(57)【要約】【課題】生体の免疫力の促進に著しく優れた特定乳酸菌からなる免疫賦活剤、及びそれを配合した免疫賦活性飼料組成物を提供する。【解決手段】本発明にかかる免疫賦活剤は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６１７）株に由来する乳酸菌またはその処理物からなることを特徴とする。  また、本発明にかかる免疫賦活組成物は、前記免疫賦活剤０．１〜１０ｍｇ％を含有することを特徴とする。  また、前記免疫賦活剤は飼料組成物であることが好適である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６１７）株に由来する乳酸菌またはその処理物からなる免疫賦活剤。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫賦活剤０．１〜１０ｍｇ％を含有することを特徴とする免疫賦活組成物。
【請求項３】
飼料組成物であることを特徴とする請求項２に記載の免疫賦活組成物。
【請求項４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６１７）株に由来する乳酸菌またはその処理物を、菌体乾燥重量として０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与することを特徴とする免疫賦活方法。
【請求項５】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６１７）株に由来する乳酸菌またはその処理物と、
グラム陰性菌の死菌体と、
を投与することを特徴とする免疫賦活方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳酸菌の免疫賦活剤としての用途、特に該免疫賦活剤を配合した飼料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの乳酸菌が食品保存や食品加工の目的で古くから利用されており、乳酸菌はヒトや動物にとって安全で有益な微生物であると認識されている。乳、穀類、野菜などを原料としてチーズやヨーグルト、味噌や醤油、漬物など多くの発酵食品が、乳酸菌を利用して生まれている。
近年、乳酸菌は食品製造に有用であるだけでなく、摂取したヒトに良い影響を与えることが知られ、プロバイオティクス作用に関する多くの研究がなされている。乳酸菌については、腸内菌叢の改善やコレステロールの低下作用などが報告されてきたが、最近は特にその免疫賦活作用が注目されており、これに関連してアレルギー低減作用、抗ウイルス作用、感染防御作用が検討されている。
【０００３】
免疫は多細胞生物において異種生物の排除を目的に獲得された機能であり、自己と異なる抗原の認識、補体や抗体による不活性化、食細胞による破壊、感染細胞のアポトーシス誘導などにより異物を排除する。免疫は自然免疫と適応免疫に大別されるが、後者は補体や食細胞などの自然免疫で病原体が排除されず感染巣が形成された場合に発動される。
微生物やウイルスに進入された場合、最初にそれを認識する細胞はマクロファージや樹状細胞であり、それらの細胞はToll-like receptor（TLR）をはじめとして多くのレセプターを発現している。TLRは微生物の特異なRAMPs（pathogen-associated molecular patterns）を認識し、免疫反応を誘導する。乳酸菌などグラム陽性菌の細胞壁は自然免疫を刺激し、PAMPsとしてペプチドグルカン、リポテイコ酸を含み、それぞれTLR2、TLR2とTLR6との複合体によって認識される。TLRの刺激はMyD88分子を介してNF-κBを活性化し、IL-12やインターフェロンα、βの産生を誘導してNK細胞など他の免疫担当細胞を活性化する。また、TLR4は大腸菌などグラム陰性菌のリポ多糖体（LPS）を認識し、NF-κBを活性化してTNF-αやIL-6を産生する。
【０００４】
マクロファージはFcレセプター、補体レセプター、マンノースレセプター、スカベンジャーレセプターを介して微生物を認識し貪食する自然免疫の代表的な細胞である。貪食された微生物はファゴソーム（phagosome）に運ばれ、ファゴソームにリソソーム（lysosome）が融合してファゴリソソームとなり、その中で微生物は活性酸素や酸化窒素（NO）及び分解酵素で処分される。貪食作用はマクロファージの活性化状態によって影響され、非活性化状態のマクロファージでは貪食能や抗原提示能が低い。様々な刺激を受けてマクロファージは活性化されるが、活性化にはいくつかの段階があり、例えば、腫瘍細胞破壊作用を誘導する場合、IFN-γの刺激のみでは不足で活性化準備状態（primed macrophage）にとどまり、活性化準備状態のマクロファージにLPSを投与することで初めて腫瘍細胞破壊作用が誘導される。活性化されたマクロファージは貪食能の昂進、殺菌成分の分泌、サイトカインの産生などを介して異物を排除し適応免疫を誘導する。
一酸化窒素（NO）は重要な殺菌分子であり、iNOSの発現を通じて一時的に産生されることから、NOの産生はマクロファージが活性化している状態とみなすことができる。マクロファージ様細胞株を使用した場合、NOの産生は培地中の亜硝酸イオンとして検出することができる。Tejada-Simonらは、マクロファージ細胞株であるRAW264.7を用いてLactobacillus sp.やStreptcoccus sp.などに属する乳酸菌の加熱殺菌菌体がNO産生を誘導することを示している。
【０００５】
