(57)【要約】      （修正有）【課題】単分子計測によるmRNA発現解析において、発現解析を行う標的mRNAが２種以上の試料由来である場合に、標的mRNAのハイブリダイズ効率に影響を与えることなく、その試料毎に異なるタグ識別が可能な発現mRNA識別方法を提供する。【解決手段】オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチド１０１および第２オリゴヌクレオチド１０２から形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、該制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体を、該オリゴdT配列により標的mRNAに試料ごとにハイブリダイズさせる工程を含む、発現mRNA識別方法。【選択図】図２
2010029142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別する方法であって、
(i)オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体を、オリゴdT配列により標的mRNAに試料ごとにハイブリダイズさせる工程と、
(ii)ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程と、
(iii)固定化されたmRNAと二本鎖DNA複合体における二本鎖DNA複合体部位に含まれる制限酵素認識配列のうち第１の制限酵素によって切断可能な配列を第１の制限酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程と、
(iv)5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程と、
(v)取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程と、
(vi)第１の制限酵素により切断されなかったメチル化修飾様式が異なる制限酵素認識配列のうち第２の制限酵素によって切断可能な配列を第２の酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程と、
(vii)第２の制限酵素により形成された5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程と、
(viii)取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程と
を有する発現mRNA識別方法。
【請求項２】
第１オリゴヌクレオチドが5'上流領域に制限酵素認識配列を、3'下流領域にオリゴdT配列を有し、第２オリゴヌクレオチドが第１オリゴヌクレオチドの5'上流領域に存在する制限酵素認識配列の相補的配列を有し、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドが二本鎖DNA複合体を形成する、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。
【請求項３】
ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程において、第２オリゴヌクレオチドが3'末端において固相担体に固定化される、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。
【請求項４】
第１および第２のオリゴヌクレオチドにより形成される二本鎖DNA複合体が有する制限酵素認識配列が、第１および第２の制限酵素に認識され、かつ第１の制限酵素がメチル化感受性であり、第２の制限酵素がメチル化非感受性である、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。
【請求項５】
メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せが、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、またはAva IIとSin Iの組合せである請求項４に記載の発現mRNA識別方法。
【請求項６】
メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがMbo IとSau3A Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GATC配列またはメチル化されたGmATC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、請求項５に記載の発現mRNA識別方法。
【請求項７】
メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがHpa IIとMsp Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、CCGG配列またはメチル化されたCmCGG配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、請求項５に記載の発現mRNA識別方法。
【請求項８】
メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがAva IIとSin Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GG(A/T)CC配列またはメチル化されたGG(A/T)mCC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、請求項５に記載の発現mRNA識別方法。
【請求項９】
二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列を２種以上有し、各配列に対するメチル化感受性制限酵素およびメチル化非感受性制限酵素をそれぞれ第１および第２の制限酵素として用いて(iii)〜(viii)の工程を繰り返す、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。
【請求項１０】
