(57)【要約】【課題】  ｐ５３活性を有効に阻害する化合物を用いた治療用途を提供する。【解決手段】  ｐ５３活性の阻害が有効な疾患を患った個体に対して、治療上有効な量のｐ５３阻害剤を投与する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ５３活性の阻害が利点をもたらす疾患または状態を処置する方法であって、当該疾患または状態に見舞われている個体に、一時的なｐ５３阻害剤の治療上有効な量を投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一時的なｐ５３阻害剤および治療におけるその使用、例えば癌の処置での、ストレスに対する組織応答の修飾での、そして、細胞加齢の修飾での使用に関する。  さらに詳細には、本発明は有効に且つ一時的にｐ５３活性を阻害する能力を有し、そしてｐ５３活性の一時的な阻害が利点をもたらす疾患または状態を処置するために、癌の処置の際の化学療法または放射線療法のような療法と組み合わせて、または単独で治療用に使用することができる化合物に関する。  ｐ５３活性を一時的に阻害し、そして治療用に使用することができる化合物の例には、以下の一般構造式(Ｉ)から(ＩＶ)：
【０００２】
【化１】
2010265321.tif 000002
【０００３】
【化２】
2010265321.tif 000003
【０００４】
【化３】
2010265321.tif 000004
【０００５】
【化４】
2010265321.tif 000005
、ならびに医薬上容認され得るこれらの塩および水和物が含まれる。
【背景技術】
【０００６】
ｐ５３遺伝子は最も研究され、そしてよく知られた遺伝子の一つである。  ｐ５３は、種々の異なる刺激、例えば、ＤＮＡ損傷、転写または複製の調節解除、および発癌遺伝子の形質転換を、細胞成長停止またはアポトーシスへと変換することによって、細胞性のストレス応答機構における重量な役割を果たす(T.M. Gottlieb et al., Biochem. Biophys. Acta, 1287, p. 77 (1996))。
【０００７】
ｐ５３は短い半減期を有しており、したがって細胞において継続的に合成および分解されている。  しかしながら、細胞がストレスにさらされると、ｐ５３は安定化される。  ｐ５３の安定化を誘導する細胞ストレスの例は、
ａ)ＵＶ(紫外線)照射、細胞変異、化学療法および放射線療法による損傷などといった、ＤＮＡ損傷；
ｂ)高熱症；ならびに
ｃ)いくつかの化学療法剤によって惹起される(例えば、タキソールまたはビンカアルカロイド類を用いた処置)微小管の調節解除などでである。
【０００８】
ｐ５３は活性化されると、細胞成長停止、またはプログラムされた自殺的細胞死を引き起こし、これは次いでゲノムの安定性に対する重要な制御機構として作用する。  特に、ｐ５３は、遺伝的に損傷を受けた細胞を細胞集団から排除することによってゲノムの安定性を制御し、その主要な機能の一つは腫瘍形成を防止することである。
【０００９】
ｐ５３は、ヒトの癌の大部分において不活性化されている(A.J. Levine et al., Br. J. Cancer, 69, p.409 (1994)およびA.M. Thompson et al., Br. J. Surg., 85, p. 1460 (1998))。  ｐ５３が不活性化されると、異常な腫瘍細胞は細胞集団から排除されず、増殖することができる。  例えば、ｐ５３欠損マウスはゲノムの安定性を維持できる遺伝子を欠いているので、ほぼ普遍的に癌に罹病することが観察されている(L.A. Donehower et al., Nature, 356, p.215 (1990)およびT. Jacks et al., Curr. Biol, 4, p. 1 (1994))。  したがって、ｐ５３の損失または不活性化は、高速度での腫瘍の進行と癌治療に対する耐性を伴う。
【００１０】
ｐ５３はまた、遺伝毒性のストレスに付された正常組織の様々な型に対して高度の感受性も付与する。  特に放射線療法および化学療法は、リンパおよび造血系上皮への重篤な損傷など、これらの療法の有効性を極限する重篤な副作用を呈する。  脱毛のような他の副作用もまた、ｐ５３が媒介するものであり、癌治療のさらなる悪評の原因となる。  これらの副作用は、ｐ５３によって媒介されるアポトーシスによって惹起され、これが癌治療の副作用に見舞われる組織の位置を割り出すのである。  したがって、癌の処置に伴う有害な副作用を排除または低減するためには、ｐ５３欠損腫瘍の処置に際して正常組織におけるｐ５３活性を阻害し、それによって正常組織を保護することが有益なはずである。
【００１１】
しかしながら、腫瘍におけるｐ５３活性の喪失は、腫瘍の進行の迅速化と癌処置に対する耐性を伴う。  したがって、従来の理論では、ｐ５３の抑制によって疾患の進行と癌治療からの腫瘍の保護とが導かれるであろうと言われていた。  その結果、以前の研究者らは、癌の予防または処置におけるｐ５３の機能を修復または模倣するよう試みていたのである。
【００１２】
ｐ５３の不活性化は、望ましくなく、且つ不要な事象であると考えられてきており、ｐ５３機能を修復することによって癌の処置を促進するために、かなりの努力が費やされてきた。  しかしながら、ｐ５３の修復または模倣は、化学療法または放射線療法の際の正常組織細胞の損傷に関して、前記のごとき問題を引き起こすのである。  これらの正常細胞は、癌治療に際してストレスにさらされ、これによって細胞内のｐ５３が、プログラム死を起こすように導くのである。  次いで癌の処置により、腫瘍細胞および正常細胞の双方が殺傷される。  様々な治療法におけるｐ５３の抑制に関する議論は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するE.A. Komorova and A.V. Gudkov, "Could p53 be a target for therapeutic suppression?," Seminers in Cancer Biology, Vol. 8(5), 389-400頁 (1998)の出版物に示されている。
【００１３】
要約すると、ｐ５３は癌の治療において二重の役割を果たしている。  一方で、様々なストレスに応答してアポトーシスおよび成長停止を媒介すること、ならびに細胞老化を制御することによって、ｐ５３は腫瘍サプレッサーとして作用する。  他方で、ｐ５３は癌治療の際の正常な組織に対する重篤な損傷の原因となる。  本明細書に開示するとおり、ｐ５３によって正常組織に惹起される損傷のため、ｐ５３が治療的抑制の標的となった。
【００１４】
加えて、ヒト腫瘍の５０％より多くが機能性のｐ５３を欠いているので、ｐ５３の抑制はかかる腫瘍に対する処置の効率に影響しないはずであり、また正常なｐ５３含有組織を保護するはずなのである。
【００１５】
臓器に対するｐ５３活性の有害な効果は、癌の治療に限るものでない。  ｐ５３は、癌治療だけでなく、傷害(例えば熱傷)、自然発生的疾患(例えば発熱に関連する高熱症、および血液供給の遮断、卒中、および虚血に関連する局所的低酸素の状態)ならびに細胞の加齢(例えば線維芽細胞の老化)に関連する種々のストレスの結果として活性化される。  したがって一時的なｐ５３の阻害は、例えば、(ａ)中枢神経系でのｐ５３依存性の神経死(すなわち、脳および脊髄傷害)の低減または排除、(ｂ)移植に先駆けた組織および臓器の保存、(ｃ)骨髄移植のための宿主の準備、ならびに(ｄ)発作の際の神経損傷の低減または排除においても、治療上有効であり得る。
【００１６】
活性化されたｐ５３は、成長停止(これは不可逆的であることが多い)、またはアポトーシスを誘導し、しかして付されたストレスに応答した正常組織の損傷を媒介するのである。  このような損傷は、ｐ５３の活性化事象の直前、最中、または直後に、ｐ５３活性が一時的に抑制されれば低減され得るのである。  これらの、そして他のｐ５３依存性疾患および状態はしたがって、一時的なｐ５３阻害剤の治療的投与に対するさらなる領域を提供するものである。
【００１７】
ｐ５３はまた、細胞の加齢においても、したがって生物の加齢にも役割を果たしている。  特に、加齢に伴う正常組織の形態学的および生理学的変化は、ｐ５３活性に関連しているのかもしれない。  長い間に組織内に蓄積する老化細胞は、非常に高レベルのｐ５３依存性転写を保っていることが知られている。  老化細胞による、成長阻害剤のｐ５３依存性の分泌は、加齢組織に集積している。  この蓄積は、増殖している細胞に影響を及ぼし得、年齢に伴う組織の全体的な増殖能力の漸減をもたらし得るのである。  したがって、ｐ５３活性の抑制は組織加齢の抑制方法として想定される。
【００１８】
しかしながら、ｐ５３の抑制を包含する治療が実施される前に満たされるべき、いくつかの重要な、例えば、以下のような事柄がある。
【００１９】
(ｉ)治療薬としての実際的な投与のために、インビボで充分に有効な(すなわち、ミクロモル(μｍ)範囲の濃度にて、ｐ５３活性を阻害する)ｐ５３阻害剤を準備すること；
(ii)治療用途で、充分に低い毒性を有するものであって、ｐ５３活性を阻害するのに充分な濃度で望ましくない副作用を起こすこともないこと；
(iii)長期のｐ５３不活性化は、癌の危険性を有意に高め得るので、可逆的なｐ５３阻害を呈すること；
(iv)一時的なｐ５３阻害の際に、細胞は付されたストレスから回復すべきであり、そしてｐ５３を活性化するシグナルは排除または低減されるべきである、さもなければ、ｐ５３活性化シグナルが活性化されている間のｐ５３活性の復旧が、細胞損傷を惹起する可能性がある；
(ｖ)ｐ５３抑制療法は、癌発生の頻度の劇的な増大に関わるものでなく、すなわち、治療的阻害剤は、ストレスに対する細胞性応答の、ｐ５３によって媒介される制御を標的としているが、ｐ５３によって媒介される発癌遺伝子の形質転換の制御に影響を及ぼすものではない。
【００２０】
本発明より以前は、治療のための適用に有用なｐ５３阻害剤は開示されていなかった。
【００２１】
ｐ５３の、潜在性を有する治療用の阻害剤は、ｐ５３シグナル伝達系路のいずれかの段階で作用し、ｐ５３によって媒介される応答の機能的な不活性化(すなわち、ｐ５３依存性の成長停止、アポトーシス、または双方の阻止)をもたらす化合物である。  治療上のｐ５３抑制は、癌腫瘍の増殖の開始へと導く不利益を導くものと考えられていたので、これまでの研究者が治療用のｐ５３阻害剤を考慮することはなかった。  したがって、本発明はｐ５３活性の治療的且つ一時的阻害、ならびにかかる阻害をすることができる化合物に関するものである。
