(57)【要約】【課題】筋細胞および心臓の修復における筋細胞の使用を提供すること。【解決手段】筋細胞および筋細胞を用いる方法が、提供される。一つの実施形態において、本発明は、移植可能な骨格筋細胞組成物およびこれらの使用方法を提供する。一つの実施形態において、被験体に骨格筋芽細胞を投与することによって、この筋細胞は、被験体における、不十分な心臓機能によって特徴付けられる傷害（例えば、うっ血性心不全）を有する患者に、移植され得る。この筋細胞は、レシピエントに対して自己、同種または異種であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮出願第６０／１４５，８４９号（１９９９年７月２３日出願）および米国特許出願第０９／６２４，８８５号（２０００年７月２４日出願）の利益を主張し、これらの両方は、本明細書中にその全体が援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
心疾患は、全ての先進国における障害および死亡の主な原因である。心疾患は、生活の質を低下させ、そして長期入院の原因となり得る。さらに、米国において、これは１００，０００人あたり約３３５人の死亡（総死亡率の約４０％）を占め、癌（１００，０００人あたり１８３人の死亡を伴う）にまさっている。心疾患の四つのカテゴリーで、全ての心臓関連性の死亡の約８５〜９０％を占める。これらのカテゴリーは、以下である：虚血性心疾患、高血圧性心疾患および肺高血圧性心疾患、弁膜症、ならびに先天性心臓疾患。虚血性心疾患（種々の形態）は、心疾患によって引き起こされる全ての死亡の約６０〜７５％を占める。さらに、心不全の発生率は、米国で増加している。破滅的な虚血性心疾患を与える因子の一つは、心筋細胞が虚血性心損傷領域を分裂させ、そして再増殖する能力がないことである。結果として、損傷または疾患の結果として喪失した心臓細胞は、不可逆性である。
【０００３】
ヒトとヒトとの心臓移植は、重度の心臓障害に対する治療の最も効果的な形態となっている。現在、多くの移植センターは、心臓移植後に８０〜９０％を上回る１年生存率および７０％以上の５年生存率を有する。しかしながら、心臓移植は、適したドナー器官不足によって、ひどく限定されている。ドナー器官を得る困難に加えて、心臓移植の費用は、広範な適用を妨げる。別の未解決の問題は、移植拒絶である。外来の心臓は、レシピエントによって不完全に寛容されており、免疫抑制薬物が無いときは、免疫系によって即座に破壊される。免疫抑制薬物は、拒絶を防ぐために使用され得るが、これらはまた、所望の免疫応答（例えば、対細菌感染および対ウイルス感染）をブロックし、これによりレシピエントを感染リスクに置く。しかし、シクロスポリンによって引き起こされる、感染、高血圧および腎機能障害、進行性冠状動脈アテローム硬化症、および免疫抑制に関連する癌は主要な合併症である。
【０００４】
細胞移植は、心筋梗塞の後に心臓組織を修復する新しい手段に最近の研究の焦点をあてる。成人心臓筋細胞の移植に関する主要な問題は、これらの細胞が培養中で増殖しないということである（Ｙｏｏｎら、（１９９５）Ｔｅｘ．Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔ．Ｊ．２２：１１９）。この問題を克服するために、骨格筋芽細胞の潜在的な使用に主眼を置いている。骨格筋組織は、増殖可能なサテライト細胞を含む。しかしながら、これらの細胞の精製方法および増殖方法は、複雑である。従って、心疾患の処置において、現在の心臓移植治療の限界を解消する明らかな必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
現在の心臓修復方法の限界を克服するために、本発明は、単離した筋細胞を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、骨格筋芽細胞、骨格筋芽細胞を含む組成物および被検者に骨格筋芽細胞を移植する方法に関する。さらに、本発明は、心筋細胞、心筋細胞の増殖を誘導する方法、および被検者に心筋細胞を移植する方法に関する。本発明は、先行技術より、この細胞および方法に関して多数の利点を提供する。
【０００６】
一つの局面において、本発明は、骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含む移植可能な筋細胞組成物を調製する方法を提供し、この方法は、ＥＧＦを含む培地中のポリ−Ｌ−リジンおよびラミニンでコートされた表面上で組成物を培養する工程を包含し、その結果、移植可能な組成物が調製される。好ましくは、この細胞は、移植前にインビトロにおいて、線維芽細胞と筋芽細胞との比が、約１：２〜１：１となるように約１０倍未満を倍加され得る。
【０００７】
一つの局面において、本発明は、骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含む移植可能な組成物を提供し、そして、一つの実施形態において、約２０％〜約７０％の筋芽細胞、好ましくは約４０％〜約６０％の筋芽細胞または約５０％の筋芽細胞を含み得る。別の実施形態において、移植可能な組成物は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の筋芽細胞を含む。
【０００８】
本発明の筋細胞は、移植前にインビトロにて培養され得、そして好ましくは、ＥＧＦを含む培地中のポリ−Ｌ−リジンおよびラミニンでコートされた表面上で培養され得る。あるいは、この表面はコラーゲンでコートされ得、そしてこの組成物は、ＦＧＦを含む培地中で培養され得る。
【０００９】
本発明の筋細胞は、好ましくは、被検者への移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）後に心臓組織へ移植（ｅｎｇｒａｆｔ）する。本発明の筋細胞は、血管形成因子を内生的に発現し得るか、もしくは血管形成因子を含む組成物の形態で投与され得るか、または本発明の筋細胞は、血管形成遺伝子産物の発現を操作してレシピエントの心臓において血管形成を誘導し得る。
【００１０】
本発明はまた、組成物中の細胞表面上の抗原を改変する工程、覆う工程または排除する工程を提供し、この結果、被検者への組成物の移植の際、細胞溶解が阻害される。一つの実施形態において、ＰＴ８５またはＷ６／３２を使用して抗原を覆う。
【００１１】
本発明はさらに、心臓組織への損傷によって特徴付けられる被検者の状態を処置する方法を提供し、この方法は、骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含む組成物を被検者へ移植する工程を包含し、この結果、この状態はこの方法によって処置される。
【００１２】
本発明はさらに、心筋の虚血性損傷を処置する方法を提供し、この方法は、被検者へ骨格筋芽細胞、そして必要に応じて線維芽細胞を含む組成物を移植する工程を包含し、この結果、心筋の虚血性損傷はこの方法によって処置される。
【００１３】
本発明の特定の実施形態に従って、骨格筋芽細胞の少なくとも一部、または骨格筋芽細胞を生じる細胞は、送達後に心臓で生存し、そしてこの中で骨格筋芽細胞の生存または分化に特有のマーカーを発現する。
一つの実施形態において、本発明の骨格筋芽細胞は、心臓細胞と似るように誘導され得る。好ましい実施形態において、骨格筋芽細胞における心臓細胞の表現型は、筋芽細胞において、心臓細胞遺伝子産物を組換え的に発現することによって促進され、この結果心臓細胞の表現型は促進される。一つの実施形態において、この遺伝子産物は、ＧＡＴＡ転写因子、そして好ましくはＧＡＴＡ４またはＧＡＴＡ６である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
機能不全性心臓を処置する方法であって、該方法は、以下：
心機能不全に対する処置を必要とする被験体を同定する工程；および
該被験体の心臓に骨格筋芽細胞を含む組成物を送達する工程であって、ここで、骨格筋芽細胞または該骨格筋芽細胞を生じ細胞の少なくとも一部が、送達後に該心臓において生存し、そして該心臓においてで骨格筋芽細胞の生存または分化に特徴的なマーカーを発現する、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記組成物が、線維芽細胞をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記マーカーが、骨格筋芽細胞、骨格筋管、骨格筋原線維または骨格筋管融合に特徴的である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記マーカーが、骨格筋特異的なミオシン重鎖である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記マーカーが、デスミンである、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記マーカーが、骨格筋芽細胞または心臓細胞由来の骨格筋芽細胞から誘導される細胞を識別する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記マーカーが、筋管由来の骨格筋芽細胞または筋原線維由来の骨格筋芽細胞を識別する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記マーカーが、ｍｙｏＤ、ミオゲニン、ｍｙｆ−５およびＮＣＡＭからなる群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記被験体がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記被験体が、虚血性心疾患を患う、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記被験体の心臓が、ウイルス感染によって引き起こされた損傷を被っている、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記被験体の心臓が、外因性化合物によって引き起こされた損傷を被っている、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記被験体の心臓が、免疫系活性によって媒介された損傷を被っている、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記被験体が、うっ血性心不全を患う、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記被験体の心臓が、前記組成物送達の少なくとも１時間前に損傷を被っている、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記被験体の心臓が、前記組成物送達の少なくとも２４時間前に損傷を被っている、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記被験体の心臓が、前記組成物送達の少なくとも１ヶ月前に損傷を受けている、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記損傷が、虚血性の損傷である、項目１５、項目１６または項目１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記被験体の心臓が、前記組成物送達の少なくとも６ヶ月前に損傷を被っている、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記被験体の心臓が、前記組成物送達の少なくとも１年前に損傷を被っている、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記損傷が、虚血性の損傷である、項目１９または項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が、心筋瘢痕組織へ送達される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記組成物が、心筋瘢痕組織および瘢痕の証拠を示さない隣接心筋組織へ送達される、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記組成物が、前記心臓の脂肪に富んだ領域へ送達される、項目１に記載の方法。
（項目２５）
少なくとも１×１０６の骨格筋芽細胞が送達される、項目１に記載の方法。
（項目２６）
約１０６と約１０７との間の骨格筋芽細胞が送達される、項目１に記載の方法。
（項目２７）
約１０７と約１０８との間の骨格筋芽細胞が送達される、項目１に記載の方法。
（項目２８）
約１０８と約１０９との間の骨格筋芽細胞が送達される、項目１に記載の方法。
（項目２９）
約１０９と約１０１０との間の骨格筋芽細胞が送達される、項目１に記載の方法。
（項目３０）
約３００×１０６の骨格筋芽細胞が送達される、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記骨格筋芽細胞が、約８×１０７細胞／ｍｌの濃度で送達される、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記骨格筋芽細胞が、１６×１０７細胞／ｍｌまでの濃度で送達される、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記組成物が、線維芽細胞をさらに含み、そしてここで、少なくとも１×１０６、約１０６と約１０７との間、約１０７と約１０８との間、約１０８と約１０９との間または約１０９と約１０１０との間の細胞が送達される、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記組成物が、線維芽細胞をさらに含み、そしてここで、前記骨格筋芽細胞および該線維芽細胞が、約８×１０７細胞／ｍｌの全濃度で送達される、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物が、線維芽細胞をさらに含み、そしてここで、前記骨格筋芽細胞および該線維芽細胞が、１６×１０７細胞／ｍｌまでの全濃度で送達される、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記組成物が、心内膜または心外膜に送達される、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記組成物が、動脈内に送達される、項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記組成物が、静脈内に送達される、項目１に記載の方法。
（項目３９）
前記組成物が、静脈系へ挿入されるカテーテルを通して前記心臓に送達される、項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記組成物が、少なくとも３０％の骨格筋芽細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４１）
前記組成物が、約３０％と約５０％との間の骨格筋芽細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４２）
前記組成物が、約５０％と約６０％との間の骨格筋芽細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４３）
前記組成物が、約６０％と約７５％との間の骨格筋芽細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４４）
前記組成物が、約７５％と約９０％との間の骨格筋芽細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４５）
前記組成物が、約９０％と約９５％との間の骨格筋芽細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４６）
記組成物が、約９５％と約９９％との間の骨格筋芽細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４７）
前記組成物が、少なくとも９９％の骨格筋芽細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４８）
前記組成物が、線維芽細胞をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４９）
前記組成物が、少なくとも５％の線維芽細胞、少なくとも１０％の線維芽細胞、少なくとも２５％の線維芽細胞、少なくとも５０％の線維芽細胞または少なくとも７０％の線維芽細胞を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記組成物が、約１％未満の筋管を含む、項目１に記載の方法。
（項目５１）
前記組成物が、約０．５％未満の筋管を含む、項目１に記載の方法。
（項目５２）
前記組成物が、本質的に筋管を含まない、項目１に記載の方法。
（項目５３）
前記組成物が、約１％未満の内皮細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目５４）
前記組成物が、約０．５％未満の内皮細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目５５）
前記組成物が、本質的に内皮細胞を含まない、項目１に記載の方法。
（項目５６）
前記骨格筋芽細胞が、自己性である、項目１に記載の方法。
（項目５７）
前記骨格筋芽細胞、または該筋芽細胞を生じる細胞が、少なくとも３０日間生存する、項目１に記載の方法。
（項目５８）
前記骨格筋芽細胞、または該筋芽細胞を生じる細胞が、少なくとも６０日間生存する、項目１に記載の方法。
（項目５９）
前記骨格筋芽細胞、または該骨格筋芽細胞を生じる細胞が、少なくとも９０日間生存する、項目１に記載の方法。
（項目６０）
前記骨格筋芽細胞、または該骨格筋芽細胞を生じる細胞が、少なくとも１年間生存する、項目１に記載の方法。
（項目６１）
小血管形成が、生存する前記骨格筋芽細胞もしくは該骨格筋芽細胞を生じる細胞でか、またはその付近で生じる、項目１に記載の方法。
（項目６２）
小血管形成が、内皮細胞マーカーの発現によって証明される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記組成物は、前記被験体が左心室補助装置を受ける手順と合わせて送達される、項目１に記載の方法。
（項目６４）
前記組成物は、前記被験体が冠状動脈バイパス移植片を受ける手順と合わせて送達される、項目１に記載の方法。
（項目６５）
前記組成物は、前記被験体が弁置換術を受ける手順と合わせて送達される、項目１に記載の方法。
（項目６６）
被験体の心臓への移植のための組成物を調製する方法であって、該方法は、以下：
被験体から筋組織のサンプルを得る工程；
該サンプルから細胞集団を単離する工程であって、ここで、該細胞集団は、骨格筋芽細胞を含む；
培養物中で該集団を増殖させる工程；ならびに
送達後に該被験体の心臓において、生存する能力または生存する細胞を生じる能力によって特徴付けられ、そして該心臓において該骨格筋芽細胞の生存または分化に特徴的なマーカーを発現する骨格筋芽細胞を含む移植可能な組成物を産生するために、前記増殖させる工程から生じる集団を調製する工程、
を包含する、方法。
（項目６７）
前記調製する工程において調製された前記集団が、線維芽細胞をさらに含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記細胞が、前記増殖させる工程の間、コンフルエント未満の状態で維持される、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記細胞が、前記増殖させる工程の間、約７５％未満のコンフルエンスで維持される、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記単離する工程が、少なくとも二つのプロテアーゼを含む消化混合物において、前記サンプルを消化する工程を包含する、項目６６に記載の方法。
（項目７１）
前記消化混合物が、ＥＤＴＡを含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記プロテアーゼが、カルボキシペプチダーゼ、カスパーゼ、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、パパイン、プロナーゼおよびトリプシンからなる群から選択される、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
前記増殖させる工程が、約５０回未満の倍加回数の間、培養物中に前記細胞集団を維持する工程を包含する、項目６６に記載の方法。
（項目７４）
前記増殖させる工程が、約５回と約１５回との間の倍加回数の間、培養物中に前記細胞集団を維持する工程を包含する、項目６６に記載の方法。
（項目７５）
前記調製する工程が、線維芽細胞を含む細胞集団と、骨格筋芽細胞を含む細胞集団と合わせる工程を包含する、項目６６に記載の方法。
（項目７６）
骨格線維芽細胞を含む前記細胞集団が、培養物中で、前記サンプルから単離された細胞集団を増殖させることによって得られる、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記調製する工程が、前記細胞を分別する工程を包含する、項目６６または項目７５に記載の方法。
（項目７８）
前記単離する工程または前記調製する工程の一つまたは両方が、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞分別を実施する工程を包含する、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記被験体がヒトである、項目６６に記載の方法。
（項目８０）
骨格筋芽細胞を含む移植可能な組成物であって、該組成物は、被験体の心臓へ送達される場合、送達後に該心臓において生存し、そして該骨格筋芽細胞の生存または分化に特徴的なマーカーを発現する能力によって特徴付けられる、組成物。
（項目８１）
前記組成物が、線維芽細胞をさらに含む、項目８０に記載の移植可能な組成物。
（項目８２）
前記マーカーが、骨格筋芽細胞、骨格筋管、骨格筋管融合または骨格筋原線維に特徴的である、項目８０に記載の移植可能な組成物。
（項目８３）
項目６６に記載の方法に従って調製された、移植可能な組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、より少ない集団倍加を受ける筋細胞が、移植後により良好な生存を生じることを示す。図１Ａは、移植前に選別した移植細胞の写真である。図１Ｂは、移植前に選別しておらず、かつインビトロにおいて、いくつかの集団倍加のみが可能であった移植細胞の写真である。
【図２】図２は、筋細胞の移植後に、血管形成（血管新生）が生じることを示す。図２Ａ（低拡大）および図２Ｂ（高拡大）は、移植後３週間における、第ＶＩＩＩ因子についての、このような移植片の染色を示す。血管は、移植片の中央に認められ得る。
