(57)【要約】【課題】  少量の試料を使用してヒト心筋組織由来の脂肪酸結合蛋白（以下、H-FABP）を迅速的且つ高感度に精度よく定量することが出来る測定試薬を提供する。ラテックス粒子に感作させた抗体と、試料中に存在する抗原（H-FABP）を抗原抗体反応させることで、ラテックス粒子が凝集反応を起こすことを利用した方法(以下、LA法)で測定する試薬。本測定試薬は、試料が少量で済むことや、独自の非特異反応抑制剤を使用すること等によりLA法でよく見受けられる非特異反応を回避でき、精度よく定量できる。また、自動分析機を用いることで迅速的に精度よく定量できるため、従来のH-FABP測定法より優れ、急性心筋梗塞（以下AMI）の判定に貢献できる。【解決手段】  生体中のH-FABPを迅速的且つ高感度に精度よく定量しAMIを診断する、少なくとも抗体を感作または担持させた不溶性担体と緩衝液から成る試薬。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体中のH-FABPを迅速的且つ高感度に精度よく定量しAMIを診断する、少なくとも抗体を感作または担持させた不溶性担体と緩衝液から成る試薬。
【請求項２】
測定方法が免疫学的凝集反応である請求項1記載の試薬。
【請求項３】
免疫学的凝集反応が、ラテックス凝集反応である請求項２記載の試薬。
【請求項４】
免疫学的凝集反応がモノクローナル抗体を用いる請求項２記載の試薬。
【請求項５】
分光学的に測定する、請求項３記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、H-FABPの測定に係り、さらに詳しくは、被測定物質を迅速的且つ高感度に精度よく定量できる凝集反応または抗原抗体反応の測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
市販されている定性試薬は陰性か陽性かを判定するもので、その判定には判定ラインを目視により確認するため測定者の技量が問われるものである。
一方、定量試薬として酵素免疫測定法（ELISA法）が市販されているが、結果が得られるまでに数時間を要し、急性心筋梗塞の疑いがある患者を診断するには時間がかかり過ぎていた。しかも、前者の定性試薬は試料を150μLも必要とし、後者の定量試薬は試料を70μLも必要とする。従って、従来の技術ではH-FABPを少量の試料で、迅速的且つ高感度に精度よく定量できる試薬は存在していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、血清または血漿検体などの生体試料中に含まれるH-FABPを少量の試料(１〜10μL、汎用自動分析機では概して2〜5μL)で迅速的且つ高感度に測定者の技量を問わず精度よく定量できる試薬を提供することにある。その結果、AMIの診断に貢献できる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記目的はH-FABPに特異的に反応する抗体価の高い抗体を用いた不溶性担体に固定した当該抗体感作試薬によってH-FABPを高感度に測定することが達成される。本試薬とそれを測り込む自動分析機によって、迅速的に精度よく定量できる。
【０００５】
本発明は、生体中のH-FABPを迅速的且つ高感度に精度よく定量しAMIを診断する、少なくとも抗体を感作または担持させた不溶性担体と緩衝液から成る試薬を要旨とするものであり、本発明に使用している抗体は細胞融合法により作製されたハイブリドーマの産するモノクロ−ナル抗体である。本発明の好ましい抗体はヒトH-FABPと特異的に反応するモノクローナル抗体である。本発明のモノクロ−ナル抗体を用いたH-FABPの測定方法は、抗原と抗体との凝集反応、抗原抗体反応、本発明のモノクロ−ナル抗体に不溶性担体を感作又は担持させて被測定物質との凝集反応、抗原抗体反応の測定を実施するものである。そして、前記凝集反応、抗原抗体反応の測定を、その測定が終了するまで攪拌又は揺動下のもとで実施してもよい。本発明の凝集反応、抗原抗体反応の測定方法によって行われる測定・検出方法としては、特に限定されず、凝集反応又は抗原抗体反応を利用して測定する様々な方法が可能であり、免疫比濁法（ＴＩＡ）、化学発光法（CLＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、LA法等が利用される。特に、汎用自動分析機で測定できるLA法が好適に用いられる。
【発明の効果】
【０００６】
以上詳述した如く、本発明によると次のような効果を奏する。本発明の試薬によりAMIの疑いのある血清あるいは血漿検体などの生体試料中のH-FABPを迅速的且つ高感度に精度よく測定することによってAMIを早期に診断する試薬を提供することができる。AMIの診断において、診断されるまでの時間が短いほど、その後の治療において予後がよいことが知られており、その要因の主となる測定時間が短縮されることが有用であることは勿論のことであるが、抗原抗体反応においてよく見受けられる非特異反応が本試薬は回避されているため精度よく測れる点も非常に有用である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０００８】
