(57)【要約】【課題】新規なＭＣＰ−１産生抑制剤を提供する。【解決手段】リグノフェノール誘導体を含有する、ＭＣＰ−１産生抑制剤を提供する。リグノフェノール誘導体のＭＣＰ−１産生抑制作用により、血管内皮障害を抑制し、血管障害性疾患を予防又は治療できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノフェノール誘導体を含有する、ＭＣＰ−１産生抑制剤。
【請求項２】
前記リグノフェノール誘導体は、１価フェノール類、２価フェノール類及び３価フェノール類からなる群から選択されるフェノール類がリグニン由来のフェニルプロパンユニットに付加したジフェニルプロパンユニットを有する、請求項１に記載の産生抑制剤。
【請求項３】
前記リグノフェノール誘導体は、フェノール類中のベンゼン環の水素が置換されていないリグノフェノール誘導体及び、フェノール類のベンゼン環の水素が炭素数が１〜４のアルキル基で置換されているリグノフェノール誘導体からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の産生抑制剤。
【請求項４】
前記リグノフェノール誘導体が、１価のフェノール類がフェニルプロパンユニットに付加したジフェニルプロパンユニットを有する、請求項１〜３のいずれかに記載の産生抑制剤。
【請求項５】
前記リグニンの１価のフェノール類は、少なくとも一つのオルト位が未置換であるフェノール類から選択される１種又は２種以上である、請求項１〜のいずれかに記載の産生抑制剤。
【請求項６】
ＭＣＰ−１活性を阻害する有効量の請求項１〜５のいずれかに記載のＭＣＰ−１産生抑制剤を有効成分として含有する、ＭＣＰ−１発現が亢進している疾患の予防又は治療のための薬学的組成物。
【請求項７】
ＭＣＰ−１活性を阻害する有効量の請求項１〜５のＭＣＰ−１産生抑制剤を有効成分として含有する、血管障害性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物。
【請求項８】
前記血管障害性疾患は、動脈硬化症並びに脳梗塞、脳出血、虚血性心疾患、大動脈瘤、大動脈瘤解離、腎硬化症、腎硬化症による腎不全及び閉塞性動脈硬化症からなる動脈硬化性疾患からなる群から選択されるいずれかである、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記血管障害性疾患は、糖尿病性腎症及び糖尿病性腎症による腎不全からなる群から選択されるいずれかである、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
リグノフェノール誘導体を有する体内留置型医療器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＣＰ−１（monocyte chemoattractant protein 1、CC chemokine ligand 2とも呼ばれる、単球走化性因子）の産生抑制剤及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）の予防及び改善が着目されている。メタボリックシンドロームは、内臓脂肪型肥満に加えて高血糖、高血圧及び脂質異常のうち２つ以上を併せもった状態とされている。こうしたメタボリックシンドロームは、血管内皮障害を生じさせ、将来的にアテローム性動脈硬化症や糖尿病を引き起こし、これらの疾患に起因ないし合併する脳梗塞や心筋梗塞や糖尿病性腎症などの重篤な各種の血管障害性疾患を引き起こす。長寿高齢化社会に向けて、健康寿命の延伸やＱＯＬ（Quality of Life）の向上を図る上で、メタボリックシンドロームを予防又は改善することは極めて重要な課題となってきている。
【０００３】
メタボリックシンドロームによって引き起こされるアテローム性動脈硬化症に先立つ血管内皮障害やプラークの形成には、マクロファージの集積やその集積に関わるケモカインであるＭＣＰ−１の活発な産生が関与していることが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
ＭＣＰ−１は、１９８９年に単球走化性因子としてグリオーマ細胞株および単球性白血病細胞株より同定されたＣＣケモカインサブファミリーに属する蛋白質である。ヒトＭＣＰ−１の成熟蛋白質は、７６個のアミノ酸からなり、単球やＴ細胞の遊走活性、サイトカイン産生誘導、接着分子の発現誘導などの機能を有し、また、その産生細胞としては、単球、マクロファージ、線維芽細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、肥満細胞が知られている。
【０００５】
また、メタボリックシンドロームが強く関連する疾患の他の態様である糖尿病ではその糖ストレスや酸化ストレスにより、糸状体の細小血管が硬化することで糖尿病性腎症などの慢性期合併症を引き起こすことが知られている。こうした合併症に対しては、血糖低下剤や血圧降下剤によって発症を予防したり伸展を抑制したりすることが行われているが、有効な治療法は確立されていないのが現状である。
【０００６】
これまで、ＭＣＰ−１遺伝子の発現を抑制する遺伝子治療や医薬の開発が試みられている（特許文献１、２）。糖尿病に関しては、２型糖尿病患者において、尿中等でＭＣＰ−１レベルが正常者に比較して有意に高いことが報告されている（非特許文献２、３、４）。
【０００７】
リグノフェノール誘導体は、植物体に含まれる天然リグニンから相分離システムにより得られる化合物である。リグノフェノール誘導体は、天然リグニンと同等な化学構造を保持しつつ、フェノール性水酸基が付加された広義のポリフェノールである。これまで、リグノフェノール誘導体は、試験管内試験により抗酸化能を有していることや、過剰の銅や亜鉛による酸化ストレスで生じるアポトーシスを抑制することが知られている。また、試験内試験により、リグノフェノール誘導体は、キサンチンオキシダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、ヒアルロニダーゼの活性を阻害することも知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−３２２６００号公報
【特許文献２】特開２０００１３６１３９号公報
【特許文献３】特開２００７−２９１０３４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Circulation. 2001 ; 103(16): 2096-2101
【非特許文献２】Journal of Clinical Laboratory Analysis. 2002; 16:1-4
【非特許文献３】Diabetes Care 2003; 26: 2421-2425
【非特許文献４】The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 2006; 91: 2214-2217
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ＭＣＰ−１の産生を抑制しかつ安全で入手が容易な薬剤は未だ提供されていない。
【００１１】
そこで、本発明は、新規なＭＣＰ−１産生抑制剤を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、これらの産生抑制剤を含有する、血管障害性疾患用の医薬を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、リグノフェノール誘導体のラットにおける実験結果から、リグノフェノール誘導体が、ＭＣＰ−１の産生を抑制する作用を有していることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【００１３】
