(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトｅｒｂＢ２遺伝子産物(ＨＥＲ２とも称されるＥｒｂＢ２、又はｃ-ＥｒｂＢ-２)に結合する新規な化合物、及び新規な化合物を含有する製薬組成物を提供する。【解決手段】ＥｒｂＢ２に結合する非天然発生アミノ酸配列からなる化合物である。化合物は、約５〜約５０のアミノ酸残基の非自然発生アミノ酸配列からなるペプチドリガンドであり、更に免疫グロブリン定常領域配列としてＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域を含むペプチドリガンドからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロアッセイにおいて、次の式：
Ｘａａ（１−１４）−Ｃｙｓ−Ｘａａ１６−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ（２１−２７）（配列番号：９０）
を有し、ここで、Ｘａａ（１−１４）がないか、１から１４のアミノ酸であり、Ｘａａ１６がＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ（２１−２７）はないか、１から７のアミノ酸であるペプチドリガンドと、ＨＥＲ２への結合について競合する、非天然発生ペプチドリガンド。
【請求項２】
次の式：
Ｘａａ（１−７）−Ｃｙｓ−Ｘａａ９−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ（１４−２０）（配列番号：９２）
を有し、ここで、Ｘａａ（１−７）がないか、１から７のアミノ酸であり、Ｘａａ９がＭｅｔ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ又はＣｙｓからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ（１４−２０）はないか、１から７のアミノ酸である、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項３】
次の式：
Ｘａａ（１−７）−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ（１４−２０）（配列番号：１６１）
を有する請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項４】
式Ａ−Ａを有するペプチドリガンドであって、ここでＡが請求項３に記載のペプチドリガンドであり、「−」が任意成分のリンカードメインであるペプチドリガンド。
【請求項５】
次の式：
Ｘａａ（１−５）−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ（１４−２０）（配列番号：９３）
を有し、ここで、Ｘａａ（１−５）がないか、１から５のアミノ酸である、請求項３に記載のペプチドリガンド。
【請求項６】
次の式：
Ｘａａ（１−３）−Ｇｌｕ−Ｘａａ５−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｌｅｕ−Ｘａａ（１７−２０）（配列番号：８７）
を有し、ここで、Ｘａａ（１−３）がないか、１から３のアミノ酸であり、Ｘａａ５がアミノ酸であり、
Ｘａａ５がアミノ酸であり、
Ｘａａ１４がアミノ酸であり、
Ｘａａ１９がアミノ酸であり、
−Ｘａａ（１７−２０）がないか、１から４のアミノ酸である、請求項５に記載のペプチドリガンド。
【請求項７】
Ｘ（１−３）−がないか、
Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−
Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−
Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−
Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−
Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−
Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−
Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−
からなる群から選択され、
Ｘａａ５は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ及びＬｙｓからなる群から選択され、
Ｘａａ１４は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＧｌｎからなる群から選択され、
Ｘａａ１５は、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐからなる群から選択され、
−Ｘａａ（１７−２０）は、次の式：
−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｃｙｓ−Ｘａａ２０
を有する４のアミノ酸のペプチドである、請求項６に記載のペプチドリガンド。
【請求項８】
−Ｘａａ（１７−２０）が、
−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ（配列番号：１０２）
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ（配列番号：１０３）
−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ（配列番号：１０４）
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号：１０５）
−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１０６）
−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１０７）
−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１０８）
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１０９）
−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号：１１０）
−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１１１）
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１１２）
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１１３）
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１１４）
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号：１１５）
−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１１６）及び
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１１７）
からなる群から選択される請求項７に記載のペプチドリガンド。
【請求項９】
−Ｘａａ（１７−２０）が、次の式：
−Ｃｙｓ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｃｙｓ
を有する４のアミノ酸であり、ここでＸａａ１８はアミノ酸であり、Ｘａａ１９はアミノ酸である、請求項６に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０】
−Ｘａａ（１７−２０）が、
−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ（配列番号：１１８）
−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ（配列番号：１１９）
−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号：１２０）
−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ（配列番号：１２１）
−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ（配列番号：１２２）
−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ（配列番号：１２３）及び
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ（配列番号：１２４）
からなる群から選択される請求項９に記載のペプチドリガンド。
【請求項１１】
次の式：
Ｘａａ（１−１０）−Ｇｌｕ−Ｘａａ１２−Ｔｒｐ−Ｘａａ１４−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ（２４−２７）（配列番号：１２６）
を有し、ここで、Ｘａａ（１−１０）がないか、１から１０のアミノ酸であり、
Ｘａａ１２はアミノ酸であり；
Ｘａａ１４はアミノ酸であり；
Ｘａａ２１はアミノ酸であり；
Ｘａａ２２はアミノ酸であり；
Ｘａａ２３はＶａｌ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘａａ（２４−２７）がないか、１から４のアミノ酸である、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項１２】
Ｘａａ（１−１０）が、次の式：
−Ｃｙｓ−Ｘａａ（２−７）−Ｃｙｓ−Ｘａａ９−Ｇｌｙ−
を有する１０のアミノ酸のペプチドであり、
Ｘａａ（２４−２７）が、次の式：
Ｘａａ（２４−２６）−Ｃｙｓ
を有する４のアミノ酸のペプチドであり、ここで、Ｘａａ（２−７）が６のアミノ酸ペプチドであり、Ｘａａ（２４−２６）が３のアミノ酸のペプチドである請求項１１に記載のペプチドリガンド。
【請求項１３】
式Ｂ−Ｂを有するペプチドリガンドであって、Ｂが請求項１１に記載のペプチドリガンドであり、ここで「−」は任意成分のリンカードメインであるペプチドリガンド。
【請求項１４】
式Ａ−Ｂを有するペプチドリガンドであって、Ａが請求項２に記載のペプチドリガンドで、Ｂが請求項１１に記載のペプチドリガンドであり、ここで「−」は任意成分のリンカードメインであるペプチドリガンド。
【請求項１５】
Ｘａａ（１−１０）が次の式：
Ｃｙｓ−Ｘａａ２−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｃｙｓ−Ｘａａ９−Ｇｌｙ−  （配列番号：１２７）
を有している請求項１２に記載のペプチドリガンド。
【請求項１６】
Ｘａａ（１−１０）が次の式：
Ｃｙｓ−Ｘａａ２−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｃｙｓ−Ｘａａ９−Ｇｌｙ−  （配列番号：１２７）
を有し、ここで、Ｘａａ２は、Ａｌａ及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ５は、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｒｇ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ６は、Ｐｈｅ、Ｖａｌ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘａａ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ９は、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸であり、
る、請求項１５に記載のペプチドリガンド。
【請求項１７】
Ｘａａ（１−１０）が次の式：
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−  （配列番号：１６２）
を有している請求項１６に記載のペプチドリガンド。
【請求項１８】
Ｘａａ（２４−２６）が次の式：
Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６
を有し、ここで、Ｘａａ２４は、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２５は、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２６は、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１７に記載のペプチドリガンド。
【請求項１９】
Ｘａａ（２４−２６）が次の式：
Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６
を有し、ここで、Ｘａａ２４は、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２５は、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２６は、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１７に記載のペプチドリガンド。
【請求項２０】
Ｘａａ２４がＶａｌであり；
Ｘａａ２５がＡｓｎであり、
Ｘａａ２６がＡｌａである、請求項１９に記載のペプチドリガンド。
【請求項２１】
（ａ）請求項１、４、１１又は１３の何れか１項に記載のペプチドリガンドと（ｂ）免疫グロブリン定常領域配列を含むポリペプチド。
【請求項２２】
リンカー配列を更に含んでなる請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
免疫グロブリン定常領域配列が、ＩｇＧ重鎖の定常ドメインである請求項２０又は２１に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
上記定常領域配列が、免疫グロブリン重鎖のＣＨ３ドメインを含む請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を更に含む請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
上記定常領域配列が、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
更なる機能部分を更に含んでなる請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
更なる機能部分が細胞毒性剤と酵素からなる群から選択される請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
更なる機能部分が細胞毒性剤である請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１に記載のペプチドリガンドと製薬的に許容可能な賦形剤を含有する製薬組成物。
【請求項３１】
請求項２１に記載のポリペプチドと製薬的に許容可能な賦形剤を含有する製薬組成物。
【請求項３２】
請求項２８に記載のポリペプチドと製薬的に許容可能な賦形剤を含有する製薬組成物。
【請求項３３】
請求項１に記載のペプチドリガンドをコードする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３４】
ＤＮＡ分子に作用可能に結合した発現コントロール配列を更に含んでなる請求項３３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３５】
コントロール配列がベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される、請求項３３のＤＮＡ分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３７】
宿主細胞中でペプチドリガンドをコードするＤＮＡ分子を発現させる方法において、ペプチドリガンドの発現に適した条件下で請求項３６に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項３８】
培地からペプチドリガンドを回収することを更に含む請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明はヒトｅｒｂＢ２遺伝子産物(ＨＥＲ２としても知られているＥｒｂＢ２、又はｃ-ＥｒｂＢ-２)に結合する新規な化合物に関する。特定の態様では、本発明は、本発明の新規な化合物を利用するＥｒｂＢ２の発現により特徴付けられる疾患の治療に関する。また本発明は、その新規な化合物を含有する組成物、例えば製薬用組成物、並びに研究、診断、治療及び予防法におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
(関連する開示の記載)
ファージディスプレイは、テンプレート配列内の特定のアミノ酸残基の無作為化を通して又は天然ペプチドライブラリーの生成によって、ペプチド及びタンパク質変異体の産生する手段を提供する(Lowman, H. (1998) Methods Mol. Biol. 87：249-264；Lowman(1997)Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26：401-424)。予め決められた標的分子に結合するディスプレイされたタンパク質又はタンパク質の同定と単離は、固定された標的分子上の非結合又は弱く結合している変異体に対してディスプレイファージを富ませることにより、達成することができる(上掲のLowman, H.(1998))。突然変異誘発と選択の連続の実施により、細胞レセプターに対して高親和性を持つペプチドリガンド又はタンパク質変異体を生成することができる(Lowman, H.(1998)上掲)。上記技術は、例えば細胞標的に帰着するペプチドモチーフを同定するため(Arapら, (1998)Science 279：377-380)、又は天然のタンパク質結合リガンドから親和性が改善され又は成熟したペプチドリガンドを産生するために(Lowmanら, (1991)Biochemistry 30：10832-10838)使用されている。親和性又は特異性が改善されたタンパク質の例には、ヒト成長ホルモン、Ｚｎフィンガー、プロテアーゼインヒビター、心房性ナトリウム利尿ペプチド、及び抗体が含まれる(Wells, J. 及びLowman H.(1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 2：597-604；Clackson, T.及びWells, J.(1994)Trends Biotechnol. 12：173-184；Lowmanら, (1991)Biochemistry 30(10)：832-838；Lowmanら.及びWells J.(1993)J. Mol. Biol. 234：564-578；Dennis M.及びLazarus R.(1994)J Biol. Chem. 269(22)：137-144)。
【０００３】
インビボでのファージ選択を利用して、ファージディスプレイは、脳及び腎臓のような種々の器官に選択的局在化を媒介可能なペプチドを同定し単離するために（Pasqualini及びRuoslohti (1996) Nature 380:364-366）、並びにαＶβ３又はαＶβ５インテグリンを担持する特定の腫瘍タイプに帰着するペプチドを同定するために使用されている(Arapら, (1998) Science 279：377-380)。米国特許第５６２７２６３号には、α５β１インテグリンにより認識され、これと選択的に結合するペプチドが記載されている。一価のファージディスプレイにより生成される構造的に限定されたペプチドライブラリーを使用して、インシュリン様成長因子１結合タンパク質(ＩＧＦＢＰｓ)に特異的に結合する１４のアミノ酸のペプチドが単離されている(Lowmanら, (1998) Biochemistry, 37：8870-8878)。そのペプチドはヘリックス構造を有し、ＩＧＦＢＰｓに結合してインビトロでインシュリン様成長因子α(ＩＧＦ-１)活性を作用させる(上掲のLowmanら,(1998)）。
新規なタンパク質に基づく治療が臨床に入っているので、特定の細胞レセプターとそれらのリガンド、特に種々のヒト悪性腫瘍の病因に関連しているものは、近年、科学界において多くの注目を集めている。例えば、上皮成長因子レセプター(ＥＧＦＲ)に関連した１８５ｋｄの膜貫通糖タンパク質レセプター(ｐ１８５ＨＥＲ２)をコードするヒトｅｒｂＢ２遺伝子(ｈｅｒ２としても知られている、又はｃ-ｅｒｂＢ-２)は、ヒトの乳癌の約２５％〜３０％で過剰発現していることが見出されている(Slamonら, (1987) Science 235:177-182；Slamonら, (1989) Science 244:707-712)。いくつかの証拠情報は、ＥｒｂＢ２を過剰発現する腫瘍の病原性及び臨床的病原力におけるＥｒｂＢ２の直接的な役割を裏付けている。非新生物細胞へｅｒｂＢ２を導入すると、その悪性形質転換を引き起こすことが示されている(Hudziakら, (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7159-7163；DiFioreら, (1987)Science 237:78-182)。ＨＥＲ２を発現するトランスジェニックマウスは、乳房腫瘍を発生させることが見出されている(Guyら, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA）。 
【０００４】
ＥｒｂＢ２過剰発現は、特に腋窩リンパ節に関与する原疾患を持つ患者における、悪い予後のプレディクターであると一般的に考えられている(上掲のSlamonら, (1987)及び(1989)；Ravdin及びChamness, Gene (1995)159:19-27；及びHynesとStern, (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184)。また過剰発現は、ＣＭＦ(シクロホスファミド、メトトレキセート及びフルオロウラシル)及びアントラサイクリン(Baselgaら, (1997) Oncology 11(3 Suppl 1):43-48)を含む、ホルモン療法及び化学療法に対する感受性及び／又は耐性に関連している。
組換えヒト化抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体(ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２又はハーセプチン(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ)と称されるマウス抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５のヒト化体)は、広範な抗癌治療を前に受けたことのあるＥｒｂＢ２過剰発現転移性乳癌を持つ患者において治療的に活性であった(Baselgaら, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744)。
