(57)【要約】【課題】マンノース−６−リン酸の分析が可能なポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法の提供。【解決手段】還元糖のカラムクロマトグラフィーを用いた分離分析方法であって，試料を陰イオン交換樹脂カラムに負荷し，水溶性無機塩を含有するホウ酸水溶液よりなる第１の移動相の十分量を該カラムに通すことによりカラムを洗浄し，該塩の濃度を高めた第２の移動相を供給して還元糖を溶離させ，溶出液に塩基性アミノ酸を添加し，加熱し，励起光を照射して放射される蛍光の強度を連続的に測定し記録すること，を含んでなるものである，分離分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる還元糖のカラムクロマトグラフィーを用いた分離分析方法であって，試料を陰イオン交換樹脂カラムに負荷し，所定濃度の水溶性無機塩を含有する所定濃度のホウ酸水溶液よりなる第１の移動相の十分量を該カラムに通すことによりカラムを洗浄し，
該カラムに，該第１の移動相に比して該塩の濃度を高めたものである第２の移動相を，所定の流速で連続的に供給して還元糖をこれにより溶離させ，
該カラムからの溶出液を連続的に流路中に導き，
該流路の所定位置で該溶出液に少なくとも１種の塩基性アミノ酸を所定速度で連続的に添加することにより，該流路中を連続的に流れる混合溶液とし，
該混合溶液をして，該流路の所定温度の加熱区域を所定時間かけて通過させることにより，該混合溶液を加熱し，
加熱後の，該流路中を流れる該混合溶液に，該流路の所定位置で励起光を連続的に照射しつつ該混合溶液から放射される蛍光の強度を連続的に測定し記録すること，
を含んでなるものである，分離分析方法。
【請求項２】
試料中に含まれる還元糖のカラムクロマトグラフィーを用いた分離分析方法であって，試料を陰イオン交換樹脂カラムに負荷し，所定濃度の少なくとも１種の塩基性アミノ酸と所定濃度の水溶性無機塩とを含有する所定濃度のホウ酸水溶液よりなる第１の移動相の十分量を該カラムに通すことによりカラムを洗浄し，
該カラムに，該第１の移動相に比して該塩の濃度を高めたものである第２の移動相を，所定の流速で連続的に供給して還元糖をこれにより溶離させ，
該カラムからの溶出液を連続的に流路中に導き，
該流路の所定温度の加熱区域を所定時間かけて通過させることにより，該溶出液を加熱し，
加熱後の，該流路中を流れる該溶出液に，該流路の所定位置で励起光を連続的に照射しつつ該溶出液から放射される蛍光の強度を連続的に測定し記録すること，
を含んでなるものである，分離分析方法。
【請求項３】
該第１の移動相のホウ酸濃度が，50〜150ｍＭ，該水溶性無機塩の濃度が10〜30ｍＭである，請求項１又は２の分離分析方法。
【請求項４】
該第１及び第２の移動相のホウ酸濃度が75〜125ｍＭである，請求項３の分離分析方法。
【請求項５】
該第１及び第２の移動相のｐＨが7.5〜9.5である，請求項１ないし４の何れかの分離分析方法。
【請求項６】
該水溶性無機塩が塩化ナトリウムである，請求項１ないし５の何れかの分離分析方法。
【請求項７】
該カラムを70℃までの温度に加熱した状態で還元糖の分離を行うものである，請求項１ないし６の何れかの分離分析方法。
【請求項８】
該塩基性アミノ酸が，該混合溶液中で0.1〜２ｗ／ｖ％の濃度となるように添加され又は0.1〜２ｗ／ｖ％の濃度となるように該第１及び第２の移動相に含有されるものである，請求項１ないし７の何れかの分離分析方法。
【請求項９】
該塩基性アミノ酸が，アルギニン，リジン及びヒスチジンよりなる群より選ばれるものである，請求項１ないし８の何れかの分離分析方法。
【請求項１０】
該所定温度の加熱区域の温度が，140〜180℃である，請求項１ないし９の何れかの分離分析方法。
【請求項１１】
該第２の移動相の該塩の濃度が少なくとも200ｍＭまで高められるものである，請求項１ないし１０の何れかの分離分析方法。
【請求項１２】
還元糖が中性糖を含むものである，請求項１ないし１１の何れかの分離分析方法。
【請求項１３】
還元糖がマンノース，グルコース，又はフコースを含むものである，請求項１ないし１２の何れかの分離分析方法。
【請求項１４】
還元糖がマンノース−６−リン酸を含むものである，請求項１ないし１３の何れかの分離分析方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４の何れかにおいて該第１の移動相として使用するための，ホウ酸50〜150ｍＭ及び塩化ナトリウム10〜30ｍＭを含有してなる水溶液。
