(57)【要約】      （修正有）【課題】耐熱性菌類を特異的にかつ迅速に検出、識別できる方法を提供する。【解決手段】耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡに含まれる、特定な配列からなる塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつ耐熱性菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いる耐熱性菌類の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）及びハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属からなる群から選ばれる少なくとも２つの菌類を検出する方法において、下記１）〜４）からなる群から選ばれる少なくとも２つの工程を含んでなる、耐熱性菌類の検出方法。
１）下記（Ａ）の塩基配列で表される核酸を用いてビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属に属する菌類の同定を行う工程、
２）下記（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の同定を行う工程、
３）下記（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の同定を行う工程、
４）下記（Ｋ）の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類の同定を行う工程
（Ａ）配列番号２４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつビソクラミス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｂ）配列番号２５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｃ）配列番号２６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｄ）配列番号２７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｅ）配列番号２８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｆ）配列番号２９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｇ）配列番号３０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｈ）配列番号３１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｉ）配列番号３２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｊ）配列番号３３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｋ）配列番号３４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【請求項２】
同定を行うために、被検菌のβ‐チューブリン遺伝子領域又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（Ａ）〜（Ｋ）のいずれかの塩基配列が含まれるか否かを確認することを特徴とする請求項１記載の耐熱性菌類の検出方法。
【請求項３】
同定を行うために、前記（Ａ）〜（Ｋ）のいずれかの塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた検出用オリゴヌクレオチドを検査対象物より抽出した核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することを特徴とする請求項１記載の耐熱性菌類の検出方法。
【請求項４】
同定を行うために、前記（Ａ）〜（Ｋ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することを特徴とする請求項１記載の耐熱性菌類の検出方法。
【請求項５】
前記増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって行うことを特徴とする請求項４記載の耐熱性菌類の検出方法。
【請求項６】
前記１）〜４）の工程が、それぞれ下記１−１）〜４−１）の工程であること特徴とする請求項５記載の耐熱性菌類の検出方法。
１−１）前記（Ａ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅反応を行う工程、
（１）ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
２−１）前記（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅反応を行う工程、
（１）タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
３−１）前記（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅反応を行う工程、
（１）ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
４−１）前記（Ｋ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅反応を行う工程
（１）ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
【請求項７】
前記１）〜４）の工程が、それぞれ下記１−２）〜４−２）の工程であること特徴とする請求項３〜６のいずれか１項記載の耐熱性菌類の検出方法。
１−２）下記（ａ）及び／又は（ｂ）の検出用オリゴヌクレオチドを用いてビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属に属する菌類の同定を行う工程、
２−２）下記（ｃ）及び／又は（ｄ）の検出用オリゴヌクレオチド、下記（ｇ）及び／又は（ｈ）の検出用オリゴヌクレオチド、下記（ｉ）及び／又は（ｈ）の検出用オリゴヌクレオチド、下記（ｅ）及び／又は（ｆ）の検出用オリゴヌクレオチド、並びに／あるいは下記（ｊ）及び／又は（ｋ）の検出用オリゴヌクレオチドを用いてタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の同定を行う工程、
３−２）下記（ｌ）及び／又は（ｍ）の検出用オリゴヌクレオチド、又は下記（ｎ）及び／又は（ｏ）の検出用オリゴヌクレオチドを用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の同定を行う工程、
４−２）下記（ｐ）及び／又は（ｑ）の検出用オリゴヌクレオチド、下記（ｒ）及び／又は（ｓ）の検出用オリゴヌクレオチド、並びに／あるいは下記（ｔ）及び／又は（ｕ）の検出用オリゴヌクレオチドを用いてハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類の同定を行う工程
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｍ）配列番号１３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｎ）配列番号１４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｏ）配列番号１５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｐ）配列番号１６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｑ）配列番号１７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｒ）配列番号１８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｓ）配列番号１９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｔ）配列番号２０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｕ）配列番号２１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項８】
前記検出用オリゴヌクレオチドを核酸プローブ又は核酸プライマーとして用いることを特徴とする請求項７記載の耐熱性菌類の検出方法。
【請求項９】
耐熱性菌類の検出方法において、発育可能温度帯の違いを利用してネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）かを識別する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の耐熱性菌類の検出方法。
【請求項１０】
耐熱性菌類の検出方法において、さらに下記（ｖ）及び／又は（ｗ）の検出用オリゴヌクレオチドを用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）かを識別する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項７又は８記載の耐熱性菌類の検出方法。
（ｖ）配列番号２２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｗ）配列番号２３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１１】
タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類を検出する工程において、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、並びに前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対を同時に用いて遺伝子増幅処理工程を行うことを特徴とする、請求項７又は８記載の耐熱性菌類の検出方法。
【請求項１２】
前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｒ）及び（ｓ）のオリゴヌクレオチド対若しくは前記（ｔ）及び（ｕ）のオリゴヌクレオチド対のいずれか一方を用いて遺伝子増幅処理を行い遺伝子の増幅が確認された試料について、他方のオリゴヌクレオチド対を用いて遺伝子増幅処理を行いハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類を検出することを特徴とする、請求項７又は８記載の耐熱性菌類の検出方法。
【請求項１３】
下記の群（１）〜（４）のオリゴヌクレオチド対から選ばれ、かつ互いに異なる群から選ばれた少なくとも２対のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして含む耐熱性菌類検出用キット。
（１）下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（２）下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対からなる群
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（３）下記（ｌ）及び（ｍ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチド対からなる群
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｍ）配列番号１３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｎ）配列番号１４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｏ）配列番号１５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｖ）配列番号２２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｗ）配列番号２３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（４）下記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｒ）及び（ｓ）のオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｔ）及び（ｕ）のオリゴヌクレオチド対からなる群
（ｐ）配列番号１６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｑ）配列番号１７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｒ）配列番号１８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｓ）配列番号１９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｔ）配列番号２０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｕ）配列番号２１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１４】
前記（１）〜（４）の各群において、各群のオリゴヌクレオチド対を少なくとも各１対ずつ含むことを特徴とする請求項１３記載の耐熱性菌類検出用キット。
【請求項１５】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｔ）及び（ｕ）のオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチド対を含むことを特徴とする請求項１３記載の耐熱性菌類検出用キット。
【請求項１６】
ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）及びハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属からなる群から選ばれる少なくとも２つの菌類を検出する方法において、下記１−３）〜４−３）からなる群から選ばれる少なくとも２つの工程を含んでなる、耐熱性菌類の検出方法。
１−３）下記（ａ’）及び／又は（ｂ’）のオリゴヌクレオチドを用いてビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属に属する菌類を検出する工程、
２−３）下記（ｃ’）及び／又は（ｄ’）のオリゴヌクレオチド、下記（ｇ’）及び／又は（ｈ’）のオリゴヌクレオチド、下記（ｉ’）及び／又は（ｈ’）のオリゴヌクレオチド、下記（ｅ’）及び／又は（ｆ’）のオリゴヌクレオチド、並びに／あるいは下記（ｊ’）及び／又は（ｋ’）の検出用オリゴヌクレオチドを用いてタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類を検出する工程、
３−３）下記（ｌ’）及び／又は（ｍ’）のオリゴヌクレオチド、又は下記（ｎ’）及び／又は（ｏ’）のオリゴヌクレオチドを用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出する工程、
４−３）下記（ｐ’）及び／又は（ｑ’）のオリゴヌクレオチド、下記（ｒ’）及び／又は（ｓ’）のオリゴヌクレオチド、並びに／あるいは下記（ｔ’）及び／又は（ｕ’）のオリゴヌクレオチドを用いてハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類を検出する工程
（ａ’）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ’）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ’）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ’）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ’）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ’）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ’）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｈ’）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｉ’）配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ’）配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ’）配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ’）配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｍ’）配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｎ’）配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｏ’）配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｐ’）配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｑ’）配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｒ’）配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｓ’）配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｔ’）配列番号２０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｕ’）配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１７】
耐熱性菌類の識別方法において、発育可能温度帯の違いを利用してネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）かを検出する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１６記載の耐熱性菌類の検出方法。
【請求項１８】
耐熱性菌類の識別方法において、さらに下記（ｖ’）及び／又は（ｗ’）のオリゴヌクレオチドを用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）かを検出する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１６記載の耐熱性菌類の検出方法。
（ｖ’）配列番号２２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｗ’）配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性菌類の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性の菌類（真菌類）は自然界に広く分布し、野菜、果物等の農作物で繁殖し、これらの農作物を原材料とした飲食品を汚染する。しかも、耐熱性の菌類は通常の他の菌類に比べて高い耐熱性を有する。例えば酸性飲料の加熱殺菌処理を行ったとしても耐熱性菌類が生存、増殖し、カビの発生原因となることがある。このため、耐熱性菌類は重大な事故を引き起こす重要危害菌として警戒されている。
【０００３】
加熱殺菌処理後の飲食品からも検出されることがある汚染事故の原因菌の主な耐熱性菌類として、ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属及びハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する耐熱性菌類が知られている。子のう胞子を形成する他の耐熱性菌類と比べ、上記４属に属する菌類は耐熱性が突出して高く、加熱殺菌後に生存する可能性が高い。一方、上記４属以外の耐熱性菌類は、通常の殺菌条件で殺滅できるため、殺菌不良などが無い限りは汚染事故を引き起こす可能性は低い。従って、飲食品及びこれらの原材料中の耐熱性菌類による事故防止のためには、これら４属に属する耐熱性菌類の検出、識別が特に重要である。
さらに、危害事故発生時における事故原因究明及び対策のためには、事故原因菌の同定が必要となる。従って、上記４属の耐熱性菌類を識別することができれば、より迅速な事故原因菌の検出、識別が可能となる。
【０００４】
一方、従来の耐熱性の菌類を検出、識別する方法としては、検体をＰＤＡ培地等で培養して検出、識別する方法がある。しかし、この方法ではコロニーが確認されるまでに約７日間を要する。しかも、菌種の同定は、菌の特徴的な器官の形態に基づいて行うので、形態学的な特徴が認められるまでさらに約７日間の培養を必要としている。したがって、この方法によると、耐熱性菌類の検出、識別に約１４日間もの時間を要する。このように耐熱性菌類の検出、識別に長期間を要することは飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるものではない。そのため、より迅速な耐熱性菌類の検出、識別方法の確立が求められている。
【０００５】
菌類の迅速な検出、識別方法としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用した検出方法が知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。しかし、これらの方法では特定の耐熱性菌類を特異的にかつ迅速に検出することが困難であるという問題を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０５７２８号公報
【特許文献２】特開２００６−６１１５２号公報
【特許文献３】特開２００６−３０４７６３号公報
【特許文献４】特開２００７−１７４９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、飲食品汚染の主な原因菌である耐熱性菌類を特異的にかつ迅速に検出、識別しうる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のように耐熱性菌類の検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたＰＣＲ法では擬陽性や擬陰性の結果が出ることが挙げられる。
本発明者等は、この問題を克服し特定の耐熱性菌類を特異的に検出・識別しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡに、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域（以下、「可変領域」ともいう）が存在し、この可変領域をターゲットとすることで、上記耐熱性菌類を特異的かつ迅速に検出・識別できることを見い出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
本発明は、ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）及びハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属からなる群から選ばれる少なくとも２つの菌類を検出する方法において、下記１）〜４）からなる群から選ばれる少なくとも２つの工程を含んでなる、耐熱性菌類の検出方法に関するものである。
１）下記の（Ａ）の塩基配列で表される核酸を用いてビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属に属する菌類の同定を行う工程、
２）下記の（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の同定を行う工程、
３）下記の（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の同定を行う工程、
４）下記の（Ｋ）の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類の同定を行う工程
（Ａ）配列番号２４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつビソクラミス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｂ）配列番号２５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｃ）配列番号２６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｄ）配列番号２７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｅ）配列番号２８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｆ）配列番号２９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｇ）配列番号３０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｈ）配列番号３１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｉ）配列番号３２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｊ）配列番号３３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｋ）配列番号３４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【００１０】
また、本発明は、下記の群（１）〜（４）のオリゴヌクレオチド対から選ばれ、かつ互いに異なる群から選ばれた少なくとも２対のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして含む耐熱性菌類検出用キットに関する。
（１）下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（２）下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対からなる群
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（３）下記（ｌ）及び（ｍ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチド対からなる群
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｍ）配列番号１３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｎ）配列番号１４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｏ）配列番号１５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｖ）配列番号２２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｗ）配列番号２３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（４）下記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｒ）及び（ｓ）のオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｔ）及び（ｕ）のオリゴヌクレオチド対からなる群
