(57)【要約】【課題】  異種動物由来のフィーダー細胞や血清の非存在下で簡便かつ効率的に、細胞を未分化状態のまま培養し得る手法を提供する。【解決手段】  レクチン、特にガレクチンに、未分化な細胞の分化を抑制する作用を見出した。レクチン、特にガレクチンを有効成分とする分化抑制剤。レクチン、特にガレクチンをコードする核酸を有効成分とする分化抑制剤。レクチンを用いた分化抑制基材。レクチンを用いて分化を抑制する方法。レクチンの分化抑制のための使用。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レクチンを有効成分として含有する分化抑制剤。
【請求項２】
レクチンをコードする核酸を有効成分として含有する分化抑制剤。
【請求項３】
前記レクチンが、当該レクチン遺伝子のノックダウンにより、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンであることを特徴とする請求項１又は２記載の分化抑制剤。
【請求項４】
前記レクチンがガラクトース結合性レクチンであることを特徴とする請求項３記載の分化抑制剤。
【請求項５】
前記レクチンがガレクチンであることを特徴とする請求項４記載の分化抑制剤。
【請求項６】
前記ガレクチンがガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９、ガレクチン１２のいずれかであることを特徴とする請求項５記載の分化抑制剤。
【請求項７】
レクチンが固定化されていることを特徴とする分化抑制培養基材。
【請求項８】
前記レクチンが、当該レクチン遺伝子のノックダウンにより、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンであることを特徴とする請求項７記載の分化抑制培養基材。
【請求項９】
前記レクチンがガラクトース結合性レクチンであることを特徴とする請求項８記載の分化抑制培養基材。
【請求項１０】
前記レクチンがガレクチンであることを特徴とする請求項９記載の分化抑制培養基材。
【請求項１１】
前記ガレクチンがガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９、ガレクチン１２のいずれかであることを特徴とする請求項１０記載の分化抑制培養基材。
【請求項１２】
レクチンと細胞とを接触させることを特徴とする分化抑制方法。
【請求項１３】
請求項１乃至６いずれか記載の分化抑制剤を用いることにより、レクチンと細胞とを接触させることを特徴とする分化抑制方法。
【請求項１４】
請求項７乃至１１いずれか記載の分化抑制培養基材を用いることにより、レクチンと細胞とを接触させることを特徴とする分化抑制方法。
【請求項１５】
前記細胞は胚性幹細胞であることを特徴とする請求項１２乃至１４いずれか記載の分化抑制方法。
【請求項１６】
レクチンの分化抑制のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レクチンを用いることにより、幹細胞の分化抑制を可能にする技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は他の体細胞とは異なり、様々な細胞に分化できる「多能性」と多能性を維持したまま増殖できる「自己複製能」とを兼ね備えた細胞であり、適切なフィードバックのもとに分化と自己抑制を繰り返しながら組織・臓器の発生、修復、維持に関わっている。そのため、幹細胞を利用した研究は、発生・分化に関するメカニズム解明や、自己の組織・臓器を用いた再生医療などにおいて、非常に重要な役割を担っている。
【０００３】
幹細胞は、その出現時期により胚性幹細胞、胎児性幹細胞、成体幹細胞に分類されるが、中でも、身体のあらゆる細胞へと分化する能力を持つ胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、細胞ソースとして無限の可能性を秘めており、その活用が大いに期待されている。また、最近、体細胞に初期化を起こす特定因子を導入することでＥＳ細胞に似た多分化能を持たせた人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の樹立法が発見された。ｉＰＳ細胞は、患者自身の細胞を用いた免疫拒絶の無い移植用組織の作製、薬の評価、病気の解明への利用など、様々なジャンルへの応用が期待されており、幹細胞培養技術を中心とした周辺技術の急速な発展が求められている。
【０００４】
幹細胞は、その様々な目的での使用において、未分化性状態のまま培養することが必要となる。すなわち、細胞の分化を抑制する技術が非常に重要である。従来、未分化性を維持したまま増殖させる培養法として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）においては、マウス由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いた共培養や、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ， ＬＩＦ）を培地へ添加する方法が行われている。
【０００５】
しかし、フィーダー細胞を用いる場合、その事前の調製が非常に煩雑である。また、医療用途における利用を目的としたヒトＥＳ細胞の培養では、異種動物由来のフィーダー細胞を用いると、細菌やウイルス、未知の病原体などの影響を排除することができないため、それらによる感染の危険性を伴う。
【０００６】