【請求項１６】
請求項１ないし１４の何れかにおいて，該第１の移動相と混合して該第２の移動相を調製するために使用するための，ホウ酸50〜150ｍＭ及び塩化ナトリウム200〜250ｍＭを含有してなる水溶液。
【請求項１７】
水に溶解させて請求項１５の水溶液を調製するための，ホウ酸と塩化ナトリウムとを１：0.1〜１：0.5のモル比で含有してなる，固形組成物。
【請求項１８】
水に溶解させて請求項１６の水溶液を調製するための，ホウ酸と塩化ナトリウムとを１：1.5〜１：2.5のモル比で含有してなる，固形組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，糖類の分析方法に関し，特にポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法を用いた還元糖及びマンノース−６−リン酸の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
還元糖の分析法として，水を移動相として用いて試料を液体クロマトグラフィーに付して得た溶出液に，アルギニン等の塩基性アミノ酸を含有するホウ酸水溶液を加え，加熱反応を行った後冷却し，この反応液に励起光を照射し蛍光強度または吸光度を測定する方法が知られている（特許文献１）。ここで用いられる装置は，液体クロマトグラフィーの流出路を延長し，この流路に塩基性アミノ酸を含有するホウ酸水溶液の供給経路を接続し，次いで加熱装置，冷却装置，励起光の照射装置，及び蛍光強度等の測定装置を取り付けたものである。この方法では，液体クロマトグラフィーに付して得た溶離液に，塩基性アミノ酸を含有するホウ酸水溶液を加えて反応させるための供給経路を設ける必要がある。
【０００３】
また，上記方法の改良型として，試料を反応試薬であるアルギニン等の塩基性アミノ酸及びホウ酸を含有する移動相を用いる液体クロマトグラフィーに付して溶離し，得られた溶出液を加熱して反応試薬と糖類を反応（加熱反応）させた後冷却し，この反応液に励起光を照射し蛍光強度または吸光度を測定する方法が知られている（特許文献２）。この方法では，液体クロマトグラフィーの移動相として塩基性アミノ酸を含有するホウ酸水溶液が用いられることから，塩基性アミノ酸を含有するホウ酸水溶液を加えて反応させるための供給経路を設ける必要がない。上記の還元糖分析法は，ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法と呼ばれている。
【０００４】
上記の還元糖分析法は共に，還元糖が，ホウ酸存在下にアルギニン等の塩基性アミノ酸と加熱反応により強い発蛍光誘導体を生成することを検出に利用している（非特許文献１）。この発蛍光誘導体は，還元糖とアミノ化合物である塩基性アミノ酸との加熱反応（メイラード反応）により生じた褐色を呈するメイラノジンであり，これは，励起光として波長320ｎｍの光の照射を受けると，波長430ｎｍの光を放射する。またこれらの還元糖分析法は，還元糖がホウ酸と容易に結合してアニオン性錯イオンを生成する性質を有すること，及びこのアニオン性錯イオンが陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに保持されることを利用している。
【０００５】
ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法では，移動相として，0.01〜５％の濃度の塩基性アミノ酸と0.05〜0.5Ｍの濃度のホウ酸とを含有する水溶液（ｐＨ７〜10）が用いられる。このとき使用される塩基性アミノ酸は，アルギニン，リジン，ヒスチジン等である。更に，最近では，液体クロマトグラフィーの移動相として，0.1Ｍホウ緩衝液及び0.4Ｍホウ酸緩衝液によるグラジエントを用いて糖の分離を行うことも知られている（特許文献３，４）。
【０００６】
ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法では，液体クロマトグラフィーにおける試料の溶離は，室温〜70℃の温度で行われ，また加熱反応（メイラード反応）は140〜180℃で行われる（特許文献２）。溶離と反応をこのような高温下に高いホウ酸濃度で行うことから，移動相に含まれるホウ酸が析出して配管を詰まらせることがある。配管が詰まったときは，もはや分析不能であるため，配管の交換や洗浄といったコストや手間の掛かる作業を経て，分析をやり直さなければならないこととなる。このことはポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法における未解決の大きな問題点の一つである。
