(57)【要約】      （修正有）【課題】ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を特異的にかつ迅速に検出しうる方法、及びそれに用いる検出用ＤＮＡ、検出用オリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】特定の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の同定を行うことを特徴とするハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の同定を行うことを特徴とするハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法。
（ｇ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【請求項２】
同定を行うために、被検菌のβ‐チューブリン遺伝子領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列が含まれるか否かを確認することを特徴とする請求項１記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項３】
同定を行うために、前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた検出用オリゴヌクレオチドを検査対象物より抽出した核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することを特徴とする請求項１記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項４】
同定を行うために、前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することを特徴とする請求項１記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項５】
前記増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって行うことを特徴とする請求項４記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項６】
前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅反応を行うことを特徴とする請求項５記載の検出方法。
（１）ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種を検出用オリゴヌクレオチドとして用いることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項８】
前記検出用オリゴヌクレオチドを核酸プローブ又は核酸プライマーとして用いることを特徴とする請求項７記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項９】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマー対として用いることを特徴とする請求項７記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及びクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項１０】
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド並びに／又は前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマー対として用いることを特徴とする請求項７記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類の検出方法。
【請求項１１】
前記検出方法において、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド並びに／又は前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマー対として用いて菌種を検出する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項９記載の検出方法。
【請求項１２】
下記（ａ’）及び（ｂ’）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることを特徴とする、ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及びクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法。
（ａ’）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ’）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１３】
下記（ｃ’）及び（ｄ’）のオリゴヌクレオチド並びに／又は下記（ｅ’）及び（ｆ’）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることを特徴とする、ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類の検出方法。
（ｃ’）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ’）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ’）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ’）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１４】
前記検出方法において、下記（ｃ’）及び（ｄ’）のオリゴヌクレオチド並びに／又は下記（ｅ’）及び（ｆ’）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて菌種を検出する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の検出方法。
（ｃ’）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ’）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ’）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ’）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１５】
ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出に用いるための、下記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表されるＤＮＡ。
（ｇ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【請求項１６】
下記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出用オリゴヌクレオチド。
（ｇ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【請求項１７】
前記検出用オリゴヌクレオチドが、前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド。
（１）ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
【請求項１８】
前記検出用オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜４又は７〜８のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プローブ又は核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６又は１７記載のハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
下記の（ａ）及び（ｂ）で示されたハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及びクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項２０】
下記の（ｃ）及び（ｄ）又は下記の（ｅ）及び（ｆ）で示されたハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項２１】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド、及び下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１つを核酸プライマー対として含むハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類検出用キット。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及びクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法、及びそれに用いる検出用ＤＮＡ、検出用オリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性の菌類（真菌類）は自然界に広く分布し、野菜、果物等の農作物で繁殖し、これらの農作物を原材料とした飲食品を汚染する。しかも、耐熱性の菌類は通常の他の菌類に比べて高い耐熱性を有する。例えば酸性飲料の加熱殺菌処理を行ったとしても耐熱性菌類が生存、増殖し、カビの発生原因となることがある。このため、耐熱性菌類は重大な事故を引き起こす重要危害菌として警戒されている。
