(57)【要約】【課題】本発明は、核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体の製造方法を提供する。【解決手段】本発明の製造方法は、セレックス法によって核酸リガンドを同定し、核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させる方法である。本発明はさらに、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合した１または２種以上の核酸リガンドからなる複合体を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体。
【請求項２】
核酸リガンドは核酸候補混合物から与えられた標的のリガンドとして、
ａ）核酸候補混合物に比較して標的に対する親和性が高い核酸が候補混合物の残部から分配できるように核酸候補混合物を標的と接触させ、
ｂ）親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配し、ついで
ｃ）親和性が高い核酸を増幅させてリガンドが濃縮された核酸混合物を得ることによって同定される「請求項１」記載の複合体。
【請求項３】
さらにｄ）工程ｂ）およびｃ）の反復からなる「請求項２」の複合体。
【請求項４】
核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物からなる「請求項１」記載の複合体。
【請求項５】
非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコール、デキストラン、アルブミン、およびマグネタイトからなる群より選択される「請求項４」記載の複合体。
【請求項６】
非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールである「請求項４」記載の複合体。
【請求項７】
核酸リガンドおよび親油性化合物からなる「請求項１」記載の複合体。
【請求項８】
親油性化合物はコレステロール、ジアルキルグリセロール、およびジアシルグリセロールからなる群より選択される「請求項７」記載の複合体。
【請求項９】
親油性化合物はコレステロールである「請求項８」記載の複合体。
【請求項１０】
親油性化合物はジアルキルグリセロールである「請求項８」の複合体。
【請求項１１】
さらに脂質構築体からなる「請求項９」記載の複合体。
【請求項１２】
脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項１１」記載の複合体。
【請求項１３】
脂質二重層小胞はリポソームである「請求項１２」記載の複合体。
【請求項１４】
さらに脂質構築体からなる「請求項７」記載の複合体。
【請求項１５】
脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項１４」記載の複合体。
【請求項１６】
脂質二重層小胞はリポソームである「請求項１５」記載の複合体。
【請求項１７】
さらに脂質構築体からなる「請求項１０」記載の複合体。
【請求項１８】
脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項１７」記載の複合体。
【請求項１９】
脂質構築体はリポソームである「請求項１８」記載の複合体。
【請求項２０】
さらに脂質構築体からなる「請求項６」記載の複合体。
【請求項２１】
脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項２０」記載の複合体。
【請求項２２】
脂質二重層小胞はリポソームである「請求項２１」記載の複合体。
【請求項２３】
核酸リガンドは上記リポソームの内部内に封入される「請求項１６」記載の複合体。
【請求項２４】
核酸リガンドは上記リポソームの外部に非共有結合的に結合される「請求項１６」記載の複合体。
【請求項２５】
核酸リガンドは第二の親油性化合物に共有結合で結合される「請求項１６」記載の複合体。
【請求項２６】
核酸リガンドはリンカーを介して第二の親油性化合物に結合される「請求項２５」記載の複合体。
【請求項２７】
核酸リガンドはリポソームの外部表面から突出している「請求項２５」記載の複合体。
【請求項２８】
核酸リガンドは、リポソームの内部に突出している「請求項２５」記載の複合体。
【請求項２９】
さらに治療用または診断用物質からなる「請求項１６」記載の複合体。
【請求項３０】
治療用物質は、リポソームの内部に封入されている「請求項２９」記載の複合体。
【請求項３１】
治療用または診断用物質はリポソームの膜に結合している「請求項２９」記載の複合体。
【請求項３２】
治療用もしくは診断用物質はリポソームの外部表面に結合している「請求項２９」記載の複合体。
【請求項３３】
核酸リガンドは予め定められた位置に対して複合体を標的化する「請求項１」記載の複合体。
【請求項３４】
複合体の薬物動態学的性質が核酸リガンド単独に比較して改良されている「請求項１」記載の複合体。
【請求項３５】
核酸リガンドのセレックス標的は細胞間のセレックス標的である「請求項１」記載の複合体。
【請求項３６】
核酸リガンドのセレックス標的は細胞内のセレックス標的である「請求項１」記載の複合体。
【請求項３７】
核酸リガンドの細胞内取り込みが核酸リガンド単独に比較して改良されている「請求項３６」記載の複合体。
【請求項３８】
さらに治療用または診断用物質からなる「請求項６」記載の複合体。
【請求項３９】
治療用または診断用物質はポリエチレングリコールに結合している「請求項３８」記載の複合体。
【請求項４０】
治療用または診断用物質はポリエチレングリコールに共有結合で結合している「請求項３９」記載の複合体。
【請求項４１】
核酸リガンドは親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に共有結合で結合している「請求項１」記載の複合体。
【請求項４２】
核酸リガンドは親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に非共有結合的に結合している「請求項１」記載の複合体。
【請求項４３】
核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体の製造方法において、核酸リガンドは核酸候補混合物から与えられた標的のリガンドとして、
ａ）核酸候補混合物に比較して標的に対する親和性が高い核酸が候補混合物の残部から分配できるように核酸候補混合物を標的と接触させ、
ｂ）親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配し、ついで
ｃ）親和性が高い核酸を増幅させてリガンドが濃縮された核酸混合物を得ることにより同定し、ついで、
ｄ）同定された核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合させる方法。
【請求項４４】
複合体は核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物からなる「請求項４３」記載の方法。
【請求項４５】
非免疫原性高分子量化合物は、ポリエチレングリコール、デキストラン、アルブミン、およびマグネタイトからなる群より選択される「請求項４４」記載の方法。
【請求項４６】
非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールである「請求項４５」記載の方法。
【請求項４７】
複合体は核酸リガンドおよび親油性化合物からなる「請求項４３」記載の方法。
【請求項４８】
親油性化合物はコレステロール、ジアルキルグリセロールおよびジアシルグリセロールからなる群より選択される「請求項４７」記載の方法。
【請求項４９】
親油性化合物はコレステロールである「請求項４８」記載の方法。
【請求項５０】
親油性化合物はジアルキルグリセロールである「請求項４８」の方法。
【請求項５１】
複合体はさらに脂質構築体からなる「請求項４９」記載の方法。
【請求項５２】
脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項５１」記載の方法。
【請求項５３】
脂質二重層小胞はリポソームである「請求項５２」記載の方法。
【請求項５４】
複合体はさらに脂質構築体からなる「請求項５０」記載の方法。
【請求項５５】
複合体はさらに脂質二重層小胞からなる「請求項５４」記載の方法。
【請求項５６】
脂質二重層小胞はリポソームである「請求項５５」記載の方法。
【請求項５７】
核酸リガンドはリポソームの外部表面から突出している「請求項５６」記載の方法。
【請求項５８】
複合体はさらに脂質構築体からなる「請求項４７」記載の方法。
【請求項５９】
脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項５８」記載の方法。
【請求項６０】
脂質二重層小胞はリポソームである「請求項５９」記載の方法。
【請求項６１】
核酸リガンドはリポソームの外部表面から突出している「請求項６０」記載の方法。
【請求項６２】
複合体は、さらに治療用もしくは診断用物質からなる「請求項６０」記載の方法。
【請求項６３】
核酸リガンドは予め定められた位置に対して複合体を標的化する「請求項４３」記載の方法。
【請求項６４】
複合体の薬物動態学的性質が核酸リガンド単独に比較して改良されている「請求項４３」記載の方法。
【請求項６５】
複合体は、さらに治療用もしくは診断用物質からなる「請求項４６」記載の方法。
【請求項６６】
治療用または診断用物質はポリエチレングリコールに結合している「請求項６５」記載の方法。
【請求項６７】
核酸リガンドの薬物動態学的性質を改良する方法において、
核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させて核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体を形成させること、および
この複合体を患者に投与することからなる方法。
【請求項６８】
細胞内セレックス標的を有する核酸リガンドの細胞内取り込みを改良する方法において、
核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させて核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体を形成させること、および
この複合体を患者に投与することからなる方法。
【請求項６９】
治療用または診断用物質を患者における予め定められた生物学的標的に標的化する方法において、
治療用または診断用物質を核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体に結合させ、この場合、核酸リガンドは特定の予め定められた生物学的標的に結合するセレックス標的を有し、核酸リガンドは複合体の外部に結合していて、この複合体を患者に投与することからなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、セレックス（ＳＥＬＥＸ）法により核酸リガンドを同定し、この核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合させることによって核酸と親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体を製造する方法に関する。本発明はさらに、核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させて複合体を形成させることによって、核酸リガンドの薬物動態学的性質を改良することに関する。本発明はさらに、核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体に治療用または診断用物質を結合させることにより上記治療用または診断用物質を特定の予め定められた生物学的標的に対してターゲッティングする方法において、核酸リガンドは上記特定の予め定められた標的と結合したセレックス標的を有し、核酸リガンドは複合体の外部に結合されている方法に関する。本発明はまた、１または２以上の核酸リガンドが親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合してなる複合体も包含する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ａ．セレックス
核酸は一義的に情報的役割を有するというのが長年にわたり定説であった。セレックスと呼ばれ、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的発生法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  として知られる方法によって、核酸はタンパク質と違わない三次元構造的多様性を有することが明らかにされてきた。セレックスは、標的分子に対して高度に特異的な結合性を有する核酸分子のインビトロ発生法であり、１９９０年０６月１１日に出願されて現在は放棄された米国特許出願一連番号第０７／５３６，４２８号（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、１９９１年０６月１０日に出願された米国特許出願一連番号第０７／７１４，１３１号（発明の名称：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）、現在は米国特許第５，４７５，０９６  号、１９９２年０８月１７日に出願された米国特許出願一連番号第０７／９３１，４７３号（発明の名称：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）、現在は米国特許第５，２７０，１３６  号（ＰＣＴ／  ＵＳ９１／０４０７８も参照）に記載されている。これらはいずれも引用により本明細書にとくに導入される。本明細書においては包括的にセレックス特許出願と呼ばれるこれらの各出願には、任意所望の標的分子に対する核酸リガンドを作成する基本的に新規な方法が記載されている。セレックス法では、それぞれがユニークな配列を有し、所望の標的化合物または分子に特異的に結合する性質を有し、核酸リガンドと呼ばれる１群の生成物が提供される。セレックスで同定された核酸リガンドはそれぞれ与えられた標的化合物または分子の特異的なリガンドである。セレックスは、核酸が実際にモノマーであれポリマーであれ任意の化学的化合物のリガンドとして作用（特異的結合ペアの形成）するのに十分多様な二次元および三次元構造の形成能ならびにそのモノマー内に利用可能な十分の化学的多様性を有するというユニークな洞察に基づくものである。任意のサイズまたは組成の分子が標的になりうる。
【０００３】
セレックス法は、実際に任意所望の規準の結合親和性および選択性を達成するために同一の一般的選択スキームを用い、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、分配および増幅の段階的反復を包含する。核酸混合物、好ましくは無作為化された配列のセグメントからなる混合物に出発し、セレックス法は、混合物を標的と結合に有利な条件下に接触させ、標的分子に特異的に結合した核酸から非結合核酸を分配し、核酸−  標的複合体を解離させ、核酸−  標的複合体から解離した核酸を増幅させ、リガンドが濃縮された核酸混合物を得て、ついで結合、分配、解離および増幅の工程を所望の回数再反復して、標的分子に対して高度に特異的な高度に親和性の核酸リガンドを得る工程を包含する。
【０００４】
化学的化合物としての核酸は広い範囲の形状、サイズおよびコンフィギュレーションを形成することが可能であり、生物学的系において核酸が示すよりもはるかに広いレパートリーの結合や他の機能を発揮できることがセレックス法により証明されたと本発明者らは認識している。
【０００５】
セレックスまたはセレックス様方法は、任意の与えられた標的に対する核酸リガンドの同定を可能にするのと同様の様式で、任意の選ばれた反応を促進できる核酸の同定に使用できることを本発明者らは認識するに至った。本発明者らは、理論的には、ほぼ１０１３〜１０１８個の核酸からなる候補混合物中に、広範囲の多様な物理的および化学的相互作用のそれぞれを促進するのに適当な形状をもつ少なくとも１個の核酸が存在すると考えている。
【０００６】
基本セレックス法は多くの特定の目的を達成するために改良されてきた。たとえば、１９９２年１０月１４日に出願された米国特許出願一連番号第０７／９６０，０９３号（発明の名称：Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）には特異的な構造特性を有する核酸分子たとえばベントＤＮＡを選択するためのゲル電気泳動と組合わせたセレックスの使用が記載されている。１９９３年０９月１７日に出願された米国特許出願一連番号第０８／１２３，９３５号（発明の名称：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）には、標的分子に対する結合および／または光架橋および／または光不活性化を可能にする光反応基を含有する核酸リガンドを選択するセレックスに基づく方法が記載されている。１９９３年１０月０７日に出願された米国特許出願一連番号第０８／１３４，０２８号（発明の名称：Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｆｆｅｉｎ）には、非ペプチドであってもよいきわめて類似した分子間の識別が可能な高度に特異的な核酸リガンドを同定する、カウンターセレックス（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法が記載されている。１９９３年１０月２５日出願の米国特許出願一連番号第０８／１４３，５６４号（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ）には、標的分子に対して高親和性および低親和性を有するオリゴヌクレオチドの間の高度に効率的な分配を達成するセレックスに基づく方法が記載されている。
【０００７】
セレックス法は、リガンドに対して改良された特性、たとえばインビボ安定性の改良または送達特性の改良を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基位置の化学的置換が包含される。修飾ヌクレオチドを含むセレックスで同定される核酸リガンドについては、１９９３年０９月０８日出願の米国特許出願一連番号第０８／１１７，９９１号（発明の名称：Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）にピリミジンの５−  および２’−  位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。上記米国特許出願一連番号第０８／１３４，０２８号には２’−アミノ（２’−ＮＨ２），２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）により修飾された１もしくは２個以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドが記載されている。１９９４年０６月２２日に出願された米国特許出願一連番号第０８／２６４，０２９号（発明の名称：Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）には様々な２’−  修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。
【０００８】
セレックス法は、１９９４年０８月０２日出願の米国特許出願一連番号第０８／２８４，０６３号（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＳＥＬＥＸ）ならびに１９９４年０４月２８日に出願された米国特許出願一連番号第０８／２３４，９９７号（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｂｌｅｎｄｅｄ  ＳＥＬＥＸ）にそれぞれ記載されているように、選ばれたオリゴヌクレオチドの他の選ばれたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチドの機能性単位との結合を包含する。これらの出願は、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状および他の性質、ならびに効率的な増幅および複製特性を、他の分子の望ましい性質と組合わせることを可能にする。基本的セレックス操作の修飾を記述する上記特許出願のそれぞれは引用によりそれらの全体がとくに本明細書に導入される。
【０００９】
Ｂ．脂質構築体
脂質二重層小胞は、極性（親水性）および非極性（親油性）部分を有する個々の分子から主として形成される、閉鎖され、液体が充填された顕微鏡的な球体である。親水性部分は、ホスファト、グリセリルホスファト、カルボキシ、スルファト、アミノ、ヒドロキシ、コリンまたは他の極性基から構成できる。親油性基の例には飽和または不飽和炭化水素たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基がある。ステロール（たとえばコレステロール）および他の医薬的に許容されるアジュバント（α−  トコフェロールのような酸化防止剤を包含する）も小胞の安定性の改良または他の所望の性質の付与のため包含させることができる。
【００１０】
リポソームはこれらの二重層小胞のサブセットであり、脂肪酸鎖からなる２つの疎水性尾部を含むリン脂質分子から主として構成される。水に暴露されると、これらの分子は自然に整列して球状の二層の膜を形成し、各層における分子の親油性末端は膜の中心に会合し、反対側の極性末端は二重層膜のそれぞれ内側および外側の表面を形成する。すなわち、膜はいずれの側も親水性の表面を提供し、一方、膜の内部は親油性の媒体を構成する。これらの膜は内部の水性空間の周囲に、水の薄い層で分離された同心球状の一連の膜として玉葱とあまり変わらない様式で配列される。これらの多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）は剪断力の適用によって小さなもしくは単ラメラ小胞（ＵＶ）に変換できる。
【００１１】
