(57)【要約】【課題】  ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔである抗癌剤は効果を示す癌と示さない癌がはっきりと分かれていることがわかっていた。しかし、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔである抗癌剤に対する感受性を事前に予測することは不可能であった。従って、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔである抗癌剤に対して、簡便かつ確実な、感受性の判定方法の提供が強く望まれていた。【解決手段】  ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔである抗癌剤に対する感受性がある細胞とない細胞の間でその遺伝子発現量に有意な差（Ｐ＜１．０×１０-5）がある２６６種の遺伝子を用いた階層的クラスター解析より、前記化合物に対して感受性を有する癌と、非感受性の癌を明確に識別し、前記化合物による治療効果の予測を提供する。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２６６で表される遺伝子２６６種からなる遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含む、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、又は薬理学的に許容できるその塩に対する癌細胞の感受性の判定方法。
【請求項２】
化合物が（５Ｓ，７Ｓ）−７−メチル−３−（３−トリフルオロメチルフェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロシンノリン−５−オール、２−（４−アミノ−３−メチルフェニル）−５−フルオロベンゾチアゾール、(５−アミノ−２，３−フルオロフェニル)−６，８−ジフルオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン又はこれらの薬理学的に許容できるその塩である請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
遺伝子群が配列番号１〜２５で表される遺伝子２５種からなる遺伝子群である請求項１又は請求項２に記載のＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、又は薬理学的に許容できるその塩に対する癌細胞の感受性の判定方法。
【請求項４】
癌細胞が乳癌細胞、肝癌細胞又は卵巣癌細胞である請求項１ないしは請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項３に記載の２５種の遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子が固定されたＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、又は薬理学的に許容できるその塩に対する癌細胞の感受性を判定するためのマイクロアレイ。
【請求項６】
請求項５に記載のマイクロアレイを含む、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、乃至は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の判定方法に用いられるキット。
【請求項７】
請求項１の遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の発現量を測定するためのプライマーセット。
【請求項８】
請求項１の遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の細胞内タンパク質量を定量するための抗体セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗腫瘍活性を示す化合物に対する原発癌組織の感受性を予測するための遺伝子セットによる感受性の判定方法に関する。本発明の判定方法は、癌患者の前記化合物若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩による治療効果を判定する場合等に有用である。
【背景技術】
【０００２】
日本における女性乳がん罹患数は顕著に増加し、１９９８年には胃癌を抜いて女性がんのトップとなっている。罹患数は２００５年で４１５００人、２０１０年で４５６００人、２０１５年時点で４８５００人と今後も増加することが予想されている。乳がんの薬物治療としては術前化学療法、術後補助療法及び再発乳癌に対する薬物療法が行われる。その中でもエストロゲンレセプター陽性〔ＥＲ（＋）〕患者は、抗ホルモン剤治療の適応となっているが、そのうちの半数（全乳癌患者の約３割）にしか有効でないことから、より広いスペクトルを持つ乳癌治療薬が望まれていた。
【０００３】
そのような状況の中、（５Ｓ，７Ｓ）−７−メチル−３−（３−トリフルオロメチルフェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロシンノリン−５−オール（以下１５０４６０という）が、既存内分泌療法剤に反応しないＥＲ（＋）乳癌細胞や、抗エストロゲン剤治療で再発した乳癌細胞、更に一部のＥＲ（−）乳癌細胞に対して広い抗腫瘍効果スペクトラムを示すことが明らかとなった（特許文献１）。また、１５０４６０にコハク酸を付加して溶解性を向上させたプロドラッグ（以下１５０４６０−Ｐという）も開発されている（特許文献２）。このプロドラッグは生体内の加水分解酵素の働きにより１５０４６０を生成すると推定されている。
【０００４】
１５０４６０と同様の抗腫瘍スペクトルを示す化合物として、２−（４−アミノ−３−メチルフェニル）−５−フルオロベンゾチアゾール（以下５Ｆ−２０３という）が見出されている（図１）。５Ｆ−２０３は、アリルハイドロカーボン受容体アゴニスト（以下ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔという）として作用し、下流遺伝子であるＣＹＰ１Ａ１を誘導する。さらにその抗腫瘍効果にそのＣＹＰ１Ａ１活性が必要であることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。ＣＹＰの分子種は各組織に発現しているが、特に肝臓に多く発現しており、その役割として体内に入り込んできた低分子を水酸化し、親水性を増すことで異物の体外排出を促進すると考えられている。また一方で、一部の薬物の活性化にも関与して、薬効に寄与することが一般的に知られている。また、５Ｆ−２０３と同様の機構で作用する化合物として、(５−アミノ−２，３−フルオロフェニル)−６，８−ジフルオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（以下ＮＳＣ６８６２８８という）なども見出されている（非特許文献３）。さらに、ＡｈＲの下流には、ＣＹＰ１Ａ２やＣＹＰ１Ｂ１といった分子種も存在し、薬剤代謝に関わることが知られている。従って、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔとして作用し、ＣＹＰ１Ａ２やＣＹＰ１Ｂ１によって活性化されて抗腫瘍効果を示す化合物も、１５０４６０や５Ｆ−２０３、ＮＳＣ６８６２８８が効果を示す細胞と同様の細胞に作用すると考えられる。
【０００５】
５Ｆ−２０３については、３種類の感受性乳癌であるＢＧ１、ＺＲ−７５−１及びＭＣＦ−７、また非感受性の乳癌であるＨｓ０５７８Ｔ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を用いて、ＳＡＧＥ  ライブラリで各遺伝子の発現頻度について解析し、更に定量的ＰＣＲによって確認した感受性細胞と非感受性細胞間で発現量に有意差のある遺伝子についての報告がなされている（非特許文献４）。しかしながら、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔ作用を持つ抗癌剤の効果を確実に予見できるものではなかった。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５２８６６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／１２１１０５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００１／０１４３５４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第１９９６／０２４５９２号パンフレット
【非特許文献１】Ｌｏａｉｚａ−Ｐ▲ｅ▼ｒｅｚ  ＡＩ，Ｔｒａｐａｎｉ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１（１）：１３−１９（２００２）
【非特許文献２】Ｌｏａｉｚａ−Ｐ▲ｅ▼ｒｅｚ  ＡＩ，Ｋｅｎｎｅｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３（６）：７１５−７２５（２００４）
【非特許文献３】Ｋｕｆｆｅｌ  ＭＪ，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ＪＣ，Ｐｏｂｓｔ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２（１）：１４３−１５３（２００２）
【非特許文献４】Ｗａｌｌｑｖｉｓｔ  Ａ，Ｃｏｎｎｅｌｌｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９（３）：７３７−７４８．（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔである抗癌剤を患者に投与する場合、薬剤投与の前に感受性の有無を判別する手法はなく大きな問題となっていた。培養癌細胞株の研究から、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔである抗癌剤は効果を示す細胞と示さない細胞がはっきりと分かれており（図１）、効果を示さない患者への投与を避けるため、事前の診断法の確立が強く望まれていた。
