(57)【要約】      （修正有）【課題】タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類を特異的にかつ迅速に検出しうる方法、及びそれに用いる検出用ＤＮＡ、検出用オリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】特定の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の同定を行うことを特徴とするタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の同定を行うことを特徴とするタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【請求項２】
同定を行うために、被検菌のβ‐チューブリン遺伝子領域又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列が含まれるか否かを確認することを特徴とする請求項１記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項３】
同定を行うために、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた検出用オリゴヌクレオチドを検査対象物より抽出した核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することを特徴とする請求項１記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項４】
同定を行うために、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することを特徴とする請求項１記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項５】
前記増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって行うことを特徴とする請求項４記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項６】
前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅反応を行うことを特徴とする請求項５記載の検出方法。
（１）タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｆ）及び（ｊ）〜（ｌ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種を検出用オリゴヌクレオチドとして用いることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項８】
前記検出用オリゴヌクレオチドを核酸プローブ又は核酸プライマーとして用いることを特徴とする請求項７記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項９】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｆ）及び（ｊ）のオリゴヌクレオチド対、並びに前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１対を核酸プライマー対として用いることを特徴とする請求項７記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項１０】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｆ）及び（ｊ）のオリゴヌクレオチド対、並びに前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対を同時に用いて遺伝子増幅処理工程を行うことを特徴とする、請求項７記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項１１】
下記（ａ’）及び（ｂ’）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｅ’）及び（ｆ’）のオリゴヌクレオチド対又は下記（ｆ’）及び（ｊ’）のオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｃ’）及び（ｄ’）のオリゴヌクレオチド対又は下記（ｋ’）及び（ｌ’）のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして同時に用いることを特徴とする、請求項１０記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法。
（ａ’）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ’）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ’）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ’）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ’）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ’）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ’）配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ’）配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ’）配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１２】
タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出に用いるための、下記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表されるＤＮＡ。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【請求項１３】
下記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出用オリゴヌクレオチド。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【請求項１４】
前記検出用オリゴヌクレオチドが、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１３記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド。
（１）タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
【請求項１５】
前記検出用オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜６又は１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プローブ又は核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１３又は１４記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
下記の（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、下記の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、下記の（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、下記の（ｆ）及び（ｊ）のオリゴヌクレオチド対、並びに下記の（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１対で示されたタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１７】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｆ）及び（ｊ）のオリゴヌクレオチド対、及び下記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１対を核酸プライマー対として含むタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類検出用キット。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１８】
前記（ｆ）及び（ｊ）のオリゴヌクレオチド対及び／又は前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして含むことを特徴とする、請求項１７記載のタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性菌類の一種であるタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法、及びそれに用いる検出用ＤＮＡ、検出用オリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性の菌類（真菌類）は自然界に広く分布し、野菜、果物等の農作物で繁殖し、これらの農作物を原材料とした飲食品を汚染する。しかも、耐熱性の菌類は通常の他の菌類に比べて高い耐熱性を有する。例えば酸性飲料の加熱殺菌処理を行ったとしても耐熱性菌類が生存、増殖し、カビの発生原因となることがある。このため、耐熱性菌類は重大な事故を引き起こす重要危害菌として警戒されている。
