(57)【要約】【課題】前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）と称され、高い程度の前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺腫瘍を含むすべての段階の前立腺癌で広く過剰発現する、新規の前立腺細胞表面抗原を提供すること。【解決手段】ＰＳＣＡに関連する癌を有する患者の寿命を延長するための方法であって、該癌細胞の増殖を阻害するのに十分な時間に亘ってＰＳＣＡと選択的に結合する一定量の抗体を被験体に投与する工程を包含し、これによって、該被験体の寿命を延長する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＳＣＡに関連する癌を有する患者の寿命を延長するための方法であって、該癌細胞の増殖を阻害するのに十分な時間に亘ってＰＳＣＡと選択的に結合する一定量の抗体を被験体に投与する工程を包含し、これによって、該被験体の寿命を延長する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願を通して、種々の刊行物が括弧内で言及される。これらの刊行物の開示は、それにより、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
癌は、冠状動脈疾患に次いで２番目の、人の主な死因である。世界中で、何百万もの人々が、毎年、癌によって死んでいる。米国だけでは、癌は、毎年約５０万人をゆうに超える人々の死亡を引き起こし、１年あたりほぼ１４０万の新たな症例が診断される。心臓疾患による死亡は顕著に減少しているとはいえ、癌による死亡は徐々に増加している。次世紀の初めには、癌は、主な死因になると予測されている。
【０００３】
世界中で、いくつかの癌が、主な致命的なものとして突出している。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓および卵巣の癌は、癌による死亡の主な原因を表す。これらの、および実質的に全ての他の癌は、共通の致死的特徴を共有する。非常に少ない例外があるが、癌からの転移性疾患が致死的である。さらに、その原発性癌を最初に生き伸びる癌患者についてさえも、肝臓が劇的に変更されるという共通の経験が示された。多くの癌患者は、再発または処置の失敗の可能性に気付くことによって強い不安を経験する。多くの癌患者は、処置後の顕著な身体的衰弱を経験する。
【０００４】
一般的にいって、最も死にそうな（ｄｅａｄｌｉｅｓｔ）癌の管理における基本的問題は、有効でかつ非毒性の全身治療がないことである。分子薬剤は、その乳児期において非常に多いが、これらの癌が管理される方法を再検討することを約束する。疑いなく、癌の診断および処置に対する新規な分子的アプローチの開発を目的とした、世界中でのかなりの努力が存在する。例えば、診断および予後のマーカーおよび／または治療の標的もしくは薬剤として用いられ得る、本当に腫瘍特異的な遺伝子およびタンパク質を同定することに大きな興味がある。これらの領域における研究努力は助長されており、そして有用な分子技術の利用可能性が増加し続けていることは、癌についての意義のある知識の獲得を加速した。それにもかかわらず、進歩はゆっくりであり、そして一般に一様でない。
【０００５】
近年、種々の免疫治療ストラテジーまたは低分子処置ストラテジーのための標的として有用であり得る、細胞表面の腫瘍特異的抗原を同定することに特に強力な興味が存在している。多数のこのような細胞表面抗原が報告されており、そしていくつかは、１以上の癌と信頼性良く関連することが証明されている。これらの抗原を標的とする新規な治療ストラテジーの開発に多くの注目が集中している。しかし、真に有効な免疫学的癌治療はほとんどもたらされていない。
【０００６】
固形癌の処置における腫瘍特異的抗原または過剰発現される抗原に対するモノクローナル抗体の使用は有用である。抗体治療はほぼ２０年間充分に調査されているが、非常にごく近年になって対応する薬剤が実現した。１つの例は、ＨＥＲ２／ｎｅｕレセプターを過剰発現する転移性乳がんの処置における使用が近年承認された、ヒト化抗ＨＥＲ２／ｎｅｕモノクローナル抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎである。別の例は、非ホジキンリンパ腫の処置について承認された、ヒト／マウスキメラ抗ＣＤ２０／Ｂ細胞リンパ腫抗体Ｒｉｔｕｘａｎである。いくつかの他の抗体は、上皮増殖因子レセプターについて特異的な、キメラの、および完全にヒトの、ＩｇＧ２モノクローナル抗体を含めて、臨床試験または前臨床研究において癌の処置について評価されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。明らかに、抗体治療は、長い胎児段階から最終的に出現している。それにもかかわらず、抗体および他の生物学的治療の適用のための、新たな、より特異的な腫瘍抗原についての非常に大きな必要性が存在する。さらに、できれば、より早期の診断およびより大きな予後判断の精度の開発をもたらす、抗体に基づく診断方法および画像化方法のためのマーカーとして有用であり得る腫瘍抗原についての対応する必要性が存在する。
【０００７】
以下で考察するように、前立腺癌の管理は、分子生物学が、診療所における真の進歩へと移される制限された程度の良好な例として役立つ。限られた例外はあるが、この状況は、上記の他の主要な癌についても多かれ少なかれ同じである。
【０００８】
世界中で、前立腺癌は、ヒトにおいて４番目に有病率の高い癌である。北アメリカおよび北ヨーロッパでは、前立腺癌は、男性の断然最も普通の癌であり、そしてヒトにおける癌による２番目の主な死因である。米国だけで、４０，０００万人をゆうに超える人々がこの疾患によって毎年死亡しており、肺癌だけについて２番目である。これらの数字の大きさにもかかわらず、転移性前立腺癌についての有効な処置は依然として存在しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモン除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）治療、および化学療法は、主な処置様式として残っている。不幸にも、これらの処置は多くについては明らかに無効である。さらに、これらの処置はしばしば、かなりの望ましくない結果を伴う。
【０００９】
診断の前面では、血清ＰＳＡアッセイが非常に有用なツールである。それにもかかわらず、ＰＳＡの特異性および一般的有用性は、いくつかの点を欠くと広範に考えられている。ＰＳＡ試験も、他の任意の試験も生物学的マーカーのいずれも、初期段階の疾患を信頼性高く同定し得ると証明されている。同様に、代表的に致死的な転移性段階のこの疾患の出現を予測するために利用可能なマーカーは存在しない。転移性前立腺癌の診断は、開放的外科的骨盤リンパ切除または腹腔鏡下骨盤リンパ切除、全身放射性核種スキャン、骨格Ｘ線撮影、および／または骨病巣生検分析によって達成される。明らかに、より良好な画像化および他のより侵襲性でない診断方法は、患者に対してこれらの手順が与える困難を容易にする見込み、ならびに治療選択肢を改善する見込みを提供する。しかし、初期の疾患を信頼性良く同定し得る前立腺腫瘍マーカー、転移に対する感受性を予測すること、および腫瘍を正確に画像化することが存在するまでは、前立腺癌の管理は極めて困難であり続ける。従って、より特異的な分子腫瘍マーカーは、前立腺癌の管理において明確に必要とされる。
【００１０】
前立腺において主に発現される、いくつかの公知のマーカー（例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）、ラットニューロペプチダーゼに対する８５％同一性を有するヒドロラーゼ）が存在する（非特許文献４；非特許文献５）。しかし、小腸および脳（非特許文献６）におけるＰＳＭの発現は、脳における神経ペプチド異化におけるその潜在的役割と同様に、抗ＰＳＭ治療を用いた潜在的神経毒性の関心を高める。再発性の前立腺癌を画像化するためにインジウム−１１１で標識した抗ＰＳＡモノクローナル抗体を用いた予備的な結果は、いくらかの見込みを示す（非特許文献７）。より近年同定された前立腺癌マーカーとしては、ＰＣＴＡ−１（非特許文献８）が挙げられる。ＰＣＴＡ−１は、新規なガレクチンであり、発現する細胞の培地中に大部分が分泌され、そして前立腺癌についての診断血清マーカーとしての見込みを保持し得る（非特許文献８）。前立腺癌についてのワクチンもまた、ＰＳＭおよびＰＳＡを含めて、種々の抗原を用いて活発に探索されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｌｏｖｉｎら、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．第１６巻ｐ．３１１
【非特許文献２】Ｆａｌｃｅｙら、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．第１６巻ｐ．３８３
【非特許文献３】Ｙａｎｇら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５９：１２３６
【非特許文献４】Ｃａｒｔｅｒら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９３巻ｐ．７４９
【非特許文献５】Ｂｚｄｅｇａら、１９９７年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．第６９巻ｐ．２２７０
【非特許文献６】Ｉｓｒａｅｌｉら、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５４巻ｐ．１８０７
【非特許文献７】Ｓｏｄｄｅら、１９９６年、Ｃｌｉｎ  Ｎｕｃ  Ｍｅｄ  第２１巻ｐ．７５９−７６６
【非特許文献８】Ｓｕら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９３巻ｐ．７２５２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によって以下が提供される：
（１）  ＰＳＣＡに関連する癌を有する患者の寿命を延長するための方法であって、
該癌細胞の増殖を阻害するのに十分な時間に亘ってＰＳＣＡと選択的に結合する一定量の抗体を被験体に投与する工程を包含し、これによって、該被験体の寿命を延長する、方法。
（２）  循環抗体を用いて被験体中のＰＳＣＡ発現腫瘍細胞を選択的に標的化するための方法であって、
一定量の抗体を、そのタンパク質が該被験体中で循環して該ＰＳＣＡ発現細胞に選択的に結合するのに十分な時間に亘って被験体に投与する工程
を包含し、それによって、該被験体内の該ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞が標的化される、
方法。
（３）  被験体中のＰＳＡの血清レベルを低減するための方法であって、
該ＰＳＡの血清レベルを低減するのに十分な時間に亘ってＰＳＣＡに選択的に結合する一定量の抗体を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（４）  サンプル中のＰＳＣＡタンパク質の量を決定するための方法であって、
ａ．抗ＰＳＣＡ抗体を該サンプルに接触して、ＰＳＣＡ／抗ＰＳＣＡ抗体複合体を形成する工程；および
ｂ．該ＰＳＣＡ／抗ＰＳＣＡ抗体複合体の量を決定するための工程
を包含する、方法。
（５）  項目１、２、３または４に記載の方法であって
ＰＳＣＡに選択的に結合する抗体がモノクローナル抗体、その抗体のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメントまたは該ＰＳＣＡタンパク質に結合する組み換えタンパク質である、方法。
（６）  ＰＳＣＡに選択的に結合する前記抗体が、治療剤に結合体化している、項目１，２、または３に記載の方法。
（７）  項目６に記載の方法であって、前記治療剤が、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌体外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、キュリシン、クロチン、カリーチアマイシン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、マイタンシノイド、および糖質コルチコイドからなる群より選択される、方法。
（８）  前記治療剤が、放射性同位体である、項目６に記載の方法。
（９）  前記放射性同位体が、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅからなる群より選択される、項目８に記載の方法。
（１０）  前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体を包含する、項目５に記載の方法。
（１１）  前記モノクローナル抗体が、ヒト化抗体である、項目５に記載の方法。
（１２）  前記モノクローナル抗体が、ヒト抗体である、項目５に記載の方法。
（１３）  前記ＰＳＣＡに関連する癌が、前立腺癌である、項目１に記載の方法。
（１４）  前記ＰＳＣＡに関連する癌が、転移性癌である、項目１に記載の方法。
（１５）  前記ＰＳＣＡに関連する癌が、膀胱癌である、項目１に記載の方法。
（１６）  前記ＰＳＣＡに関連する癌が、転移性膀胱癌である、項目１に記載の方法。
（１７）  前記ＰＳＣＡに関連する癌が、すい臓癌である、項目１に記載の方法。
（１８）  前記ＰＳＣＡに関連する癌が、転移性すい臓癌である、項目１に記載の方法。
（１９）  化学療法剤を前記被験体に投与する工程をさらに包含する、項目１、２または３に記載の方法。
（２０）  ホルモン除去治療を前記被験体に与える工程をさらに包含する、項目１、２または３に記載の方法。
（２１）  ホルモンアンタゴニストを前記被験体に与える工程をさらに包含する、項目１、２または３に記載の方法。
（２２）  放射線治療を前記被験体に与える工程をさらに包含する、項目１、２または３に記載の方法。
（２３）  前記被験体に、ＰＳＣＡに結合するモノクローナル抗体の組み合せが投与される、項目１、２または３に記載の方法。
（２４）  前記モノクローナル抗体の組み合わせが、少なくとも２つの異なるアイソタイプのモノクローナル抗体である、項目２５に記載の方法。
（２５）  前記モノクローナル抗体の組み合わせが、異なるエピトープ特異性の違いを有するモノクローナル抗体を包含する、項目２５に記載の方法。
（２６）  項目２５に記載の方法であって、
前記モノクローナル抗体の組み合わせが、ＡＴＣＣに寄託された、ＨＢ−１２６１２、ＨＢ１２５６１２、ＨＢ−１２６１４、ＨＢ−１２６１６、ＨＢ−１２６１８、ＨＢ−１２６１５、ＨＢ−１２６５１７で示されるハイブリドーマによって、それぞれ、産生された、モノクローナル抗体である、１Ｇ８、２Ａ２、２Ｈ９、３Ｃ５．３Ｅ６、３Ｇ３、および４Ａ１０を含む、方法。
（２７）  項目２に記載の方法を包含する、被験体内のＰＳＣＡ発現腫瘍細胞を検出するための方法。
（２８）  項目２に記載の方法を包含する、被験体内のＰＳＣＡ発現腫瘍細胞を死滅させる方法。
（２９）  前記ＰＳＣＡ発現腫瘍が、局所的な腫瘍細胞、局所的に再発する細胞、および転移性腫瘍細胞からなる群より選択される
（３０）  前記サンプルが、生物学的サンプルである、項目４に記載の方法。
（３１）  前記生物学的サンプルが、尿、血清、血漿、および粘液からなる群より選択される、項目４に記載の方法。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）と称され、高い程度の前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺腫瘍を含むすべての段階の前立腺癌で広く過剰発現する、新規の前立腺細胞表面抗原を提供する。ＰＳＣＡ遺伝子は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）係留細胞表面抗原のＴｈｙ−１／Ｌｙ−６ファミリーのメンバーである幹細胞抗原−２（ＳＣＡ−２）に対して３０％の相同性を示し、アミノ末端シグナル配列、カルボキシ末端ＧＰＩ係留配列、および複数のＮ−グリコシル化部位を有する１２３アミノ酸のタンパク質をコードする。ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡ発現は、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の両方の前立腺癌の異種移植片において、高度に上方制御される。インサイチュでのｍＲＮＡ分析は、前立腺の推定幹細胞区画である基底細胞上皮にＰＳＣＡ発現を位置決定する。フローサイトメトリー分析は、ＰＳＣＡが主に細胞表面で発現され、そしてＧＰＩ連結により係留されることを実証する。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション分析は、８０％を超える前立腺癌において得られる対立遺伝子（ａｌｌｅｌｉｃ  ｇａｉｎ）領域である、染色体８ｑ２４．２に対してＰＳＣＡ遺伝子を位置決定する。
【００１４】
ＰＳＣＡは、その細胞表面位置、前立腺癌細胞のような特定の型の癌における非常に上方制御された発現の観点から最適な治療標的であり得る。この点において、本発明は、そのような癌細胞の増殖を破壊もしくは阻害するために、またはＰＳＣＡ活性をブロックするために治療的に使用できるＰＳＣＡに結合可能な抗体を提供する。加えて、ＰＳＣＡタンパク質およびＰＳＣＡコード核酸分子は、ＰＳＣＡを発現する腫瘍の免疫媒介破壊または増殖阻害を促進する種々の免疫治療方法に使用され得る。
【００１５】
ＰＳＣＡはまた、理想の前立腺癌マーカーを示し得、それは、悪性の前立腺癌と、正常な前立腺と非悪性新形成とを識別するために使用され得る。例えば、ＰＳＣＡは、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）と比較して前立腺癌で非常に高いレベルで発現される。対照的に、広範に使用される前立腺癌マーカーＰＳＡは、正常な前立腺およびＢＰＨの両方で高いレベルで発現されるが、前立腺癌ではより低いレベルで発現され、ＰＳＡ発現をＢＰＨまたは正常な腺と悪性の前立腺癌とを区別するために役に立たなくする。ＰＳＣＡの発現は、本質的にＰＳＡの発現の逆であるから、ＰＳＣＡの発現の分析は、非悪性状態と前立腺癌とを区別するために使用され得る。
【００１６】
ヒトおよびマウスの両方のＰＳＣＡコード遺伝子が単離され、そしてそれらのコード配列は本明細書中で解明され、そして提供される。ヒトおよびマウスの両方のＰＳＣＡのアミノ酸配列もまた提供される。本発明はさらに、核酸に基づいたアッセイおよび免疫学的なアッセイを含む、前立腺癌の検出、モニタリング、および予後のための種々の診断アッセイを提供する。ＰＳＣＡ特異的モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに前立腺癌の処置の免疫治療方法および他の治療方法もまた提供される。本発明のこれらの局面および他の局面は、さらに以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ヒトＰＳＣＡをコードするｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ名称２０９６１２）のヌクレオチド配列（Ａ）および翻訳されたアミノ酸配列（Ｂ）である。
【図２】図２は、マウスＰＳＣＡホモログをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図３】図３は、ヒトＰＳＣＡ、マウスＰＳＣＡおよびヒト幹細胞抗原−２（ｈＳＣＡ−２）のアミノ酸配列のアラインメントである。影の領域は、保存されたアミノ酸を強調する。保存されたシステインを太字で示す。ＰＳＣＡにおける４つの予測されたＮ−グリコシル化部位を星印で示す。タンパク質の最初および最後の下線のアミノ酸は、それぞれ、Ｎ末端の疎水性シグナル配列およびＣ末端ＧＰＩ係留配列を示す。
【図４】図４は、ヒトＰＳＣＡの疎水性プロットである。
【図５】図５は、ヒトＰＳＣＡのＣｈｏｕ−Ｆａｓｓｍａｎ分析である。
【図６】図６は、モノクローナル抗体１Ｇ８が、ＬＡＰＣ９（ＰＳＣＡ陽性コントロール）および膀胱（Ｒｏｂ）と称される移行上皮癌（膀胱癌）に結合することを示すウェスタンブロットである。
【図７】図７は、正常組織および癌組織におけるＰＳＣＡ  ｍＲＮＡの制限された発現である。Ａ：前立腺、胎盤、および扁桃で高度な発現を示す正常ヒト組織におけるＰＳＣＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。示された組織由来の１ｎｇの逆転写された第１鎖ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、ＰＳＣＡ遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。示されたデータは、３０サイクルの増殖からである。Ｂ：前立腺癌異種移植片および正常組織における高いレベルを実証する、ＰＳＣＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。示された組織由来の逆転写されたｃＤＮＡの５ｎｇがＰＳＣＡ遺伝子特異的プライマーを用いて増幅された。β−アクチン遺伝子特異的プライマーを用いた増幅は、種々のサンプルの第１鎖ｃＤＮＡの規準化を示す。示されたデータは、２５サイクルの増幅からである。ＡＤ、アンドロゲン依存性；ＡＩ、アンドロゲン非依存性；ＩＴ、脛骨内異種移植片；Ｃ．Ｌ．、細胞株。
【図８】図８は、ヒトＰＳＣＡ、マウスＰＳＣＡ、およびヒトＴｈｙ−１／Ｌｙ−６遺伝子構造の模式図である。
【図９Ａ】図９Ａは、ＰＳＣＡ  ＲＮＡの発現のノーザンブロット分析である。Ａ：正常の前立腺およびＬＡＰＣ−４アンドロゲン依存性（ＡＤ）前立腺癌異種移植片およびＬＡＰＣ−４アンドロゲン非依存性（ＡＩ）前立腺癌異種移植片由来の総ＲＮＡを、ＰＳＣＡ特異的プローブまたはＰＳＡ特異的プローブを使用して分析した。等しいＲＮＡローディングおよびＲＮＡ統合性を、１８Ｓ  ＲＮＡおよび２８Ｓ  ＲＮＡのエチジウム染色により別々に示した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＰＳＣＡ  ＲＮＡの発現のノーザンブロット分析である。Ｂ：ＰＳＣＡ  ＲＮＡのヒトの複数の組織のノーザンブロット分析。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）よりフィルターを得た。そしてこのフィルターは、それぞれのレーンに２μｇのポリＡ  ＲＮＡを含む。
【図１０−１】図１０−１は、前立腺癌異種移植片および腫瘍細胞株におけるＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＡのＲＮＡの発現のノーザンブロット比較である。ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡは、高いレベルの前立腺癌特異的な遺伝子発現を示す。示された組織由来の１０μｇの総ＲＮＡが、アガロース／ホルムアルデヒドゲルにおいてサイズ分画され、ニトロセルロースに移され、そして続いてＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＡのｃＤＮＡフラグメントを表す32Ｐで標識されたプローブと順次ハイブリダイズされた。膜の４時間および７２時間のオートラジオグラフィーの露出、およびサンプルの等しいローディングを示す臭化エチジウムゲルを示す。ＢＰＨ、良性前立腺過形成；ＡＤ、アンドロゲン依存性；ＡＩ、アンドロゲン非依存性；ＩＴ、脛骨内異種移植片；Ｃ．Ｌ．細胞株。
【図１０−２】図１０−２は、前立腺癌異種移植片および腫瘍細胞株におけるＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＡのＲＮＡの発現のノーザンブロット比較である。ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡは、高いレベルの前立腺癌特異的な遺伝子発現を示す。示された組織由来の１０μｇの総ＲＮＡが、アガロース／ホルムアルデヒドゲルにおいてサイズ分画され、ニトロセルロースに移され、そして続いてＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＡのｃＤＮＡフラグメントを表す32Ｐで標識されたプローブと順次ハイブリダイズされた。膜の４時間および７２時間のオートラジオグラフィーの露出、およびサンプルの等しいローディングを示す臭化エチジウムゲルを示す。ＢＰＨ、良性前立腺過形成；ＡＤ、アンドロゲン依存性；ＡＩ、アンドロゲン非依存性；ＩＴ、脛骨内異種移植片；Ｃ．Ｌ．細胞株。
【図１０−３】図１０−３は、前立腺癌異種移植片および腫瘍細胞株におけるＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＡのＲＮＡの発現のノーザンブロット比較である。ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡは、高いレベルの前立腺癌特異的な遺伝子発現を示す。示された組織由来の１０μｇの総ＲＮＡが、アガロース／ホルムアルデヒドゲルにおいてサイズ分画され、ニトロセルロースに移され、そして続いてＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＡのｃＤＮＡフラグメントを表す32Ｐで標識されたプローブと順次ハイブリダイズされた。膜の４時間および７２時間のオートラジオグラフィーの露出、およびサンプルの等しいローディングを示す臭化エチジウムゲルを示す。ＢＰＨ、良性前立腺過形成；ＡＤ、アンドロゲン依存性；ＡＩ、アンドロゲン非依存性；ＩＴ、脛骨内異種移植片；Ｃ．Ｌ．細胞株。
【図１１−１】図１１は、正常前立腺標本および悪性前立腺標本におけるヒトＰＳＣＡ  ＲＮＡに対するアンチセンスリボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションである。Ａ：ＰＳＣＡ  ＲＮＡは、基底細胞上皮内の基底細胞の部分集合により発現される（黒矢印）が、前立腺管の内側を覆う最後まで分化した分泌細胞により発現されない（拡大率４００×）。Ｂ：ＰＳＣＡ  ＲＮＡは、高い程度の前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）により強く発現され（黒矢印）、侵襲性前立腺癌腺により強く発現される（黄矢印）が、正常の上皮においては、拡大率４０倍で検出可能でない（緑矢印）。Ｃ：高い程度の癌の場合におけるＰＳＣＡ  ＲＮＡの強い発現（拡大率２００×）。
【図１１−２】図１１は、正常前立腺標本および悪性前立腺標本におけるヒトＰＳＣＡ  ＲＮＡに対するアンチセンスリボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションである。Ａ：ＰＳＣＡ  ＲＮＡは、基底細胞上皮内の基底細胞の部分集合により発現される（黒矢印）が、前立腺管の内側を覆う最後まで分化した分泌細胞により発現されない（拡大率４００×）。Ｂ：ＰＳＣＡ  ＲＮＡは、高い程度の前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）により強く発現され（黒矢印）、侵襲性前立腺癌腺により強く発現される（黄矢印）が、正常の上皮においては、拡大率４０倍で検出可能でない（緑矢印）。Ｃ：高い程度の癌の場合におけるＰＳＣＡ  ＲＮＡの強い発現（拡大率２００×）。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＰＳＣＡタンパク質の生化学的分析である。Ａ：ＰＳＣＡタンパク質を、材料および方法に記載されたように、ＰＳＣＡ構築物を用いて一時的にトランスフェクトされ、次いで、Ｎ−グリコシダーゼＦまたはＯ−グリコシダーゼのどちらかを用いて消化した２９３Ｔ細胞から免疫沈降した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＰＳＣＡタンパク質の生化学的分析である。Ｂ：ＰＳＣＡタンパク質をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞、ならびこれらの細胞の訓化培地から免疫沈降した。細胞関連ＰＳＣＡは、１５％ポリアクリルアミドゲルにおいて、分泌されたＰＳＣＡまたは脱落したＰＳＣＡより速く移動する。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＰＳＣＡタンパク質の生化学的分析である。Ｃ：アフィニティー精製されたポリクローナル抗ＰＳＣＡ抗体を使用して、偽トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞、ＰＳＣＡをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞およびＬＡＰＣ−４前立腺癌異種移植片細胞のＦＡＣＳ分析。細胞は、表面の発現のみを検出するために透過処理されなかった。ｙ軸は、相対的な細胞数を示し、そしてｘ軸は、対数的なスケールにおける蛍光染色強度を示す。
【図１３】図１３は、フィトヘマグルチニンで刺激した末梢血液リンパ球由来のヒト分裂中期細胞に対するビオチン標識ＰＳＣＡプローブのインサイチュハイブリダイゼーションである。第８染色体ホモログは、矢印で同定される；特異的標識が、８ｑ２４．２に観察された。はめ込み図は、８ｑ２４．２での特異的な標識を例示する２つの第８染色体ホモログの部分的な核型を示す（矢尻）。画像は、冷却式電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラを連結したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡を使用して得た。ＤＡＰＩ染色した染色体およびハイブリダイゼーションシグナルの別々の画像が、画像分析ソフトウェア（ＮＵ２００およびＩｍａｇｅ１．５７）を使用して合わされた。
【図１４】図１４は、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８（緑）および３Ｅ６（赤）、マウス抗ＰＳＣＡポリクローナル血清（青）、またはコントロールの２次抗体（黒）を使用した、前立腺癌異種移植片（ＬＡＰＣ−９）、前立腺癌細胞株（ＬＡＰＣ−４）および正常な前立腺上皮細胞（ＰｒｅＣ）についての細胞表面ＰＳＣＡタンパク質発現のフローサイトメトリー分析である。詳細は、実施例５を参照のこと。
【図１５】図１５は、（ａ）７つの開示された抗体のそれぞれのエピトープ地図である。（ｂ）抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体のエピトープマッピングを、ＧＳＴ−ＰＳＣＡ融合タンパク質のウエスタンブロット分析により行った。
【図１６】図１６は、ＰＳＣＡが、ＧＰＩ係留タンパク質であることを示す模式図である。
【図１７】図１７は、前立腺癌におけるＰＳＣＡおよびｃ−ｍｙｃの遺伝子コピー数のＦＩＳＨ分析を示す写真である。
【図１８】図１８は、ＦＩＴＣ標識された１Ｇ８抗体が、ＰＳＣＡでトランスフェクトされたＬＮＣＡＰ細胞上のＰＳＣＡタンパク質に強く結合することを示す写真である。
【図１９】図１９は、ＦＩＴＣ標識された１Ｇ８抗体がＰｒｅＣ細胞に弱く結合することを示す写真である。
【図２０】図２０は、正常な前立腺基底細胞におけるＰＳＣＡのインサイチュＲＮＡハイブリダイゼーションを示す写真である。
【図２１】図２１は、原発性前立腺癌におけるＰＳＣＡの免疫染色である。４人の患者由来の代表的なパラフィン包埋切片は、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂを用いて染色された。患者１由来の標本は、グリースングレード（Ｇｌｅａｓｏｎ  ｇｒａｄｅ）４の腫瘍（矢印）におけるＰＳＣＡタンパク質の過剰発現を示し、そしてＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８を使用して隣接する正常な腺（矢尻）におけるＰＳＣＡの検出不可能な発現を示す。陽性染色の癌は、正常な腺を完全に包囲する。患者２由来の標本は、グリースングレード３＋３／４の癌における異質な染色を示す。グリースンパターン３の腺（矢尻）は、より大きな癌と比較して弱く染色し、さらなる有孔形態はグリースンパターン３／４の腺（矢印）を表す。患者３由来の標本は、ｍＡｂ  １Ｇ８を用いた弱く分化したグリースン５（矢印）の腫瘍によってＰＳＣＡの強い発現を示す。患者４は、弱く分化した腫瘍（矢尻）の大部分においてＰＳＣＡが染色していないこと、および標本中で同定された有孔形態の病巣において極度に弱く染色していることを示している生検標本である。患者４由来の一致した骨性転移は、図２８に示される。
【図２２】図２２は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結したビオチン化された１Ｇ８モノクローナル抗体により決定された場合の、前立腺癌の骨性転移を示す骨サンプルの写真である。
【図２３】図２３は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結したビオチン化された１Ｇ８モノクローナル抗体により決定された場合の、前立腺癌の骨性転移を示す骨サンプルの写真である。
【図２４】図２４は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結したビオチン化された３Ｅ６モノクローナル抗体により決定された場合の、前立腺癌の骨性転移を示す骨サンプルの写真である。
【図２５】図２５は、ＬＡＰＣ９および進行型膀胱癌の移行細胞癌におけるＰＳＣＡ  ＲＮＡの増加したレベルを示すノーザンブロットである。
【図２６】図２６は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結したビオチン化された３Ｅ６モノクローナル抗体により決定された場合の初期段階にある前立腺癌の組織の写真である。
【図２７】図２７は、ヘマトキシリン染色された３Ｅ６モノクローナル抗体により決定された場合の前立腺癌の骨性転移を示す骨サンプルの写真である。
【図２８】図２８は、骨性転移の前立腺癌におけるＰＳＣＡの免疫染色である。上のパネルは、患者５由来の骨性病巣（ｂｏｎｙ  ｌｅｓｉｏｎ）のヘマトキシリン染色およびエオシン染色（左）ならびにＰＳＣＡ（右）染色を示す。癌の疑いがある単一の病巣（矢印）は、Ｈ切片およびＥ切片において同定され、そして抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８を用いて強烈に染色することによって確認された（矢印）。下のパネルは、患者４由来の骨性病巣のＨ染色およびＥ染色（左）ならびにＰＳＣＡ染色を示す。患者４由来の原発性病巣は、図２１に示される。Ｈ染色およびＥ染色ならびにＰＳＣＡ染色の両方は、前立腺癌（矢印）による拡散性の骨性併発を示す。また、骨性転移におけるＰＳＣＡ免疫染色は均一かつ強烈である。
【図２９】図２９は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結したビオチン化された１Ｇ８モノクローナル抗体によって決定された場合の、前立腺癌の初期段階にある組織の写真である。
【図３０】図３０は、ヘマトキシリン染色により決定された場合の、１Ｇ８が、ＬＡＰＣ９細胞に結合することを示す写真である。
【図３１】図３１は、１Ｇ８が、ＰＳＣＡでトランスフェクトされたＬｎＣａＰ細胞に結合することを示す写真である。
【図３２】図３２は、１Ｇ８が、ＬｎＣａＰ細胞（ＰＳＣＡでトランスフェクトされていない）に結合しないことを示す写真である。
【図３３】図３３は、ｍＡｂ  １Ｇ８、２Ｈ９、３Ｈ６、３Ｃ５、および４Ａ１０を使用した非透過化処理したＬＡＰＣ−９ヒト前立腺癌細胞の細胞表面上のＰＳＣＡのフローサイトメトリー認識である。染色は、無関係のアイソタイプコントロール抗体と比較された。
【図３４】図３４は、ＰＳＣＡを用いて一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞およびＰＳＣＡモノクローナル抗体を用いてイムノブロットされた２９３Ｔ細胞を示す写真である。モノクローナル抗体２Ｈ９および３Ｅ６は、２９３Ｔ細胞において、脱グリコシル化されたＰＳＣＡに結合するが、グリコシル化されたＰＳＣＡには結合しない。対照的に、モノクローナル抗体１Ｇ８、３Ｃ５および４Ａ１０はグリコシル化されたＰＳＣＡを認識する。
【図３５】図３５は、非透過化処理した前立腺癌細胞におけるＰＳＣＡの細胞表面発現を示す免疫蛍光分析である。ＬＮＣａＰ細胞は、安定してＰＳＣＡでトランスフェクトされ、そしてｍＡｂ  １Ｇ８、３Ｅ６、３Ｃ５および４Ａ１０を用いて染色された。ネガティブコントロールは、無関係のアイソタイプ抗体を含み、そしてＬＮＣａＰ細胞はコントロールベクターを用いてトランスフェクトされ、その全ては、延長した曝露後でさえ、染色を示さなかった。
【図３６】図３６は、ＬＡＰＣ９細胞に結合するモノクローナル抗体２Ｈ９を示す写真である。
【図３７】図３７は、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂの免疫学的反応性を示す写真である。（Ａ）ｍＡｂ  １Ｇ８、２Ｈ９、３Ｃ５、３Ｅ６および４Ａ１０を用いてＰＳＣＡで一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来のＰＳＣＡの免疫沈降。コントロールは、無関係のマウスＩｇＧ  ｍＡｂであった。（Ｂ）５つの抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂを使用したＰＳＣＡを用いて一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のイムノブロット分析。ｍＡｂ  １Ｇ８、３Ｃ５および４Ａ１０は全て、ＰＳＣＡの等分子形態を認識し、ここで、このアッセイにおいてｍＡｂ  ２Ｈ９および３Ｅ６は、２９３Ｔ−ＰＳＣＡ細胞におけるＰＳＣＡの脱グリコシル化された形態をわずかに認識するのみである。
【図３８】図３８は、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂを用いた正常な前立腺の免疫組織化学的染色である。実施例は、ネガティブコントロールとして、無関係のアイソタイプ抗体を用いて染色された正常腺（矢印）、ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ３Ｅ６およびｍＡｂ  １Ｇ８を含むことを示した。分泌細胞（矢尻）と比較した場合、ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ３Ｅ６は、優先的に基底細胞（矢印）を染色したが、一方、ｍＡｂ  １Ｇ８は、基底細胞（矢印）および分泌細胞（矢尻）の両方を等しく染色する。ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ２Ｈ９を用いて染色された正常前立腺標本由来の萎縮性の単一層状腺の強い染色もまた示される。
【図３９】図３９は、正常な組織におけるＰＳＣＡタンパク質の発現である。（Ａ）パネルａは、ｍＡｂ  １Ｇ８を用いた膀胱の一過性の上皮の染色を示す。パネルｂは、ｍＡｂ  １Ｇ８を用いて染色した結腸神経内分泌細胞を示す。クロモグラニンを用いた二重染色は、陽性細胞が、神経内分泌起源であることを明らかにした（示さず）。パネルｃは、ｍＡｂ  ３Ｅ６を用いた集合管（矢印）および細管の染色を示す。パネルｄは、ｍＡｂ  ３Ｅ６を用いた胎盤栄養膜の染色を示す。（Ｂ）ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析。正常な前立腺、腎臓、膀胱およびＬＡＰＣ−９前立腺癌異種移植片に由来する総ＲＮＡは、ＰＳＣＡ特異的プローブを使用して分析された（上のパネル）。同膜は、負荷差異のコントロールに対してアクチンを用いてプローブされた（下のパネル）。
【図４０】図４０は、マウスＰＳＣＡ遺伝子の標的化である。（Ａ）パネルａは、ＰＳＣＡ標的化ベクターを作製するためのストラテジーを示す模式図である。（Ｂ）パネルｂは、野生型（＋／＋）ＥＳ細胞および異種接合型（＋／−）ＥＳ細胞の回復を示す３’プローブを使用したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析の写真である。
【図４１】図４１は、上のパネルが、前立腺癌のトランスジェニックマウスのモデルを産生するためのストラテジーの模式図である。下のパネルは、前立腺癌の既存のトランスジェニックマウスのモデルの一覧表である。
【図４２】図４２は、トランスフェクションアッセイのためのレポーター遺伝子構築物を示す模式図である。
【図４３】図４３は、増加した遺伝子発現活性を有する、９ｋｂヒトＰＳＣＡ上流調節領域の組織優勢発現（前立腺細胞および膀胱細胞）を示す棒グラフである。
【図４４】図４４は、増加した遺伝子発現活性を有する、ＰＳＣＡ上流領域（すなわち、９ｋｂ、６ｋｂ、３ｋｂおよび１ｋｂのＰＳＣＡ領域）中の前立腺優勢発現エレメントを同定する棒グラフである。
【図４５】図４５は、検出可能なマーカーに作動可能に連結した９ｋｂまたは６ｋｂのヒトＰＣＳＡ上流領域のいずれかを含むトランスジェニックベクターの設計を示す模式図である。
【図４６】図４６は、９ｋｂ  ＰＳＣＡ上流領域が、インビボで前立腺、膀胱および皮膚におけるレポーター遺伝子の発現を駆動することを示す写真である。
【図４７】図４７は、ヒトおよびマウスのＰＳＣＡ  ＲＮＡの組織特異的発現パターンを示す多組織ノーザンブロット分析の写真である。
【図４８】図４８は、抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体での処置によるＳＣＩＤマウスにおけるＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍増殖の完全な阻害である。上のパネルは、ＬＡＰＣ−９が皮下注射され、マウスＩｇＧコントロールを用いて処置されたマウスを示し、一方、下のパネルにおいて、マウスに、ＬＡＰＣ−９を皮下注射したが、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂカクテルを用いて処置した。各データ点は、実施例１８−Ａ（前出）に記載された特定の時点における腫瘍の楕円体容量を示す。抗ＰＳＣＡ群において、２０の任意の値は、線を書くために全てのデータ点について与えられたが、実際の腫瘍容量は、０であった（実施例１８−Ａ（前出））。
【図４９】図４９は、実施例１８に記載されるインビボ腫瘍チャレンジ研究において利用される抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体の特徴である。（Ａ）アイソタイプおよびエピトープマップ：ＰＳＣＡタンパク質のうちの、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂによって認識される領域は、ＰＳＣＡの示されたアミノ酸をコードするＧＳＴ融合タンパク質（５０ｎｇ／ウェル）を用いてＥＬＩＳＡ分析によって決定された。ハイブリドーマ上清とともにウェルをインキュベートした後、抗マウスＨＲＰ結合体抗体が添加され、そして反応性が、３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン塩基（ＴＭＢ）基質の添加によって決定された。光学密度（４５０ｎｍ）は、二連の決定の平均である。（Ｂ）ウエスタン分析によって決定されたエピトープマップ：５０ｎｇの示されたＧＳＴ−ＰＳＣＡ融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、そしてニトロセルロースに転写された。ウエスタン分析は、ハイブリドーマ上清、続いて抗マウスＨＲＰ二次Ａｂを用いてブロットをインキュベーションして、そして増強された化学発光によって可視化することにより行われた。
【図５０】図５０は、ＰＳＣＡ捕獲ＥＬＩＳＡの概略図である。（Ａ）標準化抗原およびコントロール抗原：ＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸１８〜９８をコードするＧＳＴ融合タンパク質が、未知サンプルの定量のための標準曲線を作成するために使用される。ＥＬＩＳＡにおいて使用される抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体および抗ＰＳＣＡポリクロナール抗体のおおよそのエピトープ結合領域もまた示される。ＰＳＣＡの分泌された組換え哺乳動物発現形態が、ＥＬＩＳＡアッセイの品質制御のために使用される。このタンパク質は、組換えタンパク質の分泌を指向するＩｇリーダー配列ならびにアフィニティー精製のためのＭＹＣエピトープタグおよび６×Ｈｉｓエピトープタグを含む。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ形式の図。
【図５１】図５１は、組換え分泌ＰＳＣＡタンパク質の定量である。（Ａ）ＰＳＣＡ捕獲ＥＬＩＳＡ標準曲線。（Ｂ）哺乳動物細胞によって分泌されたＰＳＣＡタンパク質の定量。空のベクターまたは組換え分泌ＰＳＣＡ（ｓｅｃＰＳＣＡ）をコードするベクターを用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来の２日間馴化組織培養物上清を、ＰＢＳまたは正常ヒト血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかの等量と混合し、そしてＰＳＣＡタンパク質の存在について分析した。データは、二連の決定の平均±範囲である。ＮＤは、検出不可能である。
【図５２】図５２は、抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体３Ｃ５を用いる細胞ペレット、ＬＡＰＣ９ＡＤ異種移植片、ＢＰＨサンプル、および前立腺癌組織の免疫組織化学的分析である。
【図５３】図５３は、抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体によるＬＡＰＣ−９腫瘍増殖の阻害である。上のパネルは、１×１０6  ＬＡＰＣ−９を皮下注射し、そしてマウスＩｇＧコントロールを用いて処置したマウス（ｎ＝１０）を示す。中のパネルは、ＬＡＰＣ−９を皮下注射し、そして抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂカクテルを用いて処置したマウス（ｎ＝１０）を示す。下のパネルは、ＬＡＰＣ−９を皮下注射し、そしてウシＩｇＧを用いて処置したマウス（ｎ＝５）を示す。各データ点は、実施例１８−Ｂに記載される特定の時点における腫瘍の楕円体容量を示す。
【図５４】図５４は、抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体１Ｇ８によるＬＡＰＣ−９腫瘍増殖の阻害である。上のパネルは、１×１０6  ＬＡＰＣ−９を皮下注射し、そしてマウスＩｇＧコントロールを用いて処置したマウス（ｎ＝６）を示し、一方、下のパネルにおいて、マウスは、ＬＡＰＣ−９を皮下注射したが、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８を用いて処置した（ｎ＝７）。各データ点は、特定の時点における腫瘍の楕円体容量を示す。
【図５５】図５５は、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体２Ａ２および２Ｈ９によるＬＡＰＣ−９腫瘍増殖の阻害である。上のパネルは、１×１０6ＬＡＰＣ−９を皮下に注射され、そしてマウスＩｇＧコントロール（ｎ＝６）または２Ａ２  ｍＡｂ（ｎ＝７）のいずれかで処置されたマウスを表す。下のパネルは、ＬＡＰＣ−９を皮下に注射され、そして同じマウスＩｇＧコントロール（ｎ＝６）または２Ｈ９  ｍＡｂ（ｎ＝７）で処置されたマウスを表す。全てのデータ点は、特定の時点における腫瘍の平均楕円体体積（ｍｍ3）を表す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図５６】図５６は、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ２Ａ２およびｍＡｂ  ２Ｈ９で処置された後のＬＡＰＣ−９腫瘍注射マウスにおける循環ＰＳＡレベルである。上のパネルは、１×１０6ＬＡＰＣ−９を皮下に注射され、そしてマウスＩｇＧコントロール（ｎ＝６）または２Ａ２  ｍＡｂ（ｎ＝７）のいずれかで処置されたマウスを表す。下のパネルは、ＬＡＰＣ−９を皮下に注射され、そして同じマウスＩｇＧコントロール（ｎ＝６）または２Ｈ９  ｍＡｂ（ｎ＝７）のいずれかで処置されたマウスを表す。各々のデータ点は、週毎の時点におけるマウスの血清から決定された平均ＰＳＡレベルを表す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図５７】図５７は、確立されたＬＡＰＣ−９前立腺癌異種移植片のＰＳＣＡモノクローナル抗体３Ｃ５による阻害である。詳細については実施例１８−Ｃ４を参照のこと。
