(57)【要約】【課題】１回の検査で複数種の標的物質について、その有無を一括に容易に判定できる検出方法の提供。【解決手段】特定の標的物質に対して特異的に結合する検出用物質を担持し、内部に蛍光色素を含有する微粒子を含む試薬液と、被験試料とを混合する混合工程と、前記検出用物質と前記標的物質との結合により生成した沈殿に光を照射し、前記沈殿に含まれる前記蛍光色素が放射する蛍光を蛍光検出手段で検出する蛍光検出工程とを有する標的物質の検出方法であって、前記微粒子は、前記標的物質の種類に応じて、前記検出用物質および前記蛍光色素の種類が異なる複数種からなり、前記蛍光検出手段は、多波長蛍光受光手段である標的物質の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の標的物質に対して特異的に結合する検出用物質を担持し、内部に蛍光色素を含有する微粒子を含む試薬液と、被験試料とを混合する混合工程と、
前記検出用物質と前記標的物質との結合により生成した沈殿に光を照射し、前記沈殿に含まれる前記蛍光色素が放射する蛍光を蛍光検出手段で検出する蛍光検出工程とを有する標的物質の検出方法であって、
前記微粒子は、前記標的物質の種類に応じて、前記検出用物質および前記蛍光色素の種類が異なる複数種からなり、
前記蛍光検出手段は、多波長蛍光受光手段であることを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２】
前記標的物質は、腸管出血性大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料に含まれる例えば病原性大腸菌などの標的物質を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌は、ヒトの腸内で生息し、環境中にも広く分布している菌であるが、なかにはヒトに下痢、腹痛などの病気を引き起こすものがある。
このように病気の原因となる大腸菌は病原性大腸菌と呼ばれ、その病原性機構により、主に腸管病原性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管凝集性大腸菌の５つに分類されている。なかでも腸管出血性大腸菌はベロ毒素を産生し、激しい腹痛、水様性の下痢、血便を引き起こし、特に小児や老人では、重症化することも多いため、注意が必要とされている。このような腸管出血性大腸菌としては、Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ８６、Ｏ１１１、Ｏ１１９、Ｏ１２８などが知られている。
【０００３】
ヒトの糞便などの被験試料に病原性大腸菌が含まれるかどうかを判断する場合には、まず、病原性大腸菌を選択的に増菌させる選択培地に糞便を塗布して、３５〜３７℃の条件で病原性大腸菌が増殖するかどうかを目視判定する１次スクリーニングが広く採用されている。
このような１次スクリーニングにより病原性大腸菌の増殖が確認され、被験試料に病原性大腸菌が含まれることが判明した場合には、ついで、増殖により形成された擬陽性および陽性のコロニーを回収して、特許文献１の段落０００９などに記載されている血清型判別法によりその種類を大まかに同定し、さらに毒素産生性などを調べて、その種類を最終的に同定する場合が多い。
【０００４】
従来の血清型判別法は、特定の病原性大腸菌にのみ反応する抗血清（免疫血清）を用いた大腸菌の分類方法であって、その具体的方法としては、まず、１次スクリーニングにより得られたコロニーを生理食塩水などに懸濁させ、この懸濁液をオートクレーブなどで滅菌する。ついで、懸濁液を遠心分離して上澄みを捨て、沈殿物を再度生理食塩水などに懸濁させる。ついで、この懸濁液をガラス製のシャーレに滴下し、特定の病原性大腸菌にのみ反応する抗血清を混ぜ合わせ、菌体の凝集の有無を目視判定する。凝集が確認されれば陽性であり、上述の特定の病原性大腸菌がコロニーに含まれると判断される。
【０００５】
また、１次スクリーニングを実施した後に実施されるその他の方法としては、特許文献１などに開示されているラテックス凝集法と呼ばれる方法も知られている。
ラテックス凝集法では、まず、１次スクリーニングにより得られたコロニーを生理食塩水などに懸濁させて懸濁液を調製する。一方、特定の病原性大腸菌に特異的に結合する検出用物質が担持された粒子を含むラテックスを用意する。ついで、懸濁液とラテックスとを混合し、この混合前後における光学特性の変化から、特定の病原性大腸菌の有無やその濃度を判断する。光学特性としては、特定波長の吸光度や散乱光強度などが利用されている。
