(57)【要約】【課題】複雑な病原体に由来する多数のタンパク質を発現させることにおいて使用される革新的なプラスミドＤＮＡの非ウイルスベクターを設計すること。【解決手段】本発明は、（ａ）第１のプロモーターおよび第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニット、（ｂ）第２のプロモーターおよび第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットと、（ｃ）第３のプロモーターおよび第３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第３の転写ユニットとを含み、第１のプロモーター、第２のプロモーターおよび第３のプロモーターのそれぞれが異なる転写ユニットに由来するＤＮＡプラスミドを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化するための組成物であって、該組成物が、以下：
（ａ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；
（ｂ）第２のＤＮＡプラスミドであって、以下：
（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニット、
（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニット、を含み、
ここで、該第１および第２のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１および第２のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第１および第２の転写ユニットが少なくとも１キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第２のＤＮＡプラスミド；および
（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む、組成物。
【請求項２】
生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与するために適切である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１のプラスミドにおける前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１のプラスミドにおける前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリＡのポリアデニル化シグナルである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１のＤＮＡプラスミドがＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードし、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の前記融合体、または、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子がＨＩＶの単離体ＨＸＢ２に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記第２のプラスミドにおける前記第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第２のプラスミドにおける前記第１のポリアデニル化シグナルがＳＶ４０ポリＡのポリアデニル化シグナルである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＨＩＶ  ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドが、ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の融合体（ｎｔｖ）から発現される、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆの融合タンパク質（ＮＴＶ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第２のプラスミドにおける前記第２のプロモーターがサルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーターである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第２のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化シグナルである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１４】
本明細書に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗原に対する予防的免疫応答および治療的免疫応答を改善するためのプラスミド、免疫原組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
プラスミドＤＮＡに基づく免疫原組成物を使用する免疫化は、感染性疾患を防止または処置するための方法を開発するために、あるいは、進行中の疾患プロセスを処置することにおいて有用な強力なツールである。プラスミドＤＮＡ免疫化が動物モデルにおいて広範囲に試験されており、動物モデルでは、広範囲の様々な感染性媒介体および腫瘍抗原に対する細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を誘発することにおいて効果的であることが見出されている。非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３を参照のこと。
【０００３】
プラスミドＤＮＡ免疫化の重要な利点は、様々な遺伝子がクローン化され、改変され、かつ、関連した転写後修飾、発現レベル、適切な細胞内輸送および抗原提示を可能にするような方法で、可能性のあるプラスミドＤＮＡ発現ベクターに配置され得ることである。ＤＮＡ免疫化のために有用なプラスミドＤＮＡベクターは、レポーター遺伝子または治療遺伝子の送達のために用いられるプラスミドＤＮＡベクターと類似する。プラスミドＤＮＡに基づく免疫化では、被験者の細胞装置が、外来タンパク質を生じさせるために使用され、かつ、被験者の免疫系が、そのタンパク質抗原に対する免疫応答を仕掛けるために刺激される。そのようなプラスミドＤＮＡベクターは一般には、広範囲の宿主細胞範囲において高レベルの遺伝子発現を行わせるための強力なウイルスプロモーター／エンハンサーエレメント、および、発現したｍＲＮＡの適切な終結を確実にするためのポリアデニル化シグナルである真核生物の転写制御エレメントを含有する。ウイルスの調節エレメントはプラスミドＤＮＡベクターにおける使用に好都合である一方で、改変されていないウイルスベクターを、関連した遺伝子を発現させるために使用することは、プラスミドＤＮＡでは遭遇しなかった安全上の問題および技術的な問題を引き起こす場合がある。
【０００４】
しかしながら、現在のプラスミドＤＮＡ設計では、多数の遺伝子を１つのベクター骨格から１個の標的細胞において発現させることが制限される。従って、多数の遺伝子を移入および発現させるためには、別個のプラスミドによる標的細胞の同時トランスフェクションが要求される。細胞が多数のプラスミドにより同時トランスフェクションされなければならないとき、すべてのコードされた遺伝子の最適な発現を達成することは、特に、プラスミドがインビボで使用されているときには困難である。これらの制限を克服し、かつ、２つ以上の遺伝子を発現させるための以前の試みには、下記の使用が含まれる：ウイルスベクター、プロウイルスＤＮＡからの多数の選択的スプライシングされた転写物、遺伝子の融合、ウイルス由来のＩＲＥＳ配列（内部リボソーム進入部位）を含有する二シストロン性ベクター、および、二重発現ベクター。非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８を参照のこと。
【０００５】
既存のプラスミド設計はどれも、３つ以上の独立したオープンリーディングフレームをヒト免疫原組成物において発現させるために好適なＤＮＡプラスミドを提供するという問題を解決していない。二シストロン性ベクターの場合においては、多くの場合、ＩＲＥＳの上流側で転写された最初の遺伝子のみがプラスミドベクターまたはレトロウイルスベクターのいずれかから強く発現されるだけである。非特許文献９；非特許文献１０を参照のこと。他方で、二重発現カセットがより良好な成績をもたらしている。例えば、２つの独立したカセットを有する１つのプラスミドを用いた、Ｂ７−１およびヒトガン胎児性抗原（ＣＥＡ）についてのｃＤＮＡの同時送達は、別々のプラスミドと比較したとき、はるかに優れた免疫応答をもたらしたことが見出されていた。非特許文献４を参照のこと。しかしながら、この場合、関与した２つの独立したカセットはともに、相同的なＨＣＭＶプロモーター配列およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列からなっていた。プラスミド骨格内における相同的な配列の存在は反復配列間の組換えの可能性を増大させ、ベクターの不安定性をもたらすので、プラスミド内の相同的な配列の存在はそのプラスミドをＤＮＡ免疫原組成物における使用に適さなくする。
プラスミドＤＮＡベクターをヒト免疫原組成物における使用のために設計するときに直面するもう１つの制約では、プラスミドのサイズおよび構成が伴う。複数の転写ユニットがプラスミドに加えられるとき、転写ユニット間の干渉が、例えば、立体的障害の形態で生じ得る。細胞のＲＮＡ転写複合体は、多転写ユニットプラスミド上の多数の部位に結合し、ＤＮＡを解きほぐし、遺伝子を効果的に転写することができなければならない。単にプラスミドをより大きくすることは、プラスミドの不安定性、プラスミド製造における困難さ、および、最も重要なことではあるが、服用のための検討事項を含むいくつかの理由から、必ずしも最良の解決策ではない。改善されたプラスミドＤＮＡ多重転写ユニットベクターを設計するために、遺伝子の設置、オープンリーディングフレームの間隔および転写方向、発現レベル、製造の容易さ、安全性、ならびに、対象を免疫化するために必要なベクターの最終的な用量を考慮しなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＪＪら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、第１５巻、ｐ．６１７〜４８
【非特許文献２】Ｉｗａｓａｋｉ  Ａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９７年、第１５８巻、第１０号、ｐ．４５９１〜６０１
【非特許文献３】Ｗａｙｎｅ  Ｃ．Ｌ．およびＢｅｎｎｅｔｔ  Ｍ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８年、第１８巻、ｐ．４４９〜４８４
【非特許文献４】Ｃｏｎｒｙ  Ｒ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９６年、第３巻、第１号、ｐ．６７〜７４
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ  ＴＴ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１５３巻、第１０号、ｐ．４７７５〜８７
【非特許文献６】Ａｙｙａｖｏｏ  Ｖ．ら、ＡＩＤＳ、２０００年、第１４巻、第１号、ｐ．１〜９
【非特許文献７】Ａｍａｒａ  Ｒ．Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００２年、第２０巻、第１５号、ｐ．１９４９〜５５
【非特許文献８】Ｓｉｎｇｈ  Ｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００２年、第２０巻、ｐ．１４００〜１４１１
【非特許文献９】Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｙ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．、１９９５年、第６巻、ｐ．９０５〜９１５
【非特許文献１０】Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  Ｈら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０００年、第１巻、ｐ．３７６〜３８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、多くのタンパク質に対する広範囲の免疫応答が要求される場合、ＨＩＶのような複雑な病原体に由来する多数のタンパク質を発現させることにおいて使用される革新的なプラスミドＤＮＡの非ウイルスベクターの設計が依然として求められている。加えて、多数のＨＩＶ遺伝子の高レベルの発現を１個の細胞において行わせることができる多価のＤＮＡ型免疫原組成物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニットと、（ｂ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットと、（ｃ）第３のプロモーターおよび第３のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第３の転写ユニットとを含み、該第１のプロモーター、該第２のプロモーターおよび該第３のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１のポリアデニル化シグナル、該第２のポリアデニル化シグナルおよび該第３のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来するＤＮＡプラスミドを提供する。本発明の別の実施形態において、第１、第２および第３のポリペプチドが真核生物細胞において発現される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＤＮＡプラスミドであって、以下：
（ａ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニット；
（ｂ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニット；
（ｃ）第３のプロモーターおよび第３のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第３の転写ユニット；
を含み、
該第１のプロモーター、該第２のプロモーターおよび該第３のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１のポリアデニル化シグナル、該第２のポリアデニル化シグナルおよび該第３のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第３の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であり、かつ、該第３の転写ユニットの転写方向とは反対方向である、
ＤＮＡプラスミド。
（項目２）
前記第１、第２および第３のポリペプチドが真核生物細胞において発現される、項目１に記載のプラスミド。
（項目３）
前記第１、第２および第３のプロモーターが真核生物細胞において活性である、項目１に記載のプラスミド。
（項目４）
前記第１、第２および第３のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目１に記載のプラスミド。
（項目５）
前記第１、第２および第３のポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群より選択される、項目１に記載のプラスミド。
（項目６）
前記第１のプロモーターがサルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーターである、項目４に記載のプラスミド。
（項目７）
前記第１のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化シグナルである、項目５に記載のプラスミド。
（項目８）
前記第２のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターである、項目４に記載のプラスミド。
（項目９）
前記第２のポリアデニル化シグナルがシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のポリアデニル化シグナルである、項目５に記載のプラスミド。
（項目１０）
前記第３のプロモーターが単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１である、項目４に記載のプラスミド。
（項目１１）
前記第３のポリアデニル化シグナルがウサギβ−グロビンのポリアデニル化シグナルである、項目５に記載のプラスミド。
（項目１２）
前記第１の転写ユニットがＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の融合体からｇａｇ−ｐｏｌ融合タンパク質を発現する、項目１に記載のプラスミド。
（項目１３）
ＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の前記融合体、または、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子がＨＩＶの単離体ＨＸＢ２に由来する、項目１２に記載のプラスミド。
（項目１４）
前記第２の転写ユニットがＨＩＶのエンベロープ遺伝子からエンベロープタンパク質を発現する、項目１に記載のプラスミド。
（項目１５）
前記エンベロープ遺伝子がＨＩＶの初代単離体６１０１に由来する、項目１４に記載のプラスミド。
（項目１６）
前記第３の転写ユニットが、ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の融合体（ｎｔｖ）から、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆの融合タンパク質（ＮＴＶ）を発現する、項目１に記載のプラスミド。
（項目１７）
ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の前記融合体、または、ｎｔｖ遺伝子がＨＩＶの単離体ＮＬ４−３に由来する、項目１６に記載のプラスミド。
（項目１８）
プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載のプラスミド。
（項目１９）
前記選択マーカーが、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子からなる群より選択される、項目１８に記載のプラスミド。
（項目２０）
前記選択マーカーの存在位置が、スペーサー領域１、スペーサー領域２およびスペーサー領域３からなる群より選択される、項目１９に記載のプラスミド。
（項目２１）
前記選択マーカーの存在位置がスペーサー領域２である、項目２０に記載のプラスミド。
（項目２２）
細菌の複製起点をさらに含む、項目１に記載のプラスミド。
（項目２３）
前記複製起点の存在位置が、スペーサー領域１、スペーサー領域２およびスペーサー領域３からなる群より選択される、項目２２に記載のプラスミド。
（項目２４）
前記選択マーカーの存在位置がスペーサー領域３である、項目２３に記載のプラスミド。
（項目２５）
前記複製起点がｐＵＣの複製起点である、項目２２に記載のプラスミド。
（項目２６）
前記プラスミドの全体的なサイズが約１５キロ塩基対未満である、項目１に記載のプラスミド。
（項目２７）
スペーサー領域１が約４００塩基対未満である、項目１に記載のプラスミド。
（項目２８）
スペーサー領域２が約１１００塩基対未満である、項目１に記載のプラスミド。
（項目２９）
スペーサー領域３が約１１００塩基対未満である、項目１に記載のプラスミド。
（項目３０）
選択された抗原に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物は、以下：
（ａ）ＤＮＡプラスミドであって、以下：
（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニット、
（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニット、
（ｉｉｉ）第３のプロモーターおよび第３のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第３の転写ユニット、
を含み、
ここで、該第１、第２および第３のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１、第２および第３のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第３の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であり、かつ、該第３の転写ユニットの転写方向とは反対方向である、ＤＮＡプラスミド；および
（ｂ）薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む、免疫原組成物。
（項目３１）
前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目３０に記載の免疫原組成物。
（項目３２）
前記第１、第２および第３のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目３０に記載の免疫原組成物。
（項目３３）
前記第１、第２および第３のポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群より選択される、項目３０に記載の免疫原組成物。
（項目３４）
前記第１のポリペプチドが、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の融合体から発現されたｇａｇ−ｐｏｌ融合タンパク質である、項目３０に記載の免疫原組成物。
（項目３５）
前記第２のポリペプチドが、ＨＩＶのエンベロープ遺伝子から発現されたエンベロープタンパク質である、項目３０に記載の免疫原組成物。
（項目３６）
前記第３のポリペプチドが、ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の融合体（ｎｔｖ）から発現された、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆの融合タンパク質（ＮＴＶ）である、項目３０に記載の免疫原組成物。
（項目３７）
選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、
（ａ）ＤＮＡプラスミドであって、以下：
（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニット、
（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニット、
（ｉｉｉ）第３のプロモーターおよび第３のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第３の転写ユニット、
を含み、
ここで、該第１、第２および第３のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１、第２および第３のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第３の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であり、かつ、該第３の転写ユニットの転写方向とは反対方向である、ＤＮＡプラスミド；および
（ｂ）薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む、免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。
（項目３８）
前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記エレクトロポレーションが、約２５Ｖ／ｃｍ〜約８００Ｖ／ｃｍの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記第１、第２および第３のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記第１、第２および第３のポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群より選択される、項目３７に記載の方法。
（項目４３）
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、
（ａ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；
（ｂ）第２のＤＮＡプラスミドであって、以下：
（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニット、
（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットを含み、
ここで、該第１および第２のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１および第２のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第１および第２の転写ユニットが少なくとも１キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第２のＤＮＡプラスミド；および
（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む、免疫原組成物。
（項目４４）
前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目４３に記載の免疫原組成物。
（項目４５）
前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群から選択される、項目４３に記載の免疫原組成物。
（項目４６）
前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群より選択される、項目４３に記載の免疫原組成物。
（項目４７）
前記第１のプラスミドにおける前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターである、項目４５に記載の免疫原組成物。
（項目４８）
前記第１のプラスミドにおける前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリＡのポリアデニル化シグナルである、項目４６に記載の免疫原組成物。
（項目４９）
前記第１のＤＮＡプラスミドがＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードし、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の前記融合体、または、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子がＨＩＶの単離体ＨＸＢ２に由来する、項目４３に記載の免疫原組成物。
（項目５０）
前記第２のプラスミドにおける前記第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターである、項目４５に記載の免疫原組成物。
（項目５１）
前記第２のプラスミドにおける前記第１のポリアデニル化シグナルがＳＶ４０ポリＡのポリアデニル化シグナルである、項目４６に記載の免疫原組成物。
（項目５２）
前記ＨＩＶ  ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドが、ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の融合体（ｎｔｖ）から発現される、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆの融合タンパク質（ＮＴＶ）である、項目４３に記載の免疫原組成物。
（項目５３）
ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の前記融合体、または、ｎｔｖ遺伝子がＨＩＶの単離体ＮＬ４−３に由来する、項目５２に記載の免疫原組成物。
（項目５４）
前記第２のプラスミドにおける前記第２のプロモーターがサルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーターである、項目４５に記載の免疫原組成物。
（項目５５）
前記第２のプラスミドにおける前記第２のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化シグナルである、項目４６に記載の免疫原組成物。
（項目５６）
前記ＨＩＶエンベロープポリペプチドがＨＩＶの初代単離体６１０１に由来する、項目４３に記載の免疫原組成物。
（項目５７）
選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；
（ｂ）第２のＤＮＡプラスミドであって、以下：
（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニット、
（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニット、を含み、
ここで、該第１および第２のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１および第２のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第１および第２の転写ユニットが少なくとも１キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第２のＤＮＡプラスミド；および
（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。
（項目５８）
前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記エレクトロポレーションが、約２５Ｖ／ｃｍ〜約８００Ｖ／ｃｍの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目５７に記載の方法。
（項目６２）
前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群より選択される、項目５７に記載の方法。
（項目６３）
前記第１のプラスミドにおける前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターである、項目６１に記載の免疫原組成物。
（項目６４）
前記第１のプラスミドにおける前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリＡのポリアデニル化シグナルである、項目６２に記載の免疫原組成物。
（項目６５）
前記第１のＤＮＡプラスミドがＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードし、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の前記融合体、または、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子がＨＩＶの単離体ＨＸＢ２に由来する、項目５７に記載の方法。
（項目６６）
前記第２のプラスミドにおける前記第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターである、項目６１に記載の方法。
（項目６７）
前記第２のプラスミドにおける前記第１のポリアデニル化シグナルがＳＶ４０ポリＡのポリアデニル化シグナルである、項目６２に記載の方法。
（項目６８）
前記ＨＩＶ  ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドが、ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の融合体（ｎｔｖ）から発現される、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆの融合タンパク質（ＮＴＶ）である、項目５７に記載の方法。
（項目６９）
ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の前記融合体、または、ｎｔｖ遺伝子がＨＩＶの単離体ＮＬ４−３に由来する、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記第２のプラスミドにおける前記第２のプロモーターがサルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーターである、項目６１に記載の方法。
（項目７１）
前記第２のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化シグナルである、項目６２に記載の方法。
（項目７２）
前記ＨＩＶエンベロープポリペプチドがＨＩＶの初代単離体６１０１に由来する、項目５７に記載の方法。
（項目７３）
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物が、以下：
（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；
（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；
（ｃ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第３のＤＮＡプラスミド；
（ｄ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；および
（ｅ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む、免疫原組成物。
（項目７４）
選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；
（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；
（ｃ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第３のＤＮＡプラスミド；
（ｄ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；および
（ｅ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む、免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。
（項目７５）
前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記エレクトロポレーションが、約２５Ｖ／ｃｍ〜約８００Ｖ／ｃｍの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
ＨＩＶに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物が、以下：
（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；
（ｂ）ＨＩＶのｇａｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；
（ｃ）ＨＩＶのｐｏｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第３のＤＮＡプラスミド；
（ｄ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；
（ｅ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第５のＤＮＡプラスミド；および
（ｆ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む、免疫原組成物。
（項目７８）
選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；
（ｂ）ＨＩＶのｇａｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；
（ｃ）ＨＩＶのｐｏｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第３のＤＮＡプラスミド；
（ｄ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；
（ｅ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第５のＤＮＡプラスミド；および
（ｆ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む、免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。
（項目７９）
前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記エレクトロポレーションが、約２５Ｖ／ｃｍ〜約８００Ｖ／ｃｍの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物が、以下：
（ａ）ＨＩＶのｇａｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；
（ｂ）ＨＩＶのｐｏｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；
（ｃ）第３のＤＮＡプラスミドであって、以下：
（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニット、
（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットを含み、
ここで、該第１および第２のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１および第２のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第１および第２の転写ユニットが少なくとも１キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第３のプラスミド；および