【図３】図３は、移植された動物（筋芽細胞および線維芽細胞）が、移植されていないコントロール動物と比較して、拡張期血圧−体積の改善を呈した事を示す。
【図４】図４は、移植された動物（筋芽細胞および線維芽細胞）が、移植されていないコントロール動物と比較して、拡張期血圧−体積の改善を呈したことを示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、移植９日後に、梗塞を起こした心筋層における筋芽細胞の生存を示す。図５は、拡大倍率下でのラットの梗塞を起こした左心室の機能していない壁（ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｒｅｅ  ｗａｌｌ）である（トリコーム染色Ａ、ＢおよびＣ）および骨格筋芽細胞に対して特有の核転写因子である（ミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）についての免疫組織化学染色：Ｄ、ＥおよびＦ）。取り囲んだ領域は、細胞移植の領域を同定する。矢印は、梗塞領域内の二つの移植片を強調表示する。
【図６】図６は、移植された心筋梗塞後の動物（筋芽細胞および線維芽細胞）が、移植されていないコントロール動物と比較して、収縮期圧−体積の改善を呈したことを示す。図６は、細胞療法前（ＭＩ  １週間後）、移植３週間後、および移植６週間後に決定した最大運動能力である。梗塞を起こしていないコントロール動物（破線のバー）；ＭＩ動物（暗黒のバー）；ＭＩ＋動物（明色のバー）；＊（ｐ＜０．０５  対  ０週間（治療前））；＃（ｐ＜０．０５  対  ＭＩ）。
【図７Ａ】図７Ａは、移植された心筋梗塞後の動物（筋芽細胞および線維芽細胞）が、移植されていないコントロール動物と比較して、拡張期血圧−体積の改善を呈したことを示す。図７Ａは、細胞治療３週間後の収縮期圧−体積との関係である。コントロールの心臓（破線）；ＭＩの心臓（黒い四角）；ＭＩ＋の心臓（明色の四角）、＊（ｐ＜０．０５  対  コントロール）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、移植された心筋梗塞後の動物（筋芽細胞および線維芽細胞）が、移植されていないコントロール動物と比較して、拡張期血圧−体積の改善を呈したことを示す。図７Ｂは、細胞治療６週間後の収縮期圧−体積との関係である。コントロールの心臓（破線）；ＭＩの心臓（黒い四角）；ＭＩ＋の心臓（明色の四角）、＊（ｐ＜０．０５  対  コントロール）。
【図８Ａ】図８Ａは、移植された心筋梗塞後の動物（筋芽細胞および線維芽細胞）が、移植されていないコントロール動物と比較して、梗塞壁の厚さに有意な低下を呈さないことを示す。図８Ａは、細胞治療３週間後の拡張期圧−体積との関係である。コントロールの心臓（破線）；ＭＩの心臓（黒い四角）；ＭＩ＋の心臓（明色の四角）、＊（ｐ＜０．０５  対  コントロール）、＃（ｐ＜０．０５  対  ＭＩ）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、移植された心筋梗塞後の動物（筋芽細胞および線維芽細胞）が、移植されていないコントロール動物と比較して、梗塞壁の厚さに有意な低下はないことを示す。図８Ｂは、細胞治療６週間後の拡張期圧−体積との関係である。コントロールの心臓（破線）；ＭＩの心臓（黒い四角）；ＭＩ＋の心臓（明色の四角）、＊（ｐ＜０．０５  対  コントロール）、＃（ｐ＜０．０５  対  ＭＩ）。
【図９】図９は、移植前に実施されたＦＡＣＳ分析のヒストグラムプロットを示す。筋芽細胞をＮ−ＣＡＭ抗体で染色し、次いで、ＦＡＣＳ分析に供した。ヒストグラムプロットは、対Ｎ−ＣＡＭおよびネガティブコントロールサンプルと一致させたアイソタイプを用いた染色の強度および同質性を示す。
【図１０】図１０は、移植片のトリクロム染色およびＭＹ−３２染色を示す顕微鏡写真である。パネル（Ａ）は、トリクロムで染色した切片における、移植片の領域を示す。パネル（Ｂ）は、ＭＹ−３２で染色した隣接切片を示す。移植誘導性筋線維は、トリクロムの赤染色およびＭＹ−３２染色の暗青染色によって同定され得る。アスタリスク（＊）は、宿主の心筋線維領域を標識する。スケールバー＝５０ミクロン。
【図１１Ａ】図１１Ａは、移植片のＣＤ３１染色を示す顕微鏡写真である。ヒトＣＤ−３１に対する抗体を、移植片切片を染色するために用いた。パネル（Ａ）は、移植片の領域における代表的な顕微鏡写真を示す。破線は、移植片と隣接瘢痕との間の境界領域を定める。スケールバー＝１００ミクロン。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、移植片および隣接瘢痕におけるＣＤ−３１で染色された血管の数を比較するための、定量係数の結果を示すパネルである。
【図１２】図１２は、患者の心臓において、生存する骨格筋線維のトリクロム染色を示す顕微鏡写真である。この領域は、心筋の心外膜表面から心外膜の脂肪の中にまで及ぶ。青い染色はコラーゲン原線維を表し、そして赤い斑は、生存する筋線維を表す。取り囲まれた領域を図１３に高倍率で示す。この画像に対する総倍率＝５０×。
【図１３】図１３は、２００倍で示された生存する骨格筋線維のトリクロム染色を示す顕微鏡写真である。青く染まる領域は、瘢痕心筋に代表的なコラーゲン原線維沈着の領域を表す。矢印によって印された赤く染まる領域は、筋線維（これらのいくつかは、筋線性の形を示す）を示す。
【図１４】図１４は、骨格筋特異的なミオシンを用いた骨格筋線維の染色を示す顕微鏡写真である。図１２に示されるような同じ領域である。１００×倍。
【図１５】図１５は、移植された心臓において、生存する骨格筋線維の筋肉特異的なミオシンの染色を示す顕微鏡写真である。筋線維は、心外膜表面に近接する心筋に認められた。５０×倍。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、単離された筋細胞（例えば、骨格筋芽細胞、心筋細胞）または骨格筋芽細胞もしくは心筋細胞を含む組成物ならびにこれらの使用方法を特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、レシピエントへの導入に適する単離された骨格筋芽細胞および単離された骨格筋芽細胞の集団を提供する。この集団および組成物はさらに、線維芽細胞を含み得る。ほとんどの場合、線維芽細胞は、筋肉サンプルから単離されるが、これらは、他の供給源（例えば皮膚組織）から単離され得るか、または細胞株であり得る。本明細書の記載目的において、用語「筋細胞組成物」とは、線維芽細胞を含む組成物をいうが、他に特定するかもしくは文脈から明らかでない限り、この用語は、任意の供給源（筋肉に限定されない）から単離された線維芽細胞を含むようにとられる。本発明はさらに、このような細胞を移植する方法を提供する。さらに、本発明は、骨格筋芽細胞、線維芽細胞、成体心筋細胞、単離された心筋細胞、単離され増殖された心筋細胞の集団、心筋細胞を含む組成物を単離しそして増殖する方法、および心筋細胞をレシピエントへ移植する方法を提供する。これらの細胞は、例えば、機能障害の心臓組織および／または損傷した心臓組織を有するレシピエント被験体へ移植され得る。このような機能障害または損傷は、広範囲にわたる種々の障害（例えば、虚血性心疾患、高血圧性心疾患ならびに肺高血圧性心疾患（肺性心）、弁膜性心疾患、先天性心臓疾患、拡張型心筋症、肥大型心筋症、心筋炎、ウイルス感染、免疫媒介性状態、外傷、外因性の化合物（例えば、薬物または毒素）（外因性の化合物とは、被験体の体内において天然には見出されない化合物を意味する）、または心不全（例えば、不十分な心機能によって特徴付けられる）の原因となる任意の状態）から生じ得る。
【００１６】
（Ｉ．定義）
便宜上、本明細書で使用される特定の用語は以下のとおりである。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、天然の環境から分離される細胞をいう。この用語は、天然の環境から、細胞の全体の物理的な分離（例えば、ドナーからの除去）を包含する。好ましくは、「単離された」は、例えば、解離によって直接的接触される、隣接する細胞との細胞の関係の変化を包含する。用語「単離された」は、組織切片にある細胞、組織切片の一部として培養される細胞、または組織切片の形態で移植される細胞には用いない。集団筋細胞をいうために用いられる場合、用語「単離された」は、本発明の単離された細胞の増殖を生じる細胞の集団を含む。
【００１８】
用語「骨格筋芽細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ）」および「骨格筋芽細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ）」とは本明細書で交互可能に使用され、筋管および骨格筋線維の前駆体をいう。用語「骨格筋芽細胞」はまた、サテライト細胞（骨格筋において筋線維と密接に接触して見出される単核細胞）を含む。サテライト細胞は、骨格筋筋線維の基底膜近辺に認められ、そして筋線維へ分化し得る。本明細書で検討されるように、骨格筋芽細胞を含む好ましい組成物は、検出可能な筋管および筋線維を欠如している。用語「心筋細胞」は、心筋に由来する筋細胞を含む。このような細胞は、一つの核を有し、そして心臓に存在する場合は、介在板構造によって結合される。
【００１９】
本明細書で使用されるように、用語「移植する」は、レシピエントの心臓の細胞に、移植された細胞の直接的な付着（例えば、デスモソームまたはギャップ結合の形成による）を伴うか、または伴わない、心臓組織への本発明の移植された筋細胞または筋細胞組成物の取り込みを包含し、その結果、これらの細胞は、例えば、心拍出量を増大することにより心機能を増強する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「血管新生」は、本発明の筋細胞が移植される心臓組織における、新しい毛細血管の形成を包含する。好ましくは、本発明の筋細胞が、虚血領域へ移植された場合、血管新生を増強する。この血管新生は、例えば、移植する細胞の作用の結果、筋細胞からの血管形成因子の分泌の結果、および／または心臓組織からの内因性血管形成因子の分泌の結果として生じ得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、数の参照における用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）または「約（ａｂｏｕｔ）」は、数のいずれかの方向（より大きいまたは未満）において、２．５％の範囲内に収まる数を含むとされる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「本質的に含まない」は、関連するアイテム（例えば、細胞）が、本明細書に記載される検出手順または当業者に公知の適合性の手順のいずれかを用いて、検出不可能であることを示す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、語句「より心臓細胞に類似の」は、表現型において心筋細胞と密接に類似するように作製される骨格筋細胞を含む。このような心臓様細胞は、例えば、これらの生理学的変化（例えば、これらは、緩慢な攣縮の表現型、緩慢なショートニングの速度、ＡＴＰ産生に関する酸化的リン酸化の利用、心臓形態の収縮タンパク質の発現、より高いミトコンドリアの含有量、より高いミオグロビンの含有量および骨格筋細胞より疲労に対して耐性である）、ならびに／または、骨格筋細胞によって通常産生されない分子もしくは骨格筋細胞によって少量で通常産生される分子の産生（例えば、心筋収縮組織をコードする遺伝子から産生されたこれらのタンパク質、および心臓の緩慢な攣縮、ホスホランバン、ならびに／もしくはβミオシン高分子と関連するＣａ＋＋  ＡＴＰａｓｅ）によって特徴付けられ得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、語句「ＧＡＴＡ転写因子」は、ジンクフィンガー転写因子のＧＡＴＡファミリーのメンバーを含む。ＧＡＴＡ転写因子は、いくつかの中胚葉由来の細胞系統の発生において、重要な役割を果たす。好ましくは、ＧＡＴＡ転写因子は、ＧＡＴＡ−４および／またはＧＡＴＡ−６を含む。ＧＡＴＡ−６およびＧＡＴＡ−４タンパク質は、他のＧＡＴＡファミリーメンバーにおいて保存されていないタンパク質のアミノ末端のプロリンリッチの領域上にわたって、高いレベルのアミノ酸配列の同一性を共有する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部位（すなわち、特異的に抗原に結合する（免疫応答する）抗原結合部位を含む分子（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント））を含むことを意図する。本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」とは、抗原の特定のエピトープと免疫応答する能力がある一つの種類のみの抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいい、一方、用語「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」とは、特定の抗原と相互作用する能力がある複数の種類の抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的に、免疫応答する特定の抗原に対して単一の結合性親和性を表す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、細胞がサンプルまたは被験体から得られる場合、あるいは、この細胞がサンプルまたは被験体から得られた細胞の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）もしくは子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）である場合、細胞は、被験体またはサンプル「に由来する」。細胞株に由来する細胞は、細胞株のメンバーであるか、または細胞株のメンバーである細胞の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）もしくは子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）である。器官、組織、個体、細胞株などに由来する細胞は、これらが得られた後に、インビトロで改変され得る。このような細胞は、なお、元の供給源に由来すると考えられている。
【００２７】
本明細書で使用される場合、心臓内における用語「筋芽細胞の生存」または「線維芽細胞の生存」は、以下：（１）筋芽細胞または線維芽細胞自体の生存；（２）筋芽細胞または線維芽細胞が分化する細胞の生存；（３）筋芽細胞または線維芽細胞の子孫の生存、のいずれかを表し、そしてこれらの任意の組み合わせを表すことを意図する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、語句「心臓損傷」または「不十分な心機能によって特徴付けられる障害」は、任意の機能障害、または正常な心機能の非存在もしくは異常な心機能の存在を含む。異常な心機能は、疾患、損傷および／または老化の結果であり得る。本明細書で使用される場合、異常な心機能は、心筋細胞もしくは心筋細胞の集団の形態的および／または機能的な異常を含む。形態的および機能的な異常の非限定例は、心筋細胞の物理的な変質および／もしくは死滅、心筋細胞の異常な増殖パターン、心筋細胞間の物理的な結合における異常、心筋細胞による物質の過小産生もしくは過剰産生、物質（正常に産生する）を産生する心筋細胞の不全、そして異常パターンでもしくは異常時間における電気インパルスの伝達、を含む。異常な心機能は、例えば、虚血性心疾患（例えば、狭心症）、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、高血圧性心疾患、肺性心疾患（肺性心）、心弁膜疾患（例えば、リウマチ熱）、僧帽弁逸脱、僧帽弁輪の石灰化、カルチノイド心疾患、感染性心内膜炎、先天性心疾患、心筋症（例えば、心筋炎）、拡張型心筋症、高血圧心筋障害、うっ血性心不全をもたらす心臓障害、および心臓腫瘍（例えば、原発性肉腫ならび続発性腫瘍）を含む、多くの障害で見られる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、語句「心筋虚血」は、「心筋虚血損傷」を生じる心臓への酸素流量の欠乏を含む。本明細書で使用される場合、語句「心筋虚血損傷」は、心筋層への血流量の減少によって引き起こされる損傷を含む。心筋虚血および心筋虚血損傷の原因の非限定的な例としては、以下が挙げられる：大動脈の拡張期血圧の減少、心室内圧および心筋収縮の増大、冠動脈狭窄（例えば、冠状動脈結紮、固定冠状動脈狭窄、急性プラーク変化（例えば、裂傷、出血）、冠動脈血栓症、血管狭窄）、大動脈弁狭窄症ならびに大動脈弁逆流、および右心房圧の増大。心筋虚血および心筋虚血損傷の有害影響の非限定的な実施例としては、以下が挙げられる：筋細胞損傷（例えば、筋細胞損失、筋細胞肥大、筋細胞の細胞性肥厚）、狭心症（例えば、安定狭心症、異型狭心症、不安定狭心症、突然心臓死）、心筋梗塞およびうっ血性心不全。心筋虚血に起因する損傷は、急性または慢性であり得、そして、結果としては、瘢痕形成、心臓リモデリング、心臓肥大、薄い壁および関連している機能的な変化を包含し得る。急性もしくは慢性の心筋損傷ならびに／または心筋虚血の存在および病因は、任意の種々の方法、および当該分野で周知の技術（例えば、非侵襲性イメージング、血管造影、負荷試験、心臓特異的なタンパク質アッセイ（例えば、心臓トロポニン）、ならびに臨床的症状）を用いて、診断され得る。これらの方法および技術、そして別の適切な技術は、被験体が本明細書に記載される治療法に対して、適切な候補者であるか否かを決定するために使用され得る。
【００３０】
用語「処置」は、本明細書中で使用される場合、心筋損傷もしくは心筋機能不全の少なくとも一つの有害な影響または症状を減少するか、あるいは軽減する工程を包含する。特に、この用語は、心筋虚血、心筋虚血損傷、心臓障害または不十分な心機能によって特徴付けられる障害の処置に適用する。心臓障害の有害な影響または症状は多数あり、そして十分に特徴付けられている。心臓障害の有害な影響または症状の制限されない例は、以下を含む：呼吸困難、胸痛、心悸亢進、眩暈、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、疲労および死亡。広範囲の心臓障害の有害な影響または症状のさらなる例に関しては、Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｓ．Ｌ．ら（１９８４）Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）５４７−６０９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｓ．Ａ．ら編（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）２５７−３５６を参照のこと。
【００３１】
（ＩＩ．本発明の筋細胞）
本発明の方法を用いて移植され得る細胞は、骨格筋芽細胞および心筋細胞を含む。本発明で使用される細胞は、適切な哺乳動物の供給源（例えば、ブタまたはヒト）に由来され得る。これらは、例えば、これらが移植される被験体に対して、自己、同種異系、異種であり得る。好ましい実施形態において、この細胞は、ヒト細胞であり、そしてこれらの細胞が由来する、同じ個体への移植に使用されるか、または、同種被験体への移植に使用される。本発明における使用のための細胞は、任意の妊娠週令のドナー（例えば、これらは、成人細胞、新生児細胞、胎児細胞、胚幹細胞または胚幹細胞由来の筋細胞であり得る）に由来し得る（例えば、Ｋｌｕｇら、１９９６．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２１６によって記載されるように）。
【００３２】
標準方法は、本発明の筋細胞を調製するために使用され得る。筋細胞は、標準方法（例えば、機械的消化および／または酵素的消化）を用いてドナー筋組織から単離され得る。例えば、骨格筋芽細胞の調製において、骨格筋細胞は、例えば、四肢筋肉（例えば、四頭筋）から単離され得るか、または別の適切な筋肉（例えば、動物の後肢筋）から単離され得る；心筋細胞は、心臓組織から調製され得る。
【００３３】
所望される場合、筋組織が得られる部位は、組織を収集する前に刺激され得、筋芽細胞の数を増大させる。この刺激は、機械的であり得、そして／または、増殖因子のような化合物による処置であり得る。本発明の特定の実施形態に従って、約０．５ｇと約２．０ｇとの間の組織が単離される。本発明の特定の実施形態に従って、約２ｇと約４ｇとの間の組織が単離される。本発明の特定の実施形態に従って、約４ｇと約６ｇとの間の組織が単離される。例えば、消化培地に組織を置く前後に外科ナイフを用いて、組織は小片にカットされ得る。所望される場合、この段階で組織を消化するというよりはむしろ、この組織は将来的な使用のために凍結保存され得る。生体組織小片は、微細なフラグメントへと細かく裂かれ得る（例えば、二つのツベルクリン注射針アセンブリの針の先端を用いる）。結合組織は、除去され得る（例えば、外観検査を用いる）。所望される場合、これらの組織は、線維芽細胞を得るために、別々に培養され得る。
【００３４】
本発明の特定の実施形態に従って、消化培地は、プロテアーゼを含む。ある実施形態において、単一のプロテアーゼのみが使用される；他の実施形態において、別々の消化工程の順序（例えば、交互の）またはこの組み合わせのいずれかで、少なくとも二つのプロテアーゼが使用される。適切なプロテアーゼは、以下のいくつかを含み得る：カルボキシペプチダーゼ、カスパーゼ、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、パパイン、プロナーゼ、およびトリプシン（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より市販）。本発明の特定の実施形態に従って、ＥＤＴＡは、消化培地中に存在する。当業者に周知であるような、異なるプロテアーゼ濃度の範囲および消化温度の範囲が使用され得る。消化時間の範囲が使用され得る。一般的に、３７℃は、適当な温度であり、そして、５分と１５分との間、または８分と１０分との間が、適当な消化時間である。ボルテックスのような手順が、組織から細胞を分離する際に、補助するために使用され得る。
【００３５】
