(57)【要約】【課題】製造の簡易性は維持しつつ高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することが可能な固相合成用基板の製造方法、及び高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を向上させることが可能な固相合成用基板を提供すること。【解決手段】本発明の第１の態様にかかる固相合成用基板１００の製造方法は、基板１上にヒドロキシ基（ＯＨ基２２）を有する有機物の溶液（ポリマ溶液２ａ）を塗布するステップと、ポリマ溶液２ａが塗布された基板１を加熱処理３０するステップと、加熱処理３０後、基板１を溶剤で洗浄４０するステップと、を備えるものである。これにより、基板１と強固に結合された、薄くて均一な固相合成層２を、比較的簡易な処理工程で形成することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上にヒドロキシ基を有する有機物の溶液を塗布するステップと、
前記溶液が塗布された前記基板を加熱処理するステップと、
加熱処理後、前記基板を溶剤で洗浄するステップと、を備える固相合成用基板の製造方法。
【請求項２】
前記有機物は、ポリヒドロキシスチレンである請求項１に記載の固相合成用基板の製造方法。
【請求項３】
前記基板は、表面にＳｉＯ２又はガラスを有する請求項１又は２に記載の固相合成用基板の製造方法。
【請求項４】
前記基板は、シランカップリング剤を用いてエポキシ基、ヒドロキシル基、及びジオール基のいずれか１つ以上を導入した基板である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の固相合成用基板の製造方法。
【請求項５】
前記基板は、シランカップリング剤を用いて表面にカルボキシル基、エステル基、エーテル基、アミノ基、チオール基、シアノ基、ピリジル基、イミノ基、ヒドロキシ基、アミド基、スルホン酸基、及びリン酸基のいずれか１つ以上を導入した基板である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の固相合成用基板の製造方法。
【請求項６】
前記基板と前記有機物とが水素結合で結合されている請求項１乃至５のいずれか１項に記載の固相合成用基板の製造方法。
【請求項７】
前記固相合成用基板はＤＮＡ検出用基板である請求項１乃至６のいずれか１項に記載の固相合成用基板の製造方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の製造方法を用いて製造された固相合成用基板。
【請求項９】
基板と、
前記基板上に形成された固相合成層と、を備え、
前記固相合成層は、固相合成層を構成する有機物に対する良溶媒に溶解されないことを特徴とする固相合成用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相合成用基板の製造方法、及び固相合成用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップは、被検対象の生体物質と特異的な化学反応をするキャプチャープローブをチップ表面の特定位置に固定した素子の総称である。バイオチップの代表例であるＤＮＡチップは、血液や細胞の抽出液に含まれるターゲットＤＮＡの種類と量を検出するために使用されている。ＤＮＡチップは、例えばスライドガラス板のような基板の上に、それぞれ既知の配列を有する１本鎖であるキャプチャープローブＤＮＡを、数千〜数万種類、アレイ状に配列したものである。このＤＮＡチップに蛍光標識させたターゲットＤＮＡを含む被験液を供給すると、配列がキャプチャープローブＤＮＡと相補関係にあるターゲットＤＮＡのみがプローブＤＮＡと水素結合により互いに結合して２本鎖を形成する。そのため、ターゲットＤＮＡが固定された部分が蛍光発色するので、チップ上の蛍光発色位置とその発色強度を測定することにより、ターゲットＤＮＡの種類と量を知ることができる。
【０００３】
このようにして使用されるＤＮＡチップをチップ表面に直接キャプチャープローブＤＮＡを合成する逐次合成方式で作成する際には、ＤＮＡ合成の起点となる分子を固定化したＤＮＡ検出用基板（固相合成用基板）が必要になる。そのため、基板表面上に検出用担体（固相合成用担体）である有機物を固定化することが行われる。この有機物は、合成中やその後の検出工程で、溶解、剥離されることなく、キャプチャープローブＤＮＡを基板上に保持し続ける必要がある。また、有機物の性質によって、検出工程における感度や再現性に影響が生じうる。
【０００４】
従来の固定化方法のひとつとして、シラン化、シラン化＋分子付加反応などの技術が知られている（例えば、特許文献１）。これらはシランカップリング剤を用いて、有機化合物の膜を固相合成層としてガラス基板上に結合するもので、比較的簡易に有機化合物の膜の形成ができるものの、有機化合物の密度が不均一になり易いため感度ムラが起こりやすく、また耐薬品性に劣るという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−１７８４９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来よりもさらに実用的なものを追求するのであれば、膜の形成の簡易性は維持しつつ、感度と耐薬品性を向上させることが望まれている。
【０００７】