本発明によれば、リグノフェノール誘導体を含有する、ＭＣＰ−１産生抑制剤が提供される。本発明のＭＣＰ−１産生抑制剤において、前記リグノフェノール誘導体は、１価フェノール類、２価フェノール類及び３価フェノール類からなる群から選択されるフェノール類がリグニン由来のフェニルプロパンユニットに付加したジフェニルプロパンユニットを有することができる。
【００１４】
本発明のＭＣＰ−１産生抑制剤は、前記リグノフェノール誘導体は、フェノール類中のベンゼン環の水素が置換されていないリグノフェノール誘導体、フェノール類のベンゼン環の水素が炭素数が１〜４のアルキル基で置換されているリグノフェノール誘導体からなる群から選択されてもよい。さらに、前記リグノフェノール誘導体は、リグニンの１価のフェノール類であってもよく、この態様において、前記リグニンの１価のフェノール類は、少なくとも一つのオルト位が未置換であるフェ類から選択される１種又は２種以上であってもよい。
【００１５】
本発明によれば、ＭＣＰ−１活性を阻害する有効量の本発明のＭＣＰ−１産生抑制剤を有効成分として含有する、ＭＣＰ−１発現が亢進している疾患の予防又は治療のための薬学的組成物が提供される。
【００１６】
本発明によれば、ＭＣＰ−１活性を阻害する有効量の本発明のＭＣＰ−１産生抑制剤を有効成分として含有する、血管障害性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物も提供される。この態様において、前記血管障害性疾患は、動脈硬化症並びに脳梗塞、脳出血、虚血性心疾患、大動脈瘤、大動脈瘤解離、腎硬化症、腎硬化症による腎不全及び閉塞性動脈硬化症からなる動脈硬化性疾患からなる群から選択されるいずれかであってもよく、糖尿病性腎症及び糖尿病性腎症による腎不全からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
【００１７】
本発明によれば、リグノフェノール誘導体を有する体内留置型医療器具も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】培地にオレイン酸を添加した肝細胞において、リグノフェノール誘導体添加の細胞生存率に対する影響を示す図である（ｎ＝３、*ｐ＜０．０５ｖｓオレイン酸０．８ｍＭ添加、**ｐ＜０．０１ｖｓオレイン酸０．８ｍＭ添加）。
【図２】脂質代謝異常の肝細胞に対するリグノフェノール誘導体添加の影響を示す図である（ｎ＝３、**ｐ＜０．０１ｖｓオレイン酸０．８ｍＭ添加）。
【図３】ＨｅｐＧ２細胞から分泌されるアポＢタンパク量に及ぼすオレイン酸とリグノフェノール誘導体の影響を示すグラフ図である（ｎ＝３、**ｐ＜０．０１ｖｓオレイン酸０．８ｍＭ添加）。
【図４】ＨｅｐＧ２細胞から分泌されるアポＢタンパク量とＭＴＴＰのｍＲＮＡ量に及ぼすオレイン酸とリグノフェノール誘導体の影響を示すグラフ図である（ｎ＝４、**ｐ＜０．０１、*ｐ＜０．０５ｖｓオレイン酸０．８ｍＭ添加）。
【図５】ＨｅｐＧ２細胞のアポ−Ｂタンパク質分泌に及ぼす影響を示す図である（ｎ＝３、**ｐ＜０．０１ｖｓオレイン酸０．８ｍＭ添加）。
【図６】対照群と糖尿病モデルラット（リグノフェノール誘導体非投与群及び投与群）の臓器重量と各種血液生化学的検査結果を示す図である。
【図７】２４時間尿中の８−ＯＨｄＧ濃度に及ぼすリグノフェノール誘導体の影響を示す図である（ｎ＝６〜７、aｐ＜０．０５ｖｓ対照群、bｐ＜０．０５ｖｓ ＳＴＺ＋ＬＰ０％群）。
【図８】大動脈及び腎臓中のスーパーオキシド（Ｏ2-）に及ぼすリグノフェノール誘導体の影響を示すグラフである。基質として、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを添加してＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性をスーパーオキシド量として測定した。単位は、大動脈１ｍｇ当たり又は腎臓ホモジネイトのタンパク質１ｍｇ当たりのRelative light unit／minである（ｎ＝６〜７、*ｐ＜０．０５ｖｓ対照群、**ｐ＜０．０５ｖｓ ＳＴＺ＋ＬＰ０％群）。
【図９】腎臓の糸球体における線維化面積率及び糸球体及び皮髄境界領域におけるマクロファージの浸潤に及ぼすリグノフェノール誘導体の影響を示すグラフである。上段は、腎臓の糸球体の線維化面積率を示し、中段は、マクロファージの浸潤数を示し、下段は、皮髄境界領域におけるマクロファージに浸潤数を示す（ｎ＝６〜８、aｐ＜０．０５ｖｓ対照群、bｐ＜０．０５ｖｓ ＳＴＺ＋ＬＰ０％群、cｐ＜０．０５ ｖｓ ＳＴＺ＋ＬＰ０．１１％群）。
【図１０】腎臓の糸球体における線維化面積率及びマクロファージの浸潤に及ぼすリグノフェノール誘導体の影響を示す顕微鏡写真である。左は、シリウスレッドによる組織染色結果を示し、右は、マクロファージの浸潤状態を示すマクロファージの染色結果を示す。
【図１１】腎臓皮質におけるＭＣＰ−１のｍＲＮＡ量に及ぼすＬＰの影響を示すグラフ図である（ｎ＝６〜７，aｐ＜０．０５ｖｓ対照群、ｂｐ＜０．０５ｖｓ ＳＴＺ＋ＬＰ０％群）。
【図１２】高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）の血圧上昇に及ぼすリグノフェノール誘導体の影響を示す図である（ｎ＝７，aｐ＜０．０５ｖｓ ＳＨＲ＋０％ＬＰ群）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、リグノフェノール誘導体を含有するＭＣＰ−１産生抑制剤及びその用途に関する。本発明によれば、安全でかつ入手容易な化合物を新規なＭＣＰ−１産生抑制剤として提供される。また、こうしたＭＣＰ−１産生抑制剤によれば、血管ＭＣＰ−１の亢進によって引き起こされる血管内皮障害を抑制し、ＭＣＰ−１の亢進が関連する疾患や血管障害性疾患の予防又は治療のための新規な薬学的組成物が提供される。
【００２０】
リグノフェノール誘導体は、あらゆる植物体に含まれるリグニンから相分離変換システムを用いて容易に調製することができる。したがって、原料が十分にあり、また安価に入手できるので、ＭＣＰ−１産生抑制剤及び薬学的組成物をより簡易にまた安定的に供給することが可能となる。さらに、廃材のほか、大量に廃棄されるイネワラ、モミガラ、間伐材などの廃棄物の再利用を促進でき、環境保全の面からも有意義である。
【００２１】
以下、本発明のＭＣＰ−１産生抑制剤及び薬学的組成物の実施形態につき説明する。
【００２２】
(ＭＣＰ−１産生抑制剤)
【００２３】
リグノフェノール誘導体は、ＭＣＰ−１遺伝子の発現を抑制することができる。ここで「発現」とは、蛋白質が産生され且つ機能的な状態で血液中に分泌されることをいう。したがって、「発現を抑制する」とは、遺伝子の転写、転写後調節、タンパク質への翻訳、翻訳後修飾、細胞外への輸送、タンパク質のフォールディング等のいかなるメカニズムも包含する。リグノフェノール誘導体は、ＭＣＰ−１遺伝子のｍＲＮＡ又は初期転写産物の合成を抑制することができると考えられる。リグノフェノール誘導体がＭＣＰ−１遺伝子の発現を抑制しているメカニズムは明らかではないが、リグノフェノール誘導体がＭＣＰ−１遺伝子の転写抑制因子、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＲＮＡ分解酵素に直接又は間接的に作用している可能性が考えられる。
【００２４】
「ＭＣＰ−１」は、ＣＣケモカインサブファミリーに属するタンパク質である。ヒトＭＣＰ−１に対応するホモログが他の哺乳動物にも存在することが知られている。本発明が適用される哺乳動物としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されるものではないが、具体的には、ヒト、サル、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられる。本発明のＭＣＰ−１産生抑制剤は、ヒトのみならず他の哺乳動物におけるＭＣＰ−１遺伝子の発現の抑制を意図している。したがって、本発明において、ＭＣＰ−１は、ヒトＭＣＰ−１、又はヒトＭＣＰ−１の哺乳動物オルソログを含有し得る。
