(57)【要約】      （修正有）【課題】ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者の同定する方法を提供する。【解決手段】ヒト被験者においてビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップであって、前記一塩基多型がワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられ、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワルファリンに対する増加した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、前
記被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップであって、前
記一塩基多型がワルファリンに対する増加した感受性と相関させられ、それによりワルフ
ァリンに対する増加した感受性を有する前記被験者を同定するステップを含む方法。
【請求項２】
前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型が、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチ
ド２５８１でのＧ→Ｃ変換である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ワルファリンに対する増加した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、
ａ）前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する増加した感受性
と相関させるステップと、および
ｂ）前記被験者においてステップ（ａ）の前記一塩基多型を検出するステップであって
、それによりワルファリンに対する増加した感受性を有する被験者を同定するステップと
、を含む方法。
【請求項４】
ワルファリンに対する増加した感受性と相関させられた前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基
多型の存在を同定する方法であって、
ａ）ワルファリンに対する増加した感受性を有する被験者を同定するステップと、
ｂ）前記被験者における前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップ
と、および
ｃ）ステップ（ｂ）の前記一塩基多型の存在を前記被験者におけるワルファリンに対す
る増加した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリンに対する増加
した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定するステップと、を含
む方法。
【請求項５】
被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する増加した感受性
と相関させる方法であって、
ａ）ワルファリンに対する増加した感受性を有する被験者を同定するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の被験者の前記ＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するステ
ップと、
ｃ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列を前記ＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配
列と比較するステップと、
ｄ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出するステップと、および
ｅ）ステップ（ｄ）の一塩基多型をステップ（ａ）の被験者におけるワルファリンに対
する増加した感受性と相関させるステップと、を含む方法。
【請求項６】
ワルファリンに対する減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、前
記被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップであって、前
記一塩基多型がワルファリンに対する減少した感受性と相関させられ、それによりワルフ
ァリンに対する減少した感受性を有する被験者を同定するステップを含む方法。
【請求項７】
前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型が、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチ
ド３２９４でのＴ→Ｃ変換である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型が、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチ
ド４７６９でのＧ→Ａ変換である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ワルファリンに対する減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、
ａ）前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する減少した感受性
と相関させるステップと、および
ｂ）前記被験者においてステップ（ａ）の前記一塩基多型を検出するステップであって
、それによりワルファリンに対する減少した感受性を有する被験者を同定するステップと
、を含む方法。
【請求項１０】
ワルファリンに対する減少した感受性と相関させられた前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基
多型の存在を同定する方法であって、
ａ）ワルファリンに対する減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、
ｂ）前記被験者におけるＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップと、
および
ｃ）ステップ（ｂ）の前記一塩基多型の存在を前記被験者におけるワルファリンに対す
る減少した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリンに対する減少
した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定するステップと、を含
む方法。
【請求項１１】
被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型をワルファリンに対する減少した感受性と相関
させる方法であって、
ａ）ワルファリンに対する減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の被験者の前記ＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するステ
ップと、
ｃ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列を前記ＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配
列と比較するステップと、
ｄ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出するステップと、および
ｅ）ステップ（ｄ）の一塩基多型をステップ（ａ）の被験者におけるワルファリンに対
する減少した感受性と相関させるステップと、を含む方法。
【請求項１２】
ビタミンＫ依存性タンパク質を作製する方法において
ａ）ビタミンＫの存在下でビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を発現し、そ
してビタミンＫ依存性タンパク質を産生する宿主細胞を培養するステップと、および
ｂ）前記培養から前記ビタミンＫ依存性タンパク質を採取するステップであって、前記
宿主細胞がビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードするヘテロ接合型核酸を含有して
、発現するステップと、を含み、
前記宿主細胞として、ビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）をコードするヘテロ
接合型核酸をさらに含有して、発現する宿主細胞を使用することを含む、改善を含む方法
。
【請求項１３】
前記ビタミンＫ依存性タンパク質が、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテイ
ンＣ、プロテインＳ、およびプロトロンビンからなる群から選択される、請求項１２に記
載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が植物細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼがウシビタミンＫ依存性カルボキシラーゼであ
る、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権についての陳述］
本発明は、米国特許法第１１９条ｅ項に基づいて、その内容全体が参照して本明細書に
組み込まれる、２００３年９月２３日に提出された米国仮特許出願第６０／５０５，５２
７号の利益を主張する。
【０００２】
［政府の支援］
本発明は、一部には、米国立衛生研究所からの補助金第５Ｐ０１  ＨＬ０６３５０−４
２号および第５−Ｒ０１  ＨＬ４８３１８の支援を受けて実施された。米国政府は、本発
明に所定の権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、単離核酸、該単離核酸を含有する宿主細胞、およびその使用方法、ならびに
ビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）の同定およ
びそれらとワルファリンに対する感受性との相関に向けられる方法および組成物に関する
。
【背景技術】
【０００４】
極めて多数のタンパク質が機能するには、複数のグルタミン酸残基がγ−カルボキシグ
ルタミン酸へ修飾されることが必要である。これらの中で最もよく知られているのは、ビ
タミンＫ依存性（ＶＫＤ）凝固タンパク質、第ＩＸ因子（クリスマス因子）、第ＶＩＩ因
子、およびプロトロンビンである。マトリックスＧｌａタンパク質の遺伝子のノックアウ
トはマウスの動脈の石灰化を生じさせるという観察（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）
「Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｅｒｉｅｓ  ａ
ｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ＧＬＡ  
ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：７８−８１）は、凝固以外の機能を備えるタン
パク質にとってのビタミンＫサイクルの重要性を強調している。さらに、機能が知られて
いないＧａｓ６およびその他のＧｌａタンパク質は神経組織内で発現し、子宮内でのワル
ファリン曝露は精神遅延および顔面奇形を生じさせる。これは、Ｇｌａ修飾を行う酵素で
あるＶＫＤカルボキシラーゼの発現が、初期胚形成期中には神経系での高発現を伴う組織
特異的方法で時間的に調節されるという観察と一致している。カルボキシル化に付随して
、反応の補基質である還元ビタミンＫは、ビタミンＫエポキシドへ転換させられる。ヒト
の食品に含まれるビタミンＫの量は限られるので、ビタミンＫエポキシドは、その欠乏を
防止するためにビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）によってビタミンＫへ再転換
されなければならない。最も広範囲に使用されている抗凝固薬であるワルファリンはＶＫ
ＯＲを標的としており、ビタミンＫの再生を妨害する。その結果、還元ビタミンＫの濃度
が減少し、これによりγ−グルタミルカルボキシラーゼによるカルボキシル化の速度を減
少させ、低カルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質を産生させる。
【０００５】
ワルファリンは、米合衆国だけでも毎年１００万人を上回る患者に処方されており、そ
してオランダでは、人口のおよそ２％が長期ワルファリン療法を受けていると報告されて
