(57)【要約】【課題】ヒト疾患モデルとしての変異動物（遺伝子組換え動物および偶発変異を有する動物を含む）の開発のための方法、生物医学研究においておよびヒト治療薬の開発において有用な生存アッセイシステムとして役立ち得る動物モデルの開発のための統合技術（綿密な仕様および質制御を含む）を提供すること。【解決手段】変異動物系を確立する方法であって、（ａ）性的に未熟な変異創始動物（Ｇ０）において過排卵を誘発させる工程；（ｂ）この過排卵する性的に未熟な変異創始動物を受精させる工程；（ｃ）妊娠期の完了時に第一世代変異動物（Ｆ１）を分娩させる工程；（ｄ）この第一世代変異動物において、この変異の安定性、遺伝子型、および遺伝的バックグラウンドの同一性を確認する工程；および、必要に応じて、（ｅ）１以上のさらなる世代の変異動物を用いて工程（ａ）から工程（ｄ）を反復する工程、を包含する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載されるような発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は、ヒト疾患モデルとしての変異動物（遺伝子組換え動物および偶発変異を有する動物を含む）の開発のための方法に関する。特に、本発明は、生物医学研究およびヒト治療薬の開発において有用な生存アッセイシステムとして役立ち得る動物モデルの開発のための統合技術（綿密な仕様および質制御を含む）を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
変異動物（遺伝子組換え動物（例えば、トランスジェニックマウス）、および偶発変異を有する動物を含む）がまず、分子生物学の分野において動物モデルとして役立った。近年では、このような動物の使用は、生命科学の他の多くの部門（疾患関連遺伝子の同定および研究、およびこのような遺伝子を標的とする薬物開発を含む）にまで拡張されている。
【０００３】
過去２０年間において、１０，０００種より多くの遺伝子操作動物（例えば、トランスジェニックマウス、ノックアウトマウス、およびノックインマウス）が作出され、バイオサイエンスの基礎研究の研究者によって広範に使用されてきたが、遺伝子組換え動物の圧倒的多数は、研究ツールおよび薬物開発のツールとしては重大な欠陥を有する。ほとんどの場合、遺伝子組換え動物の製造者は、これら動物を、綿密で厳密な信頼性のある検証プロセスに供することができず、結果として、これら動物が遺伝的局面および微生物学的局面の両方において同一であることを確実にすることができない。これは、トランスジェニック動物の遺伝的バックグラウンドが、環境的要因へのそれら動物の曝露における差異とともに、インビボでの動物の挙動に対して大きな影響を有するので、重大な問題である。あらゆる遺伝または環境の単一の差異が、遺伝子組換え動物の特徴全体において劇的な差異を生じる。さらに、代表的に、当業者の知識に基づく遺伝子制御および微生物制御の選択および決定は、対象ヒト疾患について知識を有する当業者によって実施されるわけではないので、信頼性のある疾患モデルとしての遺伝子組換え動物の有用性は制限される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、変異動物系を確立する方法に関し、この方法は、以下の工程：
（ａ）性的に未熟な変異創始動物（Ｇ０）において過排卵を誘発させる工程；
（ｂ）上記過排卵する性的に未熟な変異創始動物を受精させる工程；
（ｃ）妊娠期の完了時に第一世代変異動物（Ｆ１）を分娩させる工程；
（ｄ）上記第一世代変異動物において、上記変異の安定性、遺伝子型、および遺伝的バックグラウンドの同一性を確認する工程；および、必要に応じて、
（ｅ）工程（ａ）から工程（ｄ）を、１以上のさらなる世代の変異動物を用いて反復する工程
を包含し、ここで各工程において、遺伝的要因および環境的要因がモニタリングされ、全ての動物に対して厳密に同一であるように保たれる。
【０００５】
１つの実施形態では、受精は、自然交配によって実施される。
【０００６】
別の実施形態では、受精が、
（ｂ．１）上記の過排卵する成熟前（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）変異創始動物から得られる卵母細胞をインビトロ受精に供する工程；
（ｂ．２）上記受精した卵母細胞を初期胚期までインビトロで培養する工程；および
（ｂ．３）上記胚をレシピエント動物に導入する工程
によって実施される。
【０００７】
好ましい実施形態では、上記工程（ｂ．２）において、受精した卵母細胞は、二細胞胚期にまで培養される。初期胚は、レシピエンド動物への導入まで、代表的には液体窒素温度で、胚バンクに貯蔵され得る。
【０００８】
本発明は、いかなる特定の変異動物にも限定されず、詳細には、全ての非ヒト変異哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、モルモット、および実験室実験で代表的に使用される他の動物を含む）を包含するが、これらに限定されない。好ましい変異動物は、変異マウス（トランスジェニックマウス、ノックインマウス、ノックアウトマウス、および偶発変異マウスを含む）である。好ましい実施形態では、変異動物は、トランスジェニックマウスである。
【０００９】
代表的（しかし、限定的ではない）なプロトコルにおいて、創始動物は、過排卵を成し遂げる時点で３〜４週齢である。過排卵は、任意の従来方法（例えば、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト血清およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の使用を含む）によって誘発され得る。
【００１０】
好ましい実施形態では、上述の方法の工程（ｄ）において、遺伝子型は、以下：
（ｄ１）トランスジェニック動物および対応する非トランスジェニック動物から単離されたゲノムＤＮＡに対して、以下のＰＣＲプライマー：
（ｉ）５’トランスジーン／ゲノム連結部の検証のための、染色体特異的プライマーおよびトランスジーン特異的プライマーであって、上記、染色体特異的プライマーおよびトランスジーン特異的プライマーは、それぞれ５’トランスジーン／ゲノム連結部近傍の上記染色体および上記トランスジーンに対して、互いに対向する方向で結合する、プライマー；および
（ｉｉ）トランスジーン／トランスジーン連結部の検証のための、２つのトランスジーン特異的プライマーであって、上記２つのトランスジーン特異的プライマーは、５’末端近傍の上記トランスジーンのセグメントに対して、反対方向で結合する、プライマー
を用いてＰＣＲ反応を行う工程、
（ｄ２）大きさによって上記増幅されたＰＣＲ産物を選別する工程、ならびに
（ｄ３）組み込まれたトランスジーンのコピー数を示す上記増幅されたＰＣＲ産物の大きさに基づいて遺伝子型を決定する工程、
によって決定される。
【００１１】
この方法は、工程（ｄ１）において、３’トランスジーン／ゲノム連結部の検証のための、トランスジーン特異的プライマーおよび染色体特異的プライマーの使用をさらに包含し得、上記トランスジーン特異的プライマーおよび染色体特異的プライマーは、３’トランスジーン／ゲノム連結部の近傍のトランスジーンおよびゲノムに対して、互いに対向する方向で結合する。
【００１２】
別の実施形態では、この方法は、工程（ｄ１）において、プレ組み込み部位（ｐｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）の検証のための、２つの染色体特異的プライマーの使用をさらに包含し得、上記２つの染色体特異的プライマーは、染色体／トランスジーン連結部に対して近傍の染色体に対して、互いに対向する方向で結合する。
【００１３】
代表的なプロトコルにおいて、変異（例えば、トランスジェニック）動物の各々の世代は、定期遺伝的モニタリングおよびスポットチェック（ｓｐｏｔ  ｃｈｅｃｋ）に供される。好ましくは、遺伝的モニタリングは、遺伝的バックグラウンドにおける１つ以上の遺伝子のモニタリングを包含する。
【００１４】
好ましくは、変異動物の各々の世代は、環境的要因の定期モニタリングおよびスポットチェックに供せられ、ここで、この環境的要因は、発生上かつ近接する環境の要因を包含する。最も好ましくは、創始動物と同じ遺伝子型、表現型、および演出型（ｄｒａｍａｔｙｐｅ）を有する動物のみが、変異（例えば、トランスジェニック）動物のさらなる世代の生産に含められる。
【００１５】
別の局面では、本発明は、上述の方法によって生産された変異動物に関する。この変異動物は、例えば、トランスジェニックマウス（例えば、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓトランスジーンを有するＴｇ−ｒａｓＨ２マウス、またはヒトポリオウイルスレセプター（ＰＶＲ）遺伝子を有するＴｇＰＶＲ２１マウス）であり得る。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
変異動物系を確立する方法であって、以下の工程：
（ａ）性的に未熟な変異創始動物（Ｇ０）において過排卵を誘発させる工程；
（ｂ）当該過排卵する性的に未熟な変異創始動物を受精させる工程；
（ｃ）妊娠期の完了時に第一世代変異動物（Ｆ１）を分娩させる工程；
（ｄ）当該第一世代変異動物において、当該変異の安定性、遺伝子型、および遺伝的バックグラウンドの同一性を確認する工程；および、必要に応じて、
（ｅ）１以上のさらなる世代の変異動物を用いて工程（ａ）から工程（ｄ）を反復する工程
を包含し、ここで各工程において、遺伝的要因および環境的要因がモニタリングされ、全ての動物に対して厳密に同一であるように保たれる、方法。
・（項目２）
受精が、自然交配によって実施される、項目１に記載の方法。
・（項目３）
項目１に記載の方法であって、受精が、
（ｂ．１）上記過排卵する成熟前変異創始動物から得られる卵母細胞をインビトロ受精に供する工程；
（ｂ．２）当該受精した卵母細胞を初期胚期までインビトロで培養する工程、および
（ｂ．３）当該胚をレシピエント動物に導入する工程
によって実施される、方法。
・（項目４）
工程（ｂ．２）において、上記受精した卵母細胞が、二細胞胚期にまで培養される、項目３に記載の方法。
・（項目５）
上記初期胚が、レシピエント動物への導入まで、胚バンクに貯蔵される、項目３に記載の方法。
・（項目６）
上記初期胚が、液体窒素温度で貯蔵される、項目５に記載の方法。
・（項目７）
上記変異動物が、トランスジェニック動物である、項目１に記載の方法。
・（項目８）
上記トランスジェニック動物が、マウスである、項目７に記載の方法。
・（項目９）
上記トランスジェニック創始動物が、過排卵を成し遂げる時点で３〜４週齢である、項目８に記載の方法。
・（項目１０）
上記トランスジェニック創始動物が、過排卵を成し遂げる時点で４週齢である、項目８に記載の方法。
・（項目１１）
過排卵が、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）によって誘発される、項目８に記載の方法。
・（項目１２）
項目７に記載の方法であって、工程（ｄ）において、遺伝子型が、以下：
（ｄ１）トランスジェニック動物および対応する非トランスジェニック動物から単離されたゲノムＤＮＡに対して、以下のＰＣＲプライマー：
（ｉ）５’トランスジーン／ゲノム連結部の確認のための、染色体特異的プライマーおよびトランスジーン特異的プライマーであって、当該染色体特異的プライマーおよびトランスジーン特異的プライマーは、それぞれ５’トランスジーン／ゲノム連結部近傍の当該染色体および当該トランスジーンに対して、互いに対向する方向で結合する、プライマー；お
よび
（ｉｉ）トランスジーン／トランスジーン連結部の確認のための、２つのトランスジーン特異的プライマーであって、当該２つのトランスジーン特異的プライマーは、５’末端近傍の当該トランスジーンのセグメントに対して、反対方向で結合する、プライマー
を用いてＰＣＲ反応を行う工程、
（ｄ２）大きさまたはシグナルの分別によって当該増幅されたＰＣＲ産物を分離する工程、ならびに
（ｄ３）組み込まれたトランスジーンのコピー数を示す当該増幅されたＰＣＲ産物の大きさまたはシグナルパターンに基づいて遺伝子型を決定する工程、
によって決定される、方法。
・（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、工程（ｄ１）において、３’トランスジーン／ゲノム連結部の確認のための、トランスジーン特異的プライマーおよび染色体特異的プライマーの使用をさらに包含し、当該トランスジーン特異的プライマーおよび染色体特異的プライマーは、３’トランスジーン／ゲノム連結部の近傍のトランスジーンおよびゲノムに対して、互いに対向する方向で結合する、方法。
・（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、工程（ｄ１）において、プレ組み込み部位の確認のための、２つの染色体特異的プライマーの使用をさらに包含し、当該２つの染色体特異的プライマーは、染色体／トランスジーン連結部に対して近傍の染色体に対して、互いに対向する方向で結合する、方法。
・（項目１５）
上記大きさまたはシグナルパターンが、サザンブロットによって決定される、項目１２に記載の方法。
・（項目１６）
上記変異動物の各々の世代が、定期遺伝的モニタリングおよびスポットチェックに供される、項目１に記載の方法。
・（項目１７）
遺伝的モニタリングが、上記遺伝的バックグラウンドにおける１つ以上の遺伝子のモニタリングを包含する、項目１６に記載の方法。
・（項目１８）
遺伝的モニタリングが、各世代における上記変異動物の遺伝的バックグラウンドが上記創始動物の遺伝的バックグラウンドと同一であることを確実にすることを包含する、項目１７に記載の方法。
・（項目１９）
上記変異動物の各世代が、環境的要因の定期モニタリングおよびスポットチェックに供せられる、項目１に記載の方法。
・（項目２０）
上記環境的要因が、発生上かつ近接する環境の要因を包含する、項目１９に記載の方法。
・（項目２１）
上記創始動物と同じ遺伝子型、表現型、および演出型を有する動物のみが、変異動物のさらなる世代の生産に含められる、項目１１に記載の方法。
・（項目２２）
上記Ｆ１変異動物のバックグラウンド系統が、標的疾患に対する感受性および当該系統の生殖指標に基づいて選択される、項目１に記載の方法。
・（項目２３）
上記遺伝的バックグラウンドが、広範な遺伝的多様性を達成するために広げられる、項目２２に記載の方法。
・（項目２４）
標的疾患のモデリングにおける上記選択されたバックグラウンド系統の有用性が、最終選択の前に検証される、項目２２に記載の方法。
・（項目２５）
項目１に記載の方法によって生産された変異動物。
・（項目２６）
項目１に記載の方法によって生産されたトランスジェニック動物。
・（項目２７）
項目１２に記載の方法によって生産されたトランスジェニック動物。
・（項目２８）
マウスである、項目２７に記載のトランスジェニック動物。
・（項目２９）
Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスである項目２８に記載のトランスジェニックマウスであって、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓトランスジーンを保有する、トランスジェニックマウス。
・（項目３０）
毒性試験および発癌性試験について検証されている、項目２９に記載のトランスジェニックマウス。
・（項目３１）
ＴｇＰＶＲ２１マウスである項目２８に記載のトランスジェニックマウスであって、ヒトポリオウイルスレセプター（ＰＶＲ）遺伝子を保有する、トランスジェニックマウス。
・（項目３２）
項目３１に記載のトランスジェニックマウスであって、３型または２型の経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）の神経毒性の評価について検証されている、トランスジェニックマウス。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、動物実験の結果に影響する主要因子の模式図である。
【図２】図２は、本発明に従う遺伝的要因および環境的要因の制御を説明する。
【図３】図３は、本発明の動物実験システムを開発する際の質保証試験の一部として制御される要因を示す。
【図４】図４は、本発明の「超速」コンジェニック法の模式図である。
【図５】図５は、目的に依存した２つのタイプの遺伝学的質試験を説明する。
【図６】図６は、二重（ｄｕｐｌｅｘ）ＰＣＲによるトランスジェニック動物の遺伝子型決定を説明する。
【図７】図７は、ＦＩＳＨ法によって決定される、Ｎ１５およびＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウスにおける組み込まれたトランスジーンの染色体局在を示す。両方の場合とも、このトランスジーン位置を表す対になった蛍光シグナルが、染色体１５Ｅ３領域上で観察された。Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスはヘミ接合体であり、そのため、このハイブリダイゼーションシグナルは、一対の姉妹染色分体でのみ検出された。
【図８】図８は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるトランスジーン組み込みのサザンブロット分析の結果を示す。（Ａ）Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるトランスジーンの制限マップおよび構造（ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の７．０ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメント）。白のボックス部は、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓタンパク質をコードする４つのエキソンを表す（Ｅｘ１〜Ｅｘ４）。ＸｂａＩから上流の領域を認識するＤＩＧ標識５’−プローブを白丸および棒線で示した。（Ｂ）非トランスジェニックマウス、およびＮ１５およびＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウス由来のゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ消化し、０．６％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロン膜に転写した。この膜をＤＩＧ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズさせた。ＤＮＡサンプルを、非トランスジェニックマウス（レーン１）、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウス（Ｎ１５）（レーン２およびレーン３）、およびＴｇ−ｒａｓＨ２マウス（Ｎ２０）（レーン４およびレーン５）から得た。（Ｃ）Ｎ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウス由来のゲノムＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ消化し（レーン１；ＢａｍＨＩ、２；ＨｐａＩ、３；ＸｈｏＩ、４；ＸｂａＩ、５；ＮｃｏＩ、６；ＢｇｌＩＩ、７；ＳａｃＩ、８；ＨｉｎｄＩＩＩ）、０．６％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロン膜に転写した。この膜をＤＩＧ標識５’−プローブとハイブリダイズさせた。シグナルを、Ｘ線フィルム上で化学発光アルカリホスファターゼ基質を用いて検出した。