【０００３】
加熱殺菌処理後の飲食品からも検出されることがある汚染事故の原因菌の主な耐熱性菌類の１つとして、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する耐熱性菌類が知られている。飲食品及びこれらの原材料中の耐熱性菌類による事故防止のためには、タラロマイセス属に属する耐熱性菌類の検出が重要である。
【０００４】
一方、従来の耐熱性の菌類を検出する方法としては、検体をＰＤＡ培地等で培養して検出する方法がある。しかし、この方法ではコロニーが確認されるまでに約７日間を要する。しかも、菌種の同定は、菌の特徴的な器官の形態に基づいて行うので、形態学的な特徴が認められるまでさらに約７日間の培養を必要としている。したがって、この方法によると、耐熱性菌類の検出に約１４日間もの時間を要する。このように耐熱性菌類の検出に長期間を要することは飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるものではない。そのため、より迅速な耐熱性菌類の検出方法の確立が求められている。
【０００５】
菌類の迅速な検出方法としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用した検出方法が知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。しかし、これらの方法では特定の耐熱性菌類を特異的にかつ迅速に検出することが困難であるという問題を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０５７２８号公報
【特許文献２】特開２００６−６１１５２号公報
【特許文献３】特開２００６−３０４７６３号公報
【特許文献４】特開２００７−１７４９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、飲食品汚染の主な原因菌の１つであるタラロマイセス属に属する菌類を特異的にかつ迅速に検出しうる方法を提供することを課題とする。また、本発明は該検出方法に用いる検出用ＤＮＡ及び検出用オリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のように耐熱性菌類の検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたＰＣＲ法では擬陽性や擬陰性の結果が出ることが挙げられる。
本発明者等は、この問題を克服し特定の耐熱性菌類を特異的に検出・識別しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、タラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡ中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域（以下、「可変領域」ともいう）が存在することを見い出した。また、この可変領域をターゲットとすることで、上記タラロマイセス属に属する菌類を特異的かつ迅速に検出・識別できることを見い出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
本発明は、下記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の属レベルでの同定を行うことを特徴とするタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出方法に関するものである。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【００１０】
また、本発明は、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出に用いるための、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表されるＤＮＡに関するものである。
また、本発明は、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類の検出用オリゴヌクレオチドに関するものである。
【００１１】
また、本発明は、下記の（ａ）及び（ｂ）で示されたタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記の（ｃ）及び（ｄ）で示されたタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記の（ｅ）及び（ｆ）で示されたタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記の（ｆ）及び（ｊ）で示されたタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記の（ｋ）及び（ｌ）で示されたタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、前述したオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むタラロマイセス属に属する菌類検出用のキットに関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、飲食品の汚染事故の主な原因菌の１つであるタラロマイセス属に属する菌類を特異的にかつ迅速に検出できるＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを提供することができる。さらに、本発明によれば、前記ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを用いたタラロマイセス属に属する菌類の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１における電気泳動図である。
【図２】実施例２における電気泳動図である。
【図３】実施例２における電気泳動図である。
【図４】実施例３における電気泳動図である。
【図５】実施例４における電気泳動図である。
【図６】実施例５におけるタラロマイセス  フラバスの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図７】実施例５におけるタラロマイセス  マクロスポラスの各菌株を用いた電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列及び／又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列、すなわちタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子領域及び／又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中におけるタラロマイセス属に特異的な領域又は種特異的領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス属に属する菌類の同定を行い、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・検出する方法である。
本発明における「タラロマイセス属に属する菌類」とは、マユハキタケ科（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ）に属する不整子嚢菌類を意味する。タラロマイセス属に属する菌類は、７５℃、３０分間の加熱処理後であっても生存可能な耐熱性菌類である。タラロマイセス属に属する菌類の例として、タラロマイセス  フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、タラロマイセス  ルテウス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、タラロマイセス  トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）、タラロマイセス  ウォルトマンニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）、タラロマイセス  バシリスポラス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓ）、タラロマイセス  マクロスポラス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。
【００１５】
「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。また、本発明において「可変領域」とは、β−チューブリン遺伝子中又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中で塩基変異が蓄積しやすい領域であり、この領域の塩基配列は真菌の属間で大きく異なる。タラロマイセス属のβ-チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域はタラロマイセス属固有の塩基配列であるため、他の通常の菌類のものとは明確に区別しうるものである。
【００１６】
本発明の検出方法は、下記の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸、すなわちタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子中及び／又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中の特定領域（可変領域）の塩基配列に対応する核酸を用いることを特徴とする。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