【０００８】
本発明の目的は、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔである抗癌剤に対しての簡便かつ確実な、癌細胞の感受性の判定方法を提供することである。すなわちＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔである抗癌剤が、治療に有効か否かを、予測する方法を提供することである。
【０００９】
本願発明者らは、癌細胞における特定の遺伝子の発現量を測定することによって、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を有する化合物の癌細胞に対する感受性の有無が明確に区別されることを見出した。更に１５０４６０の感受性が不明なヒト乳癌由来のヌードラット皮下移植腫瘍のクラスター解析を行うことで感受性を判定出来ることを証明し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１〜２６６で表される遺伝子２６６種からなる遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含む、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、又は薬理学的に許容できるその塩に対する癌細胞の感受性の判定方法、
（２）化合物が（５Ｓ，７Ｓ）−７−メチル−３−（３−トリフルオロメチルフェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロシンノリン−５−オール、２−（４−アミノ−３−メチルフェニル）−５−フルオロベンゾチアゾール、(５−アミノ−２，３−フルオロフェニル)−６，８−ジフルオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン又はこれらの薬理学的に許容できるその塩である前記（１）に記載の判定方法、
（３）遺伝子群が配列番号１〜２５で表される遺伝子２５種からなる遺伝子群である前記（１）又は（２）に記載のＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、又は薬理学的に許容できるその塩に対する癌細胞の感受性の判定方法、
（４）癌細胞が乳癌細胞、肝癌細胞又は卵巣癌細胞である前記（１）ないしは（３）のいずれか一項に記載の方法、
（５）前記（３）に記載の２５種の遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子全長またはその部分配列と相補的なオリゴＤＮＡが固定された、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、又は薬理学的に許容できるその塩に対する癌細胞の感受性を判定するためのマイクロアレイ、
（６）前記（５）に記載のマイクロアレイを含む、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物その誘導体、乃至は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の判定方法に用いられるキット、
（７）前記（１）に記載の遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の発現量を測定するためのプライマーセット、
（８）前記（１）に記載の遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の細胞内タンパク質量を定量するための抗体セット、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
癌患者から分離された癌組織から抽出したｍＲＮＡを用いて、その遺伝子発現様式から感受性細胞及び非感受性細胞との遺伝子発現様式を比較することで、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物に対する感受性を予測することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】１５０４６０と５Ｆ−２０３の乳癌における作用スペクトラムが一致することを示す図である。
【図２】１５０４６０感受性乳癌においてＣＹＰ１Ａ１ｍＲＮＡが誘導され、非感受性乳癌においては誘導されないことを示す図である。
【図３】１５０４６０感受性乳癌においてＣＹＰ１Ａ１蛋白質が誘導され、非感受性乳癌においては誘導されないことを示す図である。
【図４】１５０４６０感受性乳癌ＳＫ−ＢＲ−３においてＡｈＲならびにＣＹＰ１Ａ１をノックダウンすることによって、１５０４６０の細胞増殖抑制効果がキャンセルされることを示す図である。０、２、１０μＭの１５０４６０を処理し、４８時間培養を行った後の各群の細胞数を、１５０４６０無処理群の細胞数を１００として相対標記した。
【図５】１５０４６０が肝癌細胞株に増殖抑制効果を示す図である。
【図６】本発明において選択された２６６種の遺伝子のうち３０種を示す。感受性細胞、非感受性細胞のいずれに発現が多いかについても合わせて記載した。
【図７】本発明において選択された２６６種の遺伝子のうち３０種を示す。感受性細胞、非感受性細胞のいずれに発現が多いかについても合わせて記載した。
【図８】本発明において選択された２６６種の遺伝子のうち３０種を示す。感受性細胞、非感受性細胞のいずれに発現が多いかについても合わせて記載した。
【図９】本発明において選択された２６６種の遺伝子のうち３０種を示す。感受性細胞、非感受性細胞のいずれに発現が多いかについても合わせて記載した。
【図１０】本発明において選択された２６６種の遺伝子のうち３０種を示す。感受性細胞、非感受性細胞のいずれに発現が多いかについても合わせて記載した。
【図１１】本発明において選択された２６６種の遺伝子のうち３０種を示す。感受性細胞、非感受性細胞のいずれに発現が多いかについても合わせて記載した。
【図１２】本発明において選択された２６６種の遺伝子のうち３０種を示す。感受性細胞、非感受性細胞のいずれに発現が多いかについても合わせて記載した。
【図１３】本発明において選択された２６６種の遺伝子のうち３０種を示す。感受性細胞、非感受性細胞のいずれに発現が多いかについても合わせて記載した。
【図１４】本発明において選択された２６６種の遺伝子のうち２６種を示す。感受性細胞、非感受性細胞のいずれに発現が多いかについても合わせて記載した。
【図１５】１５０４６０の感受性細胞と非感受性細胞が、任意に選択した２５種類の遺伝子によるクラスター解析で明確に分けることができることを示す図である。
【図１６】任意に選択した２５種類の遺伝子によるクラスター解析で感受性の不明なヌードラット皮下移植ヒト乳癌細胞ＫＰＬ−１が感受性細胞であると示唆されることを示す図である。
【図１７】ヌードラット皮下に移植したヒト乳癌細胞ＫＰＬ−１が１５０４６０に感受性を示す図である。横軸に投与開始日からの日数、縦軸に相対腫瘍体積を示す。コントロール群を◆のシンボル、１５０４６０−Ｐ  ６０ｍｇ／ｋｇ  ２８日間連続経口投与群を■のシンボル、１５０４６０−Ｐ  ３０ｍｇ／ｋｇ  ２８日間連続経口投与群を▲のシンボル、１５０４６０−Ｐ  １５ｍｇ／ｋｇ  ２８日間連続経口投与群を●のシンボルで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
各種細胞の３万種類以上の遺伝子に対するＤＮＡマイクロアレイ解析の結果、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであってＣＹＰ１Ａ１により活性化される化合物に感受性のある細胞と感受性のない細胞において、発現量に統計学的な有意差（Ｐ＜１．０×１０-5）が存在する遺伝子が２６６種あることが明らかとなった。感受性の判定においては、癌患者から分離された癌組織から抽出したｍＲＮＡの発現量を遺伝子チップ等の手段を用いて解析する。次いで、前記２６６種の遺伝子から任意に選ばれた２０以上の遺伝子の発現量に基づいて、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物に対する癌細胞の感受性を判定する。
【００１４】
これら２６６種の遺伝子の中から任意の遺伝子の発現量を測定することで、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであってＣＹＰ１Ａ１により活性化される化合物に対する感受性を判定することができる。さらに、２６６種の遺伝子から任意に選ばれた２０以上の遺伝子の発現量だけでも、感受性の判定が可能である。以下に本発明の詳細を述べる。
【００１５】
本発明で用いられる２６６種の遺伝子は以下の方法により得られる。なお、ここで、「発現量」とは絶対量である必要はなく相対量でよい。また、必ずしも数値的に表現される必要はなく、例えば、標識に蛍光標識等の可視的な標識を用いて目視により判定する場合等も「発現量の測定」にあたる。
【００１６】
−ＤＮＡマイクロアレイの作製−
合成ＤＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイを作製する。なお、ＤＮＡマイクロアレイとは、シリコン基板やスライドガラス上に目的遺伝子の部分配列からなる一本鎖オリゴＤＮＡを固定したものであり、ＤＮＡチップと呼ばれることもある。固定される一本鎖オリゴＤＮＡ配列と相補的な遺伝子の発現量を網羅的に解析するためのツールとして用いられており、１から数十万の遺伝子発現量を一度に解析することが可能となっている。また、ここでいう合成ＤＮＡとは、既知の遺伝子に相補的な一本鎖オリゴＤＮＡであり、細胞内の遺伝子発現量を測定するために用いる。合成ＤＮＡとしては、例えば２５〜１００塩基長の長さのものが用いられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。マイクロアレイの作製方法としては、例えば合成ＤＮＡをアレイヤーを用いてスライドガラス上にスポットした後、気相恒温器内にて８０℃で１時間静置した状態で保温し、更にＵＶクロスリンカーを用いて１２０ｍＪの紫外線を照射し、スポットした合成ＤＮＡをスライドガラス表面に固定化して作製する、などの方法が挙げられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００１７】
