(57)【要約】【課題】  スティグマステロール含量が増強された植物を提供すること。スティグマステロール含量が増強された植物を含む食品を提供すること。【解決手段】  異種染色体を植物に導入することを含む、植物におけるスティグマステロール含量を増強させる方法。前記方法によりスティグマステロール含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物を含む食品組成物。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種染色体を植物に導入することを含む、植物におけるスティグマステロール含量を増強させる方法。
【請求項２】
異種染色体が単子葉植物に由来する請求項１記載の方法。
【請求項３】
異種染色体がオオムギの３番染色体である請求項２記載の方法。
【請求項４】
異種染色体がCYP710A酵素の遺伝子を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
異種染色体を導入する植物が単子葉植物である請求項1〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
異種染色体を導入する植物がコムギである請求項５記載の方法。
【請求項７】
異種染色体がオオムギの３番染色体であり、異種染色体を導入する植物がコムギである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
スティグマステロール含量が植物体の地上部において増強する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
植物体の地上部が実生である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法によりスティグマステロール含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物を含む食品組成物。
【請求項１１】
植物が植物体の地上部である請求項１０記載の食品組成物。
【請求項１２】
植物体の地上部が実生である請求項１１記載の食品組成物。
【請求項１３】
以下の(a)、 (b) 又は(c)のタンパク質。
(a)配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
(c)配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
【請求項１４】
請求項１３記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号６のヌクレオチド配列からなる請求項１４記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
以下の(d)、(e)又は(f)のタンパク質。
(d)配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
(e)配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
(f)配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
【請求項１７】
請求項１６記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなる請求項１７記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スティグマステロール含量改変植物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギは、３大穀物の一つであり世界的に広く利用されている。小麦粉は、パンやパスタ、うどんなど主食として利用されている一方、若葉が健康食品として利用されている。一方、オオムギは穀物としての利用度がコムギよりも低いが、若葉については、コムギよりも機能性成分が多いことから、コムギよりも広く利用されている。
【０００３】
植物ステロールの摂取により血中コレステロールが低下することが知られている。特に、スティグマステロール(stigmasterol)は血中のコレステロール低下作用が著しい(非特許文献１)。コムギはオオムギよりもスティグマステロール含量が低く、コムギにおいてスティグマスロールを増強させることが求められていた。ところが、そのようなコムギを作出することは、従来技術では困難であった。
【０００４】
【化１】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、スティグマステロール含量が増強された植物を提供することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は、スティグマステロール含量が増強された植物を含む食品を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意努力した結果、オオムギの第３染色体を添加した染色体添加コムギにおいて、スティグマステロール含量が増強することを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）異種染色体を植物に導入することを含む、植物におけるスティグマステロール含量を増強させる方法。
（２）異種染色体が単子葉植物に由来する（１）記載の方法。
（３）異種染色体がオオムギの３番染色体である（２）記載の方法。
（４）異種染色体がCYP710A酵素の遺伝子を含む（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）異種染色体を導入する植物が単子葉植物である（1）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）異種染色体を導入する植物がコムギである（５）記載の方法。
（７）異種染色体がオオムギの３番染色体であり、異種染色体を導入する植物がコムギである（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）スティグマステロール含量が植物体の地上部において増強する（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）植物体の地上部が実生である（８）記載の方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の方法によりスティグマステロール含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物を含む食品組成物。
（１１）植物が植物体の地上部である（１０）記載の食品組成物。
（１２）植物体の地上部が実生である（１１）記載の食品組成物。
（１３）以下の(a)、 (b) 又は(c)のタンパク質。
(a)配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
(c)配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
（１４）（１３）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１５）配列番号６のヌクレオチド配列からなる（１４）記載のＤＮＡ。
（１６）以下の(d)、(e)又は(f)のタンパク質。