（ｐ）配列番号１６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｑ）配列番号１７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｒ）配列番号１８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｓ）配列番号１９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｔ）配列番号２０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｕ）配列番号２１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、飲食品の汚染事故の主な原因菌である耐熱性菌類を特異的にかつ迅速に検出、識別しうる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アスペルギルス  フミガタス、ネオサルトリア  フィシェリ  フィシェリ及びネオサルトリア  フィシェリ  スピノサのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列の一部を比較した図である。
【図２】ハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図３】実施例１（Ａ−１）におけるビソクラミス属に属する菌類の識別結果を示す電気泳動図である。
【図４】実施例１（Ａ−２）におけるビソクラミス  ファルバの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図５】実施例１（Ａ−２）におけるビソクラミス  ニベアの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図６】実施例１（Ｂ−１）におけるタラロマイセス属に属する菌類の識別結果を示す電気泳動図である。
【図７】実施例１（Ｂ−２）におけるタラロマイセス属に属する菌類の識別結果を示す電気泳動図である。
【図８】実施例１（Ｂ−２）におけるタラロマイセス属に属する菌類の識別の結果を示す電気泳動図である。
【図９−１】実施例１（Ｂ−３）における電気泳動図である。
【図９−２】実施例１（Ｂ−４）における電気泳動図である。
【図１０】実施例１（Ｂ−５）におけるタラロマイセス  フラバスの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図１１】実施例１（Ｂ−５）におけるタラロマイセス  マクロスポラスの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図１２】実施例１（Ｃ−１）におけるネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの識別結果を示す電気泳動図である。
【図１３】実施例１（Ｃ−２）におけるネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの識別結果を示す電気泳動図である。
【図１４】実施例１（Ｃ−３）におけるネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスとの識別結果を示す電気泳動図である。
【図１５】実施例１（Ｃ−３）におけるネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスとの識別結果を示す電気泳動図である。
【図１６】実施例１（Ｃ−４）におけるネオサルトリア  フィシェリ  フィシェリの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図１７】実施例１（Ｃ−４）におけるネオサルトリア  フィシェリ  グラブラの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図１８】実施例１（Ｃ−４）におけるネオサルトリア  ヒラツカエの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図１９】実施例１（Ｃ−４）におけるネオサルトリア  パウリステンシスの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図２０】実施例１（Ｃ−４）におけるネオサルトリア  フィシェリ  スピノサの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図２１】実施例１（Ｄ−１）におけるハミゲラ属に属する菌類の識別結果を示す電気泳動図である。
【図２２】実施例１（Ｄ−２）におけるハミゲラ属に属する菌類の識別結果を示す電気泳動図である。
【図２３】実施例１（Ｄ−３）におけるハミゲラ属に属する菌類の識別結果を示す電気泳動図である。
【図２４】実施例１（Ｄ−４）におけるハミゲラ  ストリアータの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図２５】実施例１（Ｄ−５）におけるハミゲラ  アベラネアの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図２６】実施例１（Ｄ−６）におけるハミゲラ属及びビソクラミス属に属する菌類を用いた電気泳動図である。
【図２７】実施例１（Ｄ−６）におけるハミゲラ属及びビソクラミス属に属する菌類を用いた電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列及び／又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列、すなわち耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子領域及び／又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中における耐熱性菌類の各属に特異的な領域又は種特異的領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いて耐熱性菌類の同定を行い、耐熱性菌類を特異的に識別・検出する方法である。
より詳細には、本発明は下記１）〜４）の同定・検出工程の少なくとも２つを包んでなる耐熱性菌類の検出方法である。
１）ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子領域中におけるビソクラミス属に特異的な領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いてビソクラミス属に属する菌類の同定を行い、ビソクラミス属に属する菌類を特異的に識別・検出する工程。
２）タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子領域及び／又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中におけるタラロマイセス属に特異的な領域又は種特異的領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス属に属する菌類の同定を行い、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・検出する工程。
３）ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のβ−チューブリン遺伝子領域中におけるネオサルトリア属及び／又はアスペルギルス  フミガタスに特異的な領域又は種特異的領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの同定を行い、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを特異的に識別・検出する工程。
４）ハミゲラ属（Ｈａｍｉｇｅｒａ）に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子領域中におけるハミゲラ属に特異的な領域又は種特異的領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ属に属する菌類の同定を行い、ハミゲラ属に属する菌類を特異的に識別・検出する工程。
本発明の検出方法は、上記１）〜４）の同定・検出工程のうち少なくとも２つの工程を含んでなり、好ましくは上記１）〜４）の同定・検出工程のうち少なくとも３つの工程を含んでなり、より好ましくは上記１）〜４）の同定・検出工程のすべての工程を含んでなるものである。
【００１４】
本発明における「耐熱性菌類」とは、ビソクラミス属に属する菌類、タラロマイセス属に属する菌類、ネオサルトリア属に属する菌類、アスペルギルス  フミガタス及びハミゲラ属に属する菌類を意味する。これらの菌類はマユハキタケ科（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ）に属する不整子嚢菌類であり、７５℃、３０分間の加熱処理後であっても生存可能な子のう胞子を形成する耐熱性菌類である。ビソクラミス属に属する菌類の例として、ビソクラミス  ファルバ（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ  ｆｕｌｖａ）、ビソクラミス  ニベア（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ  ｎｉｖｅａ）が挙げられる。タラロマイセス属に属する菌類の例として、タラロマイセス  フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、タラロマイセス  ルテウス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、タラロマイセス  トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）、タラロマイセス  ウォルトマンニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）、タラロマイセス  バシリスポラス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓ）、タラロマイセス  マクロスポラス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。ネオサルトリア属に属する菌類の例として、ネオサルトリア  フィシェリ  スピノサ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ｖａｒ．  ｓｐｉｎｏｓａ；以下ネオサルトリア  スピノサとする）、ネオサルトリア  フィシェリ  フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ｖａｒ．  ｆｉｓｃｈｅｒｉ；以下ネオサルトリア  フィシェリとする）、ネオサルトリア  フィシェリ  グラブラ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ｖａｒ．  ｇｌａｂｒａ；以下ネオサルトリア  グラブラとする）、ネオサルトリア  ヒラツカエ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｈｉｒａｔｓｕｋａｅ）、ネオサルトリア  パウリステンシス（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｐａｕｌｉｓｔｅｎｓｉｓ）、ネオサルトリア  シュードフィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｐｅｕｄｏｆｉｓｃｈｅｒｉ）が挙げられる。ハミゲラ属に属する菌類の例として、ハミゲラ  アベラネア（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ）、ハミゲラ  ストリアータ（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ｓｔｒｉａｔａ）が挙げられる。
本発明における「アスペルギルス  フミガタス」とは、ネオサルトリア  フィシェリのアナモルフ（無性世代）と形態学的に極めて類似しているがテレオモルフ（有性世代）を有さない不完全菌類の一種である。
【００１５】
「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。また、本発明において、「可変領域」とは、β−チューブリン遺伝子中又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中で塩基変異が蓄積しやすい領域であり、この領域の塩基配列は真菌の属又は種間で大きく異なる。これらの菌類のβ-チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域は、これらの菌類固有の塩基配列であるため、他の菌類のものとは明確に区別しうるものである。
【００１６】
本発明の検出方法は、下記の（Ａ）〜（Ｋ）の塩基配列で表される核酸、すなわち耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子中又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中の特定領域（可変領域）の塩基配列に対応する核酸を用いることを特徴とする。
【００１７】
本発明の検出方法において、ビソクラミス属に属する菌類を検出するために下記の（Ａ）の塩基配列で表される核酸、すなわちビソクラミス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子中の特定領域（可変領域）の塩基配列に対応する核酸を用いる。
（Ａ）配列番号２４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつビソクラミス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
発明者らは、ビソクラミス属に属する菌類及びビソクラミス属に属する菌類に近縁な菌類から種々のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を同定し、ビソクラミス属と近縁な属とビソクラミス属との間、及びビソクラミス属内での遺伝的距離の解析を行った。さらに、決定した各種のβ−チューブリン遺伝子配列の相同性解析をおこなった。その結果、当該配列中にビソクラミス属に属する菌類に固有の塩基配列を有する可変領域を見出した。この可変領域において、ビソクラミス属に属する菌類は固有の塩基配列を有しているため、ビソクラミス属に属する菌類を識別・同定することが可能となる。
【００１８】
本発明の検出方法において、タラロマイセス属に属する菌類を検出するために下記の（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列で表される核酸、すなわちタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子中及び／又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中の特定領域（可変領域）の塩基配列に対応する核酸を用いる。
（Ｂ）配列番号２５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｃ）配列番号２６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（Ｄ）配列番号２７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
発明者らは、タラロマイセス属に属する菌類及びタラロマイセス属に属する菌類に近縁な菌類から種々のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を同定し、タラロマイセス属と近縁な属とタラロマイセス属との間、及びタラロマイセス属内での遺伝的距離の解析を行った。さらに、決定した各種のβチューブリン遺伝子配列及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列の相同性解析をおこなった。その結果、当該配列中にタラロマイセス属に属する菌類に固有の塩基配列を有する可変領域を見出した。この可変領域において、タラロマイセス属に属する菌類は固有の塩基配列を有しているため、タラロマイセス属に属する菌類を識別・同定することが可能となる。
【００１９】
本発明の検出方法において、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを検出するために下記（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列で表される核酸、すなわちネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子中の特定領域（可変領域）の塩基配列に対応する核酸を用いる。
（Ｅ）配列番号２８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｆ）配列番号２９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｇ）配列番号３０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｈ）配列番号３１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｉ）配列番号３２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（Ｊ）配列番号３３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
発明者らは、ネオサルトリア属に属する菌類、アスペルギルス  フミガタス及びネオサルトリア属に属する菌類に近縁な菌類から種々のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を同定し、ネオサルトリア属と近縁な属とネオサルトリア属との間、ネオサルトリア属内及び、ネオサルトリア属と近縁な属やネオサルトリア属とアスペルギルス  フミガタスとの間での遺伝的距離の解析を行った。さらに、決定した各種のβチューブリン遺伝子配列の相同性解析をおこなった。その結果、当該配列中にネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスに固有の塩基配列を有する可変領域を見出した。この可変領域において、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスは固有の塩基配列を有しているため、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを識別・同定することが可能となる。
【００２０】
本発明の検出方法において、ハミゲラ属に属する菌類を検出するために下記（Ｋ）の塩基配列で表される核酸、すなわちハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子中の特定領域（可変領域）の塩基配列に対応する核酸を用いることを特徴とする。
（Ｋ）配列番号３４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
発明者らは、ハミゲラ属に属する菌類及びハミゲラ属に属する菌類に近縁な菌類から種々のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を同定し、ハミゲラ属と近縁な属とハミゲラ属との間、及びハミゲラ属内での遺伝的距離の解析を行った。さらに、決定した各種のβチューブリン遺伝子配列の相同性解析をおこなった。その結果、当該配列中にハミゲラ属に属する菌類に固有の塩基配列を有する可変領域を見出した。この可変領域において、ハミゲラ属に属する菌類は固有の塩基配列を有しているため、ハミゲラ属に属する菌類を識別・同定することが可能となる。
本発明は、これらの可変領域及び可変領域に由来する核酸、オリゴヌクレオチドをターゲットとしたものである。
【００２１】
本発明の検出方法に用いる前記（Ａ）の塩基配列は、ビソクラミス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列に対応する。
配列番号２４に記載の塩基配列及びその相補配列は、ビソクラミス  ニベアから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はビソクラミス属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、ビソクラミス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号２４に記載の塩基配列若しくはその相補配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつビソクラミス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にビソクラミス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、特にビソクラミス  ニベア及びビソクラミス  ファルバを検出するために好適に用いられる。
【００２２】
本発明の検出方法に用いる前記（Ｂ）又は（Ｃ）の塩基配列は、タラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配に対応する。また、前記（Ｄ）の塩基配列は、タラロマイセス属に属する菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の塩基配列に対応する。
配列番号２５に記載の塩基配列及びその相補配列は、タラロマイセス  フラバスから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はタラロマイセス属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号２５に記載の塩基配列若しくはその相補配において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にタラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムスを検出するために好適に用いられる。
配列番号２６に記載の塩基配列及びその相補配列は、タラロマイセス  ルテウスから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はタラロマイセス属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号２６に記載の塩基配列若しくはその相補配において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にタラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  バシリスポラス、タラロマイセス  ウォルトマンニーを検出するために好適に用いられる。
配列番号２７に記載の塩基配列及びその相補配列は、タラロマイセス  ウォルトマンニーから単離、同定された２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中の可変領域の塩基配列である。当該配列はタラロマイセス属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号２７に記載の塩基配列若しくはその相補配において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にタラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスを検出するために好適に用いられる。
【００２３】
本発明の検出方法に用いる前記（Ｅ）、（Ｇ）〜（Ｊ）の塩基配列は、ネオサルトリア属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列に対応する。また、前記（Ｆ）の塩基配列は、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列に対応する。
配列番号２８に記載の塩基配列及びその相補配列は、ネオサルトリア  グラブラから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。配列番号３０及び３１に記載の塩基配列及びその相補配列は、ネオサルトリア  フィシェリから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の部分塩基配列である。配列番号３２及び３３に記載の塩基配列及びその相補配列は、ネオサルトリア  スピノサから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の部分塩基配列である。また、配列番号２９に記載の塩基配列及びその相補配列は、アスペルギルス  フミガタスから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスに特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号２８〜３３のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、特にネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ、ネオサルトリア  ヒラツカエ、ネオサルトリア  パウリステンシス、ネオサルトリア  シュードフィシェリ及びアスペルギルス  フミガタスを検出するために好適に用いられる。
【００２４】
本発明の検出方法に用いる前記（Ｋ）の塩基配列は、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列に対応する。
配列番号３４に記載の塩基配列及びその相補配列は、ハミゲラ  アベラネアから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はハミゲラ属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、ハミゲラ属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号３４に記載の塩基配列若しくはその相補配において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にハミゲラ属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、特にハミゲラ  アベラネア及びハミゲラ  ストリアータを検出するために好適に用いられる。
以下、前記（Ａ）〜（Ｋ）のいずれかの塩基配列をまとめて「本発明の可変領域の塩基配列」ともいう。
【００２５】
上記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いて耐熱性菌類を同定する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
【００２６】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いて耐熱性菌類の同定を行うためには、被検体のβ‐チューブリン遺伝子領域又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（Ａ）〜（Ｋ）のいずれかの塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。