−全ＲＮＡの抽出−
次いで、癌細胞から全ＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡの抽出は例えば、（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｍａｃｋｅｙ，Ｋ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９（６）：９４２−９４５（１９９５））に記載の方法に従って行うことができるが、これに限られるものではない。本発明において全ＲＮＡを抽出する癌細胞としては、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであってＣＹＰ１Ａ１により活性化される化合物に対して感受性を有する細胞と感受性を持たない細胞をそれぞれ１種以上選択する必要がある。ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであってＣＹＰ１Ａ１により活性化される化合物に対して感受性を有する癌細胞としては、例えば、ＨＣＣ１４１９、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、Ｒ２７、ＺＲ−７５−１、ＣＡＭＡ１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ−７５−３０、Ｔ−４７Ｄ及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８などの乳癌細胞、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ等の肝癌細胞などを挙げることができる。ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであってＣＹＰ１Ａ１により活性化される化合物に対して感受性を持たない細胞としては、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４ＩＶ、ＵＡＣＣ８１２、Ｈｓ０５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ及びＨＣＣ１９３７等の乳癌細胞、ＳＫ−Ｈｅｐ−１、ＨＬＦ、ＨＬＥ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＬｉ７等の肝癌細胞、ＡｄｒＲ等の卵巣癌細胞を挙げることができる。しかし、ここに挙げられた癌細胞に限定されるものではない。
【００１８】
−検体用ｍＲＮＡの精製−
癌細胞から抽出された全ＲＮＡからの検体用ｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製方法・条件に限定はないが、例えば、（Ｇｏｓｓ  ＴＡ，Ｂａｒｄ  Ｍ，Ｊａｒｒｅｔｔ  ＨＷ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５８８（１−２）：１５７−１６４（１９９１））に記載の精製方法等が挙げられる。
【００１９】
−標識ｃＤＮＡの作製−
得られた検体用ｍＲＮＡを鋳型として、任意の標識分子をつけた核酸を用いることで、標識ｃＤＮＡを作製することができる。標識分子としては、例えばＣｙａｎｉｎｅ  ５−  ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｃｙ５−ｄＵＴＰ）、Ｃｙａｎｉｎｅ  ３−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｃｙ３−ｄＵＴＰ）等を本発明においては用いることができる。標識ｃＤＮＡの作成方法・条件は、例えば（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３３（３）：６２０−６３０（２００２））に記載の方法に従って行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
−ハイブリダイゼーション−
得られた標識ｃＤＮＡを検出用プローブとして、作製したＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイゼーションする。これによって、サンプル中に含まれる標識ｃＤＮＡがＤＮＡマイクロアレイ上の相補的なオリゴＤＮＡと特異的に水素結合する。続いて、洗浄操作によって、ＤＮＡマイクロアレイ上のオリゴＤＮＡと特異的にハイブリダイズした標識ｃＤＮＡ以外を除去する。ハイブリダイゼーション操作、洗浄操作の条件は適宜決定されるものであるが、例えば、（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０（５２３５）：４６７−４７０（１９９５））に記載の方法に従って行うことができる。
【００２１】
−遺伝子発現量の測定−
ハイブリダイゼーション操作、洗浄操作を行った後、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定された各合成ＤＮＡと結合した標識ｃＤＮＡの蛍光強度を測定することで、各遺伝子の発現量を見積もることができる。また、１または複数からなる任意の細胞をコントロール細胞とすることで、目的の細胞中の相対的な遺伝子発現量を算出することができる。
【００２２】
−統計学的処理−
各遺伝子の遺伝子発現量を統計学的処理により解析し、感受性細胞群と非感受性細胞群で有意に発現量の差がある遺伝子を抽出する。統計学的処理の方法としては、スチューデントのｔ検定法を用い、統計学的な有意差のあるものを本発明の判定方法において用いる。ここでいう統計学的な有意差とは、感受性群と非感受性群との間で、Ｐ＜１．０×１０-5であるものであり、本発明においてはＰ＜１．０×１０-7のものが好ましく、更にはＰ＜１．０×１０-9が好ましい。
【００２３】
−感受性の判定方法−
癌患者から手術、またはバイオプシー等により採取された癌細胞中における前記遺伝子のうち少なくとも１種以上の発現量を測定する。測定する遺伝子の数は１以上であればいくつでもよく、また、前記２６６種の遺伝子のいずれかであればよい。中でも前記遺伝子のうち配列番号１〜３０のいずれか１以上の遺伝子の発現量を用いることが好ましい。これらのうち、２０種以上の遺伝子の発現量を測定することがさらに好ましい。
【００２４】
細胞中の各遺伝子の発現量は、細胞中の各遺伝子のｍＲＮＡ量を測定することにより測定することができ、ｍＲＮＡ量の測定は周知の方法により行うことができる。例えば、本発明の判定方法で用いられるいずれかの遺伝子と相補的なオリゴＤＮＡを固定化したＤＮＡマイクロアレイを作製する。一方、検体のｍＲＮＡを元に、前記標識ｃＤＮＡの作製と同様の方法で、標識ｃＤＮＡを合成する。得られた標識ｃＤＮＡを前記ＤＮＡマイクロアレイと反応させ、標識ｃＤＮＡとＤＮＡマイクロアレイ上のオリゴＤＮＡとをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後洗浄し、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポットの標識量を測定することにより遺伝子の発現量を測定することができる。なお、検体中の各遺伝子の発現量を測定する方法は、この方法に限定されるものではなく、遺伝子の発現量を測定できる方法であれば他のいずれの方法をも採用することができる。例えば、リアルタイム検出逆転写ＰＣＲ法やノーザンブロット法等によっても検体中の各ＲＮＡを測定することが可能である。好ましい様態としては、検体から調製した標識ｃＤＮＡを、マイクロアレイ上に固定化された各オリゴＤＮＡとハイブリダイズさせてその標識量を測定する方法が挙げられる。
【００２５】
次に、測定された検体の各遺伝子の発現量を、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであってＣＹＰ１Ａ１により活性化される化合物に対する感受性を有する細胞及び有さない細胞における前記各遺伝子の発現量と比較する。感受性を有する細胞及び有さない細胞は、培養癌細胞株でも良いし、既知の応答者及び非応答者由来の検体でもよい。
【００２６】
感受性を有する細胞及び有さない細胞におけるこれら遺伝子の発現量を指標に各検体を階層的にクラスタリングすることができる。階層的クラスター解析は、「ｃｌｕｓｔｅｒ」や「ｔｒｅｅｖｉｅｗ」などのソフトウェアを用いて行うことができる。感受性群と非感受性群で発現量の有意差が十分高い遺伝子発現量を指標にして構築されるクラスターは感受性細胞群と非感受性細胞群に明瞭に区別できる。そのため、感受性を判定したいサンプルをさらに加えた階層的クラスター解析を行って、サンプルが感受性細胞群のクラスターに分布するか非感受性細胞群のクラスターに分布するか判別することによって、サンプルの薬剤感受性を判定することができる。
【００２７】
上記の方法により、検体がＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物に対する感受性を有するか否か、すなわち、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物による治療の応答者であるか非応答者であるかを判定することができる。
【００２８】