【０００７】
また，ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法で分析できる還元糖には，グルコース，マンノース，ガラクトース，果糖，ラムノース等の単糖，マルトース，マルトトリオース等のオリゴ糖，グルコサミン，ガラクトサミン等のアミノ糖，グルクロン酸等のウロン糖がある。
【０００８】
同法の分析対象として，糖タンパク質の糖鎖が挙げられる。糖タンパク質の糖鎖を構成する還元糖には，マンノース，ガラクトース，フコース糖の中性糖，ガラクトサミン等のアミノ糖等がある。糖鎖にはまた，マンノースが１分子のリン酸で修飾を受けたマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）が含まれる場合がある。
【０００９】
糖タンパク質の糖鎖に含まれるＭ６Ｐは，タンパク質が細胞内に取り込まれる際に，細胞膜上のマンノース−６−リン酸受容体と結合してその取り込みを促進する，という重要な機能を有する。Ｍ６Ｐを糖鎖に含む糖タンパク質として，リソソームに局在するイズロネート−２−サルファターゼ（Ｉ２Ｓ）等のリソソーム酵素が知られている（非特許文献２）。リソソーム酵素の中には組換え技術を用いて製造され，その酵素を遺伝的に欠損する患者の治療薬として使用されているものがある。例えば，α-ガラクトシダーゼＡ，及びグルコセレブロシダーゼである。リソソーム酵素は細胞内で機能を発揮するものであるため，静脈注射等の方法により患者に投与されたリソソーム酵素が薬効を発揮するためには，患者の細胞内に取り込まれる必要があり，そのためには，リソソーム酵素の糖鎖にＭ６Ｐが含まれている必要がある。従って，このような酵素の糖鎖を構成する糖類を分析する場合には，Ｍ６Ｐを分析することが特に重要である。ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法は，様々な糖類の分析技術として用いることができるが，この方法を用いたＭ６Ｐの分析技術は確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭５８−２１６９５３号公報
【特許文献２】特開昭６１−２５０５９号公報
【特許文献３】特開２００６−１８４１３１号公報
【特許文献４】特開２００８−２４５５５０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Mikami H. et. Al., Bunseki Kagaku (1983) 32, E207
【非特許文献２】Bielicki J. et. Al., Biochem J. (1993) 289, 241-246
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記背景の下で，本発明の一目的は，ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法で用いられる，アニオン性錯イオンの陰イオン交換樹脂への保持力を調整し，Ｍ６Ｐの分析を可能にするとともに，同法におけるマンノース，フコース，グルコース等の中性還元糖に対する分析力を高めることである。
また，本発明の別の一目的は，移動相中に含まれるホウ酸の析出により配管が詰まるという同法の問題を実質的に解消することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法において，移動相としてホウ酸及び水溶性の塩化ナトリウムのような中性無機塩の水溶液を用いることを試みた。その結果，そのような移動相では，水溶性の中性無機塩の濃度によってアニオン性錯イオンの陰イオン交換樹脂への保持力を調節することができ，しかも驚くべきことに，従来法では分析が不可能だったＭ６Ｐが分析できるようになることを見出した。また従来法に比べて，マンノース，フコース，グルコース等の中性還元糖の分析力を格段に改善できることを見出した。更には，塩化ナトリウムを添加することにより，移動相に含まれるホウ酸の濃度を下げることができることも見出し，ホウ酸の析出により配管が詰まるというポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法の問題点を実質的に解消できることをも見出した。
本発明は，これらの発見に基づいて完成されたものである。
【００１４】
すなわち，本発明は以下を提供する。