本発明は、上記のような問題点を解決するためになされたものであり、製造の簡易性を維持しつつ高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することが可能な固相合成用基板の製造方法、及び高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することが可能な固相合成用基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様にかかる固相合成用基板の製造方法は、基板上にヒドロキシ基を有する有機物の溶液を塗布するステップと、前記溶液が塗布された前記基板を加熱処理するステップと、加熱処理後、前記基板を溶剤で洗浄するステップと、を備えるものである。これにより、基板と強固に結合された、薄くて均一な固相合成層を、比較的簡易な処理工程で形成することができる。従って、製造の簡易性を維持しつつ高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することができる。
【０００９】
本発明の第２の態様にかかる固相合成用基板の製造方法は、上述の固相合成用基板の製造方法であって、前記有機物は、ポリヒドロキシスチレンであってもよい。これにより、ポリヒドロキシスチレンからなる固相合成層を形成できる。
【００１０】
本発明の第３の態様にかかる固相合成用基板の製造方法は、上述の固相合成用基板の製造方法であって、前記基板は、表面にＳｉＯ２又はガラスを有するものである。これにより、基板と固相合成層とを強固に結合させることができる。
【００１１】
本発明の第４の態様にかかる固相合成用基板の製造方法は、上述の固相合成用基板の製造方法であって、前記基板は、シランカップリング剤を用いてエポキシ基、ヒドロキシル基、及びジオール基のいずれか１つ以上を導入した基板であってもよい。これにより、基板と固相合成層とを強固に結合させることができる。
【００１２】
本発明の第５の態様にかかる固相合成用基板の製造方法は、上述の固相合成用基板の製造方法であって、前記基板は、シランカップリング剤を用いて表面にカルボキシル基、エステル基、エーテル基、アミノ基、チオール基、シアノ基、ピリジル基、イミノ基、ヒドロキシ基、アミド基、スルホン酸基、及びリン酸基のいずれか１つ以上を導入した基板であってもよい。これにより、基板と固相合成層とを強固に結合させることができる。
【００１３】
本発明の第６の態様にかかる固相合成用基板の製造方法は、上述の固相合成用基板の製造方法であって、前記基板と前記有機物とが水素結合で結合されているものである。これにより、基板と固相合成層とを水素結合により強固に結合させることができる。
【００１４】
本発明の第７の態様にかかる固相合成用基板の製造方法は、上述の固相合成用基板の製造方法であって、前記固相合成用基板はＤＮＡ検出用基板であってもよい。これにより、固相合成用基板を用いて優れた性能のＤＮＡチップを製造することができる。
【００１５】
本発明の第８の態様にかかる固相合成用基板は、上述の製造方法を用いて製造されたものである。これにより、基板と強固に結合された、薄くて均一な固相合成層を得ることができる。従って、高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することができる。
【００１６】
本発明の第９の態様にかかる固相合成用基板は、基板と、前記基板上に形成された固相合成層と、を備え、前記固相合成層は固相合成層を構成する有機物に対する良溶媒に溶解されないものである。これにより、基板と強固に結合された、薄くて均一な固相合成層を得ることができる。従って、高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、製造の簡易性は維持しつつ高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することが可能な固相合成用基板の製造方法、及び高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することが可能な固相合成用基板を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本実施の形態に係る固相合成用基板の製造工程の流れを示したフローチャートである。
【図２】本実施の形態に係る固相合成用基板の製造工程を示した断面図である。
【図３】本実施の形態に係る固相合成用層を形成するために用いるポリマの構造式である。
【図４】本実施の形態に係る固相合成用基板を用いたＤＮＡチップの蛍光強度を従来技術と比較して示したグラフである。
【図５】本実施の形態に係る固相合成用基板を用いたＤＮＡチップの蛍光強度の均一性を従来技術と比較して示す写真である。
【図６】本実施の形態に係る固相合成用基板を用いたＤＮＡチップの蛍光強度の均一性を従来技術と比較して示したグラフである。
【図７】本実施の形態に係る固相合成用基板を用いたＤＮＡチップにおいて、ハイブリダイゼーション時間を変化させたときの蛍光強度の変化を示す写真である。
【図８】従来技術に係るシラン化基板を用いたＤＮＡチップにおいて、ハイブリダイゼーション時間を変化させたときの蛍光強度の変化を示す写真である。
【図９】本実施の形態に係る固相合成用基板を用いたＤＮＡチップのハイブリダイゼーション時間に対する蛍光強度の変化を、従来技術と比較して示したグラフである。
【図１０】本実施の形態に係る固相合成用基板を用いたＤＮＡチップの蛍光強度について、加熱処理の温度条件を変化させて固相合成用基板を形成したときの変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