(d)配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
(e)配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
(f)配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
（１７）（１６）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１８）配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなる（１７）記載のＤＮＡ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、スティグマステロール含量が増強された植物が提供される。この植物は、食品原料、例えば、血中コレステロール低下作用を有する機能性食品原料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】オオムギ、コムギ、シロイヌナズナ、トマトのCYP710A酵素のアミノ酸配列のアラインメントを示す。全ての酵素で保存されているアミノ酸を太字で、少なくともオオムギ、コムギの単子葉植物で保存されているアミノ酸を網掛けで、少なくともシロイヌナズナ、トマトの双子葉植物で保存されているアミノ酸をイタリックで表示する。HvCYP710A1はオオムギCYP710Aを、TaCYP710A1/2/3はコムギのCYP710A3種類を、AtCYP710A1/2/3/4はシロイヌナズナのCYP710A4種類を、SlCYP710A11はトマトのCYP710Aを示す。
【図１−２】オオムギ、コムギ、シロイヌナズナ、トマトのCYP710A酵素のアミノ酸配列のアラインメント（図１−１の続き）を示す。
【図１−３】オオムギ、コムギ、シロイヌナズナ、トマトのCYP710A酵素のアミノ酸配列のアラインメント（図１−２の続き）を示す。
【図２】オオムギ染色体導入パンコムギ系統（オオムギ１〜７番染色体のそれぞれ１対をパンコムギに導入した）、親系統であるパンコムギ(Chinese Spring: CS)、オオムギ(Betzes)におけるＣＹＰ７１０Ａ遺伝子の発現解析結果（パネル上段：オオムギ由来遺伝子発現の同定、パネル下段：オオムギおよびコムギ由来遺伝子発現の同定）を示す。
【図３】オオムギ染色体導入パンコムギ系統（オオムギ１〜７番染色体のそれぞれ１対をパンコムギに導入した）、親系統であるパンコムギ(Chinese Spring: CS)におけるオオムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子の発現解析結果（Real Time PCRによる遺伝子発現パターン確認）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、異種染色体を植物に導入することを含む、植物におけるスティグマステロール含量を増強させる方法を提供する。
【００１３】
異種染色体は、いかなる植物に由来するものであってもよく、オオムギ、コムギ、イネ、トウモロコシ、キビ、ヒエ、アワなどの単子葉植物に由来するもの、トマト、シロイズナズナ、ナス、トウガラシ、ピーマン、キュウリ、ウリ、ダイズ、カンゾウなどの双子葉植物に由来するものなどを例示することができるが、異種染色体を導入される植物よりもスティグマステロール含量が多い植物に由来するものが好ましい。
【００１４】
異種染色体がオオムギ由来のものである場合、３番染色体であることが好ましい。
【００１５】
本発明者らは、オオムギ３番染色体導入コムギ系統では、スティグマステロールが増加していることを見出し、さらに、オオムギ３番染色体導入コムギ系統でオオムギCYP710Aが発現していることを確認した（後述の実施例を参照のこと）。これらのことから、スティグマステロール生合成に異種染色体上のCYP710A遺伝子が関わっていることが証明された。それ故、異種染色体は、CYP710A遺伝子を含むことが好ましい。
【００１６】
例えば、異種染色体を導入する植物がコムギである場合、異種染色体はオオムギ由来のものが好ましく、オオムギの３番染色体がより好ましい。コムギは、いかなる品種又は系統であってもよく、Chinese Spring、新中長、農林61号、ホクシン、チホクコムギ、春よ恋、キタノカオリ、ミナミノカオリ、ニシノカオリ、ふくほのか、ふくさやかなどの品種、WB系統、SH系統、CA系統などの系統を例示することができるが、これらに限定されることはない。オオムギもいかなる品種又は系統であってもよく、Betzes、はるな二条、アサカゴールド、ニシノチカラ、あまぎ二条などの品種、Holdeum chilense, Holdeum spontaneumなどの野生オオムギなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００１７】
異種染色体導入は、従来の交雑育種法により行うことができる。例えば、オオムギ染色体導入コムギ系統の作出については、Islam and Shepherd 1992 (Theoretical and Applied Genetics 83: 489-494); Taketa and Takeda 2001(Breeding Science 51: 199-206)に記載されている。簡単に説明すると、まずコムギを母本、オオムギを花粉親として交配し、F1を作出する。これは不稔性を示すので、コルヒチン処理または母本となったコムギを花粉親として戻し交雑を行い、次世代系統を作出する。またはさらにコムギを花粉親として戻し交雑を複数回行った系統を作出する。またはH. bulbosum法により倍加半数体系統を作出する。これらの系統から、減数分裂期の花粉母細胞の染色体をゲノミックin situハイブリダイズ法(GISH)により観察し、目的のオオムギ染色体が導入されたコムギ系統を選抜する。
【００１８】
異種染色体を導入した植物を栽培し、育成した植物体からスティグマステロールを抽出し、定量し、異種染色体を導入していない植物の植物体のスティグマステロール含量と比較することにより、異種染色体導入植物におけるスティグマステロール含量の増強を確認することができる。スティグマステロールの定量は、後述の実施例３に記載の方法で行うことができる。
【００１９】
異種染色体導入によるスティグマステロール含量の増強は、植物体の実生（若葉）、成熟葉、茎、小穂などの地上部、根、地下茎、ストロンなどの地下部、胚乳、ふすまなどいかなる部分で観察されてもよい。例えば、オオムギ３番染色体導入コムギ系統では、実生において、スティグマステロール含量の顕著な増強効果が観察された（後述の実施例２、３を参照のこと）。
【００２０】
また、本発明は、異種染色体導入により、スティグマステロール含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物を含む食品組成物を提供する。
【００２１】
本発明の食品組成物に含まれる植物は、植物体の実生（若葉）、成熟葉、茎、小穂などの地上部、根、地下茎、ストロンなどの地下部、胚乳、ふすまなどいかなる部分であってもよいし、また、植物体の全部であってもよい。例えば、オオムギ３番染色体導入コムギ系統では、実生において、スティグマステロール含量の顕著な増強効果が観察された（後述の実施例２、３を参照のこと）ので、異種染色体がオオムギ由来のものであり、異種染色体が導入される植物がコムギである場合には、実生が食品組成物に含まれることが好ましい。食品組成物に含まれる植物は、栽培した植物体の全部又はその一部を採取した後、適宜、洗浄、乾燥、加熱、粉砕などの処理をして、粉末の形態にしてもよい。
