ１と前記Ｎｄｒポリペプチド間の結合の変化を検出する工程を含む。前記可能性のあるモジュレーターは、結合を減少しＭＯＢ１を放出し得る。もしくは、前記可能性のあるモジュレーターは、特に前記モジュレーターがＭＯＢ１フラグメントまたは誘導体である場合に、結合を増加するか、または安定化し得る。
【００１７】
さらに、本発明は、本発明の前記ポリペプチドおよび／または抗体、ならびに取扱説明書を含むキットに関する。前記キットはさらに、ＭＯＢ１を含み得、所望により、ＭＯＢ１を認識する抗体を含んでいてよい。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳しい説明
本発明者らは、２つの制御残基であるＳｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４のリン酸化によるＮＤＲの制御、およびＳ１００ファミリーのＥＦハンド Ｃａ２＋結合タンパク質との直接的な相互作用によるその活性化を詳しく特徴付けている。結果として、本発明者らは、付加的制御的なＮＤＲ１のリン酸化部位、すなわちＴｈｒ７４を見出した。３つのアミノ酸残基すべてが、インビボにおけるＮＤＲ１活性に不可欠である；しかしながら、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４と対照的に、Ｔｈｒ７４は、ＮＤＲ１活性自体を直接的に制御するよりもむしろ、制御タンパク質（例えば、Ｓ１００Ｂ）への結合に関係する。これらの残基に付された番号は、ＷＯ９６／１９５７９に記載のようにヒトＮｄｒ１キナーゼ配列内のそれらの位置を示す（配列番号：１も参照）。さらに、本発明者らは、ＮＤＲ１と同様な方法で制御され、そして保存されたリン酸化部位であるＳｅｒ２８２およびＴｈｒ４４２、ならびにＴｈｒ７５のリン酸化に依存するキナーゼ活性を示す、ＮＤＲ２と呼ばれるヒトＮｄｒタンパク質キナーゼの第二のイソ型を同定し、かつ特性化した。前記Ｎｄｒ２の配列を配列番号：３に規定した。
【００１９】
故に、その最も広義の局面にて、本発明は、単離されたポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列に規定される細胞核Ｄｂｆ２関連（Ｎｄｒ）ホスホキナーゼ、その機能的相同体またはそのフラグメントであり、そしてここで該ポリペプチドは、Ｎｄｒタンパク質キナーゼ１のＴｈｒ−７４またはアミノ酸Ｔｈｒ−７４に対応するアミノ酸にてリン酸化されている。
【００２０】
相同体とは、それらが、ヒトＮｄｒ２（配列番号：３）で示されるＮｄｒタンパク質キナーゼと起源（origin）または機能の相同性を共有することを当業者に決定させるために十分な類似性を共有するポリペプチドである。ただし、前記相同体がＮｄｒタンパク質キナーゼ１のＴｈｒ−７４またはアミノ酸Ｔｈｒ−７４に対応するアミノ酸、例えばｈＮｄｒ２のＴｈｒ−７５または他の相同体の対応する位置（対応箇所）にあるセリン／スレオニン残基にてリン酸化されているか、またはこの特定のリン酸化部位が酸性アミノ酸残基で置換されている。本発明は、本方法にて改変された他の生物体由来のＮｄｒのすべての種類の相同体、例えばショウジョウバエＮｄｒ（ＷＯ９６／１９５７９の配列番号：２に示される）を含み、それらは常套方法により単離され得る。Ｎｄｒの種相同体は、本明細書に記載のポリペプチド配列の誘導体であると考えられ得る。Ｎｄｒキナーゼの「機能的相同体」とは、Ｎｄｒ生物学的活性が残っている限り、その内部もしくはアミノ末端、またはそのカルボキシ末端に生じる一つもしくは複数のアミノ酸付加、置換および／または欠失を含む、これらの相同性ポリペプチドの誘導体および類似体を包含する。すなわち、機能的相同体とは、任意のドメインを欠いていて良いか、またはもう１つのポリペプチドと結合して、例えば融合タンパク質の形状であって良い。本発明による変異体は、例えば酵素活性もしくは特異性、またはタンパク質結合に関して、まだ、記載した天然Ｎｄｒと同様に反応する。
【００２１】
故に、機能的相同体には、ポリペプチドの機能的フラグメント、ならびにリン酸化Ｔｈｒ−７４（または対応箇所）が残っている生物学的に活性なポリペプチド、リン酸化Ｔｈｒ−７４を維持している相同体またはフラグメントが含まれる。Ｎｄｒのフラグメントには、そのポリペプチドのかなりの部分が除去されているＮｄｒポリペプチド、またはその変異体（または相同体）が含まれる。Ｎｄｒフラグメントは、天然のＮｄｒとは実質的に異なる活性を有しているか、または実際天然のＮｄｒ生物学的活性の１つを欠いていて良い。故に、Ｎｄｒフラグメントは、個々のＮｄｒキナーゼドメイン、またはＮｄｒキナーゼドメインの一部、ならびにＳ１００Ｂ結合ドメインを包含していて良い。Ｎｄｒは、ＨａｎｋｓとＱｕｉｎｎにより同定された１２のタンパク質キナーゼ触媒サブドメインすべてを含む（Meth. Enzymol. (1991) 200, 38−62）。これらにより、サブドメインＶＩｂおよびＶＩＩＩの存在は、Ｎｄｒがセリン／スレオニンキナーゼであることを示唆する。故に、本発明は、Ｎｄｒのキナーゼドメインの一部、とりわけセリン／スレオニンキナーゼドメインを含む相同体を含む。さらに、ヒトＮｄｒのアミノ酸２６５−２７６（ＫＲＫＡＥＴＷＫＲＮＲＲ）が、核局在化シグナルをコードすることが明らかとなった。従って、本発明はまた、核局在化シグナルを含み、そしてアミノ酸配列ＫＲＫＡＥＴＷＫＲＮＲＲを有するＮｄｒのフラグメントを含む。
【００２２】
ポリペプチドの生物学的活性を含むより小さいペプチドが、本発明に包含される。Ｔｈｒ−７４部位（または対応箇所）を含むより小さいペプチドは、少なくとも５アミノ酸長であり、好ましくは天然のアミノ酸配列から選択される連続したアミノ酸を含む。好適なペプチドは、典型的に、それらの予定された使用に依存して６−１５アミノ酸長であり、例えば、抗体の製造には８〜１０アミノ酸長のペプチドが好適であり、そしてホスファターゼ基質としては６〜１０または６〜１５アミノ酸長のペプチドが好適である。
【００２３】
本明細書にて使用した用語「Ｎｄｒ生物学的活性」とは、Ｎｄｒキナーゼが基質をリン酸化する能力に限定されることなく、タンパク質またはペプチドの他の特性、例えば、Ｔｈｒ−７４にてリン酸化されたＮｄｒキナーゼまたはその等価体に特異的な抗体と結合する（すなわち、Ｎｄｒキナーゼのリン酸化状態と非リン酸化状態の間の識別）能力、もしくは例えばＳ１００ＢまたはＭＯＢ１などのタンパク質を含むＮｄｒキナーゼの基質またはモジュレーターに結合するその能力も含む。
【００２４】
好適な場合にて、本明細書にて用いた相同性とは、配列の同一性を示す。故に、相同体とは、本明細書に記載のＮｄｒタンパク質キナーゼと一定量の配列の同一性を有するポリペプチドでもある。配列の同一性とは、典型的に５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上である。ヒトおよびショウジョウバエのＮｄｒ配列は、６８％の配列の同一性を有する。一方、Ｄｂｆ２は、ヒトＮｄｒと全体としてたった３２％のアミノ酸の同一性を有し、そのことはＤｂｆ２がＮｄｒと関連するが、２つは種相同体ではないことを示す。Ｎｄｒタンパク質キナーゼファミリーのメンバーのアミノ酸残基が同一ではない場合、その相同体は、興味のあるキナーゼドメイン（複数可）の構造的／機能的関係を変化させない、保存的置換または変異を含むことが好ましい。相同体のＳｅｒ−２８１、Ｔｈｒ−４４４、Ｔｈｒ−７４またはそれらに対応するリン酸化部位の置換は、好ましくは酸性アミノ酸残基、例えばグルタミン酸で行われる。ただし、リン酸化部位により生じる機能を除去すること、例えば、ネガティブ対照としてアラニンで置換することが望ましい場合を除く。好ましくは、Ｔｈｒ−７４、Ｓｅｒ−２８１および／またはＴｈｒ−４４４を含む相同体は、これらの部位にてリン酸化され得るが、Ｔｈｒ−７４リン酸化部位のみを含む相同体が、例えば相互作用するタンパク質との結合活性に有用である。
【００２５】
特に好適な相同体は、配列−Ｋ−Ｅ−Ｓ／Ｔ／Ｎ−Ｅ−Ｆ／Ｙ−を含むものであり、ここで、Ｎは酸性アミノ酸であり、ＳおよびＴは、ホスホセリン残基またはホスホスレオニン残基を示し、残りのアミノ酸は、その常用される一文字表記で記載されており、そして最も好適な相同体は、配列−Ｋ−Ｅ−Ｓ／Ｔ−Ｅ−Ｆ／Ｙ−を含む。前記好適な相同体はさらに、配列−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｌｅｕ／Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｐ１−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−または−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐ２−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−のうち少なくとも１つを含んでいて良く、ここで、「／」は、いずれかから選択できるアミノ酸残基を示し、Ｐ１およびＰ２はリン酸化されたアミノ酸または酸性アミノ酸残基、好ましくはホスホセリンおよびホスホスレオニンをそれぞれ示し、Ｘａａは任意のアミノ酸であってよく、そして残りのアミノ酸は、その常用される三文字表記で記載されている。より好適な態様にて、前記相同体は、−Ａｒｇ／Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｌｅｕ／Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ｐ１−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−または−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ／Ａｓｎ−Ｐｈｅ／Ｔｙｒ−Ｐ２−Ｐｈｅ／Ｔｙｒ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−のうち少なくとも１つを含み、ここで、「／」は、代替的なアミノ酸残基を示し、Ｐ１およびＰ２はリン酸化されたアミノ酸または酸性アミノ酸残基、好ましくはホスホセリンおよびホスホスレオニンをそれぞれ示し、そして残りのアミノ酸は、その常用される三文字表記で記載されている。
【００２６】
本発明のポリペプチドが、融合タンパク質の形態で発現される場合、その融合ポリペプチドは、直接的に結合されるか、またはスペーサーにより結合されていてよい。例えば、天然には存在しない場合には、特異的に認識され、化学的または酵素的に切断され得る領域を挿入することが可能である。選択的に切断する試薬または酵素の例は、ＣＮＢｒ、Ｖ８プロテアーゼ、トリプシン、スロンビン、ファクターＸ、ペプチダーゼｙｓｃａおよびペプチダーゼｙｓｃＦである。前記融合ポリペプチドは、当業者に周知のように、「タグ」（例えば、ＨｉｓタグまたはＨＡタグ）などの、タンパク質の単離に有用な配列を含んでいてよいか、またはマーカータンパク質、例えば蛍光タンパク質または酵素、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼなどの無関係な配列と連結していてよい。組換え技術または化学的技術による融合タンパク質、変異体またはフラグメントの構築方法は、本技術分野にて周知である。
【００２７】
