(57)【要約】      （修正有）【課題】組換え型ポリクローナルタンパク質組成物、特に組換え型ポリクローナル抗体組成物を製造する方法を提供する。【解決手段】収集物中の各々の細胞が、特定の抗原を結合させるポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードし、かつ前記収集物中の個別細胞のゲノム内で同じ単一の部位にある前記ライブラリーの１成員でトランスフェクションされこの成員を発現する能力を有しており、前記核酸配列が細胞と天然に会合されていない、変異体核酸配列ライブラリーでトランスフェクションされた細胞収集物を得る段階を含む。核酸配列は、部位特異的組込みのためベクターライブラリーでのトランスフェクションにより細胞内に導入される。当該方法は、組換え型ポリクローナル抗体を製造するために適しており、かくして血漿由来の治療用免疫グロブリン製品のより優れた代替品が入手可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え型ポリクローナル製造細胞系統として適切な細胞の収集物を生成するための方法であって、
ａ）変異体核酸配列の集合を含むベクターライブラリーを提供する段階であって、前記ベクターの各々が１）特定の抗原を結合させる全く異なる成員を含むポリクローナルタンパク質の全く異なる成員をコードする全く異なる核酸配列の１つの単一コピー、及び２）１つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含んでいる、段階、
ｂ）宿主細胞系統内に前記ベクターライブラリーを導入する段階であって、前記宿主細胞系統の各々の個別細胞のゲノムが、そのゲノム内の単一の特異的部位で前記ベクターものと整合するリコンビナーゼ認識配列を含んでいる、段階；
ｃ）段階（ａ）の前記変異体核酸配列が前記宿主細胞系統の前記細胞内で部位特異的に組込まれるような形で１つ以上のリコンビナーゼの前記細胞内での存在を保証する段階であって、ここで、前記１つ以上のリコンビナーゼは、ｉ）前記核酸配列が中に導入される前記細胞により発現されるか；（ｉｉ）段階ａの前記ベクターにより操作可能な形でコードされるか；ｉｉｉ）第２のベクターから発現を通して提供されるか；又はｉｖ）１つのタンパク質として前記細胞に提供されるかのいずれかである、段階；及び
ｄ）変異体核酸配列の前記ライブラリーから、組込まれたコピーを含む細胞を選択する段階、
を含む方法。
【請求項２】
前記ポリクローナルタンパク質が前記細胞収集物と天然においては関連していない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリクローナルタンパク質がポリクローナル抗体又は抗体フラグメントである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリクローナルタンパク質がポリクローナルＴ細胞レセプタ又はＴ細胞レセプタフラグメントである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターライブラリーが、このベクターライブラリーを用いた前記宿主細胞の収集物のバルクトランスフェクションにより前記宿主細胞系統内に導入される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターライブラリーが、前記ベクターライブラリーのうちの５〜５０個のベクターを含む画分での前記宿主細胞のアリコートの半バルクトランスフェクションにより前記宿主細胞系統内に導入され、前記細胞が、段階（ｄ）の選択に先立ち又はそれに後続して組換え型ポリクローナル製造細胞系統として適切な細胞収集物を形成するべくプールされている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
部位特異的組込みのための前記ベクターライブラリーが、前記ベクターライブラリーの個別成員で別々に前記宿主細胞をトランスフェクションすることによって前記宿主細胞系統内に導入され、前記細胞が、段階（ｄ）の選択に先立ち又はそれに後続して組換え型ポリクローナル製造細胞系統として適切な細胞収集物を形成するべくプールされる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
段階（ａ）中の変異体核酸の集合が、前記特定の抗原を結合させるタンパク質をコードする核酸の同定及び／又は単離を可能にするスクリーニング手順を用いて単離又は同定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
スクリーニング手順がバイオパニング段階及び／又は免疫検出検定を内含している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記スクリーニング手順が、ファージ提示法、リボソーム提示法、ＤＮＡ提示法、ＲＮＡペプチド提示法、共有結合提示法、細菌表面提示法、酵母表面提示法、真核生物ウイルス提示法、ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴから成る群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異体核酸配列のライブラリーが少なくとも３つの変異体核酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
変異体核酸配列の前記ライブラリーの個別成員が、前記細胞収集物内の個別細胞の単一の予め定義されたゲノム遺伝子座内に組込まれており、前記遺伝子座が前記組換え型ポリクローナルタンパク質の各成員の高レベル発現を媒介する能力をもつ、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
各々の全く異なる核酸配列が、２つの異なるポリペプチド鎖から成るポリクローナルタンパク質の一成員をコードする一対の遺伝子セグメントを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子セグメント対が、抗体重鎖可変領域コーディング配列及び抗体軽鎖可変領域コーディング配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子セグメント対が、Ｔ細胞レセプタアルファ鎖可変領域コーディング配列及びＴ細胞レセプタベータ鎖可変領域コーディング配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子セグメント対が、Ｔ細胞レセプタガンマ鎖可変領域コーディング配列及びＴ細胞レセプタデルタ鎖可変領域コーディング配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異体核酸配列ライブラリーが、前記変異体核酸配列内部にある天然に発生する多様性を含んでいる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
天然に発生する多様性が、前記変異体核酸配列内に存在するＣＤＲ領域内に位置している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞収集物が、哺乳動物細胞系統又は細胞型に由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物細胞系統が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＹＢ２／０、ＮＩＨ３Ｔ３、骨髄腫細胞、線維芽細胞、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６及びそれらから誘導された細胞系統から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組換え型ポリクローナルタンパク質の製造方法であって、前記ポリクローナルタンパク質が、特定の抗原を結合させる全く異なる成員を含んでおり、
ａ）変異体核酸配列のライブラリーを含む細胞収集物を提供する段階であって、前記核酸配列の各々が前記ポリクローナルタンパク質の全く異なる成員をコードし、前記核酸配列の各々が前記細胞収集物内の各々個別の細胞のゲノムの同じ単一の部位にて組込まれている、段階、
ｂ）前記ポリクローナルタンパク質の発現を容易にする条件の下で、前記細胞収集物を培養する段階；及び
ｃ）細胞培養細胞又は細胞培養上清から前記発現されたポリクローナルタンパク質を回収する段階、
を含む方法。
【請求項２２】
段階（ａ）内の前記細胞収集物が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法に従って生成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリクローナルタンパク質を発現する細胞収集物が１つの生物反応器にて培養される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリクローナルタンパク質が前記細胞収集物と天然においては関連していない、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ａ）中の前記変異体核酸ライブラリーが、前記特定の抗原を結合させるタンパク質をコードする核酸の同定及び／又は単離を可能にするスクリーニング手順を用いて、より早期の段階で単離又は同定される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記スクリーニング手順がバイオパニング段階及び／又は免疫検出検定を内含している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記スクリーニング手順が、ファージ提示法、リボソーム提示法、ＤＮＡ提示法、ＲＮＡペプチド提示法、共有結合提示法、細菌表面提示法、酵母表面提示法、真核生物ウイルス提示法、ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴから成る群から選択される、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリクローナルタンパク質がポリクローナル抗体又は抗体フラグメントである、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリクローナルタンパク質がポリクローナルＴ細胞レセプタ又はＴ細胞レセプタフラグメントである、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記変異体核酸配列の前記相対的発現レベルが監視される、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記発現レベルがｍＲＮＡレベル及び／又はタンパク質レベルで監視される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
段階（ｂ）での前記培養は、遅くとも前記相対的発現レベルが予め定められた範囲外となった時点で終結される、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
特定の抗原に結合するポリクローナルタンパク質をコードする変異体核酸配列ライブラリーでトランスフェクションされた細胞収集物を含む組換え型ポリクローナル製造細胞系統であって、前記収集物中の各々の細胞が、前記ライブラリーの一成員でトランスフェクションされ、ポリクローナルタンパク質の全く異なる一成員を発現し得、かつ、前記変異体核酸配列は、前記収集物内の個別の細胞のゲノム内で同じ単一の部位にあり、前記核酸配列が前記収集物中の前記細胞と天然においては関連していない組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
【請求項３５】
前記変異体核酸配列ライブラリーが、ポリクローナル抗体又は抗体フラグメントの個別成員の間で天然に発生する多様性を有する前記ポリクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする、請求項３４に記載の組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
【請求項３６】
前記変異体核酸配列ライブラリーが、ポリクローナルＴ細胞レセプタ又はＴ細胞レセプタフラグメントの個別成員の間で天然に発生する多様性を有する前記ポリクローナルＴ細胞レセプタ又はＴ細胞レセプタフラグメントをコードする、請求項３４に記載の組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
【請求項３７】
前記細胞収集物が、哺乳動物細胞系統又は細胞型に由来する、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
【請求項３８】
前記哺乳動物細胞系統が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＹＢ２／０、ＮＩＨ３Ｔ３、骨髄腫細胞、線維芽細胞、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６及びそれらから誘導された細胞系統から成る群から選択される、請求項３７に記載の組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
【請求項３９】
組換え型ポリクローナル抗体またはそのフラグメントの商業的生産に適している、請求項３５に記載の組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
【請求項４０】
ＶＨおよびＶＬ遺伝子セグメントのペアーのライブラリーでトランスフェクトされた細胞収集物を含み、特定の抗原に結合する組換え型ポリクローナル抗体を発現し得るポリクローナル抗体製造細胞系統であって、各ＶＨおよびＶＬ遺伝子ペアーは、ポリクローナル抗体の異なる成員をコードし、かつ、細胞系統中の各細胞が、ライブラリーのＶＨおよびＶＬ遺伝子の１のペアーにてトランスフェクトされており、該ペアーを発現しうるものであり、かつ、ＶＨおよびＶＬ遺伝子の各ペアーは、該細胞系統中の個々の細胞のゲノム中の同じ単一部位に存在しており、該遺伝子セグメントが収集物中の該細胞と天然においては関連していないものである、細胞系統。
【請求項４１】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項４０に記載の細胞系統。
【請求項４２】
組換え型ポリクローナル抗体の商業的生産に適している、請求項４１に記載の細胞系統。
【請求項４３】
ＶＨおよびＶＬ遺伝子セグメントのペアーのライブラリーが、天然の変異体核酸配列の集合を含む部位特異的組込み用ベクターのライブラリーであって、前記ベクターの各々が、１）特定の抗原に結合するポリクローナル抗体またはそのフラグメントの全く異なる成員をコードする全く異なる核酸配列の１つのコピー、及び２）１つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含んでいる、請求項４０に記載の細胞系統。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、さまざまな感染症、炎症性疾患、移植片拒絶、癌及びアレルギーの治療、改善又は予防における新規の療法として使用するべき、例えば可溶性又は膜結合形態のＢ又はＴ細胞レセプタなどの免疫グロブリンスーパーファミリー由来のタンパク質といったような、組換え型ポリクローナルタンパク質を生産するための技術的基盤の基礎を成すものである。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
数多くの感染性疾患及び癌には、効率の良い療法が欠如している。モノクローナル抗体認識からの免疫学的回避をひき起こす複合標的の可変性および標的タンパク質の適応突然変異を一部の原因として、モノクローナル抗体はこれらの標的に対して一般に成功をおさめていない。一方、ポリクローナル抗体は、例えばウイルス又は癌細胞上で複数の動的標的をターゲティングすることができる。同様に、ポリクローナル抗体は、抗原突然変異の場合に活性を保持する最高の確率を有している。
【０００３】
１）正常なヒト供与体の血液から単離した正常なヒト免疫グロブリン；２）以前に感染症又はワクチン接種のいずれかを通して遭遇した例えばウイルスなどの特定の疾病標的に対する抗体を担持する個別ヒト供与体の血液に由来するヒト超免疫性免疫グロブリン；及び３）免疫化された動物の血液に由来する動物の超免疫性免疫グロブリンを含めた、市販のさまざまなポリクローナル抗体療法が存在している。
【０００４】
ヒトの血液から精製された免疫グロブリンが、Ｂ型肝炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス及びその他のヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ボツリヌス毒素などの感染に対して、ならびに新生児アカゲザルＤ予防において、有効であることが証明されてきた。ヒトＴ細胞で免疫化されたウサギの血液から精製された免疫グロブリンが、移植片拒絶反応の治療又は予防においてＴ細胞免疫抑制を提供するために使用される（例えばサイモグロブリン）。免疫不全症患者の免疫系をブーストするためならびにさまざまな自己免疫障害の療法において、正常なヒト免疫グロブリンが利用されてきた。
【０００５】
それでも、供与体の血液原材料の供給に制約があること、バッチ間のバラつきに関する問題及び安全性の可変性に起因して、免疫グロブリンを広く使用することは制限されてきた。特に動物由来の免疫グロブリンは、１９８０年代及び１９９０年代に動物由来のモノクローナル抗体について見られたものと同じ免疫原性の問題に直面している。
【０００６】
最後に、その他の血液製品の場合と同様、ＨＩＶ、ヘルペス又は肝炎ウイルス又はプリオンといったような感染物質の伝染の危険性が残っている。従って、臨床医は、ポリクローナル抗体が一部の状況において好ましい療法であることを認めているものの、その使用は、きわめて制限されてきた。
【０００７】
遺伝子導入動物技術と共に、ヒト免疫グロブリンを生成する新しいアプローチが現われた。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を担持する遺伝子導入マウスが、作り出された（特許文献１）。これらのマウスは、完全ヒト免疫グロブリンを産生し、特異的標的に対する抗体は、通常の免疫化技術により発生させることができる。しかしながら、マウスのサイズが比較的小さいことから、より大量の抗体収量には制限がある。例えばウシ、ヒツジ、ウサギ及びニワトリといったようなさらに大型の動物も同様に遺伝子導入型にされてきた（非特許文献１）。しかしながら、かかる動物の血液から療法用のポリクローナル抗体を産生することには、複雑さが伴う。まず第１に、動物及びヒトの免疫生理は、著しい差異を示し、これが結果としての免疫レパートリ、機能的再配置及び抗体応答の多様性の差異をひき起こし得る。第２に、導入された免疫グロブリン遺伝子座の分裂不安定性が抗体の長期産生に影響を及ぼし得る。第３に、例えば動物抗体産生がヒト抗体の産生を上回らないように動物自身の免疫グロブリンを欠失させることは、技術的に難しいことである。第４に、ウイルス、プリオン又はその他の病原体といった感染物質の伝染の危険性が、動物の体内で産生されたヒト抗体の投与に随伴する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，１１１，１６６号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】クロイワ  Ｙ．（Ｋｕｒｏｉｗａ  Ｙ．）ら、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２００２；２０：８８９−８９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、安全な臨床用途を目的としてバッチ間のバラつきが最小限である状態で、充分大量に抗体といったような組換え型ポリクローナルタンパク質を産生するための製造技術に対する必要性が存在している。真核生物（特に哺乳動物）の発現細胞系統を用いて同型の組換え型タンパク質を製造するための効率の良い方法が、モノクローナル抗体、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、凝固因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸを含めたさまざまなタンパク質の産生のために開発されてきた。これらの技術の多くは、発現細胞系統のゲノム内への問題の遺伝子のトランスフェクション及び無作為組込み及びそれに続く高産生発現クローンの選択、増幅及び特徴づけ及びマスター発現細胞系統としてのこのクローンの増殖に基づいている。
【００１１】
挿入された外来性遺伝子の発現は、周囲のゲノミックＤＮＡからの「位置効果」によって影響されるかもしれない。数多くのケースにおいて、遺伝子は、位置効果が、導入された遺伝子の産物の合成を阻害するのに充分使い部位の中に挿入される。さらに、発現は、往々にして、周囲の染色体宿生ＤＮＡにより課せられるサイレンシングメカニズム（すなわちメチル化）に起因して不安定である。
【００１２】
特定のゲノム位置における哺乳動物細胞内の問題の遺伝子の組込み及び発現を可能にするシステムが、同型組換え型タンパク質組成物の発現のために開発されてきた（米国特許第４，９５９，３１７号明細書，米国特許第５，６５４，１８２号明細書，国際公開第９８／４１６４５号パンフレット，国際公開第０１／０７５７２号パンフレット）。国際公開第９８／４１６４５号パンフレットは、例えば抗体などを分泌する哺乳動物細胞系統の産生のための部位特異的組込みについて記載している。しかしながら、この発現はモノクローナルであり、ベクターライブラリーでトランスフェクションを実施できるという表示は全く存在しない。さらに、ライブラリー内の特異的ＶＨ−ＶＬ組合せにより生成された当初の多様性をいかに維持するかの示唆も全く存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ポリクローナルタンパク質を構成する個別成員の間での多大な偏向を回避する、組換え型ポリクローナルタンパク質の発現及び産生のための細胞系統の製造に関する解決法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、ポリクローナルタンパク質の産生において動物を利用せず、従って、かかるアプローチに付随する倫理的かつ臨床的問題点を未然に防いでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】以下の要素を含む「頭−頭プロモーター」発現ベクターの概略的表現：Ａｍｐ  ｐｒｏ＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を可能にするプロモーター。Ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子。ｐＵＣ  ｏｒｉｇｉｎ＝ｐＵＣ複製開始点。制限酵素部位：ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ。プロモーターＡ／プロモーターＢ＝リーダー配列（例えばＣＭＶ／ＭＰＳＶ）を含む頭−頭プロモーターカセット。Ｖ  Ｈｅａｖｙ＝ＧＯＩの可変重鎖についてコードする配列。Ｃ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ＝定常重鎖についてコードする配列（例えばマウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２Ｂ定常重鎖のための配列）。Ｒ−Ｂ−ｇｌｏｂｉｎ  ｐＡ＝ウサギ  β−グロビンｐｏｌｙ  Ａ配列。ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ＝ウシ成長ホルモンｐｏｌｙ  Ａ配列。Ｖ  Ｋａｐｐａ＝ＧＯＩの可変カッパについてコードする配列。Ｃ  Ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ＝定常カッパ鎖についてコードする配列。ＦＲＴ  ｓｉｔｅ＝ＦＲＴ組換え部位。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ＝ハイグロマイシン耐性用遺伝子。ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ＝ｐｏｌｙＡシグナル配列。
【図２】以下の要素を含む一方向発現用発現ベクターの概略的表現：Ａｍｐ  ｐｒｏ＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を可能にするプロモーター。Ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子。ｐＵＣ  ｏｒｉ＝ｐＵＣ複製開始点。プロモーターＡ＝リーダー配列（例えばＡｄＭＬＰ）を含む哺乳動物プロモーター。Ｖ  Ｈｅａｖｙ＝ＧＯＩの可変重鎖についてコードする配列。Ｃ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ＝定常重鎖についてコードする配列（例えばマウスＩｇＧ１定常重鎖のための配列）。ｈＧＨｐｏｌｙＡ＝ヒト成長ホルモンｐｏｌｙ  Ａ配列。ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ＝ウシ成長ホルモンｐｏｌｙ  Ａ配列。ＶＫａｐｐａ＝ＧＯＩの可変カッパ重鎖についてコードする配列。Ｃ  Ｋａｐｐａ＝定常カッパ鎖についてコードする配列。ＦＲＴ＝ＦＲＴ組換え部位。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ＝ハイグロマイシン耐性用遺伝子。ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ＝ｐｏｌｙＡシグナル配列。ｈＧＨｐｏｌｙＡ及びプロモーターＡの配列は、ＩＲＥＳ構造によって置換され得る。