リポソームの治療的使用には、遊離の形態では通常毒性の薬物の送達が包含される。リポソーム型では、毒性の薬物は遮蔽され、その薬物に感受性の組織から隔離され、選択された領域に標的化される。リポソームはまた治療的に、長時間にわたって薬物を放出させて投与回数を減らすために使用される。さらに、リポソームは、通常静脈内送達に不適当な疎水性または両親媒性の薬物の水性分散剤の形成方法を提供することができる。
多くの薬物および造影剤が治療的または診断的可能性をもつためにはそれらが生体内の適当な場所に送達されることが必要であり、したがって、リポソームは注射により持続放出および特定の細胞タイプまたは生体部分への薬物送達の基盤を容易に形成することができる。封入された薬物を選択された宿主組織に標的化し感受性の組織から隔離するためにはリポソームを用いる幾つかの技術を採用することができる。これらの技術には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷およびそれらの投与経路の操作が包含される。ＭＬＶは主としてそれらが比較的大きいために、細網内皮系（主として、肝臓および脾臓）によって通常、迅速に取り込まれる。一方、ＵＶは、ＭＬＶに比較して循環時間の増大、クリアランス速度の低下および生物分布の上昇を示すことが見出されている。
【００１２】
リポソームの受動送達には静脈内、皮下、筋肉内および局所投与のような様々な投与経路が使用される。各経路によって、リポソームの局在には差が生じる。
選ばれた標的領域に対してリポソームを能動的に方向づけるために用いられる２つの通常の方法には、リポソームの表面への抗体または特異的な受容体リガンドの付着がある。抗体はそれらの相当する抗原に高度な特異性を有することが知られていてリポソームの表面に結合されてきたが、結果は多くの場合あまり成功していない。しかしながら、抗体を用いないでリポソームを腫瘍に標的化する一部の努力は成功している（たとえば米国特許第５，０１９，３６９号参照）。
【００１３】
研究者らによって精力的に追究された開発領域は、特定の細胞タイプにのみでなく、細胞の細胞質さらには核への薬剤の送達である。これはＤＮＡ，ＲＮＡ，リボザイムおよびタンパク質のような生物学的物質の送達にとくに重要である。
【００１４】
この領域における有望な治療的研究には疾患の処置のためのアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用が包含される。しかしながら、アンチセンス技術の効果的な適用に際して遭遇する大きな問題は、ホスホジエステル型のオリゴヌクレオチドが体液内でまた細胞内および細胞外酵素たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって、標的細胞に到達する前に速やかに分解されることである。静脈内投与も腎臓による血流からの速やかなクリアランスを生じ、細胞内に有効な薬物濃度を生成させるには取り込みが不十分である。
リポソームによる封入はオリゴヌクレオチドを分解酵素から保護し、リポソームの貪食の結果として、循環半減期は増大し、取り込み効率は上昇する。
【００１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させた研究が、これまでに数例報告されている。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内物質としてのみ有効である。上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドがポリエチレングリコールスペーサーを介して葉酸に連結されたリポソーム（葉酸−ＰＥＧ−リポソーム）に封入され、葉酸受容体誘導エンドサイトーシスによって培養ＫＢ細胞中に送達されている［Ｗａｎｇら（１９９５）９２：  ３３１８−３３２２］。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合で結合した親油性化合物が文献に記載されている（ＥＰ４６２  １４５  Ｂ１）。
【発明の概要】
【００１６】
発明の概要
本発明は、核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体を製造する方法において、核酸候補混合物から与えられた標的のリガンドである核酸リガンドを（ａ）核酸候補混合物を標的と接触させ、（ｂ）上記候補混合物のメンバーを標的に対する親和性に基づいて分配し、ついで（ｃ）選ばれた分子を増幅させて標的に対する結合親和性が比較的に高い核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る方法によって同定し、この同定された核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合させることからなる方法を提供する。
【００１７】
他の実施態様においては、本発明は細胞内セレックス標的を有する核酸リガンドの細胞内取り込みを改良する方法において、核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させて核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体を形成させ、この複合体を患者に投与することによる方法を提供する。
【００１８】
他の実施態様においては、本発明は核酸リガンドの薬物動態学的性質を改良する方法において、核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させ核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体を形成させこの複合体を患者に投与することによる方法を提供する。
他の実施態様においては、本発明は患者における特定の予め定められた生物学的標的に対して治療用または診断用物質をターゲッティングする方法において、治療用または診断用物質を核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体に結合させ、この核酸リガンドは特定の予め定められた生物学的標的に結合したセレックス標的を有し、核酸リガンドは複合体の外部に結合されていて、この複合体を患者に投与することからなる方法を提供する。
【００１９】
本発明の目的は、１または２個以上の核酸リガンドが親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合してなる複合体およびその製造方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合して薬物動態学的性質が改良された１または２個以上の核酸リガンドを提供する。本発明の他の態様においては、親油性化合物は脂質構築体である。
【００２０】
この実施態様においては、脂質構築体は好ましくは脂質二重層小胞であり、とくに好ましくはリポソームである。本発明のある実施態様においては、親油性化合物はコレステロール、ジアルキルグリセロール、またはジアシルグリセロールである。本発明の他の実施態様においては、非免疫原性高分子量化合物はＰＥＧである。本発明の他の実施態様においては、非免疫原性高分子量化合物はマグネタイトである。好ましい実施態様においては、核酸リガンドはセレックス法によって同定される。
【００２１】
本発明の実施態様においては、核酸リガンド（単数または複数）と結合したコレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、ＰＥＧ，またはマグネタイトからなる複合体が意図され、この場合核酸リガンド（単数または複数）は標的化能によって働くことができる。
【００２２】
本発明の実施態様においては、内部コンパートメントを限定する膜をもつタイプのたとえば脂質二重層小胞のような脂質構築体からなり、脂質構築体と結合した核酸リガンドは脂質構築体の膜と結合しているかまたはコンパートメント内に封入されている複合体が意図される。核酸リガンドが膜と結合している実施態様においては、核酸リガンドは膜の内部表面部分または外部表面部分に結合して、核酸リガンドは小胞の内部または外部に突出する。核酸リガンドが複合体の外部に突出した実施態様においては、核酸リガンドは標的化能によって働くことができる。非免疫原性高分子量化合物も膜に結合することができる。一実施態様においては、核酸リガンドは非免疫原性高分子量化合物に結合し、これが膜に結合する。膜はさらに、核酸リガンドに結合していない非免疫原性高分子量化合物と結合していてもよい。
【００２３】
複合体の核酸リガンドが標的化能によって働く実施態様においては、複合体には治療用または診断用物質を導入または結合させることができる。一実施態様においては治療用物質は薬物である。別の実施態様においては、治療用または診断用物質は１または２以上の付加的な核酸リガンドである。異なる標的に特異的な核酸リガンドを複合体の外表面から突出させることができる。複合体は、同一の標的上の異なるセレックス標的に特異的な１または２以上の核酸リガンドをその外部表面から突出させることができる。
【００２４】
これらの目的および他の目的ならびに本発明の本質、範囲および利用については以下の説明および請求の範囲から本技術分野の熟練者には自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｈ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｉ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｊ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｋ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｌ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｍ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｎ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｏ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｐ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｑ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｒ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｓ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｔ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｕ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｖ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｗ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｘ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図１Ｙ】図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５６，２２５Ｔ３，２２５Ｔ３Ｎ，Ｔ−Ｐ４，ＮＸ−２５６−ＰＥＧ−２０，０００，２２５Ｔ３Ｎ−ＰＥＧ３４００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−（２０，０００もしくは１０，０００），ＮＸ２６８，ＮＸ１９１，ＪＷ９６６，ＮＸ２７８，ＪＷ９８６，ＮＸ２１３，ＮＸ２４４，ＪＷ１１３０，ＮＸ２８７，ＪＷ１１３０−２０  ＫＰＥＧ，ＪＷ１３７９，ＪＷ１３８０，ｓｃＮＸ２７８，ＪＷ９８６−ＰＥＧ−（１０，０００，２０，０００または４０，０００），およびＪＷ１３３６（配列番号：６〜３０）の分子構造を示す。ヌクレオチドの前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシリボヌクレオチド（２’−Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。
【図２】図２は、中空のリポソーム（Ｅｍｐｔｙ），４．７ｍｇ  ＮＸ２３２含有リポソーム（Ｌ−ＮｅＸ２  ａ），１１．８ｍｇ  ＮＸ２３２含有リポソーム（Ｌ−ＮｅＸ２  ｂ），７２ｍｇの遊離ＮＸ２３２（Ｆｒｅｅ  ７２ｍｇ），７．２ｍｇの遊離ＮＸ２３２（Ｆｒｅｅ  ７．２ｍｇ）および超音波処理した１０ｍｇの遊離ＮＸ２３２（Ｆｒｅｅ／ｓｏｎｉ  １０ｍｇ）についてのゲル浸透クロマトグラムを示す。
【図３】図３にはＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５３＋リポソーム，およびＮＸ２５６−ＰＥＧ２０Ｋの１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。
【図４】図４にはＮＸ２１３（配列番号：２１），ＮＸ２６８（配列番号：１６），ＮＸ２７８（配列番号：１９），ＮＸ２７８＋リポソーム，ＪＷ９８６（配列番号：２０），リポソームに封入されたＮＸ２１３，およびＮＸ２４４（配列番号：２２）の１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。
【図５】図５にはＪＷ９６６（配列番号：１８）およびＪＷ９６６＋リポソームの１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。
【図６】図６にはＮＸ２６８（配列番号：１６）およびＮＸ２６８＋リポソームの１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。
【図７】図７にはＮＸ１９１（配列番号：１７），ＪＷ９８６＋ＰＥＧ２０Ｋ，ＰＥＧ４０Ｋ，およびＰＥＧ１０Ｋ（配列番号：２９）の１回注射後の時間の関数として血漿濃度のデータをまとめる。
【図８】図８にはＪＷ９８６＋ＰＥＧ２０Ｋ（配列番号：２９）およびＪＷ１１３０（配列番号：２３）の１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。
【図９】図９には、ＮＸ２７８＋ＰＥＧ４０Ｋ（配列番号：２４）およびＮＸ２５６（配列番号：９）の１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。
【図１０】図１０はＪＷ１１３０（配列番号：２３），１１３６−ＰＥＧ２０Ｋ（配列番号：２５），１３３６（配列番号：３０）および１３７９／８０（配列番号：２６−２７）の１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめたものである。
【図１１】図１１は、ＮＸ２３２（配列番号：７），ＮＸ２３２＋１％ＰＧＳＵＶ，ＮＸ２３２＋２．５％ＰＧＳＵＶおよびＮＸ２３２＋ＰＧＳＵＶについてのクロマトグラムを示す。
【図１２】図１２は結合した核酸リガンド（ＮＸ２５３）（配列番号：８）の分画をリポソーム：核酸リガンド比の関数として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
定義：
「共有結合」は電子の共有によって形成される化学結合である。
【００２７】
「非共有結合相互作用」はイオン性相互作用および水素結合を含む、共有結合以外の相互作用により分子実体を互いに保持する手段である。
本発明の目的において「脂質構築体」とは脂質、リン脂質またはそれらの誘導体を含有し、脂質が水性懸濁液中で採用することが知られている多様な異なる構造配列からなる構造である。これらの構造は、それらに限定されるものではないが脂質二重層小胞、ミセル、リポソーム、エマルジョン、脂質リボンまたはシートを包含し、様々な薬物および医薬的に許容されることが知られているアジュバントと複合体を形成させることができる。通常のアジュバントとしては、とくにコレステロールおよびα−トコフェロールがある。脂質構築体は単独でまたは本技術分野の熟練者には周知の任意の組合せで特定の適用に望ましい特性を提供する。さらに、脂質構築体およびリポソーム形成の技術的側面は本技術分野においては周知であり、本分野において一般に実用化されている任意の方法が本発明に使用できる。
【００２８】
「親油性化合物」とは、脂質および／または誘電率の低い他の材料もしくは相に対して結合または分配する傾向を有し、実質的に親油性成分からなる構造を包含する化合物である。親油性化合物には、脂質構築体ならびに脂質（および／または誘電率の低い他の材料もしくは相）に結合する傾向を有する非脂質含有化合物を包含する。コレステロール、リン脂質およびジアルキルグリセロールは親油性化合物のその他の例である。
【００２９】
本明細書で用いられる「複合体」の語は、核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物の結合によって形成される分子実体を記述する。結合は共有結合でも非共有結合相互作用であってもよい。
【００３０】
本明細書で用いられる「核酸リガンド」とは、セレックス標的に対して所望の活性を有する天然に存在しない核酸である。所望の活性には、それらに限定されるものではないが、セレックス標的の結合、セレックス標的の触媒的変化、セレックス標的またはセレックス標的の機能的活性を修飾／変化させる様式でのセレックス標的との反応、自殺阻害剤の場合のようなセレックス標的への共有結合、標的と他の分子の間の反応の促進が包含される。好ましい実施態様においては、活性は標的分子に対する特異的結合親和性であり、この場合の標的分子は主としてワトソン・クリック型塩基対合または三重らせん結合に依存する機構を介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、核酸リガンドは標的分子により結合される既知の生理学的機能を有する核酸ではない。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様においては、本発明の複合体の核酸リガンドはセレックス法によって同定される。核酸リガンドには、与えられた標的のリガンドである核酸の候補混合物から、（ａ）核酸候補混合物に比較して標的に対する親和性が高い核酸が候補混合物の残部から分配できるように核酸候補混合物を標的と接触させ、（ｂ）親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配し、ついで（ｃ）親和性が高い核酸を増幅させてリガンドが濃縮された核酸混合物を得ることからなる方法によって同定される核酸が包含される。
【００３２】
「候補混合物」は、それから所望のリガンドを選択する様々な配列の核酸の混合物である。候補混合物の起源は、天然に存在する核酸もしくはそれらのフラグメント、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸または上記技術の組合せにより作成された核酸とすることができる。好ましい実施態様においては、それぞれの核酸は、増幅過程を容易にするために、無作為化された領域を囲む固定された配列を有する。
【００３３】
「核酸」は、ＤＮＡ，ＲＮＡ，一本鎖または二本鎖およびそれらの任意の化学修飾体とすることができる。修飾にはそれらに限定されるものではないが、付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に対する変動を導入する他の化学基を付与する修飾が包含される。
このような修飾にはそれらに限定されるものではないが、２’−位置の糖修飾、５−位置のピリミジン修飾、８−位置のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、骨格の修飾たとえばヌクレオシド間ホスホロチオエート連鎖、メチル化、イソ塩基のイソシチジンとイソグアニジンのような異常な塩基対合の組合せ等が包含される。修飾にはまた、３’と５’の修飾たとえばキャッピングも包含される。
【００３４】
「非免疫原性高分子量化合物」は、通常免疫原性応答を起こさない約１０００Ｄａまたはそれ以上の化合物である。本発明の目的では、免疫原性応答とは生体に抗体タンパク質の作成を起こさせる応答である。非免疫原性高分子量化合物の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖たとえばデキストリン、ポリペプチドたとえばアルブミン、および磁性構造体たとえばマグネタイトがある。非免疫原性高分子量化合物は、ある種の実施態様においては、核酸リガンドであってもよい。
【００３５】
「脂質二重層小胞」は、極性（親水性）および非極性（親油性）部分を有する個々の分子から主として形成される、閉鎖され、液体が充填された顕微鏡的な球体である。親水性部分は、ホスファト、グリセリルホスファト、カルボキシ、スルファト、アミノ、ヒドロキシ、コリンまたは他の極性基から構成できる。非極性基の例には飽和または不飽和炭化水素たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基がある。ステロール（たとえばコレステロール）および他の医薬的に許容されるアジュバント（α−トコフェロールのような酸化防止剤を包含する）も小胞の安定性の改良または他の所望の性質の付与のため包含させてもよい。
【００３６】
「リポソーム」は二重層小胞のサブセットであり、長い脂肪酸鎖からなる２つの疎水性尾部を含むリン脂質分子から主として構成される。水に暴露されると、これらの分子は自然に整列して二層性の膜を形成し、各層における分子の親油性末端は膜の中心に会合し、反対側の極性末端は二重層膜のそれぞれ内側および外側表面を形成する。すなわち、膜はいずれの側も親水性の表面を提供し、一方、膜の内部は親油性の媒体を構成する。形成されたこれらの膜は内部の水性空間の周囲に玉葱の層とあまり違わない様式で、層間の水相により分離された同心の閉鎖された膜システムに全体的に配列される。これらの多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）は剪断力の適用によって小さなもしくは単ラメラ小胞（ＵＶ）に変換できる。
【００３７】
「陽イオン性リポソーム」は生理学的ｐＨにおいて、全体的に陽性の電荷を有する脂質成分を含有するリポソームである。