本発明のさらなる局面にて、Ｔｈｒ−７４（または対応箇所）にてリン酸化されたＮｄｒキナーゼに特異的な抗体を提供する。上記のように、かかる抗体は、Ｎｄｒキナーゼのリン酸化形と非リン酸化形の差異を識別することができる。かかる抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、抗体フラグメント（Ｆｃ、Ｆｖ）であってよく、そして例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒト、組換え体などを起源としてもよい。かかる抗体は、例えば、免疫染色、免疫沈降または免疫分離によるＮｄｒの同定、検出または単離に有用であり得るか、またはインビボもしくはインビトロにおけるＮｄｒ活性の阻害に有用であり得る。
【００２８】
Ｔｈｒ−７４（または対応箇所）にてリン酸化されたＮｄｒに特異的な抗体は、本技術分野にて周知の技術により調製され得る。ポリクローナル血清を調製するために、例えば、リン酸化されたＴｈｒ−７４を含むＮｄｒキナーゼの抗原部分（所望により、アジュバントが存在するか、またはキーホールリンペットヘモシアニンなどの免疫活性化薬剤と結合させたもの）を、マウスまたはウサギなどの哺乳動物に注入し、そして抗体を、固相結合キナーゼまたはその抗原部分を用いた親和性精製によりそれから回収する。モノクローナル抗体を、同様の確立された方法により調製することが可能である。
【００２９】
Ｎｄｒキナーゼのリン酸化は、Ｎｄｒを発現する細胞内で、オカダ酸で処理することにより誘導し得る。前記細胞は、自然にＮｄｒキナーゼを発現し得るか、またはＮｄｒキナーゼをコードする配列を含む発現ベクターを含み得る。故に、前記方法は、多様な宿主細胞での使用が可能である。細胞抽出物からＮｄｒキナーゼを発現および単離する方法は、本技術分野にて周知である（例えば、ＷＯ９６／１９５７９を参照）。Ｔｈｒ−７４（または対応箇所）にてリン酸化されているＮｄｒに特異的な抗体は、例えば、本技術分野にて周知のような、混入物質から所望のタンパク質を単離するための親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降を使用した、Ｎｄｒキナーゼ、またはこの部位にてリン酸化されたその相同体の単離に特に有用である。
【００３０】
前記ポリペプチド、とりわけその誘導体は、天然源から誘導されるよりもむしろ、合成法により得ることが可能である。故に、本明細書に含まれる情報を用いて、Ｎｄｒポリペプチドまたはペプチド類を、市販のタンパク質合成装置を用いて合成してよく、または商業用のペプチド合成サービスから得てもよい。合成されたＮｄｒの誘導体は、改変されたアミノ酸残基の使用、またはポリペプチドへの異種基(homologous group)もしくは側鎖の付加を含む、所望の配列修飾を含んでいて良い。その後、前記ポリペプチドまたはペプチド類は、以下の実施例に記載したように、インビトロでリン酸化し得る。
【００３１】
本発明者らは、ＮＤＲとｈＭＯＢ１の相互作用も検討し、オカダ酸刺激に依存した方法でｈＭＯＢ１がｈＮＤＲと相互作用することを発見した（実施例８参照）。ｈＭＯＢ１の過剰発現は、ＮＤＲキナーゼ活性も刺激する。ＮＤＲのＮ末端制御ドメイン内の保存残基の点変異は、ＮＤＲキナーゼ活性、ならびにＭＯＢ１結合を低下する。前記ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用は、ＭＯＢ１のオカダ酸誘導変異による影響を受けるが、ＮＤＲのオカダ酸誘導リン酸化には、相互作用を必要としない。Ｃａ２＋キレート化剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭでの細胞の処理は、ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用を低下させ、ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用におけるＣａ２＋の役割を示唆する。
【００３２】
故に、本発明のさらなる局面にて、Ｎｄｒ、その機能的相同体またはフラグメント、およびＭＯＢ１（ＭＰＳワンバインダー１）を含む複合体を提供する。ｈＭＯＢ１の配列は、ＧＩ：１１６９１８９８および以下の配列番号：５に記載されており、当業者に明らかなように、ＭＯＢ１の相同体もまた、Ｎｄｒと結合し得る。ＭＯＢ１相同体は、ＧＩ１１６９１８９８または、配列番号：５もしくは６に記載のＭＯＢ１配列と一定量の配列同一性を有するポリペプチドである。配列の同一性とは、一般に５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上である。好ましくは、前記タンパク質はヒトタンパク質である。いくつかの態様にて、１以上のタンパク質を、検出を容易にするために標識し、例えば、蛍光標識を用いて標識する。故に、２つのタンパク質（例えば、Ｎｄｒ１とＭｏｂ１）間の相互作用を、結合した蛍光標識の量によるか、または蛍光消光により検出することができる。
【００３３】
Ｎｄｒなどのキナーゼは、細胞内のシグナル伝達に関与することが知られている。この関与とは、シグナル伝達経路を調節する物質のためのキナーゼ標的を構成することである。一般に、シグナル伝達経路の調節は、特定の刺激に対する細胞の応答を変化させる。例えば、ホルモンの作用は、一般に遺伝子発現の調節因子である、ホルモン受容体から生物学的エフェクターへのシグナル伝達に関与するキナーゼを標的化することにより調節され得る。タンパク質のＳ１００ファミリーとは、細胞中の主にカルシウムイオン結合タンパク質を示し、そして多くのカルシウムを介する作用に関与する。Ｎｄｒの活性は、とりわけＳ１００Ｂにより制御される。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、Ｎｄｒキナーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストの同定に有用であり、そして、例えば細胞増殖の異常の処置における医薬としての可能性を有する。好ましくは、本発明のスクリーニング方法は、細胞をＮｄｒのアクチベータまたはインヒビターと接触させることを含む。モジュレーターとして総称されるアクチベータおよびインヒビターにはＮｄｒ模倣物が含まれ、Ｔｈｒ−７４部位またはＴｈｒ−７４部位の近隣でＮｄｒと相互作用し、それによりＮｄｒ活性におけるＴｈｒ−７４リン酸化の効果に影響を与える。言い換えれば、モジュレーターは、ＭＯＢ１に作用することが可能であり、ＮｄｒのＴｈｒ−７４領域へのその結合を阻害または増強し得、それにより他の手段によるＮｄｒの活性を活性化するか、または抑制することができる。
【００３５】
故に、本発明の１つの局面にて、Ｎｄｒキナーゼ活性の、可能性のあるモジュレーターを同定する方法は、Ｎｄｒキナーゼまたはその機能的相同体を、可能性のあるモジュレーターと接触させること、そして、ＮｄｒキナーゼのＴｈｒ−７４またはＮｄｒタンパク質キナーゼ１もしくはその機能的相同体のアミノ酸Ｔｈｒ−７４に対応するアミノ酸のリン酸化における変化を検出することにより行われる。リン酸化の変化は、リン酸特異的抗体の使用により容易に検出され得る。Ｔｈｒ−７４のリン酸化の減少は、Ｎｄｒキナーゼ活性を阻害する化合物であることを示す。
【００３６】
別の態様にて、Ｎｄｒキナーゼ活性の、可能性のあるモジュレーターを同定する方法は、Ｔｈｒ−７４（または対応箇所）にてリン酸化されたＮｄｒもしくはその機能的相同体を、可能性のあるモジュレーターと接触させること、そして、前記モジュレーターとリン酸化されたＮｄｒまたはその機能的相同体間の相互作用を検出することにより行われる。かかるモジュレーターとしては、限定するものではなく、アゴニスト、シグナル伝達経路のアンタゴニストおよび上流のメンバーが含まれ得る。
【００３７】
さらなる態様にて、本発明は、ＭＯＢ１およびＮｄｒ（またはその相同体もしくはフラグメント）のタンパク質複合体と一緒に、可能性のあるモジュレーターをインキュベートする工程、およびＭＯＢとポリペプチド間の結合の変化を検出する工程を含む、Ｎｄｒキナーゼ活性の、可能性のあるモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。故に、モジュレーターは、２つのタンパク質間の結合を減少させ、ＭＯＢ１を放出し、その場合はＮＤＲキナーゼ活性が阻害される（モジュレーターが、全長ＭＯＢ１よりもＮＤＲにより高い親和性を有するＭＯＢ１の機能的フラグメントであることが前提であり、この場合には、ＭＯＢ１の機能的フラグメントが、ＭＯＢ１活性を模倣し得、そしてＮｄｒ活性を活性化し得る）。言い換えれば、モジュレーターは、２つのポリペプチド間の結合を増加することができ、故にＮｄｒ活性を活性化することが可能である。
【００３８】
故に、本発明のＮｄｒキナーゼ要素を、増殖制御の異常の処置における使用を目的とした推定治療薬剤を同定するためのスクリーニングシステムの設計に用いることができる。参照により本明細書に引用されるＷＯ９７／１８３０３には、スクリーニング方法、キット、可能性のある治療薬およびその製造が記載されており、その教示は、本発明の材料および方法に適用され得る。
【００３９】
結合実験に関して、本発明のポリペプチドは、例えば、マイクロタイター・プレートまたはビーズのような固形担体上に固定され得るか、または、１以上の識別可能なマーカー、例えばビオチン、または放射性基、蛍光性基もしくは化学発光性基を担持し得る。本発明の好適な態様にて、Ｎｄｒ１または２は、Ｎｄｒ活性の、可能性のあるモジュレーターをスクリーニングする方法にて使用される。
【００４０】
インキュベーション条件は、分析に用いられる正確な方法、例えば、キナーゼ分析を使用するかまたはキナーゼとスクリーニングされた化合物間の相互作用の検出を使用するかにより変わる。転写活性検出システム、例えば酵母ツーハイブリッドシステムの場合、インキュベーション条件は、遺伝子転写に適当な条件であり、例えば通常の生細胞内の条件である。しかし、他の検出システムでは、異なるインキュベーション条件が必要とされる。例えば、相互作用の検出がクロマトグラフィー分析における相対的親和性に基づくもの、例えば親和性クロマトグラフィーとして周知のものである場合、条件は、結合を促進するように調整し、そしてその後、スクリーニングされた化合物が、もはやＮｄｒに結合しない点を決定できるように、除々に変える。
【００４１】
本発明のインキュベーションは、多くの手段により達成されるが、基本的な要件は、キナーゼまたはその相同体／フラグメントとスクリーニングされた化合物が互いに接触した状態になり得ることである。これは、ポリペプチドおよび前記化合物を混和することにより達成され得るか、またはインサイチュウでそれらを産すること、例えばそれらをエンコードする核酸を発現させることにより達成される。ＮｄｒまたはＮｄｒフラグメントおよび／または前記化合物が、他のポリペプチドと融合した形態である場合、それらを例えばインサイチュウで発現させることができる。
【００４２】
本発明のＮｄｒまたはその相同体もしくはフラグメントを、例えばスクリーニングする化合物と一緒にインキュベートし、そして次に、Ｎｄｒに特異的な抗体またはＭＯＢ１に特異的な抗体でＮｄｒ複合体を「沈降する（pulling down）」ことにより、それと結合する化合物をスクリーニングするために用いることができる。免疫沈降または免疫親和性クロマトグラフィーに適当な抗体を、当業者に周知の常套方法により調製することが可能であり、そしてそれは本質的にモノクローナル、ポリクローナルまたは組換え体であってよい。Ｎｄｒ化合物複合体を、親和性により単離した後、前記化合物を、常套技術によりＮｄｒ抗体から分離し、特性化することが可能である。
