(57)【要約】      （修正有）【課題】エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物細胞および非霊長類動物を提供する。【解決手段】エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物細胞及び非霊長類動物。並びに、前記細胞又は動物を用いてウイルスを分離する方法、ウイルスを検出する方法、抗ウイルス薬をスクリーニングする方法及びウイルスの毒力を試験する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物細胞。
【請求項２】
非霊長類動物がマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ又はニワトリである請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物。
【請求項４】
非霊長類脊椎動物がマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ又はニワトリである請求項２に記載の動物。
【請求項５】
請求項１若しくは２に記載の細胞又は請求項３若しくは４に記載の動物にウイルスを接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを回収する工程を含む、ウイルスの分離方法。
【請求項６】
請求項１若しくは２に記載の細胞又は請求項３若しくは４に記載の動物に被検試料を接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを検出する工程を含む、ウイルスの検出方法。
【請求項７】
請求項１若しくは２に記載の細胞又は請求項３若しくは４に記載の動物に候補物質及びウイルスを接触させ、当該接触後の細胞又は動物のウイルス感染に関する病態を評価する工程を含む、抗ウイルス薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１若しくは２に記載の細胞又は請求項３若しくは４に記載の動物にウイルスを接触させることによりウイルスの毒力を試験することを特徴とするウイルス毒力試験方法。
【請求項９】
ウイルスがエンテロウイルス71及び/又はコクサッキーウイルスA16である請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１若しくは２に記載の細胞、及び/又は請求項３若しくは４に記載の動物を含む、ウイルスの分離用、ウイルスの検出用、抗ウイルス薬のスクリーニング用又はウイルス毒力試験用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロウイルス71受容体遺伝子を含む非霊長類由来細胞およびこれらの動物又は細胞を用いた抗ウイルス薬のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
エンテロウイルス71は、コクサッキーウイルスA16などと共に、ピコルナウイルス科エンテロウイルス属のA群ヒトエンテロウイルスに分類される（非特許文献８）。エンテロウイルス71やコクサッキーウイルスA16は、ヒトの手足口病の原因ウイルスとして知られている（非特許文献８）。手足口病はそれ程重篤な感染症ではないが、EV71による手足口病の場合においてのみ、稀に重篤な無菌性髄膜炎、脳炎および急性弛緩性麻痺などを引き起こすことがある。近年、神経病原性を示すEV71の局所的な流行が、台湾、マレーシア、シンガポール、日本および中国などの東南アジアや東アジアの国々で報告されている（非特許文献1-3、5、7）。そのためEV71による手足口病の流行時には、迅速にウイルスを分離して解析する必要がある。さらにウイルスの毒力を判定したり、抗ウイルス薬を開発するのに必要な感染実験モデル系を構築する必要がある。しかし、EV71の神経病原性を実験的に再現することは非常に難しく、サルを用いた感染実験でのみ評価可能である。
【０００３】
SCARB2（scavenger receptor class B, member 2）は、LIMPII（Lysosomal Integral Membrane Protein II）として知られており、N末端とC末端の両方を細胞質内領域として持つ膜2回貫通型蛋白質である。SCARB2は、エンドソームやライソゾームの膜の輸送や認識に関与すること(非特許文献6）、また、SCARB2をノックアウトしたマウスでは、尿管の形成不全、難聴および末梢性神経障害が観察されることが報告されている(非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ahmad, K. 2000. Lancet 356:1338.
【非特許文献２】Chan, L. G. et al., 2000. Clin Infect Dis 31:678-83.
【非特許文献３】Fujimoto, T. et al., 2002. Microbiol Immunol 46:621-7.
【非特許文献４】Gamp, A. C. et al., 2003. Hum Mol Genet 12:631-46.
【非特許文献５】Ho, M. et al., 1999. N Engl J Med 341:929-35.
【非特許文献６】Kuronita, T. et al., 2002. J Cell Sci 115:4117-31.
【非特許文献７】Qiu, J. 2008. Lancet Neurol 7:868-9.