【００２５】
（リグノフェノール誘導体）
本発明のＭＣＰ−１産生抑制剤は、リグノフェノール誘導体を含有している。リグノフェノール誘導体は、リグニンを含むリグニン含有材料にフェノール類を作用させて得られる化合物である。典型的には、１，１−ジフェニルプロパンユニットを少なくとも一部に有するリグニン誘導体及び／又はこの１，１−ジフェニルプロパンユニットから誘導されるユニットを少なくとも一部に有するリグニン誘導体である。１，１−ジフェニルプロパンユニットは、リグニンの基本ユニットであるフェニルプロパンユニットのベンジル位（側鎖Ｃ１位、以下、単にＣ１位という。）にフェノール化合物がそのオルト位又はパラ位でグラフトしたユニットである。リグノフェノール誘導体は、１，１−ジフェニルプロパンユニットを有することができるほか、リグニンの基本ユニットであるフェニルプロパンユニットも保持することもできる。以下の式には、ｐ−クレゾールがオルト位でフェニルプロパンユニットにグラフトしたオルト位結合によるジフェニルプロパンユニット（オルト位結合ユニット）とｐ−クレゾールがパラ位でフェニルプロパンユニットにグラフトしたパラ位結合によるジフェニルプロパンユニット（パラ位結合ユニット）とを示す。
【００２６】
【化１】
2010265247.tif 000002
【００２７】
本明細書において「リグニン」とは、フェニルプロパンユニットを基本単位として有する高分子である。リグニン含有材料は、天然リグニンを含有するリグノセルロース系材料を含む。リグノセルロース系材料は、木質化した材料、主として木材である各種材料、例えば、木粉、チップの他、廃材、端材、古紙などの木材資源に付随する農産廃棄物や工業廃棄物を挙げることができる。また用いる木材の種類としては、針葉樹、広葉樹など任意の種類のものを使用することができる。さらに、リグノセルロース系材料としては、各種草本植物、それに関連する農産廃棄物（オガクズ、イネワラ、ムギワラ、バガス）や工業廃棄物なども使用できる。また、リグニン含有材料としては、天然リグニンを含有する材料のみならず、リグノセルロース材料をパルピング処理した後に得られるいわゆる変性したリグニンを含有する廃液である黒液も利用することができる。
【００２８】
リグニンに作用させるフェノール類は、少なくとも一つのオルト位又はパラ位が未置換であればよい。フェノール類のオルト位及びパラ位の炭素がフェニルプロパンユニットのベンジル位の炭素にグラフトされるからである。フェノール類は、少なくとも１つの未置換のオルト位又はパラ位を有する限り、１価のフェノール類、２価のフェノール類及び３価のフェノール類から選択される１種又は２種以上である。２種以上のフェノール類をリグニンに作用させてもよい。後述するように、リグノフェノール誘導体等の分子量の調節を考慮すると、オルト位置換ユニットを得ることのできる、少なくとも一つのオルト位が未置換のフェノール類を用いることが好ましい。
【００２９】
１価のフェノール類としては、１以上の置換基を有していてもよいフェノール、１以上の置換基を有していてもよいナフトール、１以上の置換基を有していてもよいアントロール、１以上の置換基を有していてもよいアントロキノンオールなどが挙げられる。２価のフェノール類の具体例としては、１以上の置換基を有していてもよいカテコール、１以上の置換基を有していてもよいレゾルシノール、１以上の置換基を有していてもよいヒドロキノンなどが挙げられる。３価のフェノール類の具体例としては、１以上の置換基を有していてもよいピロガロールなどが挙げられる。本発明においては１価のフェノール類、２価のフェノール類及び３価のフェノール類のうち、１種あるいは２種以上を用いることができるが、好ましくは１価のフェノール類を用いる。
【００３０】
フェノール類が有していてもよい置換基の種類は特に限定されず、任意の置換基を有していてもよいが、好ましくは、電子吸引性の基（ハロゲン原子など）以外の基であり、例えば、炭素数が１〜１８（より好ましくは１〜１５、さらに好ましくは１〜１０、一層好ましくは１〜７）のアルキル基が挙げられ、より好ましくは、炭素数が１〜４、好ましくは炭素数が１〜３の低級アルキル基含有置換基である。低級アルキル基含有置換基としては、例えば、低級アルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基など）、低級アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基など）である。また、アリール基（フェニル基など）の芳香族系の置換基を有していてもよい。また、水酸基含有置換基であってもよい。
【００３１】
以上のことから、フェノール誘導体の好ましい具体例としては、ｐ−クレゾール、２，４−ジメチルフェノール、２−メトキシフェノール（Ｇｕａｉａｃｏｌ）、カテコール、レゾルシノール、ホモカテコール、ピロガロール及びフロログルシノールなどが挙げられる。ｐ−クレゾールを用いることにより、高い導入効率を得ることができる。
【００３２】
リグノフェノール誘導体の分子量は特に限定されない。ただし、物性などの点から、分子量５００以上であることが好ましく、１０００以上であることがより好ましい。また、取り扱い易さなどから、分子量１０万以下であることが好ましく、１万以下であることがより好ましい。
【００３３】
リグニン含有材料に対してフェノール類を作用させてリグノフェノール誘導体を得ることは、特開平２−２３３７０１号、国際公開ＷＯ９９／１４２２３号公報、特開平９−２７８９０４号公報、特開２００１−６４４９４号、特開２００１−２６１８３９号、特開２００１−１３１２０１号、特開２００１−３４２３３号、特開２００２−１０５２４０号等において記載されている（これらの特許文献に記載の内容は、全て引用により本明細書中に取り込まれるものとする）。本発明におけるリグノフェノール誘導体をこれらの製造方法を適用して製造することができる。例えば、リグノフェノール誘導体は、以下のようにして製造することができる。
【００３４】
リグニン含有材料中のリグニンを、リグノフェノール誘導体に変換し、分離する方法としては各種方法が採用できる。例えば、リグノセルロース系材料に、液体状のフェノール誘導体（上記で説明したもの、例えば、ｐ−クレゾール）を浸透させ、リグニンをフェノール類により溶媒和し、次に、リグノセルロース系材料に酸（例えば、７２％硫酸等の濃酸）を添加し混合して、セルロース成分を溶解する。この方法によると、リグニンが低分子化され、同時にその基本構成単位のＣ１位にフェノール化合物が導入されたリグノフェノール誘導体がフェノール類相に生成される。このフェノール類相から、リグノフェノール誘導体が抽出される。リグノフェノール誘導体は、例えば、リグニン中のベンジルアリールエーテル結合が開裂して低分子化されたリグニンの低分子化体の集合体として得られる。
【００３５】
フェノール類相からのリグノフェノール誘導体の抽出は、例えば、次の方法で行うことができる。すなわち、フェノール類相を、大過剰のエチルエーテルに加えて得た沈殿物を集めて、アセトンに溶解する。アセトン不溶部を遠心分離により除去し、アセトン可溶部を濃縮する。このアセトン可溶部を、大過剰のエチルエーテルに滴下し、沈殿区分を集める。この沈殿区分から溶媒を留去し、リグノフェノール誘導体を得る。なお、粗リグノフェノール誘導体は、フェノール化合物相やアセトン可溶区分を単に減圧蒸留により除去することによって得ることができる。
【００３６】