【０００３】
加熱殺菌処理後の飲食品からも検出されることがある汚染事故の原因菌の主な耐熱性菌類の１つとして、ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する耐熱性菌類が知られている。飲食品及びこれらの原材料中の耐熱性菌類による事故防止のためには、ハミゲラ属に属する耐熱性菌類の検出が重要である。
【０００４】
一方、従来の耐熱性の菌類を検出する方法としては、検体をＰＤＡ培地等で培養して検出する方法がある。しかし、この方法ではコロニーが確認されるまでに約７日間を要する。しかも、菌種の同定は、菌の特徴的な器官の形態に基づいて行うので、形態学的な特徴が認められるまでさらに約７日間の培養を必要としている。したがって、この方法によると、耐熱性菌類の検出に約１４日間もの時間を要する。このように耐熱性菌類の検出に長期間を要することは飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるものではない。そのため、より迅速な耐熱性菌類の検出方法の確立が求められている。
また、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類は住環境や食品工場に広く分布する黒色カビであり、分生子が空気中に飛散することが知られている。クラドスポリウム属に属する菌類の菌体が加熱殺菌後の食品に接触すると増殖し腐敗事故を引き起こす。従って、クラドスポリウム属に属する菌類の迅速な検出方法の確立も求められている。
【０００５】
菌類の迅速な検出方法としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用した検出方法が知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。しかし、これらの方法では特定の耐熱性菌類を特異的にかつ迅速に検出することが困難であるという問題を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０５７２８号公報
【特許文献２】特開２００６−６１１５２号公報
【特許文献３】特開２００６−３０４７６３号公報
【特許文献４】特開２００７−１７４９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、飲食品の汚染事故の主な原因菌に挙げられるハミゲラ属に属する菌類、及びクラドスポリウム属に属する菌類を特異的にかつ迅速に検出しうる方法を提供することを課題とする。また、本発明は該検出方法に用いる検出用ＤＮＡ及び検出用オリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のように耐熱性菌類の検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたＰＣＲ法では擬陽性や擬陰性の結果が出ることが挙げられる。
本発明者等は、この問題を克服し特定の耐熱性菌類を特異的に検出・識別しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域（以下、「可変領域」ともいう）が存在することを見出した。また、この可変領域をターゲットとすることで、上記ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を特異的かつ迅速に検出・識別できることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
本発明は、下記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の同定を行うことを特徴とするハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出方法に関するものである。
（ｇ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
【００１０】
また、本発明は、ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出に用いるための、前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表されるＤＮＡに関するものである。
また、本発明は、前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類の検出用オリゴヌクレオチドに関するものである。
【００１１】
また、本発明は、下記の（ａ）及び（ｂ）で示されたハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及びクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記の（ｃ）及び（ｄ）で示されたハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記の（ｅ）及び（ｆ）で示されたハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、前述したオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類検出用のキットに関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、飲食品の汚染事故の主な原因菌に挙げられるハミゲラ属に属する菌類、及びクラドスポリウム属に属する菌類を特異的にかつ迅速に検出できるＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを提供することができる。さらに、本発明によれば、前記ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを用いたハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図２】実施例１における電気泳動図である。
【図３】実施例２における、本発明の（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図４】実施例２における、本発明の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図５】実施例３における、ハミゲラ  ストリアータの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図６】実施例４における、ハミゲラ  アベラネアの各菌株を用いた電気泳動図である。
【図７】実施例５における電気泳動図である。
【図８】実施例５における電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ハミゲラ属（Ｈａｍｉｇｅｒａ）に属する菌類又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列、すなわちハミゲラ属に属する菌類又はクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子領域中におけるハミゲラ属及び／又はクラドスポリウム属に特異的な領域又は種特異的領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の同定を行い、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に識別・検出する方法である。
本発明における「ハミゲラ属に属する菌類」とは、マユハキタケ科（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ）に属する不整子嚢菌類を意味する。ハミゲラ属に属する菌類は、７５℃、３０分間の加熱処理後であっても生存可能な子のう胞子を形成する。ハミゲラ属に属する菌類の例として、ハミゲラ  アベラネア（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ）、ハミゲラ  ストリアータ（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ｓｔｒｉａｔａ）が挙げられる。また、「クラドスポリウム属に属する菌類」は糸状不完全菌類であり、耐熱性の高い子のう胞子を形成しない。また、住環境や食品工場などに広く分布し、メラニン色素を合成するため、黒色汚れの原因菌である。クラドスポリウム属に属する菌類の例として、クラドスポリウム  クラドスポロイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、クラドスポリウム  スファエロスファーマム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｈａｅｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）が挙げられる。
【００１５】
「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。また、本発明において、「可変領域」とは、β-チューブリン遺伝子中で塩基変異が蓄積しやすい領域であり、この領域の塩基配列は真菌の属間で大きく異なる。ハミゲラ属のβ-チューブリン遺伝子の可変領域はハミゲラ属固有の塩基配列であるため、他の通常の菌類のものとは明確に区別しうるものである。
【００１６】
本発明の検出方法は、下記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸、すなわちハミゲラ属に属する菌類又はクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子中の特定領域（可変領域）の塩基配列に対応する核酸を用いることを特徴とする。
