(57)【要約】【課題】客観的かつ簡便な自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法、およびその利用を提供する。【解決手段】本発明に係る自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法は、生体から採取した試料における抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出する工程を含むものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取した試料における抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出する工程を含む、自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法。
【請求項２】
抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションに関わる遺伝子の発現の変化を検出することにより、上記クロスプレゼンテーションを検出することを特徴とする請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出することにより、上記クロスプレゼンテーションを検出することを特徴とする請求項１に記載の診断方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項に記載の自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法を実施するために用いる診断キットであって、
上記クロスプレゼンテーションを検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよび抗体のうち、少なくとも１つを備えていることを特徴とする自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断キット。
【請求項５】
抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを阻害する因子を含む、自己免疫疾患による組織傷害を抑える組織傷害抑制剤であって、該因子がクロロキン、プリマキン、ブレフェルジンＡ、ラクタシスチン、ＭＧ１３２、ＵＳ６またはＩＣＰ４７であることを特徴とする組織傷害抑制剤。
【請求項６】
抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションに関わる因子の同定方法であって、
抗原により被験体を遷延感作する工程と、
上記被験体から採取した抗原提示細胞を上記抗原と共培養する工程と、
共培養した上記抗原提示細胞において存在量に異常がある因子を検出する工程とを含む、同定方法。
【請求項７】
抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを促進する工程を含む、自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物の製造方法。
【請求項８】
遷延感作により、上記クロスプレゼンテーションの促進をおこなうことを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
自己免疫疾患による組織傷害の治療剤をスクリーニングする方法であって、
自己免疫疾患による組織傷害を誘導する組織傷害誘導剤により遷延感作した生体由来の抗原提示細胞を、候補因子の存在下にて培養する培養工程と、
培養工程の後に、上記抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションを検出する検出工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法、およびその利用に関する。より具体的には、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを指標とした、自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、本来外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかし、時にはこの免疫系の働きが、結果的に生体に有害であることがある。その１つがアレルギーである。生体は、外界からの異物に対するのみならず、自己の成分に対しても一種のアレルギー反応を起こすことが知られており、自己免疫現象と呼ばれている。自己免疫によりある種の病態が生じた疾患は、自己免疫疾患と呼ばれている。
【０００３】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患と、特異性のない疾患の２つに大別される。臓器特異的自己免疫疾患には、慢性甲状腺炎、原発性粘膜水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、およびシェーグレン症候群がある。臓器非特異的自己免疫疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病がある。
【０００４】
これら自己免疫疾患の多くは、組織に病変が認められ、組織傷害を伴うものである。
【０００５】
ところで、実験動物を同一抗原で繰り返して免疫し続けると、免疫応答は極期をむかえ、やがて疲弊する。そして、その結果として、組織傷害を伴う種々の自己免疫病態が生じることが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００６−２８８３８２号公報（平成１８年１０月２６日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
実験動物を同一抗原で繰り返して免疫し続けると、この実験動物において組織傷害を伴う自己免疫病態が生起してくる。しかしながら、組織傷害の発症の過程においてどのような細胞が関与しているのかなどについては、具体的には未解明である。そのため、免疫性の組織傷害を予防および治療する技術は、十分に確立されているとはいえず、新たな技術の確立が強く望まれている。
【０００７】
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、客観的かつ簡便な、自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、（１）実験動物に対する同一抗原の繰り返し投与（すなわち、遷延感作）により、クロスプレゼンテーションが増強されること、（２）抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化すること、（３）遷延感作に起因する自己免疫疾患による組織傷害は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって誘導されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係る自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法は、生体から採取した試料における抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出する工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る診断方法は、抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションに関わる遺伝子の発現の変化を検出することにより、上記クロスプレゼンテーションを検出することが好ましい。
【００１１】
本発明に係る診断方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出することにより、上記クロスプレゼンテーションを検出することが好ましい。
【００１２】
また、本発明には、上記の自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法を実施するために用いる診断キットであって、上記クロスプレゼンテーションを検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよび抗体のうち、少なくとも１つを備えていることを特徴とする自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断キットが包含される。
【００１３】
また、本発明には、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを阻害する因子を含む自己免疫疾患による組織傷害を抑える組織傷害抑制剤であって、該因子がクロロキン、プリマキン、ブレフェルジンＡ、ラクタシスチン、ＭＧ１３２、ＵＳ６またはＩＣＰ４７であることを特徴とする組織傷害抑制剤が包含される。
【００１４】
また、本発明には、抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションに関わる因子の同定方法であって、抗原により被験体を遷延感作する工程と、上記被験体から採取した抗原提示細胞を上記抗原と共培養する工程と、共培養した上記抗原提示細胞において存在量に異常がある因子を検出する工程とを含む、同定方法が包含される。
