(57)【要約】【課題】  本発明は、SmartAmp2による核酸増幅方法であって、核酸増幅速度を制御可能な核酸増幅方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明の核酸増幅方法は、下記第一のプライマーおよび下記第二のプライマーを用い、前記第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）の５’側の配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含み、前記第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端に含み、かつ同一鎖間でハイブリダイズする折返し配列を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含み、前記折り返し配列の融解温度および自由エネルギーの少なくとも一方を調整することを特徴とする。【選択図】  図６
2010279302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二種のプライマーを含むプライマーセットを用いて標的核酸配列を増幅する核酸の増幅方法であって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマーであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含み、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含むプライマーであり、
前記第二のプライマーの前記折り返し配列における融解温度および自由エネルギーの少なくとも一方を調整することにより、前記核酸の増幅速度を制御することを特徴とする核酸の増幅方法。
【請求項２】
前記融解温度を低下させ、かつ前記自由エネルギーを増加させることにより、前記核酸の増幅速度を加速する請求項１記載の核酸の増幅方法。
【請求項３】
前記融解温度を５０℃以下に設定し、かつ前記自由エネルギーを０kcal/mol以上に設定する請求項２記載の核酸の増幅方法。
【請求項４】
前記融解温度を上昇させ、かつ前記自由エネルギーを減少させることにより、前記核酸の増幅速度を減速する請求項１記載の核酸の増幅方法。
【請求項５】
前記融解温度を５０℃以上に設定し、かつ前記自由エネルギーを−１kcal/mol以下に設定する請求項４記載の核酸の増幅方法。
【請求項６】
前記核酸の増幅速度を減速することにより、バックグラウンドの上昇を防止する請求項４または５記載の核酸の増幅方法。
【請求項７】
さらに、前記プライマーセットにおける第二のプライマーの割合を調整することにより、前記核酸の増幅速度を制御する請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項８】
核酸の増幅方法により遺伝子の変異を検出する遺伝子変異の検出方法であって、前記核酸の増幅方法が、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であることを特徴とする遺伝子変異の検出方法。
【請求項９】
前記遺伝子の変異が、塩基の挿入、欠失、置換および付加の少なくとも一つである請求項８記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１０】
前記遺伝子の変異が、一塩基多型である請求項８記載の遺伝子変異の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法および遺伝子変異の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Smart  Amplification  Process2(SmartAmp2)は、ターンバックプライマー（TP）およびフォールディングプライマー（FP）を主要プライマーとした非対称のプライマーセットを用いた等温での核酸増幅法であり、例えば、医学および分子生物学等の広い分野で利用されている（非特許文献１−５）。TPは、標的核酸配列にアニ−リングする配列と、そこから伸長された先にある配列にアニーリングできる配列を５’側に有する、ステム−ループ構造を形成可能なプライマーである。FPは、標的核酸配列にアニーリングする配列と、５’側にプライマー内部で折り返し構造を形成可能な配列を有するプライマーである。これらの他、SmartAmp2のプライマーセットは、ブーストプライマー（BP）、２つのアウタープライマー（OP1およびOP2）を使用することも可能である。SmartAmp2は、解析結果が早く得られ（例えば、３０分以内）、検出感度が高く（例えば、従来のＰＣＲの１００倍）、数コピーからの増幅も可能である。したがって、SmartAmp2は、疾患の早期診断にも、好ましく適用可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４（２００７）２５７−２６２．
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３（２００７）４９７４−４９８３．
【非特許文献３】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３（２００７）４７９−４８４．
【非特許文献４】Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３６（２００８）２３４−２３８．
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．  １０（２００９）１３７３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
SmartAmp2において、核酸の増幅速度を制御することが求められている。すなわち、一般的な遺伝子検出であれば、検出時間の短縮化が求められるが、一塩基多型のような遺伝子変異の検出には、検出時間の短縮化よりも高い検出精度が求められる。
【０００５】
そこで、本発明は、SmartAmp2法による核酸の増幅方法であって、核酸の増幅速度を制御可能な核酸の増幅方法およびそれを用いた遺伝子変異の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の核酸の増幅方法は、少なくとも二種のプライマーを含むプライマーセットを用いて標的核酸配列を増幅する核酸の増幅方法であって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー（TP）であり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含み、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含むプライマー（FP）であり、
前記第二のプライマーの前記折り返し配列における融解温度および自由エネルギーの少なくとも一方を調整することにより、前記核酸の増幅速度を制御することを特徴とする。
【０００７】
