(57)【要約】      （修正有）【課題】システインと低濃度の窒素を含む発酵培地（天然バイオマス）を用い、簡便な操作方法で、高い生産性と光学純度のＤ−乳酸を安定的かつ安価に生産すると共に、副生産物の濃度を低減することができる、Ｄ−乳酸の製造方法を提供する。【解決手段】スポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌を用いた発酵法によるＤ−乳酸の製造方法であって、０．６ｍｇ／Ｌ以上のシステインおよび０．１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下のシステイン以外の窒素源を含む発酵原料を用いたＤ−乳酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌を用いた発酵法によるＤ−乳酸の製造方法であって、０．６ｍｇ／Ｌ以上のシステインおよび０．１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下のシステイン以外の窒素源を含む発酵原料を用いたＤ−乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記細菌がスポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）である請求項１に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵法によるＤ−乳酸の製造方法に関する。さらに詳しくは、スポロラクトバチルス属に属する細菌を用いた発酵法によるＤ−乳酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生分解性ポリマーであるポリ乳酸は、ＣＯ２問題やエネルギー問題の顕在化と共にサスティナビリティー（持続可能性）およびライフサイクルアセスメント（ＬＣＡ）対応型製品として強い注目を浴びており、その原料である乳酸には効率的で安価な製造法が求められている。
【０００３】
現在主に生産されているポリ乳酸はＬ−乳酸ポリマーであるが、乳酸にはＬ−乳酸とＤ−乳酸の２種類の光学異性体があり、Ｄ−乳酸についてもポリマー原料、農薬および医薬の中間体として近年注目が集まりつつある。
【０００４】
自然界には乳酸菌などの乳酸を効率良く生産する微生物が存在し、それらを用いた乳酸製造法が既に確立している。例えば、Ｌ−乳酸を効率良く生産させる細菌として、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）などがあり（特許文献１と２参照。）、またＤ−乳酸を効率良く生産させる細菌として、バシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）などが高い光学純度でＤ−乳酸を生産することが知られている（特許文献３参照。）。
【０００５】
また、自然界に存在する乳酸菌の他、乳酸合成酵素を組み込んだ微生物による乳酸の製造方法も知られており、ゲノム情報が豊富で、遺伝子組換え宿主としての実績が十分にある酵母や大腸菌でＤ−乳酸を生産させる試みがなされている。例えば、大腸菌を組換え宿主として、Ｄ−乳酸を生産させた試みが提案されている（特許文献４参照。）。また、既知のラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｍｕ）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより酵母によってＤ−乳酸を生産させようとする試みも存在している（特許文献５参照。）。
【０００６】
しかしながら、これまでのＤ−乳酸の発酵生産では、発酵培地に窒素源が多く含まれることによる高濃度の副生産物の産生が問題となっている。このような高濃度の副生産物は、続く精製プロセスでの費用を高める原因になり、全乳酸生産工程でのコストを上げる可能性があって懸念される。そのため、回分式発酵法または流加式発酵（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh）法、連続発酵などのいずれの発酵法でも、より安価でのかつ高収率でのＤ−乳酸の生産や高い光学純度のＤ−乳酸の生産と共に副生産物の生産抑制することで更なる効率的な生産方法が望まれ、また飛躍的な生産速度の向上が求められていた。
【特許文献１】特開２００７−２１５４２７号公報
【特許文献２】特開２００７−２１５４２８号公報
【特許文献３】特開２００３−０８８３９２号公報
【特許文献４】特開２００５−１０２６２５号公報
【特許文献５】特開２００２−１３６２９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明の目的は、微生物を用いた発酵法によってＤ−乳酸を製造するにあたり、安定した高収率および高い光学純度のＤ−乳酸の生産と共に副生産物の生産を抑制できるＤ−乳酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、発酵原料に含まれるシステインおよびシステイン以外の窒素源を調節することで減らし、本発明を完成するに至った。すなわち、本願発明は以下の通りである。
（１）スポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌を用いた発酵法によるＤ−乳酸の製造方法であって、０．６ｍｇ／Ｌ以上のシステインおよび０．１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下のシステイン以外の窒素源を含む発酵原料を用いたＤ−乳酸の製造方法。
（２）前記細菌がスポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）である（１）に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、発酵生産物であるＤ−乳酸をより低コストで安定に生産することと共に副生産物の少ない高光学純度のＤ−乳酸の生産が可能となる。本発明によるＤ−乳酸の製造方法により得られたＤ−乳酸は、例えば、酸味料、洗浄剤および医薬品、更にはポリ乳酸樹脂等の原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、スポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属し、Ｄ−乳酸を生産する能力を有する細菌（以下、Ｄ−乳酸生産菌ともいう）を用いた発酵法によるＤ−乳酸を製造する方法であって、０．６ｍｇ／Ｌ以上のシステインおよび０．１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下のシステイン以外の窒素源を含む発酵原料を用いたＤ−乳酸の製造方法である。
【００１１】