一連の消化工程が使用される、本発明のこれらの実施形態において、任意の種々の手順が続き得る。例えば、組織は、そして一定期間消化培地中で維持され得、続いて、消化培地が除去され得（例えば、細胞および組織をスピンダウンした後）、そして新しい培地と交換され得る。あるいは、組織塊から放出される細胞は、各々の消化工程で収集され得る。この工程は、筋芽細胞の精製を最大にするために、必要に応じて繰り返され得る。筋芽細胞、線維芽細胞などの絶対的な産生および相対的な産生は、各工程において推定され得る（例えば、外観検査によって）。単離された細胞は群へプールされ得、そして以下に記載されるように増殖され得る。筋細胞が多くの各消化工程において別々のプール中に回収される、本発明の特定の実施形態に従って、これは、例えば、各プールにおける筋芽細胞および線維芽細胞の割合に依存する、組み合わせおよび増殖に関して、特定のプールを選択するために所望であり得る。例えば、これは、約１０〜１２の消化工程の順序で実施されることが所望であり得る。これは、例えば、工程２〜７、工程３〜８、工程４〜９などの間に単離された細胞をプールすることが所望であり得る。一般的に、プールするための適切な集団の選択は、各プールにおける絶対的な細胞数および相対的な細胞数、所望される全細胞数、および移植可能な組成物に対して最終的に所望される細胞型に依存する。本発明の特定の実施形態に従って、細胞は、例えば、当該分野で周知の蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いてソートされ得る。ソーティングは、初期回収後（例えば、培養において細胞が増殖する前）、または増殖プロセスの間の任意の段階で実施され得る。ソーティングは、筋芽細胞または線維芽細胞の所望の割合を有する細胞集団を選択するために、使用され得る。ソーティングは、内皮細胞の数を減らすために使用され得る。
【００３６】
本発明はさらに、移植可能な筋細胞組成物を提供する。好ましくは、これらの組成物は、移植前に約５０未満の集団倍加で、インビトロで培養された筋細胞を含む。一つの実施形態において、筋細胞は、移植前にインビトロにおいて、約２０未満の集団倍加を受け得る。一つの実施形態において、筋細胞は、移植前にインビトロにおいて、約１０未満の集団倍加を受け得る。別の実施形態において、筋細胞は、移植前にインビトロにおいて、約５未満の集団倍加を受け得る。なお別の実施形態において、本発明の筋細胞は、移植前にインビトロにおいて、約１と約５との間の集団倍加を受け得る。別の実施形態において、本発明の筋細胞は、移植前にインビトロにおいて、約２と約４との間の集団倍加を受け得る。最適な倍加の数は、この細胞が単離された哺乳動物によって異なり得る；本明細書で示された最適な倍加の数は、ヒト細胞に対してである。他の種由来の細胞についての概算は、それらの種において老化に至る前の倍加の数とヒト細胞において老化に至る前の倍加の数を比較して、そしてそれに応じて倍加の数を調整することによってなされ得る。例えば、異なる種由来の細胞が、老化に至る前に、ヒト細胞の倍加の約半数を経る場合、これらの種についての集団倍加の好ましい数は、上記に示された数の約半数である。
【００３７】
一つの実施形態において、これらの組成物は、骨格筋細胞および線維芽細胞を含み、そして約２０〜約７０の筋芽細胞、および、好ましくは約４０〜６０％の筋芽細胞または約５０％の筋芽細胞から構成され得る。別の実施形態において、組成物は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の筋芽細胞を含む。これらの割合の筋芽細胞を有する組成物が、調製され得る（例えば、精製された細胞集団を得るために、標準的な細胞ソーティング技術を用いて）。次いで、精製された細胞集団は、所望の割合の筋芽細胞含む組成物を得るために混合され得る。あるいは、所望の割合の筋芽細胞を含む組成物は、制限された集団倍加の数に対して、新しく単離された骨格筋芽細胞集団をインビトロで培養することによって得られ得、その結果、組成物中の筋芽細胞の割合は、所望の範囲内に収まる。任意の理論によって結合されることは望まないが、本発明者らは、本発明の移植可能な組成物内の線維芽細胞の存在が、筋芽細胞の生存、増殖または分化および／あるいは移植抵抗力、新しい血管形成などを増強し得ることが可能であることを指摘する。従って、これは、本発明の移植可能な組成物内に線維芽細胞の変化する割合を含むことが所望であり得る。
【００３８】
なお別の実施形態において、筋細胞は、筋組織以外の組織供給源に由来する線維芽細胞（例えば、本発明の筋細胞と異なる組織の供給源（例えば、皮膚）に由来する線維芽細胞）と結合され得る。
【００３９】
例えば、細胞特異的なマーカーを有する片方または両方の細胞集団を染色することによって、そして、例えば、標準的な技術（例えば、ＦＡＣＳ分析）を使用して、マーカーを発現する組成物中の細胞の割合を決定することによって、組成物中の筋芽細胞および線維芽細胞の相対的な割合が決定され得る。例えば、筋芽細胞または線維芽細胞のいずれかで提示されるマーカーを認識する抗体は、各細胞型の相対的な割合を抗体によって決定するため、いずれか一方の細胞型または両方の細胞型を検出するのに使用され得る。例えば、筋芽細胞を認識する抗体が使用される場合、組成物中の筋芽細胞の割合は、抗体で染色する細胞の割合を評価することによって決定され、そして線維芽細胞の割合は、１００から筋芽細胞の割合を減算することによって決定される。一つの実施形態において、α７β１インテグリンを認識する抗体または筋細胞上もしくは筋細胞中に存在するミオシン重鎖を認識する抗体が、使用され得る（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、１９８７．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１７２：１）。内在性マーカーが使用される場合、これらの細胞は、染色前に透過され得る。染色に使用される一次抗体が、直接的に標識され、そして染色に使用され得るか、または二次抗体が、細胞への一次抗体の結合を検出するために使用され得る。
【００４０】
本発明の細胞および組成物は、新鮮で使用され得るか、またはこれらを移植に使用する前に培養され得、そして／もしくは凍結保存され得る。標準的な凍結保存の方法が使用され得る。
【００４１】
（ＩＩＩ．移植のための細胞の調製）
本発明の細胞は、移植前に、インビトロで増殖され得る。一つの実施形態において、本発明は、移植に用いる筋細胞の集団（すなわち、二つ以上の細胞群）を特色とする。本発明の筋細胞は、被験体に投与する前に、細胞培養で（すなわち、インビトロで増殖する細胞集団として）、細胞の増殖を支持するのに適した培地中で増殖され得る。
【００４２】
筋細胞の増殖および／または生存度を支持するために使用され得る培地は、当該分野で公知であり、そして哺乳動物細胞培養の培地を含む（例えば、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）製）。１９９４  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＆  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｕｉｄｅを参照のこと。この培地は無血清であり得るが、好ましくは、動物血清（例えば、ウシ胎仔血清）が補充される。必要に応じて、増殖因子が含まれ得る。筋細胞の増殖を促進するために使用される培地、および移植前に細胞維持のために使用される培地は、異なり得る。筋細胞に対して好ましい増殖培地は、ＭＣＤＢ  １２０＋デキサメタゾン（例えば、０．３９μｇ／ｍｌ）、＋上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、＋ウシ胎仔血清（例えば、１５％）である。筋細胞維持のために好ましい培地は、タンパク質（例えば、１０％ウマ血清）を補充されたＤＭＥＭである。他の例示的な培地は、例えば、Ｈｅｎｒｙら、１９９５．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４４：９３６；ＷＯ  ９８／５４３０１；およびＬｉら．１９９８．Ｃａｎ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１４：７３５）に教示される。
【００４３】
一つの実施形態において、骨格筋芽細胞は、１０％ＦＢＳ、デキサメタゾンおよびＥＧＦを含む筋芽細胞増殖基本培地で増殖するために、ラミニンでコートされたプレートへ播種され得る。筋芽細胞を富化したプレートは、４８時間増殖され、そして移植のために収集された。細胞は、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて収集され得、そしてＦＢＳを含む培地中で洗浄され得る。これらの単離物は、筋管融合形成および筋芽細胞または線維芽細胞に特異的なモノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーによって確認したところ、３０〜５０％の筋芽細胞を含み得る。本発明の特定の実施形態に従って、収集された細胞集団は、約５０％〜約６０％の筋芽細胞を含み得る。本発明の他の特定の実施形態に従って、収集された細胞集団は、約６０％〜約７５％の筋芽細胞を含み得る。本発明の他の特定の実施形態に従って、収集された細胞集団は、約７５％〜約９０％の筋芽細胞を含み得る。本発明の他の特定の実施形態に従って、収集された細胞集団は、約９０％〜約９５％の筋芽細胞を含み得る。本発明の他の特定の実施形態に従って、収集された細胞集団は、約９５％〜約９９％の筋芽細胞を含み得る。本発明の他の特定の実施形態に従って、収集された細胞集団は、９９％を超える筋芽細胞を含み得る。収集された細胞集団中の筋芽細胞の百分率が、移植可能な組成物に対して所望される筋芽細胞の百分率と異なる場合、この百分率は、細胞をソーティングすることによって調製され得、そして／または上記のように、異なる細胞集団を組み合わせることによって調節され得る。
【００４４】
本発明の特定の実施形態に従って、この細胞は、筋芽細胞融合の可能性を最小限にするかまたは減少するために選択された条件下で培養して増殖される。例えば、これは、亜コンフルエントな状態で細胞を維持するために所望され得る。これは、約５０％未満のコンフルエンス、約５０％〜約７５％未満のコンフルエンス、または約７５％〜約９０％未満のコンフルエンスの条件下で細胞を維持するために所望され得る。この細胞が所望されたコンフルエンスを上回らないことを確認するために、この細胞は、適当な間隔で継代され得る。
【００４５】
心筋細胞が培養して増殖される場合、好ましくは、少なくとも約２０％、さらに好ましくは少なくとも約３０％、なおより好ましくは少なくとも約４０％、なおさらに好ましくは少なくとも約５０％、そして最も好ましくは少なくとも約６０％、あるいはそれを超える心筋細胞は、心臓特異的な細胞産物の中でも特に、心臓のトロポニンおよび／もしくはミオシンを発現する。
【００４６】
一つの実施形態において、本発明の筋肉細胞は、ＥＧＦを含む培地中で、ポリＬリジンおよびラミニンでコートされた表面上で培養される。あるいは、コートされた表面は、ＦＧＦを含む培地を用いてコラーゲンでコートされ得る。この表面は、ペトリ皿または細胞の大規模培養に適切な表面であり得る。インビトロでの培養時間は、最大約１４日であり、そして好ましくは約７日である。この細胞は、インビトロにおいて約１倍からインビトロにおいて約１０倍まで集団を倍加させ得る。好ましくは、この細胞は、インビトロにおいて約５倍に集団を倍化させる。好ましくは、この細胞は、約１０倍まで集団を倍化させ、この結果、線維芽細胞  対  筋芽細胞の比は、約１：２〜１：１である。
【００４７】
（ＩＶ．細胞の改変）
本発明はまた、組成物中の細胞表面上の抗原を改変し、マスクし、もしくは除去することによって、細胞表面上の抗原を改変する工程を提供し、この結果、この組成物の被験体への移植において、この細胞の溶解は阻害される。好ましくは、この抗原は、この抗原に結合する抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体でマスクされ、より好ましくはこの抗体はモノクローナル抗体であり、そしてさらにより好ましくは、抗体は、抗ＭＨＣクラスＩ抗体またはそのフラグメントである。好ましくは、このフラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。このようなマスクすること、改変すること、または除去することは、好ましくは同種異系細胞もしくは幹細胞に対して実施される。
【００４８】
非改変状態または不変状態において、この細胞が被験体（本明細書でレシピエント、宿主またはレシピエント被験体ともいう）に投与される場合、細胞表面上の抗原は、この細胞（本明細書でドナー細胞ともいう）に対する免疫応答を刺激する。抗原を改変することにより、レシピエントの免疫系細胞によるドナー細胞の正常な免疫学的認識が破壊され、さらに、この改変された形態の抗原の「異常な」免疫学的認識は、レシピエントにおけるドナー細胞特異的な長期の不応答性を導き得る。従って、レシピエントへ細胞を投与する前のドナー細胞上の抗原の改変は、この細胞の投与後、宿主免疫系の細胞によるドナー細胞の認識の初期段階を妨害する。さらに、抗原の改変は、免疫学的な非応答性もしくは寛容を誘導し得、これによって、正常な免疫応答において外来細胞の拒否を最終的に担うエフェクター段階の免疫応答（例えば、細胞障害性Ｔ細胞の発生、抗体産生など）の誘導を妨げる。本明細書で使用されるように、用語「変更された（ａｌｔｅｒｅｄ）」および「改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」は、交換可能に使用され、そして、この抗原の免疫原性を減少させ、それによってレシピエントの免疫系による抗原の免疫学的な認識を妨げる、ドナー細胞の抗原に対して行われる変更を包含する。好ましくは、レシピエント被験体におけるドナー細胞への免疫学的な非応答性は、抗原の変更の結果として生じる。宿主免疫細胞に対する不適切なシグナルまたは不十分なシグナルの送達が、免疫学的な非応答性を達成するために必要であり得るので、用語「変更された（ａｌｔｅｒｅｄ）」および「改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」は、ドナー細胞上の抗原の完全な除去を包含することを意図しない。
【００４９】
本発明に従って改変される抗原は、同種レシピエントまたは異種レシピエントにおける免疫細胞（例えば、造血細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞）と相互作用するドナー細胞上の抗原を含み、そして、これにより、レシピエントにおけるドナー細胞に対して、特異的な免疫応答を刺激し得る。抗原と免疫細胞との間の相互作用は、間接的な相互作用（例えば、造血細胞における応答を誘導する可溶性因子によって媒介される（例えば、体液で媒介される））であり得るか、または、好ましくは、この抗原と免疫細胞表面上の分子の存在との間における直接的な相互作用（すなわち、細胞−細胞媒介性）である。本明細書で使用されるように、語句「免疫細胞」は、造血細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、および他の抗原提示細胞（ＮＫ細胞ならびにＬＡＫ細胞））を含むことを意図する。好ましい実施形態において、この抗原は、レシピエントにおけるＴリンパ球と相互作用する（例えば、Ｔリンパ球の表面上のレセプターと通常結合する抗原）か、またはレシピエントにおけるＮＫ細胞もしくはＬＡＫ細胞と相互作用するうちの一つである。
【００５０】
好ましい実施形態において、改変されるドナー細胞上の抗原は、ＭＨＣクラスＩ抗原である。ＭＨＣクラスＩ抗原は、ほとんどすべての細胞型上に発現している。正常な免疫応答において、自己ＭＨＣ分子は、自己Ｔリンパ球の表面上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）へ、抗原ペプチドを提示するよう機能する。同種細胞または異種細胞の免疫認識において、ドナー細胞上の外来ＭＨＣ抗原（おそらく、これに対して結合されたペプチドと共に）は、免疫応答を引き出すために、宿主Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターによって認識される。さらに、外来ＭＨＣクラスＩ抗原は、ＮＫ細胞上のＭＨＣクラスＩレセプターによって認識されることが知られている。ドナー細胞上のＭＨＣクラスＩ抗原は、同種宿主または異種宿主において、Ｔ細胞、ＮＫ細胞もしくはＬＡＫ細胞による認識を防止するために改変される（例えば、Ｔ細胞レセプター、ＮＫ細胞もしくはＬＡＫ細胞によって通常認識されるＭＨＣクラスＩ抗原の一部は、ブロックされるか、または「マスク」されるので、ＭＨＣクラスＩ抗原の通常の認識はもはや生じ得ない）。さらに、宿主Ｔ細胞、ＮＫ細胞もしくはＬＡＫ細胞に曝露されるＭＨＣクラスＩ抗原の改変された形態（すなわち、宿主細胞レセプターへ提示可能）は、宿主Ｔ細胞へ不適切なシグナルもしくは不十分なシグナルを送達し得、その結果、同種細胞もしくは異種細胞に対する免疫応答を刺激するのではなく、ドナー細胞特異的なＴ細胞の非応答、ＮＫ媒介性の細胞拒絶の阻害、そして／またはＬＡＫ媒介性の細胞拒絶の阻害が誘導される。例えば、Ｔ細胞レセプターを介して、不適切なシグナルもしくは不十分なシグナルを受けるＴ細胞（例えば、共刺激のシグナルの非存在下において、ＭＨＣ抗原に結合することによる（例えば、Ｂ７によって提供される））は、活性化されるのではなくアネルギー性になり、そして長期間の間、再刺激に対して低抗性を残存し得る（例えば、Ｄａｍｌｅら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５０９６−５１００；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、（１９８６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１２８９−１２９５；Ｇｉｍｍｉら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：６５７５−６５７９；Ｌｉｎｓｌｅｙら、（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０；Ｋｏｕｌｏｖａら、（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７５９−７６２；Ｒａｚｉ−Ｗｏｌｆら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２１０−４２１４を参照のこと）。
【００５１】
ＭＨＣクラスＩ抗原の代わりに、ドナー細胞上で改変される抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原であり得る。ＭＨＣクラスＩ抗原に類似して、ＭＨＣクラスＩＩ抗原は、Ｔリンパ球上のＴ細胞レセプターへ抗原ペプチドを提示することを機能する。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ抗原は、限られた数の細胞型（原始Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞および胸腺上皮細胞）上に存在する。ＭＨＣ抗原に加えて、またはＭＨＣ抗原の替わりに、宿主Ｔ細胞もしくは宿主ＮＫ細胞上の分子と相互作用し、そして同種細胞または異種細胞の免疫学的な拒絶に関与することが公知のドナー細胞上の他の抗原が、改変され得る。宿主Ｔ細胞と相互作用し、ドナー細胞の拒絶に寄与することが公知の他のドナー細胞の抗原は、ドナー細胞と宿主Ｔ細胞との間における相互作用の結合活性を増加するように機能する分子を含む。この特性に起因して、これらの分子は、代表的に、接着分子をいう（しかしながら、これらは、ドナー細胞と宿主Ｔ細胞との間の接着の増加に加えて、他の機能に役立ち得る）。本発明に従って改変され得る好ましい付着分子の例としては、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１が挙げられる。これらの分子は、それぞれ、Ｔ細胞上のＣＤ２およびＴ細胞上にＬＦＡ−１レセプターに対するリガンドである。ドナー細胞上の付着分子（例えば、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１または同様に機能する分子）を改変することによって、宿主Ｔ細胞がドナー細胞に結合する能力および宿主Ｔ細胞がドナー細胞と相互作用する能力は、低減される。ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１の両方は、移植された臓器（例えば、腎臓および心臓）における血管内で見出された内皮細胞上に見出される。これらの抗原を改変することは、ＣＤ２＋宿主Ｔリンパ球およびＬＦＡ−１＋宿主Ｔリンパ球によるこれらの抗原の認識を変えることによって、任意の血管新生化移植の移植を容易にし得る。
【００５２】
特定のドナー細胞上のＭＨＣ分子もしくは接着分子（例えば、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１など）の存在は、当該分野で公知の標準的な手順によって、評価され得る。例えば、ドナー細胞は、検出される分子（例えば、ＭＨＣ分子、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１など）に対して特異的な標識抗体と反応され得、そして、標識抗体と細胞との会合は、適切な技術（例えば、免疫組織化学、フローサイトメトリーなど）によって測定され得る。
【００５３】
この細胞に対する免疫応答を阻害するために、ドナー細胞上の抗原を変更するための好ましい方法は、この細胞表面上の抗原に結合する分子と細胞とを接触させることである。この細胞は、レシピエントへこの細胞を投与する前に、この抗原に結合する分子と接触されることが好ましい（すなわち、この細胞は、インビトロにおいてこの分子と接触される）。例えば、分子の抗原への結合を可能にする条件下で、この細胞は、この抗原に結合する分子と共にインキュベートされ得、次いで、任意の非結合性の分子が除去され得る。レシピエントへの改変された細胞を投与後、宿主細胞による免疫的な認識を防ぎ、そしてレシピエントにおける非反応性を誘導するのに十分な時間、この分子は、細胞上の抗原に結合したままである。
【００５４】
好ましくは、ドナー細胞上の抗原と結合する分子は、抗体、またはこの後退と結合する能力を有するそのフラグメントもしくは抗原である。治療適用での用途に関して、改変される抗原と結合する抗体は、補体を固定し得ない（従って、ドナー細胞の溶解を防ぐ）ことが必要である。抗体補体の固定化は、抗体のＦｃ部分の欠損により、補体を固定し得ない抗体アイソタイプを使用することにより、または補体固定化を阻害する薬物と共に補体固定抗体を使用することにより、妨げられ得る。あるいは、補体を活性化するために必要なＦｃ領域内のアミノ酸残基（例えば、Ｔａｎら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１６２−１６６；Ｄｕｎｃａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：７３８−７４０を参照のこと）は、変異されて、インタクトな抗体の補体活性能力を低減するかまたは除去し得る。同様に、Ｆｃ領域とＦｃレセプターとの結合に必要であるＦｃ領域内のアミノ酸残基はまた、インタクトな抗体が使用される場合、Ｆｃレセプター結合を低減するかまたは除去するために変異され得る（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｍ．およびＳ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；およびＬｕｎｄ，Ｊ．ら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２を参照のこと）。