【図９】図９は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウス発現における組み込みについてのノーザンブロット分析の結果を示す。Ｎ１５およびＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの発現。１０μｇの全ＲＮＡサンプル（Ｂ、Ｌ、およびＦはそれぞれ、脳、肺、および噴門洞を示す）をホルマリン−アガロースゲル上に分画し、ナイロン膜に転写した。この膜を［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子（ｃ−Ｈａ−ｒａｓ）プローブとハイブリダイズさせ、次いで［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡ（ＧＡＰＤＨ）プローブと再ハイブリダイズさせた。ｎＴｇおよびＴｇはそれぞれ、非トランスジェニックマウスおよびＴｇ−ｒａｓＨ２マウスから得たサンプルを示す。シグナルをＸ線フィルム上で検出した。
【図１０】図１０は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおける組み込まれたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の正確なコピー数の決定のためのサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す。Ｎ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウス由来のゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ（レーン１）およびＨｉｎｄＩＩＩ（レーン２）で完全消化した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡを、種々の濃度のＢａｍＨＩでさらに消化した（レーン３〜５）。次いで、この消化されたＤＮＡを、０．４％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン膜に転写した。この膜をＤＩＧ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズさせた。シグナルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を用いてＸ線フィルム上で検出した。レーンは、Ｍ，Ｅｘｐａｎｄ  ＴＭ  ＤＮＡ分子量マーカー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）でマークした。
【図１１】図１１は、ゲノム／トランスジーン連結部のＰＣＲ検証の結果を説明する。（Ａ）Ｔｇ−ｒａｓＨ２（Ｔ）マウスおよび非トランスジェニック（Ｎ）マウス由来のゲノムＤＮＡに対して、以下のプライマーセットを用いて、ＰＣＲを実施した：５’トランスジーン／ゲノム連結部の検証のため；染色体特異的プライマーＡおよびトランスジーン特異的プライマーＣ、３’トランスジーン／ゲノム連結部の検証のため；トランスジーン特異的プライマーＤおよび染色体特異的プライマーＢ、プレ組み込み部位の同定のため；染色体特異的プライマーＡおよび染色体特異的プライマーＢ、ならびにトランスジーン／トランスジーン連結部の検証のため；トランスジーン特異的プライマーＣおよびトランスジーン特異的プライマーＤ。（Ｂ）ＤプライマーおよびＣプライマーを用いて作製されたＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、トランスジーン／トランスジーン連結部の完全性を確認した。１００ｂｐ  ＤＮＡラダーをＤＮＡサイズマーカーとして使用した。（Ｃ）マウスゲノム中の中断された遺伝子座での３つのトランスジーン。ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓトランスジーンは、ヘッド−テイルの並びで存在する（塗りつぶしボックス部はエキソンを示す）。矢印は、使用したオリゴヌクレオチドの位置および方向の両方を示し、矢印の先端は、オリゴヌクレオチドの３’末端を表す。
【図１２】図１２は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるゲノム／トランスジーンの配列分析の結果を示す。非トランスジェニックマウスＤＮＡおよび注入されたＤＮＡの対応する領域もまた、比較のために示す。アスタリスクは、同一のヌクレオチドを示し、囲まれた領域は、組換え部位でのヌクレオチドとの同一性を示す。水平方向の矢印は、トポイソメラーゼＩコンセンサス配列（５’−Ａ／Ｔ−Ｇ／Ｃ−Ｔ／Ａ−Ｔ−３’）を表す。
【図１３】図１３は、微生物制御および計画生産に関して胚バンク施設を説明する。
【図１４】図１４は、代替的微生物制御法の模式図である。
【図１５】図１５は、本発明の計画生産および供給システムの模式図である。
【図１６】図１６は、ＴｇＰＶＲ２１マウスにおける組み込まれたＰＶＲトランスジーンのＦＩＳＨ分析および染色体局在の結果を示す。
【図１７】図１７は、ＴｇＰＶＲ２１マウスにおけるＰＶＲトランスジーンのサザンブロット分析の結果を示す。
【図１８】図１８は、ＴｇＰＶＲ２１マウスにおけるＰＶＲ  ｍＲＮＡの遺伝子発現プロフィールを決定するための、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、および直接配列決定分析の結果を示す。
【図１９】図１９は、ＰＶＲ−α  ｍＲＮＡ、ＰＶＲ−β  ｍＲＮＡ、およびＰＶＲ−γ  ｍＲＮＡの構造、ならびにプローブ、プライマー、および配列決定の部位を示す。
【図２０】図２０は、ＴｇＰＶＲ２１トランスジェニックマウスにおける５’ゲノム／トランスジーン連結部の構造を示す。
【図２１】図２１は、ＴｇＰＶＲ２１トランスジェニックマウスにおける５’ゲノム／トランスジーン連結部の制限マップを示す。
【図２２】図２２は、ＴｇＰＶＲ２１トランスジェニックマウスにおける５’ゲノム／トランスジーン連結部の配列決定の結果を示す。
【図２３】図２３は、Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．２８３３６８５に対するＴｇＰＶＲ２１マウスにおけるトランスジーン／マウスゲノム連結領域の上流部位の構造の決定を説明する。
【図２４】図２４は、本発明の生産および検証システムの模式図である。
【図２５】図２５は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）陽性コントロールについての腫瘍発生率を示す；噴門洞乳頭腫（単回腹腔内（ｉ．ｐ．）／７５ｍｇ／ｋｇ）。
【図２６】図２６は、ＭＮＵ陽性コントロールについての腫瘍発生率を示す；悪性リンパ腫（単回腹腔内（ｉ．ｐ．）／７５ｍｇ／ｋｇ）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
用語「変異」動物は、最も広範な意味において使用され、詳細には、遺伝子組換え（遺伝子操作）動物（例えば、トランスジェニック動物、ノックアウト動物、およびノックイン動物）、偶発変異を有する動物、および１つ以上の遺伝子において人工的変異誘発によって生成された変異を有する動物を包含する。
用語「遺伝子組換え（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」および「遺伝子操作（ｇｅｎｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ）」は、互換可能に使用され、トランスジェニック動物、ノックイン動物、およびノックアウト動物をいう。
【００１８】
本明細書中で使用される用語「卵」は、哺乳動物卵に関して使用される場合、透明帯に取り囲まれた卵母細胞およびそれらの付随したプロテオグリカンを伴う一塊の卵丘細胞（卵胞細胞）を意味する。用語「卵」は、卵巣中で卵胞腔から回収された卵（これらの卵は、成熟前卵母細胞を含む）ならびに卵胞腔から放出された卵（破裂した卵胞）に関して使用される。
【００１９】
本明細書中で使用される用語「卵母細胞」は、雌性生殖細胞をいい、一次卵母細胞、二次卵母細胞、および成熟した未受精の卵子を包含する。卵母細胞は、卵質に囲まれた大きな核（すなわち、卵核胞）を有する大きな細胞である。卵質は、非核細胞質内容物（ｍＲＮＡ、リボソーム、ミトコンドリア、卵黄タンパク質などを含む）を含有する。卵母細胞の膜は、本明細書中において、「形質膜」と呼ぶ。
【００２０】
用語「ヘミ接合体」は、トランスジェニック動物に関して、トランスジェニック動物が野生型遺伝子の一倍体とトランスジーンの一倍体（または１コピーより多くのトランスジーンが組み込まれた場合、それらトランスジーンのセットの一倍体）とを有することを意味する。
【００２１】
用語「ゴノソム」は、性染色体をいうために使用される。哺乳動物においては、Ｘ染色体およびＹ染色体が、個体の性別を決定する。雌は、２つのＸ染色体を有するが、雄は、１つのＸ染色体と１つのＹ染色体を有する。
【００２２】
本明細書中で遺伝子改変（例えば、トランスジェニック）動物に関して使用される用語
「ヘミ接合性」とは、言及される遺伝子（例えば、トランスジーン）に対してヘミ接合体であることに適用される。
【００２３】
用語「ホモ接合体」は、所与の遺伝子についての２つの対立遺伝子が同一である二倍体遺伝子型をいう。トランスジェニック動物に関して、この用語は、動物がトランスジーンの二倍体（または１コピーより多くのトランスジーンが組み込まれた場合、それらトランスジーンのセットの二倍体）を有することを意味する。
【００２４】
用語「ヘテロ接合体」は、所与の遺伝子についての２つの対立遺伝子が異なる二倍体遺伝子型をいう。
【００２５】
用語「トランスジェニック動物」は、ヒトが介入した組換えＤＮＡの導入によって改変された動物をいうために使用される。これは、遺伝可能な生殖細胞系ＤＮＡ変化を伴う動物、および遺伝可能でない体細胞性変化を伴う動物を含む。用語「トランスジーン」は、（１）体細胞に導入されているか、または（２）その動物宿主系統の生殖系列に安定に組み込まれるかのいずれかで、続く世代に伝達可能であるかある核酸（ＤＮＡ）をいう。
【００２６】
用語「遺伝子型」とは、全ての生存生物が有する「内在的にコードされた遺伝可能な情報」をいう。この貯蔵された情報は、生存生物を作り上げて維持するための「青写真（ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ）」または一連の指示として使用される。これらの指示は、ほとんど全ての細胞内で見出され（「内在」部）、コード化された言語（遺伝コード）で表され、細胞分裂または生殖の時点で複製され、ある世代から次の世代に伝達される（「遺伝性」）。これらの指示は、細胞または生物の寿命のあらゆる局面と深く関わりあう。「遺伝子型」は、タンパク質高分子の形成から代謝および合成の調節までの全てを制御する。
【００２７】
用語「表現型」は、生物の「外面上の身体的発現」をいう。これらは、身体部分（原子、分子、高分子、細胞、構造物、代謝物、エネルギー利用、組織、器官、反射、および挙動の合計）；生存生物の目に見える構造、機能、または挙動の一部であるあらゆるものである。
【００２８】
用語「演出型（ｄｒａｍａｔｙｐｅ）」は、実験動物の単一の生理学的応答における振る舞いのパターンをいう。このような応答におけるバリエーションは、以下の２つの要因の共同産物である：表現型自体、および動物が試験される近接環境条件（例えば、温度、湿度、食餌、研究者、および動物の世人など）。均一な演出型のために、動物が試験される環境条件は厳密に制御されなければならない。
【００２９】
用語「コンジェニック動物（ｃｏｎｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ）」は、ドナー系統からの特定のマーカーについて選択して、近交系（バックグラウンド）系統に対する反復戻し交雑によって生産された動物系統をいう。
【００３０】
用語「雑種動物」は、２つの近交系系統の子孫である動物（例えば、マウスまたはラット）であって、同じ方向に交雑され、遺伝的に同一であり、そして両親の大文字省略形（母方系統が最初に示される）およびその後に続くＦ１を用いて称され得る動物をいう。
【００３１】
用語「定期モニタリング（ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）」は、上述の動物の遺伝学的および微生物学的な質が時間を通して安定であることを保証にするために、定期的に、かつ標準方法によって実施される検査をいう。これは、規定のマウスと対応する近交系系統との遺伝的プロフィールおよび微生物学的プロフィールを比較することによってなされる。この定期モニタリングによって、動物の健常性の維持の情報に加え、特定の質の維持に関する情報もまた付与される。構想的に、実験動物は、「生存測定ツール
」として見られ得る。それらは、物理化学的測定において使用されるツールとは反対に、日毎に変化するという点で独特である。従って、実験動物の質をモニタリングすることは、それらの意図される用途にとって必須である。ペットまたは家畜動物に関しては、この必要性は存在しない。
【００３２】
用語「スポットチェック（ｓｐｏｔ  ｃｈｅｃｋｉｎｇ）」は、動物が感染または遺伝的汚染を受けているか否かを決定するために不定期の間隔で実施される、不定期な動物検査をいう。
【００３３】
用語「二層モニタリング」は、定期モニタリングとスポットチェックとを組み合わせたモニタリングシステムをいう。
【００３４】
用語「ノトバイオート」は、無菌的外科手順によって得られたか、または卵の滅菌孵化から得られた動物系統であって、隔離装置条件下で無菌的技術を用いて飼育管理され、かつ付随した動物相および植物相（存在する場合）の組成が、認可されている現行の方法によって十分に規定される、動物系統、をいうために使用される。
【００３５】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明は、生物医学研究および薬物開発における信頼性のあるツールとして使用され得る変異体（例えば、遺伝子組換え動物または偶発変異を有する動物）の設計および開発のための、統合的な生産および供給システムに関する。上述したように、そのような変異実験動物が、それらの特性の全てにおいて完全に同一であることが不可避である。なぜなら、種々の遺伝的要因および／または環境的要因における最もわずかな差異ですら、動物実験の結果に劇的に影響するからである。詳細には、全ての動物は、同じ遺伝子型、表現型、および演出型を有さなければならず、かつ同じ発生環境（母系効果）および近接環境に供されなければならない。これらの要因（動物実験の結果に有意に影響を与える）を図１に示す。これを達成するために、十分に確立された物理化学アッセイシステムとまさに同程度に再現可能である生存アッセイシステム（インビボ実験システム）として見られ得る変異（例えば、遺伝子組換え）動物モデルの開発のために、新規な生産および検証システムを開発した。この新規な生産および検証システムを、図２４に図示する。このシステムにおいて、動物の特性に影響する全ての要因は、緊密に制御される。これらの要因としては、動物自体の緊密な制御（例えば、雑種動物を作出するための育種における種、系統、およびそれらの組み合わせ、性別、齢、同腹子の大きさ（ｌｉｔｔｅｒ  ｓｉｚｅ）、および体重）、それらの居住環境（例えば、寝具類、動物室など）、物理化学的要因（例えば、臭気、光、騒音）、室内環境（例えば、空気速度、湿度、温度）、栄養（例えば、食餌、水分、発癌物質への曝露）、微生物（例えば、感染、常在菌叢の質）、および人間的要因（例えば、動物の世話人、研究者など）が挙げられる。さらに、遺伝的に制御されたバックグラウンド系統と遺伝的多様性との間の均衡は、実験動物科学分野における当業者および対象動物疾患に関する当業者によって設計、選択、および決定されている。これらの要因を図２に図示する。
【００３６】
「生存試験道具」として使用され得る標準化された実験動物の開発は、第一工程として、遺伝学および微生物学的に均一な質の仕様に従う参照動物を調製することで始まり、第二工程として、計画生産システムを確立することが続き、十分数の同一動物が、任意の特定の動物実験においてそれらの有用性および制限を評価するために入手され得るようになる。遺伝子組換え動物モデルが確立される前に、何百匹または何千匹もの標準化された動物が、このアプローチに従って開発され、そして徹底的に評価にかけられて、遺伝子組換えモデルが確立する前に、モデルシステムとしての有用性および制限が決定され得る。標準化された遺伝子組換え動物モデルの実際の開発における重大な第三の工程は、十分に特徴付けられた信頼性のある動物モデルを用いた統合「インビボ実験システム」の確立を包
含し、その結果、遺伝子組換え動物（例えば、トランスジェニックマウス）が、ヒト疾患モデルとして、または生物医学研究および薬学研究の他の分野において、信頼性をもって使用され得る。代表的には、実験動物研究者はこの第一工程において責任をとり、動物モデルを用いる医療研究者または薬物研究者は第三工程を完了させるが、第二工程には両方の研究者グループが参加する。このシステムをトランスジェニック動物に関して説明するが、本発明はそのように限定されない。本発明のアプローチは、他の変異動物（全てのタイプの遺伝子組換え（遺伝子操作）動物および１つ以上の偶発変異を有する動物を含む）にも等しく適用可能である。