発酵原料中のシステインは、Ｄ−乳酸生産菌の増殖または生育にとって重要であるが、本発明者らは、発酵原料中に０．６ｍｇ／Ｌ以上のシステインを加えることで、副生産物の生成が抑制される効果があり、発酵原料中のシステイン濃度が０．６ｍｇ／Ｌ未満である場合、副生産物が多く生成されてしまうことを見出した。ここでいう副生産物としては、有機酸類とアルコール類などが挙げられ、例えば、有機酸としては、ギ酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸およびクエン酸等が挙げられ、また、アルコールとしては、エタノール、ブタンジオール等が挙げられ、これら副生産物についてはＨＰＬＣまたはＧＣで測定可能である。本発明における発酵原料中のシステイン濃度の上限としては特に限定はないが、微生物の良好な生育と高濃度の乳酸生産、トータルコストの観点から、２０００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。また、発酵原料中の好ましいシステイン濃度としては０．６〜１５００ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは０．６２〜１０００ｍｇ／Ｌである。
【００１２】
また、システイン以外の窒素源はＤ−乳酸生産菌の良好な生育にとって重要であるが、本発明者らは前記システインの濃度と併せて発酵原料中のシステイン以外の窒素源の濃度を０．１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下とすることで、副生産物の生産が抑制されることを見出した。ここでいうシステイン以外の窒素源とは、具体的には、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類あるいは有機窒素源（例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、システイン以外のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ポリペプトンＳ等のタンパク質）、発酵原料中の炭素源（例えば、澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、サトウキビ由来のケーンジュース、ケーンジュース抽出物もしくは濃縮液、ケーンジュースからの精製もしくは結晶化された原料糖または精製糖）に含まれるアミノ酸またはタンパク性の不純物、あるいは酵母エキスなどの各種発酵菌体またはその加水分解物などが挙げられ、これらは単独または組み合わせて使用しても良いが、有機窒素源であることが好ましい。発酵原料中のシステイン以外の窒素源の好ましい濃度としては０．１ｇ／Ｌ以上０．４５ｇ／Ｌ以下である。なお、システイン以外の窒素源には不純物としてシステインが含まれる場合があり、その場合は該窒素源からシステインの含量を差し引いた値をもとに発酵原料中のシステイン以外の窒素源の濃度を計算するものとする。
【００１３】
その他、０．６ｍｇ／Ｌ以上のシステインおよび０．１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下のシステイン以外の窒素源を含む発酵原料を使用することにより、乳酸発酵開始から発酵終了までのＤ−乳酸生産菌の生育速度を遅らせて長時間にわたり高密度化することができ、更に副生産物の生産を抑えて乳酸生産性を向上させることができる。また、どちらの発酵でも細菌の死滅周期を遅らせ、死滅時に発生する副産物の濃度を少なめにすることができ、特に連続発酵では発酵培養液の分離膜として使用する多孔質膜の閉塞を抑えることができ、乳酸発酵の更なる長期化が可能になって、乳酸発酵の生産効率を上げることができる。
【００１４】
本発明において、０．６ｍｇ／Ｌ以上のシステインおよび０．１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下のシステイン以外の窒素源を含む発酵原料とは、乳酸発酵培地の中に０．６ｍｇ／Ｌ以上のシステインおよび０．１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下のシステイン以外の窒素源が含まれることである。該乳酸発酵培地の好ましい具体的な例として、グルコースと０．１ｇ／Ｌのシステインおよび０．４ｇ／Ｌの酵母エキスを含む乳酸発酵培地（以下、ＧＹＣ１と略すことがある。）、グルコース、０．２ｇ／Ｌのシステインおよび０．１ｇ／Ｌの酵母エキスを含む乳酸発酵培地（以下、ＧＹＣ２と略すことがある。）、グルコース、０．４ｇ／Ｌのシステインおよび０．１ｇ／Ｌの酵母エキスを含む乳酸発酵培地（以下、ＧＹＣ３と略すことがある。）、不純物として０．３重量％のタンパク質を含む原料糖１００ｇ／Ｌおよび０．１５ｇ／Ｌの酵母エキスを含む乳酸発酵培地（以下、ＲＳＥと略すことがある。）、該原料糖と０．４ｇ／Ｌのシステインを含む乳酸発酵培地（以下、ＲＳＣ１と略すことがある。）、該原料糖と１．０ｇ／Ｌのシステインを含む乳酸発酵培地（以下、ＲＳＣ２と略すことがある。）、およびグルコースと０．２ｇ／Ｌのシステイン、０．４ｇ／Ｌのポリペプトンを含む乳酸発酵培地（以下、ＧＰＣと略すことがある。）等が挙げられる。
【００１５】
上記の乳酸発酵培地は、次のようにして調製することができる。例えば、栄養素のうち、炭素源になる糖と窒素源になるものをグループに分け、グループごとにオートクレーブ処理により滅菌し、常温以下の温度まで冷却した後、窒素が各発酵培地に含んだ濃度になるように調製する。
【００１６】
本発明では、スポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属するＤ−乳酸生産菌を用いることを特徴とする。該Ｄ−乳酸生産菌は、自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。また、菌株としてＡＴＣＣ等の生物寄託機関より購入することも可能である。
【００１７】
本発明において使用されるＤ−乳酸生産菌のＤ−乳酸生産能は特に限定されるものではないが、光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力を有するＤ−乳酸生産菌であることが好ましい。光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力を有するＤ−乳酸生産菌は、滅菌した原料糖１００ｇ／Ｌの培養液にスポロラクトバチルス属に属する細菌を接種し、３７℃で、静置培養を行い、経時的に培養液中の糖濃度を測定し、糖が完全に消費された後の培養液中に生産された乳酸の光学純度を測定し、Ｄ−乳酸の光学純度が９０％以上であれば、光学純度９０％以上のＤ−乳酸生産菌であると判断することができる。
【００１８】
