(57)【要約】【課題】タンパク質の生産量を飛躍的に向上させ、実用化の観点で十分満足することを可能にする材料及び方法を提供することが課題である。【解決手段】細胞内で合成された有用物質を抽出する工程で使用する界面活性剤（Ａ）を含有する培地添加剤であって、（Ａ）の有用物質抽出指標が２０〜１００％であり、かつ細胞活動指標が５０〜１００％である培地添加剤。細胞がグラム陰性菌であることが好ましい。有用物質がタンパク質であることが好ましい。界面活性剤（Ａ）が両性界面活性剤であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内で合成された有用物質を抽出する工程で使用する界面活性剤（Ａ）を含有する培地添加剤であって、（Ａ）の下記有用物質抽出指標が２０〜１００％であり、かつ下記細胞活動指標が５０〜１００％である培地添加剤。
有用物質抽出指標：１重量％の（Ａ）を含む培地に細胞を添加し、３７℃、１時間振とうし抽出した有用物質濃度（Ｙ１）及び（Ａ）を含まない培地に４℃で１０分超音波破砕し抽出した有用物質濃度（Ｙ２）から、下記式（１）により算出し求めた指標
有用物質抽出指標＝（Ｙ１）／（Ｙ２）×１００        （１）
細胞活動指標：１重量％の（Ａ）を含む寒天培地中で細胞を３７℃、２４時間培養した後の生菌数（Ｓ１）及び（Ａ）を含まない寒天培地中で培養した後の生菌数（Ｓ２）から、下記式（２）により算出し求めた指標
細胞活動指標＝（Ｓ１）／（Ｓ２）×１００            （２）
【請求項２】
細胞がグラム陰性菌である請求項１に記載の培地添加剤。
【請求項３】
有用物質がタンパク質である請求項１又は２に記載の培地添加剤。
【請求項４】
界面活性剤（Ａ）が両性界面活性剤である請求項１〜３のいずれかに記載の培地添加剤。
【請求項５】
有用物質を抽出する工程において、界面活性剤（Ａ）の使用量が培地に対して０．００１〜１０重量％である請求項１〜４のいずれかに記載の培地添加剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の培地添加剤を使用して細胞を培養する工程を含む有用物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地添加剤に関する。詳しくは、細胞内で合成された有用物質を抽出する際に使用する培地添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は、アミノ酸、タンパク質等の生理活性物質を生産するための宿主として広く利用されている。特に近年は、遺伝子工学技術を活用して、産業上有用なタンパク質の遺伝子を導入した形質転換された微生物を使用し、生理活性物質を効率的に製造する技術が知られるようになっている。
生理活性物質を生産する好ましい微生物の例として、大腸菌やシュードモナス属菌等のグラム陰性菌、バチルス属菌や乳酸菌等のグラム陽性菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属等の酵母、アスペルギウス属やペニシリウム属等の糸状菌、ストレプトマイセス属やロドコッカス属等の放線菌を挙げることができる。
タンパク質を抽出する方法としては、超音波、高圧ホモジナイザー、フレンチプレス及びダイノミル等の物理的破砕法が挙げられ、広く実用化されている。これらの物理的破砕法は有用物質を取り出す際、同時に細胞を死滅させる。
ところで、ＢＳＥ等の問題から近年、動物由来タンパク質の使用が制限されてきている。そのため、従来、動物から抽出することで生産されていた一部のタンパク質が、需要に対して十分な供給ができなくなってきている。この供給不足は今後ますます深刻になることが予想されるため、遺伝子組み換え技術で組み換えた微生物にタンパク質を従来よりもさらに大量に発現させる技術が注目されている。例えば、発現対象である有用タンパク質をコードする遺伝子について、コドン置換／挿入部位に選択した高頻度出現コドンを組み込むように置換又は挿入した発現ベクターが提案されている。（例えば特許文献１）また、チオレドキシンをコードする第一の核酸配列及びヘモグロビンをコードする第二の核酸配列を宿主細胞にクローニングし、目的タンパク質を過剰発現させる核酸コンストラクト及び発現ベクターが提案されている。（例えば特許文献２）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−３３５９７１号公報
【特許文献２】特開２００６−００６３１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これらのベクターでは得られるタンパク量は増加するものの、タンパク質生産がバッチ式であるため一連のタンパク製造工程において微生物がタンパクを生産する時間が短く、生産効率が十分に向上するとは言えない。
そのため、タンパク質の生産量を飛躍的に向上させ、実用化の観点で十分満足することを可能にする材料及び方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、細胞内で合成された有用物質を抽出する工程で、生体膜の透過性を高め、かつ細胞活動に影響を与えず、タンパク質を連続的に生産することを可能にする培地添加剤を見出し、本発明に至った。