【００２２】
本発明の食品組成物に含まれる抽出物は、植物体から抽出されたもので、スティグマステロールを含有するものであればよい。抽出は、通常の植物成分の抽出に用いられる方法を用いることができ、例えば、後述の実施例２に記載の方法で行うことができる。さらに、ＨＰＬＣなどにより精製してもよい。
【００２３】
本発明の食品組成物は、水、果汁などを添加して、青汁などの飲料として食することができる。あるいはまた、賦形剤などを添加し、粉末、顆粒、錠剤などの形態にして、食することもできる。その他、パン、麺類、パスタ類などの食品に配合して食することもできる。
【００２４】
本発明は、さらに、以下の(a)、 (b) 又は(c)のタンパク質を提供する。
【００２５】
(a)配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
(c)配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
(a)のタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなる。配列番号７のアミノ酸配列は、オオムギＣＹＰ７１０Ａ酵素のアミノ酸配列である。
【００２６】
(b)のタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有する。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数及び位置は特に限定されるものではないが、シロイズナズナ及びトマト由来のＣＹＰ７１０Ａは公知である(The Plant Cell, Vol. 18, 1008-1022, April 2006 )ので、これらのＣＹＰ７１０Ａに相当するものは除かれる。また、後述の実施例７の表２に示すように、オオムギＣＹＰ７１０Ａ酵素のアミノ酸配列（配列番号７）とコムギＣＹＰ７１０Ａ酵素のアミノ酸配列（配列番号９、１１及び１３）との相同性は、９３．５％、９５．５％、９５．９％である。オオムギＣＹＰ７１０Ａ酵素のアミノ酸配列（配列番号７）とシロイズナズナＣＹＰ７１０Ａ酵素（表２及び図１のAtCYP710A1、AtCYP710A2及びAtCYP710A3）のアミノ酸配列との相同性は、６２．０％、５８．６％、５５．１％及び５４．５％である。オオムギＣＹＰ７１０Ａ酵素のアミノ酸配列（配列番号７）とトマトＣＹＰ７１０Ａ酵素（表２及び図１のSICYP710A11）のアミノ酸配列との相同性は、５６．８％である（GENETYX-MAC Network Version 13.0.15（株式会社ゼネティックス）を用い、本ソフトのMaximum Matching...というコマンドで計算した）。従って、(b)のタンパク質における欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数は、配列番号７のアミノ酸配列との相同性が９５．９より大きくなる数であればよい。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数の具体的な範囲は、欠失に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個であり、置換に関しては通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００２７】
(c)のタンパク質は、配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有する。
【００２８】
「ストリンジェントな条件」としては、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を下げる程に高い相同性を有するDNAのみならず、低い相同性しか有していないDNAまでも包括的に得ることができる。逆に、温度を上げる程、高い相同性を有するDNAのみを得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度以外にも塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８８％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２９】
これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAがコードするポリペプチドは、通常、(a)のタンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、通常、97％以上の相同性、好ましくは98％以上の相同性、さらに好ましくは99％以上の相同性を指す。タンパク質の相同性は、公知の方法で計算することができ、例えば、GENETYX-MAC Network Version 13.0.15（株式会社ゼネティックス）を用い、本ソフトのMaximum Matching...というコマンドで計算することができる。
【００３０】
上記の(a)、(b)又は(c)のタンパク質は、(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から目的のタンパク質を採取することにより製造することができる。
【００３１】
(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞は、(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得られる。本発明は、(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡなどを挙げることができる。「ストリンジェントな条件」は前述の通りである。配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８８％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３２】
組換えベクターを作製するには、まず、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製するとよい。目的とするタンパク質のコード領域のヌクレオチド配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、ヌクレオチドを置換してもよい。
【００３３】
次いで、このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して、組換えベクターを作製することができる（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989を参照のこと）。ＤＮＡ断片はその機能が発揮されるように発現ベクターに組み込まれるとよい。
【００３４】
(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードするＤＮＡは、オオムギＣＩＰ７１０ＡのｃＤＮＡを用いてＰＣＲで増幅することにより調製することができる。