一方、ＬＩＦの培地への添加については、霊長類のＥＳ細胞では、その顕著な未分化性維持効果が見られないことが報告されている（非特許文献１）。
【０００７】
ヒトＥＳ細胞の培養において、フィーダー細胞を用いない方法としては、マウス線維芽細胞由来成分や血清代替物を用いる方法等が報告されているが（非特許文献２〜４）、含有成分不明の血清や高価なサイトカイン等を使用するため、好ましい方法とは言えない。
【０００８】
そのため、異種動物フィーダー細胞や血清の非存在下において、低コストで簡便かつ効率的に幹細胞を培養できる手法の開発が望まれている。
【０００９】
【非特許文献１】Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS et al., Science 282, 1145-1147, 1998
【非特許文献２】Xu C, Inokuma MS, Denham J, et al., Nat Biotechnol 19, 971-974, 2001
【非特許文献３】Amit M, Shariki C, Margulets V, et al., Biol Reprod 70, 837-845, 2004
【非特許文献４】Beattie GM, Lopez AD, Bucay N, et al., Stem Cells 23, 489-495, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、異種動物由来のフィーダー細胞や血清の非存在下で簡便かつ効率的に、細胞を未分化状態のまま培養し得る手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題解決のために鋭意検討を行い、レクチンを用いることによる分化抑制手法を見出して、本発明を完成させた。
【００１２】
本発明の要旨は以下の通りである。
１．レクチンを有効成分として含有する分化抑制剤。
２．レクチンをコードする核酸を有効成分として含有する分化抑制剤。
３．前記レクチンが、当該レクチン遺伝子のノックダウンにより、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンであることを特徴とする１又は２記載の分化抑制剤。
４．前記レクチンがガラクトース結合性レクチンであることを特徴とする３記載の分化抑制剤。
５．前記レクチンがガレクチンであることを特徴とする４記載の分化抑制剤。
６．前記ガレクチンがガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９、ガレクチン１２のいずれかであることを特徴とする５記載の分化抑制剤。
７．レクチンが固定化されていることを特徴とする分化抑制培養基材。
８．前記レクチンが、当該レクチン遺伝子のノックダウンにより、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンであることを特徴とする７記載の分化抑制培養基材。
９．前記レクチンがガラクトース結合性レクチンであることを特徴とする８記載の分化抑制培養基材。
１０．前記レクチンがガレクチンであることを特徴とする９記載の分化抑制培養基材。
１１．前記ガレクチンがガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９、ガレクチン１２のいずれかであることを特徴とする１０記載の分化抑制培養基材。
１２．レクチンと細胞とを接触させることを特徴とする分化抑制方法。
１３．１乃至６いずれか記載の分化抑制剤を用いることにより、レクチンと細胞とを接触させることを特徴とする分化抑制方法。
１４．７乃至１１いずれか記載の分化抑制培養基材を用いることにより、レクチンと細胞とを接触させることを特徴とする分化抑制方法。
１５．前記細胞は胚性幹細胞であることを特徴とする１２乃至１４いずれか記載の分化抑制方法。
１６．レクチンの分化抑制のための使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、異種動物由来因子の影響を受けず、非常に簡便かつ効率的に、細胞の未分化状態を維持することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、発明を実施するための最良の形態により、本発明を詳説する。
１．本発明の分化抑制剤
本発明の分化抑制剤は、レクチンを有効成分として含有することを特徴とする。ここでいうレクチンとは、糖と特異的に結合するタンパク質のことを指し、細胞膜複合糖質（糖タンパク質や糖脂質）と結合するものの他、小胞体やゴルジ体等との結合能を有し、糖タンパク質品質管理に関わる細胞内レクチンも含む。
【００１５】
本発明におけるレクチンとしては、当該レクチン遺伝子をノックダウンした際に、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンを用いることができ、ガラクトース結合性レクチンであることが好ましい。そのようなレクチンとしては、例えばＰＮＡ（ピーナッツレクチン）、ＥＣＡ（デイゴマメレクチン）、ＳＢＡ（ダイズレクチン）、Ａｌｌｏ Ａ（カブトムシレクチン）等が例示され、ガラクトースを含む糖鎖構造の認識部位を有する人工レクチンであってもよい。
【００１６】
かかるレクチンの中でも、特にガレクチンファミリーに属するレクチンであることが好ましく、殊にガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９及びガレクチン１２が例示され、ガレクチン７が最も好ましい。
【００１７】