本発明の遺伝子変異検出方法は、核酸の増幅方法により遺伝子の変異を検出する遺伝子変異の検出方法であって、前記核酸の増幅方法が、前記本発明の核酸増幅方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明者等は、種々の検討を行った結果、FPの折り返し配列の融解温度および自由エネルギーのいずれかまたは双方を調整することにより、核酸の増幅速度を制御可能であることを見出し、本発明に至った。LAMP法等の他の等温の核酸の増幅方法で使用するプライマー配列は、全て標的核酸配列に依存するため、プライマー設計の自由度が制限される。これに対し、本発明のFPの折り返し配列は、標的核酸配列に依存しないため、自由に設計することが可能であり、調整の幅は広い。これも本発明の大きな利点の一つである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の核酸の増幅方法における第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の核酸の増幅方法における第二のプライマーの一例を示す模式図である。
【図３Ａ】図３（Ａ）は、本発明の核酸の増幅方法の基本的なメカニズムの一例を示す模式図である。
【図３Ｂ】図３（Ｂ）は、本発明の核酸の増幅方法の基本的なメカニズムの一例を示す模式図である。
【図４】図４ａからｎは、本発明の核酸の増幅方法のメカニズムのその他の例を示す模式図である。
【図５】図５（Ａ）は、本発明の実施例におけるFPの折り返し配列の融解温度（Tm）を示すグラフであり、図５（Ｂ）は、前記FPの折り返し配列の自由エネルギー（△G）を示すグラフである。
【図６】図６（Ａ）から（Ｄ）は、前記実施例におけるFPの種類、比率および反応時間の関係を示すグラフである。
【図７】図７は、前記実施例における増幅産物の電気泳動を示す写真である。
【図８】図８は、前記実施例におけるRIでラベルしたプライマーを用いて増幅した増幅産物の電気泳動の写真である。
【図９】図９は、前記実施例におけるターゲット配列とプライマー配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の核酸の増幅方法において、前記制御が、前記融解温度を低下させ、かつ前記自由エネルギーを増加させることにより、前記核酸の増幅速度を加速することであってもよい。この場合、例えば、前記融解温度を５０℃以下に設定し、かつ前記自由エネルギーを０kcal/mol以上に設定してもよい。
【００１１】
本発明の核酸の増幅方法において、前記制御が、前記融解温度を上昇させ、かつ前記自由エネルギーを減少させることにより、前記核酸の増幅速度を減速することであってもよい。この場合、例えば、前記融解温度を５０℃以上に設定し、かつ前記自由エネルギーを、例えば０kcal/mol未満、好ましくは−１kcal/mol以下に設定してもよい。また、前記核酸の増幅速度を減速することにより、バックグラウンドの上昇を防止してもよい。バックグラウンドの上昇を防止すれば、例えば、一塩基多型（SNPs）等の遺伝子変異の検出において精度を高めることが可能となる。
【００１２】
本発明の核酸増幅方法において、さらに、前記プライマーセットにおける第二のプライマーの割合を調整することにより、前記核酸の増幅速度を制御してもよい。
【００１３】
本発明の遺伝子変異の検出方法において、前記遺伝子の変異は、例えば、塩基の挿入、欠失、置換および付加等があげられる。また、本発明の遺伝子変異の検出方法は、SNPsの検出に用いることが好ましい。
【００１４】
つぎに、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明におけるプライマーセットは、少なくとも二種のプライマーを含む。前記プライマーセットに含まれる第一のプライマー（TP）は、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac’）を３’末端部分に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B’）を前記配列（Ac’）の５’側に含むものである。また、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマー（FP）は、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc’）を３’末端部分に含み、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc’）を前記配列（Cc’）の５’側に含むものである。
【００１６】
本発明において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または前記配列を有する核酸をも意味する。
【００１７】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度等に依存して決定することができ、例えば、J.Sambrook,  E.F.Frisch,  T.Maniatis;  Molecular  Cloning  2nd  edition,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  (1989)等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行うと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead  Institute  for  Biomedical  Research製）等を用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含むものである。
【００１８】
第一のプライマーによる増幅反応のメカニズムを図１に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）、および配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）を決定する。第一のプライマーは、配列（Ac’）を含んでなり、さらにその５’側に配列（B’）を含む。配列（Ac’）は、配列（A）にハイブリダイズするものであり、配列（B’）は、配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズするものである。ここで、第一のプライマーは、前記配列（Ac’）と前記配列（B’）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ac’）が標的核酸配列の配列（A）にハイブリダイズした状態となる（図１(a)）。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（B’）が、同核酸中に存在する配列（Bc）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステム−ループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（A）が一本鎖となり、この部分に先の第一のプライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図１(b)）。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズした第一のプライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図１(c)）。