【非特許文献８】Racaniello, V. 2001. Fields Virology, 4 th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、エンテロウイルスレセプター71遺伝子を含む非霊長類細胞又は非霊長類動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、エンテロウイルスレセプターであるＥＶ７１Ｒを非ヒト動物細胞にトランスフェクトすることで、ヒトのウイルスの感染系を非霊長類動物又は細胞において構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物細胞。
（２）エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物。
（３）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物にウイルスを接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを回収する工程を含む、ウイルスの分離方法。
（４）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物に被検試料を接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを検出する工程を含む、ウイルスの検出方法。
（５）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物に候補物質及びウイルスを接触させ、当該接触後の細胞又は動物のウイルス感染に関する病態を評価する工程を含む、抗ウイルス薬のスクリーニング方法。
（６）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物にウイルスを接触させることによりウイルスの毒力を試験することを特徴とするウイルス毒力試験方法。
（７）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物を含む、ウイルスの分離用、ウイルスの検出用、抗ウイルス薬のスクリーニング用又はウイルス毒力試験用キット。
【０００８】
本発明において、非霊長類動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ又はニワトリが挙げられる。また、ウイルスとしてはエンテロウイルス71及び/又はコクサッキーウイルスA16が挙げられる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物および非霊長類動物細胞が提供される。本発明の細胞及び動物は、ウイルスの分離試験や抗ウイルス薬のスクリーニング、あるいは薬剤の有効性試験等に用いることができる点で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の細胞にウイルスを感染させたときのウイルスの増殖曲線を示す図である。
【図２】本発明の細胞にウイルスを感染させたときのウイルスの力価を測定した結果、及びEV71とEV71Rとの結合試験を行った結果を示す図である。
【図３】本発明の細胞に対するウイルスの感染性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物及び非霊長類動物細胞に関する。また本発明は、前記動物又は細胞を利用して、ウイルスを分離する方法、ウイルスを検出する方法、抗ウイルス薬をスクリーニングする方法、及びウイルスの毒力を試験する方法に関する。
【００１２】
本発明は、抗ウイルス薬の作製、ウイルスの検出、ウイルスの分離、あるいはウイルスの毒力試験を行うため、当該ウイルスのレセプター分子に着目して完成されたものである。
従来、目的とするヒトのウイルス分離試験をする際にはヒト由来の細胞などが使用されていたが、これらの細胞には他のウイルスも感染するため、ウイルスを分離した後に、目的のウイルスであるかどうかについて、特異的抗体やPCR法などを用いてそのウイルス種の同定を行なう必要がある。
【００１３】
そこで本発明においては、エンテロウイルス71レセプター（SCARB2という）遺伝子を非ヒト由来の細胞又は非ヒト動物で発現させることにより、この細胞又は動物ではエンテロウイルス71とコクサッキーウイルスA16を選択的に検出することが可能となった。非ヒト由来の細胞又は非ヒト動物にエンテロウイルス71レセプター（SCARB2という）遺伝子を導入したため、本来ヒトに感染することができる他のウイルスは、上記細胞及び動物には感染することができない。従って、本発明の細胞及び動物は、ウイルス分離試験や検出を効率よく行なうことができる新たな実験系に使用することができる。
【００１４】
また、本発明者は、レセプター分子の機能をレセプターに対する抗体で阻害することで、ウイルスの感染が阻害されることを示した。レセプターが同定されていない場合にこのような薬剤の開発は困難であることから、本発明は、薬剤の開発に大きく寄与するものである。
さらに、薬剤のスクリーニングには感染モデル動物が必要である。したがって、ヒトSCARB2を発現する遺伝子改変非霊長類トランスジェニック動物を用いて、薬物の有効性試験を効率よく行なうことが可能となる。
このように、本発明においては、SCARB2を細胞あるいは非霊長類動物で発現させることにより、従来存在しなかった新たなウイルス検出系、ウイルス感染モデルとして利用することができる。
【００１５】
１．エンテロウイルス71レセプター遺伝子
（１） 遺伝子の同定