非メチル化配列またはメチル化配列を有する第１のオリゴヌクレオチドの5'末端をそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、制限酵素処理前にそれぞれの蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程をさらに有する、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。
【請求項１１】
単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別するためのキットであって、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、該制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体と、該制限酵素認識配列を認識するメチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の少なくとも１種の組合せとを含む前記キット。
【請求項１２】
メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せが、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、およびAva IIとSin Iの組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単分子計測によるmRNA発現解析において、発現解析を行う標的mRNAが２種以上の試料由来である場合に、各標的mRNAがどの試料に由来するかを識別するための発現mRNA識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、発生分化の制御や種々の環境に対する応答のために、そのゲノム上の遺伝子群の発現を制御している。このような遺伝子群の発現状態を網羅的に解析することは、生物応答の機能解明に向けて非常に有用な情報を提供する。さらに、これらの情報はそれぞれの機能の解明だけでなく、疾病関連遺伝子の同定や診断マーカー遺伝子の同定などにも極めて有用である。そのため、これまでに数多くの網羅的遺伝子発現解析技術が開発されてきた。現在、網羅的遺伝子発現解析として最もよく用いられているのは、DNAマイクロアレイを用いた解析手法である。
【０００３】
DNAマイクロアレイの測定原理は、異なる条件の２群から調製した発現mRNAに相補的な二色蛍光標識化プローブ核酸を合成し、ガラスなどの固相基板上に高密度に固定されたターゲット核酸に対してハイブリダイズさせ、各々のハイブリダイズしたプローブ核酸からの二色の蛍光シグナルを検出し、これより試料に含まれる発現mRNA比を算出するものである（特許文献１，２）。一方、ヒトゲノム解読の終了後、更なる高スループット、低コストなシーケンス解析を実現するために、キャピラリー電気泳動シーケンサに代わる次世代大規模DNAシーケンサの開発が、最近になって飛躍的に進んでいる。2005年に生物発光方式を用いた次世代DNAシーケンサが、次いで2006年に蛍光多分子方式の次世代DNAシーケンサが開発されている。さらには、ライゲーションを利用した製品も開発されている。増幅したDNAを鋳型に用いて配列決定を行う上記シーケンサに加え、近年では、鋳型として1DNA分子を用いる単分子DNAシーケンサが開発されており、鋳型DNAの増幅工程を必要としないことから、より高スループット・低コスト化に向けたシステムとして期待されている。
【０００４】
このような単分子DNA計測を行うDNAシーケンサは、DNA塩基配列決定だけでなく、一度に解析できるスループットの高さから、１から数個の細胞であれば細胞内に発現している全てのmRNAの塩基配列解析を行うことができる。これにより、配列解析された各遺伝子のmRNAの出現頻度を算出することで、この出現頻度から細胞内における各遺伝子の発現頻度を算出することが可能となり、網羅的なmRNA発現解析を実施することができる。
【０００５】
上述の単分子DNA計測によるmRNA発現解析では、塩基配列解析反応の再現性から、発現を比較する２種以上の試料由来のmRNA群を同一の反応において解析することが望ましい。しかしながら、その場合にはそれぞれどの試料に由来するmRNAであるかを識別することが必要となる。
【０００６】
PCR増幅産物を鋳型DNAとして用いる多分子DNA計測では、増幅に用いるPCRプライマーにタグとなる任意の配列を導入し、異なる試料ごとに配列が異なるタグ配列を有するPCR増幅産物を調製し塩基配列解析時にそのタグ部分の配列決定をも行うことで、どの試料に由来するかを同定している。一方、単分子DNA計測によるmRNA発現解析mRNA発現解析の場合には、配列解析の際に用いるオリゴdTプライマーに個別のタグ配列を導入する必要がある。しかしながら、異なるタグ配列を有するオリゴdT配列を用いた場合には、各mRNAのpolyA配列が同一のpolyA配列ではなく、そのため、オリゴdT配列とその近傍の配列がハイブリダイズの効率に影響を及ぼすこととなる。その結果、各試料を識別するため試料毎に異なるタグ配列を有するオリゴdTプライマーを使用した場合に、各タグ配列を有するオリゴdTプライマーのmRNAへのハイブリダイズの効率が各試料間で異なり、そのため、配列解析結果から得られたmRNA発現頻度が実際の各試料毎のmRNAの発現頻度を反映しなくなり、誤ったmRNA発現頻度の結果を得るという問題があった。
【０００７】
【非特許文献１】Proc Natl Acad Sci USA(1994)91:5022-5026
【非特許文献２】Science(1994)270:467-470
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、単分子DNA計測によるmRNA発現解析の際に、異なる試料の標的mRNAに対して差異なくハイブリダイズするオリゴdTプライマー配列を有するタグ配列用いることで、検出発現頻度に影響を与えることなく、かつ、その試料毎に異なるタグ識別が可能な発現mRNA識別方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、単分子計測によるmRNA発現解析の際に、発現解析を行う標的mRNAが２種以上の試料由来である場合に、各標的mRNAがどの試料に由来するかを識別するための発現mRNA識別方法において、検出発現頻度に影響を与えることなく、異なる試料の標的mRNAに対して差異なくハイブリダイズするオリゴdTプライマー配列とタグ配列を有した二本鎖DNA複合体として、塩基配列が同じであるが異なるメチル化修飾を受けた制限酵素認識配列をタグ配列に包含した二本鎖DNA複合体を用い、さらに、メチル化感受性およびメチル化非感受性制限酵素処理行うことにより、上記課題を解決するものである。
