(57)【要約】      （修正有）【課題】従来方法による核酸識別を改良し、核酸増幅の有無と増幅した核酸の識別を目視で短時間に行うための簡便、確実、安価な方法を提供する。【解決手段】２種以上のインターカレーターにより生じる色によって２種以上のターゲット核酸の増幅を識別することを特徴とする核酸識別方法、２種以上のインターカレーターを含むことを特徴とする核酸識別用キット、及び２種以上のインターカレーターと核酸増幅のための試薬を含むことを特徴とする核酸識別用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上のインターカレーターにより生じる色によって２種以上のターゲット核酸の増幅を識別することを特徴とする、核酸識別方法。
【請求項２】
インターカレーターがエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−３、メチレンブルー、アクチノマイシンＤ、ヨウ化プロピジウム、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ＤＡＰＩ、ＬＣ  ＧｒｅｅｎＩ、および、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓからなる群から選ばれる２種以上である請求項１記載の核酸識別方法。
【請求項３】
核酸の増幅反応前にインターカレーターを添加しておくことを特徴とする、請求項１または２に記載の核酸識別方法。
【請求項４】
ターゲット核酸が遺伝子の一塩基多型であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸識別方法。
【請求項５】
ターゲット核酸が微生物あるいはウィルス遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸識別方法。
【請求項６】
２種以上のインターカレーターを含むことを特徴とする核酸識別用キット。
【請求項７】
さらに、核酸増幅のための試薬を含むことを特徴とする、請求項６に記載の核酸識別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種以上のインターカレーターの発色の種類によって、ターゲットとする核酸増幅の有無と増幅した核酸の識別を目視で短時間に完了することを特徴とする核酸の識別方法、及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を高感度に検出する方法としてポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法が知られている。ＰＣＲ法は急激な温度変化とその繰り返しが必要で、このことが時間短縮や自動化の障壁となっている。一方、一定温度の核酸増幅法（以降、等温核酸増幅法とする。）としては、ＮＡＳＢＡ法やＬＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法等が知られており、温度変化が不要で自動化に適した方法である。いずれの方法の場合も、増幅核酸の検出や識別は電気泳動やハイブリダイゼーション法などの既知の核酸検出方法で検出するのが一般的である。
【０００３】
電気泳動では、アガロースゲルなどを使用し時間をかけて増幅核酸を泳動し、染色後に移動度などで増幅核酸を識別する方法であり、複数の増幅核酸を一度に検定するには適しているが非常に手間と時間を要する手法である。
【０００４】
また特異的に増幅産物を検出する場合、蛍光物質など検出可能な信号を発する物質で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション法などが用いられる。蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーション法では、オリゴヌクレオチドプローブ存在下で核酸増幅法などを実施しつつ、反応液の蛍光特性の変化を測定することが可能である。このため、電気泳動などにかかる別操作を必要としない検出が可能となる。
【０００５】
またサイバーグリーン（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）などのインターカレーター存在下でＰＣＲ法を行い、増幅核酸に取り込まれる際に発せられる蛍光を測定することで同様に別操作不要の検出が可能である。
【０００６】
さらには過剰のインターカレーターを核酸増幅反応後に添加し、その色調変化で増幅の程度や有無を判定する方法も存在する（特許文献１）。
【０００７】