より詳細には、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてビソクラミス属に属する菌類の同定を行うには、被検体のβ−チューブリン遺伝子領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（Ａ）の塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と本発明の前記（Ａ）記載のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいてビソクラミス属に属する菌類の同定を行うことを好ましい態様として包含する。
前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス属に属する菌類の同定を行うには、被検体のβ−チューブリン遺伝子領域又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と本発明の前記（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいてタラロマイセス属に属する菌類の同定を行うことを好ましい態様として包含する。
前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの同定を行うには、被検体のβ−チューブリン遺伝子領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と本発明の前記（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの同定を行うことを好ましい態様として包含する。
前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ属に属する菌類の同定を行うには、被検体のβ−チューブリン遺伝子領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（Ｋ）の塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と本発明の前記（Ｋ）に記載のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいてハミゲラ属に属する菌類の同定を行うことを好ましい態様として包含する。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００２７】
本発明においては、上記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いて耐熱性菌類の検出・同定を行うために、前記本発明の可変領域の塩基配列、すなわち前記（Ａ）〜（Ｋ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつ耐熱性菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
より詳細には、ビソクラミス属に属する菌類の検出・同定を行うために、前記本発明の可変領域の塩基配列、すなわち前記（Ａ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつビソクラミス属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
タラロマイセス属に属する菌類の検出・同定を行うために、前記本発明の可変領域の塩基配列、すなわち前記（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつタラロマイセス属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出・同定を行うために、前記本発明の可変領域の塩基配列、すなわち前記（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
ハミゲラ属に属する菌類の検出・同定を行うために、前記本発明の可変領域の塩基配列、すなわち前記（Ｋ）塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつハミゲラ属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、上記耐熱性菌類の検出に使用できるものであればよい。すなわち、耐熱性菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件で耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば後述の条件が挙げられる。
【００２８】
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の塩基配列から選択される領域であって、（１）上記耐熱性菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値（融解温度：melting  temperature）がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
より詳細には、ビソクラミス属に属する菌類を検出する場合、前記（Ａ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）ビソクラミス属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
タラロマイセス属に属する菌類を検出する場合、前記（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）タラロマイセス属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを検出する場合、前記（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）ネオサルトリア及び／又はアスペルギルス  フミガタスに固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
ハミゲラ属に属する菌類を検出する場合、前記（Ｋ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）ハミゲラ属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
上記（１）において「ビソクラミス属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域」とは、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の中でも、異なる属間での塩基配列の保存性が特に低く（すなわち、ビソクラミス属に属する菌類の特異性が特に高く）、１０塩基前後にわたってビソクラミス属に属する菌類に固有の塩基配列が連続して現れる領域を意味する。また、「タラロマイセス属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域」とは、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の中でも、異なる属間での塩基配列の保存性が特に低く（すなわち、タラロマイセス属に属する菌類の特異性が特に高く）、１０塩基前後にわたってタラロマイセス属に属する菌類に固有の塩基配列が連続して現れる領域を意味する。また、「ネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスに固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域」とは、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の中でも、異なる属間での塩基配列の保存性が特に低く（すなわち、ネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスの特異性が特に高く）、１０塩基前後にわたってネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスに固有の塩基配列が連続して現れる領域を意味する。また、「ハミゲラ属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域」とは、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の中でも、異なる属間での塩基配列の保存性が特に低く（すなわち、ハミゲラ属に属する菌類の特異性が特に高く）、１０塩基前後にわたってハミゲラ属に属する菌類に固有の塩基配列が連続して現れる領域を意味する。
また、上記（３）において「オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い」とは、プライマーの塩基配列からプライマー同士が結合しないことが予想されることを言う。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドの塩基数としては、特に限定されないが、１３塩基〜３０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２３塩基であることがより好ましい。ハイブリダイズ時のオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、５５℃〜６５℃の範囲内であることが好ましく、５９℃〜６２℃の範囲内であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、３０％〜８０％が好ましく、４５％〜６５％がより好ましく、５５％前後であることが最も好ましい。
【００２９】
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、下記の（ａ）〜（ｗ）のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
下記（ａ）又は（ｂ）で示されるオリゴヌクレオチドを用いることで、ビソクラミス属に属する菌類を検出することができる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００３０】
下記の（ｃ）〜（ｋ）のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドを用いることで、タラロマイセス属に属する菌類を検出することができる。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００３１】
下記の（ｌ）〜（ｏ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを用いることで、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを検出することができる。
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｍ）配列番号１３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｎ）配列番号１４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｏ）配列番号１５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
さらに、下記の（ｖ）と（ｗ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを用いることで、アスペルギルス  フミガタスを特異的に検出できる。
（ｖ）配列番号２２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｗ）配列番号２３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００３２】
下記の（ｐ）〜（ｕ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを用いることで、ハミゲラ属に属する菌類を検出することができる。
（ｐ）配列番号１６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｑ）配列番号１７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｒ）配列番号１８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｓ）配列番号１９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｔ）配列番号２０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｕ）配列番号２１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００３３】
すなわち、本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜２３のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号１〜２３のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであって、耐熱性菌類の検出に使用できるものが好ましい。耐熱性菌類の検出に使用できる塩基配列とは、配列番号１〜２３のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有し、耐熱性菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして耐熱性菌類の検出に使用できるものや、ストリンジェントな条件で各耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子やタラロマイセス属に属する菌類の２８ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域にハイブリダイズ可能な塩基配列でもよい。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。このような本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、前述するような耐熱性菌類の検出に使用できるものであれば、相同性が７５％以上であることがさらに好ましく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。
また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドには、耐熱性菌類の検出に使用できるものであれば、配列番号１から２３のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドに対して、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施されたオリゴヌクレオチドも包含される。また、本発明のオリゴヌクレオチドには、配列番号１から２３のいずれかに記載の塩基配列に対して、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであり、耐熱性菌類の検出のためのプライマーやプローブとして耐熱性菌類の検出に使用できるものや、ストリンジェントな条件で各耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子やタラロマイセス属に属する菌類の２８ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域にハイブリダイズ可能な塩基配列でもよい。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M  塩化ナトリウム、０．０１５M  クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。そのような塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施されたオリゴヌクレオチドとしては配列番号１から２３のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドにおいて１又は数個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾されたオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１から２３のいずれかに記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００３４】
前記（ａ）及び（ｂ）で示されるオリゴヌクレオチドは、ビソクラミス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。したがって、前記オリゴヌクレオチドを用いることによって、前記ビソクラミス属に属する菌類を特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【００３５】
配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、ビソクラミス属に属する菌類に特異的な塩基配列、すなわち可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、ビソクラミス属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡの一部分と特異的にハイブリダイズすることができる。
【００３６】
ビソクラミス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域をビソクラミス  ニベアを例として詳細に説明する。上述のように、ビソクラミス  ニベアのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号２４で示される。このうち、ビソクラミス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の２０位から１７５位までの領域は真菌の属間で塩基配列の保存性が特に低く、属固有の塩基配列を有する領域であることを本発明者らが見い出した。  前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号２４に記載の塩基配列のうち、それぞれ３３位から５２位まで、１５９位から１７８位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをビソクラミス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、ビソクラミス属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【００３７】
前記（ｃ）から（ｋ）のオリゴヌクレオチドは、タラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。したがって、前記オリゴヌクレオチド対を用いることによって、前記タラロマイセス属に属する菌類を特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【００３８】
配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、タラロマイセス属に属する菌類の内タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムスに特異的な塩基配列、すなわち可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。配列番号５〜６及び配列番号１０〜１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、タラロマイセス属に属する菌類の内タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  バシリスポラスに特異的な塩基配列、すなわち可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。配列番号７〜８及び配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、２８Ｓ  ｒＤＮＡ中のＤ１/Ｄ２領域に存在し、タラロマイセス属に属する菌類の内タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスに特異的な塩基配列、すなわち可変領域中の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、タラロマイセス属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
【００３９】
タラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域をタラロマイセス  フラバス及びタラロマイセス  ルテウスを例として詳細に説明する。上述のように、タラロマイセス  フラバスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号２５、タラロマイセス  ルテウスのβ―チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号２６で示される。このうち、タラロマイセス  フラバスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の可変領域は１０位から４０位までの領域、及び７０位から１００位までの領域はタラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムスと特に保存性が高い配列であり、他の真菌で類似する配列がない領域であることを本発明者らが見出した。さらに、タラロマイセス  ルテウスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の可変領域は１２０から１６０位までの領域及び２９５位から３２５位までの領域は遺伝的に近縁なタラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  バシリスポラスと保存性が高い配列であり、他の真菌で類似する配列がない領域であることを本発明者らが見い出した。
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号２５に記載の塩基配列のうち、それぞれ１５位から３４位まで、７６位から９８位までの可変領域に対応する。前記（ｅ）及び（ｆ）及び前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号２６に記載の塩基配列のうち、それぞれ１３３位から１５３位まで、３０４位から３２５位までの可変領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、タラロマイセス属に属する菌類を検出することができる。
【００４０】
タラロマイセス属に属する菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域をタラロマイセス  ウォルトマンニーを例として詳細に説明する。上述のように、タラロマイセス  ウォルトマンニーの２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列は配列番号２７で示される。このうち、タラロマイセス属に属する菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列の３００位から３５０位まで、及び４５０位から５１０位までの領域はタラロマイセス  ウォルトマニー、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  マクロスポラスで特に保存性が高い配列であり、他の真菌で類似する配列がない領域であることを本発明者らが見い出した。
前記（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２７に記載の塩基配列のうち、それぞれ３２６位から３４５位まで、４６０位から４７８位までの可変領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをタラロマイセス属に属する菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域にハイブリダイズさせることによって、タラロマイセス属に属する菌類を検出することができる。
【００４１】
前記（ｌ）〜（ｏ）のオリゴヌクレオチドは、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。したがって、前記（ｌ）〜（ｏ）のオリゴヌクレオチドを用いることによって、前記ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【００４２】
配列番号１２〜１５に記載の塩基配列で示されたオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ、ネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  ヒラツカエ、ネオサルトリア  パウリステンシス、ネオサルトリア  シュードフィシェリ等のネオサルトリア属に属する菌類、及びアスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列、すなわち可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特定的にハイブリダイズすることができる。
【００４３】
ネオサルトリア属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域をネオサルトリア  グラブラを例として詳細に説明する。上述のように、ネオサルトリア  グラブラのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号２８で示される。このうち、ネオサルトリア属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の１位から１１０位までの領域、１４０位から２１０位までの領域、及び３５０位から３８０位までの領域は真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、属間によって固有の塩基配列を有する領域であることを本発明者らが見い出した。また、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号２９で示される。このうち、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の１位から１１０位までの領域、１４０位から２１０位までの領域、及び３５０位から３８０位までの領域は真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、種間によって固有の塩基配列を有する領域であることを本発明者らが見い出した。
前記（ｌ）及び（ｍ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２８に記載の塩基配列のうち、それぞれ８４位から１０３位まで、１６９位から１８８位までの領域、配列番号２９に記載の塩基配列のうち、それぞれ８３位から１０２位まで、１６６位から１８６位までの領域に対応する。前記（ｎ）及び（ｏ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２８に記載の塩基配列のうち、それぞれ１４４位から１６３位まで、３５８位から３７７位までの領域、配列番号２９に記載の塩基配列のうち、それぞれ１４１位から１６０位まで、３５６位から３７６位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができる。