エンテロウイルス71（EV71)はヒト由来のRD細胞、サル由来のVero細胞などに感染することができ、これらの細胞がEV71の分離に使用されている。一方でマウスのL929細胞などはウイルス感受性が低く、ほとんど感染することができない。その理由は、ウイルスの感染を効率よく成立させる細胞表面のレセプターがヒトまたはサルの細胞には存在し、それ以外の種においてはその機能を持つ分子がないことに起因すると考えられた。
【００１６】
そこで本発明者は、エンテロウイルス感染の種特異性を利用して、ウイルスレセプターを単離することができると考えた。まずマウスL929細胞にヒトRD細胞染色体DNAをトランスフェクションした形質転換細胞株ライブラリーを作製した。各々の細胞にはヒトDNAが一部分だけ挿入されているので、その中にはEV71感受性を獲得した細胞が存在する可能性が高い。また本発明者は、EV71にGFPを挿入して、感染が成立すると感染細胞がGFPの蛍光を発するように操作した組換えEV71を用いて、感受性を獲得した細胞を選抜した。
【００１７】
感受性を獲得した細胞株Ltr051細胞から形質転換に直接関わったヒト由来の遺伝子を同定するために、この細胞株とL929細胞からRNAを調製し、Whole Human Genome Microarray kit 4x44K (Agilent社)を用いてLtr051細胞が新たに発現するようになったヒト由来mRNAを選抜した。
候補からSCARB2を選び、そのcDNAを単独でL929細胞で発現したところ、L929細胞はEV71感受性を示した。また本発明者は、SCARB2はウイルス粒子と直接結合すること、両者の結合や細胞への感染は抗SCARB2抗体によって阻止できることを証明した。従ってSCARB2はEV71のレセプターの機能を果たす分子であると結論づけられた。
SCARB2を発現するL929細胞(L-SCARB2細胞)は、EV71の様々な株に感受性を示すほか、コクサッキーウイルスA16にも感受性を示したが、ポリオウイルスやコクサッキーウイルスB、さらに近縁のウイルスであるA群エンテロウイルスに属するCVA2, 3, 4, 5, 6, 8, 12には感受性を示さなかった。これらのことから、この細胞株はEV71, CVA16に選択性が高いウイルス分離が可能であることが明らかになった。
【００１８】
（２）SCARB2遺伝子
本発明において使用されるエンテロウイルス71レセプター（EV71R）遺伝子は、SCARB2と呼ばれるものであり、公知のデータベースから容易に入手することができる。例えばNCBIのウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において「アクセッション番号：NM_005506」として公表されている。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列を有する。本発明においては、配列番号１に示す塩基配列の全長配列、及びコード領域（340〜1776番）の塩基配列のどちらを使用することもできる。
【００１９】
さらに、本発明は、上記EV71R又はその変異型をコードする遺伝子を使用することもできる。EV71Rのアミノ酸配列情報は配列番号２である。
「変異型」とは、EV71Rのアミノ酸配列（配列番号２）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、EV71R活性を有するタンパク質、あるいは、EV71Rのアミノ酸配列において少なくとも80％のホモロジーを有し、かつ、EV71R活性を有するタンパク質を意味する。
【００２０】
例えば、EV71Rの変異型は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と約80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは約95％以上、さらに好ましくは約98％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、EV71R活性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
【００２１】
ホモロジーは、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列の他、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば１個又は数個）のアミノ酸に欠失、挿入、置換若しくは付加等の変異、又はこれらの組み合わせ変異が生じたアミノ酸配列であって、かつ、EV71R活性を有するタンパク質のアミノ酸配列が挙げられる。
【００２２】
例えば、
(i) 配列番号２に示されるアミノ酸配列の1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２に示されるアミノ酸配列に1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２に示されるアミノ酸配列に1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号２に示されるアミノ酸配列の1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
ここで、「EV71R活性」とは、エンテロウイルス７１の細胞への感染の初期過程、すなわちウイルス粒子の細胞表面への吸着、ウイルス粒子もしくはウイルスゲノムRNAの細胞内への侵入、またはウイルス粒子からウイルスゲノムRNAの放出を引き起こす活性を意味する。
【００２３】
本発明において使用可能な変異型DNAとして、配列番号１に示される塩基配列若しくはそのコード領域の塩基配列、又はこれらの塩基配列に相補的な配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、EV71R活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００２４】
