(57)【要約】【課題】アジュバントとして、およびペプチド免疫原安定化剤として作用するように特異的に適合させた免疫刺激複合体の提供。【解決手段】正の正味電荷を有し、ターゲットＢ細胞又はＣＴＬエピトープ、及びＴヘルパー細胞エピトープを含有するカチオン性ペプチド免疫原；及びアニオン性ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷比が８：１〜１：２で含有する安定化免疫刺激複合体であって、前記複合体は、沈殿物である安定化免疫刺激複合体により、上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性ペプチド免疫原及びアニオン性ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有する安定化免疫刺激複合体であって、
前記カチオン性ペプチド免疫原は、ターゲットＢ細胞又はＣＴＬエピトープ、及びＴヘルパー細胞エピトープを含有し、該カチオン性ペプチド免疫原は、ｐＨ５．０〜８．０の範囲で、該ペプチド免疫原中のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）の各々に対して＋１の電荷、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）の各々に対して−１の電荷、及びその他のすべてのアミノ酸に対して０の電荷を割り当てることによって計算される正の正味電荷を有し、
前記アニオン性ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ｐＨ５．０〜８．０の範囲で負の正味電荷を有し且つシトシン−グアニジン部の繰り返しを有する８〜６４個のヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡであり、ＣｐＧ部の繰り返し数が１〜１０の範囲であり、
前記カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷比が８：１〜１：２の範囲であり、
前記複合体は、沈殿物である（ただし、以下のｉ）〜ｉｉｉ）の条件を全て満たす組合せは除く：
ｉ）前記カチオン性ペプチド免疫原が配列番号７、８及び９、並びにこれらの混合物からなる群から選ばれ、
ｉｉ）前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、5’ TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3’（ＣｐＧ１）（配列番号１）であり、
ｉｉｉ）複合体は、その平均粒径が１〜３０μｍの沈殿物である）、
上記安定化免疫刺激複合体。
【請求項２】
前記カチオン性ペプチド免疫原が合成ペプチド免疫原の混合物を有する請求項１記載の免疫刺激複合体。
【請求項３】
前記カチオン性合成ペプチド免疫原の正の正味電荷が少なくとも＋２である請求項１記載の免疫刺激複合体。
【請求項４】
合成ペプチド免疫原の混合物の正の正味電荷の平均が少なくとも＋２である請求項２記載の免疫刺激複合体。
【請求項５】
前記アニオン性オリゴヌクレオチドの負の正味電荷が少なくとも−２である請求項３又は４記載の免疫刺激複合体。
【請求項６】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが１８〜４８個のヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡであり、ＣｐＧ部の繰り返し数が３〜８である請求項１記載の免疫刺激複合体。
【請求項７】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、式５’Ｘ１ＣＧＸ２３’（式中、Ｃ及びＧは非メチル化であり；Ｘ１はＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）及びＴ（チミン）からなる群から選ばれ、Ｘ２はＣ（シトシン）又はＴ（チミン）である）を有する請求項１記載の免疫刺激複合体。
【請求項８】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、式５’（Ｘ３）２ＣＧ（Ｘ４）２３’（式中、Ｃ及びＧは非メチル化であり；Ｘ３はＡ、Ｔ又はＧからなる群から選ばれ、Ｘ４はＣ又はＴである）を有する請求項１記載の免疫刺激複合体。
【請求項９】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、5’ TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3’（ＣｐＧ１）（配列番号１）、３２塩基鎖長オリゴマー、及び5’nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3’（ＣｐＧ２）（配列番号２）、２４塩基鎖長オリゴマー＋ｎで示されるホスホロチオエート基からなる群から選ばれる請求項１記載の免疫刺激複合体。
【請求項１０】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、5’ TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3’（ＣｐＧ１）（配列番号１）である請求項９記載の免疫刺激複合体。
【請求項１１】
前記カチオン性ペプチド免疫原が、Ｔヘルパー細胞エピトープと共役した合成ペプチドである請求項９記載の免疫刺激複合体。
【請求項１２】
前記カチオン性ペプチド免疫原が、配列番号７、８及び９、並びにこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項１１記載の免疫刺激複合体。
【請求項１３】
カチオン性ペプチド免疫原及びアニオン性ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有する安定化免疫刺激複合体を調製する方法であって、
（ａ）ペプチド免疫原中のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）の各々に対して＋１の電荷、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）の各々に対して−１の電荷、及びその他のすべてのアミノ酸に対して０の電荷を割り当てることによってペプチド免疫原の電荷を測定し、ペプチド免疫原のＮ末端又はＣ末端に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、及びこれらの混合物からなる群から選ばれるアミノ酸を付加することによって、該ペプチド免疫原がｐＨ５．０〜８．０の範囲で正の電荷を有するように、該ペプチド免疫原の電荷を調整する工程；
（ｂ）ホスホジエステル又はホスホロチオレート基の各々に−１の電荷を割り当てることによってシトシン−グアニジン部の繰り返しを有する８〜６４個のヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡであり、ＣｐＧ部の繰り返し数が１〜１０の範囲であるＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷を測定し、ＣｐＧオリゴヌクレオチドがｐＨ５．０〜８．０の範囲で負の電荷を有するように、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの５’末端をホスホロチオレート基で修飾する工程；
（ｃ）蒸留脱イオン水、食塩水、ＰＢＳ及びこれらの混合物からなる群から選ばれる水相であって、該水相のｐＨが前記ペプチド免疫原のイオン化点よりも低い水相に前記カチオン性ペプチド免疫原を溶解するか又は分散する工程；
（ｄ）蒸留脱イオン水、食塩水、ＰＢＳ及びこれらの混合物からなる群から選ばれる水相に前記アニオン性ＣｐＧオリゴヌクレオチドを溶解する工程；
（ｅ）前記カチオン性ペプチド免疫原の溶液又は分散液に、水相中の前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷比が８：１〜１：２の範囲で、前記ペプチド免疫原と前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの安定化免疫刺激複合体を形成する量で滴下する工程；を有し、
前記複合体は、沈殿物である（ただし、以下のｉ）〜ｉｉｉ）の条件を全て満たす組合せは除く：
ｉ）前記カチオン性ペプチド免疫原が配列番号７、８及び９、並びにこれらの混合物からなる群から選ばれ、
ｉｉ）前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、5’ TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3’（ＣｐＧ１）（配列番号１）であり、
ｉｉｉ）複合体は、その平均粒径が１〜３０μｍの沈殿物である）、
上記方法。
【請求項１４】
工程（ｅ）により得られた免疫刺激複合体の懸濁液の水相を除去する工程をさらに有する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記水相を、凍結乾燥又はスプレードライによって除去する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
免疫刺激複合体が、平均粒径１〜５０μｍを有する請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
添加するペプチド免疫原及びＣｐＧオリゴヌクレオチドの量が、カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドが４：１の範囲での電荷比である請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１８】
添加するペプチド免疫原及びＣｐＧオリゴヌクレオチドの量が、カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドが２：１の範囲での電荷比である請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１９】
添加するペプチド免疫原及びＣｐＧオリゴヌクレオチドの量が、カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドが１．５：１の範囲での電荷比である請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項２０】
添加するペプチド免疫原及びＣｐＧオリゴヌクレオチドの量が、カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドが１：１の範囲での電荷比である請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項２１】
カチオン性ペプチド免疫原及びアニオン性ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有する免疫刺激複合体を含有する油中水滴型（water-in-oil）エマルションの調製方法であって、
（ａ）ペプチド免疫原中のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）の各々に対して＋１の電荷、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）の各々に対して−１の電荷、及びその他のすべてのアミノ酸に対して０の電荷を割り当てることによってペプチド免疫原の電荷を測定し、ペプチド免疫原のＮ末端又はＣ末端に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる基を付加することによって、該ペプチド免疫原がｐＨ５．０〜８．０の範囲で正の電荷を有するように、該ペプチド免疫原の電荷を調整する工程；
（ｂ）ホスホジエステル又はホスホロチオレート基の各々に−１の電荷を割り当てることによってシトシン−グアニジン部の繰り返しを有する８〜６４個のヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡであり、ＣｐＧ部の繰り返し数が１〜１０の範囲であるＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷を測定し、ＣｐＧオリゴヌクレオチドがｐＨ５．０〜８．０の範囲で負の電荷を有するように、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの５’末端をホスホロチオレート基で修飾する工程；
（ｃ）蒸留脱イオン水、食塩水、及びリン酸緩衝食塩水からなる群から選ばれる水相に、沈殿物である免疫刺激複合体を調製する工程；
（ｄ）合成油、植物油、鉱油、代謝可能な動物油（metabolizable animal oil）及びこれらの混合物からなる群から選ばれる連続油相に前記水相中の免疫刺激複合体を加える工程；
（ｅ）機械的せん断下で、前記水相中の免疫刺激複合体を連続油相に分散させて均質な油中水滴型エマルションを形成する工程；を有し、
前記カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷比が８：１〜１：２の範囲である（ただし、以下のｉ）〜ｉｉｉ）の条件を全て満たす組合せは除く：
ｉ）前記カチオン性ペプチド免疫原が配列番号７、８及び９、並びにこれらの混合物からなる群から選ばれ、
ｉｉ）前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、5’ TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3’（ＣｐＧ１）（配列番号１）であり、
ｉｉｉ）複合体は、その平均粒径が１〜３０μｍの沈殿物である）、
上記方法。
【請求項２２】
（ａ）第１のシリンジに免疫刺激複合体を含む前記水相を充填する工程；
（ｂ）第２のシリンジに対数粘度数１，５００ｍＰａ未満の前記油相を充填する工程；
（ｃ）第１及び第２のシリンジを、細管を介して制御孔径（０．０５〜２０μｍ）の膜を内蔵する膜支持体までつなぐ工程；及び
（ｄ）均質なｗ／ｏエマルションが形成されるまで、膜を介して交換を繰り返すことにより前記水相を油相へと押し出す工程；を有する、請求項２１記載の油中水滴型（water-in-oil）エマルションの調製方法。
【請求項２３】
前記油相は、医薬グレードの鉱油を伴う天然の代謝可能な動物油中の精製乳化剤；不完全フロイントアジュバント（Incomplete Freund’s Adjuvant）の化学特定物；鉱油及びマンニド・オレイン酸（mannide oleate）、並びにこれらの混合物からなる群から選ばれる代謝可能又は代謝不能な油からなる群から選ばれる請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２４】
前記水相は、界面活性剤、エマルション安定化剤、又はこれらの組合せをさらに含有する請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２５】
前記エマルション安定化剤は、マンニド−オレイン酸（mannide-oleate）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記油相は、3-O-デスアシル-4’-モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（ＭＤＰ）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、N,N-ジオクタデシル-N’,N’-ビス（2-ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（アブリジン（Avridine））、N-（2-デオキシ-2-1-ロイシルアミノ-β-D-グルコピラノシル）-N-オクタデシル-ドデカノイルアミド・ハイドロアセテート（ベイ−１００５（BAY-1005））、３β-［N-（N,N’-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ＮＡｃ-Ｍｕｒ-L-Ｔｈｒ-D-isoＧｌｎ-sn-グリセロール・ジパルミトイル（ムラパルミチン（Murapalmitine））及びこれらの誘導体からなる群から選ばれるアジュバントをさらに含有する請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２７】
前記水相は、ＰＣＰＰ、サポニン、コレラ毒、大腸菌（E.Coli）由来の熱不安定性エンテロトキシン並びにＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びこれらの誘導体からなる群から選ばれるサイトカインからなる群から選ばれる水溶性アジュバントをさらに含有する請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２８】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）をさらに含有する請求項１４記載の方法：
（ａ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、N-メチルピロリジン（ＮＭＰ）、トリアセチン、及びグリセリンからなる群から選ばれる生体適合性溶媒中のポリ-D,L-ラクチド-コグリコリド共重合体、ポリ-D,L-乳酸-コポリ-D,L-コ-グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、およびポリ（α−ヒドロキシ酪酸）からなる群から選ばれるin-situゲル化ポリマーの溶液を調製する工程；
（ｂ）生体適合性溶媒中のin-situゲル化ポリマーの溶液内で乾燥状態の免疫刺激複合体を再構成する工程。
【請求項２９】
（ｂ）工程において、用いた乾燥状態の免疫刺激複合体を凍結乾燥により得た請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリマーが以下の式（式中、Ｒ１はＯＨ又は炭素１〜５個のアルコキシであり、Ｒ２はＨであり；ｘ：ｙは共重合体の各々のモノマーユニットの比であり、ｘ＋ｙ＝１である）で表され、且つ前記ポリマーが生分解性である請求項２８記載の方法。
【化１】
2010265291.tif 000013
【請求項３１】
前記コポリマーは、分子量が２，０００〜１００，０００ダルトンの範囲であり、且つ対数粘度数が０．１〜１．０ｄｌ／ｇである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
生体適合性溶媒に溶解した前記in-situゲル化ポリマーの重量が５ｗ／ｗ％〜５０ｗ／ｗ％であり、前記in-situゲル化ポリマーが生分解性である請求項２８又は２９記載の方法。
【請求項３３】
前記生体適合性溶媒中に、3-O-デスアシル-4’-モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（ＭＤＰ）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、N,N-ジオクタデシル-N’,N’-ビス（2-ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（アブリジン（Avridine））、N-（2-デオキシ-2-1-ロイシルアミノ-β-D-グルコピラノシル）-N-オクタデシル-ドデカノイルアミド・ハイドロアセテート（ベイ−１００５（BAY-1005））、３β-［N-（N,N’-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ＮＡｃ-Ｍｕｒ-L-Ｔｈｒ-D-isoＧｌｎ-sn-グリセロール・ジパルミトイル（ムラパルミチン（Murapalmitine））及びＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びこれらの誘導体からなるサイトカインからなる群から選ばれる油溶性アジュバントを溶解させる工程をさらに有する請求項２８又は２９記載の方法。
【請求項３４】
カチオン性ペプチド免疫原及びアニオン性ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有する免疫刺激複合体を有する懸濁液の調製方法であって、
（ａ）ペプチド免疫原中のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）の各々に対して＋１の電荷、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）の各々に対して−１の電荷、及びその他のすべてのアミノ酸に対して０の電荷を割り当てることによってペプチド免疫原の電荷を測定し、ペプチド免疫原のＮ末端又はＣ末端に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる基を付加することによって、該ペプチド免疫原がｐＨ５．０〜８．０の範囲で正の電荷を有するように、該ペプチド免疫原の電荷を調整する工程；
（ｂ）ホスホジエステル又はホスホロチオレート基の各々に−１の電荷を割り当てることによってシトシン−グアニジン部の繰り返しを有する８〜６４個のヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡであり、ＣｐＧ部の繰り返し数が１〜１０の範囲であるＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷を測定し、ＣｐＧオリゴヌクレオチドがｐＨ５．０〜８．０の範囲で負の電荷を有するように、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの５’末端をホスホロチオレート基で修飾する工程；
（ｃ）蒸留脱イオン水、食塩水及びリン酸緩衝食塩水からなる群から選ばれる水相中で、沈殿物である前記免疫刺激複合体を調製する工程；
（ｄ）蒸留脱イオン水、食塩水及びリン酸緩衝食塩水からなる群から選ばれる水相中の、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびリン酸カルシウムからなる群から選ばれる無機塩の懸濁液を調製する工程；
（ｅ）水相中の免疫刺激複合体を無機塩懸濁液を含む水相へ添加する工程；
（ｆ）免疫刺激複合体を無機塩懸濁液と混合して混合懸濁液を形成する工程を有し、
前記カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷比が８：１〜１：２の範囲である（ただし、以下のｉ）〜ｉｉｉ）の条件を全て満たす組合せは除く：
ｉ）前記カチオン性ペプチド免疫原が配列番号７、８及び９、並びにこれらの混合物からなる群から選ばれ、
ｉｉ）前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、5’ TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3’（ＣｐＧ１）（配列番号１）であり、
ｉｉｉ）複合体は、その平均粒径が１〜３０μｍの沈殿物である）、
上記方法。
【請求項３５】
カチオン性ペプチド免疫原及びアニオン性ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有する免疫刺激複合体を有する懸濁液の調製方法であって、
（ａ）ペプチド免疫原中のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）の各々に対して＋１の電荷、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）の各々に対して−１の電荷、及びその他のすべてのアミノ酸に対して０の電荷を割り当てることによってペプチド免疫原の電荷を測定し、ペプチド免疫原のＮ末端又はＣ末端に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる基を付加することによって、該ペプチド免疫原がｐＨ５．０〜８．０の範囲で正の電荷を有するように、該ペプチド免疫原の電荷を調整する工程；
（ｂ）ホスホジエステル又はホスホロチオレート基の各々に−１の電荷を割り当てることによってシトシン−グアニジン部の繰り返しを有する８〜６４個のヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡであり、ＣｐＧ部の繰り返し数が１〜１０の範囲であるＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷を測定し、ＣｐＧオリゴヌクレオチドがｐＨ５．０〜８．０の範囲で負の電荷を有するように、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの５’末端をホスホロチオレート基で修飾する工程；
（ｃ）蒸留脱イオン水、食塩水及びリン酸緩衝食塩水からなる群から選ばれる水相中で配列番号４〜１３からなる群から選ばれるペプチド免疫原の溶液を調製する工程；
（ｄ）蒸留脱イオン水、食塩水及びリン酸緩衝食塩水からなる群から選ばれる水相中の、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびリン酸カルシウムからなる群から選ばれる無機塩の懸濁液を調製する工程；
（ｅ）混合しながらペプチド溶液を無機塩懸濁液へ添加する工程；
（ｆ）混合しながら配列番号１及び配列番号２からなる群から選ばれるＣｐＧヌクレオチドを添加し免疫刺激複合体と無機塩との混合懸濁液を形成する工程を有し、
前記カチオン性ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷比が８：１〜１：２の範囲であり、
得られる複合体は、沈殿物である（ただし、以下のｉ）〜ｉｉｉ）の条件を全て満たす組合せは除く：
ｉ）前記カチオン性ペプチド免疫原が配列番号７、８及び９、並びにこれらの混合物からなる群から選ばれ、
ｉｉ）前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、5’ TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3’（ＣｐＧ１）（配列番号１）であり、
ｉｉｉ）複合体は、その平均粒径が１〜３０μｍの沈殿物である）、
上記方法。
【請求項３６】
無機塩がリン酸アルミニウムゲル；水酸化アルミニウムゲル；及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項３４又は３５記載の方法。
【請求項３７】
水相が、界面活性剤、等張剤（tonifier）、保存剤又はこれらの組合せをさらに有する請求項３４又は３５記載の方法。
【請求項３８】
水相が、ＰＢＳ又は食塩水及びこれらの混合物からなる群から選ばれる等張剤を有する請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
水相に、2-フェノキシ-エタノール及びこの誘導体からなる群から選ばれる保存剤を添加する工程をさらに有する請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