例えば、ポリヒドロキシスチレン（polyhydroxystylene：ＰＨＳ）に代表される、ヒドロキシ（あるいはヒドロキシル）基（ＯＨ基）を多く含むポリマを用いて、溶媒に不溶な膜を形成できれば、高感度かつ均一な感度特性で耐薬品性の良好な固相合成用基板として非常に有用である。そのためにはまず基板上に薄くて均一な膜を塗布することが必要となる。そして、基板表面のポリマ濃度を高め、さらにポリマに対する良溶媒に不溶な膜に変化させる必要がある。
【００２０】
ポリマの薄膜を形成するためのＰＨＳ溶液は、高濃度であるほど感度を向上させる効果に寄与するものと推測できるが、一方で溶液中のＰＨＳの流動性が抑制されやすくなる。すなわち、高感度化（ＰＨＳの高濃度化）と感度の均一化（ＰＨＳの流動性）とはトレードオフの関係にある。そこで、低濃度（むしろ通常の濃度）の溶液を採用して流動性を確保し、均一に塗布した後、基板表面のＰＨＳ濃度を高める方法を検討した。
【００２１】
発明者は試行錯誤を繰り返し、ＰＨＳをアセトニトリルやアセトンなどのＰＨＳに対する良溶媒で溶解し、適宜希釈して低濃度かつ低粘性のＰＨＳ溶液に調整することで、基板表面に対して均一な塗布が容易に実施できることを確認した。さらに塗布後に溶媒を蒸発させることで、均一な塗布状態を維持したまま、基板表面におけるＰＨＳの濃度を高めることが出来ることを見出した。
【００２２】
次に、基板表面のＰＨＳ濃度を高めた膜を、ＰＨＳに対する良溶媒に不溶な膜に変化させる方法を検討した。固体ポリマの溶媒に対する溶解度は、固体を構成するポリマ分子の運動の自由度に大きく影響されると考えることができる。例えば、固体状態のＰＨＳでは、分子同士が絡み合い、分子内および分子間でＯＨ基を介した水素結合を形成していると考えられている。なお、通常は、ＯＨ基の多くがポリマ分子間で水素結合を形成している。つまり、ＰＨＳに代表される、ＯＨ基を含んだポリマでは、分子間で水素結合を形成している部分はポリマ分子の運動の自由度が比較的高く、溶媒分子がポリマ分子の間に入り込みやすいため、ポリマ分子が溶媒に溶解しやすい傾向があると考えることができる。以上のことから、ポリマ分子を用いて溶媒に不溶な膜を得るためには、分子間の結合を強めると同時に、溶媒分子がポリマ分子間に入り込みにくくする必要がある。そのためには、ポリマ分子と固体（基板）表面での結合を促進することで、溶媒に溶けにくいポリマ膜を形成することができると考えた。
【００２３】
試行錯誤した結果、基板表面のＰＨＳ濃度を高めた膜を熱処理することで、ＰＨＳと基板との結合強度が増し、アセトニトリルやアセトンなどのＰＨＳに対する良溶媒に溶解しない膜に変化させることができることを見出した。これは、ＯＨ基を含んだポリマをガラスや石英などの基板に接触した状態でガラス転移温度近辺まで加熱して冷却することで、ポリマ分子と基板表面との水素結合の比率を高め、ポリマ分子と固体基板表面が密な水素結合を形成している状態となることによるものと考えられる。またこの状態ではポリマ分子の運動が制限され、溶媒分子が入り込みにくくなるため、ポリマ分子は溶媒に対して溶解しにくくなると考えられる。
【００２４】
また、ＰＨＳ分子と基板表面の水素結合形成は基板とポリマの接触する界面においてのみ進行するため、この基板をアセトニトリルやアセトンなどのＰＨＳに対する良溶媒に浸すことで、基板表面に密に水素結合された膜部分のみを残してＰＨＳを溶解させることができることを見出した。
【００２５】
その結果、基板表面に強く結合してＰＨＳに対する良溶媒に溶けなくなった薄くて均一なＰＨＳ膜の形成を実現することができた。
【００２６】
つまり、通常の濃度のＰＨＳ溶液を塗布し、その後、加熱を行うことでＰＨＳ分子と基板表面の水素結合形成を促進し、その後、基板を溶媒で洗浄することで基板表面の水素結合形成が促進された部分以外を洗い流すことができ、高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現できる可能性を見出した。すなわち、通常の濃度のＰＨＳ溶液を塗布することで、自然な流動性を利用して感度ムラを抑え得る塗布状態を得た後に、加熱による（１）溶媒の蒸発に伴う高濃度化の効果と（２）分子運動の活性化に伴う結合確率の向上の効果と、洗浄による均一な薄膜化の効果を、期待できるであろうという着眼点である。
【００２７】
本発明の発明者は、上記の着眼点に基づき実験的に効果を検証した結果、溶媒に溶解したＰＨＳを基板表面に均一に塗布し、加熱により溶媒を除去することで基板表面のＰＨＳ分子の濃度を均一に高めた後、さらに適宜加熱処理を行うことで、基板表面とＰＨＳの間の分子間力と水素結合による結合を促進させ、最後に溶剤で洗浄して基板表面と強く結合した均一な密度のＰＨＳ分子膜部分（固相合成層）のみを残した固相合成用基板が簡単なプロセスで製造可能であり、高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現できることを確認した。
【００２８】
すなわち、本発明は、ＯＨ基を多く含むポリマ溶液を塗布した後に、基板とポリマ間の結合を促進することを目的として加熱を行った後に、洗浄を実施するプロセスの順序を提供することで、ポリマに対する良溶媒に溶けないポリマ膜を基板表面に形成することができることに主たる特徴がある。したがって、加熱温度や加熱時間は、使用する材料や基板構造や加熱装置などに依存して、適宜設計・調整されるべきものであり、本発明の特段の限定事項ではない。
【００２９】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略及び簡略化がなされている。また、説明の明確化のため、必要に応じて重複説明は省略されている。尚、各図において同一の符号を付されたものは同様の要素を示しており、適宜、説明が省略されている。
