(57)【要約】【課題】バイオマス処理での利用に有用な性質を有するセルラーゼ製剤を提供する。【解決手段】本発明は、セルラーゼ活性を有する、バイオマス処理に有用な組成物に関する。より具体的には、本発明は、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼＩ活性、セロビオヒドロラーゼＩＩ活性、及びβ−グルコシダーゼ活性を有する、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７４０のペスタロティオプシスｓｐ．ＡＮ−７から得られた組成物に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼＩ活性、セロビオヒドロラーゼＩＩ活性、及びβ−グルコシダーゼ活性を有する、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７４０のペスタロティオプシス（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）ｓｐ．ＡＮ−７から得られた組成物。
【請求項２】
エンドグルカナーゼ活性を有する成分が、配列番号１に示される塩基配列又は配列番号１に示される塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む配列によりコードされるポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼＩ活性、セロビオヒドロラーゼＩＩ活性、又はβ−グルコシダーゼ活性を有するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来の１以上のポリペプチドをさらに含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物を植物由来材料に添加するステップを含む、バイオマスの処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼ活性を有する、バイオマス処理に有用な組成物に関する。より具体的には、本発明は、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼＩ活性、セロビオヒドロラーゼＩＩ活性、及びβ−グルコシダーゼ活性を有する、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７４０のペスタロティオプシス（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）ｓｐ．ＡＮ−７から得られた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオマス資源を石油資源などの代替として有効活用する試みが数多くなされている。バイオマスとは、地球生物圏の物質循環系に組み込まれた生物体又は生物体から派生する有機物の集積を意味する（非特許文献１）。特に、食品残渣や農産廃棄物等のセルロース系バイオマスから、糖化を経てエネルギーを取り出すための種々のアプローチが提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、稲わら、麦わら等のセルロース系廃棄物に酵素を作用させて糖を生成する糖化工程を含む、セルロース系廃棄物の処理方法が記載されている。
【０００４】
しかし、セルロース系バイオマス（以下、単にバイオマスともいう。）を上記のように酵素を用いて処理しようとする場合、主成分であるセルロースがヘミセルロースやリグニンなどに包埋されているために、分解酵素が容易にこれに接触できず、単に酵素処理を行なうだけでは効率よく処理することができない。そこで、セルロースを露出させるために、高温高圧水処理、蒸煮若しくは爆砕処理や粉砕等の物理化学的処理や、酸若しくはアルカリ処理等の化学的処理、又はそれらの組み合わせによる前処理が必要とされている。
【０００５】
バイオマスの糖化のための酵素としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの微生物由来のセルラーゼが広く用いられている。バイオマスの酵素的処理では、上記のように前処理後のバイオマス由来材料にそのような酵素を作用させて糖化を行なうことが必要となる。しかし、そのような前処理直後の材料は、高温、高塩、極端なｐＨ又は中和後の高塩濃度などの過酷な条件を有するため、既存のセルラーゼを用いて酵素的処理を行なう場合、前処理後の十分な放熱、脱塩、中和などのさらなる処理が必要であり、これには設備などの追加のコスト及び追加の処理時間が必要とされる。
【０００６】
そこで、前処理後のバイオマス由来材料が有する上記のような過酷な条件でも十分な活性を発揮することができるセルラーゼ製剤の取得が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１５９９５４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＪＩＳ工業用語大辞典、第５版、財団法人日本規格協会（編、発行）、２００１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
セルロース系バイオマス処理を効率よく行なうために、耐熱性、耐塩性、及び広い至適ｐＨを有するセルラーゼ製剤が所望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記のようにバイオマス処理での利用に有用な性質を有するセルラーゼを探索し、所望のセルラーゼ活性を有する微生物を単離し、そこからセルラーゼ製剤を調製することにより、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
〔１〕エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼＩ活性、セロビオヒドロラーゼＩＩ活性、及びβ−グルコシダーゼ活性を有する、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７４０のペスタロティオプシス（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）ｓｐ．ＡＮ−７から得られた組成物。
〔２〕エンドグルカナーゼ活性を有する成分が、配列番号１に示される塩基配列又は配列番号１に示される塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む配列によりコードされるポリペプチドを含む、上記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼＩ活性、セロビオヒドロラーゼＩＩ活性、又はβ−グルコシダーゼ活性を有するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来の１以上のポリペプチドをさらに含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の組成物を植物由来材料に添加するステップを含む、バイオマスの処理方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、耐熱性、耐塩性などの好ましい性質を有するセルラーゼ製剤が提供され、これにより、バイオマスの効率のよい処理が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のセルラーゼ製剤の至適ｐＨを示す図である。