いる。抗凝固の治療レベルに必要とされるワルファリンの用量は患者によって大きく異な
るので、ワルファリンの利用には重大な副作用のリスクが付随する。例えば、ワルファリ
ン療法の開始後には患者の１〜２％において重大な出血症状が発生し、患者の０．１〜０
．７％において死亡が発生した、と報告されている。これらの危険性にもかかわらず、ワ
ルファリンの使用は誘発性出血症状１例につき２０例の発作を防止できると推定されてお
り、おそらく誘発性出血に対するおそれがあるために十分には活用されていない。
【０００６】
本発明は、被験者における一塩基多型をワルファリンに対する増加もしくは減少した感
受性と相関させるための方法および組成物を提供し、それによって被験者にとってリスク
が減少した治療用量および維持用量をより正確かつ迅速に決定することを可能にすること
によって、当分野における以前の短所を克服する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同
定する方法であって、前記被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出す
るステップであって、前記一塩基多型がワルファリンに対する増加もしくは減少した感受
性と相関させられ、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有す
る被験者を同定するステップを含む方法を提供する。
【０００８】
さらに、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同定
する方法であって、ａ）ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する増
加もしくは減少した感受性と相関させるステップと、及びｂ）前記被験者においてステッ
プ（ａ）の前記一塩基多型を検出するステップであって、それによりワルファリンに対す
る増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、を含む方法が提供
される。
【０００９】
また別の実施形態では、本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性
と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定する方法であって、
ａ）ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステ
ップと、
ｂ）前記被験者におけるＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップと、
および
ｃ）ステップ（ｂ）の前記一塩基多型の存在を前記被験者におけるワルファリンに対す
る増加もしくは減少した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリン
に対する増加もしくは減少した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を
同定するステップと、を含む方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型をワルファリンに対する増
加もしくは減少した感受性と相関させる方法であって、ａ）ワルファリンに対する増加も
しくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、ｂ）ステップ（ａ）の被験
者の前記ＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）
のヌクレオチド配列を前記ＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較するステップ
と、ｄ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出するステップと、およ
びｅ）ステップ（ｄ）の一塩基多型をステップ（ａ）の被験者におけるワルファリンに対
する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップと、を含む方法を提供する。
【００１１】
本発明のまた別の態様は、ビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）、特に哺乳動物
（例、ヒト、ヒツジ、ウシ、サルなど）ＶＫＯＲをコードする単離核酸である。例には、
（ａ）例えば配列番号８もしくは配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する単離核酸
などの、本明細書に開示した核酸と、（ｂ）上記の（ａ）の単離核酸もしくはその補体へ
（例えば、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする、および／または上記の（
ａ）の核酸との実質的な配列同一性を有する（例えば、上記の（ａ）の核酸と８０、８５
、９０、９５もしくは９９％同一性である）、およびＶＫＯＲをコードする核酸と、なら
びに（ｃ）遺伝コードの縮重のため上記の（ａ）もしくは（ｂ）の核酸と異なるが、上記
の（ａ）もしくは（ｂ）の核酸によってコードされるＶＫＯＲをコードする核酸と、が含
まれる。
【００１２】
本明細書で使用する用語「ストリンジェント」は、ハイブリダイゼーション方法の必需
品を規定するために当分野において一般に理解されているハイブリダイゼーション条件に
関する。ストリンジェンシー条件は、それらの用語は当分野において一般に知られており
、当業者には明確に認識されているので、低、高、中であってよい。本明細書に提供する
ようなヌクレオチド配列へ同種ヌクレオチド配列がハイブリダイズするのを許容する高ス
トリンジェンシー条件は、当分野において周知である。１つの例として、そのような配列
の本明細書に開示した核酸分子へのハイブリダイゼーションは、約６０％相同性の配列の
ハイブリダイゼーションを可能にするために、４２℃での２５％ホルムアミド、５×ＳＳ
Ｃ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および５％硫酸デキストラン中で実施することができ、そ
の後には４２℃での２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳの洗浄条件
を用いる。また別の例は、約４５℃での６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳのハイブリダイゼ
ーション条件、続いて５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件を
含む。ストリンジェントな条件の別の例は、標準ハイブリダイゼーションアッセイを用い
て６０〜７０℃での０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％  
ＳＤＳの洗浄ストリンジェンシーによって表される（その内容が全体として参照して本明
細書に組み込まれる、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＤＳ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９）を参照されたい）。様々な実施形態に
おいて、ストリンジェントな条件は、例えば、高度にストリンジェントな（すなわち、高
ストリンジェンシー）条件（例えば、６５℃での０．５Ｍ  ＮａＨＰ０4、７％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリ
ダイゼーション）および／または中程度にストリンジェントな（すなわち中ストリンジェ
ンシー）条件（例えば、４２℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中での洗浄）を含む
ことができる。
【００１３】
本発明の追加の態様は、異種プロモーターと連結している本明細書に記載のビタミンＫ
エポキシド還元酵素をコードする核酸を含む組換え核酸である。
【００１４】
本発明のまた別の態様は、上述の組換え核酸を含有して、発現する細胞である。適切な
細胞には、植物、動物、哺乳動物、昆虫、酵母および細菌細胞が含まれる。
【００１５】
本発明のまた別の態様は、本明細書に記載のＶＫＯＲをコードする単離核酸へハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
本発明のまた別の態様は、本明細書に記載の核酸によってコードされる単離かつ精製さ
れたＶＫＯＲ（例、均質に精製されたＶＫＯＲ）である。例えば、本発明のＶＫＯＲは配
列番号１０に記載のアミノ酸配列を含んでよい。
【００１７】
本発明のまた別の態様は、ビタミンＫ依存性タンパク質を作製する方法であって、ビタ
ミンＫの存在下でビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を発現してビタミンＫ依
存性タンパク質を産生する宿主細胞を培養するステップと、および次に前記ビタミンＫ依
存性タンパク質を前記培養から採取するステップと、を含み、前記宿主細胞がビタミンＫ
依存性カルボキシラーゼをコードする異種核酸を含有して、発現し、そして前記宿主細胞
がさらにビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）をコードする異種核酸を含有して、
発現し、本明細書に記載のＶＫＯＲを産生する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ａ〜ＤはＳＮＰであるｖｋ２５８１、ｖｋ３２９４およびｖｋ４７６９に対する野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型被験者におけるワルファリン用量の比較、ならびにＰ４５０  ２Ｙ９に対する野生型およびヘテロ接合型被験者におけるワルファリン用量の比較を示した図である。
【図２】１３個のｓｉＲＮＡプールの各々について、Ａ５４９細胞を含有する３個のＴ７フラスコをトランスフェクトし、７２時間後にＶＫＯＲ活性を決定した。ＶＫＯＲアッセイには２５μＭのビタミンＫエポキシドを使用した。遺伝子ｇｉ：１３１２４７６９に対して特異的な１つのｓｉＲＮＡプールは、８回の繰返し実験においてＶＫＯＲ活性を６４％〜７０％減少させた。
【図３】Ａ５４９細胞中でのｇｉ：１３１２４７６９に対して特異的なｓｉＲＮＡプールによるＶＫＯＲ活性の阻害の時間経過を示した図である。この期間中にＶＫＯＲ活性は持続的に減少したが、そのｍＲＮＡのレベルは正常値の約２０％へ急速に減少した。このアッセイには２５μＭのビタミンＫエポキシドを使用した。ｓｉＲＮＡはＶＫＤカルボキシラーゼの活性またはＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ  ｍＲＮＡのレベルに影響を及ぼさなかった。
【図４】ＶＫＯＲ活性は、ｍＧＣ＿１１２７６がＳｆ９昆虫細胞内で発現した時点に検出された。このアッセイでは、約１×１０6ｃｅｌｌｓを使用した。反応は、バッファーＤ中で３０分間にわたり３０℃で３２μＭ  ＫＯを用いて実施した。ブランクのＳｆ９細胞が陰性コントロールとして、そしてＡ５４９細胞が標準として機能した。
【図５】ワルファリンによるＶＫＯＲの阻害。反応は、バッファーＤ中で１５分間にわたり３０℃で、ＶＫＯＲ＿Ｓｆ９細胞、６０μＭ  ＫＯから作製された１．６ｍｇのミクロソームタンパク質、および様々な濃度のワルファリンを用いて実施した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書で使用する「１つの」または「その」は１つまたは２つ以上を意味することが
ある。例えば、「１つの」細胞は、単一の細胞または複数の細胞を意味することがある。
【００２０】
以下では、本発明をより詳細に説明する。この説明は、本発明を実行できる全ての様々
な方法、あるいは本発明に付け加えることのできる全ての特徴についての詳細な目録であ
ることは意図していない。例えば、１つの実施形態に関して例示する特徴は、他の実施形
態に組み込むことができ、そして特定の実施形態に関して例示する特徴は、その実施形態
から削除することもできる。さらに、本開示に照らせば、当業者には、本明細書に提案し
た様々な実施形態への数多くの変形および追加は本発明から逸脱せずに明白であろう。そ
こで、以下の明細書は、本発明の一部の特定の実施形態を例示することを意図しており、
全ての順列、組み合わせおよび変形を排他的に規定することは意図していない。
【００２１】
本明細書に添付の「配列リスト」は、本明細書に完全に記載されているかのように本明
細書の一部を形成する。
【００２２】
本発明は、本開示に基づいて、そしてそれらの開示が本明細書に完全に記載されている