【００１０】
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別する方法であって、
(i)オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体を、オリゴdT配列により標的mRNAに試料ごとにハイブリダイズさせる工程と、
(ii)ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程と、
(iii)固定化されたmRNAと二本鎖DNA複合体における二本鎖DNA複合体部位に含まれる制限酵素認識配列のうち第１の制限酵素によって切断可能な配列を第１の制限酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程と、
(iv)5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程と、
(v)取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程と、
(vi)第１の制限酵素により切断されなかったメチル化修飾様式が異なる制限酵素認識配列のうち第２の制限酵素によって切断可能な配列を第２の酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程と、
(vii)第２の制限酵素により形成された5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程と、
(viii)取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程と
を有する発現mRNA識別方法。
【００１１】
（２）第１オリゴヌクレオチドが5'上流領域に制限酵素認識配列を、3'下流領域にオリゴdT配列を有し、第２オリゴヌクレオチドが第１オリゴヌクレオチドの5'上流領域に存在する制限酵素認識配列の相補的配列を有し、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドが二本鎖DNA複合体を形成する、（１）に記載の発現mRNA識別方法。
【００１２】
（３）ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程において、第２オリゴヌクレオチドが3'末端において固相担体に固定化される、（１）に記載の発現mRNA識別方法。
【００１３】
（４）第１および第２のオリゴヌクレオチドにより形成される二本鎖DNA複合体が有する制限酵素認識配列が、第１および第２の制限酵素に認識され、かつ第１の制限酵素がメチル化感受性であり、第２の制限酵素がメチル化非感受性である、（１）に記載の発現mRNA識別方法。
【００１４】
（５）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せが、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、またはAva IIとSin Iの組合せである（４）に記載の発現mRNA識別方法。
【００１５】
（６）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがMbo IとSau3A Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GATC配列またはメチル化されたGmATC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、（５）に記載の発現mRNA識別方法。
【００１６】
（７）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがHpa IIとMsp Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、CCGG配列またはメチル化されたCmCGG配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、（５）に記載の発現mRNA識別方法。
【００１７】
（８）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがAva IIとSin Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GG(A/T)CC配列またはメチル化されたGG(A/T)mCC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、（５）に記載の発現mRNA識別方法。
【００１８】
（９）二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列を２種以上有し、各配列に対するメチル化感受性制限酵素およびメチル化非感受性制限酵素をそれぞれ第１および第２の制限酵素として用いて(iii)〜(viii)の工程を繰り返す、（１）に記載の発現mRNA識別方法。
【００１９】
（１０）非メチル化配列またはメチル化配列を有する第１のオリゴヌクレオチドの5'末端をそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、制限酵素処理前にそれぞれの蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程をさらに有する、（１）に記載の発現mRNA識別方法。
【００２０】
（１１）単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別するためのキットであって、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、該制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体と、該制限酵素認識配列を認識するメチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の少なくとも１種の組合せとを含む前記キット。
【００２１】