【０００５】
(発明の概要)
本発明は、ヒトｅｒｂＢ２遺伝子産物(ＥｒｂＢ２)に結合する化合物を提供する。本発明の化合物(ここではペプチドリガンドとも呼ぶ)は、例えばペプチド又はペプチド誘導体、例えばペプチド模倣物及びペプチド類似物である。好ましいペプチドリガンドには、線形又は環状のペプチド、好ましくは次の核となる式：
-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-
を含む環状ペプチド化合物、好ましくは次の一般式：
Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys  (配列番号：７０)
又は次の一般式：
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
を有するものが含まれ、また上記の一般構造のダイマー及び他の組合せも含まれる。本発明のペプチドリガンドの中で好ましいものは、次の核となる式：
-Cys-Cys/Ile-Gly-Pro-Gly-Cys  (配列番号：７１)
を含むペプチドである。このような化合物の特定の例には、約１０〜６０のアミノ酸残基の環状ペプチドで、場合によってはＮ-もしくはＣ-末端、あるいは双方が修飾されたもの、例えばそれらのエステル、アミド、塩及び他の誘導体が含まれる。本発明の好ましい態様では、化合物は、好ましくはＥｒｂＢ２に結合する非天然発生アミノ酸配列である。好ましくは、化合物は、約５〜約５０のアミノ酸残基の非自然発生アミノ酸配列である。好ましい化合物は、上記の一般式を有し、約２０〜約３０のアミノ酸残基を有する環状ペプチドで、そのダイマー及び他の組合せを含む。
【０００６】
特定の態様において、本発明はペプチドリガンドと他のペプチドリガンド又は他のタンパク質、特に血清タンパク質又はペプチドとの組合せに関する。この組合せは、ペプチドリガンドのその標的分子に対する親和性又は親和力を、例えば種々の多量体化ドメインを使用して増加させ；例えばＺプロテイン融合体としてペプチドリガンドを発現させることにより、ペプチドリガンドの安定性を増加させるか、又はその回収と精製を容易にし；例えば血清の半減期を増加又は減少させることにより、血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポプロテイン又はトランスフェリン等の細胞質タンパク質にペプチドリガンドを融合させることにより(そのような融合体は組換え宿主細胞において簡便に、又は二官能性架橋剤を使用することにより生成する)、及び機能性Ｆｃドメイン又は細胞障害又は酵素部分等の付加的機能を導入することにより、ペプチドリガンドのインビボ使用を含む本発明の態様のペプチドリガンドの治療効果を改善することを含む、種々の目的をもって調製される。
本発明の好ましい態様では、本発明の化合物は多量体化ドメインに結合する。多量体化ドメインは、好ましくは免疫グロブリン配列、又は例えばロイシンジッパー配列である。本発明のこの態様では、免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン定常領域配列、特に免疫グロブリン重鎖の定常領域である。本発明の好ましい態様では、多量体化ドメインは一又は複数のコンパニオン多量体化ドメインと対になり、ホモ-及びヘテロ-多量体組成をもたらす。本発明のこの側面の好ましい態様はホモ-及びヘテロ-多量体、特にホモ-及びヘテロダイマーにあり、そこでは、多量体化ドメインが、対となって機能的免疫グロブリンＦｃドメインを提供する免疫グロブリン重鎖定常領域である。よって、好ましい態様では、本発明は、機能的免疫グロブリンＦｃドメインと結合するエフェクター機能を有する機能的免疫グロブリンＦｃドメインとＥｒｂＢ２担持細胞型を標的とするように機能する本発明の化合物を含有するハイブリッド分子を提供する。
【０００７】
本発明のこの態様によるハイブリッド分子は、場合によってはさらなる機能的部分、例えば酵素部分及び細胞障害性部分を含む。例えば、付加的な機能的ドメインは、ハイブリッド分子に共有結合的に結合し、プロドラッグをそのより活性な形態に転換させるようにプロドラッグに作用可能な酵素であってよい。本発明の所定の好ましい態様による任意成分の機能的ドメインは、例えばハイブリッド分子に共有結合によって結合する細胞障害剤であってもよい。好ましい細胞障害剤には、例えば化学治療剤、毒素及び放射性アイソトープが含まれる。ハイブリッド分子を含む化合物とそれらを含有する組成物は、ヒトｅｒｂＢ２遺伝子産物への結合又は検出と、場合によってはＥｒｂＢ２担持細胞型への酵素又は細胞障害剤等の機能的部分の送達に使用される。
一実施態様では、本発明の化合物、例えば上述したハイブリッド分子はポリペプチドであり、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸、好ましくはＤＮＡを含有する物質の組成物を含む。この態様では、本発明は、ＤＮＡ分子に作用可能に結合した発現コントロール配列、ＤＮＡ分子を含有する発現ベクター、好ましくはプラスミドで、ここでコントロール配列がベクターで形質転換された宿主細胞により認識されるもの、及びベクターで形質転換された宿主細胞を更に含む。好ましい態様では、核酸が本発明のペプチド化合物と免疫グロブリン定常領域ドメイン配列を含有するハイブリッド分子をコードする。本発明のこの態様に係る核酸分子はハイブリッド分子をコードし、本発明のペプチド化合物をコードする核酸は免疫グロブリン定常ドメインに配列に作用可能に結合している(ＤＮＡ配列が隣接し読み枠にあるという意味)。場合によっては、ＤＮＡ配列は任意成分のリンカードメインアミノ酸配列をコードする核酸配列によって結合している。
【０００８】
本発明の組成物は、本発明のアミノ酸配列の任意のものをコードする核酸配列を単離又は合成し、適切な宿主中で核酸配列を発現可能な適切な発現ベクター内に核酸配列をライゲーションし、核酸配列がライゲーションされた発現ベクターで宿主を形質転換し、核酸配列の発現に適した条件下で宿主を培養する工程を含む方法により作成され、それにより、選択された核酸配列によりコードされるタンパク質は宿主により発現される。好ましくは、ポリペプチドはついで宿主細胞培養物から回収される。この方法では、ライゲーション工程は、核酸配列が適切な分泌シグナルに作用可能に結合するように適切な発現ベクターに核酸をライゲーションすることをさらに意図しており、それにより、アミノ酸配列は宿主により分泌される。
本発明は、本発明の化合物を含有する、特にｅｒｂＢ２遺伝子発現に関連した病気又は疾患の検出及び治療のための製薬用組成物を含む組成物を含む。例えば、癌の検出及び治療用のキット及び製造品が提供される。キット及び製造品は、好ましくは：
（ａ）容器；
（ｂ）前記容器上の又は該容器に付随するラベル；及び
（ｃ）前記容器内に収容された本発明の化合物を含む組成物を含み、ある実施態様では、当該組成物は、ｅｒｂＢ２遺伝子発現を伴う病気又は疾患、例えば癌の治療に有効である。好ましくは、前記容器上のラベルは、当該組成物が癌の治療に使用できることを表示しており、当該組成物中の化合物がヒトｅｒｂＢ２遺伝子産物に結合するここで記載された化合物を含む。キットは、場合によっては、付属品、例えば製薬的に許容されるバッファーを収容した第２の容器及び疾患の治療のために組成物を使用するための指示を含む。
【０００９】
種々の病気及び疾患、例えば癌、特にＥｒｂＢ２に関連していることを特徴とするものの治療に有用な方法が開示される。よって、本発明は、治療的有効量の本発明の化合物を宿主に投与することを含む、その必要とする宿主におけるＥｒｂＢ２媒介性又は関連性の病気又は疾患の治療方法を提供する。さらに本発明は、限定するものではないが、化合物の非経口、経口、直腸及び肺投与に適切なものを含む、本発明の化合物の種々の投与形態を提供する。本発明の好ましい態様では、治療的投与形態は静脈内送達に適するように提供され、本発明は、ＥｒｂＢ２媒介性又は関連性のプロセス又は事象、例えば癌に関連した病気又は疾患の治療のために提供される。
【００１０】
(好ましい実施態様の詳細な説明)
定義
「ＨＥＲ２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ-Ｅｒｂ-Ｂ２」という用語は互換的に使用される。特に別の定義を示さない限り、ここで使用される「ＥｒｂＢ２」、「ｃ-Ｅｒｂ-Ｂ２」及び「ＨＥＲ２」という用語はヒトタンパク質を意味し、「ｈｅｒ２」、「ｅｒｂＢ２」及び「ｃ-ｅｒｂ-Ｂ２」はヒト遺伝子を示す。ヒトｅｒｂＢ２遺伝子及びＥｒｂＢ２タンパク質は、例えばSembaら, (1985) PNAS(USA)82:6497-6501及びYamamotoら, (1986) Nature 319:230-234(Genebank受託番号 X03363)に記載されている。ＥｒｂＢ２は４つのドメインを含んでいる(ドメイン１-４)。
本発明における「ペプチドリガンド」なる用語は、その由来にかかわらず、ＥｒｂＢ２に結合するように機能するアミノ酸配列を指すことを意味する。本発明のペプチドリガンドは、一般的に束縛されている(つまり、例えばβターン又はβプリーツシートを開始するアミノ酸の存在、又はジスルフィド結合したCys残基の存在により環化したような構造のいくつかのエレメントを有している)か、又は束縛されていない(例えば、線形)、約５０アミノ酸残基未満、好ましくは約４０アミノ酸残基未満のアミノ酸配列である。約４０アミノ酸残基未満のペプチドリガンドでは、約１０〜約３０アミノ酸残基のペプチドリガンド、特に約２０〜約３０アミノ酸残基のペプチドリガンドが好ましい。しかしながら、現在の開示を読むと、当業者であれば、本発明のペプチドリガンドを区別するのは特定のペプチドリガンドの長さではなく、ＥｒｂＢ２に結合するその能力であることを認識するであろう。よって、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０アミノ酸残基のペプチドリガンドが、等しく有望な本発明のペプチドリガンドである。
【００１１】
本発明のペプチドリガンドは、ペプチドリガンドがインビトロで、好ましくはインビボでＥｒｂＢ２、例えばＥｒｂＢ２担持細胞に「帰着する（homes）」、「結合する」又は「標的とする」ならば、十分な親和性と特異性を持ってＥｒｂＢ２に結合するであろう(例えば、Pasqualini及びRuoslahti(1996) Nature, 380：364-366、及びArapら,(1998) Science 279：377-380)における「帰着する」、「帰着」及び「結合する」という用語の使用を参照されたい)。一般的に、ペプチドリガンドは、Jonesら, (1999) FEBS Letters 447：227-231により記載されたものと同様なＥｒｂＢ基質を利用する競合アッセイ等のインビトロアッセイにより定量される場合に約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、特に約１０ｎＭ未満の親和力でＥｒｂＢ２に結合する。しかしながら、ＥｒｂＢ２に対して約１ｎＭ未満、好ましくは約１ｐＭ〜１ｎＭの親和力を有するペプチドリガンドが、等しく有望な本発明のペプチドリガンドである。一般に、上述したようなＥｒｂＢ２に結合するペプチドリガンドは、固定化されたＥｒｂＢ２分子に結合させるなどのここに記載された当該技術の多くの標準的な技術の任意のものにより単離され同定され得る。
上述したように、ペプチドリガンドは自然に生じた、また非自然的に生じたアミノ酸残基を含有していてもよい上述したアミノ酸配列である。よって、特定のアミノ酸又はペプチドの構造を模倣した非アミノ酸化学構造を含みうる、いわゆる「ペプチド模倣物」及び「ペプチド類似物」も本発明のペプチドリガンドとできる。このような模倣物及び類似物は、類似の物理的特徴、例えば大きさ、電荷又はそれらの対のペプチドに見出されるような適切な空間的配向性で存在する疎水性を示すものとして一般に特徴付けられる。ペプチドの模倣化合物の特定の例は、一又は複数のアミノ酸のアミド結合が、例えば炭素-炭素結合又は当該技術でよく知られている他の結合で置換された化合物である(例えば、Sawyer, Peptide Based Drug Design pp.378-422(ACS, Washington DC 1995)を参照のこと)。
【００１２】
従って、本発明における「アミノ酸」なる用語は最も広い意味に使用され、自然に生じるＬα-アミノ酸又は残基を含むことを意味する。自然に生じるアミノ酸に対して一般的に使用されている１文字及び３文字略号がここでも使用される(Lehninger, A.L., Biochemistry, 第2版, pp.71-92,(1975) Worth Publishers, New York)。この用語には、Ｄ-アミノ酸、並びに化学的に修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸類似物、ノルロイシン等のタンパク質に通常導入されない自然に生じるアミノ酸、及びアミノ酸に特徴的な当該分野において公知の特性を有する化学的に合成された化合物が含まれる。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同じペプチド化合物の配座制限を許容するフェニルアラニン又はプロリンの類似物又は模倣物が、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物はここではアミノ酸の「機能的等価物」と称する。アミノ酸の他の例は、出典を明示してここに取り込まれるRoberts及びVellaccio(The Peptides：Analysis, Synthesis, Biology)Eds. Gross及びMeiehofer, Vol.5 p341, Academic Press, Inc, N.Y. 1983に列挙されている。
例えば、標準的な固相合成法により合成されたペプチドリガンドは、遺伝子によりコードされるアミノ酸に限定されない。遺伝子コードによりコードされない一般的に遭遇するアミノ酸には、例えば国際公開第９０／０１９４０号に記載されているもの、例えばＧｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノアジピン酸（Ａａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノブチル酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙについての２-アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬｅｕ及びＩｌｅについてのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓについてのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての２，３-ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、及びＧｌｎについてのＮ-エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓについてのヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓについてのアロヒドロキシルリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒについての３-(及び４)ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌについてのアロ-イソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａについてのρ-アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａについてのＮ-メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅについてのＮ-メチルイソロイシイン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについてのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎについてのシトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ＰｈｅについてのＮ-メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ）フェニルアラニン、トリフルオロフェニルアラニンが含まれる。
【００１３】
本発明の保存的アミノ酸置換を、「例示的置換」及び「好ましい置換」と題して表１に示す。好ましい置換がＨＥＲ２結合性を低減又は変化させない場合、表１に例示的置換と名前を付け、又はさらにここで記載する、より実質的な変化が導入され、生成物がＨＥＲ２結合について試験される。
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【００１４】
本発明のペプチドリガンドは、好ましくは自然に生じないアミノ酸配列である。自然に生じないとは、特定のペプチドリガンドのアミノ酸配列が天然に見出されないことを意味する。本発明において、「非天然発生」とは、非天然の又は非天然発生のアミノ酸配列に相当するペプチドリガンドを指すために使用される。この多様なペプチドリガンドは、当業者によく知られている種々の技術を使用して生成又は選択されうる。例えば、束縛されているか又は束縛されていないペプチドライブラリーが無作為に作製され、当該分野で標準的な技術を利用してファージにディスプレイする(例えば、Lowmanら, (1998) Biochemistry 37：8870-8878)。
少なくとも３つの異なる種のペプチドリガンドが、ＥｒｂＢ２に結合する機能に基づいて区別されうる。これらは、ここでは「中性」、「アゴニスト」及び「アンタゴニスト」ペプチドリガンドと称される。一般に、中性ペプチドリガンドは、上述したようにＥｒｂＢ２に結合するように機能する。中性ペプチドリガンドは、ＥｒｂＢ２を担持する特定の細胞型の、例えば細胞障害剤又は酵素でのターゲティングが望まれる本発明の態様において好ましい。
一般に、ＥｒｂＢ２の結合に加えて「アゴニスト」ペプチドリガンドは、ＥｒｂＢ２担持細胞に対して直接の効果を有している。好ましくは、アゴニストペプチドリガンドは記載されたようにＥｒｂＢ２に結合し、さらにＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３タンパク質複合体及び／又はＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ４タンパク質複合体に関連した事象、例えば細胞内キナーゼドメインをしてＥｒｂＢ２レセプター複合体のチロシン残基をホスホリル化させる能力を開始又は媒介する。また、アゴニストペプチドリガンドの結合は、ＥｒｂＢ２レセプターの二量体化に関連している場合がある。ＥｒｂＢ２レセプター媒介性ホスホリル化又はＥｒｂＢ２レセプター二量体化を誘発する能力は、チロシンホスホリル化アッセイ及びＳＤＳ ＰＡＧＥ等の当該分野で標準的な技術を使用して定量することができる。
【００１５】
これに対して「アンタゴニスト」ペプチドリガンドは、ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３タンパク質複合体及び／又はＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ４タンパク質複合体に結合する天然リガンドに関連した活性、例えば天然リガンドの結合により誘発される細胞反応を、例えばＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３タンパク質複合体及び／又はＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ４タンパク質複合体を天然又は自然に発生するリガンドに結合させるか又はこれをブロックすることにより、低減するように作用する。
しかしながら、上述の分類に限定されるものではない。例えば、ある実施態様では、ペプチドリガンドの結合が、ＥｒｂＢ２レセプターの内在化、又はプログラム細胞死、すなわちアポトーシスの誘発等の関連した細胞事象の誘発の原因になる。ＥｒｂＢ２又はＥｒｂＢ２レセプター複合体の内在化を開始するペプチドリガンドは、ここで以下に記載する細胞障害剤を細胞内送達することを必要とする本発明の実施態様において特に有用である。
「アポトーシスを誘発する」又は「アポトーシスを誘発可能な」という用語は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)により決定されるプログラム細胞死を誘発する化合物の能力を意味する。細胞は、ＥｒｂＢ２レセプターを発現又は過剰発現するものである。好ましくは「細胞」は、腫瘍細胞、例えば乳房、卵巣、胃、子宮体、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロでは、細胞はＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに伴う細胞事象を評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーリングにより評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／染色質凝結は低二倍体細胞の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘発する化合物は、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するという結果を生じるものである。
【００１６】
ここで使用される「ヘレグリン」(ＨＲＧ)は、ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ４タンパク質複合体を活性化する(すなわち、そこに結合する際に複合体のチロシン残基のリン酸化を誘発する)ポリペプチドを意味する。この用語に包含される種々のポリペプチドは、例えば、Jonesら, (1990) FEBS Letters 447：227-231；Holmesら,(1992) Science, 256:1205-1210；国際公開９２／２０７９８号；Wenら, (1994) Mol. Cell. Biol., 14(3):1909-1919；及びMarchionniら, (1993) Nature, 362:312-318に開示されている。この用語には、自然に生じたＨＲＧポリペプチドの変異体及び／又は生物学的に活性な断片、例えばそのＥＧＦ様ドメイン断片(例えばＨＲＧβ１１７７−２４４)が含まれる。
「ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３タンパク質複合体」と「ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ４タンパク質複合体」は、それぞれＥｒｂＢ２レセプターと、ＥｒｂＢ３レセプター又はＥｒｂＢ４レセプターの非共有的に結合したオリゴマーである。Sliwkowskiら, (1994) J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665に記載されているように、これらのレセプターの両方を発現する細胞に複合体が形成され、免疫沈降法により単離され、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析される。
