(57)【要約】【課題】１２−アミノドデカン酸などのω-アミノカルボン酸を、ラクタムを原料として、少ない環境負荷で安価に製造する方法を提供すること。【解決手段】水不溶性ラクタムをラクタマーゼと水相で接触させることを含む、ω−アミノカルボン酸の製造方法ならびにこの方法のための組成物およびキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性ラクタムをラクタマーゼと水相で接触させることを含む、ω−アミノカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
ω−アミノカルボン酸が水不溶性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
水不溶性ラクタムがラウロラクタムであり、ω−アミノカルボン酸が１２−アミノドデカン酸である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
非イオン系界面活性剤の存在下で水不溶性ラクタムをラクタマーゼと接触させる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ω−アミノカルボン酸とラクタマーゼとを分離することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
分離したラクタマーゼを使用して水不溶性ラクタムからω−アミノカルボン酸を生成することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ラクタマーゼを含有する、水不溶性ラクタムからのω−アミノカルボン酸の水相での生成のための組成物。
【請求項８】
ラクタマーゼおよび非イオン性界面活性剤を含む、水不溶性ラクタムからのω−アミノカルボン酸の水相での生成のためのキット。
【請求項９】
さらに水不溶性ラクタムを含む、請求項８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ω−アミノカルボン酸の製造方法に関する。より詳細には、水不溶性ラクタムをラクタマーゼと水相で接触させることを含む、ω−アミノカルボン酸の製造方法ならびにこの方法のための組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ω−アミノカルボン酸の一種である１２−アミノドデカン酸は、ナイロン原料、接着剤原料、硬化剤原料などに用いられる。
【０００３】
従来、１２−アミノドデカン酸の製造方法としては、１１−シアノウンデカン酸を還元する方法が知られていた。しかし、この方法には原料の１１−シアノウンデカン酸を得るまでの多数の工程および多大な費用が必要とされた。
【０００４】
そこで、安価なラウロラクタムを原料とする１２−アミノドデカン酸の製造方法が検討された。このような方法としては、酸、塩基触媒を用いたラウロラクタムからの加水分解が例示される。しかしこの方法は、生成する１２−アミノドデカン酸が塩を形成することから、当量以上の酸、塩基が必要であり、またその後の用途に用いるためには脱塩する必要があるので実用的ではなかった。さらに無触媒での加水分解も検討されたが、これには高温高圧の反応条件が必要であるのでエネルギー的に好ましくなく、また副生成物が生成するという問題点があった。
【０００５】
一方、微生物菌体や酵素などの生体触媒によるラウロラクタムからの加水分解よる１２−アミノドデカン酸の製造方法が本発明者らによって報告され（特許文献１参照）、常温、常圧の温和な条件で反応を進行させ、目的物が得られる可能性が示唆された。しかし、原料のラウロラクタムは水不溶性（水溶解度：３０℃で０．０００３ｇ／ｍｌ）であり、一般的な水系媒質における酵素反応が使用できないので、生産性の向上のために反応条件等を検討する必要があった。
【０００６】
非水溶性化合物を基質とする生体触媒反応の一般的方法の例としては、原料が可溶性である疎水性溶媒に原料を溶解し、生体触媒を溶解させた水系溶媒と混和させる二相系が挙げられる。しかし、ラウロラクタムはトルエンなどの疎水性溶媒への溶解度も低いので二相系においても基質濃度を上げることができず、従って生産性を向上させることができないことが予想された。また、有機溶媒を使用する化学プロセスには、有機溶媒の分離回収、廃液処理などが必要である。近年の環境問題意識の高まり、省エネルギー化の流れを考慮すれば、水系と比較して環境面、安全面、コスト面で不利な有機溶媒を使用する化学プロセスは好ましくなく、有機溶媒をまったく用いない系が望まれていた。
【０００７】
水不溶性（または水難溶性）の基質から、生体触媒が溶解した水系溶媒中にて、水不溶性の生成物が得られた例はきわめて少ない。水難溶性のフマル酸カルシウム塩を水中での酵素反応で同じく水難溶性のリンゴ酸カルシウムに変換した例（非特許文献１）や、水難溶性の保護化アミノ酸を原料とした水中での酵素反応でペプチド結合を形成した例（非特許文献２）は知られているが、水不溶性基質の加水分解反応は報告されていない。
