(57)【要約】【課題】ピクセル時間とライン時間を調整することなく、観察可能な拡散時間を拡張可能な画像解析方法を提供することである。【解決手段】＜ステップＳ１＞：複数フレームの蛍光画像を取得する。＜ステップＳ２＞：解析領域を設定する。＜ステップＳ３，Ｓ４＞：１フレームの蛍光画像の解析領域に対して相関計算を行なって拡散時間を推定する。＜ステップＳ５＞：推定した拡散時間に基づいて所望パラメータを算出する。＜ステップＳ６＞：算出した所望パラメータに基づいて新たなＲＩＣＳの空間相関計算式を得る。＜ステップＳ７＞：所望パラメータに基づいて解析に利用する蛍光画像を選定し、解析に利用する蛍光画像の解析領域のピクセルのデータと新たなＲＩＣＳの解析式により空間自己相関解析を行なう。同様に、異なるチャンネルのフレーム蛍光強度データを用いてＲＩＣＳの空間相互相関解析を行なう。【選択図】図９
2010237116.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各画像のピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる複数フレームの画像を時系列的に取得する画像取得ステップと、
前記画像に対して解析領域を設定する解析領域設定ステップと、
前記画像の中から解析に利用する１フレーム以上の選定画像を選定する画像選定ステップと、
前記選定画像の解析領域内のピクセルのデータに基づいて相関値を算出する計算ステップを有している画像解析方法。
【請求項２】
前記計算ステップは、前記選定画像中の時系列的に先の画像の解析領域内のピクセルのデータと、このピクセルよりも遅れて取得された、前記選定画像の解析領域内のピクセルのデータとの間の相関値を算出する、請求項１に記載の画像解析方法。
【請求項３】
推定拡散時間を推定する推定ステップをさらに有し、
前記選定画像の選定は、前記推定拡散時間に基づいて行なう、請求項１または請求項２に記載の画像解析方法。
【請求項４】
前記選定画像は、前記画像のすべてからなる、請求項１ないし請求項３のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項５】
前記選定画像は、前記画像の時系列において連続している前記画像の一部からなる、請求項１ないし請求項３のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項６】
前記画像はＫフレームの画像からなり、ここでＫは２以上の整数であり、
前記選定画像の選定および相関値の算出は次式（１）と次式（２）を用いて行なう、
【数１】
2010237116.tif 000011
ここで、ＧｓはＲＩＣＳの相関値、Ｉ１０はチャンネル１の１フレーム目のピクセルのデータ、Ｉ１ηはチャンネル１のη＋１フレーム目のピクセルのデータ、ηは０以上の整数の所望パラメータ（η＝０，１，…，Ｋ−１）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ０ηはチャンネル１の１フレーム目とη＋１フレーム目の積和計算の回数、Ｍ０はチャンネル１の１フレーム目のデータ数、Ｍηはチャンネル１のη＋１フレーム目のデータ数であり、
【数２】
2010237116.tif 000012
ここで、ＳはＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、ＧはＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、Ｗ０は励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である、請求項１に記載の画像解析方法。
【請求項７】
次式（３）と次式（４）を用いて推定拡散時間を推定し、
【数３】
2010237116.tif 000013
ここで、Ｉ１０はチャンネル１の１フレーム目のピクセルのデータ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ００はチャンネル１の１フレーム目の積和計算の回数、Ｍ０はチャンネル１の１フレーム目のデータ数であり、
【数４】
2010237116.tif 000014
前記推定拡散時間に基づいてηの値を設定する、請求項６に記載の画像解析方法。
【請求項８】
次式（６）に基づいてηminを求め、
【数５】
2010237116.tif 000015
ここで、τＤは前記推定拡散時間、ξｍａｘ，ψｍａｘは１フレーム中の空間的座標の変化の最大値、ｎは２以上の整数であり、
【数６】
2010237116.tif 000016
上式（７）を満足する最小値をηに設定する、請求項７に記載の画像解析方法。
【請求項９】
励起光を走査しながら試料に照射する光照射ステップをさらに有し、
前記画像は前記試料の蛍光画像であり、前記ピクセルのデータは、前記励起光の照射に応じて前記試料から発せられた蛍光強度に対応している、請求項１ないし請求項８のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項１０】
前記データは蛍光強度の統計値であり、前記統計値は、前記蛍光強度の平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差のいずれかである、請求項１ないし請求項９のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項１１】
前記画像は、走査型顕微鏡によって得られたものである、請求項１ないし請求項１０のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項１２】
各画像のピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる複数フレームの画像を時系列的に取得する画像取得部と、
前記画像に対して解析領域を設定する解析領域設定部と、
前記画像の中から解析に利用する１フレーム以上の選定画像を選定する画像選定部と、
前記選定画像の解析領域内のピクセルのデータに基づいて相関値を算出する計算部を有している画像解析装置。
【請求項１３】
