(57)【要約】      （修正有）【課題】キメラＧタンパク質、その発現構築物、このような構築物を発現する酵母細胞、およびそれらの作成および使用法を提供する。【解決手段】Ｃ−末端１０アミノ酸内の少なくとも３アミノ酸位置を別の別のアミノ酸で置換することによって改質した酵母Ｇα（Ｇｐａ１ｐ）アミノ酸配列を有するキメラＧαタンパク質、このキメラＧαタンパク質を含んでなる形質転換酵母細胞、および目的とする化合物を上記酵母細胞と接触させ、細胞の成長応答を観察しまたはレポーター遺伝子生成物の産生を観察することを含んでなる、レセプターと相互作用することができる化合物のスクリーニング法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ−末端１０アミノ酸内の少なくとも３アミノ酸位置を別のアミノ酸で置換することによって改質した酵母Ｇα（Ｇｐａ１ｐ）アミノ酸配列を有するキメラＧαタンパク質。
【請求項２】
アミノ酸配列が、Ｃ−末端の１０アミノ酸内の少なくとも５アミノ酸位置を別のアミノ酸で置換することによって改質した、請求項１に記載のキメラＧαタンパク質。
【請求項３】
Ｃ−末端の１０アミノ酸内の少なくとも３アミノ酸位置を異種Ｇαタンパク質由来のアミノ酸で置換することによって改質した酵母Ｇα（Ｇｐａ１ｐ）アミノ酸配列を有するキメラＧαタンパク質。
【請求項４】
アミノ酸配列が、Ｃ−末端の１０アミノ酸内の少なくとも５アミノ酸位置を異種Ｇαタンパク質由来のアミノ酸で置換することによって改質した、請求項３に記載のキメラＧαタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラＧαタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項６】
異種Ｇタンパク質結合レセプターをコードするヌクレオチド配列と、請求項５に記載のヌクレオチド配列とを含んでなる、形質転換酵母細胞。
【請求項７】
目的とする化合物を請求項６に記載の細胞と接触させ、細胞の成長応答を観察することを含んでなる、レセプターと相互作用することができる化合物のスクリーニング法。
【請求項８】
細胞が更にレポーター遺伝子を含んでなり、かつ、レポーター遺伝子生成物の産生を観察する段階を含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、キメラＧタンパク質、その発現構築物、このような構築物を発現する酵母細胞、およびそれらの作成および使用法に関する。
【０００２】
Ｇタンパク質結合レセプターは、７つの膜貫通ドメインを特徴とする内在性膜タンパク質であり、ホルモンや感覚シグナルを細胞内部に送達する（総説については(1)を参照されたい）。これらのレセプターは、一般に７ＴＭレセプターまたは７ＴＭＲと呼ばれている。これらのレセプターは、α、βおよびγサブユニットからなるヘテロトリマー性Ｇタンパク質を活性化することによってリガンド結合に応答する。Ｇαサブユニットは、Ｇタンパク質トリマー中でＧＤＰに結合し、活性化（リガンド結合）したレセプターとの相互作用は、ＧＤＰのＧＴＰでの置換を誘発する。付随するコンホメーション変化によりＧα−ＧＴＰおよびＧβ／Ｇγ粒子の解離し、これらはいずれもイオンチャンネルまたは酵素エフェクターを調節して、シグナル伝播を引起すことができる。シグナルは、ＧＴＰアーゼ活性を有するＧαが結合したＧＴＰを加水分解して、ヘテロトリマーの再組立するまで持続する。ＲＧＳ（Ｇタンパク質シグナル伝達のレギュレーター）タンパク質ファミリーのＧαサブユニットについてのＧＡＰ（ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質）として作用することによってシグナル時間を調節する(38)(17)。Ｇタンパク質シグナル伝達系は、総ての真核生物によく見られると思われる。
【０００３】
三量体性Ｇタンパク質シグナル伝達系の完全に特定された例は、発芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのフェロモン応答経路である(20)。ＭＡＴａ接合型の細胞は、ＳＴＥ２遺伝子によってコードされるレセプターを発現する。このレセプターは、逆（ＭＡＴα）接合型の細胞によって分泌されるペプチドであるα−因子接合フェロモンの結合によって活性化される。酵母Ｇタンパク質は、ＧＰＡ１（Ｇα）、ＳＴＥ４（Ｇβ）およびＳＴＥ１８（Ｇγ）遺伝子の生成物から組立てられる。Ｓｔｅ２ｐレセプターの活性化によって放出されるＧβ／Ｇγ（Ｓｔｅ４ｐ／Ｓｔｅ１８ｐ）粒子は、シグナルをマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）モジュールに送達する。これによって、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤Ｆａｒ１ｐが活性化され、ＦＵＳ１などの接合工程に関与している一組の遺伝子の細胞周期の阻止と転写誘導を引起す。この経路は、ＲＧＳファミリーの要素であるＳｓｔ２ｐによって脱感作される。逆接合型（ＭＡＴα）の細胞は、異なるレセプター（Ｓｔｅ３ｐ）を発現し、これによりＭＡＴａ細胞によって分泌されたフェロモン（ａ−因子）に応答し、そうでなければ、２つの接合型に用いられるシグナル伝達装置は同一である。
【０００４】
現在のところ、少なくとも１６個のＧαサブユニット、５個のＧβサブユニットおよび１１個のＧγサブユニットが哺乳類で同定されており、これらは極めて多様な三量体性Ｇタンパク質を組立てることができる。配列相同性に基づいて、Ｇαサブユニットは、Ｇα１、Ｇαｓ、Ｇαｑ、またはＧα１２に関連した少なくとも４つのファミリーに分けられる。典型的には、所定の７ＴＭレセプターは、Ｇαサブユニットの単一または小さなサブセットのみを活性化する。従って、複数のＧαサブユニットを発現する細胞でも、シグナル伝達は特定のＧタンパク質およびその下流のシグナル伝達経路に特異的であることがある。様々な方法の組合せにより、レセプター／Ｇタンパク質特異性の重要な決定因子としてＧαサブユニットの数個の特異的な領域が画定されている。これらには、Ｎ−末端の領域、主としてＧβ／Ｇγの結合に関与するスイッチII−スイッチIII領域(21)、および特にＣ−末端の領域が挙げられる。例えば、ＧαのＣ−末端で起こる突然変異のクラスターは、レセプター共役（recepter coupling)に欠陥を引起すことが分かっている（(29)(13)およびそれらに記載の文献）。また、Ｇαｔ（トランスデューシン）およびＧαｉ２のＣ−末端で作成されたペプチドは、それぞれロドブシンおよびβ−アドレナリンレセプターへの結合を競争し(9)(30)(35)、ＧαのＣ−末端に向けられた抗体はレセプターとの相互作用を遮断することもできる(6)(10)(36)。培養哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）におけるアデノシンのＡ１レセプターのアゴニスト刺激に対する正常な応答は、Ｇαｉファミリータンパク質の活性化であり、アデニレートシクラーゼを阻害する。Ｇαｑ含有ヘテロ三量体は、対照的に通常はＡ１活性化に応答しない。しかしながら、ＧαｑのＣ−末端の４個のアミノ酸をＧαｉ２の相当するアミノ酸に交換することによって、Ｇαｑサブユニットを誘導してＡ１レセプターと相互作用させることができる(7)。従って、シグナル伝達をキメラＧαサブユニットによって行うときには、ホスホリパーゼＣ（活性化Ｇαｑのエフェクター）をアデノシンＡ１レセプターアゴニストによって活性化することができる(7)。ソマトスタチンＳＳＴ３レセプターはＧαｓと不和合性であるが、Ｇαｓの５個のＣ−末端アミノ酸をＳＳＴ３レセプターと相互作用することが知られているＧαｉ２またはＧα１６からの相当する残基に置換することによってＣＯＳ細胞におけるアデニレートシクラーゼの活性化に共役することができる(18)。Ｇα１５およびＧα１６は広範囲の７ＴＭレセプターと相互作用し(26)、これに関して例外的である。Ｇｉ１(41)およびＧｔ(19)三量体について解明されている結晶構造では、ＧαのＣ−末端の尾は、ＧαのＮ−末端およびＧγのＣ−末端に共有結合した２個の脂質基をも含むＧタンパク質三量体の平たい大部分が帯電していない表面上にある。この表面は膜に面しており、７ＴＭレセプターの細胞内ループとの相互作用に関与していると思われる。
【０００５】
幾つかの報告は、酵母Ｇタンパク質シグナル伝達系を、異種発現した哺乳類Ｇタンパク質共役（７ＴＭ）レセプターに共役することができることを示している。ラットソマトスタチンＳＳＴ２レセプター(33)およびラットアデノシンＡ２ａレセプター(34)など幾つかのレセプターは、酵母Ｇαタンパク質Ｇｐａ１ｐと直接相互作用することができるが、ヒト成長ホルモン放出ホルモンレセプター（ＧＨＰＲＨＲ）(12)などの他のレセプターはＧｐａ１ｐと不和合性である。これらのレセプターを共役させるために、酵母Ｇαサブユニットを欠失させ、異種レセプターを完全長の哺乳類Ｇαサブユニットと同時発現させることができる。あるいは、Ｇｐａ１ｐのＣ−末端ドメイン（ペプチド配列の約１／３）が哺乳類Ｇαサブユニットで置換されているキメラＧαサブユニットが用いられてきた。これらの方法については、ＷＯ９５／２１９２５号明細書(American Cyanamid Company)を参照されたい。キメラ体または他の改質または異種Ｇαサブユニットは、酵母共役系で用いるようにするには、幾つかの基準を満足しなければならない。最も重要なことは、それらは酵母Ｇβ／Ｇγに効率的に結合して、活性化７ＴＭレセプターの非存在下でシグナル伝達を防止しなければならず、またシグナル増殖を可能とするには、それらはアゴニストに結合した活性化レセプターと効果的に相互作用しなければならない。