【００３５】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
【００３６】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合サイト、種々のシグナル配列（例えば、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナルなど）、クローニングサイト、翻訳・転写ターミネーター、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
【００３７】
また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET Expression Syetem（Novagen社）などを例示することができる。
【００３８】
宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００３９】
組換えベクターを宿主細胞に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
【００４０】
(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞を培地で培養し、培養物から(a)、(b)又は(c)のタンパク質を採取することができる。タンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地からタンパク質を分離し、精製すればよい。タンパク質が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物からタンパク質を分離し、精製すればよい。
【００４１】
タンパク質が別のタンパク質（タグとして機能する）との融合タンパク質の形態で発現される場合には、融合タンパク質を分離及び精製した後に、FactorXaや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、別のタンパク質を切断し、目的とするタンパク質を得ることができる。
【００４２】
タンパク質の分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離及び精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００４３】
本発明は、さらにまた、以下の(d)、(e)又は(f)のタンパク質を提供する。
【００４４】
(d)配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
(e)配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
(f)配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有するタンパク質
(d)のタンパク質は、配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列からなる。配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列は、コムギＣＹＰ７１０Ａ酵素のアミノ酸配列である。
【００４５】
(e)のタンパク質は、配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有する。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数及び位置は特に限定されるものではないが、シロイズナズナ及びトマト由来のＣＹＰ７１０Ａは公知である(The Plant Cell, Vol. 18, 1008-1022, April 2006 )ので、これらのＣＹＰ７１０Ａに相当するものは除かれる。また、後述の実施例７の表２に示すように、コムギＣＹＰ７１０Ａ酵素（TACYP710A1、TACYP710A2及びTACYP710A3）のアミノ酸配列（配列番号９、１１及び１３）とオオムギＣＹＰ７１０Ａ酵素のアミノ酸配列（配列番号７）との相同性は、９３．５％、９５．５％、９５．９％である。コムギＣＹＰ７１０Ａ酵素（TACYP710A1）のアミノ酸配列（配列番号９）とシロイズナズナＣＹＰ７１０Ａ酵素（表２及び図１のAtCYP710A1、AtCYP710A2及びAtCYP710A3）のアミノ酸配列との相同性は、６０．７％、５７．３％、５３．６％及び５２．８％である。コムギＣＹＰ７１０Ａ酵素（TACYP710A2）のアミノ酸配列（配列番号１１）とシロイズナズナＣＹＰ７１０Ａ酵素（表２及び図１のAtCYP710A1、AtCYP710A2及びAtCYP710A3）のアミノ酸配列との相同性は、６１．６％、５８．０％、５４．７％及び５３．９％である。コムギＣＹＰ７１０Ａ酵素（TACYP710A3）のアミノ酸配列（配列番号１３）とシロイズナズナＣＹＰ７１０Ａ酵素（表２及び図１のAtCYP710A1、AtCYP710A2及びAtCYP710A3）のアミノ酸配列との相同性は、６１．６％、５８．２％、５４．７％及び５３．９％である。コオムギＣＹＰ７１０Ａ酵素（TACYP710A1、TACYP710A2及びTACYP710A3）のアミノ酸配列（配列番号９、１１及び１３）とトマトＣＹＰ７１０Ａ酵素（表２及び図１のSICYP710A11）のアミノ酸配列との相同性は、５５．７％、５６．４％及び５６．４％である（GENETYX-MAC Network Version 13.0.15（株式会社ゼネティックス）を用い、本ソフトのMaximum Matching...というコマンドで計算した）。従って、(e)のタンパク質における欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数は、配列番号９、１１又は１３のアミノ酸配列との相同性が９５．９より大きくなる数であればよい。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数の具体的な範囲は、欠失に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個であり、置換に関しては通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００４６】
(f)のタンパク質は、配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であり、かつスティグマステロール合成酵素活性を有する。
【００４７】
「ストリンジェントな条件」としては、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を下げる程に高い相同性を有するDNAのみならず、低い相同性しか有していないDNAまでも包括的に得ることができる。逆に、温度を上げる程、高い相同性を有するDNAのみを得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度以外にも塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８８％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４８】
これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAがコードするポリペプチドは、通常、(d)のタンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、通常、97％以上の相同性、好ましくは98％以上の相同性、さらに好ましくは99％以上の相同性を指す。タンパク質の相同性は、公知の方法で計算することができ、例えば、GENETYX-MAC Network Version 13.0.15（株式会社ゼネティックス）を用い、本ソフトのMaximum Matching...というコマンドで計算することができる。
【００４９】
上記の(d)、(e)又は(f)のタンパク質は、(d)、(e)又は(f)のタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から目的のタンパク質を採取することにより製造することができる。
【００５０】
(d)、(e)又は(f)のタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞は、(d)、(e)又は(f)のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得られる。本発明は、(d)、(e)又は(f)のタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。(d)、(e)又は(f)のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡなどを挙げることができる。「ストリンジェントな条件」とは前述の通りである。配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号８、１０又は１２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８８％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００５１】
組換えベクターを作製するには、まず、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製するとよい。目的とするタンパク質のコード領域のヌクレオチド配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、ヌクレオチドを置換してもよい。
【００５２】
次いで、このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して、組換えベクターを作製することができる（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989を参照のこと）。ＤＮＡ断片はその機能が発揮されるように発現ベクターに組み込まれるとよい。
【００５３】
(d)、(e)又は(f)のタンパク質をコードするＤＮＡは、コムギＣＩＰ７１０ＡのｃＤＮＡを用いてＰＣＲで増幅することにより調製することができる。
【００５４】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
【００５５】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合サイト、種々のシグナル配列（例えば、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナルなど）、クローニングサイト、翻訳・転写ターミネーター、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
【００５６】
また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET Expression Syetem（Novagen社）などを例示することができる。
【００５７】
宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００５８】
組換えベクターを宿主細胞に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
【００５９】
(d)、(e)又は(f)のタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞を培地で培養し、培養物から(a)、(b)又は(c)のタンパク質を採取することができる。タンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地からタンパク質を分離し、精製すればよい。タンパク質が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物からタンパク質を分離し、精製すればよい。
【００６０】
タンパク質が別のタンパク質（タグとして機能する）との融合タンパク質の形態で発現される場合には、融合タンパク質を分離及び精製した後に、FactorXaや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、別のタンパク質を切断し、目的とするタンパク質を得ることができる。
【００６１】
タンパク質の分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離及び精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例により、本発明を具体的に説明する。なお、これらの実施例は、説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６３】
〔実施例１〕オオムギ染色体添加コムギの実生の栽培方法
培土は黒土：バーミキュライト：乾燥牛ふん：化成肥料（８：８：８）＝５：１：１：０．０１の混合したものを用い、オオムギBetzes、コムギChinese Spring、オオムギ染色体を1対ずつ導入したコムギ Islam and Shepherd 1992 (Theoretical and Applied Genetics 83: 489-494); Taketa and Takeda 2001(Breeding Science 51: 199-206) （独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  近畿中国四国農業研究センターより入手）を温度２２℃、明所／暗所＝１６時間／８時間にて栽培し、播種後２週間の地上部の下部を３cm程度残し刈り取ったものを抽出サンプルとした。
【００６４】
〔実施例２〕オオムギ染色体添加コムギの実生に含まれるステロール類の抽出
実施例１で育成したオオムギ、コムギ、オオムギ染色体添加コムギの実生を凍結乾燥しマルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）で細胞を破砕した。破砕した各サンプル１０ｍｇ／ｍｌに２μｇの[25,26,26,26,27,27,27-2H7]コレステロールを内部標準として加え、２ｍｌのクロロホルム-メタノール溶液 (１:１) で３回抽出した。抽出液にセライトを加えた後に減圧下溶媒除去し、得られたセライト粉末をSep-Pak(登録商標)Vac (Silica gel, 500mg/6cc, Waters) にのせ、ヘキサン-酢酸エチル溶液 (２:１) ８ｍｌとクロロホルム-メタノール溶液 (１:１) ８ｍｌで順次溶出した。ヘキサン-酢酸エチル画分は溶媒除去後、メタノールを１ｍｌと２０％水酸化カリウム水溶液を１ｍｌ加えて８０℃で１時間反応させ、けん化した。クロロホルム-メタノール画分は溶媒除去し残渣を得、抽出後の組織片と合わせ、メタノールを１ｍｌと４mol/lの塩酸を１ｍｌ加えて、８０℃で１時間反応させ、加水分解した。それぞれの反応混合物を２ｍｌのヘキサンで３回抽出し、得られたヘキサン抽出物を合わせ溶媒除去し、ステロールを含む残渣を得た。
