(57)【要約】【課題】本発明は、分子生物学の分野に存在する。より詳細には、本発明は、ポリヌクレオチド配列および対応するＴＩＡＭ２タンパク質に関する。【解決手段】本発明は、ＴＩＡＭ２タンパク質をコードする核酸配列を提供する。本発明はまた、診断アッセイ、発現ベクター、アンチセンス分子、リボザイムおよび核酸配列によりコードされるポリペプチドを発現するための宿主細胞を包含する。本発明はまた、この核酸配列によりコードされるポリペプチド配列に対する特許請求を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野に存在する。より詳細には、本発明は、ポリヌクレオチド配列および対応するＴＩＡＭ２タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＴＩＡＭ１遺伝子およびコードされるタンパク質の特徴づけは、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４において議論される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｈａｂｅｔｓら、Ｃｅｌｌ  ７７：５３７−５４９（１９９４）
【非特許文献２】Ｈａｒｔ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６２−６５（１９９４）
【非特許文献３】Ｈａｓｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：３０９−３１０（１９９３）
【非特許文献４】Ｍａｙｅｒ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  ７３：６２９−６３０（１９９３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本発明は、配列番号８のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。
【０００５】
本発明はまた、配列番号８によりコードされるポリペプチドに関する。
【０００６】
本発明はさらに、配列番号８に少なくとも８０％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【０００７】
本発明はなおさらに、配列番号８に少なくとも８５％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【０００８】
本発明はまた、配列番号８に少なくとも９０％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号８に少なくとも９５％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００１０】
本発明は、配列番号９のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
本発明はまた、配列番号９によりコードされるポリペプチドに関する。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号９に少なくとも８０％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００１３】
本発明はなおさらに、配列番号９に少なくとも８５％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
本発明はまた、配列番号９に少なくとも９０％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００１５】
本発明はさらに、配列番号９に少なくとも９５％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００１６】
本発明は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
本発明はまた、配列番号１０によりコードされるポリペプチドに関する。
【００１８】
本発明はさらに、配列番号１０に少なくとも８０％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００１９】
本発明はなおさらに、配列番号１０に少なくとも８５％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号１０に少なくとも９０％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００２１】
本発明はさらに、配列番号１０に少なくとも９５％配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００２２】
本発明は、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドに関する。
【００２３】
本発明はまた、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも８５％配列同一性を有するポリペプチドに関する。
【００２４】
本発明はさらに、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドに関する。
【００２５】
本発明はなおさらに、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するポリペプチドに関する。
【００２６】
本発明はさらに、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０により、または配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに特異的に結合し得る抗体に関する。
【００２７】
本発明はさらに、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合し得る抗体に関する。
【００２８】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＴＩＭＡ２発現産物の発現の検出の方法に関し、この方法は、生物学的サンプルからポリペプチドを得る工程、ＴＩＡＭ２に特異的に結合し得る抗体とこのポリペプチドを接触させる工程、および抗体−ポリペプチド複合体の存在または非存在を検出する工程の方法に関する。
【００２９】
本発明はまた、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリヌクレオチドを発現する工程を包含する、ＴＩＡＭ２ポリペプチドを得る方法に関する。
【００３０】
本発明はさらに、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０に少なくとも８０％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３１】
本発明はなおさらに、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０および少なくとも１つの調節領域に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３２】
本発明はまた、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０に少なくとも８０％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【００３３】
本発明はさらに、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のポリヌクレオチド配列と癌性である恐れのある卵巣組織サンプルの染色体６ｑ２５の領域のポリペプチド配列とを比較する工程、および組織サンプルのポリヌクレオチド中の配列の存在または不存在を検出する工程を包含する、卵巣癌における染色体６ｑ２５の領域の欠失を検出する方法に関する。
【００３４】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）  以下：
（ａ）配列番号１１のアミノ酸約１〜約６２６をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸約２〜約６２６をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸約１〜約６２６をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸約２〜約６２６をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸約１〜約６２６をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１３のアミノ酸約２〜約６２６をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドに少なくとも８０％同一のポリヌクレオチド；および
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド相補体、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
（項目２）  配列番号８、配列番号９または配列番号１０のコード領域由来の１０個連続したヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
（項目３）  配列番号８、配列番号９または配列番号１０のコード領域由来の２０個連続したヌクレオチドを含む、項目２に記載の単離された核酸分子。
（項目４）  配列番号８、配列番号９または配列番号１０のコード領域由来の５０個連続したヌクレオチドを含む、項目３に記載の単離された核酸分子。
（項目５）  ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、ここで少なくとも１つの保存アミノ酸置換を除いて、該ポリペプチドが以下：
（ａ）配列番号１１の約１〜約６２６のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１１の約２〜約６２６のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２の約１〜約６２６のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１２の約２〜約６２６のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１３の約１〜約６２６のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；および
（ｆ）配列番号１３の約２〜約６２６のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離された核酸分子。
（項目６）  項目１に記載の核酸分子をプロモーターへ作動可能な連結でベクター中に挿入する工程を包含する、組換えベクターを作成する方法。
（項目７）  項目６に記載の方法により生成される組換えベクター。
（項目８）  項目７の組換えベクターを宿主細胞中に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法。
（項目９）  項目８に記載の方法により生成される、組換え宿主細胞。
（項目１０）  ポリペプチドを産生する組換え方法であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で、項目９に記載の組換え宿主細胞を培養する工程および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
（項目１１）  以下：
（ａ）配列番号１１の約１〜６２６のアミノ酸；
（ｂ）配列番号１１の約２〜６２６のアミノ酸；
（ｃ）配列番号１２の約１〜６２６のアミノ酸；
（ｄ）配列番号１２の約２〜６２６のアミノ酸；
（ｅ）配列番号１３の約１〜６２６のアミノ酸；および
（ｆ）配列番号１３の約２〜６２６のアミノ酸、
からなる群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１２）  単離されたポリペプチドであって、少なくとも１つの保存アミノ酸置換を除いて、該ポリペプチドが、以下：
（ａ）配列番号１１の約１〜６２６のアミノ酸；
（ｂ）配列番号１１の約２〜６２６のアミノ酸；
（ｃ）配列番号１２の約１〜６２６のアミノ酸；
（ｄ）配列番号１２の約２〜６２６のアミノ酸；
（ｅ）配列番号１３の約１〜６２６のアミノ酸；および
（ｆ）配列番号１３の約２〜６２６のアミノ酸、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
（項目１３）  以下：
（ａ）配列番号１１の約１〜６２６のアミノ酸；
（ｂ）配列番号１１の約２〜６２６のアミノ酸；
（ｃ）配列番号１２の約１〜６２６のアミノ酸；
（ｄ）配列番号１２の約２〜６２６のアミノ酸；
（ｅ）配列番号１３の約１〜６２６のアミノ酸；および
（ｆ）配列番号１３の約２〜６２６のアミノ酸、
からなる群から選択されるアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１４）  配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のポリペプチドのエピトープ保有部分。
（項目１５）  配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の１０個連続したアミノ酸を含む、項目１４に記載のエピトープ保有部分。
（項目１６）  配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の２０個連続したアミノ酸を含む、項目１５に記載のエピトープ保有部分。
（項目１７）  項目１１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
（項目１８）  項目１２に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
（項目１９）  項目１３に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
（項目２０）  （ｉ）配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０またはそのフラグメントの少なくとも１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列を含むアンチセンスポリヌクレオチドであって、ここで該ポリヌクレオチドは、ネイティブなヒトＴＩＡＭ２のｍＲＮＡにハイブリダイズし得る、アンチセンスポリヌクレオチド；および（ｉｉ）該アンチセンスポリヌクレオチドの転写を開始し得る配列を含むポリヌクレオチド、を含むアンチセンスベクター。
（項目２１）  転写を開始するための前記配列がレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス由来である、項目２０に記載のアンチセンスベクター。
（項目２２）  さらに複製起点を含む、項目２１に記載のアンチセンスベクター。
（項目２３）  以下：
（ａ）配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０またはそのフラグメントの少なくとも１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列を含むアンチセンスポリヌクレオチドであって、そして、ネイティブなヒトＴＩＡＭ２のｍＲＮＡにハイブリダイズし得るアンチセンスポリヌクレオチドを提供する工程；および
（ｂ）該アンチセンスポリヌクレオチドを該ＴＩＡＭ２と接触させる工程、
を包含する、ＴＩＡＭ２の発現を阻害する方法。
（項目２４）  サンプル中の過剰増殖細胞を検出するための方法であって、以下：
（ａ）配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０またはそのフラグメントの少なくとも１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列を含むプローブポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）ポリヌクレオチドハイブリッドを形成させる条件下でサンプル細胞のポリヌクレオチドと該プローブとを接触させる工程；および
（ｃ）ハイブリッドを検出する工程、
を包含する、方法。
（項目２５）  サンプル中のＴＩＡＭ２ポリペプチドを検出する方法であって、以下：
（ａ）ＴＩＡＭ２ポリペプチドの特異的に結合する抗体であって、ここで該ＴＩＡＭ２ポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０またはそのフラグメントの少なくとも１つにハイブリダイズし得る配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む、抗体を提供する工程；
（ｂ）該抗体を抗体／抗原複合体を形成させる条件下で該サンプルに接触する工程；および
（ｃ）複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
（項目２６）  細胞の複製を阻害する方法であって、以下：
（ａ）ＴＩＡＭ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、ここで該ＴＩＡＭ２ポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０またはそのフラグメントの少なくとも１つにハイブリダイズし得る配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む、抗体を提供する工程；
（ｂ）該抗体を抗体／抗原複合体を形成させる条件下でサンプルに接触する工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】２μｇ／レーンのポリ（Ａ）-ｍＲＮＡを含む、ヒト脳（Ａ）ブロットおよび組織特異的（Ｂ）ブロットは、ＴＩＡＭ２の長い形態（ＴＩＡＭL）および短い形態（ＴＩＡＭS）の両方を認識するＴＩＡＭ特異的プローブとハイブリダイズされた。脳特異的ノーザンに際して、４．４−Ｋｂメッセージの５’末端由来のプローブは、長い形態のみにハイブリダイズした（Ｃ）が、一方、３’特異的プローブは、長い形態および短い形態の両方にハイブリダイズした（Ｄ）。
【図２】図２は、マウス脳中のＴＩＡＭ２およびｍＲＮＡの発現を示す。（Ａ）Ｅ１３．５胎仔脳の全量。ＴＩＡＭ２転写物は、発生している終脳（Ｔ）にわたり発現される。（Ｂ）ＴＩＡＭ２  ｍＲＮＡが軟膜（Ｐ）表面の近くの細胞に配置されることを実証する、Ｅ１３．５終脳を通る傍矢状断面；標識化は、脳室表面（Ｖ）付近には見られなかった。（Ｃ）成体マウス前脳を通る冠状切断。ＴＩＡＭ２転写物は、上皮（小さい矢印）および灰白層（矢印）において強度の標識化で、大脳皮質（Ｃｔｘ）および尾状被殻（ＣＰ）に局在化される。（Ｄ）脳梁（ＣＣ）の下の側脳室（ＬＶ）を裏打ちする上皮（矢じり）における標識化のより高い拡大の表示。（Ｅ）嗅球、糸球体層（矢じり）、僧帽状細胞層（矢印）におけるＴＩＡＭ２転写。（Ｆ）視床（矢じり）および灰白小束（矢印）における標識化を実証する冠状切断。（Ｇ）歯状回（ＤＧ）の顆粒細胞およびＣＡ２の錐体細胞における発現を示すＴＩＡＭ２の海馬の発現。
【図３】図３は、ＴＩＡＭ２Lのアミノ酸配列とＴＩＡＭ１タンパク質のカルボキシ末端のアミノ酸配列（アミノ酸５７６〜１５９１）との比較を示す。ＥＸドメイン、代替的スプライス領域、ＤＨＲドメイン、ＤＨドメインおよびＰＨドメインが、下線され、そしてＴＩＡＭ２S（アミノ酸４５２）の開始メチオニンは太字であり、そして矢印で示される。
【図４】図４は、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換アッセイの結果を示す。不完全に精製したＨｉｓ−ＴＩＡＭ２Sタンパク質は、免疫沈降したＲａｃ（Ａ）タンパク質またはＲａｓ（Ｂ）タンパク質でＧＤＰ−ＧＴＰ交換活性を刺激する能力についてアッセイされた。（Ａ）Ｒａｃが、Ｈｉｓ−ＴＩＡＭ２S（◇）、ＳＯＳ（○）、または緩衝液単独（□）の存在下で［32Ｐ］ＧＴＰとインキュベートされた、３つの別々の反応の平均。（Ｂ）Ｒａｓが、ＴＩＡＭ２S（●）、ＳＯＳ（▲）または緩衝液単独（×）の存在下で［32Ｐ］ＧＴＰとインキュベートされた代表的な実験。
【図５】図５は、腫瘍組織および正常な組織中のＴＩＡＭ２  ｍＲＮＡの発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（発明の詳細な説明）
ＴＩＡＭ２（ＤＰ−７５）（Ｔ細胞リンパ腫の侵襲および転移２について）は、ＴＩＡＭ１といくらかの配列相同性を有する新規のＤＮＡおよびアミノ酸配列に関する。（Ｈａｂｅｔｓら、Ｃｅｌｌ  ７７：５３７−７４９（１９９４）、およびＨａｂｅｔｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０：１３７１−１３７６（１９９５））。全長のまたは短縮された形態のＴＩＡＭ１の過剰発現は、マウス中でのリンパ腫の細胞の転移の可能性を増大する。ＴＩＡＭ１は、Ｒｈｏ様およびＲａｃ様のＧＴＰａｓｅを活性化するタンパク質である、ファミリーＧＤＰ解離刺激因子（ＧＤＳ）のメンバーである。ＧＤＳ、ならびにＲｈｏおよびＲａｃは、腫瘍形成性の能力を有する。
【００３７】
本発明に従うと、ＴＩＡＭ１に対して高い相同性を有する新規のタンパク質であるＴＩＡＭ２が同定されている。ＴＩＡＭ２は、約４．４ｋｂおよび約３．３ｋｂのメッセージとして発現され、これは、ＴＩＡＭ２タンパク質の長い形態（ＴＩＡＭ２L）および短い形態（ＴＩＡＭ２S）をコードする。ＴＩＡＭ２Lは、ＴＩＡＭ１のコイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）領域に対して同一性を有する領域中で開始し、そしてＴＩＡＭ１中に見出されるＥＸおよびＰＤＺドメインの両方を含む。ＴＩＡＭ２LおよびＴＩＡＭ２Sの両方が、ＴＩＡＭ１のＤＨおよびカルボキシ末端のＰＨドメインに対して同一の領域を含む。さらなるレベルの複雑度が、約４．４ｋｂのメッセージの選択的スプライシングによって加わり、この選択的スプライシングは、ＥＸドメインとＤＨＲドメインとの間に２４アミノ酸の挿入を導く。
【００３８】
約４．４ｋｂのメッセージの分析によって、翻訳のための良好な状況にある５１位のヌクレオチドでのＡＴＧが同定され、一方、さらなる分析によって、ＯＲＦがＡＴＧの５’から最初の５１ヌクレオチドへと延長され得ることが明らかになった。この延長されたＯＲＦは、ＴＩＡＭLを延長するさらなる５’配列が存在することを示し得る。開始は、おそらく、ヌクレオチド５１位で開始する、なぜなら、ｃＤＮＡクローンの大きさ（４５８６ｎｔ）は、小脳のメッセージ（約４．４ｋｂ）の概算される大きさに等しいかまたはそれよりも大きいからであり、そしてなぜなら、多数の試みにもかかわらず、さらなる５’配列が同定されなかったからである。
【００３９】
ＴＩＡＭ２SのＨｉｓタグをつけたバージョンが、ＴＩＡＭ２の発現に好ましい系であるバキュロウイルス系中で発現され、そしてニッケルカラム上で精製された。Ｈｉｓ−ＴＩＡＭ２Sは、ＳＯＳと比較され、そしてＲＡＳよりもＲＡＣを好むＧＥＦ活性を有することが示された。
【００４０】
ＴＩＡＭ１およびＴＩＡＭ２タンパク質のコード配列間での高い類似性、発現パターン、およびＧＥＦ活性は、ＴＩＡＭ１と同様に（Ｈａｂｅｔｓら、Ｃｅｌｌ  ７７：５３７−５４９、１９９４；Ｈｏｒｄｉｊｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１４６４−１４６６、１９９７；Ｅｈｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９：１−１２、１９９７；ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３９：７９７−８０７、１９９７）、ＴＩＡＭ２が神経の発達において役割を果たし得ることを示唆する。Ｅ１３．５終脳の全体にわたる高レベルのＴＩＡＭ２の発現は、ＴＩＡＭ２が前脳の発達において重要な役割を果たし得ることを示唆する。Ｅ１３．５では、有糸分裂後のニューロンが、産生される；これらの細胞は、発達しつつある脳内でのそれらの正確な位置に移動し、そしてそれらの正確な標的との接触を確立するために増殖性垂体（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｅ）を放たなければならない。これらのプロセスの全てが、環境的な合図でアクチンに基づく細胞骨格の再配列を調整することを必要とする。Ｒａｃ／ｃｄｃ４２  ＧＴＰａｓｅが、神経系中での軸索の形成および標的の認識において重要な役割を果たすことの強力な証拠が存在する（Ａｌｂｅｒｔｉｎａｚｚｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．ｂｉｏｌ．１４２：８１５−８２５，１９９８；Ｈｉｎｇら、Ｃｅｌｌ  ９７：８５３−８６３、１９９９；ｖａｎ  Ｌｅｅｗｅｎら、前出、１９９７）。マウスの胚形成の間のＴＩＡＭ２の発現のさらなる分析は、特定の形態形成の事象との相関関係、または特定のＧＴＰ−ａｓｅファミリーのメンバー、調節因子、もしくはエフェクターとの相関関係を明らかにし得る。神経の発達の間に特異的に確立されるいくつかは、ＴＩＡＭ１、ＲＡＣ３、およびＴＩＡＭ２のようなＧＴＰａｓｅのシグナル伝達経路の成分の細胞型特異的発現に起因するようである。