【図３】組換え型ポリクローナル製造細胞系統の生成及び組換え型ポリクローナルタンパク質の産生を概略的に示す流れ図。１）バルクトランスフェクション戦略を例示する；２）半バルクトランスフェクション戦略を例示する、及び３）個別トランスフェクション戦略を例示する。Ａ）  ベクターライブラリー（水平ライン）を例示し、矢印の頭はベクターのグループ化を例示する。戦略１では、ベクターは、バルク状にグループ化され、戦略２では、より小さい画分（半バルク）にグループ化され、一方戦略３では、これらは互いに別々に保たれる（個別）。Ｂ）は、トランスフェクションを例示しており、ここでチューブの数は、ライブラリーを構成するベクターのグループ化により左右される。Ｃ）はＧＯＩを宿主細胞ゲニム内に部位特異的に組込んだ細胞の選択を例示し、Ｄ）は、ポリクローナルＧＯＩライブラリーストックの生成を例示しており、ここで組込まれたライブラリーを構成する選択された細胞はフリーザーの中に保存されている。任意には、個別クローンを貯蔵するか又はクローンをプールする。Ｅ）は製造段階の始まりを例示しており、ここでストックからのクローンは（個別により小さい画分からか又はプールから）解凍され、懸濁状態での成長に適合させられる。無血清培地に対する適応は、選択段の後又はこの段において実施可能である。Ｆ）は、より大きい生物反応器の播種のためにポリクローナル細胞系統が増殖させられる、生産内の段を例示している。（中間播種ステップは、例示されていないものの１つのオプションである）。戦略２及び３では、これは、ポリクローナル細胞クローンストックがもはや個別クローン又は半バルク画分として保たれず、細胞収集物内にプールされて組換え型ポリクローナル製造細胞系統を形成する段である。Ｇ）は、生物反応器製造から得られた最終的生産を例示する。生産段階の後、ポリクローナルタンパク質組成物は、産物の精製及び特徴づけのために収獲される。
【図４】哺乳動物発現ベクターの生成を例示する流れ図。（Ａ）  ＧＯＩの一成員をコードする配列を担持するファージミドベクターｐＳｙｍｖｃ１０の概略的表現。Ｐ  ｔａｃ及びＰ  ｌａｃＺ＝細菌頭−頭プロモーターカセット。Ｖ  ｋａｐｐａ＝ＧＯＩの可変カッパ軽鎖をコードする配列。Ｃ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ＝マウス定常カッパ軽鎖についてコードする配列。Ｖ  ｈｅａｖｙ＝ＧＯＩの可変重鎖についてコードする配列。Ｃ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ＝定常重鎖ＣＨ１ドメインについてコードする配列。制限酵素部位：ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩ。ｃｐＩＩＩ＝ファージタンパク質ＩＩＩ。Ａｍｐ  ｐｒｏ＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を可能にするプロモーター。Ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子。ｐＵＣ  Ｏｒｉ＝ｐＵＣ複製開始点。ステップ１：  ＳａｃＩおよびＸｈｏＩでの制限消化により、細菌プロモーターカセットは、ｐＳｙｍｖｃ１０から切除され得、かつ連結により同じくＳａｃＩ及びＸｈｏＩでの制限消化によって調製された哺乳動物のプロモーターカセット（Ｂ）と置換され得る。（Ｃ）哺乳動物頭−頭プロモーターカセットでのプロモーター交換の後の、ＧＯＩからの配列を担持するファージミドベクターｐＳｙｍｖｃ１２の概略的表現。プロモーターＡ／プロモーターＢ＝選択した選択−選択プロモーターカセット（例えばＣＭＶ／ＭＰＳＶ。Ｖｋａｐｐａ＝ＧＯＩの可変カッパ軽鎖についてコードする配列。Ｃ  Ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ＝マウス定常カッパ鎖についてコードする配列。Ｖ  ｈｅａｖｙ＝ＧＯＩの可変重鎖についてコードする配列。Ｃ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ＝定常重鎖ＣＨ１ドメインについてコードする配列。制限酵素部位：ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ。ｃｐＩＩＩ＝ファージタンパク質ＩＩＩ。Ａｍｐ  ｐｒｏ＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を可能にするプロモーター。Ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子。ｐＵＣ  Ｏｒｉ＝ｐＵＣ複製開始点。ステップ２：  ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩでのｐＳｙｍｖｃ１２の制限消化により、カッパ、プロモーターカセット及びＶｈｅａｖｙの全体を含有する核酸フラグメントを、ｐＳｙｍｖｃ１２から切除し、同じくＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩでの制限消化により調製されたｐＳｙｍｖｃ２０といったイソタイプコーディングベクター内に連結させ、かくして哺乳動物発現ベクター  ｐＳｙｍｖｃ２１（Ｅ）を生成することができる。（Ｅ）抗体発現のための、ＧＯＩからの可変重及びカッパ領域を伴う、哺乳動物発現ベクターｐＳｙｍｖｃ２１の概略的表現。この哺乳動物発現ベクターは、以下の要素を含んでいる：Ａｍｐ  ｐｒｏ＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を可能にするプロモーター。Ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子。ｐＵＣ  Ｏｒｉ＝ｐＵＣ複製開始点。制限酵素部位：ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ。プロモーターＡ／プロモーターＢ＝選択した頭−頭プロモーターカセット（例えばＣＭＶ／ＭＰＳＶ）。Ｖ  ｋａｐｐａ＝ＧＯＩの可変カッパ軽鎖についてコードするＶカッパ配列。Ｃ  Ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ＝哺乳動物定常カッパ鎖についてコードする、配列。（例えば、マウス定常カッパ鎖）。Ｖ  ｈｅａｖｙ＝ＧＯＩの可変重鎖についてコードするＶ重配列。Ｃ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ��哺乳動物定常重鎖についてコードする配列（例えばマウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２Ｂ定常重鎖のための配列）。Ｒ−Ｂ−ｇｌｏｂｉｎ  ｐＡ＝ウサギβ−グロビンｐｏｌｙＡ配列。ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ＝ウシ成長ホルモンｐｏｌｙｌＡ配列。ＦＲＴ  ｓｉｔｅ＝ＦＲＴ組換え部位。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ＝ハイグロマイシン耐性用遺伝子。ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ＝ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列配列。当然のことながら、ステップ１及び２の順序は、カッパ、細菌プロモーターカセット及びＶｈｅａｖｙの全体を含有するｍＳｙｍｖｃ１０からのフラグメントが、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限消化を用いてｐＳｙｍｃ１０から切除され得、これが次に例えば、ｐＳｙｍｖｃ２０といったイソタイプコーディングベクター内に連結され得るような形で、逆転可能である。このときプロモーター交換は、例えば図４Ｂのように、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩを用いた制限消化物及びＳａｃＩ＋ＸｈｏＩで消化された哺乳動物プロモーターカセットフラグメントとの連結により、ｐＳｙｍｖｃ２０上で実施することができる。
【図５】プラスミド調製物１で形質転換されたＴＧ１細胞内の遺伝子型分布を示すヒストグラム。Ｅｍ２２３−２２８というのは、それぞれ、抗−β２−ミクログロブリン（抗・Ｂ２Ｍ）、抗−アルカリホスフェート（抗−ＡＰ）、抗−オボアルブミン（抗−ＯＶＡ）、抗−因子ＶＩＩＩ（抗−ＦＶＩＩＩ）、抗−リゾチーム（抗−ＬＹＳ）、抗−ハプトグロビン（抗−ＨＡＰ）をコードする細菌プロモーターを伴うベクターを意味する。Ｅｍ２２３〜２２８は、ｐＳｙｍｖｃ１０タイプのベクターである。ＲＦＬＰにより決定されたフラグメントパターンに類似する個別遺伝子型の数は、採集されたコロニーの合計数のうちの個別コロニーの数に対応する。
【図６】プラスミド調製物２で形質転換されたＴＧ１細胞内の遺伝子型分布を示すヒストグラム。Ｅｍ２２９−２３４というのは、それぞれ、抗−β２−ミクログロブリン（抗−Ｂ２Ｍ）、抗−アルカリホスフェート（抗−ＡＰ）、抗−オボアルブミン（抗−ＯＶＡ）、抗−因子ＶＩＩＩ（抗−ＦＶＩＩＩ）、抗−リゾチーム（抗−ＬＹＳ）、抗−ハプトグロビン（抗−ＨＡＰ）をコードする哺乳動物プロモーター（ＣＭＶ／ＭＰＳＶ）を伴うベクターを意味する。Ｅｍ２２９〜２３４は、ｐＳｙｍｖｃ１２タイプのベクターである。クローンの数は、そのＥｍタイプのＲＦＬＰにより決定された配列パターンと類似する観察されたクローンの数を表わしている。（完全な配列分析は実行されなかった。）
【図７】プラスミド調製物３で形質転換されたＴＧ１細胞内の遺伝子型分布を示すヒストグラム。Ｅｍ２３５−２４０というのは、それぞれ、抗−β２−ミクログロブリン（抗−Ｂ２Ｍ）、抗−アルカリホスフェート（抗−ＡＰ）、抗−オボアルブミン（抗−ＯＶＡ）、抗−因子ＶＩＩＩ（抗−ＦＶＩＩＩ）、抗−リゾチーム（抗−ＬＹＳ）、抗−ハプトグロビン（抗−ＨＡＰ）をコードする（ウサギβ−グロビンｐｏｌｙＡシグナルを含む）マウスＩｇＧ１哺乳動物発現ベクターを意味する。Ｅｍ２３５〜２４０は、ｐＳｙｍｖｃ２１タイプのベクターである。クローンの数は、そのＥｍタイプのＲＦＬＰにより決定された配列パターンと類似する観察されたクローンの数を表わしている。（完全な配列分析は実行されなかった。）
【図８】２重消化／連結プラスミド調製物で形質転換されたＴＧ１細胞内の遺伝子型分布を示すヒストグラム（プラスミド調製物１ステップの後のＥ．ｃｏｌｉ中でのＤＮＡ増幅の無い哺乳動物発現ベクター内への大量移送）。
【図９】トランスフェクション後  Ａ）１６日目及びＢ）３４日目の６つの問題の遺伝子をコードする哺乳動物発現ベクターの混合物でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞内での遺伝子型分布を示すヒストグラム。
【図１０】６つの問題の遺伝子をコードする発現ベクターの混合物でのバルクトランスフェクションの後３４日目のＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞から誘導された上清の抗原特異的ＥＬＩＳＡ。
【図１１】１つの問題の遺伝子をコードする単一の発現ベクター又は６つの問題の遺伝子をコードする発現ベクターの混合物のいずれかでのトランスフェクション後３４日目のＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞のプールから誘導された上清の抗カッパコートＥＬＩＳＡ。
【図１２】６つの問題の遺伝子をコードする発現ベクターの混合物でのバルクトランスフェクション後１７日目、３１日目、４５日目、５９日目及び７３日目におけるＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎクローン０１９から誘導された上清の定量的抗原特異的ＥＬＩＳＡ。Ａ、Ｂ及びＣは、３つの異なるトランスフェクション実験を表わす。
【図１３】ミニ−シックスライブラリーの個別成員を発現するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞系統を混合物した後、８、１７、３０、４５、５７、７２及び８５日目におけるＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ  細胞培養から誘導された上清の抗原特異的ＥＬＩＳＡ。結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、免疫グロブリンスーパーファミリーの中から往々にして選択される組換え型ポリクローナルタンパク質の産生のための組換え型ポリクローナル製造細胞系統を産生する方法を提供する。特にポリクローナル抗体、ポリクローナルＴ細胞レセプタ又はそのポリクローナルフラグメントが問題となっている。本発明は、医薬組成物中で使用するための組換え型ポリクローナルタンパク質の商業的生産を可能にする。本発明の１つの重要な特長は、製造プロセス中に、ポリクローナルタンパク質を構成する個別分子の偏向した発現が、有意でないレベルに保たれ、望ましくないバッチ間のバラつきを最小限におさえるという点にある。
【００１７】
本発明の１つの態様は、問題の細胞組換え型ポリクローナルタンパク質の製造方法であって、前記ポリクローナルタンパク質が、特定の抗原を結合させる別個の成員を含んで（又は構成して）おり、ａ）変異体核酸配列のライブラリーを含む細胞収集物を提供する段階であって、前記核酸配列の各々が前記ポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードし、前記核酸配列の各々が前記細胞収集物内の各々個別の細胞のゲノムの同じ単一の部位にて組込まれている、段階；ｂ）前記ポリクローナルタンパク質の発現を容易にする条件の下で、前記細胞収集物を培養する段階；及びｃ）細胞培養、細胞画分又は細胞培地から前記発現されたポリクローナルタンパク質を回収する段階、を含む方法に関する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、組換え型ポリクローナル製造細胞系統として適切な細胞の収集物を生成するための方法であって、ａ）変異体核酸配列の集合を含むベクターライブラリーを提供する段階であって、前記ベクターの各々が１）特定の抗原を結合させる別個の成員を含む（又はそれで構成されている）ポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードする別個の核酸配列の１つの単一コピー、及び２）１つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含んでいる、段階；ｂ）宿主細胞系統内に前記ベクターライブラリーを導入する段階であって、前記宿主細胞系統の各々の個別細胞のゲノムが、そのゲノム内の単一の特異的部位で前記ベクターものと整合するリコンビナーゼ認識配列を含んでいる、段階；ｃ）段階（ａ）の変異体核酸配列が宿主細胞系統の細胞内で部位特異的に組込まれるような形で１つ以上のリコンビナーゼの前記細胞内での存在を保証する段階であって、ここで、前記１つ以上のリコンビナーゼは、ｉ）前記核酸配列が中に導入される前記細胞により発現されるか；（ｉｉ）段階ａのベクターにより操作可能な形でコードされるか；ｉｉｉ）第２のベクターから発現を通して提供されるか；又はｉｖ）１つのタンパク質として細胞に提供されるかのいずれかである、段階；及びｄ）変異体核酸配列の前記ライブラリーから、組込まれたコピーを含む細胞を選択する段階、を含む方法に関する。
【００１９】
本発明の両方の方法において、ポリクローナルタンパク質は通常、発現がもたらされる細胞と天然に会合させられていないポリクローナルタンパク質であるということが理解されるだろう。
【００２０】
本発明は、ポリクローナル製造細胞系統として適した細胞収集物を生成するべく宿主細胞系統内に変異体核酸配列のライブラリーを導入できる複数の方法を記載する。これらの方法には、ライブラリーでの細胞収集物のバルクトランスフェクション、ライブラリーの画分での細胞アリコットの半バルクトランスフェクション又は、選択時点で生成されたクローンをプールすることが後続する、ライブラリーの個別成員で宿主細胞がトランスフェクションされる個別のトランスフェクション、が含まれる。好ましくは、本発明は哺乳動物細胞（細胞系統又は細胞型）を宿主細胞系統として利用する。
【００２１】
本発明の１つの態様においては、ポリクローナルタンパク質の個別成員は、独立した遺伝子セグメントの対からコードされる。個別の成員が２つのポリペプチド鎖から成っているポリクローナルタンパク質は、可溶性又は膜結合形態の抗体及びＴ細胞レセプタを含む。本発明のさらなる実施形態においては、遺伝子セグメント対は、抗体重鎖及び軽鎖可変領域又は、Ｔ細胞レセプタアルファ鎖及びベータ鎖可変領域又はＴ細胞レセプタガンマ鎖及びデルタ鎖可変領域をコードする。
【００２２】
本発明はさらに、変異体核酸配列ライブラリーでトランスフェクションされた細胞収集物を含む組換え型ポリクローナル産生細胞系統であって、収集物中の各々の細胞が、特定の抗原を結合させるポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードし、かつ前記収集物内の個別の細胞のゲノム内で同じ単一の部位にあるライブラリーの１成員でトランスフェクションされこの成員を発現する能力を有しており、記核酸配列が収集物中の前記細胞と天然に会合されていない組換え型ポリクローナル製造細胞系統を提供する。細胞系統は好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えばＳｐ２／０細胞、ＮＳ０）、ＹＢ２／０、ＮＩＨ３Ｔ３、線維芽細胞又はＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６といったような不死化されたヒト細胞といった哺乳動物細胞系統に由来している。しかしながら、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌、真菌などの哺乳動物でない真核生物又は原核生物細胞も使用可能である。
【００２３】
同様に本発明に包含されているのは、天然に発生する変異体核酸配列の集合を含む部位特異的組込み用ベクターライブラリーであって、前記ベクターの各々が、１）特定の抗原を結合させるポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードする別個の核酸配列の１つのコピー、及び２）１つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含んでいる、ベクターライブラリーである。
【００２４】
もう１つの態様においては、本発明は、活性成分として、好ましくは本発明の方法によって得られた組換え型ポリクローナル抗体（又はそのフラグメント）又はポリクローナルＴ細胞レセプタ（又はそのフラグメント）を含む医薬組成物を提供する。該組成物の組換え型ポリクローナルタンパク質は、予め定められた疾病標的について特異的であるか又はこれに対して反応性を有する。かかる医薬組成物は、ヒト、家畜又はペットといった哺乳動物における、癌、感染症、炎症性疾患、アレルギー、喘息又はその他の呼吸器疾患、自己免疫疾患、免疫機能不良、心臓血管疾患、中枢神経系疾患、代謝及び内分泌疾患、移植片拒絶反応又は望まれない妊娠といった疾病の治療、改善又は予防のために使用可能である。
【００２５】
定義
「タンパク質」又は「ポリペプチド」というのは、長さ又は翻訳後の修飾の如何に関わらず、あらゆるアミノ酸鎖を意味する。タンパク質は、２つ以上の組合わされたポリペプチド鎖、タンパク質フラグメント、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドを含む単量体又は多量体として存在し得る。
【００２６】
本書で使用されているように、「ポリクローナルタンパク質」又は「ポリクローナル性」という語は、好ましくは免疫グロブリンスーパーファミリーから選択された異なる、ただし相同のタンパク質分子を含むタンパク質組成物を意味する。かくして各々のタンパク質分子は、該組成物のもう１つの分子と相同であるものの、同様に、ポリクローナルタンパク質の個別成員の間のアミノ酸配列の差異によって特徴づけされる１つ以上の可変的ポリペプチド配列のストレッチをも含む。かかるポリクローナルタンパク質の既知の例としては、抗体又は免疫グロブリン分子、Ｔ細胞レセプタ及びＢ細胞レセプタが含まれる。ポリクローナルタンパク質は、例えば所望の標的抗原に対するポリクローナルタンパク質の場合には所望の標的に向かっての共有の結合活性といったような共通の特長により定義されてきた、明確なタンパク質分子サブセットで構成されていてよい。
【００２７】
「問題のポリクローナルタンパク質」という語は、例えば別々のタンパク質、微生物、寄生虫、細胞型、アレルゲン、又は炭水化物分子又は特異的抗体結合の標的となり得るその他のあらゆる構造、分子又は物質のうちの１つ以上のもの又は前記抗原の混合物である標的抗原に対する結合活性又は特異性によって表現されるポリクローナル抗体の場合において、所望の標的に向かう結合特性などといった共通の特徴を共有する明確なポリクローナルタンパク質サブセットを網羅する。
【００２８】
「組換え型ポリクローナルタンパク質組成物の一成員」又は「組換え型ポリクローナルタンパク質の一成員」という語は、各々のタンパク質分子が組成物のもう一方の分子と相同であるがポリクローナルタンパク質の個別成員の間のアミノ酸配列の差異により特徴づけされる１つ以上の可変的ポリペプチド配列のストレッチをも内含している、異なるが相同なタンパク質分子を含むタンパク質組成物の１つのタンパク質分子を意味している。
【００２９】
「可変ポリペプチド配列」及び「可変領域」という語は、互換的に使用される。
【００３０】
「組換え型ポリクローナルタンパク質の別個の成員」という語は、各々のタンパク質分子が組成物のもう一方の分子と相同であるもがポリクローナルタンパク質の個別成員の間のアミノ酸配列の差異により特徴づけされる１つ以上の可変的ポリペプチド配列のストレッチをも内含している、異なるが相同なタンパク質分子を含むタンパク質組成物の１つのタンパク質分子を意味している。
【００３１】
「抗体」という語は、血清の１つの機能的成分を表わし、往々にして１つの分子収集物（抗体又は免疫グロブリン）又は１分子（抗体分子又は免疫グロブリン分子）のいずれかに関連する。抗体分子は、それ自体免疫学的エフェクタメカニズムの誘発を導き得る特異的抗原決定基（抗原又は抗原エピトープ）に対し結合するか又はそれと反応する能力をもつ。個別の抗体分子は通常単一特異的であり、抗体分子の組成物は、モノクローナル（すなわち同一の抗体分子から成る）又はポリクローナル（すなわち同じ抗原上又さらには別個の抗原上でさえ同じ又は異なるエピトープと反応する異なる抗体分子から成る）であり得る。各々の抗体分子は、その対応する抗原に特異的に結合できるようにする独特の構造を有しており、全ての天然の抗体分子は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖の同じ全体的基本構造を有している。抗体は同様に、集合的に免疫グロブリンとしても知られている。本書で用いられている抗体（単数又は複数）という語は、同様に、キメラ又は一本鎖抗体ならびにＦａｂ、Ｆｖフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントといったような抗体の結合フラグメント、ならびに２量体ＩｇＡ分子又は五価のＩｇＭといったような多量体形態を内含するべく意図されている。
【００３２】
「ポリクローナル抗体」という語は、同じ又は異なる抗原上の複数の異なる特異的抗原決定基に結合するか又はそれと反応する能力をもつ異なる抗体分子の組成物を表現する。通常は、ポリクローナル抗体の可変性は、そのポリクローナル抗体のいわゆる可変領域内に位置設定されるものと考えられている。しかしながら、本発明の情況下においては、ポリクローナル性は、同様に、例えばヒトイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２、又はマウスイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＡといったような２つ以上の抗体イソタイプを含む抗体混合物の場合のように、いわゆる定常領域内に常在する個別抗体分子の間の差異を表現するものとしても理解され得る。
【００３３】
「問題の組換え型ポリクローナル抗体」というのは、１つの所望の標的又は標的セットに結合する能力により特徴づけされ、前記標的が例えば別々のタンパク質、微生物、寄生虫、細胞、アレルゲン又は炭水化物分子又は、特異的抗体結合の標的でありうるもう１つの構造、分子又は基質又はそれらの混合物である、明確な組換え型ポリクローナルタンパク質サブセットを表わす。
【００３４】
「免疫グロブリン」という語は、一般的には、血液又は血清中に発見される抗体の混合物の集合的呼称として用いられるが、その他の供給源から誘導された抗体の混合物を呼称するためにも使用し得る。
【００３５】
「免疫グロブリン分子」という語は、例えば免疫グロブリンの一部分又は任意のポリクローナル又はモノクローナル抗体組成物の一部分としての個別抗体分子を表わす。
【００３６】
１つのポリクローナルタンパク質の一成員が１つの抗原に結合すると言う場合、それは本書では、１ｍＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、さらに一層好ましくは１０ｎＭ未満の結合定数を有する結合を意味する。
【００３７】
「問題の変異体核酸分子のライブラリー」という語は、「問題の組換え型ポリクローナルタンパク質」を集合的にコードする核酸分子の収集物を表現するために使用される。トランスフェクションのために用いられる場合、問題の変異体核酸分子ライブラリーは、発現ベクターのライブラリー内に含まれている。かかるライブラリーは標準的に、少なくとも３、５、１０、２０、５０、１０００、１０４、１０５又は１０６個の別個の成員を有する。
【００３８】
本書で使用する場合の「問題の別個の核酸配列の１つのコピー」は、文字通り単一の遺伝子セグメントに対応する核酸の単一のストレッチとしてではなくむしろ、問題のタンパク質の１つの分子の全てのサブユニットを産生するために必要とされ例えばベクターといった１つの核酸分子の形に組立てられた全ての遺伝子セグメントの１つのコピーとして考えられるべきである。問題のタンパク質の完全な分子を発生させるのに通常複数の遺伝子セグメントが必要とされるいくつかの例としては、Ｂ細胞レセプタ、抗体及び、Ｆａｂの及び可変ドメイン又はＴ細胞レセプタといったような抗体フラグメントが含まれる。細胞内に導入された場合、問題の完全に組立てられたタンパク質を共にコードする遺伝子セグメントは同じベクター内に常在し、かくして、場合によっては異なるプロモーターの制御下での別々の転写要素として、１つの核酸配列内で一緒にリンクされる。
【００３９】
本書で使用される場合の「問題の遺伝子」という語は、問題のタンパク質の１つの成員をコードする１つ以上の遺伝子セグメント（ゲノム又はｃＤＮＡ）で構成された核酸配列を意味する。複数形態の「問題の遺伝子」は、１つの問題のポリクローナルタンパク質をコードする核酸配列のライブラリーを意味する。「ＧＯＩ」という語は、（ａ）問題の遺伝子（単複）の略号として用いられる。
【００４０】