前記計算部は、前記選定画像中の時系列的に先の画像の解析領域内のピクセルのデータと、このピクセルよりも遅れて取得された、前記選定画像の解析領域内のピクセルのデータとの間の相関値を算出する、請求項１２に記載の画像解析装置。
【請求項１４】
推定拡散時間を推定する推定部をさらに有し、
前記選定画像の選定は、前記推定拡散時間に基づいて行なわれる、請求項１２または請求項１３に記載の画像解析装置。
【請求項１５】
前記選定画像は、前記画像のすべてからなる、請求項１２ないし請求項１４のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項１６】
前記選定画像は、前記画像の時系列において連続している前記画像の一部からなる、請求項１２ないし請求項１４のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項１７】
前記画像はＫフレームの画像からなり、ここでＫは２以上の整数であり、
前記選定画像の選定および相関値の算出は次式（１）と次式（２）を用いて行なう、
【数７】
2010237116.tif 000017
ここで、ＧｓはＲＩＣＳの相関値、Ｉ１０はチャンネル１の１フレーム目のピクセルのデータ、Ｉ１ηはチャンネル１のη＋１フレーム目のピクセルのデータ、ηは０以上の整数の所望パラメータ（η＝０，１，…，Ｋ−１）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ０ηはチャンネル１の１フレーム目とη＋１フレーム目の積和計算の回数、Ｍ０はチャンネル１の１フレーム目のデータ数、Ｍηはチャンネル１のη＋１フレーム目のデータ数であり、
【数８】
2010237116.tif 000018
ここで、ＳはＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、ＧはＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、Ｗ０は励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である、請求項１２に記載の画像解析装置。
【請求項１８】
次式（３）と次式（４）を用いて拡散時間を推定し、
【数９】
2010237116.tif 000019
ここで、Ｉ１０はチャンネル１の１フレーム目のピクセルのデータ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ００はチャンネル１の１フレーム目の積和計算の回数、Ｍ０はチャンネル１の１フレーム目のデータ数であり、
【数１０】
2010237116.tif 000020
前記推定拡散時間に基づいてηの値が設定される、請求項１７に記載の画像解析装置。
【請求項１９】
次式（６）に基づいてηminを求め、
【数１１】
2010237116.tif 000021
ここで、τＤは前記推定拡散時間、ξｍａｘ，ψｍａｘは１フレーム中の空間的座標の変化の最大値、ｎは２以上の正数であり、
【数１２】
2010237116.tif 000022
上式（７）を満足する最小値がηに設定される、請求項１８に記載の画像解析装置。
【請求項２０】
励起光を走査しながら試料に照射する光照射部をさらに有し、
前記画像は前記試料の蛍光画像であり、前記ピクセルのデータは、前記励起光の照射に応じて前記試料から発せられた蛍光強度に対応している、請求項１２ないし請求項１９のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項２１】
前記データは蛍光強度の統計値であり、前記統計値は、前記蛍光強度の平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差のいずれかである、請求項１２ないし請求項２０のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項２２】
前記画像は、走査型顕微鏡によって得られたものである、請求項１２ないし請求項２１のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像解析方法および画像解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ラスターイメージ相関分光法（ＲＩＣＳ：Raster Image Correlation Spectroscopy）として以下の非特許文献１，２に示すような方法が提案されている。この画像解析方法において、１フレーム以上のラスター走査画像からなる蛍光画像を取得する。つまり、画像解析したい試料において、興味を持っている領域を決め、その領域をラスター走査方式で繰り返しスキャンし、複数フレームの蛍光強度からなる画像を取得する。フレーム中の蛍光強度はピクセル単位でデータとして表わされている。これらのピクセル単位のデータ（ピクセルのデータ）は、それぞれ取得された時間および取得された位置が異なるため、各データに対応する取得時間および取得位置はずれている。
【０００３】
したがって、これらのピクセルのデータを用いて、空間自己相関解析することで、分子の揺らぎによる相関特性を得ることができる。ここで、分子の相関特性からは、拡散定数や分子数を求めることができる。また、拡散定数からは、分子拡散時間を求めることができる。そして、分子拡散時間からは、分子量を求めることができる。
【０００４】
このように、空間自己相関解析をすることで、分子量や分子数等を評価することができるため、分子間の相互作用を観察することが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「Measuring Fast Dynamics in Solutions and Cells with a Laser Scanning Microscope」, Michelle A. Digman, Claire M. Brown, Parijat Sengupta, Paul W. Wiseman, Alan R. Horwitz, and Enrico Gratton, Biophysical Journal, Vol.89, P1317-1327, August 2005.