【００４１】
ＴＩＡＭ１とは異なり、ＴＩＡＭ２は、成体の前脳において高レベルで発現され続ける。成体での高発現の領域は、成体中のシナプス形成性の領域（皮質、海馬）、または神経形成性（歯状回、上衣／上衣下）である（Ｇｏｕｌｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｏｇｎ．Ｓｃｉ．３：１８６−１９２、１９９９；Ｔｅｍｐｌｅ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：Ｒ３９７−３９９，１９９９；ＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎおよびＰａｒｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１２６−１１２７，１９９９）。
【００４２】
ＴＩＡＭ２は、転移または腫瘍の抑制において役割を果たし得る。ＴＩＡＭ２の照射ハイブリッドマッピングは、それを卵巣癌において頻繁に欠失される染色体６ｑ２５の４−ｃＭ領域に配置する（Ｃｏｌｉｔｔｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：５５５−５５９、１９９８）。卵巣癌のほとんどが、天然において上皮性であり、そしてＴＩＡＭ１（２１ｑ２２．１；ＣｈｅｎおよびＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０：１２３−１２７、１９９５）が上皮細胞において腫瘍のサプレッサーとして作用し得ることが示唆されているので、これは、卵巣癌におけるＴＩＡＭ２の役割を示唆し得る。
【００４３】
ＴＩＡＭ２の別の形態の発現は、ＴＩＡＭ２LおよびＴＩＡＭ２Sの異なる役割を示唆する。ＴＩＡＭ２L中で見出されたＥＸドメインおよびＰＤＺドメインの両方が、タンパク質−タンパク質相互作用、およびタンパク質の細胞内局在化において役割を果たすことが示唆されている。ＴＩＡＭ２sは、ＴＩＡＭ２LのＥＸドメインおよびＰＤＺドメインの両方を欠失しているので、２つの形態が、細胞の異なる領域に局在化され得る。ＴＩＡＭ２の別の形態を理解することは、ＧＥＦのこの新生のファミリーの複雑さの知見を拡大し、そして侵襲のプロモーターおよび腫瘍サプレッサーの両方としてのＴＩＡＭ１の多様な役割についての洞察を最終的に生じ得る。
【００４４】
ＧＤＳは、種々の癌に関与し、そして本明細書中での議論に基づくと、ＴＩＡＭ２は、癌性細胞を診断するために有用であり得る。多くの技術が、組織サンプルがＴＩＡＭ２を含有している腫瘍細胞を保有しているかどうかを診断するために使用され得る。例えば、ＴＩＡＭ２  ｍＲＮＡ配列の存在を同定するための、腫瘍サンプルのＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ増幅（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版１９８９）、第１４章、またはＧａｕｇｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １７９：９２１−９３０（１９９４）を参照のこと）。また、免疫組織化学的技術またはＥＬＩＳＡアッセイが、ＴＩＡＭ−２を発現する腫瘍を同定するために使用され得る。例えば、ＴＩＡＭ２タンパク質が組換えによって発現され得、そしてモノクローナル抗体が当該分野で公知の方法に従って調製され得る。例えば、ＥＰ  １７４，２０４号、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−４９７（１９７５）、Ｆｏｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．７０：８３−９０（１９８４）、ＧＢ  ２，０８６，９３７号、同第２，１１３，７１５号、ＥＰ  ５７，１０７号、同第６２，４０９号、ＥＰ  １１８，８９３号、ＥＰ  １２４，３０１号、およびＥＰ  １３１，８７８号に示されている方法が、本発明について適切である。抗ＴＩＡＭ２モノクローナル抗体は、次いで、上記に記載される標準的なアッセイ、またはそうでなければ当該分野で公知であるこれらのアッセイにおいて使用され得る。
【００４５】
モノクローナル抗体はまた、治療的に使用され得る。抗ＴＩＡＭ２モノクローナル抗体は、当該分野で公知の手段によって投与され得る。好ましくは、抗体は、非経口的に、または皮下で投与され、より好ましくはこれらは、静脈内で投与される。モノクローナル抗体は、抗体の活性を促進するように設計された他の薬剤と組合せて、またはＴＩＡＭ２を発現する細胞に関連する根本的な状態を処置するために、投与され得る。
【００４６】
さらに、分岐したＤＮＡ試験が、米国特許第５，１２４，２４６号、および同第４，８６８，１０５号（それらの全体において参考として本明細書中で援用される）に示されているようなＴＩＡＭ２のＤＮＡについてアッセイするために行われ得る。分岐したＤＮＡ試験のためのＴＩＡＭ２核酸プローブ分子は、好ましくは、１０〜５０塩基の長さであり、より好ましくは１５〜４０塩基の長さであり、最も好ましくは、２０〜３０塩基の長さである。
【００４７】
リボザイムは、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、またはそれらのフラグメント中で同定されるＴＩＡＭ２配列に対して作用するように設計され得る。（Ｋａｓｈａｎｉ−ＣａｂｅｔおよびＳｃａｎｌｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２：２１３−２２３（１９９５）、その全体において参照として本明細書中で援用される）。細胞性の発現を得るために、リボザイム遺伝子が利用可能なベクター中にクローン化され、そして選択された細胞中にトランスフェクトされる。異なるベクターが、感染された標的細胞に基づいて選択され得る。例えば、呼吸性細胞が、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって標的化され得る。適切なプロモーターが、調節可能な発現を確実にするために、これらのベクター中に挿入され得る。（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｃａｂｅｔ、２１６頁）。
【００４８】
アンチセンス分子が、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０に示されるＴＩＡＭ２配列に基づいて開発され得る。例えば、米国特許第５，４９１，１３３号、および同第５，２７１，９４１号を参照のこと。これらは、それらの全体において本明細書中で参照として援用されている。
【００４９】
アンチセンスＲＮＡ配列は、原核生物（Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ．、Ｃｈｏｕ，Ｍ−．Ｙ．、およびＩｎｏｕｙｅ．Ｍ．（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１．（１９６６−１９７０））および真核生物（Ｈｅｙｗｏｏｄ，Ｓ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４、６７７１−６７７２（１９８６））の両方における、遺伝子発現の天然に存在する生物学的なインヒビターとして記載されており、そしてこれらの配列は、相補的なｍＲＮＡ配列に対してハイブリダイズすることによって機能し、それによって翻訳のハイブリダイゼーションによる阻止を生じる（Ｐａｔｅｒｓｏｎ．Ｂ．Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ．Ｂ．Ｅ．およびＫｕｆｆ．Ｅ．Ｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４、４３７０−４３７４）。
【００５０】
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、特定の遺伝子またはＲＮＡメッセージに対して相補的であるように形成された短い合成ヌクレオチド配列である。これらのオリゴマーの標的ＤＮＡ配列または標的ｍＲＮＡ配列に対する結合を通じて、遺伝子の転写または翻訳が、選択的にブロックされ得、そしてその遺伝子によって生成される疾患のプロセスが停止させられ得る。ｍＲＮＡの細胞質性の配置は、細胞に侵入するアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して容易に接近可能であると考えられる標的を提供する；従って、この分野での多くの作業が、標的としてＲＮＡに対して焦点をあてている。
【００５１】
アンチセンス治療は、細胞内に配置された標的ポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドの投与である。これらのオリゴヌクレオチドは、通常は外因性であるが、これらは内因的に発現され得る。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドがそれらの細胞内の標的（例えば、ＴＩＡＭ２）に対して相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  １：１−５（１９８８）を参照のこと。
【００５２】
本発明のＴＩＡＭ２のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、増強された癌細胞の増殖阻害作用を示す、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体、またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ、前出を参照のこと）のような誘導体が挙げられる。本発明のＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。このＲＮＡまたはＤＮＡは、ＴＩＡＭ２ゲノムまたは対応するｍＲＮＡに対して相補的であり、かつそれらと安定にハイブリダイズする。この領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ＴＩＡＭ２
ｍＲＮＡに対する選択的なハイブリダイゼーションを可能にし、そして他のｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションは可能にはしない。
【００５３】
好ましくは、本発明のＴＩＡＭ２のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＩＡＭ２  ｍＲＮＡに対してハイブリダイズする、アンチセンスＤＮＡ分子の１５〜４０マーのフラグメントである。あるいは、好ましいＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＩＡＭ２中の領域に対してハイブリダイズする、２０から３０マーのオリゴヌクレオチドである。有効量の少なくとも１つの本発明のＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドを、薬学的に受容可能なキャリアと組合せて含有している薬学的組成物が、本発明に含まれる。１つの実施形態においては、単一のＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドが利用される。別の実施形態においては、２つのＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドが利用され、これらは、ＴＩＡＭ２のゲノムの隣接する領域に対して相補的である。
【００５４】
２つのＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチド（これらは、ＴＩＡＭ２のゲノムの隣接する領域、または対応するｍＲＮＡに対して相補的である）の投与は、ＴＩＡＭ２のゲノムの転写またはｍＲＮＡの翻訳のより効率的な阻害を可能にし得、これによって癌細胞の増殖のより効果的な阻害を生じる。好ましくは、ＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞によるアンチセンス分子の取りこみを増強する薬剤とともに、同時に投与される。例えば、ＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポソームの形態であり得る親油性のカチオン性化合物と組み合わされ得る。
【００５５】
細胞中にヌクレオチドを導入するためのリポソームの使用は、例えば、米国特許第４，８９７，３５５号、および同第４，３９４，４４８号に教示される。これらの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用されている。また、生物学的な材料を含有しているリポソームを調製するための一般的な方法については、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，２３１，８７７号、同第４，２２４，１７９号、同第４，７５３，７８８号、同第４，６７３，５６７号、同第４，２４７，４１１号、同第４，８１４，２７０号を参照のこと。
【００５６】
あるいは、ＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、コレステロール、コール酸塩、およびデオキシコール酸を含む、多数のステロールうちのいずれか１つのような、親油性のキャリアと組み合わされ得る。好ましいステロールは、コレステロールである。さらに、ＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞によって摂取されるペプチドに対して結合され得る。有用なペプチドの例としては、ペプチドホルモン、抗原、または抗体、およびペプチド毒素が挙げられる。腫瘍性細胞によって選択的に取り込まれるペプチドを選択することによって、アンチセンス薬剤の特異的な送達がもたらされ得る。
【００５７】
ＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性化されたアミノアルキル誘導体の形成によって５’のＨ基を通じて共有結合され得る。次いで、選択されたペプチドが、ヘテロ二官能性試薬と反応するアミノおよびスルフヒドリルを介して、活性化されたＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドに対して共有結合され得る。後者は、ペプチド中に存在するシステイン残基に対して結合される。ペプチドに結合されたＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する細胞の暴露の際に、ペプチジルアンチセンス薬剤が、エンドサイトーシスされ、そしてＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレチドが、標的ＴＩＡＭ２  ｍＲＮＡに対して結合して、翻訳を阻害する。ＰＣＴ出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２３６３．１を参照のこと。
【００５８】
本発明のＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的組成物は、それらの意図された目的を達成するための任意の手段によって投与され得る。例えば、本発明のアンチセンス化合物または他の化合物の投与は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹膜内経路、または経皮経路によって行われ得る。
【００５９】
投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、平行して行われている処置の種類、必要である場合には、処置の頻度、および所望される効果の性質に依存する。本発明の範囲内の組成物としては、全ての組成物が挙げられ、ここでは、ＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、被験体の癌細胞の増殖の阻害を達成する、および／または分化を刺激するために有効である量で含まれる。
【００６０】
個体は変更を必要とするが、それぞれの組成物の有効量の最適な範囲の決定は、当業者の範囲内である。代表的には、ＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物（例えば、ヒト）に対して、０．００５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、または処置される哺乳動物の体重の１日あたりの等価な量の、それらの薬学的に受容可能な塩で、投与され得る。
【００６１】
溶液中にて生の化学薬品としてＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することに加えて、ＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に使用され得る調製物へのＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドのプロセシングを促進する賦形剤および添加剤を含有している、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含有している薬学的調製物の一部として投与され得る。用語薬学的に受容可能は、過度の毒性を伴わずに哺乳動物に対して投与され得る化合物および組成物をいう。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような、無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような、有機酸塩が挙げられる。
【００６２】
非経口的な投与に適切な処方物としては、水溶性の形態でのＴＩＡＭ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの水溶液、例えば、水溶性の塩が挙げられる。さらに、適切な油状の注射懸濁物として活性な化合物の懸濁物が、投与され得る。適切な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、例えば、ゴマ油のような脂肪油、または例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性の注射懸濁物は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む物質を含み得る。必要に応じて、懸濁物はまた、安定化剤を含み得る。
【００６３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の任意の方法に従って調製され得る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、固相合成によって調製される。オリゴヌクレオチドの化学合成の概説については、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１：１６５−１６７（１９９０）を参照のこと。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのカスタム合成を専門に扱う多数の会社から入手することができる。
【００６４】
ＴＩＡＭ２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体は、経口的、局所的、または皮下および筋肉内注射を含む非経口的な手段、徐放デポー製剤の移植、静脈内注射、鼻腔内投与などによって投与され得る。腫瘍を処置するために使用される場合は、ＴＩＡＭ２ポリペプチドまたは抗体を、例えば、腫瘍の塊を除去するための外科手術の間に、部位に対して直接適用することが有利であり得る。従って、ＴＩＡＭ２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤を含有している薬学的組成物として投与され得る。このような組成物は、水溶液、乳濁物、クリーム剤、軟膏、懸濁剤、ゲル、リポソーム懸濁剤などであり得る。適切な賦形剤としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ならびに、エタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、酢酸塩、ゼラチン、コラーゲン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、植物油の溶液などが挙げられる。１つは、さらに、適切な保存剤、安定化剤、抗酸化剤、抗菌剤、および緩衝化剤（例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなど）を含み得る。処方物中で有用なクリーム剤または軟膏の基剤としては、ラノリン、Ｓｉｌｖａｄｅｎｅ（登録商標）（Ｍａｒｉｏｎ）、Ａｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）（Ｄｕｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などが挙げられる。他の局所的な処方物としては、エアゾール、バンドエイド、および他の創傷の包帯剤が挙げられる。
【００６５】
あるいは、１つは、適切なポリマーマトリックスまたはメンブレン中にＴＩＡＭ２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を取りこみ得るかまたはカプセル化し得、これによって、局所的に処置される部位の近くでの移植に適切な徐放送達デバイスを提供する。他のデバイスとしては、Ａｌｚｅｔ（登録商標）ミニポンプのような、内在するカテーテルおよびデバイスが挙げられる。眼科用調製物が、Ｓｏｒｂｉ−ｃａｒｅ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）、Ｎｅｏｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ）、Ｌａｃｒｉｌｕｂｅ（登録商標）などのような市販のビヒクルを使用して処方され得るか、または本明細書中で参考として援用されている米国特許第５，１２４，１５５号に記載されている調製物のような局所的な調製物を使用し得る。さらに、１つは、ＴＩＡＭ２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を固体の形態で、特に凍結乾燥された粉末として提供し得る。凍結乾燥された処方物は、代表的には、安定化剤および増量剤（例えば、ヒト血清アルブミン、スクロース、マンニトールなど）を含有する。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｒｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ）において入手可能である。
【００６６】
任意の特定の障害の処置のために必要とされるＴＩＡＭ２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の量は、もちろん、障害の性質および重篤度、被験体の年齢および状態、ならびに当業者によって容易に決定される他の因子に依存して変化する。適切な投与量は、当業者によって決定され得る。
【００６７】
遺伝子治療法においては、上記の核酸分子（すなわち、リボザイムまたはアンチセンス分子）を投与することが有用であり得る。従って、以下に記載されるベクターおよび技術が有用である。以下の発現系は、上記のポリヌクレオチドの送達のための遺伝子治療の適用に有用である、ベクター、プロモーター、および調節エレメントを記載する。
【００６８】
本発明に有用なベクターおよび発現系としては、ウイルス系および非ウイルス系が挙げられる。例示的なウイルス性の送達系としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、シンドビスおよびヘルパーウイルスが挙げられる。本発明の１つの局面においては、ウイルスベクターは、上記の核酸配列を、長期間の発現のために宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。
【００６９】
１つの好ましいレトロウイルスは、マウスの白血病ウイルスである。しかし、宿主細胞のゲノム中への組込みを回避することが好まれ得る。非ウイルス性のベクターとしては、裸のＤＮＡ、およびカチオン性脂質またはリポソームを用いて処方されたＤＮＡが挙げられる。使用され得る非ウイルス系は、Ｔ７／Ｔ７系である。
【００７０】
さらに、例えば、インヒビターについて試験するためのアッセイにおいて、またはモノクローナル抗体の調製に使用される、本明細書中で開示される核酸配列からＴＩＡＭ２タンパク質を産生することが有用である。ＴＩＡＭ２は、ネイティブなまたは改変されたＴＩＡＭ２核酸配列で形質転換されているバキュロウイルスによって発現され得る。本発明において有用なＴＩＡＭ２核酸配列は、ネイティブなＴＩＡＭ２のアミノ酸配列に対して実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００７１】