本書で使用されているように、「ベクター」という語は、異なる遺伝的環境の間での輸送及び／又は宿主細胞内での発現のために核酸配列を挿入できる核酸分子を意味している。ゲノム内の予め定められた特異的遺伝子座において宿主細胞のゲノム内への組込みを行う能力をもつベクターが、本書で「部位特異的組込み用ベクター」と名付けられる。ベクターがその中に挿入された核酸配列の転写用の調節要素を担持している場合（少なくとも１つの適切なプロモーター）、該ベクターは本書では「発現ベクター」と呼ばれる。発現ベクターが宿主細胞のゲノム内で予め定められた特異的遺伝子座に組込む能力を有する場合、該発現ベクターを「部位特異的組込み用の発現ベクター」と呼んでもよい。上述の同定されたベクター内に挿入された核酸配列が本書で定義されている通りの問題のタンパク質をコードする場合、「問題のベクター」、「部位特異的組換え用の問題のベクター」、「問題の発現ベクター」及び「部位特異的組込み用の問題の発現ベクター」といった語が用いられる。「イソタイプコーディングベクター」という語は、抗体イソタイプをコードする核酸配列を担持するベクターを意味する。本明細書では、「ファージミドベクター」及び「ファージベクター」が互換的に用いられる。「プラスミド」及び「ベクター」という語は、互換的に用いられる。本発明は、適切な宿主内の所望のタンパク質の産生を導くことのできる任意の核酸分子又はプラスミド、ファージミド及びウイルスゲノムといった、同等の機能に用いられるその他の形態のベクターを内含するように意図されている。
【００４１】
核酸配列が問題の組換え型ポリクローナルタンパク質についてコードする、問題のベクターライブラリーから誘導された別個の核酸配列を伴う個別ベクター分子を表現するために、「問題のベクターライブラリーの各成員」という語が用いられる。
【００４２】
「大量移送」という語は、１つのベクター集団からもう１つのベクター集団まで問題の核酸配列を移送することそして、個別問題のＤＮＡの単離を行わずに同時に各々のＤＮＡについてそれを行なうことを表現するために用いられる。かかるベクター集団は、例えば問題の可変領域、プロモーター、リーダー又は増強要素を含有するライブラリーであり得る。これらの配列はこのとき、例えばファージベクターから哺乳動物の発現ベクターへと、先行する単離を伴わずに移動され得る。特に抗体配列について、この技術は、例えば選択ベクター（例えばファージ提示ベクター）から哺乳動物発現ベクターへとライブラリーを移動させる間にＶＨとＶＬの多様性の間のリンケージが失われないよう保証している。かくして、ＶＨとＶＬの当初の対合が保持される。
【００４３】
「トランスフェクション」という語は、ここでは、１つの細胞内に外来性ＤＮＡを導入するための広義の語として用いられる。この語は同様に、供与体細胞及び受容体細胞の融合、形質転換、感染、形質導入などといったような１つの細胞内へと外来性ＤＮＡを導入するその他の機能的に同等の方法を網羅するように意図されている。
【００４４】
「選択」という語は、細胞が或る特性を獲得した場合にその特性を獲得していない細胞からの単離を可能にする方法を表現するために用いられる。かかる特性は、細胞毒性薬に対する耐性又は必須栄養素、酵素又は色の生成であり得る。
【００４５】
「選択可能なマーカー遺伝子」、「選択マーカー遺伝子」、「選択遺伝子」及び「マーカー遺伝子」という語は、問題の遺伝子（単複）と合わせて細胞内に同時導入される選択可能マーカーをコードする遺伝子（例えば、或る種の抗生物質といったような一部の細胞毒性薬に対する耐性を付与する遺伝子、成長培地から枯渇され得る必須栄養素を産生する能力をもつ遺伝子、分析可能な代謝産物を産生する酵素をコードする遺伝子又は、例えばＦＡＣＳにより選別され得る着色タンパク質をコードする遺伝子）を表現するべく使用される。
【００４６】
「組換え型タンパク質」という語は、該タンパク質のコーディング配列を含む発現ベクターでのトランスフェクションを受けた細胞系統から発現されるタンパク質を表現するために使用される。
【００４７】
本書で使用されているように、「作動可能に連結された」という語は、その他のセグメントと機能的関係に置かれた場合のもう１つのセグメントにリンクされているセグメントを意味する。例えば、シグナル配列をコードするＤＮＡは、それが小胞体に対するポリペプチドの移送に参加するリーダーとして発現された場合にポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能な形でリンクされている。同様に、プロモーター又はエンハンサは、それがその配列の転写を刺激する場合に、コーディング配列に対し操作可能な形でリンクされている。
【００４８】
「個々の細胞の大部分」という語は、８０％を超える、好ましくは８５％を超える、より好ましくは９０％、９５％さらには９９％以上といったような細胞の百分率を意味している。
【００４９】
本書で使用されているように、「ゲノム」という語は、当初細胞内に存在する染色体の正常な補体として文字通り解釈されるべきではなく、細胞内に導入され維持され得る外部染色体要素でもある。かかる外部染色体要素は、制限的な意味なく、ミニ染色体、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＭＡＣ（マウス人工染色体）又はＨＡＣ（ヒト人工染色体）を含むことができる。
【００５０】
「プロモーター」という語は、転写を開始するためＲＮＡポリメラーゼを結合することに関与するＤＮＡの領域を意味する。
【００５１】
「頭−頭（head-to-head）プロモーター」という語は、プロモーターにより駆動される２つの遺伝子フラグメントの転写が反対方向に発生するような形で、近接してプロモーター対が置かれていることを意味する。頭−頭プロモーターは、２つのプロモーターの間に無関係な核酸から成る詰込みを伴ってでも構成され得る。かかる詰込みフラグメントは、５００を超えるヌクレオチドを難なく含むことができる。
【００５２】
「抗生物質耐性遺伝子」というのは、抗生物質の存在下で細胞の存続及び増殖の続行を確保し、細胞に対し抗生物質が有する阻害性又は毒性効果を克服できるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００５３】
「内部リボソーム進入部位」又は「ＩＲＥＳ」という語は、ｍＲＮＡ上の正常な５′−ｃａｐ構造とは異なる構造を表現している。両方の構造共、翻訳を開始するべくＡＵＧコドンについての走査を開始するためにリボソームにより認識され得る。１つのプロモーター配列及び２つの開始ＡＵＧを用いることにより、単一のｍＲＮＡから第１のおよび第２のポリペプチド配列を翻訳することができる。かくして、単一の２−シストロンｍＲＮＡからの第１及び第２のポリヌクレオチド配列の同時翻訳を可能にするため、ＩＲＥＳ配列の下流側のポリヌクレオチド配列の翻訳を可能にするＩＲＥＳ配列を含むリンカー配列を介して、第１及び第２のポリヌクレオチド配列を転写的に融合させることができる。この場合、転写されたバイシストロンＲＮＡ分子は、キャッピングされた５′末端及びバイシストロンＲＮＡ分子の内部ＩＲＥＳ配列の両方から翻訳され、かくして第１及び第２の両方のポリペプチドを産生することになる。
【００５４】
「誘発可能な発現」という語は、発現が起こるためには誘発因子分子またはコリプレッサー分子および調節タンパク質の相互作用を要する発現を記載するのに用いる。
【００５５】
「構成性発現」という語は、通常誘発可能でない発現を意味している。
【００５６】
「リコンビナーゼ」という語は、２つ以上の組換え部位の間の組換えの触媒として作用する酵素を意味する。本発明において有用であるリコンビナーゼは、特定のリコンビナーゼにより認識される特異的な核酸配列である特異的組換え部位における組換えの触媒として作用する。
【００５７】
「スクランブルリング」という語は、例えば免疫グロブリンスーパーファミリーからの２つの異なるポリペプチド鎖を含むポリクローナルタンパク質の２つ以上の別個の成員が個別細胞から発現される状況を表現している。この状況は、各遺伝子セグメント対がポリクローナルタンパク質の別個の１つの成員をコードする複数の遺伝子セグメント対をゲノム内に組込んだときに発生する。かかる状況下では、遺伝子セグメントから発現されたポリペプチド鎖の意図されていない組合せが行なわれる可能性がある。これらのポリペプチド鎖の意図されていない組合せは、いかなる治療上の効果ももたない可能性がある。
【００５８】
「ＶＨ−ＶＬ鎖スクランブリング」という語は、上述のスクランブリングの一例である。この例では、ＶＨ及びＶＬコーディング遺伝子は、１つの遺伝子セグメント対を構成している。該スクランブリングは、２つの異なるＶＨ及びＶＬコーディング遺伝子セグメント対が同じ細胞内に組込まれている細胞からＶＨ及びＶＬポリペプチドの意図されていない組合せが生み出されるときに発生する。かかるスクランブリングを受けた抗体分子は、当初の特異性を保持する確率が低く、かくして、いかなる治療的効果ももたない可能性がある。
【００５９】
「組換え型ポリクローナル製造細胞系統」という語は、一緒に組換え型ポリクローナル製造細胞系統を構成する個別細胞が、問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の一成員をコードする問題の別個の核酸配列の１つのコピーのみを担持し、かつ各コピーが各細胞のゲノムの同じ部位内に組込まれるように問題の変異体核酸配列のライブラリーでのトランスフェクションを受けるタンパク質発現細胞の集合を意味している。該組換え型ポリクローナル製造細胞系統を構成する細胞は、例えば抗生物質選択により問題の別個の核酸配列の組込まれたコピーを保持するその能力のために選択される。かかる製造細胞系統を構成し得る細胞は、例えば細菌、真菌、真核細胞例えば酵母、昆虫細胞又は哺乳動物細胞、特に不死哺乳動物細胞系統、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えばＳｐ２／Ｏ細胞、ＮＳ０）、ＮＩＨ３Ｔ３、ＹＢ２／０及び不死化ヒト細胞例えばＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３  細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６であり得る。
【００６０】
「ホットスポット細胞系統」内にあるような「ホットスポット」という語は、その部位内への発現ベクターの組込み時点で選択又は生成され、問題の組込まれた核酸配列のきわめて効率の良い転写について特徴づけされた細胞のゲノムの予め確立された遺伝子座を意味している。
【００６１】
「偏向」という語は、無作為の遺伝子突然変異、個別細胞間の増殖反応速度差、異なる発現構築物配列の間の発現レベル差又はＤＮＡのクローニング効率の差に起因してポリクローナルベクター、ポリクローナル細胞系統又はポリクローナルタンパク質の組合せが経時的に改変する、組換え型ポリクローナルタンパク質産生中の現象を示すために用いられる。
【００６２】
「ＲＦＬＰ」という語は、核酸分子フラグメントの移動性ゲルパターンを制限酵素での分裂の後に分析する方法である「制限フラグメント長多形現象」を意味する。
【００６３】
「ＨＤＳ」という語は、多数のテスト化合物を、一定の与えられた活性について同時にスクリーニングされるような形で膜上で並行してテストする高密度スクリーニング方法を意味する。
【００６４】
本書で使用されているように、「ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ」というのは、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）Ｐ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８；７２７６−７２８０（１９９１）によって記載されたＴａｑＭａｎシステムに基づいたＰＣＲ検定を意味する。
【００６５】
「５′ＵＴＲ」という語は、ｍＲＮＡの５′未翻訳領域を意味している。
【００６６】
「Ｐｆｕ  ＰＣＲ」という語は、既知の熱安定性ポリメラーゼの中で最高の信頼性をもつという理由で利用されている、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓから単離されたもの）を用いて実施されたＰＣＲ反応を意味する。
【００６７】
略号：「ＣＭＶ」＝（ヒト）サイトメガロウイルス。「ＭＳＰＳＶ」＝骨髄増殖性肉腫ウイルス。「ＡｄＭＬＰ」＝アデノウイルス主要後期プロモーター。ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ＝サルウイルス４０ＰｏｌｙＡシグナル配列。ＧＦＰ＝緑色螢光タンパク質。ＰＶＤＦ＝ポリビニリデンジフルオリド。ＴｃＲ＝Ｔ細胞レセプタ。ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着検定法。ＬＴＲ＝長末端反復。
【００６８】
組換え型ポリクローナルタンパク質発現系
本発明は、好ましくは免疫グロブリン様ドメインを伴うタンパク質ファミリーである免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される組換え型ポリクローナルタンパク質の一貫性ある製造のための方法を提供する。成員の大部分は、細胞表面認識事象に関与する。配列相同性は、抗体、Ｔ細胞レセプタ、ＭＨＣ分子、一部の細胞付着分子及びサイトカインレセプタが密な相同性を共有することを示唆する。特に、可変領域を含むこのファミリーの成員が、本発明に従った組換え型ポリクローナルタンパク質の生成に適している。かかる成員には、抗体、膜結合抗体（Ｂ細胞レセプタ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、Ｔ細胞レセプタ（ＴｃＲｓ）、可溶性ＴｃＲｓ、ＴｃＲ可変ドメインフラグメント、ポリペプチドリンカーによりリンクされたＴｃＲ可変ドメインフラグメント又はその他の抗体又はＴｃＲ由来のフラグメントが含まれる。特に、本発明は、組換え型治療用ポリクローナル抗体又はＴｃＲｓを含む新しい種類の治療薬を大規模に製造及び生産する可能性を開くことになると考えられる。
【００６９】
本発明の製造方法の主要な利点の１つは、組換え型ポリクローナルタンパク質を構成する成員全てを、１基〜約１０基の生物反応器又はその等価物の中で生産できるという点にある。さらに、該組換え型ポリクローナルタンパク質組成物は、プロセス中に組換え型ポリクローナルタンパク質を構成する個別成員を分離する必要なく、単一の調製物として反応器から精製可能である。対照的に、精製されたモノクローナル抗体（例えば国際公開第９１／１６０７４号パンフレット内に提案されているようなもの）を混合することによって組換え型ポリクローナル抗体組成物を模倣したい場合には、組成物内に内含されるべき各抗体を１つの生物反応器内で別々に製造することが必要となり、おそらくは、抗体は同様に個別に精製されることになるだろう。モノクローナル混合物のこのような生産は、本書で記載されているような組換え型ポリクローナル抗体又はその他のポリクローナルタンパク質の生産方法に比べて非常にコストが高くつき、時間及び空間を要するものと思われる。かくして、国際公開第９１／１６０７４号パンフレット内に記載されている通りの方法は、当然のことながら、かかる混合物中に含まれ得るモノクローナル抗体の数に対する実際的な限界（おそらくは１０未満）をもたらす結果となるが、これに対し、本書に記載されている通りの技術は、一般に望まれるだけの個別成員をもつポリクローナル抗体を生産することができる。
【００７０】
組換え型ポリクローナル製造細胞系統からの組換え型ポリクローナルタンパク質の予測可能な発現を得るためには、ゲノム組込み部位の調節特性を適度に充分理解すべきである。
【００７１】
無作為組込みを用いた従来のトランスフェクション及び組換え型タンパク質発現技術は、該プロセスの無作為性が、組込まれた核酸配列の数及び位置を細胞毎に変動させることになるため、組換え型ポリクローナルタンパク質の生産のためには望ましいものではない。かくして、このような従来のプロトコルにより組換え型ポリクローナルタンパク質が生産された場合、ポリクローナルタンパク質の個別成員の可変的発現速度をもつ不均質な細胞培養、及び組込まれたＤＮＡの位置効果に起因する遺伝的不安定性が結果としてもたらされる確率が高くなる。こうして、ポリクローナルタンパク質を構成する成員の偏向した発現がもたらされる確率が最も高くなる。
【００７２】
従って、予め定められたゲノム部位内への導入が望ましく、このことは原則として、相同的組換えによって達成可能である。しかしながら、非正統的組換え事象が優勢であることから、相同的組換えは、非常に効率が悪い。
【００７３】
その上、ポリクローナルタンパク質が抗体又はＴ細胞レセプタ（ＴｃＲ）である場合、もう１つの問題が、無作為組込みを結果としてもたらす従来のトランスフェクションプロトコルの使用に付随して浮上する。抗体及びＴｃＲｓは、独立した遺伝子セグメント対、つまり抗体については軽鎖及び重鎖コーディング配列そしてＴｃＲｓについてはアルファ及びベータ鎖又はデルタ及びガンマコーディング配列からコードされる。これらの遺伝子セグメントからのポリペプチド産物は、抗体分子又はＴｃＲの細胞内プロセシング中に共有結合によりリンクされた状態になる。無作為組込みを結果としてもたらす従来のトランスフェクション技術は、同じ細胞内での異なる重鎖及び軽鎖又はアルファ及びベータ鎖の複数のコピーの導入を導き、その結果、重鎖及び軽鎖の無作為組合せ、すなわち、いわゆるＶＨ−ＶＬ鎖スクランブリング又はアルファベータ鎖スクランブリングがもたらされる。その結果、このことが発現された抗体又はＴｃＲｓの性能を劣化させ、親和力及び／又は特異性の損失、新しい特異性の発生及び／又は特異的活性の低下の可能性がひき起こされる。
【００７４】
これらの問題を回避するため、本発明の発現系は、個別宿主細胞のゲノム内への部位特異的組込みを使用する。本発明の系は、問題の変異体核酸配列を含む問題のベクターライブラリーが、リコンビナーゼで媒介されたカセット交換手順により予め特徴づけされた染色体位置内に確実に挿入され得るようにし、かくして、個別細胞が問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の単一の別個の成員を発現する１つの細胞系統が生成される。上述のように、組換え型ポリクローナル製造細胞系統を構成する細胞の一部の中で多数の組込みが発生しうる。しかしながら、これは、個々の細胞の大部分が組換え型ポリクローナルタンパク質の単一の別個の成員を発現するかぎりにおいて問題を提起しないとみなされる。
【００７５】
Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ベータ−リコンビナーゼ、Ｇｉｎ、Ｐｉｎ、ＰｉｎＢ、ＰｉｎＤ、Ｒ／ＲＳ、ラムダインテグラーゼ又はファージφＣ３１インテグラーゼといったようなリコンビナーゼを使用することができる。染色体位置内に組込むための適切なリコンビナーゼは、（ｉ）前記核酸配列が導入されるその細胞自体のゲノムからの発現によってか、（ｉｉ）細胞内に挿入された核酸配列によって操作可能な形でコードされることによってか、（ｉｉｉ）第２の核酸分子からの発現を通してか又は（ｉｖ）タンパク質として提供され得る。好ましい実施形態においては、問題のベクター内に含まれた変異体核酸配列は、いわゆる「ホットスポット」である問題の核酸配列の高レベルの転写及び発現を媒介する遺伝子座内に組込まれる。
【００７６】
使用される宿主細胞系統は好ましくは、生物薬剤的タンパク質発現のために標準的に使用されるもの、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えばＳｐ２／０細胞、ＮＳ０）、ＹＢ２／０、ＮＩＨ３Ｔ３及び不死化ヒト細胞、例えばＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６を含む哺乳動物細胞系統である。本発明においては、ＣＨＯ細胞が使用された。しかしながら、当業者であれば記載されたとおりのその他の哺乳動物細胞でＣＨＯ細胞を置き換え、さらには植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌及び細菌を含めたその他のタイプの細胞を利用することさえ容易にできると思われる。かくして、細胞型の選択は、本発明を制限するように意図されたものではない。好ましい実施形態においては、問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の高い発現レベルを媒介する、予め特徴づけされたホットスポットを含有する哺乳動物細胞が製造のために使用される。
【００７７】
本発明のさらなる実施形態においては、宿主細胞内の同じ染色体組込み部位を利用する部位特異的な形で、問題の変異体核酸配列が組込まれる。単一の特異的部位内へのこのような組込みは、そうでなければゲノム内の多重部位内への組込み又は無作為組込みの場合に見られる位置効果を最小限におさえる。特に、複数のポリペプチド鎖から成るポリクローナルタンパク質を発現する場合には、ゲノム内への部位特異的組込みが発生する単一の部位を有することがさらに適切である。これは、単一の細胞が複数の組込み体を発現する場合に、サブユニット間のスクランブリングが発生する確率が高いという事実に起因している。
【００７８】
部位特異的組込み系において、個別宿主細胞は、例えば抗体又はＴｃＲの抗原結合領域といった問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の可変領域内で観察される差異は別として同じタンパク質構造全体を発現している。従って、このような細胞プール内の細胞の大部分は、生産性及び遺伝的安定性に関して類似の特性を示しているべきであり、かくしてこの技術は、例えば組換え型ポリクローナル抗体又はＴｃＲｓといった組換え型ポリクローナルタンパク質の制御された生産の可能性を提供する。
【００７９】
本発明の組換え型ポリクローナルタンパク質は、天然に可変的な、異なるが相同なタンパク質分子を含むタンパク質組成物を網羅するものとして意図されており、これはすなわち、好ましい実施形態において、変異体核酸ライブラリーが天然に発生する多様性を含むことを意味する。かくして、各々のタンパク質分子は、組成物のその他の分子と相同であるがポリクローナルタンパク質の個別成員間のアミノ酸配列の差によって特徴づけされる可変的ポリペプチド配列の１つ以上のストレッチをも含有する。可変的ポリペプチド配列を構成するアミノ酸配列（単複）の差は、アミノ酸１個といったわずかなものであり得る。好ましくは、アミノ酸配列の差異は、複数のアミノ酸を構成する。
【００８０】
通常、ポリクローナル抗体又はＴｃＲの天然の可変性は、ポリペプチド鎖のいわゆる可変領域又はＶ−領域内にあるものとみなされる。
【００８１】
本発明の１態様においては、ポリクローナルタンパク質内の個別成員は、長さがおよそアミノ酸８０〜１２０個である可変領域を含む。可変領域は、例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）といった超可変ドメインを含有する可能性がある。
【００８２】
天然に発生するＴｃＲｓにおいては、各々の可変領域内に４つのＣＤＲが存在する。天然に発生する抗体においては、重鎖内の３つのＣＤＲ及び軽鎖内の３つのＣＤＲが存在する。
【００８３】
本発明の付加的な態様においては、ポリクローナルタンパク質の個別成員の可変領域は、長さがアミノ酸１〜２６個、好ましくは４〜１６個である少なくとも１つの超可変ドメインを含有する。この超可変ドメインはＣＤＲ３領域に対応し得る。抗体については、各々の可変領域は、好ましくは３つの超可変ドメインを構成する。これらは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に対応し得る。ＴｃＲについては、各々の可変領域は、好ましくは４つの超可変ドメインを構成する。これらは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及びＣＤＲ４に対応し得る。超可変ドメインは、単独で、本発明の組換え型ポリクローナルタンパク質の可変領域内の可変配列を構成する可能性がある。
【００８４】
本発明に関連して、ポリペプチド配列内の可変性（ポリクローナル性）は同様に、例えば、ヒトイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２又はマウスイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＡといったような２つ以上の異なる抗体イソタイプを含有する抗体混合物の場合のように、抗体ポリペプチド鎖のＣ領域又はいわゆる定常領域内に常在する個別の抗体分子の間の差異を表現するものとして理解することもできる。かくして、組換え型ポリクローナル抗体は、可変領域（Ｖ領域）又は定常領域（Ｃ領域）又はその両方において個別の抗体分子間の配列差により特徴づけられる抗体分子を含み得る。
【００８５】
特定の抗原を結合させるタンパク質をコードする変異体核酸配列を提供するためには、当該技術分野において既知の数多くの方法を利用することができる。標準的には、本発明は、特定の抗原を結合させるタンパク質をコードする核酸の同定及び／又は単離を可能にするスクリーニング手順の使用に由来する恩恵を享受することになる。これらの方法のいくつかは、当該技術分野において全て既知でかつ本発明の実施において全て有利な補助的手段となる方法である、ファージ提示（カング（Ｋａｎｇ）Ａ．Ｓ．ら、１９９１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８８、４３６３−４３６６）、リボソーム提示（シャフィッツェル（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ）Ｃ．ら、１９９９．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１、１１９−１３５）、ＤＮＡ提示（カル（Ｃｕｌｌ）Ｍ．Ｇ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８９、１８６５−１８６９）、ＲＮＡ−ペプチド提示（ロバート（Ｒｏｂｅｒｔｓ）Ｒ．Ｗ．、スゾスタク（Ｓｚｏｓｔａｋ）Ｊ．Ｗ．、１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９４、１２２９７−１２３０２）、共有提示（国際公開第９８／３７１８６号パンフレット）、細胞表面提示（フーク（Ｆｕｃｈｓ）Ｐ．ら、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９、１３６９−１３７２）、酵母表面提示（ボーダ（Ｂｏｄｅｒ）Ｅ．Ｔ．、ウィットラップ（Ｗｉｔｔｒｕｐ）Ｋ．Ｄ．、１９９７．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５，５５３−５５７）及び真核ウイルス提示（グラブヘル（Ｇｒａｂｈｅｒｒ）Ｒ．、エルネスト（Ｅｒｎｓｔ）Ｗ．、２００１、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ、Ｓｃｒｅｅｎ、４、１８５−１９２）といった技術から知られているいわゆるバイオパニングステップを含んでいる。ＥＬＩＳＡ（ドレハー（Ｄｒｅｈｅｒ）、Ｍ．Ｌ．ら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３９、１９７−２０５）及びＥＬＩＳＰＯＴ（チェルキンスキー（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ）Ｃ．Ｃ．ら、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．６５，１０９−２１）も同様に、バイオパニングステップに後続してか又は単独で使用することができる。