なお、本発明におけるレクチンとは、天然型レクチンの他、天然に生ずる変異体、人工的な変異（すなわち、１個以上のアミノ酸残基において、置換、欠失、付加、修飾、挿入など）を施したもの、あるいはそれらの一部のドメインや一部のペプチドフラグメントを包含するものとする。
【００１８】
本発明の分化抑制剤は、レクチンをコードする核酸を有効成分とするものであってもよい。コードする核酸（塩基配列）には、特に限定はなく、上記した本発明で使用されるレクチンをコードする任意の核酸を使用することができる。例えば、NCBIデータベースのAccession Number NM 001042507に示された配列が挙げられ、更にこれらの塩基配列に１又は数個の塩基の置換、欠失、付加、修飾、挿入などを有する塩基配列も包含される。
【００１９】
また、本発明におけるレクチンをコードする核酸には、上記した塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸も含まれる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えばナトリウム濃度に関し、約15〜約50mM、好ましくは約19〜約40mM、より好ましくは約19〜約20mMで、温度については約35〜約85℃、好ましくは約50〜約70℃、より好ましくは約60〜約65℃の条件を示し、典型的な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下とは、例えば、6×SSC(1×SSCの組成:150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5% SDS、5×デンハルト、100mg/ml ニシン精子DNAを含む溶液中、プローブとともに65℃で一晩保温するという条件が挙げられる。
【００２０】
かかる本発明分化抑制剤の有効成分となる核酸の合成は、当業者であれば、開示された配列情報に基づいて、適宜既存技術を用いて行うことができる。
２．本発明の分化抑制培養基材
本発明の分化抑制培養基材は、レクチンが固定化されていることを特徴とする。
【００２１】
本発明におけるレクチンとしては、当該レクチン遺伝子をノックダウンした際に、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンを用いることができ、ガラクトース結合性レクチンであることが好ましい。そのようなレクチンとしては、例えばＰＮＡ（ピーナッツレクチン）、ＥＣＡ（デイゴマメレクチン）、ＳＢＡ（ダイズレクチン）、Ａｌｌｏ Ａ（カブトムシレクチン）等が例示され、ガラクトースを含む糖鎖構造の認識部位を有する人工レクチンであってもよい。
【００２２】
かかるレクチンの中でも、特にガレクチンファミリーに属するレクチンであることが好ましく、殊にガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９及びガレクチン１２が例示され、ガレクチン７が最も好ましい。
【００２３】
なお、本発明におけるレクチンとは、天然型レクチンの他、天然に生ずる変異体、人工的な変異（すなわち、１個以上のアミノ酸残基において、置換、欠失、付加、修飾、挿入など）を施したもの、あるいはそれらの一部のドメインや一部のペプチドフラグメントを包含するものとする。
【００２４】
本発明におけるレクチンを固定化する基材としては、用途に応じていかなる形状の基材であってもよいが、例えばシャーレ、フラスコ、プレート、キュベット、フィルム、ファイバー、ビーズや多孔質体など、従来から細胞培養に用いられている基材が例示される。これらの基材は、ガラス、石英等の無機材料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン等の有機材料のいずれからなっていてもよいが、滅菌可能な材料であることが好ましい。なお、これらの基材は、細胞の接着性や増殖能を向上させるための、いかなる表面コーティング処理が施されていても良い。
【００２５】
本発明におけるレクチンを固定化する方法としては、基材に単純に吸着させる方法、基材に共有結合させる方法、レクチンと特異的に結合する糖鎖高分子や抗体を吸着させた基材にレクチンを固定化する方法等が例示されるが、レクチンと基材とが接着する方法であればいかなる方法であってもよい。
３．本発明の分化抑制方法
本発明の分化抑制方法は、レクチンと対象となる細胞とを接触させることを特徴とする。
【００２６】
本発明の分化抑制方法は、全ての幹細胞、脱分化した細胞が対象細胞となり得る。かかる細胞の例としては、哺乳類の胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞等が挙げられ、中でも、霊長類の胚性幹細胞および人工多能性幹細胞が好ましい。
【００２７】
レクチンと対象となる細胞とを接触させる方法としては、本発明の分化抑制剤を添加する方法および本発明の分化抑制培養基材を用いる方法が例示されるが、レクチンと細胞とを接触させ得る方法であれば、他の手段によるものであってもよい。また、各々の方法を組み合わせたものであってもよい。
【００２８】
本発明の分化抑制剤は、任意の細胞培養基本培地に添加して使用することができる。動物細胞基本培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０などが例示されるが、これらに限定されるものではない。さらに、これらの基礎培地に血清または血清代替物を添加して用いてもよい。これら血清や血清代替物としての各種増殖因子等は当業者に周知である。
【００２９】
