(57)【要約】【課題】本発明は、検体中のＨＣＶ抗原及び抗ＨＣＶ抗体の同時検出を行うための組み合わせイムノアッセイ、試薬及びキットを目的とする。【解決手段】本発明の組み合わせイムノアッセイは、組換え型ＨＣＶ抗原による抗ＨＣＶ抗体の捕捉などの、他の試薬の機能を阻害することなく、検体中のビリオンからＨＣＶコア抗原を効果的に曝露又は放出させる非イオン系洗剤を使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のＨＣＶ抗原及び抗体を同時に検出するためのイムノアッセイにおいて、
Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドを含む非イオン系洗剤、捕捉抗原と検出抗原との第一組、捕捉抗体と複合抗体との第一組を提供することであって、前記捕捉抗原及び前記検出抗原が両方とも第一ＨＣＶタンパク質の第一ペプチド断片を含み、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が第二ＨＣＶタンパク質に特異的に結合し、前記検出抗原及び前記複合抗体が１つの同じ信号生成手段を含む、ことと、
前記検体を前記洗剤の存在下で、前記捕捉抗原、前記検出抗原、前記捕捉抗体、及び前記複合抗体に接触させることにより、前記捕捉抗原と、前記検出抗原と、前記検体中に存在する抗ＨＣＶ抗体との間でサンドイッチ複合体を形成し、前記捕捉抗体と、前記複合抗体と、前記検体中に存在するＨＣＶ抗原との間で複合体を形成することと、
前記複合体の形成の結果として前記信号生成手段から生成される信号を測定し、これにより前記検体中のＨＣＶ抗原及び抗体を同時に検出することと、
を含む、イムノアッセイ。
【請求項２】
前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドが、式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ＋−（ＣＨ３）２Ｏ−によって特徴付けられ、式中、ｎは９〜１３の範囲である、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項３】
前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドが、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）である、請求項２に記載のイムノアッセイ。
【請求項４】
前記第一ＨＣＶタンパク質及び第二ＨＣＶタンパク質が、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５からなる群から独立して選択される、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項５】
前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が同じであり、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第一ペプチド断片の外側の前記第二ＨＣＶタンパク質領域に結合する、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項６】
前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が両方とも前記ＨＣＶコア抗原である、請求項５に記載のイムノアッセイ。
【請求項７】
捕捉抗原と検出抗原との第二組が提供され、前記第二組の前記捕捉抗原及び前記検出抗原が両方とも、ＨＣＶタンパク質の第二ペプチド断片を含み、前記第二ペプチド断片は、前記第一ペプチド断片とは異なる、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項８】
前記第一ペプチド断片及び前記第二ペプチド断片が、異なるＨＣＶタンパク質から誘導される、請求項７に記載のイムノアッセイ。
【請求項９】
前記第一ペプチド断片又は前記第二ペプチド断片の少なくともいずれか一方が、前記ＨＣＶコア抗原の断片である、請求項８に記載のイムノアッセイ。
【請求項１０】
前記第一組の前記捕捉抗体が、２つ以上の抗体を含む、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項１１】
捕捉抗体と複合抗体との第二組が提供され、前記第二組の前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第二ＨＣＶタンパク質、又は異なるＨＣＶタンパク質に特異的に結合する、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項１２】
前記捕捉抗原及び前記捕捉抗体が、固相に付着している、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項１３】
検体中のＨＣＶ抗原及び抗体を同時に検出するためのキットにおいて、
Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドを含む非イオン系洗剤、捕捉抗原と検出抗原との第一組、捕捉抗体と複合抗体との第一組を含み、前記捕捉抗原及び前記検出抗原が、第一ＨＣＶタンパク質の第一ペプチド断片を含み、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が第二ＨＣＶタンパク質に特異的に結合し、前記検出抗原及び前記複合抗体が１つの同じ信号生成手段を含む、キット。
【請求項１４】
前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドが、式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ＋−（ＣＨ３）２Ｏ−によって特徴付けられ、式中、ｎは９〜１３の範囲である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドが、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５からなる群から独立して選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が同じであり、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第一ペプチド断片の外側の前記第二ＨＣＶタンパク質領域に結合する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が両方とも前記ＨＣＶコア抗原である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
捕捉抗原と検出抗原との第二組を更に含み、前記第二組の前記捕捉抗原及び前記検出抗原が、ＨＣＶタンパク質の第二ペプチド断片を含み、前記第二ペプチド断片は、前記第一ペプチド断片とは異なる、請求項１３に記載のキット。
【請求項２０】
前記第一ペプチド断片及び前記第二ペプチド断片が、異なるＨＣＶタンパク質から誘導される、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記第一ペプチド断片又は前記第二ペプチド断片の少なくともいずれか一方が、前記ＨＣＶコア抗原の断片である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記第一組の前記捕捉抗体が、２つ以上の抗体を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項２３】
