(57)【要約】 【課題】対象ウェル内からその目標細胞のみを確実に採取できる安定した細胞回収装置および方法をの提供。【解決手段】マイクロウェル基板上の複数のマイクロウェルのうち対象とするウェル内から目標細胞を採取するためのノズルを備えた細胞回収装置であって、前記ウェルの外径より大きい内径の先端開口を有するノズルと、該ノズル内に挿通状態で配置され、前記ウェルの内径より小さい外径を有するピン部材と、該ピン部材を、前記ノズルの先端開口から予め定められた長さだけ突出可能に前記ノズル内でノズル中心軸方向に沿って相対移動させるピン駆動装置と、を備えた。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロウェル基板上の複数のマイクロウェルのうち対象とするウェル内から目標細胞を採取するためのノズルを備えた細胞回収装置であって、
前記ウェルの外径より大きい内径の先端開口を有するノズルと、
該ノズル内に挿通状態で配置され、前記ウェルの内径より小さい外径を有するピン部材と、
該ピン部材を、前記ノズルの先端開口から予め定められた長さだけ突出可能に前記ノズル内でノズル中心軸方向に沿って相対移動させるピン駆動装置と、を備えていることを特徴とする細胞回収装置。
【請求項２】
前記ノズルをピン部材と共に一体的に前記マイクロウェル基板上で垂直方向に上下移動させる昇降装置を備えていることを特徴とする請求項１に記載の細胞回収装置。
【請求項３】
前記請求項１又は２に記載の細胞回収装置による細胞回収方法であって、
ノズルとノズル内に挿通状態で配置されたピン部材とをマイクロウェル基板上の対象ウェル上に位置決めする工程と、
前記ピン部材を内在させた状態でノズルを下降させ、ノズル先端開口を対象ウェルを囲むようにそのウェル外周の基板表面に当接させる工程と、
ノズルの前記ウェルを囲む当接状態を維持しながら前記ピン部材をノズル先端開口からウェルの深さ相当分だけ突出させてウェル内の細胞にピン先端部を押し当てて付着させる工程と、
先端部に細胞を付着させたピン部材をノズルと共に回収側へ移動させて細胞を回収する工程と、を備えていることを特徴とする細胞回収方法。
【請求項４】
前記細胞の回収工程は、回収用溶液中にピン部材の先端部を浸けて揺動させ、細胞を溶液中に開放する工程を有することを特徴とする請求項３に記載の細胞回収方法。
【請求項５】
前記ノズルとピン部材のマイクロウェル基板上での位置決め工程の前に、予めノズル先端開口内でピン部材の先端部に細胞を接着させるための粘着物質を付着させておく工程を更に備えていることを特徴とする請求項３又は４に記載の細胞回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロウェルチップのウェル内に分注された液中の特定細胞のみを回収するための装置と該装置による細胞回収方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウェル径が１０μｍ程度のマイクロウェルチップに分注された各ウェル内の液中細胞から所望の細胞のみを回収する方法として、従来は先端の細いノズルを正確に対象ウェルの直上に位置決めし、該ノズル先端開口を介してノズル孔内に液ごと細胞を強制的に吸引あるいは毛細管力により吸い上げて回収する方法が一般的であった（例えば、特許文献１、２参照。）。
【０００３】
このような細胞回収方法は、細胞にダメージを与えることなく容易に回収側へ細胞を吐出することができることから、細胞回収の自動化に最も適したものと言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３８９８５２６号公報
【特許文献２】特開２００７−３２６０７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のような従来の吸引回収方式においては、ウェル内の液中に沈んだ細胞を吸引する際に、適度な液流を効果的に細胞に与えることが必要であった。ただし、個々の細胞のウェル付着状態は一様でなく、この液流によって、狙った細胞が沈んでいるウェル以外の他のウェル内からも細胞を採取してしまうことがあった。このような目標細胞以外の細胞まで回収してしまうと、後の遺伝子解析や培養等の工程へ供する前に、目標細胞を選別する手間が必要となり、工程全体が煩雑で非効率的となってしまう。