【図２】本発明のセルラーゼ製剤の至適温度を示す図である。
【図３】本発明のセルラーゼ製剤のＮａＣｌによる酵素活性への影響を示す図である。
【図４】本発明のセルラーゼ製剤の金属塩による酵素活性への影響を示す図である。
【図５】ペスタロティオプシス由来エンドグルカナーゼの精製についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図６】ペスタロティオプシス由来エンドグルカナーゼの温度安定性試験を示す図である。
【図７Ａ】ペスタロティオプシス由来エンドグルカナーゼ（Ｃｅｌ５Ａ）遺伝子の塩基配列（配列番号１）である。
【図７Ｂ】ペスタロティオプシス由来エンドグルカナーゼ（Ｃｅｌ５Ａ）遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号２）である。
【図８】本発明のセルラーゼ製剤と市販のセルラーゼ製剤の水熱処理残渣に対する糖化能力の比較を表す図である。
【図９】混合酵素、ＴＰ−３協和、本発明のセルラーゼ製剤の水熱処理残渣並行複発酵における生成エタノール量の比較を表す図である。
【図１０】混合酵素及びＴＰ−３協和の添加量による水熱処理残渣からのエタノール生産量への影響を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼＩ活性、セロビオヒドロラーゼＩＩ活性、及びβ−グルコシダーゼ活性を有する、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７４０のペスタロティオプシスｓｐ．ＡＮ−７から得られた組成物に関する。
【００１５】
セルラーゼとは、一般的には、セルロース等のβ−１，４−グリコシド結合を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等を生成する酵素を意味する。セルラーゼはいくつかの異なる酵素分類に分類される酵素を含み、そのような酵素分類としては、エンドグルカナーゼ（ＥＧ；ＥＣ３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ；ＥＣ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＢＧ；ＥＣ３．２．１．２１）が挙げられる（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６０：２３５−２４２，１９９８）。
【００１６】
ＥＧ、ＣＢＨ、及びＢＧ成分を含む完全セルラーゼ系は、結晶性セルロースをグルコースに変換するのに相乗的に働く。セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼは協働してセルロースを小さなセロオリゴ糖へと分解する。これらのオリゴ糖（主としてセロビオース）は、次いでβ−グルコシダーゼによりグルコースへと加水分解される。
【００１７】
本発明においてエンドグルカナーゼ活性とは、典型的には、微結晶セルロース（アビセル）、膨潤セルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロースなどを基質として作用して、これらのセルロースのβ−１，４−グリコシド結合をエンド型で加水分解する活性（エンド型セルラーゼ活性）を意味する。詳細には、エンドグルカナーゼ活性は、例えば、０．２５重量％ＣＭＣの存在下、４０℃にて３０分間反応を行い、加水分解により生じた還元糖をソモジー・ネルソン法により定量することにより測定することができる。すなわち、反応液に銅試薬０．８ｍＬを加えて反応を停止させ、蒸留水０．４ｍＬを加え１５分間煮沸する。煮沸後５分間水冷し、Ｎｅｌｓｏｎ試薬０．８ｍＬを静かに加えて、蒸留水１．６ｍＬを加え室温で３０分間放置し発色させる。放置後５０５ｎｍ又は６６０ｎｍの吸光度を分光光度計Ｕ２０００（日立工機）により測定する。ブランクは、基質溶液に予め銅試薬を加えて反応を停止させた後に酵素液を加えて反応を行う。試料の吸光度からブランクの吸光度を引いて還元糖の増加量を求める。還元糖量はグルコース標準曲線より算出する。ＣＭＣはＳＩＧＭＡ社製のものなどが市販されている。
【００１８】
本発明においてセロビオヒドロラーゼ活性とは、微結晶セルロース、膨潤セルロースなどを基質として作用して、これらのセルロースのβ−１，４−グリコシド結合をエキソ型に加水分解する活性（エキソ型セルラーゼ活性）を意味する。詳細には、セロビオヒドロラーゼ活性は、例えば、０．２５重量％アビセル（微結晶セルロース）の存在下、４０℃にて１〜２４時間反応を行い、加水分解により生じた還元糖をソモジー・ネルソン法により定量することにより測定することができる。アビセルはＭｅｒｃｋ社製のものなどが市販されている。
【００１９】
本発明においてセロビオヒドロラーゼＩ活性とセロビオヒドロラーゼＩＩ活性とは、セロビオヒドロラーゼＩがセルロース鎖の還元末端に指向性を有するのに対して、セロビオヒドロラーゼＩＩがセルロース鎖の非還元末端に指向性を有する点で異なる。この差異を区別するためには、ｐ−ニトロフェニルラクトース（ｐＮＰＬ）を基質とした測定を用いることができる。ｐＮＰＬはＣＢＨ  Ｉ及びＣＢＨ  ＩＩのうち、ＣＢＨ  Ｉによってのみ分解されるため、そのような測定によってＣＢＨ  Ｉ活性のみを測定することができる。詳細には、ＣＢＨ  Ｉ活性は、例えば、５ｍＭ  ｐＮＰＬの存在下、４０℃にて６０分間反応を行い、加水分解によって生じたｐ−ニトロフェノールを、４２０ｎｍでの吸光度を定量することにより測定することができる。ｐＮＰＬはＳＩＧＭＡ社製のものなどが市販されている。
【００２０】
本発明においてβ−グルコシダーゼ活性とは、アリール又はアルキルβ−Ｄ−グルコシドを基質として作用して、これを加水分解してＤ−グルコースを生成する活性を意味する。詳細には、β−グルコシダーゼ活性は、例えば、０．２５重量％セロビオースの存在下、３０℃にて１５分間反応を行い、加水分解により生じたグルコースを、グルコースＣ−ＩＩテストワコー（和光純薬工業）などの公知の手法により測定することにより、測定することができる。セロビオースは和光純薬社製のものなどが市販されている。
【００２１】
本発明のセルラーゼ製剤は、以下の実施例に示すように、弱酸性領域で活性が高く（至適ｐＨ：４〜６）、常温よりも高温でも十分に作用し（至適温度：４０〜５０℃）、また、ＮａＣｌ存在下でも活性を保持している（至適ＮａＣｌ濃度：０．３〜０．９Ｍ）。このことは、上記のように前処理を施したセルロース系バイオマス材料の糖化処理において、酵素活性の維持のために必要な追加のステップを行う必要性を排除するため、コスト及び時間に関して非常に有利である。
【００２２】
本明細書中、「セルラーゼ製剤」とは、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、及びβ−グルコシダーゼ活性のうちいずれか１以上又はすべてを示す組成物を意味し、典型的には複数種類のポリペプチドを含む混合物である。本明細書中、「セルラーゼ成分」とは、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、及びβ−グルコシダーゼ活性のうちいずれか１つ以上の活性を示す、微生物等の生物由来材料の画分、又は精製されたタンパク質を意味する。
【００２３】
ペスタロティオプシス（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）ｓｐ．ＡＮ−７は、本発明者らにより海中の泥から単離され、平成２１年４月２８日に、独立行政法人食品製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７４０として寄託された。