実施例１ハイブリドーマの作製：ヒト由来精製H-FABPを等量のフロイド完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液１００μＬをＢＡＬB／ｃ系マウス腹腔内に投与することにより免疫を行った。約３０日経過後、ヒトH-FABPを等量の生理食塩液で希釈して調製したヒトH-FABP液１００μＬを、前記のマウスに投与し、３日後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し、次の細胞融合工程に用いた。細胞融合：１５％ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ（ＤＭＥ）培地５ｍＬを入れたペトリ皿に前記の脾臓を入れた。次に無血清ＤＭＥ培地１２ｍＬで前記脾臓より還流法で脾細胞を流出し５０ｍＬの遠心管に集める。遠心後、上清を捨て、無血清DMEに懸濁し、脾細胞数を数えた。一方、予め培養しておいたマウスミエロ−マ細胞SP2/Oの約2×１07個に前記脾細胞１×１０8個を加え、遠心分離した。その上清を捨て、ペレットに50％ポリエチレングリコ−ル１５００溶液（３７℃に保温）１．０ｍＬを加え良く混合する。次に、３７℃に保温しておいたＤＭＥ培地を１０ｍＬ加え、遠心分離する。上清を除去後、ペレットを１0％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ，チミジン１．６×１０-5Ｍ，ヒボキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）で懸濁した。ＨＡＴ培地２０ｍＬに懸濁した細胞懸濁液を９６穴細胞培養プレ−トの各ウェルに２００μＬずつ分注し、５％ＣＯ2Ａ含むＣＯ2培養器で培養し、10日後に後述のＥＬＩＳＡ法により、抗H-FABP抗体産生ハイブリド−マをスクリ−ニングした。スクリーニングされたハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとした。
【０００９】
ハイブリド−マの確立：ハイブリド−マ培養液の上清中の抗体の有無は、ＥＬＩＳＡ法により測定した。９６穴ＥＬＩＳＡ用プレ−ト（住友化学）の各ウェルに前記のヒトH-FABP溶液（Ａ280nm＝０．３）１００μＬずつ分注し、４℃で１６時間放置した。次に、０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−生理食塩液で３回洗浄した後、各ウェルに培養上清１００μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。次に、Ｔｗｅｅｎ８０−生理食塩液で１０００倍に希釈したペルオキシダ−ゼ結合抗マウス抗体（ＤＡＫＯ社、デンマ−ク）１００μＬを各ウェルに加えた。反応終了後、０．０１％ＢＳＡ−生理食塩液で各ウェルを３回洗浄し、ペルオキシダ−ゼの基質を加え発色を確認し、抗体価の高いハイブリドーマを数種類確立した。その中でも、Clone#2B8(以下HF2B8)とClone#4D1(以下HF4D1)の2種を使用した。
【００１０】
実施例２モノクローナル抗体の製造：プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬをＢＡＬＢ／ｃ系雄マウスの腹腔内に投与し、それからマウスの腹腔内にハイブリド−マをマウス一匹当たり細胞数、２×１０6個になるように接種した。一匹のマウスから約５〜１２ｍＬの腹水が得られた。その抗体濃度は５〜１０ｍｇ／ｍＬであった。腹水中モノクロ−ナル抗体の精製は、プロテインＡセファロ−ス４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スウェ−デン）により行なった。最終的にはIgGまたはＦ（ａｂ’）2を
凍結乾燥品として精製し、後述の試薬製造に使用する。
【００１１】
実施例３モノクローナル抗体のIsotype及び特異性の同定は、それぞれイムノブロッティング法及びＥＬＩＳＡ法により行った。IsotypeはHF2B8とHF4D1は両者ともＩｇＧ１（κ）であった。また、HF2B8およびHF4D1の特異性および抗体価は表１に示すとおりであった。
【００１２】
【表１】
2010271270.tif 000002
*抗体価は一定のH-FABP  抗原に対して吸光度を読み与える最低の希釈度とする
【００１３】
実施例４ラテックス試薬安定化液（以下R1）の製造：0.2Mトリス-塩酸緩衝液(pH8.0)に独自に開発した非特異反応抑制剤を0.4mg/mL添加し、R1を得た。
【００１４】