【００１５】
また、本発明には、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを促進する工程を含む、自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物の製造方法が包含される。
【００１６】
本発明の製造方法では、抗原の遷延感作により、上記クロスプレゼンテーションの促進をおこなうことが好ましい。
【００１７】
また、本発明には、自己免疫疾患による組織傷害の治療剤をスクリーニングする方法であって、自己免疫疾患による組織傷害を誘導する組織傷害誘導剤により遷延感作した生体由来の抗原提示細胞を、候補因子の存在下にて培養する培養工程と、培養工程の後に、上記抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションを検出する検出工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法が包含される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法は、以上のように、生体から採取した試料における抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出する工程を含むものである。そのため、自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性を、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを指標として、客観的かつ簡便に、診断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に係る自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法、診断キット、組織傷害抑制剤、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションに関わる因子の同定方法、組織傷害発症モデル動物の製造方法、および組織傷害の治療剤をスクリーニングする方法について、詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
〔１．自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法〕
本発明に係る自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法（以下、単に「本発明の診断方法」ともいう）は、生体から採取した試料における抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出する工程を含むものであればよく、その他の具体的な工程、条件、使用器具および使用装置は特に限定されるものではない。
【００２１】
本明細書において、「自己免疫疾患」とは、自己成分（例えば、免疫グロブリンなど）に対する自己抗体（例えば、リウマチ因子など）が検出され、自己免疫が病態に関与している疾患が意図される。自己免疫疾患としては、臓器特異的自己免疫疾患（例えば、慢性甲状腺炎、原発性粘膜水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、およびシェーグレン症候群など）、および臓器非特異的自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病など）が挙げられる。関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症および混合結合組織病は、膠原病として知られている。すなわち膠原病は、全身性自己免疫疾患に含まれるものである。本発明の適用対象としての自己免疫疾患は、膠原病であることが好ましい。
【００２２】
本明細書において、「組織傷害」とは、生体内の組織の形態および生理学的機能のうち少なくとも何れかが、健常者と比べて異なる状態が意図される。例えば、腎臓における組織傷害の場合には、増殖性糸球体腎炎の発症およびタンパク尿の陽性度の異常が挙げられる。
【００２３】
本明細書において、「自己免疫疾患による組織傷害」とは、上述した組織傷害が免疫応答の異常による自己免疫現象により引き起こされるものが意図される。自己免疫現象とは、外界からの異物に対してではなく、自己の成分に対して免疫反応を起こす現象である。
【００２４】
自己免疫疾患による組織傷害が発症する可能性のある組織としては、例えば、腎臓、肝臓、甲状腺、唾液腺（顎下腺）、耳介および皮膚などが挙げられる。
【００２５】
本明細書において、「クロスプレゼンテーション」とは、抗原提示細胞が外来性抗原を取り込み、プロテアソーム等により外来性抗原をプロセッシングした後、ＭＨＣクラスＩ分子で抗原を提示する抗原提示機構をいう。通常、ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞内に侵入した細菌およびウイルスによって産生されプロセッシングされた抗原（例えば、プロテアソームにより分解されて生じたペプチド断片）を提示する。一方、体内に侵入した細菌および毒物等の外来性抗原は、抗原提示細胞にエンドサイトーシスによって取り込まれると、細胞内の酵素によってプロセッシングされ分解される。そしてこの分解産物（例えば、ペプチド断片）が抗原としてＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される。すなわち、抗原提示細胞によって取り込まれた外来性抗原は、本来、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される。しかしながら、クロスプレゼンテーションによれば、本来ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される抗原が、ＭＨＣクラスＩ分子により提示される。
【００２６】
なお、本明細書中で使用される場合、「クロスプレゼンテーション」は、本来ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される抗原が、ＭＨＣクラスＩ分子により提示される現象または提示されている状態をも意図するものである。
【００２７】
本明細書において、「クロスプレゼンテーションの増強」とは、抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションの生じる頻度が、生体または細胞に対して何も処理をしていない状態または対照の処理をした状態と比較して高くなっている状態にすることを意図している。なお、本明細書中で使用される場合、「クロスプレゼンテーションの増強」は、「クロスプレゼンテーションの促進」と交換可能に使用される。
【００２８】
本明細書において、「発症可能性」は、自己免疫疾患による組織傷害が発生する危険度を示す指標をいい、発症可能性が高ければそれだけ自己免疫疾患による組織傷害が発症しやすく、逆に発症可能性が低ければ自己免疫疾患による組織傷害に罹患し難いということを示すものである。
【００２９】
本発明の診断方法において、生体から採取する試料としては、抗原提示細胞が含まれていればよい。このような試料は、例えば、末梢血、脾臓、リンパ節、肝臓、および皮膚などの各生体器官または生体組織から、公知の方法に従って採取すればよい。
【００３０】
本発明の診断方法における、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出する工程は、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出するものであれば、特に限定されるものではない。好ましくは、クロスプレゼンテーションを検出して、クロスプレゼンテーションの増強を評価するものである。
【００３１】
抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出する方法としては、例えば、後述するＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化または活性を検出する方法、およびクロスプレゼンテーションに関わる遺伝子の発現の異常を検出する方法などが挙げられるが、特に限定されるものではない。なお、クロスプレゼンテーションに関わる遺伝子としては、後述する同定方法により得ることができる。
【００３２】
クロスプレゼンテーションを検出する抗原提示細胞としては、樹状細胞であることが好ましい。
【００３３】
本発明の診断方法における一実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出することにより、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出することができる。
【００３４】
後述する実施例に示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションによって、活性化する。
【００３５】