捕捉抗体と複合抗体との第二組を更に含み、前記第二組の前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第二ＨＣＶタンパク質、又は異なるＨＣＶタンパク質に特異的に結合する、請求項１３に記載のキット。
【請求項２４】
前記捕捉抗原及び前記捕捉抗体が、固相に付着している、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は全般に、ＨＣＶ感染の検出及び診断用のイムノアッセイに関連する。特に本発明は、検体中のＨＣＶ抗原及び抗ＨＣＶ抗体の同時検出のための非イオン系洗剤の使用に基づく組み合わせイムノアッセイ、試薬及びキットに関連する。
【０００２】
〔発明の背景〕
一本鎖ＲＮＡウイルスであるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、血液感染の非Ａ非Ｂ型肝炎の病原因子である。ＨＣＶの慢性的活動性感染はしばしば、肝硬変及び肝細胞癌に進行する。疫学的研究により、ＨＣＶは世界で１億７０００万人を超える人々が感染しており、進行して最終的に死に至る慢性疾患の発症率が高い（症例の５０％超）ことが示されている。しかしながら、この疾患は主に血液感染であるため、血液検体中の病原体を識別し、輸血による疾患伝播を排除することが可能である。ＨＣＶ病原体に曝露した後、最初のうちはウイルスの存在の証拠はない（すなわち検出可能なウイルスＲＮＡ又は血清マーカーがない）。この期間は「ウィンドウ期間」（ＷＰ）と呼ばれる。一般に、ＨＣＶに曝露してから１０日後にウイルスＲＮＡが検出可能になるが、一方、抗ＨＣＶ抗体は約７０日後に検出可能になる（Ｂｕｓｃｈ  ＭＰ  ａｎｄ  Ｄｏｄｄ  ＲＹ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０（１０）：１１５７〜１１６０，２０００）。ＨＣＶ感染の拡大を防ぐためには、この観測可能な事実を考慮に入れ、検出ウィンドウを狭め得るような、信頼できる血液スクリーニング検査を確立することが非常に重要である。ＨＣＶ  ＲＮＡを検出する核酸増幅検査（ＮＡＴ）の市販開始以来、輸血後ＨＶＣ感染率は劇的に減少した。他の方法は、患者血清又は血漿中における、ＨＣＶコア抗原（Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡ（Ortho HCV Core Antigen ELISA）、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社（Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.）、ニュージャージー州ラリタン（Raritan））又はＨＣＶポリペプチドに対する抗体（Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡ（Ortho HCV 3.0 ELISA）、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社、ニュージャージー州ラリタン）の存在を検出するための、血液の血清学的スクリーニングに基づく。
【０００３】
Ｓｅｍｅら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．３２（２）：９２〜１０１，２００５）によって実施された調査によれば、第一世代のＨＣＶコア抗原アッセイは、核酸技法（ＮＡＴ）に匹敵する感度と検出限界で、ＨＣＶ感染を検出している。これらのアッセイは、現在の第三世代ＨＣＶ抗体スクリーニングアッセイよりも、４０〜５０日早くＨＣＶ感染を検出している。血液スクリーニング用に設計された第一世代ＨＣＶコア抗体アッセイは、ウィンドウ期間を顕著に短縮したが、血清変換前段階、又は早期の血清変換後段階においてのみコア抗原を検出する。更に、第一世代ＨＣＶコア抗原アッセイは、後期血清変換段階においてコア抗原が抗コア抗体と免疫複合体を形成すると、コア抗原を検出することができない。明らかに、血清変換前段階においてＨＣＶコア抗原を検出し、並びに血清変換段階において抗ＨＣＶ抗体を検出することができ、これによりＷＰを顕著に狭めることができるような、組み合わせ血清学的アッセイを有することが望ましい。この組み合わせ血清学的検査は特に、装置又は能力の欠如によりＮＡＴ検査が実施できないような状況において、血液スクリーニングの貴重な方法となり得る。
【０００４】
このようなＨＣＶ抗原抗体組み合わせアッセイは、現在の第三世代の血清学的血液スクリーニング法（Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡ）、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社、ニュージャージー州ラリタン）に対して、ＷＰを狭めるという点について、顕著な改善となる。しかしながら、抗原抗体組み合わせアッセイを成功させるための課題の１つは、組換え型ＨＣＶ抗原による抗ＨＣＶ抗体の捕捉を阻害することなく、ＨＣＶビリオンを分裂させ抗原を放出させるための適切な洗剤を選択することである。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明は、検体中のＨＣＶ抗原及び抗ＨＣＶ抗体の同時検出を行うための組み合わせイムノアッセイ、試薬及びキットを目的とする。
【０００６】
本発明の組み合わせイムノアッセイの独自性は主に、検体の予備処理なしに、しかも組換え型ＨＣＶ抗原によって抗ＨＣＶ抗体の捕捉を阻害することなく、ＨＣＶコア抗原を効果的に曝露、又は検体中のビリオンから放出させる非イオン系洗剤を使用することにあり、これによりＨＣＶコア抗原及び抗ＨＣＶ抗体の同時測定を可能にする。
【０００７】
本発明の組み合わせアッセイにおける使用に適した非イオン系洗剤は、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシド族の員である。１つの好ましい実施形態において、組み合わせアッセイではラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）が使用される。他の実施形態においては、ＬＤＡＯの誘導体又は機能的若しくは化学的に同等のものが使用される。
【０００８】
したがって、本発明は、検体中のＨＣＶ抗原及び抗ＨＣＶ抗体の同時検出のための、さまざまな形態の組み合わせイムノアッセイ、関連試薬及びキットを提供する。
【０００９】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、ＨＣＶ抗原抗体組み合わせイムノアッセイ、並びに関連する方法、試薬及びキットを目的とする。
【００１０】
ＨＣＶ抗原抗体組み合わせイムノアッセイ、又は「コンボ」アッセイとは、単一のアッセイで検体中のＨＣＶ抗原と抗ＨＣＶ抗体との両方を同時に検出するイムノアッセイを指す。この抗原／抗体組み合わせアッセイ法は、ＨＣＶ血清変換の早期段階に存在する抗原性及び免疫原性のＨＣＶ抗体及び抗原の識別及び使用に依存するものであり、これにより検出精度を高め、ウィンドウ期間中の偽結果の発生を減少させる。
【００１１】
