(57)【要約】      （修正有）【課題】供給物中の３−ヒドロキシ酸のレベルを上昇させることを回避する、ＰＨＡポリマーを産生する方法を提供する。【解決手段】補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ経路によるＰＨＡポリマー産生からなる。アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよび／またはＰＨＡシンターゼのうちの１以上の酵素をコードする遺伝子を生物体中で発現させる工程であって、少なくとも１つの遺伝子は、異種遺伝子である工程、ならびに該生物体にアルコールを供給する工程を包含する方法である。この変換工程における少なくとも１工程は、補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）ポリマーを産生する方法であって、該ポリマーは、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシバレレート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、および３−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される少なくとも１つのモノマーを含み、該方法は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼおよびＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を生物体中で発現させる工程であって、ここで少なくとも１つの遺伝子は、異種遺伝子である、工程、ならびに該生物体にアルコールを供給する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＰＨＡポリマーが、３−ヒドロキシブチレートをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＨＡポリマーが、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アルコールが、１−プロパノール、１，２−プロパンジオール、および１−ブタノールからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子が、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼからなる群より選択される酵素をさらにコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物体が、酵母、細菌、真菌、および植物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）シンターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（４−ヒドロキシアルカノエート）シンターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（４−ヒドロキシブチレート）シンターゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物体が、細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物体が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物体が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｅｕｔＥ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって形成された、ポリマー。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリマーから形成された物品であって、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および医療用デバイスからなる群より選択される、物品。
【請求項１５】
前記物品が、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、薬物送達、組織操作骨格、細胞カプセル化；標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼおよび骨セメント、ならびに診断剤からなる群より選択されるデバイスである、請求項１４に記載の物品。
【請求項１６】
細菌、酵母、真菌および植物からなる群より選択される組換え生物体であって、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子を含む、組換え生物体。
【請求項１７】
ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項１６に記載の組換え生物体。
【請求項１８】
アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１７に記載の組換え生物体。
【請求項１９】
前記遺伝子の１以上が、前記組換え生物体に対して内因性である、請求項１８に記載の組換え生物体。
【請求項２０】
前記アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子のうちの１以上が、前記組換え生物体に対して異種である、請求項１８に記載の組換え生物体。
【請求項２１】
前記遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉのｅｕｔＥである、請求項１６に記載の組換え生物体。
【請求項２２】
細菌である、請求項１６に記載の組換え生物体。
【請求項２３】
植物である、請求項１６に記載の組換え生物体。
【請求項２４】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）ポリマーを産生する方法であって、該ポリマーは、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシアレレート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、および３−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される少なくとも１つのモノマーを含み、該方法は、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびＰＨＡシンターゼを発現するように遺伝子操作された細菌、酵母、真菌および植物からなる群より選択される生物体を選択する工程、ならびに該生物体にアルコールを供給する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
前記ＰＨＡポリマーが、３−ヒドロキシブチレートをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＨＡポリマーが、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルコールが、１−プロパノール、１，２−プロパンジオール、および１−ブタノールからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物体が、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物体が、細菌および植物からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）シンターゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（４−ヒドロキシアルカノエート）シンターゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（４−ヒドロキシブチレート）シンターゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物体が、細菌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物体が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物体が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｅｕｔＥ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の方法によって形成された、ポリマー。
【請求項３７】
請求項３６に記載のポリマーから形成された物品であって、該物品が、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および医療用デバイスからなる群より選択される、物品。
【請求項３８】
前記物品が、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、薬物送達、組織操作骨格、細胞カプセル化；標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼおよび骨セメント、ならびに診断剤からなる群より選択される医療用デバイスである、請求項３７に記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
２００２年９月１６日に出願した米国仮出願第６０／４１０，０８７号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般に、２−ヒドロキシ酸モノマーの作製方法、および得られるポリヒドロキシアルカノエートポリマーの分野に関する。
【０００３】
多数の微生物は、ＰＨＡポリマーの細胞内貯蔵を蓄積する能力を有する。ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノエート］（ＰＨＡ）は、再生可能資源から製造される生分解性熱可塑性材料であり、広範囲の産業応用および生物医学的応用を有する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ  ２６，３８−４４）。文献（ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８；２１９−２２８）において報告されているところによれば、約１００種の異なるモノマーが、ＰＨＡポリマー中に取り込まれており、そしてこれらの代謝の生物学および遺伝学が概説されている（ＨｕｉｓｍａｎおよびＭａｄｉｓｏｎ，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３）。
【０００４】
今日までに、ＰＨＡは、商業的利用性は制限されているようであり、コポリマーポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）のみが開発量で入手可能である。このコポリマーは、細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａの発酵によって産生されている。他のＰＨＡ型についての発酵および回収のプロセスもまた、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅならびに遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａを含めたある範囲の細菌を用いて開発されており、近年概説されている（Ｂｒａｕｎｅｇｇら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６５：１２７−１６１；ＣｈｏｉおよびＬｅｅ，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５１：１３−２１）。より伝統的なポリマー合成アプローチもまた調べられており、このアプローチとしては、対応するラクトンの直接縮重および開環重合が挙げられる（ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，１９９４，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２７：２５９５−２６０２）。