【００３０】
はじめに、本実施の形態に係る固相合成用基板の製造方法について、図１及び図２を用いて説明する。図１は、本実施の形態に係る固相合成用基板の製造工程の流れを示したフローチャートである。また、図２は、本実施の形態に係る固相合成用基板の製造工程を示した断面図である。
【００３１】
まず、図１に示すように、ポリマ溶液２ａの調整を行う（Ｓ１０１）。本実施の形態では、固相合成層を形成するためのポリマ２１として、ヒドロキシ基（ＯＨ基）２２を有する有機物を用い、この有機物を溶媒に溶かしてポリマ溶液２ａとする。ＯＨ基２２を有する有機物には、例えば、ポリヒドトキシスチレン（ＰＨＳ）などを用いることができる。ポリマ溶液２ａの濃度は、その粘度が３０００ｍＰａ・ｓ（＝３０００ＣＰＳ）以下となるような濃度であればよいが、望ましくは１〜１０重量％とする。
【００３２】
ここでは、例えば、０．１３ｇのＰＨＳ（平均分子量２００００）に、４０ｍｌのアセトンを溶媒として加え、ＰＨＳが完全に溶けるまで攪拌する。なお、ここで用いる溶媒は、アセトンに限るものではないが、例えば、アセトニトリル、エタノール、テトラヒドロフラン（tetrahydrofuran：ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide：ＤＭＳＯ）など、ＰＨＳに対する良溶媒であることが望ましい。
【００３３】
次に、このようにして調整したポリマ溶液２ａの塗布を行う（Ｓ１０２）。すなわち、ポリマ溶液２ａであるＯＨ基２２を有する有機物の溶液を、基板１上に塗布する。本実施の形態では、ＳｉＯ２（石英）ウェハ、表面を熱酸化させたＳｉウェハ等の少なくとも表面にＳｉＯ２を有する基板１や、ガラス基板等の少なくとも表面にガラスを有する基板１を用いることができる。
【００３４】
ここでは、例えば、スピンコータを用いて、ＳｉＯ２ウェハからなる基板１上に、上記Ｓ１０１の工程にて調整を行ったＰＨＳ溶液をポリマ溶液２ａとして塗布する。塗布方法は、スピンコータを用いた方法に限らず、基板１をポリマ溶液２ａに浸して引き上げる方法や、刷毛などを用いて塗りつける、ポリマ溶液２ａをスプレーする、等の方法でも良い。これにより、図２（ａ）に示すように、ＯＨ基２２を有する有機物の溶液であるポリマ溶液２ａが基板１上に塗布される。
【００３５】
なお、ポリマ溶液２ａの塗布は、あらかじめ水酸化ナトリウム等の洗浄液で基板１の表面を洗浄処理してから行うことが好ましい。洗浄処理することによって、基板１表面にＯＨ基が導入され、基板１とポリマ溶液２ａとの間の結合を向上させることが可能である。なお、Ｏ２プラズマ処理やＵＶ照射処理を行い、基板１表面にＯＨ基を導入しても良い。
【００３６】
次に、ポリマ溶液２ａの乾燥を行う。まず、常温乾燥を行う（Ｓ１０３）。ポリマ溶液２ａが塗布された基板１を、室温で、例えば５分間乾燥させる。この工程で溶媒の蒸発が起こり、溶液中のポリマ濃度が上昇する。その後、図２（ｂ）に示すように、加熱処理３０を行う（Ｓ１０４）。この加熱処理３０により、ポリマ溶液２ａ中の溶媒が気化されるとともに、ポリマ２１と基板１との水素結合が促進され、基板表面とポリマ分子が結合した膜が形成される。具体的には、図３に示すポリマ（ポリヒドロキシスチレン）２１のＯＨ基２２と基板１表面に導入されたＯＨ基との水素結合が促進される。ここでは、上記Ｓ１０２の工程にてＰＨＳ溶液が塗布された基板１に対して、加熱処理３０として、例えば１３０℃の加熱温度で、１時間、ベークを行う。詳細については後述するが、この加熱処理３０における加熱温度は、固相合成層を形成するために用いるポリマ２１の種類に応じて、適宜、適切な温度を設定することができる。具体的には、加熱温度は、１００〜２００℃の範囲で、ポリマのガラス転移温度付近が望ましい。また、加熱時間は、１〜３時間が望ましい。これらの常温乾燥と加熱処理の工程によって、基板１上に塗布されたポリマ溶液２ａが乾燥する。以下、基板１上に塗布されたポリマ溶液２ａの乾燥状態のものを、ポリマ膜２ｂと呼ぶこととする。
【００３７】
加熱処理３０を行った後、図２（ｃ）に示すように、基板１上のポリマ膜２ｂを、ポリマに対する良溶媒で洗浄４０する（Ｓ１０５）。洗浄時間に関しては、基板１表面のポリマ膜２ｂが溶解し、薄膜のみが残るまで洗浄できる時間を適宜設定してよい。
【００３８】
この洗浄４０により、基板１と水素結合により結合されていないポリマ２１の分子間に良溶媒の分子が入り込み、ポリマ２１は溶媒中に溶解して洗い流され、図２（ｄ）に示すように、基板１と水素結合で結合されたポリマ２１からなる固相合成層２のみが残存する。この固相合成層２は、基板１表面と水素結合で強く結合した有機物分子膜部分で構成されているため、非常に薄く均一な層となる。すなわち、加熱処理３０によって、基板１表面との結合がポリマ２１同士の結合よりも強く起こった有機物分子膜部分が、洗浄４０後に固相合成層２として残存する。そのため、非常に薄くて、均一なポリマ２１の膜を固相合成層２として形成することができる。
【００３９】
ここでは、例えば、溶剤としてＴＨＦを用いて、ＰＨＳのポリマ膜２ｂを洗浄４０する。具体的には、ＴＨＦ内にポリマ膜２ｂが浸かるまで基板１を入れ、振とう機を使用して２０分間振とう洗浄を行う。その後、ＴＨＦを入れ替えて５分間超音波洗浄を行い、さらにＴＨＦを入れ替えて振とう洗浄を行う。なお、ここで用いる溶剤は、ＴＨＦに限るものではないが、例えば、アセトン、アセトニトリル、エタノール、ＤＭＳＯなど、ＰＨＳに対する良溶媒であることが望ましい。これにより、膜厚１５〜３０Å程度のＰＨＳ膜が残存し、固相合成層２が形成される。
【００４０】
