(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＩＶ抗原（gagおよび／またはpol）およびサイトカイン（γ−インターフェロン）をコードする鶏痘ウイルス構築体及びこれを含むワクチン組成物の提供。【解決手段】１またはそれ以上のＨＩＶ抗原またはその誘導体をコードする第１核酸分子およびサイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第２核酸分子を組み込んだ禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含み、その組換えウイルス構築体が該ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘引、高揚、または刺激する効果を有するワクチン組成物。感染防御抗原をサイトカインとともに発現する組換えウイルス構築体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１またはそれ以上のＨＩＶ抗原またはその誘導体をコードする第１核酸分子およびサイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第２核酸分子を組み込んだ禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含み、該ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘引、高揚、または刺激する効果を有する組換えウイルス構築体。
【請求項２】
該ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１である請求項１の組換えウイルス構築体。
【請求項３】
該ＨＩＶ−１抗原がＧａｇおよび／またはＰｏｌである請求項２の組換えウイルス構築体。
【請求項４】
該サイトカインがγ−インターフェロンである請求項１、２または３の組換えウイルス構築体。
【請求項５】
該サイトカインがＩＬ−２である請求項１、２または３の組換えウイルス構築体。
【請求項６】
該禽痘ウイルスが鶏痘ウイルスである請求項１−５のいずれか１つの組換えウイルス構築体。
【請求項７】
該禽痘ウイルスがカナリア痘ウイルスである請求項１−５のいずれか１つの組換えウイルス構築体。
【請求項８】
該禽痘ウイルスが鶏痘ウイルスであり、該ＨＩＶ−１抗原がＧａｇおよび／またはＰｏｌであり、該サイトカインがγ−インターフェロンである請求項１の組換えウイルス構築体。
【請求項９】
１またはそれ以上のＨＩＶ抗原またはその誘導体をコードする第１核酸分子およびサイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第２核酸分子を組み込んだ禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含み、その組換えウイルス構築体が該ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘引、高揚、または刺激する効果を有するワクチン組成物。
【請求項１０】
該ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１である請求項９のワクチン組成物。
【請求項１１】
該ＨＩＶ−１抗原がＧａｇおよび／またはＰｏｌである請求項１０のワクチン組成物。
【請求項１２】
該サイトカインがγ−インターフェロンである請求項９、１０または１１のワクチン組成物。
【請求項１３】
該サイトカインがＩＬ−２である請求項９、１０または１１のワクチン組成物。
【請求項１４】
該禽痘ウイルスが鶏痘ウイルスである請求項９−１３のいずれか１つのワクチン組成物。
【請求項１５】
該禽痘ウイルスがカナリア痘ウイルスである請求項９−１３のいずれか１つのワクチン組成物。
【請求項１６】
該禽痘ウイルスが鶏痘ウイルスであり、該ＨＩＶ−１抗原がＧａｇおよび／またはＰｏｌであり、該サイトカインがγ−インターフェロンである請求項９のワクチン組成物。
【請求項１７】
請求項１−８のいずれか１つの組換えウイルス構築体および１またはそれ以上の医薬用担体および／または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１−８のいずれか１つの組換えウイルス構築体の、ＨＩＶ感染の治療および／または予防処置用医薬の製造における使用。
【請求項１９】
該ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１である請求項１８の使用。
【請求項２０】
請求項１−８のいずれか１つの組換えウイルス構築体を含む、哺乳動物におけるＨＩＶに対する免疫応答を誘引、高揚、または刺激するために有用な薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は全般的に、感染防御抗原をサイトカインとともに発現する組換えウイルス構築体およびこれを含むワクチン組成物に関する。本発明は特に、ＨＩＶ抗原、最も具体的にはＨＩＶ−１抗原に対する免疫応答を誘導可能な組換えウイルス構築体に関する。本発明は、とりわけＨＩＶの治療および／または予防処置において有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書中に数字で引用されている刊行物の詳細は巻末に集められている。
【０００３】
現在、ＨＩＶ感染の有効な処置方法は存在しない。現在の処置戦略は血漿ＨＩＶ−１ ＲＮＡレベルを非常に低いレベルに抑制することができるが、ＨＩＶ−１ ＤＮＡを含有する潜在的感染細胞は依然として検出され、ウイルス耐性および再発が一般的である［１，２］。処置誘導性のＨＩＶ−１レベルの減少は、結果的に、有効な免疫応答のための抗原性刺激を喪失させる。ＨＩＶ−１の制御における重要なエフェクター機構であると思われる、ＨＩＶ特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、有効な抗ＨＩＶ治療後には低レベルに減少する［３］。
【０００４】
治療的ＨＩＶ−１ワクチンの以前の試みは、ＨＩＶ−１感染個体における抗ＨＩＶ免疫応答を刺激することが可能であることを示したが、臨床的恩恵は示されていない［４−６］。従来の研究では、ＣＴＬ応答誘導不能の、タンパク質に基づくＨＩＶ−１ワクチンを用いるか、あるいは実質的レベルの複製ＨＩＶ−１で個体にワクチン接種（vaccinate）した。適度なレベルの複製ＨＩＶ−１でさえ、有効なＣＴＬ応答を開始および持続させるのに必要とされるＨＩＶ特異的ＣＤ４＋ Ｔヘルパー（Ｔｈ）応答を喪失させる［７］。
【０００５】
さらに、予防用ＨＩＶワクチンは現在存在しない。単純な組換え禽痘ワクチン（サイトカインの同時発現なし）は一部のヒトおよび非ヒト霊長類患者においてＣＴＬ応答を誘導し得るが、この応答はしばしば弱く、一時的であり、あるいは存在しない（non-existant）。ＨＩＶ特異的ＣＴＬおよびＴｈ応答の誘導用の、より信頼できるワクチンベクターが必要である。
【０００６】
本発明に至る仕事では、発明者らは、ＨＩＶ gag/pol をコードする核酸分子およびサイトカイン、特にＩＦＮ−γをコードする核酸分子の両方を含む組換え鶏痘ウイルス構築体でワクチン接種することによってＨＩＶに対する特異的免疫応答の大きさおよび表現型を高めることができることを決定した。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の要旨
本明細書および請求の範囲を通して、特に記載しない限り、用語「含む(comprise)」ならびに「comprises」および「comprising」のようなバリエーションは、定まった完全体（integer）もしくは段階（step）または完全体群もしくは段階群の包含を意味し、任意の他の完全体もしくは段階または完全体群もしくは段階群の排除を意味しないことが理解されよう。
【０００８】
本明細書はプログラム PatentIn Version 2.0 を用いて調製されたヌクレオチド配列情報（参考文献の後に記載）を含む。配列表中、各ヌクレオチド配列は数字見出し＜２１０＞、次いで配列番号（the sequence identifier）（例えば＜２１０＞１、＜２１０＞２など）によって同定される。各ヌクレオチド配列の長さ、配列のタイプ（ＤＮＡなど）および生物起源は、それぞれ数字見出しフィールド＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞に与えられる情報によって示される。明細書中に引用されるヌクレオチド配列は、数字見出しフィールド＜４００＞、次いで配列番号（例えば＜４００＞１、＜４００＞２など）によって与えられる情報によって規定される。