【００３７】
（工程１：遺伝学および微生物学的に均一な質標準を有する参照動物の調製）
従来、トランスジェニック動物の開発は、以下の工程を包含する：（１）マイクロインジェクションによるマウス卵へのＤＮＡの導入、またはレトロウイルスベクターまたは他の方法による胚性幹細胞（ＥＳ細胞）へのＤＮＡの導入；（２）トランスジーンが組み込まれ、伝達されているかを確認する信頼性のある遺伝子型決定アッセイ（例えば、ＰＣＲまたはサザンブロット（創始動物））による試験；（３）クローニングまたは有性生殖による生殖；および（４）質制御（生化学的マーカーを使用することによる遺伝学的質制御（遺伝プロフィールモニタリング）および微生物学的質制御（続いて微生物モニタリングシステムを用いる）を含む）。小さな変化ですら、動物が実験室実験でどのように挙動するかにおいて本質的な差異を生じ得るので、各工程のモニタリングおよび質保証、ならびに育種コロニーの維持における卓越性が、変異（例えば、遺伝子組換え）動物モデルの信頼性のために必須である。本発明は、このプロセス全体の各工程において有意な改善を提供する。
【００３８】
特に、本発明は、インビボ実験のための実験動物を開発するプロセスにおける集団の仕様（（１）遺伝学的質保証（超速コンジェニック法（ｓｕｐｅｒ  ｓｐｅｅｄ  ｃｏｎｇｅｎｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ））および（２）微生物学的保証（二層モニタリング）を含む）を提供する。育種プロセスのこの部分を、「集団期（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｇｅ）」と呼ぶ。さらに、本発明は、「計画生産および供給システム」を提供し、この中には、（１）変異体（例えば、トランスジーン）の安定性および機能の進行的モニタリング、（２）危険性管理システム（大量保存）、（３）生殖操作技術、および（４）モデルの特定の目的についてのバックグラウンド系統の選択、および必要に応じて、広範であるが反復可能でありかつ再現可能な遺伝的多様性を達成するために遺伝的多様性の拡大が含まれる。
【００３９】
（遺伝学的質保証（超速のコンジェニック動物開発方法））
本発明の遺伝学的質保証の工程において、遺伝学的および微生物学的に均一な質の標準を有する参照変異体（例えば、トランスジェニック動物（例えば、マウス））の調製および検証、ならびに高速コンジェニックプロセス（ｓｐｅｅｄ  ｃｏｎｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ）および技術が含まれ、この後、計画的に遺伝的モニタリングされ、必要な質が維持されることを保証する。この工程において、本発明は、トランスジェニック動物の場合、トランスジーンの適切な挿入に加え、マウスまたは他の変異動物のバックグラウンド遺伝子の同一性もまた確実にする。遺伝的バックグラウンドもまた変異動物と同一であることを確実にする重要性は、遺伝的バックグラウンドが１００％同一でない場合、変異動物が親動物の表現型を喪失し得ることにある。例えば、ｐ５３＋／−マウスは、この理由のために、複雑な表現型を示している。本発明のこの工程によって提供される主な改善点は、このプロセスの促進（すなわち、コンジェニック動物の確立に必要な時間の短縮）、および二層遺伝的モニタリングシステムの適用である。
【００４０】
新規な変異（例えば、トランスジェニック、ノックアウト、またはノックイン）動物系の開発は、代表的には、特定の近交系動物（例えば、マウス）系統において遺伝子操作ま
たは偶発変異を確立するために、少なくとも５世代、より頻繁には少なくとも９世代、しばしば１２世代までの慎重な戻し交雑を必要とする。このプロセスの結果は、数世代後に、固定された遺伝的バックグラウンドにおける変異（例えば、トランスジェニック、ノックアウト、またはノックイン）動物モデルが確立されることであり、これを「コンジェニック」と呼ぶ。インビトロ受精に供される動物は、代表的には、少なくとも約２ヶ月齢であり、妊娠期間は１９日である。このことは、各世代の生産にほぼ３ヶ月かかることを意味する。結果として、コンジェニック動物系統の確立は、非常に長いプロセスであり、これは、代表的には数年かかる。本発明は、コンジェニック動物系統の確立のための高速の方法を提供する。本発明によれば、各世代の雌性動物（例えば、マウス）を処置して過排卵させ、約４週齢の若年時にインビトロ受精に供する。通常、１６日齢の雌性マウスに、ＰＭＳＧ注入、続いて２８日目にｈＣＧ注入を行い、過排卵を成し遂げさせる。２９日目に、このマウスを自然交配させるか、またはインビトロ受精に供する。３０日目に、二細胞胚を採集し、偽妊娠レシピエントに移植する。妊娠期間は１９日間なので、分娩は４９日目に起こる。各世代において異例に若い（約４週齢）動物を使用することにより、コンジェニック系統の確立に必要な時間が有意に減少することを理解することは容易である。このプロセスを図４に図示し、実施例１においてより詳細に説明する。
【００４１】
同様のプロセスが、低い排卵能を示す系統からコンジェニック動物を生産するために使用され得る。
【００４２】
（微生物学的質保証−代替的微生物学的質制御法）
微生物環境は、実験動物の演出型に影響する主要な要因の１つである。微生物感染が急激に発生すると、実験動物の健康を変化させ、結果として、生殖の振る舞いのような実験の結果、および血液化学を変化させることは周知の事実である（Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｉｍｍｕｎｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｏｒｄａｔ，Ｂ．ら編），Ｓ．Ｋａｒｇｅｒ
ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，１９８４．；Ｉｔｏｈ，Ｔ．ら、Ｅｘｐｒ．Ａｎｉｍ．，３０：４９１−４９５，１９８１；Ｉｔｏｈ，Ｔ．ら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．４０：６１５−６１８，１９７８；Ｉｗａｉ，Ｈ．ら、Ｅｘｐｒ．Ａｎｉｍ．２６：２０５−２１２，１９７７）。さらに、Ｎａｒｕｓｈｉｍａら（Ｎａｒｕｓｈｉｍａら、Ｅｘｐ  Ａｎｉｍ  ４７（２）：１１１−７（１９９８））は、腸内細菌がトランスジェニックｒａｓＨ２マウスにおいて発癌物質に対する応答を改変したことを実証した。これらの知見は、微生物環境の厳密な制御が実験動物の演出型の（ｄｒａｍａｔｙｐｉｃａｌ）質の保証に不可欠であることを強く示している。さらに、動物の遺伝的変化は免疫能力の改変を生じ得るので、遺伝子組換え動物の微生物学的質制御に対して特別な配慮が払われるべきである。ヌードマウスに特有であるようである感染もまた存在する。従って、厳密な微生物制御は、実験動物モデルの開発の必須となる部分である。
【００４３】
本明細書中に記載の発明によれば、動物（すなわち、マウス）は、純化された腸内細菌叢を有するようにコロニー化され、厳密な障壁システム下で飼育される。動物が他の施設から受け取ったものである場合、この動物が厳密に制御された微生物モニタリングを受けることなく従来の設備で飼育されていたのであれば、この動物は、代替的微生物学的質制御法（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄ）（ＡＭＱＣＭ）を用いることによりクリーンにされなければならず、これは、本発明の不可欠な部分である。ＡＭＱＣＭの適用により、動物モデルの開発期の間の微生物制御の費用および時間は、有意に減少され得る。二層モニタリングが、この微生物学的質を保証するために実施される。
【００４４】
従って、本発明は、それらの腸内細菌叢が厳密に保証された微生物学的質を有する遺伝子組換え動物の計画生産のための新規な方法を提供する。インビトロ受精（ＩＶＦ）、胚
低温保存、胚移入、レシピエントおよび／または養母による哺乳の工程は、全てこのプロセスに組み込まれる。
【００４５】
特に、微生物感染があると考えられる動物に由来する卵および精子をＩＶＦに供して、無菌胚を得る。この胚を、レシピエントマウスの子宮に移す。感染マウスの精子および卵を有するＩＶＦ−胚に由来する仔動物（ｐｕｐ）は、微生物学的にはクリーンである。レシピエントおよび養母マウスは、純化された腸内細菌叢（ＡＣストック）によってコロニー化された厳密に制御されたマウスストックから供給され、これにより仔動物は、乳児期に同じ叢を有する。
【００４６】
代替的微生物学的質制御法においては、順序付けられた障壁の動物飼育システム（例えば、ビニル隔離装置）に加えて、近代的な新しく設計された胚バンク設備が使用される。胚バンク設備は、以下の３つのユニットからなる：１）隔離ユニット（Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ  Ｕｎｉｔ）（ＱＵ）、２）胚操作および凍結ユニット（Ｅｍｂｒｙｏ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）（ＥＭＦＵ）、および３）回収ユニット（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｕｎｉｔ）（ＲＵ）。胚バンク設備の例を図１３に示す。ＱＵは、微生物学的に保証されていないドナーを係留するための動物室、および配偶子（ｇａｍａｔｅ）（卵および精子）の採集のための無菌装置からなる。ＥＭＦＵは、微生物学的にクリーンなドナーのための動物室、配偶子採集のための無菌設備、無菌ＩＶＦおよび凍結設備、および液体窒素タンクのための室からなる。ＲＵは、レシピエントのための室、胚移入のための室、哺乳のための室、および飼育のための室からなる。ＥＭＦＵおよびＲＵは、ＱＵによって分離された障壁システム（正に濾過された空気条件（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｉｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、オートクレーブ、衣服交換室など）を備え付けられる。正に濾過された空気条件を有するＱＵにおいて、ビニル隔離装置または陰圧式動物飼育装置（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅｄ  ａｎｉｍａｌ
ｒｅａｒｉｎｇ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）が使用される。ＲＵの各室の間、および障壁領域の外側とＲＵの各室との間に、滅菌ロックが備え付けられ、これは、レシピエントおよび養母、胚などの移動に好都合である。配偶子採集のための設備およびＩＶＦのための設備間に、パスボックスが備え付けられ、これは、無菌管の移動に好都合である。
【００４７】
これらの設備に加えて、隔離装置システムが、純化された腸内細菌叢（ＡＣストック）によってコロニー化された無菌動物およびノトバイオート動物のために備え付けられる。これらの動物は、滅菌ロックを通してビニル隔離装置システムによってＲＵに運ばれる。
【００４８】
代替的微生物学的質制御方法（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄ）を図１４に示す。大発生していると考えられるかまたは微生物学的に保証されていないと考えられる動物（すなわち、マウス）をＱＵに収容し、微生物学的に保証された動物（すなわち、ＳＰＦ（特定病原菌なし（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｅｅ））をＥＭＦＵに維持する。ドナーマウスを屠殺し、そのマウスの表面を滅菌する。卵および精子を無菌的に採集し、パスボックスに入れてＩＶＦ設備に移す。ＩＶＦを無菌的に実施し、二細胞胚にまで培養する。この胚を液体窒素中で凍結させるか、またはそのまま移植に使用する。この二細胞胚を、滅菌ロックを通してＲＵに移し、レシピエントマウスに対して無菌的に移植を実施する。
【００４９】
分娩された仔動物をレシピエント母によって自然に哺乳させる。いくつかの場合では、帝王切開によって分娩された仔動物を、養母によって哺乳させる。両場合とも、腸内細菌叢（ＡＣストック）は、哺乳の間に仔動物の腸にコロニー化される。
【００５０】
この方法を、実施例２においてさらに説明する。
【００５１】
（遺伝学的質試験）
動物モデルとして変異（例えば、遺伝子組換え）動物（例えば、マウス）を使用するためには、遺伝的に相同の動物が多数、生産されなければならない。目的に応じた２タイプの遺伝学的質試験を図４に示す。目的が遺伝子組換え動物の遺伝学的特徴を明確にすることである場合、特定の時点で、所与の系統の遺伝学的特徴をより詳細に決定するために、スポットチェックが実施される。他方で、一貫した遺伝学的質の保証には、質の変化がなかったことを確認するための動物のモニタリングが必要とされ、これは、質標準の所定のセットを定期的に試験することを含む。
【００５２】
論文のほとんどにおいて、トランスジーンおよび／またはその組み込み部位の分子分析は、通常、５世代以下しか及んでいない。マウス宿主ゲノムに組み込まれたトランスジーンの生殖系列伝達の安定性は、詳細な研究の対象にはなっていない。トランスジーン組み込みおよび安定性に関して報告された所見は矛盾しており、遺伝子特異的であるようである。安定な組み込みを確認するために加え、さらに遺伝的不安定性を取り除くかまたは防ぐためには、組み込まれたトランスジーンの徹底的な分子分析が必要であることは明らかである。
【００５３】
遺伝子変化された動物の遺伝子型（トランスジェニックに対してホモ接合体またはヘミ接合体）は、同じ系統についての繁殖者対（ｂｒｅｅｄｅｒ  ｐａｉｒ）の遺伝子型とはしばしば異なる。本発明は、異なる世代においてトランスジーン安定性をモニタリングすることを可能にすることに加え、トランスジーン組み込み部位の周囲のゲノム構造をモニタリングすることもまた可能にする、新規な方法を提供する。本発明の「早期遺伝子検出方法」は、ホモ接合性のトランスジェニック動物（例えば、マウス）とヘミ接合性のトランスジェニック動物（例えば、マウス）との間を通常２日以内に識別することを可能にする。これは、従来のアプローチとは対照的である。従来のアプローチは、同胞交配に依存し、通常１ヶ月より長くかかる。
【００５４】
任意の世代におけるトランスジーンの遺伝的安定性の検査は、代表的には、染色体局在の決定（例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法を使用）で始まる。（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．６１：２８２−２８５（１９９２）；Ｅｖａｎｓ  ＥＰ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇ−ｂａｎｄｅｄ  ｋａｒｙｏｔｙｐｅ，Ｌｙｏｎ  ＭＦ，Ｒａｓｔａｎ  Ｓ．，Ｂｒｏｕｎｄ  ＳＤＭ，編，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｏｕｓｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９９６，ｐ．１４４６−１４４９．）  これは、代表的には、この後サザンブロット分析に続き、組み込まれたトランスジーン遺伝子座の周りの制限フラグメントマップを作成し、これによりトランスジーン構造に関する重要な情報が提供される。トランスジーンの発現は、ノーザンブロット分析によって確認され得る。最後に、この分析は、挿入された遺伝子および周囲配列の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）直接配列決定により完了し、例えば、トランスジェニック動物の次の世代において生じ得る点変異が同定される。
【００５５】
本発明によれば、トランスジェニック動物は、新規で効率的なＰＣＲアプローチを使用することによって遺伝子型決定される。互いに対向する方向で、トランスジェニック動物および対応する非トランスジェニック（野生型）動物から単離された標的ＤＮＡの相補鎖に対して結合するように、遺伝子特異的ＰＣＲプライマーが設計される。詳細には、図６に示されるように、ＰＣＲは、以下のプライマー対を用いて、トランスジェニック動物および非トランスジェニック動物から単離されたゲノムＤＮＡを用いて実施される：（１）染色体特異的プライマーＡおよびトランスジーン特異的プライマーＣ（５’トランスジーン／ゲノム連結部の検証のため）；（２）トランスジーン特異的プライマーＤおよび染色
体特異的プライマーＢ（３’トランスジーン／ゲノム連結部の検証のため）；（３）染色体特異的プライマーＡおよび染色体特異的プライマーＢ（プレ組み込み部位の同定のため）；ならびに（４）トランスジーン特異的プライマーＣおよびトランスジーン特異的プライマーＤ（トランスジーン−トランスジーン連結部の検証のため９。これらのプライマー対を用いることにより作製された増幅ＰＣＲ産物は、大きさによって（例えば、アガロースゲル上で）分離され、任意の特定の動物の遺伝子型の同定を可能にするバンドパターンを提供し得る。これにより、ヘミ接合体は２つのバンドを生じ、一方は、野生型対立遺伝子に対応し、他方は、トランスジーンに対応する。対して、ホモ接合体は、トランスジーンにのみ対応するバンドを示す。さらに、染色体特異的プライマー対ＡおよびＢから得られるＰＣＲ産物の差異が、動物の遺伝的バックグラウンドの差異を示す。
【００５６】
その代わりに、あるいはそれに加えて、このＰＣＲ産物はまた、シグナル区別（例えば、蛍光染料で標識した産物の色に基づく区別）によって分離または識別され得る。例えば、トランスジーン特異的プライマーがＦＩＴＣ蛍光染料で標識され、染色体特異的プライマーがＨＥＸ染料で染色される場合、トランスジーン特異的プライマーからの産物は、緑色を帯びた色を呈し、対して、染色体特異的プライマーからの産物は赤色を帯びた色を呈するので、蛍光画像化検出器を用いて、この特性に基づいて識別され得る。この特定の例では、ヘミ接合体のＤＮＡに由来する産物は、緑と赤との組み合わせから生じる黄色を帯びた色で検出される。
【００５７】
（工程２：計画生産および供給システム）