【図５８】図５８は、ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８の重鎖可変ドメイン領域のアミノ酸配列である。ＣＤＲは、ラベルされそして下線を付されている。
【図５９】図５９は、ＰＳＣＡモノクローナル抗体４Ａ１０の重鎖可変ドメイン領域のアミノ酸配列である。ＣＤＲは、ラベルされそして下線を付されている。
【図６０】図６０は、ＰＳＣＡモノクローナル抗体２Ｈ９の重鎖可変ドメイン領域のアミノ酸配列である。ＣＤＲは、ラベルされそして下線を付されている。
【図６１】図６１は、ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８、ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ４Ａ１０およびＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ２Ｈ９のＣＤＲのアミノ酸配列整列である。
【図６２】図６２は、正常な膀胱および種々の膀胱癌組織におけるＰＳＣＡタンパク質発現を示す、ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８を用いたパラフィン包埋サンプルの免疫組織化学的染色を使用した写真である。
【図６３】図６３は、いくつかの膵臓癌細胞株におけるＰＳＣＡ発現のノーザンブロット分析である。正常な前立腺およびいくつかの前立腺癌異種移植片におけるＰＳＣＡ発現のノーザンブロット分析は、比較のために並べて示される。全てのサンプル間のＲＮＡレベルを、正規化した。
【図６４】図６４は、前立腺癌細胞株および膵臓癌細胞株におけるＰＳＣＡタンパク質発現の、ＰＳＣＡ  ｍａｂ  １Ｇ８を使用するウエスタンブロット分析である。
【図６５】図６５は、ＰＳＣＡ  ｍＡｂが、ＰＳＣＡタンパク質による増殖阻害効果を発揮する。ＬＡＰＣ−９およびＰＣ−３前立腺腫瘍に対するＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８の増殖阻害効果が比較される。ＰＣ−３腫瘍（これはＰＳＣＡ抗原を発現しない）に対しては全く効果が示さないが、ＬＡＰＣ−９腫瘍（これはＰＳＣＡ抗原を発現する）における有意な増殖阻害が示される。詳細については、実施例１８−Ｃ１、１８−Ｃ３を参照のこと。
【図６６】図６６は、確立されたＬＡＰＣ−９（ＡＤ）同所腫瘍の、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８による増殖阻害である。（Ａ）低レベルの血清ＰＳＡを有するマウス。２ｍｇの１Ｇ８をこれらのマウスに１０日目、１３日目、および１５日目に投与し、次いで、矢印でしめされるように、１ｍｇを１７、２０、２２、２５、２７、２９、３４、４１、および４９日目に投与した。（Ｂ）中程度のレベルの血清ＰＳＡを有するマウス。１ｍｇの１Ｇ８を、矢印で示されるように、１２、１３、１４、１９、２０、２２、２５、２７、２９、および３３日目に投与した。
【図６７】図６７は、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８での処置が、確立されたＬＡＰＣ−９（ＡＤ）同所腫瘍を保有するマウスの生存率を増加する。（Ａ）図６６Ａにおけるマウス（１Ｇ８で処置された）は、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して生存率の増加を示した。（Ｂ）図６６Ｂのマウス（１Ｇ８で処置された）は、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して増加した生存率を示した。
【図６８】図６８は、確立されたＬＡＰＣ−９  ＡＤ同所腫瘍の、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ３Ｃ５による増殖阻害である。（Ａ）１ｍｇの３Ｃ５を、矢印で示されるように、６、８、１０、１３、１５、１７、２０、２２、２４、および２９日目に腫瘍保有マウスに投与した。これらのマウスを、ＰＳＡ測定のためにＸ軸上に示される日に採血した。（Ｂ）２ｍｇの３Ｃ５を腫瘍保有マウスに、９、１２、および１５日目に投与し、次いで矢印で示されるように、１８、２０、２２、２５、２７および２９日目に１ｍｇを投与した。これらのマウスをＰＳＡ測定のためにＸ軸上に示される日に採血した。
【図６９】図６９は、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ３Ｃ５での処置が、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ同所腫瘍を保有するマウスの生存率を増加させる。（Ａ）図６８Ａにおけるマウス（３Ｃ５で処置された）は、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して、生存率の増加を示した。ＰＢＳ処置した群には４匹のマウスが存在し、そして３Ｃ５処置した群には５匹のマウスが存在する。（Ｂ）図６８Ｂのマウス（３Ｃ５で処置された）は、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して生存率の増加を示した。ＰＢＳ処置した群および３Ｃ５処置した群の両方に６匹のマウスが存在した。
【図７０】図７０は、確立されたＰＣ３−ＰＳＣＡ腫瘍の、１Ｇ８単独またはドキソルビシンと組合せた１Ｇ８による増殖阻害である。１ｍｇの１Ｇ８を、腫瘍保有マウスに、矢印で示されるように９、１１、１４、１６、１８、２１、２３、２５および２８日目に投与した。２５μｇのドキソルビシンを、（・）印で示されるように、９、１６および２３日目に投与した。
【図７１】図７１は、腫瘍保有マウスに投与された抗ＰＳＣＡ抗体が、循環し、そしてＰＳＣＡを発現する腫瘍を標的化する。Ａ）確立されたＰＳＣＡ発現腫瘍を保有し、３Ｃ５で処置されたマウス由来の腫瘍外植片の免疫組織化学。Ｂ）確立されたＰＳＣＡ発現腫瘍を保有し、マウスＩｇＧで処置されたマウス由来の腫瘍外稙片の免疫組織化学。
【図７２】図７２は、腫瘍保有マウスに投与された抗ＰＳＣＡ抗体が、循環し、そして腫瘍発現ＰＳＣＡを標的化する。図７１に記載されるマウスから外稙された腫瘍由来の腫瘍溶解産物の、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて調べられたウエスタンブロット分析。
【図７３】図７３は、腫瘍保有マウスに投与された抗ＰＳＣＡ抗体が、循環し、そして腫瘍発現ＰＳＣＡを標的化する。確立されたＰＳＣＡ発現腫瘍を保有し、１Ｇ１８で処置されたマウスから外稙された腫瘍由来の腫瘍溶解産物のウエスタンブロット分析。このブロットを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて調べた。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、前立腺幹細胞抗原（本明細書中以降「ＰＳＣＡ」）に関する。ＰＳＣＡは新規の、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−固着細胞表面抗原であり、これは、正常な細胞（例えば、前立腺細胞、尿路上皮、腎集合管、結腸神経内分泌細胞、胎盤、正常な膀胱細胞および尿管移行上皮細胞）において発現される（図１６）。正常な細胞に加えてＰＳＣＡはまた、アンドロゲン依存性前立腺癌細胞およびアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞の両方（図９〜１１）、骨に転移する前立腺癌（図２０〜２４および２６〜３２）、膀胱癌腫（図６、２５および２６）ならびに膵臓癌腫（図６３および６４）によって過剰発現される。癌（例えば、前立腺癌および膀胱癌）におけるＰＳＣＡの発現は、増加する悪性度分類（ｇｒａｄｅ）と相関するようである。さらに、癌（例えば、前立腺癌）を罹患する患者におけるＰＳＣＡの過剰発現（すなわち、正常な細胞において見い出される発現より高い発現）は、不良な予後の指標であるようである。
【００１９】
ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡはまた、正常な前立腺において基底細胞のサブセットにより発現される。基底細胞上皮は、末期の分化型分泌細胞についての前駆体細胞を含むと考えられる（Ｂｏｎｋｈｏｆｆら、１９９４，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２４：１１４〜１１８）。サイトケラチンマーカーを使用した最近の研究は、基底細胞上皮が少なくとも２つの異なる細胞部分集団を含み、１つはサイトケラチン５および１４を発現し、そしてもう一方は、サイトケラチン５、８および１８を発現することを示唆する（ＢｏｎｋｈｏｆｆおよびＲｅｍｂｅｒｇｅｒ、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２８：９８〜１０６）。ＰＳＣＡは、基底細胞の１つのサブセットにしか発現されないという知見は、ＰＳＣＡが、それら２つの基底細胞系統のうちの１つに対するマーカーであり得ること示唆する。
【００２０】
ＰＳＣＡの生物学的機能は知られていない。Ｌｙ−６遺伝子ファミリーは、シグナル伝達および細胞−細胞の接着を含む、多様な細胞機能に関与する。ＳＣＡ−２を通じたシグナル伝達は、未成熟の胸腺細胞におけるアポトーシスを妨ぐことが示されている（Ｎｏｄａら、１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３５５〜２３６０）。Ｔｈｙ−１は、Ｔ細胞の活性化に関与し、ｓｒｃ様チロシンキナーゼを通じてシグナルを伝達する（Ｔｈｏｍａｓら、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２３１７〜１２３２２）。Ｌｙ−６遺伝子は、腫瘍形成および同型の細胞の接着の両方に関係している（ＢａｍｅｚａｉおよびＲｏｃｋ，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４２９４〜４２９８；Ｋａｔｚら、１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５９：６８４〜６９１；Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら、１９９５，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２９：１６７７〜１６８９）。基底細胞、および基底細胞における制限された発現とそのＳｃａ−２との相同性に基づいて、本発明者らは、ＰＳＣＡが、幹細胞機能／前駆体細胞機能（例えば、自己再生（抗アポトーシス）および／または増殖）において役割を果し得るという仮説を立てた。
【００２１】
ＰＳＣＡは、マウスおよびヒトにおいて高度に保存される。前立腺に主に制限される保存された遺伝子の同定は、ＰＳＣＡが正常な前立腺の発達において重要な役割を果し得るという仮説を支持する。
【００２２】
種々の局面において、以下に詳細に記載されるように、本発明は、ＰＳＣＡタンパク質、抗体、核酸分子、組換えＤＮＡ分子、形質転換宿主細胞、産生方法、アッセイ、免疫的治療法、トランスジェニック動物、免疫学的アッセイおよび核酸に基づくアッセイ、ならびに組成物を提供する。
【００２３】
（ＰＳＣＡタンパク質）
本発明の１つの局面は、種々のＰＳＣＡタンパク質、およびそのペプチドフラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、ＰＳＣＡは、図１Ｂおよび３に提供されるような、ヒトＰＳＣＡのアミノ酸配列、図３に提供されるようなマウスＰＳＣＡホモログのアミノ酸配列、または他の哺乳動物のＰＳＣＡホモログのアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびにＰＳＣＡ活性を有するそれらタンパク質の対立遺伝子改変体、および保存的置換変異体をいう。本発明のＰＳＣＡタンパク質には、具体的に同定され、かつ特徴づけられた本明細書中に記載される改変体ならびに下記に要約される以下の方法に従って過度の実験をせずに単離／産生され、そして特徴づけられ得る対立遺伝子改変体、保存的置換改変体およびホモログが挙げられる。便宜のため、全てのＰＳＣＡタンパク質は集合的にＰＳＣＡタンパク質、本発明のタンパク質、またはＰＳＣＡといわれる。
【００２４】
用語「ＰＳＣＡ」は、図１Ｂおよび３に提供されるような、ヒトＰＳＣＡの全ての天然に存在する対立遺伝子改変体、アイソフォーム、および前駆体、ならびに図３に提供されるようなマウスのＰＳＣＡを含む。一般的に、例えば、天然に存在するヒトＰＳＣＡの対立遺伝子改変体は、図１Ｂおよび３において提供されるＰＳＣＡアミノ酸配列と有意な相同性（例えば、７０〜９０％）を共有する。対立遺伝子改変体は、わずかに異なるアミノ酸配列を有するが、ＧＰＩ結合タンパク質として前立腺細胞の表面で発現され得るか、または分泌され得るか、もしくは解離され得る。典型的に、ＰＳＣＡタンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載のＰＳＣＡ配列からの保存的アミノ酸の置換を含むか、またはＰＳＣＡホモログ（例えば、本明細書中に記載のマウスＰＳＣＡホモログ）に対応する位置からのアミノ酸の置換を含む。
【００２５】
ＰＳＣＡ対立遺伝子改変体の１つのクラスは、図１Ｂおよび３に示されるＰＳＣＡアミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するタンパク質であるが、さらにその配列由来の遊離基離脱（例えば、非保存的置換、短縮、挿入またはフレームシフト）を含む。このような対立遺伝子は、ＰＳＣＡの変異体対立遺伝子と呼ばれ、そして典型的に、同じ生物学的機能を行わないタンパク質を表す。
【００２６】
保存的アミノ酸置換は、タンパク質中において、しばしばタンパク質の高次構造またはタンパク質の機能のいずれかを変化させずになされ得る。このような変化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれかへの、これらの疎水性アミノ酸の他の任意のアミノ酸の置換；グルタミン（Ｅ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換、およびその反対の置換；アスパラギン（Ｎ）のグルタミン（Ｑ）への置換、ならびにその反対の置換；およびスレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）への置換、およびその反対の置換が挙げられる。特定のアミノ酸の環境、およびタンパク質の三次構造におけるそのアミノ酸の役割に依存して、他の置換はまた、保存的であるとみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）は互換可能で有り得、しばしばアラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）も互換可能であり得る。比較的疎水性のメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシンおよびイソロイシン、そして時にはバリンと互換され得る。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の有意な特徴がその電荷であり、かつこれら２つのアミノ酸残基の異なったｐＫが有意でない位置においてしばしば互換可能である。なお他の変化は、特定の環境中において「保存的」であるとみなされ得る。
【００２７】
ヒトＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸配列は、図１Ｂおよび３に提供される。ヒトＰＳＣＡは、１２３個のアミノ酸の単一のサブユニットから構成され、そしてアミノ末端シグナル配列、カルボキシ末端ＧＰＩ固着配列および多重Ｎグリコシル化部位を含む。ＰＳＣＡは、造血発達の最初期段階を特徴付ける細胞表面タンパク質の群であるＴｈｙ−１／Ｌｙ−６遺伝子ファミリーのメンバーである幹細胞抗原−２（ＳＣＡ−２）と３０％の相同性を示す。マウスＰＳＣＡホモログのアミノ酸配列は、図３に示される。マウスのＰＳＣＡは、ヒトＰＳＣＡおよび類似構造の生物とおよそ７０％の相同性を有する１２３個のアミノ酸の単一のサブユニットタンパク質である。
【００２８】
ＰＳＣＡタンパク質は、多くの形態で、好ましくは単離された形態で具体化され得る。本明細書中で使用される場合、タンパク質は、物理的方法、機械的方法または化学的方法を使用して、通常タンパク質に付随する細胞構築物からＰＳＣＡタンパク質を除去した場合、単離されたと言われる。当業者は、標準的精製方法を容易に使用し、単離されたＰＳＣＡタンパク質を入手し得る。精製されたＰＳＣＡタンパク質分子は、抗体または他のリガンドへのＰＳＣＡの結合を損なう他のタンパク質または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質ならびに程度は、意図された使用に依存する。ＰＳＣＡタンパク質の実施形態は、精製されたＰＳＣＡタンパク質および機能的な可溶性のＰＳＣＡタンパク質を含む。機能的な可溶性のＰＳＣＡタンパク質の１つの例は、図１Ｂにおいて示されるアミノ酸配列、またはそのフラグメントを有する。１つの形態において、そのような機能的な可溶性のＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントは、抗体または他のリガンドを結合する能力を保持する。
【００２９】
本発明はまた、図１Ｂおよび３に示されるヒトおよびマウスのＰＳＣＡアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含むペプチドを提供する。例えば、本発明は、アミノ酸配列ＴＡＲＩＲＡＶＧＬＬＴＶＩＳＫを有するペプチドフラグメント、アミノ酸配列ＶＤＤＳＱＤＹＹＶＧＫＫおよびＳＬＮＣＶＤＤＳＱＤＹＹＶＧＫを有するペプチドフラグメントを提供する。
【００３０】
本発明のペプチドは、ＰＳＣＡに関連するエピトープと特異的に結合する抗体の産生を誘導する能力のような、ＰＳＣＡの特性を示す。ＰＳＣＡタンパク質のそのようなペプチドフラグメントは、標準のペプチド合成技術および本明細書中に開示されるヒトＰＳＣＡタンパク質またはマウスＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸配列を用いて産生され得る。あるいは、組換え方法が、このＰＳＣＡタンパク質のフラグメントをコードする核酸分子を産生するために使用され得る。この点に関して、本明細書中に記載されるＰＳＣＡコード核酸分子は、ＰＳＣＡの規定されたフラグメントを産生するための手段を提供する。
【００３１】
以下に議論されるように、ＰＳＣＡのペプチドフラグメントは、：ドメイン特異的抗体の産生；ＰＳＣＡまたはＰＳＣＡドメインに結合する因子の同定；ＰＳＣＡまたはＰＳＣＡドメインに結合する細胞因子の同定；およびヒトＰＳＣＡのホモログまたは他の対立遺伝子型の単離において、特に有用である。特に興味深い構造を含むＰＳＣＡペプチドは、当該分野で周知の種々の分析技術（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ分析、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ分析、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ分析、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ分析またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析、あるいは免疫原性に基づく方法が挙げられる）を使用して予想および／または同定され得る。例として、ヒトＰＳＣＡの疎水性プロットおよびＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎプロットは、それぞれ、図４および５に提供される。そのような残基を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗ＰＳＣＡ抗体の産生またはＰＳＣＡに結合する細胞因子の同定において特に有用である。
【００３２】
ＰＳＣＡタンパク質の様々な領域は、抗ＰＳＣＡ抗体に結合し得る。このＰＳＣＡタンパク質の領域は、例えば、Ｎ末端領域、中間領域、およびＣ末端領域を含み得る（実施例１８、図４９）。このＮ末端領域は、アミノ酸残基２−５０、好ましくは、残基１８−５０に含まれるＰＳＣＡタンパク質の任意の部分を含む。この中間領域は、アミノ酸残基４６−１０９、好ましくは、残基４６−９８に含まれるＰＳＣＡタンパク質の任意の部分を含む。このＣ末端領域は、アミノ酸残基８５〜１２３、好ましくは、残基８５〜９８に含まれるＰＳＣＡタンパク質の任意の部分を含む。
【００３３】
本発明のＰＳＣＡタンパク質は、以下に挙げられる使用を含む、種々の目的に対して有用であり得るが、これらの使用に限定されない：前立腺癌の診断および／または予後のマーカーとして、抗体の産生を誘導するための能力の診断および／または予後のマーカーとして、ならびに以下にさらに記載されるような種々の治療的物理療法に対する標的として。ＰＳＣＡタンパク質はまた、ＰＳＣＡに結合するリガンドおよび他の因子を同定および単離するために使用され得る。正常な前立腺において、ＰＳＣＡは、基底細胞のサブセットにもっぱら発現し、これは、ＰＳＣＡが、基底上皮内の特定の細胞系に関してマーカーとして使用され得ることを示唆する。さらに、本出願者らの結果は、基底細胞のこのセットが、悪性形質転換の標的を表すことを示唆する。従って、例えば、形質転換の原因である分子因子を除去または調節するように設計された治療的な戦略は、ＰＳＣＡ細胞表面タンパク質を介して細胞のこの集団を特異的に指向し得る。
【００３４】
（ＰＳＣＡ抗体）
本発明はさらに、ＰＳＣＡに結合する抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体）を提供する。最も好ましい抗体は、選択的にＰＳＣＡへ結合し、そして非ＰＳＣＡタンパク質に結合しない（またはより弱く結合する）。最も好ましい抗体は、ＰＳＣＡに特異的に結合する。用語「特異的に結合する」は、抗体が優性にＰＳＣＡに結合することを意味することが意図される。特に意図された抗ＰＳＣＡ抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにそれらのフラグメント（例えば、組換えタンパク質）を含み、このフラグメントは、抗原結合ドメインおよび／またはこれらの抗体の１つ以上の補体決定領域を含む。これらの抗体は、任意の供給源（例えば、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウス、およびヒト）由来であり得る。
【００３５】
１つの実施形態において、このＰＳＣＡ抗体は、例えば、初代病巣および前立腺癌骨転移由来の前立腺癌細胞の細胞表面上のＰＳＣＡタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する。用語「細胞外ドメイン」は、細胞の形質膜に対して外部であるＰＳＣＡタンパク質の任意の部分を意味することが意図される。他の実施形態において、このＰＳＣＡ抗体は、ＰＳＣＡタンパク質または前駆体（例えば、Ｎ末端領域、中間領域、またはＣ末端領域の部分；図４９）の他のドメインに特異的に結合する。当業者によって理解されるように、抗体が指向するＰＳＣＡタンパク質の領域またはエピトープは、意図された適用により変化し得る。例えば、生存可能な前立腺癌細胞上の膜結合ＰＳＣＡの検出のためのイムノアッセイにおける使用を意図される抗体は、膜結合ＰＳＣＡ上の到達可能なエピトープに指向されるべきである。そのような抗体の例は、以下の実施例に記載される。他のエピトープを認識する抗体は、損傷した細胞または瀕死の細胞中のＰＳＣＡの同定のため、分泌されたＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントの検出のために有用であり得る。本発明はまた、ＰＳＣＡタンパク質を特異的に認識する抗体フラグメントを含む。本明細書中で使用される場合、抗体フラグメントとは、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも部分（すなわち、抗原結合領域）であるとして定義される。免疫グロブリンの定常領域のいくつかが、含まれ得る。
【００３６】
例えば、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺癌細胞の両方におけるＰＳＣＡの過剰発現、およびＰＳＣＡの細胞表面位置は、スクリーニングアッセイ、診断アッセイ、予後アッセイおよび追跡（ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ）アッセイおよび画像化方法のための優れたマーカーの特徴を示す。さらに、これらの特徴は、ＰＳＣＡが、標的抗体療法、免疫療法、および遺伝子療法のような治療方法のための優れた標的であり得ることを示す。
【００３７】
本発明のＰＳＣＡ抗体は、前立腺癌の治療技術における診断アッセイ、画像化方法論、および治療的方法において、特に有用であり得る。本発明は、ＰＳＣＡタンパク質の検出および前立腺癌の診断に有用な、種々の免疫学的アッセイを提供する。そのようなアッセイは、一般的に、ＰＳＣＡタンパク質を認識し結合し得る１つ以上のＰＳＣＡ抗体を含み、そして以下に挙げられる当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ形式を含むが、これらに限定されない：種々の型の沈降、凝集、補体結合、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）（Ｈ．Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：４０５５−４０６０（１９９８））、免疫組織化学的分析など。さらに、前立腺癌を検出し得る免疫学的画像化方法もまた、本発明によって提供され、標識したＰＳＣＡ抗体を用いた放射性シンチグラフィー（ｒａｄｉｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法を含むがこれに限定されない。このようなアッセイは、前立腺癌の検出、モニタリングおよび予後において、臨床的に有用であり得る。
【００３８】
１つの実施形態において、ＰＳＣＡ抗体およびそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）は、前立腺癌、膀胱癌腫、前立腺癌の骨転移、ＰＩＮ、またはＰＳＣＡタンパク質を発現する基底上皮細胞の存在を検出することに使用される。種々の生物学的サンプル（血清、前立腺および他の組織生検標本、骨のような他の組織、尿などが挙げられる）中の、そのようなＰＳＣＡ陽性（＋）細胞の存在は、ＰＳＣＡ抗体を用いて検出され得る。さらに、ＰＳＣＡ抗体は、インジウム−１１１（または他の同位体）結合抗体を用いた免疫シンチグラフィーのような、種々の画像化方法論において使用され得る。例えば、Ｉｎ−１１１結合抗ＰＳＭＡ抗体を用いる最近記載されたプロトコールに類似した画像化プロトコールを、再発性および転移性の前立腺癌腫の検出に使用し得る（Ｓｏｄｅｅら、１９９７、Ｃｌｉｎ  Ｎｕｃ  Ｍｅｄ  ２１：７５９−７６６）。例えば、ＳＰＭＡのような前立腺癌の他のマーカーに関連して、ＰＳＣＡは、アンドロゲン非依存性の前立腺癌細胞の標的化のために特に有用であり得る。ＰＳＣＡ抗体はまた、ＰＳＣＡ機能を阻害するために治療的に使用され得る。
【００３９】
ＰＳＣＡ抗体はまた、ＰＳＣＡタンパク質およびペプチドの精製のための方法ならびにＰＳＣＡホモログおよび関連する分子の単離のための方法において使用され得る。例えば、１つの実施形態において、ＰＳＣＡタンパク質を精製する方法は、以下の工程を包含する：固体マトリックス結合したＰＳＣＡ抗体を、ＰＳＣＡを含む溶解物または他の溶液とともに、そのＰＳＣＡ抗体がＰＳＣＡに結合することを可能にする条件下でインキュベートする工程；不純物を除去するために固体マトリックスを洗浄する工程；そしてそのＰＳＣＡを結合した抗体から溶出する工程。さらに、ＰＳＣＡ抗体は、細胞ソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）および精製技術を用いてＰＳＣＡ陽性細胞を単離するために使用され得る。前立腺腫瘍細胞上のＰＳＣＡ（単独または他の細胞表面マーカーとの組み合わせ）の存在は、ヒト前立腺癌細胞を他の細胞から区別し、そして単離するために使用され得る。特に、ＰＳＣＡ抗体は、抗体に基づく細胞ソーティングまたはアフィニティー精製技術を使用して異種移殖腫瘍組織、培養中の細胞などから前立腺癌細胞を単離するために使用され得る。本発明のＰＳＣＡ抗体の他の使用は、ＰＳＣＡタンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体の産生を含み、例えば、モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、１Ｇ８、２Ａ２、２Ｈ９、３Ｃ５、３Ｅ６、３Ｇ３および４Ａ１０のような本発明の任意のモノクローナル抗体上のイディオタイプと反応性である。
【００４０】
多量の比較的に純粋なヒトＰＳＣＡ陽性前立腺癌細胞（これは、組織培養において増殖し得るかまたは動物モデル（例えば、ＳＣＩＤマウスまたは他の免疫不全マウス）における異種移植腫瘍として増殖し得る）を産生する能力は、多くの利点を提供し、例えば、前立腺癌細胞の比較的に均質な集団の増殖または他の表現型特徴に対する種々の導入遺伝子または候補治療的化合物の評価を可能にすることが挙げられる。さらに、本発明の特徴はまた、種々の分子操作のために十分な量の、ヒトＰＳＣＡ陽性前立腺癌特異的核酸の非常に濃縮した調製物の単離を可能にする。例えば、多量なそのような核酸調製物は、前立腺癌疾患の進行に生物学的に関連した珍しい遺伝子の同定を補助する。
【００４１】
本発明のこの局面の別の価値がある適用は、局所的に進行した疾患または転移性の疾患を有する個体患者からクローン化した生存可能なＰＳＣＡ陽性前立腺癌細胞の比較的に純粋な調製物を単離し、分析しそしてそれを用いて実験する能力である。このようにして、例えば、個々の患者の前立腺癌細胞は、制限された生検サンプルから増殖され得、次いで、潜在的に混乱させる混入している細胞という変数を伴わずに、診断および予後の遺伝子、タンパク質、染色体異常、遺伝子発現プロフィール、または他の関連する遺伝型および表現型の特徴の存在について試験される。さらに、そのような細胞は、動物モデルにおいて、新生物の攻撃性および転移性能力について評価され得る。同様に、患者特異的な前立腺癌ワクチンおよび細胞性免疫治療剤が、そのような細胞調製物から作製され得る。
【００４２】
抗体の調製についての種々の方法が当該分野で周知である。例えば、抗体は、単離形態または免疫結合体形態でＰＳＣＡタンパク質、ペプチド、またはフラグメントを用いて適切な哺乳動物宿主に免疫されることによって調製され得る（Ｈａｒｌｏｗ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９））。さらに、ＰＳＣＡの融合タンパク質（例えば、はまた、ＰＳＣＡ  ＧＳＴ融合タンパク質）もまた、使用され得る。ＰＳＣＡを発現または過剰発現する細胞ＰＳＣＡもまた、免疫のために使用され得る。同様に、ＰＳＣＡを発現するように操作された任意の細胞が、使用され得る。この戦略は、内因性ＰＳＣＡを認識する能力が増強されたモノクローナル抗体の産生をもたらし得る。例えば、実施例５に記載の標準技術および標準のハイブリドーマプロトコール（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ））を使用することによって、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが生成された。このハイブリドーマは、１Ｇ８（ＡＴＣＣ番号  ＨＢ−１２６１２）、２Ａ２（ＡＴＣＣ番号  ＨＢ−１２６１３）、２Ｈ９（ＡＴＣＣ番号  ＨＢ−１２６１４）、３Ｃ５（ＡＴＣＣ番号  ＨＢ−１２６１６）、３Ｅ６（ＡＴＣＣ番号  ＨＢ−１２６１８）、および３Ｇ３（ＡＴＣＣ番号  ＨＢ−１２６１５）、４Ａ１０（ＡＴＣＣ番号  ＨＢ−１２６１７）と呼ばれる。これらの抗体は、１９９８年１２月１１日、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ２０８５２に寄託された。
【００４３】
本発明のキメラ抗体は、ヒト部分および非ヒト部分を含む、免疫グロブリン分子である。キメラ抗体の抗原結合領域（可変領域）は、非ヒト供給源（例えば、マウス）に由来し得、そしてその免疫グロブリンに生物学的エフェクター機能を与えるキメラ抗体の定常領域は、ヒト供給源由来であり得る。このキメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性およびこのヒト抗体分子により付与されるエフェクター機能を有するはずである。
【００４４】
一般的に、キメラ抗体を産生するために使用される手順は、以下の工程を含み得る：
ａ）抗体分子の抗原結合部分をコードする正確な遺伝子セグメントの同定およびクローニング；この遺伝子セグメント（重鎖についてＶＤＪ領域（可変領域、多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）領域および接合（ｊｏｉｎｉｎｇ）領域）または軽鎖についてＶＪ領域（可変領域、接合領域）として公知であるか、または単にＶ領域または可変領域として公知）は、ｃＤＮＡ形態またはゲノム形態のいずれかであり得る；
ｂ）定常領域またはその所望される部分をコードする遺伝子セグメントのクローニング；ｃ）完全なキメラ抗体が転写され得かつ翻訳され得る型でコードするように可変領域を定常領域と連結；
ｄ）この構築物を、選択可能なマーカー、ならびにプロモーター、エンハンサーおよびポリ（Ａ）付加シグナルのような遺伝子制御領域を含む、ベクター中に連結；
ｅ）細菌中でこの構築物の増幅；
ｆ）真核生物細胞（最も頻繁には、哺乳動物リンパ球）へのこのＤＮＡの導入（トランスフェクション）；
ｇ）選択可能なマーカーを発現する細胞の選択；
ｈ）所望するキメラ抗体を発現する細胞についてのスクリーニング；および
ｋ）適切な結合特異性およびエフェクター機能についての抗体の試験。
【００４５】
幾つかの異なる抗原結合特異性の抗体が、キメラタンパク質を産生するためのこれらのプロトコールにより操作された［例えば、抗ＴＮＰ：Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；および抗腫瘍抗原：Ｓａｈａｇａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６（１９８６）］。同様に、幾つかの異なるエフェクター機能が、この抗原結合領域をコードする配列に対する新規の配列を連結することによって達成された。これらの幾つかは酵素［Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４（１９８４）］、別の種由来の免疫グロブリンの定常領域、および別の免疫グロブリン鎖の定常領域［Ｓｈａｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：３６４（１９８４）；Ｔａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：３５６５−３５６７（１９８５）］を含む。さらに、抗体分子を改変するため、および遺伝子改変を目標とするための相同組換えを用いたキメラ抗体分子の産生についての手順は、記載されている（Ｆｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８５０７−８５１１（１９８９））。
【００４６】
これらの抗体は、例えば、前立腺癌細胞の細胞表面上のＰＳＣＡに結合し得、これによって、ＰＳＣＡの細胞表面位置が確認される。これらのｍＡｂが、細胞表面の外側のエピトープを認識するので、これらのｍＡｂは、前立腺癌の診断および治療のための有用性を有する。例えば、これらのｍＡｂは、転移性の疾患の部位を位置付けるために使用された（実施例６）。別の可能性は、ｍＡｂが、単独あるいは放射性同位体または他の毒素と結合されて使用される際、前立腺癌細胞を治療学的に標的化するために（例えば、全身的に）使用され得ることである。
【００４７】
ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、細胞表面を斑点状の様式で染色し（実施例５参照）、これは、ＰＳＣＡが、細胞表面の特定の領域に局在し得ることを示唆する。ＧＰＩに固着されたタンパク質は、細胞表面の界面活性剤不溶性の糖脂質に富んだマイクロドメイン（ＤＩＧＳ）において密集することが公知である。小胞およびスフィンゴ脂質（ｓｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）−コレステロールラフを含むこれらのマイクロドメインは、シグナル伝達および分子輸送において重要な役割を果たすと考えられている。ＰＳＣＡの相同体であるＴｈｙ−１は以前、脂質−マイクロドメインにおける相互作用を介してｓｒｃキナーゼへシグナルを伝達することが示された。本発明者らの研究室における細胞下分画実験は、ＤＩＧＳ中のＰＳＣＡの存在を確認する。
【００４８】
さらに、本発明のいくつかの抗体は、内部移行する抗体であり、すなわち、この抗体は、結合の際または結合の後に、細胞内へ内部移行する。用語「内部移行する」とは、抗体が細胞に取り込まれることを意味することが意図される。さらに、いくつかの抗体は、ＰＳＣＡ陽性癌細胞の増殖の阻害を誘導する。
【００４９】
例えば、前立腺癌の検体におけるこれらの抗体の特徴は、ＰＳＣＡタンパク質が、正常細胞と比較して前立腺癌において過剰発現していること、そしてこの発現が、前立腺癌の進行および転移の間にアップレギュレートされるようであることを示す。これらの抗体は、ＰＳＣＡ生物学および機能研究、ならびにＰＳＣＡ関連癌（例えば、ヒト前立腺癌、前立腺癌の骨への転移、および膀胱癌腫）のインビボ標的化において有用である。
【００５０】
ＰＳＣＡタンパク質の細胞外ドメインを特異的に認識しそして結合するＰＳＣＡｍＡｂｓが、本明細書中に記載される。これらのいくつかは、細胞表面量で発現されるとネイティブのＰＳＣＡに結合することが示されており、そしていくつかは前立腺腫瘍細胞のインビボ増殖を阻害することが示されている。
【００５１】
本明細書中に示されるＰＳＣＡのアミノ酸配列は、抗体を産生するためのＰＳＣＡタンパク質の特異的領域を選択するために使用され得る。例えば、このＰＳＣＡアミノ酸配列の親水性および疎水性の分析は、ＰＳＣＡの構造における疎水性領域を同定するために使用され得る。免疫原性構造を示すＰＳＣＡタンパク質の領域ならびに他の領域およびドメインは、当該分野で公知の種々の他の方法（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ分析、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ分析、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ分析、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ分析またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析）を用いて容易に同定され得る。これらの残基を含むフラグメントは、特定のクラスの抗ＰＳＣＡ抗体の産生に特に適する。特に有用なフラグメントには、配列ＴＡＲＩＲＡＶＧＬＬＴＶＩＳＫおよびＳＬＮＣＶＤＤＳＱＤＹＹＶＧＫが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
以下の実施例２に記載されるように、ウサギポリクローナル抗体を、合成ペプチドとして調製した前者のフラグメントに対して産生し、そしてＰＳＣＡ−グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を用いたアフィニティー精製をした。この抗体によるＰＳＣＡの認識は、ＰＳＣＡを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液およびＧＳＴ−ＰＳＣＡ融合タンパク質の、イムノブロット分析および免疫沈降分析によって確立した。この抗体はまた、ＰＳＣＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞およびＬＡＰＣ−４細胞におけるＰＳＣＡの細胞表面発現を、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いて同定した。
【００５３】
さらに、ヒツジのポリクローナル抗体を、合成ペプチドとして調製した後者のフラグメントに対して産生し、そしてペプチドＡｆｆｉ−ゲルカラムを用いてアフィニティー精製した（実施例２の方法にもよる）。この抗体によるＰＳＣＡの認識は、ＰＳＣＡを用いてトランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞の抽出液のイムノブロット分析および免疫沈降分析によって確立された。この抗体はまた、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）および免疫組織化学的分析を用いて、ＰＳＣＡでトランスフェクトされたＬＮＣａｐ細胞におけるＰＳＣＡの細胞表面の発現を同定した。
【００５４】
免疫原としての使用のためのタンパク質を調製するための方法、およびキャリア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨ、または他のキャリアタンパク質）とのタンパク質の免疫原性結合体を調製するための方法は、当該分野で周知である。いくつかの状況において、例えば、カルボジイミド試薬の使用による直接的な結合が、使用され得、他の場合において、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬによって供給されるような結合試薬は、効果的であり得る。ＰＳＣＡ免疫原の投与は、当該分野で一般的に理解されるように、適切な期間に渡って、適切なアジュバントの使用と共に、注射によって一般的に行なわれる。免疫スケジュールの間、抗体の力価が、抗体形成の適切さを決定するために得られ得る。
【００５５】
この方法で産生されるポリクローナル抗血清は、いくつかの適用にとって十分であり得るが、薬学的組成物については、モノクローナル抗体調製物が好ましい。所望するモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、一般的に公知であるように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的な方法、またはリンパ球細胞および脾細胞の不死化をもたらす改変形を使用して調製され得る。所望する抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡフラグメントであるイムノアッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養物が同定された場合、その細胞は、インビトロで培養され得るか、または腹水中の産生により培養され得るかのいずれかである。
【００５６】
次いで、所望のモノクローナル抗体を、培養上清または腹水上清から回収する。本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の、免疫学的に重要な部分（すなわち、ＰＳＣＡを認識し、そして結合する部分）を含むフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖフラグメント、融合タンパク質）を、アンタゴニスト、およびインタクトな抗体として使用し得る。ＰＳＣＡに対するヒト化抗体もまた、有用である。本明細書中において使用する場合に、ヒト化ＰＳＣＡ抗体とは、ＰＳＣＡに結合し得、そしてヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＦＲ領域、および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列またはＰＳＣＡを結合するよう操作された配列を実質的に有するＣＤＲを含む、免疫グロブリン分子である。１つ以上の非ヒト抗体ＣＤＲを対応するヒト抗体配列に置換することによって、マウスおよび他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍｎａｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。また、Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６を参照のこと。
【００５７】
免疫学的に反応性のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）2フラグメント）の使用は、特に治療の観点において、しばしば好ましい。なぜならこれらのフラグメントは、一般に、免疫グロブリン全体より免疫原性が低いからである。さらに、２つ以上のエピトープに特異的な二重特異性抗体が、当該分野において一般的に公知の方法を使用して、生成され得る。さらに、抗体エフェクター機能が、癌に対するＰＳＣＡ抗体の治療効果を増強するように、改変され得る。例えば、システイン残基がＦｃ領域内に操作されて、鎖間ジスルフィド結合の形成およびホモダイマー（これは、インターナリゼーション、ＡＤＣＣおよび／または相補体により媒介される細胞殺傷の増強された能力を有し得る）の生成を可能にし得る（例えば、Ｃａｒｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５；Ｓｈｏｐｅｓ、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２を参照のこと）。ホモダイマー抗体はまた、当該分野において公知の架橋技術によって、生成され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体または抗イデオタイプモノクローナル抗体を有する、薬学的組成物を提供する。
【００５８】
細胞表面ＰＳＣＡに結合し得るモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成を、実施例５に記載する。これらのｍＡｂのエピトープマッピングは、これらがＰＳＣＡタンパク質上の異なるエピトープを認識することを示す。例えば、あるものはカルボキシ末端領域内のエピトープを認識し、そして他のものはアミノ末端領域内のエピトープを認識する。このようなＰＳＣＡ抗体は、これらの異なるエピトープ結合特性を考慮すると、サンドイッチ形式のＥＬＩＳＡにおける使用に特に良好に適切であり得る。
【００５９】
抗体またはフラグメントはまた、現在の技術を使用して、組換え手法により生成され得る。ＰＳＣＡタンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域もまた、多様な種を起源とするキメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体の状況において生成され得る。本発明は、本発明のいずれかのモノクローナル抗体のＰＳＣＡに対する免疫特異的結合を競合的に阻害する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を含む。
【００６０】