（ｇ）配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
発明者らは、ハミゲラ属に属する菌類、クラドスポリウム属に属する菌類及びハミゲラ属に属する菌類に近縁な菌類から種々のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を同定し、ハミゲラ属と近縁な属とハミゲラ属との間、ハミゲラ属内、及びクラドスポリウム属内での遺伝的距離の解析を行った。さらに、決定した各種のβチューブリン遺伝子配列の相同性解析をおこなった。その結果、当該配列中にハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に固有の塩基配列を有する可変領域を見出した。この可変領域において、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類は固有の塩基配列を有しているため、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を識別・同定することが可能となる。本発明は、この可変領域及び可変領域に由来する核酸、オリゴヌクレオチドをターゲットとしたものである。
【００１７】
本発明の検出方法に用いる前記（ｇ）の塩基配列は、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列に対応する。また、本発明の検出方法に用いる前記（ｈ）の塩基配列は、クラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列に対応する。
【００１８】
配列番号５に記載の塩基配列及びその相補配列は、ハミゲラ  アベラネアから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はハミゲラ属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号５に記載の塩基配列若しくはその相補配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、特にハミゲラ  アベラネア、ハミゲラ  ストリアータ及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスを検出するために好適に用いられる。
配列番号６に記載の塩基配列及びその相補配列は、クラドスポリウム  クラドスポロイデスから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はクラドスポリウム属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、クラドスポリウム属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号６に記載の塩基配列若しくはその相補配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、特にクラドスポリウム  クラドスポロイデスを検出するために好適に用いられる。
以下、前記（ｇ）及び（ｈ）の塩基配列を「本発明の可変領域の塩基配列」ともいう。
【００１９】
上記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類を同定する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
【００２０】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の同定を行うには、被検体のβ−チューブリン遺伝子領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と本発明の前記（ｇ）又は（ｈ）に記載のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいてハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の同定を行うものである。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００２１】
本発明においては、上記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出・同定を行うために、前記本発明の可変領域の塩基配列、すなわち前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できるものであればよい。すなわち、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば後述の条件が挙げられる。
【００２２】
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列から選択される領域であって、（１）ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値（融解温度：melting  temperature）がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
上記（１）において「ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域」とは、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の中でも、異なる属間での塩基配列の保存性が特に低く（すなわち、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の特異性が特に高く）、１０塩基前後にわたってハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類に固有の塩基配列が連続して現れる領域を意味する。
また、上記（３）において「オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い」とは、プライマーの塩基配列からプライマー同士が結合しないことが予想されることを言う。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドの塩基数としては、特に限定されないが、１３塩基〜３０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２３塩基であることがより好ましい。ハイブリダイズ時のオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、５５℃〜６５℃の範囲内であることが好ましく、５９℃〜６２℃の範囲内であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、３０％〜８０％が好ましく、４５％〜６５％がより好ましく、５５％前後であることが最も好ましい。
【００２３】
本発明のハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチドとしては、下記の（ａ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００２４】
なかでも、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチドとしては、前記（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドが好ましく用いられる。
また、ハミゲラ属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチドとしては、前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドが好ましく用いられる。
【００２５】
すなわち、本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜４又は７〜８のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号１〜４又は７〜８のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであって、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できるものが好ましい。ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列とは、配列番号１〜４又は７〜８のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有し、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとしてハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できるものや、ストリンジェントな条件でハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズ可能な塩基配列であれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。また、相同性が７５％以上であることがさらに好ましく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがよりさらに好ましく、相同性が９５％以上ありハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できるものであることが特に好ましい。