【００２４】
本発明のセルラーゼ製剤は、以下のようにして調製することができる。ペスタロティオプシスｓｐ．ＡＮ−７を、以下の培地組成を有する培地中で、５００ｒｐｍ、通気量１．５ｖｖｍ、３０℃にて１〜６日間培養する。
【００２５】
成分                      濃度
ニッカミルキーＳ          ２％
ＫＣフロック              ２％
酵母エキス                ０．２％
ＮａＣｌ                  ３％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．５％
Ｋｓ４９６Ａ              ０．１％
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ      １００ｐｐｍ
【００２６】
ニッカミルキーＳは、日華油脂から、ＫＣフロックは日本製紙ケミカル社から、酵母エキス（ミーストＰ２Ｇ）はアサヒフードアンドヘルスケアから、Ｋｓ４９６Ａは信越化学工業からそれぞれ入手することができる。
【００２７】
培養終了後、培養液を薮田式濾過圧搾機４０−Ｄ（薮田産業）などの圧搾機を用いて濾過し、培養濾液を得る。これにデルトップ（武田薬品工業）、スラウト９９Ｎ（武田薬品工業）などを防腐剤としてそれぞれ０．０５〜０．３容量％添加する。この粗酵素溶液をすぐに次の工程に用いない場合には、使用するまで４℃で保存する。粗酵素溶液を限外濾過膜（Ｍｉｃｒｏｚａ  ＵＦ  ＡＩＰ−１０１３、旭化成ケミカルズなど）を用いて濃縮し、硫安沈殿を行なった後、凍結乾燥させて粉末を得る。その結果得られる粗酵素粉末を、０．５〜５重量％、好ましくは２重量％の濃度で水に溶解させ、限外濾過膜（ペンシル型膜モジュールＳＬＰ−００５３、旭化成ケミカルズなど）を用いて脱塩及び濃縮を行なって、セルラーゼ製剤溶液を得る。
【００２８】
セルラーゼ製剤溶液のタンパク質量は、Ｌｏｗｒｙ法などの公知の方法により測定することができる。Ｌｏｗｒｙ法の実施は、例えば以下のように行なう。２重量％炭酸ナトリウム・水酸化ナトリウム溶液／１重量％酒石酸カリウム溶液／１重量％硫酸銅（ＩＩ）５水和物溶液を１００／１／１にて混合し、この混合液１．５ｍＬに希釈したセルラーゼ製剤溶液０．３ｍＬを加え、室温にて１５分間放置する。これに１Ｎフェノール試薬（和光純薬工業）０．１５ｍＬを加えて撹拌し、室温で３０分間放置する。分光光度計により６６０ｎｍの吸光度を測定する。ブランクとして、水を試料とした測定も行なう。試料の吸光度からブランクの吸光度を差し引いて、ＢＳＡ（ＢｉｏＲａｄ）標準曲線からタンパク質濃度を算出する。
【００２９】
本発明者らは、ペスタロティオプシスｓｐ．ＡＮ−７からから調製したセルラーゼ製剤が、上記のような好ましい性質を有することを見出した。本発明者らはさらに、ペスタロティオプシスｓｐ．ＡＮ−７から、エンドグルカナーゼ活性を有する新規な酵素を単離し、そのアミノ酸配列及び該酵素遺伝子の塩基配列を明らかにした。それらの配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号１の配列として本明細書中に示す。したがって、好ましい態様において、本発明の組成物は、配列番号１に示される塩基配列又は配列番号１に示される塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む配列によりコードされるポリペプチドを含む。
【００３０】
本明細書に用いられる「ストリンジェンシー」又は「ストリンジェントな」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる時の、温度、イオン強度、及び有機溶媒のような他の化合物の存在の条件に関して用いられる。上述のパラメータを、別々に又は一斉に変化させることにより「ストリンジェンシー」条件が変化されうることを、当業者は認識すると考えられる。「ストリンジェントな」条件では、核酸塩基対構成は、相補的塩基配列が高頻度にある核酸断片間でのみ生じるであろう（例えば、「ストリンジェントな」条件下でのハイブリダイゼーションは、約７０％〜１００％の同一性、好ましくは約８５％〜１００％の同一性をもつ相同体の間で起こりうる）。中程度にストリンジェントな条件では、核酸塩基対構成は、相補的塩基配列が中間の頻度にある核酸間に生じるであろう（例えば、「中程度にストリンジェントな」条件下でのハイブリダイゼーションは、約５０％〜７０％の同一性をもつ相同体の間に起こりうる）。
【００３１】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合の「ストリンジェントな条件」とは、約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、例えば、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬及び１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃でハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することと等価の条件を含む。
【００３２】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合の「中程度にストリンジェントな条件」とは、約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、例えば、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃でハイブリダイゼーション、続いて、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することと等価の条件を含む。
【００３３】
「低いストリンジェンシーの条件」とは、約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、例えば、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．１％  ＳＤＳ、５×デンハルト試薬［５０×デンハルト試薬５００ｍｌあたり、５ｇフィコール（４００型、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、５ｇ  ＢＳＡ（フラクションＶ；シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含む］及び１００ｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃ではハイブリダイゼーション、続いて、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することと等価の条件を含む。
【００３４】
配列番号１に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列は、配列番号１に示される配列の相補的配列に対して、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％の同一性、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。
【００３５】