好ましくは、ＴＩＡＭ２核酸またはタンパク質配列は、以下に列挙される部分的な配列に対して相同である。好ましくは、上記の配列は、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、またはそれらのフラグメントに対して８０％を超えて相同であり、より好ましくは、これは、８５％を超えて相同であり、より好ましくは、９０％を超えて相同であり、なおより好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％を超えて相同である。最も好ましくは、これは、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて相同である。実質的に同一は、配列が同一であるか、またはタンパク質の活性に有害な影響を与えない１つ以上の変更（欠失、付加、置換）によって異なることを意味する。タンパク質配列が上記の同じ割合で相同であることが好ましい。パーセント同一性または相同性は、当該分野で公知の方法およびアルゴリズムを使用して計算され得る。適切であるが限定的ではない方法は、以下の検索パラメーターを用いて姻戚（ａｆｆｉｎｅ）ギャップ検索を使用するＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるような、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性検索アルゴリズムである：１２のギャップオープンペナルティー、および１のギャップ伸張ペナルティー。
【００７２】
ＴＩＡＭ２配列の正確な化学的な構造は、多数の因子に依存し得る。イオン化されたアミノ基およびカルボキシル基が分子中に存在する場合は、特定のタンパク質が、酸性の塩もしくは塩基性の塩として、または天然の形態で得られ得る。全てのこのような調製物（これらは、適切な環境条件下に配置された場合に、それらの活性を保持している）が、本明細書中のタンパク質の定義に含まれる。さらに、タンパク質の一次アミノ酸配列が、糖部分を使用する誘導体化によって、または脂質、リン酸塩、アセチル基などのような他の追加の分子によって、増大させられ得る。このような増大の特定の局面は、産生宿主の翻訳後プロセシング系を通じて達成される；他のこのような改変はインビトロで導入され得る。任意の事象においては、このような改変は、タンパク質の活性が破壊されない限りは、本明細書中のタンパク質の定義に含まれる。このような改変が、種々のアッセイにおいてタンパク質の活性を増強するかまたは低下させるかのいずれかによって、活性に定量的または定性的に影響を与え得ることが予想される。さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、誘導体化によって改変され得、そしてタンパク質は、活性を保持しているフラグメントを得るために切断され得る。活性を破壊しないこのような変更は、本明細書中のＴＩＡＭ２の定義からタンパク質配列を除去しない。
【００７３】
翻訳の間に配列中に取り込まれるアミノ酸の欠失、付加、または変更による一次配列自体に対する改変は、タンパク質の活性を崩壊させることなく行われ得る。例えば、部位特異的変異誘発は、ポリペプチド構造中の変更をもたらす、ＤＮＡ構造中での特定の変更が可能であり得る。Ｍａｒｋら、米国特許第４，９５９，３１４号、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出、第２巻、第１５章（これらは、その全体において本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。
【００７４】
ＴＩＡＭ２タンパク質としては、変異体、フラグメント、融合物、および配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、またはそれらのフラグメント中に列挙される配列によってコードされるタンパク質が挙げられる。ネイティブＴＩＡＭ２タンパク質は、天然に存在するタンパク質である。ネイティブポリペプチドのアミノ酸配列は、わずかに（代表的には、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０によってコードされる１０〜１２個未満のアミノ酸）変化する配列を含む。
【００７５】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」は、本明細書中で使用される場合は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー（好ましくは、デオキシリボヌクレオチド）をいい、そして用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」と本明細書中で互換的に使用される。この用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ、ならびにアンチセンスポリヌクレオチドを含む。以下のような既知の型の改変もまた、含まれる：例えば、当該分野で公知である標識の存在、メチル化、末端「キャップ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間での改変（例えば、特定の型の荷電していない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホロトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）または荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）での置換など）、ペンダント部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤（例えば、金属の放射活性種、ホウ素、酸化剤部分など）、アルキル化剤（例えば、αアノマー核酸など）の導入。
【００７６】
ネイティブＴＩＡＭ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＴＩＡＭ２タンパク質の他のクラスをコードするように容易に改変され得る。ＴＩＡＭ２ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能に対する有意な効果を伴わずに変更され得ることが、当該分野で認識される。配列中でのこのような変更が意図される場合には、活性を決定するタンパク質上の重要な領域が存在することが思い出されるはずである。一般的には、同様の機能を実行する残基が使用される限りにおいては、４次構造を形成する残基を置換することが可能である。他の例においては、この型の残基は、タンパク質の重要ではない領域で変更が生じた場合に、完全にささいなことであり得る。アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターに対する結合の選択性を変更し得る。Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、２つの既知の型のＴＮＦレセプターの１つのみに対するＴＮＦ−αの選択的な結合を生じる特定の変異を記載している。従って、本発明のポリペプチドは、天然の変異またはヒトの操作のいずれかによる、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含み得る。
【００７７】
従って、本発明はさらに、実質的なＴＩＡＭ２ポリペプチド活性を示すか、または以下に議論されるタンパク質部分のようなＴＩＡＭ２タンパク質の領域を含む、ＴＩＡＭ２ポリペプチドのバリエーションを含む。このような変異体は、欠失、挿入、転換、反復、および型の置換を含む。上記に示すように、アミノ酸の変更が、おそらく表現形的にはサイレントであるということに関する指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において見出される。
【００７８】
特定の目的は、別の荷電したアミノ酸での、および中性の、または負に荷電したアミノ酸での、荷電したアミノ酸の置換である。後者は、ＴＩＡＭ２タンパク質の特徴を改善するために、減少した正の電荷を有するタンパク質を生じる。凝集を防ぐことが非常に望まれる。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるだけではなく、それらが免疫原性であり得るために、薬学的処方物を調製する場合にも問題となり得る。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７（１９９３））。
【００７９】
機能に必須である本発明のポリペプチド中のアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））のような、当該分野で公知の方法によって同定され得る。後者の手順は、分子中のそれぞれの残基に単一のアラニン変異を導入する。得られた変異体分子は、次いで、レセプター結合またはインビトロで、すなわち、インビトロ増殖アッセイのような、生物学的な活性について試験される。リガンド−レセプターの結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和標識のような構造的な分析によっても決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００８０】
例えば、変異体は、保存的なアミノ酸の置換を作成することによって構築され得る。以下は、保存的な置換の例である：
【００８１】
【化１】
2010233574.tif 000002
。ムテインと呼ばれる変異体のサブセットは、中性のアミノ酸（一般的には、セリン）で置換された非ジスルフィド結合に関与するシステインを有するポリペプチドの基である。これらの変異体は、ネイティブＴＩＡＭ２タンパク質よりも広い範囲の温度にわたって安定である。示されるように、変更は、好ましくは、主要ではない性質（例えば、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意には影響を与えない保存的なアミノ酸置換）である。もちろん、当業者によって作成されるアミノ酸置換の数は、上記の因子を含む多くの因子に依存する。一般的に言うと、任意の所定のＴＩＡＭ２ポリペプチドについての置換の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、または３を超えない。変異体のコード配列は、ネイティブＴＩＡＭ２ポリペプチドをコードする配列のインビトロでの変異誘発によって構築され得る。
【００８２】
本明細書中で使用される場合は、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーをいい、そして生成物の特定の長さをいわない；従って、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびポリタンパク質、ならびにこれらのフラグメントは、この定義に含まれる。この用語はまた、タンパク質の発現後の改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）については言及しないか、またはこれらを排除する。例えば、１つ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有しているタンパク質、置換された結合を有するタンパク質、ならびに他の当該分野で公知の他の改変（天然に存在するもの、および天然には存在しないものの両方）が、この定義に含まれる。
【００８３】
指定された核酸配列「に由来する」またはそれによって「コードされる（ｃｏｄｅｄ  ｂｙ）」またはそれによって「コードされる（ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ）」ポリペプチドまたはタンパク質またはアミノ酸配列は、配列中にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列、または一部が、少なくとも３〜５個の連続しているアミノ酸、およびより好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、そしてなおより好ましくは少なくとも１１〜１５個のアミノ酸から構成されるその一部に対して同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうか、または配列中にコードされるポリペプチドを用いて免疫学的に同定が可能であるポリペプチドをいう。この用語はまた、指定された核酸配列から発現されるポリペプチドを含む。
【００８４】
「精製された」および「単離された」は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列をいう場合には、同じ型の他の生物学的なマクロ分子の実質的な非存在下に、示された分子が存在することを意味する。用語「精製された」は、本明細書中で使用される場合には、存在する同じ型の生物学的なマクロ分子の、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、より好ましくはなお少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％を意味する（しかし、水、緩衝液、および他の低分子（特に、１０００未満の分子量を有する分子）が存在し得る）。
【００８５】
本明細書中で開示されるＴＩＡＭ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのフラグメントもまた、本発明の範囲に含まれる。このようなフラグメントは、タンパク質の抗原性領域、または本明細書中に記載されるタンパク質の生物学的に機能性である領域をコードし得る。このようなフラグメントはまた、本明細書中に開示される融合タンパク質のポリペプチド成分をコードする。フラグメントはまた、配列番号８、９、および／または１０とハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを同定するためのプローブとしての使用に適切である。フラグメントは、約１０塩基対から、配列番号８については３３４４塩基対であり、配列番号９については４５９０塩基対であり、そして配列番号１０については４５１４塩基対である全長のポリヌクレオチドまでの長さの範囲であり得る。好ましいフラグメントは、配列番号８、９、または１０については、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、または３３００塩基対；配列番号９または１０については、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、または４５１０塩基対；そして配列番号１０については、４５２０、４５５０、４５７５、または４５８０塩基対である。特に好ましいフラグメントは、配列番号８のヌクレオチド１〜１０４を含む。
【００８６】
ポリペプチドフラグメントは、変異体またはネイティブのＴ１ＡＭ２タンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシル末端のアミノ酸欠失である。短縮されるアミノ酸の数は、このポリペプチドフラグメントが、所望の配列相同性、免疫学的活性または生物学的活性を示す限りは、重要ではない。好ましいフラグメントは、配列番号７、１１、１２、または１３の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６２５アミノ酸；配列番号１２または１３の６５０、６７５、７５０、８００、８２５、９００、９５０、１０００、１０２５、または１０５０アミノ酸；ならびに配列番号１３の１０６０、１０６５、１０７０または１０７５アミノ酸である。免疫学的に重要なポリペプチドフラグメントは、例えば、ネイティブＴＩＡＭ２タンパク質により共有される少なくとも１つのエピトープを含む。このようなＴＩＡＭ２タンパク質は、５〜１５アミノ酸長のみであり得る。フラグメントのアミノ酸配列の例としては、以下を含む：配列番号７、１１、１２、または１３のアミノ酸番号１〜８（ａａ１〜ａａ８）；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２〜ａａ９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３〜ａａ１０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４〜ａａ１１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５〜ａａ１２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６〜ａａ１３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７〜ａａ１４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８〜ａａ１５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９〜ａａ１６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０〜ａａ１７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１〜ａａ１８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２〜ａａ１９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３〜ａａ２０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４〜ａａ２１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５〜ａａ２２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６〜ａａ２３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７〜ａａ２４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８〜ａａ２５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９〜ａａ２６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０〜ａａ２７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１〜ａａ２８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２〜ａａ２９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３〜ａａ３０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４〜ａａ３１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５〜ａａ３２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６〜ａａ３３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７〜ａａ３４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２８〜ａａ３５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９〜ａａ３６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３０〜ａａ３７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１〜ａａ３８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３２〜ａａ３９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３〜ａａ４０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４〜ａａ４１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５〜ａａ４２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６〜ａａ４３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７〜ａａ４４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８〜ａａ４５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９〜ａａ４６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４０〜ａａ４７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１〜ａａ４８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２〜ａａ４９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３〜ａａ５０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４〜ａａ５１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５〜ａａ５２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６〜ａａ５３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７〜ａａ５４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８〜ａａ５５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９〜ａａ５６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０〜ａａ５７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１〜ａａ５８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２〜ａａ５９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５３〜ａａ６０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４〜ａａ６１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５〜ａａ６２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６〜ａａ６３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７〜ａａ６４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８〜ａａ６５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９〜ａａ６６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０〜ａａ６７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１〜ａａ６８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６２〜ａａ６９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６３〜ａａ７０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６４〜ａａ７１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６５〜ａａ７２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６６〜ａａ７３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６７〜ａａ７４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６８〜ａａ７５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６９〜ａａ７６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