【０００６】
このような異種またはキメラＧα成分は、異種７ＴＭレセプターの酵母シグナル伝達系（フェロモン応答経路）への共役を促進して、レセプター上の潜在的な新規薬剤分子のようなリガンドの効果が酵母細胞の表現型応答で観察できるようにすることができる。例えば、細胞を誘導して成長させ、シグナル伝達経路に下流のレポーター遺伝子をシグナル伝達経路に導入することによってレセプターアゴニストに応答して指示薬染料化合物転換することができる。しかしながら、ＷＯ９５／２１９２５号明細書に記載されているようなキメラ構築物は、一般に酵母Ｇタンパク質βγサブユニット対に対するアフィニティーが低く、またバックグラウンドシグナル伝達が増加している。所定のレセプターの１個または少数の既知Ｇαサブユニットに対する特異性により、様々なＧα構築物が試験したレセプターの大半と機能的共役活性を示す必要があった。
【０００７】
７ＴＭレセプターを介して作用することができる新規薬剤の発見には、高い有効性としかも高特異性のスクリーンが必要である。現在は、酵母共役系は、レセプター／Ｇタンパク質特異性が、多種多様なＧα構築物をそれぞれのレセプターを共役について試験するという要件を課することによって制約されている。共役を行うことができないレセプターについては、その失敗がレセプター／Ｇタンパク質不和合性によるものか、または例えば不適当なレセプターコンホメーションのような他の理由によるものか不確定である。単一のＧα構築物を用いて多数の様々なレセプターを酵母Ｇタンパク質シグナル伝達経路に共役させることができることが望ましい。これは、レセプター／Ｇタンパク質特異性について全く知られていないオーファンレセプターの研究に役立つ可能性がある。あるいは、Ｇα構築物を用いてオーファンレセプターの研究を行うこともできる。
【０００８】
意外なことには、本発明者らは、「移植体(transplant)」と呼ばれるある種のキメラＧタンパク質は、哺乳類の７ＴＭレセプターの酵母接合経路への共役における以前から知られているキメラ体より少なくとも１０倍有効であることを見いだした。
【０００９】
従って、第一の態様では、本発明は、Ｃ−末端１０アミノ酸内の少なくとも３アミノ酸位置を別のアミノ酸で置換することによって改質した酵母Ｇα（Ｇｐａ１ｐ）アミノ酸配列を有するキメラＧαタンパク質を提供する。好ましくは、キメラ体は、少なくとも５個のこれらの置換を含んでいる。
【００１０】
従って、体にの態様では、本発明は、Ｃ−末端の１０アミノ酸内の少なくとも３アミノ酸位置を異種Ｇαタンパク質由来のアミノ酸で置換することによって改質した酵母Ｇα（Ｇｐａ１ｐ）アミノ酸配列を有するキメラＧαタンパク質を提供する。好ましくは、キメラ体は、少なくとも５個の置換を含んでいる。本発明のこの様相での好ましい態様では、キメラ体は、異種Ｇαタンパク質のＣ−末端の１０アミノ酸由来のアミノ酸配列に相当する少なくとも３個の、望ましくは少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでいる。例えば、哺乳類Ｇαタンパク質、例えば恐らくは任意のＧαを除くＧα１６のＣ−末端は、内在性酵母Ｇαタンパク質のＣ−末端の５個のアミノ酸に取って代わり、本発明のキメラ体を提供することができる。本発明者らは、これらのキメラ体を「移植体」または「移植キメラ体」と命名した。
【００１１】
本発明のキメラＧαタンパク質は、酵母タンパク質のＣ−末端ドメインを哺乳類Ｇαタンパク質のＣ−末端ドメインに替えた以前から知られているキメラ体よりも酵母でのシグナル形質導入と和合性であり（かつ天然酵母のＧαコンホメーションにより近いと思われる）コンホメーションを採用していると考えられる。従って、本発明のキメラ体は、Ｇｐａ１ｐ配列へごくわずか変化させることによってレセプターの特異性を変化させかつ様々なレセプターを酵母シグナル伝達経路へ共役させることができるという利点を有する。野生型Ｇｐａ１ｐと極めて類似していることから、これらのキメラＧαサブユニットはＧｐａ１ｐと同様なＧβ／Ｇγに対するアフィニティーを保持しており、発現はＧＰＡ１プロモーターが指示してＧαの化学量論を最適にすることができる。他の各種のプロモーターからの発現も、レセプター共役と和合性である。
【００１２】
第三の態様では、本発明は、本発明によるキメラＧαタンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。また、上記ヌクレオチド配列を含んでなりかつ適当な形質転換の際に宿主細胞に発現させることができる発現ベクターも提供される。適当なプロモーター、転写終結配列およびマーカー遺伝子を含む発現ベクターの構築は、当業者には明らかであろう。宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae種の酵母細胞であるのが望ましいことがあり、本発明のもう一つの態様を表す。
【００１３】
従って、本発明は、本発明によるキメラＧαタンパク質をコードするヌクレオチド配列、例えばリガンドが知られていないレセプターなどの異種Ｇタンパク質共役レセプター、および酵母Ｇα（Ｇｐａ１ｐ）アミノ酸配列と本発明によるＧαタンパク質、例えば哺乳類Ｇα１６タンパク質のような異種Ｇαタンパク質のＣ−末端の１０個のアミノ酸のアミノ酸配列から誘導される少なくとも３個のアミノ酸とを含んでなるキメラＧαタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる形質転換酵母細胞も提供する。異種レセプターは、７ＴＭレセプターでよい。このようなレセプターとしては、アセチルコリン、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドパミン、ヒスタミン、メラトニン、アンギオテンシン、プロスタグランジン、カンナビノイド、神経ペプチドＹ、サブスタンスＰ、オピオイド、グルカゴン、アンギオテンシン、ブラジキニン、ケモカイン、トロンビン、糖タンパク質ホルモン、アデノシン、ヌクレオチドおよびソマトスタチンのレセプターが挙げられる。
【００１４】
本発明による形質転換酵母細胞は、Ｇタンパク質シグナル伝達経路に関与しているプロモーターと操作結合したレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含んでなることができる。このようなレポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３または他の栄養要求性マーカー（例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、またはＴＲＰ１）、またはＣＹＨ２またはＧ４１８Ｒのような薬剤選択に対する耐性または感受性を与える遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）およびルシフェラーゼのような細胞内酵素または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、をコードする他の遺伝子、またはＰＨＯ５のようなホスファターゼまたはキナーゼのような分泌酵素をコードする遺伝子を挙げることができる。酵母細胞は、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３およびＦＵＳ１−ｌａｃＺのような複数のレポーター遺伝子の組合せを含むことができるのが望ましい。好ましい態様では、形質転換酵母細胞は、ＧＰＡ１、ＳＳＴ２またはＳＴＥ２遺伝子の少なくとも１個に突然変異も含む。好ましくは、このような突然変異は欠失である。望ましくは、レポーター遺伝子をＧタンパク質シグナル伝達経路での活性の監視に用いるときには、ＦＡＲ１も欠失される。これにより、成長は、フェロモン応答経路を活性化する条件下でも確実に継続することができる。本発明の別態様では、ＦＡＲ１遺伝子は完全なままであり、シグナル伝達経路を活性化するアゴニスト刺激を、成長抑止を生じるときに監視することができるようにする。
【００１５】
好ましい酵母株は、ＳＳＴ２およびＧＰＡ１（酵母Ｇα）の欠失を有し、前者はＧＴＰアーゼのＳｓｔ２ｐ活性化によるシグナルのダウンレギュレーションを防止し、後者はＧαがＧβ／Ｇγに対して化学量論的過剰に存在するとき、活発にシグナル伝達するＧβ／Ｇγ残基が速やかに再会合して不活性なヘテロ三量体となることによるシグナルクエンチング(signal quenching)を防止する。
【００１６】