【０００５】
モノマー４−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ４ＨＢ）を含むＰＨＡポリマー（Ｄｏｉ，Ｙ．１９９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８，５８５−５９９）または４−ヒドロキシバレレートおよび４−ヒドロキシヘキサノエートを含むＰＨＡポリエステルの合成が記載されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎら，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，５０７−５１４およびＶａｌｅｎｔｉｎら，１９９４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０，７１０−７１６）。これらのポリエステルは、これらのモノマーをＰＨＡポリエステル中に無理やり取り込ませるために、微生物に比較的高価な非炭水化物供給材料が供給される、ＰＨＢＶについて元々記載された方法と類似の方法を用いて製造されている。このＰＨＢ４ＨＢコポリマーは、ある範囲のモノマー組成を有して産生され得、これは、さらにある範囲のポリマーを提供する（Ｓａｉｔｏ，Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｈｉｒａｍｉｔｓｕ，Ｍ．およびＤｏｉ，Ｙ．，１９９６，Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．３９：１６９）。
【０００６】
３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）を含むＰＨＡコポリマー（特に、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート（ＰＨＢＶ））は、商標名ＢｉｏｐｏｌＴＭで市販されている。ＰＨＢＶは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（以前はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を用いて、同時供給物（例えば、プロピオネート、イソブチレート（Ｈｏｌｍｅｓら，米国特許第４，４７７，６５４号）または奇数鎖長アルコールもしくは脂肪酸）と組み合わせた炭水化物供給材料（例えば、グルコース）から商業的に産生されている。多数の他の微生物およびプロセスが当業者に公知である（Ｂｒａｕｎｅｇｇら１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６５：１２７−１６１）。３ＨＶ単位を含むＰＨＡもまた、組換え微生物を用いて合成されている。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＡ生合成遺伝子を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、グルコースと、プロピオネートまたはバレレートのいずれかとからＰＨＢＶを産生するために用いられている（Ｓｌａｔｅｒら，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：１０８９−１０９４）。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＡ生合成遺伝子を保有するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａは、グルコースおよびプロピオネートからＰＨＢＶを産生するために用いられている（Ｚｈａｎｇら，１９９４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−１２０５）。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅのＰＨＡシンターゼ遺伝子を保有するＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａは、炭素数が奇数のアルカン酸からポリ（３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｐ）を産生するために用いられた（Ｆｕｋｕｉら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：１０９３−１０９７）。ＳｋｒａｌｙおよびＰｅｏｐｌｅｓに対する米国特許第６，３２９，１８３号は、１，２−プロパンジオールから、３ＨＶ単位を含むＰＨＡコポリマーを産生する方法を記載する。Ｈｕｉｓｍａｎらに対するＰＣＴ  ＷＯ  ００／４３５２３は、ブチレートまたはブタノールの同時供給物から３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）モノマー単位を含むＰＨＡを産生する方法を記載する。これらの場合の各々において、アルコール同時供給物は、遊離酸に変換され、次いでこの遊離酸は、脂肪アシル−補酵素Ａシンテターゼまたは脂肪アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼの作用により、補酵素Ａチオエステルへと活性化された。いくつかの場合には、この酵素活性は、宿主株にとって内在性であり、他の宿主株においてはこの活性は、遺伝子操作によって提供された。
【０００７】
開示された発明を実施するために適切な組換えＰＨＡ産生株を開発するための遺伝子および技術は、一般に、当業者に公知である（ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ，１９９９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３；ＰＣＴ  ＷＯ  ９９／１４３１３）。
【０００８】
３ＨＶコポリマーは、広範囲の適用において有用であることが証明されている。いくつかの場合には、約７〜１２重量％のコモノマーの３ＨＶレベルを有するＰＨＢＶコポリマーが適切である。他の場合には、１５〜３０重量％の３ＨＶレベルがより有用である（ＥＰ  ＬＡＴＥＸ）。より高レベルの３ＨＶは、供給物中のプロピオン酸のレベルを上昇させることによって達成される。しかし、このストラテジーに関連した２つの負の結果が存在する。第１に、プロピオン酸は細胞にとって毒性であり、それゆえ、増殖速度およびポリマー産生を低下させ、産生コストの顕著な増加を表す。第２の影響は、プロピオン酸の一部が、他の代謝プロセスに用いられ得、それゆえ、ポリマー中に取り込まれないことである。プロピオン酸は供給成分のうちの最も高価であるので、このことは、産生コストの別の増加を表す。それゆえ、同時供給において高い生産性および良好な収率を有する３ＨＶコポリマーを産生する微生物系を開発することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，４７７，６５４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３２９，１８３号明細書
【特許文献３】国際公開第００／４３５２３号
【特許文献４】国際公開第９９／１４３１３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ  ２６，３８−４４
【非特許文献２】ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８；２１９−２２８
【非特許文献３】ＨｕｉｓｍａｎおよびＭａｄｉｓｏｎ，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３
【非特許文献４】Ｂｒａｕｎｅｇｇら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６５：１２７−１６１
【非特許文献５】ＣｈｏｉおよびＬｅｅ，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５１：１３−２１
【非特許文献６】ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，１９９４，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２７：２５９５−２６０２
【非特許文献７】Ｄｏｉ，Ｙ．１９９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８，５８５−５９９
【非特許文献８】Ｖａｌｅｎｔｉｎら，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，５０７−５１４
【非特許文献９】Ｖａｌｅｎｔｉｎら，１９９４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０，７１０−７１６
【非特許文献１０】Ｓａｉｔｏ，Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｈｉｒａｍｉｔｓｕ，Ｍ．およびＤｏｉ，Ｙ．，１９９６，Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．３９：１６９
【非特許文献１１】Ｓｌａｔｅｒら，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：１０８９−１０９４
【非特許文献１２】Ｚｈａｎｇら，１９９４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−１２０５
【非特許文献１３】Ｆｕｋｕｉら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：１０９３−１０９７
【非特許文献１４】ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ，１９９９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それゆえ、本発明の目的は、供給物中の３−ヒドロキシ酸のレベルを上昇させることを回避する、ＰＨＡポリマーまたはＰＨＡコポリマーを産生するために適切な方法および微生物株を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、供給物中の３−プロピオン酸の使用を回避する、３ＨＶ単位を含むＰＨＡポリマーの産生に適切な方法および微生物株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＡシンターゼのうちの１以上をコードする遺伝子を含む生物体が提供される。いくつかの場合には、これらの遺伝子のうちの１以上は宿主生物体にとってネイティブであり、残りの遺伝子は、異種遺伝子から、遺伝子操作によって提供される。これらの生物体は、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）ホモポリマーまたは３−ヒドロキシ酪酸以外の３−ヒドロキシアルカノエートモノマーを含むコポリマーを産生し、ここで、これらの３−ヒドロキシアルカノエート単位は、アルコールから３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡモノマーへの、酵素によって触媒された変換に由来し、そしてここでこの変換経路における少なくとも１つの工程は、補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む。
【００１４】
このＰＨＡポリマーは、容易に回収され、そして物品（例えば、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および種々の医療用デバイス）用のポリマーとして産業的に有用である。この医療用デバイスは、例えば、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、組織操作骨格、細胞カプセル化、標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼ、骨セメントまたは診断剤のために用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、プロピレングリコールおよび１−プロパノールからプロピオニル−ＣｏＡの形成、ならびにブタノールからブチリル−ＣｏＡへの形成に至る経路を示す。