【０００９】
本発明の１つの側面は、１つまたはそれ以上のＨＩＶ抗原またはその誘導体をコードする第一の核酸分子および、サイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を包含する禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築体であって、該ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有用な組換えウイルス構築体を提供する。
【００１０】
本発明の別の側面では、１つまたはそれ以上のＨＩＶ−１抗原またはその誘導体をコードする第一の核酸分子および、サイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を包含する禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築体であって、該ＨＩＶ−１抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有用な組換えウイルス構築体を提供する。
【００１１】
本発明のさらに別の側面では、ＨＩＶ−１ Gag および／または Pol またはその誘導体をコードする第一の核酸分子およびサイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を包含する禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築体であって、該 Gag および／または Pol に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有用な組換えウイルス構築体を提供する。
【００１２】
本発明のさらに別の側面では、ＨＩＶ−１ Gag および／または Pol またはその誘導体をコードする第一の核酸分子および、インターフェロン−γまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を包含する禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築体であって、該 Gag および／または Pol に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有用な組換えウイルス構築体を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる側面では、ＨＩＶ−１ Gag および／または Pol またはその誘導体をコードする第一の核酸分子および、インターフェロン−γ、その機能的当価物をコードする第二の核酸分子を包含する鶏痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築体であって、該 Gag および／または Pol に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有用な組換えウイルス構築体を提供する。
【００１４】
本発明のさらに別の側面は、１つまたはそれ以上のＨＩＶ抗原またはその誘導体をコードする第一の核酸分子および、サイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を包含する禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築体であって、該ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有用な組換えウイルス構築体を含むワクチンに関する。
【００１５】
本発明のさらに別の側面では、ＨＩＶ−１ Gag および／または Pol またはその誘導体をコードする第一の核酸分子およびインターフェロンγまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を包含する禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築体を含むワクチンであって、該 Gag および／または Pol に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有用なワクチンを提供する。
【００１６】
本発明のさらに別の側面では、本発明は、本明細書中、上に規定される組換えウイルス構築体および１つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体および／または希釈剤を含む、哺乳類のＨＩＶに対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに使用するための医薬組成物を提供する。この組成物には組換えウイルス構築体を既知の抗ウイルス化合物または分子とともに含ませてもよい。
【００１７】
本発明のさらに別の側面では、哺乳類のＨＩＶに対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激する方法であって、本明細書中、上に規定されるワクチンの有効量を、１つまたはそれ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに十分な時間および条件で該哺乳類に投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらに別の側面では、哺乳類のＨＩＶに対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激する方法であって、本明細書中、上に規定される組換えウイルス構築体の有効量を、１つまたはそれ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに十分な時間および条件で該哺乳類に投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらに別の側面では、哺乳類を処置する方法であって、本明細書中、上に規定されるワクチンの有効量を、１つまたはそれ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに十分な時間および条件で該哺乳類に投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらに別の側面では、哺乳類を処置する方法であって、本明細書中、上に規定される組換えウイルス構築体の有効量を、１つまたはそれ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに十分な時間および条件で該哺乳類に投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
本発明のさらに別の側面では、哺乳類のＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを処置し、ならびに／あるいは予防する方法であって、本明細書中、上に規定されるワクチンの有効量を、１つまたはそれ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに十分な時間および条件で投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の側面では、哺乳類のＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを処置し、ならびに／あるいは予防する方法であって、本明細書中、上に規定される組換えウイルス構築体の有効量を、１つまたはそれ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに十分な時間および条件で投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、ＨＩＶ感染を処置および／または予防するための医薬品の製造における本発明の組換えウイルス構築体の使用にまで拡大する。
【００２４】
本発明のさらに別の側面では、本明細書中、上に規定される組換えウイルス構築体を含む、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有用な薬剤を提供する。