【００１９】
上記の増幅反応において、配列（B’）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、典型的には、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記第一のプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。このステム−ループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（A））に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。
【００２０】
本発明の好ましい態様における第一のプライマーの設計基準は次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の５’末端におけるステム−ループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ac’）の塩基数Ｘと標的核酸配列中における前記配列（A）と前記配列（B）に挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（A）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステム−ループ構造形成を効率よく行うことも必要となる。そして、効率の良いステム−ループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（B’）と配列（Bc）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（B’）と前記配列（Bc）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（B’）が配列（Bc）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（B’）が配列（Bc）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とするためには、配列（B’）と配列（Bc）との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
【００２１】
以上のような観点から、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、プライマーを構成する配列（Ac’）と配列（B’）の間に介在配列が存在しない場合において、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。
【００２２】
また、プライマーを構成する配列（Ac’）と配列（B’）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。
【００２３】
前記第一のプライマーは、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。このプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドとする。また、前記第一のプライマーを構成する配列（Ac’）と配列（B’）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ac’）と配列（B’）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００２４】
本発明によるプライマーセットに含まれる第二のプライマー（FP）は、上述のように、前記標的核酸配列の相補配列（第一のプライマーがハイブリダイズする鎖に対して反対側の鎖）の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc’）を３’末端部分に含み、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc’）を前記配列（Cc’）の５’側に含むものである。このような第二のプライマーの構造は、例えば、図２に示すようなものであるが、図２に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。第二のプライマーを構成する配列（Cc’）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（D-Dc’）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。折返し配列（D-Dc’）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Cc’）と折返し配列（D-Dc’）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００２５】
本発明では、第二のプライマーの折り返し配列の融解温度Tmおよび自由エネルギーの少なくとも一方を調整することで、核酸の増幅速度を制御する。前記融解温度が低く、かつ自由エネルギーが高い場合は、前記折り返し配列は、不安定な構造となる。これに対し、前記融解温度が高く、かつ自由エネルギーが低い場合、前記折り返し配列は、安定な構造となる。ここで、不安定な構造とは、折り返し構造が壊れやすいことを意味し、安定な構造とは、折り返し構造が壊れ難いことを意味する。なお、本発明において、前記融解温度および自由エネルギーは、実測値であってもよいし、予測値であってもよい。前記融解温度および自由エネルギーの実測値および予測値は、従来公知の方法により求めることができる。
【００２６】
前記融解温度および自由エネルギーは、例えば、折り返し配列において、水素結合で形成する塩基対の数およびGC含量等により調整可能である。不安定な折り返し配列の場合、塩基対数は、例えば、２〜１００個の範囲、好ましくは、４〜６０個の範囲、より好ましくは、６〜４０個の範囲である。不安定な折り返し配列の場合、GC含量は、例えば、０〜８０％の範囲、好ましくは、０〜５０％の範囲、より好ましくは、０〜３０％の範囲である。不安定な折り返し配列の場合、融解温度は、例えば、５０℃以下、好ましくは、４０℃以下、より好ましくは、３０℃以下である。なお、この場合、融解温度の下限は特に制限されないが、例えば、−２００℃以上、好ましくは、−１００℃以上である。不安定な折り返し配列の場合、自由エネルギーは、例えば、０kcal/mol以上、好ましくは、１kcal/mol以上、より好ましくは、２kcal/mol以上である。なお、この場合、自由エネルギーの上限は特に制限されないが、例えば１００kcal/mol以下である。安定な折り返し配列の場合、塩基対数は、例えば、１０〜５００個の範囲、好ましくは、１０〜１００個の範囲、より好ましくは、１０〜４０個の範囲である。安定な折り返し配列の場合、GC含量は、例えば、２０〜１００％の範囲、好ましくは、３０〜９０％の範囲、より好ましくは、４０〜８０％の範囲である。安定な折り返し配列の場合、融解温度は、例えば、５０℃以上、好ましくは、６０℃以上、より好ましくは、７０℃以上である。なお、この場合、融解温度の上限は特に制限されないが、例えば１００℃以下である。安定な折り返し配列の場合、自由エネルギーは、例えば、０kcal/mol未満、好ましくは、−１kcal/mol以下、より好ましくは、−２kcal/mol以下、特に好ましくは、−３kcal/mol以下である。なお、この場合、自由エネルギーの下限は特に制限されないが、例えば、−２００kcal/mol以上である。
