(57)【要約】      （修正有）【課題】ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルスフミガタスを特異的にかつ迅速に検出しうる方法、及びそれに用いる検出用ＤＮＡ、検出用オリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルスフミガタスの検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の同定を行うことを特徴とするネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の同定を行うことを特徴とするネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
【請求項２】
同定を行うために、被検菌のβ‐チューブリン遺伝子領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列が含まれるか否かを確認することを特徴とする請求項１記載のネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
【請求項３】
同定を行うために、前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた検出用オリゴヌクレオチドを検査対象物より抽出した核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することを特徴とする請求項１記載のネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
【請求項４】
同定を行うために、前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することを特徴とする請求項１記載のネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
【請求項５】
前記増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって行うことを特徴とする請求項４記載のネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
【請求項６】
前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅反応を行うことを特徴とする請求項５記載の検出方法。
（１）ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種を検出用オリゴヌクレオチドとして用いることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項記載のネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項８】
前記検出用オリゴヌクレオチドを核酸プローブ又は核酸プライマーとして用いることを特徴とする請求項７記載のネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
【請求項９】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド並びに／又は前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマー対として用いることを特徴とする請求項７記載のネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
【請求項１０】
前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマー対として用いることを特徴とする請求項７記載のアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
【請求項１１】
さらに下記（ア）及び／又は（イ）を用いることによりネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）かを識別する請求項９に記載の検出方法。
（ア）発育可能温度帯の違いを用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類か、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）かを検出する方法。
（イ）前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマー対として用いることを特徴とするアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出する方法。
【請求項１２】
下記（ａ’）及び（ｂ’）のオリゴヌクレオチド又は下記（ｃ’）及び（ｄ’）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることを特徴とするネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法。
（ａ’）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ’）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ’）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ’）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１３】
さらに下記（ア）及び／又は（イ’）を用いることによりネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）かを識別する請求項１２記載の検出方法。
（ア）発育可能温度帯の違いを用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）かを検出する方法。
（イ’）下記（ｅ’）及び（ｆ’）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることを特徴とするアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出する方法。
（ｅ’）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ’）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１４】
ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出に用いるための、下記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表されるＤＮＡ。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
【請求項１５】
下記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出用オリゴヌクレオチド。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
【請求項１６】
前記検出用オリゴヌクレオチドが、前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１５記載のネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）検出用オリゴヌクレオチド。
（１）ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
【請求項１７】
前記検出用オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プローブ又は核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１５又は１６記載のネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
下記（ａ）及び（ｂ）又は下記（ｃ）及び（ｄ）で示されたネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）検出用オリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１９】
下記（ｅ）及び（ｆ）で示されたアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）検出用オリゴヌクレオチド対。
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項２０】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド並びに／又は下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして含むネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）検出用キット。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項２１】
さらに下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして含む請求項２０記載の検出用キット。
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項２２】
下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして含むアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）検出用キット。