【００８６】
問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の組成物は、例えば、所望の標的抗原に対するポリクローナル抗体の場合において、所望の標的に向かう共有の結合活性といったような共通の特長により定義されてきた明確なタンパク質サブセットを含んでいる。標準的には、ポリクローナルタンパク質組成物は、少なくとも３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５又は１０６個の別個の変異体成員を有する。ポリクローナルタンパク質組成物内で必要とされる別個の成員の数は、標的の複雑性によって左右されることになる。抗体の場合、ターゲティングされる抗原（単複）の複雑性は、ポリクローナル抗体組成物内で必要な別個の変異体成員の数に影響を及ぼすことになる。例えば小型タンパク質といったような小さいか又は非常に複雑な標的の場合、３〜１００の別個の変異体成員を含むポリクローナル抗体組成物で充分となり、変異体の数は、９０又さらには８０又は７０を上回らないことが好ましい。数多くのケースで、別個の変異体の数は６０又は５０を上回らず、変異体の数が５〜３０の間といったような５〜４０の範囲内にあることが好まれる。一方、より複雑な標的、例えば複雑な又は互換性ある表面タンパク質を伴うか又は複数のウイルス亜型を包含するウイルスについては、２０〜５００の別個の変異体成員を含むポリクローナル抗体組成物で充分となる。抗原が数多くの異なる分子を含む非常に複雑な標的については、５０〜１０，０００の別個の変異体成員を含むポリクローナル抗体組成物が必要とされるかもしれない。
【００８７】
哺乳動物では、抗体又は免疫グロブリン分子といったような血液中で自由に循環しているか又はＴ細胞レセプタ及びＢ細胞レセプタといったように細胞表面上に存在する、天然に発生するポリクローナルタンパク質の複数の既知の例が存在する。これらの天然に発生するポリクローナルタンパク質の多様性は、一部の哺乳動物においては、これらのタンパク質の可変領域をコードする遺伝子の遺伝的組換えによって達成される。抗体は、体細胞突然変異によりその多様性を増大させるものとしてさらに知られている。本発明は、多様性の原因である配列（例えば、免疫グロブリン分子又はＴｃＲｓの可変ドメイン又はＣＤＲ領域）を単離しそれらから１つのライブラリーを生成することによってこれらの天然の多様性を利用することができる。例えば抗体可変重鎖及び可変軽鎖、ＴｃＲａ鎖及びβ鎖又はＴｃＲδ鎖及びγ鎖などの２つの独立した遺伝子セグメントからコードされたタンパク質については、ライブラリー内の各々のベクターが、これらの可変領域コーディング配列の対を構成することになる。可変領域コーディング配列対のライブラリーの生成は、当該技術分野において周知である。
【００８８】
天然に発生する多様性を含むライブラリーは、例えば、組合せライブラリー（可変領域コーディング配列の無作為対合）ならびに同族対ライブラリー（同じ細胞から誘導された可変領域コーディング配列の対）である。抗体又はＴｃＲ可変領域といったような適切な枠組内に取込まれている単離されたＣＤＲ遺伝子フラグメントから生成されたさらなるライブラリー（例えば、ソダーリンド（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ）Ｅ．ら，２０００、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８５２−８５６）が、本発明で応用可能である。ライブラリーは、好ましくは、所望の特異性をもつサブライブラリー（問題のライブラリー）を得るためにスクリーニングされる。
【００８９】
多様なタンパク質を、例えば合成又は突然変異による人工的な要領で作ることもできる。突然変異は、単一のタンパク質をコードする核酸配列の無作為又は点突然変異のいずれかであり得、かくして、単一のタンパク質のポリクローナル集団を生成する。人工的抗体ライブラリーを生成するもう１つの例が、ＣＤＲのもう１つのライブラリーと組合わせられ得る可変領域の枠組のライブラリーを生成することに基づく１つの方法である欧州特許第０  ８５９  ８４１号明細書中で記載されている。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態においては、組換え型ポリクローナルタンパク質は、組換え型ポリクローナル抗体又は抗体フラグメントである。
【００９１】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、組換え型ポリクローナルタンパク質は、組換え型ポリクローナルＴｃＲ又はＴｃＲフラグメントである。
【００９２】
いわゆる可変領域内の遺伝的及び体細胞組換えにより達成される多様性に加えて、重鎖により定義される異なる免疫グロブリンのイソタイプが存在する。主要なイソタイプはＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥである。
【００９３】
従って、本発明の組換え型ポリクローナルタンパク質は同様に、異なるイソタイプから又はより好ましくは異なるサブクラスから構成され得る。免疫グロブリンのポリクローナル性は、定常部分内又は免疫グロブリン分子の可変ドメイン内又は定常部分と可変ドメインの両方の中で発生し得る。
【００９４】
いわゆる定常領域特に抗体の重鎖内のポリクローナル性は、抗体の治療的応用に関して有利なものである。さまざまな免疫グロブリンイソタイプは、天然の免疫応答の異なる局面に異なる免疫グロブリンイソタイプが関与し得ることから、治療のために抗体を利用する場合に組合せることが望ましい可能性のある異なる生物学的機能（表１中に要約されているもの）を有している（カンフィールド（Ｃａｎｆｉｅｌｄ）及びモリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３、１４８３−９１；カンペル（Ｋｕｍｐｅｌ）ら、２００２、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．９、４５〜５３；スターナデル（Ｓｔｉｒｎａｄｅｌ）ら、２０００．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、Ｉｎｆｅｃｔ．１２４、１５３−１６２）。
【００９５】
表１：ヒト免疫グロブリンイソタイプの生物学的機能
【表１】
2010268806.tif 000002
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、変異体核酸配列ライブラリーでトランスフェクションされた細胞収集物を含む組換え型ポリクローナル製造細胞系統において、前記収集物中の各々の細胞が、特定の抗原を結合させるポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードしかつ前記収集物内の個別の細胞のゲノム内で同じ単一の部位にある前記ライブラリーの１成員でトランスフェクションされ、この成員を発現する能力を有しており、前記核酸配列が前記収集物中の前記細胞と天然においては関連していない組換え型ポリクローナル製造細胞系統である。
【００９７】
上述の実施形態の付加的な実施形態においては、（好ましくは免疫グロブリンスーパーファミリーからの）ポリクローナルタンパク質をコードする変異体核酸配列は全て、例えば供与体から単離された自然に発生する配列から誘導される。
【００９８】
各細胞内のゲノム内で単一の特異的部位に位置設定された変異体核酸を含有する細胞組成物が国際公開第０２／４４３６１号パンフレット中で記載されてきた。この文書は、望ましい特性を有する分子を同定するための細胞の使用を開示しているが、該参考文献は、生産システムの提供又は抗原に対する特異的結合による特徴づけされるポリクローナルタンパク質の提供を取扱っていない。
【００９９】
クローン多様性
ポリクローナルタンパク質の特徴の１つは、各々のタンパク質分子が該ポリクローナルタンパク質のその他の分子と相同であるものの該ポリクローナルタンパク質の個別成員間のアミノ酸配列の差異により特徴づけされる可変性をも有している、一定数の個別のタンパク質分子によりそれが構成されているという点にある。好ましくは、差異は、ポリクローナルタンパク質の全体的構造の別個の部域に限定される。かかる部域は、例えば抗体又はＴｃＲの可変領域であり、場合によってはさらにこれらの部域内のＣＤＲ領域に限定される。この可変性は同様に、核酸レベルならびにタンパク質の機能レベル、例えば標的に向かっての特異性及び親和力の差異の両方で同定可能な多様性としても表現できる。
【０１００】
組換え型ポリクローナルタンパク質を発現する細胞プールからの単離されたクローンについてのＲＦＬＰ（又は（ＲＴ）−ＰＣＲ産物の配列決定）により、細胞系統のクローン多様性を分析することができる。
【０１０１】
該多様性は、細胞系統により産生された組換え型ポリクローナルタンパク質についての機能的試験（例えばＥＬＩＳＡ）により分析することもできる。
【０１０２】
クローン偏向（すなわち、ポリクローナル抗体を構成する個別抗体の内容の漸進的変化）が存在する場合、これはトランスフェクションのために用いられる初期ライブラリーのクローン多様性を、組換え型ポリクローナルタンパク質を発現する細胞プール（細胞系統）内に見られる多様性と比較することによって、推定することができる。
【０１０３】
細胞系統から発現されたポリクローナルタンパク質のクローン多様性は、ポリクローナルタンパク質による標的カバレッジとして評価可能である。この場合、所望の標的分子の約２５〜１００％がポリクローナルタンパク質により結合させられている場合に、充分な多様性が獲得されたとみなされる。例えば、ポリクローナル抗体の場合、標的抗原の表面上の非同一性エピトープの少なくとも２５％に対する抗体の結合は、組成物内の充分な多様性を提供する。好ましくは、標的カバレッジによるクローン多様性は、少なくとも５０％、さらに一層好ましくは少なくとも７５％である。抗体については、このような標的カバレッジは、例えばエピトープマッピングにより評価可能である。
【０１０４】
代替的には、ポリクローナル組成物の個別成員の分布としてクローン多様性を評価することが可能である。この分布は、トランスフェクションの間に細胞系統内に当初導入された異なるコーディング配列の数と比較した、最終的なポリクローナルタンパク質組成物内の異なる個別成員の合計数として評価され得る。この場合、トランスフェクションにおいて当初使用されたコーディング配列の少なくとも５０％そして好ましくは少なくとも７５％を最終的ポリクローナルタンパク質の異なる個別成員として同定できた時点で、充分な多様性が獲得されたとみなされる。
【０１０５】
ポリクローナル組成物の個別成員の分布は同様に、個別成員の間での相互分布に関連して評価することもできる。この場合、組成物のどの単一の成員も、最終ポリクローナルタンパク質組成物中の個別成員の合計数の７５％を上回る割合を構成していない場合に、充分なクローン多様性が獲得されたとみなされる。好ましくは、いかなる個別成員も、最終ポリクローナル組成物中の個別成員合計数の５０％、さらに好ましくは２５％そして最も好ましくは１０％を上回らない。ポリクローナル組成物内の個別成員の分布に基づくクローン多様性の評価は、ポリクローナル組成物の特徴づけのための後述するアプローチといったような、ＲＦＬＰ分析、配列分析及びタンパク質分析によって実施可能である。
【０１０６】
クローン多様性は、ａ）クローニングプロセス中に、ｂ）細胞増殖の変動の結果として、又は  ｃ）多数の組込み体のスクランブリングを通して発生しうるクローン偏向の結果として、削減され得る。このような偏向が発生した場合、クローン多様性の喪失のこれらの原因の各々は、本書に記載されている通りの方法に対しわずかな修正を加えることにより容易に是正される。
【０１０７】
適切なベクター内への可変ドメインのクローニングにより導入される偏向を制限するために、１つのベクターからもう１つのベクターへの問題の遺伝子の移送を、クローニング偏向が制限されるような形で設計することができる。増幅のために使用されるＥ．ｃｏｌｉ菌株の入念な選択及び大量移送技術が、クローニング偏向を削減できる。もう１つの可能性は、本発明のベクター間で、ポリクローナルタンパク質の個別成員をコードする各々のポリヌクレオチドの個別移送を実施することである。
【０１０８】
細胞系統内の個別細胞の細胞増殖速度の変動が、長期にわたり組換え型ポリクローナルタンパク質発現に偏向を導入して、その細胞系統により発現された組換え型ポリクローナルタンパク質の一部の成員の存在を増大又は低減し得るという可能性がある。増殖速度のこのような変動の１つの理由は、初期トランスフェクションのために使用された出発細胞系統を構成する細胞集団が不均一であるということにあると考えられる。１つの細胞系統中の個別細胞が長期間にわたり異なる形で発達するということが知られている。より均一な出発材料を確保するため、単細胞レベルまでのその細胞系統の限界希釈法を用い、新しい細胞集団まで各々の単細胞を成長させること（いわゆる限界希釈法による細胞サブクローニング）により、問題のライブラリーでのトランスフェクションに先立つ細胞系統のサブクローニングを実施することができる。これらの細胞集団のうちの１つ以上のものが、このとき、その増殖及び発現特性に基づき出発材料として選択される。
【０１０９】
さらに、部位特異的組込み体を受け入れた細胞のみが生き延びることになるようにするために使用される選択圧は、ポリクローナル細胞系統内部の個別細胞の増殖速度に影響を及ぼす可能性がある。これは、選択圧に適合させるべく或る種の遺伝的変化を受ける細胞に有利に働くことに起因する可能性がある。かくして、選択マーカーの選択も、増殖速度により誘発される偏向に影響を及ぼす可能性がある。これが起こった場合、異なる選択マーカーを試験してみるべきである。選択が細胞にとって有毒な物質に基づいている場合、最適な濃度、ならびに生産期間全体を通して選択が必要とされるか又は初期段階においてのみ必要とされるかを、入念に試験すべきである。
【０１１０】
明確な細胞集団を確保するための付加的なアプローチは、トランスフェクション及び選択の手順後に蛍光励起された細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用することにある。ＩｇＧ構築物のトランスフェクションを受けた細胞のプールから誘導された生産性の高い細胞について富化するためには、螢光標識された抗体を使用することができる（ブレジンスキー（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ）ら、Ｊ．２００３．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２７７、１４１−１５５）。この方法は同様に、類似のレベルの免疫グロブリンを発現する細胞を選別し、かくして生産性に関して均一な細胞集団を作り上げるためにも使用可能である。同様にして、螢光染料５，６−カルボキシルフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）での標識を使用することにより、ＦＡＣＳ方法により、類似の増幅速度を示す細胞を選択することができる。
【０１１１】
増殖速度により誘発された偏向が実際に発生したとしても、最終組換え型ポリクローナルタンパク質産物の多様性必要条件及び多様性の経時的安定性に応じて、個別成員の喪失又は過剰な出現は、必ずしも危機的ではない可能性がある。
【０１１２】
部位特異的単一組込み体においては、細胞は、発現されるべき抗体の可変領域の配列についてのみ異なることになる。従って、組込み部位及び遺伝子調節要素の変動により課せられる異なる細胞効果は無くなり、細胞増殖速度に対し最小限の効果しかもたない。スクランブリングも多重組込みも、稀な事象であることから、製造細胞系統の増殖速度に問題をひき起こす確率は低い。無作為組込みは一般に約１０−５の効率で発生し、一方部位特異的組込みは約１０−３の効率で起こる。多重組込みが予想外に問題をひき起こした場合、上述の通り事象が再発する確率は非常に小さいことから、代替案は問題のベクターライブラリーでのトランスフェクションをくり返すことである。付加的な代替案は、以下の例３で記されている。
【０１１３】
望ましくないクローン偏向を制御するもう１つの方法は、複数のサブプール内で問題のベクターライブラリー全体でのトランスフェクションを実施するか又は、サブプール内へのトランスフェクション後に早期時点で細胞プールを分割することにある。この時点で、偏向は、有意なものとなってしまっていてはならず、又は、望ましくない増殖利点をもつクローンが欠如したサブプールを獲得することが統計的に可能でなくてはならない。結果としての望ましくないクローンの排除は、最終的組換え型ポリクローナルタンパク質産物における多様性の必要条件と一致していなければならない。統計を考慮すると、多数の細胞のバルクトランスフェクションも又、望まれないクローン偏向を回避する一つの方法を構成する。このアプローチにおいては、宿主細胞系統が変異体核酸配列ライブラリーとまとめてトランスフェクションされる。このようなライブラリーは、その各々の別個の成員の数多くのコピーを構成する。これらのコピーは、好ましくは多数の宿主細胞内に組込まれるべきである。好ましくは、少なくとも１００、１０００、１００００又は１０００００の個別細胞が変異体核酸配列ライブラリーの別個の成員のコピーでトランスフェクションされる。かくして、別個の変異体核酸配列ライブラリーが、各々１０００個の個別細胞内に組込まれる１０００の別個の成員で構成されている場合、部位特異的に組込まれたＧＯＩを含有する１０６個のクローンがトランスフェクションから発生するべきである。この要領で、個別細胞倍増速度のガウス曲線は、非常にわずかな程度でしか一般集団に影響を及ぼさないはずである。こうして、製造細胞の低い百分率が異常な増殖及び／又は発現特性を示すはずであるとしても、経時的にクローン組成物を一定に保つ確率は高くなる。
【０１１４】
代替的には、問題のベクターライブラリーを、そのライブラリーのおよそ５〜５０の個別ベクターを含む画分へと分割することができる。好ましくは、ライブラリーの一画分は、１０〜１５の個別ベクターを構成する。各々の画分はこのとき細胞アリコート内へとトランスフェクションされる。このとき、個別の細胞アリコートを一定の期間追跡調査してそのうちのいずれかにクローン偏向が発生しているか見ることができる。これが起こっている場合には、残りの細胞アリコートをプールすることにより細胞収集物が再構築される前に、かかる細胞アリコートを削除することができる。任意には、細胞アリコートは生産全体を通して別々に保たれ、ポリクローナル抗体組成物は、生産前に複数の細胞アリコートではなく各々のアリコートの産物を組合せることにより組立てられる。取扱うことのできるプールの数は、５〜１０の間にあると予想される（モノクローナル抗体についての以上の記載を参照のこと）。
【０１１５】
代替的には、問題のベクターの初期ライブラリーからの単一クローンに基づいてベクター及び細胞を用いて別々に細胞がトランスフェクションされる高速大量処理方法を実施することができる。こうして、トランスフェクション及び組込みの間に考えられるあらゆる配列偏向を無くすることができる。任意には、単一のトランスフェクタントを遺伝子型特定することそして、生産の直前か又は該当する場合にはより早い時期に完全な多様性をもつ細胞プールを組立てることができる。代替的には、変異体核酸配列ライブラリーの同じ別個の成員で多くのクローンを生成する多数の細胞の個別トランスフェクションは、個別にトランスフェクションされた細胞がポリクローナルタンパク質の製造前にプールされている場合、バルクトランスフェクションについて記載されたものと同じ統計的利点を生み出す可能性がある。
【０１１６】
宿主細胞
適切な宿主細胞は、そのゲノムの１領域の中に、１つ以上の適切な組換え部位、すなわち１つ以上のリコンビナーゼ酵素により認識可能な核酸配列を含む。組込み体（すなわち組込み部位内に問題の核酸配列の組込まれたコピーを有する細胞）について選択する能力を有するために、組換え部位は、それに対し３’のところにある第１の選択遺伝子（例えば抗生物質耐性遺伝子）に操作可能な形でリンクされる。さらに、耐性マーカーコーディング領域の一部を成す組換え部位に対し５’のところに、弱いプロモーター（例えば切形ＳＶ４０早期プロモーター）及び転写開始コドンが位置づけされ得る。かくして、転写開始コドンは、ポリクローナルタンパク質をコードする発現ベクターのライブラリーでのトランスフェクションの前に宿主細胞内の選択遺伝子の転写開始を先導する。
【０１１７】
上述の通りの部位特異的組込みのための宿主細胞は、ＤＮＡをその染色体内に取込むか又はミニ染色体、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＭＡＣ（マウス人工染色体）、又はＨＡＣ（ヒト人工染色体）といったような外部染色体要素を保持することのできるあらゆる細胞から生成可能である。ＭＡＣ及びＨＡＣについては、本明細書に参照により援用されている国際公開第９７／４０１８３号パンフレットの中で記載されている。好ましくは哺乳動物細胞例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えばＳｐ２／０又はＮＳ０細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３といった線維芽細胞、及びＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６といった不死化ヒト細胞が使用される。ただし、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などといったような哺乳動物以外の真核又は原核細胞も同様に利用可能である。
【０１１８】
本発明の１実施形態においては、出発材料として用いられるべき細胞系統は、単細胞レベルまでその細胞系統のいわゆる限界希釈法を実施し、その後続いて、問題のベクターライブラリーでのトランスフェクションに先立ち新しい細胞集団まで各々の単細胞を成長させることによってサブクローニングされる。かかるサブクローニングは、同様に、望まれる場合、正しい細胞系統を選択するプロセスにおいて後に実施することも可能である。
【０１１９】
部位特異的組込みのための宿主細胞は、弱いプロモーター（例えば切形ＳＶ４０早期プロモーター）、転写開始コドン、開始コドンに対し３’のところにある組換え部位を含む、無作為組込み用プラスミドでのトランスフェクションによって得ることができる。好ましくは、組込み用プラスミドは同様に、第１の選択遺伝子にカップリングされたマーカー遺伝子をも含んでいる。かかる組込み用プラスミドの１例としては、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのｐＦＲＴ／ＬａｃＺｅｏ２がある。問題の核酸配列を挿入するために使用されるゲノム位置での発現の相対的強度を評価するためにマーカー遺伝子を使用することができる。マーカー遺伝子（例えばベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、緑色螢光タンパク質（ＧＦＰ）又は細胞表面マーカー）を、第１の選択遺伝子及びマーカー遺伝子の同時発現が起こるような形でＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）により転写的にリンクさせるか又は遺伝子融合内で第１の選択遺伝子にリンクさせることができる。細胞系統から細胞系統への相対的発現レベルの評価を可能にするマーカーと組合せられた細胞に対する存続圧（例えば薬物耐性又は栄養枯渇）を確立する選択遺伝子の使用は、ゲノム内部に組込まれたプラスミドを維持する高産生細胞を確保するための効率の良い方法である。特に活発な転写を伴うスポットで挿入された組換え配列を伴う細胞が、例えばＧＦＰ又はＬａｃＺといったマーカー遺伝子の高い発現を導くことになる。高発現体は、蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）により選択されクローニングされ得る。この時点で、組込み体が単一の組込み体であるか否かも分析すべきである。これはリアルタイムＰＣＲ及びサザンブロット法により実施可能である。
【０１２０】
組込み用プラスミドでのトランスフェクションを受けた細胞から相対的発現レベルを評価するためのもう１つの方法は、上述の通りに生成された細胞上で付加的な組込み−切除ステップを実施することにある。選択された細胞のこのプールは、組込み用プラスミドの組換え部位に対応するリコンビナーゼをコードするプラスミド、及び第１の組込み用プラスミドに同様に対応する組換え配列が先行するコーディング領域を有する、開始コドン無しの第２の選択マーカーを含む第２のプラスミドで、再度トランスフェクションされる。この第２のプラスミドは同様に、哺乳動物プロモーターによって駆動された蛍光マーカータンパク質（例えばＧＦＰ（又は等価の蛍光タンパク質））のためのコーディング配列をも含んでいる。リコンビナーゼは、組込み用プラスミドにより予め類似の組換え配列が挿入されている宿主細胞ゲノム内へのこのプラスミドの組込みを媒介する。特に活発な転写を伴うスポットに挿入された組換え配列を伴う細胞が、蛍光タンパク質の高い発現を導くことになる。高発現体は、蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）により選択されクローニングされる。一貫して高い発現を伴い、挿入されたプラスミドの１つのコピーを含むクローンがリコンビナーゼでトランスフェクションされ、第１の選択マーカーにより選択され、第２のプラスミド配列がリコンビナーゼにより除去されてしまっている細胞を同定し、第１の選択マーカーを再度働かせる。これらの細胞はさらに、転写ホットスポットで挿入された第１の組換え配列をも含み、今や問題の遺伝子の発現のために使用可能である。
【０１２１】
プラスミドの単一コピーの組込み時点でマーカー遺伝子の高い発現を達成する細胞系統が、問題の遺伝子でのトランスフェクションのために使用される。宿主細胞内の組換え部位は好ましくは、特に活発な発現の遺伝子又は領域すなわちいわゆるホットスポットの中にある。
【０１２２】
部位特異的組込み用ベクター