また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドには、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できるものであれば、配列番号１〜４又は７〜８のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドに対し、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施されたオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１〜４又は７〜８のいずれかに記載の塩基配列に対し、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施された塩基配列からなオリゴヌクレオチドには、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとしてハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できるものや、ストリンジェントな条件でハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズ可能な塩基配列も包含される。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M  塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。そのような塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜４又は７〜８のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドにおいて１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾されたオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１〜４又は７〜８のいずれかに記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２６】
前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で示されたオリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、前記ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
また、前記（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、前記ハミゲラ属に属する菌類を特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【００２７】
配列番号１〜３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類に特異的な塩基配列、すなわち可変領域の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。また、配列番号４及び配列番号７〜８に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、ハミゲラ属に属する菌類に特異的な塩基配列、すなわち可変領域に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類のＤＮＡ及びＲＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
【００２８】
ハミゲラ属及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域をハミゲラ  アベラネアを例として詳細に説明する。上述のように、ハミゲラ  アベラネアのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号５で示される。また、クラドスポリウム  クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列は配列番号６で示される。配列番号５に記載の塩基配列のうち、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の３５０位から４８０位までの領域はハミゲラ属及びクラドスポリウム属と他の真菌の属間で塩基配列の保存性が特に低く、ハミゲラ属及びクラドスポリウム属固有の塩基配列を有することを本発明者らが見い出した。また、配列番号５に記載の塩基配列のうち、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の１８０位から２００位までの領域はハミゲラ属とクラドスポリウム属では配列が大きく異なり、ハミゲラ属固有の塩基配列を有することを本発明者らが見出した。
前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号５に記載の塩基配列のうち、それぞれ３５８位から３７７位まで、４４０位から４５９位までの領域に対応する。また、図１に示すように、ハミゲラ  アベラネアのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の３５８位から３７７位まで及び４４０位から４５９位までの領域と相同性の高い領域がクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子にも存在する。
前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号５に記載の塩基配列のうち、それぞれ２位から２２位まで、１８１位から２００位までの領域に対応する。また、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号５に記載の塩基配列のうち、それぞれ１７２位から１９１位まで、３９７位から４１６位までの領域に対応する。また、ハミゲラ  アベラネアのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の２位から２２位までの領域と相同性の高い領域がクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子にも存在する。したがって、前記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）で示されたオリゴヌクレオチドをハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に検出することができる。また、前記（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチドをハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、ハミゲラ属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【００２９】
本発明の検出方法においては、上記（ａ）〜（ｆ）の検出用オリゴヌクレオチドの内、下記の（ａ１）〜（ｆ１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号１〜４及び７〜８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いるのがより好ましい。
（ａ１）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ１）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ１）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ１）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００３０】
本発明のハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対は、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対である。前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、ハミゲラ  アベラネア、ハミゲラ  ストリアータ及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスを特異的に検出することができる。
また、本発明のハミゲラ属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対は、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対である。前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対又は前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、ハミゲラ  アベラネア、ハミゲラ  ストリアータを特異的に検出することができる。
【００３１】
本発明の検出方法においては、上記検出用オリゴヌクレオチド対のなかでも、前記（ａ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｂ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｅ１）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ１）のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対を用いることが好ましく、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号７及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いることがより好ましい。