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性菌類の一種であるネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法、及びそれに用いる検出用ＤＮＡ、検出用オリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性の菌類（真菌類）は自然界に広く分布し、野菜、果物等の農作物で繁殖し、これらの農作物を原材料とした飲食品を汚染する。しかも、耐熱性の菌類は通常の他の菌類に比べて高い耐熱性を有する。例えば酸性飲料の加熱殺菌処理を行ったとしても耐熱性菌類が生存、増殖し、カビの発生原因となることがある。このため、耐熱性菌類は重大な事故を引き起こす重要危害菌として警戒されている。
【０００３】
加熱殺菌処理後の飲食品からも検出されることがある汚染事故の原因菌の主な耐熱性菌類の１つとして、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する耐熱性菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）が知られている。飲食品及びこれらの原材料中の耐熱性菌類による事故防止のためには、ネオサルトリア属に属する耐熱性菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出が重要である。
【０００４】
一方、従来の耐熱性の菌類を検出する方法としては、検体をＰＤＡ培地等で培養して検出する方法がある。しかし、この方法ではコロニーが確認されるまでに約７日間を要する。しかも、菌種の同定は、菌の特徴的な器官の形態に基づいて行うので、形態学的な特徴が認められるまでさらに約７日間の培養を必要としている。したがって、この方法によると、耐熱性菌類の検出に約１４日間もの時間を要する。このように耐熱性菌類の検出に長期間を要することは飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるものではない。そのため、より迅速な耐熱性菌類の検出方法の確立が求められている。
【０００５】
菌類の迅速な検出方法としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用した検出方法が知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。しかし、これらの方法では特定の耐熱性菌類を特異的にかつ迅速に検出することが困難であるという問題を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０５７２８号公報
【特許文献２】特開２００６−６１１５２号公報
【特許文献３】特開２００６−３０４７６３号公報
【特許文献４】特開２００７−１７４９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、飲食品汚染の主な原因菌に挙げられるネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的にかつ迅速に検出しうる方法を提供することを課題とする。また、本発明は該検出方法に用いる検出用ＤＮＡ及び検出用オリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のように耐熱性菌類の検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたＰＣＲ法では擬陽性や擬陰性の結果が出ることが挙げられる。
本発明者等は、この問題を克服し特定の耐熱性菌類を特異的に検出・識別しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のβ−チューブリン遺伝子中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域（以下、「可変領域」ともいう）が存在することを見い出した。また、この可変領域をターゲットとすることで、上記ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を特異的かつ迅速に検出し、さらにはこれらの菌類を識別できることを見い出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
本発明は、下記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の同定を行うことを特徴とするネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出方法に関するものである。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
【００１０】
また、本発明は、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出に用いるための、前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表されるＤＮＡに関するものである。
また、本発明は、前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の検出用オリゴヌクレオチドに関するものである。
【００１１】
また、本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）で示されたネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記（ｃ）及び（ｄ）で示されたネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記（ｅ）及び（ｆ）で示されたネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）かを検出するためのオリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、前述したオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス検出用のキットに関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、飲食品の汚染事故の主な原因菌に挙げられるネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的にかつ迅速に検出できるＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを提供することができる。さらに、本発明によれば、前記ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを用いたネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】アスペルギルス  フミガタス、ネオサルトリア  フィシェリ  フィシェリ及びネオサルトリア  フィシェリ  スピノサのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列の一部を比較した図である。
【図２】実施例１における、前記（ａ）及び（ｂ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図３】実施例２における、前記（ｃ）及び（ｄ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図４】実施例３における、前記（ｅ）及び（ｆ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図５】実施例３における、前記（ｅ）及び（ｆ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図６】実施例４における、ネオサルトリア  フィシェリ  フィシェリの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図７】実施例４における、ネオサルトリア  フィシェリ  グラブラの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図８】実施例４における、ネオサルトリア  ヒラツカエの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図９】実施例４における、ネオサルトリア  パウリステンシスの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図１０】実施例４における、ネオサルトリア  フィシェリ  スピノサの各菌株を用いた電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列、すなわちネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子領域中におけるネオサルトリア属及び／又はアスペルギルス  フミガタスに特異的な領域又は種特異的領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの同定を行い、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを特異的に識別・検出する方法である。