【００２７】
これら第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図３（図３（Ａ）および図３（Ｂ））を用いて説明する。なお、図３では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、第一のプライマーが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、前記プライマーの伸長反応が起きる（図３(a)）。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（A）に新たな第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(b)）、前記プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（C）に第二のプライマーがハイブリダイズし（図３(c)）、前記プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図３(d)）。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステム−ループ構造が形成され（図３(e)）、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（図３(f)）。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（A）および配列（Bc）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（A）および配列（Bc）に第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(g)）、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（図３(h)および(i)）。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図３(h)）、そこからの伸長反応により（図３(i)）、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(j)）。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(k)）、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図３(l)および(m)）。また、図３(i)において脱離した第一のプライマーからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(n)）、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(o)）。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
【００２８】
本発明によるプライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマー以外に、第三のプライマー（ブーストプライマー：BP）を含むものとすることができる。第三のプライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。
【００２９】
本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
【００３０】
第一のプライマーおよび第二のプライマーにより標的核酸が増幅された場合には、上述のように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３’末端には折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
【００３１】
第三のプライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上の第三のプライマーを同時に用いてもよい。これら第三のプライマーは、典型的には第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三のプライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドとされる。
【００３２】
第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有するものとすることが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応液への添加量は、第一のプライマーおよび第二のプライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
【００３３】
第三のプライマーとしては、国際公開第０２／２４９０２号パンフレットに記載のような、ループを形成できる構造をもつものを鋳型として、そのループ部分に相補鎖合成の起点を与えるものを挙げることができるが、これに限定されるものではない。すなわち、標的核酸配列内であれば、いかなる部位に相補鎖合成起点を提供するものであってもよい。
【００３４】
図４の（a）から(n)に、第三のプライマー（BP）を用いた場合の増幅反応の模式図を示す。前記増幅反応には、同図(a)(b)(e)(f)(i)(l)、(a)(b)(f)(j)(m)、(a)(b)(f)(j)(g)(k)(n)、(a)(c)(g)(k)(n)または(a)(d)(h)をそれぞれ主経路とする５つの経路が存在する。以下、これらの経路を順に説明する。まず、同図(a)(b)(e)(f)(i)(l)を主経路とする第一の経路を説明する。本経路においては、まず、第一のプライマー（TP）が標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし（同図(a)）、前記第一のプライマー（TP）の伸長反応が起き、伸長鎖tp_1が生じる（同図(b)）。次に、前記伸長鎖tp_1に、第三のプライマー（BP）がハイブリダイズし（同図(b)）、前記第三のプライマー（BP）の伸長反応が起き、伸長鎖elBPが生じる（同図(e)）。また、前記伸長鎖tp_1に、第二のプライマー（FP）がハイブリダイズし（同図(b)）、前記第二のプライマー（FP）の伸長反応が起き、伸長鎖fp_tp_1が生じる（同図(f)）。次に、前記伸長鎖fp_tp_1に、前記伸長鎖elBPがハイブリダイズし（同図(i)）、前記伸長鎖elBPの伸長反応が起き、伸長鎖bp_fp_1が生じる（同図(l)）。さらに、前記伸長鎖bp_fp_1の３’末端でステム−ループ構造が形成され（同図(l)）、前記３’末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こる。