【００３２】
後述するように、本発明の検出方法において、上記本発明の検出用オリゴヌクレオチドは核酸プローブ又は核酸プライマーとして好適に用いることができる。
上記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００３３】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、ハミゲラ属に属する菌類又はクラドスポリウム属に属する菌類の遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００３４】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の同定を行うには、前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた検出用オリゴヌクレオチドを検査対象物より抽出した核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することが好ましい。この場合、前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする検出用オリゴヌクレオチドとしては、上述した本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を用いることができ、好ましい範囲も同様である。
【００３５】
本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対は、核酸プローブとして用いることができる。核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。上記核酸プローブはハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を迅速かつ簡便に検出することができる。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
このようにして標識化された本発明の検出用オリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類を検出することができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、前述した条件を挙げることができる。また、核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
【００３６】
また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。
【００３７】
本発明の検出方法において、前記本発明の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類の同定を行うには、前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸中の一部又は全部の領域からなる核酸を遺伝子増幅し、増幅産物の有無を確認することも好ましい態様である。この場合、本発明の検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を、核酸プライマー及び核酸プライマー対としても用いることができ、好ましい範囲も同様である。
なかでも、前記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、（１）ハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましい。さらに、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの検出用オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましく、前記（ａ１）〜（ｆ１）のいずれかの検出用オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることがより好ましく、配列番号１〜４及び７〜８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。また、前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記（ａ１）及び（ｂ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ１）及び（ｄ１）で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｅ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号７及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがさらに好ましい。
特に、検出感度の点からは、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのが好ましく、前記（ｅ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのがより好ましく、配列番号７及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。
本発明の核酸プライマーは、前記オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとして用いることもできるし、前記オリゴヌクレオチドを標識物で標識化して核酸プライマーとして用いることができる。標識物及び標識方法の例としては、核酸プローブの場合と同様のものが挙げられる。
【００３８】
本発明において、遺伝子増幅処理はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行うことが好ましい。ＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を約５９〜６３℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。
【００３９】
本発明において、遺伝子断片の増幅の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオチドを取り込ませる方法、ＰＣＲ反応産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、ＰＣＲ反応産物の塩基配列を解読する方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間に蛍光物質を入り込ませ発光させる方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
遺伝子増幅の確認について、前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた場合、配列番号５に記載の塩基配列において、３５８位から４５９位までの塩基数は約１００塩基である。したがって、被検体にハミゲラ属に属する菌類及び／又はクラドスポリウム属に属する菌類が含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約１００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を検出することができる。
【００４０】
前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対は、図１に示すように、配列番号５における２位から２１位まで及び１８０位から２００位までの領域に対応する。また、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対は、配列番号５に記載の塩基配列のうち、それぞれ１７２位から１９１位まで、３９７位から４１６位までの領域に対応する。そのため、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域とハイブリダイズすることができる。前記（ｃ）で示されたオリゴヌクレオチドとクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβチューブリン遺伝子の高相同性部位との相同率は９０％であり、ハミゲラ属及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスの両方とハイブリダイズすることができるが、前記（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチドとクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβチューブリン遺伝子の高相同性部位との相同率は４５％であり、クラドスポリウム  クラドスポロイデスとハイブリダイズすることができない。従って（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲ反応では、ハミゲラ属では遺伝子増幅反応が進行するが、クラドスポリウム  クラドスポロイデスでは遺伝子増幅反応が起こらない。前記（ｅ）で示されたオリゴヌクレオチドとクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβチューブリン遺伝子の高相同性部位との相同率は７０％であるが、塩基配列の異なる部位は（ｅ）で示されたオリゴヌクレオチドの３’末端に連続して存在するため、（ｅ）で示されたオリゴヌクレオチドとクラドスポリウム  クラドスポロイデスのＤＮＡを用いて遺伝子の伸長反応を行った場合、ＤＮＡの伸長が起こらないと予想される。