本発明の特定の態様において使用されるところの「多量体化ドメイン」なる用語は、直接又は「リンカードメイン」を介してペプチドリガンドが結合する分子の一部を指すことを意味する。多量体化ドメインは、好ましい実施態様では、２又はそれ以上の多量体化ドメインの相互作用を容易にするアミノ酸ドメインである。多量体化ドメインは２又はそれ以上の多量体化ドメインの間の相互作用を促進するが、本発明では、多量体化ドメインに結合するペプチドリガンドが多量体の一部として存在している必要性はない。
【００１７】
本発明の好ましい態様では、多量体化ドメインは、２又はそれ以上の多量体化ドメインの安定した相互作用を促進させるポリペプチドである。例えば、限定するものではないが、多量体化ドメインは免疫グロブリン配列、例えば免疫グロブリン定常領域、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、２又はそれ以上の多量体化ドメイン間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含有するポリペプチド、又は例えば米国特許第５７３１１６８号に記載されている「キャビティ中突起（protuberance-into-cavity）」ドメインであってよい。前記特許では、突起は、第１ポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)で置換することにより形成される。突起に対して同一又はより小さなサイズの相補的キャビティは、大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することにより、第２ポリペプチドの界面に任意につくり出される。
よって、好ましい態様では、多量体化ドメインは、２又はそれ以上の多量体化ドメインの安定した相互作用を促進するか、これを可能にし、モノマー性多量体ドメインからのダイマーと他の多量体の形成を促進させるか、これを可能にする分子の一部を提供する。好ましくは、本発明のこの態様では、多量体化ドメインは免疫グロブリンの定常領域ドメインである。免疫グロブリンの定常ドメインは、本発明の化合物のインビボ循環半減期を改善し、場合によっては、当業者をして、以下に記載する「エフェクター機能」を本発明の所定の態様に導入することを可能にするという利点をもたらす。
【００１８】
本明細書と特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、ここに出典を明示して取り込まれるKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
「抗体」(Ａｂ)と「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。
「抗体」及び「免疫グロブリン」は、通常は、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、カルボキシ(Ｃ)末端定常ドメインが続くアミノ(Ｎ)末端可変ドメイン（ＶＨ）を有している。各軽鎖は可変Ｎ-末端ドメイン（ＶＬ）及びＣ-末端定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメイン(ＣＬ)は重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。免疫グロブリンポリペプチド鎖のドメインの定義に従って、軽（Ｌ）鎖は２つのコンホメーション的に類似したドメインＶＬ及びＣＬを有し；重鎖は４つのドメイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有しており、これらの各々は１つの鎖間ジスルフィド架橋を持つ。
【００１９】
重鎖の定常（Ｃ）ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分けることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがある。免疫グロブリンクラスはさらにサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分割することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、各々α、δ、ε、γ、及びμドメインである。任意の脊椎動物種からの抗体の軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)又はラムダ(λ)と呼ばれる２つの区別される型の一つが割り当てられる。配列の研究により、ＩｇＭのμ鎖は５つのドメインＶＨ、ＣＨμ１、ＣＨμ２、ＣＨμ３、及びＣＨμ４を含むことが分かっている。ＩｇＥ（ε）の重鎖も５つのドメインを含む。
異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元的立体配置はよく知られている。これらのうちＩｇＡ及びＩｇＭはポリマーであり、各サブユニットは２つの軽鎖と２つの重鎖を含む。ＩｇＧ（γ）の重鎖はヒンジ領域として知られるＣＨγ１及びＣＨγ２ドメイン間にある所定長さのポリペプチド鎖を含む。ＩｇＡのα鎖はＯ-結合グリコシル化部位を含むヒンジ領域を有し、μ及びε鎖はγ及びα鎖のヒンジ領域に類似する配列は持たないが、それらは他のものが持たない第４の定常ドメインを含む。免疫グロブリン鎖のドメイン組成は次のように要約することができる。
軽鎖λ＝Ｖλ Ｃλ
κ＝Ｖκ Ｃκ
重鎖 ＩｇＧ(γ)＝ＶＨ ＣＨγ１ ヒンジ ＣＨγ２ ＣＨγ３
ＩｇＭ(μ)＝ＶＨ ＣＨμ１ ＣＨμ２ ＣＨμ３ ＣＨμ４
ＩｇＡ(α)＝ＶＨ ＣＨα１ ヒンジ ＣＨα２ ＣＨα３
ＩｇＥ(ε)＝ＶＨ ＣＨε１ ＣＨε２ ＣＨε３ ＣＨε４
ＩｇＤ(δ)＝ＶＨ ＣＨδ１ ヒンジ ＣＨδ２ ＣＨδ３
【００２０】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる)は通常約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで延びる。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接には対をなさないという点で独特である。むしろ、二つのＮ-結合分岐炭水化物鎖が未変性の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入されている。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域における残基Ｃ-末端からＣＨ２ドメインまでの伸展(すなわち、ＩｇＧのおよそアミノ酸残基３４１からおよそアミノ酸残基４４７まで）を含む。
「ヒンジ領域」はヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０の伸展として一般に定義されている(Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985))。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１配列と整列させられうる。
Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域」は、通常は、Ｃ-末端からヒンジ領域、すなわちＦｃ領域の２３３から２３９残基までの残基の伸展として定義されている。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片又は領域と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成し、各々が単一の抗原結合部位と残りの「Ｆｃ」断片又は領域を持つ。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常はＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸展すると定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、例えば図１に示すように、２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。「天然Ｆｃ領域配列」は天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然ヒトＦｃ領域配列を図２及び３に示し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非-Ａ及びＡアロタイプ)；ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及びヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、並びに自然に生じるその変異体を含むが、それらに限定されるものではない。天然マウスＦｃ領域配列を図２Ａに示す。
【００２１】
ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋させ得るＦ(ａｂ')２断片が得られる。またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
「機能的なＦｃ領域」は、天然のＦｃ領域の「エフェクター機能」を保持する。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害活性；Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介細胞障害活性(ＡＤＣＣ)；貪食作用、細胞表面レセプター（すなわち、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）の低減下を含む。このようなエフェクターの機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えばペプチドリガンド）に結合するのに必要とされており、当該技術で公知の様々なアッセイを用いることで評価される。
親又は天然Ｆｃ領域に適当なアミノ酸修飾を導入することにより、（ａ）ヒトエフェクター細胞の存在下で抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）をより効果的に媒介する、及び／又は（ｂ）親ポリペプチドよりも、より強い親和性でＦｃガンマレセプター（ＦｃγＲ）と結合するような、Ｆｃ領域の変異体を作製することができる。そのようなＦｃ領域の変異体は、一般に、少なくとも１つのアミノ酸修飾をＦｃ領域に含むであろう。Ｆｃ領域の変異体は、２，３，４，５個所等の置換を含み得る。
【００２２】
いくつかの抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃレセプター（ＦｃＲｓ）によって媒介される。ＦｃＲｓは、免疫グロブリンアイソタイプに対する特異性により定義され；ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターはＦｃγＲと、ＩｇＥに対してはＦｃεＲと、ＩｇＡに対してはＦｃαＲなどのように呼ばれている。ＦｃγＲの３つのサブタイプは同定されており：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４），ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。それぞれのＦｃγＲサブクラスは、２または３つの遺伝子によってコードされており、またＲＮＡスプライシングにより複数の転写産物が生じるため、ＦｃγＲアイソフォームには広い多様性が存在する。これらの異なるＦｃＲサブタイプは異なる型の細胞上で発現されている（Ravetch and Kinet, Annu.Rev.immunol. 9:457-492 (1991)）。例えばヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上にのみ見出され、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ある種のＴ細胞上に見出される。特に、ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＡＤＣＣに関係する細胞型であるＮＫ細胞上に存在する唯一のＦｃγＲである。
ＦｃγＲに対するヒトおよびマウス抗体上の結合部位は、これまでに低ヒンジ領域(２３３-２３９残基：Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) におけるようなＥＵインデックス番号付け）にマッピングされている。Woofら Molec. Immunol. 23:319-330(1986); Duncanら Nature 332:563 (1988); Canfield及びMorrison, J. Exp. Med. 173:1483-1491 (1991); Canppelら, Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:9036-9040 (1991)。
「Ｃ１ｑ」は免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓと共に、補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)経路の最初の成分である複合体Ｃ１を形成する。
【００２３】
「抗体依存性細胞媒介細胞障害」及び「ＡＤＣＣ」は、細胞が媒介する反応であって、ＦｃＲｓを発現する非特異的障害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識して、続いて標的細胞の溶解を引き起こす反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞である、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。
ここで使用される場合、「サルベージレセプター結合リガンド」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血清半減期を増加させる原因となるＩｇ分子(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のリガンドを意味する(１９９８年４月１４日に公開された米国特許第５７３９２７７号)。
「治療」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を指す。治療の必要があるものには、既に羅患しているもの、並びに疾患が予防されるべきものが含まれる。
治療の目的とされる「哺乳動物」とは、ヒト、家庭又は農場用動物、及び動物園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
「疾患」は本発明のペプチドリガンドを含有する組成物で治療することで恩恵を得るあらゆる症状のことである。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させる素因になる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。ここで治療される疾患の例は、これに限定されるものではないが、良性及び悪性の腫瘍；白血病及びリンパ悪性腫瘍；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、ストローマ及び割腔の疾患；及び炎症、血管形成及び免疫性疾患が含まれる。
【００２４】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を意味するか記述するものである。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定な例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
ここで使用される場合、「非経口」なる用語は、腸以外によって、特に静脈内(i.v.)、動脈内(i.a.)、腹膜内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、心室内及び皮下(s.c.)経路で本発明の化合物を導入することを意味する。
【００２５】
(発明の実施形態)
ペプチドリガンド
本発明のペプチドリガンドはＥｒｂＢ２に結合し、次の一般式：
Xaa(１−１４) -Cys-Xaa１６-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa(２１−２７)   (配列番号：９０)
を有するペプチドリガンドを用いたインビトロアッセイにおいてＥｒｂＢ２への結合に対して競合する能力により同定することができ、ここで、Ｘａａ(１−１４)は存在しないか、又は１〜１４のアミノ酸であり；Ｘａａ１６はＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ及びＩｌｅからなる群から選択され、好ましくはＩｌｅであり；Ｘａａ(２１−２７)は存在しないか、又は１〜７のアミノ酸である。好ましくは、ペプチドリガンドは、次の一般式：
Xaa(１−３)-Glu-Xaa５-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa１４-Xaa１５-Leu-Xaa(１７−２０) (配列番号：９１)
を有するペプチドリガンドと上述のようにＥｒｂＢ２との結合に対して競合するであろう。ここで、Ｘａａ(１−３)及びＸａａ(１７−２０)は、独立して、存在しないか、又はそれぞれ１〜３及び１〜４のアミノ酸であり；Ｘａａ１、Ｘａａ２及びＸａａ３はアミノ酸である。特定の実施態様では、本発明のペプチドリガンドは、ここに記載する配列番号：１−配列番号：４４、及び配列番号：５７−配列番号：６９で表されるペプチドリガンドの何れかと競合し、好ましくはＥｒｂＢ２との結合に対して配列番号：１４のものと競合するであろう。
以上から理解されるように、「競合する」及び「競合する能力」という用語は相対的な用語である。よって、本発明のペプチドリガンドを記述するために用いられる場合、この用語は、ここで記載したような標準的な競合アッセイにおいて、５０μＭで存在する場合、好ましくは１μＭ、より好ましくは１００μＭで存在する場合、好ましくは１ｎＭ又はそれ未満で存在する場合の、例えば配列番号：１４の結合を５０％阻害するペプチドリガンドを意味する。このようなペプチドリガンドは、実施例のセクションに記載するもののような標準的な競合アッセイで測定されるときに約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、より好ましくは約１０ｎＭ未満の親和性でＥｒｂＢ２に一般的に結合する。しかしながら、ＥｒｂＢ２に対して約１ｎＭ未満、好ましくは約１ｐＭ〜１ｎＭの親和性を有するペプチドリガンドも等しく本発明のペプチドリガンドであるようである。
【００２６】
化合物が上述したペプチドリガンドと競合するか、競合する能力を有しているか否かを決定するためのインビトロアッセイシステムに対しては、当業者であれば多数の標準的な競合アッセイの任意のものを使用することができる。このような手順には、限定するものではないが、数例を挙げると、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、好ましくは酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、免疫電気泳動アッセイ等の技術を用いる競合アッセイシステムを含む。
例として、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡアッセイを行うことができ、そこでは、マクロタイタープレート(例えば、Nunc MaxisorpＴＭ96-ウェルプレート、Inter Med, Denmark)を、５０ｍＭの重炭酸アンモノウム、ｐＨ９．３にＨＥＲ２-ＥＣＤが入ったものを５μｇ／ｍｌ使用し、４℃で終夜被覆する。ウェルは２５℃で１時間、ＢＳＡを１％含有するＰＢＳ(ＰＢＳ-ＢＳＡ)を使用してブロックすることができる。候補ペプチドリガンドをＰＢＳ-ＢＳＡで希釈し、ここに記載されたようにＺプロテイン融合体(１．１．ＦＩ-Ｚ)として生成され、ビオチン化(１．１．ＦＩ-Ｚｂ)されたペプチド１．１．ＦＩ(配列番号：１４)の、固定化されたＨＥＲ２-ＥＣＤへの結合をブロックする能力を試験した。約１時間のインキュベーションに続いて、プレートをＰＢＳ-ＴＷＥＥＮで洗浄し、ストレプトアビジン-ＨＲＰを約３０分間で添加する。プレートをＰＢＳ-ＴＷＥＥＮで再び洗浄し、結合したＨＲＰをＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を使用してアッセイする。４０５ｎｍの吸光度の変化を評価する。吸光度の減少を試料濃度に対してプロットし、各候補ペプチドリガンドに対するＩＣ５０を決定する。
先に見られたように、本発明の好ましいペプチドリガンドは約１０〜３０アミノ酸残基、好ましくは約２０アミノ酸残基の自然には生じないペプチドリガンドである。上述した特に好ましいペプチドリガンドは自然に生じるアミノ酸からなり、当業者によく知られている標準的な組換え及び合成技術を使用して産生することができる。
【００２７】
好ましいペプチドリガンドは次の一般式：
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
を有する。些かより特定的には、好ましいペプチドリガンドは次の式：
Xaa(１−７) -Cys-Xaa９-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa(１４−２０)  (配列番号：９２)
を有し、ここで、Ｘａａ(１−７)及びＸａａ(１４−２０)は、独立して、存在しないか、又は１〜７のアミノ酸であり；Ｘａａ９はＭｅｔ、Ｉｌｅ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＩｌｅである。些かより特定的には、好ましいペプチドリガンドは次の式：
Xaa(１−５) -Trp-Xaa７-Cys-Xaa９-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa(１４−２０)  (配列番号：９３)
を有し、ここで、Ｘａａ(１−５)は、存在しないか、又は１〜５のアミノ酸であり；Ｘａａ７はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ及びＨｉｓからなる群から選択され、好ましくはＧｌｙである。本発明のこの態様においてより好ましいものは、次の式：
Xaa(１−３) -Glu-Xaa５-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa１４-Xaa１５--Leu-Xaa(１７−２０)  (配列番号：９１)