【０００６】
さらに、特許文献２には、複数の被検出物（標的物質）を１回の測定により検出できるとされたメンブレンアッセイ法が記載されている。
この方法では、各被検出物に特異的に結合する第１捕捉物質をメンブレン上の異なる位置にそれぞれ固相化して、２箇所以上の判定部を作製する。一方、各被検出物に特異的に結合する第２捕捉物質に、被検出物毎に異なる色調の着色ラテックス粒子を結合して、２種類以上の標識試薬を作製する。ついで、この標識試薬と検体液とを混合し、得られた混合液を先のメンブレンに供給して展開する。そして、各判定部において、各判定部に対応する標識試薬の色が検出された場合には、その被検出物は「陽性」であると判断され、各判定部に対応する標識試薬の色が検出されない場合には、その被検出物は「陰性」であると判断される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−３０４２７５号公報
【特許文献２】特開２００８−１４７５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の血清型判別法やラテックス凝集法により、特定の種類の病原性大腸菌が被験試料に含まれるか否かについて判断する場合には、病原性大腸菌の種類ごとに上述の操作を繰り返し行う必要があった。すなわち、例えば被験試料にＯ１５７およびＯ２６が含まれるかどうかを確認するためには、まず、どちらか一方の菌が被験試料に含まれるか否かを上述の操作により調べ、その後、もう一方の菌が被験試料に含まれるか否かを同様の操作を繰り返し実施して調べる必要があった。
また、特許文献２に記載された方法でも、判定部のいずれか１つにおいて、２種類以上の着色ラテックス粒子の中間色が検出された際には、この検出方法は「無効」であると判定され、その場合にはＲＴ−ＰＣＲ法などの別の方法で再度目的とする被検出物が陽性であるか陰性であるか、判定する必要があった。
【０００９】
このように従来の血清型判別法やラテックス凝集法では、検出対象である標的物質ごとに、その有無を調べる必要があり、１回の検査で複数種の標的物質について、その有無を一括に判定することはできなかった。また、特許文献２に記載されたメンブレンアッセイ法でも、場合によっては別の方法を併用する必要があり、やはり１回の検査で複数種の標的物質について、その有無を一括に判定できない場合があった。
そのため、これら従来の方法により、複数種の標的物質についてその有無を判定しようとすると、検査に手間と時間を要した。また、特に血清型判別法では、熟練した経験者の目視判定に頼るところが大きく、判定が容易ではないという問題もあった。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、１回の検査で複数種の標的物質について、その有無を一括に容易に判定することができる標的物質の検出方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の標的物質の検出方法は、特定の標的物質に対して特異的に結合する検出用物質を担持し、内部に蛍光色素を含有する微粒子を含む試薬液と、被験試料とを混合する混合工程と、
前記検出用物質と前記標的物質との結合により生成した沈殿に光を照射し、前記沈殿に含まれる前記蛍光色素が放射する蛍光を蛍光検出手段で検出する蛍光検出工程とを有する標的物質の検出方法であって、
前記微粒子は、前記標的物質の種類に応じて、前記検出用物質および前記蛍光色素の種類が異なる複数種からなり、
前記蛍光検出手段は、多波長蛍光受光手段であることを特徴とする。
前記標的物質としては、腸管出血性大腸菌などが好ましく例示できる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の標的物質の検出方法によれば、１回の検査で複数種の標的物質について、その有無を一括に容易に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】多波長蛍光受光手段の構成を示す概略構成図である。
【図２】蛍光検出工程を説明する概略図である。