１．試料中に含まれる還元糖のカラムクロマトグラフィーを用いた分離分析方法であって，試料を陰イオン交換樹脂カラムに負荷し，所定濃度の水溶性無機塩を含有する所定濃度のホウ酸水溶液よりなる第１の移動相の十分量を該カラムに通すことによりカラムを洗浄し，
該カラムに，該第１の移動相に比して該塩の濃度を高めたものである第２の移動相を，所定の流速で連続的に供給して還元糖をこれにより溶離させ，
該カラムからの溶出液を連続的に流路中に導き，
該流路の所定位置で該溶出液に少なくとも１種の塩基性アミノ酸を所定速度で連続的に添加することにより，該流路中を連続的に流れる混合溶液とし，
該混合溶液をして，該流路の所定温度の加熱区域を所定時間かけて通過させることにより，該混合溶液を加熱し，
加熱後の，該流路中を流れる該混合溶液に，該流路の所定位置で励起光を連続的に照射しつつ該混合溶液から放射される蛍光の強度を連続的に測定し記録すること，
を含んでなるものである，分離分析方法。
２．試料中に含まれる還元糖のカラムクロマトグラフィーを用いた分離分析方法であって，試料を陰イオン交換樹脂カラムに負荷し，所定濃度の少なくとも１種の塩基性アミノ酸と所定濃度の水溶性無機塩とを含有する所定濃度のホウ酸水溶液よりなる第１の移動相の十分量を該カラムに通すことによりカラムを洗浄し，
該カラムに，該第１の移動相に比して該塩の濃度を高めたものである第２の移動相を，所定の流速で連続的に供給して還元糖をこれにより溶離させ，
該カラムからの溶出液を連続的に流路中に導き，
該流路の所定温度の加熱区域を所定時間かけて通過させることにより，該溶出液を加熱し，
加熱後の，該流路中を流れる該溶出液に，該流路の所定位置で励起光を連続的に照射しつつ該溶出液から放射される蛍光の強度を連続的に測定し記録すること，
を含んでなるものである，分離分析方法。
３．該第１の移動相のホウ酸濃度が，50〜150ｍＭ，該水溶性無機塩の濃度が10〜30ｍＭである，上記１又は２の分離分析方法。
４，該第１及び第２の移動相のホウ酸濃度が75〜125ｍＭである，上記３の分離分析方法。
５．該第１及び第２の移動相のｐＨが7.5〜9.5である，上記１ないし４の何れかの分離分析方法。
６．該水溶性無機塩が塩化ナトリウムである，上記１ないし５の何れかの分離分析方法。
７．該カラムを70℃までの温度に加熱した状態で還元糖の分離を行うものである，上記１ないし６の何れかの分離分析方法。
８．該塩基性アミノ酸が，該混合溶液中で0.1〜２ｗ／ｖ％の濃度となるように添加され又は0.1〜２ｗ／ｖ％の濃度となるように該第１及び第２の移動相に含有されるものである，上記１ないし７の何れかの分離分析方法。
９．該塩基性アミノ酸が，アルギニン，リジン及びヒスチジンよりなる群より選ばれるものである，上記１ないし８の何れかの分離分析方法。
１０．該所定温度の加熱区域の温度が，140〜180℃である，上記１ないし９の何れかの分離分析方法。
１１．該第２の移動相の該塩の濃度が少なくとも200ｍＭまで高められるものである，上記１ないし１０の何れかの分離分析方法。
１２．還元糖が中性糖を含むものである，上記１ないし１１の何れかの分離分析方法。
１３．還元糖がマンノース，グルコース，又はフコースを含むものである，上記１ないし１２の何れかの分離分析方法。
１４．還元糖がマンノース−６−リン酸を含むものである，上記１ないし１３の何れかの分離分析方法。
１５．上記１ないし１４の何れかにおいて該第１の移動相として使用するための，ホウ酸50〜150ｍＭ及び塩化ナトリウム10〜30ｍＭを含有してなる水溶液。
１６．上記１ないし１４の何れかにおいて，該第１の移動相と混合して該第２の移動相を調製するために使用するための，ホウ酸50〜150ｍＭ及び塩化ナトリウム200〜250ｍＭを含有してなる水溶液。
１７．水に溶解させて上記１５の水溶液を調製するための，ホウ酸と塩化ナトリウムとを１：0.1〜１：0.5のモル比で含有してなる，固形組成物。
１８．水に溶解させて上記１６の水溶液を調製するための，ホウ酸と塩化ナトリウムとを１：1.5〜１：2.5のモル比で含有してなる，固形組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は，ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法において，Ｍ６Ｐの分析を可能とし，且つ還元糖の分析力を高める。また，従来のポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法に比してホウ酸の使用濃度が低いため，配管の詰まりという同法の問題点をも，実質的に解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】装置の配置及び流路を模式的に示す図。