【００４３】
本発明はさらに、スクリーニングシステムにおける、Ｔｈｒ−７４（または対応箇所）にてリン酸化されたＮｄｒ、もしくはこの残基にて酸性アミノ酸を有するＮｄｒの使用を含む。
【００４４】
さらなる態様にて、本発明は、Ｎｄｒ（またはＭＯＢ１）またはそのフラグメントと、直接的または間接的に相互作用する化合物を提供する。かかる化合物は、無機物または有機物であり得、例えば、細胞内シグナル伝達に関与する抗生物質またはタンパク質性化合物であり得る。
【００４５】
本発明の化合物は、上述した技術を用いたスクリーニングにより同定され得、そして、確立された方法に従い天然源から抽出することにより調製され得るか、とりわけ低分子量の化合物の場合には、合成により調製され得る。タンパク質性化合物は、組換え発現系、例えばバキュロウイルス系または細菌系にて発現させることにより調製され得る。タンパク質性化合物は、治療に応用することが可能であるが、主にシグナル伝達経路の機能の探索に有用である。
【００４６】
一方、低分子量化合物は、好ましくは、確立された方法に従って化学合成により調製される。それらは、主として治療薬として示唆される。一般に、低分子量化合物および有機化合物は、抗増殖剤として有用であり得る。
【００４７】
故に、Ｔｈｒ−７４（または対応箇所）にてリン酸化されたＮｄｒキナーゼ、もしくはその機能的相同体は、特に細胞増殖の異常、例えばガン、免疫系の疾患または障害（例えば、免疫不全）および神経変性疾患の処置のための、医薬として有用であるか、または医薬の調製のために有用であり得る。
【００４８】
かかる化合物のスクリーニングに有用なキットを調製可能であり、基本的にＴｈｒ７４（または対応箇所）にてリン酸化されたＮｄｒまたはその機能的相同体と共に取扱説明書を含み、所望により、Ｎｄｒとスクリーニングされた化合物、ＭＯＢ１またはその相同体の間の相互作用、およびＭＯＢ１と前記スクリーニングされた化合物の間の相互作用を検出する１つ以上の手段を含んでいてよい。故に、スクリーニングキットは、上記の検出システムの１つを含むことが好ましい。
【００４９】
本発明のキットに使用するためのＮｄｒは、例えば、溶液中、懸濁液中または凍結乾燥したタンパク質の形態で提供され得るか、もしくは発現系にてＮｄｒまたはそのフラグメントの製造を可能とする核酸配列の形態で提供され得る。
【００５０】
以下の実施例は、本発明の特定の局面を記載しており、当業者に対して本発明を例証し、本発明を説明するものである。実施例は、本発明の理解および実施に有用な特定の方法を単に提供する例としてであって、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００５１】
実施例
方法
ランダムプライミング、サブクローニング、シークエンシング、制限酵素での切断、ゲル精製、ライゲーション、形質転換およびアニーリングなどの遺伝子工学における標準的な方法を、基本的にSambrookらの、Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989に記載のように実施する。
【００５２】
細胞培養
ＣＯＳ−１細胞を、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００マイクログラム／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中にて維持した。細胞を、業者の取扱説明書に従いサブコンフルエント段階でＦｕｇｅｎｅ−６トランスフェクション試薬（Roche）にて形質転換した。いくつかの実験にて、トランスフェクションの２４時間後に、細胞を０．１％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Alexis Corp.）中１マイクロＭ オカダ酸、０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Sigma）中５０マイクロＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸・テトラ（アセトキシ−メチル）エステル）、または０．１％ＤＭＳＯ（Alomone）中２０マイクロＭタプシガルギンで６０分間処理した。
【００５３】
プラスミド
ＨＡでタグ標識したＮＤＲ１を有する哺乳動物発現ベクターを、以下のプライマー：
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＧ−３’（配列番号：１０）および５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号：１１）を用いてＰＣＲにより構築し、そしてｐＣＭＶ５のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。ｐＧＥＸ−２Ｔ＿ＮＤＲ１プラスミドは、既に文献に記載されている（Millward et al., 1995, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92, 5022−5026）。キナーゼ不活性ｐＣＭＶ５＿ＨＡ−ＮＤＲ１プラスミドおよびｐＧＥＸ−２Ｔ＿ＮＤＲ１プラスミド（Ｋ１１８Ａ）、およびリン酸化部位アラニン変異体（Ｔ７４Ａ、Ｓ２８１ＡおよびＴ４４４Ａ）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位突然変異プロトコール（Stratagene）を用いて以下のプライマーで野生型ベクターから作製した：
５’−ＧＧＡＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＣＡＡＴＧＧＣＴＡＴＡＣＴＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＴＡＴＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号：１２）および５’−ＧＣＡＴＡＴＣＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＡＣＡＴＧＴ
ＣＣＣＧＴＡＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＧＡＡＣＡＡＧＣ−３’（Ｋ１１８Ａ；配列番号：１３）；５’−ＧＣＴＣＧＧＡＡＧ−ＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＴＣＴＴＣＧＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＡＧＡＣＴＴＧＧ−３’（配列番号：１４）および５’−ＣＧＡＡＧＡＡＡＣ−ＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＧＡＧＣ−ＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＧ−３’（Ｔ７４Ａ；配列番号：１５）；５’−ＣＧＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＴＴＣ−ＧＣＴＡＣＡＧＴＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＧＡＣＴＡＣＡＴＴＧＣ−３’（配列番号：１６）および５’−ＧＧＡＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＴＡＧＣＧＡ−ＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＣＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣ−３’（Ｓ２８１Ａ；配列番号：１７）；および５’−ＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＡＣ−ＧＣＴＴＡＣＡＡＧＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＣＴＧＣ−３’（配列番号：１８）および５’−ＣＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＴＧＴＡＡ−ＧＣＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ−ＴＴＧＴＴＣ−３’（Ｔ４４４Ａ；配列番号：１９）。
ｐＥＣＥ＿Ｓ１００Ｂプラスミドは既に文献に記載されている（Millward et al., 1998, EMBO J. 17, 5913−5922）。すべてのプラスミドの配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【００５４】
抗体
抗Ｓｅｒ２８１Ｐおよび抗Ｔｈｒ４４４Ｐウサギポリクローナル抗血清を、Ｓｅｒ２８１Ｐ部位の合成ペプチドＮＲＲＱＬＡＦＳ（ＰＯ４）ＴＶＧＴＰＤ（配列番号：２０）およびＴｈｒ４４４Ｐ部位のＫＤＷＶＦＩＮＹＴ（ＰＯ４）ＹＫＲＦＥＧ（配列番号：２１に対して作製した。前記ペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニンと結合させた。ウサギへの注射および血の収集を、標準的な技術を用いて行った。抗Ｓ２８１Ｐ抗血清をさらなる精製なしに用い、一方、抗Ｔ４４４Ｐ抗体を、プロテインＡ−セファロース（Pharmacia）で精製し、その後抗原ペプチド結合ＣＮＢｒ−活性化セファロース（Pharmacia）で精製した。抗体を、０．１Ｍ グリシン、ｐＨ２．５で溶出した。１２ＣＡ５ ＨＡ モノクローナル抗体ハイブリドーマ上清（ＨＡに特異的な抗体）を、ＨＡ−ＮＤＲ１変異体の免疫検出および免疫沈降に用いた。ウサギ抗ＮＤＲ１＿Ｃ末端ポリクローナル抗血清を、合成ペプチドＴＡＲＧＡＩＰＳＹＭＫＡＡＫ（ＮＤＲ１、配列番号：２のａａ４５２−４６５に対応する）結合キーホールリンペットヘモシアニンに対して作製した。ペプチド特異的抗体を、プロテインＡ−セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）で精製し、次に免疫ペプチドを結合したＡｆｆｉ−ｇｅｌ  １０（Bio−Rad）で精製した。抗体を、６Ｍ 尿素を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４で溶出し、次にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。Ｓ１００Ｂを認識するウサギポリクローナル抗血清を、組換えヒトＳ１００Ｂに対して作製し、さらなる精製なしに用いた（Ilg et al.,1996, Int.J.Cancer 68, 325−332）。
【００５５】
ヒトＧＳＴ融合ＮＤＲ１の細菌性発現
