(57)【要約】【課題】変異部位に対する高い特異性を維持すると同時に、形成される複合体の融解温度は、予め設定される温度となるように、多数種のオリゴ核酸プローブの塩基配列を選択する体系的なアルゴリズムを提供する。【解決手段】検出対象核酸分子の変異部位と、その近接塩基の部分塩基配列に基づき、プローブ側の対応部位の部分塩基配列の最適化を行った後、その対応部位の上流側、下流側に設ける相補的な領域の塩基数の組み合わせを調整する。この二段階のプローブ全体の塩基配列設計法を適用すると、検出対象核酸分子に対する選択性と、形成される複合体の融解温度とをそれぞれ適正に制御でき、目的とする検出条件に最適なプローブセットの設計が可能となる。【選択図】図７
2010004782.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多型部位を持つ遺伝子配列からなる核酸を検出するためのプローブセットにおいて、
前記多型部位の変異に対応した複数のプローブを含み、前記複数のプローブの各々の配列は、完全相補な配列を有する核酸とのハイブリッド体を形成した場合の融解温度Ｔｍαが等しく、且つ、前記複数のプローブの各々において、他のプローブに完全相補な配列を有する核酸とハイブリッド体を形成した場合の融解温度をＴｍβとしたときに、各融解温度Ｔｍβと前記融解温度Ｔｍαが最大の差をとるようにこれらのプローブの配列が選択されていることを特徴とするプローブセット。
【請求項２】
前記遺伝子配列の前記多型部位をＶ、その５’側の隣接部位をＯLＬ、３’側の隣接部位をＲＯRとし、Ｖの変異数をｉとした際に得られる遺伝子配列：ＯLＬＶ1ＲＯR〜ＯLＬＶiＲＯR（ｉ＞２）の各々を検出対象領域とする各プローブをＯLＬＶ1ＲＯR〜ＯLＬＶjＲＯR（ｊ＞２）としたときに、ＬとＲ（塩基長においてＬ＝Ｒ）のセットの塩基長を選択することにより、前記融解温度をＴｍβと前記融解温度Ｔｍαとの最大の差を得ている請求項１に記載のプローブセット。
【請求項３】
遺伝子中の変異部位の部分塩基配列に相違を有する複数種の核酸分子を、該部分塩基配列の相違に基づき、これらの複数種の核酸分子の各々を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチドからなるプローブのセットを設計する方法であって、
検出対象の核酸分子の一本鎖での検出対象領域を
ＯLＬＶＲＯR
（前記式中
変異部位に相当する、少なくとも1個の塩基を含む領域を変異領域Ｖ、
該変異領域Ｖに隣接し、その５’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＬ、
該変異領域Ｖに隣接し、その３’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＲ、
領域Ｌのさらに５’末端側に隣接している領域をＯL、
領域Ｒのさらに３’末端側に隣接している領域をＯRと定義する)
と定義し、前記検出対象領域を認識するプローブを
ＯLＬＶＲＯR
（前記式中
変異部位に相当する、少なくとも1個の塩基を含む領域を変異領域Ｖ、
該変異領域Ｖに隣接し、その３’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＬ、
該変異領域Ｖに隣接し、その５’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＲ、
領域Ｌのさらに３’末端側に隣接している領域をＯL、
領域Ｒのさらに５’末端側に隣接している領域をＯRと定義する)
と定義し、
工程１：
前記ＯLＬＶＲＯR中のＬＶＲに対応させて、プローブ側のＬＶＲを決定する工程と、
工程２：
前記工程１で決定されたＬＶＲに基づいて、前記ＯLＬＶＲＯR中のＯL及びＯRに対応させて、プローブ側の部分塩基配列：ＯL、ＯRの塩基長を決定し、配列はＯL及びＯRの対応する部分に相補とする工程と、
を有し、
前記工程１において、
変異領域Ｖの取り得る複数の変異：Ｖiの種類をＮvarとし、
プローブ側の変異領域Ｖに取り得る全ての塩基配列：Ｖjの種類をＮVPとし、
各変異：ＬＶiＲ（ｉ＝１〜可能性のある変異の数：Ｎvar：ＬＶ1Ｒ〜ＬＶNvarＲの各々）に対して、変異領域Ｖjに取りえる全ての塩基配列（J＝１〜NVP：ＬＶ1Ｒ〜ＬＶNVPＲ）の各々をハイブリダイゼーションさせた際の、各ハイブリッド体の融解温度の計算の基礎となる熱力学的パラメータを、ｆ個の近接塩基配列に依存する近似法を適用して、部分塩基配列：ＬＶiＲと、ＬＶ1Ｒ〜ＬＶNVPＲの各々の塩基配列情報に基づき算出し、各変異Ｖiと、他の変異：Ｖi'（ｉ’≠ｉ）との間で、各ハイブリッド体について算出された熱力学的パラメータを比較することによって、各Ｖiに対し、他のＶi'（ｉ’≠ｉ）とのＴｍの差が最も大きくなるＶjをそれぞれ選択し、
前記工程２においては、
前記工程１で選択されたＶjのセットから得られるＬＶjＲのセットの各々について、ＯLＬＶjＲＯRと、ＯLＬＶ1ＲＯR〜ＯLＬＶNvarＲＯRの各々とがハイブリダイゼーションしたと仮定した際の、各ハイブリッド体の融解温度の算出の基礎となる熱力学的パラメータが、ハイブリダイゼーションを行う温度：ＴHにおいて、対応する変異Ｖiとの各融解温度Ｔｍαが等しく、かつ、該融解温度Ｔｍαと、他の変異Ｖi'（ｉ’≠ｉ）との融解温度Ｔｍβとに最大の差を与えるように、検出側のＯL及びＯRに基づいてプローブ側のＯL及びＯRを決定する
ことを特徴とするプローブ設計方法。
【請求項４】
前記熱力学的パラメータが、各ハイブリッド体において算出されるΔSij、ΔHij及びΔGij（ここでSはエントロピー、Hはエンタルピー、Gはギブスのフリーエネルギー）の少なくとも１つである請求項３に記載のプローブ設計方法。
【請求項５】
前記ｆが１であり、前記近似法としてＮｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ近似法を適用している請求項３または４に記載のプローブ設計方法。
【請求項６】
前記ｆが２であり、前記近似法としてＮｅｘｔ−Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ近似法を適用している請求項３または４に記載のプローブ設計方法。
【請求項７】
遺伝子中の変異部位が、該遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）に起因している請求項３〜６のいずれかに記載のプローブ設計方法。
【請求項８】
遺伝子中の変異部位が、該遺伝子の塩基配列に対する、一塩基の欠失もしくは挿入に起因している請求項３〜７のいずれかに記載のプローブ設計方法。
【請求項９】
部分塩基配列：ＬＶiＲとＬＶjＲにおいて、領域Ｌと領域Ｌ、ならびに、領域Ｒと領域Ｒは、共に、互いに相補的な塩基配列を有する請求項３〜８のいずれかに記載のプローブ設計方法。
【請求項１０】
遺伝子中の変異部位の部分塩基配列に相違を有する複数種の核酸分子を、該部分塩基配列の相違に基づき、これらの複数種の核酸分子の各々を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチドからなるプローブのセットを設計するためのソウトウエアを電子的に収納してなる記録媒体であって、
前記ソウトウエアは、請求項３〜９のいずれかに記載のプローブ設計方法に含まれる一連の数値演算処理、ならびに、該数値演算処理結果を用いる論理演算処理をコンピュータシステム上で実行するための、プログラムを該コンピュータシステムで実行可能なプログラム言語により表記したものであることを特徴とするソウトウエア収納記録媒体。
【請求項１１】
遺伝子中の変異部位の部分塩基配列に相違を有する複数種の核酸分子を、該部分塩基配列の相違に基づき、これらの複数種の核酸分子の各々を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチドからなるプローブのセットを設計するためのコンピュータシステムであって、
請求項１０に記載のソウトウエア収納記録媒体を有してなることを特徴とするコンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ・ハイブリダイゼーション法を適用し、特定の塩基配列を有する核酸分子を選択的に識別する際に利用可能なプローブを設計する方法に関する。特には、形成されるハイブリダイゼーション複合体の熱的な安定性を、該複合体の解離平衡を熱力学的なモデルに基づき考慮した上で、特定の塩基配列を有する核酸分子の塩基配列に選択的なプローブを設計する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プローブ・ハイブリダイゼーション法は、例えば、コロニー・ハイブリダイゼーションによる、特定の遺伝子の発現の有無を評価する手段として、従来から広く利用されている。この遺伝子の発現解析に適用する際には、生物中においては、複数種の遺伝子が発現されており、検出対象の遺伝子と、同時に発現されている他の遺伝子との塩基配列を対比し、検出対象の遺伝子に対する選択性の高いプローブが利用されている。具体的には、検出対象の遺伝子の塩基配列の一部分と同一であり、他の遺伝子の塩基配列に対しては、相同性が低い「部分配列」を選択し、この選択された「部分配列」と相補的な塩基配列を有する、オリゴヌクレオチド型プローブが利用されてきた。
【０００３】
遺伝子の発現解析に適用される、高い選択性を有するプローブを設計する際には、予め、検出対象の遺伝子の塩基配列中の「部分配列」に関して、その生物の有するゲノム全体の塩基配列に対して、Ｂｌａｓｔなどの相同性検索を行う。その相同性検索において、他に高い相同性を示す部位が存在していないことを確認した上で、検出対象の遺伝子の塩基配列に特徴的な「部分配列」と相補的な塩基配列を有する、オリゴヌクレオチドを、プローブとして利用する。しかし、検出対象の遺伝子の塩基配列が数千塩基で構成されている場合、その「部分配列」の全てに関して、例えば、総塩基数が３０億塩基に達するヒトゲノム全体の塩基配列に対して、相同性検索を行うと、その作業量は、相当の負担となる。加えて、検出したい遺伝子数が増加すると、その遺伝子それぞれについて、この相同性検索を行う必要があり、負担は一層大きなものとなる。この負担を軽減するため、相同性検索を行う「部分配列」の候補を、予め選択する手法が考案されている。例えば、数塩基の「短い配列断片」について、ゲノム全体の塩基配列中、その「短い配列断片」が見出される頻度分布を予め調査し、各「短い配列断片」の「出現頻度確率」を求めておく。「部分配列」の候補を予め選択する際、「出現頻度確率」の低い「短い配列断片」を多く内在する「部分配列」を候補として選択する手法に相当する、タプル法(株式会社ノバスジーン)などの方法が知られている。
【０００４】
上記のプローブ・ハイブリダイゼーション法は、互いに相補的な塩基配列を有する核酸相互のハイブリダイゼーション複合体は安定性が高いが、ミスマッチを示す塩基数が増すと、核酸鎖相互の相互作用が極めて弱くなる現象を利用している。また、遺伝子の発現の有無を検出する場合には、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（あるいは、そのｃＤＮＡ）を検出する。その際、プローブの結合部位は、ｍＲＮＡ中に含まれる部分配列であれば、どこを選択しても構わないために、他の遺伝子の塩基配列に対しては、より相同性の低い部分配列を選択することが可能であった。
【０００５】
前記の遺伝子発現を検出するためのプローブと異なり、対象遺伝子における多型検出を目的とする場合には、利用されるプローブの塩基配列は、検出すべき多型（変異）を含む「部分配列」に選択される。加えて、検出すべき多型（変異）が一塩基のみである「一塩基多型：ＳＮＰ」など、僅かな塩基配列の相違を検出する必要があるために、ハイブリダイゼーション複合体の熱力学的安定性をより深く考察する必要がある。先ず、他の遺伝子中に存在する、相同性を有する部位に対して形成される、ハイブリダイゼーション複合体の熱力学的安定性を考慮することが必要となる。同時に、対象遺伝子内の検出部位に形成される、ハイブリダイゼーション複合体において、検出すべき多型（変異）の有無に依って、該複合体の熱力学的安定性に十分な差異を生じるか、否かを考察する必要がある。
【０００６】
ハイブリダイゼーションにおける複合体形成は、二本の核酸鎖の鎖間で塩基対：Ａ−Ｔ（またはＡ−Ｕ），Ｇ−Ｃが形成され、その水素結合を介して、核酸２重鎖を構成し、安定化する現象である。従って、ハイブリダイゼーション複合体の熱力学的安定性は、二本の核酸鎖の鎖間で形成される塩基対の多寡に依存する。その塩基配列に対する特異性の高さから、目的とする「部分塩基配列」を含む核酸分子の検出に広く利用されている。古くは、サザンブロット法等のプローブ・ハイブリダイゼーション法で利用された。また、ハイブリダイゼーション複合体の熱力学的安定性は、ＰＣＲのプライマー選択の際にも、その塩基配列を決定する上で、重要なファクターとなっている。現在では、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法や、複数種のＤＮＡプローブを具えるマイクロアレイを用いた核酸分子の検出手法など、核酸の塩基配列特異的なハイブリダイゼーションを利用した、多くの手法が開発されている。
【０００７】
ハイブリダイゼーション複合体の熱力学的安定性に関しては、ｃＤＮＡなどを用いた長鎖の核酸同士の複合体の場合には、ＧＣ含有率などの単純な指標に基づき、その安定性をある程度の確度で推定することができる。しかし、塩基長の短い、所謂、オリゴ核酸との複合体の場合には、その熱力学的性質、安定性は、塩基配列自体に大きく依存するため、ＧＣ含有率などの単純な指標のみに基づき、その安定性をある程度の確度で推定することは困難である。
【０００８】
ハイブリダイゼーション複合体の熱力学的安定性を示す指標値として、温度を上昇させ、該複合体の熱的解離を進め、２種類の核酸鎖が二重鎖を形成している割合が５０％まで低下する温度が利用されている。この温度は、核酸二重鎖（ハイブリダイゼーション複合体）の融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ）と称される。例えば、ＰＣＲ法において、鋳型の一本鎖核酸分子とプライマーの複合体の融解温度Ｔｍは、鋳型の一本鎖核酸分子にプライマーを結合させるアニーリング時の温度を選択する際、その選択基準に利用される。一般に、ハイブリダイゼーションを利用する、種々の生化学的な技術において、ハイブリダイゼーション複合体形成の温度を設定する上で、融解温度Ｔｍは、重要な指標値となる。そのために、複合体形成部位の塩基配列に依存する、その融解温度Ｔｍの値を、より正確に予測しようとする試みが行われてきた。その試みの中で、鎖間で塩基対を形成する、オリゴ核酸の構成塩基の数（及び含有割合、例えば、ＧＣ含有率）のみではなく、各鎖内における隣接塩基間の相互作用までを考慮に入れた、融解温度Ｔｍの予測手法が開発された。所謂、Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ（ＮＮ）モデルに基づく考察が、１９７０年代からＢｏｒｅｒやＴｉｎｏｃｏなどによって進められた（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）。特に、融解温度Ｔｍの予測に際に利用される、熱力学的パラメータの求め方や自由度に関する制限などを、ＤＮＡやＲＮＡ、二重鎖や一重鎖の場合に詳細に説明しているレビュー文献として、Ｇｒａｙの文献（非特許文献３を参照）ある。
【０００９】
（ＮＮモデル）
ＮＮモデルに基づく、融解温度Ｔｍの計算法について、その概略を以下に述べる（図３）。複合体形成に伴う、熱力学パラメータの変化量に関して、ＮＮモデルでは、近接塩基の熱力学パラメータを足し合わせることで、オリゴ核酸全体の値を計算する。図３では、複合体形成に伴う、ギブスの自由エネルギーの変化量：ΔＧを用いて、融解温度Ｔｍを計算している（ｇ）。すなわち、複合体形成の反応：Ａ＋Ｂ→｛Ａ：Ｂ｝における、ギブスの自由エネルギーの変化量：ΔＧは、下記のように表記できる。
【００１０】
ΔＧ＝ΔＧ0＋ＲＴｌｎ｛［Ａ：Ｂ］／（［Ａ］・［Ｂ］）｝
ΔＧ0＝ΔＨ0−ＴΔＳ0
ΔＧ＝｛ΔＨ0−ＴΔＳ0｝＋ＲＴｌｎ｛［Ａ：Ｂ］／（［Ａ］・［Ｂ］）｝
ΔＨ0＝Ｔ・〔ΔＳ0＋Ｒ・ｌｎ｛（［Ａ］・［Ｂ］）／［Ａ：Ｂ］｝〕
但しここでは平衡状態を考えてΔG＝０とした。
【００１１】
その際、複合体の形成比率が、５０％となる条件；［Ａ］＝［Ｂ］＝［Ａ：Ｂ］を達成する温度Ｔが、融解温度Ｔｍに相当する。当初の全体の核酸濃度：Ｃ≡［Ａ］0＋［Ｂ］0；但し、［Ａ］0＝［Ｂ］0とすると、温度Ｔｍにおいて、上記の式は、下記のように表記できる。
【００１２】
［Ａ］＝［Ｂ］＝［Ａ：Ｂ］＝Ｃ／４
ΔＨ0＝Ｔｍ・〔ΔＳ0＋Ｒ・ｌｎ｛（Ｃ／４）・（Ｃ／４））／（Ｃ／４）］｝〕
ΔＨ0＝Ｔｍ・〔ΔＳ0＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
Ｔｍ＝ΔＨ0／〔ΔＳ0＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
従って、図３の（ｇ）に示すように、融解温度Ｔｍを表記することが可能である。
【００１３】
複合体形成に伴うギブスの自由エネルギーの変化量：ΔＧは、二本の核酸鎖間において、塩基対の形成に起因するギブスの自由エネルギーの変化量に相当している。その際、例えば、連続した３つのＧ−Ｃ塩基対が形成される際、その部位として、５’−ＧＧＧ−３’、５’−ＣＧＣ−３’、５’−ＣＧＧ−３’、５’−ＧＧＣ−３’の４種の部分塩基配列が考えられる。その塩基配列の差異に依存して、ギブスの自由エネルギーの変化量に差違が存在する。ＮＮモデルでは、例えば、中央の塩基Ｇに着目すると、その鎖上の近接塩基の種類によって、かかる塩基ＧがＧ−Ｃ塩基対を形成することに起因する、ギブスの自由エネルギーの変化量が相違すると、近似的に取り扱う。
【００１４】
この近似では、５’末端の塩基と、３’末端の塩基とは、鎖内において、隣接する塩基の一方が欠落した状態であり、その影響を考慮する。従って、ギブスの自由エネルギーの変化量として、最端塩基対の値：ΔＧ（５’init）、ΔＧ（３’init）を用いて、近似する。加えて、一本鎖の核酸分子では、５’末端から３’末端へと方向性を有するが、複合体全体では、このような方向性は失われる。この現象に起因する、ギブスの自由エネルギーの変化量を、対称性に基づく値：ΔＧ（ｓｙｍｍｅｔｒｙ）として、考慮に加える。
【００１５】
従って、（ｅ）に示すように、塩基対が形成されている複合体においては、その塩基配列に基づき、各塩基対ｋに関して、最近接の塩基の種類が考慮された最近接塩基ペアの値：ΔＧ（ｋ）を割り当てる。複合体形成に伴うΔＧは、オリゴ核酸の塩基配列に基づく、最近接塩基ペアの値：ΔＧ（ｋ）の和に、最端塩基対の値：ΔＧ（５’init）＋ΔＧ（３’init）、対称性に基づく値：ΔＧ（ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を加えたもので表記される（ｆ）。
【００１６】
ＮＮモデルを適用して、融解温度Ｔｍを推定する際には、最近接塩基ペアにおける熱力学パラメータ；ΔＧ0（ｉ）、ΔＨ0（ｉ）、ΔＳ0（ｉ）などの近似値が必要である。最近接塩基ペアにおける、これらの熱力学パラメータの近似値は、例えば、ＳａｎｔａＬｕｃｉａやＳｕｇｉｍｏｔｏらによって実験的に求められ、さらに、改善が重ねられた値が発表されている（例えば、非特許文献４を参照）。
【００１７】
その後、完全マッチの複合体に加えて、一塩基ミスマッチを含んだ塩基配列を有する核酸鎖間で形成される複合体に関しても、同様にＮＮモデルに基づき、融解温度Ｔｍを予測する研究がなされている。一塩基ミスマッチを含んだ場合の熱力学的な安定性を推定する上で必要な熱力学パラメータの値に関して、８種類のミスマッチ（ＡＡ，ＡＣ，ＡＧ，ＣＣ，ＣＴ，ＧＧ，ＧＴ）の全てに関して、近似値が発表されている（例えば、非特許文献５を参照）。
【００１８】
ＮＮモデルに基づく、種々の熱力学パラメータを利用して、プローブやプライマー用の、特定の塩基配列を有するオリゴ核酸に関して、その融解温度Ｔｍを予測計算するソフトウェアが、開発されている。例えば、ソフトウェアＭｅｌｔＣａｌｃは、ＮＮモデルの熱力学パラメータを利用し、オリゴ核酸プローブ、プライマーの融解温度Ｔｍを計算する機能を持つ。加えて、特に、鋳型の核酸分子の塩基配列に基づき、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ製品として知られているＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ用のプローブ候補（配列候補）を求める等の機能も具えている。この鋳型の核酸分子の塩基配列に基づき、プローブ候補（配列候補）を選定する手法に関して、関連特許も発行されている（特許文献１を参照）。
【特許文献１】米国特許第６４７５７３７  Ｂ１号明細書
【非特許文献１】Ｇｒａｙ，Ｄ．Ｍ．，＆Ｔｉｎｏｃｏ，Ｉ．，Ｊｒ．，  （１９７０）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９，  ２２３−２４４
