(57)【要約】【課題】セルラーゼを用いた植物組織の可溶化方法において、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる方法を提供する。【解決手段】セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼを順不同で順次植物組織に作用させる。好ましくは、植物組織１ｇに対し、セルラーゼを 0.126〜 126単位、フェルラ酸エステラーゼを 0.00006〜0.06単位、及び、桂皮酸エステラーゼを0.000075〜 0.075単位作用させる。【選択図】図１
2010268724.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させることを特徴とする植物組織の可溶化方法。
【請求項２】
セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させることを特徴とする植物組織の可溶化方法。
【請求項３】
セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させることを特徴とする植物組織の可溶化方法。
【請求項４】
セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させることを特徴とする植物組織の可溶化方法。
【請求項５】
セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させることを特徴とする植物組織の可溶化方法。
【請求項６】
植物組織１ｇに対し、セルラーゼを 0.126〜 126単位、フェルラ酸エステラーゼを 0.00006〜0.06単位、及び、桂皮酸エステラーゼを0.000075〜 0.075単位作用させる請求項５記載の植物組織の可溶化方法。
【請求項７】
植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを含有することを特徴とする混合酵素製剤。
【請求項８】
植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを含有することを特徴とする混合酵素製剤。
【請求項９】
植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有することを特徴とする混合酵素製剤。
【請求項１０】
植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有することを特徴とする混合酵素製剤。
【請求項１１】
植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼを含有することを特徴とする混合酵素製剤。
【請求項１２】
セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼの配合割合が、セルラーゼ 100質量部に対し、フェルラ酸エステラーゼが20〜30質量部、かつ、桂皮酸エステラーゼが20〜30質量部である請求項11記載の混合酵素製剤。
【請求項１３】
セルラーゼ活性が 100〜 10000単位、フェルラ酸エステラーゼ活性が１〜 100単位、かつ、桂皮酸エステラーゼが 1.2〜 120単位である請求項11又は12記載の混合酵素製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物組織の可溶化方法及び混合酵素製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物にセルラーゼ等の酵素を作用させて植物組織を可溶化することにより、植物の食味の改善（例えば渋みや苦みの低減等）や植物繊維の有効利用が図られている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
セルラーゼ製剤で植物組織を可溶化する際、植物組織の可溶化の難易は、植物組織の種類、生育状況等で異なるが、実際には困難な場合が多い。その主な要因は、植物の構成成分に起因する。
【０００３】
セルラーゼ製剤で植物組織の崩壊、可溶化を行う場合、まず、細胞を相互に接着しているプロトペクチン、ヘミセルロース等を細胞分離酵素（ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼなど）で分解し単細胞化する。その細胞壁の全表面を露出させた後、セルロース等で構成された細胞壁をセルラーゼ製剤で分解し、内容物を溶出させる方法が基本的な可溶化方法である。この可溶化方法で比較的容易に可溶化できるのは、軟質の植物繊維に限られる。多くの植物繊維は可溶化しにくい。固い植物組織は、セルラーゼ製剤に対し抵抗性を示す。その主な理由は、セルロースやヘミセルロースで構成される細胞壁や細胞間物質がプロトリグニン等の芳香族化合物で包埋されて難分解性化合物になっていて、酵素作用を阻害するためである。
【０００４】