７０〜ａａ７７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７１〜ａａ７８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７２〜ａａ７９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７３〜ａａ８０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７４〜ａａ８１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７５〜ａａ８２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７６〜ａａ８３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７７〜ａａ８４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７８〜ａａ８４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ７９〜ａａ８６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８０〜ａａ８７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８１〜ａａ８８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８２〜ａａ８９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８３〜ａａ９０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８４〜ａａ９１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８５〜ａａ９２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８６〜ａａ９３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８７〜ａａ９４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８８〜ａａ９５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ８９〜ａａ９６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９０〜ａａ９７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９１〜ａａ９８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９２〜ａａ９９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９３〜ａａ１００；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９４〜ａａ１０１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９５〜ａａ１０２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９６〜ａａ１０３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９７〜ａａ１０４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９８〜ａａ１０５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ９９〜ａａ１０６；配列番号７、１１、または１３のａａ１００〜ａａ１０７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０１〜ａａ１０８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０２〜ａａ１０９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０３〜ａａ１１０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０４〜ａａ１１１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０５〜ａａ１１２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０６〜ａａ１１３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０７〜ａａ１１４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０８〜ａａ１１５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１０９〜ａａ１１６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１０〜ａａ１１７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１１〜ａａ１１８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１２〜ａａ１１９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１３〜ａａ１２０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１４〜ａａ１２１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１５〜ａａ１２２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１６〜ａａ１２３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１７〜ａａ１２４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１８〜ａａ１２５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１１９〜ａａ１２６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２０〜ａａ１２７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２１〜ａａ１２８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２２〜ａａ１２９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２３〜ａａ１３０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２４〜ａａ１３１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２５〜ａａ１３２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２６〜ａａ１３３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２７〜ａａ１３４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２８〜ａａ１３５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１２９〜ａａ１３６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３０〜ａａ１３７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３１〜ａａ１３８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３２〜ａａ１３９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３３〜ａａ１４０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３４〜ａａ１４１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３５〜ａａ１４２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３６〜ａａ１４３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３７〜ａａ１４４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３８〜ａａ１４５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１３９〜ａａ１４６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４０〜ａａ１４７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４１〜ａａ１４８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４２〜ａａ１４９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４３〜ａａ１５０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４４〜ａａ１５１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４５〜ａａ１５２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４６〜ａａ１５３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４７〜ａａ１５４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４８〜ａａ１５５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１４９〜ａａ１５６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５０〜ａａ１５７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５１〜ａａ１５８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５２〜ａａ１５９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５３〜ａａ１６０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５４〜ａａ１６１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５５〜ａａ１６２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５６〜ａａ１６３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５７〜ａａ１６４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５８〜ａａ１６５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１５９〜ａａ１６６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６０〜ａａ１６７；配列番号７
、１１、１２、または１３のａａ１６１〜ａａ１６８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６２〜ａａ１６９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６３〜ａａ１７０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６４〜ａａ１７１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６５〜ａａ１７２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６６〜ａａ１７３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６７〜ａａ１７４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６８〜ａａ１７５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１６９〜ａａ１７６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７０〜ａａ１７７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７１〜ａａ１７８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７２〜ａａ１７９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７３〜ａａ１８０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７４〜ａａ１８１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７５〜ａａ１８２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７６〜ａａ１８３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７７〜ａａ１８４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７８〜ａａ１８５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１７９〜ａａ１８６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８０〜ａａ１８７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８１〜ａａ１８８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８２〜ａａ１８９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８３〜ａａ１９０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８４〜ａａ１９１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８５〜ａａ１９２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８６〜ａａ１９３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８７〜ａａ１９４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８８〜ａａ１９５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１８９〜ａａ１９６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９０〜ａａ１９７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９１〜ａａ１９８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９２〜ａａ１９９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９３〜ａａ２００；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９４〜ａａ２０１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９５〜ａａ２０２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９６〜ａａ２０３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９７〜ａａ２０４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９８〜ａａ２０５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ１９９〜ａａ２０６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２００〜ａａ２０７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０１〜ａａ２０８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０２〜ａａ２０９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０３〜ａａ２１０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０４〜ａａ２１１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０５〜ａａ２１２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０６〜ａａ２１３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０７〜ａａ２１４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０８〜ａａ２１５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２０９〜ａａ２１６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１０〜ａａ２１７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１１〜ａａ２１８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１２〜ａａ２１９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１３〜ａａ２２０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１４〜ａａ２２１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１５〜ａａ２２２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１６〜ａａ２２３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１７〜ａａ２２４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１８〜ａａ２２５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２１９〜ａａ２２６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２０〜ａａ２２７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２１〜ａａ２２８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２２〜ａａ２２９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２３〜ａａ２３０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２４〜ａａ２３１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２５〜ａａ２３２；および配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２６〜ａａ２３３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２７〜ａａ２３４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２８〜ａａ２３５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２９〜ａａ２３６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３０〜ａａ２３７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３１〜ａａ２３８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２２２〜ａａ２３９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３３〜ａａ２４０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３４〜ａａ４１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３５〜ａａ２４２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３６〜ａａ２４３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３７〜ａａ２４４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３８〜ａａ２４５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２３９〜ａａ２４６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４０〜ａａ２４７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４１〜ａａ２４８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４２〜ａａ２４９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４３〜ａａ２５０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４４〜ａａ２５１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４５〜ａａ２５２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４６〜ａａ２５３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４７〜ａａ２５４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４８〜ａａ２５５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２４９〜ａａ２５６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５０〜ａａ２５７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５１〜ａａ２５８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５２〜ａａ２５９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５３〜ａａ２６０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５４〜ａａ２６１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５５〜ａａ２６２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５６〜ａａ２６３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