【非特許文献２】「Fluctuation Correlation Spectroscopy with a Laser-Scanning Microscope: Exploiting the Hidden Time Structure」,, Michelle A. Digman, Parijat Sengupta, Paul W. Wiseman, Claire M. Brown, Alan R. Horwitz, and Enrico Gratton, Biophysical Journal: Biophysical Letters, L33-36, 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＲＩＣＳの解析における観察範囲は、ラスター走査により取得した１フレーム中の各データに対応する取得時間および取得位置のずれに制限される。例えば、２５６ピクセル×２５６ピクセルの蛍光画像データにおいて、観察可能な分子拡散時間の最大値ｔｄは、２５６×τｐ＋２５５×τｌである。なお、簡単のため、任意のラインの最後のピクセルと、その次のラインの最初のピクセルと、の間の取得時間のずれを、τｐと近似している。
【０００７】
ここでτｐはピクセル間の取得時間のずれ（ピクセル時間）である。また、τｌは任意のラインの最初のピクセルと、その次のラインの最初のピクセルと、の間の取得時間のずれ（ライン時間）である。すなわち、ライン時間は、一ラインを走査するのに要する時間を意味する。この場合、２５６ピクセルが、１ラインを構成している。
【０００８】
分子拡散時間が短い分子を観察するには、ピクセル時間とライン時間を小さく設定する必要がある。何故なら、ピクセル時間とライン時間を大きく設定すると、分子拡散時間に対する画素間の取得時間のずれが大きいため、十分な回数の相関計算をすることができない。その結果、少ない計算結果に基づいて、フィッティングする必要が生じるため、得られる相関特性の精度が低くなる。
【０００９】
一方、分子拡散時間が長い分子を観察するには、ピクセル時間とライン時間を大きく設定する必要がある。何故なら、ピクセル時間とライン時間を小さく設定すると、実際の分子拡散時間が、１フレームで観察可能な分子拡散時間の最大値を越えるため、分子拡散時間を算出することができなくなるからである。
【００１０】
ここで、ピクセル時間とライン時間は、走査速度によって決まるため、一度測定が完了すると、得られた画像のデータにおけるピクセル時間およびライン時間の調整ができない。従って、分子の拡散定数等を適切に得るには、測定をする前に、適切なピクセル時間およびライン時間を推測する必要が生じる。
【００１１】
しかしながら、ほとんどのサンプルの分子拡散時間は未知数であるため、事前にピクセル時間およびライン時間の設定を推測することは難しい。
【００１２】
本発明の目的は、観察可能な拡散時間を拡張可能な画像解析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明による画像解析方法は、各画像のピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる複数フレームの画像を時系列的に取得する画像取得ステップと、前記画像に対して解析領域を設定する解析領域設定ステップと、前記画像の中から解析に利用する１フレーム以上の選定画像を選定する画像選定ステップと、前記選定画像の解析領域内のピクセルのデータに基づいて相関値を算出する計算ステップとを有している。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、観察可能な拡散時間を拡張可能な画像解析方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態による画像解析装置を概略的に示している。
【図２】図１に示される制御部の機能ブロックを示している。
【図３】画像解析のために時系列的に取得されたＫフレームの蛍光画像を示している。
【図４】１フレーム目の蛍光画像内における相関計算の積和計算を模式的に示している。
【図５】１フレーム目と２フレーム目の蛍光画像間における相関計算の積和計算を模式的に示している。
【図６】１フレーム目と３フレーム目の蛍光画像間における相関計算の積和計算を模式的に示している。
【図７】１フレーム目とＫフレーム目の蛍光画像間における相関計算の積和計算を模式的に示している。
【図８】式（１）と式（２）における変数ξ、ψ、ηと計算に使用するフレームを示している。
【図９】本実施形態による画像解析のフローチャートである。
【図１０】蛍光画像領域と解析領域を示している。
【図１１】小さい分子に対するＲＩＣＳの解析の結果を輝度で示したイメージ画像である。
【図１２】小さい分子に対するＲＩＣＳの解析のフィッティング結果を示している。
【図１３】大きい分子に対するＲＩＣＳの解析の結果を輝度で示したイメージ画像である。
【図１４】大きい分子に対するＲＩＣＳの解析のフィッティング結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照しながら本実施形態について説明する。
【００１７】
図１は、本実施形態による画像解析装置を概略的に示している。この画像解析装置は、試料の蛍光観察のための走査型共焦点光学顕微鏡をベースに構成されている。
【００１８】
図１に示すように、画像解析装置１００は、試料Ｓに励起光を照射する光照射部１１０と、試料Ｓ内の測定点から発せられる光を検出する光検出部１３０と、画像解析に必要な制御を行なう制御部１６０と、試料Ｓを支持する試料ステージ１９０とを有している。
【００１９】
試料Ｓはマイクロプレートやスライドガラスなどの試料容器に収容され、試料ステージ１９０に載置される。試料ステージ１９０は、例えば、試料Ｓを光照射部１１０および光検出部１３０に対して横方向（ｘｙ方向）および高さ方向（ｚ方向）に移動可能に支持する。例えば、試料ステージ１９０は、出力軸が互いに直交する３つのステッピング・モーターを含んでおり、これらのステッピング・モーターによって試料Ｓをｘｙｚ方向に移動し得る。
【００２０】
画像解析装置１００は、多重光照射・多重光検出型である。このため、光照射部１１０はｎチャンネルの光源系１１１を含み、これに対応して光検出部１３０はｎチャンネルの検出系１３１を含んでいる。ｎチャンネルの検出系１３１は、それぞれ、ｎチャンネルの光源系１１１から射出された励起光によって生成された蛍光を検出する。ここで、ｎチャンネルは、チャンネル１、チャンネル２、・・・チャンネルｎによって構成される。チャンネルは、励起光の種類によってそれぞれ異なる。