かのようにその全体が参照して本明細書に組み込まれるＳｔａｆｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｗｕ
への米国特許第５，２６８，２７５号およびＳｔａｆｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇへの
米国特許第６，５３１，２９８号に記載されているものを含むがそれらに限定されない、
当分野において既知の方法、構成成分、および特徴を利用して実施されてよい。
【００２３】
本明細書で使用する「核酸」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例、化学的に合成さ
れた）ＤＮＡならびにＲＮＡおよびＤＮＡのキメラを含むＲＮＡおよびＤＮＡの両方を包
含している。核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖の場合は、核酸は
センス鎖またはアンチセンス鎖であってよい。核酸は、オリゴヌクレオチドアナログもし
くは誘導体（例、イノシンもしくはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成され
てよい。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば変化した塩基対合能力またはヌクレア
ーゼに対する増加した耐性を有する核酸を調製するために使用できる。
【００２４】
「単離核酸」は、それが由来する有機体の天然型ゲノム内ではそれと隣接している（一
本は５’末端上そして一本は３’末端上）コーディング配列のどちらとも隣接していない
ＤＮＡまたはＲＮＡである。そこで、１つの実施形態では、単離核酸は、前記コーディン
グ配列に隣接する５’非コーディング（例、プロモーター）配列の一部および全部を含む
。このためこの用語は、例えば、ベクター内、自己複製プラスミドもしくはウイルス内、
または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれる、または他の配列とは
独立して個別分子（例、ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生するｃ
ＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを含む。これは
、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも
さらに含む。
【００２５】
用語「単離（した）」は、実質的に細胞性物質、ウイルス性物質、もしくは培養培地（
組換えＤＮＡ技術によって生成した場合）、または化学的前駆物質もしくは他の化学薬品
（化学合成した場合）を含んでいない核酸もしくはポリペプチドを意味することがある。
さらに、「単離核酸フラグメント」は、フラグメントとして自然には発生しない、そして
自然状態では見いだされないであろう核酸フラグメントである。
【００２６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、例えばＰＣＲ増幅におけるプライマーとして、または
ハイブリダイゼーションアッセイもしくはマイクロアレイにおけるプローブとして使用で
きる、少なくとも約６ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、例えば約１５から３０ヌ
クレオチド、もしくは約１５から３０ヌクレオチドの核酸配列を意味する。オリゴヌクレ
オチドは、天然もしくは合成、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは修飾主鎖などであってよ
い。
【００２７】
特定のヌクレオチド配列が標準ヌクレオチド配列との特定の同一性（％）を有すると言
われる場合は、同一性（％）は標準ヌクレオチド配列に比較されている。例えば、１００
塩基長である標準ヌクレオチド配列と５０％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは
９９％同一であるヌクレオチド配列は、前記標準ヌクレオチド配列の５０、７５、８５、
９０、９５もしくは９９ヌクレオチド配列と完全に同一である５０、７５、８５、９０、
９５もしくは９９塩基を有することがある。ヌクレオチド配列は、さらにその全長にわた
り標準ヌクレオチド配列と５０％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一
である１００塩基長ヌクレオチド配列であることもある。当然ながら、同一基準を同様に
満たすであろう他のヌクレオチド配列も存在する。
【００２８】
ＶＫＯＲヌクレオチド配列と「実質的に同一」である核酸配列は、配列番号８もしくは
９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一
である。核酸を比較するために、標準核酸配列の長さは、一般に少なくとも４０ヌクレオ
チド、例えば少なくとも６０ヌクレオチド以上であろう。配列同一性は、配列解析ソフト
ウエア（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（１７１０  Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、５３７０５  ウィスコンシン州マディソン）遺伝学コンピ
ュータグループの配列解析ソフトウエアパッケージ）を用いて測定できる。
【００２９】
当分野において既知のように、核酸もしくはアミノ酸が既知の配列との配列同一性もし
くは類似性を有するかどうかを同定するために多数の様々なプログラムを使用することが
できる。配列同一性もしくは類似性は、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａ
ｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄ
ｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配
列同一性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４（１９８８）の類似性方法について
の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ（ウィスコンシン州マディソン）に
おけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、好ましくはデフォ
ルト設定を用いてＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２
，３８７−３９５（１９８４）によって記載されたＢｅｓｔ  Ｆｉｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ
プログラムまたは検査を含むがそれらに限定されない当分野において既知の標準技術を用
いて決定することができる。
【００３０】
有用なアルゴリズムの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進歩的なペアワイズ
アライメントを用いて１群の関連する配列から複数の配列アライメントを作製する。ＰＩ
ＬＥＵＰはさらに、アライメントを作製するために使用されるクラスタリング関係を示し
ている系統樹をプロットできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５，３５１−３６０（１９８７）の革新的なアライメント方法
の単純化を使用する；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５
，１５１−１５３（１９８９）によって記載された方法に類似している。
【００３１】
有用なアルゴリズムのまた別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，５８７３−５７８７（１９９３
）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６
，４６０−４８０（１９９６）から入手されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、好ましくはデフォルト値へ設定されている数個の検索パラメー
タを使用する。これらのパラメータは動的数値であり、特定配列の構成およびそれに対し
て当該配列が検索されている特定データベースの構成に依存してプログラム自体によって
確立される；しかし、数値は感受性を増加させるために調整することができる。追加の有
用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒ
ｅｓ．２５，３３８９−３４０２によって報告されたようなｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴで
ある。
【００３２】
配列類似性を決定するためには、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムもまた使用できる。このア
ルゴリズムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７；Ｈ
ｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐ
ｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８
１−９０；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５；お
よびＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３
０７−３３１によって記載されている。
【００３３】
さらに、本明細書に開示した核酸より多いもしくは少ないヌクレオチドを含有する配列
については、１つの実施形態では、配列同一性（％）は、ヌクレオチド塩基の総数に関連
付けて同一ヌクレオチドの数に基づいて決定されることは理解されている。そこで、例え
ば本明細書に詳細に開示した配列より短い配列の配列同一性は、１つの実施形態では、短
い配列におけるヌクレオチド塩基の数を用いて決定されるであろう。同一性（％）の計算
においては、相対荷重は、例えば挿入、欠失、置換などの様々な配列変化の発現には割り
当てられない。
【００３４】
本発明のＶＫＯＲポリペプチドには、組換えポリペプチド、合成ペプチドおよび天然ポ
リペプチドが含まれるが、それらに限定されない。本発明は、さらにまたその中で天然型
アミノ酸配列が変化もしくは欠失しているＶＫＯＲポリペプチドの形態をコードする核酸
配列を包含している。好ましい核酸は、正常な生理的条件下で可溶性であるポリペプチド
をコードする。さらに本発明には、ＶＫＯＲの全部もしくは一部分が非関連性ポリペプチ
ド（例、マーカーポリペプチドもしくは融合パートナー）へ融合して融合タンパク質を作
製する融合タンパク質をコードする核酸が含まれる。例えば、ポリペプチドは細菌で発現
されたポリペプチドの精製を促進するためのヘキサヒスチジンタグへ、または真核細胞中
で発現したポリペプチドの精製を促進するためのヘマグルチニンタグへ、またはアフィニ
ティクロマトグラフィーもしくは免役沈降法によるポリペプチドの精製を促進するための
ＨＰＣ４タグへ融合させることができる。本発明は、第１部分および第２部分を含む単離
ポリペプチド（およびこれらのポリペプチドをコードする核酸）もさらに含み、第１部分
は、例えばＶＫＯＲポリペプチドの全部もしくは一部分を含み、そして第２部分は、例え
ば検出可能なマーカーを含む。
【００３５】
融合パートナーは、例えば、分泌を促進するポリペプチド、例えば分泌配列であってよ
い。そのような融合ポリペプチドは、一般的にプレタンパク質と呼ばれる。分泌配列は、
細胞によって切断されて成熟タンパク質を形成することができる。さらに、不活性プレタ
ンパク質を産生するためにポリペプチド配列へ融合されたＶＫＯＲをコードする核酸が含
まれる。プレタンパク質は、不活性化配列の除去によってタンパク質の活性形へ変換する
ことができる。
【００３６】
本発明は、さらに例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（本明細書に
規定したとおり）下で配列番号１〜６、８もしくは９のヌクレオチド配列の全部もしくは
一部分またはそれらの補体へハイブリダイズする核酸も含む。特定の実施形態では、ハイ
ブリダイズしている核酸のハイブリダイズしている部分は、一般的に長さが少なくとも１
５（例えば、２０、３０、もしくは５０）ヌクレオチドである。ハイブリダイズしている
核酸のハイブリダイズしている部分は、ＶＫＯＲポリペプチドをコードする核酸の一部分