また、リグニン含有材料に、固体状あるいは液体状のフェノール化合物を溶解した溶媒（例えば、エタノールあるいはアセトン）を浸透させた後、溶媒を留去（フェノール化合物の収着）した場合も、先の方法と同様、リグノフェノール誘導体が生成される。この方法においては、生成したリグノフェノール誘導体は、液体フェノール化合物にて抽出分離することができる。あるいは、全反応液を過剰の水中に投入し、不溶区分を遠心分離にて集め、脱酸後、乾燥する。この乾燥物にアセトンあるいはアルコールを加えてリグノフェノール誘導体を抽出する。さらに、この可溶区分を第１の方法と同様に、過剰のエチルエーテル等に滴下して、リグノフェノール誘導体を不溶区分として得ることもできる。以上、リグノフェノール誘導体の調製方法の具体例を説明したが、これらに限定されるわけではなく、これらに適宜改良を加えた方法で調製することもできる。
【００３７】
なお、リグノフェノール誘導体を合成するのに用いる酸は、特に限定されないで、リグノフェノール誘導体を生成しうる範囲で各種無機酸や有機酸を使用することができる。したがって、硫酸、リン酸、塩酸などの無機酸の他、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ギ酸などを使用することができる。リグニン含有材料としてリグノセルロース系材料を使用する場合には、セルロースを膨潤させる作用を有していることが好ましい。酸は、好ましくは濃酸であり、例えば、６５重量％以上の硫酸（好ましくは、７２重量％の硫酸）、８５重量％以上のリン酸、３８重量％以上の塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ギ酸などを挙げることができる。
【００３８】
このようにして得られるリグノフェノール誘導体は、式（１）に記載のジフェニルプロパンユニットを有している。リグノフェノール誘導体は、ジフェニルプロパンユニットを備えるほか、フェノール類がグラフトされていないフェニルプロパンユニットを備えることもあり、さらに、Ｃ１位へのフェノール類の導入形態がそのフェノール性水酸基を介して導入されたユニットを備えている場合もある。リグノフェノール誘導体は、おおよそ一般に以下のような性状等を有しているといえる。ただし、これに限定されるものではない。こうして得られるリグノフェノール誘導体の構造の一部の一例を以下の式に示す。
【００３９】
（１）重量平均分子量が２０００〜２００００程度である。
（２）分子内に共役系をほとんど有さずその色調は極めて淡色である。典型的には淡いピンク系白色粉末である。
（３）針葉樹のリグノセルロース由来で約１７０℃、広葉樹のリグノセルロース由来で約１３０℃に固−液相転移点を有する。
（４）メタノール、エタノール、アセトン、ジオキサン、ピリジン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドなどに容易に溶解する。
【００４０】
【化２】
2010265247.tif 000003
【００４１】
さらに、リグノフェノール誘導体は、ＭＣＰ−１活性抑制活性を損なわない限り、さらに誘導体化されていてもよい。例えば、アルカリ処理がなされてジフェニルプロパンユニット部位で低分子化されると同時に、ジフェニルプロパンユニットが以下の式で表されるアリールクマランユニットに変換されたものであってもよい。こうしたアルカリ処理体であっても、ジフェニルプロパンユニットは保持されうる。なお、アルカリ処理により低分子化する場合、リグノフェノール誘導体においてジフェニルプロパンユニットに導入されているフェノール類は、少なくとも１つのオルト位が未置換のフェノール類である必要がある。なお、以下の式で表される低分子化体のアリールクマランユニット（切断端部となる）は、ｐ−クレゾールが付加したジフェニルプロパンユニットがアルカリ処理により変換されたアリールクマランユニットである。
【００４２】
【化３】
2010265247.tif 000004
【００４３】
また、リグノフェノール誘導体に対して、アセチル基やアミノ基などの導入も可能である。リグノフェノール誘導体は、リグノフェノール誘導体中のフェノール性ＯＨ基の水素原子が−ＣＯＲ基（アシル基）で置換された構造を備えたものであってもよい。アシル基導入二次誘導体は、無水酢酸などのアシル化剤とリグノフェノール誘導体とを反応させることによって得られる。アシル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ベンゾイル基及びトルオイル基等が挙げられる。アシル基導入反応は、一般的なアシル基導入反応条件をリグノフェノール誘導体に適宜適用して実施することができる。なお、アセチルクロリドなどのカルボン酸モノハライドを用いてもアシル基を導入することができる。
【００４４】
リグノフェノール誘導体は、リグノフェノール誘導体中のフェノール性水酸基の水素原子が、−ＣＯＲＣＯＯＨ基で置換された構造を有するものであってもよい。こうしたカルボキシル基導入二次誘導体は、酸ジクロリドなどの酸ジ（あるいはそれ以上の）ハライドを用いてリグノフェノール誘導体のフェノール性水酸基をエステル化すると同時にカルボキシル基を導入することによって得られる。例えば、酸ハライドとしては、アジピン酸ジクロリドやマレイン酸ジクロリド、テレフタル酸ジクロリドなどを用いることができる。これらの酸ハロゲン化物を用いたエステル化反応については、当業者において周知であり、一般的な反応条件をリグノフェノール誘導体についても適宜適用して実施できる。
【００４５】
さらに、リグノフェノール誘導体は、リグノフェノール誘導体中の二重結合あるいは前記カルボキシル基を備える二次誘導体の当該カルボキシル基にアミド基（−ＣＯＮＨＲ）を備える構造を有するものであってもよい。アミド基のＲとしては、炭素数１〜５程度の低級直鎖若しくは分岐アルキル基又は炭素数６〜９程度の置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アルキルアリール基、アラルキル基などを挙げることができる。アミド基導入二次誘導体は、リグノフェノール誘導体中の二重結合あるいは前記カルボキシル基導入反応後に当該カルボキシル基に対してアミド基を導入することによって得られる。これらの部分に対するアミド基導入反応については、従来公知の各種試薬及び条件を適宜選択して用いることができる。
【００４６】
本発明のＭＣＰ−１産生抑制剤は、リグノフェノール誘導体が、ＭＣＰ―１産生抑制剤として機能することで、リグノフェノール誘導体を、ＭＣＰ−１の亢進が関連する疾患の予防又は治療に用いることができる。また、血管障害性疾患の予防又は治療にも用いることができる。ＭＣＰ−１の亢進が関連する疾患としては、炎症性疾患があり、例えば、炎症性腸炎、肺高圧症、関節リウマチ、遅延型アレルギー、肝線維症、肺線維症、腎硬化症などの炎症性免疫疾患が挙げられる。さらに、生活習慣病に関連した疾患が挙げられる。たとえば、肥満症、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、脂質異常症、高血圧症、動脈硬化症（例えば、慢性閉塞性動脈硬化症）、虚血性心疾患（例えば、狭心症、心筋梗塞）、脳卒中、高尿酸血症、大腸癌、肺気腫、慢性気管支炎、歯周病、骨粗髪症が挙げられる。
【００４７】
ＭＣＰ−１の産生を抑制することは、血管内皮障害を予防又は抑制するので、リグノフェノール誘導体は、血管障害性疾患の予防又は治療に用いることができる。血管障害性疾患としては、動脈硬化性疾患が挙げられる。動脈硬化性疾患は、起き方によってアテローム硬化、細動脈硬化、メンケルベルグ型（中膜）硬化に分けられ、脳梗塞、脳出血、脳血栓、クモ膜下出血などの脳血管障害、心筋梗塞や狭心症などの虚血性心疾患、大動脈瘤、大動脈瘤解離、閉塞性動脈硬化症等から選択される疾患などが挙げられる。また、動脈硬化性疾患としては、腎硬化症、糖尿病性腎症及びこれらによる腎不全などの腎臓関連の小血管障害性の疾患も挙げられる。
【００４８】
リグノフェノール誘導体は、また、糖尿病の合併症としての血管障害性疾患に有用である。すなわち、こうした血管障害性疾患としては、糖尿病性腎症などの小血管障害性疾患や、虚血性心疾患、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症等の大血管障害性疾患が挙げられる。糖尿病の合併症としてのこれらの血管障害性疾患は、一般に重篤になる傾向があるが、リグノフェノール誘導体は以下に説明する理由により有用である。