続いて、同図(a)(b)(f)(j)(m)を主経路とする第二の経路を説明する。本経路は、伸長鎖fp_tp_1が生じる（同図(f)）までは、前記第一の経路と共通である。前記伸長鎖fp_tp_1の３’末端でステム−ループ構造が形成され（同図(f)）、前記３’末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こり、伸長鎖fp_fp_2が生じる（同図(j)）。次に、前記伸長鎖fp_fp_2の３’末端でステム−ループ構造が形成され（同図(j)）、前記３’末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こり、伸長鎖fp_fp_4が生じる（同図(m)）。さらに、前記伸長鎖fp_fp_4の３’末端でステム−ループ構造が形成され（同図(m)）、前記３’末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こる。続いて、同図(a)(b)(f)(j)(g)(k)(n)を主経路とする第三の経路を説明する。本経路は、伸長鎖fp_fp_2が生じる（同図(j)）までは、前記第二の経路と共通である。前記伸長鎖fp_fp_2に、第一のプライマー（TP）がハイブリダイズし（同図(j)）、前記第一のプライマー（TP）の伸長反応が起き、伸長鎖tp_fp_1が生じる（同図(g)）。前記伸長鎖tp_fp_1の３’末端でステム−ループ構造が形成され（同図(g)）、前記３’末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こり、伸長鎖tp_tp_2が生じる（同図(k)）。また、前記伸長鎖tp_tp_2の３’末端でステム−ループ構造が形成され（同図(k)）、前記３’末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こり、伸長鎖tp_tp_4が生じる（同図(n)）。さらに、前記伸長鎖tp_tp_4の３’末端でステム−ループ構造が形成され（同図(n)）、前記３’末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こる。また、前記伸長鎖tp_tp_4に、第一のプライマー（TP）がハイブリダイズし（同図(n)）、前記第一のプライマー（TP）の伸長反応が起こる。続いて、同図(a)(c)(g)(k)(n)を主経路とする第四の経路を説明する。本経路においては、まず、第二のプライマー（FP）が標的核酸のアンチセンス鎖にハイブリダイズし（同図(a)）、前記第二のプライマー（FP）の伸長反応が起き、伸長鎖fp_1が生じる（同図(c)）。次に、前記伸長鎖fp_1に、第一のプライマー（TP）がハイブリダイズし（同図(c)）、前記第一���プライマー（TP）の伸長反応が起き、伸長鎖tp_fp_1が生じる（同図(g)）。同図(g)以後は、前記第三の経路と共通である。最後に、同図(a)(d)(h)を主経路とする第五の経路を説明する。本経路においては、まず、第三のプライマー（BP）が標的核酸のアンチセンス鎖にハイブリダイズし（同図(a)）、前記第三のプライマー（BP）の伸長反応が起き、伸長鎖bp_1が生じる（同図(d)）。次に、前記伸長鎖bp_1に、第一のプライマー（TP）がハイブリダイズし（同図(d)）、前記第一のプライマー（TP）の伸長反応が起き、伸長鎖elTPが生じる（同図(h)）。なお、前記説明した反応経路は、例示であって、本発明は、前記反応経路により何ら制限および限定されるものではない。
【００３５】
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオチド三リン酸をいい、例えば、ATP，UTP，CTP，GTP等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。
【００３６】
また、前記プライマーには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
【００３７】
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Applied  Biosystem  Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
【００３８】
核酸増幅反応において用いられる、標的核酸配列を含む鋳型核酸、または核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または生体由来試料、食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料から調製することができる。
【００３９】
鋳型核酸または核酸試料の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離等により実施することが可能である。
【００４０】
より具体的には、前記鋳型核酸または前記核酸試料としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（denaturing）を行って一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
【００４１】
上記の逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。
【００４２】
核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行うこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
【００４３】
核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（strand  displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Vent  DNAポリメラーゼ、Vent  (Exo-)  DNAポリメラーゼ、DeepVent  DNAポリメラーゼ、DeepVent  (Exo-)  DNAポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Z-Taq  DNAポリメラーゼ、Pfu  DNAポリメラーゼ、Pfu  turbo  DNAポリメラーゼ、KOD  DNAポリメラーゼ、9°Nm  DNAポリメラーゼ、Therminater  DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【００４４】
さらに、上記核酸増幅反応においては、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡからの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行うことが可能である。また、ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ逆転写酵素等の上述の逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
【００４５】
