(57)【要約】【課題】タンパク質の糖鎖付加に関わる、鱗翅目及びナス目α１，３−フコシルトランスフェラーゼを単離・同定すること、並びに鱗翅目及びナス目において前記α１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制することによって、本来非ヒト型糖鎖を付加する動植物タンパク質生産系においてヒト型糖鎖を付加したタンパク質を生産する方法を提供する。【解決手段】  α１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する方法であって、鱗翅目においてα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制するＤＮＡを細胞内に導入する工程と、当該細胞内で前記ＤＮＡを発現させる工程とを有する方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鱗翅目のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡにおいて、
前記ＤＮＡは、カイコのα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡであって、
以下（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
ナス目のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載のＤＮＡにおいて、
前記ＤＮＡは、トマトのα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。
【請求項６】
請求項４記載のＤＮＡであって、
以下（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号：４に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｇ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｈ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
鱗翅目においてα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ｉ）請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡの転写産物と相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
ナス目においてα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する、以下（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ｉｖ）請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡの転写産物と相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｖ）請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｖｉ）請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項７または８のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換細胞から得られる形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換体の子孫またはクローンである、形質転換体。
【請求項１３】
請求項１１または１２のいずれか記載の形質転換体の繁殖材料。
【請求項１４】
請求項１１または１２のいずれか記載の形質転換体の製造方法であって、
請求項７記載のＤＮＡを鱗翅目由来の卵に導入する工程と、
当該ＤＮＡが導入された卵から生じた動物体の中から、形質転換動物を選択する工程と
を有する方法。
【請求項１５】
請求項１１または１２のいずれか記載の形質転換体の製造方法であって、
請求項８記載のＤＮＡをナス目由来の細胞に導入する工程と、
当該細胞を有する植物体から、形質転換植物を選択する工程と
を有する方法。
【請求項１６】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する方法であって、
請求項７または８のいずれか記載のＤＮＡを細胞内に導入する工程と、
当該細胞内で前記ＤＮＡを発現させる工程と
を有する方法。
【請求項１７】
請求項７または８のいずれか記載のＤＮＡを含む形質転換細胞または形質転換体に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを導入し発現させて得られる組換えタンパク質。
【請求項１８】
請求項１７記載のタンパク質を製造する方法であって、
請求項７または８のいずれか記載のＤＮＡを含む形質転換細胞または形質転換体を培養する工程と、
当該形質転換細胞または形質転換体若しくはそれらの培養上清から組換えタンパク質を回収する工程と
を有する方法。
【請求項１９】
請求項７記載のＤＮＡを含む形質転換細胞または形質転換体に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを感染させて得られる組換えタンパク質。
【請求項２０】
請求項１９記載のタンパク質を製造する方法であって、
請求項７記載のＤＮＡを含む形質転換細胞または形質転換体に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを感染させる工程と、
当該形質転換細胞または形質転換体において発現した組換えタンパク質を回収する工程と
を有する方法。
【請求項２１】
請求項７または８のいずれか記載のＤＮＡを含む形質転換体と、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体とを交配させて得られる動物体若しくは植物体から得られる組換えタンパク質。
【請求項２２】
請求項１７、１９、または２１のいずれか記載のタンパク質と、薬学的に許容可能な担体とからなる薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ及び、前記α１，３−フコシルトランスフェラーゼを利用した、動植物においてヒト型糖鎖を付加したタンパク質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生命科学分野において、遺伝子組換え技術を始めとする遺伝子操作技術が大きな役割を果たしている。例えば、遺伝子組換えマウスや遺伝子組換えイネ等、遺伝子操作により種々の細胞を改変し、新たな形質若しくは有用形質を付加することが可能となっている。
【０００３】
このような遺伝子操作技術を用いて、ヒト以外の生物を生産宿主としてヒトに用いる糖タンパク質を生産することが以前から検討されている。まず、その生産宿主としては、管理面、発現体確立の容易性の観点から、従来から大腸菌が用いられてきたが、原核生物である大腸菌は、タンパク質に糖鎖を付加する機能を有していないため、ヒト型の糖鎖を付加したタンパク質を生産できないという根本的な問題があった。そのため現在では、タンパク質に糖鎖を付加する機能を備えている植物体若しくは植物細胞又は昆虫細胞等が生産宿主として検討されるに至っている。
【０００４】
しかし、植物若しくは昆虫によって生産された糖タンパク質は、ヒト体内において、その糖タンパク質本来の活性・機能を示さない場合が多い。これは、植物及び昆虫の糖鎖付加機構がヒトと異なり、それに応じて、糖タンパク質の糖鎖構造が植物及び昆虫とヒトとで異なるためである。例えば、植物及び昆虫を生産宿主として糖タンパク質を生産させた場合、このタンパク質がヒトに対して抗原性を有する場合が多い。
【０００５】
この抗原性は、糖タンパク質のα１，３−コアフコースを含む糖鎖部分に起因する。このα１，３−結合は、植物や昆虫に由来するα１，３−フコシルトランスフェラーゼによってフコースが糖タンパク質に付加されることにより形成される。そこで、このような抗原性を回避するために、α１，３−フコシルトランスフェラーゼの不活性化が望まれる。
【０００６】
具体的には、糖タンパク質の糖鎖部分は、コア構造に糖が付加された構造となっており、生物種に依存して異なる。コア構造の還元末端部位に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基へのフコースの結合は、糖鎖付加の１つの様式であり、植物ではα１，３−結合、ヒトやマウスなどの哺乳類ではα１，６−結合、昆虫ではα１，３−結合及びα１，６−結合の両方が見出されている。
【０００７】
このうち植物では、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）でα１，３−フコシルトランスフェラーゼを単離・同定すること、及びその発現を抑制する方法が非特許文献１及び特許文献１に開示されている。
【０００８】
また、昆虫では、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）でα１，３−フコシルトランスフェラーゼを単離・同定することが非特許文献２に開示されている。
【０００９】
【特許文献１】特表２００２−５３６９７８号公報
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９  Ｊｕｌ  ３０；２７４（３１）：２１８３０−９
【非特許文献２】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１  Ｊｕｌ  ２７；２７６（３０）：２８０５８−６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、タンパク質の糖鎖付加に関わる、鱗翅目及びナス目α１，３−フコシルトランスフェラーゼを単離・同定すること、並びに鱗翅目及びナス目において前記α１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制することによって、本来非ヒト型糖鎖を付加する動植物タンパク質生産系においてヒト型糖鎖を付加したタンパク質を生産する方法を提供することを目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、鱗翅目及びナス目のタンパク質生産系における糖タンパク質の生産に関与する遺伝子に関する。α１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、鱗翅目及びナス目のタンパク質生産系においてＮ−アセチルグルコサミン残基にフコースを付加する酵素をコードする遺伝子として、染色体のいずれかの場所に存在すると予測されている。本発明者らは、その存在領域を解明し、単一の遺伝子として単離することを試みた。
【００１２】
まず、本発明者らは、ショウジョウバエ由来のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＡの活性モチーフを含むアミノ酸配列をソースに、カイコのゲノムデータベース検索を行った。また、この検索結果から候補となるゲノム配列を選定し、さらにエキソンを含む領域のクローニングを行い、カイコα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ候補遺伝子を取得した。
【００１３】
また本発明者らは、シロイヌナズナα−１，３−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子配列をソースに、トマトｃＤＮＡから相同性の高いゲノム配列を同定し、トマトα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ候補遺伝子とした。
【００１４】
その後、本発明者らは、鋭意検討の結果、鱗翅目動物若しくはナス目植物を用いてヒト用糖タンパク質を生産する際、鱗翅目及びナス目が有するα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制することにより、ヒト型糖鎖を付加したタンパク質が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下の構成からなる。
【００１５】
〔１〕鱗翅目のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔２〕〔１〕のＤＮＡにおいて、前記ＤＮＡは、カイコのα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。
〔３〕〔１〕のＤＮＡであって、以下（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔４〕ナス目のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔５〕〔４〕のＤＮＡにおいて、前記ＤＮＡは、トマトのα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。
〔６〕〔４〕のＤＮＡであって、以下（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号：４に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｇ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｈ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔７〕鱗翅目においてα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ｉ）〔１〕〜〔３〕のいずれか記載のＤＮＡの転写産物と相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）〔１〕〜〔３〕のいずれか記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）〔１〕〜〔３〕のいずれか記載のＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
〔８〕ナス目においてα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する、以下（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ｉｖ）〔４〕〜〔６〕のいずれか記載のＤＮＡの転写産物と相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｖ）〔４〕〜〔６〕のいずれか記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｖｉ）〔４〕〜〔６〕のいずれか記載のＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
〔９〕〔７〕または〔８〕のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
〔１０〕〔９〕の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
〔１１〕〔１０〕の形質転換細胞から得られる形質転換体。
〔１２〕〔１１〕の形質転換体の子孫またはクローンである、形質転換体。
〔１３〕〔１１〕または〔１２〕のいずれか記載の形質転換体の繁殖材料。
〔１４〕〔１１〕または〔１２〕のいずれか記載の形質転換体の製造方法であって、〔７〕のＤＮＡを鱗翅目由来の卵に導入する工程と、当該ＤＮＡが導入された卵から生じた動物体の中から、形質転換動物を選択する工程とを有する方法。
〔１５〕〔１１〕または〔１２〕のいずれか記載の形質転換体の製造方法であって、〔８〕のＤＮＡをナス目由来の細胞に導入する工程と、当該細胞を有する植物体から、形質転換植物を選択する工程とを有する方法。
〔１６〕α１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する方法であって、〔７〕または〔８〕のいずれか記載のＤＮＡを細胞内に導入する工程と、当該細胞内で前記ＤＮＡを発現させる工程とを有する方法。