本発明において使用されるＤ−乳酸生産菌の中でも、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）、スポロラクトバチルス・イヌリナス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｕｌｉｎｕｓ）、スポロラクトバチルス・コフエンシス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｆｕｅｎｓｉｓ）、スポロラクトバチルス・ナカヤマエ・サブシピ・ナカヤマエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｋａｙａｍａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｎａｋａｙａｍａｅ）、スポロラクトバチルス・ナカヤマエ・サブシピ・ラセミカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｋａｙａｍａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｒａｃｅｍｉｃｕｓ）、スポロラクトバチルス・テラエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ）などが挙げられるが、その中でも、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）が好ましく使用できる。また、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカスの菌株としては、ＡＴＣＣ２３４９２、ＡＴＣＣ２３４９３、ＡＴＣＣ２３４９４、ＡＴＣＣ２３４９５、ＡＴＣＣ２３４９６、ＡＴＣＣ２２３５４９、ＩＡＭ１２３２６、ＩＡＭ１２３２７、ＩＡＭ１２３２８、ＩＡＭ１２３２９、ＩＡＭ１２３３０、ＩＡＭ１２３３１、ＩＡＭ１２３７９、ＤＳＭ２３１５、ＤＳＭ６４７７、ＤＳＭ６５１０、ＤＳＭ６５１１、ＤＳＭ６７６３、ＤＳＭ６７６４、ＤＳＭ６７７１株が具体例として挙げられるが、好ましくはＡＴＣＣ２３４９２である。
【００１９】
本発明においてＤ−乳酸生産菌を発酵培養する際、Ｄ−乳酸生産菌を好気的条件下で培養してもよいが、嫌気的条件下で行うことが好ましい。スポロラクトバチルス属に属する細菌は好気性または通気性の微生物であるため、通常、通気などを行うことにより好気的条件下で培養するが、好気的条件下では、グルコース等の糖はピルビン酸からクレブス回路を経て代謝されてしまうため、Ｄ−乳酸の収率という観点においては嫌気的条件が好ましく採用される。嫌気的条件下で培養を行うためには、静置して行うこともできるが、不活性ガスを通気しながら振とう培養もしくは攪拌培養を行ってもよい。ここでいう不活性ガスとしては、二酸化炭素、窒素、アンモニア、アルゴン等を用いればよく、通気量、通気手段はＤ−乳酸生産性を考えて、適宜決めればよい。なお、ここでの窒素は嫌気培養を行うために使用するガスであり、本発明におけるシステイン以外の窒素源には該当しない。
【００２０】
また、Ｄ−乳酸生産菌を発酵培養する際は発酵原料中に資化可能な炭素源を含み、適温で、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウムまたはアンモニアなどにより中和しながら培養することが好ましい。また、培養時のｐＨは該Ｄ−乳酸生産菌がＤ−乳酸を生産できる条件であれば特に限定はないが、ｐＨ４〜８の範囲内であることが好ましい。また、培養温度は該Ｄ−乳酸生産菌がＤ−乳酸を生産できる条件であれば特に限定はないが、光学純度９０％以上の高い光学純度のＤ−乳酸を生産するための培養温度であることが好ましく、具体的には３０℃から４５℃までが好ましく、３１℃から３９℃までがより好ましく、３３℃から３８℃までがさらに好ましい。
【００２１】
本発明で使用される発酵原料における炭素源としては、Ｄ−乳酸生産菌が資化可能な炭素源であれば特に限定はなく、グルコース、アラビノース、セルビオース、ラクトース、メリビオース、サリシン、イヌリン、マンノース、ラフィノース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、シュクロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、ケーンジュース、ケーンジュース抽出物または濃縮液、ケーンジュースからの精製もしくは結晶化された原料糖または精製糖、セルロース由来の糖化液、あるいは糖類以外では酢酸、フマル酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類、あるいはグリセリン等が挙げられ、中でもケーンジュースからの精製または結晶化された原料糖は炭素源として好ましく使用される。
【００２２】
前記原料糖としては、ケーンジュースまたはケーン粕に石灰または石灰乳などを加え、加熱して不純物を取り除くまたは連続沈殿させ不純物を除くことで製造される。その後、濃縮させて真空結晶化し、糖蜜と結晶に分離する。その時に結晶として分けられたものを原料糖とする。石灰または石灰乳は不純物を取り除く時に加熱しながら添加しても良い。連続沈殿時および濃縮時には加熱しても良い。真空結晶化して分離された結晶を乾燥してもよい。なお、本発明で用いられる原料糖について特に限定はないが、ムソー株式会社製の“優糖精”が好ましい例として挙げられる。
【００２３】
本発明で使用される発酵原料における炭素源の使用濃度は特に制限されず、Ｄ−乳酸の生産を阻害しない範囲であれば可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、炭素源の濃度は、倍地中に１．６（ｗ／ｖ）％以上３０（ｗ／ｖ）％以下が好ましく、より好ましくは５（ｗ／ｖ）％以上２０（ｗ／ｖ）％以下である。
【００２４】
また、発酵原料中には無機塩類を含んでもよく、無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。
【００２５】
その他、本発明で使用されるＤ−乳酸生産菌が生育のために特定の栄養素を必要とする場合にはその栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。
【００２６】
本発明において前記Ｄ−乳酸生産菌を発酵培養する際は、静置もしくは振とう培養、撹拌培養などで行うことができる。さらに、発酵形態としては、従来から知られているいかなる発酵方法、例えば、回分式（Ｂａｔｃｈ）発酵、または流加式（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）発酵、連続発酵、によってでも行うことができるが、発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続および回分または流加培養操作は、培養管理上、通常、単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続または流加培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００２７】
本発明を回分式または流加式培養において実施する場合は、培養初期に回分培養または流加培養を行って細菌濃度を高くした後に本培養を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに本培養を行っても良い。
【００２８】
本発明を連続培養において実施する場合は、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って細菌濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。また、菌体を発酵反応槽に維持したままで、発酵反応槽からの発酵培養液の連続的かつ効率的な抜き出しが可能となることから、Ｄ−乳酸生産菌を連続的に発酵培養し、十分な増殖を確保した後に発酵原料液組成を変更し、目的とするＤ−乳酸を効率よく製造することも可能である。連続培養の際の発酵原料供給と発酵培養液の引き抜きの開始時期は、必ずしも同じである必要はなく、発酵原料の供給と発酵培養液の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。発酵原料には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。なお、本発明を連続培養において実施する場合の好ましい連続培養方法としては、ＷＯ２００７／０９７２６０に開示される膜利用連続発酵法が好ましく採用される。