【００６５】
〔実施例３〕オオムギ染色体添加コムギの実生に含まれるステロール類の定量分析
実施例２で得られた残渣に、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを加え、８０℃で３０分間反応させ、トリメチルシリルエーテル体に誘導体化しＧＣ−ＭＳ分析の試料とした。ＧＣ−ＭＳの条件を、EI (70eV)、イオン源温度 250℃、カラムをDB-1 (30 m×0.25 mm, 0.25-mm; J&W Scientific)、試料導入部温度250℃、カラム昇温プログラム：80℃、1分間保持、 3分間で280℃まで上昇させて17分間保持、 境界面温度 280℃、キャリアーガスをヘリウム (1.0 mL/min)、試料導入はスプリットレスとして抽出物の分析を行った。コレステロール、カンペステロール、スティグマステロール、シトステロールは和光純薬工業株式会社より市販されており容易に入手することができ、化合物の同定はそれぞれの標品とＧＣの保持時間ならびにマススペクトルを比較することで行った。カンペスタノールとシトスタノールに関しては、長崎大学教育学部自然科学研究報告  第４４号  ５７-７５（１９９１年）及び長崎大学教育学部自然科学研究報告  第４５号  ２７-４７（１９９１年）を参照し、相対保持時間ならびにマススペクトルを比較することで決定した。各分子イオンのマスクロマトグラムの面積値と内部標準物質として添加した[25,26,26,26,27,27,27-2H7]コレステロールの分子イオンのマスクロマトグラムの面積値を比較することで各ステロールの定量を行った。定量の結果を表１に示す。オオムギ３番染色体添加系統に含まれるスティグマステロールはコムギや他の添加系統と比較して含有量が１．５倍程度であることがわかった。
【００６６】
表１  オオムギ染色体添加系統（WB１〜７はそれぞれ1〜７番染色体添加系統）、コムギ（WB８）、オオムギ（WB９）のステロール定量値（μｇ／１００ｍｇ乾燥重量）
値は３回測定の平均値。括弧内は標準偏差。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
〔実施例４〕オオムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子の部分塩基配列の取得
シロイヌナズナのＣＹＰ７１０Ａ１の遺伝子塩基配列をクエリーとして、ＮＣＢＩ (National Center for Biotechnology Information) の塩基配列データベースnt/nrにに対してｔＢＬＡＳＴｘ検索 (Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997) を行い、データベースに登録されているオオムギのＥＳＴ（Exprpessed Sequence Tag）から、既知のシロイヌナズナのＣＹＰ７１０Ａ１に高い相同性を示すＥＳＴを選抜した。選抜したＥＳＴ塩基配列をシロイヌナズナのＣＹＰ７１０Ａ１とアセンブルした結果、オオムギのＣＹＰ７１０Ａの５’末端領域の塩基配列であると推定された。シロイヌナズナのＣＹＰ７１０Ａ１の遺伝子配列と比較し、オオムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子の開始コドンを同定した。
【００６９】
〔実施例５〕オオムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列の取得
公立大学法人横浜市立大学木原生物学研究所において人工気象室（温度22℃、湿度60％、16時間日照、小糸工業製）で栽培したオオムギ（Betzes、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  近畿中国四国農業研究センターより入手）の２週間実生を採取した。ＲＮＡ抽出試薬キットRNeasy plant mini kit（Qiagen）を用いて添付のプロトコールに従いトータルＲＮＡを調製した。得られたトータルＲＮＡを用い、Rever Tra Ace(東洋紡)によりｃＤＮＡ合成を行った。実施例４より設計したプライマー（caccATGGCGGAGCTGCTGCCCA：配列番号１）及びSMART RACE cDNA amplification kit (クロンテック社)の3'-RACE CDS Primer Aプライマーを用い、KOD Plus DNAポリメラーゼ（東洋紡）により、アニール温度５０℃で２０サイクルのファーストＰＣＲを行った。さらにファーストＰＣＲ産物を１００倍希釈し、実施例４により設計したプライマー（TTCATCGTCTTCATCCGCGAC：配列番号３）及びSMART RACE cDNA amplification kit (クロンテック社)のNUPプライマーを用い、アニール温度６２℃で３０サイクルのセカンドＰＣＲを行った後、Ex TaqＴＭ DNAポリメラーゼ（宝酒造）によりＰＣＲ産物末端にアデノシンヌクレオチドを付加した。セカンドＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をｐGEM（登録商標）-Tベクター(Promega)にクローニングし、塩基配列を決定した。オオムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子全長塩基配列のＮ末端とＣ末端にアニールするようにプライマーを設計した（caccATGGCGGAGCTGCTGCCCA：配列番号１、ATAGTCCAATTTCAAACATGGCC：配列番号４）。なお、配列番号１のプライマーには、５’末端に４塩基（cacc）が付加されているが、pENTRＴＭ/D-TOPO（登録商標）エントリーベクター（インビトロジェン社）へのクローニングの際に必要である。アニール温度６０℃で４０サイクルKOD FX DNAポリメラーゼ（東洋紡）によりＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をpENTR/D-TOPOエントリーベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。これにより得られた塩基配列は、配列番号６であり、それから推定されるアミノ酸配列は、配列番号７である。
【００７０】
〔実施例６〕コムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子の部分塩基配列の取得
シロイヌナズナのＣＹＰ７１０Ａ１の遺伝子配列をクエリーとして、ＮＣＢＩの塩基配列データベースnt/nrに対してtＢＬＡＳＴＸ検索を行い、データベースに登録されているコムギのＥＳＴ（Exprpessed Sequence Tag）から、既知のシロイヌナズナのＣＹＰ７１０Ａ１に高い相同性を示すＥＳＴを選抜した。選抜したＥＳＴ塩基配列をシロイヌナズナのＣＹＰ７１０Ａ１とアセンブルした結果、コムギのＣＹＰ７１０Ａの５’末端領域の塩基配列であると推定された。シロイヌナズナのＣＹＰ７１０Ａ１の遺伝子配列と比較し、コムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子の開始コドンを同定した。