【発明の開示】
【００２２】
本発明は、治療上の適用におけるｐ５３活性の阻害に関する。  本発明はまた、ｐ５３活性を有効に且つ一時的に阻害する化合物と、かかる一時的なｐ５３阻害化合物の治療上の使用にも関するものである。
【００２３】
したがって、本発明の一つの要旨は、ｐ５３活性を可逆的に阻害し、そして治療上に使用することができるｐ５３阻害剤を提供することにあり、その阻害剤は例えば、以下の(Ｉ)〜(ＩＶ)までの一般構造式：
【００２４】
【化５】
2010265321.tif 000006
【００２５】
【化６】
2010265321.tif 000007
【００２６】
【化７】
2010265321.tif 000008
【００２７】
【化８】
2010265321.tif 000009
［式中、ＸはＯ、Ｓ、またはＮＨであり、
ｍは０または１であり、
ｎは１〜４であり、
Ｒ1およびＲ2は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アルカリール、複素環、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ハロアルキル、ハロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、ハロ、(アルキルチオ)アルキル、(アリールチオ)アルキル、および(アラルキルチオ)アルキルよりなる群から選択され、
または、Ｒ1およびＲ2は共に、脂肪族または芳香族の５乃至８員環で、炭素環または複素環のいずれかを形成し、
Ｒ3は、水素、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ハロアリール、ヘテロアラルキル、複素環、アルコキシ、アリールオキシ、ハロ、ＮＲ4Ｒ5、ＮＨＳＯ2Ｒ4Ｒ5、ＮＨＳＯ2Ｒ4、およびＳＯ2ＮＲ4Ｒ5よりなる群から選択され、そして
Ｒ4およびＲ5は独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、および複素環よりなる群から選択され、
または、Ｒ4およびＲ5は共に、脂肪族または芳香族の５乃至８員環で、炭素環または複素環のいずれかを形成するものである］を有する化合物、ならびに医薬上容認され得るこれらの塩および水和物である。
【００２８】
本発明の別の要旨は、一時的なｐ５３阻害剤の治療上有効な量を、ｐ５３活性を可逆的に阻害するために哺乳動物に投与する工程を含む、疾患または状態の処置に起因する正常細胞の死を低減または排除する方法を提供することにある。
【００２９】
本発明のさらなる要旨は、一時的なｐ５３阻害剤の治療上有効な量を、ｐ５３活性を可逆的に阻害するために哺乳動物に投与する工程を含む、外傷または疾患の縮小に起因する正常細胞の死を低減または排除する方法を提供することにある。
【００３０】
本発明の別の要旨は、一時的なｐ５３阻害剤の治療上有効な量を、ｐ５３活性を可逆的に阻害するために哺乳動物に投与する工程を含む、ｐ５３欠損癌に対する処置に起因する正常組織への損傷を低減または排除する方法を提供することにある。
【００３１】
本発明のさらに別の要旨は、改善された癌処置用組成物であって、
(ａ)化学療法剤；および
(ｂ)一時的なｐ５３阻害剤
を含む組成物を提供することにある。
【００３２】
本発明の別の要旨は、癌の改善された処置方法であって、癌を処置するために、充分な放射線量を哺乳動物に投与することと、ｐ５３活性を可逆的に阻害するために一時的なｐ５３阻害剤の治療上有効な量を哺乳動物に投与することを含む方法を提供することにある。
【００３３】
本発明の別の要旨は、細胞に影響を与える、ストレスを誘発する事象に起因する細胞死を防止する方法を提供することにあり、当該方法は、細胞におけるｐ５３活性を可逆的に阻害することができる化合物の治療上有効な量で当該細胞を処理する工程を含む。
【００３４】
本発明の別の要旨は、疾患を処置するための医薬組成物であって、
(ａ)該疾患を処置することができる薬物；および
(ｂ)一時的なｐ５３阻害剤
を含む組成物を提供することにある。
【００３５】
本発明の別の要旨は、医薬組成物であって、
(ａ)一時的なｐ５３阻害剤、および
(ｂ)担体
を含む組成物を提供することにある。
【００３６】
本発明の別の要旨は、組織加齢の調節方法であって、ｐ５３活性を可逆的に阻害することができる化合物の治療上有効な量で組織を処理することを含む方法を提供することにある。
【００３７】
本発明の別の要旨は、所定の放射線量を当てられた哺乳動物を処置する方法であって、照射された哺乳動物を保護するために、ｐ５３活性を可逆的に阻害することができる化合物の治療上有効な量を当該哺乳動物に投与することを含む方法を提供することにある。
【００３８】
本発明のさらに別の要旨は、ｐ５３欠損細胞を癌治療に対して高感度ならしめる方法であって、癌治療と組み合わせて、ｐ５３活性を可逆的に阻害することができる化合物の治療上有効な量を動物に投与する工程を含み、そうしなければ癌治療による影響を受けない細胞を破壊する方法を提供することにある。
【００３９】
本発明の別の要旨は、癌の改善された処置方法であって、癌を処置するために化学療法剤の治療上有効な量を哺乳動物に投与することと、ｐ５３活性を可逆的に阻害するために、一時的なｐ５３阻害剤の治療上有効な量を当該哺乳動物に投与することを含み、その化学療法剤の用量は、ｐ５３阻害剤を投与せずに癌の処置をするために必要とされるのと同じ化学療法剤の用量よりも多量である方法を提供することにある。
【００４０】
本発明のこれらの要旨およびその他の要旨は、以下の非限定的な発明の実施態様の詳細な説明から明らかになるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
前記のとおり、化学療法および放射線療法の有効性は、造血およびリンパ系、腸上皮、ならびに精巣細胞への傷害を含めた、正常組織への重篤な副作用によって制限されている。  ｐ５３はこのような傷害の誘導に関与しているので、正常組織への損傷を低減するための治療上での抑制に対する潜在的な標的として、ｐ５３を研究した。  ｐ５３抑制療法は、機能性ｐ５３を欠損し、したがって付加的なｐ５３抑制による利点を受けることができない腫瘍の処置において特に有用であり得る。
【００４２】
生物の全細胞社会の利点のために自信の生命を与えることを細胞に強いることによって、損傷を受け潜在的に危険な細胞を排除することにより、ｐ５３は重要な機能を果たしている。  癌治療の際にｐ５３活性を阻害することは、遺伝的に変化した細胞の生存へとつながり得、これはそうでない場合にはｐ５３依存性の成長停止またはアポトーシスによって排除されるはずのものである。  したがって、ｐ５３抑制は、損傷を受けた細胞が自己破壊しない、したがって増殖することができるという、本来の危険性を有している。
【００４３】
このことが、ｐ５３活性の抑制によって誘導される新しい癌の危険性を増大させ得るのである。
【００４４】
この本来の危険性は、一時的な、あるいは可逆的なｐ５３活性の阻害を提供することによって相殺され、これで損傷を受けた正常細胞がｐ５３阻害の間に自己を修復することが可能となることが見出されている。  ｐ５３阻害剤の効果が低減または終了すると、その後ｐ５３は、その正常な機能を遂行することができる。  この機構は癌の処置において、特にｐ５３欠損癌の急性期処置の際に、正常細胞が例えば化学療法や放射線療法などの処置の際に影響を受けている場合に有益である。  換言すると、癌の処置に起因する重篤な副作用が、低減または排除されるのである。
【００４５】
やはり前記したとおり、治療において有用なｐ５３阻害剤は、低濃度で有効であり、毒性が低く、治療上有効な濃度で望ましくない副作用を起こさず、可逆的な、すなわち一時的なｐ５３阻害を呈し、付されたストレスから正常細胞を回復させることができるのに充分な時間でｐ５３を阻害し、そして癌の発生の有意な増大を惹起しないものである。
【００４６】
本明細書において使用する場合、ｐ５３活性の「一時的な」または「可逆的な」阻害は、ｐ５３阻害剤の投与後短時間、例えば投与後約５分乃至後約１時間の阻害であって、且つｐ５３阻害剤の投与の完遂後約２４時間乃至約９６時間の間継続するものを意味する。
【００４７】
有用な治療用ｐ５３阻害剤を同定する上で重要な考慮すべき事柄は、ｐ５３の活性化がｐ５３応答性遺伝子のトランス活性化につながり、そしていくつかの細胞型では結果的にアポトーシスが引き起こされることである。  これらの効果の抑制を、治療用ｐ５３阻害剤を同定するために使用することができる。
【００４８】
特に、ｐ５３は特異的なＤＮＡ配列に結合することによって、数多くのｐ５３応答性遺伝子を活性化または抑制する核転写因子として作用する。  トランスジェニックマウスにおけるｐ５３応答性レポーター・ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子(ＬａｃＺ)の転写活性化は、癌治療の副作用を受ける組織の位置付けを行う。  したがって、ｐ５３応答性プロモーターの制御下でレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、および分泌因子)を発現している細胞は、ｐ５３転写調節の活性化または抑制のいずれかをすることができる化合物をスクリーニングするために使用できる。
【００４９】
詳細には、ｐ５３結合性ＤＮＡコンセンサス配列からなるｐ５３応答性エレメントの制御下にあるＬａｃＺ遺伝子、最小熱ショック遺伝子プロモーターと組み合わせてリボソームタンパク質プロモーター由来のｐ５３結合部位を含むｐ５３野生型Ｂａｌｂ ３Ｔ３細胞系ＣｏｎＡを使用した。  ガンマ線照射、ＵＶ光、または種々の化学療法剤を用いた処理による、これらの細胞におけるｐ５３活性化は、常法のＸ−ｇａｌ染色によって容易に検出され得るベータ−ガラクトシダーゼの蓄積をもたらす。
【００５０】
この系はこれまでに、サリチル酸ナトリウムによるｐ５３活性の阻害を同定するために使用されている。  しかしながら、サリチル酸ナトリウムは、２０mM(ミリモル濃度)から始まる高濃度のみで治療的に有効であるので、サリチル酸ナトリウムは治療上有用なｐ５３阻害剤として適切な候補物質といえない。  この治療上有効な濃度では、たとえ有効濃度の半分ででも、サリチル酸ナトリウムの注射は処理した被検動物のすべてに対して致死的であった。
【００５１】