本発明は、早期のＨＣＶ感染を高感度かつ正確に検出するための組み合わせイムノアッセイにおける使用に適切かつ効果的な非イオン系洗剤の識別に、少なくとも部分的に基づいている。このような洗剤は、検査検体中のＨＣＶウイルス性粒子を効果的に分裂させ、その結果、放出されたコア抗原が、モノクローナル抗体プローブによって効果的に捕捉かつ検出される。その一方では、この洗剤は、固相上にコーティングされた組換え型抗原を浸出することによって、又は組み合わせアッセイ中に抗ＨＣＶ抗体を捕捉するのを妨げることによって、抗体検出に対して悪影響を与えることがない。よって、本発明によって提供されるこの組み合わせアッセイでは、単一のアッセイで検体中のＨＣＶ抗原（コア抗原を含む）と抗ＨＣＶ抗体との両方を同時に検出することが可能になる。ＨＣＶ抗原又は抗ＨＣＶ抗体のいずれか一方を別々に検出することを目的としたアッセイをはじめとする既存のアッセイに比べて、本発明の組み合わせアッセイは、別個のアッセイを２回実施する必要を回避し、ＨＣＶ検出に対して改善された感度及び特異性をもたらす。
【００１２】
本発明に従って、組み合わせイムノアッセイにおける使用に好適な非イオン系洗剤には、Ｎ−アルキル−Ｎ−アルキル’−Ｎ−メチルアミンオキシド族の員が挙げられ、これらは別名、双性イオン性、又は双極性イオン系洗剤と呼ばれる。アルキル基は一般に、それぞれ１５個以下の炭素原子を含有する。
【００１３】
１つの実施形態において、この洗剤はＮ−アルキル−Ｎ−アルキル’−Ｎ−メチルアミンオキシドであり、式中、アルキル基は９〜１３個の炭素原子を含有する単鎖又は分枝状アルキル基であり、もう一方のアルキル基（「そのアルキル（the alkyl）」基）は１〜１３個の炭素原子を含有する単鎖又は分枝状アルキル基である。別の実施形態において、Ｎ−アルキル−Ｎ−アルキル’−Ｎ−メチルアミンオキシドの一方又は両方のアルキル基は、置換アルキル基である。
【００１４】
１つの好ましい実施形態において、この洗剤は、次式：
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ＋−（ＣＨ３）２Ｏ−
により特性付けられるＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドである。
式中、アルキル鎖の長さは数字ｎで定義され、これは９〜１３の範囲、又は好ましくは１０〜１２の範囲であり得、更に好ましくは、ｎは１１である。数字「ｎ」は少なくとも９であり、好ましくは少なくとも１０であり、更に好ましくは少なくとも１１である。
【００１５】
本発明の特に好ましい１つの実施形態において、ＨＣＶ組み合わせイムノアッセイに使用される非イオン系洗剤は、ＣＨ３−（ＣＨ２）１１−Ｎ＋−（ＣＨ３）２Ｏ−の式を有するラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）であり、これは以下のように図で表わされる：
【化１】
2010271313.tif 000002
【００１６】
非イオン系洗剤は、任意の適切な方法で、組み合わせアッセイに供給されることができる。例えば、洗剤は、検体を検出試薬（捕捉抗原及び抗体など）に接触させて設置する前に、検査検体に加えることができる。あるいは、洗剤は、検出のための他の試薬を加えるのと同時に検査検体に混合することができる。１つの好ましい実施形態において、この洗剤は、溶液（又は「希釈剤」）として供給され、これは、検体を捕捉抗原及び抗体に接触させる前に、生物学的検査検体を希釈又は懸濁させるのに使用される。非イオン系洗剤がアッセイにどのように供給されるかにかかわらず、検査検体との接触が起こるときの、溶液混合物における洗剤の濃度は、０．１％〜２％（ｗ／ｖ）、好ましくは少なくとも０．３％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）の範囲であるべきであり、より好ましくは約０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００１７】
本発明の組み合わせアッセイを使用してＨＣＶの検査を行うことが可能な生物学的検体には、ＨＣＶバイロン、抗原又は抗体を含有することが疑われる任意の検体が挙げられる。この検体は、体液を含む生物学的な流体又は組織であってよく、これには例えば、とりわけ、全血、乾燥全血、血清、血漿、又は他の血液構成成分（赤血球、白血球及び血小板）、尿、唾液、脳脊髄液、肝臓組織などが挙げられる。検体は、アッセイに使用する前に、任意の好適な方法で処理を行うことができる。
【００１８】
本発明に従って、この組み合わせアッセイの抗ＨＣＶ抗体の検出部分は一般に、検体中の抗ＨＣＶ抗体を結合、したがって「捕捉」する少なくとも１つ（すなわち１つ以上）の捕捉抗原を利用する。捕捉抗原は一般に、ＨＣＶゲノムによってエンコードされたＨＣＶタンパク質から誘導された抗原性ペプチド（１つ以上のエピトープを含有する）である。全ＨＣＶゲノムの配列、及びエンコードされたＨＣＶポリタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（それぞれアクセッション番号Ｍ６２３２１及びＡＡＡ４５６７６）に文書化されており、当業者に利用可能である。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、用語「ＨＣＶタンパク質」は、ＨＣＶゲノムによってエンコードされた天然の完全長タンパク質（例えば、構造化タンパク質若しくは非構造化タンパク質、又は構造化タンパク質若しくは非構造化タンパク質の前駆体）と、２つの天然ＨＣＶタンパク質の人工的融合ポリペプチド又はこれらの断片（例えばＮＳ３と部分的ＮＳ４との融合で、本明細書では「ＮＳ３／ＮＳ４」とも呼ばれる）との両方を含むことに注意されたい。
【００２０】
ＨＣＶに感染した個体から得た検体中に存在する抗原に関して本明細書で使用されるとき、用語「ＨＣＶ抗原（単数又は複数）」は、完全長ＨＣＶタンパク質、又はその抗原性断片であり得る。
【００２１】
概して、ＨＣＶタンパク質のペプチド断片は抗原性であり、その断片の長さが少なくとも６個又は７個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８個、又は少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１２個、１５個、又は２０個のアミノ酸であるときに、対応する抗体に結合して捕捉することが可能である。捕捉ＨＣＶ抗原は、１つを超えるエピトープを含有し得る。用語「エピトープ」は当該技術分野において周知であり、抗原の表面にあって抗体に結合し免疫反応を引き起こすことができる分子領域又は構造的決定子を指す。捕捉抗原は、組換えによって、又は従来の化学合成によって、作製することができる。
【００２２】
特定の実施形態において、捕捉抗原は、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、又はＮＳ５から選択されるＨＣＶタンパク質の抗原性断片である。１つの好ましい実施形態において、捕捉抗原は、後述の実施例に記載されるように、コア抗原から、又はＮＳ３／ＮＳ４融合タンパク質から誘導される。別の実施形態において、捕捉抗原として２つ以上のペプチドが使用され、これは同じＨＣＶタンパク質から誘導することも、また異なるＨＣＶタンパク質から誘導することもできる。
【００２３】
捕捉抗原は、アッセイを実施する前に、固相上にコーティングされることができる。あるいは、この捕捉抗原は、適切な試薬（例えばビオチン）と結合し、これは、液相中（例えばカクテルＥＬＩＳＡフォーマット）で捕捉抗原が抗ＨＣＶ抗体と複合体を形成（すなわち、捕捉）した後の、固相への付着の媒介となり得る。
【００２４】
本発明のイムノアッセイに使用するのに好適な固相の例としては、例えばラテックス粒子、磁気粒子、ビーズ、膜、及びマイクロタイターウェルなど、多孔質材料及び非多孔質材料の両方が挙げられる。固相材質の選択は、望まれるアッセイ形式に基づいて決定することができる。
【００２５】