【００２５】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、一部、ｇａｇ／ｐｏｌなどの１またはそれ以上の保護ＨＩＶ抗原をコードする核酸分子とＩＦＮ−γなどのサイトカインをコードする核酸分子との両者を含む組換えウイルス構築物（構築体）を用いてワクチンを行ったときに、ＨＩＶ、とりわけＨＩＶ−１に対する免疫応答を高めることができるという決定に基づく。
従って、本発明の１つの側面は、１またはそれ以上のＨＩＶ抗原またはその誘導体をコードする第一の核酸分子およびサイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を導入したアビポックス（avipox、禽痘）ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築物であって、該ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有効なものを提供する。
【００２６】
「ＨＩＶ」への言及は、ホモログおよび変異体を含むあらゆるＨＩＶ株への言及を包含すると理解されなければならない。特に好ましい態様では、該ＨＩＶはＨＩＶ−１である。
この本発明の好ましい側面によれば、１またはそれ以上のＨＩＶ−１抗原またはその誘導体をコードする第一の核酸分子およびサイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を導入したアビポックスウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築物であって、該ＨＩＶ−１抗原に対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有効なものが提供される。
【００２７】
ＨＩＶ−１抗原に対する免疫応答を「誘導し、高め、または他の仕方で刺激する（誘引、高揚、または刺激する）」とは、特定の免疫応答を刺激するまたは特定の免疫応答の刺激を容易にするものとして理解されなければならない。特定の免疫応答は、本発明の組換えウイルス構築物を含むヌクレオチド配列によってコードされるＨＩＶ抗原の、それぞれいずれか１またはそれ以上のペプチドまたはエピトープに対して向けられたＴ細胞応答および／または体液性応答であってよい。好ましくは、免疫応答はＴｈ−１およびＣＴＬ応答である。しかしながら、免疫応答がＴｈ−１型の応答に偏向される場合であっても、ある程度の抗体生成は生じる。
【００２８】
「ＨＩＶ抗原またはその誘導体」への言及は、ＨＩＶの成分またはその誘導体への言及として理解されなければならない。該成分は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または炭水化物などの非タンパク質性の断片であってよい。抗原は、特異的な免疫応答が刺激されることに関与する１またはそれ以上の部位を含むと理解されなければならない。たとえば、抗原提示細胞による抗原のプロセシングは、ＭＨＣクラスIIと同時に発現されて特定のＴヘルパー細胞を刺激する１またはそれ以上のペプチドの産生という結果となる。同様に、該ペプチドのプロセシングおよびＭＨＣクラスＩとの同時発現は、Ｔ細胞障害性細胞の１またはそれ以上の特異性の刺激に導く。該抗原はまた、体液性免疫応答が向けられる１またはそれ以上のエピトープをも含んでいてよい。該エピトープは線状であってもよいし、またはコンホメーションエピトープであってもよい。エピトープが線状エピトープである場合、該エピトープに向けられた特異的な体液性免疫の刺激が行われるためには、発現された該抗原が天然のコンホメーションに折り畳まれることは必要ではない。該抗原は、たとえば１つのエピトープのみを含み、ハプテンの形態をとってもよい。しかしながら、本発明によれば、該ハプテンを免疫原性にし、それゆえ本発明に使用するのに適したものにするには該ハプテンをサイトカインと同時に発現させれば充分である。
【００２９】
従って、ＨＩＶ「抗原」に対する応答を刺激するとは、ＨＩＶ抗原の１またはそれ以上の部位に向けられた特定の免疫細胞（すなわち、Ｔ細胞および／またはＢ細胞）の刺激として理解されなければならない。本発明に使用するのに適した抗原の例としては、これらに限られるものではないが、ＨＩＶウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌおよびｅｎｖによってコードされた１またはそれ以上の分子が挙げられる。各遺伝子の発現産物には同じ名称だが最初の文字を大文字にした通常の字体が与えられる。好ましくは、該ＨＩＶ抗原はＨＩＶ−１ Ｇａｇおよび／またはＰｏｌ分子またはその誘導体である。
【００３０】
この好ましい態様によれば、ＨＩＶ−１ Ｇａｇおよび／またはＰｏｌまたはその誘導体をコードする第一の核酸分子およびサイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を導入したアビポックスウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築物であって、該Ｇａｇおよび／またはＰｏｌに対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有効なものが提供される。
【００３１】
「サイトカイン」とは、免疫応答の刺激を変調することのできるあらゆるサイトカインまたはその誘導体をいう。たとえば、該サイトカインは、免疫応答を誘導し、アップレギュレーションし、高め、または維持する。特に好ましいサイトカインは、Ｔｈ１応答、ＣＴＬ応答を支持するか、または応答をＴｈ１型の応答に偏向させるものであり、たとえばＩＬ−２およびγインターフェロンまたはその機能的誘導体である。好ましいサイトカインはγインターフェロンである。
【００３２】
従って、特に好ましい態様において、ＨＩＶ−１ Ｇａｇおよび／またはＰｏｌまたはその誘導体をコードする第一の核酸分子およびインターフェロンγまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を導入したアビポックスウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築物であって、該Ｇａｇおよび／またはＰｏｌに対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有効なものが提供される。
【００３３】
本発明に使用するのに適したアビポックスウイルスベクターは、アビポックスウイルスの全体または一部またはその誘導体を含む。本発明は、修飾したウイルス、たとえば弱毒化したウイルスなどの誘導体を包含するものと理解されなければならない。本発明に使用するのに適したアビポックスウイルスの例としては、これらに限られるものではないが、鶏痘ウイルスおよびカナリヤポックスウイルスが挙げられる。好ましくは、該アビポックスウイルスは鶏痘ウイルスである。
【００３４】
最も好ましい態様において、ＨＩＶ−１ Ｇａｇおよび／またはＰｏｌまたはその誘導体をコードする第一の核酸分子およびインターフェロンγまたはその機能的誘導体をコードする第二の核酸分子を導入した鶏痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス構築物であって、該Ｇａｇおよび／またはＰｏｌに対する免疫応答を誘導し、高め、または他の仕方で刺激するのに有効なものが提供される。
【００３５】
"誘導体"というとき、天然、合成または融合タンパク質を含む組換え体資源からのフラグメント、一部、部分、均等物、類似体、変異体、相同体、擬似体を含むものと理解されるべきである。誘導体はアミノ酸の挿入、削除または置換によって誘導され得る。アミノ酸挿入誘導体はアミノおよび／またはカルボキシル末端融合物および、単一のまたは複数のアミノ酸の配列内挿入物を含む。挿入アミノ酸配列変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がタンパク質の予め定められた位置に導入される変異体であるが、得られた生成物の適当なスクリーニングによればランダムな挿入であってもよい。削除変異体は配列から１つまたはそれ以上のアミノ酸の除去によることを特徴とする。置換アミノ酸変異体は、配列中の少なくとも一個のアミノ酸が除去され別のアミノ酸がその位置に挿入される変異体である。アミノ酸配列への付加は他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合を含む。
【００３６】