発明者らは、タラロマイセス属に属する菌類及びタラロマイセス属に属する菌類に近縁な菌類から種々のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を同定し、タラロマイセス属と近縁な属とタラロマイセス属との間、及びタラロマイセス属内での遺伝的距離の解析を行った。さらに、決定した各種のβチューブリン遺伝子配列及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列の相同性解析をおこなった。その結果、当該配列中にタラロマイセス属に属する菌類に固有の塩基配列を有する可変領域を見出した。この可変領域において、タラロマイセス属に属する菌類は固有の塩基配列を有しているため、タラロマイセス属に属する菌類を識別・同定することが可能となる。本発明は、この可変領域及び可変領域に由来する核酸、オリゴヌクレオチドをターゲットとしたものである。
【００１７】
本発明の検出方法に用いる前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列は、タラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配に対応する。また、前記（ｉ）の塩基配列は、タラロマイセス属に属する菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の塩基配列に対応する。
【００１８】
配列番号７に記載の塩基配列及びその相補配列は、タラロマイセス  フラバスから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はタラロマイセス属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にタラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、タラロマイセス  フラバス及びタラロマイセス  トラキスペルムスを検出するために好適に用いられる。
配列番号８に記載の塩基配列及びその相補配列は、タラロマイセス  ルテウスから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はタラロマイセス属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にタラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  バシリスポラス、タラロマイセス  ウォルトマンニーを検出するために好適に用いられる。
配列番号９に記載の塩基配列及びその相補配列は、タラロマイセス  ウォルトマンニーから単離、同定された２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中の可変領域の塩基配列である。当該配列はタラロマイセス属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にタラロマイセス属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスを検出するために好適に用いられる。
以下、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列をまとめて「本発明の可変領域の塩基配列」ともいう。
【００１９】
上記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス属に属する菌類を同定する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
【００２０】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス属に属する菌類の同定を行うには、被検体のβ−チューブリン遺伝子領域又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と本発明の前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいてタラロマイセス属に属する菌類の同定を行うものである。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００２１】
本発明においては、上記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス属に属する菌類の検出・同定を行うために、前記本発明の可変領域の塩基配列、すなわち前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつタラロマイセス属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、タラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できるものであればよい。すなわち、タラロマイセス属に属する菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば後述の条件が挙げられる。
【００２２】
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の塩基配列から選択される領域であって、（１）タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値（融解温度：melting  temperature）がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
上記（１）において「タラロマイセス属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域」とは、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の中でも、異なる属間での塩基配列の保存性が特に低く（すなわち、タラロマイセス属に属する菌類の特異性が特に高く）、１０塩基前後にわたってタラロマイセス属に属する菌類に固有の塩基配列が連続して現れる領域を意味する。
また、上記（３）において「オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い」とは、プライマーの塩基配列からプライマー同士が結合しないことが予想されることを言う。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドの塩基数としては、特に限定されないが、１３塩基〜３０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２３塩基であることがより好ましい。ハイブリダイズ時のオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、５５℃〜６５℃の範囲内であることが好ましく、５９℃〜６２℃の範囲内であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、３０％〜８０％が好ましく、４５％〜６５％がより好ましく、５５％前後であることが最も好ましい。
【００２３】
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、下記の（ａ）〜（ｆ）及び（ｊ）〜（ｌ）のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００２４】
すなわち、本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜６又は１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号１〜６又は１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであって、タラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できるものが好ましい。タラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列とは、配列番号１〜６又は１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有し、タラロマイセス属に属する菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとしてタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できるものや、ストリンジェントな条件でタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域にハイブリダイズ可能な塩基配列であれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。また、相同性が７５％以上であることがさらに好ましく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがよりさらに好ましく、相同性が９５％以上ありタラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できるものであることが特に好ましい。