あるいは、ファージディスプレイおよびトランスジェニック方法を包含する、完全ヒトモノクローナル抗体を生成するための方法は、公知であり、そしてヒトｍＡｂの生成のために、使用され得る（概説については、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５３５−５３９を参照のこと）。例えば、完全ヒト抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体は、大ヒトＩｇ遺伝子無作為配列ライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して、生成され得る（ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５〜６４頁（１９９３）；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｎｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．同書、６５〜８２頁）。完全ヒト抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体はまた、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／２４８９３（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９７年１２月３日公開）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むよう操作されたトランスジェニックマウスを使用して、生成され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ７（４）：６０７−６１４もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術に関して必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高親和性真正ヒト抗体を効率的に生成する。
【００６１】
標的抗原に対する抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂの反応性は、適切であるように、ＰＳＣＡタンパク質、ペプチド、ＰＳＣＡ発現細胞またはその抽出物を使用して、多数の周知の手段（ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析を含む）によって確立され得る。抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂはまた、種々のインビトロアッセイ（相補体により媒介される腫瘍細胞溶解、抗体依存性細胞細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性マクロファージ媒介性細胞傷害性（ＡＤＭＭＣ）、腫瘍細胞増殖などを含む）において、特徴付けられ得る。このようなインビトロアッセイの例を、以下の実施例１９に提供する。
【００６２】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、これが結合する細胞に対して、細胞増殖抑制性であり得る。用語「細胞増殖抑制性」とは、その抗体が、ＰＳＣＡ陽性細胞の増殖を阻害し得るが、必ずしも殺傷する必要はないことを意味することが、意図される。
【００６３】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、検出マーカーを用いて標識され得るか、または第２の分子（例えば、それによって免疫結合体を生じる治療剤（例えば、細胞毒因子））と結合体化され得る。例えば、この治療剤としては、抗腫瘍薬物、毒素、放射性因子、サイトカイン、二次抗体または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本発明は、本発明の抗体がプロドラッグを細胞毒薬物に変換する酵素と連結される、実施形態を提供する。
【００６４】
免疫結合体は、ＰＳＣＡ陽性細胞に対してこの第２の分子を標的とするために使用され得る（Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ら、１９９３、Ｉｍｍｎｏｔｏｘｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ，ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．、Ｖ．Ｔ．ら編、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２６２４−２６３６）。
【００６５】
細胞毒因子の例としては、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、キュリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリーチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、サパオナリアオフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、およびグルココルチコイドならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位元素（例えば、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、および186Ｒｅ）が挙げられるがこれらに限定されない。適切な検出マーカーとしては、放射性放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。抗体はまた、プロドラッグをその活性形態に変換し得る、抗癌プロドラッグ活性化酵素に結合体化され得る。例えば、米国特許第４，９７５，２８７号を参照のこと。
【００６６】
さらに、本発明の任意のモノクローナル抗体の抗原結合領域を含む本発明の組換えタンパク質は、癌を処置するために使用され得る。このような状況において、組換えタンパク質の抗原結合領域は、治療的活性を有する第２のタンパク質の少なくとも機能的に活性な部分と結合される。この第２のタンパク質としては、酵素、リンホカイン、オンコスタチンまたは毒素が挙げられ得るがこれに限定されない。適切な毒素としては、上記のものが挙げられる。
【００６７】
抗体に対して、治療剤を結合体化または結合するための技術は、周知である（例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら、（編）、４７５−５０６頁（１９８５）；およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと）。治療剤としてのＰＳＣＡ抗体の使用は、以下の小節「ＰＲＯＳＴＡＴＥ  ＣＡＮＣＥＲ  ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ」においてさらに記載される。
【００６８】
（ＰＳＣＡをコードする核酸分子）
本発明の別の局面は、ＰＳＣＡタンパク質およびそのフラグメントをコードする種々の核酸分子を、好ましくは単離された形態において（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ＰＳＣＡをコードする配列に相補的な核酸分子またはその一部、ならびにＰＳＣＡ遺伝子またはＰＳＣＡコード核酸とハイブリダイズするものを含む）提供する。特に好ましい核酸分子は、本明細書中で開示されるヒトＤＮＡ配列またはマウスＤＮＡ配列と実質的に同一のヌクレオチド配列または相補的なヌクレオチド配列を有する。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイム、およびアンチセンス分子、ならびに天然供給源由来であろうと合成由来であろうと、代替の骨格に基づいた核酸または代替の塩基を含む核酸が、特に意図される。
【００６９】
例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡ、または塩基対依存様式（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ）においてＤＮＡもしくはＲＮＡを特異的に結合する他の分子（ペプチド核酸（ＰＮＡ）または非核酸分子（例えば、ホスホロチオエート誘導体）を含む）であり得る。当業者は、本明細書中に記載されているＰＳＣＡ配列を使用して、これらのクラスの核酸分子を容易に獲得し得る。便宜上、ＰＳＣＡコード核酸分子は、本明細書中で、ＰＳＣＡコード核酸分子、ＰＳＣＡ遺伝子またはＰＳＣＡ配列といわれる。
【００７０】
ヒトＰＳＣＡの１つの対立遺伝子形態をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、図１Ａにおいて提供される。マウスＰＳＣＡホモログをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（「マウスＰＳＣＡ」）は、図２において提供される。ヒトＰＳＣＡおよびマウスＰＳＣＡのゲノムクローンはまた、実施例４において記載されるように単離された。ヒトゲノムクローンおよびマウスゲノムクローンの両方が、ＰＳＣＡ遺伝子の翻訳領域および３’非翻訳領域をコードする３つのエキソンを含む。５’非翻訳領域をコードする４番目のエキソンが、Ｌｙ−６遺伝子ファミリーおよびＴｈｙ−１遺伝子ファミリーの他のメンバーに対するＰＳＣＡの相同性に基づいて、存在を推定される（図８）。
【００７１】
ヒトＰＳＣＡ遺伝子は、染色体８ｑ２４．２に位置する。ヒト幹細胞抗原２（ＲＩＧ−Ｅ）、ならびに１つの他の最近同定されたヒトＬｙ−６ホモログ（Ｅ４８）もまた、この領域に局在し、関連遺伝子の大きなファミリーが、この遺伝子座に存在し得ることを示唆する（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら、１９９５、前出；Ｍａｏら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５９１０−５９１４）。興味深いことに、染色体８ｑは、進行した前立腺癌および再発した前立腺癌の大部分において、対立遺伝子の増加および対立遺伝子の増幅の領域であることが報告されている（Ｃｈｅｒら、１９９４、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ  １１：１５３−１６２）。ｃ−ｍｙｃは、染色体８ｑ２４のＰＳＣＡの近位に局在し、そしてｃ−ｍｙｃの過剰コピー（対立遺伝子の増加または対立遺伝子の増幅のいずれかを介して）が、初期前立腺腫瘍の６８％および転移の９６％において見出された（Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：５２４−５３１）。
【００７２】
本発明のＰＳＣＡコード核酸分子の実施形態は、プライマー（これは、本発明の核酸分子またはその任意の特異的部分の特異的な増幅を可能にする）、および本発明の核酸分子またはその任意の部分と選択的にまたは特異的にハイブリダイズするプローブを含む。この核酸プローブは、検出マーカーを用いて標識され得る。検出マーカーの例としては、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。このような標識プローブは、ＰＳＣＡタンパク質を発現している細胞を診断するための手段としてＰＳＣＡタンパク質の存在を診断するために使用され得る。ＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブを生成するための技術は、周知である。
【００７３】
本明細書中で使用されるように、核酸分子は、この核酸分子がＰＳＣＡ以外のポリペプチドをコードする夾雑核酸分子から実質的に分離される場合、「単離される」と言われる。当業者は、単離されたＰＳＣＡコード核酸分子を獲得するために核酸単離手順を容易に用い得る。
【００７４】
本発明は、本発明のＰＳＣＡコード核酸分子のフラグメントをさらに提供する。本明細書中で使用されるように、ＰＳＣＡコード核酸分子のフラグメントは、ＰＳＣＡコード配列全体の小さい部分をいう。このフラグメントの大きさは、その意図された使用により決定される。
【００７５】
例えば、このフラグメントが、ＰＳＣＡタンパク質の活性部分（活性ドメイン、エフェクター結合部位またはＧＰＩ結合ドメインのような）をコードするように選択される場合、このフラグメントは、ＰＳＣＡタンパク質の機能的領域をコードするのに十分に大きいことが必要とされる。このフラグメントが核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用される場合、このフラグメントの長さは、プローブ化／プライミング化の間に比較的少数の疑陽性物を獲得するように選択される。
【００７６】
選択的ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして特に有用であるヒトＰＳＣＡのフラグメントは、当該分野で公知の方法を使用してＰＳＣＡ配列全体から容易に同定され得る。ＲＴ−ＰＣＲ分析のために有用であるＰＣＲプライマーの１つのセットは、５’−ＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧ−および３’−ＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＧＣＡ−を含む。
【００７７】
（他のＰＳＣＡコード核酸分子を単離するための方法）
本明細書中で記載されるＰＳＣＡコード核酸分子は、ＰＳＣＡホモログ、あるいはＰＳＣＡタンパク質のスライスされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体、および変異体形態、ならびにそれらのコード配列および遺伝子配列の単離を可能にする。ＰＳＣＡホモログの最も好ましい供給源は、哺乳動物生物である。
【００７８】
例えば、本明細書中に記載されるＰＳＣＡコード配列の部分が、合成され得、そしてヒト以外の生物、本明細書中に記載されるヒトＰＳＣＡタンパク質の対立遺伝子改変体、およびＰＳＣＡ遺伝子を含むゲノム配列由来のＰＳＣＡファミリーのタンパク質の１つのメンバーをコードするＤＮＡを回収するためのプローブとして使用され得る。およそ１８〜２０ヌクレオチドを含むオリゴマー（約６〜７アミノ酸ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）をコードする）が、ストリンジェントな条件または過度のレベルの擬陽性物を除去するために十分にストリジェンシーな条件下で、ハイブリダイゼーションを獲得するためのゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために調製され、そして使用される。特定の実施形態において、ヒトＰＳＣＡをコードするｃＤＮＡが、本明細書中の実施例３に記載されるように、マウスＰＳＣＡホモログをコードする全長ｃＤＮＡを単離するために、使用された。マウスクローンは、ヒトＰＳＣＡに対して７０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする。
【００７９】
さらに、ヒトＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸配列は、細胞から調製される発現ライブラリーをスクリーニングするための抗体プローブを生成するために使用され得る。典型的に、哺乳動物（例えば、精製されたタンパク質（以下に記載されるような）を用いて免疫化されたウサギ）由来のポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体が、ＰＳＣＡホモログのための適切なコード配列を獲得するために、標的生物から調製された発現ライブラリーをプローブ化するために使用され得る。クローンニングされたｃＤＮＡ配列が、融合タンパク質として発現され得るか、それ自身の制御配列を使用して直接発現され得るか、またはその酵素の発現のために使用される特定の宿主に対して適切な、制御配列を使用して発現カセットを構築することにより発現され得る。
【００８０】
ＰＳＣＡ遺伝子を含むゲノムクローンが、当該分野において周知の分子クローニング方法を使用して、獲得され得る。１つの実施形態において、ＰＳＣＡ遺伝子のエキソン１〜４を含むおよそ１４ｋｂのヒトゲノムクローンが、本明細書中の実施例４でより完全に記載されるように、ヒトＰＳＣＡ  ｃＤＮＡプローブを用いたλファージライブラリーをスクリーニングすることにより獲得された。別の実施形態において、マウスＰＳＣＡ遺伝子を含むおよそ１０ｋｂのゲノムクローンが、マウスＰＳＣＡ  ｃＤＮＡ（実施例４にもまた記載される）を用いたマウスＢＡＣ（バクテリア人工染色体）ライブラリーをスクリーニングすることにより獲得された。
【００８１】
さらに、対のオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＳＣＡコード核酸分子またはそのフラグメントを選択的に増幅／クローンニングするために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における使用のために調製され得る。このようなＰＣＲプライマーを使用するためのＰＣＲの変性／アニーリング／伸長サイクルは、当該分野において周知であり、そして、他のＰＳＣＡコード核酸分子を単離する際の使用のために容易に適用され得る。プローブとしてまたはプライマーとしての使用のために特に十分に適切なヒトＰＳＣＡ遺伝子の領域は、容易に同定され得る。
【００８２】
ＰＳＣＡの非ヒトホモログ、ＰＳＣＡの天然に存在する対立遺伝子改変体、およびゲノムＰＳＣＡ配列は、本明細書中に記載されるヒトＰＳＣＡ配列と高度な相同性を共有する。一般に、このような核酸分子は、ストリンジェントな条件下でヒトＰＳＣＡ配列にハイブリダイズする。このような配列は、代表的に、ヒトＰＳＣＡ配列に対して少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を含む。
【００８３】
ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温を用いる（例えば、５０℃で０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ硝酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ）、または（２）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミドのような変性剤（例えば、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含有するｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含有する、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド）を用いる条件である。
【００８４】
別の例は、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストラン（４２℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中において洗浄）の使用である。当業者は、明瞭かつ検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを獲得するために適切な、ストリンジェンシー条件を容易に決定し得、そして変更し得る。
【００８５】
（ＰＳＣＡコード核酸を含む組換えＤＮＡ分子）
本明細書中に記載されるようなＰＳＣＡコード配列またはそのフラグメントを含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）もまた提供される。本明細書中において使用されるように、ｒＤＮＡ分子は、インビトロの分子操作に供されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生成するための方法は、当該分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）を参照のこと。本発明の好ましいｒＤＮＡ分子において、ＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡのフラグメントをコードするＰＳＣＡコードＤＮＡ配列は、１つ以上の発現制御配列および／またはベクター配列と作動可能に連結される。ｒＤＮＡ分子は、ＰＳＣＡタンパク質全体をコードし得るかまたはＰＳＣＡタンパク質のフラグメントをコードし得るかのいずれかである。
【００８６】
ＰＳＣＡコード配列が作動可能に連結されるベクター配列および／または発現制御配列の選択は、当該分野において周知のように、所望される機能的特性（例えば、タンパク質発現）、および形質転換されるべき宿主細胞に直接的に依存する。本発明により意図されるベクターは、少なくとも複製または宿主染色体への挿入を指向することが可能であり、そして好ましくはｒＤＮＡ分子に含まれるＰＳＣＡコード配列の発現もまた可能である。
【００８７】
作動可能に連結されるタンパク質コード配列の発現を調節するために使用される発現制御エレメントは、当該分野において公知であり、そして誘導プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーターおよび他の調節エレメントが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、容易に制御される誘導プロモーター（例えば、宿主細胞培地における栄養素に応答性である）が、使用される。
【００８８】
１つの実施形態において、ＰＳＣＡコード核酸分子を含むベクターは、それを用いて形質転換される原核生物レプリコン（すなわち、原核生物宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞）において、染色体内に自律的複製および組換えＤＮＡ分子の維持を指向する能力を有するＤＮＡ配列）を含む。このようなレプリコンは、当該分野において周知である、さらに、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、発現が薬物耐性のような検出マーカーを付与する遺伝子を含み得る。代表的な細菌性薬物耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子である。
【００８９】
原核生物レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＰＳＣＡコード配列の発現（転写および翻訳）を指向し得る原核生物プロモーターまたはウイルスプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こること可能にするＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。細菌宿主と適合性のプロモーター配列は、代表的に、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための都合の良い制限部位を含むプラスミドベクターにおいて提供される。当業者に周知である種々のウイルスベクター（例えば、多くの周知のレトロウイルスベクター）もまた使用され得る。
【００９０】
真核生物細胞に適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合性のある発現ベクターはまた、ＰＳＣＡコード配列を含むｒＤＮＡ分子を改変するために用いられ得る。真核生物細胞発現ベクターは、当該分野で周知であり、そしていくつかの商業的な供給源から入手可能である。代表的に、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入に関して都合のよい制限部位を含んで、供給される。このようなベクターの代表は、ＰＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ，＃３１２５５）、本明細書中に記載されるベクターｐＣＤＭ８、および真核発現ベクターのようなベクターである。
【００９１】
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核細胞発現ベクターは、真核細胞において効果的である選択マーカー、好ましくは薬物耐性選択マーカーをさらに含み得る。好ましい薬物耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性を生じる遺伝子（すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子）である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｎａｌ  Ｇｅｎｅｔ（１９８２）１：３２７−３４１）。あるいは、選択マーカーは、別のプラスミド上に存在し得、その２つのベクターは、宿主細胞の同時トランスフェクションにより導入され、そして選択マーカーに対して適切な薬物の存在下で培養することにより選択される。
【００９２】
本発明の実施に従い、ベクターは、上記で議論されたｃＤＮＡ分子をコードしているプラスミド、コスミドまたはファージベクターであり得る。さらに、本発明は、適切な真核宿主細胞中にトランスフェクトされるプラスミド、コスミド、またはファージベクターを含む宿主ベクター系を供給する。適切な真核宿主細胞の例は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞のような動物細胞を含む。適切な細胞の例は、ＬｎＣａＰ、ＬＡＰＣ−４、および他の前立腺癌細胞株を含む。この宿主ベクター系は、ＰＳＣＡタンパク質の産生のために有用である。あるいは、宿主細胞は、細菌細胞のような真核細胞であり得る。
【００９３】
（形質転換された宿主細胞）
本発明は、ＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントをコードしている核酸分子で形質転換された宿主細胞をさらに提供する。この宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかであり得る。ＰＳＣＡタンパク質の発現に有用である真核生物細胞は、細胞株が、細胞培養方法に対して適合性があり、そして発現ベクターの増殖およびＰＳＣＡ遺伝子の発現に適合性のある限り、限定されない。好ましい真核生物宿主細胞は、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト繊維芽細胞株に由来するような脊椎動物細胞を含むが、これらに限定されない。ＬｎＣａＰ、ＬＡＰＣ−４細胞株のような前立腺癌細胞株もまた、使用され得る。任意の原核宿主が、使用され、ＰＳＣＡをコードしているｒＤＮＡ分子を発現し得る。好ましい原核宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００９４】
本発明のｒＤＮＡ分子を用いる、適切な細胞宿主の形質転換は、使用したベクターの型および利用された宿主系に代表的に依存した周知の方法により達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションおよび塩処理方法が、代表的に使用される（例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７２）６９：２１１０；およびＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｅ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）を参照のこと）。ｒＤＮＡを含むベクターを用いる脊椎動物細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理方法が代表的に利用される（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌ（１９７３）５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７９）７６：１３７３−７６を参照のこと）。
【００９５】
首尾よく形質転換された細胞、すなわち本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、周知の技術により同定され得る。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入から生じる細胞は、クローニングされ、単一のコロニーを産生し得る。それらのコロニー由来の細胞は、回収され得、溶解され得、そしてそれらのＤＮＡ成分は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９７５）９８：５０３、もしくはＢｅｒｅｎｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９８５）３：２０８により記載されるような方法、または免疫学的方法を介してアッセイされる細胞から産生されるタンパク質を使用して、ｒＤＮＡの存在について実験され得る。
【００９６】
（ＰＳＣＡタンパク質を産生する組換え方法）
本発明は、本明細書中に記載されるＰＳＣＡをコードしている核酸分子の１つを使用してＰＳＣＡタンパク質を産生するための方法をさらに提供する。大まかに言えば、組換え型ＰＳＣＡタンパク質の生成は、代表的に以下の工程を含み得る（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）。
【００９７】
第一に、図１Ａに示される核酸分子のような、ＰＳＣＡタンパク質またはそれらのフラグメントをコードする核酸分子が、得られる。次いで、ＰＳＣＡをコードしている核酸分子は、上記のように、適切な制御配列と共に作動可能に連結して好ましくは、配置され、ＰＳＣＡコード配列を含む発現ユニットを産生する。この発現ユニットは、適切な宿主を形質転換するために用いられ、そして形質転換された宿主は、ＰＳＣＡタンパク質の産生を可能にする条件下で培養される。必要に応じて、そのＰＳＣＡタンパク質は、培地から、または細胞から単離され；いくつかの不純物が許容され得るいくつかの場合は、このタンパク質の回収および精製は不必要であり得る。
【００９８】
前述の工程の各々は、種々の方法で行われ得る。例えば、所望のコード配列は、ゲノムフラグメントから得られ得、そして適切な宿主において直接的に使用され得る。種々の宿主において作動可能である発現ベクターの構築は、レプリコンおよび制御配列の適切な組み合わせを使用して達成される。この制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、遺伝子を発現するために用いられる宿主細胞の型に依存しており、そして以前に詳細に議論された。適切な制限部位は、通常的には入手不可能な場合、切除可能な遺伝子を供給してこれらのベクター中へ挿入するために、コード配列の末端に付加され得る。当業者は、ＰＳＣＡタンパク質を産生するＰＳＣＡコード配列を用いる用途のために、当該分野で公知の任意の宿主／発現系を容易に適合させ得る。
【００９９】
続く実施例に記載される特定の実施形態において、ＰＳＣＡの分泌形態は、Ｃ末端６ＸＨｉｓおよびＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＰＳＣＡをコードするＣＭＶ駆動発現ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に都合よく発現され得る。培養培地中の分泌されたＨＩＳでタグされたＰＳＣＡは、標準の技術を利用するニッケルカラムを用いて精製され得る。
【０１００】
（ＰＳＣＡリガンドおよび他の結合剤を同定するためのアッセイ）
本発明の別の局面は、ＰＳＣＡに結合するＰＳＣＡリガンドおよび他の因子ならびに細胞成分を、検出および同定するために使用され得るアッセイおよび方法に関する。具体的に、ＰＳＣＡに結合するＰＳＣＡリガンドおよび他の因子ならびに細胞成分は、ＰＳＣＡに結合するＰＳＣＡリガンドもしくは他の因子または細胞成分の能力、ならびに／またはＰＳＣＡ活性を阻害／刺激する能力により同定され得る。ＰＳＣＡタンパク質を使用するＰＳＣＡ活性（例えば、結合）のためのアッセイは、高処理能スクリーニング方法における使用に関して適切である。
【０１０１】
１つの実施形態では、このアッセイは、ＰＳＣＡを試験剤または細胞の抽出物と混合する工程を包含する。この因子または抽出物の成分とＰＳＣＡの結合を可能にする条件下での混合後、その混合物は、分析され、因子／成分がＰＳＣＡに結合するか否かを決定する。結合因子／成分は、ＰＳＣＡに対して結合し得るものとして同定される。あるいはまたは継続して、ＰＳＣＡ活性は、ＰＳＣＡ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための手段として、直接的に評価され得る。
【０１０２】
あるいは、ＰＳＣＡタンパク質に結合する標的は、酵母ツーハイブリッド系（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＳｏｎｇ，Ｏ．（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６）を使用して、または結合−捕獲アッセイ（Ｈａｒｌｏｗ、前出）を使用して、同定され得る。酵母ツーハイブリッド系において、２つのサブユニット転写因子の１つのサブユニットおよびＰＳＣＡタンパク質から作製される融合タンパク質をコードしている発現ユニットは、酵母細胞に導入され、そして発現される。この細胞は、（１）その発現が、発現のために２つのサブユニット転写因子を必要とする、検出可能なマーカーをコードしている発現ユニット、ならびに（２）転写因子の第二のサブユニットおよびＤＮＡのクローン化セグメントから作製される融合タンパク質をコードしている発現ユニット、を含むようにさらに改変される。ＤＮＡのクローン化されたセグメントが、ＰＳＣＡタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合、その発現は、ＰＳＣＡとそのコードされるタンパク質との相互作用を生じる。このことは、転写因子の２つのサブユニットを近位で結合させ、転写因子の再構築を可能にする。このことは、検出可能なマーカーの発現を生じる。酵母ツーハイブリッド系は、ＰＳＣＡの細胞の結合パートナーに関する、ｃＤＮＡをコードしているセグメントのライブラリーのスクリーニングにおいて、特に有用である。
【０１０３】
上記アッセイにおいて使用され得るＰＳＣＡタンパク質は、単離されたＰＳＣＡタンパク質、ＰＳＣＡタンパク質のフラグメント、ＰＳＣＡタンパク質を発現するために改変された細胞、またはＰＳＣＡタンパク質を発現するために改変された細胞の画分を含むが、それらに限定されない。さらにＰＳＣＡタンパク質は、ＰＳＣＡタンパク質の全体またはＰＳＣＡタンパク質の限定されたフラグメントであり得る。ＰＳＣＡタンパク質が、結合している因子について、例えば、分子量または活性におけるシフトによりアッセイされ得る限り、本アッセイは使用され得ることが当業者には明白である。
【０１０４】
薬剤／細胞の成分がＰＳＣＡタンパク質に結合するか否かを同定するために使用されるこの方法は、使用されるＰＳＣＡタンパク質の性質に主に基づく。例えば、ゲル遅延アッセイは、因子がＰＳＣＡまたはそのフラグメントに結合するか否かを決定するために使用され得る。あるいは、免疫検出およびバイオチップ技術は、ＰＳＣＡタンパク質を用いる用途に適合され得る。当業者は、特定の因子がＰＳＣＡタンパク質に結合するか否かを決定するための多くの当該分野で公知の技術を容易に利用し得る。
【０１０５】
因子および細胞の成分は、無細胞アッセイ系または細胞アッセイ系を使用して、ＰＳＣＡタンパク質の活性を調節する能力についてさらに試験され得る。ＰＳＣＡタンパク質の活性がより限定的になる場合、同定される活性に基づく機能的アッセイが利用され得る。
【０１０６】
本明細書において使用されるように、薬剤がＰＳＣＡ活性を減少する場合、その薬剤は、ＰＳＣＡ活性をアンタゴナイズするといわれる。好ましいアンタゴニストは、他の細胞性タンパク質のいずれにも影響せずに、選択的にＰＳＣＡをアンタゴナイズする。さらに、好ましいアンタゴニストは、ＰＳＣＡ活性を５０％を超えるまで、より好ましくは、９０％を超えるまで、最も好ましくは全てのＰＳＣＡ活性を除去するまで減少させる。
【０１０７】
本明細書において使用されるように、薬剤がＰＳＣＡ活性を増加する場合、その薬剤は、ＰＳＣＡ活性をアゴナイズするといわれる。好ましいアゴニストは、他の細胞性タンパク質のいずれにも影響せずに、選択的にＰＳＣＡをアゴナイズする。さらに、好ましいアンタゴニストは、ＰＳＣＡ活性を５０％を超えるまで、より好ましくは、９０％を超えるまで、最も好ましくは二倍のＰＳＣＡ活性を超えるまで増加させる。
【０１０８】
上記の方法においてアッセイされる薬剤は、無作為に選択され得るか、あるいは合理的に選択または設計され得る。本明細書中で使用されるように、因子がＰＳＣＡタンパク質の特異的配列を考慮すること無しに無作為に選択される場合、この因子は、無作為に選択されると言われる。無作為に選択された因子の例は、化学的ライブラリーまたはペプチドコンビナトリアルライブラリーの使用、あるいは生物抽出物または植物抽出物の増殖培養物である。
【０１０９】
本明細書において使用されるように、因子が標的部位の配列および／あるいはその因子の作用と関連するそのコンフォメーションを考慮する非無作為な基準に基づいて選択される場合、この因子は、合理的に選択または設計されると言われる。因子は、ＰＳＣＡタンパク質を構成するペプチド配列を利用することにより、合理的に選択、または合理的に設計され得る。例えば、合理的に選択されるペプチド剤は、アミノ酸配列がＰＳＣＡタンパク質のフラグメントに対して同一であるペプチドであり得る。
【０１１０】
本発明の方法において試験される因子は、例として、ペプチド、小分子、およびビタミン誘導体、ならびに糖質であり得る。当業者は、本スクリーニング方法において使用される因子の構造的性質に関しては制限が存在しないことを容易に認識し得る。本発明の因子の１つのクラスは、そのアミノ酸配列がＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸配列に基づいて選択されるペプチド剤である。小ペプチド剤は、ＰＳＣＡタンパク質アセンブリの競合的インヒビターとして働き得る。
【０１１１】
ペプチド剤は、当該分野で公知のような標準の固相（または液相）ペプチド合成方法を使用して調製され得る。さらに、それらのペプチドをコードしているＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成機器を使用して合成され得、そして標準の組換え産生系を使用して組換え的に産生され得る。非遺伝子コードアミノ酸が含まれている場合、この固相ペプチド合成を使用した産物が、必要とされる。
【０１１２】
本発明の薬剤の別のクラスは、ＰＳＣＡタンパク質の重要な位置に対して免疫反応性の抗体である。上記のように、抗体は、抗原性領域として、抗体により標的化されるように意図されるＰＳＣＡタンパク質の部分を含むペプチドを用いた適した哺乳動物被検体の免疫化により得られる。重要な領域は、図１５において同定されるドメインを含み得る。このような薬剤は、競合的結合研究において使用され得、第二世代の抑制性薬剤を同定する。
【０１１３】
本発明の方法において試験される細胞の抽出物は、例えば細胞または組織の水性抽出物、細胞または組織の有機抽出物、あるいは部分的に精製された細胞画分であり得る。当業者は、本発明のスクリーニング方法において使用される細胞抽出物の供給源には制限がないことを容易に認識し得る。
【０１１４】
ＰＳＣＡ抗体のようなＰＳＣＡタンパク質に結合する因子は、ＰＳＣＡの活性を調節するため、抗癌剤を適切な哺乳動物細胞に標的化するため、またはＰＳＣＡとの相互作用をブロックする因子を同定するために使用され得る。ＰＳＣＡを発現する細胞は、ＰＳＣＡに結合する因子を使用することにより標的化あるいは同定され得る。
【０１１５】
どのようにＰＳＣＡ結合剤が使用されるかは、ＰＳＣＡ結合剤の性質に依存する。例えば、ＰＳＣＡ結合剤は、ＰＳＣＡ発現細胞にジフテリア毒素、コレラ毒素、リシンまたはシュードモナス外毒素のような複合毒物を送達するため；ＰＳＣＡ活性を調節するため；ＰＳＣＡ発現細胞を直接的に殺傷するため；または競合的結合剤を同定するためのスクリーニングにおいてに使用され得る。例えば、ＰＳＣＡ阻害薬剤は、ＰＳＣＡ発現細胞の増殖を直接的に阻害するために使用され得、一方、ＰＳＣＡ結合剤は診断的薬剤として使用され得る。
【０１１６】
本発明の複数の診断的用途が存在する。例えば、本発明は、被検体（例えば、動物被検体またはヒト被検者）において、ＰＳＣＡタンパク質の存在と関連する癌を診断するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、本発明の抗体の任意の１つまたは組み合せを使用して、サンプル（例えば、細胞または生物学的液体サンプル）中のＰＳＣＡタンパク質の数を定量的に決定する工程を包含する。次いで、そうして決定されるその数は、正常な被検体由来のサンプル中の量と比較され得る。このサンプル中のはっきりと異なる量の存在（すなわち、その試験サンプル中のＰＳＣＡの数が正常なサンプル由来の数を超える）は、癌の存在を示す。試験サンプル中のＰＳＣＡの数が正常なサンプル由来の数を超える場合、ＰＳＣＡは、細胞で過剰発現される。
【０１１７】
別の実施形態では、診断は、本発明の核酸を使用して、被検体由来のサンプルにおいてＰＳＣＡタンパク質をコードしているＲＮＡの量を定量的に決定することを含む。そうして決定された量は、正常な被検体由来のサンプル中のＲＮＡの量と比較され得る。ここでも、はっきりと異なる量の存在は、癌の存在を示す。
【０１１８】
さらに、本発明は、種々の時点で被検体由来のサンプルにおけるＰＳＣＡの量を測定することにより、被検体中のＰＳＣＡと関連する癌（例えば、前立腺癌、前立腺癌の骨転移、膀胱癌、膵臓癌）または障害の経過をモニタリングするための方法を提供する。このことは、サンプルにおけるＰＳＣＡの量の変化を決定する（例えば、その変化が量的に小さな変化であるかまたは大きな変化（すなわち、ＰＳＣＡの過剰発現）であるかを決定する）目的で行われる。１つの実施形態では、この方法は、被検体由来の第一のサンプルにおいて、ＰＳＣＡタンパク質の存在を定量的に決定する工程、およびそのように決定された量をその被検体由来の第二のサンプル中に存在する量と比較する工程を包含し、ここでそのようなサンプルは、異なる時点で取り出されており、その決定された量における差は癌の経過を示している。
【０１１９】
別の実施形態では、モニタリングは、被検体由来の第一のサンプルにおいてＰＳＣＡのＲＮＡの存在を定量的に決定すること、およびそのように決定された量をその被検由来の第二のサンプル中に存在する量と比較することにより達成され、ここでそのようなサンプルは、異なる時点で取り出されており、その量における決定された差は癌（例えば、前立腺癌、前立腺癌の骨転移、膀胱癌、および膵臓癌）の経過を示唆している。
【０１２０】
さらなる実施形態として、ＰＳＣＡと関連する疾患または障害は、ＰＳＣＡ遺伝子コピー数における増加または増加したＰＳＣＡ遺伝子コピー数を検出することにより、サンプルにおいてモニタリングされ得る。ＰＳＣＡ遺伝子コピー数における増加または増加したＰＳＣＡ遺伝子コピー数は、重要である。なぜならば、乏しい結果と関連し得るからである。
【０１２１】
このサンプルは、動物またはヒト由来であり得る。さらに、このサンプルは、細胞のサンプルであり得る。例えば、本発明の方法を使用して、前立腺組織、膵臓組織、膀胱組織、神経内分泌組織および骨（癌腫が転移し得る任意の組織、例えば、節、肺、肝臓、膵臓）は、癌または転移病巣の存在について評価され得る。あるいは、そのサンプルは、生物学的液体（例えば、尿、血清または血漿）であり得る。
【０１２２】
本発明の実施に従って、検出は、組織学、ブロッティング、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＦＡを含む免疫学的検出手段により達成され得る。サンプルが組織サンプルまたは細胞サンプルである場合、そのサンプルは、ホルマリン固定、パラフィン包埋または凍結され得る。
【０１２３】
本発明は、正常組織由来の組織切片におけるＰＳＣＡの量および分布と比較して、試験される新生物形成組織由来の組織切片中のＰＳＣＡの量および分布における差異を決定する方法を、さらに提供する。１つの実施形態において、この方法は、試験される組織と正常組織の両方を、ＰＳＣＡとの複合体を特異的に形成するモノクローナル抗体と接触させる工程、それによって、ＰＳＣＡの量および分布における差異を検出する工程を包含する。
【０１２４】
さらに、本発明は、被験体における新生物形成状態または前新生物状態を診断する方法を提供する。この方法は、組織のサンプルを被験体から得る工程、上記の方法の使用においてＰＳＣＡの量および分布の差異（このような新生物形成状態または前新生物状態を示している明瞭な測定可能な差異）を検出する工程を包含する。
【０１２５】
本発明の実施に従って、抗体は、本発明のモノクローナル抗体のいずれかが指向するエピトープに対して指向され得る。さらに、組織切片は、膀胱、前立腺、骨、リンパ組織、膵臓、他の器官、または筋肉由来であり得る。
【０１２６】
本発明はまた、生物学的な流体サンプル中の、ＰＳＣＡの濃度を検出し、そして定量的に決定する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、モノクローナル抗体が固体支持体の表面に付着することを可能にする条件下で、ＰＳＣＡと複合体を形成する（好ましくは、特異的に形成する）過剰の１つ以上のモノクローナル抗体と、固体支持体を接触させる工程を包含する。次いで、モノクローナル抗体が付着する得られた固体支持体が、生物学的な流体サンプルと接触され、その結果、生物学的な流体中のＰＳＣＡが抗体と結合し、そしてＰＳＣＡ−抗体複合体を形成する。この複合体は、検出可能なマーカーで、直接的または間接的に標識され得る。あるいは、ＰＳＣＡまたは抗体のいずれかが、複合体の形成前に標識され得る。次いで、この複合体が検出および定量的に決定され、それによって、生物学的な流体サンプル中のＰＳＣＡの濃度を検出および定量的に決定し得る。正常細胞と比較したサンプル中の高濃度のＰＳＣＡは、新生物形成状態または前新生物状態を示す。
【０１２７】
本発明の実施に従って、生物学的な流体は、組織抽出物、尿、血液、血清および痰を含むが、これらに限定されない。さらに、検出可能なマーカーは、酵素、ビオチン、発蛍光団、発色団、重金属、常磁性同位体または放射性同位体を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
さらに、本発明は、ＰＳＣＡを認識および結合する抗体（抗ＰＳＣＡ抗体）；ならびに検出可能な標識の結合体、ならびに抗ＰＳＣＡ抗体の特異的結合パートナーを含む診断キットを提供する。本発明の実施に従って、標識は、酵素、放射性標識、発色団および蛍光剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
（癌免疫療法）
ＰＳＣＡタンパク質は、多くの癌（前立腺腫瘍、前立腺腫瘍の転移（例えば、骨転移）、膀胱癌、および膵臓癌を含むが、これらに限定されない）に発現または過剰発現されるので、癌免疫療法の標的である。これらの免疫療法方法としては、抗体治療、インビボワクチンおよびエキソビボ免疫療法アプローチの使用が挙げられる。
【０１３０】
１つのアプローチにおいて、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、膀胱癌および膵臓癌）を処置するために全身的に用いられ得るＰＳＣＡ抗体を提供する。ＰＳＣＡ抗体はまた、種々の他の良性腫瘍および悪性腫瘍の処置に有用であり得る。ＰＳＣＡの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体が、好ましい。腫瘍細胞を標的化するがその周りの非腫瘍の細胞および組織は標的化しない抗体が、好ましい。従って、本発明は、ＰＳＣＡ抗原を発現する癌に感受性であるかまたはこのような癌を有する患者の処置方法を提供し、この方法は、上記の患者に有効量の抗体（この抗体は、ＰＳＣＡの細胞外ドメインに特異的に結合する）を投与する工程を包含する。別のアプローチにおいて、本発明は、ＰＳＣＡを発現する腫瘍細胞の増殖の阻害方法を提供し、この方法は、患者へＰＳＣＡの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体をその腫瘍細胞の増殖を阻害するのに効果的な量で投与する工程を包含する。ＰＳＣＡ  ｍＡｂはまた、ＰＳＣＡ抗原を発現する細胞の増殖を選択的に阻害するかまたはこのような細胞を選択的に殺傷するための方法に使用され得、この方法は、ＰＳＣＡ抗体免疫結合体またはイムノトキシンを、この細胞の増殖を阻害するかまたはこの細胞を殺傷するのに有効な量でこの細胞と反応させる工程を包含する。