【図２】図２は、インヒビターの不存在下、インヒビターであるプロピオネートの存在下またはインヒビターである１−プロパノールの存在下でのＥ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３３５の増殖速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）組成物）
本明細書中で用いられる場合、「ＰＨＡ材料」は、以下の式Ｉ：
−ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ−；
の１以上の単位（例えば、１０と１００，０００との間、好ましくは１００と３０，０００との間の単位）および以下の式ＩＩ：
−ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｍＣＯ−
の１以上の単位（例えば、１と１００，０００との間、好ましくは１０と３０，０００との間の単位）を含む；
ｎは整数（例えば、１と１５との間、好ましい実施形態では１と４との間）であり；
ｍは、整数（例えば、０と１５との間、好ましい実施形態では０と４との間）であり；
そして
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は独立して、水素または炭化水素ラジカル（長鎖炭化水素ラジカルが挙げられる）；ハロ−およびヒドロキシ−置換ラジカル；ヒドロキシラジカル；ハロゲンラジカル；窒素置換ラジカル；ならびに／または酸素置換ラジカルであり得る。
【００１７】
本明細書中で用いられる場合、式−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−または−（ＣＲ３Ｒ４）ｍ−は、以下の式を含むと定義される：
−ＣＲ３Ｒ４−（ここでｎまたはｍ＝１）；
−ＣＲ３Ｒ４ＣＲ３’Ｒ４’−（ここでｎまたはｍ＝２）；および
−ＣＲ３Ｒ４ＣＲ３’Ｒ４’ＣＲ３”Ｒ４”−（ここでｎまたはｍ＝３）；
ここでＲ３、Ｒ４、Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ３”およびＲ４”は、独立して、炭化水素ラジカル（長鎖炭化水素ラジカルが挙げられる）；ハロ−およびヒドロキシ−置換ラジカル；ヒドロキシラジカル；ハロゲンラジカル；窒素置換ラジカル；酸素置換ラジカル；ならびに／または水素原子であり得る。従って、式Ｉまたは式ＩＩは、３−ヒドロキシ酸（ｎまたはｍ＝１）、４−ヒドロキシ酸（ｎまたはｍ＝２）、および５−ヒドロキシ酸（ｎまたはｍ＝３）由来の単位を含む。式ＩＩは、２−ヒドロキシ酸（ｍ＝０）（例えば、乳酸またはグリコール酸）由来の単位を含む。
【００１８】
このポリマーは代表的に、３００を超える分子量（例えば、３００と１０８との間、好ましい実施形態では１０，０００〜１０，０００，０００ダルトン）を有する。
【００１９】
代表的な実施形態では、このＰＨＡポリマーは、３ＨＶ単位を含むコポリマーである。別の実施形態では、このＰＨＡポリマーは、３ＨＨ単位を含むコポリマーである。
【００２０】
（ＩＩ．２−ヒドロキシ酸モノマーを含むＰＨＡの生合成のための方法）
（（１）ポリヒドロキシアルカノエートの合成）
１９８０年代半ばの間、いくつかの研究グループが、ＰＨＡ合成を担う遺伝子および遺伝子産物を活発に同定し単離した。これらの努力により、微生物および植物の両方におけるＰＨＡの産生のためのトランスジェニック系の開発、ならびにＰＨＡ合成のための酵素的方法がもたらされた。このような経路は、利用可能なＰＨＡ型をさらに増大させ得る。これらの進歩は、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，ＣＨＥＭＴＥＣＨ，２６：３８−４４（１９９６）ならびにＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒ．３３：２９−３２（１９９７）において概説されている。
【００２１】
分解速度を改変するためのその後の改変に適切なＰＨＡポリマーを産生するために用いられ得る方法は、例えば、以下に記載されている：Ｈｏｌｍｅｓらに対する米国特許第４，９１０，１４５号；Ｂｙｒｏｍ，「Ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｙｒｏｍ編），３３３−５９頁（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９９１）；ＨｏｃｋｉｎｇおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，「Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ」，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｇｒｉｆｆｉｎ編），４８−９６頁（ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９９４）；Ｈｏｌｍｅｓ，「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  （Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂａｓｓｅｔｔ編），第２巻，１−６５頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９８８）；Ｌａｆｆｅｒｔｙら，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ−ｂ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＲｅｈｍおよびＲｅｅｄ編）第６６巻，１３５−７６頁（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  １９８８）；ＭｕｌｌｅｒおよびＳｅｅｂａｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：４７７−５０２（１９９３）；Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ，「Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｉｃ  Ａｃｉｄｓ」，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｙｒｏｍ編），１２３−２１３頁（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９９１）；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，ＣＨＥＭＴＥＣＨ，２６：３８−４４，（１９９６）；ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７：６９１−６９７（１９９２）；米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，４８０，７９４号；同第５，５１２，６６９号；および同第５，５３４，４３２号；Ａｇｏｓｔｉｎｉら，Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，第Ａ−１部，９：２７７５−８７（１９７１）；Ｇｒｏｓｓら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２１：２６５７−６８（１９８８）；Ｄｕｂｏｉｓら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：４４０７−１２（１９９３）；ＬｅＢｏｒｇｎｅおよびＳｐａｓｓｋｙ，Ｐｏｌｙｍｅｒ，３０：２３１２−１９（１９８９）；ＴａｎａｈａｓｈｉおよびＤｏｉ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４：５７３２−３３（１９９１）；Ｈｏｒｉら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：４３８８−９０（１９９３）；Ｋｅｍｎｉｔｚｅｒら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：１２２１−２９（１９９３）；Ｈｏｒｉら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５５３３−３４（１９９３）；Ｈｏｃｋｉｎｇら，Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．，３０：１６３−７０（１９９３）；Ｘｉｅら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３０：６９９７−９８（１９９７）；Ｈｕｂｂｓに対す��米国特許第５，５６３，２３９号；Ｎｏｄａらに対する米国特許第５，４８９，４７０号および同第５，５２０，１１６号。これらの方法に由来するＰＨＡは、任意の形態（ラテックスまたは固体形態が挙げられる）であり得る。
【００２２】
いくつかの微生物由来のＰＨＡの生合成に関与する遺伝子の同定、クローニングおよび組換え生物体内でのこの遺伝子の発現は、ネイティブなＰＨＡ産生株ではない生物体内でのＰＨＡの産生を可能にする。好ましい例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび医療用途のＰＨＡである。Ｅ．ｃｏｌｉは、生物薬剤の産生についてよく認識されている宿主である。このような組換え生物体は、より大きな程度のＰＨＡ産生プロセス制御を提供する。なぜなら、これらは、望ましくないＰＨＡ前駆体の生合成またはＰＨＡ分解についてのバックグラウンドの酵素活性を有さないからである。さらに、組換え生物体の適切な選択は、産生されたＰＨＡの精製を促進するかまたは産生されたＰＨＡの生体適合性の増大を可能にする。
【００２３】
組換え生物体中でのＰＨＡ合成についての最少の必要要件は、ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび適切なＰＨＡシンターゼの供給源である（ＧｅｒｎｇｒｏｓｓおよびＭａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６２７９−８３（１９９５））。組換えＰＨＡ産生株は従って、ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡモノマーについての生合成経路および適切なＰＨＡシンターゼを必要とする。ホモポリマーの産生は、この生物体がＰＨＡシンターゼについて１つのみの適切な基質を産生することを必要とする。なぜなら、複数の基質の産生は、ＰＨＡコポリマーの形成をもたらすからである。
【００２４】
（（２）ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼを介した３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの形成）
プロピオン酸は、３ＨＶ含有ＰＨＡの産生のために用いられる標準的同時供給物であった（Ｌｕｚｉｅｒ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８３９−８４２）。この同時供給ストラテジーは、単一の発酵株を用いて１つのＰＨＡポリマー型（通常、ＰＨＢＶ）を産生し得るという利点を有し、ここで、このポリマー中での３ＨＶ濃度は、同時供給のレベルを改変することによって直接的に制御され得る。しかし、プロピオン酸は、抗微生物であり、それゆえ、プロピオン酸同時供給のレベルを上昇させることは、発酵時間の大きな増大をもたらす。３ＨＶ含有ＰＨＡを産生するために用いられ得る代替的同時供給基質としては、トレオニン、奇数鎖脂肪酸（例えば、バレレート、ヘプタノエートなど）、および奇数鎖アルコールが挙げられる。
【００２５】
