(57)【要約】【課題】連続的かつ効率的に、無菌状態で培養液に含まれる汚染微生物を捕集することができるサンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法を提供する。【解決手段】本発明のサンプリング装置１０は、バイオリアクター１１と、バイオリアクター１１内の培養液３０を循環させるサンプリングライン１２と、サンプリングライン１２の途中に設けられ、培養液３０中の汚染微生物を分離するクロスフロー方式の濾過装置１３と、濾過装置１３の透過側室２１とバイオリアクター１１を接続する回収ライン１５と、回収ライン１５の途中に設けられ、汚染微生物を捕集する濾過膜ユニット１７と、濾過膜ユニット１７を水蒸気滅菌するための水蒸気を供給する水蒸気供給ライン１８と、を備えたことを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオリアクターと、該バイオリアクター内の培養液を循環させるサンプリングラインと、該サンプリングラインの途中に設けられ、前記培養液中の生物細胞と汚染微生物を分離するクロスフロー方式の濾過装置と、前記濾過装置の透過側室と前記バイオリアクターを接続する回収ラインと、前記回収ラインの途中に設けられ、前記培養液中に含まれる汚染微生物を捕集する濾過膜ユニットと、前記濾過膜ユニットを水蒸気滅菌するための水蒸気を供給する水蒸気供給ラインと、を備えたことを特徴とするサンプリング装置。
【請求項２】
前記濾過膜ユニットは脱着可能であることを特徴とする請求項１に記載のサンプリング装置。
【請求項３】
前記濾過膜ユニットはクリーンベンチ内に配置されたことを特徴とする請求項１または２に記載のサンプリング装置。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のサンプリング装置を用いたサンプリング方法であって、
バイオリアクター内の培養液を循環させながら、クロスフロー方式の濾過装置により、この培養液を濾過する工程Ａと、濾過膜ユニットにより、前記濾過装置を透過した培養液に含まれる汚染微生物を捕集する工程Ｂと、該汚染微生物を捕集した後の培養液を、前記バイオリアクター内に戻す工程Ｃと、水蒸気供給ラインから前記濾過膜ユニットに水蒸気を供給して、前記濾過膜ユニットを水蒸気滅菌する工程Ｄと、を有することを特徴とするサンプリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法に関し、さらに詳しくは、培養液を循環させながら、連続的かつ無菌状態で培養液に含まれる汚染微生物を捕集することが可能なサンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養装置を用いて細胞を長期にわたって継続して培養する場合、培養液が微生物により汚染されるおそれがある。
そこで、閉鎖された細胞培養系における無菌サンプリング装置において、サンプリングを行わない場合、細胞培養系からの分岐ラインに新鮮滅菌空気を送り、サンプリングを行う場合には、細胞培養系から培養液をサンプリングポートに流入させてサンプリングを行うとともに、培養液貯蔵用タンク内が一定以上に減圧状態となった場合、新鮮滅菌空気を培養液貯蔵用タンク内に送り込むことにより、無菌的なサンプリングを行う無菌サンプリング装置が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開昭６４−０８０２７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来のサンプリング装置では、定期的にサンプリングを行い、その時点で採取した検体について汚染の有無を調べるため、サンプリング可能な検体量に制限があり、汚染微生物の量が少ないと、検出感度が低く、場合によっては検出できないことがあった。また、サンプリングによって、その分だけ培養中の培養液の量が減少するため、効率的に細胞培養を行うことができなかった。
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、連続的かつ効率的に、無菌状態で培養液に含まれる汚染微生物を捕集することができるサンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のサンプリング装置は、バイオリアクターと、該バイオリアクター内の培養液を循環させるサンプリングラインと、該サンプリングラインの途中に設けられ、前記培養液中の生物細胞と汚染微生物を分離するクロスフロー方式の濾過装置と、前記濾過装置の透過側室と前記バイオリアクターを接続する回収ラインと、前記回収ラインの途中に設けられ、前記培養液中に含まれる汚染微生物を捕集する濾過膜ユニットと、前記濾過膜ユニットを水蒸気滅菌するための水蒸気を供給する水蒸気供給ラインと、を備えたことを特徴とする。
【０００６】
前記濾過膜ユニットは脱着可能であることが好ましい。
前記濾過膜ユニットはクリーンベンチ内に配置されたことが好ましい。