【００２９】
本発明の発酵培養液中のＤ−乳酸生産菌の濃度は、発酵培養液の環境が細菌または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましく、一例として、乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。また、連続発酵装置の運転上の不具合、生産効率の低下を招かなければ、微生物の濃度の上限値は限定されない。
【００３０】
本発明により製造されたＤ−乳酸の濾過・分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。
【００３１】
Ｄ−乳酸の分離・精製方法としては、例えば、濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。好ましくは、濾過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮Ｄ−乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｄ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｄ−乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成分（エタノール、酢酸等）を含むＤ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＤ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＤ−乳酸を得ることもできる。
【００３２】
本発明によるＤ−乳酸の製造方法によって得られたＤ−乳酸は、ポリエステル樹脂の原料に用いられ、それらポリエステル樹脂は、射出成形、押出成形、ブロー成形、真空成形、溶融紡糸およびフィルム成形などの任意の成形方法により、所望の形状に成形することができ、機械部品などの樹脂成形品、衣料・産業資材などの繊維、および包装・磁気記録などのフィルムとして使用することができる。本発明によるＤ−乳酸の製造方法を用いることにより、これら幅広い用途のあるＤ−乳酸を効率的に製造することができることから、より安価に乳酸を提供することが可能となる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明のＤ−乳酸の製造方法をさらに具体的に説明するために回分発酵によるＤ−乳酸の発酵生産について実施例に基づいて具体的に説明する。本発明は、これらの実施例に限定されない。
【００３４】
本発明の実施例では、Ｄ−乳酸を生産させる細菌として、スポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属するＤ−乳酸生産菌のうち、乳酸菌であるスポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２３４９２株を選定した。発酵原料としては上記の乳酸発酵培地（ＧＹＣ１、ＧＹＣ２、ＧＹＣ３、ＲＳＥ、ＲＳＣ１、ＲＳＣ２またはＧＰＣ培地）を用いた。Ｄ−乳酸濃度のＨＰＬＣによる分析方法は次のとおりである。
【００３５】
[Ｄ−乳酸濃度のＨＰＬＣによる分析方法]
培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定した。
【００３６】
［分析条件］
・カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）
・移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。
【００３７】
また、Ｄ−乳酸の光学純度測定は、下記の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
・カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｅｎａｎｔｉｏ Ｌ１（東ソー株式会社製）
・移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度 ：３０℃。
【００３８】
また、Ｄ−乳酸の光学純度は、次式で計算される。
・光学純度（％）＝１００×（Ｄ−Ｌ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度であり、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【００３９】
Ｄ−乳酸生産と同時に生産される副生産物は、有機酸とアルコール類が挙げられる。有機酸としてギ酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸の濃度は上記のＤ−乳酸濃度の分析時に用いたＨＰＬＣにより同様に分析し、Ｆ−キット（ロシュ社製）により更に濃度を測定して検定を行った。アルコール類としてエタノールは以下のＧＣによる方法で測定した。
【００４０】
[ＧＣによる分析方法]
培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件により測定した。
・装置：ＧＣ−２０１０（株式会社島津製作所製）
・カラム：ＴＣ−１；１５ｍ＊０．５３ｍｍ＊１．５μｍ（ジーエルサイエンス社製）
・注入方法：スプリット（３０：１）
・キャリアガス：ヘリウム
・メイクアップガス：ヘリウム
・気化室温度：２００℃
・カラム温度：１００℃
・検出器：ＦＩＤ
・検出器温度：２００℃
・線速度：５９．２ｃｍ／ｓｅｃ。
【００４１】
（参考例１）システイン以外の窒素源に含まれる不純物としてのシステイン含量
以下、本発明の実施例にシステイン以外の窒素源として使用した酵母エキス（ＢａｃｔｏＴＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ社））、ポリペプトンＳ（日本製薬社）、そして主にスクロースを含み、不純物として０．３重量％のタンパク質を含む原料糖（ムソー株式会社“優糖精”）におけるシステイン含量は、次に示す条件で次のアミノ酸分析計を用いて測定した。
【００４２】
[酵母エキスとポリペプトンＳのアミノ酸分析計によるシステインの分析方法]
上記の酵母エキスとポリペプトンＳの前処理のため、各０．２２０１ｇと０．１２２９ｇを採取し、精製水に溶解して酵母エキスは１２．０１ｍｌに、ポリペプトンＳは１２．２９ｍｌにした。その後、試料溶液４５０μｌを別のチューブに採取し、その溶液に２０％スルホサリチル酸５０μｌを添加して攪拌を行った。続いて、０．２２μｍのフィルターによりろ過して５０μｌを採取した。各サンプル濃度を更に１０倍したものも用意し、それらを分析試料とし、Ｌ−８５００形のアミノ酸分析計を用い、次の条件によりシステインの含量を測定した。