【特許文献１】特開２００６−２７１３７８号公報
【非特許文献１】Kitahara, K. et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 6(2):108-116 (1960)
【非特許文献２】Erbeldinger, M. et al., Enzyme and Microbial Technology 23:141-148 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、従来技術における上記のような課題を解決し、ナイロン原料等として有用な１２−アミノドデカン酸などのω-アミノカルボン酸を、ラクタムを原料として、少ない環境負荷で安価に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、安価に１２−アミノドデカン酸を製造する方法に関して鋭意検討を行った結果、水不溶性のラクタムを有機溶媒などを用いて可溶化させることなく、生体触媒を含む水系媒質中、高濃度スラリー状態で加水分解して、同じく水不溶性のω-アミノカルボン酸を生成できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、
［１］水不溶性ラクタムをラクタマーゼと水相で接触させることを含む、ω−アミノカルボン酸の製造方法；
［２］ω−アミノカルボン酸が水不溶性である、［１］の方法；
［３］水不溶性ラクタムがラウロラクタムであり、ω−アミノカルボン酸が１２−アミノドデカン酸である、［１］または［２］の方法；
［４］非イオン系界面活性剤の存在下で水不溶性ラクタムをラクタマーゼと接触させる、［１］〜［３］のいずれかの方法；
［５］ω−アミノカルボン酸とラクタマーゼとを分離することをさらに含む、［１］〜［４］のいずれかの方法；
［６］分離したラクタマーゼを使用して水不溶性ラクタムからω−アミノカルボン酸を生成することをさらに含む、［５］の方法；
［７］ラクタマーゼを含有する、水不溶性ラクタムからのω−アミノカルボン酸の水相での生成のための組成物；
［８］ラクタマーゼおよび非イオン性界面活性剤を含む、水不溶性ラクタムからのω−アミノカルボン酸の水相での生成のためのキット；
［９］さらに水不溶性ラクタムを含む、［８］のキット、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、安全性、危険性に問題があり高価な有機溶媒を全く用いることなく、原料である水不溶性ラクタムを固体のまま水懸濁スラリー状態にて、水不溶性のω-アミノカルボン酸を製造することができる。加えて、生成物であるω-アミノカルボン酸が固体のまま生成するため、ろ過のような簡便な操作にて、反応系から生成物を単離でき、同時に、水に溶解した状態の生体触媒との分離も可能できる。以上により、ナイロン原料等として有用な１２−アミノドデカン酸などのω-アミノカルボン酸を、ラクタムを原料として、少ない環境負荷にて、安価に製造する方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において用いる用語「水不溶性ラクタム」は、水不溶性のラクタム（すなわち環内に−ＣＯＮＨ−なる原子団を含む環式化合物）を指す。本発明において使用する水不溶性ラクタムの炭素数は、例えば８〜１６、好ましくは１０〜１４、より好ましくは１１〜１３であり、最も好ましくは１２（すなわち、ラウロラクタム）である。ここで、本明細書において用いる用語「水不溶性」は、水系媒質に実質的に溶解しないことを指す。本発明者らは、ラウロラクタムが水系媒質にほとんど溶解しないにもかかわらずその大部分がラクタマーゼと接触させることによってω−アミノカルボン酸である１２−アミノドデカン酸に加水分解されることを見出した。従って、「水不溶性」は、ラクタムの少なくとも大部分が水系媒質に溶解しない状態で基質として加水分解反応に供されることを意味する。具体的には、水不溶性は、３０℃での水溶解度が、例えば０．０１ｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．００１ｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．０００３ｇ／ｍｌ以下であることを意味する。基質として使用する水不溶性ラクタムの形状に限定はなく、例えば、ペレット状でも針状晶でもよい。ラクタマーゼとの接触の観点からは、単位重量当たりの面積が大きい形状が好ましい。
【００１３】
本明細書において用いる用語「ω−アミノカルボン酸」は、上記水不溶性ラクタムの環を開裂する加水分解反応によって得られるアミノ基をもつカルボン酸を指す。１つの実施態様において、ω−アミノカルボン酸は水不溶性である。例えば、ラウロラクタムを加水分解することによって水不溶性の１２−アミノドデカン酸（水溶解度：２０℃で０．０００１９ｇ／ｍｌ）が得られる。