さらに、本発明は、計画生産および供給システムを提供し、この中には、（１）トランスジーンの安定性および機能の進行的モニタリング、（２）危険性管理システム（大量保存）、（３）生殖操作技術、および（４）広範な遺伝的多様性を達成するために遺伝的バックグラウンドの拡大が含まれる（図１５を参照のこと）。この計画生産は、上述の４つの工程に従って実施される。このプロセスは、胚の凍結保存と共に、核コロニー（ｎｕｃｌｅａｒ）、拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）コロニー、および生産コロニーを使用して、漸進的な生産を成し遂げる。コロニーの使用は危険性管理にとって重要である。この漸進的な生産拡大は、指定した標的のヒト疾患または生理的機能についてそれらの有用性および制限を評価するために十分な数の実験動物（生産系列）を低給するために必要である。
【００５８】
核コロニー期で、同胞交配の受精卵が、低温保存によって保存される。拡大および／または生産期で、この卵は、インビトロ受精後に低温保存によって塊として保存される。卵は多数の雌性マウスから採集されるが、精子は、単一の雄性マウスから採集されて、大量保存されたものである。自然の精子進入によって生産コロニーを確立するには、通常、数十ヶ月かかる。このような核コロニーにおけるその血統系列のための低温保存システム、ならびに拡大コロニーおよび生産コロニーにおける大量保存システムは、事故（例えば、計画生産における汚染、または生産の中止に至る他の問題）の危険性を減少させる。
【００５９】
核コロニーの確立、ならびに計画生産および供給システムによる動物の遺伝子型の決定は、本発明の新規な方法が適用される場合、通常よりもはるかに短い時間内で完了される。実に、トランスジーンの安定性および遺伝子型は、あらゆる世代において１日以内でチェックされる。従って、本発明によると、使用者の仕様に従って、任意の所望の体重または齢の実験動物を迅速に提供することができる。これは、従来の手順に対する顕著な改善である。従来の手順では、幼動物の供給が非常に困難であった。
【００６０】
（工程３  動物モデルの有用性および制限の評価）
真に有用であるヒト疾患の動物モデルについては、そのモデルが規定されなければならず、そして以下の要件を満たす動物のみが、この規定の動物モデルとしてみなされ得る：ヒトに似ている生理的表現型または病理的表現型が、ヒトと同一の遺伝的原因を有してい
なければならず、そしてモデルとしての動物の有用性および制限）が規定されなければならない。これらの要件は、ヒト疾患のモデルとして使用されるべき全ての遺伝子組換え動物に対して等しく適用される。
【００６１】
この工程の重要性の元となる例は、デュシェーヌ型筋ジストロフィーをモデリングするために日本において開発された動物モデルである。このプロジェクトの開始時に、筋ジストロフィーのためのモデルとして国際的に使用されてきたほとんど全ての動物が集められ、評価のために臨床研究グループに提供された（例えば、以下を参照のこと：Ｇｏｒｄｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：７３５０−７３８４（１９８０）；ＳｕｇｉｔａおよびＮｏｎａｋａ，Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｕｔｉｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ，ｐ．２７１−２８６  ｉｎ：Ｊ．ＫａｗａｍａｔａおよびＥ．Ｃ．Ｍｅｌｂｙ（編），Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ：ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｃｏｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ
ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｕｌｆｉｅｌｄら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１：１１８９−１１９２（１９８４）；Ｔａｎａｂｅら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ６９：９１−９５（１９８６））。偶発変異体に由来するこれらの筋ジストロフィーモデルは、疾患の病因の分類において非常に有用であったが、デュシェーヌ型筋ジストロフィーの研究にはあまり有用でなかった。研究が進行するにつれて、これらのモデルが、ヒトの筋ジストロフィーの兆候と似た兆候のみを伴う疾患を有することが判明した。同様の考察が、全ての遺伝子組換え動物モデル（トランスジェニック動物、ノックアウト動物、およびノックイン動物）の有用性の評価において適用される。さらなる詳細については、例えば、Ｎｏｍｕｒａ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４７：１１３−１１７（１９９７）を参照のこと。
【００６２】
ヒト疾患の機構の解明における有用性および制限が評価された動物が、ヒト疾患についての動物モデルとして規定される。ポリオウイルスレセプター遺伝子を有するトランスジェニックマウス（ＴｇＰＶＲマウス）を例にとると、ポリオウイルスの神経毒性に対するＴｇＰＶＲマウスの感受性が、ヒト疾患のポリオのポリオウイルス神経毒性と比較されて、それらが同じであるかを決定する。標的疾患（例えば、ポリオウイルス神経毒性／ポリオに対する感受性）の解明における有用性および制限が評価された動物が、その疾患の解明に有用なヒト疾患モデルとして規定される。
【００６３】
本発明の更なる詳細は、限定ではない以下の実施例によって説明する。実施例１は、超速コンジェニック法（ｓｕｐｅｒ  ｓｐｅｅｄ  ｃｏｎｇｅｎｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）の説明である。実施例２は、本発明の代替的微生物学的質制御法（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄ）（ＡＭＱＣＭ）を説明する。実施例３および４は、それぞれ、Ｔｇ−ｒａｓＨ２トランスジェニックマウスおよびＴｇＰＶＲ２１トランスジェニックマウスにおけるトランスジーンの安定性の決定を説明する。実施例５は、トランスジーン／マウスゲノム連結部位の分析に対しての本発明の新規なアプローチを記載する。実施例６は、広範な遺伝的多様性を達成するために、トランスジェニック動物の遺伝的バックグラウンドを拡大するための本発明のアプローチを説明する。実施例７〜９は、異なるトランスジェニック動物モデルの試験による、本発明の技術の検証として提供される。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）
（超速コンジェニック法）
超速コンジェニック法を図４に図示する。性的に成熟前の若年マウス（未熟マウス）は、外因性ゴナドトロピンに対して感受性であることが分かっている。従って、このような
未熟マウスでの過排卵は、ゴナドトロピンの注入によって誘発され得る。動物生産のために過排卵手順を使用することにより、天然の交配に基づく従来の手順に比較して、変異マウス（例えば、トランスジェニック（Ｔｇ）マウス）の遺伝的バックグラウンドを他の近交系系統の遺伝的バックグラウンドに変更するのに必要な期間が有意に短縮される。本研究では、未熟マウスにおいて、過排卵の誘発に適切な条件、およびインビトロ受精後の排卵した卵母細胞の発生能を調べた。
【００６５】
（材料および方法）
未熟Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雌性マウス（３〜４週齢）を過排卵手順に供し、同じ系統の成熟雄をインビトロ受精（ＩＶＦ）のための精子ドナーとして使用した。
【００６６】
２３日齢、２４日齢、２５日齢、２６日齢、および２７日齢の未熟雌性マウスに、１．２５ＩＵ、２．５ＩＵ、５ＩＵ、１０ＩＵ、または２０ＩＵの妊馬血清ゴナドロトロピン（ＰＭＳＧ）と５ＩＵヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とのそれぞれを、４８時間間隔をあけて注射して、過排卵を誘発させた。ｈＣＧの注入から１７〜２０時間後、排卵された卵母細胞の数を各群において評価した。２８日齢マウス由来のいくつかの卵母細胞をＩＶＦ手順に供し、二細胞期までインビトロで培養した。得られた二細胞期胚を、偽妊娠の１日目に成熟Ｊｃｌ：ＭＣＨ（ＩＣＲ）雌性マウスの卵管に移入し、胎児発生を評価した。
【００６７】
（結果および考察）
排卵が誘発されたマウスの割合および排卵された卵母細胞の数は、検査したマウスの齢に関係しなかった。１．２５〜１０ＩＵのＰＭＳＧを注入した場合、７５〜１００％のマウスが排卵を誘発された。排卵された卵母細胞の最大数は、各群（１マウス当たり平均５２．３〜７６．３個の卵母細胞）において５ＩＵ  ＰＭＳＧの注入によって得られた。１５ＩＵまたは２０ＩＵのＰＭＳＧの注入による排卵誘導効果は、他の投与量よりも少なかった。
【００６８】
排卵した卵母細胞の正常性を評価するために、２８日齢マウス由来の卵母細胞をＩＶＦ手順に供した。この結果は、９５％より多くの卵母細胞が受精し、二細胞期にまで発生することを示した。レシピエントマウスへの胚移入後、得られた胚の５０％より多くが、子孫を生じた。このことは、未熟マウス由来の卵母細胞が正常な発生能を有することを示唆する。
【００６９】
これらの結果は、正常な卵母細胞がＰＭＳＧおよびｈＣＧの注入により、約４週齢の未熟マウスから得られ得ることを示した。この場合、未熟マウス由来の卵母細胞の数は、成熟マウスの３〜４倍であり、この卵母細胞は、正常に胎児を発生する能力を有した。この手順を用いて、他の系統とのＴｇマウスの戻し交雑を開始し、新規なコンジェニックマウス系統を確立した。上述のように未熟マウスを用いて、戻し交雑を４８日毎に実施し得る。
【００７０】
（実施例２）
（代替的微生物学的質制御法（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄ）（ＡＭＱＣＭ））
（材料および方法）
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１０週齢）をウイルス感染のために使用した；ＪＣＬ：ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（１０〜１５週齢）をレシピエントとして使用した。ウイルス：センダイウイルス（ＨＶＪ  ＭＮ株）およびマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ  Ｎｕ−６７株）を使用した。血清学的検査：ＨＶＪについて、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびヘマグルチニン阻害（ＨＩ）試験を実施し、ＭＨＶについて、ＥＬ
ＩＳＡおよび補体結合（ＣＦ）試験を実施した。ウイルスをＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに、このマウスの鼻から感染させた（０日目、実験開始日）。排卵のために、ＰＭＳＧ（２日目）およびｈＣＧ（４日目）をウイルス感染Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに注入した。インビトロ受精（ＩＶＦ）のために、卵および精子を５日目に感染マウスから採集し、二細胞胚をＪＣＬ：ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウスの卵管に移入した。分娩（２５日目）後、仔動物を離乳（５３日目）まで養母によって哺乳させた。離乳マウスを８１日目まで飼育し、血清学的検査に供した。血清学的検査はまた、レシピエントマウスおよびウイルス感染ドナーマウスにおいても実施した。
【００７１】
（結果）
ＩＶＦおよび胚移入：全部で６０個の卵が５匹のＨＶＪ感染Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスから採集され（平均：１２．０卵／マウス）、そして４４個の卵（７３．３％）が二細胞卵にまで発生した。４０個の二細胞胚をレシピエントに移入され、そして２２匹の仔動物（５５．０％）が産まれ、最終的に２０匹のマウス（９０．９％）が離乳された。他方で、全部で１６３個の卵が５匹のＭＨＶ感染Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスから採集され（平均：１６．３卵／マウス）、そして１４５個の卵（８９．０％）が二細胞卵にまで発生した。８０個の二細胞胚がレシピエントに移入され、そして４５匹の仔動物（５６．３％）が産まれ、最終的に、３９匹のマウス（８６．７％）が離乳された。
【００７２】
ウイルス検出：ＨＶＪ感染ドナーマウス（１匹の雄および５匹の雌）をＥＬＩＳＡおよびＨＩ試験に供した。試験したサンプルの全てが、ＥＬＩＳＡの光学密度で測定過剰であり；ＣＦ試験では１：１６０価を上回る（範囲１：３２０〜１：１６０）ことが示された。ＭＨＶ感染ドナーマウス（１匹の雄および５匹の雌）をＥＬＩＳＡおよびＣＦ試験に供した。試験したサンプルの全てがＥＬＩＳＡの光学密度で測定過剰であり；ＣＦ試験では１：２０価を上回る（範囲１：１６０〜１：２０）ことが示された。これらの結果は、そのウイルスがまさにドナーマウスにおいて感染していたことを示す。一方、ＨＶＪ感染ドナー由来およびＭＨＶ感染ドナー由来のレシピエントマウス移入胚（各３）を血清学的検査に供した。さらに、ＨＶＪ感染ドナー精子および卵に由来ならびにＭＨＶ感染由来の仔動物（各５）を血清学的検査に供した。試験したレシピエントマウスおよび仔動物のいずれも、いずれの血清学的検査においても陽性試験結果を示さなかった。
【００７３】
（実施例３）
（短期発癌性試験のための動物モデルとしてのｒａｓＨ２マウスのトランスジーン安定性および特徴）
（材料および方法）
（動物）
１２番目のコドンまたは６１番目のコドンに単一点変異を有するヒト活性化ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の各正常部の連結により、トランスジーンを構築し、次いで、ｐＳＶ２−ｇｐｔプラスミドのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした（Ｓｅｋｉｙａ  Ｔ，ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８４；８１：４７７１−４７７５；Ｓｅｋｉｙａ  Ｔら、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８５；７６：８５１−８５５）。本研究において使用したトランスジェニックマウスの生産は以前に記載された通りである（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９０；５：１１９５−１２００）。トランスジェニックマウスの基礎コロニーを維持するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｉｃ−ＴｇＮ（ＲＡＳＨ２）（Ｔｇ−ｒａｓＨ２）マウスを、雄性ヘミ接合性ｒａｓＨ２トランスジェニックマウスを雌性近交系Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｉｃマウスに対して戻し交雑することにより得た。本研究では、Ｎ２０およびＴｇ−ｒａｓＨ２マウス（Ｎ１５）（低温保存胚から得た）と自然交配した５週齢の雄性Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウス、および１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｉｃ（非トランスジェニック）マウスを使用した。使用した全ての動物は、財団法人実験動物中央研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ）（日本）により確立された指針に従って取り扱った。
【００７４】
（ＤＮＡプローブ）
顕微注入ＤＮＡ（７．０ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメント）のアリコートをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（ｐＢＳＩＩ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）プラスミドのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。このプラスミドをＣｓＣＩ平衡遠心分離、次いでセファロースＣＬ６Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）上のゲル濾過によって精製した。ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を含む７．０ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントをＢａｍＨＩ消化によってプラスミドから切り出し、アガロースゲルから回収した。この７．０ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントを、ＤＩＧ  ＤＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造者の指示に従ってジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−１１−ｄＵＴＰで標識した（ＤＩＧ標識ランダムプライムプローブ）。このＤＩＧ標識した５’−プローブ（１，７９３〜２，４００位由来）を、鋳型ＤＮＡとして７．０−ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントを用いて、以下のプライマーを使用してＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）によって調製した：
（順方向：
【００７５】
【化１】
2010029219.tif 000002
（配列番号２））。
【００７６】
（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション分析）