（１２）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せが、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、およびAva IIとSin Iの組合せからなる群から選択される、（１１）に記載のキット。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、異なる試料に由来する標的mRNAに対して差異なくハイブリダイズするオリゴdTプライマー配列とタグ配列を有した二本鎖DNA複合体として、塩基配列が同じであるが異なるメチル化修飾を受けた制限酵素認識配列をタグ配列として含む二本鎖DNA複合体を用い、メチル化感受性およびメチル化非感受性制限酵素処理を行うことにより、単分子計測によるmRNA発現解析の際に、検出発現頻度に影響を与えることなく、発現mRNAの由来を識別することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別する方法に関する。
【００２４】
第１の工程は、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体を、オリゴdT配列により標的mRNAに試料ごとにハイブリダイズさせる工程である。
【００２５】
二本鎖DNA複合体は、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドから形成され、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、通常、少なくとも制限酵素認識配列部位において相補的であり、互いにハイブリダイズする。二本鎖DNA複合体は、発現解析する試料毎に異なるものを用いる。従って、解析する試料の数だけ異なる二本鎖DNA複合体を用いる。そして、複数の異なる二本鎖DNA複合体は、互いに塩基配列は同じであり、制限酵素認識配列におけるメチル化修飾様式においてのみ異なる。例えば、２種の試料由来のmRNAに対しそれぞれ１個の制限酵素認識配列を含む２種の二本鎖DNA複合体を用いる場合、これら二本鎖DNA複合体における制限酵素認識配列は、塩基配列は同じであるが、一方はメチル化修飾を有し他方はメチル化修飾を有しないものとなる。二本鎖DNA複合体が２種以上の制限酵素認識配列を含む場合でもその塩基配列は互いに同じものとなるが、少なくとも１種の制限酵素認識配列においてメチル化修飾の有無が互いに異なれば、二本鎖DNA複合体のメチル化修飾様式は互いに異なるものとされる。第１工程では、解析する試料の数だけの異なる二本鎖DNA複合体を、オリゴdT配列を介して、試料ごとに標的mRNAにハイブリダイズさせる。
【００２６】
第１および第２のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さに特に限定はないが、オリゴdT配列は２０〜３０塩基が好ましく、また、二本鎖DNA部分の長さは導入する制限酵素認識配列の数にもよるが、ハイブリダイズの特異性を考慮し２０〜５０塩基が好ましい。
【００２７】
以後、例示として、２種の試料由来のmRNA解析の場合について説明する。
本発明の発現mRNA識別方法において用いる、制限酵素認識配列を有する二本鎖DNA複合体を形成する第１および第２のオリゴヌクレオチドの模式図を図１に示す。
【００２８】
二本鎖DNA複合体は、第１のオリゴヌクレオチド１と第２のオリゴヌクレオチド３、または第１のオリゴヌクレオチド２と第２のオリゴヌクレオチド４から形成されている。第１のオリゴヌクレオチド１、２は、その3'末端側にmRNAのpolyAとハイブリダイズするオリゴdT配列５、６を有している。また、第１のオリゴヌクレオチド１、２は、その5'末端側に第２のオリゴヌクレオチド３、４と図１に示すように二本鎖DNA複合体を形成する相補的配列を保持しており、その二本鎖DNA部分には制限酵素認識配列７、８が包含されている。この制限酵素認識配列７、８は、DNAメチル化修飾の有無において異なっており、図１では、制限酵素認識配列７はメチル化修飾を受けておらず、制限酵素認識配列８がメチル化修飾を受けている場合を模式的に示している。
【００２９】
次に、第１のオリゴヌクレオチド１と第２のオリゴヌクレオチド３からなる二本鎖DNA複合体と、第１のオリゴヌクレオチド２と第２のオリゴヌクレオチド４からなる二本鎖DNA複合体のオリゴdT配列５または６に対して、それぞれ異なる試料由来のmRNA101または102をハイブリダイズさせ、図２に示すような二本鎖DNA複合体と標的mRNAとの複合体を形成させる。
【００３０】
第２の工程は、ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程である。即ち、第１の工程で得られたmRNAと二本鎖DNA複合体からなる複合体を固相担体に固定化させる工程である。固相化以降の工程を図３および図４を用いて説明する。
【００３１】
mRNAと二本鎖DNA複合体からなる複合体の固相担体201への固定は、例えば、図３(a)に示すように第２のオリゴヌクレオチド３、４の3'末端を用いる。3'末端と固相担体201の結合は、用いる固相担体の材質によって適切な方法を選択すればよい。一例として、第２のオリゴヌクレオチド３、４の3'末端にS-H修飾を行い、金被膜を有する固相担体表面にチオール結合により固定化する方法がある。
【００３２】
第３の工程は、固定化されたmRNAと二本鎖DNA複合体における二本鎖DNA複合体部位に含まれる制限酵素認識配列のうち第１の制限酵素によって切断可能な配列を第１の制限酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程である。
【００３３】
図３(a)では、第１の制限酵素として、メチル化感受性制限酵素であるMbo Iを用いる場合を示している。図３(a)の上側に位置するmRNA・二本鎖DNA複合体は、制限酵素認識配列であるGATC配列７がメチル化修飾を受けておらず、下側の複合体は制限酵素認識配列であるGATC配列８がメチル化修飾を受けている場合を示している。両者をメチル化感受性である制限酵素Mbo Iで処理することにより、図３(b)に示すようにメチル化修飾を受けていないMbo I認識配列７のみが切断される。二本鎖DNA複合体が制限酵素認識配列を２種以上有する場合は、用いたメチル化感受性制限酵素により認識されるメチル化修飾を受けていない制限酵素認識配列のみが切断される。