（ｄ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；および
（ｅ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む、免疫原組成物。
（項目８２）
前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目８１に記載の組成物。
（項目８３）
前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群より選択される、項目８１に記載の組成物。
（項目８４）
選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）ＨＩＶのｇａｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；
（ｂ）ＨＩＶのｐｏｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；
（ｃ）第３のＤＮＡプラスミドであって、以下：
（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニット、
（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットを含み、
ここで、該第１および第２のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１および第２のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第１および第２の転写ユニットが少なくとも１キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第３のプラスミド；および
（ｄ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；および
（ｅ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つ
を含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。
（項目８５）
前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記エレクトロポレーションが、約２５Ｖ／ｃｍ〜約８００Ｖ／ｃｍの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化するための医薬品の製造における、項目３７〜４２、５７〜６２、６５〜７２、７４〜７６、７８〜８０または８４〜８７のいずれか１項に記載される免疫原組成物の使用。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、（ａ）（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニットと、（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットと、（ｉｉｉ）第３のプロモーターおよび第３のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第３の転写ユニットとを含み、該第１、第２および第３のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第１、第２および第３のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来するＤＮＡプラスミド、および、（ｂ）薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む免疫原組成物を提供する。本発明の１つの具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。本発明の別の実施形態において、第１、第２および第３のポリペプチドが真核生物細胞において発現される。
【００１０】
本発明の特定の実施形態において、免疫原組成物は、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される。１つの具体的な実施形態において、エレクトロポレーションは、約２５Ｖ／ｃｍ〜約８００Ｖ／ｃｍの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激することを伴う。
【００１１】
さらに別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、（ａ）（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニットと、（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットと、（ｉｉｉ）第３のプロモーターおよび第３のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第３の転写ユニットとを含み、該第１、第２および第３のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第１、第２および第３のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来するＤＮＡプラスミド；および（ｂ）薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する方法を提供する。本発明の別の実施形態において、第１、第２および第３のポリペプチドが真核生物細胞において発現される。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、選択された抗原は、細菌、ウイルス、アレルゲンおよび腫瘍からなる群に由来する。１つの具体的な実施形態において、選択された抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルスおよびコロナウイルス（ＳＡＲＳ）からなる群から選択されるウイルスに由来するウイルス抗原である。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態において、選択された抗原は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）（分類可能型および分類不能型の両方）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（糞便連鎖球菌）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（淋菌）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（トラコーマクラミジア）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎クラミジア）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ（オウム病クラミジア）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳菌）、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｄｉｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（チフス菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフス菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（豚コレラ菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（赤痢菌属）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ菌）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ複合体、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（表皮ブドウ球菌）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風菌）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍからなる群から選択される細菌に由来する細菌抗原である。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、脊椎動物宿主は、哺乳動物、鳥類および魚類からなる群から選択される。本発明の特定の実施形態において、脊椎動物宿主は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコの生物種からなる群から選択される哺乳動物である。
【００１５】
本発明の１つの実施形態において、第１、第２および第３のプロモーターは真核生物細胞において活性である。本発明の他の実施形態において、第１、第２および第３のプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群から選択される。
【００１６】
本発明の特定の実施形態において、第１、第２および第３のポリアデニル化シグナルは、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群から選択される。
【００１７】
本発明の具体的な実施形態において、第１の転写ユニットはＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の融合体からｇａｇ−ｐｏｌ融合タンパク質を発現する。本発明の１つの実施形態において、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の融合体、または、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子はＨＩＶの単離体ＨＸＢ２に由来する。
【００１８】
本発明の特定の実施形態において、第２の転写ユニットはＨＩＶのエンベロープ遺伝子からエンベロープタンパク質を発現する。本発明の具体的な実施形態において、エンベロープ遺伝子はＨＩＶの初代単離体６１０１に由来する。
【００１９】
本発明の具体的な実施形態において、第３の転写ユニットは、ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の融合体（ｎｔｖ）から、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆの融合タンパク質（ＮＴＶ）を発現する。本発明の特定の実施形態において、ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の融合体（ｎｔｖ）、または、ｎｔｖ遺伝子はＨＩＶの単離体ＮＬ４−３に由来する。
【００２０】
本発明の具体的な実施形態において、三転写ユニットプラスミドにおいて、第１の転写ユニットについての転写方向が第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向である。本発明の別の実施形態において、第１の転写ユニットについての転写方向が第３の転写ユニットの転写方向とは反対方向である。
【００２１】
本発明の特定の実施形態において、本発明は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む三転写ユニットプラスミドを提供する。１つの実施形態において、選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子からなる群から選択される。別の実施形態において、選択マーカーの存在位置が、スペーサー領域１、スペーサー領域２およびスペーサー領域３からなる群から選択される。具体的な実施形態において、選択マーカーの存在位置はスペーサー領域２である。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、本発明は、細菌の複製起点をさらに含む三転写ユニットプラスミドを提供する。別の実施形態において、複製起点の存在位置が、スペーサー領域１、スペーサー領域２およびスペーサー領域３からなる群から選択される。具体的な実施形態において、選択マーカーの存在位置はスペーサー領域３である。特定の実施形態において、複製起点はｐＵＣの複製起点である。
【００２３】
本発明の１つの実施形態において、本発明は、全体的なサイズが約１５キロ塩基対未満である三転写ユニットプラスミドを提供する。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域１が約４００塩基対未満であり、スペーサー領域２が約１１００塩基対未満であり、スペーサー領域３が約１１００塩基対未満である。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、（ａ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニットと、（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットとを含み、該第１および第２のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１および第２のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、また、第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第１および第２の転写ユニットが少なくとも１キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる第２のＤＮＡプラスミド；および（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む免疫原組成物を提供する。本発明の具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。具体的な実施形態において、第１のプラスミドにおけるプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターであり、第１のプラスミドにおけるポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリＡのポリアデニル化シグナルであり、第１のＤＮＡプラスミドがＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードし、この場合、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の融合体、または、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子はＨＩＶの単離体ＨＸＢ２に由来する。特定の実施形態において、第２のプラスミドにおける第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターであり、第２のプラスミドにおける第１のポリアデニル化シグナルがＳＶ４０ポリＡのポリアデニル化シグナルであり、ポリペプチドが、ＨＩＶの単離体ＮＬ４−３に由来するｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の融合体（ｎｔｖ）から発現される、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆの融合タンパク質（ＮＴＶ）である。具体的な実施形態において、第２のプラスミドにおける第２のプロモーターがサルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーターであり、第２のプラスミドにおける第２のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化シグナルであり、コードされるエンベロープポリペプチドがＨＩＶの初代単離体６１０１に由来する。
【００２５】
さらにさらなる実施形態において、本発明は、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、（ａ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニットと、（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットとを含み、該第１および第２のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１および第２のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、また、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第１および第２の転写ユニットが少なくとも１キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる第２のＤＮＡプラスミド；および（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する方法を提供する。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子はブピバカインである。具体的な実施形態において、第１のプラスミドにおけるプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターであり、第１のプラスミドにおけるポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリＡのポリアデニル化シグナルであり、第１のＤＮＡプラスミドがＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードし、この場合、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の融合体、または、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子はＨＩＶの単離体ＨＸＢ２に由来する。特定の実施形態において、第２のプラスミドにおける第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターであり、第２のプラスミドにおける第１のポリアデニル化シグナルがＳＶ４０ポリＡのポリアデニル化シグナルであり、ポリペプチドが、ＨＩＶの単離体ＮＬ４−３に由来するｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子の融合体（ｎｔｖ）から発現される、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆの融合タンパク質（ＮＴＶ）である。具体的な実施形態において、第２のプラスミドにおける第２のプロモーターがサルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーターであり、第２のプラスミドにおける第２のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化シグナルであり、コードされるエンベロープポリペプチドがＨＩＶの初代単離体６１０１に由来する。１つの実施形態において、免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される。具体的な実施形態において、エレクトロポレーションは、約２５Ｖ／ｃｍ〜約８００Ｖ／ｃｍの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激することを伴う。１つの実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、（ａ）ＨＩＶのｇａｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）ＨＩＶのｐｏｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；（ｃ）（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニットと、（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットとを含み、該第１および第２のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１および第２のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、また、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第１および第２の転写ユニットが少なくとも１キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる第３のＤＮＡプラスミド；および（ｄ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；および（ｅ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む免疫原組成物を提供する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、（ａ）ＨＩＶのｇａｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）ＨＩＶのｐｏｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；（ｃ）（ｉ）第１のプロモーターおよび第１のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の転写ユニットと、（ｉｉ）第２のプロモーターおよび第２のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の転写ユニットとを含み、該第１および第２のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第１および第２のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、また、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第１の転写ユニットについての転写方向が該第２の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第１および第２の転写ユニットが少なくとも１キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる第３のＤＮＡプラスミド；および（ｄ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；および（ｅ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を提供する。具体的な実施形態において、エレクトロポレーションは、約２５Ｖ／ｃｍ〜約８００Ｖ／ｃｍの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激することを伴う。１つの実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明は、ＨＩＶに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；（ｃ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第３のＤＮＡプラスミド；（ｄ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；および（ｅ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む免疫原組成物を提供する。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。別の実施形態において、ブピバカインを含有する免疫原組成物がエレクトロポレーションとの併用で投与される。具体的な実施形態において、ＨＩＶのエンベロープポリペプチド、ｇａｇ−ｐｏｌポリペプチド、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリペプチドおよびアジュバントポリペプチドが真核生物細胞において発現される。１つの実施形態において、第１、第２、第３および第４のプラスミドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターを含有する。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明は、免疫原組成物を脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法を提供し、この場合、免疫原組成物は、（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；（ｃ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第３のＤＮＡプラスミド；（ｄ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；および（ｅ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。別の実施形態において、ブピバカインを含有する免疫原組成物がエレクトポレーションとの併用で投与される。具体的な実施形態において、ＨＩＶのエンベロープポリペプチド、ｇａｇ−ｐｏｌポリペプチド、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリペプチドおよびアジュバントポリペプチドが真核生物細胞において発現される。１つの実施形態において、第１、第２、第３および第４のプラスミドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターを含有する。
【００３０】
本発明の特定の実施形態において、第１、第２、第３および第４のプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含有する。本発明の特定の実施形態において、第１、第２、第３および第４のプラスミドは、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群から選択されるポリアデニル化シグナルを含有する。
【００３１】
具体的な実施形態において、本発明は、上記で記載されるような４つのプラスミドを含み、かつ、それぞれのプラスミドがさらに、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子からなる群から選択される選択マーカーを含む、ＨＩＶに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物を提供する。別の実施形態において、それぞれのプラスミドはさらに細菌の複製起点を含む。さらに別の実施形態において、複製起点がｐＵＣの複製起点である。
【００３２】
本発明はまた、４つのＤＮＡプラスミドが、調節エレメントに作動可能に連結された、２つのアジュバントポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含む一次転写ユニットおよび二次転写ユニットを含む免疫原組成物を提供する。１つの実施形態において、一次転写ユニットは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＩＬ−１２のｐ３５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、二次転写ユニットは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＩＬ−１２のｐ４０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は、ＨＩＶに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）ＨＩＶのｇａｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；（ｃ）ＨＩＶのｐｏｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第３のＤＮＡプラスミド；（ｄ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；（ｅ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第５のＤＮＡプラスミド；および（ｆ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む免疫原組成物を提供する。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。別の実施形態において、ブピバカインを含有する免疫原組成物がエレクトポレーションとの併用で投与される。１つの実施形態において、ＨＩＶのエンベロープポリペプチド、ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリペプチドおよびアジュバントポリペプチドが真核生物細胞において発現される。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）ＨＩＶのｇａｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第２のＤＮＡプラスミド；（ｃ）ＨＩＶのｐｏｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第３のＤＮＡプラスミド；（ｄ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第４のＤＮＡプラスミド；（ｅ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第５のＤＮＡプラスミド；および（ｆ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する方法を提供する。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。別の実施形態において、ブピバカインを含有する免疫原組成物がエレクトポレーションとの併用で投与される。
【００３５】
本発明の１つの実施形態において、第１、第２、第３、第４および第５のプラスミドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターを含有する。特定の実施形態において、第１、第２、第３、第４および第５のプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）潜伏期関連プロモーター−１（ＬＡＰ１）、シミアンウイルス４０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーターならびにヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含有する。本発明の他の実施形態において、第１、第２、第３、第４および第５のプラスミドは、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβグロビンポリＡ、ポリオーマウイルスポリＡおよびウシ成長ホルモンポリＡからなる群から選択されるポリアデニル化シグナルを含有する。
【００３６】
具体的な実施形態において、本発明は、上記で記載されるような５つのプラスミドを含み、かつ、それぞれのプラスミドがさらに、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子からなる群から選択される選択マーカーを含む、ＨＩＶに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物を提供する。別の実施形態において、それぞれのプラスミドはさらに細菌の複製起点を含み、この場合、複製起点はｐＵＣの複製起点である。
【００３７】
本発明はまた、第５のＤＮＡプラスミドが、調節エレメントに作動可能に連結された、２つのアジュバントポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含む一次転写ユニットおよび二次転写ユニットを含む免疫原組成物を提供する。１つの実施形態において、一次転写ユニットは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＩＬ−１２のｐ３５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、二次転写ユニットは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、ＩＬ−１２のｐ４０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明の他の局面および実施形態が下記の詳細な説明において開示される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、６つのＨＩＶ遺伝子またはＨＩＶ遺伝子構築物を真核生物細胞において３つの別個のオープンリーディングフレームから発現させるために組み立てられた例示的な三連転写ユニットＤＮＡプラスミドの環状概略図を示す。図１は、同じプラスミドの線状の、しかし、より詳細な概略図を示す。下記の略号が使用される：ＳＣＭＶ：サルサイトメガロウイルスプロモーター、ＨＣＭＶ：ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ＢＧＨｐｏｌｙＡ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、ｋａｎ：耐性のためのカナマイシンマーカー遺伝子、ＨＳＶｌａｐ１：単純ヘルペスウイルス潜伏期関連プロモーター１、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ：シミアンウイルス４０のポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ｓｄ／ｓａ：シミアンウイルス４０のスプライスドナーおよびスプライスアクセプター、ｇａｇ−ｐｏｌ：ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合体、ｎｔｖ：ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合体、ｅｎｖ：ＨＩＶのエンベロープ。
【図２】図２は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｇａｇの発現を示す。２９３細胞に２μｇの示されたプラスミドＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表３４】
2010265313.tif 000003
【図３】図３は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｐｏｌの発現を示す。２９３細胞に２μｇの示されたプラスミドＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表３５】
2010265313.tif 000004
【図４】図４は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｎｅｆ／ｔａｔ／ｖｉｆ（ｎｔｖ）の発現を示す。２９３細胞に２μｇの示されたプラスミドＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表３６】
2010265313.tif 000005
【図５】図５は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｅｎｖの発現を示す。２９３細胞に２μｇの示されたプラスミドＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表３６】
2010265313.tif 000006
【図６】図６は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｇａｇの発現を示す。２９３細胞に１μｇの示されたプラスミドＤＮＡ組合せをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表３７】
2010265313.tif 000007
【図７】図７は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｅｎｖの発現を示す。２９３細胞に１μｇの示されたプラスミドＤＮＡ組合せをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表３８】
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【図８】表８は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｎｔｖの発現を示す。２９３細胞に１μｇの示されたプラスミドＤＮＡ組合せをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表３９】
2010265313.tif 000009
【図９】図９は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｐｏｌの発現を示す。２９３細胞に、示されたプラスミドＤＮＡ濃度および組合せをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表４０】
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【図１０】図１０は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｇａｇの発現を示す。２９３細胞に、示されたプラスミドＤＮＡ濃度および組合せをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表４１】
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【図１１】表１１は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｅｎｖの発現を示す。２９３細胞に、示されたプラスミドＤＮＡ濃度および組合せをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表４２】