もしくは全部の配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％も
しくは１００％同一である。本明細書に記載のタイプのハイブリダイズしている核酸は、
例えばクローニングプローブ、プライマー（例、ＰＣＲプライマー）、または診断用プロ
ーブとして使用できる。本発明には、例えば本明細書に記載の、そして当分野において既
知のような活性アッセイにおいて決定されるように、ＶＫＯＲの機能を阻害する低分子干
渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および／またはアンチセンスＲＮＡもまた含まれる。
【００３７】
また別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸を含有する細胞、例えば形質転換細胞
を特徴とする。「形質転換細胞」は、ＶＫＯＲポリペプチド、および／またはアンチセン
ス核酸もしくはｓｉＲＮＡの全部もしくは一部をコードする核酸が組換え核酸技術によっ
てその中に（もしくはその祖先の中に）導入されている細胞である。例えば細菌、酵母、
昆虫、マウス、ラット、ヒト、植物などの原核および真核細胞の両方が含まれる。
【００３８】
本発明は、例えば発現ベクターのような、発現を可能にする転写および／または翻訳調
節エレメントへ機能的に連結している本発明の核酸を含有する核酸構築物（例えば、ベク
ターおよびプラスミド）もさらにまた特徴とする。「機能的に連結した」は、前記調節エ
レメントが選択された核酸の転写および／または翻訳を調節できるように、例えばＶＫＯ
ＲポリペプチドをコードするＤＮＡ分子のような選択された核酸が、配列の転写および／
または翻訳を指令する１つ以上の調節エレメント、例えばプロモーターに隣接して配置さ
れていることを意味する。
【００３９】
本発明は、プライマーもしくはプローブとして使用できる、本発明の核酸のフラグメン
トもしくはオリゴヌクレオチドをさらに提供する。そこで、一部の実施形態では、本発明
のフラグメントもしくはオリゴヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９に記載の
ヌクレオチド配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０
、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２５、１５０、１７５
、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０
、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、２５００
もしくは３０００連続ヌクレオチドであるヌクレオチド配列である。本発明のオリゴヌク
レオチドの例を本明細書に含まれた配列リストに提供する。そのようなフラグメントもし
くはオリゴヌクレオチドは、例えば増幅（例、ＰＣＲ）アッセイにおけるプライマーとし
て使用する場合は、制限酵素切断部位を含める、および／または組み込むために、検出可
能に標識もしくは修飾することができる。
【００４０】
本発明は、例えば配列番号１０のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントもしく
はペプチドを含む、本質的にそれからなる、および／またはそれからなるポリペプチドな
どの精製もしくは単離ＶＫＯＲポリペプチドをさらに特徴とする。そのようなフラグメン
トもしくはペプチドは、典型的には配列番号１０のアミノ酸配列の少なくとも約１０アミ
ノ酸（例えば、配列番号１０のアミノ酸配列の１５、２０、２５、３０、３５、４０、４
５、５０、５５、６０、６５、７５、８５、９５、１００、１２５、もしくは１５０アミ
ノ酸）であり、（例えば、配列番号１０に記載のような）ＶＫＯＲタンパク質のアミノ酸
配列の連続アミノ酸のペプチドもしくはフラグメントであってよい。本発明のフラグメン
トもしくはペプチドの生物活性は、本明細書に提供した、そしてＶＫＯＲ活性を同定する
ために当分野において既知のような方法にしたがって決定できる。本発明のＶＫＯＲタン
パク質のフラグメントおよびペプチドは、抗体を産生するための抗原としてさらに活性を
有する可能性がある。本発明のフラグメントもしくはペプチド上のエピトープの同定は、
周知のプロトコルによって実施され、当業者の通常の技術の範囲内に含まれる。
【００４１】
本明細書で使用する「タンパク質」および「ポリペプチド」はどちらも、長さまたは翻
訳後修飾（例、グリコシル化、リン酸化もしくはＮ−ミリスチル化）とは無関係に、アミ
ノ酸の鎖を意味する。そこで用語「ＶＫＯＲポリペプチド」には全長天然型ＶＫＯＲタン
パク質、ならびに全長天然型ＶＫＯＲタンパク質に、または天然型もしくは合成ＶＫＯＲ
ポリペプチドの一部分に一致する組換えにより、もしくは合成により産生したポリペプチ
ドが各々含まれる。
【００４２】
「精製」もしくは「単離」化合物もしくはポリペプチドは、当該の化合物の重量で少な
くとも６０％の組成物、例えば天然型微生物もしくはウイルスの他の構成成分の少なくと
も一部、例えば細胞もしくはウイルス構造成分またはそのポリペプチドと一般に結び付い
て見いだされる他のポリペプチドもしくは核酸から分離されている、もしくはそれらを実
質的に含有していないＶＫＯＲポリペプチドもしくは抗体である。本明細書で使用する「
単離」ポリペプチドは、少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％
、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％（ｗ／ｗ）以上純粋である。好まし
くは、前記調製物は当該の化合物の重量で少なくとも７５％（例、少なくとも９０％もし
くは９９％）である。純度は、適切な標準方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法、またはＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００４３】
好ましいＶＫＯＲポリペプチドには、天然型ＶＫＯＲポリペプチドの全部もしくは一部
分と実質的に同一である配列が含まれる。本明細書に記載のＶＫＯＲポリペプチド配列と
「実質的に同一」であるポリペプチドは、配列番号１０のＶＫＯＲポリペプチドのアミノ
酸配列と少なくとも８０％もしくは８５％（例、９０％、９５％もしくは９９％）同一で
あるアミノ酸配列を有する。比較のために、標準ＶＫＯＲポリペプチドの長さは、一般に
少なくとも１６アミノ酸、例えば少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０
、７５もしくは１００アミノ酸であろう。
【００４４】
標準配列と１００％未満同一であるポリペプチド配列の場合は、非同一である位置は、
必ずではないが、好ましくは標準配列に対して保存的置換である。保存的置換には、典型
的には以下の基：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；ア
スパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオ
ニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン内の置換が含
まれるが、それらに限定されない。
【００４５】
特定のポリペプチドが規定長さの標準ポリペプチドとの特定の同一性（％）を有すると
言われる場合は、同一性（％）は標準ポリペプチドに比較されている。そこで例えば、１
００アミノ酸長である標準ポリペプチドに対して５０％、７５％、８５％、９０％、９５
％もしくは９９％同一であるポリペプチドは、前記標準ポリペプチドの５０、７５、８５
、９０、９５もしくは９９アミノ酸長部分と完全に同一である５０、７５、８５、９０、
９５もしくは９９アミノ酸ポリペプチドであってよい。それは、その全長にわたり標準ポ
リペプチドと５０％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である１００
アミノ酸長ポリペプチドであってもよい。当然ながら、他のポリペプチドもまた同一基準
を満たすであろう。
【００４６】
本発明は、本発明のＶＫＯＲポリペプチドもしくはそのフラグメントへ特異的に結合す
る精製もしくは単離抗体もさらに特徴とする。「特異的に結合する」とは、抗体が特定の
抗原、例えばＶＫＯＲポリペプチド、またはＶＫＯＲポリペプチドのフラグメントもしく
はペプチド上のエピトープを認識して結合するが、しかしサンプル中の他の分子を実質的
に認識して結合することがないことを意味する。１つの実施形態では、抗体はモノクロー
ナル抗体であり、そして他の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。キメラ抗
体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメントなどを含むモノクロー
ナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の生成法は、当分野において周知である。
【００４７】
また別の態様では、本発明はサンプル中のＶＫＯＲポリペプチドを検出する方法を特徴
とする。本方法は、抗体とＶＫＯＲとの複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルを
ＶＫＯＲポリペプチドもしくはそのフラグメントに特異的に結合する抗体と接触させるス
テップと、もしあれば複合体の産生を、前記サンプル中のＶＫＯＲポリペプチドもしくは
そのフラグメントの検出として検出するステップと、を含む。そのようなイムノアッセイ
は、当分野において周知であり、免疫沈降アッセイ、免疫ブロットアッセイ、免疫標識ア
ッセイ、ＥＬＩＳＡなどが含まれる。
【００４８】
本発明は、サンプル中のＶＫＯＲポリペプチドをコードする核酸を検出する方法であっ
て、ハイブリダイゼーション複合体が形成できる条件下で、前記サンプルをＶＫＯＲポリ
ペプチドもしくはそのフラグメントをコードする本発明の核酸と、またはＶＫＯＲもしく
はそのフラグメントをコードする核酸の補体と接触させるステップと、それによりサンプ
ル中のＶＫＯＲをコードする核酸を検出するためにハイブリダイゼーション複合体の形成
を検出するステップと、を含む方法をさらに提供する。そのようなハイブリダイゼーショ
ンアッセイは当分野において周知であり、プローブ検出アッセイおよび核酸増幅アッセイ
が含まれる。
【００４９】
本発明には、ＶＫＯＲ遺伝子（すなわち、その機能的ホモログ）に関連する遺伝子を入
手する方法もまた包含される。そのような方法は、ＶＫＯＲの全部もしくは一部分をコー
ドする単離核酸、またはそのホモログを含む検出可能に標識されたプローブを入手もしく
は生成するステップと、標識されたプローブを用いて核酸フラグメントライブラリーを、
前記ライブラリー内の核酸フラグメントへのプローブのハイブリダイゼーションを可能に
し、それにより核酸重複部位を形成させる条件下でスクリーニングするステップと、もし
あれば標識された重複部位を単離するステップと、およびＶＫＯＲ遺伝子に関連する遺伝
子を入手するためにいずれかの標識された重複部位内の核酸フラグメントから全長遺伝子
配列を調製するステップと、を含む。
【００５０】
本発明のまた別の態様は、ビタミンＫ依存性タンパク質を作製する方法であって、ビタ
ミンＫの存在下でビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を発現してビタミンＫ依
存性タンパク質を産生する宿主細胞を培養するステップと、および次に前記ビタミンＫ依
存性タンパク質を前記培養から採取するステップと、を含み、前記宿主細胞がビタミンＫ
依存性カルボキシラーゼをコードする異種核酸を含有して、発現し、そして前記宿主細胞
がさらにビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）をコードする異種核酸を含有して、
発現し、本明細書に記載のＶＫＯＲを産生する方法である。ＶＫＯＲをコードする核酸の
発現およびＶＫＯＲの産生は、細胞がＶＫＯＲの非存在下で産生されるであろうレベルよ
り高レベルのビタミンＫ依存性タンパク質を産生することを誘発するであろう。
【００５１】
そこで一部の実施形態では、本発明は、ビタミンＫ依存性タンパク質を生成する方法で
あって、
ａ）細胞内にビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を、それにより前記核酸が
発現して前記ビタミンＫ依存性タンパク質がビタミンＫの存在下で産生する条件下で導入
するステップであって、前記細胞がビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする異種