ＰＨＡ代謝の一部となるためには、プロピオン酸は、補酵素Ａによって活性化されなければならない。それゆえ、活性なＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣｏＡシンテターゼが細胞中に存在すべきである。Ｅ．ｃｏｌｉでは、この機能は、ａｔｏ系によって実施される。ＡｔｏＤＡ複合体は、プロピオネートの取り込みおよびプロピオネートへのＣｏＡ輸送の両方を担うようである（ＪｅｎｋｉｎｓおよびＮｕｎｎ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４２−５２）。従って、プロピオネートをＰＨＢＶ産生Ｅ．ｃｏｌｉに供給する場合、ａｔｏ系のポジティブレギュレーターであるａｔｏＣ（ＪｅｎｋｉｎｓおよびＮｕｎｎ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０９６−２１０２）を構成的に発現する株を用いることは有用である。プロピオニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡと縮合して、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡを生じる。３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡは、ＰＨＡシンターゼによって取り込まれるべき活性化モノマーである。
【００２６】
他の同時供給物（例えば、１−プロパノールまたはプロピレングリコール）のプロピオン酸への変換もまた、ＣｏＡシンテターゼまたはＣｏＡトランスフェラーゼを必要とする。これらの同時供給物は両方とも、プロピオンアルデヒドを介して代謝され、次いでこれは、遊離プロピオン酸へと変換され得る。
【００２７】
ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、プロピオンアルデヒドをプロピオニル−ＣｏＡへと直接的に変換することに作用し得、従って別のＣｏＡシンテターゼまたはＣｏＡトランスフェラーゼについての必要性を軽減し得、細胞質における遊離プロピオン酸の存在を回避し得る。次いで、プロピオニル−ＣｏＡは、β−ケトチオラーゼによってアセチル−ＣｏＡと縮合してβ−ケトアシル−ＣｏＡを形成し、これは次いでレダクターゼ酵素によって還元されてＤ−β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡとなり、３ＨＶを含むコポリマーの産生に必要な３ＨＶモノマー単位を提供する。
【００２８】
このストラテジーはまた、他のＰＨＡコポリマーの産生に有用である。例えば、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、他のアルデヒドをそれらの対応するアシル−ＣｏＡへと（例えば、ブチルアルデヒドをブチリル−ＣｏＡへと）変換し得る。細胞への取り込みに続いて、このブタノールは、ブチレートへと変換され、ブチリル−ＣｏＡへと活性化され、そしてβ−ケトチオラーゼによってアセチル−ＣｏＡと縮合して、β−ケトヘキサノイルＣｏＡを形成し、次いでこれは、レダクターゼ酵素によってＤ−β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへと還元され、そして最終的に重合される。図１は、プロピレングリコールおよび１−プロパノールからプロピオニル−ＣｏＡを、そしてブタノールからブチリル−ＣｏＡを作製するために用いられる経路をまとめる。
【００２９】
補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは周知である。例えば、ＪｏｎｅｓおよびＴｕｒｎｅｒ  は、１９８４年に、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの検出および活性についての２つの研究を報告した（ＪｏｎｅｓおよびＴｕｒｎｅｒ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  １３０（第２部）：２９９−３０８（１９８４）；ＪｏｎｅｓおよびＴｕｒｎｅｒ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３０（第４部）：８４９−６０（１９８４））。１つの実施形態では、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉのｅｕｔＥ遺伝子によってコードされる。多くの他の有用なＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｔｏｔｈら，「Ｔｈｅ  ａｌｄ  Ｇｅｎｅ，Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ−Ａｃｙｌａｔｉｎｇ  Ａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ａｎｄ  Ｔｗｏ  ｏｔｈｅｒ  Ｓｏｌｖｅｎｔ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ」，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６５（１１）：４９７３−８０（１９９９）に記載される他の種の遺伝子によってコードされる。
【００３０】
Ｅ．ｃｏｌｉによってコードされるこのＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼのホモログは、他の生物体中に存在する。酵素アッセイによって決定され得る、配列相同性によって、同じ型の活性を有し得る候補酵素を見出し得る。このような遺伝子の例は、以下である：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｅｕｔＥ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１８５６０）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ  ｅｕｔＥ（ＡＬ５９６１６７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＦ１５７３０６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｐｄｕＰ（ＡＦ０２６２７０）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＥ００４２７７）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｄｈＥのアルデヒドデヒドロゲナーゼセグメント（Ｍ３３５０４）、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＪ４１４１５１）、鉄を含有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＴＩＧＲ４アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＥ００７４９１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＣｏＡ依存性コハク酸半アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｌ２１９０２）およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓアルコール−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＪ００１００８）。多くの他の候補物は、アライメント技術およびデータベース（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／におけるＧｅｎＢａｎｋ）を用いることによって見出され得る。
【００３１】
プロピオンアルデヒドは、前駆体基質（例えば、１−プロパノールまたはプロピレングリコール）から作製され得、そしてブチルアルデヒドは、ブタノールから産生され得る。これらの変換を触媒し得る酵素の例は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、またはいくつかの他の生物体のうちの１つ由来の、ジオールオキシドレダクターゼ（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＬｉｎ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０５０−２０５４；Ｄａｎｉｅｌら，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２１５１−２１５６）およびグリセロールデヒドラターゼまたはジオールデヒドラターゼ（ＰｏｚｎａｎｓｋａｙａおよびＫｏｒｓｏｖａ，１９８３，Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ  ４８：５３９−５４３；Ｔｏｂｉｍａｔｓｕら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２３５２−２２３５７）である。これらの酵素は、グリセロールを１，３−プロパンジオールへと変換し得る生物体中に見出されるが、ホモログは、配列決定された遺伝子およびゲノムのデータベースを検索することにより、他の生物体中に見出され得る。グリセロールまたはジオールデヒドラターゼは、補酵素Ｂ１２依存性反応においてプロピレングリコールをプロピオンアルデヒドへと変換し得る；ジオールオキシドレダクターゼは、ＮＡＤ＋依存性反応において１−プロパノールをプロピオンアルデヒドへと変換し得る。
【００３２】
本明細書中に記載される方法において有用なＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼのアナログは、アライメント技術およびデータベース（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／におけるＧｅｎＢａｎｋ）を用いることによって同定され得る。一般に、有用なアナログは、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼに対して特定の程度の配列相同性（例えば、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％またはそれより高い相同性）を有する。種々の異なる種における既知のＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの配列は、例えば、データベース（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／におけるＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能である。
【００３３】
本明細書中に提供される生物体は、以下のうちの１以上の酵素をコードする遺伝子を含む：補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＡシンターゼ。これらの生物体は、３−ヒドロキシブチレート以外の３−ヒドロキシアルカノエートモノマーを有する、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）のホモポリマーまたはコポリマーを産生し、この３−ヒドロキシアルカノエート単位は、化学の酵素によって触媒された変換（例えば、アルコールの３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡモノマーへの変換）由来であり、この変換工程における少なくとも１つの工程は、補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む。
【００３４】
この生物体は、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する野生型生物体であってもよく、またはＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するための遺伝子変異によって改変されてもよく、またはＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が発現される組換え生物体であってもよい。この生物体は、細菌、植物、酵母、および真菌のうちの１つであり得る。１つの実施形態では、この生物体は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。他の実施形態では、この生物体は植物である。
【００３５】