すなわち本発明は、細胞内で合成された有用物質を抽出する工程で使用する界面活性剤（Ａ）を含有する培地添加剤であって、（Ａ）の下記有用物質抽出指標が２０〜１００％であり、かつ下記細胞活動指標が５０〜１００％であることを要旨とする。
有用物質抽出指標：１重量％の（Ａ）を含む培地に細胞を添加し、３７℃、１時間振とうし抽出した有用物質濃度（Ｙ１）及び（Ａ）を含まない培地に４℃で１０分超音波破砕し抽出した有用物質濃度（Ｙ２）から、下記式（１）により算出し求めた指標
有用物質抽出指標＝（Ｙ１）／（Ｙ２）×１００        （１）
細胞活動指標：１重量％の（Ａ）を含む寒天培地中で細胞を３７℃、２４時間培養した後の生菌数（Ｓ１）及び（Ａ）を含まない寒天培地中で培養した後の生菌数（Ｓ２）から、下記式（２）により算出し求めた指標
細胞活動指標＝（Ｓ１）／（Ｓ２）×１００            （２）
【発明の効果】
【０００６】
本発明の培地添加剤は、下記の効果を奏する。
（１）細胞内で合成された有用物質の生体膜に対する透過性を高めることができる。
（２）細胞活動に影響を与えない。
（３）有用物質を連続的に生産することができ、生産量を飛躍的に向上することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の培地添加剤は、細胞内で合成された有用物質を抽出する工程で使用され、界面活性剤（Ａ）を含有する。
【０００８】
本発明における細胞として、以下の細菌細胞及び動物細胞が挙げられる。
細菌細胞としては、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）等のグラム陰性菌細胞、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、酵母細胞及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞等のグラム陽性菌細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳf９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞）等が挙げられる。
【０００９】
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の具体例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕等が挙げられる。
【００１０】
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の具体例としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕等が挙げられる。
【００１１】
これらのうち有用物質の生産性の観点から好ましくは、細菌細胞であり、さらに好ましくはグラム陽性菌であり、最も好ましくはエシェリヒア属菌である。その中でも入手しやすさの観点から大腸菌が好ましい。
【００１２】
本発明における有用物質は、特に限定されないが、タンパク質（酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等）、オリゴ糖及び核酸等が含まれる。
【００１３】
酵素としては、酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等が挙げられる。
【００１４】
組み換えタンパク質としては、上記酵素の遺伝子組み換え酵素、タンパク製剤｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝、ワクチン（Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ワクチン等）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）等が挙げられる。
【００１５】
抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等が挙げられる。
【００１６】
ペプチドとしては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド及びトリペプチド等が挙げられる。
【００１７】
オリゴ糖としては、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、ラフィノース、パノース、シクロデキストリン、ガラクトオリゴ糖及びフラクトオリゴ糖等が挙げられる。
【００１８】
核酸としては、イノシン一リン酸、アデノシン一リン酸及びグアノシン一リン酸等が挙げられる。
【００１９】
これらの生理活性物質のうち、活性維持の観点から、タンパク質（酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種）が好ましく、さらに好ましくは酵素及び組み換えタンパク質である。
【００２０】
本発明の培地添加剤中に含まれる界面活性剤（Ａ）としては両性界面活性剤（Ａ１）、非イオン性界面活性剤（Ａ２）、アニオン性界面活性剤（Ａ３）及びカチオン性界面活性剤（Ａ４）が含まれる。
【００２１】