水相に、3-O-デスアシル-4’-モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（ＭＤＰ）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、N,N-ジオクタデシル-N’,N’-ビス（2-ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（アブリジン（Avridine））、N-（2-デオキシ-2-1-ロイシルアミノ-β-D-グルコピラノシル）-N-オクタデシル-ドデカノイルアミド・ハイドロアセテート（ベイ−１００５（BAY-1005））、３β-［N-（N,N’-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ＮＡｃ-Ｍｕｒ-L-Ｔｈｒ-D-isoＧｌｎ-sn-グリセロール・ジパルミトイル（ムラパルミチン（Murapalmitine））、ＰＣＰＰ、サポニン（saponin）、コレラ毒、大腸菌（E. Coli）由来の熱不安定性エンテロトキシン、並びにＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びこれらの誘導体からなる群から選ばれるサイトカインからなる群から選ばれるアジュバントを添加する工程をさらに有する請求項３４又は３５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定化免疫刺激複合体（stabilized immunostimulatory complex）および安定化免疫刺激複合体の調製方法に関する。特に、本発明は、インビボでの向上した免疫応答を有する、ワクチンデリバリーシステムに有用な安定化合成免疫刺激複合体を提供する。これらの免疫刺激複合体はまた、該免疫刺激複合体の放出を調節するための貯蔵庫（depot）として機能するように設計されたワクチン配合物を調製するのにも有用である。また、誘導される免疫応答の質を相乗的に改善するために特定の細胞型をターゲットとするように設計された配合物に免疫刺激複合体を組み込むこともできる。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、感染性疾患の防御のための予防用組成物として、さらに最近では、ガンおよび非感染性疾患の処置のための治療用組成物として、長年、成功裡に用いられている。
【０００３】
伝統的にはワクチンは弱毒もしくは死滅ウイルスまたは細菌病原体に由来し、ポリオウイルスおよび百日咳菌（Bordetella pertussis）のような疾患に対して非常に有効であることが判明している。これらの成功にもかかわらず、このようなワクチンの安全性に対する懸念が高まっている。このため、これらの病原体または完全に合成されたペプチド免疫原の成分に由来するサブユニットワクチンの開発が進められている。
【０００４】
サブユニットワクチンの例として、破傷風トキソイドおよびＢ型肝炎表面抗原などがある。これらの抗原は、しばしば免疫原性が乏しく、得られる免疫応答を向上させるためにアジュバントが必要とされる。十分特徴づけされた生物学的に活性な化合物、例えば合成ペプチドは、生物学的応答の誘導、安全性および制御目的で好ましい基質である。しかしながら、これらの免疫原は最適ではなく、動物モデルにおいて部分的かまたはごくわずかな応答しか誘導しない。合成ペプチドには、インビボで有効な免疫応答を誘導するために安定性およびアジュバント作用の双方が必要とされる。
【０００５】
種々の方法を用いて、化学的および物理学的経路などの種々の過程により媒介されるインビトロおよびインビボでの分解に対して合成ペプチド免疫原を保護している１。（上付き数字は本発明に関連する当分野の状況をさらに十分に記載する出版物を意味する。これらの参照文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる。各文献の引用はこのセクションの末尾に見出される）。
【０００６】
種々の方法を用いて、ペプチド溶解性を改善するか、またはインビボでの分解に対してペプチドを保護している２。これには一般的には塩濃度および／または溶液のｐＨを修飾するような単純な方法が含まれる。ペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）のような水溶性化合物と結合することによって化学修飾して、双方共にその水溶性およびインビボ循環時間を改善させている３。ＰＥＧまたはＰＥＯ由来のアジュバントは、免疫系を下方制御し得ることが実証されている４。よって、ＰＥＧまたはＰＥＯ修飾ペプチドは、アジュバントとして効果的に機能しないと予測される。ペプチドに電荷を加えるために複数のリジンを付加することによりその水溶性を改善することができるが、一般に、結果的に免疫原性が改善されることはない。
【０００７】
これらの種々の試験計画の目的はインビボで循環時間を改善するか、又はペプチドをワクチン配合物に用いる場合の物理学的条件（例えば塩、ｐＨ、温度、バッファ型）及び／又は化学的不適合性に伴う免疫原性の問題を最小限にするか又は排除することである。
【０００８】
多価カチオン性ポリマーを含むポリエーテルブロック共重合体がKabanovら、米国特許第5,656,611号５に開示されている。これらは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを安定化するためのものである。ポリエーテルブロック共重合体−ポリヌクレオチド複合体を用いて細胞膜を通るポリヌクレオチドの輸送を促し、生物学的活性を改善する。しかしながら、これらのポリヌクレオチド−ポリエーテルブロック共重合体は、免疫原性ではなく、ワクチンとしては適さない。
【０００９】
Allcockら、米国特許第5,562,909号６は、ホスファゼン（phosphazen）多価電解質に由来する免疫アジュバントについて記載している。免疫アジュバントを溶液中で抗原と直接混合し、ポリマーおよび抗原の溶液をスプレードライすることにより、又はCohen、米国特許第5,149,543号７に記載される方法により、微粒子として調製することができる。しかしながら、アジュバント作用の増強がこれらの系で示されたが、面倒な機械的方法をもちいなければならず、微粒子組成物を調製するのが困難であり、市販用製品のために規模を拡大することは困難であろう。さらに、このように形成されたポリマー−抗原複合体の安定性は、塩濃度およびｐＨ条件に大きく依存する。
【００１０】
異なる研究法が、Mossら、ＷＯ９１／０４０５２号８に記載されている。ここで、固体ワクチン組成物は、抗原（ペプチドでよい）、サポニンおよび多価カチオン性アジュバント、例えばＤＥＡＥデキストランから調製される。この組合せから配合されたワクチンは、寿命が改善されており、移植片として使用するのに適するような組合せになっている。しかしながら、抗原は、最初にキャリャー分子に化学的に抱合され、徹底的に精製されなければならない。その後、精製された抗原−キャリヤをサポニンおよび多価カチオン性アジュバントと組合せて固体組成物がもたらされた。この方法により製品の物理特性、例えば粒径は調節されない。
【００１１】
ヒトおよび獣医学用ワクチンと共に使用することになっている多くのアジュバントおよび／または貯蔵庫（depot）をベースとした非経口、粘膜または経皮デリバリーシステムが、免疫応答を増強するように開発されている。これには、無機塩類、油中水滴型（water-in-oil）（ｗ／ｏ）エマルション、リポソーム、ポリマー微粒子、ナノ粒子およびゲル／ヒドロゲルの使用が含まれている９。種々の（ｗ／ｏ）エマルション組成物を用いる臨床試験が数多く行われている。
【００１２】
臨床研究を非常に多く行っているにもかかわらず、皮下または筋内に投与される典型的な非経口用配合物は、アルミニウム塩、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム由来のアジュバントと共に調製される。ミョウバン塩は、弱毒病原体、死滅病原体および生物学的物質由来のサブユニット抗原をベースとする多くのワクチンに適し、且つ有効である。しかしながら、アルミニウムをベースとしたアジュバントは、必要とされるペプチドが多量であり、より強力なアジュバント作用が必要であるために、しばしば合成ペプチドをベースとした免疫原に関して全く無効である。ワクチン組成物における多量の免疫原とアジュバント作用の弱いミョウバンとの組合せは、免疫原耐性および反応原性（reactogenicity）、即ち不所望の副作用、例えば注射部位の腫脹および発赤に至る可能性があるので、理想的ではない。
【００１３】
界面活性剤を含む鉱油中加熱死滅化ヒト型結核菌(M. tuberculosis)ミコバクテリアの懸濁液であるフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）は、最も強力なアジュバントの１つとして認識されている。しかしながら、注射部位の軽微な刺激から損傷および無菌性膿瘍にわたる重篤な副作用が報告されている。これらの副作用のためにＦＣＡは、ヒトおよび獣医学用適用が禁じられている。
【００１４】
よって、ミョウバン又はＦＣＡに伴う毒性及び／又は反応原性（reactogenic）の問題がなく、安全であり、免疫原性を効果的に増強することができ、且つペプチド免疫原の有効性を長期化させてミョウバンに伴う耐性の問題を回避できるアジュバントを開発する明確な必要性がある。また、単一の組成物でペプチド免疫原の安定化することができ且つ免疫応答のアジュバント作用化（adjuvant）できる組成物及び方法を開発することも非常に望まれている。
【００１５】
Jonesら１０は、Ａｏｔｕｓサルでペプチドをベースとしたマラリアワクチンと同時投与して免疫応答を増強させることができる２つの特異的ＣｐＧオリゴヌクレオチドを開示している。Jonesの研究では、用いたペプチドのイオン化点（ＩＰ）は５．９６である。これは、ペプチドが理論的ゼロ電荷を有するｐＨに相当する１１。そのアミノ酸組成のために、用いたペプチドは、選択した水性溶媒中、生理学的ｐＨで有効に非荷電性である。よって、２つのＣｐＧオリゴマー間で複合体形成は起こり得ない。得られた混合物は、ｗ／ｏエマルションに配合された場合、一過性にアジュバント作用化することが予測される。有用なレベルの免疫原性を達成するために複数回の注射及び多量のアジュバントが必要とされる。さらに、このような組成物の長期安定性は疑わしい。実際、Jonesらは、１度の注射に際し５００μｇという多量のＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いる必要があると開示した。なお、ｗ／ｏエマルションを調製するために用いた方法は、市販適用のために容易に規模を拡大することができない。異なるＣｐＧオリゴマーが異なる哺乳動物種に有用であることをJonesらが教示したことに留意すべきである。例えば、ＣｐＧオリゴマーであるＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６は、マウスおよび下等霊長類に関しては分裂促進性であるが、チンパンジーまたはヒトに関しては分裂促進性でなく、その効果は予見できない。
【００１６】
Kriegら、米国特許第6,194,388B1号１２は、抗原と混合した場合、免疫応答を刺激する能力をベースとする治療適用に特に有用である非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドを記載している。Kriegら、米国特許第6,207,646B1号１３は、非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドを使用してＴｈ２応答をＴｈ１応答に方向転換することについてさらに記載している。双方において、Ｂ細胞をホスホロチオエート修飾ＣｐＧオリゴマーと共に培養したＢ細胞刺激によりＣｐＧオリゴマーの有効性が示された。ＣｐＧオリゴマーをどのように使用して安定化した免疫刺激複合体又はワクチンを提供できるかに関しては開示も示唆もなされていない。
【００１７】
別の分野の強い興味および研究は、代替のデリバリールート、例えば粘膜、経皮または経口用に合成免疫原を配合する方法に集中している。粘膜免疫は、外分泌（例えば腸、気管支または鼻洗浄）で見出される分泌性免疫グロブリン（ｓＩｇＡ）の誘導により媒介される。ワクチンの経皮または粘膜デリバリーは、粘膜表面を介して入り込む大部分の病原体生物に有効であると考えられている。例えば経口投与されたコレラワクチンは、非経口投与された類似物よりもはるかに優れていることが示されている１４。
【００１８】
Friedeら、ＷＯ９９／５２５４９号１５は、粘膜使用を意図したワクチン組成物を主要アジュバントであるポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステルと抗原との組合せから誘導することができると教示している。標的抗原は、合成ペプチドであると示唆された。Friedeらは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドをワクチン組成物に添加することにより応答が改善されることも示唆している。彼らは、ポリオキシエチレンエーテル又はポリオキシエチレンエステルとＣｐＧオリゴヌクレオチドとの組合せが、抗原と同時に投与された場合、粘膜応答を改善できることを示した。しかしながら、その結果によりＣｐＧオリゴヌクレオチドと記載した抗原との単純な混合物からアジュバント作用が全く欠如していることが示された。
【００１９】
経皮投与されたワクチンは、最近の興味の分野を提示している。理想的には、装置、即ちパッチまたは針不要のジェット式注射器を用いて皮内ランゲルハンス細胞、即ち樹状細胞を標的化することができる。これらの特異性細胞は、免疫原の効率的な処理および提示に寄与し、全身体液性および細胞性応答を直接誘導するのに用いることができる。経皮方法により筋肉内免疫が達成された例もあった１６。例えば最近の新聞では、パッチとして投与されるジフテリアワクチンについて記載された。アジュバントと同時投与された場合、種々の組成物に関してジフテリアトキソイドに対する全身抗体が見出された１７。
【００２０】
先行技術により種々のワクチン配合物の可能性が例示されているが、粘膜または経皮デリバリーのための合成ペプチドをベースとしたワクチン配合物の開発に関して多くの現実的な制限がある。これには、
１）粘膜表面での又は皮内での粘膜液もしくは分泌物および／またはタンパク質分解酵素による免疫原分解；
２）粘膜上皮を通って、または皮内層を介する極わずかな吸収；および
３）適当なレベルの免疫応答を誘導するのに必要な濃度以下の濃度への免疫原の希釈；
などがある。
【００２１】
単一のワクチン組成物で合成ペプチドをベースとした免疫原を安定させ且つアジュバント作用化させる計画はほとんど存在しない。このような組成物は、非常に効果的な非経口、粘膜、または経皮用ペプチドベースのワクチンの開発に必須である。
【００２２】
必要な投与回数を減らすために免疫原応答の期間を長期化させるのも望まれている。これによりコンプライアンスの改善およびワクチン接種に関する全体的な経費の低減がなされる。
【００２３】
種々の方法を用いて合成ペプチドベースの免疫原にアジュバント作用を行うことができるが、通常長期間有効な免疫原応答のためにキャリヤまたは貯蔵庫（depot）系が必要である。注目される例として、免疫原を無機塩またはゲルに吸収させることなどがある。例えば、ペプチド免疫原をポリマーマトリックス（モノリシックマトリックス）またはゲル内に封入するか、またはペプチド免疫原（コア・シェル）の周りにポリマーマトリックスを積層するのが有効な戦略であろう。または、免疫原をリポソームまたは小胞型の配合物に組み込むことができ、免疫原は脂質マトリックスに包埋されているか、または物理学的に内部水相に捕捉されているかのいずれかである。別の戦略は、鉱物ベース、植物ベース又は動物ベースの油を用いて、種々の比率の免疫原の水溶液と共に、油中水滴型（ｗ／ｏ）エマルションまたは水中油中水滴型（water-in-oil-in-water）（ｗ／ｏ／ｗ）二重エマルションを調製するのがよい１８。
【００２４】
多様な粒径、形態、表面疎水性および残基表面電荷が検討すべき可能性ある配合物依存性変数である。これらのパラメータの調節が、非経口投与を介するミクロンの大きさの粒子のファゴサイトーシスに１９、２０、および経口デリバリのための腸管内のパイエル板の特異的Ｍ細胞での粒子状物質の取り込みに２１、２２重要であることが解っている。同様に、これらのパラメータは、鼻内デリバリのターゲットである鼻咽頭管の鼻随伴リンパ節組織への接近に重要であることが示されている２３、２４。
【００２５】
Kroneら、米国特許第5,700,459号２５は、複合化物質がポリマーである、ポリ酸およびポリ塩基に由来する微粒子形態の多価電解質複合体の使用について記載している。これらの複合体の種々の用途が記載されており、抗原または抗原性ペプチドを含むワクチン組成物が含まれる。組成物には生分解能のある材料を用いた放出制御配合物もある。一例として、多価電解質複合体微粒子に抗原を組み込む方法が記載されている。しかしながら、１００μｍのサイズの粒子の混合物を約１〜４μｍまで粉砕して微粒子を調製するために記載された機械的な方法は面倒である。これは市販用製品のために容易に規模拡大できない。
【００２６】
Eldridgeら２６は、抗原をインビボで放出制御するための、ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド共重合体から製造されたポリマー性生分解性マイクロスフェアを開発した。微粒子に抗原を封入するのに有用であると開示されたポリマーには、ポリ-D,L-ラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリオルトエステルおよびポリ（α−ヒドロキシ酪酸）などがある。
【００２７】
抗原の放出制御は先行技術で達成されたが、記載した方法により微粒子が製造される場合、困難に遭遇した。記載した方法は規模拡大するのが困難である。また、生物学的材料が有機溶媒に暴露されること及び機械的処理されることにより変性に至る可能性があり、封入の効率が低から中程度になる。さらに、記載方法では親水性抗原は封入の効率が悪い。
【００２８】
Henryら、米国特許第5,126,141号および第5,135,751号２７、２８は、肉体の損傷部分に適用するために付着を避けるためのポリオキシアルキレン・ポリマーおよびイオン性多糖類から形成された水性熱可逆性ゲル組成物について記載した。Rosenbergら、ＷＯ９３／０１２８６号２９は、再狭窄の処置のための外科的に暴露された血管表面に、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを局所デリバリするために同一型のポリオキシアルキレン・ポリマーを用いることを記載した。HenryらもRosenbergらも、ワクチンとしてゲル組成物を用いることを教示も示唆もしていない。
【００２９】
Dunnら、米国特許第4,938,763号および第5,702,716号３０、３１は、生物学的に活性な材料の放出制御に有用なポリマー性組成物について記載している。生体適合性溶媒を用いて、注射時にin-situゲル化により移植体形成に至る、直接非経口注射のための抗原の溶液または懸濁液を調製した。小型合成ペプチドベースの免疫原などの種々の抗原の利用性が特許請求の範囲に記載された。しかしながら、Dunnら、米国特許第5,702,716号３１は、放出制御組成物が１５重量％までのゲル化速度遅延化剤を必要とすると記載した。遅延化剤は、ゲル化速度を変調するために添加され、且つ抗原の捕捉効率を高めるために必要であり、インビボで容易に抽出される。溶媒抽出は主に拡散により支配されるので、これは大きなサブユニットまたはタンパク質ベースの抗原よりも小型合成免疫原に関してより多くの問題を提示している。
【００３０】
米国特許第4,938,763号３０も、米国特許第5,702,716号３１も、生体適合性溶媒内に懸濁された免疫刺激複合体として安定化した合成ペプチドベースの免疫原を教示も示唆もしていなかった。さらに、米国特許第4,938,763号３０も、米国特許第5,702,716号３１も、自己アジュバント作用があり、初回抗原刺激相および追加免疫相の双方で免疫応答を上方制御できる組成物を教示も示唆もしていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明の目的は、インビボで自己アジュバント特性を有する、合成ペプチド免疫原および安定化分子からの安定した免疫刺激複合体を開発することにある。また、本発明の目的は、インビトロおよびインビボで合成ペプチド免疫原を安定化させる単純な方法を提供することにある。
【００３２】
また、本発明の目的は、これらの安定化合成ペプチドベースの免疫刺激複合体に適合する持続した、または制御された放出分配ベヒクルを提供することにある。
【００３３】
また、本発明の目的は、保護応答などの免疫応答の相乗的増強を達成するための放出制御デリバリーシステムにおいて、安定化合成ペプチドベースの免疫刺激複合体および複合化されていない免疫原の組合せを用いる配合物を開発することにある。
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【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明はカチオン性ペプチドおよびアニオン性分子またはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを有する安定化免疫刺激複合体、並びに電解質会合を介したアニオン性分子またはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの複合化によりカチオン性ペプチドを安定化させるための方法に関する。安定化免疫刺激複合体を免疫原デリバリーシステムとして医薬用組成物に組み込むことができる。
【００３５】
本明細書で記載する「カチオン性ペプチド」は、ｐＨ５．０〜８．０の範囲で正に荷電したペプチドを意味する。リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）の各々に＋１の電荷を、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）の各々に−１の電荷を、配列内のその他のアミノ酸に０の電荷を割り当てることによりペプチドまたはペプチドカクテルの正味電荷を計算する。各ペプチドのＮ末端アミン（＋１）およびＣ末端カルボキシル（−１）末端基からの電荷寄与は、置換されない場合、互いに効果的に相殺される。電荷は各ペプチドで合計され、平均正味電荷として表される。適当なペプチド免疫原は＋１の正の平均正味電荷を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は＋２以上の範囲の正の正味電荷を有する。
【００３６】
ペプチド免疫原はＢ細胞エピトープおよびＴｈエピトープを有する。Ｔｈエピトープはペプチドに固有であるか、または先行技術で記載されたようにそこに付加され得る。適当なペプチド免疫原は本明細書の以下に記載する。
【００３７】
本明細書で記載する「アニオン性分子」は、ｐＨ５．０〜８．０の範囲で負に荷電した分子を意味する。オリゴマーまたはポリマーの負の正味電荷は、オリゴマーの各リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート基に−１の電荷を割り当てることにより計算される。適当なアニオン性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフの繰り返し数を１〜１０の範囲で有する、８〜６４個のヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激一本鎖ＤＮＡは、ＣｐＧモチーフの繰り返し数を３〜８の範囲で有する、１８〜４８個のヌクレオチド塩基を含む。
【００３８】
さらに好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’Ｘ１ＣＧＸ２３’（式中、ＣおよびＧは非メチル化であり；Ｘ１はＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）およびＴ（チミン）からなる群から選択され；Ｘ２はＣ（シトシン）またはＴ（チミン）である）で表される。または、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’（Ｘ３）２ＣＧ（Ｘ４）２３’（式中、ＣおよびＧは非メチル化であり；Ｘ３はＡ、ＴまたはＧからなる群から選択され；Ｘ４はＣまたはＴである）で表される。
【００３９】
最も好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＴ  ３’（ＣｐＧ１）配列番号１（３２塩基鎖長のオリゴマー）および５’ｎＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  Ｔ  ３’（ＣｐＧ２）配列番号２（２４塩基鎖長のオリゴマーにホスホロチオエート基（５’末端でｎと称される）を加えたもの）からなる群から選択される。
【００４０】
得られた免疫刺激複合体は典型的には、１〜５０ミクロンの範囲のサイズの粒子の形態であり、相対電荷化学量論および相互作用種の分子量などの多くの因子の関数である３２。粒子状免疫刺激複合体は、アジュバント作用およびインビボ特異的免疫応答の上方制御を提供する利点が加えられている。加えて、安定化免疫刺激複合体は、油中水滴型エマルション、無機塩懸濁液およびポリマー性ゲルなどの種々の方法によるワクチン配合物の調製に適している。
【００４１】
本明細書で用いる「安定化」なる用語は、インビトロまたはインビボでの分解に対して合成ペプチド免疫原を保護するいずれかの材料の使用により達成され得る。これは、化学的修飾および／または物理学的会合により達成され得る。安定化剤は、合成ペプチド免疫原、オリゴ糖修飾糖ペプチドまたは脂質結合ペプチドの生理学的特性を増大させてより有効な配合物を提供することができる。
【００４２】
本明細書で記載する「アジュバント」なる用語は、ヒトまたは動物における免疫原により引き出される免疫応答を増強または上方制御できるいずれかの材料を意味する。アジュバント自体は免疫原応答を誘導しても、しなくてもよい。
【００４３】
安定化剤はまた、ワクチン中でアジュバントとして機能し、免疫応答を効果的に上方制御するのも好ましい。安定化剤は、免疫系の処理専門細胞、例えばマクロファージおよび樹状細胞に対する免疫原の提示を積極的に促進することによりアジュバントとして作用することができる。本発明では、安定化免疫刺激複合体は、投与されたとき、理想的には溶液中に完全なユニットとして残存する。
【００４４】
安定化免疫刺激複合体は、放出制御用にも配合され、投与部位近くの「貯蔵庫（depot）」で濃縮された形態で複合体として残存することができる。これらの配合物は、免疫エフェクター細胞への免疫原の局所持続放出と合わせた安定化アジュバント免疫原の利点を相乗的に組合せている。ある組成物においては、アジュバント自体の役割はまた、免疫原貯蔵庫（depot）の近傍への免疫系の細胞の誘引作用に関与し、このような細胞を刺激し免疫応答を引き出すことができる。
【００４５】
本発明の第２の態様では、免疫刺激複合体を含むワクチン組成物を調製する方法が提供される。好ましい態様として、免疫刺激複合体は、インビトロで安定化した合成ペプチドベースの免疫原であることの利点が付与され、同時にインビボで特異的免疫応答の上方制御を伴う自己アジュバント作用を有する。
【００４６】
本発明の第３の態様では、免疫刺激複合体からワクチン組成物を調製する方法が提供される。免疫刺激複合体または複合化されていない免疫原と免疫刺激複合体との混合物を、溶液中の懸濁液、油中水滴型エマルション、無機塩懸濁液と組合せた懸濁液または生体適合性溶液で再構成された懸濁液として配合することができる。免疫刺激複合体は、単独で、または複合化されていない免疫原との混合物中で、ポリマー性ゲル中の生体適合性溶媒に協配合する（coformulate）こともできる。
【００４７】
本発明はさらに非経口、経口、鼻腔内、直腸、口腔、膣および経皮経路などの種々の経路により投与するための有用な免疫原デリバリーシステムの生成に関連する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の第１の態様に従って、カチオン性ペプチド免疫原は、アニオン性一本鎖ＤＮＡと複合化して安定な免疫刺激複合体を形成する。