【００５５】
抗原を改変するのに好ましい抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである。抗体は、従来の技術を用いて断片化され得る。例えば、抗体のＦｃ部分は、ペプシンを用いてインタクトな抗体を処理することによって除去され得、これによって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する標準的な手順において、インタクトな抗体は、固定化されたペプシンと共にインキュベートされ、そして消化された抗体の混合物は、固定化されたプロテインＡカラムに適用される。遊離Ｆｃ部分は、カラムに結合するが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、このカラムを通過する。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣによって、さらに精製され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントを産生するために、ジスルフィド架橋を減少するように処理され得る。
【００５６】
抗原を改変するために使用される抗体（または、これらのフラグメントもしくは誘導体）は、抗原上の多数のエピトープと反応性の抗体を含むポリクローナル抗血清から誘導され得る。好ましくは、この抗体は、抗原に対するモノクローナル抗体である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、当該分野で公知の標準的な技術によって調製され得る。例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ハムスターもしくはウサギ）は、哺乳動物における抗原に対する抗体応答を誘発するために、抗原またはこの抗原を（例えば、細胞表面上で）発現する細胞で免疫され得る。あるいは、抗原を発現する組織または全臓器は、抗体を誘発するために使用され得る。免疫化の進行は、血漿または血清における抗体力価の検出によってモニターされ得る。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイは、抗体のレベルを評価するために抗原と共に使用され得る。免疫後、抗血清が得られ得、そして、所望する場合、ポリクローナル抗体は血清から単離され得る。モノクローナル抗体を産生するために、抗体を産生する細胞（リンパ球）は、免疫された動物から収集され得、そして、標準的な体細胞性の融合手順によって、骨髄腫細胞と融合され得、このようにして、これらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を産生する。このような技術は、当該分野で周知である。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）によって最初に開発されたハイブリドーマの技術、および他の技術（例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌｌｅｎ  Ｒ．Ｂｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁））が使用され得る。ハイブリドーマ細胞は、特に、抗原および単離されたモノクローナル抗体と反応性の抗体の産生について、免疫化学的にスクリーニングされ得る。
【００５７】
抗原に対して反応性の特異的な抗体（または抗体フラグメント）を生成する別の方法は、抗原（または、これらの一部）を有する細菌中に発現される免疫グロブリン遺伝子（またはこれらの一部）をコードする発現ライブラリーをスクリーンすることである。例えば、完全なＦａｂフラグメント、ＶＨ領域、ＦＶ領域および単鎖抗体は、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌で発現され得る。例えば、Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６；Ｈｕｓｅら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照のこと。あるいは、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスが、抗体またはこれらのフラグメント（Ｇｅｎｐｈａｒｍから入手可能）を産生するために使用され得る。これらの技術によって作製される適切な結合特異性抗体は、ドナー細胞上の抗原を改変するために使用され得る。
【００５８】
抗体がヒト被験体に投与される場合（例えば、これらと結合された抗体を有するドナー細胞が、ヒト被験体に投与される場合）、そしてこの抗体に対する免疫応答が被験体で発生され得る場合、非ヒト被験体で産生された抗体またはこれらのフラグメントは、異物として種々の度合いで認識され得る。この問題を最小化するかもしくは除去するための一つのアプローチは、キメラ抗体の誘導体またはヒト化抗体の誘導体（すなわち、非ヒト抗体から誘導される部分およびヒト抗体から誘導される部分を含む抗体分子）を産生することである。キメラ抗体分子は、例えば、ヒト定常領域を有するマウス、ラットもしくは他の種の抗体由来の抗原結合ドメインを含み得る。キメラ抗体を作製する種々のアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１（１９８５）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，４５２（１９８５），Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、ヨーロッパ特許公開ＥＰ１７１４９６；ヨーロッパ特許公開０１７３４９４、イギリス特許ＧＢ２１７７０９６Ｂを参照のこと。治療用途における使用に関して、ドナー細胞抗原を改変するために使用される抗体は、Ｆｃ部分を含まないことが好ましい。従って、抗体の可変領域の一部（特に、抗原結合ドメインの保存されたフレームワーク領域）が、ヒト起源であり、かつ超可変領域のみが非ヒト起源ヒト化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが好ましい抗体誘導体である。このように改変された免疫グロブリン分子は、当該分野（例えば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，７３０８−７３１２（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４，７２７９（１９８３）；Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２，３−１６（１９８２））で公知の任意のいくつかの技術によって作製され得、そして、好ましくは、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３またはＥＰ  ０２３９４００の技術に従って作製される。ヒト化抗体は、例えば、Ｓｃｏｔｇｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２  Ｈｏｌｌｙ  Ｒｏａｄ，Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎによって、商業的に産生され得る。
【００５９】
改変されるべき細胞表面の各々、（例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１）は、十分に特徴付けられた分子であり、そしてこれらの抗原に対する抗体は、市販されている。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩ抗原に対する抗体（すなわち、抗ＨＬＡクラスＩ抗体）（Ｗ６／３２）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ９５）から入手可能である。この抗体は、ヒト扁桃腺のリンパ球膜に対して産生され、そしてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃに結合する（Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ，Ｃ．Ｊ．ら（１９７８）Ｃｅｌｌ  １４：９−２０）。使用され得る別の抗ＭＨＣクラスＩ抗体は、ＰＴ８５である（Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｃ．ら、（１９８４）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｎ．Ｊ．ＳｔｅｒｎおよびＨ．Ｒ．Ｇａｍｂｌｅ，編，ＲｏｗｎｍａｎおよびＡｌｌｅｎｈｅｌｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐ１２１を参照のこと；Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡから市販される）。この抗体は、ブタ白血球抗原（ＳＬＡ）に対して産生され、そして、いくつかの異なる種（例えば、ブタ、ヒト、マウス、ヤギ）由来のクラスＩ抗原と結合する。抗ＩＣＡＭ−１抗体は、ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ．（Ｍａｉｎｅ）から得られ得る。抗ＬＦＡ−３を産生するハイブリドーマ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから得られ得る。好ましい実施形態において、この抗体はＰＴ８５である。
【００６０】
本発明で使用されるのに適当な抗体（またはこれらのフラグメントもしくは誘導体）は、同種細胞または異種細胞の免疫学的な拒絶を阻害する能力に基づいて同定され得る。簡単に言えば、この抗体（または抗体フラグメント）は、移植される細胞または組織と共に、短期間の間（例えば、室温で３０分）、インキュベートされ、そして、任意の非結合性抗体は洗い流される。次いで、細胞もしくは組織は、レシピエント動物へ移植される。次いで、抗体の前処置が移植された細胞もしくは組織の拒絶を阻害する能力もしくは妨げる能力が、処置されていないコントロールと比較された細胞もしくは組織の拒絶をモニターすることによって、決定される。
【００６１】
抗原を改変するために使用される抗体（またはこれらのフラグメントもしくは誘導体）は、少なくとも１０−７Ｍの抗原と結合するアフィニティーを有する。抗原と結合する抗体または他の分子のアフィニティーは、従来の技術によって決定され得る（Ｍａｓａｎ，Ｄ．Ｗ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８７：１−１０を参照のこと）。簡単に言えば、試験される抗体は、１２５Ｉで標識され、そして平衡状態に到達するまで、増加する濃度において抗原を発現する細胞と共にインキュベートされる。データは、［結合抗体］／［遊離抗体］対［結合抗体］としてグラフにプロットされ、そして、線の傾きは、ｋＤ（スキャッチャード分析）に相当する。
【００６２】
ドナー細胞上の抗原に結合し、そして抗体またはこれらのフラグメントもしくは誘導体と類似の結果を機能的に生じる他の分子（例えば、抗原と造血細胞との相互作用を防止し、そして免疫学的な非反応性を誘導する他の分子）は、ドナー細胞上の抗原を改変するために使用され得る。このような分子の一つは、ドナー細胞上の抗原を改変するために使用され得た、ドナー細胞上の抗原（例えば、レセプター）に対するリガンドの可溶性形態である。例えば、ＣＤ２の可溶性形態（すなわち、膜貫通型ドメインまたは細胞質ドメインがないＣＤ２の細胞外ドメインを含む）は、抗体と類似の様式で、ドナー細胞上のＬＦＡ−３と結合することによって、ドナー細胞上のＬＦＡ−３を変えるために使用され得る。あるいは、ＬＦＡ−１の可溶性形態は、ドナー細胞上のＩＣＡＭ−１を改変するために使用され得る。リガンドの可溶性形態は、細胞外ドメインを取り囲むリガンドをコードする（すなわち、膜貫通型ドメインおよび細胞質ドメインをコードするＤＮＡを欠く）ＤＮＡを含む組換え発現ベクターを使用して、標準的な組換えＤＮＡ手順によって作製され得る。リガンドの細胞外ドメインをコードする組換え発現ベクターは、可溶性のリガンド（これは、次いで単離され得る）を産生するために、宿主細胞へ導入され得る。この細胞がレシピエントへ投与される場合、有用な可溶性リガンドは、免疫学的な認識を防ぎ、そして非反応性を誘導するレセプターへの結合を維持するのに十分な、ドナー細胞上のレセプターに対する結合アフィニティーを有する（例えば、好ましくは、可溶性リガンドのレセプターへの結合に対するアフィニティーは、少なくとも約１０−７Ｍである）。さらに、可溶性リガンドは、別のタンパク質またはタンパク質の一部と融合されたリガンドのレセプター結合部分を含む、融合タンパク質の形態であり得る。例えば、細胞外ドメインを含む免疫グロブリン融合タンパク質、または免疫グロブリンの重鎖の定常領域（例えば、ヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域）に結合したＣＤ２またはＬＦＡ−１の機能的部分が使用され得る。免疫グロブリン融合タンパク質は、例えば、Ｃａｐｏｎ，Ｄ．Ｊ．ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：５２５−５３１およびＣａｐｏｎおよびＬａｓｋｙによる米国特許第５，１１６，９６４号の技術に従って調製され得る。
【００６３】
ＭＨＣ抗原（および、例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原）を変えるために使用され得る別な型の分子は、ＭＨＣ抗原に結合するペプチドであり、そして、ＭＨＣ抗原とＴリンパ球、ＮＫ細胞またはＬＡＫ細胞との相互作用を防止するペプチドである。一つの実施形態において、可溶性ペプチドは、ＭＨＣ抗原と接触するＴ細胞レセプターの領域を模倣する。このペプチドは、インタクトなＴ細胞レセプター（Ｔリンパ球上）とＭＨＣ抗原との相互作用を防止するために使用され得る。このようなペプチドは、Ｔ細胞レセプター（例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原のα−１ドメインまたはα−２ドメイン）の一部によって特異的に認識されるＭＨＣ分子の領域に結合し、これによって、ＭＨＣクラスＩ抗原を変え、そして、Ｔ細胞レセプターによる抗原の認識を阻害する。別の実施形態において、可溶性ペプチドは、ＭＨＣ抗原と接触するＴ細胞表面分子の領域（例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原と接触するＣＤ８分子の領域、またはＭＨＣクラスＩＩ抗原と接触するＣＤ４分子の領域）を模倣する。例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原のα−３ループ領域と結合するペプチドは、ＣＤ８とこの抗原との結合を阻害するために使用され得、これによって、Ｔ細胞による抗原の認識を阻害する。Ｔ細胞レセプター誘導性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限性の免疫応答を阻害するために使用されており（例えば、Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．ら（１９９３）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：４７７−４７８を参照のこと）、そして、レシピエントに対して皮下に注射される場合、インビボにおける同種皮膚移植片の生存を長引かせるために使用されている（例えば、Ｇｏｓｓ，Ｊ．Ａ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９８７２−９８７６を参照のこと）。
【００６４】
ドナー細胞上の抗原はさらに、同じ抗原または異なる抗原と結合する二つ以上の分子を使用することによって、改変され得る。例えば、同じ抗原上の二つの異なるエピトープに対して特異的な二つの異なる抗体が使用され得る（例えば、二つの異なる抗ＭＨＣクラスＩ抗体が組み合わせで使用され得る）。あるいは、同じ抗原と結合する二つの異なる分子型が使用され得る（例えば、抗ＭＨＣクラスＩ抗体およびＭＨＣクラスＩ結合性ペプチド）。ヒト細胞で使用され得る抗ＭＨＣクラスＩ抗体の好ましい組み合わせは、Ｗ６／３２抗体およびＰＴ８５抗体、またはＦ（ａｂ’）２フラグメント自体である。被験体へ投与されるドナー細胞が、一より多くの造血細胞相互作用的な抗原を生じる場合、二つ以上の処置が共に使用され得る。例えば、異なる抗原に対して各々指向される、二つの抗体（例えば、抗ＭＨＣクラスＩ抗体および抗ＩＣＡＭ−１抗体）は、組み合わせで使用され得るか、または、異なる抗原と各々結合する、二つの異なる分子型が使用され得る（例えば、抗ＩＣＡＭ−１抗体およびＭＨＣクラスＩ結合ペプチド）。あるいは、ドナー細胞を含む全体のドナー細胞または全体のドナー組織に対して産生されたポリクローナル抗血清は、Ｆｃ領域の除去後に、ドナー細胞の多様な細胞表面抗原を改変するために、使用され得る。
【００６５】
同じ抗原に結合する二つの異なるモノクローナル抗体が、抗原上の異なるエピトープに結合する能力は、競合結合アッセイを用いて決定され得る。簡単に言えば、一つのモノクローナル抗体が標識され、そして、抗原を発現する細胞を染色するために使用される。次いで、非標識化二次モノクローナル抗体が、一次標識化モノクローナル抗体と細胞上の抗原との結合を阻害する能力が評価される。二次モノクローナル抗体が、一次抗体に比べて抗原上の異なるエピトープに結合する場合、二次抗体は、一次抗体と抗原との結合を競合的に阻害し得ない。
【００６６】
細胞に対する免疫応答を阻害するために、ドナー細胞上の抗原の少なくとも二つの異なるエピトープを改変する好ましい方法は、この細胞をエピトープに結合する少なくとも二つの異なる分子と接触することである。この細胞をレシピエントへ投与する前に、この細胞は、少なくとも二つの異なる分子（異なるエピトープに結合する）と接触されることが好ましい（すなわち、この細胞はインビトロにおいてこの分子と接触される）。例えば、この細胞は、分子とエピトープとの結合を可能にする条件下で、エピトープに結合する分子と共にインキュベートされ得、次いで、任意の非結合性分子が除去され得る。ドナー細胞のレシピエントへ投与後、この分子は、十分な時間の間、表面抗原上のエピトープと結合し続け、宿主細胞による免疫学的な認識を妨害し、そして、レシピエントにおける非応答性を誘導する。
【００６７】
この細胞の免疫学的な拒絶を阻害するために、ドナー細胞上の抗原と分子（例えば、抗体）との結合に替わり、ドナー細胞上の抗原は、他の手段によって改変され得る。例えば、この抗原は、直接的に改変され（例えば、変異され）得、この結果、これは、もはや同種レシピエントまたは異種レシピエントにおいて、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球）、ＮＫ細胞またはＬＡＫ細胞と正常に相互作用し得ず、そしてレシピエントにおいて免疫学的な非応答性をドナー細胞へ誘導する。例えば、Ｔ細胞活性化に寄与しないが、Ｔ細胞上のレセプターと結合する際、Ｔ細胞に対して不適当なシグナルまたは不十分なシグナルを送達するクラスＩ  ＭＨＣ抗原または付着分子（例えば、ＬＦＡ−３もしくはＩＣＡＭ−１）の変異形態が、変異誘発および選択によって作製され得る。次いで、抗原の変異形態をコードする核酸は、（野生型抗原をコードする内在性遺伝子を置換するために）導入遺伝子または相同的組み換えのどちらか一方によって、非ヒト動物のゲノムへ挿入され得る。次いで、抗原の変異形態を発現する非ヒト動物由来の細胞は、同種レシピエントまたは異種レシピエントへ移植するためのドナー細胞として使用され得る。
【００６８】
あるいは、ドナー細胞上の抗原は、下方調節（ｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｅ）することによって、またはドナー細胞の表面上の発現レベルを変えることによって改変され得、その結果、抗原とレシピエント免疫細胞との間の相互作用が改変される。ドナー細胞上の一つ以上の抗原の表面発現のレベルを減少することによって、ドナー細胞と免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞）との間の相互作用の結合活性は減少される。ドナー細胞上の抗原の表面発現のレベルは、転写、翻訳または細胞表面への抗原の輸送を阻害することによって、下方調節され得る。抗原の表面発現を減少する因子は、ドナー細胞と接触され得る。例えば、多数の腫瘍ウイルスは、感染細胞においてＭＨＣクラスＩの発現を減少することが実証されている（Ｔｒａｖｅｒｓら、（１９８０）Ｉｎｔ‘ｌ．Ｓｙｍｐ．ｏｎ  Ａｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ，１７５１８０；Ｒｅｅｓら、（１９８８）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７：３７４−３７７）。さらに、ＭＨＣクラスＩ発現のこの効果は、インタクトなウイルスに加えて、ウイルスゲノムのフラグメントを用いて達成され得ることが見出されている。例えば、アデノウイルスのフラグメントを用いた培養された腎臓細胞へのトランスフェクションは、表面ＭＨＣクラスＩの抗原性発現の排除の原因となる（Ｗｈｏｓｈｉら、（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１５３−２１６４）。ドナー細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ発現を減少する目的で、非感染性のウイルスフラグメントは、全ウイルスであることが好ましい。
【００６９】
あるいは、ドナー細胞表面上の抗原のレベルは、抗原をキャッピングすることによって改変され得る。キャッピングは、表面抗原の凝集および不活性化を引き起こす抗体の使用をいう用語である。キャッピングを誘導するために、組織は、改変される抗原に対して特異的に一次抗体と接触され、抗原−抗体免疫複合体の形成を可能にする。その後、この組織は、一次抗体を有する免疫複合体を形成する二次抗体と接触される。二次抗体を用いた処置の結果、一次抗体は、凝集され細胞表面上の単一位置において、キャップを形成する。キャッピングの技術は周知であり、例えば、Ｔａｙｌｏｒら、（１９７１），Ｎａｔ．Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．２３３：２２５−２２７；およびＳａｎｔｉｓｏら、（１９８６），Ｂｌｏｏｄ，６７：３４３−３４９に記載されている。ＭＨＣクラスＩ抗原を改変するために、ドナー細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と反応性の一次抗体（例えば、Ｗ６／３２抗体、ＰＴ８５抗体）と共にインキュベートされ、その後ドナー種に反応性の二次抗体（例えば、ヤギ抗マウス抗体）と共にインキュベートされ、凝集を生じる。