【０００６】
液流の量や流れの方向を調節することによって改善は可能であるが、安定して目標細胞のみを採取することは困難であり、更に吸引後の回収側へのノズル移動の途中で液の流出と共に回収細胞も落としてしまう危険もあった。
【０００７】
また、上記の吸引回収方式では、目標細胞が浮遊性の細胞の場合は容易にノズル孔内に吸い上げ回収できるが、ＥＳ細胞などの接着性細胞が目標細胞である場合には、細胞がウェル側壁に付着していると液流と共に吸引するだけで確実に回収するのは困難であった。
本発明の目的は、上記問題点に鑑み、対象ウェル内からその目標細胞のみを確実に採取できる安定した細胞回収装置および方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、請求項１に記載の発明に係る細胞回収装置は、マイクロウェル基板上の複数のマイクロウェルのうち対象とするウェル内から目標細胞を採取するためのノズルを備えた細胞回収装置であって、
前記ウェルの外径より大きい内径の先端開口を有するノズルと、
該ノズル内に挿通状態で配置され、前記ウェルの内径より小さい外径を有するピン部材と、
該ピン部材を、前記ノズルの先端開口から予め定められた長さだけ突出可能に前記ノズル内でノズル中心軸方向に沿って相対移動させるピン駆動装置と、を備えているものである。
【０００９】
請求項２に記載の発明に係る細胞回収装置は、請求項１に記載の細胞回収装置において、前記ノズルをピン部材と共に一体的に前記マイクロウェル基板上で垂直方向に上下移動させる昇降装置を備えているものである。
【００１０】
請求項３に記載の発明に係る細胞回収装置は、請求項１又は２に記載の細胞回収装置による細胞回収方法であって、
ノズルとノズル内に挿通状態で配置されたピン部材とをマイクロウェル基板上の対象ウェル上に位置決めする工程と、
前記ピン部材を内在させた状態でノズルを下降させ、ノズル先端開口を対象ウェルを囲むようにそのウェル外周の基板表面に当接させる工程と、
ノズルの前記ウェルを囲む当接状態を維持しながら前記ピン部材をノズル先端開口からウェルの深さ相当分だけ突出させてウェル内の細胞にピン先端部を押し当てて付着させる工程と、
先端部に細胞を付着させたピン部材をノズルと共に回収側へ移動させて細胞を回収する工程と、を備えているものである。
【００１１】
請求項４に記載の発明に係る細胞回収方法は、請求項３に記載の細胞回収方法において、前記細胞の回収工程は、回収用溶液中にピン部材の先端部を浸けて揺動させ、細胞を溶液中に開放する工程を有するものである。
【００１２】
請求項５に記載の発明に係る細胞回収方法は、請求項３又は４に記載の細胞回収方法において、前記ノズルとピン部材のマイクロウェル基板上での位置決め工程の前に、予めノズル先端開口内でピン部材の先端部に細胞を接着させるための粘着物質を付着させておく工程を備えているものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明においては、マイクロウェル基板のウェルの外径より大きい内径の先端開口を有するノズル内に、前記ウェルの内径より小さい外径を有するピン部材が挿通状態で配置され、ピン駆動装置によってピン部材をノズルの先端開口から予め定められた長さだけ突出可能にノズル内でノズル中心軸方向に沿って相対移動できるものであるため、ピン部材を内在させたノズルの先端開口を、目標細胞が沈んでいる対象ウェルの開口を囲むようにウェル外周の基板表面に当接させた状態で、ピン駆動装置を制御してピン部材をノズル先端開口からウェル内底部に向けてその深さ相当分突出させるだけで、ピン部材の先端部がウェル内の目標細胞に押し当てられ、その付着性によって細胞がピン部材先端部に付着し、該細胞をウェル外に取り出すことができるため、従来のような液流を用いた吸引により対象ウェル以外のウェル内の細胞まで吸い上げてしまうことなく確実に目標細胞のみを回収できるという効果がある。
【００１４】