また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドには、タラロマイセス属に属する菌類の検出に使用できるものであれば、配列番号１〜６及び１０〜１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドに対して、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施されたオリゴヌクレオチドも包含される。配列番号１〜６及び１０〜１２に記載の塩基配列に対して、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドで、タラロマイセス属に属する菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして耐熱性菌類（耐熱性カビ）の検出に使用できるものや、ストリンジェントな条件でタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域の塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列でもよい。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。そのような塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施されたオリゴヌクレオチドとしては配列番号１〜６又は１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドにおいて１又は数個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾されたオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１〜６又は１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２５】
本発明の前記（ａ）から（ｆ）及び（ｊ）〜（ｌ）で示されたオリゴヌクレオチドは、タラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。したがって、これらのオリゴヌクレオチドを用いることによって、前記タラロマイセス属に属する菌類を特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【００２６】
配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、タラロマイセス属に属する菌類の内タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムスに特異的な塩基配列、すなわち塩基配列の変異が蓄積しやすい可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。配列番号３〜４及び配列番号１１〜１２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、タラロマイセス属に属する菌類の内タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  バシリスポラスに特異的な塩基配列、すなわち塩基配列の変異が蓄積しやすい可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。配列番号５〜６及び配列番号１０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドは、２８Ｓ  ｒＤＮＡ中のＤ１/Ｄ２領域に存在し、タラロマイセス属に属する菌類の内タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスに特異的な塩基配列、すなわち塩基配列の変異が蓄積しやすい可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、タラロマイセス属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
【００２７】
タラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域をタラロマイセス  フラバス及びタラロマイセス  ルテウスを例として詳細に説明する。上述のように、タラロマイセス  フラバスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号７、タラロマイセス  ルテウスのβ―チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号８で示される。
このうち、タラロマイセス  フラバスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の１０位から４０位までの領域及び、７０位から１００位までの領域はタラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムスと特に保存性が高い配列であり、他の真菌で類似する配列がない領域であることを本発明者らが見出した。さらに、タラロマイセス  ルテウスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の１２０位から１６０位までの領域、及び２９５位から３２５位までの領域はタラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  バシリスポラスと保存性が高い配列であり、他の真菌で類似する配列がない領域であることを本発明者らが見い出した。
前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号７に記載の塩基配列のうち、それぞれ１５位から３４位まで、７６位から９８位までの領域に対応する。前記（ｃ）〜（ｄ）及び前記（ｋ）〜（ｌ）で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号８に記載の塩基配列のうち、それぞれ１３３位から１５３位まで、３０４位から３２５位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、タラロマイセス属に属する菌類を検出することができる。
【００２８】
タラロマイセス属に属する菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変領域をタラロマイセス  ウォルトマンニーを例として詳細に説明する。上述のように、タラロマイセス  ウォルトマンニーの２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列は配列番号９で示される。このうち、タラロマイセス属に属する菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列の３００位から３５０位まで、及び４５０位から５１０位までの領域はタラロマイセス  ウォルトマニーと近縁の種であるタラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  マクロスポラスで特に保存性が高い配列であり、他の真菌で類似する配列がない領域であることを本発明者らが見い出した。
前記（ｅ）〜（ｆ）及び前記（ｊ）で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号９に記載の塩基配列のうち、それぞれ３２６位から３４５位まで、４６０位から４７８位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをタラロマイセス属に属する菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域にハイブリダイズさせることによって、タラロマイセス属に属する菌類を検出することができる。
【００２９】
本発明の検出方法においては、上記（ａ）〜（ｆ）及び（ｊ）〜（ｌ）の検出用オリゴヌクレオチドの内、下記の（ａ１）〜（ｆ１）及び（ｊ１）〜（ｌ１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号１〜６及び１０〜１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いるのがより好ましい。
（ａ１）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ１）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ１）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ１）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｊ１）配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｋ１）配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｌ１）配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００３０】
本発明のタラロマイセス属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対は、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、（ｃ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｊ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｋ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｌ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対である。