【図２−１】新法による中性還元糖混合物標準溶液の分析結果を示すクロマトグラム。
【図２−２】従来法による中性還元糖混合物標準溶液の分析結果を示すクロマトグラム。
【図３−１】新法によるＭ６Ｐ標準溶液の分析結果を示すクロマトグラム。
【図３−２】従来法によるＭ６Ｐ標準溶液の分析結果を示すクロマトグラム。
【図４−１】新法による中性糖混合物標準溶液とＭ６Ｐ標準溶液の混合液の分析結果を示すクロマトグラム。
【図４−２】従来法による中性糖混合物標準溶液とＭ６Ｐ標準溶液の混合液の分析結果を示すクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において，「ホウ酸水溶液」の語は，ｐＨを適宜調整するために水酸化ナトリウム（又はホウ酸ナトリウム）等のような，少量のｐＨ調整剤としての塩基が添加されたものも包含する。
【００１８】
本発明おいて，ホウ酸水溶液について，「ホウ酸濃度」というときは，当該水溶液中のホウ素をホウ酸（Ｈ3ＢＯ3）に換算したときの濃度をいう。従って，（ホウ酸ナトリウム等のような）塩の形で添加されたホウ酸も含む。
【００１９】
本発明において，第２の移動相に含有される塩の濃度を高めるには，例えば，第１の移動相に，塩濃度を高めた別のホウ酸水溶液を，その配合比率を高めつつ加えればよい。このとき，当該配合比率は，連続的に高めても，断続的に高めてもよいが，好ましくは連続的に高められ，また特に好ましくは，直線的に（すなわち，一定の速度で連続的に）高められる。第２の移動相における塩濃度の上昇は，分析の対象である還元糖が溶出するまで行なえばよい。通常は200ｍＭ付近になるまで塩濃度を上昇させれば十分であるが，更に高めてもよく，例えば塩濃度が250ｍＭに達するまで行ってもよい。
本発明において，移動相に含有される塩は，水溶性の無機塩（但しホウ酸塩は除く）であれば特に限定はないが，水に溶解したときに中性を示す中性塩が好ましく，特に塩化ナトリウム，塩化カリウムが好ましい。
【００２０】
本発明において，移動相のホウ酸濃度は，糖類の分析，特に，目的に応じ中性還元糖又はＭ６Ｐの分析ができる限り限定はないが，好ましくは50〜150ｍＭの範囲であり，より好ましくは75〜125ｍＭであり，特に好ましくは約100ｍＭである。
【００２１】
本発明において，移動相のｐＨは，好ましくは7.5〜9.5の範囲であり，特に好ましくは約９である。
【００２２】
本発明における陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いる陰イオン交換樹脂としては，弱陰イオン交換樹脂及び強陰イオン交換樹脂のいずれをも用いることができるが，好ましくは強陰イオン交換樹脂が用いられる。また，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる溶離は，室温で行ってもよいが，カラムを加熱して行うことが好ましい。但し，その場合の加熱温度は約70℃までであり，好ましくは約65℃である。
【００２３】
本発明において使用する塩基性アミノ酸としては，特に限定はないが，好ましくはアルギニン，リジン，ヒスチジンであり，特に好ましくはアルギニンである。また，塩基性アミノ酸は何れかを単独で用いても，複数のアミノ酸を混合物として用いてもよい。また，このときの塩基性アミノ酸の添加は，これを含有する水溶液を，流路中を流れるカラムからの溶出液に注入することによって行われる。塩基性アミノ酸の注入速度は，一回の分析の間一定に保たれる限り適宜であってよい。通常は，流路内でカラムからの溶出液と混合した後の濃度（終濃度）が0.1〜２ｗ／ｖ％となるように注入すればよく，0.5〜1.8ｗ／ｖ％となるように注入するのが好ましく，1.0〜1.5ｗ／ｖ％となるように行うのがより好ましい。塩基性アミノ酸の添加は，例えば，これを含有するホウ酸水溶液の形で流路に注入する方法により行うことが好ましい。その場合，ホウ酸濃度は，移動相のホウ酸濃度と一致させてもよいが，ある程度異なっていても差し支えない。塩基性アミノ酸はまた、予め所定濃度の塩基性アミノ酸を移動相に溶解させておくことによって添加される。塩基性アミノ酸の濃度は0.1〜２ｗ／ｖ％に調整すればよく、0.5〜1.8ｗ／ｖ％となるように調整するのが好ましく、1.0〜1.5ｗ／ｖ％となるように調整するのがより好ましい。この場合、塩基性アミノ酸を含有するホウ酸水溶液を加えて反応させるための供給経路を設ける必要がない。
【００２４】