【非特許文献２】Ｂｏｒｅｒ，Ｐ．Ｎ．，  Ｄｅｎｇｌｅｒ，Ｂ．，  Ｔｉｎｏｃｏ，Ｉ．，Ｊｒ．，  ＆  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．，  （１９７４）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ８６，  ８４３−８５３
【非特許文献３】Ｇｒａｙ，Ｄ．Ｍ．（１９９７）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９，  ７８３−７９３，  ７９５−８１０
【非特許文献４】ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊ  Ｊｒ．，  Ａｌｌａｗｉ  ＨＴ，  Ｓｅｎｅｖｉｒａｔｎｅ  ＰＡ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９６）  ３５，  ３５５５−３５６２
【非特許文献５】Ｐｅｙｒｅｔ  Ｎ，  Ｓｅｎｅｖｉｒａｔｎｅ  ＰＡ，  Ａｌｌａｗｉ  ＨＴ，  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊ  Ｊｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （１９９９）  ３８，  ３４６８−７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ヒトゲノムの全塩基配列の解読が完了し、さらに、複数の人のシーケンス情報が蓄積された結果、個人間の遺伝情報（塩基配列）には、相当の頻度で見出される違いが存在することが確認されてきた。この相当の頻度で見出される相違点の幾つかは、その個人が示す疾患感受性や薬剤応答性などと、高い相関を示すことも判明してきた。疾患感受性や薬剤応答性などに大きな影響を与えることが判明した、遺伝子の変異（多型）のうち、特に、全体の集団中において、見出される頻度が相当に高いものは、様々な応答性を予測する際、指標としての利用可能性が高い。
【００２０】
これまで多くの疾患感受性に関して、複数遺伝子が関与すると考えられる「多因子疾患」に関する相関解析などの手法を用いて、ゲノムワイドな探索が行われ、原因遺伝子の特定が進められてきている。「多因子疾患」に関しては、「原因遺伝子」と、環境要因との関連が複雑であり、ゲノム解析から疾患の罹りやすさを予測する上では、更なる研究の進展が必要である。しかしながら、既に、いくつかの遺伝子の多型が、特定の疾患と有意に相関を示す例も、多数確認がされてきている。
【００２１】
さらに、薬剤応答性に関しては、従来から、薬の効きやすさや、副作用の発現に、大きな個人差がみられることが知られている。すなわち、薬剤となる化学物質が対象とする、タンパク質などと該化学物質との相互作用に、個々の個人間で存在する、対象タンパク質のアミノ酸配列の差違に由来する影響の存在が推定される。換言するならば、対象タンパク質の発現に関与する、各種の遺伝子の多型が、薬剤応答性に与える影響も想定されてきている。ゲノム情報の蓄積により、これまで生化学的に集められてきたデータを、遺伝子情報と対比させて、より詳しく考察することが可能となっている。その考察によって、多くの代謝酵素を中心に、各種酵素タンパク質をコードする遺伝子の多型と、薬物反応との関連性の解明が進んできている。
【００２２】
このような状況の中で、遺伝子の多型を正確に、低コストで効率よく検出する技術の開発が進められている。特定の「遺伝子の多型」を検出する際には、検出対象は、予め特定されている核酸分子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）である上に、多くの場合、その遺伝子の変異が極わずかであり（例えば、一塩基多型：ＳＮＰなど）、その変異部位も判明している。そのため、かかる変異部位の塩基配列に対して、相補的プローブを用いて、ハイブリダイゼーション複合体の熱力学的安定性の差に基づき、特定の「遺伝子の多型」に相当する「変異」の有無を検出する方法が広く知られている。
【００２３】
プローブ・ハイブリダイゼーション法以外にも、遺伝子の多型検出法には様々な方法が知られている。例えば、特定の「遺伝子の多型」に相当する「変異」が存在する部分領域について、シーケンサーを利用して、その塩基配列を全て読んでしまう方法がある。さらには、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）の有無を検出する手法としては、液相系でのＰＣＲ反応の進行過程を観察するリアルタイムＰＣＲ法がある。
【００２４】
前記のプラーマーからのＤＮＡ鎖の伸長反応を利用する手法と、上記のプローブ・ハイブリダイゼーション法とで共通する技術的な特徴は、長い鎖長を有する検出対象の核酸分子（鋳型）とオリゴ核酸のハイブリダイゼーション反応である。従って、利用するプローブやプライマーの塩基配列を、それぞれの検出手法に応じて選択されるハイブリダイゼーションの反応温度において、適正な複合体形成が達成されるように最適化を行う必要がある。換言するならば、予め設定されるハイブリダイゼーションの反応温度において、適正な複合体形成が達成されるように、利用するプローブやプライマーの塩基配列を適正に選択する設計技術が必要である。
【００２５】
ＮＮモデルに基づき、ハイブリダイゼーション複合体の熱力学的安定性、特に、融解温度Ｔｍを予測し、その予測結果を参照して、プローブセットの候補を選択する試みは広く行われている。しかし、従来の手法の適用範囲は、一塩基多型を判定するプローブの設計に限定されている。換言すると、変異が生じる塩基数が複数である、より広範な変異を含む遺伝子の多型の検出に対応可能な、プローブ塩基配列の最適化に適用可能な体系的アルゴリズムは存在しなかった。
【００２６】
また、主に一塩基多型（ＳＮＰ）の有無の検出を目的とする、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法では、利用されるプライマーには、対象となる一ヶ所の変異の検出に適する、塩基配列に対する高い特異性が要求される。その際、ハイブリダイゼーション温度は、その高い特異性を発揮するように、利用されるプライマーの塩基配列に基づき、設定される。従って、検出対象の核酸分子の塩基配列と、完全にマッチするプライマーの融解温度と、変異部位の一塩基のみがミスマッチするプライマーの融解温度とが、十分な温度差を有するように、その塩基配列の設計がなされる。設計された二つの融解温度に基づき、両者の中間にハイブリダイゼーション温度を設定することが可能である。
【００２７】
一方、プローブ・ハイブリダイゼーション法は、プローブがハイブリダイゼーションする領域に、複数の変異部位が存在する系にも適用される。その場合、それら複数の変異部位を同時に検出するため、変異部位の総個数をＮtotalとすると、少なくとも、２Ntotal種類のプローブで構成されるプローブセットを用いる。そして、特定のハイブリダイゼーション温度において、多数種のプローブのうち、一種類のプローブとのみ選択的にハイブリダイゼーション反応は進行するように、多数種のプローブの塩基配列を設計する必要がある。従って、これら多数種のプローブが、それぞれ選択的にハイブリダイゼーションすることで形成される複合体多数種について、その融解温度は、ほぼ等しい温度となるように、各プローブの塩基配列を設計する必要がある。このように、予め設定される融解温度を示すと同時に、複数の変異部位に対して、高い特異性を維持する複合体形成がなされるように、多数種のプローブの塩基配列を選択する体系的なアルゴリズムが必要となる。
【００２８】
本発明は、前記の課題を解決するものである。本発明の目的は、変異部位に対する高い特異性を維持すると同時に、形成される複合体の融解温度は、予め設定される温度となるように、多数種のオリゴ核酸プローブの塩基配列を選択する体系的なアルゴリズムを提供することにある。特には、かかる体系的なアルゴリズムを利用して、複数の変異部位が存在する遺伝子の多型の検出にも適用可能な、プローブ・ハイブリダイゼーション法で利用されるプローブセットの作成を目的とする、プローブ設計法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明のプローブセットは、多型部位を持つ遺伝子配列からなる核酸を検出するためのプローブセットにおいて、前記多型部位の変異に対応した複数のプローブを含み、前記複数のプローブの各々の配列は、完全相補な配列を有する核酸とのハイブリッド体を形成した場合の融解温度Ｔｍαが等しく、且つ、前記複数のプローブの各々において、他のプローブに完全相補な配列を有する核酸とハイブリッド体を形成した場合の融解温度をＴｍβとしたときに、各融解温度Ｔｍβと前記融解温度Ｔｍαが最大の差をとるようにこれらのプローブの配列が選択されていることを特徴とするプローブセットである。
【００３０】
本発明のプローブセットの設計方法は、遺伝子中の変異部位の部分塩基配列に相違を有する核酸分子複数種を、該部分塩基配列の相違に基づき、各核酸分子複数種を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチドからなるプローブのセットを設計する方法であって、
検出対象の核酸分子の一本鎖での検出対象領域を
ＯLＬＶＲＯR
（前記式中
変異部位に相当する、少なくとも1個の塩基を含む領域を変異領域Ｖ、
該変異領域Ｖに隣接し、その５’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＬ、
該変異領域Ｖに隣接し、その３’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＲ、
領域Ｌのさらに５’末端側に隣接している領域をＯL、
領域Ｒのさらに３’末端側に隣接している領域をＯRと定義する)
と定義し、前記検出対象領域を認識するプローブを
ＯLＬＶＲＯR
（前記式中
変異部位に相当する、少なくとも1個の塩基を含む領域を変異領域Ｖ、
該変異領域Ｖに隣接し、その３’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＬ、
該変異領域Ｖに隣接し、その５’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＲ、
領域Ｌのさらに３’末端側に隣接している領域をＯL、
領域Ｒのさらに５’末端側に隣接している領域をＯRと定義する)
と定義し、
工程１：
前記ＯLＬＶＲＯR中のＬＶＲに対応させて、プローブ側のＬＶＲを決定する工程と、
工程２：
前記工程１で決定されたＬＶＲに基づいて、前記ＯLＬＶＲＯR中のＯL及びＯRに対応させて、プローブ側の部分塩基配列：ＯL、ＯRの塩基長を決定し,配列はＯL及びＯRの対応する部分に相補とする工程と、
を有し、
前記工程１において、
変異領域Ｖの取り得る複数の変異：Ｖiの種類をＮvarとし、
プローブ側の変異領域Ｖに取り得る全ての塩基配列：Ｖjの種類をＮVPとし、
各変異：ＬＶiＲ（ｉ＝１〜可能性のある変異の数：Ｎvar：すなわちＬＶ1Ｒ〜ＬＶNvarＲの各々）に対して、変異領域Ｖjに取りえる全ての塩基配列（J＝１〜NVP、すなわちＬＶ1Ｒ〜ＬＶNVPＲ）の各々をハイブリダイゼーションさせた際の、各ハイブリッド体の融解温度の計算の基礎となる熱力学的パラメータを、ｆ個の近接塩基配列に依存する近似法を適用して、部分塩基配列：ＬＶiＲと、ＬＶ1Ｒ〜ＬＶNVPＲの各々の塩基配列情報に基づき算出し、各変異Ｖiと、他の変異：Ｖi'（ｉ’≠ｉ）との間で、各ハイブリッド体について算出された熱力学的パラメータを比較することによって、各Ｖiに対し、他のＶi'（ｉ’≠ｉ）とのＴｍの差が最も大きくなるＶjをそれぞれ選択し、
前記工程２においては、
前記工程１で選択されたＶjのセットから得られるＬＶjＲのセットの各々について、ＯLＬＶjＲＯRと、ＯLＬＶ1ＲＯR〜ＯLＬＶNvarＲＯRの各々とがハイブリダイゼーションしたと仮定した際の、各ハイブリッド体の融解温度の算出の基礎となる熱力学的パラメータが、ハイブリダイゼーションを行う温度：ＴHにおいて、対応する変異Ｖiとの各融解温度Ｔｍαが等しく、かつ、該融解温度Ｔｍαと、他の変異Ｖi'（ｉ’≠ｉ）との融解温度Ｔｍβとに最大の差を与えるように、検出側のＯL及びＯRに基づいてプローブ側のＯL及びＯRを決定する
ことを特徴とするプローブ設計方法である。
【００３１】
本発明のソウトウエア収納記録媒体は、遺伝子中の変異部位の部分塩基配列に相違を有する核酸分子複数種を、該部分塩基配列の相違に基づき、各核酸分子複数種を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチドからなるプローブのセットを設計するためのソウト・ウエアを電子的に収納してなる記録媒体であって、
前記ソウト・ウエアは、上記のプローブ設計方法に含まれる一連の数値演算処理、ならびに、該数値演算処理結果を用いる論理演算処理をコンピュータシステム上で実行するための、プログラムを該コンピュータシステムで実行可能なプログラム言語により表記したものであることを特徴とするソウトウエア収納記録媒体である。
【００３２】
本発明のコンピュータシステムは、遺伝子中の変異部位の部分塩基配列に相違を有する核酸分子複数種を、該部分塩基配列の相違に基づき、各核酸分子複数種を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチドからなるプローブのセットを設計するためのコンピュータシステムであって、上記のソウト・ウエア収納記録媒体を有してなることを特徴とするコンピュータシステムである。
【発明の効果】
【００３３】
従来の手法では、例えば、「一塩基多型」の変異に対して、検出用プローブは、それぞれ、検出すべきアレルの塩基配列に対して、完全相補鎖となるものを用いている。そして、変異部位の５’、３’側に設ける周辺領域の長さを変化させて、プローブのTmを調整している。従って、複数のアレルに対して、検出すべきアレルの塩基配列に対して、完全相補鎖となるプローブを選択し、それぞれ、複合体の融解温度：Ｔｍを推定計算した上で、融解温度の差：ΔＴｍを算出している。融解温度：Ｔｍと、融解温度の差：ΔＴｍを参照して、適する検出用プローブの塩基配列を選択している。
【００３４】
従来の手法を適用する場合、「一塩基多型」の変異のように、検出すべきアレルの種類が少ない場合には、融解温度：Ｔｍを推定計算すべき、複合体の総数は膨大な数にはならない。従って、「一塩基多型」の変異のように、検出すべきアレルの種類が少なく、それぞれのアレルに対して、完全相補鎖型のプローブを選択することで、検出の選択性が達成される系には、問題なく適用できる手段である。一方、より複雑な変異を含む対象核酸分子を判定する場合は、従来の手法を適用して選択されるプローブが、最適なプローブの選択とは限らない。
【００３５】
例えば、液相系のように、複数のプローブ間で、その融解温度：Ｔｍを揃える必要のない場合には、従来の手法で選択されるプローブは、問題はない。一方、マイクロアレイを利用する際には、多数のプローブを同一温度でハイブリダイゼーション反応させる必要がある。このような場合には、多数のプローブ間において、その融解温度：Ｔｍにバラツキがあると、問題となる。
【００３６】
本発明のプローブ設計方法においては、近傍塩基からの相互作用を考慮した近似計算法を利用して、熱力学的パラメータの変化量を算出する。その熱力学的パラメータの変化量に基づき、融解温度の差：ΔＴｍを評価することで、遺伝子の変異をハイブリダイゼーション反応により判別するために最も適する変異部位に対する相補鎖を、先ず決定する。その後、この変異部位の５’、３’側に設ける周辺領域の塩基数、塩基配列を、目的とするハイブリダイゼーション条件に適合する、融解温度：Ｔｍを示すように適正化している。従って、複数のプローブを同一のハイブリダイゼーション条件のもとで反応させる必要がある場合に最も適したプローブ候補を求めることが可能となる。
【００３７】
また、本発明では、目的とするハイブリダイゼーションの温度：ＴHを設定して、その条件において、融解温度の差：ΔＴｍを実際に算出する代わりに、その指標値ＩＰに基づき、ΔＴｍの大きさの評価を行っている。その評価結果に基づき、プローブの変異対応領域：ＬＶＲを先に決定し、その後、対応するＬＶＲに対して、５’、３’側領域を選択するという二段階の手順を用いる。検討すべきプローブの変異対応領域：ＬＶＲの種類をＭ１、その５’、３’側領域として、検討すべき種類をＭ２とする。従来の方法では、プローブ全体の塩基配列の種類の総数：Ｍ１×Ｍ２について、検出対象核酸分子との複合体における融解温度Ｔｍを算出している。一方、本発明では、検討すべきプローブの変異対応領域：ＬＶＲの種類：Ｍ１に対して、指標値ＩＰを算出する。その後、決定された変異対応領域：ＬＶＲについてのみ、５’、３’側領域として、検討すべき種類：Ｍ２の計算を行う。従って、二つの段階で行う総計算量は、Ｍ１＋Ｍ２に相当する。従って、本発明の方法は、従来の方法と比較して、設計の過程で必要な総計算量は、格段に少なくなるという利点を有している。
【００３８】
更に、本発明にかかる手法は、同一核酸配列中に、一塩基多型部分が複数ある場合に特に好適に利用でき、どの一塩基多型部分を選択すると、より効果的に変異を区別できるかについての情報を効率良く獲得可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明では、その塩基配列上に変異を含む対象核酸分子の判定を行う際、該対象核酸分子と、プローブ用のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを記述する熱力学的パラメータを算定して、設計の指標とする。この複合体形成に伴う熱力学的パラメータの変化量を算定する際、各熱力学的パラメータの変化量に対して、塩基対を形成する塩基の種類に加えて、その近接する塩基の種類に依る寄与も考慮する。その際、寄与する近接塩基の数を、左右それぞれｆ個とする近似モデルに基づいて（ＮＮモデルの場合には、ｆ＝１）、プローブを設計することを考える。検出対象核酸分子の配列全体の中、変異部位Ｖiと、その３’、５’側のｆ個の塩基配列Ｌ，Ｒからなる塩基配列ＬＶiＲを考える。このＬＶiＲとハイブリダイゼーションを行う、プローブ側の塩基配列をＬＶjＲとする。そして、検出対象核酸分子中の、かかるＬＶiＲの塩基配列情報に基づき、この検出対象核酸分子を選択的に判別する上で、最適なＬＶjＲの部分塩基配列を設計する手法を提供する。
【００４０】
さらに、各プローブのハイブリダイゼーションが同一の温度条件のもとで行われることを考慮する。その条件において、各プローブの対象核酸分子の変異判別能が、設定されたハイブリダイゼーション温度で最適となるように、ＬＶjＲの両側の領域（部分塩基配列）ＯL、ＯRの長さを決定し、プローブ全体の塩基配列ＯLＬＶＲＯRを設計する手法を提供する。
【００４１】
プローブ全体の塩基配列ＯLＬＶＲＯRを設計する手順として、次に述べる二つのステップを採用する構成となっている。判別が必要な変異部分に最適なプローブ対応部分を設計するプロセスと、複数のプローブに対して、対象核酸分子との複合体が示す融解温度Ｔｍを揃えるプロセスとで構成されている。特に、後段のプロセスでは、ハイブリダイゼーションの温度と、対象核酸分子との複合体が示す融解温度Ｔｍとの差違を、適正に調整するので、ハイブリダイゼーションによる判定の精度を高める上で、大きな効果を示す。結果として、複数の対象核酸分子のそれぞれに対して、最適なプローブの設計がなされているプローブセットを簡便に作製することを可能としている。
【００４２】
本発明にかかるプローブ設計方法、ならびに、該プローブ設計方法に基づく、塩基配列の設計がなされているプローブセット、該プローブ設計用のソフトウエア、該ソフトウエアを実装し、プローブ設計の操作を行うシステムを以下に述べる。
【００４３】
まず、本発明にかかるプローブセット、プローブ設計方法は、具体的には、その構成、ならびに、その好ましい形態は、下記のように記述することができる。
【００４４】
本発明にかかるプローブセットは、本発明にかかるプローブ設計方法により得ることができるものである。このプローブセットを構成する各プローブは、検出対象としての変異を含む領域と完全相補の配列を有し、これらがハイブリッド体を形成した場合に算出される融解温度は、各プローブにおいて等しく、Ｔｍαで表される。なお、「Ｔｍαが等しい」とは、実質的に等しいＴｍαが与えられば良く、この「実質的に等しい範囲」としては、一つのＴｍαに対して±１〜２℃の範囲とすることが好ましい。また、ＬやＲの配列を変化させたり、配列長を変えたりする中でＴｍαが等しくなる配列を選択することができる。
【００４５】
更に、各プローブは、他のプローブと完全相補である配列とハイブリッド体を形成した場合に算出される融解温度ＴｍβとＴｍαの差が最大となるように各プローブの配列が選択される。
【００４６】
この各プローブの関係を遺伝子間の変異が３種ある場合を例として次に説明する。
【００４７】