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムスを特異的に検出することができる。また、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対又は前記（ｋ）及び（ｌ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  バシリスポラスを特異的に検出することができる。さらに、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスを特異的に検出することができる。また、前記（ｊ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスを特異的に検出することができる。
【００３１】
本発明の検出方法においては、上記検出用オリゴヌクレオチド対のなかでも、前記（ａ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｂ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、（ｃ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｊ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｋ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｌ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましく、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号１０及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号１１及び配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがより好ましい。
【００３２】
後述するように、本発明の検出方法において、上記本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対は核酸プローブ又は核酸プライマーとして好適に用いることができる。
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００３３】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、タラロマイセス属に属する菌類の遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００３４】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス属に属する菌類の同定を行うには、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた検出用オリゴヌクレオチドを検査対象物より抽出した核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することが好ましい。この場合、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドとしては、上述した本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を用いることができ、好ましい範囲も同様である。
【００３５】
本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対は、核酸プローブとして用いることができる。核酸プローブは、前記検出用オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。上記核酸プローブはタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子又は２８Ｓ  ｒＤＮＡの可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のタラロマイセス属に属する菌類を迅速かつ簡便に検出することができる。かかる標識の測定・検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
このようにして標識化された本発明の検出用オリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでタラロマイセス属に属する菌類を検出することができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、前述した条件を挙げることができる。また、核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
【００３６】
また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。
【００３７】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてタラロマイセス属に属する菌類の同定を行うには、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することも好ましい態様である。この場合、本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を、核酸プライマー及び核酸プライマー対として用いることができ、好ましい範囲も同様である。
なかでも、前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）タラロマイセス属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましい。さらに、前記（ａ）〜（ｆ）及び（ｊ）〜（ｌ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、前記（ａ１）〜（ｆ１）及び（ｊ１）〜（ｌ１）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがより好ましく、配列番号１〜６及び１０〜１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。また、本発明の検出用オリゴヌクレオチド対の少なくとも１つを核酸プライマー対として用いて遺伝子増幅処理を行い、遺伝子の増幅を確認することにより検出することが好ましく、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｊ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対及び前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対のうちのいずれか１対以上を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、前記（ａ１）及び（ｂ１）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ１）及び（ｄ１）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ１）及び（ｆ１）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｊ１）及び（ｆ１）のオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｋ１）及び（ｌ１）のオリゴヌクレオチド対のうちのいずれか１対以上を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましく、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号１０及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、及び配列番号１１及び配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対のうちのいずれか１対以上を核酸プライマー対として用いることが特に好ましい。
また、検出特異性及び検出感度の点からは、前記（ｊ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｋ）及び（ｌ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｊ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｋ１）及び（ｌ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号１０及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号１１及び配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。
本発明の核酸プライマーは、前記検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとして用いることもできるし、前記オリゴヌクレオチドを標識物で標識化して核酸プライマーとして用いることができる。標識物及び標識方法の例としては、核酸プローブの場合と同様のものが挙げられる。
【００３８】
本発明の検出方法においては、前記増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行うことがより好ましい。ＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９７℃で約１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５〜６１℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。
【００３９】