このようなマクロファージの活性化に係る乳酸菌の報告として、例えば、非特許文献１には、ブタ由来の腸官系乳酸菌の一種であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍのペプチドグリカンが哺乳類をはじめ、鳥類・魚類などの下等な免疫担当細胞をも賦活化することを示し、その応答機構として、経口投与された該ペプチドグリカンがＭ細胞に取り込まれ、マクロファージ等の抗原提示細胞にその情報が伝達され、免疫応答能が連鎖的に反応を繰返す結果、生体内における免疫系そのものが増強されることが示唆されている。
【０００６】
また、ウシ等の飼料に用いられるサイレージの製造に用いられる乳酸菌についても、家畜の免疫賦活作用への応用が期待されている。本来、サイレージは飼料となる草を長期保存する手段として、草に付着する乳酸菌の発酵能を利用したものであるが、畜産動物の免疫力が生産性を大きく左右する畜産分野においては、上記のような乳酸菌の免疫賦活作用を踏まえた、様々な乳酸菌配合飼料の開発が積極的に行われている。
例えば、特定の乳酸菌の免疫促進能を示すものとして、Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（特許文献１）、Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ（特許文献２）、Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（特許文献３）を含有する飼料が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２６２２４７号公報
【特許文献２】特許第３６４８２３３号公報
【特許文献３】特開２００５−２１１５６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】乳酸菌の科学と技術  学会出版センター  ｐ．７７〜１０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、乳酸菌の示す免疫賦活効果にはその菌種によって生体への作用、賦活効果の高さにばらつきがあり、これらについて総合的に優れた乳酸菌が求められていた。特に、乳酸菌を配合した飼料に関しては、家畜の生存率改善へ十分に寄与し得る免疫賦活効果を得るには至っておらず、その組成や投与方法には依然改善の余地が残されている。
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、生体の免疫力の促進に著しく優れた特定乳酸菌からなる免疫賦活剤及びそれを配合した免疫賦活組成物、並びに飼料組成物と、免疫賦活方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明者らが鋭意研究を行った結果、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉに属する特定乳酸菌が極めて高い免疫賦活効果を有することを見出した。さらに、前記乳酸菌を少量投与したマクロファージが活性化準備状態とし、該マクロファージへグラム陰性菌の死菌体またはリポ多糖体を作用させることによって、マクロファージを著しく活性化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明にかかる免疫賦活剤は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６１７）株に由来する乳酸菌またはその処理物からなる。
また、本発明にかかる免疫賦活組成物は、前記免疫賦活剤０．１〜１０ｍｇ％を含有することを特徴とする。
また、前記免疫賦活組成物は、飼料組成物であることが好適である。
【００１２】
さらに、本発明にかかる免疫賦活方法は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６１７）株に由来する乳酸菌またはその処理物を、菌体乾燥重量として０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与する工程を含むことを特徴とする。
また、本発明にかかる免疫賦活方法は、  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６１７）株に由来する乳酸菌またはその処理物と、
グラム陰性菌の死菌体と、
を投与することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生体の免疫力の促進に優れた免疫賦活剤を得ることができる。また、該免疫賦活剤を配合した飼料組成物は、対象の免疫力、すなわち病原菌への抵抗性を著しく賦活して、家畜等の生産性を向上せしめる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の免疫賦活剤を投与したマウスの生残率を示すグラフである。
【図２】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１、微生物菌体、リポ多糖体によるマクロファージの活性化を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明にかかる免疫賦活剤であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１は、キムチから分離された乳酸菌Ｌ．ｓａｋｅｉに属し、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６１７として独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託されている。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の同定及び培養方法については、該乳酸菌を漬物用野菜に添加し、発酵させた発酵漬物を開示する「特許第３０９１１９６号」に詳しい。なお、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１は、漬物の食味を向上させる乳酸菌として知られているが、プロバイオティクスとしての評価は行なわれていない。