本明細書において、「ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化」とは、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８陽性Ｔ細胞）が、細胞の内外からのシグナルに応答して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に特有の機能を発現する状態になることが意図される。具体的には、標的細胞表面の主要組織適合（ＭＨＣ）抗原のクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩ分子に提示された外来抗原ペプチドを認識し、抗原ペプチドを提示している標的細胞に対して細胞傷害機能を発揮するようになることが意図される。
【００３６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞に発現しているＣＤ８はＭＨＣクラスＩ分子を認識する補助レセプターであるため、ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示される抗原に対しては、ＣＤ８＋Ｔ細胞が認識できない。したがってこのような抗原が存在しても、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化されることはない。しかし、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションが引き起こされると、本来ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される抗原がＭＨＣクラスＩ分子により提示されることになる。それにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞がこの抗原を認識できるようになり、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化される。すなわち、クロスプレゼンテーションが引き起こされると、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化される。
【００３７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出する方法は、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に存在する成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質などの高分子化合物、ならびに低分子化合物）、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞に特徴的な形態および生理活性（例えば、物質生産能、物質分泌能、物質吸収能および物質分解能など）、ならびに活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞を識別するために用いられる従来公知の識別マーカーを指標として、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出する方法であれば、特に限定されない。
【００３８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出する方法としては、例えば、後述する実施例に示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現を検出する方法が挙げられる。この場合、ＣＤ６９に対する抗体を識別マーカーとして用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞中におけるＣＤ６９陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在比率を測定し、対照ＣＤ８＋Ｔ細胞における存在比率と比較することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出することができる。
【００３９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出する他の方法としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生細胞の存在を検出する方法が挙げられる。この場合、ＩＦＮγを識別マーカーとして、全ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の存在比率を測定し、対照ＣＤ８＋Ｔ細胞における存在比率と比較することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出することができる。
【００４０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出するさらに他の方法としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞が産生したインターフェロンγ（ＩＦＮγ）またはインターロイキン２（ＩＬ−２）を検出する方法が挙げられる。この場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞が産生した培養上清中のＩＦＮγまたはＩＬ−２の量を測定し、対照ＣＤ８＋Ｔ細胞からの産生量と比較することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検出することができる。
【００４１】
上記識別マーカーは、単独で、または複数のものを組み合わせて用いられてもよい。識別マーカーを検出する方法は、それぞれの識別マーカーに応じて、適宜選択可能であり、特に限定されるものではない。識別マーカーを検出する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、遺伝子導入法、ＤＮＡアレイ、タンパク質アレイ、サザンブロッテイング法、ノザンブロッティング法、ウェスタンブロッティング法、ラジオイムノアッセイ法、酵素免疫測定法、形態学的検出方法（例えば、組織免疫染色法、および細胞免疫染色法）、蛍光活性化セルソータ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ：ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー、クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー、およびガスクロマトグラフィー）、および質量分析法などが挙げられる。またこれらの方法は、単独で、または複数を組み合わせて用いることができる。
【００４２】
本発明の一実施形態における抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出する工程においては、上述した方法により被験者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞の存在比率を測定する。その後、得られたＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞の存在比率を、同様の方法で測定した健常者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞の存在比率と比較する。両者の間で有意な相違が見られた場合には、この被験者は、自己免疫疾患による組織傷害を発症しているか、または自己免疫疾患による組織傷害を発症可能性があると診断する。
【００４３】
より具体的にいえば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性、または活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞の存在比率が健常者と比較して上昇していれば、自己免疫疾患による組織傷害を発症しているか、または自己免疫疾患による組織傷害を発症可能性があると診断できる。
【００４４】
また、本発明の診断方法における別の実施形態において、クロスプレゼンテーションに関わる遺伝子の発現の変化を検出することにより、クロスプレゼンテーションを検出することができる。
【００４５】
本明細書において、「遺伝子の発現の変化を検出する」とは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の何れをも包含するものである。
（ｉ）遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量を測定する。
（ｉｉ）遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の発現量を測定する。
（ｉｉｉ）遺伝子の翻訳産物であるタンパク質に由来する活性量を測定する。
【００４６】
本明細書において、「遺伝子の発現量」とは、その遺伝子の転写量、すなわち、その遺伝子のｍＲＮＡ量、およびその遺伝子の翻訳産物であるタンパク質量のいずれをも含む意味で用いている。
【００４７】