両性界面活性剤（Ａ１）としては、カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ１−１）、硫酸エステル塩型両性界面活性剤（Ａ１−２）、スルホン酸塩型両性界面活性剤（Ａ１−３）及びリン酸エステル塩型両性界面活性剤（Ａ１−４）等が含まれる。
【００２２】
カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ１−１）は、アミノ酸型両性界面活性剤（Ａ１−１−１）、ベタイン型両性界面活性剤（Ａ１−１−２）及びイミダゾリン型両性界面活性剤（Ａ１−１−３）等が挙げられる。
アミノ酸型両性界面活性剤（Ａ１−１−１）は、分子内にアミノ基とカルボキシル基を有する両性界面活性剤であり、例えば、下記一般式（１）で示される化合物が挙げられる。
［Ｒ−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯ］mＭ           （１）
一般式（１）中、Ｒは炭素数１〜２０の１価の炭化水素基である。ｎは１又は２の整数である。ｍは１又は２の整数である。Ｍは水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム（アミン及びアルカノールアミン等由来のカチオンを含む）及び第４級アンモニウム等の１価又は２価のカチオンである。
（Ａ１−１−１）は、具体的には、アルキルアミノプロピオン酸型両性界面活性剤（ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等）；アルキルアミノ酢酸型両性界面活性剤（ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等）等が挙げられる。
【００２３】
ベタイン型両性界面活性剤（Ａ１−１−２）は、分子内に第４級アンモニウム塩型のカチオン部分とカルボン酸型のアニオン部分を持っている両性界面活性剤であり、下記一般式（２）で示されるアルキルジメチルベタイン（ステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等）、アミドベタイン（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン等）、アルキルジヒドロキシアルキルベタイン（ラウリルジヒドロキシエチルベタイン等）等が挙げられる。
Ｒ−Ｎ+（ＣＨ3）2−ＣＨ2ＣＯＯ-          （２）
一般式（２）中、Ｒは炭素数１〜２０の１価の炭化水素基である。
【００２４】
イミダゾリン型両性界面活性剤（Ａ１−１−３）としては、２−ウンデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。
【００２５】
その他の両性界面活性剤としては、ナトリウムラウロイルグリシン、ナトリウムラウリルジアミノエチルグリシン、ラウリルジアミノエチルグリシン塩酸塩及びジオクチルジアミノエチルグリシン塩酸塩等のグリシン型両性界面活性剤；ペンタデシルスルホタウリン等のスルホベタイン型両性界面活性剤；コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）；ラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルアミンオキサイド型両性界面活性剤等が含まれる。
【００２６】
非イオン性界面活性剤（Ａ２）としては、高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加物（Ａ２−１）、アルキルフェノールＡＯ付加物（Ａ２−２）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ２−３）及び多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ａ２−４）が含まれる。
【００２７】
高級アルコールＡＯ付加物（Ａ２−１）としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モル及び／又はプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）１〜２０モル付加物（ブロック付加物及び／又はランダム付加物を含む。以下同様）［例えば、デシルアルコールのＥＯ８モル／ＰＯ７モルブロック付加物］のうち、ＨＬＢが９〜１３．５のものが含まれ、ラウリルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）、オレイルアルコールＥＯ５モル付加物（ＨＬＢ＝９．０）、オレイルアルコールＥＯ６モル付加物（ＨＬＢ＝１０．２）、オレイルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１１．０）及びオレイルアルコールＥＯ１０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）等が挙げられる。
【００２８】
ＨＬＢとは界面活性剤の親水性及び疎水性を示す尺度として用いられており、ＨＬＢの値が高いほど親水性が高いことを意味する。本発明におけるＨＬＢとは下記式（１）で計算される数値である（界面活性剤入門、１４２頁、藤本武彦著、三洋化成工業株式会社発行）。
ＨＬＢ＝２０×｛親水基の分子量／界面活性剤の分子量｝      （１）
【００２９】