その後、乾燥を行う（Ｓ１０６）。例えば、乾燥Ｎ２を基板１に吹き付ける（ブロワー）など、窒素雰囲気下で、基板１上に固相合成層２が積層された固相合成用基板１００を乾燥させる。これにより、図２（ｄ）に示す構成となる。以上の工程を経て、本実施の形態に係る固相合成用基板１００が完成する。
【００４１】
なお、本実施の形態では、これらの工程を経て固相合成用基板１００が完成するまでに要する時間は、２時間程度である。一方、シラン化により固相合成層を形成する従来技術の場合は、本実施の形態よりも処理工程が多く、より長い所要時間が必要となる。これは、具体的には次のような工程を経て固相合成層が形成されるためである。例えば、まず、ＮａＯＨ溶液中で２時間、基板を振とうさせながら反応させた後、精製水で洗浄し、恒温槽で乾燥させる。そして、シランカップリング剤として、例えばエポキシシラン溶液を用い、この溶液中に基板を２４時間入れて反応させる。その後、基板をエタノールで洗浄し、ブロワーで乾燥させ、１１０℃に３時間置く。さらに、基板を０．２Ｎ塩酸で３時間反応させた後、精製水で洗浄し、ブロワーで乾燥させる。そのため、従来技術では、完成までに３１時間程度かかってしまう。よって、本実施の形態の固相合成用基板１００の製造方法は、従来技術と比べて処理工程数が少なく、所要時間が短縮されるので、生産性を向上できる。また、酸、アルカリなどの反応促進用の試薬を必要としないため、反応残渣や、固相合成反応に影響する不純物等の発生を抑制できる。
【００４２】
なお、本実施の形態で形成された固相合成層２は、固相合成層２を構成する有機物であるＰＨＳに対する良溶媒のＴＨＦに浸けた状態で４８時間振とうしても溶解や剥離などを起こさず、ＴＨＦに溶解しない膜を形成していることを確認した。また、固相合成層２は基板表面に結合した非常に薄い膜として形成されるため、この手法は平面基板だけでなく、凹凸のある基板にも適用することができる。例えば、エッチングなどの微細加工技術によって作製される、１０ｎｍ〜５００μｍ前後の段差を持った凹凸形状の基板に対しても、表面の凹凸形状に沿った固相合成層２を形成することが可能となる。
【００４３】
このようにして形成された固相合成用基板１００は、基板１と、基板１上に形成され、加熱により促進された水素結合により基板１と結合された固相合成層２と、を備える。この固相合成用基板１００は、薄く、均一であるため、優れた感度と均一性を示すことができる。また、固相合成層２と基板１とが水素結合と分子間力とにより強固に結合されていることで、固相合成層２を構成するＰＨＳに対する良溶媒に４８時間以上浸漬しても溶解することのない優れた耐薬品性及び耐熱性を示すことができる。さらに、固相合成層２は、構造中に合成の起点となるＯＨ基２２を有するため、ＤＮＡ合成などの固相合成用基板１００として好適に利用することが可能である。
【００４４】
この固相合成用基板１００は、以下に具体的に示すＤＮＡの逐次合成のような、ＴＨＦやアセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＳＯなどの溶媒および試薬を用いた反応工程を繰り返し実施する場合においても、溶解、剥離などの変化を起こさず、ＤＮＡの固相合成用基板１００として用いるのに十分な耐薬品性を有する。
【００４５】
ここで、本実施の形態に係る固相合成用基板１００をＤＮＡ検出基板として用いる場合について説明する。この場合、例えば以下のようにＤＮＡの逐次合成を行うこととなる。
【００４６】
まず、５'末端がジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基で保護され、３'末端のＯＨ基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた１塩基目のヌクレオシドを準備する。なお、ヌクレオシドに含まれるアデニン（Ａ）及びシントシン（Ｃ）のアミノ基はベンゾイル基で保護されており、グアニン（Ｇ）のアミノ基はイソブチル基で保護されている。次に１塩基目のヌクレオシドを、固相合成用基板１００に滴下する。滴下によって、固相合成用基板１００のＯＨ基に１塩基目のヌクレオシドのリン酸シアノエチルアミダイト誘導体を塩基触媒等を用いて結合させる。
【００４７】
固相合成用基板１００の未反応のＯＨ基は、無水酢酸と１−メチルイミダゾール（テトラヒドロフラン溶液）で処理してアセチル化し、２塩基目以降のヌクレオシドとの結合を阻害させる。次に、１塩基目のヌクレオシドのＤＭＴｒ基を３％トリクロロ酢酸／ジクロロメタン酸性溶剤で脱保護し、ＯＨ基を１塩基目のヌクレオシドに導入する。
【００４８】
３'末端のＯＨ基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた２塩基目のヌクレオシドを固相合成用基板１００に滴下し、１塩基目のヌクレオシドの５'ＯＨ基に２塩基目のヌクレオシドのリン酸シアノエチルアミダイト誘導体を塩基触媒等を用いて縮合反応で結合させる。なお、１塩基目のヌクレオシドの未反応の５'ＯＨ基は、無水酢酸とテトラヒドロフラン溶液で処理してアセチル化し、キャッピングする。
【００４９】
縮合反応で生じた亜リン酸トリエステル結合は、ヨウ素と水（ピリジン含有テトラヒドロフラン溶液）で酸化し、より安定なリン酸トリエステル結合に変換させる。その後、２塩基目のＤＭＴｒ基を除去し、目的のＤＮＡ鎖長になるまでヌクレオシドホスホロアミダイトとの縮合反応を繰り返す。
【００５０】