トランスジーンの染色体位置を、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，前出；Ｅｖａｎｓ  ＥＰ，前出）を用いて決定した。Ｎ１５およびＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウスから得られたマイトジェン活性化脾細胞由来の２０の分裂中期を、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のビオチン−１６−ｄＵＴＰ−標識７．０ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントを用いて分析した。ビオチン標識ＤＮＡを  抗ビオチンヤギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびフルオレセインイソチオシアネート標識抗ヤギ免疫グロブリンＧ（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ  Ｂｅａｃｈ，ＣＡ）で可視化し、次いで、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で対比染色した。ＭＩＣＲＯＰＨＯＴＯ−ＦＸＡ（ＮＩＫＯＮ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察を行い、蛍光シグナルを有する染色体をＧ染色標準（Ｅｖａｎｓ  ＥＰ，前出）に従って同定した。
【００７７】
（サザンブロット分析）
ゲノムＤＮＡを、標準プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＷ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００１）に従って、プロテイナーゼＫとの終夜インキュベーションおよび続くフェノール：クロロホルムでの抽出およびエタノール沈降によって、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスおよび非トランスジェニックマウスの尾生検から調製した。ゲノムＤＮＡ（代表的には１０μｇ）を、ＤＮＡ１μｇ当たり３Ｕの制限酵素で３７℃
にて一晩消化し、−２０℃でエタノール沈降させた。沈降後、このゲノムＤＮＡサンプルを１０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再可溶化し、０．６％アガロースゲル上で一晩電気泳動した。このゲルを、７５ｍＭ  ＨＣｌ中で逐次脱プリンさせ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で変性させ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．５中で中和させた。ＤＮＡを、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中のキャピラリー転移によって、一晩、ゲルからナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．）に転写した。この膜を風乾し、紫外線架橋させた。２×標準生理食塩水クエン酸（ＳＳＣ；０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび３０ｍＭクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）中で短時間リンスした後、この膜を、ハイブリダイゼーションオーブンにおいてＣｈｕｒｃｈハイブリダイゼーション緩衝液（Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ，ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９８４；８１：１９９１−１９９５）中、４２℃で６時間、プレハイブリダイズさせた。プローブを、５分間沸騰させることにより変性し、新たなＣｈｕｒｃｈハイブリダイゼーション溶液中でブロットに加えた。このブロットを４２℃で一晩ハイブリダイズさせ、次いで、５０℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで２回、および６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで２回洗浄した。ハイブリダイズしたプローブを、ＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を製造者の指示に従って使用することにより検出した。化学発光シグナルの検出のために、このブロットを、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ  Ｘ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）に露光した。
【００７８】
（ノーザンブロット分析）
全細胞ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）．を用いて抽出した。このＲＮＡ溶液を、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコルに従って用いて処理した。ＲＮＡ（１０μｇ）を１％アガロース／６％ホルムアルデヒドゲル上で分画し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜上に転写した。以前に記載（Ｍａｒｕｙａｍａら、Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ２００１；８：２３３−２３７）のように、ブロットを風乾し、紫外線架橋させ、ハイブリダイズさせた。ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子およびマウスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡ（７．０ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメント）を、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｄ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）によって［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ  で標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。膜をＫｏｄａｋ  ＡＲフィルムに露呈させた。
【００７９】
（ゲノム／トランスジーン連結領域のクローニング）
ゲノム／トランスジーン連結部のクローニングのために、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，ら、前出）によって、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウス由来のゲノムＤＮＡ１００μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで完全消化し、次いでフェノール：クロロホルムで抽出し、沈降させた。二重消化ＤＮＡの６〜９ｋｂフラグメントを、スクロース濃度勾配上での超遠心分離によって分画し、ｐＢＳＩＩプラスミドの同じ部位に連結した。製造者の指示に従って、組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｉｎｃ．Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用い、鋳型としてベクター連結ゲノムＤＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。ＰＣＲプライマー、
【００８０】
【化２】
2010029219.tif 000003
（配列番号４））を５’ゲノム／トランスジーン連結部の増幅のために使用し；ｐＢＳＩＩ−ｒｅｖおよびＤ（
【００８１】
【化３】
2010029219.tif 000004
（配列番号５））を３’トランスジーン／ゲノム連結部の増幅のために使用した。反応混合物を９４℃で２分間加熱し、次いで３５サイクル（９４℃で３０秒、６６℃で３０秒、および７２℃で３分）増幅させ、その後この混合物を、ＡＢＩ  ＰＣＲ２４００（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において７２℃で５分間保持した。ＨｉｎｄＩＩＩ隣接領域のヌクレオチド配列を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって決定した。ゲノム／トランスジーン連結部を単離するために、２つの新規なプライマー、
【００８２】
【化４】
2010029219.tif 000005
（配列番号７））を、ＰＣＲクローニング法により決定した配列に基づいて設計した。鋳型としてＴｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノムＤＮＡと、プライマーＣ＋Ａ（５’ゲノム／トランスジーン連結部のため）、およびプライマーＤ＋Ｂ（３’トランスジーン／ゲノム連結部のため）とを用いて、ＰＣＲ増幅を実施した。トランスジーン／トランスジーン連結部のクローニングのために、ＰＣＲ増幅をＴｇ−ｒａｓＨ２マウスＤＮＡとプライマーＤおよびプライマーＣとを用いて実施した。トランスジーン挿入によって生じた組み込みプロセスおよび考えられる位置効果を明確にするために、プレ組み込み部位をプライマーＡおよびプライマーＢを用いて、非トランスジェニックマウスＤＮＡ．およびＴｇ−ｒａｓＨ２マウスＤＮＡから増幅させた。ＰＣＲ条件は上述と同じであった。
【００８３】
（組み込まれたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の配列）
組み込まれたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子全体の範囲に及んだ５つの重複ＰＣＲ産物を、プライマーＤ（上記参照）＋Ｅ
【００８４】
【化５】
2010029219.tif 000006
および
【００８５】
【化６】
2010029219.tif 000007
（配列番号１３））を用いるＰＣＲによってＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２から得た。
【００８６】
ＰＣＲ産物をＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ，ＣＡ）を用いて精製し、次いでヌクレオチド配列をプライマーウォーキング法によって決定した。
【００８７】
（結果）
（Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるトランスジーン安定性の検査）
トランスジェニックマウス系ｒａｓＨ２は、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を含む７．０ｋｂの構築物（ＢａｍＨＩフラグメント）（図８Ａに示される）を顕微注入することにより、Ｓａｉｔｏｈら、１９９０によって確立された。この創始マウスは、元来、雑種（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ／２Ｊ）系統として作出され、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｉｃに戻し交雑されて、遺伝的に均質な集団が作製された。その後、戻し交雑がＮ２０を超えて進行し、３０，０００匹を超えるトランスジェニックマウスが生産された。多くの世代にわたる大規模繁殖の間に、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノムにおける組み込まれたトランスジーンの遺伝的安定性が調べられている。Ｔｇ−ｒａｓＨ２  マウスにおける組み込まれたトランスジーンの染色体局在をＦＩＳＨ法によってＮ１５およびＮ２０で決定した。両方の場合とも、このトランスジーン位置を表す対合した蛍光シグナルは、染色体１５Ｅ３領域上で観察された（図７）。Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスはヘミ接合体であり、そのため、このハイブリダイゼーションシグナルは、一対の姉妹染色分体でのみ検出された。
【００８８】
サザンブロット分析を実施し、組み込まれたトランスジーン遺伝子座の周囲の制限フラグメントマップを作成した。これは、トランスジーン構造について重要な情報を提供した。ＢａｍＨＩでのＴｇ−ｒａｓＨ２マウスＤＮＡの消化は、ＤＩＧ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズした３つのバンド（７．０ｋｂおよび２つの高分子量バンド）を生じた（図８Ｂ）。Ｎ１５（図８Ｂ、レーン２およびレーン３）およびＮ２０（図８Ｂ、レーン４およびレーン５）のＴｇ−ｒａｓＨ２マウスの間ではハイブリダイズバンドパターンの差異は観察されなかった。ＢａｍＨＩでの非トランスジェニックマウスＤＮＡの消化は、同じプローブといかなるハイブリダイズバンドも生じなかった（図８Ｂ、レーン１）。ＢａｍＨＩ消化Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスＤＮＡに対するＤＩＧ標識５’プローブ（図８Ｃ、レーン１）またはＤＩＧ標識３’プローブ（６，０２４〜６，７１２位；データは示さず）とのハイブリダイゼーションもまた、ＤＩＧ標識ランダムプライムプローブを用いることにより得られる同じハイブリダイズバンドパターンを示した。本発明者らは、ノーザンブロット分析によってトランスジーンの発現を確認した。ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の発現は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスの脳（Ｂ）において観察されたが、非トランスジェニックマウスでは観察されなかった。脳に加えて、肺（Ｌ）および噴門洞（Ｆ）が、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスの各世代（Ｎ１５およびＮ２０）においてトランスジーンを発現した（図９）。逆転写ＰＣＲ（ＰＴ−ＰＣＲ）直接配列決定分析は、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子におけるコドン１２および６１に優先的に生じた点変異が、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスのいずれの世代においても見られなかったことを明らかにした。コード領域においては、変異ホットスポットにおける以外には何のヌクレオチド変化も見られなかった（データは示さず）。
【００８９】
（Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるトランスジーンの向きおよびコピー数の決定）
組み込まれたトランスジーンの構造を明確化するために、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノムＤＮＡを、いくつかの制限酵素（ＨｐａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＮｃｏＩ、ＮｇｌＩＩ）で消化してトランスジーン中の公知の単一部位で切断させ、これをサザンブロット分析に供した。組み込まれたトランスジーンがヘッド−ｙ−テイル配置で縦列に存在する場合、これらの制限酵素は７ｋｂフラグメントを生じる。直接反復トランスジーンコピーのＸｂａＩ消化は７ｋｂフラグメントを生じるが、逆方向反復は９．１ｋｂ（テイル−テイル）または４．９ｋｂ（ヘッド−ヘッド）のフラグメントを生じる。実際に、ＸｂａＩでのＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウス由来ゲノムＤＮＡの消化は、ＤＩＧ標識５’プローブとハイブリダイズした７ｋｂのバンドを生じた（図８Ｃ、レーン４）。トランスジーン中の公知の単一部位で切断する他の全ての制限酵素もまた、ＤＩＧ標識５’プローブとハイブリダイズした７ｋｂバンドを生じた（図８Ｃ、レーン２、レーン３、レーン５、およびレーン６）。これらの結果は、組み込まれたトランスジーンのいくつかのコピーがヘッド−テイル配置で縦列に存在することを示唆した。同じハイブリダイズバンドパターンはまた、Ｎ１５のＴｇ−ｒａｓＨ２マウスにおいても観察された（データは示さず）。
【００９０】
組み込まれたトランスジーンのコピー数を決定するために、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで完全消化し、次いでそのアリコートを種々の濃度のＢａｍＨＩ制限酵素で部分消化した。この消化されたＤＮＡを０．４％アガロースゲル上で電気泳動し、高分子量ＤＮＡサンプルを明白に分離した。ＤＩＧ標識ランダムプライムプローブを用いたサザンブロット分析を図１０に示す。ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで完全消化したとき、２２．２ｋｂのバンドのみがＤＩＧ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズされた（図１０、レーン２）。この２２．２ｋｂフラグメントは、７．０ｋｂのトランスジーンの最大３コピーを含み得る。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ二重消化は、ＤＩＧ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズした８ｋｂのフラグメントおよび複数の７ｋｂのフラグメントを生じた（図１０、レーン５）。２２．２ｋｂ、８ｋｂ、および７ｋｂのバンドに加えて、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩでさらに部分消化したとき１４．２ｋｂおよび１５ｋｂのバンドがＤＩＧ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズした（図１０、レーン３）。これらの結果は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスがそのゲノム中にトランスジーンを３コピー含むことを実証した。
【００９１】
（ゲノム／トランスジーン連結部およびそれらの対応するプレ組み込み部位のクローニングおよび配列決定）