アルキルフェノールＡＯ付加物（Ａ２−２）としては、炭素数６〜２４のアルキル基を有するアルキルフェノールＡＯ付加物のＨＬＢが９〜１３．５のものが含まれ、オクチルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物並びにノニルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物等が挙げられる。また、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＨＬＢ＝１３．５）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４（ＨＬＢ＝１２．４）、ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−５２０（ＨＬＢ＝１０．０）及びｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０（ＨＬＢ＝１３．０）、等が市場から容易に入手できる。
【００３０】
脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ２−３）としては、炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物のうち、ＨＬＢが９〜１３．５のものが含まれ、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．８）、ジオレイン酸ＥＯ１２モル付加物（ＨＬＢ＝１０．４）、ジオレイン酸ＥＯ２０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．９）及びステアリン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．９）等が挙げられる。
【００３１】
多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ａ２−４）としては、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物、並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド及びこれらのＡＯ付加物が含まれ、ソルビタンテトラオレイン酸エステルＥＯ付加物（ＨＬＢ＝１１．４）及びソルビタンヘキサオレイン酸エステルＥＯ付加物（ＨＬＢ＝１０．２）等が挙げられる。
【００３２】
アニオン性界面活性剤としては（Ａ３）、エーテルカルボン酸（Ａ３−１）又はその塩、硫酸エステル（Ａ３−２）もしくはエーテル硫酸エステル（Ａ３−３）及びそれらの塩、スルホン酸塩（Ａ３−４）、スルホコハク酸塩（Ａ３−５）、リン酸エステル（Ａ３−６）もしくはエーテルリン酸エステル（Ａ３−７）及びそれらの塩、脂肪酸塩（Ａ３−８）、アシル化アミノ酸塩、並びに天然由来のカルボン酸及びその塩（ケノデオキシコール酸、コール酸及びデオキシコール酸等）が挙げられる。
【００３３】
エーテルカルボン酸（Ａ３−１）又はその塩としては炭素数８〜２４の炭化水素基を有するエーテルカルボン酸及びその塩が含まれ、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム塩及びラウリルグリコール酢酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３４】
硫酸エステル（Ａ３−２）及びその塩としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有する硫酸エステル及びその塩が含まれ、ラウリル硫酸ナトリウム塩及びラウリル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００３５】
エーテル硫酸エステル（Ａ３−３）及びその塩としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有するエーテル硫酸エステル及びその塩が含まれ、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００３６】
スルホン酸塩（Ａ３−４）としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩及びナフタレンスルホン酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３７】
スルホコハク酸塩（Ａ３−５）としては、ポリオキシエチレンラウリルスルホコハク酸二ナトリウム塩、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム塩及びスルホコハク酸ポリオキシエチレンラウロイルエタノールアミド二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３８】
リン酸エステル（Ａ３−６）としては、オクチルリン酸二ナトリウム塩及びラウリルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３９】