これによって、後の遺伝子解析や培養、各種反応等の工程に供する前に目標細胞の選別という煩雑で手間のかかる作業は必要なくなり、工程全体の効率化が図れる。また、液流の吸い込みによる細胞回収の際の余分な液体の吸い込みもないため、回収吐出側で不要な液量も抑えられ、次工程への影響が低減されるという効果もある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例による細胞回収装置の概略構成図である。
【図２】図１の細胞回収装置による細胞回収工程を示す説明図であり、（ａ）〜（ｄ）は各過程を示すノズル先端の部分拡大断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の細胞回収装置は、マイクロウェル基板のウェルの外径より大きい内径の先端開口を有するノズルと、該ノズル内に挿通状態で配置され、前記ウェルの内径より小さい外径を有するピン部材を備え、ピン駆動装置によって、ピン部材をノズルの先端開口から予め定められた長さだけ突出可能にノズル内でノズル中心軸方向に沿って相対移動できるものであるため、ピン部材を内在させたノズルの先端開口を、目標細胞が沈んでいる対象ウェルの開口を囲むようにウェル外周の基板表面に当接させた状態で、ピン駆動装置を制御してピン部材をノズル先端開口からウェル内底部に向けてその深さ相当分突出させるだけで、ピン部材の先端部がウェル内の目標細胞に押し当てられ、その付着性によって細胞がピン部材先端部に付着し、該細胞のみをウェル外に取り出して回収することができる。
【００１７】
従って、本発明の細胞回収装置によれば、従来のような液流を用いた吸引が必要ないため、対象ウェルの開口周縁にノズルの先端開口を正確に当接させられれば、対象ウェル以外のウェル内の細胞まで吸い上げてしまうことなく確実に目標細胞のみを回収することができる。これによって、後の遺伝子解析や培養、各種反応等の工程に供する前に目標細胞の選別という煩雑で手間のかかる作業は必要なくなり、工程全体の効率化が図れる。また、液流の吸い込みによる細胞回収の際の余分な液体の吸い込みもないため、回収吐出側で不要な液量も抑えられ、次工程への影響が低減される効果もある。
【００１８】
なお、ピン駆動装置として、例えば数μｍ単位でピン部材の移動、位置決め制御できる小型アクチュエータを用いれば、ウェル外周の基板表面に先端開口が当接されたノズルからウェル内でその深さ相当分だけピン部材を正確に突出させることができる。なお、ピン部材は、必ずしも全長に亘って同一径である必要はなく、少なくともノズル先端開口から突出する部分を含む先端部領域がウェル内径より小さい外径であれば良く、他の領域は、ノズル内での相対移動が可能な寸法であれば良い。
【００１９】
従って、予めこの突出量を設定しておけば、このピン駆動装置によって少なくともピン部材の突出による目標細胞の付着回収工程は自動化が可能である。しかも、このピン部材の突出量は、同一基板内の他のウェルにおいても共通となるため、同じ設定で次の対象ウェル内からの次の目標細胞の回収にも採用でき、連続的な細胞回収工程も効率的に行うことが可能となる。
【００２０】
なお、ノズル先端開口の基板表面当接時には、ピン部材はノズル先端開口からほとんど突出することなくノズル孔内に内在状態とするが、できれば、ピン部材の先端位置がノズルの先端開口面にほぼ一致していることが望ましい。この状態を初期状態とすれば、正確に予め設定されたウェル深さ相当分だけのピン部材の突出で、ピン部材のウェル内挿入量が目標細胞に接触できる必要充分なものとなる。なお、本発明で云うウェル深さ相当分とは、ウェル深さに正確に一致させる必要はなく、ほぼ該深さに近いが若干小さい程度の距離で良い。
【００２１】
そこで、ノズル下降前に、この初期状態を確実に得るように前記ピン駆動装置による調整を行うが、このとき、確実に初期状態が得られるように、画像手段によってノズルの先端に対するピン部材の位置関係を確認することが好ましい。画像手段としては、ノズル先端部を水平（横）方向あるいは底面から観察する顕微鏡装置を利用したものが簡便である。
【００２２】