また、セルラーゼ製剤で木材等のセルロース系原料を糖化する際、リグニン等により酵素作用が阻害される要因を除去するため、前処理が行われる（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。前処理の方法は化学的方法や物理的方法あるいは微生物的方法が利用されるが、いずれの方法も一長一短があり有効な方法はまだ確立されていない。また前処理にコストがかかるのも問題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−１６１２５８号公報
【特許文献２】特許第２９４８４７１号公報
【非特許文献１】木材学会誌２８（２）１２２（１９８２）
【非特許文献２】木材学会誌３５  ５２１−５２９（１９８９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、セルラーゼを用いた植物組織の可溶化方法において、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる方法を提供することにある。また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる混合酵素製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成するため、植物組織の多様な構造を理解し、まず天然芳香族化合物に特異性をもつ酵素製剤の検討を行った。
植物組織の基幹部分は、セルロース、ヘミセルロース、リグニンで構成され、これにタンパク質、澱粉、脂質等が結合している。リグニンは、細胞間や細胞壁に沈着し、セルロースやヘミセルロースと化学的に結合し物理的な強度を与えている。
ヘミセルロースは、種々の糖残基が多様な結合をしたヘテロポリマーである。セルロースのように規則性がなく、複雑な結合様式をしている。このセルロースやヘミセルロースにリグニンが結合し、植物の基幹構造が形成されている。
【０００８】
リグニンとは、その前駆体（モノリグノール）である桂皮アルコールが酵素的に脱水素されたフェノキシラジカルが非酵素的に重合したものである。その結合様式は規則性のない複雑な構造であり、三次元網目構造を形成した、巨大な生体高分子である。
しかし、基本的な分子の結合のすべてがＣ６−Ｃ３単位ではなく、その結合様式もβ−Ｏ−４型だけではなく、他の結合方法も種々存在する。この基質の多様性から、今後、色々な基質特異性を持った酵素製剤の検討が非常に重要になる。
植物組織に広く分布するリグニン以外の天然芳香族化合物のなかで、低分子のフェノール酸類は、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン等とエステル結合をして存在するものも多い。これらの存在様式の詳細は不明だが、本発明者は、これを桂皮酸エステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ等のエステラーゼで加水分解することで、難分解性化合物の一角を崩し、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの反応性が高まることを見出し、本発明を完成するにいたった。
【０００９】
すなわち、本発明に係る植物組織の可溶化方法は、セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる方法である。
また、セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる方法である。
また、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる方法である。
また、セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる方法である。
【００１０】
また、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる方法である。
また、植物組織１ｇに対し、セルラーゼを 0.126〜 126単位、フェルラ酸エステラーゼを 0.00006〜0.06単位、及び、桂皮酸エステラーゼを0.000075〜 0.075単位作用させる方法である。
【００１１】
また、本発明に係る混合酵素製剤は、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを含有するものである。
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを含有するものである。
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有するものである。
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有するものである。
【００１２】
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼを含有するものである。
また、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼの配合割合が、セルラーゼ 100質量部に対し、フェルラ酸エステラーゼが20〜30質量部、かつ、桂皮酸エステラーゼが20〜30質量部である。