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【図１２】図１２は、２９３細胞におけるＨＩＶ  ｎｔｖの発現を示す。２９３細胞に、示されたプラスミドＤＮＡ濃度および組合せをトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞と結合しているＨＩＶタンパク質をウエスタンブロットによって可視化した。具体的なプラスミドについてのプロモーターおよびオープンリーディングフレームを下記に示す：
【表４３】
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【発明を実施するための形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
ＤＮＡに基づく免疫原組成物は、タンパク質抗原およびアジュバントの投与を含む従来の免疫原組成物の代替物を提供する。その代わり、ＤＮＡに基づく免疫原組成物では、１つまたは複数の抗原をコードするＤＮＡを、その抗原が対象の組織の細胞によって発現される対象の組織に導入することが伴う。本明細書中で使用される場合、そのような免疫原組成物は「ＤＮＡに基づく免疫原組成物」または「核酸に基づく免疫原組成物」と呼ばれる。以前からの問題の１つは、多数の遺伝子が、保護免疫応答を生じさせるために要求されるとき、多数のプラスミドを、その多数の遺伝子を個々に発現させるために使用しなければならなかったことである。このことは製造および調節での負担を強いる。本発明の様々な実施形態は、この問題に対する解決策を、３つの独立したオープンリーディングフレームを同じ細胞において発現させることができるプラスミド設計により提供する。本発明の特定の実施形態では、遺伝子が、ポリタンパク質を作製するために融合され、このようにして、さらに多くのタンパク質を１つのプラスミドから発現させることができる。１つの実施形態において、６つのタンパク質が１つのプラスミドから発現させられる。
【００４０】
非常に多数の要因が、抗原遺伝子の発現、および／または、ＤＮＡに基づく免疫原組成物の免疫原性に影響を及ぼし得る。そのような要因の例には、プラスミドベクターの構築、プラスミドベクターのサイズ、抗原遺伝子の発現を行わせるために使用されるプロモーターの選択、プラスミド上の転写ユニットの数およびサイズ、ＲＮＡ転写物の安定性、プラスミド内での転写ユニットの配向、免疫化の再現性、ならびに、プラスミドにおける挿入された遺伝子の安定性が挙げられる。本発明の実施形態では、これらの重要なパラメーターの多くを最適化するプラスミド設計が提供される。
【００４１】
多数の転写ユニットを有するプラスミドＤＮＡベクターの設計および最適化は非常に重要である。免疫化された対象によって受け入れられる抗原の実際の用量を改善するために、プラスミドのサイズは最小限にしなければならず、その一方で、タンパク質生成物の数および産生されたタンパク質の量は最大にしなければならない。これらの事項をバランスさせるために、遺伝子の設置；転写ユニットの間隔；オープンリーディングフレームの転写方向；発現レベル；プロモーターのサイズ、配向および強さ；エンハンサーのサイズ、設置、配向および強さ；オープンリーディングフレームのサイズおよび構成；製造の容易さ；プラスミドの安定性；安全性；ならびに、対象を免疫化するために必要なベクターの最終的な用量を検討しなければならない。
【００４２】
ＤＮＡプラスミドを免疫化のために使用することに関する重要な検討事項は、プラスミドの製造である。潜在的な安全性問題のために、製造プロセスおよび最終的な製造物は厳しい安全確保を受けなければならず、また、広範囲に及ぶ品質管理を受けなければならない。その結果はそのような手続きのための大きなコストで反映される。その結果として、多数のプラスミドを必要とするＤＮＡ免疫化はどれも、それに比例して費用がより大きくなり、効果的である可能性が低くなる。従って、本発明の特定の実施形態では、製造コストを抑制する必要がある場合、免疫応答を事実上任意の疾患プロセスにおいて誘発するために好適である適用あたり１つのプラスミドを含む免疫原組成物が提供される。
【００４３】
一部の状況では、より大きな製造コストにもかかわらず、１つだけの転写ユニットまたは２つの転写ユニットをそれぞれが含有するプラスミドの組合せの使用により、より効果的な免疫原組成物がもたらされる場合がある。そのような場合、効果的な免疫応答を誘発するために必要な遺伝子のすべてをコードするプラスミドの最適な数を有するように免疫原組成物を設計することが重要である。１つだけの転写ユニットをそれぞれが含有する多数のプラスミドの代わりに、必要な遺伝子のすべてを発現する３つの転写ユニットを含有するプラスミドの使用は特定の抗原の免疫原性とバランスさせなければならない。一転写ユニットプラスミド法の組合せの利点の１つは、個々の遺伝子がそれぞれ、同じ強さのプロモーターによって駆動させられ得ることである。例えば、ＨＣＭＶプロモーターを、三転写ユニットプラスミドでは当てはまるように、プラスミドあたり１回だけでなく、それぞれのプラスミドにおいて使用することができる。対照的に、三転写ユニットプラスミドを使用するとき、ＨＣＭＶプロモーターは、内部での相同組換えおよびプラスミドの不安定性の可能性を防止するために１回のみ使用できる。例えば、一方のプラスミドが１つの転写ユニットを有し、第２のプラスミドが２つの転写ユニットを有する、２つの抗原発現プラスミドを有する組成物においてである。そのような組成物では、ＨＣＭＶプロモーターを、１つの転写ユニットを有するプラスミドにおいて１つだけの抗原または融合タンパク質の発現を行わせるために使用することができ、また、２つの転写ユニットを有するプラスミドにおいて複数のタンパク質または融合タンパク質のうちの１つの発現を行わせるために使用することもできる。
【００４４】
病原体がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である場合、ＨＩＶのエンベロープポリペプチド、ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチド、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチド、および、アジュバントポリペプチドをそれぞれコードするヌクレオチド配列を含有する４つの一転写ユニットプラスミドを伴う免疫原組成物が記載される。所望されるならば、ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する一転写ユニットプラスミドの代わりに、ＨＩＶのｇａｇポリペプチドおよびＨＩＶのｐｏｌ融合ポリペプチドをそれぞれコードするヌクレオチド配列を含有する２つの一転写ユニットプラスミドを使用することができる（従って、この局面では、５つのプラスミドが使用される）。
【００４５】
一般に、その起源に依存して、プロモーターは、ｍＲＮＡ合成を開始する際の組織特異性および効率が異なる［Ｘｉａｎｇ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０９：５６４〜５７９（１９９４）；Ｃｈａｐｍａｎ他、Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１９：３９７９〜３９８６（１９８１）］。今日まで、哺乳動物系におけるほとんどのＤＮＡに基づく免疫原組成物は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するウイルスプロモーターに依拠している。ＣＭＶは起源がヒトまたはサルであり得る。これらは数多くの哺乳動物種における筋肉免疫化および皮膚免疫化の両方で良好な効率を有する。ＤＮＡ免疫化によって誘発される免疫応答に影響を及ぼすことが知られている別の要因は、ＤＮＡの送達方法である。例えば、非経口経路は低い割合の遺伝子移入をもたらし、かつ、遺伝子発現のかなりの変動を生じさせ得る。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、１２：７７７〜７８３（１９９３）を参照のこと。遺伝子銃を使用するプラスミドの高速度接種では、おそらくはＤＮＡトランスフェクションのより大きな効率および樹状細胞によるより効果的な抗原提示のために、マウスの免疫応答が高まった。Ｆｙｎａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０：１１４７８〜１１４８２（１９９３Ｂ）；Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２：７９１〜７９７（１９９３）を参照のこと。本発明の核酸型免疫原組成物を含有するベクターはまた、この分野で知られている他の方法によって、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、顕微注入（マイクロインジェクション）、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リポソーム融合）またはＤＮＡベクター輸送体によって所望の宿主に導入することができる。例えば、Ｗｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：９６３〜９６７（１９９２）；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：１４６２１〜１４６２４（１９８８）；Ｈａｒｔｍｕｔ他、カナダ国特許出願第２，０１２，３１１号（１９９０年３月１５日出願）を参照のこと。
【００４６】
従って、本発明は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、鳥類および魚類など）の遺伝子的免疫化のためのプラスミド、免疫原組成物および方法に関連する。本発明のプラスミド、免疫原組成物および方法は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコの生物種を含む哺乳動物対象のために特に有用であり得る。本発明のプラスミド、免疫原組成物および方法は、下記において詳しく、かつ、当業者に知られている詳細を提供するために参考として組み込まれる引用文献を参照して記載される。
【００４７】
（Ａ．ＤＮＡプラスミド、ベクター、構築物、免疫原組成物）
プラスミド、構築物およびベクターの各用語が本明細書全体を通して使用される。本明細書中で使用される用語「プラスミド」は、調節配列、オープンリーディングフレーム、クローニング部位、停止コドン、スペーサー領域、または、構造的領域もしくは機能的領域のために選択された他の配列をコードする様々な核酸分子が組み立てられ、遺伝子を脊椎動物宿主において発現させるためのベクターとして使用される環状かつスーパーコイル状のＤＮＡ分子を示す。さらに、本明細書中で使用される「プラスミド」は細菌株において複製することができる。本明細書中で使用される用語「構築物」は、遺伝子および調節エレメントの指定された構成を有する特定のベクターまたはプラスミドを示す。核酸配列は、「外因性」（これは、核酸配列が、ベクターが導入されようとしている細胞に対して外来であることを意味する）、「異種」（これは、核酸配列が、異なる遺伝子源に由来することを意味する）、または、「同族」（これは、宿主細胞の核酸内の位置においてその配列が通常的には見出されないことを除いて、配列が細胞内の配列に対して構造的に近縁であることを意味する）であることが可能である。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築し、または、本発明のプラスミドを改変するために十分な素養を有している。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）およびその引用参考文献（例えば、３．１８頁〜３．２６頁および１６．１７頁〜１６．２７頁での引用参考文献）、ならびに、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５）に記載される（両者は参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００４８】
用語「ベクター」は、１つまたは複数の抗原をコードする示された核酸分子が、その核酸分子を発現させることができる細胞への導入のために挿入され得るキャリア核酸分子を示すために使用される。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）、および、人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。用語「発現ベクター」は、転写させることができる、遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを示す。場合により、ＲＮＡ分子が、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合には、これらの配列は、例えば、発現した干渉性ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンス分子またはリボザイムの産生では翻訳されない。発現ベクターは様々な「制御配列」を含有することができ、この場合、「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の転写、および、可能ならば、その翻訳のために必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を同様に果たし、下記に記載される核酸配列を含有することができる。
【００４９】
用語「核酸」および用語「オリゴヌクレオチド」は、多数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基に連結し、かつ、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基に連結した糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味するために交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、これらの用語はオリゴリボヌクレオチドならびにオリゴデオキシリボヌクレオチドを示す。これらの用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、リン酸基を除いたポリヌクレオチド）および任意の他の有機塩基含有ポリマーを包含するものとする。核酸分子は、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得ることができ、しかし、合成的に製造することができる（例えば、オリゴヌクレオチド合成によって製造することができる）。
【００５０】
本明細書中で使用される表現「それぞれが、異なる転写ユニットに由来する」は、類似する機能の調節制御エレメントのそれぞれ（例えば、プロモーターなど）がすべて異なる起源であり、かつ、組換えによる遺伝的不安定性がプラスミドにおいて生じ得るようなレベルに互いに相同的でないことを意味する。Ｈｅｒｒｅｒａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７９：５４８〜５５１（２０００）を参照のこと。
【００５１】
本発明の免疫原組成物は、免疫応答が所望される少なくとも３つの選択された抗原をコードするＤＮＡ配列を含む三連転写ユニットＤＮＡプラスミドを含む。このプラスミドにおいて、選択された各抗原は、哺乳動物細胞または脊椎動物細胞におけるその発現を行わせる調節配列の制御下にある。本発明の免疫原組成物はまた、選択された抗原をコードするプラスミドの組合せを含む。そのような組合せは、さらなる選択された抗原をコードする２つ、３つまたは４つのプラスミドから構成され得る。１つ、２つまたは３つの転写ユニットが組合せ内の任意の特定のプラスミドにおいて存在し得る。さらに、アジュバントポリペプチドをコードするさらなるプラスミドを本発明の免疫原組成物に含めることができる。
【００５２】
本発明において有用な非ウイル性スプラスミドベクターは、選択された免疫原および抗原をコードするＤＮＡ配列を含む単離および精製されたＤＮＡ配列を含有する。標的抗原をコードするＤＮＡ分子は、外因性または異種の核酸配列をコードするために設計されているウイルス性供給源または非ウイルス性供給源（例えば、細菌種または腫瘍抗原など）に由来し得る。そのようなプラスミドまたはベクターは、ウイルスまたはファージに由来する配列を含むことができる。様々な非ウイルス性ベクターがこの分野では知られており、これらには、限定されないが、プラスミド、細菌ベクター、バクテリオファージベクター、「裸の」ＤＮＡ、カチオン性の脂質またはポリマーと縮合したＤＮＡ、ならびに、下記で議論される他のトランスフェクション促進因子（例えば、ブピバカインなどの局所麻酔剤）と配合されたＤＮＡが挙げられ得る。
【００５３】
本発明のプラスミドの構成成分を既存のベクターから得ることができる。細菌ベクターの例には、特に、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）、サルモネラ属、赤痢菌属、大腸菌およびリステリア属に由来する配列が挙げられるが、これらに限定されない。構成成分を得るための好適なプラスミドベクターには、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５１、ｐＫＨ４７、ｐＵＢ１１０、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ｐＢＡＤ１８およびｐＢＲ３２８が挙げられる。
【００５４】
他の構成成分を誘導可能な発現ベクターから得ることができる。好適な誘導可能な大腸菌発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ他、Ｇｅｎｅ、６９：３０１〜３１５（１９８８））、アラビノース発現ベクター（例えば、ｐＢＡＤ１８、Ｇｕｚｍａｎ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７：４１２１〜４１３０（１９９５））およびｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：６０〜８９（１９９０））が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現はハイブリッド型のｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依る。ｐＥＴＩＩｄベクターからの標的遺伝子の発現は、同時発現したウイルスＲＮＡポリメラーゼＴ７ｇｎＩにより媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依る。このウイルスポリメラーゼは、Ｔ７ｇｎ１遺伝子をｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下に有する常在性プロファージから宿主菌株のＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳＩ７４（ＤＥ３）によって供給される。ｐＢＡＤシステムは、ａｒａＣ遺伝子によって調節される誘導可能なアラビノースプロモーターに依る。このプロモーターはアラビノースの存在下で誘導される。
【００５５】
調節性の構成成分を、外部から供給された化合物によって調節される誘導可能なプロモーターから得ることができ、これらには、亜鉛誘導可能なヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導可能なマウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６〜１７６９（１９９５））およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ他、Ｊ  ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１００：２８６５〜２８７２（１９９７））が挙げられる。
【００５６】
真核生物における転写制御シグナルはプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントから構成される。本明細書中で使用される「プロモーター」および「エンハンサー」は、転写に関与するタンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列を示す。Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３６；１２３７（１９８７）を参照のこと。上記で議論されたように、５’非翻訳領域を、選択された抗原の発現を高めるためにプロモーターおよびエンハンサーと組み合わせることができる。抗原の発現を所望の哺乳動物対象または脊椎動物対象において行わせるプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列は同様に、その目的のために有用であることが知られているプロモーターの広範囲のリストから選択することができる。様々なそのようなプロモーターが下記に開示される。下記に記載される免疫原性ＤＮＡプラスミド組成物の実施形態において、有用なプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー（例えば、米国特許第５，１５８，０６２号および同第５，３８５，８３９号（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される）、ヒトヘルペスウイルス潜伏期関連プロモーター１および２（ＨＳＶＬａｐ１＆ＨＳＶＬａｐ２：これらは「潜伏期活性プロモーター１＆２」と呼ばれることがある）、および、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーターエンハンサーである。Ｇｏｉｎｓ  Ｗ．Ｆ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８：２２３９〜２２５２（１９９４）；Ｓｏａｒｅｓ，Ｋ．Ｊ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７０：５３８４〜５３９４；Ｇｏｉｎｓ  Ｗ．Ｆ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３：５１９〜５３２（１９９９）を参照のこと。マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーターもまた使用に好適である。
【００５７】
他の有用な転写制御エレメントには、転写後制御エレメント、例えば、スプライシングされていないＲＮＡまたは部分的にスプライシングされたＲＮＡの細胞質への輸送を助ける構成的輸送エンハンサー（ＣＴＥ）またはＣＴＥ様エレメント（例えば、ＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）など）などが挙げられる。米国特許第５，５８５，２６３号（Ｈａｍｍａｒｓｋｊｏｌｄ他）、および、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：９４４〜７９５２（１９９４）を参照のこと。ＣＴＥまたはＲＴＥは、発現を改善することが示されているので、また、多くの遺伝子が転写後制御エレメントの存在を必要としているので望ましい。数タイプのＣＴＥおよびＣＴＥ様エレメントが存在しており、それらは、異なる経路を使用して機能している。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：９５〜１０１（１９９７）を参照のこと。国際特許出願公開ＷＯ９９／６１５９６もまた参照のこと（これは、ＣＴＥに取って代わることができる新しいタイプの転写後制御エレメントを記載する）。
【００５８】
遺伝子発現はまた、ｍＲＮＡの蓄積を支援するというレベルで、または、ｍＲＮＡの安定性を増大させるというレベルで、または、リボソーム進入の円滑化（そのような機構のすべてがより大きなレベルの翻訳をもたらす）によって機能するポリヌクレオチド配列を含むことによって高めることができる。本発明の特定の実施形態において、ある種の５’非翻訳領域およびイントロンを、より高レベルの遺伝子発現を行わせることができる複合プロモーターまたはキメラなプロモーターを作製するためにプロモーターおよびエンハンサーと組み合わせることができる。
【００５９】
遺伝子発現を高めるために有用な５’非翻訳領域の例には、プロモーターの特異性を変化させることなく、翻訳を高めることによって遺伝子または導入遺伝子の発現を増大させるためにプロモーターの下流側に挿入することができるアデノウイルスの三成分リーダー配列（Ａｄｔｐ）が挙げられる。Ｗ．Ｓｈｅａｙ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５（５）：８５６〜６２（１９９３）を参照のこと。チンパンジーおよびマウスの伸長因子１α（ＥＦ−１α）ｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、ＲＮＡ転写および／またはＲＮＡ安定性を増大することによって遺伝子発現を高めることが知られているイントロンを含有する。Ｓ．Ｙ．Ｋｉｍ他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４；９３（２）：１８３〜７（１９９３）を参照のこと。真核生物の開始因子４ｇ（ｅＩＦ４ｇ）をコードするｍＲＮＡの５’−ＵＴＲは、推定される内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の存在によって特徴づけられ、強いプロモーター活性を示す。Ｂ．Ｈａｎ  Ｂ．＆Ｊ．Ｔ．Ｚｈａｎｇ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２２（２１）：７３７２〜８４（２００２）を参照のこと。加えて、ヒト熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）ｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、通常の細胞培養条件のもとでｍＲＮＡ翻訳の効率を１桁までも増大させるエレメントを含有する。Ｓ．Ｖｉｖｉｎｕｓ他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６８（７）：１９０８〜１７（２００１）を参照のこと。ＮＦ−κＢ抑制因子の５’ＵＴＲは強力なＩＲＥＳとして作用し、また、モノシストロンｍＲＮＡの状況では翻訳エンハンサーとしても機能する。Ａ．Ｏｕｍａｒｄ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２０（８）：２７５５〜９（２０００）を参照のこと。ＣＡＰと開始コドンとの間に結合されて付加された場合、ＳＶ４０の５’ＵＴＲ、および、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）タイプＩの長末端反復に由来するＲ領域（ＳＵＲ）は、おそらくはｍＲＮＡ安定化により翻訳効率を増大させる。Ｙ．Ｔａｋｅｂｅ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、８（１）：４６６〜４７２（１９８８）を参照のこと。
【００６０】
本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸分子、ＤＮＡプラスミドまたはベクターに含められる調節配列には、限定されないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、５’非翻訳領域配列、イントロン、ＣＴＥ、ＲＴＥ、ポリアデニル化配列、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列、翻訳される遺伝子の開始部および末端部にそれぞれ配置される転写開始および転写終結のための部位、転写された領域における翻訳のためのリボソーム結合部位、エピトープタグ、核局在化配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ゴールドバーグ・ホグネス「ＴＡＴＡ」エレメント、制限酵素切断部位、ならびに、選択マーカーなどが含まれる。エンハンサー配列には、例えば、ＳＶ４０  ＤＮＡの７２ｂｐのタンデム反復、または、レトロウイルスの長末端反復もしくはＬＴＲなどが挙げられ、エンハンサー配列は、転写効率を増大させるために用いられる。Ｗａｓｙｌｙｋ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２：５５８９〜５６０８（１９８４）を参照のこと。
【００６１】
ＤＮＡプラスミドにおいて有用なこれらの他の構成成分には、例えば、複製起点、ポリアデニル化配列（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリＡ）、および、薬物耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性）など含まれ、これらの他の構成成分もまた、実施例において記載される配列および下記において具体的に言及される配列を含む、広く知られている配列の中から選択することができる。
【００６２】
個々のプロモーターおよび他の一般的なプラスミドエレメントの選択は通常的であり、多くのそのような配列を、本発明において有用なプラスミドを設計するために利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）およびその引用参考文献（例えば、３．１８頁〜３．２６頁および１６．１７頁〜１６．２７頁での引用参考文献）、ならびに、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）を参照のこと。本発明において有用なプラスミドの構成成分のすべてを、この分野における知られている材料、および、製薬業界から入手可能である、知られている材料の中から当業者によって容易に選択することができる。
【００６３】
抗原またはポリペプチドを発現する好適な遺伝子の様々な例が下記の議論において特定される。本明細書中におけるプラスミドおよび免疫原組成物の１つの実施形態において、選択された抗原はＨＩＶ−１抗原であり、これらには、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆおよびｔａｔの各遺伝子によって発現される抗原が含まれる。１つの実施形態において、ＤＮＡプラスミドのコード配列および非コード配列ならびに他の構成成分が、例えば、意図された宿主に対して適切なコドン選択によって、また、何らかの阻害配列の除去（これもまた、抗原調製に関して下記で議論される）によって最適化される。
【００６４】
本発明の実施形態によれば、組成物は、少なくとも３つの選択された抗原を発現する１つのプラスミドを含有する。あるいは、プラスミド組成物はまた、少なくとも３コピーの同じ選択された目的とする抗原またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む１つのＤＮＡプラスミドを含む。本発明の１つの実施形態において、組成物は、多数の選択された抗原を多数のオープンリーディングフレームから発現する１つのプラスミドを含有する場合がある。別の実施形態において、プラスミド組成物は、多数の選択された抗原（例えば、異なるクレードに由来する多数のｅｎｖ遺伝子）をコードする多数コピーの類似するオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡ配列を含む１つのＤＮＡプラスミドを含む。
【００６５】
本発明の特定の実施形態において、それぞれが１つの抗原を発現するプラスミドの組合せの使用により、より効果的な免疫原組成物がもたらされる場合がある。例えば、１つの実施形態において、本発明は、それぞれがＨＩＶ免疫原またはアジュバントをコードする４つのプラスミドを含有する免疫原組成物を提供する。１つのそのような具体的な免疫原組成物は、４つのプラスミドの下記の組合せ：（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単一転写ユニットを含む第２のＤＮＡプラスミド；（ｃ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第３のＤＮＡプラスミド；（ｄ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する第４のＤＮＡプラスミドと、（ｅ）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも１つとを含有する。具体的な実施形態において、これらのＨＩＶ遺伝子のそれぞれの発現を行わせるプロモーターはＨＣＭＶプロモーターであり、これらのＨＩＶ遺伝子のそれぞれについてのポリＡ配列はウシ成長ホルモンのポリＡである。
【００６６】
本発明の具体的な実施形態において、それぞれが１つの抗原を発現するプラスミドの組合せの使用が所望される場合、個々のポリペプチドをコードする個々の遺伝子をより多く含有し、かつ、融合ポリペプチドをコードする融合遺伝子をより少なく含有するプラスミドをより多く使用することが好都合である場合がある。例えば、１つの実施形態において、本発明は、それぞれがＨＩＶ免疫原またはアジュバントをコードする５つのプラスミドを含有する免疫原組成物を提供する。この実施形態において、免疫原組成物は、（ａ）ＨＩＶのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第１のＤＮＡプラスミド；（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第２のＤＮＡプラスミド；（ｃ）ＨＩＶのｐｏｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第３のＤＮＡプラスミド；（ｄ）ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第４のＤＮＡプラスミド；（ｅ）アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する第５のＤＮＡプラスミド、を含む。具体的な実施形態において、これらのＨＩＶ遺伝子のそれぞれの発現を行わせるプロモーターはＨＣＭＶプロモーターであり、これらのＨＩＶ遺伝子のそれぞれについてのポリＡ配列はウシ成長ホルモンのポリＡである。
【００６７】
さらにさらなる実施形態において、ＤＮＡプラスミドおよび免疫原組成物はさらに、望ましいサイトカイン、リンホカインまたは他の遺伝子アジュバントをコードするヌクレオチド配列を個々のＤＮＡプラスミド構成成分として、または、抗原含有ＤＮＡプラスミドの一部として含有することができる。核酸配列が利用可能であるそのような好適なアジュバントの記載が下記に示される。本発明において例示される実施形態において、本発明のＤＮＡプラスミド組成物とともに投与される望ましいサイトカインはインターロイキン−１２である。
【００６８】
ＤＮＡプラスミド組成物は、薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリア（例えば、下記で議論される希釈剤、賦形剤またはキャリアなど）において投与することができる。組成物は任意の選択された投与経路によって投与され得るが、１つの実施形態において、望ましい投与方法は、下記で記載されるトランスフェクション促進因子としてのブピバカインとの、プラスミド分子を含む組成物の筋肉内同時投与である。
【００６９】
（Ｂ．プラスミド内におけるエレメントの物理的構成）
脊椎動物の免疫原組成物を設計するための実際的な検討事項は、対象を免疫化するときに効果的な投与され得るＤＮＡの量である。用量が検討されるとき、プラスミドの全体的なサイズを制限し、その一方で、プラスミド内での完全な転写ユニットの数を同時に最大にすることは、プラスミドＤＮＡ設計をもたらすための方針を提供する。プラスミドのサイズを最小限に抑え、かつ、発現される遺伝子の数を最大にすることの利点は、１マイクログラムの注入されたＤＮＡあたり送達される免疫原タンパク質の量が高まることである。加えて、ベクターのサイズが増大するに従い、ベクターの不安定性の可能性が増大することが知られている。Ｈｅｒｒｅｒａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７９：５４８〜５５１（２０００）を参照のこと。従って、この目標を達成するために、個々の調節制御エレメント（例えば、プロモーターなど）のサイズを検討し、所与の発現レベルのために要求されるプロモーターの強さとバランスさせなければならない。同様に、オープンリーディングフレームのサイズがプラスミドの全体的なサイズの一因となる。本明細書中で使用される場合、転写ユニット間のＤＮＡ領域（これは、調節的な役割または選択された抗原をコードする役割を有しないＤＮＡによって占められる）は、本明細書中では「スペーサー領域」として指される。スペーサー領域のサイズは、転写ユニット間の転写干渉のレベル、立体的障害のレベル、および、全体的なプラスミドサイズを決定することにおいて重要である。従って、各エレメントのサイズは、それがタンパク質コードであるか、または調節制御であるか、またはスペーサー領域であるとしても、慎重に検討しなければならず、また、最小の効果的な塩基対数に制限しなければならない。
【００７０】
本発明の実施形態では、全長が約１８キロ塩基対（ｋｂ）以下のＤＮＡである三連転写ユニットＤＮＡプラスミドが提供される。代わりの実施形態において、本発明は、全長が約１７ｋｂ以下のＤＮＡである三連転写ユニットＤＮＡプラスミドを提供する。本発明の別の実施形態では、全長が約１６ｋｂ以下のＤＮＡである三連転写ユニットＤＮＡプラスミドが提供される。本発明の特定の実施形態では、全長が約１５ｋｂ以下のＤＮＡである三連転写ユニットＤＮＡプラスミドが提供される。本発明のさらに別の実施形態では、全長が約１４ｋｂ以下のＤＮＡである三連転写ユニットＤＮＡプラスミドが提供される。本発明の具体的な実施形態では、全長が約１３ｋｂ以下のＤＮＡである三連転写ユニットＤＮＡプラスミドが提供される。本発明の特定の実施形態では、全長が約１２ｋｂ以下のＤＮＡである三連転写ユニットＤＮＡプラスミドが提供される。本発明の別の実施形態では、全長が約１１ｋｂ以下のＤＮＡである三連転写ユニットＤＮＡプラスミドが提供される。
【００７１】
本明細書中で使用される「約」または「およそ」は、示された値または範囲の２０パーセント以内を一般に意味するものとする。
【００７２】