【００４９】
リグノフェノール誘導体は、ＭＣＰ−１活性抑制作用のほか、各種の生理活性を有している。例えば、既に経口投与で血中の総コレステロール量やＬＤＬコレステロール、トリグリセリドを低下させることが知られている。このような生理活性も上記のような生活習慣病、血管障害性疾患、糖尿病の合併症の予防又は治療に相乗的に作用する。また、本発明者らは、リグノフェノール誘導体が、血圧低下作用を有することも新たに見出している。このようなリグノフェノール誘導体の生理活性作用も、同様に、上記各疾患の予防又は治療に相乗的に作用する。なお、リグノフェノール誘導体は、それ自体降圧剤としても利用でき、また、リグノフェノール誘導体を血圧低下のための有効成分として含有する薬学的組成物も提供される。
【００５０】
（薬学的組成物）
上記したリグノフェノール誘導体のＭＣＰ−１産生抑制作用に基づく各種作用を奏する薬学的組成物として用いることができる。本発明の薬学的組成物は、任意の投与形態に適した製剤形態を採ることができる。いずれの投与形態であっても、薬学的組成物は、単位投与形態等に関し医薬分野で知られている任意の方法により調製することができる。本発明の薬学的組成物は、経口、直腸、局所、鼻、眼または非経口（腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、関節内注射を包含する）投与に適した製剤とすることができる。経口投与形態としては、カプセル、錠剤、分散剤、顆粒剤、懸濁剤、サイクロデキストリン包埋剤のほか、例えば腸溶コーティング等がされたカプセルおよび／または錠剤、リグノフェノール誘導体がコーティングされたペレットを含有するカプセルおよび／または錠剤が挙げられる。非経口投与形態としては、局所用製剤としては、粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、経皮パッチが挙げられる。その他、口腔内パッチ、経口または鼻腔スプレーが挙げられる。
【００５１】
本発明の薬学的組成物は、有効量のリグノフェノール誘導体と、１種または複数の不活性な薬学的に許容できる担体、さらに任意選択で任意の他の治療成分、安定剤などを含むことができる。薬学的組成物は、希釈剤、緩衝剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、滑剤、防腐剤（抗酸化剤を包含する）、香料、矯味剤、無機塩（例えば塩化ナトリウム）、抗菌剤（例えば塩化ベンザルコニウム）、甘味剤、帯電防止剤、界面活性剤、ソルビタンエステル、脂質（例えばレシチンおよび他のホスファチジルコリンなどのリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸および脂肪族エステル、ステロイド（例えばコレステロール））およびキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ、亜鉛および他のこのような適切なカチオン）をさらに包含してもよい。
【００５２】
薬学的組成物中のリグノフェノール誘導体の量は、投与形態、予防又は治療される状態、予防又は治療の目的、投与対象となる患者集団他、様々な因子に応じて変動する。通常、当業者であれば、容易に決定することができる。有効量とは、リグノフェノール誘導体が、ＭＣＰ−１の産生を抑制するのに必要な量である。有効量は、実際には、治療される状態の重度、患者集団、製剤の安定性などに応じて幅広く変動するが、薬学的組成物は、通常、概して有効成分を約０．００１質量％から約９９質量％、好ましくは活性剤を約０．０１質量％から約５質量％、さらに好ましくは活性剤を約０．０１質量％から２質量％含有することができる。また、本発明の薬学的組成物の投与量は、リグノフェノール誘導体に関する実験データを考慮し、従来の用量決定試験を使用することで、当業者であれば所定の一連の状態に関して最適な用量を得ることができる。
【００５３】
本発明の組成物は、医薬組成物を調製するために通常知られている方法で、例えば、混合、溶解、顆粒化、包埋、糖衣丸製造、湿式粉砕、乳化、カプセル封入、閉じ込めまたは凍結乾燥などの従来技術を使用して製造することができる。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は、また、除放性システムを備えたものであってもよい。除放性システムは、各種投与形態において公知のシステムが適用される。徐放性製剤としては、例えば、適切な半透過性ポリマーマトリックス、適切な疎水性物質、イオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体などを用いることができる。
【００５５】
なお、本発明によれば、リグノフェノール誘導体を、降圧作用を有する有効成分としてその有効量を含有する薬学的組成物も提供される。降圧作用は、ＭＣＰ−１産生抑制作用と必ずしも関連があるとはされていない。したがって、降圧のための薬学的組成物における有効量は、降圧作用が得られるのに必要な量として設定される。
【００５６】
（体内留置型医療器具）
本発明によれば、リグノフェノール誘導体を有する体内留置型医療器具も提供される。本発明の体内留置型医療器具は、体内留置時にリグノフェノール誘導体を放出可能に有している。体内留置型医療器具としては、血管拡張術等に用いられ血管内に留置されるステント等が挙げられる。こうした器具にリグノフェノール誘導体を付与するには、器具表面をリグノフェノール誘導体で被覆したり、リグノフェノール誘導体を保持させた繊維性材料等で器具を被覆してもよい。さらに、器具にリグノフェノール誘導体を貯蔵するための溝や孔部を設けその中にリグノフェノール誘導体を含ませてもよい。本発明の体内留置型医療器具を血管内等に留置することで、血管内周囲に局所的にリグノフェノール誘導体が供給され、ＭＣＰ−１の発現、産生を抑制し、局所的に炎症を抑え、動脈硬化病変治療効果を発揮することができる。特に、こうした医療器具は、各種ステント後の再狭窄や血栓症、各種血管内治療処置、例えば、ＰＣＩ後、ＰＴＣＡ後、ＣＥＡ後等の再狭窄及び血栓症に好適に用いられる。
【００５７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５８】
（リグノフェノール誘導体の合成）
スギ由来リグノフェノールを二次誘導体変換し、低分子化したものを実験に供した（Funaoka et al. 1995; 1996; Fujita et al.2003)。すなわち、乾燥させたスギを製粉し、８０メッシュの篩にかけ、さらにエタノール−ベンゼン液（１：２，ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ）を用い、粗精製した。その後、そのスギ木粉にアセトンに溶解したρ−クレゾール（１０ｍＬ／ｇスギ木粉）を攪拌しながら加えた。数分間、静置させたのち、７２％硫酸を加え、室温にて攪拌し、反応混合物を有機物層と水層に分離した。有機物層に過剰量の水を攪拌しながら加え、ｐＨが中性になるまでこれを繰り返した。ＬＰは、０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてアルカリ処理し加熱した二次誘導体変換によって低分子化し、凍結乾燥して、低分子化体を得た。その後、精製物の分子量について、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて確認した(Nagamatsu & Funaoka 2001; Fujita et al. 2003)。
この低分子化体の重量平均分子量は１６００であった。
【実施例２】
【００５９】
（スギ由来リグノフェノール誘導体（ＬＰ）による脂質代謝異常の改善作用の評価）