【図３】図２の蛍光検出工程により得られた蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図４】試験例１で得られた蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図５】試験例２で得られた蛍光スペクトルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の標的物質の検出方法は、好適には、例えば先に説明したような１次スクリーニングにより得られたコロニーを被験試料として、この被験試料中に特定の標的物質が含まれるか否かを検出する確定診断に好適に用いられるものである。
標的物質としては、例えば、腸管病原性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管凝集性大腸菌などの病原性大腸菌が例示できる。なかでも、腸管出血性大腸菌はベロ毒素を産生し、激しい腹痛、水様性の下痢、血便を引き起こし、特に小児や老人では、重症化することも多く、特に迅速な検出が求められる大腸菌であり、本発明の検出方法が好ましく適用できる。腸管出血性大腸菌としては、Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ８６、Ｏ１１１、Ｏ１１９、Ｏ１２８などが挙げられる。
その他にも、標的物質としては、サルモネラ菌、リステリア菌などの病原性細菌、放線菌、酵母、かび、ウィルスなどの微生物を挙げることができ、特に制限はない。
【００１５】
［混合工程］
本発明の検出方法では、被験試料と試薬液とを混合する混合工程を行う。被験試料として、１次スクリーニングにより得られたコロニーなどの固体を使用する場合には、これをリン酸緩衝液、生理食塩水、トリプトソーヤ培地、ハートインフュージョンブイヨン培地などの液体培地などにあらかじめ分散させてから、試薬液と混合することが好ましい。
なお、被験試料としては、１次スクリーニングにより得られたコロニーに限定されず、例えば、血液、血清、体液、尿などの検体や、固体の検体を分散した液の上澄み等が挙げられる。
【００１６】
試薬液は、特定の標的物質に対して特異的に結合する検出用物質を表面に担持し、内部に蛍光色素を含有する微粒子を含有する。
そして、本発明では、このような微粒子として、標的物質の種類に応じて、検出用物質および蛍光色素の種類が異なる複数種を含む試薬液を使用する。すなわち、この試薬液は、例えばＯ１５７に特異的に結合する微粒子、Ｏ２６に特異的に結合する微粒子など、複数種を含有する。
【００１７】
ここで検出用物質は、特定の標的物質と特異的に結合するものであればよく、標的物質の種類に応じて決定される。検出用物質としては、抗体が好適に用いられ、その場合、標的物質との特異的な結合は、抗原抗体反応による結合である。
【００１８】
抗体の由来は限定されず、例えば、ウサギ抗体、ラット抗体、マウス抗体、ヤギ抗体などいかなる動物種の血清由来のものも使用できる。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいし、抗体であってもＦ（ａｂ’）２等の抗体フラグメントであってもよい。コストの面では、ヤギ血清から精製した抗体が好ましく使用される。
抗体の精製方法および純度も特に制限されず、例えば、硫酸アンモニウム塩析等によって精製された抗体を用いることができる。
【００１９】
内部に蛍光色素を含有する微粒子としては、蛍光色素を内包するラテックス粒子が好適に使用される。ラテックス粒子であれば、工業的に一定の品質性能のものを大量生産できる点で好ましい。
ラテックス粒子の材料としては、粒径が比較的一定で、かつ、一定の品質、性能のものを工業的に大量生産できるものが好適に使用され、例えばスチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等が挙げられる。
これらのうち、抗体などの検出用物質の吸着性（担持性）に優れ、かつ、抗体を検出用物質として使用する場合にはその生物学的活性を長期間保持できる等の観点から、ポリスチレン系のポリマー粒子がさらに好ましい。ラテックス粒子の平均粒径は、１００〜３５０ｎｍの範囲が好適である。
その他にも、微粒子としては、無機物質粒子、細胞膜片、血球、微生物などを挙げることができ、特に制限はない。
【００２０】