【００４９】
カチオン性ペプチド免疫原は、ｐＨ５．０〜８．０の範囲で正の正味電荷を有するペプチドである。リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）の各々に＋１の電荷を、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）の各々に−１の電荷を、配列内のその他のアミノ酸に０の電荷を割り当てることによりペプチドまたはペプチドカクテルの正味電荷を計算する。各ペプチドのＮ末端アミン（＋１）およびＣ末端カルボキシル（−１）末端基からの電荷寄与は、置換されない場合、互いに効果的に相殺される。電荷は、各ペプチドで合計され、平均正味電荷として表される。好ましくは、ペプチド免疫原の平均正味電荷は少なくとも＋２である。
【００５０】
カチオン性ペプチド免疫原は元来、そのアミノ酸配列に基づいて上記のように計算された正の正味電荷を有し得る。リジン、アルギニンもしくはヒスチジン、またはこれらのアミノ酸の混合物をペプチド免疫原のＮ末端またはＣ末端に加えることにより、正の電荷を有するようにすることができる。水溶液中でペプチド免疫原に正の電荷を提供するその他の合成部分、例えばポリエチレンイミンまたはポリアミンを加えることもできる。
【００５１】
カチオン性ペプチド免疫原は、Ｔｈエピトープおよび標的Ｂ細胞エピトープを有する。Ｔｈエピトープは、ペプチドに固有であるか、または合成的にペプチドに加えることができ、標的Ｂ細胞エピトープとして機能する。好適なペプチド免疫原には、保護免疫応答または治療免疫応答を引き出すペプチドなどがあり、疾患を引き起こすことが解っている病原体またはタンパク質に由来する。これには、アレルギーの免疫治療のためのヒトまたは動物ＩｇＥペプチド、例えばＷＯ９９／６７２９３号５１記載のＩｇＥペプチド免疫原；US 5,763,160号５２記載のＨＩＶ感染の保護免疫および免疫治療のためのＨＩＶペプチド；米国特許第6,090,388号５３記載のＨＩＶからの保護免疫並びにＨＩＶ感染及び免疫疾患の免疫治療のためのＣＤ４ペプチド；US 5,749,551号５４およびUS 6,025,468号５５記載のアンドロゲンおよびエストロゲン依存性腫瘍、避妊および免疫去勢（immunocastration）の免疫治療、およびイノシシ感染（boar taint）の除去のための黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）ペプチド；USSN 09/865,294号５６記載のアルツハイマー病の予防および免疫治療のためのβ−アミロイドペプチド；US 6,107,021号５７記載の口蹄疫（foot-and-mouth disease）に対する保護免疫のための口蹄疫ウイルスペプチド；USSN 09/747802号５８記載の尿路感染からの保護免疫のための細菌線毛由来のペプチド；ＷＯ９９／６６９５７号５９記載のマラリアからの保護免疫のためのマラリア原虫(Plasmodium)ペプチド；およびＷＯ９９／６６９５０号６０に記載の家畜の成長促進のためのソマトスタチンペプチド；などがある。本明細書で取り上げた特異的ペプチド免疫原は,説明のみの目的のための実例であり、いかなる場合であっても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００５２】
「アニオン性一本鎖ＤＮＡ」は、ｐＨ５．０〜８．０の範囲で負に荷電しているポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの負の正味電荷は、オリゴマーの各リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート基に−１の電荷を割り当てることにより計算される。適当なアニオン性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフの繰り返しを伴う、８〜６４個のヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子である。ＣｐＧモチーフの繰り返し数は１〜１０の範囲である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激一本鎖ＤＮＡは、ＣｐＧモチーフの繰り返し数が３〜８の範囲である、１８〜４８個のヌクレオチド塩基を含む。
【００５３】
好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’Ｘ１ＣＧＸ２３’（式中、ＣおよびＧは非メチル化であり；Ｘ１はＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）およびＴ（チミン）からなる群から選択され；Ｘ２はＣ（シトシン）またはＴ（チミン）である）で表される。または、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’（Ｘ３）２ＣＧ（Ｘ４）２３’（式中、ＣおよびＧは非メチル化であり；Ｘ３はＡ、ＴまたはＧからなる群から選択され；Ｘ４はＣまたはＴである）で表される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端でホスホロチオエートまたはチオール・アセトアミド糖ポリマーで修飾されていてもよい３４。
【００５４】
最も好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＴ  ３’（ＣｐＧ１）配列番号１（３２塩基鎖長のオリゴマー）、及び５’ｎＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  Ｔ  ３’（ＣｐＧ２）配列番号２（２４塩基鎖長のオリゴマーにホスホロチオエート架橋基（５’末端でｎと称される）を加えたもの）からなる群から選択される。
【００５５】
また、非メチル化シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチド由来のＤＮＡ配列は、リンパ球を活性化し、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ応答などの対象の免疫応答を増強することができる３３。これらの分子は、これらの知見に基づいて、合成カチオン性ペプチド免疫原の安定化させ且つ新規免疫原デリバリーシステムを提供するという双方を行うことができる好ましい相補的基質を提示する。本発明の安定化免疫刺激複合体はまた、注射部位で重要な希釈を行うことなく、インビボで免疫応答の自己アジュバント作用を提供する。
【００５６】
カチオン性ペプチド免疫原由来の別個の免疫刺激複合体の形成は、主に電荷中和の作用である。安定した複合体は、天然または合成の双方により修飾されたヌクレオチド配列に由来するＣｐＧ含有免疫刺激ＤＮＡ分子から形成できると予測される。なお、免疫刺激複合体の安定性における改善は、ペプチド免疫原に備わっているカチオン性電荷を増加させることにより実現させることができる。これには、ペプチドをさらにリジン、アルギニンもしくはヒスチジンまたはその他の合成部分で伸長させることを含み、これにより上述したように水溶液中で修飾されたペプチドに正の電荷が提供される。
【００５７】
ＣｐＧ不含免疫刺激配列（ＩＳＳ）が同定され、適当な水性溶媒での合成カチオン性ペプチド免疫原と組合せた場合、これらの一本鎖ＤＮＡ基質が免疫刺激複合体を形成するのに有用な材料であることが判明するであろうと予測される。
【００５８】
修飾化ＣｐＧモチーフもまた想定され、ここで定義されたアニオン性一本鎖ＤＮＡは、細胞特異的取り込みの増強及び標的化するためのレクチン、糖もしくは脂質、またはインビボで循環を改善するためのポリマー、共重合体およびグラフト共重合体、例えばＰＥＧなどの別の生物学的に機能する分子と化学的に結合している。化学的に結合したＤＮＡは、ポリアニオン性であってもよく、続いてカチオン性ペプチド免疫原と複合化されて、潜在的に新規な物理特性又は生物学的特性を有する、修飾化免疫刺激複合体を提供することができる３４、３５。
【００５９】
ポリアニオン性オリゴマーおよびポリエチレングリコールに由来するブロックおよびグラフト共重合体は、アニオン性分子の別の種類、即ち向上した安定性及び向上したアジュバント作用をもたらすこともできる別の種類を提示することが企図される。
【００６０】
本発明の別の態様では、免疫刺激複合体は、修飾ＣｐＧオリゴヌクレオチドから調製することができる。ここで、複合化を改善するために、さらにホスホロチオエートまたは別の架橋基がオリゴマーの５’末端に付加されている。
【００６１】
好ましくは、免疫刺激複合体の平均凝集粒径分布は、約１〜５０μｍの範囲である。さらに好ましくは、免疫刺激複合体の平均凝集粒径分布は、約１〜３０μｍの範囲である。最も好ましくは、免疫刺激複合体の平均凝集粒径分布は、約１〜１５μｍの範囲である。
【００６２】
ＣｐＧモチーフの繰り返しの数は、固有のアジュバント作用および免疫刺激の程度に影響し、最小数のＣｐＧの繰り返しが必要とされるという証拠がある。また、ＣｐＧに隣接するフランキングヌクレオチド塩基の選択は、種特異的様式でアジュバント作用に直接影響すると思われるので、非常に重要であるという強力な証拠がある１０、３６。例えば、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが、式：Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４（式中、ＣおよびＧは非メチル化であり、Ｘ１Ｘ２が基ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡから選択され、及び／又はＸ３Ｘ４が基ＴｐＴ、ＣｐＴおよびＧｐＴから選択される）により表される場合、ヒト細胞の免疫刺激活性が増強されることがKreigら１３により実証された。
【００６３】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞マイトジェンとして機能でき３７且つ有用なアジュバントであるが、可溶性形態のＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合した抗原に対して、免疫応答は一般に、投与後２週間でピークに達することが示されている。このために保護を確実にし高い抗体価を維持するために複数回反復注射が必要とされる３８。よって、放出制御配合物においてこれらのオリゴヌクレオチドと共に構築物を効果的に分配する方法が強く望まれている。
【００６４】
安定性に関しては、ＣｐＧバックボーンのホスホジエステル結合は、インビボでヌクレアーゼによる分解に対して感受性がある３９。よって、免疫応答の期間を改善するために、リン酸基をホスホロチオエート基に修飾することができる。
【００６５】
本発明の免疫刺激複合体を、非経口、粘膜および経皮などの多くの経路による分配用に配合することができる。本発明の免疫刺激複合体は、複合体のＣｐＧオリゴヌクレオチドがインビボで非経口および粘膜応答の双方で上方制御に有用なアジュバントである点で特にワクチン配合物に望ましい４０、４１。
【００６６】
我々の実験の結果から、免疫刺激複合体の凝集粒径が、ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの比率に基づいて変化することがわかる。免疫刺激複合体の固有の安定性および組成物のサイズを調節する能力は、非経口経路によるファゴサイトーシスの可能性を高める１９。特異的細胞、例えば経口経路によるパイエル板に位置するＭ細胞２１または鼻腔内経路による鼻関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）２３を標的化することによる粘膜免疫は、同様に本発明の安定化免疫原を使用することにより促進される。
【００６７】
本発明の免疫刺激複合体は、制御された自己集積化法により調製される。ここで、水溶液中のアニオン性ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、カチオン性ペプチド免疫原の水溶液に添加される。免疫刺激複合体の調製用の好適な水溶液は、蒸留脱イオン水（ＤＤＷ）、生理食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）からなる群から選択される。蒸留脱イオン水および生理食塩水は典型的には、約５．５のｐＨを呈するが、ＰＢＳではｐＨは７．２〜７．４の範囲で調節される。複合化プロセスは、電荷比、相互作用する電解質の分子量、溶媒のｐＨおよびイオン強度の関数である３２。
【００６８】
多価アニオン性分子、例えば短鎖ＣｐＧオリゴマーは、水溶液のｐＨが５．５〜７．４の範囲であるとき、負の正味電荷を有する。ペプチド免疫原の正味電荷は、ペプチドのアミノ酸組成に依存し、水溶液のｐＨにより影響を受ける可能性がある。従って、有効な複合化のために正の正味電荷を確実にする水性溶媒を選択する。個々のペプチドに関するイオン化点（ＩＰ）またはゼロ電荷の点の試験により、選択方法を導くことができる。一般に、等電点電気泳動実験のｐＨグラジエントを通る分子の動きによりＩＰが決定される１１。ペプチドが正に荷電していることを確実にするために、選択した水性溶媒のｐＨを、問題のペプチドの等電点よりも小さくすべきである。
【００６９】
免疫刺激複合体を調製するために、以下の工程を続ける。第１に、一緒に混合したペプチドのモル比および最終ワクチン組成物中の各ペプチド成分からの電荷寄与に基づいて、望ましいペプチド免疫原またはペプチド免疫原のカクテルに関して平均モル正電荷寄与を決定する。第２に、オリゴマーのモル比および最終ワクチン組成物中のこの成分からの電荷寄与に基づいて、複合化オリゴヌクレオチドに関してモル負電荷寄与を決定する。第３に、全平均モル正電荷に基づくペプチド免疫原の量は、複合化に用いたオリゴヌクレオチドの量およびその全モル負電荷に依存する。この関係を用いて水性溶媒中で組合せるペプチド免疫原およびオリゴヌクレオチドの相対量を決定して免疫刺激複合体を形成する。過剰のカチオン性免疫原ペプチドを用いて免疫刺激複合体および過剰の非複合化ペプチドの混合物を提供する。または、過剰のオリゴヌクレオチドを用いて過剰のオリゴヌクレオチドを提供することもできる。選択したペプチド免疫原およびオリゴヌクレオチドの相対量は望ましいワクチン配合物に基づく。
【００７０】
最後に、適合する水性溶媒中の計算量のアニオン性オリゴヌクレオチドを、適合する水性溶媒に同様に溶解した計算量のカチオン性ペプチド免疫原に混合しながら添加する。用いたカチオン性ペプチド免疫原のｎｍｏｌ量は一般に、１負電荷を提供するアニオン性オリゴヌクレオチドのｎｍｏｌ量に、８正電荷から０．５正電荷を提供する範囲である。これを電荷比と称する。電荷比が８：１である場合、大過剰のペプチド免疫原が存在する。電荷比が１：２である場合、少し過剰のアニオン性オリゴヌクレオチドが存在する。複合体は、溶液中で自然に懸濁液の形態を形成する。溶液から複合体を分離し、紫外線分光法（ＵＶ）または逆相高速クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により上澄溶液をアッセイすることにより、ペプチド免疫原またはオリゴヌクレオチドの残量の推定を行うことができる。
【００７１】
懸濁液として調製した免疫刺激複合体をワクチン組成物として用いることができる。免疫刺激複合体を非経口的に注射する場合、最終ワクチン組成物が等張であり、このような目的に適するように水性溶媒を選択する。複合体を最初に蒸留脱イオン水で形成する場合、適当な塩濃度の水性緩衝液を添加して、最終ワクチン組成物が等張であることを確実にする。
【００７２】
懸濁液または溶液として調製した免疫刺激複合体を凍結乾燥することができる。凍結乾燥した組成物を次いで再構成し、望ましいデリバリー形態に従って異なるワクチン配合物に組み込むことができる。本発明の免疫刺激複合体を、無機塩懸濁液または生体適合ポリマー性ゲルを組合せた油中水滴型エマルションとして配合することもできる。
【００７３】
本発明の別の態様に従って、本発明は凍結乾燥により安定した粒子として安定化免疫刺激複合体を単離する方法を記載する。水性溶媒又は生体適合性溶媒中の懸濁液としての安定化免疫刺激複合体の再構成により、粒径分布又はインビボ有効性に本質的な変化は示されない。これは、効果を維持するために冷蔵を必要とする配合物、例えばミョウバンベースのワクチン組成物に重要な利点を提示する。この特徴は、免疫前の直接再構成及び安定した固体状態の投与形態を必要とする代替デリバリー形態、例えば肺又は鼻腔内デリバリーのための乾燥粉末エアロゾル又は噴霧などのこれらの系の利用可能性を広げる４２。
【００７４】
本発明の別の態様により、本発明は、本発明の安定化免疫刺激複合体を有する安定した油中水滴型エマルション４３を調製する、種々の方法を提供する。このようなエマルションでは、水相は、免疫刺激複合体または免疫刺激複合体と非複合化ペプチド免疫原との混合物を有し；連続油相は、合成油、鉱油、動物油または植物油を有するのが好ましい。また、油相はまた、免疫刺激乳化剤、生体適合性または代謝可能成分を有することもできる。
【００７５】
特に、本発明の油中水滴型エマルションの調製に有用な油には、合成油（例えばミリスチン酸イソプロピル）、植物油（例えば落花生油）、鉱油（例えばドラケオール（Drakeol（商標））またはマルコール（Marcol（商標）））、代謝可能な動物油（metabolizable animal oil）（例えばスクアレンまたはスクアラン）、およびその混合物などがあるが、これらに限定されない。鉱油が好ましい。エマルションの安定化に有用な油ベースの乳化剤には、マンニド−オレイン酸（mannide-oleates）およびその誘導体のファミリーなどがあるが、これらに限定されない。
【００７６】
必要な乳化剤の相対量は、特定の条件下で生成された油中水滴型エマルションの親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）および固有の安定性の関数である。油および乳化剤の組合せの選択方法は当業者に公知である。
【００７７】
ｗ／ｏエマルションは、内部水相に１０ｖ／ｖ％〜８０ｖ／ｖ％の水を有することができる。たいていの目的のために、最適な水濃度は、３０ｖ／ｖ％〜５０ｖ／ｖ％の範囲である。内部水相は、典型的には１〜１０μｍ、好ましくは１〜５μｍの大きさの非常に微細な小滴を有してなるのが特徴的である。室温でまたは冷蔵で維持する場合、調製物は安定である。
【００７８】
その他の安定化剤を用いてエマルションを調製することもできる。これには界面活性剤、コロイド性粒子、タンパク質および当業者に公知のその他のポリマー化剤および安定化剤などが含まれる。
【００７９】
ｗ／ｏエマルションは、少なくとも１つの油溶性親油性アジュバント、例えば3-O-デスアシル-4’-モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（ＭＤＰ）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、N,N-ジオクタデシル-N’,N’-ビス（2-ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（アブリジン（Avridine））、N-（2-デオキシ-2-1-ロイシルアミノ-β-D-グルコピラノシル）-N-オクタデシル-ドデカノイルアミド・ハイドロアセテート（ＢＡＹ−１００５）、３β−［N-（N,N’-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ＮＡｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ｓｎ−グリセロール・ジパルミトイル（ムラパルミチン（Murapalmitine））およびこれらの混合物または誘導体をさらに有することができる。ｗ／ｏエマルションはまた、分散相で少なくとも１つの水溶性アジュバント、例えばポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）］ホスファゼン（ＰＣＰＰ）、Quillajaサポニン（ＱＳ−２１）、コレラ・ホロトキシン（ＣＴ）またはコレラ・トキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、大腸菌（E.coli）由来の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）または大腸菌（E.coli）由来の熱不安定性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴＢ）およびサイトカイン例えばインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）並びにこれらの混合物または誘導体を有することができる。水溶性アジュバントは合成であっても天然であってもよい。フィルム形成特性を有する水溶性アジュバント、例えばオリゴマーまたはポリマーの存在はさらに、エマルションを安定化させるのに役立つことができる。ｗ／ｏエマルションは免疫原の免疫系への提示を促して、さらに有効なワクチンを提供することができる。
【００８０】
免疫刺激複合体または非複合化免疫原とのその混合物を有する油中水滴型エマルションは、以下のように調製することができる。第１に、水溶液中免疫刺激複合体単独の形成を確実にする比率で、または過剰の残留ペプチド免疫原を伴う混合物でペプチド免疫原およびオリゴヌクレオチドから免疫刺激複合体を調製する。第２に、水溶液を、乳化剤を含む油と混合し、均質化して水相が連続油相に分散される油中水滴型エマルションを提供する。このような油中水滴型エマルションは非経口注射に適している。
【００８１】
均質化することにより、又は２個のシリンジ間を移動させることにより、又は制御孔径のメンブランフィルターを通して成分を押出すことにより水相および油相の乳化を達成することができる。低エネルギー半手動方法が迅速である。しかしながら、他の方法よりもせん断がかなり少ないので、生成されたエマルションは高せん断機械系を用いて生成されるものほど微細ではない。高せん断系の例として、ロートステーター（rotostator）、マイクロフルイダイザー（microfluidizer）およびソニフィヤー（sonifier）などが挙げられる。乳化用に公知のこれらの高せん断系に類似のその他の装置を用いることもできる。
【００８２】
本発明の別の態様に従って、本発明は、本発明の安定化免疫刺激複合体を有する、生理学的に許容される無機塩の懸濁液を調製する種々の方法を提供する。このような混合系では、水相は無機塩および免疫刺激複合体の組合せ懸濁液を有し、これは溶液中に残留する、非結合ペプチド免疫原をさらに含んでもよい。
【００８３】
特に、本発明の完全水性ベースの懸濁液を調製するのに有用な無機塩として、水酸化アルミニウム（例えばアルヒドロゲル（Alhydrogel（登録商標））、レヒドラゲルＨＰＡ（Rehydragel HPA（登録商標））、レヒドラゲルＬＶ（Rehydragel LV（登録商標）））、リン酸アルミニウム（例えばアジュフォス（Adju-phos（登録商標））またはレヒラフォス（Rehyraphos（登録商標）））またはリン酸カルシウム（例えばカルフォス（Calphos（登録商標）））およびこれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
無機塩を選択し、用いる無機塩またはその組合せの好ましい濃度を決定する方法は当業者に公知である。
【００８５】
その他の安定化剤を用いて無機塩懸濁液を調製することもできる。これには界面活性剤、抗酸化剤、生理学的に許容される緩衝液、等張剤（tonifier）、保存剤および当業者に公知のその他の物質などがある。
【００８６】
無機塩懸濁液は、少なくとも１つのさらなるアジュバント（例えばＭＰＬ、ＭＤＰ、ＤＤＡ、Ｎ，Ｎ−アブリジン、ＢＡＹ−１００５、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ムラパルミチン、ＰＣＰＰ、ＱＳ−２１、ＣＴまたはＣＴＢ、ＬＴまたはＬＴＢおよびサイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ並びにこれらの混合物および誘導体）をさらに有することができる。無機塩は、貯蔵庫（depot）の形態で免疫原の免疫系への提示を促すか、または走化性（chemotaxis）として公知の過程により免疫系の特定の細胞を誘引することができる。
【００８７】
免疫刺激複合体を有する無機塩懸濁液、または残留する非複合化免疫原と組合せた免疫刺激複合体の混合物は、以下のように調製できる。第１に、溶液中の全てのペプチド免疫原およびオリゴヌクレオチドの完全な複合化を確実にする電荷比で、ペプチド免疫原およびオリゴヌクレオチドから免疫刺激複合体を調製する。また別に、溶液中のペプチド免疫原およびオリゴヌクレオチドの部分的複合化を確実にする電荷比で、ペプチド免疫原およびオリゴヌクレオチドから免疫刺激複合体を調製する；第２に、水性懸濁液を、混合しながら、無機塩懸濁液と組合せて、全成分の完全な水性懸濁液を提供する。このような懸濁液の組合せは非経口注射に適している。
【００８８】
補足的な方法では、免疫刺激複合体または非複合化ペプチド免疫原とのその混合物を有する無機塩懸濁液は、以下のように調製できる。第１に、ペプチド免疫原を無機塩懸濁液と混合する。無機塩、ペプチド免疫原および水性緩衝液の物理特性に依存して、この段階で、種々の比率の免疫原を無機塩に直接吸収させることができる；第２に、この懸濁液にオリゴヌクレオチドを攪拌しながら添加する。溶液中の残留した非結合ペプチド免疫原の部分的または完全複合化に至る。このような懸濁液の組合せは非経口注射に適している。図１６では双方の調製方法を示している。
【００８９】
本発明の別の態様に従って、安定化免疫刺激複合体または安定化免疫刺激複合体および非複合化免疫原の混合物が分散されている、in-situゲル化生分解性ポリマーを調製するための方法が提供される。免疫刺激複合体は、溶液に、又は生体適合性溶媒内の懸濁液としてのいずれかで分散させることができる。生体適合性溶媒は、合成または天然の可溶性アジュバントをさらに有することができる。生分解性ゲル化ポリマーの溶液または懸濁液は、免疫原の宿主へのデリバリー用に設計される。in-situゲル化ポリマーは、生分解性であり、分子量が約２，０００〜約１００，０００ダルトンの範囲で且つ対数粘度数が約０．２〜１．０ｄｌ／ｇである、ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド（ＰＬＧ）およびポリ-D,L-乳酸-コ-グリコール酸（ＰＬＧＡ）の共重合体である。in-situゲル化ポリマーの式は、以下の式で表される。
【００９０】
【化４】
2010265291.tif 000002
【００９１】
式中、Ｒ１はＯＨまたは炭素数１から５のアルコキシであり、Ｒ２はＨであり；ｘ：ｙは共重合体の各モノマーユニットの比率であり、ｘ＋ｙ＝１である。ＰＬＧの場合、Ｒ１がアルコキシであり且つモノマーユニットがラクチドおよびグリコリドであり、ＰＬＧＡの場合、Ｒ１がＯＨであり且つモノマーユニットが乳酸およびグリコール酸である。
【００９２】
in-situゲル化ポリマーを有する、安定化免疫刺激複合体または非複合化免疫原とのその混合物は、単一の相として、または生体適合性溶媒中の懸濁液として調製することができる。
【００９３】
本発明に有用な生体適合性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、N-メチルピロリジン（ＮＭＰ）、トリアセチンおよびグリセリンからなる群から選択される。ＤＭＳＯが好ましい。ＤＭＳＯは重量パーセントで多量のポリマーを溶解する高い能力を有している。ポリマーのin-situゲル化用の溶媒として広く用いられている。ＤＭＳＯは、本発明の安定化免疫刺激複合体の懸濁液を調製するためにも用いることができる。