１つの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、種々のレベルの３ＨＶ単位を取り込んだＰＨＢＶコポリマーを産生するために用いられ得る。例えば、本明細書中に提供される方法は、約３０ｍｏｌ％の３ＨＶ単位を有するＰＨＡコポリマーを産生するために用いられ得る。
【００３６】
（ＩＩＩ．ＰＨＡ組成物および医療用デバイスとしてのその使用）
本明細書中に記載されるポリマーは、種々のポリマー組成物を形成し得る。このポリマー組成物は、例えば、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および生分解性医療用デバイスのために有用である。
【００３７】
本明細書中に記載されるＰＨＡコポリマーから調製されるデバイスは、広範囲の異なる医療用適用に用いられ得る。このような適用の例としては、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、薬物送達、組織操作骨格、細胞カプセル化；標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼおよび骨セメント（接着剤および／または構造的フィラーが挙げられる）、ならびに診断剤が挙げられる。
【００３８】
本明細書中に記載されるＰＨＡコポリマーは、種々の治療剤、予防剤または診断剤のいずれかをカプセル化するため、これらのいずれかと混合するため、またはこれらのいずれかに対してイオン結合もしくは共有結合するために用いられ得る。広範囲の種々の生物学的に活性な材料は、ポリヒドロキシアルカノエートによってある部位への送達のため、またはこのポリマーに対して特性（例えば、生体接着、細胞付着、細胞増殖の増強、細菌増殖の阻害、および凝固痙性の予防）を付与するためのいずれかで、カプセル化され得るかまたは取り込まれ得る。
【００３９】
適切な治療剤および予防剤の例としては、治療活性、予防活性または診断活性を有する、合成無機化合物および合成有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖および他の糖、脂質、ならびにＤＮＡ核酸配列およびＲＮＡ核酸配列が挙げられる。核酸配列としては、遺伝子、相補性ＤＮＡに結合して転写を阻害するアンチセンス分子、およびリボザイムが挙げられる。広範囲の分子量（例えば、１モルあたり１００グラムと５００，０００グラムとの間またはより大きい）を有する化合物が、カプセル化され得る。特定の例としては、以下が挙げられる：タンパク質（例えば、レセプターリガンド、抗体、酵素、血液凝固因子、インヒビターまたは凝血溶解剤（例えば、ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーター）；免疫のための抗原；ホルモンおよび増殖因子；ペプチド（えば、接着ペプチド））、多糖（例えば、ヘパリン）；オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムならびに遺伝子治療において使用するためのレトロウイルスベクター）。このポリマーもまた、細胞および組織をカプセル化するために用いられ得る。代表的診断剤は、Ｘ線、蛍光、磁気共鳴画像化、放射能、超音波、断層撮影（ＣＴ）および陽電子断層撮影（ＰＥＴ）によって検出可能な薬剤である。超音波診断剤は、代表的には、気体（例えば、空気またはペルフルオロカーボン）である。
【００４０】
この化合物は、代表的には、０．１重量％と７０重量％との間、より好ましくは５重量％と５０重量％との間の充填率でＰＨＡ中に組み込まれる。これらのＰＨＡは、ほぼ任意の物理的形態（例えば、粉末、フィルム、成型品、粒子、球、ラテックス、および結晶材料または非晶質材料）であり得る。これらは、さらなる非ＰＨＡ材料（例えば、他のポリマー）と合わされ得る。これらは、ゆっくり分解する生体適合性の成型可能材料（例えば、医療用デバイス）を必要とする適用における使用に適切である。このポリマーから調製され得る医療用デバイスの例としては、ロッド、骨螺子、ピン、外科用縫合糸、ステント、組織操作デバイス、薬物送達デバイス、創傷包帯、およびパッチ（例えば、ヘルニアパッチおよび心膜パッチ）が挙げられる。
【００４１】
本明細書中に記載されるＰＨＡコポリマーを用いて製造され得る分解性インプラントは、広範囲の整形外科適用および血管適用、組織操作、組織再生誘導、ならびに他の熱可塑性エラストマーが現在用いられている適用において用いられ得る（ＭｃＭｉｌｌｉｎ，Ｒｕｂｂｅｒ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６７：４１７−４６（１９９４））。このインプラントは、修復および治癒を刺激する他の因子を含み得る。好ましいデバイスは、体液の通過に適切なチューブである。これらのデバイスは、細胞付着因子、増殖因子、ペプチド、ならびに抗体およびそれらのフラグメントを用いて改変され得る。
【００４２】
医療用デバイスを製造する好ましい方法としては、溶媒成型（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃａｓｔｉｎｇ）、溶融加工（ｍｅｌｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、押出し成型、射出成型および圧縮成型、ならびに噴霧乾燥が挙げられる。粒子は好ましくは、当該分野で利用可能な方法を用いて、発酵ベースのプロセスから、または溶媒エバポレーション技術、二重エマルジョン技術もしくはマイクロフルイダイゼーションによって、直接的に調製され得る（Ｋｏｏｓｈａ，Ｆ．Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，１９８９，Ｕｎｉｖ．Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ．，Ｄｉｓｓ．Ａｂｓｔｒ．Ｉｎｔ．Ｂ  ５１：１２０６（１９９０）；Ｂｒｕｈｎ，Ｂ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍｕｅｅｌｌｅｒ，Ｂ．Ｗ．Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．１８：６６８−６９（１９９１）；Ｃｏｎｔｉ，Ｂ．ら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，９：１５３−１６６（１９９２）；Ｏｇａｗａ，Ｙ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６：１０９５−１０３（１９８８）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，Ｅ．およびＬａｎｇｅｒ，Ｒ．「Ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｓ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｍ．Ｄｏｎｂｒｏｗ編，「ＭｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓＮａｎｏｐａｒｔ．Ｍｅｄ  Ｐｈａｒｍ．」，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９２，Ｃｈ．５，９９−１２３頁）。
【００４３】
本明細書中に記載されるＰＨＡコポリマーは、創傷治癒において使用するためにデバイスに製造され得る。例えば、不織繊維材料は、当業者に公知の手順を用いて、最初にポリマー繊維を産生することによって、穿孔出口を通してポリマーを加圧することによって、このポリマーから調製され得る。次いで、この繊維を固体支持体上で広げ、そしてこれらを圧縮成型に供することにより、この繊維は、多孔質膜（布帛）に製造され得る。このデバイスの厚さは、好ましくは５００μｍ未満である。この創傷治癒デバイスはまた、レーザーを用いてフィルムまたは膜に穿孔を空けて多孔性を達成すること、または浸出技術を用いて多孔質材料を調製することによって調製され得る。穴のサイズは、理想的には、細胞および他の組織質を閉じ込めるに十分に小さいべきである。創傷治癒デバイスは、組織を分離して組織再生を刺激するために、インビボで配置され得る。
【００４４】
本明細書中に記載されるＰＨＡコポリマーは、細胞をカプセル化するために用いられ得る。当業者に公知の手順を用いて、細胞は、最初に予備コーティングされ得る（Ｍａｙｓｉｎｇｅｒ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６：１５−３３（１９９５））。粒子カプセル化手順（例えば、二重エマルジョン技術）を用いて、次いで、これらの細胞は、ＰＨＡによってカプセル化され得る（Ｏｇａｗａら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６：１０９５−１０３（１９８８））。次いで、カプセル化された細胞は、インビボで移植され得る。
【００４５】
本明細書中に記載されるＰＨＡポリマーは、広範囲のポリマー加工技術を用いて組織操作骨格に製造され得る。ＰＨＡ組織操作骨格を製造する好ましい方法としては、溶媒成型、溶融加工、繊維加工／紡績／織り成型、押出し成型、射出成型および圧縮成型、積層、ならびに溶媒浸出／溶媒成型が挙げられる。このような方法は、当業者に公知である。
【００４６】
本明細書中に記載されるＰＨＡコポリマーを組織操作骨格に製造する１つの好ましい方法は、エクストルーダー（例えば、Ｂｒａｂｅｎｄｅｒエクストルーダー）を用いることを包含する。例えば、この技術は、ある範囲の長さおよびサイズでの移植に適切な、押出しされたチューブを調製するために用いられ得る。
【００４７】
別の好ましい方法は、繊維から不織ＰＨＡ骨格を調製することを包含する。繊維は、当業者に公知の方法を用いて、溶融物または溶液から製造され得、そして不織物へと加工され得る。不織物の特性は、例えば、ＰＨＡ材料、繊維の直径、繊維の密度、材料の厚さ、繊維の配向、および繊維の加工法を変化させることによって調整され得る。多孔質膜は、所望の場合、さらに加工され得る。例えば、これらの膜は、中空のチューブに成形され得る。
【００４８】
別の好ましい方法は、適切なＰＨＡを適切な鋳型中に溶融加工または溶媒加工し、そしてレーザーまたは他の手段を用いてこの材料を穿孔して所望の多孔度を達成することを含む。また好ましいのは、圧縮成型ＰＨＡシートをループになるように巻き、そしてヒートシールすることを含む方法である。このＰＨＡシートは、必要に応じて、別の材料（例えば、第２の生分解性ポリマー）とともに巻かれ得る。例えば、この後者の材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、またはグリコール酸と乳酸とのコポリマーの不織物であり得る。このような手順は、新たな血管、管およびチューブの操作において使用するために適切な積層チューブを提供すべきである。このＰＨＡはまた、他の組織操作骨格をコーティングするために用いられ得る。このような材料は、他の分解性ポリマー由来であり得る。コーティングは、例えば、溶媒ベースの溶液を用いて、または溶融技術によって、またはＰＨＡラテックスを用いて、実施され得る。
【００４９】
本明細書中で記載される組織操作デバイスには、移植前または移植後に細胞が播種され得る。これらの細胞は、ドナー組織の健常セクションから収集され得、細胞培養技術を用いてインビトロで増大され得、次いで移植前または移植後のいずれかで骨格（またはマトリックス）に播種され得る。あるいは、これらの細胞は、他のドナー組織から、または既存の細胞株から、入手され得る。
【００５０】
本明細書中に記載されるＰＨＡコポリマーは、他のデバイスおよび材料をコーティングするために用いられ得る。このようなコーティングは、医療用適用のためのそれらの特性を改善し得る（例えば、生体適合性、機械的特性を改善し得、そしてそれらの分解および制御放出プロフィールを調整し得る）。本明細書中で記載されるＰＨＡコポリマーは、上記の製造手順を用いて他のデバイス上にコーティングされ得る。コーティングの厚さは、コーティングの重量または濃度を変化させることによって、ならびに／またはオーバーコーティングすることによって、特定の適用の必要に応じて調節され得る。
【００５１】
本明細書中に記載されるＰＨＡコポリマーは、広範囲のポリマー加工技術を用いてステントに製造され得る。ＰＨＡステントを製造する好ましい方法としては、溶媒成型、溶融成型、繊維加工／紡績、押出し、射出成型、および圧縮成型が挙げられる。このような方法は、当業者に公知である。
【００５２】