【００２１】
光照射部１１０のｎチャンネルの光源系１１１は、光源１１２ａ，…，１１２ｎとコリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎとダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎとを含んでいる。光源１１２ａ，…，１１２ｎは、試料Ｓに含まれる蛍光色素を励起して試料Ｓから光（蛍光）を発せさせるための励起光を発する。光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられる励起光の波長は、試料Ｓに含まれる蛍光色素の種類に対応して、互いに相違している。光源１１２ａ，…，１１２ｎは、例えば、試料Ｓ中の蛍光色素に合った発振波長のレーザー光源で構成される。コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎは、それぞれ、光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられた励起光をコリメートする。ダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎは、それぞれ、コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎを通過した励起光を同じ方向に反射する。ダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎは、それぞれ、図１の上方から入射する励起光を透過し、図１の右方から入射する励起光を反射する。その結果、光源１１２ａ，…，１１２ｎからそれぞれ射出された異なる波長の励起光は、ダイクロイックミラー１１６ａの通過後に一本のビームに合成される。ダイクロイックミラー１１６ｎは、励起光を透過する必要がないので、単なるミラーに変更されてもよい。
【００２２】
光照射部１１０はさらに、ダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６と対物レンズ駆動機構１２８を含んでいる。ダイクロイックミラー１２２は、光源系１１１からの励起光をガルバノミラー１２４に向けて反射し、試料Ｓから発せられる蛍光を透過する。ガルバノミラー１２４は、励起光を対物レンズ１２６に向けて反射するとともに、その反射方向を変更する。対物レンズ１２６は、励起光を収束して試料Ｓ内の測定点に照射するとともに、試料Ｓ内の測定点からの光を取り込む。対物レンズ１２６には、微小な共焦点領域（測定点）の形成のために、ＮＡ（開口数）の大きいものが使用される。これにより得られる共焦点領域の大きさは、直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円筒状となる。ガルバノミラー１２４は、測定点をｘｙ方向に走査するｘｙ走査手段を構成している。ｘｙ走査手段は、ガルバノミラーを使用して構成するほかに、音響光学変調素子（ＡＯＭ）やポリゴンミラー、ホログラムスキャナーなどを使用して構成してもよい。対物レンズ駆動機構１２８は、対物レンズ１２６を光軸に沿って移動させる。これにより、測定点がｚ方向に移動される。つまり、対物レンズ駆動機構１２８は、測定点をｚ方向に走査するｚ走査手段を構成している。
【００２３】
光検出部１３０は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２を光照射部１１０と共有している。光検出部１３０はさらに、収束レンズ１３２とピンホール１３４とコリメートレンズ１３６とを含んでいる。収束レンズ１３２は、ダイクロイックミラー１２２を透過した光を収束する。ピンホール１３４は、収束レンズ１３２の焦点に配置されている。つまり、ピンホール１３４は、試料Ｓ内の測定点に対して共役な位置にあり、測定点からの光だけを選択的に通す。コリメートレンズ１３６は、ピンホール１３４を通過した光を平行にする。コリメートレンズ１３６を通過した光は、ｎチャンネルの検出系１３１に入射する。
【００２４】
ｎチャンネルの検出系１３１は、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎと蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎと光検出器１４２ａ，…，１４２ｎとを含んでいる。
【００２５】
ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎは、それぞれ、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって試料Ｓから生成された蛍光の波長領域付近の波長の光を選択的に反射する。ダイクロイックミラー１３８ｎは、光を透過する必要がないので、単なるミラーに変更されてもよい。蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎは、それぞれ、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎによって反射された光から、不所望な波長成分の光を遮断し、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって生成された蛍光だけを選択的に透過する。蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎを透過した蛍光はそれぞれ光検出器１４２ａ，…，１４２ｎに入射する。光検出器１４２ａ，…，１４２ｎは、入射した光の強度に対応した信号を出力する。すなわち、光検出器１４２ａ，…，１４２ｎは、試料Ｓ内の測定点からの蛍光強度信号を出力する。
【００２６】
制御部１６０は例えばパーソナルコンピューターで構成される。制御部１６０は、試料Ｓの観察領域の蛍光画像の取得と記憶と表示、取得する蛍光画像のフレーム数（枚数）や解析領域や所望パラメータの設定の入力待ち、画像解析（相関値の算出）、拡散時間の推定などを行なう。また制御部１６０は、ｘｙ走査手段であるガルバノミラー１２４、ｚ走査手段である対物レンズ駆動機構１２８、試料ステージ１９０などの制御を行なう。
【００２７】