「セレックス」法は、標的と所望の様式で相互作用するたとえばタンパク質に結合する核酸リガンドの選択と、これらの選ばれた核酸の増幅の組合せを包含する。選択／増幅工程の反復サイクリングにより、多数の核酸を含有するプールから標的に最も強力に相互作用する１個もしくは少数の核酸の選択が可能になる。選択／増幅操作のサイクリングは選択された最終目標が達成されるまで続ける。本発明においては、セレックス法は所望の標的に対する核酸リガンドを得るために採用される。
【００３８】
セレックス法については、セレックス特許出願に記載されている。
「セレックス標的」とは、そのリガンドが望まれる任意の関心化合物または分子を意味する。標的は、タンパク質（たとえば、ＶＥＧＦ，トロンビン、およびセレクチン）、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態アナログ、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養物、増殖因子等とすることができ、制限はない。「セレックス標的」および「標的」の語は本明細書においては相互に交換して使用できる。文章の内容から「標的」が「セレックス標的」を意味するか否かは明白である。
【００３９】
「標的」とは、生物系において予め選択された位置、たとえば組織、臓器、細胞、細胞内コンパートメント、細胞外成分を意味する。後者としては、ホルモン（内分泌、傍分泌、自己分泌）、酵素、神経伝達物質および生理学的カスケード現象（たとえば血液凝固、補体等）の構成成分が包含される。
【００４０】
「改良された薬物動態学的性質」とは、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物に結合した核酸リガンドが、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合していない同一の核酸リガンドに比較して、インビボにおいて循環半減期の延長または他の薬物動態学的利点たとえば改良された標的対非標的濃度比を示すことを意味する。
【００４１】
「リンカー」は、２個またはそれ以上の分子実体を共有結合または非共有結合相互作用によって連結する分子実体である。
「スペーサー」は、１または２以上の分子実体の機能的性質が保存されるように２個以上の分子実体の空間的分離を可能にするサイズのリンカーである。
【００４２】
本発明の目的は、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合した１または２以上の核酸リガンドからなる複合体を提供することにある。このような複合体は、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合していない核酸リガンドに比し１または２以上の以下の利点を有する。すなわち１）薬物動態学的性質の改善、２）細胞内送達能の改善、または３）標的化能の改善である。
【００４３】
本発明の複合体はこれらの利点の１，２または３すべての利点がある。本発明の複合体には複合体中で全体として異なる目的で働く異なる核酸リガンドを含有させることができる。たとえば本発明の複合体は、ａ）リポソーム、ｂ）細胞内のセレックス標的に標的化され、リポソームの内部に封人された核酸リガンド、およびｃ）特定の細胞型に標的化され、リポソームに結合してその外部表面から突出した核酸リガンドから構成することができる。このような場合、複合体には１）リポソームの存在により、薬物動態学的性質の改善、２）リポソームの性質により、封入された核酸リガンドの細胞内送達能の上昇、および３）外部に結合した核酸リガンドにより、インビボにおける選ばれた位置への特異的な標的化が達成される。
【００４４】
他の実施態様においては、本発明の複合体は、親油性化合物たとえばコレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、または非免疫原性高分子量化合物たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合で結合した核酸リガンドから構成される。これらの場合、複合体の薬物動態学的性質は核酸リガンド単独に比べて改善される。さらに他の実施態様においては、本発明の複合体はリポソームの内部に封入された核酸リガンドから構成され、核酸リガンドの細胞内取り込みには複合体化されていない核酸リガンドの場合に比べて上昇が認められる。
【００４５】
本発明のある実施態様においては、本発明の複合体は１個（二量体）または２個以上（多量体）の他の核酸リガンドに結合した核酸リガンドから構成される。
核酸リガンドは同一のまたは異なるセレックス標的に向けることができる。多重核酸リガンドが同一のセレックス標的に向けられる実施態様においては、セレックス標的との多重結合相互作用により結合活性が上昇する。さらに、複合体が１個または２個以上の他の核酸リガンドに結合した核酸リガンドから構成される本発明の実施態様においては、複合体の薬物動態学的性質は１個の核酸リガンド単独の場合に比べて改善される。
【００４６】
親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物は、核酸リガンド（単数または複数）と共有結合で結合していても、また非共有結合相互作用によって会合していてもよい。親油性化合物がコレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、または非免疫原性高分子量化合物がＰＥＧである実施態様においては、核酸リガンドとの共有結合が好ましい。親油性化合物が陽イオン性リポソームであるかまたは核酸がリポソーム内に封入されている実施態様においては核酸リガンド（単数または複数）との非共有結合が好ましい。共有結合が採用された実施態様においては、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物は核酸リガンド上の様々な位置、たとえば塩基上の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５−位置、プリンヌクレオチドの８−位置、ホスフェートのヒドロキシル基または核酸リガンドの５’もしくは３’末端におけるヒドロキシル基もしくは他の基に共有結合させることができる。しかしながら、その５’または３’ヒドロキシル基に結合させることが好ましい。核酸リガンドの複合体の他の成分に対する結合は直接またはリンカーもしくはスペーサーを用いて行われる。
【００４７】
親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物は、非共有結合相互作用により核酸リガンド（単数または複数）に結合させることができる。たとえば、本発明の一実施態様においては、核酸リガンドは親油性化合物の内部コンパートメント内に封入される。本発明の他の実施態様においては、核酸リガンドは静電的相互作用によって親油性化合物に結合される。たとえば、陽イオン性リポソームは陰イオン性核酸リガンドに結合させることができる。イオン吸引力を介した非共有結合相互作用の他の例には、核酸リガンドの一部が、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合したオリゴヌクレオチドにワトソン・クリック型塩基対合または三重らせん塩基対合によってハイブリダイズする相互作用がある。
【００４８】
核酸の治療的およびインビボ診断的使用に際して遭遇する一つの問題は、ホスホジエステル型のオリゴヌクレオチドが体液中で、細胞内および細胞外酵素たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにより、所望の効果を発現する前に迅速に分解することである。核酸リガンドのある種の化学的修飾は、核酸リガンドのインビボ安定性の増大または核酸リガンドの送達の促進もしくは誘導を可能にする。本発明において意図される核酸リガンドの修飾にはそれらに限定されるものではないが、付加的な電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用および核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に対する変動を導入する他の化学基を提供する修飾が包含される。このような修飾には、それらに限定されるものではないが、２’−位置の糖修飾、５−位置のピリミジン修飾、８−位置のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、骨格の修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェート修飾、メチル化、イソ塩基イソシチジンおよびイソグアニジンのような異常な塩基対合の組合せ等が包含される。修飾にはまた、３’と５’の修飾たとえばキャッピングも包含される。
【００４９】
核酸リガンドがセレックス法によって誘導される場合には修飾は前または後セレックス修飾とすることができる。前セレックス修飾によれば、セレックス標的に対する特異性および改良されたインビボ安定性の両者を有する核酸リガンドが生成する。２’−ＯＨ核酸リガンドに行われる後セレックス修飾では、核酸リガンドの結合能に悪影響を与えることなくインビボ安定性の改善が達成できる。本発明の核酸リガンドの好ましい修飾は５’および３’ホスホロチオエートキャッピングまたは３’末端における３’３’逆転ホスホジエステル連鎖がある。ＲＮＡリガンドの場合、一部またはすべてのヌクレオチドの付加的２’アミノ（２’−ＮＨ２）修飾が好ましい。
【００５０】
本発明の他の態様においては、核酸リガンドの親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物との結合は、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合していない核酸リガンドに比較して、薬物動態学的性質の改善（すなわち、クリアランス速度の遅延）を生じる。本発明の一実施態様においては、複合体は脂質構築体を包含する。核酸リガンドとの複合体は共有結合または非共有結合相互作用によって形成することができる。好ましい実施態様においては、脂質構築体は脂質二重層小胞である。最も好ましい実施態様においては、脂質構築体はリポソームである。
【００５１】
本発明のある実施態様においては、複合体は、リポソームから突出した標的化核酸リガンドを有するリポソームからなる。同一の標的に対する多重核酸リガンが存在する実施態様においては、標的との多重結合相互作用によって結合活性が上昇する。
【００５２】
本発明で用いられるリポソームは、本技術分野で現在既知のまたは今後開発される様々な任意の方法で調製することができる。それらは通常、リン脂質、たとえばジステアロイルホスファチジルコリンから調製され、他の材料たとえば中性脂質、たとえばコレステロール、またさらに表面修飾剤、たとえば陽性に荷電した（たとえば、コレステロールのステリルアミンまたはアミノマンノースもしくはアミノマンニトール誘導体）または陰性に荷電した（たとえば、ジセチルホスフェート、ホスファチジルグリセロール）化合物を包含してもよい。多重ラメラリポソームは慣用技術、すなわち脂質を適当な溶媒に溶解し、ついで溶媒を蒸発させて容器の内側に薄いフィルムを残留させて適当な容器の内壁に選ばれた脂質を沈積させることによりまたは噴霧乾燥によって形成させることができる。ついで容器に水相を、水平または垂直の渦状に攪拌しながら加えるとＭＬＶの形成が起こる。ＵＶはついで、ＭＬＶのホモジェニゼーション、超音波処理または押し出し（フィルターから）によって形成できる。さらに、ＵＶは界面活性剤除去法により形成させることもできる。
【００５３】
本発明のある実施態様においては、複合体はリポソームとリポソームの表面に結合した標的化核酸リガンド（単数または複数）および封入された治療用または診断用物質から構成される。予め形成されたリポソームを核酸リガンドと結合させて修飾することができる。たとえば、陽イオン性リポソームは静電相互作用を介して核酸リガンドに結合させる。別法として、親油性化合物たとえばコレステロールに結合した核酸リガンドを予め形成されたリポソームに添加すると、コレステロールがリポソームの膜に結合する。別法として、核酸リガンドはリポソームの形成時にリポソームと結合させることができる。好ましくは核酸リガンドは予め形成されたリポソーム中に負荷することによりリポソームと結合させる。
【００５４】
リポソームが広範囲の多様な治療用または診断用物質の封入または導入に有利であることは本技術分野においてよく知られている。多様な任意の化合物がリポソームの内部水性コンパートメント中に封入可能である。治療用物質の例としては抗生物質、抗ウイルス性ヌクレオシド、抗かび性ヌクレオシド、代謝調節剤、免疫調節剤、化学療法薬、トキシン解毒剤、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アンチセンスオリゴヌクレオチド等がある。同様に、脂質二重層小胞には診断用核種（たとえば、イリジウム１１１，ヨウ素１３１，イットリウム９０，リン３２またはガドリニウム）ならびに蛍光物質またはインビトロおよびインビボ適用で検知可能な材料を負荷することができる。治療用または診断用物質はリポソーム壁部によって水性の内部に封入できることを理解すべきである。別法として、担体物質を小胞壁形成材料の一部として、すなわち小胞壁形成材料中に分散または溶解することができる。
【００５５】
リポソームの形成時に、水溶性の担体物質はそれらを水和溶液中に包含させて水性の内部に封入し、親油性分子は脂質処方中に包含させることにより脂質二重層中に導入させることができる。ある種の分子（たとえば、陽イオン性または陰イオン性親油性薬物）の場合には、予め形成されたリポソーム中への薬物の負荷はたとえば米国特許第４．９４６，６８３号に記載の方法により行うことができる。この開示は引用により本明細書に導入される。薬物の封入後、リポソームはゲルクロマトグラフィーまたは限外ろ過のような方法により処理して封入されなかった薬物を除去する。リポソームは通常ついで滅菌ろ過して懸濁液中に存在する可能性のある微生物を除去する。微生物は無菌操作によっても除去できる。
大きな親水性分子をリポソーム中に封入することを所望の場合には、大きな単ラメラ小胞をたとえば相転換蒸発（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ；ＲＥＶ）または溶媒注入法のような方法によって形成させることができる。リポソームの形成のための他の標準方法には、本技術分野においてたとえば米国特許第４，７５３，７８８号に記載されたホモジェニゼーション操作を含むリポソームの工業的製造方法、ならびに米国特許第４，９３５，１７１号に記載の薄層フィルム蒸発法が知られている。これらの特許出願は引用により本明細書に導入される。
【００５６】
治療用または診断用物質はまた、脂質二重層小胞の表面への結合も可能であることを理解すべきである。たとえば、薬物はリン脂質またはグリセライドに結合させることができる（プロドラッグ）。プロドラッグのリン脂質またはグリセライド部分は、脂質処方中への包含または予め形成されたリポソーム中への負荷によりリポソームの脂質二重層中に導入することができる（米国特許第５，１９４，６５４号および第５，２２３，２６３号参照。両特許は引用により本明細書に導入される）。
【００５７】
特定のリポソームの製造方法は、二重層膜の形成に用いられる脂質の意図される用途および種類に依存することになる。
親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合した核酸リガンド（単数または複数）では、非結合核酸リガンド（単数または複数）に比較して核酸リガンド（単数または複数）の細胞内送達が増大する。複合体の細胞への送達効率はリポソームと細胞の膜の融合を増強することが知られている脂質処方および条件を用いることにより至適化される。たとえば、ある種の陰性に荷電した脂質たとえばホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルセリンは、とくに他のフゾゲン（たとえば、Ｃａ２+のような多価陽イオン、遊離脂肪酸、ウイルス融合タンパク質、短鎖ＰＥＧ，リゾセレクチン、界面活性剤）の存在下に融合を促進する。ホスファチジルエタノールアミンも膜融合を増強するためにリポソーム処方に包含させることが可能であり、同時に細胞送達を増大させる。さらに、遊離脂肪酸および、たとえばカルボキシレート残基を含有するその誘導体は、高いｐＨまたは中性では陰性に荷電し、低いｐＨではプロトン化されるｐＨ−感受性リポソームの製造に使用できる。このようなｐＨ−感受性リポソームは高い融合傾向を有することが知られている。
【００５８】
好ましい実施態様では、本発明の核酸リガンドはセレックス法により誘導される。セレックスは、現在は放棄された米国特許出願一連番号第０７／５３６，４２８号（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、１９９１年０６月１０日付で出願の米国特許出願一連番号第０７／７１４，１３１号（発明の名称：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）、現在米国特許第５，４７５，０９６  号、１９９２年０８月１７日出願の米国特許出願一連番号第０７／９３１，４７３号（発明の名称：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）、現在米国特許第５，２７０，１３６号（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８も参照）に記載されている。これらの出願はいずれも引用により本明細書にとくに導入され、包括的にセレックス特許出願と呼ばれる。
【００５９】
セレックス法では、それぞれがユニークな配列を有し、所望の標的化合物または分子に特異的に結合する性質を有する核酸分子である１群の生成物が提供される。標的分子は好ましくはタンパク質であるが、他の炭水化物、ペプチドグリカンおよび各種の小分子もとくに包含できる。セレックス法は、細胞表面またはウイルスのような生物学的構造をその生物学的構造の必須部分である分子との特異的相互作用を介して標的化するためにも使用することができる。
【００６０】
その最も基本的な形態において、セレックス法は、以下の一連の工程によって定義することができる。
１）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は一般に、固定された配列の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一の位置に同一の配列を含有する）および無作為化された配列の領域を含有する。固定された配列領域は、（ａ）以下に記載する増幅工程を補助するため、（ｂ）標的に結合することが既知の配列を模倣するため、または（ｃ）候補混合物中の与えられた構造アレンジメントの核酸の濃度を増大させるために選択される。無作為化配列は全体的に無作為化されていても、すなわち、任意の位置にある塩基が見出される確率は１／４  である）また部分的に無作為化されていてもよい（たとえば、任意の位置にある塩基が見出される確率は０〜１００％の任意のレベルで選択できる）。
【００６１】
２）候補混合物を選択された標的と、標的と候補混合物のメンバーの間の結合に好ましい条件下に接触させる。これらの環境下では、標的と候補混合物の核酸の間の相互作用は、標的とその標的に対して最強の親和性を有する核酸の間での核酸−標的ペアを形成すると考えることができる。
【００６２】
３）標的に対して最強の親和性を有する核酸を、標的に対する親和性がより弱い核酸から分配する。最高の親和性の核酸に相当する配列は、きわめて少数しか（多分１分子の核酸分子しか）候補混合物中には存在しないので、候補混合物中の有意な量の核酸（約５〜５０％）が分配後に残るように分配規準を設定することが一般的に望ましい。
【００６３】
４）分配時に標的に対して比較的高い親和性を有するとして選択された核酸をついで増幅して、標的に対して比較的高い親和性を有する核酸が濃縮された新しい候補混合物を創成する。
【００６４】
５）上述の分配および増幅工程を反復することにより、新たに形成される候補混合物に含まれるユニークな配列は次第に減少し、標的に対する核酸の平均的な親和性の程度は一般に上昇する。その極限を考えれば、セレックス法では最初の候補混合物からの標的に対して最高の親和性を有する核酸である１種または少数種のユニークな核酸を含有する候補混合物が生成することになる。
【００６５】
基本セレックス法は多くの特殊な目的を達成するために改良されてきた。たとえば、１９９２年１０月１４日に出願された米国特許出願一連番号第０７／９６０，０９３号（発明の名称：Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）には特異的な構造特性を有する核酸分子たとえばベントＤＮＡを選択するためのゲル電気泳動と組合わせたセレックスの使用が記載されている。１９９３年０９月１７日に出願された米国特許出願一連番号第０８／１２３，９３５号（発明の名称：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）には、標的分子に対する結合および／または光架橋および／または光不活性化を可能にする光反応基を含有する核酸リガンドを選択するセレックスに基づく方法が記載されている。１９９３年１０月０７日に出願された米国特許出願一連番号第０８／１３４，０２８号（発明の名称：Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｆｆｅｉｎ）には、きわめて類似した分子間の識別が可能な高度に特異的な核酸リガンドを同定するカウンターセレックスと呼ばれる方法が記載されている。１９９３年１０月２５日に出願された米国特許出願一連番号第０８／１４３，５６４号（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ）には標的分子に対して高親和性および低親和性を有するオリゴヌクレオチドの間の高度に効率的な分配を達成するセレックスに基づく方法が記載されている。１９９２年１０月２１日に出願された米国特許出願一連番号第０７／９６４，６２４号（発明の名称：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）には、セレックスの実施後に、改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。１９９５年０３月０８日付出願の米国特許出願一連番号第０８／４００，４４０号（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）にはリガンドをその標的に共有結合で連結させる方法が記載されている。