本発明者らは、Ｇｐａ１ｐのＮ−末端の４６７アミノ酸とＧα１６の５個のＣ−末端アミノ酸とのキメラ体をＧｐａ１−Ｇα１６移植体と命名した。同様に、ＧαｑのＣ−末端の５個のアミノ酸を含むキメラ体をＧｐａ１−Ｇαｑ移植片と命名し、ＧαｓのＣ−末端の５個のアミノ酸を含むキメラ体をＧｐａ１−Ｇαｓ移植体と命名した。また、下記の移植体も構築した。それらは上記のものと同一であり、すなわちＧｐａ１ｐのＮ−末端の４６７アミノ酸とＧαタンパク質由来の５個のＣ−末端アミノ酸とを含んでなり、次のようなものである：Ｇｐａ１−Ｇα１２、Ｇｐａ１−Ｇα１３、Ｇｐａ１−Ｇα１４、Ｇｐａ１−Ｇαｉ１、Ｇｐａ１−Ｇαｉ３、Ｇｐａ１−Ｇα０およびＧｐａ１−Ｇαｚ。
【００１７】
もう一つの移植体を、Ｇα、Ｇｐａ１ｐ、および酵母Ustilago maydis由来のＧαサブユニットであるＧｐａ３とから調製した。この移植体は、Ｇｐａ１−Ｇｐａ３と命名されている。これらの移植体は、Ｇｐａ１の５個のＣ−末端アミノ酸を変えることによって、レセプターに対するＧαサブユニットの特異性を変えることができることを示している。また、これらの結果は、酵母中の異種レセプターへの共役における「移植体」の有効性が、異種Ｇα領域が一層長いキメラサブユニットと比較して予想外に良好であることを示唆している。
【００１８】
哺乳類細胞では、プリン作動性ヌクレオチドＰ２Ｙ２レセプターが、Ｇαｑを介してホスホリパーゼＣβ（ＰＬＣβ）の活性化に共役している。本発明者らは、Ｇｐａ１−Ｇαｑ移植体が、野生型Ｇｐａ１ｐで見られたアゴニストに対する弱い応答を実質的に改良することを見いだした。同様に、Ｇｐａ１−Ｇα１６移植体を用いて得られたソマトスタチンＳＳＴ２レセプターの共役は、野生型のＧｐａ１ｐまたはＧαｉ／０ファミリーのキメラと比較して１０倍に増強されたが、このことはこのレセプターが哺乳類細胞のＧαｉ／０タンパク質と相互作用することを考慮すれば注目に値する。また、５ＨＴ１Ａレセプターは、ＭＭＹ９酵母細胞中の野生型Ｇｐａ１ｐを刺激することができなくとも、それはＧｐａ１−Ｇα１６移植体と相互作用することができる。アミノ酸をごくわずか置換することにより、酵母Ｇｐａ１ｐに、キメラ体構築に対する以前に報告された方法ではできなかった遺伝子Ｇタンパク質の特性を賦与することができる。従って、本発明は、単一のＧαサブユニットを含んでなりかつ広汎な７ＴＭレセプターを共役させることができる系の可能性を初めて示している。
【００１９】
更に、本発明者らは、Ｇｐａ１の５個のＣ−末端アミノ酸を置換して移植体を生成する方法が広汎に応用可能であることを見いだし、４種類総てのＧαファミリーの代表的要素Ｇαｉ、Ｇαｓ、ＧαｑおよびＧα１２の移植体を生成した。これは、キメラ体構築に対する以前に報告された方法ではできないことであった。更に、これらの移植体の総ては、ＧＰＡ１遺伝子のプロモーターから発現させて、効率的共役のための最適化学量論を得ることができる。これらのキメラ体の幾つかは、Ｇｐａ１／Ｇα（文献12）の場合のように、より強力なプロモーターからの発現が必要であったので、キメラ体構築に対する以前に報告された方法ではできないことであった。最後に、フェロモン応答経路は、活性化レセプターの非存在下では移植体の組込みバージョン(integrated versions)を発現する細胞では活性化されない。このことは、Ｃ−末端アミノ酸に対する操作はＧβ／Ｇγとの相互作用を干渉しないことを示唆しているが、これはキメラ体構築に対する以前に報告された方法では真実ではなかった。総合すれば、本発明者らのデータは、移植体の作成法を、任意の新たに発見された哺乳類Ｇα、または本明細書には記載されていないＧαサブユニット（ＧαｔまたはＧαｏｌｆ）、または任意の他の動物界の種由来のＧαサブユニットに適用可能であることを示している。
【００２０】
本発明を、図を用いて下記の実験例によって更に説明するが、実施例および例示のためのものであって、本発明を制限するためのものではない。
【００２１】
材料および方法：
プラスミドおよび菌株
核酸操作は、標準的方法に準じて行った(24)。
【００２２】
レセプター発現構築体
レセプター発現構築体は、高コピー数のエピソーム酵母−E. coliシャトルベクターｐＦＬ６１(27)、ＹＥｐ２４およびｐＤＴ−ＰＧＫ（図６(ａ)のプラスミドマップ参照）であってKang et al. (14)によって報告されたｐＰＧＫと同一であるものに基づいていた。未改質のヒトＧタンパク質に共役したレセプターをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列をＰＧＫ１遺伝子のプロモーターとターミネーター領域の間のこれらのベクター中に導入して、酵母細胞に強力な構成的発現を与えた。ソマトスタチンＳＳＴ２レセプター（Genbank登録番号Ｍ８１８３０）は、ｐＦＬ６１に導入した。メラトニンＭＬ１Ｂ（Genbank登録番号Ｕ２５３４１）、ソマトスタチンＳＳＴ５（Genbank登録番号Ｌ１４８６５）、セロトニン５ＨＴ１Ａ（Genbank登録番号Ｘ１３５５６）、およびセロトニン５ＨＴ１Ｄ（Genbank登録番号Ｍ８１５８９）レセプターは、ｐＤＴ−ＰＧＫに導入した。プリン作動性ヌクレオチドＰ２Ｙ１レセプター（Genbank登録番号Ｓ８１９５０）およびアデノシンＡ２ｂレセプター（Genbank登録番号Ｍ９７７５９）は、ｐＤＴ−ＰＧＫに導入した。プリン作動性ヌクレオチドＰ２Ｙ２レセプターも、ｐＤＴ−ＰＧＫに導入した。Ｐ２Ｙ２レセプターの配列は、コドン３４８が恐らくは系統発生的変異の結果としてＧＡＡ（Ｇｌｕ）でありＧＧＡ（Ｇｌｙ）ではないことを除き、Parr et al. (Genbank登録番号Ｕ０７２２５）(32)(31)によって報告されたものに相当した。内在性酵母α−因子レセプターＳＴＥ２をコードする遺伝子は、構築体Ｙｅｐ２４−ＳＴＥ２を用いてそれ自身のプロモーターから発現させた。
【００２３】
Ｇα発現構築体
Ｇタンパク質αサブユニットをコードする配列を発現する構築体を作成するため、ＧＰＡ１遺伝子（ＧＰＡ１プロモーター）の１Ｋｂ上流の領域と、複合クローニング部位およびＡＤＨ１遺伝子（ＡＤＨｔ）の転写終結領域とからなるカセットを動原体性プラスミドｐＲＳ３１４(Stratagene)に挿入して、ｐＪＷ１を生成させた（図６(ｂ)）。ＧＰＡ１オープンリーディングフレームをｐＪＷ１のＮｒｕｌ部位に挿入して、ＧＰＡ１発現プラスミドｐＲＳ３１４−ＧＰＡ１を作成した（図６(ｃ))。
【００２４】
Ｇｐａ１／Ｇαｉ３キメラ体
キメラＧαサブユニットＧｐａ１／Ｇαｉ３をコードする配列を、プラスミドｐＡＤＣ２−ＳＣＧｉ３から誘導した。このプラスミドによってコードされるキメラ体は、Ｇαｉ２の代わりにＧαｉ３のＣ−末端を含むことを除き、Kang et al. (14)（スイッチIIドメインにＢａｍＨＩ部位を有する）によって報告されたものと同一構造のものである。この研究に用いられるＧｐａ１／Ｇαｉ３発現構築体は、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅でオープンリーディングフレームに隣接してＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を組込むことによって作成した。
【００２５】
Ｇｐａ１／Ｇαｉ３キメラ体をコードする配列をｐＪＷ１のＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位の間に挿入して、プラスミドｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１／Ｇαｉ３（図６(d)）を作成した。Ｇｐａ１／Ｇα０、Ｇｐａ１／Ｇαｉ１、Ｇｐａ１／Ｇαｉ２、Ｇｐａ１／Ｇαｓ、Ｇｐａ１／ＧαｑおよびＧｐａ１／Ｇα１６キメラ体を発現する構築体は、ｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１／Ｇαｉ３から（ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位の間の）Ｇαｉ３由来の配列をＧα０、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｓ、ＧαｑおよびＧα１６の相当するＣ−末端領域をコードする配列に変えることによって誘導した。ｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１／Ｇα０、ｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１／Ｇαｉ１、ｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１／Ｇαｉ２、およびｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１／Ｇα１６のプラスミドマップを、それぞれ図６(ｅ)、６(ｆ)、６(ｇ)および６(ｈ)に示す。
【００２６】
Ｇα移植体