化合物を治療上の適用において有用ならしめる性質を保有するものとして、ｐ５３阻害剤を検出するためのスクリーニングプログラムによって、以下の化合物のクラスが同定された。  詳細には、以下のクラスの化合物が、有効に且つ可逆的にｐ５３活性化を阻害する。  以下にさらに詳説するとおり、癌の処置、または疾患もしくは外傷によって加えられたストレスに起因するｐ５３プログラム細胞死から正常細胞を保護するために、それら化合物は単独で、または例えば癌の処置の際に化学療法または放射線療法と組み合わせて使用することができるのである。  加えて、化学療法の際に、腫瘍と正常細胞の双方ともが破壊されてしまう。  腫瘍細胞は、正常細胞に比べて優先的に殺され、これが化学療法が成功する基礎となっている。  治療用ｐ５３阻害剤を投与することによって正常細胞が保護され、しかして化学療法剤の用量を増加させて、癌をより効率的に処置することができるのである。
【００５２】
治療上有効な、一時的ｐ５３阻害剤の例には、以下の一般構造式(Ｉ)〜(ＩＶ)：
【００５３】
【化９】
2010265321.tif 000010
【００５４】
【化１０】
2010265321.tif 000011
【００５５】
【化１１】
2010265321.tif 000012
【００５６】
【化１２】
2010265321.tif 000013
［式中、ＸはＯ、Ｓ、またはＮＨであり、
ｍは０または１であり、
ｎは１〜４であり、
Ｒ1およびＲ2は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アルカリール、複素環、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ハロアルキル、ハロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、ハロ、(アルキルチオ)アルキル、(アリールチオ)アルキル、および(アラルキルチオ)アルキルよりなる群から選択され、
または、Ｒ1およびＲ2は共に、脂肪族または芳香族の５乃至８員環で、炭素環または複素環のいずれかを形成し、
Ｒ3は、水素、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリール、アラルキル、ハロアリール、ヘテロアラルキル、複素環、アルコキシ、アリールオキシ、ハロ、ＮＲ4Ｒ5、ＮＨＳＯ2Ｒ4Ｒ5、ＮＨＳＯ2Ｒ4、およびＳＯ2ＮＲ4Ｒ5よりなる群から選択され、そして
Ｒ4およびＲ5は独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、および複素環よりなる群から選択され、
または、Ｒ4およびＲ5は共に、脂肪族または芳香族の５乃至８員環で、炭素環または複素環のいずれかを形成するものである］を有するもの、ならびに医薬上容認され得るこれらの塩および水和物が含まれる。
【００５７】
式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物には、置換されていないか、または１以上、典型的には１〜３の置換基で置換された、Ｒ1からＲ5までの基が含まれる。  好適な置換基には、アルキル、アリール、ＯＨ、ＮＲ4Ｒ5、ＣＮ、Ｃ(＝Ｏ)ＮＲ4Ｒ5、ＳＲ4、ＳＯ2Ｒ4、ＣＯ2Ｒ6［Ｒ6は水素またはアルキルである］、ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ6、ＯＲ6、ＣＦ3、ハロ、およびＮＯ2が包含されるが、これらに限定されることはない。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、「アルキル」なる語は単独または組み合わせで、Ｃ1〜Ｃ8からの直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基を含むものとして定義される。  「低級アルキル」の語は本明細書中、Ｃ1〜Ｃ4として定義される。  アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル等が包含されるが、これらに限定されることはない。  「アルキル」なる語にはまた、「シクロアルキル」も含まれ、この語は本明細書中、Ｃ3〜Ｃ7からの環状炭化水素基を包含する。  シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、およびシクロペンチルが包含されるが、これらに限定されることはない。  「アルケニル」および「アルキニル」の語は、「アルキル」と同様であるが、少なくとも１つの炭素間二重結合または三重結合をそれぞれ含むものとして定義される。
【００５９】
「アリール」なる語は単独または組み合わせて、単環式または多環式芳香族基として定義され、好ましくは、例えば、ハロ、アルキル、フェニル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、およびアルキルスルホニルから選択される１以上の、特に１乃至３の置換基で置換されているか、または置換されていないのもののいずれかであることができる、例えば、フェニルまたはナフチルなどといった単環式または多環式の芳香族基である。  アリール基の例には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２−メチルフェニル、４−メチルフェニル、ビフェニル、４−ヨードフェニル、４−メトキシフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−ニトロフェニル等が包含される。
【００６０】
「ハロアリール」および「ハロアルキル」なる語は、本明細書中において、前記のごとき定義のアルキルまたはアリール基で、少なくとも１つの水素原子が本明細書において定義されるごとき「ハロ」基で置換されているものとして定義される。
【００６１】
「ヘテロアリール」なる語は、本明細書中で、例えば、チエニル、フリル、またはピリジルなどの５員または６員の複素環芳香族基として定義され、これらは融合したベンゼン環を任意に有し、そして、例えば、ハロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、およびアルキルスルホニルのような、１以上の、特に１乃至３の置換基で置換されているか、または置換されていないのもののいずれかであることができる。  ヘテロアリール基の例には、チエニル、フリル、ピリジル、ベンズオキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキサゾリル、キノリル、イソキノリル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、ベンズイミダゾリル、インドリル、ベンゾフリル、およびベンゾチエニルが包含されるが、これらに限定されることはない。
【００６２】
「アラルキル」なる語は、本明細書において、前記のごときに定義されたアルキル基であって、水素原子の１つが本明細書にて定義されるごときアリール基、例えば、ハロ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ等の１以上の置換基を任意に有するフェニル基などで置換されているものとして定義される。  アラルキル基の例は、ベンジルである。
【００６３】
「ヘテロアラルキル」なる語は、「アラルキル」なる語と同様に定義されるが、水素がヘテロアリール基で置換されたものである。
【００６４】
「アルカリール」なる語は、本明細書中ににおいて、前記のごとく定義されたアリール基で、水素原子の１つが本明細書中にて定義されるごときアルキル基により置換されているものとして定義され、このアルキル基は、置換されているものか非置換のもののいずれかである。  アルカリール基の例には、４−メチルフェニルが挙げられる。
【００６５】
「アルコキシアルキル」および「アリールオキシアルキル」の語は、水素がそれぞれ、アルコキシ基またはアリールオキシ基で置換されているアルキル基として定義される。  「アラルコキシアルキル」は同様に、アルキル基の水素にアラルコキシ基が置換されているものとして定義される。  「(アルキルチオ)アルキル、」「(アリールチオ)アルキル、」および「(アラルキルチオ)アリル」は酸素原子でなくイオウ原子が存在することを除いて、前記３種の基と同様のものとして定義される。
【００６６】
「ハロゲン」または「ハロ」なる語は本明細書において、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を含むものとして定義される。
【００６７】
「複素環」なる語は、酸素、イオウ、および窒素よりなる群から選択される、１乃至３の原子を含み、残余の原子は炭素であるＣ4〜Ｃ8の脂肪族環式、好ましくはＣ5〜Ｃ6の脂肪族環式として定義される。  複素環の例には、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、モルホリン、ジオキサン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリドン、およびモルホリンが包含されるが、これらに限定されることはない。
【００６８】
「アルコキシ」および「アリールオキシ」は、−ＯＲ［Ｒはアルキルまたはアリールである］として定義される。
【００６９】
「ヒドロキシ」なる語は、−ＯＨとして定義される。
【００７０】
「ヒドロキシアルキル」なる語は、アルキル基に付加されたヒドロキシ基として定義される。
【００７１】
「アミノ」なる語は−ＮＨ2として定義され、そして「アルキルアミノ」なる語は−ＮＲ2［少なくとも１つのＲはアルキルであり、第２のＲはアルキルまたは水素である］として定義される。
【００７２】
「アシルアミノ」なる語は、ＲＣ(＝Ｏ)Ｎ［Ｒはアルキルまたはアリールである］として定義される。
【００７３】
「ニトロ」なる語は、−ＮＯ2として定義される。
【００７４】
「アルキルチオ」なる語は−ＳＲ［Ｒはアルキルである］として定義される。
【００７５】
「アルキルスルフィニル」なる語は、Ｒ−ＳＯ2［Ｒはアルキルである］として定義される。
【００７６】
「アルキルスルホニル」なる語は、Ｒ−ＳＯ3［Ｒはアルキルである］として定義される。
【００７７】
好ましい実施態様において、ＸはＳまたはＮＨであり；ｍは１であり；ｎは１または２であり；Ｒ1およびＲ2は独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリールであるか、または共に５員もしくは６員の炭素環もしくは複素環を形成し；そしてＲ3は、アルキル、アリール、アルカリール、アラルキル、ハロアリール、または複素環であり、そしてこれらの塩および溶媒和物を含む。
【００７８】