【００７０】
（Ｖ．細胞の遺伝的改変）
本発明の筋細胞（または本発明の筋細胞組成物中に含まれる他の細胞）は、「遺伝子産物を発現するために改変」され得る。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子産物を発現するための改変される」とは、この細胞によって遺伝子産物の産生を生じる様式で、この細胞が処置されることを意味することが意図される。好ましくは、この細胞は、改変前に遺伝子産物を発現しない。あるいは、この細胞の改変は、この細胞によってすでに発現された遺伝子産物の増加された産生を生じ得るか、または、別の産生（この細胞によって通常発現される所望でない遺伝子産物）を減少する遺伝子産物（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子）の産生を生じ得る。
【００７１】
一つの実施形態において、骨格筋細胞は、これらをより心臓様にする遺伝子産物（例えば、コネキシン４３）を産生するように改変される（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８９．１０８：５９５）。
【００７２】
好ましい実施形態において、細胞は、この細胞へ遺伝物質（例えば、核酸分子（例えば、ＲＮＡまたは、より好ましくはＤＮＡ）を導入することにより、遺伝子産物を発現するように改変される。この細胞へ導入される核酸分子は、この細胞によって発現される遺伝子産物をコードする。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子産物」は、タンパク質、ペプチドおよび機能的なＲＮＡ分子を含むことが意図される。一般的に、核酸分子によってコードされる遺伝子産物は、被験体に供給される所望の遺伝子産物である。あるいは、コード化遺伝子産物は、この細胞によって所望の遺伝子産物の発現を誘導する遺伝子産物である（例えば、導入された遺伝子物質は、被験体に供給される遺伝子産物の転写を誘導する転写因子をコードする）。
【００７３】
遺伝的に改変された筋細胞を介して、被験体へ送達され得る遺伝子産物の例としては、将来的に心疾患を妨げ得る遺伝子産物（例えば、心筋に浸潤する血管を助長する増殖因子（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）１、ＦＧＦ−２、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）およびアンジオテンシン）が挙げられる。遺伝的に改変された心筋細胞を介して、被験体へ送達され得る他の遺伝子産物としては、心筋細胞の生存を促進する因子（例えば、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＣＴＬＡ  ４−Ｉｇおよびｂｃｌ−２）が挙げられる。
【００７４】
細胞へ導入される核酸分子は、核酸によってコードされる遺伝子産物の細胞中の発現に対して適切な形態である。従って、核酸分子は、遺伝子（またはこれらの一部）の転写、および遺伝子産物がタンパク質またはペプチドである場合、遺伝子によってコードされる遺伝子産物の翻訳に必要とされるコード化配列ならびに調節配列を含む。核酸分子中に含まれ得る調節配列として、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナル、ならびにコード化タンパク質またはコード化ペプチドの輸送に必要な配列（例えば、細胞表面に対するタンパク質もしくはペプチドの輸送または分泌に関するＮ末端シグナル配列）を含む。
【００７５】
遺伝子産物の発現を調節するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列）は、この遺伝子産物が発現される細胞型、および所望されるレベルの遺伝子産物の発現に基づいて選択される。例えば、プロモーターに連結される遺伝子の細胞型特異的発現を与えることが公知であるプロモーターが、使用され得る。筋芽細胞の遺伝子発現に特異的なプロモーターは、この遺伝子産物の筋肉特異的な発現を与えるような目的の遺伝子に連結され得る。当該分野で公知の筋肉特異的調節エレメントは、ジストロフィン遺伝子（Ｋｌａｍｕｔら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２３９６）、クレアチンキナーゼ遺伝子（ＢｕｓｋｉｎおよびＨａｕｓｃｈｋａ、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２６２７）およびトロポニン遺伝子（ＭａｒおよびＯｒｄａｈｌ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：６４０４）の上流領域を含む。他の細胞型に特異的な調節エレメントは、当該分野で公知である（例えば、肝臓特異的発現に対するアルブミンエンハンサー；膵島細胞特異的発現に対するインスリン調節エレメント；種々の神経細胞特異的調節エレメント（神経ジストロフィン、神経エノラーゼおよびＡ４アミロイドプロモーターを含む））。あるいは、種々の異なる細胞型において、構成的な遺伝子発現を指向し得る調節エレメント（例えば、ウイルス調節エレメント）が、使用され得る。遺伝子発現を駆動するのに一般的に使用されるウイルスプロモーターの例としては、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスならびにシミアン  ウイルス４０、ならびにレトロウイルスＬＴＲから誘導されるプロモーターが挙げられる。あるいは、これらのプロモーターに連結された誘導可能な遺伝子発現を提供する調節エレメントが、使用され得る。調節誘導可能エレメント（例えば、誘導可能プロモーター）の使用は、細胞における遺伝子産物の産生の調節を可能にする。真核細胞における使用のための潜在的に有用性のある誘導調節系の例としては、ホルモン−調節エレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３−５６０７を参照のこと）、合成リガンド−調節エレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−１０２４を参照のこと）および電離放射線−調節エレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０６０７−１０６１３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０１４９−１０１５３）が挙げられる。発展され得るさらなる組織特異的な調節系または誘導可能調節系がまた、本発明に従って使用され得る。
【００７６】
本発明の細胞を改変するために適用され得る細胞へ遺伝物質を導入することについての、当該分野で公知の多数の技術が存在する。一つの実施形態において、核酸は、裸の核酸分子の形態である。この状態において、改変される細胞へ導入される核酸分子は、遺伝子産物をコードする核酸および必要な調節エレメントのみからなる。あるいは、遺伝子産物をコードする核酸（必要な調節エレメントを含む）は、プラスミドベクター内に含まれる。プラスミド発現ベクターの例としては、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。別の実施形態において、細胞へ導入される核酸分子は、ウイルスベクター内に含まれる。この状態において、遺伝子産物をコードする核酸は、ウイルスゲノム（または部分的なウイルスゲノム）へ挿入される。遺伝子産物の発現を指向する調節エレメントは、ウイルスゲノムへ挿入される核酸と共に含まれ得るか（すなわち、ウイルスゲノムへ挿入される遺伝子と連結される）、または、ウイルスゲノム自身によって提供され得る。
【００７７】
裸のＤＮＡは、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含む沈殿物を形成することによって、細胞へ導入され得る。あるいは、裸のＤＮＡはまた、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デキストランの混合物を形成し、そして、この混合物をこの細胞と共にインキュベートすることによって、または、適切な緩衝液中でこの細胞とこのＤＮＡを共にインキュベートし、そして、高圧電気パルス（すなわち、エレクトロポレーションによって）に細胞を供することによって、細胞へ導入され得る。裸のＤＮＡ細胞に導入するためのさらなる方法は、ＤＮＡとカチオン脂質を含むリポソーム懸濁液とを混合することによる。次いで、ＤＮＡ／リポソーム複合体は、細胞と共にインキュベートされる。裸のＤＮＡはまた、例えば、マイクロインジェクションによって、細胞へ直接的に注入され得る。インビトロでの細胞培養について、ＤＮＡは、インビトロにおけるマイクロインジェクション、またはインビボにおける遺伝子銃によって導入され得る。あるいは、裸のＤＮＡはまた、ＤＮＡをカチオン（例えば、ポリリジン）と複合することによって、細胞へ導入され得、細胞表面レセプターに対するリガンドと結合される（例えば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；および米国特許第５，１６６，３２０号を参照のこと）。レセプターへのＤＮＡ−リガンド複合体の結合は、レセプター媒介性エンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みを促進する。細胞に裸のＤＮＡを導入する工程を包含し、遺伝子産物を発現するために改変される細胞を生成する代替方法は、目的の遺伝子産物を発現するために改変された細胞を含むトランスジェニック動物を作製することである。
【００７８】
核酸（例えば、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターの用途は、核酸を細胞へ導入する好ましいアプローチである。ウイルスベクターでの細胞の感染は、大部分の細胞が核酸を受け入れるという利点を有する（これは、核酸を受け入れている細胞を選択する必要性を除去し得る）。さらに、ウイルスベクター内にコードされる分子（例えば、ウイルスベクター内に含まれるｃＤＮＡによって）は、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞内に、効率的に発現され、そしてウイルスベクター系は、インビトロまたはインビボのいずれかで使用され得る。
【００７９】
欠陥性レトロウイルスは、遺伝子治療の目的における遺伝子導入での用途に対して、十分に特徴付けられる（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１を参照のこと）。組換えレトロウイルスは、目的の遺伝子産物をコードする核酸を、レトロウイルスゲノムへ挿入させて構築され得る。さらに、レトロウイルスゲノムの一部は、レトロウイルスを複製欠陥にするために除去され得る。次いで、複製欠陥レトロウイルスは、ビリオン（標準的な技術により、ヘルパーウイルスの利用を介して、標的細胞を感染するために使用され得る）の中へパッケージされる。
【００８０】
アデノウイルスのゲノムは操作され得、この結果、目的の遺伝子産物をコードし、そして目的の遺伝子産物を発現するが、通常の溶解ウイルス生活環での複製能力の観点では、不活性化されている。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照のこと。アデノウイルス株  Ａｄ５型  ｄ１３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適当なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、遺伝子送達媒体に効果的であるために分裂細胞を必要としないという点で有利であり、そして、広範囲の細胞型（気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）前出で引用）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２−２８１６）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１−２５８４）を含む）を感染するために使用され得る。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびこれらに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれず、エピソームに残存し、これによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）へ組み込まれる状況において、挿入突然変異の結果として生じ得る潜在的な問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの運搬能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前出で引用；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在使用されるほとんどの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１遺伝子およびウイルスＥ３遺伝子の全部または一部を欠失されるが、８０％程度に多くのアデノウイルスの遺伝子物質を保持する。
【００８１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製に関するヘルパーウイルスおよび増殖的なライフサイクルとして、別のウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を必要とする、天然に存在する欠陥ウイルスである（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９を参照のこと）。これはまた、このＤＮＡを非分裂細胞へ組み込み得る数少ないウイルスの一つであり、そしてこれは、高頻度の安定した組み込みを示す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら、（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照のこと）。３００塩基対ほどの大きさのＡＡＶを含むベクターは、パッケージされ得、そして組み込み得る。外因性ＤＮＡに対するスペースは、約４．５ｋｂに制限される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記載されるようなＡＡＶベクターを使用して、ＤＮＡを細胞へ導入し得る。種々の核酸は、ＡＡＶベクターを用いることによって、異なる細胞型へ導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照のこと）。
【００８２】
核酸を細胞集団へ導入するために使用される方法が、大部分の細胞の改変を生じ、かつ細胞による遺伝子産物の効率的な発現を生じる場合（例えば、しばしばあることだが、ウイルス発現ベクターを用いる場合）、改変された細胞集団は、集団内において、個々の細胞のさらなる単離あるいはサブクローン化をしないで使用され得る。すなわち、細胞の集団による遺伝子産物は十分な生産量であり得、この結果、これ以上の細胞単離は必要とされない。あるいは、遺伝子産物を効率的に発現する細胞を単離するために、改変された単一の細胞から同様に改変された細胞の同種集団を増殖することが所望され得る。このような均一細胞集団は、希釈クローニングを制限することにより、単一の改変された細胞を単離することにより調製され、その後、標準的な技術で培養中の単一細胞をクローンな細胞集団へ増殖し得る。
【００８３】
遺伝子産物を発現する細胞を改変するために、核酸分子を細胞へ導入する替わりに、細胞による遺伝子産物の発現レベルを誘導するかまたは増大することによって、細胞は改変され得る。例えば、細胞は特定の遺伝子産物を発現する可能性があり得るが、細胞の付加的な処理がないとこのようにはできない。同様に、この細胞は、所望される目的に対して、十分量の遺伝子産物を発現し得る。従って、遺伝子産物の発現を刺激する因子を使用して、この細胞による遺伝子産物の発現を誘導または増大し得る。例えば、細胞は、インビトロにおいて培養培地中の因子と接触され得る。遺伝子産物の発現を刺激する因子は、例えば、その産物をコードする遺伝子の転写を増加することによって、産物をコードするｍＲＮＡの翻訳速度もしくは安定性（例えば、転写後改変（例えば、ポリＡ尾部））を増大させることによって、または遺伝子産物の安定性、輸送もしくは局在化を増大させることによって、機能し得る。遺伝子産物の発現を誘導するために使用され得る因子の例としては、サイトカインおよび増殖因子が挙げられる。
【００８４】
細胞による遺伝子産物の発現を誘導するかまたは増大するために使用され得る別の因子の型は、産物をコードする遺伝子の転写をアップレギュレートする転写因子である。目的の遺伝子産物をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする転写因子は、例えば、転写因子をコードする核酸分子を細胞へ導入することによって、細胞に提供され得る。従って、このアプローチは、（例えば、以前検討された方法の一つにより）細胞へ導入され得る核酸分子の代替型を表す。もしそうなら、導入された核酸は、目的の遺伝子産物を直接コードせず、むしろ遺伝子産物の発現を誘導することによって、間接的に細胞による遺伝子産物の生産を与える。
【００８５】
一つの実施形態において、本発明は、筋芽細胞における心臓細胞遺伝子産物を組み換え的に発現することによって、骨格筋芽細胞における心臓細胞の表現型を促進する方法を提供し、この結果、心臓細胞の表現型は促進される。一つの実施形態において、遺伝子産物はＧＡＴＡ転写因子であり、そして、好ましくは、ＧＡＴＡ４またはＧＡＴＡ６である。ＧＡＴＡ６をコードするヌクレオチド配列は、例えば、任意の公衆データベースまたは私的なデータベースで見出され得る。この配列は、例えば、受入番号００５２５７としてＧｅｎＢａｎｋで入手できる。この配列はまた、例えば、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９６．３８（３）：２８３−９０で教示される。ＧＡＴＡ−４をコードするヌクレオチド配列はまた、種々のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ３４３５７で）を通じて入手できる。別の実施形態において、この細胞は、血管形成の遺伝子産物（例えば、ＣＴＧＦ（Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９９年７月１日；１２６：１３７）、ＶＥＧＦ（Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９年１月；９０：９３−１００）、ＩＧＲ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ  βまたは血管形成因子を誘導するために間接的に作用する因子（例えば、ＦＧＦ  ４（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７年１２月１５日；５７（２４）５５９０−７）））を組み換え的に発現するように操作され得る。
【００８６】
（ＶＩ．細胞性移植、移植可能な組成物、および処置の方法）
用語「被験体」は、哺乳動物（特に、ヒト）を含むことを意図する。被験体の例は、霊長類（例えば、ヒトおよびサル）を含む。本発明の方法を用いる移植に適する被験体は、不十分な心機能または心臓損傷または心筋虚血性損傷によって特徴付ける障害を有する。
【００８７】
本発明の筋細胞を心機能不全または心臓損傷（例えば、心筋虚血に起因する心機能不全または心臓損傷）を有する被験体の心臓への移植は、種々の方法において心機能を改善し得る。本発明の移植可能な組成物は、存在する心筋細胞を補充し得、そして／または失われた心筋細胞の置換を生じ得る。本発明の特定な実施形態に従って、心臓へ送達後、骨格筋芽細胞および／もしくは線維芽細胞は生存し、分化し、そして／または増殖する。例えば、本発明の特定な実施形態に従って、骨格筋芽細胞は、筋管および／または筋線維を形成するためにインビボにて融合する。骨格筋芽細胞の生存、分化および／または増殖の証拠（例えば、筋管および／または筋繊維形成の証拠）は、このような細胞に特徴的である細胞の遺伝子発現および／またはタンパク質発現（マーカー）に対して心臓組織を検査することによって得られ得る。血管新生の証拠は、内皮細胞に特徴的である遺伝子および／またはタンパク質を発現する細胞に対して、心臓組織を検査することによって得られ得る。特に、心臓組織は、以下の一つ以上の細胞型（骨格筋芽細胞、骨格筋管、骨格筋線維、線維芽細胞ならびに内皮細胞）に存在する遺伝子および／またはタンパク質を発現する細胞の存在に対して検査され得る。当該分野で周知である種々のマーカーが使用され得る。組織標本の免疫組織学的な検査は、タンパク質発現（実施例を参照のこと）を評価する簡便な手段であるが、ｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現を評価する他の適切な手段は、例えば、ＰＣＲ、マイクロアレイハイブリダイゼーション、ノーザンブロットもしくはウエスタンブロットなどを包含して使用され得る。骨格筋芽細胞は、これらの細胞をマーカー（例えば、ミオゲニン、ｍｙｏＤもしくはｍｙｆ−５）の発現について検査することによって、さらに分化された骨格筋細胞（例えば、筋管もしくは筋線維）および心臓細胞の両方から区別され得る。成熟した心筋は筋芽細胞を欠いているので、このようなマーカーは、誘導された筋芽細胞をさらに分化された骨格筋細胞および心臓起源の細胞の両方と区別する。心臓細胞から骨格起源のさらに分化された細胞を区別するために、骨格筋（例えば、骨格筋特異的なミオシン）に特徴的なマーカーの発現が使用され得る。移植後の心臓組織の実際の検査より確実ではないが、移植片の機能的な証拠および生存は、当該分野で公知の任意の種々の方法を用いて得られ得る。例えば、画像試験は、駆出率、壁運動、細胞代謝などを評価するために使用され得る。臨床的な改善の証拠はまた、例えば、運動負荷試験、症状（例えば、呼吸困難または胸痛など）を評価することによって、得られ得る。
【００８８】
本明細書で使用されるように、用語「投与する」、「導入する」、「送達する」および「移植する」は交換可能に使用され、そして、所望の部位（例えば、被験体における心臓損傷の部位）において筋細胞の局在化を生じる方法または経路によって、被験体（例えば、同系被験体、同種被験体、異種被験体）への本発明の筋細胞の置換をいう。
【００８９】
一つの実施形態において、本発明の細胞は、左心室に心臓損傷を有する被験体へ導入される。別の実施形態において、本発明の細胞は、左心室の前方部分に心臓損傷を有する被験体へ導入される。別の実施形態において、本発明の細胞は、心筋症（例えば、本質的には肥大型心筋症または拡張型心筋症）を有する被験体へ導入される。別の実施形態において、本発明の細胞は、心筋虚血損傷を有する被験体へ導入される。なお別の実施形態において、この細胞は、５０％未満（例えば、４０〜５０％）の駆出率によって特徴付けられた心臓損傷を有する被験体へ投与される。