３種の変異Ｍ１〜Ｍ３とし、Ｍ１を検出するためのプローブをＰ１、Ｍ２を検出するためのプローブをＰ２、Ｍ３を検出するためのプローブをＰ３とする。更に、Ｐ１とＭ１とのハイブリッド体の融解温度をＴｍα１、Ｐ２とＭ２とのハイブリッド体の融解温度をＴｍα２、Ｐ３とＭ３とのハイブリッド体の融解温度をＴｍα３とする。更に、Ｐ１とＭ２のハイブリッド体、Ｐ１とＭ３のハイブリッド体、Ｐ２とＭ１のハイブリッド体、Ｐ２とＭ３のハイブリッド体、Ｐ３とＭ１のハイブリッド体及びＰ３とＭ２のハイブリッド体のそれぞれの融解温度をＴｍβ１〜Ｔｍβ６とする。本発明においては、Ｔｍα１、Ｔｍα２及びＴｍα３が実質的に等しくＴｍαとして表すことができ、かつ、ＴｍαとＴｍβ１〜Ｔｍβ６とのそれぞれの差が最大となるように、各プローブの配列が選択されている。
【００４８】
好ましくは、多型部位、すなわち変異部位と隣接する２つの領域の塩基長を選択することで上記の融解温度差を得ることができる。具体的には、検出対象の遺伝子配列の多型部位をＶ、その５’側の隣接部位をＯLＬ、３’側の隣接部位をＲＯRとする。この条件で、Ｖの変異数をｉとした際に得られる遺伝子配列：ＯLＬＶ1ＲＯR〜ＯLＬＶiＲＯR（ｉ＞２）の各々を検出対象領域とする各プローブをＯLＬＶ1ＲＯR〜ＯLＬＶjＲＯR（ｊ＞２）とする。そのときに、ＬとＲ（塩基長においてＬ＝Ｒ）のセットの塩基長を選択することにより、融解温度をＴｍβと融解温度Ｔｍαとの最大の差を得ることができる。
【００４９】
次に、本発明のプローブ設計方法、すなわち、遺伝子中の変異部位の部分塩基配列に相違を有する複数種の核酸分子を、この部分塩基配列の相違に基づき、これらの複数種の核酸分子の各々を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチドからなるプローブのセットを設計する方法について説明する。
【００５０】
まず、検出対象領域のプローブを以下のとおり定義する。
【００５１】
検出対象の核酸分子の一本鎖の検出対象領域を
ＯLＬＶＲＯR
（前記式中
変異部位に相当する、少なくとも1個の塩基を含む領域を変異領域Ｖ、
該変異領域Ｖに隣接し、その５’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＬ、
該変異領域Ｖに隣接し、その３’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＲ、
領域Ｌのさらに５’末端側に隣接している領域をＯL、
領域Ｒのさらに３’末端側に隣接している領域をＯRと定義する)
と定義する。
【００５２】
また、上記の検出対象領域を認識するプローブを
ＯLＬＶＲＯR
（前記式中
変異部位に相当する、少なくとも1個の塩基を含む領域を変異領域Ｖ、
該変異領域Ｖに隣接し、その３’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＬ、
該変異領域Ｖに隣接し、その５’末端側のｆ個の塩基を含む領域をＲ、
領域Ｌのさらに３’末端側に隣接している領域をＯL、
領域Ｒのさらに５’末端側に隣接している領域をＯRと定義する)
と定義する。
【００５３】
本発明にかかる設計方法は、上記の定義に基づいて、以下の工程１及び２を有する。
工程１：
前記ＯLＬＶＲＯR中のＬＶＲに対応させて、プローブ側のＬＶＲを決定する工程。
工程２：
前記工程１で決定されたＬＶＲに基づいて、前記ＯLＬＶＲＯR中のＯL及びＯRに対応させて、プローブ側の部分塩基配列：ＯL、ＯRを決定する工程。
【００５４】
工程１においては、変異領域Ｖの取り得る複数の変異：Ｖiの種類をＮvarとする。変異領域Ｖを有する複数の領域は、ＬＶiＲ（ｉ＝１〜可能性のある変異の数：Ｎvar）、すなわちＬＶ1Ｒ〜ＬＶNvarＲとして表すことができる。また、変異領域Ｖjに取りえる全ての塩基配列（ｊ＝１〜NVP）をＬＶ1Ｒ〜ＬＶNVPＲとする。そして、ある１つの変異：ＬＶiＲ（ｉ＝１〜可能性のある変異の数のいずれか）に対して、他のＶi'（ｉ’≠ｉ）とのＴｍの差が最も大きくなるＶj（ｊは１〜NVPのいずれか)を選択する。この選択を行う際に、まず、ＬＶ1Ｒ〜ＬＶNvarＲから選択された１つの配列（ＬＶiＲ：サンプル１とする）に対して、ＬＶ1Ｒ〜ＬＶNVPＲの各々を用いてハイブリッド体を形成したと仮定した場合における熱力学的パラメータを算出する。
【００５５】
この熱力学的パラメータには、ハイブリッド体の融解温度の算出の基礎となるものが選択される。また、その算出は、上記のｆ個の塩基を利用した近接塩基配列に依存する近似法を適用し、部分塩基配列：ＬＶiＲ（ＬＶ1Ｒ〜ＬＶNvarＲ）とＬＶjＲ（ＬＶ1Ｒ〜ＬＶNVPＲ）の塩基配列情報から必要な情報を選択してそれに基づき行う。
【００５６】
更に、ＬＶ1Ｒ〜ＬＶNvarＲのサンプル１以外のそれぞれについて同様に熱力学的パラメータを算出する。そして、算出された熱力学的パラメータを比較し、その比較結果から、各変異：ＬＶiＲ（ｉ＝１〜可能性のある変異の数のいずれか）に対して、他のＶi'（ｉ’≠ｉ）とのＴｍの差が最も大きくなるＶj（ｊは１〜NVPのいずれか)を選択する。
【００５７】
前記工程２においては、工程１で選択されたＶjのセットから得られるＬＶjＲのセットの各々について次の処理を行う。まず、選択されたＶjを有するＯLＬＶjＲＯRと、ＯLＬＶ1ＲＯR〜ＯLＬＶNvarＲＯRの各々とがハイブリダイゼーションしたと仮定した際の、各ハイブリッド体の熱力学的パラメータを算出する。この熱力学的パラメータとしても、ハイブリッド体の融解温度の算出の基礎となるものが用いられる。そして、ハイブリダイゼーションを行う温度：ＴHにおいて、対応する変異Ｖiとの各融解温度Ｔｍαが同じであり、かつ、該融解温度Ｔｍαと、他の変異Ｖi'（ｉ’≠ｉ）との融解温度Ｔｍβとに最大の差を与えるように、検出側のＯL及びＯRに基づいてプローブ側のＯL及びＯRを決定する。こうして、先に記載したプローブセットの条件を満たす複数のプローブからなるプローブセットを得ることができる。
【００５８】
工程２について、Ｖiの変異が２種であり、Ｖjとしてとりえる変異が４種であり、かつ、この内の２つの変異がＶjとして選択された場合を例として捕捉する。工程１により選択されたＶｊが、Ｖ3とＶ4であるとすると、プローブセットは、ＯLＬＶ2ＲＯR及びＯLＬＶ4ＲＯRとなる。ここで、ＯLＬＶ2ＲＯR（Ｐ１）が、ＯLＬＶ1ＲＯR（Ｍ１）の検出のためのプローブであり、ＯLＬＶ4ＲＯR（Ｐ２）が、ＯLＬＶ2ＲＯR（Ｍ２）の検出のためのプローブであるとする。そしてプローブＰ１、Ｐ２と検出対象Ｍ１、Ｍ２それぞれ組み合わせて得られるハイブリッド体の熱力学的パラメータをＯL及びＯRの配列に基づいて算出する。そして、ハイブリッド体Ｐ１Ｍ１とハイブリッド体Ｐ２Ｍ２との融解温度がＴｍαとして実質的に等しくなり、かつ、ハイブリッド体Ｐ１Ｍ２の融解温度Ｔｍβ１とハイブリッド体Ｐ２Ｍ１の融解温度Ｔｍβ２とＴｍα１との差が最大となるＯL及びＯRの配列を選択して、目的とするプローブセットを構成する各プローブを決定する。
【００５９】
上記の熱力学的パラメータとしては、各ハイブリッド体において算出されるΔSij、Ｓ、ΔHij、ΔGij（ここでSはエントロピー、Hはエンタルピー、Gはギブスのフリーエネルギー）から選択された１以上のパラメータを用いることが好ましい。なお、ΔSij、ΔHijとして文献等で計算されているものを、ΔGijとしては、より直接的に実測したデータなどから得てもよい。
【００６０】
また、ｆとしては１を選択することで近似法としてＮｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ近似法を適用することができる。また、ｆとして２を選択することで近似法としてＮｅｘｔ−Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ近似法を適用することができる。なお、ｆの上限は特に設定されないが、プローブの全長については、プローブの目的、用途に応じて適宜選択でき、３０塩基程度から７０塩基程度まで種々の長さから選択可能である。
【００６１】
更に、遺伝子中の変異部位として、遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）に起因しているものを対象とすることができる。
【００６２】
また、遺伝子中の変異部位として、遺伝子の塩基配列に対する、一塩基の欠失もしくは挿入に起因しているものを対象とすることができる。
【００６３】
また、部分塩基配列：ＬＶiＲとＬＶjＲにおいて、領域Ｌと領域Ｌ、ならびに、領域Ｒと領域Ｒは、共に、互いに相補的な塩基配列を有する組合せも設計対象として利用できる。更に、塩基配列：ＯLＬＶiＲＯRとＯLＬＶjＲＯRにおいて、領域ＯLと領域ＯL、ならびに、領域ＯRと領域ＯRは、共に、互いに完全相補的な塩基配列を有する組合せも設計対象として利用できる。更に、領域Ｌと領域Ｌ、領域Ｒと領域Ｒ、領域ＯLと領域ＯL、ならびに、領域ＯRと領域ＯRは完全相補的である組合せを用いることもできる。
【００６４】
一方、ＯLＬＶjＲＯRを用いたハイブリダイゼーションおける、各変異：Ｖiの、他の変異：Ｖi'（ｉ’≠ｉ）からの判別をより明確にするために、領域Ｌと領域Ｌ、あるいは、領域Ｒと領域Ｒには、互いに相補的でない塩基配列を用いる場合もある。
【００６５】
更に、ＯLＬＶjＲＯRを用いたハイブリダイゼーションでの各変異：Ｖiの、他の変異：Ｖi'（ｉ’≠ｉ）からの判別をより明確にするために、領域ＯLと領域ＯL、ならびに、領域ＯRと領域ＯRには、互いに相補的でない塩基配列を用いる場合もある。
【００６６】
上記の工程１の一例について以下に記載する。
【００６７】
工程１において、上記と同様にして、変異領域Ｖの取り得る複数の変異：Ｖiの種類をＮvarとし、プローブ側の変異領域Ｖに取り得る全ての可能な塩基配列：Ｖjの種類をＮVPとする。更に、上記と同様に、各変異：Ｖi（ｉ＝１〜可能性のある変異の数：Ｎvar）の部分塩基配列：ＯLＬＶiＲＯRに対して、変異領域Ｖを有するプローブをハイブリダイゼーションさせた際の熱力学的パラメータの変化量を算出する。各プローブは、変異領域Ｖとして取りえる塩基配列：Ｖj（ｊ＝１〜可能な塩基配列の数：ＮVP）を有する塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRからなる。また、熱力学的パラメータの変化量としては、ΔＨij、ΔＳijを、ｆ個の近接塩基配列に依存する近似法適用して、部分塩基配列：ＬＶiＲとＬＶjＲの塩基配列情報に基づき、下記のように算出する。
【００６８】
ΔＳij≡ΔＳ（ＯL＋ＯR）＋δ（ΔＳij）
ΔＨij≡ΔＨ（ＯL＋ＯR）＋δ（ΔＨij）
（但し、
δ（ΔＳij）≡ΣknVΔＳij（ｋ）
＝｛ΔＳij(k1-f,…,k1,…k1+f)＋…＋ΔＳij(knV-f,…,knV,…knV+f)｝
δ（ΔＨij）≡ΣknVΔＨij（ｋ）
＝｛ΔＨij(k1-f,…,k1,…k1+f)＋…＋ΔＨij(knV-f,…,knV,…knV+f)｝
ｎｖは、部分塩基配列：Ｖiの部分に存在する塩基数である。
【００６９】
ｋ1、ｋnvは、部分塩基配列：ＯLＬＶiＲＯR中における、部分塩基配列：ＬＶiＲの存在する塩基番号の両端を表す。ΔＳij（ｋ）、ΔＨij（ｋ）は、ｆ個の近接塩基配列に依存する近似法適用した際の、ｋ番目の塩基に起因するエントロピーＳの変化量、エンタルピーＨの変化量の近似値を表す。
【００７０】
さらに、各変異：Ｖiと、他の変異：Ｖi'（ｉ’≠ｉ）との間で、該熱力学的パラメータの変化量：ΔＨij、ΔＳijの相違：ｄＨiji'、ｄＳiji'を以下のようにして求める。
ｄＨiji'≡ΔＨi'j−ΔＨij＝δ（ΔＨi'j）−δ（ΔＨij）
ｄＳiji'≡ΔＳi'j−ΔＳij＝δ（ΔＳi'j）−δ（ΔＳij）
そして、Ｎvar種類の変異領域：ＬＶiＲ（i＝１〜Ｎvar）に対して、合計｛Ｎvar×（Ｎvar−１）×ＮVP｝個の差ベクトル：ｖiji'は、下記のように定義する。
ｖiji'≡（｛δ(ΔSi'j)−δ(ΔSij)｝，｛δ(ΔHi'j)−δ(ΔHij)｝）＝（ｄＳiji'，ｄＨiji'）
更に、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、ハイブリダイゼーションの温度：ＴH（Ｋ）によって定義される、単位ベクトル：ｕを以下のように定義する。
ｕ＝｛1/√（１＋ＴH2）｝（１，ＴH）＝｛1/norm｝（１，ＴH）
次いで、該単位ベクトル：ｕと直交する単位ベクトル：ｎを、下記のように定義し、
ｎ＝｛1/norm｝（−ＴH，１）
前記差ベクトル：ｖiji'と該単位ベクトル：ｎとの内積に基づき、下記の指標値を算出する。
【００７１】
ＩＰiji'＝ｖiji'・ｎ
＝｛1/norm｝・(ｄＨiji'−ＴH・ｄＳiji')
さらに、各変異：Ｖiと、他の変異：Ｖi'（ｉ’＝１〜Ｎvar；但し、ｉ’≠ｉ）との間での指標値：ＩＰiji'が最小となるものを選択する。そして、ＩＰijimとし、各変異：Ｖiに対して、ＩＰijimの最大となるものを選択し、この最大値を与えている、ＬＶjmＲを特定する。それと同時に、その最大のＩＰijimを与えている、他の変異：Ｖimを特定し、各変異：Ｖiを判定するための、プローブにおける対応部位；ＬＶjＲとして、ＬＶjmＲを選択する。
【００７２】
更に、全ての変異：Ｖi（ｉ＝１〜Ｎvar）に対して、同じ選択操作によって、各変異：Ｖiを判定するための、プローブにおける対応部位；ＬＶjmＲの選択を行う。
【００７３】
上記の工程１及び工程２の組合せの更なる一例について以下に記載する。
【００７４】
工程１において、各変異：Ｖiの部分塩基配列：ＬＶiＲに対して、選択されるプローブ側の部分塩基配列：ＬＶjmＲを決定し、同時に、その最大のＩＰijimを与えている、他の変異：Ｖimを特定する。その後、工程２において、検出対象の核酸分子における塩基配列：ＯLＬＶiＲＯRにおける、領域ＯLと領域ＯRに対して、プローブ側の塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRにおける、領域ＯLと領域ＯRとを相補的な塩基配列を選択する。そして、工程１で特定されたＬＶjmＲと、他の変異：Ｖimに対する、差ベクトルｖiを、下記のように定義する。
ｖi＝（｛ΔＳimjm−ΔＳijm｝,｛ΔＨimjm−ΔＨijm｝）
＝（｛δ（ΔＳimjm）−δ（ΔＳijm）｝,｛δ（ΔＨimjm）−δ（ΔＨijm）｝）
≡（ΔＳvar（Ｖi），ΔＨvar（Ｖi））
一方、ハイブリダイゼーションを行う温度：ＴHと、核酸の濃度に対応するパラメータ：Ｃを用いて、（ΔＳ，ΔＨ）空間上において、下記の式（Ａ）で示される直線を定義する。
【００７５】
ΔＨ＝ＴH・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕    式（Ａ）
また、（ΔＳ，ΔＨ）空間上において、点（ΔＳijm，ΔＨijm）と点（ΔＳimjm，ΔＨimjm）を結ぶ線分の中点（ΔＳCi，ΔＨCi）を下記のように定義する。
【００７６】
ΔＳCi≡1/2｛ΔＳimjm＋ΔＳijm｝＝ΔＳijm＋1/2ΔＳvar（Ｖi）
ΔＨCi≡1/2｛ΔＨimjm＋ΔＨijm｝＝ΔＨijm＋1/2ΔＨvar（Ｖi）
（ΔＳ，ΔＨ）空間上において、中点（ΔＳCi，ΔＨCi）と、式（Ａ）で示される直線との距離が最小となるように、領域ＯLと領域ＯL、および領域ＯRと領域ＯRに依存する、前記ΔＳ（ＯL＋ＯR）とΔＨ（ＯL＋ＯR）を選択する。この選択されるΔＳ（ＯL＋ＯR）とΔＨ（ＯL＋ＯR）を与える、領域ＯLと領域ＯL、および領域ＯRと領域ＯRの塩基配列を特定する。そして、この特定された領域ＯLと領域ＯRの塩基配列を有する、ＯLＬＶjmＲＯRの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、各変異：Ｖiを判定するためのプローブとして、選択する。
【００７７】
また、本発明のプローブ設計方法は、一連の数値演算処理、ならびに、該数値演算処理結果を用いる論理演算処理を行うことで、プローブセットを構成するオリゴヌクレオチド複数種の塩基配列を特定する形態として実施できる。これらの演算処理を含む操作は、コンピュータシステム上で実行するため、専用のソウト・ウエアとして、記録媒体上に記録し、ソウトウエア収納記録媒体の形態とすることが望ましい。
【００７８】
従って、本発明は、前記の「専用のソウト・ウエア」を収納する、ソウト・ウエア収納記録媒体の発明をも提供する。
【００７９】
その記録媒体上に収納されるソウト・ウエアは、下記の構成上の特徴を有する。
（１）上述の構成を有する本発明のプローブ設計方法を適用して、プローブセットを構成するオリゴヌクレオチド複数種の塩基配列を特定するためのものである。
・その方法に基づく、一連の数値演算処理、ならびに、該数値演算処理結果を用いる論理演算処理をコンピュータシステム上で実行するための、プログラムを主要な要素としている。
（２）このプログラムを、該コンピュータシステムにおいて、実行可能なプログラム言語により表記したソウトウエアを記録媒体上に電子的に収納してなるものである。
【００８０】
また、本発明のプローブ設計方法は、上述するように、「専用のソウト・ウエア」を用いて、コンピュータシステム上において、その設計操作を実施することが一般的である。従って、本発明は、本発明のプローブ設計方法を適用して、プローブセットを構成するオリゴヌクレオチド複数種の塩基配列を特定する操作を実施する用途に適するコンピュータシステムの発明をも提供する。
【００８１】
すなわち、本発明にかかるプローブ設計の操作を実行するためのコンピュータシステムは、下記の構成上の特徴を有する。
（Ａ）上述の構成を有する本発明のプローブ設計方法を適用して、プローブセットを構成するオリゴヌクレオチド複数種の塩基配列を特定するためのものである。
（Ｂ）その方法に基づく、一連の数値演算処理、ならびに、該数値演算処理結果を用いる論理演算処理をコンピュータシステム上で実行するための、プログラムを主要な要素として含んでいる。
（Ｃ）このプログラムを、該コンピュータシステムにおいて、実行可能なプログラム言語により表記したソウト・ウエアを、当該コンピュータシステムに設ける情報記録媒体上に実装している。
【００８２】
以下に本発明を更に詳しく説明する。
【００８３】
例えば、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用して、特定のハイブリダイゼーション温度ＴHにおいて、複数個所の変異箇所（Ｖ）に関して、それぞれ、専用のプローブ：Ｐ（Ｖ）をハイブリダイズさせ、対象の一本鎖核酸分子と複合体を形成させる。その場合、各変異箇所（Ｖ）と特異的にハイブリダイズする専用のプローブ：Ｐ（Ｖ）によって、複合体形成がなされる領域は、この変異箇所（Ｖ）を中心として、その上流側、下流側の領域を含む、ある塩基長ｎｐ（Ｖ）を有するものとなる。この複合体形成領域の塩基配列は、下記のように、記述できる。対象の一本鎖核酸分子の各変異箇所（Ｖ）に近接する、５’側ｆ個の塩基、３’側ｆ個の塩基をそれぞれ、Ｌ（Ｖ）、Ｒ（Ｖ）とすると、各変異箇所と、その近接部分の部分配列として、Ｌ（Ｖ）ＶＲ（Ｖ）が定義できる。このＬ（Ｖ）ＶＲ（Ｖ）の、５’側に隣接する領域：ＯL（Ｖ）、３’側に隣接する領域：ＯR（Ｖ）を含め、複合体形成領域の塩基配列全体は、ＯL（Ｖ）Ｌ（Ｖ）ＶＲ（Ｖ）ＯR（Ｖ）と表記される。
【００８４】
一方、本発明においては、専用のプローブ：Ｐ（Ｖ）の塩基配列は、３’側から５’側に向かって、ＯL（Ｖ）Ｌ（Ｖ）ＶＲ（Ｖ）ＯR（Ｖ）と表記することができる。その際、ＯL（Ｖ）の領域は、ＯL（Ｖ）の領域と相補的な塩基配列とし、ＯR（Ｖ）の領域は、ＯR（Ｖ）の領域と相補的な塩基配列とする。また、Ｌ（Ｖ）ＶＲ（Ｖ）の部分の塩基配列は、各変異箇所と、その近接部分の部分配列：Ｌ（Ｖ）ＶＲ（Ｖ）に応じて、選択される。このＬ（Ｖ）ＶＲ（Ｖ）の部分は、変異箇所（Ｖ）の塩基長ｎ（Ｖ）と、その両端に各ｆ個の塩基を含む、｛ｆ＋ｎ（Ｖ）＋ｆ｝個の塩基で構成されている。また、ＯL（Ｖ）の領域の長さｎL（Ｖ）と、ＯR（Ｖ）の領域の長さｎR（Ｖ）は、該プローブ：Ｐ（Ｖ）全体の塩基長：ｎｐ（Ｖ）と、下記の条件を満足するように選択する。
【００８５】
ｎｐ（Ｖ）＝ｎL（Ｖ）＋｛ｆ＋ｎ（Ｖ）＋ｆ｝＋ｎR（Ｖ）
本発明においては、同一の試料中に含まれる、各変異箇所（Ｖ）を内在する一本鎖核酸分子について、同時に、総数Ｎtotalの変異箇所：Ｖ（ｈ）；ｈ＝１，…, Ｎtotalを、それぞれの変異箇所に特異的な専用のプローブを用いて検出する。具体的には、検出すべき各変異箇所：Ｖ（ｈ）は、それぞれ、特定の「遺伝子の多型」に相当する「変異」箇所である。例えば、該「変異」箇所が、「一塩基多型」に起因するものである場合は、その変異箇所：Ｖ（ｈ）に含まれる塩基の数：ｋ（ｈ）は、ｋ（ｈ）＝１である。また、該「変異」箇所が、一塩基の欠損に起因するものである場合は、その変異箇所：Ｖ（ｈ）に含まれる塩基の数：ｋ（ｈ）は、ｋ（ｈ）＝1と見做す。あるいは、該「変異」箇所が、一塩基の挿入に起因するものである場合は、その変異箇所：Ｖ（ｈ）に含まれる塩基の数：ｋ（ｈ）は、ｋ（ｈ）＝１と見做す。
【００８６】