誘導体は、ペプチド、ポリペプチドまたは他のタンパク質性または非タンパク質性分子に融合した総タンパク質の特定のエピトープまたは一部を有するフラグメントを含む。例えば、ベクターまたはその誘導体は細胞内への移行を容易にする分子と融合していてもよい。核酸配列の誘導体は、単一または複数のヌクレオチドの置換、削除およびまたは他の核酸分子との融合を含む付加によって誘導される。本発明の核酸分子の誘導体はオリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子および核酸分子の融合物を含む。
【００３７】
均等物は機能的な類似体またはアゴニストとして働き得る分子というときも含むものと理解されるべきである。均等物は必ずしも当該分子から誘導される必要はないが、ある種の立体配置的な類似性をもっていてもよい。別法として、均等物は、当該分子のある種の免疫的かつ生理化学的性質に類似するように設計することができる。例えば、均等物は天然の生成物のスクリーニング後検出することができる。均等物はまたペプチド擬態物を含む。ここでいう相同体はこれに限定されるものではないが、異なる種属から誘導される分子を含む。フラグメントは本発明の目的を達成するのに効果的な部分を含む。
【００３８】
本発明の使用に適する核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。好ましくは上記の核酸分子はＤＮＡである。核酸分子によってコードされたサイトカインまたはＨＩＶ抗原というときは上記核酸分子の発現生成物をいう。
【００３９】
本発明はいずれか一つの作用の理論または方法に限定されるものではなく、本発明の組換え構築体の投与はＨＩＶ特異的Ｔ−細胞の応答の表現型および規模を増強すると考えられる。それはまた本発明の構築体を含むＴ−細胞抗原に対するＴ−細胞の能力範囲の拡大をもたらし得る。従って、本発明の組換えウイルス性構築体を投与された人におけるＨＩＶ−１(特に本発明の構築体を含むＨＩＶ−１抗原)に対する感染防御免疫応答が刺激される。
【００４０】
医薬組成物の形態の当該ウイルス性構築体の投与は都合のよい手段によって行うことができる。医薬組成物のウイルス性構築体または試剤は具体的なケースによって変化する量で投与された場合、治療作用を発揮するものをいう。例えば、人または動物によって種々に変化する。広範囲の投与量を適用し得る。例えば、一人の患者について、構築体約０.１μg〜約１mg／kg体重／日を投与することができる。投与計画は最適の治療効果をもたらすように調整することができる。例えば、数回に分割した投与量で日、週、月または他の適当な時間毎に投与することができ、またその投与量は症状の緊急性による指示に比例して減少させることができる。構築体は、経口、静脈内(水溶性の場合)、経鼻、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内または坐薬経路、または移植(例えば、徐放性分子を用いて)などの都合のよい方法で投与することができる。
【００４１】
従って、本発明の別の態様は、組換えウイルス性構築体を含むワクチンであって、構築体が１またはそれ以上のＨＩＶ−抗原またはその誘導体をコードする第１核酸分子およびサイトカインまたはその機能的誘導体をコードする第２核酸分子を組み込んだ禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含み、その組換えウイルス構築体が該ＨＩＶ−抗原に対する免疫応答を誘引、高揚、または刺激する効果を有するワクチンに関する。
【００４２】
好ましくは、上記ＨＩＶ抗原はＨＩＶ−１Ｇagおよび／またはＰolである。さらにより好ましくは、上記サイトカインはγ−インターフェロンである。
【００４３】
好ましい具体例によれば、構築体がＨＩＶ−１Ｇagおよび／またはＰolまたはその誘導体をコードする第１核酸分子およびγ−インターフェロンまたはその機能的誘導体をコードする第２核酸分子を組み込んだ禽痘ウイルスベクターまたはその機能的誘導体を含む組換えウイルス性構築体を含むワクチンであって、上記ワクチンが該Ｇagおよび／またはＰolに対する免疫応答を誘引、高揚、または刺激する効果を有するワクチンを提供する。
【００４４】
最も好ましくは、上記禽痘ウイルスベクターは鶏痘ウイルスベクターである。
【００４５】
本発明の別の態様は哺乳動物におけるＨＩＶに対する免疫応答を誘導、増強、またはさもなくば刺激するのに使用するための上記で定義した組換えウイルス構築体および１つまたはそれ以上の医薬的に許容され得る担体および／または希釈剤を含む医薬組成物である。この組成物は組換えウイルス構築体とともに公知の抗ウイルス化合物または分子もまた含んでいてもよい。
【００４６】
注射用に適した医薬形態は滅菌水溶液(水溶性の場合)および注射溶液または懸濁液の用時調製製剤のための滅菌粉末を含む。すべての場合おいてこの形態は滅菌されていなければならずまた容易に注射可能な状態になる程度に液体でなければならない。製造および貯蔵条件のもと安定でなければならないし、バクテリアやカビなどの微生物による汚染作用から保護されていなければならない。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適当な液性は、例えば、リシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散の場合には必要な粒径を保つことによって、界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用からの防御は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、サーメロサール(thirmerosal)などの種々の抗菌または殺菌剤によって行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射用組成物の吸収遅延は組成物中に吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって行うことができる。
【００４７】
活性成分が適切に保護されるとき、それらは、例えば、不活性希釈剤または同化性可食担体とともに経口投与するか、または硬質または軟質のゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に打錠するか、または直接食物や食事に混合することもできる。経口治療用投与については、活性化合物を担体とともに混合し、摂取可能な錠剤、口内錠剤、トローチ、カプセル、エリクシル、懸濁剤、シロップ、ウエハースなどの形態で用いることができる。このような組成物および製剤は活性化合物を少なくとも１重量％含んでいる。組成物および製剤の％は、当然変化してもよく、好都合には単位当たり約５〜約８０重量％の範囲である。治療的に有用な組成物内の活性化合物の量は適当な投与量が得られる量である。本発明の好ましい組成物および製剤は、経口投与単位形態が活性化合物約０.１μg〜２０００mgの範囲で含むように調製される。
【００４８】
錠剤、トローチ、ピル、カブセルなどは下記のものを含んでいてもよい：トラガントガム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびショ糖、乳糖またはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント油、冬緑油またはさくらんぼフレーバーなどの矯味剤を添加することもできる。投与単位形態がカプセルのとき、上記の種類の材料に加えて、液体の担体を含んでいてもよい。コーティング剤として、またはそうでなければ単位投与の物理的形態を変えるために、種々の他の材料を含んでいてもよい。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルはセラック、糖またはその両方でコーティングされていてもよい。シロップ剤およびエレクシル剤は活性化合物、甘味料としてのショ糖、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、着色料およびさくらんぼまたはオレンジフレーバーなどの矯味剤を含んでいてもよい。もちろん、単位投与形態の製造に用いられる材料は医薬的に純粋でなければならず、採用される量で実質的に無毒でなければならない。さらに、活性化合物は徐放性製剤および調剤に処方することができる。
【００４９】
医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤は、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延化剤などを含む。医薬的に活性な物質のためのそれら媒質および剤の使用は、当該分野でよく知られている。いずれかの通常の媒質または剤が活性成分と適合しない場合を除いて、治療学的組成物中でのそれらの使用を意図するものとする。補助的な活性成分をも組成物に含有し得る。