適切なベクターは、宿主細胞の構築のために用いられる選択遺伝子とは異なる適切な選択遺伝子にリンクされた適切な組換え部位を含む。哺乳動物細胞発現において使用するための適切な選択遺伝子には、栄養選択を可能にする遺伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ遺伝子（ＧＳ）、トリプトファンシンターゼ遺伝子（ｔｒｐＢ）又はヒスチジノールジヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｉｓＤ）が含まれるが、これらに制限されるわけではない。さらに、選択マーカーは、薬物耐性を付与する代謝拮抗剤耐性遺伝子、例えば、ヒポキサンチン及びチミジン欠損培地で選択可能でありさらにはメトトレキセートで選択可能であるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、マイコフェノール酸で選択可能であるキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、真核細胞内のＧ４１８又は原核細胞内のネオマイシン又はカナマイシンで選択可能なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、ハイグロマイシンで選択可能であるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ、ｈｐｈ、ｈｐｔ）遺伝子、ピューロマイシンで選択可能であるピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）又はブラスチシジンで選択可能であるブラスチシジンＳデアミナーゼ遺伝子（Ｂｓｄ）である。最後に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、神経成長因子レセプタ（ＮＧＦＲ）又はその他の膜タンパク質又はベータ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）といったような、例えばフローサイトメトリによる選別を可能にするタンパク質をコードする遺伝子も、選択マーカーとして使用可能である。
【０１２３】
本発明の１態様においては、選択可能な遺伝子は、プロモーターにより先行されず、又翻訳開始コドンも備わっていない。プロモーター及びＡＴＧコドンは、選択された部位特異的組換え部位に提供されている。このベクターが、宿主細胞のゲノム内に選択された組換え部位以外の場所で組込まれている場合、この第２の選択遺伝子の発現は、プロモーター及び開始コドンの欠如に起因して全く発生し得ない。組込みが宿主細胞のゲノム内で選択された部位で起こる場合、第２の選択遺伝子は発現され、第１の選択遺伝子の発現は失なわれる。
【０１２４】
組込みは、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦｌｐリコンビナーゼ又はその突然変異体と共に部位特異的組込み用ベクター上で、ゲノム内のいわゆるＦＲＴ部位（５’−ｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｃｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃ−３’（配列番号１）及びその変異体）を用いて実施され得る。しかしながら、ａｔｔＰ部位及びａｔｔＢ部位の間の組換えを実施するファージインテグラーゼφＣ３１又はラムダインテグラーゼを用いることによって（Ａ．Ｃ．グロス（Ｇｒｏｔｈ）ら，ＰＮＡＳ２０００，９７；５９９５−６０００）か又は、バクテリオファージＰ１からのｌｏｘＰ又はその変異体又は突然変異体例えばｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ７６、ｌｏｘ７５、ｌｏｘ４３、ｌｏｘ４４及びｌｏｘ５１１といったようなさまざまなｌｏｘ部位（Ｃ、ゴーマン及びＣ．バロック（Ｃ．Ｇｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｂｕｌｌｏｃｋ）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００，１１：４５５−４６０）及びＣｒｅリコンビナーゼのものを含め、その他のリコンビナーゼ系も同等にうまく使用することができる。本発明で利用可能なさらなるリコンビナーゼ系としては、細菌プラスミドｐＳＭ１９０３５からのβ−リコンビナーゼ−ｓｉｘ系、バクテリオファージＭｕからのＧｉｎ−ｇｉｘ系又はＺｙｇｏ  ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ由来のＲ−ＲＳ系があるが、これらに制限されるわけではない。
【０１２５】
部位特異的組換え系に対するさらなる変形形態は、非相同組換え部位を使用することにある。このような系においては、２つの同一でない組換え部位が、特異的標的部位の生成のため宿主ゲノム内に導入される。標的部位をフランキングするものに対応する組換え部位が、同様に、問題の遺伝子を含む構築物をもフランキングする。かかる系については、本明細書に参照により援用されている国際公開第９９／２５８５４号パンフレット内で記載されてきた。非相同組換え部位の使用は、染色体からのＧＯＩの切除を抑制することが示された。非同一組換え部位は、対応するリコンビナーゼが提供されるかぎりにおいて上述の組換え部位のいずれかで構成され得る。例えば、非同一組換え部位は、組込みのためにＦｌｐリコンビナーゼを利用するＦＲＴ部位及び突然変異体ＦＲＴ部位、又は組込みのためにＦｉｐ及びＣｒｅリコンビナーゼを利用するＦＲＴ部位及びｌｏｘＰ部位から成ると考えられる。
【０１２６】
さらに、２つの異なるＦＲＴ部位を用いた系は、バーホーエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  １２、９３３−４４で記載されてきた。このアプローチでは、組込み用プラスミドは、レトロウイルス感染によって宿主細胞に移送される。該プラスミドは、リポータ遺伝子及び第１の選択マーカー遺伝子ならびに感染に必要とされるレトロウイルス要素の組合せで構成されている。レトロウイルス３’ＬＴＲは２つの異なるＦＲＴ部位を含んでいる。プロモーター及び翻訳開始コドンが欠如した非機能的な第２の選択マーカー遺伝子が、これらの部位に対し３’のところに位置設定されている。レトロウイルス感染プロセス中、３’ＬＴＲ配列は、５’ＬＴＲにコピーされる。この結果、各々の側で２つの異なるＦＲＴ部位によりリポータ遺伝子及び第１の選択マーカーがフランキングされている。外部ＦＲＴ部位の間の配列は強いプロモーターの制御下でＧＯＩに対して交換可能である。ＧＯＩを含むカセットは、ＦＲＴ部位の同じセットによりフランキングされている。反応はＦｌｐリコンビナーゼによる触媒作用を受ける。トランスフェクションを受けた交換プラスミドにおいては、ＩＲＥＳ要素及び翻訳開始コドンがＧＯＩのさらに下流側に位置設定されている。組込まれたカセットの置換の後、ＦＲＴ部位の外側の３’ＬＴＲ配列内に位置設定された非機能的選択マーカー遺伝子は、ＧＯＩ構成カセットによって提供される翻訳開始コドンによって活性化される。交換状態は、組込みベクター内に負の選択マーカー（例えばチミジンキナーゼ）が存在する場合に、さらに富化され得る。
【０１２７】
組込み用ベクターは、同様に、標準トランスフェクションによって宿主細胞に移送され得る。この場合、組込み用カセットは５’末端でＦＲＴにより、そして３’末端で異なるＦＲＴ’部位によりフランキングされる。ＡＴＧが欠損した第２の耐性マーカー遺伝子は、３’ＦＲＴ’部位のさらに下流側に位置づけされている。ＧＯＩについての交換は、レトロウイルス系について記載されている通りに進行する。
【０１２８】
染色体内へのその部位特異的組込みの後のＧＯＩの切除を妨げるもう１つの系は、同じく以上で言及したφＣ３１インテグラーゼである。この系については、その全体が本明細書に参照により援用されている特許出願国際公開第０１／０７５７２号パンフレット及び国際公開第０２／０８４０９号パンフレットの中で徹底的に記載されてきた。
【０１２９】
発明のさらなる一態様においては、問題の遺伝子の部位特異的組込み用のベクターはさらに、任意にはタンパク質の発現を導くその独自の哺乳動物プロモーターが先行している、問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の一つの成員をコードするＤＮＡを含んでいる。問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の一成員が複数のタンパク質鎖を含む場合、例えば該成員が抗体又はＴ細胞レセプタである場合、タンパク質の鎖をコードするＤＮＡには、その各々の鎖の高レベルの発現（双方向又は単方向、それぞれ図１及び２を参照のこと）を導く独自の哺乳動物プロモーターが先行している可能性がある。双方向発現においては、発現ベクター内の頭−頭のプロモーター形態を使用することができ、単方向発現のためには、発現用に例えばＩＲＥＳ配列と組合わされた１つのプロモーター又は２つのプロモーターを使用することができる。適切な頭−頭のプロモーター形態としては、例えば、両方の方向性でのマウスメタロチオネイン−１プロモーターと合わせたＡｄＭＬＰプロモーター、両方の方向性での伸長因子−１プロモーターと合わせたＡｄＭＬＰプロモーター又は両方の方向性でのＭＰＳＶプロモーターと合わせたＣＭＶプロモーターであるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３０】
細胞小器官といったような細胞内の特定の場所又は小胞体に遺伝子産物を導くため、発現ベクター内に機能的リーダー配列をコードする核酸配列を含み入れることができる。強いポリアデニル化シグナルは、タンパク質コーディングＤＮＡ配列の３’のところに位置づけされ得る。ポリアデニル化シグナルは、未完成ＲＮＡ写しの終結及びポリアデニル化を確保し、メッセージ安定性と相関される。問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の一成員をコードするＤＮＡは例えば、抗体又は複数の抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖の両方をコードすることができ、ここで各々の遺伝子配列には任意には、独自の哺乳動物プロモーター要素が先行しかつ／又は２つの鎖の各々の高レベル発現を導く強いｐｏｌｙＡシグナルが後続している。
【０１３１】
部位特異的組込みのための発現ベクターは、組込み部位における発現の増大のため、エンハンサ又はＵＣＯＥ（遍在性染色質開放要素）といったような付加的な転写調節要素を担持することができる。エンハンサは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する核酸配列である。ＵＣＯＥは、染色質を開放するか又は開放状態で染色質を維持し、（その全体が本明細書に参照により援用されている国際公開第００／０５３９３号パンフレットの中で詳述されている）作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にする。以上で記載した調節要素のうちの１つ以上のものが宿主細胞の染色体内に組込まれた時点で、これらは異種調節要素と呼ばれる。
【０１３２】
タンパク質の高レベル発現のための発現系を確立する。
１つの細胞内に核酸配列を導入するための方法は、当該技術分野において既知である。これらの方法は、標準的に、細胞、ゲノム又は外部染色体要素内に問題の配列を導入するためのＤＮＡベクターの使用を含んでいる。細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈降、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リポゾーム融合、ＲＢＣゴースト融合、原形質融合などを含めた、当業者にとって既知の一定数の方法によって達成され得る。
【０１３３】
宿主細胞系統のトランスフェクションのためには、各ベクターが問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の１つの成員をコードする核酸配列のコピーを１つだけ含む、問題のベクターライブラリーが使用される。この問題の発現ベクターライブラリーは、問題の組換え型ポリクローナルタンパク質を集合的にコードする。部位特異的組込みのための適切なベクターが前節内で記載された。問題の変異体核酸配列ライブラリーを構成する個別ベクターを、一緒に単一の組成物へと混合させることができ、そうでなければ、各ライブラリー成員をコードする個別ベクターを、別々の組成物内に又は１つの組成物内のライブラリーの約５〜５０の個別ベクターの混合物内に保つことができる。
【０１３４】
組換え型ポリクローナル製造細胞系統の生成及びかかる細胞系統からの組換え型ポリクローナルタンパク質の産生は、複数の異なるトランスフェクション及び製造戦略によって得ることができる。これらの戦略は、図３で概略的に説明されている。
【０１３５】
１つのやり方は、宿主細胞系統のトランスフェクションのために単一の組成物の形に混合されたベクターライブラリーを使用することである。この方法は、バルクトランスフェクション又は大量トランスフェクションと呼ばれる。一般に、以前に記載されたベクター及び宿主細胞の設計は、適切な選択の時点でポリクローナル細胞が確実に得られるようにすることになる。このような細胞系統では、個々の細胞の大部分は、問題の核酸配列ライブラリーからゲノム内へ、組換え型ポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードする核酸分子の１つのコピーを組込んでいた。核酸配列の単一のコピーは、細胞収集物内の各細胞のゲノムの単一の特定的部位内に組込まれ、かくして、問題のポリクローナルタンパク質の個別成員を発現する個別細胞から成るポリクローナル細胞系統を生成する。組換え型ポリクローナルタンパク質の製造開始の前にポリクローナル細胞系統の凍結ストックが生成される。
【０１３６】
もう１つの方法は、トランスフェクションのために、１つの組成物内にライブラリーの約５〜５０の個別ベクターを含む、画分に分割されたベクターライブラリーを使用することである。好ましくは、ライブラリーの画分は１０〜２０個の個別ベクターを構成する。各組成物はこのとき宿主細胞アリコート内にトランスフェクションされる。この方法は、半バルクトランスフェクションと呼ばれる。トランスフェクションを受けるアリコートの数は、ライブラリーのサイズ及び各画分内の個別ベクターの数によって左右されることになる。ライブラリーが例えば、１組成物内に２０の別個の変異的成員を含む画分に分割される１００の別個の変異的成員を構成する場合、５つの宿主細胞アリコートが、オリジナルのライブラリーの別個の画分を構成するライブラリー組成物でのトランスフェクションを受ける必要があると思われる。宿主細胞アリコートは、部位特異的組込みについて選択される。好ましくは、別個のアリコートは別々に選択される。ただし、これらは同様に、選択前にプールされてもよい。アリコートは、そのクローン多様性について分析可能であり、充分な多様性をもつものだけが、ポリクローナルＧＯＩライブラリーのストックを生成するのに使用されることになる。製造用の所望のポリクローナル細胞系統を得るためには、アリコートを、ストックからそれらが回収された直後、又は短かい増殖及び適応時間の後に、冷凍ストックを生成する前に混合することができる。任意には、細胞アリコートは、生産全体を通して別々に保たれ、ポリクローナルタンパク質組成物は、生産の前の細胞アリコートではなく各アリコートの産物を組合せることによって組立てられる。
【０１３７】
第３のやり方は、問題のライブラリーを構成する個別ベクターを用いて宿主細胞が別々にトランスフェクションされる、高速大量処理方法である。この方法は、個別トランスフェクションと呼ばれる。個別にトランスフェクションを受けた宿主細胞は好ましくは、部位特異的組込みについて別々に選択される。しかしながら、これらを選択の前にプールすることもできる。選択時点で生成された個別細胞クローンは、増殖時間及び組込みパターンに関して分析され得、類似の成長速度及び単一の部位特異的組込みをもつものが、ポリクローナルＧＯＩライブラリーストックを生成するために使用される。ストックから回収された直後又は短かい増殖及び適応時間の後、ストックを生成する前に所望のポリクローナル細胞系統を得るべく、個別細胞クローンを混合することができる。
【０１３８】
このアプローチは、トランスフェクション、組込み及び選択の間に考えられるあらゆる残留配列偏向を除去することができる。代替的には、個別にトランスフェクションを受けた宿主細胞は、選択が実施される前に混合され、こうしてトランスフェクションに起因する配列偏向の制御が可能となる。
【０１３９】
以上で概略的に記した製造戦略における共有の特長は、組換え型ポリクローナルタンパク質を構成する全ての個別成員を、約１０基を最大として、１基又は制限された数の生物反応器の中で生産できるという点にある。唯一の差異は、組換え型ポリクローナル製造細胞系統を構成する細胞収集物を生成することを選択する段にある。
【０１４０】
問題の組換え型ポリクローナルタンパク質の発現及び産生のために使用されるべき宿主細胞系統は、リコンビナーゼ酵素（単複）により認識可能な１つ以上の核酸分子を有する（例えば、米国特許第５，６７７，１７７号明細書中に記載されているようなゲノム内の予め定められた場所にＦＲＴ部位をもつ予め調製された細胞）。
【０１４１】
部位特異的組込み用のベクターは、好ましくは、高レベル発現を媒介する所定のゲノム遺伝子座、つまりいわゆるホットスポット内に組込まれる。
【０１４２】
発現レベルを増大させる必要がある場合、ＤＨＦＲ遺伝子又はグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子についての選択を用いて、遺伝子増幅を実施することができる。これには、このような選択マーカーを含むベクターを使用することが必要となる。
【０１４３】
ポリクローナルタンパク質の製造のためには、各タンパク質成員が３つ以上のポリペプチド鎖で構成されている場合、鎖の組合せは、それらが形成するタンパク質の親和性、特異性及び活性にとって重要なものであり得る。このことは例えば、抗体及びＴｃＲｃについて見られる。例えば、抗体可変重鎖及び可変軽鎖の組合せは、鎖から形成される抗体の親和性及び特異性に影響を及ぼすことが知られている。かくして、或る種の標的に対する親和性をもつ抗体を生成するその能力のために抗体コーディング配列の１つのライブラリーが選択された場合、最終的産物内の可変重鎖及び可変軽鎖の組合せがこれに確実に対応するようにすることが望ましい。この理由から、ポリクローナルタンパク質の個別成員を構成するポリペプチド鎖は、組込みのために用いられるのと同じベクター内に置かれ、かくしてそれらが確実にプロセス全体を通して一緒に保たれるようにする。
【０１４４】
以下の記載は、鎖のスクランブリングが存在したとしても最小限である、組換え型ポリクローナル抗体発現細胞系統の獲得方法の１例である。
【０１４５】
可変重鎖及びカッパ軽鎖全体によりとり囲まれた頭−頭の構造といったような反対の転写方向に置かれた２つのプロモーターをもつ構成的発現用の汎用プロモーターカセットが構築され、ＦＲＴ部位及びハイグロマイシン耐性遺伝子及び重鎖定常領域を含む部位特異的組込み用ベクター内への構築物全体の移送を可能にした。誘発的発現用プロモーターカセットも同じく使用可能であると考えられている。その上、反対方向での転写を結果としてもたらす尾−尾（tail-to-tail）又は単方向転写用の尾−頭（tail-to-head）の関係にプロモーターを置くこともできる。ｌａｃＺ−ゼオシン融解遺伝子を安定した形で発現するＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））が実験のために使用され、細胞に抗生物質ゼオシン耐性を付与した。細胞は、ゼオシンを含有する培地の中に維持された。Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するプラスミドと合わせて異なる選択マーカー（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）及びポリクローナル抗体をコードする部位特異的組込み用のベクターライブラリーで、細胞をまとめてトランスフェクションに付した。発現の制御のためには、誘発可能なプロモーターも同様に使用可能である。トランスフェクションの後、ハイグロマイシンの存在下で細胞を培養した。ハイグロマイシン耐性を有する細胞をその後、従来の小型培養フラスコ、Ｎｕｎｃ多層セルファクトリ、小型高収率生物反応器（ミニパーム（ＭｉｎｉＰｅｒｍ）、インテグラセルライン（ＩＮＴＥＧＲＡ−ＣＥＬＬｉｎｅ））及びスピナーフラスコから中空繊維−及び生物反応器に至るまでといった異なる培養システムの中で成長させた。ＥＬＩＳＡを用いて、抗体産生について細胞をテストした。長時間、選択圧無しで、血清を含まない培地中での懸濁液成長の可変性についてポリクローナル細胞系統を選択した。細胞系統のストックをハイグロマイシンの存在下で成長させた。
【０１４６】
発現系内のポリクローナル性の保存の評価
本発明に従うと、ポリクローナル性が実際に改変された時点で産生を停止させることが可能であるような形で、産生中に発現系内のポリクローン性が重大な改変を受けないように保証することが往々にして重要である。これは、変異体核酸配列の相対的発現レベルを監視することによって本発明に従って行なわれる。発現レベルは例えば、ＲＦＬＰ分析、アレイ又はリアルタイムＰＣＲなどを用いてｍＲＮＡレベルで、又は２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析法又はさまざまなクロマトグラフィ技術を用いてタンパク質レベルで、監視可能である。これらの技術を用いて、一定数の個別発現レベル全てについて基準値を確立し、その後、発現レベルが（合計して及び相対的にの両方で）変化したか否かを評価するべく産生中培養から試料を取り出すことが可能となる。発明の通常の実践においては、基準値をとり囲む値の範囲を確立することができ、相対的発現レベルがその範囲外にあることがわかった場合には、産生は終結される。
【０１４７】
発現系の安定性及び再現性を評価することができるように、ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）、ウシアルカリホスフォターゼ（ＡＰ）、ヒトβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）、ヒト−ハプトグロビン（ＨＡＰ）、ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）及びニワトリ卵白リゾチーム（ＬＹＳ）に対する反応性をもつ６つの別個のＦａｂフラグメントをコードするベクター（ミニ６ライブラリー）が調製された。異なるＦａｂ  フラグメントコーディング配列は同一ではなく、従って、異なるＲＦＬＰパターンを示し、かくして遺伝子型組成を分析するためにＲＦＬＰを使用することができる。
【０１４８】
ミニシックス（mini six）ライブラリーは、頭−頭のプロモーターカセットを伴う発現ベクターを用いたトランスフェクションによりＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞内に導入された。ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、既知の組合せでの６つの抗体を発現するポリクローナル細胞系統を結果としてもたらす６つの別個の抗体をコードする問題の発現ベクターの混合物とまとめてトランスフェクションさせるか又は、問題の発現ライブラリーの１成員で細胞を個別にトランスフェクションに付し、その後トランスフェクションを受けた細胞を混合し、既知の組合せで６つの抗体を発現する組換え型ポリクローナル抗体発現細胞系統を生成させた。このようにして、組換え型ポリクローナル抗体発現細胞系統の１つ又は複数の個別クローンに対する偏向無く哺乳動物細胞のトランスフェクションが発生しているか否かをテストすることが可能であった。さらに、増殖偏向及び抗体のポリクローナル組成物の精製によってひき起こされる偏向を検査することが可能であった。
【０１４９】
抗−オボアルブミン組換え型ポリクローナル製造細胞系統の確立
関連するクローンを同定するため、ファージ提示及びＥＬＩＳＡを用いてオボアルブミン結合ファージクローンを選択した。オボアルブミン結合クローンから抗体を同定するために、２つの構成すなわち、オボアルブミンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート又はＰＶＤＦ膜上のオボアルブミンの固定化に基づく高密度スクリーニング方法（ＨＤＳ）を使用した。この要領で、一群の抗体が得られ、その一部分は、ＥＬＩＳＡプレート上で固定化されたオボアルブミンを認識し、その他はＰＶＤＦ膜上に固定化されたオボアルブミンを認識する。
【０１５０】
選択されたオボアルブミン結合ファージクローンは、哺乳動物プロモーターにリンクされかつ抗体発現のためｐＳｙｍｖｃ２０型（図４Ｄ）のベクター内に移送されてｐＳｙｍｖｃ２１型（図４Ｅ）のクローン収集物を生成する可変重鎖及びカッパ鎖ＤＮＡ配列を有していてよい。ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞は、ｐＳｙｍｖｃ２１クローンの混合物でまとめてトランスフェクションを受けるか、又は、細胞は１つのｐＳｙｍｖｃ２１抗体発現プラスミドで個別にトランスフェクションを受けその後その他のオボアルブミン結合抗体を発現するトランスフェクションを受けた細胞が混合される。抗オボアルブミンポリクローナル抗体産生細胞系統を作り上げる手順は、個別の抗体発現細胞のＤＮＡ配列決定、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ及びＲＦＬＰ分析ならびに、産生された抗体混合物のＥＬＩＳＡ、２次元（２Ｄ）液体クロマトグラフィ（ＬＣ）及び質量分析法（ＭＳ）によって監視できる。
【０１５１】
細胞の培養及び組換え型ポリクローナル抗体の産生
上述の通りに産生されたポリクローナル細胞系統は、細胞のゲノム内に挿入された変異体核酸配列によりコードされた問題のポリクローナルタンパク質を発現するのに適した条件下で適切な培地内で成長させられる。細胞培養は、複数のステップで実施可能である。第１のステップは、部位特異的の組込み体についてポリクローナル細胞系統が選択されるステップである。哺乳動物細胞を使用する場合、選択された細胞は次に好ましくは懸濁状態での成長ならびに無血清条件に適合される。これは、１ステップ又は２ステップで、選択圧を用いて又は用いずに実施可能である。ポリクローナル細胞系統が適切な条件に適合された時点で、スケールアップを開始することができる。この時点で、作業用細胞ストックを凍結させることができる。好ましくは３０〜１００リットルの間の生物反応器が用いられるが、それより小さい又は大きい生物反応器を利用してもよい。適切な生産時間及び生物反応器サイズの選択は、バッチからのタンパク質の所望の収率及び細胞系統からの発現レベルによって左右される。時間は、数日から３ヵ月まで変動し得る。発現された組換え型ポリクローナルタンパク質は、細胞又は上清から単離される。組換え型タンパク質は、当業者により既知の手順に従って特徴づけされる。精製及び特徴づけ手順の例が以下で列挙されている。
【０１５２】
培養上清からの組換え型ポリクローナルタンパク質の精製