【００４３】
［分析条件］
・アミノ酸分析計：Ｌ−８５００形（株式会社日立製作所製）
・カラム：強酸性イオン交換樹脂 ＃２６２０Ｍ  ＳＣ（株式会社日立製作所）４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×８ｃｍ
・移動相：緩衝液ＰＳ−１、ＰＳ−３、ＰＳ−４及びＰＳ−ＲＧ（Ｌ−８５００形日立高速アミノ酸分析計用、和光純薬工業株式会社製）
・移動相流速：０．１９ｍＬ／ｍiｎ
・反応溶液：ニンヒドリン試液−Ｌ８５００セット（ニンヒドリン溶液、緩衝液）（Ｌ−８５００形日立高速アミノ酸分析計用、和光純薬工業株式会社製）
・反応溶液流速：０．２ｍＬ／ｍiｎ
・化学反応槽温度：１３０℃
・反応時間：５０秒
・検出波長：５７０ｎｍ、４４０ｎｍ
・試料注入量：５０μｌ。
【００４４】
[原料糖のアミノ酸分析計によるシステインの分析方法]
原料糖の前処理のため、水１Ｌに１００ｇの原料糖を溶かし、１８０μｌを採取して２０％スルホサリチル酸２０μｌを添加して攪拌を行った。続いて、０．２２μｍのフィルターによりろ過して２５μｌを採取し、それを分析試料とし、Ｌ−８８００Ａ形のアミノ酸分析計を用い、次の条件によりシステインの含量を測定した。
【００４５】
［分析条件］
・アミノ酸分析計：Ｌ−８８００Ａ形（株式会社日立製作所製）
・カラム：日立カスタムイオン交換樹脂  ＃２６２２（株式会社日立製作所製）６ｍｍ×２５ｍｍ×２本
・アンモニアフィルタカラム：日立カスタムイオン交換樹脂＃２６５０（株式会社日立製作所製）４．６ｍｍ×６０ｍｍ
・移動相：Ｌ−８５００緩衝液ＰＦ−１、ＰＦ−２、ＰＦ−３、ＰＦ−４、Ｌ−８５００カラム再生液ＰＦ（Ｌ−８５００形日立高速アミノ酸分析計用、和光純薬工業株式会社製）
・反応溶液：ニンヒドリン試液ワコーニンヒドリン試液−Ｌ８５００セット（ニンヒドリン溶液、緩衝液）（Ｌ−８５００形日立高速アミノ酸分析計用、和光純薬工業株式会社製）
・化学反応槽温度：１３５℃
・検出波長：５７０ｎｍ，４４０ｎｍ
・試料注入量：２５μｌ。
【００４６】
上記分析により、上記の酵母エキスが含むシステインは酵母エキス１ｇあたり１．１１ｍｇであり、ポリペプトンＳが含むシステインはポリペプトンＳ１ｇあたり０．４８ｍｇ、原料糖１００ｇが含むシステインは０．４８ｍｇであった。
【００４７】
（実施例１）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その１）
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ２３４９２株を、試験管で５ｍｌの窒素ガスでパージしたＧＹＣ１倍地で２４時間、３０℃の温度で静置培養した（前培養）。前培養液を同培地で植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで培養終了まで振とう培養した。
【００４８】
１５０時間の発酵試験を行った結果、光学純度の向上が見られて９９％以上、かつ生産収率が９０％であった。また副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．４ｇ／Ｌと非常に低濃度であり、比較例と比べて１／３以上に副生産物の生産を削減できた（表１）。
【００４９】
上記のＧＹＣ１倍地は、水１Ｌに１００ｇのグルコースと０．１ｇのシステイン、システイン以外の窒素源として０．４ｇの酵母エキス、さらにリン源として０．２ｇのリン酸二水素カリウムを溶かして調製し、ＧＹＣ１とした。
【００５０】
（実施例２）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その２）
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ２３４９２株を、試験管で５ｍｌの窒素ガスでパージしたＧＹＣ２倍地で２４時間、３０℃の温度で静置培養した（前培養）。前培養液を同培地で植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで培養終了まで振とう培養した。
【００５１】
１６０時間の発酵試験を行った結果、光学純度の向上が見られて９９％以上、かつ生産収率が９３％であった。また副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．１ｇ／Ｌと非常に低濃度であり、比較例と比べて１／１５以上に副生産物の生産を削減できた（表１）。
【００５２】
上記のＧＹＣ２倍地は、水１Ｌに１００ｇのグルコースと０．２ｇのシステイン、システイン以外の窒素源として０．１ｇの酵母エキス、０．２ｇのリン酸二水素カリウムを溶かして調製し、ＧＹＣ２とした。
【００５３】
（実施例３）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その３）
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ２３４９２株を、試験管で５ｍｌの窒素ガスでパージしたＧＹＣ３倍地で２４時間、３０℃の温度で静置培養した（前培養）。前培養液を同培地で植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで培養終了まで振とう培養した。
【００５４】
１５０時間の発酵試験を行った結果、光学純度の向上が見られて９９％以上、かつ生産収率が９５％であった。また副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．１ｇ／Ｌと非常に低濃度であり、比較例と比べて１／１５以上に副生産物の生産を削減できた（表１）。
【００５５】
上記のＧＹＣ３倍地は、水１Ｌに１００ｇのグルコースと０．４ｇのシステイン、システイン以外の窒素源として０．１ｇの酵母エキス、０．２ｇのリン酸二水素カリウムを溶かして調製し、ＧＹＣ３とした。
【００５６】
（実施例４）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その４）
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ２３４９２株を、試験管で５ｍｌの窒素ガスでパージしたＲＳＥ倍地で２４時間、３０℃の温度で静置培養した（前培養）。前培養液を同培地で植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで培養終了まで振とう培養した。
【００５７】
１８０時間の発酵試験を行った結果、光学純度の向上が見られて９９％以上、かつ生産収率が９０％であった。また副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．５ｇ／Ｌと非常に低濃度であり、比較例と比べて１／３以上に副生産物の生産を削減できた（表１）。
【００５８】
上記のＲＳＥ培地は、水１Ｌに１００ｇの原料糖（ムソー株式会社“優糖精”）と０．１５ｇの酵母エキス、０．２ｇのリン酸二水素カリウムを溶かして調製し、ＲＳＥとした。なお、原料糖１００ｇにはシステインが０．４８ｍｇ含まれているため、ＲＳＥ培地には０．６５ｍｇ／Ｌのシステインが含まれる。また、システイン以外の窒素源は０．４５ｇ／Ｌ含まれる。