５７〜ａａ２６４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２５８〜ａａ２６５；配列番号７、１１、１２１、または１３のａａ２５９〜ａａ２６６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６０〜ａａ２６７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６１〜ａａ２６８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６２〜ａａ２６９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６３〜ａａ２７０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６４〜ａａ２７１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６５〜ａａ２７２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６６〜ａａ２７３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６７〜ａａ２７４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６８〜ａａ２７５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２６９〜ａａ２７６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７０〜ａａ２７７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７１〜ａａ２７８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７２〜ａａ２７９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７３〜ａａ２８０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７４〜ａａ２８１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７５〜ａａ２８２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７６〜ａａ２８３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７７〜ａａ２８４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７８〜ａａ２８４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２７９〜ａａ２８６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２８０〜ａａ２８７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２８１〜ａａ２８８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２８２〜ａａ２８９；配列番号７、１１、１２、または１３；ａａ２８３〜ａａ２９０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２８４〜ａａ２９１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２８５〜ａａ２９２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２８６〜ａａ２９３；配列番号７、１１、１２または１３；ａａ２８７〜ａａ２９４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２８８〜ａａ２９５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２８９〜ａａ２９６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９０〜ａａ２９７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９１〜ａａ２９８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９２〜ａａ２９９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９３〜ａａ３００；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９４〜ａａ１０１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９５〜ａａ１０２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９６〜ａａ１０３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９７〜ａａ１０４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９８〜ａａ１０５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ２９９〜ａａ１０６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３００〜ａａ３０７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３０１〜ａａ３０８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３０２〜ａａ３０９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３０３〜ａａ３１０；配列番号７のａａ３０４〜ａａ３１１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３０５〜ａａ３１２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３０６〜ａａ３１３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３０７〜ａａ３１４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３０８〜ａａ３１５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３０９〜ａａ３１６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１０〜ａａ３１７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１１〜ａａ３１８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１２〜ａａ３１９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１３〜ａａ３２０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１４〜ａａ３２１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１５〜ａａ３２２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１６〜ａａ３２３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１７〜ａａ３２４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１８〜ａａ３２５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３１９〜ａａ３２６；配列番号７、１１、１２、または１３；ａａ３２０〜ａａ３２７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３２１〜ａａ３２８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３２２〜ａａ３２９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３２３〜ａａ３３０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３２４〜ａａ３３１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３２５〜ａａ３３２；配列番号７、１１、１２、または１３の；ａａ３２６〜ａａ３３３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３２７〜ａａ３３４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３２８〜ａａ３３５；配列番号７、１１、１２、または１３の；ａａ３２９〜ａａ３３６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３０〜ａａ３３７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３１〜ａａ３３８；配列番号
７、１１、１２、または１３のａａ３３２〜ａａ３３９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３３〜ａａ３４０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３４〜ａａ３４１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３５〜ａａ３４２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３６〜ａａ３４３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３７〜ａａ３４４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３８〜ａａ３４５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３３９〜ａａ３４６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４０〜ａａ３４７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４１〜ａａ３４８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４２〜ａａ３４９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４３〜ａａ３５０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４４〜ａａ３５１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４５〜ａａ３５２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４６〜ａａ３５３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４７〜ａａ３５４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４８〜ａａ３５５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３４９〜ａａ３５６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５０〜ａａ３５７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５１〜ａａ３５８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５２〜ａａ３５９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５３〜ａａ３６０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５４〜ａａ３６１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５５〜ａａ３６２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５６〜ａａ３６３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５７〜ａａ３６４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５８〜ａａ３６５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３５９〜ａａ３６６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６０〜ａａ３６７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６１〜ａａ３６８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６２〜ａａ３６９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６３〜ａａ３７０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６４〜ａａ３７１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６５〜ａａ３７２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６６〜ａａ３７３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６７〜ａａ３７４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６８〜ａａ３７５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３６９〜ａａ３７６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７０〜ａａ３７７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７１〜ａａ３７８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７２〜ａａ３７９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７３〜ａａ３８０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７４〜ａａ３８１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７５〜ａａ３８２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７６〜ａａ３８３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７７〜ａａ３８４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７８〜ａａ３８５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３７９〜ａａ３８６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８０〜ａａ３８７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８１〜ａａ３８８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８２〜ａａ３８９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８３〜ａａ３９０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８４〜ａａ３９１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８５〜ａａ３９２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８６〜ａａ３９３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８７〜ａａ３９４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８８〜ａａ３９５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３８９〜ａａ３９６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９０〜ａａ３９７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９１〜ａａ３９８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９２〜ａａ３９９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９３〜ａａ４００；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９４〜ａａ４０１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９５〜ａａ４０２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９６〜ａａ４０３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９７〜ａａ４０４；配列番号７、１１、１２、または１３；ａａ３９８〜ａａ４０５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ３９９〜ａａ４０６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４００〜ａａ４０７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４０１〜ａａ４０８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４０２〜ａａ４０９；配列番号７、１１、１２、または１３；ａａ４０３〜ａａ４１０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４０４〜ａａ４１１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４０５〜ａａ４１２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４０６〜ａａ４１３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４０７〜ａａ４１４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４０８〜ａａ４１５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４０９〜ａａ４１６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１０〜ａａ４１７；配列番号７、１１、１２、または１３の、ａａ４１１〜ａａ４１８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１２〜ａａ４１９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１３〜ａａ４２０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１４〜ａａ４２１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１５〜ａａ４２２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１６〜ａａ４２３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１７〜ａａ４２４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１８〜ａａ４２５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４１９〜ａａ４２６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２０〜ａａ４２７；配列番号７、１１、１２、または１３；ａａ４２１〜ａａ４２８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２２〜ａａ４２９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２３〜ａａ４３０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２４〜ａａ４３１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２５〜ａａ４３２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２６〜ａａ４３３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２７〜ａａ４３４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２８〜ａａ４３５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４２９〜ａａ４３６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３０〜ａａ４３７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３１〜ａａ４３８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３２〜ａａ４３９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３３〜ａａ４４０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３４〜ａａ４４１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３５〜ａａ４４２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３６〜ａａ４４３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３７〜ａａ４４４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３８〜ａａ４４５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４３９〜ａａ４４６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４０〜ａａ４４７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４１〜ａａ４４８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４２〜ａａ４４９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４３〜ａａ４５０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４４〜ａａ４５１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４５〜ａａ４５２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４６〜ａａ４５３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４７〜ａａ４５４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４８〜ａａ４５５