培養上清からの特定のタンパク質の単離は、タンパク質の物理化学特性の差、例えば分子量、正味電荷、疎水性又は特定のリガンド又はタンパク質に向かう親和力の差を利用するさまざまなクロマトグラフィ技術を用いて可能である。かくして、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて分子量に従って、又は、イオン交換（カチオン／アニオン）クロマトグラフィを用いて又代替的にはクロマトフォーカシングを用いて正味電荷に従ってタンパク質を分離することができる。同様にして、特定の固定化されたリガンド又はタンパク質に向かう親和力の差を利用するアフィニティクロマトグラフィ又は疎水性相互作用クロマトグラフィを用いて、疎水性に従ってタンパク質を分離することもできる。タンパク質の複合混合物の分離は、かくして、さまざまなクロマトグラフィ原理の逐次的組合せによって達成可能である。かくして、イオン交換クロマトグラフィを用いて例えば正味電荷に従ってタンパク質の混合物を最初に分離し、これに続いて、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて分子量に従って又は、選択された高濃度の塩の存在下で疎水性相互反応クロマトグラフィを用いて疎水性に従って、類似の正味電荷のタンパク質を分離することができる。
【０１５３】
例えば腹水、細胞培養上清及び血清といった異なる供給源からのＩｇＧ（ポリクローナルならびにモノクローナル）及びＴｃＲの精製のためには、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用及びゲルろ過といったようなその後の精製ステップと組合わせたアフィニティクロマトグラフィが使用されることが多かった。分離がタンパク質（単複）とクロマトグラフィマトリクスにカップリングされた特定のリガンドの間の可逆的相互作用に基づいている親和力分離は、高い選択性、通常は高い容量及びより小さい体積への濃縮を提供する容易かつ迅速な方法である。２つの細菌細胞表面タンパク質であるプロテインＡ及びプロテインＧは、Ｆｃ領域に対する高い親和力を有し、固定化された形態で、さまざまな種からのポリクローナルＩｇＧ及びそのサブクラスの精製及び免疫複合体の吸収及び精製を含めた数多くの常套的適用のために使用されてきた。
【０１５４】
宿主細胞タンパク質、漏出したプロテインＡ及びＤＮＡを除去するためには、以下のアフィニティクロマトグラフィ、下流側クロマトグラフィステップ、例えばイオン交換及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィを実施することができる。
【０１５５】
最終精製ステップとしてのゲルろ過を、２量体及びその他の凝集体といったような汚染物質分子を除去しかつ試料を貯蔵用緩衝液中に移送する目的で使用することができる。供給源及び発現条件に応じて、要求される抗体純度レベルを達成するための付加的な精製ステップを内含することが必要であるかもしれない。かくして、治療用途で抗体を精製するためには、プロテインＡ及びゲルろ過クロマトグラフィとの組合せで、疎水性相互作用クロマトグラフィ又はイオン交換クロマトグラフィが使用されることが多い。
【０１５６】
その他の抗体クラスを精製するためには、プロテインＡ及びＧがＩｇＡ及びＩｇＭを結合させないことから、代替的なアフィニティクロマトグラフィ媒質を使用しなければならない。免疫親和力精製を使用することができ（固相にカップリングされた抗−ＩｇＡ又は抗ＩｇＭモノクローナル抗体）、そうでなければ、イオン交換及び疎水性相互反応を含めた多重ステップ精製戦略を利用することができる。
【０１５７】
構造的特徴づけ
抗体及びＴｃＲといったポリクローナルタンパク質の構造的特徴づけには、混合物の複雑性に起因して高い分解能が必要となる（クローン多様性及びグリコシル化）。ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ又は電気泳動といったような従来のアプローチは、個別抗体の間で弁別するのに充分な分解能を有していない可能性がある。複合タンパク質混合物のプロファイリングのためには２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）が使用されてきており、その後に、質量分析法（ＭＳ）又は液体クロマトグラフィ（ＬＣ）−ＭＳ（例えばプロテオミクス）が行なわれた。タンパク質の電荷及び質量に基づく分離を組合せた２Ｄ−ＰＡＧＥが、血清試料中のポリクローナル、オリゴクローナル及びモノクローナル免疫グロブリンの間での弁別のために有用であることが立証された。しかしながら、この方法には、いくつかの制限がある。クロマトグラフィ技術、特にエレクトロスプレーイオン化ＭＳにカップリングされた毛管及びＬＣクロマトグラフィは、複合ペプチド混合物の分析のために応用されることが増々多くなってきている。ＬＣ−ＭＳはモノクローナル抗体の特徴づけのために使用されてきており、最近はポリクローナル抗体軽鎖のプロファイリングにも使用されている。非常に複雑な試料の分析は、２次元（又はそれ以上）での分離により得ることのできるクロマトグラフィシステムのより高い分解能を必要とする。かかるアプローチは、第１の次元ではイオン交換に基づき、任意にはＭＳにカップリングされた第２の次元では逆相クロマトグラフィ（又は疎水性相互作用）に基づくものである可能性がある。
【０１５８】
機能的特徴づけ
ポリクローナルタンパク質は、例えば、同じ標的に向かっての特異性又は類似の活性をもつポリクローナルタンパク質との比較可能性研究を通して機能的に特徴づけすることができる。かかる研究は、インビトロでもインビボでも実施可能である。
【０１５９】
ポリクローナル抗体のインビトロでの機能的特徴づけというのは、例えば、未精製細胞溶解物からの標的抗原の分析的分離のためのきわめて特異的な技術である免疫沈降であり得る。免疫沈降をＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くタンパク質染色（クマシーブルー、銀染色又はビオチン標識）及び／又は免疫ブロット法といったその他の技術と組合せることによって、例えば抗原を検出及び定量化すること及びかくして抗体の機能的特性のいくつかを評価することが可能である。この方法は、抗体分子の数の推定もその結合親和力も与えないものの、標的タンパク質の視覚化ひいては選択性を提供する。この方法は、同様に、発現プロセス中に抗原に向かう抗体の潜在的差異（クローン多様性の無欠性）を監視するために使用できる。
【０１６０】
ポリクローナル抗体のインビボでの機能的特徴づけは例えば感染研究であり得る。マウスといったような実験動物を、例えばポリクローナル抗体を発生させる対象である特定のウイルスに感染させることが可能である。この感染の阻害の程度が、ポリクローナル抗体の機能性を表わすことになる。
【０１６１】
治療用組成物
本発明の一実施形態においては、その活性成分として免疫グロブリンスーパーファミリーから選択された組換え型ポリクローナルタンパク質を含む医薬組成物は、癌、感染症、炎症性疾患、アレルギー、喘息及びその他の呼吸器疾患、自己免疫疾患、免疫機能不全、心臓血管疾患、中枢神経系疾患、代謝及び内分泌疾患、移植片拒絶及び望まれない妊娠といったような哺乳動物の疾病の治療及び予防用に意図されている。該哺乳動物は、好ましくは、ヒト、家畜又はペットである。
【０１６２】
本発明の好ましい実施形態においては、該医薬組成物は、活性成分としての組換え型ポリクローナル抗体又は抗体フラグメント及び薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【０１６３】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該医薬組成物は、活性成分としての組換え型ポリクローナルＴ細胞レセプタ又はＴ細胞レセプタフラグメント及び薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【０１６４】
感染症の治療又は予防用には、本発明に従った医薬組成物は、細菌、マイコバクテリア、ウイルス、マイコプラズマ、リケッチア、スピロヘータ、原虫、真菌、蠕虫及び外部寄生虫の中から選択された微生物といったような感染性微生物と反応するか又はこれに結合する能力をもつ問題の組換え型ポリクローナルタンパク質を含む。
【０１６５】
組換え型ヒトポリクローナルタンパク質は、単位剤形の形で薬学的に受容可能な希釈剤、担体又は賦形剤の中に入って投与され得る。例えば過剰な細胞増殖によってひき起こされる疾病を患う患者に該化合物を投与するための適切な処方又は組成物を提供するには、従来の薬学的実践方法を利用してもよい。投与は、患者が症状を示す前に始まってよい。任意の適切な投与経路を利用してよく、例えば、投与は非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、関節包内、髄腔内、槽内、腔腔内、鼻腔内、エアゾル、座薬又は経口投与でありうる。例えば、治療用処方は、液体溶液又は懸濁液の形をしていてよく、経口投与のためには、処方は錠剤又はカプセルチューインガム、パスタの形をしていてよく、皮ふに塗布するのに適した組成物は、クリーム、軟こう、ローション、ジェル、パッドその他の形をしていてよく、膣又は泌尿生殖器粘膜上への適用に適した組成物は、ｖａｇｉｔｏｒｉｅｓ、ジェル他の形をしていてよく、鼻腔内処方については、粉剤、点鼻薬又はエアゾルの形をしていてよい。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、それ自体既知の要領、例えば従来の溶解、凍結乾燥、混合、造粒及び調合プロセスを用いて調製される。該医薬組成物は、従来の薬学的実践方法に従って処方可能である（例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：薬学の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）（第２０版）、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、ペンシルバニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）、及び薬学技術百科辞典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｊ．スワーブリック（Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ）及びＪ．Ｃ．ボイラン（Ｂｏｙｌａｎ）編、１９８８−１９９９、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク州ニューヨークを参照のこと）。
【０１６７】
活性成分の溶液と同様、懸濁液も、そして特に等張水溶液又は懸濁液が好んで用いられ、例えば活性成分を単独で又はマンニトールといった担体と合わせて含む凍結乾燥された組成物の場合には、このような溶液又は懸濁液を使用に先立って生成することが可能である。該医薬組成物は、滅菌されていてよく、かつ／又は例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節用の塩及び／又は緩衝液などの賦形剤を含んでいてよく、それ自体既知の要領、例えば従来の溶解又は凍結乾燥プロセスを用いて調製される。前記溶液又は懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン又はゼラチンといった造粘物質を含み得る。
【０１６８】
注射用組成物は、無菌条件下で通例の要領で調製される。同じことは、アンプル又はガラスビン内への組成物の導入及び容器の密封にもあてはまる。
【０１６９】
経口投与のための医薬組成物は、固体担体と活性成分を組合せ、望まれる場合には、結果として得られた混合物を造粒し、望ましいか又は必要である場合には、適切な賦形剤の添加後混合物を錠剤、糖剤コア又はカプセルの形に加工することによって得ることができる。活性成分が規定された量で拡散するか又は放出されるようにするプラスチック担体の中にそれらを包含させることも同じく可能である。
【０１７０】
医薬組成物は、約１％〜約９５％、好ましくは約２０％〜約９０％の活性成分を含む。本発明に従った医薬組成物は、例えばアンプル、ガラスビン、座薬、糖剤、錠剤又はカプセルといった単位剤形をとり得る。
【０１７１】
処方は、疾病又は身体条件に対する療法を提供するべく治療上有効な量（例えば、病的状態を防止、削除又は低減する量）でヒトの患者に投与することができる。投与されるべき治療薬の好ましい投薬量は、障害のタイプ及び程度、特定の患者の全身的健康状態、化合物賦形剤の処方、及びその投与経路といった変数によって左右される確率が高い。
【０１７２】
望ましい場合には、組換え型ヒトポリクローナル抗体での治療を、より伝統的な療法と組合わせることができる。例えば、癌治療においては、かかる組合せ療法は、外科手術又は化学療法又はその他の抗癌剤の投与の形をとり得る。
【０１７３】
発明のもう１つの実施形態においては、本発明に従った医薬組成物は、細菌、マイコバクテリア、ウイルス、マイコプラズマ、リケッチア、スピロヘータ、原虫、真菌、蠕虫及び外部寄生虫の中から選択された微生物といったような感染性微生物と反応するか又はこれに結合する能力をもつ問題の組換え型ポリクローナルタンパク質を含む。
【０１７４】
発明に従った組成物の治療的使用
本発明に従った医薬組成物は、哺乳動物における疾病の治療、改善又は予防用に使用可能である。当該医薬組成物で治療できる疾病としては、癌、感染性疾患、炎症性疾患、アレルギー、喘息及びその他の呼吸器疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾患、中枢神経系疾患、代謝及び内分泌疾患、移植片拒絶及び望まれない妊娠が含まれる。
【０１７５】
本発明の１つの態様は、組換え型ポリクローナル抗体又は抗体フラグメントが有効量投与される、動物における疾病の治療、改善又は予防用の方法である。さらなる態様においては、組換え型ポリクローナルＴ細胞レセプタ又はＴ細胞レセプタフラグメントが有効量投与される。
【０１７６】
本発明の付加的な形態は、癌、感染症、炎症性疾患、アレルギー、喘息又はその他の呼吸器疾患、免疫機能不全、自己免疫疾患、心臓血管疾患、中枢神経系疾患、代謝疾患、内分泌疾患、移植片拒絶及び望まれない妊娠から成る群から選択された疾病の治療用の組成物の調製を目的とする、組換え型ポリクローナル抗体又は組換え型ポリクローナルＴ細胞レセプタ又は抗体又はＴ細胞レセプタのフラグメントの使用にある。
【０１７７】
診断用途及び環境検出用途
発明のもう１つの実施形態は、診断用キット及び環境検出用途向けキットならびにこれらのキットの使用方法に向けられている。本発明に従ったキットは、検出可能な標識で標識されているか又は非標識検出用に標識されていない本発明に従って調製された組換え型ポリクローナルタンパク質を含んでいる。標識されている場合、当該組換え型ポリクローナルタンパク質は、標的分子を含有している疑いのある試料に対し添加され得、該標識の有無が標的分子の有無を表わす。テストされるべき試料は、血液、血清、血漿、髄液、リンパ又は尿といったような体液の試料又は汚染物質が隠れている疑いのある環境供給源からの試料といった哺乳動物以外の試料であり得る。哺乳動物以外の試料は、水、空気又は汚染土であり得る。非標識検出は、標的分子を捕捉するために組換え型ポリクローナルタンパク質が使用される、結合時点でのＢＩＡ  ｃｏｒｅの屈折変化の測定を包含する。
【実施例】
【０１７８】
以下の実施例は、予め特徴づけされた染色体「ホットスポット」部位内への部位特異的組込みによって問題の遺伝子（単複）／ベクター（単複）が挿入されている高産生細胞系統内で、組換え型ポリクローナル抗体がいかに発現され産生されるかについて記載する。
【０１７９】
実施例では、宿主細胞としてＣＨＯ細胞が利用された。その利点としては、適切な成長培地の入手可能性、培養中で高密度に至るまで効率よく成長できるその能力、及び生物学的に活性な形での抗体といった哺乳動物タンパク質を発現するその能力、がある。
【０１８０】
一般に、本発明に従ったＥ．ｃｏｌｉの形質転換及び哺乳動物細胞のトランスフェクションは、従来の方法に従って実施されることになる。本発明をより良く理解できるように、以下の実施例は、ベクター例の構築及び組換え型ポリクローナルタンパク質発現のための組換え型ポリクローナル製造細胞系統を生産する上でのその利用について記載する。
【０１８１】
以下の実施例は、本発明を例示しているが、本発明の範囲を制限するものとみなされるべきものではない。
【０１８２】
実施例１
部位特異的組込み対無作為組込み
以下のトランスフェクション実験のためには、ＣＨＯＦｌｐ−Ｉｎ−細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州、カールスバッド）が使用された。リポータ遺伝子としてヒト分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を用いて、系の効率をテストした。次の２つのプラスミド構築物を調製した：
１．ｐｃＤＮＡ３．１  ｈｙｇｒｏ＋（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州、カールスバッド）内に挿入されたＳＥＡＰ（無作為組込み用）。
２．ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州、カールスバッド）内に挿入されたＳＥＡＰ（部位特異的組込み用）。
【０１８３】
２つのプラスミド構築物は、調節要素すなわちプロモーター、ポリアデニル化などに関しきわめて類似しており、このため部位特異的組込みと無作為組込みを比較するためにこれらのプラスミドを使用することが可能になっている。
【０１８４】
ＣＨＯＦｌｐ−Ｉｎ  細胞を、プラスミド構築物１単独か又はリコンビナーゼコーディングプラスミドｐＯＧ４４と合わせたプラスミド構築物２で、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載された手順に従ってトランスフェクションに付された。トランスフェクタントをハイグロマイシンを用いて選択し、トランスフェクタントのプールからのＳＥＡＰの産生を測定した。
【０１８５】
部位特異的組込みによるトランスフェクションを受けた細胞は、無作為組込みによるトランスフェクションを受けた細胞に比べて約６倍産生し、該系及び該細胞系統の効率を証明した。
【０１８６】
実施例２
宿主細胞内の部位特異的組込みのための発現ベクターの設計と調製
宿主細胞のホットスポット染色体領域内への部位特異的組込みに適した、以下のＤＮＡ要素を含む発現ベクターを、組立てることができる：
【０１８７】
ａ）ハイグロマイシン耐性遺伝子にリンクされたＦＲＴ組換え部位、
ｂ）ｐＵＣ複製開始点、
ｃ）アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）
ｄ）アンピシリン（ｂｌａ）耐性遺伝子の発現を可能にするｂｌａ−プロモーター、
ｅ）問題のタンパク質をコードする遺伝子（単複）（ＧＯＩ）、
ｆ）ＧＯＩの発現を可能にするプロモーター（単複）；及び
ｇ）任意には、組込み部位又はＩＲＥＳにおける発現を増大するための、エンハンサ又はＵＣＯＥといった付加的な転写又は翻訳調節要素。
【０１８８】
発現ベクターの構築をより良く理解できるようにするため、各要素についてさらに詳しく記載する：
【０１８９】
ａ）大部分の単一組込み体を伴う１つの細胞系統のＦｌｐリコンビナーゼ媒介組込み及び選択のためハイグロマイシン耐性遺伝子にリンクされたＦＲＴ組換え部位が使用された。ハイグロマイシン遺伝子にはプロモーターも先行しておらず、又は転写開始コドンも備わっていないが、遺伝子の３’のところでポリアデニル化シグナルが付加された。使用されたＦＲＴ部位は、５’−ｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｃｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃ−３（配列番号１）であった。
【０１９０】
ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞内での高コピー数の複製を可能にするため、ｐＵＣ複製開始点を内含させた。
【０１９１】
ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体の選択を可能にするアンピシリン（ｂｌａ）耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ）を内含させた。
【０１９２】
ｄ）ｂｌａ−プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ内のアンピシリン（ｂｌａ）耐性遺伝子の発現を可能にした。
【０１９３】
ｅ）問題のタンパク質をコードするＧＯＩ、例えば組換え型ポリクローナルタンパク質、抗体、抗体の重鎖及び軽鎖、ならびに抗体分子の定常領域又は可変領域のいずれかの全て又は一部分をコードするヌクレオチド配列、及び任意には抗体分子の発現を制御する調節ヌクレオチド配列の全て又は一部分を内含させた。
【０１９４】
重鎖のための免疫グロブリン遺伝子座としては、Ｖ．Ｄ．Ｊ及びスイッチ領域（イントロンとしても知られる介在配列を含めたもの）及び特定の重鎖定常領域遺伝子に付随する又はこれに隣接するフランキング配列の全て又は一部分が含まれ得るがこれらに制限されるわけではなく、これには、定常領域（イントロンを含む）内又はその下流にある領域が含まれ得る。
【０１９５】
軽鎖のための免疫グロブリン遺伝子座としては、Ｖ、Ｊ領域、その上流側フランキング配列及び軽鎖定常領域遺伝子に付随する又はこれに隣接する介在配列（イントロン）が含まれ得るがこれらに制限されるわけではなく、これには、定常領域（イントロンを含む）内又はその下流にある領域が含まれ得る。
【０１９６】
抗体の定常領域の全て又は一部分の修飾のためには、本発明の修飾配列には、特定のエフェクタ機能、クラス及び／又は由来をもつ抗体定常領域（例えばヒト免疫グロブリン又はその他の任意の種のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＥ定常領域）又は、該抗体の定常領域の活性又は特性を修飾する定常領域の一部分、ならびに例えば酵素、毒素などといった修飾済み抗体分子に幾分かの新しい機能を付与するその他の分子をコードする遺伝子が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１９７】
問題のタンパク質をコードする遺伝子（単複）は、分泌経路に遺伝子産物を導く機能的リーダー配列をコードするヌクレオチド配列に操作可能な形でリンクされていてよい。
【０１９８】
さらに、例えば重鎖及び軽鎖を含むポリクローナル抗体といったような問題のタンパク質をコードするＧＯＩに対し３’のところには、強いポリアデニル化シグナルが存在し得る。以下の実施例の中でのマウスイソタイプＩｇＧ１の使用は、例示を目的としたものであって、本発明の範囲を制限する意図をもつものではない。
【０１９９】
ｆ）ＧＯＩの発現を可能にするプロモーターが提供される。従って、発現のためのプロモーター及びエンハンサ要素を含むカセットが記載されている。発現ベクターの中では、各々の抗体遺伝子は、転写カセットの一方向、双方向又は尾−尾方向性のいずれが使用されるかに関わらず、２つの鎖の各々の高レベル発現を導く独自の哺乳動物プロモーター要素によって先行され得る。
【０２００】
双方向の発現方向性では、頭−頭プロモーター形態を使用することができる（かかる系の構築は、その全体が本発明に参照により援用されている米国特許第５，７８９，２０８号明細書の中で詳述されている）。一方向発現系においては、発現のために例えばＩＲＥＳ配列と組合わされた２つのプロモーター又は１つのプロモーターも同様に使用できる。
【０２０１】
頭−頭プロモーターの構築のためには、プロモーターのＰｆｕ  ＰＣＲ増幅が個別に実施される。５’−プライマはプロモーターの最も５’の塩基上で開始することになり、３’末端プライマは、ＸｂａＩ部位といったようなユニーク制限部位を含むことになる。ＰＣＲ増幅に続いてフラグメントは、アガロースゲル上で分離され得、Ｑｌａ  Ｑｕｉｃｋカラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲルから単離され得る。この後、ＸｂａＩ制限消化、６５℃で２０分間の熱不活性化及びＱｉａＱｕｉｃｋを用いたフラグメントのカラム精製が続く。フラグメントはこのとき混合され、付着末端を優先的に連結する酵素であるＥ．ｃｏｌｉリガーゼ（ニューイングランドバイオラブ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））を用いて合わせて連結される。連結混合物は、各プロモーターの５’−プライマでＰＣＲ増幅されて、完全な頭−頭プロモーター（プロモーターＡ／プロモーターＢ）フラグメントを生成する。このフラグメントは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（ＮＥＢ）でキナーゼ処理され、該酵素は、２０分間６５℃で不活性化され、フラグメント（平滑末端）は、問題のベクター（増幅に用いられたプライマがプロモーター領域の各々の側でアニールしてプロモーターを除いた全てを増幅する、ＰＣＲ増幅されたｐＳｙｍｖｃ１０（図４参照）フラグメント）の中に、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）を用いて連結される。
【０２０２】
図１及び２は、それぞれに双方向及び一方向向けのプロモーターを含む発現ベクターを示す。これらのプロモーターは、本発明におけるプロモーターの選択を例示する意図をもつが、それを制限するわけではない。
【０２０３】
ｇ）  発現ベクターは、組込み及び／又はＩＲＥＳ部位における増大した発現のため、エンハンサ及び／又はＵＣＯＥといった付加的な転写及び／又は翻訳調節要素を担持することができる。
【０２０４】
実施例３
開発された製造系内でのポリクローナル性保存の評価
製造系の安定性及び再現性を評価できるようにするため、既知の組合せでの別個の抗体のポリクローナル組成物を発現する細胞系統を調製した。該ポリクローナル抗体組成物は、ミニシックス組成物と呼ばれた。ミニシックス組成物をコードする核酸配列ライブラリーは、ミニシックスライブラリーと呼ばれた。
【０２０５】
（ａ）クローン起源
この実施例では、抗原１〜６に対する反応性をもつＦａｂフラグメント（問題の遺伝子）をコードする以下の配列を使用した：
１．オボアルブミン（ＯＶＡ）。Ｆａｂコーディングフラグメントは、マウス抗−ＯＶＡファージ提示ライブラリーから選択された。
２．アルカリホスファターゼ（ＡＰ）。Ｆａｂコーディングフラグメントは、マウス抗ＡＰファージ提示ライブラリーから選択された。
３．β２−ミクログロブリン（β２ｍ）。Ｆａｂコーディングフラグメントは、β２ｍに対して生成されたハイブリドーマＢＢＭ．１（デンマークのＬ．φ、ペデルセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）博士から寄贈されたもの）からクローニングされた。
４．ヒトハプトグロブリン（ＨＡＰ）、Ｆａｂコーディングフラグメントは、マウス抗ヒトハプトグロビンファージ提示ライブラリーから選択された。
５．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）。このＦａｂフラグメントの親モノクローナル抗体は、ＦＶＩＩＩＦ２５モノクローナル抗体（デンマーク、ノボノルディスク（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋから寄贈されたもの）であった。このＦａｂフラグメントのＶＨ及び完全カッパ鎖をコードするＤＮＡは、ファージミドへとサブクローニングされ、その後、原核性プロモーターカセットが構築物内に挿入された。