本発明分化抑制剤における核酸のベクターへの導入は、適宜ベクターに核酸を結合して行うことができる。なお、ベクターへの導入に際して、核酸の機能を損なわない限りにおいて、例えば制限酵素断片の連結、又は、核酸の末端領域の一部を切断してベクターへの導入を行ったとしても、当業者であれば本発明分化抑制方法の目的が達成されることは容易である。
【００３０】
かかるベクターとしては、本発明分化抑制方法を適用する対象の細胞で発現するベクターである限りにおいて特に限定されず、目的の細胞に合わせて適宜選択して使用することができる。また、かかる本発明分化抑制剤の有効成分となる核酸の細胞への導入は、当業者であれば、適宜既存技術を用いて行うことができる。
【００３１】
本発明の分化抑制培養基材を使用する方法としては、例えば、ポリスチレンディッシュにレクチンをコートし、その培養器上で細胞を培養する方法、多孔質ビーズにレクチンをコートし、それらを添加した培養器上で細胞を培養する方法等が例示され、この時、培養液として、更に、本発明分化抑制剤を添加したものを用いてもよい。
【００３２】
本発明分化抑制方法で使用する培養基材は、複数の異なる細胞の集団から幹細胞、殊に胚性幹細胞、人工多能性幹細胞のスクリーニングに使用することも可能である。例えば、胚性幹細胞と、多分化能を失った他の細胞の混合溶液を本発明分化抑制培養基材に導入することで、胚性幹細胞を本発明分化抑制培養基材に捕捉させ、多分化能を失った他の細胞は除去することができ、かつ、その工程に続いて胚性幹細胞を培養することができる。
【００３３】
また、本発明分化抑制方法で使用する培養基材は、幹細胞、殊に胚性幹細胞、人工多能性幹細胞の取得効率の向上にも有用である。特に、作製効率の低い人工多能性幹細胞の作製に関し、例えば、分化万能性獲得に必要な任意の遺伝子を導入した後の培養において、本発明分化抑制培養基材を用いることで、人工多能性幹細胞の取得効率を高めることが可能である。
【００３４】
本発明分化抑制方法により培養した幹細胞、好ましくは胚性幹細胞の未分化程度は、細胞膜状に存在するアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定することにより確認することができる。未分化な胚性幹細胞ではＡＬＰの活性が維持され、分化すると減少することが知られている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６、ｐ６８４、１９９８年）。
【００３５】
ＡＬＰ活性は、例えば、ＡＬＰ染色法によって検出することができる。培養器上の細胞に、基質としてリン酸エステル塩とジアゾニウム塩を含む反応溶液を添加する。細胞膜上に存在するアルカリフォスファターゼにより、リン酸エステルが加水分解され、次いでジアゾニウム塩とカップリング反応することによりアゾ色素が生じ、ＡＬＰ活性部位に色素が沈殿する。染色されたコロニー数を計測することにより細胞の未分化度合を定量することができる。
【００３６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の記述に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
「ＲＮＡｉによるガレクチン発現の抑制」
配列番号１〜７に記載された配列およびそれと相補的な配列をステムループ型ｓｉＲＮＡ発現プラスミド（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−Ｈ１ｐｕｒｏ（Ａｍｂｉｏｎ）に組み込み、常法によりｓｉＲＮＡ発現ベクターを作製した。陰性対象として、配列番号１〜７に記載された配列に代えて、ＥＧＦＰ配列（配列番号８に記載された塩基配列およびそれと相補的な配列からなる）を連結したプラスミドを使用した。
【００３８】
「ＲＮＡｉベクターの細胞への導入」
上記ｓｉＲＮＡ発現ベクターをリポフェクション法によりマウスＥＳ細胞に導入した後、導入後１日目からピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含む培地で２４時間培養し、セレクションを行った。セレクション後、細胞を回収し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ ｄｉｓｈでまき直して５日間培養を行った。
【００３９】
「アルカリフォスファターゼ染色」
培養後、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ溶液キット（ナカライテスク社製）を用いてアルカリフォスファターゼ染色を行い、アルカリフォスファターゼ陽性コロニー数の割合（５０コロニー中の陽性率）を算出することで未分化性を評価した。
【００４０】
結果、ガレクチンがマウスＥＳ細胞の未分化性維持に関与していることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、異種動物由来因子の影響を受けず、また、非常に簡便かつ効率的に、幹細胞の未分化状態を維持した培養を可能とするため、医療・バイオテクノロジーに関わる広範な技術に使用でき、特に、細胞移植療法や薬物の探索への利用に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ガレクチンがマウスＥＳ細胞の未分化性に与える影響を示す図である。各ガレクチンのｓｉＲＮＡを発現させた時のアルカリフォスファターゼ染色陽性率を示す（ＥＧＦＰのｓｉＲＮＡ発現時の陽性率を１とする）。
【図１】
2010004796.tif 000002
【配列表】
2010004796000001.app