ＤＮＡ伸長後、固相合成層２が浸るように固相合成用基板１００を５５℃でアンモニア（ＮＨ４ＯＨ）水等のアルカリ溶液に３０分間沈める、アルカリ溶液処理を行う。なお、ＮＨ４ＯＨ水の重量パーセント濃度は、調整時で４０％である。アルカリ溶液処理により、リン酸基に結合したシアノエチル保護基が脱離する。また、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）等の塩基が脱保護される。その後、固相合成用基板１００をＮＨ４ＯＨ水から取り出し、最後に、末端のＤＭＴｒ基を脱保護する。このような工程を経て、固相合成用基板１００上にＤＮＡが逐次合成され、ＤＮＡチップが完成する。
【００５１】
次に、本実施の形態の製造方法を用いて製造された固相合成用基板１００の特性について、各特性の評価結果を参照しながら説明を行う。
【００５２】
図４は、本実施の形態に係る固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップの蛍光強度を従来技術と比較して示したグラフである。
【００５３】
図４の評価では、まず、本実施の形態と従来技術の製造方法で固相合成層を形成したそれぞれ基板に対して、同一のＤＮＡ逐次合成工程により、２０ｍｅｒのキャプチャープローブＤＮＡを合成して、ＤＮＡチップを形成した。そして、蛍光標識を付けた、キャプチャープローブＤＮＡと相補的な配列を持つ合成オリゴＤＮＡをディテクションプローブＤＮＡとして、２．０〜２．０×１０−５ｍｏｌ／ｌの各濃度の溶液に調整したうえで、それぞれのＤＮＡチップに１時間ハイブリダイゼーションを行った。その後、ＤＮＡチップを洗浄し、表面の蛍光強度を測定した。なお、蛍光強度の測定はＡｘｏｎ社製のＧｅｎｅｐｉｘ４０００Ｂを用いて行った。本実施の形態と従来技術の製造方法の間で蛍光強度の比較を行うため、それぞれの基板に対して、ＤＮＡ逐次合成工程以降で全く同じ処理を行い、蛍光強度の測定条件も全て同一条件で実施した。
【００５４】
なお、本実施の形態として用いた固相合成用基板１００は、基板１として石英基板、ポリマ２１として平均分子量２００００のＰＨＳを用いて、前述の方法によって形成したものである。また、従来技術として用いた基板は、エポキシシランをシランカップリング剤として用いて、石英基板のシラン化を前述の方法により行ったシラン化基板である。
【００５５】
各ＤＮＡチップの蛍光強度の平均値を、ディテクションプローブＤＮＡのサンプル濃度に対してプロットした評価結果を図４に示す。この評価において、測定される蛍光強度が高いほど、キャプチャープローブＤＮＡとディテクションプローブＤＮＡのハイブリダイゼーションが多く起こっていることを示している。すなわち、測定される蛍光強度が高いほど、低濃度のディテクションプローブＤＮＡを検出でき、感度が高いＤＮＡチップであるといえる。
【００５６】
図４のグラフに示すように、本実施の形態の固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップは、従来技術のものと比較して、いずれのサンプル濃度でも高い蛍光強度が測定されていることが明らかである。この結果により、本実施の固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップが高感度となるための条件は、従来技術のものと比べて約１００倍という、高い感度を示すことが分かった。ＤＮＡチップは、ＤＮＡチップ表面に配置されたディテクションプローブＤＮＡの単位面積あたりの密度が高いこと、ディテクションプローブＤＮＡとキャプチャープローブＤＮＡのハイブリダイゼーション反応が促進されやすいことなどが、高感度となるための条件である。ＤＮＡチップのハイブリダイゼーションは、基板表面とディテクションプローブＤＮＡの距離が適度に離れている時にハイブリダイゼーションの効率が高まることが知られている。本実施の形態の固相合成層２は、従来技術と比較してその分子量の大きさから、基板１表面とディテクションプローブＤＮＡの距離を適度に離すことが可能である。従って、ハイブリダイゼーションの効率を大幅に高めることができ、従来技術よりも感度を向上させることができる。
【００５７】
また、図５は、本実施の形態に係る固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップの蛍光強度の均一性を従来技術と比較して示す写真である。図５（ａ）は、本実施の形態の固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップ、図５（ｂ）は、従来技術のシラン化基板を用いたＤＮＡチップの観察結果をそれぞれ示している。また、図６は、本実施の形態に係る固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップの蛍光強度の均一性を従来技術と比較して示したグラフである。図６（ａ）は、本実施の形態の固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップにおける、第４列（図５（ａ）のVIA−VIAで示す列）の９つのスポットの蛍光強度をそれぞれ示している。図６（ｂ）は、従来技術のシラン化基板を用いたＤＮＡチップにおける、第４列（図６（ａ）のVIB−VIBで示す列）の９つのスポットの蛍光強度をそれぞれ示している。
【００５８】
図５及び図６の評価では、図４の評価の際と同様に、まず、本実施の形態と従来技術の製造方法で固相合成層を形成したそれぞれ基板で、ＤＮＡチップを形成した。そして、図４の評価の際と同様に、それぞれのＤＮＡチップに１時間ハイブリダイゼーションを行った。但し、ハイブリダイゼーションに用いたディテクションプローブＤＮＡ溶液の濃度は、０．２ｍｏｌ／ｌのものとした。なお、本実施の形態として用いた固相合成用基板１００と、従来技術として用いたシラン化基板は、図４の評価と同様に用意されたものである。なお、本評価では、蛍光強度のバラつきを比較する目的のため、双方の蛍光強度の最大値が同等になるようにＧｅｎｅｐｉｘ４０００ＢのＰｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ−ｔｕｂｅ−ｇａｉｎを調整して測定を行った。