本発明における「ネオサルトリア属に属する菌類」とは、マユハキタケ科（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ）に属する不整子嚢菌類を意味する。ネオサルトリア属に属する菌類は、７５℃、３０分間の加熱処理後であっても生存可能な子のう胞子を有する。ネオサルトリア属に属する菌類の例として、ネオサルトリア  フィシェリ  スピノサ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ｖａｒ．  ｓｐｉｎｏｓａ；以下ネオサルトリア  スピノサとする）、ネオサルトリア  フィシェリ  フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ｖａｒ．  ｆｉｓｃｈｅｒｉ；以下ネオサルトリア  フィシェリとする）、ネオサルトリア  フィシェリ  グラブラ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ｖａｒ．  ｇｌａｂｒａ；以下ネオサルトリア  グラブラとする）、ネオサルトリア  ヒラツカエ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｈｉｒａｔｓｕｋａｅ）、ネオサルトリア  パウリステンシス（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｐａｕｌｉｓｔｅｎｓｉｓ）、ネオサルトリア  シュードフィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｐｅｕｄｏｆｉｓｃｈｅｒｉ）が挙げられる。
本発明における「アスペルギルス  フミガタス」とは、ネオサルトリア  フィシェリのアナモルフ（無性世代）と形態学的に極めて類似しているがテレオモルフ（有性世代）を有さない不完全菌類の一種である。
【００１５】
「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。また、本発明において、「可変領域」とは、β-チューブリン遺伝子中で塩基変異が蓄積しやすい領域であり、この領域の塩基配列は真菌の属間で大きく異なる。ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのβ-チューブリン遺伝子の可変領域はネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス固有の塩基配列であるため、他の通常の菌類のものとは明確に区別しうるものである。
【００１６】
本発明の検出方法は、下記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸、すなわちネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子中の特定領域（可変領域）の塩基配列に対応する核酸を用いることを特徴とする。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列
発明者らは、ネオサルトリア属に属する菌類、アスペルギルス  フミガタス及びネオサルトリア属に属する菌類に近縁な菌類から種々のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を同定し、ネオサルトリア属と近縁な属とネオサルトリア属との間、ネオサルトリア属内及び、ネオサルトリア属と近縁な属やネオサルトリア属とアスペルギルス  フミガタスとの間での遺伝的距離の解析を行った。さらに、決定した各種のβチューブリン遺伝子配列の相同性解析をおこなった。その結果、当該配列中にネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスに固有の塩基配列を有する可変領域を見出した。この可変領域において、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスは固有の塩基配列を有しているため、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを識別・同定することが可能となる。本発明は、この可変領域及び可変領域に由来する核酸、オリゴヌクレオチドをターゲットとしたものである。
【００１７】
本発明の検出方法に用いる前記（ｇ）、（ｉ）〜（ｌ）の塩基配列は、ネオサルトリア属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列に対応する。また、前記（ｈ）の塩基配列は、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列に対応する。
【００１８】
配列番号７に記載の塩基配列及びその相補配列は、ネオサルトリア  グラブラから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。配列番号９及び１０に記載の塩基配列及びその相補配列は、ネオサルトリア  フィシェリから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の部分塩基配列である。配列番号１１及び１２に記載の塩基配列及びその相補配列は、ネオサルトリア  スピノサから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の部分塩基配列である。また、配列番号８に記載の塩基配列及びその相補配列は、アスペルギルス  フミガタスから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスに特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号７〜１２のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にネオサルトリｂア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、特にネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ、ネオサルトリア  ヒラツカエ、ネオサルトリア  パウリステンシス、ネオサルトリア  シュードフィシェリ及びアスペルギルス  フミガタスを検出するために好適に用いられる。
以下、前記（ｇ）〜（ｌ）の塩基配列を「本発明の可変領域の塩基配列」ともいう。
【００１９】
上記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを同定する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
【００２０】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの同定を行うには、被検体のβ−チューブリン遺伝子領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と本発明の前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの同定を行うものである。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００２１】
本発明においては、上記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出・同定を行うために、前記本発明の可変領域の塩基配列、すなわち前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できるものであればよい。すなわち、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば後述の条件が挙げられる。
【００２２】
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列から選択される領域であって、（１）ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値（融解温度：melting  temperature）がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
上記（１）において「ネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスに固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域」とは、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の中でも、異なる属間での塩基配列の保存性が特に低く（すなわち、ネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスの特異性が特に高く）、１０塩基前後にわたってネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスに固有の塩基配列が連続して現れる領域を意味する。
また、上記（３）において「オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い」とは、プライマーの塩基配列からプライマー同士が結合しないことが予想されることを言う。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドの塩基数としては、特に限定されないが、１３塩基〜３０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２３塩基であることがより好ましい。ハイブリダイズ時のオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、５５℃〜６５℃の範囲内であることが好ましく、５９℃〜６２℃の範囲内であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、３０％〜８０％が好ましく、４５％〜６５％がより好ましく、５５％前後であることが最も好ましい。
【００２３】
本発明のネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス検出用オリゴヌクレオチドとしては、下記の（ａ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