【０００７】
本発明のサンプリング方法は、本発明のサンプリング装置を用いたサンプリング方法であって、バイオリアクター内の培養液を循環させながら、クロスフロー方式の濾過装置により、この培養液を濾過する工程Ａと、濾過膜ユニットにより、前記濾過装置を透過した培養液に含まれる汚染微生物を捕集する工程Ｂと、該汚染微生物を捕集した後の培養液を、前記バイオリアクター内に戻す工程Ｃと、水蒸気供給ラインから前記濾過膜ユニットに水蒸気を供給して、前記濾過膜ユニットを水蒸気滅菌する工程Ｄと、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のサンプリング装置によれば、サンプリングラインや回収ラインを介して、１つの閉鎖された循環系を形成しているので、培養液を循環させながら、連続的かつ無菌状態でサンプリングを行うことができ、培養液のサンプリング量の制限がなくなるので、従来よりも、汚染微生物の検出感度を上げることができる。加えて、サンプリングによって培養液が無駄に廃棄されることがなく、効率的に細胞培養を行うことができる。さらに、濾過膜ユニットの交換などによって、循環系が汚染されるおそれがあっても、水蒸気供給ラインによる濾過膜ユニットの水蒸気滅菌によって、この循環系の無菌状態を維持することができるので、常に無菌状態を保つことができ、高精度に汚染微生物の検出を行うことができる。
【０００９】
本発明のサンプリング方法によれば、サンプリングラインや回収ラインを介して形成された、１つの閉鎖された循環系を使用するので、培養液を循環させながら、連続的かつ無菌状態でサンプリングを行うことができ、培養液のサンプリング量の制限がなくなるので、従来よりも、汚染微生物の検出感度を上げることができる。加えて、サンプリングによって培養液が無駄に廃棄されることがなく、効率的に細胞培養を行うことができる。さらに、濾過膜ユニットの交換などによって、循環系が汚染されるおそれがあっても、水蒸気供給ラインによる濾過膜ユニットの水蒸気滅菌によって、この循環系の無菌状態を維持することができるので、常に無菌状態を保つことができ、高精度に汚染微生物の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のサンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法の最良の形態について説明する。
なお、この形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００１１】
図１は、本発明のサンプリング装置の一実施形態を示す概略構成図である。
この実施形態のサンプリング装置１０は、バイオリアクター１１と、サンプリングライン１２と、クロスフロー方式の濾過装置１３と、第一のポンプ１４と、回収ライン１５と、第二のポンプ１６と、濾過膜ユニット１７と、水蒸気供給ライン１８とから概略構成されている。
【００１２】
バイオリアクター１１は、培養液３０を収容して、この培養液３０によって所定の細胞の培養を行う装置である。
サンプリングライン１２は、バイオリアクター１１内の培養液３０をサンプリングするとともに、濾過装置１３における濾過処理を経た培養液３０を再びバイオリアクター１１内に戻すためのラインである。
【００１３】
クロスフロー方式の濾過装置１３は、サンプリングライン１２の途中に設けられている。
濾過装置１３は、精密濾過（ＭＦ）膜、限外濾過（ＵＦ）膜などの濾過膜２０を備えており、これらの濾過膜２０の孔の大きさは、１μｍ以上、１０μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは２μｍ以上、５μｍ以下である。
濾過膜２０の孔の大きさが１μｍ未満では、濾過装置１３において、培養液３０に含まれる生物細胞とともに汚染微生物を濾別して、これらを含んだ培養液３０を、サンプリングライン１２を通じて、再びバイオリアクター１１内に戻すことになってしまい、汚染微生物の存在、すなわち、培養液３０の汚染度を検知することができなくなる。一方、濾過膜２０の孔の大きさが１０μｍを超えると、濾過装置１３において生物細胞が透過してしまい、濾過装置１３の後段（濾過膜ユニット１７）にて、汚染微生物とともに生物細胞が捕集されてしまい、細胞培養の効率が低下する。
【００１４】
第一のポンプ１４は、サンプリングライン１２の途中で、かつ、培養液３０の循環方向において、濾過装置１３の後段に設けられている。
第一のポンプ１４としては、特に限定されず、例えば、一般的な循環ポンプ、送液ポンプなどが用いられる。
【００１５】
回収ライン１５は、濾過装置１３を構成する濾過膜２０の透過側室２１とバイオリアクター１１を接続し、濾過装置１３における濾過処理、および、濾過膜ユニット１７における濾過処理を経た培養液３０を再びバイオリアクター１１内に戻すためのラインである。
【００１６】
第二のポンプ１６は、回収ライン１５の途中で、かつ、培養液３０の流れ方向において、濾過装置１３の後段に設けられている。