【００５０】
投与が容易であることおよび用量が均一であることのために、非経口組成物を用量単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用する用量単位形態とは、単位用量として処置する哺乳動物の被験者に適合する物理的に別個な単位を意味し、各単位は所望の治療学的効果を生み出すように計算された予め決めた量の活性物質を、必要とされる医薬的な担体と共に含有する。本発明の新規な用量単位形態についての詳細は、（ａ）活性物質に特有の性質および達成すべき特定の治療学的効果、および（ｂ）身体の健康が本明細書で詳細に開示するように損なわれている病態を有する生きている被験者における疾患の処置のために活性物質などの混ぜ合わせに関する分野に固有な制限により決定され、それらに直接に左右される。
【００５１】
主要な活性成分を、便利で有効な投与のために、本明細書で先に開示した用量単位形態中で適当な医薬的に許容し得る担体と、有効な量で混ぜ合わせる。例えば、単位用量形態は主要な活性化合物を０.５μｇ〜約２０００ｍｇの範囲の量で含有する。比率で表わすと、活性化合物は通常、約０.５μｇ〜約２０００ｍｇ／担体ｍＬで存在する。補助的な活性成分を含有する組成物の場合には、用量は該成分の投与の通常の用量および様式に照らして決定する。
【００５２】
本発明の更に別の態様は哺乳動物におけるＨＩＶに対する免疫反応を誘起し、増大しまたはそうでなければ刺激する方法を提供するものであって、該方法はそれら哺乳動物に、ワクチンの有効な量を１つ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫反応を誘起し、増大しまたはそうでなければ刺激するのに十分な時間と条件下で投与することを含む。
【００５３】
該ＨＩＶはＨＩＶ−１が好ましい。
【００５４】
本発明の更に別の態様は哺乳動物におけるＨＩＶに対する免疫反応を誘起し、増大しまたはそうでなければ刺激する方法を提供するものであって、該方法はそれら哺乳動物に、本明細書で先に定義した組換えウイルス構築物の有効な量を、１つ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫反応を誘起し、増大しまたはそうでなければ刺激するのに十分な時間と条件下で投与することを含む。
【００５５】
該ＨＩＶはＨＩＶ−１が好ましい。
【００５６】
本発明のなお別の態様は哺乳動物の処置方法を提供するものであって、該方法はそれら哺乳動物に、本明細書で先に定義したワクチンの有効な量を、１つ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫反応を誘起し、増大しまたはそうでなければ刺激するのに十分な時間と条件下で投与することを含む。
【００５７】
該ＨＩＶ抗原はＨＩＶ−１抗原が好ましい。
【００５８】
本発明のなお別の態様は哺乳動物の処置方法を提供するものであって、該方法はそれら哺乳動物に、本明細書で先に定義した組み換えウイルス構築物の有効な量を、１つ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫反応を誘起し、増大しまたはそうでなければ刺激するのに十分な時間と条件下で投与することを含む。
【００５９】
該ＨＩＶ抗原はＨＩＶ−１抗原が好ましい。
【００６０】
「哺乳動物」とは、霊長類（例えば、ヒト、サル）、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、ブタ）、実験室試験用動物（例えば、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター）、仲間的動物（例えば、イヌ、ネコ）および捕獲された野生動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）を含む全ての動物を含むと理解すべきである。
【００６１】
本発明の方法は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療および／または予防において有用である。例えば、本発明のワクチンをＨＩＶに感染していることが分かっている被験者に投与し、次いでＨＩＶに対する免疫反応を誘起して、その結果ＡＩＤＳの発症を防止することができる。別法として、本発明の方法は血清ウイルス負荷を減少し、ＡＩＤＳの症状を軽減し、またはＨＩＶ感染の危険があると考えられる哺乳動物の免疫を誘起するのに使用することができる。
【００６２】
本発明の方法は、特にＨＩＶ感染の早期ではウイルス保有宿主の確立を防止するのに、またはＨＩＶ感染の供給源への曝露後の期間に特に有用となり得る。
【００６３】
本発明のなお別の態様は哺乳動物のＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療方法および／または予防方法を提供するものであって、該方法は本明細書で先に定義したワクチンの有効な量を、１つ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫反応を誘起し、増大しまたはそうでなければ刺激するのに十分な時間と条件下で投与することを含む。
【００６４】
該ＨＩＶ抗原はＨＩＶ−１抗原が好ましい。
【００６５】
本発明の更になお別の態様は、哺乳動物のＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療方法および／または予防方法を提供するものであって、該方法は本明細書で先に定義した組み換えウイルス構築物の有効な量を、１つ以上のＨＩＶ抗原に対する免疫反応を誘起し、増大しまたはそうでなければ刺激するのに十分な時間と条件下で投与することを含む。
【００６６】
該ＨＩＶ抗原はＨＩＶ−１抗原が好ましい。
【００６７】
「有効な量（有効量）」とは、所望の免疫反応を得るのに、予防するのに、発症を遅らせたりもしくは進行を阻害するのに、または処置する特定の病気の発症もしくは進行を全く停止するのに少なくとも部分的に必要な量を意味する。この量は、処置する個体の健康状態および身体状態、処置する個体の分類群、個体が有する抗体を合成する免疫系の能力、所望する保護の程度、ワクチンの製造化、医療状況の評価およびその他の関連因子に応じて変わる。それらの量はかなり広い範囲に及び、その量は決まりきった治験で決定することができるであろうと予想される。
【００６８】
本明細書で「治療（処置）」および「予防」とは、最も広義に解釈すべきである。用語「治療」とは哺乳動物が全快するまで治療することを必ずしも意味するものではない。同様に、用度「予防」とは、被験者が最後まで病気にかからないであろうことを必ずしも意味するものではない。従って、治療および予防とは、特定の病気の症状の緩和、または特定の病気が進展する危険の防止もしくはそうでなければ低下を含む。用語「予防」は、特定の病気の発症の激しさを減少させるものと解釈することができる。「治療」もまた、存在する病気の激しさまたは急性の発作の回数を減少し得る。
【００６９】
この方法に関連して、本発明のワクチンは、公知の抗ウイルス化合物または分子と共に投与することができる。それらの化合物または分子としては、例えば逆転写酵素インヒビター（例えば、ジドブジンまたは３ＴＣ）またはプロテアーゼインヒビター（例えば、インディナビル（Indinavir））を含むが、これらに限定されない。「共に投与する」とは、同一の製剤でまたは２つの異なる製剤を同一もしくは異なる経路によって同時に投与すること、または同一もしくは異なる経路によって順次投与することを意味する。「順次」投与とは、ワクチンの投与および公知の抗ウイルス化合物もしくは分子の投与との間の時間（秒、分、時間または日）差を意味する。ワクチンおよび公知の抗ウイルス化合物もしくは分子をいずれの順序でも投与することができる。
【００７０】
投与経路としては、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼球内、鞘内、大脳内、鼻腔内、静脈内注射、点滴および移植を含むが、これらに限定されない。筋肉内経路が特に好ましい。
【００７１】
本発明は更に、ＨＩＶ感染の治療および／または予防のための薬物の製造における、被験用組換えウイルス構築物の使用にまで及ぶ。
【００７２】
該ＨＩＶ感染は、ＨＩＶ−１感染が好ましい。
【００７３】
本発明のなお別の態様は、哺乳動物におけるＨＩＶに対する免疫反応を誘起し、増大しまたはそうでなければ刺激するのに有用な薬剤を提供するものであって、該薬剤は本明細書で先に定義した組換えウイルス構築物を含む。
【００７４】