実施例１で合成したリグノフェノール誘導体の一種である低分子化体を、ジメチスルホキシド（ＤＭＳＯ）に一次希釈し、フィルター滅菌して各種濃度のＬＰ溶液を調製した。継代培養したＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝臓由来株化細胞）を、１０％ウシ胎児血清（ＢＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地を用いて、φ３５ｍｍプラスティックディッシュに播き、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで８０％コンフルエントまで前培養した。前培養終了後、細胞をＰＢＳ−で洗浄した後、異なる濃度（０，７．５，１５，３０μｇ／ｍｌ）のＬＰを、培地中のＤＭＳＯの最終濃度が０．５％以下となるように培地に添加した１％ウシ血清アルブミン、０．８ｍＭオレイン酸を含むＤＭＥＭ培地に交換して４８時間の本培養を行った。
【００６０】
（試験方法及び結果）
（１）ＬＰによる細胞毒性
ＬＰによる細胞毒性は、ニュートラルレッド法を用いて評価した。すなわち、４８時間の本培養後、培地を取り除き、ニュートラルレッド溶液（０．５％ＰＢＳ溶液）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで６０分間、細胞を培養した。培養終了後、細胞固定液（１％ＣａＣｌ２・１％ホルムアルデヒド溶液）でプラスティックディッシュを洗浄し、抽出液（１％酢酸、５０％エタノール溶液）を用いて生細胞に取り込まれたニュートラルレッドを抽出した。その後、５４０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定し、ＬＰによるＨｅｐＧ２細胞の生細胞数に及ぼす影響を調べた。結果は、図１に示すように、培地にオレイン酸を添加した肝細胞において、ＬＰ添加による細胞生存率の低下は30μg/mlまで認められなかった。このことは、ＬＰは肝細胞に細胞死を誘導することなく、生理調節機能を有することを示していた。結果は、平均値±標準偏差で示した。
【００６１】
（２）細胞内コレステロールの測定
細胞内コレステロール含量に及ぼすＬＰの影響を酵素法にて測定した。４８時間の本培養後、ＨｅｐＧ２細胞を回収した。細胞内コレステロールは、脂質抽出液（クロロホルム：メタノール＝２：１）を用いて抽出し、減圧濃縮によって有機溶媒を除去して抽出した。抽出したコレステロールは、エタノールに溶解した後にＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｓｔｅｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、総コレステロール含量として定量した。結果は、図２に示すように、培地にオレイン酸を添加し、脂質代謝異常とした肝細胞では、肝細胞内のコレステロール濃度が有意に上昇したが、ＬＰ添加により濃度依存的に減少した。結果は、平均値±標準偏差で示した。
【００６２】
（３）培地中のアポＢ蛋白質の測定
アポＢ蛋白質（アポＢ）分泌に及ぼすＬＰの影響を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。４８時間の本培養後、ＨｅｐＧ２細胞の培地を回収した。回収した培地に分泌されたアポＢ量は、ＡＬｅｒＣＨＥＫ，ｉｎｃ．Ｔｏｔａｌ Ｈｕｍａｎ ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ（ＡｐｏＢ）ＥＬＩＳＡ Ａｓｓａｙキットを用いて測定した。結果を図３に示す。結果は、平均値±標準偏差で示した。
【００６３】
図３に示すように、培地にオレイン酸を添加し、脂質代謝異常とした肝細胞では、培地中のアポＢ量が上昇したが、ＬＰ添加により濃度依存的に減少した。このことは、ＬＰは肝細胞からのアポＢの分泌を抑制していることを示していた。
【００６４】
（４）アポＢタンパク質及びコレステロール代謝関連タンパク質ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＴＴＰ）のｍＲＮＡ発現量の測定
ＬＰによるコレステロール代謝関連遺伝子（アポＢ及びｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＴＴＰ））のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲ法にて定量した。４８時間の本培養後、ＨｅｐＧ２細胞内の総ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを用いて各遺伝子に特異的に対応するプライマー・プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、各遺伝子のｍＲＮＡ発現の相対量を評価した。
アポＢ、ＭＴＴＰ、内在性コントロールとして用いたｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）のプローブとプライマーは、ＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）であり、コード番号は各々、Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１、Ｈｓ０１０７１２０８＿ｇ１、Ｈｓ００１６５１７７＿ｍ１であった。ΔΔＣｔ法を用いて、対照群のＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対するアポＢ、ＭＴＴＰの相対発現量を算出して各群を比較した。なお、総ＲＮＡの抽出は、以下のようにして行った。すなわち、細胞からの総ＲＮＡの抽出では、抽出キットであるＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。抽出した総ＲＮＡの純度評価および定量は、バイオアナライザ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて行った。結果を図４に示す。結果は、平均値±標準偏差で示した。
【００６５】
図４に示すように、培地にオレイン酸を添加し、脂質代謝異常とした肝細胞では、トリグリセリドを輸送するタンパク質ＭＴＴＰのｍＲＮＡ発現量は上昇したが，ＬＰ添加により有意に減少することがわかった。
【実施例３】
【００６６】
（オイルパーム空果房（Ｅｍｐｔｙ Ｆｒｕｉｔ Ｂｕｎｃｈｅｓ：ＥＦＢ）由来リグノフェノール誘導体（ＥＦＢ−ＬＰ）による脂質代謝異常の改善作用の評価）
オイルパーム空果房を原料として用いる以外は、実施例１に準じて操作してＥＦＢ−ＬＰを得た。このＥＦＢ−ＬＰを用いる以外は、実施例２と同様にして細胞を培養し、培地中のアポＢ蛋白質の測定を行った。なお、群間の有意差検定は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行った後、Tukey法（多重比較法）を用いた。結果を図５に示す。結果は、平均値±標準誤差で示した。
【００６７】
図５に示すように、培地にオレイン酸を添加し、脂質代謝異常とした肝細胞では、培地中のアポＢ量が上昇したが、ＥＦＢ−ＬＰ添加により濃度依存的に減少した。このことはＬＰが肝細胞からのアポＢの分泌を抑制することを示していた。
【実施例４】
【００６８】
（リグノフェノール誘導体による糖尿病における腎障害の改善作用の評価）
（実験動物および糖尿病モデルラットの作製）
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（雄性，６週齢）を日本クレア株式会社より購入し、実験に用いた。実験動物は、２３±１°Ｃ、明暗期１２時間の条件で飼育した。１週間の馴化期間の後、実験に供した。飲料水は、蒸留水を自由摂取させた。飼料として、馴化飼育期間は全ての動物にＭＦ飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）を与えた。なお、本研究は「青森県立保健大学動物実験に関する指針」に従って実施した。