【００４４】
前記（ｖ）及び（ｗ）で示されるオリゴヌクレオチドはアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
配列番号２２及び配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、アスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列、すなわち可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、アスペルギルス  フミガタスのＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特定的にハイブリダイズすることができるが、ネオサルトリア属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡにはハイブリダイズすることができない。
【００４５】
アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の別の可変領域について説明する。配列番号２９に記載のアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の２０位から５０位までの領域、及び２００位から２３０位までの領域は真菌、特にネオサルトリア属に属する菌類との間で塩基配列の保存性が特に低いことを本発明者らが見い出した。
前記（ｖ）及び（ｗ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２９に記載の塩基配列のうち、それぞれ２３位から４４位まで、２００位から２２２位までの領域に対応する。前記オリゴヌクレオチドはアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることができるが、ネオサルトリア属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡにはハイブリダイズさせることができない。これを図１に基づき詳しく説明する。図１は、配列番号２９〜３３に記載のアスペルギルス  フミガタス、ネオサルトリア  フィシェリ及びネオサルトリア  スピノサのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列の一部を比較した図である。図１に示すように、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子における配列番号２２及び２３のオリゴヌクレオチドが認識する領域と、この領域に対応するネオサルトリア属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の領域とを比較すると、塩基配列の相同性が他の領域と比べて非常に低いことがわかる。したがって、前記（ｖ）及び／又は（ｗ）で示されるオリゴヌクレオチドを用いることにより、被検体に含まれる菌類がネオサルトリア属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタスかを識別することができる。
【００４６】
例えば、前記（ｌ）〜（ｏ）のオリゴヌクレオチドを用いた検出方法により陽性反応を示した試料において、前記（ｖ）及び／又は（ｗ）のオリゴヌクレオチドを用いることにより、当該試料に含まれる菌種を識別・検出することができる。上述のように、前記（ｖ）及び（ｗ）で示されるオリゴヌクレオチドはアスペルギルス  フミガタスのＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特定的にハイブリダイズすることができるが、ネオサルトリア属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡの一部分には、ハイブリダイズすることができない。したがって、被検体に含まれるＤＮＡ又はＲＮＡに前記（ｖ）及び／又は（ｗ）で示されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした場合は被検体に含まれる菌類はアスペルギルス  フミガタス、ハイブリダイズしなかった場合は被検体に含まれる菌類はネオサルトリア属の菌類、と識別することができる。
【００４７】
さらに本発明では、前記（ｌ）〜（ｏ）のオリゴヌクレオチドを用いた検出方法により陽性反応を示した試料において、ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスの発育可能温度帯の違いを利用することにより、又は前記（ｖ）及び／又は（ｗ）のオリゴヌクレオチドを用いることにより、当該試料に含まれる菌種を識別・検出することもできる。
【００４８】
ネオサルトリア属に属する菌類の発育可能温度の上限は約４５℃である。これに対して、アスペルギルス  フミガタスは５０℃以上でも発育が可能である。この発育可能温度帯の違いを利用して、例えば以下のような操作を行うことで菌種を検出することができる。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の前記（ｌ）〜（ｏ）のオリゴヌクレオチドを用いた検出方法により陽性反応を示した試料について、単一コロニーから菌糸をＰＤＡ培地やＰＤＢ培地（ポテトデキストロース液体培地）等に植付け、４８〜５２℃で培養を行う。１〜２日間培養後、菌糸の伸長を確認する。そして、上記発育可能温度帯の違いに基づき、増殖が確認された場合はアスペルギルス  フミガタス、増殖が確認されなかった場合はネオサルトリア属に属する菌類と識別することができる。なお、増殖の確認方法に特に制限はないが、実体顕微鏡による菌糸の伸長、液体培地中での菌糸の伸長、菌塊の形成、分生子の形成が挙げられる。
【００４９】
前記（ｐ）〜（ｕ）ので示されるオリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。したがって、前記オリゴヌクレオチドを用いることによって、前記ハミゲラ属に属する菌類を特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【００５０】
配列番号１６〜２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、ハミゲラ属に属する菌類に特異的な塩基配列、すなわち可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
【００５１】
ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域をハミゲラ  アベラネアを例として詳細に説明する。上述のように、ハミゲラ  アベラネアのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号３４で示される。このうち、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の３５０位から４８０位までの領域、１位から２５位までの領域、及び１８０位から２００位までの領域は真菌の属間で塩基配列の保存性が特に低く、属間によって固有の塩基配列を有することを本発明者らが見い出した。
前記（ｐ）及び（ｑ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号３４に記載の塩基配列のうち、それぞれ３５８位から３７７位まで、４４０位から４５９位までの領域に対応する。前記（ｒ）及び（ｓ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号３４に記載の塩基配列のうち、それぞれ２位から２２位まで、１８１位から２００位までの領域に対応する。また、前記（ｔ）及び（ｕ）で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号３４に記載の塩基配列のうち、それぞれ１７２位から１９１位まで、３９７位から４１６位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、ハミゲラ属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【００５２】
なお、図２に示すように、ハミゲラ  アベラネアのβ−チューブリン遺伝子の３５８位から３７７位まで及び４４０位から４５９位までの領域と相同性の高い領域がクラドスポリウム  クラドスポロイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）等のクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にも存在する。しかし、ハミゲラ  アベラネアのβ−チューブリン遺伝子の１８１位から２００位までの領域と相同性の高い領域はクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子には存在しない。従って、前記（ｐ）〜（ｕ）のオリゴヌクレオチドを組み合わせて用いることで、ハミゲラ属に属する菌類とクラドスポリウム属に属する菌類とを検出することができる。
すなわち、前記（ｓ）、（ｔ）及び（ｕ）のオリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域とハイブリダイズすることができるが、クラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域とハイブリダイズすることができない。そのため、例えば前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチドを用いた検出方法により陽性反応を示した試料について、前記（ｒ）及び（ｓ）で示されたオリゴヌクレオチド及び／又は前記（ｔ）及び（ｕ）で示されたオリゴヌクレオチドを用いることにより当該試料に含まれる菌種がハミゲラ属かクラドスポリウム属であるかを識別することができる。
【００５３】
なお、「クラドスポリウム属に属する菌類」は糸状不完全菌類であり、耐熱性の高い子のう胞子を形成しない。また、住環境や食品工場などに広く分布し、メラニン色素を合成するため、黒色汚れの原因菌である。クラドスポリウム属に属する菌類の例として、クラドスポリウム  クラドスポロイデス、クラドスポリウム  スファエロスファーマム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｈａｅｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）が挙げられる。
【００５４】
本発明の検出方法においては、上記（ａ）〜（ｗ）の検出用オリゴヌクレオチドの内、下記の（ａ１）〜（ｗ１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号１〜２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがより好ましい。
（ａ１）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ１）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ１）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ１）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ１）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｈ１）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｉ１）配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ１）配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ１）配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ１）配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｍ１）配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｎ１）配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｏ１）配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｐ１）配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｑ１）配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｒ１）配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｓ１）配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｔ１）配列番号２０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｕ１）配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｖ１）配列番号２２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｗ１）配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００５５】
後述するように、本発明の検出方法において、上記本発明の検出用オリゴヌクレオチドは核酸プローブ又は核酸プライマーとして好適に用いることができる。
上記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００５６】
本発明で用いられる検出用オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、耐熱性菌類の遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００５７】
本発明においては、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対をビソクラミス属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対として用いることができる。なかでも、前記（ａ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｂ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましく、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがより好ましい。
【００５８】
本発明においては、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、（ｅ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｈ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｈ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｊ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｋ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対をタラロマイセス属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対として用いることができる。なかでも、前記（ｃ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、（ｅ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｈ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｉ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｈ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｊ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｋ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましく、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号７及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号９及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号１０及び配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがより好ましい。
前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムスを特異的に検出することができる。また、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対又は前記（ｊ）及び（ｋ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  バシリスポラスを特異的に検出することができる。さらに、前記（ｇ）及び（ｈ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスを特異的に検出することができる。また、前記（ｉ）及び（ｈ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスを特異的に検出することができる。
【００５９】
本発明においては、前記（ｌ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｍ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｎ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｏ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｖ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｗ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対をネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス検出用オリゴヌクレオチド対として用いることができる。
なかでも、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを検出するためには、前記（ｌ）及び（ｍ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましく、前記（ｌ１）及び（ｍ１）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｎ１）及び（ｏ１）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのがより好ましく、配列番号１２及び配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号１４及び配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがさらに好ましい。  前記（ｌ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｍ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対及び前記（ｎ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｏ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対は、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ、ネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  ヒラツカエ、ネオサルトリア  パウリステンシス、ネオサルトリア  シュードフィシェリ等のネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出に特に好適に用いられる。
また、アスペルギルス  フミガタスを検出するためには、前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましく、前記（ｖ１）及び（ｗ１）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのがより好ましく、配列番号２２及び配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがさらに好ましい。前記（ｖ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｗ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対は、アスペルギルス  フミガタスの検出に好適に用いられる。
【００６０】
本発明においては、前記（ｐ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｑ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｒ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｓ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｔ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｕ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対をハミゲラ属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対として用いることができる。なかでも、前記（ｐ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｑ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｒ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｓ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｔ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｕ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましく、配列番号１６及び配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号１８及び配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号２０及び配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがより好ましい。
前記（ｐ）及び（ｑ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｒ）及び（ｓ）で示されたオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｔ）及び（ｕ）で示されたオリゴヌクレオチド対は、ハミゲラ  アベラネア、ハミゲラ  ストリアータの検出に好適に用いられる。
【００６１】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いて耐熱性菌類の同定を行うには、前記（Ａ）〜（Ｋ）のいずれかの塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた検出用オリゴヌクレオチドを検査対象物より抽出した核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することが好ましい。この場合、前記（Ａ）〜（Ｋ）のいずれかの塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドとしては、上述した本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を用いることができ、好ましい範囲も同様である。
【００６２】
本発明で用いられる検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対は、核酸プローブとして用いることができる。核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。上記核酸プローブは耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡの可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするので、被検体中の耐熱性菌類を迅速かつ簡便に検出することができる。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
このようにして標識化された本発明の検出用オリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することで耐熱性菌類を検出することができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、前述した条件を挙げることができる。また、核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
【００６３】
例えば、前記（ｌ）及び／若しくは（ｍ）で示されるオリゴヌクレオチド、前記（ｎ）及び／若しくは（ｏ）で示されるオリゴヌクレオチド又は前記（ｖ）及び／若しくは（ｗ）で示されるオリゴヌクレオチドを標識化して核酸プローブとすることができる。上記前記（ｌ）及び／若しくは（ｍ）で示されるオリゴヌクレオチド又は前記（ｎ）及び／若しくは（ｏ）で示されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プローブはネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを迅速かつ簡便に検出することができる。また、前記（ｖ）及び／又は（ｗ）で示されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プローブは、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするが、ネオサルトリア属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡにはハイブリダイズできない。したがって、これらのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたかを確認することで、被検体中の菌類がネオサルトリア属に属する菌類であるかアスペルギルス  フミガタスであるかを迅速かつ簡便に識別することができる。
【００６４】