核酸を含み、そしてビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする異種核酸をさらに含むス
テップと、および
ｂ）前記細胞から前記ビタミンＫ依存性タンパク質を任意に採取するステップと、を含
む方法をさらに提供する。生成できるビタミンＫ依存性タンパク質は、第ＶＩＩ因子、第
ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳおよびプロトロンビンをあらゆる組み
合わせで含むが、それらに限定されない、現在知られている、もしくは本質的に後になっ
て同定されるあらゆるビタミンＫ依存性タンパク質であってよい。本明細書に記載の核酸
を用いて形質転換させることのできる全ての宿主細胞は、本明細書に記載のように使用で
きるが、一部の実施形態では、非ヒトもしくは非哺乳動物宿主細胞さえ使用できる。本明
細書に記載のビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする核酸およびビタミンＫ依存
性タンパク質をコードする核酸は当分野において周知であり、それらを発現させるための
細胞内への導入は、日常的プロトコルにしたがって実施されるであろう。
【００５２】
本発明のある実施形態は、抗凝固療法のための被験者のワルファリンの治療用量は、前
記被験者の前記ＶＫＯＲ遺伝子内の１つ以上の一塩基多型の存在と相関させることができ
るという、本発明者らの発見に基づいている。そこで本発明は、ワルファリンに対する増
加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、前記被験者にお
いてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップであって、前記一塩基多型
がワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられ、それによりワルフ
ァリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップを含む方
法をさらに提供する。
【００５３】
ワルファリンに対する増加した感受性と相関させられたＳＮＰの例は、配列番号８のゲ
ノム配列ならびにこの配列の前後のおよそ１０００ヌクレオチドを含む標準配列である、
配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２５８１（配列番号１２）（ＶＫＯＲ遺
伝子のイントロン２において；参照して本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッ
ション番号ｒｅｆＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ８０５０８９４）でのＧ→Ｃの変化である。この配
列は、ゲノム位置「ヒト染色体１６ｐ１１．２」を有する、またはヒト染色体１６：３１
００９７００−３１０１３８００としてＮＣＢＩデータベース内の物理的地図において位
置を決定することができる。
【００５４】
ワルファリンに対する減少した感受性と相関させられたＳＮＰの例は、配列番号１１の
ヌクレオチド配列のヌクレオチド３２９４（配列番号１３）（ＶＫＯＲ遺伝子のイントロ
ン２において；参照して本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｒｅ
ｆＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ２３５９６１２）でのＴ→Ｃの変化および配列番号１１のヌクレオ
チド配列のヌクレオチド４７６９（配列番号１４）（ＶＫＯＲ遺伝子の３’ＵＴＲにおい
て；参照して本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｒｅｆＳＮＰ  
ＩＤ：ｒｓ７２９４）でのＧ→Ａの変化である。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「ワルファリンに対する増加した感受性」を有する被験
者は、前記被験者のためのワルファリンの適合する治療用量もしくは維持用量が正常被験
者のために適合するであろうワルファリンの治療用量もしくは維持用量より少ない被験者
、すなわちＶＫＯＲ遺伝子内にワルファリンに対する増加した感受性の表現型を付与する
ＳＮＰを有していなかった被験者である。これとは逆に、本明細書で使用するように、「
ワルファリンに対する減少した感受性」を有する被験者は、前記被験者のためのワルファ
リンの適合する治療用量もしくは維持用量が正常被験者のために適合するであろうワルフ
ァリンの治療用量もしくは維持用量より多い被験者、すなわちＶＫＯＲ遺伝子内にワルフ
ァリンに対する減少した感受性の表現型を付与するＳＮＰを有していなかった被験者であ
る。正常被験者に対するワルファリンの典型的な治療用量の例は１週間当たり３５ｍｇで
あるが、この量は変動する可能性がある（例えば、Ａｉｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９
９）Ｌａｎｃｅｔ  ３５３：７１７−７１９には１週間当たり３．５から４２０ｍｇの用
量範囲が記載されている）。ワルファリンの典型的な治療用量は、本明細書に記載の方法
にしたがって所定の試験について決定でき、これを使用するとこの用量を上回る、もしく
は下回るワルファリン治療用量を備える被験者を同定し、それによってワルファリンに対
する減少もしくは増加した感受性を有する被験者を同定することができる。
【００５６】
さらに本明細書では、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト
被験者を同定する方法であって、ａ）ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリ
ンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップと；およびｂ）前記被験者
においてステップ（ａ）の前記一塩基多型を検出するステップであって、それによりワル
ファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、を
含む方法が提供される。
【００５７】
さらに、本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられ
たＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定する方法であって、ａ）ワルファリンに対する増
加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、ｂ）前記被験者におけ
るＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップと、およびｃ）ステップ（ｂ
）の前記一塩基多型の存在を前記被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少
した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリンに対する増加もしく
は減少した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定するステップと
、を含む方法を提供する。
【００５８】
さらに、本明細書では、被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型をワルファリンに対す
る増加もしくは減少した感受性と相関させる方法であって、ａ）ワルファリンに対する増
加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、ｂ）ステップ（ａ）の
被験者における前記ＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するステップと、ｃ）ステ
ップ（ｂ）のヌクレオチド配列を前記ＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較す
るステップと、ｄ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出するステッ
プと、およびｅ）ステップ（ｄ）の一塩基多型をステップ（ａ）の被験者におけるワルフ
ァリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップと、を含む方法も提供
する。
【００５９】
被験者は、周知のプロトコルにしたがった抗凝固療法のためのワルファリンの治療用量
もしくは維持用量を確立するステップと、その被験者のための治療用量もしくは維持用量
を、それからワルファリンの平均もしくは中間治療用量もしくは維持用量が計算される１
集団の正常被験者（例えば、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関さ
せられるＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰが欠如している被験者）の抗凝固療法のためのワルフ
ァリンの治療用量もしくは維持用量と比較するステップによって、ワルファリンに対する
増加または減少した感受性を有するかを画定される。ワルファリンの平均治療用量もしく
は維持用量を下回るワルファリンの治療用量もしくは維持用量（例えば、野生型ＶＫＯＲ
遺伝子を有する、すなわちワルファリン感受性に関連付けられた一塩基多型が欠如してい
る被験者にとって治療的である、もしくは維持レベルを提供するワルファリンの用量）を
有する被験者は、ワルファリンに対する増加した感受性を有すると同定された患者である
。ワルファリンの平均治療用量もしくは維持用量を上回るワルファリンの治療用量もしく
は維持用量を有する被験者は、ワルファリンに対する減少した感受性を有すると同定され
た被験者である。野生型ＶＫＯＲ遺伝子を備える被験者のためのワルファリンの平均治療
用量もしくは維持用量は、当業者によって容易に決定されるであろう。
【００６０】
被験者のＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列は、当分野において標準の、そして本明細
書に提供した実施例に記載のような方法にしたがって決定される。例えば、ゲノムＤＮＡ
は被験者の細胞から抽出され、ＶＫＯＲ遺伝子は既知のプロトコルにしたがって特定され
てシーケンシングされる。ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型は、被験者の配列と当分野にお
いて既知の野生型配列（本明細書に配列番号１１として示した標準配列）との比較によっ
て同定される。
【００６１】
ＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰは、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有
する、すなわち前記平均用量を上回る、もしくは下回るワルファリンの維持用量もしくは
治療用量を有すると同定された被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の１つのＳＮＰもしくは複数の
ＳＮＰの存在を同定するステップと、周知の統計分析方法にしたがって、１つ以上のＳＮ
Ｐとワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性との相関の統計分析を実施するス
テップと、によってワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられる
。１つ以上のＳＮＰ（遺伝子型）と増加もしくは減少したワルファリン感受性（表現型）
との統計的関連（例、有意な関連）を同定する分析は、被験者における１つ以上のＳＮＰ
の存在とその被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性との相関
関係を確立する。
【００６２】
被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の１つ以上のＳＮＰの存在を含む要素の組み合わせは、その
被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させることがで
きることは企図されている。そのような要素には、シトクロムｐ４５０  ２Ｃ９多型、人
種、年齢、性別、喫煙歴および肝疾患が含まれるが、それらに限定されない。
【００６３】
そこでまた別の実施形態では、本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した