前記（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチドとクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβチューブリン遺伝子の高相同性部位との相同率は６５％であるが、塩基配列の異なる部位が伸長方向に集中しているため、（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチドとクラドスポリウム  クラドスポロイデスのＤＮＡを用いて遺伝子の伸長反応を行った場合、ＤＮＡの伸長が起こらないと予想される。従って、（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲ反応では、ハミゲラ属では遺伝子増幅反応が進行するが、クラドスポリウム  クラドスポロイデスでは遺伝子増幅反応が起こらない。したがって、上記方法により陽性反応を示した試料について、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対及び／又は前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることにより当該試料に含まれる菌種がハミゲラ属かクラドスポリウム属であるかを識別することができる。このうち前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましい。本発明の検出方法において、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対及び／又は前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いる場合の操作方法などは、前記（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いる場合と同様である。
【００４１】
本発明の検出方法において、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対又は前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅処理を行い、遺伝子の増幅を確認することにより菌種を特定することも好ましい。遺伝子増幅処理はＰＣＲ反応により行うことが好ましい。ＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＡＮにハイブリダイズさせるアニーリング反応を約５９℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。遺伝子増幅の確認について、前記（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた場合、配列番号５に記載の塩基配列において、２位から２００位までの塩基数は約２００塩基である。また、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた場合、配列番号５に記載の塩基配列において、１７２位から４１６位までの塩基数は２４５塩基である。したがって、被検体にハミゲラ属に属する菌類が含まれる場合、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、この菌類に特異的な約２００ｂｐ又は約２４０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、被検体に含まれる菌種がハミゲラ属であるかを確認することができる。
【００４２】
本発明の検出方法においては、上述の（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることも好ましい態様である。また、上述の（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることも好ましい態様である。（ａ）及び（ｂ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法はハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を、（ｃ）及び（ｄ）で示されたオリゴヌクレオチド対又は（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法はハミゲラ属に属する菌類をそれぞれ検出することができるため、これらの方法を組合わせることにより被検体から検出された菌類がハミゲラ属かクラドスポリウム属であるかを識別することができる。ハミゲラ属に属する菌類はマイコトキシン（カビ毒）を生産しないので、両属の検出によりマイコトキシンのリスク予測が可能となる。また、両属は耐熱性が異なるため、属の違いを検出することにより、菌体の混入が加熱前なのか否かの予想を立てることができるため、殺菌工程の見直しや容器の機密性の確認など原因解明に生かすことが出来る。なかでも、前記（ａ１）及び（ｂ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｃ１）及び（ｄ１）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｅ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがより好ましく、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対又は配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
特に、検出感度の点からは、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｅ）及び（ｆ）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることが好ましく、前記（ａ１）及び（ｂ１）のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記（ｅ１）及び（ｆ１）で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがより好ましく、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
【００４３】
本発明の耐熱性菌類の検出方法において、被検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
被検体からＤＮＡを調製する方法としては、耐熱性菌類の検出を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、通常の方法や市販の調製用キットを用いることができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００４４】
本発明のハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類の検出方法によれば、被検体の調製工程から菌類の検出工程までを約５〜１２時間という短時間で行うことが可能である。
【００４５】
本発明のハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類検出用キットは、前記本発明の検出用オリゴヌクレオチドを核酸プローブ又は核酸プライマーとして含有するものである。このキットは、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属の検出方法に用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プローブ又は核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明の検出用オリゴヌクレオチドによって検出反応が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の検出用オリゴヌクレオチドにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４７】
実施例１
１．βチューブリン部分長の塩基配列決定
下記の方法によりハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。ポテトデキストロース寒天斜面培地にてハミゲラ  アベラネアは３０℃、クラドスポリウム  クラドスポロイデスは２５℃で７日間、暗所培養した。菌体からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ（株）社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD製）を用いて、プライマーとしてBt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：配列番号９）、Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：配列番号１０）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を使用した。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度９５℃、アニーリング温度５９℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto  SegTM  G−50（Amersham  Pharmacia  Biotech社製）を使用し精製した。ＰＣＲ産物は、BigDye  terminator  Ver.  1.1（商品名：Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetiｃ  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC  Ver.4”（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定したハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報及び、各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、ハミゲラ属に属するハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスに特異的な塩基配列を含有するβ−チューブリン遺伝子の中の特定領域（配列番号５及び６）を決定した。