【００５９】
（実施例５）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その５）
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ２３４９２株を、試験管で５ｍｌの窒素ガスでパージしたＧＰＣ倍地で２４時間、３０℃の温度で静置培養した（前培養）。前培養液を同培地で植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで培養終了まで振とう培養した。
【００６０】
１６０時間の発酵試験を行った結果、光学純度の向上が見られて９９％以上、かつ生産収率が９０％であった。また副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．５ｇ／Ｌと非常に低濃度であり、比較例と比べて１／３以上に副生産物の生産を削減できた（表１）。
【００６１】
上記のＧＰＣ倍地は、水１Ｌに１００ｇのグルコースと０．２ｇのシステイン、システイン以外の窒素源として０．４ｇのポリペプトンＳ、リン源として０．２ｇのリン酸二水素カリウムを溶かして調製し、ＧＰＣとした。
【００６２】
（実施例６）Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ発酵によるＤ−乳酸の製造（その６）
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ２３４９２株を、試験管で５ｍｌの窒素ガスでパージしたＲＳＥ培地で２４時間、３０℃の温度で静置培養した（前々培養）。前培養液を同培地で植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで培養終了まで振とう培養した。残存総糖濃度を測り、残存糖の濃度が０．５ｇ／Ｌになっていることを確認し、培養液２００ｍｌを、別の発酵槽で用意したＲＳＣ１培地８００ｍｌに植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで培養終了まで振とう培養した。
【００６３】
１５０時間の発酵試験を行った結果、光学純度の向上が見られて９９％以上、かつ生産収率が９５％であった。また副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．３ｇ／Ｌと非常に低濃度であり、比較例と比べて１／５以上に副生産物の生産を削減できた（表１）。
【００６４】
上記のＲＳＣ１培地は、水１Ｌに、１００ｇの原料糖（ムソー株式会社“優糖精”）、０．４ｇのシステイン、０．２ｇのリン酸二水素カリウムを溶かして調製し、ＲＳＣ１とした。なお、原料糖には０．３重量％のタンパク質が不純物として含まれるため、ＲＳＣ１培地にはシステイン以外の窒素源が０．３ｇ／Ｌ含まれている。
【００６５】
（実施例７）Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ発酵によるＤ−乳酸の製造（その７）
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ  ２３４９２株を、試験管で５ｍｌの窒素ガスでパージしたＲＳＥ培地で２４時間、３０℃の温度で静置培養した（前々培養）。前培養液を同培地で植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで培養終了まで振とう培養した。残存総糖濃度を測り、残存糖の濃度が０．５ｇ／Ｌになっていることを確認し、培養液２００ｍｌを、別の発酵槽で用意したＲＳＣ２培地８００ｍｌに植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで培養終了まで振とう培養した。
【００６６】
１５０時間の発酵試験を行った結果、光学純度の向上が見られて９９％以上、かつ生産収率が９５％であった。また副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．４ｇ／Ｌと非常に低濃度であり、比較例と比べて１／３以上に副生産物の生産を削減できた（表１）。
【００６７】
上記のＲＳＣ２培地は、水１Ｌに、１００ｇの原料糖（ムソー株式会社“優糖精”）、０．４ｇのシステイン、０．２ｇのリン酸二水素カリウムを溶かして調製し、ＲＳＣ２とした。なお、原料糖には０．３重量％のタンパク質が不純物として含まれるため、ＲＳＣ２培地にはシステイン以外の窒素源が０．３ｇ／Ｌ含まれている。
【００６８】
（比較例１）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その８）
水１Ｌに１００ｇのグルコースと０．５ｇの酵母エキスを溶かして作製したＧＹ１培地を使用する他は、実施例１と同様にして、バッチ発酵試験を行った。添加した酵母エキス１ｇあたりに１．１１ｍｇのシステインが含まれることから、ＧＹ１培地には０．５６ｍｇ／Ｌのシステインが含まれる。
【００６９】
２２０時間の発酵試験を行った結果、光学純度が９７％以下であり、副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成され、発酵液中の副産物濃度は１．５ｇ／Ｌ以上と多く生産された（表１）。
【００７０】
（比較例２）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その９）
水１Ｌに１００ｇのグルコースと１ｇの酵母エキスを溶かして作製したＧＹ２培地を使用する他は、実施例１と同様にして、バッチ発酵試験を行った。添加した酵母エキス１ｇあたりに１．１１ｍｇのシステインが含まれることから、ＧＹ２培地には１．１１ｍｇ／Ｌのシステインが含まれる。
【００７１】
１８０時間の発酵試験を行った結果、光学純度が９７.５％であったが、副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成され、発酵液中の副産物濃度は２ｇ／Ｌ以上と多く生産された（表１）。
【００７２】
（比較例３）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その１０）
水１Ｌに１００ｇのグルコースと５ｇの酵母エキスを溶かして作製したＧＹ３培地を使用する他は、実施例１と同様にして、バッチ発酵試験を行った。添加した酵母エキス１ｇあたりに１．１１ｍｇのシステインが含まれることから、ＧＹ３培地には５．５５ｍｇ／Ｌのシステインが含まれる。
【００７３】
１６０時間の発酵試験を行った結果、光学純度が９７.９％であったが、副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成され、発酵液中の副産物濃度は５ｇ／Ｌ以上と多く生産された（表１）。
【００７４】
【表１】
2010029119.tif 000002
【００７５】
以下、本発明のＤ−乳酸の製造方法をさらに具体的に説明するためにＷＯ２００７／０９７２６０に開示される連続発酵装置を用いることによる連続的なＤ−乳酸の発酵生産について実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００７６】