本発明において，溶出液を塩基性アミノ酸とともに加熱して反応（加熱反応）させるときの反応温度は140〜180℃とすることができ，好ましくは約150℃である。またこのときの反応は，糖分子中の還元基と塩基性アミノ酸が反応して褐色物質（メラノイジン）を生ずるメイラード反応である。
【００２５】
本発明において，蛍光強度の測定は，加熱反応後の反応液に，励起光として波長約320ｎｍの紫外線を照射し，それにより放射される波長約430ｎｍの蛍光について行われる。これに際し，ノイズの発生を防止するために，蛍光強度の測定に先立って冷却装置等により反応液を室温程度にまで冷却しておくことが好ましい。
【００２６】
本発明で分析することのできる糖類は，塩基性アミノ酸とメイラード反応を起こす還元糖である。例としては，グルコース，マンノース，ガラクトース，果糖，ラムノース等の単糖類，マルトース，マルトトリオース等のオリゴ糖，グルコサミン，ガラクトサミン等のアミノ糖，グルクロン酸等のウロン酸，及びリン酸化糖等が挙げられ，特に，マンノース，グルコース，フコース等の中性糖及びマンノース−６−リン酸等のリン酸化糖が挙げられる。
【００２７】
また，本発明の方法で使用される移動相が試薬として予め準備されていることが，分析操作の利便性を高める点で有利である。試薬の形態は，水溶液でもよく，また純水で溶解させることにより移動相となる固形組成物（粉末，顆粒等）でもよい。水溶液の場合，第１の移動相として用いられる試薬は，好ましくは50〜150ｍＭ，より好ましくは75〜125ｍＭ，例えば約100ｍＭのホウ酸と，10〜30ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ7.5〜9.5
のものである。ｐＨの調整は，例えば水酸化ナトリウムの添加によっても，またホウ酸の一部をホウ酸ナトリウム（例えばホウ砂）に置換することによっても可能であり，これらの何れによっても得られる水溶液は，同一組成である。
【００２８】
また第１の移動相に添加，混合して第２の移動相を調製するための，水溶液の形の試薬は，例えば，好ましくは50〜150ｍＭ，より好ましくは75〜125ｍＭ，例えば約100ｍＭのホウ酸と，好ましくは200〜250ｍＭ，例えば約200ｍＭの塩化ナトリウムとを含むｐＨ7.5〜9.5の水溶液である。
【００２９】
純粋で溶解させて第１の移動相を調製するための試薬としての固形組成物の場合は，水に溶解させてホウ酸濃度が50〜150ｍＭ，75〜125ｍＭ，例えば約100ｍＭ，且つ塩化ナトリウム濃度10〜30ｍＭとすることができる比率でホウ酸及び塩化ナトリウムを配合したものである。従って，例えば，ホウ酸と塩化ナトリウムとを１：0.1〜１：0.5のモル比で含有してなる，固形組成物とすればよい。このとき一部ホウ酸の代わりに適宜の量のホウ酸ナトリウムを配合することにより，水溶液としたときのｐＨを予め調整しておくことができる。
【００３０】
この場合，所定量の水に溶解したときそのようなｐＨが得られるように調合するには，例えば，予め目的の水溶液の少量を調製して，当該範囲内のｐＨとするために要するホウ酸量及びホウ酸ナトリウム（ホウ砂等）量を測定し，以後それらの量に基づき，調製すべき液量に応じて，ホウ酸及びホウ酸ナトリウム（ホウ砂等）の適正量を調合するようにすればよい。また水溶液のｐＨの調製を水酸化ナトリウムの添加により行った場合，要した水酸化ナトリウムのＮａイオンのモル数と同一モル数のＮａイオンに対応するホウ酸ナトリウム量が，ｐＨ調整を水酸化ナトリウムの代わりにホウ酸ナトリウム量で行う場合におけるホウ酸ナトリウムの必要量である。またホウ酸の使用量は，添加されるホウ酸ナトリウムに由来するホウ素のモル数相当分だけ減少される。
【００３１】
第１の移動相に添加，混合して第２の移動相を調製するための高濃度の塩化ナトリウムを含有する水溶液を調製するために水に溶解させるための試薬としての固形組成物は，水溶液としたときにホウ酸の濃度が，好ましくは50〜150ｍＭ，より好ましくは75〜125ｍＭ，例えば約100ｍＭ，且つ塩化ナトリウムの濃度が200〜250ｍＭ，ｐＨが7.5〜9.5となるように調合されたものである。従って例えば，ホウ酸と塩化ナトリウムとを１：1.5〜１：2.5のモル比で含有してなる，固形組成物とすればよい。
【実施例】
【００３２】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【００３３】
〔標準溶液の作成〕