を有するペプチドリガンドであり、ここで、Ｘａａ(１−３)-は存在しないか、又は１〜３のアミノ酸であり、Ｘａａ５は一つのアミノ酸であり、Ｘａａ１３は一つのアミノ酸であり、Ｘａａ１４は一つのアミノ酸であり、-Ｘａａ(１７−２０)は存在しないか、又は１〜４のアミノ酸である。本発明のこの態様における例示的なペプチドリガンドは、Ｘ(１−３)-は存在しないか、又はＧｌｎ-Ａｒｇ-Ａｓｎ-、Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｐｒｏ-、Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｔｒｐ-、Ａｌａ-Ｓｅｒ-Ｈｉｓ-、Ｌｙｓ-Ｌｅｕ-Ａｓｎ-、Ｔｈｒ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-、Ａｌａ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-、Ｇｌｎ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ-、Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｇｌｕ-、Ｐｈｅ-Ａｌａ-Ｇｌｙ-、Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ａｒｇ-、Ａｒｇ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-、Ａｓｎ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-、Ｃｙｓ-Ｉｌｅ-Ａｓｐ-、Ｔｙｒ-Ｇｌｕ-Ｔｒｐ-、Ａｒｇ-Ｔｒｐ-Ａｓｐ-、Ｈｉｓ-Ｔｒｐ-Ｍｅｔ-、Ａｓｎ-Ｔｒｐ-Ｐｒｏ-、Ｐｈｅ-Ａｓｎ-Ｔｒｐ-、Ｐｈｅ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙ-、Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｔｒｐ-、Ｌｅｕ-Ｔｒｐ-Ｐｈｅ-、Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-、Ｔｒｐ-Ｔｒｐ-Ｔｈｒ-、Ｌｅｕ-Ｇｌｙ-Ｔｒｐ-、Ｓｅｒ-Ｐｒｏ-Ｔｒｐ-、Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ｔｒｐ-、Ｔｙｒ-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-、Ｔｙｒ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-、Ｔｙｒ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-、Ｔｙｒ-Ｓｅｒ-Ｐｈｅ-、Ｔｙｒ-Ａｓｐ-Ｐｈｅ-、Ａｓｐ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-、Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-、Ｐｈｅ-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-、及びＨｉｓ-Ａｓｐ-Ｖａｌ-からなる群から選択されるペプチドリガンドであり、Ｘａａ５はＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ及びＬｙｓからなる群から選択され；Ｘａａ１４はＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ及びＧｌｎからなる群から選択され；Ｘａａ１５はＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ及びＡｓｎからなる群から選択され；-Ｘ(１７−２０)は次の例示的配列：
-Phe-Gly-Ala-His  (配列番号：９４)
-Phe-Asp-Ala-His  (配列番号：９５)
-Leu-Glu-Ala-His  (配列番号：９６)
-Phe-Glu-Gly-His  (配列番号：９７)
-Phe-Gly-Ala-Leu  (配列番号：９８)
-Phe-Glu-Ala-Tyr  (配列番号：９９)
-Phe-Ala-Gly-His  (配列番号：１００)及び
-Phe-Glu-Ala-Phe  (配列番号：１０１)
を有する４つのアミノ酸のペプチドである。
好ましくは、-Ｘａａ(１７−２０)は、次の式：
-Xaa１７ -Xaa１８-Cys-Xaa２０    
を有する４つのアミノ酸のペプチドである。
【００２８】
本発明のこの態様における例示的ペプチドリガンドは、-Ｘａａ(１７−２０)が次の式：
-Gln-Ala-Cys-Met  (配列番号：１０２)
-Leu-Gln-Cys-Trp  (配列番号：１０３)
-Met-Ser-Cys-Val  (配列番号：１０４)
-Leu-Arg-Cys-Ile  (配列番号：１０５)
-Gln-Ala-Cys-Leu  (配列番号：１０６)
-Leu-Ser-Cys-Leu  (配列番号：１０７)
-Ile-Gly-Cys-Leu  (配列番号：１０８)
-Leu-Ala-Cys-Leu  (配列番号：１０９)
-Leu-Ser-Cys-Ile  (配列番号：１１０)
-Met-Asn-Cys-Leu  (配列番号：１１１)
-Leu-Arg-Cys-Leu  (配列番号：１１２)
-Leu-Lys-Cys-Leu  (配列番号：１１３)
-Leu-Gly-Cys-Leu  (配列番号：１１４)
-Leu-Asn-Cys-Ile  (配列番号：１１５)
-Met-Gly-Cys-Leu  (配列番号：１１６)及び
-Met-Ala-Cys-Leu  (配列番号：１１７)
からなる群から選択されるペプチドリガンドである。
【００２９】
本発明のこの態様における他の実施態様では、-Ｘａａ(１７−２０)が次の式：
-Cys-Xaa１８ -Xaa１９-Cys
を有する４つのアミノ酸ペプチドであり、Ｘａａ１８が一つのアミノ酸であり、Ｘａａ１９が一つのアミノ酸であるペプチドリガンドである。本発明のこの態様では、例示的ペプチドリガンドは：
-Cys-Ala-Trp-Cys  (配列番号：１１８)
-Cys-Ser-Trp-Cys  (配列番号：１１９)
-Cys-Glu-Pro-Cys  (配列番号：１２０)
-Cys-Asp-Trp-Cys  (配列番号：１２１)
-Cys-Glu-Trp-Cys  (配列番号：１２２)
-Cys-Asn-Trp-Cys  (配列番号：１２３)及び
-Cys-Gly-Trp-Cys  (配列番号：１２４)
からなる群から選択される-Ｘａａ(１７−２０)を含むものである。
【００３０】
本発明のこの態様における例示的ペプチドリガンドは、
-Gln-Arg-Asn-Glu-Ala-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Met-Leu-Cys-Ala-Trp-Cys  (配列番号：１)
-Leu-Ser-Pro-Glu-Thr-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Met-Leu-Cys-Ser-Trp-Cys  (配列番号：２)
-Glu-Asn-Trp-Glu-Met-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Lys-Phe-Leu-Cys-Glu-Pro-Cys  (配列番号：３)
-Glu-Val-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Lys-Ala-Leu-Cys-Asp-Trp-Cys  (配列番号：４)
-Glu-Arg-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Arg-Met-Leu-Cys-Glu-Trp-Cys  (配列番号：５)
-Glu-Val-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Asp-Met-Leu-Cys-Asn-Trp-Cys  (配列番号：６)
-Glu-Val-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ser-Met-Leu-Cys-Gly-Trp-Cys  (配列番号：７)
-Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa-Met-Leu-Cys-Xaa-Trp-Cys  (配列番号：８)
-Ala-Ser-His-Glu-Val-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Lys-Cys-Leu-Gln-Ala-Cys-Met  (配列番号：９)
-Lys-Leu-Asn-Glu-Glu-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Cys-Leu-Leu-Gln-Cys-Trp  (配列番号：１０)
-Lys-Leu-Asn-Glu-Asp-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Cys-Leu-Leu-Xaa-Cys-Xaa  (配列番号：１１)
-Thr-Gln-Ala-Glu-Arg-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Cys-Leu-Met-Ser-Cys-Val  (配列番号：１２)
-Ala-Pro-Arg-Glu-Val-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Cys-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile  (配列番号：１３)
-Gln-Val-Tyr-Glu-Ser-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Cys-Leu-Gln-Ala-Cys-Leu  (配列番号：１４)
-Arg-Thr-Glu-Glu-Gln-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Arg-Cys-Leu-Leu-Ser-Cys-Leu  (配列番号：１５)
-Phe-Ala-Gly-Glu-Ser-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Cys-Leu-Ile-Gly-Cys-Leu  (配列番号：１６)
-Thr-Ala-Arg-Glu-Val-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Asn-Cys-Leu-Leu-Ala-Cys-Leu  (配列番号：１７)
-Arg-Pro-His-Glu-Pro-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ser-Cys-Leu-Leu-Ser-Cys-Ile  (配列番号：１８)
-Glu-Val-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Cys-Leu-Met-Asn-Cys-Leu  (配列番号：１９)
-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Cys-Leu-Leu-Arg-Cys-Leu  (配列番号：２０)
-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Gly-Cys-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu  (配列番号：２１)
-Glu-Pro-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Cys-Leu-Leu-Gly-Cys-Leu  (配列番号：２２)
-Glu-Glu-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Cys-Leu-Leu-Asn-Cys-Ile  (配列番号：２３)
-Glu-Gln-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Lys-Cys-Leu-Met-Gly-Cys-Leu  (配列番号：２４)
-Glu-Gln-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Gly-Cys-Leu-Leu-Arg-Cys-Leu  (配列番号：２５)
-Glu-Ala-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Gly-Cys-Leu-Met-Ala-Cys-Leu  (配列番号：２６)
-Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa-Cys-Leu-Leu-Xaa-Cys-Leu  (配列番号：２７)
-Asn-Val-Cys-Glu-Phe-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Gln-Leu-Cys  (配列番号：２８)
-Cys-Ile-Asp-Glu-Thr-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Glu-Leu-Arg-Cys-Lys-Arg  (配列番号：２９)
-Tyr-Glu-Trp-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Pro-Ala-Leu-Gly-Phe-Gly-Tyr  (配列番号：３０)
-Arg-Trp-Asp-Glu-Glu-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Trp-Leu-Val-Val-Arg-Lys  (配列番号：３１)
-His-Trp-Met-Glu-Arg-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Gly-Phe-Leu  (配列番号：３２)
-Asn-Trp-Pro-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Lys-Leu-Leu  (配列番号：３３)
-Phe-Asn-Trp-Glu-Lys-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Arg-Thr-Leu  (配列番号：３４)
-Phe-Ser-Gly-Glu-Arg-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Gln-Val-Leu  (配列番号：３５)
-Gly-Gly-Trp-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Arg-Tyr-Leu  (配列番号：３６)
-Leu-Trp-Phe-Glu-Arg-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Thr-Xaa-Leu  (配列番号：３７)
-Gly-Ile-Pro-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Trp-Leu  (配列番号：３８)
-Trp-Trp-Thr-Glu-Arg-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ser-Met-Leu  (配列番号：３９)
-Xaa-Cys-Xaa-Glu-Arg-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ser-Met-Leu  (配列番号：４０)
-Leu-Gly-Trp-Glu-Arg-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Arg-Ala-Leu  (配列番号：４１)
-Ser-Pro-Trp-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Arg-Trp-Leu  (配列番号：４２)
-Arg-Gly-Trp-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ser-Phe-Leu  (配列番号：４３)
-Xaa-Xaa-Trp-Glu-Xaa-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa  (配列番号：４４)
-Tyr-Glu-Val-Glu-Ala-Trp-Asp-Cys-Met-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Asn-Leu-Phe-Glu-Ala-His  (配列番号：５７)
-Tyr-Glu-Phe-Glu-Gly-Trp-Asp-Cys-Met-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Ser-Val-Phe-Gly-Ala-His  (配列番号：５８)
-Tyr-Glu-Gly-Glu-Ser-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Ser-Leu-Phe-Asp-Ala-His  (配列番号：５９)
-Tyr-Glu-Val-Glu-Val-Trp-Glu-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Gly-Tyr-Leu-Phe-Gly-Ala-His  (配列番号：６０)
-Tyr-Glu-Val-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Met-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu-Leu-Glu-Ala-His  (配列番号：６１)
-Tyr-Ser-Phe-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Tyr-Leu-Phe-Glu-Gly-His  (配列番号：６２)
-Tyr-Asp-Phe-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Gly-Asn-Leu-Leu-Glu-Ala-His  (配列番号：６３)
-Tyr-Asp-Phe-Glu-Gly-Trp-Asp-Cys-Thr-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Tyr-Leu-Phe-Glu-Gly-His  (配列番号：６４)
-Asp-Glu-Val-Glu-Ser-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Tyr-Leu-Phe-Gly-Ala-Leu  (配列番号：６５)
-Ser-Glu-Val-Glu-Val-Trp-His-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Val-Tyr-Leu-Phe-Glu-Ala-Tyr  (配列番号：６６)
-Phe-Glu-Phe-Glu-Gly-Trp-Glu-Cys-Met-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Glu-Leu-Phe-Ala-Gly-His  (配列番号：６７)
-His-Asp-Val-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Asp-Leu-Phe-Glu-Ala-Phe  (配列番号：６８)
-Tyr-Glu-Phe-Glu-Gly-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Ala-Tyr-Leu-Phe-Glu-Ala-His  (配列番号：６９)
と、上述した例示的アミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む。
【００３１】
さらに好ましいペプチド化合物は次の一般式：
Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys  (配列番号：１２５)
を有する。些かより特定的には、次の式：
Xaa(１−１０)-Glu-Xaa１２-Trp-Xaa１４-Cys-Cys-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa２１-Xaa２２-Xaa２３-Xaa(２４−２７)    (配列番号：１２６)
を有し、ここでＸａａ(１−１０)は存在しないか、又は１〜１０のアミノ酸であり、Ｘａａ１２は一つのアミノ酸であり、Ｘａａ１４は一つのアミノ酸であり、Ｘａａ２１は一つのアミノ酸であり、Ｘａａ２２は一つのアミノ酸であり、Ｘａａ２３はＶａｌ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ(２４−２７)は存在しないか、又は１〜４のアミノ酸であるものである。本発明のこの態様において、好ましくは、Ｘａａ１２はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１４はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２１はＧｌｙ及びＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２２はＴｒｐ、Ｌｅｕ及びＰｈｅからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２３はＶａｌである。
本発明のこの態様において好ましいペプチドリガンドは、Ｘａａ(１−１０)が次の式：
Cys-Xaa(２−７)-Cys-Xaa９-Gly-
を有する１０のアミノ酸であり、Ｘａａ(２４−２７)が次の式：
Xaa(２４−２６)-Cys
を有する４つのアミノ酸であり、Ｘａａ(２−７)が６つのアミノ酸であり、Ｘａａ(２４−２６)が３つのアミノ酸であるものを含む。
【００３２】
本発明のこの態様において好ましいものは、Ｘａａ(１−１０)が次の式：
Cys-Xaa２-Trp-Val-Xaa５−Xaa６-Xaa７-Cys-Xaa９-Gly-  (配列番号：１２７)
を有し、ここでＸａａ２がＡｌａ及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ５がＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｒｇ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ６がＰｈｅ、Ｖａｌ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ７がＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ９がＧｌｙ、Ｐｈｅ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸であるペプチドリガンドである。
この群のペプチド中で好ましいものは、Ｘａａ(１−１０)が次の式：
Cys-Ala-Trp-Val-Leu-Xaa６-Xaa７-Cys-Gly-Gly-  (配列番号：１２８)
を有し、Ｘａａ(２４−２６)が次の式：
Xaa２４−Xaa２５-Xaa２６