さらに、ノズルをピン部材と共に一体的に前記マイクロウェル基板上で垂直方向に上下移動させる昇降装置を備えれば、該昇降装置の制御によってノズルの先端開口の基板表面への当接を自動制御できるものとすれば、さらなる細胞回収工程の自動化が図れる。
【００２３】
この昇降装置としては、例えば、鉛直方向に延びるガイドに沿って上下方向に摺動可能な支持部を介してノズルをガイドに装着すると共に、ノズル内に挿通状態で配置されたピン部材をノズル中心軸方向に上下移動させるピン駆動装置を支持部に搭載する構成とすることによって、ノズルをピン部材と一体的に昇降させることができる。
【００２４】
正確なノズルの基板表面当接位置までの下降移動は、例えば、基板表面から予め定められた距離だけ上方の位置を初期高さ位置に設定し、該初期高さ位置から前記ガイドに沿ったノズルの変位量をエンコーダで読み取って位置制御する制御機構を備えればよい。
【００２５】
また、ノズルを対象ウェルの直上に位置決めする工程も、ノズルを昇降装置ごと基板に対する水平方向での相対移動を制御する機構、例えばＸ−Ｙステージ機構等によって行えば、細胞回収工程のほぼ全体の自動化も可能である。この機構と、前記ノズルの昇降装置を駆動制御すれば、ピン部材の先端に目標細胞を接着させた状態のままノズルを上昇させ、回収側へ水平移動させ、再びノズルを下降させてピン部材先端を所定の回収位置へ送ることができる。
【００２６】
以上の構成を備えた本発明の細胞回収装置によれば、内部にピン部材が挿通状態で配置されたピン部材をマイクロウェル基板上の対象ウェル上に位置決めする工程と、ピン部材を内在させたノズルを下降させ、ノズル先端開口を対象ウェルを囲むようにそのウェル外周の基板表面に当接させる工程と、ノズルの前記ウェルを囲む当接状態を維持しながらピン部材をノズル先端開口からウェルの深さ相当分だけ突出させてウェル内の細胞にピン先端部を押し当てて付着させる工程と、先端部に細胞を付着させたピン部材をノズルと共に回収側へ移動させて細胞を回収する工程とを行う方法によって、効率的に目標細胞だけを対象ウェルから確実に回収することができる。
【００２７】
なお、細胞回収工程としては、回収用溶液中にピン部材の先端部を浸けて揺動させ、細胞を溶液中に開放する方法が簡便である。
【００２８】
ただし、目標細胞が接着性の無いものである場合、ピン部材を押し当てただけではその先端に細胞を付着させて回収することが困難であるため、目標細胞を接着させるための粘着物質を、予めノズルの基板上での位置決め工程の前にピン部材の先端に付着させれば良い。
【００２９】
この粘着物質は、細胞との接着性があり、回収用溶液に溶解して容易に液中に細胞を開放できるものであれば良く、例えば、ポリビニルアルコール、天然由来デンプン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロール、メチルセルロール、ポリアクリル酸系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド等からなる群より選択されるものが適している。
【実施例１】
【００３０】
本発明の一実施例による細胞回収装置を図１の概略構成図に示す。本細胞回収装置１は、ノズル３と、該ノズル３をその先端部領域が外部に露出した状態で固定された支持部としてのノズル装置２と、このノズル装置２を、ノズル３の先端部開口が下方に向いたままノズル中心軸が鉛直方向に沿う状態でガイド４に沿って上下方向に摺動させる昇降装置（不図示）とを備えたものである。なお、ノズル装置２は上部がバネ８を介して固定ピン９に固定されており、常に上方向に付勢されており、昇降装置による下降は該バネ８の付勢力に抗してなされる。
【００３１】
ノズル３内には、極細のピン部材６が挿通状態で配置され、ピン部材６をノズル先端開口から突出可能にノズル内でノズル中心軸方向に沿って相対移動させるピン駆動装置としてのマイクロアクチュエータ７がノズル装置２に搭載されている。従って、ノズル装置２の前記昇降装置によるガイド４に沿った昇降に伴って、ノズル３とピン部材６とは一体的に上下移動されるものである。このマイクロアクチュエータ７は、ノズル３に対してピン部材６を数μｍ単位で上下鉛直方向に沿って相対移動できるものである。