対象とする遺伝子の発現を検出する方法として、対象とする遺伝子の発現量を測定する方法を用いる場合、その測定方法は、特に限定されるものではない。具体的には、遺伝子の発現量の測定方法は、ｍＲＮＡレベルで遺伝子の発現量を測定する方法もしくはタンパク質レベルで遺伝子の発現量の測定する方法、またはその両方を測定する方法であってもよい。より具体的には、（Ａ）対象とする遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を定量することにより、遺伝子の発現量を測定する方法、（Ｂ）対象とする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を定量することにより、遺伝子の発現量を測定する方法のいずれをも用いることができる。また、上記（Ａ）および（Ｂ）の両方の方法で遺伝子の発現量を測定してもよい。そうすることにより、対象とする遺伝子の発現量をより正確に測定することができる。以下、上記（Ａ）および（Ｂ）の方法について説明する。
【００４８】
（Ａ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者から採取した試料より抽出したｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを用いて、ノザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などにより、対象とする遺伝子のｍＲＮＡを定量することができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、より定量的な解析をおこなうことが可能である。
【００４９】
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合うことができる異なる蛍光色素で標識したプライマーを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲが進んでＴａｑポリメラーゼの５'−３'エクソヌクレアーゼ活性により、このプライマーが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムにおこなう。上記検出対象についてコピー数の明らかな標準試料についても同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods and Applications 4(6):357-362;Heid,C.A.et al.,Genome Research 6:986-994;Gibson,E.M.U.et al.,1996,Genome Research 6:995-1001を参照）。これにより、検出対象を定量することができる。
【００５０】
上記プライマーは、特に限定されるものではなく、対象とする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を利用して、従来公知の方法で設計すればよい。
【００５１】
採取した試料からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法または市販のキットを用いてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出することができる。
【００５２】
また、ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーならびにノザンハイブリダイゼーション法およびドットブロット法に用いるプローブを蛍光色素などにより標識する場合には、その標識方法は特に限定されるものではない。例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーション法、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識法、クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識法（Berger SL,Kimmel AR.(1987)Guide to Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology,Academic Press;Hames BD,Higgins SJ(1985)Genes Probes:A Practical Approach.IRL Press;Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.(1989)Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照）、ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識法（Melton DA,Krieg,PA,Rebagkiati MR,Maniatis T,Zinn K,Green MR.(1984)Nucleic Acid Res.,12,7035−7056を参照）、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Krick a LJ.(1992)Nonisotopic DNA Probing Techniques.Academic Pressを参照）などを用いることができる。また、アルカリホスファターゼ等の酵素を化学架橋によって核酸に直接結合させて、プローブを標識することも可能である。
【００５３】
（Ｂ）タンパク質を用いる方法
被験者から採取した試料より抽出したタンパク質を用いる場合、分析対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ法などの従来公知の免疫化学的手法によりタンパク質を定量することができる。また、分析対象となるタンパク質の活性を測定することにより、タンパク質を定量することができる。さらに、本発明はこれに限定されず、従来公知のあらゆる手法を用いて、タンパク質を定量することができる。このように、対象とする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を定量することで、遺伝子の発現量を測定することができる。
【００５４】
また、採取した試料からタンパク質を抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記タンパク質を含有する生物学的試料（例えば、細胞、および組織等）などから、タンパク質が分解されない条件下で、従来公知の緩衝液および装置、キット等を用いてタンパク質を抽出することができる。
【００５５】
抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、抗体の取得方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離することにより取得することができる。また、ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。さらに、必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離してもよい。
【００５６】
また、モノクローナル抗体は、例えば、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させて得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収することにより取得することができる。
【００５７】
本発明の一実施形態における抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを検出する工程においては、上述した方法により被験者における対象とする遺伝子の発現量を測定する。その後、その発現量を、同様の方法で測定した健常者における発現量と比較する。両者の間で有意な相違が見られた場合には、この被験者は、自己免疫疾患による組織傷害を発症しているか、または自己免疫疾患による組織傷害を発症可能性があると診断する。
【００５８】
より具体的にいえば、クロスプレゼンテーションが増強したときに発現が上昇する遺伝子の場合には、その遺伝子が健常者と比較して上昇していれば、自己免疫疾患による組織傷害を発症しているか、または自己免疫疾患による組織傷害を発症可能性があると診断できる。一方、クロスプレゼンテーションが増強したときに発現が低下する遺伝子の場合には、その遺伝子が健常者と比較して低下していれば、自己免疫疾患による組織傷害を発症しているか、または自己免疫疾患による組織傷害を発症可能性があると診断できる。
【００５９】
〔２．診断キット〕
本発明に係る診断キットは、上述した自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法を実施するために用いる診断キットであって、クロスプレゼンテーションを検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよび抗体のうち、少なくとも１つを備えていればよい。
【００６０】