サザンブロット分析から得られた結果は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ二重消化によるＴｇ−ｒａｓＨ２ゲノムＤＮＡに由来する７ｋｂおよび８ｋｂのフラグメントがゲノム／トランスジーン連結領域および／またはトランスジーン／ゲノム連結領域を含むことを示唆した。Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノム中のゲノム／トランスジーン連結部の精密な構造を研究するために、６〜９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ二重消化フラグメント（これは、スクロース濃度勾配上の超遠心分離によって分画した）を、ｐＢＳＩＩプラスミドの同じ部位に連結した。２つのＰＣＲプライマー間に位置する配列を、適切なプライマー（ｐＢＳＩＩ−ｒｅｖおよびＣ（５’ゲノム／トランスジーン連結部のため）、ｐＢＳＩＩ−ｒｅｖおよびＤ（３’トランスジーン／ゲノム連結部のため））を用いてＰＣＲ（第１ＰＣＲ）によって増幅し、そしてＰＣＲ直接配列決定によって分析した（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＡＢ０７２３３４）。増幅されたＤＮＡフラグメントがＰＣＲクローニング手順の人工産物である可能性を取り除くために、ゲノム／トランスジーン連結部の各側を、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノムＤＮＡから、第２ＰＣＲによって以下のプライマーセットを用いて再クローニングした（Ｃ＋ＡおよびＤ＋Ｂ、図１１Ｃ）。プライマーセットＣ＋ＡおよびＤ＋Ｂを用いて増幅された各々のＰＣＲ産物はＴｇ−ｒａｓＨ２マウスにおいてのみ観察され、それぞれ、８６７ｂｐ（図１１Ａ、レーン１）および８０４ｂｐ（図１０Ａ、レーン３）の推定サイズであった。第２ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列は、第１ＰＣＲ産物でのヌクレオチド配列と一致した。これらの結果は、Ｐ
ＣＲクローニングによって得られたゲノム／トランスジーン連結部配列が実際にＴｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノム中に存在することを示唆した。
【００９２】
ＰＣＲアプローチを用いて、非トランスジェニックマウスＤＮＡおよびＴｇ−ｒａｓＨ２マウスＤＮＡからのプレ組み込み部位の増幅および続くクローニングを行った。プレ組み込み部位をプライマーＡおよびＢを用いて増幅すると、独特の配列がトランスジーンの挿入部位に隣接した。プライマーセットＡ＋Ｂは、２．２ｋｂのＰＣＲ産物を非トランスジェニックマウスだけでなくＴｇ−ｒａｓＨ２マウスにおいても生じた（図１１Ａ、レーン５およびレーン６）。さらに、この２．２ｋｂのＰＣＲ産物はまた、ＤＢＡ／２ＪマウスＤＮＡからも得られた（データは示さず）。この実験において、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｉｃマウスを非トランスジェニックコントロールとして使用し、プレ組み込み部位の決定を行った。しかし、オリジナルｒａｓＨ２マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ／２Ｊ雑種系統において生成されたので、本発明者らは、顕微注入したヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子がＤＢＡ／２Ｊ対立遺伝子に組み込まれたという可能性を排除できない。Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスはヘミ接合体であり、１つの野生型対立遺伝子を有する。２．２ｋｂフラグメントがマウスゲノムＤＮＡ配列を含むことが判明したが、この配列は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノム中では欠失していたかもしれない配列である。本発明者らは、ＰＣＲ直接配列決定によってこの２．２ｋｂフラグメントのヌクレオチド配列を決定し（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０７２３３５）、これをトランスジーン／ゲノム連結部の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０７２３３４）および顕微注入したＤＮＡの配列と比較した。ＤＮＡ配列決定分析は、顕微注入したヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子がマウス宿主ゲノム中に組み込まれた場合に１，８２０ｂｐの配列が欠失していることを示した。
【００９３】
図１２は、５’ゲノム／トランスジーン連結部（５’Ｊ）および３’トランスジーン／ゲノム連結部（３’Ｊ）の配列を、宿主ゲノム配列および注入したＤＮＡ配列と比較する。これら両連結部に共通した顕著な特徴は、親配列間の短い相同性の存在であった。５’Ｊの全長を見ると、注入された配列の５’末端に１４８ｂｐ欠失があり、親配列間で４ｂｐの相同性（ＣＣＡＧ）が最終組み込み体の５’末端に存在した。３’Ｊの全長を見ると、トランスジーン組み込み体の３’末端で配列間に１０ｂｐ（ＴＣＣＴｇＣＴＧＣＣ；小文字はミスマッチ位置を示す）が相同であったストレッチ内で９０％の相同性があり、このトランスジーン組み込み体は、この３’末端および親配列では２４ｂｐの欠失を有した。本発明者らの結果は、この短い相同性の対合部分が染色体組み込み事象に寄与したという仮定を支持する。哺乳動物トポイソメラーゼＩの切断部位のコンセンサス配列が、宿主ゲノムの５’Ｊおよび３’Ｊの付近で見出された。この配列はまた、５’Ｊ部位および３’Ｊ部位近辺で、注入されたＤＮＡ中で見られた。
【００９４】
（Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウス中のトランスジェニック構築物および組み込まれたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の配列分析）
コンカテマー内のトランスジーン／トランスジーン連結部を、ＰＣＲ制限フラグメント長多型およびＰＣＲ直接配列決定によって分析した。プライマーＤおよびプライマーＣを用いて増幅されたＰＣＲ産物は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスのみで見られ、これは１．４ｋｂの推定サイズであった（図１１Ａ、レーン７、および図１１Ｂ、レーン１）。増幅された１．４ｋｂのフラグメントは、ＢａｍＨＩ消化によって２つの０．７ｋｂフラグメントに分割された（図１１Ｂ、レーン２）。ＰＣＲ直接配列決定がまた、トランスジーン／トランスジーン連結部がＴｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノム中のＢａｍＨＩ認識配列を保存すること、およびこれらの連結部で配列欠失や再配置がなかったことを示した。
【００９５】
（Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウス中のトランスジーン構築物および組み込まれたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の配列分析）
この７．０ｋｂ構築物を、ヒトメラノーマおよび膀胱癌細胞系由来のｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の各正常部と連結させることにより調製した（Ｓｅｋｉｙａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ
８１：４７７１−４７７５（１９８４）；Ｓｅｋｉｙａら、Ｊｐｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７６：８５１−８５５（１９８５））。これらの細胞系中のｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のヌクレオチド配列は公共のデータベース上に登録されている（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．Ｍ３０５３９およびＶ００５７４）。この構築物の７．０ｋｂはキメラ人工ｒａｓ遺伝子であったので、本発明者らには、顕微注入のために使用したこの構築物の正確なヌクレオチド配列が分からなかった。従って、本発明者らは、顕微注入ＤＮＡのアリコートのヌクレオチド配列を再確認した。本発明者らは、キメラヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子（＝ＢａｍＨＩフラグメントの７．０ｋｂ、６，９９２ｂｐ）のヌクレオチド配列を決定した。このキメラヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子をメラノーマおよび膀胱癌細胞系由来のヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子配列と比較したとき、この遺伝子にはいくつかの些細な差異が見られた。しかし、本発明者らは、各エキソンにおいていかなる変化も検出し得なかった。本発明者らはまた、組み込まれたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。組み込まれたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓトランスジーン全体に及ぶ５つの重複ＰＣＲ産物を、適切なプライマーを用いたＰＣＲによって得（材料および方法を参照のこと）、これらをＰＣＲ直接配列決定によって分析した（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０７２３３４）。本発明者らは、Ｎ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウス由来のヌクレオチド配列と、顕微注入したＤＮＡのヌクレオチド配列との間に、縦列に並んだトランスジーンの両末端の小さな欠失を除いていかなる差異も検出し得なかった。
【００９６】
（考察）
オリジナルｒａｓＨ２マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ／２Ｊの雑種）は、遺伝的に均質な集団を作出するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｉｃ系統に対して戻し交雑された。現時点では、この戻し交雑はＮ２０を超えて進行している。このトランスジェニック系の遺伝的バックグラウンドはＣ５７ＢＬ／６ＪＪｉｃバックグラウンドでほぼ置換されたようである（約９９．９９９８％，（Ｓｉｌｖｅｒ  ＬＭ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｉｃｅ．Ｓｉｌｖｅｒ  ＬＭ  編，Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ；１９９５，ｐ．４６−４８）。発癌性試験において使用される動物の遺伝的バックグラウンドを考慮することが重要である。なぜなら、偶発的な腫瘍の発生率および化学的に誘発された腫瘍の発生率はマウス系統間で異なるからである。短期発癌性試験のために、本発明者らは、雌性ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスと雄性Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスとの交配によって得られたＦ１雑種ｒａｓＨ２トランスジェニックマウス（ＣＢ６Ｆｌ−Ｔｇ−ｒａｓＨ２）の使用を推奨している。この独特の育種システムは、２つの利点を有する：１つは、化合物に対する広範な種々の反応を達成できること、そしてもう一方は、検査コントロールとして同胞非トランスジェニック（ＣＢ６Ｆｌ−ＮｏｎＴｇ）マウスを使用できることである。
【００９７】
本研究において、本発明者らは、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおいて、組み込まれたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子が世代を超えて安定に伝達されることを示した。培養細胞または受精マウス卵に顕微注入されたＤＮＡ分子は、通常、宿主ゲノム中の単一の部位で組み込まれ、そしてこれらのトランスジーンが多重コピーで存在する場合、それらは主としてヘッド−テイル縦列並びで、またかなり稀な場合であるが、ヘッド−ヘッドまたはテイル−テイルの向きに並べられる（Ｆｉｌｇｅｒら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：１３７２−１３８７（１９８２）；ＧｏｒｄｏｎおよびＲｕｄｄｌｅ，Ｇｅｎｅ  ３３：１２１−１３６（１９８５）；ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ２０：４６５−４９９（１９８６））。Ｔｇ．ＡＣ  トランスジェニックマウスは、陽性コントロール化合物１２−０−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート
に対して応答しない集団を有することが知られ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ２６：５４８−５５５（１９９８）；Ｗｅａｖｅｒら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｈｔｈｏｌ  ２６：５３２−５４０（１９９８）；Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ２６：５４１−５４７（１９９８））、この非応答者は、逆方向反復のヘッド−ヘッド連結部の尖端部近辺に遺伝子欠失を示した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  前出；Ｈｏｎｃｈｅｌら、Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  ３０：９９−１１０（２００１））。いくつかの研究は、トランスジーンにおいてパリンドローム構造を有するこの逆方向反復配列がこの遺伝子の不安定性を生じることを示した（Ａｋｇｕｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７：５５５９−５５７０（１９９７）；Ｃｏｌｌｉｃｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：１１６３−１１７１（１９９６）；Ｆｏｒｄ
ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄ，Ｃｅｌｌ  ４５：４２５−４３０（１９８６））。運良く、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノム中の縦列に並んだヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓトランスジーン中にはパリンドローム構造は存在しなかったが、本発明者らには、多数の世代にわたる大規模繁殖の間にトランスジーン再配置が生じたか否かは分からない。Ａｉｇｎｅｒらは、育種プログラムは、チロシナーゼ遺伝子トランスジェニックマウスのいくつかの系を観察することにより、確立されたホモ接合性トランスジェニック系においては厳密な分子分析をさらに行うことなく多数の世代まで続けられ得ると提唱した（Ａｉｇｎｅｒら、前出）。しかし、彼らは、彼らの実験において非常に少ない個体ではあるがトランスジーンコピー欠失によって影響を受けることに言及した。本発明者らは、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおいて組み込まれたトランスジーンが数世代にわたって、かつ大規模繁殖の間に安定に伝達されたことを本研究において決定した（図７および図８）。４５０匹のＴｇ−ｒａｓＨ２マウスのサザンブロット分析において、本発明者らは、個々のＤＮＡサンプル間でいかなる差異も見出さなかった（データは公開せず）。しかし、本発明者らは、発癌性試験のために使用されるＴｇ−ｒａｓＨ２マウスにおいて、定期的に遺伝子型および表現型のチェックが必要であると考える。なぜなら、基礎コロニーにおける非応答者変異体による汚染の可能性が発癌性試験結果の信頼性に影響を及ぼすからである。従って、本発明者らは、各世代での親Ｔｇ−ｒａｓＨ２（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｉｃ−ＴｇＮ（ＲＡＳＨ２））マウスの完全性を、発現されたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の詳細な分子遺伝学分析（サザンブロットおよびノーザンブロットならびにＰＣＲ直接配列決定を含む）によって確認すべきである（Ｎ２３での最新の結果は明白な変化がない、データは公開せず）。さらに、実際の試験モデルＣＢ６Ｆｌ−Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスは、標準的な陽性コントロール化合物としてＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素を用いる発癌性試験に供されるべきである。
【００９８】