図１において明らかにされるように、３つの転写ユニットの間における転写方向の配向はＤＮＡプラスミド設計のためのもう１つの検討事項である。分子生物学の当業者は、環状ＤＮＡプラスミドにおいて、転写方向は２つしかないことを理解する。従って、３つの転写ユニットを有するプラスミドでは、それらのうちの少なくとも２つが同じ方向で進行する。本発明の特定の実施形態において、第１の転写ユニットについての転写方向が第２の転写ユニットの発現方向とは反対方向である。本発明の別の実施形態において、第１の転写ユニットについての転写方向が第２の転写ユニットの発現方向とは反対方向であり、かつ、第３の転写ユニットの転写方向が第２の転写ユニットと同じ方向である。本発明のさらに別の実施形態において、第１の転写ユニットについての転写方向が第２の転写ユニットの発現方向とは反対方向であり、かつ、第３の転写ユニットの転写方向が第１の転写ユニットと同じ方向である。
【００７３】
当業者は、「第１」、「第２」および「第３」としての転写ユニットの番号付けが便宜上にすぎないことを理解する。これら３つの転写ユニットはプラスミドを周って任意の順で配置することができる。
【００７４】
２つの転写ユニットを有するプラスミドでは、いくつかの制約が２つの転写ユニットの転写方向に関して存在する。２つの転写ユニットについての転写方向が反対方向であるならば、そのような２つの転写ユニットは２００ｂｐもの小さいスペーサー領域によって互いに隔てることができ、あるいは、３００ｂｐもの小さいスペーサー領域によって互いに隔てることができ、あるいは、４００ｂｐもの小さいスペーサー領域によって互いに隔てることができる。
【００７５】
２つの転写ユニットを有するプラスミドにおいて、２つの転写ユニットについての転写方向が同じ方向であるならば、そのような２つの転写ユニットは少なくとも約５００ｂｐのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。別の実施形態では、そのような２つの転写ユニットは少なくとも約６００ｂｐのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。さらに別の実施形態では、そのような２つの転写ユニットは少なくとも約７００ｂｐのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。特定の実施形態では、そのような２つの転写ユニットは少なくとも約８００ｂｐのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。別の実施形態では、そのような２つの転写ユニットは少なくとも約９００ｂｐのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。さらに別の実施形態では、そのような２つの転写ユニットは少なくとも約１０００ｂｐのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。
【００７６】
本発明の別の実施形態において、第１の転写ユニットについての転写方向が第２の転写ユニットの発現方向と同じ方向である。本発明のさらに別の実施形態において、第１の転写ユニットについての転写方向が第２の転写ユニットの発現方向と同じ方向であり、かつ、第３の転写ユニットの転写方向が第２の転写ユニットと同じ方向である。本発明の特定の実施形態において、第１の転写ユニットについての転写方向が第２の転写ユニットの発現方向と同じ方向であり、かつ、第３の転写ユニットの転写方向が第１の転写ユニットとはは反対方向である。
【００７７】
スペーサー領域のサイズは、転写ユニット間の転写干渉を緩和し、立体障害を軽減し、かつ、全体的なプラスミドサイズを抑制するために操作することができる１つの変数である。図１に示される実施形態では、ＳＣＭＶプロモーターとＨＣＭＶプロモーターとの間に配置されている、転写ユニット１および転写ユニット２を隔てるスペーサー領域が存在する。本明細書中で使用される場合、転写ユニット１および転写ユニット２を隔てるスペーサー領域が「スペーサー領域１」として理解される。図１に示される実施形態において、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡとＨＳＶ  Ｌａｐ１プロモーターとの間に配置されている、転写ユニット２および転写ユニット３を隔てるスペーサー領域が存在する。本明細書中で使用される場合、転写ユニット２および転写ユニット３を隔てるスペーサー領域が「スペーサー領域２」として理解される。図１に示される実施形態において、ＢＧＨｐｏｌｙＡとウサギβグロビンｐｏｌｙＡとの間に配置されている、転写ユニット３および転写ユニット１を隔てる第３のスペーサー領域が存在する。本明細書中で使用される場合、転写ユニット３および転写ユニット１を隔てるスペーサー領域が「スペーサー領域３」として理解される。図１を参照のこと。
【００７８】
本発明の別の特徴は、全体的なプラスミドサイズが、プラスミドおよび／またはアジュバントの機能を満たすために真核生物プラスミドのスペーサー領域を使用することによって最小限に抑えられ得ることである。例えば、図１に示される実施形態において、スペーサー領域３はまた、細菌の複製起点を含む。加えて、図１に示される実施形態において、スペーサー領域２はカナマイシン遺伝子を細菌における成長のために含む。他の実施形態において、スペーサー領域は、免疫応答を刺激するためにＣｐＧアイランド配列を含む。別の実施形態において、スペーサー領域は、抗原の発現を高めるためにＣＴＥ配列および／またはＲＴＥ配列を含む。本発明のさらに別の実施形態において、スペーサー領域はエンハンサー配列を含むことができる。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域は、発現を高めることにおいて有用であることが知られている非翻訳配列を含むことができる。
【００７９】
本発明の１つの実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約５ｋｂ未満であり、あるいは約４ｋｂ未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約３ｋｂ未満であり、あるいは約２ｋｂ未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約１ｂ未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約８００塩基対（ｂｐ）〜約１０００ｂｐの間である。本発明の代わりの実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約６００ｂｐ〜約８００ｂｐの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約４００ｂｐ〜約６００ｂｐの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約３００ｂｐ〜約４００ｂｐの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約４００ｂｐ未満である。本発明の具体的な実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約２００ｂｐ〜約３００ｂｐの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約１００ｂｐ〜約２００ｂｐの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域１はサイズが約１０ｂｐ〜約１００ｂｐの間である。
【００８０】
本発明の１つの実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約５ｋｂ未満であり、あるいは約４ｋｂ未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域２サイズが約３ｋｂ未満であり、あるいは約２ｋｂ未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約１ｂ未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約１１００ｂｐ未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約８００塩基対（ｂｐ）〜約１０００ｂｐの間である。本発明の代わりの実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約６００ｂｐ〜約８００ｂｐの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約４００ｂｐ〜約６００ｂｐの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約３００ｂｐ〜約４００ｂｐの間である。本発明の具体的な実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約２００ｂｐ〜約３００ｂｐの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約１００ｂｐ〜約２００ｂｐの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域２はサイズが約１０ｂｐ〜約１００ｂｐの間である。
【００８１】
本発明の１つの実施形態において、スペーサー領域３はサイズが約５ｋｂ未満であり、あるいは約４ｋｂ未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域３はサイズが約３ｋｂ未満であり、あるいは約２ｋｂ未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域３はサイズが約１ｂ未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域３はサイズが約１１００ｂｐ未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域３はサイズが約８００ｂｐ〜約１０００ｂｐの間である。本発明の代わりの実施形態において、スペーサー領域３はサイズが約６００ｂｐ〜約８００ｂｐの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域３サイズが約４００ｂｐ〜約６００ｂｐの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域３サイズが約３００ｂｐ〜約４００ｂｐの間である。本発明の具体的な実施形態において、スペーサー領域３はサイズが約２００ｂｐ〜約３００ｂｐの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域３はサイズが約１００ｂｐ〜約２００ｂｐの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域３はサイズが約１０ｂｐ〜約１００ｂｐの間である。
【００８２】
（Ｃ．本発明の免疫原組成物により発現される抗原）
本明細書中で使用される「ポリペプチド」は、本発明のプラスミドおよび免疫原組成物によってコードされる選択されたタンパク質抗原、糖タンパク質抗原、ペプチド抗原または他の改変されたタンパク質抗原を指す。本発明の実施形態では、選択された抗原に対して脊椎動物宿主における「ポリペプチド」に対する免疫応答を誘発するプラスミドおよび免疫原組成物が提供される。本明細書中で使用される用語「選択された抗原」はこのようなポリペプチドを指す。ポリペプチドを含む選択された抗原には、プラスミドＤＮＡによって発現されるとき、病原性のウイルス、細菌、菌類、寄生虫、プリオンまたはそれらの組合せに由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る。あるいは、選択された抗原には、ガン細胞または腫瘍細胞に由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る。別の実施形態において、選択された抗原には、ＩｇＥの産生を妨害し、その結果、アレルゲンに対するアレルギー性応答を和らげるようにするために、アレルゲンに由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る。さらに別の実施形態において、選択された抗原には、望ましくない様式、量または存在位置で宿主によって産生される分子（自己分子）を表す分子またはその一部分に由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る（例えば、脊椎動物宿主におけるアミロイド沈着によって特徴づけられる疾患を防止または処置するようにするために、アミロイド前駆体タンパク質に由来する分子など）。本発明の１つの実施形態において、選択された抗原には、ＨＩＶ−１に由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントが含まれ得る。
【００８３】
本発明の実施形態はまた、（１）脊椎動物宿主において免疫応答を誘発するために、病原性のウイルス、細菌、菌類または寄生虫に由来する選択された抗原、あるいは（２）哺乳動物対象において治療的または予防的な抗ガン作用を誘発するために、ガン細胞または腫瘍細胞由来のガン抗原または腫瘍関連抗原に由来する選択された抗原、あるいは（３）ＩｇＥの産生を妨害し、その結果、アレルゲンに対するアレルギー性応答を和らげるようにするために、アレルゲンに由来する選択された抗原、あるいは（４）望ましくない様式、量または存在位置で宿主によって産生される分子（自己分子）を表す分子またはその一部分に由来する、そのような望ましくない作用を軽減するようにするために選択された抗原、をコードするプラスミドを含む免疫原組成物に関する。
【００８４】
別の実施形態において、望ましい免疫原組成物は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス１型〜３型、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルス（以前では、七面鳥鼻気管炎ウイルス）、ヘンドラウイルス、ニパーウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、ブタ呼吸繁殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび様々な脳炎ウイルス、ならびに、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳウイルスなど）のウイルス疾患のうちの１つを防止または処置することを目指した免疫応答を誘発するための選択された抗原をコードする本発明の三連転写ユニットプラスミドを利用することができる。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明の三連転写ユニットプラスミドを含む免疫原組成物は、新出現疾患を引き起こす病原体、例えば、重症急性呼吸器（ＳＡＲＳ）ウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）、ハンターンウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）０１３９、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）およびボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）などに由来する選択された抗原をコードするプラスミドを含む。
【００８６】
別の実施形態において、本発明のプラスミドを含む免疫原組成物は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）（分類可能型および分類不能型の両方）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（糞便連鎖球菌）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（淋菌）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（トラコーマクラミジア）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎クラミジア）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ（オウム病クラミジア）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳菌）、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｄｉｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（チフス菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフス菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（豚コレラ菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（赤痢菌属）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ菌）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ複合体、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｌｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（表皮ブドウ球菌）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｔｅｔａｎｉ（破傷風菌）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ（これらに限定されない）によって引き起こされる細菌疾患の防止および／または処置に向けられたプラスミドを含む。
【００８７】
本発明の実施形態はまた、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ（アスペルギルス属）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ（ブラストミセス属）、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ属）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ（コクシジオイデス属）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（クリプトコックス属）およびＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ（ヒストプラスマ属）（これらに限定されない）に由来する選択された抗原をコードするプラスミドを含む免疫原組成物に関する。特定の実施形態において、菌類に由来する選択された抗原をコードするプラスミドを含むそのような免疫原組成物は、菌類疾患の防止および／または処置のために使用される。
【００８８】
別の実施形態において、本発明はまた、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ（森林型熱帯リーシュマニア）、Ａｓｃａｒｉｓ（回虫属）、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ（鞭虫属）、Ｇｉａｒｄｉａ（ジアルディア属）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ（住血吸虫属）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（クリプトスポリジウム属）、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ（トリコモナス属）、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ（トキソプラズマ）およびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ（ニューモシスティス）（これらに限定されない）に由来する選択された抗原をコードするプラスミドを含む免疫原組成物に関する。特定の実施形態において、寄生虫の選択された抗原をコードするプラスミドを含むそのような免疫原組成物は寄生虫疾患の防止および／または処置のために使用される。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明は、前立腺特異的抗原、ガン胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−３が非限定的に挙げられるガン抗原または腫瘍関連抗原などの選択された抗原をコードするプラスミドを含む、脊椎動物宿主における治療的または予防的な抗ガン作用を誘発するための免疫原組成物を提供する。一部の実施形態では、同じ抗原または抗原の変化種を、特定の標的抗原の転写および最終的な服用量を高めるために多数の転写ユニットに配置することができる。
【００９０】
本発明の実施形態は、脊椎動物宿主においてアレルゲンに対する応答を和らげる際に使用される、アレルゲンである選択された抗原をコードするプラスミドを含む免疫原組成物もまた提供し、アレルゲンまたはそのフラグメントを含有する免疫原組成物を包含する。そのようなアレルゲンの様々な例が米国特許第５，８３０，８７７号および国際特許出願公開ＷＯ９９／５１２５９に記載される（これらは本明細書により参考として組み込まれる）。そのようなアレルゲンには、限定されないが、花粉、昆虫毒、動物鱗屑、菌類胞子および薬物が挙げられる。本発明の免疫原組成物は、ＩｇＥ抗体の産生（アレルギー性反応の知られている原因）を妨害するために使用することができる。
【００９１】
本発明の実施形態はまた、脊椎動物宿主において自己分子に対する応答を和らげるための選択された抗原をコードするプラスミドを含む免疫原組成物に関する。そのような選択された抗原には、自己分子またはそのフラグメントを含有する抗原が挙げられる。そのような自己分子の例には、糖尿病に関与するインスリンのβ鎖、胃食道逆流疾患に関与するＧ１７分子、および、様々な疾患（例えば、多発性硬化症、狼瘡およびリウマチ様関節炎など）において自己免疫応答をダウンレギュレーションする抗原が挙げられる。β−アミロイドペプチド（これはまたＡβペプチドと呼ばれる）もまた含まれ、これはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の内部の３９アミノ酸〜４３アミノ酸のフラグメントであり、このフラグメントはβセクレターゼ酵素およびγセクレターゼ酵素によるＡＰＰのプロセシングによって生じる。Ａβ１〜４２ペプチドは下記の配列を有する：
【００９２】
【化１】
2010265313.tif 000014
。
【００９３】
選択された抗原をコードする遺伝子配列、ならびに、その遺伝子配列が挿入されるＤＮＡプラスミドのコドン使用を、抗原の発現を増大させ、かつ／または、それにおける阻害配列を除くために変更することもまた、本発明のＤＮＡプラスミドを設計するための、選択された抗原をコードする配列の選択および使用において望ましい。阻害配列の除去を、米国特許第５，９６５，７２６号、同第５，９７２，５９６号、同第６，１７４，６６６号、同第６，２９１，６６４号および同第６，４１４，１３２号、ならびに、国際特許出願公開ＷＯ０１／４６４０８（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）に詳しく議論される技術を使用することによって達成することができる。簡単に記載すると、この技術は、選択された遺伝子における特定された阻害因子／不安定性配列を好ましくは多数の点変異により変異させることを伴う。
【００９４】
下記に例示される１つの具体的な実施形態として、本発明のＤＮＡプラスミドおよび免疫原組成物では、望ましくは、ＨＩＶ−１の遺伝子（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆなど）について最適化された１つまたは複数の配列が用いられる。
【００９５】
本発明の三連転写ユニットプラスミドはまた、宿主細胞をトランスフェクションし、または形質転換し、または感染させて、３つ以上のタンパク質またはポリペプチドをインビトロで発現させるための使用に好適である。
【００９６】
（Ｄ．転写ユニットにおいて有用なプロモーター）
本発明のＤＮＡプラスミドは、１つ、２つまたは３つの転写ユニットを含む。それぞれの転写ユニットが少なくとも１つのプロモーターを含む。従って、本発明の特定の実施形態において、選択された抗原をコードする核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために要求される、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列を指す。表現「転写制御下」は、プロモーターが、遺伝子のＲＮＡポリメラーゼによる開始および転写を制御するために核酸に関して正しい存在位置および配向にあることを意味する。
【００９７】
プロモーターの用語は、ＲＮＡポリメラーゼのための開始部位の付近にクラスター化している一群の転写制御モジュールを指すために本明細書中では使用される。プロモーターがどのように構成されるかについての考えの多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）転写ユニットおよびＳＶ４０初期転写ユニットについてのプロモーターを含むいくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。これらの研究は、より近年の研究によって増大しているが、プロモーターがいくつかの異なった機能的モジュールから構成され、そのそれぞれがおよそ７ｂｐ〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、かつ、転写活性化因子タンパク質または転写抑制因子タンパク質のための１つまたは複数の認識部位を含有することを示している。
【００９８】
それぞれのプロモーターにおける少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成のための開始部位を設置するように機能する。このことの最もよく知られている例がＴＡＴＡボックスであり、しかし、ＴＡＴＡボックスを有していない一部のプロモーター、例えば、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーター、および、ＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーターなどでは、開始部位そのものに重なる異なったエレメントが、開始場所を固定することを助ける。
【００９９】
転写ユニットのいずれかにおいて使用される好適なプロモーターには、真核生物細胞において活性なすべてのプロモーターが含まれる。好適な真核生物プロモーターの例には、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーター（場合によりＨＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Ｂｏｓｃｈａｒｔ他、Ｃｅｌｌ、４１：５２１〜５３０（１９８５）を参照のこと）、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＬＡＰ１プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、レトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）、筋細胞特異的なデスミンプロモーター、または、抗原提示細胞において活性な任意の他のプロモーターが挙げられる。
【０１００】
加えて、好適な真核生物プロモーターは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーターおよび組織特異的なプロモーターなどの中から選択されるとして特徴づけることができる。活性において非特異的であり、かつ、選択された抗原をコードするＤＮＡプラスミドにおいて用いられる構成的プロモーターの例には、限定されないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。外部から供給された化合物によって調節される誘導可能なプロモーターには、限定されないが、アラビノースプロモーター、亜鉛誘導可能なヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導可能なマウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際特許出願公開ＷＯ９８／１００８８）、エコジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６〜１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２〜５１８（１９９８）もまた参照のこと）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９〜２４３（１９９７）、および、Ｗａｎｇ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、４：４３２〜４４１（１９９７））、ならびに、ラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５〜２８７２（１９９７））が挙げられる。
【０１０１】
本発明のＤＮＡプラスミドにおいて有用であり得る誘導可能なプロモーターの他のタイプは、特定の生理学的状態（例えば、温度または急性期）によって調節されるプロモーター、または、複製中の細胞においてのみ調節されるプロモーターである。有用な組織特異的なプロモーターには、骨格β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに、天然に存在するプロモーターよりも大きい活性を有する合成された筋肉プロモーター（Ｌｉ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：２４１〜２４５（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。組織特異的であるプロモーターの例が下記の組織について知られている：中でも、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４〜３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスのコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１００２〜９（１９９６）；α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７：１５０３〜１４（１９９６））、骨（オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５〜９６（１９９７）；骨シアロタンパク質、Ｃｈｅｎ他、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４〜６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３〜８（１９８８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体α鎖）、ニューロン（ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎ他、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３〜１５（１９９３）；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１〜５（１９９１）；ニューロン特異的ｎｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ他、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３〜８４（１９９５））。この関連で有用な、知られているプロモーターのさらなる列挙については、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／５５３３５を参照のこと。
【０１０２】
（Ｅ．転写ユニットにおいて有用なポリアデニル化シグナル）
本発明のＤＮＡプラスミドは３つの転写ユニットを含み、それぞれの転写ユニットが少なくとも１つのポリアデニル化シグナルを含む。本明細書中で定義される「ポリアデニル化シグナル」は、特定の転写ユニットの転写を終結させ、かつ、ポリペプチドをコードする核酸配列が適切に転写および翻訳されることを確実にする停止配列（または停止コドン）を指す。停止部位は合成または天然起源が可能である。停止部位の例には、ポリアデニル化シグナルおよび合成された二方向転写停止部位が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、ポリアデニル化シグナルにより、ＤＮＡ配列の転写が停止する。
【０１０３】
転写ユニットのいずれかにおいて使用される好適なポリアデニル化シグナルには、真核生物細胞において活性なすべてのポリアデニル化シグナルが挙げられる。真核生物のポリアデニル化シグナルの例には、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナルが挙げられ、これは、強いとして文献において特徴づけられているシグナルである（ＧｉｌおよびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｃｅｌｌ、４９：３９９〜４０６（１９８７）；ＧｉｌおよびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：４７３〜４７４（１９８４））。その重要な特徴の１つが、ＵＧリッチドメインおよびＵリッチドメインの両方を含有するその下流側エレメントの構造である。他のポリＡシグナルには、合成ポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ（Ｃｏｌｅ  Ｃ．Ｎ．およびＴ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：２１０４〜２１１３（１９８５）を参照のこと）、ヒトαグロビンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ、Ｃｏｏｋｅ，Ｃ．およびＪ．Ｃ．Ａｌｗｉｎｅ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２：５３８６〜５３９３（１９９２）を参照のこと）、ヒトβグロビンポリＡ（Ｇｉｌ，Ａ．およびＮ．Ｊ．Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｃｅｌｌ、４９：３９９〜４０６（１９８７）を参照のこと）、ポリオーマウイルスポリＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．ＢおよびＧ．Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５：４７８３〜４７９０（１９９５）を参照のこと）、ウシ成長ホルモンポリＡ（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．、Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．およびＩ．Ｃ．Ｄｅｃｋｍａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１９８９））が挙げられる。多くの他のポリアデニル化シグナルがこの分野では知られており、これらもまた本発明の実施形態において有用である。
【０１０４】
ＳＶ４０の初期ポリアデニル化シグナルおよび後期ポリアデニル化シグナルはともに本発明の様々な実施形態において有用である。Ｓｃｈｅｋ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２：５３８６〜５３９３（１９９２）を参照のこと。これらの配列は、ＳＶ４０ゲノムのヌクレオチド２５３３におけるＢａｍｎＨＩ部位と、ヌクレオチド２７７０におけるＢｃｌＩ部位との間の２３７塩基対のフラグメントにおいてコードされる（ＣａｒｓｗｅｌｌおよびＡｌｗｉｎｅ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９：４２４８；１９８９）。ＣａｒｓｗｅｌｌおよびＡｌｗｉｎｅは、最も考えられることには、効率的な切断およびポリアデニル化を容易にする下流側配列エレメントおよび上流側配列エレメントの両方を含むので、ＳＶ４０のこれら２つのポリアデニル化シグナルのうち、後期シグナルの方が効率的であると結論していた。
【０１０５】
さらなるポリアデニル化部位を、この分野で知られている方法を使用して特定または構築することができる。最小限のポリアデニル化部位が、ＡＡＵＡＡＡと、約３０ヌクレオチド下流側で見出される第２の認識配列（一般には、Ｇ／Ｕリッチ配列）とから構成される。本明細書中で使用される場合、配列は、発現ベクターへの組み込みのための好適なＤＮＡの調製を容易にするために、ＲＮＡではなく、ＤＮＡとして提供される。ＤＮＡとして提供されるとき、ポリアデニル化部位は、例えば、Ｇ／Ｔリッチ領域を下流側に伴うＡＡＴＡＡＡから構成される。両方の配列が、効率的なポリアデニル化部位を形成するために存在しなければならない。これらの部位の目的は、特異的なＲＮＡ結合タンパク質をＲＮＡに呼び寄せることである。ＡＡＵＡＡＡは切断ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ；Ｍｕｒｔｈｙ  Ｋ．Ｇ．およびＭａｎｌｅｙ  Ｊ．Ｌ．（１９９５）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、９：２６７２〜２６８３）と結合し、第２の部位（頻繁には、Ｇ／Ｕ配列）は切断刺激因子（ＣｓｔＦ；Ｔａｋａｇａｋｉ  Ｙ．およびＭａｎｌｅｙ  Ｊ．Ｌ．（１９９７）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１７：３９０７〜３９１４）に結合する。ＣｓｔＦは数個のタンパク質から構成され、しかし、ＲＮＡ結合を担うタンパク質はＣｓｔＦ−６４であり、これはリボ核タンパク質ドメインファミリーのタンパク質の１つである（Ｔａｋａｇａｋｉ他（１９９２）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９：１４０３〜１４０７）。
【０１０６】
（Ｆ．本発明の免疫原組成物のために有用なキャリア、希釈剤、促進因子、アジュバントおよび配合物）