また、セルラーゼ活性が 100〜 10000単位、フェルラ酸エステラーゼ活性が１〜 100単位、かつ、桂皮酸エステラーゼが 1.2〜 120単位である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の植物組織の可溶化方法によれば、前処理にコストをかけることなく、植物組織を効率的に可溶化することができる。また、本発明の混合酵素製剤によれば、前処理にコストをかけることなく、植物組織を効率的に可溶化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例10の各試験区のサンプル中のグルコース濃度を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明で使用されるセルラーゼとしては、セルロースに作用するものであれば特に限定されない。微生物起源としては、バチルス  サブティリス（Bacillus subtilis ）、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger ）、イルぺクス  ラクトース（Irpex lacteus）、ヒュミクラ  インソレンス（Humicura insorens ）、トリコデルマ  バリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ  リーセイ（Trichoderm reesei ）等が代表的なものである。このなかでも特に、トリコデルマ属由来のものが最適である。
通常、セルラーゼは、上記生産菌を使用して、固形培養法又は液体培養法で製造されるが、セルラーゼとしては、麹、培養液、これを精製した濃縮液又は粉末等あらゆる態様で使用することが可能である。また、市販されているセルラーゼ製剤、例えば、協和化成株式会社製セルラーゼ製剤「ＴＰ２−協和」等を使用することもできる。
【００１６】
本発明で使用されるフェルラ酸エステラーゼは、酵素の反応形式に基づくＥＣ分類では、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）に属しエステル結合に作用する公知の酵素である。フェルラ酸エチル等に基質特異性を示す。
本発明で使用される桂皮酸エステラーゼは、フェルラ酸エステラーゼと同じくＥＣ分類で加水分解酵素に属しエステル結合に作用する公知の酵素である。桂皮酸エチル等に基質特異性を示す。桂皮酸エチルを分解すると桂皮酸とエタノールになる。
【００１７】
フェルラ酸エステラーゼあるいは桂皮酸エステラーゼとしては、エステル結合を有する基質に対しエステラーゼ活性を有するものであればよく、例えば、アスペルギルス属やボトリシス属等に属し、フェルラ酸エステラーゼや桂皮酸エステラーゼ生産能を有する微生物を培養に用いる培地を用い、常法にしたがって固形培養又は液体培養して得られた培養物又はその処理物があげられる。処理物としては、（１）該培養物の水抽出液、（２）液体培養濾液、（３）該水抽出液又は該液体培養液から硫安等を用いる塩析法又はアルコール等を用いる沈澱法により沈殿物を得、これを乾燥した粗酵素粉末、（４）必要によりこの粗酵素粉末から調整した精製酵素、及び、市販されるフェルラ酸エステラーゼ、桂皮酸エステラーゼ等が挙げられる。
【００１８】
本発明で使用されるタンナーゼとしては、通常のタンナーゼ、例えば、没食子酸エステルを加水分解する活性を有するタンナーゼが挙げられる。具体的には、アスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属、ムコール属等に属しタンナーゼ生産能を有する微生物をこれら微生物の培養に用いられる培地を用い、常法にしたがって固体培養又は液体培養して得られた、培養物又はその処理物が挙げられる。処理物としては、（１）該培養物の水抽出液、（２）液体培養濾液、（３）該水抽出液又は該液体培養濾液から硫安等を用いる塩析法又はアルコール等を用いる沈殿法等により沈殿物を得、これを乾燥した粗酵素粉末、及び、（４）市販されているタンナーゼ製剤、例えば、キッコーマン株式会社製タンナーゼ等が挙げられる。
【００１９】
上記酵素により処理される植物としては、セルロースを主体成分とする植物であればよく、例えば、茶葉、ユーカリ、ポプラ等の木の葉、根及び枝等、サツマイモ、トウモロコシ、稲、麦、豆等の蔓、茎、葉、及び、刈草等、リンゴ、ユズ、ブドウなどの果実類等が挙げられる。
これらの植物は、そのままでもよく、必要に応じて乾燥、粉砕、加熱等の前処理を施してもよい。
【００２０】
本発明の第１の実施の形態について説明する。上記植物に上記のセルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼを添加し、これら３種類の酵素を植物組織に作用させる。
これら３種類の酵素は、植物組織に別々に順次添加して作用させてもよいが、植物組織に同時に添加して作用させる方が好ましい。順次添加する場合、３種類の酵素の添加順序は順不同でよく、特に限定されないが、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、桂皮酸エステラーゼの順で添加するのが好ましい。
【００２１】
上記の３種類の酵素を同時に添加して作用させる場合、各酵素の添加量及び酵素反応条件は、処理対象の植物の種類や酵素の形態等によっても異なるが、通常、次のようにするとよい。
【００２２】
セルラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、 0.126〜126単位、好ましくは、 7.2〜18単位（１単位はＣＭＣ溶液中で40℃、30分反応させたとき、１分間に１マイクロモルのグルコースを生成する酵素量）であることが好ましい。
フェルラ酸エステラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、 0.00006〜0.06単位、好ましくは、 0.006〜0.0015単位（１単位は37℃の水中において１分間に１マイクロモルのフェルラ酸を生成する酵素量）であることが好ましい。
桂皮酸エステラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、0.000075〜 0.075単位、好ましくは、0.0075〜 0.018単位（１単位は30℃で20分間反応させたとき、１分間に１マイクロモルの桂皮酸を生成する酵素量）であることが好ましい。
【００２３】
上記の３種類の酵素を同時に添加して作用させる場合の酵素反応は、従来より行われている方法に準じて行うことができ、例えば、植物に水又は水溶液を加え、そこに上記の３種類の酵素を同時に添加する方法、或いは３種類の酵素を予め混合しておき、この混合酵素と植物とを水又は水溶液に加える方法等により行うことができる。
この際の酵素反応条件は、反応温度が30〜50℃、特に40〜43℃で、反応時間が２〜50時間、特に３〜６時間であることが好ましい。水又は水溶液のｐＨは、調整しても調整しなくてもよいが、 3.0〜 7.0、特に 4.0〜 6.0に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくてもよい。
【００２４】
また、上記の３種類の酵素を別々に順次添加して作用させる場合は、植物に水又は水溶液を加え、そこに上記の３種類の酵素を順次添加して反応させればよく、その際の各酵素の添加量及び各酵素反応条件は次のようにするとよい。
【００２５】
セルラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、 0.126〜126単位、好ましくは 7.2〜18単位であることが好ましい。
セルラーゼ処理に当り、反応温度は30〜50℃、特に、40〜50℃に調整することが好ましい。反応時間は２〜50時間、好ましくは３〜６時間である。また、上記水又は水溶液のｐＨは、調整しても調整しなくてもよいが、 3.0〜 7.0、特に、 4.0〜 6.0に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくてもよい。
【００２６】
フェルラ酸エステラーゼの添加量は、植物組織に含まれるフェルラ酸を殆ど、ないし完全に遊離するのに十分な量、例えば、植物組織１ｇに対し、 0.00006〜0.06単位、好ましくは、 0.006〜 0.015単位であることが好ましい。フェルラ酸エステラーゼ処理にあたり、反応温度は25〜60℃、特に、50〜55℃に調整することが好ましい。反応時間は１〜10時間、好ましくは２〜６時間である。また、上記水又は水溶液のｐＨは、調整しても調整しなくてもよいが、 5.0〜 8.0、特に 6.0〜 7.0に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくてもよい。
【００２７】
桂皮酸エステラーゼの添加量は、植物組織１ｇに対し、0.000075〜 0.075単位好ましくは0.0075〜 0.018単位であることが好ましい。桂皮酸エステラーゼ処理にあたり、反応温度は30〜50℃、特に35℃〜40℃に調整することが好ましい。反応時間は１〜10時間、好ましくは２〜６時間である。また、ｐＨは調整しても調整しなくてもよいが、 4.5〜 6.0、特に 5.0〜 5.5に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくても良い。
【００２８】
上記の３種類の酵素を別々に順次添加して作用させる場合、前に添加した酵素を失活させてから次の酵素を添加してもよく、前に添加した酵素を失活させずに次の酵素を添加してもよい。
【００２９】
次に、第２の実施の形態について説明する。セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる。その他の構成は、第１の実施の形態と同様である。
【００３０】
次に、第３の実施の形態について説明する。セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる。その他の構成は、第１の実施の形態と同様である。
【００３１】
次に、第４の実施の形態について説明する。セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる。
タンナーゼの添加量は、植物１ｇに対し、 0.002〜２単位、好ましくは、 0.2〜 0.5単位であることが好ましい。タンナーゼ処理に当たり、反応温度は30℃〜46℃、特に40℃〜42℃に調整することが好ましい。反応時間は１〜10時間、好ましくは２〜６時間である。また、ｐＨは、調整しても調整しなくてもよいが、 4.5〜 6.0、特に 5.0〜 5.5に調整することが好ましい。また、反応中、攪拌しても攪拌しなくてもよい。