【００６６】
セレックス法は、リガンドに対して改良された特性、たとえばインビボ安定性の改良または送達特性の改良を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基位置の化学的置換が包含される。修飾ヌクレオチドを含むセレックスで同定される核酸リガンドについては、１９９３年０９月０８日出願の米国特許出願一連番号第０８／１１７，９９１号（発明の名称：Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）にピリミジンの５−および２’−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。上記米国特許出願一連番号第０８／１３４，０２８号には２’−アミノ（２’−ＮＨ２），２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）により修飾された１もしくは２個以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドが記載されている。１９９４年０６月２２日に出願された米国特許出願一連番号第０８／２６４，０２９号（発明の名称：Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）には様々な２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。
【００６７】
セレックス法は、１９９４年０８月０２日出願の米国特許出願一連番号第０８／２８４，０６３号（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＳＥＬＥＸ）ならびに１９９４年０４月２８日に出願された米国特許出願一連番号第０８／２３４，９９７号（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｂｌｅｎｄｅｄ  ＳＥＬＥＸ）にそれぞれ記載されているように、選ばれたオリゴヌクレオチドの他の選ばれたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチドの機能性単位との結合を包含する。これらの出願は、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状および他の性質、ならびに効率的な増幅および複製特性を、他の分子の望ましい性質と組合わせることを可能にする。基本的セレックス操作の修飾を記述する上記特許出願のそれぞれは引用によりそれらの全体がとくに本明細書に導入される。
【００６８】
セレックスは標的に高い親和性および顕著な特異性で結合できる核酸リガンドを同定し、これは核酸研究の分野において先例のない卓絶した業績である。これらの特性はもちろん、本技術分野の熟練者が治療用または診断用リガンドに求めている望ましい性質である。
【００６９】
医薬としての使用に望ましい核酸リガンドを製造するためには、核酸リガンドは（１）標的に対して所望の効果を達成できる様式で結合し、（２）所望の効果を得るために可能な限り小さく、（３）可能な限り安定であり、（４）選ばれた標的に対して特異的なリガンドであることが好ましい。大部分の場合、核酸リガンドは標的に対して可能な最高の親和性をもつことが好ましい。さらに、核酸リガンドは促進作用をもつことができる。
【００７０】
１９９２年１０月２１日に出願され係属中の共通に譲渡された米国特許出願一連番号第０７／９６４，６２４号（’６２４）にはセレックスの実施後に改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。’６２４出願（発明の名称：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）は引用によりとくに本明細書に導入される。
【００７１】
核酸リガンド（単数または複数）が標的化能によって働く実施態様においては核酸リガンドは、核酸リガンドがその標的に結合できるために維持されなければならない三次元構造を選択する。さらに、核酸リガンドはその標的結合能が弱化されないように複合体の表面に関し適切な方向性で配置されなければならない。これは、核酸リガンドを核酸リガンドの結合部分から離れた位置で結合させることによって達成できる。三次元構造および適切な方向性は上述のリンカーまたはスペーサーの使用によって維持することもできる。
【００７２】
複合体による標的化送達には上述のように、任意の様々な治療用または診断用物質を複合体に結合、封入または導入することができる。複合体がリポソームと核酸リガンドからなる実施態様においては、たとえば、複合体の表面上に暴露されたかび特異的な核酸リガンドは、殺かび剤（たとえば、アンホテリシンＢ）の送達のためにかびの細胞に標的化できる。別法として、化学療法剤は、腫瘍抗原に対する核酸リガンドを介して腫瘍細胞に送達することができる。
【００７３】
別の実施態様においては、標的細胞に送達すべき治療用または診断用物質は他の核酸リガンドとすることができる。たとえば、腫瘍抗原に結合する核酸リガンドは複合体の外側に提示し、細胞内標的たとえばｒａｓ遺伝子のタンパク質産物であるｐ２１の突然変異アイソフォームに結合し、それを阻害する核酸リガンドは送達すべき物質とすることができる。
【００７４】
本発明によればさらに、送達すべき物質は複合体に、複合体の外部表面に結合する様式で導入できることも意図されている（たとえば、プロドラッグ、受容体アンタゴニスト、または処置もしくは造影用の放射性物質）。核酸リガンドの場合のように、この物質は共有結合または非共有結合相互作用によって結合させることができる。複合体はその物質の細胞外への標的化送達を提供し、リポソームはリンカーとして働く。
【００７５】
他の実施態様においては、非免疫原性高分子量化合物（たとえば、ＰＥＧ）はリポソームに結合されて複合体に改良された薬物動態学的性質を与える。核酸リガンドは、上述のようにリポソーム膜に結合されるかまたは非免疫原性高分子量化合物に結合され、一方これが膜に結合される。この方法で、複合体は血中のタンパク質から遮蔽されて長時間にわたって循環され、一方、核酸リガンドは依然としてそのセレックス標的に接触しそれに結合するのに十分暴露される。
【００７６】
本発明の一実施態様においては、複合体の外面に存在する核酸リガンドは、細網内皮系（すなわち、肝臓および脾臓）による除去のため循環タンパク質（たとえば、抗体、増殖因子、タンパク質ホルモン）に標的化することができる。一例として、このような複合体によれば、自己免疫疾患の処置が可能である。自己免疫疾患は、生体の免疫系に自己抗体および自己反応性Ｔ細胞の産生による自己認識の回避が欠如する結果である。宿主細胞に対する免疫系による攻撃は、神経疾患たとえば多発性硬化症および重症筋無力症、関節疾患たとえば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスに認められるような核酸に対する攻撃、様々な臓器が関連するこのような他の疾患、たとえば乾癬、若年性糖尿病、シェーグレン病およびグレーブス病を含む多くの疾患を引き起こすことができる。タンパク質と結合したリポソームは一般的に、タンパク質と結合していないリポソームよりも迅速に細網内皮系（すなわち、肝臓および脾臓）によって除去されることが見出されていることから、リポソームで複合体化された核酸リガンドは細網内皮系による自己抗体の除去に使用できる。
【００７７】
本発明の他の実施態様においては、同一のセレックス標的に対して特異的な核酸リガンドが同一のリポソームの表面に結合される。これは、同一のセレックス標的を互いに接近させる可能性を提供し、同一のセレックス標的の間の特異的な相互作用を発生させるために使用できる。たとえば、リポソームに結合させたチロシンキナーゼ受容体に対する核酸リガンドは、この受容体を互いに接近させることが期待される。これは、シグナル伝達カスケードを開始させる自己リン酸化を促進することが考えられる。
【００７８】
本発明の別の実施態様においては、異なるセレックス標的に対して特異的な核酸リガンドを同一のリポソームの表面に結合させる。これは、異なる標的を互いに接近させる可能性を提供し、それらの標的の間の特異的な相互作用を発生させるために使用できる。たとえば、腫瘍マーカーまたは抗原に特異的な核酸リガンドおよびＴ−細胞受容体に特異的な核酸リガンドは、Ｔ−細胞を腫瘍に接近させることが期待される。標的を接近させる方法としてのリポソームの使用に加えて薬剤（たとえば、免疫系調節剤）をリポソームに封入して、相互作用の強度を増大（たとえば、Ｔ−細胞免疫応答の増強）させることができる。
【００７９】
関心細胞標的にユニークな生物分子の同定が困難な場合には、標的に対する２またはそれ以上のマーカーに特異的な核酸リガンドを複合体と結合させることによって特異性を得ることができる。このシナリオでは、最善の核酸リガンドはそれらのそれぞれの標的に対して低いまたは中等度の親和性を有することが期待される。高い親和性を有する核酸リガンドではいずれかのマーカータンパク質をもつすべての細胞と薬物の結合を導きそれによって特異性が低下することから、上述のタイプの核酸リガンドの使用が推薦される。低親和性リガンドでは、必要な特異性を提供するためには結合活性が要求される。
【００８０】
リポソーム／核酸リガンド複合体はまた、標的に対する多重結合相互作用の可能性も生じる。これはもちろん、複合体あたりの核酸リガンドの数ならびに核酸リガンドおよび受容体のそれらそれぞれの膜における可動性に依存する。有効結合定数は各部位における結合定数の積として増大するので、多重結合相互作用があることは実質的に有利である。換言すれば、多くの核酸リガンドをリポソームに結合させることによって、すなわち多価結合を創成することによって、その標的に対する多重複合体の有効親和性（すなわち、結合活性）は各部位に対する結合定数の積と同程度に改良される。
【００８１】
本発明のある実施態様においては、本発明の複合体は、親油性化合物たとえばコレステロール、ジアルキルグリセロール、またはジアシルグリセロールに結合した核酸リガンドから構成される。この場合、複合体の薬物動態学的性質は核酸リガンド単独の場合に比較して改善される。上述のように、コレステロールは核酸リガンド上の多くの位置で核酸リガンドに共有結合することができる。本発明の他の実施態様においては、複合体はさらに、脂質構築体たとえばリポソームから構成されてもよい。この実施態様においてはコレステロールは、コレステロールの他の親油性化合物と結合しやすい傾向により、リポソーム中への核酸リガンドの導入を補助することができる。核酸リガンドと結合したコレステロールは、リポソーム処方中への包含または予め形成されたリポソーム中への負荷により、リポソームの脂質二重層に導入することができる。好ましい実施態様では、コレステロール／核酸リガンド複合体は、予め形成されたリポソームと結合させる。
コレステロールは、核酸リガンドがリポソームの内部または外部に突出するような様式でリポソームの膜に結合させることができる。核酸リガンドが複合体の外部に突出している実施態様においては核酸リガンドは標的化能によって働く。
【００８２】
他の実施態様においては、本発明の複合体は、非免疫原性高分子量化合物たとえばＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステロールに結合した核酸リガンドから構成される。この実施態様においては、複合体の薬物動態学的性質は核酸リガンド単独の場合に比較して改善される。上に述べたように、結合は共有結合または非共有結合相互作用を介することができる。
【００８３】
好ましい実施態様においては、核酸リガンドは、ＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステロール分子と共有結合によって結合される。また上述のように、共有結合が採用された場合、ＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはコレステロールは核酸リガンドの様々な位置に共有結合させることができる。ＰＥＧまたはジアシルグリセロールが用いられる実施態様では、核酸リガンドは、マレイミドもしくはビニルスルホン官能基によりまたはホスホジエステル結合を介して５’チオールに結合させることが好ましい。ジアルキルグリセロールおよびコレステロールが用いられる実施態様では、核酸リガンドはホスホジエステル結合を介して結合させることが好ましい。ある種の実施態様では、複数個の核酸リガンドを単一のＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはコレステロール分子に結合させることができる。核酸リガンドは同一または異なる標的に対するものであってよい。
【００８４】
多重核酸リガンドが同一の標的に対するものである実施態様では、標的との多重結合相互作用により結合活性の増大が起こる。さらに他の実施態様においては、複数個のＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステロール分子が互いに結合することができる。これらの実施態様においては、同一の標的または異なる標的に対する１または２個以上の核酸リガンドを、それぞれのＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステロール分子に結合させることができる。これも各核酸リガンドのそのセレックス標的に対する結合活性の増大を生じる。同一のセレックス標的に特異的な複数の核酸リガンドがＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはコレステロールに結合している実施態様においては、同一の標的の間での特異的相互作用を発生させるために、同一の標的を互いに接近させる可能性がある。
【００８５】
異なる標的に特異的な複数の核酸リガンドがＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはコレステロール分子に結合している場合には、それらの標的の間での特異的相互作用を発生させるために、異なる標的を互いに接近させる可能性がある。さらに、同一の標的または異なる標的に対する核酸リガンドがＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステロール分子に結合している実施態様では、薬物を同じくＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステロールに結合させることができる。すなわち、複合体は薬物の標的化送達を提供し、この場合、ＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステロールはリンカーとして働く。
【００８６】
本発明の他の実施態様においては、複合体は非免疫原性高分子量化合物たとえばマグネタイトに結合した核酸リガンドから構成される。上に述べたように、結合は共有結合または非共有結合相互作用によることができる。好ましい実施態様においては、核酸リガンドはマグネタイトと共有結合によって結合される。マグネタイトは、結合のために異なる化学的機能を発揮する様々な化合物でコーティングすることができる（たとえば、デキストラン、親油性化合物）。マグネタイトと結合した核酸リガンドは核磁気共鳴造影に使用するマグネタイトの標的化送達を提供する。
【００８７】
以下の実施例は本発明の説明および例示のために提供されるものであって、本発明の限定として受け取るべきではない。以下の実施例に記載する核酸リガンドの構造は図１に示す。実施例１には核酸リガンドの脂質、ジアルキルグリセロールまたはジアシルグリセロールとの接合、ならびに自動合成による薬物動態調節物質の導入を記載する。実施例２にはＰＥＧおよびコレステロールの核酸リガンドとの接合を記載する。核酸リガンドに対する修飾は、ＰＥＧ−接合およびコレステリル化核酸リガンドの結合親和性が非接合および非コレステリル化分子の場合と同一であったように、そのセレックス標的に対する結合能を妨害することはない。実施例３には、コレステロール誘導体化核酸リガンドの脂質処方への導入を記載する。トロンビン核酸リガンドを含有する核酸リガンド／リポソーム処方の活性をインビトロ凝血阻害アッセイで試験した。リポソーム処理条件は核酸リガンドの抗凝血活性に影響しない。さらに、リポソームの結合は核酸リガンドのその標的に対する結合能および阻害能に影響しない。実施例４にはコレステロール単独、ジアルキルグリセロール単独、ＰＥＧ単独、コレステロールとリポソーム、ジアルキルグリセロールとリポソーム、およびＰＥＧとリポソームに結合した核酸リガンドの薬物動態学的性質を記載する。プリンおよびピリミジンの２’糖位置で修飾された核酸リガンドも包含する。実施例５には陽イオン性リポソーム−核酸リガンド複合体の毒性およびヒトリンパ球による細胞内取り込みを記録する。実施例６〜１０は予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入に対する以下の影響、すなわち、脂質の陰性電荷の変動、コレステロール含量の変動、固定量の核酸リガンドでの脂質／核酸リガンド比の変動、固定量のＳＵＶでの脂質／核酸リガンド比の変動、およびリン脂質の鎖長の変動の影響を記載する。実施例１１は、リポソーム処方中への核酸リガンド／コレステロール接合体の導入が起こったことを非変性ゲル電気泳動によって証明する。実施例１２は、核酸リガンドのリポソーム中への受動的封入を可能にする方法を記述する。実施例１３には、核酸リガンドをリポソーム中に遠隔負荷できる方法を記載する。実施例１４は核酸リガンドのリポソームへの共有結合による接合を記載する。実施例１５には核酸リガンド−リポソーム複合体のインビトロおよびインビボ効率を記載する。
【実施例】
【００８８】
実施例１．オリゴヌクレオチド修飾のための脂質、ＰＥＧ，ジアルキルグリセロールおよびジアシルグリセロール試薬
この実施例では、核酸リガンドの脂質および／またはＰＥＧまたはジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールとの接合、ならびにホスホロアミダイトもしくはＨ−ホスホネートカップリング化学を用いる自動合成による薬物動態学的修飾物質の導入を説明する。以下に示す反応図中、実線の矢印は完成した工程を示し、点線の矢印は未完成の工程を示す。反応図１は、スルフヒドリル−修飾オリゴヌクレオチド基質にカップリングするためのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンマレイミド試薬の調製を示す。この操作は、単純な脂肪族ジおよびトリアミン基質からビスおよびトリス−マレイミド試薬の製造のためにＣｈｅｒｏｎｉｓ  ら［Ｃｈｅｒｏｎｉｓ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）３５：１５６３−１５７２］によって報告された操作と同様である。リン脂質のメトキシカルボニルマレイミドでの処理により、性質未決定の中間体の形成が起こり、これはスルフヒドリル−修飾オリゴヌクレオチドとインキュベーションすると、オリゴヌクレオチドのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン接合体への完全な変換が起こる（下記参照）。同様の試薬はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから市販品も入手できる。
反応図１
【００８９】
【化１】
2010265300.tif 000002
【００９０】
オリゴヌクレオチドを自動合成条件下に修飾できれば多くの利点があることは明白である。脂質および／またはＰＥＧ残基の標準的自動合成条件下での容易な導入を可能にする試薬を調製した。最初に、アミノ基の化学選択的な官能化ついでヒドロキシル基のホスフィチル化により多数の関心オリゴ修飾試薬に放散的に変換できる多目的モジュール１０を設計し合成した（反応図２）。修飾基（アミンリガンド）および２’−ヒドロキシル基の誘導体化によって導入される活性化ホスフェート前駆体（ホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート、またはホスフェートトリエステル）に関して、この戦略が提供する柔軟性は注目に値する。さらに、この方法で調製される自動合成試薬のグリセロール核は、生成物を内部鎖の位置または５’末端におけるオリゴ修飾に適当にする。モジュール１０の別法による合成を反応図３に示す。テトラエチレングリコール（１；ＴＥＧ）を塩基性メジウム好ましくはピリジン中で、限定量のｐ−トルエンスルホニルクロリド好ましくは１０モル％で処理すると、モノトシレート２ａに誘導体化される。この方法では２ａはシリカゲルろ過後７５％の収率で得られた。２ａのＴＥＧフタルイミド３ａへの変換は塩基としてジアザビシクロウンデカン（ＤＢＵ）の存在下にＤＭＦ溶液中で加温してフタルイミドにより処理すると、８０％の収率で達成された。フタルイミド３ａのアリル化（アリルブロミド，ＮａＨ，ＴＨＦ／ＤＭＦ）は６０％の収率でアリルＴＥＧ４ａを与えた。４ａを０．５％ＯｓＯ４および１．１当量のＮ−メチルモルホリンＮ−オキシド（ＮＭＯ）により処理するとジオール中間体が得られ、これはさらに精製することなくジメトキシトリチル（ＤＭＴ）エーテル誘導体９に、２工程の総収率８９％で変換された。最後に、４０％ＭｅＮＨ２を用いてアミンの脱保護を行うと１０が精製後収率９５％で得られた。モジュール１０はさらにＰＥＧ−ニトロフェニルカルボネート（ＰＥＧ−ＮＰＣ；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）で処理して精密化した。この方法で、ホスフィチル化前駆体１２（反応図４）が好収率で調製された。１２のホスホロアミダイト１３およびＨ−ホスホネート１４両者への更なる変換も実施された。
反応図２
【００９１】
【化２】
2010265300.tif 000003
【００９２】
反応図３
【００９３】
【化３】
2010265300.tif 000004
【００９４】
【化４】
2010265300.tif 000005
【００９５】