しかしながら蛍光物質による方法では核酸増幅中に検出・識別が可能で短時間ではあるが、ターゲットの種類に応じてプローブが必要であり、複数のターゲットを検定するには適当ではなく、また蛍光標識した検出用プローブは高価であり、安価で簡便な手法とは言い難かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１５４００８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来方法による核酸識別を改良し、核酸増幅の有無と増幅した核酸の識別を目視で短時間に行うための簡便、確実、安価な方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、２種以上のターゲットに対して、それぞれ色調の異なるインターカレーターをＰＣＲ法などの核酸増幅前に添加し、異なる増幅核酸を色によって目視識別できれば、検出にかかる時間を短縮できるばかりでなく、特殊な検出用装置も、特殊な検出用プローブも不要になり、さらには色の種類により明確に増幅パターンを判定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
本発明の特徴の１つは、２種以上のインターカレーターにより生じる色によって２種以上のターゲット核酸の増幅を識別することを特徴とする、核酸識別方法である。
【００１２】
本発明の特徴の１つは、２種以上のインターカレーターを含むことを特徴とする核酸識別用キットである。
【００１３】
本発明の特徴の１つは、さらに、核酸増幅のための試薬を含むことを特徴とする核酸識別用キットである。
【発明の効果】
【００１４】
２種以上のインターカレーターによる色の種類によってターゲットとする核酸の検出を目視で短時間に完了することを特徴とする核酸の検出方法、及びそのためのキットが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１６】
１．核酸の検出方法
本発明は、２以上のインターカレーター存在下で２種以上のターゲットに対するＰＣＲ法等の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物をインターカレーターの色調によって識別することを特徴とする、核酸の識別方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法は、具体的には以下の工程を含む；
（１）試料用容器に、鋳型となるターゲット核酸、プライマー、核酸増幅用ポリメラーゼ、インターカレーター及び基質ヌクレオチドを含む増幅用反応液を添加する工程、
（２）試料用容器内において等温もしくは可変温度条件下で核酸増幅反応を行う工程、及び、
（３）上記増幅核酸を目視またはインターカレーターの発色を確認できる波長での光照射下で増幅核酸の有無確認や識別を行う工程。
【００１８】
２．試料
本発明の方法では、まず試料用容器内に、ターゲット核酸、プライマー、核酸増幅用ポリメラーゼ、インターカレーター及び基質ヌクレオチドを含む試料を添加する。
【００１９】
本発明の方法で用いられる「試料用容器」とは、核酸増幅が可能な容器であれば特に制限はなく、例えば、ＰＣＲチューブ、マイクロチューブ、ＰＣＲプレート、マイクロプレートなどが用いられる。
【００２０】
試料用ウェル内への標的核酸、プライマー、核酸増幅用ポリメラーゼ、インターカレーター及び基質ヌクレオチドを含む増幅用反応液の添加順序は特に限定されず、適当な順番で１つずつ導入しても、全て同時に導入してもよい。あらかじめ標的核酸、プライマー、核酸増幅用ポリメラーゼ、インターカレーター及び基質ヌクレオチドを含む増幅用反応液を調製し、これを一度に添加すれば操作が簡便でよい。またインターカレーターはターゲット核酸が多種の場合、それぞれのターゲットに発色の異なるインターカレーターを使用し、増幅後に発色による識別ができるようにしておく。
【００２１】
なお、本発明において「ターゲット核酸」とは、検出すべき核酸分子を意味する。「ターゲット核酸」は生体由来のものであっても、人工的に合成されたものであってもよく、例えば、DNA、cDNA、RNA、mRNA、及びPNA等が例示される。また、１本鎖核酸であっても良いし、２本鎖核酸であってもよい。さらに、アミノ酸、ペプチド、タンパク質などの核酸以外の物質で部分的に修飾されたヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、本発明の「ターゲット核酸」に含まれる。また、遺伝子（生命に関わる特定の機能や情報を担う核酸）も、「ターゲット核酸」に含まれる。なお、本発明における「ターゲット核酸」の構成塩基数は制限されない。
【００２２】
本発明の方法で用いられる「プライマー」は、標的核酸の配列に従い、用いられる核酸増幅反応に適したプライマーを適宜調製する。また、「基質ヌクレオチドを含む増幅反応液」は、基質ヌクレオチドについては市販のdNTPやその修飾物などを用いればよく、また増幅反応液については後述する核酸増幅用ポリメラーゼの反応に適した溶液などが挙げられる。
【００２３】