【００９０】
本発明はさらに、心臓組織への損傷によって特徴付けられた被験体の状態を処置する方法を提供し、この方法は、被験体へ本発明の筋細胞または筋細胞組成物を移植する工程を包含し、この結果、この状態はこれによって処置される。本発明の特定の実施形態に従って、心臓障害の少なくとも一つの有害影響もしくは症状に対して、少なくとも部分的な減少もしくは部分的な緩和を生じるための、十分な量の筋細胞が、心臓障害を有する被験体へ導入される。本発明の特定の実施形態に従って、細胞は、心臓の虚血帯へ移植される。本発明の特定の実施形態に従って、細胞は、心筋の瘢痕組織へ送達される。本発明の特定の実施形態において、細胞は、心筋の瘢痕組織の代わりまたはこれに加えて心筋の瘢痕の付近の組織へ送達される。別の実施形態において、欠如した心筋細胞または損傷された心筋細胞を置換するために十分な量の筋細胞が、被験体へ導入される。
【００９１】
本発明の特定な実施形態に従って、この組成物は、損傷された心臓組織または機能障害の心臓組織（例えば、虚血によって損傷された心臓組織、または、線維性組織もしくは瘢痕組織）へ、直接的な注射によって移植される。本発明の特定の実施形態において、この組成物を注射するためにカテーテルが使用される。心臓組織は、上記のような多数の原因のいずれか（例えば、梗塞、心筋虚血損傷もしくは心筋症など）に起因して、損傷されるかまたは機能障害であり得る。処置される領域は、心室壁に局在され得る。好ましい方法において、処置される領域（例えば、心臓損傷の領域）は、心室壁（例えば、左心室壁）に局在される。本発明の好ましい実施形態において、自家細胞（例えば、本明細書で記載されるように、被験体から得られ、そして培養で増殖される細胞）が移植される。別の実施形態において、この組成物は、被験体の冠状血管へ移植される。
【００９２】
本発明の筋細胞を被験体へ送達されるために使用され得る一つの方法は、被験体の心室の心筋へ、筋細胞の直接的な注射である。例えば、Ｓｏｏｎｐａａ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９８−１０１；Ｋｏｈ，Ｇ．Ｙ．ら、（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３３：Ｈ１７２７−１７３３を参照のこと。筋細胞は、生理学的に適合するキャリア（例えば、緩衝化した食塩水）において投与され得る。投与される細胞数は、変動し得る。この数は、基準（例えば、心臓損傷領域の大きさ、心臓の機能状態など）に基づいて選択され得る。さらに、因子（例えば、送達前に、細胞を増殖し得る期間）は、投与される細胞数を拘束し得る。本発明の特定の実施形態に従って、ヒト被験体を処置する場合、約１０６と１０９との間の細胞（例えば、約１０６と１０７との間の細胞、約１０７と１０８との間の細胞、約１０８と１０９との間の細胞および／または約１０９と１０１０との間の細胞）が送達される。特定の状況において、１０億にわたる細胞数の送達は、所望でない効果を有しえることであり得る。一般的に、約１０１０より少ない細胞が送達される。
【００９３】
送達される細胞の濃度は、因子（例えば、全細胞数および送達部位の数）に依存して変動する。本発明の特定の実施形態に従って、細胞は、約８×１０７細胞／ｍｌの濃度で送達される。もちろん、より低い濃度が使用され得る。一般的に、１６×１０７細胞／ｍｌより低い濃度で細胞を送達することが好ましい。移植可能な組成物は、上記のような百分率で骨格筋芽細胞を含み得、そして必要に応じて、線維芽細胞を含み得る。本発明の特定の実施形態に従って、この組成物は、本質的に内皮細胞が無いか、または約５％未満、約１％未満、もしくは約０．５％未満の内皮細胞を含む。
【００９４】
この組成物を投与するために、本発明の筋細胞は、被験体への心筋細胞の導入（注射または移植によって）を促進する送達装置へ挿入され得る。このような送達装置は、レシピエント被験体の体へ、細胞および液体を注射するチューブ（例えば、シリンジもしくはカテーテル）を含む。好ましい実施形態において、さらにこのチューブは、針（この針を介して、本発明の細胞が所望の部位で被験体へ導入され得る）を有する。本発明の筋細胞は、異なる形態で、このような送達装置（例えば、シリンジ）へ挿入され得る。細胞移植で使用される針のゲージは、例えば、２５〜３０であり得る。
【００９５】
細胞は、心臓内の複数の部位へ送達され得る（例えば、複数の注射が使用され得る）。注射の数は、送達される細胞数および処置される領域の大きさに依存して変動し得る。この針が抜き取られた場合、例えば、針のトラックに沿って、細胞は継続して送達され得るか、または多数の不連続なボーラスで送達され得る。本発明の特定の実施形態に従って、細胞は、心内膜表面または心外膜表面から様々な深さで心筋壁の多数の部位へ送達される。本発明の特定の他の実施形態に従って、細胞は、心内膜表面または心外膜表面からほぼ同じ距離（例えば、特定の心筋層内）の複数の部位へ送達される。本発明の特定の実施形態に従って、いくつかの細胞あるいは全ての細胞は、心内膜下方または心外膜下方へ送達される。本発明の特定の実施形態に従って、いくつかの細胞あるいは全ての細胞は、心外膜の脂肪層へ送達される。
【００９６】
本発明の特定の実施形態に従って、細胞性組成物は、別の手順（例えば、左心補助装置（ＬＶＡＤ）もしくは大動脈内バルーンポンプの留置、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＧＢ）、弁置換術、血管造影法など）との組み合わせ（すなわち、直前、中間もしくは直後）で送達される。処置される領域は、視覚的（例えば、手術の間）に選択され得る。心エコー検査および代謝画像法（例えば、ポジトロン放出断層撮影）を含む非侵襲性技術（例えば、画像法）は、処置に対して適切な領域を選択するために使用され得る。
【００９７】
適切な送達装置に含まれる場合、細胞は、溶液中に懸濁され得るかまたは支持マトリックスに包埋され得る。本明細書で使用されるように、用語「溶液」は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液（本発明の細胞がこの中で懸濁される結果、これらは生存可能であり続ける）を含む。薬学的に受容可能なキャリアおよび希釈液は、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒ならびに／または分散媒を含む。これらのキャリアおよび希釈液の使用は、当該分野で周知である。容易な注射針通過可能性が存在する程度まで、この溶液は、好ましくは滅菌されそして流体である。好ましくは、この溶液は、製造および保管の条件下で安定し、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用を介して、微生物（例えば、細菌および真菌）の混入する作用に対抗して保存される。本発明の溶液は、フィルター滅菌後、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液（そして必要に応じて、上記に列挙された他の成分）において、本明細書に記載されるように、筋細胞を取り込むことによって調製され得る。
【００９８】
本発明の特定の実施形態に従って、この組成物は、化合物（例えば、医薬品（例えば、心臓に作用する抗生物質もしくは薬剤））、因子（例えば、筋芽細胞の生存、増殖もしくは分化を刺激し得る増殖因子、血管新生を促進し得る因子など）を含み得る。
【００９９】
一つの実施形態において、損傷された心臓の領域に対するこの細胞の直接的な送達は、心臓の虚血領域へ到達し、そして心筋組織へ入り得るカテーテルを用いて達成され得る。例えば、カテーテルは、経皮的に導入され、そして脈管系を介するか、または外科的切開（例えば、肋骨間の切開術を含む制限された開胸術）を介して心臓へ到達するカテーテルによって、経路決めされ得る。
【０１００】
好ましい実施形態において、細胞を送達するために通常使用されていないカテーテルのタイプは、本発明の筋細胞を送達するために使用される（例えば、細胞の送達に適切であるとは当該分野で知られていないが、薬物、生物学的、タンパク質または遺伝子を送達するために使用されるカテーテル）。驚くことに、これらのカテーテルは、損傷された心臓壁がかなり薄いものであり得る場合でさえも、損傷された心臓組織へ細胞が送達され得る、優れたメカニズムを提供する。例えば、カテーテルの一つのタイプは、大腿動脈へ導入され得、そして左心室へ突き通し得、この左心室において、このカテーテルは、カテーテルの末端から押し出される針を経由して、心内膜表面から心臓へ細胞を送達するために使用される。このタイプのカテーテルは、蛍光透視（ＭｉｃｒｏＨｅａｒｔ）または心筋の虚血帯に対する細胞の標的化を支援するセンサー（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、所望される領域へ局在され得る（ＢｉｏＳｅｎｓｅ）。第二のタイプのカテーテルは、心静脈系を経由して導入される（例えば、Ｔｒａｎｓｖａｓｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能な、ｗｗｗ．ｔｒａｎｓｖａｓｃｕｌａｒ．ｃｏｍのＵＲＬを有するウェブサイトに記載されるカテーテルを参照のこと）。虚血帯へ到達すると、カテーテル末端のハウジングから押し出される針を介して、細胞は、心外膜側から心筋へ注射され得る。多数針のカテーテルは、小さな開胸術によって導入され得、そして、所望される深度、パターンおよび容量は、この細胞を送達するために設定され得る。これらのカテーテルはまた、レーザー（心内膜の開口を作製するために使用される）との組み合わせで使用され、細胞のよりよいアクセスを許容し、そしてレーザーによって形成された経路に新しい血管の増殖を刺激し得る。
【０１０１】
筋細胞が取り込まれるかまたは包埋され得る支持マトリックスは、レシピエントに適合するマトリックスおよびレシピエントに有害でない産物へ分解するマトリックスを含む。天然の生分解性マトリックスおよび／または合成生分解性マトリックスは、このようなマトリックスの例である。天然の生分解性マトリックスは、例えば、コラーゲンマトリックスを含む。合成生分解性マトリックスは、合成ポリマー（例えば、ポリ無水物、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）を含む。このようなマトリックスは、インビボにおいて、心筋細胞に対する支持および保護を提供する。
【０１０２】
筋細胞は、被験体において、細胞を移植する所望の位置へこの細胞の送達を生じる任意の適切な経路によって、被験体へ投与され得る。少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、さらに好ましくは少なくとも約２０％、なおさらに好ましくは少なくとも約３０％、なおさらに好ましくは少なくとも約４０％、および最も好ましくは少なくとも約５０％、またはこれ以上の細胞が、被験体へ投与後、生存し続けることが好ましい。被験体へ投与後、細胞のバイアビリティの期間は、数時間と同じくらい短い期間（例えば、２４時間）から、数日、数週間、数ヶ月あるいは数年という長い期間まであり得る。
【０１０３】
一旦送達されると、本発明の細胞および組成物が被験体における心機能を増強する能力は、当該分野で公知の種々の手段によって、測定され得る。例えば、この細胞が収縮期の心筋のパフォーマンスまたは収縮能を改善する能力が、測定され得る。さらに、本発明の細胞および組成物は、被験体における拡張期圧−緊張圧の関連を改善する能力を試験され得る。機能試験（例えば、心エコー検査）および他の画像試験、ストレス試験の実施などが使用され得る。臨床基準（例えば、呼吸困難および胸痛）が評価され得る。本明細書の他の場所でより詳細に検討されるように、本発明の細胞および組成物が心臓内に生存する能力および移植する能力は、組織化学を含む種々の技術を用いて評価され得る。
【０１０４】
本発明の筋細胞はさらに、筋細胞または本発明の筋細胞組成物とは別の因子を含む組成物の中に含まれ得る。例えば、このような組成物は、薬学的なキャリア、抗体、免疫抑制剤または血管形成因子を含み得る。
【０１０５】
（ＶＩＩ．インビボにおける本発明の方法および組成物の適用）
実施例でさらに詳細に示すように、本発明者らは、種々の動物モデルとの関連で本明細書に記載される特定の移植可能な組成物および方法を利用している。これらのいくつかのモデル動物は、人工的に誘導された心筋機能障害および／または心筋損傷を受ける。さらに、特定の移植可能な組成物は、心臓機能障害または心臓損傷（例えば、虚血性損傷）に罹患するヒト被験体へ送達されている。実施例９および実施例１０に記載されるように、本発明者らは、ヒト心臓内のヒト骨格筋芽細胞の生存および分化を示す組織学的な証拠、および損傷された心筋組織領域内（例えば、瘢痕組織）の血管新生を示す組織学的な証拠を提供している。本発明者らが知っている限りでは、これらの結果は、ヒト心臓内の骨格筋芽細胞の生存および分化の初めての組織学的な証拠を示す。
【０１０６】
ヒト被験体において本発明の方法および組成物を適用する前に、本発明者らは、動物において広範な調査を行った。本発明者らは、多数の動物モデルにおいて、これらのプロトコールおよびアプローチを試験した。動物モデルは、有効的な治療を予想するのに慣用的に使用される。それにもかかわらず、ある場合においては、ヒトにおける結果が、効力を確証するために必要とされる。例えば、ある場合には、動物モデルにおいて誘導された人工的な心臓損傷は、ヒトにおいて、虚血性損傷の特徴または他の天然に生じる損傷の特徴を適切に模倣しないかもしれない。特に、動物において損傷を作製する方法は、侵襲性プロセスを頻繁に含み、そして多くの場合突然であるが、ヒト被験体における特定のタイプの心筋損傷は慢性であり得、そして／または慢性成分および急性成分の両方を含み得る。同様に、動物モデルにおいて心筋損傷を生じる事象と、細胞移植が実施される時点との間の時間間隔は、頻繁に、ヒト被験体における心筋損傷と細胞移植との間の時間間隔よりも短い。また、ヒト被験体における心筋損傷は、動脈供給内の凝血塊の存在から頻繁に生じ、従って、凝血塊形成と分解とを関連させた媒介物および因子は、損傷された心筋近辺に存在する。さらに、骨格筋芽細胞、筋管、筋線維、線維芽細胞および分化プロセスとの間の種間の相違は、動物細胞にとって適切な細胞調製技術が、ヒト細胞に適切ではないかもしれないことを意味し得る。
【０１０７】
本発明は、ヒト被験体における骨格筋芽細胞移植の最初の研究を包含する。ヒト被験体の特定の機能的評価を用いる経験は、有害事象（例えば、不整脈）のモニターが実施され得ることを可能にする。さらに、これは、治療に対する患者の主観的な応答に従うことが可能になる。症状（例えば、呼吸困難および胸痛）および全体的な福利の指標が評価され得る。前述の理由の全ておよびその他のたくさんの理由において、本発明の実証（ヒト被験体における安全性および有効性）は、ヒト被験体における使用において、骨格筋芽細胞移植の治療に対する有益な情報を提供する。
【０１０８】
実施例においてさらに詳細に記載されているように、本発明の特定の移植可能な組成物は、本明細書に記載される方法に従って調製され、そしてヒト被験体へ送達されている。被験体うちの４人は、心臓移植のブリッジとして、左心補助装置の設置との組み合わせにおいて、注射によって組成物を受けた。３人の被験体に対して、この心臓は、心臓移植の時点で取り除かれ、そして細胞の生存および分化の徴候を検査された。４番目のＬＶＡＤのレシピエントは、移植を待っている。さらに、９人の被験体は、ＣＡＢＧ手順を組み合わせた注射により、この組成物を受けた。２００２年３月２１日の時点において、これらの被験体は、全員生存し、良好な状態である。表６および表７は、各々の被験体に関連するデータの概要（年齢、移植の日付、移植された細胞数（用量）、移植された組成物の筋芽細胞（％）、細胞が凍結保存されたかどうか、移植片数、心筋梗塞の日付（知られている場合）、注射の数および移植に起因する有害事象の数を含む）を示す。本発明の移植可能な組成物および方法は、これらおよび広範囲の他の臨床的な設定（急性心筋梗塞から任意の原因に起因する長年不変の心機能異常までの範囲）で有用である。
【０１０９】
【表６】
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【０１１０】
【表７】
2010265320.tif 000003
（免疫応答の調節）
被験体へ導入する前に、この筋細胞は、免疫学的拒絶を阻害するために改変され得る。本明細書で詳細に記載されるように、この筋細胞は、少なくとも一つの免疫原生細胞表面抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原）の改変により、被験体への導入に適切にされ得る。移植された筋細胞の拒絶を阻害するために、そして、同種間移植レシピエントまたは異種間移植レシピエントにおける免疫学的な非応答性を達成するために、本発明の方法は、被験体へ導入する前に、筋細胞の表面上の免疫原生抗原の改変を包含し得る。筋細胞上の一つ以上の免疫原生抗原を改変するこの工程は、単独または被験体のＴ細胞活性を阻害する因子の、被験体への投与との組み合わせで実施され得る。あるいは、筋細胞移植片の拒絶の阻害は、筋細胞表面上の免疫原生抗原の事前の改変を欠く場合は、被験体にＴ細胞活性を阻害する因子を被験体へ投与することによって、達成され得る。本明細書で使用されるように、Ｔ細胞活性を阻害する因子は、被験体内のＴ細胞の除去（例えば、隔離）または破壊を生じる因子、あるいは被験体内のＴ細胞機能を阻害する因子として規定される（すなわち、Ｔ細胞は、なお、被験体に存在し得るが、非機能状態であり、この結果、これらは増殖し得ず、エフェクター機能（例えば、サイトカイン産生、細胞障害性など）を誘発も果たしもし得ない）。用語「Ｔ細胞」は、成熟した末梢血Ｔリンパ球を含む。Ｔ細胞活性を阻害する因子はまた、未熟なＴ細胞（例えば、胸腺細胞）の活性または成熟を阻害し得る。
【０１１１】
レシピエント被験体におけるＴ細胞活性を阻害する用途に好ましい因子は、免疫抑制薬物である。用語「免疫抑制薬物（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｒｕｇ）または免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」は、正常な免疫機能を阻害するかまたは妨害する薬学的な薬剤を含むことを意図される。好ましい免疫抑制薬物は、シクロスポリンＡである。使用され得る他の免疫抑制薬物は、ＦＫ５０６およびＲＳ−６１４４３を含む。一つの実施形態において、免疫抑制薬物は、少なくとも一つの他の治療薬との組み合わせで投与される。投与し得るさらなる治療剤は、ステロイド（例えば、グルココルチコイド（例えば、プレドニソン、メチルプレドニゾロンおよびデキサメタゾン））および化学療法剤（例えば、アザチオプリンおよびシクロホスファミド）を含む。別の実施形態において、免疫抑制薬物は、ステロイドおよび化学療法剤の両方との組み合わせで投与される。適した免疫抑制薬物は、市販されている（例えば、シクロスポリンＡは、Ｓａｎｄｏｚ，Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪから入手可能である）。
【０１１２】
免疫抑制剤は、投与経路に適合する処方物で投与される。適切な投与経路は、静脈注射（単回注入、複数の注入として、または経時的な点滴としてのいずれか）、腹腔内注射、筋内内注射および経口投与を含む。静脈内注射のために、この薬物は、滅菌され、そして注射を可能（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｙ）にする薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、緩衝された食塩水）中に溶解され得る。薬物の分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物内で、ならびに油内で調製され得る。便利な投与経路および免疫抑制剤のためのキャリアは、当該分野で公知である。例えば、シクロスポリンＡは、食塩水中で静脈内に投与され得か、またはオリーブオイル中で、または他の適切なキャリアもしくは希釈剤中で、経口的、腹腔内もしくは筋肉内に投与され得る。
【０１１３】
免疫抑制剤は、所望の治療効果（例えば、移植細胞の拒絶の阻害）を達成するに十分な用量でレシピエント被験体へ投与される。免疫抑制剤の用量範囲およびこれらと同時投与され得る他の因子（例えば、ステロイドならびに化学療法薬）は、当該分野で公知である（例えば、Ｋａｈａｎ，Ｂ．Ｄ．（１９８９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１（２５）：１７２５−１７３８を参照のこと）。免疫抑制剤の好ましい用量範囲（ヒトの処置に適する）は、１日あたり約１〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。シクロシポリンＡに対する好ましい用量範囲は、１日あたり約１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、さらに好ましくは、１日あたり約１〜５ｍｇ／ｋｇ（体重）である。用量は、レシピエント被験体の血清において、免疫抑制剤の至適濃度を維持するために調整され得る。例えば、用量は、ヒト被験体において、シクロシポリンＡの好ましい血中濃度（約１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）を維持するために調整され得る。用量値は、因子（例えば、個体の疾患状態、年齢、性別および体重）に従って変動し得る、ということが注意されるべきである。用量養生法は、個体の必要性、および組成物を投与するか、もしくは組成物の投与を管理する者の専門的な判断に従って、最適な治療応答を提供するために、経時的に調整され得、しかも、本明細書に示される用量範囲は例示であり、そして、請求の範囲に記載されている組成物の範囲もしくは様式を狭く限定することを意図しない。
【０１１４】
本発明の一つの実施形態では、免疫抑制剤は、被験体における移植細胞に寛容を誘導するに十分な時間の間、一過性に被験体へ投与される。免疫抑制剤の一過性の投与は、移植片レシピエントにおいて、長期間の移植片特異的な寛容を誘導することが見い出されている（Ｂｒｕｎｓｏｎら（１９９１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５２：５４５；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら（１９８１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ３２：２１０；Ｇｒｅｅｎら（１９７９）Ｌａｎｃｅｔ２：１２３；Ｈａｌｌら（１９８５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：１６８３を参照のこと）。被験体へのこの薬物の投与は、被験体へのこの細胞の移植前に開始され得る。例えば、薬物投与の開始は、移植の数日（例えば、１〜３日）前であり得る。あるいは、薬物投与は、移植日、または移植の数日後（一般に３日より多くない）に開始し得る。薬物の投与は、薬物投与が中止される場合、ドナー細胞がレシピエントによって受容され続けるよう、レシピエント中でドナー細胞特異的な寛容を誘導するに十分な時間の間、継続される。例えば、この薬物は、移植後、３日程度の短い間、あるいは３ヶ月程度の長い間投与され得る。代表的には、この薬物は、移植後、少なくとも１週間投与されるが、１ヶ月以上は投薬されない。被験体における移植細胞に対する寛容の誘導は、免疫抑制剤の投与が中止された後に、移植細胞の継続された受容性によって示される。移植組織の受容性は、形態学的に決定され得る（例えば、皮膚移植片においては、移植組織を検査するかもしくは生検によって）か、または移植片の機能的活性の評価によって決定され得る。