核酸増幅反応において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、dNTPミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl  sulfoxide)やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【００４６】
核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Tm）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
【００４７】
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類等の、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００４８】
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等の酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。
【００４９】
本発明によるプライマーセットを用いる核酸増幅反応は、等温で実施可能である。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、この核酸増幅反応は、鋳型核酸または核酸試料と本発明によるプライマーセットとを含んでなる核酸増幅用溶液を用意する工程、およびこの核酸増幅用溶液を等温でインキュベートする工程を含んでなる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。
【００５０】
一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００５１】
上記の核酸増幅反応においては、酵素が失活するか、またはプライマーをはじめとする試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで増幅反応が繰り返される。
【００５２】
上記の核酸増幅反応においては、非天然ヌクレオチドを含む核酸を鋳型核酸とすることも可能である。本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドに含まれる塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンもしくはウラシル）以外の塩基を含むヌクレオチドであって、核酸配列中に取り込まれうるものを意味し、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、isoG，isoC（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  92,  6329-6333,  1995）等が挙げられる。非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅には、一般に、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる。一方で、上記核酸増幅反応は、例えば５０℃前後の等温で行うことが可能であるため、従来のＰＣＲ法と比較して核酸増幅酵素（ＤＮＡポリメラーゼ等）が失活する可能性が低い。従って、本発明によるプライマーセットによる核酸増幅反応は、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅にも有効である。非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅に用いられる酵素は、そのような標的核酸を増幅可能なものであればよく、特に限定されないが、特に取り込み効率の観点から、Y188L/E478Q変異型ＨＩＶ  Ｉ  逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、９°N  DNA  ポリメラーゼ、HotTub  DNAポリメラーゼ等が好適である（Michael  Sismour1  et  al.,  Biochemistry  42,  No.28,  8598,  2003／米国特許第６６１７１０６号明細書、Michael  J.  Lutz  et  al.,  Bioorganic  &  Medical  Chemistry  letters  8,  1149-1152,  1998等）。さらに、核酸増幅酵素の耐熱性を向上させる物質、例えばトレハロース等、を反応溶液に添加することもでき、これにより、より効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅を行うことができる。
【実施例】
【００５３】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により、なんら制限および限定されない。
【００５４】
融解温度および２次構造の最小自由エネルギーの予測
Ｔｍ値予測は、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアパッケージ（S.Rozenら、  Bioinformatics  Methods  and  Protocols:  Methods  in  Molecular  Biology.  Humana  Press,  Totowa,NJ,365-386(2000).）中の「ｏｌｉｇｏｔｍ」ソフトウェアを使用して行った。２次構造の最小自由エネルギー予測は、「ｍｆｏｌｄ」プログラム（http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi）を使用して行った。前記Ｔｍ値および最小自由エネルギー予測時のシミュレーションにおいて、イオン条件は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ＋および８ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ２＋、温度は、６０℃に設定した。
【００５５】
２種類のFP折り返し配列
FPのセルフプライミングは、変性およびヘアピン構造形成後に起こる。したがって、FP折り返し配列のＴｍ値および２次構造の最小自由エネルギーによるヘアピン構造安定性と、SmartAmp2法による核酸増幅との関係を解析するために、以下のようにFP折り返し配列の設計を行った。FP折り返し配列のＴｍ値は、１９．５〜６１．８℃の範囲内で、２次構造の最小自由エネルギーは、−４．３〜１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲内で変化させた。さらに、前記Ｔｍ値および２次構造の最小自由エネルギーにしたがって、FP折り返し配列を、Ｓ型およびＷ型の２つの型に分類した。Ｗ型は、融解温度が低く、高い自由エネルギーを持ち、Ｓ型は、融解温度が高く、低い自由エネルギーを持つ。図５（Ａ）には、上記のように設計した２つのＷ型のFP折り返し配列であるＷ１およびＷ２のＴｍ値、ならびに、２つのＳ型のFP折り返し配列であるＳ１およびＳ２のＴｍ値を示す。同図（Ｂ）には、上記のように設計した２つのＷ型のFP折り返し配列であるＷ１およびＷ２の２次構造の最小自由エネルギー、ならびに、２つのＳ型のFP折り返し配列であるＳ１およびＳ２の２次構造の最小自由エネルギーを示す。