２つのアミノ酸配列または塩基配列の％同一性を決定するためには、最適な比較がなされるように配列をアライメントする。２つの配列間の％同一性は、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置（例えば、一部重複する位置）の総数×１００）。１つの態様において、比較対象の２つの配列は同じ長さである。２つの配列間の％同一性は、ギャップを許容する場合、許容しない場合の両方で、以下に述べるものに類似した方法を用いて決定し得る。％同一性の算出に関しては、一般的に、厳密に一致するもののみを算定する。
【００３６】
２つの配列間の％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877において改変された、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、Altschulら, (1990) J. Mol. Biol., 215, 403のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明のポリペプチドの変異体を得るには、ＢＬＡＳＴのタンパク質検索を、スコア＝３０、ワード長（wordlength）＝３としたＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行するとよい。本発明のＤＮＡの変異体を得るためには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、スコア＝１００、ワード長＝１２としたＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行するとよい。比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、Altschulら, (1997) Nucleic Acid Res., 25, 3389に記載されたＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いるとよい。
【００３７】
配列番号１に示される配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によりコードされるポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチドに対して、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。配列番号２に示されるポリペプチドに対してアミノ酸の変化を有するそのような変異体が、本明細書中に示される配列番号２に示されるポリペプチドと同一又は同等の活性及び性質を有する限り、該変異体は本発明の組成物において用いられるのに好適である。アミノ酸の変化とは、アミノ酸の欠失、置換又は付加を含む。
【００３８】
ここで、アミノ酸の置換に関して、アミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷などの化学的性質または構造的性質においてそれぞれ異なるものであるが、実質的にポリペプチド全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。本発明のアミノ酸間の置換は、化学的または構造的性質の類似したアミノ酸間の保存的置換でもよいし、あるいは、そのような性質の異なるアミノ酸間の非保存的置換でもよい。化学的または構造的性質の類似したアミノ酸は次のように分類することができる。
【００３９】
疎水性アミノ酸群には、アラニン（Ａｌａ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）が含まれる。極性アミノ酸群には、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）が含まれる。芳香族アミノ酸群には、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）が含まれる。酸性アミノ酸群には、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）が含まれる。塩基性アミノ酸群には、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が含まれる。
【００４０】
例えば、保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とアスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）またはアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が含まれる。
【００４１】
また、以下の実施例に詳細に示すとおり、本発明者らは、驚くべきことに、本発明のセルラーゼ製剤は、従来用いられているトリコデルマ属由来のセルラーゼ製剤と一緒に用いると相乗的に作用し、従来のセルラーゼ製剤単独と比較して非常に高い活性を示すことを見出した。
【００４２】
よって、本発明は、トリコデルマ属由来のセルラーゼ成分をさらに含む、本発明の組成物にも関する。
【００４３】
市販されているトリコデルマ属由来セルラーゼ製剤としては、ＴＰ−３協和（協和化成）、セルラーゼ“オノズカ”ＲＳ（ヤクルト薬品工業）、Ｃｅｌｌｓｏｆｔ（ノボ・ノルディクス）、メイセラーゼ（明治製菓）、セルライザー（ナガセ生化学工業）、アクセルラーゼ（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ）１５００（ジェネンコア）などが挙げられる。
【００４４】
トリコデルマ属由来セルラーゼ成分と本発明のペスタロティオプシス由来セルラーゼ製剤との混合比は、例えばタンパク質重量比で１：９９〜９９：１、好ましくは１０：９０〜９９：１、より好ましくは３０：７０〜９０：１０、さらに好ましくは５０：５０〜８０：２０、最も好ましくは６０：４０〜７５：２５、特に好ましくは７５：２５である。
【００４５】
本発明のペスタロティオプシス由来セルラーゼ製剤は、リグニンの含量が比較的多めの基質に対しては、トリコデルマ由来酵素よりも高い分解性を示す性質を持っている。この性質を活かすと、酵素の生産性が高く、市販の価格の安いトリコデルマ由来酵素を助ける役割として、本発明のセルラーゼ製剤を添加することにより、リグニン含量が比較的多いバイオマス基質に対して効率的な糖化、したがって効率的なアルコール生産を行うことができる。
【００４６】
本発明はまた、本発明のセルラーゼ製剤を植物由来材料に添加することを含む、バイオマスの処理方法にも関する。
バイオマスの処理方法とは、例えば、セルロース系バイオマスを本発明のセルラーゼ製剤を用いて糖化するステップ、及び酵母などによりアルコール生産するステップを含む。本発明のバイオマスの処理方法では、糖化ステップとアルコール生産ステップとを同時に行ってもよい。
【００４７】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
セルラーゼ製剤の分析
１．セルラーゼ製剤の調製
ペスタロティオプシスｓｐ．ＡＮ−７は、５０Ｌジャーファーメンター２基を用いて、５００ｒｐｍ、通気量１．５ｖｖｍ、３０℃にて、３日間培養した。培地組成は以下のとおりである。
【００４９】
成分                      濃度
ニッカミルキーＳ          ２％
ＫＣフロック              ２％
酵母エキス                ０．２％
