(57)【要約】【課題】グリシンを高濃度含有する培地条件下において耐性を示し、経済的に有利にアルカリプロテアーゼを大量生産することが可能な新規微生物の提供。【解決手段】グリシン濃度１質量％以上の液体培地で生育可能なバチルス属に属するアルカリプロテアーゼ生産菌。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシン濃度１質量％以上の培地で生育可能なバチルス属に属するアルカリプロテアーゼ生産菌。
【請求項２】
アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌を突然変異処理に付し、次いで得られた菌株をグリシンを含有する培地中で培養して得られる、請求項１記載のアルカリプロテアーゼ生産菌。
【請求項３】
アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌が、バチルス・エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ−Ｐ１８５６６）、バチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＵ５１（ＦＥＲＭ−Ｐ２１６０８）又はバチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１（ＦＥＲＭ−Ｐ２１６０９）である請求項２記載のアルカリプロテアーゼ生産菌。
【請求項４】
バチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＹ１０と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２１６０７として寄託されたアルカリプロテアーゼ生産菌。
【請求項５】
アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌を突然変異処理に付し、次いで得られた変異株を、グリシンを含有する培地中で培養して請求項１〜４のいずれかの項記載のアルカリプロテアーゼ生産菌を製造する方法。
【請求項６】
請求項１〜４いずれかの項記載のアルカリプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物からアルカリプロテアーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製造法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼ生産菌に、アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を導入した組換え細菌。
【請求項８】
請求項７記載の組換え細菌を用いるアルカリプロテアーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規アルカリプロテアーゼ高生産菌及びその製法、並びに当該微生物を用いるアルカリプロテアーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、食品・水産加工工業、皮革工業、繊維工業、醸造工業、洗剤工業などに広く用いられている酵素であるが、洗浄剤への配合も古くから行われており、現在多くのアルカリプロテアーゼが洗浄剤用酵素として用いられている。
さらに近年、特に衣料用洗剤は、環境問題の面から無リン化あるいは洗剤使用量の省力化が進められているが、これにより低下する洗浄力を強化するためにアルカリプロテアーゼの配合が行われており、ますます高性能なアルカリプロテアーゼの需要が高まっている。
【０００３】
ところで、プロテアーゼが洗浄剤中に有効に配合されるためには、単にアルカリ性条件下において作用するというだけでは不充分であり、洗浄剤に配合される界面活性剤中で安定であること、及び衣類の汚れを分解しうる能力、すなわち優れた洗浄力を有することが要求される。
【０００４】
このような状況下において、本発明者らは、界面活性剤および酸化剤に対して高い安定性を有し、かつ高い洗浄力を有するアルカリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した（特許文献１）。この菌株により優れたアルカリプロテアーゼの生産が可能となったが、工業的により有利に生産するためには、より生産性が向上した菌株の提供及びこれを用いたアルカリプロテアーゼの効率の良い製造法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１９９５５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、先ず前記アルカリプロテアーゼ生産菌の変異株を取得することによって、アルカリプロテアーゼの生産性を高められること見出した。しかし、アルカリプロテアーゼの工業的醗酵生産では、高濃度の窒素源及び炭素源を培地に添加することが多く、安価な窒素原料であるグリシンを高濃度含有する培地条件を用いた場合、菌の生育および酵素生産が著しく阻害され、アルカリプロテアーゼを効率的に得ることができないことが判明した。
【０００７】
従って、本発明は、グリシンを高濃度含有する培地条件下において耐性を示し、経済的に有利にアルカリプロテアーゼを大量生産することが可能な新規微生物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特に突然変異株取得によるアルカリプロテアーゼ生産性向上について鋭意研究を行った結果、アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌に変異を導入し、グリシン耐性を付与することにより、アルカリプロテアーゼ生産菌の生育及び酵素生産能が維持され、アルカリプロテアーゼの生産性が著しく向上することを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、グリシン濃度１質量％以上の培地で生育可能なバチルス属に属するアルカリプロテアーゼ生産菌を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌を用いれば、洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼの高生産が可能なことから、工業的に極めて有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、バチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＹ１０株の菌増殖能を示す図である。