アミノ酸改質である一番端のＣ−末端を有する「移植体」を、３段階で生成した。第一に、ｐＲＳ３１４−ＧＰＡ１のＧＰＡ１プロモーターに配置されたＡｆｌII部位をKlenowによる平滑末端形成および再連結によって除いた。次いで、ＧＰＡ１のコドン４６７を位置指定突然変異誘発によってＡＡＡからＡＡＧへ変更し、これはQuik-changeキット(Stratagene)を用いて行った。このヌクレオチド変化により、コードしたタンパク質配列を変えることなくＡｆｌII部位を導入した。最後に、ＡｆｌII／ＸｈｏＩ断片を、表１に示したオリゴデオキシヌクレオチドの対をアニーリングすることによって作成したオリゴデオキシヌクレオチドリンカーに替えた。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
生成するプラスミドは、Ｇｐａ１のアミノ酸１〜４６７と哺乳類Ｇαサブユニットの５個のＣ−末端酸の間のインフレーム融合体をコードした（図５Ｃ）。５個のＣ−末端酸を欠いているＧｐａｐ１の切断型バージョンを発現するためのプラスミドは、上記と同様に（表１）リンカーの挿入によるコドン位置４６８における停止コドンの導入によって作成した。
【００２９】
酵母株
酵母株ＭＭＹ９を作成して、７個の膜貫通ヘリックスレセプターとＧタンパク質の間の機能的相互作用を研究した。この株は、一般的な実験室株Ｗ３０３−１Ａ（遺伝子型：ＭＡＴａ  ｈｉｓ３  ａｄｅ２  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｕｒａ３  ｃａｎ１）から誘導された。フェロモン応答経路の活性化は、それぞれＦＵＳ１およびｌｅｕ２座に組込まれた２個のレポーター遺伝子ＦＵＳ１−ＨＩＳ３およびＦＵＳ１−ｌａｃＺによって監視した。ＦＡＲ１遺伝子をｆａｒ１Δ::ＵＲＡ３ＤＮＡ構築体を用いる１段階遺伝子置換によって欠失し、フェロモン応答経路を活性化した条件下でも成長が継続するようにした。ＳＳＴ２遺伝子をｓｓｔ２Δ::ＵＲＡ３ＤＮＡ構築体を用いて１段階遺伝子置換によって欠失して、この遺伝子によってコードされたＧＴＰアーゼ活性化機能によりＧタンパク質シグナル伝達のダウンレギュレーションを防止した。これらの操作のそれぞれの後、ｕｒａ３マーカーを、内部の２４３ｂｐ（ＥｃｏＲＶ〜ＳｔｕＩ）の欠失を有するＵＲＡ３遺伝子からなるｕｒａ３Δ断片を用いる形質転換によって回収した後、５−フルオロ−オロチン酸選択を行った。染色体ＧＰＡ１（Ｇα）遺伝子は、ｇｐａ１Δ::ＡＤＥ２ＤＮＡ構築体を用いる１段階遺伝子置換によって欠失した。
【００３０】
酵母株ＭＭＹ１１は、ｓｔｅ２Δ::Ｇ４１８ＲＤＮＡ構築体を用いる１段階遺伝子置換によって誘導し、ジェネテイシン耐性コロニーを選択し、この耐性コロニーはＳｔｅ２ｐアゴニストであるα−因子に応答できないことを確かめた。
【００３１】
レポーター遺伝子発現のアッセイ
アゴニストであるソマトスタチン（Ｓ−１４）、メラトニン、セロトニン、アデノシン５′−二リン酸（ＡＤＰ）およびウリジン５′−三リン酸（ＵＴＰ）は、Sigma社から入手した。α−因子は、Peptide and Protein Research, Exeter, 英国によって合成した。５′−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ）は、Research Biochemicals Internationalから入手した。
【００３２】
ＦＵＳ１−ＨＩＳ３発現のアッセイ  
逆ハロアッセイは、トリプトファンおよびウラシルを欠いている液体ＳＣ−グルコース（２％）培地中でＭＭＹ９細胞を初期安定相（ＯＤ６００≒４）まで成長させることによって行った。細胞（５×１０７）を、ＳＣ−グルコース寒天中２２．５cm×２２．５cmバイオアッセイ皿(Nunc)（１％）まで塗布し、５０℃まで平衡にした。この培地はトリプトファン、ウラシルおよびヒスチジンを欠き、１０ｍＭの３−アミノトリアゾールを補足し、０．１Ｍリン酸ナトリウムで緩衝してｐＨ７．０とした。抗生物質ディスクを固化寒天上に置き、一定量のアゴニスト溶液（１〜５μｌ）をそれぞれのディスクに加えた。プレートを３０℃で３日間インキュベーションした。
【００３３】
ＦＵＳ１−ｌａｃＺ発現のアッセイ
細胞抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性を、２回のアッセイによって測定した。第一のアッセイ（ＯＮＰＧアッセイ）では、細胞抽出物を、(37)に記載の基質ＯＮＰＧを用いてインキュベーションした。単位は、（Ａ４２０×１０００）／（ＯＤ６００×ｔ×ｖ）として定義した(25)。化学発光分析では、細胞を後期対数相まで成長させ、９６穴マイクロタイタープレート中で１μＭのα−因子の存在下または非存在下にて１００μｌＳＣ−ＷＨ培地で０．０２ＯＤ６００まで希釈した。インキュベーション（３０℃、６時間）の後、２０μlを取出し、２０μlアッセイ混合物（１２５ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．５、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２００μＭGalacton-Starβ−ガラクトシダーゼ基質(Tropix)、１０％（ｖ／ｖ）Sapphire II (Tropix)、１U／μlオキザリチカーゼ(Enzogenetics)）と混合した。インキュベーション（３０℃、１時間）の後、Top-countシンチレーションカウンター(Packard)で化学発光を測定した。
【００３４】
組合わせたＦＵＳ１−ｌａｃＺおよびＦＵＳ１−ＨＩＳ３発現のアッセイ
レポーター遺伝子のイン・ビボアッセイでは、細胞をトリプトファン、ウラシルおよびヒスチジンを欠く２００μlＳＣ−グルコース（２％）中で０．０２ＯＤ６００まで懸濁することによって誘導（ＣＰＲＧアッセイ）を行った。この培地にアゴニストと、更に１０ｍＭの３−アミノトリアゾールおよびβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）基質であるクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ；Boehringer）を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度まで補足した。色変化反応を可視化するため、培地を０．１Ｍリン酸ナトリウムでｐＨ７．０に緩衝した。アッセイは、９６穴マイクロタイタープレートフォーマットで行った。プレートを攪拌せずに２４時間インキュベーションし、５７０ｎｍにおける吸光度をVictorマイクロタイタープレートリーダー(Wallac)を用いて測定した。ＥＣ５０値（＋／−標準誤差）は、Robosageソフトウェアパッケージを用いて曲線フィッティング(curve-fitting)によって計算した。
【００３５】
本発明の研究で用いた酵母株

株                    遺伝子型                                        
Ｗ３０３−１Ａ           MATa his3 ade2 leu2 trp1 ura3 can1
ＭＭＹ９                 W303-1A fus1:FUS1-HIS3 FUS1-lacZ::LEU2
far1Δ::ura3Δ gpa1Δ::ADE2 sst2Δ::ura3Δ
ＭＭＹ１１               MMY9 ste2Δ::G418R 
【００３６】
実験１：酵母フェロモン経路を活性化するレセプター
この実験では、酵母フェロモン応答経路を活性化することができるレセプターの例として４個のヒトＧタンパク質に共役したレセプターを用いた。４個のレセプターは、メラトニンＭＬ１Ｂレセプター、セロトニン５ＨＴ１Ａレセプター、ソマトスタチンＳＳＴ２レセプター、およびプリン作動性ヌクレオチドレセプターＰ２Ｙ２であった。これらのレセプターを、上記の酵母株ＭＭＹ９で発現させた。この株は、ＳＳＴ２、ＦＡＴ１およびＧＰＡ１を欠失していたが、ＳＴＥ２によってコードされる内在性α−因子レセプターは保持していた。フェロモン応答経路の活性化は、２つの組込みレポーター遺伝子、すなわちヒスチジンを欠く培地中で成長読み出しを行うＦＵＳ１−ＨＩＳ１、およびβ−ガラクトシダーゼ読み出しを行うＦＵＳ１−ｌａｃＺを用いて監視した。これらのアッセイは、本明細書に上記している。本発明者らは、最初に内在性酵母ヘテロ三量体Ｇタンパク質（Ｇｐａ１ｐ／Ｓｔｅ４ｐ／Ｓｔｅ１８ｐ）を介するこれらのレセプターのシグナル伝達を検討した。レセプターを、高コピー数エピソームベクターを用いて強力なＰＧＫプロモーターから酵母株ＭＭＹ９で発現させた。図１において、パネルＡ〜Ｆは、野生型ＧＰＡ１遺伝子を発現するプラスミドｐＲＳ３１４−ＧＰＡ１（パネルＢ〜Ｆ）および更にレセプター発現構築体またはベクター、例えばｐＤＴ−ＰＧＫ（ベクター；パネルＢ）；ｐＦＬ６１−ＳＳＴ２（パネルＣ）；ｐＤＴ−ＰＧＫ−ＭＬ１Ｂ（パネルＤ）；ｐＤＴ−ＰＧＫ−Ｐ２Ｙ２（パネルＥ）；ｐＤＴ−ＰＧＫ−５−ＨＴ１Ａ（パネルＦ）と同時形質転換したＭＭＹ９細胞を用いて行った逆ハロアッセイを示す。ＦＵＳ１−ＨＩＳ３のアゴニスト依存活性化は、アゴニストをパネルＡに示す配置のフィルターディスクに下記の量を加える逆ハロアッセイによって測定した：３ｎＭソマトスタチン−１４（Ｓ−１４）；４０ｎＭメラトニン（Ｍｅｌ）；３ｎＭ  α−因子；１００ｎＭ  ＵＴＰ；４０ｎＭセロトニン（５−ＨＴ）。予想されたように、ＭＭＹ９を酵母フェロモンであるα−因子で処理したところ、内在性酵母レセプターＳｔｅ２ｐを刺激し、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３の発現を増加させ、ヒスチジンの非存在下でのハロの細胞成長させることができた（図１、パネルＢ）。同様に、ＭＬ１Ｂレセプター（パネルＤ）を発現するＭＭＹ９細胞は、メラトニンに応答して並びにα−因子に応答してＦＵＳ１−ＨＩＳ３を活性化した。ＳＳＴ２レセプターを発現する細胞（パネルＣ）はソマトスタチンに応答し、Ｐ２Ｙ２レセプターを発現する細胞（パネルＥ）はアゴニストＵＴＰに応答した。図１における細胞成長のゾーンは大きさが匹敵するものであるが、それぞれのレセプターには異なるモル量のアゴニストが必要であった。従って、ＭＬ１Ｂ、ＳＳＴ２およびＰ２Ｙ２レセプターは、内在性ＧαであるＧｐａ１ｐの活性化によって酵母フェロモン応答経路に共役することができる。５−ＨＴ１Ａレセプター発現構築体で形質転換したＭＭＹ９細胞は、アゴニストであるソマトスタチンに応答してＦＵＳ１−ＨＩＳ３を活性化せず、このレセプターはＧｐａ１ｐとほとんど相互作用しないかまたは機能的に相互作用することができないことを示していた。