蛍光色素としては、例えば波長が３００〜８００ｎｍである蛍光を発するものが好適に使用され、具体的には、ペリレン（４５０ｎｍ、４８０ｎｍ、５０５ｎｍ）、チオフラビン（４８０ｎｍ）、ベルベリン（５１５ｎｍ）、フルオレセイン（５２０ｎｍ）、ローダミン１２３（５３５ｎｍ）、ローダミン６Ｇ（５５５ｎｍ）、テトラメチルローダミン（５７０ｎｍ）、ローダミンＢ（５８０ｎｍ）、ＤｉＩＣ１２（３）（５８０ｎｍ）、ナイルレッド（５９０ｎｍ）、ＤｉＩＣ１（５）（６７０ｎｍ）、Ｃｙ７（７７０ｎｍ）が例示できる。
【００２１】
微粒子の内部に蛍光色素を含有させる方法には特に制限はないが、微粒子がラテックス粒子である場合には、例えば次のような方法が挙げられる。
まず、水性媒体の中にラテックス粒子が安定に分散している、例えばポリスチレンなどのラテックスを調製する。ここで調製されるラテックス中の固形分濃度には特に制限はないが、１〜１５質量％が好ましい。ついで、このラテックスをアセトンと混合してラテックス粒子を膨潤させた状態とし、そこへ蛍光色素を例えばアセトン溶液の状態で添加する。これにより、蛍光色素をラテックス粒子に内包させることができ、内部に蛍光色素を含有する微粒子を含んだ液が得られる。なお、蛍光色素を内包させた後には、アセトンを減圧蒸留などで除去する。
ここで添加する蛍光色素の量は、ラテックス粒子の粒径や要求される蛍光の強度に応じて決定されればよいが、通常、ラテックス粒子１００質量部に対して０．０１〜１質量部の範囲とされる。
【００２２】
このようにして内部に蛍光色素を含有する微粒子を含んだ液を調製した後、この液に検出用物質を添加して、微粒子の表面に検出用物質を担持させる。担持方法としては、具体的には、物理的に吸着させる方法、化学的に結合させる方法などがある。物理的に吸着させる場合には、蛍光色素を含有する微粒子を含んだ液と、検出用物質とを単に混合すればよい。検出用物質はあらかじめリン酸緩衝液、トリス緩衝液などの液に分散または溶解させた後、混合してもよい。化学的に結合させる場合には、微粒子の表面と検出用物質の表面とに存在する官能基同士を反応させる方法、適当な官能基を有するスペーサ物質を介して、微粒子と検出用物質とを結合させる方法が挙げられる。スペーサ物質としては、例えば、カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどが挙げられる。
このようにして担持させることによって、特定の標的物質に対して特異的に結合する検出用物質が表面に担持され、内部には蛍光色素を含有する微粒子を含む液を調製することができる。
ついで、このような液の調製を検出用物質および蛍光色素の種類を変えて行うことで、標的物質の種類に応じて、担持した検出用物質および内包する蛍光色素の種類が異なる微粒子を含む液を複数種調製する。ここで、これら各液の微粒子濃度は例えばアルブミン緩衝液で０．０５質量％程度に調整されることが好ましい。
そして、これら複数種の各液を混合することにより、標的物質の種類に応じて、検出用物質および蛍光色素の種類が異なる複数種の微粒子を含む試薬液が得られる。
【００２３】
［蛍光検出工程］
上述の混合工程で試薬液と被験試料とを混合した場合において、被験試料中に特定の標的物質が含まれ、かつ、試薬液にはこの標的物質と特異的に結合する検出用物質が担持された微粒子が含まれると、検出用物質と標的物質とが結合して凝集し、沈殿が生成する。
そこで、こうして生成した沈殿に対して光（励起光）を照射し、沈殿の微粒子に含まれる蛍光色素が放射する蛍光を蛍光検出手段で検出する蛍光検出工程を行う。
【００２４】
ここで被験試料中に特定の標的物質が１種類しか含まれない場合には、生成する沈殿も１種類であるため、放射される蛍光はその沈殿から放射される特定の波長の光のみとなるが、被験試料中に特定の標的物質が複数種含まれる場合には、生成する沈殿も同様に複数種となり、これら各沈殿からそれぞれ特定の波長の蛍光が放射されることとなる。その場合、こうして放射される蛍光は、複数種の波長の蛍光が含まれるものとなる。
そこで、本発明の検出方法では、蛍光検出工程において蛍光を検出する蛍光検出手段として、複数種の波長からなる蛍光を受光した場合に、この蛍光に含まれる各波長を一括して検出できる多波長蛍光受光手段を採用する。
【００２５】