【図２】図２は、バチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＹ１０株のアルカリプロテアーゼ生産能を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のバチルス属に属するアルカリプロテアーゼ生産菌は、グリシン濃度１質量％（以下、単に「％」と記する）以上の培地でも生育可能な細菌である。本発明において「生育可能」とは、細菌の通常の培養条件下で、良好に菌体増殖を行うことが可能なことを云う。また、「グリシン濃度１質量％以上の培地でも生育可能」とは、グリシンを１％以上含有する培地にアルカリプロテアーゼ生産菌を接種し、バチルス属に属する細菌の通常の培養条件で培養を行ったときに、良好に菌体増殖を行うことが可能なことを云う。より具体的には、グリシン濃度１％以上含有する培地において３０℃で２日間（４８時間）培養した場合の生育度（OD600値）が１５以上であることを云う。培地は、バチルス属に属する細菌を培養する際に用いられる液体培地、例えばペプトン含有系培地などを用いることができる。
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌の生育度（OD600値）は、１５以上であり、好ましくは２０以上、より好ましくは３０以上である。この生育度（OD600値）は、後記実施例記載の方法によって測定できる。
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は、アルカリプロテアーゼの生産性の点から、培地中のグリシン濃度が１〜２．５％、更に１．２〜２．５％、特に１．２〜２％で生育可能なことが好ましい。
【００１３】
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は、グリシン濃度１％以上の培地条件下において培養中のｐＨ低下を起こしにくいことが好ましく、ｐＨ調整剤として炭酸ナトリウムを０．２％含む培地条件を用いた場合、培養２日後のｐＨ低下率が２５％以下であることがより好ましい。なお、ここでのｐＨ低下率は、培養開始前の培地ｐＨと、培養２日（４８時間）後の培地ｐＨをそれぞれ測定し、次式（１）により算出される。
ｐＨ低下率（％）＝[（培養開始前の培地ｐＨ）−（培養２日後の培地ｐＨ）]／（培地開始前の培地ｐＨ）×１００        （１）
【００１４】
このような本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は、アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌を突然変異処理に付し、次いで得られた変異株を、グリシンを含有する培地中で培養することによって取得できる。
アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌（以下、「親株」と称する）は、野生株または変異株のいずれでもよく、またアルカリプロテアーゼ生産能を本来的に備えるものやアルカリプロテアーゼ生産能を本来的に有しない細菌に遺伝子導入など公知の人為的な改変を付すことによりアルカリプロテアーゼ生産能を付与したものであってもよい。好ましくはバチルス・エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ−Ｐ１８５６６）、及びこの菌株を突然変異処理に付して得られたバチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＵ５１（ＦＥＲＭ−Ｐ２１６０８）やバチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１（ＦＥＲＭ−Ｐ２１６０９）等が挙げられる。
バチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＵ５１及びバチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１は、バチルス・エスピーＫＳＭ−９８６５に比べ、よりアルカリプロテアーゼ生産性が向上しているため、親株としてバチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＵ５１又はバチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１を用いるのが好ましい。さらに、バチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１は、バチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＵ５１に比べ、よりアルカリプロテアーゼ生産性が向上しているため、親株としてバチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１を用いるのがより好ましい。
【００１５】
親株を突然変異処理に付す方法としては、例えば、突然変異剤を作用させる方法、紫外線、電離放射線等の放射線を照射する方法等、菌株に突然変異を惹起せしめる一般的手法を用いることができる。突然変異剤としては、例えば、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン等の塩基類似物質、亜硝酸、ヒドロキシアミン、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸、アクリジン類等が挙げられる。
【００１６】
突然変異処理後、得られた変異株をグリシンを含有する培地中で培養し、さらにグリシンを１％以上含有する培地条件下でも親株より生育が旺盛でかつアルカリプロテアーゼを高生産する菌株を選択すればよい。
グリシン耐性株選択用の培地中のグリシンの含有量は、変異株取得の効率の点から、０．６〜２％が好ましく、特に０．８〜１．２％が好ましい。
使用する培地は、バチルス属細菌が生育可能な培地を用いることができ、例えばスキムミルク含有アルカリ寒天培地が挙げられる。その他、必要に応じて、後記の培地に添加し得る栄養源を適宜組合せて用いてもよい。
【００１７】
また、変異株の培養は、常法に従って好気培養すればよいが、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３５℃で１〜４日間、好ましくは２〜４日間行うのが好ましい。培養開始時の培地のｐＨは、生産菌の生育の点から、ｐＨ７〜１０とすることが好ましく、特にｐＨ８〜９とすることが好ましい。なお、ｐＨ調整剤としては、通常の液体培地に添加されるものでよく、例えば炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
アルカリプロテアーゼ生産菌は、スキムミルク選択プレート上でのタンパク分解活性を指標に選抜できる。
【００１８】