【００１４】
本明細書において用いる用語「水相」は、有機溶媒を含有せず、水系媒質からなる相を指す。例えば、水、生理食塩水、緩衝液などを水相での反応のために使用することができる。
【００１５】
本明細書において用いる用語「ラクタマーゼ」は、ラクタムをω−アミノカルボン酸に加水分解する活性を有する酵素を指す。好ましくは、本発明で使用するラクタマーゼは、ラウロラクタムを１２−アミノドデカン酸に加水分解する活性を有する。ラクタマーゼの例としては、特許文献１に記載されるクプリアビドスｓｐ．（Cupriavidus sp.）Ｔ７（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年２月１８日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４１６のもと寄託）、アシドボラックスｓｐ．（Acidovorax sp.）Ｔ３１（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年１２月１４日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７３４のもと寄託）、クプリアビドスｓｐ．Ｕ１２４（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年２月１８日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４１８のもと寄託）、ロドコッカスｓｐ．（Rhodococcus sp.）Ｕ２２４（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年２月１８日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４１９のもと寄託）、又はスフィンゴモナスｓｐ．（Sphingomonas sp.）Ｕ２３８（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年２月１８日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４２０のもと寄託）由来のものが挙げられる。さらに、Tsuchiya, K. et al., J. Bacteriol. 171(6):3187-3191 (1989)に記載されるフラボバクテリウムｓｐ．（Flavobacterium sp.）Ｋ１７２またはシュードモナスｓｐ．（Pseudomonas sp.）ＮＫ８７由来の６−アミノヘキサノアート−サイクリック−ダイマー  ヒドロラーゼを使用することもできる（それぞれＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２６９５３およびＭ２６９５２）。
【００１６】
ラクタマーゼは上記のような微生物の培養物から抽出、精製などによって得てもよく、あるいは上記のような微生物から得られたラクタマーゼをコードする遺伝子を適切な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入して得られた組換え体の培養物から得てもよい。クプリアビドスｓｐ．Ｔ７、アシドボラックスｓｐ．Ｔ３１、クプリアビドスｓｐ．Ｕ１２４、ロドコッカスｓｐ．Ｕ２２４、スフィンゴモナスｓｐ．Ｕ２３８、フラボバクテリウムｓｐ．Ｋ１７２、シュードモナスｓｐ．ＮＫ８７由来の酵素のアミノ酸配列を配列番号１〜７に示す。例えば、ラクタマーゼをコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉを宿主として発現させる場合には、天然のヌクレオチド配列中に存在するＥ．ｃｏｌｉによる使用頻度の低いコドン（レアコドン）をＥ．ｃｏｌｉによる使用頻度の高いコドンに置換することによって、アミノ酸配列を変化させることなく効率よくラクタマーゼを発現させることができる。ラクタマーゼの精製には例えば特許文献１に記載される方法を使用することができる。ラクタマーゼの組換え発現のために使用される組換えＤＮＡ技術は当該分野において公知である。なお、ラクタマーゼのアミノ酸配列は上記のものに限定されない。例えば、これらの配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクタマーゼ活性を有するタンパク質を本発明に好適に使用することができる。あるいは、これらの配列と例えば９０％以上、好ましくは９５％、より好ましくは９７％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつラクタマーゼ活性を有するタンパク質を本発明に好適に使用することができる。
【００１７】