【００５６】
ターゲット遺伝子検出用プライマーの配列
Ｂ２ＡＲおよびＵＣＰ１を検出するためのプライマー配列の決定は、公開されたプライマー配列決定システム（http://smap.gsc.riken.jp/smap/PrimerDesign.do）を使用して行った。図９（Ａ）に、標的核酸配列周辺のＵＣＰ１およびＢ２ＡＲ、および、各種検出用プライマーの配列を示す。同図（Ａ）（１）上段に、標的核酸配列周辺のＵＣＰ１の配列を示す。前記ＵＣＰ１の配列に付した下線は、各種検出用プライマーがハイブリダイズする配列である。また、前記ＵＣＰ１の配列において太字で示した部位は、一塩基多型の発生部位である。同図（Ａ）（１）下段に、ＵＣＰ１検出用プライマーの配列を示す。なお、ＵＣＰ１  ＦＰ  ｔａｉｌ−Ｗ１およびＵＣＰ１  ＦＰ  ｔａｉｌ−Ｓ１が、ＵＣＰ１にハイブリダイズする配列は、同一である。同図（Ａ）（２）上段に、標的核酸配列周辺のＢ２ＡＲの配列を示す。前記Ｂ２ＡＲの配列に付した下線は、各種検出用プライマーがハイブリダイズする配列である。また、前記Ｂ２ＡＲの配列において太字で示した部位は、一塩基多型の発生部位である。同図（Ａ）（２）下段に、Ｂ２ＡＲ検出用プライマーの配列を示す。なお、Ｂ２ＡＲ  ＦＰ  ｔａｉｌ−Ｗ１およびＢ２ＡＲ  ＦＰ  ｔａｉｌ−Ｓ１が、Ｂ２ＡＲにハイブリダイズする配列は、同一である。
【００５７】
鋳型プラスミドの調製
増幅した領域以外のゲノム断片が、SmartAmp2法の結果に影響しないように、以下に示す方法により調製したプラスミドを、SmartAmp2法の鋳型とした。まず、ＰＣＲにより、前記ＵＣＰ１およびＢ２ＡＲの標的核酸配列周辺領域を増幅した。前記増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミドに挿入してクローン化し、ＵＣＰ１およびＢ２ＡＲのターゲット領域を含むプラスミドを得た。前記プラスミドを、ＵＣＰ１およびＢ２ＡＲを増幅させるSmartAmp2法の鋳型とした。前記プラスミドは、SmartAmp2法の鋳型として使用するまで、−２０℃で保存した。
【００５８】
SmartAmp2法
Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４（２００７）２５７−２６２、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３（２００７）４９７４−４９８３．およびＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．  １０（２００９）１３７３．において報告した方法を用いて、以下のようにSmartAmp2法を行った。前記鋳型プラスミドは、２０００コピー／μＬに希釈した後、９８℃に熱し、変性させたものを使用した。SmartAmp2反応液の組成は、下記に示す通りである。FPの濃度は、図９（Ｂ）に示すように、０．５、１、２、４または８μｍｏｌ／Ｌとした。前記反応液は、氷上で調製し、２５μＬとした。前記反応液を、６０℃で１２０分インキュベートすることにより、SmartAmp2反応を行い、核酸を増幅した。増幅産物の生成は、リアルタイム蛍光検出装置（商品名Ｍｘ３０００Ｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて１分ごとにモニタリングした。
【００５９】
（SmartAmp2反応液）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ                        トリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)
１０ｍｍｏｌ／Ｌ                        塩化カリウム
１０ｍｍｏｌ／Ｌ                        硫酸アンモニウム
８ｍｍｏｌ／Ｌ                          硫酸マグネシウム
５％                                    ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
０．１％                                Ｔｗｅｅｎ２０
１．４ｍｍｏｌ／Ｌ                      ｄＮＴＰ
２．０μｍｏｌ／Ｌ                      ＴＰ
２．０μｍｏｌ／Ｌ                      ＢＰ
０．５、１、２、４または８μｍｏｌ／Ｌ  ＦＰ
０．００１％                            ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）
６ｕｎｉｔｓ                            ＡａｃＤＮＡポリメラーゼ
（ダナフォーム社製）
２０００コピー                          鋳型プラスミド
【００６０】
SmartAmp2反応時間決定方法
SmartAmp2反応の開始時から、前記リアルタイム蛍光検出装置によって各時点でモニタリングされる蛍光強度変化速度が最大となる時間を、SmartAmp2反応時間として定義した。前記蛍光強度変化速度が最大となる時間は、以下の方法によって決定した。まず、１分おきに隣接する各時点間の蛍光強度の差を算出し、各時点での蛍光強度変化量を決定した。次に、基準となる時点の２分前、１分前、基準時、１分後、２分後の５つの時点で、平均の蛍光強度の差を算出し、それらの値を比較することで、蛍光強度変化量が単調増加する時間帯を決定した。前記蛍光強度変化量の平均値が最大となる基準時点を反応時間として決定した。
【００６１】
ゲル電気泳動
SmartAmp2の増幅産物は、１０％ポリアクリルアミドゲル（ＡＭＲＥＳＣＯ社、オハイオ、ＵＳＡ）を用いた電気泳動により解析した。電気泳動サイズマーカーとして、オレンジルーラー（商品名）１００ｂｐ  ＤＮＡラダー（フェルメンタス社製）を用いた。前記電気泳動は、３５Ｗで１５０分間、１×ＴＢＥ緩衝液（４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ，２０ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸，１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）中で行った。前記電気泳動後に、前記ゲルをエチジウムブロマイド溶液（５μｇ／ｍｌ）で２０分間染色した後、脱イオン水で２０分間洗浄し、ＵＶ透照により観察した。
【００６２】
プライマーの３２Ｐ−ＡＴＰラベリングおよびオートラジオグラフィー