上記（ａ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドのうち、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス検出用オリゴヌクレオチドとしては、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかで示されるものが好ましい。アスペルギルス  フミガタスを検出するためのオリゴヌクレオチドとしては、前記（ｅ）又は（ｆ）で示されるものが好ましい。
【００２４】
すなわち、本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであって、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できるものが好ましい。ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できる塩基配列とは、配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有し、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出のための核酸プライマーや核酸プローブとしてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できるものや、ストリンジェントな条件でネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズ可能な塩基配列であれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。また、相同性が７５％以上であることがさらに好ましく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがよりさらに好ましく、相同性が９５％以上ありネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できるものであることが特に好ましい。
また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドには、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出に使用できるものであれば、配列番号１から６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドに対して、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施されたオリゴヌクレオチドも包含される。また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドには、配列番号１から６に記載の塩基配列に対して、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドで、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして耐熱性カビの検出に使用できるものや、ストリンジェントな条件でネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズ可能な塩基配列でもよい。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。そのような塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施されたオリゴヌクレオチドとしては配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドにおいて１又は数個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾されたオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１から６のいずれかに記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２５】
配列番号１〜４に記載の塩基配列で示されたオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ、ネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  ヒラツカエ、ネオサルトリア  パウリステンシス、ネオサルトリア  シュードフィシェリ等のネオサルトリア属に属する菌類、及びアスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列、すなわち可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特定的にハイブリダイズすることができる。
【００２６】
ネオサルトリア属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域をネオサルトリア  グラブラを例として詳細に説明する。上述のように、ネオサルトリア  グラブラのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号７で示される。このうち、ネオサルトリア属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の１位から１１０位までの領域、１４０位から２１０位までの領域、及び３５０位から３８０位までの領域は真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、属間によって固有の塩基配列を有する領域であることを本発明者らが見い出した。また、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号８で示される。このうち、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の１位から１１０位までの領域、１４０位から２１０位までの領域、及び３５０位から３８０位までの領域は真菌間で塩基配列の保存性が低く、種間によって固有の塩基配列を有する領域であることを本発明者らが見い出した。
前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号７に記載の塩基配列のうち、それぞれ８４位から１０３位まで、１６９位から１８８位までの領域、配列番号８に記載の塩基配列のうち、それぞれ８３位から１０２位まで、１６６位から１８６位までの領域に対応する。前記（ｃ）及び（ｄ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号７に記載の塩基配列のうち、それぞれ１４４位から１６３位まで、３５８位から３７７位までの領域、配列番号８に記載の塩基配列のうち、それぞれ１４１位から１６０位まで、３５６位から３７６位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができる。
【００２７】
配列番号５及び配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、アスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列、すなわち塩基配列の変異が種間で蓄積しやすい可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、アスペルギルス  フミガタスのＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特定的にハイブリダイズすることができる。
【００２８】
アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号８で示される。このうち、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の２０位から５０位までの領域、及び２００位から２３０位までの領域は真菌、特にネオサルトリア属に属する菌類との間で塩基配列の保存性が低いことを本発明者らが見い出した。
前記（ｅ）及び（ｆ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号８に記載の塩基配列のうち、それぞれ２３位から４４位まで、２００位から２２２位までの領域に対応する。前記オリゴヌクレオチドはアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることができるが、ネオサルトリア属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡにはハイブリダイズさせることができない。これを図１に基づき詳しく説明する。図１は、配列番号８〜１２に記載のアスペルギルス  フミガタス、ネオサルトリア  フィシェリ及びネオサルトリア  スピノサのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列の一部を比較した図である。図１に示すように、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子における配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドが認識する領域と、この領域に対応するネオサルトリア属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の領域とを比較すると、塩基配列の相同性が他の領域と比べて非常に低いことがわかる。したがって、前記（ｅ）及び／又は（ｆ）で示されるオリゴヌクレオチドを用いることにより、被検体に含まれる菌類がネオサルトリア属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタスかを識別することができる。
【００２９】