【００９４】
動物モデルにおいて、少量で用いた場合、ＤＭＳＯの耐性が高いことが実証されていることは重要である４４。従って、ＤＭＳＯを有する組成物が非経口経路を介して投与される場合、毒性の懸念は最小限である。
【００９５】
本発明に適した生分解性ポリマーとして、ポリエステルのＰＬＡ、またはＰＬＧＡファミリーが挙げられるがこれらに限定されない。これらの材料は、種々の生体適合性溶媒に５ｗ／ｗ％〜５０ｗ／ｗ％の範囲の濃度で溶解することができる。いくつかの物理学的因子が生体適合性溶媒に溶解できるポリマーの実際の量に影響し得る。これにはポリマーの組成、分子量、対数粘度数および結晶化などがある。共重合体のＰＬＧ／ＰＬＧＡシリーズに関しては、これらの因子は高度に変動する。例えば、ポリ-D,L-乳酸（ＰＬＡ）またはポリ-D,L-ラクチド（ＰＬ）のホモポリマー、およびＰＬＧまたはＰＬＧＡと乳酸モノマー成分の長いブロックとの共重合体は、相対的に高い対数粘度数を有する高度に結晶性の材料である。
【００９６】
可溶化できるこれらの結晶性材料の相対重量パーセントは、アモルファスＰＬＧまたはＰＬＧＡ類似体よりも明らかに低く、乳酸：グリコール酸成分の比率は、およそ１：１に等しい。注射により投与できるポリマー全量の差異は、マトリックス分解速度に劇的な影響力を有し、封入された免疫原の放出速度に影響すると予期される。生体適合性溶媒中の物理学的に適合するポリマーおよび種々の物理特性を有する共重合体の混合を変化させて、新規の生物学的効果を達成することが可能であると想定される。
【００９７】
本発明に適したその他の生分解性ポリマーが企図される。これには、ポリカプロラクトン類、ポリ無水物類、ポリオルソエステル類およびポリ（α−ヒドロキシ酪酸）が挙げられるがこれらに限定されない。これらのポリマーは、有用な重量パーセントで生体適合性溶媒に溶解でき、有用なマトリックス形成基質を提供することができる。
【００９８】
本発明に従って、安定した形態の放出制御または放出遅延ワクチン調製物が、このようなワクチン調製物を作製する方法と一緒に提供される。放出制御または放出遅延ワクチン組成物のゲルマトリックスは、ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド（ＰＬＧ）およびポリ-D,L-乳酸-コ-グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン類、ポリ無水物類、ポリオルソエステル類およびポリ（α−ヒドロキシ酪酸）からなる群から選択される生分解性ポリマー、生体適合性溶媒並びに安定化免疫刺激複合体を有する。
【００９９】
ポリマー性ゲルは、少なくとも１つのさらなるアジュバント、例えばＭＰＬ、ＭＤＰ、ＤＤＡ、Ｎ，Ｎ−アブリジン、ＢＡＹ−１００５、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ムラパルミチン、ＰＣＰＰ、ＱＳ−２１、ＣＴまたはＣＴＢ、ＬＴまたはＬＴＢ又はサイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ並びにこれらの混合物および誘導体をさらに有することができる。
【０１００】
本発明の放出制御組成物の利点には、
（ａ）完全な生分解性および生体適合性ゲル配合物；
（ｂ）免疫原性の改善に至る、免疫エフェクター細胞に提示するための免疫原の持続的放出；
（ｃ）安定した組成物において望ましい免疫原を伴う高いゲル負荷率（loading）；および
（ｄ）自己アジュバント作用する安定化免疫刺激複合体の懸濁液を含む適応性のあるデリバリー様式；
などがある。
【０１０１】
ポリマーの分子量および結晶性は、インビボでの捕捉効率に直接影響する。ポリマー性ゲル化材料は、極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＳＯに混和性を有する。しかしながら、筋内または皮下注射の場合、ＤＭＳＯは、ポリマー富化溶液を可逆的に浸透する水分で周囲の体組織に抽出される。この過程は、in-situゲル形成を制御する１次メカニズムとして提供される。この過程が進行する速度は、ゲル形成により免疫原が捕捉される前であって生体適合性溶媒が積極的に体組織へ抽出され、生理学的溶液と交換される間に、免疫原の放出の最初のバーストに直接影響する４５。結晶化過程の制御は、ゲル内の免疫原の保持を改善できる重要な主要メカニズムであることが解っている４６。これは、免疫原を放出できる拡散経路を制限する、形成されたゲルの内部形態に密接に関係している。
【０１０２】
捕捉された、または保持された免疫刺激複合体は続いて、ポリマーを形成するマトリックスのバルクが侵食されるとき、多量のブースト放出と共に、持続的形態で制限された量でゲルから放出される。これは、ゲル化に影響する多くの同一の条件、例えば分子量、結晶性の程度、組成、疎水性および添加剤の存在に依存して変化する。
【０１０３】
溶媒ＤＭＳＯに対する有害な毒性応答の可能性は最近の研究４４で取り組まれており、その研究では、ＤＭＳＯに懸濁されたペプチドホルモンを含む装置がイヌ及びヒトの皮下に外科的に埋め込まれた。研究に用いたＤＭＳＯの容量は１５０μｌであった。移植片は１年間かけてペプチドを放出するように設計され、研究の終わりに外科的に除去された。イヌでもヒトでも有害な組織反応は観察されなかった。移植片からペプチド／ＤＭＳＯ混合物が生理学的組織へ放出されるのを制御することは、完全生分解性のin-situゲル化ポリマー性組成物に関する毒性の可能性の懸念を評価するためのモデルとして有用である。本発明に有用なＤＭＳＯの量はその研究で用いた量と本質的に同一であることが企図される。
【０１０４】
ポリマーの溶解限界を越える前に、ＤＭＳＯ中の免疫刺激複合体の体組織への最初の抽出が行われると予測される。凝固が起こり、安定化免疫刺激複合体の放出が遅延される。続いて、安定化免疫刺激複合体は、ポリマー特性の作用である放出速度で、拡散制御経路によりＤＭＳＯと一緒に放出されるか、またはゲルに保持される。ゲル内のこれらの分子の拡散率がいくつかの因子、例えばゲル内部形態および有孔性、水のゲルへの浸透の程度並びにポリマーのバルクの加水分解により支配されることは明白である４５。
【０１０５】
ゲル中で懸濁液として分散される本発明の安定化免疫刺激複合体の場合、最初の抽出は、主にゲル化領域の近くに位置する少量の免疫刺激複合体を伴うＤＭＳＯの抽出である。従って、少量の免疫刺激複合体は、最初のゲル化相の間に効果的に捕捉されず、インビボの免疫応答の最初の初回刺激に寄与する。その後、ポリマーのバルクが十分に加水分解されて捕捉された免疫刺激複合体の完全な放出に至るまで、ＤＭＳＯは、ゲルマトリックスに捕捉されたままである免疫刺激複合体のバルクと共に拡散により放出され続けると予測される。
【０１０６】
具体的には、α−ヒドロキシ酸由来の高分子量且つより結晶性のポリマーから配合されるポリマー性ゲルは、低分子量のアモルファス類似体よりも長時間をかけて分解される。この現象は、加水分解に不安定なエステル結合への水の接近可能性に関係していることが解っている４６。
【０１０７】
分子量８，０００〜５０，０００ダルトンの範囲の５０％  D,L-ラクチドおよび５０％  グリコリドから成るランダムアモルファス共重合体は、最も高い分解速度を示すことが確立されている。ＰＢＳ緩衝液に浸漬した場合、およそ６〜８週後に５０重量％以下のポリマーが残存する４７。
【０１０８】
ゲル化速度、免疫原放出速度およびゲル内部形態を制御するパラメータを修飾するのが望ましい。具体的には、種々の孔形成物質、可塑剤、および安定化剤、例えば界面活性剤、糖、タンパク質、ポリマーおよび当業者に公知のその他の賦形剤の使用がこの目的のために有用である。
【０１０９】
調製物は、冷蔵した場合または室温で安定である。ＤＭＳＯの凝固点は約１８℃であるので、ＤＭＳＯを用いる本発明のワクチン組成物は凍結する。解凍はインビボでワクチンの有効性に変化を引き起こさないことが解っている。
【０１１０】
本発明に従って、in-situゲル化生分解性ポリマーおよび安定化免疫刺激複合体は、別個に配合することができる。in-situゲル化ポリマーを１個のバイアル中で生体適合性溶媒に溶解し、乾燥状態の安定化免疫刺激複合体を別のバイアルにすることができる。乾燥状態の免疫刺激複合体をスプレードライまたは好ましくは凍結乾燥により調製することができる４８、４９。次いで乾燥した免疫刺激複合体は、生体適合性溶媒に再構成され、シリンジにより溶液または懸濁液のいずれかとして生分解性ポリマー溶液に分配する。その後、混合物は、即座にまたはその直後に免疫に用いる。
【０１１１】
別個のバイアルを用いることにより、いずれかの潜在的な安定性の問題を最小限にする利点が付与される。これには反応性官能側鎖、例えば遊離のアミン基またはカルボキシル基を有し得るペプチド免疫原の存在下でのポリマーの分解５０、または選択的アミノ酸、例えばＤＭＳＯの存在下のペプチド免疫原のシステインおよびトリプトファンの酸化１などがある。
【０１１２】
免疫刺激複合体を含む再構成築用のin-situゲル化ポリマー組成物を調製するために、免疫刺激複合体は、上述したように調製される。次いで、この水溶液を凍結乾燥して乾燥組成物を形成する。次いで乾燥した組成物を、計算された重量パーセンテージの生分解性ゲル化ポリマーを含有する生体適合性溶媒中の懸濁液として再構成する。最終ワクチン組成物は、in-situゲル化ポリマーを提示し、非経口注射に適している。
【０１１３】
本発明の組成物は、ワクチンとして、即ち治療目的として有用であることがわかる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドと効率よく複合化するために、概してｐＨ４．０〜８．０の範囲でカチオン性電荷を有するように修飾できるその他の生物学的材料として、タンパク質、タンパク質擬似物質、細菌、細菌ライゼート（lysate）、ウイルス、ウイルス感染細胞ライゼート、抗原、抗体、薬理学的物質、抗生物質、炭水化物、脂質、サイトカイン、ケモカイン、脂質化アミノ酸、糖脂質、ハプテン並びにこれらの組合せおよび混合物などを挙げることができる。
【０１１４】
これらの組成物は、皮下または筋内注射により非経口的に投与することができる。非経口的に投与する場合、免疫応答は、抗体を中和するための細胞媒介応答または局所もしくは血清抗体応答とすることができる。粘膜で投与する組成物に関しては、免疫応答は、局所分泌型抗体応答をさらに有するであろう。
【０１１５】
免疫刺激複合体はまた、水中油滴型（oil-in-water）（ｏ／ｗ）ベースのエマルションと混合物できることも当業者に容易に明らかであろう。その他の可能性として、水中油中水滴型（ｗ／ｏ／ｗ）二重エマルション、生分解性ポリマー性微粒子、脂質小胞またはリポソーム構造内の安定化免疫刺激複合体の封入がある。たいていのこれらのデリバリーシステムは持続性放出配合物の開発に魅力的である。
【０１１６】
好ましくは、本発明のペプチド免疫刺激複合体は、無機塩、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムと組合せて、または生分解性ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）もしくはポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）共重合体に基づく１回投与用の放出制御されるin-situゲル化配合物で、ＳＥＰＰＩＣの油ベースのアジュバントを用いるｗ／ｏベースのエマルションに用いることができる。
【０１１７】
最も好ましくは、本発明のワクチン組成物は、ペプチド免疫原と、非複合化ペプチド免疫原と混合したＣｐＧオリゴヌクレオチドとの安定化免疫刺激複合体を有する。
【０１１８】
本発明の種々の態様は、医薬品の分野、特にワクチン接種、細菌およびウイルスなどの病原体での感染の診断および処置の分野において多くの応用を有することが当業者に明確である。本発明の別の用途を以下に記載する。
【０１１９】
ワクチン調製物
ワクチンとして用いるのに適した免疫原性組成物は、ｗ／ｏエマルションとして、無機塩懸濁液と組合せた懸濁液として、またはin-situゲル化ポリマーまたは本明細書に開示するこれらの系の組合せとして、本発明の免疫刺激複合体から調製することができる。免疫刺激複合体を含む免疫原性組成物は、それが投与された宿主により免疫応答を誘導させるのに有用である。免疫応答には宿主による抗体の産生などがある。
【０１２０】
免疫原性組成物は、注射用として、溶液または懸濁液として、凍結乾燥またはスプレードライ粉末またはエマルションとして調製することができる。免疫刺激複合体を有する組成物は、生理学的に許容される緩衝液または賦形剤、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびこれらの組合せと混合することができる。ワクチンは、別の物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはその有効性をさらに高めるためのアジュバントをさらに含むことができる。ワクチンは、別の生体適合性物質をさらに含む。具体的にはin-situゲル化ポリマー、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、N-メチルピロリジン（ＮＭＰ）、トリアセチン、グリセリンおよびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を伴うことができる。
【０１２１】
本発明のワクチンは、非経口的に、例えば皮下、筋内または経皮注射により投与することができる。本発明のワクチンは、口腔、鼻腔内、直腸、膣または眼経路を介して粘膜に投与することができる。
【０１２２】
ワクチンは、配合物に適合する方法で、治療上有効、保護的且つ免疫原性であるような量で投与する。投与する量は、処置すべき対象または種、例えば抗体を合成する対象または種の免疫系の能力、および必要な場合、細胞媒介の免疫応答を生み出す対象または種の免疫系の能力などに依存する。
【０１２３】
乳化油、無機塩またはゲル化ポリマーおよび、効果を得るために投与が必要とされる生物学的活性を有する材料の正確な量は、医師または獣医師の判断に依存する。しかしながら、適当な用量範囲は、当業者に容易に決定され、マイクログラムからミリグラムのオーダーであるのがよい。最初の投与およびブースター投与のための適当な投与計画もまた変動するが、最初の投与、それに続く次の投与を含むことができる。ワクチンの用量もまた、投与経路に依存するので宿主または種によって変化する可能性がある。
【実施例】
【０１２４】
上述の開示は、本発明を一般的に記載する。以下の具体的な実施例を参照することにより、さらに完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単に例示の目的のために記載され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。状況が示唆するほどに特定の目標を達成するのに必要である形態の変化および等価物の代用が企図される。特定の用語が本明細書で用いられているが、このような用語は説明の意味で意図され、限定の目的ではない。
【０１２５】
本開示およびこれらの実施例において用いたが、明示的に記載していない化学、有機化学、高分子化学、タンパク質生化学および免疫学の方法は、科学文献で十分に報告されており、十分に当業者の能力内である。
【０１２６】
免疫刺激複合体の調製
一般に、水溶液中の合成ペプチド免疫原およびＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫刺激複合体は、適当な水性溶媒中のペプチド貯蔵溶液を、穏やかに攪拌した、適当な水性溶媒に溶解したＣｐＧオリゴヌクレオチドの貯蔵溶液の入ったバイアルに滴下することにより、調製する。逆の添加方法も同等に有効である。適合する水性溶媒として、蒸留脱イオン水、生理食塩水（ＮＳ＝０．９％ＮａＣｌ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ＝１０ｍＭリン酸緩衝液、０．９％ＮａＣｌ）またはその混合物が挙げられるがこれらに限定されない。複合化の過程は主に生理学的緩衝液による影響を受けず、合成ペプチド免疫原およびＣｐＧオリゴヌクレオチドの双方に適合する溶媒系を選択した場合、可能性（flexibility）が提供される。
【０１２７】
複合体は即座に形成され、溶液に懸濁された微細の沈殿物を観察することにより視覚的に同定することができる。このように形成された懸濁液の量は、溶液中のカチオン性ペプチド：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの相対量の関数である。沈殿過程は、逆に荷電した分子の静電気的中和により制御される。熱力学的に好ましい過程では、高度に荷電した多価アニオン性一本鎖ＤＮＡは、正に荷電したカチオン性ペプチド免疫原と結合する６１。
【０１２８】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＴ  ３’（ＣｐＧ１）配列番号１（３２塩基鎖長のオリゴマー）、および５’ｎＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  Ｔ  ３’（ＣｐＧ２）配列番号２（２４塩基鎖長のオリゴマーにホスホロチオエート基（５’末端でｎと表される）を加えたもの）からなる群から選択される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Oligo’s Etc.（Wilsonville、オレゴン州）により合成され、凍結乾燥状態で得られる。これらの材料は、使用前に適当な水性溶媒で再構成した。ＣｐＧ１は、８個のヌクレオチド塩基の配列内の隔離されたＣｐＧモチーフを有し、高い親和性でカチオン性ペプチドを結合することにより、短いオリゴヌクレオチドよりも、インビボで強力なアジュバント作用及び向上した安定性を提供することができる。ＣｐＧ２の５’末端でホスホロチオエート修飾された基は、モル負電荷密度を上昇させ、潜在的に結合の改善を促進する。
【０１２９】
ペプチド免疫原を合成し、適当な水性緩衝液を用いてペプチドが溶液中でカチオン性であることを確実にした。これは、ペプチド免疫原のＣｐＧオリゴヌクレオチドへの複合化が望ましいワクチンにおいて、重要な検討材料である。各ペプチド免疫原に関するイオン化点すなわちＩＰおよび溶媒のｐＨは、適当な緩衝液の選択を導くのに用いられる。蒸留脱イオン水または生理食塩水（ＮＳ）に溶解したペプチド貯蔵溶液の水性混合物のｐＨはおよそ５．５である一方、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ではペプチド貯蔵溶液のｐＨはおよそ７．２で著しく高かった。水性溶媒系を注意深く選択して、弱塩基性側鎖、特にヒスチジンを有するアミノ酸由来のペプチドに関して完全なプロトン化を確実にする。
【０１３０】
表１は、免疫刺激複合体を形成するために用いた合成ペプチド免疫原およびＣｐＧオリゴヌクレオチドの物理特性をリストアップする。３個の例のペプチド免疫原のターゲットを表１に示す。２または３個のペプチド免疫原のカクテル、または、ある例では、ペプチドの類似体を含むペプチドの組換ライブラリーを用いて各ワクチンを調製した。各ペプチド免疫原は、２個のセグメントである標的Ｂ細胞エピトープおよびＴヘルパーエピトープを有する。Ｔｈエピトープは、ペプチド免疫原の免疫原性を改善するために含まれる。
【０１３１】
適当な動物モデルのペプチドライブラリーをスクリーニングした後、Ｂ細胞およびＴヘルパーエピトープを選択した。これらの構築物の同定および組成に関する詳細な情報は、米国特許第6,090,388号５３、米国特許第5,759,551号５４およびＷＯ９９／６７２９３号５１並びに米国特許第6,107,021号５７を参照することにより見出すことができる。表１の配列番号７〜９は、ＬＨＲＨ免疫原ペプチドを有し、ホルモン・アブレーション処置のために計画された前立腺ガン免疫治療用のワクチンに有用である。配列番号１０〜１１は、アレルギー処置用の抗ＩｇＥ免疫治療ワクチンに有用である。配列番号４〜６は、ＨＩＶ感染処置用の抗ＣＤ４免疫治療ワクチンに有用である。配列番号１２〜１３は、ＦＭＤペプチドの組換ライブラリーを有し、口蹄疫に対する保護免疫用の抗ＦＭＤワクチンに有用である。
【０１３２】
本発明の免疫刺激複合体は、種々の比率でのカチオン性ペプチド：ＣｐＧオリゴヌクレオチドで調製することができ、異なる物理特性、例えば微粒子複合体のサイズを提供することができる。表２は、混合物中のペプチド免疫原に対して計算された平均モル正電荷および平均式量を示す。表２はまた、ＣｐＧ１（配列番号１）およびＣｐＧ２（配列番号２）からの計算された各々の平均モル負電荷寄与を提供する。
【実施例１】
【０１３３】
ＬＨＲＨ免疫原およびＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの免疫刺激複合体の調製
本実施例は、種々の割合のＬＨＲＨペプチド免疫原およびＣｐＧ１オリゴヌクレオチドからの免疫刺激複合体の調製を例示する。本明細書に記載する複合体形成の過程の流れ図を図１に示す。
【０１３４】
全てのガラス製品、攪拌子およびピペットチップを使用前に１２１℃で４０分間、オートクレーブ処理した。夾雑を避けるために、層流フード内で全試薬の重量測定、分配、移動または反応容器への添加を行った。
【０１３５】
配列番号７〜９のペプチドを１：１：１モル比で、且つ蒸留脱イオン水中３ｍｇ／ｍｌの濃度で混合することにより、ＬＨＲＨペプチド免疫原貯蔵溶液を調製した。マイクロ攪拌子を備えた一連の２ｍｌバイアルの各々に貯蔵溶液３３μＬ（ペプチド免疫原１００μｇ）を添加した。この溶液に希釈剤として蒸留脱イオン水０．５ｍｌを加えた。蒸留脱イオン水中２．０μｇ／μｌ  ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの貯蔵溶液を調製した。種々の量のＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの貯蔵溶液を各バイアルに加え、免疫刺激複合体を形成した。各バイアルに加えるＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの量は、ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１の電荷比が、ＬＨＲＥが大過剰である８：１〜ＣｐＧ１が過剰である１：２の範囲で提供されるように計算することにより、決定した。これらの組成物を調製するために用いたＣｐＧ１の各々の量を表３に示す。ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１の比率は、モル電荷比として表され、表３に示す計算に基づくことに留意すべきである。
【０１３６】
絶えず攪拌しながら室温で添加を行い、３０分間平衡化した。すべてのケースにおいて、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド貯蔵溶液の添加時に、反応混合物の即座な混濁が観察された。ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの添加完了後、微細な白色粒状懸濁液が観察された。粒子は徐々に沈着し、穏やかに振盪すると容易に再懸濁できた。
【０１３７】
固体微粒子複合体は、沈着した後本質的に除去することができ、分離した上澄溶液は、残留非複合ペプチド免疫原に関して（λ＝２８０ｎｍ）または残留ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドに関して（λ＝２６０ｎｍ）紫外線分光法により分析することができる。ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝８：１、４：１または２：１である過剰のＬＨＲＨを用いて調製された免疫刺激複合体に関して、過剰量のペプチドが検出された。
【０１３８】
紫外線分光法により得られた結果は推定値であり、以下の理由により、得られた数字の±２０％になる可能性がある。ペプチド発色団は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較してかなり小さな減衰係数を有し、ペプチドおよびＣｐＧ１を検出するために用いた最大波長は互いに極めて近似している。よって、遊離の残留ペプチドに関する推定値は恐らく誇張されているだろう。さらに、ペプチドＣｐＧ複合体の少量のナノ粒子が上澄に存在する可能性がある。ＣｐＧに相対して過剰量のペプチド免疫原の増加により、一般的に、平均粒径の小さい複合凝集に至るという観察により、これらの結果の解釈はさらに複雑である。
【０１３９】
平均凝集粒径分布に関するＬＨＲＨ／ＣｐＧ１複合体の順位付けは、ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１  ２：１＞４：１＞８：１の順であることが図２から観察される。複合過程の効率は、選択したペプチド免疫原およびＣｐＧオリゴヌクレオチドの物理特性及びワクチン組成物における各々の相対比率に基づいて変化すると予測される。ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１系に関して、紫外線分光法により測定した非複合ペプチドの残留レベルは、各々バックグラウンドを超えて６０〜９０％（ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝８：１）、４０〜８０％（ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝４：１）および２５〜６５％（ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝２：１）の範囲である。１：１電荷比で調製されたＬＨＲＨ：ＣｐＧ１複合体に関して、残留ペプチド免疫原（〜３％）または残留ＣｐＧオリゴヌクレオチド（〜２％）は、ほとんど検出できない濃度であった。本質的に完全な免疫原の複合化を有する、この複合体の凝集サイズの大きな増加は、中和電荷で予測される多電解質挙動と合致する。電荷比がＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝１：２の免疫刺激複合体に関して、過剰のＣｐＧ１、即ちＣｐＧ１の残留レベル４８％がλ＝２６０ｎｍで見出された。残留ＣｐＧ１のこの量は、最初の等価量のＣｐＧ１が溶液中でペプチド免疫原と完全に複合化したかどうかが予測されるＣｐＧ１量を概算する。
【０１４０】
ＵＶ法の結果から、オリゴヌクレオチドに対して大過剰のペプチド（例えばＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝８：１電荷比）で調製した免疫刺激複合体は、溶液中に著しい量の遊離ペプチドをもたらすことがわかる。同様に、ペプチドに対して中程度に過剰なオリゴヌクレオチド（例えばＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝１：２電荷比）で調製した免疫刺激複合体は、遊離オリゴヌクレオチドが過剰の組成物になる。図２で示すように、オリゴヌクレオチドが過剰に存在すると、より小さな凝集物を安定化させることができる。
【０１４１】