を有し、ここでＸａａ２４がＴｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＶａｌであり；Ｘａａ２５がＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｎであり、Ｘａａ２６がＡｌａ、Ｓｅｒ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａであるペプチドリガンドである。
【００３３】
例として、限定するものではないが、次のもの：
Cys-Ser-Trp-Val-Leu-Val-Gln-Cys-Gly-Gly-Glu-Trp-Trp-His-Cys-Cys-Gly-Leu-Gly-Cys-Gly-Leu-Val-Val-Asn-Ala-Cys  (配列番号：４５)
Cys-Ala-Trp-Val-Ser-Phe-Glu-Cys-Gly-Gly-Glu-Val-Trp-His-Cys-Cys-Gly-Leu-Gly-Cys-Gly-Trp-Val-Trp-Lys-Ala-Cys  (配列番号：４６)
Cys-Ala-Trp-Val-Leu-Val-Gln-Cys-Gly-Gly-Glu-Trp-Trp-His-Cys-Cys-Gly-Pro-Gly-Cys-Glu-Phe-Val-Val-Asp-Ala-Cys  (配列番号：４７)
Cys-Ala-Trp-Val-Ala-Val-Tyr-Cys-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-His-Cys-Cys-Gly-Pro-Gly-Cys-Gly-Phe-Val-Val-Asp-Ser-Cys  (配列番号：４８)
Cys-Ala-Trp-Val-Arg-Val-Trp-Cys-Phe-Gly-Glu-Trp-Trp-Asp-Cys-Cys-Gly-Leu-Gly-Cys-Gly-Trp-Val-Val-Asn-Val-Cys  (配列番号：４９)
Cys-Ala-Trp-Val-Arg-Val-Leu-Cys-Gly-Gly-Glu-Trp-Trp-His-Cys-Cys-Gly-Leu-Gly-Cys-Gly-Trp-Val-Val-Glu-Ala-Cys  (配列番号：５０)
Cys-Ser-Trp-Val-Ser-Val-Leu-Cys-Gly-Gly-Glu-Trp-Trp-Gln-Cys-Cys-Gly-Pro-Gly-Cys-Gly-Leu-Val-Val-Asn-Ala-Cys  (配列番号：５１)
Cys-Ser-Trp-Val-Ser-Leu-Gln-Cys-Gly-Gly-Glu-Trp-Trp-His-Cys-Cys-Gly-Gly-Gly-Cys-Gly-Trp-Val-Val-Asn-Val-Cys  (配列番号：５２)
Cys-Ser-Trp-Val-Leu-Leu-His-Cys-Gly-Gly-Glu-Trp-Trp-His-Cys-Cys-Gly-Gly-Gly-Cys-Gly-Trp-Val-Gly-Glu-Ala-Cys  (配列番号：５３)
Cys-Ser-Trp-Val-Leu-Leu-Glu-Cys-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Glu-Cys-Cys-Gly-Leu-Gly-Cys-Gly-Trp-Val-Ala-Asp-Ala-Cys  (配列番号：５４)
Cys-Ser-Trp-Val-Val-Phe-Glu-Cys-Leu-Gly-Glu-Ser-Trp-His-Cys-Cys-Gly-Gly-Gly-Cys-Gly-Trp-Val-Val-His-Ala-Cys  (配列番号：５５)
Cys-Ala-Trp-Val-Ser-Val-Glu-Cys-Gly-Gly-Glu-Trp-Trp-His-Cys-Cys-Gly-Pro-Gly-Cys-Gly-Trp-Val-Val-Asp-Ala-Cys  (配列番号：５６)
が本発明の適切なペプチドリガンドである。
【００３４】
ペプチドリガンドの組み合わせ
Ａ．多量体化ドメイン
本発明の好適な実施態様では、ペプチドリガンドは多量体化ドメインと組み合わされる。本発明のこの側面においては、少なくとも二つの別のドメインを有するハイブリッド分子が提供される。各分子はペプチドリガンドドメインと多量体化ドメインを有している。本発明では、ペプチドリガンドドメインは任意には柔軟なリンカードメインを介して免疫グロブリンＦｃ領域のような多量体化ドメインに結合されている。
本発明のハイブリッド分子は適切な多量体化ドメインにペプチドリガンドを組み合わせることにより構築される。通常は、本発明のハイブリッド分子を調製する場合、ペプチドリガンドをコード化する核酸は多量体化ドメイン配列をコード化する核酸に作用可能に結合される。典型的には、作成物は、ペプチドリガンドのＣ末端が多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端、好ましくはＣ末端に結合されている融合タンパク質をコードしている。しかし、ペプチドリガンドのＮ末端が多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に結合されている融合体もまた可能である。
好適な多量体化ドメインは免疫グロブリンの定常領域配列である。典型的には、そのような融合体では、コードされたハイブリッド分子は免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持しているであろう。融合体はまた例えば定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１の直ぐ近くのＮ末端又は軽鎖の対応する領域に対して生成される。
【００３５】
免疫グロブリン定常ドメインへのペプチドリガンドの融合がなされる正確なアミノ酸部位は重要ではない；特定の部位はよく知られており、生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択することができる。この点に関して、当業者は文献（米国特許第５１１６９６４号、同第５７１４１４７号及び同第５３３６６０３号；Caponら、(1989) Nature 337:525-531; Trauneckerら, (1989) Nature 339:68-70;及びByrnら, (1990) Nature 344:667-670; Watsonら, (1990) J. Cell. Biol. 110:2221-2229; Watsonら, (1991) Nature 349:164-167; Aruffoら, (1990) Cell 61:1303-1313; Linsleyら, (1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Lisleyら, J. Exp. Med. 174:561-569; Stamenkovicら, Cell 66:1133-1144; Ashkenaziら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Lesslaierら, (1991) Eur. J. Immunol. 27:2883-2886; 及びPeppelら, (1991) J. Exp. Med. 174:1483-1489; Mohlerら, (1993) J. Immunol. 151:1548-1561; Bennettら, (1991) J. Biol. Chem. 266:23060-23067; Kurschnerら, (1992) J. Biol. Chem. 267:9354-9360; Chalupnyら, (1992) PNAS USA 89:10360-10364; Ridgway及びGorman, (1991) J. Cell. Biol. 115, Abstract No. 1448）に記載された様々なイムノアドヘシンの構築を参考にすることができる。
特定の側面では、免疫グロブリンタイプの多量体化ドメインは機能性Ｆｃドメインを有するダイマーのような多量体を提供するように選択される。好適な側面では、多量体化ドメインは天然の免疫グロブリンＦｃ領域に伴うエフェクター機能を有しているＦｃドメインを提供するように選択される。従って、ペプチドリガンドは、特定の側面では、特定のエフェクター機能又は機能群に対して選択された機能性Ｆｃドメインを有する多量体を提供する免疫グロブリン重鎖定常ドメインに結合される。この場合、免疫グロブリン鎖−ペプチドリガンド配列をコードするＤＮＡは典型的には第二のペプチドリガンド−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌の際、ハイブリッド重鎖は二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖を有する免疫グロブリン様構造を提供するように共有結合的に結合される。当業者であれば、エフェクター機能には、例えばＣ１ｑ結合；補体依存性細胞毒素；Ｆｃレセプター結合；抗体依存細胞性細胞毒素（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；及びサルベージレセプター結合リガンドの導入による半減期の延長と細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションで、例えば１９９８年４月１４日に発行された米国特許第５７３９２７７号にされたようなものが含まれることを認識するであろう。
【００３６】
好ましくは、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域、例えば天然配列ヒトＦｃ領域ヒトＩｇＧ１（Ａ及び非Ａアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域である。そのような配列は図２及び３に示されている。また、親Ｆｃ領域に適当なアミノ酸配列の修飾を導入することにより、（ａ）ヒトエフェクター細胞の存在下で抗体依存細胞性細胞毒素を媒介し、及び／又は（ｂ）天然配列よりも良好な親和性でＦｃガンマレセプター（Ｆｃ（Ｒ））に結合する変異体Ｆｃ領域をつくり出すことができる。そのようなＦｃ領域変異体は一般にＦｃ領域に少なくとも一つのアミノ酸の修飾を含んでいる。
好適な実施態様では、ペプチドリガンド配列は免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域のＮ末端に融合している。ペプチドリガンド配列に重鎖定常領域の全体を融合させることが可能である。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４であるとして、残基２１６）、又は他の免疫グロブリンの類似部位の丁度上流のヒンジ領域で始まる配列が融合に使用される。特定の好適な実施態様では、ペプチドリガンドアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域（又は他のリンカードメイン）及びＣＨ２及びＣＨ３又は（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合している。更に好適な実施態様では、ペプチドリガンドアミノ酸配列はＩｇＧの（ａ）ヒンジ領域（又は他のリンカードメイン）及び（ｂ）ＣＨ３ドメインに融合している（例えば、Huら, (1996) Cancer Res. 56:3055-3061に記載された構築物を参照されたい）。
【００３７】
この実施態様の特定の側面では、ペプチドリガンドと多量体化ドメインを含むハイブリッド分子が多量体、例えばホモダイマー、又はヘテロダイマーあるいはヘテロテトラマーとしてでさえ構築される。ホモダイマーはペプチドリガンドと多量体化ドメインを含む二つのモノマーの対合又は架橋から生じる。しかし、二つの同一のモノマー対は必須ではない。本発明の特定の側面では、免疫グロブリン定常ドメインのような多量体化ドメインとペプチドリガンドを含むここに記載したハイブリッド分子は免疫グロブリンの一つのアームを含む対の他方の免疫グロブリンと対合しうる。本発明の範囲に入る様々な例示的構築ハイブリッド分子は以下に概略的に模式化される：
（ａ）ＡＣＨ
（ｂ）ＡＣＨ−ＡＣＨ
（ｃ）ＡＣＨ−ＶＨＣＨ−ＶＬＣＬ
（ｄ）ＡＣＨ−ＶＨＣＨ
ここで、Ａはそれぞれ同一の又は異なるペプチドリガンドを表し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、及び
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインである。
簡略にするために、上記の構造はキーとなる特徴のみを示している；上記構造は以下に記載されるような多量体化ドメインとペプチドリガンドドメインの間に任意のリンカードメインを示していない；上記構造は免疫グロブリンのジョイニング、ヒンジ又は他のドメインを示していないし、ジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要とされる場合、それらは免疫グロブリン分子に占める通常の位置に存在する構造とされている。
【００３８】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のハイブリッド分子に必要とされていないけれども、免疫グロブリン軽鎖はペプチドリガンド−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、ペプチドリガンドに直接融合するかして、存在しているかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡは典型的にはペプチドリガンド−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質と同時発現される。分泌の際、ハイブリッド重鎖及び軽鎖は二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供するように共有結合的に結合する。
ここに記載されたハイブリッド分子は免疫グロブリンｃＤＮＡ配列に読み枠を一致させてペプチドリガンド部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより最も簡便に構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合体もまた使用できる（Aruffoら, (1990), Cell 61:1303-1313;及びStamenkovicら, (1991), Cell 66:1133-1144）。後者のタイプの融合体は発現のためにＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって脾臓又は末梢血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーから発表された配列に基づいて単離できる。ハイブリッド分子のペプチドリガンドと免疫グロブリン部分をコードしているｃＤＮＡは、選択された宿主細胞において効果的な発現をさせるプラスミドベクターにタンデムに挿入される。
【００３９】
あるいは、特にペプチドリガンドが例えば標準的な固相合成法によって合成される実施態様では、ペプチドリガンドは当業者によく知られた様々な手段の任意のものによって多量体化ドメインに結合されうる。共有結合的接合が典型的には最も簡便であるが、他の形態の接合も用途に応じて用いることができる。共有結合的な接合の好適な形態の例には、多量体化ドメインのアミノ酸側鎖と活性化された化学基を持つ分子の反応により生じる結合が含まれ、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。
本発明は、ＨＥＲ２を有する細胞型のペプチドリガンド経由インビボでの特定のターゲティング及び本発明のこの側面によれば、Ｆｃエフェクター機能、例えばＦｃレセプター結合、補体結合、プロテインＡ結合、半減期の増加又は分子までの血液脳関門の通過の付与を含む。
【００４０】
Ｂ．ペプチドリガンド融合体
本発明では、ペプチドリガンドドメインは、任意には、例えば他のペプチドリガンドドメインに、以下に記載するように直接又は柔軟なペプチドリンカーを経由して結合される。本発明では、リンカードメインは以下に更に詳細に記載するように二以上のペプチドリガンドドメインの間に空間的ブリッジを提供する任意の分子群である。本発明のこの側面では、ペプチドリガンドは例えば融合タンパク質におけるように互いに結合される。本発明のこの側面のハイブリッド分子は例えば二以上のレセプターを架橋させるのに有用である。
【００４１】
Ｃ．リンカードメイン
本発明では、ペプチドリガンドドメインは、任意には、例えば他のペプチドリガンドドメインに又は柔軟なペプチドリンカーを経由して多量体化ドメインに結合される。本発明のハイブリッド分子のリンカー成分はハイブリッド分子の機能に必ずしも関与しないが寄与しうる。従って、本発明では、リンカードメインは、二以上のペプチドリガンドドメイン又はペプチドリガンドドメインと多量体化ドメインの間に空間的ブリッジを提供する任意の分子群である。
リンカードメインは可変の長さ及び構造とできる。一般には、重要であるのは、リンカードメインにより引き起こされる配向であり、その化学構造ではない。リンカードメインは、好ましくは、配位ＥｒｂＢ２分子に対する空間的／立体配置的制約を実質的に生じないで、ハイブリッド分子のペプチドリガンドドメインを結合させない。従って、リンカードメインの長さは、ハイブリッド分子の例えばペプチドリガンドと多量体化ドメインの二つの機能の性質に依存する。
当業者であれば、原子の様々な組み合わせが様々な結合間の既知の距離に基づいて可変長さの分子を提供することが分かるであろう（Morrison及びBoyd, Organic Chemistry, 3版, Allyn及びBacon, Inc., Boston, MA (1977)）。例えば、リンカードメインは可変長さのポリペプチドでありうる。ポリペプチドのアミノ酸組成がリンカーの性質と長さを決定する。例示的なリンカードメインは２から１０のアミノ酸、好ましくは約６のアミノ酸、例えばGly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly（配列番号：１２９）、Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly（配列番号：１３０）、及びGly-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly（配列番号：１３１）を含む。
【００４２】
Ｄ．他の二重特異的組み合わせ
本発明のある側面では、少なくとも一つのペプチドリガンドドメインを含む二又は二重特異的組成物が考えられる。例えば、二重特異性抗体組成物はロイシンジッパーを使用して生産されている（Kostelnyら, (1992) J.Immunol., 148(5):1547-1553)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再び酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ヘテロダイマーの結合ドメインの代わりにペプチドリガンドを使用するペプチドリガンドホモダイマー及びヘテロダイマーの生産に対して使用することができる。
本発明はここに記載されたペプチドをコードする単離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む物質の組成物を包含する。本発明のペプチドをコードするＤＮＡは当該分野で知られている様々な方法によって調製することができる。これらの方法は、限定されるものではないが、出典明示により開示の全体がここに取り込まれるEngelsら, (1989) Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734に記載された任意の方法、例えばトリエステル、亜リン酸、ホスホラミダイト及びＨ-ホスホネート法による化学合成を含む。一実施態様では、発現宿主細胞により好まれるコドンはコード化ＤＮＡの設計に使用される。あるいは、ペプチドをコードしているＤＮＡを、組換えＤＮＡ法、例えば部位特異的突然変異誘発（Kunkelら, (1991) Methods Enzymol. 204:125-139; Carter, P.ら, (186） Nucl. Acids. Res. 13:4331; Zoller, M.J.ら, (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487）、カセット突然変異誘発（Wells. J.A.ら, (1985) Gene 34:315）、制限選択突然変異誘発（Wells, J.A.ら,(1986)Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415）等々を使用して一又は複数の変異体をコードするように変更させることができる。
【００４３】
本発明は更に作用可能に結合した発現コントロール配列、及びベクターで形質転換した宿主細胞によりコントロール配列が認識されるＤＮＡ分子を含むプラスミドのような発現ベクターを更に含む。一般には、プラスミドベクターは宿主細胞と適合性がある種から取り出された複製及びコントロール配列を含む。ベクターは通常は複製部位並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供することができるタンパク質をコードする配列を有する。
ＤＮＡを発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞を含む。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌（E.coli）のような腸内菌科を含む。様々な大腸菌株が公的に利用でき、例えば大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)；大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)；大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)及びＫ５ ７７２(ＡＴＣＣ５３６３５)である。
原核生物に加えて、真核生物体、例えば酵母菌、あるいは多細胞生物体由来の細胞を宿主細胞として使用することができる。一般的なパン酵母又はサッカロミセス・セレヴィシアのような酵母宿主細胞中での発現に対しては、好適なベクターには、２ミクロンプラスミドに基づくエピソーム的に複製するベクター、組込み型ベクター、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターが含まれる。発現にまた好適な宿主細胞は多細胞生物体から由来する。無脊椎動物細胞の例には、ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ（Spodoptera）ＳＦ９のような昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。ＳＦ９細胞のような昆虫宿主細胞での発現に対しては、好適なベクターにはバキュロウイルスベクターが含まれる。植物宿主細胞、特にタバコのような双子葉植物宿主における発現に対しては、好適な発現ベクターにはアグロバクテリウムツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するベクターが含まれる。
【００４４】