エーテルリン酸エステル（Ａ３−７）としては、ポリオキシエチレンオクチルエーテルリン酸二ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００４０】
脂肪酸塩（Ａ３−８）としては、オクチル酸ナトリウム塩、ラウリル酸ナトリウム塩及びステアリン酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００４１】
カチオン性界面活性剤（Ａ４）としては、第４級アンモニウムカチオン性界面活性剤（Ａ４−１）及びアミン塩型カチオン性界面活性剤（Ａ４−２）が含まれる。
【００４２】
第４級アンモニウムカチオン性界面活性剤（Ａ４−１）としては、炭素数８〜２２のアルキル基を１つ含むカチオン性界面活性剤（Ａ４−１−１）及び２つ含むカチオン性界面活性剤（Ａ４−１−２）が含まれる。
（Ａ４−１−１）としては、セチルトリメチルアンモニウム塩化物塩、ステアリルトリメチルアンモニウム塩化物塩、セチルトリメチルアンモニウム臭化物塩、ステアリルトリメチルアンモニウム臭化物塩、ベヘニルトリメチルアンモニウム塩化物塩ベンザルコニウム塩化物塩及びラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウムエチル硫酸塩等が挙げられる。
（Ａ４−１−２）としては、ジデシルジメチルアンモニウム塩化物塩、ジデシルジメチルアンモニウムアジピン酸塩、ジデシルジメチルアンモニウムブタンテトラカルボン酸塩及びジステアリルジメチルアンモニウム塩化物塩等が挙げられる。
【００４３】
アミン塩型カチオン性界面活性剤（Ａ４−２）としては、オクチルアミン塩酸塩、ラウリルアミン塩酸塩及びステアリルアミン塩酸塩等が挙げられる。
【００４４】
これらのうち、有用物質抽出及び細胞活動維持の観点から、両性界面活性剤（Ａ１）及びアニオン性界面活性剤（Ａ３）が好ましく、さらに好ましくは両性界面活性剤（Ａ１）及び（Ａ３−１）である。
【００４５】
本発明の培地添加剤において界面活性剤（Ａ）は、使用に当たっては、界面活性剤（Ａ）をそのまま使用してもよいし、必要により水と混合して、水性希釈液（水溶液状又は水分散液状）として用いることができる。
水性希釈液における、界面活性剤（Ａ）の合計濃度は、対象となる微生物、生理活性物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、溶菌性及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、１〜９９重量％が好ましく、好ましくは２〜５０重量％である。
【００４６】
本発明の培地添加剤における（Ａ）は、有用物質抽出指標が２０〜１００％である。生産性の観点から、３０〜１００％が好ましい。
有用物質抽出指標が２０％未満の場合、目的タンパク質の収率が低く、生産性の観点で実使用に耐えない。
【００４７】
ここで有用物質抽出指標とは１重量％の（Ａ）を含む培地に細胞を添加し、３７℃、１時間振とうし抽出した有用物質濃度（Ｙ１）及び（Ａ）を含まない培地に４℃で１０分超音波破砕し抽出した有用物質濃度（Ｙ２）から、下記式（１）により算出し求めた指標を指す。
有用物質抽出指標＝（Ｙ１）／（Ｙ２）×１００       （１）
【００４８】
有用物質抽出指標を小さくするには、（Ａ）として炭素数の小さいものを使用する等の方法で行うことができる。
有用物質抽出指標を大きくするには、（Ａ）として炭素数の大きいものを使用する等の方法でおこなうことができる。
【００４９】
本発明の培地添加剤における（Ａ）は、細胞活動指標が５０〜１００％である。生産性の観点から、６０〜１００％が好ましい。
細胞活動指標が５０％未満の場合、目的タンパク質の収率が低く、生産性の観点で実使用に耐えない。
【００５０】
ここで細胞活動指標とは１重量％の（Ａ）を含む寒天培地中で細胞を３７℃、２４時間培養した後の生菌数（Ｓ１）及び（Ａ）を含まない寒天培地中で培養した後の生菌数（Ｓ２）から、下記式（２）により算出し求めた指標を指す。
細胞活動指標＝（Ｓ１）／（Ｓ２）×１００      （２）
【００５１】
細胞活動指標を小さくするには、（Ａ）として炭素数の大きいものを使用する等の方法でおこなうことができる。
細胞活動指標を大きくするには、（Ａ）として炭素数の小さいものを使用する等の方法でおこなうことができる。
【００５２】
本願発明の培地添加剤における（Ａ）の含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、培地添加剤の重量を基準として、１〜８０が好ましく、さらに好ましくは１０〜５０である。
【００５３】
有用物質を抽出する工程における培地添加剤に含まれる界面活性剤（Ａ）の使用量（重量％）は、対象となる微生物、生産される有用物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培地の重量を基準として、０．００１〜１０が好ましく、溶菌性及びタンパク質の変性のさせにくさの観点から、さらに好ましくは０．０５〜１０、次にさらに好ましくは０．１〜５である。
【００５４】
界面活性剤（Ａ）を含有する培地添加剤はあらかじめ培地と混合して使用する以外に、微生物を懸濁させた培地に後から添加しても良い。培地との混合は、２０℃〜４０℃で培地に界面活性剤（Ａ）を含有する培地添加剤を添加し、撹拌羽根又はスターラー等で撹拌することで行うことができる。後から混合する際は、撹拌羽根等で撹拌しながら添加することで行うことができる。