【０１１５】
被験体においてＴ細胞活性を阻害するために使用され得る他のタイプの因子は、抗体、フラグメントもしくはこれらの誘導体（レシピエントにおけるＴ細胞を枯渇するか隔離する）である。被験体へ投与される場合、インビボにおいてＴ細胞を枯渇しもしくは隔離し得る抗体は、当該分野で公知である。代表的には、これらの抗体は、Ｔ細胞の表面上の抗原に結合する。ポリクローナル抗血清（例えば、抗リンパ球血清）が使用され得る。あるいは、一つ以上のモノクローナル抗体が使用され得る。好ましいＴ細胞−枯渇性（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）抗体は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４もしくはＣＤ８に結合するモノクローナル抗体を含む。これらの抗原に結合する抗体は、当該分野で公知であり、市販されて入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから）。ヒトＴ細胞上のＣＤ３への結合の好ましいモノクローナル抗体は、ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８００１）である。Ｔ細胞上の表面抗原への抗体の結合は、被験体におけるＴ細胞の隔離、および／または被験体において内因性メカニズムによるＴ細胞の破壊を促進し得る。あるいは、Ｔ細胞表面上の抗原に結合するＴ細胞−枯渇性抗体は、Ｔ細胞に抗体が結合する際、Ｔ細胞の破壊を促進するために、毒素（例えば、リシン）または他の細胞障害性分子（例えば、放射性同位元素）と結合され得る。本発明で使用され得る抗体産生に関する詳細については、１９９４年３月３１日に出願された米国特許出願第０８／２２０，７２４号を参照のこと。
【０１１６】
レシピエント被験体においてＴ細胞活性を阻害するために使用され得る別のタイプの抗体は、Ｔ細胞増殖を阻害する抗体である。例えば、Ｔ細胞増殖因子（例えば、ＩＬ−２）に対して惹起された抗体、またはＴ細胞増殖因子レセプター（例えば、ＩＬ−２レセプター）に対して惹起された抗体は、Ｔ細胞の増殖を阻害し得る（例えば、ＤｅＳｉｌｖａ，Ｄ．Ｒ．ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３２６１−３２６７を参照のこと）。従って、ＩＬ−２抗体またはＩＬ−２レセプター抗体は、移植細胞の拒絶を阻害するために、レシピエントへ投与され得る（例えば、Ｗｏｏｄら（１９９２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４９：４１０を参照のこと）。さらに、ＩＬ−２抗体およびＩＬ−２レセプター抗体の両方は、Ｔ細胞活性を阻害するために同時投与され得るか、または（例えば、Ｔ細胞上の表面抗原と結合する）別の抗体と共に投与され得る。
【０１１７】
レシピエント内のＴ細胞を枯渇、隔離または阻害する抗体は、移植に際し、細胞の拒絶を阻害するために、所定用量でかつ適切な時間の間投与され得る。抗体は、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、滅菌食塩溶液）の中に入れて静脈内に投与される。抗体投与は、移植前（例えば、移植の１〜５日前）に開始され得、そして、所望される効果を達成するために、移植後は基本的に毎日継続し得る（移植後１４日まで）。ヒト被験体に対する抗体の投与のための好ましい用量範囲は、１日あたり約０．１〜０．３ｍｇ／ｋｇ（体重）である。あるいは、抗体の単回高用量（例えば、１ボーラス約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量）が、移植日にヒト被験体に対して投与され得る。末梢血からＴ細胞を枯渇する抗体処置の有効性は、抗体処置の前後に被験体から採取された血液サンプル内のＴ細胞数を比較することによって、決定され得る。用量計画は、個体の必要性、および組成物を投与するか、もしくは組成物の投与を管理する者の専門的な判断に従って、最適な治療応答を提供するために、経時的に調整され得る。本明細書に示される用量範囲は例示に過ぎず、そして、請求の範囲に記載されている組成物の範囲もしくは実施を限定することを意図しない。
【０１１８】
本発明はさらに、以下の実施例によって例示され、これは、さらに限定するものであるとして解釈されるべきではない。本明細書中に引用される全ての参考文献（学術文献、発行された特許、公開された特許出願および同時係属中の特許出願を含む）の内容は、本明細書中に参考として明示して援用される。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１：心筋修復のための細胞療法：急性心筋梗塞後の心臓中への、冠内注射により成功した筋芽細胞の移植）
細胞移植（ＣＴ）（心筋修復のための可能性ある戦略）は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の大きな動物モデルでは実施されていない。インビボにおいて、梗塞されたイヌの心筋中への冠内注射（ＩＣ）によって送達されたヒト筋芽細胞（ＨＭ）を用いるＣＴの可能性を調査した。
【０１２０】
インビトロの研究：骨格筋生検から単離したクローン化ＨＭを、胎児心筋細胞（ＦＣ）と同時培養した；２）インビボの研究：成体雑種犬は（左開胸術により）９０分間、左冠状動脈前下降枝動脈（ＬＡＤ）の閉塞を受け、次いで、持続する再灌流を受けた。ＡＭＩの１時間後または１日後に、レポーター遺伝子ＬａｃＺでトランスフェクトしたＣＭ（４０×１０６細胞）を、ＬＡＤへボーラス注射した。シクロスポリンおよびプレドニゾンを毎日与えた。移植１時間後または７日後に、心臓を回収し、そして連続切片をβ−ｇａｌ組織化学について検査した。
【０１２１】
同時培養において、ＨＭは、組込みおよびＦＣとの同期収縮性を示した。２）イヌにおけるＬａｃＺ陽性細胞は、ａ）血管周囲にＨＭの浸潤；ｂ）心外膜から心内膜までのＡＭＩゾーンを縁取りするＨＭの広範囲な移植；およびｃ）新しい血管培養（ｖａｓｃｕｌｔｕｒｅ）を発生しているＡＭＩゾーン中へのＨＭの浸透を示した。従って、イヌにおいて、ＨＭは、移植され得、そして梗塞された心筋の周囲で生存し得る；２）損傷心筋細胞を増強するためのＣＴは、ＩＣ注射によって実施され得る。
【０１２２】
（実施例２：心筋細胞特異的なＧＡＴＡ４／６転写因子を用いた骨格筋芽細胞における心筋細胞表現型の誘導）
筋芽細胞の注入の時間および様式に関する問題を取り扱うために、シクロスポリンＡ（ＣｙＡ）およびプレドニゾンの免疫抑制養生法（細胞移植１日前に開始）の下で、イヌの筋芽細胞を用いて、研究を実施した。イヌ筋芽細胞を雄骨格筋（ＴＡ）生検から単離し、そして雌イヌへ移植した。短期間の研究のための細胞は、移植前にＣＭ−ＤＩＩで標識し、そして蛍光顕微鏡によって検出した。細胞移植の時間および様式を取り扱うために、これらの同種イヌの筋芽細胞の研究（短期間）を計画した。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）組換えアデノウイルスベクター系は、移植された筋芽細胞の強力な検出方法を提供するために使用され得る。このアプローチは、３７℃での短いインキュベーションの間に、ＧＦＰレポーター遺伝子で大部分（＞９０％）の筋芽細胞を感染することで高度に効率的である。
【０１２３】
ＧＦＰ  ｃＤＮＡを運ぶＥ１欠失組換えアデノウイルスベクターの構築は、当該分野で公知である。ＧＦＰ  ｃＤＮＡおよびＧＡＴＡ  ｃＤＮＡを含む、Ｅ１欠失組換えベクターおよびＥ３欠失組換えベクターの両方を含む類似の構築物を、各々作製した。一旦、このアデノウイルスベクターが筋芽細胞へ感染すると、これは複製欠陥であり、そしてさらなる細胞へ再感染し得ない。ＧＦＰ  ｃＤＮＡを、細菌プラスミドベクターｐＡｄ．ＲＳＶ４（プロモーターとしてＲＳＶ長末端反復配列ならびにＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを使用し、そして、Ａｄ配列０〜１マップ単位ならびに９〜１６マップ単位を含む）のＮｏｔ  １部位とＸｈｏ  Ｉ部位との間でサブクローンした。次いで、プラスミドベクターを、ｐＪＭ１７と共に２９３細胞中に同時トランスフェクトした。次いで、２９３細胞中の増殖によって、組換えアデノウイルスベクターを高力価のストックとして調製した。プラークアッセイにより、ウイルス力価を１０１ｐｆｕ／ｍＬであると決定した。
【０１２４】
ＧＦＰレポーター遺伝子およびヒト心筋細胞特異的な転写因子ＧＡＴＡ４  ｃＤＮＡまたはＧＡＴＡ６  ｃＤＮＡを含むさらなるアデノウイルスベクターを用いて筋芽細胞を感染し、収縮性の心筋細胞表現型への分化を援助し得る。これは、収縮器および心臓の遅延収縮に関連するＣａ＋＋ＡＴＰａｓｅをコードする遺伝子（ＳＥＲＣＡ）の内因性のアップレギュレーションを含む。
【０１２５】
（実施例３：抗原マスキング：ヒト細胞およびブタ細胞と結合するＰＴ−８５およびＷ６／３２との比較）
複数の以前の実験から判断すると、変動を制限するために単一の実験にて、ヒト細胞およびブタ細胞に対するＰＴ−８５およびＷ６／３２の親和性を、ＦＡＣＳ分析によって測定した。ブタ細胞  対  ヒト細胞に対するＰＴ−８５の親和性を比較した。また、ヒト細胞の反応性について、ＰＴ−８５とＷ６／３２とを比較した。
【０１２６】
内皮細胞に対するＰＴ−８５の最大の半分の（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）結合は、０．００７μｇの抗体（１０５個の細胞）であり、そしてＨｅＬａ細胞に対しては、０．００５μｇの抗体であった。結論は、細胞表面ＭＨＣクラスＩに対するアフィニティーは、ブタ細胞とヒト細胞とでおおよそ類似しているということである。
【０１２７】
ブタ細胞由来の可溶性クラスＩ分子（ＨＯ）  対  ヒト細胞由来の可溶性クラスＩ分子に対する相対的なアフィニティーは同じでない。ＰＴ−８５は、ヒト分子（ＪＹ細胞由来）よりもかなり高いみかけのアフィニティーを有するブタ分子（ＰＢＬ由来）を沈殿させる。細胞表面ＭＨＣ分子についての結果と可溶性ＭＨＣ分子についての結果との間で生じる相関関係の欠如は、ＰＴ−８５と９−３との比較で認められることに類似する。
【０１２８】
ＨｅＬａ細胞に対するＷ６／３２の最大の半分の結合は、ＰＴ−８５（１０５個の細胞）についての０．００５μｇと比較して、０．０４μｇの抗体であった。従って、ＰＴ−８５のアフィニティーは、ヒト細胞についてのＷ６／３２よりもわずかに高い。両抗体とも、１μｇにほぼ等しい濃度で飽和に達したが、Ｗ６／３２は、わずかに高い蛍光強度を示した。
【０１２９】
ＪＹ細胞上の免疫沈降を使用するので、可溶性ＨＬＡに対するＷ６／３２の結合は、ＰＴ８５よりもさらに強い：Ｗ６／３２（２μｇの抗体）を用いて暗帯が得られるが、同じ濃度のＰＴ−８５についての帯は、ほとんど検出できない。
【０１３０】
この結果は、ＰＴ−８５およびＷ６／３２が細胞表面ＨＬＡに対して類似のアフィニティーを示すことを示唆し、そして、可溶性ＭＨＣ分子に結合する抗体は抗原の同定に有用であるが、相対的なアフィニティーの決定には有用ではないことを示唆する。この結果は、同じ細胞に対してＷ６／３２およびＰＴ−８５の両方の結合を示す２色のＦＡＣＳ分析と一致しており、両方のエピトープが同時にマスクされ得ることを示唆している。
【０１３１】
（実施例４：レシピエントの心臓における筋細胞の移植および生存）
すべてオスＬｅｗｉｓラットへの以下の細胞移植を実施した。
【０１３２】
（Ａ）同系骨格筋から単離し、３日間のみＥＧＦと共にラミニン上で増殖させた細胞（デキサメタゾンなし）を移植し、そして以下のように観察した：
７Ａ１：１週間凍結した心臓（１２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣｙＡ＋４ｍｇ／ｋｇ  プレドニゾン）、および
７Ａ２：１週間凍結した心臓（免疫抑制なし）。
【０１３３】
（Ｂ）同系骨格筋から単離し、３日間のみＦＧＦと共にコラーゲン上で増殖させた細胞を移植し、以下のように観察した：
７Ｂ１：１週間凍結した心臓（１２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣｙＡ＋４ｍｇ／ｋｇ  プレドニゾン）；
７Ｂ２：１週間凍結した心臓（免疫抑制なし）；
７Ｂ３：１週間ホルマリン固定した心臓（１２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣｙＡ＋４ｍｇ／ｋｇ  プレドニゾン）；および
７Ｂ４：１週間ホルマリン固定した心臓（免疫抑制なし）。
【０１３４】
本実験で使用される細胞は、インビトロにおいて２０未満の集団倍加を受けることを許容し、また、移植前にはソートしなかった。−１日目に動物の免疫抑制を開始した。０日目に２×１０５細胞／部位（２針トラック（ｎｅｅｄｌｅ  ｔｒａｃｋ）／部位）の注射により動物に移植した。７日目に動物から採取した。移植物を切片にし、Ｈ＆Ｅ（＋トリクロム）によって分析し、抗ミオゲニン（＋抗ＣＤ１１）で免疫染色した。全てのラットの心臓の切片は、非常に良好な細胞の生存および抗ミオゲニン染色が見られた。免疫抑制有りまたは無しの群の間で検出可能な相違点は観察されなかった。同系メスラットの心臓への精製した細胞を用いた実験と比較して、１０倍少ない移植細胞を有する広い生存領域に注目した。結果を表３に表す。
【０１３５】
【表３】
2010265320.tif 000004
（実施例５：移植前の細胞ソーティングの有無による移植結果の比較）
すべてオスＬｅｗｉｓラットへの以下の細胞移植を実施した。本実施例では、１日目に誘発性心筋梗塞を実験的に被験体に与えた。動物を１週間回復させた。１週間の安静の後、移植を実施した。
【０１３６】
（Ａ）細胞を同系骨格筋から単離し、そして３日間のみＥＧＦと共にラミニン上で増殖させた。２×１０５細胞／心臓を注射し（１０５個／部位）、そして以下のように観察した：
８Ａ１：１週間生存（凍結）
８Ａ２：４週間生存（凍結）
８Ａ３：４週間生存（ホルマリン）
８Ａ４：免疫抑制して４週間生存（４８時間；凍結）
８Ａ５：免疫抑制して４週間生存（凍結）
（Ｂ）同系骨格筋から単離し、そしてＥＧＦと共にラミニン上で増殖させた細胞をソートし、そして増殖させた。２×１０５細胞／心臓を注射し（１０５個／部位）、以下のように観察した：
８Ｂ１：１週間生存（凍結）
８Ｂ２：４週間生存（凍結）
８Ｂ３：４週間生存（ホルマリン）
８Ｂ４：免疫抑制して４週間生存（凍結）
（Ｃ）同系骨格筋から単離し、そしてＥＧＦと共にラミニン上で増殖させた細胞をソートし、そして増殖させた。２×１０６細胞／心臓を注射し（１０６個／部位；５〜１０倍）、以下のように観察した：
８Ｃ１：１週間生存（凍結）
８Ｃ２：４週間生存（凍結）
８Ｃ３：４週間生存（ホルマリン）
８Ｃ４：免疫抑制して４週間生存（凍結）
ポジティブコントロールとしての免疫抑制（１２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣｙＡ＋４ｍｇ／ｋｇ  プレドニゾン）。細胞を３日間培養する（すなわち、ソートしないで、インビトロにおいて一定時間培養し、その結果、細胞は一定数の集団倍加を受ける。）か、またはソートして、６〜１０日間増殖した（ソートした）。未精製の細胞を１０５細胞／部位（２針トラック／心臓）（１２．５μｌ／部位）で注射した。ソートした細胞：１０５細胞／部位  対  １０６細胞／部位（４０μｌ／部位）（すなわち、１２．５μｌ／部位  対  ４０μ／ｌ／部位）との間を比較した。Ａ１の心臓、Ｂ１の心臓およびＣ１の心臓を１週と２週との間で採取した。残りの心臓を４週までに採取した。心臓を切片にし、Ｈ＆Ｅ（＋トリクロム）で分析した。細胞を抗ミオゲニン（＋抗ＣＤ１１）で免疫染色した。結果を表４に示す。
【０１３７】
【表４】
2010265320.tif 000005
移植された移植片の組織学は、骨格筋芽細胞を含む組成物（より少ない集団倍加を受けさせる）が、精製細胞を得るためにソートされ、そしてさらなる集団倍加を受けさせるこのような組成物よりも多く生存することを示唆する。図１は、トリクロムを用いた移植片の染色を示す。図１Ａは、移植前にソートした移植細胞の写真であり、図１Ｂは、ソートしてないで、かつ移植前にインビトロにおいて数回の集団倍加を受けさせただけの移植細胞の写真である。より多くの移植細胞が図１Ｂで生存している。
【０１３８】
組織学の結果はまた、梗塞したラットの心臓への骨格筋芽細胞を含む組成物の移植に際して、血管形成（血管新生）が生じることを示唆する。図２Ａ（弱拡大）および図２Ｂ（強拡大）は、移植３週後の第ＶＩＩＩ因子についてのこのような移植片の染色を示す。血管は、移植片の中央に認められ得る。
【０１３９】
運動最大試験を、ラット心臓の梗塞された領域に骨格筋芽細胞を移植した動物で実施した。例示的な試験結果を、表５に示す。表５は、移植（筋芽細胞）動物およびコントロール（偽細胞）動物についての運動結果を比較し、そして移植動物が、トレッドミルでより長く（持続時間）運動し得、そして偽の移植を受けたコントロール動物よりもさらに先に（距離）行き得たことを示す。
【０１４０】
【表５】
2010265320.tif 000006
さらに、図３および図４は、移植されていないコントロール動物と比較して、移植動物（筋芽細胞）が拡張期圧−容積の改善を見せたことを示す。図３および図４は、容積（動物サイズに対して補正）比に対する拡張終期圧の低下を示す。これらのデータは、筋芽細胞を移植した動物の左心室が強化されており、その結果、血圧が上昇するにつれて、移植された心臓における赤血球の容積が小さくなることを示唆する。
【０１４１】
（実施例６：心筋梗塞後の心室再構築および収縮機能における移植結果の比較）
オスＬｅｗｉｓラットへ以下の細胞移植を実施した。本実施例では、１日目に冠状結紮によって、誘導性心筋梗塞を実験的に被験体に与えた（Ｐｆｅｆｆｅｒら（１９７９）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．４４：５０３−５１２；Ｊａｉｎら（２０００）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４６：６６−７２；Ｅｂｅｒｌｉら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３０：１４４３−１４４７を参照のこと）。動物を１週間回復させた。１週間の安静の後、移植を実施した。新生仔Ｌｅｗｉｓラットの後肢骨格筋から単離された筋芽細胞および線維芽細胞を単離し、そして４８時間、２０％ウシ胎仔血清を補充した増殖培地中のラミニン上で増殖させた。細胞を１０７細胞／ｍＬにてＨＢＳＳ中に再懸濁し、そして、以下のように１０６細胞／心臓を注射した（６〜１０の注射）：
（コントロール）：非梗塞性のコントロール
（ＭＩ）        ：心筋梗塞＋偽注射
（ＭＩ＋）      ：心筋梗塞＋細胞注射
３つの動物群を、細胞療法の３週後および６週後に調査した。
【０１４２】
移植片の生存を、骨格筋芽細胞（抗ミオゲン染色）および成熟筋芽細胞（抗骨格ミオシン染色）の検出について、トリクロム染色および免疫細胞化学によって評価した。移植片の生存を筋芽細胞移植後９日目（図５）に確認した。早くも移植後９日目に、ミオゲニン陽性染色が観察された（図５Ｄ〜Ｆ）が、骨格ミオシン重鎖の発現は、移植後３週まで観察されなかった。筋芽細胞の生存は、治療の３週後および６週後に、それぞれ、７匹の動物のうち６匹、および９匹の動物のうち９匹で確認した。同系細胞療法を受けている動物は、体重の減少、追加の死亡率、または組織切片へのマクロファージの蓄積によって決定されるような、細胞拒絶についての証拠を示さなかった。
【０１４３】
最大運動能力（インビボにおける心室機能および総合的な心機能の測定）を、細胞移植前（ＭＩの１週後）、ならびに治療の３週後および６週後に、全ての動物で決定した（図６）。ＭＩ動物は、時間に対する運動能力において漸落を示した（６週目のコントロール動物と比較して、運動能力の３０％以上の低下を示した）。細胞療法（ＭＩ＋）は、ＭＩ後の運動能力の継続的な低下を防ぎ、これは、インビボにおける心機能の進行性の低下に対する防御を示唆している。
【０１４４】
単離した等容的に鼓動している心臓において、心収縮機能（収縮期圧−容積曲線を用いて測定）を、（Ｊａｉｎら（２０００）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４６：６６−７２；Ｅｂｅｒｌｉら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３０：１４４３−１４４７に記載されているように）心臓全体のランゲンドルフ潅流研究によってアッセイした（図７）。非梗塞性のコントロール心臓は、心室容積の増加を伴って、収縮期圧の典型的な上昇を示した。移植３週後、ＭＩ心臓は、収縮期圧−容積曲線の右方向へのシフトを示した（図７Ａ）。細胞移植は、ＭＩ＋心臓においてこのシフトを妨げ、この結果、任意の所定の前負荷（心室容積）においても、より大きい収縮期圧の発生を生じる。しかしながら、群の間で、最大の心室容積で発生するピーク収縮期圧（拡張終期圧４０ｍｍＨＧ）には有意差がなかった。細胞療法の有益な効果をまた、治療６週後に観察し（図７Ｂ）、これは、エキソビボにおいて、筋芽細胞移植での全体的な収縮機能の改善を示唆している。
【０１４５】
ポンプ機能障害に加えて、心室の再構築は、特徴として、進行性の全体的な腔肥大をもたらす。心室の肥大を、拡張期圧−容積の相関で評価し、（Ｊａｉｎら；Ｅｂｅｒｌｉら、前出に記載されるように）拡張期容積の範囲を上回る拡張期圧のモニタリングを介して、単離された心臓を確立した（図８）。全ての時点において、任意の所定の拡張期圧における非梗塞性のコントロール心臓と比較して、ＭＩ心臓は、実質的な左心室肥大を示し、これを血圧−容積曲線の右方向の復位により実証した。しかしながら、細胞療法は、心室腔肥大において有意な減少を生じ（移植の３週後および６週後の両方において、ＭＩ群からの心臓の有意に左方向にＭＩ＋群からの心臓を配置する）、これは、有害な心筋梗塞後の細胞移植での心室再構築の減衰を示唆している。
【０１４６】