捕捉抗原が検査検体と接触したときに、もし抗ＨＣＶ抗体がその検体内に存在すると、そのような抗体は捕捉抗原に結合する。捕捉抗原によって捕捉された抗体（すなわち捕捉された抗体）は、多数のアプローチを使用して検出することができる。
【００２６】
１つのアプローチでは、捕捉されたＨＣＶ抗体を認識し結合するような、第二の抗体を利用する。第二の抗体、例えば抗ヒトＩｇＧは、信号生成手段に結合される。第二の抗体が、捕捉された（第一の）抗体に結合すると、信号生成手段が測定可能な信号を生成し、これが、検査検体内に第一の抗体が存在していることを示す。
【００２７】
別のアプローチでは、信号生成手段に結合することができる第二の抗原を利用し、これは「検出抗原」とも呼ばれる。捕捉抗原と同様に、検出抗原も１つを超えるエピトープを含有することができる（ただし、１つの共通エピトープが、捕捉抗原と検出抗原との両方に存在する限りにおいて）。更に、１つ以上の検出抗原を使用することができる。検出抗原が、捕捉された抗体に結合し、これによって捕捉抗原−抗体−検出抗原のサンドイッチを形成すると、検出抗原内の信号生成手段が測定可能な信号を生成し、これが、検査検体内に抗体が存在していることを示す。この「Ａｇサンドイッチ」アプローチは、２つの異なる抗原分子にある２つの同じエピトープを同時に結合することができる抗ＨＣＶ抗体の能力を前提条件としている。このＡｇサンドイッチアプローチでは、抗ＨＣＶ抗体を高い特異性で検出することが可能になる。そしてこの高い特異性により、このアプローチでは大量の検査検体を使用することができ、これにより、検体中に存在するＨＣＶ抗原をより高い感度で検出することが可能になる。
【００２８】
この信号生成手段は、それ自体が検出可能であるか、又は１つ以上の化合物と反応して検出可能な信号を生成するものであり得る。信号生成手段の例としては、色原体、放射性同位元素、化学発光化合物、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びリボヌクレアーゼなど）、又は結合する組の一方（ビオチン又はストレプトアビジン（strepavidin）など）が挙げられる。ある酵素を信号生成手段として使用する場合（例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ）、発色性、蛍光性、又は発光性の基質を加えることによって、検出可能な信号の生成が起こる。
【００２９】
本発明に従って、組み合わせアッセイのＨＣＶ抗原検出部分は、一般に、抗体サンドイッチ形態での捕捉抗体と複合抗体との１つ以上の組を使用して達成される。
【００３０】
複合抗体は、前述の信号生成手段の任意の１つに付着する。この捕捉抗体は、アッセイを実施する前に、固相（すなわち、前述の捕捉抗原と同じ固相）上にコーティングされることができる。あるいは、この捕捉抗原は、適切な試薬（例えばビオチン）と結合し、これは、液相中で捕捉抗体がＨＣＶ抗原と複合体を形成（すなわち捕捉）した後の、固相への付着（複合抗体とすでに結合している、又はこの後に結合することになる）の媒介となり得る。いずれのアプローチにおいても、いったん捕捉抗体−抗原−複合抗体のサンドイッチが形成され、固相上に捕捉されると、信号生成手段が測定可能な信号を生成することができ、これが、検査検体内に抗原が存在していることを示す。
【００３１】
各組内において、それぞれが異なるエピトープを認識する１つ以上の捕捉抗体、及びそれぞれが異なるエピトープを認識する１つ以上の複合抗体が存在していてよい。捕捉抗体と複合抗体とを同一の抗原分子に同時に結合し、サンドイッチ複合体を形成できるようにするため、捕捉抗体（複数可）は、同じ組内にある複合抗体（複数可）によって認識されるものとは異なるエピトープを識別しなければならず、同時に、捕捉及び複合抗体それぞれによって識別されるエピトープは、抗体−抗原−抗体サンドイッチを形成するために、同じＨＣＶ抗原内になければならない。例えば、捕捉抗体及び複合抗体は、ＨＣＶゲノムによってエンコードされた、任意のＨＣＶタンパク質、構造的又は非構造的ＨＣＶポリペプチドにおいて、エピトープに向わせることができる。好ましくは、抗体は、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、又はＮＳ５から選択されるＨＣＶタンパク質内のエピトープに向う。特に好ましい１つの実施形態において、１組の捕捉抗体及び複合抗体は、ＨＣＶコア抗原内のエピトープに向う（すなわち、特異的に結合する）。別の実施形態において、２組以上の捕捉抗体及び複合抗体が使用され、この組のうち少なくとも１組は、ＨＣＶコア抗原内のエピトープに向う捕捉抗体及び複合抗体を含む。
【００３２】
捕捉抗体及び複合抗体は、モノクローナル抗体、若しくはポリクローナル抗体、又はこれらの組み合わせであり得る。好ましくは、モノクローナル抗体が使用される。
【００３３】
本発明に従って組み合わせアッセイを実施するためには、捕捉抗原と、複合抗体若しくは検出抗原（抗ＨＣＶ抗体を検出するためのもの）；捕捉抗体と、ＨＣＶ特異性抗体複合体（ＨＣＶ抗原を検出するためのもの）；及び適切な非イオン系洗剤が供給される。検査検体を、洗剤、捕捉試薬及び複合試薬と、順に又は同時に接触させ、複合試薬から生成された信号を、ＨＣＶ感染の診断に相互に関連させることができる。
【００３４】
１つの具体的な実施形態では、捕捉抗原、検出抗原、捕捉抗体及び複合抗体、並びに適切な非イオン系洗剤が提供される。好ましい１つの実施形態では、捕捉抗原及び捕捉抗体は両方とも、固相上にコーティングされる（共有結合的又は非共有結合的に付着する）。検査検体は、洗剤の存在下でこの固相に付着した捕捉試薬と接触させられる。同時に、又は好ましくは続いて、複合試薬（すなわち検出抗原及び複合抗体）が反応混合物に加えられる。複合試薬も固相に結合した結果生成される信号は、ＨＣＶ感染の診断に相互に関連させることができる。
【００３５】
捕捉試薬及び複合試薬は、交差反応及び偽陽性結果を避けるよう選択すべきであることに注意されたい。例えば、抗ＨＣＶ抗体を検出するために使用されるＨＣＶ抗原は、捕捉抗体及び複合抗体が目的とするポリペプチドとは異なるＨＣＶポリペプチドから誘導される。あるいは、抗体検出のために使用される抗原が、抗体試薬が産出されるタンパク質と同じＨＣＶタンパク質（例えばコア抗原）から誘導される場合、抗体検出のために使用される抗原は、抗原検出に使用される抗体試薬によって認識されないエピトープを有するべきである。本質的に、アッセイの抗原検出部分において抗体が結合するエピトープは、ＨＣＶ抗体検出に使用される抗原にあってはならない。
【００３６】
本発明では、ＨＣＶ感染の診断を支援するため、ＨＣＶ抗原及び抗ＨＣＶ抗体を同時に検出することを目的とした組み合わせアッセイ実施のための、上述のさまざまな試薬を含むキットも提供する。
【００３７】
〔実施例〕
以下の実施例は、洗剤のラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、並びにそれが抗原アッセイでのＨＣＶコア抗原の放出を達成することにおける効率、及びＨＣＶ抗体アッセイとの適合性を調べることにより、本発明の利点及び重要性を詳細に説明するものである。ＨＣＶコア抗原及びＨＣＶ抗体の同時測定における洗剤のラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）使用についても記載される。
【００３８】
以下に示される実施例は、実例を挙げるためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【００３９】
ＨＣＶコア抗原及び抗ＨＣＶ抗体検出のための一般的な試薬
Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡ検査システム
ヒト血清又は血漿中のＣ型肝炎ヌクレオカプシドコア抗原（ＨＣＶコア抗原）を検出するために、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡ（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社、ニュージャージー州ラリタン）が使用された。抗原を捕捉するために、マイクロウェル固相上にコーティングされたモノクローナル抗体が使用され、その捕捉された抗原を検出するために、ＨＲＰに結合した第二のモノクローナル抗体が使用された。前処理工程なしに捕捉及び検出するために、洗剤を含んだ試料希釈剤を使用して、ＨＣＶコア抗原を曝露した。
【００４０】
Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡ検査システム
Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡ（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社、ニュージャージー州ラリタン）は、ヒト血清又は血漿中のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体（抗ＨＣＶ）の検出のためのものであった。マイクロウェル固相上にコーティングされた、組換え型ＨＣＶ抗原ｃ２２（アミノ酸２〜１２０、コア領域）、ｃ２００（アミノ酸１１９２〜１９３１、ＮＳ３／ＮＳ４領域）及びＮＳ５（アミノ酸２０５４〜２９９５）が、抗ＨＣＶ抗体の捕捉に使用された。捕捉されたヒト抗ＨＣＶを検出するために、ＨＲＰに結合したマウスのモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体が使用された。このフォーマットでは、試料希釈剤中に洗剤Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。
【００４１】
Ｃｈｉｒｏｎ  ＲＩＢＡ  ＨＣＶ  ３．０  ＳＩＡ
Ｃｈｉｒｏｎ  ＲＩＢＡ  ＨＣＶ  ３．０  ＳＩＡ（ノバルティス・ワクチン・アンド・ダイアグノスティックス社（Novartis Vaccines & Diagnostics）、カリフォルニア州エメリービル（Emeryville））は、ヒト血清又は血漿中のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体（抗ＨＣＶ）の検出に使用されるストリップイムノブロットアッセイである。抗ＨＣＶ抗体を捕捉するために、ＨＣＶ抗原又はペプチドｃ２２ｐ（アミノ酸１０〜５３、コア領域）、ｃ３３ｃ（アミノ酸１１９２〜１４５７、ＮＳ３領域）、５−１−１及びｃ１００ペプチド（それぞれアミノ酸１６９４〜１７３５及び１９２０〜１９３５、ＮＳ４領域）並びにＮＳ５（アミノ酸２０５４〜２９９５）が、検査ストリップ上に個々の帯として固定された。マウスのモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体がＨＲＰに結合され、次いで捕捉されたヒト抗ＨＣＶを検出した。このアッセイは、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡ反応性試料の個々の抗原に対する抗体特異性反応性に関する追加情報を提供する。
【００４２】
抗原
アミノ酸１０〜アミノ酸４５のＨＣＶコアタンパク質配列をカバーするよう、２つのペプチド誘導体が合成された。ＨＣＣ５Ｎについては、配列は配列番号：１に示されている（Ｎ−末端は、アセチル化によりブロックされたアミノ基ではなく、遊離アミノ基を有する）。ＨＣＣ５ＮにはＣ末端にＮｏｒＬｅｕｃｉｎｅ及びＣｙｓの２つの残基があり、これらはＨＣＶコアタンパク質に属していない。ＨＣＣ５−ｂについては、配列は配列番号：２に示されている（Ｎ−末端は遊離アミノ基を有する）。ＨＣＣ５−ｂにはＣ末端にＧｌｙ及びＬｙｓの２つの残基があり（ビオチン）、これらはＨＣＶコアタンパク質に属していない。ＨＣＣ５Ｎは更に、還元性条件下でＨＣＣ５ＮのＣ末端Ｃｙｓを介してＳＭＣＣ活性化ＢＳＡに結合していた。
【００４３】
残基Ｐ１２０８〜Ｔ１６５７をカバーする組換え型ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼ（ｒＮＳ３（ｈ））が、前述のように大腸菌にクローン化及び発現された（Ｊｉｎ，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２３（１）：４７−５３，１９９５）。タンパク質を精製するため、６ｘＨｉｓタグがｒＮＳ３（ｈ）のＮ末端に融合された（これにより６ｘＨｉｓタグ及びｒＮＳ３（ｈ）の融合タンパク質を表わす配列番号：３が生じた）。ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアース（Pierce）社、カタログ番号２１３３５）を使用して、ビオチン結合ｒＮＳ３（ｈ）が生成された。この複合タンパク質がｒＮＳ３（ｈ）分子当たり３個のビオチンを有していることが判定された。
【００４４】
モノクローナル抗ＨＣＶコア抗体
本研究では４つのモノクローナル抗体が使用された。モノクローナル抗体Ｃ１１−３、Ｃ１１−７及びＣ１１−１４の調製及びエピトープ認識部位については、欧州特許公報第ＥＰ  ０  ９６７  ４８４  Ａ１号に記述されている。これらモノクローナル抗体のエピトープ認識部位のいずれも、ＨＣＶのアミノ酸１０〜４５の範囲内にはなかった。モノクローナル抗ＨＣＶ抗体１２Ｆ１１が、組換え型ｃ２２に対して産出された。１２Ｆ１１の認識部位は、ＨＣＶのアミノ酸５８〜７２付近であった（コア抗原）。抗体Ｃ１１−１４及び１２Ｆ１１は、標準手順を使用してホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合された。
【００４５】
ＨＣＶ試料
（１）抗ｃ２２及び抗ｃ３３ｃが減損した抗ＨＣＶ試料
試料ＷＨＯ  Ｈｕ−ａ−ｃ３３ｃ、４１５３０８２２、４１５３０８３２及び４１５３０８８３は、最初に、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡによって抗ＨＣＶ強反応性、またＯｒｔｈｏ  ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡによって非反応性であった。クロマトグラフィー樹脂が組換え型ＨＣＶコア抗原ｃ２２（Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡに使用されているコーティング抗原の１つと同じ抗原）に結合した親和性カラムに試料を通すことによって、抗体の抗ｃ２２部分（抗ＨＣＶコア）を減損させた。
【００４６】
試料ＷＨＯ  Ｈｕ−ａ−ｃ２２、Ｉ−２０、及び３６０６５０は、最初に、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡによって抗ＨＣＶ強反応性、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡによって非反応性であった。クロマトグラフィー樹脂が組換え型ＨＣＶコア抗原ｃ３３（Ｃｈｉｒｏｎ  ＲＩＢＡ  ３．０  ＳＩＡで固定されている同じ抗原（ｃ３３ｃ）、及びＯｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡに使用されているコーティング抗原（ｃ２００）の１つの短いバージョン）に結合した親和性カラムに試料を通すことによって、抗体の抗ｃ３３ｃ部分（部分的抗ＮＳ３）を減損させた。