30ｍｇのＤ（＋）−マンノース，10ｍｇのＬ（−）−フコース，30ｍｇのＤ（＋）−ガラクトースを純水に溶かして100ｍＬとした。この水溶液18ｍＬに純水を加えて50ｍＬとしたものを中性還元糖混合物標準溶液とした。また，20ｍｇのマンノース−６−リン酸ナトリウム塩を純水に溶かして100ｍＬとしたものをＭ６Ｐ標準原液とした。Ｍ６Ｐ標準原液は1ｍＬずつ分注して−20℃にて保存し，用時溶解し，純水で２倍希釈したものをＭ６Ｐ標準溶液とした。
【００３４】
〔移動相用の溶液の作成（新法用）〕
ホウ酸6.2ｇを純水に加えて溶かし，２Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ9.0に調整した後，純水を加えて全量を1000ｍＬとし，0.22μｍのメンブレンフィルターを用いて吸引ろ過した。得られた溶液を溶液Ａ（100ｍＭホウ酸溶液（ｐＨ9.0））とした。またホウ酸6.2ｇ及び塩化ナトリウム11.7ｇを純水に加えて溶かし，２Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ9.0に調整した後，純水を加えて全量を1000ｍＬとし，0.22μｍのメンブレンフィルターを用いて吸引ろ過した。得られた溶液を溶液Ｂ（100ｍＭホウ酸−200ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ9.0））とした。
【００３５】
〔移動相用の溶液の作成（従来法用）〕
ホウ酸6.2ｇを純水に加えて溶かし，２Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ8.0に調整した後，純水を加えて全量を1000ｍＬとし，0.22μｍのメンブレンフィルターを用いて吸引ろ過した。得られた溶液を溶液Ａ’（100ｍＭホウ酸溶液（ｐＨ8.0））とした。ホウ酸24.8ｇを純水に加えて溶かし，２Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ9.0に調整した後，純水を加えて全量を1000ｍＬとし，0.22μｍのメンブレンフィルターを用いて吸引ろ過した。この溶液を溶液Ｂ’（400ｍＭホウ酸水溶液（ｐＨ9.0））とした。
【００３６】
〔反応試液の作成〕
Ｌ−アルギニン10ｇとホウ酸30ｇを純水に加えて溶かし，全量を1000ｍＬとし，0.22μｍ以下のメンブレンフィルターを用いて吸引ろ過し，得られた溶液を反応試液とした。
【００３７】
〔ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法による糖分析（１）〕
（１）装置
島津HPLCシステムLC-10Avp（還元糖分析システム）に陰イオン交換カラムであるShim-pack ISA-07/S2504（4.0ｍｍI.D.×250ｍｍ）（基材：ポリスチレンゲル，固定相：第４級アンモニウム基）をセットし，更にこのカラムを加熱するカラムオーブンとしてShim-pack ガードカラムISA（4.0ｍｍI.D.×50ｍｍ）をセットした。また，カラムの流出口の下流に加熱反応用のヒートブロック（ALB-221，旭テクノグラス製）をセットした。カラムオーブンでカラムを65℃に加熱するとともに，ヒートブロックを150℃にセットした。また，ヒートブロックの下流に蛍光検出器を設置し，励起光として波長320ｎｍの紫外線を照射し，波長430nmの蛍光を検出するようにセットした。装置の配置及び流路を模式的に図１に示した。
【００３８】
（２）操作手順
還元糖分析システムのオートサンプラーに，溶液Ａと溶液Ｂをセットし，更に，カラムの流出口の下流（ヒートブロックの上流）から，反応試液が供給されるようにセットした。クロマトグラフィー開始時の移動相（溶液Ａ）でカラムを平衡化した後，中性還元糖混合物標準溶液，及びＭ６Ｐ標準溶液，またはこれらの混合溶液をカラムに負荷した。
【００３９】
新法においては，カラムに糖類の標準溶液を負荷した後，溶液Ａと溶液Ｂを90：10の体積比率で混合して製した第１の移動相（従って，ホウ酸100ｍＭ，塩化ナトリウム20ｍＭ）を，0.3ｍＬ／分の流速で35分間カラムに流した後，同一流速で25分かけて溶液Ａと溶液Ｂの体積比率を25：75まで直線的に変え（従って，ホウ酸100ｍＭ，塩化ナトリウムは150ｍＭまで高まる），更に10分間溶液Ｂの体積比率を100％（従って，ホウ酸は100ｍＭ，塩化ナトリウムは200ｍＭ）として同一流速で流し，その後は，第１の移動相の場合と同様に溶液Ａと溶液Ｂを90：10の体積比率（従って，ホウ酸は100ｍＭ，塩化ナトリウムは20ｍＭ）で同一流速で流した。また，反応試液は，カラムの流出口の下流において，0.2ｍＬ／分の流速で流路に供給した。従って，反応混合液中におけるアルギニン濃度は，３×0.2／(0.3 + 0.2)＝1.2ｗ／ｖ％であった。