ＮａＣｌ                  ３％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．５％
Ｋｓ４９６Ａ              ０．１％
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ      １００ｐｐｍ
【００５０】
ニッカミルキーＳは、日華油脂から、ＫＣフロックは日本製紙ケミカル社から、酵母エキス（ミーストＰ２Ｇ）はアサヒフードアンドヘルスケアから、Ｋｓ４９６Ａは信越化学工業からそれぞれ入手した。
【００５１】
培養終了後、培養液を薮田式濾過圧搾機４０−Ｄ（薮田産業）を用いて濾過し、４３Ｌの培養濾液を得た。これに防腐剤としてデルトップ（武田薬品工業）及びスラウト９９Ｎ（武田薬品工業）をそれぞれ０．１５容量％添加し、４℃で保存した。この粗酵素溶液３５Ｌを限外濾過膜（Ｍｉｃｒｏｚａ  ＵＦ  ＡＩＰ−１０１３、旭化成ケミカルズ）を用いて濃縮し、硫安沈殿を行なった後、凍結乾燥させて粉末を得た。その結果、３４０ｇの粗酵素粉末が得られた。この粗酵素粉末を、２重量％の濃度で水に溶解させ、限外濾過膜（ペンシル型膜モジュールＳＬＰ−００５３、旭化成ケミカルズ）を用いて脱塩及び濃縮を行なって、セルラーゼ製剤溶液を得た。
【００５２】
セルラーゼ製剤溶液のタンパク質量をＬｏｗｒｙ法により測定した。２重量％炭酸ナトリウム・水酸化ナトリウム溶液／１重量％酒石酸カリウム溶液／１重量％硫酸銅（ＩＩ）５水和物溶液を１００／１／１にて混合し、この混合液１．５ｍＬに希釈したセルラーゼ製剤溶液０．３ｍＬを加え、室温にて１５分間放置した。これに１Ｎフェノール試薬（和光純薬工業）０．１５ｍＬを加えて撹拌し、室温で３０分間放置した。分光光度計により６６０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクとして、水を試料とした測定も行なった。試料の吸光度からブランクの吸光度を差し引いて、ＢＳＡ（ＢｉｏＲａｄ）標準曲線からタンパク質濃度を算出した。上記のセルラーゼ溶液のタンパク質量は３８．２ｍｇ／ｍＬであった。
【００５３】
２．セルラーゼ製剤の活性評価
上記の粗酵素溶液、粗酵素粉末及びセルラーゼ製剤溶液について、以下に記載する方法によって各酵素活性を評価した。
【００５４】
エンドグルカナーゼ活性
エンドグルカナーゼ活性は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（ＳＩＧＭＡ）を基質（１．０重量％の基質溶液とする）として、反応液１００μＬ当たり基質溶液２５μＬ、及び粗酵素溶液２５μＬ、セルラーゼ製剤１ｇ、又はセルラーゼ製剤溶液２５μＬを添加し、４０℃にて３０分間反応させ、加水分解により生じた還元糖をソモジー・ネルソン法によって定量することにより測定した。すなわち、反応液に銅試薬０．８ｍＬを加えて反応を停止させ、蒸留水０．４ｍＬを加え１５分間煮沸した。煮沸後５分間水冷し、Ｎｅｌｓｏｎ試薬０．８ｍＬを静かに加えて、蒸留水１．６ｍＬを加え室温で３０分間放置し発色させた。放置後５０５ｎｍの吸光度を分光光度計Ｕ２０００（日立工機）により測定した。ブランクは、上記の実験と同量の１重量％ＣＭＣ溶液に予め銅試薬を加えて反応を停止させた後に酵素液を加えて同試薬との反応を行った。試料の吸光度からブランクの吸光度を引いて還元糖の増加量を求めた。還元糖量はグルコース標準曲線より算出した。
【００５５】
セロビオヒドロラーゼ活性
セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）活性は、１重量％のアビセル（Ｍｅｒｃｋ社製）懸濁液を基質として、反応液４００μＬ当たり基質溶液１００μＬ、及び上記のセルラーゼ製剤溶液１００μＬを添加し、４０℃にて２４時間反応させ、加水分解により生じた還元糖をソモジー・ネルソン法によって定量することにより測定した。
【００５６】
ＣＢＨ  Ｉ活性
ＣＢＨ  Ｉ活性は、５ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルラクトース（ＳＩＧＭＡ）を基質として、反応液４００μＬ当たり基質溶液１００μＬ、及び上記のセルラーゼ製剤溶液１００μＬを添加し、４０℃にて６０分間反応させた後、１重量％炭酸ナトリウム水溶液を１ｍＬ添加し、酵素反応を停止させた。さらに２ｍＬのイオン交換水を加えた後、加水分解によって生じたｐ−ニトロフェノールを４２０ｎｍでの吸光度から定量することにより測定した。
【００５７】
β−グルコシダーゼ活性
β−グルコシダーゼ活性は、５ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルグルコースを基質として、反応液４００μＬ当たり基質溶液１００μＬ、及び粗酵素溶液又はセルラーゼ製剤溶液１００μＬを添加し、４０℃にて６０分間反応させた後、１重量％炭酸ナトリウム水溶液を１ｍＬ添加し、酵素反応を停止させた。さらに２ｍＬのイオン交換水を加えた後、加水分解によって生じたｐ−ニトロフェノールを４２０ｎｍでの吸光度から定量することにより測定した。
【００５８】
結果
測定の結果、上記粗酵素溶液は６．１単位／ｍＬのエンドグルカナーゼ活性及び７．３単位／ｍＬのβ−グルコシダーゼ活性を含み、上記粗酵素粉末は４４５単位／ｇのエンドグルカナーゼ活性及び４８８単位／ｇのβ−グルコシダーゼ活性を含み、上記セルラーゼ製剤溶液は１３４単位／ｍＬのエンドグルカナーゼ活性（３．５０単位／ｍｇタンパク質）、３．０７単位のセロビオヒドロラーゼ活性（０．０８００単位／ｍｇタンパク質）、８．３５単位／ｍＬのＣＢＨ  Ｉ活性（０．２１９単位／ｍｇタンパク質）、及び２７．５単位／ｍＬのβ−グルコシダーゼ活性（０．７１９単位／ｍｇタンパク質）を含んでいた。
【００５９】
３．セルラーゼ製剤の性質評価
至適ｐＨ
基質としてＣＭＣを用いて、上記のセルラーゼ製剤溶液のエンドグルカナーゼ活性による酵素反応に最適なｐＨを調べた。１．０重量％ＣＭＣ溶液を基質として、反応液１００μＬ当たり基質溶液２５μＬ、及びセルラーゼ製剤溶液２５μＬを添加し、４０℃にて３０分間反応させ、加水分解により生じた還元糖をソモジー・ネルソン法を用いて定量した。反応液のｐＨは、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ’ｓ広域緩衝液を用いて、ｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、又はｐＨ９に調整した。
【００６０】
結果を図１に示す。ペスタロティオプシスから得られたセルラーゼ製剤は、ｐＨ５付近で最大活性を示し、ｐＨ４〜ｐＨ６で最大活性の８０％以上の活性を示した。
【００６１】
至適温度
基質としてＣＭＣを用いて、上記のセルラーゼ製剤溶液のエンドグルカナーゼ活性による酵素反応に最適な温度を調べた。１．０重量％ＣＭＣ溶液を基質として、反応液１００μＬ当たり基質溶液２５μＬ、及びセルラーゼ製剤溶液２５μＬを添加し、４０℃、５０℃、６０℃、又は７０℃にて０〜６０分間反応させ、加水分解により生じた還元糖をソモジー・ネルソン法を用いて定量した。
【００６２】
結果を図２に示す。４０℃及び５０℃では、反応時間とともに生成還元糖量が増加し、６０℃では反応開始２０分後からは生成還元糖量がほとんど増加しなかった。７０℃では反応開始直後からほとんど還元糖が生成されず、酵素の失活により酵素反応が起こっていないと考えられた。以上より、ペスタロティオプシスから得られたセルラーゼ製剤の至適温度は４０〜５０℃と考えられる。
【００６３】
ＮａＣｌによる影響