本発明によれば、ラクタマーゼは通常水系媒質に溶解または懸濁して不溶性ラクタムに作用させる。反応系におけるラクタマーゼの濃度は、例えば０．１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ以上、かつ例えば５ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは２ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１ｍｇ／ｍｌ以下である。また反応系における水不溶性ラクタムの濃度は、例えば１０ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは２０ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５０ｍｇ／ｍｌ以上、かつ例えば５００ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは３００ｍｇ／ｍｌ以下である。例えば、ラウロラクタムを１００ｍｇ／ｍｌの濃度で水系媒質に入れると完全に溶解せず、スラリー状になる。このような状態でもラクタマーゼによる水不溶性ラクタムの加水分解反応は効率よく進行する。反応温度、反応時間は、使用するラクタマーゼの性質などに従って適切に決定することができる。
【００１８】
本発明の方法の１つの実施態様において、非イオン系界面活性剤の存在下で水不溶性ラクタムをラクタマーゼと接触させる。本明細書において用いる用語「非イオン系界面活性剤」は、界面活性剤（水の表面張力の低下など、界面または表面の性質を変化させる性質（界面活性）を有する物質）のうち、親水基として非イオン基を含む界面活性剤を指す。非イオン系界面活性剤を使用すると、基質から生成物への転化率が向上する。これは、非イオン系界面活性剤によって酵素の基質への吸着が抑制されることに起因すると考えられる。これにより、使用する酵素量を減少させることも可能になる。酵素の基質への吸着を抑制する可能性のある他の物質（例えば、ウシ血清アルブミン）も同様に有効である可能性がある。非イオン系界面活性剤の例としてはＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０などが挙げられる。
【００１９】
水不溶性ラクタムからω−アミノカルボン酸への転化率は基質濃度、酵素濃度、反応温度、反応時間、界面活性剤の有無、反応容積などによって変動し得るが、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上とすることができる。
【００２０】
１つの実施態様において、本発明の方法は、ω−アミノカルボン酸とラクタマーゼとを分離することをさらに含む。別の実施態様において、本発明の方法は、分離したラクタマーゼを使用して水不溶性ラクタムからω−アミノカルボン酸を生成することをさらに含む。基質のラクタムのみならず、生成物のω−アミノカルボン酸も水不溶性である場合は、分離は例えばろ過、遠心分離などの物理的手段によって簡便に実施することができる。上記のような非イオン系界面活性剤を使用すれば、ラクタマーゼの回収率をさらに向上させることができる。回収したラクタマーゼはそのまま次の反応に使用してもよく、あるいは硫安沈殿や限外ろ過などによって濃縮して使用してもよい。
【００２１】
本発明は、上記の方法に使用される、ラクタマーゼを含有する組成物を提供する。さらに、本発明は、上記の方法に使用される、ラクタマーゼおよび非イオン系界面活性剤を含むキットを提供する。本発明のキットはさらに水不溶性ラクタムを含んでもよい。本発明の組成物、キットに含有され得るラクタマーゼ、非イオン性界面活性剤、水不溶性ラクタムは、上記したとおりである。
【００２２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
実施例１：各種加水分解反応の検討
１−１．酵素の調製
アシドボラックスｓｐ．Ｔ３１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７３４）（特許文献１）由来のラクタマーゼコード配列中のＥ．ｃｏｌｉによる使用頻度の低いコドン（レアコドン）をアミノ酸配列（配列番号２）が変化しないようにＥ．ｃｏｌｉによる使用頻度の高いコドンに置換し、５’側にリボソーム結合部位（ＳＤ配列）を有し、さらに５’末端および３’末端にそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩの認識部位を付加したＤＮＡを合成した。このＤＮＡをプラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位の間に挿入し、このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。１０Ｌの培養液から回収した菌体から特許文献１に記載の方法に従って超音波および除核酸処理、硫安分画ならびにイオン交換カラムクロマトグラフィーによって酵素を精製し、凍結乾燥した精製酵素０．３ｇを得た。