自動合成によるオリゴヌクレオチド修飾のための脂質試薬の設計には、上述のジパルミトイルホスファチジル誘導体におけるようにネイティブなジアシルグリセロールのエステル結合を合成オリゴの回収に必要な塩基性脱保護プロトコールに安定なグリセロール−アルキル結合によって置換する必要がある。検討が最初に選択された結合は既知のジパルミトイルグリセロール誘導体１５（Ｓｉｇｍａから入手できる）におけるようにエーテル結合であったが、長鎖アルキルカルバメート（またはエーテルとカルバメートの組合せ）も適当と思われる。ジパルミトイルグリセロールはアシルカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ，ピリジン）として活性化し、この活性化中間体をモジュール１０にカップリングした（ピリジン、８０℃；４４％）。１６のホスフィチル化［ＣＩＰ（ｉＰｒ２Ｎ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ；ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ），ＣＨ２Ｃｌ２；５９％］はホスホロアミダイト１７を与えた（反応図５）。アミダイト１７のＣ１８アナログのクロロホルメート中間体を経由する合成を反応図６に示す。ジアルキルグリセロール（１８；ＤＡＧ）はトルエン中過剰のホスゲンで処理して相当するクロロホルメート１９に変換した。１９とアミノアルコール１０の接合はピリジン中で実施し、精製後の収率５７％で付加物２０が得られた。２０の二級ヒドロキシルの標準条件下でのホスフィチル化によって、ホスホロアミダイト２１が９５％の収率で得られた。アミダイト１７のトリヌクレオチド（ＴＴＴ）の５’−末端へのカップリングは、ＡＢＩ３９４自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーによって、脂質アミダイトのためにカップリング時間を延長した（カップリング２×３０分）わずかに改変した合成サイクルを用いて行い、平行トリチル陽イオン分析で測定して９４＋％のカップリング効率が得られた。
反応図５
【００９６】
【化５】
2010265300.tif 000006
【００９７】
反応図６
【００９８】
【化６】
2010265300.tif 000007
【００９９】
実施例Ａ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）マレイミド試薬の合成
２００ｍｇ（０．２８９ミリモル）のＤＰＰＥおよび５４ｍｇ（０．３４７ミリモル）のメトキシカルボニルマレイミドの１０ｍｌＴＨＦ／飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１：１）中懸濁液を室温で攪拌した。１２時間後、混合物を１００ｍｌのＥｔＯＡｃで処理し、有機相（生成物のゼラチン状懸濁液を含有する）を水相から分離した。有機相を真空中で濃縮し、ＭｅＯＨと２回共蒸発させ、得られた白色の固体をＥｔＯＡｃと３回磨砕した。この物質はさらに分析または精製することなく、オリゴヌクレオチド接合実験に用いた（下記参照）。
【０１００】
実施例Ｂ：自動合成モジュール１０の合成および推敲
テトラエチレングリコールジメトキシトリチルエーテル（２）：テトラエチレングリコール（７６．４ｍＬ，０．４４モル）を３００ｍＬの無水ピリジンに溶解し、０℃に冷却した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１５ｇ，０．０４４モル）を固体として、攪拌しながら添加した。反応フラスコを乾燥管で覆い、反応混合物を一夜放置して温度を室温まで上昇させた。反応混合物を真空中、低い温度（＜３０℃）で濃縮した。残留物を３００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、３×３００ｍＬの水で抽出した。水層を合わせて酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。粗製の残留物を１０００ｍＬのシリカゲル（５％トリエチルアミン含有ヘキサンでカラムに湿式充填）を用い、５％トリエチルアミン含有ヘキサン中１０−２０−４０−６０−８０％酢酸エチルついで５％トリエチルアミン含有酢酸エチルで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。１９．５１ｇ（８９％）の２が、金色の油状物として収集された。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．４７−７．１６（重複シグナル，９Ｈ），６．７９（ｄ，４Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．６６−３．６２（ｍ，２Ｈ），３．２２（ｔ，Ｊ＝５．２２Ｈｚ，１Ｈ），２．９６（ｂｒ  ｔ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １５８．１２，１４４．８６，１３６．０４，１２９．８１，１２７．９３，１２７．４９，１２６．４０，１１２．７８，８５．６７，７２．３１，７０．４８，７０．４４，７０．１２，６２．８９，６１．３９，５４．８９；低分解能ＭＳ  ｍ／ｅＣ１５Ｈ２５Ｏ７Ｓ（Ｍ−  ＤＭＴ＋  １＋）での計算値  ３４９．１６７，分析値  ３４９．１．
テトラエチレングリコールジメトキシトリチルエーテルｐ−  トルエンスルホネート（３）：化合物２（５．０ｇ，１０．０６ミリモル）を５０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解し、０℃に冷却した。トリエチルアミン（１８．２ｍＬ，１３．１ミリモル）、ついでｐ−トルエンスルホニルクロリド（１．９２ｇ，１０．０６ミリモル）を固体として攪拌しながら添加した。反応混合物を一夜冷蔵庫に保存した。ＴＬＣ分析は反応がほぼ８０％完了したことを示した。さらに、０．５当量のトリエチルアミンおよび０．５当量のｐ−トルエンスルホニルクロリドを加え、反応混合物を室温で一夜攪拌した。反応混合物をセライトを通してろ過し、濃縮した。残留物を３００ｍＬのシリカゲル（５％トリエチルアミン含有ヘキサンでカラムに湿式充填）を用い、５％トリエチルアミン含有ヘキサン中２５−５０−７５％酢酸エチルついで５％トリエチルアミン含有酢酸エチルで溶出させるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。５．７ｇ（８７％）の３が橙色の油状物として収集された。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．７５（ｄ，２Ｈ），７．４４−７．１２（ｍ，１１Ｈ），６．７８（ｄ，４Ｈ），４．１２−４．０９（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．６６−４．５４（ｍ，１３Ｈ），３．２２（ｔ，Ｊ＝３．８７Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ），
テトラエチレングリコールモノトシレート（２ａ）：テトラエチレングリコール（２００ｍＬ，１．１５モル）を５００ｍＬのピリジンに溶解し、０℃に冷却し２２．０ｇ（０．１１５モル）のｐ−トルエンスルホニルクロリドで処理した。溶液が完成したならば、反応混合物を冷蔵庫中に一夜放置し、ついで真空中で濃縮した。残留物を８００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、３×６００ｍＬのＨ２Ｏにより抽出した。Ｈ２Ｏ分画をＥｔＯＡｃで逆抽出し、ＥｔＯＡｃ分画を合わせて飽和Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液で抽出した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮すると、無色の油状物が得られた。この油状物を８００ｍＬのシリカゲルを使用してフラッシュクロマトグラフィーに付し、ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ−５０％ＥｔＯＡｃ，ついでＥｔＯＡｃ，ついでＥｔＯＡｃ中１０％ＭｅＯＨ−２０％ＭｅＯＨで溶出して精製すると２３．７ｇ（６０％）の純粋な生成物および微量の不純物含有生成物（１１％）が得られた。２ａ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．７７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１３（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６８−３．５３（ｍ，１４Ｈ），２．５８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．２，１５８．３，１４４．８，１３５．９，１３３．８，１３２．０，１２９．９，１２８．０，１２７．７，１２６．６，１２３．１，１１３．０，８５．９，７３．０，７０．６，７０．４，７０．０，６９．７，６７．８，６４．４，５５．１，３７．１；低分解ＭＳ  ｍ／ｅＣ１５Ｈ２４Ｏ８Ｓ（Ｍ＋１）として３４９．１．
テトラエチレングリコールモノフタルイミド（３ａ）：４００ｍＬの無水ＤＭＦ中３１．９６ｇ（０．０９２モル）の２ａの溶液を攪拌しながら、これに１４．２ｇ（１．０５当量）のフタルイミドおよび１４．４ｍＬ（１．０５当量）の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを加えた。この溶液を７０℃に１８時間加熱し、真空中において濃縮した。粗製の黄色油状物を１６００ｍＬのシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーに付し、ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ−５０％ＥｔＯＡｃ，ＥｔＯＡｃ，ついでＥｔＯＡｃ中１０％ＭｅＯＨ−２０％ＭｅＯＨで溶出して精製すると、２３．８ｇ（８０％）の３ａが油状物として得られた。放置すると３ａは蝋状の白色固体となった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８４−７．７８（ｍ，２Ｈ），７．７０−７．６６（ｍ，２Ｈ），３．８６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６４−３．５１（ｍ，１２Ｈ），２．６７（ｂｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．２，１３３．８，１３２．０，１２３．１，７２．４，７０．５，７０．４，７０．２，７０．０，６７．８，６１．６，３７．２．
化合物４ａの合成：１５０ｍＬのＴＨＦおよび１５ｍＬのＤＭＦ中１５ｇ（０．０４６４モル）の３ａの溶液をＡｒ下に０℃に冷却した。この溶液にアリルブロミド（６．０ｍＬ，１．５当量）、ついで１．７６ｇ（１．５当量）のＮａＨを固体として加えた。不透明な黄色の懸濁液を０℃で３０分間ついで室温で１８時間攪拌した。５０〜１００ｍＬのＭｅＯＨを加えて濃縮しついで混合物を真空中で濃縮した。粗製の物質を１５００ｍＬのシリカゲルを用いフラッシュクロマトグラフィーに付し、ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ−５０％ＥｔＯＡｃ−７５％ＥｔＯＡｃついでＥｔＯＡｃついでＥｔＯＡｃ中１０％ＭｅＯＨで溶出すると、１１．０５ｇ（６５％）の４ａが黄色油状物として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８４−７．８０（ｍ，２Ｈ），７．７２−７．６７（ｍ，２Ｈ）５．９４−５．８４（ｍ，１Ｈ），５．２８−５．１４（ｍ，２Ｈ），３．９９（ｄ，Ｊ＝５．６１Ｈｚ，２Ｈ），３．８８（ｔ，Ｊ＝５．８５Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝５．７６Ｈｚ，２Ｈ），３．６４−３．５４（ｍ，１３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．２，１３４．６，１３３．７，１３１．９，１２３．０，１１６．９，７２．０，７０．４，６９．９，６９．２，６７．７，３７．０．
（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラニル−４−イルメチル（ジメトキシトリチル）テトラエチレングリコール（５）：焔で乾燥したフラスコに水素化ナトリウム（０．５６ｇ，２３．５ミリモル）を秤量し、７０ｍＬ  の無水テトラヒドロフランおよび１５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加えた。この懸濁液をアルゴン下０℃に冷却し、シリンジを介して（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（２．７ｍＬ，２１．７ミリモル）を滴下して加えた。０℃で３０分間攪拌したのち、１５ｍＬのテトラヒドロフラン中化合物３（１１．７ｇ，１８．１ミリモル）を滴下ろ斗を通して滴下して加えた。反応混合物を室温で一夜攪拌し、１００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムで反応を停止させ、３００ｍＬのジエチルエーテルで希釈した。層を分離し、エーテル層を３００ｍＬの水で３回抽出した。エーテル層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。残留物を５００ｍＬのシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーに付し、最初にヘキサン、ついでヘキサン中１０−２０−３０−４０−５０−７５％酢酸エチル、ついで酢酸エチルで溶出して精製した。８．９３ｇ（８２％）の５が無色の油状物として収集された。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ７．４６−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３４−７．１７（ｍ，７Ｈ），６．７８（ｄ，４Ｈ），４．２３（ｐｅｎｔｅｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｔ，８．２Ｈ），３．７５（ｓ，６Ｈ），３．７１−３．６０（ｍ，１５Ｈ），３．５３（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，５．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（１０．４，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），１．３３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １５８．２４，１４４．９７，１３６．２０，１２９．９３，１２８．０７，１２７．６１，１２６．５１，１１２．８９，１０９．２１，８５．７７，７４．５７，７２．２０，７０．８２，７０．５９，７０．４０，６９．６８，６６．６７，６３．０１，５５．０４，２６．６７，２５．２９；  低分解ＭＳ  ｍ／ｅＣ３５Ｈ５０Ｏ９Ｎ（Ｍ＋ＮＨ４＋）として計算値  ６２８．３９９，分析値  ６２８．５．
（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−  ジオキソラニル−４−  イルメチルテトラエチレングリコール（６）：１００ｍＬの８０％酢酸を０℃に冷却し、ついで化合物５（６．６ｇ，１０．８ミリモル）を加えた。澄明な橙色の溶液を０℃で１時間攪拌した。メタノール（１００ｍＬ）を加え、反応混合物を真空中低い温度（＜３０℃）で濃縮した。残留物を２００ｍＬのシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーに付し、最初に酢酸エチル、ついで酢酸エチル中５−１０−１５−２０％メタノールで溶出して精製した。２．５ｇ（７４％）の６が無色油状物として収集された。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．２１（ｐｅｎｔｅｔ，Ｊ＝６．２  Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝５．９，４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．３５（ｍ，１９Ｈ），２．９３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１．３４（ｓ，３Ｈ），１．２８（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １０９．２０，７４．５０，７２．４２，７２．１４，７０．７６，７０．３９，７０．３２，７０．１４，６６．６３，６１．４８，２６．６１，２５．２３；低分解能ＭＳ  ｍ／ｅ  Ｃ３５Ｈ５０Ｏ９Ｎ（Ｍ＋ＮＨ４＋）として計算値  ６２８．３９９，分析値  ６２８．５．
（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラニル−４−イルメチル（フタルイミド）テトラエチレングリコール（８）：アルコール６（４．０６ｇ，１３．２ミリモル）を無水ジクロロメタン５０ｍＬに溶解し、０℃に冷却した。トリエチルアミン（３．７ｍＬ，２６．３ミリモル）、ついでｐ−トルエンスルホニルクロリド（３．２６ｇ，１７．１ミリモル）を加えた。反応フラスコを乾燥管で保護し、反応混合物を一夜放置して温度を室温まで上昇させた。反応混合物をセライトを通してろ過し、ろ液を真空中で濃縮した。粗製の物質を４００ｍＬのシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに付し、最初にヘキサン中１０％酢酸エチル、ついで２０−４０−６０−８０−１００％酢酸エチル、ついで酢酸エチル中１０％メタノールで溶出して精製した。中間体のトシレート５．２１ｇ（８５％）が、金色の油状物として収集された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ，トシル芳香族），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ，トシル芳香族），４．２５（ｐｅｎｔｅｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｔ，４．７Ｈ），４．０２（ｄｄ，Ｊ＝８．１２，６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７１−３．４０（ｍ，１８Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），１．４６（ｓ，３Ｈ），１．３４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １４４．７４，１３３．１，１２９．７６，１２７．９１，１０９．８，７４．６３，７２．２７，７０．８９，７０．６８，７０．５２，７０．４４，６９．１９，６８．６０，６６．７４，６４．１，２６．７３，２５．３４，２１．５９；低分解ＭＳ  ｍ／ｅ  Ｃ２１Ｈ３８Ｏ９ＮＳ（Ｍ＋ＮＨ４＋）として計算値  ４８０．３６４，分析値  ４８０．２．このトシレート（５．２ｇ，１１．２４ミリモル）を６０ｍＬの無水ジメチルホルムアミドに溶解した。１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１．７ｍＬ，１１．２４  ミリモル）、ついでフタルイミド（１．６５ｇ，１１．２４ミリモル）を加えた。反応混合物を７０℃に一夜加熱した。反応混合物を真空中で濃縮し、４００ｍＬのシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーに付し、ヘキサン中５０％酢酸エチルで溶出して精製した。３．９６ｇ（８１％）の８が無色油状物として収集された。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８３−７．７９（ｍ，２Ｈ），７．７２−７．６８（ｍ，２Ｈ），４．２６（ｐｅｎｔｅｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．０３（ｄｄ，Ｊ＝８．２，６．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７４−３．４４（ｍ，１８Ｈ），１．３９（ｓ，１Ｈ），１．３３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．２１，１３３．８８，１３２．１０，１２３．１９，１０９．３３，７４．６６，７２．３０，７０．９０，７０．５２，７０．０４，６７．８７，６６．７９，３７．１９，２６．７５，２５．３７；低分解ＭＳ  ｍ／ｅ  Ｃ２２Ｈ３５Ｏ８Ｎ２（Ｍ＋ＮＨ４＋）として計算値  ４５５．２８８，分析値  ４５５．２．
１−ジメトキシトリチル−３−（フタルイミドテトラエチレングリコリル）−ｓｎ−グリセロール（９）：反応図２に従い、化合物９を以下のように合成する。アセチル８（５．１６ｇ，１１．８ミリモル）を無水メタノール  １００ｍＬに溶解し、無水ｐ−トルエンスルホン酸（１００ｍｇ）を加えた。反応フラスコを乾燥管で保護し、反応混合物を室温で２．５時間攪拌し、ついで無水ピリジン１０ｍＬを加えて中和し、真空中で濃縮し、無水ピリジンと共蒸発させた。得られたジオールをついで１５０ｍＬの無水ピリジンに溶解し、０℃に冷却した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４．３９ｇ，１３ミリモル）を固体として加えた。反応フラスコを乾燥管で保護し、反応混合物を一夜放置して温度を室温に上昇させた。メタノール（５０ｍＬ）を加え、反応混合物を真空中で濃縮した。粗製の物質を７００ｍＬのシリカゲル（ヘキサン中５％トリエチルアミンによりカラムに湿式充填）を用い、フラッシュクロマトグラフィーに付し、最初にヘキサン中１０％酢酸エチル（５％トリエチルアミン含有）、ついで２０−４０−６０−８０−１００％酢酸エチル（５％トリエチルアミン含有）で溶出して精製した。６．９８ｇ（８２％）の９が淡黄色の油状物として収集された。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８０（ｄｄ，Ｊ＝５．４，３．１  Ｈｚ，２Ｈ），７．６８（ｄｄ，Ｊ＝５．４，３．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４２−７．１４（ｍ，９Ｈ，ＤＭＴ），６．７９（ｄ，４Ｈ，ＤＭＴ），３．９５（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），３．８６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７５（ｓ，６Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６３−３．３７（ｍ，１８Ｈ），３．１６（ｍ，２Ｈ），２．８４（ｂｒ  ｄ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．１５，１５８．３２，１４４．７９，１３５．９５，１３３．８２，１３２．０２，１２９．９５，１２８．０４，１２７．６９，１２６．６４，１２３．１２，１１２．９７，８５．８９，７２．９７，７０．６４，７０．４３，６９．９７，６９．７４，６７．８０，６４．３４，５５．１０，３７．１４；  低分解ＭＳ  ｍ／ｅ  Ｃ４０Ｈ４９Ｏ１０Ｎ２（Ｍ＋ＮＨ４＋）として計算値  ７１７．３９８，分析値  ７１５．５．