図１に示される制御部の機能ブロックを図２に示す。制御部１６０は、図２に示すように、走査制御部１６２と画像形成部１６４と記憶部１６６と表示部１６８と入力部１７０と解析領域設定部１７２と画像選定部１７４とデータ抽出部１７６と解析部１７８とステージ制御部１８０とを含んでいる。走査制御部１６２は、試料Ｓの蛍光画像を取得する際、励起光の照射位置を試料Ｓに対してラスター走査するようにガルバノミラー１２４を制御する。走査制御部１６２はまた、必要であれば、励起光の照射位置を試料Ｓに対してｚ走査するように対物レンズ駆動機構１２８を制御する。画像形成部１６４は、走査制御部１６２から入力される励起光の照射位置の情報と光検出器１４２ａ，…，１４２ｎの出力信号とから試料Ｓの蛍光画像を形成する。記憶部１６６は、画像形成部１６４で形成された蛍光画像を順次記憶する。表示部１６８は、試料Ｓの蛍光画像や解析結果を表示する。入力部１７０は、例えばマウスやキーボードを含み、表示部１６８と共同してＧＵＩを構成する。このＧＵＩは、取得フレーム数や観察領域や解析領域の設定、所望パラメータの入力などに利用される。ステージ制御部１８０は、例えば観察領域を設定するために、入力部１７０からの入力情報に従って試料ステージ１９０を制御する。解析領域設定部１７２は、入力部１７０からの入力情報に従って解析領域を設定する。画像選定部１７４は、入力部１７０から入力される所望パラメータに基づいて解析に利用する１フレーム以上の蛍光画像を選定する。データ抽出部１７６は、解析領域設定部１７２と画像選定部１７４からの入力情報に基づいて、記憶部１６６に記憶されている蛍光画像から必要なデータを抽出する。必要なデータは状況によって変わる。必要なデータは、例えば、記憶部１６６に記憶されているすべての蛍光画像のすべてのピクセルのデータまたは一部のピクセルのデータであってよく、あるいは、記憶部１６６に記憶されている一部の蛍光画像のすべてのピクセルのデータまたは一部のピクセルのデータであってもよく、また、１フレームの蛍光画像のすべてのピクセルのデータまたは一部のピクセルのデータであってもよい。解析部１７８は、データ抽出部１７６によって抽出されたデータに対して後述する相関値の演算を行なう。
【００２８】
図１において、光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられた励起光は、コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎとダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎとダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６を経て試料Ｓ内の測定点に照射される。励起光が照射される測定点は、ガルバノミラー１２４によってｘｙ方向にラスター走査される。さらに必要であれば、対物レンズ駆動機構１２８によってｚ走査される。励起光を受けた試料Ｓは測定点から蛍光を発する。試料Ｓからの光（蛍光のほかに不所望な反射光などを含む）は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２と収束レンズ１３２を経てピンホール１３４に至る。ピンホール１３４は測定点と共役な位置にあるため、試料Ｓ内の測定点からの光だけがピンホール１３４を通過する。ピンホール１３４を通過した光すなわち試料Ｓ内の測定点からの光はコリメートレンズ１３６を経てｎチャンネルの検出系１３１に入射する。ｎチャンネルの検出系１３１に入射した光は、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎによって波長に従って分離される（つまり分光される）とともに、蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎによって不所望な成分が除去される。その結果、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって生成された蛍光だけが光検出器１４２ａ，…，１４２ｎにそれぞれ入射する。光検出器１４２ａ，…，１４２ｎは、それぞれ、入射光すなわち試料Ｓ内の測定点から発せられた蛍光の強度を示す蛍光強度信号を出力する。この蛍光強度信号は画像形成部１６４に入力される。画像形成部１６４は、１回のラスター走査（およびｚ走査）ごとに、入力される蛍光強度信号をｘｙ方向（およびｚ方向）の位置情報に同期させて処理して、試料Ｓ内の焦点面（測定点が移動した平面または曲面）の１フレームの蛍光画像を形成する。形成された蛍光画像は、記憶部１６６に保存される。ここに述べた一連の動作は、設定された取得するフレーム数だけ繰り返され、設定されたフレーム数の蛍光画像が取得される。各蛍光画像は、ピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる。
【００２９】
記憶部１６６に保存された蛍光画像は、必要に応じて処理され、表示部１６８に表示される。例えば、測定点のｚ位置を変えて複数フレームの蛍光画像を取得し、それらを合成して三次元画像を形成し、これを表示部１６８に表示することも可能である。
【００３０】
以下、本実施形態による画像解析の手法について説明する。本実施形態による画像解析において最も重要な部分は、ＲＩＣＳのようなイメージ画像データを計算の元とする相関解析において、観察可能な拡散時間を拡張するために、空間相関計算式に所望パラメータを導入したことにある。
【００３１】
次式（１）は、本実施形態において使用するＲＩＣＳの解析に使用する空間相関計算式を表している。
【数１】
2010237116.tif 000003
【００３２】
ここで、ＧｓはＲＩＣＳの相関値、Ｉ１０はチャンネル１の１フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、Ｉ１ηはチャンネル１のη＋１フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ηは０以上の整数の所望パラメータ（η＝０，１，…，Ｋ−１）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ０ηはチャンネル１の１フレーム目とη＋１フレーム目の積和計算の回数、Ｍ０はチャンネル１の１フレーム目のデータ数、Ｍηはチャンネル１のη＋１フレーム目のデータ数である。
【００３３】
次式（２）は、本実施形態において使用するＲＩＣＳの解析に使用するフィッティング式を表している。
【数２】
2010237116.tif 000004
【００３４】
ここで、ＳはＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、ＧはＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、Ｗ０は励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間を表している。