６．ニワトリ卵白リゾチーム（ＬＹＳ）。この構築物は、ＶＨ及びＶＫフラグメントのＰＣＲ増幅及びファージミドへのクローニングによって、Ｄ１．３ｓｃＦｖクローン（ブロット（Ｂｏｕｌｏｔ）Ｇ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２１３（４）（１９９０）６１７−６１９）から生成された。
【０２０６】
ファージミドクローンは、形質転換済み大腸菌菌株ＴＧ１グリセロールストック（−８０℃に保たれたもの）の中か又はファージミドＤＮＡ調製物として存在する。
【０２０７】
（ｂ）  ミニシックスライブラリーのＲＦＬＰ分析及びＤＮＡ配列決定
Ｆａｂフラグメントの重鎖をコードするヌクレオチド配列を以下のようにＲＦＬＰによって分析した；ＮｌａＩＩＩ及びＨｉｎｆＩ酵素でのＰＣＲで生成されたフラグメントの消化の後に得られたバンドパターンを検討した。異なるＦａｂフラグメントコーディング配列は非常に異なる容易に区別可能なパターンを示した。ＶＨ及びＶＬフラグメントをコードするヌクレオチド配列を配列決定し、ＲＦＬＰパターンに対応する配列を発見した。さらに、ヌクレオチド配列は、読取り枠をコードし、明確なポリペプチドに翻訳した。
【０２０８】
（ｃ）ミニシックス組成物のＥＬＩＳＡ分析
クローンから発現されたＦａｂフラグメントを、ＥＬＩＳＡを用いて分析し、この中で、全てのＦａｂフラグメントを全ての抗原との反応性について分析した。抗カッパＥＬＩＳＡを用いてＦａｂ発現を監視した。ＥＬＩＳＡ内では、全てのＦａｂフラグメントを、デュプリケートでテストした。全てのクローンはＦａｂフラグメントを発現し、Ｆａｂフラグメントはその関連する抗原と特異的に反応した。ＥＬＩＳＡ分析においては、いかなるバックグラウンド問題も見られなかった。
【０２０９】
個別に形質転換された大腸菌菌株ＴＧ１グリセロールストックの中に６つのファージミドクローンが存在し、これらが以下に記載されている通り接種のためのモデル系の中で使用された。
【０２１０】
（ｄ）既知の組合せでの６つの別個の抗体を伴うポリクローナルモデル系の設計
関連する抗原に対する発現されたＦａｂフラグメントの反応性をテストすることにより、６つの選択されたＦａｂ発現クローン（抗−ＯＶＡ、抗−ＡＰ、抗−β２ｍ、抗−ＨＡＰ、抗−ＦＶＩＩＩ、及び抗−ＬＹＳ）を特徴づけした。これらのクローンは、既知の組合せでの６つの別個の抗体（ミニシックス組成物）の発現及び産生をテストするためのポリクローナルモデル系の一部を成していた。ヌクレオチド配列をコードする全てのＦａｂフラグメント（ミニシックスライブラリー）をファージミドベクター（ｐＳｙｍｖｃ１０により例示されているもの、図４Ａ）内に移送した。
【０２１１】
（ｄ．１）  ファージミドベクターから哺乳動物発現用ベクターへのＧＯＩの個別移送
ファージミドベクターから哺乳動物発現用ベクターへの問題の遺伝子（ミニシックスライブラリー）の移送は、この例では、２ステップ手順によって実施された。第１のステップは、頭−頭方向性で哺乳動物プロモーターカセットで原核性プロモーターを置換することにあった。このステップの後、以下で詳述された図４に例示されているように、ＧＯＩの可変領域、プロモーターカセット及び定常のカッパが発現ベクターに移送された。
【０２１２】
頭−頭プロモーターカセット（プロモーターＡ／プロモーターＢ）は、ＳａｃＩ／ＸｈｏＩ消化を用いそれに続いて細菌から哺乳動物へのプロモーターの交換を結果としてもたらす連結を行なうことによって、各クローンについてファージミドベクター内に挿入された。その後、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ消化物を用いて、可変的重鎖、頭−頭プロモーターカセット（プロモーターＡ／プロモーターＢ）及び完全カッパ鎖（ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩフラグメント）をファージミドベクターから発現ベクターまで移動させた。
【０２１３】
各クローンの個別移送の一例は、図４に流れ図と共に示されている。この図は、ｐＳｙｍｖｃ１２を生成するＳａｃＩ／ＸｈｏＩフラグメント移送を用いて細菌プロモーターを置換するべく頭−頭哺乳動物プロモーターカセット構築物が中に連結されたファージミドベクターの中に問題の重及びカッパコーディング配列（例えばｇｅ０３２ＯＶＡ）が存在している、プラスミドｐＳｙｍｖｃ１０を示す。
【０２１４】
この構築物から、カッパ鎖コーディング配列全体及びプロモーターカセットを含む可変重鎖コーディング配列は、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ移送により哺乳動物イソタイプ−コーディングベクター（ｐＳｙｍｖｃ２０）内に移送された。結果としてのベクター（ｐＳｙｍｖｃ２１）は、問題のマウス抗体（例えば抗−ＯＶＡ  ＩｇＧ１抗体）を発現した。
【０２１５】
６つのクローンの各々からの全カッパ鎖コーディング配列、哺乳動物プロモーターカセット及び可変重鎖コーディング配列は、個別にＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ移送により移送され、結果として哺乳動物発現ベクターｐＳｙｍｖｃ２１をもたらし、このベクターはマウスＩｇＧ１抗体としてＧＯＩコードされた抗体配列の各々を発現する。
【０２１６】
６つのＧＯＩを含む６つの個別ｐＳｙｍｖｃ２１クローンは、ＴＧ１グリセロールストックとして保たれた。
【０２１７】
ＣＨＯ  Ｆｉｐ−Ｉｎ細胞内へのトランスフェクションのためには、ＴＧ１ストックを個別に増殖させ、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の数についてのＯＤ６００正規化の後、６つの培養を混合させ、プラスミド調製のために使用した。組換え型ポリクローナルタンパク質発現のための哺乳動物細胞のバルクトランスフェクションのために、６つのＧＯＩ（ミニシックスライブラリー）を含むこのプラスミド調製物を使用した。
【０２１８】
（ｄ．２）ファージミドベクターから哺乳動物発現用ベクター内へのＧＯＩの大量移送
ファージミドベクター内に位置設定され６つの別個のＦａｂフラグメント（抗ＯＶＡ、抗ＡＰ、抗−β２ｍ、抗ＨＡＰ、抗−ＦＶＩＩＩ及び抗−ＬＹＳ）についてコードするＧＯＩ（ミニシックスライブラリー）（ここではＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩフラグメント）を、６つのベクター構築物の混合物として哺乳動物発現用ベクター内にまとめて移送し、結果として６つの別個の発現ベクターをもたらした。
【０２１９】
大量移送に関する実験的手順は、それがまとめて実施された、すなわち（頭−頭プロモーターカセット及び完全カッパ鎖を含め、可変重鎖をコードする）６つのＧＯＩ全てが６つのファージミドベクターの混合物として同時に移送された、という点を除いて、（ｄ．１）に記載した手順に従っている。
【０２２０】
ミニシックスライブラリーのプラスミド調製物
プラスミド調製物１は、（抗体コーディング配列がベクターｐＳｙｍｖｃ１０内に含まれている状態で）６つのファージミドベクターの混合物のプラスミド調製物を意味する。
【０２２１】
プラスミド調製物２は、哺乳動物プロモーターカセット構築物との原核性プロモーターの交換を結果としてもたらす、大量移送ステップ１後のベクターｐＳｙｍｖｃ１２（図４ｃ）に含まれるコーディング配列を伴う６つのファージミドベクターのプラスミド調製物を意味する。
【０２２２】
プラスミド調製物３というのは、哺乳動物発現ベクター（ｐＳｙｍｖｃ２１）に対するｐＳｙｍｖｃ１２からの可変重鎖、頭−頭プロモーターカセット及び完全カッパ鎖の交換を提供し、かくして全長マウスＩｇＧ１抗体としての６つの選択された抗体の発現を可能にする大量移送ステップ２の後のプラスミド調製物（図４Ｄ参照）を意味する。
【０２２３】
大量移送において使用されたプラスミド調製物で形質転換されたＴＧ１細胞の遺伝子型特定
ＴＧ１細胞を、まとめて電気穿孔によってミニシックスライブラリーで形質転換させ、２ｘＹＴ（ＳｉｇｍａＹ２６２７）プレート上での一晩のインキュベーションの後、個別コロニーを採集した。各々の実験において、１８０のコロニーを採集し、２ｘＹＴ液体培地内で４時間、９６ウェルのフォーマットでインキュベートした。培養のアリコートを水で希釈し、変性させ、ＰＣＲ内で鋳型として使用した。全ての実験において、可変重鎖を増幅した。ファージミドベクター（ｐＳｙｍｖｃ１０−型）のプライマ配列は、以下のとおりであった：
５’−ＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＴＧＡＧＧＣ−３’（配列番号２）及び５’−ＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号３）
【０２２４】
哺乳動物プロモーターカセットを伴うベクターのためのプライマは（ｐＳｙｍｖｃ１２−型）、以下のとおりであった：
５’−ＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＴＧＡＧＧＣ−３’（配列番号４）及び５’−ＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号５）
【０２２５】
ｐＳｙｍｖｃ２１構築物のためのプライマは以下のとおりであった：
５’−ＣＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号６）及び５’−ＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号７）。
【０２２６】
明白な遺伝子型特定を確実にするため、全てのＰＣＲ産物をＮｌａＩＩＩ及びＨｉｎｆＩの両方で消化した。消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分析し、ＥｔＢｒ染色によりバンドを視覚化した。ＲＦＬＰにより決定されたフラグメントパターンと類似する個別遺伝子型の数は、採集されたコロニーの合計数の中の６つの抗体の各々を表わす個別のコロニーの数に対応する。
【０２２７】
（ｄ．２ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内でのＤＮＡ増幅（２−ステップ増幅方法）の後のファージミドベクターから哺乳動物ベクターへの大量移送
プラスミド調製物１を、ミニシックスライブラリーを構成する６つのファージミドベクターのうちの１つを含む６つのＥ．ｃｏｌｉＴＧ１グリセロールストックの各々から調製した。ストックを個別に調製し、Ｅ．ｃｏｌｉの数についてのＯＤ６００正規化の後、６つの培養を等量で混合し、プラスミド調製のために使用して結果としてプラスミド調製物１を得た。エレクトロコンピテントＴＧ１細胞への形質転換及びその後のＲＦＬＰ分析によって、プラスミド調製物１内の６つのファージミドベクターの遺伝子型分布をテストした。ＴＧ１細胞内の異なる遺伝子型の分布は図５に示されている。
【０２２８】
６つの選択されたＦａｂフラグメント遺伝子型の等しい混合物を発現するポリクローナルファージミドベクターを含むプラスミド調製物１をＳａｃＩ／ＸｈｏＩで消化させた。その後、連結により、頭−頭プロモーターカセット（ＣＭＶプロモーター／ＭＰＳＶプロモーター）を挿入した。ベクター内のプロモーター交換後のベクターの遺伝子型分布を、連結ステップからのＤＮＡでの形質転換後にＴＧ１細胞内でテストした（図６）。
【０２２９】
細胞をプレート固定し、大きい（２４５ｍｍ×２４５ｍｍ）２×ＹＴ寒天プレート上で成長させ、今や頭−頭プロモーターカセットを含有するファージミドベクター（ｐＳｙｍｖｃ１２）を生成するためにプラスミド調製物を調製した。
【０２３０】
プラスミド調製物２から、プロモーターカセット及び完全カッパ鎖配列を含む可変重鎖コーディング配列をＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ消化物によりファージミドベクターから切り取り、すでにマウスＩｇＧ１の定常領域ドメインを含むベクター（ｐＳｙｍｖｃ２０）内に移送した。こうして、ｐＳｙｍｖｃ２１ベクターの収集物が結果としてもたらされ、これは、全長マウスＩｇＧ１抗体として６つの選択された抗体クローンの可変領域を発現する。
【０２３１】
代替的には、プロモーター移送は、イソタイプをコードする哺乳動物ベクターにおいて、哺乳動物ベクターに対する問題のＤＮＡの移送のためのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩで始まる制限消化物そして次にプロモーター領域の挿入のためのＳａｃＩ／ＸｈｏＩ制限消化物フラグメントの順序を逆転させて実施することもできる。
【０２３２】
可変重鎖コーディング配列、プロモーターカセット及び全カッパ鎖コーディング配列を発現ベクター内に移送した後の遺伝子型の分布を、第２の連結ステップからのＤＮＡでＴＧ１細胞を形質転換することによってテストした（図７）。細胞を大きい（２４５ｍｍ×２４５ｍｍ）２×ＹＴ寒天プレート上に固定し、６つのクローンの可変領域がマウスＩｇＧ１抗体枠組の状況下で発現されているプラスミド調製物３を調製した（ｐＳｙｍｖｃ２１）。
【０２３３】
プラスミド調製物３は、組換え型ポリクローナル抗体発現のための組換え型ポリクローナル製造細胞系統を生成するべく哺乳動物細胞のバルクトランスフェクションのために用いることができる。
【０２３４】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内のＤＮＡ増幅の後のファージミドベクターからイソタイプコーディング哺乳動物ベクターへの大量移送の結果は、個別に増殖させ混合させた後に６つのベクター構築物の均衡のとれた分布を得ることが可能であるということを示した（プラスミド調製物１、図５）。６つの構築物は、プロモーターカセットの交換後（プラスミド調製物２、図６）ならびにマウスＩｇＧ１イソタイプコーティングベクター内への挿入後（プラスミド調製物３、図７）、全て比較可能なレベルで検出可能であった。
【０２３５】
（ｄ．２ｂ）プラスミド調製物１ステップ後のＥ．ｃｏｌｉにおけるＤＮＡ増幅無しのファージミドベクターから哺乳動物発現用ベクターへの大量移送（１ステップ増幅方法）
６つの選択されたＦａｂフラグメント遺伝子型の等しい混合物を発現するポリクローナルファージミドベクター（ｐＳｙｍｖｃ１０）を含むプラスミド調製物１からのＤＮＡ（ここでは２５μｇを使用）を、プロモーターの交換のためＳａｃＩ／ＸｈｏＩで消化させた。ＳａｃＩ／ＸｈｏＩベクターフラグメントを精製し、頭−頭プロモーターカセット（ＣＭＶプロモーター／ＭＰＳＶプロモーター）と連結させた。いかなる増幅も実施せずにプロモーターを交換した後、ＣＭＶ／ＭＰＳＶプロモーターカセットを伴うベクターを、大量移送用ファージミドベクターから哺乳動物発現用ベクターへと、プロモーターカセット及び全カッパ鎖コーディング配列を含めた可変重鎖コーディング配列で全領域を切取るためにＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩで消化させた。可変重鎖、プロモーターカセット及びカッパ鎖をコードするＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをマウスＩｇＧ１−コーディングベクター（ｐＳｙｍｖｃ２０）内に連結させた後、マウスＩｇＧ１全長抗体という状況下で６つの選択されたクローンの可変領域を発現する発現ベクターを獲得した。この発現ベクターの組成は、図１に例示されている。
【０２３６】
ベクター内のプロモーター交換及び可変重鎖、プロモーターカセット及び完全カッパ鎖をコードするヌクレオチド配列の哺乳動物発現用ベクター内への移送を結果としてもたらす大量移送の後、第２の連結ステップからのプラスミドによるＴＧ１細胞の形質転換により、遺伝子型の分布をテストした。大きい（２４５ｍｍ×２４５ｍｍ）２×ＹＴ寒天プレート上に細胞を固定し、この２重消化／連結プラスミド調製物というプラスミド調製物を調製した（ベクターｐＳｙｍｖｃ２１、この中では、６つのクローンの可変領域は、ｄ、２ａからのプラスミド調製物３に対応する、マウスＩｇＧ１抗体という状況下で発現される）。１ステップ増幅方法からのプラスミド調製物による形質転換後のＴＧ１細胞内の遺伝子型分布は、図８に示されている。
【０２３７】
１ステップ増幅方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ内での増幅中では通常削除されている望ましくない連結産物の生成の結果としてもたらされる６つのＦａｂコーディング配列からの重鎖及び軽鎖の間の幾分かのスクランブリングを導入する可能性がある。しかしながら、このようなスクランブリングが発生した場合、充分なクローン多様性を確実に維持できるようにするためスクリーニングステップを導入することができる。
【０２３８】
（ｄ．２ｃ）プロモーター交換後の哺乳動物細胞の直接的トランスフェクション
２ステップ増幅方法又は１ステップ増幅方法のいずれかからのミニシックスライブラリーのプラスミド調製物からの産物を、組換え型ポリクローナル抗体発現のために哺乳動物細胞をまとめてトランスフェクションすることに直接使用することができる。
【０２３９】
（ｄ．３）トランスフェクションを受けた哺乳動物細胞の試験
ミニシックスポリクローナルモデル系の既知の抗体組合せを使用してテストを行ない、哺乳動物細胞内への大量移送及びトランスフェクションを、クローン多様性を維持するような形でかつトランスフェクション及びその後の培養中の抗体可変配列遺伝子型の組成に偏向を導入することなく確実に発生させることができる。大量移送、バルクトランスフェクション及び哺乳動物発現のプロセス全体を通して遺伝子型組成を監視する方法には、以下のものが含まれ得る：
−単離されたクローンのＤＮＡ配列決定、
−個別クローンのＲＦＬＰ分析、
−産生された抗体混合物のＥＬＩＳＡ、
−産生された抗体混合物の質量分析、
−異なる重鎖及び軽鎖を発現するｍＲＮＡ及びゲノム配列の相対的組成物のＴａｑｍａｎＰＣＲ。
【０２４０】
トランスフェクションプロセス中に導入された遺伝子型組成の偏差は、それが万一発生する場合、無作為組込み又は多重組込み体によりひき起こされ得る。「発明を実施するための最良の形態」の中で記載しているように、部位特異的組込み用に予め設計された宿主細胞系統を用いた場合に問題がひき起こされる確率は低い。しかしながら、これをさまざまな形で制御することは可能である。無作為ゲノム位置（部位特異的位置以外の場所）における組込みに反対する選択は、例えばリポフェクタミンでトランスフェクションを実施する場合には１μｇ／１０７個の細胞又電気穿刺法によりトランスフェクションを行なう場合には０．２μｇ／１０７個の細胞といったような非常に少量のＤＮＡを用いて行なうことができる。同様に、組込まれるべきＤＮＡは、無作為組込みのためには不利であるものとして知られている形態であるスーパーコイル状の形で供給され得る。
【０２４１】
予め設計された標的部位の外側での単一の又は多数の組込みは、選択可能マーカーがプロモーター又は開始コドン無くゲノム内に存在することになるため、負の選択により除去されることになる。従って、これらの無作為組込み事象の受容細胞は選択プロセスを生き延びる事ができない。
【０２４２】
組換え事象の１つが標的部位において発生する多数の組込みを有する形質転換体は、選択プロセスを生き延びることになる。ただし、このタイプの多重組込みの確率はきわめて低い。従って、この事象は、ポリクローナルタンパク質の最小のスクランブリングを導く。さらに、たとえ異所性発現が高くても、同じ組換え型ポリクローナルタンパク質をコードする１００〜１０００個のその他のクローンが存在すると思われることから、多重組込みが発生した場合のスクランブリング効果は、約１％未満となるだろう。前述のとおり、異所性組込みの確率は、該方法で使用されるＤＮＡの数量を減少させることによって低減され得る。
【０２４３】
最も確率の低い事象は、標的部位における多重縦列組込みである。ここで記載されているＦｌｐリコンビナーゼ系を用いると、染色体からの切除活性が組込み活性よりも著しく高いことから、このタイプの事象は稀になる。ただし、万一受容できないほど高い頻度で縦列組込みが発生した場合には、Ｆｌｐ系は、単一のコピーインサートのみが可能であるものと交換され得る（例えば、参照により援用されている国際公開第９９／２５８５４号パンフレットを参照のこと)。
【０２４４】
（ｅ）  哺乳動物細胞内の既知の組合せでの６つの別個の抗体の発現
一般に可変増殖速度を最小限におさえるためには、各々の特異的ＧＯＩ（この場合は、ミニシックスライブラリーの各々の個別成員）を少なくとも１００、好ましくは１０００そして最も好ましくは１００００個の細胞内に組込むことが好ましい。全てのＧＯＩについて同じＧＯＩを発現する多数の個別細胞を含むポリクローナル細胞系統が、個別細胞の増殖速度差により受ける影響がより少なく、最終的ポリクローナルタンパク質組成の偏向の可能性が低いということが、統計的に予想されている。
【０２４５】
さらに、発現のための均質な宿主細胞系統を確保するのが有利である可能性がある。これは、トランスフェクションに先立ち宿主細胞系統をサブクローニングすることによって達成され得る。このプロセスは、クローン多様性に関する段落で記載されている。
【０２４６】
さらなる偏向制御が望まれるポリクローナルライブラリーについては、ポリクローナルタンパク質産物の最終組成は、発現ベクタープラットフォーム内に誘発可能な転写制御要素を導入することによって制御され得る。適切な誘発可能な制御要素としては、例えば、ＢＤＴｅｔオン／オフ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ニュージャージ州フランクリンレイクス（ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ））及びジーンスイッチ（Ｇｅｎｅ  Ｓｗｉｔｃｈ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州、カールスバッド）が含まれる。これらの転写スイッチは、遺伝子発現又はタンパク質産物内の変動に起因するあらゆる増殖偏向を最小限におさえるため、適切な時点（例えば細胞プールが充分に拡張した時点）で誘発可能である。当該実験は、かかる制御要素では実施されなかった。
【０２４７】
（ｄ．１）に記載されているように個別に又は（ｄ．２）に記載されているような大量移送によりファージミドベクターから哺乳動物発現ベクターまで６つの選択されたＧＯＩを移送した後、以下に記載されているように、６つの別個の抗体を発現するため部位特異的組込みを使用することによりＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞系統内のホットスポットにトランスフェクションを行なうために、哺乳動物発現ベクターを使用した。
【０２４８】
個別に移送されたＧＯＩ（ｄ．１）用として、プラスミドＤＮＡを個別に増殖させ、ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞内への個別トランスフェクションのために使用するか、そうでなければＴＧ１ストックを個別に増殖させ、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の数についてのＯＤ６００正規化の後、６つの培養を混合し、プラスミド調製物のために使用した。問題の６つの遺伝子を含有するこのプラスミド調製物は、組換え型ポリクローナル抗体発現のため、哺乳動物細胞のバルクトランスフェクションに用いられた。
【０２４９】
大量移送されたＧＯＩ（ｄ、２ａ又はｄ、２ｂ）については、プラスミドＤＮＡがＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞内にトランスフェクションされるか又は、（ｄ、２ａ又はｄ２、ｂ）に記載された手順に従って増幅され精製され（プラスミド調製物３）次にバルクトランスフェクションのために用いられる。
【０２５０】
（ｅ．１）  細胞培養
グルタミン（２ｍＭ）及びＦＣＳ（１０％）及び１００μｇ／ｍｌのゼオシン（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）を添加しながら、ハムのＦ−１２培地内にＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ  宿主細胞系統（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールスバッド）を維持した。サブクローニングのためには、細胞をトリプシンで離脱させ、メーカーの指示に従って分割させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。培地及び培地添加剤は、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）製のものであった。
【０２５１】
この細胞系統は、ｌａｃＺ−ゼオシン融合遺伝子を安定した形で発現させ、外来性遺伝子の部位特異的組込みの時点で失なわれる耐性である抗生物質ゼオシンに対する耐性を細胞に付与する。細胞は、Ｆｌｐ組換え標的（ＦＲＴ）部位の単一コピーを含有し、かくしてＦｌｐ−Ｉｎ系（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）の使用により部位特異的組込みのための宿主細胞系統としていつでも使用できる状態にある。
【０２５２】
（ｅ．２）  ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
６つのウェルを伴う組織培養プレートに、４．０×１０５個のＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞／ウェルを接種し、これらのプレートを３７℃／５％ＣＯ２でＯ／Ｎインキュベートした。メーカーの指示に従い、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎＴＭ、又はＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ２０００ＴＭ（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いて異なるＴＦＮ方法をテストして、これらの細胞のトランスフェクションを実施した。この例では、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００ＴＭを使用した。簡単に言うと、トランスフェクションの前日に、上述のとおりに、指数増殖するＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を播種し、３７℃／５％ＣＯ２でＯ／Ｎインキュベートした。同時トランスフェクションのために、８５〜９５％の細胞集密度をもつウェルを使用した。
【０２５３】
以下の中味を有する２本のチューブを調製した：