かくして得られる本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は、グリシンを高濃度含有する液体培地条件下においてプロテアーゼ生産性が向上している点で親株とは異なっている。本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌としては、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−ＧＬＹ１０と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）にＦＥＲＭ  Ｐ−２１６０７として寄託された微生物が挙げられる。
【００１９】
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−ＧＬＹ１０は、親株と同様の菌学的性質、生理学的性質を有する。
【００２０】
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は、アルカリプロテアーゼ高生産用宿主として利用できる。例えば、目的とするアルカリプロテアーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法を用いて本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌に取り込ませることによって、組換え細菌（形質変換体）を得ることができる。
ここで、ベクターとしては、アルカリプロテアーゼを安定に発現させることができ、その遺伝子を安定に保持できるベクターであれば特に制限されず、例えば、ｐＨＹ３００ＰＬＫシャトルベクター（ヤクルト）、ｐＡＳＰ６４（特開２０００-２８７６８７号公報）等が挙げられる。また、形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。
形質転換体の選択は、アルカリプロテアーゼ生産菌の選択と同様の方法で行うことができる。
【００２１】
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌又は前記形質変換体を適当な液体培地に接種し、常法に従って好気培養すれば、アルカリプロテアーゼを効率良く生産することができる。
本発明で用いられるアルカリプロテアーゼ生産用液体培地としては、バチルス属細菌が生育可能なものであれば特に制限されないが、例えば、資化しうる窒素源、炭素源、更にビタミン類、金属塩類等の微量栄養源を適宜組合せた富栄養培地が用いられる。炭素源、窒素源は特に限定されないが、炭素源としては、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシット、グリセリン、可溶性澱粉や安価な廃糖蜜、転化等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール、アジプロン、無機窒素化合物等が挙げられる。
培地中にグリシンは、経済性及び生産性の点から、１％以上、特に１〜２％、更に１．２〜２％とするのが好ましく、窒素源全体としては、培地中に２〜６％、特に４〜６％とするのが好ましい。また、炭素源は、培地中に１〜１０％、特に５〜１０％とするのが好ましい。
また、培地には、リン酸、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｎａ+、Ｋ+等の無機塩や、ビオチン、パントテン酸、ピリドキサール、チアミン等のビタミン類を添加することもできる。
【００２２】
アルカリプロテアーゼの生産性向上の点から、培地のｐＨは７〜１０、特に８〜９が好ましく、ｐＨの調整には、前記ｐＨ調整剤を用いることができる。また、培養は、２５〜４０℃、好ましくは３０〜３５℃で、１〜４日間、好ましくは２〜４日間行い、必要により振とう培養を行うのが好ましい。
【００２３】
得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。
すなわち、培養物を遠心分離、濾過等によって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液から、通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈殿法、溶媒沈殿法（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等）によってタンパク質を沈殿させたり、また、限外濾過法により濃縮させてアルカリプロテアーゼを得る。塩析法では、例えば硫安（９０％飽和画分）、溶媒沈殿では、例えば７５％エタノール中で酵素を沈殿させた後、濾過または遠心分離、さらに脱塩することによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能である。
【００２４】
このようにして得られる酵素液は、そのまま使用することもできるが、更に公知の方法により精製、結晶化、あるいは造粒化して用いることもできる。更に酵素を精製するには、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロース、ＣＭ−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びセファデックスやバイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分離精製すればよい。
【００２５】
かくして得られるアルカリプロテアーゼは、洗剤用、写真工業、食品加工用として用いることができ、特に洗浄剤配合酵素として有用である。
【実施例】
【００２６】
[プロテアーゼ活性測定法]
実施例において得られたアルカリプロテアーゼの活性測定は次の如くして行った。すなわち、１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．９ｍｌ、４０ｍＭＧｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍｌを試験管に採り、３０℃で５分間保温した。これに酵素液０．０５ｍｌを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍｌを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、酵素１単位は上記反応において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する量とした。
【００２７】
［生育度（OD600値）測定法］
培養液の一部を分取したものを５％(ｗ/ｖ）塩化ナトリウム水溶液を用いて１００倍に希釈混合した後、Ｕ−２０００形日立分光光度計（日立製作所）を用いて波長６００ｎｍにおける濁度（OD600値）を測定した。