【０１３１】
例えば、非結合体化ＰＳＣＡ抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体およびそのフラグメント（例えば、組換えタンパク質）を含む）が、患者に導入され得、その結果、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害性、ＰＳＣＡの生理学的機能の変化、および／またはリガンド結合もしくはシグナル伝達経路の阻害を含み得る機構によって、抗体が、癌細胞上のＰＳＣＡに結合し、そしてこのような細胞および腫瘍の増殖阻害（この破壊を含む）を媒介する。本発明の非結合体化ＰＳＣＡ抗体、そのフラグメントおよび組換えタンパク質に加えて、リシンのような毒物と結合体化されたＰＳＣＡ抗体がまた、治療的に用いられ、毒物を、ＰＳＣＡ保有腫瘍細胞へ直接的に送達し得、それによって、腫瘍を破壊する。
【０１３２】
ＰＳＣＡ抗体を用いた癌免疫療法は、結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３１７９−３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：２４３７−２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｙｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：２７７１−２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：９３−１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  ２０：５８１−５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：６１６０−６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：４３９８−４４０３）および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：１１７−１２７）を含むが、これらに限定されない他の型の癌に関して、首尾よく利用されている種々のアプローチから生じた技術に従い得る。
【０１３３】
例えば、臨床的に抗腫瘍モノクローナル抗体を適用するための１つの方法は、抗腫瘍活性（例えば、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性）ならびに／またはインビトロおよび／もしくは動物モデルにおいて内部移行化する能力を提示する、本発明のモノクローナル抗体を用いて、改変されない形態でその抗体を投与することである（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）を参照のこと）。ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を検出するために、モノクローナル抗体が、４時間のインキュベーション時間にわたり、培養された51Ｃｒ標識化腫瘍標的細胞の溶解について試験され得る。標的細胞は、51Ｃｒで標識され、次いで、エフェクター細胞（リンパ球分離培地の使用によって精製されたヒトリンパ球の形態で）と抗体との組み合わせに４時間曝露され得、これは例えば、０．１μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌの間で変化する濃度で添加される。標的細胞からの51Ｃｒの放出が、腫瘍細胞溶解（細胞傷害）の証拠として測定される。コントロールは、標的細胞単独の、または別々にリンパ球もしくはモノクローナル抗体のいずれかとの標的細胞のインキュベーションを含む。放出され得る51Ｃｒの総量が測定され、そして単独でインキュベートされる標的細胞と比較して、ＡＤＣＣが、モノクローナル抗体およびエフェクター細胞を用いて観察される標的細胞のパーセント殺傷として算出される。ＣＤＣについての手順は、補体の供給源としてのヒト血清（１：３から１：６に希釈された）が、エフェクター細胞の代わりに添加されることを除いて、ＡＤＣＣを検出するために用いたものと同一である。
【０１３４】
本発明の方法の実施において、細胞表面上にＰＳＣＡを発現する癌細胞の増殖を阻害し得る抗ＰＳＣＡ抗体は、癌患者（この患者の腫瘍は、ＰＳＣＡを発現するかまたは過剰発現する）に治療有効量で投与される。本発明の抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ治療方法は、インビボにおいて前立腺癌の顕著な腫瘍増殖阻害を示す。従って、本発明は、前立腺癌の特異的、効果的かつ長期必要とされる処置を提供する。本発明の方法はまた、ＰＳＣＡを発現するかまたは過剰発現する他の癌（膀胱癌および膵臓癌を含むがこれらに限定されない）の処置についても有用であり得る（なぜなら、これら両方の癌は、上昇したレベルのＰＳＣＡを発現するからである）。本発明の抗体治療法法は、化学療法、照射および／または他の治療レジメンと組み合わされ得る。
【０１３５】
以下の実施例１８Ａに記載するように、個々のマウス抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂならびにこれらの抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体の組み合わせは、異種の前立腺癌ＳＣＩＤマウスモデルを用いてインビボにおいて、前立腺癌増殖を有意に阻害し得る。ある研究において、ヒト前立腺癌異種移植片の注射を受けたＳＣＩＤマウスの集団は、いくつかのマウス抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂの組合せで処置された。この研究の結果によって、この処置が、腫瘍注射後６１日でさえ、これらのマウス全てにおいて腫瘍形成が完全にブロックされ得たことが示された。対照的に、同じ前立腺腫瘍異種移植片を受けたがコントロールマウスのＩｇＧで処置されたＳＣＩＤマウスのコンロトール群中の全ての動物は、その研究の間に有意かつ進行性のより大量の腫瘍を生じた。抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ調製物を用いたこれらの動物の処置と関連する明らかな毒性は存在しなかった。なぜなら、処置群の全てのマウスは実験の間中、生存しかつ健康なままであったからである。本研究に使用された異種移植片（ＬＡＰＣ−９）は、ホルモン難治性性転移性前立腺癌を有する患者の骨腫瘍生検から作製され、非常にアンドロゲン感受性の表現型によって特徴付けられ（ＰＳＡレベルは、レシピエントＳＣＩＤマウスにおける去勢後、ゼロまで低下する）、特に進行性の増殖特性、およびＰＳＣＡの高レベルの過剰発現によって特徴付けられる。ＬＡＰＣ−９は、さらに他の文献において記載される（ＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／１６６２８，Ｓａｗｙｅｒｓら、１９９８年４月２３日）。これらの結果は、実施例１８Ｂに記載される第２のインビボ研究において確認された。さらに、さらなるインビボ研究によって、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、単独で使用される場合に治療的に有効であることが示された（実施例１８Ｃ１、Ｃ２）。これら全てのインビボ研究において、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ処置を受けるマウスにおける腫瘍は、有意に低速な増殖速度、より長い潜伏期間を有し、そしてコントロール抗体の処置を受けるマウスにおける腫瘍と比較してより小さいサイズであった。血清ＰＳＡレベルはまた、コントロール処置された動物に対してより低く、そして腫瘍阻害と相関していた。さらに、異なるＰＳＣＡエピトープを認識する抗体ならびに異なるＩｇＧアイソタイプを有する抗体は、治療的に有効である。１つの研究において、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、インビボにおいて、確立された前立腺癌の増殖を効果的に阻害した（実施例１８、Ｃ４）。この特定の研究において処置されたマウスの数匹は、ＰＳＣＡ処置後に腫瘍の後退を示した（実施例１８）。
【０１３６】
さらに、腫瘍保有マウスに投与された３Ｃ５抗体は、ＰＳＣＡを発現する腫瘍細胞を標的化した。ＬＡＰＣ−９腫瘍を保有するＳＣＩＤマウス（例えば、発現されたＰＳＣＡ）は、３Ｃ５抗体で処置された。腫瘍は、外植され、そして免疫組織化学分析によって３Ｃ５抗体の存在について調べられた（実施例２６、図７１）。固定された組織切片を、ヤギ抗マウスＩｇＧを用いてプローブした。３Ｃ５抗体は、ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞の塊に局在し（図７１）、そしてこの腫瘍を通じて検出し得た。ＳＣＩＤマウスは免疫グロブリンを産生しないので、この腫瘍組織中で検出された抗体は、おそらく３Ｃ５処置に由来する。３Ｃ５抗体の局在を確認するために、ウエスタンブロット分析を、同じマウス由来の腫瘍外植片に対して実施した。このブロットは、腫瘍外植片由来のタンパク質抽出物、コントロールＩｇＧ抗体および３Ｃ５抗体を含んだ。そしてこのブロットを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体でプローブした。ＩｇＧの重鎖および軽鎖が、３Ｃ５処置マウス由来の腫瘍溶解物中で容易に検出された（図７２）。
【０１３７】
異なる研究結果によってまた、抗ＰＳＣＡ抗体がＰＳＣＡ発現腫瘍を標的化し得ることが示された。確立されたＬＡＰＣ−９腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスを、１Ｇ８抗体で処置した。外植された腫瘍を、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体をプローブとして用いたウエスタンブロット分析によって、１Ｇ８抗体の存在について調べた（実施例２６、図７２）。重鎖および軽鎖は、１Ｇ８処置されたマウスにおいて容易に検出可能であった。これらの結果により、被験体に投与された抗ＰＳＣＡが、循環し得、そしてＰＳＣＡ発現腫瘍を標的化することが示される。これは、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体が、循環し得、そして腫瘍（これは、局所であり、局所的に再発し、そして転移性である）においてＰＳＣＡ発現細胞を標的化し得ることを示唆する。さらに、これは、結合体化抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体が、ＰＳＣＡを発現する細胞を標的化し得、そしてこの腫瘍細胞を殺傷し得ことを示唆する。
【０１３８】
以下の実施例２４に記載するように、個々の抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、異種前立腺癌ＳＣＩＤマウスモデルにおいてインビボで前立腺癌増殖を阻害し得る。例えば、ＳＣＩＤマウスの２つの集団は、ＬＡＰＣ−９の注射を受け、そして、１Ｇ８または３Ｃ５で処置された。これらの結果により、１Ｇ８または３Ｃ５を単独で用いた処置が、腫瘍保有マウスにおける腫瘍増殖を阻害したことが示された。対照的に、同じ前立腺癌異種移植片を受けたがマウスＩｇＧまたはリン酸緩衝液で処置されたコンロトール群中のマウスは、その研究の間により大きい腫瘍を発生した。さらに、抗ＰＳＣＡ処置は、コントロールマウスに比べて、抗体処置を受けたマウスの生命を有意に延長した。抗体処置されたマウスの延長した生命は、腫瘍増殖の減少と関連し、血清ＰＳＡレベルのレベルに影響を与えた。これらの結果により、抗ＰＳＣＡ抗体を用いた処置が、腫瘍増殖を阻害することによって腫瘍保有動物の生命を延長し得ることが示される。
【０１３９】
細胞毒性の薬剤と組み合わせた抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂの効果をまた、試験した。以下の実施例２５に記載されるように、ＳＣＩＤマウスの２つの集団は、ＰＳＣＡを発現するように操作されたＰＣ３細胞の注射を受け、そして、このマウスを、１Ｇ８単独でか、またはドキソルビシンとの組合せた１Ｇ８で処置した。この結果により、１Ｇ８を用いた処置が、ＰＳＣＡ陽性ＰＣ３細胞の腫瘍増殖を阻害し、そして、１Ｇ８とドキソルビシンとの組合せが、リン酸緩衝液またはドキソルビシン単独で処置されたマウスにおける腫瘍と比較して、腫瘍増殖の阻害に対して相乗効果を有することが示された。
【０１４０】
従って、実施例２４の結果は、異なるアイソタイプを有する抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体が、確立されたアンドロゲン依存性腫瘍の増殖阻害に効果的であることを示す。例えば、ＬＡＰＣ−９異種移植片を、ホルモン難治性転移性前立腺癌を有する患者の骨腫瘍生検から作製した。１Ｇ８抗体は、マウスγ−１のアイソタイプの中性抗体である、これは、ＰＳＣＡ抗原と直接相互作用する。３Ｃ５抗体は、マウスγ−２Ａアイソタイプの抗体であり、これは、細胞および補体に結合する。従って、１Ｇ８抗体は、抗体依存性の細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機構を介して、アンドロゲン依存性腫瘍の細胞の細胞傷害性に向くことができ、そして３Ｃ５抗体は、腫瘍に対して強力な免疫応答を開始することができる。同様に、実施例２５の結果によって、抗ＰＳＣＡ抗体が、確立されたアンドロゲン依存性腫瘍の処置において効果的であることが示される。
【０１４１】
患者は、腫瘍中のＰＳＣＡ過剰発現の存在およびＰＳＣＡ過剰発現のレベルについて評価され得、これは、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学評価、定量的ＰＳＣＡ画像化、またはＰＳＣＡ発現の存在およびＰＳＣＡ発現の程度を容易に示し得る他の技術を用いる。腫瘍生検または外科的検体の免疫組織化学分析が、本目的に対して好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学分析に関する方法は、当該分野で周知である。サンプル中のＰＳＣＡ過剰発現のレベルを検出するのに有用な免疫組織化学分析技術の例は、以下の実施列の節に記載される。
【０１４２】
癌の処置に有用な抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体としては、腫瘍に対して強力な免疫応答を開始し得るモノクローナル抗体、および細胞傷害性を指向し得るモノクローナル抗体が挙げられる。この点に関して、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、補体媒介の細胞の細胞傷害性機構または抗体依存性の細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機構（これらの両方は、エフェクター細胞Ｆｃレセプター部位との相互作用のための免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分または補体タンパク質を必要とする）のいずれかによって、腫瘍細胞溶解を誘発し得る。さらに、腫瘍増殖に対する直接的な生物学的効果をもたらす抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂが、本発明の実施に有用である。このようなｍＡｂは、この効果をもたらすために完全な免疫グロブリンを必要としなくてもよい。このような直接的な細胞傷害性ｍＡｂによって作用し得る潜在的な機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍新脈管形成因子プロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂが抗腫瘍効果をもたらすこの機構は、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介細胞溶解などを決定するように設計された任意の数のインビトロアッセイ（例えば、以下の実施例１９に記載されるもの）を用いて評価され得る。
【０１４３】
特定の抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂまたは抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂの組み合わせの抗腫瘍活性は、好ましくは、適切な動物モデルを用いて評価される。異種癌モデル（ここで、ヒト癌外植片または継代された異種移植片組織は、免疫易感染性動物（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ａｎｉｍａｌ）（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）が、特に適切であり、そして公知である。ヒト前立腺癌の異種移植モデル（原発性腫瘍の発生、微小転移巣の発生、および後期疾患の特徴である骨芽細胞転移の形成を再発し得る）の例は、Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：４０２−４０８およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８、Ｓａｗｙｅｒｓら、１９９８年４月２３日刊行に記載される。本明細書中の例は、インビボにおいて抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ調製物の抗腫瘍能力を評価するための詳細な実験プロトコールを提供する。確立された腫瘍の後退、転移の発生の妨害などを測定する他のインビボアッセイが、意図される。
【０１４４】
マウスまたは他の非ヒトのモノクローナル抗体およびキメラｍＡｂの使用が、数人の患者において強力な免疫応答に対する緩和を誘導し得ることに注意すべきである。最も重篤な場合、このような免疫応答は、強力に腎不全をもたらし得る免疫複合体の大規模な形成を導き得る。従って、本発明の治療方法の実施に使用される好ましいモノクローナル抗体は、完全なヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体のいずれか、および標的ＰＳＣＡ抗原と高い親和性で特異的に結合するが患者において低い抗原性を示すかもしくは抗原性を示さないモノクローナル抗体である。
【０１４５】
本発明の方法は、単一の抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ、ならびに異なるエピトープを認識するもののような異なる個々のｍＡｂの組合わせ（すなわち、カクテル）の投与を意図する。このようなｍＡｂカクテルは、これらが異なるエピトープに結合するｍＡｂを含み、そして／または異なるエフェクター機構を活用するか、もしくは細胞傷害性ｍＡｂと、免疫エフェクター機能に依存するｍＡｂとを直接組合わせるｍＡｂを含む限り、特定の利点を有し得る。組合わせたこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂの投与は、他の治療薬剤（種々の化学療法剤、アンドロゲンブロッカー、および免疫モジュレーター（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない）と組合わせられ得る。抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、それらの「裸の」または結合体化されていない形態で投与され得るか、または治療薬剤が抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂに結合体化された状態であり得る。
【０１４６】
本発明の方法の実施において用いられる抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体は、所望の送達方法に適切なキャリアを含む薬学的組成物に処方され得る。適切なキャリアとしては、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂと組合わせた場合に、抗体の抗腫瘍機能を保持し、そして被験体の免疫系と非反応性である任意の物質が挙げられる。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：任意の多くの標準的薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水など）（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６版、Ａ．Ｏｓａｌ編，１９８０を参照のこと）。
【０１４７】
抗ＰＳＣＡ抗体処方物は、腫瘍部位に抗体を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。潜在的に有効な投与経路としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内など。好ましい投与経路は、静脈内注射による。静脈内注射のための好ましい処方物は、保存された静菌水、滅菌の保存されていない水の溶液中に、および／または０．９％  滅菌注射用塩化ナトリウム（米国薬局方）を含むポリ塩化ビニルもしくはポリエチレンのバッグ中に希釈された抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂを含む。抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ調製物は、凍結乾燥され得、そして好ましくは減圧下で滅菌粉末として保存され得、次いで、注射前に、例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含む静菌水または滅菌水中に再構成され得る。
【０１４８】
処置は、一般に、受容可能な投与経路（例えば、静脈内注射（ＩＶ））を介した有効用量の抗ＰＳＣＡ抗体調製物の反復投与を含む。投薬量は、当業者によって一般に理解される種々の因子に依存する。これらの因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ガンおよび重篤度の型、悪性度分類（ｇｒａｄｅ）、すなわちガンの病期、使用したｍＡｂの結合親和性および半減期、患者におけるＰＳＣＡ発現の程度、循環している遊離（ｓｈｅｄ）ＰＳＣＡ抗原の程度、所望の安定期抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組合わせて用いられる化学療法剤の影響。代表的な１日用量は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。１０〜５００ｍｇ  ｍＡｂ／週の範囲の用量が有効かつ十分に寛容であるが、より高い１週間毎の用量ですら、適切かつ／または／または十分に寛容され得る。適切な用量を規定する際の重要な決定因子は、特定の状況において治療的に有効であるために必要な特定の抗体の量である。反復投与は、腫瘍阻害または後退を達成するために必要であり得る。最初の負荷用量は、より高くてもよい。最初の負荷用量は、注入として投与され得る。周期的な維持用量は、同様に投与され得るが、ただし、初期用量は十分に寛容されている。
【０１４９】
ＰＳＣＡ  ｍＡｂの直接投与もまた可能であり、そして特定の状況において利点を有し得る。例えば、膀胱癌の処置のために、ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、膀胱に直接注射され得る。膀胱に直接投与されたＰＳＣＡ  ｍＡｂは、患者から迅速に消失するので、抗原性の有意な合併症無く、非ヒトまたはキメラ抗体を効率的に使用することもまた可能であり得る。
【０１５０】
患者は、最も有効な投薬レジメンおよび関連する因子の決定を補助するために、血清ＰＳＣＡについて評価され得る。実施例２０（後述）に記載のＰＳＣＡ捕捉ＥＬＩＳＡまたは類似のアッセイは、処置前に患者の循環ＰＳＣＡレベルを定量するために用いられ得る。このようなアッセイはまた、治療全体を通してモニターする目的で使用され得、そして血清ＰＳＡレベルのような他のパラメーターの評価と組合わせて治療結果を測定するために有用であり得る。
【０１５１】
本発明は、ＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントを含むように処方されたワクチンを、さらに提供する。抗癌治療における使用についての、体液性免疫および細胞媒介性免疫を産生するためのワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そして例えば、ヒトＰＳＭＡ免疫原および齧歯類ＰＡＰ免疫原を用いた前立腺癌において、利用されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：２３１−２３７；Ｆｏｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３−３１１７）。このような方法は、ＰＳＣＡタンパク質もしくはそのフラグメント、または、ＰＳＣＡ免疫原を発現および適切に提示し得るＰＳＣＡをコードする核酸分子および組換えベクターの利用によって容易に実施され得る。
【０１５２】
例えば、ウイルス遺伝子の送達系が、ＰＳＣＡをコードする核酸分子の送達に使用され得る。本発明のこの局面の実施において用いられ得る種々のウイルス遺伝子の送達システムとしては、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスおよびシンドビスウイルス（ｓｉｎｄｂｕｓ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３）。非ウイルス性送達システムがまた、患者に導入された（例えば、筋肉内に）ＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントをコードする裸のＤＮＡの使用によって利用され、抗腫瘍応答を誘導し得る。１つの実施形態において、全長のヒトＰＳＣＡ  ｃＤＮＡが利用され得る。別の実施形態において、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードするＰＳＣＡ核酸分子が、利用され得る。ＣＴＬエピトープが、特定のアルゴリズム（例えば、Ｅｐｉｍｅｒ，Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて決定され、特異化されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得るＰＳＣＡタンパク質内のペプチドを同定し得る。
【０１５３】
種々のエキソビボ戦略がまた、利用され得る。１つのアプローチは、樹状細胞の使用を含み、患者の免疫系に対してＰＳＣＡ抗原を提示する。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７同時刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）ならびにＩＬ−１２を発現し、従って、高度に特異化された抗原提示細胞である。前立腺癌においては、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドを用いてパルスされた自己樹状細胞が、第Ｉ相臨床試験において用いられ、前立腺癌患者の免疫系を刺激する（Ｔｊｏａら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９：３７１−３８０）。樹状細胞は、ＰＳＣＡペプチドをＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の状況におけるＴ細胞に提示するために用いられ得る。１つの実施形態において、自己樹状細胞は、ＭＨＣ分子と結合し得るＰＳＣＡペプチドを用いてパルスされる。別の実施形態において、樹状細胞は、完全なＰＳＣＡタンパク質を用いてパルスされる。さらに別の実施形態は、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）および腫瘍誘導性ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２）のような、当該分野において公知の種々の実行（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）ベクターを用いた樹状細胞におけるＰＳＣＡ遺伝子の過剰発現を操作する工程を包含する。
【０１５４】
抗イディオタイプ抗ＰＳＣＡ抗体はまた、ＰＳＣＡタンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして、抗癌治療において用いられ得る。特に、抗イディオタイプ抗体の産生は、当該分野で周知であり、そして、ＰＳＣＡタンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗ＰＳＣＡ抗体を産生するために、容易に適応され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３３−４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９６：３３４−３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４３：６５−７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、腫瘍抗原に対して指向される他の抗イディオタイプ抗体を用いて現在実施される場合に、抗イディオタイプ治療において用いられ得る。
【０１５５】
遺伝的免疫化方法は、ＰＳＣＡを発現する癌細胞に対して指向される、予防的または治療的体液性免疫応答および細胞性免疫応答を産生するために、利用され得る。本明細書中で記載されるＰＳＣＡをコードするＤＮＡ分子を用いて、ＰＳＣＡタンパク質／免疫原および適切な調節配列をコードするＤＮＡを含む構築物が、個体の筋肉または皮膚に直接的に注入され得、その結果、筋肉または皮膚の細胞が、構築物を利用して、そしてコードされたＰＳＣＡタンパク質／免疫抗原を発現する。ＰＳＣＡタンパク質／免疫原は、細胞表面タンパク質として発現され得るかまたは分泌され得る。ＰＳＣＡタンパク質／免疫原の発現は、前立腺癌に対して、予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の産生を生じる。当該分野で公知の、種々の予防的および治療的な遺伝的免疫化技術が用いられ得る（概説については、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開される情報および参考文献を参照のこと）。
【０１５６】
本発明は、その細胞表面上の複数のＰＳＣＡ抗原を発現する細胞の細胞活性（例えば、細胞増殖、細胞活性化または細胞繁殖）を阻害するための方法をさらに提供する。この方法は、本発明の免疫結合体（例えば、異種混合物または同種混合物）を細胞と反応させ、その結果、細胞表面上のＰＳＣＡ抗原が、免疫結合体との複合体を形成する工程を包含する。細胞表面上のＰＳＣＡ抗原の数が増加する程、用いられ得るＰＳＣＡ抗体複合体の数も増加する。ＰＳＣＡ抗体複合体の数が増加する程、阻害される細胞活性も増加する。細胞活性の阻害が細胞死を生じる場合、新生物形成状態または前新生物形成状態を有する被験体が、この方法に従って、処置され得る。
【０１５７】
異種混合物は、異なるエピトープまたは同一のエピトープを認識するＰＳＣＡ抗体（各々の抗体は、同一の治療薬剤または異なる治療薬剤と結合体化されている）を含む。同種混合物は、同一のエピトープを認識する抗体（各々の抗体は、同一の治療薬剤と結合体化される）を含む。
【０１５８】
本発明は、ＰＳＣＡがそのリガンドと結合することをブロックすることによって、ＰＳＣＡの生物学的活性を阻害するための方法をさらに提供する。この方法は、ＰＳＣＡ免疫結合体またはＰＳＣＡ抗体複合体を可能にする条件下で、ある量のＰＳＣＡを、本発明の抗体または免疫結合体と接触させ、それによって、ＰＳＣＡがそのリガンドと結合することをブロックし、そしてＰＳＣＡの活性を阻害する工程を包含する。
【０１５９】
別の実施形態において、本発明は、本発明の免疫結合体のいずれか１つまたは組み合わせを、細胞を阻害するに十分な量で細胞と反応させることによって、ＰＳＣＡ抗原を発現する細胞を選択的に阻害する方法を提供する。このような量は、細胞を殺傷する量、または細胞成長または細胞増殖を阻害するに十分な量を含む。すでに議論した通り、用量および投薬レジメンは、ＰＳＣＡ、その集団、抗体が指向されるべき部位、特定の免疫毒素の特徴および患者に関連した処置されるべき疾患または障害の性質に依存する。例えば、免疫結合体の量は、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲であり得る。
【０１６０】
（ＰＳＣＡタンパク質ならびにＰＳＣＡ遺伝子およびＲＮＡを同定するための方法）  本発明は、ＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡ遺伝子を発現する、細胞、組織または器官を同定するための方法を提供する。このような方法は、インビボまたはインビトロでＰＳＣＡタンパク質を発現する、細胞または器官の存在を診断するために用いられ得る。本発明の方法は、特に、前立腺の病理学的状態を媒介する細胞の存在の決定において有用である。特に、ＰＳＣＡタンパク質の存在は、ＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡタンパク質をコードする核酸が発現されるか否かを決定することによって、同定され得る。ＰＳＣＡタンパク質の発現は、ＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡ遺伝子を発現する、細胞、組織または器官の存在を診断するための手段として、用いられ得る。
【０１６１】
種々の免疫学的および分子遺伝学的技術が、ＰＳＣＡタンパク質が、特定の細胞またはサンプル中で発現／産生されるか否かを決定するために、用いられ得る。一般に、核酸分子を含む抽出物またはタンパク質を含む抽出物が調製される。次いで、抽出物は、ＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡをコードする核酸分子が細胞中で産生されるか否かを決定するために、アッセイされる。
【０１６２】
当該分野で周知の種々のポリヌクレオチドを基にした検出方法が、ＰＳＣＡをコードする核酸分子の検出のため、および生物学的試料中のＰＳＣＡ発現細胞の検出のために、利用され得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＰＳＣＡのｍＲＮＡまたはそのフラグメントを選択的に増幅するために用いられ得、そしてこのような方法は、後述の実施例１において記載されるように、ＰＳＣＡを発現する細胞を同定するために、利用され得る。特定の実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲは、微小転移性の前立腺癌細胞、膀胱癌細胞もしくは膵臓癌細胞または循環性の前立腺癌細胞、膀胱癌細胞もしくは膵臓癌細胞を検出するために用いられる。種々の他の増幅型検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ方法のような）およびＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブを用いた種々の周知のハイブリダイゼーションアッセイはまた、ＰＳＣＡをコードするポリヌクレオチドまたはＰＳＣＡ発現細胞の検出のために用いられ得る。
【０１６３】
タンパク質の検出のための種々の方法は、当該分野で周知であり、そしてＰＳＣＡタンパク質およびＰＳＣＡ発現細胞の検出のために利用され得る。タンパク質に基づいた診断試験を行うために、適切なタンパク質サンプルが得られ、そして従来技術を用いて調製される。タンパク質サンプルは、例えば、単にＳＤＳとともにサンプルをボイルすることによって調製され得る。次いで、抽出されたタンパク質は、公知の方法を用いて、ＰＳＣＡタンパク質の存在を決定するために分析され得る。例えば、特異的なサイズのタンパク質の改変体または特異的に荷電したタンパク質の改変体の存在は、電場における移動度を使用して同定され得る。あるいは、抗体は、検出の目的のために用いられ得る。当業者は、公知のタンパク質分析方法を容易に適応し、サンプルがＰＳＣＡタンパク質を含むか否かを決定し得る。
【０１６４】
あるいは、ＰＳＣＡ発現はまた、ＰＳＣＡ遺伝子の発現のレベルを減少させる薬剤を同定するための方法において、用いられ得る。例えば、ＰＳＣＡタンパク質を発現する、細胞または組織が、試験薬剤と接触され、ＰＳＣＡ発現に対する薬剤の効果を決定し得る。ＰＳＣＡ発現を活性化する薬剤は、ＰＳＣＡ活性のアゴニストとして用いられ得、一方、ＰＳＣＡ発現を減少させる薬剤は、ＰＳＣＡ活性のアンタゴニストとして用いられ得る。
【０１６５】
（ＰＳＣＡプロモーターおよび他の発現調節エレメント）
本発明は、発現ベクターおよびトランスジェニック動物を産生するために用いられ得る形態において、新規に同定されたＰＳＣＡ遺伝子の５’側で見出された、発現制御配列をさらに提供する。特に、ＰＳＣＡプロモーター（ＰＳＣＡ遺伝子におけるＡＴＧ開始コドンから５’側にあると容易に同定され得、そして作動可能に連結された、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を指向するために用いられ得る）のようなＰＳＣＡ発現制御エレメント。ＰＳＣＡ発現が、前立腺細胞において主に発現されるため、発現制御エレメントは、組織特異的様式において誘導された導入遺伝子の発現の指向において、特に有用である。当業者は、当該分野で公知の方法を用いて、発現ベクターにおける、ＰＳＣＡ遺伝子プロモーターおよび他の調節エレメントを容易に使用し得る。
【０１６６】
真核生物細胞において、調節配列は、遺伝子のコード領域の上流、下流および内部で見出され得る。真核生物調節配列は、プロモーター配列、そして時折、少なくとも１つのエンハンサー配列を含む。代表的な真核生物遺伝子において、プロモーター配列は、遺伝子のコード領域に対して上流および近接して存在し、そして１方向に方向付けられて、遺伝子の発現を制御するはずである。代表的な真核生物遺伝子において、エンハンサー配列は、遺伝子のコード領域の上流、下流および内部にさえも存在し得、そして遺伝子の発現を増強するような方向または抑制するような方向のいずれかに向き得る。
【０１６７】
本発明はＰＳＣＡコード領域の上流の９ｋｂの配列を含むＤＮＡフラグメントを提供する。このＰＳＣＡフラグメントが作動可能に連結された導入遺伝子の発現を駆動する能力は、細胞にトランスフェクトされた一連のキメラレポーター構築物を用いて試験された。そのキメラレポーター構築物は、ネイティブな内因性ＰＳＣＡと同様の発現パターンを示し、そしてそのＰＳＣＡフラグメントは順配向で連結した場合に、導入遺伝子の発現を駆動する。従って、このＰＳＣＡフラグメントは、プロモーター様の活性を示すＰＳＣＡ上流の調節領域を含む。
【０１６８】
ＰＳＣＡ転写物はまた、前立腺腫瘍細胞中に有意に高いレベルで存在するが、良性の前立腺過形成中には存在しない。従って、ＰＳＣＡ転写物は、前立腺優勢の様式において検出可能であり、そして前立腺腫瘍サンプルにおいてより高いレベルで検出可能である。有意により高いレベルのＰＳＣＡ転写物、または当該分野で公知のような過剰発現は、正常な前立腺における検出可能なＰＳＣＡ転写物の量の測定および、前立腺腫瘍サンプルとの比較によって決定され得る。この比較は、ノーザン分析およびＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む、当該分野で周知の方法によって行われ得、そして転写物レベルにおける相異が定量され得る。従って、サンプルにおける測定可能な程に異なる量のＰＳＣＡ転写物（すなわち、正常なサンプルからのＰＳＣＡ転写物の数を超える、試験サンプルにおけるＰＳＣＡ転写物の数）の存在は、前立腺癌の存在を示すのに使用され得る。
【０１６９】
ＰＳＣＡ発現はまた、他のヒトのガン（特に、膀胱および膵臓の癌腫）において観察され得る。膀胱癌腫の場合において、ＰＳＣＡ発現の程度は、疾患の重篤度と相関するようであり、侵襲性膀胱癌における過剰発現の最高レベルに達する（以下の実施例１７を参照のこと）。
【０１７０】
ＰＳＣＡの転写物およびタンパク質の蓄積のパターンは公知であり、そしてＰＳＣＡ上流調節領域が単離され、そして特徴付けられた。導入遺伝子に作動可能に連結したＰＳＣＡ上流調節領域を含む一連のキメラ構築物が、試験された。そのＰＳＣＡ上流調節領域は、種々の前立腺細胞および細胞株、ならびに膀胱において、導入遺伝子の発現を駆動し、そして腎臓においてより低い程度に駆動する。従って、ＰＳＣＡ上流領域は、前立腺優勢な様式において導入遺伝子の発現を駆動する。
【０１７１】
好ましい実施形態において、図４２に示される様な、ＰＳＣＡ遺伝子の５’上流領域由来の９ｋｂ、６ｋｂ、３ｋｂ、および１ｋｂのＤＮＡフラグメントが、本明細書で記載される技術によって産生された。９ｋｂのＰＳＣＡ上流領域（ｐＥＧＦＰ−ＰＳＣＡ）は、遺伝子調節活性に関係し、そして１９９９年５月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５２に寄託され、そしてそこで、以下のＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−８０として同定される。この９ｋｂのフラグメントはＴ７プライマーおよびＲＩｈＰＳＣＡ３’−５（５’−ｇｇｇａａｔｔｃｇｃａｃａｇｃｃｔｔｃａｇｇｇｔｃ−３’）を用いた増幅によって得られた。
【０１７２】
（遺伝子調節活性を有するフラグメントの使用）
本発明は、細胞／部位に対して、目的の遺伝子を標的化し、その結果、その遺伝子によりコードされたタンパク質が発現され得、それにより、疾患状態を直接または間接的に回復させるための方法（例えば、遺伝子治療法）を提供する。
【０１７３】
感受性の細胞が、腫瘍細胞において有意に増大した遺伝子発現活性を有するＰＳＣＡ上流領域の制御下で導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）を発現する発現ベクターと共に導入される。腫瘍細胞において優勢に治療遺伝子を発現する発現ベクターの使用は、前立腺、膀胱および、膵臓腫瘍細胞のような標的細胞において治療遺伝子を発現させる。
【０１７４】
感受性細胞を感染した後、導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）が、その導入遺伝子によってコードされたタンパク質を発現するベクターにおいて、増大した遺伝子発現活性を有するＰＳＣＡ上流領域によって駆動される。かなり特異的な前立腺特異的遺伝子ベクターの使用は、標的細胞（例えば、前立腺癌細胞）における特定の遺伝子の選択的な発現を可能にする。
【０１７５】
増大した遺伝子発現活性を有するＰＳＣＡ領域は、誘導体分子を産生するために、例えば配列の変異、欠失、および挿入によって改変され得る。改変は、前立腺細胞に特異的な調節タンパク質に結合し得る配列の数の増加、および遺伝子発現活性を有するＰＳＣＡ領域において機能しない配列の欠失を含む。他の改変は、エンハンサーの付加を含み、それによって、プロモーター活性を有するＰＳＣＡ領域の効率が改善される。エンハンサーは、位置独立的な様式において機能し得、そして、転写される領域の上流、内部または下流に位置し得る。
【０１７６】
誘導体分子は、増大した遺伝子発現活性を有するＰＳＣＡ上流領域の機能特性を保持する。すなわち、このような置換を有する分子は、フラグメントの３’に位置する目的の遺伝子の前立腺組織特異的な発現を、実質的に、なお可能にする。改変は、誘導体分子が、プロモーター活性のみを有するＰＳＣＡフラグメントと比較して、実質的に前立腺特異的な様式で遺伝子発現を駆動するその能力を保持している限り、許容される。
【０１７７】
好ましい実施形態において、ベクターは、プロモーター活性を有するＰＳＣＡ上流領域の下流に異種配列（治療遺伝子）を挿入することによって、構築された。
【０１７８】
治療遺伝子の例には、自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ）が挙げられる。これらは、その発現によって、腫瘍細胞の増殖または腫瘍細胞の死（例えば、前立腺腫瘍細胞）を阻害するタンパク質または因子が産生される遺伝子配列である。自殺遺伝子には、酵素（例えば、プロドラッグ酵素）をコードする遺伝子、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、毒素をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、またはオンコスタチンをコードする遺伝子が挙げられる。治療遺伝子の目的は、癌細胞の増殖を阻害するか、または癌細胞を殺傷すること、あるいはサイトカインまたは直接もしくは間接的に癌細胞の増殖を阻害するか、もしくは前立腺癌細胞を殺傷する他の細胞傷害性因子を産生することである。
【０１７９】
適切なプロドラッグ酵素には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子、またはＥ．Ｃｏｌｉのシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、もしくはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が挙げられる。
【０１８０】
適切な癌遺伝子および癌抑制遺伝子には、ｎｅｕ、ＥＧＦ、ｒａｓ（Ｈ  ｒａｓ、Ｋ  ｒａｓ、およびＮ  ｒａｓを含む）、ｐ５３、網膜芽癌抑制遺伝子（Ｒｂ）、ウィルムス腫瘍遺伝子産物、ホスホチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）、およびｎｍ２３が挙げられる。適切な毒素には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素ＡおよびＳ；ジフテリア毒素（ＤＴ）；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＴ毒素、Ｓｈｉｇａ毒素、Ｓｈｉｇａ様毒素（ＳＬＴ−１、−２）、リシン、アブリン、スポリン、およびゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）が挙げられる。
【０１８１】