【００６９】
糖尿病モデルラットを作製するために、０．０５ｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）に溶解したストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）をラットの体重１ｋｇあたり６５ｍｇとなるように尾静脈内に単回投与した。４８時間後の血糖値を測定し、３００ｍｇ／ｄｌ以上の動物を糖尿病ラットとした。なお、対照群（健常ラット）には、クエン酸緩衝液を尾静脈内に単回投与した。
【００７０】
糖尿病ラットを４群に分け、ＬＰを５週間投与した。すなわち、ＬＰ非投与群（０％ＬＰ群、６例）、０．１１％投与群（６例）、０．３３％投与群（６例）および１．０％投与群（７例）である。対照群（健常ラット、８例）には、標準動物飼料であるＭＦ飼料のみを投与した。飼料および飲料水は自由摂取させた。
【００７１】
投与後４週に各群のラットを代謝ケージに入れ、２４時間尿を採取した。投与後５週に、前日に一晩絶食させた後、すべてのラットの体重を測定し、ジエチルエーテルによる吸入麻酔下にて採血し、屠殺した。腎臓および胸部・腹部大動脈を素早く摘出し、０．９％食塩水で洗浄し、水分を取り除いた後、腎臓重量を測定した。腎臓の半分は、皮質部と髄質部にわけた。腎臓の一部は病理標本および免疫組織化学的検査のために、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液に一晩浸漬させた。腎臓の残りは直ちに、液体窒素に浸漬させた後、分析まで−８０℃で保存した。大動脈はスーパーオキシド測定のために、生理食塩水中で４℃にて一晩保存した。
【００７２】
なお、統計処理は、以下の手法に従って行った。群間の有意差検定は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った後、Ｔｕｋｅｙ法（多重比較法）を用いた。結果は、平均値±標準誤差で示した。
【００７３】
（試験方法及び結果）
（１）血液生化学検査
ラットから採血後、３０００ｒｐｍで（１０分間、４℃）遠心分離を行い、血漿を得、これを検体として測定に供した。血漿中のグルコース、尿素窒素（ＢＵＮ）、トリグリセリド、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロールの各濃度を生化学自動分析装置（富士ドライケム３５００Ｖ：富士写真フイルム株式会社）を用いて測定した。血漿中クレアチニン濃度は、クレアチニン−ＨＡ テストワコーを用いて測定した。結果を図６に示す。
【００７４】
図６に示すように、通常食を与えた糖尿病ラット（ＬＰ０％群）の血糖値は、対照群に比べて有意に上昇したが、ＬＰ０．１１％群を除き、他のＬＰ投与群との間には差はほとんど認められなかった。また、糖尿病ラットであるＬＰ０％群のトリグリセリド濃度は、対照群に比べて増加傾向がみられたが、ＬＰ０．３３％および１．０％群では減少していた。さらに、糖尿病ラットであるＬＰ０％群の総コレステロール濃度は、対照群に比べて増加傾向がみられたが、ＬＰ１．０％群では減少していた。以上のことから、ＬＰは、糖尿病ラットにおいても有意に血中脂質を低下させることがわかった。
【００７５】
（２）２４時間尿中の８−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ（８−ＯＨｄＧ）の測定
ＤＮＡ中のグアニン塩基は活性酸素の作用により酸化損傷を受けると８−ＯＨｄＧとなるので、８−ＯＨｄＧは酸化ストレスの指標となることが知られている。そこで、２４時間尿中の８−ＯＨｄＧ量を高感度８−ＯＨｄＧ Ｃｈｅｃｋ（日本老化制御研究所）を用い、競合ＥＬＩＳＡ法により定量した。結果を図７に示す。
【００７６】
図７に示すように、糖尿病ラットであるＬＰ０％群の８−ＯＨｄＧ濃度は、対照群に比べて増加したが、ＬＰを投与した群では低下した。
【００７７】
（３）大動脈および腎臓中のスーパーオキシドの測定
大動脈のスーパーオキシドは、ルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−９、９’−ｂｉａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｄｉｎｉｔｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ社）を用いた化学発光法により測定した。すなわち、９８６μＬのＰＢＳがはいったマイクロチューブに３〜５ｍｍの輪切りにした大動脈を入れ、ルシゲニンを最終濃度が５μＭになるように添加した。次いで、基質として最終濃度が１００μＭとなるように  ＮＡＤＨ（nicotinamide adenine dinucleotide）あるいはNADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）を加え、転倒混和し、室温にて３分間静置させた。その後、直ちに、ルミノメータ（プロメガ社）を用いて、計測時間を３０秒として発光強度を測定した。測定した後、大動脈に付着している水分を十分除去して重量を測定した。大動脈のスーパーオキシドの値は、大動脈１ｍｇあたりのＲｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）／ｍｉｎで表した。
【００７８】
腎臓の皮質部および髄質部のスーパーオキシドは、以下のように測定した。すなわち、腎皮質の場合は約０．２ｇを採取し、２０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．８、ＰＢＳ）を加え、腎髄質の場合は約０．１２ｇを採取し、１０ｍｌのＰＢＳを加え、ホモジナイズし、遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を行い、その上清を採取した。上清は、測定時まで−８０℃の冷凍庫で保存した。腎臓の皮質および髄質のスーパーオキシドは、大動脈と同様にルシゲニンを用いた化学発光法により測定した。すなわち、１．５ｍｌのマイクロチューブにＰＢＳ８８６μｌを入れ、腎臓サンプルを１００μｌ、ルシゲニンを最終濃度が１μＭになるように添加した。基質としてＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ（いずれも、最終濃度が１００μＭ）を加え、転倒混和し、室温にて３分間静置させた。その後直ちに、ルミノメータで計測時間を３０秒として発光強度を測定した。腎臓のスーパーオキシド量は、ＲＬＵ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎで表した。なお、腎臓の髄質・皮質の上清中のタンパク質濃度は、ＢＣＡＴＭＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ社）を用いて測定した。結果を図８に示す。
【００７９】
図８に示すように、糖尿病ラットであるＬＰ０％群の大動脈のＯ２−量は、対照群に比べて有意に増加したが、ＬＰ１．０％群では有意に減少が認められた。また、糖尿病ラットであるＬＰ０％群の腎臓の皮質のＯ２−量は、対照群に比べて有意に増加したが、ＬＰ１．０％群では有意に減少が認められた。
【００８０】
（４）病理標本の作製および免疫組織化学的検査
線維化の程度を調べるために、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液で化学固定した腎臓の薄切組織切片を脱パラフィン処理した。その後、線維を赤色に染めるシリウスレッド染色を施した。すべてのラットについて５箇所の糸球体を無作為に選び、腎臓の糸球体の線維化領域の面積をＣｏｌｏｒ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて画像処理して計測した。線維化面積は糸球体面積を１００としてパーセントで表した。結果を図９及び図１０に示す。