サザンブロット分析の結果は、組み込まれたトランスジーンのコピー数を示した。一般に、組み込まれたトランスジーンの正確なコピー数を決定することは困難である。なぜなら、顕微注入されたＤＮＡは、繰り返されて一部位当たり約１〜数百コピーの縦列のまたは逆方向の並びを形成するからである。Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおいて、顕微注入されたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子は、その配列中にいかなるＨｉｎｄＩＩＩ認識部位も有さなかった。従って、このトランスジーン組み込み遺伝子座は、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によってＴｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノムの外側で切断され、サザンブロット分析によって、１つの２２．２ｋｂバンドとして検出された。インタクトな７ｋｂのヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子がＴｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノム中に組み込まれた場合、この組み込まれたトランスジーンは３コピーを超えない。さらに、ＢａｍＨＩ消化は、７ｋｂのヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の全体に及ぶランダムプライムプローブとハイブリダイズした３つのバンドを生じた。このことは、この組み込まれたトランスジーンが、最少で３コピーを有したことを示唆する。しかし、遺伝子が環状形態で存在した場合、同様のバンド形成パターンが、この遺伝子の２コピーの組み込みによっても起こり得る。その場合、ＢａｍＨＩ消化は、ハイブリダイゼーションをヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の７ｋｂの１，７９３〜２，４００位に及ぶ５’−プローブ（図８Ｃ、レーン１）または６，０２４〜６，７１２位に及ぶ３’−プローブ（データは公開せず）を用いて実施した場合に、２つのハイブリダイズした
バンドを生じる。これらの領域特異的プローブの両方ともがハイブリダイズし、ランダムプライムプローブと同様の３つのバンドを生じた。これらの結果は、組み込まれたトランスジーンが３コピーを有することを示唆した。両末端でのゲノム／トランスジーン連結部の配列の存在（図１２）がまた、環状形態の組み込みの可能性を否定する。
【００９９】
顕微注入されたＤＮＡがマウスゲノム中に組み込まれた場合にトランスジーンコピーが何らかの欠失または再配置を示したかどうかが分からないので、本発明者らは、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスＤＮＡからゲノム／トランスジーン連結部およびトランスジーン／ゲノム連結部を、そして非トランスジェニックマウスからそれらの対応するプレ組み込み部位をクローニングした。顕微注入されたＤＮＡの末端配列は、トランスジェニックマウスにおいて比較的保存されており、最大でも数ヌクレオチドの欠失または挿入によって改変されることが報告されている（Ｐａｗｌｉｋら、Ｇｅｎｅ  １６５：１７３−１８１（１９９５）；Ｈａｍａｄａら、Ｇｅｎｅ  １２８：１９７８−２０２（１９９３）；ＭｃＦａｒｌａｎｅおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ５：１７１−１７７（１９９６））。サザンブロット分析の結果から、本発明者らは、縦列に並んだトランスジーンコピーの両方の（５’および３’）末端がＴｇ−ｒａｓＨ２マウスゲノムにおいていくらかの欠失を有しているのではないかと推測した。縦列に並んだトランスジーンがインタクトに組み込まれた場合、この組み込まれたトランスジーンコピーは、それらの連結部にＢａｍＨＩを保存し、ＢａｍＨＩ消化によって７．０ｋｂのモノマーフラグメントのみを生じる。トランスジーン／ゲノム連結部の配列および顕微注入されたＤＮＡの配列の比較は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスがトランスジーン組み込みの際に５’末端に１４８ｂｐ欠失および３’末端に２４ｂｐ欠失を有することを示した（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０７２３３４）。両末端で見られるこれらの欠失は、トランスジーンコンカテマーが組み込みまで環状形態ではなく直鎖状形態で存在し、この直鎖状コンカテマーの遊離末端が組換えに好ましい部位であることを示唆した。トランスジーンのヌクレオチド配列分析は、組み込み連結部で親配列間に短い相同性（５’末端の４ｂｐおよび３’末端の１０ｂｐ中９ｂｐ）が存在することを示した。組み込み連結部での宿主ゲノムとトランスジーンとの間のこれらの短い相同性は、トランスフェクトされた線維芽細胞およびトランスジェニックマウス系において観察されている（Ｈａｍａｄａら、Ｇｅｎｅ  １２８：１９７−２０２（１９９３）；ＭｃＦａｒｌｎ＼ａｎａ  およびＷｉｌｓｏｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ５：１７１−１７７（１９９６））。さらに、ＤＮＡトポイソメラーゼＩは、顕微注入されたＤＮＡの組み込みにおいて重要な役割を果たすようである。哺乳動物トポイソメラーゼＩについての切断部位のコンセンサス配列（ＢｅｅｎおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：３０９７−３１１４（１９８４））は、いくつかのトランスジェニック系統（Ｈａｍａｄａら、前出、ＭｃＦａｒｌａｎｅおよびＷｉｌｓｏｎら、前出）およびＴｇ−ｒａｓＨ２マウス（図１２）において、組み込まれたトランスジーン部位の付近で見出された。
【０１００】
それは、トランスジーン挿入の際に生じる宿主ゲノムの欠失または再配置の場合に依存する。Ｔｇ−ｒａｓＨ２の宿主ゲノムでは、顕微注入されたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子がマウス宿主ゲノム中に組み込まれた場合、ヌクレオチド欠失（１，８２０ｂｐ）が生じた。Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおいて欠失したヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０７２３３５）を、ＢＬＡＳＴ２プログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋデータベース由来の配列と比較し、あり得る相同性を同定した。この欠失配列は、データベース上の公知の機能的遺伝子といかなる相同性も有さなかった。しかしながら、この欠失領域は、ＲＰＬ７（６０Ｓ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７，ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ０３１５８９）偽遺伝子を含む染色体２２において、クローンＲＰ６−１１Ｏ７由来のヒトＤＮＡ配列に対して相同な配列を有することが見出された。この３１２ｂｐの欠失領域配列（６９８〜１，００９位）は、ヒトＤＮＡクローンＲＰ６−１１Ｏ７（９，０２３〜９，３３４位）と８８％の相同性を示し
たが、ＲＰＬ７のコード領域内では配列相同性は見られなかった。この欠失配列が種々のフレームおよび向きで対応するアミノ酸配列に翻訳されたとき、アミノ酸レベルでの配列相同性はみられなかった。本発明者らが決定した欠失配列がイントロンまたはプロモーター領域中に位置するという可能性も残っているが、宿主マウスゲノム配列中へのヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の挿入は、挿入変異を引き起こさない。Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおいては、基礎遺伝子発現は、トランスジーン挿入によって影響を受けなかった。この結論は、発現プロファイリングアプローチからの予備の証拠によって支持される。本発明者らは、９，５１４の単遺伝子（ｕｎｉｇｅｎｅｓ）の基礎遺伝子発現と比較して、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウス肝と非トランスジェニックマウス肝との間に目立った差異を見出すことはできなかった（データは公開せず）。
【０１０１】
Ｔｇ−ｒａｓＨ２トランスジェニックマウスは、遺伝的に相同な集団であり、分子生物学的分析（トランスジーン構造および宿主ゲノム配列の変化を含む）によって精緻化されているが、これは、短期発癌性試験のために有用なげっ歯類モデルである。
【０１０２】
（実施例４）
（神経毒性試験（ＮＶＴ）のための動物モデルとしてのＴｇＰＶＲ２１マウスのトランスジーン安定性）
ヒトポリオウイルスレセプター（ＰＶＲ）遺伝子を有するトランスジェニックマウスは、Ｎｏｍｏｔｏ（ＰＮＡＳ，８８：９５１−９５５，１９９１）によって作出された。このマウスは、財団法人実験動物中央研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ）（日本）でのサル神経毒性試験（ＭＮＶＴ）に対する代替法として、神経毒性試験（ＮＶＴ）のための動物モデルとして開発された。トランスジーンの安定性は、ＮＶＴのための動物モデルとしてのＴｇＰＶＲ２１トランスジェニックマウスの質の再現を保証するために必須の要因の１つである。ＴｇＰＶＲ２１マウスにおけるトランスジーンの安定性を調べるために、トランスジーンの分子構造をＩＱＩ系統に対するコンジェニックプロセスで異なる世代において分析した。
【０１０３】
（材料および方法）
ＴｇＰＶＲ２１マウスにおけるトランスジーンの構造を、ＩＱＩ系統に対する戻し交雑数Ｎ３、Ｎ１５、およびＮ２０で分析した（表Ａ）。以下に記載のように、標準的な手順に従って、ＦＩＳＨ、サザンブロットおよびノーザンブロット、およびＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した（表Ａ）。トランスジーンのコード領域のヌクレオチド配列もまた決定した。
【０１０４】
（結果）
（ＦＩＳＨ（図１６））
ＦＩＳＨ分析を、プローブとしてビオチン標識ＨＣ５クローンを用いて実施し、そしてアビジン−ＦＩＴＣ法によって可視化した。図１６に示されるように、それぞれ、Ｎ１５のトランスジェニックホモ接合体の第１３染色体（１３Ｂ３位）において２つのツインスポットが、そしてＮ２０のヘミ接合体では１つのツインスポットが見られた。この分析において観察されたトランスジーンの染色体位置は、以前の結果（Ｎｏｍｏｔｏ，１９９１、前出）と一致した。
【０１０５】
（サザンブロット分析（図１７））。
【０１０６】
Ｎ１５のトランスジェニックホモ接合体およびＮ２０マウスのヘミ接合体から得られた１０μｇのＤＮＡをＢａｍＨｌで消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。ＤＮＡを膜上に転写した。この膜を図１７に示すプローブ（ＰＶＲ−αのコード領域）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたバンドは、マウスおよびコントロールのＨＣ５クローンの両方において１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、および１０ｋｂの大きさで見られた。これらの
所見は、以前の結果と一致した。このことは、再配置が起こらなかったこと、およびトランスジーンが、ＴｇＰＶＲ２１系統においてコンジェニックプロセスで安定であったことを示唆する。
【０１０７】
（遺伝子発現分析）
ノーザンブロット、ＰＴ−ＰＣＲ、および直接配列決定を、ＴｇＰＶＲ２１系統の遺伝子発現プロフィールを調べるために実施した（図１８）。組み込まれたトランスジーン遺伝子の構造、および遺伝子スプライシングによって生成された３つのｍＲＮＡ産物、ノーザン分析のためのプローブ、プライマー、および配列決定の一部を図１９に示す。全細胞ＲＮＡをゲル中に流し、膜上に転写した。この膜を、図１７に示すプローブ（ＰＶＲ−α
ｍＲＮＡのｃＤＮＡ）とハイブリダイズさせた。ＴｇＰＶＲ２１系統のＮ１５およびＮ２０の両方で、１つの３．３ｋバンドが検出された。ここで得られたデータは、以前の結果（Ｎｏｍｏｔｏ，１９９１、前出）と一致した。ＴｇＰＶＲ２１マウスのＮ３、Ｎ１５、およびＮ２０の脳、腎臓、および腸から得られたＲＮＡをＰＴ−ＰＣＲ分析に供した。選択的スプライシングによる組み込まれたＰＶＲ遺伝子に由来する３タイプのＲＮＡ産物（ＰＶＲ−α、ＰＶＲ−β、およびＰＶＲ−γ）が期待サイズ（１４９ｂｐ、１７３ｂｐ、および３０８ｂｐ）として検出された。Ｎ１５マウス脳のＲＮＡから得られたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ直接配列法を実施した。この結果は、組み込まれたトランスジーンが、ＰＶＲ遺伝子のコード領域（１，２５４ｂｐ、開始コドンのＡＴＧから終止コドンのＴＧＡまで）に完全にマッチしたＲＮＡを生じることを確認した。
【０１０８】
（実施例５）
（トランスジーン／マウスゲノム連結部位の分析）
本発明の生産方法に従えば、トランスジーンは、世代間で安定に伝達され得ることが確認された。この事実により、マウスを遺伝子型決定するための新規な方法を開発することができる。新規なトランスジェニックマウス系統（ＴｇＰＶＲ２１マウス−上記実施例４を参照のこと、およびｒａｓＨ２マウス上記実施例３）におけるトランスジーン／マウスゲノム連結領域を含むトランスジーンの組み込み部位をクローニングおよび分析し、これらの系統を用いて新規な遺伝子型決定法の説明を行った。新規な遺伝子型決定法の一般の構想を図６に示す。この図において、濃い方の色の矢印は、野生型を検出するように設計されたＰＣＲプライマーを示し、薄い矢印は、マウスのトランスジェニックタイプを検出するように設計されたＰＣＲプライマーを示す。この方法に従うことにより、種々の遺伝子型（例えば、野生型ホモ接合体、ヘミ接合体（またはへテロ接合体）、およびトランスジェニックホモ接合体）が、容易かつ明確に区別され得る。ＤＮＡは、ＴｇＰＶＲ２１  マウスのトランスジェニックホモ接合体から得た。
【０１０９】
（サザンブロット分析）
サザンブロット分析を、トランスジーン／マウスゲノム連結部位の５’領域についての制限酵素マップを得るために実施した。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩ、およびＸｂａＩをＤＮＡ消化のために使用した。トランスジーンのベクター部分の７００ｂｐセグメントを、サザンブロット分析のためのプローブとして使用した（図２０）。
【０１１０】
サザンブロット分析の結果を図２１Ａに示す。各バンドの大きさを計算し、そしてこれを図２１Ｂに示す。制限酵素マップをバンドの大きさの情報によって得、そしてこれを図２１Ｃに示す。このマップは、以下の価値のある情報を提供する。第一に、トランスジーン／マウスゲノム連結点に関して非対称のパターンであることは、トランスジーンがヘッド−ヘッド配置を有しないことを示唆する。第二に、各制限酵素消化工程において１つのバンドのみが得られたという事実は、トランスジーンの１つのコピーがＴｇＰＶＲ２１トランスジェニックマウスにおいてマウスゲノム中に組み込まれていることを示唆する。
【０１１１】
（トランスジーン／マウスゲノム連結部の５’領域のクローニングおよび配列決定）
ＴｇＰＶＲ２１のトランスジェニックホモ接合体由来のゲノムＤＮＡを、ＢｇｌＩＩで完全消化した。２．９ｋｂフラグメントを含むＤＮＡを  スクロース濃度勾配上での超遠心分離によって分画し、自己連結に供した（図２２Ａ）。５’ゲノム／トランスジーン連結部の増幅のために、連結されたＤＮＡを用いて、逆ＰＣＲを実施した（図２２Ｂ）。このＰＣＲ産物を直接配列決定に供し、連結部位のヌクレオチド配列情報を得た（第１ＰＣＲ）。次いで、トランスジーン／マウスゲノム連結領域を含むＤＮＡフラグメントを、プローブとして第１ＰＣＲ産物を用いてゲノムＤＮＡからクローニングした（図２２Ｃ）。第２ＰＣＲを、鋳型としてクローニングされたＤＮＡを用いて実施し、期待された１．５ｋｂのＰＣＲ産物を増幅した（図２２Ｄ）。最後に、ウォーキングプライマーを用いたＰＣＲ直接配列決定を実施し、トランスジーン／マウスゲノム連結点から１ｋｂ上流部のゲノム情報を得た（図２２Ｅ）。
【０１１２】
このトランスジーン／マウスゲノム連結部位の得られたマウスゲノム情報を用いて、ＢＬＡＳＴ検索を実施した。このＢＬＡＳＴ検索は、クローニングされた２００ｂｐのフラグメント（ＰＶＲ遺伝子）と完全な相同性を有する登録クローンＮｏ．２８３３６８５を示し、そしてトランスジーン／マウスゲノム連結領域の上流部位の構造を、（図２３）に示すように決定した。
【０１１３】
（実施例６）
（広範な遺伝的多様性を達成するための遺伝的バックグラウンドの拡大）
実験動物を安全性試験において使用する場合、それらの遺伝的バックグラウンドを拡大（拡張）して、広範な遺伝的多様性を達成する（これは、順に、より広い範囲の感受性、多様な振る舞い、およびより広いスペクトルの表現型局面および演出型局面を生じる）ことが非常に望ましい。さらに、このシステムの再現性は、このような動物の連続的な遺伝子公正および安定性を検証することなく保証されない。広範な遺伝的バックグラウンドおよび連続的な遺伝子平等／安定性の両方を確実にするために、選択された近交系（および完全にコンジェニックの）系統からの雑種動物が生産される。遺伝的多様性のさらなる拡張が必要な場合、雑種系統は、他の雑種系統と交配されて、多交雑雑種が生産され得る。このように、広範な遺伝的多様性は雑種交配によって確実とされるが、連続的な遺伝的同一性／安定性は各選択系統の遺伝的モニタリングによって保証される。このプロセスにおける第一の工程は、第一世代（Ｆ１）動物について最も適切なバックグラウンドの選択である。異なる系統は標的疾患に関して異なる感受性、スペクトルおよび振る舞いを示すので、この選択は、種々の系統における標的疾患に関した情報の検討を包含する。このような情報は、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙデータベース（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、および当該標的疾患の当業者から入手可能である。バックグラウンド系統の選択の第二の構成要素は、種々の系統の生殖指標（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）に関して入手可能な情報の検討である。このような情報は、日本の財団法人実験動物中央研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ）（ＣＩＥＡ）の生殖指標データベース（Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄａｔａｂａｓｅ）から入手可能である。
【０１１４】
一般に、いくつかの近交系系統からのＦ１選択の目標は、ヒト患者において観察される多様性と同様に、標的疾患の多様性（例えば、癌の発生率およびスペクトル）の保存、および安定な生殖率の提供であり、これらにより、必要とされる動物数について良好なプランニングが可能になる。
【０１１５】
種々の近交系マウス系統についての生殖データを以下の表Ｂに示す。