本発明の更なる特徴は、以下の限定されない実施例でより十分に記載する。しかしながら、それら詳細な記載は単に本発明を例示する目的で含むものと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１ａ】ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγ構築の模式図。
【図１ｂ】ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγ構築の模式図。
【図２ａ】ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ構築の模式図。
【図２ｂ】ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ構築の模式図。
【図３ａ】ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγ免疫の安全性のグラフ表示。カニクイザルのＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγワクチン後に有意の発熱は記録されなかった。動物Ｍ９およびＭ１０（◆、
【化１】
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）はＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγを１０８ＰＦＵ ＩＭ投与され、動物Ｍ７（△）はＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌを投与され、動物Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ５（○）はワクチンを受けない対照であった。
【図３ｂ】ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγ免疫の安全性のグラフ表示。カニクイザルのＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγワクチン後にＴ細胞または単球数に変化は観察されなかった。ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγ（Ｍ９、Ｍ１０）またはＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ（Ｍ７）でワクチンした動物からのＰＢＭＣを、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ１４＋単球について、ワクチン前（△、ワクチン前の８ヶ月に６回、平均±ＳＤを示す）、ワクチンを施した日（○）およびワクチン後（
【化２】
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、ワクチン後４週間の間に毎週、平均±ＳＤを示す）に染色した。
【図４ａ】カニクイザルのＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγワクチン後の高められたｇａｇ特異的Ｔｈ１応答のグラフ表示。ｐ２４抗原に対するＴ細胞の増殖性応答（proliferative response）を、ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγ（動物Ｍ９、Ｍ１０、塗りつぶした棒および斜線の棒）またはＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ（動物Ｍ７、白抜きの棒）でのカニクイザルの２回のワクチン（矢印）後に連続して測定した。
【図４ｂ】カニクイザルのＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγワクチン後の高められたｇａｇ特異的Ｔｈ１応答のグラフ表示。最初のＦＰＶワクチンの前および後に得られた、組換えＨＩＶ−１ＳＦ２ｐ２４タンパク質刺激に応答したＰＢＭＣによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の分泌。ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγワクチンしたカニクイザル（Ｍ９およびＭ１０）およびＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ免疫した動物（Ｍ７）を示す。
【図５】ＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＩＦＮγワクチン後の高められたＧａｇ／ｐｏｌ特異的ＣＴＬ応答のグラフ表示。Ｅｎｖ抗原およびＧａｇ／ｐｏｌ抗原に対するＣＴＬ前駆体の定量をＦＰＶワクチン後に分析した。ＣＴＬの頻度を最初のＦＰＶワクチンおよびブースターＦＰＶワクチン（矢印）後に評価した。ワクシニア抗原のみを発現する対照標的の認識は差し引いてある。
【図６】Ｇａｇ／ｐｏｌ特異的抗体がＦＰＶｇａｇ／ｐｏｌワクチン後に高められることを示す写真表示。ＦＰＶワクチン（矢印）後の動物Ｍ７、Ｍ９およびＭ１０からの系列希釈血漿（１：１００希釈）のウエスタンブロッティング。ストリップを第一のワクチンおよび第二のワクチンの前または後の週に標識する。陰性対照および陽性対照は、それぞれ未感染のヒトおよびＨＩＶ−１に感染したヒトを表す。
【実施例１】
【００７６】
動物
マカク(M.nemestrina、２４〜３２ヶ月齢)にＳＲＶ感染はなく、処置する前にケタミン(１０ｍg／ｋgＩＭ)で麻酔した。この実験は、制度化された動物実験・倫理委員会(the institutional Animal Experimentation and Ethics Committees)によって承認された。
【００７７】
試験した７頭の動物は以前に記載されている［９、１０］。４頭(Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５)を対照とし、この実験の期間中はワクチン投与を行なわなかった。これら４頭の動物(Ｍ２〜５)には、ＤＮＡとＦＰＶ ＨＩＶ−１ワクチン(サイトカインを含まない)を実験の１１〜１９ヶ月前に投与しておき、この実験の９ヶ月前にＨＩＶ−１投与に抵抗させた。３頭の動物(Ｍ７、Ｍ９、Ｍ１０)にはＨＩＶ−１ワクチン投与は前もって行なわず、この実験の９ヶ月前にＨＩＶ−１ＬＡＩを静脈内投与することによりＨＩＶ−１に感染させた。これら動物のうちの２頭(Ｍ９、Ｍ１０)には、gag／polとヒトＩＦＮγの両方をコードする新規ＦＰＶを投与し、１頭（Ｍ７)にはgag／polのみをコードするＦＰＶワクチンを投与した。各ＦＰＶワクチンは、３ヶ月の間隔をおいて、ＨＩＶ−１感染後９ヶ月目と１２ヶ月目に、ＩＭ投与により２回、０．３ｍＬ中ＰＦＵ１０８で前大腿部へ投与した。
【００７８】
すべてのマカクは、ＨＩＶ−１ワクチン接種前に、予め破傷風トキソイド(CSL, Parkville, Australia)でＩＭ投与により３回ワクチン接種した。ワクチン接種後、各動物を、前に記載されたように［１１］、注射部位の腫脹または発赤について、および多様な通常のマカクの行動(個々のおよび仲間同士の戯れ、略奪、取り替え(replacement)、マウンティングおよび毛繕い行動)を計測することにより活性について調べた。ワクチン接種の１週間前における平均の基底の活性と比較したとき、総活性の２５％の減少を有意であるとみなした。１日の体温の記録は、ハンドヘルド電子体温計(Braun Thermoscan)を用い、この温度計を舌へ１秒以上あてがうよう動物を訓練することによって測定した。この体温の測定方法は、安静時のマカクに対して直腸体温計を用いて２２回連続して得られた直腸温よりも０〜０.８℃(平均０.３℃)低いことが分かった。
【実施例２】
【００７９】
ワクチン
ヒトＩＦＮγ遺伝子を有するまたは有しないＨＩＶ−１gag／pol遺伝子は、ＦＰＶゲノムのＦＰＶチミジンキナーゼ(ＴＫ)領域と３'オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)の間に、E. coli lacZおよびgptマーカー遺伝子とともに挿入した。図１および図２参照。
【００８０】
プラスミド構築物
Ａ.  ＦＰＶ-gag／pol-ＩＦＮγの構築のためのプラスミド
これらプラスミドの構造を図１に示す。