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４４９〜ａａ４５６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５０〜ａａ４５７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５１〜ａａ４５８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５２〜ａａ４５９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５３〜ａａ４６０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５４〜ａａ４６１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５５〜ａａ４６２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５６〜ａａ４６３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５７〜ａａ４６４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５８〜ａａ４６５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４５９〜ａａ４６６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６０〜ａａ４６７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６１〜ａａ４６８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６２〜ａａ４６９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６３〜ａａ４７０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６４〜ａａ４７１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６５〜ａａ４７２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６６〜ａａ４７３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６７〜ａａ４７４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６８〜ａａ４７５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４６９〜ａａ４７６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７０〜ａａ４７７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７１〜ａａ４７８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７２〜ａａ４７９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７３〜ａａ４８０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７４〜ａａ４８１；配列番号７、１１、１７、または１３のａａ４７５〜ａａ４８２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７６〜ａａ４８３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７７〜ａａ４８４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７８〜ａａ４８４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４７９〜ａａ４８６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８０〜ａａ４８７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８１〜ａａ４８８；配列番号７、１１、１２または１３のａａ４８２〜ａａ４８９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８３〜ａａ４９０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８４〜ａａ４９１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８５〜ａａ４９２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８６〜ａａ４９３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８７〜ａａ４９４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８８〜ａａ４９５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４８９〜ａａ４９６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９０〜ａａ４９７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９１〜ａａ４９８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９２〜ａａ４９９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９３〜ａａ５００；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９４〜ａａ５０１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９５〜ａａ５０２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９６〜ａａ５０３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９７〜ａａ５０４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９８〜ａａ５０５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ４９９〜ａａ５０６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５００〜ａａ５０７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０１〜ａａ５０８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０２〜ａ
ａ５０９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０３〜ａａ５１０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０４〜ａａ５１１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０５〜ａａ５１２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０６〜ａａ５１３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０７〜ａａ５１４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０８〜ａａ５１５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５０９〜ａａ５１６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１０〜ａａ５１７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１１〜ａａ５１８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１２〜ａａ５１９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１３〜ａａ５２０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１４〜ａａ５２１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１５〜ａａ５２２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１６〜ａａ５２３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１７〜ａａ５２４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１８〜ａａ５２５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５１９〜ａａ５２６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２０〜ａａ５２７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２１〜ａａ５２８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２２〜ａａ５２９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２３〜ａａ５３０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２４〜ａａ５３１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２５〜ａａ５３２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２６〜ａａ５３３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２７〜ａａ５３４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２８〜ａａ５３５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５２９〜ａａ５３６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５３０〜ａａ５３７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５３１〜ａａ５３８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５３２〜ａａ５３９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５３３〜ａａ５４０；配列番号７、１１、１２、または１３の；ａａ５３４〜ａａ５４１；配列番号７、１１、１２、または１３の；ａａ５３５〜ａａ５４２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５３６〜ａａ５４３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５３７〜ａａ５４４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５３８〜ａａ５４５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５３９〜ａａ５４６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４０〜ａａ５４７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４１〜ａａ５４８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４２〜ａａ５４９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４３〜ａａ５５０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４４〜ａａ５５１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４５〜ａａ５５２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４６〜ａａ５５３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４７〜ａａ５５４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４８〜ａａ５５５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５４９〜ａａ５５６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５０〜ａａ５５７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５１〜ａａ５５８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５２〜ａａ５５９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５３〜ａａ５６０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５４〜ａａ５６１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５５〜ａａ５６２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５６〜ａａ５６３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５７〜ａａ５６４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５８〜ａａ５６５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５５９〜ａａ５６６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６０〜ａａ５６７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６１〜ａａ５６８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６２〜ａａ５６９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６３〜ａａ５７０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６４〜ａａ５７１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６５〜ａａ５７２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６６〜ａａ５７３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６７〜ａａ５７４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６８〜ａａ５７５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５６９〜ａａ５７６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７０〜ａａ５７７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７１〜ａａ５７８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７２〜ａａ５７９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７３〜ａａ５８０；配列番号７、１１、１２、または１３の；ａａ５７４〜ａａ５８１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７５〜ａａ５８２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７６〜ａａ５８３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７７〜ａａ５８４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７８〜ａａ５８５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５７９〜ａａ５８６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８０〜ａａ５８７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８１〜ａａ５８８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８２〜ａａ５８９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８３〜ａａ５９０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８４〜ａａ５９１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８５〜ａａ５９２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８６〜ａａ５９３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８７〜ａａ５９４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８８〜ａａ５９５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５８９〜ａａ５９６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９０〜ａａ５９７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９１〜ａａ５９８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９２〜ａａ５９９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９３〜ａａ６００；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９４〜ａａ６０１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９５〜ａａ６０２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９６〜ａａ６０３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９７〜ａａ６０４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ５９８〜ａａ６０５；配列番号７、１１、１２、または１３の；ａａ５９９〜ａａ６０６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６００〜ａａ６０７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０１〜ａａ６０８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０２〜ａａ６０９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０３〜ａａ６１０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０４〜ａａ６１１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０５〜ａａ６１２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０６〜ａａ６１３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０７〜ａａ６１４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０８〜ａａ６１５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６０９〜ａａ６１６；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１０〜ａａ６１７；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１１〜ａａ６１８；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１２〜ａａ６１９；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１３〜ａａ６２０；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１４〜ａａ６２１；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１５〜ａａ６２２；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１６〜ａａ６２３；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１７〜ａａ６２４；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１８〜ａａ６２５；配列番号７、１１、１２、または１３のａａ６１９〜ａａ６２６；配列番号１２または１３のａａ６２０〜ａａ６２７；配列番号１２または１３のａａ６２１〜ａａ６２８；配列番号１２または１３のａａ６２２〜ａａ６２９；配列番号１２または１３のａａ６２３〜ａａ６３０；配列番号１２または１３のａａ６２４〜ａａ６３１；配列番号１２または１３のａａ６２５〜ａａ６３２；配列番号１２または１３のａａ６２６〜ａａ６３３；配列番号１２または１３のａａ６２７〜ａａ６３４；配列番号１２または１３のａａ６２８〜ａａ６３５；配列番号１２または１３のａａ６２９〜ａａ６３６；配列番号１２または１３のａａ６３０〜ａａ６３７；配列番号１２または１３のａａ６３１〜ａａ６３８；配列番号１２または１３のａａ６３２〜ａａ６３９；配列番号１２または１３のａａ６３３〜ａａ６４０；配列番号１２または１３のａａ６３４〜ａａ６４１；配列番号１２または１３のａａ６３５〜ａａ６４２；配列番号１２または１３のａａ６３６〜ａａ６４３；配列番号１２または１３のａａ６３７〜ａａ６４４；配列番号１２または１３のａａ６３８〜ａａ６４５；配列番号１２または１３のａａ６３９〜ａａ６４６；配列番号１２または１３のａａ６４０〜ａａ６４７；配列番号１２または１３のａａ６４１〜ａａ６４８；配列番号１２または１３のａａ６４２〜ａａ６４９；配列番号１２または１３のａａ６４３〜ａａ６５０；配列番号１２または１３のａａ６４４〜ａａ６５１；配列番号１２または１３のａａ６４５〜ａａ６５２；配列番号１２または１３のａａ６４６〜ａａ６５３；配列番号１２または１３のａａ６４７〜ａａ６５４；配列番号１２または１３のａａ６４８〜ａａ６５５；配列番号１２または１３のａａ６４９〜ａａ６５６；配列番号１２または１３のａａ６５０〜ａａ６５７；配列番号１２または１３のａａ６５１〜ａａ６５８；配列番号１２または１３のａａ６５２〜ａａ６５９；配列番号１２または１３のａａ６５３〜ａａ６６０；配列番号１２または１３のａａ６５４〜ａａ６６１；配列番号１２または１３のａａ６５５〜ａａ６６２；配列番号１２または１３のａａ６５６〜ａａ６６３；配列番号１２または１３のａａ６５７〜ａａ６６４；配列番号１２または１３のａａ６５８〜ａａ６６５；配列番号１２または１３のａａ６５９〜ａａ６６６；配列番号１２または１３のａａ６６０〜ａａ６６７；配列番号１２または１３のａａ６６１〜ａａ６６８；配列番号１２または１３のａａ６６２〜ａａ６６９；配列番号１２または１３のａａ６６３〜ａａ６７０；配列番号１２または１３のａａ６６４〜ａａ６７１；配列番号１２または１３のａａ６６５〜ａａ６７２；配列番号１２または１３のａａ６６６〜ａａ６７３；配列番号１２または１３のａａ６６７〜ａａ６７４；配列番号１２または１３のａａ６６８〜ａａ６７５；配列番号１２または１３のａａ６６９〜ａａ６７６；配列番号１２または１３のａａ６７０〜ａａ６７７；配列番号１２または１３のａａ６７１〜ａａ６７８；配列番号１２または１３のａａ６７２〜ａａ６７９；配列番号１２または１３のａａ６７３〜ａａ６８０；配列番号１２または１３のａａ６７４〜ａａ６８１；配列番号１２または１３のａａ６７５〜ａａ６８２；配列番号１２または１３のａａ６７６〜ａａ６８３；配列番号１２または１３のａａ６７７〜ａａ６８４；配列番号１２または１３のａａ６７８〜ａａ６８４；配列番号１２または１３のａａ６７９〜ａａ６８６；配列番号１２または１３のａａ６８０〜ａａ６８７；配列番号１２または１３のａａ６８１〜ａａ６８８；配列番号１２または１３のａａ６８２〜ａａ６８９；配列番号１２または１３のａａ６８３〜ａａ６９０；配列番号１２または１３のａａ６８４〜ａａ６９１；配列番号１２または１３のａａ６８５〜ａａ６９２；配列番号１２または１３のａａ６８６〜