適切なサイトカインには、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（Ｗｏｎｇ  Ｇら、Ｈｕｍａｎ  ＧＭ−ＣＳＦ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８５；２２８：８１０）；ＷＯ９３２３０３４（１９９３）；Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ  ＭＡら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−  ａｎｄ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｍｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｔｈａｔ  ｔｈｅｙ  ｃｏｎｔａｉｎ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０年３月，６４（３）：１１７１−８１；Ｌｉ  ＹＰら、Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＩＬ−６，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＩＬ−１，ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２年２月１日，１４８（３）：７８８−９４；Ｐｉｚａｒｒｏ  ＴＴら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＴＮＦ  ｂｅｔａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３年８月，５６（２）：３９９−４０４）が挙げられる。（Ｂｒｅｖｉａｒｉｏ  Ｆら、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２年１１月５日，２６７（３１）：２２１９０−７；Ｅｓｐｉｎｏｚａ−Ｄｅｌｇａｄｏ  Ｉら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＩＬ−２  ａｎｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２年１１月１日，１４９（９）：２９６１−８；Ａｌｇａｔｅ  ＰＡら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３（ＩＬ−３）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ＩＬ−３  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＦＬ５．１２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｂｌｏｏｄ，１９９４年５月１日，８３（９）：２４５９−６８；Ｃｌｕｉｔｍａｎｓ  ＦＨら、ＩＬ−４  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＩＬ−２−，ＩＬ−３−，ａｎｄ  ＧＭ−ＣＳＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐ���ｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９４年６月，６８（６）：２９３−８；Ｌａｇｏｏ，ＡＳら、ＩＬ−２，ＩＬ−４，ａｎｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４年２月１５日，１５２（４）：１６４１−５２；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＯＭら、ＩＬ−２  ａｎｄ  ＩＬ−５  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３年５月，５５（５）：１１５９−６６；Ｐａｎｇ  Ｇら、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−１  ａｌｐｈａ，ＩＬ−１  ｂｅｔａ，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１０，ＩＣＡＭ−１  ａｎｄ  ＶＣＡＭ−１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＩＬ−１  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４年６月，９６（３）：４３７−４３；Ｕｌｉｃｈ  ＴＲら、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．ＩＩＩ．ＩＬ−６  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＩＬ−６．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１年４月１日，１４６（７）：２３１６−２３；Ｍａｕｖｉｅｌ  Ａら、Ｌｅｕｋｏｒｅｇｕｌｉｎ，ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ＩＬ−８  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ−ｄｒｉｖｅｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２年１１月１日，１４９（９）：２９６９−７６）。
【０１８２】
成長因子には、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦα）およびβ（ＴＧＦβ）、サイトカインコロニー刺激因子（Ｓｈｉｍａｎｅ  Ｍら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ−ＣＳＦ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｃＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９４年２月２８日，１９９（１）：２６−３２；Ｋａｙ  ＡＢら、Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３（ＩＬ−３），ＩＬ−４，ＩＬ−５，ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ｉｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌａｔｅ−ｐｈａｓｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９１年３月１日，１７３（３）：７７５−８；ｄｅ  Ｗｉｔ  Ｈら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍ−ＣＳＦ  ａｎｄ  ＩＬ−６  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９４年２月，８６（２）：２５９−６４；Ｓｐｒｅｃｈｅｒ  Ｅら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１  ｂｅｔａ，ＴＮＦ−ａｌｐｈａ，ａｎｄ  ＩＬ−６  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｅｘｕｄａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−１．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９２，１２６（１−４）：２５３−６９）。
【０１８３】
本発明の方法における使用に適切なベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクターを含むウイルス性ベクターである。
【０１８４】
好ましくは、選択されたウイルス性ベクターは、以下の基準を満たすべきである：１）そのベクターは、腫瘍細胞に感染し得なければならず、従って、適切な宿主範囲を有するウイルス性ベクターが選択されなければならない；２）転移される遺伝子は、長期間細胞中で持続し得、そして発現され得るべきである；そして３）そのベクターは、宿主に対して安全であるべきであり、そして最少の細胞の形質転換を引き起こすべきである。レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスは、哺乳動物細胞に、外来の遺伝子を効率的に導入し、そして発現する、効率的で有用な、そして現在では最もよく特徴付けられた手段を提供する。非常に広い宿主および細胞型の範囲を有するこれらのベクターは、遺伝子を安定に、かつ効率的に発現する。これらのベクターの安全性は、多くの研究グループによって証明された。実際、その多くが臨床試験にある。
【０１８５】
障害の補正のために細胞に遺伝子を転移するために使用され得る他のウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のようなレトロウイルス；ＪＣ、ＳＶ４０、ポリオーマのようなパポバウイルス；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）；パピローマウイルス（例えば、ウシパピローマウイルスＩ型（ＢＰＶ））；ワクシニアおよびポリオウイルスならびに他のヒトおよび動物のウイルスが挙げられる。
【０１８６】
アデノウイルスは、それ自身をクローニングビヒクルとして魅力的にするいくつかの特性を有する（Ｂａｃｈｅｔｔｉｓら、Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９７７  ７４：１５９０；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８  ６：６１６；Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  Ｇら、Ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｇｅｎｅ  １９８６；５０：１６１；Ｈａｇ−Ａｈｍａｎｄ  Ｙら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｅｌｐｅｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９８６；５７：２５７；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  Ｍら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  α1−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；２５２：４３１）。
【０１８７】
例えば、アデノウイルスは、細胞核において複製する中間のサイズのゲノムを有し：多くの血清型が臨床的に無害であり；アデノウイルスゲノムは、外来の遺伝子を挿入するが、安定なようであり：外来の遺伝子は、欠失または再配列することなく維持されるようであり；そしてアデノウイルスは、４週間から数ヶ月までの発現期間を有する高いレベルの一過性発現ベクターとして使用され得る。広範な生化学および遺伝的研究は、ネイティブのアデノウイルス配列への７〜７．５ｋｂまでの異種配列の置換によって、生存可能で、条件的な、ヘルパー独立性ベクターを作製可能であることを示唆する（Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９８５  ８２：６８９）。
【０１８８】
ＡＡＶは、約５ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有する小さなヒトパルボウイルスである。このウイルスは、いくつかのヒト細胞型において、組込み型プロウイルスとして増殖され得る。ＡＡＶベクターは、ヒトの遺伝子治療にとっていくつかの利点を有する。例えば、ＡＡＶベクターはヒト細胞に対して栄養性であるが、他の哺乳動物細胞にもまた感染し得る；（２）ヒトまたは他の動物において、ＡＡＶに関連する疾患はない；（３）組込まれたＡＡＶゲノムは、その宿主細胞内で安定であるようである；（４）ＡＡＶの組込みが、宿主の遺伝子もしくはプロモーターの発現を変化させるか、またはその再配列を促進するという証拠がない；（５）導入された遺伝子は、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスの感染によって、宿主細胞から奪還され得る。
【０１８９】
ＨＳＶ−１ベクター系は、非有糸細胞への実質的にいかなる遺伝子の導入をも容易にする（Ｇｅｌｌｅｒら、ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９０  ８７：８９５０）。
【０１９０】
哺乳動物遺伝子の転移のための別のベクターは、ウシパピローマウイルスに基づくベクターである（Ｓａｒｖｅｒ  Ｎら、Ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８１；１：４８６）。
【０１９１】
ワクシニアおよび他のポックスウイルスに基づくベクターは、哺乳動物遺伝子転移系を提供する。ワクシニアウイルスは、１２０キロダルトン（ｋｄ）のゲノムサイズの巨大な二本鎖ＤＮＡウイルスである（Ｐａｎｉｃａｌｉ  Ｄら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ａｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８２；７９：４９２７；Ｓｍｉｔｈら、ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８３  ３０２：４９０）。
【０１９２】
レトロウイルスは、ウイルス遺伝子の宿主細胞への挿入のために設計されたパッケージである（Ｇｕｉｌｄ  Ｂら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９８８；６２：７９５；Ｈｏｃｋ  ＲＡら、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８６；３２０：２７５）。
【０１９３】
基本的なレトロウイルスは、プロウイルスのタンパク質中にパッケージングされたＲＮＡの２つの同一鎖からなる。そのコアはエンベロープと呼ばれる保護被膜によって囲まれ、そのエンベロープは、ウイルスによって寄与される糖タンパク質で改変される以外は、前の宿主の膜に由来する。
【０１９４】
好ましくは、例えば、前立腺における細胞の欠損、疾患または損傷の処置にのために、本発明のベクターは、治療遺伝子または導入遺伝子（例えば、ＴＫをコードする遺伝子）を含む。その遺伝的に改変されたベクターは、欠損、疾患（例えば、前立腺癌をインビボで改善効果を有する内因性分子の産生を増大する治療遺伝子産物の前立腺への導入によって）を処置するために前立腺に投与される。この同じ原理は、他の癌（例えば、ＰＳＣＡを発現する膵臓癌、膀胱癌または他の癌）の処置に関して適用される。
【０１９５】
本発明の方法のこの実施形態における基本的な課題は、目的の遺伝子の単離、遺伝子調節活性を有するフラグメントへの目的遺伝子の結合、目的の遺伝子を身体に送達するための適切なベクタービヒクルの選択、目的の遺伝子を有するベクターの身体への投与、および標的細胞への目的遺伝子の適切な発現の達成である。本発明は、クローン化された遺伝子（すなわち、目的の遺伝子）を、この遺伝子を必要とする患者の血流または関連する器官に直接注射され得るような様式でのパッケージングを提供する。そのパッケージングは、外来のＤＮＡを、免疫系による排除から保護し、そしてそれを適切な組織または細胞へ指向させる。
【０１９６】
ヒトまたは動物の目的の遺伝子と共に、別の遺伝子（例えば、選択可能マーカー）が挿入され得、改変されたレトロウイルスを取り込んだ細胞の同定が容易となる。遺伝子治療のプロセス上の重大な焦点は、新しい遺伝子が、標的細胞において、発現の十分な持続期間を有し、適切なレベルで発現されなければならないことである。
【０１９７】
ベクターを改変するための、および標的器官（例えば、前立腺）にこのような改変されたベクターを投与するための以下に記載の方法は、単に例証の目的であり、そして使用され得る方法の典型である。しかし、他の手順もまた、当該分野で理解されるように使用され得る。
【０１９８】
ベクターなどを構築するために使用される大部分の技術は、当該分野で広く実施されており、そして大部分の専門家は、特定の条件および手順を記載する標準的な供給源の試料に精通する。しかし、簡便のために、以下の段落が、ガイドラインとして役立ち得る。
【０１９９】
（ベクター構築のための一般的方法）
所望の治療的遺伝子コード配列および制御配列を含む適切なベクターの構築は、当該分野で十分に理解されている、標準的連結および制限技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと）を使用する。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドを、所望の形態に切断し、改変し、そして再連結する。
【０２００】
部位特異的なＤＮＡ切断を、当該分野で一般的に理解されている条件下で、適切な制限酵素を用いて処理すること、およびこれらの市販されている制限酵素の製造業者によって特定化される詳細により、実行する（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと）。概して、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２０μｌの緩衝溶液中で１単位の酵素により切断する。代表的に、過剰の制限酵素は、ＤＮＡ基質の完全な消化を保証するために使用される。
【０２０１】
変更を行い得るが、約３７℃での約１時間〜２時間のインキュベーション時間は、実行可能である。各々のインキュベーションの後、タンパク質をフェノール／クロロホルムを用いた抽出により除去し、そして続いてエーテル抽出し得、そして核酸を、エタノールを用いた沈殿により水相から回収する。所望の場合、切断したフラグメントのサイズ分離を、標準的な技術を使用するポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって実行し得る。サイズ分離の一般的記述は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５：４９９−５６０（１９８０）中に見出される。
【０２０２】
制限切断されたフラグメントを、４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、６ｍＭ  ＤＴＴおよび５〜１０μＭ  ｄＮＴＰ中で２０℃〜２５℃、約１５〜２５分のインキュベーション時間を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）の大きなフラグメントを用いて処理することにより、平滑断端にし得る。このＫｌｅｎｏｗフラグメントは、４種類のｄＮＴＰが存在しても、５’粘着末端で充填するが、突出した３’一本鎖を消化する。所望される場合、選択的な修復を、粘着末端の性質により指示される制限内で、ｄＮＴＰの一種類のみを提供することにより、または選択されたｄＮＴＰを用いて実行し得る。Ｋｌｅｎｏｗを用いた処置の後、この混合物をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、そしてエタノールを用いて沈殿する。Ｓ１ヌクレアーゼまたはＢａｌ−３１を用いた適切な条件下での処理により、任意の一本鎖部分の加水分解が生じる。
【０２０３】
連結を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、次の標準条件および温度の下で、１０〜１５μｌの容量において実行する。連結プロトコルは、標準である（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９１））。
【０２０４】
「ベクターフラグメント」を使用するベクター構築において、ベクターフラグメントを、５’ホスフェートを除去し、そしてベクターの再連結を妨害するために、一般的に、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処理する。あるいは、再連結を、好ましくないフラグメントのさらなる制限酵素消化により二重に消化されるベクターにおいて、妨害し得る。
【０２０５】
適切なベクターは、ウイルスベクター系（例えば、ＡＤＶ、ＲＶ、およびＡＡＶ（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編（１９９１））を含む。
【０２０６】
機能的ＤＮＡ導入遺伝子を細胞へ挿入するための多くの方法は、当該分野で公知である。例えば、非ベクター的方法としては、細胞へのＤＮＡの非ウイルス性物理的トランスフェクションが挙げられ；例えば、マイクロインジェクション（ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ  ６：６６２−６８０（１９８８））；リポソーム媒介トランスフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７），ＦｅｌｇｎｅｒおよびＨｏｌｍ、Ｆｏｃｕｓ  １１：２１−２５（１９８９）およびＦｌｅｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｗｅｓｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｏｃ．３２：１１５−１２１（１９８９））および当該分野で公知の他の方法。
【０２０７】
（改変されたベクターの被験体への投与）
標的細胞へＤＮＡを入れるための１つの方法は、膜結合された、嚢（ｓａｃ）または小胞（例えば、スフェロプラストまたはリポソーム）の中へＤＮＡを加えることであるか、またはリン酸カルシウム沈殿（ＣａＰＯ4）による（Ｇｒａｈａｍ  Ｆ．およびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６  １９７３；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ  Ｍ．ら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ｇｅｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  Ｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８２；２１５：１６６；Ｓｔａｖｒｉｄｉｓ  ＪＣら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ．  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９８６；１６４：５６８−５７２）。
【０２０８】
ベシクルを、その膜が標的細胞の外膜と融合するような方法において構築し得る。ベシクル中の本発明のベクターは、標的細胞の中へ向かわせ得る。スフェロプラストは、ポリエチレングリコールのような融合剤（ｆｕｓｏｇｅｎ）を用いて哺乳動物標的細胞を通して融合され得るまで、高いイオン強度の緩衝液中で保持される。
【０２０９】
リポソームは、人工のリン脂質ベシクルである。ベシクルは、０．２〜４．０μｍの範囲の大きさであり、そして高分子を含む緩衝水溶液の１０％〜４０％を包括し得る。このリポソームは、ヌクレアーゼからＤＮＡを保護し、そして標的細胞へのその導入を容易にする。トランスフェクションはまた、エレクトロポレーションを介して生じ得る。
【０２１０】
投与の前に、改変されたベクターを、注入のために選択された濃度で完全なＰＢＳ中に懸濁する。ＰＢＳに加えて、任意の浸透圧的に均衡の取れた溶液（この溶液は、被験体に対して生理学的に適合する）を使用し、改変されたベクターを懸濁し得、そして宿主へ注入し得る。
【０２１１】
注入のために、細胞の懸濁液をシリンジの中へ引き上げ、麻酔したレシピエントへ投与する。多重注入をこの手順を用いて行い得る。ウイルス懸濁手順は、従って、遺伝子改変されたベクターを、標的器官（例えば、前立腺）の任意の予定された部位へ投与することを可能にし、比較的非外傷性であり、同じウイルス懸濁液を用いる、いくつかの異なる部位または同じ部位における同時の多重投与を可能にする。多重注入は、治療的遺伝子の混合物からなり得る。
【０２１２】
（改変されたベクターの使用）
本発明は、発現活性を有するフラグメントを用いる治療的遺伝子の発現を保持および増加するための方法を提供する。
【０２１３】
本発明の方法は、治療的遺伝子を保有する改変されたベクターが、被験体へ注入される実施形態によって例証される。
【０２１４】
第１の実施形態において、宿主においてタンパク質を産生するように本発明の宿主ベクター系を増殖させる工程、およびそのようにして産生されたタンパク質を回収する工程を包含するタンパク質生成物が、発現される。この方法は、単細胞生物および多細胞生物の両方において目的の遺伝子の発現を可能にする。例えば、インビボのアッセイにおいて、目的の遺伝子（例えば、ｒａｓ遺伝子）を含む本発明のベクターを有する前立腺細胞を、ｒａｓ遺伝子産物に対して無制限のようにマイクロタイターウェルにおいて使用し得る。被験体由来のサンプルを、ｒａｓ遺伝子に対して指向された抗体の存在を検出するためにこのウェルへ加える。このアッセイは、被験体の免疫系が、上昇したレベルのｒａｓと関連する疾患と闘っているか否かの臨床的評価に対して、サンプル中のｒａｓ抗体の存在の定量的決定および定性的決定を補助し得る。
【０２１５】
第２の実施形態において、転移性の前立腺癌を、遺伝子治療、すなわち本発明の核酸分子の使用を通してインビボでの疾患表現型の補正を介して処置する。
【０２１６】
本発明の実施に従って、遺伝子治療の被験体は、ヒト被験体、ウマ被験体、ブタ被験体、ウシ被験体、マウス被験体、イヌ被験体、ネコ被験体、またはトリ被験体であり得る。他の哺乳動物をまた、本発明において含む。
【０２１７】
本発明の分子について投与および投与計画の最も有効な形態は、処置される前立腺腫瘍の正確な位置、癌の重症度および経過、処置に対する被験体の健康および応答、ならびに処置する内科医の判断による。従って、この分子の投与量を、個々の被験体に対して滴定すべきである。これらの分子を、別の細胞（自系細胞が好ましいが、異種細胞は本発明の範囲内に包含される）を介して直接または間接的に送達し得る。
【０２１８】
表面積のｍｇ／ｍ2に基づく、種々の大きさおよび種の動物ならびにヒトに対する投与量の相互関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，Ｒｅｐ．５０（４）：２１９−２４４（１９６６）によって記載される。投与計画における調節は、腫瘍細胞増殖を阻害または殺傷する応答を最適化するようになされ得、例えば、用量を毎日の基準に対して分割または投与し得るか、または用量を状況に依存して比例的に減少し得る（例えば、いくつかの分割された用量を、特異的な治療的状況に従って毎日投与するか、または比例的に減少し得る）。
【０２１９】
処置を達成するために必要とされる本発明の分子の用量は、計画の最適化ともにさらに改変され得ることは明かである。
【０２２０】
（トランスジェニック動物の産生）
本発明の別の局面は、ＰＳＣＡ核酸を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。例えば、１つの適用において、ＰＳＣＡ欠失非ヒト動物を、ＰＳＣＡホモログを不活性化するように標準ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）手順を用いて産生し得るか、またはこのような動物が生存不可能な場合、誘導性のＰＳＣＡホモログアンチセンス分子を使用して、ＰＳＣＡホモログ活性／発現を調節し得る。あるいは、動物を、ヒトＰＳＣＡコード核酸分子あるいはＰＳＣＡタンパク質またはアンチセンス分子の発現を組織特異的様式に指向するアンチセンスＰＳＣＡの発現単位を含むように変え得る。このような使用において、ＰＳＣＡホモログ遺伝子の発現が、不活性化もしくは活性化によって変化し、そして／またはヒトＰＳＣＡ遺伝子によって置換される、非ヒト哺乳動物（例えば、マウスまたはラット）を、産生する。このことを、標的化された組換えのような当該分野で公知の種々の手順を用いて達成し得る。一旦、産生されると、ＰＳＣＡホモログ欠失動物、組織特異的様式でＰＳＣＡ（ヒトもしくはホモログ）を発現する動物、またはアンチセンス分子を発現する動物、を使用して（１）ＰＳＣＡタンパク質によって媒介される生物学的プロセスおよび病理学的プロセスを同定し得、（２）ＰＳＣＡタンパク質と相互作用するタンパク質および他の遺伝子を同定し得、（３）ＰＳＣＡタンパク質の欠失を克服するように外因的に提供され得る薬剤を同定し得、そして（４）活性を増加または減少するＰＳＣＡ遺伝子の中の変異を同定するための適切なスクリーンとして役立ち得る。
【０２２１】
例えば、組織特異的様式でＰＳＣＡをコードするヒトミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）を発現するトランスジェニックマウスを産生し得、そして通常はＰＳＣＡタンパク質を含まない、組織および細胞においてタンパク質の過剰発現の効果を試験し得る。このストラテジーは、他の遺伝子、すなわちｂｃｌ−２（Ｖｅｉｓら、Ｃｅｌｌ  １９９３  ７５：２２９）に対して首尾良く使用されてきた。このようなアプローチは、ＰＳＣＡタンパク質／遺伝子へ容易に適用され得、そして特定の組織におけるＰＳＣＡタンパク質の潜在的に有益なまたは有害な効果の問題に取り組むために使用され得る。
【０２２２】
さらに、他の実施形態において、本発明は、癌遺伝子を含む、生殖細胞および体細胞を有するトランスジェニック動物を提供し、この癌遺伝子は、癌遺伝子に関連する癌のプロモーションに対して上記マウスの組織における上記遺伝子の発現に対して有効なＰＳＣＡ上流領域へ連結され、それによってその癌のマウスモデルを産生する。
【０２２３】
（組成物）
本発明は、本発明のＰＳＣＡ核酸分子またはＰＳＣＡタンパク質をコードするかもしくはそのフラグメントをコードする発現ベクター、および必要に応じて、適切なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、さらに、ＰＳＣＡタンパク質を認識および結合する、抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物を提供する。１つの実施形態において、抗体またはそのフラグメントは治療薬剤または細胞毒性薬剤へ結合または連結される。
【０２２４】
薬学的組成物のための適切なキャリアは、任意の物質を含み、本発明の核酸または他の分子と合わされる場合、この物質は、この分子の活性を保持し、そして被験体の免疫系と反応性でない。例としては、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、水中油滴型エマルジョンのようなエマルジョン、および種々の型の湿潤剤のような任意の標準の薬学的キャリアが挙げられるが、これらに限定されない。他のキャリアとしてはまた、無菌溶液、コーティングされた錠剤およびカプセル剤を含む錠剤が挙げられる。代表的に、このようなキャリアは、デンプン、牛乳、砂糖、ある型の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、滑石、植物性脂肪または植物性油、ゴム、グリコールあるいは他の公知の賦形剤のような賦形剤を含む。このようなキャリアとしてはまた、香味添加剤および彩色添加剤または他の成分が挙げられ得る。このようなキャリアを含む組成物は、周知の慣習的な方法によって処方される。このような組成物はまた、例えばリポソームのような種々の脂質組成物およびポリマーミクロスフェアのような種々のポリマー組成物中に処方され得る。
【０２２５】
本発明はまた、ＰＳＣＡ核酸分子を含む診断用組成物、本発明の核酸分子もしくはその任意の部分へ特異的にハイブリダイズするプローブ、またはＰＳＣＡ抗体もしくはそのフラグメントを提供する。核酸分子、プローブまたは抗体もしくはそのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得る。検出可能なマーカーの例としては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本発明は、ＲＴ−ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応方法論を用いてＰＳＣＡコード配列を増幅し得るＰＳＣＡ特異的プライマー対を含む診断用組成物を提供する。
【実施例】
【０２２６】
（実施例１：新規な前立腺細胞表面抗原（ＰＳＣＡ）の同定および分子的特性付け）
（材料および方法）
（ＬＡＰＣ−４異種移植片）  ＬＡＰＣ−４異種移植片を、Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：４０２−４０８に記載のように産生した。
【０２２７】
（ＲＤＡ、ノーザン分析およびＲＴ−ＰＣＲ）  アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−４腫瘍およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４腫瘍の表象差異分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を、以前に記載（Ｂｒａｕｎら、１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４６２３−４６３０）のように実行した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＵｌｔｒａｓｐｅｃ（登録商標）ＲＮＡ単離システム（Ｂｉｏｔｅｃｘ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて単離した。ノーザンフィルターを、コード配列およびＰＳＣＡの３’非翻訳配列の部分に相当する６６０ｂｐＲＤＡフラグメントまたはＰＳＡの約４００ｂｐフラグメントを用いてプローブした。ヒト多重組織ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得、詳述されるようにプローブした。逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ分析について、第１鎖ｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲコアキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ｒｏｃｈｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて全ＲＮＡから合成した。ヒトＰＳＣＡ転写物のＲＴ−ＰＣＲについて、プライマー５’−ｔｇｃｔｔｇｃｃｃｔｇｔｔｇａｔｇｇｃａｇ−および３’−ｃｃａｇａｇｃａｇｃａｇｇｃｃｇａｇｔｇｃａ−を、約３２０ｂｐフラグメントを増幅するために使用した。熱サイクルを、９５度で３０秒間、６０度で３０秒間および７２度で１分間の２５〜２５サイクル、続いて７２度で１０分間の伸長によって実行した。ＧＡＰＤＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）についてのプライマーを、コントロールとして使用した。マウスＰＳＣＡについて、使用したプライマーは、５’−ｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔｇｇｃｃａｃｃｔａｃ−および３’−ｇｃａｇｃｔｃａｔｃｃｃｔｔｃａｃａａｔ−であった。
【０２２８】
（ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡについてのインサイチュハイブリゼーションアッセイ）
ｍＲＮＡインサイチュハイブリゼーションのために、全長のＰＳＣＡ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＣＲＩＩ（１μｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を線状にし、センスジゴキシゲニンおよびアンチセンスジゴキシゲニン標識したリボプローブを産生した。インサイチュハイブリゼーションを、以前に記載（Ｍａｇｉ−Ｇａｌｌｕｚｚｉら、１９９７，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：３７−４３）のように自動化した機器（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｇｅｎ  ＩＩ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）上で実行した。前立腺標本を、約１３０標本にまで拡大された以前に記載されたデータベース（Ｍａｇｉ−Ｇａｌｌｕｚｚｉら、前出）から得た。スライドを、盲検的な様式において、二人の病理学者によって読み取り、そして点数化した。０〜３の点数を、陽性な細胞のパーセンテージ（０＝０％；１＝＜２５％；２＝２５〜５０％；３＝＞５０％）および染色の強度（０＝０；１＝１＋；２＝２＋；３＝３＋）に従って割り当てた。２つの点数を掛けて、０〜９の全体の点数を所与した。
【０２２９】
（結果）
（ヒトＰＳＣＡ  ｃＤＮＡ）  表象差異分析（ＲＤＡ）（ＰＣＲに基づく差し引きハイブリダイゼーション技術）を、ヒト前立腺癌異種移植片（ＬＡＰＣ−４）のホルモン依存性改変体とホルモン非依存性改変体との間で、遺伝子発現を比較するため、およびアンドロゲン−非依存性ＬＡＰＣ−４亜系統においてアップレギュレートされたｃＤＮＡを単離するために、使用した。複数の遺伝子を、クローニングし、配列決定し、そして示差的発現について調べた。一つの６６０ｂｐフラグメント（クローン番号１５）を同定し、このフラグメントは、正常の前立腺と比較した場合、異種移植片腫瘍において高度に過剰発現されることが見出された。正常な前立腺および異種移植片腫瘍における、このクローンの発現とＰＳＡの発現との比較は、クローン番号１５が、比較的癌特異的であることを示唆した（図９）。
【０２３０】
配列分析は、クローン番号１５がデータベースで正確に適合するものを有さないが、幹細胞抗原２（グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカー型細胞表面抗原のＴｈｙ−１／Ｌｙ−６スーパーファミリーのメンバー）と３０％のヌクレオチド相同性を共有するということを明らかにした。クローン番号１５は、１２３アミノ酸のタンパク質をコードし、このタンパク質は、ＳＣＡ−２（ＲＩＧ−Ｅとも呼ばれる）と３０％同一であり、そしてＬｙ−６／Ｔｈｙ−１遺伝子ファミリーに特徴的な、多数の高度に保存されたシステイン残基を含む（図３）。ＧＰＩ−アンカー型タンパク質のファミリーとのその相同性と一致して、クローン番号１５は、アミノ末端疎水性シグナル配列、および小さなアミノ酸の群（ＧＰＩ結合についての切断／結合部位を規定する）に続く疎水性アミノ酸のカルボキシ末端ストレッチの両方を含む（ＵｄｅｎｆｒｉｅｎｄおよびＫｏｄｕｋｕｌａ、１９９５、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：５６３−５９１）。これはまた、四つの推定Ｎ−グリコシル化部位も含む。幹細胞抗原−２に対するその強い相同性のために、クローン番号１５は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）と改名された。次いで、５’および３’ＰＣＲ  ＲＡＣＥ分析を、ＬＡＰＣ−４アンドロゲン非依存性異種移植片から得られたｃＤＮＡを使用して行い、そして全長ｃＤＮＡヌクレオチド配列（コード領域および非翻訳領域を含む）を得た。ヒトＰＳＣＡをコードする全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、図１Ａに示され、翻訳されたアミノ酸配列は図１Ｂおよび図３に示される。
【０２３１】
（ＰＳＣＡは前立腺細胞において発現される）  正常ヒト組織中のＰＳＣＡ  ｍＲＮＡの分布を、ノーザンブロット分析により調べた。その結果（図９Ｂに示される）は、ＰＳＣＡが前立腺において優性に発現され、胎盤においてはより低レベルの発現が存在することを実証する。少量のｍＲＮＡを、長い露光の後、前立腺組織で見られたレベルの約１００分の１のレベルで、腎臓および小腸において検出し得る。正常ヒト組織におけるＰＳＣＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析はまた、ＰＳＣＡ発現が制限されることを実証する。正常な組織のパネルにおいて、高レベルのＰＳＣＡ  ｍＲＮＡ発現を前立腺で検出し、有意の発現を、胎盤および扁桃で検出した（図７Ａ）。種々の前立腺癌異種移植片の前立腺癌細胞株およびその他の細胞株、ならびに正常な前立腺におけるＰＳＣＡ  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析は、正常な前立腺、ＬＡＰＣ−４およびＬＡＰＣ−９前立腺癌異種移植片、ならびに卵巣癌細胞株Ａ４３１に限定される高レベルの発現を示した（図７Ｂ）。正常な前立腺における主要なＰＳＣＡ転写物は、約１ｋｂである（図９Ｂ）。マウスのＰＳＣＡ発現を、マウスの脾臓、肝臓、肺、前立腺、腎臓、および精巣におけるＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ヒトＰＳＣＡと同様に、マウスのＰＳＣＡは、前立腺で優性に発現される。発現はまた、ヒト組織のうち胎盤で見られたレベルと同様のレベルで、腎臓において検出され得る。
【０２３２】
前立腺癌細胞株および異種移植片におけるＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＡの発現を、ノーザンブロット分析により比較した。図１０に示されるその結果は、ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡの両方の高レベルの前立腺癌に特異的な発現を実証する一方、ＰＳＡ発現は前立腺癌特異的ではない。
【０２３３】
（ＰＳＣＡは正常な前立腺における基底細胞のサブセットにより発現される）
正常な前立腺は、二つの主要な上皮細胞集団（分泌性管腔細胞および下の基底細胞）を含む。インサイチュハイブリダイゼーションを、その発現を局在化するために、ＰＳＣＡに特異的なアンチセンスリボプローブを使用して、正常な前立腺の複数の部分で行った。図１１に示されるように、ＰＳＣＡは、正常基底細胞のサブセットにおいて排他的に発現される。支質、分泌性細胞または浸潤性リンパ球において、染色はほとんど見られない。センスＰＳＣＡリボプローブを用いるハイブリダイゼーションは、バックグランド染色を示さなかった。ＧＡＰＤＨについてのアンチセンスプローブを用いるハイブリダイゼーションは、全ての細胞の型におけるＲＮＡがインタクトであるということを確証した。基底細胞は、最終分化分泌性細胞の推定前駆細胞を表すため、これらの結果は、ＰＳＣＡが前立腺特異的な幹細胞／前駆細胞のマーカーであり得るということを示唆する（Ｂｏｎｋｈｏｆｆら、１９９４、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２４：１１４−１１８）。さらに、基底細胞はアンドロゲン非依存性であるため、ＰＳＣＡの基底細胞との関連は、ＰＳＣＡが、アンドロゲン非依存性前立腺癌の進行において役割を果たし得るという可能性を生じる。
【０２３４】
（ＰＳＣＡは、前立腺癌細胞において過剰発現される）  正常な前立腺およびＬＡＰＣ−４異種移植片腫瘍におけるＰＳＣＡの発現を比較する初期の分析は、ＰＳＣＡが前立腺癌において過剰発現されることを示唆した。図９に示されるような、ノーザンブロット分析により明らかにされたように、ＬＡＰＣ−４前立腺癌腫瘍は、ＰＳＣＡを強く発現するが、ＢＰＨのサンプルにおいて検出可能な発現はほとんど無い。対照的に、ＰＳＡ発現は、正常な前立腺において明確に検出可能であり、ＬＡＰＣ−４腫瘍において見られたレベルの２〜３倍のレベルである。従って、前立腺癌におけるＰＳＣＡの発現は、ＰＳＡで見られた発現の逆であるようである。ＰＳＡは、悪性の前立腺組織よりも正常な前立腺組織において、より強く発現されるが、ＰＳＣＡは、前立腺癌においてより高度に発現される。
【０２３５】
前立腺癌の診断におけるＰＳＣＡの発現とその値を確かめるために、１２６個のパラフィンに包埋された前立腺癌の標本を、ＰＳＣＡ発現についてｍＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションにより分析した。標本を、一つを除く全ての場合において、根治的な前立腺切除または経尿道切除により除去された初期の腫瘍から得た。全ての標本を、バックグランド染色を制御するためにセンス構築物およびアンチセンス構築物の両方でプローブした。材料および方法に記載するように、スライドには複合スコアが与えられ、６から９のスコアは強い発現を示し、４のスコアは穏やかな発現を意味する。１２６個のうち１０２個（８１％）の癌がＰＳＣＡについて強く染色されたが、１２６個のうち別の９個（７％）は穏やかな染色を示した（図１１Ｂおよび図１１Ｃ）。高段階の前立腺上皮内新形成（侵襲性前立腺癌の推定の前駆病変）は、標本の８２％（１１８個のうち９７個）においてＰＳＣＡについて強く陽性に染色された（図１１Ｂ）（Ｙａｎｇら、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：６９３−７０３）。正常な腺は、一貫して悪性腺より弱く染色された（図１１Ｂ）。９個の標本を、手術の前にホルモン除去治療で処置された患者から得た。これらの残りの推定アンドロゲン非依存性の癌の９個のうち７個（７８％）は、ＰＳＣＡを過剰発現し、パーセントは未処置の癌で見られたものに類似であった。このような高いパーセントの標本が、ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡを発現したため、ＰＳＣＡ発現と腫瘍病期および悪性度分類のような病理学的特徴との間に、統計学的相関はあり得ない。これらの結果は、ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡの過剰発現が、アンドロゲン依存性および非依存性の前立腺癌に共通の特徴であるということを示唆する。
【０２３６】
（ＰＳＣＡは、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株において発現される）ＰＳＣＡを差し引きハイブリダイゼーションを使用して初めにクローニングしたが、ノーザンブロット分析は、アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片腫瘍およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片腫瘍の両方における強いＰＳＣＡ発現を実証した（図９）。さらに、ＰＳＣＡ発現を、全ての前立腺癌異種移植片（ＬＡＰＣ−４異種移植片およびＬＡＰＣ−９異種移植片を含む）において検出した。
【０２３７】
アンドロゲン非依存性の、アンドロゲンレセプター陰性前立腺癌細胞株ＰＣ３およびＤＵ１４５におけるＰＳＣＡの発現をまた、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応分析により検出した。これらのデータは、ＰＳＣＡが、機能的アンドロゲンレセプターの非存在下で発現され得るということを示唆する。
【０２３８】
（実施例２：ＰＳＣＡの生化学的特徴付け）
この実験は、ＰＳＣＡが、グリコシル化された、ＧＰＩアンカー型細胞表面タンパク質であることを示す。
【０２３９】
（材料および方法）
（ポリクローナル抗体および免疫沈降）ウサギポリクローナル抗血清を、合成ペプチド−ＴＡＲＩＲＡＶＧＬＬＴＶＩＳＫ−に対して生成し、そしてＰＳＣＡグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を使用してアフィニティー精製した。２９３Ｔ細胞を、ＰＳＣＡ、ＣＤ５９、Ｅ２５を含むｐＣＤＮＡ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）発現ベクターまたはベクターのみを用いてリン酸カルシウム沈殿により一過的にトランスフェクトした。免疫沈降を以前に記載されたように（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ））行った。簡単にいうと、細胞を、５００ｕＣｉのトランス３５Ｓ標識（ＩＣＮ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて６時間標識化した。細胞溶解産物および馴化培地を、１ｕｇの精製されたウサギ抗ＰＳＣＡ抗体および２０ｕｌのプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともに２時間インキュベートした。脱グリコシル化のために、免疫沈降物を１ｕのＮ−グリコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３７℃で一晩処理するか、または０．１ｕのノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で１時間処理した後、２．５ｍＵのＯ−グリコシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で一晩処理した。