その他の構成は、第１の実施の形態と同様である。
【００３２】
次に、第５の実施の形態について説明する。セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させる。その他の構成は、第４の実施の形態と同様である。
【００３３】
次に、第１の実施の形態の植物組織の可溶化方法に用いられる本発明の混合酵素製剤について説明する。
すなわち、第１の実施の形態に用いられる本発明の混合酵素製剤は、上述した３種類の酵素（セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、桂皮酸エステラーゼ）及び必要に応じてこの種の酵素製剤の製造に従来より用いられている種々の担体、賦形剤、その他の添加剤を配合して製剤化したものである。剤型は、錠剤、散剤、顆粒剤、液剤等であり、常法により製剤化することができる。
【００３４】
第１の実施の形態に用いられる混合酵素製剤において、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ及び桂皮酸エステラーゼの配合割合は、セルラーゼ 100質量部に対し、フェルラ酸エステラーゼを20〜30質量部、特に25〜27質量部とし、桂皮酸エステラーゼを20〜30質量部、特に25〜27質量部とすることが好ましい。また、本発明の混合酵素製剤は、セルラーゼ活性が 100〜 10000単位、特に 500〜5000単位、フェルラ酸エステラーゼ活性が１〜 100単位、特に５〜50単位、及び、桂皮酸エステラーゼ活性が 1.2〜 120単位、特に６〜60単位であることが好ましい。本発明混合製剤には、例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ等を適宜配合してもよい。
【００３５】
次に、第２の実施の形態に用いられる混合酵素製剤について説明する。植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを含有する。その他の構成は、第１の実施の形態に用いられる混合酵素製剤と同様である。
【００３６】
次に、第３の実施の形態に用いられる混合酵素製剤について説明する。植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを含有する。その他の構成は、第１の実施の形態に用いられる混合酵素製剤と同様である。
【００３７】
次に、第４の実施の形態に用いられる混合酵素製剤について説明する。植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有する。
第４の実施の形態に用いられる混合酵素製剤において、タンナーゼの配合割合は、セルラーゼ 100質量部に対し、20〜30質量部、特に25〜27質量部とすることが好ましい。
その他の構成は、第１の実施の形態に用いられる混合酵素製剤と同様である。
【００３８】
次に、第５の実施の形態に用いられる混合酵素製剤について説明する。植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有する。その他の構成は、第４の実施の形態に用いられる混合酵素製剤と同様である。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
【００４０】
実施例１
（１）茶葉の分解−１
茶葉（生）１ｇに対し純水30mlを加えた。これに、次の１）〜４）の製剤を添加した。１）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）単独
２）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）に桂皮酸エステラーゼ （協和化成社製）３ｍｇ（ 0.011単位）を併用
３）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）にフェルラ酸エステラーゼ （協和化成社製）３ｍｇ（ 0.009単位）を併用
４）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）に桂皮酸エステラーゼ（協和化成社製）３ｍｇ（ 0.011単位）及びフェルラ酸エステラーゼ（協和化成社製）３ｍｇ（ 0.009単位）を併用
以上４区について比較試験を行った。酵素反応は、40℃で43時間行い、反応終了後、分解液の生成還元糖を定量した。その結果を下記に示す。
１）セルラーゼ製剤単独： 138ｍｇ
２）セルラーゼ製剤に桂皮酸エステラーゼ製剤を併用： 149ｍｇ
３）セルラーゼ製剤にフェルラ酸エステラーゼ製剤を併用： 190ｍｇ
４）セルラーゼ製剤に桂皮酸エステラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを併用： 248ｍｇ
この結果から、セルラーゼ製剤にエステラーゼを併用することで、セルラーゼの反応性が高まることがわかる。特に、３種類の酵素を併用した第１の実施の形態の４）区は生成還元糖量がセルラーゼ製剤単独処理の１）区の約1.79倍である。また、この４）区は、分解液の全体的な低分子化が進み濾紙濾過時の濾過速度も速く、完全な透明液が得られた。
【００４１】
実施例２
（２）茶葉の分解−２