ａａ６９３；配列番号１２または１３のａａ６８７〜ａａ６９４；配列番号１２または１３のａａ６８８〜ａａ６９５；配列番号１２または１３のａａ６８９〜ａａ６９６；配列番号１２または１３のａａ６９０〜ａａ６９７；配列番号１２または１３のａａ６９１〜ａａ６９８；配列番号１２または１３のａａ６９２〜ａａ６９９；配列番号１２または１３のａａ６９３〜ａａ７００；配列番号１２または１３のａａ６９４〜ａａ７０１；配列番号１２または１３のａａ６９５〜ａａ７０２；配列番号１２または１３のａａ６９６〜ａａ７０３；配列番号１２または１３のａａ６９７〜ａａ７０４；配列番号１２または１３のａａ６９８〜ａａ７０５；配列番号１２または１３のａａ６９９〜ａａ７０６；配列番号１２または１３のａａ７００〜ａａ７０７；配列番号１２または１３のａａ７０１〜ａａ７０８；配列番号１２または１３のａａ７０２〜ａａ７０９；配列番号１２または１３のａａ７０３〜ａａ７１０；配列番号１２または１３のａａ７０４〜ａａ７１１；配列番号１２または１３のａａ７０５〜ａａ７１２；配列番号１２または１３のａａ７６〜ａａ７１３；配列番号１２または１３のａａ７０７〜ａａ７１４；配列番号１２または１３のａａ７０８〜ａａ７１５；配列番号１２または１３のａａ７０９〜ａａ７１６；配列番号１２または１３のａａ７１０〜ａａ７１７；配列番号１２または１３のａａ７１１〜ａａ７１８；配列番号１２または１３のａａ７１２〜ａａ７１９；配列番号１２または１３のａａ７１３〜ａａ７２０；配列番号１２または１３のａａ７１４〜ａａ７２１；配列番号１２または１３のａａ７１５〜ａａ７２２；配列番号１２または１３のａａ７１６〜ａａ７２３；配列番号１２または１３のａａ７１７〜ａａ７２４；配列番号１２または１３のａａ７１８〜ａａ７２５；配列番号１２または１３のａａ７１９〜ａａ７２６；配列番号１２または１３のａａ７２０〜ａａ７２７；配列番号１２または１３のａａ７２１〜ａａ７２８；配列番号１２または１３のａａ７２２〜ａａ７２９；配列番号１２または１３のａａ７２３〜ａａ７３０；配列番号１２または１３のａａ７２４〜ａａ７３１；配列番号１２または１３のａａ７２５〜ａａ７３２；配列番号１２または１３のａａ７２６〜ａａ７３３；配列番号１２または１３のａａ７２７〜ａａ７３４；配列番号１２または１３のａａ７２８〜ａａ７３５；配列番号１２または１３のａａ７２９〜ａａ７３６；配列番号１２または１３のａａ７３０〜ａａ７３７；配列番号１２または１３のａａ７３１〜ａａ７３８；配列番号１２または１３のａａ７３２〜ａａ７３９；配列番号１２または１３のａａ７３３〜ａａ７４０；配列番号１２または１３のａａ７３４〜ａａ７４１；配列番号１２または１３のａａ７３５〜ａａ７４２；配列番号１２または１３のａａ７３６〜ａａ７４３；配列番号１２または１３のａａ７３７〜ａａ７４４；配列番号１２または１３のａａ７３８〜ａａ７４５；配列番号１２または１３のａａ７３９〜ａａ７４６；配列番号１２または１３のａａ７４０〜ａａ７４７；配列番号１２または１３のａａ７４１〜ａａ７４８；配列番号１２または１３のａａ７４２〜ａａ７４９；配列番号１２または１３のａａ７４３〜ａａ７５０；配列番号１２または１３のａａ７４４〜ａａ７５１；配列番号１２または１３のａａ７４５〜ａａ７５２；配列番号１２または１３のａａ７４６〜ａａ７５３；配列番号１２または１３のａａ７４７〜ａａ７５４；配列番号１２または１３のａａ７４８〜ａａ７５５；配列番号１２または１３のａａ７４９〜ａａ７５６；配列番号１２または１３のａａ７５０〜ａａ７５７；配列番号１２または１３のａａ７５１〜ａａ７５８；配列番号１２または１３のａａ７５２〜ａａ７５９；配列番号１２または１３のａａ７５３〜ａａ７６０；配列番号１２または１３のａａ７５４〜ａａ７６１；配列番号１２または１３のａａ７５５〜ａａ７６２；配列番号１２または１３のａａ７５６〜ａａ７６３；配列番号１２または１３のａａ７５７〜ａａ７６４；配列番号１２または１３のａａ７５８〜ａａ７６５；配列番号１２または１３のａａ７５９〜ａａ７６６；配列番号１２または１３のａａ７６０〜ａａ７６７；配列番号１２または１３のａａ７６１〜ａａ７６８；配列番号１２または１３のａａ７６２〜ａａ７６９；配列番号１２または１３のａａ７６３〜ａａ７７０；配列番号１２または１３のａａ７６４〜ａａ７７１；配列番号１２または１３のａａ７６５〜ａａ７７２；配列番号１２または１３のａａ７６６〜ａａ７７３；配列番号１２または１３のａａ７６７〜ａａ７７４；配列番号１２または１３のａａ７６８〜ａａ７７５；配列番号１２または１３のａａ７６９〜ａａ７７６；配列番号１２または１３のａａ７７０〜ａａ７７７；配列番号１２または１３のａａ７７１〜ａａ７７８；配列番号１２または１３のａａ７７２〜ａａ７７９；配列番号１２または１３のａａ７７３〜ａａ７８０；配列番号１２または１３；ａｎ７７４〜ａａ７８１；配列番号１２または１３のａａ７７５〜ａａ７８２；配列番号１２または１３のａａ７７６〜ａａ７８３；配列番号１２または１３のａａ７７７〜ａａ７８４；配列番号１２または１３のａａ７７８〜ａａ７８４；配列番号１２または１３のａａ７７９〜ａａ７８６；配列番号１２または１３のａａ７８０〜ａａ７８７；配列番号１２または１３のａａ７８１〜ａａ７８８；配列番号１２または１３のａａ７８２〜ａａ７８９；配列番号１２または１３のａａ７８３〜ａａ７９０；配列番号１２または１３のａａ７８４〜ａａ７９１；配列番号１２または１３のａａ７８５〜ａａ７９２；配列番号１２または１３のａａ７８６〜ａａ７９３；配列番号１２または１３のａａ７８７〜ａａ７９４；配列番号１２または１３のａａ７８８〜ａａ７９５；配列番号１２または１３のａａ７８９〜ａａ７９６；配列番号１２または１３のａａ７９０〜ａａ７９７；配列番号１２または１３のａａ７９１〜ａａ７９８；配列番号１２または１３のａａ７９２〜ａａ７９９；配列番号１２または１３のａａ７９３〜ａａ８００；配列番号１２または１３のａａ７９４〜ａａ８０１；配列番号１２または１３のａａ７９５〜ａａ８０２；配列番号１２または１３のａａ７９６〜ａａ８０３；配列番号１２または１３のａａ７９７〜ａａ８０４；配列番号１２または１３のａａ７９８〜ａａ８０５；配列番号１２または１３のａａ７９９〜ａａ８０６；配列番号１２または１３のａａ８００〜ａａ８０７；配列番号１２または１３のａａ８０１〜ａａ８０８；配列番号１２または１３のａａ８０２〜ａａ８０９；配列番号１２または１３のａａ８０３〜ａａ８１０；配列番号１２または１３のａａ８０４〜ａａ８１１；配列番号１２または１３のａａ８０５〜ａａ８１２；配列番号１２または１３のａａ８０６〜ａａ８１３；配列番号１２または１３のａａ８０７〜ａａ８１４；配列番号１２または１３のａａ８０８〜ａａ８１５；配列番号１２または１３のａａ８０９〜ａａ８１６；配列番号１２または１３のａａ８１０〜ａａ８１７；配列番号１２または１３のａａ８１１〜ａａ８１８；配列番号１２または１３のａａ８１２〜ａａ８１９；配列番号１２または１３のａａ８１３〜ａａ８２０；配列番号１２または１３のａａ８１４〜ａａ８２１；配列番号１２または１３のａａ８１５〜ａａ８２２；配列番号１２または１３のａａ８１６〜ａａ８２３；配列番号１２または１３のａａ８１７〜ａａ８２４；配列番号１２または１３のａａ８１８〜ａａ８２５；配列番号１２または１３のａａ８１９〜ａａ８２６；配列番号１２または１３のａａ８２０〜ａａ８２７；配列番号１２または１３のａａ８２１〜ａａ８２８；配列番号１２または１３のａａ８２２〜ａａ８２９；配列番号１２または１３のａａ８２３〜ａａ８３０；配列番号１２または１３のａａ８２４〜ａａ８３１；配列番号１２または１３のａａ８２５〜ａａ８３２；配列番号１２または１３のａａ８２６〜ａａ８３３；配列番号１２または１３のａａ８２７〜ａａ８３４；配列番号１２または１３のａａ８２８〜ａａ８３５；配列番号１２または１３のａａ８２９〜ａａ８３６；配列番号１２または１３のａａ８３０〜ａａ８３７；配列番号１２または１３のａａ８３１〜ａａ８３８；配列番号１２または１３のａａ８３２〜ａａ８３９；配列番号１２または１３のａａ８３３〜ａａ８４０；配列番号１２または１３のａａ８３４〜ａａ８４１；配列番号１２または１３のａａ８３５〜ａａ８４２；配列番号１２または１３のａａ８３６〜ａａ８４３；配列番号１２または１３のａａ８３７〜ａａ８４４；配列番号１２または１３のａａ８３８〜ａａ８４５；配列番号１２または１３のａａ８３９〜ａａ８４６；配列番号１２または１３のａａ８４０〜ａａ８４７；配列番号１２または１３のａａ８４１〜ａａ８４８；配列番号１２または１３のａａ８４２〜ａａ８４９；配列番号１２または１３のａａ８４３〜ａａ８５０；配列番号１２または１３のａａ８４４〜ａａ８５１；配列番号１２または１３のａａ８４５〜ａａ８５２；配列番号１２または１３のａａ８４６〜ａａ８５３；配列番号１２または１３のａａ８４７〜ａａ８５４；配列番号１２または１３のａａ８４８〜ａａ８５５；配列番号１２または１３のａａ８４９〜ａａ８５６；配列番号１２または１３のａａ８５０〜ａａ８５７；配列番号１２または１３のａａ８５１〜ａａ８５８；配列番号１２または１３のａａ８５２〜ａａ８５９；配列番号１２または１３のａａ８５３〜ａａ８６０；配列番号１２または１３のａａ８５４〜ａａ８６１；配列番号１２または１３のａｎ８５５〜ａａ８６２；配列番号１２または１３のａａ８５６〜ａａ８６３；配列番号１２または１３のａａ８５７〜ａａ８６４；配列番号１２または１３のａａ８５８〜ａａ８６５；配列番号１２または１３のａａ８５９〜ａａ８６６；配列番号１２または１３のａａ８６０〜ａａ８６７；配列番号１２または１３のａａ８６１〜ａａ８６８；配列番号１２または１３のａａ８６２〜ａａ８６９；配列番号１２または１３のａａ８６３〜ａａ８７０；配列番号１２または１３のａａ８６４〜ａａ８７１；配列番号１２または１３のａａ８６５〜ａａ８７２；配列番号１２または１３のａａ８６６〜ａａ８７３；配列番号１２または１３のａａ８６７〜ａａ８７４；配列番号１２または１３のａａ８６８〜ａａ８７５；配列番号１２または１３のａａ８６９〜ａａ８７６；配列番号１２または１３のａａ８７０〜ａａ８７７；配列番号１２または１３のａａ８７１〜ａａ８７８；配列番号１２または１３のａａ８７２〜ａａ８７９；配列番号１２または１３のａａ８７３〜ａａ８８０；配列番号１２または１３のａａ８７４〜ａａ８８１；配列番号１２または１３のａａ８７５〜ａａ８８２；配列番号１２または１３のａａ８７６〜ａａ８８３；配列番号１２または１３のａａ８７７〜ａａ８８４；配列番号１２または１３のａａ８７８〜ａａ８８４；配列番号１２または１３のａａ８７９〜ａａ８８６；配列番号１２または１３のａａ８８０〜ａａ８８７；配列番号１２または１３のａａ８８１〜ａａ８８８；配列番号１２または１３のａａ８８２〜ａａ８８９；配列番号１２または１３のａａ８８３〜ａａ８９０；配列番号１２または１３のａａ８８４〜ａａ８９１；配列番号１２または１３のａａ８８５〜ａａ８９２；配列番号１２または１３のａａ８８６〜ａａ８９３；配列番号１２または１３のａａ８８７〜ａａ８９４；配列番号１２または１３のａａ８８８〜ａａ８９５；配列番号１２または１３のａａ８８９〜ａａ８９６；配列番号１２または１３のａａ８９０〜ａａ８９７；配列番号１２または１３のａａ８９１〜ａａ８９８；配列番号１２または１３のａａ８９２〜ａａ８９９；配列番号１２または１３のａａ８９３〜ａａ９００；配列番号１２または１３のａａ８９４〜ａａ９０１；配列番号１２または１３のａａ８９５〜ａａ９０２；配列番号１２または１３のａａ８９６〜ａａ９０３；配列番号１２または１３のａａ８９７〜ａａ９０４；配列番号１２または１３のａａ８９８〜ａａ９０５；配列番号１２または１３のａａ８９９〜ａａ９０６；配列番号
１２または１３のａａ９００〜ａａ９０７；配列番号１２または１３のａａ９０１〜ａａ９０８；配列番号１２または１３のａａ９０２〜ａａ９０９；配列番号１２または１３のａａ９０３〜ａａ９１０；配列番号１２または１３のａａ９０４〜ａａ９１１；配列番号１２または１３のａａ９０５〜ａａ９１２；配列番号１２または１３のａａ９０６〜ａａ９１３；配列番号１２または１３のａａ９０７〜ａａ９１４；配列番号１２または１３のａａ９０８〜ａａ９１５；配列番号１２または１３のａａ９０９〜ａａ９１６；配列番号１２または１３のａａ９１０〜ａａ９１７；配列番号１２または１３のａａ９１１〜ａａ９１８；配列番号１２または１３のａａ９１２〜ａａ９１９；配列番号１２または１３のａａ９１３〜ａａ９２０；配列番号１２または１３のａａ９１４〜ａａ９２１；配列番号１２または１３のａａ９１５〜ａａ９２２；配列番号１２または１３のａａ９１６〜ａａ９２３；配列番号１２または１３のａａ９１７〜ａａ９２４；配列番号１２または１３のａａ９１８〜ａａ９２５；配列番号１２または１３のａａ９１９〜ａａ９２６；配列番号１２または１３のａａ９２０〜ａａ９２７；配列番号１２または１３のａａ９２１〜ａａ９２８；配列番号１２または１３のａａ９２２〜ａａ９２９；配列番号１２または１３のａａ９２３〜ａａ９３０；配列番号１２または１３のａａ９２４〜ａａ９３１；配列番号１２または１３のａａ９２５〜ａａ９３２；配列番号１２または１３のａａ９２６〜ａａ９３３；配列番号１２または１３のａａ９２７〜ａａ９３４；配列番号１２または１３のａａ９２８〜ａａ９３５；配列番号１２または１３のａａ９２９〜ａａ９３６；配列番号１２または１３のａａ９３０〜ａａ９３７；配列番号１２または１３のａａ９３１〜ａａ９３８；配列番号１２または１３のａａ９３２〜ａａ９３９；配列番号１２または１３のａａ９３３〜ａａ９４０；配列番号１２または１３のａａ９３４〜ａａ９４１；配列番号１２または１３のａａ９３５〜ａａ９４２；配列番号１２または１３のａａ９３６〜ａａ９４３；配列番号１２または１３のａａ９３７〜ａａ９４４；配列番号１２または１３のａａ９３８〜ａａ９４５；配列番号１２または１３のａａ９３９〜ａａ９４６；配列番号１２または１３のａａ９４０〜ａａ９４７；配列番号１２または１３のａａ９４１〜ａａ９４８；配列番号１２または１３のａａ９４２〜ａａ９４９；配列番号１２または１３のａａ９４３〜ａａ９５０；配列番号１２または１３のａａ９４４〜ａａ９５１；配列番号１２または１３のａａ９４５〜ａａ９５２；配列番号１２または１３のａａ９４６〜ａａ９５３；配列番号１２または１３のａａ９４７〜ａａ９５４；配列番号１２または１３のａａ９４８〜ａａ９５５；配列番号１２または１３のａａ９４９〜ａａ９５６；配列番号１２または１３のａａ９５０〜ａａ９５７；配列番号１２または１３のａａ９５１〜ａａ９５８；配列番号１２または１３のａａ９５２〜ａａ９５９；配列番号１２または１３のａａ９５３〜ａａ９６０；配列番号１２または１３のａａ９５４〜ａａ９６１；配列番号１２または１３のａａ９５５〜ａａ９６２；配列番号１２または１３のａａ９５６〜ａａ９６３；配列番号１２または１３のａａ９５７〜ａａ９６４；配列番号１２または１３のａａ９５８〜ａａ９６５；配列番号１２または１３のａａ９５９〜ａａ９６６；配列番号１２または１３のａａ９６０〜ａａ９６７；配列番号１２または１３のａａ９６１〜ａａ９６８；配列番号１２または１３のａａ９６２〜ａａ９６９；配列番号１２または１３のａａ９６３〜ａａ９７０；配列番号１２または１３のａａ９６４〜ａａ９７１；配列番号１２または１３のａａ９６５〜ａａ９７２；配列番号１２または１３のａａ９６６〜ａａ９７３；配列番号１２または１３のａａ９６７〜ａａ９７４；配列番号１２または１３のａａ９６８〜ａａ９７５；配列番号１２または１３のａａ９６９〜ａａ９７６；配列番号１２または１３のａａ９７０〜ａａ９７７；配列番号１２または１３のａａ９７１〜ａａ９７８；配列番号１２または１３のａａ９７２〜ａａ９７９；配列番号１２または１３のａａ９７３〜ａａ９８０；配列番号１２または１３のａａ９７４〜ａａ９８１；配列番号１２または１３のａａ９７５〜ａａ９８２；配列番号１２または１３のａａ９７６〜ａａ９８３；配列番号１２または１３のａａ９７７〜ａａ９８４；配列番号１２または１３のａａ９７８〜ａａ９８４；配列番号１２または１３のａａ９７９〜ａａ９８６；配列番号１２または１３のａａ９８０〜ａａ９８７；配列番号１２または１３のａａ９８１〜ａａ９８８；配列番号１２または１３のａａ９８２〜ａａ９８９；配列番号１２または１３のａａ９８３〜ａａ９９０；配列番号１２または１３のａａ９８４〜ａａ９９１；配列番号１２または１３のａａ９８５〜ａａ９９２；配列番号１２または１３のａａ９８６〜ａａ９９３；配列番号１２または１３のａａ９８７〜ａａ９９４；配列番号１２または１３のａａ９８８〜ａａ９９５；配列番号１２または１３のａａ９８９〜ａａ９９６；配列番号１２または１３のａａ９９０〜ａａ９９７；配列番号１２または１３のａａ９９１〜ａａ９９８；配列番号１２または１３のａａ９９２〜ａａ９９９；配列番号１２または１３のａａ９９３〜ａａ１０００；配列番号１２または１３のａａ９９４〜ａａ１００１；配列番号１２または１３のａａ９９５〜ａａ１００２；配列番号１２または１３のａａ９９６〜ａａ１００３；配列番号１２または１３のａａ９９７〜ａａ１００４；配列番号１２または１３のａａ９９８〜ａａ１００５；配列番号１２または１３のａａ９９９〜ａａ１００６；配列番号１２または１３のａａ１０００〜ａａ１００７；配列番号１２または１３のａａ１００１〜ａａ１００８；配列番号１２または１３のａａ１００２〜ａａ１００９；配列番号１２または１３のａａ１００３〜ａａ１０１０；配列番号１２または１３のａａ１００４〜ａａ１０１１；配列番号１２または１３のａａ１００５〜ａａ１０１２；配列番号１２または１３のａａ１００６〜ａａ１０１３；配列番号１２または１３のａａ１００７〜ａａ１０１４；配列番号１２または１３のａａ１００８〜ａａ１０１５；配列番号１２または１３のａａ１００９〜ａａ１０１６；配列番号１２または１３のａａ１０１０〜ａａ１０１７；配列番号１２または１３のａａ１０１１〜ａａ１０１８；配列番号１２または１３のａａ１０１２〜ａａ１０１９；配列番号１２または１３のａａ１０１３〜ａａ１０２０；配列番号１２または１３のａａ１０１４〜ａａ１０２１；配列番号１２または１３のａａ１０１５〜ａａ１０２２；配列番号１２または１３のａａ１０１６〜ａａ１０２３；配列番号１２または１３のａａ１０１７〜ａａ１０２４；配列番号１２または１３のａａ１０１８〜ａａ１０２５；配列番号１２または１３のａａ１０１９〜ａａ１０２６；配列番号１２または１３のａａ１０２０〜ａａ１０２７；配列番号１２または１３のａａ１０２１〜ａａ１０２８；配列番号１２または１３のａａ１０２２〜ａａ１０２９；配列番号１２または１３のａａ１０２３〜ａａ１０３０；配列番号１２または１３のａａ１０２４〜ａａ１０３１；配列番号１２または１３のａａ１０２５〜ａａ１０３２；配列番号１２または１３のａａ１０２６〜ａａ１０３３；配列番号１２または１３のａａ１０２７〜ａａ１０３４；配列番号１２または１３のａａ１０２８〜ａａ１０３５；配列番号１２または１３のａａ１０２９〜ａａ１０３６；配列番号１２または１３のａａ１０３０〜ａａ１０３７；配列番号１２または１３のａａ１０３１〜ａａ１０３８；配列番号１２または１３のａａ１０３２〜ａａ１０３９；配列番号１２または１３のａａ１０３３〜ａａ１０４０；配列番号１２または１３のａａ１０３４〜ａａ１０４１；配列番号１２または１３のａａ１０３５〜ａａ１０４２；配列番号１２または１３のａａ１０３６〜ａａ１０４３；配列番号１２または１３のａａ１０３７〜ａａ１０４４；配列番号１２または１３のａａ１０３８〜ａａ１０４５；配列番号１２または１３のａａ１０３９〜ａａ１０４６；配列番号１２または１３のａａ１０４０〜ａａ１０４７；配列番号１２または１３のａａ１０４１〜ａａ１０４８；配列番号１２または１３のａａ１０４２〜ａａ１０４９；配列番号１２または１３のａａ１０４３〜ａａ１０５０；配列番号１２または１３のａａ１０４４〜ａａ１０５１；配列番号１２または１３のａａ１０４５〜ａａ１０５２；配列番号１２または１３のａａ１０４６〜ａａ１０５３；配列番号１２または１３のａａ１０４７〜ａａ１０５４；配列番号１３のａａ１０４８〜ａａ１０５５；配列番号１３のａａ１０４９〜ａａ１０５６；配列番号１３のａａ１０５０〜ａａ１０５７；配列番号１３のａａ１０５１〜ａａ１０５８；配列番号１３のａａ１０５２〜ａａ１０５９；配列番号１３のａａ１０５３〜ａａ１０６０；配列番号１３のａａ１０５４〜ａａ１０６１；配列番号１３のａａ１０５５〜ａａ１０６２；配列番号１３のａａ１０５６〜ａａ１０６３；配列番号１３のａａ１０５７〜ａａ１０６４；配列番号１３のａａ１０５８〜ａａ１０６５；配列番号１３のａａ１０５９〜ａａ１０６６；配列番号１３のａａ１０６０〜ａａ１０６７；配列番号１３のａａ１０６１〜ａａ１０６８；配列番号１３のａａ１０６２〜ａａ１０６９；配列番号１３のａａ１０６３〜ａａ１０７０；配列番号１３のａａ１０６４〜ａａ１０７１；配列番号１３のａａ１０６５〜ａａ１０７２；配列番号１３のａａ１０６６〜ａａ１０７３；配列番号１３のａａ１０６７〜ａａ１０７４；配列番号１３のａａ１０６８〜ａａ１０７５；配列番号１３のａａ１０６９〜ａａ１０７６；配列番号１３のａａ１０７０〜ａａ１０７７；ならびに配列番号１３のａａ１０７１〜ａａ１０７８。フラグメントのコード配列は、変異体またはネイティブのＴＩＡＭ２タンパク質コード配列由来の不必要なヌクレオチドを切断することにより構築され得る。
【００８７】
融合物は、末端のいずれか、または両方でさらなるアミノ酸を有する、フラグメント、変異体、またはネイティブＴＩＡＭ２タンパク質である。さらなるアミノ酸配列は、一般的には、ネイティブＴＩＡＭ２ポリペプチド中に見出される配列と相同ではない。さらなるアミノ酸残基は、例えば、ポリペプチドの発現、検出、または活性を促進し得る。さらなるアミノ酸配列はまた、ＴＩＡＭ２タンパク質の多量体を構築するためのリンカーとして使用され得る。全ての融合ポリペプチドは、所望される配列相同性、免疫学的活性、または生物学的活性を示す。組換えＴＩＡＭ２融合タンパク質が、好ましい細胞系であるバキュロウイルスを使用して産生され得る。
【００８８】
移入ベクター中にＴＩＡＭ２  ＤＮＡ配列を挿入した後、ベクターおよび野生型のウイルスのゲノムが、昆虫宿主細胞中にトランスフェクトされる。ここで、ベクターおよびウイルスゲノムが、組換えされる。パッケージされた組換えウイルスが発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞の発現系についての材料および方法は、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から、キット形態で市販されている。これらの技術は、一般的には、当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に十分に記載されている。
【００８９】
バキュロウイルスのゲノム中へのタンパク質をコードするＤＮＡ配列の挿入の前に、プロモーター、リーダー（所望される場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含有している上記の成分が、通常は、中間体構築物（移入ベクター）に組み立てられる。
【００９０】
ＡｃＮＰＶ中に外来遺伝子を導入するために現在、最も一般的に使用される移入ベクターは、ｐＡｃ３７３である。多くの他のベクター（当該分野で公知である）もまた、設計されている。これらとしては、例えば、ｐＶＬ９８５が挙げられる。これは、ポリヘドリン開始コドンがＡＴＧからＡＴＴに変更され、そしてＡＴＴの３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位が導入されている；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７：３１（１９８９）を参照のこと。
【００９１】
プラスミドはまた、通常は、ポリへドロンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７（１９８８））、および原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ中での選択および増殖のための複製起点を含む。
【００９２】
バキュロウイルス移入ベクターは、通常は、バキュロウイルスプロモーターを含む。プロモーターは、通常は、コード配列の５’末端の近位に配置される、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルス移入ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第２のドメインを有し得る。これは、存在する場合には、通常は、構造遺伝子に対して遠位である。発現は、調節され得るかまたは構成的であるかのいずれかであり得る。