「遺伝子の多型」に相当する「変異」では、該変異箇所：Ｖ（ｈ）の部分塩基配列は、メジャー・アレルと称される野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）と、マイナー・アレルと称される変異型（Ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅ）とが存在している。その野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）の部分塩基配列は、最も高い頻度で見出されるものであり、変異型（Ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅ）の部分塩基配列は、低い頻度で見出される。従って、野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）の部分塩基配列は、一種類であるが、変異型（Ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅ）の部分塩基配列は、複数種が見出されることも少なくない。該変異箇所：Ｖ（ｈ）の部分塩基配列に関して、可能性のある変異の種類の数：Ｎvar（ｈ）は、野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）の部分塩基配列の一種類と、変異型（Ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅ）の部分塩基配列の複数種の合計となる。
【００８７】
各変異箇所：Ｖ（ｈ）について、その可能性のある変異の種類の数：Ｎｖａｒ（ｈ）の変異：Ｖｈ（ｉ）；ｉ＝１，…，Ｎvar（ｈ）の何れかを具える対象核酸分子と、選択的に複合体形成を行う「専用プローブ」を選択する。その際、選択された「専用プローブ」は、その対象核酸分子以外の変異：Ｖｈ（ｉ）を示す核酸分子とは、ハイブリダイゼーション温度ＴHでは、複合体形成を起こさないように、該「専用プローブ」の塩基配列を設計する。
【００８８】
以下に、本発明にかかるプローブセットの設計方法を、具体例を挙げて、さらに詳しく説明する。以下に示す具体例は、本発明の最良の実施形態の一例であるが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではない。
【００８９】
（第一の実施形態）
この実施形態では、ＮＮモデルに基づく、融解温度Ｔｍの推定方法を応用して、「一塩基多型（ＳＮＰ）」に起因する変異を判定するプローブセットを設計する方法の一例を説明する。
【００９０】
「一塩基多型（ＳＮＰ）」に起因する変異では、各変異箇所：Ｖ（ｈ）の部分塩基配列は、特定の一塩基が、相違している。この例では、各変異箇所：Ｖ（ｈ）に近接する、５’側１個の塩基、３’側１個の塩基を、それぞれ、Ｌ（Ｖ（ｈ））、Ｒ（Ｖ（ｈ））とする。すなわち、各変異箇所と、その近接部分の部分配列として、３塩基長からなるＬ（Ｖ（ｈ））Ｖ（ｈ）Ｒ（Ｖ（ｈ））を考慮する。
【００９１】
例えば、変異箇所：Ｖ（ｈ）について、その可能性のある変異の種類の数：Ｎｖａｒ（ｈ）が、Ｎｖａｒ（ｈ）＝２である場合、二種のアレルが存在することになる。「一塩基多型（ＳＮＰ）」に起因する変異における、野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）の塩基（Ｗ）と変異型（Ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅ）の塩基（Ｍ）は、センス鎖において、それぞれ、ＬＷＲ、ＬＭＲとして含まれる。図１に、変異箇所：Ｖ（ｈ）を含む、３塩基長からなるＬ（Ｖ（ｈ））Ｖ（ｈ）Ｒ（Ｖ（ｈ））領域における、センス鎖とアンチセンス鎖の部分塩基配列に関して、二種のアレルについて、対比して示す。
【００９２】
図２に示すように、センス鎖の部分塩基配列：ＬＷＲに対して、この部分と、ミスマッチ無くハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖の部分塩基配列を、ＬＷＲと表記している。同じく、センス鎖の部分塩基配列：ＬＭＲに対して、この部分と、ミスマッチ無くハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖の部分塩基配列を、ＬＭＲと表記している。仮に、部分塩基配列：ＬＷＲを有するセンス鎖と、部分塩基配列：ＬＭＲを有するアンチセンス鎖をハイブリダイゼーションさせると、この部分領域の上流側、下流側では、互いに相補的な塩基配列を有するため、一応、複合体を形成する。一方、この変異箇所では、相補的で無いため、「Ｗ：Ｍ」の部位にミスマッチを生じることになる。その結果、それに隣接する塩基対「Ｌ：Ｌ」と「Ｒ：Ｒ」において、その塩基対形成に付随する熱力学的パラメータの変化量（ΔＨ，ΔＳ）に、このミス・マッチの影響が及ぶ。
【００９３】
先ず、「一塩基多型（ＳＮＰ）」に起因する変異における、野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）の塩基（Ｗ）と変異型（Ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅ）の塩基（Ｍ）の組み合わせ（Ｗ⇔Ｍ）の可能性を考える。それぞれ、採りえる塩基の種類ｎｂは、Ａ，Ｔ（Ｕ），Ｇ，Ｃの４種であり、組み合わせ（Ｗ⇔Ｍ）の種類は、ｎｂ・（ｎｂ−１）／２！、すなわち、４×３／２＝６通りとなる。一方、Ｌ（Ｖ（ｈ））、Ｒ（Ｖ（ｈ））が採りえる塩基の種類ｎｂも、Ａ，Ｔ（Ｕ），Ｇ，Ｃの４種のいずれかであり、その組み合わせの可能性は、ｎｂ・ｎｂ通り、すなわち、４×４＝１６通りとなる。３塩基長からなるＬ（Ｖ（ｈ））Ｖ（ｈ）Ｒ（Ｖ（ｈ））部分に関して、可能性のある（ＬＷＲ⇔ＬＭＲ）の組み合わせは、１６×６通りとなる。図２に、可能性のある（ＬＷＲ⇔ＬＭＲ）の組み合わせを纏めて示す。
【００９４】
ハイブリダイゼーション反応によって、複数のＳＮＰを同時に検出するために、利用されるプローブセットに対する必須条件は、次の二点である。
条件（１）  各ＳＮＰにおいて、二種のアレル間の塩基の相違；ＬＷＲとＬＭＲを効率よく見分けること。
条件（２）  複数のＳＮＰの検出用のプローブの全てが、同じハイブリダイゼーション条件（温度）の下で、目的のアレルと選択的にハイブリダイゼーションを起こすこと。
【００９５】
先ず、最初に、条件（１）を満たすための、プローブの塩基配列の設計指針を考える。各ＳＮＰにおいて、二種のアレル間の塩基の相違；ＬＷＲとＬＭＲを効率よく見分けるためには、用いるプローブは、このＳＮＰ部位を含む領域の部分塩基配列に対応した「相補的な部分塩基配列」を有する必要がある。すなわち、二種のアレルにおけるセンス鎖の、ＳＮＰ部位を含む領域の部分塩基配列を、ＯLＬＷＲＯR、ＯLＬＭＲＯRとすると、利用するプローブは、それらと相補的な塩基配列；ＯLＬＶＲＯRを有する必要がある。そして、この塩基配列；ＯLＬＶＲＯRを有するプローブが、ＯLＬＷＲＯR、ＯLＬＭＲＯRの部分塩基配列を有する領域にハイブリダイゼーションした際、その熱力学的な安定性に大きな差違を示すことが必要である。
【００９６】
この塩基配列；３’−ＯLＬＶＲＯR−５’を有するプローブの塩基長をｎｋとし、その３’末端側から、（ｋ−１）番目がＬ，ｋ番目がＶ，（ｋ＋１）番目がＲとする。図３に示すＮＮモデルに基づく、熱力学的パラメータの近似計算法に従って、例えば、塩基配列；３’−ＯLＬＷＲＯR−５’を有するプローブについて、複合体形成に伴う熱力学的パラメータの変化量を計算する。
【００９７】
図４に例示されるように、プローブの塩基配列：３’−ＯLＬＷＲＯR−５’のＷに相当する部位が、ＳＮＰ部位に相当している。
【００９８】
ＳＮＰ部位を含む領域の部分塩基配列がＯLＬＷＲＯRである場合、熱力学的パラメータ：ΔＧW/W、ΔＨW/W、ΔＳW/Wは、下記のように近似される。
ΔＧW/W＝ΔＧ（５’init）＋ΔＧ（３’init）＋ΔＧW（symmetry）
＋ΣknkΔＧW/W（ｋ）
ΔＨW/W＝ΔＨ（５’init）＋ΔＨ（３’init）＋ΔＨW（symmetry）
＋ΣknkΔＨW/W（ｋ）
ΔＳW/W＝ΔＳ（５’init）＋ΔＳ（３’init）＋ΔＳW（symmetry）
＋ΣknkΔＳW/W（ｋ）
ＳＮＰ部位を含む領域の部分塩基配列がＯLＬＭＲＯRである場合、熱力学的パラメータ：ΔＧM/W、ΔＨM/W、ΔＳM/Wは、下記のように近似される。
ΔＧM/W＝ΔＧ（５’init）＋ΔＧ（３’init）＋ΔＧM（symmetry）
＋｛ΔＧW/W（１）＋…＋ΔＧM/W（ｋ−１）＋ΔＧM/W（ｋ）＋ΔＧM/W（ｋ＋１）＋…＋ΔＧW/W（ｎｋ）｝
なお、ΔＧM/W（ｋ−１）はΔＧ（ＧＬＭ／ＣＬＷ）、ΔＧM/W（ｋ）はΔＧ（ＬＭＲ／ＬＷＲ）、ΔＧM/W（ｋ＋１）はΔＧ（ＭＲＧ／ＷＲＣ）となる。
ΔＨM/W＝ΔＨ（５’init）＋ΔＨ（３’init）＋ΔＨM（symmetry）
＋｛ΔＨW/W（１）＋…＋ΔＨM/W（ｋ−１）＋ΔＨM/W（ｋ）＋ΔＨM/W（ｋ＋１）＋…＋ΔＨW/W（ｎｋ）｝
なお、ΔＨM/W（ｋ−１）はΔＨ（ＧＬＭ／ＣＬＷ）、ΔＨM/W（ｋ）はΔＨ（ＬＭＲ／ＬＷＲ）、ΔＨM/W（ｋ＋１）はΔＨ（ＭＲＧ／ＷＲＣ）となる。
ΔＳM/W＝ΔＳ（５’init）＋ΔＳ（３’init）＋ΔＳW（symmetry）
＋｛ΔＳW/W（１）＋…＋ΔＳM/W（ｋ−１）＋ΔＳM/W（ｋ）＋ΔＳM/W（ｋ＋１）＋…＋ΔＳW/W（ｎｋ）｝
なお、ΔＳM/W（ｋ−１）はΔＳ（ＧＬＭ／ＣＬＷ）、ΔＳM/W（ｋ）はΔＳ（ＬＭＲ／ＬＷＲ）、ΔＳM/W（ｋ＋１）はΔＳ（ＭＲＧ／ＷＲＣ）となる。
【００９９】
但し、ｎｋ≫３の条件では、ΔＧW（symmetry）≒ΔＧM（symmetry）、ΔＨW（symmetry）≒ΔＨM（symmetry）、ΔＳW（symmetry）≒ΔＳM（symmetry）と見做すことができる。従って、ｎｋ≫３の条件を満たす際には、下記にように、両者の差違を近似的に表記できる。
ΔＧSNP（Ｗ／Ｗ→Ｍ／Ｗ）≡ΔＧM/W−ΔＧW/W
≒｛ΔＧM/W（ｋ−１）＋ΔＧM/W（ｋ）＋ΔＧM/W（ｋ＋１）｝−｛ΔＧW/W（ｋ−１）＋ΔＧW/W（ｋ）＋ΔＧW/W（ｋ＋１）｝
ΔＨSNP（Ｗ／Ｗ→Ｍ／Ｗ）≡ΔＨM/W−ΔＨW/W
≒｛ΔＨM/W（ｋ−１）＋ΔＨM/W（ｋ）＋ΔＨM/W（ｋ＋１）｝−｛ΔＨW/W（ｋ−１）＋ΔＨW/W（ｋ）＋ΔＨW/W（ｋ＋１）｝
ΔＳSNP（Ｗ／Ｗ→Ｍ／Ｗ）≡ΔＳM/W−ΔＳW/W
≒｛ΔＳM/W（ｋ−１）＋ΔＳM/W（ｋ）＋ΔＳM/W（ｋ＋１）｝−｛ΔＳW/W（ｋ−１）＋ΔＳW/W（ｋ）＋ΔＳW/W（ｋ＋１）｝
一方、塩基配列；３’−ＯLＬＭＲＯR−５’を有するプローブについても、同様に、複合体形成に伴う熱力学的パラメータの変化量を計算する。
【０１００】
ＳＮＰ部位を含む領域の部分塩基配列がＯLＬＭＲＯRである場合、熱力学的パラメータ：ΔＧM/M、ΔＨM/M、ΔＳM/Mは、下記のように近似される。
ΔＧM/M＝ΔＧ（５’init）＋ΔＧ（３’init）＋ΔＧM（symmetry）
＋ΣknkΔＧM/M（ｋ）
ΔＨM/M＝ΔＨ（５’init）＋ΔＨ（３’init）＋ΔＨM（symmetry）
＋ΣknkΔＨM/M（ｋ）
ΔＳM/M＝ΔＳ（５’init）＋ΔＳ（３’init）＋ΔＳM（symmetry）
＋ΣknkΔＳM/M（ｋ）
ＳＮＰ部位を含む領域の部分塩基配列がＯLＬＷＲＯRである場合、熱力学的パラメータ：ΔＧW/M、ΔＨW/M、ΔＳW/Mは、下記のように近似される。
ΔＧW/M＝ΔＧ（５’init）＋ΔＧ（３’init）＋ΔＧW（symmetry）
＋｛ΔＧM/M（１）＋…＋ΔＧW/M（ｋ−１）＋ΔＧW/M（ｋ）＋ΔＧW/M（ｋ＋１）＋…＋ΔＧM/M（ｎｋ）｝
なお、ΔＧW/M（ｋ−１）はΔＧ（ＧＬＷ／ＣＬＭ）、ΔＧM（ｋ）はΔＧ（ＬＷＲ／ＬＭＲ）、ΔＧM（ｋ＋１）はΔＧ（ＷＲＧ／ＭＲＣ）となる。
ΔＨW/M＝ΔＨ（５’init）＋ΔＨ（３’init）＋ΔＨW（symmetry）
＋｛ΔＨM/M（１）＋…＋ΔＨW/M（ｋ−１）＋ΔＨW/M（ｋ）＋ΔＨW/M（ｋ＋１）＋…＋ΔＨM/M（ｎｋ）｝
なお、ΔＨW/M（ｋ−１）はΔＨ（ＧＬＷ／ＣＬＭ）、ΔＨW/M（ｋ）はΔＨ（ＬＷＲ／ＬＭＲ）、ΔＨW/M（ｋ＋１）はΔＨ（ＷＲＧ／ＭＲＣ）となる。
ΔＳW/M＝ΔＳ（５’init）＋ΔＳ（３’init）＋ΔＳW（symmetry）
＋｛ΔＳM/M（１）＋…＋ΔＳW/M（ｋ−１）＋ΔＳW/M（ｋ）＋ΔＳW/M（ｋ＋１）＋…＋ΔＳM/M（ｎｋ）｝
なお、ΔＳM（ｋ−１）はΔＳ（ＧＬＷ／ＣＬＭ）、ΔＳM（ｋ）はΔＳ（ＬＷＲ／ＬＭＲ）、ΔＳM（ｋ＋１）はΔＳ（ＷＲＧ／ＭＲＣ）となる。
【０１０１】
但し、ｎｋ≫３の条件では、ΔＧW（symmetry）≒ΔＧM（symmetry）、ΔＨW（symmetry）≒ΔＨM（symmetry）、ΔＳW（symmetry）≒ΔＳM（symmetry）と見做すことができる。従って、ｎｋ≫３の条件を満たす際には、下記にように、両者の差違を近似的に表記できる。
ΔＧSNP（Ｍ／Ｍ→Ｗ／Ｍ）≡ΔＧW/M−ΔＧM/M
≒｛ΔＧW/M（ｋ−１）＋ΔＧW/M（ｋ）＋ΔＧW/M（ｋ＋１）｝−｛ΔＧM/M（ｋ−１）＋ΔＧM/M（ｋ）＋ΔＧM/M（ｋ＋１）｝
ΔＨSNP（Ｍ／Ｍ→Ｗ／Ｍ）≡ΔＨW/M−ΔＨM/M
≒｛ΔＨW/M（ｋ−１）＋ΔＨW/M（ｋ）＋ΔＨW/M（ｋ＋１）｝−｛ΔＨM/M（ｋ−１）＋ΔＨM/M（ｋ）＋ΔＨM/M（ｋ＋１）｝
ΔＳSNP（Ｍ／Ｍ→Ｗ／Ｍ）≡ΔＳW/M−ΔＳM/M
≒｛ΔＳW/M（ｋ−１）＋ΔＳW/M（ｋ）＋ΔＳW/M（ｋ＋１）｝−｛ΔＳM/M（ｋ−１）＋ΔＳM/M（ｋ）＋ΔＳM/M（ｋ＋１）｝
図４に示すように、二種のアレルに対して、そのＳＮＰ部位を含む領域にプローブをハイブリダイゼーションした際、熱力学的パラメータ：ΔＧ、ΔＨ、ΔＳの差違は、その変異部位近傍のＬＷＲとＬＭＲからの寄与の差として近似できる。
【０１０２】
なお、各プローブと、二種のアレルに由来する対象の一本鎖核酸分子との複合体の融解温度Ｔｍは、当初の全体の核酸濃度：Ｃ≡［Ａ］0＋［Ｂ］0；但し、［Ａ］0＝［Ｂ］0とすると、図３の式（ｇ）のように示すことができる。
【０１０３】
すなわち、各複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨ、ΔＳを用いて、Ｔｍは、下記のように表記される。
【０１０４】
Ｔｍ＝ΔＨ／〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
この式は、変形すると、下記の式となる。
【０１０５】
ΔＨ＝Ｔｍ・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
エントロピーの変化量：ΔＳを横軸、エンタルピーの変化量：ΔＨを縦軸とする、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、ΔＳ−横軸との交点（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）、ΔＨ−縦軸との交点（０，Ｔｍ・Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４））の直線となる。プローブの塩基配列と、対象の一本鎖核酸分子の塩基配列に基づき、その複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨ、ΔＳを推定すると、この直線上の点（ΔＳ,ΔＨ）と、核酸濃度：Ｃを用いて、融解温度Ｔｍを推定できる。図５に示すように、融解温度Ｔｍは、直線：ΔＨ＝Ｔｍ・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕の傾きに相当している。
【０１０６】
例えば、塩基配列；３’−ＯLＬＷＲＯR−５’を有するプローブと、ＳＮＰ部位を含む領域の部分塩基配列がＯLＬＷＲＯRである核酸分子、部分塩基配列がＯLＬＭＲＯRである核酸分子との複合体とを考える。各複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨ、ΔＳは、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（ΔＳW/W，ΔＨW/W）と、（ΔＳM/W，ΔＨM/W）と表示される。図６に示すように、この二点と、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を結ぶ直線の傾きが、それぞれの融解温度Ｔｍとなっている。その際、両者の差違：（ΔＳSNP（Ｗ／Ｗ→Ｍ／Ｗ）、ΔＨSNP（Ｗ／Ｗ→Ｍ／Ｗ））は、ＳＮＰ部位とその近接塩基からなる部分塩基配列；ＬＷＲとＬＭＲと、プローブの対応部位の部分配列；ＬＷＲによって支配されている。一方、（ΔＳW/W，ΔＨW/W）と、（ΔＳM/W，ΔＨM/W）自体は、ｎｋ≫３の条件では、この変異領域の上流部、下流部の塩基配列；ＯLとＯRの寄与がその主要部分となっている。
【０１０７】
すなわち、ＳＮＰ部位（Ｖi）とその近接塩基からなる部分塩基配列；ＬＶiＲに対して、プローブの対応部位の部分塩基配列；ＬＶjＲを選択すると、ＬＶiＲの部分塩基配列が、ＬＶjＲと完全に相補的である場合、その融解温度Ｔｍは極大を示す。その際、ＬＶiＲの部分塩基配列が、ＬＶjＲと完全に相補的でない場合、その融解温度は、低下する。その融解温度の低下量：ΔＴｍが大きい程、プローブの対応部位の部分塩基配列；ＬＶjＲに対して、ＳＮＰ部位（Ｖi）が、プローブの対応部位の塩基（Ｖj）と相補的か否かの判定がより高い確度で実施できる。
【０１０８】
一方、その融解温度Ｔｍ自体は、プローブの対応部位の部分塩基配列；ＬＶjＲの上流側、下流側に設ける塩基配列；ＯLとＯRのそれぞれの塩基長、ならびに、プローブ全体の塩基長；ｎｋを調節することで、一定の範囲で調節することが可能である。ＬＶiＲの部分塩基配列が、ＬＶjＲと完全に相補的である場合、プローブ全体の塩基長；ｎｋを１７〜３０Ｍｅｒの範囲に選択すると、その複合体の融解温度Ｔｍを、５０℃以上７０℃以下の範囲に調節することが可能である。
【０１０９】
ＬＶiＲとＬＶjＲの組み合わせについて、上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択して、実際に、複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨij、ΔＳijを推定計算して、Ｔｍijを推定する。その後、ＬＶiＲがＬＶjＲと完全に相補的である場合のＴｍijと、ＬＶiＲがＬＶjＲとが相補的でない場合のＴｍijとの差、ΔＴｍを算出する。従来の手法は、ＬＶiＲがＬＶjＲと完全に相補的である場合のＴｍijと、プローブ・ハイブリダイゼーション温度：ＴHとが、（Ｔｍij−ＴH）≒1/2（ΔＴｍ）の関係を満足するように、ＯLとＯRの選択を調節する手法であった。この従来の手法では、プローブの塩基配列：ＯLＬＶＲＯRの最適化を計る上では、相当の量の推定計算が必要となっていた。
【０１１０】
本発明では、検出すべきＳＮＰ部位（Ｖi）とその近接塩基の「可能な部分塩基配列」；ＬＶiＲに基づき、各ＬＶiＲの選択的な検出に適する、プローブの対応部位の部分塩基配列；；ＬＶjＲを予め選択する。その後、このＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択して、検出対象のＬＶiＲを含む一本鎖核酸分子と形成する複合体の融解温度Ｔｍが、（Ｔｍ−ＴH）≒1/2（ΔＴｍ）を満足するようにする。このように、二段階のプローブ塩基配列の最適化を行うため、従来の手法と比較して、格段に少ない推定計算量によって、温度：ＴHにおいて、対象のＳＮＰ部位（Ｖi）を高い選択性で検出可能なプローブを設計することができる。
【０１１１】
以下に、検出すべきＳＮＰ部位（Ｖi）とその近接塩基の「可能な部分塩基配列」；ＬＶiＲとして、ＬＷＲとＬＭＲの二種（Ｎｖａｒ＝２）を例に挙げて、本発明の手法を具体的に説明する。
【０１１２】
（ステップ１）
プローブの対応部位の部分塩基配列の候補を、ＬＶjＲと示す。その際、変異部位に対応するＶｊの候補として、４種の塩基：Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、Ｃを考慮する。すなわち、プローブの対応部位の「可能な部分塩基配列」；ＬＶjＲの種類ＮVPを、ＮVP＝４とする。これら４種のＬＶjＲを内在するプローブと、変異部位として、ＬＷＲとＬＭＲの二種をそれぞれ別個に有する一本鎖との複合体形成に付随する熱力学パラメータの変化量の差分：ΔＨVar、ΔＳVarを推定計算する。
【０１１３】
ΔＨVar（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）≡ΔＨM/Vj−ΔＨW/Vj
＝｛ΔＨM/Vj（ｋ−１）＋ΔＨM/Vj（ｋ）＋ΔＨM/Vj（ｋ＋１）｝−｛ΔＨW/Vj（ｋ−１）＋ΔＨW/Vj（ｋ）＋ΔＨW/Vj（ｋ＋１）｝      （式１−１）
ΔＳVar（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）≡ΔＳM/Vj−ΔＳW/Vj
＝｛ΔＳM/Vj（ｋ−１）＋ΔＳM/Vj（ｋ）＋ΔＳM/Vj（ｋ＋１）｝−｛ΔＳW/Vj（ｋ−１）＋ΔＳW/Vj（ｋ）＋ΔＳW/Vj（ｋ＋１）｝      （式１−２）
（ステップ２）