第二のポンプ１６としては、特に限定されず、例えば、一般的な循環ポンプ、送液ポンプなどが用いられる。
【００１７】
濾過膜ユニット１７は、回収ライン１５の途中で、かつ、培養液３０の流れ方向において、第二のポンプ１６の後段に設けられている。
濾過膜ユニット１７は、精密濾過（ＭＦ）膜、限外濾過（ＵＦ）膜などの濾過膜を備えており、これらの濾過膜の孔の大きさは、０．１μｍ以上、１μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは０．２μｍ以上、０．５μｍ以下である。
濾過膜の孔の大きさが０．１μｍ未満では、濾過膜ユニット１７における圧力損失が大きくなり、回収ライン１５における培養液３０の流動性が低下する。一方、濾過膜の孔の大きさが１μｍを超えると、濾過膜ユニット１７において汚染微生物が透過してしまい、汚染微生物を捕集することができないので、汚染微生物の存在、すなわち、培養液３０の汚染度を検知することができなくなる。
【００１８】
また、この濾過膜ユニット１７は、回収ライン１５に対して脱着可能であることが好ましい。このようにすれば、培養液３０の循環を所定時間繰り返した後、あるいは、所定量の培養液３０を循環させた後一時的にその循環を停止させて、濾過膜ユニット１７を新しいものと交換した後、培養液３０の循環を再開することができる。したがって、培養液３０の循環を継続しながらも、これとは別に、回収ライン１５から取り外された濾過膜ユニット１７に捕集されている汚染微生物の検査を行うことができるので、効率的である。
【００１９】
さらに、濾過膜ユニット１７は、クリーンベンチ１９内に配置されていてもよい。このようにすれば、濾過膜ユニット１７における汚染微生物のサンプリングおよび濾過膜ユニット１７の脱着を無菌状態で行うことができる。
【００２０】
また、回収ライン１５の途中で、かつ、培養液３０の流れ方向において、濾過膜ユニット１７の前段に、第一のバルブ２３、第三のバルブ２５が設けられている。また、回収ライン１５の途中で、かつ、培養液３０の流れ方向において、濾過膜ユニット１７の後段に、第二のバルブ２４、第四のバルブ２６が設けられている。
第一のバルブ２３、第二のバルブ２４、第三のバルブ２５、第四のバルブ２６としては、特に限定されず、一般的な電磁バルブなどが用いられる。
【００２１】
水蒸気供給ライン１８は、回収ライン１５の途中で、かつ、第一のバルブ２３と第三のバルブ２５の間、並びに、回収ライン１５の途中で、かつ、第二のバルブ２４と第四のバルブ２６の間に接続されている。
この水蒸気供給ライン１８は、濾過膜ユニット１７を水蒸気滅菌するための水蒸気を、濾過膜ユニット１７に供給するためのラインである。
【００２２】
サンプリング装置１０は、サンプリングライン１２や回収ライン１５を介して、１つの閉鎖された循環系を形成しているので、培養液３０を循環させながら、連続的かつ無菌状態でサンプリングを行うことができる。したがって、このサンプリング装置１０によれば、培養液３０のサンプリング量の制限がなくなるので、従来よりも、汚染微生物の検出感度を上げることができる。加えて、サンプリングによって培養液が無駄に廃棄されることがないので、効率的に細胞培養を行うことができる。
また、濾過膜ユニット１７の交換などによって、循環系が汚染されるおそれがあっても、回収ライン１５の途中に設けられた各バルブ（第一のバルブ２３、第二のバルブ２４、第三のバルブ２５、第四のバルブ２６）の開閉操作、および、水蒸気供給ライン１８による濾過膜ユニット１７の水蒸気滅菌によって、この循環系の無菌状態を維持することができるので、常に無菌状態を保つことができ、高精度に汚染微生物の検出を行うことができる。
【００２３】
さらに、第一のバルブ２３および第二のバルブ２４を閉じれば、バイオリアクター１１、サンプリングライン１２および濾過装置１３からなる循環系に、水蒸気供給ライン１８からの水蒸気が流入することがないので、濾過膜ユニット１７の水蒸気滅菌を行うと同時に、バイオリアクター１１における細胞培養およびサンプリングライン１２における培養液のサンプリングを行うことができる。したがって、細胞培養、培養液のサンプリングおよび濾過膜ユニット１７の水蒸気滅菌を効率的に行うことができる。
【００２４】
（サンプリング方法）
次に、本発明のサンプリング方法を説明する。
本発明のサンプリング方法は、本発明のサンプリング装置を用いたサンプリング方法であって、バイオリアクター内の培養液を循環させながら、クロスフロー方式の濾過装置により、この培養液を濾過する工程Ａと、濾過膜ユニットにより、前記濾過装置を透過した培養液に含まれる汚染微生物を捕集する工程Ｂと、該汚染微生物を捕集した後の培養液を、前記バイオリアクター内に戻す工程Ｃと、水蒸気供給ラインから前記濾過膜ユニットに水蒸気を供給して、前記濾過膜ユニットを水蒸気滅菌する工程Ｄと、を有する方法である。
【００２５】