感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、ＶＫＯＲ遺伝子の１つ以上の一塩基
多型、１つ以上のシトクロムｐ４５０  ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患
およびこれらの要素の２つ以上の組み合わせからなる群から選択された、ワルファリンに
対する増加もしくは減少した感受性と相関させられた要素の組み合わせの存在を同定する
ステップであって、前記要素の組み合わせがワルファリンに対する増加もしくは減少した
感受性と相関させられ、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を
有する被験者を同定するステップを含む方法を提供する。
【００６４】
さらに、本明細書では、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒ
ト被験者を同定する方法であって、ａ）要素の組み合わせの存在をワルファリンに対する
増加もしくは減少した感受性と相関させるステップであって、前記要素が、ＶＫＯＲ遺伝
子の１つ以上の一塩基多型、１つ以上のシトクロムｐ４５０  ２Ｃ９多型、人種、年齢、
性別、喫煙歴、肝疾患およびこれらの要素の２つ以上の組み合わせからなる群から選択さ
れるステップと；およびｂ）前記被験者においてステップ（ａ）の要素の組み合わせを検
出するステップであって、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性
を有する被験者を同定するステップと、を含む方法が提供される。
【００６５】
さらに、本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられ
た要素の組み合わせを同定する方法であって、前記要素が、ＶＫＯＲ遺伝子の１つ以上の
一塩基多型、１つ以上のシトクロムｐ４５０  ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、
肝疾患およびこれらの要素の２つ以上の組み合わせからなる群から選択され、ａ）ワルフ
ァリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、ｂ）
前記被験者における前記要素の組み合わせの存在を検出するステップと、およびｃ）ステ
ップ（ｂ）の要素の組み合わせの存在を前記被験者におけるワルファリンに対する増加も
しくは減少した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリンに対する
増加もしくは減少した感受性と相関させられた要素の組み合わせを同定するステップと、
を含む方法を提供する。
【００６６】
本明細書では、さらにまた要素の組み合わせを相関させる方法であって、前記要素が、
ＶＫＯＲ遺伝子の１つ以上の一塩基多型、１つ以上のシトクロムｐ４５０  ２Ｃ９多型、
人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患およびこれらの要素の２つ以上の組み合わせからなる
群から選択される方法であって、ａ）ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性
を有する被験者を同定するステップと、ｂ）前記被験者における前記要素の組み合わせの
存在を同定するステップと、およびｃ）ステップ（ｂ）の要素の組み合わせをステップ（
ａ）の被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるス
テップと、を含む方法もまた提供される。
【００６７】
本明細書に記載の要素の組み合わせは、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感
受性を有すると同定された被験者における要素の組み合わせの存在を同定するステップと
、および周知の統計分析方法にしたがって、要素の組み合わせとワルファリンに対する増
加もしくは減少した感受性との関連についての統計分析を実施するステップとによって、
ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられる。要素の組み合わせ
と（増加もしくは減少した）ワルファリン感受性表現型との統計的関連（例、有意な関連
）を同定する分析は、被験者における要素の組み合わせの存在とその被験者におけるワル
ファリンに対する増加もしくは減少した感受性との相関関係を確立する。
【００６８】
本明細書では、ＶＫＯＲをコードし、本明細書に記載の１つ以上のＳＮＰを含む核酸が
さらに提供される。そこで、本発明は、本質的に配列番号１２、１３、１４、１５および
１６に規定したヌクレオチド配列を含む、本質的にそれらからなる、および／またはそれ
らからなる核酸をさらに提供する。前記核酸はベクター内に存在していてもよく、該ベク
ターは細胞内に存在していてよい。さらに、配列番号１２、１３、１４、１５および１６
に規定したヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされたタンパク質、ならびに配列
番号１２、１３、１４、１５および１６に規定したヌクレオチド配列を含む核酸によって
コードされたタンパク質へ特異的に結合する抗体が含まれる。以下の実施例では、本発明
をより詳細に記載するが、当業者には多数の修飾および変形が明白であろうから、前記実
施例は単に例示することが企図されている。
【実施例１】
【００６９】
ＶＫＯＲ遺伝子内の１つ以上のＳＮＰとワルファリンに対する増加もしくは減少した感受
性との相関関係
ＶＫＯＲ遺伝子の最も主要なアイソフォームは約４ｋｂ長であり、３つのエクソンを有
し、そして１８．４ｋＤａの質量を備える１６３アミノ酸の酵素をコードする。本試験で
は、ＳＮＰ（各々、４６．９％、４６．８％および４６．３％のヘテロ接合性率）として
同定された３つの突然変異ｖｋ２５８１（Ｇ＞Ｃ）、ｖｋ３２９４（Ｔ＞Ｃ）およびｖｋ
４７６９（Ｇ＞Ａ）を、被験者におけるそれらの存在と治療効果のある反応を達成するた
めに必要とされるワルファリンの維持用量との相関関係について試験した。
【００７０】
１．被験者の選択
被験者は、外来ケアセンター内のＵＮＣ凝固クリニックから入手した。研修を積んだ遺
伝カウンセラーによってインフォームドコンセントを入手した。英語を流暢に話せない被
験者は、通訳がおらず、同意を得るための要件が満たされないために除外した。本試験適
格者となるために、被験者は少なくとも６ヶ月間にわたりワルファリンを摂取しており、
年齢が１８歳以上であり、外来ケアクリニックでのＵＮＣ凝固クリニックによってフォロ
ーアップされた。
【００７１】
２．全血からのゲノムＤＮＡの抽出
ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥ
Ｎ社製品番号５１１０４）を用いて被験者の全血から抽出した。ＤＮＡ濃度は１０ｎｇ／
μＬへ調整した。
【００７２】
３．ゲノムＤＮＡサンプルのシーケンシング
およそ１０ｎｇのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイのために使用した
。ＶＫＯＲ遺伝子を増幅させるために使用したプライマーは次のとおりであった：５’−
ＵＴＲおよびエクソン１領域のためのエクソン１−５’ＣＣＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＴＣＡ
ＧＡＧＧ（配列番号２９）およびエクソン１−３’ＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧ
ＴＣＴ（配列番号３０）；エクソン２領域のためのエクソン２−５’ＡＧＧＧＧＡＧＧＡ
ＴＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号３１）およびエクソン２−３’ＣＣＴＧＴＴＡＧＴＴ
ＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡ（配列番号３２）；ならびにエクソン３および３’−ＵＴＲ領域
のためのエクソン３−５’ＡＴＡＣＧＴＧＣＧＴＡＡＧＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号３３）
およびエクソン３−３’ＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣＣＣＣＣＴＴＡＧ（配列番号３４）。
ＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰを検出するためには、自動ハイスループットキャピラリー電気
泳動ＤＮＡシーケンシングを使用した。
【００７３】
４．リアルタイムＰＣＲを用いた既知のＳＮＰの検出
ＳＮＰ遺伝子型特定のためのアッセイ試薬は、Ａｓｓａｙ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ（商標
）ｓｅｒｖｉｃｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、製品番号４３３２０７２
）から入手した。プライマーおよびプローブ（ＦＡＭ（商標）およびＶＩＣ（商標）色素
標識）は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアを用いて設計し、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製合成装置内で合成した。各ＳＮＰのためのプライマー対はＳ
ＮＰ部位の上流／下流位置に配置され、ＰＣＲ反応において１００ｂｐ長未満のＤＮＡフ
ラグメントを生成できる。ＦＡＭ（商標）およびＶＩＣ（商標）色素標識プローブは、１
５〜１６ｎｔの長さを備えるＳＮＰ部位をカバーするように設計した。各ＶＫＯＲ  ＳＮ
Ｐのためのプライマーおよびプローブ配列は表２に示した。
【００７４】
ＰＣＲ反応では、２×ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅ
ｒ  Ｍｉｘ，Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社、製品番号４３２４０１８）を使用した。４０サイクルのリアルタイムＰＣＲは、Ｏｐ
ｔｉｃｏｎ  ＩＩ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）機内で実施した。９５℃で１０分間予熱さ
れ、次に９２℃で１５秒間、６０℃で１分間加熱され、そしてその後にプレートが読み取
られた。結果は、ＦＡＭおよびＶＩＣ色素のシグナル値にしたがって読み取った。
【００７５】
５．統計的分析
様々な遺伝子型間の平均用量の差は、ＳＡＳバージョン８．０（ＳＡＳ社、ノースカロ
ライナ州カリー）を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって比較した。０．０５未満の両
側ｐ値を有意と見なした。ＳＮＰ群間の平均治療用量についての分布および残余について
の試験は、分散の均質性の前提を満たすために対数変換が不可欠であることを示していた
。
【００７６】
６．ＳＮＰとワルファリン用量との相関関係
直接ゲノムＤＮＡシーケンシングおよびＳＮＰリアルタイムＰＣＲ検出によって、ＶＫ
ＯＲ遺伝子内で５つのＳＮＰが同定された：１つは５’−ＵＴＲ内、２つはイントロンＩ
Ｉ内、１つはコーディング領域内および１つは３’−ＵＴＲ内（表１）。
【００７７】
これらのＳＮＰの中で、ｖｋ５６３およびｖｋ４５０１  ＳＮＰ対立遺伝子を有してい
たのは本試験の被験者５８例中１例（さらに３’−ＵＴＲ  ＳＮＰ対立遺伝子も有し、三
重ヘテロ接合型）だけであり、その他のＳＮＰは１７〜２５例のヘテロ接合型患者におい
て同定された。
【００７８】
最初に各マーカーを個別に分析した。図１Ａは、ｖｋ２５８１野生型対立遺伝子を備え
る患者についての平均ワルファリン用量が１週間当たり５０．１９±３．２０ｍｇであっ
たが（ｎ＝２６）、他方この多型についてヘテロ接合型およびホモ接合型である場合の用
量が、各々１週間当たり３５．１９±３．７３（ｎ＝１７）および３１．１４±６．２ｍ
ｇ（ｎ＝１５）であったことを示している。図１Ｂは、ｖｋ３２９４野生型対立遺伝子を
備える患者についての平均ワルファリン用量は１週間当たり２５．２９±３．０５ｍｇで
あったが（ｎ＝１１）、他方ヘテロ接合型およびホモ接合型対立遺伝子を有する患者は、
各々１週間当たり４１．６±８４．９２（ｎ＝２５）および４７．７３±２．７５ｍｇ（
ｎ＝２２）であったことを示している。図１Ｃは、ｖｋ４７６９ＳＮＰ野生型を備える患
者についての平均ワルファリン用量が１週間当たり３５．３５±４．０１ｍｇであったが
（ｎ＝２７）、他方ヘテロ接合型およびホモ接合型対立遺伝子を備える患者は、各々１週
間当たり４４．４８±４．８０（ｎ＝１９）および４７．５６±３．８６ｍｇ（ｎ＝１２