さらに、組織切片の形態学的な分析を介して心室再構築を検討した。全ての時点において、ＭＩ心臓およびＭＩ＋心臓は、非梗塞性コントロール心臓と比較して、肥大した房室径を示した。細胞療法の６週後、ＭＩ＋群からの心臓は、ＭＩ心臓と比較して減少した心内膜腔径を有し、心室肥大の減衰を示唆している（図８Ｂにおける拡張期圧−容積曲線での観察と類似する）。さらに、ＭＩ心臓は、治療の３週後および６週後の両方において、梗塞壁厚の減少を示し、これは、特徴的な心筋梗塞後の瘢痕の壁厚減少および梗塞拡大を示唆した。しかしながら、ＭＩ＋心臓は、非梗塞性のコントロール心臓と比較して、梗塞壁厚における有意な減少はなかった。隔壁厚は、治療の３週後および６週後の両方において、全ての群の間で類似した。これらのデータは、ＭＩ後の筋芽細胞移植が、インビボおよびエキソビボの両方において、全体的な心室機能障害の指標および有害な再構築を改善することを示唆し、そして細胞移植がＭＩ後に有用であり得ることを示唆する。
【０１４７】
（実施例７：末期心疾患の処置における自家筋芽細胞移植および自家線維芽細胞移植）
骨格筋由来の自家筋芽細胞および自家線維芽細胞を、末期心疾患の被験体の心筋に移植する。本研究におけるヒト被験体は、心臓移植手術の候補者であり、また同所移植でのブリッジとして左心補助装置の留置が予定される。
【０１４８】
移植前に、筋芽細胞および線維芽細胞を、被験体の骨格筋の生検より得られた衛星細胞から、インビトロにて増殖させる。この細胞の組成は、好ましくは４０〜６０％の筋芽細胞である。この細胞を８×１０７細胞／ｍｌの濃度で、左心室の梗塞周囲域に注射する。１００μｌまでの注射を、３５部位（最大３００×１０６細胞の注射）まで行う。
【０１４９】
筋芽細胞移植および線維芽細胞移植の安全性を、予期せぬ副作用（例えば、心機能異常）に基づいてアッセイする。自家移植片の生存および心機能の改善の可能性についての予備的な情報（自家筋芽細胞移植および自家線維芽細胞移植に関連し得る）が得られる。
【０１５０】
（実施例８：梗塞された心筋の処置のための自家筋芽細胞移植および自家線維芽細胞移植）
骨格筋由来の自家筋芽細胞および自家線維芽細胞を、心筋梗塞後の、心筋虚血領域または心筋瘢痕領域に、およびその周囲に移植する。本研究におけるヒト被験体は心筋梗塞を罹患し、そして左心室機能障害から成る付加的な心疾患（冠状動脈バイパス移植についての候補者のハイリスク群に被験体を置く）を有する。
【０１５１】
移植前に、筋芽細胞および線維芽細胞を、被験体の骨格筋の生検より得られた衛星細胞から、インビトロにて増殖する。この細胞の組成は、好ましくは４０〜６０％の筋芽細胞である。この細胞を８×１０７細胞／ｍｌの濃度で、適当な潅流を有する左心室壁領域における梗塞部位におよびその周囲に注射する。１００μｌまでの注射を、３０部位まで行う。
【０１５２】
筋芽細胞移植および線維芽細胞移植の安全性を、移植細胞および移植手順の副作用に基づいてアッセイする。心エコー検査法および磁気共鳴映像法を用いて、局所壁運動を評価する（心機能の改善を検出するためのアッセイ）。
【０１５３】
（実施例９：梗塞されたヒト心筋へ移植した自家筋芽細胞の生存）
（材料および方法）
本実施例は、自家骨格筋芽細胞をヒト被験体から単離し、組織培養で処理し、増殖し、次いで被験体（患者は左心補助装置（ＬＶＡＤ）の埋め込みを受けているが、心臓移植を待っている）の心臓に送達するという研究を記載する。臨床第Ｉ相試験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）で承認され、そして、承認された治験薬（ＩＮＤ）およびインフォームドコンセントのプロセスの下で、連邦政府のガイドラインに従って実施された。心臓移植の時に、患者の心臓を取り出して分析した。これらの研究は、初めて、骨格筋芽細胞の生存の組織学的および病理学的な証拠および骨格筋芽細胞のヒト心臓への移植を提供する。
【０１５４】
（研究の被験体およびプロトコール）
患者（表６の被験体ＦＣＳ−０２）は、６０歳男性で、虚血性心筋症（左心室拍出画分１５％）、１９８６年の先の冠状動脈バイパス移植術、ならびに血管再生を受けにくい重度の先天性冠状動脈疾患および移植片冠状動脈疾患の既往を有した。この患者を評価し、そして心臓移植に対して承認され、研究の補強および筋生検を受けた。この筋生検は、局部麻酔を使用して無菌状態の下で、右の大腿四頭筋から採取した。筋標本をすぐに、搬送培地に移し、そしてＧＭＰ隔離施設へ送った。
【０１５５】
移植のリストアップの４週後に、患者は、難治性の低血圧および非持続性の心室頻拍を発現した。患者を評価し、そして心臓移植のブリッジとして、Ｈｅａｒｔ  Ｍａｔｅ（登録商標）ＬＶＡＤ（Ｔｈｏｒａｔｅｃ，Ｉｎｃ．）の移植を受けた。ＬＶＡＤ移植時に、長さ０．５インチの２６ゲージ針を用いて、左心室の前壁に自家骨格筋芽細胞を複数回注射した。注射部位は、手術前の心エコー検査法に基づいて、そして、開心術中の直接的な露出に基づいて選択した。１５回の１００μｌの注射を、一定のゆっくりした送達速度で送達した。長さ１インチの２５ゲージ針を用いて、さらに１５回の１００μｌの注射を約１ｃｍ離して送達した。すべての注射を、外科用クリップを用いて境界を定めた約３×３ｃｍ２の指定領域に行った。ＬＶＡＤの移植手順は、通常通りの様式で完了した。患者は何事もなく回復し、術後１８日目にＬＶＡＤ補助を伴って退院して帰宅した。ＬＶＡＤ移植の９１日後、患者はＬＶＡＤ外移植および心臓移植を受けた。手術時に、外科用クリップによって境界を定められた左心室の一部を切除し、組織学分析の前に、ホルマリン溶液中に保存した。患者の術後経過において、腎機能不全は注目すべきことであった。患者は改善し、術後３０日目に満足な状態で退院して帰宅した。移植の１０ヵ月後も、患者は生存し、そして良好である。
【０１５６】
（自家骨格筋芽細胞の調製）
生検で得られた初めの１．５３ｇの骨格筋の結合組織を剥ぎ取り、消化培地のスラリーに細かく刻み、次いで、衛星細胞を放出するために、１×トリプシン／ＥＤＴＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ  トリプシン、０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）および正規のコラゲナーゼ−肝細胞（０．５ｍｇ／ｍｌ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と共に３７℃で数サイクルの酵素消化に供した。骨格筋芽細胞培養物を、改変されたＨａｍの方法２７に従って増殖した。衛星細胞を撒き、１５〜２０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、組換えヒト上皮細胞成長因子（ｒｈＥＧＦ：１０ｎｇ／ｍＬ）およびデキサメタゾン（３μｇ／ｍＬ）を含む筋芽細胞基本増殖培地（ＳｋＢＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で増殖させた。この細胞の一部を１０倍加増殖させ、次いで凍結保存した。解凍後、最終的に３億８００万の細胞収量に達するように、これらの細胞を、１４倍加増殖させた第２の細胞群と混ぜ合わせた。培養プロセスの間、任意の筋管形態の可能性を避けるために、このプロセスの間中、細胞密度を維持し、その結果、７５％以上の培養表面が細胞によって占有された。
【０１５７】
筋芽細胞の純度を、抗ＮＣＡＭモノクローナルＡｂ（５．１Ｈ１１、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂｒｏｗｎ博士によって提供）との反応性により、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）を使用して測定した。この抗体は、ヒト筋芽細胞を選択的に染色するが、繊維芽細胞は染色しない２８。インビトロにて筋芽細胞が多核性筋管へと融合する能力をまた、２４ウエル組織培養プレートあたり２×１０５の細胞を増殖培地中に播種することによって、確認した。翌日、培養培地を融合培地（ダルベッコ最小必須培地＋０．１％ウシ血清アルブミンおよび５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ）へ転換し、そして、融合を評価するために培養物を３日後に観察した。移植前に、３億個より多い細胞を洗浄し、１ｃｃあたり約１億個の細胞で移殖培地へ懸濁し、そして、５つの１ｃｃのツベルクリンシリンジへ充填した。輸送の間、これらの細胞を４℃に保った。無菌試験を、最終産物で行い、そして消化手順および増殖手順を通じて行った。
【０１５８】
（組織学的分析および免疫組織化学技術）
切除した心筋をホルマリンで固定し、小さなブロックへカットし、そしてパラフィン包埋した。６ミクロンの厚さの切片をカットし、標本にし、そしてトリクロムで染色した。ミオシン重鎖の検出について、脱パラフィン化切片をアルカリホスファターゼ結合体化ＭＹ−３２ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）（心筋を染色しない骨格筋反応性の抗ミオシン重鎖抗体）と共にインキュベートした２９。切片をＢＣＩＰ−ＮＢＴ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ  Ｉｎｃ）で発色させそして、核を赤で対比染色した。血管内皮細胞を抗ＣＤ−３１ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ  ＪＣ／７０Ａ、ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ．）で、そしてＴ細胞をポリクローナルウサギ抗ヒトＣＤ３抗体（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ．）で検出するために、製造業者の推奨に従って、脱パラフィン化切片を一次抗体した。二次抗体とのインキュベーションは、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  ＥｌｉｔｅまたはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｇｏａｔ  Ｅｌｉｔｅ  Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）についての指示に従って実施した。切片をジアミノベンジジン（ＤＡＢ基質キット；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１５９】
血管内皮の定量化に関しては、移植領域内の合計６つの独立した位置を抗ＣＤ−３１ｍＡｂで免疫染色した。計数を、移植細胞領域および移植片と直接隣接する移植されていない瘢痕領域で実施した。２０×対物レンズを有するＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡およびＫｏｄａｋデジタルカメラを用いて、各視野を撮影した。次いで、この画像をＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ５．０に取り入れ、そして、個々の血管エレメントについて全視野を計数した。計数を分析し、そして分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって統計的分析を実施した。統計的に有意な差を、ｐ＜０．０５で規定した。
【０１６０】
（結果）
２９時間の平均的な倍加時間で、培養物中で骨格筋芽細胞を増殖させた。移植前に、３０８×１０６細胞の集団は単一細胞のみを含み、融合された筋芽細胞を含まなかった。細胞調製物は、骨格筋特異的な抗ＮＣＡＭｍＡｂ染色およびＦＡＣＳ分析に基づき、９６．５％の筋芽細胞からなった（残りの細胞は、線維芽細胞からなる）（図９）。最終的な筋芽細胞調製物を、融合して多核性の筋管を形成する能力を実証することによって、さらに特徴付けた。
【０１６１】
複数の注射を用いて、約３００×１０６の細胞を患者の左心室壁へ移植した。細胞移植の約３ヶ月後の同所性の心臓移植時において、外殖された心臓を固定し、そして切片にした。トリクロム染色によって、ひどく瘢痕のある心臓組織中の、生存する自己骨格筋細胞を同定した（図１０Ａ）。線維芽細胞および瘢痕のコラーゲンに関連する青色染色と対比して、心筋および骨格筋に特徴的な赤色のトリクロム染色によって、筋原線維構造を移植領域内で同定した（図１０Ａ）。筋原線維は、長さ約１．２ｃｍ幅約２ｃｍの範囲に及ぶいくつかの組織ブロックにわたって続いた。骨格筋特異的なミオシン重鎖の染色によって、赤色で染色された筋原線維組織が、骨格の発生源であることを確認した（図１０Ｂ）。移植された骨格筋線維のみが、筋肉特異的なミオシン重鎖について染色され、そして宿主心筋線維は染色されない。さらに、移植に関連している筋原線維のほとんどが、宿主心筋線維と平行して並んだ。移植細胞の形態学的な相違にも生存の相違にも、瘢痕のある心筋内の移植片または正常な心筋に隣接した移植片の間で注目すべきものはない（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。
【０１６２】
自己筋芽細胞の移植片と関連する炎症性細胞の存在をより良好に評価するために、トリクロム染色に加えてＨ＆Ｅ染色を実施した。移植された領域および移植されていない領域に関連する免疫反応またはリンパ球浸潤の証拠はなかった。この結論を、Ｔ細胞特異的な抗ＣＤ３ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色で確認した（データは示していない）。しかしながら、移植片内および移植片周囲では、多数の多核巨細胞の例が検出されたが、移植されていない心筋内には検出されなかった。巨細胞は、細胞の注射の間におそらく導入される屈折物質と関連して認められた。移植された筋線維自体に関連する巨細胞の証拠はなかった。
【０１６３】
移植された心筋内および移植されていない心筋内の血管内皮の存在を評価するために、抗ＣＤ−３１ｍＡｂを用いた免疫組織化学染色もまた実施した（図１１）。６つの独立した移植片領域からの定量的な測定は、生存する移植片の部分（図１１Ａおよび図１１Ｂ）において、対応する移植されていない瘢痕組織における血管数と比較して、ＣＤ−３１で染色された、有意により多い血管を示した（それぞれ、移植された領域の視野あたり２２８±２４細胞  対  移植されていない領域の視野あたり７２±１７細胞；ｐ＜０．０００１）（図１１Ｂ）。
【０１６４】
要約すれば、上記に記載される結果は、ヒト心臓への送達後に、瘢痕のある心筋および健全な心筋の両方内での、広範囲の骨格筋芽細胞の生存および骨格筋線維への分化を示す。さらに、これらの結果は、有意な血管新生が細胞生存領域内に生じたことを示す。これらの結果は、ヒトの心臓の損傷または機能不全に対する骨格筋芽細胞療法の実現可能性を確認する。
【０１６５】
（実施例９に関する参考文献）
【０１６６】
【数１】
2010265320.tif 000007
【０１６７】
【数２】
2010265320.tif 000008
【０１６８】
【数３】
2010265320.tif 000009
【０１６９】
【数４】
2010265320.tif 000010
（実施例１０：梗塞したヒト心筋へ移植された自己筋芽細胞の生存）
（材料および方法）
（研究する被験体およびプロトコール）
患者（表６の被験体ＪＤＲ−０３）は、虚血性心筋症および入院を必要とした肺水腫の反復性エピソードを伴う心不全の徴候（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ）の診断を有する６２歳男性である。この患者の過去の病歴は、高血圧、心筋梗塞および１９９２年の冠状動脈バイパス手術について特筆すべきである。この患者は評価され、そして心臓移植について承認し、研究の募集および筋生検を受けた。この筋生検は、局部麻酔を使用して無菌条件下で、右の大腿四頭筋から採取した。この筋標本をすぐに、輸送培地へ置き、そしてＧＭＰ隔離施設へ送った。
【０１７０】
筋サンプルの採取後、患者は評価され、そして心臓移植のブリッジとして、ＨｅａｒｔＭａｔｅ（登録商標）ＬＶＡＤ（Ｔｈｏｒａｔｅｃ，Ｉｎｃ．）移植を受けた。ＬＶＡＤ移植時に、自己骨格筋芽細胞の複数の注入を実施例９に記載される様式と類似の様式で行った。ＬＶＡＤの移植手順は、通常通りの様式で完了した。患者は何事もなく回復し、そしてＬＶＡＤサポートを伴って退院し、帰宅した。ＬＶＡＤ移植の４ヶ月後、患者はＬＶＡＤ外移植および心臓移植を受けた。手術時において、外科用クリップによって境界を定められた心臓の一部を切除し、組織学的分析の前に、ホルマリン溶液中に保存した。患者は改善し、満足な状態で退院し、帰宅した。移植の７ヵ月後、患者は生存し、そして良好である。
【０１７１】
（自己骨格筋芽細胞の調製および組織学的分析ならびに免疫組織化学的技術）
筋芽細胞の割合が約６２％であり、そして合計１７回の注射を実施したこと以外は、実施例９の記載と同様にこれらを実施した。細胞の濃度は、１ｃｃあたり約１億個であった。合計容積３．５ｍｌの注射になるように、１７回の注射（７回の１００μｌの注射、４回の２×１００μｌの注射、４回の４×１００μｌの注射および２回の４×１００μｌの注射）を実施した。定量的な評価を実施例９に記載されるように実施した。
【０１７２】
（結果）
骨格筋芽細胞を上記のような培養物中で増殖した。移植前に、約３００×１０６細胞の集団は、単一細胞のみを含み、融合した筋芽細胞は含まなかった。細胞調製物は、骨格筋特異的な抗ＮＣＡＭ  ｍＡｂ染色およびＦＡＣＳ分析に基づくと、６２％の筋芽細胞からなった（残りの細胞は、線維芽細胞からなった）。最終的な筋芽細胞調製物を、融合して多核性の筋管を形成する能力を実証することによって、さらに特徴付けた。
【０１７３】
複数の注射を用いて、約３００×１０６細胞を移植した。細胞移植の約４ヶ月後の同所性の心臓移植時において、外殖された心臓を固定し、そして切片にした。実施例９に記載されるようにこの組織を分析した。
【０１７４】
図１２は、被験体心臓において生存する骨格筋線維のトリクロム染色を示す顕微鏡写真である。この領域は、心筋の心外膜表面から心外膜脂肪へ及ぶ。青い染色は、コラーゲン原線維を表し、そして赤い斑は、生存する筋線維を表す。四角で囲まれた領域を、図１３に高倍率で示す。筋芽細胞移植の広範囲の証拠は、脂肪に富んだ領域および他の心臓領域内に認められた。異なる注射部位から得られた結果を比較した場合、細胞の生存または細胞の表現型の相違は認められなかった。
【０１７５】
図１３は、２００×倍率で示された生存する骨格筋線維のトリクロム染色を示す顕微鏡写真である。青色で染色する領域は、瘢痕のある心筋の代表的なコラーゲン原線維の沈着の領域を表す。矢印によって印された赤く染色された領域は、筋原線維を示し、そのいくつかは、骨格筋原線維の形態と一致した筋状の外観を示す。
【０１７６】
図１４は、心臓内の骨格筋芽細胞の生存および分化を示す、骨格筋特異的なミオシンを用いた骨格筋原線維の染色を示す。図１５は、移植細胞を受けた心臓組織における、生存する骨格筋原線維の筋肉特異的なミオシン染色を示す。筋原線維は、心外膜表面に近接する心筋内に示される。
【０１７７】
（実施例１１：梗塞したヒト心筋へ移植された不十分な数の自己筋芽細胞の生存の証拠の欠如）
（材料および方法）
（研究する被験体および方法）
患者（表６の被験体ＪＷ−０１）は、心臓機能不全の病歴を有する４３歳男性であった。この患者は、評価され、そして心臓移植について承認し、研究の募集および筋生検を受けた。この筋生検は、局部麻酔を使用して無菌条件下で、右の大腿四頭筋から採取した。この筋標本をすぐに、輸送培地へ置き、そしてＧＭＰ隔離施設へ送った。
【０１７８】
筋サンプルの採取後、患者は評価され、そして心臓移植へのブリッジとして、ＨｅａｒｔＭａｔｅ（登録商標）ＬＶＡＤ（Ｔｈｏｒａｔｅｃ，Ｉｎｃ．）移植を受けた。ＬＶＡＤ移植時に、自己骨格筋芽細胞の複数の注入を実施例９に記載される様式と類似の様式で行った。ＬＶＡＤの移植手順は、通常通りの様式で完了した。患者は何事もなく回復し、そしてＬＶＡＤサポートを伴って退院し、帰宅した。ＬＶＡＤ移植の約３ヶ月後、患者はＬＶＡＤ外移植および心臓移植を受けた。手術時において、外科用クリップによって境界を定められた心臓の一部を切除し、組織学的分析の前に、ホルマリン溶液中に保存した。患者は改善し、満足な状態で退院し、帰宅した。移植の１０ヵ月後、患者は生存し、そして良好である。
【０１７９】
（自己骨格筋芽細胞の調製および組織学的分析ならびに免疫組織化学的技術）
一般に、実施例９に記載されるのと同様にこれらを実施した。しかしながら、この患者は、筋肉標本を得た後すぐに心臓移植を受けたので、骨格筋芽細胞の増殖に利用可能な時間は制限された。従って、移植時に、全部で約２．２×１０６細胞のみを送達し得た。筋芽細胞の割合は約７５％であり、そして全部で３回の注射のみを、少数の細胞に起因して実施した。定量的な評価を実施例９に記載のように実施した。
【０１８０】
（結果）
骨格筋芽細胞を上記のような培養物中で増殖した。移植前に、約２．２×１０６細胞の集団は、単一細胞のみを含み、融合した筋芽細胞は含まなかった。細胞調製物は、骨格筋特異的な抗ＮＣＡＭ  ｍＡｂ染色およびＦＡＣＳ分析に基づくと、約７５％の筋芽細胞からなった（残りの細胞は、線維芽細胞からなった）。最終的な筋芽細胞調製物を、融合して多核性の筋管を形成する能力を実証することによって、さらに特徴付けた。
【０１８１】
複数の注射を用いて、約２．２×１０６細胞を移植した。細胞移植の約３ヶ月後の同所性の心臓移植時において、外殖された心臓を固定し、そして切片にした。実施例９に記載されるようにこの組織を分析した。骨格筋芽細胞の生存または移植の証拠は認められなかった。この結果は、おそらく、心臓へ送達された非常にわずかな細胞数に起因する。少数の細胞の送達後の、骨格筋芽細胞の生存または移植の証拠の欠如は、有用なネガティブコントロールとして働き、実施例９および実施例１０に記載される心臓について得られた結果が、実際に骨格筋芽細胞の生存および分化に起因することを確認している。この結果は、さらに、適切な数の細胞を心臓に送達する重要性を確認する。
【０１８２】
（等価物）
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または、通常にすぎない実験だけを用いて確認し得る。このような等価物は、上記の特許請求の範囲によって、包含されることを意図する。
【０１８３】
【数５】
2010265320.tif 000011
【０１８４】
【数６】
2010265320.tif 000012
【０１８５】
【数７】
2010265320.tif 000013
【図１】
2010265320.tif 000014
【図２】
2010265320.tif 000015
【図３】
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【図４】
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【図５】
2010265320.tif 000018
【図６】
2010265320.tif 000019
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2010265320.tif 000021
【図８Ａ】
2010265320.tif 000022
【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2010265320.tif 000025
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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