まず、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の菌学的性質を以下に示す。
【００１６】
Ａ．形態的性状
細胞形態            桿菌
大きさ              ０．８×２〜３μｍ
グラム染色性        陽性
【００１７】
Ｂ．生理学的性状（＋：陽性、−：陰性）
１５℃での生育                      ＋
４５℃での生育                      −
６．５％食塩存在下での生育          ＋
ｐＨ４での生育                      −
ｐＨ５での生育                      ＋
発酵形式                            ホモ
生成乳酸異性体タイプ                ＤＬ
酢酸存在下での乳酸異性体タイプ      Ｌ
ペプチドグリカンの型                非ＤＡＰ
【００１８】
Ｃ．糖類発酵性（＋：陽性、−：陰性）
アラビノース                        ＋
リボース                            ＋
キシロース                          −
フラクトース                        ＋
マンノース                          ＋
ラクトース                          ＋
シュクロース                        ＋
トレハロース                        ＋
ラフィノース                        −
マンニトール                        −
ソルビトール                        −
グルコン酸ナトリウム                ＋
マルトース                          ＋
ガラクトース                        ＋
メリビオース                        ＋
【００１９】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の培養は、一般的な乳酸菌の培養方法、ないしは特許第３０９１１９６号に記載される方法により行なうことができる。一般的な培養方法としては、例えば、ＭＲＳ培地やＧＹＰ培地等の合成培地ないしは半合成培地を用い、培養温度を１０〜１５℃、ｐＨを５〜７に保持しながら静地培養することが挙げられる。このような培養方法により、２〜３日で菌数１０８〜１０１１程度のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１を得ることができる。
また、漬物用スターターとして市販されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１乳酸菌を用いてもよい。
【００２０】
本発明にかかる免疫賦活剤は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の菌体、またはその処理物からなる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の免疫賦活能は、加熱等によって菌を不活化しても損なわれない。そのため発明においては、前記乳酸菌の生菌及び死菌のいずれを用いることも可能である。また、本発明に使用するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１は、目的とする免疫賦活能を有する限りどのような形態であってもよく、例えば、培養した生菌を培地等から分離して用いる他、培地成分や生成物を含む培養物または培養残渣として用いることもできる。
前記乳酸菌の処理物としては、菌の破砕物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状物、希釈物、殺菌物などが挙げられる。本発明においては、処理の容易性や製剤としての使用性から、特に乾燥物が好ましい。前記乾燥物は、例えば、加熱乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、マイクロ波乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等によって菌を乾燥処理することにより得られ、より好ましくは加熱乾燥、凍結乾燥物である。
なお、本発明にかかる免疫賦活剤における菌体数は、生菌・死菌とも１０６〜１０１２個／ｇ、好ましくは１０６〜１０８個／ｇである。
【００２１】
本発明にかかる免疫賦活剤は、経口ないし非経口的に生体内へ投与することにより、生体中に広く分布するマクロファージを直接的に活性化してその非特異的貪食機能を増強し、生体の免疫機能は向上せしめる。前記免疫賦活剤を構成するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１は、免疫賦活作用が知られた他の乳酸菌に比べ極めて高い効果を有する。
本発明にかかる免疫賦活剤が体内の有害菌に対する十分な効果を発揮するための投与量は、投与対象にもよるが、菌体乾燥重量として1日あたり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【００２２】
また、本発明は、次の実施形態により使用することもできる。