有用な哺乳動物宿主細胞の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, (1997) J. Gen Virol., 36:59）；ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216)；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, (1980) Biol. Reprod., 23:243-251）；サルの腎細胞 (CVI ATCC CCL 70)；アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2)； イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；マウス乳房腫瘍(MMT 060562, ATTC CCL51)；ＴＲＩ細胞（Motherら, (1982) Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)が含まれる。
原核生物宿主中での発現に対しては、好適なベクターにはｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ第３７０１７）、ｐｈＧＨ１０７（ＡＴＣＣ第４００１１）、ｐＢＯ４７５、ｐＳ０１３２、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２０又はｐＲＩＴ３０シリーズの任意のベクター（Nilsson及びAbrahmsen, (1990) Meth. Enzymol., 185:144-161）、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３-２、ｐＤＲ５４０及びｐＰＬ-ラムダが含まれる。本発明の発現ベクターを含む原核生物宿主細胞には、大腸菌Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ第３１４４６)、大腸菌株ＪＭ１０１（Messingら, (1981) Nucl. Acid Res., 9:309）；大腸菌株Ｂ、大腸菌χ１７７６(ＡＴＣＣ第３１５３７)、大腸菌ｃ６００（Appleyard, Genetics, 39: 440(1954)）、大腸菌Ｗ３１１０(Ｆ-、ガンマ-、原栄養菌株、ＡＴＣＣ第２７３２５)、大腸菌株２７Ｃ７（Ｗ３１１０、ｔｏｎＡ、ｐｈｏＡ、Ｅ１５、（ａｒｇＦ-ｌａｃ）１６９、ｐｔｒ３、ｄｅｇＰ４１、ｏｍｐＴ、ｋａｎχ）（米国特許第５２８８９３１号、ＡＴＣＣ第５５２４４）、枯草菌、サルモネラ菌、セラチア・マルセッセンス及びシュードモナス種が含まれる。
【００４５】
哺乳動物宿主細胞における発現に対しては、有用なベクターには、ＳＶ４０由来のベクター、サイトメガロウイルス由来のベクター、例えばｐＲＫ５及びｐＲＫ７を含むｐＲＫベクター（Suvaら, (1987) Science, 237:893-896; ＥＰ３０７２４７（３／１５／８９）、ＥＰ２７８７７６（８／１７／８８））、ワクシニアウイルス又は他のポックスウイルス由来のベクター、及びモロニーのマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来のベクターのようなレトロウイルスベクターが含まれる。
場合によっては、対象のペプチドをコードしているＤＮＡは宿主細胞による発現産物の培地中への分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に結合される。分泌リーダー配列の例には、ｓｔＩＩ、エコチン（ecotin）、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である（Abrahmsenら, (1985) EMBO J., 4:3901）。
宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターで形質移入され、好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された一般的な培養液中で培養される。
形質移入は、コード化配列が実際に発現されようとされまいと、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。数多くの形質移入の方法が当業者に知られており、例えばＣａＰＯ４沈殿法及びエレクトロポレーション法である。このベクターの作用の任意の兆しが宿主細胞内で生じた場合に一般に成功した形質移入が認められる。
【００４６】
形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体構成成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。Sambrookら, Molecular Cloning (2版）, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989)のセクション１．８２に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, (1983) Gene, 23:315及び１９８９年６月２９日公開の国際公開第８９／０５８５９に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。そのような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、上掲のSambrookらのセクション１６．３０−１６．３７に記載されたリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物宿主系の形質転換の一般的な側面は１９８３年８月１６日に発行された米国特許第４３９９２１６号にAxelによって記載されている。酵母菌への形質転換は典型的には、Van Solingenら, (1977) J. Bact.,130:946及びHsiaoら, (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829の方法に従って実施される。しかし、核注入、エレクトロポレーション、あるいは原形質融合のような他の細胞にＤＮＡを導入する方法を使用することもできる。
他の好適なベクターは上述のベクターの関連した形質を組み合わせることによって標準的な方法を使用して構築することができる。関連する形質には、プロモーター、リボソーム結合部位、対象遺伝子又は遺伝子融合体（プロテインＡのＺドメイン及び対象遺伝子及びリンカー）、抗生物質耐性マーカー、及び適切な複製起点が含まれる。
【００４７】
上記の方法の変形例は、ベクターにおいて、所望のペプチドをコードする遺伝子が他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝子に結合している遺伝子融合体の使用を考える。これは、所望のペプチドが他のタンパク質又はペプチドとの融合体として宿主細胞によって産生される結果となる。「他の」タンパク質又はペプチドはしばしば細胞によって分泌されうるタンパク質又はペプチドであり、培地から所望のペプチドを単離し精製することを可能にし、所望のペプチドが細胞内に残る場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を排除する。あるいは、融合タンパク質は細胞内に発現されうる。高度に発現される融合タンパク質を使用するのが有用である。
遺伝子融合体の使用は、必須ではないが、昆虫細胞における異種性ペプチドの発現並びにその遺伝子産物の続く精製を容易にしうる。プロテインＡの結合、又はより詳細にはプロテインＡのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製のための「アフィニティーハンドル」を提供するので、ＺドメインプロテインＡ融合体がしばしば使用される。例えば、所望のペプチドリガンドをコードするＤＮＡ配列を、Ｚドメインとして知られているプロテインＡのコンセンサスドメインの遺伝子と部位特異的突然変異誘発によって融合させることができる（Nilssonら, (1987) Protein Engineering 1:107-113）。発現及び分泌後に、融合タンパク質を酵素的に切断して、酵素混合物から精製できる遊離のペプチドを生じさせることができる（例えばVaradarajanら, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:5681-5684; Castellanos-Serraら, (1996) FEBS Letters 378:171-176; Nilssonら, (1996) J. Biotechnol. 48:241-250を参照されたい）。
融合タンパク質は、薬品、例えばメチオニンで切断する臭化シアノゲン、又はＡｓｎ及びＧｌｙ残基の間で切断するヒドロキシルアミンを使用して切断できる。標準的な組換体ＤＮＡ法を使用して、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対を所望のペプチドをコードする遺伝子の５'末端の直ぐ前に挿入してもよい。
【００４８】
あるいは、融合タンパク質のタンパク分解的切断を用いることができる。Cater, Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, Ladischら編, (American Chemical Society Symposium Series No.427, 1990), Ch 13, p181-193。
プロテアーゼ、例えばＸａ因子、トロンビン、及びサブチリシン又はその変異体、及び多くの他のものが融合タンパク質を切断するために首尾良く使用された。約３０未満のアミノ酸のペプチドリガンドの生産に対して本発明において好適なものは、Ａｒｇ及びＬｙｓ残基に高度に特異的なプロテアーゼトリプシンである。トリプシン切断は一般にNilssonら, (1996) J. Biotech. 48:241及びSmithら, Methods Mol. Biol. 32:289にいて検討されている。典型的には、使用されるプロテアーゼによる切断に受け入れられるペプチドリンカーは「他の」タンパク質（例えば、プロテインＡのＺドメイン）と所望のペプチドの間に挿入される。組換体ＤＮＡ法を使用して、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対を他のタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子断片の間に挿入する。ついで、正しいリンカーを含む部分的に精製された融合タンパク質のタンパク分解的切断は天然融合タンパク質又は還元されもしくは変性された融合タンパク質の何れかで実施できる。
ペプチドは融合タンパク質として発現されるときに正しく折り畳まれても折り畳まれなくてもよい。また、切断部位を含む特異的ペプチドリンカーはプロテアーゼに接近可能でも可能でなくてもよい。これらの因子は、融合タンパク質が変性され、再び折り畳まれなければならないかを、そして、しかりであれば、これらの手順が切断の前又は後の何れに使用されるかを決定する。
【００４９】
変性と再折り畳みが必要な場合、典型的にはペプチドはグアニジンＨＣｌのようなカオトロープで処理し、ついで、例えば還元され酸化されたジチオスレイトール又はグルタチオンを適切な比、ｐＨ、及び温度で含むレドックスバッファーで、ペプチドがその天然構造まで再折り畳みされるように処理する。
この明細書において言及される宿主細胞はインビトロ培養中の細胞並びに宿主動物内である細胞を包含する。
本発明の環化実施態様では、組換え的に産生されたペプチドは上述したような細胞内ジスルフィド結合の形成により環化できる。
一般的に言って、本発明のペプチドリガンドとハイブリッド分子は、例えば天然又は変異体ヘルグリン分子又はＥｒｂＢ２に対する抗体が使用されるのと同じ用途に使用することができる。もちろん、本発明のいくつかのペプチドリガンド又はハイブリッド分子は他の用途よりも特定の用途により適している場合がある。当業者であれば、ペプチドリガンド又はハイブリッド分子の生物活性を決定する一又は複数の一般的な生物学的アッセイを使用することによって与えられた用途にどの分子が適しているかを容易に確認できるであろう。
一つの例として、ヘレグリンは様々な障害、例えば神経系、筋肉組織及び上皮に影響を及ぼす障害及び疾患の治療に有用である。例えば、本発明のアゴニストペプチドリガンド又はハイブリッド分子はヘレグリン又はヘレグリン変異体が使用されるのと同じようにしてインビボでニューロンの発生、維持及び／又は再生を促進するのに使用される。本発明のこの側面に係るペプチドリガンド又はハイブリッド分子での治療を受け入れることができる疾患又は障害には、例えば外傷、手術、脳卒中、虚血、感染、代謝異常栄養不足、悪性又は毒物に伴う中枢神経系の損傷が含まれる。これらに限定されるものではないがヒト神経変性疾病又は障害、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、神経性難聴及びメニエール病を治療することができる。同様に、特定のペプチドリガンドは神経障害、例えば糖尿病のような全身性疾患又は障害に伴う末梢神経障害の治療における使用に適している。
【００５０】
ＥｒｂＢ２への結合の際に上述のようなリン酸化事象を開始させるアゴニストペプチドリガンドは特に本発明の前述の態様に有用である。本発明の特定のアゴニストペプチドリガンドは細胞の生存を亢進することができ、すなわち、特定のアゴニストペプチドリガンドに暴露されていなかった細胞の生存期間に対してインビボかインビトロでＥｒｂＢ２保有細胞の生存期間を増加させる。好適な実施態様では、アゴニストペプチドリガンドは、例えば細胞による３Ｈ-チミジンの取り込みを測定することによって定量されるＥｒｂＢ２保有細胞型の増殖をインビボかインビトロの何れかで生じさせ又は亢進する。増殖には、表現型の変化についてＥｒｂＢ２保有細胞集団をスクリーニングすることによって決定されるＥｒｂＢ２細胞の分化を伴いうる。
本発明の他の側面では、ある種のペプチドリガンド及びハイブリッド分子、特にＥｒｂＢ２に結合するがアゴニスト関連応答を誘発しないものは、以下に十分に説明されるように、例えば腫瘍細胞浸潤及び転移を阻害するのに有用である。例えば、ＥｒｂＢ２レセプターを発現する腫瘍（特にＥｒｂＢ２を過剰発現するもの）は細胞毒性剤に結合したペプチドリガンド又はハイブリッド分子を使用して治療することができ、又はＥｒｂＢ２を発現する細胞にプロドラッグをターゲティングする際に使用される。
【００５１】
Ａ．エフェクター機能の設計
例えば、本発明のハイブリッド分子の多量体化ドメインをエフェクター機能について改変し、例えば癌の治療における抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基を免疫グロブリンＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。このようにして産生されたホモ又はヘテロダイマーハイブリッド分子は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caronら, (1992) J. Exp. Med. 176:1191-1195及びShopes, B. (1992) J. Immunol. 148:2918-2922を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマーハイブリッド分子は、Wolffら, (1993) Cancer Research 53:2560-2565に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。
別法として、二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうるヘテロダイマーハイブリッド分子を設計することができる。Stevensonら (1989) Anti-Cancer Drug Design 3:219-230を参照されたい。
【００５２】
Ｂ．コンジュゲート
また本発明は、細胞障害剤、例えば化学療法剤、例えばタンパク質毒素もしくは細胞障害性薬物もしくは毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒又はそれらの断片)、又は放射性アイソトープ(すなわち、放射性コンジュゲート)に結合したここに記載の任意のハイブリッド分子又はペプチドリガンドを含有するコンジュゲートにも関する。
このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述した。化学療法剤は、悪性腫瘍、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含む癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、カリケアマイシンのような微生物から単離された抗生物質（Leeら, (1987) J. Am. Chem. Soc. 109:3464-3466; Hinmanら, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342）、メイタンシノイド（例えば、Liuら, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8323に記載されているもの）、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン(Carminomydcin)、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラミシン、メルファラン、及び他の関連したナイトロジェンマスタード、及びエンドクリン治療薬（例えば、ジエチルスチルベストロール、タモキシフェン、ＬＨＲＨ-拮抗薬、プロゲスチン、抗プロゲスチン等々）が含まれる。
【００５３】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。
種々の放射性核種も放射性コンジュゲートペプチドリガンド又はハイブリッド分子の生産に利用できる。例としては２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。炭素-１４標識された１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）はハイブリッド分子へ放射性ヌクレオチドを結合させるためのキレート剤の例である。
ペプチドリガンド又はハイブリッド分子と細胞障害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, (1987) Science 238:1098に記載されているようにして調製することができる。
他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)にペプチドリガンド又はハイブリッド分子が結合され、ペプチドリガンド又はハイブリッド分子-レセプターコンジュゲートが患者に投与され、続いてキレート剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートが除去され、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)に結合された「リガンド」(例えばアビジン)が投与される。
【００５４】
Ｃ．リポソーム
ここで開示されているハイブリッド分子又はペプチドリガンドはまたリポソームとして処方することもできる。ハイブリッド分子を含むリポソームは、例えばEpsteinら, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688；Hwangら, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号に記載されているように、当該分野において知られている方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。例えば、ここに記載されたような免疫グロブリン定常ドメインを有するハイブリッド分子は、ジスルフィド交換反応を介して、Martinら,J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームに結合させることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【００５５】
Ｄ．酵素媒介性プロドラッグ治療法
また、本発明のペプチドリガンド又はハイブリッド分子は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５号を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素にペプチドリガンド又はハイブリッド分子を結合させることにより、抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法（ＡＤＥＰＴ）の抗体のようにして使用することもできる。例えば国際公開８８／０７３７８号及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴ型治療法に有用なコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含むプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なβガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた当該分野で知られている酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, (1987) Nature 328:457-458を参照)。ペプチドリガンド／ハイブリッド分子-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞集団にアブザイムを送達するために調製することができる。
酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、ハイブリッド分子に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明のハイブリッド分子の少なくともペプチドリガンド部分を含む融合タンパク質を、当該分野においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neubergerら, (1984) Nature 312:604-608参照)。
【００５６】
Ｅ．医薬組成物
本発明のペプチドリガンドを含有する医薬組成物は、腸管外、局所、経口又は局部的（エアロゾル又は経皮など）又はその任意の組み合わせを含む任意の適切な形で投与されうる。好適な治療法にはまた静脈内ボーラス注射による最初の投与に続いて一又は複数のインターバルで繰り返し投与を行うことが含まれる。
本発明の化合物の医薬組成物は、所定の純度を持つ化合物を含むペプチドリガンドを、任意成分の製薬的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより（Remington's Pharmaceutical sciences 16th edition, Osol, A. 編, [1980]）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製され保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