ＢＬ２１−ＤＥ３−ｐＲｅｐ４大腸菌株を、ｐＧＥＸ−２Ｔ＿ＮＤＲ１野生型または変異プラスミドで形質転換した。ＢＬ２１−ＤＥ３はプロテアーゼ欠損大腸菌株であり、ｐＲｅｐ４はＬａｃＩｑリプレッサー担持プラスミドであり、共に市販されている。所望により、望ましい場合はＧｒｏＥＳＬを含む大腸菌株を使用してよく、それはキナーゼを安定化するシャペロンタンパク質を発現する。対数増殖期中期(mid-logarithmic phase)の細胞を、３０℃で４時間、０．５ｍＭ イソプロピル ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。細菌を、１ｍｇ／ｍｌリソソームの存在下で加圧型細胞破壊装置（French press）を用いて溶解し、融合タンパク質を、前記装置の製造業者が記載のようにグルタチオン−アガロース（Amersham Pharmacia Biotech）で精製した。組換えタンパク質を、下記のようにキナーゼ活性について分析し、自己リン酸化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後にチェレンコフ計測（Cerenkov counting）によるか、またはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーニングに暴露し、その後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Molecular Dynamics）で分析することにより決定した。
【００５６】
ＧＳＴ−ＮＤＲ１キナーゼ分析
１マイクログラムの精製した組換えＧＳＴ−ＮＤＲ１野生型および変異体（さらなる処理なしにか、または１ｍＭ ＣａＣｌ２および１０ｍＭ ウシＳ１００Ｂ（Ｓｉｇｍａ）の存在下または非存在下にて２時間自己リン酸化させる）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰ（〜０．５ｍＣｉ／マイクロリットル）、および１ｍＭ ＮＤＲ１基質ペプチド（ＫＫＲＮＲＲＬＳＶＡ；配列番号：２２）を含む２０マイクロリットルの反応混合物中にて分析した。３０℃で３０分間インキュベーション後に、反応を５０ｍＭ ＥＤＴＡで停止し、そして反応混合物１０マイクロリットルを、２ｃｍ２の正方形のＰ８１ホスホセルロース・ペーパー（Whatman）上にスポットとした。それらを、１％ リン酸中で４×５分、次に３×２０分間洗浄し、アセトンで１度洗浄し、その後、液体シンチレーションカウンター中にて測定した。ＮＤＲ１活性の１単位を、１分間に１ｎｍｏｌペプチド基質のリン酸化を触媒する量として定義した。
【００５７】
ＨＡ−ＮＤＲ１キナーゼ分析
形質転換され、かつ処理されたＣＯＳ−１細胞を氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４および２０ｍＭ ベータ−グリセロリン酸を含む１ｍｌの氷冷ＰＢＳ中にラバーポリスマン（rubber policeman）で収集し、その後、５００マイクロリットルのＩＰ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ノニデットＰ−４０、１０％ グリセロール、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２０ｍＭ ベータ−グリセロリン酸、１マイクロモル マイクロシスチン−ＬＲ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、４マイクロモル ロイペプチン、１ｍＭ ベンズアミジン、および１錠／コンプレート・プロテアーゼ・インヒビター１０ｍｌ ＩＰ（Roche））中に溶解した。溶解物を、２０分間２００００ｇで遠心し、そして上清の３等分のアリコート（２００ｍｇ）を、６０分間プロテインＡ−セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）で事前にきれいにしておき、そして次に、４℃で３時間１２ＣＡ５抗体と混合し、プロテインＡ−セファロースに事前に結合させた（２マイクロリットル ビーズに対して〜１マイクロｇ抗体）。その後、前記ビーズをＩＰ緩衝液で２度洗浄し、１０分間、１Ｍ ＮａＣｌを含むＩＰ緩衝液で１度洗浄し、再び１０分間、ＩＰ緩衝液で１度洗浄し、そして最後に４マイクロモル ロイペプチンおよび１ｍＭ ベンズアミジンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で２度洗浄した。その後、ビーズを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１００マイクロモル［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰ（〜０．１マイクロＣｉ／マイクロリットル）、１マイクロモル ｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼインヒビター・ペプチドＰＫＩ（Bachem）、４マイクロモル ロイペプチン、１ｍＭ ベンズアミジン、１マイクロモル ミクロシスチン−ＬＲ、および１ｍＭ ＮＤＲ１基質ペプチド（ＫＫＲＮＲＲＬＳＶＡ）を含む３０マイクロリットルの緩衝液中に再懸濁した。３０℃でインキュベーションした６０分後、１５マイクロリットルの上清を除去し、そして基質ペプチドへのリン酸の取り込みを、上記ＧＳＴ−ＮＤＲ１のように判定した。
【００５８】
Ｓｅｒ２８１またはＴｈｒ４４４でリン酸化されたＮＤＲ１の免疫検出
上記の１００マイクログラムのＣＯＳ−１界面活性剤抽出物から免疫沈降した１マイクログラムのＧＳＴ−ＮＤＲ１またはＨＡ−ＮＤＲ１のどちらかを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そして室温で２時間、または４℃で一晩、５０マイクログラム／ｍｌの競合的非リン酸化ペプチドまたは抗Ｔｈｒ４４４Ｐ精製抗体（１：５００）の存在下に抗Ｓｅｒ２８１Ｐ抗血清（１：１０００）で免疫ブロッティングした。両抗体を、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ−結合ロバ抗ウサギＩｇ抗体（Amersham biosciences）で検出し、そしてＥＣＬ（化学発光； Amersham Pharmacia Biotech）で現像した。
【００５９】
ウエスタンブロッティング
ＧＳＴ−ＮＤＲ１またはＨＡ−ＮＤＲ１を検出するため、試料を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてＰＶＤＦ膜（Immobilon-P; Millipore）に転写した。膜を、５％スキムミルク粉末を含むＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中でブロッキングし、その後、抗ＮＤＲ１＿Ｃ末端（４マイクログラム／ｍｌ）または１２ＣＡ５モノクローナル抗体上清（１：１００）で２時間プロービングした。結合した抗体を、対応するホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ−結合二次抗体およびＥＣＬで検出した。免疫沈降したＳ１００Ｂを検出するため、試料を１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてＰＶＤＦに転写した。前記膜をＴＢＳＴ中５％ＢＳＡおよび１％ＦＣＳで２時間ブロッキングし、その後、同じ緩衝液（ＢＳＡおよびＦＣＳを含むＴＢＳＴ）で１：１０００に希釈した抗Ｓ１００Ｂ抗血清でプロービングした。その後、結合した抗体をＴＢＳＴ中の対応するホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ−結合二次抗体およびＥＣＬで検出した。
【００６０】
ＮＤＲ１およびＳ１００Ｂの共免疫沈降
細胞質性のＣＯＳ−１細胞抽出物を、低張緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２０ｍＭ ベータ−グリセロリン酸、１マイクロモル マイクロシスチン−ＬＲ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、４マイクロモル ロイペプチン、１ｍＭ ベンズアミジン、および１錠剤／完全なプロテアーゼ・インヒビター１０ｍｌ）中にて１０分間、細胞を溶解することにより調製した。その後、細胞を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いてホモジナイズした。３３００ｇで１５分間遠心後、細胞質抽出物を含む上清を取っておき、そしてペレット中に見られる単離された核をさらに高塩緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２５％ グリセロール、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２０ｍＭ ベータ−グリセロリン酸、１マイクロモル マイクロシスチン−ＬＲ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、４マイクロモル ロイペプチン、１ｍＭ ベンズアミジン、および１錠剤／コンプレート・プロテアーゼ・インヒビター１０ｍｌ）中にて３０分間溶解処理した。２００００ｇで３０分間遠心後、細胞質および核抽出物を、４：１の割合で合わせた。１ｍｇのタンパク質抽出物を、６０分間プロテインＡ−セファロースで事前にきれいにしておき、そして１０ｍｌ プロテインＡ−セファロースに固定された５ｍｌの抗Ｓ１００Ｂ抗血清と一緒に、４℃で３時間インキュベートした。その後、前記ビーズを、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２５ｍＭ ＫＣｌ、５％ グリセロール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、４マイクロモル ロイペプチン、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２０ｍＭ ベータ−グリセロリン酸、１マイクロモル マイクロシスチン−ＬＲ、および５０ｍＭ ＮａＦ）中で４度洗浄した。免疫沈降物を、試料緩衝液中で沸騰し、そして上記のようにＳ１００ＢまたはＨＡ−ＮＤＲ１に免疫ブロットした。
【００６１】
質量分析
１０マイクログラムの未処理ＧＳＴ−ＮＤＲ１または自己リン酸化ＧＳＴ−ＮＤＲ１（１ｍＭ ＣａＣｌ２および１０マイクロモル ウシＳ１００Ｂホモ二量体の存在下か非存在下のどちらかにて３０℃で２時間）を、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシー・ブルーＲ−３５０（Sigma）で染色し、そしてさらなる処理のためにゲルから抽出した。次に、ゲル片をアセトニトリル中で３×８分洗浄し、そして２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中で２×１２分洗浄した。その後、ゲル片を１０ｍＭ ＤＴＴ中５７℃で１時間還元し、続いて５５ｍＭ ヨードアセトアミド中室温で４５分間アルキル化した。アセトニトリル／ＮＨ４ＨＣＯ３中での洗浄を繰り返した後、ゲル結合ＧＳＴ−ＮＤＲ１を、３７℃で一晩、連続的に等級調製されたトリプシン（Promega）で切断した。その後、切断されたペプチドを、水：アセトニトリル：ギ酸（２０：７０：１０）および水：メタノール：ギ酸（９３：２：５）中における２度の１５分間の超音波処理工程により抽出した。
【００６２】