【００３５】
η＝０のとき、式（１）は次式（３）で表される。ここで、τｆは、任意のフレームの最初のピクセルと、その次のフレームの最初のピクセルと、の間の取得時間のずれである。すなわち、フレーム時間は、一フレームを走査するのに要する時間を意味する。
【数３】
2010237116.tif 000005
【００３６】
ここで、Ｉ１０はチャンネル１の１フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ００はチャンネル１の１フレーム目の積和計算の回数、Ｍ０はチャンネル１の１フレーム目のデータ数である。
【００３７】
また式（２）は次式（４）で表される。
【数４】
2010237116.tif 000006
【００３８】
式（３）と式（４）は、それぞれ、ＲＩＣＳの解析における従来の空間相関計算式とフィッティング式と同じである。つまり、本実施形態において使用するＲＩＣＳの解析の空間相関計算式は、η＝０の場合には、従来のＲＩＣＳの解析の空間相関計算式と同じになる。
【００３９】
本実施形態において導入した所望パラメータηは、複数フレームの蛍光画像に対して、相関解析に利用する蛍光画像を選定するためのものである。より詳しくは、１フレーム目の蛍光画像のほかに、相関解析に利用する蛍光画像を選定するためのものである。このため、η＝０の場合には、１フレーム目の蛍光画像のほかに相関解析に利用する蛍光画像はなく、その結果、ＲＩＣＳの解析の空間相関計算式は従来と同じになる。
【００４０】
相関解析に利用する蛍光画像は、例えば、取得した蛍光画像のすべてであってよい。
【００４１】
以下、取得した蛍光画像を相関解析に利用する例について説明する。図３に示すように、Ｋフレームの蛍光画像を取得したとする。ここでＫは２以上の整数である。この場合、η＝Ｋ−１となる。
【００４２】
式（１）と式（２）を使用する計算は、ηの値を０，１，２，…，Ｋ−１と順に変えつつ、ηの各値に対して、さらにξ，ψを順に変えつつ行なう。例えば、解析領域Ｒ２が２５６ピクセル×２５６ピクセルの領域である場合、ξ，ψをそれぞれ０，１，２，…，２５５と順に変える。
【００４３】
例えば、η＝０，ψ＝０に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、次にψを１増やし、η＝０，ψ＝１に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、この計算処理をψ＝２５５になるまで繰り返す。その後、ηを１増やし、η＝１，ψ＝０に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、次に、η＝１，ψ＝１に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、この計算処理をψ＝２５５になるまで繰り返す。この計算処理はηを１ずつ増やしながら、η＝Ｋ−１になるまで繰り返す。
【００４４】
図４は、Ｇｓ（２，４，０）中の積和計算を模式的に示している。この計算は、同一フレーム（１フレーム目）の画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータ間の相関計算である。これは、ＲＩＣＳの解析の従来の相関計算と同様である。
【００４５】
図５は、Ｇｓ（２，４，１）中の積和計算を模式的に示している。この計算は、異なるフレームの画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータの間の相関計算である。具体的には、１フレーム目の画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータと２フレーム目の画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータとの間の相関計算である。
【００４６】
同様に、図６は、Ｇｓ（２，４，２）中の積和計算を模式的に示している。つまり、１フレーム目の画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータと３フレーム目の画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータとの間の相関計算を示している。また図７は、Ｇｓ（２，４，Ｋ−１）中の積和計算を模式的に示している。つまり、１フレーム目の画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータとＫフレーム目の画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータとの間の相関計算を示している。
【００４７】
図８は、式（１）と式（２）における変数ξ，ψ，ηと計算に使用するフレームを示している。図８から、本実施形態による式（１）と式（２）を使用した計算では、遅延時間が拡張されていることがわかる。具体的には、遅延時間は、２５６τｐ＋２５５τｌを超えて、２５６τｐ＋２５５τｌ＋（Ｋ−１）τｆまで拡大されている。
【００４８】
ここで、遅延時間とは、一の画素の取得時間と、別の画素の取得時間と、の差を意味している。例えば、（ξ，ψ，η）＝（１，１，０）と、（ξ，ψ，η）＝（４，２，０）と、の遅延時間は、（４−１）τｐ＋（２−１）τｌ＋（０−０）τｆで表される。
【００４９】
そして、一つの遅延時間に対して、一つの相関値Ｇｓが得られる。ここで、理想的には、遅延時間が小さいほど、相関値Ｇｓは大きくなり、遅延時間が大きいほど、相関値Ｇｓは小さくなる。
【００５０】
取得した蛍光画像のすべてを相関解析に利用すれば、正しい解析結果を得られるが、すべての蛍光画像を利用すると、その分、計算処理が増えるので計算に時間がかかり、効率が悪い。このため、取得した蛍光画像のすべてを相関解析に利用する代わりに、相関解析に利用する蛍光画像のフレーム数を適当に少なくする、すなわちηの値を十分に相関解析できる範囲内で、適当に小さく設定するとよい。
【００５１】
しかし、ηの値が小さ過ぎると、データ数が不足するため、言い換えれば、十分な遅延時間が取れないために、解析結果が正しくないものになる。すなわち、ηの値が小さ過ぎると、拡散時間が長い分子を観察する場合には、最大の遅延時間の半分の時間よりも分子拡散時間の方が長い場合がある。この場合には、適切に、拡散時間を算出することができない。
【００５２】