本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、DNA濃度、DNAの長さ、反応時間等の条件を適宜設定することができる。
【００２５】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を参照することができる。
【００２６】
ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列若しくはそのコード領域の塩基配列又はこれらの塩基配列に相補的な塩基配列に対して、少なくとも50％以上、好ましくは70％、さらに好ましくは80％、さらに好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには99％以上)の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２７】
変異型EV71R遺伝子は、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
【００２８】
２．EV71R遺伝子の細胞又は動物への導入
（１）細胞への導入
EV71R遺伝子を細胞に導入するには、例えばヒト染色体DNAをトランスフェクションする手法が採用される。ヒト染色体DNAをトランスフェクションする手法としては、特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを使用することができる。
ヒト遺伝子を発現するようになった細胞の中には、EV71Rを発現しているものがある。そこで、EV71Rを発現している細胞を、ウイルス感受性を指標にして選択し、細胞をクローニングする。クローニング後は、ヒトDNA 特異的反復配列などを指標にしてDNAが組み込まれたか否かを確認する。 
【００２９】
一旦遺伝子が同定されると、その後は、EV71R遺伝子を細胞に導入する方法として、EV71R遺伝子を含むDNAをトランスフェクションする手法、EV71R遺伝子を発現するウイルスベクター（アデノウイルス、レトロウイルス等）を用いる方法等が採用される。DNAをトランスフェクションする手法としては、特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを使用することができる。EV71Rを細胞で発現させる手法は、特に限られた方法ではない。
遺伝子導入の宿主細胞としては、非霊長類由来の細胞を挙げることができる。例えば、げっ歯類細胞、鳥類細胞などを例示することができる。
げっ歯類細胞は、L929、NIH3T3などのマウス由来細胞、PC-12、NRKなどのラット由来細胞、BHK21、CHOなどのハムスター由来細胞などを使用することができ、L929細胞が好ましい。
【００３０】
（２）動物への導入
以下に、本発明の非ヒト非霊長類トランスジェニック動物の作出方法について説明する。これらの非ヒト動物は、ヒト由来のEV71R遺伝子を前記動物に導入することにより、ウイルスに感受性を示すトランスジェニック動物となる。非霊長類動物としてはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ又はニワトリが挙げられる。
【００３１】
本発明に使用するマウスとしては、いずれの系統のマウスを用いてもよいが、BALB/c系、129系、ICR系、C57BL/10系等がある。トランスジェニックマウスは、公知の作出方法、すなわち受精卵前核へのDNAマイクロインジェクションによる方法、胚性幹細胞（ES細胞）にDNAを導入した後キメラを作製する方法、及びレトロウイルスベクターを初期発生胚に感染させて導入する方法のいずれの方法を用いることができる。これらの方法については、例えば、「Manipulating the Mouse Embryo-A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1994) Hogan B et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor」、「マウス ラボマニュアル 第２版−ポストゲノム時代の実験法−（第271〜296頁）, 発行日：2003年5月26日（初版）, 編集：東京都臨床医学総合研究所 実験動物研究部門, 発行者：平野皓正, 発行所：シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社」、「発生工学実験マニュアル (1987) 勝木元也（編）講談社サイエンティフィク, 東京」、「マウス胚の操作マニュアル 第２版 (1997) Hogan B et al.（著）, 山内一也ら（訳）近代出版, 東京」、「Gordon, J. W. (1993) Guide to Techniques in Mouse Development (Wassarman, P. M., and DePamphilis, M. L., Eds.), Academic Press, San Diego」等に記載されており、これらの記載を適宜参照してトランスジェニックマウスを作出することができる。
【００３２】
ここでは、非霊長類動物としてマウスを用いた場合を例に挙げて説明したが、他の非霊長類動物を用いる場合についても同様の方法を適用することができる。例えば、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ及びネコは、ウイルス感受性トランスジェニックマウスを樹立した方法と同じ手法にて、クローニングされたヒトEV71R遺伝子を各種動物の受精卵の雌性あるいは雄性前核に微量注入した後、偽妊娠させた仮親の卵管にもどし、生育、出産した動物について、ヒトEV71R遺伝子が導入されている動物を選別する方法によって得ることができる。ラットの場合はＷ（Wister）系、Spraque-Dawky系、F344系等が、ハムスターの場合はNSJ系等が、モルモットの場合はHartley等を使用することができる。