【００９３】
ウイルスの感染のサイクルにおいて後期に豊富に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルスのポリへドロンタンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ（Ｗａｌｔｅｒ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開第１２７８３９号および同第１５５４７６号）；ならびに、ｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５（１９８８））に由来する配列が挙げられる。
【００９４】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌される昆虫またはバキュロウイルスのタンパク質（例えば、バキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ、７３：４０９（１９８８））の遺伝子に由来し得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後の改変（例えば、シグナルペプチドの切断、タンパク質分解的切断、およびリン酸化）は、昆虫細胞によって認識されるようであり、そして分泌のために必要とされるシグナルおよび核の蓄積はまた、無脊椎動物細胞および脊椎動物細胞間で保存されているようである。昆虫以外の起源のリーダー（例えば、ヒトのα−インターフェロンをコードする遺伝子に由来するもの、Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２（１９８５））；ヒトのガストリン放出ペプチドをコードする遺伝子に由来するもの、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９（１９８８）；ヒトＩＬ−２、Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８４０４（１９８５）；マウスのＩＬ−３をコードする遺伝子に由来するもの（Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ  ５８：２７３（１９８７）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子に由来するもの、Ｍａｒｔｉｎら、ＤＮＡ  ７：９９（１９８８））もまた、昆虫での分泌を提供するように使用され得る。
【００９５】
タンパク質の発現産物前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主が、移入ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを用いて、通用は、同時トランスフェクションによって同時形質転換される。バキュロウイルスの所望される部位に異種ＤＮＡを導入するための方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６（１９８３）；およびＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、相同二重交差組換えによって、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子中であり得る；挿入はまた、所望されるバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位中であり得る。Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ４：９１（１９８９）。
【００９６】
新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、その後、感染性の組換えバキュロウイルス中にパッケージされる。組換えウイルスを同定するための方法は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）、１６．８（補遣１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）に記載されている。
【００９７】
組換えバキュロウイルス発現ベクターが、いくつかの昆虫細胞中への感染のために開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスは、とりわけ、以下について開発されている：Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３（１９８５）；Ｗｒｉｇｈｔ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７１８（１９８６）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６（１９８３）；および一般的には、Ｆｒａｓｅｒら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５（１９８９）を参照のこと）。
【００９８】
ＴＩＡＭ２タンパク質は、インヒビターについてのアッセイにおいて、およびＴＩＡＭ２に対して指向された抗体を調製するために、使用され得る。ＴＩＡＭ２タンパク質はまた、培養物中の癌細胞の増殖を促進する因子として有用であり得る。ＴＩＡＭ２タンパク質は、ＴＩＡＭ２アンチセンス分子を用いる使用についての上記の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされ得る。
【００９９】
本発明は、特に有利な実施形態を示す以下の実施例を参照して本明細書中で説明される。しかし、以下の実施例は、これらの実施形態が説明され、そしていかなる様式にも本発明を制限するようには解釈されないことが留意されるべきである。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
（ＴＩＡＭ２遺伝子の同定）
新規の遺伝子の縮重ＰＣＲに基づくスクリーニングにおいて、単一の３７７ヌクレオチドのクローン（ＤＰ−７５）を同定した。これは、マウスおよびヒトのＴＩＡＭ１遺伝子に対して高い相同性を有した。ＴＩＡＭ１に対するその類似性に起因して、この新規の遺伝子およびその推定されるタンパク質産物を、Ｔ細胞リンパ腫侵襲および転移２（ＴＩＡＭ２）と命名した。
【０１０１】
ＤＰ−７５プローブでのノーザン分析は、大脳皮質、大脳後頭極、前頭葉、および側頭葉中での約３．３ｋｂの転写物、ならびに精巣および小脳中の約４．４ｋｂの転写物を明らかにした（図１Ａおよび１Ｂ）。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよびＲＡＣＥクローニングによって、重複しているクローンを単離し、そしてそれぞれ約４．４ｋｂおよび約３．３ｋｂのメッセージを示す全長配列に従った。ノーザン分析を行うために、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＳｐｅｅｄＨｙｂ溶液（ＢＩＯＳ  ｌａｂ）中でＤＰ７５プローブと６５℃でハイブリダイズさせた。ブロットを、０．５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを用いて、１０分間、室温で２回洗浄し、そして０．１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにおいて６５℃で１時間、１回洗浄した。
【０１０２】
約４．４ｋｂのメッセージに従うｃＤＮＡは、４５８６ヌクレオチドの長さであり、ポリアデニル化を伴わず、そしてＴＩＡＭ２タンパク質の１０７７アミノ酸の長い形態（ＴＩＡＭ２L）をコードすると推定される。最初のＡＴＧは、ヌクレオチド５１位であり、そして翻訳に良好な状況にある。ＴＩＡＭ１に対する推定されるタンパク質のアラインメント（図３）は、ＴＩＡＭ２の最初のメチオニンおよびＴＩＡＭ２の５７６位のメチオニンで開始する有意な同一性を示し、この領域は、ＴＩＡＭ１のコイルドコイルドメイン（ａａ５４８−５９０）の最後の１４アミノ酸に対応する。この同一性は、ヒトのＴＩＡＭ１のアミノ酸５９９からアミノ酸６９１に伸びるＥＸドメインにまで続く。ＴＩＡＭ１／ＴＩＡＭ２LのＥＸドメインの比較は、全体的に６２％の同一性を示すが、６０ａａのサブドメインにおいては８５％の同一性を有する。ＥＸドメインに続く、７２ヌクレオチドのミニエキソンの選択的スプライシングは、ＴＩＡＭ１またはＳＩＦ配列に対して有意な同一性を有さない、２４アミノ酸配列の存在または非存在を導く。選択的にスプライシングされた領域の後ろはＴＩＡＭ１に対して弱い同一性（１８％）を有する配列であるが、これは、ＰＤＺドメインまたはＤＨＲドメインの保存された残基を含む（Ｍｉｃｈｉｅｌｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：３３８−３４０、１９９５）。残りの配列は、ＤＨ触媒領域に対する同一性を含み（７０％）、そしてカルボキシ末端のＰＨドメインに対する同一性（５４％）を含む。
【０１０３】
約３．３ｋｂのメッセージに従う配列は、３３４４ヌクレオチドの長さであり、そしてＴＩＡＭ２（ＴＩＡＭS）の短い形態（６２６ａａ）をコードすると推定される。約３．３ｋｂのメッセージは、最初の１０４ヌクレオチドが独特である点で、約４．４ｋｂのメッセージとは異なる。このことは、約３．３ｋｂのメッセージが、約４．４ｋｂのメッセージのプロモーターとは異なるプロモーターでの開始によって生じることを示唆する。１６２位での開始メチオニンは、４．４ｋｂのＴＩＡＭ２推定タンパク質のアミノ酸４２８でのメチオニンと一致し、そしてタンパク質の残りは、ＴＩＡＭ２Lと完全な同一性を示す。ＴＩＡＭ１遺伝子（Ｈａｂｅｔｓら、Ｃｅｌｌ  ７７：５３７−５４９、１９９４）で見られるものと同様に、約３．３ｋｂのメッセージ中に２つの上流のＡＴＧが存在し、これらが長いオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１６２）の前にあり、ヌクレオチド１６２位の開始コドンのみが、翻訳に良好な状況にある。ＴＩＡＭとの比較は、ＴＩＡＭ２SがＤＨドメインのすぐ上流（２４ａａ）で開始することを示す。
【０１０４】
約４．４ｋｂのメッセージの５’末端から単離したプローブを用いるノーザン分析によって、長いＴＩＡＭ２転写物のみを同定し（図１Ｃ）、一方、ＴＩＡＭ２の３’末端から単離したプローブによって両方の転写物を同定した（図１Ｄ）。
【０１０５】
照射ハイブリッドマッピング実験を、以下のように行った。ＴＩＡＭ２特異的オリゴＡＧＴＣＣＴＡＣＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＧ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）１４）およびＴＴＡＧＴＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧ（配列番号１５）を合成し、そして製造業者の説明書に従ってＧ３パネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）とともに使用した。得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって分析し、そして得られたデータを、ＳｔｅｗａｒｔおよびＣｏｘ、「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐ．Ｄｅａｒら編）７３〜９３頁、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７の方法に従って分析した。２点最大可能性（ｔｗｏ−ｐｏｉｎｔ
ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）分析は、マーカーが、１００のロッドスコアでＤ６Ｓ１５５６（６ｑ２５）に関連することを示した。
【０１０６】
（実施例２）
（インサイチュハイブリダイゼーション）
ヒトの３．３ｋｂのＴＩＡＭ２  ｃＤＮＡのヌクレオチド５６６−５８６（ＡＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＣＧ）から、およびヌクレオチド１３４８−１３６７（ＴＡＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＧ）から設計したオリゴを、マウスの脳のｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に対してＰＣＲを行うために使用した。４０℃のアニーリング温度を用いて行った３０回のサイクルのＰＣＲによって、予測された長さ（８０２ｎｔ）の生成物（ＭＤＰ７５）の産生を導いた。クローニングおよび配列決定によって、ＭＤＰ７５が、クローンの長さ全体にわたってヒトのＴＩＡＭ２に対して９０％同一であることを確認した。マウスの胚（ＣＤ−１）を、ホールマウント（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ）ＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションのために、Ｎｉｅｔｏら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ａｖｉａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ」（Ｍ．Ｂｒｏｎｎｅｒ−Ｆｒａｓｅｒ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９５）のプロトコールに従って処理した。成体の脳の切片を、記載されるように、凍結切片についてのプロトコールを使用して処理した（Ｓｃｈａｅｒｅｎ−ＷｉｅｍｅｒｓおよびＧｅｒｆｉｎ−Ｍｏｓｅｒ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １００：４３１−４４０（１９９３））。
【０１０７】
胚１３．５日（Ｅ１３．５）および成体のマウス脳でのＴＩＡＭ２  ｍＲＮＡの発現を、ジゴキシゲニンで標識したリボプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションによって試験した。離散性および再現可能な標識を、アンチセンスプローブを用いて両方の年齢で観察した；センスプローブでは標識は検出されなかった。Ｅ１３．５および成体の脳の両方におけるＴＩＡＭ２転写物の細胞性の局在は、グリア細胞よりもむしろニューロン細胞中でのＴＩＡＭ２の発現と一致する。Ｅ１３．５では、ＴＩＡＭ２転写物は、終脳全体にわたって存在する（図２Ａ）。終脳全体にわたる側副平面の切片により、発現は初期に生じた有糸分裂後のニューロンが局在化される軟膜表面に局在化されることが実証される（図２Ｂ）。ＴＩＡＭ２は、脳室に沿う増殖性神経前駆細胞中では発現されない。
【０１０８】
成体のマウスの脳においては、ＴＩＡＭ２は、終脳に由来する領域において主に発現され続ける（図２Ｃ〜２Ｇ、表１）。強力な発現の領域としては、嗅球、大脳皮質、尾状の被殻、および海馬が挙げられる。海馬での発現は、歯状回、およびそれに由来する領域、灰白鞘、ならびに灰白帯の細胞において高度に特異的である；そしてＣＡ領域（ＣＡ２）の１つの部分領域のピラミッド型細胞（ｐｙｒａｍｉｄａｌ  ｃｅｌｌ）は、非常に強く標識されるが、一方、ＣＡ１およびＣＡ３は非常にわずかな発現を示す。ＴＩＡＭ２はまた、側脳室の側方表面の上衣細胞中で強く発現される（図２Ｄ）。この領域は、ニューロンが成体の寿命を通じて生成される胚の領域である。この領域で発生したニューロンの大部分は、嗅球に移動すると考えられる。
【０１０９】
【表１】
2010233574.tif 000003
（実施例３：ＧＤＰ−ＧＴＰ交換活性）
アミノ末端ＨＩＳタグ化したバージョンの３．３ｋｂＴＩＡＭｓタンパク質（Ｈｉｓ−ＴＩＡＭ２）を、バキュロウイルスの系において発現した。推分子量（７５．６６１Ｄａ）のタンパク質を、ニッケルカラムで部分精製し、そしてそのタンパク質の同一性をアミノ末端配列決定および質量分析によって確認した。Ｈｉｓタグ化したＴＩＡＭ２ｓ発現構築物を生成するために、リンカー−アダプターを生成して、ＴＩＡＭ２ｓ配列の最初の２９ｂｐの５’末端にＥｃｏＲＩ部位を付加した（ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣＣＧＣＧＧＧＡ−ＧＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣ）。ＢａｍＨＩ部位（ＴＩＡＭ２配列の塩基２３〜２９）で終結するこのリン酸化したリンカー／アダプターを、ＴＩＡＭ２ｓの全コード領域を含む、ＢａｍＨＩフラグメントによって直鎖状化されたｃＤＮＡクローンＤＰ−７５＃１と連結した。その後のＳａｌＩ消化は、ＴＩＡＭ２ｓの全コード領域を含む、約２０００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを遊離した。このフラグメントを単離、精製し、そしてＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ消化したｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。生じるクローン（ｐＨＩＳ−ＴＩＡＭ２ｓ）を配列分析によって確認した。
【０１１０】
ｐＨＩＳ−ＴＩＡＭ２ｓを、ＳＦ９細胞に導入し、そして高レベルのｐＨＩＳ−ＴＩＡＭ２ｓを発現するクローンをウェスタンブロットによって同定した。クローンの増殖後、ｐＨＩＳ−ＴＩＡＭ２ｓ発現細胞を濃縮し、溶解し、そしてニッケルカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にアプライした。ｐＨＩＳ−ＴＩＡＭ２ｓタンパク質を、５０ｍＭのイミダゾール洗浄後にタンパク質を直接５００ｍＭのイミダゾール中で直接溶出した以外は、製造業者の推奨によってカラムから精製した。ｐＨＩＳ−ＴＩＡＭ２ｓを含有する画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ）３０カラムにおいて、５０００ｇで３０分間遠心することによって濃縮した。
【０１１１】
Ｈｉｓ−ＴＩＡＭ２ｓを、ＲａｃまたはＲａｓタンパク質を用いるＧＤＰ−ＧＴＰ交換活性を刺激するその能力について試験し、そしてＳＯＳ（公知のＲａｓ
ＧＥＦ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：２３０３−２３１０、１９９８））の活性と比較した。これらの実験において（図４）、免疫沈降したＲａｃまたはＲａｓタンパク質に予めＧＤＰをロードしておき、そして［32Ｐ］ＧＴＰ含有緩衝液単独中か、またはＨｉｓ−ＴＩＡＭ２ｓまたは精製ＳＯＳのいずれかを含む緩衝液中でインキュベートした。複数の実験において、Ｈｉｓ−ＴＩＡＭ２ｓは、緩衝液単独と比べて、３０分の時点で、およそ５倍のＲａｃ交換活性の刺激を示したが、ＳＯＳは、せいぜい穏やかな刺激（×１．６）を示した（図４Ａ）。逆に、Ｈｉｓ−ＴＩＡＭ２ｓおよびＳＯＳをＲＡＳとインキュベートした場合、ＳＯＳは、４〜５倍の交換活性の刺激を示したが、Ｈｉｓ−ＴＩＡＭ２ｓは、ほとんど効果を有さなかったか、または全く効果を有さなかった（図４Ｂ）。
【０１１２】
（実施例４：癌の診断のためのポリヌクレオチドの使用）
ドットブロット分析において、ＴＩＡＭ２を、癌組織および正常組織の両方由来のＲＮＡとハイブリダイズした。癌組織の供給源としては、腎臓、甲状腺、胸部、結腸、尿管、肺、鼻、胃、食道、肝臓、リンパ腫、子宮、膀胱、直腸および脳が挙げられる。
【０１１３】
ブロットは、ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡからであった。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を、１×１０6ｃｐｍ／ｍｌで２時間、ＴＩＡＭ２（配列番号１）とともに、６８℃でブロッティングするために使用した。
【０１１４】
図５において示すように、４つの甲状腺サンプル中の４サンプルにおいて、配列番号１のｍＲＮＡレベルが、正常組織よりも癌組織において高かった。４つの結腸サンプルのうちの２つにおいて、配列番号１のｍＲＮＡレベルが正常組織よりも癌組織において高かった。２つの尿管サンプルのうちの１つにおいて、配列番号１（ＴＩＡＭ２）のｍＲＮＡレベルが正常組織よりも癌組織において高かった。４つの胸部サンプルのうちの１つにおいて、配列番号１のｍＲＮＡレベルが正常組織よりも癌組織において高かった。４つの腎臓サンプルのうちの１つにおいて、配列番号１のｍＲＮＡレベルが正常組織よりも癌組織において高かった。他の全ての試験した組織型において、配列番号１のｍＲＮＡレベルは、癌サンプルよりも正常サンプルにおいて、同一であるか、または高かった。
【０１１５】
【化２】
2010233574.tif 000004
（実施例５：配列番号６の単離）
配列番号６を、ファージベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用する前頭皮質ライブラリーより単離した。このライブラリーを、約１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの最終放射活性カウントを用いるランダムプライム標識によって生成した配列番号１によってプローブした。このプローブをＲｅｄｉＰｒｉｍｅTM  ＤＮＡラベリングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従って、標識した。
【０１１６】
ファージライブラリーを増殖して、製造業者の指示に従って、３．０〜５．０×１０5プラーク／プレートで２０枚のプレートにプレーティングした。プラークをニトロセルロースメンブレンに移した。各メンブレンを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）より購入した２時間６５℃、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液中で、配列番号１プローブとともに、インキュベートした。このフィルターをＣｌｏｎｔｅｃｈの指示に従って、洗浄した。フィルムをメンブレンに曝露して、所望のＴＩＡＭ２ポリヌクレオチドを含む推定陽性プラークを同定した。
【０１１７】
２回目のプレーティングおよびハイブリダイゼーションを実行して、単一の陽性プラークを同定した。１回目の陽性プラークを増殖して、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅによって提供される指示に従う寒天培地上にプレーティングした。プラークをフィルターに移した。これらのフィルターを配列番号１プローブとともにインキュベートした。プローブおよびハイブリダイゼーション条件は、上記と同一であった。陽性プラークを同定し、そして増殖した。
【０１１８】
製造業者の指示に従って、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミドをファージベクターから回収した。プラスミド由来のＥｃｏＲＩ挿入物を配列決定した。ポリヌクレオチド配列を、配列番号６に示す。
【０１１９】
本発明を、特定の実施形態を参照して記載した。しかし、この適用は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲を逸脱することなく当業者によってなされ得る変化および置換を含むことが、意図される。
【０１２０】
（寄託の情報）
以下の材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。
【０１２１】
【表２】
2010233574.tif 000005
上記の材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）に、示された受託番号のもとで寄託された。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約のもとで維持される。この寄託は、本特許の発行後３０年間、または本特許の有効な期間のいずれかより長い期間、維持される。特許の発行に際して、この寄託は、ＡＴＣＣから制限されることなく公衆に利用可能となる。
【０１２２】
これらの寄託は、単に、当業者の確認のために提供されるのであって、寄託が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとで必要とされることを承認するものではない。寄託された材料に含まれるポリヌクレオチド配列、ならびにそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書に取り込まれ、そして本明細書において記載される配列とのいかなる不一致の場合においても、優先する。寄託された物質の、生産、使用、または販売のためには、ランセンスが必要とされるかもしれないが、そのようなラインセスは、本明細書によって与えられるものではない。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【配列表】
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