本発明において、遺伝子断片の増幅の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオチドを取り込ませる方法、ＰＣＲ反応産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、ＰＣＲ反応産物の塩基配列を解読する方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間に蛍光物質を入り込ませ発光させる方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
配列番号７に記載の塩基配列において、１５位から９８位までの塩基数は８３塩基、配列番号８に記載の塩基配列において１３３位から３２５位までの塩基数は１９２塩基である。また、配列番号９に記載の塩基配列において、３２６位から４７８位までの塩基数は１５２塩基である。したがって、被検体にタラロマイセス  フラバス及び／又はタラロマイセス  トラキスペルムスが含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約８０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。また、被検体にタラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー及び／又はタラロマイセス  バシリスポラスが含まれる場合、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約２００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。さらに、被検体にタラロマイセス  マクロスポラス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  フラバス及び／又はタラロマイセス  トラキスペルムスが含まれる場合、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約１５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。被検体にタラロマイセス  マクロスポラス、タラロマイセス  フラバス及び／又はタラロマイセス  トラキスペルムスが含まれる場合、前記（ｊ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約１５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、タラロマイセス属に属する菌類を検出することができる。なお、被検体にタラロマイセス  ウォルトマンニーが含まれる場合、前記（ｃ）及び（ｄ）、又は（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対及び前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対を同時に用いると、約２００ｂｐと約１５０ｂｐの２本のバンドが確認される。
【００４０】
本発明の検出方法において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｊ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを同時に用いることも好ましい態様である。複数のオリゴヌクレオチド対を組み合わせて用いることで、タラロマイセス属に属する菌類を網羅的に検出することができる。なかでも、前記（ａ１）及び（ｂ１）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ１）及び（ｆ１）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｊ１）及び（ｆ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｃ１）及び（ｄ１）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｋ１）及び（ｌ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがより好ましく、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号１０及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号１１及び１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
具体的には、上述したように前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムスを特異的に検出することができる。また、前記（ｃ）及び（ｄ）又は前記（ｋ）及び（ｌ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  バシリスポラスを特異的に検出することができる。さらに、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  マクロスポラスを特異的に検出することができる。またさらに、前記（ｊ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスペルムス、タラロマイセス  マクロスポラスを特異的に検出することができる。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）、前記（ｅ）及び（ｆ）、又は前記（ｊ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対と、前記（ｃ）及び（ｄ）、又は前記（ｋ）及び（ｌ）で示されたオリゴヌクレオチド対とを組み合わせて用いることにより、食品事故で特に問題となるタラロマイセス属に属する菌類を網羅的に検出することができる。
特に、検出感度の点からは、前記（ｊ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組み合わせて用いることが好ましく、前記（ｊ１）及び（ｆ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と前記（ｋ１）及び（ｌ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組み合わせて用いることがより好ましく、配列番号１０及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号１１及び１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
なお、本発明において、「同時に用いて遺伝子増幅処理工程を行う」とは、２つのオリゴヌクレオチド対を混合し、混合したものを１の反応系にプライマーとして添加して前述のような遺伝子増幅処理工程を行うことを意味する。２つのオリゴヌクレオチド対を同時に用いることで、タラロマイセス属に属する菌類をより迅速かつ網羅的に検出することができる。２つのオリゴヌクレオチド対の混合比は特に制限はないが、１：１〜１：２が好ましい。
【００４１】
本発明の耐熱性菌類の検出方法において、被検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
被検体からＤＮＡを調製する方法としては、耐熱性菌類の検出を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、通常の方法や市販の調製用キットを用いることができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００４２】
本発明のタラロマイセス属に属する菌類の検出方法によれば、被検体の調製工程から菌類の検出工程までを約５〜１２時間という短時間で行うことが可能である。
【００４３】
本発明のタラロマイセス属に属する菌類検出用キットは、前記本発明の検出用オリゴヌクレオチドを核酸プローブ又は核酸プライマーとして含有するものである。このキットは、タラロマイセス属に属する菌類の検出方法に用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プローブ又は核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｆ）及び（ｊ）のオリゴヌクレオチド対と、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対とが核酸プライマー対として含まれていることが好ましく、前記（ｆ）及び（ｊ）のオリゴヌクレオチド対と前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチド対とが核酸プライマー対として含まれていることがより好ましい。本発明のキットには、本発明の検出用オリゴヌクレオチドによって検出反応が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の検出用オリゴヌクレオチドにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４５】
実施例１
１．タラロマイセス属に属する菌類に特異的な塩基配列の解析