【００３３】
３．ウイルスの分離方法
本発明はウイルスの分離方法を提供し、本発明の上記細胞又は動物にウイルスを接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを回収する工程を含む。
前記の通り、一般にヒトのウイルス分離試験をする際にはRD細胞などヒト由来の細胞などを使用している。しかし、これらの細胞にはヒトに感染することが出来る多くのウイルスが感染するため、ウイルスを分離したのちに特異的抗体やPCR法などを用いてそのウイルス種の同定を行なう必要がある。これに対し、例えばL929細胞はマウスに由来する細胞であるため、本来ヒトに感染する多くのウイルスは感染することができない。
そこで、エンテロウイルス71レセプターであるSCARB2を例えばマウス細胞で発現させると、この細胞ではエンテロウイルス71及び/又はコクサッキーウイルスA16を選択的に検出することができる。この細胞はウイルス分離試験を効率よく行なうことができる新たな実験系に使用することができる。
本発明において、SCARB2が導入された細胞にウイルスを接触させると、これらのウイルスは細胞内で増殖する。この増殖したウイルスを回収することにより、ウイルスを分離することができる。
【００３４】
ここで、本明細書において「接触」とは、本発明の細胞又は動物が、ウイルス、被検物質又は被検試料と接触し得るように処理することを意味し、接種、投与、培養、混合又は感染等の広い意味で使用することができる。例えば、細胞を用いるときは細胞とウイルスと被検物質又は被検試料とを混合すること、細胞をウイルス及び被検物質又は被検試料とともに培養することなどが挙げられる。また、動物を用いるときは、動物体内にウイルス、被検物質又は被検試料を注射すること、経口投与すること、経皮投与することなどが挙げられる。
分離の対象となるウイルス（上記細胞に接触させるウイルス）としては、エンテロウイルス71及びコクサッキーウイルスA16のいずれか一方又は両者が挙げられる。
接触後は細胞を適当な期間培養する。例えば、SCARB2が導入された細胞に上記ウイルスを含むと思われるサンプルを感染させ、１〜４日程度培養する。培養後、培養細胞を凍結融解することによりウイルスを回収する。
SCARB2遺伝子が導入されたトランスジェニック動物からウイルスを分離する場合は、細胞の場合と同様にサンプルをトランスジェニック動物に接触させ、１〜14日程度の後にトランスジェニック動物の各種臓器からウイルスを回収する。
【００３５】
４．検出方法
前記の通り、SCARB2が導入された細胞又は動物にウイルスを接触させると、これらのウイルスは細胞内又は動物内で増殖する。したがって、この特徴を利用してウイルスを検出し、被検試料を検査することが可能である。すなわち、本発明の検出方法は、前記細胞又は動物に被検試料を接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを検出する工程を含む。
例えば、被検試料を本発明の細胞又は動物に接触させる。接触後の本発明の細胞又は動物からウイルスが検出されると、被検試料中にはウイルスが含まれていたものと判断することができる。
【００３６】
上記ウイルスの検出は、上記ウイルスの分離の項で述べた方法を適用することができる。
検出されたウイルスが目的のウイルス（エンテロウイルス71及びコクサッキーウイルスA16）であることの確認は、特異的抗体を利用したウイルス種や株の識別、ウイルスのゲノムRNAを標的としたPCR等により増幅することで行うことができる。また、ウイルスに対する特異的抗体を利用した間接蛍光抗体法を利用することにより行うことも可能である。
【００３７】
５．スクリーニング方法
本発明は、前記細胞又はトランスジェニック動物に候補物質及びウイルスを接触させ、当該接触後の前記細胞又は動物のウイルス感染に関する病態を評価する工程を含む、抗ウイルス薬をスクリーニングする方法である。また、本発明は、前記細胞に、ウイルスの存在下で候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性又は生存状況を測定し、得られる測定結果を指標として抗ウイルス薬をスクリーニングする方法である。
本発明に使用するウイルスとしては、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスA16などが挙げられる。
【００３８】
本明細書において「候補物質」とは、ウイルス感染、ウイルスによる病態発現を変化させることのできる任意の分子である。例えば、天然又は合成の低分子化合物ライブラリー由来の化合物、遺伝子ライブラリーの発現産物（ペプチド、タンパク質等）、天然又は合成のオリゴ核酸、天然又は合成のペプチドライブラリー由来のペプチド、抗体、細菌由来の物質（細菌から代謝により放出される物質等）、微生物、植物細胞抽出液、動物細胞抽出液、培養液（微生物、植物細胞、動物細胞等の培養物）由来の化合物、土壌中の化合物、ファージディスプレイライブラリー等に含まれる化合物などが挙げられる。化合物は、従来の化学的手段、物理的手段及び／又は生化学的手段により改変したものであってもよく、たとえばアルキル化、エステル化、アミド化などの直接的化学修飾又はランダムな化学修飾に付して構造的類似体に改変させることができる。
【００３９】