本発明の検出方法においては、上記（ａ）〜（ｆ）の検出用オリゴヌクレオチドの内、下記の（ａ１）〜（ｆ１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号１〜６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いるのがより好ましい。
（ａ１）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ１）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ１）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ１）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００３０】
本発明のネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタス検出用オリゴヌクレオチド対は、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対である。
なかでも、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対又は前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましく、前記（ａ１）及び（ｂ１）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対又は前記（ｃ１）及び（ｄ１）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのがより好ましく、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対又は配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがさらに好ましい。前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対及び前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対は、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ、ネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  ヒラツカエ、ネオサルトリア  パウリステンシス、ネオサルトリア  シュードフィシェリ等のネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出に特に好適に用いられる。
また、アスペルギルス  フミガタスを検出するためには、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましく、前記（ｅ１）及び（ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いるのがより好ましく、配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがさらに好ましい。前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対は、アスペルギルス  フミガタスの検出に好適に用いられる。
【００３１】
前述のように、前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドは、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。したがって、本発明の前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いることによって、前記ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【００３２】
本発明では、前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いた検出方法により陽性反応を示した試料において、ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスの発育可能温度帯の違いを利用することにより、又は前記（ｅ）又は（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いることにより、当該試料に含まれる菌種を識別することができる。
【００３３】
ネオサルトリア属に属する菌類の発育可能温度の上限は約４５℃である。これに対して、アスペルギルス  フミガタスは５０℃以上でも発育が可能である。この発育可能温度帯の違いを利用して、以下のような操作を行うことで菌種を識別することができる。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いた検出方法により陽性反応を示した試料について、単一コロニーから菌糸をＰＤＡ培地やＰＤＢ培地（ポテトデキストロース液体培地）等に植付け、４８〜５２℃で培養を行う。１〜２日間培養後、菌糸の伸長を確認する。そして、上記発育可能温度帯の違いに基づき、増殖が確認された場合はアスペルギルス  フミガタス、増殖が確認されなかった場合はネオサルトリア属に属する菌類と識別することができる。なお、増殖の確認方法に特に制限はないが、実体顕微鏡による菌糸の伸長、液体培地中での菌糸の伸長、菌塊の形成、分生子の形成が挙げられる。
【００３４】
前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いた検出方法により陽性反応を示した試料において、前記（ｅ）又は（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いることにより、当該試料に含まれる菌種を識別することができる。前述したように、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されるオリゴヌクレオチドはアスペルギルス  フミガタスのＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特定的にハイブリダイズすることができる。しかし、ネオサルトリア属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡの一部分には、ハイブリダイズすることができない。したがって、被検体に含まれるＤＮＡ又はＲＮＡに前記（ｅ）及び／又は（ｆ）で示されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした場合は被検体に含まれる菌類はアスペルギルス  フミガタス、ハイブリダイズしなかった場合は被検体に含まれる菌類はネオサルトリア属の菌類、と識別することができる。
【００３５】
後述するように、本発明の検出方法において、上記本発明の検出用オリゴヌクレオチドは核酸プローブ又は核酸プライマーとして好適に用いることができる。
上記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００３６】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、ネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスの遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００３７】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの同定を行うには、前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた検出用オリゴヌクレオチドを検査対象物より抽出した核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することが好ましい。この場合、前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドとしては、上述した本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を用いることができ、好ましい範囲も同様である。
【００３８】
本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対は、核酸プローブとして用いることができる。核酸プローブは、前記検出用オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
【００３９】
このようにして標識化された本発明の検出用オリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを検出することができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、前述した条件を挙げることができる。
例えば、前記（ａ）及び／若しくは（ｂ）で示されるオリゴヌクレオチド、前記（ｃ）及び／若しくは（ｄ）で示されるオリゴヌクレオチド又は前記（ｅ）及び／若しくは（ｆ）で示されるオリゴヌクレオチドを標識化して核酸プローブとすることができる。上記前記（ａ）及び／若しくは（ｂ）で示されるオリゴヌクレオチド又は前記（ｃ）及び／若しくは（ｄ）で示されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プローブはネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを迅速かつ簡便に検出することができる。また、前記（ｅ）及び／又は（ｆ）で示されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プローブは、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするが、ネオサルトリア属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡにはハイブリダイズできない。したがって、これらのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたかを確認することで、被検体中の菌類がネオサルトリア属に属する菌類であるかアスペルギルス  フミガタスであるかを迅速かつ簡便に識別することができる。核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