【００２４】
１−２．加水分解反応
（ｉ）二相系
３０ｍｌのスクリュー管に内部標準としてのテトラデカン（１０ｍｇ）、基質としてのラウロラクタム（東京化成）３９ｍｇ（０．０２Ｍ）が溶解した各種有機溶媒９ｍｌを加え、そこに１−１で得た精製酵素の溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、３０℃で反応を開始させた。反応開始の１、３、６、２４時間後に反応液から０．１ｍｌ分取し、メタノール０．９ｍｌを加えて、下記条件でのガスクロマトグラフィーにてラウロラクタム残存量を定量した。結果を表１に示す。なお、表中＊は完全に溶解していない場合の目安値を示す。
装置：島津  ＧＣ−１７００
カラム：ＤＢ−１７０１（３０ｍ、０．２５ｍｍＩＤ）
カラム温度：１８０℃（３分間）、１８０℃から２８０℃に昇温（２０℃／分）及び２８０℃（３分間）
Ｉｎｊ（注入部）：２７０
Ｄｅｔ．（検出部）：２９０
スプリット比：  １：１０
保持時間：７．５４分（ラウロラクタム）、２．９分（テトラデカン：内部標準）
【００２５】
【表１】
2010004766.tif 000002
【００２６】
（ｉｉ）逆ミセル系
界面活性剤（ＡＯＴ、Ｓｐａｎ６０またはＴｗｅｅｎ２０）の溶液（トルエン中１００ｍＭ）１０ｍｌに基質としてのラウロラクタム３９ｍｇと内部標準としてのテトラデカン１０ｍｇを溶解又は分散させた。そこに精製酵素溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７）中５ｍｇ／ｍｌ）３６μｌを加え、充分に攪拌して均一な分散系を調製し反応を開始させた。反応は３０ｍｌスクリュー管中にて密栓して、３０℃または４０℃の恒温槽中２００ｒｐｍ旋回振とうして行った。上記（ｉ）と同様に経時変化を測定した。結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
2010004766.tif 000003
【００２８】
（ｉｉｉ）界面活性剤複合体系
精製酵素（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中１ｍｇ／ｍｌ）を界面活性剤Ｓｐａｎ６０（ＭＷ４３０．６３、Ａｌｄｒｉｃｈ）または２Ｃ１８ＧＥ（特開平６−３０３９７３号公報参照）（それぞれ、シクロヘキサン中１０ｍＭ）と１００ｍｌナス型フラスコ中で混合し、ポリトロン型ホモジナイザーで攪拌乳化させた後、−８０℃で凍結し、一晩凍結乾燥させて、界面活性剤複合体を得た。収量：Ｓｐａｎ６０、２５０ｍｇ；２Ｃ１８ＧＥ、３３０ｍｇ。
【００２９】
３０ｍｌのスクリュー管に内部標準としてのテトラデカン１０ｍｇ、基質３９ｍｇ（０．０２Ｍ）が溶解したｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍｌを加え、そこに界面活性剤複合体５ｍｇまたは１０ｍｇを加え、１８μｌ（１８ｍｇ）の水を添加し反応を開始させた。上記（ｉ）と同様に経時変化を測定した。結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
2010004766.tif 000004
【００３１】
（ｉｖ）ＰＥＧ複合体系
エマルジョン法：精製酵素溶液（０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中１０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌにポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００、和光純薬）２０ｍｇを加え溶解させた。そこにシクロヘキサン１３ｍｌを加え、ポジトロンミキサーにて２分間攪拌しエマルジョンを形成させたものをドライアイス−エタノール浴にて凍結させた後、凍結乾燥させた。
【００３２】
均一系法：精製酵素溶液（０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中１０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌにポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ２００００、和光純薬）２０ｍｇを加え溶解させた後、ドライアイス−エタノール浴にて凍結させた後、凍結乾燥させた。
【００３３】
３０ｍｌのスクリュー管に内部標準としてのテトラデカン１０ｍｇ、基質３９ｍｇ（０．０２Ｍ）が溶解した有機溶媒１０ｍｌを加え、そこにＰＥＧ複合体を３ｍｇ加え、１８μｌ（１８ｍｇ）の水を添加し反応を開始させた。上記（ｉ）と同様に経時変化を測定した。結果を表４に示す。なお、表中＊は完全に溶解していない場合の目安値を示す。
【００３４】
【表４】
2010004766.tif 000005
【００３５】