なお、上記した本発明の方法により、感受性を判定できる化合物はＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍効果を示すものであれば限定されないが、具体例としては（５Ｓ，７Ｓ）−７−メチル−３−（３−トリフルオロメチルフェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロシンノリン−５−オール（１５０４６０）、２−（４−アミノ−３−メチルフェニル）−５−フルオロベンゾチアゾール（５Ｆ−２０３）又は(５−アミノ−２，３−フルオロフェニル)−６，８−ジフルオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（ＮＳＣ６８６２８８）等が挙げられる。なお、本発明においては、ＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであってＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２またはＣＹＰ１Ｂ１により活性化される化合物と同一の作用機序・作用効果を有する化合物及びそれらの誘導体、乃至は薬理学的に許容できるその塩等であればいずれも本発明の判定方法によって、感受性を判定でき、治療効果を予測することができる。ここで、誘導体とは、ある化合物を構成する一つ又は複数の任意の置換基が、任意の異なる置換基または原子で置換された化合物であって、同様の性質の薬効を示すものである。ここで置換基の数は特に限定されないが、５個以下が好ましく、また、置換基としては炭素数１〜６の低級アルキル基、ハロゲン、アミノ基、水酸基、ニトロ基及びカルボキシル基等、特に炭素数１〜６の低級アルキル基を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、薬理学的に許容できる塩としては、メシル酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明のマイクロアレイとは、本発明の判定方法において用いられる遺伝子全長、またはその部分配列と相補的なオリゴＤＮＡを１つ以上固定化したＤＮＡマイクロアレイをいう。前記遺伝子のうち配列番号１〜３０のいずれか１以上の遺伝子全長、またはその部分配列と相補的なオリゴＤＮＡを固定化したものが好ましく、２０種以上を固定化したものがさらに好ましい。ここでいう相補的なオリゴＤＮＡは一般的に２５〜１００塩基の長さのものが用いられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００３０】
本発明のキットとは、本発明のＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、又は薬理学的に許容できるその塩に対する癌細胞の感受性判定のためのマイクロアレイを含むものであって、ハイブリダイゼーションのための試薬、反応液、洗浄液等を含みうる。
【００３１】
本発明のプライマーセットとは、本発明のＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、又は薬理学的に許容できるその塩に対する癌細胞の感受性判定のために用いられる遺伝子をＰＣＲ法によって増幅するためのオリゴＤＮＡである。一般的には、１７〜４０塩基長のオリゴＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。これらオリゴＤＮＡはホスホロアミダイト法など公知の方法で合成することが可能である。検体由来のｍＲＮＡから逆転写反応で合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法で目的遺伝子量を定量することができる。該リアルタイムＰＣＲ法を行う場合には、ＰＣＲ産物の生成量を測定するためにサイバーグリーンなどのＤＮＡインターカレーター蛍光色素を用い、測定装置として例えばＭＸ３０００Ｐ（ストラタジーン社製）を用いることができる。但し、これらの条件は、実験が再現できる限り、適宜変更できる。その変更した条件で発明が実施される場合も、本発明の範囲に含まれるものとする。この方法で目的遺伝子の定量を行うことができるので、以下前記の方法に従って感受性の判別を行うことができる。
【００３２】
本発明の抗体セットとは、本発明のＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔであって抗腫瘍活性を示す化合物、その誘導体、又は薬理学的に許容できるその塩に対する癌細胞の感受性判定のために用いられる遺伝子産物を免疫染色するために用いられる抗体を指す。抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など、特異的に抗原を認識できるものであれば何でもよい。また、これら抗体はマウス、ウサギ、ヤギなどを抗原で免疫して得ることができる。この抗原は目的遺伝子産物の全長でも良いし、その一部でも良い。これら抗体で腫瘍組織を免疫染色することによって、目的遺伝子の発現量を知ることが可能となるので、以下前記の方法に従って感受性の判別を行うことができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  １５０４６０のＡｈＲ  ａｇｏｎｉｓｔ作用が抗腫瘍効果に必要であることの証明
【００３５】
１．１５０４６０によるＣＹＰ１Ａ１ｍＲＮＡの誘導
１５０４６０感受性の乳癌細胞株ＭＣＦ−７，Ｔ−４７Ｄ，ＳＫ−ＢＲ−３，ＭＤＡ−ＭＢ−４５３，ならびに１５０４６０非感受性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ，Ｈｓ０５７８Ｔ，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をそれぞれ１００万個ずつ直径９０ｍｍの培養ディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で終夜培養した後、終濃度０及び２．５μＭの１５０４６０を処理し、３時間培養した。続いて、培養液を除去後、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、１ｍＬのＩＳＯＧＥＮ溶液（ニッポンジーン社製）を加えて、細胞を溶解した。溶解した細胞に２５０μＬのクロロホルムを加え、激しく攪拌した後、１５，０００ｒｐｍで３分間，４℃にて遠心し、蛋白質を除去した。上清を５００μＬ回収し、等量のイソプロパノールを加え、室温で１０分間保温後、１２，０００ｒｐｍで１０分間、４℃にて遠心しＲＮＡを沈降させた。沈降させたＲＮＡを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄後、エタノールを除去し、水を加えることによってＲＮＡ溶液とした。ＲＮＡ溶液は吸光度を用いて濃度と純度の検定を行った。
【００３６】
それぞれ１μｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成を行った。すなわち、１μｇのＲＮＡと２μＬの５０μＭオリゴ（ｄＴ）２０溶液（インビトロジェン社製）を６５℃で５分間保温したのち、１μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）、４μＬの５倍濃度バッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素に添付のもの）、１μＬのＲＮアーゼインヒビター（インビトロジェン社製）、１μＬの０．１Ｍジチオトレイトール、４μＬの２．５ｍＭｄＮＴＰを加え、さらに全量が２０μＬとなるように水を加え、穏やかにピペッティングで攪拌した後、５０℃で５０分間保温し、ｃＤＮＡを合成した。
【００３７】
続いてｃＤＮＡ中に含まれるＣＹＰ１Ａ１遺伝子発現量の定量を行った。得られたｃＤＮＡ１μＬに、１５μＬのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）、１．５μＬのＣＹＰ１Ａ１定量用ＴａｑＭａｎプローブ（アプライドバイオシステムズ社製）、１２．５μＬの水を加え、穏やかに攪拌した後、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００Ｐ（ストラタジーン社製）を用い、９５℃１５秒、６０℃１分のサイクルを４０サイクル行うことによって、遺伝子の増幅を行った。それぞれの細胞について、遺伝子が対数的に増幅されている点を選択し、Ｃｔ値を求めた。コントロール遺伝子としては、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨという）遺伝子を用い、同様の方法でＣｔ値を求めた。各細胞の１５０４６０処理群と非処理群について、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子のＣｔ値から、ＧＡＰＤＨのＣｔ値を引いた値を△Ｃｔ値として求め、相互に比較することによって、各群中におけるＣＹＰ１Ａ１の相対的な発現量を見積もった。１５０４６０非処理群におけるＣＹＰ１Ａ１遺伝子発現量を１００とした時の、１５０４６０処理群の発現量を図２に示した。この結果、１５０４６０感受性癌においては、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子発現の誘導が認められるが、１５０４６０非感受性癌には認められないことが明らかとなった。
【００３８】
２．１５０４６０によるＣＹＰ１Ａ１蛋白質の誘導