【００４０】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。
【００４１】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスの同定を行うには、前記（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することも好ましい態様である。この場合、本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を、核酸プライマー及び核酸プライマー対としても用いることができ、好ましい範囲も同様である。
この場合、（ｇ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスに固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましい。なかでも、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの検出用オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましく、前記（ａ１）〜（ｆ１）のいずれかの検出用オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることがより好ましく、配列番号１〜６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。また、前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ａ１）及び（ｂ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ１）及び（ｄ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｅ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのがさらに好ましい。
特に、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを検出する場合には、検出特異性及び検出感度の点からは、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｃ１）及び（ｄ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。アスペルギルス  フミガタスを検出する場合には、検出特異性及び検出感度の点からは、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ｅ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。
本発明の核酸プライマーは、前記オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとして用いることもできるし、前記オリゴヌクレオチドを標識物で標識化して核酸プライマーとして用いることができる。標識物及び標識方法の例としては、核酸プローブの場合と同様のものが挙げられる。
【００４２】
本発明において、遺伝子増幅処理はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行うことが好ましい。ＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド又は前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応においては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５９〜６１℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを３０〜３５サイクル行う。前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応においては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５９〜６１℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを３０〜３５サイクル行う。
【００４３】
本発明において、遺伝子断片の増幅の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオチドを取り込ませる方法、ＰＣＲ反応産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、ＰＣＲ反応産物の塩基配列を解読する方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間に蛍光物質を入り込ませ発光させる方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
例えば、被検体にネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスが含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約１００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。また、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約２００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、ネオサルトリア属に属する菌類及び／又はアスペルギルス  フミガタスを検出することができる。
被検体にアスペルギルス  フミガタスが含まれる場合、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約２００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、アスペルギルス  フミガタスを検出することができる。
【００４４】
本発明の検出方法においては、前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対並びに／又は前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることも好ましい態様である。前述したように、前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法はネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法はアスペルギルス  フミガタスをそれぞれ検出することができるため、これらの方法を組合わせることにより被検体から検出された菌類がネオサルトリア属に属する菌類かアスペルギルス  フミガタスであるかを識別することができる。なかでも、前記（ａ１）及び（ｂ１）で示されたオリゴヌクレオチド対並びに／又は前記（ｃ１）及び（ｄ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｅ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがより好ましく、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対並びに／又は配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
さらに、検出感度の点から、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対と前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対とを組み合わせて用いることが好ましく、前記（ｃ１）及び（ｄ１）で示されたオリゴヌクレオチド対と前記（ｅ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対とを組み合わせて用いることがより好ましく、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
【００４５】
本発明の耐熱性菌類の検出方法において、被検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
被検体からＤＮＡを調製する方法としては、耐熱性菌類の検出を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、通常の方法や市販の調製用キットを用いることができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００４６】
本発明のネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出方法によれば、被検体の調製工程から菌類の検出工程までを約５〜１２時間という短時間で行うことが可能である。
【００４７】