本実施例は、著しい量のペプチドが溶液中で遊離のままである、大過剰量のＬＨＲＨ（ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝８：１電荷比）での免疫刺激複合体の調製に現実的な利点がないことを例示する。同様に、中程度に過剰のＣｐＧ１（ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝１：２電荷比）で調製した免疫刺激複合体に現実的な利点がないことを例示する。ここで、図２で示すように、電気的中和点での完全な複合化の後、凝集物を安定化させるためにのみ過剰のオリゴヌクレオチドを提供できると考えることが妥当である。この結果から、組成物中の粒径を有効に低減させるために、実施した１：１電気的中性複合体に適合するアニオン性分子および／またはポリマーを連続的に添加できることが示される。これは、粒径調節を併せ持った完全な免疫刺激複合化のための新規な戦略を示している。
【０１４２】
本発明の目的は、インビボでワクチンの安定性を最大にするためのある応用に対して溶液中のペプチド免疫原を効果的に結合させることにある。よって、ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷比が各々４：１から１：１の範囲で調製した免疫刺激複合体が好ましい。本発明の別の目的は、免疫系への提示のためにより小型でより多くの個々の粒子（〜１０ミクロン以下）を用いることにより、インビボで免疫刺激複合体のアジュバント作用を最大にすることにある。
【０１４３】
残留する遊離且つ非複合化ペプチドが存在することが、より複合化されたワクチン配合物、例えば油中水滴型エマルションまたは無機塩への吸収に対してより望ましいことが見出されている。これらの配合物では、免疫応答のアジュバント作用は、免疫刺激複合体として結合した免疫原の結果であり、ｗ／ｏエマルション中に分散された、または無機塩に直接吸収された非複合化免疫原の結果であろう。よって、ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷比が各々８：１〜２：１の範囲で調製した免疫刺激複合体は、これらの応用に有用であることが見出されている。
【０１４４】
ペプチド免疫原：ＣｐＧオリゴヌクレオチドの電荷比が４：１〜２：１の範囲で調製した免疫刺激複合体に対して、安定性のためには最大ペプチド複合化およびアジュバント作用の改善のためには粒径が小であるという組合せがより好ましいことが見出されている。
【０１４５】
最も好ましい免疫刺激複合体は、代替のデリバリ様式に適合させる物理特性を有するように調製されたものである。具体的には、特に直腸、膣、口腔および鼻デリバリ用に平均粒径が１０ミクロン以下のオーダーであるのが望ましい。
【実施例２】
【０１４６】
ＲＰ−ＨＰＬＣによるペプチド免疫原およびオリゴヌクレオチド複合化効率の定量化
本実施例は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてペプチド免疫原およびオリゴヌクレオチドワクチン成分に関する複合化効率を決定するための好ましい方法を例示する。本技術は、分離および同定すべきペプチドカクテル混合物中の各残留非複合化ペプチドの定量化を可能にし（λ＝２２６ｎｍ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの完全な複合化を確認するのに用いることができる（λ＝２６０ｎｍ）。固体微粒子複合体は、遠心し、次いで濾過することにより、上澄溶液から分離することができる。２つの別個のＲＰ−ＨＰＬＣプログラムを上澄サンプルで実行して、溶液中の残留ＬＨＲＨペプチド免疫原およびＣｐＧ１オリゴヌクレオチドを同定および定量する。
【０１４７】
ペプチドは、Vydac ４．６×２５０ｍｍ  Ｃ−１８カラム（カタログ番号２１８ＴＰ５４）、９５％溶液Ａ（０．０５％ＴＦＡのＨＰＬＣ用水溶液）および５％溶液Ｂ（０．０５％ＴＦＡのＨＰＬＣ用アセトニトリル水溶液）から２４％溶液Ａおよび７６％溶液Ｂまでのグラジエントを用いる、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、流速１ｍｌ／分で４０分間、分離した。ＵＶ波長吸光度を２２６ｎｍでモニターした。標準ペプチドを用いて保持時間によりペプチドの同定を行った。
【０１４８】
オリゴヌクレオチドは、PerSpective Biosystem ４．６×１００ｍｍ  Oligo  Ｒ３カラム（カタログ番号Ｒ３３０−０５０）、９５％溶液Ａ（０．１ＭＴＥＡＡのＨＰＬＣ用水溶液、ｐＨ＝８）および５％溶液Ｂ（ＨＰＬＣ用アセトニトリル）から２４％溶液Ａおよび７６％溶液Ｂのグラジエントを用いる、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、流速１ｍｌ／分で４０分間、分離した。ＵＶ波長吸光度を２６０ｎｍでモニターした。標準オリゴヌクレオチドを用いて保持時間によりペプチドの同定を行った。
【０１４９】
実施例１および実施例１１に記載するように、ＬＨＲＨおよびＣｐＧ１が８：１〜１：１の範囲の免疫刺激複合体をこの研究用に調製した。これらの組成物を調製するのに用いたＣｐＧ１の各々の量を表３および表９に示す。ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１の比率をモル電荷比として表し、表３および表９に示す計算に基づいていることに留意すべきである。
【０１５０】
ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝８：１、４：１または２：１である、過剰のＬＨＲＨを用いて調製した免疫刺激複合体に関して、上澄溶液中に非等価量の残留ペプチドが、ＲＰ−ＨＰＬＣにより検出された。これは、複合化過程が選択的であることを示している。この技術により、結合親和性に基づいて溶液中のＣｐＧ１オリゴヌクレオチドを選好するＬＨＲＨペプチド免疫原の順位付けが可能になる。すべてのケースにおいて、残留する非複合化ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドはＲＰ−ＨＰＬＣにより検出することができなかった。これは、この成分が完全に複合化していることを示している。
【０１５１】
電荷比（ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１＝１：１）に基づいて、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドに対してＬＨＲＨの等価量を用いて調製した免疫刺激複合体に関して、本質的にはペプチドもＣｐＧ１も、ＲＰ−ＨＰＬＣにより検出されなかった。これは、全成分が完全に複合化していることを示している。
【０１５２】
これらの分析に関する結果の完全なセットを表８に表す。ＬＨＲＨペプチド免疫原のＣｐＧ１オリゴヌクレオチドとの結合は、ｐ６０７Ｅ＞ｐ６６７＞ｐ５００と順位付けできることは明らかである。３個のペプチドはほぼ同一のイオン化点を有し、３個全てが表１で計算されるように正に荷電している。ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドのｐ６６７（電荷＋５）に勝るｐ６０７Ｅ（電荷＋４）に関する選好（ｐ６０７Ｅおよびｐ６６７は双方共にｐ５００（電荷＋４）よりも選好される）は、分子量およびこれらのペプチド内の電荷の分布に関係する可能性がある。
【実施例３】
【０１５３】
乾燥免疫刺激複合体の調製
本実施例は、乾燥状態の免疫刺激複合体を調製するのに用いた手順を説明する。
【０１５４】
実施例１に記載するように調製した、水性溶媒、蒸留脱イオン水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝食塩水中０．５〜１．０ｍｌのＬＨＲＨ／ＣｐＧ１複合体の懸濁液をドライアイス／アセトン浴中におき、１５分間凍結させた。次いで凍結したサンプルを凍結乾燥器（Vertis 25LEZ）に置き、３日間で２００ｍｌ、昇華により水を除去した。この手順によりバイアルにほぼ透明なガラス状に仕上がった生成物が得られた。回収された残留固体の外観は用いた水性溶媒に依存し、ほぼ透明なガラス状から白色の綿毛状の固体までの範囲にすることができる。
【０１５５】
同一容量の水性溶媒中の乾燥材料の再構成により、個々の粒子の懸濁液を再生した。実施例２に記載するように、測定した粒径分布は、本質的な変化を示さなかった。
【０１５６】
これにより、乾燥および再懸濁方法が、調製された免疫刺激複合体の物理特性に影響しないことが例示された。よって、本発明の免疫刺激複合体を有するワクチン組成物は、懸濁液、固体または乾燥粉末の形態で提供することができる。
【実施例４】
【０１５７】
（実施例４ａ）
高せん断均質化を用いる油中水滴型エマルションの調製
本実施例は、均質化技術を用いて、ＬＨＲＨペプチド免疫原（溶液中１：１：１のモル比の配列番号７〜９）、ＩｇＥペプチド免疫原（溶液中２：１のモル比の配列番号１０〜１１）、ＣＤ４ペプチド免疫原（溶液中２：１：１のモル比の配列番号４〜６）由来のカチオン性ペプチド、または種々の比率のＬＨＲＨ、ＩｇＥもしくはＣＤ４免疫原およびＣｐＧ１もしくはＣｐＧ２オリゴヌクレオチド由来の免疫刺激複合体から油中水滴型（ｗ／ｏ）エマルションを調製する方法を例示する。本明細書に記載する均質化を介するエマルションの形成方法を説明する流れ図を図３に示す。
【０１５８】
全てのガラス製品、攪拌子およびピペットチップを使用前に１２１℃で４０分間、オートクレーブ処理した。夾雑を避けるために、層流フード内で全試薬の重量測定、分配、移動または反応容器への添加を行った。
【０１５９】
必要とされる、水相：油相の容量比に関する安定性について、ｗ／ｏエマルションを最適化した。モンタニド（Montanide（登録商標））ＩＳＡ  ７２０オイル（SEPPIC, Inc.）を用いる組成物に関して、水：油の比率は容量で３０：７０であった。ＩＳＡモンタニド（登録商標）５１またはＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖオイル（SEPPIC, Inc.）を用いる組成物に関して、水：油の比率は容量で５０：５０であった。
【０１６０】
（実施例４ｂ）
ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０および免疫刺激複合体からの油中水滴型エマルションの調製
１０ｍｌ容器に、適当な水性緩衝液に溶解したペプチド免疫原３，３３３μｇ（１，１１１μｌ、３ｍｇ／ｍｌ）または適当な水性緩衝液に溶解したペプチド免疫原３，３３３μｇ（１，１１１μｌ、３ｍｇ／ｍｌ）およびＣｐＧ１もしくはＣｐＧ２のいずれかのオリゴヌクレオチドから調製した免疫刺激複合体を加えた。表３および表４は、用いた各試薬の相対量を決定するための計算を示す。
【０１６１】
具体的には、ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１の電荷比４：１でＬＨＲＨペプチド免疫原から免疫刺激複合体を調製するのに、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド２４４μｇ（１２２μｌ、２．０μｇ／ｍｌ）を用いた。
【０１６２】
具体的には、ＩｇＥ：ＣｐＧ１の電荷比４：１でＩｇＥペプチド免疫原の免疫刺激複合体を調製するのに、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド３８７μｇ（１９３．５μｌ、２．０μｇ／μｌ）を用いた。ＩｇＥ：ＣｐＧ１の１：１中性複合体を形成するのに、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド１，５４８μｇ（７７４．０μｌ、２．０μｇ／μｌ）を用いた。
【０１６３】
具体的には、ＣＤ４：ＣｐＧ２の電荷比２：１でＣＤ４ペプチド免疫原の免疫刺激複合体を調製するのに、ＣｐＧ２オリゴヌクレオチド４０２μｇ（２０１μｌ、２．０μｇ／μｌ）を用いた。ＣＤ４：ＣｐＧ２の１：２の電荷比を形成するのに、ＣｐＧ２オリゴヌクレオチド１６０８μｇ（８０４μｌ、２．０μｇ／μｌ）を用いた。
【０１６４】
各々のＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０ｗ／ｏエマルションを調製するのに、各容器に希釈水性溶媒をさらに加えて水相の最終容量を３．０ｍｌに固定した。
【０１６５】
ＬＨＲＨまたはＩｇＥペプチドに関して、生理食塩水またはＰＢＳが複合化に適していることが見出された。各ペプチド免疫原に関して計算されたＩＰは、９．０を超え（表１）、選択された水性溶媒のｐＨよりもはるかに大きい。
【０１６６】
ＣＤ４ペプチドの場合、水性溶媒の選択が重要であることが判明した。生理食塩水またはＰＢＳのいずれかで希釈するとき、固体沈殿物が溶液中で速やかに形成されるのが観察された。この不安定性により非経口経路によるこの免疫原の組合せの使用が妨げられる。ペプチド免疫原の試験から、ペプチド配列番号６（表１）の計算されたイオン化点は６．９１であることが示された。ＰＢＳ（ｐＨ〜７．２）では、このペプチドは凝集する傾向があり、不安定性を呈すると予測される。この問題に対する解決法は、最初に蒸留脱イオン水中で免疫刺激複合体を調製し、続いて十分なイオン強度の食塩水またはＰＢＳで希釈することにより、懸濁液が等張であり且つ注射に適することを確実にできることが見出された。
【０１６７】
本実施例は、ＬＨＲＨ、ＩｇＥまたはＣＤ４ペプチドの免疫刺激複合体の形態で溶液中の免疫原を安定化することの利点を例示する。
【０１６８】
その後、希釈された水溶液または懸濁液を、ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０  ７．０ｍｌを充填した乾燥２５ｍｌ反応容器にゆっくりと添加した。粗雑なエマルションを作製するために、混合物を低速（２，０００〜３，０００ｒｐｍ）で均質化（High Shear Laboratory Mixer, Sealed Unit, Silverson）しながら添加を行った。水性サンプルが完全に添加されるまでこの処理速度を維持し、水相および油相の均一な予備混合を確実にするために丸２分間続けた。次いで均質化速度を上げ（５，０００〜８，０００ｒｐｍ）、さらに５〜１０分間維持し、結果的に均質な白色の微細に分散されたｗ／ｏエマルションが形成された。
【０１６９】
懸濁液として、または上述したような油中水滴型エマルションに一度配合された免疫原の最終濃度は、２００μｇ／ｍｌであった。
【０１７０】
（実施例４ｃ）
均質化法により調製された油中水滴型エマルションの安定性評価
均質化により調製したｗ／ｏエマルションの一貫性および安定性を種々の方法により検査した。エマルションが水中油滴型（oil-in-water）（ｏ／ｗ）または水中油中水滴型（ｗ／ｏ／ｗ）でなく、油中水滴型（ｗ／ｏ）エマルションであることを証明するために、組成物の小滴を、蒸留脱イオン水の入ったビーカーに加えた。ｗ／ｏエマルションの小滴は、表面に浮き、水に分散しない。逆に、ｏ／ｗエマルションからの小滴は、即座に水に分散し、ｗ／ｏ／ｗ二重エマルションからの小滴は、表面上および水相のバルク中の双方で分散する。ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０から調製したエマルションからの小滴は、分散が最小限で表面に浮き、ＩＳＡモンタニド（登録商標）５１オイルから調製したエマルションからの小滴は、本質的に分散せずに表面に浮くのが観察された。これらの結果により、エマルションがｗ／ｏであり、分散する傾向がＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０から調製したｗ／ｏエマルションでより高いことがわかる。これは、油自体の最初の粘度および得られたエマルションの粘度に関係する。これは、得られるワクチン配合物の貯蔵庫（depot）能力を最大にするために、重要な検討材料である。
【０１７１】
ロット間の一貫性に関して、および長期安定性試験について、仕上がったエマルションおよび油の見かけの粘度を検査した（Brookfield  ＤＶ−１＋１回転式粘度計）。ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０は、２５℃で〜１５ｍＰａの粘度を有する一方、ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０から調製したｗ／ｏエマルションは、２５℃で〜４５−５０ｍＰａの粘度を有した。かなり流動性のある生成物を提供した。これは、取り扱いを容易にし、ワクチンをシリンジで分配するのに望ましい。
【０１７２】
対照的に、ＩＳＡモンタニド（登録商標）５１は、２０℃で〜５０ｍＰａの粘度を有する一方、ＩＳＡモンタニド（登録商標）から調製したｗ／ｏエマルションは、２５℃で〜１，５００〜２，９００ｍＰａの粘度を有した。粘度の広範な変動は、緩衝液選択の作用であることが解った。（ＰＢＳ＝〜２，９００ｍＰａ、ＮＳ＝〜２，５００ｍＰａおよび蒸留脱イオン水＝〜１，５００ｍＰａ）この高粘度の材料は、移動およびシリンジでの分配に関していくつかの困難を提示する可能性がある。しかしながら、これらの組成物の長期安定性は改善された。１．５ｍｌエッペンドルフバイアルに各エマルション１ｍｌを入れ、高速（５，０００ｒｐｍ）で１０分間内容物を遠心することによりエマルションの長期安定性を評価した。これらの条件は、実際の保存条件をシミュレートしないが、エマルションの分離に対する抵抗性を予測するのに用いることができる。ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０の場合、５〜１０％の容量が透明または麦わら色の油相を伴って分離するのが表面で観察された。ＩＳＡモンタニド（登録商標）５１の場合、０〜２％の容量が透明または麦わら色の油相を伴って分離するのが表面で観察された。高粘度のＩＳＡモンタニド（登録商標）５１エマルション生成物は、より大きな沈殿に対する安定性および分離に対する抵抗性を説明する。
【０１７３】
ｗ／ｏエマルションに関する粒径および分布を光学顕微鏡（Nikon DIAPHOT 200）によりさらに特徴付けした。各組成物の顕微鏡写真が得られ、コンピューターで作製したスケールを用いて粒子のサイズ範囲の見積もりを行った。スケール自体は公知の粒径（ＮＩＳＴ追跡可能微粒子−Duke Scientific）の標準に対する外部参照である。ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０またはＩＳＡモンタニド（登録商標）５１のいずれか、およびペプチド免疫原から調製したｗ／ｏエマルションに関して、粒径は本質的に同一（約１〜２ミクロン）であり、凝集または融合は最小限であった。ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０またはＩＳＡモンタニド（登録商標）５１のいずれかおよび免疫刺激複合体から調製したｗ／ｏエマルションに関して、粒径はわずかかに大きく（約１〜３ミクロン）、凝集または融合は最小限であった。図４は、ＩＳＡモンタニド（登録商標）５１および、最終電荷比ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１  ４：１を有するＬＨＲＨペプチド免疫原１００μｇ由来の免疫刺激複合体からの均質化により調製したｗ／ｏエマルションから得られた顕微鏡写真である。
【０１７４】
最初の平均粒径は１０ミクロンのオーダーであった。高せん断下で免疫刺激複合体の水性懸濁液を均質化させる過程の結果、より小型の平均凝集粒径に至った。１〜３ミクロンの範囲のサイズの小滴を伴う、安定したｗ／ｏエマルションが得られた。
【実施例５】
【０１７５】
（実施例５ａ）
低せん断押出を用いる油中水滴型エマルションの一般的な調製
本実施例は、押出技術を用いる、ＬＨＲＨ、ＩｇＥもしくはＣＤ４免疫原由来のカチオン性ペプチドまたは種々の割合のＬＨＲＨ、ＩｇＥもしくはＣＤ４免疫原およびＣｐＧ１もしくはＣｐＧ２オリゴヌクレオチド由来の免疫刺激複合体からのｗ／ｏエマルション形成の方法を説明する。表３および表４は、用いた各試薬の相対量を決定する一般的な計算を示す。本明細書で記載する押出によるエマルション形成の方法を説明する流れ図を図３に示す。
【０１７６】
全てのガラス製品、攪拌子およびピペットチップ並びに押出機械全体を使用前に１２１℃で４０分間、オートクレーブ処理した。夾雑を避けるために、層流フード内で全試薬の重量測定、分配、移動または反応容器への添加を行った。
【０１７７】
押出法には、１つのシリンジに装填された水相を、２つのシリンジを連結する細管を通して、第２のシリンジに装填された油相に繰り返し通過させることが含まれる。流動体が細管を通って加圧下で、典型的には１００ｐｓｉで送られるので、乳化が起こる。対照的に、ホモジナイザー系は典型的には、１，０００ｐｓｉを超えた圧力で作動する。上述の押出法に必要な繰返し（return passage）の数は、視覚的に均一なｗ／ｏエマルションが作製されるまでしばしば２０から３０を超える。この手動の押出法は、顕著なせん断を作製することができず、ｗ／ｏエマルションを効果的に生成するのに必要な交換数が大きく変動する。ｗ／ｏエマルションの物理特性は、一貫性を欠き、全体の安定性および結果的にインビボでの可能性は典型的には高度に再現不能である。これらの問題にかかわらず、この方法により生成された生成物に関して多くの適用が可能である。
【０１７８】
これらの欠点に対処するために、押出機械が改良されている（LiposoFast（商標）Basic, Avestin, Inc.、オタワ、カナダ）。装置は２つのシリンジ（０．５ｍｌまたは１．０ｍｌ）から構成され、その２つのシリンジはそれらの間に置かれた特定の孔径のポリカーボネート膜を有するホルダーに連結された細管の流路に、ルアー・ロックを介して取り付けられている。元来設計された装置は、調節された大きさのリポソームを調製するためのものであった６３。ｗ／ｏエマルションを調製するための、適合する油ベースの生成物を用いるこのような装置の適用は企図されていなかったようである。膜の孔径を選択することができる（Whatman Nucleopore、０．０５μＭ〜１０μＭ）。小さい孔径によりせん断を高めた分散物の押出が可能になる。粒子が大きなサイズになる配合物には大きい孔径を選択することができる。この装置を用いることにより乳化の効率が高まった。より均一且つ安定した生成物を提供するのに必要とされる繰返し（return passage）は少なくなった。このような調製物のインビボでの可能性はより再現性が高くなると予測される。しかしながら、実際に用いることができる最大容量が少ない（約１０ｍｌ）ため、および油成分の選択における実際的な制約のために依然制限がある。
【０１７９】
ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０由来のｗ／ｏエマルションの調製にはこの方法がうまく作動する。しかしながら、ＩＳＡモンタニド（登録商標）５１由来の、高粘度のエマルションは、著しい逆方向の圧力（backpressure）を招き、この押出装置の使用が不可能になる。このように、この方法は見かけの粘度が１，５００ｍＰａ未満の油からの即時的なｗ／ｏエマルションの調製のための方法としては最良であると見なすことができる。
【０１８０】
特に、ワクチンの保存および安定性に伴う経費が懸念されるか、または患者のコンプライアンスが問題であるかもしくは緩和医療としての適用が関係する場合、この分配方法は、コスト的に有効且つ現実的であろう。一般的な使用のために現場で即時的なｗ／ｏ配合物を調製するのに熟練者、例えば医師または薬剤師に頼ることができるのが理想的である。
【０１８１】
せん断および押出が制御されている必要がある、即時的なｏ／ｗおよびｗ／ｏ／ｗ、マイクロエマルションの調製のために、または精製された生成物の調製のためにこの装置およびプロトコルを用いることができる。
【０１８２】
（実施例５ｂ）
ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０からの油中水滴型エマルションの調製
１．０ｍｌガラスシリンジ（気密性）に、適当な水性緩衝液に溶解したＬＨＲＨ、ＩｇＥもしくはＣＤ４ペプチド免疫原３３３μｇ（１１１μｌ、３ｍｇ／ｍｌ）、または各々表３および表４に記載する適当な比率のＣｐＧ１もしくはＣｐＧ２オリゴヌクレオチド、および適当な溶媒に溶解したＬＨＲＨもしくはＩｇＥペプチド免疫原３３３μｇから調製した免疫刺激複合体（電荷比４：１）またはＣＤ４ペプチド免疫原３３３μｇから調製した免疫刺激複合体（電荷比２：１）を加えた。
【０１８３】
具体的には、ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１が４：１の電荷比でＬＨＲＨペプチド免疫原から免疫刺激複合体を調製するために、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド２４．３μｇ（１２．２μｌ、２．０μｇ／ｍｌ）を加えた。
【０１８４】
ＩｇＥ：ＣｐＧ１が４：１の電荷比でＩｇＥペプチド免疫原から免疫刺激複合体を調製するために、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド３８．７μｇ（１９．４μｌ、２．０μｇ／μｌ）を加えるか、またはＩｇＥ：ＣｐＧ１の１：１中性複合体を形成するために、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド１５４．８μｇ（７７．４μｌ、２．０μｇ／μｌ）を加えた。
【０１８５】
ＣＤ４：ＣｐＧ２が２：１の電荷比でＣＤ４ペプチド免疫原から免疫刺激複合体を調製するために、ＣｐＧ２オリゴヌクレオチド４０μｇ（２０μｌ、２．０μｇ／μｌ）を加えるか、またはＣＤ４：ＣｐＧ２が１：２の電荷比で複合体を形成するために、ＣｐＧ２オリゴヌクレオチド１６０μｇ（８０μｌ、２．０μｇ／μｌ）を加えた。
【０１８６】
さらに希釈用水性溶媒を加えて水相の最終容量を３００μｌにした。
【０１８７】
第２の１．０ｍｌガラスシリンジ（気密性）に、ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０  ７００μｌを加えた。シリンジを、ルアー・ロックを介してポリカーボネートメンブレンフィルタの膜ホルダーおよび支持体を含む押出内蔵ユニットに連結した。水相でペプチド免疫原を用いてｗ／ｏエマルションを調製するのに孔径３μｍまたは５μｍのメンブレンフィルタを選択した。一方、水相に懸濁された免疫刺激複合体を用いてｗ／ｏエマルションを調製するのに孔径５μｍまたは１０μｍのメンブレンフィルタを選択した。次いで、典型的には非常に容易に、水相が最初に膜を通って油相に通過した。エマルション過程の間に作製される逆方向の圧力（backpressure）の上昇を伴い、続く交換にはさらなる圧力が必要とされる。８〜１２回の通過後、押出時の逆方向の圧力は均等化され、典型的には均質な白色エマルションが得られた。
【０１８８】
上述したように、溶液として、又は油中水滴型エマルション中の免疫刺激複合体として一度配合された免疫原の最終濃度は、２００μｇ／ｍｌであった。
【０１８９】
（実施例５ｃ）
押出により調製した油中水滴型エマルションの安定性評価
実施例４ｃで行われた試験に類似の安定性試験により、押出法により調製したこれらの組成物がｗ／ｏエマルションであることを確認した。蒸留脱イオン水の表面上に置いた小滴は、最小限に分散するだけで浮くことが観察された。得られたエマルションの粘度は、〜３５−４０ｍＰａの範囲であり、実施例４ｃの高エネルギー均質化を行った系と比較した場合わずかに低下したことが見出された。エマルション小滴の粒径分布は、類似の均質化された系よりも大きかった。ペプチド免疫原から調製したｗ／ｏエマルションに関しては約１〜３ミクロン、免疫刺激複合体から調製したｗ／ｏエマルションに関しては約２〜５ミクロンであった。比較のために図５は、ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０並びに最終電荷比ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１が４：１のＬＨＲＨペプチド免疫原２００μｇおよびＣｐＧ１オリゴヌクレオチド由来の免疫刺激複合体から押出により調製したｗ／ｏエマルションから得られた顕微鏡写真である。