基質としてＣＭＣを用いて、上記のセルラーゼ製剤溶液のエンドグルカナーゼ活性のＮａＣｌに対する耐塩性を調べた。公知のセルラーゼ製剤と比較するために、ドリセラーゼ（協和発酵社製）についても同一条件化で試験した。ドリセラーゼは、ウスバタケ由来のセルラーゼを含むセルラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ複合酵素である。１．０重量％ＣＭＣ溶液を基質として用いて、反応液１００μＬ当たり基質溶液２５μＬ、及びセルラーゼ製剤溶液２５μＬ又は１ｍｇ／ｍＬドリセラーゼ溶液２５μＬを添加し、４０℃にて３０分間反応させ、加水分解により生じた還元糖をソモジー・ネルソン法を用いて定量した。反応液のＮａＣｌ濃度は、０、０．３、０．６、０．９、１．２、又は１．５Ｍに調整した。
【００６４】
結果を図３に示す。０Ｍ  ＮａＣｌの測定値を１００％として示している。ペスタロティオプシスから得られたセルラーゼ製剤では、０．６Ｍ  ＮａＣｌ（３重量％に相当）で最大活性を示し、約１Ｍまでは０Ｍでの反応時以上の活性を示した。一方、ドリセラーゼは塩濃度の上昇により活性が徐々に低下した。
【００６５】
他の金属塩による影響
基質としてＣＭＣを用いて、上記のセルラーゼ製剤溶液のエンドグルカナーゼ活性への他の金属塩の影響を調べた。金属塩としては、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、及びＢａＣｌ２を用いた。１．０重量％ＣＭＣ溶液を基質として用いて、反応液１００μＬ当たり基質溶液２５μＬ、及びセルラーゼ製剤溶液２５μＬを添加し、４０℃にて３０分間反応させ、加水分解により生じた還元糖をソモジー・ネルソン法を用いて定量した。反応液中には、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＢａＣｌ２を１０ｍＭの濃度でさらに添加した。
【００６６】
結果を図４に示す。いずれの金属塩化物の添加によっても、セルラーゼ製剤のエンドグルカナーゼ活性の上昇が見られた。ＢａＣｌ２添加では、金属塩を添加しない場合と比較して反応開始後６０分の時点で約５倍の還元糖が生成され、ＭｇＣｌ２又はＭｎＣｌ２の添加によっては２〜３倍の還元糖が生成された。これにより、ペスタロティオプシスから得られたセルラーゼ製剤は、種々の金属塩の存在により酵素活性が阻害されないばかりか、顕著に活性が上昇することが示された。
【実施例２】
【００６７】
エンドグルカナーゼ酵素の解析
１．エンドグルカナーゼＣｅｌ５Ａの単離
炭素源としてアビセル（Ｍｅｒｃｋ社製）を含む培地（培地組成：３重量％ＮａＣｌ、０．０７重量％ＫＣｌ、１．０８重量％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．５３重量％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１重量％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１重量％ＮＨ４ＮＯ３、０．０５％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１重量％酵母粉末、１重量％アビセル）で、室温にて３日間培養し、培養上清を硫安沈殿、ゲル濾過カラム（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、陰イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ−Ｑ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて順次精製を行なった。約３１ｋＤａの分子量を有するタンパク質が得られた（図５、レーン３）。上記の実施例１と同様に行なったＣＭＣを基質とするエンドグルカナーゼ活性測定では、精製されたタンパク質の酵素活性は２２．４単位／ｍｇタンパク質であった。
【００６８】
２．精製エンドグルカナーゼの性質分析
上記の実施例１と同様に行なったｐＨ安定性の分析では、ｐＨ２〜１１の範囲において安定した活性が見られ、至適ｐＨは４であった。また、上記の実施例１と同様に行なった至適温度の分析では、至適温度は６０℃であった。
【００６９】
耐熱性を調べるために、精製エンドグルカナーゼを含む溶液を６０℃、８０℃又は１００℃で１５分間、３０分間又は６０分間処理し、３０℃にてエンドグルカナーゼ活性を測定した。
【００７０】
結果を図６に示す。ペスタロティオプシスから得られたエンドグルカナーゼは、６０℃にて６０分間の熱処理によっては顕著に活性が失われることはなく、熱処理をしない場合の約８０％の活性を保持していた。本酵素は、８０℃にて６０分間の熱処理後には、約５０％の活性を保持し、１００℃での熱処理では、３０分間の処理後に約３５％、６０分間の処理後に約１０％の活性を保持していた。以上より、ペスタロティオプシスから得られたエンドグルカナーゼは、著明な耐熱性を有することが示された。
【００７１】
また、実施例１と同様に行なった耐塩性試験では、ＮａＣｌが１．５％濃度のときに、ＮａＣｌを添加しない場合の１６０％の活性が見られ、ＮａＣｌが３％濃度でも、ＮａＣｌ無添加の場合よりも高い活性が見られた。それと比較して、ウスバタケ由来の酵素製剤であるドリセラーゼでは、ＮａＣｌの存在によって活性の低下が見られた。
【００７２】
３．Ｃｅｌ５Ａ遺伝子のクローニング
精製したペスタロティオプシス由来エンドグルカナーゼの全長及びプロテーゼ処理により得られたその断片について、公知のペプチドシーケンス法によりＮ末端配列を決定した。得られた配列に基づきＰＣＲ用プライマーを設計し、ペスタロティオプシスｓｐ．ＡＮ−７培養物から得たｍＲＮＡからエンドグルカナーゼ遺伝子（Ｃｅｌ５Ａ）のｃＤＮＡを取得した。得られたｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１（図７Ａ）に、そこから推定されるアミノ酸配列を配列番号２（図７Ｂ）に示す。得られたｃＤＮＡは開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＧＡ）を含む９７８塩基から構成され、３２５アミノ酸残基のタンパク質をコードしていた。精製されたエンドグルカナーゼからペプチドシーケンス法により得られたＮ末端配列は、推定アミノ酸配列の２２残基目から始まり、このことから、当該エンドグルカナーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、該ポリペプチドが菌体外に分泌される際に切断される２１アミノ酸残基のシグナルペプチドを有することが推測された。
【実施例３】
【００７３】
本発明のセルラーゼ製剤の市販セルラーゼ製剤との活性比較
１．セルロース系基質分解活性
（１）実験方法
セルラーゼ製剤中の作用機序の異なるセルラーゼ活性を測定するため、指標となる３種類の基質、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（ＳＩＧＭＡ）、微結晶セルロース（Ｍｅｒｃｋ）、セロビオース（和光純薬工業）を用いた活性測定とタンパク質量を測定した。活性測定には以下の式を用いた。
2010268748.tif 000003
【００７４】
本発明のセルラーゼ製剤としては、実施例１に従い調製したセルラーゼ製剤溶液を用いた。市販のセルラーゼ製剤としては、ＴＰ−３協和（協和化成）、ドリセラーゼ（協和発酵）、及びセルクラスト（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を使用した。
【００７５】
ＣＭＣ分解活性