【００４７】
（２）ＨＣＶコア抗原反応性試料
ＨＣＶコア抗原反応検体ロット１６は、血漿プールであり、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡによって抗ＨＣＶが非反応性であり、ＰＣＲによってＨＣＶ  ＲＮＡが反応性であり、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡによってＨＣＶコア抗原が反応性であった試料から作られていた。ＨＣＶコア抗原試料９１６０８３４は、ボストン・バイオメディカ（Boston Biomedica）社（ＢＢＩ）から得た血漿試料である。この試料は、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡによって抗ＨＣＶに対して非反応性であり、Ｖｅｒｓａｎｔ  ｂＤＮＡ（バイエル（Bayer）社）によって約３６，３７９，９４０ＩＵ／ｍＬ又は１８９，１７５，５００コピー／ｍＬでＨＣＶ  ＲＮＡに対して反応性であり、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡに対して反応性であった。
【００４８】
（３）ＨＣＶ血清変換パネル
本研究で試験されたＨＣＶ血清変換パネルはすべて市販されているものであり、米国のセラケア・ライフ・サイエンシス社（SeraCare Life Sciences, Inc.）（ＢＢＩダイアグノスティックス（BBI Diagnostics））、及び米国のゼプトメトリックス社（ZeptoMetrix Corporation）（旧社名：インパス・バイオクリニカル・パートナーズ社（Impath/BioClinical Partners, Inc.））から購入された。ＨＣＶ血清変換パネルは、ＨＣＶに感染した個体から採取されたヒト血液試料の一連の採血から構成されていた。試料は、抗ＨＣＶ非反応性から反応性までの一周期をカバーしていた。
【００４９】
実施例１：抗ＨＣＶ抗体の検出（間接的なアッセイ形式）
アッセイは、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡキットの試薬を使用して実施された。洗剤Ｔｗｅｅｎ−２０、ＢＳＡ、カゼイン、酵母抽出液及びその他のタンパク質を含有するリン酸系緩衝液から構成される試料希釈剤１５０μＬと、試料５０μＬとを、各ウェルに加えた。このプレートを３７℃で６０分間インキュベートし、次にＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０含有の洗浄緩衝液で５回洗った。その後、ＨＲＰ結合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体２００μＬを各ウェルに加えた。このプレートを３７℃で６０分間インキュベートし、続いて６回洗った。２００μＬのＯＰＤ／基質（ＯＰＤ錠剤１錠（シグマ（Sigma）社、カタログ番号Ｐ−８２８７）をＥＬＩＳＡ基質緩衝液６ｍＬに溶解）を各ウェルに加え、このプレートを室温の暗所で３０分間インキュベートした。４ＮのＨ２ＳＯ４停止溶液を５０μＬ／ウェルの比率で加えた。プレート分光測光法リーダーを使用して、４９３ｎｍでＯＤを記録した。アッセイのカットオフ設定は、平均マイナスプラス０．６のＯＤのＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡから適応された。アッセイの例外は次の事項であった。
（１）「ＥＬＩＳＡ−１」では、洗剤Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する試料希釈剤がキットから得られた。一方、「ＥＬＩＳＡ−２」では、この洗剤はＮ−ラウリルサルコシン（ＮＬＳ）に置き換えられ、「ＥＬＩＳＡ−３」では、洗剤はラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）に置き換えられた。
（２）「ＥＬＩＳＡ−１」では、キットに供給されているＨＲＰ結合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体を、使用前に１：３に希釈した。「ＥＬＩＳＡ−２」及び「ＥＬＩＳＡ−３」では、キットに供給されている結合抗体を、使用前に１：２に希釈した。
【００５０】
表１に示すように、抗ｃ２２及び抗ｃ３３ｃ両方の減損試料において、Ｔｗｅｅｎ  ２０（抗ＨＣＶ抗体検出に一般的に使用される）及びＬＤＡＯはそれぞれ、ＮＬＳ（ＨＣＶ抗原検出に典型的に使用される）に比べ、信号対カットオフ比（「Ｓ／Ｃ」）に表われているように、より良いアッセイ感度をもたらした。
【００５１】
実施例２：抗ＨＣＶ抗体の検出（Ａｇサンドイッチアッセイ形式）
Ａｇサンドイッチアッセイ形式においては、ビオチンで標識された抗原が複合体として使用された。ビオチン−抗原複合体が、固相に捕捉されているヒト抗ＨＣＶ抗体に結合して、Ａｇ−Ａｂ−Ａｇサンドイッチが形成された。このサンドイッチ複合体は次に、続くインキュベーションにおいてＨＲＰ結合したストレプトアビジンによって検出された。
【００５２】
２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にそれぞれ２．２μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体Ｃ１１〜３及びＣ１１〜７並びに０．１μｇ／ｍＬのＨＣＣ５Ｎ−ＢＳＡをあらかじめ混合した溶液で、ＣＯＳＴＡ（商標）高結合マイクロタイタープレートを２００μＬ／ウェルの割合でコーティングした。このプレートを２５℃で一晩インキュベートした。コーティング溶液を吸引し、ＰＢ（ｐＨ７．０）中２μｇ／ｍＬのｒＮＳ３（ｈ）を、２００μＬ／ウェルの割合で加えた。プレートを２５℃で一晩インキュベートした。次にこのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液で１回洗い、続いて２５℃で１時間、ＰＢＳ／ＢＳＡブロッキング溶液（ＰＢＳ中、１％ウシ血清アルブミン及び３０％スクロース）を３００μＬ／ウェルの割合で加えた。このプレートを吸引し、２５℃、湿度１０％で一晩乾燥させ、乾燥剤と共に小袋に入れた。
【００５３】
試料希釈剤組成物は実施例１で使用したものと同じであったが、「ＥＬＩＳＡ−４」は洗剤Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有し、「ＥＬＩＳＡ−５」は洗剤Ｎ−ラウリルサルコシン（ＮＬＳ）を含有し、「ＥＬＩＳＡ−６」は洗剤ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）を含有していた。各ウェルに試料希釈剤１００μＬ及び試料１００μＬを加えた。試料インキュベーションは、３７℃で１時間、振盪と共に行われた。次にこのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で５回洗った。２００μＬのビオチン−ｒＮＳ３（ｈ）（又は「ｒＮＳ３（ｈ）−ｂ」）を６０ｎｇ／ｍＬで、又はビオチン−ＨＣＣ５（ＨＣＣ５−ｂ）を５ｎｇ／ｍＬで、各ウェルに加えた。ビオチン−抗原を、複合希釈剤ＣＤ−１（ＰＢＳ中のカゼインブロッカー、ピアース社カタログ番号３７５２８、Ｔｗｅｅｎ  ２０を０．０５％以下、ＥＤＴＡを２ｍＭ以下添加）で希釈した。ビオチン−抗原インキュベーションは、３７℃で６０分間、振盪と共に維持された。このプレートを５回洗い、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）社、カタログ番号０１６−０３０−０８４）をＣＤ−１中に１：８，０００で希釈した溶液を、２００μＬ／ウェルの割合で加えた。ＨＲＰ−ストレプトアビジンのインキュベーションは、室温で３０分間維持された。次にこのプレートを６回洗い、その後各ウェルに２００μＬのＯＰＤ／基質が加えられた。このプレートを室温の暗所で３０分間インキュベートし、４ＮのＨ２ＳＯ４停止溶液の５０μＬのアリコートを、各ウェルに加えた。プレート分光測光法リーダーを使用して、４９３ｎｍでＯＤを記録した。アッセイカットオフは、マイナス平均プラス０．３００のＯＤとして決定された。アッセイ結果を表２に示す。この結果、抗３３ｃ減損試料では、Ｔｗｅｅｎ２０及びＬＤＡＯそれぞれが、ＮＬＳよりも良いアッセイ感度をもたらすことが示された。またこの結果、抗原サンドイッチ形式（Ａｇ−Ａｂ−Ａｇ）が、間接形式（Ａｇ−Ａｂ−第二のＡｂ）よりも良いことが示された。