【０１９０】
一般に、図５で示すような低エネルギー押出法により得られた小滴のサイズは、図４で示すような高エネルギー均質化した小滴よりも大きく、高度に凝集されていた。全体的に、これらの即時的ｗ／ｏエマルションは、即座にまたは同一日に使用するのに十分安定である。
【実施例６】
【０１９１】
（実施例６ａ）
in-situポリマーゲルの調製
本実施例は、直接再構成技術を用いる、種々の比率のＩｇＥまたはＣＤ４免疫原およびＣｐＧ１またはＣｐＧ２オリゴヌクレオチド由来の免疫刺激複合体のin-situゲルマトリックス形成および封入の方法を説明する。本明細書に記載する、再構成によるペプチド免疫原または免疫刺激複合体のいずれかを用いるin-situゲル配合物を調製する方法を示す流れ図を図６に示す。
【０１９２】
全てのガラス製品、攪拌子およびピペットチップを使用前に１２１℃で４０分間、オートクレーブ処理した。夾雑を避けるために、層流フード内で全試薬の重量測定、分配、移動または反応容器への添加を行った。
【０１９３】
一般に、種々の重量パーセンテージのＰＬＧまたはＰＬＧＡ共重合体（Boehringer Ingerheim）を生体適合性溶媒、例えば無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Aldrich）に溶解した。高分子量ポリマーでは溶解過程は、激しい振盪を必要とし、完全な溶解を確実にするために継続的に４〜６時間攪拌を続けた。次いでポリマー溶液を孔径０．４５ミクロンの有機溶媒に適合する膜（Phenomenex、ＰＴＦＥ）を通して濾過した。これに、適当な生体適合性溶媒中のカチオン性ペプチド免疫原の溶液またはより好ましくは免疫刺激複合体の懸濁液を加えた。ペプチド免疫原またはペプチド／ＣｐＧ複合体またはこれらの混合物を最初に凍結乾燥し（実施例３に記載するように）、続いて適当な生体適合性溶媒、例えばＤＭＳＯに溶解または再懸濁した。
【０１９４】
極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＳＯの使用によりペプチドの長期安定性に関していくつかの問題が提示され得る。ＤＭＳＯは強力な酸化剤として知られ、感受性のあるアミノ酸、例えばシステインおよびトリプトファンを含むペプチドは、これらの溶液中で化学的に非適合性であり得る。従って、これらの残基を含むペプチド免疫原は、即時使用のために現場で再構成されなければならない。
【０１９５】
凍結乾燥ペプチド免疫原もしくは免疫刺激複合体またはこれらの混合物を、使用時にバイアル中で直接ＤＭＳＯ中のポリマー溶液に再構成し、それによりペプチド免疫原のＤＭＳＯへの長期暴露を避けた。ペプチド免疫原の溶解または免疫刺激複合体もしくは免疫刺激複合体とペプチド免疫原との混合物の再懸濁は迅速で、サンプルの均一性を確実にするために穏やかな振盪を必要とした。
【０１９６】
これらの一般的な組成物に関しては、安定性が低く、予測される製造上の問題がある。無水ＤＭＳＯ中のポリマー溶液は、水溶液に溶解または懸濁したペプチド免疫原と比較されるほどには加水分解を受け易くない。ポリマー溶液は、解凍時に物理特性に検出される変化なく、凍結することができる（ＤＭＳＯは約１８℃で凍結する）。凍結乾燥状態で単離したペプチドまたは免疫刺激複合体もまた、水の不存在下で安定性が高くなることが示されると予測される。
【０１９７】
このようなポリマーおよびペプチド免疫原または免疫刺激複合体の混合物は、皮下または筋内注射に適した単一相溶液または懸濁液を構成する。
【０１９８】
いずれかの系に関して重要なことは、溶液または懸濁液の粘度である。これは皮下または筋肉内経路により組成物を注入および注射する能力に直接影響する。
【０１９９】
これらの系の見かけの粘度は、ＰＬＧまたはＰＬＧＡ共重合体の構成、分子量、結晶性および対数粘度数などの種々因子の関数である。これらの因子は、各ポリマーに関して溶解できるが、実際の流動性を維持する有用な量を重量で範囲を定める。表５は選択したＰＬＧまたはＰＬＧＡポリマーに関する物理特性および実際の使用の溶液粘度を得るためにＤＭＳＯに溶解できる対応する量を重量パーセンテージで示す。これらの溶液の見かけの粘度をBrookfield  ＤＶ−１＋回転式粘度計により測定した。
【０２００】
これらの組成物に望ましい上限として任意に１００ｍＰａを選択した。たいていの場合、見かけの粘度が２００ｍＰａ未満のin-situゲル化ポリマー溶液として配合した溶液または懸濁液を従来のシリンジにより均一に分配することができる。
【０２０１】
１００ｍＰａの見かけの粘度を提供するために必要とされる、溶液に対して過剰のポリマーを含むポリマー／ＤＭＳＯ溶液は、従来のシリンジまたはニードルレス法などの代替の様式による分配に価値がある。注射および免疫原のバースト放出時のゲル化挙動は、組成物中のポリマーの濃度に一部関係する。結果的に、ゲル化の速度を最大にし、免疫原のバースト放出を低減することが、１回投与を選択できる放出制御組成物の開発において考慮すべき２つのさらなる設計パラメータである。
【０２０２】
（実施例６ｂ）
ＰＬＧＡリソマー（ＰＬＧＡ  Resomer（登録商標））−ＲＧ  ５０３ＨまたはＲＧ  ５０４Ｈからのポリマーゲルの調製
攪拌子を備えた２個の別個の２５ｍｌフラスコに、各々ＲＧ  ５０４Ｈ  ２，２００ｍｇまたはＲＧ  ５０３Ｈ  ２，７５０ｍｇを加えた。トランスファーピペットで各フラスコに、無水ＤＭＳＯ（１．１ｇｍ／ｍｌ）１０．０ｍｌを加えた。室温で約２〜３時間、混合物を激しく攪拌し、その後共重合体を十分に可溶化した。完全に溶解した後、貯蔵溶液を０．４５μｍ有機溶媒安定性メンブレンフィルタ（Phenomenex、ＰＴＦＥ）で濾過した。ＲＧ  ５０４ＨおよびＲＧ  ５０３ＨポリマーのＤＭＳＯ溶媒に対する最終重量パーセントは各々２０％および２５％であった。
【０２０３】
次いでこのように調製したポリマー／ＤＭＳＯ溶液１０ｍｌをシリンジを介して、凍結乾燥したＩｇＥまたはＣＤ４ペプチド免疫原（２，０００μｇ）またはＣｐＧ１オリゴヌクレオチド２３２μｇ（１１６μｌ、２．０μｇ／μｌ）と混合したＩｇＥペプチド２，０００μｇもしくはＣｐＧ２オリゴヌクレオチド２４１μｇ（１２０．５μｌ、２．０μｇ／μｌ）と混合したＣＤ４ペプチド２，０００μｇ由来の凍結乾燥化免疫刺激複合体（ＩｇＥ：ＣｐＧ１電荷比４：１またはＣＤ４：ＣｐＧ２電荷比２：１）の入ったバイアルに加えた。溶液中の、または懸濁液中の免疫刺激複合体の形態の免疫原の最終濃度は２００μｇ／ｍｌであった。免疫原または免疫刺激複合体を溶液または懸濁液で即座に再構成し、内容物の均一性を確実にするために穏やかに振盪した。
【０２０４】
特定の重量比でこれらのポリマーから調製した溶液の見かけの粘度は、１００ｍＰａに近似することが見出された。（表５参照）。およそ１００ｍＰａの溶液粘度のために、リソマー（Resomer（登録商標））ＲＧ  ５０３Ｈ、リソマー（登録商標）ＲＧ  ５０４Ｈおよびリソマー（登録商標）ＲＧ  ７５６が臨界であり、リソマー（登録商標）ＲＧ  ５０３Ｈおよびリソマー（登録商標）ＲＧ  ５０４Ｈに関する濃度は、対数粘度数がかなり低く、並びに双方はアモルファスの特徴を有するＰＬＧＡに由来する。ここでモノマー組成物は約５０％D,L-ラクチドおよび５０％グリコリドであった。これらの材料は、インビボでポリマーの５０％が６〜８週の速度で分解すると推定された。従って、封入された成分は、リソマー（登録商標）ＲＧ  ５０３Ｈまたはリソマー（登録商標）ＲＧ  ５０４Ｈから調製したゲルで２〜３か月の放出プロファイルを有する。これらの材料から調製したゲルは、短期間の１回投与用放出制御適用に最も適している。逆に、リソマー（登録商標）ＲＧ  ７５６は２５％  グリコリド残基に対して７５％  D,L-ラクチドから成るより結晶性のポリマーである。インビボで分解するために、ポリマーの５０％で４〜６か月必要であり、封入成分の放出速度は結果的により遅くなる。リソマー（登録商標）ＲＧ  ７５６は長期間１回投与用放出制御適用により望ましいと予測される。
【実施例７】
【０２０５】
免疫刺激複合体としてまたはｗ／ｏエマルションとしてまたは組合せで配合されたＩｇＥおよびＣＤ４ペプチド免疫原の免疫原性
本実施例は、筋内に免疫したモルモットにおいて、ＣｐＧ１またはＣｐＧ２オリゴヌクレオチドを用いて免疫刺激複合体として、ｗ／ｏエマルションとして、またはｗ／ｏエマルションに分散した免疫刺激複合体として配合したＩｇＥおよびＣＤ４ペプチド免疫原の免疫原性を例示する。ｗ／ｏエマルションは、実施例４ａ／４ｂに記載する均質化により、または実施例５ａ／５ｂに記載する押出により、調製した。
【０２０６】
６〜８週齢の雌モルモット（Covance Research Products Inc., Denver、ペンシルバニア州）３群を０、３および６週に以下の組成物で筋内（Ｉ．Ｍ．）免疫した。表４に記載するように調製したＩｇＥペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比４：１および電荷比１：１）１００μｇをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に最終容量２５０μｌで懸濁；表４に記載するように調製したＣＤ４ペプチド／ＣｐＧ２免疫刺激複合体（電荷比２：１および電荷比１：２）７５μｌをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に最終容量２５０μｌで懸濁；ＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５μｌ中のＩｇＥペプチドをＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０（１７５μｌ）で乳化；蒸留脱イオン水７５μｌ中のＣＤ４ペプチドをＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０（１７５μｌ）で乳化；ＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５μｌ中の、表４に記載するように調製したＩｇＥペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比４：１および中和電荷比１：１）をＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０（１７５μｌ）で乳化；または蒸留脱イオン水７５μｌ中の、表４に記載するように調製したＣＤ４ペプチド／ＣｐＧ２免疫刺激複合体（電荷比２：１および電荷比１：２）をＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０（１７５μｌ）で乳化。
【０２０７】
免疫刺激複合体、ペプチド免疫原を含むｗ／ｏエマルションまたは免疫刺激複合体を含むｗ／ｏエマルションを投与した後、モルモットは全体的な病理学または挙動変化を示さなかった。＋３、＋５、＋９、＋１１および＋１７週に血清を入手し、ＩｇＥ免疫原の場合は抗ＩｇＥ抗体、またはＣＤ４免疫原の場合は抗ＣＤ４抗体の存在を免疫原特異的ＥＬＩＳＡにより評価した。
【０２０８】
抗ＩｇＥ抗体の測定
抗ＩｇＥペプチド力価をＩｇＥペプチドＥＬＩＳＡにより、およびヒトＩｇＥに対する交差反応性をヒトＩｇＥ  ＥＬＩＳＡにより決定した。上述したように６４、抗ＩｇＥペプチド反応性の測定のためのペプチドＥＬＩＳＡを、Ｔヘルパー部位を含まない標的抗原部位ペプチドでコートしたマイクロタイタープレートで、行った。抗ヒトＩｇＥ交差反応性を測定するために、同様の方法で、ヒトＩｇＥ  ＥＬＩＳＡを、ヒトＩｇＥミエローマタンパク質（American Biosystems, Inc.  カタログ番号Ａ１１３）５μｇ／ｍｌでコートしたマイクロタイタープレートで行った。
【０２０９】
捕捉した抗ペプチドまたは抗ＩｇＥ抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化抗モルモットＩｇＧヤギ抗体により検出した。相互希釈のｌｏｇ１０として表されるＥＬＩＳＡ力価を吸光度の直線回帰分析に基づいてカットオフＡ４９２を０．５に設定して計算した。各アッセイで用いた、希釈した正常モルモット対照サンプルに関する値が０．１５未満であったので、このカットオフ値は正確である。超免疫モルモット抗ＩｇＥペプチド免疫原抗血清をポジティブ・コントロールとして使用した。免疫前血清をネガティブ・コントロールとして使用した。
【０２１０】
抗ＣＤ４抗体の測定
組換え可溶性ＣＤ４に対する結合に関するＥＬＩＳＡを、０．２５μｇ／ｍｌ  ｒｓＣＤ４（American BioTechnologies）でコートした９６ウェルマイクロタイタープレートで、ウェルあたり１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．５）１００μｌを用いて行った。ウェルを３％ゼラチン２５０μｌで遮断し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％  ＴＷＥＥＮ２０で洗浄し乾燥した。被験ウェルを希釈した免疫血清１００μｌで３７℃で１時間反応させた。ウェルをＰＢＳ中０．０５％ＴＷＥＥＮ２０で洗浄し、ＰＢＳ中１％ヤギ血清、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で１：１，０００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌと反応させ、洗浄した。クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中０．０４重量％  オルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質１００μｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）および０．１２％  Ｈ２Ｏ２を１５分間加えた。１．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌの添加により反応を停止させ、Ａ４９２を決定した。超免疫モルモット抗ＣＤ４ペプチド免疫原抗血清をポジティブ・コントロールとして使用した。免疫前血清をネガティブ・コントロールとして使用した。
【０２１１】
競合ＥＬＩＳＡによる機能的抗原性の測定
この競合ＥＬＳＩＡでは、その公知の特異性がＨＩＶに結合する宿主細胞表面でのＣＤ４複合体に関するものである、機能的モノクローナル抗体、ｍＡｂ  Ｂ４を競合的に阻止する能力に関して惹起された抗体を試験することにより、ＣＤ４免疫原に関する機能的抗原性を定量化した。この抗結合部位モノクローナル抗体は、ＨＩＶ結合複合体のその高度な親和性に関して、可溶性組換えＣＤ４（ｒｓＣＤ４）のドメイン１に対する結合に関して、およびＨＩＶ−１  １次単離体を中和する能力に関して十分に特徴づけされている６５。
【０２１２】
抗結合部位モノクローナル抗体を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製し、ホースラディッシュペルオキシダーゼに抱合させた。ｍＡｂ  Ｂ４−ＨＲＰ抱合体を０．５μｇ／ｍｌの濃度でアッセイにおいてトレーサーとして使用した。９６ウェルマイクロタイタープレートを０．１Ｍ  炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中１μｇ／ｍｌ組換え可溶性ＣＤ４タンパク質で一晩インキュベートしてコートした。ＰＢＳ／ヤギ血清／ゼラチン／ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の全容量１００μｌ中、連続希釈した免疫血清（モルモット、ブタ、またはヒヒ）およびｍＡｂ  Ｂ４−ＨＲＰ作業用貯蔵物３０μｌを用いてマイクロタイターウェルで反応を行った。希釈した血清およびｍＡｂ  Ｂ４−ＨＲＰを予めインキュベートした後、混合物をウェルに加えた。競合ＥＬＩＳＡのポジティブ・コントロールは、正常血清中０．５μｇ／ｍｌ非標識化抗結合部位ｍＡｂ  ５μｌであり、ネガティブ・コントロールは正常血清である。血清／抗体希釈混合物１００μｌをコートしたウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを空にし、洗浄し、色素原との反応により結合したｍＡｂ  Ｂ４−ＨＲＰを検出した。色素原は3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）であり、ＴＭＢ結合ｍＡｂ  Ｂ４抱合体をＡ４５０で検出した。適当な種の正常血清に１０μｇ／ｍｌから連続希釈した、精製されたｍＡｂ  Ｂ４で検量線が得られ、それによりｍＡｂ  Ｂ４−ＨＲＰのヒト組換え可溶性ＣＤ４に対する結合を競合的に阻止する免疫血清の希釈に関するｍＡｂの等価値が得られた。
【０２１３】
ウイルス中和アッセイ
熱不活化血清を１５％ＦＢＳ、抗生物質、２％グルタミンおよび炭酸緩衝液を有する５０％高グルコースＤＭＥＭ、およびプールした５０％脱繊維素正常ヒト血漿で連続希釈した以外は、記載された６６ようにＭＴ−２マイクロプラークアッセイを実施した。このアッセイでは、希釈した血清をＨＩＶ２０ｐｆｕと共にマイクロタイターウェルでインキュベートする。ＨＩＶ感受性ＭＴ−２細胞を加え、溶融アガロースの下で遠心力により単層を形成させる。１週間後、ヨウ化プロピジウム染色したプラークの存在により残留ウイルス感染性を検出する。終末点は、プラーク計数における５０％減または９０％減での血清希釈であった。
【０２１４】
免疫原性結果
ＩｇＥ免疫原の免疫に続く血清抗体価を図７（均質化系）および図９（押出系）に示し、ＣＤ４免疫原に関しては図８（均質化系）および図１０（押出系）に示す。表６は、各々９週、１１週および１７週のＣＤ４ペプチド研究（均質化、および押出ｗ／ｏエマルション系）から得られた血清に関して検定したＢ４モノクローナル抗体の競合阻止を比較する。表７は、各々９週および１１週のＣＤ４ペプチド研究（均質化、および押出ｗ／ｏエマルション系）から得られた血清に関して検定したウイルス中和活性（各々５０％および９０％阻止）を比較する。コントロール実験から、すべてのケースにおいて、アジュバント化していないペプチドは免疫原性がないかまたは免疫原性が弱いことがわかった。
【０２１５】
ＩｇＥおよびＣＤ４双方のワクチンに関して、免疫の結果により、免疫刺激複合体はアジュバント作用し、図７〜１０に示すようにエマルションを均質化技術により、または押出技術により調製したかどうかに関わらず、９週までの力価はｗ／ｏエマルションで得られた力価よりもわずかに弱いかまたはそれに匹敵した。
【０２１６】
いずれかの方法により調製したｗ／ｏエマルションとして分散された免疫刺激複合体を用いる組合せ系により、最も高度な持続性免疫応答が一貫して提供された。図７〜１０に表されるように、１１から１７週にＩｇＥおよびＣＤ４双方の免疫原に関して誘導された抗体価が対数単位のオーダーかまたは、免疫刺激複合体単独か、もしくはペプチド単独でのｗ／ｏエマルションのいずれかで得られた抗体価よも高いことが見出された。これに対する唯一の例外は均質化により調製したＣＤ４ｗ／ｏエマルションであり、ここでこの区別は１７週まで見出されない。
【０２１７】
この観察は、表６および７で強調するＣＤ４ペプチド競合阻止およびウイルス中和研究から得られたデータによりさらに支持される。ここでＣＤ４ペプチド／ＣｐＧオリゴヌクレオチド（電荷比ＣＤ４：ＣｐＧ２＝２：１）とのｗ／ｏエマルション組合せ系に対する免疫血清は、単純なｗ／ｏエマルションまたはＣＤ４ペプチド単独との免疫刺激複合体に対する免疫血清と比較して、Ｂ４モノクローナル抗体を最高レベルで競合的に阻止した。さらに、同一の配合物は感染性ウイルスに対して中和活性を誘導するのに最も有効であることが示される。
【０２１８】
均質化調製物又は押出調製物の間で小さな差異が認められ、その差異にはＥＬＩＳＡにより得られた、ＩｇＥまたはＣＤ４免疫原に対して誘導される力価がピークに達するのに観察された速度が含まれる。押出ｗ／ｏエマルションでは免疫応答が早期（９週）にピークに達したが、得られた応答期間は良好である（本質的に１１週までに等価であり、１７週までにわずかに低下）。類似の均質化系はわずかに遅く（１１週）にピークに達し、高力価で認めることができるような持続性応答が提供され、１７週で持続していた。
【０２１９】
この傾向はまた、ＣＤ４ペプチド／ｍＡｂ  Ｂ４−ＨＲＰ競合阻止アッセイおよび表６および７で強調するウイルス中和研究から得られたデータによっても支持される。
【０２２０】
９週までに、均質化を介する（８７．２％）かまたは押出により（８８．６％）非複合化ＣＤ４ペプチドから調製したｗ／ｏエマルション系により免疫された動物から得られた血清に関するアッセイにより、高レベルのＢ４モノクローナル抗体の競合阻止が示されている。これらは、均質化を介する（７０．１％）かまたは押出により（９４．９％）調製したＣＤ４ペプチド／ＣｐＧ２オリゴヌクレオチド（２：１）のｗ／ｏエマルション組合せ系で免疫化した動物から得られた血清と同一の大きさのオーダー（実験誤差内）であることが見出された。１７週までに、均質化を介する（１１．２％）かまたは押出により（４２．６％）非複合化ＣＤ４ペプチドから調製したｗ／ｏエマルション系により免疫化した動物から得られた血清に関するアッセイにより、劇的に低レベルのＢ４モノクローナル抗体を競合阻止した。阻止の程度は、均質化法を介する（８５．０％）かまたは押出法により（７７．２％）調製したＣＤ４ペプチド／ＣｐＧ２オリゴヌクレオチド（２：１）のｗ／ｏエマルション組合せ系で免疫化した動物からの血清で得られた阻止の程度に概してもはや匹敵しなかった。
【０２２１】
さらに、感染性ＨＩＶ−１ウイルスの中和に関してアッセイした場合、ＣＤ４ペプチドの配合物から得られた血清で同一の傾向が示される。
【０２２２】
９週までに、均質化を介する（５０％ウイルス中和に７３％、または９０％ウイルス中和に２７％）かまたは押出により（５０％ウイルス中和に３１％、または９０％ウイルス中和に１２％）非複合化ＣＤ４ペプチドから調製したｗ／ｏエマルション系により免疫化した動物から得られた血清に関するアッセイにより、本質的に同一のパーセンテージの感染性ＨＩＶウイルスが中和された（実験誤差内）。均質化を介する（５０％ウイルス中和に１２％、または９０％ウイルス中和に＜１０％）かまたは押出により（５０％ウイルス中和に１０３％、または９０％ウイルス中和に３３％）調製したＣＤ４ペプチド／ＣｐＧ２オリゴヌクレオチド（２：１）のｗ／ｏエマルション組合せ系で免疫化した動物から得られた血清に関するアッセイにより、この時点で、均質化系は、感染性ＨＩＶ−１ウイルスに対して中和抗体を作製するのに著しく効果が低いことがわかる。１１週までに、均質化を介する（５０％ウイルス中和に５７％、または９０％ウイルス中和に１７％）かまたは押出により（５０％ウイルス中和に＜１０％、または９０％ウイルス中和に＜１０％）非複合化ＣＤ４ペプチドから調製したｗ／ｏエマルション系により免疫化した動物から得られた血清に関するアッセイにより、感染性ＨＩＶウイルスを中和する能力が低減されるかまたは排除されることが実証された（実験誤差内）。均質化を介する（５０％ウイルス中和に４０％、または９０％ウイルス中和に３０％）かまたは押出により（５０％ウイルス中和に１２０％、または９０％ウイルス中和に３９％）調製したＣＤ４ペプチド／ＣｐＧオリゴヌクレオチド（２：１）のｗ／ｏエマルション組合せ系で免疫化した動物から得られた血清に関するアッセイにより、均質化および押出の双方の系は今や、感染性ＨＩＶウイルスに対して中和抗体応答を誘導するのに有効であることが明確に示された。均質化系の応答は、押出組成物に相対して遅延することがわかった。
【０２２３】
これらの傾向に関する１つの可能な説明は、次のようであろう。低エネルギー押出法を介して調製したｗ／ｏエマルションは、免疫エフェクター細胞に対して相互作用できるか又は早期の時点で免疫エフェクター細胞に対してより有効に複合化免疫原を提示することができる。一方、高エネルギー均質化法は、より均一なエマルションを提供し、本質的により有効な貯蔵庫（depot）として作用する。このような系により得られた免疫応答は、遅延され、より持続性である可能性があると予測される。
【０２２４】
ｗ／ｏエマルションに分散した免疫刺激複合体と残留する非複合化ペプチドとの組合せは、ＩｇＥおよびＣＤ４の双方の免疫原の全体的な力価を相乗的に増強することが見出された。調製方法は、応答の速度および期間に影響する可能性があり、均質化および押出の双方で有効なワクチンを調製するのに適合することが示された。
【０２２５】
加えて、別個の研究で、ＣｐＧ投与量の免疫応答に及ぼす影響を試験した。ＩｇＥおよびＣＤ４の双方の免疫原に関して、免疫刺激複合体を、種々の投与量のＣｐＧ１またはＣｐＧ２オリゴヌクレオチド（すなわちＩｇＥ：ＣｐＧ１＝４：１または１：１およびＣＤ４：ＣｐＧ２＝２：１または１：２）から調製し、水性緩衝液で、またはｗ／ｏエマルションに分散してのいずれかで投与した。全ての組成物が免疫原性であることが見出されたが、しかし双方の研究で、相対投与量が少ないオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドに対して合成ペプチド免疫原が過剰である）が絶対力価および期間に関して優れた免疫応答を誘導した。ＩｇＥペプチド／ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの場合、順位付けは４：１電荷比＞１：１中性電荷比の順になる一方、ＣＤ４ペプチド／ＣｐＧ２オリゴヌクレオチドの場合、順位付けは２：１電荷比＞１：２電荷比の順になる。たいていの場合、アジュバント作用の改善がアジュバントの投与量増加に相関し得る。これらの実施例では、同時配合した安定化免疫刺激複合体および非複合化ペプチドが免疫応答の最大相乗性に関して予想外に有利であることが実証されている。
【０２２６】
従って、本実施例で記載するようにＩｇＥまたはＣＤ４免疫原から調製した免疫刺激複合体がインビボで免疫応答を有効にアジュバント作用できると結論付けることができる。得られた応答は、ｗ／ｏエマルションに分散したこれらの同一の免疫原に関して見出される応答に匹敵するが、ｗ／ｏエマルションとして合成免疫原を分散するのとは対照的に、合成免疫原の水に分散できる免疫刺激複合体を十分に使用した結果、反応原性の成果は少なくなると予測される。
【０２２７】
本実施例では、油中水滴型エマルションベヒクル内に分散した、非複合化ペプチドと組合せた免疫刺激複合体としてのＩｇＥまたはＣＤ４免疫原のデリバリにより、最も有効な免疫原の免疫系への提示が提供されることが実証されている。組合せ系で得られた免疫応答は、各系で別個に得られた免疫応答の合計よりも著しく大きい。
【０２２８】
なお、油中水滴型エマルションベヒクル内に分散されたＣＤ４免疫原の免疫刺激複合体および非複合化ＣＤ４免疫原の組合せで免疫化した動物から得られた血清のアッセイにより、Ｂ４モノクローナル抗体の競合的な阻止において単純な非複合化ＣＤ４免疫原のｗ／ｏエマルションよりもさらに有効であることが示された。また、これらの同一の系は、感染性ＨＩＶ−１ウイルスを中和するのに最も有効であることが示された。
【０２２９】
モルモットモデルでは、得られた免疫応答の量および寿命により、ＩｇＥ／ＣｐＧ１およびＣＤ４／ＣｐＧ２の組合せに由来する免疫刺激複合体が好ましいことが示された。ＩｇＥ／ＣｐＧ２およびＣＤ４／ＣｐＧ１の代替の対に由来する組成物は、同程度ではないが、アジュバント作用を有することが実験的に測定された。
【０２３０】
さらに少量および低度（免疫原／アジュバント）での投与計画の可能性が、これらの結果により示される。反応原性が問題である場合、組合せ系により、類似のまたはより高いレベルの免疫原性を有する、より少ない容量のエマルションを投与する可能性が開かれる。
【０２３１】