さらに、候補化合物は、ファーマコフォア検索、又はコンピューターを用いた構造比較プログラムにより同定される化合物であってもよい。本発明において、ファーマコフォア検索、コンピューターを用いた構造比較プログラムなどにより同定される化合物を用いる場合は、EV71とEV71Rとの結合部位の構造解析の結果に基づき、これらタンパク質間の相互作用を阻害する化合物の候補をIn silicoにおいて選別することができる。
【００４０】
これら化合物は新規な化合物であっても公知の化合物であってもよく、また塩を形成していてもよい。「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、前記化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されるものではない。具体的には、たとえば好ましくはハロゲン化水素酸塩（たとえばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（たとえば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（たとえば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（たとえばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（たとえばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（たとえばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（たとえばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。
【００４１】
前記細胞又はトランスジェニック動物に候補物質及びウイルスを接触させる時期は、１回の実験スケジュール内において候補物質とウイルスを動物又は細胞に接触させることができれば同時であっても異なる時期であってもよい。例えば候補物質を動物又は細胞に接種した後にウイルスを接種してもよく、その逆の順で接種することもできる。
【００４２】
本明細書において、「病態を評価する」とは、候補物質を接種した後における本発明の細胞又はトランスジェニック非霊長類動物のウイルス性疾患に関する病態の表現型を解析することを意味し、候補物質の投与前後の細胞又はトランスジェニック非霊長類動物におけるウイルス性疾患に関する病態を比較検討すること、あるいは、候補物質を投与した被験動物又は細胞と投与しない対照動物又は細胞との比較検討を行うことのいずれをも意味するものである。
【００４３】
「ウイルス性疾患に関する病態」としては、例えば、細胞を用いたときは、感染細胞の活性、感染細胞の生存状況、感染細胞の形態などが挙げられる。また、動物を用いたときは、手足の麻痺、神経障害、生死、生化学検査値の変化などが挙げられる。
上記試験の結果、被検化合物を用いたときの解析結果（病態）が、対照と比較して改善又は治癒したときは、被検化合物は抗ウイルス薬として選択することができる。
【００４４】
６．ウイルス毒力試験方法
本発明は、前記細胞又は動物にウイルスを接触させることによりウイルスの毒力を試験することを特徴とするウイルス毒力試験方法を提供する。
本発明のウイルス毒力試験に使用するための非霊長類動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ又はニワトリなどが挙げられる。
また、毒力試験に使用される細胞としては、上記非霊長類動物由来の細胞を用いることができる。
本発明に使用するウイルスとしては、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスA１６などが挙げられる。
本発明に使用するウイルス量は、ウイルス株の感染価を指標として使用される。感染価は、例えば「TCID50（tissue culture infective dose）」又は「PFU（Plaque forming unit）」で表される。
本発明において感染価とは、培養細胞にウイルスを接種した時に、その感染率50％を与えるようなウイルスの量、あるいは１つの感染性ウイルス粒子から生じるプラック数から算定するウイルスの量を単位として表現する。
例えば、「106TCID50」と記載した場合は、培養細胞にウイルスを接種した時に、その感染率50％を与えるウイルスの量を１としたとき、その106倍のウイルス量を有することを意味する。TCID50の測定は、Reed-Muench法やKarber法等で行うことができる。
接種量（投与量）としては、１μｌ〜５ｍｌが好ましく、マウスでは１〜500μｌを通常の接種量とする。
【００４５】
ウイルス接種後、一定期間臨床観察を行う。観察期間は１〜３０日、好ましくは２１日間とし、臨床症状を指標としたLD50（50％のトランスジェニック動物を死亡させるウイルス量）、又は手、足、口、全身の臓器等の病理検査により、ウイルス毒力の数量化を行う。但し、観察期間は上記期間に限定されるものではなく、観察目的に応じて適宜変更することができる。
臨床観察の項目としては、活動性、毛並み、体重、体温等が挙げられる。病理検査をするには、薄切切片をつくり、HE染色、KB染色等による病理組織標本を作製し、各種顕微鏡で炎症像、細胞死、ウイルス抗原等を指標としてウイルス毒力を観察する。
細胞を毒力試験に使用する場合は、感染細胞の生存状況、感染細胞の活性、感染細胞の形態などを指標とすることができる。
【００４６】
７．キット
本発明のキットは、本発明の細胞及び動物を含むものであり、上記ウイルスの分離方法、検査方法、スクリーニング方法及びウイルス毒力試験方法のために使用することができる。