すべての実験を、ＮａｎｏＥＳＩ源（Protana、Odense、Denmark）を備えたＡＰＩ３００三連四重極質量分析計（triple-quadrupole mass spectrometer）（PE-Sciex、Toronto、Canada）で行った。ｍ／ｚ−７９の前駆体イオンスキャンに関して、試料をＷｉｌｍとＭａｎｎ（1996, Anal.Chem. 68, 1−8）にしたがったオフライン・ナノエレクトロスプレーにより注入した。その装置を、ネガティブイオン・モードにて操作した；ｍ／ｚ−７９の検出の感度を良くするため、少量のアンモニアを試料調製中に噴射用注射針に添加した。ＬＣ−ＭＳ配列分析に関して、リン酸化ペプチドをさらにＡＰＩ３００質量分析器と連動した高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離した。Ｒｈｅｏｓ４０００クロマトグラフには、１×２５０ｍｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ８カラム（Hesperia、Canada）が装備されている。ＨＰＬＣカラムを９５％ 溶媒Ａ（水中２％ ＣＨ３ＣＮ、０．０５％ トリフルオロ酢酸）、５％ 溶媒Ｂ（水中８０％ ＣＨ３ＣＮ、０．０４５％ トリフルオロ酢酸）にて平衡化し、そして１８０マイクロリットル／分の流速で６０分間にわたる溶媒Ｂの５から５０％の直線勾配を展開した。カラム後、流出物を質量分析に用いるために少量ずつ（約５％）取り分けた。リン酸化ペプチドを、集めたＨＰＬＣ画分にてチェレンコフ計測で検出した。さらなる配列調査のために、リン酸化ペプチド含有画分を乾燥し、数マイクロリットルの水：ＣＨ３ＣＮ：ギ酸（４９．５：４９．５：１）中に再溶解し、ナノエレクトロスプレー源を用いて質量スペクトル分析器に徐々に注入し、そしてポジティブイオン・モードにて低エネルギー・タンデムＭＳ装置により分析した。
【００６３】
実施例１：Ｎｄｒ１自己リン酸化部位のマッピング
ＮＤＲ１を、ＥＦハンドＣａ２＋結合Ｓ１００Ｂタンパク質とインキュベートすることにより、自己リン酸化およびＮｄｒ１キナーゼ活性の両方が増加した（Millward ら, 1995; Millwardら, 1998）。本実施例ではさらに、ナノスプレーＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析法によりＮＤＲ１自己リン酸化部位を分析した。
【００６４】
簡単には、１０マイクログラムのＧＳＴ−ＮＤＲ１を未処理のままか、または１ｍＭ ＣａＣｌ２および１０ｍＭ ウシＳ１００Ｂの非存在下または存在下にて２時間自己リン酸化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、ＧＳＴ−ＮＤＲ１を切り出し、リン酸化ペプチドの質量スペクトル分析のためにトリプシン切断処理した。得られたトリプシンとペプチドの混合物を、三連四重極質量分析計に注入し、ネガティブイオン・モードにてｍ／ｚ−７９に関して前駆体イオンスキャンすることによりリン酸化ペプチドを分析した。この方法にて、衝突セル（collision cell）におけるフラグメント化後、ｍ／ｚ−７９種を遊離し、リン酸化ペプチドの特徴であるネガティブ・フラグメントイオンＰＯ３−特性を示す、前記混合物中の各ペプチドを検出した（Carr et al., 1996, Anal. Biochem. 239, 180−192; Wilm et al, 1996, Anal.Chem. 68, 527−533）。ｍ／ｚがＮＤＲ１誘導リン酸化ペプチドであると考えられるリン酸化ペプチドを、便宜上Ｐ１〜Ｐ４と標識した。前記ペプチドのいくつか（例えば、Ｐ２およびＰ１）を、重荷電状態にて検出した。ペプチドＰ２は、Ｐ１と重複し芳香族性残基が末端であるため、トリプシン調製物の微量のキモトリプシン混入により生じたと推定される。多くの二重−荷電非リン酸化ＮＤＲ１ペプチド（配列番号：２のアミノ酸３７８−３９１）を、ｍ／ｚ８６０として検出した。
【００６５】
ＮＤＲ１ポリペプチドの３つの領域から誘導されるリン酸化ペプチドＰ１−Ｐ４（それぞれ、配列番号：２のアミノ酸２７７−３０１、２７７−２９４、４３８−４４７および７２−７８）を、Ｎｄｒ１完全長配列に関する番号付けにしたがい示したホスホアクセプター残基としてまとめた。
【表１】
2010279371.tif 000002
【００６６】
未処理ＧＳＴ−ＮＤＲ１をｍ／ｚ−７９の前駆体イオンスキャンにより分析した場合、ペプチドＰ２およびＰ４に対応する弱いリン酸化シグナルのみを検出することができた。しかしながら、Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂの非存在下または存在下のどちらかで自己リン酸化されたＧＳＴ−ＮＤＲ１試料では、多量のリン酸化ペプチドが明らかに増加した。ほとんどのこれらのシグナルの観察されたｍ／ｚ値は、両方の試料にて、リン酸基（７９．９７Ｄａ）を遊離させる際に、期待されるトリプシン性（または、一例としてキモトリプシン性）ＮＤＲ１脱リン酸化ペプチドを生じる４つのＮＤＲ１誘導リン酸化ペプチドＰ１−Ｐ４とした。
【００６７】
これらのペプチドの同一性を確認するため、［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰでのＧＳＴ−ＮＤＲ１の自己リン酸化のＬＣ−ＭＳ分析を行った。リン酸化ペプチドに富む放射活性画分を収集した後、試料をｍ／ｚ−７９前駆体イオンスキャン法を用いてＥＳＩ質量測定器により分析した。標識されていないＧＳＴ−ＮＤＲ１の分析にて同じ種が発見され、その後、低エネルギー・タンデム質量（ＭＳ／ＭＳ）分析をポジティブイオン法にて行った。上記に一覧としたリン酸化ペプチドに対応するイオン種（リン酸化された残基を含む）が検出され、よってＮＤＲ１インビトロ自己リン酸化部位の同一性を確認した。
【００６８】
前記４つのリン酸化ペプチドを、ＮＤＲ１ポリペプチドの３つの領域から誘導した。最初の３つは、オカダ酸によりインビボにて活性化されたＮＤＲ１において先に同定された部位に対応する。Ｐ１およびＰ２は、活性断片のＳｅｒ２８１を含むリン酸化ペプチドを示し、Ｐ３は、ＮＤＲ１のカルボキシル末端領域に位置する疎水性モチーフ由来の残基Ｔｈｒ４４４を含むリン酸化ペプチドを示す（ＥＰ１０９７９８９、表題「Ｎｄｒホスホキナーゼ」を参照）。前記リン酸化ペプチドＰ４は、アミノ酸６２−８３を包含するＳ１００結合領域として定義されているＮＤＲ１のＮ末端領域ではこれまで同定されていないリン酸化残基であるＴｈｒ７４を含む（Millward et al.,1998）。
【００６９】
故に、本実施例は、インビトロにおける３つの残基のＮＤＲ１自己リン酸化を示す。その第一番のＴｈｒ７４は、ＮＤＲ１のＮ末端Ｓ１００Ｂ結合ドメインに位置する。第二番目、主な部位であるＳｅｒ２８１（すべてのＡＧＣ群のキナーゼによく保存されている）は、ＮＤＲ１の核局在化シグナルおよびキナーゼドメイン・インサートのすぐ後ろのキナーゼ触媒ドメインのサブドメインＶＩＩＩ中の活性断片（「Ｔ−ループ」としても知られる）の必須部分を構成する。第三の部位であるＴｈｒ４４４もまた、ＡＧＣスーパーファミリー中に保存されており、疎水性アミノ酸残基に富む領域（故に、「疎水性モチーフ」と呼称する）内にてキナーゼ触媒ドメインの外側に位置する。
【００７０】
実施例２：ＧＳＴ−リン酸化部位変異体における自己リン酸化割合およびキナーゼ活性の低下
インビトロでのＮＤＲ１の残基Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ２８１、およびＴｈｒ４４４における自己リン酸化を確認するため、ならびにＮＤＲ１の自己リン酸化誘導キナーゼ活性におけるこれらの残基の影響を評価するために、リン酸化部位残基をアラニンで置換するか、または触媒部位中のＬｙｓ１１８をアラニンで置換して一連のＧＳＴ−ＮＤＲ１変異体を構築し、ＧＳＴ−ＮＤＲ１キナーゼ不活性変異体を形成した。これらを、自己リン酸化およびキナーゼ活性について分析した。
【００７１】
簡潔には、１マイクログラムの精製されたＧＳＴ−ＮＤＲ１（溶液中、〜０．５マイクロモル）野生型、キナーゼ不活性（Ｋ１１８Ａ）、リン酸化残基Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ２８１、およびＴｈｒ４４４のアラニン変異体を、さらなる付加物なしにか、または１ｍＭ ＣａＣｌ２および１０マイクロモル ウシＳ１００Ｂの存在下でインビトロにて２時間リン酸化した。タンパク質を、クマシー・ブルーＲ−３５０染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてＳＤＳゲル上で可視化し、そして［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰ−標識タンパク質を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーニング上に作成したゲルの自己リン酸化により可視化した。取り込まれた３２Ｐの量を、チェレンコフ計測により定量した。
【表２】
2010279371.tif 000003
【００７２】
ＧＳＴ−ＮＤＲ１変異体の特異的活性もまた、上記のようにしてペプチドキナーゼ分析により測定した。本目的のために、１マイクログラムの精製したＧＳＴ−ＮＤＲ１野生型およびアラニン変異体を、さらなる処理なしか、または１ｍＭ ＣａＣｌ２および１０ｍＭウシＳ１００Ｂの存在下または非存在下で２時間自己リン酸化させた。
【表３】
2010279371.tif 000004
【００７３】
野生型ＧＳＴ−ＮＤＲ１は、インビトロで効率的に自己リン酸化されるようになり（０．４ピコモルＡＴＰ／ピコモルＧＳＴ−ＮＤＲ１まで）、そのためＳ１００Ｂホモ二量体の付加が、（Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４の両方における）自己リン酸化の約２倍の増加をもたらし、同時にキナーゼ活性の約５倍の増加をもたらした。キナーゼ不活性変異体が、検出可能な自己リン酸化を示さなかったため、ＮＤＲ１キナーゼ活性が、観察される効果の主な原因であると考えられる。Ｓ２８１Ａ変異体は、（Ｓ１００Ｂの添加に関わりなく）劇的に低下した自己リン酸化割合を示し、故に、この残基が、インビトロにおけるＮＤＲ１の主な自己リン酸化部位であることを確認した。Ｓ２８１Ａのキナーゼ活性は、同じく低下し、ほとんど検出不可能になった。
【００７４】
Ｔ４４４Ａ点変異はまた、Ｓ２８１Ａと同程度ではないが、自己リン酸化割合およびキナーゼ活性両方の顕著な低下（約５倍）をもたらし、Ｔ４４４もまた、インビトロにおける自己リン酸化を受けやすいことを示した。理論に縛られることを望んでいないが、Ｓ２８１Ａ変異との比較として顕著ではないＴ４４４Ａの効果が、好ましくない、たった２つの離れた塩基性アミノ酸を有する疎水性ペプチド配列上流のこの残基により容易に説明され得る。
【００７５】
最後に、Ｔ７４Ａ変異体は、Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂの非存在下における自己リン酸化割合およびキナーゼ活性のごくわずかな低下のみを示した。ＬＣ−ＭＳによる定量分析によれば、この部位のリン酸化は、全リン酸取り込みの５％未満を占める。しかしながら、Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂの添加後、この点変異の影響はＴ４４４Ａの影響に近づき、そして自己リン酸化割合およびキナーゼ活性におけるＣａ２＋／Ｓ１００Ｂの刺激効果が、他のＧＳＴ−ＮＤＲ１種と比較して大きく低下した。これらの結果は、Ｔｈｒ７４が少ない自己リン酸化部位しか関係していないことを示し、そしてＣａ２＋／Ｓ１００Ｂの付加に対する低い反応性が、Ｔ７４Ａ変異体とＳ１００Ｂの相互作用ができないことを最も反映しているようである。
【００７６】