【０２４０】
（フローサイトメトリー）  ＰＳＣＡ細胞表面発現のフローサイトメトリー分析のために、単一細胞懸濁液を、２ｕｇ／ｍｌの精製された抗ＰＳＣＡ抗体および１：５００希釈のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で染色した。データをＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得し、ＬＹＳＩＳ  ＩＩソフトウェアを使用して分析した。コントロールサンプルを、二次抗体のみを用いて染色した。グリコシルホスファチジルイノシトール結合を、２×１０6の細胞を０．５ユニットのホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３７℃で９０分間消化することにより、分析した。細胞を、ＦＡＣＳスキャニングまたはイムノブロット法のいずれかによって、消化の前および後で分析した。
【０２４１】
（結果）
（ＰＳＣＡは、細胞表面に発現されたＧＰＩアンカー型糖タンパク質である）
推定ＰＳＣＡアミノ酸配列は、ＰＳＣＡが高度にグリコシル化され、そしてＧＰＩ機構により細胞表面上に係留されているということを予測する。これらの予測を試験するために、本発明者らは、固有のＰＳＣＡペプチドに対して惹起された、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体を産生した（材料および方法を参照のこと）。このペプチドは、グリコシル化部位を含まず、ＣＤ５９（別のＧＰＩアンカー型ＰＳＣＡホモログ）の三次元構造との比較に基づいて、成熟タンパク質の露出された部分にあると推測された（Ｋｉｅｆｅｒら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：４４７１−４４８２）。アフィニティー精製された抗体によるＰＳＣＡの認識を、ＰＳＣＡおよびＧＳＴ−ＰＳＣＡ融合タンパク質でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の抽出物のイムノブロット分析および免疫沈降分析により、実証した。このポリクローナル抗体は、ＰＳＣＡトランスフェクト細胞からの２４ｋｄのバンドを優性に免疫沈降したが、偽トランスフェクト細胞からは免疫沈降しなかった（図１２Ａ）。３つの小さなバンドも存在し、最小のものは、約１０ｋｄであった。この免疫沈降物を、これらのバンドがＰＳＣＡのグリコシル化形態を表すか否かを決定するために、ＮおよびＯ特異的グリコシダーゼで処理した。Ｎ−グリコシダーゼＦはＰＳＣＡを脱グリコシル化したが、Ｏ−グリコシダーゼは、全く効果が無かった（図１２Ａ）。いくつかのＧＰＩアンカー型タンパク質は、膜結合形態および分泌形態の両方を有することが公知である（ＦｒｉｔｚおよびＬｏｗｅ、１９９６、Ａｍ．Ｊ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７０：Ｇ１７６−Ｇ１８３）。図１２Ｂは、いくつかのＰＳＣＡが、２９３Ｔ過剰発現系において分泌されるということを示す。ＰＳＣＡの分泌形態は、細胞表面結合形態よりも低い分子量で移動し、これはおそらく共有結合性ＧＰＩ結合の非存在を反映する。この結果は、高レベルの２９３Ｔ細胞株における発現を反映し得、前立腺癌細胞株およびインビボにおいて確認される必要がある。
【０２４２】
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を、ＰＳＣＡ発現を、細胞表面に局在化するために使用した。非透過化処理した偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞、ＰＳＣＡ発現２９３Ｔ細胞およびＬＡＰＣ−４細胞を、アフィニティー精製された抗体または二次抗体のみで染色した。図１２Ｃは、ＰＳＣＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞およびＬＡＰＣ−４細胞におけるＰＳＣＡの細胞表面発現（偽トランスフェクト細胞では生じない）を示す。この細胞表面発現が、共有結合性ＧＰＩ結合によって媒介されていることを確認するために、細胞を、ＧＰＩ特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）で処理した。ＰＬＣによる細胞表面からのＰＳＣＡの放出が、蛍光強度における１ｌｏｇ換算（ｏｎｅ  ｌｏｇ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）より大きいことによって示された。消化後の馴化培地におけるＰＳＣＡの回収をまた、イムノブロット法により確認した。ＧＰＩアンカー型タンパク質に対するホスホリパーゼＣ消化の特異性を、ＧＰＩ結合抗原ＣＤ５９またはＧＰＩ非結合膜貫通タンパク質Ｅ２５ａでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に同じ実験を行うことで確認した（Ｄｅｌｅｅｒｎｉｊｄｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９４７５−１９４８２）。ＰＬＣ消化は、ＣＤ５９の細胞表面発現をＰＳＣＡと同じ程度まで減少させるが、Ｅ２５には影響しなかった。これらの結果は、ＰＳＣＡが、グリコシル化された、ＧＰＩアンカー型細胞表面タンパク質であるという予測を支持する。
【０２４３】
（実施例３：ｃＤＮＡをコードするマウスＰＳＣＡホモログの単離）
ヒトＰＳＣＡ  ｃＤＮＡを、潜在的トランスジェニック実験およびノックアウト実験のためのホモログを同定するために、マウスＥＳＴデータベースを検索するために使用した。マウス胎児から得られた一つのＥＳＴおよび新生児腎臓から得られたもう一つのＥＳＴは、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルの両方で、ヒトｃＤＮＡと７０％同一であった。マウスクローンとヒトＰＳＣＡとの間の相同性は、ヒトＰＳＣＡとそのＧＰＩアンカー型ホモログとの間の相違の領域を含み、このことは、これらのクローンがＰＳＣＡのマウスホモログをおそらく表すということを示す。これらのＥＳＴの整列化およびＲＡＣＥ−ＰＣＲを使用する５’伸長は、そのコード配列全体を提供した（図２）。
【０２４４】
（実施例４：ヒトおよびマウスＰＳＣＡ遺伝子の単離）
この実験は、ＰＳＣＡが、第８染色体、バンドｑ２４．２に位置することを示す。
【０２４５】
（材料および方法）
（ゲノムクローニング）ヒトＰＳＣＡ遺伝子を含むλファージクローンを、ヒトＰＳＣＡ  ｃＤＮＡプローブを用いてヒトゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングすることにより得た（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ））。マウスＰＳＣＡ遺伝子を含むＢＡＣ（細菌性人工染色体）クローンを、マウスＰＳＣＡ  ｃＤＮＡプローブを用いてマウスＢＡＣライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をスクリーニングすることにより得た。１４ｋｂのヒトＮｏｔＩフラグメントおよび１０ｋｂマウスＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングし、配列決定し、そして制限酵素地図を作成した。
【０２４６】
（蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによる染色体マッピング）  蛍光インサイチュ染色体分析（ＦＩＳＨ）を、以前記載されたように、オーバーラップヒトλファージクローンを使用して行った（Ｒｏｗｌｅｙら、１９９０、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：９３５８−９３６２、Ｈ．Ｓｈｉｚｕｙａ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９：８７９４）。
【０２４７】
（結果）
（ＰＳＣＡ遺伝子の構造）  それぞれ約１４ｋｂおよび１０ｋｂのヒトおよびマウスゲノムクローンを得て、制限酵素地図を作成した。ヒトおよびマウスのＰＳＣＡおよびＬｙ−６／Ｔｈｙ−１の遺伝子構造の概略図を、図８に示す。ヒトゲノムクローンおよびマウスゲノムクローンの両方は、ＰＳＣＡ遺伝子の翻訳領域および３’非翻訳領域をコードする３つのエキソンを含む。Ｌｙ−６およびＴｈｙ−１遺伝子ファミリーの他のメンバーに対するＰＳＣＡの相同性に基づいて、５’非翻訳領域をコードする第４のエキソンの存在が推測される（図８）。
【０２４８】
（染色体８ｑ２４．２に対するヒトＰＳＣＡ遺伝子地図）  ＬＡＰＣ−４ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析は、ＰＳＣＡが、単一コピーの遺伝子によりコードされるということを明らかにした。他のＬｙ−６遺伝子ファミリーのメンバーは４つのエキソンを含み、この４つのエキソンは、５’非翻訳領域をコードする第一のエキソン、ならびに翻訳領域および３’非翻訳領域をコードするさらに３つのエキソンを含む。その推定の５’第一エキソン以外の全てを含むヒトおよびマウスＰＳＣＡのゲノムクローンを、λファージライブラリーのスクリーニングにより得た。マウスおよびヒトＰＳＣＡクローンは、類似のゲノム構成を有していた。このヒトクローンを、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション分析によりＰＳＣＡを局在化するために使用した。オーバーラップヒトＰＳＣＡλファージクローンの同時ハイブリダイゼーションは、第８染色体のみの特異的標識を生じた（図１３）。検出されたシグナルの９７％は、染色体８ｑ２４に局在化し、そのうちの８７％は、染色体８ｑ２４．２に特異的であった。これらの結果は、ＰＳＣＡが第８染色体のバンドｑ２４．２に位置していることを示す。
【０２４９】
（実施例５：ＰＳＣＡの異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体の生成）
（材料および方法）
（モノクローナル抗体の生成および産生）  ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＳＣＡアミノ酸２２〜９９（図１Ｂ）を含む、精製されたＰＳＣＡ−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を用いて３回免疫化した。簡単にいうと、ヒトＰＳＣＡアミノ酸配列のアミノ酸１８〜９８に対応するＰＳＣＡコード配列を、以下のプライマー対
【０２５０】
【化１】
2010265323.tif 000002
を使用して、ＰＣＲ増幅した。
【０２５１】
増幅されたＰＳＣＡ配列を、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用しそして融合タンパク質を単離した。
【０２５２】
脾臓細胞を、標準ハイブリドーマ技術を使用して、ＨＬ−１骨髄腫細胞と融合した。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析によりＰＳＣＡについて陽性であったハイブリドーマ（結果を参照のこと）を、サブクローニングした。腹水をＣ．Ｂ．１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスにおいて産生し、そしてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をプロテインＧアフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して精製した。ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８をまた、Ｃｅｌｌ−Ｐｈａｒｍ  Ｓｙｓｔｅｍ  １００で、製造業者（Ｕｎｉｓｙｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）により推奨されるように、生産した。
【０２５３】
（ハイブリドーマスクリーニングのためのＥＬＩＳＡ）  ＧＳＴまたはＰＳＣＡ−ＧＳＴを、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ無水マレイン酸活性化ポリスチレンプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に固定化した。５０ｕｌのハイブリドーマ培地をそれぞれのウェルに添加し、そして、１時間、室温でインキュベートした。ウェルを、０．１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２００ｕｌのＰＢＳで３回洗浄し、そして、アルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で標識した１００ｕｌの抗マウスＩｇＧ（１：４０００）と共に１時間インキュベートした。プレートをアルカリホスファターゼ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて発色させた。
【０２５４】
（細胞培養）  ＬＮＣａＰをＡＴＣＣより入手し、ＰＳＣＡを含むｐＣＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクター、または単独のベクターで安定にトランスフェクトした（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒら、１９９８）。一過性にＰＳＣＡまたはベクターのみでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、以前に記載されたように（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒら、１９９８）調製した。１％プロナーゼ中で室温で１８分間消化した後、ＬＡＰＣ−９異種移植片の外殖片を、ＰｒＥＧＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中で増殖した。ＦＡＣＳ分析の前に、ＬＡＰＣ−９細胞を４０ｕｍのセルストレーナーに通し、単一の細胞懸濁物を得た。
【０２５５】
（免疫蛍光）  細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでコートしたカバーガラス上で増殖させた。免疫蛍光アッセイを、透過化処理した、および透過化処理していない固定細胞について行った。固定のため、細胞を、２％のパラホルムアルデヒドのＰＢＳ−ＣＭ（ＰＢＳ、１００ｕＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）溶液で３０分間、暗所で処理し、５０ｕＭのＮＨ4ＣｌのＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ（ＰＢＳ、１００ｕＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２％  ＢＳＡ）溶液で１０分間クエンチし、そしてＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡで２回洗浄した。透過化処理のため、細胞をさらにＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ−Ｓａｐｏｎｉｎ（０．０７５％のサポニン（Ｓｉｇｍａ）のＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ溶液）で１５分間、室温で処理した。一次ｍＡｂをＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ（透過化処理の場合には、サポニンを追加）中、２〜５ｍｇ／ｍｌで６０分間添加し、そしてＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡで２回洗浄した。ＦＩＴＣと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ＋／−サポニンに１：５００で希釈；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を３０分間添加し、そしてＰＢＳ−ＣＭで３回洗浄した。スライドをベクターシールド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）に載せた。
【０２５６】
（フローサイトメトリー）  細胞（１×１０6）を、２％のウシ胎児血清またはハイブリドーマ馴化培地を含むＰＢＳ中、２ｕｇ／ｍｌで、１００ｕｌのｍＡｂと共に３０分間、４℃で、インキュベートした。洗浄後、細胞をＦＩＴＣと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）の１：５００希釈液で染色した。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でデータを得、そしてＬＹＳＩＳ  ＩＩソフトウエアを用いることにより分析した。
【０２５７】
（イムノブロット法および免疫沈降）免疫沈降を、記載のように（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、１９８８）行った。簡単には、細胞を５００ｕＣｉのトランス３５標識（ＩＣＮ）で６時間、標識した。細胞溶解産物を、３ｕｇのｍＡｂおよび２０ｕｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に、２時間インキュベートした。イムノブロット法のため、細胞を１×  ＳＤＳ  Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中に溶解し、そして５分間、煮沸することによりタンパク質抽出物を調製した。タンパク質を１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミド上で分離し、そしてニトロセルロース膜に転写し、洗浄し、そして１０ｍｌのブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ中５％無脂肪乳）中の２ｕｇ  ｍＡｂと共にインキュベートした。ブロットをＡｍｅｒｓｈａｍ増強化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて発光させた。
【０２５８】
（免疫組織化学）  正常な、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織サンプルを、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｔ  Ｂｅｔｈ−Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ−Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌおよびＵＣＬＡから入手した。初期の根治的前立腺切除術の標本を、以前に記載されたデータベースから選択した（Ｍａｇｉ−Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｃら、１９９７）。骨転位およびそれに一致する初期の生検標本を、ＵＣＬＡ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙから入手した。再現性を保証するため、２つの研究所で独立に、正常組織を染色し、そしてスコア付けした。ＵＣＬＡから入手した標本を、以前に記載された免疫ペルオキシダーゼ技術（Ｓａｉｄ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９８）の改変法で染色した。抗原の検索を、業務用蒸し器および０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、パラフィン切片で行った。ＰＳＣＡ  ｍＡｂｓとの５０分間のインキュベーションの後（以下を参照のこと）、スライドガラスを、ウサギ抗マウスＩｇＧ、ブタ抗ウサギＩｇＧおよびウサギ抗ブタＩｇＧ（全てビオチン結合している）で続けて処理した。次いで、スライドガラスをストレプトアビジン−ペルオキシダーゼと共にインキュベートし、そしてジアミノベンジジン反応を用いて抗体局在化を行った。Ｂｅｔｈ−Ｉｓｒａｅｌ−Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ−Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌから入手した標本を、以前に記載した自動化Ｖｅｎｔａｎａ  ＮｅｘＥＳ機器（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を用いて染色した（Ｍａｇｉ−Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｃら、１９９７）。７５０Ｗでのマイクロ波により、１５分間、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０５）において、抗原の検索を行った。ＳＣＩＤ腹水から約１ｕｇ／ｕｌの濃度で精製したｍＡｂｓを、以下の濃度で用いた：１Ｇ８＝１：２０；３Ｅ６＝１：３０；２Ｈ９＝１：５０；４Ａ１０＝１：１００；３Ｃ５＝１：１００。ｍＡｂ１Ｇ８をＣｅｌｌＰｈａｒｍ  Ｓｙｓｔｅｍ  １００中に産生し、１：１０の濃度で使用した。陽性コントロールはＬＡＰＣ−９およびＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡを含み、そして陰性コントロールはＬＮＣａＰ、およびアイソタイプが一致した無関係な抗体であった。最初の生検標本は、骨転位を有する３人の患者について入手可能であった。脱石灰の状態に近づけるため、ＰＳＣＡ  ｍＡｂｓで染色する前に、これらの標本からのスライドガラスを２０分間、Ｄｅｃａｌ−Ｓｔａｔ（Ｌｅｎｇｅｒｓ、ＮＹ）中で処理した。
【０２５９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を、ＰＳＣＡのアミノ末端およびカルボキシル末端のシグナル配列の両方を欠くＰＳＣＡ−ＧＳＴ融合タンパク質に対して惹起した。ＰＳＣＡ−ＧＳＴ融合タンパク質およびＧＳＴのみを用いるＥＬＩＳＡによって、陽性の融合物を選別した。スクリーニングされた４００のハイブリドーマの内、２８はＰＳＣＡ−ＧＳＴ融合物を認識したが、ＧＳＴのみは認識しなかった。これらの融合物を、ＰＳＣＡでトランスフェクトした透過化処理していない２９３Ｔ細胞および偽トランスフェクトした２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリーにより二次スクリーニングした。ＦＡＣＳによる二次スクリーニングは、細胞表面上のＰＳＣＡを認識可能なクローンが、後にインビボ標的化適用に有用であることを仮定して、それらを選別するために行った。７つの陽性融合物をこのように同定し（ｍＡｂ  ２Ａ２、３Ｇ３、４Ａ１０、１Ｇ８、３Ｅ６、３Ｃ５および２Ｈ９）、そのうちの５つ（ｍＡｂ  ４Ａ１０、１Ｇ８、３Ｅ６、３Ｃ５および２Ｈ９）をサブクローン化し、そして精製した。
【０２６０】
ｍＡｂを、ＰＳＣＡを免疫沈降する能力、および／またはイムノブロット上のＰＳＣＡを認識する能力について試験した。全てのｍＡｂは、２９３Ｔ−ＰＳＣＡ細胞に由来する、ならびに、高レベルの内因性ＰＳＣＡを発現するＬＡＰＣ−９前立腺癌異種移植片腫瘍に由来する、ＰＳＣＡを免疫沈降し得た（図３７）。同様に、全てのｍＡｂは、イムノブロットによりＰＳＣＡを検出した。しかし、ｍＡｂｓ  ２Ｈ９および３Ｅ６は、約１２ｋｄの脱グリコシド化形態のＰＳＣＡしか認識しなかった（図３４）。
【０２６１】
５つのｍＡｂにより認識されるエピトープのＰＳＣＡ上の位置を、３つの短縮型ＰＳＣＡ−ＧＳＴ融合タンパク質を用いるイムノブロット分析により決定した。ｍＡｂ  ４Ａ１０、２Ｈ９および３Ｃ５は、ＰＳＣＡのアミノ末端部分に存在するエピトープ（すなわち、アミノ酸２１〜５０）を認識し；ｍＡｂ  １Ｇ８はＰＳＣＡの中間部分に存在するエピトープ（すなわち、アミノ酸４６〜８５）を認識し；そして、ｍＡｂ  ３Ｅ６はＰＳＣＡのカルボキシル末端（アミノ酸８５〜９９）において反応する（図１５）。５つ全てのｍＡｂは、図１５に記載するようにＩｇＧである。これらの結果は、５つのｍＡｂが、複合アッセイにおいてＰＳＣＡを検出することができ、そして少なくとも３つの異なるＰＳＣＡ上のエピトープを認識し得ることを示す。
【０２６２】
（ＰＳＣＡ  ｍＡｂは前立腺癌細胞の細胞表面上を染色する）
ＰＳＣＡ生物学を研究するための、およびインビボ標的化適用のような潜在的臨床適用のためのｍＡｂの有用性は、原形質膜上で目的の抗原を認識するそれらの能力に依存する（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９７；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｐ．ら、１９９８；Ｗｕ，Ｙ．ら、１９９５；Ｔｏｋｕｄａ，Ｙ．ら、１９９６）。ｍＡｂ  ２Ｈ９、３Ｅ６、１Ｇ８、４Ａ１０およびＣ５が、特に前立腺癌細胞の細胞表面上のＰＳＣＡを認識する能力を決定するため、ＰＳＣＡでトランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ）およびＬＡＰＣ−９細胞をフローサイトメトリーおよび間接的免疫蛍光により調べた。２９３Ｔ−ＰＳＣＡ細胞についてと同様、５つ全てのｍＡｂｓは、透過化処理していないＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡおよび／またはＬＡＰＣ−９細胞の細胞表面上のＰＳＣＡを、フローサイトメトリーにより検出し得た（図３３）。偽トランスフェクト（ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）したＬＮＣａＰ、およびネオマイシン単独を含むベクター（ＬＮＣａＰ−ｎｅｏ）でトランスフェクトしたＬＮＣａＰ（いずれも検出可能なＰＳＣＡ  ｍＲＮＡを発現しない）は、共に陰性であった。
【０２６３】
免疫蛍光分析を、ＰＳＣＡタンパク質が細胞表面に局在するか否かを確認するために、透過化処理した細胞および透過化処理していない細胞の両方で行った（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９７）。透過化処理していないＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡは、ｍＡｂ  １Ｇ８、３Ｅ６、４Ａ１０および３Ｃ５に対して明らかな細胞表面反応性を示したが、ｍＡｂ  ２Ｈ９に対しては染色されなかった（ｍＡｂ  ２Ｈ９はまた、ＦＡＣＳによりＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ細胞上のＰＳＣＡを検出しなかった）。ＬＡＰＣ−９細胞は、５つ全てのｍＡｂに対して細胞表面反応性を示した（図３５）。ＬＮＣａＰ−ｎｅｏは、予想されたように、透過化処理の有無に関わらず陰性であった。ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡおよびＬＡＰＣ−９の透過化処理は、膜染色および細胞質染色の両方を生じた。全てのｍＡｂは、細胞表面上に斑点の染色パターンを生じたが、それはｍＡｂ  ３Ｅ６、３Ｃ５および４Ａ１０に関して最も顕著であった（図３５）。このパターンは、ＰＳＣＡの細胞表面の領域への凝集またはクラスター化を反映し得る。これらの結果は、５つ全てのｍＡｂがインタクトな前立腺癌細胞の細胞表面上ＰＳＣＡと反応することを示す。
【０２６４】
（正常前立腺中のＰＳＣＡの免疫組織化学的染色）
ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡは、正常前立腺中の基底細胞のサブセットに位置し、このことはＰＳＣＡが前立腺の幹細胞／前駆細胞に対する細胞表面マーカーであり得ることを示唆する（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒ．ら、１９９８）。ＰＳＣＡタンパク質が基底細胞のマーカーであり得る可能性を試験するため、正常前立腺のパラフィン包埋切片において、ＰＳＣＡ発現を免疫組織化学的に調べた。ｍＡｂ  １Ｇ８および２Ｈ９は基底細胞および分泌細胞の両方の細胞質を染色し、一方でｍＡｂ  ３Ｅ６は基底細胞と主に反応した（図３８）。基底細胞サイトケラチンを発現する萎縮性腺は、全ての３つのｍＡｂで強く染色された（図３８）（Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｆ．Ｐ．ら、１９９０）。ｍＡｂ  ３Ｃ５および４Ａ１０は、パラフィン切片において強いバックグラウンド染色および／または非特異的な核染色を生じ、さらには使用されなかった。これらの結果は、ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡが基底細胞において特異的に検出されるが、ＰＳＣＡタンパク質は前立腺の上皮細胞層の両方（すなわち、基底および分泌）において検出され得ることを示唆する。しかし、それぞれの抗体の染色パターンにいくらかの違いはある。
【０２６５】
（正常組織の免疫組織化学的分析）
本発明者らの初期の研究は、男性におけるＰＳＣＡ発現が、腎臓および小腸において検出可能なＲＮＡが低レベルであり、主に前立腺特異的であることを示した。ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡを、胎盤においてもまた検出した。ＰＳＣＡタンパク質発現の前立腺特異性を、ｍＡｂ  １Ｇ８を用いて、２０の組織の免疫組織化学染色により試験した（表１を参照のこと）。ｍＡｂ  １Ｇ８での陽性の組織染色は、異なるエピトープに対するｍＡｂとの再現性を保証するため、ｍＡｂ  ２Ｈ９および／または３Ｅ６で確認された。染色はまた、結果を確認するため、２つの研究所で独立に行い、そしてスコア付けした。ＲＮＡ分析から予想されたように、胎盤は試験した全てのｍＡｂについて陽性であり、細胞質染色が栄養膜で検出された（図３９Ａ）。腎臓において、染色は集合尿細管および遠位曲尿細管において検出されたが、糸球体においては検出されなかった（図３９Ａ）。膀胱および尿管の移行上皮（以前は、ｍＲＮＡレベルで調べていなかった）は、試験した全てのｍＡｂについて陽性であった（図３９Ａ）。有意な免疫反応性を有する他の唯一の組織は結腸であり、陰窩の奥深くで単一の細胞が強く陽性に染色された（図３９Ａ）。クロモグラニンを用いた二重染色は、これらの細胞が神経内分泌由来であることを示した。
【０２６６】
膀胱におけるｍＡｂの反応性がＰＳＣＡを表すことを確認するため、根治的膀胱切除で得られた３つの正常な膀胱サンプルに対してノーザンブロット分析を行い、前立腺、腎臓およびＬＡＰＣ−９異種移植片におけるＰＳＣＡ発現と比較した（図３９Ｂ）。ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡは、膀胱において、前立腺において見られたより低いレベルで検出され、免疫組織化学的結果を確証した。３つの腎臓標本において、シグナルは検出されず、腎臓におけるＰＳＣＡ発現は前立腺よりも有意に低いという本発明者らの以前の結果と首尾一貫していた（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒ．ら、１９９８）。骨転位から樹立された前立腺癌異種移植片ＬＡＰＣ−９は、正常な膀胱および前立腺と比較して非常に高いレベルのＰＳＣＡ  ｍＲＮＡを発現する（Ｗｈａｎｇ，Ｙ．Ｅ．ら、１９９８）。これらの結果は、男性におけるＰＳＣＡ発現が主に前立腺優性であることを確証するが；尿路上皮、腎臓の集合尿導管および結腸の神経内分泌細胞における検出可能なＰＳＣＡタンパク質発現もまた存在する。
【０２６７】
（ＰＳＣＡタンパク質は、局在化した前立腺癌の大部分で発現される）
本発明者らの以前の研究において、ｍＲＮＡは約８０％の腫瘍において発現し、そして悪性腺よりも正常腺においてより高度に発現するようである（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒ．ら、１９９８）。ＰＳＣＡタンパク質が前立腺癌において検出され得るか否か、およびＰＳＣＡタンパク質レベルが良性腺と比較して悪性腺において増加するか否かを決定するため、初期転位性前立腺癌のパラフィン包埋の病理標本をｍＡｂ  １Ｇ８で免疫染色した（図２１および２８）。単離された場合もまた、染色の特異性を確認するために、ｍＡｂ  ３Ｅ６または２Ｈ９で染色した。１５の初期癌の内、１２は陽性に染色された（図２１）（高い段階の前立腺の上皮内新形成の病巣を含む２つの症例のうち２つを含む）。染色強度は異なり、７つの症例は癌および隣接する正常な腺において同等な染色を示し、そして５つは癌において有意に強い染色を示した。いくつかの場合においては、悪性腺において強い発現が存在し、そして隣接した正常組織において検出可能な発現は存在しなかった（図２１；患者１）。また、染色が不均一であり、いくつかの悪性腺について、他と比べてより強く染色されるいくつかの症例も存在した（図２１；患者２）。全体的に、あまり分化していない腫瘍は、十分に分化した腫瘍より強く染色され、このことはＰＳＣＡ過剰発現が腫瘍段階の増進と相関し得ることを示唆した（図２１；患者３）。これらの結果はＰＳＣＡタンパク質が前立腺癌において発現することを示す。本発明者らのインサイチュ研究における以前のｍＲＮＡと一致して、ＰＳＣＡは、おそらく増進する腫瘍の段階と一致して、有意な割合の癌において過剰に発現すると思われる。
【０２６８】
本研究は、ＰＳＣＡに対する５つのモノクローナル抗体を用いたＰＳＣＡタンパク質発現の最初の特徴付けを記載する。これらのｍＡｂは細胞表面の外側のエピトープを認識するので、これらは前立腺癌診断および治療のための有用性を有し得る（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９７）。１つの可能性は、ＰＳＭＡに対する抗体を使用するＰｒｏｓｔａｓｃｉｎｔスキャンと同様に、これらのｍＡｂが転位性疾患の部位を位置決めするために用いられ得ることである（Ｓｏｄｅｅ，Ｄ．Ｂ．ら、１９９６）。別の可能性は、それらが、単独でか、または放射性同位体もしくは他の毒素と結合されるかのいずれかで、前立腺癌細胞を治療的に標的化するために用いられ得ることである。同様のアプローチは、現在、ＰＳＭＡ上の細胞外エピトープに対する抗体を用いて評価されている（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．ら、１９９８；Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９７；Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９８）。
【０２６９】
ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、細胞表面を斑点状に染色し、ＰＳＣＡが細胞表面の特定の領域に局所化し得ることを示唆する。ＧＰＩ−アンカー型タンパク質は、細胞表面の界面活性剤の不溶性の糖脂質富化ミクロドメイン（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎ）（ＤＩＧＳ）においてクラスター化することが公知である（Ｖａｒｍａ，ＲおよびＭａｙｏｒ，Ｓ．，１９９８）。カベオラおよびスフィンゴ脂質−コレステロールラフト（ｒａｆｔ）を含むこれらのミクロドメインは、シグナル伝達および分子輸送において重要な役割を果たすと考えられている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｃａｖｅｏｌａｅ，１９９３；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｏｎ，Ｔ．およびＫｕｒｚｃｈａｌｉａ，Ｔ．Ｖ．，１９９８；Ｈｏｅｓｓｌｉ，Ｄ．Ｃ．およびＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，１９９８）。Ｔｈｙ−１（ＰＳＣＡの相同体）は以前、脂質−ミクロドメインにおける相互作用を介してｓｒｃキナーゼにシグナルを送ることが示された（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｍ．およびＳａｍｕｅｌｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．，１９９２；Ｓｔｅｆａｎｏｖａ，Ｉ．ら、１９９１）。本発明者らの実験室における予備的な亜細胞分画実験は、ＤＩＧＳ中のＰＳＣＡの存在を確認する（Ｘａｖｉｅｒ，Ｒ．ら、１９９８）。
【０２７０】
ＧＰＩ−アンカー型タンパク質はまた、プロスタソーム（ｐｒｏｓｔａｓｏｍｅ）（前立腺上皮細胞より放出された、膜結合保存小胞）に局在化すると報告された（Ｒｏｎｑｕｉｓｔ，Ｇ．およびＢｒｏｄｙ，Ｉ．、１９８５）。ＣＤ５９（補体媒介性細胞溶解のＧＰＩアンカー型インヒビター）は、正常な前立腺上皮細胞のプロスタソームおよび前立腺分泌物中に高濃度で見出される（Ｒｏｏｎｅｙ，Ｉ．ら、１９９３）。ＰＳＣＡタンパク質は、前立腺分泌細胞中に検出される。
【０２７１】
ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡが独占的に基底細胞に局在化するという本発明者らの以前の発見に反して、本結果は、ＰＳＣＡタンパク質が基底細胞および分泌細胞の両方に存在し得ることを示唆する。前立腺におけるｍＲＮＡとタンパク質局在性との間の同様の違いは、ＰＳＭＡおよびアンドロゲンレセプターについて記載されている（Ｍａｇｉ−Ｇａｌｕｚｚｉ，Ｃ．ら、１９９７；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｍ．およびＮａｋａｙａｍａ，Ｊ．，１９９７）。分泌細胞中のＰＳＣＡタンパク質の存在についての１つの可能な説明は、ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡが基底前駆細胞において転写されるが、そのＰＳＣＡタンパク質発現は、基底細胞が分泌細胞へ分化する際に存続するということである。別の可能性は、ＰＳＣＡタンパク質が基底細胞から分泌細胞へ翻訳後に移され得ることである。
【０２７２】
ｍＡｂ  ３Ｅ６、１Ｇ８および２Ｈ９による基底細胞および分泌細胞の染色強度における違いは、基底および分泌細胞において抗体および／またはＰＳＣＡの翻訳後修飾における違いにより認識される異なるエピトープを反映し得る。この可能性を支持するのは、５つのｍＡｂが、全てのアッセイまたは細胞株においてＰＳＣＡと同等には反応しない、という知見である。ｍＡｂ  ２Ｈ９は、ＬＡＰＣ−９の細胞表面上のＰＳＣＡを認識するが、ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡは認識しない。このことは、この抗体により認識されるエピトープが、後者の細胞型において改変され得るか、または覆い隠され得ることを示唆する。本発明者らはまた、ｍＡｂ  ３Ｅ６が、いくつかの場合、ｍＡｂ  １Ｇ８および２Ｈ９と同じように強く癌を染色しないことを観測した。このことは、ｍＡｂ  ３Ｅ６がＰＳＣＡの特定の型と優先的に反応し得ることを示唆する。
【０２７３】
男性においては大部分は前立腺特異的であるが、ＰＳＣＡはまた、尿路上皮、直腸の神経内分泌細胞、ならびに腎尿細管および集合管において低レベルで発現される。腎尿細管および集合管において見られる染色は、これらの構造が発生学的に中腎管の尿管芽に由来することにおいて興味深く、腎臓において見られる染色パターンに対する考えられ得る理由を示唆する。検出可能なＰＳＣＡ  ｍＲＮＡの腎臓検体における非存在は、低レベルの発現、または集合管が腎髄質中に位置するが故に、このサンプルが腎皮質から主に得られたという可能性のいずれかを反映し得る。
【０２７４】
前立腺特異的な細胞表面遺伝子を同定するための主な起動力は、選択的な、無毒性の治療を開発することが望まれる。ＰＳＭＡ（別の「前立腺制限」タンパク質）はまた、十二指腸、結腸の神経内分泌細胞、および近位尿細管において発現されることが示されている（Ｓｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ａ．ら、１９９７）。ＰＳＭＡワクチン治療の先の報告は、有意な毒性を生じていない（Ｔｊｏａ，Ｂ．Ａ．ら、１９９８）。
【０２７５】
尿路上皮および腎臓におけるＰＳＣＡの発現は、正常な前立腺における発現より低く、そして評価された多くの前立腺癌において見られる発現よりも顕著に低いようである。ＰＳＣＡに対して指示される治療は、それ故、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現する乳癌を主に標的にするＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗体と同程度に、癌に対して相対的に選択的であり得る（Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．およびＣｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．Ａ．，１９９７）。
【０２７６】
尿路上皮および腎臓におけるＰＳＣＡの発現は、それが移行細胞癌および腎臓細胞癌において発現され得る可能性をもたらす。検査された２つの膀胱癌はＰＳＣＡを発現し、１つはＬＡＰＣ−９と同様のレベルであり、これはＰＳＣＡが移行細胞癌のいくつかの場合において過剰発現され得ることを示唆する。膀胱癌検体のより完全な調査が、この可能性を試験するために必要とされる。
【０２７７】
本明細書中のデータは、ＰＳＣＡが前立腺癌の大多数において発現されるという本発明者らの初期の知見を支持する。同様に、ＰＳＣＡタンパク質は、隣接する正常な腺と比較した場合に、いくつかの前立腺腫瘍において過剰発現され、前立腺癌治療のための標的としてのその使用を支持している。ｍＲＮＡのインサイチュ研究と対照的に、現在の結果はＰＳＣＡタンパク質発現が、癌の段階および／または癌の程度と相関し得ることを示唆する。ＲＮＡとタンパク質発現との間の同様の差異は、チモシンＢｅｔａ−１５について記載されている（Ｂａｏ，Ｌ．ら、１９９６）。
【０２７８】
（表１．正常組織におけるＰＳＣＡ発現）
（染色）      （組織）
陽性        前立腺（上皮）
膀胱（移行上皮）
胎盤（栄養膜）
結腸（神経内分泌細胞）
腎臓（尿細管および集合管）*
陰性        腎臓（糸球体）
前立腺（間質）
膀胱（平滑筋）
精巣
子宮内膜
小腸
肝臓
膵臓
乳房
胆嚢
骨格筋
脳
末梢神経
骨髄
胸腺
脾臓
肺
気管支
心臓
*ｍＡｂ  ３Ｅ６は遠位曲尿細管と反応し、一方ｍＡｂ  １Ｇ８は遠位尿細管と反応し、そしていくつかの場合には、近位尿細管と反応する。
**引続く実験分析はまた、正常な胃組織におけるＰＳＣＡ発現を示す。
【０２７９】
（実施例６）
（前立腺癌の骨転移におけるＰＳＣＡ発現）
本実験は、ＰＳＣＡ発現が前立腺癌の骨転移において増幅されることを示す。
【０２８０】
（材料および方法）
ウマ血清（ＮＨＳ）（ＧＩＢＣＯ  ＃２６０５０−０７０）を１％カゼイン、ＰＢＳＴ中に希釈した（１／２０希釈）。ＰＳＣＡを認識する本発明の抗体を、１／１００ＮＨＳ、ＰＢＳＴ中に希釈した。
【０２８１】
検出システムは、ＨＲＰ−ウサギ抗マウスＩｇ（ＤＡＫＯ  Ｐ２６０）、ＨＲＰ−ブタ抗ウサギＩｇ（ＤＡＫＯ  Ｐ２１７）、ＨＲＰ−ウサギ抗ブタＩｇ（ＤＡＫＯ  Ｐ１６４）を含んだ。それぞれを、１／１００ＮＨＳ、ＰＢＳＴ中１／１００に希釈した。
【０２８２】
３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）（Ｆｌｕｋａ）ストックを、１３５ｍｌの０．０５Ｍトリス（ｐＨ７．４）中に５ｇｍ溶解することにより作製した。ＤＡＢを、１ｍｌ／バイアル中に等分し、そして−２０℃で凍結した。ＤＡＢの検量用溶液を、１ｍｌのＤＡＢを４０ｍｌのＤＡＢ緩衝液および４０マイクロリットルの５０％Ｈ2Ｏ2に加えることにより作製した。
【０２８３】
ＤＡＢ緩衝液を、１．３６ｇｍのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｉ−０１２５）と１００ｍｌのＤ2−Ｈ2Ｏを混合し、次いで５Ｎ  ＨＣｌでｐＨを７．５に調整することにより調製した。ｐＨ調整後、２０ｍｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４および８０ｍｌのＤ2−Ｈ2Ｏを加えた。
【０２８４】
抗体に対して陽性であることが既知であり、そしてそのことが先に示された組織／腫瘍の切片を、患者のスライドと共に実行した。このスライドは、その抗体に対する「陽性のコントロール」として役立つ。患者の試験検体の切片を、一次抗体の代わりに陰性のコントロール抗体とインキュベートした。このスライドは、試験のための「陰性のコントロール」として役立つ。
【０２８５】
染色手順は以下のとおりである。骨サンプルをスライドに適用した。次いで、このスライドを、６０℃で一晩ベーキングした。スライドを、５分間ずつ４交換のキシレン中で脱パラフィン化し、そして段階的な一連のエチルアルコール（１００％×４、９５％×２）から水道水までを通過させ、次いでＮＢＦに移し、そして３０分間固定した。固定されたスライドを、流水道水中に１５分間置き、３％Ｈ2Ｏ2−ＭｅＯＨに移し、１０分間インキュベートし、そして流水道水で５分間洗浄し、次いで脱イオン水でリンスした。
【０２８６】
次いで、スライドを０．０１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０に供し、４５℃で２５分間加熱し、１５分間冷却し、次いでＰＢＳで洗浄した。次いで、このスライドをＰＢＳでリンスし、そして以下の４工程のプログラムを用いるプログラムされたＤＡＫＯ自動染色機に配置した。この４工程のプログラムは以下の通りである。スライドをＰＢＳでリンスし、そしてＰＢＳＴ中１％カゼイン中の１／２０  ＮＨＳを用いて１０分間ブロックする。次いで、一次抗体を適用し、そして３０分間インキュベートし、続いて緩衝液でリンスする。次いで、ＨＲＰ−ウサギ抗マウスＩｇを適用し、そして１５分間インキュベートし、続いて別の緩衝液でリンスする。ＨＲＰ−ブタ抗ウサギＩｇを適用し、そして１５分間インキュベートし、続いて緩衝液でリンスする。ＨＲＰ−ウサギ抗ブタＩｇを適用し、そして１５分間インキュベートし、続いて緩衝液でリンスする。
【０２８７】
次いで、ＤＡＢをこのスライドに適用し、そして５分間インキュベートし、続いて緩衝液でリンスする。第二のＤＡＢを適用し、そして５分間インキュベートし、続いて緩衝液でリンスする。
【０２８８】
このスライドを、自動染色機（Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ）から取り出して、そしてスライドホルダー中に置き、水道水でリンスし、そしてＨａｒｒｉｓヘマトキシリンで対比染色する（１５秒）。次いで、このスライドを水道水で洗浄し、酸アルコールに浸漬し、水道水で洗浄し、炭酸水素ナトリウム溶液に浸漬し、そして水道水で洗浄する。次いで、このスライドを、段階的なエチルアルコール（９５％×２、１００％×３）およびＰｒｏｐａｒ×３で脱水し、そしてＰｅｒｍｏｕｎｔでカバーガラスをする。
【０２８９】
（ＰＳＣＡタンパク質は、前立腺癌の骨への転移において強力に発現される）