ここでの組成物は、治療される特定の徴候に必要ならば一以上の活性化合物も含んでよく、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものである。例えば、一つの製剤にＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（例えばＥｒｂＢ２上の異なるリガンドに結合する抗体）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体のような分子を更に提供することが望ましい。あるいは、又は加えて、組成物は、細胞毒性剤、サイトカイン、成長抑制剤及び／又は心臓保護剤を含有することもできる。そのような分子は好適には意図される目的に対して効果的な量で組み合わされて存在する。
【００５７】
Ｆ．疾患の診断と予後
本発明における予後及び診断のための疾患は、好ましくは、ＥｒｂＢ２レセプターの過剰発現により特徴づけられる良性又は悪性腫瘍、例えば、癌、例えば乳癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。従って、本発明の一実施態様は、試料中のＥｒｂ２の検出及び／又は測定と、そのような検出又は測定の診断、段階決定、重症度の決定、及び疾患の予後一般への使用に関する。
特定の実施態様では、記載された診断方法は治療の進行に従って使用することができる。Ｅｒｂ２保持細胞の量の増加又は減少に至る治療処置を受けている患者では、試料中のＥｒｂ２保持細胞の量が治療の成功又は失敗の有用な目安となりうる。しかして、本発明は、Ｅｒｂ−２発現細胞を含むと疑われる組織試料において発現されるＥｒｂ２の量を適当な時間間隔で測定することを含む、患者における治療の効果をモニターする方法を提供する。Ｅｒｂ２の全量が、疾患と治療に依存して、正常な被験者、疾患の発症前又は疾患の緩解時の患者、又は治療開始前の患者の同様な試料中のＥｒｂ２の量でありうる「ベースライン」又は「コントロール」値と比較される。当業者であれば、過度の実験を行うことなく特定の状況に使用される好適なベースラインが容易に分かるであろう。
本発明の化合物を使用する試料中のＥｒｂ２の測定の実施においては分析物の測定に対して当該分野で知られている任意の方法を使用できる。そのような方法には、限定されるものではなく、少しだけ挙げると、競合及び非競合アッセイシステムで、ラジオイムノアッセイのような技術を使用するもの、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、好ましくは酵素結合免疫吸着検定法（エライザ：ＥＬＩＳＡ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、及び免疫電気泳動アッセイが含まれる。好適なイムノアッセイ法の例については、米国特許第４８４５０２６号（１９８９年７月４日）及び同第５００６４５９号（１９９１年４月９日）を参照されたい。
【００５８】
診断及び予後の応用に対しては、本発明の化合物、典型的にはここに上述したハイブリッド分子は検出可能な部分で標識され、上述のような試料中のＥｒｂ−２を検出するために使用される。多数の標識が利用可能であり、それらは好適には次の範疇にグループ分けされる：
（ａ）放射性同位体、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ等。ハイブリッド分子は、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen等, 編, Wiley-Interscience, New York, Pubs. (1991)に記載された技術を用いて放射性同位体で標識でき、放射活性はシンチレーションカウンティングを使用して測定できる。
（ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、リサミン(Lissamine)、フィコエリトリン及びテキサスレッドが使用できる。蛍光標識は、例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いてハイブリッド分子に結合させることができる。蛍光は蛍光定量計を用いて定量できる。
（ｃ）様々な酵素−基質標識が利用でき、米国特許第４２７５１４９号は、それらの幾つかの概説を提供している。酵素は好ましくは種々の技術を用いて測定可能な色素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒し、それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させることもある。蛍光変化を定量化する技術は上述した。化学発光基質は化学反応によって電子的に励起され、ついで（例えば化学発光計を用いて）測定可能な光を放出するか、又は蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が含まれる。酵素を抗体に結合させる技術は、O'Sullivanら, Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis編）Academic press, New York, 73: 147-166 (1981)に記載されている。
【００５９】
酵素−基質の組み合わせは、例えば以下を含む：
(i)西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としてのハイドロジェンペルオキシダーゼで、ハイドロジェンペルオキシダーゼが染料前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３,３',５,５'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））を酸化する；
(ii)アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート；
(iii)β-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ。
当業者には、多くの他の酵素−基質の組み合わせが利用可能である。これらの一般的な概説については、米国特許第４２７５１４９号及び第４３１８９８０号を参照されたい。
本発明のアッセイでは、好ましくは、ハイブリッド分子は、固相の支持体又は坦体に結合している。「固相の支持体又は坦体」という用語により、抗原又は抗体と結合可能な任意の支持体が意図される。周知の支持体又は坦体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然又は修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及び磁鉄鉱が含まれる。坦体の性質は、本発明の目的に対して、ある程度可溶性であるか、不溶性であり得る。支持材料は、結合された分子が抗原又は抗体と結合可能である限り、実質的には、任意の可能な立体構造をとってもよい。従って、支持体の立体構造は、ビーズのような球状、又は試験管の内面、又はロッドの外表面のような円筒状であってもよい。あるいは、表面はシート、テストストリップ等々のような平坦面でもよい。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者であれば、抗体又は抗原を結合させるための他の多くの好適な坦体が分かり、日常的な実験を行うことにより、同一性について確認を行うことができるであろう。
【００６０】
好ましい実施態様では、サンドイッチイムノアッセイが利用される、すなわち、Ｅｒｂ２は、一次抗体又はハイブリッド分子のＥｒｂ２抗原に対する結合、及び二次抗体又はハイブリッド分子のＥｒｂ２に対する結合を含み、一次及び二次抗体の両方、又はハイブリッド分子による免疫特異的なErb2への結合を検出又は測定することを含む方法によって検出され又は測定される。特別の実施態様では、一次又は二次抗体のどちらかがモノクローナル抗体であり、一次又は二次のどちらか又はその両方が、本発明のハイブリッド分子である。この実施態様では、ハイブリッド分子のペプチドリガンド部分は、好ましくは、一次抗体のリガンド部分とは異なる部位に結合する（例えば、抗原への結合に対する、抗体とハイブリッド分子間における競合阻害の欠如に反映される）。他の特定の実施態様では、一次又は二次抗体はポリクローナル抗体である。
また、本発明中のアッセイを実施するための成分を含む一又は複数の容器又はバイアルを含むキットも本発明の範囲内である。例えば、そのようなキットは、腫瘍のバイオプシーのような免疫組織化学的サンプル分析に必要とされる薬剤を含み得る。薬剤には、例えば、ハイブリッド分子又は抗体のような一又は複数の結合相手が含まれる。組織学的なアッセイに対しては、キットは、色素生産性の基質並びに発色したとき酵素反応を停止する薬剤を含む。キットに含まれる基質は本発明のハイブリッド分子の一つに結合した酵素に適したものである。これらは、当該技術分野において周知である。また、キットは、例えば、既知量の精製Ｅｒｂ２などの標準物質を含む。
以下の実施例は、例示のために提供されるもので、限定するものではない。明細書中の全ての文献の開示は、ここに明示的に出典明示により取り込まれる。
【００６１】
実施例
実施例Ｉ  
ＨＥＲ２結合ペプチドの同定及び成熟
方法
ファージライブラリー−  ランダム配列の多価ペプチドファージライブラリー（表１）は、テンプレートであるpB2479.g8の大規模なクンケル突然変異導入法を用いることにより構築された。このファージミドは、Tacプロモーター、malシグナル配列、３つのストップコドン、及びgVIIIと融合されたリンカー配列を含み、LacIq及びアンピシリン耐性遺伝子を有する。従って、このペプチドライブラリーは、IPTGでコピー数を制御することが可能なpVIII融合体として、多価的にファージ上で発現される。各ライブラリーは、109クローンを越える多様性を有する。
【００６２】
2010004885.tif 000003
【００６３】
選択条件−  ＨＥＲ２-ＥＣＤは、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ９．３中にて、５μｇ／ｍｌを使用し、４℃で一晩反応させ、マキシソープ（maxisorp）プレートに直接固定化された。ウェルは、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を用いて、２５℃で１時間ブロッキングした。上述のライブラリーから得られたファージを、表１に示すような７つのグループにプールした。各プールからのファージは、ＰＢＳ−ＢＳＡ にＨＥＲ２-ＥＣＤを含むウェル中で、２５℃で３時間反応させた；通常、約5 x 1010のファージが各実験ラウンドの開始時に添加された。結合しなかったファージは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（PBS-Tween）による繰り返しの洗浄により除去された；残存するファージは、５００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＣｌ、ｐＨ２により溶出された。その後、溶出されたファージは、XL1-Blue細胞中でＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Stratagene）を用い、３７℃で一晩増幅させた。ＩＰＴＧ（10μＭ）は、最初のファージライブラリー及び増幅中の第１回目のラウンドに、添加された；その後のラウンドは、ペプチド-ｐＶＩＩＩ発現産生のためのｔａｃプロモーターの基本発現に依存した。濃縮度は、ＢＳＡがコートされているウェルに結合するファージ数に対して、標的がコートされているウェルに結合するファージ数を希釈することにより、観察した。
ＨＥＲ２ファージ結合アッセイ−  Ｅｒｂ２の固定化された細胞外ドメイン（ＨＥＲ２-ＥＣＤ、Hudziak等、(1991) J. Biol. Chem. 266:24109-15）に対する、表面にペプチド1.1FI（表１）の単一コピーを表示するファージの結合阻害は、ファージＥＬＩＳＡを使用して評価した。ＨＥＲ２-ＥＣＤは、５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム、ｐＨ９．３中にて、５μｇ／ｍｌになるように使用して、４℃で一晩反応させ、直接、マキシソープ・プレート（Nunc）に固定化させた。ウェルは、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を用いて、２５℃で１時間ブロッキングした。ＰＢＳによる１．１ＦＩ−Ｆｃの希釈物は、１．１Ｆｃ−Ｆｃを表示するファージの固定化ＨＥＲ２-ＥＣＤへの結合に対する阻害能についてテストされた。マイクロタイタープレートは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（PBS-Tween）により洗浄され、ＨＥＲ２-ＥＣＤに結合したファージは、抗ｇＶＩＩＩ／ＨＲＰモノクローナル抗体（Amersham Pharmacia Biotech）により検出された。結合したＨＲＰの量は、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を使用し、４０５ｎｍにおける変化を検出することにより測定された。
【００６４】
結果
ＨＥＲ２-ＥＣＤへ結合する多価ペプチド-ファージの選択−  多価のペプチドライブラリーは、固定化ＨＥＲ２-ＥＣＤに対して７つのプール（表１）に分類された。多価のファージディスプレイ（Scott等 (1990) Science 249:386-390）が、アビディティー効果を介して結合を促進するために使用された。濃縮度、つまり、ＨＥＲ２-ＥＣＤでコートされたウェルから溶出されたファージの数をＢＳＡでコートされたウェルから溶出されたファージの数で除した数は、ラウンド３及びラウンド４について図４に示されている。各プールにおけるランダムクローンから得たＤＮＡは、配列確認され、その予想されるペプチド配列が表２に示されている。プール１は、単一クローンとして得られたが、他のプールは、複数の配列を含んでいた。
ファージ結合アッセイを用いたところ、ファージクローン１．１、５．１及び７．１は、固定化ＨＥＲ２-ＥＣＤに結合するが、固定化ＢＳＡ又は、近縁関係にあるＨＥＲ３又はＨＥＲ４には結合しないことが見いだされ、これらのファージクローンがＨＥＲ２-ＥＣＤを特異的に認識することを示す（図５）。これらのクローンの配列は、更に高い親和性を持つクローンの再選択のために、部分的ランダム化に供された。
【００６５】
表２
2010004885.tif 000004
2010004885.tif 000005
【００６６】
実施例ＩＩ
方法
一価ファージの部分的又は完全なランダム化−  ファージ表面に、ｇＩＩＩによってコードされる尾タンパク質に対しリンカー配列を介して融合されたペプチドの単一コピーを表示する一価ライブラリーが、類似のファージミド、ｐＢ２４７９．ｇ３に対する一本鎖鋳型指向性突然変異（Kunkel等, (1991) Met. Enz. 204:125-139）を用いて構築された。このベクターにおいて、ｇＶＩＩＩに対するコード配列は、ｇＩＩＩによって置換され、さらに、ＣＭＰγ遺伝子は、ＡＭＰγ遺伝子の唯一のｈｉｎｃＩＩ部位に挿入された。薬剤耐性の変化は、弱い親和性ながらも、アビディティー効果を介して集団化を引き起こす（Cwirlaら, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87:6378-6382）多価クローンの関連クローンによるコンタミネーションを除去するように設計された。部分的にランダム化されたライブラリーは、各アミノ酸位置において５０％の変異率を許容しながらも、初期の多価ライブラリーから同定されたペプチド配列への偏りを維持するように設計された。この突然変異率は、70-10-10-10の塩基の混合物によりオリゴを合成することにより達成される（この場合、オリゴのドープ領域の各塩基は、野生型配列に寄与する塩基の７０％を含む混合物を用いて、関連づけられ、他の３塩基の各塩基は、野生型の配列塩基の１０％により関連づけられる）。これに対して、ライブラリーにおける完全なランダム化は、特定のコドンに関しＮＮＳを用いてオリゴを合成することにより、配列の他の部分を一定に保ちながら、得ることができた。
【００６７】
結果
ペプチドファージの部分的なランダム化−  作製された実際のライブラリーが、およそ１０９クローン（潜在的な多様性のほんの一部の多様性）しか含まないのに対し、設計された最初のペプチドライブラリーは、２０２０（１０２６）以上の潜在的な多様性をコードしていた。サーチ範囲を狭め、最初に選択したペプチドの範囲内におけるペプチド多様性を更に探索するために、部分的ランダム化技術を用いた。この技術は、各アミノ酸位置に５０％の突然変異率（アミノ酸レベルにおいて）を導入する間、野生型配列へ向かう偏りを維持する；従って、平均して、２０アミノ酸のペプチドを表示するファージは、１０のランダム突然変異を必要とするであろう。その上、更なる親和性の改善が予想されるため、このようなライブラリーを一価ファージ（gIII）（Bassら, (1990) Protein: Struct. Funct. Genet. 8:309；Lowmanら, (1991) Biochemistry 30:10832）について構築することにした。
クローン１．１、５．１、及び７．１の一価の部分的ランダム化ライブラリーが構築され、ＨＥＲ２に対して４ラウンドの分類がなされた。１００００倍より高い濃縮度が、ライブラリー１．１及び７．１について観察された；しかし、ライブラリー５．１の濃縮は観察されなかった。再び、ランダムクローンが選択され、配列決定が行われた；ライブラリー１．１及び７．１のクローンから選択された予想されるペプチド配列が、図１５に示される。ライブラリー１．１及び７．１における幾つかのアミノ酸位置は、１００％保持されており、さらに、複数のコドンがこれらの多くの位置において観察された。続いて行われた部分的ランダム化において、強固に保持された残基は、直接的な接触を通じた結合又は構造的な理由の何れかに対して重要となりうる。
【００６８】
ＨＥＲ２結合配列の完全成熟−  クラス１配列の親和性の成熟を完成させるために、１００％保存された位置は固定化し、残りの位置は完全にランダムである、第三のライブラリーセットが構築された。クラス１配列のジスルフィドループに隣接するアミノ酸残基の役割は、アミノ及びカルボキシ末端の何れかを欠失するライブラリーを構築することにより解明された。よって、３つの一価ライブラリーが図１６に示されるようにして構築された。５００倍よりも高い濃縮度が、ラウンド４における各ライブラリーによって観察された；ランダムクローンの配列は、図１６に示されている。１０の位置において完全にランダム化されたこれらのライブラリーは、完全にはほど遠いが、全長及びアミノ末端を欠失したライブラリーを比較することにより、クラス１配列のＣ末端領域における付加的なジスルフィドへの選択性が示された。両ライブラリーにおいて、付加的なジスルフィド結合は、２箇所に見いだされる。３つ目のライブラリーにおいて、Ｃ末端位置の欠失は、これらの位置における付加的なジスルフィド結合の選択を防止する。付加的なジスルフィド結合の選択とは別に、他のランダム化された位置において選択された残基は非常に多様性を有している。
【００６９】
実施例ＩＩＩ
方法
ペプチド合成−  ペプチドは、ＰＥＧ-ポリスチレン樹脂を用い（Bodanszkyら, (1984) Int. J Peptide and Protein Res. 23(1):111）、０．２５mmolスケールにて、手動又は自動化されたＦｍｏｃに基づく固相合成により合成された。側鎖の保護基が除去され、ペプチドは９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び５％のトリイソプロピルシランによって樹脂から切断された。酢酸による飽和ヨウ素溶液がジスルフィド結合を酸化するために添加された。ペプチドは、０．１％のＴＦＡを含んだ水／アセトニトリルの濃度勾配を用い、逆相ＨＰＬＣによって精製された。ペプチドは、分析的なＨＰＬＣによると、純度＞９５％であり、同一性については、マススペクトロメトリーによって確認された。
ペプチド-Z融合物の生成−  ＨＥＲ２-ＥＣＤへの結合のために選択されたファージペプチドは、プロテインＡのZタンパク質との融合体として大腸菌（27C7株）中で発現され、分泌された。オリゴは、ファージ-ペプチド配列に対するコード化配列をｓｔＩＩシグナル配列とZドメインを持つプラスミド（ｐＺＣＴ）中のZドメインとの間に挿入するように設計された。細胞はリン酸を制限した培地中で増殖され、ペプチド-Z融合体は、記載されているように、ＩｇＧアフィニティーカラムを使用して（Dennis等, (1993) Proteins: Struct. Funct. Genetics 15:312-321）、培地から精製された。ＩｇＧでアフィニティー精製されたペプチド-Z融合体は、ＮＨＳ-ＬＣ-ビオチン（Pierce）によってビオチン化され、マススペクトロメトリーによって性質決定された。
多量体を形成するペプチド-Z融合体は、ＰＢＳにてSuperdex７５カラムのサイズ排除クロマトフラフィーにより、単量体及びダイマーを含む画分へ分離し得る。
【００７０】
精製されたペプチド-Z融合体からのZドメインの除去−  精製されたペプチド-Z融合体からのZドメインの除去は、トリプシンによる融合体の切断により行うことができる。トリプシン（１％, w/w）は、１００ｍＭ Tris pH８．０、及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中にて３７℃、４時間、添加された。Zドメインが除去されたペプチドは、０．１％のＴＦＡを含んだ２０から５０％のアセトニトリル濃度勾配を用い、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって精製された。
ＨＥＲ２-Ｆｃ発現ベクターの構築−  ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmigen）を基礎とする組換体転移ベクターの構築には、標準的な組換えＤＮＡ技術が用いられた（Sambrook, J., Fritsch, E. F., 及びManiatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; O’Reilly, D. R., Miller, L. K., 及びLuckow, V. A. (1994) Baculovirus Expression Vectors: A Lboratory Mnual, Oxford University Press, New York）。ｐＶＬ１３９３由来プラスミドｐｂＰＨ．Ｈｉｓは、ＮｃｏＩとＳｍａＩによって直線状にされ、エビのアルカリホスファターゼで処理された（Dweyer, M. A.ら, (1999) J. Biol. Chem. 274:9738-9743）。ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃ部分は、他のｐＶＬ１３９３由来プラスミドｐＶＬ１３９３．ＩｇＧから、ＮｄｅＩで切断し、続いてＫｌｅｎｏｗで処理し、更にＮｃｏＩで切断することで得られる７００塩基対の断片として得られた。ＭＩＰ．５シグナル配列は、大腸菌で切断されたＰＣＲ断片としてＦｃ配列の前に導入され、その断片には、ＡｓｃＩ部位が含まれる。ＡｓｃＩ部位は、予想されるシグナル配列切断部位の後に生じる。ライゲーションの後、コンピテント化された大腸菌XL-1 Blueが形質転換され、ＤＮＡの配列決定により正しい組換体プラスミド（pVL1393.MIP.5sig.Fc）を持つ大腸菌が選択された。その後、pVL1393.MIP.5sig.Fcは、ＡｓｃＩ及びＳｔｕＩにより直線化され、エビのアルカリホスファターゼにより処理された。直線化されたベクターは、その後、整合する末端を持つ合成ＤＮＡ片とライゲーションされた。合成ＤＮＡ挿入断片は、以下の２オリゴをアニールすることにより生成された：5'-CGC GCC CAG GTG TAC GAG TCC TGG GGA TGC ATC GGC CCC GGC TGC GCC TGC CTG CAG GCC TGC CTG GGA GGC GGG AGC TCC GGC-3'（配列番号：159）及びGGGSSG（配列番号：130）リンカーを含むペプチド配列1.1FIに対するコード化配列である５'-GCC GGA GCT CCC GCC TCC CAG GCA GGC CTG CAG GCA GGC GCA GCC GGG GCC GAT GCA TCC CCA GGA CTC GTA CAC CTG GG-3'（配列番号：160）。