〔１７〕〔７〕または〔８〕のいずれか記載のＤＮＡを含む形質転換細胞または形質転換体に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを導入し発現させて得られる組換えタンパク質。
〔１８〕〔１７〕のタンパク質を製造する方法であって、〔７〕または〔８〕のいずれか記載のＤＮＡを含む形質転換細胞または形質転換体を培養する工程と、当該形質転換細胞または形質転換体若しくはそれらの培養上清から組換えタンパク質を回収する工程とを有する方法。
〔１９〕〔７〕記載のＤＮＡを含む形質転換細胞または形質転換体に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを感染させて得られる組換えタンパク質。
〔２０〕〔１９〕のタンパク質を製造する方法であって、〔７〕記載のＤＮＡを含む形質転換細胞または形質転換体に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを感染させる工程と、当該形質転換細胞または形質転換体において発現した組換えタンパク質を回収する工程とを有する方法。
〔２１〕〔７〕または〔８〕のいずれか記載のＤＮＡを含む形質転換体と、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体とを交配させて得られる動植物体から得られる組換えタンパク質。
〔２２〕〔１７〕、〔１９〕、または〔２１〕のいずれか記載のタンパク質と、薬学的に許容可能な担体とからなる薬学的組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼは、糖鎖コア構造の還元末端部位に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３−結合によりフコースを付加する酵素である。前記酵素をコードする遺伝子を単離・同定し、更に、前記遺伝子の発現を抑制することにより、ヒト型糖鎖を付加した糖タンパク質を安定的に生産できるようになった。この新手法により、鱗翅目動物若しくはナス目植物を用いて、ヒト型糖鎖を付加したタンパク質を生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（実施形態１）
まず鱗翅目に係る本発明の実施形態を説明する。
【００１８】
ここで鱗翅目動物の例としては、アゲハチョウ科（Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ）、タテハチョウ科（Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、スズメガ科（Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ）、カイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）等が挙げられ、ギフチョウ、オオムラサキ、スズメガ、カイコガ等が含まれる。また、タンパク質生産の際には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｔｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ等の鱗翅目動物細胞が宿主として用いられる。
【００１９】
以下においては、この中のカイコガの幼虫であるカイコの例を説明する。
【００２０】
（１）本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ
本明細書において「α１，３−フコシルトランスフェラーゼ」とは、糖タンパク質のタンパク質部分の合成後、糖鎖付加の際に生じる還元末端アセチルグルコサミン残基にフコース残基を付加する酵素である。この酵素は、ＧＤＰ−フコースを糖供与体として、糖タンパク質のアスパラギン結合型糖鎖の最もペプチド鎖に近いＮ−アセチルグルコサミンにα１，３−結合でフコースを連結させる機能を有する。
【００２１】
本発明は、タンパク質の糖鎖構造に関与するα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを提供する。
【００２２】
本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、具体的には、
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
が含まれる。
【００２３】
ここで、本明細書における「１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列」は、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を失わない限り、その置換等されるアミノ酸数は限定されるものではない。例えば、置換等されるアミノ酸の数は、３０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、特により好ましくは３個以下である。
【００２４】
また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、相同遺伝子をコードするＤＮＡを単離するために行うハイブリダイゼーション反応条件を指し、このハイブリダイゼーション反応は、当業者に既知の方法に準じて行うことができる。
【００２５】
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」としては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２６】
本明細書に係る「α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ」は、「α１，３−フコシルトランスフェラーゼ」をコードするものであれば、その形態に制限はなく、ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡや、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡ等を含む。
【００２７】
ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、カイコからゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作成し、これを展開して、α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：２に記載のＤＮＡ）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション若しくはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、カイコから抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをプラスミド、ファージ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーション若しくはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【００２８】
このＤＮＡを利用することにより、鱗翅目においてヒト型糖鎖が付加された糖タンパク質を生産することが可能となる。ここで「ヒト型糖鎖」とは、糖鎖コア構造の還元末端部分に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基に、α１，３−結合によるフコース残基が存在しない糖鎖を意味する。
【００２９】
（２）本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制するＤＮＡ
本発明はまた、鱗翅目のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制するＤＮＡを提供する。このようなＤＮＡには、具体的には、
（ｉ）鱗翅目α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）鱗翅目α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）鱗翅目α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
が含まれる。
【００３０】
（ｉ）のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡであり、（ｉｉ）のＤＮＡは、触媒活性を有するＤＮＡであり、（ｉｉｉ）のＤＮＡは、内因性のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。
【００３１】
また「α１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制」には、ＤＮＡの転写の抑制及びタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡ発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００３２】
このＤＮＡにより、鱗翅目において、糖鎖コア構造の還元末端部位に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基へのフコースのα１，３−結合を抑制することができる。
【００３３】
（３）本発明の組換えベクター
本発明はまた、（２）で説明した抑制用ＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。
【００３４】
抑制用ＤＮＡを導入するベクターは、細胞内で導入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、昆虫細胞内で恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、アクチンプロモーター）を有するベクターや、外的刺激によって活性が誘導されるプロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）を有するベクターであっても良い。ベクターへの本発明の抑制用ＤＮＡの挿入は、既知の方法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。
【００３５】
上記ベクターには、導入遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、若しくは宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いても良い。例えば、宿主細胞としてカイコを用いる場合には、クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のマーカー遺伝子を組み込んでいても良い。この場合、マーカー遺伝子の上流に３ｘＰ３等のプロモーター配列を組み込み、その作用によりマーカー遺伝子を発現させるようにする。また、大腸菌を用いる場合には、カナマイシン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として組み込んでいても良い。
【００３６】
抑制用ＤＮＡが挿入されたベクターは、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法によって細胞に導入することができる。
【００３７】
本発明のベクターが導入される宿主細胞は特に制限されるものではなく、目的に応じて種々の宿主細胞を用いることができる。例えば、細菌細胞（大腸菌等）、真菌細胞（酵母等）、昆虫細胞（カイコ等）、動物細胞（ＣＨＯ等）、植物細胞等である。
【００３８】
この組換えベクターにより、抑制用ＤＮＡを細胞内で効率的に発現させることができる。
【００３９】
（４）本発明の形質転換細胞、形質転換体、繁殖材料、及びこの形質転換体の製造方法
本発明はまた、（２）で説明した抑制用ＤＮＡ若しくは（３）で説明した組換えベクターが導入された形質転換細胞、前記形質転換細胞から作り出された形質転換体、前記形質転換体の子孫若しくはクローンである形質転換体、これら形質転換体の繁殖材料、並びにこれら形質転換体を製造する方法を提供する。この方法は、具体的には、
（Ａ１）抑制用ＤＮＡを鱗翅目由来の卵に導入する工程、
（Ａ２）当該ＤＮＡが導入された卵から生じた動物体の中から、トランスジェニック動物を選択する工程
とからなる。
【００４０】
ここで、本発明の形質転換細胞は、抑制用ＤＮＡ若しくは組換えベクターが導入された細胞若しくは細胞の集合であって形質転換体である動物を再生し得るものであれば特に制限はない。本発明の形質転換細胞は、例えば卵等である。
【００４１】
組換えベクターを導入した形質転換細胞は、ベクターに導入されている所定のマーカー遺伝子に応じて、種々の方法を用いて選抜することができる。例えば、マーカー遺伝子としてＧＦＰが導入されている場合には、発現したＧＦＰタンパク質の蛍光を検出することによって形質転換細胞の選抜ができる。また、マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子が導入されている場合には、適した選抜用薬剤を有する既知の選抜用培地で培養しても良い。
【００４２】
また、形質転換細胞及び形質転換体に導入されたＤＮＡは、ハイブリダイゼーションやＰＣＲ法等の当業者に公知の方法によって、若しくは昆虫のＤＮＡ塩基配列を解析することによって確認できる。
【００４３】
また、上述の形質転換体の染色体内に抑制用ＤＮＡを導入することで、この形質転換体から有性生殖若しくは無性生殖により子孫を得ることが可能となる。更に、この形質転換体若しくはその子孫又はクローンから繁殖材料（例えば、卵）を得ることで、前記形質転換体を量産することが可能となる。
【００４４】
（５）本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する方法
本発明はまた、（２）で説明した抑制用ＤＮＡを用いてα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する方法を提供する。具体的には、この方法は、
（Ｂ１）抑制用ＤＮＡを細胞内に導入する工程、
（Ｂ２）当該細胞内で抑制用ＤＮＡを発現させる工程、
とからなる。
【００４５】
「ＤＮＡを細胞内に導入する工程」は、例えば、エレクトロポレーション法やパーティクルガン法等の当業者にとって既知の種々の方法を用いて行うことができる。上記のような（５）の方法により、抑制用ＤＮＡを発現可能な状態で含むベクターが細胞に導入され、従って、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を効果的に抑制することが可能となる。
【００４６】
（６）本発明の組換えタンパク質及びその製造方法
本発明はまた、ヒト型糖鎖を付加した組換えタンパク質を提供する。このタンパク質は、（４）で説明した形質転換細胞に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを導入し発現させて得られるものである。また、このタンパク質は、（４）で説明した形質転換細胞に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを感染させて得られるものであっても良い。更に、このタンパク質は、（４）で説明した形質転換体と、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体とを交配させて得られる動物体若しくは植物体から得られる組換えタンパク質であっても良い。
【００４７】
本発明はまた、上記組換えタンパク質の製造方法を提供する。この方法は、具体的には、
（Ｃ１）抑制用ＤＮＡを含むベクターを含む形質転換細胞若しくは形質転換体に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを感染させる工程、
（Ｃ２）当該細胞または形質転換体において発現した組換えタンパク質を回収する工程
とからなる。更に、この方法は、
（Ｄ１）（２）で説明した抑制用ＤＮＡを含むベクターを含む形質転換細胞を培養する工程、