【００５５】
培地添加剤には上記界面活性剤（Ａ）以外に、キレート剤、無機塩、有機酸及びその塩並びに多価アルコール等のタンパク質安定化剤を加えても良い。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸及びその塩、ポリリン酸及びその塩並びにメタリン酸及びその塩が挙げられる。
無機塩としては、塩化ナトリウム及び塩化カリウム等の１価金属塩、塩化マグネシウム及び塩化カルシウム等の２価金属塩等が挙げられる。
有機酸及びその塩としては、アミノ酸及びその塩、乳酸及びその塩並びにヒアルロン酸及びその塩等が挙げられる。塩としてはアルカリ金属塩が挙げられ、入手のしやすさの観点でナトリウム塩が好ましい。
多価アルコールとしては、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ペンタエリスリトール、キシリトール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコール等が挙げられる。
【００５６】
タンパク質安定化剤を使用する場合その含有量（重量％）は、生産性の観点から、界面活性剤（Ａ）の重量に対し、１〜１００が好ましく、さらに好ましくは２〜３０である。
【００５７】
本発明の培地添加剤は、界面活性剤（Ａ）又は（Ａ）の水性希釈液をそのまま培地添加剤とすることができる。タンパク質安定化剤を使用する場合は、（Ａ）又は（Ａ）の水性希釈液とタンパク質安定化剤を公知の方法で混合することで本発明の培地添加剤を製造することができる。
【００５８】
本発明の培地添加剤の使用の方法であり、本発明の別の実施態様でもある有用物質の製造方法は、上記に記載の培地添加剤を使用して細胞を培養する工程を含む有用物質の製造方法である。
【００５９】
以下に本発明の培地添加剤を使用して細胞を培養する工程を含む有用物質の製造方法の一例を示す。
（ｉ）遺伝子組み換え
（ｉ−１）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージ又はプラスミドに組み込む。
（ｉ−２）得られた組み換えファージ又はプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉ−３）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。細胞膜を貫通させるタグを同時に連結することもできる。
（ｉｉ）培養
（ｉｉ−１）宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は寒天培地上で通常１５〜４３℃で３〜２４時間行う。
（ｉｉ−２）培養に用いる培地を１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で培養した組み換えした宿主を本培養する。通常１５〜４３℃で２４〜７２時間行う。なお、培養の際から、本願発明の培地添加剤を使用する場合は、本発明の培地添加剤と培地を混合し均一化したものを、培地として用いて同様の操作を行う。
（ｉｉｉ）精製
（ｉｉｉ−１）本工程で本発明の培地添加剤を添加する。なお、工程（ｉｉ−２）において既に本発明の培地添加剤を使用している場合は、その培地添加剤を含んだ培地が本工程に供されるので、本工程での培地添加剤の添加は必要に応じて行えばよい。
本工程で本発明の培地添加剤を添加する場合は、１５℃〜３７℃に温調した培地添加剤を無菌的に添加し、１５〜３７℃で３０分〜２時間程度撹拌する。
培地中に抽出されたタンパク質は、遠心分離、中空糸分離、限外ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
（ｉｉｉ−２）タンパク質を含む培地水溶液は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜おこなうにことよって分離精製される。
【００６０】
上記の工程において、本発明の培地添加剤は、有用物質の生産性の観点から、工程（ｉｉ−２）で使用することが好ましい
【００６１】
（ｉｉｉ−１）で分離された宿主細胞は、その後、培養釜に戻し、新たに培地を供給することにより、さらに培養することができる。その培地等をさらに（ｉｉｉ）の工程に供し精製、培養を繰り返すことにより、有用物質の連続生産を行うことができる。
本願発明の培地添加剤は、宿主細胞を破壊することが無いので、この様な連続生産における宿主細胞の生存率が高まる。したがって、有用物質を連続的に生産することができ、生産量を飛躍的に向上することができる。
【００６２】
上記の（ｉｉｉ）のタンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【００６３】
目的生産物質が不溶体を形成した場合は、（ｉｉ）工程と（ｉｉｉ）工程の間に以下の２工程を加えることで有用物質の抽出をおこなうことができる。
（α）アンフォールディング工程：
不溶体となった目的生産物質に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤及び２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（β）リフォールディング工程：
アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、０．２〜６モル／Ｌの濃度になるようにリフォールディング剤を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置する。又はリフォールディングバッファーで大希釈することによりリフォールディングを行う。
【００６４】
上記の（α）のアンフォールディング工程において使用されるアンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素及びこれらの併用等が挙げられる。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジン及び／又は尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン又はチオフェノール等を加えてもよい。
【００６５】
上記の（β）のリフォールディング工程におけるタンパク質のリフォールディング方法は、希釈法、透析法、界面活性剤利用法、人工シャペロン利用法及び特開２００７−１４５８０１号公報記載の方法いずれの方法でもリフォールディングすることができる。特に特開２００７−１４５８０１号公報記載の方法は生産性・汎用性の観点から好ましい。
【００６６】
本発明の製造方法で得られる有用物質は、上記の方法で得られるため、従来よりも活性が高い。また生産性に優れているので短時間で高い収量を得ることができる。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り、部は重量部を意味する。
【００６８】
実施例１＜培地添加剤（Ｍ−１）の作製＞
塩酸ラウリルジアミノエチルグリシン（三洋化成工業（株）製、商品名「レボンＬＡＧ−４０」）及びイオン交換水を表１の部数添加し、２５℃で撹拌混合して溶解させ培地添加剤（Ｍ−１）を作製した。
塩酸ラウリルジアミノエチルグリシンが界面活性剤（Ａ）に相当し、その有用物質抽出指標は８０％、細胞活動指標は８０％であった。
【００６９】
【表１】
2010233513.tif 000002
【００７０】
実施例２＜培地添加剤（Ｍ−２）の作製＞
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン（三洋化成工業（株）製、商品名「レボン２０００」）及びイオン交換水を表１の部数添加し、２５℃で撹拌混合して溶解させ培地添加剤（Ｍ−２）を作製した。
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタインが界面活性剤（Ａ）に相当し、その有用物質抽出指標は１００％、細胞活動指標は８０％であった。
【００７１】
実施例３＜培地添加剤（Ｍ−３）の作製＞
ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム（三洋化成工業（株）製、商品名「ビューライトＥＣＡ」）及びイオン交換水を表１の部数添加し、２５℃で撹拌混合して溶解させ培地添加剤（Ｍ−３）を作製した。
ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウムが界面活性剤（Ａ）に相当し、その有用物質抽出指標は２０％、細胞活動指標は８０％であった。
【００７２】
実施例４＜培地添加剤（Ｍ−４）の作製＞
オクチルフェノールエチレンオキサイド１０モル付加物（和光純薬（株）製）及びイオン交換水を表１の部数添加し、２５℃で撹拌混合して溶解させ培地添加剤（Ｍ−４）を作製した。
オクチルフェノールエチレンオキサイド１０モル付加物が界面活性剤（Ａ）に相当し、その有用物質抽出指標は６０％、細胞活動指標は１００％であった。
【００７３】
実施例５＜培地添加剤（Ｍ−５）の作製＞
ジデシルジメチルアンモニウム・アジピン酸塩（三洋化成工業（株）製、商品名「オスモリンＤＡ−５０」）及びイオン交換水を表１の部数添加し、２５℃で撹拌混合して溶解させ培地添加剤（Ｍ−５）を作製した。
ジデシルジメチルアンモニウム・アジピン酸塩が界面活性剤（Ａ）に相当し、その有用物質抽出指標は４０％、細胞活動指標は５０％であった。
【００７４】
実施例６＜培地添加剤（Ｍ−１）を用いたタンパク質生産＞
膜貫通するシグナルを持ち、かつＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をコードするＤＮＡをプラスミドに構築する。このプラスミドと大腸菌ＢＬ−２１株をヒートショック法（８０℃、３０秒）で形質転換し、寒天培地が入ったシャーレに播き３７℃、１晩培養した。
オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分）したＬＢ培地１０ｍＬにシャーレから白金耳で掻き取った大腸菌コロニーを添加し、３７℃で振とう培養器を用いて１晩振とうした。オートクレーブ滅菌したＬＢ培地１０００ｍＬに１晩培養した大腸菌懸濁液１０ｍＬを加え、３７℃で振とうした。ＯＤ６００が０．６になったときにＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、１時間振とうした。その後、実施例１で作製した培地添加剤（Ｍ−１）を５０ｍＬ添加し、３７℃、３時間振とうした。