本発明において有用なＤＮＡプラスミドおよび免疫原組成物はさらに、薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤または薬学的に受容可能なキャリアを含む。１つの実施形態において、前記薬学的に受容可能な希釈剤は、無菌水、無菌の等張性生理的食塩水、または生物学的緩衝液である。抗原性組成物はまた、そのような希釈剤またはキャリアと従来の様式で混合することができる。本明細書中で使用される表現「薬学的に受容可能なキャリア」は、ヒトまたは他の脊椎動物宿主に対する投与との適合性を有するありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性薬剤および吸収遅延剤などを包含することが意図される。適切なキャリアは当業者には明白であり、主として投与経路に依存する。
【０１０７】
本発明の免疫原組成物に存在させることができるさらにさらなる賦形剤が、アジュバント、促進因子、保存剤、表面活性剤、および、化学的安定化剤、懸濁化剤または分散化剤である。典型的には、安定化剤、アジュバントおよび保存剤が、ヒト対象または動物対象における効力のための最良の配合物を決定するために最適化される。
【０１０８】
（１．アジュバント）
アジュバントは、免疫原または抗原と一緒に投与されたときに免疫応答を高める物質である。数多くのサイトカインまたはリンホカインが免疫調節活性を有することが示されており、従って、アジュバントとして使用することができ、それらには、インターロイキン１−α、インターロイキン１−β、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン１０、インターロイキン１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号を参照のこと）、インターロイキン１３、インターロイキン１４、インターロイキン１５、インターロイキン１６、インターロイキン１７およびインターロイキン１８（およびその変異形態）、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣアクセション番号３９９００を参照のこと）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、ならびに、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用なさらに他のアジュバントには、ケモカインが挙げられ、これには、限定されないが、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳが挙げられる。接着分子（例えば、セレクチン（例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチン）など）もまたアジュバントとして有用である場合がある。さらに他の有用なアジュバントには、限定されないが、ムチン様分子（例えば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１）、インテグリンファミリーのメンバー（例えば、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５など）、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３）、ＣＤ２およびＬＦＡ−３など）、共刺激分子（例えば、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌなど）、増殖因子（血管成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１および血管内皮細胞増殖因子が挙げられる）、受容体分子（Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２およびＤＲ６が挙げられる）が挙げられる。さらに別のアジュバント分子には、カスパーゼ（ＩＣＥ）が挙げられる。国際特許出願公開ＷＯ９８／１７７９９および同ＷＯ９９／４３８３９もまた参照のこと（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１０９】
１つの実施形態において、所望されるアジュバントは、プラスミドから発現されるＩＬ−１２タンパク質である。例えば、米国特許第５，４５７，０３８号、同第５，６４８，４６７号、同第５，７２３，１２７号および同第６，１６８，９２３号を参照のこと（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。１つの実施形態において、サイトカインはタンパク質として投与することができる。特定の実施形態において、ＩＬ−１２が、本発明のＤＮＡプラスミドの３つの転写ユニットのうちの１つまたは２つから発現される。あるいは、ＩＬ−１２は別個のプラスミドから独立的に発現される。別の実施形態において、ＩＬ−１５をコードし、かつ、発現するプラスミドが、ＩＬ−１２をコードし、かつ、発現するプラスミドの代わりに投与される。
【０１１０】
免疫応答を高めるために使用される好適なアジュバントには、限定されないが、米国特許第４，９１２，０９４号（これは本明細書により参考として組み込まれる）に記載されるＭＰＬＴＭ（３−Ｏ−脱アセチル化モノホスホリル脂質Ａ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）が挙げられる。アジュバントしての使用のために同様に好適なものが、Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）から入手可能であり、かつ、米国特許第６，１１３，９１８号（これは本明細書により参考として組み込まれる）に記載される合成された脂質Ａアナログまたはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、あるいは、その誘導体またはアナログである。１つのそのようなＡＧＰが２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル  ２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これはまた、５２９（以前にはＲＣ５２９として知られていた）として知られている。この５２９アジュバントは水性形態または安定なエマルションとして配合される。
【０１１１】
さらに他のアジュバントには、鉱油および水のエマルション、アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、死菌化Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、サポニン（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号（これは本明細書により参考として組み込まれる）に記載されるＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ．）など）、および、それらから作製される粒子（例えば、ＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）など）、結核菌、細菌リポ多糖、合成ポリヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号、これは本明細書により参考として組み込まれる）、百日咳毒素（ＰＴ）、または、大腸菌の熱不安定毒素（ＬＴ）（特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９；例えば、国際特許出願公開ＷＯ９３／１３３０２および同ＷＯ９２／１９２６５（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）が挙げられる。
【０１１２】
アジュバントして同様に有用なものが、コレラ毒素およびその変異体であり、これらには、国際特許出願公開ＷＯ００／１８４３４に記載されるもの（この場合、アミノ酸位置２９のグルタミン酸が別のアミノ酸（アスパラギン酸以外）（好ましくは、ヒスチジン）によって置換される）が挙げられる。類似するＣＴ毒素または変異体が国際特許出願公開ＷＯ０２／０９８３６８に記載され、この場合、アミノ酸位置１６のイソロイシンが、単独で、または、アミノ酸位置６８のセリンを別のアミノ酸によって置換することとの組合せでのいずれかで別のアミノ酸によって置換され、かつ／あるいは、アミノ酸位置７２のバリンが別のアミノ酸によって置換される。他のＣＴ毒素が国際特許出願公開ＷＯ０２／０９８３６９に記載され、この場合、アミノ酸位置２５のアルギニンが別のアミノ酸によって置換され、かつ／または、アミノ酸がアミノ酸位置４９において挿入され、かつ／または、２つのアミノ酸がアミノ酸位置３５およびアミノ酸位置３６において挿入される。
【０１１３】
一部の実施形態において、アジュバントをコードするＤＮＡプラスミドを免疫原組成物において投与することができる。そのような場合、本発明の免疫原組成物に含まれるためにそのＤＮＡがプラスミドに挿入されるアジュバントには、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＢＬ−１（これらは国際特許出願公開ＷＯ９８／１７７９９に記載される）；Ｂ７．２（これは国際特許出願公開ＷＯ００／５１４３１２に記載される）；ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異型ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＴＮＦ−Ｒ（これらは国際特許出願公開ＷＯ９９／４３８３９に記載される）；および変異型ＣＤ８０（これは国際特許出願公開ＷＯ００／６６１６２に記載される）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される用語「ＩＬ−１２タンパク質」は、単鎖のＩＬ−１２タンパク質（この場合、その２つのサブユニットが１つのコード配列によってコードされ、２つのサブユニットをつなぐリンカー配列を有する１つのタンパク質として発現される）を含めて、ヒトＩＬ−１２の一方のサブユニットまたは両方のサブユニットを指すことが意味される。
【０１１４】
特定の実施形態において、サイトカインが、哺乳動物細胞におけるその発現を行わせる調節配列の制御下でサイトカインをコードするＤＮＡ配列を含む核酸組成物として投与される。さらに別の実施形態において、サイトカイン発現プラスミドが、免疫原組成物において、選択された抗原をコードするＤＮＡプラスミドとともに投与される。さらに別の実施形態において、サイトカインが、初回免疫刺激用の免疫原組成物の投与と、追加抗原投与用の免疫原組成物の投与との間で投与される。さらに別の実施形態において、サイトカインが追加抗原投与工程とともに投与される。さらに別の実施形態において、サイトカインが初回免疫刺激用組成物および追加抗原投与用組成物の両方とともに投与される。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態において、ＣｐＧ  ＤＮＡをアジュバントとしてプラスミドに含むことができる。本明細書中で使用される場合、ＣｐＧ  ＤＮＡは、非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、「ＣｐＧ  ＤＮＡ」）を含み、すなわち、５’シトシンと、それに続く３’グアノシンとを含み、かつリン酸エステル結合によって連結されたＤＮＡを含有し、そして免疫系を活性化する、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド核酸分子を含有するオリゴヌクレオチドを指す。米国特許第６，４０６，７０５号（Ｄａｖｉｓ他）および米国特許第６，２０７，６４６号（Ｋｒｉｅｇ他）を参照のこと（これらは本明細書によりその全体が参考として組み込まれる）。脊椎動物ＤＮＡからではなく、細菌ＤＮＡから得られたＣｐＧ  ＤＮＡは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する直接的な免疫刺激作用をインビトロで有する。このリンパ球活性化は非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドのためであり、この非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、細菌ＤＮＡでは予想された頻度（１／１６）で存在するが、脊椎動物ＤＮＡでは低く表され（ＣｐＧ抑制、１／５０〜１／６０）、そしてメチル化されている。ＣｐＧ  ＤＮＡに対する応答における迅速な免疫活性化が、微生物の分子に対して特異的な構造的パターンを認識する生来的な免疫防御機構の１つの構成要素として進化してきたかもしれないことが示唆されている。米国特許第６，４０６，７０５号（Ｄａｖｉｓ他）および米国特許第６，２０７，６４６号（Ｋｒｉｅｇ他）を参照のこと（これらは本明細書によりその全体が参考として組み込まれる）。
【０１１６】
特定の実施形態において、対象にはアジュバントの組合せが投与され、この場合、アジュバントの組合せは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡジヌクレオチドを含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、少なくとも１つの非核酸アジュバント（例えば、ＩＬ−１２など）とを含む。
【０１１７】
（２．促進因子または共薬剤）
ポリヌクレオチド分子から構成される免疫原組成物は望ましくは、ポリヌクレオチドトランスフェクション促進因子または「共薬剤」などの、場合により使用される賦形剤、例えば、細胞へのポリヌクレオチド移入を容易にする、局所麻酔剤、ペプチド、脂質（カチオン性脂質、リポソームまたは脂質粒子が含まれる）、ポリカチオン（例えば、ポリリシンなど）、枝分かれした三次元ポリカチオン（例えば、デンドリマーなど）、炭水化物、カチオン性の両親媒性物質、界面活性剤、ベンジルアンモニウム系界面活性剤または別の化合物などを含有する。そのような促進因子には、局所麻酔剤のブピバカインまたはテトラカインが挙げられる（米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，８１７，６３７号、同第５，３８０，８７６号、同第５，９８１，５０５号および同第６，３８３，５１２号、ならびに、国際特許出願公開ＷＯ９８／１７７９０を参照のこと；これらは本明細書により参考として組み込まれる）。本発明において有用なそのような促進因子または共薬剤の他の非網羅的な例が、米国特許第５，７０３，０５５号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８３７，５３３号；国際特許出願公開ＷＯ９６／１００３８（１９９６年４月４日公開）および国際特許出願公開ＷＯ９４／１６７３７（１９９４年８月８日公開）に記載される（これらはそれぞれが参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１１８】
より好ましくは、トランスフェクション促進因子が、核酸分子との１つまたは複数の複合体を形成する量で存在する。トランスフェクション促進因子が本発明の核酸分子またはプラスミドと混合されるとき、トランスフェクション促進因子は、ＤＮＡを詰め込み、かつ、均一である様々な小さい複合体または粒子を形成する。従って、本発明の免疫原組成物の１つの実施形態において、複合体が、トランスフェクション促進因子を本発明の少なくとも１つのプラスミドと混合することによって形成される。
【０１１９】
特定の実施形態において、本発明の免疫原組成物が２つ以上のタイプのプラスミドから構成される場合がある。あるいは、本発明の組成物の別の実施形態において、トランスフェクション促進因子がそれぞれのプラスミドと別々に予備混合される場合がある。その後、別個の混合物は、すべてのプラスミドが１回のボーラス投与で投与される場合に、プラスミドの所望する比率が１つの免疫原組成物に存在することを確保するために１つの組成物において一緒にされる。あるいは、トランスフェクション促進因子および各プラスミドを別々に混合し得、所望する比率が得られるように別々に投与することができる。
【０１２０】
以降、「複合体」または「１つまたは複数の複合体」または「複合体」の用語が、免疫原組成物のこの実施形態を定義するために使用される場合、この用語は１つまたは複数の複合体を包含することが理解される。それぞれの複合体がプラスミドを含有する。好ましくは、複合体は直径が約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの間である。使用される促進因子が局所麻酔剤（好ましくは、ブピバカイン）である場合、ポリヌクレオチド組成物の総重量に基づいて約０．１重量パーセント〜約１．０重量パーセントの量が好ましい。国際特許出願公開ＷＯ９９／２１５９１もまた参照のこと。これは本明細書により参考として組み込まれ、好ましくは約０．００１重量パーセント〜０．０３重量パーセントの間での量で投与される共薬剤としてのベンジルアンモニウム系界面活性剤の配合を教示する。本発明によれば、局所麻酔剤のそのような量が、約１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの核酸に対して約０．０１％（ｗ／ｖ）〜２．５％（ｗ／ｖ）の局所麻酔剤の前記核酸分子に対する比率で存在する。別のそのような範囲は約１００μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの核酸に対して約０．０５％（ｗ／ｖ）〜１．２５％（ｗ／ｖ）の局所麻酔剤である。
【０１２１】
（３．免疫原組成物に対する他の添加剤）
他の賦形剤を本発明の免疫原組成物に含めることができ、そのような賦形剤には、保存剤、安定化成分および表面活性剤などが含まれる。
【０１２２】
好適な例示的保存剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが含まれる。
【０１２３】
使用することができる好適な安定化成分には、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物および粉乳が含まれる。
【０１２４】
好適な表面活性剤には、限定されないが、フロイント不完全アジュバント、キノンアナログ、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクチルアンモニウム、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール；ポリアミン、例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、カルボポール；ペプチド、例えば、ムラミルペプチドおよびムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン；オイルエマルション；および無機ゲル、例えば、リン酸アルミニウムなど、ならびに、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が含まれる。プラスミドはまた、免疫原組成物として使用されるリポソームに組み込むことができる。免疫原組成物はまた、免疫原組成物の選択された投与様式のために好適な他の添加剤を含有することができる。本発明の免疫原組成物はまた、凍結乾燥ポリヌクレオチドを伴い得、これは、粉末、液体または懸濁物の投薬形態を開発するための他の薬学的に受容可能な賦形剤とともに使用され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２巻、第１９版（１９９５）、例えば、第９５章エアロゾル）および国際特許出願公開ＷＯ９９／４５９６６を参照のこと（それらの教示は、参考として本明細書に援用される）。
【０１２５】
これらの免疫原組成物は、任意の従来の投与経路での投与に適した添加剤を含有することができる。一部の実施形態において、本発明の免疫原組成物は、例えば、液体、粉末、エアロゾル、錠剤、カプセル、腸溶性被覆の錠剤またはカプセル、あるいは坐薬の形態でのヒト被験体への投与のために調製される。従って、免疫原組成物にはまた、懸濁物、溶液、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中のエマルション、ペースト、および、埋め込み可能な持続放出処方物または生分解性処方物が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態において、免疫原組成物が非経口投与のための処方物として調製され、有効成分が、再構成された組成物の非経口投与に先立って好適なビヒクル（例えば、無菌の発熱因子非含有水）により再構成される乾燥形態（すなわち、粉末または顆粒）で提供される。他の有用な非経口投与可能な処方物には、有効成分を微結晶形態で、またはリポソーム調製物で、または生分解性ポリマー系の構成成分として含む処方物が含まれる。持続放出または埋め込みのための組成物は、薬学的に受容可能なポリマー材料または疎水性材料（例えば、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩など）を含むことができる。
【０１２６】
本発明の免疫原組成物は、従来の生理学的に許容され得るキャリア、希釈剤および賦形剤（例えば、上記で記載されたタイプの医薬調製物において有用な溶媒、緩衝剤、アジュバント、促進因子または他の成分など）の選択によって制限されない。適切なｐＨ等張性、安定性および他の従来の特徴を有し、上記で記載された構成成分からこれらの薬学的に受容可能な組成物を調製することはこの技術分野の技術の範囲内である。
【０１２７】
（Ｆ．免疫原組成物のための投薬量および投与経路、エレクトロポレーション）
一般に、本発明の免疫原組成物の構成成分についての適切な「有効量」または投薬量の選択はまた、用いられる免疫原組成物中の選択された抗原の正体、ならびに、被験体の身体状態（特にとりわけ、免疫化被験体の全身の健康状態、年齢および体重が含まれる）に基づく。投与方法および投与経路、ならびに、免疫原組成物中のさらなる構成成分の存在もまた、ＤＮＡプラスミド組成物の投薬量および量に影響を及ぼし得る。有効用量のそのような選択および上方調節または下方調節はこの技術分野の技術の範囲内である。免疫応答（好ましくは、保護応答）を誘発するために、または、著しい有害な副作用を伴うことなく患者において外因性の作用を生じさせるために要求されるプラスミドの量は、これらの要因に依存して変化する。好適な用量が当業者によって容易に決定される。
【０１２８】
本発明の免疫原組成物はヒトまたは非ヒト脊椎動物に様々な経路によって投与され、そのような経路には、鼻腔内、経口、膣、直腸、非経口、皮内、経皮（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９８／２０７３４（これは、参考として本明細書に援用される）を参照のこと）、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内および動脈内が含まれるが、これらに限定されない。適切な経路が、使用される免疫原組成物の性質、ならびに、患者の年齢、体重、性別および全身の健康状態の評価、ならびに、免疫原組成物中に存在する抗原、ならびに、類似する様々な要因に依存して主治医によって選択される。
【０１２９】
免疫原組成物の投与順序および個々の投与の間隔期間を、その方法の適用に対する受容者の身体的特徴および正確な応答に基づいて主治医または当業者によって選択することができる。そのような最適化は十分にこの技術分野の技術の範囲内であることが予想される。
【０１３０】
別の実施形態において、別個の遺伝子産物の、１つ、２つまたは３つのオープンリーディングフレームを１つの細胞においてインビボで同時発現させるための方法が提供され、この方法は、約０．１μｇ〜約１００ｍｇのポリヌクレオチドを哺乳動物の組織に導入する工程を包含する。
【０１３１】
免疫原組成物は、投与時のエレクトロポレーションの使用によって投与され得、そして、プラスミドの取り込みを投与時のエレクトロポレーションの使用によって高めることができる。エレクトロポレーションを行うために、電極が、ポリヌクレオチドが注入される領域の近くに約１ｍｍ〜４ｍｍ離して設置される。電極の正確な位置または設計は、電流が、注入されたポリヌクレオチドの領域内のそれらの方向に対して筋繊維を直交して通過し得る限り様々であり得る。米国特許第５，２７３，５２５号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ）、米国特許第５，８６９，３２６号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ）、米国特許第５，９９３，４３４号（Ｓ．Ｂ．Ｄｅｖ他）、米国特許第６，０１４，５８４号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ他）、米国特許第６，０６８，６５０号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ他）、米国特許第６，０９６，０２０号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ）、米国特許第６，２３３，４８２号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ他）、米国特許第６，２４１，７０１号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ）、米国特許第６，４１８，３４１号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ他）、米国特許第６，４５１，００２号（Ｓ．Ｂ．Ｄｅｖ他）、米国特許第６，５１６，２２３号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ）、米国特許第６，７６３，２６４号（Ｇ．Ａ．Ｈｏｆｍａｎｎ）、米国特許第６，１１０，１６１号（Ｉ．Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ他）を参照のこと（これらのすべてがその全体について参考として援用される）。
【０１３２】
電極が所定の位置に置かれると、筋肉がエレクトロポレーションされ、すなわち、電気的に刺激される。刺激は、所定の振幅および持続時間を有するパルスとして送達される。トランスフェクション効率を最適化するために、パルスの持続時間、電圧、キャパシタンス、電場の強さ、数、波形のパラメーターを変化させることができ、トランスフェクション効率を比較することができる。電気パルスは、エレクトロポレーションにより加えられたパルス状の電場である。パルスは、単極性、双極性、指数的または矩形の波形が可能である。電圧はおよそ０ボルト〜１０００ボルトの範囲を有する；パルスの持続時間は５マイクロ秒〜５ミリ秒の範囲を有する；パルスの数は単パルス〜３０，０００パルスの範囲を有する；一連のパルス列におけるパルス振動数は０．５Ｈｚ〜１０００Ｈｚの範囲を有する。電場の強さについての有用な範囲は約２５Ｖ／ｃｍ〜約８００Ｖ／ｃｍの範囲である。本発明の実施における使用のために意図される電気パルスには、エレクトロポレーションを生じさせるための十分な電圧および持続時間のそのようなパルスが含まれる。Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｇ．Ａ．、Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ（Ｅ．Ｎｅｕｍａｎｎ、Ａ．Ｅ．Ｓｏｗｅｒｓ＆Ｃ．Ａ．Ｊｏｒｄａｎ（編）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ（３８９頁〜４０７頁）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９８９））を参照のこと。
【０１３３】
（Ｇ．キット構成成分）
さらに別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対する免疫応答が所望される上記の疾患または状態のいずれかを処置するための免疫原レジメン、予防的レジメンまたは治療的レジメンを即座に施すための医薬用キットを提供する。このようなキットは、高レベルの抗原特異的な免疫応答を哺乳動物被験体または脊椎動物被験体において誘発する方法で使用するために設計される。キットは、１セットの選択された抗原またはペプチドをコードする３つの転写ユニットを含むＤＮＡプラスミドを含む少なくとも１つの免疫原組成物を含有する。免疫原組成物の多数回分の事前に包装された投薬量を多数回投与のためにキットにより提供することができる。
【０１３４】
ＤＮＡプラスミドを含む上記の免疫原組成物によっても、サイトカインまたは他のアジュバント（例えば、ＩＬ−１２など）が発現されない場合、キットはまた必要に応じて、別個のサイトカイン／アジュバント組成物を含有するか、または、多数回分の事前に包装された投薬量のサイトカイン／アジュバント組成物を多数回の投与のために含有する。これらのサイトカイン組成物は一般に、選択されたサイトカインを、哺乳動物細胞または脊椎動物細胞におけるその発現を誘導する調節配列の制御下にコードするＤＮＡ配列を含む核酸組成物である。他のアジュバントを必要に応じて、事前に包装されたバイアルにより、溶液、液体または固体のいずれかとして提供することができる。
【０１３５】
キットはまた、免疫原組成物を初回免疫／追加抗原投与法において使用するための説明書を含有する。キットはまた、特定のアッセイを行うための説明書、上記で記載された様々なキャリア、賦形剤、希釈剤およびアジュバントなど、ならびに、組成物を投与するための装置（例えば、シリンジ、スプレーデバイスなど）を含むことができる。他の構成成分には、他の組成の中でも特に、使い捨て手袋、汚染除去説明書、アプリケータースティックまたはアプリケーター容器が含まれ得る。
【０１３６】
本発明がより良く理解され得るために、下記の実施例が示される。実施例は例示目的のためだけであり、本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。下記の実施例において引用されているすべての文書、刊行物および特許は参考として本明細書中に援用される。
【実施例】
【０１３７】
（実施例１．ＨＩＶ遺伝子の選択および改変）
当業者は、多くのウイルスおよび細菌からの配列情報がこの技術分野では利用できることを理解する。より具体的には、配列情報を、ポリペプチドを本発明のプラスミドにおいて発現させる際に使用される遺伝子をクローン化するために使用することができる。ＨＩＶおよび他の病原体に由来する多くの配列に関する情報を、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ロスアラモス国立研究所）、および、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（国立医学図書館）（８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４）でのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立バイオテクノロジー情報センター）におけるＨＩＶ配列データベースから入手することができる。
【０１３８】
本発明の１つの実施形態において、下記のＨＩＶ遺伝子が、ＨＩＶゲノムのほとんどを発現する１つの例示的なＤＮＡプラスミドに含むために選択された：単離体ＨＸＢ２に由来するｇａｇ遺伝子、および、単離体ＨＸＢ２に由来するｐｏｌ遺伝子。完全なＨＸＢ２配列が登録番号Ｋ０３４５５でＧｅｎＢａｎｋコンピューターデータベースに登録されている。ｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子が単離体ＮＬ４−３に由来した。完全なＮＬ４−３配列が登録番号Ｍ１９９２１でＧｅｎＢａｎｋコンピューターデータベースに登録されている。ＨＩＶエンベロープ遺伝子が、Ｄａｖｉｄ  Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｅ博士から得られた初代単離体６１０１に由来した。完全なＨＩＶエンベロープ配列が登録番号ＡＹ６１２８５５および同ｂａｎｋｉｔ６２５２４４でＧｅｎＢａｎｋコンピューターデータベースに登録されている。
【０１３９】
ＨＩＶゲノムのほとんどを１つの発現プラスミドに含むことを可能にするために、遺伝子融合体を、全長のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子およびほぼ全長のｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ遺伝子を使用して調製した。加えて、ｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子との間のプロテアーゼ切断部位を除いた。本発明の実施形態で使用されたすべてのＨＩＶ遺伝子は、高レベルのタンパク質発現のために最適化された（配列改変された）ＲＮＡであった。米国特許第５，９６５，７２６号、同第５，９７２，５９６号、同第６，１７４，６６６号、同第６，２９１，６６４号および同第６，４１４，１３２号を参照のこと。
【０１４０】
あるいは、これらのＨＩＶ遺伝子を米国特許出願第６０／５７６，８１９号（２００４年６月４日出願）に提供される方法に従って最適化することができる。この方法に従って、遺伝子の発現が、特定の野生型コドンを「代用」コドンにより置換することによって高められる。ポリヌクレオチドの強化された配列が、好適な代用コドンを選択することによって決定される。代用コドンは、天然に存在する（野生型）遺伝子の、ＡおよびＴ（あるいは、ＲＮＡの場合にはＡおよびＵ）の含有量を変更させるために選択される。代用コドンは、アラニン、アルギニン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、トレオニンおよびバリンのアミノ酸をコードするコドンである。従って、改変された核酸配列は配列全体を通してこれらのアミノ酸のそれぞれについての代用コドンを有する。残る１１個のアミノ酸については、変化を行わず、それにより、対応する天然に存在するコドンがその位置に残っている。
【０１４１】
標準的な技術を用いて、上記のＨＩＶ遺伝子を、それらの安全性を改善し、かつ、それらの発現を最適化するために改変した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦおよびＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ（１９８９））を参照のこと。例えば、下記の遺伝子改変を、安全性を高めるために（すなわち、ウイルス酵素を不活性化することによって）、また、その後のベクターに含まれるＨＩＶ遺伝子の大きさを最大限にするために使用した。
【０１４２】
１）ＨＩＶ−１のｇａｇ−ｐｏｌの融合ポリペプチドを、ｇａｇ終結因子およびｐｏｌ開始因子をそれぞれの遺伝子から除くことによって１つのオープンリーディングフレームで作製し、変異を、２つの個々のタンパク質が形成されないようにするために野生型のフレームシフト領域に導入した。融合構築物のこの例では、野生型ｇａｇｐｏｌにおけるフレームシフト「すべる（ｓｌｉｐｐｅｒｙ）」配列ＴＴＴＴＴＴ（配列番号２）をｃＴＴｃＴｇ（配列番号３）に変化させている。ｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子を構築することに関する情報については、Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．Ｚ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７７：６１９７〜６２０７（２００３）を参照のこと（この開示は本明細書によりその全体が参考として組み込まれる）。野生型ｇａｇ−ｐｏｌ融合タンパク質は、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を隔てる、機能を有しない５６アミノ酸のオープンリーディングフレームのポリペプチドを含有する。この構築物の全体的なサイズを最小限に抑えるために、（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）（配列番号４）の最後の４残基を有するｇａｇポリタンパク質を、短縮した１０アミノ酸の遺伝子間領域（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ）（配列番号５）が続くように改変した。ｐｏｌポリタンパク質の最初の４残基はそのままである（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ）（配列番号６）。三連転写ユニットプラスミドでの発現を容易にするために、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の野生型コード領域からの逸脱を行わなかった。
【０１４３】
２）ＨＩＶ−１プロテアーゼのすべてのタンパク質分解活性を、３つの活性部位アミノ酸（２５位〜２７位のＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）をコードするヌクレオチドを欠失させることによって不活性化した。Ｌｏｅｂ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４０：３９７（１９８９）；Ｗｕ他、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７０：３３７８（１９９６）を参照のこと。
【０１４４】
３）逆転写酵素（ＲＴ）を、下記の４つのアミノ酸をコードするヌクレオチドを欠失させることによって不活性化した：Ｔｙｒ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ａｓｐ１８５、Ａｓｐ１８６。Ｌａｒｄｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２７：７１６〜７１７（１９８７）；Ｌａｒｄｅｒ他、ＰＮＡＳ、８６：４８０３〜４８０７（１９８９）を参照のこと。
【０１４５】
４）ＲＮＡｓｅ活性を、１個のアミノ酸（ｇｌｕ４７８）をコードするヌクレオチドを欠失させることによって失わせた。Ｄａｖｉｅｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：８８〜９５（１９９１）；Ｓｃｈａｔｚ他、１９８９、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．、２５７：３１１〜３１４（１９８９）を参照のこと。
【０１４６】
５）インテグラーゼ機能を、下記の３つのアミノ酸をコードするヌクレオチドを欠失させることによって失わせた：Ａｓｐ６２６、Ａｓｐ６７８およびＧｌｕ７１４。Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６９：３７６〜３８６（１９９５）；Ｌｅａｖｉｔｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：２１１３〜２１１９（１９９３）を参照のこと。
【０１４７】