【００３７】
実験２：レセプターへの酵母／哺乳類キメラ体の共役
この実験では、ある種のレセプターに対して、酵母フェロモン応答経路への共役の効率は、酵母と哺乳類Ｇαサブユニットとの間にキメラ体を作成することによって増強することができることを示す。一連のキメラＧαサブユニットであって、Ｇｐａ１ｐのＣ−末端ドメイン（Ｃ−末端の１４２個のアミノ酸）をラットＧα０、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３の相当する領域に置換した（図５(b)）。Ｇタンパク質サブユニットの適当な化学量論を得るため、キメラ体を動原体プラスミド上でコードし、ＧＰＡ１遺伝子のプロモーターから発現した。これにより、過剰のＧαによるＧβ／Ｇγによって伝達されたシグナルの消去が回避される(33)。これらの構築体を、実験に用いて、ＭＭＹ９細胞を、一対のプラスミドであって、一方がＧαサブユニットを発現し、第二のものがベクター（ｐＤＴ−ＰＧＫ）またはレセプター発現構築体ｐＦＬ６１−ＳＳＴ２、ｐＤＴ−ＰＧＫ−ＭＬ１Ｂ、ｐＤＴ−ＰＧＫ−Ｐ２Ｙ２またはｐＤＴ−ＰＧＫ−５−ＨＴ１Ａの一つであるもので動じ形質転換した。ＦＵＳ１−ｌａｃＺのアゴニスト依存性活性化を、発色性の細胞浸透性β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）基質であるクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ；Boehringer Mannheim）を補足した培地で細胞をインキュベーションすることによって測定した。３０℃で２４時間インキュベーションの後のこの基質の転換率を、分光光度法によって測定し、酵母Ｇαおよび４個のキメラ体の結果を図２Ａ〜Ｄに示す。２Ａ  Ｓｔｅ２ｐレセプター（ｐＤＴ−ＰＧＫ−形質転換細胞）；２Ｂ  ＳＳＴ２レセプター（ｐＦＬ６１−ＳＳＴ２）；２Ｃ  ＭＬ１Ｂレセプター（ｐＤＴ−ＰＧＫ−ＭＬ１Ｂ）；２Ｄ  ５−ＨＴ１Ａレセプター（ｐＤＴ−ＰＧＫ−５−ＨＴ１Ａ）。
【００３８】
予想されたように、α−因子は内在性Ｓｔｅ２ｐレセプターを刺激して、ＦＵＳ１−ｌａｃＺを誘導し、Ｇｐａ１ｐで最強の応答を誘導した（ＥＣ５０；５．２±０．４ｎＭ）。この値は、α−因子ペプチドに対するＳｔｅ２ｐの報告された親和性と一致している（Ｋｄ；１７ｎＭ）(３)。Ｇｐａ１／Ｇα０およびＧｐａ１／Ｇαｉ２キメラ体を発現するＭＭＹ９細胞も、高濃度のα−因子に応答してＦＵＳ１−ｌａｃＺを誘導するが、用量−応答曲線は少なくとも２対数単位だけ上方に移動し、Ｓｔｅ２ｐレセプターは野生型Ｇｐａ１ｐと比較してこれらのキメラ体とは余り効率的に相互作用しないことを示していた。Ｇｐａ１／Ｇαｉ１またはＧｐａ１／Ｇαｉ３を発現するＭＭＹ９細胞は、α−因子に応答してＦＵＳ１−ｌａｃＺを誘導しなかった。対照的に、ソマトスタチンＳＳＴ２レセプターは、総てのＧαｉキメラ体によってフェロモン応答経路に共役した（Ｇｐａ１ｐ、Ｇｐａ１／Ｇα０、Ｇｐａ１／Ｇαｉ１、Ｇｐａ１／Ｇαｉ２、およびＧｐａ１／Ｇαｉ３に対してそれぞれＥＣ５０値；４３０±４４ｎＭ；３００±３８ｎＭ；６５０±６５ｎＭ；３００±２２ｎＭ；および６３０±３０ｎＭ）。これにより、キメラＧαサブユニットは機能的であることが確かめられ、レセプターがフェロモン応答経路に共役することができないのはＧαＣ−末端領域との不和合性によることを示している。本発明者らは、キメラタンパク質を、これらのタンパク質総てに共通のＧｐａ１ｐのＮ−末端に指定されたポリクローン性抗体を用いて定量的ウェスタンブロット法（データは示さず）によって野生型Ｇｐａ１ｐに匹敵する量で産生することを確かめた。
【００３９】
他のレセプターの中、５−ＨＴ１ＡおよびＭＬ１Ｂは、いずれもＧｐａ１ｐを発現するものよりキメラＧαサブユニットを発現する細胞中でのフェロモン応答経路により効率的な共役を示した。５−ＨＴ１Ａレセプターは、Ｇｐａ１／Ｇα０を活性化することができる酵母中の配座を採用し、このレセプターがＧｐａ１ｐと不和合性であるかまたはほとんど和合しないという実験１からの仮定を支持している。注目に値することは、これらのレセプターが特定のキメラ体に対して特異的であり、例えばＭＬ１ＢはＧｐａ１／Ｇαｉ２を活性化するが、Ｇｐａ１／Ｇαｉ３は活性化せず、これらのキメラ体は調度１４個のアミノ酸位置で異なっているが、発現の水準はそれぞれの場合に同様である。シグナル伝達を野生型Ｇｐａ１ｐによって行うときには、ＦＵＳ１−ｌａｃＺは他のレセプターと比較してＰ２Ｙ２によっては余り誘導されず（データは示さず）、逆ハロアッセイでの同様な成長ゾーンを得るにはアゴニストのモル量を大きくする必要があることと一致している（図１）。Ｐ２Ｙ２アゴニスト応答は、Ｇαｉキメラ体のいずれによっても増強されなかった（データは示さず）。
【００４０】
実験３：Ｇα１６のＣ−末端領域を有するキメラ体
Ｇα１５／Ｇα１６サブユニットは、Ｇαサブユニットについて典型的であるよりもずっと広範囲のレセプターと相互作用することが報告されており、Ｇαｉ、ＧαｓまたはＧαｑと通常に相互作用するレセプターと共役する能力を有する(26)。Ｇｐａ１／Ｇα１６のＣ−末端キメラ体が完全長のＧα１６と同様な特性を示すときには、様々なレセプターをフェロモン応答経路に共役させることが期待できる。本発明者らは、上記の機能的キメラ体の発現に用いたのと同じ動原体性ベクターから誘導されるＧｐａ１／Ｇα１６のＣ−末端ドメインキメラ体をコードするプラスミドを構築した（ｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１／Ｇα１６；図５(b)；図６(h)）。Ｇｐａ１／Ｇα１６キメラ体を発現するＭＭＹ９細胞でのＦＵＳ１−ＬａｃＺ誘導の水準を、細胞抽出物を調製して、これらをＬａｃＺ基質であるｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ；材料および方法を参照）と共にインキュベーションすることによって測定した。Ｇｐａ１／Ｇα１６は、ＦＵＳ１−ＬａｃＺ発現を減少させ、β−ガラクトシダーゼ活性は７９±８単位となった（表２）。この水準は、Ｇαが存在しないため経路が構成的に活性化されるベクターで形質転換した対照細胞の活性（２３９±３０単位）と、野生型Ｇｐａ１ｐを産生する細胞での基礎活性（１９±４単位）との中間であった。従って、フェロモン応答経路は部分的に活性化され、ＧＰＡ１プロモーターからのＧｐａ１／Ｇα１６の発現を指定するこの構築体は、総ての遊離Ｇβ／Ｇγを隔絶することができないことを示している。
【００４１】
【表２】
2010279369.tif 000004
【００４２】
本発明者らは、一層強力なＴＥＦ１およびＧＰＤ１プロモーターからＧｐａ１／Ｇα１６を発現するため、構築体を更に作成した。これらは、ＦＵＳ１−ｌａｃＺ発現をＧｐａ１ｐ産生細胞に匹敵する水準に減少させた（表１）。図３において、様々なＧｐａ１／Ｇα１６発現構築体で形質転換したＭＭＹ９細胞または対照プラスミドをヒスチジンを補足した非選択的寒天プレート（パネルＡ）およびヒスチジンを欠きかつ３−アミノトリアゾールを補足した選択的寒天プレート（パネルＢ）にストリークした。ＴＥＦ−Ｇｐａ１／Ｇα１６およびＧＰＤ−Ｇｐａ１／Ｇα１６発現構築体は、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３レポーター遺伝子発現を減少させ、野生型ＧＰＡ１を発現するポジティブコントロールプラスミド（ｐＲＳ３１４−ＧＰＡ１）と同様にヒスチジン選択的培地上での成長を防止した。対照的に、ＧＰＡ１プロモーターを用いるＧｐａ１／Ｇα１６発現構築体（ｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１／Ｇα１６）は、ベクター形質転換細胞（対照）を用いる場合と同様にヒスチジン選択的条件下で成長を防止するのに十分にはＦＵＳ１−ＨＩＳ３発現を減少させることはできなかった。この結果は、上表にまとめたＯＮＰＧアッセイの結果と一致し、従って、２個のレポーター遺伝子、ＦＵＳ１−ｌａｃＺおよびＦＵＳ１−ＨＩＳ３は同様な挙動を示す。