水溶性セルロースに対する活性測定には、ＣＭＣを基質とした。ＣＭＣ１ｇを蒸留水９９ｍＬに溶かし、よく混合して２４時間膨潤させた。防腐剤としてトルエンを１滴加え、１重量％ＣＭＣ溶液としてＣＭＣ分解活性測定に用いた。１重量％ＣＭＣ溶液０．１ｍＬ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）０．２ｍＬ、希釈した酵素液０．１ｍＬを混合し、３０℃で１５分間反応させた。反応終了後、生成した還元糖量をソモジー・ネルソン法により測定した。すなわち、反応液に銅試薬０．８ｍＬを加えて反応を停止させ、蒸留水０．４ｍＬを加え１５分間煮沸した。煮沸後５分間水冷し、Ｎｅｌｓｏｎ試薬０．８ｍＬを静かに加えて、蒸留水１．６ｍＬを加え室温で３０分間放置し発色させた。放置後５０５ｎｍの吸光度を分光光度計Ｕ２０００（日立工機）により測定した。ブランクは、１重量％ＣＭＣ溶液に予め銅試薬を加えて反応を停止させた後に酵素液を加えて反応を行った。試料の吸光度からブランクの吸光度を引いて還元糖の増加量を求めた。還元糖量はグルコース標準曲線より算出した。
【００７６】
セロビオヒドロラーゼ活性
セロビオヒドロラーゼ活性測定には、微結晶セルロース（アビセル（Ｍｅｒｃｋ））を基質とした。微結晶セルロース１ｇを蒸留水９９ｍＬに加え懸濁した。防腐剤としてトルエンを１滴加え、１重量％微結晶セルロース溶液として微結晶セルロース分解活性測定に用いた。１重量％微結晶セルロース溶液０．１ｍＬ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）０．２ｍＬ、希釈した酵素液０．１ｍＬを混合し、３０℃で６０分間反応させた。反応終了後、生成した還元糖量をＣＭＣ活性測定と同様にソモジー・ネルソン法により測定した。
【００７７】
β−グルコシダーゼ活性
β−グルコシダーゼ活性測定には、セロビオースを基質とした。セロビオース１ｇを蒸留水９９ｍＬに溶かした。防腐剤としてトルエンを１滴加え、１重量％セロビオース溶液としてβ−グルコシダーゼ活性測定に用いた。１重量％セロビオース溶液０．１ｍＬ、適当に希釈した酵素液０．１ｍＬを混合し、３０℃で１５分間反応させた。反応終了後生成したグルコース量を、グルコースＣ−ＩＩテストワコー（和光純薬工業）を使用して測定した。すなわち、反応液に１Ｎ塩酸（和光純薬工業）０．５ｍＬを加えて反応を停止させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液（純正化学）と２Ｎ水酸化ナトリウム（和光純薬工業）の混合溶液（ｖ／ｖ＝４：１）０．５ｍＬを加えて中和した。発色試薬１．５ｍＬに中和した反応液０．０１ｍＬを加え、３７℃水浴中で５分間発色させた。５分後に、５０５ｎｍの吸光度を測定した。ブランクは、１重量％セロビオース溶液に予め１Ｎ  塩酸を加えて反応を停止させた後に酵素液を加えて反応を行った。試料の吸光度からブランクの吸光度を引いてグルコースの増加量を求めた。
【００７８】
タンパク質量
酵素溶液中のタンパク質量をＬｏｗｒｙ法により測定した。すなわち、２重量％炭酸ナトリウム・水酸化ナトリウム溶液（炭酸ナトリウム（和光純薬工業）を水酸化ナトリウムに溶解）／１重量％酒石酸カリウム溶液（関東化学）／１重量％硫酸銅（ＩＩ）５水和物溶液（和光純薬工業）＝１００／１／１（ｖ／ｖ／ｖ）１．５ｍＬに希釈した酵素溶液０．３ｍＬを加え、室温で１５分間放置した。放置後、１Ｎ  フェノール試薬（和光純薬工業）０．１５ｍＬを加えて撹拌し、室温で３０分間放置した。分光光度計により６６０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクは酵素溶液を蒸留水に換えて反応させた。試料の吸光度からブランクの吸光度を引いてタンパク質の増加量を求めた。タンパク質量は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）標準曲線より算出した。
【００７９】
（２）実験結果
表１に、セルロース系基質に対する市販酵素との比較データを示した。セルラーゼ生産性の高いといわれるトリコデルマ属の菌の生産する酵素であるＴＰ−３協和に比較するとその比活性は低いものとなった。この値は、通常の塩のない条件での測定結果であり、塩存在下では、その値の差は小さくなる。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
２．バイオマス材料分解活性
１９０℃、１０分間の水熱処理を行った試料（エノキタケ栽培後の培地、大豆皮、ビートファイバー、コーンコブ）を用いた。水熱処理後のそれぞれに含まれるα−セルロースの量はそれぞれ、エノキタケ廃培地２０．８％、大豆皮４６．８％、ビートファイバー４０．３％、コーンコブ６４．２％であった。本発明のセルラーゼ製剤としては、実施例１と同様に培養したペスタロティオプシスｓｐ．ＡＮ−７の培養上清を硫安沈殿し、粉末化したものを用いた。方法は以下のとおりである。
【００８２】
水熱処理残渣の糖化は、基質である水熱処理残渣の濃度１００ｍｇ／ｍＬ、セルラーゼ濃度１０重量％（＝０．１ｇセルラーゼ製剤／１ｇ乾燥水熱処理残渣）を基本として行った。各水熱処理残渣を、２．０ｇずつ５０ｍＬチューブに入れ、蒸留水を１０ｍＬ加えてオートクレーブＳＸ−３００（トミー精工）により滅菌した。セルラーゼ製剤０．２ｇを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍＬに溶かして調製した後、滅菌した水熱処理残渣に加えよく撹拌した。十分に撹拌した後、すぐに０．５ｍＬを分取した。これを０時間での分取とし、反応開始後３、６、１２、２４、４８、７２時間で０．５ｍＬずつ分取した。分取時には、先端を切除したチップと１．５ｍＬマイクロチューブを使用し、出来るだけ均一な試料を取り出せるよう、分取直前に十分に撹拌した。試料は５分間煮沸して酵素を失活させ、冷凍保存した。なお、分取作業は汚染を防ぐためにクリーンベンチ内で行い、先端を切除したチップ及び１．５ｍＬマイクロチューブは、予めクリーンベンチ内で紫外線により殺菌したものを使用した。
【００８３】
本発明のセルラーゼ製剤としては、培養液を硫安沈殿させただけのものを用いた。そのため、粉末中の酵素量はかなり低いと考えられる。３種類の市販のセルラーゼ製剤と本発明のセルラーゼ製剤中に含まれるタンパク質濃度を比較すると、ドリセラーゼ：８．６０ｍｇ／ｍＬ、セルクラスト：４．１９ｍｇ／ｍＬ、ＴＰ−３協和：１６．７７ｍｇ／ｍＬ、本発明のセルラーゼ製剤：５．４６ｍｇ／ｍＬで、本発明の海洋性糸状菌由来セルラーゼ粉末中のタンパク質濃度は、ドリセラーゼ、セルクラストと同程度であった。図８に示したように、タンパク質量が多いＴＰ−３協和が最も多くの還元糖量を生産した。そのほかの酵素は、エノキタケの栽培後の培地を除いては、ほぼ同等であり、タンパク質当たりのバイオマスの分解能力は、概ね同等と考えられた。
【実施例４】
【００８４】
トリコデルマ属由来酵素との相乗効果
１．セルロース系基質分解活性
ＴＰ−３協和との各セルラーゼ成分における相乗効果を、実施例２に記載の方法を用いて測定した。酵素製剤としては、ＴＰ−３協和と本発明のセルラーゼ製剤との１：１（乾燥粉末重量比）混合物を用いた。結果を表２に示す。結晶性セルロースに対する相乗効果は認められなかったが、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）の分解、及びセロビオースの分解においては相乗効果が認められた。このことは、実際にセルロースを分解したときに、結晶性のセルロースを分解する酵素の生成物阻害を回避するうえで役立つものと考えられる。
【００８５】
【表２】