【００５４】
実施例３：ＨＣＶコア抗原の検出
実施例３に示されているＨＣＶコア抗原の検出は、モノクローナル抗体−ＨＣＶコア抗原−モノクローナル抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡであった。試料にさらされたＨＣＶコア抗原が、プレート上にコーティングされた２つのモノクローナル抗ＨＣＶコア抗体によって捕捉され、別の２つのＨＲＰ標識されたモノクローナル抗ＨＣＶ抗体によって検出された。
【００５５】
試料希釈剤を除き、実施例３に使用されたＥＬＩＳＡ試薬は基本的にＯｒｔｈｏ  ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡキットのものであった。「ＥＬＩＳＡ−７」は、洗剤Ｎ−ラウリルサルコシン（ＮＬＳ）を１．０％含有する本来のキット試料希釈剤を使用した。しかしながら、「ＥＬＩＳＡ−８」は、洗剤Ｔｗｅｅｎ  ２０を１．０％含有する試料希釈剤を使用し、「ＥＬＩＳＡ−９」は、洗剤ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）を１．０％含有する試料希釈剤を使用した。
【００５６】
ＥＬＩＳＡはＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡのプロトコルに従って実施された。各ウェルに試料希釈剤１００ｕＬ及び試料１００μＬを加えた。試料のインキュベーションは、３７℃で９０分間、振盪と共に行われた。このプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で５回洗い、複合抗体を各ウェルに２００μＬ加えた。この複合体インキュベーションは、３７℃で３０分間行われた。このプレートを６回洗い、２００μＬのＯＰＤ／基質を各ウェルに加えた。次にこのプレートを室温の暗所で３０分間インキュベートした。次に４ＮのＨ２ＳＯ４停止溶液を５０μＬ／ウェルの比率で加えた。プレート分光光度計リーダーを使用して、４９３ｎｍでＯＤを記録した。アッセイカットオフ設定はＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡと同様であり、すなわち、マイナス平均プラス０．３００のＯＤであった。
【００５７】
アッセイ結果を表３に示す。試料については、ＮＬＳ及びＬＤＡＯはそれぞれ、Ｔｗｅｅｎ２０よりも良いアッセイ感度をもたらした。
【００５８】
実施例４：ＨＣＶコア抗原／抗ＨＣＶ組み合わせアッセイ
ＨＣＶコア抗原／抗ＨＣＶ抗体組み合わせＥＬＩＳＡが、実施例２で使用されたものと同じプレート上で実施された。プレートは、モノクローナル抗ＨＣＶ抗体Ｃ１１〜３及びＣ１１〜７、ＨＣＣ５−ＢＳＡ並びにｒＮＳ３（ｈ）でコーティングされた。試料希釈剤は、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）、０．５Ｍの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％の洗剤ＬＤＡＯ、１％のＢＳＡ、０．０３％の酵母抽出液、及び０．０１％の変性スーパーオキシダーゼジスムターゼ（ＳＯＤ）、２００μｇ／ｍＬのマウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）並びに０．１％の２−クロロアセトアミドで構成されていた。抗体／抗原複合体は、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中に、ＨＲＰ標識された抗ＨＣＶモノクローナル抗体Ｃ１１−１４（４μｇ／ｍＬ）及びＨＲＰ標識されたモノクローナル抗体１２Ｆ１１（４μｇ／ｍＬ）、ＨＣＣ５−ビオチン（５ｎｇ／ｍＬ）並びにｒＮＳ３（ｈ）−ビオチン（６０ｎｇ／ｍＬ）、１４２ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、０．１％の洗剤Ｔｗｅｅｎ  ２０、１．５％のＢＳＡ、２０％の加熱不活性化した新生仔ウシ血清、０．０３％のフェリシアン化カリウム、１００ｕｇ／ｍＬのマウス免疫グロブリンＧ（モノクローナル）並びに０．１％の２−クロロアセトアミドで構成されていた。ＨＲＰ標識されたストレプトアビジン複合体は、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチ社、カタログ番号０１６−０３０−０８４）をＣＤ−１（ＰＢＳ中のカゼインブロッカー、ピアース社カタログ番号３７５２８、Ｔｗｅｅｎ  ２０を０．０５％以下、ＥＤＴＡを２ｍＭ以下添加）で１：８，０００に希釈したもので構成されていた。
【００５９】
アッセイプロトコルは、実施例２に記述されたものと同じであった。各ウェルに試料希釈剤１００μＬ及び試料１００μＬを加えた。次にプレートを３７℃で１時間、振盪と共にインキュベートし、続いてＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で５回洗った。次に２００μＬの抗体／抗原複合体混合物を各ウェルに加えた。抗体／抗原複合体のインキュベーションは、３７℃で６０分間、振盪と共に行った。次にプレートを５回洗い、続いて２００μＬ／ウェルの割合でＨＲＰ−ストレプトアビジンを加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。その後プレートを６回洗い、２００μＬのＯＰＤ／基質を各ウェルに加え、プレートを室温の暗所で３０分間インキュベートした。４ＮのＨ２ＳＯ４停止溶液を５０μＬ／ウェル加え、プレート分光測光法リーダーを使用して、４９３ｎｍでＯＤを記録した。アッセイカットオフは０．３００に設定された。
【００６０】
ＢＢＩ  ＨＣＶ血清変換パネルについてのＨＣＶ抗原／抗体組み合わせＥＬＩＳＡのアッセイ結果を表４に示す。ゼプトメトリックスＨＣＶ血清変換パネルについてのＨＣＶ抗原／抗体組み合わせＥＬＩＳＡのアッセイ結果を表５に示す。早期感染段階において、抗体検出アッセイにおける検出は陰性であり、一方ＨＣＶ  ＲＮＡアッセイ、ＨＣＶ抗原アッセイ、又はＨＣＶ抗原抗体組み合わせアッセイを使用した検出は陽性であったことがわかる。例えば、表４の、最初の採血から４日目、７日目、１３日目の「ＰＨＶ９０７」を参照されたい。一方、抗原の検出が陰性になりＨＣＶ  ＲＮＡの量が減少する、感染の後期段階において（例えば「ＰＨＶ９０７」の１６４日目）、抗ＨＣＶ抗体は抗体検出アッセイではっきりと検出され、抗原抗体組み合わせアッセイにおいてはＳ／Ｃ比もゆうに１を上回った。これらの結果から、ＨＣＶ抗原抗体組み合わせアッセイは、ＨＣＶ抗原単独又は抗ＨＣＶ抗体単独の検出に基づくアッセイよりも広い検出ウィンドウをもたらしたことが示されている。