３種類の茶葉（生）（茶葉−１、茶葉−２、茶葉−３）を用いた。この茶葉１ｇに対し純水30ｍｌを加え、これにセルラーゼ６ｍｇ（36単位）、フェルラ酸エステラーゼ２ｍｇ（ 0.006単位）及び桂皮酸エステラーゼ２ｍｇ（0.0075単位）を含む混合製剤10ｍｇを添加し、反応させた。コントロールとして、セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和）10ｍｇ（60単位）を単用した。40℃で保温して反応させ、24時間経過後にサンプリングし、ポアサイズ 0.2μｍのメンブランフィルターで濾過して、濾過液の総ポリフェノール量を測定した。その結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2010268724.tif 000003
【００４３】
本発明の第１の実施の形態に用いられる混合酵素製剤使用区は、総ポリフェノール量がコントロール（単用区）に比べて大きく上回っている。茶葉の種類によって酵素作用に違いはあるが、３種類の酵素の併用効果が各葉で認められた。総ポリフェノール量を経時的にみると、茶葉−１では、本発明の第１の実施の形態に用いられる混合酵素製剤使用区及びコントロール（単用区）の何れにおいても、酵素反応開始後６時間でほぼピークに達し、その後は横ばいで推移した。茶葉−２と茶葉−３では、６時間後も、本発明の第１の実施の形態に用いられる混合酵素製剤使用区では総ポリフェノール量が徐々に増加したが、コントロール（単用区）では横ばいか、少し低下傾向を示した。
【００４４】
実施例３
（３）茶葉の分解−３
茶葉（生）１ｇに対し純水30mlを加えた。これに、次の１）〜４）の製剤を添加した。１）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）単独
２）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）にフェルラ酸エステラーゼ（協和化成社製）３ｍｇ（ 0.009単位）を併用
３）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）にタンナーゼ製剤 （キッコーマン社製）３ｍｇ（ 0.3単位）を併用
４）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）にフェルラ酸エステラーゼ（協和化成社製）３ｍｇ（ 0.009単位）及びタンナーゼ製剤（キッコーマン社製）３ｍｇ（ 0.3単位）を併用
以上４区について比較試験を行った。酵素反応は、40℃で43時間行い、反応終了後、分解液の生成還元糖を定量した。その結果を下記に示す。
１）セルラーゼ製剤単独： 125ｍｇ
２）セルラーゼ製剤にフェルラ酸エステラーゼ製剤を併用： 185ｍｇ
３）セルラーゼ製剤にタンナーゼ製剤を併用： 160ｍｇ
４）セルラーゼ製剤にフェルラ酸エステラーゼ製剤及びタンナーゼ製剤を併用： 251ｍｇ
この結果から、セルラーゼ製剤にエステラーゼを併用することで、セルラーゼの反応性が高まることがわかる。特に、３種類の酵素を併用した第４の実施の形態の４）区は生成還元糖量がセルラーゼ製剤単独処理の１）区の約２倍である。また、この４）区は、分解液の全体的な低分子化が進み濾紙濾過時の濾過速度も速く、完全な透明液が得られた。
【００４５】
実施例４
（４）茶葉の分解−４
３種類の茶葉（生）（茶葉−１、茶葉−２、茶葉−３）を用いた。この茶葉１ｇに対し純水30ｍｌを加え、これにセルラーゼ６ｍｇ（36単位）、フェルラ酸エステラーゼ２ｍｇ（ 0.006単位）及びタンナーゼ２ｍｇ（ 0.2単位）を含む混合製剤10ｍｇを添加し、反応させた。コントロールとして、セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和）10ｍｇ（60単位）を単用した。40℃で保温して反応させ、24時間経過後にサンプリングし、ポアサイズ 0.2μｍのメンブランフィルターで濾過して、濾過液の総ポリフェノール量を測定した。その結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
2010268724.tif 000004
【００４７】
本発明の第４の実施の形態に用いられる混合酵素製剤使用区は、総ポリフェノール量がコントロール（単用区）に比べて大きく上回っている。茶葉の種類によって酵素作用に違いはあるが、３種類の酵素の併用効果が各葉で認められた。
【００４８】
実施例５
（５）茶葉の分解−５
茶葉（生）１ｇに対し純水30mlを加えた。これに、次の１）〜４）の製剤を添加した。１）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）単独
２）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）に桂皮酸エステラーゼ （協和化成社製）２ｍｇ（ 0.0075単位）を併用
３）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）にタンナーゼ製剤 （キッコーマン社製）３ｍｇ（ 0.3単位）を併用