（Ｄ２）当該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程
とからなっても良い。
【００４８】
この方法によって得られる組換えタンパク質は、ヒト型糖鎖を付加された任意のタンパク質である。即ち、糖鎖コア構造の還元末端部位に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基へのフコースのα１，３−結合を有さないタンパク質である。
【００４９】
（７）本発明の薬学的組成物
本発明はまた、（６）で説明した組換えタンパク質と薬学的に許容可能な担体とからなる薬学的組成物を提供する。この担体は、動物体内における送達に適したものであり、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、弛緩剤、懸濁剤、等張化剤、流動性促進剤等を含むが、これらに限定されるものではなく、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、乳糖、デンプン、マンニトール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、白糖、コーンスターチ等である。
【実施例１】
【００５０】
以下に、本発明の実施例を詳細に説明する。
【００５１】
実施例１．１  カイコα１，３−フコース転移酵素のクローニング
独立行政法人  農業生物資源研究所のＫＡＩＫＯＢＬＡＳＴデータベースを用い、相同性検索を行った。検索にはショウジョウバエ由来α−１，３−フコシルトランスフェラーゼＡの活性モチーフを含むアミノ酸配列（Ａｓｐ３５４−Ｍｅｔ３９０）をソースとした。
【００５２】
データベース検索により高い相同性を示した塩基配列について、ＧＥＮＳＣＡＮプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）解析により、エキソン領域を推定した。
【００５３】
ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、エキソンを含む領域を増幅及びクローニングした。ＰＣＲにはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、図１に示す条件で反応した。
【００５４】
ＫＡＩＫＯＢＬＡＳＴ  データベース検索の結果、ショウジョウバエ由来ＦｕｃＴＡ活性モチーフ領域と高い相同性を示すゲノム配列が見出され（図２）、更に、ＧＥＮＳＣＡＮ解析から、完全長ＦｕｃＴに相当するエキソンをコードしている事が示された。
【００５５】
ＦｕｃＴ候補遺伝子について、エキソンを含む領域をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した結果、目的配列と一致するＤＮＡ断片の増幅が確認できた（図３）。
【００５６】
実施例１．２  ＲＮＡｉ用カイコ形質転換ベクターの作製
（１）ＲＮＡｉ用のプラスミドｐＢａｃ［ＵＡＳ−Ａ３ｉ−ＳＶ４０，３ｘＰ３ｅｇｆｐ］の構築
Ｐ５０系統のカイコのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーにＡ３  ｓｈｏｒｔ２−ＲＥ（５'−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＧＣＣＡＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＣＴＣＴＣＧＧＣＣＧＧＴＧＧＧＣＣＧＴＴＡＴＣＧＡＣＣＧＴＴＡＴＣＴＧ−３'）とＡ３  ｓｈｏｒｔ２ｒ−ＥＲ（５'−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＡＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＧＧＣＣＧＡＧＡ−３'）とを用いたＰＣＲにより、カイコのアクチン３遺伝子の第１と第２エキソンの一部を含む第１イントロン領域を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＸｂａ１で処理し、プラスミドｐＢｌｕｅ（ＵＡＳ）（Ｓａｋｕｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，８９４１−８９４６，２００７）のＢｌｎ１サイトに挿入した（図４Ａ）。得られたプラスミドを精製し、Ｘｈｏ１とＢａｍＨ１とで処理することによってＵＡＳとＡ３イントロン、Ｓ４０のポリＡシグナルを含む領域を切り出し、プラスミドｐＢａｃＭＣＳ（Ｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｓｅｒｉｃｏｌ．７５，８９−９７，２００６）の同じ制限酵素の認識配列部位に挿入した（図４Ａ）。このプラスミドのＥｃｏＲ１サイトにプラスミドｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＥＧＦＰ］（Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）をテンプレートとし、３ｘＰ３−ＥＧＦＰ．１３Ｕ１９−ＥｃｏＲＩ（５'−ｇｇｇｇａａｔｔｃＧＣＴＴＣＧＧＴＴＴＡＴＡＴＧＡＧＡＣ−３'）と３ｘＰ３−ＥＧＦＰ．１３５２Ｌ２１−ＥｃｏＲＩ（５'−ｇｇｇｇａａｔｔｃＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣ−３'）とをプライマーとするＰＣＲによって増幅した３ｘＰ３−ＥＧＦＰ断片をＥｃｏＲ１で処理したものを挿入することによって、ｐＢａｃ［ＵＡＳ−Ａ３ｉ−ＳＶ４０，３ｘＰ３ｅｇｆｐ］を作出した（図４Ｂ）。得られた各プラスミドの塩基配列はＡＢＩ自動シークエンサーによって決定した。
【００５７】
（２）フコース転移酵素ＲＮＡｉ用配列のｐＢａｃ［ＵＡＳ−Ａ３ｉ−ＳＶ４０，３ｘＰ３ｅｇｆｐ］への挿入
実施例１．１でクローニングしたフコース転移酵素遺伝子を鋳型とし、以下のプライマーの組み合わせによるＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を、ＲＮＡｉ用のプラスミドｐＢａｃ［ＵＡＳ−Ａ３ｉ−ＳＶ４０，３ｘＰ３ｅｇｆｐ］に逆方向に挿入したベクターを作出した。  
Ｆｕｔ１ｆ（ＮｈｅＩ）：５'−ｇａＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＴＧＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡ−３'
Ｆｕｔ１ｒ（ＣｐｏＩ）：５'−ａａａＣＧＧａＣＧＧＡＴＧＴＴＴＴＡＴＧＴＡＡＴＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴ−３'
Ｆｕｔ２ｆ（ＳｐｅＩ）：５'−ｇｇＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＴＴＡＴＧＴＡＡＴＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴ−３'
Ｆｕｔ２ｒ（ＳｆｉＩ）：５'−ａａＧＧＣＣｔａｃａｔＧＧＣＣＴＴＡＡＴＧＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡ−３'
Ｆｕｔ３ｆ（ＮｈｅＩ）：５'−ｇａＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＴＣＡＡＴＣ−３'
Ｆｕｔ３ｒ（ＣｐｏＩ）：５'−ａａａＣＧＧａＣＣＧＴＧＧＧＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣ−３'
Ｆｕｔ４ｆ（ＳｐｅＩ）：５'−ｇｇＡＣＴＡＧＴＴＧＧＧＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣ−３'
Ｆｕｔ４ｒ（ＳｆｉＩ）：５'−ａａＧＧＣＣｔａｃａｔＧＧＣＣＴＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＴＣＡＡＴＣ−３'
すなわち、ｐＢａｃ［ＵＡＳ−Ａ３ｉ−ＳＶ４０，３ｘＰ３ｅｇｆｐ］のＮｈｅＩ−ＣｐｏＩ間およびＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ間に以下の表１のようにＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を挿入し、転写産物がヘアピン構造をとるようなコンストラクトを３種類作出した（図５）。
【００５８】
【表１】
2010029102.tif 000002
【００５９】
得られた各プラスミドの塩基配列はＡＢＩ自動シークエンサーによって決定した。
【００６０】
実施例１．３  トランスジェニックカイコの作製
実施例１．２で得たプラスミドを精製し、ヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００）と一緒に注射用の緩衝液（５ｍＭ  ＫＣｌ／０．５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０）に溶かし、各プラスミドＤＮＡが２００μｇ／ｍｌになるように注射液を調製した。この液を産卵後８時間以内のｗ１−ｐｎｄ系統のカイコの卵に注射した。その結果、３種類のコンストラクトのうち２種類についてはトランスジェニックカイコが得られた（表２）。このうち、フコース転移酵素の全長が逆方向に挿入されたものについて系統化を行った。その結果、３系統が作出された。これらの系統にカイコの細胞質アクチン遺伝子の上流をプロモーターとするＧＡＬ４系統（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２，１１７５１−７１１７５６，２００５）を交配し、Ｆ１の卵を採種し５℃で保存した。卵を２５℃に移した後、ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの検出用のフィルターを装備した蛍光実体顕微鏡で胚を観察することによって、フコース転移酵素のヘアピンＲＮＡとＧＡＬ４の遺伝子を持つ個体を選抜した。得られた個体を５令まで飼育し、ＲＮＡｉ用の幼虫としてＮＰＶの感染に用いた。
【００６１】
【表２】
2010029102.tif 000003
【００６２】
実施例１．４  トランスジェニックカイコでの糖タンパク質の発現と精製
（１）糖タンパク質の発現
糖タンパク質であるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）を発現する組換えバキュロウイルスを、既存の方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．９８（１）：１−８，２００１）で作製した。５齢２日目の、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ抑制トランスジェニックカイコ及び非トランスジェニックコントロールカイコに、ＰＢＳで１００倍に希釈したＨＡ発現バキュロウイルス（４．７７×１０６ＰＦＵ／ｍｌ）を５０μｌずつ注射した。各々にエサとして蚕用人工飼料を与え２３℃で飼育をおこない、感染後５日後に、虫体を回収した。
【００６３】
（２）糖タンパク質の精製
感染回収カイコ（２０頭）に、３００ｍｌの磨砕バッファー（４０ｍｌの５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０にＥＤＴＡ・２Ｎａを０．７５ｇ、ベンズアミジンを１．６ｇ、過硫酸ナトリウムを０．５ｇ加え、１０００ｍｌにメスアップしたもの）を加え、ホモジェネート及び超音波処理をおこなった。磨砕バッファーをさらに加え、液量を３６０ｍｌとし、これに４０ｍｌの２０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を加え、室温で３０分攪拌した。次に０．１％になるようにプロタミン硫酸を加え攪拌し、４℃で１５分静置した。３，０００ｒｐｍで１５分遠心し、上清を濾紙でろ過し、ＨＡ抽出試料とした。
【００６４】
ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に、Ｆｅｔｕｉｎ（ＳＩＧＭＡ）を添付の説明書に従って結合させた。約２０ｍｌのＦｅｔｕｉｎを結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦをカラムにパッキングし、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で平衡化した。これにＨＡ抽出試料を０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速でカラムにアプライし、その後、平衡化バッファーで非吸着成分を洗い流した。０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む１０ｍＭのホウ酸バッファーｐＨ１０．０で洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む１００ｍＭのホウ酸バッファーｐＨ１０．０でＨＡの溶出をおこない、２８０ｎｍの吸光度でのピークを回収した。
【００６５】
カラム溶出物に、１５％量のＰＥＧ６０００を加え１５分攪拌し、１００００×ｇ  １０分の遠心をおこない、上清を捨てた。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌを加え沈殿を溶解し、精製試料とした。
【００６６】
実施例１．５  トランスジェニックカイコ発現糖タンパク質の糖鎖構造の解析
１．５．１  精製糖タンパク質からの糖鎖の切り出し
（１）脱塩したＨＡタンパク質を凍結乾燥し、完全に乾燥させた。
【００６７】
（２）１．０ｍｌの無水ヒドラジン（東京化成工業）を加え、１００℃で１０時間加熱した。
【００６８】
（３）反応後、アセトン中に反応液を移し、２０分静置した後、４℃、１５分、１２,０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００６９】
（４）上清を捨て、得られたペレットを凍結乾燥し、完全にアセトンを取り除いた。
【００７０】
（５）乾燥したペレットに３ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と１２０μｌの無水酢酸（Ｗａｋｏ）を加えて十分に混合し、室温で２０分静置した。
【００７１】
（６）あらかじめｐＨ２．０に調整しておいたＤＯＷＥＸ５０×２（室町化学工業）を、試料のｐＨが２．０になるまでｐＨ試験紙で確認しながら加えた。ガラスウールを軽くつめたカラムを用いて樹脂と溶液を分離し、５倍容量のｄＨ２Ｏで洗浄して溶出液をナス型フラスコに全て集めた。
【００７２】
（７）この溶出液に適量の１−ブタノールを加えてエバポレータで濃縮し、あらかじめ０．１Ｎアンモニア水で平衡化しておいたＴＳＫ  ｇｅｌ  ＴＯＹＯ  ＰＥＲＡＬ  ＨＷ−４０（ＴＯＳＯＨ）ゲル濾過カラム（２．５×３０ｃｍ）に通し、溶出液を８０滴（約４ｍｌ）ずつ４０フラクションまで分画した。分画は、２１２８  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行った。
（８）各フラクションをよく攪拌した後、１００μｌをとり、１００μｌの５％フェノールとよく混ぜた後、４００μｌの濃硫酸と混合し、糖鎖が存在するフラクションを回収し、適量の１−ブタノールを加え、エバポレータで濃縮した後、更に凍結乾燥で濃縮した。
【００７３】
１．５．２  糖鎖のピリジルアミノ（ＰＡ）化
（１）凍結乾燥した試料にＰＡ化試薬（２．７６ｇ／ｍｌ  ２−アミノピリジン酢酸溶液）をサンプルが十分浸るように加え、９０℃で１時間加熱した。
【００７４】
（２）室温まで冷却した試料にジメチルアミン−ボラン溶液（１９５  ｍｇ／ｍｌ  ホウ酸ジメチルアミン（Ｗａｋｏ）酢酸溶液）を前項で加えたＰＡ化試薬と等量加えてよく混合し、８０℃で４０分加熱した。
【００７５】
（３）室温で冷却後、試料と等量のｄＨ２Ｏを加えて十分混合し、あらかじめ０．１Ｎのアンモニア水で平衡化しておいたＴＳＫ  ｇｅｌ  ＴＯＹＯ  ＰＥＲＡＬ  ＨＷ−４０（ＴＯＳＯＨ）ゲル濾過カラム（２．５×３０ｃｍ）に通し、溶出液を８０滴（約４ｍｌ）ずつ４０フラクションまで分画した。分画は、２１２８  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行った。