また、本発明で用いられる検出用オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。
【００６５】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いて耐熱性菌類の同定を行うには、前記（Ａ）〜（Ｋ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することも好ましい態様である。この場合、本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を、核酸プライマー及び核酸プライマー対としても用いることができ、好ましい範囲も同様である。なかでも、本発明の検出用オリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いて遺伝子増幅処理を行い、遺伝子の増幅を確認することにより検出することが好ましい。
【００６６】
より詳細には、ビソクラミス属に属する菌類の同定を行うには、前記（Ａ）の塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。この場合、前記（Ａ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）ビソクラミス属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましい。なかでも、前記（ａ）及び／又は（ｂ）のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を、核酸プライマー及び核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ａ１）及び／又は（ｂ１）のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を、核酸プライマー及び核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマー及び核酸プライマー対として用いるのがさらに好ましい。
【００６７】
タラロマイセス属に属する菌類の同定を行うには、前記（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。この場合、前記（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）タラロマイセス属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましい。なかでも、前記（ｃ）〜（ｋ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましく、前記（ｃ１）〜（ｋ１）のいずれかのオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることがより好ましく、配列番号３〜１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。また、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ）及び（ｈ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｉ）及び（ｈ）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｊ）及び（ｋ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｃ１）及び（ｄ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ１）及び（ｈ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｉ１）及び（ｈ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｊ１）及び（ｋ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号７及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号９及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号１０及び配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのがさらに好ましい。
また、検出特異性及び検出感度の点からは、前記（ｉ）及び（ｈ）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｊ）及び（ｋ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｉ１）及び（ｈ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｊ１）及び（ｋ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号９及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号１０及び配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。
【００６８】
ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの同定を行うには、前記（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。この場合、前記（Ｅ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスに固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましい。なかでも、前記（ｌ）〜（ｏ）及び（ｖ）〜（ｗ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いることが好ましく、前記（ｌ１）〜（ｏ１）又は（ｖ１）〜（ｗ１）のいずれかのオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いることがより好ましく、配列番号１２〜１５及び２２〜２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。例えば、前記（ｌ）及び（ｍ）のオリゴヌクレオチド又は前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅処理を行い、遺伝子の増幅を確認することで、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを検出することができる。食品事故で特に問題となるネオサルトリア属に属する菌類を検出するために、前記の方法によりこれらの菌が検出された試料について、さらに（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅処理を行い、遺伝子の増幅を確認することで、ネオサルトリア属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタスかを識別することができる。
また、前記（ｌ）及び（ｍ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｎ）及び（ｏ）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｖ）及び（ｗ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｌ１）及び（ｍ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｎ１）及び（ｏ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｖ１）及び（ｗ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、配列番号１２及び配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号１４及び配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号２２及び配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのがさらに好ましい。
特に、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを検出する場合には、検出特異性及び検出感度の点からは、前記（ｎ）及び（ｏ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｎ１）及び（ｏ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号１４及び配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。アスペルギルス  フミガタスを検出する場合には、検出特異性及び検出感度の点からは、前記（ｖ）及び（ｗ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｖ１）及び（ｗ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号２２及び配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。
【００６９】
ハミゲラ属に属する菌類の同定を行うには、前記（Ｋ）の塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。この場合、前記（Ｋ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）ハミゲラ属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましい。なかでも、前記（ｐ）〜（ｕ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを、核酸プライマー及び核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｐ１）〜（ｕ１）のいずれかのオリゴヌクレオチドを、核酸プライマー及び核酸プライマー対として用いることが好ましく、配列番号１６〜２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。例えば、前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅処理を行い、遺伝子の増幅を確認することでハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を検出することができる。食品事故で特に問題となるハミゲラ属に属する菌類を検出するために、前記の方法によりこれらの菌が検出された試料について、さらに前記（ｒ）及び（ｓ）のオリゴヌクレオチド又は前記（ｔ）及び（ｕ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅処理を行い、遺伝子の増幅を確認することで、ハミゲラ属に属する菌類かクラドスポリウム属に属する菌類かを識別することができる。
また、前記（ｐ）及び（ｑ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｒ）及び（ｓ）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｔ）及び（ｕ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｐ１）及び（ｑ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｒ１）及び（ｓ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｔ１）及び（ｕ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、配列番号１６及び配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号１８及び配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号２０及び配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがさらに好ましい。
特に、検出特異性の点からは、前記（ｒ）及び（ｓ）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｔ）及び（ｕ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのが好ましく、前記（ｒ１）及び（ｓ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｔ１）及び（ｕ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのがより好ましく、配列番号１８及び配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号２０及び配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。検出感度の点からは、前記（ｔ）及び（ｕ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのが好ましく、前記（ｔ１）及び（ｕ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのがより好ましく、配列番号２０及び配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。
【００７０】
本発明の核酸プライマーは、前記オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとして用いることもできるし、前記オリゴヌクレオチドを標識物で標識化して核酸プライマーとして用いることができる。標識物及び標識方法の例としては、核酸プローブの場合と同様のものが挙げられる。
【００７１】
本発明において、遺伝子増幅処理はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行うことが好ましい。ＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、ビソクラミス属に属する菌類を検出する場合には、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５９〜６１℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。タラロマイセス属に属する菌類を検出する場合には、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９７℃で約１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５〜６１℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。前記（ｌ）及び（ｍ）オリゴヌクレオチド又は前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチドを用いてネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを検出する場合には、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５９〜６１℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチドを用いてネオサルトリア属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタスかを検出する場合は、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５９〜６１℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを３０〜３５サイクル行う。前記（ｐ）及び（ｑ）で示されるオリゴヌクレオチドを用いてハミゲラ属に属する菌類を検出する場合には、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を約５９〜６３℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。前記（ｒ）及び（ｓ）で示されるオリゴヌクレオチド又は前記（ｔ）及び（ｕ）で示されるオリゴヌクレオチドを用いてハミゲラ属に属する菌類を検出する場合には、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を約５９〜６３℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。
【００７２】
本発明において、遺伝子断片の増幅の確認は通常の方法で行うことができる。例えば遺伝子増幅反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオチドを取り込ませる方法、ＰＣＲ反応産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、ＰＣＲ反応産物の塩基配列を解読する方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間に蛍光物質を入り込ませ発光させる方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
【００７３】
配列番号２４に記載の塩基配列において、３３位から１７８位までの塩基数は１４６塩基である。したがって、被検体にビソクラミス属に属する菌類が含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、ビソクラミス属に属する菌類に特異的な約１５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、ビソクラミス属に属する菌類を検出、識別することができる。
【００７４】
配列番号２５に記載の塩基配列において、１５位から９８位までの塩基数は８３塩基、配列番号２６に記載の塩基配列において１３３位から３２５位までの塩奇数は１９２塩基である。また、配列番号２７に記載の塩基配列において、３２６位から４７８位までの塩基数は１５２塩基である。したがって、被検体にタラロマイセス  フラバス及び／又はタラロマイセス  トラキスペルムスが含まれる場合、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約８０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。また、被検体にタラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー及び／又はタラロマイセス  バシリスポラスが含まれる場合、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約２００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。さらに、被検体にタラロマイセス  マクロスポラス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  フラバス及び／又はタラロマイセス  トラキスペルムスが含まれる場合、前記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約１５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。被検体にタラロマイセス  マクロスポラス、タラロマイセス  フラバス及び／又はタラロマイセス  トラキスペルムスが含まれる場合、前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約１５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、タラロマイセス属に属する菌類を検出、識別することができる。なお、被検体にタラロマイセス  ウォルトマンニーが含まれる場合、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対と、前記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対とを同時に用いると、約２００ｂｐと約１５０ｂｐの２本のバンドが確認される。
【００７５】
被検体にネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスが含まれる場合、前記（ｌ）及び（ｍ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約１００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。また、前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約２００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを検出、検出することができる。
さらに、被検体にアスペルギルス  フミガタスが含まれる場合、前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約２００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。しかし、ネオサルトリア属に属する菌類が含まれる場合、前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行っても、ＤＮＡ断片の増幅が認められない。従って、前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行うことにより、アスペルギルス  フミガタスのみを検出することができる。
【００７６】
遺伝子増幅の確認について、前記（ｐ）及び（ｑ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた場合、配列番号３４に記載の塩基配列において、３５８位から４５９位までの塩基数は約１００塩基である。したがって、被検体にハミゲラ属に属する菌類が含まれる場合、前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約１００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。
配列番号３４に記載の塩基配列において、２位から２００位までの塩基数は約２００塩基である。また、前記（ｔ）及び（ｕ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた場合、配列番号３４に記載の塩基配列において、１７２位から４１６位までの塩基数は２４５塩基である。したがって、被検体にハミゲラ属に属する菌類が含まれる場合、前記（ｒ）及び（ｓ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｔ）及び（ｕ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、この菌類に特異的な約２００ｂｐ又は約２４０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、ハミゲラ属に属する菌類を検出、検出することができる。
【００７７】
本発明の検出方法において、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを同時に用いてタラロマイセス属に属する菌類を検出することも好ましい態様である。複数のオリゴヌクレオチド対を組み合わせて用いることで、タラロマイセス属に属する菌類を網羅的に検出することができる。なかでも、前記（ｃ１）及び（ｄ１）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ１）及び（ｈ１）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｉ１）及び（ｈ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｅ１）及び（ｆ１）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｊ１）及び（ｋ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがより好ましく、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号９及び８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号１０及び１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
具体的には、上述したように前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムスを特異的に検出することができる。また、前記（ｅ）及び（ｆ）、又は前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  バシリスポラスを特異的に検出することができる。さらに、前記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  マクロスポラスを特異的に検出することができる。また、前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスを特異的に検出することができる。したがって、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対と、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対とを組み合わせて用いることにより、食品事故で特に問題となるタラロマイセス属に属する菌類を網羅的に検出することができる。
特に、検出感度の点からは、前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組み合わせて用いることが好ましく、前記（ｉ１）及び（ｈ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と前記（ｊ１）及び（ｋ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組み合わせて用いることがより好ましく、配列番号９及び８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号１０及び１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
なお、本発明において、「同時に用いて遺伝子増幅処理工程を行う」とは、２つのオリゴヌクレオチド対を混合し、混合したものを１の反応系にプライマーとして添加して前述のような遺伝子増幅処理工程を行うことを意味する。２つのオリゴヌクレオチド対を同時に用いることで、タラロマイセス属に属する菌類をより迅速かつ網羅的に検出することができる。２つのオリゴヌクレオチド対の混合比は特に制限はないが、１：１〜１：２が好ましい。
【００７８】