【００６１】
【表１】
2010271313.tif 000003
【表２】
2010271313.tif 000004
【表３】
2010271313.tif 000005
【表４−１】
2010271313.tif 000006
【表４−２】
2010271313.tif 000007
【表５−１】
2010271313.tif 000008
【表５−２】
2010271313.tif 000009
【００６２】
〔実施の態様〕
（１）  検体中のＨＣＶ抗原及び抗体を同時に検出するためのイムノアッセイにおいて、
Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドを含む非イオン系洗剤、捕捉抗原と検出抗原との第一組、捕捉抗体と複合抗体との第一組を提供することであって、前記捕捉抗原及び前記検出抗原が両方とも第一ＨＣＶタンパク質の第一ペプチド断片を含み、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が第二ＨＣＶタンパク質に特異的に結合し、前記検出抗原及び前記複合抗体が１つの同じ信号生成手段を含む、ことと、
前記検体を前記洗剤の存在下で、前記捕捉抗原、前記検出抗原、前記捕捉抗体、及び前記複合抗体に接触させることにより、前記捕捉抗原と、前記検出抗原と、前記検体中に存在する抗ＨＣＶ抗体との間でサンドイッチ複合体を形成し、前記捕捉抗体と、前記複合抗体と、前記検体中に存在するＨＣＶ抗原との間で複合体を形成することと、
前記複合体の形成の結果として前記信号生成手段から生成される信号を測定し、これにより前記検体中のＨＣＶ抗原及び抗体を同時に検出することと、
を含む、イムノアッセイ。
（２）  前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドが、式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ＋−（ＣＨ３）２Ｏ−によって特徴付けられ、式中、ｎは９〜１３の範囲である、実施態様１に記載のイムノアッセイ。
（３）  前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドが、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）である、実施態様２に記載のイムノアッセイ。
（４）  前記第一ＨＣＶタンパク質及び第二ＨＣＶタンパク質が、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５からなる群から独立して選択される、実施態様１に記載のイムノアッセイ。
（５）  前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が同じであり、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第一ペプチド断片の外側の前記第二ＨＣＶタンパク質領域に結合する、実施態様１に記載のイムノアッセイ。
（６）  前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が両方とも前記ＨＣＶコア抗原である、実施態様５に記載のイムノアッセイ。
（７）  捕捉抗原と検出抗原との第二組が提供され、前記第二組の前記捕捉抗原及び前記検出抗原が両方とも、ＨＣＶタンパク質の第二ペプチド断片を含み、前記第二ペプチド断片は、前記第一ペプチド断片とは異なる、実施態様１に記載のイムノアッセイ。
（８）  前記第一ペプチド断片及び前記第二ペプチド断片が、異なるＨＣＶタンパク質から誘導される、実施態様７に記載のイムノアッセイ。
（９）  前記第一ペプチド断片又は前記第二ペプチド断片の少なくともいずれか一方が、前記ＨＣＶコア抗原の断片である、実施態様８に記載のイムノアッセイ。
（１０）  前記第一組の前記捕捉抗体が、２つ以上の抗体を含む、実施態様１に記載のイムノアッセイ。
【００６３】
（１１）  捕捉抗体と複合抗体との第二組が提供され、前記第二組の前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第二ＨＣＶタンパク質、又は異なるＨＣＶタンパク質に特異的に結合する、実施態様１に記載のイムノアッセイ。
（１２）  前記捕捉抗原及び前記捕捉抗体が、固相に付着している、実施態様１に記載のイムノアッセイ。
（１３）  検体中のＨＣＶ抗原及び抗体を同時に検出するためのキットにおいて、
Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドを含む非イオン系洗剤、捕捉抗原と検出抗原との第一組、捕捉抗体と複合抗体との第一組を含み、前記捕捉抗原及び前記検出抗原が、第一ＨＣＶタンパク質の第一ペプチド断片を含み、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が第二ＨＣＶタンパク質に特異的に結合し、前記検出抗原及び前記複合抗体が１つの同じ信号生成手段を含む、キット。
（１４）  前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドが、式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ＋−（ＣＨ３）２Ｏ−によって特徴付けられ、式中、ｎは９〜１３の範囲である、実施態様１３に記載のキット。
（１５）  前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドが、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）である、実施態様１４に記載のキット。
（１６）  前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５からなる群から独立して選択される、実施態様１３に記載のキット。
（１７）  前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が同じであり、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第一ペプチド断片の外側の前記第二ＨＣＶタンパク質領域に結合する、実施態様１３に記載のキット。
（１８）  前記第一ＨＣＶタンパク質及び前記第二ＨＣＶタンパク質が両方とも前記ＨＣＶコア抗原である、実施態様１７に記載のキット。
（１９）  捕捉抗原と検出抗原との第二組を更に含み、前記第二組の前記捕捉抗原及び前記検出抗原が、ＨＣＶタンパク質の第二ペプチド断片を含み、前記第二ペプチド断片は、前記第一ペプチド断片とは異なる、実施態様１３に記載のキット。
（２０）  前記第一ペプチド断片及び前記第二ペプチド断片が、異なるＨＣＶタンパク質から誘導される、実施態様１９に記載のキット。
【００６４】
（２１）  前記第一ペプチド断片又は前記第二ペプチド断片の少なくともいずれか一方が、前記ＨＣＶコア抗原の断片である、実施態様２０に記載のキット。
（２２）  前記第一組の前記捕捉抗体が、２つ以上の抗体を含む、実施態様１３に記載のキット。
（２３）  捕捉抗体と複合抗体との第二組を更に含み、前記第二組の前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第二ＨＣＶタンパク質、又は異なるＨＣＶタンパク質に特異的に結合する、実施態様１３に記載のキット。
（２４）  前記捕捉抗原及び前記捕捉抗体が、固相に付着している、実施態様１３に記載のキット。
【外国語明細書】
2010271313000001.pdf