ハイブリダイゼーション温度：ＴHと同じ温度の融解温度Ｔｍを示す条件を考慮する。例えば、ＴH＝５０℃とすると、絶対温度に換算すると、ＴH＝３２３Ｋとなる。Ｔｍ＝ＴH＝３２３Ｋを示す上では、複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨ、ΔＳは、下記の条件式を満足する必要がある。
【０１１４】
ΔＨ＝ＴH・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
図７に示す（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、前記の直線の傾きを表す単位ベクトル：ｕを考える。この単位ベクトル：ｕは、以下のように記述できる。
【０１１５】
ｕ＝｛1/√（１＋ＴH2）｝（１，ＴH）＝｛1/norm｝（１，ＴH）
この単位ベクトル：ｕと直交する単位ベクトル：ｎを、下記のように定義する。
【０１１６】
ｎ＝｛1/norm｝（−ＴH，１）
ＬＶjＲを対応部位の部分塩基配列とするプローブと、ＳＮＰ部位（Ｖi）とその近接塩基からなる変異領域；ＬＷＲとＬＭＲをそれぞれ別個に含む一本鎖核酸分子の複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量を考える。それぞれ、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（ΔＳW/Vj，ΔＨW/Vj）、（ΔＳM/Vj，ΔＨM/Vj）となる。その融解温度は、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）と（ΔＳW/Vj，ΔＨW/Vj）を結ぶ直線の傾き：ｔａｎΘW、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）と（ΔＳM/Vj，ΔＨM/Vj）を結ぶ直線の傾き：ｔａｎΘMで与えられる。
【０１１７】
従って、その融解温度の差違：ΔＴｍは、図６に示すように、下記の式で示される。
【０１１８】
ΔＴｍ＝Ｔｍ（Ｗ/Ｖj）−Ｔｍ（Ｍ/Ｖj）
＝ｔａｎΘW−ｔａｎΘM
仮に、ハイブリダイゼーション温度：ＴHを下記のように設定する。
【０１１９】
ＴH＝ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝
その際、（ΘW−ΘM）≪ΘM＜ΘWであるとすると、下記の条件を満たすものとなっている。
【０１２０】
（Ｔｍ（Ｗ/Ｖj）−ＴH）≒（ＴH−Ｔｍ（Ｍ/Ｖj））≒1/2（ΔＴｍ）
（ステップ３）
（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を起点とする、ベクター（ΔＳM/Vj＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨM/Vj）と（ΔＳW/Vj＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨW/Vj）の差ベクトル：ｖを考える。この差ベクトル：ｖは、下記のように与えられる。
【０１２１】
ｖ＝（｛ΔＳM/Vj−ΔＳW/Vj｝，｛ΔＨM/Vj−ΔＨW/Vj｝）
＝（ΔＳVar（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj），ΔＨVar（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj））
一方、ベクター（ΔＳM/Vj＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨM/Vj）と（ΔＳW/Vj＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨW/Vj）の長さと、差ベクトル：ｖの長さを比較する。差ベクトル：ｖの長さが、ベクター（ΔＳM/Vj＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨM/Vj）と（ΔＳW/Vj＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨW/Vj）の長さよりも十分に短いと、（ΘW−ΘM）≪ΘM＜ΘWである条件が満足される。
【０１２２】
さらに、差ベクトル：ｖの単位ベクトルｎ方向の成分ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）を考える。ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）は、差ベクトル：ｖの単位ベクトルｎの内積として、下記のように与えられる。
【０１２３】
ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）＝ｖ・ｎ
＝｛1/norm｝・（ΔＨVar(W/Vj→M/Vj)−ＴH・ΔＳVar(W/Vj→M/Vj)）  （式２）
さらには、（ΘW−ΘM）≪ΘM＜ΘWである条件下では、
ΔＴｍ  ∝  ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）
という比例関係もほぼ成り立っている。従って、ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値を指標として、ΔＴｍの大小関係を見積もることが可能である。
【０１２４】
図８に、ＬＷＲとＬＭＲの二種の全ての組み合わせについて、ＬＶjＲの4通りに関して、ＴH＝３２３Ｋにおける、ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値を推定計算した結果をまとめて示す。
【０１２５】
プローブの対応部位の「可能な部分塩基配列」；ＬＶjＲ全てについて、ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値を算出する。このＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値が、正である場合、Ｔｍ（Ｗ/Ｖj）＞Ｔｍ（Ｍ/Ｖj）であることを示す。逆に、ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値が、負である場合、Ｔｍ（Ｗ/Ｖj）＜Ｔｍ（Ｍ/Ｖj）であることを示す。
【０１２６】
従って、ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値が、正であり、最大の値を示す、ＬＶjＲを対応部位とするプローブは、変異領域；ＬＷＲを含む一本鎖核酸分子を選択的に検出するアンチセンス鎖型のプローブとなる。逆に、ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値が、負であり、最大の絶対値を示す、ＬＶjＲを対応部位とするプローブは、変異領域；ＬＭＲを含む一本鎖核酸分子を選択的に検出するアンチセンス鎖型のプローブとなる。
【０１２７】
図８のＡ＆Ｔで記載されたカラムについての具体例で説明すると、Ａ＆Ｔとして囲まれたカラム内は、Ａ/Ｔ多型が、Ｌ、Ｒとしてそれぞれ左コラムに示されているような組合せで存在する場合に、塩基Ａ→Ｔの変化に対してプローブ側の塩基ＶがＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃである場合のＩＰ値を示している。なお、Ｔ→Ａの場合は符号が逆になるが同じ値を示す。ここで、Ｖ＝Ａに対するプローブとしては、ＩＰ値が最も小さくなるＶを選択する必要がある。そこで、図８から、Ｒ及びＬのすべての組みあわせに対してＶ＝Ｔとなる場合が最もＩＰ値が小さくなっており、プローブ側にＴが選択できる。逆にＶ＝Ｔに対するプローブはＩＰ値が最も大きくなるものを選択する必要があり、この場合は、すべてのＲ及びＬの組みあわせに対してプローブ側にＶ＝Ａとなる場合が選択できる。
【０１２８】
また、図８のＩＰ値等を利用することによって、同一核酸配列中に一塩基多型部分が複数ある場合にプローブセットの配列を選択する上で、すなわち、どの一塩基多型部分を選択すると、より効果的に変異を区別できるかについての情報を効率良く獲得可能である。
【０１２９】
（ステップ４）
上記のステップ１〜ステップ３では、検出対象の一本鎖核酸分子は、センス鎖であり、変異部位として、ＬＷＲとＬＭＲの二種を仮定している。場合によっては、検出対象の一本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖であり、その変異部位として、ＬＷＲとＬＭＲの二種を仮定することもある。すなわち、検出対象の一本鎖核酸分子は、センス鎖であるｍＲＮＡを鋳型として、その相補鎖として調製されたｃＤＮＡである場合である。
【０１３０】
このアンチセンス鎖型の変異部位；ＬＷＲとＬＭＲを別個に有する検出対象の一本鎖核酸分子に対しては、センス鎖型のプローブの対応部位の「可能な部分塩基配列」；ＬＶjＲを用いる。上記のステップ１〜ステップ３の手順に従って、同様の選択作業を進め、アンチセンス鎖型の変異部位；ＬＷＲ、あるいはＬＭＲを含む一本鎖核酸分子を選択的に検出するセンス鎖型のプローブの対応部位ＬＶjＲを決定する。
【０１３１】
（ステップ５）
一方、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（ΔＳW/Vj，ΔＨW/Vj）と（ΔＳM/Vj，ΔＨM/Vj）を結ぶ線分上に位置する（ΔＳ,ΔＨ）と（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通る直線を考える。この直線の傾き；ｔａｎΘは、下記の範囲となる。
【０１３２】
ｔａｎΘW＞ｔａｎΘ＞ｔａｎΘM
（ΔＳW/Vj，ΔＨW/Vj）と（ΔＳM/Vj，ΔＨM/Vj）を結ぶ線分の中点（ΔＳC,ΔＨC）と、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通る直線の傾き；ｔａｎΘCは、（ΘW−ΘM）≪ΘM＜ΘWの条件下では、下記のように近似できる。
【０１３３】
ｔａｎΘC≒ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝≒1/2｛ｔａｎΘW＋ｔａｎΘM｝
この中点（ΔＳC,ΔＨC）と、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通る直線は、下記のように記述される。なお、ｔａｎΘC＝ＴCと表記する。
【０１３４】
ΔＨ＝ｔａｎΘC・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
＝ＴC・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
また、中点（ΔＳC,ΔＨC）は、（ΔＳW/Vj，ΔＨW/Vj）と（ΔＳM/Vj，ΔＨM/Vj）を用いて、下記のように表記される。
【０１３５】
ΔＳC＝1/2｛ΔＳW/Vj＋ΔＳM/Vj｝
ΔＨC＝1/2｛ΔＨW/Vj＋ΔＨM/Vj｝
なお、ΔＳVar（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）＝｛ΔＳM/Vj−ΔＳW/Vj｝；
ΔＨVar（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）＝｛ΔＨM/Vj−ΔＨW/Vj｝であり、これを用いると、中点（ΔＳC,ΔＨC）は、下記のように表記される。
【０１３６】
ΔＳC＝ΔＳW/Vj＋1/2・ΔＳVar（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）
ΔＨC＝ΔＨW/Vj＋1/2・ΔＨVar（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）
変異部位：ＬＷＲを含むＯLＬＷＲＯRの領域を有する一本鎖核酸分子（野生型）と、塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRのプローブの複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨW/Vj、ΔＳW/Vjを実際に推定計算する。
【０１３７】
野生型のＯLＬＷＲＯRの領域に対しては、それを選択的に検出するプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRは、完全に相補的な塩基配列：ＯLＬＷＲＯRが選択されている。この塩基配列：ＯLＬＷＲＯRの長さｎｐを、ｎｐ＝ｎｐmin〜ｎｐmaxの範囲とする。変異部位に対応するＬＷＲは、ここでは、Ｌ，Ｍは、一塩基（ｆ＝１）であり、ＳＮＰ部位も一塩基であり、全体で、（ｆ＋１＋ｆ）＝３塩基の長さとなる。従って、ＬＷＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRの長さを併せると、（ｎｐ−３）塩基となる。また、変異部位に対応するＬＷＲは、該プローブの末端に位置しないようにする。すなわち、ＯLとＯRの長さは、１塩基以上とする。従って、ＯLとＯRの長さの組み合わせ（ＯL，ＯR）は、（１，（ｎｐ−３）−１），…，（（ｎｐ−３）−１，１）の（ｎｐ−３）−１通りとなる。
【０１３８】
このＯLＬＷＲＯR／ＯLＬＷＲＯRの完全マッチする複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨW/W、ΔＳW/Wの推定計算は、図３に例示する手法を用いて行われる。プローブの長さｎｐ（ｎｐ＝ｎｐmin〜ｎｐmax）毎に、ＯLとＯRの長さの組み合わせ；（１，（ｎｐ−３）−１），…，（（ｎｐ−３）−１，１）の順に従って、ＯLとＯRの塩基配列候補の全てについて、ΔＨW/W、ΔＳW/Wの推定計算を行う。推定計算される（ΔＳW/W、ΔＨW/W）は、（ΔＳW/W（ｎｐ，１）、ΔＨW/W（ｎｐ，１）），…，（ΔＳW/W（ｎｐ，ｎｐ−４）、ΔＨW/W（ｎｐ，ｎｐ−４））（但し、ｎｐ＝ｎｐmin〜ｎｐmax）という、マトリクス状の点列となる。
【０１３９】
同様に、変異部位：ＬＭＲを含むＯLＬＭＲＯRの領域を有する一本鎖核酸分子（変異型）と、塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRのプローブの複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨM/Vj、ΔＳM/Vjを実際に推定計算する。
【０１４０】
変異型のＯLＬＭＲＯRの領域に対しては、それを選択的に検出するプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRは、完全に相補的な塩基配列：ＯLＬＭＲＯRが選択されている。従って、ＯLＬＭＲＯR／ＯLＬＭＲＯRの完全マッチする複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨM/M、ΔＳM/Wの推定計算を行う。推定計算される（ΔＳM/M、ΔＨM/M）は、（ΔＳM/M（ｎｐ，１）、ΔＨM/M（ｎｐ，１）），…，（ΔＳM/M（ｎｐ，ｎｐ−４）、ΔＨM/M（ｎｐ，ｎｐ−４））（但し、ｎｐ＝ｎｐmin〜ｎｐmax）という、マトリクス状の点列となる。
【０１４１】
（ステップ６）
ハイブリダイゼーション温度：ＴHに対して、（ΘW−ΘM）≪ΘM＜ΘWの条件下で、下記の条件を満たすように、プローブの対応部位の部分塩基配列；ＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択する手法を説明する。
【０１４２】
ＴH＝ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝
上記の条件は、（ΘW−ΘM）≪ΘM＜ΘWの条件下では、下記の条件とほぼ等価な条件である。
【０１４３】
ＴH≒1/2｛ｔａｎΘW＋ｔａｎΘM｝
一方、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通り、傾き：ＴHの直線は、下記の式で表記される。
【０１４４】
ΔＨ＝ＴH・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕      （式３）
先に計算された（ΔＳW/W、ΔＨW/W）のマトリクス状の点列に対して、対応する点（ΔＳM/W、ΔＨM/W）と結ぶ線分の中点（ΔＳC（LWR:np,l）,ΔＨC（LWR:np,l））は、下記のように表記できる。
【０１４５】
ΔＳC（LWR:np,l）＝ΔＳW/W（np,l）＋1/2・ΔＳVar（Ｗ/Ｗ→Ｍ/Ｗ）
ΔＨC（LWR:np,l）＝ΔＨW/W（np,l）＋1/2・ΔＨVar（Ｗ/Ｗ→Ｍ/Ｗ）
（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（ΔＳC（LWR:np,l）,ΔＨC（LWR:np,l））と、上記（式３）で示す直線との距離を考える。
【０１４６】
（ΔＳC（LWR:np,l）,ΔＨC（LWR:np,l））から（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）へのベクトル：ｖC（LWR:np,l）を考える。このベクトル：ｖC（LWR:np,l）の、上記（式３）で示す直線と直交する単位ベクトルｎ方向成分が、（ΔＳC（LWR:np,l）,ΔＨC（LWR:np,l））と、上記（式３）で示す直線との距離：Ｌｅｎ（LWR:np,l）に相当する。
【０１４７】
（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、ベクトル：ｖC（LWR:np,l）は、下記のように表記できる。
【０１４８】
ｖC(LWR:np,l)＝（−Ｒ・ｌｎ(Ｃ/４)−ΔＳC(LWR:np,l)，−ΔＨC(LWR:np,l)）
従って、Ｌｅｎ（LWR:np,l）は、ｖC（LWR:np,l）と単位ベクトルｎとの内積の絶対値を用いて、下記のように求めることができる。
【０１４９】
Ｌｅｎ（LWR:np,l）＝｜ｖC（LWR:np,l）・ｎ｜
＝｜｛1/norm｝（ＲＴH・ｌｎ（Ｃ／４）＋ＴHΔＳC（LWR:np,l）−ΔＨC（LWR:np,l））｜
この距離Ｌｅｎ（LWR:np,l）が最小となるものから最大となるものまで順序付けし、その順序に従って、（ΔＳC（LWR:np,l）,ΔＨC（LWR:np,l））をリストアップする。そして、該リストアップされた（ΔＳC（LWR:np,l）,ΔＨC（LWR:np,l））を与えている、（ΔＳW/W（np,l）、ΔＨW/W（np,l））を同じ順序でリストアップする。
【０１５０】
また、リストアップされた（ΔＳC（LWR:np,l）,ΔＨC（LWR:np,l））と、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通る直線の傾き：ｔａｎΘC（LWR:np,l）を、下記の式に基づき求める。
【０１５１】
ΔＨC（LWR:np,l）＝ｔａｎΘC（LWR:np,l）・〔ΔＳC（LWR:np,l）＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
前記のリストアップ順序に従って、求められたｔａｎΘC（LWR:np,l）を、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝と比較して、最も近い値を示すものから、その順序に従って、再リストアップを行う。
【０１５２】
具体的には、距離Ｌｅｎ（LWR:np,l）が同じ場合、プローブの長さｎｐが長いものの方が、算定されるｔａｎΘC（LWR:np,l）は、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝と近い値を示す。加えて、距離Ｌｅｎ（LWR:np,l）とプローブの長さｎｐが同じ場合、実際に算定されるｔａｎΘC（LWR:np,l）と、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝との詳細な比較によって、より好ましいものを選択する必要がある。実際には、距離Ｌｅｎ（LWR:np,l）が僅かに異なる場合、プローブの長さｎｐが長いものの方が、算定されるｔａｎΘC（LWR:np,l）は、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝と近い値を示すことが少なくない。
【０１５３】
以上の点を考慮し、距離Ｌｅｎ（LWR:np,l）の比較に基づき、その最小のものから、各プローブ長さｎｐ毎に、二つの候補をリストアップすることに相当する候補数をリストアップする。具体的には、（ｎｐmax−ｎｐmin）〜２（ｎｐmax−ｎｐmin）個程度の範囲で、距離Ｌｅｎ（LWR:np,l）が、最小のものと同程度の水準にあるものを候補としてリストアップすることが好ましい。
【０１５４】
そのリストアップされたものに関して、算定されるｔａｎΘC（LWR:np,l）と、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝との対比を行って、その比較結果に基づき、その順序に従って、再リストアップを行う。
【０１５５】