１.  ＨＩＶ−１のgag／pol遺伝子、ARV-2／SF2単離物を、sacIおよびNdeIエンドヌクレアーゼを用いてpUC19.ARV(Chiron Corporation, Emeryville, CA)から得た。この断片(ヌクレオチド６８４〜５１３２に対応、Genbank Accession No. K02007)を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、HincIIで線状化したpBCB07(12)ヘ、ワクシニアＰ７.５プロモーターの制御下に挿入した。このプラスミドをpBCB07.ARVと命名した。
【００８１】
２.  ヒトＩＦＮγ遺伝子をコードする配列は、プラスミドpUC9-2テンプレートよりＰＣＲによって得た。pUC9-2は、ヒトＩＦＮγｃＤＮＡの８４４塩基対のSau３Ａフラグメントを含んでいる（１３）。センスＰＣＲプライマーは、５'-gcttaattctctcggｇａｔｃgatg(＜４００＞１)とした。このプライマーは、ＩＦＮγｃＤＮＡ(Genbank Accession No. X13274)のヌクレオチド８９〜１１１の範囲に及び、Sau３Ａ部位(太字（訳者注：本翻訳文においては全角で示す）)を作製するために２つのミスマッチが導入されている。ＩＦＮγｃＤＮＡ開始コドンには下線を引いている。アンチセンスプライマーは５'-attcｇｇatccattacaaaaaagttgc(＜４００＞２)とした。このプライマーは、この遺伝子のヌクレオチド７５１〜７２６(アンチセンス鎖、ヌクレオチド６０７に位置する終止コドンの下流)の範囲に及び、BamHI／SauA部位(太字（訳者注：本翻訳文においては全角で示す）)を作製するために４つのミスマッチと、センス鎖においてTTTTTNT転写ターミネーター(下線)を作製するために１つのミスマッチが導入されている。
【００８２】
ＰＣＲ産物をSau３Ａで消化し、pAF09（１４）のBamHI部位へクローニングした。これにより、ＦＰＶ Ｐ．Ｅ／Ｌ二方向性プロモーターの制御下にヒトＩＦＮγ遺伝子が配置され、この遺伝子の開始コドンをＰ．Ｅ／Ｌ開始コドンについてインフレームで有する。このプラスミドをpDB42aと命名した。このプラスミドはさらに、E. coli lacZおよびgptマーカー遺伝子をそれぞれＰ．Ｅ／ＬおよびワクシニアＰ.７.５プロモーターの制御下に含み、組換えを容易にする鶏痘ＴＫ遺伝子と３'ＯＲＦ領域を含んでいる。
【００８３】
３.  gag／pol遺伝子およびＰ７.５プロモーターは、EcoRI消化によりpBC07.ARVから取り出し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑化し、SmaI線状化pDB42aへクローニングした。このプラスミドpDB42a.gag／polは、ＦＰＶ-gag／pol-hＩＦＮγの構築に使用した。
【００８４】
Ｂ.  ＦＰＶ-gag／polの構築のためのプラスミド
これらのプラスミドの構造を図２に示す。
１.  ＨＩＶ−１のgag／pol遺伝子は、テンプレートとしてpUC19.ARVを用いて得た(上記１を参照)。センスＰＣＲプライマーは、５'-taattａｔｃｇａｔaataaatgggtgcgagagcg(＜４００＞３)とした。このプライマーは、Ｐ．Ｅ／Ｌプロモーター由来の配列とＨＩＶ−１gag／pol遺伝子(Genbank Accession No. K02007)のヌクレオチド７９１〜８０５を含んでいる。gag遺伝子産物の開始コドンには下線を引き、太字（訳者注：本翻訳文においては全角で示す）はClaI部位を示す。アンチセンスプライマーは、５'-aaaｇｇａｔｃctttagctttcttaaaaaaaaacatatgg(＜４００＞４)とした。このプライマーは、遺伝子のヌクレオチド５１６４〜５１２８(センス鎖上、ヌクレオチド５１０１に位置するpol終止コドンの下流)の範囲に及ぶ。BamHI部位(太字（訳者注：本翻訳文においては全角で示す）)を作製するために２つのミスマッチと、センス鎖において２つの重複したTTTTTNT転写ターミネーター(下線)を作製するために４つのミスマッチが導入されている。
【００８５】
ＰＣＲ産物をClaIとBamHIで消化し、pAF04(D. Boyle, personal communication)のClaIとBamHI部位の間にクローニングした。これにより、gag／pol遺伝子は、gag遺伝子の天然の開始コドンが利用されるように整列されたＦＰＶ Ｐ．Ｅ／Ｌ二方向性プロモーターの制御下に配置される。これは、gag遺伝子産物の発現とミリストイル化に必須である。このプラスミドをpDB43と命名した。このプラスミドはさらに、ワクシニアＰ７.５プロモーターの制御下にE. coli gptマーカー遺伝子、および組換えを容易にするためにＦＰＶ ＴＫ遺伝子と３'ＯＲＦ領域を含んでいる。
【００８６】
ウイルス構築
組換えウイルスは、標準的な方法（１５）により、ＦＰＶ-Ｍ３感染したニワトリ雛細胞をpDB42agag／polまたはpDB43でトランスフェクトすることによって構築した。プラスミドのｔ遺伝子および３'ＯＲＦ領域の両方と野生型ウイルスとの間の相同的組換えにより、ＨＩＶgag／polおよびgpt遺伝子(ｈＩＦＮγおよびlacZ遺伝子を有するおよび有しない)のウイルスへの挿入が起こる。gpt遺伝子はミコフェノール酸に対する耐性を付与し、組換えウイルスは増幅され、ミコフェノール酸存在下での数ラウンドのプラ-ク精製の後に選択された。挿入部位に連結した配列に相補的なプライマーを用いてＰＣＲを用い、野生型の親ウイルスが存在しないことを確認した。
【実施例３】
【００８７】
血液細胞計数および血漿生化学
ワクチンによって発現したＩＦＮγが血漿生化学または血液細胞数に異常きたすかどうかを調べるため、一組の生化学的および細胞の解析を、マカクから採取した一連の血液試料に対して行なった。マルチパラメーター生化学的解析および血球計測は自動化された機械で行ない、血球数は手動で確認した。白血球数と判別は手動計測によって確認した。ワクチン投与の前後で得たＰＢＭＣを単球およびＴ細胞マーカーについて染色し、以前［９］に記載されたようにＣＤ２（Leu5-PE, Becton Dickinson, San Jose, CA）、ＣＤ４（OKT4-FITC, Ortho Diagnostics, Raritan, NJ）、ＣＤ８（Leu2a-FITC, Becton Dickinson）およびＣＤ１４に対する抗体を用いてフローサイトメトリーによって解析した。
【実施例４】
【００８８】
ＨＩＶ−１抗体およびＴｈ応答
２００μgの標準混合ＨＩＶ−１タンパク質ストック［９］を用い、粒子の凝集（Serodia-HIV, Fujirebio, Japan)およびウェスタンブロッティングによって、血漿をＨＩＶ−１抗体について調べた。リンパ球増殖応答は、記載されたように［９］、標準的な３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによって調べた。ウェルに１０５細胞／ウェルで入れたマカクＰＢＭＣを３つ組にして、１０％自己由来熱不活化血清を含む培地中、１０μg／ｍLの組換えＨＩＶ−１ＳＰ２ｇｐ１２０またはＨＩＶ−１ＳＰ２ｐ２４(Chiron)で６日間刺激し、β-計測の前に３Ｈ−チミジンでパルスした。ＰＢＭＣはさらに、培地のみでインキュベーションするかまたは１０μg／ｍLの培養細胞由来の対照抗体を添加した培地でインキュベーションし、刺激されない対照の応答を調べ、明確な有糸分裂のおよび抗原の対照応答としてＰＨＡ(１０μg／ｍL)または破傷風トキソイド(０.０１Lf／ｍL)で刺激した。増殖を刺激指数(ＳＩ、抗原により刺激された細胞の平均の３Ｈ−チミジン取り込み／抗原刺激なしの平均の取り込み)として表す。選択されたリンパ球増殖培養細胞から得られた上清を、ＥＩＡ(Genzyme, Cambridge, MA)により、ＩＬ−４およびＩＦＮγの存在について分析した。
【実施例５】
【００８９】
定量的なＨＩＶ特異的ＣＴＬ解析
マカクのマカクＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１EnvおよびGag／Pol抗原に対するＣＴＬ前駆体度数の解析を限界希釈法［９］により行なった。９６ウェルの丸底プレートに１０５〜８.８×１０３細胞／ウェルの７連の１.５倍希釈でＰＢＭＣを２４回分プレートした。ＨＩＶ−１ＬＡＩEnv／Gag／Pol抗原を発現する組換えワクシニアウイルスで感染させた１０４の自己由来ＰＢＭＣで各ウェルを刺激し、１０Ｕ／ｍLのｒＩＬ−２(Hoffman-La Roche, Nutley, NJ)を３〜４日間毎日加えた。１０〜１４日後、各ウェルの細胞を、野生型ワクシニアまたはＨＩＶ−１ＬＡＩEnv抗原またはＨＩＶ−１ＬＡＩGag／Polを発現する組換えワクシニアで感染させた自己由来標的細胞に対する細胞溶解活性について分析した。細胞溶解が標的からの平均の自律的放出を３標準偏差分越えれば、ウェルを陽性とみなした。ＣＴＬ度数および９５％信頼区間を、S Kalams, Harvard Medical School［１６］により提供されたソフトウエアを用いて最大尤解析によって決定した。標的細胞は、ＰＢＭＣをヒヒヘルパーウイルスであるH.papio［９］で感染させることにより各マカクから確立された自己由来Ｂリンパ芽細胞腫細胞系(ＢＬＣＬ)であった。ＢＬＣＬは、１頭の対照動物（Ｍ４）のＰＢＭＣでは形質転換できず、１頭のワクチン投与された動物（Ｍ１０）に由来する長期間の培養細胞においては維持できず、ＣＴＬのデータはそれらの動物からとることができなかった、