続いて、１５０４６０により、ＣＹＰ１Ａ１の蛋白質が誘導されているかどうか検討した。１５０４６０、感受性の乳癌細胞株ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ，ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ならびに１５０４６０非感受性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、Ｈｓ０５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をそれぞれ１００万個ずつ直径９０ｍｍの培養ディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で終夜培養した後、終濃度０及び１μＭの１５０４６０を処理し、６時間培養した。培地を取り除いた後、１０ｍＬのＰＢＳにて洗浄を行い、スクレイパーで細胞を回収した。それぞれの細胞に、２００μＬの細胞溶解液（５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５％  トライトンＸ−１００）を加え、ピペッティングで攪拌した後、氷上にて３０分間保温した。続いて、１５０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心し、上清を蛋白質画分として回収した。蛋白質画分はＢＣＡ蛋白質アッセイキット（ピアス社製）を用いて、蛋白質定量を行い濃度を決定した。２０μｇずつの蛋白質を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、ブロッティング装置を用いて、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液（２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で室温にて１時間ブロッキングした後、０．２μｇ／ｍＬの抗ＣＹＰ１Ａ１抗体（ｓｃ−２０７７２、サンタクルズ社製）を加えて、４℃にて終夜反応した。ＴＢＳ−Ｔで３回の洗浄を行った後、二次抗体としてＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を加え、室温で１時間反応した。ＴＢＳ−Ｔで３回の洗浄を行った後、ＥＣＬウエスタンブロッティングディテクションシステム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて化学発光を行い、Ｘ線フィルムを感光させた。ウエスタンブロッティングの結果を図３に示す。この結果より、１５０４６０感受性細胞においては、ＣＹＰ１Ａ１蛋白質の誘導が起こり、非感受性細胞では起こらないことが明らかとなった。
【００３９】
３．１５０４６０の抗腫瘍効果にＡｈＲ、ＣＹＰ１Ａ１が必要であることの証明
続いて、１５０４６０の抗腫瘍効果にＣＹＰ１Ａ１ならびにＡｈＲが必要であるかどうか検討した。１５０４６０感受性の乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を５万個ずつ２４ウエル培養プレートに播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で終夜培養した後、ＡｈＲｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製）、ＣＹＰ１Ａ１ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製）、ネガティブコントロールとしてノンサイレンシングｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製）を以下の方法で導入した。また、ＡｈＲｓｉＲＮＡとＣＹＰ１Ａ１ｓｉＲＮＡは各３種類ずつを用いた。すなわち、２０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを１μＬのリポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）、１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）と混合し、室温で２０分間保温した後、各培養ウエルに投与した。投与後２４時間培養を行い、各遺伝子をノックダウンした後、終濃度０、２、１０μＭの１５０４６０を処理し、さらに４８時間培養を行った。続いて、培養液を抜き取り、メタノール固定後、メチレンブルー染色を行うことによって、細胞数を測定し、１５０４６０による細胞増殖抑制効果と各ｓｉＲＮＡがその作用をキャンセルできるかどうか調べた。その結果を図４に示す。ＡｈＲならびにＣＹＰ１Ａ１のｓｉＲＮＡはいずれも１５０４６０の細胞増殖抑制効果を強く抑制したことから、１５０４６０の細胞増殖抑制作用にＡｈＲとその下流のＣＹＰ１Ａ１が必要であることが明らかとなった。
【００４０】
実施例２  １５０４６０の抗腫瘍効果
１５０４６０は、複数の乳癌細胞株に細胞増殖抑制作用を示すが、それ以外の細胞種においてもそのような作用が認められるかどうか肝癌細胞株を用いて検討した。肝癌細胞株ＨＬＥ、ＨＬＦ、ＨｕＨ６、ＨｕＨ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＫ−Ｈｅｐ１、ＨＴ１７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２株を９６ウエルの培養ディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で終夜培養した。続いて、終濃度０、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０μＭの１５０４６０を処理し、さらに７２時間培養を行った。続いて、培養液を抜き取り、メタノール固定後、メチレンブルー染色を行うことによって、細胞数を測定し、１５０４６０による細胞増殖抑制効果を調べた。その結果を図５に示す。ＨｕＨ６、ＨＴ１７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２株は１５０４６０に感受性を示し、乳癌以外の細胞株においても１５０４６０は増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。
【００４１】
実施例３  マイクロアレイの作製
ヒト遺伝子断片ライブラリ(マイクロダイアグノスティック社)を超微量分注装置（マイクロダイアグノスティック社製、ＧｅｎｅＭａｔｒｉｘＭａｋｅｒ−Ｒ）を用いてスライドガラス（松浪硝子工業社製、Ｓ９１１５）上にスポットし、マイクロアレイを作製した。該マイクロアレイスライドガラスをスライド染色バスケット（松浪ガラス社製、Ｂ−６０）に挿入し、気相恒温器（Ｓｔｏｖａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ）内にて８０℃で１時間静置した状態で保温し、更にＵＶクロスリンカー（Ｈｏｅｆｅｒ社製、ＵＶＣ５００）を用いて１２０ｍＪの紫外線を照射し、スポットした合成ＤＮＡをスライドガラス表面に固定化した。
【００４２】
１．判定に使用するための遺伝子の選択
−全ＲＮＡの調製−
解析には１５０４６０の感受性癌細胞のうち乳癌としてＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＺＲ−７５−１、Ｒ２７、ＨＣＣ１４１９、ＺＲ−７５−３０及びＣＡＭＡ１の１１種類を用いた。また、１５０４６０の非感受性細胞のうち、乳癌として、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４ＩＶ、Ｈｓ０５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７及びＵＡＣＣ８１２を用い、肝癌として、ＨＬＥ、ＳＫ−Ｈｅｐ−１、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＨＬＦ及びＬｉ７、卵巣癌としてＡｄｒＲの１２種類を用いた。これら細胞については、底面積が１７５ｃｍ2の培養フラスコにて１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞密度が８０〜９０％になった時点で、培地を速やかに除去し、１０．５ｍＬのＩＳＯＧＥＮｒｅａｇｅｎｔ（ニッポンジーン社製）を加えて細胞を溶解後、添付のマニュアルに従って、全ＲＮＡを抽出した。プロトコルに準じて得られた１００?ｇ以上の全ＲＮＡは分光光度計で２６０ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度を測定することで、純度の確認を行った。さらに、変性アガロースゲル電気泳動によって、ＲＮＡ分解の有無の確認を行った後、以下の実験に進んだ。
【００４３】
−標識ｃＤＮＡの合成−
検体用ｍＲＮＡは各細胞から抽出した全ＲＮＡから、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅキット（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いてポリアデニル酸［ポリ（Ａ）］＋ＲＮＡを抽出して得た。このｍＲＮＡをそれぞれ２．０μｇ分取し、ラベリング＆ハイブリダイゼーションキット（マイクロダイアグノスティック社製）、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（インビトロジェン社製）、及びＣｙａｎｉｎｅ  ５−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｃｙａｎｉｎｅ５−ｄＵＴＰ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用い、各細胞検体の標識ｃＤＮＡを作製した。またコントロールとして、使用した全細胞のｍＲＮＡの等量混合サンプルをＣｙａｎｉｎｅ  ３−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｃｙａｎｉｎｅ３−ｄＵＴＰ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社)で標識したｃＤＮＡを作製した。
【００４４】
−標識プローブの作製−
これらの標識ｃＤＮＡ、すなわち、Ｃｙａｎｉｎｅ５で標識された各細胞検体およびＣｙａｎｉｎｅ３で標識されたコントロールを、同一試験管内で混合し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ３０（ミリポア社製）によって精製し、最終的に核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）付属のハイブリダイゼーションバッファーおよび純水を用いて１５μＬに調製した。