上記の距離Ｌｅｎ（LWR:np,l）が小さなものとしてリストアップされるプローブ候補は、目標とするハイブリダイゼーション温度：ＴHで、対象とする野生型の一本鎖核酸分子とのみ選択的に複合体形成を行う。従って、対象とする野生型の一本鎖核酸分子を、変異型の一本鎖核酸分子から、高い確度で分離する目的により適するプローブ候補となる。
【０１５６】
同様に、先に計算された（ΔＳM/M、ΔＨM/M）のマトリクス状の点列に対して、対応する点（ΔＳW/M、ΔＨW/M）と結ぶ線分の中点（ΔＳC（LMR:np,l）,ΔＨC（LMR:np,l））下記のように表記できる。
【０１５７】
ΔＳC（LMR:np,l）＝ΔＳM/M（np,l）−1/2・ΔＳVar（Ｍ/Ｍ→Ｗ/Ｍ）
ΔＨC（LMR:np,l）＝ΔＨM/M（np,l）−1/2・ΔＨVar（Ｍ/Ｍ→Ｗ/Ｍ）
（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（ΔＳC（LMR:np,l）,ΔＨC（LMR:np,l））と、上記（式３）で示す直線との距離を考える。
【０１５８】
上記の手順に準じて、距離Ｌｅｎ（LMR:np,l）が最小となるものから最大となるものまで順序付けし、その順序に従って、（ΔＳC（LMR:np,l）,ΔＨC（LMR:np,l））をリストアップする。そして、該リストアップされた（ΔＳC（LMR:np,l）,ΔＨC（LMR:np,l））を与えている、（ΔＳM/M（np,l）、ΔＨM/M（np,l））を同じ順序でリストアップする。
【０１５９】
また、リストアップされた（ΔＳC（LMR:np,l）,ΔＨC（LMR:np,l））と、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通る直線の傾き：ｔａｎΘC（LMR:np,l）を、下記の式に基づき求める。
【０１６０】
ΔＨC（LMR:np,l）＝ｔａｎΘC（LMR:np,l）・〔ΔＳC（LMR:np,l）＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
前記のリストアップ順序に従って、求められたｔａｎΘC（LMR:np,l）を、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝と比較して、最も近い値を示すものから、その順序に従って、再リストアップを行う。
【０１６１】
上記の距離Ｌｅｎ（LMR:np,l）が小さなものとしてリストアップされるプローブ候補は、目標とするハイブリダイゼーション温度：ＴHで、対象とする変異型の一本鎖核酸分子とのみ選択的に複合体形成を行う。従って、対象とする変異型の一本鎖核酸分子を、変異型の一本鎖核酸分子から、高い確度で分離する目的により適するプローブ候補となる。
【０１６２】
（ステップ７）
上記のステップ５〜ステップ６では、検出対象の一本鎖核酸分子は、センス鎖であり、変異部位として、ＬＷＲとＬＭＲの二種を仮定している。場合によっては、検出対象の一本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖であり、その変異部位として、ＬＷＲとＬＭＲの二種を仮定することもある。すなわち、検出対象の一本鎖核酸分子は、センス鎖であるｍＲＮＡを鋳型として、その相補鎖として調製されたｃＤＮＡである場合である。
【０１６３】
このアンチセンス鎖型の変異部位；ＬＷＲとＬＭＲを別個に有する検出対象の一本鎖核酸分子に対しては、ステップ４で選択される、センス鎖型のプローブの対応部位；ＬＶjＲを用いる。その上で、上記のステップ５〜ステップ６の手順に従って、同様の選択作業を進め、アンチセンス鎖型の変異部位；ＬＷＲ、あるいはＬＭＲを含む一本鎖核酸分子を選択的に検出するセンス鎖型のプローブ候補を決定する。すなわち、センス鎖型のプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRに関して、ＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRの組み合わせの候補を選択する。
【０１６４】
このステップ５〜ステップ７において、共通のハイブリダイゼーション温度：ＴHを目標として、プローブ候補の選択がなされている。従って、上記の条件（２）を満足するプローブ候補の選択がなされている。
【０１６５】
（ステップ８）
上記の一つの変異箇所：Ｖ（ｈ）を含む変異領域ＬＶ（ｈ）Ｒに関して、検出対象の一本鎖核酸分子が、センス鎖型、アンチセンス鎖型の双方について、それぞれ適するプローブ候補がリストアップされる。
【０１６６】
このリストアップされたプローブ候補に対して、次の観点で更に、選別を加える。
【０１６７】
先ず、プローブ・ハイブリダイゼーション法を適用する検出では、プローブを固定化した上で、検出対象の一本鎖核酸分子と複合体形成を行うことが一般的である。そのため、プローブの５’末端、または、３’末端において、固相表面にプローブを結合する。その状況下では、固相表面と一本鎖核酸分子との相互作用、あるいは、固相表面に近接するプローブの先端部位の自由度の低下などの影響が、この先端部における塩基対形成の効率を低下させる場合がある。従って、プローブの対応部位；ＬＶ（ｈ）Ｒが、この固定端にあまりに近接すると、対象とする一本鎖核酸分子と複合体形成の効率の低下が引き起こされることが懸念される。その点を考慮すると、プローブの対応部位；ＬＶ（ｈ）Ｒは、その末端部にあまりに近接していないものを選択することが望ましい。
【０１６８】
具体的には、プローブの対応部位；ＬＶ（ｈ）Ｒは、その末端から、５塩基以上離れた位置とすることが好ましい。換言するならば、例えば、アンチセンス鎖型のプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRにおいて、ＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRの長さは、５塩基以上に選択することが好ましい。また、センス鎖型のプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRにおいても、ＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRの長さは、５塩基以上に選択することが好ましい。
【０１６９】
加えて、このプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯR自体が、偶々、他の変異を示さない領域と相同性が高くなる場合もある。その場合、ＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択する際、他の領域との相同性を可能な限り低下させる選択を行うことが必要となる。但し、ＬＶjＲの部位自体は変更できないため、例えば、上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択する際、他の領域と一致する塩基数を可能な限り低下するようにする。リストアップされたプローブ候補の内から、この条件に基づき、より好ましいものを選択する。
【０１７０】
その他、プローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯR自体が、偶々、高次構造を形成が可能な塩基配列となる場合もある。具体的には、プローブの塩基配列の５’末端側の部分塩基配列と、３’末端側の部分塩基配列とが互いに相補的なものとなる場合がある。但し、ＬＶjＲの部位自体は変更できないため、例えば、上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択する際、前記の相補的な部分塩基配列部分において、形成可能な塩基対の数を可能な限り減少させることが望ましい。
【０１７１】
上記の付加的な制約条件を考慮した上で、リストアップされたプローブ候補の内から、算定されるｔａｎΘC（LWR:np,l）が、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（ΘW＋ΘM）/２｝とより近い値を示すものを選択することが好ましい。
【０１７２】
（ステップ９）
同時に検出を行う、変異箇所：Ｖ（ｈ）の総数は、ＮTOTALである場合、各変異箇所：Ｖ（ｈ）について、上記のステップ１〜ステップ８の操作を繰り返す。
【０１７３】
その際、ステップ５〜ステップ７において、各変異箇所：Ｖ（ｈ）における各アレルの変異部位（ＬＷＲとＬＭＲ）の選択的な検出に用いるプローブ候補を選択する際、目標とするハイブリダイゼーション温度：ＴHを共通とする。この条件を設定することで、上記の条件（２）は、各変異箇所：Ｖ（ｈ）においても、満足されるものとなる。
【０１７４】
その結果、各変異箇所：Ｖ（ｈ）に対して、それぞれ選択されたプローブを、一組として、プローブセットとする。
【０１７５】
（第二の実施形態）
一塩基多型では、変異箇所：Ｖ（ｈ）において、野生型の塩基Ｗと、変異型の塩基Ｍとの間で、Ｗ⇔Ｍの変換が生じている。
【０１７６】
遺伝子の多型の要因として、変異箇所：Ｖ（ｈ）において、野生型の塩基Ｗが、変異型においては、一塩基欠失を起こしている場合への適用を説明する。この一塩基欠失の場合、この変異箇所：Ｖ（ｈ）よりも、下流側では、フレーム・シフトが生じ、コードされるアミノ酸配列は、全く異なったものとなる。例えば、野生型では、ＡＧＣ-ＴＴＡ-ＧＣＴ-Ａ  （−Ser-Leu-Ala-）の部分において、一塩基欠失により、ＴＴＡ⇒ＴＡへと変異がなされると、変異型では、ＡＧＣ-ＴＡＧ-ＣＴＡ  （−Ser-amber-Leu-）となる。すなわち、一塩基欠失により、フレーム・シフトが起こった結果、上流側から続く読み枠中に、終止コドン（amber）であるＴＡＧが生じ、これ以後の翻訳は停止する。
【０１７７】
この一塩基欠失を起こす変異箇所：Ｖ（ｈ）を検出するための、プローブの設計に本発明を適用する際には、野生型の塩基Ｗが、変異型の欠失塩基Ｘへと変換されたと見做し、上記の一塩基多型の手法を応用する。
【０１７８】
一塩基欠失を有する変異型のセンス鎖の変異部位の部分塩基配列は、ＬＸＲと表記し、一方、野生型のセンス鎖の変異部位の部分塩基配列は、ＬＷＲとなる。このＬＷＲを含む、ＯLＬＷＲＯRの部分塩基配列の領域に、対応部位として、ＬＸＲを含む、ＯLＬＸＲＯRの塩基配列を有するプローブが複合体形成する過程を考える。その場合、塩基対の形成は、互いに相補的な塩基配列を有する、上流側のＯL／ＯLと、下流側のＯR／ＯRとの間で先行する。最終的に、ＬＷＲとＬＸＲの変異部位が残され、この部位で相対的に熱的な安定性が劣る塩基対の形成が起こる。一般的に、ＬＷＲとＬＲの間で塩基対を形成する際には、Ｌ／ＬとＲ／Ｒの塩基対が同時に安定して形成されることは無く、いずれか一方は、不安定な塩基対となる。例えば、図９に例示するような変異部位に関して、複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＧ、ΔＨ、ΔＳを、ＮＮモデルを適用して、近似計算する。
【０１７９】
その際、この変異部位が関与する部分は、下記のように表記できる。
【０１８０】
ΔＧtotal＝…＋ΔＧW/X（ｋ−１）＋ΔＧW/X（ｋ）＋ΔＧW/X（ｋ＋１）＋…
＝…＋ΔＧCTA/GAX＋ΔＧTAG/AXC＋ΔＧAGC/XCG＋…
一塩基多型の場合、ミスマッチ塩基を考慮したＮＮパラメータとして、ΔＧCTA/GAA、ΔＧTAG/AAC、ΔＧAGC/ACGなどが定義されている。一塩基欠失の場合、欠失塩基Ｘを考慮したＮＮパラメータとして、ΔＧCTA/GAX、ΔＧTAG/AXC、ΔＧAGC/XCGなどを対応させて定義する。そのＮＮパラメータを利用することで、上記の一塩基多型の手法と同様の取り扱いが可能となる。
【０１８１】
例えば、図９に例示する一塩基欠失においては、欠失塩基Ｘを考慮したＮＮパラメータは、下記のように考えることもできる。
【０１８２】
（ｋ−１）番目の塩基に関しては、センス鎖側は、ＣＴＡとして存在し、アンチセンス鎖側では、実際には、ＧＡＣとして存在している。その点を考慮すると、ＣＴＡ／ＧＡＣ間で、Ｔ／Ａの塩基対形成に付随する熱力学パラメータの変化量と見做すことも可能である。
【０１８３】
ΔＧW/X（ｋ−１）＝ΔＧCTA/GAX
≒ΔＧCTA/GAC
ｋ番目の塩基に関しては、センス鎖側は、ＴＡＧとして存在し、アンチセンス鎖側では、実際には、ＡＣＧとして存在している。その点を考慮すると、ＴＡＧ／ＡＣＧ間で、ミスマッチしている、Ａ／Ｃの塩基の近接に付随する熱力学パラメータの変化量と見做すことも可能である。
【０１８４】
ΔＧW/X（ｋ）＝ΔＧTAG/AXC
≒ΔＧTAG/ACG
（ｋ＋１）番目の塩基に関しては、センス鎖側は、ＡＧＣとして存在し、アンチセンス鎖側では、実際には、ＡＣＧとして存在している。その点を考慮すると、ＡＧＣ／ＡＣＧ間で、Ｇ／Ｃの塩基対形成に付随する熱力学パラメータの変化量と見做すことも可能である。
【０１８５】
ΔＧW/X（ｋ＋１）＝ΔＧAGC/XCG
≒ΔＧAGC/ACG
遺伝子の多型の要因として、変異箇所：Ｖ（ｈ）において、野生型の塩基Ｗが、変異型においては、一塩基挿入が起き、ＭＷとなっている場合への適用を説明する。この一塩基挿入の場合も、この変異箇所：Ｖ（ｈ）よりも、下流側では、フレーム・シフトが生じ、コードされるアミノ酸配列は、全く異なったものとなる。例えば、野生型では、ＡＧＣ-ＴＧＣ-ＧＣＡ  （−Ser-Cys-Ala-）の部分において、一塩基挿入により、ＴＧＣ⇒ＴＡＧＣへと変異がなされると、変異型では、ＡＧＣ-ＴＡＧ-ＣＧＣ-Ａ  （−Ser-amber-Agr-）となる。すなわち、一塩基挿入により、フレーム・シフトが起こった結果、上流側から続く読み枠中に、終止コドン（amber）であるＴＡＧが生じ、これ以後の翻訳は停止する。
【０１８６】
この一塩基挿入を起こす変異箇所：Ｖ（ｈ）を検出するための、プローブの設計に本発明を適用する際には、野生型の塩基Ｗが、変異型の二塩基ＭＷへと変換されたと見做し、上記の一塩基多型の手法を応用する。
【０１８７】
一塩基挿入を有する変異型のセンス鎖の変異部位の部分塩基配列は、ＬＭＷＲと表記し、一方、野生型のセンス鎖の変異部位の部分塩基配列は、ＬＷＲとなる。このＬＷＲを含む、ＯLＬＷＲＯRの部分塩基配列の領域に、対応部位として、ＬＭＷＲを含む、ＯLＬＭＷＲＯRの塩基配列を有するプローブが複合体形成する過程を考える。その場合、塩基対の形成は、互いに相補的な塩基配列を有する、上流側のＯL／ＯLと、下流側のＯR／ＯRとの間で先行する。最終的に、ＬＷＲとＬＭＷＲの変異部位が残され、この部位で相対的に熱的な安定性が劣る塩基対の形成が起こる。一般的に、ＬＷＲとＬＭＷＲの間で塩基対を形成する際には、Ｌ／Ｌ、Ｗ／Ｗ、Ｒ／Ｒの塩基対が同時に安定して形成されることは無く、いずれかは、不安定な塩基対となる。例えば、複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＧ、ΔＨ、ΔＳを、ＮＮモデルを適用して、近似計算する。
【０１８８】
一塩基挿入の場合、挿入塩基ＭＷを考慮したＮＮパラメータとして、ΔＧCLW/GLMW、ΔＧLWR/LMWR、ΔＧWRC/MWRGなどを対応させて定義する。そのＮＮパラメータを利用することで、上記の一塩基多型の手法と同様の取り扱いが可能となる。
【０１８９】
その際、この変異部位が関与する部分は、下記のように表記できる。
【０１９０】
ΔＧtotal＝…＋ΔＧW/MW（ｋ−１）＋ΔＧW/MW（ｋ）＋ΔＧW/MW（ｋ＋１）＋…
＝…＋ΔＧCLW/GLMW＋ΔＧLWR/LMWR＋ΔＧWRC/MWRG＋…
例えば、挿入塩基Ｍを考慮したＮＮパラメータは、下記のように考えることもできる。
【０１９１】
（ｋ−１）番目の塩基に関しては、センス鎖側は、ＣＬＷとして存在し、アンチセンス鎖側では、実際には、ＧＬＭとして存在している。その点を考慮すると、ＣＬＷ／ＧＬＭ間で、Ｌ／Ｌの塩基対形成に付随する熱力学パラメータの変化量と見做すことも可能である。
【０１９２】
ΔＧW/MW（ｋ−１）＝ΔＧCLW/GLMW
≒ΔＧCLW/GLM
ｋ番目の塩基に関しては、センス鎖側は、ＬＷＲとして存在し、アンチセンス鎖側では、実際には、ＭＷＲとして存在している。その点を考慮すると、ＬＷＲ／ＭＷＲ間で、Ｗ／Ｗの塩基対形成に付随する熱力学パラメータの変化量と見做すことも可能である。
【０１９３】
ΔＧW/MW（ｋ）＝ΔＧLWR/LMWR
≒ΔＧLWR/MWR
（ｋ＋１）番目の塩基に関しては、センス鎖側は、ＷＲＣとして存在し、アンチセンス鎖側では、実際には、ＷＲＧとして存在している。その点を考慮すると、ＷＲＣ／ＷＲＧ間で、Ｒ／Ｒの塩基対形成に付随する熱力学パラメータの変化量と見做すことも可能である。
【０１９４】
ΔＧW/MR（ｋ＋１）＝ΔＧWRC/MWRG
≒ΔＧWRC/WRG
なお、上記のような近似を行うと、（ｋ＋１）番目の塩基に関する熱力学パラメータの変化量：ΔＧW/MR（ｋ＋１）には、挿入塩基Ｍの影響が見かけ上、反映されないものとなる。より近似の精度を増すため、センス鎖の塩基と、アンチセンス鎖の塩基間の相互作用を反映する熱力学パラメータの変化量の近似に、最近接塩基に加えて、その隣に存在する塩基の影響をも考慮に入れることが望ましい。すなわち、所謂、Ｎｅｘｔ−Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ近似に基づき、最近接塩基及びその隣の塩基（ｆ＝２）からの影響を考慮することが望ましい。
【０１９５】
（第３の実施形態）
以下に、遺伝子の多型として、変異部位が「一塩基多型」、一塩基欠失、挿入に限定されず、狭い領域において、複数の塩基の変異が生じている形態に、本発明を適用する手法を説明する。
【０１９６】
例えば、変異部位において、一つのアミノ酸をコードするコドンが、野生型のコドン：Ｗ1Ｗ2Ｗ3から、変異型のコドン：Ｒ1Ｒ2Ｒ3へと変異している場合を考える。その際、変異型のコドン：Ｍ1Ｍ2Ｍ3として、複数種が見出される場合がある。例えば、Ｌｅｕをコードするコドンとして、野生型のコドン：ＴＴＡが、変異型のコドンとして、ＴＴＧ，ＣＴＡ，ＣＴＣの三種が存在している場合を考慮する。すなわち、第一番目の塩基と、第三番目の塩基とが変異可能な部位となっているが、このコドン：Ｗ1Ｗ2Ｗ3全体を変異部位：Ｖ（ｈ）と見做して、本発明の方法を適用することができる。
【０１９７】
図１０に、この複数の塩基からなる変異部位：Ｖ（ｈ）を有する「多型」に適用するため、一般化を行った「プローブセットの設計操作」の流れをフローチャートにより示す。
【０１９８】
（ステップ０）
先ず、複数の塩基からなる変異部位：Ｖ（ｈ）において、この変異部位に見出される部分塩基配列：Ｖiは、上記の例のように既に判明しており、その種類の総数を、Ｎvarとする。すなわち、その種類の総数：Ｎvarは、野生型の部分塩基配列：１種類と、そのから変異を示す変異型の部分塩基配列：（Ｎvar−１）種類とからなっている。
【０１９９】
この部分塩基配列：Ｖiの塩基長は、例えば、上記の例では、野生型の部分塩基配列：Ｗ1Ｗ2Ｗ3から、変異型の部分塩基配列：Ｒ1Ｒ2Ｒ3へと変異がなされており、３塩基となる。実際には、第二番目の塩基は保存され、野生型のコドン：Ｗ1Ｗ2Ｗ3＝ＴＴＡから、変異型のコドン：Ｗ1Ｗ2Ｍ3型コドン；ＴＴＧ，Ｍ1Ｗ2Ｍ3型コドン；ＣＴＡ，ＣＴＣの三種への変異がなされており、Ｎvar＝４となっている。
【０２００】
変異部位が「一塩基多型」の場合、例えば、野生型の塩基：Ｗ（例えば、Ｔ）から、変異型の塩基：Ｍ1（Ｇ），Ｍ2（Ｃ）の二種へと変異がなされていると、Ｖiの塩基長は、１塩基である。また、可能性のある変異の数：Ｎvarは、Ｎvar＝３となる。
【０２０１】
「一塩基欠失」の場合、野生型の塩基：Ｗが、変異型の塩基配列中では欠失しているが、形式的に、「欠失塩基」Ｘに変異していると見做す。従って、Ｖiの塩基長は、１塩基とし、一方、可能性のある変異の数：Ｎvarは、Ｎvar＝２となる。
【０２０２】
「一塩基挿入」の場合、例えば、野生型の塩基：Ｗ（例えば、Ｔ）から、変異型の塩基配列中では、「ＭＷ」型の二塩基；Ｍ1Ｗ（ＧＴ），Ｍ2Ｗ（ＣＴ），Ｍ3Ｗ（ＴＴ）の三種へと変異がなされていると、Ｖｉの塩基長は、１塩基である。また、可能性のある変異の数：Ｎvarは、Ｎvar＝４となる。
【０２０３】
検出対象の一本鎖核酸分子の変異領域：ＬＶiＲに対して、複合体を形成させるプローブの対応領域：ＬＶjＲを考える。その際、プローブの変異対応部位：Ｖjに関して、以下の範囲を考慮する。
【０２０４】
変異部位が「一塩基多型」の場合、例えば、Ｖiが、野生型の塩基：Ｗ（例えば、Ｔ）、変異型の塩基：Ｍ1（Ｇ），Ｍ2（Ｃ）である場合、プローブの変異対応部位：Ｖjの塩基長は、１塩基とする。従って、Ｖjに置かれる可変塩基の数：ｋは、ｋ＝１とする。
【０２０５】
「一塩基挿入」の場合、例えば、Ｖiが、野生型の塩基：Ｗ（例えば、Ｔ）、変異型の「ＭＷ」型二塩基；Ｍ1Ｗ（ＧＴ），Ｍ2Ｗ（ＣＴ），Ｍ3Ｗ（ＴＴ）である場合、プローブの変異対応部位：Ｖjの塩基長は、１塩基と見做す。その際、Ｖjは、Ｗ（例えば、Ａ）、「ＭＷ」型二塩基として、４種（例えば、ＣＡ，ＧＡ，ＡＡ，ＴＡ）を考慮する。この「ＭＷ」型二塩基も、「１塩基」として取り扱い、Ｖjに置かれる可変塩基の数：ｋは、ｋ＝１とする。
【０２０６】