【００７６】
（４）各フラクションの蛍光強度（Ｅｘ：３２０ｎｍ，Ｅｍ：４００ｎｍ）をＦ−２０００形蛍光分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ）で測定し、糖鎖が含まれるフラクションを回収し、１−ブタノールを適量加えてエバポレータで濃縮した。
【００７７】
１．５．３  高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるＰＡ化糖鎖の分析
（１）精製した糖鎖をＯＤＳカラムによるＨＰＬＣで分画を行ない、さらに各フラクションについてアミドカラムによるＨＰＬＣで分画を行った。
【００７８】
（２）分析にはＨＩＴＡＣＨＩ  ＦＬ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｌ−７４８０を持つＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＰＬＣシステム、及び蛍光検出器を持つＮＡＮＯＳＰＡＣＥ  ＳＩ−１（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）を用いた。
【００７９】
（３）ＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＰＬＣシステムでのＯＤＳカラムによる精製及び分析には、カラムはＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（６．０×２５０  ｍｍ，  ｎａｋａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）カラムを用いた。調製したＰＡ化糖鎖や市販のＰＡ化糖鎖を試料として用いた。分析条件を以下に示す。
Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ    ：０．０２％ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ    ：２０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／０．０２％ＴＦＡ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ        ：０％→４％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（５ｍｉｎ→４０ｍｉｎ）
［０％→２０％ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ］
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ    ：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ：５０ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ    ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｅｘ：３１０ｎｍ，Ｅｍ：３８０ｎｍ）
Ｃｏｌｕｍｎ  ｔｅｍｐ．：３０℃
【００８０】
（４）アミドカラムによる精製及び分析カラムには、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０（４．６×２５０ｍｍ，昭和電工）カラムを用いた。調製したＰＡ化糖鎖や市販のＰＡ化糖鎖に等量のアセトニトリルを加えて試料とした。分析条件を以下に示す。
Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ    ：８０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ    ：２０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ        ：７４％→５０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（５ｍｉｎ→２５ｍｉｎ）
［１０％→５０％ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ］
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ    ：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ：４０ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ    ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｅｘ：３１０ｎｍ，Ｅｍ：３８０ｎｍ）
Ｃｏｌｕｍｎ  ｔｅｍｐ    ：３０℃
１．５．４  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析
（１）ＨＰＬＣで分画したそれぞれのフラクションに含まれる糖鎖の質量分析をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて行い、得られた分子量から糖鎖構造を推定した。なお、糖鎖の分子量は全てＮａ付加型と判断した。また、それぞれのフラクションごとに前述したＯＤＳカラムによるＨＰＬＣを行い、現れたピークを質量分析で推定された構造のスタンダード糖鎖のものと比較した。
【００８１】
（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析はａｕｔｏｆｌｅｘ（ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ）を用いた。リフレクターポヂティブモードに設定し、Ｎ２ガスの圧力は、１８００〜２０００ｍｂａｒ程度、３．０×ｅ−６以下の真空下で測定を行った。１０ｍｇの２，５−ジヒドロキシ安息香酸（Ｓｉｇｍａ）をｄＨ２Ｏ：アセトニトリル＝１：１の割合で混合した溶液１ｍｌに溶かしマトリックス試薬とした。ｄＨ２Ｏに溶解したＰＡ化糖鎖と等量のマトリックス試薬と混合した。このうち２μｌをターゲットにスポットし室温で乾燥させて結晶化させた後分析を行った。
【００８２】
１．５．５  エキソグリコシダーゼ処理
（１）糖鎖構造をより正確に解析するために、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを持つものはＮ−アセチルグルコサミニダーゼで、マンノースをもつものはα−Ｄ−マンノシダーゼで処理した後、アミドカラム又はＯＤＳカラムによるＨＰＬＣにより解析し、推定される酵素反応後の構造のスタンダード糖鎖と比較し、一致したものを糖鎖と同定した。
【００８３】
（２）スタンダード糖鎖である高マンノース型糖鎖（Ｍａｎ９〜Ｍａｎ５）に関してはＴａＫａＲａにおいて販売されている構造既知のＰＡ化糖鎖を用いた。
【００８４】
（３）α−Ｄ−マンノシダーゼ（Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ；Ｓｉｇｍａ）処理は、１０ｍＭのＺｎ（ＣＯＯＨ）２と１２０ｍＵのα−Ｄ−マンノシダーゼを含む、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）の下で、３７℃で３日間行った。酵素反応の停止は３分間煮沸することで停止させ、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清をＨＰＬＣに供した。試料糖鎖の溶出時間は既知のスタンダード糖鎖の溶出時間と比較し、糖鎖構造を同定した。
【００８５】
（４）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；生化学工業）処理は、１ｍＵのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼを含む、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）の下で、３７℃で３日間行った。酵素反応の停止は３分間煮沸することで停止させ、４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清をＨＰＬＣに供した。試料糖鎖の溶出時間は既知のスタンダード糖鎖の溶出時間と比較し、糖鎖構造を同定した。
【００８６】
１．５．６  コントロール（非トランスジェニック）カイコで発現させたＨＡタンパク質の糖鎖構造解析
ＰＡ化した糖鎖をＯＤＳカラムにより１０フラクションに分画し（図６）、各フラクションについてアミドカラムにより分画した（図７）。分取した各フラクションをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析を行い、それぞれのフラクションに含まれる糖鎖構造を推定した（表３）。
【００８７】
【表３】
2010029102.tif 000004
なお、表中に記していないフラクションにはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる糖鎖の存在を示すピークが存在しない、又は、考えられる糖鎖の分子量と一致していないためにＮ−結合型糖鎖が存在しないと判断した。表３中に記したフラクションでは、その質量分析結果から予想された糖鎖構造をもとに、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによりスタンダード糖鎖と各フラクションのピークの位置を比較した。更に、非還元末端が、Ｎ−アセチルグルコサミンのものは、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼにより、マンノースのものはマンノシダーゼで消化を行い、ＯＤＳカラム、アミドカラムによりピークの溶出位置をスタンダード糖鎖と比較し、ピークが一致したものを糖鎖として構造を同定した（表４）。
【００８８】
【表４】
2010029102.tif 000005
フラクションごとのアミドカラムを用いたＨＰＬＣによるピーク面積を基にして、糖鎖の構造ごとの存在率を算出した（表４）。
【００８９】
１．５．７  ＦｕｃＴ抑制トランスジェニックカイコで発現させたＨＡタンパク質の糖鎖構造解析
ＰＡ化した糖鎖をＯＤＳカラムにより９フラクションに分画し（図８）、各フラクションについてアミドカラムにより分画した（図９）。分取した各フラクションを前項と同様の方法で解析し、糖鎖構造の同定（表５）と、糖鎖の種類ごとの存在率を算出した（表６）。
【００９０】
【表５】
2010029102.tif 000006
【００９１】
【表６】
2010029102.tif 000007
【００９２】
実験の結果、コントロールでは４３．９％がフコシル化されているのに対し、ＦｕｃＴ抑制カイコでは１６．０２％と、顕著にフコシル化が抑制されている、かつα１，６のフコシル化に比べてもα１，３のフコシル化の割合が低くなっていることが分かった。
【００９３】
実施例１．６  ｄｓＲＮＡを用いたカイコα１，３−フコース転移酵素に対するＲＮＡｉ
（１）ｄｓＲＮＡの作製
フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の配列を大まかに６つに区切り、各々を増幅させるためのプライマーを設計した（図１０）。これに加え、５'側にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ）を付加させた物も同時に設計した。フコシルトランスフェラーゼをクローニングしたベクターをテンプレートにし、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いて、ＰＣＲをおこなった。組成、反応条件は以下のように設定した。
組成
×１０  Ｂｕｆｆｅｒ    ５μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ    ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４    ２μｌ
プライマーＭｉｘ    ３μｌ（各１５ｐｍｏｌ）
テンプレート    １μｌ（１０ｎｇベクター）
ＫＯＤ＋        １μｌ
ＤＷ        ３３μｌ
計        ５０μｌ
反応条件
１、９４℃  ２ｍｉｎ
２、９４℃  １５ｓｅｃ
３、４５℃  ３０ｓｅｃ
４、６８℃  ３０ｓｅｃ
３０サイクル反応
【００９４】
ＰＣＲ産物に対し、Ｔ７  ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｄｓＲＮＡを作製した。方法はこのキットに添付の使用説明書に従った。
【００９５】
（２）カイコ培養細胞へのトランスフェクション
２０μｌのｄｓＲＮＡに、８０μｌのＴＣ−１００を加え希釈した。これに、ＴＣ−１００で５０倍希釈し、攪拌後５分静置したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を各々１００μｌ加え、混和後２０分静置した。その後、８００μｌのＴＣ−１００を加えてｄｓＲＮＡ溶液とした。５．１×１０５ｃｅｌｌのＢｍＮを４日培養し、培地を捨て、ＴＣ−１００で１回リンス後、ｄｓＲＮＡ溶液を加え、２７℃で培養を開始した。ネガティブコントロールとして、ｄｓＲＮＡを使用しない実験区も作製した。５時間後、培地をＴＣ−１００（ＦＢＳ＋）に交換し、トランスフェクションから４４時間後に細胞を回収した。
【００９６】
（３）リアルタイムＰＣＲ法によるα１，３−フコシルトランスフェラーゼＲＮＡ量の測定
回収した細胞からＩｓｏｇｅｎ−ＬＳ（ニッポンジーン）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。方法は使用説明書に従った。抽出したＲＮＡを４２μｌのＤＷで溶解し、これに３μｌのＣｌｏｎｅｄ  ＤＮａｓｅＩ（ＴａＫａＲａ）及び５μｌの添付１０×Ｂｕｆｆｅｒを加え、３７℃で３０分反応させた。その後、フェノール・クロロホルム処理、イソプロ沈をおこない、乾燥後のＲＮＡを５０μｌのＤＷで溶解した。これを１μｌ取り、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）のＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを８μｌ、酵素２μｌ加え、さらにＤＷにより総液量を４０μｌとした。２５℃５分→４２℃３０分→８５℃５分の反応をおこないｃＤＮＡを作製した。リアルタイムＰＣＲには、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。内部標準として、アクチンＡ３遺伝子を用い、これを増幅させるプライマー（ＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＣ、ＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＣＧＧＣＴＴＧ）及びフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を増幅させるプライマー（ＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＧＴＴＣＧ、ＧＧＧＣＡＧＴＴＧＴＡＡＴＧＣＴＴＴＴＴＧＧ）を実験に用いた。逆転写済みのサンプルをＤＷで１０倍に希釈していき、１００％〜０．０１％（×１〜×１００００）の希釈系列を作製した。１実験区当たり、４０μｌのＳｕｐｅｒｍｉｘと４μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌ  プライマー、２μｌのサンプルを加え、ＤＷで総液量８０μｌとした。攪拌後、２０μｌずつ反応プレートに分注した。反応プレートをＣｈｒｏｍｏ４リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）にセットし、以下の条件で反応及び蛍光測定をおこなった。  
１、９５℃  ３ｍｉｎ
２、９５℃  １５ｓｅｃ
３、６０℃  ４５ｓｅｃ
４、Ｒｅａｄ
５０サイクル反応
【００９７】
実験の結果、効果にばらつきはあるものの、複数のｄｓＲＮＡで阻害効果が見られ、２００ｂｐ程度の短い遺伝子配列でも、ＲＮＡｉが起きることが示された（図１１）。