本発明のキットは上記細胞及び/又は動物を含むが、その他に、検出に必要なプライマー、制限酵素、標識物質などを含めることができる。標識物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等が挙げられる。また、本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の方法を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液などを含めることができる。さらに、本発明のキットには、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、注射器、洗浄剤、実験操作マニュアル（説明書）等を含めることもできる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
＜材料＞
ヒトのSCARB2は、pCAGGS-PUR（Hatakeyama, S. et. al., 2005. J Clin Microbiol 43:4139-46.）にcDNA（No. NM_005506）をクローニングして発現させた。
実験に用いたEV71のBrCr株、SK-EV006株、Nagoya株およびIsehara株はそれぞれEV71のGenogroup A、B、BおよびCに分類される。
CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA7、CVA8、CVA10、CVA12、CVA14およびCVA16は、それぞれ代表的な株であるFreetwood株、Olson株、JR株、Swartz株、Parker株、Donovan株、Kowalik株、Texas12株、G14株およびG10株を用いた。
細胞への感染が成立したことのレポーター（細胞内でウイルスの転写・複製が開始したことに依存）としてGFPを組み込んだ組み換えEV71ウイルス（EV71-GFP）は、EV71（SK-EV-006株）ゲノムの5’-NTRとVP4の間にGFPのシークエンスをインフレームで挿入して作出した（pSVA-EV71-GFP）。
Ltr051細胞およびLtr246細胞は、L929細胞にRD細胞のゲノムDNAをトランスフェクトした細胞群の中から、上記３のEV71-GFPに感受性に変化した細胞をクローニングすることによりそれぞれ独立して得られた。
L-SCAEB2細胞は、L929細胞に上記１のプラスミドをトランスフェクトし、プラスミドが導入されSCARB2を安定発現する細胞をクローニングして得られた。
【００４８】
＜方法＞
Ltr051細胞からSCARB2を同定する方法には、Human Microarray（Agillent）を用いた。これにより、マウスのL9292細胞へ持ち込まれたヒトの遺伝子を効率よく、また網羅的に検出することを目的とした。
ウイルス力価は、Vero細胞を用いて50%細胞培養感染量 TCID50として求めた（Reed, L. J., and H. Muench. 1938. Am. J. Hyg. 27:493-499.）。
抗原の発現確認は間接蛍光抗体法で行っており、1次抗体としてSCARB2に対する抗体（R&DSystemsから購入）を、2次抗体としてAlexa488標識抗体を用いた。
【００４９】
EV71粒子とSCARB2分子が直接結合しているかを確認するためにPull-Down Assayを行った。0.1〜10μgのSCARB2/Fc（SCARB2分子の細胞外ドメイン部分とヒトのIgGのFc部分を融合させたもの。R&DSystemsから購入）もしくは10μg のControl/Fc（R&DSystemsから購入）とProtein G-sepharose（SIGMA）を混和し、4°Cで1時間感作させた。その後、8.55×106TCID50のEV71（SK-EV006株）を加え、さらに2時間反応させた。その後、感作させたビーズを培地で3回洗浄し、SDS-PAGE用のサンプルバッファーおよび10mMのDTTを加え、95°Cで5分間加熱した。この上清をサンプルとして、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットでEV71の粒子を形成する主要な蛋白質であるVP1の検出を行った。
Pull-Down AssayにおいてEV71とSCARB2の結合を阻害する実験では、2μgのSCARB2/FcとProtein G-sepharoseの感作の後に、1〜25μgの抗SCARB2抗体もしくは25μgのコントロール抗体を加え、4°Cで1時間反応させた。そして、8.55×106TCID50のEV71（SK-EV006株）を加え、さらに2時間反応させ、以下は上記と同様な操作を行った。
【００５０】
＜感染阻害実験＞
抗SCARB2抗体による感染阻害
50μg/mlの抗SCARB2抗体もしくはコントロール抗体を含んだ培地で37°Cで30分処理したRD細胞にEV71-GFPを感染させ、18時間の培養後、GFP陽性細胞数を感染効率の指標として数えた。EV71-GFPは未処理の細胞において、GFP陽性細胞が100個前後になるように調整して用いた。
SCARB2/Fcによる競合的感染阻害
12μg /mlのSCARB2/FcもしくはBSAとEV71-GFPを37°Cで1時間反応させた後に、RD細胞に感染させ、18時間の培養後、GFP陽性細胞数を感染効率の指標として数えた。EV71-GFPは未処理での感染時に約100個の細胞をGFP陽性にするような濃度に調節した。
【００５１】
＜結果＞
結果を図１〜３に示す。
図１
Ltr051細胞およびLtr246細胞におけるEV71（SK-EV006株）の増殖曲線を、高感受性であるRD細胞および非感受性であるL929細胞での増殖曲線と比較した。すると、Ltr051細胞でのEV71の増殖は、RD細胞とほぼ同程度であったのに対し、Ltr246細胞での増殖はL929細胞より明らかに上昇しているものの、RD細胞より劣っていた。
【００５２】
図２
パネルa. 