【００４３】
しかしながら、Ｇｐａ１／Ｇα１６発現構築体のいずれを用いても、Ｓｔｅ２ｐレセプターは、細胞をα−因子で処理してもＦＵＳ１−ＬａｃＺを誘導しないので、フェロモン応答経路に共役するとは思われなかった（表１）。Ｇｐａ１／Ｇα１６と組合わせて他のレセプター（ＭＬ１Ｂ、５−ＨＴ１Ａ、Ｐ２Ｙ２またはＳＳＴ２）を発現するＭＭＹ９細胞も、ＦＵＳ１−ＬａｃＺのアゴニスト依存性誘導は示さなかった（データは示さず）。従って、Ｇｐａ１／Ｇα１６は、酵母Ｇβ／Ｇγ粒子がフェロモン応答経路を活性化するのを、恐らくはＧタンパク質三量体に構築することによって防止することができるが、活性化レセプターの存在下では遊離Ｇβ／Ｇγは放出されない。明らかに、Ｇｐａ１ｐのＮ−末端領域に融合した哺乳類Ｇαサブユニットから誘導される大きなＣ−末端ドメインを含むこの種のキメラ体を構築する方法は、一般的には総てのＧαサブユニットには適用可能ではないが、幾つかのＧαサブユニット（ＧαｉファミリーおよびＧαｓ）では上手く行くが、他のもの（例えば、Ｇα１６）では上手く行かない。Ｇｐａ１／Ｇα１６は、完全長Ｇα１６の重要な特性、すなわち他のＧαサブユニットよりずっと広範囲のレセプターと共役する特性を欠いている。この実験では、Ｇｐａ１／Ｇα１６のＣ−末端ドメインキメラタンパク質が細胞中に産生され、従ってＧタンパク質と共役したレセプターをフェロモン応答経路に共役することができないのは、レセプターとこのＧαサブユニットとの不和合性によることが確かめられている。
【００４４】
Ｇｐａ１／Ｇαｓキメラ体は、酵母ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）遺伝子の強力な構成的プロモーターから発現されるときには、成長ホルモン放出ホルモンレセプター(12)と共役することが報告されている。本発明者らは、上記と同様なＧｐａ１／ＧαｓおよびＧｐａ１／Ｇαｑキメラ体を構築し（図５Ｂ）、それらをＧＰＡ１遺伝子のプロモーターからＭＭＹ９細胞中で発現させた。本発明者らは、上記のＯＮＰＧアッセイの代わりに化学発光アッセイを用いてこれらの細胞中のＦＵＳ１−ＬａｃＺ活性をアッセイした。結果を、表３に示す。前の実験から予想されるように、ＧＰＡ１プロモーターからのＧｐａ１／Ｇα１６を発現する細胞は、Ｇｐａ１ｐを発現する対照細胞より著しく高い活性を示した。Ｇｐａ１／ＧαｓおよびＧｐａ１／Ｇαｑキメラ体は、これらがＧｐａ１ｐを発現する対照細胞より著しく高い活性を示す点でＧｐａ１／Ｇα１６と同様である。対照的に、ＧＰＡ１プロモーターからのＧｐａ１／Ｇα０、Ｇｐａ１／Ｇαｉ１、Ｇｐａ１／Ｇαｉ２、またはＧｐａ１／Ｇαｉ３を発現する細胞は、予想されたように、Ｇｐａ１ｐを発現する対照細胞に匹敵する活性を含んでいた。この実験では、野生型Ｇｐａ１ｐおよびＧｐａ１／Ｇα０キメラ体だけが、１μＭのα−因子と共にインキュベーションした細胞中のＦＵＳ１−ＬａｃＺ水準を増加させることによってＳｔｅ２ｐレセプターと共役した。これは、上記のＣＰＲＧアッセイの結果と一致している。この実験では、更に、Ｇｐａ１／Ｇα０、Ｇｐａ１／Ｇαｉ１、Ｇｐａ１／Ｇαｉ２、またはＧｐａ１／Ｇαｉ３キメラ体をＧＰＡ１プロモーターから発現させることができ、活性化レセプターの非存在下ではフェロモン応答経路の活性化を十分低くして、共役を検出することができるが、Ｇｐａ１／Ｇαｓ、Ｇｐａ１／ＧαｑおよびＧｐａ１／Ｇα１６キメラ体は発現されないことが確かめられている。
【表３】
2010279369.tif 000005
【００４５】
実験４：移植体法
哺乳類ＧαサブユニットのＣ−末端に対する小さな改質によってレセプター特異性を変化させることができると仮定すれば、上記のキメラ体よりも長いＧｐａ１ｐのＮ−末端領域および短い哺乳類Ｇαサブユニットの領域を用いる融合は、レセプターの特異性を更に変化させることができる(7)(40)(23)(18)。これにより、キメラ体がＧβ／Ｇγに対するアフィニティーを減少させるという問題を回避することができる。本発明者らは、「移植体」と命名される精製した組のＧｐａ１−Ｇα融合体を作成し、それらを哺乳類Ｇαのより長い領域を有するキメラ体と識別した（図５(B)）。これらの融合体は、Ｇα１６（ＥＩＮＬＬＣＯＯＨ）、Ｇαｑ（ＥＹＮＬＶＣＯＯＨ）またはＧαｓ（ＱＹＥＬＬＣＯＯＨ）の５個のＣ−末端残基によって置換されたＧｐａ１ｐの５個のＣ−末端残基（４６８ＫＩＧIIＣＯＯＨ）を有していた（図５(C)）。ＭＭＹ９細胞を、移植構築体と、および更にｐＤＴ−ＰＧＫ（異種レセプターを持たないベクター）またはレセプター発現構築体ｐＤＴ−ＰＧＫ−５−ＨＴ１Ａ、ｐＦＬ６１−ＳＳＴ２またはｐＤＴ−ＰＧＫ−Ｐ２Ｙ２と同時形質転換した。実験２と同様に、ＦＵＳ１−ＬａｃＺのアゴニスト依存活性化を、ＣＰＲＧを補足した培地で細胞をインキュベーションすることによって測定し、３０℃で２４時間インキュベーション後の生成物への転換率を分光光度法によって測定した。結果を、図４Ａ〜Ｄに示す。この実験は、移植体が、ＭＭＹ９細胞でのＦＵＳ１−ＬａｃＺ発現をＧＰＡ１プロモーターから発現するときに基底水準にまで減少させるので、Ｇβ／Ｇγと効率的に相互作用することができたことを示している。実験２および３のＣ−末端ドメインキメラ体とは対照的に、Ｇｐａ１−Ｇα１６、Ｇｐａ１−ＧαｑおよびＧｐａ１−Ｇαｓ移植体は総て、活性化Ｓｔｅ２ｐレセプターをフェロモン応答経路に共役させる能力を保持していたが、用量−応答曲線は、Ｇｐａ１ｐと比較して、移植体はＳｔｅ２ｐと余り効率的に相互作用しなかった（Ｇｐａ１−Ｇαｓ、Ｇｐａ１−Ｇα１６およびＧｐａ１−Ｇαｑに対して，それぞれＥＣ５０＝２５７±１３ｎＭ；７５±２ｎＭ；１０２±５ｎＭ）（図４Ａ）。酵母レセプターとは反対にヒトレセプターを用いると、移植体はＧαサブユニット／レセプター相互作用を改良した。Ｇｐａ１−Ｇαｑ移植体は、Ｇｐａ１ｐに比較してＰ２Ｙ２レセプターの共役を著しく増強し、Ｐ２Ｙ２は哺乳類細胞中のＧαｑを介してそのエフェクターホスホリパーゼＣβにシグナルを伝達するという知見と一致している。対照的に、Ｇｐａ１−Ｇαｓ移植体がＰ２Ｙ２をフェロモン経路に共役させる能力は、Ｇｐａ１ｐの能力と識別できなかった。
【００４６】
Ｇｐａ１−Ｇα１６は、４個のヒトレセプターの中３個を発現する（ＳＳＴ２、５−ＨＴ１Ａ、およびＰ２Ｙ２を発現するが、ＭＬ１Ｂは発現しない）細胞のアゴニスト応答を増強した。ＳＳＴ２レセプターと共にＧｐａ１−Ｇα１６移植体を動じ発現するＭＭＹ９細胞は、Ｇｐａ１ｐを産生する対照細胞に対して同様な応答を誘導するのに凡そ１０分の１のソマトスタチンを必要とする（Ｇｐａ１−Ｇα１６に対して、ＥＣ５０＝２７±０．８ｎＭ；Ｇｐａ１ｐに対してＥＣ５０＝４３０±４４ｎＭ）。５−ＨＴ１Ａレセプターは、野生型Ｇｐａ１ｐを介してＭＭＹ９細胞にシグナル伝達を行うことはできなかったが、Ｇｐａ１−Ｇα１６移植体を介してかなり良好にシグナル伝達を行うことができた。ＳＳＴ２レセプターについては、Ｇｐａ１−Ｇα１６移植体が最も効率的なＧαであり、５−ＨＴ１ＡおよびＰ２Ｙ２レセプターについては、Ｇｐａ１−Ｇα１６移植体は共役を支持することができたが、それぞれＧｐａ１／Ｇα０キメラ体およびＧｐａ１−Ｇαｑ移植体ほど効率的ではなかった。
【００４７】
Ｓｔｅ２ｐα−因子レセプターをコードするＳＴＥ２遺伝子が欠失すると、異種発現レセプターの共役効率を増強することができることが報告されている(34)。これは、Ｇ−タンパク質三量体についてのレセプター間の競争によるものである可能性がある。本明細書に記載のレセプターとＧαサブユニットの機能についてのレセプター競争の効果を検討するため、本発明者らはＭＭＹ９の誘導体であって、ＳＴＥ２遺伝子をＧ４１８Ｒ耐性マーカーを用いる組込み分断によって欠失したものを構築した。新規な株を、ＭＭＹ１１と命名した。この株を、ＭＭＹ９およびＭＭＹ１１細胞をＧｐａ１ｐ発現構築体ｐＲＳ３１４−ＧＰＡ１（図６(ｃ)）で形質転換する実験に用いて、ＣＰＲＧアッセイにおいて様々な濃度のα−因子と共にインキュベーションした（図７）。予想されたように、ＭＭＹ１１はα−因子へ応答することはできない。
【００４８】
ＭＭＹ１１を、上記と同様に、細胞をプラスミドの対であって、一方がＧαサブユニットを発現し、他方がレセプター発現構築体を発現するもので形質転換する実験に用いた。この実験は、本明細書で上記した４個のレセプター発現構築体（ｐＦＬ６１−ＳＳＴ２、ｐＤＴ−ＰＧＫ−ＭＬ１Ｂ、ｐＤＴ−ＰＧＫ−Ｐ２Ｙ２、およびｐＤＴ−ＰＧＫ−５−ＨＴ１Ａ）、および４個の他のレセプター発現構築体ｐＤＴ−ＰＧＫ−ＳＳＴ５、ｐＤＴ−ＰＧＫ−Ａ２ｂ、ｐＤＴ−ＰＧＫ−Ｐ２Ｙ１およびｐＤＴ−ＰＧＫ−５−ＨＴ１Ｄを含んでいた。本発明者らは、他の移植構築体を構築して、Ｃ−末端の５個のアミノ酸がＧα０（ＧＣＧＬＹＣＯＯＨ）、Ｇαｉ１（ＤＣＧＬＦＣＯＯＨ）、Ｇαｉ３（ＥＣＧＬＹＣＯＯＨ）、およびＧα１４（ＥＦＮＬＶＣＯＯＨ）のアミノ酸で置換したＧｐａ１ｐの改質バージョンを発現させた。これらを、本明細書で上記したＧαサブユニット発現構築体と共にこの実験で用いた。細胞にＣＰＲＧアッセイを施し、レセプターとＧαサブユニットとのそれぞれの組合せについてアゴニストに対する濃度応答曲線を決定した。フェロモン応答経路活性化が検出される場合には、半最大応答(half-maximal response)を得るのに要するアゴニスト濃度（ＥＣ５０±標準誤差；特に断らない限り総ての値はｎＭで示す）を曲線−フィッティング(curve-fitting)によって決定し、表４Ａに示す。曲線フィッティングを行うには不十分な弱い活性化が検出される場合には、これを表４Ａに示す（弱(weak)）。共役が見られないときには、これもまた示しておく（ＮＣ）。