各種プライマーの３２Ｐ−ＡＴＰによるラベリングは、以下の方法で行った。１×キナーゼ緩衝液（ＮＥＢ社、ＵＳＡ）５０μｌ中で、３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ社、ＵＳＡ）と３７℃、３０分間反応させることによって、前記各種プライマーを３２Ｐ−ＡＴＰによるリン酸化に供した。次に、６５℃で２０分間処理によって、前記反応を停止させ、ラベル化プライマーを得た。前記ラベル化プライマーを、前記SmartAmp2反応液に使用するプライマーミックスに添加し、前記SmartAmp2反応液を調製した。前記SmartAmp2反応液を６０℃で７０分間インキュベートし、SmartAmp2反応を行った。前記SmartAmp2反応の増幅産物は、前述の方法によるゲル電気泳動に供した。前記ゲル電気泳動後に、前記ゲルをイメージアナライザー（富士フィルム社製）により解析し、３２Ｐ−ＡＴＰのシグナルを検出した。
【００６３】
SmartAmp2法における核酸増幅速度におけるFP折り返し配列の影響
プライマーセットにおけるFPの割合、ならびに、FP折り返し配列におけるＴｍ値および２次構造の最小自由エネルギーと、前記核酸の増幅速度との関係を調べるために、以下の実験を行った。FP濃度を０．５、１、２、４、８μｍｏｌ／Ｌとした、SmartAmp2アッセイをＵＣＰ１およびＢ２ＡＲを含む数種のターゲットについて行った。図６（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれＷ１型折り返し配列を有するＵＣＰ１  FP（ＵＣＰ１−Ｗ）、Ｓ１型折り返し配列を有するＵＣＰ１  FP（ＵＣＰ１−Ｓ）、Ｗ１型折り返し配列を有するＢ２ＡＲ  FP（Ｂ２ＡＲ−Ｗ）およびＳ１型折り返し配列を有するＢ２ＡＲ  FP（Ｂ２ＡＲ−Ｓ）を用いてSmartAmp2法を行った際の、FPの濃度と反応時間との関係を示すグラフである。各グラフにおいて、横軸は、FPの濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示し、縦軸は、SmartAmp2反応時間（分）を示す。同図（Ａ）および（Ｃ）に示すように、Ｗ１型FP折り返し配列を有するFPの場合は、FP濃度に関わらずSmartAmp2反応時間が一定であった。一方、同図（Ｂ）および（Ｄ）に示すように、Ｓ１型FP折り返し配列を有するFPの場合は、FP濃度が高いほどSmartAmp2反応時間が長くなった。データは示さないが、ＵＣＰ１およびＢ２ＡＲ以外のターゲット遺伝子の場合も、FP濃度とSmartAmp2反応時間との間には、上記のようなFP折り返し配列のＷ１型、Ｓ１型に依存した関係が見られた。また、折り返し配列以外の部分のＴｍ値および２次構造の最小自由エネルギーに関しては上記の関係は見られなかった。以上の結果から、前記プライマーセットにおけるFPプライマーの割合を増加させることにより、前記核酸の増幅速度を制御できることが分かった。さらに、前記融解温度を低下させ、かつ前記自由エネルギーを増加させることにより、前記核酸の増幅速度は加速され、また、前記融解温度を上昇させ、かつ前記自由エネルギーを減少させることにより、前記核酸の増幅速度は減速されることが分かった。
【００６４】
増幅産物の電気泳動解析
FPプライマーの最適化は、増幅速度だけでなく、増幅産物の生成パターンにも重要である。そこで、FPプライマーの添加量と増幅産物の生成パターンとの関係、および、FPプライマー折り返し配列と増幅産物の生成パターンとの関係を調べるために、Ｂ２ＡＲのSmartAmp2増幅産物を、電気泳動解析した。図７に、Ｗ１型折り返し配列を有するＢ２ＡＲ  FP（Ｂ２ＡＲ−Ｗ）およびＳ１型折り返し配列を有するＢ２ＡＲ  FP（Ｂ２ＡＲ−Ｓ）を用いた場合の、Ｂ２ＡＲのSmartAmp2増幅産物の電気泳動解析結果を示す。同図に示すように、Ｂ２ＡＲ−ＷとＢ２ＡＲ−Ｓとでは、前記増幅産物の泳動パターンは、明確に異なっていた。また、同図に示すように、Ｂ２ＡＲ−ＷおよびＢ２ＡＲ−Ｓにおいて、FP濃度の変化に応じて、多くのバンドのシグナルの増減が同時に観察された。これらの結果は、SmartAmp2法による核酸増幅経路に変化があったことを示す。
【００６５】
ＲＩラベルした増幅産物のオートラジオグラフィー解析
FPプライマーの添加量と増幅産物の生成パターンとの関係、核酸増幅におけるTP、BPまたはFPのそれぞれの貢献度、および、FPプライマー折り返し配列と増幅産物の生成パターンとの関係を調べるために、TP、BPまたはFPを３２Ｐ−ＡＴＰラベルして増幅させた、Ｂ２ＡＲのSmartAmp2増幅産物を、オートラジオグラフィー解析した。図８（Ａ）および（Ｂ）に、Ｗ１型折り返し配列を有するＢ２ＡＲ  FP（Ｂ２ＡＲ−Ｗ）およびＳ１型折り返し配列を有するＢ２ＡＲ  FP（Ｂ２ＡＲ−Ｓ）を用いた場合の、Ｂ２ＡＲのSmartAmp2増幅産物のオートラジオグラフィー解析結果をそれぞれ示す。また、同図（Ａ）（Ｂ）の左から順に、TPを３２Ｐ−ＡＴＰラベルした場合（TPラベル）、BPを３２Ｐ−ＡＴＰラベルした場合（BPラベル）およびFPを３２Ｐ−ＡＴＰラベルした場合（FPラベル）の解析結果を示す。さらに、各反応につき、FP濃度は、０．５、２または８μｍｏｌ／Ｌとした。同図（Ａ）（Ｂ）のTPラベルおよびBPラベルの結果に示すように、TPまたはBPを含む増幅産物の泳動パターンは、FP折り返し配列がＷ１型の場合（Ｂ２ＡＲ−Ｗ）とＳ１型の場合（Ｂ２ＡＲ−Ｓ）とで、明確に異なることが分かった。また、FP濃度が増すほど、TPまたはBPを含む増幅産物の量が増加し、長さが増すことが分かった。また、この傾向は、FP折り返し配列がＷ１型の場合でもＳ１型の場合でも同様であった。FPは増幅反応の鋳型を産生することにより、TPまたはBPを含む増幅産物の産生に貢献する。この結果から、FP折り返し配列が、Ｗ１型およびＳ１型のいずれであっても、FPの濃度依存的に、TPまたはBPを含む増幅産物を増加できることが分かった。また、同図（Ａ）（Ｂ）のFPラベルの結果に示すように、FPを含む増幅産物の泳動パターンは、FP折り返し配列がＷ１型の場合とＳ１型の場合とで、明確に異なることが分かった。同図（Ａ）FPラベルの結果に示すように、FP折り返し配列がＷ１型の場合、FPを含む増幅産物は少量であった。一方、同図（Ｂ）FPラベルの結果に示すように、FP折り返し配列がＳ１型の場合、FPを含む増幅産物は比較的多かった。この結果から、FP折り返し配列をＳ１型にすることにより、FPを含む増幅産物を増加できることが分かった。また、FPの濃度依存的に、FPを含む増幅産物は増加することが分かった。以上の結果から、FP折り返し配列をＳ１型にし、核酸増幅速度を減少することによって、FPを含む増幅産物を増加させることが可能であることが分かった。核酸増幅速度と、FPを含む増幅産物量とのこのような逆相関関係は予想外であった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、核酸配列の増幅法および遺伝子変異の検出方法に関するものであり、本発明の核酸配列の増幅法によれば、核酸の増幅速度が制御可能となる。一方、一般的な遺伝子検出であれば、検出時間の短縮化が求められるが、一塩基多型のような遺伝子変異の検出には、検出時間の短縮化よりも高い検出精度が求められる。このため、本発明の核酸配列の増幅法および遺伝子変異の検出方法は、例えば、遺伝子工学分野において、極めて有用なツールと言える。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図７】
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【図８】
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