反応図３に従い、化合物９は以下の通り合成した。１００ｍＬのアセトンおよび１ｍＬのＨ２Ｏ中４ａ（１０．１３ｇ，０．０２７９ミリモル）の溶液を攪拌しながらこれに３．９８ｇ（１．２２当量）のＮ−メチルモルホリンＮ−オキシドを加えた。この懸濁液に１．７５ｍＬ（０．００５当量）の四酸化オスミウムをｉＰｒＯＨ中２．５％溶液として加えた。ＯｓＯ４溶液の添加後には反応混合物は澄明な黄色を呈した。ＴＬＣ分析が４ａの完全な変換を示したのち（約１６時間）、反応混合物を１．５ｇの亜硫酸水素ナトリウムおよび５．０ｇのフロリジルで処理し、３０分間攪拌した。懸濁液をフロリジルを通してろ過し、ろ液を濃縮して油状物を得た。この粗生成物を、１．０ｇの４ａから同様の方法で調製された他のバッチと合わせた。合わせたロットから１００ｍＬ部のピリジンを用い２回共蒸発し、残留物を３００ｍＬのピリジンに溶解した。この溶液を０℃に冷却し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド１０．８９ｇ（１．０５当量）を加えた。反応フラスコを乾燥管を挿入し、反応混合物を室温で１６時間攪拌した。この溶液を５０ｍＬのＭｅＯＨで処理し、水浴の温度を４０℃以下に保持して真空中で濃縮した。粗製の油状物を１１００ｍＬのシリカゲル（ヘキサン中３％トリエチルアミンを用いカラムに湿式充填）を用いフラッシュクロマトグラフィーに付し、ヘキサン（すべて３％トリエチルアミン含有）中１０−１００％ＥｔＯＡｃ（すべて３％トリエチルアミン含有）で溶出して精製すると、２１．３ｇ（２工程後８９％）の９が黄色の油状物として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８０−７．７７（ｍ．２Ｈ），７．６６−７．６４（ｍ，２Ｈ），７．３９−７．２２（ｍ，９Ｈ），７．２０−６．７６（ｍ，４Ｈ），３．９７（ｂｓ，１Ｈ），３．８４（ｔ，Ｊ＝５．９７Ｈｚ，２Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．６８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．６０−３．４９（ｍ，１４Ｈ），３．１３−２．７６（ｍ，２Ｈ），２．００（ｂｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．２，１５８．３，１４４．８，１３５．９，１３３．８，１３２．０，１２９．９，１２８．０，１２７．７，１２６．６，１２３．１，１１３．０，８５．９，７３．０，７０．６，７０．４，７０．０，６９．７，６７．８，６４．４，５５．１，３７．１；低分解ＭＳ  ｍ／ｅ  Ｃ４０Ｈ４５Ｏ１０Ｎ（Ｍ＋ＮＨ４＋）として７１７．５．
１−ジメトキシトリチル−３−（アミノテトラエチレングリコリル）−ｓｎ− グリセロール（１０）：反応図２に従い、化合物１０を以下のように合成した。化合物９（５．２ｇ，７．２ミリモル）をＨ２Ｏ中４０％メチルアミン５０ｍＬに取り、出発原料を可溶化するために１０ｍＬのメタノールを加えた。反応混合物を５０℃に５時間加熱し、ついで真空中で濃縮し、トルエンと共蒸発させた。粗製の物質を２００ｍＬのシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに付し、ジクロロメタン中１５％メタノール性アンモニアで溶出して精製した。３．９４ｇ（９６％）の１０が淡黄色の油状物として収集された。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．４６−７．２１（ｍ，９Ｈ，ＤＭＴ），６．８１（ｄ，４Ｈ，ＤＭＴ），４．００（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．７０−３．４９（重複ｍ，１８Ｈ），３．２０（ｄｄ，Ｊ＝９．２４Ｈｚ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ＝９．２１Ｈｚ，１Ｈ），２．８４−２．８０（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １５８．３０，１４４．８２，１３６．０１，１２９．９５，１２８．０４，１２７．６６，１２６．６１，１１２．９５，８５．８５，７３．４６，７２．８５，７０．５５，７０．４５，６９．９９，６９．５１，６４．４３，５５．１０，４１．４０；  低分解ＭＳ  ｍ／ｅ  Ｃ３２Ｈ４４Ｏ８Ｎ（Ｍ＋１＋）として計算値  ５７０．３５３，分析値  ５７０．４．
反応図３に従い、化合物１０は以下のように合成した。Ｈ２Ｏ中４０％メチルアミン５０ｍＬに化合物９（５．２ｇ，７．２ミリモル）を取り、１０ｍＬのメタノールを出発原料を可溶化するために添加した。反応混合物を５０℃に５時間加熱し、ついで真空中で濃縮し、トルエンと共蒸発させた。粗製の物質を２００ｍＬのシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに付し、ジクロロメタン中１５％メタノール性アンモニアで溶出して精製した。３．９４ｇ（９６％）の１０が淡黄色の油状物として収集された。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．４６−７．２１（ｍ．９Ｈ，ＤＭＴ），６．８１（ｄ，４Ｈ，ＤＭＴ），４．００（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．７０−３．４９（重複ｍ，１８Ｈ），３．２０（ｄｄ，Ｊ＝９．２４，５．４９Ｈｚ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ＝９．２１，６．０Ｈｚ，ＩＨ），２．８４−２．８０（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １５８．３０，１４４．８２，１３６．０１，１２９．９５，１２８．０４，１２７．６６，１２６．６１，１１２．９５，８５．８５，７３．４６，７２．８５，７０．５５，７０．４５，６９．９９，６９．５１，６４．４３，５５．１０，４１．４０；低分解ＭＳ  ｍ／ｅ  Ｃ３２Ｈ４４Ｏ８Ｎ（Ｍ＋１＋）として計算値  ５７０．３５３，分析値  ５７０．４．
ＰＥＧ試薬１２：１０ｍＬのＤＭＦ中０．２４ｇ（０．４１ミリモル）の１０の溶液を攪拌しながら、これに２．０８ｇ（０．４ミリモル）のメトキシ−ＰＥＧ５０００−ニトロフェニルカルボネート（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を加えた。混合物を７０時間攪拌し、次に真空中で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、有機相を３０ｍＬ部の１０％ＮａＯＨで３回洗浄した。１００ｍＬのシリカゲル（５％Ｅｔ３Ｎ含有ジクロロメタンを用い湿式充填）を用いてフラッシュクロマトグラフィーに付しジクロロメタン中２０％メタノール性アンモニアで溶出して精製すると、１．９７ｇ（８５％）の１２が白色固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．４２−７．３９（ｄ，２Ｈ，ＤＭＴ），７．３９−７．１８（ｍ，７Ｈ，ＤＭＴ），６．７９（ｍ，４Ｈ，ＤＭＴ），５．７０（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，６Ｈ，ＤＭＴ），３．７８−３．５０（ｂｒ  ｍ，〜５００，ＰＥＧ  Ｈｓ），３．４２−３．３１（重複ｍｓ），３．３５（ｓ，ＰＥＧ  Ｍｅ），３．１６（ｍ，２Ｈ），２．８４（ｂｒ  ｄ，４．２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １５９．３６，１５７．１９，１４６．１５，１３６．９５，１３０．８３，１２８．８６，１２８．６５，１２７．６１，１１３．８６，８６．４８，７３．５８，７２．８８，７２．５−７０．０（ＰＥＧ  炭素），６８．３１，６５．７７，６４．４５，４１．３６，３０．７５（未帰属不純物）．
ＰＥＧホスホロアミダイト試薬１３：６０ｍＬのＴＨＦ中２．２２ｇ（０．４ミリモル）の１２の溶液を３Åモルキュラーシーブ上で攪拌しながら、これに０．２４ｍＬ（１．３９ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンおよび０．１ｍＬ（０．４４ミリモル）の２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを添加した。
【０１０１】
５時間後、３１Ｐ  ＮＭＲは所望の生成物の形成ならびに加水分解したホスフィチル化試薬を示し、さらに０．０５ｍＬ（０．２２ミリモル）の２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを添加した。１２時間後、０．０７ｍＬ（０．４ミリモル）のＤＩＰＥＡおよび０．１ｍＬのクロロホスホロアミダイトを加えた。混合物を２日間攪拌し、セライトを通してろ過し、真空中で濃縮した。残留物を数回エーテルと磨砕した。３１Ｐ  ＮＭＲ：δ  １５６．４，１５５．８。δ  ２０．６，１９．８にもシグナルが観察され、加水分解されたホスフィチル化試薬に相当するものと思われた。
【０１０２】
ＰＥＧ  Ｈ−ホスホネート試薬１４：１０ｍＬのＭｅＣＮ中無水イミダゾール（０．４ｇ；５．９ミリモル）溶液を０℃で攪拌しながら、これに０．１７ｍＬ（１．９ミリモル）のＰＣｌ３、ついで０．８６ｍＬ（６．２ミリモル）のＥｔ３Ｎを添加した。この混合物に、１２ｍＬのＭｅＣＮ中３．０ｇ（０．５５ミリモル）の１２の溶液を滴下して加えた。反応混合物を放置して温度を室温まで上昇させ、１６時間攪拌し、１０ｍＬの０．１Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩で処理し、真空中で濃縮した。トリエチルアミンついでトルエンを粗製の残留物から共蒸発させ、ついで生成物をジクロロメタンに溶解した。有機相を１．０Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ＴＥＡＢ）溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。３００ｍＬのシリカゲル（ヘキサン／Ｅｔ３Ｎ９５：５で湿式充填）上フラッシュクロマトグラフィーに付し、ジクロロメタン中２−４−６−８−１０−１２−１５％メタノール性アンモニアで溶出して精製すると、１．９５ｇの生成物が白色固体として得られた。３１Ｐ  ＮＭＲ：δ  １０．３，１０．２．
脂質ホスホロアミダイト１７の合成：ピリジン１０ｍＬ中５４０ｍｇ（１ミリモル）の１，２−ジ−Ｏ−パルミチルｒａｃ−グリセロールの溶液を１９５ｍｇ（１．２ミリモル）のカルボニルジイミダゾールで処理し、得られた混合物を室温で一夜攪拌した。この混合物に５７０ｍｇ（１ミリモル）のアミノアルコールを３ｍＬのＤＭＦ中溶液として添加した。混合物を一夜４０℃に加温したのち、反応混合物からのアリコートの１Ｈ  ＮＭＲ分析を行ったところ生成物の形成は無視できる程度であった。混合物を８０℃に６時間加熱し（１Ｈ  ＮＭＲによれば生成物：出発原料は約１：１）、ついで真空中で濃縮した。粗製の残留物を１２５ｍＬのＳｉＯ２ゲル（ヘキサン中で充填）カラムに適用し、ヘキサン（２％ＴＥＡ含有）中２０−５０％ＥｔＯＡｃの勾配で生成物を溶出すると、５００ｍｇ（４４％）の中間体１６が透明の蝋状物として得られた。１６：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．４２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３０−７．１８（ｍ．７Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，４Ｈ），５．３４（ｂｒ  ｔ，１Ｈ），４．２０−３．２５（重複シグナル），３．１６（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ），１．２４（ｍ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）．アルコール１６（５００ｍｇ，０．４４ミリモル）を４ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２ならびに０．１５ｍＬ（２当量）のＤＩＰＥＡに溶解した。この溶液に０．１５ｍＬ（０．６６ミリモル）の２−シアノエチル（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスホロアミダイトを添加した。３時間後、ＴＬＣは２スポットへの変換を示し、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。粗製の残留物を５０ｍＬのＳｉＯ２ゲルカラム（ヘキサン中で充填）に適用し、生成物をヘキサン（２％ＴＥＡ含有）中２０％ＥｔＯＡｃで溶出し、３５０ｍｇ（５９％）のホスホロアミダイト１７を透明の蝋状物として得た。
【０１０３】
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  １５１．５５，１５１．０８．
脂質−  オリゴの自動合成：ホスホロアミダイト１７を、Ｔ−３マー（ＡＢＩ３９４型装置で標準自動ＤＮＡ合成により調製）の５’−末端にＭｅＣＮ中４０％ＴＨＦ中０．１Ｍの１７溶液のカラムへの各３０分２回暴露からなる改良カップリングサイクルを用いて結合させた。平行トリチル分析はアミダイト１７について９４％のカップリング効率を示した。
【０１０４】
クロロホルメート１９：トルエン６０ｍＬ中３ｇ（５．０３ミリモル）の１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロール２１の溶液を攪拌しながら、これに１．９３Ｍホスゲン溶液２０ｍｌを加えた。アルコール出発原料の残留が認められなくなるまで（濃縮アリコートの１Ｈ  ＮＭＲ分析）ホスゲン溶液を追加した（２×１０ｍＬ；総ホスゲン量１５．４当量）。過剰のホスゲンおよびＨＣｌをアスピレーターで除去したのち反応混合物を真空中で濃縮すると、３．３ｇ（９８％）の所望のクロロホルメート１９が白色の粉末として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ４．４５（ｄｄ，Ｊ＝１１．２２，３．６９Ｈｚ，１Ｈ），４．３４（ｄｄ，Ｊ＝１１．２２，６．１５Ｈｚ，１Ｈ），３．６５（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．４０（ｍ，６Ｈ），１．５３（ｍ，４Ｈ），１．２４（ｍ，６２Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．３６Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７５．９０，７１．９１，７１．３５，７０．９３，６９．３６，３１．９９，２９．９６−２９．４４（炭化水素鎖からの重複シグナル），２６．１３，２６．０４，２２．７６，１４．１８．
接合体２０：６０ｍＬのピリジン中２．２５ｇ（３．９５ミリモル）の１０の溶液を攪拌しながら、これに２．６ｇのジステアリルグリセロールクロロホルメート１８を添加した。２時間後の濃縮アリコートの１Ｈ  ＮＭＲ分析により、クロロホルメートの残留は認められなかったので、混合物を真空中で濃縮した。この粗製の残留物を、０．５ｇ（０．８８ミリモル）の１０および０．５８ｇのクロロホルメートから同様にして調製した生成物と合わせ、合わせたロットを１００ｍＬのシリカゲル（２％トリエチルアミン含有ヘキサン中で充填）上フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーに付し、２００ｍＬのヘキサン、ついでそれぞれ２５０ｍＬのヘキサン中１０−２０および３０％ＥｔＯＡｃ、５００ｍＬのヘキサン中４０％ＥｔＯＡｃ、ついでそれぞれ２５０ｍＬのヘキサン中５０−６０−７０および８０％ＥｔＯＡｃで溶出して精製した。生成物を含有する分画を濃縮すると３．３ｇ（５７％）の接合体２０が得られた。
【０１０５】
ホスホロアミダイト２１：２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中３．８ｇ（３．２６ミリモル）の接合体の溶液を攪拌しながら、これに１．１４ｍＬ（６．５２ミリモル）のジイソプロピルエチルアミン、ついで１．０９ｍＬ（４．８８ミリモル）の２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを添加した。２時間後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。
【０１０６】
粗製の残留物を１２５ｍＬのシリカゲルカラム（２％トリエチルアミン含有ヘキサン中で充填）上フラッシュクロマトグラフィーに付し、１００ｍＬのヘキサン、ついでそれぞれ２５０ｍＬのヘキサン中１０および２０％ＥｔＯＡｃ、５００ｍＬのヘキサン中３０％ＥｔＯＡｃ、ついで２５０ｍＬのヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃで溶出して精製した。生成物を含有する分画を濃縮すると４．２ｇ（９５％）のホスホロアミダイト２１が得られた。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  １５１．５２，１５１．０８．
実施例２．ＰＥＧ接合およびコレステロール誘導体化核酸リガンドの調製および機能的性質
核酸リガンドのＰＥＧ３４００接合体は非接合分子の結合親和性を維持する
ｂＦＧＦリガンド／ＰＥＧ−３４００接合体のｂＦＧＦに対する結合能を調べた。
【０１０７】
分子２２５ｔ３（配列番号：１０）、すなわちｂＦＧＦに対する高親和性ＤＮＡリガンドを一級アミン−ＮＨＳカップリング反応を介するＰＥＧとの接合に選択した。
リガンド２２５ｔ３  は１ｎＭの結合親和性を有し、Ｔｍ６８℃おいてブラント末端ヘアピンにフォールディングする。リガンド２２５ｔ３は、３’−アミノ修飾剤Ｃ７  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）により標準ＤＮＡ合成法を使用して修飾し、２２５ｔ３  Ｎ（配列番号：１１）と呼ぶ。２２５ｔ３  ＮはｐＨ８．５に緩衝化した２０％（ｖ／ｖ）ジメトキシホルムアミド、８０％（ｖ／ｖ）０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム中ＰＥＧ（平均分子量  ３４００）のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化エステルと反応させた。得られた接合体、２２５ｔ３  Ｎ−ＰＥＧ−３４００（配列番号：１４）は１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上遊離のＤＮＡから精製した。接合体は３２Ｐで５’−末端を標識し、結合アッセイを行った。２２５ｔ３  Ｎ−ＰＥＧ−３４００（配列番号：１４）は２２５ｔ３と同じ親和性（Ｋｄ＝１ｎＭ）でｂＦＧＦに結合した。
【０１０８】
トロンビンＤＮＡリガンドへのＰＥＧ−２０，０００  の接合
アミノとジスルフィド官能基を有するトロンビンＤＮＡリガンドＮＸ２５６（配列番号：９）（図１Ｄ）は標準ＤＮＡ合成法、ならびにｄＴ−５’−ＬＣＡＡ−５００Å制御多孔性ガラス固体支持体および市販のホスホロアミダイト試薬による  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８９０９ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上での操作を用いて調製した。脱保護に続いてイオン交換ＨＰＬＣ精製を行った。５’−末端ジスルフィド結合は、ＤＮＡを５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液中３７℃で３０分間インキュベートすると減少した。還元ＤＮＡ（５’−末端チオールを含む）をＮａｐ−５サイズ排除カラムに通して、ＤＮＡを含むがＤＴＴを含まない空隙容量を、アルゴン層下にマレイミド誘導体化ＰＥＧを含有する反応容器中に集めた。溶液はすべてアルゴンで洗浄し酸素を除去した。反応混合物を４０℃に１時間保持した。反応の進行は、少量のアリコートを採取し、８％／７Ｍ尿素ポリアクリルアミド上電気泳動により分析してモニターした。１時間のインキュベーションの終了後、反応はほぼ完了し、この時点で反応混合物に等容のメチレンクロリドを加え乳状の白色懸濁液が形成されるまで容器を振盪した。混合物をエッペンドルフ遠心分離器により１４，０００ｒｐｍで層が分離するまで遠心分離した。遊離の核酸リガンドを含む水層は捨てた。生成物（ＰＥＧ−２０，０００  修飾ＤＮＡリガンドＮＸ２５６  、ＮＸ２５６−ＰＥＧ−２０，０００と呼ぶ。配列番号：１３）（図１Ｇ）はイオン交換クロマトグラフィーついで逆相脱塩を用いてさらに精製し、凍結乾燥して白色の粉末を得た。この物質はＤＮＡ核酸リガンドの薬物動態学的挙動に対するＰＥＧ修飾の効果の測定に用いた（下記参照）。ＰＥＧ−１０，０００修飾リガンドＮＸ２５６（ＮＸ２５６−ＰＥＧ−１０，０００と呼ぶ）も同様に調製された。