移植前に、生体吸収可能なポリマー物品は、レシピエントの疾患および感染を予防するために滅菌されなければならない。滅菌は、ポリマーデバイスに細胞を播種する前に実施される。ＰＨＡ含有物品の加熱滅菌はしばしば非実用的である。なぜなら、熱処理は、（特に、ＰＨＡが、加熱滅菌処理に必要とされる温度よりも低い溶融温度を有する場合）物品を変形させ得るからである。この問題は、冷エチレンオキシドガスを滅菌剤として用いて克服され得る。移植前のＰＨＡ含有物品のエチレンオキシド蒸気への曝露は、物品を滅菌して、これを移植に適切にする。冷エチレンオキシドガスを用いた滅菌の間に、このＰＨＡ含有物品は、その形状を保持する。この型の処理は理想的に、成型物品または形成前の物品の滅菌に適切であり、この物品の形状は、その適切な機能において重要な役割を果たす。
【００５３】
本明細書中に記載されるデバイスは、全身的または局所的に、または特に細胞培養には、インビトロでさえも、投与され得る。デバイス（例えば、微粒子）を全身投与する好ましい方法は、注射、吸入、経口投与および移植によってである。デバイスを投与する他の適切な方法は、デバイスをローション、軟膏、パッチまたは包帯中に局所的に投与することを包含する。
【００５４】
以下の実施例は、本明細書中に開示される方法およびコポリマーをさらに例示する。
【実施例】
【００５５】
（実施例１．ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの単離および同定）
Ｅ．ｃｏｌｉの多機能性アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質（ＡｄｈＥ）のＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ成分をコードする遺伝子へのその相同性に起因して、ｅｕｔＥ遺伝子を、  以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＥ．ｃｏｌｉゲノムから増幅した：
５’−ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＴＡＴ  ＴＧＡ  ＡＣＡ−３’（ｅｕｔＥ５’Ａｃｃ６５Ｉ）
５’−ＧＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＡＣＡ  ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＴＣＧ−３’（ｅｕｔＥ  ３’ＮｏｔＩ）。
このＰＣＲ産物をＡｃｃ６５ＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして同じ酵素で切断したｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に連結した。ｅｕｔＥ遺伝子をＩＰＴＧ誘導性ｔｒｃプロモーターの制御下に含む、得られたプラスミドを、ｐＭＳ３５と命名した。
【００５６】
ｐＭＳ３５またはｐＴｒｃＮ（ＮｏｔＩ制限部位が除去されていること以外はｐＴｒｃ９９ａ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎと同じ）のいずれかを増殖するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａを、２ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン中で３７℃にて一晩、２５０ｒｐｍにて振盪しながら増殖させた。これらを、同じ培地の１００ｍＬ培養物についての接種物として用い、これを、６００ｎｍでの光学密度がｐＴｒｃＮ含有細胞については０．５５に到達するまで、そしてｐＭＳ３５含有細胞については０．５７に到達するまで、２５０ｍＬ三角フラスコ中で振盪しながら３７℃にて増殖させた。次いで、１．３ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、そしてインキュベーションを２時間続けた。２０００×ｇにて１０分間の遠心分離によって細胞を培地から取り出し、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）中で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして−２０℃にて凍結した。細胞を、小さな体積の氷冷５０ｍＭ  ＡＭＰＤ（ｐＨ８．５）中での再懸濁によって、超音波処理のために調製した。超音波処理を、マイクロチップを用いて２分間実施した（０．７秒間オン、０．３秒間オフ）。粗製細胞抽出物を、この超音波処理した細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｃ微量遠心機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎ．Ｙ．）において最大速度で４℃にて１０分間スピンし、そして上清を収集することによって得た。最終的なアッセイ混合物は、ＡＭＰＤ（ｐＨ８．５、５０ｍＭ）、ジチオトレイトール（５ｍＭ）、ＮＡＤ＋（２ｍＭ）、補酵素Ａ（０．５ｍＭ）、１〜５μＬ／ｍＬ粗製細胞抽出物、および１５ｍＭプロピオンアルデヒドを含んでいた。石英キュベット中で、このアルデヒド以外の全ての成分を合わせ、そして充分に混合した。３４０ｎｍでの定常吸光度読取りを確立した後、プロピオンアルデヒドを添加し、そしてピペッティングによって混合した。吸光度の変化の初速度を用い、ＮＡＤＨについて６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１の吸光率と仮定して、酵素活性を計算した。あるいは、このアッセイを、補酵素Ａなしで行った。１単位の酵素活性を、１分間当り１μｍｏｌのプロピオンアルデヒドを減少させるために必要な酵素の量として定義した。ＣｏＡを含めた場合、ｐＴｒｃＮ抽出物は、活性を示さなかったが、ｐＭＳ３５抽出物は、１０．５μｇタンパク質／ｍＬおよび５２．５μｇタンパク質／ｍＬの両方を用いた場合、約１３Ｕ／ｍｇ総タンパク質の活性を与えた。ＣｏＡなしでは、いずれも抽出物も活性ではなかった。従って、これは、ｅｕｔＥがＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードすると結論付けられた。
【００５７】
同じアッセイを、ブチルアルデヒドを基質として用いたこと以外は上記と同様にして作製した別々の抽出物対について行った。この抽出物は、再度Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ由来であり、そして今回は、ｐＭＳ３５を、ｐＭＳ３１（これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｌｄＡ遺伝子を含むこと以外はｐＭＳ３５と類似である）に対して比較した。ｐＭＳ３１抽出物（１７０μｇタンパク質／ｍＬまで）は、補酵素Ａをこのアッセイ混合物に添加しようと添加しまいと、活性を示さなかった。このｐＭＳ３５抽出物は、７．５〜１５．０μｇタンパク質／ｍＬを用いた場合、５．９Ｕ／ｍｇ総タンパク質の平均活性を与えた。しかし、ＣｏＡなしでは、同じ濃度のｐＭＳ３５抽出物は、ほんの約０．１Ｕ／ｍｇ総タンパク質の平均を与えた。従って、ＥｕｔＥタンパク質はまた、ＣｏＡ依存性様式でブチルアルデヒドに対して作用する。
【００５８】
（実施例２．プロピオネートと１−プロパノールとの間での毒性の相違）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３３５を、プロピオネートまたは１−プロパノールの存在下で増殖させて、これらの化合物による増殖速度の阻害を比較した。プロピオネート供給に対する代替物を見出すことに関する１つの重要な理由は、プロピオネートが増殖速度および発酵における代謝を遅延させることである。
【００５９】
ＭＢＸ１３３５を、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地中で一晩増殖させた。この培養物を用いて、種々の濃度のプロピオネートまたは１−プロパノールを補充した最少培地の３ｍＬ培養物のいくつかを接種した。これらの３ｍＬ培養物中の基本培地は、１リットルあたり、以下を含んでいた：５ｇグルコース；１ｍｍｏｌ  ＭｇＳＯ４；１０ｍｇチアミン；２５．５ｍｍｏｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４；３３．３ｍｍｏｌ  Ｋ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌ  ＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇ  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１ｇカゼイン加水分解物；および２５μｇクロラムフェニコール。この培地はまた、プロピオン酸ナトリウム（ｐＨ７）もしくは１−プロパノールのいずれかを含んでいたか、または基質を何も添加しなかった。用いたプロピオネート濃度および１−プロパノール濃度は、２、５、および１０ｇ／Ｌであった。それぞれの場合の各々についての実験を、三連で行った。図２は、各々の場合について決定した増殖曲線を示す。明確には、プロピオネートは、増殖速度を１−プロパノールよりも実質的に大きく阻害する。
【００６０】
培養物を増殖させ続けた場合、細胞はプロピオネートの存在下でよりゆっくり増殖するとはいえ、最終的にはこれらは、１−プロパノールの存在下よりも高い光学密度に到達することが注目されるべきである。これはおそらく、これらが、プロピオネートを増殖のための炭素源として用い得るからである。１０ｇ／Ｌプロピオネートを用いた培養物は、例えば、５．０の平均ＯＤ６００に到達し、一方、１０ｇ／Ｌの１−プロパノールを用いた培養物は３．８に到達し、そしてインヒビターを含まない培養物は３．７に到達した。細胞が同時供給物について増殖することは望ましくない。なぜなら、これらは、より安価な一次供給物をこの目的で使用し得るからである。それゆえ、１−プロパノールは、ＰＨＢＶへとより完全に変換され、他の細胞代謝によって利用されないというさらなる利点を提供し得る。
【００６１】
（実施例３．野生型株およびアルコールデヒドロゲナーゼ調節解除株におけるグルコースおよび１−プロパノールからのＰＨＢＶ産生）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＤＣ６７５およびＤＣ６９８は、ＣｌａｒｋおよびＲｏｄ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．２５：１５１−１５８（１９８７）に記載されている。株ＤＣ６９８は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ遺伝子の産物）を構成的に産生する調節変異体である。株ＤＣ６７５（これからＤＣ６９８を誘導した）は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株についてとほぼ同様に、アルコールデヒドロゲナーゼを嫌気性条件下でのみ産生する。これらの株を、染色体からＰＨＢ合成遺伝子を安定に発現するＥ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３３５のバクテリオファージＰ１溶解産物で形質導入した。
【００６２】
ＭＢＸ１３３５のバクテリオファージＰ１溶解産物を以下の通りに作製した：ＭＢＸ１３３５を、３ｍＬ  Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）中で約０．２の光学密度（６００ｎｍ）まで増殖させた。塩化カルシウムを１０ｍＭまで添加し、そして予め作製した３０μＬのＰ１溶解産物を添加した。この混合物を３７℃にて４時間インキュベートした。インキュベーション後、５０μＬのクロロホルムを添加し、そして混合物を激しく攪拌した。最高速度にて微量遠心機中で３分間遠心分離し、そしてスクリューキャップガラスチューブ中にピペッティングすることにより、上清を収集した。３０μＬクロロホルムの添加を行い、そして得られた混合物を４℃で保存した。
【００６３】