下記の方法によりタラロマイセス属各種のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定した。ポテトデキストロース寒天斜面培地にて２５℃、７日間、暗所培養したタラロマイセス属菌体からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ（株）社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD製）を用いて、プライマーとして、βチューブリンの部分長に関してはBt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：配列番号１３）、Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：配列番号１４）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を使用し、２８ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域はNL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’：配列番号１５）とNL4（５’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’：配列番号１６)（The  fungal  homorph：Mitotic  and  plemorphic  speciation  in  fungal  systematics.，Wallingford：CAB  international．）を用いた。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度９５℃、アニーリング温度５９℃、伸長温度７２℃、３５サイクル、２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域は編成温度９５℃、アニーリング温度５５℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto  SegTM  G−50（Amersham  Pharmacia  Biotech社製）を使用し精製した。ＰＣＲ産物は、BigDye  terminator  Ver.  1.1（商品名：Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetiｃ  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC  Ver.4”（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定した各種菌類（タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  ウォルトマンニー）のβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、タラロマイセス属に属する菌類に特異的な塩基配列を含有するβ−チューブリン遺伝子及び２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の中の特定領域（配列番号７〜９）を決定した。
【００４６】
２．タラロマイセス属に属する菌類の検出及び属レベルでの同定
（１）プライマーの設計
上記で得られたタラロマイセス属に属する菌類に特異的な塩基配列領域（配列番号７〜９）のうち、３’末端側でタラロマイセス属に属する菌類の特異性が特に高い領域から、１）属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にしてβチューブリン遺伝子に関しては５組のプライマー対を、２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域に関しては５組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるタラロマイセス属検出及び属同定の有効性を検討した。その結果、βチューブリン遺伝子のプライマーのうち５組中１組でタラロマイセス  フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）及びタラロマイセス  トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）で特異的に、設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅が認められた。有効性が確認できたプライマー対は配列番号１及び２である。
続いて複数のプライマー対を組み合わせることによりタラロマイセス属の網羅的な検出、すなわちタラロマイセス属ＤＮＡを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅反応が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、βチューブリンのプライマー５組中２組のプライマー対と２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域のプライマー５組中２組のプライマー対を混合して用いることによりタラロマイセス属の網羅的な検出、すなわちタラロマイセス属の属レベルでの同定が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号３、４、５、６、１０、１１及び１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【００４７】
（２）検体の調製
設計したプライマーの特異性の評価に用いる真菌類、すなわちタラロマイセス属とその他の耐熱性カビ及び一般カビとしては、表１に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて指摘温度、すなわち一般カビは２５℃、耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃で７日間培養した。
【００４８】
【表１】
2010004878.tif 000002
【００４９】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【００５０】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９５℃、１分間の熱変性反応、（ｉｉ）５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【００５１】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図１に示す。
その結果、タラロマイセス  フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）及びタラロマイセス  トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）のゲノムＤＮＡを含む試料（１レーン及び２レーン）では、８０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、タラロマイセス属に属する菌のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、タラロマイセス属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【００５２】
実施例２
タラロマイセス属に属する菌類の検出及び属レベルでの同定
（１）プライマー
実施例１で設計した、配列番号３，４，５，６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００５３】
（２）検体の調製
タラロマイセス属に属する菌類としては、タラロマイセス  フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、タラロマイセス  トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）、タラロマイセス  ウォルトマンニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）、及びタラロマイセス  ルテウス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌｕｔｅｕｓ）を使用した。前記（ｃ）から（ｆ）のオリゴヌクレオチドのタラロマイセス属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確かめるために、表２及び表３に示す菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて３０℃で７日間培養した。
【００５４】
【表２】
2010004878.tif 000003
【００５５】
【表３】
2010004878.tif 000004
【００５６】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００５７】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）２５μｌ、無菌蒸留水２０μｌを混合し、配列番号３に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌ、配列番号４に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌ、配列番号５に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌ、及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌを加え、５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９７℃、１０秒間の熱変性反応、（ｉｉ）５９℃、１分間のアニーリング反応、及び（ｉｉｉ）７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【００５８】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図２（ａ）、図２（ｂ）及び図３に示す。なお、図２（ａ）は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図２（ｂ）は表３に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。図３はタラロマイセス属に属する菌類の試料のみの電気泳動図を示す。