ライゲーションの後、コンピテント化された大腸菌XL-1 Blueが形質転換され、ローダミンダイターミネーター法及びApplied Biosystems ABI Model 373自動ＤＮＡシークエンサーを用いたＤＮＡの配列決定により正しい組換体プラスミド（pVL1393.MIP.5.1.1FI-Fc）を持つ大腸菌が選択された。組換体転移ベクターは、キアゲンのMini-Prepを使用して精製され、組換体バキュロウィルスの構築のために使用された。
【００７１】
組換体バキュロウィルスは、ｓｆ９細胞に対する転移ベクターと直線化された野生型バキュロウィルスＤＮＡ（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNpV)、Pharmingen）との共形質移入により生産された。組換体バキュロウィルスの最初の増幅により、検出可能なタンパク質の発現を達成することができた。次いで、プラーク精製及びウイルスストック希釈が、プラークアッセイにおいて実施された。先に記載されたような標準的な方法が用いられた（O'Reilly, D. R., Miller, L. K., 及びLuckow, V. A. (1994) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, New York）。
細胞培養−  スポデプテラ・フルギペルダ(Spodeptera frugiperda)(Ｓｆ９)昆虫細胞（ATCC CRL 1711）の接着培養は、GRACE's（JRH Biosciences, ＃51942-78p）、グルタミン、ストレプトマイシン／ペニシリン、及び１０％ウシ胎仔血清（５６℃、３０分間、熱により不活性化されたもの）が添加されたヒンクスのＴＮＦ-ＦＨ昆虫用培地中、２８℃で培養された。培養細胞は３日毎に継代された。High５細胞のスピナーによる培養細胞は、０．５の感染多重度にて感染され、感染６時間後に回収された。浮遊培養は、スピナーフラスコ中、２８℃でＥＳＰ-９２１タンパクフリーの昆虫細胞培地（Expression Systems LLC、＃96-001）を用いて維持された。培養細胞は、最初の細胞密度が１０６細胞／ｍｌとなるように３日毎に継代された。
ペプチド-Ｆｃの精製−  至適化された感染方法に従い、High５細胞は、４℃、800 x gにて１０分間遠心することにより除去された。細胞が除かれた上清（0.5 L）は、０．４５μのNalgene社のフィルターを用いてろ過され、２５℃にてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で平衡化されたHi-Trap プロテインＡカラム（Amersham Pharmacia Biotech）に添加された。２０ｍｌのＰＢＳで洗浄後、カラムは０．２Ｎ ＨＯＡｃ、３ｍｌで溶出され、ペプチド-Ｆｃを含む画分が凍結乾燥され、４℃にて保存された。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ−  サンプルが、Laemmli（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227:680-685）の方法により、プレステインタンパク質分子量マーカー（SeaBlue、Novex）を用い、還元又は非還元状態で４−２０％のトリス-グリシンＳＤＳ-ＰＡＧＥ（Novex）にて解析された。
【００７２】
タンパク質の配列決定−  感染されたＳｆ９細胞の上清から精製された１．１ＦＩ−Ｆｃを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけ、その後PVDF膜に移した。ミリポアImmobilon-PSQ膜上への電気的なブロットは、BioRad Trans-Blot Transferセルにより、２５０ｍＡの定電流で１時間行われた（Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem. 262:10035-10038）。ＰＶＤＦ膜は、５０％メタノール中の０．１％クマジーブルーで０．５分間染色し、１０％酢酸、５０％メタノールで２から３分間脱染色した。膜は、水で完全に洗浄した後、−２０℃で保存する前に乾燥させた。５０ｋＤ付近の１．１ＦＩ−Ｆｃのバンドを切り出し、オンラインＰＴＨ分析装置を備えた494型Applied Biosystems シークエンサーを用いて最初の１１残基を配列決定した。Nelson Analytical 760 インターフェースにより、Justice Innovation Softwareを用いてピーク面積を積算した。配列翻訳は、DEC alphaにより実行した（Henzel, W. J., Rodringuez, H., 及びWatanabe, C. (1987) J. Chromatog. 404:41-52）。
ＨＥＲ２競合ＥＬＩＳＡ−  ＨＥＲ２-ＥＣＤに対する１．１ＦＩ−Ｆｃへの結合は、競合ＥＬＩＳＡにより測定した。サンプルをＰＢＳ-ＢＳＡにて希釈し、上述した方法でマイクロタイタープレートに固定化されたＨＥＲ２-ＥＣＤに対する４０ｎＭのビオチン化１．１ＦＩ−Ｚの結合を阻害する能力を試験した。1時間のインキュベーションの後、プレートをPBS-Tweenにて洗浄し、ストレプタビジン／HRP結合体（Spreptavidin-POD, Roche Molecular Biochemicals）を３０分間添加した。プレートを、再度PBS-Tweenで洗浄し、結合されたHRPをＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質（Kirkegaard & Perry Laboratories）を用いてアッセイし、４０５ nmにおける吸収を測定した。４０５ nmにおける吸収値を、ウェルに元々添加されていた１．１ＦＩ−Ｆｃの濃度に対してプロットした。非線形回帰分析により（Marquardt, J. Soc.Indust. Appl. Math. 11:431-441 (1963)）、シグモイド曲線は、４つの変数の方程式にフィットさせられた；このアッセイにおいて、最大値の半数のシグナルを与えるのに必要な１．１ＦＩ−Ｆｃの濃度は、この曲線より計算され、ＩＣ５０値と呼ぶことにした。
【００７３】
細胞の結合−  ＨＥＲ２（BT 474 [3+], MDA 361[2+], 及びBaF3 [0+]）を発現する細胞をトリプシンで剥がし、洗浄用緩衝液（０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ NaOHを含むPBS）で２回洗浄し、各々０．５ｘ１０６細胞を含む画分に分けられた。細胞は、０、０．５又は５μＭの１．１ＦＩ−Ｚｂを含む洗浄用緩衝液に懸濁し、洗浄用緩衝液で2回洗浄し、ストレプタビジン-ＰＥを含む洗浄用緩衝液に懸濁され、更に２回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ分析にかけた。
ＨＥＲ２-ＥＣＤに結合するペプチドの性質決定−  ペプチドＨＥＲ２０１は、部分的にランダム化されたファージ-クローン1.1.2（図１５）に一致するように合成された。更にまた、完全にランダム化された全長ライブラリーに由来する代表的なクローンである1.1.FI（図１６）に一致するペプチドＨＥＲ２１２も合成された。このペプチドに存在する２つのジスルフィドに起因して、1-2及び3-4のジスルフィド配列を誘導するために、直交性の保護基が、システインのために使用された。ジスルフィド結合が選択の段階中に誘導されたため、この配列が考えられた。
また、前記ペプチド及びライブラリー7.1（図１５）（7.1c）のコンセンサス配列に由来するペプチド配列が、プロテインAのZドメインタンパク質との融合体（1.1.FI-Z及び7.1c-Zと呼ぶ）として発現され、システインの酸化がファージ生産の段階と同様に生じ得るような大腸菌から分泌された。1.1FI-Zの調製物は、ビオチン化され（1.1.FI-Zb）、全タンパク質に基づいた場合2ｎＭのＥＣ５０で、固定化ＨＥＲ２に結合し（Fig.6）、競合ELISAに対する試薬として役立った。
組換体ペプチド融合体である1.1.FI-Z及び7.1c-ZペプチドＨＥＲ２０１、ＨＥＲ２１２は、固定化されたＨＥＲ２に対する1.1.FI-Zbの結合を阻害する能力に関しテストされた（図７）。ＨＥＲ２０１及び7.1c-Zは、それぞれ300及び1,100 nMのIC50を示した。興味深いことに、ＨＥＲ２１２及び1.1FI-Z、これらは同じファージペプチド配列に由来するが、劇的に異なるIC50を示した；各々、9μMと50 nMであった。一つの説明として挙げられることは、他のジスルフィド配列がＨＥＲ２１２の合成中に強制的に生じた可能性である。更に、1.1.FI-Z（Fig.8B）（レーンS）のＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析によると、分子間のジスルフィド結合による多量体化に起因するらしき不均一な混合物であることが明らかにされた。マススペクトロ分析によると、ＨＥＲ２１２はモノマーでのみ存在するのに対し、ダイマー1.1FI-Zの存在が確認された。
【００７４】
1.1.FI-Z調製物は、更にSuperdex７５を用いてモノマーとダイマーの画分に精製された（図８Ａ及び８Ｂ）。驚くべきことに、ＨＥＲ２結合は、ＨＥＲ２の競合ＥＬＩＳＡでアッセイした場合、モノマーの画分よりはむしろダイマーの画分に一致した（図８Ｂ及び８Ｃ）。
更に、1.1.FI-Zは、Zドメインを除去するためにトリプシンにより切断され、逆相HPLCにかけられた。HPLCから得られる画分は、ＨＥＲ２競合ＥＬＩＳＡにおける競合能に関し、テストされた。活性画分は、ＨＥＲ２の配列に一致する質量を有したが、ダイマーを含むことも見いだされた。この画分は、ＨＥＲ２の競合ＥＬＩＳＡにおいて、タンパク質濃度に基づき３ｎＭのIC50を示した。
ダイマー形成を促進するため、1.1FIのアミノ酸配列はZドメインと融合する前に二度繰り返されるような発現ベクターが構築された（図９）。この「一本鎖ダイマー」（(FI)2-Zと称する）も、ダイマーを生産するが、生産される主な種はモノマーであった（図９Ｂ）。更に、Superdex７５カラムで分画し（図９Ａ）、ＨＥＲ２の競合ＥＬＩＳＡでアッセイした場合、活性のある種は、モノマーとして同定された（図９Ｂ及び９Ｃ）。(FI)2-Zは、1.1FI-Zダイマー（IC50=20 nM）と同等の親和性を示す。
ＨＥＲ２上の結合部位−  クラス１及びクラス７の配列は、ＨＥＲ２上の同一、それとも独立の部位に結合されるのかどうか検討するために、固定化ＨＥＲ２に対する、クラス１及びクラス７のファージクローンの結合がＨＥＲ２０１又は7.1c-Zの存在下において調べられた。図１０Ａ及び図１０Ｂより、ＨＥＲ２０１及び7.1c-Zはクラス１及びクラス７のファージ両方の結合を阻害するようであり、このことは、両クラスはＨＥＲ２の同一の部位に結合することを示すものである。これら２つのクラスにおいて得られ配列をつぶさに見ると、コアの相同領域が存在することが分かる（図１１）。
【００７５】
また、クラス１及びクラス７ペプチドの結合部位は、ＨＥＲ２に対する既知のモノクローナル抗体が、固定化ＨＥＲ２に対する1.1.FI-ファージへの結合と、直接競合しないＨＥＲ２上の新規な部位のようである（図１２）。固定化ＨＥＲ２に対する1.1.FI-ファージの結合を阻害するために、種々のモノクローナル抗体の濃度を増加させても影響はなかった。ＨＥＲ２に対するこのモノクローナル抗体の親和性は、１００ｐＭ以下であるため、３Ｈ４の非常に高濃度（>１００ｎＭ）な状態における結合の減少は、間接的な効果を介した結果であると考えられる。
細胞の結合−  1.1.FI-Zbは、細胞上に発現されたＨＥＲ２を認識する能力について調べられた。それぞれ異なる量にてＨＥＲ２を細胞上に発現する3つのタイプの細胞が、調べられた；BT 474 [3+]（3 x 106 レセプター／細胞）、MDA 361[2+]（4 x 105 レセプター／細胞）及びＨＥＲ２を発現しないコントロールの細胞株、BaF3である。ＦＡＣＳ分析によると、1.1.FI-Zbは、レセプターとなるＨＥＲ２の細胞あたりの数、及び用いた1.1.FI-Zbの濃度に比例して細胞に結合することが見いだされた（図１３）。
ペプチド-Fc融合体−  1.1.FI配列をコードするＤＮＡが、リンカーを介してIgG1のFc領域と融合され、バキュロウィルス中において発現された。その結果得られたタンパク質は、プロテインＡカラムにより精製され、酸化及び還元状態下、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより性質決定された（図１４）。これら２つの状態において、明らかな分子量のシフトが観察されており、このことは、Fcの二量体化を示すものである。この分子は、固定化されたＨＥＲ２に対する1.1FIファージの結合を阻害する能力に関してテストした場合、3 nMのIC50を示した。ＨＥＲ２の競合ＥＬＩＳＡによりテストした場合、1.1FI-Fcは1.1FI-Zと同様なIC50を示したが、このことは、1.1FI配列がFcに融合された場合ＨＥＲ２と結合することが、十分可能であったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】天然ＩｇＧ及びパパイン及びペプシン消化により得られたそれらの断片の概略図である。ジスルフィド結合は、例えばＣＨ１とＣＬドメインの間の-Ｓ-Ｓ-により表される。この図において、Ｖは可変ドメインであり；Ｃは定常ドメインであり；Ｌは軽鎖の略であり、Ｈは重鎖の略である。
【図２Ａ】図２Ａは天然ＩｇＧ Ｆｃ領域アミノ酸配列の整列を示す。ヒト(ｈｕｍ)ＩｇＧ Ｆｃ領域配列を示しており、ｈｕｍＩｇＧ(非-Ａ及びＡアロタイプ)(それぞれ、配列番号：７２及び７３)、ｈｕｍＩｇＧ２(配列番号：７４)、ｈｕｍＩｇＧ３(配列番号：７５)及びｈｕｍＩｇＧ４(配列番号：７６)が示されている。ヒトＩｇＧ１配列は非-Ａアロタイプであり、この配列とＡアロタイプとの差異(３５６及び３５８位置；EU番号方式)を、ヒトＩｇＧ１配列の下に示す。また、天然マウス(ｍｕｒ)ＩｇＧ Ｆｃ領域配列を示し、ｍｕｒＩｇＧ１(配列番号：７７)、ｍｕｒＩｇＧ２Ａ(配列番号：７８)、ｍｕｒＩｇＧ２Ｂ(配列番号：７９)及びｍｕｒＩｇＧ３(配列番号：８０)が示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは図２ＡのＦｃ領域配列間のパーセント同一性を示す。
【図３】星印が付された配列間に差異を有する、天然ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域配列、ｈｕｍＩｇＧ１(非-Ａ及びＡアロタイプ)(配列番号：７２及び７３)、ｈｕｍＩｇＧ２(配列番号：７４)、ｈｕｍＩｇＧ３(配列番号：７５)及びｈｕｍＩｇＧ４(配列番号：７６)の整列を示す。
【図４】ＨＥＲ２細胞外ドメイン(ＥＣＤ)に結合する多価ペプチドファージの富化を示す。選択の３及び４回に対して、ＨＥＲ２で被覆されたウェル対ＢＳＡで被覆したウェルから溶出したファージの比率が示されている。
【図５】ファージ結合アッセイの結果を示す。ファージクローン１．１,５．１及び７．１は固定化されたＨＥＲ２-ＥＣＤに結合したが、ＢＳＡ、又はＨＥＲ２-ＥＣＤを特異的に認識することが示されている密接に関連したＨＥＲ３又はＨＥＲ４には結合しなかった。
【図６】固定化されたＨＥＲ２に結合するペプチド１．１．ＦＩＺｂのＥＣ５０の定量を示す。
【図７】固定化されたＨＥＲ２-ＥＣＤへの結合に対するペプチド１．１．ＦＩ-Ｚｂとの、合成ペプチドＨＥＲ２０１及びＨＥＲ２１２並びに組換えペプチド１．１．ＦＩ-Ｚ及び７．１ｃ-Ｚの競合アッセイの結果を示す。
【図８】図８Ａはモノマー(Ｍ)及びダイマー(Ｄ)含有画分にSuperdex75を使用して精製した１．１．ＦＩ-Ｚ(配列番号：８１)の調製物を示す。図８Ｂは、出発物質とペプチド１．１．ＦＩ-ＺのSUPERDEXＴＭ75カラムからの画分のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。図８Ｃは、競合アッセイを使用してアッセイした場合に、１．１．ＦＩ-Ｚのダイマー画分と符合するＨＥＲ２結合活性を示す。
【図９】図９Ａはモノマー及びダイマー含有画分にSUPERDEXＴＭ75を使用して精製した(１．１ＦＩ)２-Ｚ(配列番号：８２)(１．１ＦＩを２回繰り返して、プロテインＡのＺドメインに融合させたもの)調製物を示す。図９Ｂはペプチド(１．１ＦＩ)２-ＺのSUPERDEXＴＭ75カラムからの画分のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。図９Ｃは、競合アッセイを使用してアッセイした場合に、(１．１ＦＩ)２-Ｚのダイマー画分と符合するＨＥＲ２結合活性を示す。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ペプチドＨＥＲ２０１と７．１ｃ-Ｚがクラス１とクラス７のファージの結合をブロックすることを示しており、双方のクラスのペプチドがＨＥＲ２の同じ部位に結合することを示唆している。
【図１１】２つのクラスのペプチド間の核の相同性領域を表すクラス１及びクラス７の配列の例を示す。配列７．１ｃ(配列番号：８３)、１．１．２(配列番号：８４)、１．１．Ｆｃ(配列番号：８５)、１．１．ＦＡ(配列番号：８６)、１．１．ＦＢ(配列番号：８７)、１．１．ＦＨ(配列番号：８８)、１．１．ＣＦ(配列番号：８９)。
【図１２】ＨＥＲ２-ＥＣＤへの結合に対する、ＨＥＲ２に対する既知のモノクローナル抗体とのクラス１及びクラス７のペプチドの競合アッセイの結果を示す。該ペプチドはＨＥＲ２-ＥＣＤへの結合に対して、モノクローナル抗体と競合せず、既知のモノクローナル抗体により認識されるものとは異なるＨＥＲ２-ＥＣＤ部位に該ペプチドが結合することを示唆している。
【図１３】ペプチド１．１．ＦＩ-Ｚｂと異なるレベルでＨＥＲ２を発現する細胞(ＭＤＡ３６１[４ｘ１０５レセプター／細胞]及びＢＴ４７４[３ｘ１０６レセプター／細胞]）、又はＨＥＲ２を発現しない細胞(ＢａＦ３)を使用して行われた結合アッセイの結果を示す。１．１．ＦＩ-Ｚｂは、細胞で発現したＨＥＲ２レセプターの数及び１．１．ＦＩ-Ｚｂペプチドの濃度に比例して細胞に結合することが見出された。
【図１４】ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインにリンカーを介して融合したペプチド１．１．ＦＩ(１．１ＦＩ-Ｆｃ)の、酸化及び還元条件下でのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析の結果を示す。２つの条件下で分子量がシフトすることは、Ｉｇ定常領域の二量体化とＦｃドメインの生成を示唆している。
【図１５】ライブラリー１．１及び７．１．のクローンからの推定ペプチド配列を示す。配列１．１(配列番号：５７)；１．１．８(配列番号：５８)；１．１．９(配列番号：５９)；１．１．１０(配列番号：６０)；１．１．１(配列番号：６１)；１．１．２(配列番号：６２)；１．１．６(配列番号：６３)；１．１．１１(配列番号：６４)；１．１．３(配列番号：６５)；１．１．４(配列番号：６６)；１．１．５(配列番号：６７)；１．１．７(配列番号：６８)；コンセンサス(配列番号：６９)；７．１(配列番号：４５)；７．１．１(配列番号：４６)；７．１．９(配列番号：４７)；７．１．６(配列番号：４８)；７．１．５(配列番号：４９)；７．１．３(配列番号：５０)；７．１．４(配列番号：５１)；７．１．２(配列番号：５２)；７．１．７(配列番号：５３)；７．１．８(配列番号：５４)；７．１．１１(配列番号：５５)；コンセンサス(配列番号：５６)。
【図１６】第４の選択回による各ライブラリーのランダムクローンからの配列を示す。配列１．１(配列番号：５７)；コンセンサス(配列番号：５８)；１．１．ＦＣ(配列番号：３０)；１．１．ＦＮ(配列番号：３１)；１．１．ＦＡ(配列番号：１)；１．１．ＦＭ(配列番号：２)；１．１．ＦＥ(配列番号：３)；１．１．ＦＨ(配列番号：２９)；１．１．ＦＢ(配列番号：１２)；１．１．ＦＦ(配列番号：１３)；１．１．ＦＩ(配列番号：１４)；１．１．ＦＫ(配列番号：１５)；１．１．ＦＤ(配列番号：１６)；１．１．ＦＱ(配列番号：１７)；１．１．ＦＳ(配列番号：１８)；１．１．ＦＸ(配列番号：９)；１．１．ＦＹ(配列番号：１０)；１．１．ＦＺ(配列番号：１１)；１．１．ＮＣ(配列番号：４)；１．１．ＮＢ(配列番号：５)；１．１．ＮＭ(配列番号：６)；１．１．ＮＱ(配列番号：７)；１．１．ＮＡ(配列番号：１９)；１．１．ＮＧ(配列番号：２０)；１．１．ＮＨ(配列番号：２１)；１．１．ＮＥ(配列番号：２２)；１．１．ＮＪ(配列番号：２３)；１．１．ＮＦ(配列番号：２４)；１．１．ＮＫ(配列番号：２５)；１．１．ＮＲ(配列番号：２６)；１．１．ＣＦ(配列番号：２８)；１．１．ＣＡ(配列番号：３２)；１．１．ＣＢ(配列番号：３３)；１．１．ＣＣ(配列番号：３４)；１．１．ＣＤ(配列番号：３５)；１．１．ＣＥ(配列番号：３６)；１．１．ＣＧ(配列番号：３７)；１．１．ＣＨ(配列番号：３８)；１．１．ＣＩ(配列番号：３９)；１．１．ＣＪ(配列番号：４０)；１．１．ＣＬ(配列番号：４１)；１．１．ＣＭ(配列番号：４２)；１．１．ＣＰ(配列番号：４３)。
【図１７】固定化されたＨＥＲ２-ＥＣＤへの結合に対する、ペプチド１．１．ＦＩ-Ｚｂとの、１．１ＦＩ-Ｆｃ及び１．１ＦＩ-Ｚの競合アッセイの結果を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月11日(2009.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロアッセイにおいて、次の式：
Ｘａａ（１−１４）−Ｃｙｓ−Ｘａａ１６−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ（２１−２７）（配列番号：９０）
を有し、ここで、Ｘａａ（１−１４）がないか、１から１４のアミノ酸であり、Ｘａａ１６がＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ（２１−２７）はないか、１から７のアミノ酸であるペプチドリガンドと、ＨＥＲ２への結合について競合する、非天然発生ペプチドリガンド。
【外国語明細書】
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