振とう後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清を回収した。
上清中のＧＦＰ量は抗ＧＦＰ抗体を用い蛍光定量した。蛍光定量した結果を用いて、生産性を下記の指標で評価した。
【００７５】
生産性  ５：ＧＦＰ濃度  ０．１ｍｇ／ｍＬ以上
４：            ０．０５ｍｇ／ｍＬ以上〜０．１ｍｇ／ｍＬ未満
３：            ０．０１ｍｇ／ｍＬ以上〜０．０５ｍｇ／ｍＬ未満
２：            ０．００５ｍｇ／ｍＬ以上〜０．０１ｍｇ／ｍＬ未満
１：            ０．００５ｍｇ／ｍＬ未満
【００７６】
実施例７＜培地添加剤（Ｍ−２）を用いたタンパク質生産＞
実施例６において、培地添加剤（Ｍ−１）を（Ｍ−２）に変更する以外は実施例６と同様におこない蛍光定量し、生産性を評価した。
【００７７】
実施例８＜培地添加剤（Ｍ−３）を用いたタンパク質生産＞
実施例６において、培地添加剤（Ｍ−１）を（Ｍ−３）に変更する以外は実施例６と同様におこない蛍光定量し、生産性を評価した。
【００７８】
実施例９＜培地添加剤（Ｍ−４）を用いたタンパク質生産＞
実施例６において、培地添加剤（Ｍ−１）を（Ｍ−４）に変更する以外は実施例６と同様におこない蛍光定量し、生産性を評価した。
【００７９】
実施例１０＜培地添加剤（Ｍ−５）を用いたタンパク質生産＞
実施例６において、培地添加剤（Ｍ−１）を（Ｍ−５）に変更する以外は実施例６と同様におこない蛍光定量し、生産性を評価した。
【００８０】
実施例１１＜培地添加剤（Ｍ−１）を用いたタンパク質生産＞
実施例６において、培地添加剤（Ｍ−１）５０ｍＬを（Ｍ−１）０．０５ｍＬに変更する以外は実施例６と同様におこない蛍光定量し、生産性を評価した。
【００８１】
実施例１２＜培地添加剤（Ｍ−１）を用いたタンパク質生産＞
実施例６において、培地添加剤（Ｍ−１）５０ｍＬを（Ｍ−１）５００ｍＬに変更する以外は実施例６と同様におこない蛍光定量し、生産性を評価した。
【００８２】
実施例１３＜培地添加剤（Ｍ−１）を用いたタンパク質生産＞
実施例６において、ＩＰＴＧを添加後の振とうする時間を１時間から３時間に変更する以外は実施例６と同様におこない蛍光定量し、生産性を評価した。
【００８３】
実施例１４＜培地添加剤（Ｍ−１）を用いたタンパク質の連続生産＞
実施例６において、遠心分離後に１度目の上清を回収した後の遠心分離後の残さの大腸菌を、オートクレーブ滅菌したＬＢ培地１０００ｍＬに加え、３７℃で３時間振とうした。振とう後、再度遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清を回収し、１度目の遠心分離の際の上清と混合し、実施例６と同様に蛍光定量し、生産性を評価した。
【００８４】
比較例１＜超音波＞
膜貫通するシグナルを持ち、かつＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をコードするＤＮＡをプラスミドに構築する。このプラスミドと大腸菌ＢＬ−２１株をヒートショック法（８０℃、３０秒）で形質転換し、寒天培地が入ったシャーレに播き３７℃、１晩培養した。
オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分）したＬＢ培地１０ｍＬにシャーレから白金耳で掻き取った大腸菌コロニーを添加し、３７℃で振とう培養器で１晩振とうした。オートクレーブ滅菌したＬＢ培地１０００ｍＬに１晩培養した大腸菌懸濁液１０ｍＬを加え、３７℃で振とうした。ＯＤ６００が０．６になったときにＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、１時間振とうした。その後、超音波ホモジナイザー（１３０Ｗ、１０分）で大腸菌を破砕後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清を回収した。
上清中のＧＦＰ量は抗ＧＦＰ抗体を用い蛍光定量した。
【００８５】
比較例２＜フレンチプレス＞
比較例１において、超音波ホモジナイザー（１３０Ｗ、１０分）での大腸菌の破砕を、フレンチプレス（３０００ｐｓｉ、１パス）での大腸菌の破砕に変更する以外は比較例１と同様におこなった。
【００８６】
比較例３＜リゾチーム＞
比較例１において、超音波ホモジナイザー（１３０Ｗ、１０分）での大腸菌の破砕を、「終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようにリゾチーム水溶液（和光純薬工業製）を加え、２５℃、３時間振とうする」処理に変更する以外は比較例１と同様におこなった。
【００８７】
実施例６〜１４及び比較例１〜３の結果を表２に示す。
【００８８】
【表２】
2010233513.tif 000003
【００８９】
表２の結果から、従来の物理的破砕法では生産性（タンパク抽出効率）が悪いことがわかる。一方、本発明の培地添加剤を用いる実施例６〜１４はタンパク抽出効率が高く、特に実施例６〜８及び実施例１４は特に効率がよいことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の培地添加剤は、タンパク質などの有用物質を生産菌から抽出する際に使用できる。タンパク質としては酵素、組換えタンパク質及びペプチドが挙げられる。