【００７１】
〔実施例７〕コムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列の取得
公立大学法人横浜市立大学木原生物学研究所において人工気象室（温度22℃、湿度60％、16時間日照、小糸工業製）で栽培したコムギ（Chinese Spring、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  近畿中国四国農業研究センターより入手）の２週間実生を採取した。ＲＮＡ抽出試薬キットRNesey plant mini kit（Qiagen）を用いて添付のプロトコールに従いトータルＲＮＡを調製した。得られたトータルＲＮＡを用い、Rever Tra Ace(東洋紡)によりｃＤＮＡ合成を行った。実施例６より設計したプライマー（caccATGGCGGAGCTGCTGCGAG：配列番号２）及びSMART RACE cDNA amplification kit (クロンテック社)の3'-RACE CDS Primer Aプライマーを用い、KOD Plus DNAポリメラーゼ（東洋紡）により、アニール温度５０℃で２０サイクルのファーストＰＣＲを行った。さらにファーストＰＣＲ産物を１００倍希釈し、実施例７により設計したプライマー（TTCATCGTCTTCATCCGCGAC：配列番号３）及びSMART RACE cDNA amplification kit (クロンテック社)のNUPプライマーを用い、アニール温度６２℃で３０サイクルのセカンドＰＣＲを行った後、Ex TaqＴＭ DNAポリメラーゼ（宝酒造）によりＰＣＲ産物末端にアデノシンヌクレオチドを付加した。セカンドＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をpGEM（登録商標）-Tベクター(Promega)にクローニングし塩基配列を決定した。コムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子全長塩基配列のＮ末端とＣ末端にアニールするようにプライマーを設計した（caccATGGCGGAGCTGCTGCGAG：配列番号２、AAAATAATAAACTGATGAATGGACC：配列番号５）。なお、配列番号２のプライマーには、５’末端に４塩基（cacc）が付加されているが、pENTRＴＭ/D-TOPO（登録商標）エントリーベクター（インビトロジェン社）へのクローニングの際に必要である。アニール温度６０℃で４０サイクルKOD FX DNAポリメラーゼ（東洋紡）によりＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をpENTR/D-TOPOエントリーベクターにクローニングし、３種類の塩基配列を決定した。これにより得られた塩基配列は、配列番号８、１０、１２であり、それから推定されるアミノ酸配列は、配列番号９、１１、１３である。オオムギ、コムギ、シロイヌナズナ、トマトのCYP710A酵素のアミノ酸配列の相同性の数値を表２に示す。また、オオムギ、コムギ、シロイヌナズナ、トマトのCYP710A酵素のアミノ酸配列のアラインメントを図１に示す。
【００７２】
【表２】
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なお、表２において、HvCYP710A1はオオムギCYP710Aを、TaCYP710A1/2/3はコムギのCYP710A3種類を、AtCYP710A1/2/3/4はシロイヌナズナのCYP710A4種類を、SlCYP710A11はトマトのCYP710Aを示す。タンパク質の相同性は、GENETYX-MAC Network Version 13.0.15（株式会社ゼネティックス）を用い、本ソフトのMaximum Matching...というコマンドで計算した。
【００７３】
〔実施例８〕オオムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子の発現解析
公立大学法人横浜市立大学木原生物学研究所において人工気象室（温度22℃、湿度60％、16時間日照、小糸工業製）によりオオムギ染色体を1対ずつ導入したパンコムギ系統 Islam and Shepherd 1992 (Theoretical and Applied Genetics 83: 489-494); Taketa and Takeda 2001(Breeding Science 51: 199-206)および親系統オオムギ（Betzes）およびパンコムギ（Chinese Spring: CS、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  近畿中国四国農業研究センターより入手）を栽培した。播種後２週間の実生を採取し、ＲＮＡ抽出試薬キットRNesey plant mini kit（Qiagen）を用いて添付のプロトコールに従いトータルＲＮＡを調製した。得られたトータルＲＮＡ２mgを用い、Rever Tra Ace(東洋紡)によりｃＤＮＡ合成を行った。実施例５および実施例７で得られたオオムギとコムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子全長配列を比較し, オオムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子に特異的にアニールするアンチセンスプライマー（CGAGAGAGAGACAGATGATACTCT：配列番号１４）を設計した。ｃＤＮＡを鋳型として、KOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡）を用いて、センスプライマー（GGACTACGCCCTCTTCAACC：配列番号１５）およびアンチセンスプライマー（CGAGAGAGAGACAGATGATACTCT：配列番号１４）によりアニール温度６１℃で４１サイクルのＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析することで、オオムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子はオオムギおよびオオムギ３番染色体導入コムギにおいて発現していることが明らかとなった（図２の各パネルにおける「オオムギ特異Primer」のゲル）。また、オオムギおよびコムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子に共通してアニールするセンスプライマー（TTCATCGTCTTCATCCGCGAC：配列番号３）よびアンチセンスプライマー（GCCGAACATGTAGATGAGGTTGTG：配列番号１６）を設計し、KOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡）を用いて、アニール温度６０℃で４０サイクルのＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析することで、全てのオオムギ染色体導入コムギ系統および親系統パンコムギ、オオムギにおいてＣＹＰ７１０Ａ遺伝子が発現していることを確認した（図２の各パネルにおける「オオムギ／コムギ共通Primer」のゲル）。さらに、SYBR（登録商標） Premix Ex TaqＴＭ（宝酒造）を用いて、オオムギ、コムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子共通にアニールするセンスプライマー（ACCGCGTCTTCGCCAACGTC：配列番号１７）よびアンチセンスプライマー（GCCGAACATGTAGATGAGGTTGTG：配列番号１６）によりアニール温度６０℃でリアルタイムＰＣＲを行い、親系統パンコムギに対してオオムギ３番染色体導入コムギ系統におけるＣＹＰ７１０Ａ遺伝子の発現が高いことを確認した（図３）。