基質が水不溶性である場合の生体触媒反応に一般的に使用される、有機溶媒を使用した上記４種類の反応のうち、ラウロラクタムの溶解度が非常に低い有機溶媒を用いた二相系反応において高い転化率が観察された。界面活性剤複合体では、ほとんど活性は見出せなかったが、ＰＥＧ複合体は活性を示し、その活性は有機溶媒の疎水性が高くなるほど高かった。この傾向は二相系でも同様であり、有機溶媒と酵素反応に関する一般則と合致した。なお、ラウロラクタムは、疎水性の高い溶媒では溶解度が低く、一部が溶けたのみのスラリー状であった。
【００３６】
実施例２：スラリー状態での反応
実施例１にて、ラウロラクタムの溶解度が非常に低い有機溶媒を用いた二相系反応においても、加水分解の進行が確認でき、基質がほとんど溶解していないスラリー状態にて、反応が進行していることが示された。そこで、有機溶媒を全く添加しない場合とラウロラクタムの溶解度が非常に低いイソオクタン添加系でラウロラクタム加水分解を行った。
【００３７】
蓋付き試験管に、ラウロラクタム３．９ｍｇ、７．８ｍｇ、または１９．５ｍｇを量り取り、そこに精製酵素０．１ｍｇ、０．５ｍｇまたは１．０ｍｇを溶解した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）１．０ｍｌ、またはイソオクタン０．９ｍｌおよび０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．１ｍｌを加え、３０℃インキュベーター中、２００ｒｐｍ旋回振とうにより反応を行った。
【００３８】
２４時間後、３ｍｌのアセトンを加えて攪拌し、反応を停止させた。次に内部標準としてのテトラデカン溶液（アセトン中５ｍｇ／ｍｌ）１．０ｍｌを加え、ミキサーにて攪拌し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を分取し、実施例１と同様にガスクロマトグラフィー分析に供した。なお、基質、生成物とも溶解度が低く、反応系がスラリー状であったので、経時変化測定を行わず、２４時間目のみを分析した。結果を表５に示す。
【００３９】
【表５】
2010004766.tif 000006
【００４０】
本実施例の反応条件では、すべて高い転化率が示された。一般的に水に難溶性の固体は酵素反応を受けにくいと考えられていたが、予想外なことに、有機溶媒が存在する二相系のみならず、有機溶媒が存在しないスラリー状態の反応でも高い転化率が示された。
【００４１】
実施例３：ラウロラクタムの形状の影響
ラウロラクタムとして針状晶（東京化成）または直径２〜３ｍｍのペレット（宇部興産）を用いて加水分解反応を行った。蓋付き試験管（１２ｍｌ）にラウロラクタム５０ｍｇを量り取り、精製酵素溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中０．２５ｍｇ／ｍｌまたは２．５ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを加え、３０℃インキュベーター中、小型フットボール型攪拌子を加え、電磁スターラー（リモート・マルチ１６型）にて攪拌（約１０００ｒｐｍ）することにより反応を行った。１、３、６または２４時間後に８ｍｌのメタノールを加えて攪拌し、反応を停止させた。次に内部標準としてのテトラデカン溶液（メタノール中５ｍｇ／ｍｌ）２．０ｍｌを加え、ミキサーにて攪拌し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を分取して、実施例１と同様にガスクロマトグラフィー分析に供した。なおこの場合、スプリット比：  １：５０、保持時間：７．９分（ラウロラクタム）、３．２分（テトラデカン：内部標準）であった。結果を表６に示す。
【００４２】
【表６】
2010004766.tif 000007
【００４３】
酵素量の多い（２．５ｍｇ／ｍｌ）場合は、反応が非常に早く、針状晶を基質とした場合、３時間で転化率ほぼ１００％に達した。ペレットを用いた場合の反応は若干遅かったが、時間と共に反応が進み、２４時間後ではほぼ１００％の転化率となった。目視においても、経時的にペレットの形状が崩れ、粉状に変化するのが確認できた。酵素量の少ない（０．２５ｍｇ／ｍｌ）場合は、必ずしも反応時間と転化率との間に相関関係は見られず、特にペレットを使用した場合に大きなバラツキが認められた。この原因としては、用いるペレットの粒径の不均一性や、飛散による試験管上部への付着に加えて、基質への酵素の吸着の可能性が考えられた。
【００４４】
実施例４：添加物の影響
実施例３において示唆された酵素の基質への吸着が転化率に及ぼす影響を検討するために、ＥＬＩＳＡにおけるブロッキングなどとしてよく用いられる水溶性タンパクであるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはノニオン系界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を反応系に添加し、その効果を、上記実施例において転化率のばらつき、反応の停止が認められた低酵素濃度で検討した。