免疫賦活剤であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の菌体またはその処理物を対象へ少量投与し、体内の非活性状態のマクロファージを活性準備状態へ遷移させる。この際のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の投与量は、菌体乾燥重量として０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度、すなわち、ＨＳ１によりマクロファージを活性化させる場合の約１／１０の量で足る。
活性準備状態のマクロファージには、活性状態にみられる亜硝酸の産生はほとんど認められず、非活性状態との一見した差異はない。しかしながら、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の投与と同時、または投与から１〜２４時間後にグラム陰性菌の死菌体を同対象へ少量投与することによって、活性準備状態にあったマクロファージは急速に、しかも通常よりも高レベルに活性化される。
本発明において前記グラム陰性菌は、外膜にリポ多糖体を有し、且つ腸内常在菌であることが好ましく、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＥ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ等が挙げられる。これらの菌体は、加熱等によって完全に殺菌された死菌体を用いることができる。死菌体には、さらに破砕等の処理を施すことも可能であるが、マクロファージの活性にかかるリポ多糖体を処理物中に残存させておく必要がある。グラム陰性菌の死菌体の投与量は、菌体乾燥重量として０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ程度とすることが好ましい。
また、前記グラム陰性菌の死菌体に替えて、前記死菌体相当量の精製リポ多糖体を用いてもよい。
上記実施形態における各製剤の投与は、経口及び非経口のどちらの経路を用いることも可能であり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１と、グラム陰性菌の死菌体またはリポ多糖体とを一緒に投与することも、別々に投与することも可能である。
【００２３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１からなる本発明の免疫賦活剤は、該製剤を単独で用いる他、食品、健康食品、医薬品等へ配合し、免疫賦活組成物として用いることができる。なお、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１は従来漬物に生息する乳酸菌であることから、食品等へ配合して経口摂取することについて、特に安全上の問題はないと考えられる。また、本発明の免疫賦活剤を注射剤や外用剤基材等に適宜配合し、非経口により摂取することも可能である。
免疫賦活組成物における免疫賦活剤の配合量は、投与対象の種類、大きさ、年齢等に応じ、前述した免疫賦活剤の投与量に準じて決定することができる。一般に、本発明にかかる免疫賦活剤を有効成分とする場合、該免疫賦活剤を組成物に対して０．１〜１０ｍｇ％配合することが好ましい。配合量があまりに少量であると、十分な免疫賦活作用を得ることができないことがあり、過剰に配合しても一定以上の効果を得ることはできない。
本発明にかかる免疫賦活組成物には、上記以外にも本発明の効果を損ねない範囲で食品、健康食品、医薬品等に用いられる各種成分を適宜配合することができ、組成物の剤形についても特に制限されない。
【００２４】
特に、本発明にかかる免疫賦活組成物は、飼料成分を配合し、免疫賦活性を有する飼料組成物とすることが好ましい。本発明にかかる免疫賦活剤は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳類の他、魚類、鳥類、昆虫類などにも有効であるため、投与対象により飼料成分を調整することによってあらゆる生体に有効な免疫賦活組成物を得ることができる。
【００２５】
前記飼料成分としては、例えば、動物由来成分として家畜（例えばウシ、ブタ、ニワトリ及びヒツジ等）及び魚介類（例えばマグロ、カツオ、アジ、イワシ、ヒラメ、サンマ、エビ、タコ、ホタテ等）から得た肉、皮、骨、臓器、卵、血液、乳、動物性脂肪等の生体組織、その乾燥粉末、又はそれらの加工品等が挙げられる。
【００２６】
また、植物由来成分としては、例えば、ニンジン、カボチャ、キャベツ、ピーマン等の野菜類、ゴマ、アーモンド、ケシの実、ヒマワリの実等の種実類、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等の穀類、ダイズ、インゲン、ソラマメ等の豆類、ジャガイモ、サツマイモ、コーンスターチ等のデンプン類、ダイズ油、ゴマ油等の植物性油脂類、ミカン、リンゴ、カキ等の果実類、エノキ、シイタケ、シメジ等の菌糸類、ワカメ、コンブ、クロレラ等の藻類、牧草等から得られる植物組織やその粉末、又はそれらの加工品等が挙げられる。
【００２７】
また、本発明にかかる飼料組成物には、上記成分に加え、発色剤、着色料、香料、甘味料、保存料、乳化剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、調味料、増粘剤、膨張剤、消泡剤、結着剤、栄養強化剤等の飼料組成物に通常用いられる添加物を適宜配合することができる。
さらに、本発明の飼料組成物は、その剤型についても特に制限はなく、投与対象等に応じて、固形状、ペレット状、液状、ペースト状、顆粒状、粉状、フレーク状等、いずれを適用することもできる。
【００２８】
以下、本発明について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれに制限されない。なお、配合量は特に記載のない限り、全て重量％で示す。