【００７４】
〔実施例９〕バキュロウイルス−昆虫細胞発現系による本発明のタンパク質発現
実施例５および実施例７において作製した、配列番号６，８，１０，１２に示すポリヌクレオチドを有するプラスミド（エントリークローン）とデスティネーションベクターpDESTＴＭ 8（インビトロジェン社）を混合し、塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAYＴＭ attL ｘ attR 反応）により、配列番号６，８，１０，１２に示すＤＮＡ断片をpDESTＴＭ8ベクターに移すことで、昆虫細胞発現用コンストラクトを作製した。塩化カルシウム法によって、得られたコンストラクトを大腸菌株DH10Bac（インビトロジェン社）に形質転換した。得られたコロニーから、添付のプロトコールに従いBacmid ＤＮＡ（初代組換えバキュロウイルス）を調製する。定法に従い、Bacmid ＤＮＡを昆虫細胞に感染・増殖させる。昆虫細胞培養液よりミクロソーム画分を調製する。
【００７５】
〔実施例１０〕オオムギ３番染色体添加コムギＳＨ系統の実生に含まれるステロール類の定量分析
さらに、３番染色体添加系統のあるＳＨ系統についても、実施例３と同様の方法で各ステロールの定量を行った。結果を表３に示す。ＷＢ系統の結果と同様に、オオムギ３番染色体添加系統において４割程度スティグマステロール含量が増加していることがわかった。
【００７６】
表３  オオムギ染色体添加系統（ＳＨ１１、２〜７はそれぞれ１、２〜７番染色体添加系統）、コムギ（W１００）、オオムギ（ＳＰ２）のステロール定量値（μｇ／１００ｍｇ乾燥重量）
値は３回測定の平均値。括弧内は標準偏差。
【００７７】
【表３】
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〔コムギ若葉粉末製造例〕
コムギを種蒔きし、３ ０ 〜 ３ ５ ｃ ｍ に成長したところで、下部１ ０ ｃ ｍ 程度を残して刈り取り後、葉と葉軸を分離する。次に、水洗し土や異物を取り除き、これを９ ０ 〜 １ ０ ０ ℃ の熱風式棚式乾燥機にて乾燥する。乾燥した若葉は、ミキサーで軽く回転させ葉肉部分と葉脈部分を分離する。葉肉部分は、粉砕機（ アトマイザー） で粉砕し、目開き５ ０ ０ μ ｍ のスクリーン通過分が９ ０ 重量％ で、目開き３ ０ ０ μ ｍ のスクリーン未通過分が４ ８ 重量％の粗粉末を得る。この粗粉末を更に気流粉砕機（ 水平型ジェットミルＳ Ｔ Ｊ ； 株式会社セイシン企業） にて微粉砕して、粒度が１ ０ ０ μ ｍ 以下であり、かつ５ ０ μ ｍ 以下の割合が８ ０ 重量％ 以上（粒度範囲： ２ 〜 ６ ５ μ ｍ 、５ ０ 累積％ １ ３ ． ４ ５ μ ｍ ） のコムギ若葉祖粉末を得る。この粗粉末を更に気流粉砕機にて更に微粉砕に加工し、粒度５ ０ μ ｍ 以下（ 粒度範囲； １〜 ５ ０ μ ｍ 、５ ０ 累積％ ８ ． ３ １ μ ｍ ） のコムギ若葉粉末を得る。コムギ若葉粉末を少量のキサンタンガムを使用して造粒し、これを、３ ｇ づつに分包し、ドリンク用顆粒を製造する。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により、スティグマステロール含量が増強された植物は、食品（例えば、機能性食品）、ペット食品などの分野に利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００７９】
<配列番号１>
プライマーの塩基配列（実施例５）。5’末端の４塩基（cacc）は、pENTRTM/D-TOPO(登録商標)エントリーベクターへのクローニングの際に必要であるため人工的に付加した。
<配列番号２>
プライマーの塩基配列（実施例７）。5’末端の４塩基（cacc）は、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）エントリーベクターへのクローニングの際に必要であるため人工的に付加した。
<配列番号３>
プライマーの塩基配列（実施例５）。
<配列番号４>
プライマーの塩基配列（実施例５）。
<配列番号５>
プライマーの塩基配列（実施例７）。
<配列番号６>
オオムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列。
<配列番号７>
オオムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
<配列番号８>
コムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列。
<配列番号９>
コムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
<配列番号１０>
コムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列。
<配列番号１１>
コムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
<配列番号１２>
コムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列。
<配列番号１３>
コムギＣＹＰ７１０Ａの遺伝子コード領域全長塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
<配列番号１４>
オオムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子に特異的にアニールするアンチセンスプライマーの塩基配列（実施例８）。
<配列番号１５>
オオムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子に特異的にアニールするセンスプライマーの塩基配列（実施例８）。
<配列番号１６>
オオムギおよびコムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子に共通してアニールするアンチセンスプライマーの塩基配列（実施例８）。
<配列番号１７>
オオムギおよびコムギＣＹＰ７１０Ａ遺伝子に共通してアニールするセンスプライマーの塩基配列（実施例８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００８０】
【非特許文献１】Batta et al. 2006, Metabolism Clinical and Experimental 55: 292-299
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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