実施例５不溶性担体に固定した当該抗体感作試薬（以下R2）の製造：モノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）2 分画（１ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液５ｍＬと、ラテックス溶液（２％、日本合成ゴム社：２１２ｎｍ）５ｍＬとを混合し約１時間強く攪拌した。遠心後、ペレットをＢＳＡ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）に懸濁して、約１時間強く攪拌し、R2を得た。
【００１５】
実施例６分光学的の方法によるH-FABPの定量：実施例４および５で調製したR1とR2を用いて、H-FABPとの凝集反応を自動分析機で測定した。その場合、波長は400〜900nmまで選択可能である。例えば波長700nmにおける測定結果は表２の如く、H-FABP濃度0〜160ng/mLまで測定可能であった。
【００１６】
【表２】
2010271270.tif 000003
【００１７】
実施例７健常者における測定値：本試薬を用いて健常者の血清を測定した結果、表３に示すような結果となった。本試薬における参考正常値は0〜5.0ng/mL
であった。
【００１８】
【表３】
2010271270.tif 000004
【００１９】
実施例８心筋梗塞を発症していないリウマトイド因子（以下ＲＦ）含有血清を倍々希釈し、測定値に各々希釈倍率を乗じた換算値が一致するか否かによりRFによる非特異反応の有無を確認したところRF濃度が6000IU/mLでも干渉を回避できる結果であった。表４に本試薬と、一般に市販されているH-FABP抗体で一般的なラテックス試薬作製法から得た試薬とを比較した。
【００２０】
【表４】
2010271270.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月28日(2009.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
市販されている定性試薬は陰性か陽性かを判定するもので、その判定には判定ラインを目視により確認するため測定者の技量が問われるものである。
一方、定量試薬として酵素免疫測定法（ELISA法）が市販されているが、結果が得られるまでに数時間を要し、急性心筋梗塞等の急性冠症候群の疑いがある患者を診断するには時間がかかり過ぎていた。しかも、前者の定性試薬は試料を150μLも必要とし、後者の定量試薬は試料を70μLも必要とする。従って、従来の技術ではH-FABPを少量の試料で、迅速的且つ高感度に精度よく定量できる試薬は存在していない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
本発明の目的は、血清または血漿検体などの生体試料中に含まれるH-FABPを少量の試料(１〜10μL、汎用自動分析機では概して2〜5μL)で迅速的且つ高感度に測定者の技量を問わず精度よく定量できる試薬を提供することにある。その結果、AMI等の急性冠症候群の診断に貢献できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明は、生体中のH-FABPを迅速的且つ高感度に精度よく定量しAMI等の急性冠症候群を診断する、少なくとも抗体を感作または担持させた不溶性担体と緩衝液から成る試薬を要旨とするものであり、本発明に使用している抗体は細胞融合法により作製されたハイブリドーマの産するモノクロ−ナル抗体である。本発明の好ましい抗体はヒトH-FABPと特異的に反応するモノクローナル抗体である。本発明のモノクロ−ナル抗体を用いたH-FABPの測定方法は、抗原と抗体との凝集反応、抗原抗体反応、本発明のモノクロ−ナル抗体に不溶性担体を感作又は担持させて被測定物質との凝集反応、抗原抗体反応の測定を実施するものである。そして、前記凝集反応、抗原抗体反応の測定を、その測定が終了するまで攪拌又は揺動下のもとで実施してもよい。本発明の凝集反応、抗原抗体反応の測定方法によって行われる測定・検出方法としては、特に限定されず、凝集反応又は抗原抗体反応を利用して測定する様々な方法が可能であり、免疫比濁法（ＴＩＡ）、化学発光法（CLＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、LA法等が利用される。特に、汎用自動分析機で測定できるLA法が好適に用いられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
以上詳述した如く、本発明によると次のような効果を奏する。本発明の試薬によりAMI等の急性冠症候群の疑いのある血清あるいは血漿検体などの生体試料中のH-FABPを迅速的且つ高感度に精度よく測定することによってAMI等の急性冠症候群を早期に診断する試薬を提供することができる。AMI等の急性冠症候群の診断において、診断されるまでの時間が短いほど、その後の治療において予後がよいことが知られており、その要因の主となる測定時間が短縮されることが有用であることは勿論のことであるが、抗原抗体反応においてよく見受けられる非特異反応が本試薬は回避されているため精度よく測れる点も非常に有用である。