「一塩基欠失」の場合、例えば、Ｖiが、野生型の塩基：Ｗ（例えば、Ｔ）、変異型の「欠失塩基：Ｘ」である場合、プローブの変異対応部位：Ｖjの塩基長は、形式的に１塩基とする。実際に考慮するＶjは、Ｗ（例えば、Ａ）と、「欠失塩基：Ｘ」のみである。その際、Ｖjに置かれる可変塩基の数：ｋは、ｋ＝０とする。
【０２０７】
より一般的な場合、例えば、変異部位が、野生型のコドン：Ｗ1Ｗ2Ｗ3（ＴＴＡ）、変異型のコドン：Ｗ1Ｗ2Ｍ3型コドン（ＴＴＧ），Ｍ1Ｗ2Ｍ3型コドン（ＣＴＡ，ＣＴＣ）、Ｗ1Ｍ2Ｗ3型コドン（ＴＣＡ）である場合を考える。勿論、プローブの変異対応部位：Ｖjの塩基長は、３塩基である。一方、考慮すべきＶjは、「Ｗ1Ｗ2Ｖ3」型を含む「Ｖ1Ｗ2Ｖ3」型の部分塩基配列と、「Ｗ1Ｖ2Ｗ3」型の部分塩基配列となる。すなわち、Ｖjに置かれる可変塩基の数：ｋは、「Ｗ1Ｗ2Ｖ3」型を含む「Ｖ1Ｗ2Ｖ3」型ではｋ＝２、「Ｗ1Ｖ2Ｗ3」型ではｋ＝１となる。
【０２０８】
前記の例で示すように、野性型のＶiを基準として、変異型のＶiにおいて、変異が見出される塩基数を考え、その最小値をＭｉｎ（Ｖi）、最大値をＭａｘ（Ｖi）と定義する。その際、考慮すべきＶjに置かれる可変塩基の数：ｋは、この最小値：Ｍｉｎ（Ｖi）と最大値：Ｍａｘ（Ｖi）の間となり、ｋ＝Ｍｉｎ（Ｖi）〜Ｍａｘ（Ｖi）と表記できる。
【０２０９】
ハイブリダイゼーション反応によって、複数種の変異：Ｖi（ｉ＝Ｎvar）を同時に検出するために、利用されるプローブセットに対する必須条件は、次の二点である。
条件（１）  各Ｖi（ｉ＝Ｎvar）に対して、それ以外のＶi'との相違；ＬＶiＲとＬＶi'Ｒを効率よく見分けること。
条件（２）  複数種の変異：Ｖi（ｉ＝Ｎvar）の検出用のプローブの全てが、同じハイブリダイゼーション条件（温度）の下で、目的のアレルと選択的にハイブリダイゼーションを起こすこと。
【０２１０】
（ステップ１）
対象の一本鎖核酸分子の変異領域：ＬＶiＲに対する、プローブの対応領域：ＬＶjＲを考える際、考慮すべきプローブの変異対応部位：Ｖjの総数をＮVPとする。
【０２１１】
一般に、Ｖjに置かれる可変塩基の数：ｋである場合、この可変塩基のそれぞれに、４種の塩基：ＡＴ（Ｕ）ＧＣを選択する可能性を考慮する結果、Ｖjの採り得る部分塩基配列の種類は、４k通りとなる。加えて、考慮すべきＶjにおいて、可変塩基の数：ｋが、上記の例のように、複数ある場合、それぞれのｋに対する採り得る部分塩基配列の種類：４k通りを合計したものとなる。従って、考慮すべきプローブの変異対応部位：Ｖjの総数：ＮVPは、一般に、ＮVP＝Σk４kとなる。
【０２１２】
実際に、変異部位が「一塩基多型」の場合、ｋ＝１であり、考慮すべきプローブの変異対応部位：Ｖjの総数：ＮVPは、ＮVP＝４1＝４となる。
【０２１３】
「一塩基欠失」の場合、Ｖjに置かれる可変塩基の数：ｋは、ｋ＝０と見做しており、４0＝１となるが、実際には、考慮するＶjは、Ｗと、「欠失塩基：Ｘ」の二種であり、ＮVP＝２となる。
【０２１４】
「一塩基挿入」の場合、Ｖjに置かれる可変塩基の数：ｋは、ｋ＝１と見做しており、４1＝４となるが、実際には、Ｗ（例えば、Ａ）、「ＭＷ」型二塩基として、４種（例えば、ＣＡ，ＧＡ，ＡＡ，ＴＡ）を考慮する。従って、考慮すべきプローブの変異対応部位：Ｖjの総数：ＮVPは、ＮVP＝５となる。
【０２１５】
また、対象の一本鎖核酸分子の変異領域：ＬＶiＲ中、変異部位Ｖiの上流側（５’側）、下流側（３’側）に位置するＬ、Ｒの部分は、その塩基数は、ｆとする。それに併せて、プローブの対応領域：ＬＶjＲ中、Ｖjの上流側（３’側）、下流側（５’側）に位置するＬ、Ｒの部分も、その塩基数はｆとする。前記Ｌ、Ｒの部分の部分塩基配列は、野生型の塩基配列中の相当部分と同じ塩基である。また、プローブ中のＬ、Ｒの部分は、対象の一本鎖核酸分子中のＬ、Ｒの部分と、完全に相補的とされる。
【０２１６】
対象の一本鎖核酸分子にプローブをハイブリダイゼーションさせた際、その複合体形成に伴う熱力学的パラメータの変化量：ΔＳij，ΔＨijを考える。その際、ΔＳij，ΔＨij中、対象の一本鎖核酸分子の変異領域：ＬＶiＲと、プローブの対応領域：ＬＶjＲとの相互作用に起因する寄与：δ（ΔＳij）、δ（ΔＨij）に着目する。
【０２１７】
変異領域：ＬＶiＲの上流側、下流側に設けるＯL、ＯRと、プローブの対応領域：ＬＶjＲの上流側、下流側に設けるＯL、ＯRは、ともに、野生型の塩基配列中の相当部分と同じ塩基とされる。従って、このＯL／ＯL、ＯR／ＯRの領域では、鎖間の塩基対形成に由来する、熱力学的パラメータの変化量への寄与：｛ΔＳij−δ（ΔＳij）｝、｛ΔＨij−δ（ΔＨij）｝は、ＬＶiＲ／ＬＶjＲの組み合わせに依存しない。ここでは、この共通部分による寄与を、ΔＳ（ＯL＋ＯR）、ΔＨ（ＯL＋ＯR）と定義する。
【０２１８】
ΔＳ（ＯL＋ＯR）≡｛ΔＳij−δ（ΔＳij）｝
ΔＨ（ＯL＋ＯR）≡｛ΔＨij−δ（ΔＨij）｝
一方、δ（ΔＳij）、δ（ΔＨij）は、ＬＶiＲとＬＶjＲに含まれる「ｋ番目の塩基」間の相互作用に起因する、ΔＳij（ｋ）、ΔＨij（ｋ）を合計したものとして、算出される。
【０２１９】
Ｖｉの塩基長を、ｎViと定義し、Ｖjの塩基長を、ｎVjと定義すると、ＬＶiＲに含まれる塩基数は、（ｆ＋ｎVi＋ｆ）、ＬＶjＲに含まれる塩基数は、（ｆ＋ｎVj＋ｆ）となる。例えば、変異型のＶiが、「一塩基挿入」型の変異部位を含む場合、その塩基長は、野生型のＶiの塩基長より、挿入されている塩基数分多くなる。一方、変異型のＶjが、「一塩基欠失」型の変異部位を含む場合、その塩基長は、野生型のＶjの塩基長より、欠失されている塩基数分少なくなる。
【０２２０】
ＬＶiＲに含まれる塩基数：ｎLViR＝（ｆ＋ｎVi＋ｆ）と、ＬＶｊＲに含まれる塩基数：ｎLVjR＝（ｆ＋ｎVj＋ｆ）が異なる場合、δ（ΔＳij）、δ（ΔＨij）を算出する際、考慮すべき塩基数：ｎVは、下記のようになる。
【０２２１】
ｎV≡Ｍａｘ（ｎLViR，ｎLVjR）
一方、「ｋ番目の塩基」間の相互作用に起因する、ΔＳij（ｋ）、ΔＨij（ｋ）は、対象となる「ｋ番目の塩基」間の相互作用を推定する際、その上流側のｆ個の塩基、下流側のｆ個の塩基の影響を考慮に入れた推定値（近似値）とする。具体的には、ｆ＝１の場合、Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ近似に基づき、最近接塩基（ｆ＝１）からの影響を考慮する。すなわち、「ｋ番目の塩基」間の相互作用を算出する際、「（ｋ−１）番目の塩基」と「（ｋ＋１）番目の塩基」の塩基の種類を考慮した近似値を用いる。また、ｆ＝２の場合、Ｎｅｘｔ−Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ近似に基づき、最近接塩基（ｆ＝１）に加えて、その隣の塩基（ｆ＝２）からの影響をも考慮する。すなわち、「ｋ番目の塩基」間の相互作用を算出する際、「（ｋ−２）番目の塩基」、「（ｋ−１）番目の塩基」と「（ｋ＋１）番目の塩基」、「（ｋ＋１）番目の塩基」の塩基の種類を考慮した近似値を用いる。
【０２２２】
従って、ΔＳij（ｋ）、ΔＨij（ｋ）は、考慮される塩基の範囲を明示すると、下記のように、表記される。
【０２２３】
ΔＳij（ｋ）≡ΔＳij（ｋ−ｆ，…，ｋ，…ｋ＋ｆ）
ΔＨij（ｋ）≡ΔＨij（ｋ−ｆ，…，ｋ，…ｋ＋ｆ）
δ（ΔＳij）、δ（ΔＨij）は、プローブのＬＶjＲの末端を「ｋ1番目」とすると、この「ｋ1番目」を含め、ｎV個の塩基間のΔＳij（ｋ）、ΔＨij（ｋ）を合計する。従って、下記のように表記できる。
【０２２４】
δ（ΔＳij）≡ΣknVΔＳij（ｋ）
＝｛ΔＳij(k1-f,…,k1,…k1+f)＋…＋ΔＳij(knV-f,…,knV,…knV+f)｝
δ（ΔＨij）≡ΣknVΔＨij（ｋ）
＝｛ΔＨij(k1-f,…,k1,…k1+f)＋…＋ΔＨij(knV-f,…,knV,…knV+f)｝
複数の塩基からなる変異部位：Ｖ（ｈ）に関して、Ｎvar種類のＬＶiＲ、ＮVP種類のＬＶjＲの全ての組み合わせ（Ｎvar×ＮVP）について、δ（ΔＳij）、δ（ΔＨij）を近似計算する。
【０２２５】
（ステップ２）
ハイブリダイゼーション温度：ＴHと同じ温度の融解温度Ｔｍを示す条件を考慮する。例えば、ＴH＝５０℃とすると、絶対温度に換算すると、ＴH＝３２３Ｋとなる。Ｔｍ＝ＴH＝３２３Ｋを示す上では、複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨ、ΔＳは、下記の条件式を満足する必要がある。
【０２２６】
ΔＨ＝ＴH・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
図７に示す（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、前記の直線の傾きを表す単位ベクトル：ｕを考える。この単位ベクトル：ｕは、以下のように記述できる。
【０２２７】
ｕ＝｛1/√（１＋ＴH2）｝（１，ＴH）＝｛1/norm｝（１，ＴH）
この単位ベクトル：ｕと直交する単位ベクトル：ｎを、下記のように定義できる。
【０２２８】
ｎ＝｛1/norm｝（−ＴH，１）
（ステップ３）
ＬＶjＲを対応部位の部分塩基配列とするプローブと、変異領域；ＬＶiＲとＬＶi'Ｒをそれぞれ別個に含む一本鎖核酸分子の複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量を考える。それぞれ、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（ΔＳij，ΔＨij）、（ΔＳi'j，ΔＨi'j）となる。その融解温度は、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）と（ΔＳij，ΔＨij）を結ぶ直線の傾き：ｔａｎΘij、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）と（ΔＳi'j，ΔＨi'j）を結ぶ直線の傾き：ｔａｎΘi'jで与えられる。
【０２２９】
従って、その融解温度の差違：ΔＴｍij-i'jは、下記の式で示される。
【０２３０】
ΔＴｍij-i'j＝Ｔｍij−Ｔｍi'j
＝ｔａｎΘij−ｔａｎΘi'j
仮に、ハイブリダイゼーション温度：ＴHに対して、  Ｔｍij＞ＴH＞Ｔｍi'j  の条件が満たされる場合、ＬＶjＲを含むプローブは、ＬＶiＲを含む一本鎖核酸分子を、ＬＶi'Ｒを含む一本鎖核酸分子と区別する上で利用可能と判断される。
【０２３１】
その際、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を起点とする、ベクター（ΔＳi'j＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨi'j）と（ΔＳij＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨij）の差ベクトル：ｖiji'を考える。この差ベクトル：ｖiji'は、下記のように与えられる。
【０２３２】
ｖiji'＝（｛ΔＳi'j−ΔＳij｝，｛ΔＨi'j−ΔＨij｝）
一方、下記の関係が成り立っている。
【０２３３】
ΔＳ（ＯL＋ＯR）＝｛ΔＳij−δ（ΔＳij）｝＝｛ΔＳi'j−δ（ΔＳi'j）｝
ΔＨ（ＯL＋ＯR）＝｛ΔＨij−δ（ΔＨij）｝＝｛ΔＨi'j−δ（ΔＨi'j）｝
従って、差ベクトル：ｖiji'は、下記のように表記することもできる。
【０２３４】
ｖiji'＝（｛δ(ΔSi'j)−δ(ΔSij)｝，｛δ(ΔHi'j)−δ(ΔHij)｝）
一方、ベクター（ΔＳi'j＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨi'j）と（ΔＳij＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨij）の長さと、差ベクトル：ｖiji'の長さを比較する。差ベクトル：ｖiji'の長さが、ベクター（ΔＳi'j＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨi'j）と（ΔＳij＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），ΔＨij）の長さよりも十分に短いと、（Θij−Θi'j）≪Θi'j＜Θijである条件が満足される。
【０２３５】
さらに、差ベクトル：ｖiji'の単位ベクトルｎ方向の成分ＩＰiji'を考える。ＩＰiji'は、差ベクトル：ｖiji'の単位ベクトルｎの内積として、下記のように与えられる。
【０２３６】
ＩＰiji'＝ｖiji'・ｎ
＝｛1/norm｝・(｛δ(ΔHi'j)−δ(ΔHij)｝−ＴH・｛δ(ΔSi'j)−δ(ΔSij)｝) 
さらには、（Θij−Θi'j）≪Θi'j＜Θijである条件下では、
ΔＴｍij-i'j  ∝  ＩＰiji'
という比例関係もほぼ成り立っている。従って、ＩＰiji'の値を指標として、ΔＴｍi'j-ijの大小関係を見積もることが可能である。
【０２３７】
Ｎvar種類の変異領域：ＬＶiＲ（i＝１〜Ｎvar）に対して、上記の（Ｎvar×ＮVP）組のδ（ΔＳij）、δ（ΔＨij）を用いて、合計｛Ｎvar×（Ｎvar−１）×ＮVP｝組のｄＳiji'、ｄＨiji'を下記のように定義する。
【０２３８】
ｄＳiji'≡δ（ΔＳi'j）−δ（ΔＳij）
ｄＨiji'≡δ（ΔＨi'j）−δ（ΔＨij）
次いで、Ｎvar種類の変異領域：ＬＶiＲ（i＝１〜Ｎvar）に対して、合計｛Ｎvar×（Ｎvar−１）×ＮVP｝個の差ベクトル：ｖiji'は、下記のように定義する。
【０２３９】
ｖiji'≡（｛δ(ΔSi'j)−δ(ΔSij)｝，｛δ(ΔHi'j)−δ(ΔHij)｝）
＝（ｄＳiji'，ｄＨiji'）
この合計｛Ｎvar×（Ｎvar−１）×ＮVP｝個の差ベクトル：ｖiji'に関して、単位ベクトルｎ方向の成分ＩＰiji'を考える。合計｛Ｎvar×（Ｎvar−１）×ＮVP｝個のＩＰiji'は、それぞれ、差ベクトル：ｖiji'の単位ベクトルｎの内積として、下記のように与えられる。
【０２４０】
ＩＰiji'＝ｖiji'・ｎ
＝｛1/norm｝・(ｄＨiji'−ＴH・ｄＳiji')
（ステップ４）
このＩＰiji'の値が、正である場合、ΔＴｍij-i'j＝Ｔｍij−Ｔｍi'j＞０であること、すなわち、Ｔｍij＞Ｔｍi'jであることを示す。一方、ＩＰiji'の値が、負である場合、ΔＴｍij-i'j＝Ｔｍij−Ｔｍi'j＜０であること、すなわち、Ｔｍij＜Ｔｍi'jであることを示す。
【０２４１】
変異領域：ＬＶiＲを含む一本鎖核酸分子を、他の変異領域：ＬＶi'Ｒを含む一本鎖核酸分子から、区別し、選択的に検出するためのプローブにおける、対応部位；ＬＶjＲは、少なくとも、下記の条件（ａ）を満足する必要がある。
【０２４２】
条件（ａ）
すなわち、このＶiとＶjの組み合わせ（Ｖi：Ｖj）に対する、（Ｎvar−１）個のＩＰiji'の値（ｉ’＝１〜Ｎvar；但し、ｉ’≠ｉ）を考える。その際、この（Ｎvar−１）個のＩＰiji'の値の全てが正であるような、Ｖjでなければならない。
【０２４３】
この条件（ａ）を満足する複数のＶjから、ＬＶiＲを含む一本鎖核酸分子を、他のＬＶi'Ｒを含む一本鎖核酸分子から、選択的に検出するためのプローブにおける、対応部位；ＬＶjＲとして、最適なものを選択する。その選択の手順は、下記のようになる。
【０２４４】
手順４−１：
対象となるＶiとＶjの組み合わせ（Ｖi：Ｖj）に対する、（Ｎvar−１）個のＩＰiji'の値から、最小のものを選択し、ＩＰijimとする。このＩＰijimを与えるＶi'は、Ｖjに依って異なっている。すなわち、Ｖj毎に、それぞれｉｍ（ｊ）が選択されている。
【０２４５】
ＮVP個のＶjについて、この選択を行うと、ＮVP個のＩＰijim（ｊ＝１〜ＮVP）が得られる。
【０２４６】
手順４−２：
ＮVP個のＩＰijim（ｊ＝１〜ＮVP）中から、最大のものを選択し、ＩＰijmimとする。このＩＰijmimを与えるＶjを特定して、Ｖjm、すなわち、ｊ＝ｊｍのＶjとする。ここで選択されるｊｍは、対象となるＶiに対して、唯一つであり、ｊｍ（ｉ）と表記する。
【０２４７】
ＮVP個のＩＰijim（ｊ＝１〜ＮVP）中には、負の値を示すもの、正の値を示すものが含まれているが、選択されるＩＰijmimは、ＮVP個のＩＰijim（ｊ＝１〜ＮVP）中、正の値を示し、最大のものとなっている。
【０２４８】
その際、対象となるＶiとＶjmの組み合わせ（Ｖi：Ｖjm）に対する、（Ｎvar−１）個のＩＰijmi'の値を考えてみる。このＩＰijmimは、（Ｎvar−１）個のＩＰijmi'の値の最小値として、手順４−１で選択されているので、ＩＰijmi'≧ＩＰijmimとなっている。
【０２４９】
換言するならば、
ΔＴｍijm(i)-i'jm(i)≧ΔＴｍijm(i)-im(jm)jm(i)＞０となっており、また、Ｔｍijm(i)＞Ｔｍim(jm)jm(i)≧Ｔｍi'jm(i)の条件を満足するものとなっている。
【０２５０】
勿論、このＶjm(i)以外のも、Ｔｍij＞Ｔｍim(j)j≧Ｔｍi'jの条件を満足するＶjは存在するが、ΔＴｍijm(i)-im(jm)jm(i)＞ΔＴｍij-im(j)jとなっている。従って、ＬＶjm(i)Ｒは、ＬＶiＲを含む一本鎖核酸分子を、他のＬＶi'Ｒを含む一本鎖核酸分子から、選択的に検出するためのプローブにおける、対応部位；ＬＶjＲとして、最適なものとなっている。
【０２５１】
手順４−３：
対象となるＶi（ｉ＝１〜Ｎvar）の全てについて、前記手順４−１，４−２を繰り返す。その結果、各Ｖi（ｉ＝１〜Ｎvar）に対して、Ｖjm(i)の選択がなされる。また、この選択されたＶjm(i)に対して、Ｖim(jm)も特定される。
【０２５２】
（ステップ５）
上記の手順４−１〜手順４−３では、検出対象の一本鎖核酸分子は、センス鎖であり、変異部位として、ＬＶiＲを有する一本鎖（ｉ＝１〜Ｎvar）と仮定している。場合によっては、検出対象の一本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖であり、その変異部位として、ＬＶiＲを有する一本鎖（ｉ＝１〜Ｎvar）であることもある。すなわち、検出対象の一本鎖核酸分子は、センス鎖であるｍＲＮＡを鋳型として、その相補鎖として調製されたｃＤＮＡである場合である。
【０２５３】
このアンチセンス鎖型の変異部位；ＬＶiＲ（ｉ＝１〜Ｎvar）を有する検出対象の一本鎖核酸分子に対しては、センス鎖型のプローブの対応部位の「可能な部分塩基配列」；ＬＶjＲ（ｊ＝１〜ＮVP）を用いる。上記の手順４−１〜手順４−３に従って、同様の選択作業を進め、アンチセンス鎖型の変異部位；ＬＶiＲ（ｉ＝１〜Ｎvar）を含む一本鎖核酸分子を選択的に検出するセンス鎖型のプローブの対応部位ＬＶjm(i)Ｒを決定する。また、その過程において、選択されたＬＶjm(i)Ｒに対して、ＬＶim(jm)Ｒも特定される。
【０２５４】
（ステップ６）
一方、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（ΔＳijm，ΔＨijm）と（ΔＳimjm，ΔＨimjm）を結ぶ線分上に位置する（ΔＳ,ΔＨ）と（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通る直線を考える。この直線の傾き；ｔａｎΘは、下記の範囲となる。
【０２５５】
ｔａｎΘijm＞ｔａｎΘ＞ｔａｎΘimjm
（ΔＳijm，ΔＨijm）と（ΔＳimjm，ΔＨimjm）を結ぶ線分の中点（ΔＳCi,ΔＨCi）と、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通る直線の傾き；ｔａｎΘCiを考える。このｔａｎΘCiは、（Θijm−Θimjm）≪Θimjm＜Θijmの条件下では、下記のように近似できる。
【０２５６】
ｔａｎΘCi≒ｔａｎ｛（Θijm−Θimjm）/２｝
≒1/2｛ｔａｎΘijm＋ｔａｎΘimjm｝
この中点（ΔＳCi,ΔＨCi）と、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通る直線は、下記のように記述される。なお、ｔａｎΘCi＝ＴCiと表記する。
【０２５７】
ΔＨ＝ｔａｎΘCi・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
＝ＴCi・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
また、中点（ΔＳCi,ΔＨCi）は、（ΔＳijm，ΔＨijm）と（ΔＳimjm，ΔＨimjm）を用いて、下記のように表記される。
【０２５８】
ΔＳCi＝1/2｛ΔＳijm＋ΔＳimjm｝
ΔＨCi＝1/2｛ΔＨijm＋ΔＨimjm｝
なお、ｄＳijmim＝δ（ΔＳimjm）−δ（ΔＳijm）；
ｄＨijmim＝δ（ΔＨimjm）−δ（ΔＨijm）であり、これを用いると、中点（ΔＳCi,ΔＨCi）は、下記のように表記される。
【０２５９】
ΔＳCi＝ΔＳijm＋1/2・ｄＳijmim
ΔＨCi＝ΔＨijm＋1/2・ｄＨijmim