【００８１】
腎臓のマクロファージの出現を調べるために、薄切組織切片を脱パラフィン処理した後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに溶かした０．１％トリプシン溶液を加え、３７℃で１５分間反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄した。その後、内因性のペルオキシダーゼを不活性化するために３％過酸化水素水を加え、室温で１０分間反応させてからＰＢＳで３回洗浄した。次にＰＢＳで溶かした１．５％スキムミルク溶液を加え、室温で３０分間反応させて、一次抗体である抗ＥＤ１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を抗体希釈液（１％ウシ血清アルブミン）で２００倍に希釈し、組織切片に滴下し、乾燥を防ぐためにモイスチャーチャンバー内にて一晩４℃にて反応させた。染色にはＬＳＡＢ２キット／ＨＲＰ（ダコ社）を用い、ビオチン標識二次抗体を加え、室温にて３０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを加え、室温にて３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、組織切片にＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）１０ｍｇを５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍｌで調整し３％過酸化水素水を加えた発色基質溶液中で反応させた。発色反応は蒸留水を加えて停止させた。その後、ヘマトキシリンにより対比染色を行い、脱水、透徹後、封入剤で封入した。
【００８２】
すべてのラットについて腎臓の糸球体５０箇所を無作為に選び、糸球体１箇所中のＥＤ１陽性マクロファージ数を、また腎臓の皮髄境界領域から５箇所を無作為に選び、単位面積（０．０６２５ｍｍ２）あたりのＥＤ１陽性マクロファージ数を計測した。結果を図９に示す。
【００８３】
図９及び図１０に示すように、糖尿病ラットであるＬＰ０％群の糸球体ではシリウスレッド染色による濃赤色を呈し、対照群に比べて線維化面積率は増加したが、ＬＰ１．０％群では減少した。また、図９に示すように、糖尿病ラットであるＬＰ０％群の腎臓の糸球体のマクロファージ浸潤数は対照群に比べて有意に増加したが、ＬＰ投与群では減少した。また、図９に示すように、糖尿病ラットであるＬＰ０％群の腎臓の皮髄境界領域のマクロファージ浸潤数は対照群に比べて有意に増加したが、ＬＰ投与群では減少した。
【００８４】
（６）腎臓のＭＣＰ−１のｍＲＮＡの測定
凍結保存した腎臓の皮質からの総ＲＮＡの抽出では、抽出キットであるＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。抽出した総ＲＮＡの純度評価および定量は、バイオアナライザ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて行った。次にＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使って、２μｇの総ＲＮＡから逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを合成した。その後、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡを定量するために、ｃＤＮＡからＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７０００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍおよびＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。用いたＭＣＰ−１のプライマーおよびプローブは、ＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（Ｒｎ００５８０５５５＿ｍ１）であった。また、内在性コントロールとしてｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡについて、Ｔａｑｍａｎ Ｒｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて同様に定量的ＰＴ−ＰＣＲを行った。検量線法により得られたＭＣＰ−１ｍＲＮＡの相対発現量をＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの相対発現量により標準化し、対照群のうちの１個体のＭＣＰ−１ｍＲＮＡ発現量を１として各群を比較した。結果を図１１に示す。
【００８５】
図１１に示すように、マクロファージの活性化や浸潤に関連するＭＣＰ−１のｍＲＮＡはＬＰ０％群では高値であったが、ＬＰ１．０％群では低下した。
【実施例５】
【００８６】
（リグノフェノール誘導体による血圧上昇の抑制作用の評価）
（実験動物）
高血圧自然発症ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔ，ＳＨＲ）とその対照動物であり正常血圧のＷｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏ Ｒａｔ（ＷＫＹ）（いずれも、７週齢の雄性）を実験動物として使用した。動物は購入後、動物飼育環境に２週間、馴化させてから実験に供した。飼育環境は室温２３±１℃、湿度５５±７％、各１２時間の明暗サイクルとした。なお、本研究は「青森県立保健大学動物実験に関する指針」に従って実施した。
【００８７】
（ＬＰの投与）
ＬＰは、三重大学・舩岡研究室より供与された。これを市販のＭＦ飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）に混合し、ＬＰ含有粉末飼料とした。
ＳＨＲおよびＷＫＹを用いて６週間投与した。すなわち、ＳＨＲは０％ＬＰ群（７例）および１．０％ＬＰ群（７例）、ＷＫＹも同様に０％ＬＰ群（７例）および１．０％ＬＰ群（７例）である。０％ＬＰ群には標準動物飼料であるＭＦ飼料のみを投与した。飼料および飲料水は自由摂取させた。投与期間中、２週間に１回、収縮期血圧を測定した。
【００８８】
（血圧の測定及び結果）
尾部カフ法により血圧を測定した。すなわち、予め３５℃に加温した保温チャンバーにラットを入れラットを保温した。その後、ラットを動物固定ホルダに固定し、計測チャンバー内にセットし、尾部にカフ・パルスセンサーを取り付け、収縮期血圧を測定した。なお、群間の有意差検定は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った後、Ｔｕｋｅｙ法（多重比較法）を用いた。結果は、平均値±標準誤差で示した。結果を図１２に示す。
【００８９】
図１２に示すように、ＳＨＲ＋１．０％群の収縮期血圧はＳＨＲ＋０％ＬＰ群に比べて低下した。この結果からＬＰは血圧上昇抑制作用を有していることを示していた。
【００９０】
以上の実施例によれば、リグノフェノールは、ＭＣＰ−１産生抑制活性を示すと同時に、アテローム性動脈硬化症の予防改善に有効であることがわかった。さらに、血圧降下作用があることがわかった。また、血中脂質の低下作用も備えることから、メタボリックシンドロームに起因する各種の態様の血管障害性疾患に有用であることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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