【０１０９】
ＰＥＧ接合体のＴｍ  値
ＰＥＧの機能性はチオホスフェート−マレイミド反応によっても導入することができる。本発明者らは、トロンビンＤＮＡリガンドの５’−末端に、チオホスフェート基を、標準ホスホロアミダイト法によって、市販の試薬を用いて導入した（このリガンドはＴ−Ｐ４と呼ぶ）（図１Ｆ，配列番号：１２）。マレイミドを含有するＰＥＧへの接合は上記スルフヒドリル−マレイミド反応の場合と同様である。ＰＥＧ接合リガンドはＴ−Ｐ４−ＰＥＧ−１０，０００およびＴ−Ｐ４−ＰＥＧ−２０，０００（配列番号：１５）と呼ぶ。Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−１０，０００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−２０，０００およびＴ−Ｐ４−ＤＮＡの融点（Ｔｍ）は最初の誘導体の２６０ｎｍにおける吸光度対温度プロットから決定された。Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−１０，０００，Ｔ−Ｐ４−ＰＥＧ−２０，０００およびＴ−Ｐ６のＴｍ値は３つのリガンドすべて４０℃であった。これらのデータおよび上述のｂＦＧＦ−ＰＥＧ−３４００リガンド結合データは、ＰＥＧへの接合が核酸リガンドの構造に影響しないことを示唆している。
【０１１０】
コレステリル化ｂＦＧＦ−  リガンドは非コレステリル化分子の結合親和性を維持する
コレステロールは、標準固相ホスホロアミダイト法により、核酸リガンドの配列中の任意の位置に導入することができる。たとえば、本発明者らは、リガンド２２５ｔ３（図１Ｅ；配列番号：１０）の３’末端にテトラエチレングリコールコレステロールホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を導入してリガンド２２５ｔ３−コレステロールを作成した。１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上で精製したのち、２２５ｔ３−コレステロールは３２Ｐで５’−末端を標識し、結合アッセイを実施した。２２５ｔ３−Ｃｈｏｌの結合親和性は２２５ｔ３の値（Ｋｄ＝１ｎＭ）と同じであった。
【０１１１】
実施例３ 核酸リガンド−  リポソーム製剤および抗凝固活性
Ａ．ＮＸ２３２  リポソームの調製
フルオレセイン−標識、コレステロール誘導体化ＮＸ２３２（図１Ｂ；配列番号：７）を主としてジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）２：１のモル比からなるリポソームに導入した。
ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（２：１モル比）を含有するＮＸ２３２リポソームの８種の製剤を調製した。ＮＸ２３２のモル百分率は存在する総脂質に対して０．０１〜０．１モル％で変動させた。組成（Ａ〜Ｈ）は表１に示す。製剤Ｄ〜Ｈでは、陽イオン性の脂質１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）の分画を増大させて、ＮＸ２３２とリポソーム表面の間の結合の強度に対する陽性電荷の影響を評価した。
【０１１２】
【表１】
2010265300.tif 000008
【０１１３】
脂質およびＮＸ２３２はクロロホルム、メタノール、水（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ，１：１：１，ｖ：ｖ：ｖ）の混合物中に共可溶化して試験管に移した。脂質フィルムは窒素気流下に溶媒を蒸発させて形成させた。乾燥脂質フィルムは、水和まで真空下に保存した。フィルムは、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）および１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有９％スクロース（約２５０ｍＭ）水溶液（ｐＨ７．４）によって６５℃で水和した。水和後、脂質はプローブ型ソニケーターを用いて約６〜９分間超音波処理し、ついで室温に冷却した。
【０１１４】
導入されなかったＮＸ２３２（図１Ｂ；配列番号：７）は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００を用いてＦＰＬＣゲル透過クロマトグラフィーにより、上述のスクロース水和溶液で溶出して除去した。空のリポソーム（Ｅｍｐｔｙ）、４．７ｇ  ＮＸ２３２含有リポソーム（Ｌ−ＮｅＸ２ａ）、１１．８μｇ  ＮＸ２３２含有リポソーム（Ｌ−ＮｅＸ２ｂ）、７２μｇの遊離ＮＸ２３２（Ｆｒｅｅ  ７２μｇ）、７．２μｇの遊離ＮＸ２３２（Ｆｒｅｅ  ７．２μｇ）および超音波処理した１０μｇの遊離ＮＸ２３２（Ｆｒｅｅ／ｓｏｎｉ  １０μｇ）のゲル透過クロマトグラムを図２に示す。これらのクロマトグラムは遊離ＮＸ２３２とリポソームの良好な分離が可能であることを示している。７２μｇの遊離ＮＸ２３２のクロマトグラムはリポソームの後に明瞭なピーク（約５３分の溶出ピーク）を示すが、２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収によって可視化するためには７２μｇの遊離核酸リガンドを添加しなければならなかった。７．２μｇの遊離ＮＸ２３２では類似のピークは識別できない。したがって、リポソーム製剤に関しては、ＮＸ２３２  量（「ａ」については４．７μｇおよび「ｂ」については１１．８μｇ）はクロマトグラムに明瞭なピークを示すためには十分ではなかった。
【０１１５】
２５４ｎｍにおける吸収の測定によれば、ＮＸ２３２はこれらのリポソームにほぼ定量的に導入された。約５０％程度のＮＸ２３２しかフルオレセイン標識されなかったので、定量的な導入はフルオレセイン標識の存在がＮＸ２３２のリポソームとの結合に有意な影響は与えないことを示唆している。
【０１１６】
Ｂ．凝血阻害のインビトロアッセイ
ＮＸ２３２（図１Ｂ；配列番号：７）はトロンビンに対して親和性の高い核酸リガンドのＤＮＡ配列を含有する。トロンビンは血液凝固カスケードの重要な成分である。トロンビンのタンパク分解活性の阻害は血液の凝固能力を低下させることが知られている。各種ＮＸ２３２製剤の活性を、抗凝固活性を測定するフィブリン／トロンビン凝血アッセイを用い評価した。アッセイには、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．１％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）（ＭＷ８，０００），ｐＨ７．４の緩衝溶液を使用した。最終３００μｌのアッセイ混合物では、ガラス試験管に２．５ｍｇ／ｍｌ濃度のフィブリノーゲンおよび１国立保健研究所（ＮＩＨ）単位のトロンビンを加えた。凝血の測定ではすべての溶液および容器を３７℃に加温または維持した。凝固時間を表２に示す。
【０１１７】
【表２】
2010265300.tif 000009
【０１１８】
これらの結果は超音波処理、可溶化、加熱および乾燥を含む典型的なリポソーム処理条件はＮＸ２３２の抗凝血活性に影響しないことを示している。さらにリポソームの結合はＮＸ２３２のその標的に対する結合および阻害に影響しない。
【０１１９】
実施例４．コレステロール、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロールおよびＰＥＧ修飾ＤＮＡの薬物動態学的性質
トロンビンＤＮＡリガンドＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５３＋リポソームおよびＮＸ２５６−ＰＥＧ２０Ｋの薬物動態学的性質を測定した（分子構造については図１Ａ〜１Ｃ，１Ｇ参照）（配列番号：６〜８，１３）。各オリゴヌクレオチドは２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収および吸光係数０．０３３μｇ  オリゴ／ｍｌに基づいて０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ  の溶液濃度でＰＢＳに希釈した。１つを除く全試験で、６匹のラットに０．５〜１．０ｍｇオリゴヌクレオチド／ｋｇ動物体重を投与し、血漿サンプルを１〜４時間の様々な時点で採取した。１匹のラットはＮＸ２５３を試験する実験に使用した。血漿サンプルおよび品質管理サンプルはハイブリダイゼーションアッセイを用いて分析した。ハイブリダイゼーションアッセイには、酸化鉄（ＦｅＯ）ビーズに接合したＤＮＡリガンドの５’−末端に相補性の配列を含有する捕捉オリゴヌクレオチド［ＦｅＯ−スペーサ−５’−ｄ（ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＣＣ−３’）（配列番号：１），スペーサ＝（ｄＴ）８］および３’−末端にビオチン基を含有する検出オリゴヌクレオチド［５’−ｄ（ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＡＣＣ−スペーサ−３’−ビオチン−ビオチン），スペーサ＝（ｄＴ）１０］（配列番号：２）を使用した。ビーズに結合するビオチンオリゴヌクレオチドの量はルミネセント基質としてＣＳＰＤ−Ｓａｐｐｈｉｒｅを用いストラプトアビジン連結アルカリホスファターゼで定量した。
【０１２０】
ＮＸ２２９，ＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５３＋リポソームおよびＮＸ２５６−ＰＥＧ２０Ｋ（配列番号：６〜８，１３）の血漿濃度の１回注射後の時間の関数としてのデータを図３にまとめる。時間の関数としてのＮＸ２３２，ＮＸ２５３，ＮＸ２５３＋リポソームおよびＮＸ２５６−ＰＥＧ２０Ｋの血漿濃度はＮＸ２２９（配列番号：６）の場合に比較してかなり大きかった。これらのオリゴヌクレオチドはすべて、同一のトロンビン結合モジュール［ｄ（ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＧＧ）］（配列番号：３）を共有する。時間の関数としてのオリゴヌクレオチドの血漿濃度は、オリゴヌクレオチドへの適当な官能基の導入によって有意に増大させることができる。コレステロール含有オリゴヌクレオチドの対照（非コレステロール含有）オリゴヌクレオチドに比較した血漿半減期の延長は以前に観察されている（ｄｅ  Ｓｍｉｄｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：  ４６９５，１９９１）。
【０１２１】
ＮＸ２１３（分子構造は図１参照）の基本配列に様々な官能基が結合した広範囲の核酸リガンド、ならびにこれらのオリゴヌクレオチドのリポソーム製剤の一部の血漿薬物動態学的性質を評価した。これらのデータは図４にまとめる（配列番号：１６，１９，２１，２２および２９）。クリアランスの速度が最も遅い製剤はＮＸ２１３（図１Ｐ；配列番号：２１）がリポソームに封入された製剤であった。
【０１２２】
ジアルキルグリセロールＤＮＡ接合体＋および−リポソーム役割を決定するために、ＰＫ試験７７および７３をトロンビンＤＮＡリガンドジアルキルグリセロール接合体（分子構造については図１参照）について実施した。データは図５にまとめる（配列番号：１８）。
【０１２３】
コレステリル化ＶＥＧＦオリゴヌクレオチドＮＸ２１３（ＮＸ２６８）（分子構造は図１Ｋ参照；配列番号：１６）はＰＥＧ−リポソームまたは標準リポソームによって製剤化し、薬物動態を評価した（ＰＫ８５−８６）。これらの製剤はオリゴヌクレオチドをリポソームの内側および外側両者に含有する。図６（配列番号：１６）は注射後の時間の関数としての完全長オリゴヌクレオチドのラット血漿レベルを示す。両リポソーム製剤とも類似のオリゴヌクレオチド薬物動態を示す。
【０１２４】
クリアランスに対するサイズ依存性を評価するために、様々なＰＥＧ接合体を有する２’Ｏ−メチルＶＥＧＦオリゴヌクレオチドを試験した（分子構造については図１参照）（ＰＫ５０，８０，８７＆８８）。図７はすべての２’Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド＋ＰＥＧ４０Ｋ，２０Ｋ，１０ＫならびにＰＥＧの不存在（配列番号：１７および２９）の比較を示す。これらのデータは、ＰＥＧ接合体のサイズが増大するとともに、血漿クリアランスは有意に遅延することを証明する。
【０１２５】
ＰＫ９６は、２’Ｏ−メチルプリンならびにＰＥＧ２０Ｋと接合した２’Ｆピリミジン（ＪＷ１１３０）の薬物動態を評価するために実施された（分子構造については、図１Ｒ参照；配列番号：２３）。図８にはこのオリゴヌクレオチドの血漿レベルの全２’Ｏ−メチルバージョン（ＰＫ８０，ＪＷ９８６）との比較を示す（分子構造については図１Ｘ参照；配列番号：２９）。これらのデータは両オリゴヌクレオチドのかなり類似したクリアランス性を示す。
【０１２６】
２’Ｆピリミジン含有ＪＷ１１３０（配列番号：２３）がＪＷ９８６（２’Ｏ−メチルピリミジン）と類似のクリアランスを示すという観察は２’Ｆピリミジンを有するオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ消化に抵抗性であることを示唆する。
【０１２７】
ＰＫ９７は４０ＫＰＥＧと接合したＬ−セレクチンＤＮＡリガンド（ＮＸ２８７）（図１Ｓ；配列番号：２４）のクリアランス性を測定するために実施した。時９は１回注射（用量１ｍｇ／ｋｇ）後の時間の関数としてのこのオリゴヌクレオチドの血漿レベルを示す。比較のために、２０Ｋ  ＰＥＧと接合したトロンビンＤＮＡリガンド（ＮＸ２５６）（図１Ｈ；配列番号：１３）を包含させた。図９に示すように、これらの２つのオリゴヌクレオチドは類似のクリアランスを示し、これは代謝によるものと考えられる。
【０１２８】
ＰＫ試験９９，１００および１０２はオリゴヌクレオチドのインビボ安定性を評価するさらに大きな試験の一部として行われた。これらの試験は図１０に示す。比較のためＰＫ９６（ＪＷ１１３０ＶＥＧＦ）２’Ｆ  Ｐｙ  ２’Ｏ−Ｍｅｔ（１４Ｐｕ）＋ＰＥＧ２０Ｋ（図１Ｒ：配列番号：２３）も包含させる。ＰＫ試験９６，１００および１０２に用いたオリゴヌクレオチドは、２’デオキシヌクレオチドを含有するプリン位置の数のみが相違し、ＰＫ９６は２’デオキシプリンを含まず、ＰＫＩ００は４個の２’デオキシプリンを含み、ＰＫ１０２では１４個のプリンがすべて２’デオキシである。図１０（配列番号：２３，２５，２６，２７および３０）は、クリアランス速度の上昇とオリゴヌクレオチド中のデオキシヌクレオチドの数の間の明瞭な関係を証明するものである。デオキシヌクレオチドの数の増加とともにこの観察されたクリアランス速度の上昇はこれらのオリゴヌクレオチドの代謝の増大による可能性が考えられる。４個の２’デオキシプリンを含むＰＫ１００で示された高レベルの安定性という有望な観察は、多数のプリンが修飾できるならばセレックス後修飾が適当であることを示唆している。図１０にはまたＰＥＧ２０Ｋ接合の異なるＰＫ９９およびＰＫ１００が示されている。他のオリゴヌクレオチドで以前に認められているように、大きな分子量のＰＥＧ分子の接合は観察された血漿からのクリアランス速度を劇的に低下させる。
【０１２９】
実施例５．陽イオン性リポソーム−  核酸リガンド複合体：毒性およびヒトリンパ球によるその細胞内取り込み
毒性：リポソーム−核酸リガンドの細胞に対する毒性作用を測定するためヒト一次末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を核酸リガンド単独、２種類のリポソーム単独、ならびに２種類のリポソーム−核酸リガンドの組合せで処置した（下記参照）。
【０１３０】
２つのタイプの異なるリポソーム、タイプ１［＝ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）：アミノマンノースコレステロール，１：１重量比］およびタイプ２［＝ＤＯＰＥ：アミノマンノースコレステロール：ＤＯＴＡＰ，１：１．５：１重量比］をこの試験に用いた。リポソームはＨＩＶ−１逆転写酵素と約１〜５ｎＭのＫｄで結合する一本鎖標準ＤＮＡセレックスリガンドＲＴ１ｔ４９ＰＳ［５’−ｄ（ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  Ａｓ  Ｔｓ  Ｔｓ  Ｔｓ  Ｔ）−３’（配列番号：４）；小文字のｓはホスホロチオエート結合を示す］と５：１（リポソーム：核酸リガンド、重量比）に混合した。陽イオン性リポソーム−核酸リガンド複合体はリポソームおよびタイプ１またはタイプ２リポソームをＲＴ１ｔ４９ＰＳと６５℃で１０分間インキュベートして形成させた。
【０１３１】
ＰＢＬ（フィトヘマグルチニンおよび天然のＩＬ−２刺激）は９６−ウエルプレートの各ウエルあたり２×１０５細胞の密度でプレーティングした。細胞は日０に核酸リガンド単独、２種類のリポソーム単独、または２種類のリポソーム−核酸リガンド複合体で処置し、分裂させ、日４に再処置した。生存細胞は日７に計数した。各処置群についての生存細胞の百分率を以下にまとめる。
【０１３２】
処置          ％生存率
細胞単独        ８５
３０μｇ／ｍｌＲＴ１ｔ４９ＰＳ  ８２
リポソームタイプ１(150μg/ml)  ８５
リポソームタイプ２(150μg/ml)  ６３
リポソームタイプ１(150μg/ml)＋RT1t49PS(30μg/ml）  ８８
リポソームタイプ２(150μg/ml)＋RT1t49PS(30μg/ml)  ７７
これらの結果は以下のことを示唆する。リガンドＲＴ１ｔ４９ＰＳは３０μｇ／ｍｌまでの濃度では毒性はない。リポソームタイプ１は１５０μｇ／ｍｌまでの濃度で毒性は示さないが、リポソームタイプ２はこの濃度で中等度の毒性を示す（生存率の約２５％低下）。ＤＯＰＴＡの毒性は既知であることから、リポソームタイプ２には毒性が期待される。リガンドＲＴ１ｔ４９ＰＳはリポソームタイプ２の毒性を見掛け上約５０％まで低下させる。
【０１３３】
細胞取り込み．  フルオレセイン標識ＲＴ１ｔ４９ＰＳリガンドの細胞内送達を、フルオレセイン活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析ならびに共焦点顕微鏡を使用してＣＥＭｓｓ細胞（ヒトＴ細胞系）で調べた。この試験では、ＤＯＰＥ：アミノマンノース（１：１モル比）リポソームを用いた。脂質フィルムは２．３３ｍｇのＤＯＰＥおよび２．３３ｍｇのアミノマンノースをクロロホルムに溶解し、デシケーター中一夜真空下に保持して調製した。１ｍｌの９％スクロースをフィルムに加え、試験管を６５℃に０．５分間加熱しボルテックス攪拌した。この脂質混合物をついで、５０℃に加熱した水を含むビーカー中パワー設定７（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）で２分間超音波処理した。リポソームにさらに０．５ｍｌの９％スクロースを加え、ＭｉｃｒｏＴｒａｃ  粒子サイザーを用いてサイズを揃え（平均サイズ  ４５ｎｍ）、０．４５μｍ  酢酸セルロースフィルターを用いて滅菌ろ過した。リポソーム−核酸リガンド複合体はリポソームを核酸リガンドと脂質：オリゴヌクレオチド  ５：１ｗ／ｗ比において６５℃で１０分間インキュベートして調製した。
【０１３４】
細胞取り込み実験には、１０６  ＣＥＭ細胞をＴ２５フラスコ中、１６４０ＲＰＭＩ／１０  ％ウシ胎児血清１０ｍｌに希釈した。核酸リガンドは遊離薬物またはリポソーム複合体として０．６μＭを各フラスコに加え、５％ＣＯ２含有雰囲気中３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離し、２回洗浄して過剰の薬物を除去したのち観察した。
【０１３５】
共焦点顕微鏡試験は空冷アルゴンレーザー（励起４８８ｎｍ）により実施した。共焦点映像は１μｍスライスで撮影した（１シリーズあたり約２０スライス）。核酸リガンド単独とインキュベートしたＣＥＭ細胞には有意な（バックグランド以上の）蛍光は２４時間を通じて検出されなかった。リポソーム結合核酸リガンドとインキュベートしたＣＥＭ細胞には５時間までに有意な蛍光が検出され、２４時間を通じて増強された。蛍光は小胞に局在するように見えて、核には認められなかった。分極した細胞（たとえば７時間リポソーム結合核酸リガンドとインキュベーション）では、蛍光は前縁／先端から離れた細胞の後部に局在する。
ＦＡＣＳ分析は、空冷アルゴンレーザー（励起４８８ｎｍ）を装着したＣｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  Ｅｌｉｔｅを用いて行った。ＣＥＭ細胞は前方および側方スキャッターによりゲートし、緑色の蛍光を検査した。死亡細胞および凝集体はゲートで排除された。共焦点顕微鏡試験で示唆されたように、リポソーム結合核酸リガンドとインキュベートされた細胞の蛍光は遊離の核酸リガンドとインキュベートされた細胞の場合よりほぼ１オーダー大きい。リポソーム結合核酸リガンドの取り込みは完全には均一ではない。一部の細胞では他に比べて蛍光が有意に強い。脂質：核酸リガンド比  ５：１ｗ／ｗ（核酸リガンドのＭｒ約１４，０００；脂質のＭｒ約７００）で、リポソームあたり脂質４０，０００と仮定すると、リポソームあたり約４００の核酸リガンドが存在する。ＦＡＣＳによる検出の下限は細胞あたり約５００蛍光粒子または細胞あたり１個のリポソームよりわずかに大きい。
【０１３６】
結論として、遊離の５’Ｆ１−ＲＴ１ｔ４９ＰＳ核酸リガンドは、２４時間以内にＣＥＭ細胞内に有意には局在しない。ＤＯＰＥ：アミノマンノースリポソームに結合した核酸リガンドはＣＥＭ細胞内に５時間までに局在し、２４時間を通して細胞内に局在を続ける。リポソーム結合核酸リガンドは小胞に蓄積し、核には蓄積しないように思われる。リポソーム結合核酸リガンドの取り込みは、ＦＡＣＳ分析から判断して、遊離の核酸リガンドの少なくとも１０倍である。
【０１３７】
実施例６．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：脂質の陰性電荷の変動の影響
表３に示すモル比での処方を使用して、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）からなる小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）を調製した。
【０１３８】