本発明のネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス検出・識別用キットは、前記本発明の検出用オリゴヌクレオチドを核酸プローブ又は核酸プライマーとして含有するものである。このキットは、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出方法に用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プローブ又は核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明の検出用オリゴヌクレオチドによって検出反応が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の検出用オリゴヌクレオチドにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４９】
実施例１
１．βチューブリン部分長の塩基配列決定
下記の方法によりネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。ポテトデキストロース寒天斜面培地にて３０℃で７日間、暗所培養した。菌体からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ（株）社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD製）を用いて、プライマーとしてBt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：配列番号１３）、Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：配列番号１４）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を使用した。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度９５℃、アニーリング温度５９℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto  SegTM  G−50（Amersham  Pharmacia  Biotech社製）を使用し精製した。ＰＣＲ産物は、BigDye  terminator  Ver.  1.1（商品名：Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetiｃ  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC  Ver.4”（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定したネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報及び各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列を含有するβ−チューブリン遺伝子の中の特定領域（配列番号７〜１２）を決定した。
【００５０】
２．ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスの検出
（１）プライマーの設計
上記で得られたネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列領域のうち、３’末端側で両菌の保存性が特に高い領域から、１）属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして４組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるネオサルトリア属とアスペルギルス  フミガタスの一括検出の有効性を検討した。すなわち、ネオサルトリア属及びアスペルギルス  フミガタスのＤＮＡを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅反応が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、２組のプライマー対でネオサルトリア属及びアスペルギルス  フミガタスに特異的にＤＮＡ増幅が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認めらかった。この結果より、２組のプライマー対がネオサルトリア属とアスペルギルス  フミガタスの一括検出が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対及び配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【００５１】
（２）検体の調製
ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスとしては、表１に記載の菌類を使用した。前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドのこれらの菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確かめるために、表１に示す菌類も使用した。なお、これらの菌株は独立行政法人理化学研究所がＪＣＭナンバーで管理する菌株や東京大学分子細胞生物学研究所がＩＡＭナンバーで管理する菌株及び独立行政法人製品評価技術基盤機構がＩＦＯナンバーで管理する財団法人醗酵研究所菌由来の株を入手し、評価に使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：ＰＤＡ培地（パールコア  ポテトデキストロース寒天培地）、栄研化学株式会社製）を用いて耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃、その他一般カビは２５℃で７日間培養した。
【００５２】
【表１】
2010004879.tif 000002
【００５３】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【００５４】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９８℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【００５５】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図２に示す。
その結果、ネオサルトリア属に属する菌類又はアスペルギルス  フミガタスのゲノムＤＮＡを含む試料（１、２及び７レーン）では、１００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのいずれのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができる。
【００５６】
（６）ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスの識別
上記（５）において遺伝子断片の増幅が確認された検体について、単一コロニーから菌糸をＰＤＡ培地（商品名：ポテトデキストロース培地、栄研化学株式会社製）に植菌し、５０℃で１日間培養し、実体顕微鏡により菌糸の伸長を観察した。その結果、アスペルギルス  フミガタスを植菌した試料では活発な菌糸の成長が認められたが、ネオサルトリア属に属する菌類を植菌した試料では菌糸の成長が認められなかった。この結果から、発育可能温度帯の違いを利用して、ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスとを識別することができた。
【００５７】
実施例２
（１）プライマー
実施例１で設計した、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００５８】
（２）検体の調製
ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスとしては、表２及び表３に記載の菌類を使用した。前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドのネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確かめるために、表２及び表３に示すその他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、ナンバリングにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃、その他一般カビは２５℃で７日間培養した。
【００５９】
【表２】
2010004879.tif 000003
【００６０】
【表３】
2010004879.tif 000004
【００６１】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００６２】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号３に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９７℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【００６３】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図３（ａ）及び図３（ｂ）に示す。なお、図３（ａ）は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図３（ｂ）は表３に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのゲノムＤＮＡを含む試料では、２００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスのいずれのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができる。
【００６４】
（６）ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスの識別