より好ましい実施態様において、化合物は、構造式(Ｉ)または(ＩＩＩ)を有し、ＸはＳであり；ｍは１であり；ｎは１であり；Ｒ1およびＲ2は共に５員または６員の脂肪族炭素環を形成し；そしてＲ3は、アルキル、フェニルであって、好ましくはハロ(例えば、ヨード)、アルキル(例えば、メチル)、またはアリール(例えば、フェニル)で置換されている。
【００７９】
治療用のｐ５３阻害剤は、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物の幾何異性体の可能性あるものすべてを包含する。  ｐ５３阻害剤はまた、ラセミ化合物だけでなく光学活性異性体をも含めて、構造式(ＩＩ)および(ＩＶ)の化合物の立体異性体の可能性あるものすべても包含する。  構造式(ＩＩ)または(ＩＶ)の化合物が単一の鏡像異性体として所望される場合、最終産物の分割によるか、または、異性体的に純粋な出発物質か、もしくは何らかの至便な中間体のいずれかからの立体特異的合成によるかのいずれかにて、入手することができる。  最終産物、中間体、または出発物質の分割は、当該技術分野において知られている好適な方法のいかなるものによっても成し遂げることができる。  加うるに、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物の互変異性体が可能な場合、本発明はその化合物の互変異性体すべてを包含することが意図される。  例えば、構造式(Ｉ)の化合物［ｍおよびｎはそれぞれ１である］は、以下の互変異性体の形態で存在し得る。
【００８０】
【化１３】
2010265321.tif 000014
酸部分を含む構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物は、好適な陽イオンと共に医薬上容認され得る塩を形成することができる。  好適な医薬上容認され得る陽イオンには、アルカリ金属(例えば、ナトリウムまたはカリウム)およびアルカリ土類金属(例えば、カルシウムまたはマグネシウム)陽イオンが包含される。  塩基性中心を有する構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物の医薬上容認され得る塩は、医薬上容認され得る酸とで形成される酸付加塩である。  例には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩または重硫酸塩(ビサルフェート)、リン酸塩またはリン酸化水素、酢酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、およびｐ−トルエンスルホン酸塩が包含される。  前記を考慮して、本明細書に記載せる本発明の化合物についての言及はすべて、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物だけでなく、それらの医薬上容認され得る塩および溶媒和物を含めることが意図される。
【００８１】
構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物は、ｐ５３遺伝子を保有する生物のいずれにおいてでも、ｐ５３を阻害するために使用することができる。  典型的には、可逆的なｐ５３の阻害は、ヒトを含めた哺乳動物において実施することができる。  治療的には、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物などの可逆的ｐ５３阻害剤は、ｐ５３活性の阻害によって利点がもたらされる疾患、状態、または傷害のいずれかを処置するために、治療上有効な量にて哺乳動物に投与することができる。
【００８２】
以下に述べるとおり、哺乳動物への本発明のｐ５３阻害剤の投与は、例えば、癌の処置および高熱症において起こる細胞ストレスによって惹起される死から、損傷を受けた細胞を救出すること；潜在的に有害な放射線量にさらされる、原子力発電所での作業従事者、および放射性医薬品にかかる作業に従事している人などといった個体を処置する方法を提供すること；ならびに老化細胞に起因する組織加齢を調節することを含め、様々な潜在的利点を有している。
【００８３】
構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物のような一時的ｐ５３阻害剤は、化学品そのままで治療用に投与することができるが、医薬組成物または製剤として、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)の化合物を投与することが好ましい。  したがって、本発明はさらに、例えば、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物、またはその医薬上容認され得る塩を、１以上の医薬上容認され得る担体と、そして任意に他の治療用および／または予防用成分と共に含む医薬製剤を提供する。  担体は、製剤の他の成分との適合性があり、そしてそのレシピエントに有害でないという意味において「容認され得る」ものである。
【００８４】
治療での使用のために必要とされる一時的ｐ５３阻害剤の量は、処置されるべき状態の性質、ｐ５３の抑制が望まれる時間の長さ、ならびに患者の年齢および状態によって変動し、最終的には担当医によって決定される。  しかしながら一般的に、成人したヒトの処置のために使用される用量は、典型的には１日あたり、.００１mg／kgから約２００mg／kgの範囲にある。  好ましい用量は、１日あたり約１μｇ／kgから約１００μｇ／kgである。  所望の用量は、単回投与で、または、例えば、１日あたり２、３、または４以上の副用量として、適切な間隔をもって複数回投与で、都合がよいように投与することができる。  ｐ５３活性の抑制が一時的であるため、複数回投与が望ましいこと、またはこれが必要であることが多い。
【００８５】
本発明の製剤は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所、吸入による、または口腔内投与などの標準法で投与することができる。  非経口投与には静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内、および関節内が包含されるが、これに限定されることはない。
【００８６】
獣医師が使用するためには、ｐ５３阻害剤、特に式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物またはその無毒性の塩が、通常の獣医師の実務にしたがって、好適な容認可能製剤として投与される。  獣医師は、特定の動物に対して最も適切な投薬計画および投与経路を容易に決定することができる。
【００８７】
本発明のｐ５３阻害剤を含有する医薬組成物は、従来の方法にて調剤された錠剤またはトローチ剤(lozenge)の形状とすることができる。  例えば、経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、結合剤(例えば、シロップ、アラビアゴム(accacia)、ゼラチン、ソルビトール、トランガント、デンプンまたはポリビニルピロリドンのゴム糊(mucilage))、充填剤(例えば、ラクトース、砂糖、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、またはソルビトール)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、またはシリカ)、崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム)、または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの従来の賦形剤を含有することができる。  錠剤は、当該技術分野でよく知られた方法によって被覆することができる。
【００８８】
あるいは、本発明の化合物は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤などの経口用液剤に組み入れることができる。  さらに、これらの化合物を含有する製剤は、使用前に水または他の好適な溶媒(vehicle)で構成させるための乾燥産物として提供することができる。  このような液剤は、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／砂糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および水素化可食性脂肪などの懸濁化剤；レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、またはアラビアゴムなどの乳化剤；アーモンド油、分画化ココナッツ油、油性エステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールなどの非水性溶媒(可食性油を包含し得る)；ならびにメチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートおよびソルビン酸などの保存剤のような従来の添加剤を含有することができる。
【００８９】
かかる製剤は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬用基剤を含有する坐剤として調剤することもできる。  吸入用の組成物は典型的には、乾燥粉末として投与することができる、溶液、懸濁化剤もしくはエマルジョンの形態にて、またはジクロロジフルオロメタンもしくはトリクロロフルオロメタンなどの従来の噴霧剤を使用したエアロゾルの形態にて提供することができる。  典型的な経皮製剤は、クリーム、軟膏、ローション、およびペーストなどの水性または非水性媒体を含み、あるいは、医薬用の硬膏剤、パッチ、または膜の形態とされる。
【００９０】
加えて、本発明の組成物は、注射または継続注入による非経口投与のために製剤化することができる。  注射または継続注入が、投与の好ましい方法であることが想像される。
【００９１】
注射用の製剤は、油性または水性溶媒中の懸濁剤、溶液、またはエマルジョンの形態とすることができ、そして懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤などの配合剤を含有することができる。  あるいは主成分を、使用前に好適な媒体(例えば、無菌の発熱物質不含水)で再構成するための粉末の形態とすることができる。
【００９２】