【実施例】
【００２９】
本発明の免疫賦活剤を用い、マウスの大腸菌に対する感染抵抗性試験を行った。
＜菌の調製例＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１株をＧＹＰ培地（蒸留水１００ｍＬにグルコース１ｇ、酵母エキス１ｇ、ペプトン０．５ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、塩類溶液０．５ｍＬ、ツイーン８０溶液１ｍＬを加えてオートクレーブ殺菌する）に接種し、３０℃で２日間培養した。
増殖した菌体を遠心分離して集菌し、さらにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を加えて遠心分離後、分離した菌体をＰＢＳにて２回洗浄した。洗浄した菌体に０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳを加え、沸騰水中で１５分間の加熱処理を施し、放冷後ＰＢＳで３回洗浄して凍結した。その後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥（乾燥温度３５℃）し、乾燥菌体粉末を得た。
【００３０】
＜試験方法＞
自由給水、自由給餌にて２日間の予備飼育（飼育温度２４±３℃、相対湿度５５±５％）を行った２９日齢の雄ＩＣＲ系マウス４０匹を１０匹ずつ４群に分け、各群のマウスに下記試料を腹腔内投与した。
【００３１】
試験群１：上記乾燥菌体粉末を２５００μｇ／ｍＬ含むＰＢＳ懸濁液を０．５ｍＬ／匹。
試験群２：上記乾燥菌体粉末を５００μｇ／ｍＬ含むＰＢＳ懸濁液を０．５ｍＬ／匹。
試験群３：上記乾燥菌体粉末を５０μｇ／ｍＬ含むＰＢＳ懸濁液を０．５ｍＬ／匹。
対照群：上記乾燥菌体粉末無添加のＰＢＳを０．５ｍＬ／匹。
【００３２】
上記試料投与の３日後に、上記と同じ試料を各群へ再度腹腔内投与した。この投与の翌日に、全群へ大腸菌（全農家畜衛生研究所E.coli72-5）のＰＢＳ希釈液（１０８ＣＦＵ／ｍＬ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、予備飼育と同様の環境で７日間飼育して経過を観察した。各群のマウス生残数の推移を表１、大腸菌投与後の各群の生存率を図１に示す。
【００３３】
【表１】
2010265184.tif 000002
【００３４】
表１及び図１に示すとおり、ＰＢＳを投与した対照群においては、大腸菌の投与後１日で８０％のマウスが死亡したが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１懸濁液を投与した試験群１〜３はいずれも生残数が高く、試験群１及び２においては１００％の生残率を示した。また、３日目の試料投与から大腸菌投与までの期間（３〜６日目）においては全てのマウスが生残していたことから、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の生体への投与に関して、その安全性が確認された。
【００３５】
以上の結果から、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１が、対象の大腸菌に対する感染抵抗性を著しく向上させたことが分かる。すなわち、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１は、免疫機構を極めて強く賦活させる作用を有することが認められた。
また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の死菌にこのような作用が認められたことから、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１を構成するペプチドグリカン等の成分が、生体内においてある種の抗原として認識され、大腸菌感染を防御するＩｇＡ等の免疫グロブリンの産生を促進しているものと推測される。
【００３６】
次に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１、微生物菌体、リポ多糖体によるマクロファージの活性化について検討した。使用したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の調製は前述の例に従って乾燥菌体粉末としたものを用いた。グラム陰性菌及びリポ多糖体は以下のとおり準備した。
【００３７】
グラム陰性菌及びリポ多糖体（ＬＰＳ）
乳酸菌はＧＹＰ培地を用いて３０℃で２日間培養し、グラム陰性菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ１１７７５、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ１３０４８）はＬＢ培地を用いて３７℃で２日間培養した。遠心分離して集菌した微生物は沸騰水中で３０分間加熱殺菌後、凍結乾燥した。
リポ多糖体は、和光純薬・大腸菌由来ＬＰＳを使用した。
【００３８】
マクロファージの培養と活性化試験
マクロファージ細胞株Ｊ７７４．１（理研  ＢＲＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  ＲＣＢ０４３４）は１０％の非動化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ペニシリンを加えたＰＲＭＩ１６４０培地を用い、３７℃、５％炭酸ガス−９５％大気条件下で培養した。マクロファージ活性化試験は２４穴の培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の１穴ごとに２×１０６／ｍｌの細胞を１ｍｌずつ加えて２日間培養してコンフルエントとした後、古い培地を除去して新しい培地０．９ｍｌと、下記試料をそれぞれＰＢＳに懸濁して０．１ｍｌとしたものを加えて行なった。培養２４時間後の上清中の亜硝酸濃度（μＭ）をグリース試薬で分析した。