６）１つのオープンリーディングフレームを、１つのポリタンパク質をコードするように読み枠を合わせて下記のコード領域（ｎｅｆアミノ酸残基４〜２０６；ｔａｔアミノ酸残基２〜８０；ｖｉｆアミノ酸残基２〜１９２）を融合することによって、ＨＩＶ−１のｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子について作製した。このポリタンパク質はｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆまたはｎｔｖとして示される。
【０１４８】
７）安全上の措置として、ｎｅｆタンパク質およびｔａｔタンパク質を、ｎｅｆのミリスチル化シグナル（残基１〜３、ＭＧＧ）の除去およびｔａｔからの２つのシステイン（Ｃ３０＆Ｃ３４）の欠失によって不活性化した。
【０１４９】
（実施例２．単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドの構築）
これらの例において議論されるプラスミドを表１および表２に示す。
【０１５０】
三連転写ユニット発現カセットを、環状の二本鎖ＤＮＡプラスミドにおいて様々な構成成分を使用することによって構築した。図１を参照のこと。第１の構成成分は、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）プロモーターと、クローニング部位と、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルとから構成される、ポリペプチドを真核生物細胞において発現させるための第１の転写ユニットであった。第２の構成成分は、ポリペプチドを真核生物細胞において発現させるための第２の転写ユニットであり、これは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時初期プロモーターと、クローニング部位と、ＳＶ４０ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルとから構成される。第１の転写ユニットと第２の転写ユニットとを隔てるのがスペーサー領域１である。第３の構成成分は、ポリペプチドを真核生物細胞において発現させるための第３の転写ユニットであり、単純ヘルペスウイルスＬａｐ１プロモーターと、ＳＶ４０のスプライスドナー／アクセプターと、クローニング部位と、ウサギのβグロビンポリＡシグナルとから構成される。Ｇｏｉｎｓ  Ｗ．Ｆ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８：２２３９〜２２５２（１９９４）；Ｓｏａｒｅｓ，Ｋ．Ｊ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７０：５３８４〜５３９４；Ｇｏｉｎｓ  Ｗ．Ｆ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３：５１９〜５３２（１９９９）を参照のこと。第２の転写ユニットと第３の転写ユニットとを隔てるのがスペーサー領域２である。細菌由来のキメラなカナマイシン耐性（ｋｍｒ）遺伝子（アデニリル４’−ヌクレオチジルトランスフェラーゼタイプ１ａ）もまたスペーサー領域２とともに含まれる。Ｓｈａｗ  ＫＪ他、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、５７：１３８〜１６３（１９９３）、および、Ｓａｄａｌｅ，Ｙ．他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１４１：１１７８〜１１８２（１９８０）を参照のこと。この遺伝子は、プラスミドを含有する細菌の選択を可能にしながら、限定された数のアミノグリコシドに対する耐性を与えるために考案されている。第３の転写ユニットと第１の転写ユニットとを隔てるのがスペーサー領域３である。スペーサー領域３は、細菌におけるプラスミドの増殖のために必要とされるｐＵＣの細菌複製起点を含む。
【０１５１】
（実施例３．６つのＨＩＶ遺伝子を含有する三連転写ユニットプラスミド）
三転写ユニットプラスミドＤＮＡベクターの使用の実例として、３つの真核生物オープンリーディングフレームを同時発現することができるプラスミドベクターを作製した。三転写ユニットプラスミドＤＮＡベクターを、ＨＩＶ−１抗原をコードする下記の選択された遺伝子を実施例２に記載される三連転写ユニット発現カセットに挿入することによって作製した。すべてのクローニング技術を通常的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）に従って行った。
【０１５２】
最初に、ＨＩＶ−１のｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子を第１の転写ユニットのＳＣＭＶ部位とＢＧＨポリＡ部位との間にあるＰｍｅＩ−ＸｈｏＩクローニング部位に挿入した。ｇａｇ遺伝子は単離体ＨＸＢ２に由来し、同様に、ｐｏｌ遺伝子もまた単離体ＨＸＢ２に由来した。完全なＨＸＢ２配列が登録番号Ｋ０３４５５でＧｅｎＢａｎｋコンピューターデータベースに登録されている。当業者は、他のクレードに由来する他のＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子、あるいは、他のウイルス遺伝子または細菌遺伝子が同様の様式で挿入され得ることを理解する。ＨＩＶおよび他の病原体に関する配列情報は、Ｌｏｓ
Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ロスアラモス国立研究所）、および、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（国立医学図書館）（８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４）でのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立バイオテクノロジー情報センター）におけるＨＩＶ配列データベースから入手することができる。
【０１５３】
次に、ＨＩＶ−１の初代単離体（６１０１）に由来する全長のエンベロープ遺伝子（ｇｐ１６０）を第２の真核生物転写ユニットのＨＣＭＶ部位とＳＶ４０ポリＡ部位との間にあるＭｌｕＩクローニング部位に挿入した。６１０１のエンベロープ配列は、登録番号ＡＹ６１２８５５および同ｂａｎｋｉｔ６２５２４４でＧｅｎＢａｎｋコンピューターデータベースにおいて得ることができる。
【０１５４】
最後に、ｔａｔの残基２〜８０に融合され、かつ、ｖｉｆの残基２〜１９２に融合されたｎｅｆの残基４〜２０６を含む、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ（ＮＴＶ）融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を、ＨＳＶＬａｐ１プロモーターとウサギβ−グロビンポリＡシグナルとの間にあるＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶクローニング部位に挿入した。ｎｅｆ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子はＨＩＶ−１の単離体ＮＬ４−３に由来した。ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３の完全な配列が登録番号Ｍ１９９２１でＧｅｎＢａｎｋコンピューターデータベースに登録されている。
【０１５５】
従って、構築されたように、ｇａｇ−ｐｏｌのオープンリーディングフレームが第１の転写ユニットにおけるＳＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリＡ部位の制御下に置かれ、エンベロープのオープンリーディングフレームが第２の真核生物転写ユニットにおけるＨＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナルの制御下に置かれ、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合体のオープンリーディングフレームが第３の真核生物転写ユニットにおけるＨＳＶＬａｐ１／ＳＶ４０イントロンおよびウサギβ−グロビンポリＡシグナルの制御下に置かれた。
【０１５６】
（実施例４．単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドからのＨＩＶ遺伝子の発現）
材料および方法；細胞およびトランスフェクション
実施例３で記載された６つのＨＩＶ遺伝子を発現するプラスミドを、コードされたタンパク質を発現する能力についてインビトロで評価した。すべてのインビトロ発現研究のために使用した細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られた２９３細胞およびＲＤ細胞であった。ＨＩＶタンパク質をこれらの細胞において発現させるための手順は下記の通りであった：細胞をトランスフェクションの２４時間前に直径３５ｍｍのウエルあたり２×１０５細胞の密度でプレートし、精製したプラスミドＤＮＡによりトランスフェクションした。トランスフェクションのために、２μｇのプラスミドをＦｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と混合し、１００μｌの総体積で細胞に重層した。次いで、細胞を、１０％のＦＢＳを含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地（ＢＲＬ）により４８時間インキュベーションした。最後に、細胞溶解物をさらなる分析のために集めた。
【０１５７】
（発現タンパク質の検出）
ＨＩＶタンパク質の特異的な検出を、ウェスタンブロットアッセイを使用して達成した。例えば、ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質、エンベロープタンパク質およびｖｉｆタンパク質のそれぞれについてのウェスタンブロットアッセイを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してタンパク質混合物を分離することによって行った。次いで、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブラン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に転写した。事前に染色された分子量マーカー、ならびに、ＨＩＶ−１の組換えｐ２４（ｇａｇ）タンパク質、組換えｐ６６（ｐｏｌ）タンパク質、組換えｇｐ１６０（ｅｎｖ）タンパク質および組換えｖｉｆタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をサイズ標準物およびポジティブコントロールとしてそれぞれ使用した。ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｖｉｆの発現の検出を免疫染色によって達成し、結合している分離されたタンパク質を有するＰＶＤＦメンブランをそれぞれのタンパク質に対して特異的な抗体とインキュベーションした。アルカリホスファターゼに結合体化された二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、発色検出を、発色検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって行った。
【０１５８】
（単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドからのＨＩＶ遺伝子の発現）
三連転写ユニットプラスミドからのＨＩＶ遺伝子の発現を評価し、単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミドのそれぞれからの同じ遺伝子の発現と比較した。単一転写ユニットプラスミドは、ＨＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリＡシグナルを発現調節エレメントとして含有する単一の真核生物転写ユニットを有していた。単一転写ユニットプラスミドには、表１に示されるように、１０１〜１０５、ならびに、１１０および１１１の番号が付けられている。例えば、プラスミド１０１はＨＩＶのｅｎｖ遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。同様に、プラスミド１０２はＨＩＶのｇａｇ遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。加えて、プラスミド１０３はＨＩＶのｐｏｌ遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有し、プラスミド１０４はＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ（ｎｔｖ）融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。プラスミド１０１はまた、プラスミド１０４内のＨＣＭＶではなく、Ｌａｐ１プロモーターによって駆動されることを除いて、ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ（ｎｔｖ）融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。最後に、プラスミド１１０はＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有し、プラスミド１１１はＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。
【０１５９】
二連転写ユニットプラスミドは２つの完全な真核生物転写ユニットを有していた。二連転写ユニットプラスミドには、表１に示されるように、２０１〜２０４および２１２の番号が付けられた。二連転写ユニットプラスミドのための発現調節エレメントは、第１の転写ユニットではＳＶ４０ポリＡと共役したＨＣＭＶプロモーターから構成され、第２の転写ユニットではＢＧＨポリＡシグナルと共役したＳＣＭＶプロモーターから構成された。この実施形態において、プラスミド２０１はＨＩＶのｐｏｌ遺伝子を第１の転写ユニットに含有し、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子を第２の転写ユニットに含有した。プラスミド２０２はＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合遺伝子の遺伝子を第１の転写ユニットに含有し、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子を第２の転写ユニットに含有した。プラスミド２０３はＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合遺伝子の遺伝子を第１の転写ユニットに含有し、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子を第２の転写ユニットに含有した。プラスミド２０４はＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子の遺伝子を第１の転写ユニットに含有し、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子を第２の転写ユニットに含有した。
【０１６０】
一部の実施形態において、アジュバントが、アジュバントをプラスミドから発現させることによって提供される。そのような場合、プラスミドは適切な数の転写ユニットを含有しなければならない。明確化のために、また、抗原プラスミドと区別するために、一次、二次および三次の用語法が、１つまたは２つまたは３つの転写ユニットを有するアジュバントプラスミドを示すために使用される。例えば、ＩＬ−１２は、２つのポリペプチドから構成されるアジュバントである。適切なプラスミドがプラスミド２１２であり、これは、一次転写ユニットにおいてＨＣＭＶ即時初期プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの制御下で発現させられるＩＬ−１２のｐ３５サブユニットと、二次転写ユニットにおいてサルＣＭＶ（ＳＣＭＶ）プロモーターおよびＢＧＨポリアデニル化シグナルの制御下で発現させられるＩＬ−１２のｐ４０サブユニットとを含有した。
【０１６１】
三連転写ユニットプラスミドは３つの完全な真核生物転写ユニットを有し、３０１、３０２および３０３の番号が付けられた。表２を参照のこと。これら３つのプラスミドの間の違いは、挿入されているＨＩＶのオープンリーディングフレームの数であった。三連転写ユニットプラスミドのための発現調節エレメントは、第１の転写ユニットではＢＧＨポリＡシグナルと共役したＳＣＭＶプロモーターから構成され、第２の転写ユニットではＳＶ４０ポリＡと共役したＨＣＭＶプロモーターから構成され、第３の転写ユニットではウサギβグロビンポリＡシグナルと共役したＨＳＶＬａｐ１プロモーターから構成された。表２に示されるように、プラスミド番号３０１は三連転写ユニットプラスミドであるが、挿入されたオープンリーディングフレームを有する転写ユニットが１つだけである。具体的には、プラスミド３０１はｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子のオープンリーディングフレームを第１の転写ユニットに含有した。プラスミッド番号３０２は、挿入されたオープンリーディングフレームを有する転写ユニットが２つである三連転写ユニットプラスミドである（第１の転写ユニットにおけるｇａｇ−ｐｏｌ、および、第３の転写ユニットにはＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合遺伝子のオープンリーディングフレーム）（第２の転写ユニットには遺伝子が挿入されなかった）。最後に、プラスミド番号３０３は、３つの転写ユニットのすべてが、挿入されたオープンリーディングフレームを有する三連転写ユニットプラスミドである（第１の転写ユニットにはｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子のオープンリーディングフレーム、第２の転写ユニットにはｅｎｖ遺伝子のオープンリーディングフレーム、および、第３の転写ユニットにはｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合遺伝子のオープンリーディングフレーム）。
表１．単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミド＊
【０１６２】
【表１】
2010265313.tif 000015
＊下記の略号が使用される：ＳＣＭＶ：サルサイトメガロウイルスプロモーター、ＨＣＭＶ：ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶｌａｐ１：単純ヘルペス潜伏期関連プロモーター１、ｇａｇ−ｐｏｌ：ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合体、ｎｔｖ：ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合体、ｅｎｖ：ＨＩＶのエンベロープ、ｍＩＬ−１２：マウスインターロイキン−１２。
表２．三連転写ユニットプラスミド＊
【０１６３】
【表２】
2010265313.tif 000016
＊下記の略号が使用される：ＳＣＭＶ：サルサイトメガロウイルスプロモーター、ＨＣＭＶ：ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶｌａｐ１：単純ヘルペス潜伏期関連プロモーター１、ｇａｇ−ｐｏｌ：ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ融合体、ｎｔｖ：ＨＩＶのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合体、ｅｎｖ：ＨＩＶのエンベロープ、ＨＣＭＶ−［ｎｏｎｅ］、Ｌａｐ１−［ｎｏｎｅ］は、転写ユニットがオープンリーディングフレームを含有しなかったことを示す（プラスミド３０１を参照のこと）；
＊＊ＩＬ−１２はマウスまたはアカゲザルまたはヒトのいずれかに由来し得る。
【０１６４】
上記で議論されたように、多数の単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミドを、三連転写ユニットプラスミドの発現と比較することに使用するために構築した。表１および表２を参照のこと。これらのｇａｇ含有構築物、ｐｏｌ含有構築物、ｅｎｖ含有構築物、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ含有構築物、ｇａｇ−ｐｏｌ含有構築物およびｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ含有構築物の発現パターンを、２９３細胞および／またはＲＤ細胞を、単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドで一過的にトランスフェクションし、細胞溶解物を、適切な抗体を使用するウェスタンブロットによって分析することによって評価した。
【０１６５】
様々な構築物からの細胞溶解物におけるｇａｇのインビトロ発現を行い、その結果を、ウェスタンブロットを使用して検出した。図２および表１を参照のこと。ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質がマウス抗ｇａｇモノクローナル血清およびヒトポリクローナル血清によりそれぞれ検出された。分子量マーカーおよびＨＩＶ  ｐ２４を標準物として最初の２つのレーンに含めた。ｇａｇを発現した単一転写ユニットプラスミド１０２を最初のサンプルレーンにおいて泳動した。２つの転写ユニット、すなわち、挿入されたオープンリーディングフレームを伴う２つの転写ユニットを有するプラスミドが、プラスミド２０１、プラスミド２０３およびプラスミド２０４であり、すべてがかなりの量のｇａｇまたはｇａｇ含有ポリタンパク質（例えば、ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆなど）またはｇａｇ−ｐｏｌを発現した。ｇａｇ−ｐｏｌ融合構築物において、ｇａｇとｐｏｌとの間におけるフレームシフト配列を、同じ読み枠からのｇａｇおよびｐｏｌの発現を可能にするように変異させた。二転写ユニットプラスミドの２０１、２０３および２０４は、単一転写ユニットプラスミド１０２よりも少ないｇａｇを産生した。ｇａｇ−ｐｏｌ融合体をコードした二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドは、約１８０ｋｄの予想サイズで移動した等しい量のｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質を発現した。大型のｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｔｖポリタンパク質をコードするプラスミド２０３からのｇａｇの発現もまた、トランスフェクションされた細胞の細胞溶解物において検出され、このタンパク質は約２２０ｋＤの予想サイズで移動した。しかしながら、この大型の融合体（プラスミド２０３）からの発現は、ｇａｇ−ｐｏｌをコードするプラスミド３０２およびプラスミド３０３の発現よりも低かった。三転写ユニットプラスミド３０３もまた、かなりの量のｇａｇをｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質の形態で産生したが、ｇａｇは単一転写ユニットプラスミドよりも少なく、また、二連転写ユニットプラスミドから産生されたレベルとほぼ等しかった。挿入された２つのオープンリーディングフレームと、オープンリーディングフレームを含まない１つの転写ユニットとを有した三転写ユニットプラスミド３０２は二転写ユニットプラスミドとほぼ同じレベルでｇａｇを産生した。図２を参照のこと。
【０１６６】
様々な構築物からの細胞溶解物におけるｐｏｌのインビトロ発現プロフィールを行い、ウェスタンブロットを使用して検出されたときの結果は、ｇａｇの場合に観測されたものと類似するパターンであった。図３および表１を参照のこと。この場合、ｐｏｌタンパク質がヒトポリクローナル血清により検出された。分子量マーカーおよびＨＩＶ逆転写酵素を標準物として最初の２つのレーンに含めた。ｐｏｌを発現した単一転写ユニットプラスミド１０３を最初のサンプルレーンにおいて泳動した。次に、２つの転写ユニット、すなわち、挿入されたオープンリーディングフレームを伴う２つの転写ユニットを有するプラスミド２０１、プラスミド２０３およびプラスミド２０４はすべてが、かなりの量のｐｏｌまたはｐｏｌ含有ポリタンパク質（例えば、ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆなど）またはｇａｇ−ｐｏｌを発現した。ｇａｇに関する状況とは対照的に、二転写ユニットプラスミドの２０１、２０３および２０４は、単一転写ユニットプラスミド１０３とほぼ同じレベルのｐｏｌを産生した。ｐｏｌおよびｇａｇ−ｐｏｌ融合物は、ｐｏｌについてはおよそ１１０ｋｄの予想サイズで、ｇａｇ−ｐｏｌについてはおよそ１８０ｋｄの予想サイズで、ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆについてはおよそ２５０ｋｄの予想サイズで移動したｐｏｌポリタンパク質を発現した。三転写ユニットプラスミド３０３もまた、ｐｏｌをｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質の形態で産生したが、単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミドよりも少ないｐｏｌを産生した。再度ではあるが、挿入された２つのオープンリーディングフレームと、オープンリーディングフレームを含まない１つの転写ユニットとを有した三転写ユニットプラスミド３０２は二転写ユニットプラスミドの２０１および２０３とほぼ同じレベルでｐｏｌをｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質の形態で発現した。図３を参照のこと。この実施例では、プラスミド２０４が他の二転写ユニットプラスミド（２０１および２０３）よりも高いレベルのｐｏｌを発現した。図３を参照のこと。
【０１６７】
同様の分析を、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆまたはＮＴＶとして知られているＨＩＶ調節タンパク質の融合体の細胞溶解物においてインビトロ発現について行った。図４および表１を参照のこと。ＮＴＶタンパク質がマウス抗ｖｉｆモノクローナル抗体により検出された。分子量マーカーおよび組換えＨＩＶ  ｖｉｆ  ｐ２３を標準物として最初の２つのレーンにそれぞれ含めた。ＮＴＶをＨＣＭＶプロモーターまたはＬａｐ１プロモーターのいずれかからそれぞれ発現した２つの単一転写ユニットプラスミド（１０４および１０５）を最初の２つのサンプルレーンにおいて泳動した。図４を参照のこと。両方のプラスミドからのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆの発現レベルはほぼ同じであった。次に、挿入されたオープンリーディングフレームを有する２つの完全な転写ユニットを有する２つのプラスミド（プラスミド２０２およびプラスミド２０３）はともにかなりの量のｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリタンパク質を産生した。ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆタンパク質の発現レベルは、プラスミド２０３についてはより少ないようであったが、このことは、発現しているポリタンパク質が非常に大きかった（ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ、約２２０ｋＤ）ためであると予想された。挿入された２つのオープンリーディングフレームと、オープンリーディングフレームを含まない１つの転写ユニットとを有した三転写ユニットプラスミド３０２は単一転写ユニットプラスミドとほぼ同じレベルのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆを産生した。図４を参照のこと。挿入された３つのオープンリーディングフレームを有した三転写ユニットプラスミド３０３もまた、かなりの量のｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリタンパク質を産生した。具体的には、三転写ユニットプラスミド３０３は単一転写ユニットプラスミド（１０４および１０５）よりも少ないｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆを産生し、二重転写ユニットプラスミド（２０２および２０３）から産生されたｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリタンパク質のレベルとほぼ等しいか、または、それよりも良好にｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆを産生した。図４を参照のこと。
【０１６８】
様々な単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドがＨＩＶのエンベロープ遺伝子を発現する能力を細胞溶解物において評価した。図５および表１を参照のこと。エンベロープタンパク質がマウス抗ｅｎｖモノクローナル抗体により検出された。分子量マーカーおよび組換えＨＩＶ  ｇｐ１２０を標準物として最初の２つのレーンにそれぞれ含めた。最初のサンプルレーンは、単一転写ユニットプラスミド１０１（これは、ｅｎｖをＨＣＭＶプロモーターから発現する）から発現したタンパク質を含有する。図５を参照のこと。かなりの量のエンベロープ糖タンパク質が発現した。次に、２つの挿入されたオープンリーディングフレームを有する２つの完全な転写ユニットを有する３つのプラスミド（プラスミド２０２、プラスミド２０３およびプラスミド２０４）はかなりの量のエンベロープ糖タンパク質を産生した。それぞれの場合において、エンベロープ遺伝子はＳＣＭＶプロモーターによって制御されていた。三転写ユニットプラスミド３０３もまた、かなりの量のｅｎｖ糖タンパク質を産生したが、発現レベルは、単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミド（１０１、２０２、２０３および２０４）と比較したとき、１／２〜１／３ほど低下していた。図５を参照のこと。
【０１６９】
（結論）
半定量的なインビトロ発現分析に基づいて、データは、ｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｎｔｖを含む、挿入されたＨＩＶ遺伝子のすべてが、３つの独立した転写ユニットを保持する三連プロモータープラスミドから著しいレベルで発現したことを示している。
【０１７０】
（実施例５：プラスミドあたり一定のＤＮＡ濃度での、多数のプラスミドを介するか、または、単一のプラスミドによる多数の遺伝子の発現）
次に、多数の遺伝子をコードする１つの三連転写ユニットプラスミドからの発現を、それぞれが１つの遺伝子を同じ遺伝子アレイから発現する多数のプラスミドからの発現と比較した。この場合、プラスミドあたりのＤＮＡを１μｇで一定に保った。それぞれの場合において、ＤＮＡの総量もまた、オープンリーディングフレームのインサートを有しないプラスミドＤＮＡを補充することによって４μｇで一定に保った。ＨＩＶ  ｇａｇの発現を、１μｇのそれぞれのプラスミドで一過的にトランスフェクションされた培養細胞を使用して評価し、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。図６に示されるように、ＨＩＶ  ｇａｇの発現が、レーン２（２つのプラスミド）、レーン３（１つのプラスミド）、レーン４（１つのプラスミド）およびレーン５（４つのプラスミド）において容易に検出された。ＨＩＶ  ｇａｇの発現がレーン１（３つのプラスミド）では低かった。再度ではあるが、三転写ユニットプラスミド３０３はかなりの量のｇａｇタンパク質を産生したが、２つ以上のプラスミドを含有する組合せよりも少なかった。
【０１７１】
１つのプラスミドまたは複数のプラスミドからのＨＩＶ  ｅｎｖの発現を評価した。結果を図７に示す。再度ではあるが、１μｇのそれぞれのプラスミドを培養細胞に一過的にトランスフェクションし、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。結果は、ＨＩＶ  ｅｎｖの発現が、レーン１（３つのプラスミド）、レーン２（２つのプラスミド）、レーン３（１つのプラスミド）、レーン４（１つのプラスミド）およびレーン５（４つのプラスミド）において容易に検出されたことを明らかにしている。それぞれの場合において、ＤＮＡの総量を、オープンリーディングフレームのインサートを有しないプラスミドＤＮＡを補充して、ＤＮＡの総量を４μｇにすることによって４μｇで一定に保った。再度ではあるが、三転写ユニットプラスミド３０３はかなりの量のｅｎｖ糖タンパク質を産生した。図７を参照のこと。この場合、１つの三転写ユニットプラスミド３０３は、４つのプラスミドが使用されたレーン５において産生された量と匹敵する量のｅｎｖ糖タンパク質を産生した。
【０１７２】
図８に示されるように、１つのプラスミドまたは複数のプラスミドからのＨＩＶ  ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆの発現を、培養細胞に一過的にトランスフェクションさせ、１μｇのそれぞれのプラスミドを使用して評価し、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。図８を参照のこと。結果は、ＨＩＶ  ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆの発現が、レーン１（３つのプラスミド）、レーン２（２つのプラスミド）、レーン３（１つのプラスミド）、レーン４（１つの三転写ユニットプラスミド）およびレーン５（４つのプラスミド）において検出されたことを明らかにしている。図８を参照のこと。ＤＮＡの総量を４μｇで一定に保った。三転写ユニットプラスミド３０３はかなりの量のｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆタンパク質を産生したが、２つのプラスミドを含有する組合せよりも少なかった。
【０１７３】
（結論）
図６、図７および図８に示されるように、三転写ユニットプラスミド（３０３）を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質、ｅｎｖタンパク質およびｎｔｖタンパク質をコードする３つのオープンリーディングフレームのすべてが、類似したレベルで同時に発現された。従って、このことから、このプラスミドの機能性が確認される。
【０１７４】
（実施例６：一定の総ＤＮＡ濃度での、２つのプラスミドを介するか、または、単一のプラスミドによる多数の遺伝子の発現）
ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆのＨＩＶ遺伝子の発現を、２μｇの濃度での三連転写ユニットプラスミドと、それぞれ１μｇのＤＮＡの２つのプラスミドの組合せとの間で比較した。総ＤＮＡ濃度を、図９、図１０、図１１および図１２に示されるように２μｇで一定に保った。
【０１７５】
図９は、ｐｏｌタンパク質の発現が、２つのプラスミドの組合せのいずれかからであっても、または、三連転写ユニットプラスミドからであっても類似していたことを示す。レーン２は、プラスミド２０１およびプラスミド２０２（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆおよびｅｎｖの完全なＨＩＶ遺伝子アレイを発現させるために構築された２つの二連転写ユニットプラスミド）の組合せから発現したｐｏｌタンパク質のウェスタンブロットを示す。次に、二連転写ユニットプラスミドおよび単一転写ユニットプラスミド（これらは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆを様々な構成で発現している）の２つの組合せからのｐｏｌタンパク質の発現を、ｐｏｌタンパク質のウェスタンブロットを使用して評価した。図９のレーン３（プラスミド２０４およびプラスミド１０４）およびレーン５（プラスミド３０２およびプラスミド１０１）を参照のこと。それぞれの場合において、検出可能なｐｏｌ発現が認められる。レーン４は、プラスミド２０３（これは、ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆおよびｅｎｖの完全なＨＩＶ遺伝子アレイを発現する二連転写ユニットプラスミドである）から発現したｐｏｌタンパク質のウェスタンブロットを含む。図９を参照のこと。レーン６は、プラスミド３０３（これは、実施例２および実施例３で記載されるように、ｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆの完全なＨＩＶ遺伝子アレイを発現する三連転写ユニットプラスミドの一例である）から発現したｐｏｌタンパク質のウェスタンブロットを含む。図９を参照のこと。
【０１７６】
図１０および図１１では、２つのプラスミドの組合せからのｇａｇおよびエンベロープのタンパク質発現と三連転写ユニットプラスミドからのタンパク質発現とを比較する。レーン２は、プラスミド２０１およびプラスミド２０２（これらは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆおよびｅｎｖの完全なＨＩＶ遺伝子アレイを発現するために構築された２つの二連転写ユニットプラスミドであった）の組合せから発現したｇａｇタンパク質およびｅｎｖタンパク質のウェスタンブロットを示す。次に、二連転写ユニットプラスミドおよび単一転写ユニットプラスミドの組合せからのｇａｇタンパク質およびｅｎｖタンパク質の発現を、ウェスタンブロットを使用して評価した。図１０および図１１を参照のこと：レーン３（プラスミド２０４およびプラスミド１０４）およびレーン５（プラスミド３０２およびプラスミド１０１）。プラスミド３０２は、２つの挿入されたオープンリーディングフレームのみを有するので、二転写ユニットプラスミドとして機能する三転写ユニットプラスミドである。表２を参照のこと。検出可能なｇａｇ発現およびｅｎｖ発現がそれぞれの場合に認められた。図１０を参照のこと。レーン４は、プラスミド２０３（これは、ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆおよびｅｎｖの完全なＨＩＶ遺伝子アレイを発現する二連転写ユニットプラスミドであった）から発現したｇａｇタンパク質およびｅｎｖタンパク質のウェスタンブロットを例示する。図１０および図１１を参照のこと。レーン６は、実施例２および実施例３で記載される三連転写ユニットプラスミド３０３から発現したｇａｇタンパク質およびｅｎｖタンパク質のウェスタンブロットを含む。図１０および図１１を参照のこと。三連転写ユニットプラスミド３０３からのｇａｇタンパク質およびｅｎｖタンパク質の発現は、プラスミドの組合せからのｇａｇタンパク質およびｅｎｖタンパク質の発現と匹敵していた。