本発明の組成物は、デポ製剤として調剤することもできる。  かかる長時間作用性の製剤は、埋め込み(例えば、皮下または筋肉内へ)によって、または、筋肉内注射によって投与することができる。  本発明の化合物はしかるべく、好適なポリマー材料もしくは疎水性材料(例えば、容認され得る油中のエマルジョンとして)、イオン交換樹脂を用いて、または、やや溶けにくい誘導体として(例えば、やや溶けにくい塩として)製剤化することができる。
【００９３】
式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物のような一時的なｐ５３阻害剤はまた、癌およびその他の状態つまり疾患状態の処置において有用となり得るその他の治療剤と組み合わせて使用することもできる。  かくして本発明は他の要旨において、治療用の一時的なｐ５３阻害剤と第２の治療用活性薬剤との組み合わせを提供する。
【００９４】
式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物のような一時的なｐ５３阻害剤は、ｐ５３活性の阻害が有益である状態の処置における、第２の治療用活性薬剤との同時投与のための医薬の調製において使用することができる。  加うるに、一時的なｐ５３阻害剤は、かかる状態を処置するための第２の治療用活性化合物との付加療法として使用するための医薬の調製において使用することができる。  一時的なｐ５３阻害剤と組み合わせて使用するための、既知の第２の治療薬剤の適切な用量は、当業者によって容易に認識されるものである。
【００９５】
例えば、治療用の一時的なｐ５３阻害剤は、放射線療法または化学療法などの癌治療と組み合わせて使用することができる。  特にｐ５３阻害剤は、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ビンカアルカロイド類、タキソール、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロランブシル、ブスルファン、メクロレタミン、マイトマイシン、ダカルバジン、カルボプラチン、チオテパ、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、エスペラマイシンＡ1、ダクチノマイシン、プリカマイシン、カルムスチン、ロムスチン、タウロムスチン、ストレプトゾトシン、メルファラン、ダクチノマイシン、およびプロカルバジンなどの化学療法剤と組み合わせて使用することができる。  治療用ｐ５３阻害剤はまた、卒中、虚血、または血液供給遮断を処置するために使用される薬物と組み合わせて、または関節炎もしくは高熱症を起こす疾患を処置するために使用される薬物と組み合わせて使用することもできる。
【００９６】
以上参照した組み合わせは、単一の医薬製剤の形態での使用目的で提供することができ、かように、医薬上容認され得る希釈剤または担体と共に、前記のごとく定義された組み合わせを含んでなる医薬組成物が、本発明のさらなる要旨に含まれる。
【００９７】
前記のごとき組み合わせの個々の成分はしたがって、同じかまたは別々の医薬製剤から、連続的または同時のいずれかにて投与することができる。  本発明の治療用ｐ５３阻害剤の場合と同様に、第２の治療剤は、例えば、経口、口腔内、吸入、舌下、直腸内、腟内、経尿道、経鼻、局所、経皮(すなわち、経皮膚)、または非経口(静脈内、筋肉内、皮下、および冠動脈内を含む)投与などの、好適な経路のいずれによってでも投与することができる。
【００９８】
いくつかの実施態様において、式(Ｉ)から(ＩＶ)の化合物などの一時的なｐ５３阻害剤、および第２の治療剤は、同じ経路によって、同じかまたは異なる医薬組成物より投与される。  しかしながら、他の実施態様においては、治療用ｐ５３阻害剤と第２の治療剤に対して同じ投与経路を使用することは不可能か、または好ましくない場合がある。  当業者は、単独、または組み合わせのいずれかでの、各治療剤に対する投与の最良の態様を了知している。
【００９９】
一般的に、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物は、A. Andreani et al., J. Med. Chem., 38, pp. 1090-1097 (1995)(本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する)に開示された以下の合成スキームにしたがって、調製することができる。  構造式(Ｉ)または(ＩＩ)［式中、ｎは１である］の化合物は次いで、構造式(ＩＩＩ)または(ＩＶ)の化合物へと変換することができる。  Andreani et al.の出版物に開示されたスキームで、合成化学の一般的な原理に従い、必要とあれば保護基を用いることができることが当該技術分野において理解される。  これらの保護基は、当業者に知られ、且つ容易に明らかとなる塩基性、酸性、または水素化分解条件下に、合成の最終段階で除去される。  いずれかの化学官能基の適切な操作および保護を採用することによって、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物の合成は、本明細書に特記しないが、以下に示すスキームと類似の方法によって成し遂げることができる。  特に断りのない限り、すべての出発物質は、市販品であり、さらに精製することなく使用した。
【０１００】
Andreani et al.の出版物に開示されるとおり、一般構造式(Ｉ)または(ＩＩ)の化合物［式中、ＸはＳである］は、２−アミノチアゾールをモル当量のブロモケトン化合物と、アセトン中で還流下に約３０分間反応させることによって調製することができる。  次いで反応混合物は冷却され、そして産物が臭化水素酸塩として単離される。  式(Ｉ)の他の化合物は、２−アミノイミダゾール(Ｘ＝ＮＨ)または２−アミノオキサゾール(Ｘ＝Ｏ)をブロモケトンと反応させることによって同様に調製することができる。  構造式(Ｉ)の化合物［式中、ＸはＳである］を提供するための反応は、以下の式によって示される。
【０１０１】
【化１４】
2010265321.tif 000015
同じ反応を、例えば、２−アミノイミダゾリジンをブロモケトンと反応させることにより、構造式(ＩＩ)の化合物を提供するために使用することができる。  あるいは、構造式(Ｉ)の化合物を、構造式(ＩＩ)の化合物へ変換することができる。
【０１０２】
構造式(Ｉ)または(ＩＩ)の化合物［式中、ｍおよびｎはそれぞれ１である］は、それぞれ構造式(ＩＩＩ)または(ＩＶ)の化合物へと変換することができる。  この変換は、メタノール、エタノール、またはイソプロピルアルコールなどの溶媒中の構造式(Ｉ)または(ＩＩ)の組成物を、例えば約１乃至約１０時間程度の充分な時間加熱して化合物を環化し、構造式(ＩＩＩ)または(ＩＶ)の化合物を得ることによって成し遂げられる。  場合によっては、構造式(Ｉ)または(ＩＩ)の化合物は溶液中で、室温下において構造式(ＩＩＩ)または(ＩＶ)の化合物へとゆっくり環化される。  構造式(Ｉ)および(ＩＩ)の化合物からの、構造式(ＩＩＩ)および(ＩＶ)の化合物の調製は、以下に示すとおりである。
【０１０３】
【化１５】
2010265321.tif 000016
【０１０４】
【化１６】
2010265321.tif 000017
構造式(Ｉ)および(ＩＩＩ)の特定の化合物を、以下の手順によって調製した。
【０１０５】
【化１７】
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４０mlのベンゼン中に、シクロヘキサノン(１．９６ｇ、２０mMol)、チオ尿素(１．５２ｇ、２０mMol)、Ｎ−ブロモスクシンイミド(ＮＢＳ)(３．５６ｇ、２０mMol)、および過酸化ベンゾイル(１００mg)を含有する反応混合液を調製し、次いで還流下に終夜加熱した。  その後ベンゼンを、減圧下に除去した。  残渣を水に溶解し、次いで炭酸ナトリウムで中和した。  得られた沈澱を濾取して、減圧乾燥し、そしてヘキサンから再結晶して２−アミノアゾール誘導体Ａ(１．８１ｇ、収率５９％)を得た。
【０１０６】
５０mlのベンゼン中、化合物Ａ(１．５４ｇ、１０mMol)および臭化パラ−メチルフェナシル(２．３４ｇ、１１mMol)の溶液を調製し、その後、室温にて４８時間撹拌した。  その反応混合液から沈澱した産物(Ｖ)(構造式(Ｉ)の化合物［式中、Ｘ＝Ｓであり、ｎ＝１である］)を濾取し、次いでベンゼンで洗浄して２．４２ｇ(収率６６％)の構造式(Ｖ)の化合物を得た。  構造式(Ｖ)の化合物は、安定で水溶性の化合物であった。
【０１０７】
３０mlのエタノール中、化合物(Ｖ)(１．１０ｇ、３．０mMol)の溶液を６時間還流した。  次いで反応混合液を冷却し、水と混合して炭酸ナトリウムで中和した。  得られた固形産物を混合液から濾取し、減圧乾燥してエタノールから再結晶させ、化合物(ＶＩ)(すなわち、構造式(ＩＩＩ)の化合物)の０．４５ｇ(収率５６％)を得た。
【０１０８】
構造式(Ｉ)および(ＩＩＩ)に包含される、これらの、そして他の特定の(これらに限定されることはない)、以下の構造を有する化合物を合成した。
【０１０９】
【化１８】
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【０１１０】
【化１９】
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【０１１１】
【化２０】
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【０１１２】
【化２１】
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【０１１３】
【化２２】
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【０１１４】
【化２３】
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【０１１５】
【化２４】
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構造式(Ｖ)〜(ＸＩ)の化合物はそれぞれ、
(Ｖ)−−２−［２−イミノ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−３(２Ｈ)−イル］−１−(４−メチルフェニル)−１−エタノン；
(ＶＩ)−−２−(４−メチルフェニル)−５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［ｄ］イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール；