故に、変異分析は、Ｎｄｒ１のＳｅｒ２８１残基は、自己リン酸化されたＮＤＲ１中のリン酸取り込みの大部分に関与し、一方、Ｔｈｒ７４およびＴｈｒ４４４は、取り込まれたリン酸の少ない部分を占めることを示している。さらに、Ｓｅｒ２８１の変異は、ＮＤＲ１自己リン酸化誘導キナーゼ活性の劇的な低下をもたらし、故に、この残基が、主なＮＤＲ１自己リン酸化部位であることが確認された。しかし、この結果は、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４の両方が十分に活性なＮＤＲ１に必要であることを示唆し、ＮＤＲ１の活性化におけるこれらの２つの残基間の相乗効果を示している。
【００７７】
実施例３：Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂは、Ｔｈｒ７４リン酸化を経て、Ｓｅｒ２８１とＴｈｒ４４４の両方におけるＧＳＴ−ＮＤＲ１の自己リン酸化を促進する
ＮＤＲ１リン酸化状態におけるＳ１００Ｂの効果を正確に定量するために、ウサギポリクローナル抗体を、Ｓｅｒ２８１またはＴｈｒ４４４を含むリン酸エピトープに対して作製した。ＧＳＴ−ＮＤＲ１変異体を、基本的には実施例２に記載のように処理し、そしてＳｅｒ２８１またはＴｈｒ４４４にてリン酸化されたＮＤＲ１を認識する抗ＮＤＲ１＿Ｃ末端抗血清またはポリクローナル抗体のどちらかで検出した。これらの抗体は、対応するリン酸の点変異体Ｓ２８１ＡもしくはＴ４４４Ａ、またはキナーゼ不活性体を認識しないため、リン酸化ＮＤＲ１に排他的に特異性を有する。
【００７８】
これらの試薬を用いて、Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂは、どちらの残基にも優先性を示すことなく、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４両方におけるリン酸化を増大することを発見した（実施例２にて見られる自己リン酸化の全体的な増加に類似）。一方、Ｓ２８１Ａ変異はＴｈｒ４４４における自己リン酸化を完全になくし、Ｔ４４４Ａ変異体は、Ｓｅｒ２８１におけるほぼ正常な自己リン酸化を示した。Ｔｈｒ４４４は、わずかな範囲でのみリン酸化されるが、これらのデータは、ＮＤＲ１キナーゼ活性における活性化断片リン酸残基の影響が、疎水性モチーフ残基の影響よりも大きいこと、またはこれらの残基が、他のＡＧＣファミリータンパク質キナーゼのほとんどで既知の連続的方法にてリン酸化されることを示している（Newton、A. C. (2001) Chem.Rev. 101, 2353−2364）。最後に、Ｔ７４Ａ点変異は、内因性ＮＤＲ１自己リン酸化を活性化することなしに、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４残基の両方のＳ１００Ｂを介したリン酸化の増大をなくし、Ｓ１００Ｂとの相互作用におけるこの残基の重要な役割をまた強調する。
【００７９】
実施例４：インビボでＳｅｒ２８１は、主な自己リン酸化残基であり、一方Ｔｈｒ４４４は、上流キナーゼにより標的化される
インビボでのＮＤＲ１のキナーゼ活性における個々のリン酸化部位の相対的な影響を判定するため、本発明者らは、３つの同定されたリン酸化部位に、ＨＡ標識したＮＤＲ１野生型、キナーゼ不活性体、そしてアラニン変異体を有する一連の哺乳動物発現ベクターを構築した。
野生型ＨＡ−ＮＤＲ１か、またはその記載した変異体のどちらかを発現するＣＯＳ−１細胞を、１マイクロモル オカダ酸または溶媒のみで１時間処理した。その後、ＨＡタグ標識したＮＤＲキナーゼ変異体を、（１００マイクログラムの界面活性剤抽出物から）１２ＣＡ５モノクローナル抗体で免疫沈降し、そして上記のようなペプチドキナーゼ分析によりキナーゼ活性について分析した。
【表４】
2010279371.tif 000005
【００８０】
Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４である２つの確立されたインビボ調節リン酸化部位における点変異は、未処理ＣＯＳ−１細胞および１マイクロモル オカダ酸処理したＣＯＳ−１細胞の両方におけるＮＤＲ１キナーゼ活性の予期される低下をもたらした（Ｓ２８１Ａ変異体に対して幾分優先的に）。しかしながら、ＧＳＴ−ＮＤＲ１キナーゼ分析とは異なり、ＨＡ−ＮＤＲ１キナーゼ活性の劇的な低下が、Ｔｈｒ７４変異後に検出された。このことは、Ｔｈｒ７４依存性のＳ１００Ｂを介する自己リン酸化が、インビボにて重要な役割を果たし得ることを示す。
【００８１】
この可能性を検討するため、形質転換したＣＯＳ−１細胞からの抽出物を、抗Ｓｅｒ２８１Ｐおよび抗Ｔｈｒ４４４Ｐ抗血清で分析した。形質転換したＣＯＳ−１細胞からのタンパク質抽出物（１０マイクログラム）を、１２ＣＡ５で免疫ブロットし、それぞれのＨＡ−ＮＤＲ１構築物が同様の発現レベルであることを確認した。リン酸化状態の分析に関し、（１００マイクログラムのタンパク質抽出物から）１２ＣＡ５で免疫沈降したＨＡ−ＮＤＲ１変異体を、Ｐ−Ｓ２８１またはＰ−Ｔ４４４に対するリン酸化特異的抗体で免疫ブロットすることにより分析した。
【００８２】
前記Ｓｅｒ２８１残基は、インビボにて構成的にリン酸化されており（また、このリン酸化はさらに、１ｍＭ オカダ酸での処理後に増大された）、一方、Ｔｈｒ４４４部位は、オカダ酸での処理後にのみリン酸化された。前記Ｓｅｒ２８１のリン酸化は、キナーゼ不活性化Ｋ１１８Ａ変異体が、この部位におけるリン酸化を示さないことから、全体的にＮＤＲ１の活性に依存する。この事実は、Ｓｅｒ２８１が、インビボでもまた自己リン酸化残基であることを示す。このことは、オルトリン酸塩代謝のインビボ標識により確認された。しかしながら、Ｔｈｒ４４４の変異は、Ｓｅｒ２８１のリン酸化を減じることなく、そのことは、ＮＤＲ１自己リン酸化のためのこの残基の低い重要性をさらに示している。しかしながら、Ｔｈｒ４４４残基は、キナーゼ不活性化変異体Ｋ１１８ＡにおけるＮＤＲ１のキナーゼ活性をなくした後でもリン酸化され、上流キナーゼの標的として関与している。最後に、残基Ｔｈｒ７４の変異は、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４両方のリン酸化の著しい低下をもたらしており（オカダ酸処置の有無のどちらにおいても）、キナーゼ活性データと一致している。このことは、Ｔｈｒ７４が、Ｓ１００Ｂを介するＮＤＲ１の自己リン酸化のみでなく、ＮＤＲ１に対する上流キナーゼの標的化にも関係することを示す。
【００８３】
実施例５：Ｓｅｒ２８１とＴｈｒ４４４の両方のリン酸化は、Ｃａ２＋依存的な方法にて起こる
Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂが、インビボにおけるＮＤＲ１活性およびインビトロにおけるＳｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４での効率的なＮＤＲ１自己リン酸化の両方に不可欠であり、かつＳ１００Ｂ−ＮＤＲ１相互作用が、完全にＣａ２＋依存性であることが既知であるため（Millward et al., 1998）、本実施例では、ＮＤＲ１の活性化、すなわち、Ｓｅｒ２８１またはＴｈｒ４４４、もしくは両方のＮＤＲ１のリン酸化における内生Ｃａ２＋の役割を調査する。本目的のために、細胞に自由に取り込まれ、細胞質エステラーゼにより加水分解され、活性な膜透過性Ｃａ２＋キレート化剤であるＢＡＰＴＡとして細胞内に捕捉される膜透過性物質であるＢＡＰＴＡ−ＡＭで、ＣＯＳ−１細胞を形質転換する（TaylorとBroad,1998, Trends Pharmacol.Sci. 19, 370−375）。
【００８４】
偽形質転換した（Mock-transfected）ＣＯＳ−１細胞またはＨＡ−ＮＤＲ１を発現するＣＯＳ−１細胞を、１ｍＭ ＯＡ、５０マイクロモル ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、および２０ｍＭ タプシガルギンまたは溶媒（０．１％ ＤＭＦまたは０．１％ ＤＭＳＯ）のみで１時間処理した。その後、（１００マイクログラムタンパク質抽出物からの）１２ＣＡ５免疫沈降物を、ＮＤＲ１キナーゼ活性のペプチドキナーゼ分析を用いて分析した。
【表５】
2010279371.tif 000006
【００８５】
偽形質転換したＣＯＳ−１細胞およびＨＡ−ＮＤＲ１で形質転換したＣＯＳ−１細胞からのタンパク質抽出物（１０マイクログラム）もまた、１２ＣＡ５で免疫ブロットし、ＨＡ−ＮＤＲ１構築物の同等の発現レベルを確認した。リン酸化状態の分析に関して、（１００マイクログラムタンパク質抽出物から）１２ＣＡ５で免疫沈降したＨＡ−ＮＤＲ１を、Ｐ−Ｓ２８１またはＰ−Ｔ４４４に対するリン酸化特異的抗体を用いた免疫ブロットにより分析した。
【００８６】
５０ｍＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭは、オカダ酸で刺激したＮＤＲ１活性をオカダ酸で刺激していない細胞のほぼ基本的活性レベルまで劇的に低下する。同様に、ＮＤＲ１のリン酸化状態の調査により、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４の両方のリン酸化が、ほぼ基底値まで低下したことを実証した。とりわけ、ＮＤＲ１活性ならびにＳｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４のリン酸化は両方とも、ＢＡＰＴＡ−ＡＭと２０ｍＭ タプシガルギン(筋小胞体性小胞体Ｃａ２＋・ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）ポンプの阻害により、すなわち、細胞内Ｃａ２＋貯蔵の遊離を介することにより細胞質Ｃａ２＋を上昇するセスキテルペン・ラクトンである)の共インキュベーションにより減少した（Treiman et al.,1998, Trends Pharmacol.Sci. 19, 131−135）。これらの結果は、観察されたＢＡＰＴＡ−ＡＭ効果のＣａ２＋特異性を支持しており、上述のデータと合わせて、ＮＤＲ１が、Ｃａ２＋に依存した、おそらくＳｅｒ２８１のＳ１００Ｂを介した自己リン酸化により、および未だ同定されていないＴｈｒ４４４のＣａ２＋依存性上流キナーゼによるリン酸化により制御されることが示された。
【００８７】
まとめると、Ｓｅｒ２８１におけるＮＤＲ１の自己リン酸化、ならびにＴｈｒ４４４における上流キナーゼによるリン酸化は両方とも、Ｃａ２＋依存性の過程である。Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂの付加により、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４にて増加したリン酸化が観察され、それはＮＤＲ活性の刺激を生じる結果となった。前記Ｃａ２＋キレート化剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭは、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４の両方におけるＮＤＲ１の活性およびリン酸化を抑制し、そして特に、これらの効果は、ＳＥＲＣＡ Ｃａ２＋ポンプインヒビター・タプシガルギンの付加により無くなった。理論に縛られることを望まないが、Ｓｅｒ２８１におけるＮＤＲ１の自己リン酸化のＣａ２＋依存性は、自己リン酸化を効率的にするためにＮＤＲ１がＣａ２＋／Ｓ１００Ｂを必要とすることにより、容易に説明することができる。