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【００８６】
２．混合酵素を用いたアルコール発酵
実験方法
（１）酵母液の調製
本研究では、酵母として、清酒醸造用酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｋｙｏｋａｉ  Ｎｏ．９０１株を使用した。ＹＰＤ寒天培地（１重量％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、２重量％ポリペプトン（日本製薬）、２重量％グルコース（和光純薬工業）、１．５重量％寒天（和光純薬工業））で保存していた株を、ＹＰＤ液体培地５ｍＬを入れた１５ｍＬチューブに植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで２４時間前培養した。本培養はＹＰＤ液体培地１００ｍＬを入れた３００ｍＬ三角フラスコを使用し、前培養液２ｍＬを加え３０℃、１２０ｒｐｍで４８時間行った。培養液を新しい５０ｍＬチューブに移して３，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により上清を取り除いた。沈殿に滅菌蒸留水を加えて撹拌し、再び３，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により上清を取り除いた。この操作を２度繰り返して培養液を完全に洗浄した後に、沈殿に５ｍＬの滅菌蒸留水を加えて再懸濁し、酵母液とした。
【００８７】
（２）水熱処理残渣の発酵
水熱処理残渣の発酵は、基質である水熱処理残渣の濃度１００ｍｇ／ｍＬ、セルラーゼ濃度１０重量％（＝０．１ｇセルラーゼ製剤／１ｇ乾燥水熱処理残渣）を基本として行った。各水熱処理残渣を２．０ｇずつ５０ｍＬチューブに入れ、蒸留水を１２ｍＬ加えてオートクレーブにより滅菌した。セルラーゼ製剤０．２ｇを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍＬに溶かして調製した。調製したセルラーゼ製剤を滅菌した水熱処理残渣に加え、酵母液１ｍＬ、窒素源として滅菌した２．７ｍｇ／ｍＬ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ）２ｍＬを加えた。十分に撹拌した後、すぐに０．５ｍＬを分取した。これを０時間での分取とし、反応開始後３、６、１２、２４、４８、７２、９６時間で０．５ｍＬずつ分取した。反応中は、試料を３０℃に保持し、静置で並行複発酵を行なった。分取操作では、ミキサーによる強い撹拌で試料中のエタノールが揮発しないように、先端を切除したチップを使用したピペッティングによって静かに撹拌した。試料はエタノールが揮発しないように、すぐに冷凍保存した。
【００８８】
（３）アルコール濃度の測定方法
冷凍保存しておいた試料を水浴中で解凍し、遠心分離機を用いて１３，０００ｒｐｍで１０分間、２回遠心分離した。分離後、上清を０．１ｍＬ測定用のバイアル瓶に分取し、内標準溶液として０．３％（ｖ／ｖ）のｎ−ブチルアルコール（和光純薬工業）を０．９ｍＬ加えた。標準物質には１．０％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いた。各試料をガスクロマトグラフにより分析し、標準物質のピーク面積からエタノール量を計算した。ＧＣシステムは、ＧＣ１４Ａ（島津製作所）、キャピラリーカラムはＴＣ−１（ジーエルサイエンス、長さ：３０ｍ×直径：０．５３ｍｍ、膜圧：１．５μｍ）を使用した。
【００８９】
実験結果
セルラーゼ製剤の使用量をできるだけ抑える目的で、各水熱処理残渣の濃度を１００ｍｇ／ｍＬに固定し、ＴＰ−３協和の添加量を、０．１、１、５、１５重量％と変えて酵母と供に加え糖化発酵を試みた。ＴＰ−３協和０．００２ｇ（０．１重量％）、０．０２ｇ（１重量％）、０．１ｇ（５重量％）、０．３ｇ（１５重量％）を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍＬに溶かして調製した後、各水熱処理残渣の発酵を行い、得られたエタノールを経時的に定量した。エノキタケ廃培地では、ＴＰ−３協和濃度が１５重量％の時に最大１６．０ｍｇのエタノールが培養１２０時間までに得られたが、１０、５重量％と濃度を下げていくにつれて、１０．３、８．０ｍｇと減少し、１重量％以下ではほぼ０ｍｇであった。大豆皮では、ＴＰ−３協和濃度が１５重量％の時に最大２４０．０ｍｇのエタノールが培養１２０時間までに得られた。ＴＰ−３協和濃度１０重量％では２１２．４ｍｇで、１５重量％の時とエタノール生成量に著しい差はなかった。しかし、５、１、０．１重量％と濃度を下げていくに連れて、１３６．５、７７．８、３．０ｍｇとエタノール生成量は大きく減少した。
【００９０】
エタノールへの変換率を計算すると、ＴＰ−３協和濃度０．１、１、５、１０、１５重量％で、エノキタケ廃培地では０、０．４、３．９、５．４、７．８％、大豆皮では０．６、１７．８、３２．２、４８．５、５５．０％、ビートファイバーでは０．５、１１．２、６９．７、８１．７、８５．８％、コーンコブでは０．０６、３．１、６６．２、６７．２、６９．３％となった。これらの結果から、水熱処理残渣の糖化発酵においてＴＰ−３協和の添加量を減らすと、水熱処理残渣中のセルロースを効率的にエタノールへと変換できないことが分かった。特にＴＰ−３協和濃度が１％以下では極端にエタノールへの変換率が低下し、現状では少なくとも５％以上のＴＰ−３協和が必要であった。
【００９１】
そこで、アルコールへの変換率が高かったＴＰ−３協和と本発明のペスタロティオプシス由来セルラーゼ製剤を用いて、その相乗効果（図９）と、使用する酵素量の削減（図１０）を検討した。先の図８では、バイオマスの分解能力を還元糖の生成能力で比較したが、エタノールへの変換率を比較すると、本発明のペスタロティオプシス由来セルラーゼ製剤は、エノキタケの使用済み培地や、大豆の皮の水熱反応残渣に対して分解性が高く、初期にはトリコデルマ属由来酵素よりもアルコールへの変換率が高かった。また、両酵素を混合することにより、最終的に得られるアルコール濃度は２倍程度に上昇することが判明した。
【００９２】
ＴＰ−３協和の酵素では、反応初期のアルコールの生成が特に悪い傾向にあった。発酵時間の短縮は実用的には望ましいことであり、酵素濃度を変化させて、初期の発酵速度の比較を行った。図９に示したように、発酵初期に単独の酵素ではエタノール生産がほとんど起こらず、一定時間経過後からアルコールが生成しているが、混合酵素系は初期の立ち上がりが非常に高かった。また、最終的に得られるエタノール濃度も高く、実用的な酵素であることが分かった。
【００９３】
以上のように、本発明のペスタロティオプシス由来セルラーゼ製剤は、リグニンの含量が比較的多めの基質に対しては、トリコデルマ由来酵素よりも高い分解性を示す性質を持っている。この性質を活かすと、酵素の生産性が高く、市販の価格の安いトリコデルマ由来酵素を助ける役割として、本発明のセルラーゼ製剤を添加することにより、リグニン含量が比較的多いバイオマス基質に対して効率的な糖化、したがって効率的なアルコール生産を行うことができることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のセルラーゼ製剤は、セルロース系バイオマスの処理において有用性を有するため、エネルギー産業における利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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