【００４５】
蓋付き試験管（１２ｍｌ）にラウロラクタム（針状晶、東京化成）５０ｍｇを量り取り、ＢＳＡ（２．５ｍｇ／ｍｌ、和光純薬）またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．０１％、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、和光純薬）を含む精製酵素溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中０．２５ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを加え、３０℃インキュベーター中、小型フットボール型攪拌子を加え、電磁スターラー（リモート・マルチ１６型）にて攪拌（約１０００ｒｐｍ）することにより反応を行った。
【００４６】
１、３、６、２４時間後、８ｍｌのメタノールを加えて攪拌し、反応を停止させた。次に内部標準としてのテトラデカン溶液（メタノール中５ｍｇ／ｍｌ）２．０ｍｌを加え、ミキサーにて攪拌し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を分取し、実施例３と同様にガスクロマトグラフィー分析に供した。結果を表７に示す。
【００４７】
【表７】
2010004766.tif 000008
【００４８】
無添加区では転化率の頭打ちが認められた。それに対して、界面活性剤またはＢＳＡを添加した場合、対照の無添加区に比べて転化率の向上が認められた。すなわち両者とも酵素の吸着抑制効果を有することが示された。特にＴｒｉｔｏｎＸ−１００添加区は経時的に転化率が高くなり、酵素量が少なくても（０．２５ｍｇ／ｍｌ）２４時間後に８９％と非常に高い値を示した。
【００４９】
実施例５：酵素回収率の検討
実施例４において、ＢＳＡや界面活性剤の添加が転化率向上に寄与し、酵素の吸着を抑制していることが示された。これにより、酵素を回収して再利用できる可能性が示唆された。反応後の上清からの酵素回収については、酵素濃度１．０ｍｇ／ｍｌでは回収率がほぼ０％であること、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加で回収率が改善されることが判明していた。本実施例では、酵素回収率に対するＢＳＡまたはＴｗｅｅｎ−２０（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と同様にノニオン系界面活性剤である）の添加効果を検討した。
【００５０】
１回目の反応：蓋付き試験管（１２ｍｌ）にラウロラクタム（針状晶、東京化成）５０ｍｇを量り取り、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌ、和光純薬）および／またはＴｗｅｅｎ２０（０．０５％、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬）を含む精製酵素溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中１ｍｇ／ｍｌを加え、３０℃インキュベーター中、２４時間小型フットボール型攪拌子を加え、電磁スターラー（リモート・マルチ１６型）にて攪拌（約１０００ｒｐｍ）することにより反応を行った。
【００５１】
２回目の反応：１回目の反応の後、反応液に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを加え、混合物をマイクロチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清０．５ｍｌを分取し、２回目の反応に用いた。２回目の反応は、酵素液を上記回収液とした以外は、１回目と同様に行い、反応時間は１時間とした。反応開始の１時間後に８ｍｌのメタノールを加えて攪拌し、反応を停止させた。次に内部標準としてのテトラデカン溶液（メタノール中５ｍｇ／ｍｌ）２．０ｍｌを加え、ミキサーにて攪拌し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を分取し、実施例３と同様にガスクロマトグラフィー分析に供した。同様の操作を２回行って平均値を求めた。２回目の反応と同時に、１回目の反応液の代わりに、精製酵素溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）または精製酵素液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて２倍希釈したもの０．５ｍｌを用いて同様の反応を行った。２回目の反応を行う際に１回目の反応液を２倍希釈していることを考慮し、転化物なしで２倍希釈した精製酵素溶液（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて得られた転化率に対する相対値を転化率比として算出した。結果を表８に示す。