(ＶＩＩ)−−２−［２−イミノ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−３(２Ｈ)−イル］−１−(４−ヨードフェニル)−１−エタノン；
(ＶＩＩＩ)−−２−［２−イミノ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−３(２Ｈ)−イル］−１−(ビフェニル)−１−エタノン；
(ＩＸ)−−２−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［ｄ］イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール；
(Ｘ)−−３−メチル−６−フェニルイミダゾ［２，１−ｂ］−チアゾール；および
(ＸＩ)−−２，３−ジメチル−６−フェニルイミダゾ［２，１−ｂ］チアゾールと命名される。  構造式(Ｖ)の化合物は、ピフィスリン−アルファおよびＰＦＴ−αの慣用名でも知られている。  構造式(ＶＩ)の化合物は、ピフィスリン−ベータおよびＰＦＴ−βの慣用名でも知られている。  構造式(ＶＩＩ)の化合物は、化合物８６Ｂ１０としても知られている。
【０１１６】
構造式(Ｖ)および(ＶＩ)の化合物は、Balse et al., Indian J. Chem., Vol. 19B, pp.293-295(1980年４月)に開示されている。  構造式(ＩＸ)の化合物は、Singh et al., Indian J. Chem., Vol. 14B, pp.997-998(1976年12月)、およびS. Naito et al., J. Heterocyclic Chem., 34, pp.1763-1767(1997)に開示されている。  構造式(Ｘ)および(ＸＩ)の化合物は、P.M. Kochergin et al., J. Gen. Chem. U.S.S.R., 26, pp.483-489(1956)に開示されている。
【０１１７】
構造式(ＶＩＩ)および(ＶＩＩＩ)の化合物は、適切なα−ブロモケトンすなわち、ブロモメチル４−(フェニル)ケトンおよびブロモメチル４−ヨードフェニルケトンをそれぞれ使用することによって、化合物(Ｖ)と同じスキームにて調製した。  構造式(Ｉ)および(ＩＩ)のその他の化合物は、適切なチアゾール、イミダゾール、またはオキサゾール誘導体とブロモケトンを使用して、同様の方法で調製することができる。
【０１１８】
構造式(Ｉ)〜(ＩＶ)の化合物はまた、前記したBalse et al.およびSingh et al.の出版物に開示せる方法によっても調製した。  したがって、構造式(ＸＩＩ)〜(ＸＶ)の以下の化合物も、一時的なｐ５３阻害剤として利用することができる。
【０１１９】
【化２５】
2010265321.tif 000026
【０１２０】
【化２６】
2010265321.tif 000027
【０１２１】
【化２７】
2010265321.tif 000028
【０１２２】
【化２８】
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［式中、Ｒ7は水素またはアルキルであり、Ｒ8はＣＯ2Ｒ6または水素であり、そして、Ｒ3はフェニル、４−クロロフェニル、４−ニトロフェニル、３−ニトロフェニル、４−メチルフェニル、４−フェニルフェニル、および４−ブロモフェニルよりなる群から選択される］３−ニトロフェニル誘導体は、ＷＯ ９８／１７２６７に開示されている。
【０１２３】
さらなる、構造式(Ｉ)〜(ＩＶ)の一時的なｐ５３阻害剤は、以下の構造［式中、Ｒ1およびＲ2は共に、６員芳香環を形成する］を有する。
【０１２４】
【化２９】
2010265321.tif 000030
構造式(ＩＩＩ)を有するさらなる化合物［式中、ＸはＳである］は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するＪＰ１１−１０６３４０およびＪＰ７−２９１９７６に開示されている。
【実施例】
【０１２５】
構造式(Ｉ)から(ＩＶ)の化合物が効果的且つ可逆的の双方にてｐ５３活性を阻害する能力と、治療剤としてのそれらの有用性を、以下の試験および実験で立証した。
【０１２６】
構造式(Ｉ)から(ＩＶ)の化合物のような一時的なｐ５３阻害剤がｐ５３活性を阻害する能力を立証するために、ｐ５３活性化因子(例えば、ドキソルビシンまたはガンマ線照射)をＣｏｎＡ細胞に直接付し、その後Ｘ−ｇａｌ染色を行った。  次いで、ｐ５３活性化因子の存在下に、１μＭから２０μＭの濃度で被検細胞にｐ５３阻害剤を適用した。  標準的なアッセイによって、ｐ５３阻害剤の細胞毒性も調べた。  ｐ５３阻害剤化合物の抗アポトーシス活性の評価は、ｐ５３依存性のアポトーシスに感受性の標準細胞系(すなわち、S.W. Lowe et al., Cell, 74, pp.957-968 (1993)に記載の、Ｅｌａ＋ｒａｓで形質転換されたマウス胚線維芽細胞、Ｃ８系)においてアポトーシス細胞死を抑制する能力に基づくものであった。  化合物活性のｐ５３依存性は、ｐ５３欠損細胞への効果(すなわち、Lowe et al., 1993に記載の、Ｅｌａ＋ｒａｓで形質転換されたｐ５３−／−マウス胚線維芽細胞、Ａ４系の放射線感受性または薬物感受性)を試験することによって分析した。
【０１２７】
これらの試験の結果を、添付の図面(図１〜図１６)に示す。  これらの図面はおしなべて、構造式(Ｖ)および(ＶＩ)の化合物について実施した試験に基づくものである。  以下の図面において化合物(Ｖ)すなわち、ＰＦＴ−αについて示した試験結果を、化合物(ＶＩ)すなわち、ＰＦＴ−βについて繰り返した。  ＰＦＴ−βを用いた試験結果は、ＰＦＴ−αを用いた試験結果と基本的に同様であった。
【０１２８】
図１には、ｐ５３依存性の転写活性化の抑制についての、化学ライブラリーのスクリーニングを示す。  スクリーニング試験において、ＣｏｎＡ細胞(E.A. Komorova et al., EMBO J., 16, pp. 1391-1400 (1997)に記載されるごときｐ５３応答性プロモーターの制御下にある細菌ｌａｃＺ遺伝子を発現しているマウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞)を９６ウェルプレートに播種し、そして０．２μｇ／mlのドキソルビシン(すなわち、ｐ５３を活性化する化学療法剤、アドリアマイシンとしても知られている)と共に、約１０乃至約２０μＭの濃度の被検化合物と組み合わせて２４時間処理した。  ＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド)およびサリチル酸ナトリウムをそれぞれ陰性および陽性対照として使用した(左のカラム)。  細胞を固定してｌａｃＺ発現をモニターするために標準的なＸ−ｇａｌ法によって染色した。  ピフィスリン−アルファを含有するウェルは、図１の矢印によって同定され、ｐ５３を阻害するうえでのＰＦＴ−αの有効性が示されている。
【０１２９】
ＰＦＴ−αは図２に示すように、用量依存的に紫外(ＵＶ)光によって誘発されるＣｏｎＡ細胞におけるｐ５３応答性のｌａｃＺの活性化も阻止した。  詳細には、図２(ａ)は、ＵＶ照射された(２５Ｊ／ｍ2)ＣｏｎＡ細胞におけるβ−Ｇａｌ活性に対し、ＰＦＴ−αが１０、２０、および３０μＭで影響を及ぼすことを示している。  細胞をＵＶ処理から８時間後に集めて、抽出物中のβ−Ｇａｌ発現を標準比色アッセイによって評価した。  (例えば、V.A. Tron et al., Am. J. Pathol., 153, p. 597 (1998)を参照されたい。)
【０１３０】
図２(ｂ)は、ｐ５３応答性遺伝子として知られているサイクリンＧ、ｐ２１／ｗａｆ１、ｍｄｍ２、およびＧＡＰＤＨの、ＵＶで誘発されたトランス活性化をＰＦＴ−αが阻害することを示している。  図２(ｂ)は、以下のようなＣｏｎＡ細胞からのＲＮＡのノザンブロットを含むものである：ｕ／ｔ，未処理；ＰＦＴ，１０mMのＰＦＴ−αと８時間インキュベートされたもの；ＵＶ，ＵＶ処理(２５Ｊ／ｍ2)後８時間；ＵＶ＋ＰＦＴ，ＰＦＴ処理(１０mM)とＵＶ処理との組み合わせ。
【０１３１】
しかしながら、治療上有用であるためには、ｐ５３阻害剤は(ａ)低濃度での有効性、(ｂ)低毒性、(ｃ)副作用がない、(ｄ)可逆的なｐ５３阻害、(ｅ)付されたストレスからの細胞の回復を許容するのに充分な時間のｐ５３阻、害、ならびに(ｆ)癌の発生の劇的な増大を引き起こすことがないという特性を保有していなければならない。
【０１３２】
図３は、ドキソルビシンによって引き起こされたｐ５３依存性のアポトーシスを、ピフィスリン−アルファが抑制することを示している。  Ｅｌａ＋ｒａｓで形質転換されたマウス胚線維芽細胞(Ｃ８系、ｐ５３依存性のアポトーシスに対する感受性が高い)の同数を、０、０．４、および０．８μｇ／mlのドキソルビシンを含む６ウェルのプレートに播種し、ＤＭＳＯおよびＰＦＴ−α(１０μＭ)で４８時間処理し、メタノールで固定し、そしてクリスタルバイオレットで染色して、その後１％ＳＤＳを用いて色素を溶出した。  光学密度(５３０μＭ)を、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ３１１マイクロプレートリーダーを使用して定量した。  染色の強度は生存細胞の数を反映する。  その結果は、ドキソルビシンによって誘発されたＣ８細胞のアポトーシス死を、１０μＭのＰＦＴ−αが阻害したことを示すものである。
【０１３３】
同様の試験を実施して、エトポシド、タキソール、シトシンアラビノース、ＵＶ光、およびガンマ線放射によって引き起こされるｐ５３依存性のアポトーシスをピフィスリン−アルファが抑制することを示した(図１０を参照されたい)。  結果は、ドキソルビシンについて図３に示したものと同様であった。
【０１３４】
ガンマ線照射を用いた試験に関しては、驚くべきことに、構造式(Ｉ)または(ＩＩ)の化合物、例えば、ピフィスリン−アルファは照射からｐ５３欠損細胞(Ａ４)を保護しないが、これと反対に、２０μＭの濃度ではｐ５３欠損細胞の放射線感受性を高めることが見出された。  したがって、ＰＦＴ−αは、ｐ５３を含有する細胞におけるｐ５３活性を阻害し、それにより放射の効果からかかる細胞を保護する一方で、ｐ５３欠損癌細胞に関しては放射を増強するという、二重の予期せざる利点を示すのである。  図１０には、タキソールおよびＡｒａＣ(シトシンアラビノシド)で処理したｐ５３欠損細胞へのピフィスリン−アルファの選択的な毒性を示す。  このデータは、図３に関連して前記した、ＰＦＴ−αによって立証された予期せざる二重の効果を裏付けるものである。