【００４５】
−ハイブリダイゼーション−
この溶液を９９℃で５分間加熱して熱変性させ、室温で５分間放置した後、マイクロアレイスライドガラスのＤＮＡがスポットされている領域上に滴下し、２４ｍｍ×４０ｍｍのカバーガラス（松浪硝子工業社製、ＮＥＯカバーガラス）を被せ、ハイブリダゼーションカセット（マイクロダイアグノスティック社製）に格納した。このマイクロアレイを格納したハイブリダゼーションカセットを、気相恒温器（三洋電機バイオメディカ社製、ＭＩＲ２６２）に入れ、４２℃で２０時間、静置した状態で保温した。
【００４６】
−洗浄−
該ハイブリダゼーションカセットを気相保温器からとりだし、核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）付属のハイブリダイゼーション洗浄溶液を用い、同社推奨のプロトコルに従ってスライドガラスを洗浄した。
【００４７】
−ハイブリダイゼーションの検出および数値化−
このようにしてハイブリダイゼーションと洗浄を行ったマイクロアレイスライドガラスを、スキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ）を用いて波長６３５ｎｍおよび５３２ｎｍの蛍光シグナルを同時測定した。スキャナ付属の解析ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ）を用いて光学的に評価し、各試料についてのＣｙａｎｉｎｅ３：Ｃｙａｎｉｎｅ５比からコントロールに対する相対的発現量を算出した。
【００４８】
−統計学的処理−
次いで、感受性細胞と非感受性細胞の判別分離に有用な遺伝子を選択するために、感受性細胞及び非感受性細胞間において、各遺伝子の対数変換相対的発現量に対して、スチューデントのｔ分布の確率を返すＴＤＩＳＴ関数を実施してＰ値を算出した。
【００４９】
その結果、順列のＰ値が１．０×１０-5未満である２６６種類の遺伝子が候補として抽出された（図６〜１４）。これら２６６種類の遺伝子のうち、１４４の遺伝子は、感受性細胞に比べて非感受性細胞において発現レベルが増大しており、１２２の遺伝子は発現レベルが減少していた。
【００５０】
２．有意差の大きい遺伝子によるクラスタリング
配列番号１〜２５の２５種類の遺伝子を用いて、階層的クラスター解析を行った。階層的クラスター解析は、Ｍ． Ｅｉｓｅｎにより開発され、インターネットのウェブから利用できるソフトウェアである「ｃｌｕｓｔｅｒ」及び「ｔｒｅｅｖｉｅｗ」（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ５／ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ／ＳＭＤ／ｒｅｓｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ）を用いて行った。クラスター分割アルゴリズムを適用する前に、各スポットについての蛍光比を対数変換し、次いで、各試料についてのデータをメジアン中央化して実験的なバイアスを除去した。その結果、これらの遺伝子セットを用いた解析により、細胞が感受性と非感受性の２つに明瞭に分離された（図１５） 。
【００５１】
実施例４  １５０４６０感受性が未知である腫瘍の１５０４６０感受性の予測
１５０４６０感受性が不明な腫瘍の感受性を判定できるかどうか検討する目的で、ヌードラットに移植した乳癌細胞株ＫＰＬ−１から全ＲＮＡを取得し、マイクロアレイプロファイリングを行った。図１５で作ったクラスター解析に、ＫＰＬ−１を加えることによって、ＫＰＬ−１は１５０４６０感受性であることが予想された（図１６）。続いて、ヌードラットに移植したＫＰＬ−１細胞に１５０４６０−Ｐを投与し、１５０４６０感受性であることが確認された（図１７）。このことより、この感受性判定方法を用いることによって、感受性が未知の腫瘍であっても、前もって感受性を判定することが出来ることが明らかとなった。以下に具体的実験例を示す。
【００５２】
１．ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍からの全ＲＮＡの調製とマイクロアレイ解析
１５０４６０の感受性が不明なヒト乳癌株ＫＰＬ−１を、当施設にてヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ雌性；日本クレア株式会社製）の背側部皮下に移植して継代維持した。そして継代維持したＫＰＬ−１をヌードラット（Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｕｎ雌性；日本クレア株式会社製）の皮下に移植して増殖したものを摘出し、液体窒素にて凍結した腫瘍を、予めＩＳＯＧＥＮ  ｒｅａｇｅｎｔ（ニッポンジーン社製）を加えた１５ｍＬのチューブに入れた。チューブに入れた凍結腫瘍はポリトロン（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いてよく破砕した後、プロトコルに準じて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは分光光度計で２６０ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度を測定することで、純度と濃度の確認を行った。さらに、変性アガロースゲル電気泳動によって、ＲＮＡ分解の有無の確認を行った後、以下の実験に進んだ。
【００５３】
実施例３の実験例２と同様に、ヌードラットの皮下に移植したＫＰＬ−１についてマイクロアレイによる遺伝子発現解析を実施した。そこで得られたデータのうち、配列番号１〜２５の２５種類の遺伝子発現量を選択した。解析する対象には、感受性癌細胞のうち乳癌としてＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＺＲ−７５−１、Ｒ２７、ＨＣＣ１４１９、ＺＲ−７５−３０及びＣＡＭＡ１の１１種類を用いた。また、１５０４６０の非感受性細胞のうち、乳癌として、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４ＩＶ、Ｈｓ０５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７及びＵＡＣＣ８１２を用い、肝癌として、ＨＬＥ、ＳＫ−Ｈｅｐ−１、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＨＬＦ及びＬｉ７、卵巣癌としてＡｄｒＲの１２種類を用いた。これらの選択された２５種類の遺伝子の発現量に関する１１種類の感受性細胞及び１２種類の非感受性細胞のデータを元に、ＫＰＬ−１について階層的クラスター解析を行った。階層的クラスター解析は、実験例２と同様、「ｃｌｕｓｔｅｒ」及び「ｔｒｅｅｖｉｅｗ」を用いて行った。クラスター分割アルゴリズムを適用する前に、各スポットについての蛍光比を対数変換し、次いで、各試料についてのデータをメジアン中央化して実験的なバイアスを除去した。その結果、これらの遺伝子セットを用いた解析により、ＫＰＬ−１が感受性の腫瘍であることが示唆された（図１６） 。
【００５４】
２．ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍の１５０４６０感受性の評価
ＫＰＬ−１の１５０４６０感受性を判断するために、ヌードラット皮下に移植したＫＰＬ−１に対する抗腫瘍試験を行った。ＫＰＬ−１を移植したヌードラットは、投与開始日に腫瘍体積及び体重を基に無作為に各群に振り分けた。腫瘍はデジタルノギスを用いて長径（Ｌｍｍ）と短径（Ｗｍｍ）を用いて、腫瘍体積（ＴＶ（ｍｍ３））を以下の式から算出した。
【００５５】
【化１】
2010268690.tif 000003
【００５６】
腫瘍体積を算出し、腫瘍の形状、生着位置から不良なものを除外し、腫瘍体積及び体重を用いて多変数による個体の除去を行った後、多変数によるブロック化割付け（ＳＡＳシステム前臨床パッケージＶｅｒ．５．０、ＳＡＳインスティチュートジャパン社製）を行い、１群６匹で４群に割付けた。１５０４６０−Ｐ非投与群及び１５０４６０−Ｐを一日一回２８日間、それぞれ６０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの経口投与を行う群に分けた。投与開始日の腫瘍体積を１とした相対腫瘍体積から、経時的な腫瘍増殖曲線を作成した。その結果、ＫＰＬ−１は１５０４６０に対して感受性を示すことが示された（図１７）。このことより、上記遺伝子セットを用いた感受性判定によって、感受性未知の細胞の１５０４６０感受性が判定できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の判定方法ならびにキットによって、手術又はバイオプシー等の手段によって癌患者から分離された癌細胞より抽出したｍＲＮＡをサンプルとして、その遺伝子発現様式を遺伝子チップ等を用いて解析し、感受性細胞及び非感受性細胞との遺伝子発現様式を比較することで、薬剤に対する感受性を予測することできる。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号１：ＳＰＤＥＦのｃＤＮＡ配列
配列番号２：ＭＳＮのｃＤＮＡ配列
配列番号３：ＰＲＯＭ２のｃＤＮＡ配列
配列番号４：ＦＬＪ３３２３５のｃＤＮＡ配列
配列番号５：ＲＡＢ２５のｃＤＮＡ配列
配列番号６：ＳＴＡＲＤ１０のｃＤＮＡ配列
配列番号７：ＸＢＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号８：ＣＲＥＢ３Ｌ４のｃＤＮＡ配列
配列番号９：ＩＧＦ２ＢＰ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１０：ＦＬＪ１０４４４のｃＤＮＡ配列
配列番号１１：ＣＡＶ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１２：ＦＬＪ３５４１８のｃＤＮＡ配列