前立腺癌は、優先的に骨に転移し、そして骨芽細胞の応答を誘導するその傾向において、ヒトの腫瘍の中でも独特である。前立腺癌の骨転移の９個の切片が、免疫組織化学的に検査された（図２８）。全てが、ｍＡｂ  １Ｇ８（および／または３Ｅ６）と強烈にそして均一に反応した。２つの例において、微小転移はヘマトキシリンで容易に検出可能ではなく、そしてｍＡｂ  １Ｇ８を用いる染色後に、エオシン切片が見られ得る（図２８；患者５）。全体的に、骨転移における染色は、原発性腫瘍における染色よりも強力で、そしてより均一であった。３つの場合において、原発性腫瘍由来の生検試料は、比較のために利用可能である。対応する骨転移と比較した場合、全てはＰＳＣＡに対して弱く陽性であり、このことは、ＰＳＣＡ発現が骨で増加することを示唆した。１つの生検試料においては、悪性の腺の小さな病巣のみにおいて弱い染色が現れ、一方で残りの腫瘍は陰性であった（図２１および２８；患者４）。２つの場合においては、生検試料は骨転移の１０年前および１５年前に得られ、原発性病変の発生と転移病変の発生との間の長い潜伏期間を示した。骨における強力な染色が骨切片を調製するために用いられる脱灰プロセスにより引き起こされたという可能性を除外するため、３つの原発性生検試料をまた脱灰緩衝液で処理する。この処理はバックグラウンド染色を増加させたが、それは上皮の反応性を顕著には変化させず、このことは、骨における強力なシグナルは脱灰プロセスにより引き起こされたのではなさそうだということを示す。これらの結果は、ＰＳＣＡが骨への前立腺癌の転移において選択され得るかまたは上方制御され得ることを示唆する。
【０２９０】
図２１〜２３は、前立腺癌の骨転移の骨サンプルがＰＳＣＡに対して陽性であったことを示す。前立腺癌の骨転移の９つの切片が検査された。一貫して、強烈な染色が９つの前立腺癌の骨転移において見られ、そして全てがｍＡｂ  １Ｇ８（および／または３Ｅ６）と強烈にそして均一に反応した。２つの例において、病理学者は、１Ｇ８を用いる染色が病変を強調するまで転移を容易に同定し得ない。全体的に、骨転移における染色は、原発性腫瘍における染色よりも強力にそしてより均一に現れた。
【０２９１】
これらの結果は、ＰＳＣＡが骨への前立腺癌の転移において非常に過剰発現され得ることを示唆する。Ｓｃａ−２（ＰＳＣＡの近いホモログ）が骨髄において破骨細胞活性を抑制することが最近報告されたので、これは特に興味深い。ＰＳＣＡが同様の活性を有する場合、破骨細胞活性の阻害は骨形成における骨の活性のバランスを傾けるので、ＰＳＣＡの活性は、前立腺癌転移が破骨細胞応答を生じる傾向についての、１つの説明を提供し得る。別の可能性は、他のＬｙ−６／Ｔｈｙ−１ファミリーのメンバーが同様のプロセスにおいて関与するので、ＰＳＣＡが骨への接着に関与し得ることである。多数の原発性前立腺癌におけるＰＳＣＡの異種の発現が存在した。これらの結果は、進行した疾患のための新規の標的としてのＰＳＣＡの用途をさらに支持する。
【０２９２】
本研究の最も興味深い結果の１つは、一貫して、強烈な染色が９つの前立腺癌の骨転移において見られたことである。ＬＡＰＣ−９（骨の転移より定着された異種移植片）はまた、ＰＳＣＡについて強烈に染色される。３人の患者において、対応する原発性生検試料は骨の転移と比較して低レベルのＰＳＣＡ発現を示した。検査された３人の患者の原発性腫瘍における強力なＰＳＣＡ発現の領域は、生検のみが分析のために利用可能であるので、避けられ得た。ＰＳＣＡの異質な発現は、少なくとも１つの対応する原発性腫瘍、および対応する転移病変が利用可能ではなかったいくつかの原発性腫瘍において検出された。また、２つの場合において、原発性腫瘍は、骨転移の少なくとも１０年前にサンプリングされ、それは、原発性腫瘍内に高レベルのＰＳＣＡを発現するクローンが、初期の生検に続いて発生し得る可能性を生じた。これらの結果は、明らかに骨転移におけるＰＳＣＡ発現を示し、さらに、進行した疾患についての新規な標的としてそれを支持する。
【０２９３】
（実施例７：膀胱癌および膵臓癌におけるＰＳＣＡ過剰発現）
本実験は、ＰＳＣＡ発現が、膀胱癌において通常の膀胱よりも高いことを示す。
【０２９４】
前立腺、膀胱、腎臓、精巣、および小腸由来の組織（前立腺癌ならびに膀胱癌および腎臓癌を含む）を患者から得た。次いで、これらの組織を、以下の通りにノーザンブロット分析およびウエスタンブロット分析を用いて、ＰＳＣＡへの結合について検査した。
【０２９５】
ノーザンブロット分析については、組織サンプルを切除し、そして０．５×０．５ｃｍより小さい組織サンプルを、液体窒素で急速冷凍した。これらのサンプルを、Ｂｉｏｔｅｃｘにより提供されたプロトコルを用いるｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（ＵｌｔｒａｓｐｅｃTM  ＲＮＡ単離システム、Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ：２７，１９９２）を用いて、７ｍｌのＵｌｔｒａｓｐｅｃ（Ｂｉｏｔｅｃｘ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）中でホモジナイズした。
【０２９６】
定量した後、各サンプル由来の２０μｇの精製ＲＮＡを、１％アガロースホルムアルデヒドゲル上にロードした。運転条件およびブロッティング条件は、実施例１において用いられた条件と同じであった。フィルターを、標識化ＰＳＣＡおよび内部標準（アクチン）で、別々にプローブした。フィルターを洗浄し、そして数時間〜終夜で曝した。
【０２９７】
ウエスタンブロット分析については、組織サンプルを切除し、そして０．５×０．５ｃｍより小さい組織サンプルを取り出して、そして素早くミンスし、そして同容積の熱い２Ｘ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（５％ＳＤＳ、２０％グリセロール）中でボルテックスした。サンプルを１００℃で５分間インキュベートし、３０分間ボルテックスし、そして透明にした。タンパク質濃度を、Ｂｉｏｒａｄ’ｓ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）により決定した。４０μｇ／サンプルを、１２％ポリアクリルアミドタンパク質ゲル上でロードした。ニトロセルロースフィルターへの転写を標準的な方法（Ｔｏｗｂｉｎら、ＰＮＡＳ  ７６：４３５０（１９７９）により行った。ウエスタンブロットを、フィルターをＩＧ８一次抗体、続いてＩＧ８二次抗体（すなわち、ヤギαマウスＩｇＧ  ＨＲＰ）とともにインキュベートすることにより行った。検出は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）によった。
【０２９８】
１Ｇ８は、ウエスタンブロット分析において、ＬＡＰＣ９および膀胱癌（指定された膀胱（Ｒｏｂ））の細胞表面上のＰＳＣＡを認識し、結合した（図６）。図６において、ＬＡＰＣ９を除く全ての組織は正常であった。ノーザンブロット分析によって、膀胱癌組織（指定された膀胱（Ｒｏｂ）（Ｒｏｂ’ｓ  Ｋｉｄ  ＣＡともいう）およびＬＡＰＣ９）における増強したＰＳＣＡを確認した（図２５）。
【０２９９】
ノーザンブロット分析を実施して、以下の膵臓癌細胞株から単離した転写物を試験した：ＰＡＮＣ−１（類上皮、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４６９）、ＢｘＰＣ−３（腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＣ（類上皮腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１１９）、およびＣａｐａｎ−１（腺癌、肝臓転移、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−７９）。ノーザンブロットをＰＳＣＡの全長ｃＤＮＡクローンを用いてプローブして、２つの膵臓癌細胞株（ＨＰＡＣおよびＣａｐａｎ−１）におけるＰＳＣＡ転写物を検出した（図６３）。
【０３００】
ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８を用いたウエスタンブロット分析は、ＨＰＡＣ細胞株において、高レベルのＰＳＣＡタンパク質を検出し、そしてＣａｐａｎ−１およびＡＳＰＣ−１（腺癌、腹水、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６８２）においては、より低レベルを検出した（図６４）。
【０３０１】
（実施例８）
（前立腺癌におけるＰＳＣＡ遺伝子増幅）
本実験は、ＰＳＣＡ遺伝子コピー数がｃ−ｍｙｃのコピー数の増加と同様に増加することを示す（図１７）。ｃ−ｍｙｃ増幅は不幸な結果と相関するので、これは重要である。従って、このデータは、ＰＳＣＡ増幅はまた、不幸な結果に対する前兆となり得ることを示唆する。
【０３０２】
（染色体列挙プローブおよびｃ−Ｍｙｃに対するプローブを用いるＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨの方法は周知である（Ｑｉａｎ，Ｊ．ら、「Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，５５：５４０８−５４１４）。手短には、組織切片（サンプル３４および７５は２人の患者由来であった）を脱パラフィン化し、脱水し、２Ｘ  ＳＳＣ中７５℃で１５分間インキュベートし、３７℃で１５分間ペプシン溶液中（０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ１．５）中４ｍｇ／ｍｌ）で消化し、室温で５分間２Ｘ  ＳＳＣでリンスし、そして空気乾燥した。
【０３０３】
ＰＳＣＡに対しておよび８ｑ２４（ｃ−ｍｙｃ）領域に対して直接的に標識された蛍光ＤＮＡプローブを選択した。ＰＳＣＡ  ｃＤＮＡ（図１）を、製造者のプロトコル（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）に従ったＦＩＳＨ分析において次に用いられる、１３０ｋｂの細菌性人工染色体（ｂａｃ）クローン（ＰＳＣＡプローブ）を同定するために用いた。このように同定され、ＦＩＳＨ分析において用いられたｂａｃクローンは、ＢＡＣＨ−２６５Ｂ１２（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．コントロール番号１７４２４）であった。
【０３０４】
ＳＧ標識ＰＳＣＡプローブと共に、８ｑ２４（ｃ−ｍｙｃ）に対するＳＯ標識プローブを用い、連続的な５μｍ切片上でデュアルプローブハイブリダイゼーションを行った。プローブおよび標的ＤＮＡを、８０℃のオーブンで５分間、同時に変性させ、そしてそれぞれのスライドを３７℃で一晩インキュベートした。
【０３０５】
１．５Ｍ尿素／０．１Ｘ  ＳＳＣ中、４５℃で３０分間、および２Ｘ  ＳＳＣ中、室温で２分間、ハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。核を、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールおよびａｎｉｌｆａｄｅ化合物ｐ−フェニレンジアミンで対比染色した。
【０３０６】
ＦＩＳＨシグナルの数を、トリプルパスフィルター（Ｉ０２−１０４−１０１０；ＶＹＳＩＳ）を装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を用いて数えた。ｃ−ｍｙｃシグナルおよびＰＳＣＡシグナルの数を、各々の核について数え、そしてｃ−ｍｙｃ：ＰＳＣＡ比の全体的な平均値を計算した。結果を図１７に示す。
【０３０７】
この結果は、ＰＳＣＡ遺伝子コピー数が、前立腺癌サンプルにおいて増加したことを示す（図７）。ＰＳＣＡ遺伝子は、８ｑ２４．２に位置する。遺伝子コピー数の増加は、第８染色体の増加、およびＰＳＣＡ遺伝子の増幅の両方による（図１７）。興味深いことには、ＰＳＣＡ遺伝子コピー数の増加は、これもまた８ｑ２４に位置するｃ−ｍｙｃの遺伝子コピー数の増加と類似する（図１７）。先の研究は、第８染色体の増加およびｃ−ｍｙｃの増幅は、前立腺癌の進行の潜在的なマーカーであることを示した（Ｒ  Ｂ  Ｊｅｎｋｉｎｓら  １９９７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：５２４−５３１）。
【０３０８】
（実施例９）
（ルシフェラーゼ発現を駆動するためのｈＰＳＣＡ  ９ｋｂ上流領域を使用したレポーター遺伝子構築物）
実施例４に記載されるように、ヒトＰＳＣＡ遺伝子をコードする１４ｋｂ  ＮｏｔＩゲノムフラグメントを、全長ヒトＰＳＣＡ  ｃＤＮＡプローブでライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトゲノムＤＮＡ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)をコードするλＦ［ＸＩ］ライブラリーから単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）。１４ｋｂ  ヒトＰＳＣＡゲノムフラグメントはレポーター遺伝子の発現を駆動するために使用された９ｋｂのＰＳＣＡ上流配列を含む。
【０３０９】
レポーター遺伝子ベクターは図４２に示され、そして以下のように構築した。１４ｋｂ  ＮｏｔＩフラグメントをλベクターからＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ヘサブクローニングし、ｐＢＳＫＳ−ＰＳＣＡ（１４ｋｂ）構築物を生じた。ＰＳＣＡ上流配列を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの中に含まれるＴ７配列に対応するプライマーおよびＰＳＣＡエクソン１の中に含まれる配列に対応するプライマー（プライマーＨ３ｈＰＳＣＡ３’−５、このプライマーの配列は以下の通りである：Ｈ３ｈＰＳＣＡ３’−５の配列は５’−ｇｇｇａａｇｃｔｔｇｃａｃａｇｃｃｔｔｃａｇｇｇｔｃ−３’である）を使用して、ＰＣＲ増幅によりｐＢＳＫＳ−ＰＳＣＡ（１４ｋｂ）からサブクローニングした。ＰＳＣＡエクソン１に対応するプライマーは、ＰＣＲ増幅後のさらなるサブクローニングを可能にするために導入されたＨｉｎｄＩＩＩ配列を含んだ。生じた増幅されたフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして、ｐＧＬ３−基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中にサブクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子と作動可能に連結された種々の長さのＰＳＣＡ上流配列を含む一連の欠失レポーター遺伝子構築物を生成するのに使用されたｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（７ｋｂ）を生成した（図４２）。ＰＳＣＡ上流領域の欠失された部分をｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（７ｋｂ）から制限フラグメントをサブクローニングすることにより得た。−９ｋｂと−７ｋｂの間のＰＳＣＡ上流領域をｐＢＳＫＳ−ＰＳＣＡ（１４ｋｂ）構築物からサブクローニングし、ＮｏｔＩ部位をＫｌｅｎｏｗによって平滑末端へ変換し、そして、そのフラグメントをｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（９ｋｂ）構築物を得るためにｐＧＬ−ＰＳＣＡ（７ｋｂ）のＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。ＰＳＣＡコード領域の上流配列に対する表示は（例えば−９ｋｂおよび−６ｋｂ（など））ＡＴＧ翻訳開始コドンと関連する。レポーター遺伝子構築物ｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（９ｋｂ）、ｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（６ｋｂ）、ｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（３ｋｂ）およびｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（１ｋｂ）をルシフェラーゼ遺伝子と作動可能に連結した（図４２）。プラスミド、ｐＧＬ３−ＣＭＶは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結されたサイトメガロウイルスプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ，Ｍ．ら、１９８５  Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０）を含み、そして陽性コントロールとして使用した。また、プラスミドｐＧＬ３はプロモーター配列を含まず、そしてこれをネガティブコントロールプラスミドとして使用した。
【０３１０】
（実施例１０）
（ｈＰＳＣＡ上流領域を含むレポーター遺伝子構築物を使用したトランスフェクションアッセイ）
前立腺細胞株および非前立腺細胞株の３通りの皿を、Ｔｆｘ５０（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）により、ＰＳＣＡ構築物ｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（９ｋｂ）または陽性コントロール構築物であるｐＧＬ３−ＣＭＶ（両方とも上記実施例９に記載される）を用いてトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ活性についてアッセイした（図４３）。トランスフェクトされた細胞および細胞株には、ＰｒＥＣ（アンドロゲン非依存性前立腺基底細胞）、ＬＮＣａＰ（アンドロゲン依存性前立腺分泌細胞株）、ＬＡＰＣ４（アンドロゲン依存性前立腺細胞株）、ＨＴ１３７６（膀胱細胞株）および２９３Ｔ（腎臓細胞株）が挙げられる。その構築物の発現活性はＣＭＶプロモーターの活性の割合として表される。標準誤差がバーの上に示される。
【０３１１】
結果は、９ｋｂのヒトＰＳＣＡ上流配列が、図１０に示された天然ｈＰＳＣＡに見られるｍＲＮＡ発現パターンと類似する組織特異的様式においてルシフェラーゼ遺伝子の発現を駆動することを示す（実施例１）。ルシフェラーゼは、アンドロゲン依存性前立腺細胞株およびアンドロゲン非依存性前立腺細胞株ならびに膀胱の両方において容易に検出可能であった。ルシフェラーゼもまた、低レベルではあるが、腎臓細胞で検出可能であった。
【０３１２】
（実施例１１）
（ＰＳＣＡ上流領域内の調節エレメントの同定）
ＰｒＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）またはＬＮＣａＰ細胞の３通りの皿を、上記実施例９に記載されたレポーター遺伝子構築物または陽性コントロール構築物でトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。レポーター遺伝子構築物は、ルシフェラーゼ遺伝子に作動可能に連結された種々の長さのｈＰＳＣＡ上流領域を含む。陽性コントロール構築物であるｐＧＬ３−ＣＭＶは、ルシフェラーゼに作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターを含む。その細胞をＴｆｘ５０トランスフェクション系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼの発現をＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、アッセイし、ルシフェラーゼ発現のレベルを相対的単位（ＲＬＵ）で測定した。
【０３１３】
種々の長さのｈＰＳＣＡ上流領域がルシフェラーゼ発現を駆動する能力は、ＣＭＶプロモーターを含む陽性コントロール構築物の活性の割合として表される。標準誤差を示す。
【０３１４】
図４４に示される結果は、ＰｒＥｃ細胞およびＬＮＣａＰ細胞の両方において３ｋｂのｈＰＳＣＡ上流配列はルシフェラーゼの発現を駆動することを実証するが、ＰｒＥＣ細胞と比較して、ＬＮＣａＰ細胞における検出可能なルシフェラーゼのレベルは６倍高い。この比較は検出可能なルシフェラーゼのレベルに基づいた。対照的に、１ｋｂのｈＰＣＳＡ上流配列は、いずれの細胞株のルシフェラーゼの発現をも駆動しなかった。
【０３１５】
（実施例１２）
（標的ベクター）
標的ベクターを相同組換えによって、内因性ＰＳＣＡコード領域を欠失するように設計した。図４０は、マウスＰＳＣＡ遺伝子の標的ベクター、およびマウス細胞に含まれる内因性ＰＳＣＡ遺伝子を欠失させるためにこの標的ベクターを使用するためのストラテジーを示す。標的ベクターは、マウスＰＳＣＡ上流配列を含む１２ｋｂ  ＳｐｅＩフラグメント、ｐＧＴ−Ｎ２９ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ）由来のｎｅｏr遺伝子に作動可能に連結されたＰＧＫプロモーターを含むＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント、およびマウスＰＳＣＡ下流配列を含む３．５ｋｂＢｓｔＸＩ／ＸｈｏＩフラグメントを含む。ネオマイシン耐性遺伝子の構成的発現はＰＧＫプロモータにより制御され、標的ベクターを含む標的細胞の抗生物質選択を可能にする。
【０３１６】
当業者に理解されているように、本明細書に記載される標的ベクターとしては、標的ベクターを含むか、または選択レポーター遺伝子を含み得ない細胞の選択のためのｎｅｏr遺伝子が挙げられるがこれに限定されない。標的ベクターはまた、トランスジェニックマウス（当該分野で公知の、それぞれ標的ベクターがレポーター遺伝子を含むか否かに依存する、ノックインマウスまたはノックアウトマウス）の生成に使用され得る。トランスジェニックマウスは、マウスの前立腺発達におけるＰＳＣＡ遺伝子の機能を研究するための動物モデルとして使用され得る。
【０３１７】
限定することを意図しない１つの例として、標的ベクターを使用して、欠失されたＰＳＣＡ遺伝子を含む、ヘテロ接合性の細胞を生成するために、胚性幹細胞（ＥＳ）細胞中の野生型内因性ゲノムマウスＰＳＣＡコード配列を欠失させた。例えば、標的ベクターを使用して生成したヘテロ接合性細胞は、図４０に結果として示されるようなＰＳＣＡ＋／ｎｅｏrである。ヘテロ接合性細胞またはトランスジェニックマウスの表現型は野生型ＰＳＣＡ細胞または動物と比較され得る。
【０３１８】
標的ベクターは以下のように構築される。ＰＳＣＡ上流およびエキソン１配列の一部を含む１２ｋｂ  ＳｐｅＩフラグメントの末端を、平滑末端化し、そしてネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＧＴ−Ｎ２９（Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ）由来の平滑末端化されたＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。ネオマイシン耐性遺伝子の３’末端を、ＰＳＣＡ  エキソン３の一部および下流配列を含む平滑末端化された３．５ｋｂＢｓｔＸＩ／ＸｈｏＩフラグメントに連結した。生じたフラグメントを、標的ベクターｐＧＴ−Ｎ２９−ｍＰＳＣＡ５’／３’を生成するためにｐＧＴ−Ｎ２９へクローニングした。
【０３１９】
標的ベクターを、以下に記載される方法を使用して、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞へトランスフェクトした：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）。ネオマイシン耐性細胞を、選択し、そしてゲノムＤＮＡを選択された細胞から単離した。ゲノムサザン分析を実施して、相同組換え反応の結果を決定した。相同組換え反応および非標的ＥＳ細胞由来の１０μｇのＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そしてサザンブロット法によって分析した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ＥＭ  １９７５  Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３）。ブロットをＰＳＣＡコード領域に対する配列３’を含むＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを用いてプローブした。その結果は、このプローブが、ＰＳＣＡ＋／ＰＳＣＡ＋であるコントロール非標的細胞に対応する１０ｋｂフラグメントおよびヘテロ接合性であり、そしてＰＳＣＡ＋／ｎｅｏrを含む標的細胞に対応する４ｋｂフラグメントを検出することを示す。
【０３２０】
（実施例１３）
（前立腺癌についてのトランスジェニックマウスモデル）
本発明は、前立腺基底細胞における腫瘍形成を誘導するために、オンコジーンの発現を駆動するようにＰＳＣＡ遺伝子の上流領域を使用して、前立腺癌についてのトランスジェニックマウスモデルを作製するためのストラテジーを意図する。図４１に示されるように、このストラテジーは、投与（例えば、腫瘍形成を誘導する遺伝子産物をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたＰＳＣＡ遺伝子の上流領域を含む、キメラオンコジーンベクターのマイクロインジェクション）を含む。他の研究者らは、オンコジーンに作動可能に連結された異なる前立腺調節配列および非前立腺調節配列を使用する、この技術を使用してきた。例えば、Ｃ３（１）は、前立腺優勢調節配列であり（Ｍｏｒｏｕｌａｋｏｕら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１１２３６〜１１２４０）、そしてプロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）は、前立腺特異的調節配列であり（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：３４３９〜３４４３）、そしてこれらの両方の調節配列は、前立腺分泌細胞において、導入遺伝子の発現を駆動する。クリプトジン（ｃｒｙｐｔｄｉｎ）２は、前立腺内分泌細胞におけるオンコジーンの発現を引き起こした小腸優勢調節配列である（Ｇａｒａｇｅｎｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１５３８２〜１５３８７）。対照的に、本発明は、前立腺癌についてのトランスジェニックマウスモデルを作製するために、前立腺基底細胞におけるオンコジーンの発現を駆動するＰＳＣＡ上流領域を使用することを意図する。
【０３２１】
誘導された前立腺腫瘍の臨床的特徴は、キメラオンコジーンベクターを構築する際に使用される特定のオンコジーンにより生じる腫瘍の既知の特徴を用いて分析および比較され得る。さらに、トランスジェニックマウスの種々の組織および器官は、そのキメラオンコジーンベクターの存在および発現パターンを確認するために、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析およびタンパク質分析により分析され得る。
【０３２２】
（実施例１４）
（ｈＰＳＣＡ上流配列および導入遺伝子を含むキメラベクターを保有するトランスジェニックマウス）
ｈＰＳＣＡ上流領域の制御下における導入遺伝子の発現パターンを試験する。この目的のために、ｈＰＳＣＡ上流配列および導入遺伝子を含むキメラベクターを保有するキメラマウスを作製した。導入遺伝子と作動可能に連結された９ｋｂまたは６ｋｂのｈＰＳＣＡ上流配列を含むキメラベクターを構築し、そしてそれは、図４５において図式的に表されている。その導入遺伝子としては、ＳＶ４０ポリアデニル化配列と連結された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ｃＤＮＡ（ＰＳＣＡ（９ｋｂ）−ＧＦＰおよびＰＳＣＡ（６ｋｂ）−ＧＦＰ）、ｍＲＮＡに安定性を与えるイントロンカセットを含むヒト成長ホルモンの３’領域と連結された緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ（ＰＳＣＡ（９ｋｂ）−ＧＦＰ−３’ｈＧＨおよびＰＳＣＡ（６ｋｂ）−ＧＦＰ−３’ｈＧＨ）（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８８  ＰＮＡＳ  ８５：８３６〜８４０）ならびにイントロンを含む、ＳＶ４０小Ｔ抗原およびＳＶ４０大Ｔ抗原をコードするゲノムフラグメント（ＰＳＣＡ（９ｋｂ）−ＳＶ４０ＴＡＧおよびＰＳＣＡ（６ｋｂ）−ＳＶ４０ＴＡＧ）（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８４  Ｃｅｌｌ  ３７：３６７〜３７９）が挙げられる。
【０３２３】
キメラベクターを使用して、始祖トランスジェニックマウスの系統を作製した。線状キメラベクターを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｘ  Ｃ３Ｈハイブリッドマウスの異種交配に由来するマウス受精卵内に微量注入した。キメラベクターを保有する始祖マウスを、プローブとしてＧＦＰｃＤＮＡまたはＳＶ４０ゲノムＤＮＡを使用して、テールＤＮＡのサザン分析によって同定した。各々のトランスジェニックマウス系統の始祖数は、図４５の右パネルに示される。
【０３２４】
（実施例１５）
（ｈＰＳＣＡ上流配列は、トランスジェニックマウスの導入遺伝子の発現を駆動する）
ＰＳＣＡ（９ｋｂ）−ＧＦＰ導入遺伝子を保有する、２匹の独立始祖マウスをＢａｌｂ／ｃマウスと交配させて、その子孫を得た。８週齢および１２週齢において、雄性および雌性のトランスジェニック同腹子または非トランスジェニック同腹子を屠殺した。屠殺後、全ての泌尿生殖組織および他の組織を、蛍光性照明下において、固定された組織を観察することによって、ＧＦＰ発現について試験した。図４６に示される結果は、非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックマウスに由来する前立腺組織、膀胱組織および皮膚組織の緑色蛍光画像を示す。２つの始祖系統のうち１つの系統が、前立腺、膀胱および皮膚においてＧＦＰタンパク質を発現した（図４６）。ＧＦＰを発現しなかった組織としては、精嚢、肝臓、胃、腎臓、肺、脳、精巣、膵臓、心臓、骨格筋、小腸、結腸、胎盤が挙げられる。
【０３２５】
（実施例１６）
（ヒト組織およびマウス組織におけるＰＳＣＡの転写発現パターン）
図４７の上部パネルは、全長ヒトＰＳＣＡ  ｃＤＮＡプローブを用いて検出された、複数のヒト組織のノーザンブロットを示す（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈより入手）。この結果は、ヒトＰＳＣＡ転写物は、前立腺に豊富に存在し、そして胎盤には容易に検出可能であるがあまり豊富に存在せず、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球（ＰＢＬ）、心臓、脳、肺、肝臓、筋肉、腎臓および膵臓においては検出不可であるということを実証している。
【０３２６】
図４７の下部パネルは、種々のマウス組織におけるマウスＰＳＣＡ転写発現パターンのＲＴ−ＰＣＲ分析のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲルを示す。そのＲＴ−ＰＣＲを、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ．ＲＮＡ（Ｂｉｏｔｅｘ）およびｃＤＮＡサイクルキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製した。ＰＳＣＡのエキソン１およびエキソン３内の領域に対応するプライマーを使用して、３２０ｂｐフラグメントを増幅した。エキソン１プライマー配列は以下の通りである：５’プライマー：５’−ＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣ−３’。エキソン３プライマー配列は以下の通りである：３’プライマー：５’−ＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＴ−３’。コントロールとして、種々のマウス組織から単離されたＲＮＡサンプルの完全性を実証するために、３００ｂｐのＧ３ＰＤフラグメントを増幅した。
【０３２７】
図４７の下部パネルに示される結果は、マウスＰＳＣＡ転写物は、背側／外側前立腺、腹側前立腺、膀胱、胃（噴門、本体および幽門）ならびに皮膚において検出可能であるということを実証している。対照的に、マウスＰＳＣＡ転写物は、前方前立腺、腹側前立腺、精嚢、尿道、精巣、腎臓、十二指腸、小腸、結腸、唾液腺、脾臓、胸腺、骨髄、骨格筋、心臓、脳、眼、肺および肝臓において検出されない。このＧ３ＰＤＨの結果は、種々のマウス組織から単離された転写物がインタクトであったということを実証している。
【０３２８】
（実施例１７）
（膀胱癌におけるＰＳＣＡの高レベルの過剰発現の免疫組織化学的証拠）
以下の実施例は、ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８を使用して、パラフィン包埋した膀胱組織切片および膀胱癌組織切片の免疫組織化学染色によって決定される場合、ＰＳＣＡタンパク質は、種々の段階の膀胱癌において高度に過剰発現されているということを実証している。詳細には、以下の４組織を試験した：（Ａ）正常膀胱、（Ｂ）非浸潤性表面乳頭（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｐａｐｉｌｌａｒ）、（Ｃ）上皮内癌（高段階の前癌性病変）、（Ｄ）浸潤性膀胱癌。
【０３２９】
その結果は、図６２に示される。ＰＳＣＡは、正常膀胱組織の移行上皮において低レベルで発現される。非常に高いレベルの発現が、全ての細胞層において、上皮内癌サンプルにおいて検出された。浸潤性膀胱癌サンプルにおいて、非常に強い染色が、再び全ての細胞において観察された。低レベルの染色が、表面乳頭サンプルにおいて観察された。これらの結果は、ＰＳＣＡ発現レベルは、段階が進むことと相関し得ることを示唆する。
【０３３０】
上記の研究に加えて、多数の膀胱組織標本および膀胱癌組織標本におけるＰＳＣＡ発現の免疫組織化学的分析に由来する予備結果は、以下を示す：（１）正常膀胱は、移行上皮において低レベルのＰＳＣＡを発現する；類似の発現レベルが低い段階の乳頭状非浸潤性病変において観察される；（２）上皮内癌（高い段階の、しばしばかなり急速進行性の前癌性病変）は、全ての細胞において、ＰＳＣＡに対してほとんどいつも（９０％）極度に陽性である；（３）ＰＳＣＡは、約３０％の浸潤性癌によって、極度に発現される（すなわち、正常膀胱と比較した場合、過剰発現されている）；そして（４）転移は、ＰＳＣＡについて極度に陽性である。
【０３３１】
（実施例１８）
（ＰＳＣＡモノクローナル抗体は、インビボにおいて前立腺腫瘍の阻害を媒介した）
以下の実施例は、非結合体化ＰＳＣＡモノクローナル抗体が、単独または組み合わせて投与された場合の両方で、ＳＣＩＤマウスにおいて増殖するヒト前立腺腫瘍異種移植片の増殖を阻害するということを実証している。
【０３３２】
（Ａ．複数の非結合体化ＰＳＣＡ  ｍＡｂを使用する腫瘍阻害−研究１）
（材料および方法）
（抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体）
マウスモノクローナル抗体を、標準的なモノクローナル抗体産生方法を利用して、ＰＳＣＡアミノ酸配列のＰＳＣＡアミノ酸残基１８〜９８（図１Ｂ）を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させたＧＳＴ−ＰＳＣＡ融合タンパク質に対して惹起した。以下の７つの抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体（１９９８年１２月１１日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された対応するハイブリドーマ細胞株によって産生される）をこの研究に使用した：
抗体 アイソタイプ ＡＴＣＣ  Ｎｏ．
１Ｇ８                    ＩｇＧ１                    ＨＢ−１２６１２
２Ｈ９                    ＩｇＧ１                    ＨＢ−１２６１４
２Ａ２                    ＩｇＧ２ａ                  ＨＢ−１２６１３
３Ｃ５                    ＩｇＧ２ａ                  ＨＢ−１２６１６
３Ｇ３                    ＩｇＧ２ａ                  ＨＢ−１２６１５
４Ａ１０                  ＩｇＧ２ａ                  ＨＢ−１２６１７
３Ｅ６                    ＩｇＧ３                    ＨＢ−１２６１８。
【０３３３】
抗体は、ＰＳＣＡを結合する能力について、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫沈降により特徴づけされた。図４９は、添付の図面説明に記載されるように、ＥＬＩＳＡおよびウェスタン分析により決定される場合の上記の７つの抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂについてのエピトープマッピングデータを示す。これは、７つの抗体がＰＳＣＡタンパク質上の異なるエピトープを認識することを実証する。これらの抗体を用いる前立腺癌組織および細胞の免疫組織学的分析は、以下の実施例５および６に記載される。
【０３３４】
（抗体処方物：）
上記のモノクローナル抗体は、プロテインＧＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによりハイブリドーマ組織培養上清から精製され、ＰＢＳに対して透析され、そして−２０℃で保存された。タンパク質決定をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により行った。
【０３３５】
以下の表２に示されるような、７つの個別のモノクローナル抗体の混合物を含む治療用抗体カクテルを調製し、そしてＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍異種移植片の皮下注射を受けているＳＣＩＤマウスの処置に用いた。マウスＩｇＧ（ＩＣＮ（Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）から購入）を、非特異的コントロール抗体として用いた。マウスへの注射の前に、全ての抗体を０．２２μのフィルターを用いて滅菌した。
【０３３６】
（表２：抗ＰＳＣＡ抗体カクテル）
【０３３７】
【表２】
2010265323.tif 000003
（前立腺癌異種移植片のＳＣＩＤマウスへの導入）
ヒト前立腺癌異種移植片株ＬＡＰＣ−９（これは、非常に高レベルのＰＳＣＡを発現する）は、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍を生成するために用いた（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／１６６２８、前出、Ｋｌｅｉｎら、１９８７、前出）。
【０３３８】
ＩｃＲ−ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）への注射のために、ＬＡＰＣ−９の単一細胞懸濁液を、以下のように調製した。約２．０ｇの大きさのＬＡＰＣ−９異種移植片腫瘍を、ＳＣＩＤマウスから収集し、ハサミまたはピンセットを用いて微小片へと切り刻み、ＲＰＭＩ中で１回洗浄し、そしてプロナーゼの１％溶液中で２０分間消化した。消化の後、細胞懸濁液を、ＲＰＭＩ中で２回洗浄し、そして１０ｍｌのＰｒＥＧＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中に再懸濁した。一晩のインキュベーションの後、細胞を収集し、ＰｒＥＧＭ中で１回洗浄し、次いで２００μのナイロンフィルターを通過させて大きな凝集塊および細片を取り除いた。フィルターを通過した細胞を、収集し、遠心分離し、そしてＰｒＥＧＭ培地中に再懸濁した。次いで、細胞を計数し、そして適切な数の細胞を、新しいチューブに移し、遠心分離し、そして２Ｘ濃度でＲＰＭＩに再懸濁した。次いで、当量の氷冷マトリゲルを細胞懸濁液に添加し、そしてその懸濁液を注射まで氷上に保った。注射のために、雄性ＩｃＲ−ＳＣＩＤマウスは、その側腹を剃毛し、そして各マウスは、右側腹に１００μｌの容量中に１×１０6細胞の単回の皮下（ｓ．ｃ．）注射を受けた。腫瘍細胞を注射したマウスを、以下に記載されるように、コントロール抗体かまたは抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体調製物のいずれかを用いて処置した。
【０３３９】
（処置プロトコル：）
腫瘍細胞を注射した２０匹のＳＣＩＤマウスを、以下のように、コントロール抗体（マウスＩｇＧ）かまたは抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体カクテル（上記）のいずれかを用いて処置した。１０匹のマウスを、マウスＩｇＧコントロール抗体で処置し、そして１０匹のマウスを抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体調製物で処置した。マウスＩｇＧコントロール抗体または抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体カクテルの２００μｇの注射物を、腫瘍細胞の注射に対して、−１日、＋３日、＋７日、＋１１日、＋１４日、および＋２１日目に腹腔内投与した。ＬＡＰＣ−９腫瘍の増殖を、カリパス測定により追跡して、腫瘍細胞の注射に対して、＋３２日、＋３５日、＋３９日、＋４２日、＋４７日、＋５４日、および＋６１日目に腫瘍容積を決定した。さらに、マウスを、市販のＰＳＡ試験（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ，Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔ，ＣＡ）を用いて循環ＰＳＡレベルをアッセイするために、周期的に採血した。
【０３４０】
コントロール群（マウス＃２）のマウスの１匹は、研究の期間の間に死に、そしてこの時点で検出可能な腫瘍は有していなかった。
【０３４１】
（結果）
ＬＡＰＣ−９前立腺癌異種移植片の皮下注射を受けているＳＣＩＤマウスを、上記のように、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ調製物またはマウスＩｇＧコントロール抗体のいずれかで処置した。明白な腫瘍は、腫瘍細胞注射後４週間で、マウスＩｇＧコントロール群において始めに現れた。腫瘍容積測定を、＋３２日目に開始した。
【０３４２】
結果（以下の表３に作表され、そして図４８に図示される）は、コントロールｍＡｂ処置マウスの全てが腫瘍を発症した（生存する９匹の内９匹、マウス＃１、＃３−１０）ことを示すが、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ処置マウスは、検出可能な腫瘍増殖を発症しなかった（１０匹の内０匹、マウス＃１１−２０）こと示す。コントロール処置動物は、殆どの例において有意な腫瘍を急速に発症し、そしてこれらのマウスは、時間と共に、次第により大きな腫瘍サイズになる、一定の腫瘍増殖を経験した。５４日目までに、全てのコントロール処置マウスは、検出可能な腫瘍を発症した。コントロール処置群に対して際立って対照的には、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ調製物で処置した１０匹のマウスは、異種移植片注射の６１日後でさえ、検出可能な腫瘍を発症しなかった。
【０３４３】
（表３：記録した腫瘍容積（ｍｍ3）測定）
【０３４４】
【表３】
2010265323.tif 000004
*マウス＃１−１０は、マウスＩｇＧコントロール抗体を用いて処置した群を示す。マウス＃１１−２０は、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂカクテルを用いて処置した群を示す。
*腫瘍容積は、長さ（Ｌ）×幅（Ｗ）×高さ（Ｈ）測定（ｍｍ）に対応する。図１に示される楕円体容積（これは、腫瘍質量を正確に示す（ＴｏｍａｙｋｏおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ，１９８９））を決定するために、本発明者らは、式Ｌ×Ｗ×Ｈ×１／２を用いた。
【０３４５】
臨床的に、コントロール処置マウスは、全て、腫瘍が発症および拡大した場合、次第に不健康な視覚的症状を示した。対照的に、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ処置群のマウスは、処置期間を通じて、外見上は、活発（ａｃｔｉｖｅ）、強健（ｖｉｇｏｒｏｕｓ）、かつほぼ健康なままであった。このことは、明かな毒性または明白な副作用がこの処置に付随しないことを示唆する。
【０３４６】
腫瘍容積に加えて、マウスを循環ＰＳＡの決定のために採血した。循環ＰＳＡレベルは、コントロール群における腫瘍容積の漸増と相関したが、検出可能なＰＳＡは、実験を通じて抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ処置群において観察されなかった。
【０３４７】
（Ｂ．複数の非結合体化ＰＳＣＡ  ｍＡｂを用いる腫瘍阻害−研究２）
実施例１８、前出、に記載の結果を検証するために、新規に調製した抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂカクテルを、本質的に上記のように、インビボでのＬＡＰＣ−９腫瘍異種移植片の増殖阻害について評価した。簡単に言えば、各ｍＡｂの新規のバッチを調製し、そして表４に示した比率に従って共に混合した。全ての抗体を、ＰＳＣＡ反応性について試験した。ＳＣＩＤマウスは、上記のようにＬＡＰＣ−９異種移植片細胞の皮下注射を受けた。マウスを、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂのカクテルまたはマウスＩｇＧのコントロール調製物、または精製したウシＩｇＧのいずれかで処置した。ウシＩｇＧコントロール群をこの研究に入れて、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにおける抗ＰＳＣＡ抗体を用いて共精製したウシＩｇＧの効果を研究した。２００マイクログラムの抗体を、腫瘍細胞の注射に対して−１日、＋３日、＋７日、＋１１日、＋１４日、および＋２１日目に腹腔内注射により各マウスに投与した。長さ（Ｌ）×（Ｗ）×（Ｈ）（ｍｍ）に対応する腫瘍容積を、カリパス測定によりモニターし、そして血清を週間隔で収集した。腫瘍の楕円体容積（これは、腫瘍質量を正確に示す）を決定するために、本発明者らは、式Ｌ×Ｗ×Ｈ×１／２（ＴｏｍａｙｋｏおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ，１９８９）を用いた。
【０３４８】
（表４：抗ＰＳＣＡ抗体カクテル２）
【０３４９】
【表４】
2010265323.tif 000005
*このカクテルを処方するために用いたモノクローナル抗体調製物の１つである、３Ｇ３は、弱い反応性を示した。
【０３５０】
本研究の結果を、図５３に示し、そしてこれは前出の実施例１８−Ａに記載した研究から生じた結果を確かめる。抗ＰＳＣＡ処置群の動物は、コントロール群の両方と比較して、腫瘍細胞増殖の有意な阻害を経験した。腫瘍増殖における検出可能な差異は、ウシＩｇＧまたはマウスＩｇＧのいずれを受けたマウスにおいても、観察されなかった。コントロール群における腫瘍は、等しい速度で増殖し、そして類似の潜伏期を有した。対照的に、抗ＰＳＣＡ抗体反応混液を受けたマウスにおけるＬＡＰＣ−９腫瘍は、実験の最後に、より長い潜伏期で、有意に遅い増殖速度およびより小さなサイズを示した。最終時点での平均の腫瘍容量は、マウスＩｇＧで処置したマウス（４６日）で１，１３９ｍｍ3であり、ウシＩｇＧで処置したマウス（４２日）で１０９１ｍｍ3であり、そして抗ＰＳＣＡ処置マウス（４６日）で３９１ｍｍ3であった。ウシＩｇＧ処置群における大きな腫瘍サイズに起因して、これらのマウスを、他の群のマウスよりも早く屠殺した。さらに、腫瘍容量は、処置マウスの血清中のＰＳＡレベルに相関した。抗ＰＳＣＡ抗体を受けたいくらかのマウスは、前出の実施例１に記載した研究において以前に観察されたように、非常に小さな腫瘍を示すかまたは全く腫瘍増殖を示さず、実施例１８−Ａに記載した研究と一貫して、この抗体反応混液調製物のいずれの投与も、明らかな毒性を付随しなかった。
【０３５１】
（Ｃ．単一の非結合体化ＰＳＣＡ  ｍＡｂを用いるインビボ腫瘍阻害）
（材料および方法：）