【００９８】
（実施形態２）
次にナス目に係る本発明の実施形態を説明する。
【００９９】
ナス目植物の例としては、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）、ヒルガオ科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ）、ミツガシワ科（Ｍｅｎｙａｎｔｈａｃｅａｅ）等が挙げられ、タバコ、トマト、シバザクラ、サツマイモ、アサザ等が含まれる。
【０１００】
以下においては、この中のトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）の例を説明する。
【０１０１】
（１）本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ
本明細書において「α１，３−フコシルトランスフェラーゼ」とは、糖タンパク質のタンパク質部分の合成後、糖鎖付加の際に生じる還元末端アセチルグルコサミン残基にフコース残基を付加する酵素である。この酵素は、ＧＤＰ−フコースを糖供与体として、糖タンパク質のアスパラギン結合型糖鎖の最もペプチド鎖に近いＮ−アセチルグルコサミンにα１，３−結合でフコースを連結させる機能を有する。
【０１０２】
本発明は、タンパク質の糖鎖構造に関与するα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを提供する。
【０１０３】
本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、具体的には、
（ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号：４に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｇ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｈ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
が含まれる。
【０１０４】
ここで、本明細書における「１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列」は、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を失わない限り、その置換等されるアミノ酸数は限定されるものではない。例えば、置換等されるアミノ酸の数は、３０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、特により好ましくは３個以下である。
【０１０５】
また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、相同遺伝子をコードするＤＮＡを単離するために行うハイブリダイゼーション反応条件を指し、このハイブリダイゼーション反応は、当業者に既知の方法に準じて行うことができる。
【０１０６】
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」としては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【０１０７】
本明細書に係る「α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ」は、「α１，３−フコシルトランスフェラーゼ」をコードするものであれば、その形態に制限はなく、ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡや、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡ等を含む。
【０１０８】
ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、植物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作成し、これを展開して、α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：４に記載のＤＮＡ）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション若しくはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、植物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをプラスミド、ファージ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーション若しくはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【０１０９】
このＤＮＡを利用することにより、ナス目においてヒト型糖鎖が付加された糖タンパク質を生産することが可能となる。ここで「ヒト型糖鎖」とは、糖鎖コア構造の還元末端部分に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基に、α１，３−結合によるフコース残基が存在しない糖鎖を意味する。
【０１１０】
（２）本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制するＤＮＡ
本発明はまた、ナス目のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制するＤＮＡを提供する。このようなＤＮＡには、具体的には、
（ｉｖ）ナス目α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｖ）ナス目α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｖｉ）ナス目α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
が含まれる。
【０１１１】
（ｉｖ）のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡであり、（ｖ）のＤＮＡは、触媒作用を有するＤＮＡであり、（ｖｉ）のＤＮＡは、内因性のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。
【０１１２】
また「α１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制」には、ＤＮＡの転写の抑制及びタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡ発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【０１１３】
このＤＮＡにより、ナス目において、糖鎖コア構造の還元末端部位に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基へのフコースのα１，３−結合を抑制することができる。
【０１１４】
（３）本発明の組換えベクター
本発明はまた、（２）で説明した抑制用ＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。
【０１１５】
抑制用ＤＮＡを挿入するベクターは、細胞内で導入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、若しくは外的刺激によって活性が誘導されるプロモーターを有するベクターであっても良い。ベクターへの本発明の抑制用ＤＮＡの挿入は、既知の方法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。
【０１１６】
上記ベクターには、導入遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、若しくは宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いても良い。例えば、宿主細胞として大腸菌を用いる場合には、形質転換された大腸菌を選抜するための遺伝子（例えば、カナマイシン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子）をマーカー遺伝子として組み込んでいても良い。また、大腸菌以外のベクターとしては、昆虫細胞由来の発現ベクター、植物由来の発現ベクター、レトロウイルス由来の発現ベクター等が挙げられる。
【０１１７】
抑制用ＤＮＡが挿入されたベクターは、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の当業者に既知の方法によって細胞に導入されることができる。
【０１１８】
本発明のベクターが導入される宿主細胞は特に制限されるものではなく、目的に応じて種々の宿主細胞を用いることができる。例えば、細菌細胞（大腸菌等）、真菌細胞（酵母等）、昆虫細胞（カイコ等）、動物細胞（ＣＨＯ等）、植物細胞等である。
【０１１９】
この組換えベクターにより、抑制用ＤＮＡを細胞内で効率的に発現させることができる。
【０１２０】
（４）本発明の形質転換細胞、形質転換体、繁殖材料、及びこの形質転換体の製造方法
本発明はまた、（２）で説明した抑制用ＤＮＡ若しくは（３）で説明した組換えベクターが導入された形質転換細胞、前記形質転換細胞から作り出された形質転換体、前記形質転換体の子孫若しくはクローンである形質転換体、これら形質転換体の繁殖材料、並びにこれら形質転換体を製造する方法を提供する。この方法は、具体的には、
（Ｅ１）抑制用ＤＮＡをナス目由来の細胞に導入する工程、
（Ｅ２）当該細胞を有する植物体から、形質転換植物を選択する工程
とからなる。
【０１２１】
ここで、本発明の形質転換細胞は、抑制用ＤＮＡ若しくは組換えベクターが導入された細胞若しくは細胞の集合であって形質転換体である植物を再生し得るものであれば特に制限はない。本発明の形質転換細胞には、例えば、カルス、葉切片、プロトプラスト等が含まれる。
【０１２２】
組換えベクターを導入した形質転換細胞は、ベクターに導入されている所定のマーカー遺伝子に応じて、種々の方法を用いて選抜することができる。例えば、マーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子が導入されている場合には、ベクターに導入されている所定の薬剤耐性遺伝子に応じて、適した選抜用薬剤を有する既知の選抜用培地で培養する必要がある。これにより形質転換された培養細胞を得ることができる。
【０１２３】
形質転換細胞から形質転換体を作り出す方法には、細胞の種類に応じて当業者に公知の種々の方法を採用できる。例えばトマトであれば、所定の薬剤を含む培地でカルスを形成させ、発根を確認した後に、培養土に順化させても良い。
【０１２４】
また、形質転換細胞及び形質転換体に導入されたＤＮＡは、ハイブリダイゼーションやＰＣＲ法等の当業者に公知の方法によって、若しくは植物体のＤＮＡ塩基配列を解析することによって確認できる。
【０１２５】
また、上述の形質転換体の染色体内に抑制用ＤＮＡを導入することで、この形質転換体から有性生殖若しくは無性生殖により子孫を得ることが可能である。更に、この形質転換体若しくはその子孫又はクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、株、カルス等）を得ることで、前記形質転換体を量産することが可能である。
【０１２６】
（５）本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する方法
本発明はまた、（２）で説明した抑制用ＤＮＡを用いてα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を抑制する方法を提供する。具体的には、この方法は、
（Ｆ１）抑制用ＤＮＡを細胞内に導入する工程、
（Ｆ２）当該細胞内で抑制用ＤＮＡを発現させる工程
とからなる。
【０１２７】
「ＤＮＡを細胞内に導入する工程」は、例えば、エレクトロポレーション法やパーティクルガン法等の当業者にとって既知の種々の方法を用いて行うことができる。上記のような（５）の方法により、抑制用ＤＮＡを発現可能な状態で含むベクターが細胞に導入され、従って、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を効果的に抑制することが可能となる。
【０１２８】
（６）本発明の組換えタンパク質並びにその製造方法
本発明はまた、ヒト型糖鎖を付加した組換えタンパク質を提供する。このタンパク質は、（４）で説明した形質転換細胞に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを導入し発現させて得られるものである。また、このタンパク質は、（４）で説明した形質転換体と、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体とを交配させて得られる動物体若しくは植物体から得られる組換えタンパク質であっても良い。
【０１２９】
本発明はまた、上記組換えタンパク質の製造方法を提供する。この方法は、具体的には、
（Ｇ１）（２）で説明した抑制用ＤＮＡを含むベクターを含む形質転換細胞を培養する工程、
（Ｇ２）当該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程
とからなる。
【０１３０】
この方法によって得られる組換えタンパク質は、ヒト型糖鎖を付加された任意のタンパク質である。即ち、糖鎖コア構造の還元末端部位に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基へのフコースのα１，３−結合を有さないタンパク質である。
【０１３１】
（７）本発明の薬学的組成物
本発明はまた、（６）で説明した組換えタンパク質と薬学的に許容可能な担体とからなる薬学的組成物を提供する。この担体は、動物体内における送達に適したものであり、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、弛緩剤、懸濁剤、等張化剤、流動性促進剤等を含むが、これらに限定されるものではなく、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、乳糖、デンプン、マンニトール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、白糖、コーンスターチ等である。
【実施例２】
【０１３２】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明する。
【０１３３】
実施例２．１  トマトα１，３−フコシルトランスフェラーゼのクローニング
２．１．１  ｃＤＮＡ作製およびＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）
トマト品種「タイムリー」（タキイ種苗）の自殖固定系統の本葉０．５ｇを液体窒素で凍らせ、乳鉢と乳棒により粉砕し、ＥＡＳＹＰｒｅｐ  ＲＮＡ（タカラバイオ）を用いてプロトコールに従い、全ＲＮＡの抽出を行った。このうち全ＲＮＡ１００ｎｇをＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）へ供試し、添付のプロトコールに従い、ｃＤＮＡを作製した。また、作製後のｃＤＮＡを鋳型として３'−ＲＡＣＥ  ＰＣＲおよび５'−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。
【０１３４】
３'−ＲＡＣＥ  ＰＣＲのプライマーには、キットに添付されたＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｍｅｒｓ  Ａ  Ｍｉｘおよびｙａｍａ１を用いて、また５'−ＲＡＣＥ  ＰＣＲのプライマーには、キットに添付されたＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｍｅｒｓ  Ａ  Ｍｉｘおよびｙａｍａ２を用いて、プロトコールに従い、ＰＣＲ反応を行った。
これら全ての反応にはＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（タカラバイオ）を使用した。