まず、第一のポンプ１４を作動させて、サンプリングライン１２内に培養液３０を循環させるとともに、濾過装置１３において、クロスフロー方式により培養液３０の濾過を行う（工程Ａ）。
濾過装置１３においては、培養に必要な生物細胞を濾別して、この生物細胞を濾過膜２０の供給側室２２から透過側室２１に透過させないようにする。一方、培養液３０に含まれる汚染微生物は、培養液３０とともに濾過膜２０を透過し、濾過膜２０の透過側に移動する。
そして、この生物細胞を含む培養液３０が、サンプリングライン１２を通じて、濾過装置１３からバイオリアクター１１内に戻される。
【００２６】
濾過膜２０を透過した培養液３０の量が所定量を超えるか、あるいは、サンプリングライン１２における培養液３０の循環を開始してからしばらく経った後、第二のポンプ１６を作動させて、回収ライン１５内に濾過膜２０を透過した培養液３０を流す。このとき、第一のバルブ２３、第二のバルブ２４、第三のバルブ２５および第四のバルブ２６は開いている。回収ライン１５を流れた培養液３０は、その途中に設けられた濾過膜ユニット１７を透過するが、濾過膜ユニット１７によって培養液３０に含まれる汚染微生物が捕集される（工程Ｂ）。
【００２７】
汚染微生物を捕集した後の培養液３０は、回収ライン１５を通じて、バイオリアクター１１内に戻される（工程Ｃ）。
【００２８】
これらの工程Ａ〜Ｃを継続することにより、連続的に培養液３０のサンプリング、すなわち、培養液３０における汚染微生物の検知（培養液３０の汚染度の検知）を行うことができる。
【００２９】
また、回収ライン１５において、培養液３０を流してから所定時間経過後、あるいは、所定量の培養液３０を流した後、第二のポンプ１５を停止するとともに、第一のバルブ２３を閉じて、濾過装置１３から回収ライン１５への培養液３０の流入を停止する。このとき、サンプリングライン１２における培養液３０の循環は、停止しても、継続してもよい。
【００３０】
その後、第二のバルブ２４、第三のバルブ２５および第四のバルブ２６を順次閉じて、濾過膜ユニット１７への培養液３０の流入を完全に停止する。
次いで、回収ライン１５に濾過膜ユニット１７を装着したまま、そこに捕集された汚染微生物を回収、検査するか、あるいは、回収ライン１５から濾過膜ユニット１７を取り外して、新しいものと交換する。取り外された濾過膜ユニット１７は、汚染微生物の検査に回される。
【００３１】
また、回収ライン１５に濾過膜ユニット１７を装着したまま、汚染微生物を回収、検査した後、あるいは、新しい濾過膜ユニット１７と交換した後、第三のバルブ２５および第四のバルブ２６のみを開いて、水蒸気供給ライン１８から濾過膜ユニット１７に水蒸気を供給し、濾過膜ユニット１７を水蒸気滅菌する（工程Ｄ）。
【００３２】
このサンプリング方法は、サンプリングライン１２や回収ライン１５を介して形成された、１つの閉鎖された循環系を使用するので、培養液３０を循環させながら、連続的かつ無菌状態でサンプリングを行うことができる。したがって、このサンプリング方法によれば、培養液３０のサンプリング量の制限がなくなるので、従来よりも、汚染微生物の検出感度を上げることができる。加えて、サンプリングによって培養液が無駄に廃棄されることがないので、効率的に細胞培養を行うことができる。
また、濾過膜ユニット１７の交換などによって、循環系が汚染されるおそれがあっても、回収ライン１５の途中に設けられた各バルブ（第一のバルブ２３、第二のバルブ２４、第三のバルブ２５、第四のバルブ２６）の開閉操作、および、水蒸気供給ライン１８による濾過膜ユニット１７の水蒸気滅菌によって、この循環系の無菌状態を維持することができるので、常に無菌状態を保つことができ、高精度に汚染微生物の検出を行うことができる。
【００３３】
さらに、第一のバルブ２３および第二のバルブ２４を閉じれば、バイオリアクター１１、サンプリングライン１２および濾過装置１３からなる循環系に、水蒸気供給ライン１８からの水蒸気が流入することがないので、濾過膜ユニット１７の水蒸気滅菌を行うと同時に、バイオリアクター１１における細胞培養およびサンプリングライン１２における培養液のサンプリングを行うことができる。したがって、細胞培養、培養液のサンプリングおよび濾過膜ユニット１７の水蒸気滅菌を効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のサンプリング装置の一実施形態を示す概略構成図である。
【符号の説明】
【００３５】
１０・・・サンプリング装置、１１・・・バイオリアクター、１２・・・サンプリングライン、１３・・・濾過装置、１４・・・第一のポンプ、１５・・・回収ライン、１６・・・第二のポンプ、１７・・・濾過膜ユニット、１８・・・水蒸気供給ライン、１９・・・クリーンベンチ、２０・・・濾過膜、２１・・・透過側室、２２・・・供給側室、２３・・・第一のバルブ、２４・・・第二のバルブ、２５・・・第三のバルブ、２６・・・第四のバルブ、３０・・・培養液。
【図１】
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