本発明の検出方法においては、前記（ｌ）及び（ｍ）で示されたオリゴヌクレオチド対並びに／又は前記（ｎ）及び（ｏ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｖ）及び（ｗ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることも好ましい態様である。前述したように、前記（ｌ）及び（ｍ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｎ）及び（ｏ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法はネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを、前記（ｖ）及び（ｗ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法はアスペルギルス  フミガタスをそれぞれ検出することができるため、これらの方法を組合わせることにより被検体から検出された菌類がネオサルトリア属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタスであるかを識別することができる。なかでも、前記（ｌ１）及び（ｍ１）で示されたオリゴヌクレオチド対並びに／又は前記（ｎ１）及び（ｏ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｖ１）及び（ｗ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがより好ましく、配列番号１２及び１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対並びに／又は配列番号１４及び１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号２２及び２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
特に、検出感度の点からは、前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組み合わせて用いることが好ましく、前記（ｎ１）及び（ｏ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｖ１）及び（ｗ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組み合わせて用いることがより好ましく、配列番号１４及び１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号２２及び２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
【００７９】
本発明の検出方法においては、前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｒ）及び（ｓ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｔ）及び（ｕ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることも好ましい態様である。これらの方法を組合わせることにより被検体からハミゲラ属に属する菌類のみを特異的に検出することができる。すなわち、これらの方法を組合わせることにより被検体から検出された菌類がハミゲラ属かクラドスポリウム属であるかを識別することができる。ハミゲラ属に属する菌類はマイコトキシン（カビ毒）を生産しないので、両属の検出によりマイコトキシンのリスク予測が可能となる。また、両属は耐熱性が異なるため、属の違いを検出することにより、菌体の混入が加熱前なのか否かの予想を立てることができるため、殺菌工程の見直しや容器の機密性の確認など原因解明に生かすことが出来る。なかでも、前記（ｐ１）及び（ｑ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｒ１）及び（ｓ１）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｔ１）及び（ｕ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがより好ましく、配列番号１６及び１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号１８及び１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対又は配列番号２０及び２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
特に、検出感度の点からは、前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｔ）及び（ｕ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることが好ましく、前記（ｐ１）及び（ｑ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｔ１）及び（ｕ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがより好ましく、配列番号１６及び１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号２０及び２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
【００８０】
次に、本発明の耐熱性菌類の検出方法の一実施態様について具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８１】
１）事故原因菌解析
耐熱性菌により汚染事故を引き起こす可能性がある飲食品としては、糖類や蛋白質を含むために強い条件で殺菌ができない飲食品が挙げられる。このような飲食品としては、果実、果汁等の農産物や乳等の畜産物を原料等する飲食品が挙げられる。
事故を引き起こした飲料等より検出された菌糸からＤＮＡを回収する。その後、耐熱性菌検出用プライマーを用いてＰＣＲ反応等の遺伝子増幅処理を行う。例えば、前記（ａ）及び（ｂ）で示されるオリゴヌクレオチド対、前記（ｔ）及び（ｕ）で示されるオリゴヌクレオチド対、前記（ｎ）及び（ｏ）で示されるオリゴヌクレオチド対、前記（ｉ）及び（ｈ）で示されるオリゴヌクレオチド対並びに、前記（ｊ）及び（ｋ）で示されるオリゴヌクレオチド対を用いてＰＣＲ反応等の遺伝子増幅処理を行う。遺伝子増幅処理後電気泳動を行い、反応産物の有無を確認する。これと同時に、回収した菌体の一部をクロラムフェニコール加ＰＤＡに接種し、５０℃で培養する。
ネオサルトリア属に属する菌類検出用プライマー（前記（ｎ）及び（ｏ）で示されるオリゴヌクレオチド対）を用いた系で反応産物が確認された場合、５０℃で培養した菌糸の伸長を確認し、ネオサルトリアであるかアスペルギルス  フミガタスであるのかを確認する。又は、ネオサルトリアとアスペルギルス  フミガタス検出用オリゴヌクレオチドを用いて検出を行う。例えば、前記（ｖ）及び（ｗ）で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、約２００ｂｐの反応産物が認められた場合はアスペルギルス  フミガタス、反応産物が認められなかった場合はネオサルトリア属に属する菌類が陽性であると判定する。
ビソクラミス属に属する菌類検出用プライマー（前記（ａ）及び（ｂ）で示されるオリゴヌクレオチド対）を用いた系で反応産物が確認された場合、ビソクラミス属に属する菌類が陽性であると判定する。
ハミゲラ属に属する菌類検出用プライマー（前記（ｔ）及び（ｕ）で示されるオリゴヌクレオチド対）を用いた系で反応産物が確認された場合、ハミゲラ属に属する菌類が陽性であると判定する。
タラロマイセス属に属する菌類検出用プライマー（前記（ｊ）及び（ｋ）で示されるオリゴヌクレオチド対及び／又は前記（ｉ）及び（ｈ）で示されるオリゴヌクレオチド対）を用いた系で反応産物が確認された場合、タラロマイセス属に属する菌類が陽性であると判定する。
耐熱性菌類は熱殺菌条件でも生存することから、原料及び工程より耐熱性菌類が混入した可能性が極めて高い。そのため、耐熱性菌類陽性の場合は、原料及び製造環境の清浄度の精査が必要となる。逆に耐熱性菌類が陰性である場合は、殺菌不良あるいは殺菌後の混入が原因であるので、殺菌工程の見直しや容器の機密性の確認を行う必要がある（原因究明）。
【００８２】
２）原料の微生物検査
通常の原料の菌類の検査は、一般菌類（検体をヒートショック処理しない）と耐熱性菌類（検体をヒートショックする）の２つの試験が必要となる。しかしながら、本発明によれば、検体をヒートショック処理する必要がなくなる。すなわち、一般菌類だけの検査を行い、菌糸が確認された場合はその菌糸を用いて上記１）の方法により耐熱性菌類であるか否かの判断を行うことができる。従来の方法では、通常耐熱性菌類検出に７日間程度が必要であったが、本発明によれば、通常３日間程度の菌糸確認後、２日以内での検出が可能であり、２日間検出を早めることが可能となる。また、従来の方法では、熱性菌類検出後菌種の同定に更に約７日間必要とするが、本発明の方法では、検出と同時に属レベルの同定を行うことができる。
【００８３】
本発明の耐熱性菌類の検出方法において、被検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
被検体からＤＮＡを調製する方法としては、耐熱性菌類の検出を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、通常の方法や市販の調製用キットを用いることができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００８４】
本発明の耐熱性菌類の検出方法によれば、被検体の調製工程から菌類の検出工程までを約５〜１２時間という短時間で行うことが可能である。
【００８５】
また、本発明の耐熱性菌類識別用キットは、下記の区分（１）〜（４）のオリゴヌクレオチド対から選ばれ、かつ互いに異なる群から選ばれた少なくとも２対のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして含有するものである。
（１）前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対
（２）前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、並びに前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対からなる群
（３）前記（ｌ）及び（ｍ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチド対、並びに前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチド対からなる群
（４）前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｒ）及び（ｓ）のオリゴヌクレオチド対、並びに前記（ｔ）及び（ｕ）のオリゴヌクレオチド対からなる群
本発明の耐熱性菌類識別用キットは、前記（１）〜（４）の各区分から選ばれたオリゴヌクレオチド対を、各区分につき少なくとも１対ずつ含有するのが好ましい。また、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、並びに前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対が核酸プライマーとして含まれていることも好ましい態様である。また、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｉ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｔ）及び（ｕ）のオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチド対が核酸プライマーとして含まれていることも好ましい態様である。
このキットは、耐熱性菌類の検出、識別方法に用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出、識別に通常用いられる物質を含有する。このキットには、本発明の検出用オリゴヌクレオチド対によって遺伝子増幅反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の検出用オリゴヌクレオチドにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
【実施例】
【００８６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８７】
実施例１
（Ａ−１）ビソクラミス属に属する菌類の検出、識別
１．βチューブリン部分長の塩基配列決定
下記の方法によりビソクラミス属各種のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。ポテトデキストロース寒天斜面培地にて３０℃、７日間、暗所培養したビソクラミス属菌体からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ（株）社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD製）を用いて、プライマーとしてBt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：配列番号３５）、Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：配列番号３６）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を使用した。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度９５℃、アニーリング温度５９℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto  SegTM  G−50（Amersham  Pharmacia  Biotech社製）を使用し精製した。ＰＣＲ産物は、BigDye  terminator  Ver.  1.1（商品名：Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetiｃ  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC  Ver.4”（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定したビソクラミス  ニベアや各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、ビソクラミス属に属する菌類に特異的な塩基配列を含有するβ−チューブリン遺伝子の中の特定領域（配列番号２４）を決定した。
【００８８】
２．ビソクラミス属に属する菌類の検出及び属レベルでの同定
（１）プライマーの設計
上記で得られたビソクラミス属に属する菌類に特異的な塩基配列領域のうち、３’末端側でタラロマイセス属に属する菌類の特異性が特に高い領域から、１）属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして１組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるビソクラミス属検出及び属同定の有効性を検討した。すなわち、ビソクラミス属ＤＮＡを鋳型とした反応では約１５０ｂｐにＤＮＡ増幅反応が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、ビソクラミス  ニベア及びビソクラミス  ファルバで特異的に約１５０ｂｐにＤＮＡ増幅が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認めらかった。この結果より、ビソクラミス属の網羅的な検出、すなわちビソクラミス属の属レベルでの同定が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【００８９】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちビソクラミス属とその他の耐熱性カビ及び一般カビとしては、表１及び表２に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて指摘温度、すなわち一般カビは２５℃、耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃で７日間培養した。
【００９０】
【表１】
2010004876.tif 000002
【００９１】
【表２】
2010004876.tif 000003
【００９２】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【００９３】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるプライマー（０．０２ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるプライマー（０．０２ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００９４】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図３（ａ）及び図３（ｂ）に示す。なお、図３（ａ）は表１に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図３（ｂ）は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ビソクラミス属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含む試料（図３（ｂ）の１〜４レーン）では、１５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ビソクラミス属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明ののオリゴヌクレオチドを用いることによって、ビソクラミス属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【００９５】
（Ａ−２）ビソクラミス属に属する菌類の検出、識別
（１）プライマーの調製
実施例１（Ａ−１）で設計した、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００９６】
（２）検体の調製
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドのビソクラミス属に属する菌類に対する検出特異性を確かめるために、図４に示すビソクラミス  ファルバの各菌株及び図５に示すビソクラミス  ニベアの各菌株を使用した。これらの菌類は独立行政法人製品製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ番号で管理されているもの及びThe  Centraalbureau  voor  SchimmelculturesによりＣＢＳ番号で管理されているもの等を入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて３０℃で７日間培養した。
【００９７】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【００９８】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるプライマー（０．０２ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるプライマー（０．０２ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００９９】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から４μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図４及び図５に示す。なお、図４はビソクラミス  ファルバの各菌株の試料についての電気泳動図を示し、図５はビソクラミス  ニベアの各菌株の試料についての電気泳動図を示す。
その結果、使用したビソクラミス  ファルバ及びビソクラミス  ニベアの全ての菌株において、特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくビソクラミス属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
【０１００】
（Ｂ−１）タラロマイセス属に属する菌類の検出、識別
１．タラロマイセス属に属する菌類に特異的な塩基配列の解析
下記の方法によりタラロマイセス属各種のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定した。ポテトデキストロース寒天斜面培地にて２５℃、７日間、暗所培養したタラロマイセス属菌体からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ（株）社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD製）を用いて、プライマーとして、βチューブリンの部分長に関してはBt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：配列番号３５）、Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：配列番号３６）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を使用し、２８ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域はNL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’：配列番号３７）とNL4（５’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’：配列番号３８)（The  fungal  homorph：Mitotic  and  plemorphic  speciation  in  fungal  systematics.，Wallingford：CAB  international．）を用いた。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度９５℃、アニーリング温度５９℃、伸長温度７２℃、３５サイクル、２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域は編成温度９５℃、アニーリング温度５５℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto  SegTM  G−50（Amersham  Pharmacia  Biotech社製）を使用し精製した。ＰＣＲ産物は、BigDye  terminator  Ver.  1.1（商品名：Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetiｃ  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC  Ver.4”（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定した各種菌類（タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー）のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列情報、及び各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、タラロマイセス属に属する菌類に特異的な塩基配列を含有するβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の中の特定領域（配列番号２５〜２７）を決定した。
【０１０１】
２．タラロマイセス属に属する菌類の検出及び属レベルでの同定
（１）プライマーの設計
上記で得られたタラロマイセス属に属する菌類に特異的な塩基配列領域（配列番号２５〜２７）のうち、３’末端側でタラロマイセス属に属する菌類の特異性が特に高い領域から、１）属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にしてβチューブリン遺伝子に関しては５組のプライマー対を、２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域に関しては５組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるタラロマイセス属検出及び属同定の有効性を検討した。その結果、βチューブリン遺伝子のプライマーのうち５組中１組でタラロマイセス  フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）及びタラロマイセス  トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）で特異的に、設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅が認められた。有効性が確認できたプライマー対は配列番号３及び４である。
続いて複数のプライマー対を組み合わせることによりタラロマイセス属の網羅的な検出、すなわちタラロマイセス属ＤＮＡを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅反応が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、βチューブリンのプライマー５組中２組のプライマー対と２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域のプライマー５組中２組のプライマー対を混合して用いることによりタラロマイセス属の網羅的な検出、すなわちタラロマイセス属の属レベルでの同定が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号５〜１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【０１０２】
（２）検体の調製
設計したプライマーの特異性の評価に用いる真菌類、すなわちタラロマイセス属とその他の耐熱性カビ及び一般カビとしては、表３に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて指摘温度、すなわち一般カビは２５℃、耐熱性カビは３０℃で７日間培養した。
【０１０３】
【表３】
2010004876.tif 000004
【０１０４】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１０５】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号３に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【０１０６】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図６に示す。
その結果、タラロマイセス  フラバス及びタラロマイセス  トラキスペルムスのゲノムＤＮＡを含む試料（１レーン及び２レーン）では、８０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、タラロマイセス属に属する菌のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いることによって、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【０１０７】