【００４８】
２．ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類の検出
（１）プライマーの設計
上記で得られたハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスに特異的な塩基配列領域のうち、３’末端側で両菌の保存性が特に高い領域から、１）属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして５組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるハミゲラ属とクラドスポリウム  クラドスポロイデスの一括検出の有効性を検討した。すなわち、ハミゲラ属及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスのＤＮＡを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅反応が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、１対のプライマー対でハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスで特異的にＤＮＡ増幅が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められなかった。この結果より、ハミゲラ属とクラドスポリウム  クラドスポロイデスの一括検出が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【００４９】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちハミゲラ属とその他の耐熱性カビ及び一般カビとしては、表１に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーやＴナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて指摘温度、すなわち一般カビは２５℃、耐熱性カビは３０℃で７日間培養した。
【００５０】
【表１】
2010004877.tif 000002
【００５１】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００５２】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９８℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)６３℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【００５３】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図２に示す。図中の番号は表１記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ハミゲラ属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含む試料（１レーン）では、１００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ハミゲラ属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ハミゲラ属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【００５４】
実施例２
（２−１）  ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類の検出
（ａ）プライマー
実施例１で設計した、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００５５】
（ｂ）検体の調製
ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類としては、表２に記載のハミゲラ  アベラネア（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ）及びクラドスポリウム  クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）を使用した。前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を示すために、表２に示すその他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーやＴナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。なお、ポジティブコントロールとして、Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ（菌株名：Ｔ３４）を鋳型ＤＮＡとして用いた。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて至適温度、すなわち一般カビは２５℃、耐熱性カビ及びアスペルギルス  フミガタスは３０℃で７日間培養した。
【００５６】
【表２】
2010004877.tif 000003
【００５７】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００５８】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９７℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)６３℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【００５９】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図３に示す。図中の番号は表２記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含む試料では、１００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のいずれのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に検出することができる。
【００６０】
（２−２）  ハミゲラ属に属する菌類とクラドスポリウム属に属する菌類の識別
（ａ）プライマーの設計
配列番号５及び６記載のハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスを含めたその他のカビのβ‐チューブリン塩基配列領域のアライメント解析（ＤＮＡsis  Ｐｒｏ）を行い、有意な塩基配差の存在する部位を特定した。その部位の中で、３’末端側でハミゲラ  アベラネアの特異性が特に高い領域から、１）属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして７組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応によるハミゲラ属とクラドスポリウム  クラドスポロイデスの識別法の有効性を検討した。すなわち、ハミゲラ属のＤＮＡを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにＤＮＡ増幅反応が認められ、その他のカビＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、２対のプライマー対でハミゲラ  アベラネアを含むハミゲラ属で特異的にＤＮＡ増幅が認められ、その他のカビのゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認めらかった。この結果より、ハミゲラ属とクラドスポリウム  クラドスポロイデスの識別が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対及び配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【００６１】
（ｂ）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちハミゲラ属とその他の耐熱性カビ及び一般カビとしては、表３に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて至適温度、すなわち一般カビは２５℃、耐熱性カビは３０℃で７日間培養した。
【００６２】
【表３】
2010004877.tif 000004