【０１７７】
図１２では、様々なプラスミドの組合せからのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリタンパク質の発現と、三連転写ユニットプラスミドからのタンパク質発現とを、ウェスタンブロット検出を使用して比較する。レーン２は、プラスミド２０１およびプラスミド２０２（これらは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆおよびｅｎｖのＨＩＶ遺伝子を発現するように設計された２つの二連転写ユニットプラスミドであった）の組合せから発現したｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリタンパク質のウェスタンブロットを示す。レーン３およびレーン５は、ウェスタンブロットを使用して検出される、二連転写ユニットプラスミドおよび単一転写ユニットプラスミドの２つの異なる組合せからのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリタンパク質の発現を示す。図１２を参照のこと：レーン３（プラスミド２０４およびプラスミド１０４）およびレーン５（プラスミド３０２およびプラスミド１０１）。上記で議論されたように、プラスミド３０２は、２つの挿入されたオープンリーディングフレームのみを有するので、二転写ユニットプラスミドとして機能する三転写ユニットプラスミドである。表２を参照のこと。この場合、レーン５において見られるプラスミド３０２からのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆタンパク質の発現は、２０１および２０２のプラスミドの組合せ（レーン２）または２０４および１０４のプラスミドの組合せ（レーン３）よりも低いレベルであった。図１２を参照のこと。レーン４は、プラスミド２０３（これは、ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆおよびｅｎｖの完全なＨＩＶタンパク質アレイを発現する二連転写ユニットプラスミドであった）から発現したｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリタンパク質を示す。図１２を参照のこと。レーン６は、三連転写ユニットプラスミド３０３から発現したｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリタンパク質を示す。図１２を参照のこと。３０３からのｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆの発現はプラスミド３０２からのものよりも著しく多かった。特筆すべきことに、大型のｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆポリタンパク質を１つのプロモーターから発現し、かつ、ｅｎｖタンパク質をもう一方のプロモーターから発現する二転写ユニットプラスミド（２０３）からの発現は、３つの独立した転写ユニットからの同じ遺伝子をコードするプラスミド３０３からの発現よりもかなり低かった。
【０１７８】
まとめると、三連転写ユニットプラスミドを使用して、３つのオープンリーディングフレームをほぼ等しいレベルで同時に発現させることができ、かつ、全体的なレベルが、そのような遺伝子をコードする単一のプロモーター構築物および二連でのプロモーター構築物の両方と匹敵していた。このインビトロ発現データは、多数のＨＩＶ遺伝子が三重転写ユニットプラスミドから発現されるとき、著しいプロモーター干渉がないことを示す。従って、個々の転写ユニットがベクター内に適切に設置されている。
【０１７９】
（実施例７：総ＤＮＡ濃度を一定に保つことなく、多数のプラスミドを介するか、または、単一のプラスミドによる多数の遺伝子の発現）
多数の遺伝子をコードする１つの三連転写ユニットプラスミドからの発現を、同じ遺伝子アレイを発現する多数のプラスミドと比較した。この場合、プラスミドあたりのＤＮＡが１μｇで一定に保たれた。実施例５とは対照的に、ＤＮＡの総量は、ＤＮＡの総量を補うため、オープンリーディングフレームのインサートを有しないプラスミドＤＮＡにより補充しなかった。データを示さないが、下記にまとめる。
【０１８０】
本実施例では、ＨＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｎｔｖの発現を、１μｇのそれぞれのプラスミドで一過的にトランスフェクションした培養２９３細胞を使用して評価し、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。ＨＩＶ  ｇａｇの発現が、３つのプラスミド（１０１、１０４、３０１）、２つのプラスミド（２０１および２０２）、１つのプラスミド（２０３）、１つのプラスミド（３０３）、および、４つのプラスミド（１０１、１０２、１０３、１０４）との様々な組合せによるトランスフェクションから検出された。三転写ユニットプラスミド３０３は、より多くのプラスミドを必要とする組合せと比較したとき、かなりの量のｇａｇタンパク質を産生した。具体的には、三転写ユニットプラスミド３０３は、６個すべてのＨＩＶ遺伝子を有する二転写ユニットプラスミド２０３よりも多くのｇａｇタンパク質を産生し、そして６個すべてのＨＩＶ遺伝子を有する二転写ユニットプラスミドの２０１および２０２の組合せよりもわずかに少ないｇａｇタンパク質を産生した。ｇａｇが、ＳＣＭＶプロモーターによって駆動されるｇａｇ−ｐｏｌ融合体として発現された場合、３つのプラスミド（１０１、１０４、３０１）の組合せからのｇａｇの発現は乏しかった。
【０１８１】
単一のプラスミドまたは複数のプラスミドからのＨＩＶ  ｅｎｖの発現もまた評価した。結果は、ＨＩＶ  ｅｎｖの発現が、３つのプラスミド（３０１、１０１および１０４）、２つのプラスミド（２０１および２０２）、１つのプラスミド（２０３）、１つのプラスミド（３０３）、および、４つのプラスミド（１０１、１０２、１０３、１０４）による様々な組合せから容易に検出されたことを明らかにしている。ＤＮＡの総量は、使用されているプラスミドの数に依存し、プラスミドあたり１μｇのＤＮＡをトランスフェクションした。この場合、三転写ユニットプラスミド３０３は、あらゆる他のプラスミドまたはプラスミドの組合せよりも多くのｅｎｖタンパク質を産生した。
【０１８２】
単一のプラスミドまたは複数のプラスミドからのＨＩＶ  ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆの発現を、培養細胞に一過的にトランスフェクションさせた、１μｇのそれぞれのプラスミドを使用して評価し、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。ＨＩＶ  ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆの発現が、３つのプラスミド（３０１、１０１および１０４）、２つのプラスミド（２０１および２０２）、１つのプラスミド（２０３）、１つのプラスミド（３０３）、および、４つのプラスミド（１０１、１０２、１０３、１０４）による様々な組合せから検出された。三転写ユニットプラスミド３０３はかなりの量のｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆタンパク質を産生した。
【０１８３】
（結論）
高レベルの特定のタンパク質をｒｅｖ非依存的様式で発現する、多数のＨＩＶ遺伝子をコードする三連転写ユニットプラスミドを設計し、構築した。これにより、単一のプラスミド構築物により、３つの転写物が独立的かつ効率的に発現したことが確認された。本実施例では、三連転写ユニットプラスミドからのＨＩＶ遺伝子の発現を、単一転写ユニット構築物または二連転写ユニット構築物のいずれかからの同じ遺伝子の発現と比較した。データは、一発現カセットまたは二連発現カセットによって発現された遺伝子発現と比較したとき、三連転写ユニットプラスミドからの遺伝子発現の方が低かったことを示している。しかしながら、上記実施例では、ＨＣＭＶプロモーターに駆動される遺伝子発現がＳＣＭＶプロモーターよりも高く、ＨＳＶ−ｌａｐ１プロモーターがそれに続いたことが見出された。三連転写ユニット構築物におけるプロモーターの強さにおけるこの違いは、より低い免疫原性の抗原に対してより高い免疫原性の抗原を発現させるための遺伝子をプラスミドに配置するときには考慮しなければならない。
【０１８４】
（実施例８．１つ、２つまたは３つの完全な転写ユニットを含有するプラスミドベクターを用いたマウス免疫化研究）
マウス研究を、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆを含む６つのＨＩＶ−１遺伝子からタンパク質を発現する三転写ユニットプラスミドベクターの免疫原機能性を明らかにし、かつ、比較するために行った。具体的には、様々な１個、２個または３個のプラスミドＤＮＡに基づく免疫原組成物が、多重抗原特異的な細胞媒介性免疫応答をＢａｌｂ／ｃマウスにおいて誘発する、相対的な能力を比較した。
【０１８５】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、表３に概略されるように、１００μｇ総用量のＤＮＡにより皮下に免疫化した。すべての場合において、免疫原組成物を０．２５％ブピバカインにより処方し、大腿四頭筋に１００μｌの体積で注射した。２回目の免疫化の１０日後、動物を屠殺し、血清および脾臓を免疫アッセイのために単離した。免疫化マウスの血清を抗ｇａｇ特異的抗体力価および抗ｅｎｖ特異的抗体力価について分析した。脾臓を使用して、下記に記載されるようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞を測定した。
【０１８６】
（動物）
これらの研究のために、４週齢〜６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを使用した。マウスを、研究室動物の管理および使用のための指針（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９６）に従って飼育した。加えて、マウスの使用および管理のための手順はＷｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの施設内動物管理使用委員会によって承認された。
【０１８７】
（免疫原組成物および免疫化）
ＨＩＶのｅｎｖ  ｇｐ１６０、ｇａｇ  ｐ５５、ｐｏｌまたはｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合タンパク質をコードする様々なプラスミドＤＮＡ発現ベクターを実験用免疫原組成物として使用し、空の発現ベクターバックボーンをコントロールの免疫原組成物ベクターとして使用した。研究設計については下記の表３を参照のこと。様々な発現ベクターによるＨＩＶ遺伝子の発現を、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞の一過的トランスフェクションの後、ウェスタンブロットによって確認した。実施例４〜実施例７を参照のこと。
【０１８８】
これらの研究のために使用されたアジュバントもまた、ＤＮＡプラスミドによって送達した。本実施例では、すべての動物に、ＩＬ−１２を発現するプラスミド番号２１２の２５μｇを同時注射した。このアジュバントプラスミドは、マウスＩＬ−１２のｐ３５遺伝子およびｐ４０遺伝子をコードする二転写ユニット発現プラスミド（表１におけるプラスミド番号２１２）である。表１を参照のこと。ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットをＨＣＭＶ即時初期プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの制御下で発現させ、同時に、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットをサルＣＭＶプロモーター（ＳＣＭＶ）およびＢＧＨポリアデニル化シグナルの制御下で発現させた。ＲＤ細胞の一過的トランスフェクションの後、マウスＩＬ−１２の産生を、抗マウスＩＬ−１２ｐ７０捕獲ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用して細胞上清をスクリーニングすることによって確認した（データは示していない）。
表３．マウス研究設計−２回の免疫化
【０１８９】
【表３】
2010265313.tif 000017
免疫化用の発現プラスミドをＰｕｒｅｓｙｎ，Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）によって作製した。プラスミドを大腸菌において増殖させ、アルカリ溶解によって単離し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。このプラスミドを、ＤＮＡ：ブピバカイン複合体の形成を可能にするための促進因子として０．２５％のブピバカインを含有する等張性クエン酸塩緩衝液（２９．３ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．６７ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３４ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝６．４〜６．７）により２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で個別に処方した。すべての群について、アジュバントプラスミドを免疫原組成物の一部として抗原発現プラスミドと混合した。最終的なプラスミド調製物は、９０％を越えるスーパーコイル状プラスミドＤＮＡからなることが示され、残留エンドトキシンが３０ＥＵ／ｍｇＤＮＡ未満であることが示された（データは示していない）。免疫化直前に、免疫原組成物を、適切なプラスミド発現ベクター処方物を混合することによって調製した。得られた免疫原組成物を、１８ゲージのニードルおよび０．３ｍＬのシリンジを使用して両方の大腿四頭筋に筋肉内注射によって投与した（部位あたり０．０５ｃｃによる０．１ｃｃの総注射体積）。
【０１９０】
（マウスＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ＥＬＩＳＰＯＴ（またはＥｌｉｓａＳｐｏｔ、これは酵素結合免疫スポットアッセイの省略形である）は最初、抗体を分泌するＢ細胞を検出するための方法として開発された。この方法は現在、特定の抗原に対するＴ細胞の反応（通常、百万個あたりの活性化細胞の数として表される）を明らかにするために適合化されている。本実施例では、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を単一の細胞の活性化についての読み取りとして使用した。
【０１９１】
この分析では、ＥＬＩＳＰＯＴが、特定のＨＩＶ抗原を発現する免疫原組成物によって誘発される細胞傷害性Ｔ細胞の活性を明らかにするために役立った。ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴ応答を測定するために、マウスＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴキット（製品番号５５１０８３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、各ウエルにメンブランの底部を有する９６ウエルマイクロタイタープレートで行った。具体的には、９６ウエル平底ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）を、精製抗マウスγ−インターフェロン（ｍＩＦＮ−γ）モノクローナル抗体（製品番号５１−２５２５ＫＣ、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により１０ｍｃｇ／ｍＬの濃度で一晩被覆し、その後、プレートを滅菌した１×リン酸緩衝化生理食塩水（１×ＰＢＳ）により３回洗浄し、次いで、Ｒ１０完全培養培地（１０％の熱不活化（ＨＩ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００ｍｃｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍｃＭの非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ−１６４０）により２時間ブロッキング処理した。ますマウスの脾臓を、２枚の滅菌された顕微鏡用スライドガラスのすりガラス端の間で脾臓をすりつぶすことによって処理した。得られたホモジネートを１０ｍｌの不完全Ｒ０５培養培地（５％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００ｍｃｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍｃＭの非必須アミノ酸を補充したＲＰＭＩ１６４０培地）に再懸濁し、続いて脾臓細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離し、２ｍｃｇ／ｍＬのＣｏｎ−Ａ（Ｓｉｇｍａ）、または、ＨＩＶのｇａｇ  ｐ５５、ＨＩＶ−１  ６１０１  ｅｎｖ  ｇｐ１６０、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｉｆにわたるペプチドプール（１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒ体；各２．５ｍｃＭの最終ペプチド濃度）、または、培地単独のいずれかを含有する完全Ｒ１０培養培地で再懸濁した。投入細胞数はウエルあたり４×１０５個の脾臓細胞（１ｍＬあたり４×１０６個の脾臓細胞）であり、二連のウエルでアッセイした。脾臓細胞を３７℃で２２時間〜２４時間インキュベーションし、その後、まず脱イオン水で３回洗浄して、そして氷上での１０分間〜２０分間のインキュベーションによってＥＬＩＳＰＯＴプレートから除いた。その後、プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳにより６回洗浄した。その後、プレートを、Ｒ１０で希釈した抗マウスＩＦＮ−γビオチン化検出抗体（５．０ｍｃｇ／ｍｌ、製品番号５１−１８１８ＫＺ、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理し、４℃で一晩インキュベーションした。その後、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳにより１０回洗浄し、Ｒ１０で１：１００希釈した１００ｍｃＬ／ウエルのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（カタログ番号５１−９０００２０９、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理し、室温でさらに１時間インキュベーションした。結合していないストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を、プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳにより６回、次いで、１×ＰＢＳにより３回すすぎ洗いすることによって除いた。次に、ペルオキシダーゼ基質を、ＡＥＣ基質溶液中の２０ｍｃＬ／ｍＬのＡＥＣ発色原（カタログ番号５５１９５１、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を希釈することによって調製した。発色を、１００ｍｃＬ／ウエルの基質溶液を３分間〜５分間加えることによって開始させた。最後に、プレートを水によりすすぎ洗いし、風乾した。結果を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートの１個のウエルを写真撮影するＥＬＩＳＰＯＴアナライザーまたは画像化装置を使用して測定し、スポットを数えた。この場合、生じたスポットを、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒ（ＣＴＬ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を使用して計数した。ペプチド特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答は、応答（−培地バックグランド）が培地応答の３倍以上であり、かつ、１０６個の脾臓細胞あたりの、インターフェロン−γを分泌するスポット形成細胞（＃ＳＦＣ／１０６脾臓細胞）が５０個以上であったならば、陽性であると見なした。
【０１９２】
表４に示されるように、多プラスミドＤＮＡ免疫化後のマウスにおける個々のＨＩＶ−１抗原応答および全体的なＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を、表３に示されるプラスミドから構成された免疫原組成物による２回の免疫化の後で測定した。
表４．２回の免疫化の後でのマウス免疫応答
【０１９３】
【表４】
2010265313.tif 000018
＊抗原特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答が、１０６個の脾臓細胞あたりの、インターフェロン−γを分泌するスポット形成細胞（＃ＳＦＣ／１０６脾臓細胞）として報告された。
【０１９４】
＃ｎｔｖ、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合タンパク質
すべての場合において、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ特異的な応答は比較的低かった。ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆがｌａｐ１プロモーターの制御下にある群１マウスでは最も低かった。しかしながら、上記の実施例４〜実施例７では、ＨＣＭＶプロモーターに駆動される遺伝子発現がＳＣＭＶプロモーターの場合よりも大きく、ＳＣＭＶプロモーターに駆動される遺伝子発現がＨＳＶ−ｌａｐ１プロモーターの場合よりも大きいことが見出されていた。三連プロモーター構築物において利用されているプロモーターの強さのこの違いが、この構築物が免疫原組成物において使用されたときに観測された、誘発された免疫応答がより低いことの原因であると考えられる。
【０１９５】
融合タンパク質の使用に関して、３ａおよび３ｃにおいてＨＩＶ  ｐｏｌに対するＥＬＩＳＰＯＴ応答を比較すると、単一のポリペプチドではなく、融合ポリペプチドを使用したときには免疫原性がある程度低下しているようである。
【０１９６】
別の検討事項は、調べられているタンパク質の相対的な免疫原性である。例えば、（ＨＣＭＶプロモーターに駆動される遺伝子発現により、単一の転写ユニットを含有する単一のプラスミドにおけるその遺伝子のそれぞれ（ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ）が作動する場合）３ｂを３ｃに対して調べることによって、おおまかにはｅｎｖ＞ｐｏｌ＞ｇａｇ＞ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆである免疫原性の序列が依然として存在する。上記で議論されたように、プロモーターの強さおよび相対的な免疫原性はともに、個々のプラスミドの設計、および、免疫原組成物で使用されるプラスミドの組合せにおいて考慮しなければならない。
【０１９７】
次に、別の研究を、１つ、２つおよび３つのプラスミド免疫原組成物を使用する３回の免疫化のときの免疫応答に対する影響を評価するために行った。表５を参照のこと。６匹のマウスからなる群を、３週間間隔で２回ではなく、３週間間隔で３回免疫化したことを除いて、上記で記載されたように免疫化した。表５を参照のこと。群１、群２ｅおよび群３ａでは、表３の場合と同じ免疫原組成物を用いる。加えて、３回の免疫化を使用するこの研究では、新しいプラスミド（これは３０１と称される）を構築し、ｇａｇ／ｐｏｌ融合タンパク質のＨＣＭＶプロモーターに駆動される遺伝子発現とｇａｇ／ｐｏｌ融合タンパク質のＳＣＭＶプロモーターに駆動される遺伝子発現とを直接比較した。表５および表６における群３ａおよび群４ｂを比較のこと。このプラスミドはまた、三連転写ユニットプラスミドから発現されているｇａｇ−ｐｏｌ融合体の潜在的な免疫原能力を、類似するプロモーターにより駆動される３つの単一転写ユニットプラスミドから発現されているｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子およびｅｎｖ遺伝子と比較することを可能にした。表５および表６における群１および群４ｂを比較のこと。脾臓組織を最後の追加抗原投与の１７日後に集め、個々のＨＩＶタンパク質に対する抗原特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答について分析した。
表５．マウス研究設計−３回の免疫化
【０１９８】
【表５】
2010265313.tif 000019
１群１、群２ｅおよび群３ａでは、３回の免疫化が行われたことを除いて、表３の場合と同じ免疫原組成物が用いられる。
【０１９９】
三転写ユニットプラスミドから誘発された全体的な細胞性免疫応答は、単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミドを含有する免疫原組成物によって誘発された細胞性免疫応答とほぼ同じであったか、または、それらよりも大きかった。表６を参照のこと。
表６．マウスの細胞性免疫応答−３回の免疫化
【０２００】
【表６】
2010265313.tif 000020
＊抗原特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答が＃ＳＦＣ／１０６脾臓細胞として報告された。
＃ｎｔｖ、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合タンパク質
免疫原組成物による３回の免疫化後のＥＬＩＳＰＯＴ結果は、三転写ユニットプラスミドに基づく免疫原組成物による３回の免疫化の後におけるＨＩＶ細胞性免疫応答が３回目の免疫化の後で１００％増大したことを示した。しかしながら、応答のバランスは、関与したプロモーターの強さ、および、抗原の相対的な免疫原性に依存して、依然として変化し得る。明らかではあるが、製造上の利点が必要であるいくつかの状況では、三連転写ユニットプラスミドは、３つ以上の遺伝子を免疫原組成物により投与するための良好なビヒクルである。
【０２０１】
免疫原組成物によりこれまでに調べられたすべてのプラスミド設計体は、その抗原を正しく発現し、かつ、免疫原性であり、細胞性免疫応答を３回の免疫化の後で活性化していることが見出されている。しかしながら、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆに特異的な応答は、三連転写ユニットプラスミドにおいてＨＳＶ  Ｌａｐ１プロモーターの制御下に置かれたときには検出することができなかった。
【０２０２】
いくつかの状況のもとでは、様々な抗原に対する広範囲で、かつ、バランスの取れた細胞性免疫応答を誘発する免疫原組成物が好ましい。この場合、表３および表４に示されるような２つおよび３つのｐＤＮＡ免疫原組成物の設計（２ｄ、３ａおよび３ｃ）が、強力（＞６００ＳＦＣ／１０６細胞）、かつ、バランスの取れたＨＩＶ特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答を誘発することができるようであり、これらを非ヒト霊長類でのさらなる試験のために選択した。実施例９を参照のこと。
【０２０３】
（実施例９．１つまたは２つの完全な転写ユニットを含有するプラスミドベクターを用いたマカク免疫化研究）
実施例８の表３および表４において、３つのｐＤＮＡ免疫原組成物、特に、群２ｄ、群３ａおよび群３ｃで使用された免疫原組成物は、６個すべてのＨＩＶタンパク質に対する強力（＞６００ＳＦＣ／１０６細胞）、かつ、バランスの取れたＨＩＶ特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答を誘発することができるようであった。これらを非ヒト霊長類でのさらなる試験のために選択した。
【０２０４】
（実験設計）
この研究のために、合計で３０頭のＭａｍｕ−Ａ＊０１陰性の、自家繁殖させたオスのインド産アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）を使用した。マカクをＮｅｗ  Ｉｂｅｒｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ  Ｉｂｅｒｉａ、ＬＡ）に収容し、研究室動物の管理および使用に関する指針（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９６）に従って飼育した。加えて、マカクの使用および管理に関する手順はＷｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの施設内動物管理使用委員会によって承認された。
【０２０５】
（免疫化）
免疫化用の発現プラスミドをＰｕｒｅｓｙｎ，Ｉｎｃ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）によって作製した。プラスミドを大腸菌により増殖させ、アルカリ溶解によって細胞から単離し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。その後、プラスミドを個々に、ＤＮＡ：ブピバカイン複合体の形成を可能にするために０．２５％のブピバカインを含有する等張性クエン酸塩緩衝液（２９．３ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．６７ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３４ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝６．４〜６．７）により２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で処方した。最終的なプラスミド調製物は、９０％を越えるスーパーコイル状プラスミドＤＮＡからなることが示され、残留エンドトキシンは３０ＥＵ／ｍｇＤＮＡ未満であることが示された（データは示していない）。
【０２０６】
このアカゲザル研究のために使用されたアジュバントは、免疫原組成物の一部として送達されたＤＮＡプラスミドであった。このアジュバントプラスミドは、アカゲザルのＩＬ−１２のｐ３５遺伝子およびｐ４０遺伝子をコードする二転写ユニット発現プラスミドである（表１におけるプラスミド番号２１２）。表７を参照のこと。ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットをＨＣＭＶ即時初期プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの制御下で発現させ、同時に、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットをサルＣＭＶプロモーター（ＳＣＭＶ）およびＢＧＨポリアデニル化シグナルの制御下で発現させた。プラスミド発現によるアカゲザルＩＬ−１２の生物活性を、一過的にトランスフェクションしたＲＤ細胞由来の上清が、アカゲザルの休止末梢血リンパ球（ＰＢＬ）にＩＦＮ−γ分泌を誘導する能力についてアッセイすることによって確認した（データは示していない）。
表７．マカク研究設計
【０２０７】
【表７】
2010265313.tif 000021
１すべての群に、アカゲザルのＩＬ−１２（ｒＩＬ−１２）をコードするプラスミド番号２１２（ＨＣＭＶ−ＩＬ−１２ｐ３５、ＳＣＭＶ−ＩＬ−１２ｐ４０）の１．５ｍｇをアジュバントとして与えた。
【０２０８】
２別の一群３ｃが含められ、この群では、エレクトロポレーションが投与プロトコルに加えられた。
【０２０９】
３さらなる群（４ａ）が、示された４つのベクターワクチン設計の免疫原性を明らかにするために後日、このマカク研究に加えられた。
【０２１０】
すべてのマカクを０週間、４週間および８週間のスケジュールで免疫化した。免疫化直前に、適切なプラスミド発現ベクター処方物を、免疫原組成物を作製するために混合し、１８ゲージのニードルおよび３ｍＬのシリンジを使用した両方の三角筋および両方の大腿四頭筋への筋肉内注射（１ｍＬの注射体積、部位あたり２．５ｍｇのＤＮＡ）によって投与した（群２ｄ、群３ａ、群３ｃおよびコントロール）。
【０２１１】
群３ｃＥのマカクは、標準的な１ｍＬのシリンジを使用し、２１ゲージのニードル（Ｂｒａｕｎ）を８．０ｍｍ離して配置して両方の三角筋および両方の大腿四頭筋への筋肉内注射を行い、その直後、電気刺激（すなわち、エレクトロポレーション）を行うことによって、ｐＤＮＡにより免疫化された。注射体積は０．２ｍｌであり、これにより、合計で２ｍｇの総ＤＮＡのための部位あたり、注射あたり０．５ｍｇのプラスミドＤＮＡが与えられた。従って、エレクトロポレーション群（３ｃＥ）には、それ以外の群に投与された総ＤＮＡの１／５を与えた。
【０２１２】
本実施例において、エレクトロポレーション条件は下記の通りであった：２５０ｍＡかつ約１００Ｖ／ｃｍでの６回の２０ｍｓ単極性パルス。各パルスの間には２５０ｍｓの中断があった。
【０２１３】
エレクトロポレーションがない場合、表８に示される結果は、単一の転写ユニットを有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物（群３ａ）が、２つ以上の転写ユニットを有する少なくとも１つのプラスミドを含有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物と比較した場合、１０週間後または１６週間後、最も大きい全体的な細胞性免疫応答を生じさせたことを示した。３ａを２ｄおよび３ｃと比較のこと。
表８．多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での経時的な全体的なＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答
【０２１４】
【表８】
2010265313.tif 000022
＊全体的なＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告される。
【０２１５】
１ｎｄ、測定されず
驚くべき結果は、エレクトロポレーションにより、全体的な細胞性免疫応答が１０週で４５０％より高く増大し、１６週で９９０％より高く増大したことであった。３ｃＥを３ｃと比較のこと。表８に示される結果は、２つ以上の転写ユニットを有する少なくとも１つのプラスミドを含有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物が、エレクトロポレーションと組み合わされたとき、単一の転写ユニットを有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物と比較して、最大の全体的な細胞性免疫応答を１０週間後または１６週間後に生じさせていたことを示していた。群３ｃおよび群３ａを比較のこと。
【０２１６】
このマカク研究において、エレクトロポレーションの使用を除いた場合、群３ａは、１０週または１６週での最大の全体的なＨＩＶ抗原特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答を発達させていた（１，６５２ＳＦＣ／１０６細胞および１０１５ＳＦＣ／１０６細胞）。この応答は群２ｄ（７７０ＳＦＣ／１０６細胞）または群３ｃ（７８７ＳＦＣ／１０６細胞）に対して統計学的に異なっていなかった。表８を参照のこと。しかしながら、最大のＥＬＩＳＰＯＴ応答がエレクトロポレーションの使用により達成された。表８において群３ｃＥを参照のこと。
【０２１７】
興味深いことに、エレクトロポレーションを使用した追加抗原投与免疫化の後におけるピーク免疫応答は非エレクトロポレーション群の場合よりも後であった。例えば、群３ａの動物についての全体的なＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔ応答は、第４週の免疫化または追加抗原投与の後の第６週前後でピークに達した。表８を参照のこと。対照的に、エレクトロポレーション群については、ピークは第１０週により近かった。表８を参照のこと。
【０２１８】
細胞性免疫応答を、６個のＨＩＶタンパク質に対するＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答としてさらに分析した。表９は、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質、ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質、および、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆタンパク質の融合タンパク質に対するＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。このマカク研究において、再度ではあるが、エレクトロポレーションの使用を除いた場合、群３ａは、ｅｎｖおよびｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆに対する１０週での最大のＨＩＶ抗原特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答を発達させた。表９を参照のこと。群３ｃの動物はｇａｇに対する最大のＥＬＩＳＰＯＴ応答を発達させ、群２ｄはｐｏｌタンパク質に対する最大のＥＬＩＳＰＯＴ応答を発達させた。表９において３ａを２ｄおよび３ｃと比較のこと。今までにないほどの最大のＥＬＩＳＰＯＴ応答がエレクトロポレーションの使用により達成された。表９において群３ｃＥを参照のこと。
表９．多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での第１０週における個々のＨＩＶ抗原特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答
【０２１９】
【表９】
2010265313.tif 000023
＊個々のＨＩＶ抗原特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告される。
【０２２０】
１群２ｄに対して統計学的により大きいｅｎｖ特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答（ｐ＜０．０５）。
【０２２１】
２群３ａに対して統計学的により大きいｇａｇ特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答（ｐ＜０．０５）。