４）セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和、協和化成社製）10ｍｇ（60単位）に桂皮酸エステラーゼ（協和化成社製）２ｍｇ（0.0075単位）及びタンナーゼ製剤（キッコーマン社製）３ｍｇ（ 0.3単位）を併用
以上４区について比較試験を行った。酵素反応は、40℃で43時間行い、反応終了後、分解液の生成還元糖を定量した。その結果を下記に示す。
１）セルラーゼ製剤単独： 130ｍｇ
２）セルラーゼ製剤に桂皮酸エステラーゼ製剤を併用： 168ｍｇ
３）セルラーゼ製剤にタンナーゼ製剤を併用： 156ｍｇ
４）セルラーゼ製剤に桂皮酸エステラーゼ及びタンナーゼ製剤を併用： 220ｍｇ
この結果から、セルラーゼ製剤にエステラーゼを併用することで、セルラーゼの反応性が高まることがわかる。特に、３種類の酵素を併用した第５の実施の形態の４）区は生成還元糖量がセルラーゼ製剤単独処理の１）区の約1.69倍である。また、この４）区は、分解液の全体的な低分子化が進み濾紙濾過時の濾過速度も速く、完全な透明液が得られた。
【００４９】
実施例６
（６）茶葉の分解−６
３種類の茶葉（生）（茶葉−１、茶葉−２、茶葉−３）を用いた。この茶葉１ｇに対し純水30ｍｌを加え、これにセルラーゼ６ｍｇ（36単位）、桂皮酸エステラーゼ２ｍｇ（0.0075単位）及びタンナーゼ２ｍｇ（ 0.2単位）を含む混合製剤10ｍｇを添加し、反応させた。コントロールとして、セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和）10ｍｇ（60単位）を単用した。40℃で保温して反応させ、24時間経過後にサンプリングし、ポアサイズ 0.2μｍのメンブランフィルターで濾過して、濾過液の総ポリフェノール量を測定した。その結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
2010268724.tif 000005
【００５１】
本発明の第５の実施の形態に用いられる混合酵素製剤使用区は、総ポリフェノール量がコントロール（単用区）に比べて大きく上回っている。茶葉の種類によって酵素作用に違いはあるが、３種類の酵素の併用効果が各葉で認められた。
【００５２】
実施例７
（７）呈味性への影響
実施例２で用いたものと同じ３種類の茶葉（茶葉−１、茶葉−２、茶葉−３）を用いて、呈味性に関係する遊離アミノ酸を調べた。茶葉１ｇに対し純水30ｍｌを加え、これに、実施例２で用いたものと同じ混合酵素製剤10ｍｇを添加し、反応させた。コントロールとして、セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和  協和化成社製）10ｍｇを単用した。40℃で保温して反応させ、経時的に、アスパラギン酸、グルタミン酸及びテアニンの量を測定した。結果は、いずれの試験区もアミノ酸量が２時間でピークとなり、酵素作用の違いは認められなかった。水溶性で低分子の遊離アミノ酸は比較的容易に水に溶解しやすいことが原因だと思われる。茶葉の種類でそれぞれのアミノ酸の溶出量に差はあるが、経時的にみた溶出量のパターンは同じで、２時間をピークにあとは横ばいに推移した。
【００５３】
実施例８
（８）稲ワラの分解
稲ワラ（粉砕物又は未粉砕物）５ｇに対し水 100ｍｌを加え、実施例２で用いたものと同じ混合酵素製剤 200ｍｇを添加し、40℃で48時間反応させた。コントロールとして、セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和  協和化成社製） 200ｍｇを単用した。反応終了後、反応液の生成還元糖を測定した。その結果を下記に示す。
結果：
還元糖（稲ワラ乾物あたり）
稲ワラ（粉砕）  ：本発明（混合酵素製剤使用区）          35.2％
：コントロール（セルラーゼ製剤単用区）  28.9％
還元糖（稲ワラ乾物あたり）
稲ワラ（未粉砕）：本発明（混合酵素製剤使用区）          19.6％
：コントロール（セルラーゼ製剤単用区）  15.5％
粉砕ワラ及び未粉砕ワラのいずれの場合も、本発明の混合酵素製剤の分解力がコントロール（単用区）を上回った。粉砕と未粉砕では粉砕ワラがよい結果を示した。セルロース系固形基質の場合、一般に、粒度と分解率に相関がみられる。粉砕稲ワラと未粉砕稲ワラの分解率の違いは粒度の関係である。稲ワラのリグニン含有量は６〜７％である。
【００５４】
実施例９
（９）サツマイモの蔓（生）の分解
サツマイモの蔓（生）60ｇに水 200ｍｌを加え、ミキサーでジュース状にした。少量の水で、全体を 300ｍｌにして、２等分にした、これに、液量に対して 0.1質量％の酵素を添加して、40℃で24時間酵素反応を行った。酵素は、実施例２で用いたものと同じ混合酵素製剤を用いた。またコントロールとして、セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和  協和化成社製）を単用した。反応終了後、濾紙で自然濾過した。この濾過液について生成還元糖を測定した。その結果を下記に示す。
生成還元糖の総量は、コントロール（単用区）では 590ｍｇであったのに対し、本発明の混合酵素製剤使用区では 940ｍｇであった。これは対照区の 1.6倍である。この影響で酵素処理液の粘性に差が生じ、コントロール（単用区）では32ｃｐ（30℃）、本発明の混合酵素製剤使用区では11ｃｐ（30℃）の粘度であった。これは濾過性にも反映し、本発明の混合酵素製剤使用区の濾過速度はコントロール区（単用区）の３倍であった。この多糖類の低分子化で濾過性が改善されることになり、濾過工程時間の短縮になる。