【実施例６】
【００９０】
HIV-1 DNAおよびウイルスレベルの分析
記載したPCR条件[9]を用いてPBMC試料から抽出したDNAからHIV-1 gagおよびHLA-DQ DNAを増幅し、それぞれプライマーペアSK38/39およびGH26/27(Gibco-BRL)を用いて定量した。105個のPBMCから得たDNAをDQバンド密度に従って8E5細胞DNA(HIV-1 DNA 1コピー/細胞を含む)と比較して標準化し、分光光度計(Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech)で260nmの吸収を測定することにより確認した。106個のマカークPBMCと106個のPHA刺激プールヒトPBMCおよび50U/ml IL-2を同時培養することによりウイルス分離を行った。新鮮培地およびIL-2を１週間に２回培養に加え、PHA刺激ヒトPBMCを１週間に１回、４週間加えた。HIV-1 p24 EIA (Abbott Laborators, Abbott Park, IL)により培養上清中のHIV-1を定量した。
【実施例７】
【００９１】
IFN-γ発現FPVの安全性
一般に、局所的に供給する、ウイルスベクターによりコードされたサイトカインは、全身的に投与するサイトカインより毒性が低い[8]。本発明者らは、FPVgag/pol-IFN-γの反応原性（reactogenicity）を４マッチ非免疫コントロールおよびFPVgag/pol-IFN-γのみを投与したコントロール動物との比較により分析した。あらゆる有意な副作用を検出するために高用量のFPVワクチンを投与した（108FPU)。FPV免疫マカーク３頭すべてにおいてワクチネーション後の最初の２４時間に活動性の44〜75％の低下がみられ、FPVgag/pol-IFN-γ免疫動物２頭のうち１頭(M9)に24〜48時間の間に活動性の28%低下がみられたが、その後は全ての動物が正常であった。FPVワクチネーション動物３頭すべてにおいてワクチネーション後１〜２日に注射部位の腫脹が観察された。FPVワクチネーション後に発熱はみられなかった(図3a)。すべての動物の体重増加は正常であった。ワクチネーション後、PBMC中のCD4+もしくはCD8+T細胞サブセット、または単球レベルは変化しなかった (図3b)。さらに、FPVgag/polまたはFPVgag/pol-IFN-γワクチネーション後に、血漿電解質、血漿クレアチニンおよび尿素により評価した腎機能、肝機能マーカー、ヘモグロビン、白血球数、または血小板数の有意な変化はみられなかった。
【実施例８】
【００９２】
T細胞免疫原性
FPVgag/pol-IFN-γによるワクチネーションがGag/pol特異的Th反応を増強するか否かを検討するため、９カ月前にHIV-1感染させたマカークをFPVgag/pol-IFN-γ(2頭、M9およびM10)またはFPVgag/pol(1頭、M7)で２回ワクチネーションした。p24 Gagタンパク質に対するTh増殖反応は、初回FPVgag/po1-IFN-γワクチネーション後１〜２週間で4〜7倍増加し、３カ月後もベースラインレベルより高かった(図4a)。２回目のFPVgag/pol-IFN-γワクチネーション後、p24-特異的Th反応はさらにベースラインよりブーストされ（5〜30倍）、少なくともさらに２カ月間維持された。2回のFPVgag/pol免疫を受けた動物のp24特異的Th反応は３倍増加した。破傷風特異的Th反応はFPVワクチネーション後変化しなかった（時間による変動<3倍)。コントロールマカーク４頭(M2、M3、M4、M5)のGagまたは破傷風抗原に対するTh反応は４ヶ月の観察期間にわたり変化せず、変動<2倍であった(p24に対する平均SIは3.2であり、破傷風トキソイドに対するそれは3.6であった)。
【００９３】
本発明者らは、HIV-1感染動物のFPVgag/pol-IFN-γワクチネーションがGag特異的Th反応の表現型の変化と関連するかどうかについても評価した。FPVgag/polおよびFPVgag/pol-IFN-γの両方を投与した動物からのGag特異的Th反応によりIFN-γの分泌増加が観察されたが、IL-4の分泌は増加しなかった（サイトカイン分泌の変調度はFPVgag/pol-IFN-γ免疫動物でより大きかった)(図4b)。FPVワクチネーション後、動物M7、M9、およびM10からの破傷風特異的Th表現型の変化はみられず、FPVワクチネーション動物３頭全てのFPVワクチネーション前およびワクチネーション後２〜６週間のIL-4分泌はIFN-γより大きかった(4〜12倍）。
【実施例９】
【００９４】
FPVgag/pol-IFN-γ免疫後のHIV特異的CTL活性
HIV-1複製に由来する抗原刺激の顕著な減少に逆らってCTL反応を維持する免疫戦略に現在かなりの関心が向けられている[2、5]。HIV-1感染後最初の数カ月間のHIV-1 DNAの減少と平行するマカークにおけるHIV-1特異的CTL反応、および「潜伏」期におけるHIV-1特異的CTL反応は低い（＜10 HIV特異的CTL/106 PSMC)[9]。限界希釈分析により、Gag/Pol(Envではなく)抗原に対するCTL前駆体は、１回のFPVgag/pol-IFN-γワクチネーション後に＜5から15/106 PBMCに、また２回目のFPVgag/pol-IFN-γワクチネーション後に44/106 PBMCに増加した(図3)。非ワクチネーションコントロール動物（M2、M3、M5）、もしくはIFN-γを含まないFPVgag/pol-IFN-γでワクチネーションしたコントロール動物(M7、図5)では、Gag/PolまたはEnv特異的CTLの検出し得る増加はなかった（＜5/106 PBMC)。
【実施例１０】
【００９５】
ワクチネーション後のHIV-1レベル
FPVgag/pol-IFN-γワクチネーションが予めHIV-1、HIV-1 DNA、および培養可能なウイルスに感染したマカークのHIV-1ウイルスレベルを変化させるか否かの検討をワクチネーションの前および後に試験した。env特異的プライマーを用いると、動物M7、M9、およびM10では、ワクチネーション前０、１、および４カ月のHIV-1 DNAは＜10コピー/105 PBMCであり、初回FPVワクチネーション後１、２、および４週目のHIV-1 DNAも＜10コピー/105 PBMCのままであり、HIV-1 DNAレベルの検出し得る変化はみられなかった。ワクチネーションの前（0、-4週）もしくは後（+1、+2、+4、+6週）のワクチネーションFPV動物３頭のいずれの同時培養PBMCからもHIV-1は回収できなかった。血漿HIV-1 RNAレベルが100〜400コピーの場合、用いた同時培養法ではHIV-1が常套的に回収され[(9)、(10)]、このことはHIV-1血漿RNAの有意な上昇が起きなかったことを示唆している。
【実施例１１】
【００９６】
HIV-1抗体レベル
Gag/Pol特異抗体も２回のFPVワクチネーション後に増加した(図6)。p24特異抗体はワクチネーション動物３頭すべてで増加し、FPVgag/pol-IFN-γおよびFPVgag/polワクチネーション動物間で差はみられなかった。gp120抗体反応の変化もみられなかった。
当業者は、本明細書に記載の発明について、具体的に記載した以外の変化および修飾が可能であることを十分理解するであろう。本発明にはそのようなすべての変化および修飾が含まれると理解すべきである。本発明には、個々にかまとめて本明細書に示すかまたは暗示した全ての工程、特徴、組成物および化合物、ならびに該工程もしくは特徴のあらゆる２またはそれ以上のあらゆる全ての組合せも含まれる。
【００９７】
参考文献
【表１】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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