【００３２】
また、本装置１には、ノズル装置２の移動量をノズル３の変位量として検出するエンコーダ５を備えており、この検出結果に基づいて、昇降装置は制御装置（不図示）によって、ノズル３の変位量が所望の下降位置に相当するようにフィードバック制御される。
【００３３】
以上の構成を備えた細胞回収装置１を用いて浮遊性細胞の回収を粘着部室としてポリビニルアルコールを用いて行った場合を図２の工程図をもって説明する。本実施例では、ウェル１１が、直径１０μｍ、深さ１５μｍであり、先端開口内径が１５μｍのセラミックス製ノズル３の内部に先端部径が数μｍの真鍮製ピンが挿通されているものである。また、ピン部材６の突出量は１２μｍ程度に設定した。
【００３４】
まず、初期状態として、ピン部材６がノズル孔内に内在し、ピン部材６の先端がほぼノズル３の先端開口面位置にあることを顕微鏡装置等の画像手段によって確認する。ピン部材６の先端がこの初期状態からずれている場合は、マイクロアクチュエータ７により位置調整を行い初期状態を得る。
【００３５】
この初期状態にあるノズル３の先端を２０ｗｔ％のポリビニルアルコール液（以下、ＰＶＡ液と記す）２０に浸漬し、ノズル３の先端孔内に少量のＰＶＡ液を含ませることによってピン部材６の先端にＰＶＡ液を付着させる（図２（ａ））。
【００３６】
このノズル３にＰＶＡ液を含ませた状態で、ノズル３がマイクロウェル基板１０の対象ウェル１１の直上に来るように、ノズル装置２を水平移動させて位置決めする。その後、昇降装置の駆動制御によりノズル３を初期高さ位置から所定変位量分だけ下降させてノズル３の先端開口を対象ウェル１１を囲むようにそのウェル外周の基板１０表面に当接させる（図２（ｂ））。
【００３７】
次に、マイクロアクチュエータ７を駆動制御してピン部材６を下方へ移動させ、先端部を１２μｍだけノズル先端開口から突出させて少量のＰＶＡ液と共にウェル１１内に挿入する（図２（ｃ））。この挿入によってＰＶＡ液を介して目標細胞１２がピン部材６の先端に接着される。
【００３８】
ピン部材６の先端に目標細胞１２を接着させた状態でノズル３を上昇させ、次いで回収側へ水平移動させた後、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）用チューブなどの次工程用の回収容器３０へ向けてノズル３を再び下降させ、ピン部材６の先端を回収容器３０内の回収用溶液３１中に浸漬する（図２（ｄ））。この状態でノズル３を左右時揺動させることにより、ＰＶＡ液が該溶液３１に溶解し、溶液３１中に目標細胞が開放され、細胞回収がなされる。
【００３９】
以上のように、本実施例によれば、液流を伴った吸引なしで目標細胞だけを確実に対象ウェルから回収することができる。このとき、細胞回収に伴う液体は、ピン部材先端部に付着してくる僅かな細胞保存液だけで済むため、次工程の解析操作等での混入液は非常に少なく、液流と共に吸引していた従来方法に比べて分析精度の向上が見込まれ、フローチップへの直接注入の場合にも有利である。これは、例えばガンやインフルエンザのような抗原に特異的に作用するリンパ球を回収して抗体創薬に用いたり、あらゆる組織のもとになるＥＳ細胞などの付着性細胞の取り扱いの使用にも有効である。
【００４０】
なお、以上の実施例においては、ピン部材の先端部に細胞を接着させるために粘着部材を用いる場合を示したが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、電荷や磁化などの作用を利用して細胞接着せることも可能である。
【符号の説明】
【００４１】
１：細胞回収装置
２：ノズル装置
３：ノズル
４：ガイド
５：エンコーダ
６：ピン部材
７：マイクロアクチュエータ
８：バネ
９：固定ピン
１０：マイクロウェル基板
１１：ウェル
１２：目標細胞
２０：ＰＶＡ液
３０：回収容器
３１：回収用溶液
【図１】
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【図２】
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