本発明の方法で用いられる「核酸増幅用ポリメラーゼ」としては、特に核酸を合成できる酵素であれば制限はないが、例えば、Ｔａｑポリメラーゼや、ＥＸ−Ｔａｑ、ＬＡ−Ｔａｑ、Ｅｘｐａｎｄシリーズ、Ｐｌａｔｉｎｕｍシリーズ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔ１ｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ（以上はＰｏｌＩ型酵素）、Ｐｆｕ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（以上はα型酵素）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等を用いることができる。これら核酸増幅用ポリメラーゼは、市販の酵素液やキットを購入したり、また既知の遺伝子配列を利用して、大腸菌等にクローニングしてタンパク質発現させることにより入手することができる。上記核酸増幅用ポリメラーゼは単独で用いても良い。また、これらは反応速度を高めたりするなどの目的から必要に応じて組み合わせて使用することもできる。
【００２４】
「インターカレーター」とは、２本鎖DNAに結合しうる化合物であって、核酸塩基対のなす平面と平面の間に挿入する化合物のことを言う。本発明の場合、２本鎖DNA分子の溝（主溝、副溝）に結合しうる化合物も含める。この用件を満たせば本発明で用いられるインターカレーターに特に制限はないが、例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−３、メチレンブルー、アクチノマイシンＤ、ヨウ化プロピジウム、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ＤＡＰＩ、ＬＣ  ＧｒｅｅｎＩ、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ等を挙げることができる。通常インターカレーターは核酸増幅産物の確認のため、１種のみで用いられる。しかし、本発明者らは、複数種のターゲット核酸を増幅識別するには、それぞれ色調の異なるもの（例えば、DAPI→青、SYBRGreen→緑）を複数種用いることで、各ターゲット増幅核酸を色で識別する方法を見出した。この際用いるインターカレーター量は、核酸増幅が確認できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／μｌ以下、より好ましくは０．１μｇ／μｌ以下の濃度である。またこれらのインターカレーターは１つのターゲット増幅核酸に複数用いることも可能である。これにより色調を変えることが可能となる。
【００２５】
３．核酸増幅反応
核酸増幅反応としては、等温もしくは可変温度条件で行う２つの方法があり、本発明ではいずれの手法でも実施することが可能である。
【００２６】
等温で行う核酸増幅の場合、所望の核酸フラグメントの増幅が可能な反応条件を満たせばその条件に特に制限はないが、例えば９０℃以下、好ましくは７０℃以下で、０．５分以上、好ましくは５分以上の条件等で行う。
【００２７】
また可変温度条件で行う核酸増幅の場合、これも所望の核酸フラグメントの増幅が可能な反応条件を満たせばその条件に特に制限はないが、例えば変性工程は、９０〜１０５℃、好ましくは９０〜１００℃で、０．５〜５分間、好ましくは０．５〜３分間、プライマーと鋳型のアニーリング工程は、３５〜７０℃、好ましくは３７〜６０℃で、０．５〜５分間、好ましくは１〜３分間、プライマー伸長生成物を形成させる伸長工程は、４０〜８０℃、好ましくは５０〜７５℃で、０．１〜４０分間、好ましくは１〜３分間等の条件にて行う。
【００２８】
なお、これらの反応条件は酵素の反応速度、増幅産物の長さや増幅量、ターゲット領域の塩基配列等の影響により、適宜変更することが可能である。
【００２９】
試料用容器を加熱する方法は、核酸増幅反応に必要な等温もしくは可変温度に設定できるものであれば、特に限定されない。例えば、市販のヒートブロックなどの保温装置、核酸増幅装置などが挙げられる。
【００３０】
本発明の方法に用いることができる、等温条件下での核酸増幅反応としては、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＲＣＲ法、ＴＭＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などが挙げられる。これらの方法による等温核酸増幅法では、それぞれの手法に適したプライマー、核酸増幅用ポリメラーゼ及び基質ヌクレオチドを含む増幅用反応液を使用することができる。
【００３１】
４．識別
核酸増幅反応後、引き続き増幅核酸の検出と識別を行う。増幅核酸の検出と識別は、それぞれのインターカレーターの発色可能な波長の光を照射できる市販の装置を使用することができる。有無確認と識別は増幅反応終了後だけでなく、特定の時点で行ってもよいし、経時的（リアルタイム）に行ってもよい。市販の装置に測定値を解析するための装置を付属し、得られたデータを即時に解析処理することもできる。
【００３２】
本発明はまた、核酸増幅及び検出・識別一体型装置を提供する。当該装置は、標的核酸、プライマー、核酸増幅用ポリメラーゼ、インターカレーター及び基質ヌクレオチドを含む増幅用反応液を試料用容器内において等温もしくは可変温度条件下で核酸増幅反応を行う手段、及び増幅核酸を目視またはインターカレーターの発色を確認できる波長での光照射下で増幅核酸の検出や識別を行うための手段を備える。また、本発明の装置には、さらに得られた画像や得られた測定データを画像撮影・保存したり、コンピューターで処理する手段を備えていてもよい。