従って、ηの値は、適切な解析結果が得られる範囲において、なるべく小さく設定するとよい。そのようなηの値の設定は、例えば、拡散時間を推定し、推定された拡散時間（推定拡散時間）に基づいて行なうとよい。
【００５３】
このようなηの値の設定は、例えば、次のようにして行なう。
【００５４】
まず、式（１）と式（２）中の所望パラメータηを０とした式（３）と式（４）を使用してＲＩＣＳの解析を行ない、拡散時間を推定する。具体的には、式（３）を用いて、異なる遅延時間に対する相関値Ｇｓをそれぞれ求める。そして、遅延時間と相関値Ｇｓとの関係から、式（４）を用いて、拡散定数と分子数を求める。
【００５５】
すなわち、遅延時間がゼロのときは（ξ＝０、ψ＝０）、Ｓは１であり、Ｇｓは１／Ｎで表せる。従って、分子数を求めることができる。これを新たに、式（４）に代入することで、各遅延時間に対応した拡散定数を求めることができる。拡散定数からは、拡散時間を求めることができる。
【００５６】
すなわち、拡散定数と、拡散時間との関係は、次式（５）で表される。
【数５】
2010237116.tif 000007
【００５７】
ここで、Ｄは拡散定数、τは拡散時間、Ｗ０は励起レーザビームの横方向の半径を意味する。
【００５８】
なお、拡散時間の短い分子について解析しているのであれば、ηが０であっても、得られる拡散時間は、適切な拡散時間を示している。最大の遅延時間が、拡散時間の２倍よりも大きい場合、式（４）を用いて十分にフィッティングできるからである。
【００５９】
一方、拡散時間の長い分子について解析しているのであれば、ηが０の場合、式（４）を用いてフィッティングしても、そこから得られる拡散時間は、必ずしも、実際の拡散時間と一致しない。従って、この場合は、拡散時間の推定に過ぎない。
【００６０】
次に、次式（６）を使用してηminを求める。
【数６】
2010237116.tif 000008
【００６１】
ここで、τＤは推定拡散時間、ξｍａｘ，ψｍａｘは１フレーム中の空間的座標の変化の最大値、ｎは２以上の整数である。
【数７】
2010237116.tif 000009
【００６２】
さらに、上式（７）を満足する最小値の整数をηに設定する。
【００６３】
一般に、相関値の算出には、最大の遅延時間が、拡散時間の２倍程度あればよいとされている。最大の遅延時間が、拡散時間の２倍よりも短いと、式（２）を用いて適切にフィッティングすることが困難となる。従って、少なくともｎ＝２とした上で、式（６）（７）を用いて、ηを算出すれば、式（２）を用いて適切にフィッティングすることができると考えられる。ただし、解析結果に求められる精度に応じて、ｎを３以上の整数に設定してもよい。これにより、式（７）を満足するηを代入した式（１）と式（２）を使用したＲＩＣＳの解析であれば、適切な解析結果が得られると考えられる。
【００６４】
これまでの説明から分かるように、本実施形態による所望パラメータηを導入したＲＩＣＳの相関解析は大きく分けて三つの部分からなる。
【００６５】
第一の部分は、式（１）と式（２）中の所望パラメータηをゼロとした場合の式（３）と式（４）を用いて拡散時間を推定する部分である。まずは、複数フレームの蛍光画像から相関解析を行なう領域（解析領域）のデータを抽出する（フレーム全体のデータを使う場合は不要）。次に、解析領域のデータを元に所望パラメータをゼロとした式（３）と式（４）を用いてＲＩＣＳの解析を行ない、拡散時間を推定する。所望パラメータをゼロとした場合の式（３）と式（４）によるＲＩＣＳの解析では、図４と同様に、相関計算の主な部分は、同一フレーム中のデータ（矢印両端データの）による積和計算からなる。
【００６６】
第二の部分は、推定された拡散時間（推定拡散時間）により、式（６）と式（７）を用いて所望パラメータを算出する部分である。このように算出したゼロでない所望パラメータを用いることで、観察可能な拡散時間が拡張される。
【００６７】
最後の部分は、第二の部分で算出した所望パラメータを式（１）と式（２）に代入し、相関値を算出する。そして、再び拡散時間等を含むＲＩＣＳの解析を行なう。また、この算出した所望パラメータを用いる式（１）と式（２）によるＲＩＣＳの解析は、図３〜図７に示したように、相関計算の積和計算は、同一フレーム中のデータ積和計算から異なるフレーム間のデータ（矢印両端データの）積和計算に拡張されていく。
【００６８】
上記の画像解析の主な手順は図９のフローチャートで示される。
【００６９】
＜ステップＳ１＞：
試料Ｓの観察領域と取得する蛍光画像のフレーム数を設定した上で、前述した１フレームの蛍光画像を取得する動作を設定したフレーム数の回数だけ繰り返して、設定したフレーム数の蛍光画像を取得する。蛍光画像の取得は、もちろん、同一の観察領域に対して同一の走査方法によって行なう。取得する複数フレームの蛍光画像は、時系列的に取得された画像であり、各画像は、ピクセルデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる。
【００７０】
＜ステップＳ２＞：
図１０に示すように、蛍光画像領域Ｒ１に対して解析領域Ｒ２を設定する。解析領域Ｒ２は、蛍光画像領域Ｒ１の一部に限定されるものではなく、蛍光画像領域Ｒ１に一致していてもよい。解析領域Ｒ２は、アプリケーション的にはデフォルトで蛍光画像領域Ｒ１すなわちステップＳ１における走査領域に設定されており、蛍光画像領域Ｒ１の全体を解析する場合には、このステップは不要である。
【００７１】
＜ステップＳ３＞：
式（１）と式（２）の所望パラメータηをゼロとして式（３）と式（４）を得る。
【００７２】
＜ステップＳ４＞：
ステップＳ２で設定した解析領域Ｒ２に基づいて、１フレーム目の蛍光画像の解析領域Ｒ２のピクセルのデータを抽出する。抽出したデータとステップＳ３の式（３）と式（４）（ＲＩＣＳの相関解析）から拡散定数を算出する。そして、算出された拡散定数を用いて、式（５）から、その拡散時間を推定する。
【００７３】
＜ステップＳ５＞：
推定した拡散時間と式（６）と式（７）を用いて所望パラメータηを算出する。
【００７４】
＜ステップＳ６＞：
算出した所望パラメータηを式（１）と式（２）に代入して新たなＲＩＣＳの空間相関計算式を得る。
【００７５】
＜ステップＳ７＞：
ステップＳ５で算出した所望パラメータηに基づいて解析に利用する蛍光画像を選定する。より具体的には、１フレーム目からη＋１フレーム目までの連続して取得された画像を選定する。また、ステップＳ２で設定した解析領域Ｒ２に基づいて、解析に利用する蛍光画像の解析領域Ｒ２のピクセルのデータを抽出する。抽出したデータとステップＳ６で得た新たなＲＩＣＳの空間相関計算式により相関解析を行なう。