）を必要としたことを示している。さらに、Ｐ４５０  ２Ｃ９＊３は、以前に報告された
ように（Ｊｏｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）「Ｗａｒｆａｒｉｎ  ｄｏｓｉｎｇ  ａ
ｎｄ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｃ９  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」Ｔｈｒ
ｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９１：１１２３−１１２８）、ワルファリン用量へ有意な作用
を有することも観察された（図１Ｄ）。Ｐ４５０  ２Ｃ９＊１（野生型）を備える患者に
ついての平均ワルファリン用量が１週間当たり４３．８２±２．７５ｍｇ（ｎ＝５０）で
あったが、他方この対立遺伝子に対してヘテロ接合型の患者は１週間当たり２２．４±４
．３４ｍｇ（ｎ＝８）を必要とした。
【００７９】
７．統計的分析
Ｌｏｇe（ワルファリン平均用量）（ＬｎＤｏｓｅ）とＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰとの
関連を分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって試験した。最初にＳＡＳを使用して、ＶＫＯＲ  
ＳＮＰ以外の用量に影響を及ぼす可能性がある要素を同定するために、一連の要素（人種
、性別、喫煙歴、肝疾患、シトクロムＰ４５０  ２Ｙ９遺伝子でのＳＮＰなど）を試験す
る繰返し手順を実施した。Ｐ４５０  ２Ｃ９＊３はワルファリンの平均用量と統計的有意
に関連していた；そこで、これが詳細な分析のための共変成分であると結論した。この分
析は、共変量を含めたときに、３つのＶＫＯＲのＳＮＰが依然として１週間当たりのワル
ファリン用量と統計的有意に関連していることを示した（ｖｋ２５８１、Ｐ＜０．０００
１；ｖｋ３２９４，Ｐ＜０．０００１；およびｖｋ４７６９、Ｐ＝０．００４４）。
【００８０】
ＶＫＯＲの３つのＳＮＰがワルファリン用量と独立して関連しているかどうかを詳細に
試験するために、ＶＫＯＲ遺伝子内の２つのＳＮＰを他のＳＮＰに対する共変量として含
めた分析を繰り返した。３つのＶＫＯＲ  ＳＮＰは相互に２ｋｂの距離内に位置していた
ので、密接に連結していると予想される。検査から、少なくとも白色人種については、１
つのハプロタイプ（Ａ＝ｖｋ２５８１である場合はグアニンおよびａ＝ｖｋ２５８１であ
る場合はシトシン；Ｂ＝ｖｋ３２９４ではチアミンおよびｂ＝ｖｋ３９２４ではシトシン
；Ｃ＝ｖｋ４７６９ではグアニンおよびｃ＝ｖｋ４７６９ではアデニン）はＡＡｂｂｃｃ
であり、他方はａａＢＢＣＣであることが明白であった。患者における個々のＳＮＰの分
布は、他のＳＮＰと統計的有意に相関していることが見いだされた（Ｒ＝０．６３〜０．
８７、ｐ＜０．００１）。実際に、ハロタイプＡＡｂｂｃｃを備える被験者（ｎ＝７）は
、ハロタイプａａＢＢＣＣを備える患者のワルファリン用量（２５．２９±３．０５；ｐ
＜０．００１）に比較して有意に高いワルファリン用量（ワルファリン用量＝４８．９８
±３．９３）を必要とした。
【実施例２】
【００８１】
ｓｉＲＮＡの設計および合成
ｓｉＲＮＡは、最新バージョンの合理的設計アルゴリズム（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  
ａｌ．（２００４）「Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  
ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：３２６
−３３０）を用いて選択した。１３の遺伝子各々について、最高スコアを備える４つのｓ
ｉＲＮＡ重複部位を選択し、Ｈｕｍａｎ  ＥＳＴデータベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を
実施した。不正確なサイレンシング作用の可能性を最小限に抑えるために、非関連配列に
対して４つ以上のミスマッチを備える配列標的だけを選択した（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  
ａｌ．（２００３）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｏ
ｆｆ  −  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡｉ」Ｎａｔ  
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：６３５−７）。全部の重複部位は２’−ＡＣＥ  ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２０００）「Ａｄｖａｎｃｅｄ  ５’−ｓｉｌｙｌ−２
’−ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１７：３−１８）
の変法を用いてＵＵオーバーハングを備える２１−ｍｅｒとしてＤｈａｒｍａｃｏｎ（コ
ロラド州ラファイエット）において合成し、ＡＳストランドは、最高活性を保証するため
に化学的にリン酸化した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）「Ｓｉｎｇｌｅ
−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｉＲＮＡｓ  ｇｕｉｄｅ  ｔａｒｇｅｔ  
ＲＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ＲＮＡｉ」Ｃｅｌｌ  １１０：５６３−７４）。
【実施例３】
【００８２】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションは、小さな変更を加えただけで、本質的には以前に記載されたと
おりであった（Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａ
ｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ」
Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：４５５７−６５）。
【実施例４】
【００８３】
ＶＫＯＲ活性のアッセイ
ｓｉＲＮＡトランスフェクトＡ５４９細胞をトリプシン処理し、低温ＰＢＳを用いて２
回洗浄した。各ＶＫＯＲアッセイのために１．５×１０7ｃｅｌｌｓを採取した。２００
μＬのバッファーＤ（２５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、５００ｍＭ  ＫＣｌ、
２０％グリセロールおよび０．７５％  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．４）を細胞ペレットに添加
し、次に細胞溶解液の超音波処理を実施した。溶解させたマイクロソームをアッセイする
ために、ミクロソームを（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）「Ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖ
ｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｃａｒ
ｂｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  
ｂｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈ
ｅｍ  ２７７：２８５８４−９１）に記載されたとおりに２×１０9ｃｅｌｌｓから調製
した；各アッセイのために１０〜５０μＬの溶解マイクロソームを使用した。ビタミンＫ
エポキシドを図の説明文に記載の濃度へ添加し、ＤＴＴを４ｍＭへ添加して反応を開始さ
せた。反応混合液を３０℃で３０分間にわたり黄灯下でインキュベートし、５００μＬの
０．０５Ｍ  ＡｇＮＯ3：イソプロパノール（５：９）を添加することにより反応を停止
させた。５００μＬのヘキサンを添加し、混合液を１分間にわたり強力にボルテックスミ
キサーにかけることによりビタミンＫおよびＫＯを抽出した。５分間の遠心後、上層の有
機層を５ｍＬの褐色バイアルへ移し、Ｎ2を用いて乾燥させた。１５０μＬのＨＰＬＣバ
ッファー、アセトニトリル：イソプロパノール：水（１００：７：２）を添加してビタミ
ンＫおよびＫＯを溶解させ、サンプルをＡＣ−１８カラム（Ｖｙｄａｃ社、製品番号２１
８ＴＰ５４）上でのＨＰＬＣによって分析した。
【実施例５】
【００８４】
ＲＴ−ｑＰＣＲ（逆転写酵素定量的ＰＣＲ）
１×１０6ｃｅｌｌｓをＰＢＳで２回洗浄し、製造業者（インビトロジェン社）のプロ
トコルにしたがってＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて全ＲＮＡを単離した。ＲＱ１  ＤＮａｓｅ
ｌ（プロメガ社）によって１μｇのＲＮＡを消化し、熱不活化した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵
素（インビトロジェン社）を用いて第１ストランドｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡをＤｙ
ＮＡｍｏ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲプレミックス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社）と混
合し、Ｏｐｔｉｃｏｎ  ＩＩ  ＰＣＲサーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）
を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。次のプライマーを使用した：
１３１２４７６９−５’（Ｆ）：（ＴＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＴＴＣＧＧＴＴＧＣ、配列
番号１）；
１３１２４７６９−３（Ｒ）’：（ＴＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＴ、配列
番号２）；
ＧＡＰＤＨ−Ｆ：（ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ、配列番号３）；
ＧＡＰＤＨ−Ｒ：（ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ、配列番号４）；
Ｌａｍｉｎ−ＲＴ−Ｆ：（ＣＴＡＧＧＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＡ、配列番号５）
および
Ｌａｍｉｎ−ＲＴ−Ｒ：（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣ、配列番号６）
。
【実施例６】
【００８５】
Ｓｆ９昆虫細胞系におけるＶＫＯＲの過剰発現
ｍＧＣ１１２７６コーディング領域についてのｃＤＮＡは、（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２
０００）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｖｉｔａ
ｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｃａｒｂｏｘｙｌａ
ｓｅ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：１８２９１−６）に記載されたように、そのア
ミノ末端でＨＰＣ４タグ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ、配列番号７）を用いてｐＶＬ１３
９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）内へクローニングし、Ｓｆ９細胞内で発現させた。
【実施例７】
【００８６】
遺伝子の選択
ＶＫＯＲ遺伝子についての検索はマーカーＤ１６Ｓ３１３１とＤ１６Ｓ４１９の間のヒ
ト染色体１６番に集中した。この領域は、遺伝地図上の５０ｃＭ〜６５ｃＭでの染色体１
６番および物理的地図上の２６〜４６．３Ｍｂに一致する。この領域内の１９０の予測さ
れるコーディング配列をＮＣＢＩ非冗長性タンパク質データベースのＢＬＡＳＴＸ検索に
よって分析した。それらのヒト遺伝子および既知の機能を備える関連種からのオルソログ