従来法においては，カラムに糖類の標準溶液を負荷した後，溶液Ａ’と溶液Ｂ’の体積比率を100：０から０：100まで50分かけて連続的に変えつつ（従って，ホウ酸100ｍＭから400ｍＭまで高まる），0.6ｍＬ／分の流速でカラムに流した後，溶液Ｂ’（400ｍＭホウ酸）のみを同一流速で20分間，その後は溶液Ａ’（100ｍＭ）のみを同一流速で流した。また反応試液は，カラムの流出口の下流において0.5ｍＬ／分の流速で流路に供給した。従って，反応混合液中におけるアルギニン濃度は，３×0.5／(0.6 + 0.5)＝1.36ｗ／ｖ％であった。
【００４０】
新法及び従来法における各溶液の組成及びクロマトグラフィーの条件を表１に，溶液Ｂ，Ｂ’の比率を表２にそれぞれ示した。
【００４１】
【表１】
2010237199.tif 000002
【００４２】
【表２】
2010237199.tif 000003
【００４３】
〔中性糖混合物標準溶液の分析〕
新法で中性糖混合物標準溶液を分析したところ，マンノース，フコース及びガラクトースに由来する蛍光の強度を表す各ピークが完全に分離して得られた（図２−１）。一方，従来法で中性糖混合物標準溶液を分析したところ，マンノース，フコース及びガラクトースに由来する各ピークは完全には分離せず，特にフコースとガラクトースに由来するピークが重なって得られた（図２−２）。これらの結果から，新法は，中性糖の分析方法，特に定量的な分析方法として従来法と比較して優れていることがわかった。
【００４４】
〔Ｍ６Ｐ標準溶液の分析〕
新法でＭ６Ｐ標準溶液を分析したところ，Ｍ６Ｐに由来するピークが得られた（図３−１）。一方，従来法でＭ６Ｐ標準溶液を分析したところ，Ｍ６Ｐに由来するピークは得られなかった（図３−２）。これらのことは，移動相への塩化ナトリウムの配合が，他の還元等の同時分析を可能にしつつ，しかも従来法では陰イオン交換樹脂に強く結合したまま容易には溶離させ得なかったＭ６Ｐに対する保持力を低下させるよう，陰イオン交換樹脂への保持力に対し調整的に作用したものと考えられる。なお新法の上記実施例において，Ｍ６Ｐは，移動相中の塩化ナトリウム濃度を一旦200ｍＭに高めた10分間中にて中性糖と共には溶出せず，その後塩化ナトリウム濃度を20ｍＭに低下させた後に見られているが，実施例全体の結果から塩化ナトリウム濃度が高い方がＭ６Ｐの溶離が起こりやすいことが明らかであるから，移動相の塩化ナトリウムの濃度を200ｍＭから低下させることなくそのまま維持カラムに流しても，Ｍ６Ｐの分離が得られることは明らかである。
【００４５】
〔中性糖混合物標準溶液とＭ６Ｐ標準溶液の混合液〕
新法で中性糖混合物標準溶液とＭ６Ｐ標準溶液の混合液を分析したところ，マンノース，フコース，ガラクトース及びＭ６Ｐに由来するピークが完全に分離して得られた（図４−１）。一方，従来法で中性糖混合物標準溶液とＭ６Ｐ標準溶液の混合液を分析したところ，マンノース，フコース及びガラクトースに由来する各ピークは完全には分離せず，また，Ｍ６Ｐに由来するピークも得られなかった（図４−２）。これらの結果は，新法が，マンノース，フコース，ガラクトース等の中性糖の分析技術として，またＭ６Ｐの分析技術として，特にこれらの定量的な分析方法として，従来法と比較して極めて優れていることを示した。また，新法によれば，Ｍ６Ｐとマンノースを同時に分析することが可能であるため，Ｍ６Ｐが分解して生じるマンノースを定量することにより，糖鎖，糖タンパク質を構成するＭ６Ｐの安定性を評価することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は，ポストカラム蛍光検出−ホウ酸錯体陰イオン交換法において，Ｍ６Ｐの分析を可能とし，且つ中性糖間の分離能を高め，更には配管詰まりという同法の問題点を解消した，還元糖の新たな分析法として使用することができる。
【符号の説明】
【００４７】
１：オートサンプラー
２：カラムオーブン
３：カラム
４：ヒートブロック
５：蛍光検出器
Ａ：溶液Ａ（Ａ’）
Ｂ：溶液Ｂ（Ｂ’）
Ｃ：反応試液
【図１】
2010237199.tif 000004
【図２−１】
2010237199.tif 000005
【図２−２】
2010237199.tif 000006
【図３−１】
2010237199.tif 000007
【図３−２】
2010237199.tif 000008
【図４−１】
2010237199.tif 000009
【図４−２】
2010237199.tif 000010