【００５５】
実施例10
（10）トウモロコシの芯の分解
トウモロコシの芯１ｇに水30ｍｌを加え、オートクレーブ後、セルラーゼ製剤（ＴＰ２−協和  協和化成社製）、フェルラ酸エステラーゼ（協和化成社製）、桂皮酸エステラーゼ（協和化成社製）、ペクチナーゼ製剤（新日本化学社製）、ヘミセルラーゼ製剤（新日本化学社製）各15ｍｇを表２に示す通りに添加した。試験区として表４に示す８試験区を用意した。37℃で４日間放置後、サンプル中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度の測定は、グルコース測定キット（Magazyme社製）を用いた。
【００５６】
【表４】
2010268724.tif 000006
【００５７】
図１に各試験区のサンプル中のグルコース濃度を示す。一般的に植物組織分解酵素とされるペクチナーゼ製剤やヘミセルラーゼ製剤を添加した試験区５や試験区６に比べて、フェルラ酸エステラーゼ製剤を添加した試験区４では、それを上回った。また、本発明の第１の実施の形態に用いられる３種類の酵素を併用した試験区８ではさらにグルコース濃度が高くなる結果となった。
【００５８】
以上のように、本発明は、セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させるので、セルラーゼを用いた植物組織の可溶化方法において、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
また、セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させるので、セルラーゼを用いた植物組織の可溶化方法において、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
【００５９】
また、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させるので、セルラーゼを用いた植物組織の可溶化方法において、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
また、セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させるので、セルラーゼを用いた植物組織の可溶化方法において、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
【００６０】
また、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼを順不同で順次又は同時に植物組織に作用させるので、セルラーゼを用いた植物組織の可溶化方法において、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
また、植物組織１ｇに対し、セルラーゼを 0.126〜 126単位、フェルラ酸エステラーゼを 0.00006〜0.06単位、及び、桂皮酸エステラーゼを0.000075〜 0.075単位作用させるので、セルラーゼの分解力を効率良く高めることができる。
【００６１】
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを含有するので、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ及び桂皮酸エステラーゼを含有するので、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
【００６２】
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有するので、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、桂皮酸エステラーゼ、及び、タンナーゼを含有するので、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
【００６３】
また、植物組織に作用させて植物組織を可溶化するための混合酵素製剤であって、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼを含有するので、前処理にコストをかけることなく、セルラーゼの分解力を高めることによって植物組織を効率的に可溶化できる。
また、セルラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、及び、桂皮酸エステラーゼの配合割合が、セルラーゼ 100質量部に対し、フェルラ酸エステラーゼが20〜30質量部、かつ、桂皮酸エステラーゼが20〜30質量部であるので、セルラーゼの分解力を効率良く高めることができる。
また、セルラーゼ活性が 100〜 10000単位、フェルラ酸エステラーゼ活性が１〜 100単位、かつ、桂皮酸エステラーゼが 1.2〜 120単位であるので、セルラーゼの分解力を効率良く高めることができる。
【図１】
2010268724.tif 000007