（Ｂ−２）タラロマイセス属に属する菌類の検出、識別
（１）プライマーの調製
実施例１（Ｂ−１）で設計した、配列番号５から８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１０８】
（２）検体の調製
タラロマイセス属に属する菌類としては、タラロマイセス  フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、タラロマイセス  トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）、タラロマイセス  ウォルトマンニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）、及びタラロマイセス  ルテウス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌｕｔｅｕｓ）を使用した。前記（ｅ）から（ｈ）のオリゴヌクレオチドのタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確かめるために、表４及び表５に示す菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて３０℃で７日間培養した。
【０１０９】
【表４】
2010004876.tif 000005
【０１１０】
【表５】
2010004876.tif 000006
【０１１１】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１１２】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）２５μｌ、無菌蒸留水２０μｌを混合し、配列番号５に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌ、配列番号６に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌ、配列番号７に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌ、及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌを加え、５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９７℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【０１１３】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図７（ａ）、図７（ｂ）及び図８に示す。なお、図７（ａ）は表４に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図７（ｂ）は表５に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。図８はタラロマイセス属に属する菌類の試料のみの電気泳動図を示す。
その結果、タラロマイセス属に属する菌類のうちタラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムス又はタラロマイセス  ウォルトマンニーのゲノムＤＮＡを含む試料（図７（ａ）の１〜２及び５〜８レーン、並びに図７（ｂ）の１〜２及び５〜８レーン）では、１５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。この遺伝子断片は配列番号７及び配列番号８の塩基配列で表されるプライマーを用いたことで増幅されたものである。また、タラロマイセス  ウォルトマンニー又はタラロマイセス  ルテウスのゲノムＤＮＡを含む試料（図７（ａ）の３〜４及び７〜８レーン、並びに図７（ｂ）の３〜４及び７〜８レーン）では、２００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。この遺伝子断片は配列番号５及び配列番号６の塩基配列で表されるプライマーを用いたことで増幅されたものである。一方、タラロマイセス属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド及び前記（ｇ）及び（ｈ）を同時に用いることによって、タラロマイセス属に属する菌類を特異的にかつ網羅的に検出することができる。
【０１１４】
（Ｂ−３）タラロマイセス属に属する菌類の検出、識別
（１）プライマーの調製
実施例１（Ｂ−１）で設計した、配列番号８及び９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１１５】
（２）検体の調製
前記（ｈ）及び（ｉ）のオリゴヌクレオチドの検出特異性を確かめるために、表６に示すタラロマイセス属に属する菌類及びその他の菌類を使用した。これらの菌類は独立行政法人製品製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ番号で管理されているもの及びThe  Centraalbureau  voor  SchimmelculturesによりＣＢＳ番号で管理されているもの等、真菌の供託機関より分譲された株を入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いてタラロマイセス属を含む耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃で７日間、その他の一般カビは２５℃で７日間培養した。
【０１１６】
【表６】
2010004876.tif 000007
【０１１７】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１１８】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号９に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９５℃、１分間の熱変性反応、（ｉｉ）５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【０１１９】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図９−１に示す。図中の番号は表６記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、タラロマイセス属に属する菌類のうち、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  マクロスポラス及びタラロマイセス  トラキスペルムスのゲノムＤＮＡを含む試料（１〜３レーン）についてのみ、１５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、タラロマイセス属に属する菌のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、タラロマイセス属に属する菌類のうち、特定の菌種のみを特異的に検出することができることがわかる。
【０１２０】
（Ｂ−４）タラロマイセス属に属する菌類の検出、識別
（１）プライマー
実施例１（Ｂ−１）で設計した、配列番号１０及び１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１２１】
（２）検体の調製
前記（ｊ）及び（ｋ）のオリゴヌクレオチドの検出特異性を確かめるために、実施例１（Ｂ−３）の表６と同様のタラロマイセス属に属する菌類及びその他の菌類を使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いてタラロマイセス属を含む耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃で７日間、その他の一般カビは２５℃で７日間培養した。
【０１２２】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１２３】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１０に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１１に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９５℃、１分間の熱変性反応、（ｉｉ）５５℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【０１２４】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図９−２に示す。図中の番号は表６記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、タラロマイセス属に属する菌類のうち、タラロマイセス  バシリスポラス、タラロマイセス  ウォルトマンニー及びタラロマイセス  ルテウスのゲノムＤＮＡを含む試料（４〜６レーン）についてのみ、２００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、タラロマイセス属に属する菌のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、タラロマイセス属に属する菌類のうち、特定の菌種のみを特異的に検出することができることがわかる。
【０１２５】
（Ｂ−５）タラロマイセス属に属する菌類の検出、識別
（１）プライマーの調製
実施例１（Ｂ−１）で設計した、配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１２６】
（２）検体の調製
前記（ｇ）及び（ｈ）のオリゴヌクレオチドのタラロマイセス属に属する菌類に対する検出特異性を確かめるために、図１０に示すタラロマイセス  フラバスの各菌株及び図１１に示すタラロマイセス  マクロスポラスの各菌株を使用した。これらの菌類は独立行政法人製品製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ番号で管理されているもの及びThe  Centraalbureau  voor  SchimmelculturesによりＣＢＳ番号で管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【０１２７】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１２８】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号７に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９５℃、１分間の熱変性反応、（ｉｉ）６１℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【０１２９】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から４μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図１０及び図１１に示す。
その結果、使用したタラロマイセス  フラバス及びタラロマイセス  マクロスポラスの全ての菌株において、特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくタラロマイセス属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
【０１３０】
（Ｃ−１）ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出、識別
１．βチューブリン部分長の塩基配列決定
下記の方法によりネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。ポテトデキストロース寒天斜面培地にて３０℃で７日間、暗所培養した。菌体からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ（株）社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD製）を用いて、プライマーとしてBt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：配列番号３５）、Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：配列番号３６）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を使用した。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度９５℃、アニーリング温度５９℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto  SegTM  G−50（Amersham  Pharmacia  Biotech社製）を使用し精製した。ＰＣＲ産物は、BigDye  terminator  Ver.  1.1（商品名：Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetiｃ  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC  Ver.4”（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定したネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報、及び各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列を含有するβ−チューブリン遺伝子の中の特定領域（配列番号２８〜３３）を決定した。
【０１３１】
２．ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出
（１）プライマーの設計
上記で得られたネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列領域のうち、３’末端側で両菌の保存性が特に高い領域から、１）属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして４組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるネオサルトリア属とアスペルギルス  フミガタスの一括検出の有効性を検討した。すなわち、ネオサルトリア属及びアスペルギルス  フミガタスのＤＮＡを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅反応が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、２組のプライマー対でネオサルトリア属及びアスペルギルス  フミガタスに特異的にＤＮＡ増幅が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認めらかった。この結果より、２組のプライマー対がネオサルトリア属とアスペルギルス  フミガタスの一括検出が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号１２及び１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対及び配列番号１４及び１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【０１３２】
（２）検体の調製
ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスとしては、表７に記載の菌類を使用した。前記（ｌ）及び（ｍ）のオリゴヌクレオチドのこれらの菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確かめるために、表７に示す菌類も使用した。なお、これらの菌株は独立行政法人理化学研究所がＪＣＭナンバーで管理する菌株や東京大学分子細胞生物学研究所がＩＡＭナンバーで管理する菌株及び独立行政法人製品評価技術基盤機構がＩＦＯナンバーで管理する財団法人醗酵研究所菌由来の株を入手し、評価に使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：ＰＤＡ培地（パールコア  ポテトデキストロース寒天培地）、栄研化学株式会社製）を用いて耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃、その他一般カビは２５℃で７日間培養した。
【０１３３】
【表７】
2010004876.tif 000008
【０１３４】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１３５】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１２に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１３に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９８℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【０１３６】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図１２に示す。
その結果、ネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスのゲノムＤＮＡを含む試料（１、２及び７レーン）では、１００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのいずれのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、前記（ｌ）及び（ｍ）のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができる。
【０１３７】
（６）ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスの発育温度差を用いた識別
上記方法により遺伝子断片の増幅が確認された検体について、単一コロニーから菌糸をＰＤＡ培地（商品名：ポテトデキストロース培地、栄研化学株式会社製）に植菌し、５０℃で１日間培養し、実体顕微鏡による菌糸の確認法により観察した。その結果、アスペルギルス  フミガタスを植菌した試料では活発な菌糸の成長が認められたが、ネオサルトリア属に属する菌類を植菌した試料では菌糸の成長が認められなかった。この結果から、発育可能温度帯の違いを利用して、ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスとを識別することができた。
【０１３８】
（Ｃ−２）ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出、識別
（１）プライマーの調製
実施例１（Ｃ−１）で設計した、配列番号１４及び１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１３９】
（２）検体の調製
ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスとしては、表８及び表９に記載の菌類を使用した。前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチドのネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確かめるために、表８及び表９に示すその他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、ナンバリングにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃、その他一般カビは２５℃で７日間培養した。
【０１４０】
【表８】
2010004876.tif 000009
【０１４１】
【表９】
2010004876.tif 000010
【０１４２】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１４３】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１４に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１５に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９７℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【０１４４】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図１３（ａ）及び図１３（ｂ）に示す。なお、図１３（ａ）は表８に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図１３（ｂ）は表９に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのゲノムＤＮＡを含む試料では、２００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのいずれのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができる。
【０１４５】
（６）ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスの発育温度差を用いた識別
上記方法により遺伝子断片の増幅が確認された検体について、単一コロニーから菌糸をＰＤＡ培地（商品名：ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）に植菌し、５０℃で１日間培養し、実体顕微鏡により菌糸の伸長を観察した。その結果、アスペルギルス  フミガタスを植菌した試料では活発な菌糸の成長が認められたが、ネオサルトリア属に属する菌類を植菌した試料では菌糸の成長が認められなかった。この結果から、発育可能温度帯の違いを利用して、ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスとを識別することができた。
【０１４６】
（Ｃ−３）前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチドを用いたネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスの識別
（１）アスペルギルス  フミガタス検出用プライマーの設計
配列番号２８〜３３に示したネオサルトリア  グラブラ、アスペルギルス  フミガタス、ネオサルトリア  フィシェリ及びネオサルトリア  スピノサのβチューブリン遺伝子の塩基配列のアライメント解析（ＤＮＡsis  Ｐｒｏ)を用いて両種の塩基配列の差が存在する領域を決定した。決定した領域の中でアスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列部位のうち、３’末端側で両菌の保存性が特に高い領域から、１）アスペルギルス  フミガタス固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして２組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるネオサルトリア属とアスペルギルス  フミガタスの識別の有効性を検討した。すなわち、アスペルギルス  フミガタスのＤＮＡを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅反応が認められ、ネオサルトリア属のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、１組のプライマー対でアスペルギルス  フミガタスに特異的にＤＮＡ増幅が認められ、その他の菌類のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められなかった。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号２２及び２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【０１４７】
（２）検体の調製
ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスとしては、表１０及び表１１に記載の菌類を使用した。また、参考として、表１０及び表１１に示すネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス以外の菌類も使用した。菌株は千葉大学真菌医学研究センターが保存し、ナンバリングにより管理をしている株を入手し、試験に用いた。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃、その他一般カビは２５℃で７日間培養した。
【０１４８】
【表１０】
2010004876.tif 000011
【０１４９】
【表１１】
2010004876.tif 000012
【０１５０】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１５１】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号２２に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２３に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【０１５２】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２．５μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図１４及び図１５に示す。なお、図１４は表１０に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図１５は表１１に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
図１４及び図１５で示すように、アスペルギルス  フミガタスのゲノムＤＮＡを含む試料でのみ約２００ｂｐの増幅断片がはっきりと確認された。これに対して、ネオサルトリア属の菌類を含む他の菌類のゲノムＤＮＡを含む試料では、約２００ｂｐの増幅断片は確認されなかった。
この結果から、前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子増幅処理を行い、増幅産物の有無を確認することにより、アスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができる。
【０１５３】
（Ｃ−４）ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出、識別
（１）プライマーの調製
実施例（Ｃ−１）及び（Ｃ−３）で設計した、配列番号１４〜１５及び２２〜２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１５４】
（２）検体の調製