多波長蛍光受光手段は、図１に示すように、放射された蛍光を集めるレンズ１などを備えた集光部と、集められた蛍光を分光するグレーティング（回折格子）２などを備えた分光部と、分光された蛍光を受光するＣＣＤ（電荷結合素子）３などの受光部とを有して構成されている。分光部には、グレーティング２やプリズムが使用されるが、分解能の点からは、グレーティング２が好適である。この例では、２×３ｃｍのグレーティング２を使用している。また、その場合、集光部で集められた蛍光は、直径が０．３〜３ｍｍの略円形でグレーティング２の表面に照射されることが好適である。０．３ｍｍ以上であれば、感度が良好となり、３ｍｍ以下であれば、分解能も維持できる。受光部には、ＣＣＤの他、フォトダイオード、フォトマル（光電子増倍管）などが使用されるが、例えば、一列に配置された４０４８画素のＣＣＤ３が好適に使用される。このＣＣＤ３を使用すると、どの画素に蛍光が当たるかによって、その蛍光の波長を決定することができる。
【００２６】
図２は、蛍光検出工程を説明する概略図であって、試験管１０中に生成した沈殿１１に対して３つの光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃから励起光が同時に照射され、それにより沈殿１１から放射された蛍光を多波長蛍光受光手段１３により受光、検出する様子を示すものである。
この例の各光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃは、それぞれが異なる波長の可視光を励起光として放射する３つのＬＥＤからなり、具体的な波長の組み合わせとしては、例えば、４１０ｎｍ、５２５ｎｍ、６３０ｎｍの組み合わせが例示できる。また、各ＬＥＤの照射面積は、１ｍｍ２以下とされている。
蛍光色素は一般に、照射される励起光の波長により放射する蛍光の強度が異なり、かつ、照射される励起光の波長と、放射する蛍光の強度との関係は、蛍光色素の種類ごとに異なる特有のパターンを示す。そのため、この例のように光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃを複数設置して、各光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃから複数種の異なる波長の光が発せられるようにすると、励起光の波長を幅広くカバーでき、沈殿１１に含まれる蛍光色素の種類によらず、各蛍光色素から充分な強度の蛍光を放射させることが可能となる。
このような効果は、走査型の光源を用いて、短波長側から長波長側まで連続的に励起光をスキャンして沈殿に照射する方法によっても得られるが、スキャンに長時間を要するとともに、光源が高価となり、コスト面で好適ではない。
【００２７】
この例では、多波長蛍光受光手段１３および３つの光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃは、試験管１０の底部１０ａに対向するように配置されている。具体的には、多波長蛍光受光手段１３は、試験管１０の底部１０ａの直下に配置され、３つの光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃは、多波蛍光受光手段１３を囲むように配置されている。
このように多波長蛍光受光手段１３および３つの光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃを配置すると、各光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃからの励起光を試験管１０の底部１０ａに位置する沈殿１１に対して効果的に照射することができ、かつ、多波長蛍光受光手段１３が３つの光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃからの励起光を直接には受光せず、沈殿１１から放射された蛍光のみを受光することができる。
【００２８】
図３は、図２の蛍光検出工程により得られた蛍光スペクトルと、この蛍光スペクトルを微分した微分値を示すグラフである。
本発明では、蛍光検出手段として多波長蛍光受光手段１３を使用しているために、蛍光に含まれる複数の各波長を検出して、このような蛍光スペクトルを得ることができる。
【００２９】
こうして得られた蛍光スペクトルを分析し、どの波長にピークが有るかを明らかにすることにより、沈殿１１に含まれる標的物質の種類を同定することができる。
具体的には、まず、図３に示すように蛍光スペクトルの微分値を得て、ピークの有無を判定するパターン分析を行う。