【００８８】
実施例６：Ｔｈｒ７４は、ＨＡ−ＮＤＲ１とＣａ２＋／Ｓ１００Ｂの結合に必要とされる
ＮＤＲ１は、完全なＮＤＲ１のＮ末端ドメインに依存してインビボでＳ１００Ｂを有する機能的複合体を形成する（Millward et al., 1998）。本実施例では、ＮＤＲ１のリン酸化状態に依存する結合を実証する。ＣＯＳ−１細胞を、Ｓ１００ＢおよびＮＤＲ１野生型またはアラニン変異体発現プラスミドで形質転換し、そしてＮＤＲ１−Ｓ１００Ｂ相互作用を、ＮＤＲ１とＳ１００Ｂの共免疫沈降により観察した。
【００８９】
ＣＯＳ−１細胞を、ＨＡ−ＮＤＲ１野生型、キナーゼ不活性体（Ｋ１１８Ａ）、およびリン酸化残基Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ２８１、またはＴｈｒ４４４のアラニン変異体、ならびにＳ１００Ｂ、または示された対応する空ベクターで形質転換した。４８時間後、非洗浄の細胞核および細胞質性細胞溶解物を調製し、集め、そしてＨＡ−ＮＤＲ１種の発現について分析した。１ｍｇのタンパク質抽出物をさらに、抗Ｓ１００Ｂ−セファロースで免疫沈降し、そしてＳ１００Ｂ発現および抗Ｓ１００Ｂ免疫沈降物とＮＤＲ１の結合について分析した。
【００９０】
ＮＤＲ１−Ｓ１００Ｂ複合体の形成は、ＮＤＲ１キナーゼ活性または調節残基Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４のリン酸化状態に依存的でなく、故に、構成的であると見なされる。しかしながら、Ｔｈｒ７４（少ないインビトロ自己リン酸化部位）が、Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂとの相互作用を起こすためにＮＤＲ１に必須であるように思われる。ＮＤＲ１のＮ末端ドメインは、Ｓ１００Ｂまたは他の可能性のある相互作用タンパク質の結合により軽減され得るキナーゼ触媒ドメインにおける自己阻害効果に影響を及ぼすようである。
【００９１】
実施例７：ＮＤＲ２タンパク質キナーゼの分子特性
本実施例は、ＮＤＲ２タンパク質キナーゼの同定および分子特性を記載する。ＮＤＲ１およびＮＤＲ２は、８６％のアミノ酸の同一性を有する異性体形であり、ヒトおよびマウス間で高く保存されている。前記データは、ＮＤＲ２がオカダ酸処理により強く活性化され、結果として、Ｓｅｒ−２８２およびＴｈｒ−４４２におけるリン酸化を生じることを示す。ＮＤＲ２はまた、ＥＦハンド カルシウム結合Ｓ１００Ｂタンパク質により制御されることが示される。インビトロにて、Ｓ１００Ｂは、Ｓｅｒ−２８２およびＴ４４２におけるＮＤＲタンパク質キナーゼの自己リン酸化を誘導する。
【００９２】
ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴ検索により、ヒトＫＩＡＡ０９６５ ｍＲＮＡ（Genebank 受入番号AB023182クローンhj06174s1）を、ヒトＮＤＲ１タンパク質キナーゼと顕著な相同性を有する不完全ｃＤＮＡとして同定した。完全なｃＤＮＡを、標準的なプロトコル（www.clontech.com, PT1156−1）に従い、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）のＰＣＲスクリーニングにより単離した。マウスＮｄｒ１ｃＤＮＡを、標準的なプロトコル（www.clontech.com, PT 1156−2）に従い、λＺＡＰＩＩ（Stratagene）、３’ｍＥＳＴを有するマウスＮｄｒ２ｃＤＮＡ（genebank受入番号AA277870）中のいくつかのマウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、タッチダウン法によりマウス脳ライブラリー由来の５’末端（Clontech）をサブクローニングすることによりクローニングした。すべてのクローンを、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（United Sates Biochemical）および慣習的な合成プライマーを用いて良好の両方鎖を完全にシークエンスし、ゲノムデータベース（Ensembl）と比較した。
【００９３】
ＨＡ−エピトープ標識したｈＮｄｒ１をコードする哺乳動物発現ベクターを、実施例１に記載する。ＨＡ−ｈＮｄｒ２の発現ベクターを、それぞれ標識していないｃＤＮＡとプライマー５’−ＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号：２３）および５’−ＴＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＧＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号：２４）ならびに５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＣＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号：２５）でＰｆｕポリメレース（Promega）を用いて増幅することにより構築し、その後ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＣＭＶ５中にクローニングした。ＧＳＴ−Ｎｄｒ２およびＧＦＰ−Ｎｄｒ２を、Ｎｄｒ２ｃＤＮＡとプライマー５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＧＧＧＡＣＴＡＣ−３’（配列番号：２６）および５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号：２７）でＰｆｕポリメラーゼ（Promega）を用いて増幅することにより構築した。その後ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで切断し、ｐＧＥＸ２Ｔ（Smith,D.B.およびJohnson,K.S. (1988) Single−step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S−transferase Gene 67 (1), 31−40）およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech)中にクローニングした。その後、挿入の方向を、ＫｐｎＩ切断およびシークエンシングにより検査した。ＧＦＰ−Ｎｄｒ１を、Ｎｄｒ１ ｃＤＮＡとプライマー５’−ＡＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号：２８）および５’−ＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＧＧＡＴＴＣＣＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：２９）で増殖することにより構築し、そしてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech）中にクローニングし、シークエンシングにより検査した。ＧＦＰ−Ｎｄｒ２を、基本的に同様の方法にて構築した。
【００９４】
すべての他の方法（細菌性発現、キナーゼ分析、免疫検出および質量スペクトル分析を含む）を、基本的には上述の方法部分に記載したように実行した。
【００９５】
ＮＤＲキナーゼ サブファミリーを調べるために、ｈＮｄｒ２、ｍＮｄｒ１およびｍＮｄｒ２のｃＤＮＡ配列および遺伝子配列を決定した。推定アミノ酸配列を比較し、ｈＮＤＲ１、キイロショウジョウバエＮＤＲ ＴＲＣ、線虫ＮＤＲ Ｓａｘ−１および酵母ＣＢＫ１の既知の配列に対して位置合わせした。ヒトおよびマウスＮＤＲ１配列は、９９％の同一性を示し、ＮＤＲ２配列は９７％の同一性を示し、一方、ＮＤＲ１およびＮＤＲ２は８６％の同一性を示す。ヒトＮｄｒ２は、進化の過程において、キイロショウジョウバエ、線虫および酵母とそれぞれ６８％、６７％および４７％の同一性を有する高い保存性を示す。ヒトおよびマウスＮＤＲ２は、４６４アミノ酸長であり、推定質量５４．０ｋＤａを有する。遺伝子マッピングにより、ｈＮｄｒ１およびｍＮｄｒ１、ならびにｈＮｄｒ２およびｍＮｄｒ２が、オーソロガス領域に位置することが示される。ｈＮｄｒ１は、６ｐ２１にマッピングされ（Tripodis N. et al.）、ｈＮｄｒ２は１２ｐ１２．３にマッピングされるが、一方、対応するマウス遺伝子は、１７Ｂ１および６Ｇ２−Ｇ３にマッピングされる。さらにＮｄｒ２の偽遺伝子が、マウスゲノムの染色体１Ｄおよび８Ａ１．２にて発見された。イントロン−エキソン境界は、すべてのヒトおよびマウス遺伝子に保存されている。ヒトおよびマウス遺伝子は、保存されたイントロン−エキソン境界を有する１４エキソンを含む。エキソン１は、５’ＵＴＲを含む非コードエキソン；エキソン２は、開始コドンを含む；そして終止コドンは、エキソン１４に位置する。
【００９６】
ＮＤＲ２とＮＤＲ１の配列の比較は、ＮＤＲ２が、ＮＤＲ１リン酸化部位であるＳｅｒ−２８１およびＴｈｒ−４４４に対応するＳｅｒ−２８２およびＴｈｒ−４４２を含むことを示し（Millward et al.）、そのことは、ＮＤＲ２活性が、ＮＤＲ１と同様に制御されることを示唆する。さらに調べるため、Ｓｅｒ−２８２またはＴｈｒ−４４２のどちらかをアラニンにより置換されたＮＤＲ２変異体を作製した。さらに、インビトロにおけるリン酸化部位変異体Ｔ７５Ａは基本的に上記した通りであり、キナーゼ不活性化変異体Ｋ１１９Ａは、Ｎｄｒ２について作製した。これらの変異体のそれぞれのタンパク質キナーゼ活性を、オカダ酸（ＯＡ）または溶媒のみで処理した細胞にて測定した。ＨＡ−ＮＤＲ２−ＷＴは、ＯＡにより強力に刺激された（〜１０倍）。すべてのリン酸化部位変異体（Ｓ２８２Ａ、Ｔ４４２ＡおよびＴ７５Ａ）は、基底活性を顕著に減少したが、未だ活性化されていた。Ｋ１１９Ａ変異体は、基底活性を検出されない程度のレベルまで低下させ、ＯＡによりいかなる活性化も示さなかった。
【００９７】
ＮＤＲ１のＳｅｒ２８１およびＴｈｒ４４２に対して作製したリン酸化部位特異的抗体を用いた、制御リン酸化部位変異体Ｓ２８２ＡおよびＴ４４２Ａのウエスタンブロッティング分析は、ＮＤＲ２ｗｔ（野生型）、ならびにＴ４４２Ａ変異体およびＴ７５Ａ変異体のＳｅｒ２８２のＮＤＲのリン酸化を示し、そして、このリン酸化は、ＮＤＲ２ｗｔおよびＴ４４２ＡではＯＡ処理後に増加するが、Ｔ７５Ａでは増加しない。キナーゼ不活性化Ｋ１１９Ａ変異体は、Ｓ２８２でリン酸化されない。Ｔ４４２は、ＮＤＲ２ｗｔ、ならびにＳ２８２Ａ変異体、Ｔ７５Ａ変異体およびＫ１１９Ａ変異体のＯＡ処理にてリン酸化される。このことは、ＮＤＲ１の対応する変異体について上記の通りであった。ウエスタンブロッティング分析により、ｗｔおよび変異体が、同じレベルで発現されることを確認した。これらの結果により、活性ループのリン酸化部位２８２および制御疎水性モチーフのリン酸化部位Ｔ４４２の両方におけるリン酸化が、ＮＤＲ２活性に必要であることが確認された。
【００９８】