（実施例８）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その１）
図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｄ−乳酸が連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地にはＧＹＣ１を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメントとしては図３に示される形態を採用し、分離膜には、ＷＯ２００７／０９７２６０の参考例２に従って作製したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜、分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。この多孔性膜の特性を調べたところ、平均細孔径が０.１μｍであり、純水透過係数が５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａであった。この実施例８における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【００７７】
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３５（℃）
・発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・ｐＨ調整：８Ｎ  水酸化カルシウムによりｐＨを６．０に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【００７８】
発酵培養液に含まれるＤ−乳酸は、上記ＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
【００７９】
まず、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ２３４９２株を、試験管で５ｍｌの窒素ガスでパージした上記比較例２のＧＹ２倍地で２４時間、３０℃の温度で静置培養した（前々々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地ＧＹＣ１５０ｍｌに植菌し、４８時間、３０℃の温度で静置培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の窒素ガスでパージした１Ｌの乳酸発酵培地ＧＹＣ１に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３５℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ＧＹＣ１倍地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、３７℃での連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。このとき、気体供給装置から窒素ガスを発酵反応槽１内に供給し、排出されたガスを回収して再度発酵反応槽１に供給した。すなわち、窒素ガスを含む気体のリサイクル供給を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【００８０】
５００時間の発酵試験を行った結果、この連続発酵装置を用いることにより、安価で、且つ９９％以上の高い光学純度の安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．３ｇ／Ｌと少なく、比較例と比べて１／５以上に削減することができた（表２）。
【００８１】
（実施例９）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その２）
図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｄ−乳酸がで得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地にはＧＹＣ３を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜と分離膜エレメントは実施例８のものを使用した。この実施例９における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【００８２】
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：１００（Ｌ／分）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・ｐＨ調整：８Ｎ  水酸化カルシウムによりｐＨを６．０に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【００８３】
生産物であるＤ−乳酸およびグルコースは、実施例８に示す方法で測定した。
【００８４】
まず、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ２３４９２株を、試験管で５ｍｌの窒素ガスでパージしたＧＹ２倍地で２４時間、３０℃の温度で静置培養した（前々々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地としてＧＹＣ３倍地５０ｍｌに植菌し、４８時間、３０℃の温度で静置培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す膜分離型連続発酵装置の窒素ガスでパージした１Ｌの乳酸発酵培地ＧＹＣ３に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３７℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、連続・バッチ発酵培地としてＧＹＣ３の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。このとき、気体供給装置から窒素ガスを発酵反応槽１内に供給し、排出されたガスを回収して再度発酵反応槽１に供給した。すなわち、窒素ガスを含む気体のリサイクル供給を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵培養液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【００８５】
５００時間の発酵試験を行った結果、この連続発酵装置を用いることにより、安価で、且つ９９％以上の高い光学純度の安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．１ｇ／Ｌと少なく、比較例と比べて１／１５以上に削減することができた（表２）。
【００８６】
（実施例１０）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その３）