【００３３】
次に、本発明の核酸識別用検査キットは、上記本発明の識別方法に従って２種以上のインターカレーターの発色の種類によって、ターゲットとする核酸増幅の有無と増幅した核酸の識別を目視で行うためのキットであって、インターカレーターと核酸増幅を行える試薬が含まれれば特に制限はないが、標的核酸、プライマー、核酸増幅用ポリメラーゼ、インターカレーター及び基質ヌクレオチドを含む増幅用反応液を含むことを特徴とする。さらに、生体由来の検体から核酸を抽出及び／又は精製するための前処理用の生体破壊試薬、精製用試薬等が含まれていても構わない。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
（検体の採取）
ヒト全血よりMagExtractor（登録商標）Genome（TOYOBO社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、ABO遺伝子のＳＮＰ検出実験を行った。抽出されたDNAは使用するまで-20℃で保存した。
【００３６】
（プライマーの合成）
検出に使用するプライマーは核酸合成受託会社（シグマアルドリッチジャパン（株）等）に依頼した。
【００３７】
使用したプライマーの塩基配列を表１に示した。プライマーF1〜F2はそれぞれ配列番号1〜2より選ばれる18塩基、18塩基からなる塩基配列である。プライマーR1〜R3はそれぞれ配列番号3〜5より選ばれる18塩基、23塩基、17塩基からなる塩基配列である。
【００３８】
ABO遺伝子の262番目〜264番目の塩基はそれぞれ「Ｇ」「Ａ」「Ｇ」であり、263番目の塩基が「A」である配列をＡ or Ｂ型配列、263番目の塩基を欠失する配列をO型配列である。F1は3'末端が「A」末端から２番目が「Ｇ」となるように設計したプライマーである。F2は3'末端が「Ｇ」末端から２番目が「Ｇ」となるように設計したプライマーである。
【００３９】
ABO遺伝子の配列において、703番目の塩基が「Ｇ」である遺伝子をA型配列とし、この塩基が3'末端となるようにSNP部分を含む特異的プライマーR1を設計した。ABO遺伝子の配列において、803番目の塩基が「C」である遺伝子をB型配列とし、この塩基が3'末端となるようにSNP部分を含む特異的プライマーR2を設計した。R３はABO遺伝子の704〜720番目の塩基に相当する配列を有するプライマーである。
【００４０】
F1プライマーとR1プライマーとを共に用いてPCRを行うと、A型配列特異的に1527bpのPCR産物が得られる。F1プライマーとR2プライマーとを共に用いてPCRを行うと、B型配列特異的に1627bpのPCR産物が得られる。また、F2プライマーとR3プライマーとを共に用いてPCRを行うと、O型配列特異的に1526bpのPCR産物が得られた。
【００４１】
【表１】
2010233530.tif 000002
【００４２】
（ＰＣＲ）
PCRは、サーマルサイクラーとしてBiometra（登録商標）T3000(ビーエム機器株式会社製.)を使用した。PCR反応液の調製はExTaq PCRキット（タカラバイオ社製）の説明書に従い、以下の通りに行った。15 ng/ml のゲノムDNA溶液１μl、25 ng/mlの蛍光色素（DAPI、ヨウ化プロピジウム、SYBRGreenI）１μl、5U/μlのExTaq（タカラバイオ）0.5 μl、10XPCR緩衝液（ExTaqに添付）5μl、2 ｍMのdNTP5 μl、各々10μMのプライマー1.5μlおよび滅菌水34.5μlを混合し、全量を50μlとした。標的DNAの初期変性を98℃で2分間行った後、98℃・15秒の変性工程、55℃・30秒のアニーリング工程、72℃・90秒の伸長工程のサイクルを35回繰り返した。
【００４３】
（増幅核酸の識別）
増幅反応後の反応溶液をTOYOBO社製の紫外線ランプを用いて、核酸増幅の検出と発色を確認した。
【００４４】
その結果を表２に示した。各血液型に特異的なプライマーと異なる蛍光色素を用いてPCR増幅を行ったのち、紫外線ランプにて発色を確認した。その結果、青色の蛍光のみ目視検出でき、これは、A型配列特異的プライマーでPCRを行ったサンプルであった。次に、PCR反応液をアガロースゲル電気泳動後、EtBrにて検出を行ったところ、A型配列特異的プライマーを用いたサンプルのみ、約1500bpのPCR産物が確認された。以上の結果から、PCR反応後の蛍光色素の色調により、簡便に血液型SNPを判別することが可能であることが判った。
【００４５】
【表２】
2010233530.tif 000003
【実施例２】
【００４６】
それぞれ異なる血液型を有するボランティアより採取した全血よりゲノムＤＮＡを抽出し、実施例１と同様の実験を行った。
【００４７】
PCR後に紫外線ランプを用いて、核酸増幅の有無を目視確認した結果を表3に示す。全ての組合せの血液型を、蛍光の色調により判別することができた。例えば、サンプル2は青と緑の蛍光が目視確認できAO型と判別し、サンプル5は青と赤の蛍光によりAB型と判別した。
【００４８】
【表３】
2010233530.tif 000004