【００３４】
第４の工程は、第３の工程により形成された5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程である。取り込ませるデオキシリボヌクレオチド基質は、すべて蛍光標識されていなくてもよく、いずれか１つが蛍光標識されていればよい。図３(c)では、(b)での制限酵素処理後に基板上の酵素および切断断片を洗浄したのち、DNAポリメラーゼと蛍光標識された基質としてdCTPと標識されていない基質dGTP、dATP、dTTPを新たに基板上に導入し塩基伸長反応を行う場合を示している。蛍光標識されている基質としては、dCTP以外にdGTP、dATP、dTTPのうちのどれか１種が蛍光標識されたものを用いてもよい。
【００３５】
第５の工程は、第４の工程で取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程である。図３(c)において、左側の図示しない蛍光検出装置により、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出する。このとき、左側の図示しない蛍光検出装置により、蛍光検出位置301を同定する。
【００３６】
第６の工程は、第１の制限酵素により切断されなかったメチル化修飾様式が異なる制限酵素認識配列のうち第２の制限酵素によって切断可能な配列を第２の酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程である。図４(e)では、第１の制限酵素Mbo Iにより切断されなかったメチル化修飾を受けているGATC配列８を第２の制限酵素Sau3A Iにより処理することで、GATC配列８を含む二本鎖DNA複合体部位に5'突出末端を形成させる。
【００３７】
第７の工程は、第６の工程により形成された5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程である。図４(f)では、(e)での制限酵素処理後に基板上の酵素および切断断片を洗浄したのち、DNAポリメラーゼと蛍光標識された基質としてdGTPを新たに基板上に導入し塩基伸長反応を行う場合を示している。第４の工程と同様、取り込ませるデオキシリボヌクレオチド基質は、すべて蛍光標識されていなくてもよく、いずれか１つが蛍光標識されていればよい。なお、蛍光標識された基質dGTPの蛍光色素は第４の工程で用いた蛍光標識基質とは別の蛍光色素で標識されているほうが望ましい。また、dGTP以外にdATP、dTTPのうちのどれか１種が蛍光標識されたものを用いてもよい。
【００３８】
第８の工程は、第７の工程で取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程である。図４(f)において、左側の図示しない蛍光検出装置により、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出する。このとき、左側の図示しない蛍光検出装置により、蛍光検出位置401を同定する。
【００３９】
本発明の方法では、第５の工程で同定された位置と第８の工程で同定された位置が、それぞれ異なる試料に由来するmRNAが固定されていた位置であると認定できる。
【００４０】
図５に第５の工程より得られる蛍光検出結果501、第８の工程で得られる蛍光検出結果502、さらに、図３(a)において逆転写酵素を用いて蛍光標識基質を取り込ませることにより行った塩基配列解析の際に、輝点が得られた解析結果503を示した。ここで、得られた蛍光検出結果501で検出されている輝点位置301と302を、塩基配列解析結果503の輝点位置と比較することで、輝点位置301と302がそれぞれ塩基配列解析結果の輝点22、23に対応することがわかる。また、得られた蛍光検出結果502で検出されている輝点位置401と402を、塩基配列解析結果503の輝点位置と比較することで、輝点位置401と402がそれぞれ塩基配列解析結果の輝点21、24に対応することがわかる。これより、塩基配列解析結果の22、23が同じ試料由来のmRNAであることが、また、塩基配列解析結果の21、24が同じ試料由来のmRNAであることが判定できる。
【００４１】
本発明の方法は、好ましくは、非メチル化配列またはメチル化配列を有する第１のオリゴヌクレオチドの5'末端をそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、制限酵素処理前にそれぞれの蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程をさらに有する。例えば、図３(a)において、5'末端の蛍光を検出することにより、固相担体においてmRNAがハイブリダイズした二本鎖DNA複合体が固定化された位置すべてを検出することができる。
【００４２】
本発明の方法において、第１の制限酵素として用いるメチル化感受性制限酵素と第２の制限酵素として用いるメチル化非感受性制限酵素の組合せとしては、例えば、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、またはAva IIとSin Iの組合せがあげられる。
【００４３】
別の実施形態において本発明の発現mRNA識別方法は、第３および第６の工程において、メチル化感受性制限酵素としてHpa IIを、メチル化非感受性制限酵素としてMsp Iを使用し、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、CCGG 配列またはメチル化されたCmCGG配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有するものである。
【００４４】
別の実施形態において本発明の発現mRNA識別方法は、第３および第６の工程において、メチル化感受性制限酵素としてAva IIを、メチル化非感受性制限酵素としてSin Iを使用し、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GG(A/T)CC 配列またはメチル化されたGG(A/T)mCC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有するものである。
【００４５】