試料は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１の前記調製例による乾燥菌体粉末を１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、ＡＴＣＣ１１７７５（Ｅ．Ｃｏｌｉ）を０．１μｇ、１μｇ、ＬＰＳを１ｎｇ、１０ｎｇとし、ＰＢＳのみとした例を対照例とした。結果を図２に示す。
【００３９】
図２に示すとおり、本試験において、マクロファージの活性化には、ＨＳ１で１００μｇ、Ｅ．ｃｏｌｉで１μｇ、ＬＰＳで１０ｎｇを要した。ＨＳ１を１μｇまたは１０μｇ添加した例、Ｅ．ｃｏｌｉを０．１μｇ添加した例、ＬＰＳを１０ｎｇ添加した例においては、マクロファージの活性化は認められなかった。なお、それぞれの有効量においては、ＨＳ１が優れたマクロファージ活性化能を示した。
【００４０】
続いて、前記試験によりマクロファージ活性化能を有することが明らかになった成分について、その相乗効果を検討するため下記試験を行った。
乳酸菌で刺激したマクロファージの低レベル大腸菌等による活性化
前述のマクロファージＪ７７４．１の培養時に１０μｇのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１を添加して２４時間培養後、培地を取り替えると共にＡＴＣＣ１１７７５（Ｅ．Ｃｏｌｉ）０．１μｇ、ＡＴＣＣ１３０４８（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）１μｇ、またはＬＰＳ１ｎｇを加えた。その後さらに２４時間培養し、上清中の亜硝酸濃度（μＭ）をグリース試薬で分析した。なお、対照として、ＨＳ１に代えてＰＢＳを添加した例も行なった。
【００４１】
（表２）
亜硝酸濃度（μＭ）    
前処理                Ｅ．ｃｏｌｉ      Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ      ＬＰＳ    
ＰＢＳ（対照例）        ０．７                  ０．７              ０．６    
ＨＳ１  １０μｇ        ８．８                  １５              １１．５    
【００４２】
表２に示すとおり、図２においてマクロファージ活性化の有効量に満たなかった量の
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１と、グラム陰性菌（死菌）またはリポ多糖体（ＬＰＳ）とを組み合わせて投与することにより、マクロファージが著しく活性化されることが明らかになった。これは、先に添加された少量のＨＳ１によってマクロファージが刺激されて活性化準備状態となったため、少量のグラム陰性菌またはＬＰＳの添加で著しいマクロファージの活性化が成ったものと考えられる。
したがって、本発明にかかる免疫賦活方法において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＨＳ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６１７）株に由来する乳酸菌またはその処理物を低濃度で投与する工程と、前記工程と同時または前記工程後に、グラム陰性菌の死菌体またはリポ多糖体を低濃度で投与する工程とを含むことが好適である。
【００４３】
さらに、本発明により活性化したマクロファージの貪食能を下記方法で評価した。
活性化マクロファージの貪食能の評価
前述のマクロファージ細胞の培養において、培地へ生きている大腸菌を加えた際にマクロファージに捕らえられた大腸菌数を計測した。２４穴プレートを用い、上記マクロファージ活性化試験と同様にマクロファージを培養した。対照の非活性マクロファージはＰＢＳを、活性化マクロファージは１０μｇのＨＳ１と、０．１μｇのＡＴＣＣ１１７７５（Ｅ．ｃｏｌｉ）殺菌菌体を添加し１日培養して調製した。古い培地を除去後、前もってＰＢＳで調製しておいた生きているＥ．ｃｏｌｉを各穴に６×１０６となるように添加し、マクロファージと大腸菌との接触を増やすため遠心（１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）をした。３０分間炭酸ガスインキュベーターに放置後、上清を捨て、残っているマクロファージ細胞に１ｍｌのＰＢＳを加えてピペッティングで細胞を取り出し、常法により大腸菌数を測定して結合大腸菌数とした。試験は対照群１２穴、試験群１２穴として２回繰り返した。結果を下記表３に示す。
【００４４】
（表３）
マクロファージの状態                結合大腸菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）
非活性化                            ６．７±１．７×１０５
活性化                              １．９±０．３×１０６ 
活性化：加熱殺菌したＨＳ１  １０μｇとＥ．ｃｏｌｉ  ０．１μｇを添加して１日培養
非活性化：微生物菌体のかわりにＰＢＳを添加して１日培養
【００４５】
マクロファージＪ７７４．１の培養時に乳酸菌ＨＳ１と大腸菌の加熱菌体を添加して活性化させたマクロファージは、非活性状態のマクロファージに比べてほぼ３倍量の生きている大腸菌を結合した。活性化によって微生物結合レセプターの増加、貪食能の亢進が生じたものと考えられる。
【図１】
2010265184.tif 000003
【図２】
2010265184.tif 000004