前記（ｎ）及び（ｏ）のオリゴヌクレオチドのネオサルトリア属に属する菌類に対する検出特異性、及び前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチドのアスペルギルス  フミガタスに対する検出特異性を確かめるために、図１６に示すネオサルトリア  フィシェリの各菌株、図１７に示すネオサルトリア  グラブラの各菌株、図１８に示すネオサルトリア  ヒラツカエの各菌株、図１９に示すネオサルトリア  パウリステンシスの各菌株、及び図２０に示すネオサルトリア  スピノサの各菌株を使用した。また、前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチドを用いた反応系のポジティブコントロールとして、アスペルギルス  フミガタスを使用した。なお、これらの菌類は独立行政法人製品製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ番号で管理されているもの及びThe  Centraalbureau  voor  SchimmelculturesによりＣＢＳ番号で管理されているもの等、真菌の供託機関から入手したもの及び千葉大学真菌医学研究センターで保存しＩＦＭナンバーで管理された株等を入手し、供試菌として使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃、その他一般カビは２５℃で１４日間培養した。
【０１５５】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１５６】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１４に記載の塩基配列で表されるプライマー（０．０２ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１５に記載の塩基配列で表されるプライマー（０．０２ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号２２に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２３に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌに変更した以外は上記と同様にしてＰＣＲ反応溶液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【０１５７】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から４μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図１６〜図２０に示す。なお、図１６はネオサルトリア  フィシェリの各菌株の試料についての電気泳動図を示し、図１７はネオサルトリア  グラブラの各菌株の試料についての電気泳動図を示し、図１８はネオサルトリア  ヒラツカエの各菌株の試料についての電気泳動図を示し、図１９はネオサルトリア  パウリステンシスの各菌株の試料についての電気泳動図を示し、及び図２０はネオサルトリア  スピノサの各菌株の試料についての電気泳動図を示す。
その結果、配列番号１４及び１５に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系においては、使用したネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  ヒラツカエ、ネオサルトリア  パウリステンシス及びネオサルトリア  スピノサの全ての菌株において、特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された（図１６(ａ)、図１７(ａ)、図１８(ａ)、図１９(ａ)、図２０(ａ)）。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくネオサルトリア属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
配列番号２２及び２３に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系においては、アスペルギルス  フミガタスのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた試料のみ特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された。一方、ネオサルトリア属の各菌株を用いた試料では、いずれもＤＮＡ断片の増幅は確認されなかった（図１６(ｂ)、図１７(ｂ)、図１８(ｂ)、図１９(ｂ)、図２０(ｂ)）。したがって、前記（ｖ）及び（ｗ）のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子増幅処理を行い、増幅産物の有無を確認することにより、アスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができることがわかる。
【０１５８】
（Ｄ−１）ハミゲラ属に属する菌類の検出、識別
１．βチューブリン部分長の塩基配列決定
下記の方法によりハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。ポテトデキストロース寒天斜面培地にてハミゲラ  アベラネアは３０℃、クラドスポリウム  クラドスポロイデスは２５℃で７日間、暗所培養した。菌体からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ（株）社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD製）を用いて、プライマーとしてBt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：配列番号３５）、Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：配列番号３６）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を使用した。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度９５℃、アニーリング温度５９℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto  SegTM  G−50（Amersham  Pharmacia  Biotech社製）を使用し精製した。ＰＣＲ産物は、BigDye  terminator  Ver.  1.1（商品名：Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetiｃ  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC  Ver.4”（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定したハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報、及び各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、ハミゲラ属に属するハミゲラ  アベラネアに特異的な塩基配列を含有するβ−チューブリン遺伝子の中の特定領域（配列番号３４）を決定した。
【０１５９】
２．ハミゲラ属に属する菌類に属する菌類の検出
（１）プライマーの設計
上記で得られたハミゲラ  アベラネアに特異的な塩基配列領域のうち、３’末端側で両菌の保存性が特に高い領域から、１）属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして５組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるハミゲラ属に属する菌類の検出の有効性を検討した。その結果、１対のプライマー対でハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスで特異的にＤＮＡ増幅が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められなかった。この結果より、ハミゲラ属の検出が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号１６及び１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【０１６０】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちハミゲラ属とその他の耐熱性カビ及び一般カビとしては、表１２に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーやＴナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて指摘温度、すなわち一般カビは２５℃、耐熱性カビは３０℃で７日間培養した。
【０１６１】
【表１２】
2010004876.tif 000013
【０１６２】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１６３】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１６に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１７に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９８℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)６３℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【０１６４】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図２１に示す。図中の番号は表１２記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ハミゲラ属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含む試料（１レーン）では、１００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ハミゲラ属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ハミゲラ属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【０１６５】
（Ｄ−２）ハミゲラ属に属する菌類の検出、識別
（ａ）プライマーの調製
実施例１（Ｄ−１）で設計した、配列番号１６及び１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１６６】
（ｂ）検体の調製
ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類としては、表１３に記載のハミゲラ  アベラネア（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ）及びクラドスポリウム  クラドスポロイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）を使用した。前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を示すために、表１３に示すその他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーやＴナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。なお、ポジティブコントロールとして、Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ（菌株名：Ｔ３４）を鋳型ＤＮＡとして用いた。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて至適温度、すなわち一般カビは２５℃、耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃で７日間培養した。
【０１６７】
【表１３】
2010004876.tif 000014
【０１６８】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１６９】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１６に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１７に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９７℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)６３℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【０１７０】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図２２に示す。図中の番号は表１３記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含む試料では、１００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のいずれのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、前記（ｐ）及び（ｑ）のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【０１７１】
（Ｄ−３）ハミゲラ属に属する菌類の検出、識別
（ａ）プライマーの調製
配列番号３４記載のハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスを含めたその他のカビのβ‐チューブリン塩基配列領域のアライメント解析（ＤＮＡsis  Ｐｒｏ）を行い、有意な塩基配差の存在する部位を特定した。その部位の中で、３’末端側でハミゲラ  アベラネアの特異性が特に高い領域から、１）属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして７組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるハミゲラ属とクラドスポリウム  クラドスポロイデスの識別法の有効性を検討した。すなわち、ハミゲラ属のＤＮＡを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅反応が認められ、その他のカビＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、２対のプライマー対でハミゲラ  アベラネアを含むハミゲラ属で特異的にＤＮＡ増幅が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認めらかった。この結果より、ハミゲラ属とクラドスポリウム  クラドスポロイデスの識別が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号１８及び１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対及び配列番号２０及び２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【０１７２】
（ｂ）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちハミゲラ属とその他の耐熱性カビ及び一般カビとしては、表１４に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて至適温度、すなわち一般カビは２５℃、耐熱性カビは３０℃で７日間培養した。
【０１７３】
【表１４】
2010004876.tif 000015
【０１７４】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１７５】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスのゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１９に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９７℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)６０℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【０１７６】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図２３に示す。図中の番号は表１４記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ハミゲラ属に属する菌類に属する菌類のゲノムＤＮＡを含む試料（試料番号１〜３）では、２００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、クラドスポリウム属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含む試料（試料番号１７）及びその他のハミゲラ属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、前記（ｒ）及び（ｓ）のオリゴヌクレオチドを用いることによって、試料に含まれる菌類がハミゲラ属に属する菌類であるかクラドスポリウム属に属する菌類であるかを識別することができる。
【０１７７】
（Ｄ−４）ハミゲラ属に属する菌類の検出、識別
（ａ）プライマーの調製
実施例１（Ｄ−３）で設計した、配列番号１８〜２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１７８】
（ｂ）検体の調製
前記（ｒ）〜（ｕ）のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確認するために、ハミゲラ属に属する菌類として、図２４に示すハミゲラ  ストリアータ（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ｓｔｒｉａｔａ）の各菌株を使用した。
各菌体を上述の（Ｄ−１）と同様に培養した。
【０１７９】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
上述の（Ｄ−１）と同様の方法で、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１８０】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１９に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号２０に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２１に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌに変更した以外は上記と同様にしてＰＣＲ反応溶液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)６１〜５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【０１８１】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から４μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図２４に示す。
その結果、配列番号１８及び１９に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系及び配列番号２０及び２１に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系のいずれにおいても、使用したハミゲラ  ストリアータの全ての菌株において、特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された（９〜１６レーン）。また、配列番号２０及び２１に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系の方が、検出されたバンドがより鮮明であった（９〜１２レーン）。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくハミゲラ属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
【０１８２】
（Ｄ−５）ハミゲラ属に属する菌類の検出、識別
（ａ）プライマーの調製
実施例１（Ｄ−３）で設計した、配列番号１８〜２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１８３】
（ｂ）検体の調製
前記（ｒ）〜（ｕ）のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確認するために、ハミゲラ属に属する菌類として、図２５に示すハミゲラ  アベラネア（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ）の各菌株を使用した。
各菌体を上述の（Ｄ−１）と同様に培養した。
【０１８４】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
上述の（Ｄ−１）と同様の方法で、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【０１８５】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１９に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号２０に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２１に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌに変更した以外は上記と同様にしてＰＣＲ反応溶液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【０１８６】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図２５に示す。
その結果、配列番号１８及び１９に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系及び配列番号２０及び２１に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系のいずれにおいても、使用したハミゲラ  アベラネアの全ての菌株において、特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された（各１〜８レーン）。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくハミゲラ属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
【０１８７】
（Ｄ−６）ハミゲラ属に属する菌類の検出、識別
（ａ）プライマー
実施例１（Ｄ−３）で設計した、配列番号１８〜２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【０１８８】
（ｂ）検体の調製
前記（ｒ）〜（ｕ）のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に対する特異性を確認するためにハミゲラ属に近縁なビソクラミス属の菌類として、図２６及び図２７に示すビソクラミス  ニベア及びビソクラミス  フルバの各菌株を使用した。なお、これらの菌類は独立行政法人製品製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ番号で管理されているもの及びThe  Centraalbureau  voor  SchimmelculturesによりＣＢＳ番号で管理されているもの等を入手し、使用した。
各菌体を実施例１（Ｄ−１）と同様に培養した。
【０１８９】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
実施例１（Ｄ−１）と同様の方法で、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【０１９０】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１９に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号２０に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２１に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌに変更した以外は上記と同様にしてＰＣＲ反応溶液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【０１９１】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図２６及び図２７に示す。
その結果、図２６に示すように、配列番号１８及び１９に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系ではポジティブコントロールのハミゲラ  アベラネア以外にもビソクラミス  フルバの一部の菌株ＮＢＲＣ31877株及びＮＢＲＣ31878株（レーン９、１０）で２００ｂｐのサイズに遺伝子増幅が認められたものの、他のビソクラミス属に属する菌類に関しては遺伝子増幅が認められなかった。なお、ＮＢＲＣ31877株及び31878株で遺伝子増幅が認められた理由は、これらの株が他の株と比較して遺伝学的にハミゲラ属に近縁であるためと推測される。
一方、図２７に示すように、配列番号２０及び２１に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系では、ビソクラミス  フルバＮＢＲＣ31877株及びＮＢＲＣ31878株では遺伝子増幅が認められなかった。したがって、配列番号２０及び２１に記載のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ビソクラミス属に属する菌類を検出せずハミゲラ属に属する菌類のみを高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
【０１９２】
以上のように、本発明で規定するオリゴヌクレオチドを用いることにより、耐熱性菌類の検出が可能であることがわかった。すなわち、配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドを用いることでビソクラミス属に属する菌類を識別することが出来る。配列番号３〜１１のオリゴヌクレオチドを用いることでタラロマイセス属に属する菌類を識別することが出来る。配列番号１２〜１５のオリゴヌクレオチドを用いることでネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを検出することが出来る。なお、本発明によれば、ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスとを識別することもできる。配列番号１６〜２１のオリゴヌクレオチドを用いることによりハミゲラ属に属する菌類を検出することが出来る。従って、本発明における特定のオリゴヌクレオチドを用いて耐熱性菌類を検出する工程の少なくとも２つ以上、好ましくはすべての工程、を行うことにより耐熱性菌類を識別することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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