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｍｅｒｓ  Ａ  Ｍｉｘ  ：
Ｌｏｎｇ５'−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３'
Ｓｈｏｒｔ５'−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３'
ｙａｍａ１：５'−ＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＴＧＧＴＴ−３'
ｙａｍａ２：５'−ＡＡＣＣＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧ−３'
ｙａｍａ１およびｙａｍａ２は、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｐｅｎｎｅｌｌｉｉから単離された部分配列ＡＷ６１８８３６を参考に作製した。
【０１３５】
２．１．２  ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物のクローニングと大腸菌の形質転換
ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物のクローニングには、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を供試し、プロトコールに従いｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターとＰＣＲ反応液を混合し、ライゲーション反応を行った。次に、同キットに付属の大腸菌ＴＯＰ１０（遺伝子型：Ｆ−ｍｃｒＡ  Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｒｅｃＡ１  ａｒａＤ１３９  Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ）を溶解し、クローニング反応液２μｌを加え、５分間氷上で静置した後、４２℃の温湯に４０秒間浸漬し、大腸菌ＴＯＰ１０の形質転換処理を行った。キットに添付のＳＯＣ培地を５００μｌ加え、３７℃で１時間静置した後、直径９ｃｍ滅菌シャーレに分注したＬＢ固形培地（５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加）の表面に塗布し、乾燥後３７℃で１６〜２４時間培養した。培地上に形成されたシングルコロニーを爪楊枝で３ｍｌ  ＬＢ液体培地（５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加）に移植し、３７℃で１６時間培養した。
【０１３６】
２．１．３プラスミドＤＮＡの抽出
ＬＢ液体培地で増殖させた大腸菌培養液を１．５ｍｌ遠心チューブに移し、卓上遠心機ＭＴＸ−１５０（ＴＯＭＹ）を使い、１５，０００ｒｐｍで２回に分けて集菌した。その後Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を供試して、プロトコールに従いプラスミドＤＮＡの抽出を行った。
【０１３７】
２．１．４  シークエンス
クローニングしたＰＣＲ産物の遺伝子配列については、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を供試し、各プラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型にしてＭ１３ＦＷまたはＭ１３ＲＶをプライマーとして用い、プロトコールに従いサイクルシークエンス反応を行った。また、反応液をエタノール沈殿した後、１０μｌホルムアミドを加え、チューブを煮沸処理して、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で遺伝子配列の決定を行った。
Ｍ１３ＦＷ：５'−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３'
Ｍ１３ＲＶ：５'−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３'
【０１３８】
２．１．５  Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ
トマトα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の全長をクローニングするため、５'−ＲＡＣＥ  ＰＣＲと３'−ＲＡＣＥ  ＰＣＲで得られた遺伝子配列から類推された読み枠（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）の末端側にｙａｍａ３、ｙａｍａ４、ｙａｍａ５、ｙａｍａ６の４種類のプライマーを作製し、１ｓｔ  ＰＣＲにはｙａｍａ３とｙａｍａ４を、２ｎｄ  ＰＣＲにはｙａｍａ５とｙａｍａ６をそれぞれ供試した。
【０１３９】
２．１．１の項で前述のＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で作製したｃＤＮＡ反応液１μｌをテンプレートとして１ｓｔ  ＰＣＲを行った後、この反応液を１００倍希釈した液１μｌをテンプレートとして２ｎｄ  ＰＣＲを行った。
【０１４０】
１ｓｔ  ＰＣＲ、２ｎｄ  ＰＣＲともにポリメラーゼにはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を０．２μｌ、２０μＭに調整したプライマーをそれぞれ１μｌずつ、さらにポリメラーゼに添付されたバッファー、ｄＮＴＰｓを所定の濃度に調整し、最終的な反応液量を２０μｌとしてＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（タカラバイオ）で反応を行った。ＰＣＲの反応条件は１ｓｔ  ＰＣＲ、２ｎｄ  ＰＣＲともにプリヒート９６℃３分の後，９６℃１０秒−５４℃３０秒−６８℃３分を３０サイクルとした。
ｙａｍａ３：５'−ＧＡＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＴＡＴＣＣＴ−３'
ｙａｍａ４：５'−ＧＡＡＣＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＴＡＧＴＣＡＴＡＧＣ−３'
ｙａｍａ５：５'−ＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＴＣＣＧＣＴＴＧＴＣＴＣ−３'
ｙａｍａ６：５'−ＧＣＴＡＧＡＡＡＣＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＡＴＧＧＡＡＧ−３'
【０１４１】
２．１．６  Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ産物のクローニングと大腸菌の形質転換
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ産物のクローニングには、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を供試し、プロトコールに従いｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターとＰＣＲ反応液を混合し、ライゲーション反応を行った。次に、同キットに付属の大腸菌ＴＯＰ１０（遺伝子型：Ｆ−ｍｃｒＡ  Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｒｅｃＡ１  ａｒａＤ１３９  Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ）を溶解し、クローニング反応液２μｌを加え、５分間氷上で静置した後、４２℃の温湯に４０秒間浸漬し、大腸菌ＴＯＰ１０の形質転換処理を行った。キットに添付のＳＯＣ培地を５００μｌ加え、３７℃で１時間静置した後、直径９ｃｍ滅菌シャーレに分注したＬＢ固形培地（５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加）の表面に塗布し、乾燥後３７℃で１６〜２４時間培養した。培地上に形成された単一コロニーを爪楊枝で３ｍｌ  ＬＢ液体培地（５０ｍｇ／ｌ  カナマイシン添加）に移植し、３７℃で１６時間培養した。
【０１４２】
２．１．７  トマトα１，３−フコシルトランスフェラーゼ全長遺伝子のシークエンス
２．１．３および２．１．４の項で前述のとおりプラスミドの抽出ならびにシークエンスを行い、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ全長遺伝子のシークエンスを行った。トマトα１，３−フコシルトランスフェラーゼ全長遺伝子の配列を図１２に示す。またその際、前述Ｍ１３ＦＷとＭ１３ＲＶの２種類のプライマーに加え、プライマーウォーキングにより作製したｙａｍａ７、ｙａｍａ８、ｙａｍａ９およびｙａｍａ１０の４種類のプライマーを供試した。
ｙａｍａ７：５'−ＣＡＡＴＣＴＴＧＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧＧ−３'
ｙａｍａ８：５'−ＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＴＡＣ−３'
ｙａｍａ９：５'−ＣＡＴＣＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＡＡＧＣ−３'
ｙａｍａ１０：５'−ＣＡＴＴＴＴＣＧＴＡＴＡＧＴＴＧＡＡＧ−３'
【０１４３】
実施例２．２  ＲＮＡｉ用トマトトランスジェニックベクターの作製
２．２．１  ＲＮＡｉ誘導ベクターの作製
トマトの内性α１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制するために、トマトα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の逆方向反復塩基配列を有するＲＮＡｉ誘導ベクターの作製を行った。
【０１４４】
（１）ベクター構築用配列のサブクローニング
逆方向反復塩基配列の鋳型にはトマトα１，３−フコシルトランスフェラーゼ全長遺伝子を供試し、ＡＴＧ５００はｙａｍａ１１、ｙａｍａ１２の両プライマーで、ＡＴＧ６００の断片はｙａｍａ１３、ｙａｍａ１４の両プライマーでＰＣＲにより増幅した。ポリメラーゼにはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を０．２μｌ、２０μＭに調整したプライマーをそれぞれ１μｌずつ、さらにポリメラーゼに添付されたバッファー、ｄＮＴＰｓを所定の濃度に調整し、最終的な反応液量を２０μｌとしてＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（タカラバイオ）で反応を行った。ＰＣＲの反応条件はプリヒート９６℃３分の後，９６℃１０秒−６０℃３０秒−６８℃１分を３０サイクルとした。
【０１４５】
２．１．６の項で前述のＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を供試してＡＴＧ５００とＡＴＧ６００のＰＣＲ産物をクローニングし、２．１．３および２．１．４の項で前述のとおりプラスミドの抽出ならびにシークエンスの確認を行った。
ｙａｍａ１１：５'−ＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＴＣＣＧＣＴ−３'
ｙａｍａ１２：５'−ＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＡＴＴＧＧＴＴＣＣＡＡＡＣＴＴＡＣＡＴ−３'
ｙａｍａ１３：５'−ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＡＧＴＡＴＴＧ−３'
ｙａｍａ１４：５'−ＧＧＡＧＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＴＣＣＧＣＴ−３'
【０１４６】
（２）逆方向反復塩基配列の作製
ＡＴＧ６００断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化するとともに、ｐＵＣ１９（Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ７７７８９）をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化した後、両断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）でプロトコールに従いライゲーションし、１．２の項と同様に大腸菌ＴＯＰ１０の形質転換を行った。また、ＬＢ固形培地（５０ｍｇ／ｌアンピシリン添加）上に形成されたシングルコロニーを爪楊枝で３ｍｌ  ＬＢ液体培地（５０ｍｇ／ｌアンピシリン添加）に移植し、３７℃で１６時間培養した。
【０１４７】
次に、ＡＴＧ５００断片をＥｃｏＲＩで消化するとともにＡＴＧ６００断片を挿入したｐＵＣ１９を  ＥｃｏＲＩで消化した後、両断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）でライゲーションし、１．２の項と同様に大腸菌ＴＯＰ１０の形質転換を行った。
【０１４８】
さらに、目的の断片が形成されたコロニーを選抜するため、ＬＢ固形培地（５０ｍｇ／ｌアンピシリン添加）上のシングルコロニーを爪楊枝の先で掻き取り、ＰＣＲ反応液に直接浸けてＰＣＲの鋳型とし、コロニーダイレクトＰＣＲを行った。反応条件はプリヒート９６℃３分の後，９６℃１０秒−６０℃３０秒−７２℃１分を３５サイクルとした。前述ｙａｍａ１１とｙａｍａ１４の両プライマーを供試し、ポリメラーゼにはＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を０．２μｌ、２０μＭに調整したプライマーをそれぞれ１μｌずつ、さらにポリメラーゼに添付されたバッファー、ｄＮＴＰｓを所定の濃度に調整し、最終的な反応液量を２０μｌとしてＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（タカラバイオ）で反応を行った。その後、１％アガロースゲル電気泳動の結果、約１１００ｂｐのバンドが確認されるコロニーを選抜し、プラスミドの抽出を行った。
【０１４９】
（３）トランスジェニック用ＲＮＡｉ誘導ベクター、ｐＢＩ１２１−ＦｕｃＴＲＮＡｉの作製
トマトの内性α１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の逆方向反復塩基配列（約１１００ｂｐ）と、ｐＢＩ１２１（Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ４８５７８３）のＧＵＳ遺伝子を置換することにより、トランスジェニック用ＲＮＡｉ誘導ベクター、ｐＢＩ１２１−ＦｕｃＴＲＮＡｉの作製を行った（図１３）。
【０１５０】
ＡＴＧ５００断片とＡＴＧ６００断片を挿入したｐＵＣ１９をＸｂａＩ、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＩ１２１をＸｂａＩ、ＳａｃＩおよびＳｎａＢＩで消化した後、両反応液をエタノール沈殿させ、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）でライゲーションし、２．１．２の項と同様に大腸菌ＴＯＰ１０の形質転換を行った。ＬＢ固形培地（５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加）上のシングルコロニーを爪楊枝の先で掻き取り、ＰＣＲ反応液に直接浸けてＰＣＲの鋳型とし、コロニーダイレクトＰＣＲを行った。前述（２）の項と同様にｙａｍａ１１とｙａｍａ１４の両プライマーを供試し、ポリメラーゼにはＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を０．２μｌ、２０μＭに調整したプライマーをそれぞれ１μｌずつ、さらにポリメラーゼに添付されたバッファー、ｄＮＴＰｓを所定の濃度に調整し、最終的な反応液量を２０μｌとしてＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（タカラバイオ）で反応を行った。その後、１％アガロースゲル電気泳動の結果、約１１００ｂｐのバンドが確認されるコロニーを選抜し、ＲＮＡｉ誘導ベクター（ｐＢＩ１２１−ＦｕｃＴＲＮＡｉ）の抽出を行った。