本明細書中に記載のモノクローナル抗体のいくつかを、以前に記載した腫瘍チャレンジアッセイ（上記の実施例１８−Ａおよび１８−Ｂを参照のこと）を使用して、その非結合体化（すなわち「裸の」）形態での、前立腺腫瘍異種移植片の増殖を阻害するその能力について研究した。一般にこの研究は、アッセイした抗体の各々について以下で示す結果の節に記載するようなわずかな改変を伴って、上記のように行った。
【０３５２】
（Ｃ１：ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８）
抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。１Ｇ８の抗腫瘍効果を、ＬＡＰＣ−９異種移植片およびコントロールとしてマウスＩｇＧを使用して評価した。図５４に示す結果は、１Ｇ８抗体でのマウスの処置が、腫瘍増殖を阻害したことを実証する。詳細には、コントロール群についての最終時点での平均腫瘍容量は、１Ｇ８抗体処置群の平均腫瘍容量が３３５ｍｍ3であることに対して８５４ｍｍ3であった。これらの結果は、１Ｇ８モノクローナル抗体が、単独で使用される場合に前立腺腫瘍の増殖を阻害し得ることを示す。前出に記載された研究を用いる場合、１Ｇ８  ｍＡｂで処置したこれらの動物の処置には、明らかな毒性を付随しなかった。
【０３５３】
ＰＣ−３細胞を用いて作製された前立腺癌の増殖に対する１Ｇ８モノクローナル抗体の効果もまた、決定した。ＰＣ−３細胞は、ＰＳＣＡを発現しない。図６５に示されるように、１Ｇ８抗体は、ＰＳＣＡ発現ＬＡＰＣ−９異種移植片に対するその効果とは著しく対照的に、ＰＣ−３異種移植片腫瘍の発達に対して効果を有さなかった。これらの結果は、１Ｇ８抗体が、ＰＳＣＡ抗原を介して腫瘍の細胞増殖を阻害することを明瞭に示す。
【０３５４】
（Ｃ２：ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ２Ａ２および２Ｈ９）
異なるアイソタイプの２つの抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体を、前立腺腫瘍増殖のインビボ阻害について同時に評価した。抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ２Ａ２（ＩｇＧ２ａアイソタイプ）および２Ｈ９（ＩｇＧ１アイソタイプ）を、直前に記載した実施例１８−Ｃ１に記載するような前立腺腫瘍の阻害について試験した。図５５に示すこの結果は、コントロール群に対して、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ処置群における腫瘍細胞増殖の著しい阻害を実証する。詳細には、最終時点での平均腫瘍容量は、マウスＩｇＧで処置したマウス（４２日）について４８３ｍｍ3であり、２Ａ２  ｍＡｂで処置したマウス（４２日）について４９ｍｍ3であり、そして２Ｈ９  ｍＡｂで処置したマウス（４２日）について７２ｍｍ3であった。より顕著には、腫瘍発生率は、２Ａ２処置群について２／７および２Ｈ９処置群について１／７であったのに対して、マウスＩｇＧコントロール群において６／６マウスであった。２Ａ２処置群において、最初の腫瘍は２５日で現れ、そして第２の腫瘍は４２日で現れた。２Ｈ９処置群において、１つの腫瘍の存在は２１日で現れた。マウスＩｇＧコントロール群において、マウスの４／６が２１日で腫瘍を発達した。上記のインビボ研究を用いる場合、２Ａ２または２Ｈ９  ｍＡｂでのこれらの動物の処置は、明らかな毒性を付随しなかった。
【０３５５】
処置マウスの血清におけるＰＳＡレベルは、コントロールマウスよりも有意に低く、そして腫瘍の容量に直接相関した（図５６）。６週目で、マウスＩｇＧコントロール群における平均ＰＳＡ血清レベルは３５ｎｇ／ｍｌであり、２Ａ２群では２ｎｇ／ｍｌであり、そして２Ｈ９群では８ｎｇ／ｍｌであった。
【０３５６】
この研究は、単一の「裸の」抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体が、抗腫瘍活性に十分であるという結論をさらに支持する。さらに、これらのデータは、異なるＰＳＣＡエピトープを認識するｍＡｂが有効であり、そして抗腫瘍効果は、単一のＩｇＧアイソタイプに依存しない（なぜなら、ＩｇＧ１（ＩＧ８、２Ｈ９）ｍＡｂおよびＩｇＧ２ａ（２Ａ２）ｍＡｂの両方が、腫瘍増殖を阻害したからである）ことを実証する。
【０３５７】
（Ｃ３：ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、特異的にＰＳＣＡを介して増殖阻害効果を及ぼす）
ＰＳＣＡ  ｍＡｂが、特異的にＰＳＣＡタンパク質を介して腫瘍増殖阻害を及ぼすことを実証するために、１Ｇ８  ｍＡｂおよびＰＣ−３腫瘍異種移植片を用いて腫瘍阻害研究を行った。ＰＣ−３細胞は、内因性ＰＳＣＡを発現しない。この研究は、上記の実施例のＣ１節に記載されるように行った。図６５に示されるこの結果は、ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  １Ｇ８が、４０日の期間にわたって、マウスのＰＣ−３腫瘍の増殖に効果を有さないことを示す。比較のために、ＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍異種移植片（実施例Ｃ１，上記）に対する１Ｇ８の効果の並行研究と一緒に、この結果を示す。
【０３５８】
（Ｃ４：ＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ３Ｃ５は、確立したＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍の増殖をインビボで阻害する）
ＰＳＣＡ  ｍＡｂが、確立した腫瘍の増殖に影響し得るか否かを決定するために、以下の研究を行った。手短に言うと、本質的に実施例Ｃ１およびＣ２に記載されるように、ＳＣＩＤマウスの同齢集団に１０6のＬＡＰＣ−９細胞ＳＱを注射した。腫瘍が約１００立方ミリメートルのサイズに達した後、マウスを２つの群（マウスＩｇＧを受けたコントロール群およびＰＳＣＡ  ｍＡｂ  ３Ｃ５を受けた処置群）に分けた。各マウスに、以下のプロトコルに従ってコントロールＩｇＧまたは３Ｃ５  ｍＡｂを用いてＩＰ注射した：注射１回当たり１ｍｇ、最初の２週間は１週当たり３回、続いて３週目は１週当たり２回。腫瘍の容量およびＰＳＡ測定を、上記のようにして決定した。図５７に示すこの結果は、３Ｃ５  ｍＡｂが、確立したＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍の増殖をインビボ阻害することを示す。処置群のマウス少なくとも数匹において、腫瘍の最初の前処理したサイズの５０％までの腫瘍の後退を観察した。
【０３５９】
（実施例１９：）
（ＰＳＣＡモノクローナル抗体を特徴付けるためのインビトロアッセイ）
（１９−Ａ：抗体依存性細胞傷害性アッセイ）
抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂが、腫瘍細胞をＡＤＣＣに対して感作するか否かを決定するために、以下のアッセイを実施した。第１に、ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣについて、ＳＣＩＤマウス由来の脾臓細胞を、Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇら、１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：２６２７−２６３４に記載されるように、インビトロで５日間培養する。次いで、活性化細胞を、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂまたはコントロールマウスＩｇＧのいずれかの存在下で、51Ｃｒ標識ＬＡＰＣ−９、ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ、またはＬＮＣａＰ標的細胞と共に４時間共存培養した。ＬＮＣａＰは、全てのアッセイにおいてネガティブコントロールとして役立つ。なぜなら、これはＰＳＣＡを発現しないからである。単一のｍＡｂを使用する場合、それぞれのマウスＩｇＧアイソタイプコントロールをまた、使用する。活性化脾臓細胞のＮＫ活性を、マウスＮＫ感受性標的ＹＡＣ−１とのインキュベーションによって決定する。全ての場合において、死滅は、培地への51Ｃｒの放出によって決定する。自発的放出を、標識細胞のみのインキュベーションの後に決定し、そして全放出を、５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００との標識細胞のインキュベーションによって決定する。特定の細胞の溶解のパーセントを、以下によって決定する：
％細胞溶解  ＝  実験の51Ｃｒ放出−自発的51Ｃｒ放出
全51Ｃｒ放出−自発的51Ｃｒ放出
（１９−Ｂ：抗体依存性マクロファージ媒介細胞傷害性アッセイ）
抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂが、腫瘍細胞をＡＤＭＭＣに対して感作するか否かを決定するために、以下のアッセイを実施する。腹膜マクロファージを、Ｌａｒｓｏｎら、１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４２：８７７−８８２に記載されるように、Ｂｒｅｗｅｒのチオグリコレート培地でのＳＣＩＤマウスの腹腔内注射によって活性化する。４日後、細胞を腹腔内洗浄によって収集し、そして活性化マクロファージのパーセントを、Ｍａｃ−１染色によって決定する。アッセイのために、活性化マクロファージを、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂまたはコントロールマウスＩｇＧのいずれかの存在下で、3Ｈ−チミジン標識ＬＡＰＣ−９、ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ、およびＬＮＣａＰ標的細胞と共に４８時間共存培養する。アッセイの最後に、上清をウェルから収集し、そして上記の51Ｃｒ放出について記載したように、放出された3Ｈ−チミジンの量によって死滅を決定する。
【０３６０】
（１９−Ｃ：補体媒介腫瘍細胞溶解アッセイ）
補体依存性溶解による腫瘍標的の破壊を、Ｈｕａｎｇら、１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：６１０−６１６に記載される方法に従って実施し得る。例えば、ＬＡＰＣ−９、ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ、およびＬＮＣａＰ細胞を、51Ｃｒで標識し、次いで、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂまたはマウスＩｇＧコントロールのいずれかと共に氷上で３０分間インキュベートする。洗浄して未結合の抗体を除去した後、この細胞を、ウサギ補体と共に３７℃で２時間インキュベートし、そして細胞溶解を、上清への51Ｃｒ放出によって測定する。細胞溶解のパーセントを、上記のように決定する。
【０３６１】
（１９−Ｄ：細胞増殖アッセイ）
細胞増殖に対する抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂの効果を、ＭＴＴアッセイによって決定し得る。手短に言うと、ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡまたはＬＮＣａＰ細胞を、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂまたはコントロールとしてのマウスＩｇＧのいずれかの種々の量と共に、７２時間培養する。インキュベーション期間の最後に、この細胞を洗浄し、そしてＭＴＴの溶液中で４時間インキュベートする。増殖は、ＭＴＴ溶液の、紫色へのデヒドロゲナーゼ媒介転換によって示され、そして５７０ｎｍの波長で測定される。
【０３６２】
（１９−Ｅ：ソフトアガーにおけるコロニー形成についてのアッセイ）
抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂの存在下でのコロニー形成を、ソフトアガー中の細胞の増殖によって測定し得る。要するに、１×１０4のＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ細胞またはＬＮＣａＰ細胞を、Ｎｏｂｅｌアガーを含む培地にプレートする。次いで、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂの一連の希釈物をプレートに２連で添加し、コロニー増殖に対する効果を決定する。マウスＩｇＧを、コントロールとして使用する。巨視的コロニーを、培養物中で１４〜２１日後に計数する。
【０３６３】
（実施例２０：）
（ＰＳＣＡ捕捉ＥＬＩＳＡ）
ＰＳＣＡ捕捉ＥＬＩＳＡを、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂでの処理前の血清中のＰＳＣＡレベルを測定するために開発し、そしてこれは、治療投薬レジメンの決定において有用な情報を提供する。このアッセイはまた、治療に応答して患者をモニタリングする際に有用であり得る。
【０３６４】
このアッセイ形式の概略図を、図５０Ｂに示す。手短に言うと、アフィニティー精製した抗ＰＳＣＡペプチドヒツジポリクローナル抗体（ＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸６７〜８１に対する）および抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８を、捕捉抗体として使用し、そしてマイクロタイターウェルにコートする。コーティング後、試験抗原の一連の希釈物とのインキュベーションを、標準曲線を作製するために行う。患者の血清をウェルに添加し、そして室温でインキュベートする。インキュベーション後、結合していない抗体をＰＢＳで洗浄する。抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体２Ａ２、３Ｃ５および４Ａ１０（ＩｇＧ２ａアイソタイプ）（これらは、ＰＳＣＡタンパク質上の異なるエピトープを認識する）を検出抗体として使用し、そしてウェルに添加し、インキュベートし、そしてウェルを洗浄して、結合していない抗体を除去する。次いで、この捕捉反応を、抗マウスＩｇ２ａ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体の添加、その後の３，３’５，５’テトラメチルベンジジンベース基質での発色によって可視化し、ＯＤ測定を行う。
【０３６５】
標準化の概略図およびコントロール抗原を、図５０Ａに示す。手短に言うと、ＰＳＣＡのアミノ酸１８〜９８をコードするＧＳＴ融合タンパク質を、未知サンプルの定量化のための標準曲線を作製するために使用する。ＰＳＣＡの分泌組換え哺乳動物発現形態を、このＥＬＩＳＡアッセイの質的制御のために使用する。このタンパク質は、この組換えタンパク質の分泌を指向するためのＩｇリーダー配列、ならびにアフィニティー精製のためのＭＹＣおよび６×ＨＩＳエピトープタグを含む。
【０３６６】
ＰＳＣＡを発現および分泌するよう操作された２９３Ｔ細胞から分泌された組換えＰＳＣＡの定量化を、図５１に示す。
【０３６７】
（実施例２１：）
（ＰＳＣＡ  ｍＡｂ遺伝子の配列）
マウスモノクローナル抗体１Ｇ８、４Ａ１０および２Ｈ９の重鎖可変領域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、Ｃｏｌｏｍａら、１９９２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５３：８９−１０４に記載の方法を使用して決定した。ｍＡｂ  １Ｇ８および４Ａ１０の重鎖可変領域配列決定のためのプライマーは、以下のとおりであった：
【０３６８】
【化２】
2010265323.tif 000006
ｍＡｂ  ２Ｈ９の重鎖可変領域配列決定のためのプライマーは、以下のとおりであった：
【０３６９】
【化３】
2010265323.tif 000007
総ＲＮＡを、トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  カタログ番号１５５９６）を使用して、１Ｇ８、２Ｈ９および４Ａ１０ハイブリドーマ細胞から単離した。５μｇのＲＮＡに対する第１鎖合成反応物を、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素反応（製造業者のプロトコルに従って）およびＣＨ３’を使用して生成した。この３０μｌの第１鎖反応物のうちの２μｌを、可変領域を増幅するためのＰＣＲにおいて使用した。
【０３７０】
第１鎖ｃＤＮＡを、重鎖の定常領域由来のプライマー（ＣＨ３’）を使用して、ハイブリドーマＲＮＡから合成した。可変領域を、ＣＨ３’およびリーダー配列に対して設計されたプライマー（ＨＬＥＡＤ．１およびＨＬＥＡＤ．２）を使用して増幅した。得られたＰＣＲ産物を配列決定し、そして相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Ｋａｂａｔの法則を使用して決定した。これらの配列を、図５８、５９および６０に示す。これら３つのｍＡｂのＣＤＲのアミノ酸アライメントを、図６１に示す。
【０３７１】
（実施例２２：）
（ＰＳＣＡ  ｍＡｂ結合親和性）
ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８（上記）の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅTM装置（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して決定した。この装置は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｗｅｌｆｏｒｄ  Ｋ．１９９１，Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｅｌｅｃｔ．２３：１＋ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２９５：２６８）を使用し、リアルタイムで生体分子の相互作用をモニターする。製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって概要された一般手順に基づいて、この抗体の速度論分析を、センサ表面上に低密度（３０ＲＵ）で固定した組換えＰＳＣＡを使用して行った。組換えＰＳＣＡは、以下のように生成した。一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞またはＣ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグを有するＰＳＣＡをコードするＣＭＶ駆動発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を安定に発現する２９３細胞を、精製のための分泌可溶性ＰＳＣＡタンパク質の供給源として使用した。このＨＩＳタグ化ＰＳＣＡタンパク質を、標準的な技術を使用して、ニッケルカラム上で精製した。会合速度および解離速度を、製造業者によって提供されたソフトウェアを使用して決定した。以下に作表した（表５）結果は、１Ｇ８が１ナノモルのＫDを有することを示し、これはＰＳＣＡ抗原に対する強い親和性を示す。
【０３７２】
【表５】
2010265323.tif 000008
本発明は、本明細書中に開示される実施形態によって範囲を限定されず、これらの実施形態は、本発明の個々の局面の単一の例示として意図され、そして機能的に等価な任意のものが、本発明の範囲内にある。本明細書中に記載されるものに加え、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、前述の記載および教示から当業者に明らかであり、そして本発明の範囲内にあることが同様に意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実施され得る。
【０３７３】
（実施例２３：）
（免疫組織化学的分析）
本実施例は、上記の７つの抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂを用いた、種々のホルマリン固定したパラフィン包理組織の免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を記載する。
【０３７４】
（材料および方法）
７つの抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体の各々を、以下に対して試験した：（１）ＰＳＣＡを過剰発現するＬＮＣａＰ細胞、ＬＮＣａＰ親細胞および２９３Ｔ細胞からなる細胞ペレット；（２）ＬＡＰＣ９ＡＤ異種移植片；および（３）良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺癌および正常前立腺組織。全ての組織染色を、ＱｕａｌＴｅｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって行った。組織ブロックを４ミクロンで切片化し、そして正に荷電したＣａｐｉｌｌａｒｙ  Ｇａｐ顕微鏡スライド（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）上にプレートした。キシレン中での脱ろう化、その後の一連のアルコールでの水和後、組織切片を、抗体反応性を最適化するために、クエン酸ナトリウム（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）の存在下で２０分間スチーマー中で前処理した。
【０３７５】
５分間の冷却後、スライドを、ＡＢＣペルオキシダーゼ技術を使用して免疫染色した。手短に言うと、スライドを、ブロッキング血清（正常ヤギ）中で５分間その後、２μｇ／ｍｌの抗ＰＳＣＡモノクローナル一次抗体または２μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ（ネガティブコントロールとして）中（２５分）、ビオチン化二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ中（２５分）およびペルオキシダーゼ酵素に結合体化したアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）中（２５分）で、インキュベートした。これらのインキュベーション工程の間、切片を緩衝液中でリンスした。ＤＡＢ−ジアミノベンジジン色素原（ＱｕａｌＴｅｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｂｓ）を使用してこの反応を発色させた（褐色沈殿物を生じる）。引き続いて、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、次いでカバーガラスをかけた。染色を、ＴｅｃｈＭａｔｅ  １０００自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）上、室温で行った。
【０３７６】
（結果）
図５２は、細胞ペレット、ＬＡＰＣ９ＡＤ異種移植片、ＢＰＨサンプルおよび前立腺癌組織（左パネル）における、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体３Ｃ５についてのＩＨＣ結果を示す。細胞ペレット混合物は、３つの細胞型を含み、その１つのみ（ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ細胞）が、抗ＰＳＣＡモノクローナルで染色されると予測される。予測されたように、３Ｃ５は、これらの細胞の約１／３を強く染色した。この染色は、同じスライド上の陽性染色および陰性染色している細胞型を都合よく示す。ＬＡＰＣ９ＡＤ異種移植片は、３Ｃ５抗体で非常に強く染色される。ＢＰＨ組織の管における基底細胞および上皮細胞は、よく染色するが、基底細胞が特に優性である。最後に、前立腺癌組織は、腫瘍性の管における強い染色を示す。右側のパネルは、免疫前マウス血清からなるバックグラウンドコントロールを表す。評価したいかなるサンプルにおいても、バックグラウンド染色は検出されなかった。
【０３７７】
（実施例２４：）
抗ＰＳＣＡ抗体処置後の確立されたＬＡＰＣ−９腫瘍増殖の阻害および長期の生存。ホルモン抵抗性転移性前立腺癌を有する患者の骨腫瘍生検材料から、ＬＡＰＣ−９異種移植片を生成した。
【０３７８】
以下の実施例は、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体である、１Ｇ８および３Ｃ５が、ＳＣＩＤマウスにおいて確立された同所ＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍の増殖を阻害し、有意にそれらの生存を延ばしたことを実証する。腫瘍の増殖を、血清ＰＳＡのレベルを追跡することによってモニタリングした。
【０３７９】
（同所注入）
ＬＡＰＣ−９腫瘍の単一の細胞懸濁液を、実施例１８−Ａに記載の方法に従って調製した。細胞懸濁液を、１：１の希釈でＭａｔｒｉｇｅｌと混合した。細胞懸濁液を、同所注入の前に氷上に置いた。同所注入を、ケタミン／キシラジンを使用した麻酔下の雄性ＩｃＲ−ＳＣＩＤマウスに対して行った。麻酔されたマウスの下腹部を剪毛し、５〜８ｍｍの切開を、ペニスのちょうど上に作製し、腹壁および筋肉を露出させた。切開を腹筋を貫いて作製し、膀胱および精嚢を露出させ、次いで膀胱および精嚢を切開部を通して摘出し、背側の前立腺を露出させた。ＬＡＰＣ−９細胞懸濁液を、５００μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して、各背側の葉に注入した。各葉に、約５×１０5細胞に対応する、１０μｌの細胞懸濁液を注入した。注入の後、両方の切開を直線（ｒｕｎｎｉｎｇ）縫合を用いて閉じ、そしてマウスを回復のためにヒートランプの下に維持した。注入の後、ＰＳＡの血清レベルをモニタリングした。マウスを、ＰＳＡの血清レベルに依存して、１Ｇ８抗体または３Ｃ５抗体の異なるレジメンで処置した。抗体処置の後、マウスを生存させ続けて、腫瘍の増殖の測度としてＰＳＡレベルを決定し、そして各処置群におけるマウスの生存を決定した。
【０３８０】
（ＰＳＡの血清レベルのモニタリング：）
血清ＰＳＡのレベルを、腫瘍サイズを追跡するために使用した。マウスを、ほぼ毎週基準で採血し、血清ＰＳＡのレベルをモニタリングした。血清ＰＳＡのレベルを、市販のＰＳＡキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ，Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ）を使用して測定した。マウスを、血清ＰＳＡのレベルに基づいて２つの処置群に分離した。例えば、これらの群としては、以下が挙げられる：低レベルのＰＳＡ（例えば、２〜３ｎｇ／ｍｌ；図６６Ａ）；および中程度のレベルのＰＳＡ（例えば、６４〜７８ｎｇ／ｍｌ；図６６Ｂ）。血清ＰＳＡレベルを、腫瘍が腹部にわたって目に見えるまでモニタリングした。
【０３８１】
血清ＰＳＡレベルを、腫瘍細胞の注入の日に対して、＋９、＋１５、＋２２、＋３０、＋３７、＋４４、および＋５１日目にモニタリングした（図６６Ａ）。同様に、血清ＰＳＡレベルを、＋１３、＋２１、＋２７、および＋３４日目に（図６６Ｂ）、＋９、＋１６、＋２２、＋２９、および＋３６日目に（図６８Ａ）、そして＋７、＋１４、＋２１、および＋２８日目に（図６８Ｂ）、モニタリングした。
【０３８２】
（１Ｇ８を用いた処置：）
同所性の腫瘍を保有するマウスを、上記の方法に従って確立した。（ｉ）低レベルの血清ＰＳＡ（２〜３ｎｇ／ｍｌ）、または（ｉｉ）中程度のレベルの血清ＰＳＡ（６４〜７８ｎｇ／ｍｌ）を示す２群の動物を、処置のために選択した。
【０３８３】
低レベルのＰＳＡ（例えば、２〜３ｎｇ／ｍｌ）を有するマウスを、１週間の１週あたり３回の、２ｍｇの１Ｇ８抗体の腹腔内注入、それに続く、次の２週間の１週あたり３回の、１ｍｇの１Ｇ８、それに続く、次の３週間の１週あたり１回の、１ｍｇの１Ｇ８で処置した（図６６Ａにおいて矢印によって示されるように）。
【０３８４】
中程度のレベルのＰＳＡ（例えば、６４〜７８ｎｇ／ｍｌ）を有するマウスを、３週間連続で１週あたり３回の１ｍｇの１Ｇ８抗体の、腹腔内注入、それに続く、翌週の１ｍｇの１Ｇ８の単回注入で処置した（図６６Ｂにおいて矢印によって示されるように）。
【０３８５】
低レベルまたは中程度のレベルのＰＳＡを有するコントロールマウスを、約０．５〜０．８ｍｌのリン酸緩衝溶液（Ｇｉｂｃｏ）で処置した（図６６ＡおよびＢ）。
【０３８６】
（３Ｃ５を用いた処置：）
同様の処置を、３Ｃ５抗体を使用して、同所腫瘍を保持するマウスに対して行った。第１の実験において、１ｍｇの３Ｃ５抗体を、３週間連続で１週あたり３回、腹腔内に投与し、それに続いて１ｍｇの３Ｃ５を単回注入した（図６８Ａ）。第２の実験において、２ｍｇの３Ｃ５を第１週に１週あたり３回投与し、それに続いて次の２週間に１週あたり３回の、１ｍｇを投与した（図６８Ｂ）。注入を、図６８ＡおよびＢにおいて矢印で示される日に投与した。
【０３８７】
（結果−１Ｇ８を用いた処置は、腫瘍の増殖の阻害および生存の増大を生じる）
腫瘍保有マウスの血清ＰＳＡレベルを、腫瘍の増殖を追跡するために使用した。なぜなら、血清ＰＳＡレベルは、腫瘍サイズに非常に関連するからである。抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体である１Ｇ８で処置されたＬＡＰＣ−９  ＡＤ腫瘍を保有するマウスは、血清ＰＳＡレベルの増加速度の減少を示した（図６６ＡおよびＢ）。この結果は、１Ｇ８が、ＰＳＣＡを発現する腫瘍の増殖を阻害することを示す。
【０３８８】
図６６Ａにおいて、各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝６）または１Ｇ８（ｎ＝６）を受けたマウスについての平均ＰＳＡレベルを表す。マウスを、ＰＳＡ定量のためにＸ軸に示される日に採血した。
【０３８９】
図６６Ｂに示されるように、マウスを、ＰＳＡの定量のためにＸ軸に示される日に採血した。各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝４）または１Ｇ８（ｎ＝５）を受けたマウスの平均ＰＳＡレベルを表す。図６７において、ＰＢＳ処置群におけるマウスは４匹であり、そして１Ｇ８処置群におけるマウスは５匹である。
【０３９０】
さらに、１Ｇ８抗体で処置した、より低い血清ＰＳＡレベルを有するマウスは、１Ｇ８抗体で処置した、より高い血清ＰＳＡレベルを有するマウスと比較して、血清ＰＳＡのレベルの増加速度の減少を示した（例えば、図６６ＡおよびＢにおいて
【０３９１】
【化４】
2010265323.tif 000009
によって記載されるデータと比較して）。この結果は、１Ｇ８抗体が、本研究の投与プロトコル下で、より小さな腫瘍身体負荷量が存在した場合に、腫瘍の増殖を減少させるのにより有効であったことを示唆する。
【０３９２】
腫瘍保有マウスの生存に対する１Ｇ８処置の影響をまた、モニタリングした。一般的に、ＰＢＳのみで処置されたマウスは、局所的な腫瘍の増殖および転移のために、注入後５〜６週間以内に死亡し始めた。対照的に、１Ｇ８抗体で処置されたマウスは、長期の生存を示した。例えば、生存への影響は、低い血清ＰＳＡレベルを有するマウスにおいて、より劇的であり（図６７Ａ）、ここでＰＢＳ処置マウスにおける中間生存時間は、５６．５日（４２〜７１日の範囲）であり、そして、１Ｇ８処置マウスにおける中間生存時間は、８９日（７７〜１０１日の範囲）であった。中程度の血清ＰＳＡレベルを有するマウスにおいて（図６７Ｂ）、ＰＢＳ処置マウスにおける中間生存時間は、４０日（３２〜４８日の範囲）であり、これに比較して、１Ｇ８処置マウスにおける中間生存時間は、７８．５日（５２〜１０５日）であった。このことは、１Ｇ８処置マウスにおける３８．５日の中間生存時間の増加を示唆する。
【０３９３】
腫瘍の増殖の阻害は、長期の生存に関連する。まとめると、これらの結果は、１Ｇ８処置が、腫瘍の増殖を阻害し、そして同所腫瘍を保有するマウスの生存時間を増加したことを実証する。従って、これらの結果は、１Ｇ８を用いた処置が、腫瘍の増殖を阻害することによって生存時間を増加させたことを示唆する。
【０３９４】
１Ｇ８を用いた処置は、より小さな同所腫瘍に対する腫瘍の増殖を効果的に阻害した。従って、１Ｇ８は、再発性の局所疾患（一次処置の後）および転移性腫瘍の形成における、最小の残存性疾患のための効果的な治療処置を表し得る。
【０３９５】
３Ｃ５抗体で処置されたマウスの結果は、１Ｇ８抗体で処置されたマウスから得られたデータと同様である。抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体である３Ｃ５で処置された、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ腫瘍を保有するマウスは、血清ＰＳＡレベルの減少を示した。この結果は、３Ｃ５が、ＰＳＣＡを発現する腫瘍の増殖を阻害することを示す。
【０３９６】
２つの別の実験を、３Ｃ５処置の効果を評価するために行った。３Ｃ５抗体で処置されたマウスは、リン酸緩衝溶液で処置されたマウスに比べると、血清ＰＳＡのレベルのより低い増加速度を示した（図６８ＡおよびＢ）。この結果は、３Ｃ５抗体が、腫瘍の増殖を阻害したことを示唆する。
【０３９７】
図６８Ａにおいて、各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝４）または３Ｃ５（ｎ＝５）を受けたマウスについての平均ＰＳＡレベルを表す。図６８Ｂにおいて、各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝６）または３Ｃ５（ｎ＝６）を受けたマウスについての平均ＰＳＡレベルを表す。
【０３９８】
３Ｃ５抗体で処置されたマウスは、ＰＢＳで処置されたマウス（図６９Ｂ）と比較して、長期の生存を示した（図６９Ａ）。第１の実験において、ＰＢＳ処置マウスの中間生存時間は、５２日（４５〜５９日の範囲）であり、これに比較して、３Ｃ５処置群における中間生存時間は、９２日以上（５９〜＋１２５日の範囲）（図６９Ａ）（１匹のマウスはまだ生存している）であった。第２の実験において、ＰＢＳ処置マウスにおける中間生存時間は、４３日（２９〜５７日の範囲）であり（図６９Ｂ）、これに比較して、３Ｃ５処置マウスにおける中間生存時間は、５７．５日（３３〜８２日の範囲）であった。
【０３９９】
腫瘍増殖の阻害は、長期の生存に関連した。まとめると、これらの結果は、３Ｃ５処置が、腫瘍の増殖を阻害し、それによって同所腫瘍保有マウスの生存時間を増加したことを実証した。従って、これらの結果は、３Ｃ５での処置が、腫瘍の増殖を阻害することによって、生存時間を増加したことを示す。
【０４００】
（実施例２５：）
単独またはドキソルビシンと組み合わされた抗ＰＳＣＡ抗体処置後の確立されたＰＣ３−ＰＳＣＡ腫瘍の増殖の阻害および長期の生存。
【０４０１】
以下の実施例は、１Ｇ８（抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体）が、ＳＣＩＤマウスにおいて増殖する確立された皮下のＰＣ３−ＰＳＣＡ前立腺腫瘍（ＡＩ）の増殖を阻害したことを実証する。さらに、１Ｇ８は、単独またはドキソルビシンと組み合わされて投与される場合、前立腺腫瘍の増殖を阻害した。さらに、１Ｇ８を用いた処置は、単独またはドキソルビシンと組合されて投与される場合に、これらのマウスの生存を延ばす。１Ｇ８およびドキソルビシンを用いた処置は、腫瘍の増殖および生存に対する相乗的な阻害効果を生じるようである。
【０４０２】
（ＰＳＣＡ発現ＰＣ３細胞）
ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞を、レトロウイルス遺伝子移入によって得た。簡潔には、ＰＳＣＡ  ｃＤＮＡを、レトロウイルスベクターｐＳＲ−α（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１  Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１７８５−１７９２）中に挿入した。アンホトロピックレトロウイルスを、ＰＳＣＡ含有ｐＳＲ−αおよびアンホトロピックエンベロープタンパク質含有レトロウイルスヘルパープラスミドでの２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションによって生成した。引き続いて、ＰＣ３細胞に、このＰＳＣＡ含有アンホトロピックレトロウイルスを感染させ、そして感染後４８時間目に、ＰＣ３細胞を、ネオマイシン類似体Ｇ４１８を含有する培地における増殖によって選択した。選択および増大の２〜３週間後、ウェスタンブロットを実施して、ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞がＰＳＣＡタンパク質を発現することを確認した。ＰＳＣＡを含まない空のベクターを感染させた、親のＰＣ３またはＰＣ３細胞は、両方ともＰＳＣＡタンパク質発現について陰性であった。
【０４０３】
（皮下注射）
ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞を、注射前に、Ｔ−１５０フラスコ内においてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖させた。細胞を、対数期まで増殖させ、収集し、洗浄し、カウントし、次いで、１：１の希釈度でマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）と混合し、そして氷上で維持した。注射のために、雄性ＩｃＲ−ＳＣＩＤマウスを、それらのフラスコ内で剪毛し、そして右側のフラスコにおいて、各マウスに、１００μｌ容量中約１×１０6細胞の単回皮下注射を与えた。ＰＣ３−ＰＳＣＡ腫瘍の増殖に次いで、増殖腫瘍のカリパス測定を行った。皮下注射後約９日目に腫瘍が１００〜２００ｍｍ3のサイズに到達した場合に、処置のためにマウスを選択した。腫瘍サイズを、注射後＋９日目、＋１５日目、＋２３日目、＋２９日目、＋３６日目、および＋４３日目に測定した。
【０４０４】
（ＰＢＳでの処置）
コントロールマウスを、約０．５〜０．８ｍｌのリン酸緩衝化溶液（Ｇｉｂｃｏ）で処置した（図６６ＡおよびＢ）。
【０４０５】
（１Ｇ８での処置）
１Ｇ８で処置されたマウスは、連続３週間にわたって１週間あたり３回、１ｍｇの１Ｇ８を投与された。
【０４０６】
（ドキソルビシンでの処置）
ドキソルビシンの最大耐量を決定するために、ＬＤ50実験を実施した。ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）を、滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。ドキソルビシンを、以下の用量：５０μｇ、２５μｇ、１２．５μｇ、および６．７５μｇで、腹腔内注射によって投与した。最高用量である５０μｇでは、すべてのマウスが２週間以内に死滅した。より低い用量範囲では、マウスは、４週間より長く生存した。最大耐量は２５μｇであった。
【０４０７】
ドキソルビシンのみで処置されたマウスは、連続３週間にわたって１週間あたり１回、２５μｇを投与された。
【０４０８】
（１Ｇ８およびドキソルビシンでの処置）
１Ｇ８およびドキソルビシンで処置されたマウスは、連続３週間にわたって１週間あたり３回、１ｍｇの１Ｇ８を投与され（図７０；１Ｇ８＝矢印）、そして連続３週間にわたって１週間あたり１回、２５μｇのドキソルビシンを投与された（図７０；ドキソルビシン＝（  ））。
【０４０９】
（結果−１Ｇ８単独での処置またはドキソルビシンとの組み合わせにおける１Ｇ８での処置は、腫瘍増殖の阻害を生じる）
抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体、１Ｇ８単独、またはドキソルビシンとの組み合わせにおける１Ｇ８で処置された、ＰＣ３−ＰＳＣＡ腫瘍保有マウスは、リン酸緩衝化溶液またはドキソルビシン単独で処置されたマウスと比較して、腫瘍増殖の減少を示した（図７０）。これらの結果は、１Ｇ８が、ＰＳＣＡを発現する腫瘍の増殖を阻害することを示す。これらの結果はまた、１Ｇ８とドキソルビシンとの組み合わせが、相乗作用的に、腫瘍増殖を阻害するように作用することを示唆する。
【０４１０】
各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝５）、ドキソルビシン（ｎ＝６）、１Ｇ８（ｎ＝６）、または１Ｇ８＋ドキソルビシン（ｎ＝６）を受容したマウスの平均腫瘍体積を示す。
【０４１１】
ドキソルビシンで処置されたマウスは、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して、わずかにより低い腫瘍増殖率を示した（例えば、４３日目に４％の増殖阻害）。対照的に、１Ｇ８抗体単独で処置されたマウスは、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して、腫瘍増殖率において、より大きな減少を示した（例えば、４３日目に２０％の増殖阻害）。１Ｇ８およびドキソルビシンの組み合わせで処置されたマウスは、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して、腫瘍増殖率において、わずかにより大きな減少を示した（例えば、４３日目に３６％の増殖阻害）。
【０４１２】
ＰＣ３−ＰＳＣＡ異種移植片を用いるこの皮下モデルにおいて、１Ｇ８単独での処置は、確立されたアンドロゲン非依存性腫瘍（例えば、ＰＣ３細胞は、ホルモン難治性である）における腫瘍増殖を効率的に阻害した。さらに、１Ｇ８とドキソルビシンとの組合せは、腫瘍増殖阻害効果の増大を示した。従って、１Ｇ８とドキソルビシンとの組合せでの処置は、ホルモン除去療法（ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）に失敗した、転移性疾患を有する前立腺癌患者に対する有効な治療的処置を示す。
【０４１３】
（実施例２６）
（抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体は循環し、そしてＰＳＣＡ発現腫瘍を標的化する）
１つの研究では、上記の実施例１８  Ｃ４に記載の確立された皮下ＬＡＰＣ−９  ＡＤ腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスを、コントロールマウスＩｇＧまたは記載のような３Ｃ５抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂのいずれかで処置した。３４日目（最後の抗体処置の６日後）に、マウスを屠殺し、そして腫瘍を外植した。異なる研究では、腫瘍保有ＳＣＩＤマウスを、コントロールマウスＩｇＧまたは１Ｇ８で処置した。両方の研究からの腫瘍サンプルにおける抗体の存在を、ウェスタンブロット分析または免疫組織化学（ＩＨＣ）のいずれかによって検出した。
【０４１４】
（免疫組織化学）
外植した腫瘍をホルマリン中で固定し、そして免疫組織化学分析のためにパラフィン中に包埋した（ＱｕａｌＴｅｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｂｓ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡによって実施された）。このパラフィンブロックをスライスし、このスライスをスライド上に固定し、そしてこのスライドを、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ、次いでペルオキシダーゼ酵素に結合体化されたアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で探索した。ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）色素原を使用して、この反応（これは、褐色沈殿を生じる）を現像した。引き続いて、スライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、次いで、カバーガラスをかけた。染色を、室温でＴｅｃｈＭａｔｅ  １０００自動化染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）において実施した（図７１）。
【０４１５】
（結果−免疫組織化学）
図７１は、３Ｃ５抗体が、コントロールＩｇＧ処置マウスではなく、３Ｃ５処置マウス由来のＬＡＰＣ−９  ＡＤ腫瘍に局在化したことを示す。さらに、抗体は、腫瘍全体を通して検出され得た。
【０４１６】
（ウェスタンブロッティング）
ＩｇＧ処置群および３Ｃ５処置群における３匹のマウス（例えば、上記実施例１８  Ｃ４に記載のようなマウス）から外植された腫瘍を、沸騰したＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解した。細胞溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動し、ニトロセルロースフィルターに転写し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で探索し、そして増強された化学発光によって可視化した。マウスＩｇＧコントロール抗体および３Ｃ５もまた、コントロールとしてゲルにおいて泳動した（図７２）。
【０４１７】
同様の実験において、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ皮下腫瘍保有マウスを、コントロールマウスＩｇＧまたは１Ｇ８抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂのいずれかで処置した。３０日目（最後の抗体処置の７日後）に、マウスを屠殺し、そして腫瘍を外植した。ウェスタンブロット分析を、各群の３匹のマウスから外植された腫瘍において実施した。この外植された腫瘍を、沸騰したＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解した。細胞溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動し、ニトロセルロースに転写し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で探索し、そして増強された化学発光によって可視化した。マウスＩｇＧコントロール抗体および１Ｇ８もまた、コントロールとしてゲルにおいて泳動した（図７３）。
【０４１８】
（結果−ウェスタンブロッティング）
図７２は、ＩｇＧの重鎖および軽鎖が、マウスＩｇＧコントロール処置マウスにおいてではなく、３Ｃ５処置マウス由来の腫瘍溶解産物において容易に検出され得たことを実証する。
【０４１９】
図７３は、ＩｇＧの重鎖および軽鎖が、マウスＩｇＧコントロール処置マウスにおいてではなく、１Ｇ８処置マウス由来の腫瘍溶解産物において容易に検出され得たことを実証する。
【０４２０】
これらの結果は、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂ（例えば、３Ｃ５および１Ｇ８）が、腫瘍保有マウスへの投与後に、循環し得、そしてＰＳＣＡ発現腫瘍を標的化し得ることを実証する。さらに、抗体の局在性は特異的であった。なぜなら、ＰＳＣＡを認識しないコントロールマウスＩｇＧには、腫瘍が存在しないか、または抗ＰＳＣＡ処置マウス由来の腫瘍と比較して非常に低いレベルで存在するかのいずれかであるからである。これらの結果は、抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂが、癌患者において、身体を通して循環し、そして原発性および転移性のＰＳＣＡ発現腫瘍に局在化する能力を有することを示唆する。さらに、結合体化された抗ＰＳＣＡ  ｍＡｂは、局所的に再発しかつ転移性の疾患に対して、ＰＳＡＣ発現腫瘍を局所で効率的に破壊し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【配列表】
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