その結果、タラロマイセス属に属する菌類のうちタラロマイセス  フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、タラロマイセス  トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）又はタラロマイセス  ウォルトマンニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）のゲノムＤＮＡを含む試料（図２（ａ）の１〜２及び５〜８レーン、並びに図２（ｂ）の１〜２及び５〜８レーン）では、１５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。この遺伝子断片は配列番号５及び配列番号６の塩基配列で表されるプライマーを用いたことで増幅されたものである。また、タラロマイセス  ウォルトマンニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）又はタラロマイセス  ルテウス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌｕｔｅｕｓ）のゲノムＤＮＡを含む試料（図２（ａ）の３〜４及び７〜８レーン、並びに図２（ｂ）の３〜４及び７〜８レーン）では、２００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。この遺伝子断片は配列番号３及び配列番号４の塩基配列で表されるプライマーを用いたことで増幅されたものである。一方、タラロマイセス属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、タラロマイセス属に属する菌類を特異的にかつ網羅的に検出することができる。
【００５９】
実施例３
タラロマイセス属に属する菌類の検出及び属レベルでの同定
（１）プライマー
実施例１で設計した、配列番号６及び１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００６０】
（２）検体の調製
前記（ｆ）及び（ｊ）のオリゴヌクレオチドの検出特異性を確かめるために、表４に示すタラロマイセス属に属する菌類及びその他の菌類を使用した。これらの菌類は独立行政法人製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ番号で管理されているもの及びThe  Centraalbureau  voor  SchimmelculturesによりＣＢＳ番号で管理されているもの等、真菌の供託機関より分譲された株を入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いてタラロマイセス属を含む耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃で７日間、その他の一般カビは２５℃で７日間培養した。
【００６１】
【表４】
2010004878.tif 000005
【００６２】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【００６３】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号６に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１０に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９５℃、１分間の熱変性反応、（ｉｉ）５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【００６４】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図４に示す。図中の番号は表４記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、タラロマイセス属に属する菌類のうち、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  マクロスポラス及びタラロマイセス  トラキスペルムスのゲノムＤＮＡを含む試料（１〜３レーン）についてのみ、１５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、タラロマイセス属に属する菌のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、タラロマイセス属に属する菌類のうち、特定の菌種のみを特異的に検出することができることがわかる。
【００６５】
実施例４
タラロマイセス属に属する菌類の検出及び属レベルでの同定
（１）プライマー
実施例１で設計した、配列番号１１及び１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００６６】
（２）検体の調製
前記（ｋ）及び（ｌ）のオリゴヌクレオチドの検出特異性を確かめるために、実施例３の表４と同様のタラロマイセス属に属する菌類及びその他の菌類を使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いてタラロマイセス属を含む耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃で７日間、その他の一般カビは２５℃で７日間培養した。
【００６７】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【００６８】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１１に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号１２に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９５℃、１分間の熱変性反応、（ｉｉ）５５℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００６９】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図５に示す。図中の番号は表４記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、タラロマイセス属に属する菌類のうち、タラロマイセス  バシリスポラス、タラロマイセス  ウォルトマンニー及びタラロマイセス  ルテウスのゲノムＤＮＡを含む試料（４〜６レーン）についてのみ、２００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、タラロマイセス属に属する菌のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、タラロマイセス属に属する菌類のうち、特定の菌種のみを特異的に検出することができることがわかる。
【００７０】
実施例５
タラロマイセス属に属する菌類の検出
（１）プライマー
実施例１で設計した、配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００７１】
（２）検体の調製
前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドのタラロマイセス属に属する菌類に対する検出特異性を確かめるために、図６に示すタラロマイセス  フラバスの各菌株及び図７に示すタラロマイセス  マクロスポラスの各菌株を使用した。これらの菌類は独立行政法人製品製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ番号で管理されているもの及びThe  Centraalbureau  voor  SchimmelculturesによりＣＢＳ番号で管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【００７２】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。  ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【００７３】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号５に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９５℃、１分間の熱変性反応、（ｉｉ）６１℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００７４】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から４μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図６及び図７に示す。
その結果、使用したタラロマイセス  フラバス及びタラロマイセス  マクロスポラスの全ての菌株において、特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくタラロマイセス属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
【図１】
2010004878.tif 000006
【図２】
2010004878.tif 000007
【図３】
2010004878.tif 000008
【図４】
2010004878.tif 000009
【図５】
2010004878.tif 000010
【図６】
2010004878.tif 000011
【図７】
2010004878.tif 000012
【配列表】
2010004878000001.app