こうしてどの波長にピークがあるか判断し、ピークの波長から、沈殿１１に含まれる蛍光色素の種類を特定する。蛍光色素は、標的物質の種類に応じたものが微粒子に含まれているため、蛍光色素の種類が明らかになれば、沈殿に含まれる標的物質の種類も明らかとなる。
なお、この例では、３種類の光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃを使用し、各光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃからの励起光を同時に照射して蛍光スペクトルを得ているが、順次照射してもよい。その場合には、各光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃごとに蛍光スペクトルが得られるため、得られた３種類の蛍光スペクトルを合成してから、パターン分析することが好適である。
【００３０】
このように本発明の検出方法では、蛍光検出工程で採用する蛍光検出手段として、多波長蛍光受光手段を採用している。そのため、試薬液として、標的物質の種類に応じて異なる複数種の微粒子を含むものを用いて、含有する標的物質が異なる複数種の沈殿からの蛍光を１回の検査で検出して、各沈殿に含まれる各標的物質をそれぞれ同定することができる。また、このような方法は、蛍光色素から放射される蛍光を多波長蛍光受光手段で検出するものであって、目視によるものではないので、経験者の熟練に頼ることなく、容易に判定することができる。
【００３１】
なお、蛍光検出工程で照射される励起光は、可視光に限定されず、紫外光でもよい。また、光源としては、ＬＥＤの他、レーザー装置、ブラックライトなどが例示でき、１種以上を使用できる。また、以上の例では、多波長蛍光受光手段１３は、試験管１０の底部１０ａの直下に配置され、３つの光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃは、多波蛍光受光手段１３を囲むように配置された形態を例示したが、ＬＥＤなどの光源の数は３つに限定されず、また、これらの配置にも特に制限はない。
さらに、試験管１０内の沈殿１１以外の上澄み部分に励起光が当たると、白色光が発せられ、沈殿から放射された蛍光の検出精度が低下する。そのため、試験管１０の底部１０ａ以外の部分には励起光が当たらないように、遮光板などの遮光手段を適宜設置してもよい。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明について、具体例を挙げて説明する。
［試験例１］
病原性大腸菌Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１２８、Ｏ１５７の４種を標的物質とし、まず、以下の４種の微粒子をそれぞれ含む液（１）〜（４）を調製した。ついで、各液（１）〜（４）を混合して、試薬液を調製した。
【００３３】
液（１）：病原性大腸菌Ｏ２６に特異的に結合するＯ２６抗体（検出用物質）が表面に担持され、波長４１０ｎｍの励起光に対して青色の蛍光（波長：４５０ｎｍ、４８０ｎｍ、５０５ｎｍ）を放射するペリレン（蛍光色素）を内包した微粒子を含む。
液（２）：病原性大腸菌Ｏ１１１に特異的に結合するＯ１１１抗体（検出用物質）が表面に担持され、波長５２５ｎｍの励起光に対して黄色の蛍光（波長：５６０ｎｍ）を放射するローダミン６Ｇ（蛍光色素）を内包した微粒子を含む。
液（３）：病原性大腸菌Ｏ１２８に特異的に結合するＯ１２８抗体（検出用物質）が表面に担持され、波長５２５ｎｍの励起光に対してオレンジ色の蛍光（波長：５９０ｎｍ）を放射するナイルレッド（蛍光色素）を内包した微粒子を含む。
液（４）：病原性大腸菌Ｏ１５７に特異的に結合するＯ１５７抗体（検出用物質）が表面に担持され、波長６３０ｎｍの励起光に対して近赤外の蛍光（波長：６７０ｎｍ）を放射するＤｉＩＣ１（５）（蛍光色素）を内包した微粒子を含む。
【００３４】
ここで、液（１）の調製は以下のように行った。
ポリスチレンラテックス（藤倉化成社製、平均粒径：２００ｎｍ、固形分：５質量％）を２０ｍＬ用意し、これに水８０ｍＬを加え、固形分が１質量％となるように希釈した。さらに、アセトン１００ｍＬを加えて、ポリスチレン微粒子を膨潤させた。ついで、膨潤したポリスチレン粒子を含む液の中に、１ｍｇ／ｍＬの濃度でペリレン（蛍光色素）を含むアセトン溶液５ｍＬを加えることで、ポリスチレン微粒子に蛍光色素を内包させた。その後、エバポレータによる減圧蒸留でアセトンを除去した。