【００７６】
＜ステップＳ８＞：
ステップＳ７で算出した結果を輝度値によるイメージ画像で表示する。
【００７７】
図１１〜図１４は、ＲＩＣＳの解析の結果を示している。図１１は、小さい分子に対する相関計算結果を輝度で示したイメージ画像であり、図１２はそのフィッティング結果を示している。図１３は、大きい分子に対する相関計算結果を輝度で示したイメージ画像であり、図１４はそのフィッティング結果を示している。
【００７８】
本実施形態によれば、ＲＩＣＳの画像解析において、ピクセル時間とライン時間を調整することなく、観察可能な拡散時間を拡張できる。このため、データ収集をし直さなくても、すでに取得したデータを用いて試料に適した拡散時間を推測することができる。これにより、大きい拡散時間の分子についても、小さい拡散時間の分子についても、適切な拡散時間を算出することが可能となる。
【００７９】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【００８０】
上述した実施形態では、解析に利用する画像の選定において、１フレーム目および必要に応じてそれ以降の画像を選定しているが、選定する画像の先頭は必ずしも１フレーム目である必要はない。例えば、ｋフレームの画像からｊフレームの画像を解析に利用する場合、選定する画像は、ｉフレーム目からｉ＋ｊ−１フレーム目までの画像であってもよい。ただし、ｉ＋ｊ−１≦ｋである。また実施形態では、選定する画像は、時系列において連続しているが、必ずしもその必要はない。ただし、遅延時間ごとに、相関値が求められるため、ラスター走査が周期的であれば、選定される画像のフレームナンバーも周期的である必要がある。例えば、解析に利用する画像は、１フレーム目、４フレーム目、７フレーム目と、二つおきに、選定されても良い。
【００８１】
実施形態では、相関値の演算に使用する各ピクセルのデータとして、そのピクセルのデータをそのまま相関計算に使用したが、複数のピクセルのデータを読み出してそれらの統計値を相関計算に使用してもよい。統計値としては、例えば、平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差、相対比があげられる。どのような統計値を使用するかは、ＲＩＣＳの解析によってどのような情報を得たいかによって決める。例えば、最大値で分類すると、同じ最大値分類のフレームからの同じ分子影響を除去することができる。他の場合も同様で、同分類フレームから同じ分子影響を除去することができる。つまり、基準が変わると、フレームの分類が変わり、それぞれ異なる分子影響の除去が可能となる。
【００８２】
また実施形態では、ラスター走査によって取得された画像について説明したが、画像は、ラスター走査によって取得されたものに限定されるものではなく、ピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる画像であればよく、他の走査方法によって取得されたものであってもよい。
【００８３】
また実施形態では、ピクセルのデータを蛍光強度のデータでとして説明したが、ピクセルのデータは、他のデータであってもよい。
【００８４】
また実施形態では、同一のチャンネルのピクセルのデータを用いて相関解析する、自己相関解析について説明した。これに代えて、異なるチャンネルのピクセルのデータを用いて、相関解析する、相互相関解析を行ってもよい。この場合、次式（８）で表される。
【数８】
2010237116.tif 000010
【００８５】
ここで、Ｇｓ´はＲＩＣＳの相互相関値、Ｉ１０はチャンネル１の１フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、Ｉ２ηはチャンネル２のη＋１フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ηは０以上の整数の所望パラメータ（η＝０，１，…，Ｋ−１）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２はチャンネル１の１フレーム目とチャンネル２のη＋１フレーム目の積和計算の回数、Ｍ１はチャンネル１の１フレーム目のデータ数、Ｍ２はチャンネル２のη＋１フレーム目のデータ数である。
【符号の説明】
【００８６】
１００…画像解析装置、１１０…光照射部、１１２…光源、１１６…ミラー、１２２…ダイクロイックミラー、１２４…ガルバノミラー、１２６…対物レンズ、１２８…対物レンズ駆動機構、１３０…光検出部、１３２…収束レンズ、１３４…ピンホール、１３６…コリメートレンズ、１３８…蛍光フィルター、１４０…収束レンズ、１４２…光検出器、１６０…制御部、１６２…走査制御部、１６４…画像形成部、１６６…記憶部、１６８…表示部、１７０…入力部、１７２…解析領域設定部、１７４…画像選定部、１７６…データ抽出部、１７８…解析部、１８０…ステージ制御部、１９０…試料ステージ、Ｒ１…蛍光画像領域、Ｒ２…解析領域。
【図１】
2010237116.tif 000023
【図２】
2010237116.tif 000024
【図３】
2010237116.tif 000025
【図４】
2010237116.tif 000026
【図５】
2010237116.tif 000027
【図６】
2010237116.tif 000028
【図７】
2010237116.tif 000029
【図８】
2010237116.tif 000030
【図９】
2010237116.tif 000031
【図１０】
2010237116.tif 000032
【図１１】
2010237116.tif 000033
【図１２】
2010237116.tif 000034
【図１３】
2010237116.tif 000035
【図１４】
2010237116.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月14日(2009.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
したがって、これらのピクセルのデータを用いて、空間自己相関解析することで、分子の揺らぎによる相関特性を得ることができる。ここで、分子の相関特性からは、拡散定数や分子数を求めることができる。また、拡散定数からは、分子拡散時間を求めることができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
このように、空間自己相関解析をすることで、拡散時間や分子数等を評価することができるため、分子間の相互作用を観察することが可能である。