クロスプレゼンテーションを検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよび抗体としては、例えば、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞の識別マーカーを検出するために用いられるものが挙げられる。上述したように、クロスプレゼンテーションにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化するとＣＤ６９、ＩＬ−２およびＩＦＮγを産生する。したがって、これらプライマー、プローブ、マイクロアレイまたは抗体を用いて、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞を検出することにより、クロスプレゼンテーションの増強を判定することができる。
【００６１】
また、クロスプレゼンテーションを検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよび抗体としては上記したものの他に、クロスプレゼンテーションに関わる遺伝子の発現を検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよび抗体が挙げられる。上述したように、クロスプレゼンテーションに関わる遺伝子の発現の変化を検出することにより、クロスプレゼンテーションの増強を検出することができる。したがって、これらプライマー、プローブ、マイクロアレイまたは抗体を用いて、抗原提示細胞における遺伝子の発現の変化を検出することにより、クロスプレゼンテーションの増強を判定することができる。
【００６２】
これらのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよび抗体についての説明は、上記〔１．自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性の診断方法〕の項における説明を準用できる。
【００６３】
また、キットの構成としては上述したものに限定されるものではなく、他の酵素、試薬、培養器具および測定器具等を備えていてもよい。
【００６４】
本発明に係る判定キットを用いれば、抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションを指標として、自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性を、客観的にかつ簡便に診断することができる。
【００６５】
〔３．自己免疫疾患による組織傷害を抑える組織傷害抑制剤〕
本発明に係る組織傷害抑制剤は、自己免疫疾患による組織傷害を抑制する分子を含むことを特徴としている。この分子は、クロスプレゼンテーションを阻害する因子であればよく、その生物学的特性および物理学的特性については特に限定されない。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「因子」は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、およびＲＮＡなど）、ペプチド（ポリペプチド、およびタンパク質なと）、糖類（オリゴ糖、多糖類、および糖鎖誘導体など）などの高分子化合物、および低分子化合物が意図される。また、この因子は、クロスプレゼンテーションの阻害に直接的に関与しても、他の因子を介して間接的に関与してもよい。
【００６７】
本明細書において、「クロスプレゼンテーションの阻害」には、（ｉ）抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションの生じる頻度が、生体または細胞に対して阻害処理を何もしていない状態または対照の処理をした状態と比較して低くなるようにすること、（ｉｉ）クロスプレゼンテーションを促進させる処理をおこなっても、クロスプレゼンテーションの生じる頻度が、阻害処理をおこなわずクロスプレゼンテーションを促進させる処理のみをおこなった状態と比較して低くなるようにすること、および（ｉｉｉ）クロスプレゼンテーションにより提示された抗原および抗原を提示したＭＨＣクラスＩ分子を、ＣＤ８＋Ｔ細胞が認識できないようにすること、が包含される。
【００６８】
阻害因子は、上述したようにクロスプレゼンテーションを阻害すれば、特に限定されるものではない。抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを阻害する因子としては、抗原がＭＨＣクラスＩ分子に提示される過程を阻害する因子であることが好ましい。このような因子としては、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ；ＣＱ）、プリマキン、ブレフェルジンＡ、ラクタシスチン、ＭＧ１３２、ＵＳ６およびＩＣＰ４７などが挙げられる。
【００６９】
本発明に係る組織傷害抑制剤を被験体に投与することにより、被験体における自己免疫疾患による組織傷害の発症を抑制することができる。
【００７０】
組織傷害抑制剤を被験体に投与する方法は、特に限定されるものではなく、使用する組織傷害抑制剤に応じて当業者は適宜決定し得る。好ましい投与方法としては、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内および経口的な投与が挙げられる。
【００７１】
本発明に係る組織傷害抑制剤によれば、クロスプレゼンテーションに起因する自己免疫疾患による組織傷害の発症を抑制することができる。したがって、本発明は、自己免疫疾患による組織傷害の予防および治療に利用することができる。
【００７２】
〔４．クロスプレゼンテーションに関わる因子の同定方法〕
本発明に係る同定方法は、抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションの促進に関わる因子の同定方法であって、抗原により被験体を遷延感作する工程と、上記被験体から採取した抗原提示細胞を上記抗原と共培養する工程と、共培養した上記抗原提示細胞において存在量に異常がある因子を検出する工程とを含むものであればよく、その他の具体的な工程、条件、使用器具および使用装置は特に限定されるものではない。
【００７３】
本明細書において、「抗原の遷延感作」とは、同一抗原を被験体に繰り返し投与し、抗体産生またはＴ細胞応答を誘導しておくことが意図される。
【００７４】
被験体に抗原を投与する方法は、特に限定されない。好ましい投与方法としては、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内および経口的な投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
繰り返し投与における、１回あたりの投与量、繰り返しの回数、間隔および期間は、特に限定されるものではなく、使用する抗原、傷害を引き起こされる組織、傷害の程度および態様、被験体の種類、体重および状態等に応じて適宜決定すればよい。例えば、繰り返しの回数は、８回〜２４回、各投与間の間隔は、５日〜１５日、繰り返し投与をおこなう期間は、４０日間〜２０週間おこなうことが好ましい。
【００７６】
遷延感作に用いる抗原は、最終的にＭＨＣ抗原により提示され得る物質であればよく、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡ等のポリヌクレオチド、ペプチドおよびタンパク質等のポリペプチド、オリゴ糖、多糖類および糖類誘導体等の糖類、ならびにその他の高分子化合物および低分子化合物等が挙げられる。
【００７７】
遷延感作に用いる抗原として好ましいのは、卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）である。
【００７８】
抗原提示細胞を抗原と共培養する方法は、抗原提示細胞を抗原の存在下において培養するものであれば、特に限定されるものではない。培養する細胞、および使用する抗原等に応じて、当業者は適宜決定し得る。
【００７９】
本明細書中で用いられる限り、「存在量に異常がある」とは、遷延感作した被験体の抗原提示細胞を抗原と共培養した場合と、遷延感作していない被験体の抗原提示細胞を抗原と共培養した場合とを比較して、抗原提示細胞における存在量に変化があることが意図される。また、存在量に変化があるとは、存在量が増加しているもの、および減少しているものいずれをも含む意味である。
【００８０】
存在量に異常がある因子を検出する方法は、抗原提示細胞における存在量の変化を検出できる方法であれば、特に限定されるものではない。存在量に異常がある因子を検出する方法としては、マイクロアレイ、ディファレンシャル・ディスプレイ法、二次元電気泳動、質量分析など、従来公知のトランスクリプトーム解析手法、プロテオーム解析手法およびメタボローム解析手法を用いることができる。
【００８１】
抗原提示細胞からｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、タンパク質、糖類、または代謝産物を抽出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いて抽出することができる。また、市販のキットを用いて抽出することもできる。
【００８２】
本発明に係る同定方法の一実施形態において、存在量に異常がある因子を検出する方法は、抗原提示細胞から抽出したＲＮＡを用いたマイクロアレイ解析であることが好ましい。マイクロアレイ解析によれば、簡便に、多数の遺伝子に関する情報を得ることができる。
【００８３】