形質導入を、株ＤＣ６７５およびＤＣ６９８について以下の通りに行った：各株を、２ｍＬのＬＢ培地中で定常期まで増殖させ、そして塩化カルシウムを１０ｍＭになるように添加した。微量遠心管中で、２００μＬの各培養物を、上記の１００μＬのＰ１溶解産物またはプレーンのＬＢ培地と合わせた。これらの４本のチューブを、３７℃にて１５分間インキュベートし、次いで１００μＬの１Ｍクエン酸ナトリウムおよび５００μＬ  ＬＢを各々に添加した。３７℃にて３０分間のさらなるインキュベーションの後、これらの細胞を、微量遠心機での最高速度での１０秒間の遠心分離によって液体から取り出した。各ペレットを１００μＬの１００ｍＭクエン酸ナトリウム中に再懸濁し、そして各チューブの内容物を選択的寒天培地（２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ）上にプレーティングした。これらのプレートを３７℃にて一晩インキュベートし、そして溶解産物で処理した培養物のみがコロニーを生じた。１つのコロニーを、これらの２つのプレートの各々から採取した。ＤＣ６７５形質導入体をＭＢＸ１５７９と示し、そしてＤＣ６９８形質導入体をＭＢＸ１５８０と示した。
【００６４】
株ＭＢＸ１５７９およびＭＢＸ１５８０を、１リットルあたり以下を含む２ｍＬの培地中で振盪しながら３７℃にて一晩増殖させた：５ｇグルコース；１ｍｍｏｌ  ＭｇＳＯ４；１０ｍｇチアミン；２５．５ｍｍｏｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４；３３．３ｍｍｏｌ  Ｋ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌ  ＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇ  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；および２５μｇクロラムフェニコール。次いで、これらの培養物を上記と同じ５０ｍＬの培地に添加し、そして１５ｍＬの２×ＹＴ培地（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）を各々に、合計体積が６５ｍＬになるように添加した。これらの培養物を、２５０ｍＬ三角フラスコ中で振盪しながら３７℃にて１６時間インキュベートした。この期間の最後に、細胞を、２０００×ｇにて１０分間の遠心分離によって培地から取り出した。次いで、これらを、１リットル当り以下を含む５０ｍＬの培地中に再懸濁した：５ｇグルコース；０または５ｇの１−プロパノール；７．７５ｇの２×ＹＴ粉末；１ｍｍｏｌ  ＭｇＳＯ４；１０ｍｇチアミン；２５．５ｍｍｏｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４；３３．３ｍｍｏｌ  Ｋ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌ  ＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇ  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；および２５μｇクロラムフェニコール。この期間の最後に、細胞を、上記の通りの遠心分離によって培地から取り出し、水で洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。各フラスコからの約１５ｍｇの凍結乾燥細胞塊を、（体積で）９０％  １−ブタノールおよび１０％濃塩酸を含む２ｍＬの混合物中での１１０℃にて３時間の同時抽出およびブタノール溶解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）に供した（２ｍｇ／ｍＬ安息香酸を内部標準として添加した）。得られた混合物の水溶性成分を、３ｍＬ水での抽出によって除去した。有機相（２ｍＬ／分の全体流量において１：５０の分割比で１μＬ）を、以下の温度プロフィールを用いて、ＳＰＢ−１縮合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍ  ＩＤ；０．２５μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ．）において分析した：８０℃、２分間；２５０℃まで１分間当り１０℃；２５０℃、２分間。用いた標準的は、ＰＨＢＶ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）であった。各培養物についてのポリマー含有量および組成を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2010268797.tif 000002
１−プロパノールを提供した場合、ＭＢＸ１５７９は、いくつかの３ＨＶ単位をポリマー中に取り込み得るが、ＭＢＸ１５８０は、構成的アルコールデヒドロゲナーゼを用いて、３ＨＶ組成物に関してポリマーの重量百分率に基づいて約６倍多くを取り込み得る。ＭＢＸ１５７９およびＭＢＸ１５８０は、大部分同じ遺伝子バックグラウンドを有し、従って、ａｄｈＥ遺伝子産物がこの増加を少なくとも部分的に担うようである。
【００６６】
（実施例４．プラスミドに基づく株を用いた、グルコースおよび１−プロパノールから
のＰＨＢＶ）  プラスミドｐＭＳ７２は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｄｈａＴ遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ  ｅｕｔＥ遺伝子の両方をＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下に含む。ｐＭＳ７２を、ｅｕｔＥ遺伝子をｐＴＣ４２（Ｓｋｒａｌｙら，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８−１０５）中に挿入することによって構築した。このｅｕｔＥ遺伝子を、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩでの消化によってｐＭＳ３５から取り出した。このフラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩ（これは、ＮｈｅＩと適合性の粘着末端を共有する）で消化したｐＴＣ４２中に連結した。
【００６７】
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３３５を、ｐＭＳ７２で形質転換して、この構築物がグルコースおよび１−プロパノールをＰＨＢＶへと変換し得るか否かを評価した。ｐＭＳ７２を誘導したベクターであるｐＴｒｃＮで形質転換したＭＢＸ１３３５をコントロールとして用いた。各株を、培養チューブ中で１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充した最少グルコース培地中で３ｍＬの体積で、２００ｒｐｍにて振盪しながら３７℃にて一晩増殖させた。最少培地は、１リットルあたり以下を含んでいた：２５．５ｍｍｏｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４；３３．１３ｍｍｏｌ  Ｋ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌ  ＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇ  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１ｍｍｏｌ  ＭｇＳＯ４；１０ｍｇチアミン；１００ｍｇアンピシリン；および５ｇグルコース。この培養物（０．１ｍＬ）を用いて、５０ｍＬの同じ培地を含む２００ｍＬの四角のガラス瓶を接種した。各培養物に添加したのは、１５ｍＬの２×ＹＴ培地（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）であった。これらの６５ｍＬ培養物を、３７℃にて２００ｒｐｍにて振盪しながら６時間インキュベートした。この期間の最後に、この細胞を、２０００×ｇにて１０分間の遠心分離によって培地から取り出した。次いで、これらを、５ｇ／Ｌ  １−プロパノール；０．５×ＹＴ；１００μｇ／ｍＬアンピシリン；および０、０．０１または０．０５ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した上記の５０ｍＬの最少グルコース培地中に再懸濁した。３０℃にて９０時間のインキュベーション後、これらの細胞を上記の通りに遠心分離し、水で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。乾燥した細胞塊を、上記の通りのブタノール溶解に供し、そしてＧＣの結果は表２に列挙した通りである。
【００６８】
【表２】
2010268797.tif 000003
従って、ｐＭＳ７２は、ＭＢＸ１３３５に、このプラスミドなしのものよりもずっと効率的にグルコースおよび１−プロパノールからＰＨＢＶを合成させ得る。
【００６９】
（実施例５．プラスミドに基づく株を用いた、グルコースおよび１，２−プロパンジオールからのＰＨＢＶ）
プラスミドｐＦＳ８３（これは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅグリセロールデヒドラターゼ、すなわち、ｄｈａＢ遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ  ｅｕｔＥアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む）を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３３５を、３ｍＬの体積で、２００ｒｐｍにて振盪しながら、培養チューブ中でＬＢ培地中で３７℃にて６時間増殖させた。この培養物（０．２５ｍＬ）を用いて、１リットル当り以下を含む５０ｍＬの培地を含む２５０ｍＬ三角フラスコを接種した：２５．５ｍｍｏｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４；３３．３ｍｍｏｌ  Ｋ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌ  ＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇ  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０ｇグルコース；１ｍｍｏｌ  ＭｇＳＯ４；１０ｍｇチアミン；０．１ｇカゼイン加水分解物；０．０１ｍｍｏｌ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）；１００ｍｇアンピシリン；０または２０ｎｍｏｌ補酵素Ｂ−１２；および０、５、または１０ｇの１，２−プロパンジオール。これらの５０ｍＬ培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて２４時間インキュベートした。この期間の最後に、細胞を、２０００×ｇにて１０分間の遠心分離によってこの培地から取り出した。これらを水で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。乾燥した細胞塊を上記の通りのブタノール溶解に供し、そしてＧＣの結果は、表３に列挙した通りである。
【００７０】
【表３】
2010268797.tif 000004
【００７１】
ＰＨＢＶは、補酵素Ｂ−１２および１，２−プロパンジオールの両方の存在下でのみ形成され、このことは、補酵素Ｂ−１２依存性グリセロールデヒドラターゼの作用が、プロピオンアルデヒドへの１，２−プロパンジオールの変換を担うことを強力に示唆する。プロピオンアルデヒドは、ポリマー中に３ＨＶとして最終的に取り込まれる。
【００７２】
このプラスミドｐＦＳ８３を、ｅｕｔＥ遺伝子をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｐＭＳ３５から得て、このフラグメントを、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＦＳ４４Ｂに連結することによって構築した。プラスミドｐＦＳ４４Ｂを、ｄｈａＢ遺伝子を含むｐＴＣ５３（Ｓｋｒａｌｙら，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８−１０５）のＳａｌＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、同じ制限酵素で消化したベクターｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結することによって構築した。