上記方法により遺伝子断片の増幅が確認された検体について、単一コロニーから菌糸をＰＤＡ培地（商品名：ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）に植菌し、５０℃で１日間培養し、実体顕微鏡により菌糸の伸長を観察した。その結果、アスペルギルス  フミガタスを植菌した試料では活発な菌糸の成長が認められたが、ネオサルトリア属に属する菌類を植菌した試料では菌糸の成長が認められなかった。この結果から、発育可能温度帯の違いを利用して、ネオサルトリア属に属する菌類とアスペルギルス  フミガタスとを識別することができた。
【００６５】
実施例３  
（１）アスペルギルス  フミガタス検出用プライマーの設計
配列番号７〜１２に示したネオサルトリア  グラブラ、アスペルギルス  フミガタス、ネオサルトリア  フィシェリ及びネオサルトリア  スピノサのβチューブリン遺伝子の塩基配列のアライメント解析（ＤＮＡsis  Ｐｒｏ)を用いて両種の塩基配列の差が存在する領域を決定した。決定した領域の中でアスペルギルス  フミガタスに特異的な塩基配列部位のうち、３’末端側で両菌の保存性が特に高い領域から、１）アスペルギルス  フミガタス固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして２組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるネオサルトリア属とアスペルギルス  フミガタスの識別の有効性を検討した。すなわち、アスペルギルス  フミガタスのＤＮＡを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅反応が認められ、ネオサルトリア属のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、１組のプライマー対でアスペルギルス  フミガタスに特異的にＤＮＡ増幅が認められ、その他の菌類のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められなかった。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【００６６】
（２）検体の調製
ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタスとしては、表４及び表５に記載の菌類を使用した。また、参考として、表４及び表５に示すネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルス  フミガタス以外の菌類も使用した。菌株は千葉大学真菌医学研究センターが保存し、ナンバリングにより管理をしている株を入手し、試験に用いた。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃、その他一般カビは２５℃で７日間培養した。
【００６７】
【表４】
2010004879.tif 000005
【００６８】
【表５】
2010004879.tif 000006
【００６９】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００７０】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号５に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００７１】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２．５μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図４及び図５に示す。なお、図４は表４に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図５は表５に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
図４及び図５で示すように、アスペルギルス  フミガタスのゲノムＤＮＡを含む試料でのみ約２００ｂｐの増幅断片がはっきりと確認された。これに対して、ネオサルトリア属の菌類を含む他の菌類のゲノムＤＮＡを含む試料では、約２００ｂｐの増幅断片は確認されなかった。
この結果から、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子増幅処理を行い、増幅産物の有無を確認することにより、アスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができることがわかる。
【００７２】
実施例４
（１）プライマー
実施例１及び３で設計した、配列番号３〜６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００７３】
（２）検体の調製
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドのネオサルトリア属に属する菌類に対する検出特異性、及び前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドのアスペルギルス  フミガタスに対する検出特異性を確かめるために、図６に示すネオサルトリア  フィシェリの各菌株、図７に示すネオサルトリア  グラブラの各菌株、図８に示すネオサルトリア  ヒラツカエの各菌株、図９に示すネオサルトリア  パウリステンシスの各菌株、及び図１０に示すネオサルトリア  スピノサの各菌株を使用した。また、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いた反応系のポジティブコントロールとして、アスペルギルス  フミガタスを使用した。なお、これらの菌類は独立行政法人製品製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ番号で管理されているもの及びThe  Centraalbureau  voor  SchimmelculturesによりＣＢＳ番号で管理されているもの等、真菌の供託機関から入手したもの及び千葉大学真菌医学研究センターで保存しＩＦＭナンバーで管理された株等を入手し、供試菌として使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃、その他一般カビは２５℃で１４日間培養した。
【００７４】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。
【００７５】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号３に記載の塩基配列で表されるプライマー（０．０２ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるプライマー（０．０２ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号５に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌに変更した以外は上記と同様にしてＰＣＲ反応溶液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００７６】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から４μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図６〜図１０に示す。なお、図６はネオサルトリア  フィシェリの各菌株の試料についての電気泳動図を示し、図７はネオサルトリア  グラブラの各菌株の試料についての電気泳動図を示し、図８はネオサルトリア  ヒラツカエの各菌株の試料についての電気泳動図を示し、図９はネオサルトリア  パウリステンシスの各菌株の試料についての電気泳動図を示し、及び図１０はネオサルトリア  スピノサの各菌株の試料についての電気泳動図を示す。
その結果、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系においては、使用したネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  グラブラ、ネオサルトリア  ヒラツカエ、ネオサルトリア  パウリステンシス及びネオサルトリア  スピノサの全ての菌株において、特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された（図６(ａ)、図７(ａ)、図８(ａ)、図９(ａ)、図１０(ａ)）。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくネオサルトリア属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系においては、アスペルギルス  フミガタスのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた試料のみ特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された。一方、ネオサルトリア属の各菌株を用いた試料では、いずれもＤＮＡ断片の増幅は確認されなかった（図６(ｂ)、図７(ｂ)、図８(ｂ)、図９(ｂ)、図１０(ｂ)）。したがって、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子増幅処理を行い、増幅産物の有無を確認することにより、アスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することができることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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