【００５２】
【表８】
2010004766.tif 000009
【００５３】
添加物を使用しない場合、１時間の反応では酵素濃度が１．０ｍｇ／ｍｌでもまだ飽和状態に達しておらず、酵素添加量と転化率に相関関係が見られた。このことは、上記条件で得られた２回目の反応の転化率が、酵素の回収量の指標となることを示す。Ｔｗｅｅｎ２０の添加が酵素の回収率に及ぼす効果は顕著であり、相当量の対照をわずかに上回る転化率となった。これは、回収率の向上と、活性測定時の界面活性剤の共存との相乗効果によるためと思われる。ＢＳＡ添加区は、１ｍｇ／ｍｌ添加区ではほとんど効果が見られなかったが、１０ｍｇ／ｍｌ濃度では、顕著な効果があった。
【００５４】
実施例６：スケールアップした反応
上記の検討から、基質が高濃度（１０ｗｔ％）のスラリー条件で反応が進行すること、酵素の吸着阻害や回収には界面活性剤の添加が有効であることが判明した。これらの知見に基づいて、本実施例では大スケール（５０ｍｌ）で反応を行い生成物の収率、純度、回収率を検討した。同じ操作を２回行い平均値を算出した。
【００５５】
ガラス製２００ｍｌ反応器にラウロラクタム（針状晶、東京化成）５．００ｇを量り取り、精製酵素溶液（０．１ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬）を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中０．５ｍｇ／ｍｌ）５０ｍｌを加え、パラレル合成装置（ＣｈｅｍｉＳｔａｔｉｏｎ  ＰＰＶ−ＣＨＡ、ＥＹＥＲＡ）において、ブロックヒーター温度を３５℃とし、マグネチックスターラーにて攪拌（５００ｒｐｍ）することにより２４時間反応を行った。
【００５６】
反応終了後、反応混合物をキリヤマ漏斗にて吸引ろ過した。ろ液は、希釈することなく、回収し、酵素活性測定、およびタンパク濃度測定に供した。ろ物は、純水（２５ｍｌ×２）にて洗浄し、真空検体乾燥機にて減圧乾燥（８０℃、１６時間）し白色粉末状の生成物５．３４ｇを得た。
【００５７】
生成物５．０ｍｇを精秤し、そこに内部標準としてのテトラデカン１０．０ｍｇを精秤して加え、メタノール１０ｍｌを加えてミキサーにて攪拌し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を分取し、以下の条件でのガスクロマトグラフィー分析に供した。標準サンプルとしては、生成物の代わりにラウロラクタム（東京化成）を用いた。その結果、転化率は９９％以上であった。
装置：島津  ＧＣ−１７００
カラム：ＤＢ−１７０１（３０ｍ、０．２５ｍｍＩＤ）
カラム温度：１８０℃（０分間）、１８０℃から２８０℃に昇温（２０℃／分）及び２８０℃（０分間）
Ｉｎｊ（注入部）：２７０
Ｄｅｔ．（検出部）：２９０
スプリット比：  １：５０
保持時間：５．０分（ラウロラクタム）、２．４分（テトラデカン：内部標準）
【００５８】
生成物の純度は、滴定法（検体を酢酸に溶解し、過塩素酸により中和滴定する）によって測定した。各サンプルについて２回反復して測定し、平均値から純度を算出した。その結果、純度は９９．２％であった。
【００５９】
上記実施例において観察された小スケールでの転化率が９５％程度であったのに対して、本実施例において観察された大スケールでの転化率は９９％以上とさらに向上した。これは、ラウロラクタムの加水分解反応が不均一な系での反応であり、小スケールでは器壁への未反応基質の付着が避けられなかったのに対して、大スケールでは器壁への付着をほとんど無くすことができたためと考えられる。また、小スケールの反応物から酵素含有液を回収しようとすると大部分が生成物の湿粉末に吸着した状態で回収が困難であったが、大スケールでは流動性も良く吸引ろ過にて９割程度回収できた。本実施例ではラウロラクタムのスラリー濃度を小スケールでの結果に基づいて１０ｗｔ％としたが、大スケールの場合はさらに高濃度で反応できる余地があるようであった。このように、大スケールでの効率的なラウロラクタムの加水分解が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、安全性、危険性に問題があり、高価な有機溶媒を全く用いることなく、原料である水不溶性ラクタムを固体のまま水懸濁スラリー状態にて、水不溶性のω-アミノカルボン酸を製造することができる。加えて生成物であるω-アミノカルボン酸が、固体のまま生成するため、ろ過のような簡便な操作にて、反応系から生成物を単離でき、同時に、水に溶解した状態の生体触媒との分離も可能できる。以上により、ナイロン原料等として有用な１２−アミノドデカン酸などのω-アミノカルボン酸を、ラクタムを原料として、少ない環境負荷にて、安価に製造する方法を提供できる。
【配列表】
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