チューブ１：  （ｄ．１）で記載されているＧＯＩを伴う個別の発現ベクター０．５μｇ（例えばＯＶＡを伴うｐＳｙｍｖｃ２１）＋４．５μｇのｍｐ０４０（ｐＯＧ４４のマキシプレップ）（リコンビナーゼＦｌｐを発現するプラスミド）を、２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（１．５ｍｌのエッペンドルフ管）に添加した。
【０２５４】
チューブ２：  ２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（１．５ｍｌのエッペンドルフ管）に対して、７．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ２０００ＴＭを添加し、５分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。
【０２５５】
チューブ２の中味を試験管１に移送し、その後２０分間ＲＴでインキュベートした。
【０２５６】
メーカーの指示に従ってＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を、細胞を伴うウェルに移した。
【０２５７】
２４時間後に、トリプシンによって細胞を離脱させ、（１：３）に分割し、Ｔ−２５フラスコと１００ｍｍ入りペトリ皿に分配し、選択圧として９００μｇのハイグロマイシンＢ／ｍｌを伴う新鮮な栄養混合物Ｆ−１２Ｈａｍ＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭのＬ−グルタミン培地内で培養した。
【０２５８】
（ｅ．３）  部位特異的組込み体の選択及びトランスフェクションを受けた細胞の二次培養
２〜３週間ハイグロマイシンＢ選択圧下で細胞を培養し、この期間中、２−４日毎に同じ濃度の選択用作用物質を含有する新しい培地で細胞をリフレッシュした。Ｔ−２５フラスコ及びペトリ皿内の生き延びた細胞プールをトリプシンにより離脱させ、（１：６）で分割させ、上述の選択圧下でのさらなる増殖のためＴ−フラスコに分配した。（ｄ．１）に記載された方法に従って生成された形質転換体を含有するペトリ皿から（いわゆるクローニングシリンダを用いて）いくつかの単一クローンを採集し、増殖及び発現レベル研究用に新しいウェルに移送した。
【０２５９】
閾値ハイグロマイシンＢ濃度に対する耐性をもつ細胞又は単一クローンの各プールをその後、６ウェルプレート内で集密状態となるまで成長させ、ペトリ皿、Ｔ−２５、Ｔ８０及びＴ−１７５フラスコ内でそのそれぞれの培地プラスハイグロマイシンＢの中で再度プレート固定した。指数増殖中の細胞がＴ８０組織培養フラスコ内で８０％の集密度に達した時点で、各々の細胞系統のガラスビンを凍結させ、液体窒素Ｎ２（Ｌ）−フリーザー内に貯蔵した。
【０２６０】
６つの問題の遺伝子を含有するプラスミド混合物（ミニシックスライブラリー）でのトランスフェクションのために、６つの個別培養を、Ｅ．ｃｏｌｉの数についてＯＤ６００で正規化し、混合し、６つの問題の遺伝子を含有するポリクローナルプラスミド調製物のために使用した。上述のものの７．５倍もの試薬及び細胞を用いたトランスフェクション手順を実施し、６つの別個の抗体の混合物を発現する組換え型ポリクローナル細胞系統を産生させた。
【０２６１】
選択された抗体の個別成員を発現する６つの細胞系統及び６つの別個の抗体の混合物を発現する細胞系統を、培養及び増殖の間、抗原特異的ＥＬＩＳＡにより抗体産生についてテストした。
【０２６２】
（ｆ）  既知の組合せの６つの別個の抗体を発現するポリクローナル細胞系統の組成の監視
発現ベクター内にある６つの選択された問題の遺伝子の混合物を生成しその後バルクトランスフェクション及びＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞内への部位特異的組込みを行なうことにより、６つの別個の抗体を発現するポリクローナル細胞系統を生成した。
【０２６３】
３４日間、細胞系統を追跡調査し、ここで遺伝子型分布、抗体発現及び増殖速度を追跡した。結果は以下で記載されている。
【０２６４】
（ｆ．１）  ＯＤ６００正規化された細胞混合物からのプラスミド調製物でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞中の６つの選択された問題の遺伝子の遺伝子型分布
ポリクローナルＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞系統をトリプシン処理し、細胞懸濁液を１０個の細胞／ｍｌまで希釈させた。その後、合計１０枚の９６ウェルプレートの各ウェルに２００μｌを移送した。約１０日後、単一コロニーをもつウェルを顕微鏡検査により同定した。単一コロニーを伴うウェルをＰＢＳ中で１回洗浄し、５０μｌの水を添加した。プレートを１０分間８０℃でインキュベートし、溶解物をもう１つの９６ウェルプレートに移した。１０μｌの溶解物を、以下のプライマと共に２５μｌのＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））中で使用した。
５’−ＣＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号６）及び
５’−ＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号７）
【０２６５】
２時間３７℃でインキュベートさせた１５μｌの反応中の１０μｌのＲＴ−ＰＣＲ混合物上でＨｉｎｆＩ及びＮｌａＩＩＩを用いて、ＲＦＬＰを実施した。消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動とそれに続くゲルのＥｔＢｒ染色を用いて視覚化した。経時的に（トランスフェクションから１６日及び３４日後）抗−ＯＶＡ、抗−ＡＰ、抗β２ｍ、抗−ＨＡＰ、抗−ＦＶＩＩＩ及び抗−ＬＹＳを産生する細胞の遺伝子型分布を追跡調査した。図９を参照のこと。
【０２６６】
（ｆ．２）Ｅ．ｃｏｌｉのＯＤ６００正規化混合物（ｄ．１）からのプラスミド調製物でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞に由来する試料のＥＬＩＳＡ
ポリクローナルＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞系統（ｅ．３）をトリプシン処理し、Ｔ−７５フラスコ内でＦ−１２ＨＡＭ＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭのＬ−グルタミン及び９００μｇのハイグロマイシン中で、３×１０６個の細胞をプレート固定した。培地を毎日変え、３日目にＥＬＩＳＡのために上清を選択した。５０ｍＭの炭酸塩緩衝液中で１０μｇ／ｍｌに至るまで、抗原（β−ミクログロブリン）（コペンハーゲン大学から寄贈されたもの）、アルカリホスファターゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、オボアルブミン（シグマ）、第ＶＩＩＩ因子（デンマークのノボノルディスク（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）より寄贈されたもの）、ニワトリ卵白リゾチーム（シグマ）及びハプトグロピン（シグマ））を希釈させた。ＥＬＩＳＡプレートに抗原（各ウェルに５０μｌ）をコーティングし、４℃でＯ／Ｎインキュベートした。洗浄用緩衝液（１×ＰＢＳ／０．０５％のツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）で４回ウェルを洗浄し、洗浄用緩衝液（各ウェルに対し１００μｌ）中２％のスキムミルク粉末で１時間遮断した。ウェルに５０μｌの試料を添加し、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、１時間二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＨＲＰ接合体（シグマ））を添加し、ひき続き４回洗浄した。ＥＬＩＳＡをＴＭＢ基質（各ウェル中５０μｌ、ＤＡＫＯ  Ｓ１６００）で５分間展開させ、１ＭのＨ２ＳＯ４５０μｌを添加することにより、反応を停止させた。プレートを４５０ｎｍで直ちに読みとった。問題の６つの遺伝子をコードする発現ベクターの混合物でのトランスフェクション後３４日目に誘導された溶解物中での６つの問題の抗体全ての発現を実証するデータが、図１０に示されている。図１０に提示されているデータは６つの異なる抗原特異的ＥＬＩＳＡ検定から誘導されていることから、ＯＤ４５０の読取り値は抗体の数量に関し直接比較可能ではないということを指摘すべきである。
【０２６７】
抗体発現レベルは、各々の個別ＧＯＩ又は６つのＧＯＩの混合物でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞のプール内で抗カッパコートＥＬＩＳＡによってさらに分析された。この結果は図１１に示されている。これは、抗体発現レベルが、個別にトランスフェクションされた細胞系統の間で匹敵するものであることを示している（例えば、抗−β２ｍコーディングベクターでのトランスフェクションを受けた細胞系統は、抗ＡＰ抗体をコードするベクターでのトランスフェクションを受けた細胞系統に比べ匹敵する量の抗体を発現する）。個別ＧＯＩでのトランスフェクションを受けたＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞のプールという語がここで使用されているのは、個別細胞系統が単一クローンから誘導されずｅ．３で記載されているように複数のクローンプールから誘導されているからである。
【０２６８】
（ｇ）  実験からの結論
まず第１に、製造系におけるポリクローン性の保存についてのこれらの評価（試験）は、ファージミドベクターから哺乳動物発現ベクターへの（抗ＯＶＡ、抗ＡＰ、抗β２ｍ、抗ＨＡＰ、抗−ＦＶＩＩＩ、及び抗ＬＹＳをコーディングする）ミニシックスライブラリーからの６つの選択された問題の遺伝子の大量移送が、選択又は増殖偏向の導入なく可能であり（図７）、かくして、６つの選択された問題の遺伝子に関して匹敵する頻度で終了するということを示した。
【０２６９】
第２に、６つの選択された問題の遺伝子を含む構築物の混合物でのＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞のバルクトランスフェクションは同様に、単離された哺乳動物細胞内の構築物の比較可能な分布を結果としてもたらした。経時的な（トランスフェクション後１６日目及び３４日目）６つの選択された問題の遺伝子の遺伝子型分布も同様に類似であり（図９）、このことは、発現系が３４日目まで、増殖偏向を導入することなく６つの遺伝子型の当初の等しい分布を維持しているということを示していた。
【０２７０】
第３に、６つの問題の遺伝子の混合物でのバルクトランスフェクションを受けた細胞は、トランスフェクション後３４日目に細胞からの上清についての抗原特異的ＥＬＩＳＡにより検査された通り、６つの抗体全ての発現を示した（図１０）。異なる抗原についてのＥＬＩＳＡの結果は、異なる結合親和力に起因して、抗体量に関して直接比較可能ではない。
【０２７１】
しかしながら、ａ）（ｄ．１）で記載されているようなベクター調製物を用いて生成された６つの個別にトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞系統からの上清及び、ｂ）６つの選択された問題の遺伝子の混合物を発現するポリクローナル細胞系統の上清について実施されたヤギ抗マウスカッパ鎖抗体でのコーティングに基づく捕捉ＥＬＩＳＡは、６つの遺伝子型から匹敵する抗体発現レベルを示した。
【０２７２】
要約すると、ファージミドベクターから哺乳動物発現ベクターへとポリクローナルＧＯＩをまとめて移送することが実現可能なものであることが実証された。このことは以前にシャロン（Ｓｈａｒｏｎ）（米国特許第５，７８９，２０８号明細書）で記載されてきた。さらに、哺乳動物発現構築物の混合物は、哺乳動物細胞内にまとめてトランスフェクションされ得、少なくともトランスフェクション後３４日目まで匹敵する頻度に維持され得る。
【０２７３】
実施例３Ａ
ミニシックスライブラリーでのＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞系統からのサブクローンのバルクトランスフェクションにより生成された細胞培地内のポリクローン性保存の評価。
【０２７４】
（ａ）「オリジナルの」ＣＨＯＦｌｐ−Ｉｎ細胞系統のサブクローニング
記載された通りに（実施例３、第ｅ．１項）、オリジナルのＣＨＯ  Ｆｌｐ−ｉｎ細胞系統（インビトロジェン）を培養した。トリプシン処理細胞を計数し、９６ウェルの培養プレート内でウェルあたり１個の細胞でプレート固定した。約１４日後、単一のコロニーをもつ２０のウェルを同定し、細胞をトリプシン処理し、２４ウェルプレートに移送した。成長挙動ならびに発現レベルの特徴づけの後、今後の研究のために、サブクローン、ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎクローン０１９の１つを選択した。
【０２７５】
（ｂ）ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎクローン０１９細胞のバルクトランスフェクション及び選択
トランスフェクションをトリプリケートで実施し、ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎクローン０１９細胞の選択は基本的に、ｐＳｙｍｖｃ２１中でネオマイシン選択マーカーがハイグロマイシンマーカーで置換されたという点を除いて（図４．ｅ）、記載されている通りに（実施例３、第ｅ．２項及び第ｅ．３項）で実施した。その結果、細胞の選択及び培養中、ハイグロマイシンＢの代りにゲニチシン（４５０μｇ／ｍｌ）が使用された。
【０２７６】
（ｃ）ミニシックスライブラリーでのバルクトランスフェクションを受けたＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎクローン０１９細胞から得た試料のＥＬＩＳＡ
トランスフェクション後７３日間細胞を培養し、１７、３１、４５、５９及び７３日目にＥＬＩＳＡ用試料を採取した。記載された通りに（実施例３、第ｆ、２項）、（個別に精製されたミニシックス抗体を標準として用いて）定量的ＥＬＩＳＡを実施した。３つの独立したトランスフェクションからの結果は図１２に示されている。異なるトランスフェクションの間で異なる発現プロフィールが観察された。しかしながら、６つの抗体は全て、５９日目まで全ての実験において検出可能であった。
【０２７７】
（ｄ）実験からの結論
ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎクローン０１９細胞についてのネオマイシン選択系での実験は、バルクトランスフェクションの後２ヵ月間、個別バッチの比較的保存された発現プロフィールを示した（図１２）。かかる安定性期間は、製造目的で充分なものである。観察されたバッチ間の変動は、生産に先立ち個別バッチの大きな凍結ストックを生成し貯蔵することによって処理できる。
【０２７８】
実施例３Ｂ
選択後の個別にトランスフェクションを受けたＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を混合することによる細胞培地内のポリクローン性保存の評価
（ａ）ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞の個別トランスフェクション及び選択
ミニシックスライブラリーの個別成員を発現する６つの細胞系統の生成のための実験的手順については、先に記載した（実施例３、第ｅ．３項）。等数（各細胞系統５×１０５個）での選択後直ちに、ミニシックスライブラリーの個別成員を発現する６つの細胞系統を混合し、混合細胞集団を８５日間培養した。個別細胞系統から３つの個別混合物を作った。
【０２７９】
（ｂ）（ａ）で生成されたポリクローナル細胞培養から得られた試料のＥＬＩＳＡ
試料を２週間後毎に採取し、ミニシックスライブラリーから発現された抗体の組成を、記載された通り（実施例３、第ｆ．２項）ＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡを、混合後８、１７、３０、４５、５７、７２及び８５日目に実施した。結果（トリプリケートでの実験の平均±ＳＤ）は、図１３に示されている。６つの抗体はすべて、混合物から８５日後に検出可能であった。先に記載した通り（実施例３、第ｆ．２項）、異なる抗体についての読取り値は直接比較可能ではなく、図１３で提示されているデータは、少なくとも混合後４５日目まで比較的安定した発現プロフィールを示し、その後、生産性の全体的降下が見られる。さらに、３つの独立した混合物から得られた結果の比較は、ミニシックス抗体の経時的に類似した発現プロフィールを示し、これは結果が再現可能であることを表していた。
【０２８０】
（ｃ）実験からの結論
ミニシックスライブラリーの別個の成員でのトランスフェクションを個別に受けた細胞の混合物から成るポリクローナル細胞培養は、少なくとも混合から４５日目までは、組成の保存を示した。４５日間の組成保存は、大部分の場合、製造目的で充分な時間となる。その上、トリプリケートでの実験は類似の結果を示しており、かくして、異なる構築物での個別のトランスフェクションを受けた細胞の混合が低いバッチ間変動をもつ混合された細胞培養を結果としてもたらすことを示唆した。
【０２８１】
実施例４
抗オボアルブミン組換え型ポリクローナル抗体製造細胞系統の確立
（ａ）抗オボアルブミンポリクローナル抗体組成物の発現
完全に特徴づけされたオボアルブミン結合ファージクローンの収集物を以下の通りに同定した。生後８週の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス４匹を完全フロイドアジュバント中の５０μｇのＯＶＡで、腹腔内及び皮下で免疫化させ、免疫化０日から２１日目及び４２日目に不完全フロインドアジュバント中のＯＶＡでブーストし、全ての動物が、抗原特異的ＥＬＩＳＡにより測定される通りＯＶＡに対抗して変換された血清を有していることが確認された。３１日目及び５２日目に、最も良く応答したマウスから脾臓を収獲した。前述したように、ファージミドベクター（Ｓｙｍｖｃ１０）を用いて、脾臓ＲＮＡからＦａｂ提示ファージミドライブラリーを生成した。結果として得たライブラリーは、およそ１０６個の独立したクローンを含んでいて、これらのライブラリーの選択は、ＮＵＮＣイムノチューブ上にコーティングされたＯＶＡと５×１０１１個のＦａｂ提示ファージミドを反応させることによって実施された。第１ラウンドのパニングからの溶出液は、ＯＶＡ結合剤を高い割合で含んでいたことから、第１及び第２ラウンドのパニングからの溶出液がＯＶＡ結合ファージクローンについてスクリーニングされた。
【０２８２】
最初に、ＥＬＩＳＡによってＯＶＡ−反応性ファージクローンを同定した。簡単に言うと、ＥＬＩＳＡプレートをＯＶＡでコーティングし、ファージ提示されたＦａｂｓと反応させ、その後、ＨＲＰ−接合された二次抗体と反応させた。負の対照としては、無関係の抗原（ＢＳＡ）又は無関係のファージ提示されたＦａｂｓ（抗−ＡＰ）を使用した。
【０２８３】
さらに、ＰＶＤＦ膜上のＯＶＡ固定化に基づいたＨＤＳ方法が確立された。これら２つの方法の結果として、別々のクローンサブセットすなわち１つのセットアップでＯＶＡを認識しもう１つのセットアップでは認識しなかった一部のクローン及びその逆が同定されることとなった。ＥＬＩＳＡ又はＨＤＳのいずれかによりＯＶＡと反応したＦａｂ提示ファージクローンについては、ＶＨの可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ＤＮＡ配列決定によって決定し、ベクターＮＴＩソフトウェアパッケージを用いて、系統発生解析により遺伝子多様性を推定した。結果として得た一団には、１２７のＯＶＡ結合クローンが含まれ、その全てについてＶＨの可変部分のヌクレオチド配列が確立された。
【０２８４】
１２７個のＯＶＡ結合クローンによって発現されたＦａｂフラグメントは全て、未変性及び変性形態のいずれかのオボアルブミンに結合する能力を有する。このセットから、我々は、大量移送及び哺乳動物発現のために使用すべき例えばｐＳｙｍｖｃ１０といったファージミドベクター内に含まれたほぼ３０の異なるクローンを同定した。これらの抗体は、マウスＩｇＡ、ＩｇＧ２Ａ又はＩｇＧ２Ｂ抗体のいずれかの形で発現される。我々は、これらの抗体産生クローンのＤＮＡ配列を完全に特徴づけしていたことから、実施例３に記載された６つの別個の抗体をもつモデル系について使用されたものと同じ方法を用いて、大量移送及び哺乳動物発現手順全体を通して遺伝子型の分布を監視することができる。
【０２８５】
（ｂ）哺乳動物発現用ベクターへのＯＶＡ特異的抗体配列の大量移送
ファージミドベクターから発現ベクターへの問題の遺伝子の移送は、２ステップ手順（図４に例示）であり、ここで第１ステップは、選択された哺乳動物プロモーターの頭−頭方向性をもつプロモーターカセットとのプロモーター交換であり、この後に、問題の遺伝子の可変領域及びプロモーターカセットを発現ベクターまで移送する。頭−頭プロモーターカセット（プロモーターＡ／プロモーターＢ）は、ＳａｃＩ／ＸｈｏＩ消化物を用いることによって各クローンのファージミドベクター内に挿入でき、その後連結されてその結果、細菌から哺乳動物プロモーター（ｐＳｙｍｖｃ１２）へのプロモーター交換がもたらされる。
【０２８６】
このとき、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ消化物が、ファージミドベクター（ｐＳｙｍｖｃ１２）からイソタイプコーディングベクターｐＳｙｍｖｃ２０まで、可変重鎖、頭−頭プロモーターカセット（プロモーターＡ／プロモーターＢ）及び完全カッパ鎖をコードする配列を移動させることになる。ｐＳｙｍｖｃ２０ベクターは、ファージミドベクターからあらゆるＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを受容することができる。このフラグメントは、ｐＳｙｍｖｃ２０内で定常重鎖配列と接続すべき可変重鎖をコードする配列ならびにｂＧＨ  ＰｏｌｙＡ配列と接続されるべきカッパ鎖をコードする配列全体を移送すると思われる。この大量移送は、この移送の後マウスＩｇＧ２Ｂ抗体として可変重領域及びカッパ鎖全体を発現する図１に示されているような発現ベクターを結果としてもたらすことになる。
【０２８７】
ベクターｐＳｙｍｖｃ２０は、ＩｇＡ、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＥ又はＩｇＧ１遺伝子の重鎖のマウス定常領域を含有でき、かくして、選択された関連するマウス免疫グロブリンイソタイプのいずれでも発現する能力を有する。
【０２８８】
（ｃ）抗オボアルブミン組換え型ポリクローナル抗体の発現
大量移送により、重鎖の可変領域、プロモーター及びカッパ鎖全体をコードする配列が、ファージベクタライブラリーからイソタイプコーディングベクターまで移動させられ、ポリクローナル哺乳動物発現ベクター組成物を結果としてもたらす。この後には、トランスフェクションとＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞系統への部位特異的組込みが続き、組換え型ポリクローナル製造細胞系統が生成される。この後者の細胞系統は、トランスフェクションを受けた各々の細胞のゲノム内の同じ特定の場所に組換え型ポリクローナルタンパク質の各々の成員をコードする問題の遺伝子をターゲティングすると同時に、トランスフェクションを受けた各々の細胞内の前記核酸配列を含む発現構築物の１つのコピーのみを組込むことによって、生成される。
【０２８９】
細胞培養及びトランスフェクション及び選択手順は、実施例３（ｅ．１−ｅ．３）に記載されているものと同じである。
【０２９０】
（ｄ）組成安定性の監視
大量移送及び哺乳動物細胞内へのトランスフェクションがクローニング、発現及び個別クローン間の多様性に関する多大な偏向を導入すること無く確実に行なわれるようにするため、以下の方法を用いて、大量移送及び哺乳動物発現のプロセスを監視することができる。
【０２９１】
１）  トランスフェクションを受けた各々の構築物からの細胞プールの生成時間の分析、
２）  トランスフェクションを受けた各々の構築物からの細胞プールの発現レベルの分析、
３）  単細胞上のＲＦＬＰによる分析、
４）  産生された抗体混合物のＥＬＩＳＡ、
５）  産生された抗体混合物の質量分析法、
６）  各々の異なるクローンの比率を同定するための、Ｖ領域特異的プライマを用いた明確なバッチサイズについてのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）による分析、又は
７）  選択圧（ハイグロマイシン）を伴って及び伴わずに経時的培養されたパッチの分析は、以下のパラメータについて実施可能である：
ａ）  クローナル分布
ｂ）  タンパク質発現レベル（数量及び分布）
ｃ）  ゲノム安定性
ｄ）  無血清培地に対する適合の効果
【０２９２】
（ｅ）抗オボアルブミン組換え型ポリクローナル抗体組成物の産生
従来の小型培養フラスコ、Ｎｕｎｃ多層セルファクトリ及び小型高収量生物反応器（ＭｉｎｉＰｅｒｍ，  ＩＮＴＥＧＲＡ−ＣＥＬＬｉｎｅ）を含めた、異なる培養系の中で、組換え型ポリクローナル抗体産生ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞系統を産生させる。さらに、細胞系統は、スピナーフラスコ、中空ファイバ及び生物反応器内のその後の培養のため無血清懸濁液に適合されている。
【０２９３】
選択された細胞系統を成長させるために用いられる培地は、メーカー（インビトロジェン、Ｂ＆Ｄ、ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））により推奨されている通りの無血清、無タンパク質であるか又は化学的に明確な培地である。
【０２９４】
選択（ハイグロマイシン）無しで培養される付着又は懸濁細胞からの上清が収集される。収集された上清は、記載通りに（３ｆ）分析され特徴づけされる。産生された抗体の産生収率、機能性及び品質は、供給されたバッチ又は灌流条件下での細胞の成長中及びその後に検査される。懸濁液中の細胞は、より大きいスピナーフラスコ又は生物反応器の接種のために使用される。
【０２９５】
収集された上清からのポリクローナル抗体を、その後動物研究で使用するために精製する。
【０２９６】
本発明のその他の実施形態及び用途は、本書で開示された本発明の明細及び実践を考慮することで当業者には明らかになることだろう。明細書及び実施例は例としてのみみなされるものとして意図されており、発明の真の範囲及び精神は、特許請求の範囲によって表わされている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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