陰性に荷電した脂質であるＤＳＰＧの含有モル百分率が変動する４つの組成物を調製し、多重陰イオン性核酸リガンドの導入に対する陰性リポソーム電荷の影響を評価した。脂質をＣＨＣｌ３に溶解し、混合し、窒素を絶えず流しながら乾燥させた。乾燥した脂質フィルムは水和の前に一夜真空中でさらに乾燥させ、保存した。脂質フィルムはＮａ２ＨＰＯ４（１．１５ｇ／Ｌ），ＮａＨ２ＰＯ４（０．２２８ｇ／Ｌ）およびスクロース（９０ｇ／Ｌ）を含有するｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）により６５℃で水和し、５０ｍｇ／ｍＬの脂質懸濁液を得た。水和された脂質懸濁液をついでプローブ型ソニケーターを使用して不透明な溶液が得られるまで超音波処理した。
【０１３９】
これらの予め形成されたＳＵＶを等容量の核酸リガンド２３２（ＮＸ２３２）（配列番号：７）ＰＢＳ中１．０ｍｇ／ｍＬ（終濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ  ＮＸ２３２，２５ｍｇ／ｍＬ脂質）に加えた。この混合物を６５℃で１５分間インキュベートするかまたは室温に保持したのち、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ  Ｓ３００サイズ排除カラム（０．５×２０ｃｍ）上クロマトグラフィーに付し、ＳＵＶ結合ＮＸ２３２から遊離体を分離した。クロマトグラフィー条件は次の通りである。溶出液：上述のＰＢＳ；流速：０．１ｍＬ／分；注入サンプル：２５μＬ；検出：２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収；分画：０．２ｍＬ／分画。収集した分画は蛍光強度によってもモニターした（励起：４９４ｎｍ，発光：５１６ｎｍ）。
【０１４０】
ＳＵＶ結合ＮＸ２３２  はＳＵＶピーク（排除容量）に遊離のＮＸ２３２は包含容量に溶出した。クロマトグラム（図４）はＳＵＶとのＮＸ２３２の結合程度がＳＵＶ中のＤＳＰＧ含量に依存することを明らかに示している。ＳＵＶ中に含まれる陰性に荷電したＤＳＰＧの百分率がサンプルＡ〜Ｄの間で上昇するに従い、ＮＸ２３２のＳＵＮとの結合は減少した。
【０１４１】
【表３】
2010265300.tif 000010
【０１４２】
実施例７．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：コレステロール含量の変動の影響
ＤＳＰＣおよびＣｈｏｌからなるＳＵＶを調製し、実施例６のようにＮＸ２３２の導入をアッセイした。リポソームは表４に指示するように、ＤＳＰＣおよびコレステロールを異なるモル比で含有した。ＮＸ２３２はリポソームと結合し、室温で調製した場合、ＳＵＶとともに溶出した。
【０１４３】
【表４】
2010265300.tif 000011
【０１４４】
リポソーム処方ＪおよびＫ（ＤＳＰＣ：コレステロールのモル比約２：１）で核酸リガンドＮＸ２３２の最も効率的な導入が可能であった。
実施例８．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：ＮＸ２３２の固定量において脂質／核酸リガンド比の変動の影響
ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（モル比２：１）ＳＵＶを調製し、脂質／ＮＸ２３２比を変動させたほかは実施例６と同様にアッセイした。ＮＸ２３２（配列番号：７）の固定量１．０ｍｇ／ｍＬを室温において、脂質濃度２．５〜５０ｍｇ／ｍＬのＳＵＶの等容量と混合した（表５）。結果はＮＸ２３２のＳＵＶとの最大結合が脂質／ＮＸ比（ｗ／ｗ）２５／１で得られたことを示唆している。最高の脂質／ＮＸ比５０／１はＳＵＶに結合するＮＸ２３２の量を増大させなかった。
【０１４５】
【表５】
2010265300.tif 000012
【０１４６】
実施例９．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：ＳＵＶの固定量において脂質／核酸リガンド比の変動の影響
実施例６と同様に調製した予め形成されたＳＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ：２／１）５０ｍｇ／ｍＬを０．５〜５．０ｍｇ／ｍＬの様々な濃度におけるＮＸ２３２  の等容量と室温で混合した（表６）。結果はＮＸ２３２のＳＵＶとの最大結合が脂質／ＮＸ２３２比（ｗ／ｗ）２５／１で得られたことを指示している。ＳＵＶに結合するＮＸ２３２の分画は脂質／ＮＸ２３２比量が低いと減少した。
【０１４７】
【表６】
2010265300.tif 000013
【０１４８】
実施例１０．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：リン脂質鎖長の変動の影響
様々な鎖長を有するリン脂質から作成したＳＵＶとＮＸ２３２の結合を試験するために、表７に示すリン脂質から実施例６と同様にしてＳＵＶを調製した。
【０１４９】
【表７】
2010265300.tif 000014
【０１５０】
試験した３種のリポソーム処方中、ＤＰＰＣ／コレステロールリポソームが核酸リガンドＮＸ２３２の最高導入能をもつことが明らかにされた。
実施例１１．核酸リガンド−リポソーム複合体の非変性ゲル電気泳動分析
この実施例ではコレステロールと接合した核酸リガンドのリポソーム製剤への導入を証明する。本実施例で用いたリポソーム製剤はＤＳＰＣ：コレステロール（２：１モル比）である。１２５Ｉ−ボルトン−ハンター試薬で放射標識したコレステリル化トロンビンリガンドＮＸ２５３｛５’−［コレステロール］［ｄＴ−ＮＨ−１２５Ｉ−ボルトン−ハンター］−ｄ（ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＡＡ）［３’３’ｄＴ］ｄＴ−３’（配列番号：８）；ｄＴ−ＮＨ−１２５Ｉ−ボルトン−ハンターは、ボルトン−ハンター試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に接合しているアミノモディファイアーＣ６ｄＴ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）であり、３’３’ｄＴ（ｄＴ−５’−ＣＥホスホロアミダイト，Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）は逆方向性ホスホロアミダイトである｝はリポソーム：核酸リガンド比の関数として結合核酸リガンド分画の測定のために検査した。核酸リガンド−リポソーム複合体は核酸リガンドを９％スクロース含有２５ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．４中リポソームと６５℃で１５分間インキュベートして調製した。遊離の核酸リガンドはリポソーム結合核酸リガンドから、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離できる。
【０１５１】
この方法はこの２種の迅速かつ完全な分離を可能にする。リポソーム結合核酸リガンドをゲルに入れる（すなわち可視化可能にする）ためには、電気泳動試行の終了約５分間、負荷ウエルにｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の１％溶液を加えてリポソームを破壊する必要がある。リポソーム結合核酸リガンドの量は、よく定義されたバンドとして移動する遊離核酸リガンドの相対量からリン造影分析によって測定された。リポソームあたり約６０，０００の脂質が存在し、脂質の平均ＭＷを６５５．９Ｄａ（＝７９０．１５×０．６７＋３８６．７×０．３３）と仮定すると、核酸リガンドによるリポソームの飽和は核酸リガンド対リポソームのモル比約３００で起こる（図１２）。コレステロール残基をもたないＮＸ２５３  のアナログは、リポソーム濃度の同程度の範囲ではリポソームに導入されない（データは示していない）。
【０１５２】
実施例１２．核酸リガンドのリポソームへの受動封入
核酸リガンドをリポソームの水性内部内に封入する。核酸リガンドの水溶液は核酸リガンドをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に溶解し、濃度約３．５ｍｌ／ｍｌの保存溶液を得る。ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（２：１モル比）を含有する脂質フィルムは、クロロホルム：メタノール：水（１：５：１，ｖ：ｖ：ｖ）溶媒から脂質混合物を乾燥させて調製する。核酸リガンド保存溶液１ｍｌを脂質フィルムに添加し、４０℃で１０秒間浴超音波処理する。得られた溶液を、液体窒素を用いる４サイクルの凍結−解凍操作に付す。得られた均一な溶液を最初０．８μｍフィルター膜から押し出し（３回）、ついで０．４５μｍフィルター膜から（３回）、最後に０．２μｍフィルター膜から（３回）押し出す。非封入核酸リガンドは、床容量約２０ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムに分散液を通過させて除去する。
【０１５３】
実施例１３．リポソームへの核酸リガンドの遠隔負荷
核酸リガンドは遠隔負荷により、ＭＬＶの水性内部内に封入する。ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（２：１モル比）の脂質混合物を、２０μｍｏｌの脂質を用いて脂質フィルムに調製する。脂質フィルムは０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いて６５℃でボルテックス攪拌して懸濁し、平均直径１ミクロンのＭＬＶを形成させる。リポソーム懸濁液を液体窒素中で凍結し、６５℃で解凍する。凍結／解凍サイクルを３回反復し、塩がラメラ全体に均一に分布することを保証する。内部水相の浸透圧は約３００ミリオスモール（ｍＯｓｍ）である。リポソーム懸濁液を１０，０００ｇで１５分間遠心分離してペレット化して外部のＭｇＣｌ２溶液を除去する。上清を除き、リポソームペレットを６５℃で５分間加熱する。核酸リガンド溶液（水１００μｌ中２０μｇ）を予め６５℃で５分間加熱し、リポソームペレットに加える。加熱を３０分間続け、ついでサンプルを徐々に室温に冷却し、１ｍｌのＰＢＳで希釈する。捕捉されなかった核酸リガンドはＭＬＶの遠心分離ついで上清の除去により除く。ペレットを新たなＰＢＳに再懸濁し、遠心分離して再ペレット化する。
【０１５４】
実施例１４．リポソームへの核酸リガンドの共有結合
以下のスキーム１に示すようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびビニルスルホン官能基を含む二機能性ＰＥＧ−２０００（分子量２０００ＤａのＰＥＧ）を最初、２モル％のジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を含有するリポソームにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル残基を介して接合させた。生成物はサイズ排除クロマトグラフィーによって遊離のＰＥＧから精製した。ビニルスルホン生成物をついで還元ＮＸ２５６（図１Ｄ；配列番号：９）と反応させた。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ビニルスルホンは市販品が入手可能でビニルスルホン官能基を含むリポソームの製造に使用できるので、スキーム１の接合工程は省略できる。
【０１５５】
【化７】
2010265300.tif 000015
【０１５６】
以下のスキーム２に示すように第二の反応は完成した。出発原料は２モル％のＤＳＰＥマレイミドを含有するジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）リポソームとした。リポソームあたり５０，０００脂肪価を用いると、リポソームはリポソームあたり約１０００のマレイミド分子をもつことになり、その約６００が外側に存在する。核酸リガンド−リポソーム複合体は遊離の核酸リガンドからサイズ排除クロマトグラフィーによって分離した（上記参照）。２６０ｎｍの吸収から、核酸リガンド約２００分子が各リポソームに接合したと評価された。
【０１５７】
【化８】
2010265300.tif 000016
【０１５８】
実施例１５．核酸リガンド−リポソーム複合体のインビトロおよびインビボ効率．リポソーム二重層に封埋されたジアルキルグリセロール（ＤＡＧ）修飾ＶＥＧＦリガンド（ＮＸ２７８）
ＮＸ２７８−リポソーム複合体は、１ｍｇのＮＸ２７８（図１Ｎ；配列番号：１９）を９％スクロース含有１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．４）緩衝液中、ＤＳＰＣ：コレステロールの混合物（５０ｍｇ）とインキュベートして調製し、プローブ型ソニケーターを用いて、不透明な溶液が得られるまで１５〜３０分超音波処理した。核酸リガンドＮＸ−２７８の配列スクランブルアナログ（ｓｃＮＸ２７８）（図１Ｗ；配列番号：２８）を含有する対照核酸リガンド−リポソーム複合体を同様にして調製した。粒子アナライザー（Ｌｅｅｄｓ  ＆  Ｎｏｒｔｈｒｕｐ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｉｃｒｏｔｒａｃｋ  ＵＰＡ  １５０，Ｈｏｒｓｈｍａｎ，ＰＡ）で測定したリポソーム粒子のサイズ（通常５０〜１００ｎＭ）は核酸リガンドの不存在下に得られた粒子と同じであった。ＮＸ２７８−リポソーム複合体は、ビオチン標識核酸リガンドと、ポリスチレン固定化ＶＥＧＦへの結合でＶＥＧＦに競合し、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおける見掛けのＥＤ５０は約１０−７Ｍであった。同じアッセイで、ｓｃＮＸ２７８−リポソーム複合体は２μＭ核酸リガンドまででは有効に競合しなかった。比較のための、ＮＸ２７８と同じ配列を有するが５’末端にＤＡＧ残基をもたない遊離核酸リガンド，ＮＸ２１３（図１Ｐ；配列番号：２１）はＶＥＧＦに対してＥＤ５０値約１０−９Ｍの競合を示した。ＮＸ２１３に比較してＮＸ２７８−リポソームの固定化ＶＥＧＦに対する結合能の低下は、リポソームの外表面に提示された核酸リガンドの分画のみが平坦表面への結合に利用されると期待されることから、単純な幾何的抑制によるものと考えられる。さらに、内部表面に提示された核酸リガンドの分画はこのアッセイにおける結合には当然利用されない。
【０１５９】
ヒト映帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびカポジ肉腫（ＫＳ）細胞の組織培養における増殖に対するＮＸ２７８−リポソーム、ｓｃＮＸ２７８−リポソームおよびＮＸ２１３の作用を検討した。ＨＵＶＥＣは１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびヘパリン（４５μｇ／ｍｌ）含有ＩＭＤＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培地中ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下に増殖させた。細胞は日０に２４−ウエルゼラチン被覆プレートにウエルあたり２０，０００細胞の密度でプレーティングし、上述のリガンド０．１ｎＭ〜１μＭ濃度で日１，２および３に処理した（培地をリガンドとともに置換）。細胞の計数は日４に実施した。ＫＳ細胞系ＫＳＹ−１は、２％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０含有培地中に、日０に２４−ウエルゼラチン被覆プレートにウエルあたり７，５００〜１０，０００細胞密度でプレーティングした。核酸リガンドは新鮮培地中０．１ｎＭ〜１μＭ濃度で日１，２および３に添加し、細胞の計数は日４に実施した。ＮＸ２７８−リポソームはＨＵＶＥＣの増殖をＩＣ５０約３００ｎＭで阻害した（濃度は核酸リガンド成分の濃度を示す）。遊離核酸アナログＮＸ２１３の効果は有意に低かった（ＩＣ５０＞１μＭ）。
【０１６０】
ＮＸ２７８−リポソームはＫＳ細胞の増殖もＩＣ５０約１００ｎＭで阻害し、ＮＸ２７８−リポソームはこれらの細胞の増殖を１μＭで完全に阻害した。ｓｃＮＸ２７８−リポソームおよびＮＸ２１３はＩＣ５０＞１μＭであった。ＮＸ２７８−リポソームがインビボにおけるＶＥＧＦの血管透過活性を阻害する能力を調べた。血管透過性アッセイ［Ｍｉｌｅｓアッセイとも呼ばれる（Ｍｉｌｅｓ，Ａ．Ａ．＆  Ｍｉｌｅｓ，Ｅ．Ｍ．（１９５２）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）１１８：２２８］はＳｅｎｇｅｒら（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｓ．ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：９８３）の記載にほぼ従いモルモットで実施した。濃度１μＭのＮＸ２７８−リポソームはＶＥＧＦ誘発血管透過性を有意に阻害した。対照化合物，ｓｃＮＸ２７８−リポソームはこの濃度では阻害を示さず、実際には血管透過性は上昇を示したようであった。
【図１Ａ】
2010265300.tif 000017
【図１Ｂ】
2010265300.tif 000018
【図１Ｃ】
2010265300.tif 000019
【図１Ｄ】
2010265300.tif 000020
【図１Ｅ】
2010265300.tif 000021
【図１Ｆ】
2010265300.tif 000022
【図１Ｇ】
2010265300.tif 000023
【図１Ｈ】
2010265300.tif 000024
【図１Ｉ】
2010265300.tif 000025
【図１Ｊ】
2010265300.tif 000026
【図１Ｋ】
2010265300.tif 000027
【図１Ｌ】
2010265300.tif 000028
【図１Ｍ】
2010265300.tif 000029
【図１Ｎ】
2010265300.tif 000030
【図１Ｏ】
2010265300.tif 000031
【図１Ｐ】
2010265300.tif 000032
【図１Ｑ】
2010265300.tif 000033
【図１Ｒ】
2010265300.tif 000034
【図１Ｓ】
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【図１Ｔ】
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【図１Ｕ】
2010265300.tif 000037
【図１Ｖ】
2010265300.tif 000038
【図１Ｗ】
2010265300.tif 000039
【図１Ｘ】
2010265300.tif 000040
【図１Ｙ】
2010265300.tif 000041
【図２】
2010265300.tif 000042
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2010265300.tif 000049
【図１０】
2010265300.tif 000050
【図１１】
2010265300.tif 000051
【図１２】
2010265300.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月9日(2010.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の一本鎖核酸リガンド、及び当該核酸リガンドの５’若しくは３’末端に共有結合したポリエチレングリコールを含む治療用または診断用複合体の製造方法であって、
ここにおいて、核酸リガンドは、ワトソン／クリック型塩基対合または三重らせん結合に依存する機構を介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチドよりも、標的分子に対する高い親和性及び特異性を有しており、そして、
ポリエチレングリコールは１０００Ｄａまたはそれ以上の分子量を有しており、
前記方法は、単一の一本鎖核酸リガンドを１０００Ｄａまたはそれ以上の分子量を有するポリエチレングリコールに、核酸リガンドの５’若しくは３’末端に共有結合させることを含み、
前記方法は、以下の工程を含む方法によって核酸候補混合物から核酸リガンドを同定することを含む：
（ａ）単一の一本鎖核酸リガンドの候補混合物を、結合に好ましい条件下で標的と接触させ；
（ｂ）結合しなかった核酸を標的分子に結合した核酸からから分配し；
（ｃ）核酸−標的ペアを解離し；
（ｄ）核酸−標的ペアから解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド−富化混合物を得る；
ここにおいて、工程（ａ）−（ｄ）は標的分子に結合した核酸が得られるように、所望の回数再反復する、
前記方法。
【請求項２】
ポリエチレングルコールを核酸リガンドの５’若しくは３’ヒドロキシル基に共有結合させることを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
ポリエチレングルコールを、マレイミド若しくはビニルスルホン官能基を介して５’チオール基に結合させることを含む、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
核酸リガンドの５’若しくは３’末端にリンカー分子を共有結合させ、そして、ポリエチレングリコールをリンカー分子に結合させることを含む、請求項１ないし３のいずれか１項の方法。
【請求項５】
核酸リガンドが３’末端に、３’３’逆転ホスホジエステル連鎖を有する、請求項１ないし４のいずれか１項の方法。
【請求項６】
核酸リガンドがＤＮＡである、請求項１ないし５のいずれか１項の方法。
【請求項７】
核酸リガンドがＲＮＡである、請求項１ないし５のいずれか１項の方法。
【請求項８】
核酸リガンドが化学的に修飾されている、請求項１ないし７のいずれか１項の方法。
【請求項９】
修飾が以下のグループから選択される、請求項８の方法
−  ２’−位置の糖修飾；
−  ５−位置のピリミジン修飾；
−  ８−位置のプリン修飾；
−  環外アミンの修飾；
−  ４−チオウリジンの置換；
−  ５−ブロモウラシルの置換；
−  ５−ヨードウラシルの置換；
−  骨格の修飾；
−  ホスホロチオエート連鎖；
−  アルキルホスフェート；
−  メチル化；
−  ５’ ホスホロチオエートキャッピング；
−  ３’ ホスホロチオエートキャッピング。