本発明に係る同定方法によれば、クロスプレゼンテーションが促進されたときに、存在量が変化する因子を同定することができる。抗原提示細胞内において、これら同定された因子の量を測定することにより、クロスプレゼンテーションの増強の有無を検出できる。したがって、本発明に係る同定方法により得られた因子を検出することにより、自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性を診断することができる。また、本発明に係る同定方法により得られた因子の量を調節することにより、クロスプレゼンテーションの増強を調節でき、自己免疫疾患による組織傷害の発症を誘導したり、または抑制したりすることができる。
【００８４】
〔５．自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物の製造方法〕
本発明に係る組織傷害発症モデル動物の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」ともいう）は、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを促進する工程を含むものであればよく、その他の具体的な工程、条件、使用器具および使用装置は特に限定されるものではない。
【００８５】
抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを促進する方法は、促進させる処理をおこなった抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションの頻度が、対照抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションの頻度よりも高くなればよく、特に限定されるものではない。抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを促進する方法としては、例えば、被験体に対する抗原の遷延感作が挙げられる。
【００８６】
本発明の製造方法における一実施形態において、非ヒト哺乳動物を抗原により遷延感作することにより、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションを促進することができる。
【００８７】
被験体を遷延感作する方法としては、例えば、上記〔４．クロスプレゼンテーションに関わる因子の同定方法〕において説明した方法を用いることができる。
【００８８】
被験体である非ヒト哺乳動物としては、ヒト以外の哺乳動物であれば限定されるものではないが、ヒトの自己免疫疾患による組織傷害に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物が好ましい。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびイヌ等が挙げられる。
【００８９】
また、本発明の製造方法における別の実施形態において、抗原提示細胞のクロスプレゼンテーションが促進した生体から、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞を採取し、採取した活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を別の生体に移入することにより、自己免疫疾患による組織傷害を発症するモデル動物を製造することができる。
【００９０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を生体に移入する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。例えば、皮下、皮内、静脈、動脈および腹腔に注入する方法が挙げられる。活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞を生体に移入する場合に、移入するＣＤ８＋Ｔ細胞は、移入先である生体と同種または同系の動物由来であることが好ましい。
【００９１】
また、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、末梢血、脾臓、リンパ節、肝臓および皮膚などの各生体器官または生体組織から、公知の方法に従って採取すればよい。
【００９２】
本発明の製造方法によれば、免疫性の組織傷害を引き起こした非ヒトモデル動物を製造することができる。したがって、本発明は、自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物を用いた自己免疫疾患による組織傷害の研究（例えば、自己免疫疾患による組織傷害の予防剤および治療剤のスクリーニングなど）に利用することができる。
【００９３】
なお、組織傷害発症モデル動物が自己免疫疾患による組織傷害を発症しているか否か、またはその可能性があるか否かは、上述した本発明の診断方法により診断することができる。また、組織傷害発症モデル動物が自己免疫疾患による組織傷害を発症しているか否かを検出するその他の方法としては、組織における遺伝子発現の異常の有無の検出、生理学的手法（例えば、物質生産、物質分泌、物質吸収および物質分解等の検出）、組織免疫染色などの組織病理学的手法、および組織傷害を識別するために用いられる従来公知の識別マーカーを指標とした手法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの手法は、単独で、または複数のものを組み合わせて用いられてもよい。
【００９４】
〔６．自己免疫疾患による組織傷害の治療剤のスクリーニング方法〕
本発明に係るスクリーニング方法は、自己免疫疾患による組織傷害を誘導する組織傷害誘導剤により遷延感作した生体由来の抗原提示細胞を、候補因子の存在下にて培養する培養工程と、培養工程の後に、上記抗原提示細胞におけるクロスプレゼンテーションを検出する検出工程とを含むことを特徴とする。
【００９５】
本発明における遷延感作は、被験体を遷延感作できれば特に限定されるものではなく、例えば、上記〔４．クロスプレゼンテーションに関わる因子の同定方法〕の項で説明した方法を用いることができる。
【００９６】
候補因子は、特に限定されるものではなく、クロスプレゼンテーションを直接的または間接的に阻害することが期待される、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、およびＲＮＡなど）、ペプチド（ポリペプチド、およびタンパク質なと）、糖類（オリゴ糖、多糖類、および糖鎖誘導体など）などの高分子化合物、および低分子化合物が好ましい。
【００９７】
上述した本発明に係るスクリーニング方法を用いることにより、自己免疫疾患による組織傷害の治療剤を得ることができる。
【００９８】
また、本発明により得られる治療剤は、クロスプレゼンテーションに起因する自己免疫疾患による組織傷害を引き起こしている患者の治療に用いられ得る。
【００９９】
臨床適用のための治療剤の投与条件は、本明細書に記載した組織傷害発症モデル動物系を用いて決定され得る。すなわち、このモデル動物を用いて、投与量、投与間隔、投与ルートなどの投与条件を検討し、適切な予防効果または治療効果を得るための条件が決定され得る。このような治療剤は、自己免疫疾患による組織傷害の発症に対する予防または治療のための医薬となる。
【０１００】
また、治療剤は、薬学的に受容可能な任意のキャリアをさらに含む組成物であり得る。キャリアとしては、例えば、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、徐放剤、他のタンパク質（ＢＳＡなど）およびトランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等が挙げられる。さらに、本発明において使用可能なキャリアとしては、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンのり、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ばれいしょデンプンおよび尿素などが挙げられる。
【０１０１】
本発明に係るスクリーニング方法により得られた治療剤が製剤化される場合の剤型は、特に制限されず、例えば、溶液（注射剤）、粉体、マイクロカプセルまたは錠剤などであってもよい。例えば、本発明に係る治療剤を徐放剤と組み合わせるか、または徐放性容器（例えば、カプセル）中に格納することにより、自己免疫疾患による組織傷害を発症している組織を標的とするドラッグデリバリーをおこなうことが可能となる。それにより、効果的な治療がおこなわれ得る。
【０１０２】
本発明に係るスクリーニング方法により得られた治療剤の患者への投与経路は、有効成分の性質に応じて適宜選択され、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内または経口的におこなわれ得るがこれらに限定されない。また、治療剤は全身的または局所的に投与され得るが、全身投与による副作用が問題となる場合には、病変部位への局所投与が好ましい。投与量および投与方法は、治療剤の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者は適宜選択し得る。
【０１０３】