【００５９】
図５及び図６に示すように、本実施の形態の固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップは、従来技術のものでは、スポット間の蛍光強度に約２倍の差が生じているのと比べて、スポット間の蛍光強度にバラつきが少なく、安定した蛍光強度が得られていることが確認できる。これは、本実施の形態の固相合成層２が、薄く、均一で、その表面における官能基（ＯＨ基２２）の密度ばらつきが少ないという特徴を有しているためである。従って、均一な密度でＤＮＡの固相合成を行うことが可能で、従来技術よりも感度の均一性を向上させることができる。
【００６０】
図７は、本実施の形態に係る固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップにおいて、ハイブリダイゼーション時間を変化させたときの蛍光強度の変化を示す写真である。同様に、図８は、従来技術に係るシラン化基板を用いたＤＮＡチップにおいて、ハイブリダイゼーション時間を変化させたときの蛍光強度の変化を示す写真である。図７（ａ）及び図８（ａ）は１時間のハイブリダイゼーション、図７（ｂ）及び図８（ｂ）は４８時間のハイブリダイゼーションを行ったときの蛍光強度の観察結果をそれぞれ示している。また、図９は、本実施の形態に係る固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップのハイブリダイゼーション時間に対する蛍光強度の変化を、従来技術と比較して示したグラフである。図９では、各ＤＮＡチップの蛍光強度の平均値を、ハイブリダイゼーション時間に対してプロットした評価結果が示されている。
【００６１】
図７〜図９の評価では、図４〜図６の評価の際と同様に、まず、本実施の形態と従来技術の製造方法で固相合成層を形成したそれぞれ基板で、ＤＮＡチップを形成した。そして、図５及び図６の評価の際と同様に、濃度０．２ｍｏｌ／ｌのディテクションプローブＤＮＡ溶液を用いて、それぞれのＤＮＡチップに１時間ハイブリダイゼーションを行い、表面の蛍光強度をＡｘｏｎ社製のＧｅｎｅｐｉｘ４０００Ｂを用いて測定した。その後、ＤＮＡチップをディテクションプローブＤＮＡ溶液に戻し、さらに追加で４７時間ハイブリダイゼーションを行い、再度、表面の蛍光強度を測定した。なお、本実施の形態として用いた固相合成用基板１００と、従来技術として用いたシラン化基板は、図４〜図６の評価と同様に用意されたものである。
【００６２】
図８に示すように、従来技術のシラン化基板を用いたＤＮＡチップは、４８時間後にはキャプチャープローブＤＮＡが表面から完全に脱落（剥離）し、蛍光強度が観察できないほどである。そのため、従来技術では、図９に示すように、４８時間後の蛍光強度が１時間後よりも大幅に低下し、耐薬品性に劣るということが確認できる。一方、本実施の形態の固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップでは、図７及び図９に示すように、４８時間後もキャプチャープローブＤＮＡが表面に残っており、１時間後とほぼ同等の蛍光強度を維持している。これは、固相合成層２と基板１とが水素結合と分子間力とにより強固に結合されていることで、ハイブリダイゼーションに用いられる各種試薬により溶解、剥離されることなく、キャプチャープローブＤＮＡを基板上に保持し続けることができるためである。従って、本実施の形態の固相合成用基板１００は、高い耐久性を実現することが可能で、従来技術よりも耐薬品性を向上させることができる。
【００６３】
このように、本実施の形態の固相合成用基板１００を用いると、感度が高く、均一で、耐薬品性の高いＤＮＡチップを製造することができ、ＤＮＡチップ用基板として優れた性能を有する。
【００６４】
また、図１０は、本実施の形態に係る固相合成用基板１００を用いたＤＮＡチップの蛍光強度について、加熱処理３０の温度条件を変化させて固相合成用基板１００を形成したときの変化を示すグラフである。
【００６５】
図１０の評価では、基板１として石英基板、ポリマ２１として平均分子量２００００のＰＨＳを用いて、前述の方法によって固相合成用基板１００を形成した。但し、固相合成用基板１００を形成する際、基板１上に塗布されたポリマ溶液２ａに対して行う加熱処理３０を、９５℃、１３０℃、２００℃の加熱温度でそれぞれ実施した。その後、それぞれの基板に対して、同一のＤＮＡ逐次合成工程により、２０ｍｅｒのキャプチャープローブＤＮＡを合成して、ＤＮＡチップを形成した。そして、蛍光標識を付けた、キャプチャープローブＤＮＡと相補的な配列を持つ合成オリゴＤＮＡをディテクションプローブＤＮＡとして、０．２ｍｏｌ／ｌの濃度の溶液に調整したうえで、それぞれのＤＮＡチップに７２時間ハイブリダイゼーションを行った。その後、ＤＮＡチップを洗浄し、表面の蛍光強度を測定した。
【００６６】