【００４９】
比較のため、表４Ｂに、ＭＭＹ９で得られた同様なデータを示す。従って表４Ａと４Ｂの値の差は、異種発現レセプターによるシグナル伝達に対するＳｔｅ２ｐの効果によるものと思われる。
【表４】
2010279369.tif 000006
【表５】
2010279369.tif 000007
【００５０】
この実験は、実験２および３に記載のキメラＧｐａ１／Ｇαサブユニットと比較しても、共役効率はこの「移植体」型の改質によって実質的に増強することができることも示している。Ｓｔｅ２ｐレセプターの共役は、総ての移植体によって支持されたが、半最大応答を誘導するには更に高濃度のα−因子が必要であることによって示されるように、いずれも野生型Ｇｐａ１ｐほど有効ではなかった（表４Ｂ）。しかしながら、移植体は、一般に半最大応答を誘導するのに要したアゴニストの濃度が低いことによって示されるように、野生型Ｇｐａ１ｐ（表４Ａ）と比較してヒトレセプターの共役を増強した。移植体は、野生型Ｇｐａ１ｐと余り変わらないＧｐａ１−Ｇαｓを除き、いずれもＰ２Ｙ２シグナル伝達を増強した。最も有効なものは、Ｇｐａ１−Ｇαｉ３移植体であった。同様に、移植体は、Ｇｐａ１ｐまたはＧαｉ／ｏの長いＣ−末端ドメインを有するキメラ体と比較して、ＳＳＴ２、ＳＳＴ５、ＭＬ１Ｂ、５ＨＴ１ＤおよびＡ２ｂレセプターの共役効率を増強し、ＥＣ５０が１０分の１以下になることも多かった。Ｐ２Ｙ１レセプターは、移植体によってのみフェロモン応答経路に共役することができ、Ｇｐａ１−Ｇα１４移植体が最も効率的であった。（Ｇαｉ１およびＧαｉ２のＣ−末端の５個のアミノ酸は同一であるので）哺乳類Ｇα由来の配列の長さのみが異なるＧｐａ１／Ｇαｉ２キメラ体とＧｐａ１−Ｇαｉ１移植体とを比較することは有益である。ＭＬ１ＢおよびＳＳＴ２についてのＥＣ５０値は、Ｇｐａ１−Ｇαｉ１移植体ではＧｐａ１／Ｇαｉ２キメラ体でよりも１０倍以上大きかった。同じ比較は、Ｇｐａ１／Ｇαｉ３キメラ体とＧｐａ１−Ｇαｉ３移植体について行うことができる。明らかに、哺乳類Ｇαサブユニットの長さが短いキメラ体の方が、幾つかのレセプターの共役をより効率的に行うことができる。移植体が最適共役効率を示さなかった本研究における唯一のレセプターは、５ＨＴ１Ａであり、最も効率的な移植体はＧｐａ１−Ｇα０（ＭＭＹ１１でのＥＣ５０；１．０±０．１μＭ）であったが、最も効率的共役はＧｐａ１／Ｇα０キメラ体で得られた（ＭＭＹ１１でのＥＣ５０；３９０±１４ｎＭ）。これは、哺乳類レセプターの大半に対して、酵母での最も効率的共役はＧαサブユニットの移植体型で得られることを示している。
【００５１】
レセプターとＧαサブユニットとの同一の組合せについてＭＭＹ９およびＭＭＹ１１で得られたＥＣ５０を比較すると、Ｓｔｅ２ｐが含まれていないと、共役効率を約１０倍だけ増強することができることを示している。更に、ある種の和合性に乏しいレセプター／Ｇ−タンパク質の組合せに対しては、共役はＭＭＹ１１で見られたが、ＭＭＹ９では見られず、例えば５ＨＴ１ＡとＧｐａ１ｐであった。これは、Price et al. (34)によって報告されたＳＴＥ２遺伝子の欠失の以前観察された効果と完全に一致しており、上記の結論に影響を与えない。
【００５２】
本発明者らは、５個のＣ−末端アミノ酸を欠いている切断型Ｇｐａ１ｐ分子を発現させるためもう一つの構築体を作成した(図８Ｄ)。この切断突然変異体は、Ｇβ／Ｇγと結合するが、Ｓｔｅ２ｐをフェロモン応答経路に共役させることはできないことが報告されている(11)。予想されたように、この切断型Ｇｐａ１ｐ突然変異体のＭＭＹ９またはＭＭＹ１１細胞での発現により、低水準のＦＵＳ１−ＬａｃＺ活性を生じ、切断型突然変異体がＧβ／Ｇγと結合できることを示唆している（データは示さない）。ＣＰＲＧβ−ガラクトシダーゼアッセイでは、この突然変異体はＳｔｅ２ｐまたは他のレセプターをフェロモン応答経路に共役させることはできない（データは示さない）。これは、Hirsh et al. (11)の報告と完全に一致しており、Ｇ−タンパク質と共役したレセプターとの相互作用におけるＧαサブユニットの５個のＣ−末端アミノ酸の重要性が確かめられる。
【００５３】
本発明者らは、５個のＣ−末端アミノ酸がＧαｚ（ＹＩＧＬＧＣＯＯＨ）、Ｇα１２（ＤＩＭＬＱＣＯＯＨ）、およびＧα１３（ＱＬＭＬＱＣＯＯＨ）のもので置換されたＧｐａ１ｐの改質バージョンを発現させるためもう一つの構築体を作成した。ｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１−Ｇｐａ１−Ｇαｚ、ｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１−Ｇα１３、およびｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１−Ｇα１２構築体から発現したＧｐａ１−Ｇαｚ、Ｇｐａ１−Ｇα１３、および余り多くはないがＧｐａ１−Ｇα１２移植体は移植体は、Ｓｅｔ２ｐレセプターと共役することができたが、レセプター活性化の非存在下でもＦＵＳ１−ＬａｃＺの基礎水準の増加と関連しているので、Ｇβ／Ｇγを完全に隔絶することはできなかった（図８）。おそらく、これはＧβ／Ｇγとの相互作用の中断、または内在性酵母タンパク質またはプラスミド安定性の減少（下記参照）による活性化によるものと思われる。定量的免疫ブロッティングは、総ての移植体タンパク質が同様な水準にまで産生されることを示していた。本発明者らは、Ｇｐａ１−Ｇαｚ、Ｇｐａ１−Ｇα１３およびＧｐａ１−Ｇα１２発現カセットがｐＲＳ３０４に含まれているプラスミドも作成した。プラスミドｐＲＳ３０４は組込みベクターであり、一方ｐＲＳ３１４はエピソーム性の動原体ベクターである。ｐＲＳ３０４−Ｇｐａ１−Ｇαｚ、ｐＲＳ３０４−Ｇｐａ１−Ｇα１３およびｐＲＳ３０４−Ｇｐａ１−Ｇα１２構築体を、ＭＭＹ１１株のｔｒｐ１座への組込みを標的としてこの株へ形質転換した。生成する株は、遊離のエピソーム性プラスミド上に位置している遺伝子ではなく染色体上に位置した遺伝子からＧｐａ１−Ｇαｚ、Ｇｐａ１−Ｇα１３およびＧｐａ１−Ｇα１２移植体を発現した。図８に示した実験では、ＭＭＹ１１細胞をｐＲＳ３０４またはｐ３１４を基礎とした（それぞれ組込みおよびエピソーム性）プラスミドで形質転換して、Ｇｐａ１−Ｇαｚ（図８Ａ）、Ｇｐａ１−Ｇα１３（図８Ｂ）およびＧｐａ１−Ｇα１２移植体（図８Ｃ）を発現した。更に、細胞をＹｅｐ２４−ＳＴＥ２で形質転換して、ＳＴＥ２遺伝子を発現したが、これはＭＭＹ１１株から欠失されたものであった。様々な濃度のα−因子に応答するＦＵｓ１−ＬａｃＺの活性化は、ＣＰＲＧアッセイで測定した。この実験は、移植体発現構築物を染色体へ組込むことにより、レセプター活性化の非存在下でＦＵＳ１−ＬａｃＺ活性化の基礎水準を減少させることを示している。これにより、ヒトレセプター発現構築物を用いる実験においてＧｐａ１−Ｇαｚ、Ｇｐａ１−Ｇα１３およびＧｐａ１−Ｇα１２移植体が異種発現レセプターを共役させる能力について試験することができる（データは示さない）。
【００５４】
本発明者らは、移植体発現カセットをｐＲＳ３０４プラスミドへ移し、ＭＭＹ１１のゲノムへ組込む同じ方法を他の移植体について行った。これにより、Ｇｐａ１−Ｇα０、Ｇｐａ１−Ｇαｉ１、Ｇｐａ１−Ｇαｉ３、Ｇｐａ１−Ｇα１４、Ｇｐａ１−Ｇαｓ、Ｇｐａ１−Ｇαｑ、Ｇｐａ１−Ｇα１６、Ｇｐａ１−Ｇαｚ、Ｇｐａ１−Ｇα１３、およびＧｐａ１−Ｇα１２移植体の染色体コピーを発現する一連の株を得た。いずれの場合にも、本発明者らは、ＥＣ５０には影響を与えることなくレセプター活性化の非存在下でＦＵＳ１−ＬａｃＺ活性化の基礎水準を減少させる上記の現象を観察した。本発明者らは、この結果から、エピソーム性Ｇαサブユニット構築体は不安定であると結論する。本発明者らは、エピソーム性Ｇαプラスミドを含む細胞の個体群において、少数の細胞がこのプラスミドを喪失することがあると仮定している。これらの細胞は、ＵＲＡ３遺伝子を欠いているので、増殖しない。しかしながら、それらは総てのＧαサブユニットを欠いているので、フェロモン応答経路は構成的に活性化され、ＬａｃＺ酵素を蓄積する。従って、基礎ＦＵＳ１−ｌａｃＺ水準の上昇は全個体群で明らかであり、明らかなタンパク質水準の変化は見られない。Ｇαをコードする遺伝子の組込みコピーでは、これは起こらない。
【００５５】