ＮＤＲ１およびＮＤＲ２間の配列保存はまた、上記のＮＤＲ１のＳ１００結合ドメインを包含する。故に、インビトロでのＮＤＲ２活性におけるＣａ２＋／Ｓ１００Ｂの影響を、時間および濃度に依存的な方法で測定した。Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂは、４時間インキュベーション後、マススペクトル分析により測定してＮＤＲ２自己リン酸化の割合を〜２倍に増加させ、そして濃度依存的方法で特定のＮＤＲ活性を〜４倍まで刺激した。このことは、ＮＤＲ２が、ＮＤＲ１と同様の方法でＣａ２＋／Ｓ１００Ｂにより活性化されることを示す。Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂの存在下および非存在下におけるＧＳＴ−ＮＤＲ２のインビトロでのインキュベーション後、前記タンパク質をトリプシンで切断し、生じた混合物を、−７９前駆体スキャン中ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳにより分析し、断片化後の単一のリン酸基を遊離するすべてのペプチド種の質量変化率（ｍ／ｚ）を測定した。５ＮＤＲ２誘導リン酸ペプチドの同一性を、両方の試料、ＧＳＴ−ＮＤＲ２およびＧＳＴ−ＮＤＲ２／Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂにて測定することができた。
【表６】
2010279371.tif 000007
【００９９】
これらのペプチドのうち３つは、Ｓｅｒ−２８２リン酸化部位を含む、活性化に対応する領域（またはＮＤＲ２のＴ−ループ）から誘導される。４番目のリン酸ペプチドは、制御リン酸化部位であるＴｈｒ−４４２を含むＮＤＲ２ポリペプチドのカルボキシ末端領域に由来し、５番目のはＳ１００Ｂ結合ドメイン内部位である、Ｔｈｒ−７５に対応する。これらの結果は、ＮＤＲ１と同様の方法にて、ＮＤＲ２がＳ１００Ｂタンパク質により制御されることを実証する。
【０１００】
実施例８：ヒトＮｄｒは、ｈＭＯＢ１（ＧＩ：１１６９１８９８）と相互作用する
ＨＡタグ標識したｈＮＤＲおよびｍｙｃタグ標識したｈＭＯＢ１を、ＣＯＳ１細胞中に共トランスフェクションし、それをオカダ酸または溶媒のみで刺激した。細胞を溶解し、抽出物を調製後、ＨＡ−ＮＤＲを、免疫沈降し、共免疫沈降したｍｙｃ−ｈＭＯＢ１を検出するか、またはＭｙｃ−ｈＭＯＢ１を免疫沈降し、共免疫沈降したＨＡ−ＮＤＲを検出した。ｍｙｃ−ｈＭＯＢ１とＨＡ−ＮＤＲ１の共免疫沈降、ならびにＨＡ−ＮＤＲとｍｙｃ−ｈＭＯＢ１の共免疫沈降により、ＭＯＢ１がＮＤＲ１と結合し得、そしてこの相互作用がＯＡによる細胞の刺激に依存することが明らかとなった。
【０１０１】
この相互作用がＰＰ２Ａ−インヒビターとＮＤＲアクチベータであるＯＡによる刺激に依存するために、本発明者らは、前記相互作用がＮＤＲキナーゼ活性に依存するかどうかを試験した。ＨＡ−ＮＤＲ、ｗｔおよび変異体、ならびにｍｙｃ−ｈＭＯＢ１を、ＣＯＳ−１細胞に共トランスフェクションし、前記細胞を溶解前にＯＡで処理した。ＨＡ−ＮＤＲを免疫沈降し、そして共免疫沈降したｍｙｃ−ｈＭＯＢ１を検出した。ＡＴＰ結合部位にて触媒性リシンを変異されたキナーゼ不活性化変異体Ｋ１１８Ａは、オカダ酸刺激後も未だｈＭＯＢ１と相互作用し得る。さらに、ＮＤＲの２つの主要なインビボリン酸化部位である、活性断片中のセリン−２８１およびＣ末端制御ドメイン内の疎水性モチーフ部位であるスレオニン−４４４、ならびにＮ末端制御ドメインのスレオニン−７４を、ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用におけるそれらの役割について試験した。ＯＡ刺激後も、変異体Ｓ２８１ＡおよびＴ４４４ＡはＭＯＢ１と相互作用するが、一方Ｔ７４Ａ変異体は、ＭＯＢ１との相互作用が完全にないことを示した。
【０１０２】
内生ＮＤＲとｈＭＯＢ１が相互作用するかどうかを試験するため、ｍｙｃ−ｈＭＯＢ１を、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション１６時間後ＯＡまたは溶媒のみで処理し、その後溶解した。その後、Ｍｙｃ−ｈＭＯＢ１を、プロテインＧセファロースと連結した９Ｅ１０抗体で免疫沈降し（Evanら、Isolation of monoclonal antibody specific for human c−myc proto−oncogene product. Mol.cell. Biol. 5：3610−3616,1985）、対照として、プロテインＧセファロースビーズのみで免疫沈降した。その後、共免疫沈降した内生ＮＤＲを、モノクローナル抗ＮＤＲ抗体で検出した。内生ＮＤＲが、ＯＡ刺激依存的方法でｍｙｃ−ｍｏｂと相互作用することが分かった。
【０１０３】
まとめると、これらの結果は、ＮＤＲが、キナーゼ活性ではなくオカダ酸刺激依存的方法でｈＭＯＢ１と相互作用し、そして、ＮＤＲのＮ末端制御ドメイン内の残基Ｔ７４が、この相互作用に重要な役割を果たすことを示す。
【０１０４】
実施例９：ｈＭＯＢ１は、ＮＤＲキナーゼ活性を刺激する
ｈＭＯＢ１が、ＮＤＲ活性にて役割を果たすかどうかを試験するために、ｍｙｃ−ｈＭＯＢ１または空ベクターをＣＯＳ１細胞内にＨＡ−ＮＤＲ１と一緒に共トランスフェクションし、そしてＯＡで処理した。その後、１２ＣＡ５免疫沈降物をＨＡ−ＮＤＲキナーゼ活性についてペプチドキナーゼ分析を用いて分析した。その結果、ＯＡ刺激されたＮＤＲキナーゼ活性の２〜３倍刺激が明らかとなり、ＮＤＲ活性におけるｈＭＯＢ１の役割を示す。ＧＳＴ−ＭＯＢおよびＧＳＴをそれぞれ免疫沈降したＨＡ−ＮＤＲに付加し、そしてキナーゼ反応を行った。前記反応物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そして、phosphoimagerを用いて放射活性を可視化した。ＧＳＴ−ｈＭＯＢ１のＨＡ−ＮＤＲキナーゼ反応物への付加は、ＮＤＲ自己リン酸化活性を刺激した。
【０１０５】
実施例１０：ＮＤＲのＮ末端ドメインは、キナーゼ活性化に重要である
本実施例は、キナーゼ活性化におけるＮ末端ドメインの重要性を説明するものである。Ｎ末端の高度に保存されている残基のアラニンへの点変異は、ＯＡ刺激されたキナーゼ活性の強力な阻害を誘導する。アルギニン４１、アルギニン４４またはロイシン４８のアラニンへの変異は、すべて、アミノ酸４０〜５５にまたがる予測される第１のアルファ−ヘリックスに位置し、アルファ−ヘリックスの同じ側に共に近接して位置しており、野生型の活性の２０％以下にキナーゼ活性を低下する。予測される第２のアルファ−ヘリックス内の残基は、アミノ酸６０〜８０にまたがるＮＤＲのＳ１００Ｂ結合領域内に位置し、またキナーゼ活性の阻害を導く。リシン７２、グルタミン酸７３、スレオニン７４、アルギニン７８またはロイシン７９のアラニンへの変異は、２０％またはそれ以下にキナーゼ活性を低下する。アミノ酸１〜３３にまたがり、そしてｈＮＤＲ内の予測されるベータ−シートを含むＮ末端ドメインの第一の部分はまた、キナーゼ活性化に重要であることが明らかとなった。最初の３０アミノ酸の欠失は、キナーゼ活性化を完全になくす。この領域における点変異は、同様にキナーゼ活性を強力に低下し、スレオニン１６、グルタミン酸１８およびグルタミン酸２８の変異は野生型の約４０％のキナーゼ活性に終わり、そしてリシン２４およびチロシン３１の変異は野生型の２０％のキナーゼ活性に終わった。これらの結果は、キナーゼ機能におけるＮＤＲファミリー活性ドメイン（ＮＦＡＤ）の高度に保存されている残基に関する重要な役割に関係があることを示す。
【０１０６】
実施例１１：ＮＤＲファミリー活性化ドメインで(ＮＦＡＤ)は、ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用を必要とする
本実施例は、Ｔ７４がＮＤＲキナーゼ活性およびＳ１００Ｂとの相互作用に重要であるのみならず、ＮＤＲ−ｍｏｂ相互作用に必要であることを実証するものである。ＨＡ−ＮＤＲ Ｎ末端点変異体およびｍｙｃ−ｍｏｂ１をＣＯＳ１細胞に共トランスフェクションし、それをＯＡで処理した後に溶解した。ＨＡ−ＮＤＲ変異体を免疫沈降し、そして共免疫沈降したｍｙｃ−ｈＭＯＢ１を検出した。ＨＡタグ標識したＮＤＲ変異体およびｍｙｃ−ｈＭＯＢ１の共トランスフェクション、およびその後のｍｙｃ−ＭＯＢとＨＡ−ＮＤＲの共免疫沈降は、キナーゼ活性化に重要ないくつかの保存された残基が、同様に、ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用に必要であることを明らかにした。チロシン３１、アルギニン４１、スレオニン７４またはアルギニン７８のアラニンへの置換は、試験した条件下で、ＭＯＢとの相互作用に認容性がなく、一方、リシン２４、アルギニン４４およびロイシン７９変異体は、低下した相互作用を示した。強力に低下したキナーゼ活性を有する変異体のうち３つのみが、ＭＯＢ結合能における低下を有さなかった：アルギニン４８、リシン７２およびグルタミン酸７３。これらをまとめると、前記結果は、ＮＦＡＤがＮＤＲ−ｈＭＯＢ１相互作用に重要であることを示している。
【０１０７】
実施例１２：ＮＤＲ−ｈＭＯＢ１相互作用は、オカダ酸が誘導するＭＯＢ１の変形に依存するが、一方、ＮＤＲにおけるオカダ酸が誘導するリン酸化は必要なかった
本実施例は、ＮＤＲ−ｈＭＯＢ１相互作用のＯＡ依存性が、ＮＤＲまたはｈＭＯＢ１のＯＡ誘導修飾に（または細胞のＯＡ処置に）依存するかどうかの疑問を解決する。ＣＯＳ−１細胞を、ＨＡ−ＮＤＲおよびｍｙｃ−ｈＭＯＢ１で別々にトランスフェクトし、そしてＯＡで刺激するか、または刺激せずに溶解した。その後、溶解物（ＨＡ−ＮＤＲ−または＋ＯＡとｍｙｃ−ｈＭＯＢ１−もしくは＋ＯＡ）を集め、抗ＨＡ抗体で免疫沈降し、そしてｍｙｃ−ｍｏｂ１を検出した。ＯＡ処理した細胞のｍｙｃ−ＭＯＢを含む２つの組合せにて、ｍｙｃ−ＭＯＢは、ＨＡ−ＮＤＲがＯＡ処理した細胞または刺激していない細胞に由来するかどうかに関わらず、ＨＡ−ＮＤＲと強く結合した。刺激していない細胞のＭｙｃ−ｍｏｂは、刺激していない細胞および同様にＯＡ刺激した細胞のＨＡ−ＮＤＲと弱い相互作用を示すのみであった。故に、本発明者らは、ＮＤＲのＯＡ誘導修飾がｍｏｂとの相互作用に必要ないが、一方、ｈＭＯＢ１ ＯＡ修飾が必要であることを結論付け得る。
【０１０８】
実施例１３：Ｃａ２＋キレート化剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭは、ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用を低下する
Ｃａ２＋キレート化剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭでのＣＯＳ１細胞の処理は、ＯＡ誘導ＮＤＲキナーゼ活性化を低下した。本実施例にて、ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用におけるＢＡＰＴＡ−ＡＭでのＣＯＳ１細胞の処理の効果を測定した。ＨＡ−ＮＤＲおよびｍｙｃ−ＭＯＢ１を、ＣＯＳ１細胞に共トランスフェクションし、前記細胞をＢＡＰＴＡ−ＡＭおよびＯＡもしくは溶媒のみで処理し、溶解した。ＨＡ−ＮＤＲを免疫沈降し、共免疫沈降したｍｙｃ−ＭＯＢ１を検出した。ＨＡ−ＮＤＲ免疫沈降物のキナーゼ活性を、ペプチドキナーゼ分析にて測定した。ＢＡＰＴＡのｍｙｃ ｈＭＯＢ１とＨＡ−ＮＤＲの共免疫沈降およびＯＡ処理した細胞は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭがＮＤＲキナーゼ活性の観察される低下に対応するＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用の低下を誘導することを明らかとした。
【配列表】
2010279371000001.app