【０１５１】
２．２．２  アグロバクテリウムの形質転換
植物へ目的の遺伝子断片を導入するため、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にｐＢＩ１２１−ＦｕｃＴＲＮＡｉを導入し、形質転換を行った。
【０１５２】
１０ｍｇ／ｌリファンピシン、２５０ｍｇ／ｌストレプトマイシン添加ＬＢ液体培地３ｍｌで３０℃４８時間培養したＬＢＡ４４０４を２．１．３の項と同様に集菌し、上清を取り除いた後、ｐＢＩ１２１−ＦｕｃＴＲＮＡｉの抽出液１５μｌで懸濁し、すぐにチューブを液体窒素で５分間処理した。その後、３７℃の温湯で１５分間、液体窒素で５分間の処理を３回繰り返し、５００μｌのＬＢ培地を加え、３０℃で３時間静置した。処理後の液体を１０ｍｇ／ｌリファンピシン、２５０ｍｇ／ｌストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｌカナマイシンを添加したＬＢ固形培地上に塗布し、３０℃で３日間培養し、シングルコロニーを確認した。
【０１５３】
実施例２．３  トランスジェニックトマトの作製
２．３．１  トマトの無菌播種
トマト品種「タイムリー」（タキイ種苗）の自殖固定系統を供試し、不織布で作った袋（３ｃｍ×３ｃｍ）にトマト種子２５粒を小分けし、ホッチキスでとめ、ｔｗｅｅｎ２０を１滴添加した１％アンチホルミン５０ｍｌとともに滅菌済みプラントボックス（Ｗａｋｏ）内で１５分間滅菌処理を行った。その後、滅菌水１００ｍｌで３回洗浄し、袋から取り出した種子をプラントボックス（Ｗａｋｏ）内に分注した３０ｍｌ  １／２ＭＳ培地上に並べ、２５℃１６時間日長の培養室で９〜１０日間静置した。
１／２ＭＳ培地：
２．２ｇ／ｌ  ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ  ＡＮＤ  ＳＫＯＯＧ  ＢＡＳＡＬ  ＭＡＤＩＵＭ  （ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ５５１９）、
１５ｇ／ｌ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、
０．８％Ａｇａｒ
ｐＨ５．８
【０１５４】
２．３．２  前培養
無菌播種後９〜１０日目の幼苗の子葉を約５ｍｍ角に切り分け、深さ２ｃｍ、直径９ｃｍの滅菌シャーレに３０ｍｌ程度分注したＳＴ−１培地上に裏返しで切片を置床した。蓋をパラフィルム（ハイテック）で固定し、２５℃１６時間日長の培養室で２４時間静置した。
ＳＴ−１培地：
４．４ｇ／ｌ  ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ  ＡＮＤ  ＳＫＯＯＧ  ＢＡＳＡＬ  ＭＡＤＩＵＭ  （ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ５５１９）、
３０ｇ／ｌ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、
１ｍｇ／ｌ  ｔｒａｎｓ−Ｚｅａｔｉｎ
０．８％Ａｇａｒ
ｐＨ５．８
【０１５５】
２．３．３  共存培養
ｐＢＩ１２１−ＦｕｃＴＲＮＡｉを導入したＬＢＡ４４０４の培養液をＯＤ６００＝０．１に水またはＬＢ培地で調整し、前培養したトマト切片を浸積した。その後、約２ｍｌフィーダーセルを前培養で用いたＳＴ−１培地上に塗布し、その上から滅菌濾紙を置き、裏返しで切片を置床した。アルミホイルで包み、２５℃暗黒下で３日間共存培養を行った。
フィーダーセル：タバコ懸濁細胞ＢＹ−２をＴＳ−１培地で懸濁培養（約１００ｒｐｍ）し、１週間毎に新しいＴＳ−１培地４０ｍｌに懸濁細胞０．５ｍｌを加えて継代したもの。
ＴＳ−１培地：
４．４ｇ／ｌ  ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ  ＡＮＤ  ＳＫＯＯＧ  ＢＡＳＡＬ  ＭＡＤＩＵＭ  （ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ５５１９）、
３０ｇ／ｌ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．０１ｍｇ／ｌチアミンＨＣｌ、１ｍｇ／ｌミオイノシトール、１．７ｍｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、
０．２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、ｐＨ５．８
【０１５６】
２．３．４  選抜培養
２００ｍｇ／ｌカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＳＴ−１培地上に共存培養後の切片を移植し、蓋をサージカルテープで固定し、２５℃１６時間日長の培養室で２週間静置した。
【０１５７】
２．３．５  継代培養
新しい２００ｍｇ／ｌカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＳＴ−１培地上へ選抜培養した切片を移植し、２５℃１６時間日長の培養室で静置した。その後、培養中にカルスが形成され、シュートが伸長してきた切片をプラントボックスに５０ｍｌ程度分注した１００ｍｇ／ｌリラシリン、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＭＳ培地上に移植した。
【０１５８】
また、プラントボックス内で２ｃｍ以上伸長したシュートを切り取り、１００ｍｇ／ｌリラシリン、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＭＳ培地上に移植し、発根の有無を確認した。
ＭＳ培地：
４．４ｇ／ｌ  ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ  ＡＮＤ  ＳＫＯＯＧ  ＢＡＳＡＬ  ＭＡＤＩＵＭ  （ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ５５１９）、
３０ｇ／ｌ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．８％  Ａｇａｒ、ｐＨ５．８
【０１５９】
２．３．６  導入遺伝子の確認
カナマイシン添加培地中に発根したシュートが１０ｃｍ程度まで伸長した場合、Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９（６）：  １３４９に従い全ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲの鋳型とした。ｙａｍａ１５とｙａｍａ１６を選抜マーカー検出用のプライマーとして供試し、ポリメラーゼにはＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を０．２μｌ、２０μＭに調整したプライマーをそれぞれ１μｌずつ、さらにポリメラーゼに添付されたバッファー、ｄＮＴＰｓを所定の濃度に調整し、最終的な反応液量を２０μｌとしてＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（タカラバイオ）で反応を行った。反応条件はプリヒート９６℃３分の後，９６℃１０秒−６０℃３０秒−７２℃１分を３５サイクルとした。その後、１％アガロースゲル電気泳動の結果、約８００ｂｐのバンドが確認された株については、順化を行った。
ｙａｍａ１５：５'−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧ−３'
ｙａｍａ１６：５'−ＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣ−３'
【０１６０】
２．３．７  順化
ＰＣＲにより遺伝子の導入が確認されたシュートについては、組換え植物用温室内でバーミキュライトとニッピ園芸培土を入れた１０．５  ｃｍビニールポットに鉢上げし、半透明のケース内で湿度を徐々に下げて順化を行った。また、順化後、旺盛に成長する株については１８ｃｍビニールポットに移植した。
【０１６１】
実施例２．４  ＲＴ−ＰＣＲ法によるトマトα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の検出
組換え植物用温室内で栽培した形質転換体２２株からサンプリングを行い、２．１．１の項と同様に全ＲＮＡを抽出し、Ｃｌｏｎｅｄ  ＡＭＶ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を供試してｃＤＮＡを作製した。
【０１６２】
各サンプルとも１００ｎｇ全ＲＮＡを鋳型とし、キットに添付のＲａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒｓおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子に相補的なｙａｍａ１７をそれぞれ５０ｎｇ、１ｎｇ添加し、プロトコールに従い逆転写反応を行った。温度条件は５０℃３０分−５５℃１５分−６０℃１５分−６５℃１５分とし、この反応液１μｌをＰＣＲの鋳型とし、ｙａｍａ３とｙａｍａ１２を供試してα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の転写量を確認した。ポリメラーゼにはＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を０．２μｌ、２０μＭに調整したプライマーをそれぞれ１μｌずつ、さらにポリメラーゼに添付されたバッファー、ｄＮＴＰｓを所定の濃度に調整し、最終的な反応液量を２０μｌとしてＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（タカラバイオ）で反応を行った。反応条件はプリヒート９６℃３分の後，９６℃１０秒−６２℃３０秒−７２℃１分を４０サイクルとした。その後、１％アガロースゲル電気泳動の結果（図１４）、約５６０ｂｐのバンドが確認されなかった株または薄かった株については、全タンパク質の糖鎖解析へ供試した。
ｙａｍａ１７：５'−ＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＡＧＴＡＴＴＧ−３'
【０１６３】
実施例２．５  トランスジェニックトマトからの糖鎖の調製
野生型トマト及び、形質転換体トマトのうちＮｏ．１，９，１４の葉、約４０ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢上で破砕し、その試料を融解後、４℃，１２，０００ｒｐｍ，１５分遠心した。上清に十分量の氷冷したアセトンを加え、氷中で静置後４℃，１２，０００ｒｐｍ，２０分遠心することで糖タンパク質（約５００ｍｇ）を沈殿させた。得られたペレットを凍結乾燥後、十分量の無水ヒドラジン（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を加え混合し、１００℃で１０時間インキュベートすることで糖鎖の切り出しを行った。
【０１６４】
反応後のヒドラジン分解産物を過剰の氷冷したアセトン中に加え、静置後４℃，１２，０００ｒｐｍ，２０分遠心し得られたペレットを乾燥した。ペレットに飽和炭酸水素ナトリウム（Ｗａｋｏ）を２ｍｌ、及び８０μｌの無水酢酸（Ｗａｋｏ）を添加混合し、室温でＮ−アセチル化を行った。次に、試料に１Ｎ  ＨＣｌで平衡化したイオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０×２（室町化学工業）を試料のｐＨが２付近になるまで加え脱塩処理を行った。樹脂と溶液をガラスウール上で濾過分離し、エバポレータを用いて試料を濃縮した。濃縮した試料を０．１Ｎアンモニア水で平衡化したＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０（Ｔｏｓｏｈ）カラム（２．５×３０ｃｍ）を用いてカラムクロマトグラフィーに供した。Ｍｏｄｅｌ  ２１２８  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により４ｍｌずつに分取した試料の各フラクションについてフェノール・硫酸法を利用して糖を含む画分を選抜した。糖を含む画分を回収し、エバポレータを用いて濃縮後、凍結乾燥を行った。
【０１６５】
凍結乾燥後試料にＰＡ化試薬（２−アミノピリジン（Ｗａｋｏ）５５２ｍｇに対し酢酸（Ｗａｋｏ）２００μｌを混合し調製）を適量加え、９０℃で１時間インキュベートした。室温で冷却後、等量の還元試薬（ジメチルアミノボラン（Ｗａｋｏ）３９ｍｇに対して２００μｌの酢酸を混合し調製）を加えて８０℃，４０分インキュベートした。反応停止の際、等量のｄＨ２Ｏを添加した。得られたＰＡ化試料を０．１Ｎアンモニア水で平衡化したＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０（Ｔｏｓｏｈ）カラム（２．５×３０ｃｍ）を用いてカラムクロマトグラフィーに供した。Ｍｏｄｅｌ  ２１２８  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により４ｍｌずつに分取した試料の各フラクションについて、蛍光分光光度計（Ｆ−２０００  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて励起３２０ｎｍ，蛍光４００ｎｍの波長で蛍光強度を測定した。蛍光強度測定後の結果よりＰＡ化糖鎖を含むフラクションを回収し、エバポレータを用いて濃縮した。各ＰＡ化糖鎖はさらにＣｅｌｌｕｌｏｓｅをカラムに充填したＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを用いて精製し１）、精製画分はさらに遠心乾燥に供し、濃縮、乾燥させた。
１）Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｙ，Ｎａｋａｔａ  Ｍ，Ｋｕｒｏｄａ  Ｙ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｆ，Ｋｏｊｉｍａ  Ｎ，ａｎｄ  Ｍｉｚｕｏｃｈｉ  Ｔ（２００１）Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３２，３８１−３８８
【０１６６】
実施例２．６  トランスジェニックトマトの糖タンパク質糖鎖の解析
２．６．１  高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析
分析器はＨＩＴＡＣＨＩ  ＦＬ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｌ−７４８０を持つＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＰＬＣシステムを用いて分析を行った。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）解析の際、カラムはＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−Ｐ（６×２５０ｍｍ；Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｐｕｅ）カラムを用いた。逆相ＨＰＬＣに用いたｓｏｌｖｅｎｔおよび各時間におけるグラジエントを以下に示す。
ｓｏｌｖｅｎｔＡ：０．０２％  Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ
ｓｏｌｖｅｎｔＢ：２０％  Ａｃｅｔｅｎｉｔｏｒｉｌｅ／０．２％  Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：０→２０→０％  ｓｏｌｖｅｎｔＢ（５→４０→４１ｍｉｎ）
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｅｘ；３１０ｎｍ，Ｅｍ；３８０ｎｍ）
Ｃｏｌｕｍｎ  ｔｅｍｐ．：３０℃
【０１６７】