具体的には、本実施例は、有効な投与形態としての開発のために、これらの新たな組合せをベースとした配合物の可能性を強く示している。
【実施例８】
【０２３２】
免疫刺激複合体としてまたはin-situゲル化ポリマー溶液としてまたは組合せで配合されるＩｇＥおよびＣＤ４ペプチド免疫原の免疫原性
本実施例は、ＣｐＧ１もしくはＣｐＧ２オリゴヌクレオチドを用いた免疫刺激複合体として、またはin-situゲル化ポリマーおよび生体適合性溶媒として、またはin-situゲル化ポリマーおよび生体適合性溶媒に懸濁した免疫刺激複合体として配合されたＩｇＥおよびＣＤ４ペプチド免疫原の、筋内免疫化したモルモットにおける免疫原性を例示する。凍結乾燥したペプチド免疫原またはペプチド免疫原およびＣｐＧオリゴヌクレオチド由来の免疫刺激複合体を、実施例３に記載するように調製した。in-situゲル化ポリマーを実施例６ａ／６ｂに記載するように調製した。
【０２３３】
in-situゲル化ポリマー（リソマー（登録商標）ＲＧ  ５０４Ｈ）として、または本発明に従って形成したin-situゲル化ポリマー（リソマー（登録商標）ＲＧ５０４Ｈ）に懸濁したＣｐＧ１もしくはＣｐＧ２オリゴヌクレオチドを用いた免疫刺激複合体として配合したＩｇＥおよびＣＤ４ペプチド免疫原の免疫原性を試験するために、６〜８週齢の雌モルモット（Covance Research Products Inc., Denver、ペンシルバニア州）３群を、０週に以下の量の免疫原で筋内（Ｉ．Ｍ．）免疫化した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に最終容量２００μｌで再構成および懸濁した、表４に記載するように調製したＩｇＥペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比４：１）３００μｇ、またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）に最終容量２００μｌで再構成および懸濁した、表４に記載するように調製したＣＤ４ペプチド／ＣｐＧ２免疫刺激複合体（電荷比２：１）３００μｇ、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したリソマー（登録商標）ＲＧ  ５０４Ｈ（２０重量％）２００μｌに再構成および懸濁したＩｇＥペプチド３００μｇ、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したリソマー（登録商標）ＲＧ  ５０４Ｈ（２０重量％）２００μｌに再構成および懸濁したＣＤ４ペプチド３００μｇ、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したリソマー（登録商標）ＲＧ  ５０４Ｈ（２０重量％）２００μｌに再構成および懸濁した、表４に記載するように調製した凍結乾燥したＩｇＥペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比４：１）３００μｇ、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したリソマー（登録商標）ＲＧ  ５０４Ｈ（２０重量％）２００μｌに再構成および懸濁した、表４に記載するように調製した凍結乾燥したＣＤ４ペプチド／ＣｐＧ２免疫刺激複合体（電荷比２：１）３００μｇ。
【０２３４】
免疫刺激複合体、ペプチド免疫原を含むＤＭＳＯ中のin-situゲル化ポリマーまたは免疫刺激複合体を含むＤＭＳＯ中のin-situゲル化ポリマーを投与した後、モルモットは全体的な病理学または挙動変化を示さなかった。＋３、＋６、＋９、＋１２週に血清を入手し、実施例７に記載した手順に従って、ＩｇＥ免疫原の場合は抗ＩｇＥ抗体、またはＣＤ４免疫原の場合は抗ＣＤ４抗体の存在を免疫原特異的ＥＬＩＳＡにより評価した。
【０２３５】
免疫原性結果
ＩｇＥ免疫原の１回投与免疫化後の血清抗体価を図１１に、ＣＤ４免疫原に関しては図１２に示す。コントロール実験から、非アジュバント化ペプチドが非免疫原性かまたは弱い免疫原性のいずれかの場合であることがわかった。双方の研究では、免疫化の結果から、免疫刺激複合体単独で中程度にアジュバント作用し、力価は９週までにピークに達することが示された。逆に、in-situゲル化ポリマーに懸濁した非複合化免疫原もまた弱いアジュバント作用を有し、１２週でピーク応答が観察された。
【０２３６】
ＩｇＥおよびＣＤ４の双方の免疫原に関して、in-situゲル化ポリマーとして懸濁された、それに由来する免疫刺激複合体が最も高い免疫応答を誘導した。これらの応答は、９週近くでピークに達するのが認められ、１２週を通して持続できた。得られた免疫応答の量および期間は、免疫刺激複合体単独、またはin-situゲル化ポリマー単独を含む組成物で投与された非複合化免疫原のいずれでも見出されなかった。
【０２３７】
ペプチドのような分子量の小さい免疫原は、ポリマー移植体およびゲル中に容易に拡散でき、注射時に多量のバースト放出に至ることが予測される。ゲル化を制御する物理的因子がこの過程を遅延させるように調整することができる；しかしながら、このように放出されるペプチドの塊は、本質的にはアジュバント作用がなく、インビボで通常経験される標準的な分解過程に供される。加えて、封入されて残る少量の材料は、ポリマーが一旦分解すると、有効なブーストには十分でないと予測され、さらに大投与量のペプチドが必要とされる。マトリックス内に捕捉された残留ＤＭＳＯもまた、ペプチドに含まれる感受性のあるアミノ酸が酸化され得る安定性の問題を提示する。なお、水が、種々の因子、例えばゲル微構造、ポリマー疎水性および結晶性に依存する種々の速度で、これらの材料を浸透できることは十分に確立されている４５、４６。マトリックスを浸透する水は、インビボでＰＬＧ／ＰＬＧＡ共重合体で作動する主要な分解メカニズムであるバルクの加水分解を促進する。この過程は、劇的な局所ｐＨ変化に伴うことが解っており、これは本質的にｐＨを２または３に低下させることができる６７。遊離の非複合可溶化ペプチドは、このような環境に安定でない可能性があり、これはさらにこれらの系の可能性を限定する。酸緩衝剤を用いてこれらの問題を埋め合わせることができるが、理想的であると考えることはできない。免疫刺激複合体の形態のペプチド免疫原の懸濁液を封入することにより、この系に多くの安定性およびアジュバント作用の利点が与えられる。ポリマーゲルの注入が一旦行われると、ゲルに有効に封入されていない少量の複合体（恐らくゲル化部位近くに位置する）を、非複合化ペプチド免疫原単独よりもさらに有効に、免疫応答を開始または初回刺激するために提供することができる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ペプチド免疫原と密接に接触したままであり、複合体粒子の形態でペプチド免疫原をインビボでの酵素消化から、またはマトリックスに含まれるＤＭＳＯ溶媒に起因し得る化学的不安定性から、さらに保護および安定化させることができる。
【０２３８】
なお、粒子形態でマトリックスに捕捉されたままであるペプチド免疫原は、遊離の非複合化ペプチドよりも酸性化過程に対してより良好に保護されると予測される。この形態で存在する免疫原は、そうでなければ１回投与放出制御配合物で可能な応答よりも、さらに強力で長く持続する免疫応答を誘導する免疫系に、より効果的な免疫原のブーストを提供すると予測できる。
【０２３９】
コントロール実験では、ＤＭＳＯ中のＲＧ  ５０４Ｈ（２０重量％）のポリマー組成物に溶解した非複合化ペプチド免疫原の溶液が、ＰＢＳの溶液と接触した場所で迅速にゲル化することが測定された。これらのサンプルに関してゲル相から溶液を分離し、紫外線分光法（λ＝２８０ｎｍ）により溶液を分析することにより、相当量の非複合化ペプチド（約５０〜７０％）がＤＭＳＯで同時抽出されることが示された。
【０２４０】
in-situゲル化ポリマーに懸濁した免疫刺激複合体および非複合化ペプチド免疫原の組合せは、これらの放出制御調製物において、ＩｇＥおよびＣＤ４双方の免疫原の全体的な力価を相乗的に増強することが見出された。
【０２４１】
免疫応答に及ぼすＣｐＧオリゴヌクレオチド投与量の効果を試験する別の研究は、本研究では行わなかった。電気的中性近くで、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドもしくは代替の別の適合する賦形剤のいずれかにより供給された過剰の負電荷を伴って調製した免疫刺激複合体を用いることにより、絶対力価においてさらなる改善がなされ得ると予測される。これらの組成物では大部分のペプチド免疫原が免疫刺激複合体として結合しており、注射時のゲル化過程により、生体適合性溶媒での同時抽出による非アジュバント化ペプチドの大きな喪失には至らない。
【０２４２】
よって、免疫刺激複合体が免疫刺激複合体としてのペプチド免疫原を安定化すること、およびin-situゲル化ポリマーと組合せた場合、これらの組成物がインビボで免疫応答を効果的にアジュバント作用できることの双方を結論付けることができる。これは特に、１回投与での使用が意図されるこれらのポリマー系に重要である。in-situゲル化ポリマーベヒクル内に懸濁された免疫刺激複合体として免疫原を分配することにより、免疫原は免疫系に対して最も効果的に提示される。組合せ系に関して得られた応答は、独立した各系で得られた免疫応答の合計よりも著しく大きく、持続性であり、生体適合性溶媒中のポリマーからの非複合化ペプチド免疫原の単純な再構成により調製されたin-situゲル化ポリマーとは異なっている。
【０２４３】
モルモットモデルでは、得られた応答の量および寿命により、ＩｇＥ／ＣｐＧ１およびＣＤ４／ＣｐＧ２の組合せに由来する免疫刺激複合体が好ましいことが示された。ＩｇＥ／ＣｐＧ２およびＣＤ４／ＣｐＧ１の代替の対に由来する組成物は、アジュバント作用するが、同一の程度ではないことが実験的に測定された。
【０２４４】
１回投与計画の可能性がこれらの結果により示される。具体的には、本実施例により、有効な放出制御投与形態として開発するためにこれらの新たな即時的に再構成される組合せをベースとした配合物の可能性が強く示される。
【実施例９】
【０２４５】
組合せ免疫刺激複合体および無機塩懸濁液の調製
本実施例は、ＬＨＲＨペプチド免疫原（溶液中１：１：１のモル比の配列番号７〜９）由来のカチオン性ペプチド、または種々の比率のＬＨＲＨ免疫原およびＣｐＧ１オリゴヌクレオチド由来の免疫刺激複合体から無機塩懸濁液を調製する方法を例示する。本明細書に記載する混合懸濁液の調製方法を説明する流れ図を図１６に示す。
【０２４６】
全てのガラス製品、攪拌子およびピペットチップを使用前に１２１℃で４０分間、オートクレーブ処理した。夾雑を避けるために、層流フード内で全試薬の重量測定、分配、移動または反応容器への添加を行った。
【０２４７】
攪拌子を備えた５．０ｍｌガラスバイアルに、水溶液に溶解したＬＨＲＨペプチド免疫原１００μｇ（２５０μｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ）または１，６００μｇ（５３４μｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。蒸留脱イオン水中ＬＨＲＨ免疫原およびＣｐＧ１オリゴヌクレオチドから２つの電荷比（すなわち４：１または１．５：１）のいずれかを有する免疫刺激複合体を調製した。
【０２４８】
具体的には、ＬＨＲＨ免疫原１００μｇまたは１，６００μｇからの４：１複合体の調製にはＣｐＧ１オリゴヌクレオチド（２．０ｍｇ／ｍｌ）７．３μｇまたは１１６．８μｇが必要であった。一方、ＬＨＲＨ免疫原１，６００μｇからの１．５：１複合体の調製にはＣｐＧ１オリゴヌクレオチド（２．０ｍｇ／ｍｌ）３５０．４μｇが各々必要であった。
【０２４９】
表９は、特定の電荷比を有する一定の最終用量２５μｇ／０．５ｍｌまたは４００μｇ／０．５ｍｌのために、ＬＨＲＨペプチド免疫原との複合化に必要なＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの相対量を決定するために用いた計算を示す。
【０２５０】
第２の５．０ｍｌガラスバイアルに、蒸留脱イオン水中アルヒドロゲル（登録商標）（アルミニウム（Ａｌ）３．２ｍｇ／ｍＬ）無機塩懸濁液１．０ｍｌを加えた。０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加することにより、用いるアルヒドロゲル（登録商標）貯蔵懸濁液の最初のｐＨをｐＨ７．１〜７．４に調整した。分解能＋／−０．３ｐＨユニットのｐＨ試験片を用いてｐＨ測定を行った。
【０２５１】
免疫刺激複合体および残留する非結合免疫原の入ったバイアルに無機塩懸濁液を加え、３０分間かけて攪拌して平衡化した。
【０２５２】
アルヒドロゲル（登録商標）および免疫刺激複合体の混合物に、等張度（tonicity）のために２０％ＮａＣｌ９０μｌ、2-フェノキシ-エタノール（２−ＰＥ）保存剤（選択される場合）５．０μｌおよびさらなる蒸留脱イオン水を加えて配合物の最終容量が２．０ｍｌに等しくなることを確実にした。
【０２５３】
上述したように、無機塩と組合せた免疫刺激複合体の懸濁液として一旦配合した免疫原の最終濃度は、各々２５μｇ／０．５ｍｌまたは４００μｇ／０．５ｍｌであった。調製したアルヒドロゲル（登録商標）の最終濃度は標的の種に依存した。ゲッ歯類を意図する配合物は、０．４ｍｇ  ＡＬ／０．５ｍｌで調製したが、非ヒト霊長類を意図する配合物は、０．８ｍｇ  ＡＬ／０．５ｍｌで調製した。すべてのケースにおいて、終了した配合物を、等張度（tonicity）に関して調整し（０．９％  ＮａＣｌ）、非ヒト霊長類に用いるものは保存剤（０．２５容量／容量％、２−ＰＥ）を含んだ。
【実施例１０】
【０２５４】
ゲッ歯類において無機塩で免疫刺激複合体の懸濁液として配合したＬＨＲＨペプチド免疫原の免疫原性
本実施例は、無機塩と組合せてＣｐＧ１オリゴヌクレオチドを用いて免疫刺激複合体として配合したＬＨＲＨペプチド免疫原の、雄ラットに筋内免疫化した免疫原性を例示する。無機塩懸濁液を実施例９に記載するように調製した。
【０２５５】
６〜８週齢のスプラーグ−ドーリー（Sprague-Dawley）雄ラット４群を、以下の組成物で０、４および８週に筋内（Ｉ．Ｍ．）免疫化した。ＬＨＲＨペプチド２５μｇを５００μｌの容量の蒸留脱イオン水に懸濁した；ＬＨＲＨペプチド２５μｇを２５０μｌの容量の蒸留脱イオン水に懸濁し、アルヒドロゲル（登録商標）（１．６ｍｇ  Ａｌ／ｍｌ）２５０μｌを加えた；表９に記載するように調製したＬＨＲＨペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比４：１）２５μｇを５００μｌの容量の蒸留脱イオン水に懸濁した；表９に記載するように調製したＬＨＲＨペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比４：１）２５μｇを２５０μｌの容量の蒸留脱イオン水に懸濁し、アルヒドロゲル（登録商標）（１．６ｍｇ  Ａｌ／ｍｌ）２５０μｌを加えた。各配合物に２０％食塩水溶液４５μｌおよび蒸留脱イオン水４５５．０μｌを加えた。各配合物の最終容量は０．１ｍｌであった。
【０２５６】
ラットは、ペプチド免疫原を含む無機塩または免疫刺激複合体を含む無機塩を投与された後、全体的な病理学または挙動変化を示さなかった。＋０、＋４、＋６、＋８および＋１２週に血清を入手し、免疫原特異的ＥＬＩＳＡにより抗ＬＨＲＨ抗体の存在およびＲＩＡイムノアッセイにより血清テストステロンを評価した。
【０２５７】
抗ＬＨＲＨ抗体の測定
免疫吸着剤としてＬＨＲＨペプチド５４でコートした９６ウェルマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡにより抗体活性を測定した。
【０２５８】
５μｇ／ｍｌの濃度のペプチド免疫原溶液のアリコート（１００μｌ）を３７℃で１時間インキュベートした。続いてウェルを３％ゼラチン／ＰＢＳ溶液で、３７℃で１時間遮断した。次いでプレートを乾燥し、アッセイに使用した。サンプル希釈緩衝液で１：１００希釈で出発し、その後１０倍連続希釈した被験免疫血清のアリコート（１００μｌ）をペプチドでコートしたプレートに加えた。プレートを３７℃で１〜１．５時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％ＴＷＥＥＮ２０でプレートを６回洗浄した。ラット血清で実施したアッセイにはホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ）１００μｌ、ブタ血清で実施したアッセイにはヤギ抗ブタホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌ、またはヒヒ血清で実施したアッセイにはホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ａｎｏｇｅｎ）１００μｌを、抱合希釈緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび正常ヤギ血清を含むＰＢＳ）に適当な希釈で加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、上述したように洗浄した。クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中０．０４重量％のオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（Ｐｉｅｒｃｅ）および０．１２％Ｈ２Ｏ２のアリコート（１００μｌ）を１５分間加えた。２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４５０μｌの添加により反応を停止させ、各ウェルに関してＡ４９２を測定した。
【０２５９】
吸光度の直線回帰分析に基づいて、カットオフＡ４９２を０．５に設定してＥＬＩＳＡ力価を計算した。各アッセイで用いた、希釈した正常コントロールサンプルに関する値が０．１５未満であったので、このカットオフ値は正確であった。
【０２６０】
血清テストステロンの測定
血清テストステロン値に関するＲＩＡにより免疫原を効率に関して評価した。Diagnostic Products（ロサンゼルス、カリフォルニア州）のＲＩＡキットを用いて、製造者の指示書に従って血清テストステロンレベルを測定した。テストステロンに関する低い検出限界は、０．０１〜０．０３ｎＭｏｌ／ｌの範囲であった。各サンプルを２検体ずつ分析した。
【０２６１】
テストステロンレベルが検出限界以下である場合、血清サンプルを去勢レベルであると記録し、＜０．１ナノモル／ｌで「去勢に近い」と記録した。
【０２６２】
免疫原性結果
ＬＨＲＨ免疫原の免疫化の後の血清抗体価を図１３ａに示す。対応する血清テストステロンレベルを図１３ｂに示す。
【０２６３】
本研究において、雄ラットから得られた血清から測定した抗体価から、緩衝液中のＬＨＲＨペプチドの組成物も、アルヒドロゲル（登録商標）無機塩と組合せたＬＨＲＨペプチドも免疫原性ではないことがわかった。逆に、ＬＨＲＨ／ＣｐＧ１免疫刺激複合体単独に由来するか、またはアルヒドロゲル（登録商標）無機塩との組合せの双方の組成物が、図１３ａで表されるように免疫原性であることが示された。
【０２６４】
これらの後者の２群の抗体応答は最初の８週間にわたって類似することが判明した。１２週までに、ＬＨＲＨ免疫刺激複合体およびアルヒドロゲル（登録商標）無機塩の組合せ系に関して見出された抗体力価は、ＬＨＲＨ免疫刺激複合体単独で測定された力価よりも極わずか良好であった（すなわち〜０．５ｌｏｇ単位）。
【０２６５】
緩衝液中のＬＨＲＨペプチドおよびアルヒドロゲル（登録商標）無機塩と組合せたＬＨＲＨペプチドの組成物に関して測定された対応する血清テストステロンレベルから、ＬＨＲＨペプチドも無機塩配合物を伴うＬＨＲＨペプチドも雄ラットにおいて免疫去勢を達成できないことが同様にわかった。
【０２６６】
逆に、図１３ｂで示すように、ＬＨＲＨペプチド／ＣｐＧ１単独に由来する免疫刺激複合体およびＬＨＲＨペプチド／ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドとアルヒドロゲル（登録商標）無機塩との組合せの双方が、各群の全てのラットで効果的に免疫去勢化（immunocastrate）した。
【０２６７】
アルヒドロゲル（登録商標）無機塩と組合せたＬＨＲＨ免疫刺激複合体に由来する組成物で各ラットに関して完全な免疫去勢が６週までに（最初のブーストの２週後）達成された。１０週までに（２回目のブーストの２週後）ＬＨＲＨ免疫刺激複合体単独に由来する組成物に関して類似のレベルの免疫去勢は達成されなかった。
【０２６８】
本実施例で、新規ワクチン接種計画により、ＬＨＲＨ免疫刺激複合体（３用量免疫計画）または無機塩と組合せたＬＨＲＨ免疫刺激複合体（２用量免疫計画）から調製されたいずれかの組成物で有効な免疫去勢（血清テストステロンにより測定される）が得られることを実証した。
【０２６９】
ＬＨＲＨペプチド免疫原と共に単独で投与されたアルヒドロゲル（登録商標）無機塩が無効なアジュバントであることが判明した。しかしながら、一旦免疫刺激複合体の形態のＬＨＲＨ免疫原で配合すると、組合せにより相乗的にはるかに優れた結果が生み出された。無機塩自体は２つの様式で作用することができる。第１は、免疫刺激複合体を注射部位に局在する貯蔵庫（depot）を提供することであり、第２は、免疫原の免疫系への提示を促すことができる免疫系の特異細胞を補充することによる。
【０２７０】
代替の無機塩であるアジュ・ホス（登録商標）（リン酸アルミニウムに由来する）を用いて本実験を行い、８週までにアジュ・ホス（登録商標）無機塩と組合せたＬＨＲＨ免疫刺激複合体に由来する系に関してのみ、全ラットで完全免疫去勢化が達成された。
【実施例１１】
【０２７１】
無機塩との免疫刺激複合体の懸濁液として配合されたＬＨＲＨペプチド免疫原のヒヒにおける免疫原性
本実施例は、雄ヒヒに筋内免疫化した、無機塩と組合せた種々の比率でＣｐＧ１オリゴヌクレオチドとの免疫刺激複合体として配合したＬＨＲＨペプチド免疫原の免疫原性を例示する。無機塩懸濁液は実施例９に記載したように調製した。
【０２７２】
２歳雄ヒヒ２群を０、４および８週に以下の組成物で筋内（Ｉ．Ｍ．）免疫化した。５００μｌの蒸留脱イオン水に懸濁した表９に記載するように調製したＬＨＲＨペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比４：１または１．５：１）４００μｇ；２５０μｌの蒸留脱イオン水に懸濁した表９に記載するように調製したＬＨＲＨペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比４：１または１．５：１）４００μｇ、アルヒドロゲル（登録商標）（３．２ｍｇ  Ａｌ／ｍｌ）２５０μｌを加えた。各配合物に２０％食塩水溶液４５μｌ、2-フェノキシ-エタノール２．５μｌおよび蒸留脱イオン水４５２．５μｌを加えた。各配合物の最終容量は１．０ｍｌであった。
【０２７３】
いずれかの比率の免疫刺激複合体またはアルヒドロゲル（登録商標）無機塩との組合せを投与した後、ヒヒは全体的な病理学または挙動変化を示さなかった。＋０、＋４、＋６、＋８、＋１２および＋１４週（１．５：１複合体に関してのみ）に血清を入手し、免疫原特異的ＥＬＩＳＡにより抗ＬＨＲＨ抗体の存在に関して、および血清テストステロンに関してＲＩＡイムノアッセイにより評価した。
【０２７４】
免疫原性結果
ＬＨＲＨ免疫原の免疫化後の血清抗体力価を図１４ａに示す。各ヒヒに関して、対応する血清テストステロンレベルを各々図１４ｂおよび１４ｃに示す。
【０２７５】
図１４ａに示すように、電荷比４：１または１．５：１のいずれかで調製したＬＨＲＨ免疫刺激複合体、または電荷比４：１または１．５：１のいずれかのＬＨＲＨペプチド免疫刺激複合体およびアルヒドロゲル（登録商標）無機塩の組合せにより免疫化した雄ヒヒから得られた血清から測定した抗体力価から、全ての組成物が免疫原性であることが示された。
【０２７６】
アルヒドロゲル（登録商標）無機塩が存在するかしないかにかかわらず、電荷比４：１で調製した双方の系では、１．５：１系で得られた抗体価に相対してわずかに高い抗体価が見出された。
【０２７７】
図１４ｂに示すように、アルヒドロゲル（登録商標）無機塩を含まない電荷比４：１で調製したＬＨＲＨ免疫刺激複合体で免疫化した雄ヒヒから得られた血清から測定した対応する血清テストステロンレベルにより、試験した双方のヒヒでは全体として無効であることが判明した。
【０２７８】
図１４ｃに示すように、アルヒドロゲル（登録商標）無機塩を含まない電荷比１．５：１で調製したＬＨＲＨ免疫刺激複合体から配合された系は、試験したヒヒの１頭では血清テストステロン応答がより効果的に下方制御されることが示されたが、完全な免疫去勢化は達成されなかった。
【０２７９】
図１４ｂに示すように、アルヒドロゲル（登録商標）と組合せたＬＨＲＨペプチド免疫刺激複合体（電荷比４：１）から調製した組成物に関して、１０週までに１頭のヒヒで完全な免疫去勢化が得られ、１４週を通して持続することが実証された。図１４ｂに示すように、この群の別のヒヒで去勢レベルに近い血清テストステロンが得られたが、この応答は一過性であることが判明した。
【０２８０】
図１４ｃに示すように、アルヒドロゲル（登録商標）と組合せたＬＨＲＨ免疫刺激複合体（電荷比１．５：１）から調製した組成物に関して、研究した双方のヒヒで免疫去勢化が成功し（一方のヒヒでは８週までに、他方のヒヒは１０週までに達成された）、この効果は１４週を通して持続することが実証された。
【０２８１】
４：１または１．５：１のいずれかの電荷比で調製したＬＨＲＨ免疫刺激複合体由来の配合物に関して（ＬＨＲＨペプチド濃度＝４００μｇ）、免疫刺激複合体の形態で結合したＬＨＲＨペプチド免疫原の実際の量は、著しく変化する。表８は、この形態で投与されたＬＨＲＨ免疫原の比率を変動する電荷比の関数として示す。４：１の電荷比で調製した場合、溶液中およそ１６％（〜６３μｇ）のＬＨＲＨ免疫原が免疫刺激複合体の形態で結合する一方、１．５：１の電荷比で調製した場合、溶液中およそ８６％（〜３４４μｇ）が結合している。
【０２８２】
１．５：１比率系でのように免疫刺激複合体の形態の大部分のＬＨＲＨ免疫原の提示により、ヒヒにおいてより長時間持続し、早期の免疫去勢応答が提供された。アルヒドロゲル（登録商標）無機塩が添加時に溶液中のさらに１０％の遊離の非結合性ＬＨＲＨ免疫原を吸収することが実験的に測定された。従って、免疫刺激複合体と組合せた場合、無機塩がワクチンの効率を改善するメカニズムは、おそらく間接的な免疫変調効果に関連している可能性がある。
【０２８３】
代替の無機塩であるアジュ・ホス（登録商標）（リン酸アルミニウムに由来する）を用いて本実験を行い、１０週までに一方のヒヒで完全免疫去勢化が実証されたが、試験した他方のヒヒはこの時点までに去勢レベルに近い血清テストステロンが実証された。
【０２８４】
本実施例において、無機塩と組合せたＬＨＲＨ免疫刺激複合体が非ヒト霊長類で免疫去勢化（血清テストステロンにより測定）を達成するのに有効なワクチンであることが実証された。
【０２８５】
なお、免疫去勢応答の配合物速度論は、ＬＨＲＨ免疫原：ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの最初の電荷比および無機塩の選択の関数であることが示された。
【０２８６】
具体的には、本実施例は、ホルモン・アブレーション動物またはヒトに有用な安全なワクチンの開発のための、これらの新しい組合せをベースとした配合物の可能性を示している。
【０２８７】
また、本実施例は、ヒトのアンドロゲン感受性前立腺ガンの処置に適した安全なワクチンの開発のための、これらの新しい組合せをベースとした配合物の可能性を示している。
【実施例１２】
【０２８８】