は除外した。ＶＫＯＲは膜貫通タンパク質であると思われるので（Ｃａｒｌｉｓｌｅ  ＆
Ｓｕｔｔｉｅ（１９８０）「Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｒｂｏｘ
ｙｌａｓｅ：ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘ
ｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  
ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：
１１６１−７）、残りの遺伝子をＮＣＢＩデータベース内のｃＤＮＡ配列にしたがって翻
訳させ、プログラムＴＭＨＭＭおよびＴＭＡＰ（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈ社
、  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて分析
して膜貫通ドメインを備えるものを予測した。その後の分析のために内在性膜たんぱく質
をコードすると予測された１３の遺伝子を選択した。
【実施例８】
【００８７】
ＶＫＯＲ活性についての細胞系のスクリーニング
この方法は、多量のＶＫＯＲ活性を発現する細胞系を同定し、ｓｉＲＮＡを使用して全
１３の候補遺伝子を系統的にノックダウンさせるためのものであった。２１〜２３ヌクレ
オチドの二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡは、細胞培養中で特異的ＲＮＡ分解を引き起こす
ことが証明されている（Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）「Ｒａｐｔｏｒ，ａ  ｂｉ
ｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ＴＯＲ
），ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＴＯＲ  ａｃｔｉｏｎ」Ｃｅｌｌ  １１０：１７７−８９；Ｋｒ
ｉｃｈｅｖｓｋｙ  ＆  Ｋｏｓｉｋ（２００２）「ＲＮＡｉ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ
ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃ
ａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１１９２６−９；Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）
「Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｖｅｌ  ｐ５３  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅ  
Ｓｎｋ／Ｐｌｋ２  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｍｉｔｏｔｉｃ  Ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ  ｉｎ
Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ）−Ｅｘｐｏｓｅｄ  Ｃｅｌｌｓ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌ
ｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：５５５６−７１）。しかし、哺乳動物細胞における大規模スクリー
ニングのためのｓｉＲＮＡの適用は、特異的哺乳動物細胞ｍＲＮＡに対する機能的標的を
同定するのが困難であるために、以前には報告されていない（Ｈｏｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．
（２００３）「Ｓｉｍｉｌａｒ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎ
ｄ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈｅｙ
ａｃｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ＲＮＡｉ  ｐａｔｈｗａｙ」Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：２４０１−７）。ｓｉＲＮＡ設計のための合理的な選
択アルゴリズムの開発（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．）は、特異的ｓｉＲＮＡを開発
できる可能性を増加させる；さらに、４つの合理的に選択されたｓｉＲＮＡをプールする
ことによって成功の確率を増加させることができる。以前には同定されていない遺伝子に
ついて検索するためにｓｉＲＮＡを使用することは、ＶＫＯＲ活性が活性のために２つ以
上の遺伝子の産物を必要とする場合でさえ、アッセイが酵素活性の消失を決定するために
、スクリーニングは依然として有効であるという長所を有する。
【００８８】
１５の細胞系をスクリーニングし、容易な測定のために十分なワルファリン感受性ＶＫ
ＯＲ活性を示すヒト肺癌細胞系Ａ５４９を同定した。ほとんどＶＫＯＲ活性を発現しない
第２のヒト結腸直腸腺癌腫細胞系であるＨＴ２９を標準として使用した。
【実施例９】
【００８９】
Ａ５４９細胞におけるＶＫＯＲ活性のｓｉＲＮＡによる阻害
ｓｉＲＮＡの１３のプール各々を３回ずつＡ５４９細胞内へトランスフェクトし、７２
時間後にＶＫＯＲ活性についてアッセイした。遺伝子ｇｉ：１３１２４７６９に対して特
異的な１つのｓｉＲＮＡプールは、８回の個別アッセイにおいてＶＫＯＲ活性を６４％〜
７０％へ減少させた（図２）。
【００９０】
７２時間後にＶＫＯＲ活性がその初期活性の約３５％までしか阻害されなかったことに
ついて考えられる１つの理由は、哺乳動物タンパク質の半減期が大きく変動する（数分間
から数日間まで）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）「Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｃａ
ｌｐａｉｎ  ｉｓｏｚｙｍｅｓ  ａｒｅ  ｌｏｎｇｌｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｄｅ
ｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃａｌｐａｉ
ｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅ
ｍ  ２７１：１８８２５−３０；Ｂｏｈｌｅｙ（１９９６）「Ｓｕｒｆａｃｅ  ｈｙｄｒ
ｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３７７：４２５−３５；Ｄｉｃｅ  ＆
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９７５）「Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎ  
ｖｉｖｏ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐ
ｏｉｎｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ
７２：３８９３−７）、そしてｍＲＮＡ翻訳は阻害されるが、酵素活性は阻害されない
ことにある。このため、細胞を１１日間を通して保有し、それらのＶＫＯＲ活性を追跡し
た。図３は、ｇｉ：１３１２４７６９  ｍＲＮＡについてのｍＲＮＡのレベルが正常値の
約２０％へ急速に減少し、他方この期間中にＶＫＯＲ活性が持続的に減少したことを示し
ている。活性におけるこの減少は、ＶＫＤカルボキシラーゼ活性のレベルおよびＬａｍｉ
ｎ  Ａ／Ｃ  ｍＲＮＡが一定のままであったので、ｓｉＲＮＡの一般的作用もしくは細胞
死の結果ではない。さらに、ｇｉ：１３２１２４７６９  ｍＲＮＡのレベルは、高いＶＫ
ＯＲ活性を示すＡ５４９細胞内より低いＶＫＯＲ活性を有するＨＴ−２９細胞内の４分の
１である。これらのデータは、ｇｉ：１３１２４７６９がＶＫＯＲ遺伝子に一致すること
を示している。
【実施例１０】
【００９１】
ＶＫＯＲをコードする遺伝子の同定
本明細書でＶＫＯＲをコードすると同定された遺伝子ＩＭＡＧＥ  ３４５５２００（ｇ
ｉ：１３１２４７６９、配列番号８）は、ヒト染色体１６ｐ１１．２、マウス染色体７Ｆ
３、およびラット染色体１：１８０．８Ｍｂに位置する。ＮＣＢＩデータベース内には７
種のスプライシングパターンを表す３３８個のｃＤＮＡクローンが存在する（ＮＣＢＩ  
ＡｃｅＶｉｅｗプログラム）。これらは２から４個のエクソンの全部もしくは一部から構
成される。これらの中で最も重要なアイソフォームであるｍＧＣ１１２７６は３個のエク
ソンを有し、肺および肝細胞中において高レベルで発現する。この３つのエクソン転写産
物（配列番号９）は、１８．２ｋＤａの質量を備える１６３アミノ酸からなる予測タンパ
ク質（配列番号１０）をコードする。これは、予測のために使用されたプログラムに依存
して、１から３つの膜貫通ドメインを備える推定Ｎ−ミリスチル化小胞体タンパク質であ
る。これは、酵素活性がチオール試薬に依存するという観察所見に一致して、７つのシス
テイン残基を有する（Ｔｈｉｊｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）「Ｍｉｃｒｏｓｏｍ
ａｌ  ｌｉｐｏａｍｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｖｉｔａｍｉｎ  
Ｋ  ｅｐｏｘｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａ
ｌｅｎｔｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２９７：２７７−８０）。７つのシステイン中５つは
、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、Ｘｅｎｏｐｕｓ（アフリカツメガエル）お
よびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ（ハマダラカ）の間で保存されている。
【００９２】
前記ＶＫＯＲ遺伝子が同定されていたことを確証するために、酵素の最も重要な形態（
３つのエクソン）をＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）、Ｓｆ９
細胞内で発現させた。Ｓｆ９細胞は測定可能なＶＫＯＲ活性を有していないが、ｍＧＣ１
１２７６  ｃＤＮＡを用いてトランスフェクトさせるとワルファリン感受性活性を示す（
図４）。ＶＫＯＲ活性は、それらのアミノもしくはカルボキシル末端のいずれかでエピト
ープタグを備える構築物から観察される。このタグは、ＶＫＯＲの精製に関与するであろ
う。
【００９３】
ＶＫＯＲはワルファリン感受性を示すはずであり、したがってＶＫＯＲを発現するＳｆ
９細胞からミクロソームを作製し、ワルファリン感受性について試験した。ＶＫＯＲ活性
はワルファリン感受性である（図５）。
【００９４】
要約すると、本発明は知られていない遺伝子を同定するために哺乳動物細胞中のｓｉＲ
ＮＡを使用する最初の例を提供する。ＶＫＯＲ遺伝子の同一性は、昆虫細胞中での発現に
よって確証された。ＶＫＯＲ遺伝子は数個のアイソフォームをコードする。各アイソフォ
ームの活性および発現パターンを特徴付けることが重要であろう。世界中で数百万人が抗
凝固を阻害するためにワルファリンを利用している。このため、より安全、より効果的な
抗凝固薬のより正確な用量設定または設計をもたらすことができるので、ＶＫＯＲを詳細
に特徴付けることが重要である。
【００９５】
上記は本発明の例示であり、それを限定するものと見なすべきではない。本発明は、本
明細書に含まれるべき請求項の同等物とともに、添付の請求項によって限定される。
【００９６】
本明細書で言及した全ての出版物、特許出願、特許、特許公報およびその他の参考文献
は、その中で参考文献が提示されている文章および／または段落にとって重要な教示のた
めに参照して全体に組み込まれる。
【００９７】
【表１】
2010268803.tif 000002
【００９８】
【表２】
2010268803.tif 000003
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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