別の実施形態において本発明の発現mRNA識別方法は、第３および第６の工程において、メチル化感受性制限酵素としてAva IIを、メチル化非感受性制限酵素としてSin Iを使用し、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GG(A/T)CC 配列またはメチル化されたGG(A/T)mCC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有するものである。
【００４６】
別の実施形態において本発明の発現mRNA識別方法は、二本鎖DNA複合体として、制限酵素認識配列を２種以上有するものを用い、各配列を認識するメチル化感受性制限酵素およびメチル化非感受性制限酵素をそれぞれ第１および第２の制限酵素として用いて第３〜第８の工程を繰り返すものである。制限酵素認識配列をそれぞれ２種有する二本鎖DNA複合体を３種を用いる場合について図６に示す。図６には、第３〜第８の工程を繰り返して実施する際に、第３および第８の工程において使用するメチル化感受性および非感受性制限酵素処理をそれぞれ異なる制限酵素を用いて行うことで３種以上の試料の識別を可能にする方法を示している。図６の31、33はメチル化感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列であり、32、34はメチル化非感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列である。31と32は、メチル化修飾の有無においては異なるが同じ塩基配列を有し、33と34もまた、メチル化修飾の有無においては異なるが同じ塩基配列を有する。まず、1個目のメチル化感受性制限酵素により処理することで、制限酵素認識配列31が切断されるが、32は切断されない。これにより、まずmRNA 111の由来する試料を同定できる。次に、1個目のメチル化非感受性制限酵素により処理することで、制限酵素認識配列32が切断される。これにより、mRNA 112および113の由来する試料を同定できる。引き続き、２個目のメチル化感受性制限酵素により処理することで、制限酵素認識配列33は切断されるが、34は切断されない。これより、1個目のメチル化非感受性制限酵素処理の結果同定されたmRNA 112および113が異なる試料由来であることが判定できる。二本鎖DNA複合体に含まれる制限酵素認識配列の数をさらに増やすことにより、より多くの試料に由来するmRNAを識別することができる。
【００４７】
別の実施形態において本発明は、単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別するためのキットに関する。該キットは、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、該制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体と、該制限酵素認識配列を認識するメチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の少なくとも１種の組合せとを含む。メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せ、それらが認識する制限酵素認識配列については上述のとおりである。
【００４８】
本発明のキットは、前記のほか、DNAポリメラーゼなどのその他の酵素、dNTP、NTP、緩衝液、減菌水、標品（標準菌株、標準DNAなど）等を含んだものとして構成される。
【００４９】
上述してきたように、本発明によれば、単分子計測によるmRNA発現解析において、発現解析を行う標的mRNAが２種以上の試料由来である場合に、標的mRNAのハイブリダイズ効率に影響を与えることなく、その試料毎に異なるタグ識別が可能な発現mRNA識別方法を提供することが出来る。これにより、高精度にかつ高スループットな単分子計測によるmRNA発現解析を達成できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明において用いる制限酵素認識配列を有する二本鎖DNA複合体を形成する第１および第２のオリゴヌクレオチドの模式図を示す。
【図２】異なる試料由来のmRNAをハイブリダイズさせた二本鎖DNA複合体と標的mRNAとの複合体の模式図を示す。
【図３】mRNAと二本鎖DNA複合体からなる複合体の固相担体への固定化以降の工程の説明図である。
【図４】mRNAと二本鎖DNA複合体からなる複合体の固相担体への固定化以降の工程の説明図である。
【図５】第５および第８の工程より得られる蛍光検出結果と逆転写酵素を用いて蛍光標識基質を取り込ませることにより行ったmRNA塩基配列解析結果を比較することにより、発現mRNAを同定・識別する方法の説明図である。
【図６】２種以上の制限酵素認識配列を保持する二本鎖DNA複合体を示す模式図である。
【符号の説明】
【００５１】
１，２…第１のオリゴヌクレオチド、３，４…第２のオリゴヌクレオチド、５，６…オリゴdT配列領域、７…メチル化修飾を受けていない制限酵素認識配列、８…メチル化修飾を受けている制限酵素認識配列、９…メチル化修飾を受けていないGATC配列、１０…メチル化修飾を受けているGATC配列、２１，２２，２３，２４…塩基配列解析の際に検出された輝点位置、３１…１個目のメチル化感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列、３２…１個目のメチル化非感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列、３３…２個目のメチル化感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列、３４…２個目のメチル化非感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列、１０１，１０２，１１１，１１２，１１３…異なる試料由来の標的mRNA、２０１…固相担体、３０１，３０２…第５の工程より得られる蛍光検出輝点位置、４０１，４０２…第８の工程で得られる蛍光検出輝点位置、５０１…第５の工程より得られる蛍光検出結果、５０２…第８の工程で得られる蛍光検出結果、５０３…単分子計測による塩基配列解析結果
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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