【０１３５】
図４は、ＰＦＴ−αの抗アポトーシス活性がｐ５３依存性であること、すなわち、ＰＦＴ−αがｐ５３野生型細胞に特異的に発効することを示している。  ＵＶ照射に対するＣ８細胞の感受性は、ピフィスリン−アルファの存在に左右され、一方ＧＳＥ５６によって不活性化されたｐ５３を有するＣ８(優性の負の変異)の感受性は、ＰＦＴ−αの存在に左右されることはなかった。  したがって、ＰＦＴ−αは、遺伝毒性ストレス後のｐ５３欠損細胞の生存に対しては効果を有しない。
【０１３６】
図５(ａ)および(ｂ)は、ピフィスリン−アルファが、インビトロでラット胚線維芽細胞の加齢を遅延させること、すなわち、細胞成長の３日間における、示した濃度のピフィスリン−アルファによる前老化細胞の成長刺激を示している。  図５(ａ)には、播種された細胞の数に対する細胞成長が示されている。
【０１３７】
図６は、ｐ５３経路でのＰＦＴ−αの効果と、この経路におけるどの段階でＰＦＴ−αがｐ５３を標的とするかが示されている。  図６(ａ)は、一過性にｐ５３を発現しているＳａｏｓ−２細胞でのアポトーシスをＰＦＴ−αが阻害することを示している。  野生型ヒトｐ５３(中央および下部)を担持するか、またはインサートなし(上部)のいずれかのプラスミドの５倍過剰量と共に、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を発現するＤＮＡプラスミドで細胞をトランスフェクトした。  トランスフェクトされた細胞を、ＰＦＴ−α添加(下部)または無添加(上部および中央)にて維持した。  ｐ５３を発現するプラスミドでトランスフェクトされた蛍光細胞の大部分は、トランスフェクション後４８時間、アポトーシスを行う(中央)。  アポトーシスは、ＰＦＴ−αの存在下に阻害された(下部)。
【０１３８】
図６(ｂ)は、異なる濃度のＰＦＴ−α(０、１０、２０、および３０μＭ)の存在下にＵＶ照射された(２５Ｊ／ｍ2)ＣｏｎＡ細胞の溶解物におけるｐ５３タンパク質変異体のスペクトルを、二次元タンパク質ゲル電気泳動を用いて比較したものを示す。  図６(ｃ)は、ＰＦＴ−αは部分的に、そして用量依存的に、ＵＶ処理後のＣｏｎＡ細胞におけるｐ５３蓄積を阻害することを示している。  ＰＦＴ−αはＵＶ処理前に細胞に添加し、そして総細胞溶解物を１８時間後に調製した。
【０１３９】
図６(ｄ)は、ＰＦＴ−αがｐ５３の核および細胞質分布を変化させることを示している。  核および細胞質画分は、ＵＶ照射６時間後に、ＵＶ処理されたＣｏｎＡ細胞から単離した。  ｐ５３およびｐ２１waf1タンパク質をイムノブロッティングによって検出した。
【０１４０】
ｐ５３の核と細胞質の割合は、ＰＦＴ−αで処理された細胞では有意に減少していたが、ｐ２１waf1についてはそのようなことがなかった。
【０１４１】
図６(ｅ)は、ＰＦＴ−αがｐ５３のＤＮＡ結合活性に影響を及ぼさないことを示す。  詳細には、ＰＦＴ−αを含有する培地において生育された、未処理またはＵＶ照射されたＣｏｎＡ細胞のいずれかからの細胞溶解液を使用したゲルシフトアッセイの結果を示す。
【０１４２】
ゲルの右半分は、モノクローナル抗体Ｐａｂ４２１によるｐ５３結合ドメインのスーパーシフトを示す。  結合されたＤＮＡの量の減少は、ＰＦＴ−αの存在下でのｐ５３含量の全体的な減少に比例する。
【０１４３】
図６(ａ)における結果は、ＰＦＴ−αがｐ５３の下流で作用することを示している。  図６(ｂ)〜(ｅ)は、二次元タンパク質分析およびゲルシフトアッセイを組み合わせて行ったタンパク質イムノブロッティングによって判定したところ、ＤＮＡ損傷処理後のＣｏｎＡ細胞における、ｐ５３のリン酸化または配列特異的ＤＮＡ結合を変化させなかったことを示している。  しかしながら、ＰＦＴ−αはＵＶ照射によって誘発される核ｐ５３のレベルを僅かに低下させたが、細胞質のものを低下させることはなかった。  対照的に、ＰＦＴ−αはｐ５３誘発可能ｐ２１waf1タンパク質の核−細胞質比に影響を及ぼさなかった。  これらの結果は、ＰＦＴ−αが核のエクスポートもしくはインポートまたはその両方をモジュレートすることができるか、あるいは核ｐ５３の安定性を低下させることができることを示している。
【０１４４】
図７(ａ)〜(ｄ)は、ＰＦＴ−αの単回注射によるマウスの致死量の放射線に対する感受性へのインビボの効果を示すものである。  詳細には、図７はピフィスリン−アルファが、放射線によって誘発される死からマウスを保護することを示している。  この試験では、２つの異なる系のマウス(Ｃ５７ＢＬおよびＢａｌｂ(ｃ))を、全身へのガンマ線照射の致死および亜致死量で処理した。  (ｉ)未処理未照射マウス、(ｉｉ)ＰＦＴ−αの単回腹腔内(ｉ.ｐ.)注射を受けた未照射マウス、(ｉｉｉ)未処理ガンマ線照射マウス、および(ｉｖ)ガンマ線照射の直前にＰＦＴ−αで腹腔内注射されたマウスの間で比較を行った。
【０１４５】
ＰＦＴ−α処理によって、双方の系のマウスがガンマ線照射の６０％死滅用量(Ｃ５７ＢＬについては８Ｇｙ、そしてＢａｌｂ／ｃについては６Ｇｙ)から完全に救出された。
【０１４６】
対照の動物に対しては致死的な、より高い量の放射でも有意な保護が認められた(図７(ａ)〜(ｃ))。  ＰＦＴ−αが注射されたマウスは、薬物で前処理されなかった照射マウスよりも体重減少が少なかった(図７(ｄ))。  ＰＦＴ−αは致死的な照射からｐ５３のないマウスを保護しなかったので、ＰＦＴ−αがインビボでｐ５３依存性の機構を通じて作用することが確認された。
【０１４７】
図７のプロットにおいて、全身へガンマ線照射されたマウス(計６０)を４群に分けた。
【０１４８】
各群からのマウスのうち１０匹に、照射の５分前にピフィスリン−アルファ(２.２mg／kg)を腹腔内注射した。  各群の１０匹にはＰＦＴ−αの注射を行わなかった。  図７に、前記３群の各々のマウスに対する生存曲線を示す。  図７のデータは、一時的ｐ５３阻害剤が、有効な放射線保護剤であることと、ＰＦＴ−αが双方のマウス系で強い救出効果を有することを示している。  ＰＦＴ−αの注射は、８Ｇｙのガンマ線照射後にＣ５７ＢＬ６マウスによる体重の漸減を抑止した(非照射マウスで観察された体重の増加は、若い５週齡の動物の正常な成長を反映するものである)。  実験は、各実験の部分群あたり１０匹のマウスで少なくとも３回繰り返された。
【０１４９】
図８には、ピフィスリン−アルファがマウスにおいて、ｐ５３により媒介される成長停止をインビボで阻止することができる(単回腹腔内注射、２.２mg／kg)ことを示している。  ４週齡のｐ５３欠損マウスおよびｐ５３野生型(ｗｔ)マウスの全身にガンマ線照射を行った(１０Ｇｙ)。  ピフィスリン−アルファは、照射の５分前にｐ５３野生型動物の１匹に注射した。  14Ｃ−チミジン(１匹あたり１０ｍＣｉ)を照射後８時間に、各マウスへ腹腔内注射した。  マウスを照射後２４時間に屠殺し、クリオスタティックミクロトームを用いて薄切した全身(２５μｍの厚み)を調製し、そして組織における14Ｃの分布をモニターするためにＸ線フィルムに露光した。  図８は、代表的な切片のオートラジオグラムを示す。  矢印は、皮膚および腸における14Ｃ−チミジンの取り込みを示す。  試験の結果、ＰＦＴ−αの注射がガンマ線照射されたマウスの皮膚および小腸におけるアポトーシスを阻害することが示された。
【０１５０】
図８は、皮膚、腸、および他の様々な組織の14Ｃ標識化が、ｐ５３+/+マウスでは有意に減少したが、ｐ５３-/-マウスではそのようなことがなく、この効果のｐ５３依存性を反映していることを示す。  放射線で誘発される14Ｃ−チミジン取り込みの低下は、対照の照射マウスよりもＰＦＴ−α処理マウスにおいて明白さが劣り、ｐ５３活性のＰＦＴ−α阻害を反映していた。
【０１５１】
これらの結果は、全身へのガンマ線照射後に迅速に増殖している組織で、ＰＦＴ−αがＤＮＡ複製のｐ５３依存性の阻止を減弱することを示す。
【０１５２】
図９は、全身への１０Ｇｙのガンマ線照射後２４時間での、Ｃ５７ＢＬ６野生型マウス(ＰＦＴ処理(＋)および未処理(−))の小腸の上皮における組織形態およびアポトーシスを比較する写真を含むものである。  大規模なアポトーシスの領域を矢印で示す。  小腸の陰窩および絨毛において観察される広範囲にわたるアポトーシスは、照射前にＰＦＴ−αで処理されたマウスで抑止されていたが、これは図８に示すチミジン取り込みにおける変化に呼応するものである。
【０１５３】
図１１は、ＵＶ照射後のＣ８細胞生存の、ＰＦＴ−α適用の時間および期間への依存性を示す。  図１１は、ＵＶ照射(２５Ｊ／ｍ2)で処理されたＣ８細胞に、異なる時間間隔で添加されたＰＦＴ−αの抗アポトーシス効果の比較を含むものである。  １０μＭのＰＦＴ−αを、異なる時間間隔で培地に添加した(図１１(ａ))。  ＵＶ処理後４８時間で、ＭＴＴアッセイを使用して生存細胞の比率を評価し、これを図１１(ｂ)に示している。
【０１５４】
図１１(ａ)および(ｂ)は、前もって(１８時間まで)投与されて、Ｃ８細胞のＵＶ処理直前に除去された場合、ＰＦＴ−αは保護効果がないに等しいことを示す。  しかしながら、ＵＶ処理後にＰＦＴ−αと３時間という短時間インキュベーションすると、顕著な保護効果があり、２４時間のインキュベーションで最高の保護が達成された。  ＰＦＴ−αはＵＶ照射後３時間で投与された場合、ＵＶ照射細胞をアポトーシスから救出することはなかった。  これらの結果は、ＰＦＴ−αが効率的にｐ５３依存性のアポトーシスを阻害すること、そしてその効果が可逆的で一時的ｐ５３阻害剤の存在を必要とすることを示す。
【０１５５】
ＰＦＴ−αとインキュベートした後わずか３時間で多くの細胞は致死量のＵＶ照射で生存したので、ＵＶによって誘発されるアポトーシス死シグナルは数時間以内に優位に低減し、そして照射の２４時間以内で完全に消失するものである。
【０１５６】
図１２のプロットは、ＰＦＴ−αがｐ５３野生型細胞の長期間生存を可能とするもののガンマ線照射後のｐ５３欠損細胞についてはそうでないことを示している。  野生型ｐ５３を有するヒトの二倍体線維芽細胞と、リー-フラウメニ癌症候群患者からのｐ５３欠損線維芽細胞０４１系を、培地中に２０μＭのＰＦＴ−αを添加または非添加で、図示用量のガンマ線照射にて処理を行った(図１２(ｂ))。  ＰＦＴ−αは照射後４８時間で除去し、そして細胞をさらなる３日間成長させた。  その時までに、未照射細胞は完全な単層となるに至った。  クリスタルバイオレット染色アッセイを使用して、細胞数を概算した(１００％は、集密的な細胞培養物に対応する)。  破線は播種された細胞の数を示す。  ｐ５３野生型およびＥｌａ＋ｒａｓで形質転換されたｐ５３欠損マウス胚線維芽細胞(ＭＥＦ)、Ｃ８およびＡ４形質転換をそれぞれ、２０μＭのＰＦＴ−αの存在下および非存在下に指示量のガンマ線照射で処理して、照射後１２時間に低密度にて(プレートあたり１０3細胞)再播種した(図１２(ａ))。  成長コロニーの数を２週間で計数し、そして非照射対照について標準化した。