実施例８で使用した多孔性膜の代わりに、分離膜としてＷＯ２００７／０９７２６０の参考例１３に従って作製したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする中空糸膜を用いた。分離膜エレメントとしては図４に示される形態を採用した。またＧＰＣ培地を用いた他は、実施例８と同様にして、連続発酵試験を行った。
【００８７】
５００時間の発酵試験を行った結果、この連続発酵装置を用いることにより、安価で、且つ９９％以上の高い光学純度の安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．４５ｇ／Ｌと少なく、比較例と比べて１／３以上に削減することができた（表２）。
【００８８】
（実施例１１）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その４）
分離膜エレメントとして実施例１０のものを使用し、ＲＳＣ１培地を使用する他は、実施例９と同様にして、連続発酵試験を行った。
【００８９】
５００時間の発酵試験を行った結果、この連続発酵装置を用いることにより、安価で、且つ９９％以上の高い光学純度の安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．３ｇ／Ｌと少なく、比較例と比べて１／５以上に削減することができた（表２）。
【００９０】
（実施例１２）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その５）
ＲＳＥ培地を用いた他は、実施例１１と同様にして、連続発酵試験を行った。５００時間の発酵試験を行った結果、この連続発酵装置を用いることにより、安価で、且つ９９％以上の高い光学純度の安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は０．４５ｇ／Ｌと少なく、比較例と比べて１／３以上に削減することができた。
【００９１】
（比較例４）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その６）
比較例１のＧＹ１培地を使用する他は、実施例８と同様にして、連続発酵試験を行った。２００時間の発酵試験を行った結果、光学純度が８８％以下であり、発酵液中の糖も消費されず多くの糖が残存してしまった。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成され、副生産物の濃度は１．５ｇ／Ｌと多く生産されていた（表２）。
【００９２】
（比較例５）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その７）
比較例２のＧＹ２培地を使用する他は、実施例８と同様にして、連続発酵試験を行った。２００時間の発酵試験を行った結果、光学純度が９９％であり、発酵液中の糖も消費されず多くの糖が残存してしまった。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成され、副生産物の濃度は１．７ｇ／Ｌと多く生産されていた（表２）。
【００９３】
（比較例６）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その８）
水１Ｌに１００ｇの原料糖と１ｇの酵母エキスを溶かして作製したＲＳＥ１培地（システインを１．５９ｍｇ／Ｌ含有する）を使用する他は、実施例８と同様にして、連続発酵試験を行った。２００時間の発酵試験を行った結果、光学純度が９９.２％であり、発酵液中の糖も消費されず多くの糖が残存してしまった。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成され、副生産物の濃度は１．７ｇ／Ｌと多く生産されていた。
【００９４】
【表２】
2010029119.tif 000003
【００９５】
実施例および比較例から、バッチ発酵で副生産物の生産を大幅に低減しながら乳酸の生産が可能であることが明らかになった。また、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ発酵でも、副生産物生産の低減や高い乳酸生産収率かつ高い光学純度のＤ−乳酸生産が可能であることが明らかになった。更に、図１および図２の膜分離型の連続発酵装置を用いる連続発酵により、副生産物の生産を大幅に低減しながら乳酸の生産速度や光学純度が大幅に向上することが明らかになった。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ膜分離型の連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるＤ−乳酸の製造が可能であることが明らかとなった。更に、低濃度の窒素を含んだ乳酸発酵培地を用いることで今まで行ってきた従来のＤ−乳酸の製造より低コスト、且つ副生産物の生産を低減し、Ｄ−乳酸の光学純度を向上させることと共に高い光学純度のＤ−乳酸の生産を維持しながらの長期間のＤ−乳酸の製造が可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明によるＤ−乳酸の製造方法によれば、システインと低濃度の窒素を含む発酵培地を用いることと簡便な操作条件で、Ｄ−乳酸の高生産性およびＤ−乳酸の光学純度を向上させることと共に高い光学純度のＤ−乳酸の生産が可能となり、副生産物の濃度も低減させることも可能となった。広く発酵工業において、発酵生産物であるＤ−乳酸を高い光学純度での生産および副生産物の濃度の低減、且つ天然バイオマスを用いることによる低コストで安定に生産することが可能となる。本発明によるＤ−乳酸の製造法により得られたＤ−乳酸は、例えば、ポリ乳酸樹脂の原料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概要側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概要側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる多孔性膜を利用した分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概要斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる中空糸膜を利用した分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概要斜視図である。
【符号の説明】
【００９８】
１  発酵反応槽
２  分離膜エレメント
３  水頭差制御装置
４  気体供給装置
５  攪拌機
６  レベルセンサ
７  培地供給ポンプ
８  ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９  ｐＨセンサ・制御装置
１０  温度調節器
１１  発酵液循環ポンプ
１２  膜分離槽
１３  支持板
１４  流路材
１５  分離膜
１６  凹部
１７  集水パイプ
１８  分離膜束
１９  上部樹脂封止層
２０  下部樹脂封止層
２１  支持フレーム
２２  集水パイプ
【図１】
2010029119.tif 000004
【図２】
2010029119.tif 000005
【図３】
2010029119.tif 000006
【図４】
2010029119.tif 000007