図１０に示すように、加熱温度１３０℃で最も高い蛍光強度が得られることが分かる。なお、加熱温度２００℃に関しては、形成される固相合成層２の厚さにバラつきが生じ、ＤＮＡチップとした際に蛍光強度が安定しなかった。この結果から、ポリマの薄膜形成に適した加熱温度が存在することが確認された。適切な加熱温度は使用するポリマ２１の種類や、基板１表面の組成や形状により異なる。これらの組み合わせに応じて、加熱処理３０の加熱温度を適宜調整することが望ましい。なお、固相合成層２を形成するためのポリマ２１として平均分子量２００００のＰＨＳを使用する場合は、図１０の結果から、加熱処理３０を６０℃〜１８０℃、検出感度の観点からより好適には、１００℃〜１６０℃で行うことが好ましい。
【００６７】
以上のように、本実施の形態では、基板１上にＯＨ基２２を有する有機物の溶液をポリマ溶液２ａとして塗布し、このポリマ溶液２ａが塗布された基板１を加熱処理３０した後に、この基板１を溶剤で洗浄４０することによって、固相合成層２を形成する。これにより、基板１と強固に結合された、薄くて均一な固相合成層２を、比較的簡易な処理工程で形成することができる。従って、本実施の形態によれば、製造の簡易性は維持しつつ高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することが可能な固相合成用基板１００の製造方法、及び高感度かつ均一な感度特性と耐薬品性を実現することが可能な固相合成用基板１００を提供することができる。
【００６８】
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。上記実施の形態では、固相合成層２を形成するためのポリマ２１として、平均分子量２００００のＰＨＳを用いた場合について例示的に説明を行ったが、ポリマ２１の種類はこれに限るものではない。例えば、平均分子量８０００以上のＰＨＳや、ヒドロキシスチレンユニットが全体の５０〜９９％の割合で含まれる、平均分子量が８０００以上のポリマーを用いてもよい。平均分子量は、８０００未満では蛍光が弱いため、感度の観点から８０００以上が好ましい。一方、流動性の観点から、平均分子量は５０００００以下が望ましい。これらの他、ＯＨ基２２を有する有機物であれば固相合成層２を形成するためのポリマ２１として好適に用いることができる。
【００６９】
また、少なくとも表面にＳｉＯ２又はガラスを有する基板１を用いるとして例示的に説明を行ったが、固相合成層２と水素結合で結合可能な基板１はこれらに限定されるものではない。
【００７０】
例えば、表面にＳｉＯ２又はガラスを有する基板に、シランカップリング剤等を用いてエポキシ基、ヒドロキシル基、ジオール基を導入した基板を、基板１として用いてもよい。また、表面にＳｉＯ２又はガラスを有する基板に、シランカップリング剤を用いて表面にカルボキシル基、エステル基、エーテル基、アミノ基、チオール基、シアノ基、ピリジル基、イミノ基、ヒドロキシ基、アミド基、スルホン酸基、リン酸基を導入した基板１を用いてもよい。すなわち、基板１上に、シランカップリング剤で１次処理を行い、この１次処理後の基板に対して本実施の形態の製造方法を適用して固相合成層２を形成してもよい。これにより、基板１と固相合成層２とを強固に結合させることができる。なお、基板１として金属基板、金属酸化物基板、樹脂基板を用いても良い。
【００７１】
あるいは、基板１は、表面にヒドロキシル基、ジオール基、カルボキシル基、エステル基、エーテル基、アミノ基、チオール基、シアノ基、ピリジル基、イミノ基、ヒドロキシ基、アミド基、スルホン酸基、リン酸基などを有する、金属基板、金属酸化物や樹脂基板であってもよい。これらの基板を用いても、上記実施の形態と同様に、固相合成層２と水素結合で結合が可能である。
【００７２】
また、上記実施の形態では、固相合成用基板１００は、ＤＮＡ検出用基板であるとして例示的に説明を行ったが、合成する物質はＤＮＡ以外、例えばペプチド合成、ポリマ合成、その他の有機合成でもよい。また、基板１の形状は、平板状のものに限らず、流路、ナノワイヤ、ビーズ、ポーラス構造などでもよい。従って、ＤＮＡチップ以外のデバイス、分析器、カラムなど、様々な固相合成用の担体として利用できる。
【００７３】
本発明は、ポリマ２１と基板１が水素結合（分子間力）により結合するものについて、実験的に感度に関する効果を確認している。また加熱という簡易な方法でプロセス時間を短縮できるという意味でも簡易製造性を犠牲にすることもない。さらに、実験的には耐薬品性の向上という点についても、効果を確認できている。実験では、加熱温度が１３０℃で良好な結果を得ており、これ以上に過度に高い温度（具体的には２００℃）では感度のばらつきが発生することから、適正な温度範囲で加熱する必要があることも確認している。また、言うまでもなく過度に低い温度（具体的には９５℃）では加熱効果が低下するため、やはり同様に適正な温度範囲で加熱する必要がある。これについては、前述したように、適宜設計・調整すればよい。なお、上記の加熱の工程を入れるプロセスは、結合を促進させるものであり、選ばれる材料などによってはその効果の程度に差が現れるが、そのことにより本発明の価値が否定されるものではない。
【符号の説明】
【００７４】
１  基板、
２  固相合成層、
２ａ  ポリマ溶液、
２ｂ  ポリマ膜、
２１  ポリマ、
２２  ＯＨ基、
３０  加熱処理、
４０  洗浄、
１００  固相合成用基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
2010233490.tif 000009
【図５】
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【図７】
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【図８】
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