順相ＨＰＬＣ（ＳＦ−ＨＬＣ）解析の際、カラムはＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０（４．６×２５０ｍｍ；Ｓｈｏｗａ  ｄｅｎｋｏ）カラムを用いた。順相ＨＰＬＣに用いたｓｏｌｖｅｎｔおよび各時間におけるグラジエントを以下に示す。
ｓｏｌｖｅｎｔＡ：８０％  Ａｃｅｔｅｎｉｔｏｒｉｌｅ
ｓｏｌｖｅｎｔＢ：２０％  Ａｃｅｔｅｎｉｔｏｒｉｌｅ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：１０→５０→１０％  ｓｏｌｖｅｎｔＢ（５→２５→２６ｍｉｎ）
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｅｘ；３１０ｎｍ，Ｅｍ；３８０ｎｍ）
Ｃｏｌｕｍｎ  ｔｅｍｐ．：３０℃
【０１６８】
各ｐｅａｋを回収しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析により分子量を測定、各ｐｅａｋの推定糖鎖構造を解析した。
【０１６９】
２．６．２  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析はａｕｔｏｆｌｅｘ（ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ）を用いて行った。レーザー強度は１８００〜２０００ｍｂａｒで使用した。また、データは３．０×ｅ−７以下の真空下で得た。１０ｍｇの２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ）をｄＨ２Ｏ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ＝１：１の割合で混合した溶液に溶かしマトリックス試薬とし、ｄＨ２Ｏに溶解したＰＡ化糖鎖と等量のマトリックス試薬を混合し、この内２μｌをターゲットに置き室温で乾燥し結晶化させた後、Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅ分析を行った。
【０１７０】
２．６．３  グリコシダーゼ消化
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｋ．Ｋ．）消化は、５０μｌの酵素溶液（１０ｐｍｏｌのＰＡ化糖鎖、３ｍＵのＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０））を３７℃で３日間インキュベートすることで行った。またα−マンノシダーゼ（ｊａｃｋ  ｂｅａｎ，Ｓｉｇｍａ）消化は、５０μｌの酵素溶液（１０ｐｍｏｌのＰＡ化糖鎖、１０μＵのα−マンノシダーゼ、１０ｍＭの酢酸亜鉛を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０））を３７℃で３日間インキュベートすることで行った。各酵素反応は５分間煮沸することで停止させ、４℃，１２，０００ｒｐｍ，５分間遠心後、上清をＳＦ−ＨＰＬＣに供した。さらに消化が確認されたＰＡ化糖鎖はＲＰ−ＨＰＬＣに供し、酵素反応産物の溶出位置を既知ＰＡ化糖鎖（Ｔａｋａｒａ）と比較し、各構造を決定した。
【０１７１】
２．６．４  形質転換体Ｎｏ．１
形質転換体Ｎｏ．１の葉の可溶性タンパク質の糖鎖構造を行った。形質転換体Ｎｏ．１の葉より分離し、ＰＡ化した糖鎖をＯＤＳカラムにより１０フラクションに分画し（図１５）、各フラクションについてアミドカラムにより分画した（図１６）。分取した各フラクションをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析を行い、それぞれのフラクションに含まれる糖鎖構造を推定した。なお、表中に記していないフラクション（１−ａ，１−ｂ，１−ｃ，２−ｄ，３−１，３−２，３−３，３−ａ，３−ｂ，４−ｃ，５−ａ，５−ｂ，５−ｄ，５−ｅ，５−ｆ，５−ｇ，６−ｄ，７−ａ，７−ｂ，７−ｄ）にはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるピークが存在しない、又は、考えられる糖鎖の分子量と一致していないために糖鎖が存在しないと判断した。質量分析結果から予想された糖鎖構造をもとに、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによりスタンダード糖鎖とピークの位置を比較した。更に、非還元末端が、Ｎ−アセチルグルコサミンのものは、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｍｏａｅ由来）により、マンノースのものはα−マンノシダーゼ（ｊａｃｋ  ｂｅａｎ由来）で消化を行い、ＯＤＳカラム、アミドカラムによりピークの溶出位置をスタンダード糖鎖と比較し、ピークが一致したものを糖鎖として構造を同定した。２−ｂ，２−ｃ，８−ａはＭ３Ｘ、５−ｃはＧｎ２Ｍ３ＦＸ、６−ａはＭ２ＦＸ、６−ｂはＧｎＭ３ＦＸ、７−ｃ，８−ｂはＧｎＭ３Ｘ（Ａ）、９−ａはＧｎ２Ｍ３Ｘ、１０−ｂはＧｎＭ３Ｘ（Ｂ）を含むと判断した。また、Ｍａｎ３ＦｕｃＸｙｌＧｃｌＮＡｃ２型糖鎖（Ｍ３ＦＸ）、Ｍａｎ３ＸｙｌＧｃｌＮＡｃ２型糖鎖（Ｍ３Ｘ）、高マンノース型と考えられる糖鎖については、ＯＤＳカラム、アミドカラムの溶出位置について、対応する標準糖鎖と比較した［４−ａ（Ｍ３ＦＸ），４−ｄ（Ｍ９），６−ｃ（Ｍ６Ｂ），８−ａ（Ｍ３Ｘ）］。分子量から推定した糖鎖構造を持つ糖鎖のピークと一致しなかったフラクションには、Ｎ−結合型糖鎖が含まれていないものと判断した（２−ｅ，４−ｂ，７−ｅ，８−ｂ，１０−ａ）。フラクションごとのアミドカラムを用いたＨＰＬＣによるピーク面積を基にして、糖鎖の構造ごとの存在率を算出した（図１７）。
【０１７２】
２．６．５  形質転換体Ｎｏ．９
形質転換体Ｎｏ．９の葉の可溶性タンパク質の糖鎖構造を行った。形質転換体Ｎｏ．９の葉より分離し、ＰＡ化した糖鎖をＯＤＳカラムにより１０フラクションに分画し（図１５）、各フラクションについてアミドカラムにより分画した（図１８）。分取した各フラクションをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析を行い、それぞれのフラクションに含まれる糖鎖構造を推定した。なお、表中に記していないフラクション（１−ａ，１−ｂ，１−ｃ，１−ｄ，１−ｅ，２−ｄ，２−ｆ，３−１，３−２，３−ｃ，３−ｄ，４−ｂ，４−ｃ，４−ｄ，４−ｅ，５−ａ，５−ｂ，５−ｅ，５−ｆ，５−ｇ，６−ｂ，６−ｆ，７−ａ，７−ｄ，８−ｃ，９−ｂ，９−ｃ，１０−ａ，１０−ｃ，１０−ｄ）にはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるピークが存在しない、又は、考えられる糖鎖の分子量と一致していないために糖鎖が存在しないと判断した。質量分析結果から予想された糖鎖構造をもとに、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによりスタンダード糖鎖とピークの位置を比較した。更に、上記同様に、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｍｏａｅ由来）及びα−マンノシダーゼ（ｊａｃｋ  ｂｅａｎ由来）で消化を行い、ＯＤＳカラム、アミドカラムによりピークの溶出位置をスタンダード糖鎖と比較し、ピークが一致したものを糖鎖として構造を同定した。５−ｃはＧｎ２Ｍ３ＦＸ、６−ａはＭ２ＦＸ、６−ｄはＧｎＭ３ＦＸ、９−ａはＧｎ２Ｍ３Ｘ、１０−ｂはＧｎＭ３Ｘを含むと判断した。また、Ｍａｎ３ＦｕｃＸｙｌＧｃｌＮＡｃ２型糖鎖（Ｍ３ＦＸ）、Ｍａｎ３ＸｙｌＧｃｌＮＡｃ２型糖鎖（Ｍ３Ｘ）、高マンノース型と考えられる糖鎖については、ＯＤＳカラム、アミドカラムの溶出位置について、対応する標準糖鎖と比較した［２−ａ（Ｍ３Ｘ），２−ｂ（Ｍ３Ｘ），４−ａ（Ｍ３ＦＸ），６−ｅ（Ｍ６Ｂ），８−ｄ（Ｍ５Ａ）］。分子量から推定した糖鎖構造を持つ糖鎖のピークと一致しなかったフラクションには、Ｎ−結合型糖鎖が含まれていないものと判断した（２−ｅ，２−ｆ，３−ａ，３−ｂ，５−ｄ，６−ｃ，７−ｂ，７−ｃ，７−ｅ）。フラクションごとのアミドカラムを用いたＨＰＬＣによるピーク面積を基にして、糖鎖の構造ごとの存在率を算出した。（図１７）
【０１７３】
２．６．６  形質転換体Ｎｏ．１４
形質転換体Ｎｏ．１の葉の可溶性タンパク質の糖鎖構造を行った。形質転換体Ｎｏ．１の葉より分離し、ＰＡ化した糖鎖をＯＤＳカラムにより７フラクションに分画し（図１５）、各フラクションについてアミドカラムにより分画した（図１９）。分取した各フラクションをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析を行い、それぞれのフラクションに含まれる糖鎖構造を推定した。なお、表中に記していないフラクション（１−ａ，１−ｄ，２−ｃ，３−ｂ，４−１，４−ｄ，４−ｅ，５−ａ，５−ｂ，５−ｅ，５−ｆ，５−ｇ，６−ｅ，６−ｆ，７−ａ，７−ｅ，７−ｆ）にはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるピークが存在しない、又は、考えられる糖鎖の分子量と一致していないために糖鎖が存在しないと判断した。質量分析結果から予想された糖鎖構造をもとに、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによりスタンダード糖鎖とピークの位置を比較した。更に、上記同様に、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｍｏａｅ由来）及びα−マンノシダーゼ（ｊａｃｋ  ｂｅａｎ  由来）で消化を行い、ＯＤＳカラム、アミドカラムによりピークの溶出位置をスタンダード糖鎖と比較し、ピークが一致したものを糖鎖として構造を同定した。３−ａはＧｎＭ３ＦＸ、５−ｃはＧｎ２Ｍ３ＦＸ、６−ｂはＭ２ＦＸ、６−ｃはＧｎＭ３ＦＸ、７−ｂはＭ３Ｘを含むと判断した。また、Ｍａｎ３ＦｕｃＸｙｌＧｃｌＮＡｃ２型糖鎖（Ｍ３ＦＸ）、高マンノース型と考えられる糖鎖については、ＯＤＳカラム、アミドカラムの溶出位置について、対応する標準糖鎖と比較した［３−ｃ（Ｍ８Ａ），４−ａ（Ｍ３ＦＸ），４−ｃ（Ｍ７Ａ），５−ｄ（Ｍ７Ｂ），６−ｄ（Ｍ６Ｂ），７−ｄ（Ｍ５Ａ）］。分子量から推定した糖鎖構造を持つ糖鎖のピークと一致しなかったフラクションには、Ｎ−結合型糖鎖が含まれていないものと判断した（１−ｂ，１−ｃ，２−ａ，２−ｂ，２−ｄ，４−ｂ，６−ａ，７−ｃ）。フラクションごとのアミドカラムを用いたＨＰＬＣによるピーク面積を基にして、糖鎖の構造ごとの存在率を算出した。（図１７）
【０１７４】
２．６．７  野生型トマト
野生型トマトの葉の可溶性タンパク質の糖鎖構造を行った。野生型トマトの葉より分離し、ＰＡ化した糖鎖をＯＤＳカラムにより９フラクションに分画し（図１５）、各フラクションについてアミドカラムにより分画した（図２０）。分取した各フラクションをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析を行い、それぞれのフラクションに含まれる糖鎖構造を推定した。なお、表中に記していないフラクション（１−ａ，１−ｂ，１−ｃ，２−ａ，３−ａ，３−ｃ，４−ｃ，４−ｄ，５−ｂ，５−ｄ，５−ｅ，５−ｆ，５−ｇ，６−ｃ，６−ｄ，６−ｅ，７，８−ａ，８−ｃ，８−ｄ，９）にはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるピークが存在しない、又は、考えられる糖鎖の分子量と一致していないために糖鎖が存在しないと判断した。質量分析結果から予想された糖鎖構造をもとに、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによりスタンダード糖鎖とピークの位置を比較した。更に、上記同様に、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｍｏａｅ由来）及びα−マンノシダーゼ（ｊａｃｋ  ｂｅａｎ由来）で消化を行い、ＯＤＳカラム、アミドカラムによりピークの溶出位置をスタンダード糖鎖と比較し、ピークが一致したものを糖鎖として構造を同定した。５−ｃはＧｎ２Ｍ３ＦＸ、６−ａはＭ２ＦＸ、６−ｂはＧｎＭ３ＦＸを含むと判断した。また、Ｍａｎ３ＦｕｃＸｙｌＧｃｌＮＡｃ２型糖鎖（Ｍ３ＦＸ）、Ｍａｎ３ＸｙｌＧｃｌＮＡｃ２型糖鎖（Ｍ３Ｘ）、高マンノース型と考えられる糖鎖については、ＯＤＳカラム、アミドカラムの溶出位置について、対応する標準糖鎖と比較した［４−ａ（Ｍ３ＦＸ），５−ａ（Ｍ３ＦＸ），８−ｂ（Ｍ３Ｘ）］。分子量から推定した糖鎖構造を持つ糖鎖のピークと一致しなかったフラクションには、Ｎ−結合型糖鎖が含まれていないものと判断した（２−ｂ，２−ｃ，３−ｂ，４−ｂ）。フラクションごとのアミドカラムを用いたＨＰＬＣによるピーク面積を基にして、糖鎖の構造ごとの存在率を算出した（図１７）。
【０１７５】
実験の結果、野生型トマトでは９３．２％、転写抑制を示さなかった形質転換体Ｎｏ
．１４では７８．２％の糖鎖にフコースが付加していたのに対し、転写抑制を示した形質転換体Ｎｏ１．では２３．４％、Ｎｏ．９では３１．４％と、顕著にフコース付加の抑制を示すことが分かった（図２１）。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１は、カイコα１，３−フコシルトランスフェラーゼのクローニング条件を示す図である。
【図２】図２は、ショウジョウバエ由来フコシルトランスフェラーゼＡの活性モチーフ領域と高い相同性を示すカイコゲノム配列を示す図である。
【図３】図３は、カイコゲノムＤＮＡを鋳型とした、カイコα１，３−フコシルトランスフェラーゼ候補遺伝子のエキソン領域のＰＣＲ増幅を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、カイコα１，３−フコシルトランスフェラーゼのＲＮＡｉ用プラスミドの作成方法を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、カイコα１，３−フコシルトランスフェラーゼのＲＮＡｉ用プラスミドの作成方法を示す図である。
【図５】図５は、カイコα１，３−フコシルトランスフェラーゼのＲＮＡｉ用ベクターを示す図である。
【図６】図６は、コントロールカイコで発現させたＨＡタンパク質由来ＰＡ化糖鎖の逆相カラムを用いた精製を示す図である。
【図７】図７は、コントロールカイコで発現させたＨＡタンパク質由来ＰＡ化糖鎖のアミドカラムを用いた精製を示す図である。
【図８】図８は、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ抑制カイコで発現させたＨＡタンパク質由来ＰＡ化糖鎖の逆相カラムを用いた精製を示す図である。
【図９】図９は、フコシルトランスフェラーゼ抑制カイコで発現させたHAタンパク質由来ＰＡ化糖鎖のアミドカラムを用いた精製を示す図である。
【図１０】図１０は、カイコフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を増幅させるためのプライマーを示す図である。
【図１１】図１１は、カイコにおける各ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉ効果の比較を示す図である。
【図１２】図１２は、トマトα１，３−フコシルトランスフェラーゼ全長遺伝子配列を示す図である。
【図１３】図１３は、トマトα１，３−フコシルトランスフェラーゼのＲＮＡｉ用ベクターを示す図である。
【図１４】図１４は、ＲＴ−ＰＣＲによる形質転換トマトからのα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の検出を示す図である。
【図１５】図１５は、形質転換体及び野生型のＰＡ化糖鎖の逆相ＨＰＬＣによる分析を示す図である。
【図１６】図１６は、形質転換体Ｎｏ．１由来のＰＡ化糖鎖の順相ＨＰＬＣによる分析を示す図である。
【図１７】図１７は、糖鎖構造解析の結果を示す図である。
【図１８】図１８は、形質転換体Ｎｏ．９由来のＰＡ化糖鎖の順相ＨＰＬＣによる分析を示す図である。
【図１９】図１９は、形質転換体Ｎｏ．１４由来のＰＡ化糖鎖の順相ＨＰＬＣによる分析を示す図である。
【図２０】図２０は、野生型トマト由来のＰＡ化糖鎖の順相ＨＰＬＣによる分析を示す図である。
【図２１】図２１は、糖鎖構造解析の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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