【０２２２】
３群３ｃに対して統計学的により大きいｎｔｖ特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答（ｐ＜０．０５）。
【０２２３】
表１０は、第１６週（最後の免疫化の８週間後）での、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質、ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質、および、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆタンパク質の融合タンパク質に対するＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。エレクトロポレーションの使用を除いた場合、群３ａは、ｅｎｖおよびｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆに対する１６週での最大のＨＩＶ抗原特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答を発達させ、一方で、群３ｃの動物はｇａｇおよびｐｏｌに対する１０週での最大のＨＩＶ抗原特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答を発達させた。最大のＥＬＩＳＰＯＴ応答がエレクトロポレーションの使用により達成された。表１０において群３ｃＥを参照のこと。
【０２２４】
表９および表１０は、抗原発現プラスミドの数を免疫原組成物中で３から４へ増やすことにより、これらＨＩＶタンパク質のすべてに対する免疫応答が低下したことを示している。表９および表１０を参照のこと。
【０２２５】
表９および表１０はまた、免疫原組成物中に２つの抗原発現プラスミド（この場合、一方のプラスミドが２つの転写ユニットを有する）を含む群２ｄのプラスミドが、これらＨＩＶタンパク質のすべてに対する最も広く、かつ、最もバランスの取れた免疫応答を誘発したことを示す。表９および表１０を参照のこと。
表１０．多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での第１６週における個々のＨＩＶ抗原特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答
【０２２６】
【表１０】
2010265313.tif 000024
＊個々のＨＩＶ抗原特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告される。
【０２２７】
１ｎｄ、測定されず
表１１は、３０週（最後の免疫化の２２週間後）での、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質、ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質、および、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆタンパク質の融合タンパク質に対するＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。このマカク研究において、再度ではあるが、エレクトロポレーションの使用を除いた場合、群３ａは、ｅｎｖ、ｐｏｌおよびｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆに対する最大のＨＩＶ抗原特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答を発達させた。表１１を参照のこと。群３ｃの動物はｇａｇに対する最大のＥＬＩＳＰＯＴ応答を発達させた。表１１において３ａを２ｄおよび３ｃと比較のこと。最大のＥＬＩＳＰＯＴ応答がエレクトロポレーションの使用により達成された。表１１において群３ｃＥを参照のこと。
【０２２８】
マウス研究およびマカク研究の両方において、抗原特異的なＥＬＩＳＰＯＴ応答は一般に、ＨＣＭＶプロモーターの制御下でそれぞれの個々の遺伝子を単独で受け入れている群において最も大きかった。マカク研究では、エレクトロポレーションが、免疫応答を生じさせることにおいて、免疫原組成物が、２つの完全な転写ユニットに対して、１つの完全な転写ユニットを有するプラスミドを含有するかどうかよりも、または、融合タンパク質が使用されたかどうかよりも重要な要因であった。
表１１．多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での第３０週における個々のＨＩＶ抗原特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答
【０２２９】
【表１１】
2010265313.tif 000025
＊個々のＨＩＶ抗原特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告された。
【０２３０】
１測定されず
個々のＨＩＶタンパク質に対する経時的な細胞性免疫応答
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を、表７に記載されるプラスミドによる免疫化の後、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆの個々のＨＩＶタンパク質に対して、第２週、第４週、第６週、第８週、第１０週および第１６週で測定した。結果を表１２〜表１７に示す。
表１２：多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での経時的なＨＩＶ  ｅｎｖ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答
【０２３１】
【表１２】
2010265313.tif 000026
＊ＨＩＶ  ｅｎｖ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告された。
【０２３２】
１ｎｄ、測定されず
表１３：多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での経時的なＨＩＶ  ｇａｇ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答
【０２３３】
【表１３】
2010265313.tif 000027
＊ＨＩＶ  ｇａｇ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告される。
【０２３４】
１ｎｄ、測定されず
表１４：多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での経時的なＨＩＶ  ｐｏｌ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答
【０２３５】
【表１４】
2010265313.tif 000028
＊ＨＩＶ  ｐｏｌ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告される。
【０２３６】
１ｎｄ、測定されず
表１５：多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での経時的なＨＩＶ  ｎｅｆ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答
【０２３７】
【表１５】
2010265313.tif 000029
＊ＨＩＶ  ｎｅｆ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告される。
【０２３８】
１ｎｄ、測定されず
表１６：多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での経時的なＨＩＶ  ｔａｔ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答
【０２３９】
【表１６】
2010265313.tif 000030
＊ＨＩＶ  ｔａｔ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告される。
【０２４０】
１ｎｄ、測定されず
表１７：多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での経時的なＨＩＶ  ｖｉｆ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答
【０２４１】
【表１７】
2010265313.tif 000031
＊ＨＩＶ  ｖｉｆ特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６ＰＢＬ±標準誤差として報告される。
【０２４２】
１ｎｄ、測定されず
表１２〜表１７は、個々のタンパク質に対する免疫応答を経時的に示しており、抗原発現プラスミドの数を免疫原組成物中で３から４へ増やすことにより、投与されたＤＮＡのこの所定の濃度では、これらＨＩＶタンパク質のすべてに対する免疫応答の低下がもたらされたことを示している。表１２〜表１７を参照のこと。
【０２４３】
（実施例１０：ＨＩＶ特異的ＣＴＬおよびヘルパー細胞の割合の推定）
ＨＩＶ特異的ＣＴＬおよびヘルパー細胞の相対的な量を、全体的なＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答を、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞の未分画の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をまず枯渇化させ、その後第１０週および第１６週で測定することによって推定した。
【０２４４】
（ビーズ枯渇化ＰＢＬの調製）
ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞を、抗ヒトＣＤ４特異的マウスモノクローナル抗体または抗ヒトＣＤ８特異的マウスモノクローナル抗体で被覆された磁性ポリスチレンビーズを製造者の説明書（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）に従って使用して未分画ＰＢＬから枯渇させた。簡単に記載すると、新しく単離されたアカゲザルＰＢＬを洗浄し、２％のＦＢＳを含有する氷冷した１×ＰＢＳにより２×１０６細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。抗ヒトＣＤ４特異的マウスモノクローナル抗体または抗ＣＤ８特異的マウスモノクローナル抗体のいずれかで被覆されたＤｙｎａｌミクロビーズを、２％のＦＣＳを含有する１×ＰＢＳにより３回洗浄し、その後、未分画ＰＢＬに５：１のビーズ対細胞の比率で加え、回転／傾斜装置において４℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ビーズ／細胞懸濁物を磁性カラムに入れ、ＣＤ４＋細胞枯渇化ＰＢＬまたはＣＤ８＋細胞枯渇化ＰＢＬのいずれかを含有する貫流したもの（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を集めた。細胞を、５％のＦＢＳが補充された完全培養培地により１回洗浄し、５％のＦＢＳを補充した完全培養培地により元の体積に再懸濁した。等体積の未分画のビーズ枯渇化ＰＢＬをＥＬＩＳｐｏｔアッセイでそのまま使用した。
【０２４５】
続いて、ＣＤ４＋細胞サブセット枯渇化およびＣＤ８＋細胞サブセット枯渇化の効率、ならびに、ＥＬＩＳｐｏｔプレートに加えられたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の正確な数をフローサイトメトリーによって定量化した。簡単に記載すると、ビーズ枯渇化ＰＢＬを、２％のＦＢＳを含有する１×ＰＢＳにより１回洗浄し、下記のモノクローナル抗体により室温で１５分間染色した：抗アカゲザルＣＤ３−フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ、クローンＳＰ３４；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）；抗ヒトＣＤ４−フィコエリトリン（ＰＥ、クローンＭ−Ｔ４７７；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）；抗ヒトＣＤ８−ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ；クローンＳＫ１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）；および抗ヒトＣＤ２０−アロフィコシアニン（ＡＰＣ、クローンＬ２７；ＢＤ
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。その後、細胞を、２％のＦＢＳおよび０．０２％のアジ化物を含有する１×ＰＢＳにより１回洗浄し、１％のパラホルムアルデヒドを含有する１×ＰＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳ分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ
Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを使用して分析した。ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞の枯渇化率は通常、９５％を越えていた（データは示していない）。
表１８：未分画のＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞を枯渇させたＰＢＬにおける第１０週および第１６週での全体的なＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答
【０２４６】
【表１８】
2010265313.tif 000032
＊全体的なＨＩＶ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が平均＃ＳＦＣ／１０６未分画のＣＤ４＋枯渇化ＰＢＬまたはＣＤ８＋枯渇化ＰＢＬ±標準誤差として報告される。
【０２４７】
１ｎｄ、測定されず
表１８に示される結果は、特定の誘発された免疫応答に関与するＨＩＶ特異的ＣＴＬ細胞対ヘルパー細胞の相対的な百分率の推定を示す。２、３の一般的な観察をデータから引き出すことができる。第１に、群２ｄ、群３ａおよび群３ｃは、ＨＩＶに対する同様な強度の細胞性免疫応答を誘発している。群３ａはより高レベルの免疫応答を誘発するようであり、しかし、アッセイにおける変動量もまた、その群に関してはより大きい。エレクトロポレーションを免疫化と組み合わせて使用した場合、群３ｃにおけるプラスミドに対する免疫応答の強度が約５倍〜約１０倍高まった。表１８を参照し、３ｃＥおよび３ｃを比較のこと。より多くの細胞が、エレクトロポレーションを免疫化とともに使用したことの結果として免疫応答に関係していたこともまた注目に値する。
【０２４８】
（実施例１１：多プラスミド免疫化により誘発されるＨＩＶ特異的な抗体力価）
プラスミドＤＮＡを含有する免疫原組成物（ＩＣ）は、現在使用中の免疫原組成物技術の他のタイプを上回る利点をいくつか提供する。例えば、ＤＮＡに基づくＩＣは、タンパク質に基づく従来のサブユニットＩＣとは対照的に、コードされた抗原が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原プロセシング経路によって効率的にプロセシングおよび提示されることを可能にする。クラスＩ抗原プロセシング経路は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される免疫応答の誘発のために非常に重要である。しかしながら、タンパク質に基づく従来のサブユニットＩＣは、典型的には、抗原特異的な抗体応答を誘発するその能力に関して、ＤＮＡに基づくＩＣよりも効率がよい。
【０２４９】
ＨＩＶウイルス溶解物に特異的な抗体力価を測定するために、ＥＬＩＳＡプレートを、界面活性剤により破壊されたＨＩＶ−１ＭＮにより２０ｎｇ／ウエルで、４℃で１８時間被覆した（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）。界面活性剤により破壊されたＨＩＶ−１ＭＩＮを炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で希釈した。ＨＩＶのｅｎｖに特異的な抗体の力価を測定するために、ＥＬＩＳＡプレートを、１×ＰＢＳに希釈された精製ＨＩＶ−１  ６１０１  ｇｐ１２０（これはＬａｒｒｙ  Ｌｉａｏ（Ｄｕｋｅ大学）によって譲渡された；２０ｎｇ／ウエル）により被覆した。ＨＩＶタンパク質との１８時間のインキュベーションの後、ＥＬＩＳＡプレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳにより５回洗浄し、その後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０および３％のＢＳＡを含有する１×ＰＢＳにより室温で２時間ブロッキング処理した。免疫化動物およびコントロール動物から得られた血清サンプルを、１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳで希釈し、１：１００の開始希釈度でＥＬＩＳＡプレートに加え、プレート上でさらに３倍希釈した。希釈された血清サンプルをタンパク質被覆プレートとともに４℃で一晩インキュベーションした。抗原特異的な免疫グロブリンの検出を、霊長類ＩｇＧに対して特異的なビオチン結合体化一次抗体を室温で２時間インキュベーションすることによって達成した。この抗体は、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、１％のＢＳＡが補充された１×ＰＢＳにより１：３０，０００希釈された（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）。次いで、一次抗体を洗い流し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ビオチン二次抗体（５００ユニット／ｍｌのストック液（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、１％のＢＳＡが補充された１×ＰＢＳで１：１０，０００希釈される）、Ｒｏｃｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の１時間の室温でのインキュベーションを続けた。最後に、１００ｍｃＬ／ウエルのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）の添加によって発色させた。抗原特異的な抗体力価を、同じ動物の未投薬血清（すなわち、第０週）＋３標準偏差よりも大きいＯ．Ｄ．４５０を与える最終血清希釈度の逆数として定義した。
【０２５０】
多プラスミドＤＮＡ免疫化の最初の１６週間での特定の時点についてのＨＩＶエンベロープ力価を決定し、表１９に示す。ＨＩＶ−１  ６１０６のｅｎｖ  ｇｐ１２０のＥＬＩＳＡ力価を、同じ動物の未投薬血清（すなわち、第０週）＋３標準偏差よりも大きいＯ．Ｄ．４５０を与える最終血清希釈度の逆数として計算した。表１９（ならびに下記の表２０）におけるデータを平均ｌｏｇ１０力価±平均の標準誤差として示された。この場合、２．００以下のＨＩＶ−１のｅｎｖ力価は１：１００未満のエンドポイント（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）力価を表しており、これは検出限界未満であった。
表１９：多プラスミドＤＮＡ免疫化の後での経時的なＨＩＶ−１  ６１０６のｅｎｖ  ｇｐ１２０特異的なＥＬＩＳＡ抗体力価
【０２５１】
【表１９】
2010265313.tif 000033
＊データが平均ｌｏｇ１０力価±平均の標準誤差として報告された。２．００以下のＨＩＶ−１のｅｎｖ力価は１：１００未満のエンドポイント力価を表し、これは検出限界未満であった。
【０２５２】
１ｎｄは、測定されなかったことを示す。
【０２５３】
表１９に示されるように、２つ以上の転写ユニットを有する少なくとも１つのプラスミドを含有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物により免疫化された群３ｃの動物は第１６週で最大の非エレクトポレーション力価を達成した。しかしながら、群２ｄおよび群３ａについての結果はある程度類似していたが、群３ａの動物は第８週および第１０週で最大の力価を示した。表１９を参照し、３ａを２ｄおよび３ｃと比較のこと。２つ以上の転写ユニットを有する少なくとも１つのプラスミドを含有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物により免疫化され、かつ、エレクトポレーション−電気刺激を免疫化とともに受けた動物は、ＨＩＶエンベロープタンパク質に対するこれまでにない最大の力価を発達させた。表１９を参照し、３ｃを３ｃＥと比較のこと。
【０２５４】
ウイルス溶解物全体に対する総ＨＩＶ力価を、多プラスミドＤＮＡ免疫化の第２週、第４週、第６週、第８週、第１０週および第１６週について測定した。その総ＨＩＶ力価を表２０に示す。ＨＩＶ−１ＭＮウイルス溶解物に特異的なＥＬＩＳＡ力価を、同じマカクの未投薬血清（すなわち、免疫前）＋３標準偏差よりも大きいＯ．Ｄ．４５０を与える最終血清希釈度の逆数として決定した。この表において、データは平均ｌｏｇ１０力価±平均の標準誤差として報告された。１．７０以下の抗体力価は１：５０未満のエンドポイント力価を表し、これは検出限界未満であったことには留意すること。第１６週での表２０における結果は、表１９に示された結果と類似していた。
表２０：多プラスミドＤＮＡワクチン接種の後での経時的かつ全体的なＨＩＶ−１特異的ＥＬＩＳＡ抗体力価
【０２５５】
【表２０】
2010265313.tif 000034
＊データが平均ｌｏｇ１０力価±平均の標準誤差として報告された。１．７０以下の抗体力価は１：５０未満のエンドポイント力価を表し、これは検出限界未満であった。
【０２５６】
１ｎｄは、測定されなかったことを示す。
【０２５７】
（実施例１２：マカクにおける様々な血清学的パラメーターおよび体重に対する多プラスミド免疫化の影響）
研究で使用されたマカクにおける末梢血白血球数（ＷＢＣ）を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均ＷＢＣ（×１０００／ｍｌ）±標準誤差として報告した。表２１を参照のこと。
表２１：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおける総ＷＢＣ数（×１０００）
【０２５８】
【表２１】
2010265313.tif 000035
＊完全血球計数分析によって測定された末梢血白血球数（ＷＢＣ）が平均ＷＢＣ（×１０００／ｍｌ）±標準誤差として報告される。
【０２５９】
１ｎｄ、測定されず
研究で使用された動物における末梢血赤血球数（ＲＢＣ）を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均ＲＢＣ（×１０６／ｍｌ）±標準誤差として報告した。表２２を参照のこと。
【０２６０】
研究で使用された動物における末梢血ヘモグロビンレベル（ｇ／ｄＬ）を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均ヘモグロビンレベル±標準誤差として報告した。表２３を参照のこと。
【０２６１】
表７に記載されるプラスミドおよび免疫原組成物による多プラスミド免疫化は、この研究で使用された動物において、ＷＢＣ、ＲＢＣおよびヘモグロビンレベルに対する有害な影響を何ら生じさせなかった。表２１〜表２３を参照のこと。１つの明確なポジティブな効果が、群３ｃＥを免疫化するために使用された免疫原組成物とともにエレクトロポレーションを使用したときに検出された。この群では、ＷＢＣの数が研究期間中を通して著しく上昇していた。表２１を参照のこと。
表２２：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおける総ＲＢＣ数（×１０６）
【０２６２】
【表２２】
2010265313.tif 000036
＊末梢血赤血球数（ＲＢＣ）が完全血球計数分析によって経時的に測定され、平均ＲＢＣ（×１０６／ｍｌ）±標準誤差として報告された。
表２３：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおける総ヘモグロビンレベル
【０２６３】
【表２３】
2010265313.tif 000037
＊完全血球計数分析によって測定された末梢血ヘモグロビンレベル（ｇ／ｄＬ）が平均ヘモグロビンレベル±標準誤差として報告される。
【０２６４】
１ｎｄ、測定されず
この研究で使用された動物において測定される末梢血血小板レベルを完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均血小板レベル（×１０００）±標準誤差として報告した。表２４を参照のこと。
【０２６５】
この研究で使用された動物におけるパーセントヘマトクリットレベルを完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均パーセントヘマトクリットレベル±標準誤差として報告した。表２５を参照のこと。
【０２６６】
この研究で使用された動物において測定される末梢血総リンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総リンパ球数±標準誤差として報告した。表２６を参照のこと。
【０２６７】
この研究で使用された動物における末梢血総ＣＤ３＋Ｔリンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総ＣＤ３＋Ｔリンパ球数±標準誤差として報告した。表２７を参照のこと。
【０２６８】
この研究で使用された動物における末梢血総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔｈリンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔｈリンパ球数±標準誤差として報告した。表２８を参照のこと。
【０２６９】
この研究で使用された動物における末梢血総ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球数±標準誤差として報告した。表２９を参照のこと。
【０２７０】
この研究で使用された動物における末梢血総ＣＤ２０＋リンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総ＣＤ２０＋リンパ球数±標準誤差として報告した。表３０を参照のこと。
表２４：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおける総血小板数（×１０００）
【０２７１】
【表２４】
2010265313.tif 000038
＊完全血球計数分析によって測定された末梢血血小板レベルが平均血小板レベル（×１０００）±標準誤差として報告される。
【０２７２】
１ｎｄ、測定されず
表２５：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおけるパーセントヘマトクリット
【０２７３】
【表２５】
2010265313.tif 000039
＊完全血球計数分析によって測定されたパーセントヘマトクリットレベルが平均パーセントヘマトクリットレベル±標準誤差として報告される。
【０２７４】
１ｎｄ、測定されず
表２６：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおける総リンパ球数
【０２７５】
【表２６】
2010265313.tif 000040
＊完全血球計数分析によって測定された末梢血総リンパ球数が平均総リンパ球数±標準誤差として報告される。
【０２７６】
１ｎｄ、測定されず
表２７：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおける総ＣＤ３＋Ｔリンパ球数
【０２７７】
【表２７】
2010265313.tif 000041
＊末梢血
表２８：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおける総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔｈリンパ球数
【０２７８】
【表２８】
2010265313.tif 000042
＊完全血球計数分析によって測定された末梢血総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔｈリンパ球数が平均総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔｈリンパ球数±標準誤差として報告される。
表２９：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおける総ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球数
【０２７９】
【表２９】
2010265313.tif 000043
＊完全血球計数分析によって測定された末梢血総ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球数が平均総ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球数±標準誤差として報告される。
【０２８０】
１ｎｄ、測定されず
表３０：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用での多プラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクにおける総ＣＤ２０＋リンパ球数
【０２８１】
【表３０】
2010265313.tif 000044
＊完全血球計数分析によって測定された末梢血総ＣＤ２０＋リンパ球数が平均総ＣＤ２０＋リンパ球数±標準誤差として報告される。
【０２８２】
１ｎｄ、測定されず
表７に記載されるプラスミドおよび免疫原組成物による多プラスミド免疫化はまた、この研究で使用された動物において、血小板数（表２４）、パーセントヘマトクリット（表２５）、総リンパ球数（表２６）、総ＣＤ３＋Ｔリンパ球数（表２７）、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔｈリンパ球数（表２８）、総ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球数（表２９）および総ＣＤ２０＋Ｔリンパ球数（表３０）に対する有害な影響を何ら生じさせなかった。再度ではあるが、これらの分析において、総リンパ球数（表２６）、総ＣＤ３＋Ｔリンパ球数（表２７）、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔｈリンパ球数（表２８）、総ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球数（表２９）に対するポジティブな効果が、群３ｃＥを免疫化するためにブピバカイン処方免疫原組成物と組み合わせてエレクトロポレーションを使用したときに検出された。この群において、これらのカテゴリーのそれぞれにおけるリンパ球の数が研究期間中の様々な時点で著しく上昇していた。
【０２８３】
この研究で使用された動物の体重を毎週モニターした。体重（ｋｇ）を平均体重±標準誤差として報告した。表３１を参照のこと。
表３１：エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用での多プラスミドＤＮＡワクチンにより免疫化されたマカクの体重（ｋｇ）
【０２８４】
【表３１】
2010265313.tif 000045
＊体重（ｋｇ）が平均体重±標準誤差として報告される。
【０２８５】
１ｎｄ、測定されず
最後に、この分析は、表７に記載されるプラスミドおよび免疫原組成物による多プラスミド免疫化がまた、この研究で使用された動物の体重（表３１）に対する有害な影響を何ら生じさせなかったことを示している。
【０２８６】
（実施例１３：単一の転写ユニットをそれぞれ有する４つのプラスミドを含む免疫原組成物を使用するマウス免疫化研究）
前記実施例は、全体的な免疫応答を最大限にしなければならない状況では、プラスミドあたり１つの抗原を発現する単一の転写ユニットを有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物を使用することが好都合であり得ることを示唆している。本実施例では、マウス免疫化研究を、４つのプラスミドに基づく免疫原組成物の免疫原機能性と３つのプラスミドに基づく免疫原組成物のそれとを比較するために行った。より具体的には、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、および、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ遺伝子の融合体のみを含む６個のＨＩＶ−１遺伝子の発現を誘導する４つの個々のプラスミドに基づく免疫原組成物の免疫原機能性を、ｅｎｖ遺伝子、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の融合体、および、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ遺伝子の第２の融合体を含む６個のＨＩＶ−１遺伝子の発現を行わせる３つの個々のプラスミドに基づく免疫原組成物と比較した。免疫原機能性を、多重抗原特異的な細胞媒介性免疫応答をＢａｌｂ／ｃマウスにおいて誘発する様々な３つおよび４つのプラスミドＤＮＡに基づく免疫原組成物の相対的な能力として評価した。ＨＩＶ遺伝子および配列を実施例１に記載した。群３ａおよび群３ｃからの３つのプラスミド免疫原組成物は実施例８および実施例９に記載されるものと同じであった。表１および表３２を参照のこと。
【０２８７】
（免疫原組成物および免疫化）
ＨＩＶのｅｎｖ  ｇｐ１６０、ｇａｇ  ｐ５５、ｐｏｌ（もしくはｇａｇ−ｐｏｌ融合体）またはｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ発現ベクターを実験用免疫原組成物として使用し、空の発現ベクターバックボーンをコントロールの免疫原組成物ベクターとして使用した。研究設計については下記の表３２を参照のこと。様々な発現ベクターによるＨＩＶ遺伝子の発現を、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞の一過的トランスフェクションの後、ウェスタンブロットによって確認した。実施例４〜実施例７を参照のこと。
【０２８８】
群３ａは、プラスミドあたり単一の転写ユニットをそれぞれが有する３つのプラスミドを有するが、抗原の２つが融合タンパク質（ｇａｇ−ｐｏｌおよびｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ）である。群３ｃもまた３つのプラスミドを有するが、これらのプラスミドのうちの２つが単一の転写ユニットを有し、第３のプラスミドが２つの完全な転写ユニットを有する。表３２を参照のこと。抗原の１つのみが融合タンパク質として発現される（ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ）。群４ａは、単一転写ユニットプラスミドである４つのプラスミドをそれぞれ有するが、これらの抗原のうちの１つのみが融合タンパク質（ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ）であった。
【０２８９】
これらの研究のために使用されたアジュバントもまた、ＤＮＡプラスミドによって送達された。本実施例では、すべての動物が、マウスＩＬ−１２のｐ３５遺伝子およびｐ４０遺伝子をコードし、マウスＩＬ−１２を発現するプラスミド番号２１２の２５μｇにより同時注入された。表１を参照のこと。
【０２９０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、表３２に概略されるように１００μｇの総用量のＤＮＡにより筋肉内に免疫化した。すべての場合において、免疫原組成物を０．２５％ブピバカインと処方し、大腿四頭筋に１００μｌの体積で注射した。２回目の免疫化の１０日後、動物を屠殺し、血清および脾臓を免疫アッセイのために単離した。脾臓を使用して、抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞を、下記に記載されるようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定した。
【０２９１】
（動物）
これらの研究のために、４週齢〜６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを使用した。マウスを研究室動物の管理および使用に関する指針（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９６）に従って飼育した。加えて、マウスの使用および管理についての手順はＷｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｃｈの施設内動物管理使用委員会によって承認された。
表３２．マウス研究設計−２回の免疫化
【０２９２】
【表３２】
2010265313.tif 000046
１群３ａおよび群３ｃでは、表３と同じ免疫原組成物を用いる。
【０２９３】
表３３に示されるデータは、免疫原組成物中の抗原発現プラスミドの数を３から４へ増やすことにより、ＨＩＶタンパク質に対する免疫応答に劇的な増大は何ら生じなかったことを示している。表３３を参照のこと。
表３３．２回の免疫化の後におけるマウス免疫応答
【０２９４】
【表３３】
2010265313.tif 000047
＊抗原特異的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答が、１０６個の脾臓細胞あたりの、インターフェロン−γを分泌するスポット形成細胞（＃ＳＦＣ／１０６脾臓細胞）として報告される。
【０２９５】
＃ｎｔｖ、ｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ融合タンパク質
本明細書中で引用されるすべての文書は参考として援用される。方法および構成要素における様々な改変および小さな変更が当業者には明らかであると考えられる。
【図１】
2010265313.tif 000048
【図２】
2010265313.tif 000049
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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