【００２８】
実施例１  [変異剤処理]
（１）親株としてバチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＵ５１株（ＦＥＲＭ−Ｐ２１６０８）を用いて、以下の変異処理を行った。すなわち、凍結保存しておいたバチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＵ５１株を表１の液体培地に接種し（植菌量０．１％）、１３時間前培養（３０℃、１２０ｒｐｍ）を行った後、同じ組成培地に前培養液を接種し（植菌量０．５％）、三角培養フラスコ中にて３０℃で振とう培養を行った。菌の生育が対数増殖後期に入った時点（培養約１１時間後）の培養液から遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間、４℃）で菌体を集め、表１の液体培地５０ｍに菌を懸濁した後、ＮＴＧを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３０〜３７℃で約４５分間振とうを行った。遠心分離（２８００ｒｐｍ、３０分間、４℃）で菌体を集め、表１の液体培地２０ｍｌにて２回洗浄を行った。得られた菌液を生理食塩水で適当に希釈し、表２に示す平板培地に塗布した後、３０℃で３日間培養を行った。
生育したコロニーの周辺にスキムミルク溶解斑が明確に認められる菌を選抜し、プロテアーゼ組換え生産プラスミドによる形質転換後、種々のアルカリプロテアーゼ生産用液体培地を用いて、プロテアーゼの生産性を評価した。
得られた変異株をバチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１と命名し、平成２０年７月１８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２１６０９として寄託した（特願２００９−０９５４４９参照）。
【００２９】
【表１】
2010279283.tif 000002
【００３０】
【表２】
2010279283.tif 000003
【００３１】
（２）（１）で作製したバチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１株を親株として用いて以下の変異処理を行った。すなわち、凍結保存しておいたバチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１株を表１の液体培地に接種し（植菌量０．１％）、１３時間前培養（３０℃、１２０ｒｐｍ）を行った後、同じ組成培地に前培養液を接種し（植菌量０．５％）、三角培養フラスコ中にて３０℃で振とう培養を行った。菌の生育が対数増殖後期に入った時点（培養約１１時間後）の培養液から遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間、４℃）で菌体を集め、表１の液体培地５０ｍに菌を懸濁した後、ＮＴＧを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３０〜３７℃で約６０分間振とうを行った。遠心分離（２８００ｒｐｍ、３０分間、４℃）で菌体を集め、表１の液体培地２０ｍｌにて２回洗浄を行った。
【００３２】
実施例２  ［グリシン耐性変異株の選択］
変異剤処理を行った菌液を生理食塩水で適当に希釈し、表３に示す選択用平板培地に塗布した後、３０℃で３日間培養を行った。正常な形態を形成し、かつ生育したコロニーの周辺にスキムミルク溶解斑が明確に認められた菌株１９６株を選抜し、後述の形質転換及び液体培地評価に供した。
【００３３】
【表３】
2010279283.tif 000004
【００３４】
実施例３  [プロテアーゼ組換え生産プラスミドによる形質転換]
バチルス・エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼ（特開２００４−１２２号公報）構造遺伝子約２．０ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を、バチルス属細菌内で複製可能な発現ベクターｐＡＳＰ６４（特開２０００-２８７６８７号公報）に組み込んだプラスミドを作製し、以後の形質転換用ＤＮＡとして用いた。
形質転換すべき宿主としてバチルス・エスピーＫＳＭ−ＰＨ４０１（親株）及び実施例２で選抜した１９６株を用いた。形質転換法はエレクトロポレーション法により、ＳＳＨ−１０（島津製作所）及びジーンパルサーキュベット（バイオラッド）を用いて形質転換を行った。
形質転換体は、表４に示す平板培地に生育させ、スキムミルク溶解斑の形成状況により目的のプロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。
親株及びその変異株に対して得られた形質転換体を以後の培養に供した。
【００３５】
【表４】
2010279283.tif 000005
【００３６】
実施例４  [液体培地での菌増殖能およびプロテアーゼ生産性の評価]
実施例３で得られた各形質転換体について単集落分離およびコロニー周辺のスキムミルク溶解斑の形成を確認した後、表５に示す液体培地３０ｍｌの入った坂口フラスコに一白金耳ずつ植菌を行い、３０℃、１２５ｒｐｍで一晩前培養を行った。この培養液０．６ｍｌを表６に示す液体培地３０ｍｌに植菌し、培養三角フラスコ中にて３０℃、２３０ｒｐｍで２日間（４８時間）振とう培養を行った。各菌株の生育度（OD600値）及び培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。
その結果、３０株において生育度（OD600値）及びプロテアーゼの生産性が親株より上昇していた。このうち１株をバチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＹ１０と命名し、平成２０年７月１８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２１６０７として寄託した。ＫＳＭ−ＧＬＹ１０株においては、生育度（OD600値）は親株に対して約４倍、および組換えプロテアーゼの生産性は親株に対して約５倍上昇していることが認められた（図１および図２参照）。また、ＫＳＭ−ＧＬＹ１０株のｐＨ低下率（前記式（１）より算出）は６％であった。
従って、本発明のバチルス・エスピーＫＳＭ−ＧＬＹ１０は、グリシン感受性に関わる遺伝子に変異が起きたとものと推察される。
【００３７】
【表５】
2010279283.tif 000006
【００３８】
【表６】
2010279283.tif 000007
【図１】
2010279283.tif 000008
【図２】
2010279283.tif 000009