配列番号１３：ＡＮＸＡ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１４：ＴＯＢ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１５：ＧＲＨＬ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１６：ＤＤＲ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１７：ＦＬＪ４１６９２のｃＤＮＡ配列
配列番号１８：ＳＹＤＥ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１９：ＰＲＳＳ８のｃＤＮＡ配列
配列番号２０：ＣＬＤＮ３のｃＤＮＡ配列
配列番号２１：ＣＭＴＭ３のｃＤＮＡ配列
配列番号２２：ＰＯＰＤＣ３のｃＤＮＡ配列
配列番号２３：ＥＭＰ３のｃＤＮＡ配列
配列番号２４：ＫＩＡＡ０１８２のｃＤＮＡ配列
配列番号２５：ＴＲＰＳ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２６：ＣＣＤＣ８２のｃＤＮＡ配列
配列番号２７：ＳＴＫ１７ＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２８：ＲＢＭ３５ＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２９：Ｃ１ｏｒｆ１７２のｃＤＮＡ配列
配列番号３０：ＪＵＰのｃＤＮＡ配列
配列番号３１：ＦＬＪ１０９６０のｃＤＮＡ配列
配列番号３２：ＰＳＤ４のｃＤＮＡ配列
配列番号３３：ＡＲＲＤＣ１のｃＤＮＡ配列
配列番号３４：ＲＧＬ２のｃＤＮＡ配列
配列番号３５：ＬＩＸ１ＬのｃＤＮＡ配列
配列番号３６：ＳＰＩＮＴ１のｃＤＮＡ配列
配列番号３７：ＣＡＶ１のｃＤＮＡ配列
配列番号３８：ＬＵＺＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号３９：ＩＲＸ５のｃＤＮＡ配列
配列番号４０：ＳＨ３ＫＢＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号４１：ＬＥＰＲＥ１のｃＤＮＡ配列
配列番号４２：ＷＢＳＣＲ２１のｃＤＮＡ配列
配列番号４３：ＡＲＨＧＡＰ８のｃＤＮＡ配列
配列番号４４：ＥＭＰ２のｃＤＮＡ配列
配列番号４５：ＭＡＬ２のｃＤＮＡ配列
配列番号４６：ＢＭＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号４７：ＧＡＬＮＴ６のｃＤＮＡ配列
配列番号４８：ＰＲＫＣＡのｃＤＮＡ配列
配列番号４９：ＣＡ１２のｃＤＮＡ配列
配列番号５０：ＥＦＮＡ１のｃＤＮＡ配列
配列番号５１：ＣＬＤＮ７のｃＤＮＡ配列
配列番号５２：ＡＣＳＬ４のｃＤＮＡ配列
配列番号５３：ＲＨＯＢのｃＤＮＡ配列
配列番号５４：ＣＤＣ４２ＳＥ１のｃＤＮＡ配列
配列番号５５：ＳＴ３ＧＡＬ２のｃＤＮＡ配列
配列番号５６：ＬＡＲＰ６のｃＤＮＡ配列
配列番号５７：ＰＳＭＢ９のｃＤＮＡ配列
配列番号５８：ＳＬＣ３７Ａ１のｃＤＮＡ配列
配列番号５９：ＣＡＲＤ１０のｃＤＮＡ配列
配列番号６０：ＴＲＩＭ５のｃＤＮＡ配列
配列番号６１：ＳＥＬＥＮＢＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号６２：ＦＡＤＳ３のｃＤＮＡ配列
配列番号６３：ＧＡＴＡ３のｃＤＮＡ配列
配列番号６４：Ｃ１０ｏｒｆ５７のｃＤＮＡ配列
配列番号６５：ＡＮＴＸＲ１のｃＤＮＡ配列
配列番号６６：ＥＮＳＡのｃＤＮＡ配列
配列番号６７：ＦＬＪ３３８５０のｃＤＮＡ配列
配列番号６８：Ｆ１１ＲのｃＤＮＡ配列
配列番号６９：ＨＥＧ１のｃＤＮＡ配列
配列番号７０：ＳＭＡＤ３のｃＤＮＡ配列
配列番号７１：ＫＲＴ１０のｃＤＮＡ配列
配列番号７２：ＦＬＪ３１８７４のｃＤＮＡ配列
配列番号７３：ＴＡＣＳＴＤ２のｃＤＮＡ配列
配列番号７４：ＺＮＦ２１７のｃＤＮＡ配列
配列番号７５：ＦＬＪ４３４３６のｃＤＮＡ配列
配列番号７６：ＰＢＸ１のｃＤＮＡ配列
配列番号７７：ＦＬＪ２０６５３のｃＤＮＡ配列
配列番号７８：ＢＳＰＲＹのｃＤＮＡ配列
配列番号７９：ＤＮＡＰＴＰ６のｃＤＮＡ配列
配列番号８０：ＤＥＮＮＤ２ＤのｃＤＮＡ配列
配列番号８１：ＫＩＡＡ１５４３のｃＤＮＡ配列
配列番号８２：ＦＬＪ２２９４５のｃＤＮＡ配列
配列番号８３：ＧＰＲ１６０のｃＤＮＡ配列
配列番号８４：ＬＯＸＬ２のｃＤＮＡ配列
配列番号８５：ＬＹＮのｃＤＮＡ配列
配列番号８６：ＫＩＡＡ０８０２のｃＤＮＡ配列
配列番号８７：ＰＨＬＤＢ２のｃＤＮＡ配列
配列番号８８：ＳＭＡＲＣＤ２のｃＤＮＡ配列
配列番号８９：ＢＩＮ１のｃＤＮＡ配列
配列番号９０：ＮＢＥＡＬ２のｃＤＮＡ配列
配列番号９１：ＭＡＰＫ１２のｃＤＮＡ配列
配列番号９２：ＡＧＰＳのｃＤＮＡ配列
配列番号９３：ＦＬＪ３９７７０のｃＤＮＡ配列
配列番号９４：ＩＣＡ１のｃＤＮＡ配列
配列番号９５：ＤＣＵＮ１Ｄ２のｃＤＮＡ配列
配列番号９６：ＫＩＦ３ＣのｃＤＮＡ配列
配列番号９７：ＧＰＤ１ＬのｃＤＮＡ配列
配列番号９８：ＦＬＪ３０５５０のｃＤＮＡ配列
配列番号９８：ＫＩＡＡ１３２４のｃＤＮＡ配列
配列番号１００：ＦＬＪ１２３５４のｃＤＮＡ配列
配列番号１０１：ＴＳＰＡＮ１５のｃＤＮＡ配列
配列番号１０２：ＣＵＬ４ＢのｃＤＮＡ配列
配列番号１０３：ＴＡＸ１ＢＰ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１０４：ＦＬＪ３０８４２のｃＤＮＡ配列
配列番号１０５：ＡＣＴＮ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１０６：ＡＢＣＣ４のｃＤＮＡ配列
配列番号１０７：ＴＲＩＭ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１０８：ＦＬＪ３９０８４のｃＤＮＡ配列
配列番号１０８：ＭＡＰ７のｃＤＮＡ配列
配列番号１１０：ＯＳＭＲのｃＤＮＡ配列
配列番号１１１：ＦＸＹＤ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１１２：ＣＯＴＬ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１１３：ＫＲＴ１９のｃＤＮＡ配列
配列番号１１４：ＥＰＮ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１１５：ＩＧＳＦ９のｃＤＮＡ配列
配列番号１１６：ＥＦＨＤ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１１７：ＣＬＮ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１１８：ＦＬＪ３０９５３のｃＤＮＡ配列
配列番号１１９：ＳＥＭＡ３ＦのｃＤＮＡ配列
配列番号１２０：ＩＮＰＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１２１：ＤＣＢＬＤ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１２２：ＤＨＲＳ１３のｃＤＮＡ配列
配列番号１２３：ＶＩＭのｃＤＮＡ配列
配列番号１２４：ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ配列
配列番号１２５：ＩＲＦ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１２６：ＴＲＩＯのｃＤＮＡ配列
配列番号１２７：ＴＭＥＭ１３２ＡのｃＤＮＡ配列
配列番号１２８：ＦＬＪ２０９１３のｃＤＮＡ配列
配列番号１２９：ＳＣＹＬ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１３０：ＳＹＮＧＲ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１３１：ＩＴＧＡ５のｃＤＮＡ配列
配列番号１３２：ＳＨ３ＹＬ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１３３：ＷＷＴＲ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１３４：ＱＫＩのｃＤＮＡ配列
配列番号１３５：ＦＬＪ２１５６３のｃＤＮＡ配列
配列番号１３６：ＩＧＦＢＰ５のｃＤＮＡ配列
配列番号１３７：ＦＮ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１３８：ＦＬＪ３５６７７のｃＤＮＡ配列
配列番号１３９：ＬＯＣ３８７８８２のｃＤＮＡ配列
配列番号１４０：ＡＰＢＢ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１４１：ＦＬＪ３０８６９のｃＤＮＡ配列
配列番号１４２：ＴＡＰ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１４３：ＢＡＧ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１４４：ＦＬＪ１１２３２のｃＤＮＡ配列
配列番号１４５：ＥＸＴ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１４６：ＰＰＡ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１４７：ＨＳＤ１７Ｂ１１のｃＤＮＡ配列
配列番号１４８：ＭＹＬ９のｃＤＮＡ配列
配列番号１４９：ＭＡＰ４Ｋ４のｃＤＮＡ配列
配列番号１５０：ＡＢＣＡ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１５１：ＴＦＰＩのｃＤＮＡ配列
配列番号１５２：ＩＮＡＤＬのｃＤＮＡ配列
配列番号１５３：ＬＹＰＤ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１５４：ＧＬＳのｃＤＮＡ配列
配列番号１５５：ＰＡＴＺ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１５６：ＦＬＪ２１１７５のｃＤＮＡ配列