ＩＬ−１β由来のペプチドフラグメントの存在下、ＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ、ＬＨＲＨ由来の免疫刺激複合体からの油中水滴型エマルションの調製
１０ｍｌ容器に、免疫刺激複合体（電荷比１６：１）を調製するのに適当な水性緩衝液に溶解したＬＨＲＨペプチド免疫原（溶液中モル比１：１：１の配列番号７〜９）１，０００μｇ（２，５００μｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ）およびＣｐＧ１オリゴヌクレオチド、もしくは適当な水性緩衝液に溶解したペプチド免疫原１，０００μｇ（２，５００μｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ）に加えて溶液中ＩＬ−１βに由来するペプチド（配列番号１４、Ｃ※ＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＣ※−ＣＯ２Ｈ．ＨＣｌ（式中、Ｃ※は２つのシステイン間の環化を示す））を加えるか；または適当な水性緩衝液に溶解したペプチド免疫原１，０００μｇ（２，５００μｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ）をＣｐＧ１およびＩＬ−１βペプチドの混合物に加えて、ＬＨＲＨ免疫刺激複合体（電荷比１６：１）およびＩＬ−１βペプチドの組合せを調製した。表９は、特定の電荷比に関して固定された最終用量である１００μｇ／１．０ｍｌでＬＨＲＨペプチド免疫原との複合化に必要なＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの相対量を決定するために用いた計算を示す。
【０２８９】
ＩＬ−１β由来のペプチドベースのフラグメントは、アジュバント作用特性を有することが解っている６９。本明細書で用いたＩＬ−１βペプチドは、比較的小さく（ＦＷ＝１４２１．５）、標準的な生理学的緩衝液に溶解したとき負に荷電する。実施例２に記載する計算を用いると、１ｎｍｏｌのＩＬ−１βペプチドは、２ｎｍｏｌの負電荷に寄与する。このように、この分子は、ＬＨＲＨ免疫原と物理的に相互作用しないと予測され、混合時に沈殿物の形態の複合化が見出された証拠はなかった。
【０２９０】
具体的には、ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１の電荷比が１６：１でＬＨＲＨペプチド免疫原から免疫刺激複合体を調製するのに、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド１８．３μｇ（９．２μｌ、２．０μｇ／ｍｌ）を使用した。ＬＨＲＨペプチド免疫原およびＩＬ−１βの溶液を調製するのに、ＩＬ−１β  １０μｇ（５．０μｌ、２．０μｇ／ｍｌ）を適当な水性緩衝液に加えた。ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１の電荷比が１６：１でＬＨＲＨペプチド免疫原からの免疫刺激複合体にＩＬ−１βを加えたものを調製するのに、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド１８．３μｇ（９．２μｌ、２．０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１βペプチド１０μｇ（５．０μｌ、２．０μｇ／ｍｌ）を混合した。
【０２９１】
各々のＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ  ｗ／ｏエマルションを調製するのに、各容器にさらなる水性溶媒希釈剤を加えて水相の最終容量が５．０ｍｌに固定するようにした。
【０２９２】
プラセボ群の調製のために、水相に生理食塩水５．０ｍｌを用いた。
【０２９３】
ＬＨＲＨペプチド免疫原には、複合化に生理食塩水が適していることが見出された。各ペプチドに関して計算されたＩＰは９．０よりも大きく（表１）、選択した水性溶媒のｐＨよりもかなり大きい。
【０２９４】
本実施例は、免疫刺激複合体の形態の溶液中の免疫原を安定化させる利点を例示する。複合化過程はさらなる免疫モデュレーターの存在に適合することが示されている。
【０２９５】
次いでＬＨＲＨ免疫原の希釈した水性懸濁液またはプラセボ溶液をＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ（５．０ｍｌ）を充填した乾燥した２５ｍｌ反応容器にゆっくりと加えた。粗雑なエマルションを作成するために低速（２，０００〜３，０００ｒｐｍ）で混合物を均質化（High Shear Laboratory Mixer, Sealed Unit, Silverson）しながら添加を行った。水性サンプルが完全に添加されるまでこの処理速度を維持し、水相および油相の均一な予備混合を確実にするために丸２分間続けた。次いで均質化速度を上げ（５，０００〜８，０００ｒｐｍ）、さらに５から１０分間維持して、均質な白色の微細に分散されたｗ／ｏエマルションの形成に至った。
【０２９６】
前記したように油中水滴型エマルションとして一度配合された免疫原の最終濃度は１００μｇ／ｍｌであった。
【実施例１３】
【０２９７】
免疫刺激複合体としてまたはＩＬ−１βペプチドと共にまたはｗ／ｏエマルション中免疫刺激複合体のＩＬ−１βペプチドとの組合せとして配合されたＬＨＲＨペプチド免疫原の免疫原性および成長促進効果
本実施例は、イノシシに筋内免疫化した、ｗ／ｏエマルションと組合せたＣｐＧ１オリゴヌクレオチドと、もしくはｗ／ｏエマルションと組合せた免疫モデュレーター（ＩＬ−１βペプチド）との免疫刺激複合体として、またはｗ／ｏエマルション中のさらなる免疫モデュレーター（ＩＬ−１βペプチド）と組合せた免疫刺激複合体として；配合されたＬＨＲＨペプチド免疫原の免疫原性を例示する。実施例４ａおよび実施例１２に記載するように均質化によりｗ／ｏエマルションを調製した。
【０２９８】
８週齢のイノシシ（各３０ｋｇ）５群を以下の組成物で０および８週に筋内（Ｉ．Ｍ．）免疫化した。最終用量５００μｌのＮａＣｌに懸濁し、ＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ（５００μｌ）を分散した、表９に記載するように調製したＬＨＲＨペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比１６：１）１００μｇ；ＬＨＲＨペプチド／ＩＬ−１βペプチド（１μｇ）を最終容量５００μｌのＮａＣｌに懸濁し、モンタニド（録商標））ＩＳＡ  ５０ｖ（５００μｌ）を分散した；または表９に記載するように調製したＬＨＲＨペプチド／（ＣｐＧ１＋ＩＬ−１βペプチド（１μｇ））免疫刺激複合体（電荷比１６：１）をモンタニド（登録商標）５０ｖ（５００μｌ）を分散した最終容量５００μｌのＮａＣｌに懸濁した。ＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ（５００μｌ）を分散したＮａＣｌ５００μｌのプラセボ・コントロール群を調製し、この研究に含まれた免疫化していないコントロール群は外科的に去勢した。
【０２９９】
プラセボｗ／ｏエマルション、ＩＬ−１βペプチドと組合せたペプチド免疫原を含むｗ／ｏエマルションまたは免疫刺激複合体もしくはＩＬ−１βペプチドと組合せた免疫刺激複合体を含むｗ／ｏエマルションを投与した後、イノシシは全体的な病理学または挙動変化を示さなかった。＋０、＋８、＋１０、＋１２および＋１４週に血清を入手し、免疫原特異的ＥＬＩＳＡにより抗ＬＨＲＨ抗体の存在に関して、ＲＩＡイムノアッセイにより血清テストステロンに関して、および体重増加に関して評価した。
【０３００】
免疫原性結果
ＬＨＲＨ免疫原の免疫化後の血清抗体価を図１５ａに示す。対応する血清テストステロンレベルを図１５ｂに示す。試験期間中の体重増加に及ぼす、ＬＨＲＨ免疫原の免疫化後の免疫去勢対外科的去勢の影響を図１５ｃに示す。コントロール実験により、全てのケースにおいて、非アジュバント化ペプチドは、非免疫原性であるかまたは弱い免疫原性であることが実証された。
【０３０１】
ＬＨＲＨ免疫刺激複合体、サイトカインによりアジュバント化されたＬＨＲＨペプチド、またはｗ／ｏエマルションとして投与されたサイトカインと同時配合されたＬＨＲＨ免疫刺激複合体により免疫化された雄イノシシから得られた血清から測定した抗体価により、３つ全ての組成物が免疫原性であることが示された。試験期間中全ての時点で得られた力価が同程度であることが判明した。図１５ａに示すようにプラセボおよび外科的に去勢されたネガティブ・コントロール群は力価なしに戻った。
【０３０２】
ｗ／ｏエマルション中のＬＨＲＨ免疫刺激複合体もしくはｗ／ｏエマルション中ＩＬ−１βペプチドによりアジュバント化されたＬＨＲＨペプチドにより、またはｗ／ｏエマルションとして投与されたＬＨＲＨ免疫刺激複合体およびＩＬ−１βペプチドの組合せにより免疫化されたイノシシから得られた血清から測定した対応する血清テストステロンレベルにより、これらの群の雄イノシシが１２週までに効果的に免疫去勢されたことが示された。
【０３０３】
特に、ｗ／ｏエマルション中のＬＨＲＨ免疫刺激複合体およびｗ／ｏエマルション中ＩＬ−１βペプチドによりアジュバント作用されたＬＨＲＨペプチド由来の組成物は、この血清テストステロンレベルを維持することができなかった。１４週までに双方の群からの血清テストステロンレベルがリバウンドすることが示され、いずれの群も免疫去勢されたとは記載されなかった。
【０３０４】
図１５ｂに示すように、ｗ／ｏエマルションとして免疫刺激複合体およびＩＬ−１βペプチドの組合せとして配合されたＬＨＲＨワクチンは、早期のリバウンドを示さずに同一レベルの免疫去勢をさらに効果的に維持することが判明した。
【０３０５】
プラセボ・ネガティブ・コントロール群は、種々の時点で血清テストステロン値を大きく変動させて戻り、月間ホルモンレベルの予測される変化に合致して評価された。図１５ｂで示すように、外科的に去勢したポジティブ・コントロール群は、試験期間の全時点で陰性血清テストステロンレベルに戻った。
【０３０６】
屠殺前のイノシシの血清テストステロンレベルは、製造された食肉の品質に直接相関した。高レベルのテストステロンは、魅力のない味の製品（イノシシ感染）を生み出し、従ってこの特性を制御することは重要な市場検討材料である。無視できる量のテストステロンを確実にするための標準的な方法は、外科的去勢であった。生ワクチン研究法は、イノシシが通常市場に運ばれる時間間隔を超えて有効であることが判明していなければならない。その時点でイノシシは１１０〜１３０ｋｇの体重に到達している。
【０３０７】
この研究では８週齢で免疫したイノシシの成長促進が、１４週間追跡調査された。ｗ／ｏエマルション中ＬＨＲＨ免疫刺激複合体により、またはｗ／ｏエマルション中ＩＬ−１βペプチドによってのみアジュバント化されたＬＨＲＨペプチドにより免疫去勢されたイノシシは、体重増加が知らされ、外科的に去勢した群と同等であった。図１５ｃに示すように、これらは１４週までに平均１１０ｋｇに達した。
【０３０８】
予期せず、ｗ／ｏエマルション中ＬＨＲＨ免疫刺激複合体およびＩＬ−１βペプチドの組合せとして配合されたＬＨＲＨワクチンにより免疫された群は、さらにかなり有効であることが判明した。この群の全てのイノシシは、試験したその他の群と比較して評価された全ての時点で迅速に応答し、最も高い平均体重増加が報告された。図１５ｃに示すように、この群のイノシシは、１２週までに１２０ｋｇをわずかに下回る平均体重を獲得し、１４週までに１３０ｋｇに到達した。
【０３０９】
この群および試験したその他の群の間の格差は、ＬＨＲＨ／ＣｐＧ１の免疫刺激複合体をｗ／ｏエマルション中ＩＬ−１βペプチドおよび遊離の非複合化ＬＨＲＨペプチドと組合せて免疫系に提示する場合に得られる効果の相乗的組合せに起因し得る。
【０３１０】
懸濁液に存在する非常に少量のＬＨＲＨ／ＣｐＧ１の免疫刺激複合体を伴う組合せ配合物が有効であることが判明した。本実施例において、１６：１のＬＨＲＨ：ＣｐＧ１電荷比が、全ブタにおいて著しい応答を提供した。
【０３１１】
プラセボ・コントロール群は、試験期間中成長促進させるのが最も劣っていた。図１５ｃに示すように、この群に関する平均体重増加は、全てのその他のものに相対して著しく低下していた。
【０３１２】
プラセボ・コントロールに相対して免疫去勢の結果としての体重増加におけるわずかな改良が過去７０に観察されているが、本実施例では、イノシシの感染の除去のために効果的な免疫去勢を得るための新規方法（血清テストステロンにより測定）が実証され、外科的去勢の標準的な方法に関して試験期間にわたって優れた成長促進（体重増加により測定）が得られた。
【０３１３】
なお、ｗ／ｏエマルション中免疫刺激複合体およびＩＬ−１βペプチドの組合せとして配合されたＬＨＲＨワクチンにより免疫去勢されたイノシシは、代替の配合物かまたは現行の優先される方法である外科的去勢のいずれかにより免疫化された雄イノシシよりも２週間早く市場に出すことができた。
【０３１４】
具体的には、手術のトラウマに因る喪失を避けるという観点での金銭上の節約、食餌および飼育経費の減少、並びに市場までの時間という観点でのターンオーバーの改善が顕著であり、免疫去勢および成長促進のこの改善された方法の利点が実証される。
【実施例１４】
【０３１５】
ＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖおよびＦＭＤ由来の免疫刺激複合体からの油中水滴型エマルションの調製
２０ｍｌ容器に、適当な水性緩衝液に溶解したＦＭＤペプチド免疫原（溶液中配列番号１２〜１３）４，０００μｇ（２，０００μｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ）を加えるか、または免疫刺激複合体（電荷比４：１）を調製するのに適当な水性緩衝液に溶解したペプチド免疫原４，０００μｇ（２，０００μｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ）およびＣｐＧ１オリゴヌクレオチドを加えた。表９は、特定の電荷比に関して固定した最終用量２００μｇ／１．０ｍｌのＦＭＤペプチド免疫原との複合化に必要なＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの相対量を決定するために用いた計算を示す。
【０３１６】
具体的には、ＦＭＤ：ＣｐＧ１の電荷比４：１でＦＭＤペプチド免疫原から免疫刺激複合体を調製するのに、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド１２５μｇ（６２．５μｌ、２．０μｇ／ｍｌ）を使用した。
【０３１７】
各々のＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ  ｗ／ｏエマルションを調製するのに、各容器にさらなる水性溶媒希釈剤を加えて水相の最終容量を１０．０ｍｌに固定した。
【０３１８】
プラセボ群を調製するのに、水相に生理食塩水１０．０ｍｌを使用した。
【０３１９】
ＦＭＤペプチド免疫原のライブライリー用に生理食塩水が複合化に適していることが見出された。ライブラリーの位置アナログに由来する各ペプチドに関して計算した平均ＩＰは９．０を超え（表１）、選択した水性溶媒のｐＨよりもはるかに大きい。
【０３２０】
次いでＦＭＤ免疫原の希釈した水性懸濁液またはプラセボ溶液をＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ（１０．０ｍｌ）を充填した乾燥した２５ｍｌ反応容器にゆっくりと加えた。粗雑なエマルションを作製するために低速（２，０００〜３，０００ｒｐｍ）で混合物を均質化（High Shear Laboratory Mixer, Sealed Unit, Silverson）しながら添加を行った。水性サンプルが完全に添加されるまでこの処理速度を維持し、水相および油相の均一な予備混合を確実にするために丸２分間続けた。次いで均質化速度を上げ（５，０００〜８，０００ｒｐｍ）、さらに５〜１０分間維持し、結果的に均質な白色の微細に分散されたｗ／ｏエマルションが形成された。
【０３２１】
上述したように、油中水滴型エマルションに一旦配合された免疫原の最終濃度は、２００μｇ／ｍｌであった。
【実施例１５】
【０３２２】
ｗ／ｏエマルション中に免疫刺激複合体として配合されたＦＭＤペプチド免疫原の免疫原性および保護
本実施例は、ウシを筋内免疫化した、ｗ／ｏエマルションとして、またはｗ／ｏエマルションと組合せたＦＭＤ免疫刺激複合体として配合されたＦＭＤペプチド免疫原の免疫原性を例示する。実施例４ａおよび実施例１４に記載するように均質化することによりｗ／ｏエマルションを調製した。
【０３２３】
成熟したウシ３群を０および３週に以下の組成物で筋内（Ｉ．Ｍ．）免疫化した。最終容量１，０００μｌのＮａＣｌに懸濁し、ＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ（１，０００μｌ）を分散したＦＭＤペプチド４００μｇ；または最終容量１，０００μｌのＮａＣｌに懸濁し、ＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ（１，０００μｌ）を分散した、表９に記載するように調製したＦＭＤペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体（電荷比４：１）。ＩＳＡモンタニド（登録商標）５０ｖ（１，０００μｌ）で乳化したＮａＣｌ  １，０００μｌのプラセボ・コントロール群を調製した。
【０３２４】
プラセボｗ／ｏエマルションまたはＦＭＤペプチド免疫原もしくはＦＭＤ免疫刺激複合体を含むｗ／ｏエマルションを投与した後、ウシは、全体的な病理学または挙動変化を示さなかった。＋５週に入手した血清をＦＭＤ中和抗体の存在に関して評価し、＋６週に１４日間継続する試験における保護レベルを決定するためにウシを生ウイルスで誘発した。
【０３２５】
抗ＦＭＤ抗体の測定−中和アッセイ
ＦＭＤ抗体の定量的中和アッセイ（ＮＡ）を、ＢＨＫ−２１細胞を用いて平底組織培養用マイクロタイタープレートで実施した。試験は５０μｌ量の同一容量試験である。１：４希釈で始めて、２倍希釈シリーズで２検体ずつ血清を希釈した。試験する血清サンプルを同一容量のＦＭＤＶ  ＯＭａｎｉｓａ血清型（２００  ＴＣＩＤ５０／０．０５ｍｌ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。１０％ウシ血清を含む培地で１０６セル／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。５０μｌの容量の細胞懸濁液を各ウェルに加えた。プレートを密閉し、３７℃で２〜３日インキュベートした。
【０３２６】
４８時間後に顕微鏡試験を行うことができた。１０％ホルモル／食塩水で３０分間固定を行った。染色のためにプレートを１０％ホルマリン中０．０５％メチレンブルーに３０分間浸漬した。陽性のウェル（この場合ウイルスは中和されており、細胞は無傷のままであった）は青色に染色された細胞を含有するのが認められた。陰性ウェルは空である。力価を、５０％終点で血清／ウイルス混合物に存在する血清の最終希釈として表した。
【０３２７】
ウシ誘発試験プロトコル
０日および２１日にワクチンまたはプラセボを投与した全ウシを３５日に、別個の密閉された部屋に群分けした。４２日に、各動物を舌の背面の２箇所に注射した全部で１０４  ＢＩＤ５０  ＦＭＤＶ  Ｏで舌側皮内（ＩＤＬ）に誘発した。
【０３２８】
誘発後、１４日間ＦＭＤの臨床徴候の発達に関してウシを観察し、体温を毎日記録した。保護されなかった動物は、舌以外の部位で障害を示した。有効であると考えられるウイルス誘発のために、コントロール動物は、少なくとも３本の脚で障害により示される一般的な感染を発達させるはずである７１。
【０３２９】
免疫原性結果
ＦＭＤ免疫原の免疫の後の中和抗体（Ｎ．Ａ．）力価および対応する保護結果を表１０に示す。
【０３３０】
ｗ／ｏエマルションとして投与されたＦＭＤペプチド免疫原により、またはＦＭＤ免疫刺激複合体により免疫化されたウシ（＋５週）から得られた血清から測定したＮ．Ａ．力価により、双方の組成物が免疫原性であることが示された。５週の時点で得られた力価は、高度に変動性であるが、すべてのケースにおいて、１６よりも大きいことが示された。Office International des Epizooties（ＯＩＥ）により確立されるような口蹄疫ワクチンの効力の証明のための最低要件は,Ｎ．Ａ．力価１６である７１。表１０に示すように、プラセボ・ネガティブ・コントロール群の各去勢ウシは、わずかなＮ．Ａ．力価に戻り、その全ては１６未満であった。
【０３３１】
保護の確証は、特定の力価の生ウイルスでの免疫群の誘発により得られるはずである。生ウイルスを舌の背面の２箇所に注射した全部で１０４  ＢＩＤ５０  ＦＭＤＶ  Ｏで舌側皮内（ＩＤＬ）に投与した。
【０３３２】
Ｎ．Ａ．力価が全群で確立された１週間後である６週に、誘発プロトコルを開始し、表１０に示す結果により、ｗ／ｏエマルションとして投与された非結合性ＦＭＤペプチドと組合せたＦＭＤペプチド／ＣｐＧ１免疫刺激複合体由来の配合物（３／３が保護された）が、ｗ／ｏエマルション単独として投与されたＦＭＤペプチド由来の配合物（１／３が保護された）よりも優れていることが判明した。
【０３３３】
プラセボ・コントロール群により、この群の３匹全てのウシが感染され、表１０に示すように誘発後１４日以内に疾病の徴候を示した（０／３が保護された）ので、誘発に用いた生ウイルスは十分に悪性であることが確認された。
【０３３４】
ｗ／ｏエマルション中ＦＭＤ免疫原またはＦＭＤ免疫刺激複合体で配合した双方の群は＋５週までに著しいＮ．Ａ．抗体価を得た。
【０３３５】
驚くべきことに、誘発研究により、優れた効果の配合物がｗ／ｏエマルション中ＦＭＤ免疫刺激複合体を含む配合物から誘導されることが実証された。この組成物は同時にＮ．Ａ．応答を改善し、ウイルス感染に対抗するのに重要な特定の種類の免疫応答を上方制御するのにさらに有効である可能性がある。
【０３３６】
具体的には、ｗ／ｏエマルションの形態で提示されたＦＭＤおよびＣｐＧ１由来の免疫刺激複合体は、免疫応答（例えばＩＦＮ−γ）のＴｈ１アームを効果的に増強できる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのこの役割は、別のモデルで十分に確立されており、ＩＦＮ−γ自体が、インフルエンザウイルスに対して免疫保護を達成する有効な免疫モデュレーターであることが示されている７２。
【０３３７】
口蹄疫の制御は、一旦発生が同定されると、しばしば感染した、および近隣の群れを処分することにより成し遂げられる。ウシ、ブタおよびヒツジのような重要な商品の経済的損失はしばしば重大である。既存のワクチン接種計画は死滅ウイルスを用いるが、これは場合によっては現地で製造され、品質が劣っている。生ウイルスからの製造は、それに伴って、製造に関連する種々の問題を有し、製品自体が安全性に関するリスクの可能性があることを提示する。合成ペプチド由来の免疫原に基づく戦略は、有効な免疫のための改善された方法を提示し、リスクは低いはずであると考えられる。
【０３３８】
具体的には、本実施例は、合成ペプチドをベースとしたワクチン接種計画が安全且つ有効にウシを口蹄疫に対して保護できることを例示する。
【０３３９】
なお、本実施例は、口蹄疫に対して感受性のある重要な家畜の一般的な保護のためのこのワクチン研究法の利用性を例示する。
【０３４０】
【表１】
2010265291.tif 000003
【０３４１】
【表２】
2010265291.tif 000004
【０３４２】
【表３】
2010265291.tif 000005
【０３４３】
【表４】
2010265291.tif 000006
【０３４４】
【表５】
2010265291.tif 000007
【０３４５】
【表６】
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【０３４６】
【表７】
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【０３４７】
【表８】
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【０３４８】
【表９】
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【０３４９】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０３５０】
図面を参照することにより、本発明はさらに理解される。
【図１】図１は、カチオン性免疫原及びＣｐＧオリゴヌクレオチドの複合化プロセスを示す概略図である。
【図２】図２は、レーザ回折測定法により測定した、種々の比率でのＬＨＲＨペプチド免疫原及びＣｐＧ１オリゴヌクレオチドから調製した安定化免疫刺激複合体の典型的な粒径分布を示す。
【図３】図３は、均質化又は押出技術を用いる水中油（ｗ／ｏ）エマルションの製法の概略図である。
【図４】図４は、ＩＳＡモンタニド（登録商標）５１及びＬＨＲＨ：ＣｐＧ１免疫刺激複合体から均質化を介して調製したｗ／ｏエマルションの典型的な顕微写真を示す。ここで、ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１は、最終的に固定した全ペプチド濃度１００μｇ／ｍＬにおいて、４：１である。
【図５】図５は、ＩＳＡモンタニド（登録商標）７２０及びＬＨＲＨ：ＣｐＧ１免疫刺激複合体から押出化を介して調製したｗ／ｏエマルションの典型的な顕微写真を示す。ここで、ＬＨＲＨ：ＣｐＧ１は、最終的に固定した全ペプチド濃度２００μｇ／ｍＬにおいて、４：１である。
【図６】図６は、再構成を行うin-situポリマーゲル化法の詳細の概略図である。
【図７】図７は、実施例７に記載した免疫化プロトコールによって筋内（I.M.）免疫処置したモルモットの血清ＩｇＧ応答を示す。
【図８】図８は、実施例７に記載した免疫化プロトコールによって筋内（I.M.）免疫処置したモルモットの血清ＩｇＧ応答を示す。血清なしは、ＣＤ４ペプチド及びＣｐＧ２由来の免疫刺激複合体で１７週間、免疫処置した動物で得た。これは図８においてアスタリスクで示す。
【図９】図９は、実施例７に記載した免疫化プロトコールによって筋内（I.M.）免疫処置したモルモットの血清ＩｇＧ応答を示す。
【図１０】図１０は、実施例７に記載した免疫化プロトコールによって筋内（I.M.）免疫処置したモルモットの血清ＩｇＧ応答を示す。血清なしは、ＣＤ４ペプチド及びＣｐＧ２由来の免疫刺激複合体で１７週間、免疫処置した動物で得た。これは、図１０においてアスタリスクで示す。
【図１１】図１１は、実施例８に記載した免疫化プロトコールによって筋内（I.M.）免疫処置したモルモットの血清ＩｇＧ応答を示す。
【図１２】図１２は、実施例８に記載した免疫化プロトコールによって筋内（I.M.）免疫処置したモルモットの血清ＩｇＧ応答を示す。
【図１３】図１３ａは、実施例１０に記載した免疫化プロトコールによって筋内（I.M.）免疫処置した雄ラットの血清ＩｇＧ応答を、図１３ｂは合計血清テストステロンを示す。
【図１４】図１４ａは、実施例１１に記載した免疫化プロトコールによって筋内（I.M.）免疫処置した雄ヒヒの血清ＩｇＧ応答を、図１４ｂ及び図１４ｃは合計血清テストステロンを示す。
【図１５】図１５ａは、実施例１３に記載した免疫化プロトコールによって筋内（I.M.）免疫処置したイノシシの血清ＩｇＧ応答を、図１５ｂは合計血清テストステロンを、図１５ｃは群内の平均体重増加を示す。
【図１６】図１６は、免疫刺激複合体及び無機塩の混合懸濁液の調製法の詳細を示す概略図である。
【配列表フリーテキスト】
【０３５１】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【配列表】
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