【００７３】
（実施例６．組み込まれた株を用いた、グルコースおよび１−プロパノールからのＰＨＢＶ）
いくつかのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を、Ｔｎ１０由来のｔｅｔＡ遺伝子とともにＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｄｈａＴおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｅｕｔＥ遺伝子の、ＭＢＸ１３３５の染色体への組み込みによって構築した。組み込みは、ｐＵＴＨｇ（Ｈｅｒｒｅｒｏら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６５６７）の誘導体であるプラスミドｐＵＴ−ｅｕｔＥ−ｄｈａＴ−ｔｅｔＡを用いて達成した。ｐＵＴ−ｅｕｔＥ−ｄｈａＴ−ｔｅｔＡを構築するために、最初のｔｅｔＡ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＴｎ１０からＰＣＲによって増幅した：
５’−ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＴＡＧ  ＴＴＣ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＣＧＣ−３’（ｔｅｔＡ  ５’ＡｖｒＩＩ）
５’−ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＴＡ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＴＧＴ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＡＣ−３’（ｔｅｔＡ  ３’ＳｐｅＩ）。
このｔｅｔＡ  ＰＣＲ産物を、ＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴＨｇに連結した（ＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩは、適合性の粘着性末端を生じる）。これにより、プラスミドｐＵＴ−ｔｅｔＡが得られた。ｅｕｔＥ遺伝子およびｄｈａＴ遺伝子を、ＳａｌＩおよびＳｐｅＩでの消化によってｐＭＳ７２から得て、そしてＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化したｐＵＣ１８Ｓｆｉ（Ｈｅｒｒｅｒｏら，同書）に連結した。これによって、プラスミドｐＭＳ７７が得られた。次いで、ｅｕｔＥ−ｄｈａＴフラグメントを、ＡｖｒＩＩでの消化によってｐＭＳ７７から得て、そしてこれをＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴ−ｔｅｔＡに連結して、ｐＵＴ−ｅｕｔＥ−ｄｈａＴ−ｔｅｔＡを形成した。結合体化後、ドナー−レシピエント混合物を、１５ｇ／ｍＬテトラサイクリンおよび２５ｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ中で、３７℃にて連続的に培養することにより、約４０世代にわたって直ちに増殖させた。この富化した集団を、同じ抗生物質を補充したＬＢ寒天上にプレーティングした。
【００７４】
いくつかのコロニーを、例えば、これをプレーティングすることから単離し、そしてそれらがグルコースおよび１−プロパノールからＰＨＢＶを合成する能力について試験した。ＭＢＸ１３３５（これから誘導した）をコントロールとして用いた。各株を、培養チューブ中で、３ｍＬの体積で、２００ｒｐｍにて振盪しながら、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および１０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを補充したＬＢ培地中で３７℃にて８時間増殖させた。この培養物（１ｍＬ）を用いて、１リットル当り以下を含む１００ｍＬの培地を含む５００ｍＬ三角フラスコを接種した：２５．５ｍｍｏｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４；３３．３ｍｍｏｌ  Ｋ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌ  ＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇ  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０ｇグルコース；５ｍｍｏｌ  ＭｇＳＯ４；１０ｍｇチアミン；０．１ｇカゼイン加水分解物；２５ｍｇクロラムフェニコール；５０ｍｇカナマイシン；１０ｍｇテトラサイクリン；および７ｇ／Ｌ  １−プロパノール。これらの１００ｍＬ培養物を、３０℃にて４６時間、２００ｒｐｍにて振盪しながらインキュベートした。この期間の最後に、細胞を、２０００×ｇにて１０分間の遠心分離によって培地から取り出した。これらを水で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。この乾燥した細胞塊を上記の通りのブタノール溶解に供した。そしてＧＣの結果は、表４に列挙する通りである。別の実験において、ｅｕｔＥ遺伝子産物およびｄｈａＴ遺伝子産物の活性を測定した。７ｇ／Ｌ  １−プロパノールの代わりに４ｇ／Ｌ  １−プロパノールを用い、そして４６時間の代わりに３０℃で２４時間インキュベートしたこと以外は、これらの細胞を上記の通りに増殖させた。株ＬＳ５２１８を培養して、３７℃にて８時間、１００ｍＬ  ＬＢにおいてバックグラウンドを確立した。インキュベーション後、５０ｍＬの各培養物を上記の通りに遠心分離し、次いで５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭジチオトレイトール、および０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含む２５ｍＬの緩衝液中で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして２ｍＬの同じ緩衝液中に再懸濁した。この懸濁物をマイクロチップを２分間（０．４秒間オン、０．４秒間オフ）用いて超音波処理し、そして酵素アッセイを、ＤｈａＴについてはＪｏｈｎｓｏｎおよびＬｉｎ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０５０−４においての通りに、そしてＥｕｔＥについてはＹａｎおよびＣｈｅｎ，１９９０，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：２５９１−９においての通りに実施した。結果を表４に示す。
【００７５】
【表４】
2010268797.tif 000005
異なる組み込み株は、１−プロパノールを供給した場合に３ＨＶをポリマー中に組み込む異なる能力を有しており、そしてこれらの能力は、プロピオニル−ＣｏＡへの１−プロパノールの変換を担う２つの酵素であるＥｕｔＥおよびＤｈａＴの活性とほぼ対応した。
【００７６】
（実施例７．組み込み株を用いた、グルコースおよび１，２−プロパンジオールからのＰＨＢＶ）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１６４８を、Ｔｎ１０由来のｔｅｔＡ遺伝子と一緒でのＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｄｈａＢ遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ  ｅｕｔＥ遺伝子の、ＭＢＸ１３３５染色体への組み込みによって構築した。組み込みを、ｐＵＴＨｇ（Ｈｅｒｒｅｒｏら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６５６７）の誘導体であるプラスミドｐＵＴ−ｄｈａＢ−ｅｕｔＥ−ｔｅｔＡを用いて達成した。ｐＵＴ−ｄｈａＢ−ｅｕｔＥ−ｔｅｔＡを構築するために、最初のｔｅｔＡ遺伝子を、上記の実施例の通りにＴｎ１０からＰＣＲによって増幅した。ｔｅｔＡ  ＰＣＲ産物を、ＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴＨｇに連結した（ＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩは、適合性の粘着性末端を生じる）。これにより、プラスミドｐＵＴ−ｔｅｔＡが得られた。ｄｈａＢ遺伝子およびｅｕｔＥ遺伝子を、ＳａｌＩおよびＳｐｅＩでの消化によってｐＭＳ８２（ＡｖｒＩＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによってフィルインし、そして自己連結させてＡｖｒＩＩ部位を除去したｐＦＳ８３）から得て、そしてＳａｌＩおよびＸｂａＩ（これは、ＳｐｅＩと適合性の粘着性末端を共有する）で消化したｐＵＣ１８Ｓｆｉ（Ｈｅｒｒｅｒｏら，同書）に連結した。これによって、プラスミドｐＭＳ８３が得られた。次いで、ｅｕｔＥ−ｄｈａＢフラグメントを、ＡｖｒＩＩでの消化によってｐＭＳ８３から得て、そしてこれをＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴ−ｔｅｔＡに連結して、ｐＵＴ−ｄｈａＢ−ｅｕｔＥ−ｔｅｔＡを形成した。結合体化後、ドナー−レシピエント混合物を、１５μｇ／ｍＬテトラサイクリンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ中で、３７℃にて連続的に培養することにより、約４０世代にわたって直ちに増殖させた。この富化した集団を、同じ抗生物質を補充したＬＢ寒天上にプレーティングした。ＭＢＸ１６４８は、このプレーティングから単離された１つのコロニーであった。
【００７７】
ＭＢＸ１６４８を、グルコースおよび１，２−プロパンジオールからＰＨＢＶを合成する能力について試験した。ＭＢＸ１３３５（これから誘導した）をコントロールとして用いた。各株を、培養チューブ中で、３ｍＬの体積で、２００ｒｐｍにて振盪しながら、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地中で３７℃にて８時間増殖させた。この培養物（０．１ｍＬ）を用いて、１リットル当り以下を含む５０ｍＬの培地を含む２５０ｍＬ三角フラスコを接種した：２５．５ｍｍｏｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４；３３．３ｍｍｏｌ  Ｋ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌ  ＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇ  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０ｇグルコース；１ｍｍｏｌ  ＭｇＳＯ４；１０ｍｇチアミン；０．１ｇカゼイン加水分解物；２５ｍｇクロラムフェニコール；ならびに以下の表５に示した通りの種々の量の補酵素Ｂ−１２および１，２−プロパンジオール。これらの５０ｍＬ培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて４６時間インキュベートした。この期間の最後に、これらの細胞を、２０００×ｇにて１０分間の遠心分離によって培地から取り出した。これらを水で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。乾燥した細胞塊を上記の通りのブタノール溶解に供した。そしてＧＣの結果は、表５において列挙した通りである。
【００７８】
【表５】
2010268797.tif 000006
【００７９】
従って、ＭＢＸ１６４８は、種々の条件下で全体的なポリマー含量を維持しながら、顕著な３ＨＶ含有量を有するコポリマーを合成し得る。
【図１】
2010268797.tif 000007
【図２】
2010268797.tif 000008
【配列表】
2010268797000001.app
【外国語明細書】
2010268797000001.pdf