全範囲の組込み移植体を含む株の組は、薬剤発見に関連すると思われるあらゆる種類の既知哺乳類Ｇαサブユニットを表している（ＧαｔおよびＧαｏｌｆ移植体は試験しなかった）。同じ移植体の構築法を、将来発見されるあらゆるＧαサブユニットを用いて行うことができる。
【００５６】
結論として、この方法は、ｉ）広範囲のＧαサブユニットに適用可能であり、ii）特に、Ｇα１６に適用可能であり、iii）Ｇｐａ１−Ｇα１６移植体は、少なくともある程度まで広範囲のレセプターと相互作用するＧα１６の特性を有しており、従って、生理学的に関連のあるＧタンパク質標的が知られていないオーファンレセプターの共役に選択されるＧαサブユニットであることができるので、以前に報告された手法に比較して著しい改良法である。
【００５７】
参考文献一覧
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【００５９】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】改質酵母(S. cerevisiae)ＭＭＹ９株のアゴニスト依存性成長。４種類のヒトＧタンパク質に共役したレセプターの一つを発現する細胞は、これらのレセプターが内因性酵母Ｇαサブユニット（Ｇｐａ１ｐ）と相互作用して、これを活性化することができることを示している。
【図２ａ】レセプターを発現する細胞と別種の改質Ｇαサブユニットを用いるレセプターアゴニストに応答するＦＵＳ１−ｌａｃＺレセプター遺伝子の誘導。
【図２ｂ】レセプターを発現する細胞と別種の改質Ｇαサブユニットを用いるレセプターアゴニストに応答するＦＵＳ１−ｌａｃＺレセプター遺伝子の誘導。
【図２ｃ】レセプターを発現する細胞と別種の改質Ｇαサブユニットを用いるレセプターアゴニストに応答するＦＵＳ１−ｌａｃＺレセプター遺伝子の誘導。
【図２ｄ】レセプターを発現する細胞と別種の改質Ｇαサブユニットを用いるレセプターアゴニストに応答するＦＵＳ１−ｌａｃＺレセプター遺伝子の誘導。
【図３】Ｇｐａ１／Ｇα１６キメラ体（Ｇα１６由来の大きなＣ−末端ドメインを含む）を発現する構築体は、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３レポーター遺伝子発現を基底水準まで減少させることを示す。
【図４ａ】Ｃ−末端の５個の残基が改質されたＧｐａ１ｐ（移植体）によって伝達されるレセプターアゴニストによるＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子のアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４ｂ】Ｃ−末端の５個の残基が改質されたＧｐａ１ｐ（移植体）によって伝達されるレセプターアゴニストによるＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子のアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４ｃ】Ｃ−末端の５個の残基が改質されたＧｐａ１ｐ（移植体）によって伝達されるレセプターアゴニストによるＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子のアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４ｄ】Ｃ−末端の５個の残基が改質されたＧｐａ１ｐ（移植体）によって伝達されるレセプターアゴニストによるＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子のアゴニスト依存性活性化を示す。
【図５】本発明の研究に用いたＧαサブユニット構築体の模式的表現。スイッチドメインには、陰影を付けている。括弧内の数字は、野生型Ｇαサブユニットのアミノ酸数を表す。Ｂ）のＧｐａ１／Ｇαキメラ体は、下記のようなＣ−末端領域（区画を設けた）を含んでいた：Ｇαｉ１（２１２〜３５４），Ｇαｉ２（２１３〜３５５），Ｇαｉ３（２１２〜３５４），Ｇα０（２１３〜３５４），Ｇα１６（２２１〜３７４），Ｇαｓ（２３５〜３９４），Ｇαｑ（２１１−３５３）。
【図６ａ】本発明の研究に用いたある種のプラスミド構築体の模式的表現（プラスミドマップ）。
【図６ｂ】本発明の研究に用いたある種のプラスミド構築体の模式的表現（プラスミドマップ）。
【図６ｃ】本発明の研究に用いたある種のプラスミド構築体の模式的表現（プラスミドマップ）。
【図６ｄ】本発明の研究に用いたある種のプラスミド構築体の模式的表現（プラスミドマップ）。
【図６ｅ】本発明の研究に用いたある種のプラスミド構築体の模式的表現（プラスミドマップ）。
【図６ｆ】本発明の研究に用いたある種のプラスミド構築体の模式的表現（プラスミドマップ）。
【図６ｇ】本発明の研究に用いたある種のプラスミド構築体の模式的表現（プラスミドマップ）。
【図６ｈ】本発明の研究に用いたある種のプラスミド構築体の模式的表現（プラスミドマップ）。
【図７】アゴニストであるα−因子を用いるインキュベーションに応答してｐＲＳ３１４−Ｇｐａ１で形質転換したＭＭＹ９（ＳＴＥ２）およびＭＭＹ１１（ΔＳＴＥ２）細胞におけるＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子の活性を示す。
【図８ａ】移植体Ｇｐａ１−Ｇαｚ（図８ａ）、Ｇｐａ１−Ｇα１３（図８ｂ）、およびＧｐａ１−Ｇα１２（図８ｃ）を発現するエピソーム性または組込み構築体を含む同質遺伝子的酵母株の比較を示す。細胞は、プラスミド（Ｙｅｐ２４−ＳＴＥ２）で形質転換してＳｔｅ２ｐを発現して、α−因子に応答してＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子の活性化を欠失することができるようにすること以外は内在性ＳＴＥ２遺伝子を欠失した。
【図８ｂ】移植体Ｇｐａ１−Ｇαｚ（図８ａ）、Ｇｐａ１−Ｇα１３（図８ｂ）、およびＧｐａ１−Ｇα１２（図８ｃ）を発現するエピソーム性または組込み構築体を含む同質遺伝子的酵母株の比較を示す。細胞は、プラスミド（Ｙｅｐ２４−ＳＴＥ２）で形質転換してＳｔｅ２ｐを発現して、α−因子に応答してＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子の活性化を欠失することができるようにすること以外は内在性ＳＴＥ２遺伝子を欠失した。
【図８ｃ】移植体Ｇｐａ１−Ｇαｚ（図８ａ）、Ｇｐａ１−Ｇα１３（図８ｂ）、およびＧｐａ１−Ｇα１２（図８ｃ）を発現するエピソーム性または組込み構築体を含む同質遺伝子的酵母株の比較を示す。細胞は、プラスミド（Ｙｅｐ２４−ＳＴＥ２）で形質転換してＳｔｅ２ｐを発現して、α−因子に応答してＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子の活性化を欠失することができるようにすること以外は内在性ＳＴＥ２遺伝子を欠失した。
【図１】
2010279369.tif 000008
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４ａ】
2010279369.tif 000014
【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
2010279369.tif 000025
【図６ｈ】
2010279369.tif 000026
【図７】
2010279369.tif 000027
【図８ａ】
2010279369.tif 000028
【図８ｂ】
2010279369.tif 000029
【図８ｃ】
2010279369.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月15日(2010.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全長のSaccharomyces cerevisiaeＧα（Ｇｐａ１ｐ）アミノ酸配列において、Ｇｐａ１ｐのＣ−末端１０アミノ酸内の連続した５個のアミノ酸位置が、異種Ｇαタンパク質のＣ−末端１０アミノ酸中の相当する連続した５個のアミノ酸で置換されてなる配列からなる、キメラＧαタンパク質。
【請求項２】
Ｇｐａ１ｐのＣ末端５アミノ酸が、異種Ｇαタンパク質のＣ−末端５アミノ酸で置換されてなる、請求項１に記載のキメラＧαタンパク質。
【請求項３】
Saccharomyces cerevisiaeＧα（Ｇｐａ１ｐ）タンパク質のＮ−末端４６７アミノ酸と、
Ｃ末端に、異種Ｇαタンパク質由来のＣ−末端５アミノ酸と
を含んでなる、キメラＧαタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラＧαタンパク質をコードする、ヌクレオチド。
【請求項５】
異種Ｇタンパク質結合レセプターをコードするヌクレオチド配列と、請求項４に記載の核酸分子とを含んでなる、形質転換酵母細胞。
【請求項６】
目的とする化合物を請求項５に記載の細胞と接触させ、細胞の成長応答を観察することを含んでなる、レセプターと相互作用することができる化合物のスクリーニング法。
【請求項７】
細胞が更にレポーター遺伝子を含んでなり、かつ、レポーター遺伝子生成物の産生を観察する段階を含む、請求項６に記載の方法。