配列番号１５７：ＦＬＪ１０５００のｃＤＮＡ配列
配列番号１５８：Ｃ１４ｏｒｆ１４７のｃＤＮＡ配列
配列番号１５９：ＣＯＲＯ１ＣのｃＤＮＡ配列
配列番号１６０：ＦＬＪ２２１３１のｃＤＮＡ配列
配列番号１６１：ＮＰＤＣ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１６２：ＦＯＸＯ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１６３：ＡＬＤＨ３Ｂ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１６４：ＣＯＭＴのｃＤＮＡ配列
配列番号１６５：ＥＰＣＡＭのｃＤＮＡ配列
配列番号１６６：ＣＦＬ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１６７：ＩＴＧＢ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１６８：ＣＯＬ４Ａ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１６９：ＤＣＸＲのｃＤＮＡ配列
配列番号１７０：ＳＴ１４のｃＤＮＡ配列
配列番号１７１：ＡＮＸＡ５のｃＤＮＡ配列
配列番号１７２：ＩＧＦ２ＢＰ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１７３：ＰＤＣＤ４のｃＤＮＡ配列
配列番号１７４：ＲＥＬＢのｃＤＮＡ配列
配列番号１７５：ＭＣＦＤ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１７６：ＦＭＮＬ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１７７：ＴＹＭＳのｃＤＮＡ配列
配列番号１７８：ＦＯＸＡ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１７９：ＰＤＬＩＭ７のｃＤＮＡ配列
配列番号１８０：ＡＫＡＰ１２のｃＤＮＡ配列
配列番号１８１：ＩＧＦＢＰ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１８２：ＫＲＴ１７のｃＤＮＡ配列
配列番号１８３：ＴＭＣ４のｃＤＮＡ配列
配列番号１８４：ＡＲＴ４のｃＤＮＡ配列
配列番号１８５：ＴＭＥＭ１８３ＡのｃＤＮＡ配列
配列番号１８６：ＰＩＫ３ＣＤのｃＤＮＡ配列
配列番号１８７：ＯＰＴＮのｃＤＮＡ配列
配列番号１８８：ＪＴＢのｃＤＮＡ配列
配列番号１８９：ＤＺＩＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１９０：ＭＥＴのｃＤＮＡ配列
配列番号１９１：ＦＬＪ２３４３１のｃＤＮＡ配列
配列番号１９２：ＢＴＮ３Ａ３のｃＤＮＡ配列
配列番号１９３：ＦＬＪ１１６２８のｃＤＮＡ配列
配列番号１９４：ＳＰＴＢＮ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１９５：ＥＰＨＡ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１９６：ＦＬＪ３３８９２のｃＤＮＡ配列
配列番号１９７：ＣＯＬ６Ａ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１９８：ＴＬＮ１のｃＤＮＡ配列
配列番号１９９：ＩＦＩ４４のｃＤＮＡ配列
配列番号２００：ＭＡＰ７Ｄ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２０１：ＳＯＡＴ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２０２：ＦＬＪ３２２０４のｃＤＮＡ配列
配列番号２０３：ＩＧＦＢＰ７のｃＤＮＡ配列
配列番号２０４：ＣＮＴＮＡＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２０５：Ｃ９ｏｒｆ３０のｃＤＮＡ配列
配列番号２０６：ＳＬＣ４４Ａ２のｃＤＮＡ配列
配列番号２０７：ＨＡＤＨのｃＤＮＡ配列
配列番号２０８：ＺＮＦ３８５ＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２０９：ＦＬＪ３２１０８のｃＤＮＡ配列
配列番号２１０：ＦＬＪ１１４１７のｃＤＮＡ配列
配列番号２１１：ＴＩＭＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２１２：ＮＡＶ２のｃＤＮＡ配列
配列番号２１３：ＴＡＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２１４：ＥＣＨＤＣ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２１５：ＲＡＢ３ＤのｃＤＮＡ配列
配列番号２１６：ＦＡＭ１２６ＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２１７：ＫＩＡＡ０７５４のｃＤＮＡ配列
配列番号２１８：ＣＯＬ６Ａ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２１９：ＣＴＮＮＤ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２２０：ＡＲＨＧＡＰ２３のｃＤＮＡ配列
配列番号２２１：ＡＵＲＫＢのｃＤＮＡ配列
配列番号２２２：ＬＯＣ１５１３６１のｃＤＮＡ配列
配列番号２２３：ＴＩＭＰ２のｃＤＮＡ配列
配列番号２２４：ＦＡＭ５７ＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２２５：ＳＰＲＹ２のｃＤＮＡ配列
配列番号２２６：ＣＤ４４のｃＤＮＡ配列
配列番号２２７：ＴＧＦＢＩのｃＤＮＡ配列
配列番号２２８：ＦＳＣＮ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２２９：ＰＩＫ３Ｒ３のｃＤＮＡ配列
配列番号２２０：ＤＨＴＫＤ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２３１：Ｃ１０ｏｒｆ１１６のｃＤＮＡ配列
配列番号２３２：ＣＣＤＣ５０のｃＤＮＡ配列
配列番号２３３：ＭＧＣ１６２９１のｃＤＮＡ配列
配列番号２３４：ＴＲＩＰ１０のｃＤＮＡ配列
配列番号２３５：ＭＡＣＦ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２３６：ＡＫＴ３のｃＤＮＡ配列
配列番号２３７：ＫＩＲＲＥＬのｃＤＮＡ配列
配列番号２３８：ＶＣＬのｃＤＮＡ配列
配列番号２３９：Ｆ２ＲのｃＤＮＡ配列
配列番号２４０：ＳＣＨＩＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２４１：ＡＤＭのｃＤＮＡ配列
配列番号２４２：ＥＰＳ８Ｌ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２４３：ＡＤＡＭ１５のｃＤＮＡ配列
配列番号２４４：ＦＬＪ１０７６８のｃＤＮＡ配列
配列番号２４５：ＮＲＰ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２４６：ＦＬＪ３１０９０のｃＤＮＡ配列
配列番号２４７：ＡＲＬ４ＣのｃＤＮＡ配列
配列番号２４８：ＦＬＪ９０４６０のｃＤＮＡ配列
配列番号２４９：ＣＣＤＣ８８ＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２５０：ＳＬＣ４１Ａ３のｃＤＮＡ配列
配列番号２５１：ＮＦＥ２Ｌ３のｃＤＮＡ配列
配列番号２５２：ＦＬＪ１４０４４のｃＤＮＡ配列
配列番号２５３：ＳＧＫ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２５４：ＡＢＣＧ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２５５：ＰＡＲＶＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２５６：ＦＬＪ４５２０４のｃＤＮＡ配列
配列番号２５７：ＦＬＪ３４５８０のｃＤＮＡ配列
配列番号２５８：ＧＬＴ２５Ｄ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２５９：ＵＢＥ２Ｅ３ｃのＤＮＡ配列
配列番号２６０：ＳＬＣ２５Ａ１のｃＤＮＡ配列
配列番号２６１：ＦＬＪ４１９６６のｃＤＮＡ配列
配列番号２６２：ＦＬＪ３２２３５のｃＤＮＡ配列
配列番号２６３：ＰＰＰ２Ｒ５ＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２６４：ＨＩＧ２のｃＤＮＡ配列
配列番号２６５：ＲＮＦ２０８のｃＤＮＡ配列
配列番号２６６：ＴＭＥＭ１４１のｃＤＮＡ配列
【図１】
2010268690.tif 000004
【図２】
2010268690.tif 000005
【図３】
2010268690.tif 000006
【図４】
2010268690.tif 000007
【図５】
2010268690.tif 000008
【図６】
2010268690.tif 000009
【図７】
2010268690.tif 000010
【図８】
2010268690.tif 000011
【図９】
2010268690.tif 000012
【図１０】
2010268690.tif 000013
【図１１】
2010268690.tif 000014
【図１２】
2010268690.tif 000015
【図１３】
2010268690.tif 000016
【図１４】
2010268690.tif 000017
【図１５】
2010268690.tif 000018
【図１６】
2010268690.tif 000019
【図１７】
2010268690.tif 000020
【配列表】
2010268690000001.app