【００６３】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００６４】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したハミゲラ  アベラネア及びクラドスポリウム  クラドスポロイデスのゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号３に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９７℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)６０℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【００６５】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図４に示す。図中の番号は表３記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ハミゲラ属に属する菌類に属する菌類のゲノムＤＮＡを含む試料（試料番号１〜３）では、２００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、クラドスポリウム属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含む試料（試料番号１７）及びその他のハミゲラ属に属する菌類のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いることによって、試料に含まれる菌類がハミゲラ属に属する菌類であるかクラドスポリウム属に属する菌類であるかを識別することができる。
【００６６】
実施例３
（ａ）プライマー
実施例２で設計した、配列番号３，４，７，８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００６７】
（ｂ）検体の調製
前記（ｃ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確認するために、ハミゲラ属に属する菌類として、図５に示すハミゲラ  ストリアータ（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ｓｔｒｉａｔａ）の各菌株を使用した。
各菌体を実施例１と同様に培養した。
【００６８】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
実施例１と同様の方法で、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００６９】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号３に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号７に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌに変更した以外は上記と同様にしてＰＣＲ反応溶液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)６１〜５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００７０】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から４μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図５に示す。
その結果、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系及び配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系のいずれにおいても、使用したハミゲラ  ストリアータの全ての菌株において、特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された（９〜１６レーン）。また、配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系の方が、検出されたバンドがより鮮明であった（９〜１２レーン）。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくハミゲラ属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
【００７１】
実施例４
（ａ）プライマー
実施例２で設計した、配列番号３，４，７，８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００７２】
（ｂ）検体の調製
前記（ｃ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確認するために、ハミゲラ属に属する菌類として、図６に示すハミゲラ  アベラネア（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ）の各菌株を使用した。
各菌体を実施例１と同様に培養した。
【００７３】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
実施例１と同様の方法で、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００７４】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号３に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号７に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌに変更した以外は上記と同様にしてＰＣＲ反応溶液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００７５】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図６に示す。
その結果、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系及び配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系のいずれにおいても、使用したハミゲラ  アベラネアの全ての菌株において、特異的な増幅ＤＮＡ断片が確認された（各１〜８レーン）。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくハミゲラ属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
【００７６】
実施例５
（ａ）プライマー
実施例２で設計した、配列番号３，４，７，８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
【００７７】
（ｂ）検体の調製
前記（ｃ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に対する特異性を確認するために、耐熱性菌類の１種であってハミゲラ属に近縁なビソクラミス属に属する菌類として、図７及び図８に示すビソクラミス  ニベア及びビソクラミス  フルバの各菌株を使用した。なお、これらの菌類は独立行政法人製品製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ番号で管理されているもの及びThe  Centraalbureau  voor  SchimmelculturesによりＣＢＳ番号で管理されているもの等を入手し、使用した。
各菌体を実施例１と同様に培養した。
【００７８】
（ｃ）ゲノムＤＮＡの調製
実施例１と同様の方法で、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００７９】
（ｄ）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号３或に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号７に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号８に記載の塩基配列で表されるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌに変更した以外は上記と同様にしてＰＣＲ反応溶液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００８０】
（ｅ）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図７及び図８に示す。
その結果、配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系ではポジティブコントロールのハミゲラ  アベラネア以外にもビソクラミス  フルバの一部の菌株ＮＢＲＣ31877株及びＮＢＲＣ31878株（レーン９、１０）で２００ｂｐのサイズに遺伝子増幅が認められたものの、他のビソクラミス属に属する菌類に関しては遺伝子増幅が認められなかった。なお、ＮＢＲＣ31877株及び31878株で遺伝子増幅が認められた理由は、これらの株が他の株と比較して遺伝学的にハミゲラ属に近縁であるためと推測される。
一方、配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系では、ビソクラミス  フルバＮＢＲＣ31877株及びＮＢＲＣ31878株では遺伝子増幅が認められなかった。したがって、配列番号７及び８に記載のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ビソクラミス属に属する菌類を検出せずハミゲラ属に属する菌類のみを高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
【図１】
2010004877.tif 000005
【図２】
2010004877.tif 000006
【図３】
2010004877.tif 000007
【図４】
2010004877.tif 000008
【図５】
2010004877.tif 000009
【図６】
2010004877.tif 000010
【図７】
2010004877.tif 000011
【図８】
2010004877.tif 000012
【配列表】
2010004877000001.app