【０１５７】
図１３(ａ)は、全身への照射に付したマウスの効果を示す。  野生型(ｗｔ)マウスおよびｐ５３欠損マウスの双方を照射した。  野生型マウスの一群を、ＰＦＴ−αで処理した。  図１３(ａ)は、ＰＦＴ−αで処理したマウスが照射後３００日に生存したことを示す。  これに対して、１５匹の未処理野生型マウスは１００日以内に死亡した。  ｐ５３欠損型マウスは、約１２５日間影響を受けず、その後次なる２５〜３０日以内に死亡した。
【０１５８】
図１３(ｂ)は、ＰＦＴ−βの同様の保護効果を示す。
【０１５９】
図１４は、Ｘ−ｇａｌで染色したＣｏｎＡ細胞の顕微鏡写真を含み、そしてドキソルビシンで処理されたＣｏｎＡ細胞での、ｐ５３抑制におけるピフィスリン-アルファおよび８６Ｂ１０についての結果を示す。  ８６Ｂ１０はＰＦＴ−αと類似であるが弱いｐ５３阻害効果を呈する。
【０１６０】
図１５は、ＰＦＴ−βの投与および非投与にて、シクロホスファミド(ＣＴＸ)で処理したＣ５７ＢＬマウスについての、日数に対する腫瘍容量のプロットである。  マウスは第０、１、および２日にＣＴＸで処理され、そして腫瘍容量を１６日間モニターした。  ＰＦＴ−βで処理されたマウスは、腫瘍成長に実質的な減少を呈した。
【０１６１】
前記したとおりＰＦＴ−αを用いて、図１〜図１５に示す試験および実験を、ＰＦＴ−βを用いて繰り返した。  ＰＦＴ−βを使用した試験からの結果は、ＰＦＴ−αを使用した試験からの結果と本質的に同様であった。  しかしながら、図１６に示すように、ＰＦＴ−βの毒性はＰＦＴ−αの毒性よりも実質的に低かったので、ＰＦＴ−βは好ましい一時的なｐ５３阻害剤である。
【０１６２】
前記の試験および実験は、ＰＦＴ−αおよびＰＦＴ−βのような一時的なｐ５３阻害剤が、ｐ５３活性化の下流で作用することを示す。  ＰＦＴ−αおよびＰＦＴ−βはまた、ｐ５３の転写後修飾またはｐ５３のＤＮＡ結合親和性のいずれかに影響することはない。
【０１６３】
重要なことは、ＰＴＦ−αおよびＰＦＴ−β、ならびにその他の一時的なｐ５３阻害剤は、ｐ５３の核での蓄積を減じることが試験から示されるものであり、このことが構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物などの一時的なｐ５３阻害剤の治療における用途に対する基礎として役立つのである。
【０１６４】
ｐ５３の抑制は、典型的には細胞の生存を結果として引き起こし、これはそうでなければｐ５３によって排除されたものであって、新しい癌の発生の危険性を高めることができるのである。  例えば、ｐ５３欠損マウスは、放射線によって誘発された腫瘍新生に対して極めて感受性が高い。  しかしながら、致死的なガンマ線照射から照射後７ヶ月でＰＦＴ−αによって救出された３０匹の生存マウスの群において、腫瘍も他の病理学的傷害もまったく認められなかった。  このように、ｐ５３活性の一時的な抑制は、癌の素因という面からｐ５３欠損と異なっている。
【０１６５】
構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物のような一時的なｐ５３阻害剤は、有効且つ可逆的にｐ５３機能を阻害する。  したがって、ゲノムストレスによって惹起されるアポトーシス死または不可逆的成長停止から、ｐ５３を有する細胞を救出するために、一時的なｐ５３阻害剤を適用することができるのである。  重要なことは、一時的なｐ５３阻害剤の細胞効果は可逆的であって短時間継続するもので、したがって、ｐ５３抑制は、かかる阻害剤の定常的な存在を本質的に必要とするのである。  さらに、本発明の阻害剤のインビボの効果は、ｐ５３の存在に依存する。
【０１６６】
構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物、特にＰＦＴ−αおよびＰＦＴ−βは、(ａ)迅速に増殖しているマウス組織におけるｐ５３依存性の放射線誘発された成長停止を抑制し、(ｂ)単回の腹腔内注射を使用したガンマ線照射の致死容量からマウスを救出し、(ｃ)化学療法の毒性を減じ、(ｄ)ｐ５３欠損マウス腫瘍の化学療法または放射線療法の効率を低減させることはなく、(ｅ)照射された動物における腫瘍の発生率上昇をもたらさず、これらにより、一時的なｐ５３阻害剤の治療用途を示すものである。
【０１６７】
ＰＦＴ−αおよびＰＦＴ−βを使用した前記の試験は、機能的なｐ５３を喪失しているヒト癌に対する放射線療法または化学療法の副作用を低減する、一時的なｐ５３阻害剤の治療用途を示すものである。  ＰＦＴ−αおよびＰＦＴ−βの効果はｐ５３依存性であるので、これら化合物は、かかる腫瘍の処置に対する感受性に影響を及ぼさない。  事実、ＰＦＴ−αの腹腔内注射は、ｐ５３+/+ヌードマウスにおけるｐ５３欠損腫瘍異種移植の放射線応答を変化させることがなかった。
【０１６８】
したがって、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物のような一時的なｐ５３阻害剤は、例えば、以下の適用において使用することができる。
【０１６９】
(ａ)ｐ５３活性に関連する種々のストレス(例えば、抗癌放射線療法および化学療法、虚血、卒中、高熱症等)に対する組織応答の病理学的な結果を低減するためにｐ５３抑制を使用する治療；
(ｂ)ｐ５３経路分析およびモジュレーションを研究するためのツールとしての、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物、例えば構造式(Ｖ)または(ＶＩ)の化合物などといった一時的なｐ５３阻害剤の適用；
(ｃ)種々のストレスの後の死亡から細胞を救出するための薬物としての、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物などの一時的なｐ５３阻害剤の投与；
(ｄ)抗癌治療に対してｐ５３欠損細胞を高感度にするための薬物としての、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物などの一時的なｐ５３阻害剤の投与；
(ｅ)組織加齢を抑制するための潜在的抗老化薬物としての、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物などの一時的なｐ５３阻害剤の投与；
(ｆ)ｐ５３経路分析およびモジュレーションのためのツールとしてｐ５３依存性のトランス活性化を抑制するための、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物などの一時的なｐ５３阻害剤の適用；
(ｇ)インビボでの放射線保護剤としての、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物などの一時的なｐ５３阻害剤の投与；
(ｈ)抗癌治療の副作用、急性炎症、傷害(例えば、熱傷および中枢神経系外傷)、細胞加齢、高熱症、発作、移植前の移植組織および臓器、骨髄移植のための宿主の準備、ならびに低酸素症(例えば、虚血および卒中)を含めた、異なる病理学的環境にて種々のストレスから細胞を保護するための、インビボでの、構造式(Ｉ)から(ＩＶ)までの化合物などの一時的なｐ５３阻害剤の投与。
【０１７０】
明らかに、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、以上に述べた本発明の多くの修飾および変更をなすことが可能であり、したがって、添付の請求の範囲に示されるごとき限定しか、本発明に付されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】ｐ５３阻害剤に対する化学ライブラリーのスクリーニングを示す図である。
【図２】(ａ)および(ｂ)は、ＵＶ照射されたＣｏｎＡ細胞における１０、２０、および３０μＭのＰＦＴ−αでのβ−ガラクトシダーゼ活性の依存性、ならびにｐ５３応答性遺伝子のＰＦＴ−α阻害をそれぞれ示す図である。
【図３】ＰＦＴ−α投与による、ｐ５３依存性アポトーシスの抑制を示す図である。
【図４】ｐ５３野生型細胞に対するＰＦＴ−αの特異性を示す図である。
【図５】(ａ)および(ｂ)は、ＰＦＴ−αがインビトロで、ラット胚線維芽細胞の加齢を遅延させることを示す図である。
【図６】(ａ)〜(ｅ)は、ｐ５３経路に対するＰＦＴ−αの効果を示す図である。
【図７】(ａ)〜(ｄ)は、ガンマ線照射に供されたマウス、ならびにＰＦＴ−αで処理したものもしくは処理しないものについての、照射後の日数に対する生存動物のプロットと、照射後の日数に対する重量(％)のプロットを含む図である。
【図８】インビボにおける、ｐ５３によって媒介される成長停止を阻止するＰＦＴ−αの効果を示すオートラジオグラムを含む図である。
【図９】全身へのガンマ線照射後２４時間での、ｐ５３野生型マウスの小腸を示す図である。
【図１０】タキソールおよびＡｒａＣで処理したｐ５３欠損細胞に対する、ＰＦＴ−αの選択的な毒性を示す図である。
【図１１】(ａ)および(ｂ)は、ＵＶ照射後のＣ８細胞の生存に対する、ＰＦＴ−αの効果、および適用時間を示す図である。
【図１２】(ａ)および(ｂ)は、Ｃ８およびＡ４型細胞への照射量、ならびにヒト二倍体線維芽細胞への照射量に対する、コロニー数のプロットであり、ＰＦＴ−αの効果を示す図である。
【図１３】(ａ)および(ｂ)は、照射後の日数に対する動物数のプロットであり、ＰＦＴ−αおよびＰＦＴ−βで処理された動物では癌発生の促進を伴わないことを示す図である。
【図１４】ドキソルビシンで処理したＣｏｎＡ細胞における、ＰＦＴ−αおよび８６Ｂ１０によるｐ５３の抑制を示す図である。
【図１５】ＰＦＴ−βを投与して、および非投与にて、シクロホスファミドでの処理に付したＣ５７ＢＣマウスについての、日数に対する腫瘍容量のプロットを示す図である。
【図１６】ＰＦＴ−αとＰＦＴ−βの毒性を比較している図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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