レセプター分子であるSCARB2を安定発現させたL-SCARB2細胞におけるEV71およびCVA16の各株の増殖性を検討した。エンテロウイルス71（EV71）のSK-EV006株、Nagoya株、Isehara株およびBrCr株およびコクサッキーウイルスA16（CVA16）のG10株を、RD細胞、L929細胞およびL-SCARB2細胞に、それぞれmoi=0.01で感染させた。48時間の培養の後、ウイルス力価（TCID50）を用いて測定した結果、L-SCARB2細胞におけるそれぞれのウイルスの力価は、L929細胞と比べ明らかに上昇しており、RD細胞とほぼ同程度であった。これらの結果は、SCARB2がEV71およびCVA16の感染受容体として機能していることを示している。
パネルb.
EV71がSCARB2と直接結合しているかを検討した。まず、Protein G-sepharoseビーズに0.1〜10μgのSCARB2/Fc （SCARB2分子の細胞外ドメイン部分とヒトのIgGのFc部分を融合させたもの）を結合させた。これにEV71を4℃で感作させ、ウイルス粒子がSCARB2-ビーズ複合体に結合したかどうかをウエスタンブロットにより確認した。
その結果、SCARB2/Fcの濃度依存的にEV71の構造蛋白質VP1のバンドが濃くなっていることが確認された。つまり、EV71はSCARB2に直接結合していることが示された。
【００５３】
パネルc.
EV71とSCARB2の結合が、SCARB2に対する抗体で阻害されるかを検討した。2μgのSCARB2/Fcを結合させたProtein G-sepharoseビーズに1〜25μg のSCARB2に対する抗体を感作させた後、EV71を結合させた。その結果、EV71とSCARB2/Fcの結合は、抗体の濃度依存的に阻害されていた。
パネルd.
EV71の感染がSCARB2に対する抗体で阻害されるかを検討した。RD細胞にSCARB2に対する抗体を反応させた後に、感染するとGFPを発現するように改変したEV71（EV71-GFP）を感染させた。18時間後にGFP陽性細胞の数を指標に感染効率を比較したところ、EV71-GFPの感染はSCARB2に対する抗体で約70％阻害された。
パネルe.
EV71-GFPの感染がSCARB2/Fcにより競合的に阻害されるかを検討した。EV71-GFPとSCARB2/Fcを感作させ後にRD細胞に感染させ、GFP陽性細胞の数を指標に感染効率を比較したところ、SCARB2/Fcと感作させることによりEV71-GFPの感染が約60％阻害された。
【００５４】
図３
EV71やCVA16と同じA群ヒトエンテロウイルスに分類されるCVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA7、CVA8、CVA10、CVA12およびCVA14が、L-SCARB2細胞で増殖可能になっているのかを調べた。
RD細胞、L929細胞およびL-SCARB2細胞に、それぞれのウイルスを感染させ、48時間後に細胞の写真を撮影した。CVA7、CVA10およびCVA14は、RD細胞のみでなくL929細胞でも増殖した。他のウイルスは、L-SCARB2細胞で増殖することが出来るようにならなかった。以上のことから、L929細胞とL-SCARB2細胞を組み合わせることで、CVA16およびEV71を選択的に分離することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の細胞およびトランスジェニック非霊長類動物は、抗ウイルス薬を開発するためのツールとして有用である。また、本発明の動物は、ウイルス感染に関する実験モデルとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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