アセトンを除去した後、後述のようにして調製されたＯ２６抗体（検出用物質）のリン酸緩衝液を加えることで、Ｏ２６抗体を微粒子の表面に物理的に吸着させ、担持させた。その後、アルブミン緩衝液により、微粒子濃度を０．０５質量％に調整して、液（１）を得た。
なお、液（２）〜（４）については、検出用物質および蛍光色素を上記のように変更して、液（１）と同様にして調製した。
【００３５】
また、Ｏ２６抗体の調製は以下のように行った。
ホルマリン固定した病原性大腸菌Ｏ２６を１×１０９個／ｍＬに調整した抗原を用意し、この抗原０．３ｍＬを５週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに３〜４日間隔で４回投与して、免疫を付与した。さらに２週間後、上記抗原０．３ｍＬを投与して追加免疫を行った。その３日後にマウスから脾臓細胞を摘出した。摘出した脾臓細胞は、ケラーらの方法（Ｎａｔｕｅｒ，ｖｏｌ．２５６，ｐ４９５−４９７（１９７５））により、マウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３）と融合し、Ｏ２６抗体産生細胞を確立した。確立した細胞をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から硫酸アンモニウム塩析によってＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）を精製し、これをＯ２６抗体とした。このＯ２６抗体を塩化ナトリウム１５０ｍＭ／Ｌのリン酸緩衝液中に１０ｍＭ／Ｌの濃度となるように加えて溶解させた。
なお、Ｏ２６をＯ１１１、Ｏ１２８、Ｏ１５７にそれぞれ変更して、Ｏ１１１抗体、Ｏ１２８抗体、Ｏ１５７抗体も同様に調製し、リン酸緩衝液に溶解させた。
【００３６】
上述のようにして調製された試薬液１００μＬをハートインフュージョンブイヨン培地が１ｍＬ入っている試験管に採取し、そこに病原性大腸菌Ｏ２６の１白金耳を添加して、３７℃で１５時間培養したところ、沈殿の生成を目視確認することができた。
そこで、図２に示すように、蛍光検出手段として多波長蛍光受光手段１３を備え、該多波長蛍光受光手段１３を囲むようにＬＥＤからなる３つの光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃが配置された蛍光装置を用いて、生成した沈殿１１を分析した。
具体的には、３つの各光源１２ａ、１２ｂ、１２ｃからそれぞれ４１０ｎｍ、５２５ｎｍ、６３０ｎｍの各波長の励起光を同時に放射させ、沈殿１１に対して照射した。
そして、多波長蛍光受光手段１３により、沈殿１１から放射された蛍光を検出した。
得られた蛍光スペクトルを図４に示す。
この蛍光スペクトルをパターン分析したところ、蛍光としては、４８０ｎｍ、５０５ｎｍにピークを有する青色の蛍光のみが確認され、沈殿にはＯ２６が含まれ、Ｏ１１１、Ｏ１２８、Ｏ１５７は含まれないことが示された。なお、４５０ｎｍの蛍光は、フィルタでカットした。
【００３７】
［試験例２］
試験例１で調製したものと同じ試薬液１００μＬをハートインフュージョンブイヨン培地が１ｍＬ入っている試験管に採取し、そこに病原性大腸菌Ｏ２６、Ｏ１２８、Ｏ１５７を各１白金耳添加して、３７℃で１５時間培養したところ、沈殿の生成を目視確認することができた。
そこで、試験例１と同様にして、生成した沈殿を分析した。
得られた蛍光スペクトルを図５に示す。
この蛍光スペクトルをパターン分析したところ、蛍光としては、４８０ｎｍ、５０５ｎｍにピークを有する青色の蛍光、５９０ｎｍにピークを有するオレンジ色の蛍光、６７０ｎｍにピークを有する近赤外の蛍光が確認され、沈殿にはＯ２６、Ｏ１２８、Ｏ１５７が含まれ、Ｏ１１１は含まれないことが示された。なお、４５０ｎｍの蛍光は、フィルタでカットした。
【００３８】
以上各例の方法によれば、１回の検査で複数種の標的物質について、その有無を一括に容易に判定できることが示された。
【符号の説明】
【００３９】
１０  試験管
１１  沈殿
１２ａ、１２ｂ、１２ｃ  光源
１３  多波長蛍光受光手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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