変異部位：ＬＶiＲを含むＯLＬＶiＲＯRの領域を有する一本鎖核酸分子と、塩基配列：ＯLＬＶjmＲＯRのプローブの複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨijm、ΔＳijmを実際に推定計算する。
【０２６０】
ＯLＬＶiＲＯRの領域に対しては、それを選択的に検出するプローブの塩基配列：ＯLＬＶjmＲＯRは、通常、完全に相補的な塩基配列：ＯLＬＶiＲＯRが選択されている。この塩基配列：ＯLＬＶiＲＯRの長さｎｐを、ｎｐ＝ｎｐmin〜ｎｐmaxの範囲とする。変異部位に対応するＬＶiＲは、ここでは、Ｌ，Ｍは、ｆ塩基であり、Ｖi部位は、ｎV塩基であり、全体で、（ｆ＋ｎVi＋ｆ）＝ｎV塩基の長さとなる。従って、ＬＶiＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRの長さを併せると、（ｎｐ−ｎV）塩基となる。また、変異部位に対応するＬＶiＲは、該プローブの末端に位置しないようにする。すなわち、ＯLとＯRの長さは、１塩基以上とする。従って、ＯLとＯRの長さの組み合わせ（ＯL，ＯR）は、（１，（ｎｐ−ｎV）−１），…，（（ｎｐ−ｎV）−１，１）の（ｎｐ−ｎV）−１通りとなる。
【０２６１】
このＯLＬＶiＲＯR／ＯLＬＶiＲＯRの完全マッチする複合体形成に伴う熱力学パラメータの変化量：ΔＨijm、ΔＳijmの推定計算は、図３に例示する手法を用いて行われる。プローブの長さｎｐ（ｎｐ＝ｎｐmin〜ｎｐmax）毎に、ＯLとＯRの長さの組み合わせ；（１，（ｎｐ−ｎV）−１），…，（（ｎｐ−ｎV）−１，１）の順に従って、ＯLとＯRの塩基配列候補の全てについて、ΔＨijm、ΔＳijmの推定計算を行う。推定計算される（ΔＳijm、ΔＨijm）は、（ΔＳijm（ｎｐ，１）、ΔＨijm（ｎｐ，１）），…，（ΔＳijm（ｎｐ，ｎｐ−ｎV−１）、ΔＨijm（ｎｐ，ｎｐ−ｎV−１）（但し、ｎｐ＝ｎｐmin〜ｎｐmax）という、マトリクス状の点列となる。
【０２６２】
（ステップ７）
ハイブリダイゼーション温度：ＴHに対して、（Θijm−Θimjm）≪Θimjm＜Θijmの条件下で、下記の条件を満たすように、プローブの対応部位の部分塩基配列；ＬＶjmＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択する手法を説明する。
【０２６３】
ＴH＝ｔａｎ｛（Θijm＋Θimjm）/２｝
上記の条件は、（Θijm−Θimjm）≪Θimjm＜Θijmの条件下では、下記の条件とほぼ等価な条件である。
【０２６４】
ＴH≒1/2｛ｔａｎΘijm＋ｔａｎΘimjm｝
一方、（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通り、傾き：ＴHの直線は、下記の式で表記される。
【０２６５】
ΔＨ＝ＴH・〔ΔＳ＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕      （式３）
先に計算された（ΔＳijm、ΔＨijm）のマトリクス状の点列に対して、対応する点（ΔＳimjm、ΔＨimjm）と結ぶ線分の中点（ΔＳCi（np,l）,ΔＨCi（np,l））は、下記のように表記できる。
【０２６６】
ΔＳCi（np,l）＝ΔＳijm（np,l）＋1/2・ｄＳijmim
ΔＨCi（np,l）＝ΔＨijm（np,l）＋1/2・ｄＨijmim
（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、（ΔＳCi（np,l）,ΔＨCi（np,l））と、上記（式３）で示す直線との距離を考える。
【０２６７】
（ΔＳCi（np,l）,ΔＨCi（np,l））から（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）へのベクトル：ｖCi（np,l）を考える。このベクトル：ｖCi（np,l）の、上記（式３）で示す直線と直交する単位ベクトルｎ方向成分が、（ΔＳCi（np,l）,ΔＨCi（np,l））と、上記（式３）で示す直線との距離：Ｌｅｎ（ｉ：np,l）に相当する。
【０２６８】
（ΔＳ,ΔＨ）の座標空間において、ベクトル：ｖCi（np,l）は、下記のように表記できる。
【０２６９】
ｖCi(np,l)＝（−Ｒ・ｌｎ(Ｃ/４)−ΔＳCi(np,l)，−ΔＨCi(np,l)）
従って、Ｌｅｎ（ｉ:np,l）は、ｖCi（np,l）と単位ベクトルｎとの内積の絶対値を用いて、下記のように求めることができる。
【０２７０】
Ｌｅｎ（ｉ:np,l）＝｜ｖCi（np,l）・ｎ｜
＝｜｛1/norm｝（ＲＴH・ｌｎ（Ｃ／４）＋ＴHΔＳCi（np,l）−ΔＨCi（np,l））｜
この距離Ｌｅｎ（ｉ:np,l）が最小となるものから最大となるものまで順序付けし、その順序に従って、（ΔＳCi（np,l）,ΔＨCi（np,l））をリストアップする。そして、該リストアップされた（ΔＳCi（np,l）,ΔＨCi（np,l））を与えている、（ΔＳijm（np,l）、ΔＨijm（np,l））を同じ順序でリストアップする。
【０２７１】
また、リストアップされた（ΔＳCi（np,l）,ΔＨCi（np,l））と、（−Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４），０）を通る直線の傾き：ｔａｎΘCi（np,l）を、下記の式に基づき求める。
【０２７２】
ΔＨCi（np,l）＝ｔａｎΘCi（np,l）・〔ΔＳCi（np,l）＋Ｒ・ｌｎ（Ｃ／４）〕
前記のリストアップ順序に従って、求められたｔａｎΘCi（np,l）を、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（Θijm＋Θimjm）/２｝と比較して、最も近い値を示すものから、その順序に従って、再リストアップを行う。
【０２７３】
具体的には、距離Ｌｅｎ（ｉ:np,l）が同じ場合、プローブの長さｎｐが長いものの方が、算定されるｔａｎΘCi（np,l）は、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（Θijm＋Θimjm）/２｝と近い値を示す。加えて、距離Ｌｅｎ（ｉ:np,l）とプローブの長さｎｐが同じ場合、実際に算定されるｔａｎΘCi（np,l）と、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（Θijm＋Θimjm）/２｝との詳細な比較によって、より好ましいものを選択する必要がある。実際には、距離Ｌｅｎ（ｉ:np,l）が僅かに異なる場合、プローブの長さｎｐが長いものの方が、算定されるｔａｎΘCi（np,l）は、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（Θijm＋Θimjm）/２｝と近い値を示すことが少なくない。
【０２７４】
以上の点を考慮し、距離Ｌｅｎ（ｉ:np,l）の比較に基づき、その最小のものから、各プローブ長さｎｐ毎に、二つの候補をリストアップすることに相当する候補数をリストアップする。具体的には、（ｎｐmax−ｎｐmin）〜２（ｎｐmax−ｎｐmin）個程度の範囲で、距離Ｌｅｎ（ｉ:np,l）が、最小のものと同程度の水準にあるものを候補としてリストアップすることが好ましい。
【０２７５】
そのリストアップされたものに関して、算定されるｔａｎΘCi（np,l）と、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（Θijm＋Θimjm）/２｝との対比を行って、その比較結果に基づき、その順序に従って、再リストアップを行う。
【０２７６】
上記の距離Ｌｅｎ（ｉ:np,l）が小さなものとしてリストアップされるプローブ候補は、目標とするハイブリダイゼーション温度：ＴHで、対象とするＬＶiＲを含む一本鎖核酸分子とのみ選択的に複合体形成を行う。従って、対象とするＬＶiＲを含む一本鎖核酸分子を、他のＬＶi'Ｒを含む一本鎖核酸分子から、高い確度で分離する目的により適するプローブ候補となる。
【０２７７】
（ステップ８）
一つの変異部位：ＬＶ（ｈ）Ｒに対して、その全てのＬＶiＲ（ｉ＝１〜Ｎvar）について、それぞれ選択されているＬＶjm(i)Ｒ、ＬＶim(jm)Ｒ（ｉ＝１〜Ｎvar）を用いて、前記ステップ６〜ステップ７の操作を行う。その結果、同様に、距離Ｌｅｎ（ｉ:np,l）が小さなものとしてリストアップされるプローブ候補は、目標とするハイブリダイゼーション温度：ＴHで、対象とするＬＶiＲを含む一本鎖核酸分子とのみ選択的に複合体形成を行う。従って、対象とするＬＶiＲを含む一本鎖核酸分子（ｉ＝１〜Ｎvar）を、他のＬＶi'Ｒを含む一本鎖核酸分子から、高い確度で分離する目的により適するプローブ候補となる。
【０２７８】
（ステップ９）
上記のステップ６〜ステップ８では、検出対象の一本鎖核酸分子は、センス鎖であり、変異部位として、ＬＶiＲ（ｉ＝１〜Ｎvar）を有する一本鎖と仮定している。場合によっては、検出対象の一本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖であり、その変異部位として、ＬＶiＲ（ｉ＝１〜Ｎvar）を有する一本鎖であることもある。すなわち、検出対象の一本鎖核酸分子は、センス鎖であるｍＲＮＡを鋳型として、その相補鎖として調製されたｃＤＮＡである場合である。
【０２７９】
このアンチセンス鎖型の変異部位；ＬＶiＲ（ｉ＝１〜Ｎvar）を有する検出対象の一本鎖核酸分子に対してが、ステップ４で選択される、センス鎖型のプローブの対応部位；ＬＶjm(i)Ｒを用いる。また、分離すべき、他のＬＶi'Ｒを含む一本鎖核酸分子の変異部位として、同時に特定されるＬＶim(jm)Ｒを用いる。その上で、上記のステップ６〜ステップ８の手順に従って、同様の選択作業を進め、アンチセンス鎖型の変異部位；ＬＷＲ、あるいはＬＭＲを含む一本鎖核酸分子を選択的に検出するセンス鎖型のプローブ候補を決定する。すなわち、センス鎖型のプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRに関して、ＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRの組み合わせの候補を選択する。
【０２８０】
このステップ６〜ステップ９において、共通のハイブリダイゼーション温度：ＴHを目標として、プローブ候補の選択がなされている。従って、上記の条件（２）を満足するプローブ候補の選択がなされている。
【０２８１】
（ステップ１０）
複数の塩基からなる変異部位：Ｖ（ｈ）を含む変異領域ＬＶ（ｈ）Ｒに関して、検出対象の一本鎖核酸分子が、センス鎖型、アンチセンス鎖型の双方について、それぞれ適するプローブ候補がリストアップされる。
【０２８２】
このリストアップされたプローブ候補に対して、次の観点で更に、選別を加える。
【０２８３】
先ず、プローブ・ハイブリダイゼーション法を適用する検出では、プローブを固定化した上で、検出対象の一本鎖核酸分子と複合体形成を行うことが一般的である。そのため、プローブの５’末端、または、３’末端において、固相表面にプローブを結合する。その状況下では、固相表面と一本鎖核酸分子との相互作用、あるいは、固相表面に近接するプローブの先端部位の自由度の低下などの影響が、この先端部における塩基対形成の効率を低下させる場合がある。従って、プローブの対応部位；ＬＶ（ｈ）Ｒが、この固定端にあまりに近接すると、対象とする一本鎖核酸分子と複合体形成の効率の低下が引き起こされることが懸念される。その点を考慮すると、プローブの対応部位；ＬＶ（ｈ）Ｒは、その末端部にあまりに近接していないものを選択することが望ましい。
【０２８４】
具体的には、プローブの対応部位；ＬＶ（ｈ）Ｒは、その末端から、５塩基以上離れた位置とすることが好ましい。換言するならば、例えば、アンチセンス鎖型のプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRにおいて、ＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRの長さは、５塩基以上に選択することが好ましい。また、センス鎖型のプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯRにおいても、ＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRの長さは、５塩基以上に選択することが好ましい。
【０２８５】
加えて、このプローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯR自体が、偶々、他の変異を示さない領域と相同性が高くなる場合もある。その場合、ＬＶjＲの上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択する際、他の領域との相同性を可能な限り低下させる選択を行うことが必要となる。但し、ＬＶjＲの部位自体は変更できないため、例えば、上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択する際、他の領域と一致する塩基数を可能な限り低下するようにする。リストアップされたプローブ候補の内から、この条件に基づき、より好ましいものを選択する。
【０２８６】
その他、プローブの塩基配列：ＯLＬＶjＲＯR自体が、偶々、高次構造を形成が可能な塩基配列となる場合もある。具体的には、プローブの塩基配列の５’末端側の部分塩基配列と、３’末端側の部分塩基配列とが互いに相補的なものとなる場合がある。但し、ＬＶjＲの部位自体は変更できないため、例えば、上流側、下流側の塩基配列；ＯLとＯRを選択する際、前記の相補的な部分塩基配列部分において、形成可能な塩基対の数を可能な限り減少させることが望ましい。
【０２８７】
上記の付加的な制約条件を考慮した上で、リストアップされたプローブ候補の内から、算定されるｔａｎΘCi（np,l）が、目標とするＴH＝ｔａｎ｛（Θijm＋Θimjm）/２｝とより近い値を示すものを選択することが好ましい。
【０２８８】
（ステップ１１）
同時に検出を行う、変異部位：Ｖ（ｈ）の総数は、ＮTOTALである場合、各変異部位：Ｖ（ｈ）について、上記のステップ０〜ステップ１０の操作を繰り返す。
【０２８９】
その際、ステップ６〜ステップ９において、各変異部位：Ｖ（ｈ）における各アレルの変異領域（ＬＶiＲと、その他のＬＶi'Ｒ）の選択的な検出に用いるプローブ候補を選択する際、目標とするハイブリダイゼーション温度：ＴHを共通とする。この条件を設定することで、上記の条件（２）は、各変異部位：Ｖ（ｈ）においても、満足されるものとなる。
【０２９０】
その結果、各変異部位：Ｖ（ｈ）に対して、それぞれ選択されたプローブを、一組として、プローブセットとする。
【産業上の利用可能性】
【０２９１】
本発明は、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用して、遺伝子の多型を検出する際、用いられるプローブセットの選択に好適に利用される。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】本発明において、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用して、検出する対象、一本鎖核酸分子における変異部位の部分塩基配列を模式的に示す図である。特に、変異部位として、「一塩基多型」の変異部位：Ｖ（ｈ）と、その上流側、下流側の一塩基Ｌ，Ｒを含む変異領域：ＬＶ（ｈ）Ｒを例に挙げて、該変異部位の塩基が、野生型のＷと、変異型のＭの場合について、模式的に示す。  （ａ）野生型の塩基配列を有するセンス鎖における変異領域：ＬＷＲ；  （ｂ）変異型の塩基配列を有するセンス鎖における変異領域：ＬＭＲ；  （ｃ）野生型の塩基配列を有するアンチセンス鎖における変異領域：ＬＷＲ；  （ｄ）変異型の塩基配列を有するアンチセンス鎖における変異領域：ＬＭＲ。
【図２】「一塩基多型」の変異領域：ＬＶ（ｈ）Ｒに関して、可能性のあるＬＷＲとＬＭＲの組み合わせを示す。Ｌ，Ｒの組み合わせを縦のカラムに、Ｗ⇔Ｍの組み合わせを横カラムとして、マトリクス状に可能性のある、ＬＷＲ／ＬＷＲ⇔ＬＭＲ／ＬＭＲの4種の変異領域を記載する。なお、上段が、センス鎖における変異領域ＬＷＲ⇔ＬＭＲ、下段が、アンチセンス鎖における変異領域ＬＷＲ⇔ＬＭＲを示す。図中、（１）で表示される枠は、ＮＮモデルにおいて、熱力学的パラメータの変化量が、ΔＨLWR/LWR＝ΔＨLMR/LMR；ΔＳLWR/LWR＝ΔＳLMR/LMRとなるものを示す。
【図３】ＮＮモデルにおける、複合体形成に付随する熱力学的パラメータの変化量：ΔＧTotal；ΔＨTotal；ΔＳTotalの近似計算法を模式的に説明する図である。  （ｅ）ＮＮモデルにおける、センス鎖とアンチセンス鎖の間に、ｋ番目の塩基対の形成による熱力学的パラメータの変化量：ΔＧ（ｋ）；ΔＨ（ｋ）；ΔＳ（ｋ）の近似値において、考慮される最隣接塩基を説明する。  （ｆ）ＮＮモデルにおける、複合体形成に付随する熱力学的パラメータの変化量：ΔＧTotalの近似計算法を説明する。  （ｇ）センス鎖とアンチセンス鎖間の複合体形成の比率が、５０％となる条件；［Ａ］＝［Ｂ］＝［Ａ：Ｂ］を達成する温度Ｔを、融解温度Ｔｍとする近似下における、Ｔｍの算出方法を説明する。  なお、ΔＨ、ΔＳは、センス鎖とアンチセンス鎖間の複合体形成に付随するエンタルピーの変化量、エントロピーの変化量を表す。Ｃは、複合体形成を行う核酸の濃度を示すパラメータである。
【図４】ＮＮモデルによる、完全にマッチするセンス鎖とアンチセンス鎖間の複合体形成と、一塩基のミスマッチが存在する複合体形成とにおける、複合体形成に付随する熱力学的パラメータの変化量の相違を模式的に説明する図である。  上段に、野生型のＬＷＲを有する対象核酸のセンス鎖と、野生型のＬＷＲを有するアンチセンス鎖型のプローブとの複合体形成に伴う、熱力学的パラメータの変化量：ΔＧW、ΔＨW、ΔＳWの近似計算値を示す。  下段に、変異型のＬＭＲを有する対象核酸のセンス鎖と、野生型のＬＷＲを有するアンチセンス鎖型のプローブとの複合体形成に伴う、熱力学的パラメータの変化量：ΔＧM、ΔＨM、ΔＳMの近似計算値を示す。  なお、ΔＧ（ｋ）、ΔＨ（ｋ）、ΔＳ（ｋ）は、完全マッチするセンス鎖とアンチセンス鎖間における、ｋ番目の塩基対の寄与分を示す。ΔＧM（ｋ）、ΔＨM（ｋ）、ΔＳM（ｋ）は、一塩基のミスマッチが存在するセンス鎖とアンチセンス鎖間における、ｋ番目の塩基対の寄与分を示す。
【図５】融解温度：Ｔｍと、その温度における、センス鎖とアンチセンス鎖間の複合体形成に伴う熱力学的パラメータの変化量：ΔＳとΔＨの関係を、（ΔＳ，ΔＨ）平面上で表記する図である。
【図６】完全にマッチするセンス鎖とアンチセンス鎖間の複合体と、一塩基のミスマッチが存在する複合体と間における、融解温度：Ｔｍの相違を、（ΔＳ，ΔＨ）平面上で表記する図である。すなわち、「一塩基多型」に由来する一塩基のミスマッチに起因する融解温度：Ｔｍの差違と、完全マッチ型複合体形成と、一塩基のミスマッチが存在する複合体形成との間における、熱力学的パラメータの変化量の差：ΔＳSNP，ΔＨSNPとの関係を示す。
【図７】（ΔＳ，ΔＨ）平面上において、融解温度：Ｔｍがハイブリダイゼーション温度：ＴHと等しくなる条件を示す直線と、その直線の傾きを示す単位ベクトルｕ、それと直交する単位ベクトルｎを模式的に示す図である。併せて、完全マッチ型複合体形成と、ミスマッチが存在する複合体形成との間における、熱力学的パラメータの変化量の差を示す、差ベクトルｖ＝（ΔＳvar，ΔＨvar）を示す。また、差ベクトルｖの、単位ベクトルｎ方向の成分を、「投影Ｌ」として、表記している。
【図８】「一塩基多型」に由来する変異部位：ＬＶiＲとして、ＬＷＲとＬＭＲの二種、プローブ側の対応部位：ＴＶjＲとして、４種類を選択した場合に関して、ＴH＝３２３Ｋにおける、ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値を推定計算した結果をまとめて示す。なお、各変異は図２に対応している。ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値が、正である場合、Ｔｍ（Ｗ/Ｖj）＞Ｔｍ（Ｍ/Ｖj）であることを示す。逆に、ＩＰ（Ｗ/Ｖj→Ｍ/Ｖj）の値が、負である場合、Ｔｍ（Ｗ/Ｖj）＜Ｔｍ（Ｍ/Ｖj）であることを示す。
【図９】「一塩基欠失」型の変異において、センス鎖とアンチセンス鎖間の複合体形成に付随する熱力学的パラメータの変化量：ΔＧtotal，ΔＳtotal，ΔＨtotalを、ＮＮモデルを応用して、近似する際の取り扱いを説明する図である。その際、「一塩基欠失」の寄与を有する、熱力学的パラメータの変化量の寄与分；ΔＧ（ｋ）；ΔＨ（ｋ）；ΔＳ（ｋ）は、「欠失塩基」をＸと表記して、それぞれ定義する。
【図１０】本発明にかかるオリゴヌクレオチド・プローブセットを設計する方法における、各操作の流れを、フローチャート形式で示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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