本発明に係るスクリーニング方法により得られた治療剤は、目的物質を総組成物の０．１〜９０重量％含む。治療剤中に含まれる目的物質の投与量は、非経口投与では、１日当たり体重１ｋｇ当たり、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。しかし、疾患状態、体重、治療に対する患者の個々反応、治療剤が投与される組成物の種類、投与形態、病気の経過の段階、または投与の間隔に依存して、これら投与頻度は適宜調整され得る。なお、投与は、１回〜数回に分けておこなわれ得、１日あたり１〜５回投与され得る。
【０１０４】
治療対象となる個体としては、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびサルなど）、ならびにその他の脊椎動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒトの組織傷害疾患に対する予防法または治療法を開発するためにも有用である。例えば、非ヒト哺乳動物を用いて作製したモデル動物を用いることにより、自己免疫疾患による組織傷害の発症を予防する新たな治療プロトコルを開発することができる。
【０１０５】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【０１０６】
[実施例１：ＣＤ８＋Ｔ細胞による組織傷害の誘導]
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．５ｍｇの卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）またはＰＢＳを５日毎に１回、合計１２回、腹腔内投与により投与した。投与後のマウスの脾臓から、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）、Ｔ細胞（ＣＤ３陽性細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４陽性細胞）およびＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気ビーズにより単離した。
【０１０７】
これらの細胞を２．５×１０７個ずつ、それぞれ別の未感作のＢＡＬＢ／ｃマウスに、静脈注射により養子移入した。細胞の移入から２４時間後に、０．５ｍｇのＯＶＡを１回腹腔内投与した。細胞の移入から２週間後にタンパク尿を検出した。さらに、これらのマウスを屠殺した後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色、Ｈ＆Ｅ染色）により腎臓の病理学的評価をおこなった。
【０１０８】
タンパク尿の検出結果を図１に示す。図１に示すように、Ｔ細胞移入群においてタンパク尿が検出された。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞移入群とＣＤ８＋Ｔ細胞移入群とを比較すると、タンパク尿の陽性度は、ＣＤ８＋Ｔ細胞移入群の方がより高かった。
【０１０９】
腎臓のＨＥ染色の結果を図２に示す。図２に示すように、腎臓の病理学的評価の結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞移入群では、増殖性糸球体腎炎が発症していた。
【０１１０】
以上より、ＯＶＡの遷延感作により活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞を移入することにより、組織傷害が誘導されることが分かった。
【０１１１】
[実施例２：ＣＤ８＋Ｔ細胞欠損による組織傷害の抑制]
ＢＡＬＢ／ｃマウス（野生型マウス）およびＣＤ８＋Ｔ細胞欠損マウスであるβ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（β２ｍ）欠損マウス（遺伝的背景はＢＡＬＢ／ｃマウス）に、０．５ｍｇのＯＶＡまたはＰＢＳを５日毎に１回、合計１２回、腹腔内投与により投与した。
【０１１２】
最終投与から９日目にタンパク尿を検出した。さらに、これらのマウスを屠殺し、腎臓におけるＩｇＧとＣ３との免疫複合体の沈着を、免疫蛍光染色により検出した。
【０１１３】
免疫蛍光染色による結果を図３に示す。図３に示すように、ＯＶＡを１２回投与したβ２ｍ欠損マウスの腎臓における免疫複合体の沈着は、野生型マウスの腎臓における沈着と同程度であった。
【０１１４】
タンパク尿の検出結果を図４に示す。図４に示すように、β２ｍ欠損マウスにおけるタンパク尿の陽性度は、野生型マウスにおける陽性度と比較して低下していた。
【０１１５】
野生型マウスと比較して、β２ｍ欠損マウスでは、免疫複合体の沈着は同程度であるが、タンパク尿の陽性度が低下していることから、ＣＤ８＋Ｔ細胞欠損マウスでは腎炎が抑制されることが示された。
【０１１６】
以上より、自己免疫疾患による組織傷害には、ＣＤ８＋Ｔ細胞が必要であることが分かった。
【０１１７】
[実施例３：クロスプレゼンテーションによるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化]
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．５ｍｇのＯＶＡまたはＰＢＳを５日毎に１回、合計１２回、腹腔内投与により投与した。投与後のマウスの脾臓から樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ；ＤＣ、ＣＤ１１ｃ陽性細胞）を磁気ビーズにより単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に３時間培養した。ＯＶＡをパルスしたＤＣを、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）が導入されているトランスジェニックマウス（ＤＯ１１．１０ＴＣＲ  ＴＧマウス）から単離したＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞と共に培養した。
【０１１８】
ＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養を開始してから２４時間後、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９（活性化マーカー）の発現をＦＡＣＳで検出した。さらに、培養上清中のＩＬ−２およびＩＦＮγをＥＬＩＳＡにより測定し、ＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を検討した。
【０１１９】
なお、ＤＣにＯＶＡをパルスした際、処理されたＯＶＡペプチドがＭＨＣクラスＩ上に提示されなければ、ＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化されることはない。クロスプレゼンテーションが起こり、ＯＶＡペプチドがＭＨＣクラスＩ上に提示されると、ＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化される。したがって、ＤＣとの共培養後のＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を解析することにより、ＤＣにおける抗原のクロスプレゼンテーションの有無を検討することができる。
【０１２０】
ＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現の検出結果を図５に示す。図中（ａ）は、ＣＤ６９を発現しているＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を計測した結果であり、図中（ｂ）は、（ａ）の結果を棒グラフとして表したものである。図５に示すように、ＰＢＳ投与群のＤＣ（図中、「ＰＢＳ  ＤＣ」）を用いた場合と比較して、ＯＶＡ投与群（図中、「ＯＶＡ  ＤＣ」）を用いて共培養をおこなった場合には、ＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＤＯ１１．１０  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ）におけるＣＤ６９の発現が有意に（Ｐ＜０．００１）増加した。
【０１２１】
培養上清中のＩＬ−２およびＩＦＮγの発現の検出結果を図６に示す。図６に示すように、培養上清中のＩＬ−２およびＩＦＮγも同様に、ＯＶＡ投与群のＤＣを用いて共培養をおこなった場合には、これらの産生が有意に（ＩＬ−２：Ｐ＜０．００１、ＩＦＮγ：Ｐ＜０．００５）増加した。
【０１２２】
以上より、ＯＶＡの繰り返し投与によって、ＤＣにおけるクロスプレゼンテーションが増強し、これによりＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化することが分かった。
【０１２３】
[実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるクロスプレゼンテーションの阻害]
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．５ｍｇのＯＶＡまたはＰＢＳを５日毎に１回、合計１２回、腹腔内投与により投与した。投与後のマウスの脾臓からＤＣ（ＣＤ１１ｃ陽性細胞）を磁気ビーズにより単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてクロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ；ＣＱ）（２０μｇ／ｍｌ）と共に２時間培養し、その後、クロロキンを含まない培養液中においてＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に３時間培養した。
【０１２４】
ＣＱおよびＯＶＡをパルスしたＤＣを、ＯＶＡ特異的ＴＣＲが導入されているＤＯ１１．１０ＴＣＲ  ＴＧマウスから単離したＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞とそれぞれ共培養した。
【０１２５】
ＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞とのそれぞれの共培養開始から２４時間後、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９の発現をＦＡＣＳで検出し、ＯＶＡ応答性Ｔ細胞の活性化を検討した。
【０１２６】
ＯＶＡ応答性Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現の検出結果を図７に示す。図７に示すように、実施例３においても示したとおり、ＤＣにＯＶＡのみをパルスする場合に、ＯＶＡ投与群のＤＣ（図中、「ＯＶＡ  ＤＣ」）を用いて共培養をおこなうと、ＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞（図中、「ＤＯ１１．１０ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ」）におけるＣＤ６９の発現が増加した。
【０１２７】
一方、ＤＣにＣＱをパルスすると、ＯＶＡ投与群のＤＣを用いた場合でも、ＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９の発現はＰＢＳ投与群のＤＣ（図中、「ＰＢＳ  ＤＣ」）を用いた場合と同程度に抑制された。
【０１２８】
ＯＶＡのみをパルスしたＤＣをＯＶＡ応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＤＯ１１．１０ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ）と共培養した場合、ＯＶＡ投与群およびＰＢＳ投与群のＤＣは、互いに同程度にＯＶＡ応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させた。さらに、ＤＣにＣＱをパルスした場合でもＯＶＡ応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞を十分に活性化させた。
【０１２９】
以上より、ＣＱはＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化には影響せず、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化のみを抑制する、すなわちクロスプレゼンテーションを阻害することが分かった。
【０１３０】
[実施例５：クロスプレゼンテーションの阻害による組織傷害の抑制]
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２５０μｇのＣＱを腹腔内投与により投与し、３時間後に、０．５ｍｇのＯＶＡまたはＰＢＳを腹腔内投与により投与した。これを５日毎に１回、合計１２回繰り返しおこなった。
【０１３１】
最終投与から９日目にタンパク尿を検出した。さらに、このマウスを屠殺し、脾細胞の細胞内染色をおこない、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞をＦＡＣＳにより検出した。
【０１３２】
ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出結果を図８に示す。図８に示すように、ＯＶＡを単独で繰り返し投与した場合には、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は増加する。これに対し、ＣＱとＯＶＡとを繰り返し投与した場合（図中、「ＣＱ＋ＯＶＡ」）には、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は増加しなかった。
【０１３３】
タンパク尿の検出結果を図９に示す。図９に示すように、ＣＱとＯＶＡとを繰り返し投与した場合に検出されるタンパク尿は、ＯＶＡ単独を繰り返し投与した場合におけるタンパク尿と比較して、陽性度が低下していた。
【０１３４】
ＣＱの投与によりクロスプレゼンテーションを阻害することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を抑制し、腎炎を抑制した。
【０１３５】
[実施例６：クロスプレゼンテーションに関与する遺伝子の探索]
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．５ｍｇのＯＶＡまたはＰＢＳを５日毎に１回、合計１２回腹腔内投与により投与した。これらのマウスの脾臓からＤＣ（ＣＤ１１ｃ陽性細胞）を磁気ビーズにより単離した。ＤＣをＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に３時間培養し、クロスプレゼンテーションを誘導した後、ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを用いてＡｇｉｌｅｎｔ社のＷｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙによりマイクロアレイ解析をおこない、ＰＢＳ投与群およびＯＶＡ投与群のＤＣにおける遺伝子発現を比較した。
【０１３６】
ＰＢＳ投与群のＤＣにおける発現と比較して、ＯＶＡ投与群のＤＣにおけるｍＲＮＡの発現が５倍以上増加していた遺伝子を表１に示す。
【０１３７】
【表１】
2010004750.tif 000002
【０１３８】
表１に示すように、クロスプレゼンテーションに関与する遺伝子を同定することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
以上のように、本発明によれば、クロスプレゼンテーションを指標として、自己免疫疾患による組織傷害の発症または発症可能性を診断することができる。また、本発明は、自己免疫疾患による組織傷害の予防または治療のための医薬品のスクリーニング試験などに好適に用いることができる。したがって、本発明は、医療分野、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞が移入されたマウスのタンパク尿を測定した結果を示すグラフである。
【図２】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞が移入されたマウスにおける腎炎の発症を調べた結果を示す図である。
【図３】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＣＤ８＋Ｔ細胞欠損マウスの腎臓における免疫複合体の沈着を、免疫蛍光染色により検出した結果を示す図である。
【図４】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＣＤ８＋Ｔ細胞欠損マウスのタンパク尿を測定した結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）および（ｂ）は、本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＣと共に培養したＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ６９陽性細胞の変動を調べた結果を示す図である。
【図６】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＣと共に培養したＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞が産生した、ＩＬ−２およびＩＦＮγの量の変動を調べた結果を示す図である。
【図７】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＣと共にＣＱの存在下で共培養したＯＶＡ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ６９陽性細胞の変動を調べた結果を示す図である。
【図８】本実施例において、抗原およびＣＱを繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγの産生細胞の変動を調べた結果を示す図である。
【図９】本実施例において、抗原およびＣＱを繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのタンパク尿を測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図３】
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