【０１１６】
（表Ｂ）
【０１１７】
【表１】
2010029219.tif 000008
ＣＩＥＡおよび日本クレア。
【０１１８】
出生率＝交配親マウス数に対する母マウス数の％。同胞の平均＝分娩した母マウスの数に対する同胞総数。離乳比率＝同胞総数に対する離乳した同胞の数。生殖指標＝交配親マウス数に対する離乳した同胞の数。
【０１１９】
（表Ｃ）
【０１２０】
【表２】
2010029219.tif 000009
。
【０１２１】
表Ｂおよび表Ｃに示したデータを合わせて以下の表Ｄにする。
【０１２２】
（表Ｄ）
【０１２３】
【表３】
2010029219.tif 000010
。
【０１２４】
（実施例７）
（ＴｇＰＶＲ２１）
霊長類のみがポリオウイルスに感受性であるので、経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）の神経毒性に対する安全性および一貫性は、サル神経毒性試験（ＭＮＶＴ）において従来アッセイされてきた。ヒトポリオウイルスレセプター（ＰＶＲ）の遺伝子を有するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの開発の後、これらのマウスがＯＰＶ試験についてサルの代わりとなるのに適切であるかを評価した。Ｔｇマウスの２つの系であるＴｇＰＶＲ１およびＴｇＰＶＲ２１を試験した。脊髄に接種したＴｇＰＶＲ２１マウスは、サル神経毒性試験を通過した３型および２型のＯＰＶロットと、これに落ちたものとの間の識別においてサルと同程度に感受性であった。ポリメラーゼ連鎖反応および制限酵素切断によるこの新規な分子アッセイの結果は、各ＯＰＶロットが、ウイルスゲノム中に取るに足らない量の神経毒性復帰変異体を含むことを示した。サル神経毒性試験に落ちた全ての３型ＯＰＶロットは、この試験を通過したロットよりも高い割合の４７２−Ｃ復帰変異体を有した。多数の３型ＯＰＶロットの分析はまた、４７２−Ｃ  復帰変異体の含有量とＴｇＰＶＲ２１マウス試験の結果との間に良好な相関があることを示した。有意なデータセットの全体像は、ＴｇＰＶＲ２１マウスモデルが３型および２型のＯＰＶの評価に適切であることを示唆する。１型ＯＰＶ（これは、３つのＳａｂｉｎ株の中で最も安定である）の神経毒性についてのＴｇＰＶＲマウス試験の必要性は、考慮中である。
【０１２５】
霊長類のみがポリオウイルスの３つの血清型全てにおいて感受性であるので、経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）の安全性およびその一貫性は、サル神経毒性試験（ＭＮＶＴ）において試験されている（１）。三価ワクチンバッチのために、約１００匹のサルが使用される。多数の国において、ＭＮＶＴは２回実施される（１回は、製造者によって、そして１回は国家規制当局によって）。高い費用に加えて、通常、サルは、野生から入手され、ヒトに外来の疾患を伝染する可能性がある。本発明者らは、代替の動物システム−ポリオウイルスに対して感受性であるトランスジェニックマウスの状態を記載する。
【０１２６】
２グループの科学者が、ポリオウイルスに対する細胞レセプターをコードするヒト遺伝子をマウスゲノムに導入することによって、ヒトポリオウイルスレセプター（ＴｇＰＶＲ）マウスを有するトランスジェニックマウスを得た（Ｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  ６３：３５３−３６２，１９９０；Ｋｏｉｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５１−９５５，１９９１）。ポリオウイルスに感染した場合、ＴｇＰＶＲマウスは、弛緩性麻痺を発症し（その後いくつかのマウスは死亡した）、そしてサルにおいて観察されるのと同様に、中枢神経系において組織学的病変を生じた。ＴｇＰＶＲマウスは、実験誘発灰白髄炎の病因およびポリオウイルス弱毒化の種々の局面を研究するために広範に使用されている（Ｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  ６３：３５３−３６２，１９９０；Ｋｏｉｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５１−９５５，１９９１
；Ｒｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１３７７−１３８２，１９９１；Ｒｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６”２９６−３０４，１９９２；Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏら、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．７８：１０９−１１６，１９９３；Ｋｏｉｋｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ  ７８：１０１−１０７．１９９３；Ｈｏｒｉｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：６８１−６８８，１９９４；Ｋｏｉｋｅら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３９：３５１−３６２，１９９４）。１９９２年において、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＨＯ）は、異なる神経毒性度を有する３型ポリオウイルス株の使用により、ＴｇＰＶＲマウスの感受性（Ｋｏｉｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５１−９５５，１９９１）とサルの感受性とを比較することを推奨した（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｂｕｌｌ．Ｗ．Ｈ．Ｏ．，１：２３３−２３７，１９９２）。大脳内に接種されたＴｇＰＶＲ１マウス系に対して米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）により実施された研究は、このマウスシステムが、野生型Ｌｅｏｎ／３７株、Ｓａｂｉｎ  ３ワクチン株、および糞便から単離されたワクチンウイルスの実質的に脱弱毒化された（ｄｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）クローンの間を区別し得ることを示した（Ｄｒａｇｕｎｓｋｙら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２１：２３３−２３７，１９９３）。しかしながら、大脳内接種ＴｇＰＶＲ１マウスは、ＭＮＶＴを通過したＯＰＶロットとこれに落ちたロットとの間を区別しなかった。後に、Ｈｏｒｉｅら（Ｈｏｒｉｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：６８１−６８８，１９９４）は、このマウスシステムがサルについて比較的低いが異なるレベルの神経毒性を有するポリオウイルス３型株間を識別できなかったことを見出した；この研究においてＯＰＶロットは含まれなかった。ＴｇＰＶＲ１マウスシステムはＯＰＶを試験するのに不適切であるので、もう一方のマウス系（ＴｇＰＶＲ２１）に目を向けられた。ＭＮＶＴにおけるのと同様に、ウイルスサンプルをマウス脊髄に接種した。ＭＮＶＴにおけるワクチンバッチに対する合否判定は、サルの中枢神経系における組織学的病変のスコア付けに基づく（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ  Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．８００；Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３，ａｎｎｅｘ  １，１９９０）。それに反して、ＭＮＶＴに落ちたＯＰＶロットを検出するためのＴｇＰＶＲ２１マウスにおける試験は、灰白髄炎の臨床徴候の評価によって可能となった。有望な結果のため、１９９３年にはＷＨＯにより共同研究が着手された（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ／ＭＩＭ／ＰＶＤ／９４．１  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，１９９３）。この研究の目標は、ＴｇＰＶＲ２１マウスが、まず３型ＯＰＶについて、ＭＮＶＴにおいてサルの代わりとなるのに適切であるかを評価することであった。財団法人実験動物中央研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍ���ｌｓ）の研究者は、制限された研究ツールから、大量にかつ規定の質標準を有して入手可能な信頼性のある動物供給源に、ＴｇＰＶＲ２１マウスを開発することに成功した（Ｈｉｏｋｉら、Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．４２：３００−３０３（和文），１９９３）。ＴｇＰＶＲマウスの維持、封じ込め、および輸送についての推奨は、ヒトウイルスに対して感受性のトランスジェニックマウスに関するＷＨＯメモランダムにおいて与えられた（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｂｕｌｌ．Ｗ．Ｈ．Ｏ．．７１：４９７−５０２，１９９３）。接種手順、臨床スコア付け法、統計学的解析の原理が記載された（Ａｂｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０６：１０７５−１０８３，１９９５；Ａｂｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１０：１６０−１６６，１９９５；Ｄｒａｇｕｎｓｋｙら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２４：７７−８６，１９９６）。それらの研究で使用されたウイルスサンプルは、まずＭＮＶＴにおいて試験され、そしてＦＤＡで開発されたポリメラーゼ連鎖反応および制限酵素切断による非常に感度の高い分子アッセイを用いて、ウイルスゲノムにおける神経毒性復帰変異体の量について調べられた（Ｃｈｕｍａｋｏｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１９９−２０３，１９９１）。後者の方法は、一価３型ＯＰＶの各ロットにおいて、取るに足らない量で４７２位（Ｕ→Ｃ）におよびより多い量で２４９３位（Ｃ→Ｕ）に復帰変異体を検出した
。３型ＯＰＶにおける４７２−Ｃ復帰は、ＭＮＶＴにおける神経毒性の増大に対する重大な寄与因子として記録されている。ＭＮＶＴに落ちたワクチンロットは、これらの復帰変異体を１％より多くで含んだ。３型ＯＰＶの４７２位のものと同様の戻り変異は、１型および２型のＯＰＶロットにおいても見出されたが、神経毒性に対するそれらの寄与は、それほど強くはなかった（Ｒｅｚａｐｋｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２：３７０−３７８，１９９４；Ｔａｆｆｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０９：３６６−３７３，１９９５）。Ｓａｂｉｎ１型および２型のウイルスのゲノムにおいて生じる神経毒性の原因となる他の変異が存在し得る。
【０１２７】
ＴｇＰＶＲ２１マウスが、ＭＮＶＴに落ちた３型ワクチンロットを検出し得るか否かを決定するために、ＷＨＯの研究は、３％  ４７２−Ｃ復帰変異体を含む１つのワクチンロット、および比較のために参照ワクチンＷＨＯ／ＩＩＩ（これは、０．５％  ４７２−Ｃ復帰変異体を含む）を伴った。参加した全ての研究所からの結果は、ＴｇＰＶＲ２１マウスが明確にこれら２つのワクチン間を識別することを示した（Ｗｏｏｄ，Ｄ．Ｊ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（印刷中），１９９６）。この識別は、臨床スコアおよび感染の臨床徴候の出現日（すなわち、失格時間）を判定基準として使用した場合に、より良好であった。５０％麻痺用量および５０％致死用量は、より満足のいくものではなかった。ＭＮＶＴに落ちた３型ＯＰＶ調製物の大部分は、４７２−Ｃ復帰変異体を３％未満で、それらのほとんどは２％未満で含んだ。簡潔のために、後者のワクチンは、「限界（ｍａｒｇｉｎａｌ）」と名付けられた。３つの限界ワクチン（１．３％、１．４％、および１．７％）が、ＷＨＯ／ＩＩＩおよびＮＣ−２（それぞれ、０．５％、０．８％の４７２−Ｃ復帰変異体）と共にＦＤＡで試験された（Ｄｒａｇｕｎｓｋｙら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２４：７７−８６，１９９６）。３つの限界ロットは全て、神経毒性、臨床スコア、および失格時間のうち２つの主要な指標について高い確率値で、マウス試験に落ちた。１．４％しか４７２−Ｃ復帰変異体を含まず、かつＭＮＶＴに通過したもう１ロットのワクチンロットは、このマウス試験に落ちた。この所見は、ＭＮＶＴよりもこのマウス試験の方が感度が高いことを示唆し得る。
【０１２８】
興味深い問いは、ワクチンまたは実験サンプルにおける２４９３−Ｕ復帰変異体の含有量とサルおよびＴｇＰＶＲ２１マウスにおける神経毒性との間の関係であった。サルについての神経毒性におけるこれらの復帰変異体の役割に関する報告は、論争の余地があった（Ｔａｔｅｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３１９４−３１９７，１９９２；Ｃｈｕｍａｋｏｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：９６６−９７０，１９９２）。最初の報告は、サルについて神経毒性の増大において最も重要であるとしてこの位置の戻り変異を考察したが、二番目の発表における所見は違った風に示した。この位置の変異は、４７２位での変異よりも早く発現する。従って、４７２−Ｃの割合においていくらかの増大を有するワクチンロットは、通常、非常に高い含有量（１００％まで）の２４９３−Ｕを有する。いくつかの製造者は、１００％  ２４９３−Ｕ復帰変異体および非常に低い含有量（０．３％）の４７２−Ｃを有する、Ｓａｂｉｎｅ  ３クローンに由来するワクチンを作製した。これらのワクチンが、２４９３−Ｕ復帰変異体を低い含有量で有するワクチンよりも、ヒトに対して安全ではなかったことを示すデータはない。それらの１つである、ＭＮＶＴにおいてＷＨＯ／ＩＩＩおよびＮＣ−２参照と比較した参照ワクチンＦ３１３は、前者２つのワクチンほど毒性ではなかった（１６，Ｄｒａｇｕｎｓｋｙら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２４：７７−８６，１９９６）。しかしながら、ＴｇＰＶＲ２１マウスにおいて、Ｆ３１３は、ＷＨＯ／ＩＩＩおよびＮＣ−２よりも高いレベルの神経毒性を有した（Ｄｒａｇｕｎｓｋｙら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２４：７７−８６，１９９６）。ＴｇＰＶＲ２１マウス試験は、Ｆ３１３と４７２−Ｃ復帰変異体の含有量が増大したその誘発体（これは、「不良」ワクチンを模倣する）との間を識別し得るか否かを決定することが必須になった。従って、Ｆ３１３ワクチンに由来し、かつ１．８％および２．４％の４７２−Ｃを含む２つの実験通過サンプルを、親Ｆ３１３ワクチンに対してマウスにおいて試験した。ＴｇＰ
ＶＲ２１マウス試験は、これらのサンプル間を区別した（Ｄｒａｇｕｎｓｋｙら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２４：７７−８６，１９９６）。Ａｂｅら（Ａｂｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１０：１６０−１６６，１９９５）は、ＴｇＰＶＲ２１マウスにＷＨＯ／ＩＩＩおよびＦ３１３参照を接種し、それらを３８℃で増殖した２つのＦ３１３誘発調製物と比較した。彼らは、ＭＮＶＴとマウス試験結果との密な相関を認めた。不運にも、３８℃で増殖したこれら２つのウイルス調製物は、不良ワクチンに類似しているとはみなされることはなかった。なぜなら、それらはそれぞれ、７８％および９４％の４７２−Ｃ復帰変異体を含んでおり、弱毒のインビトロ温度感受性マーカーをｒｃｔ４０−からｒｃｔ４０＋へ変更したためである。このことは、製造条件下のワクチンにおいて生じ得るよりも高い神経毒性であることを示した。ＯＰＶ生産の要件（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ  Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．８００：４６−４９，１９９０）によれば、細胞培養物におけるワクチンウイルス増殖は、３５．５±０．５℃を超えることはない。これよりも高い温度は、より神経毒性であるウイルス粒子の選択的な増殖を生じさせる。
【０１２９】
ＴｇＰＶＲ２１マウスにおけるＯＰＶ−３研究の間に、全ての実験において最も識別するウイルス用量は、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の３．５  ｌｏｇ１０および４．５  ｌｏｇ１０であった。限界ワクチンの信頼性のある識別はまた、これらの２つの量のみを用いるが、各量を接種したマウスの数を増大させることによって達成され得ることが見出された。一群あたりのマウスの数が十分であることに加えて、もう１つの要因が成功のために重要である；ＭＮＶＴのための接種材料中のウイルス含有量の１．０  ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の差異は重要ではない（Ｃｏｎｔｒｅａｒａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．１６：１９５−２０５，１９８８）。対照的に、マウス試験において用量依存性がより強いこと、および接種材料の容量が非常に小さいこと（０．５μｌ）が、マウス試験とサル試験との間の差異について最も考えられる理由である。必要な精度を達成し、研究所間の結果を調和させるために、ＷＨＯガイドライン（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＤｏｃｕｍｅｎｔＷＨＯ／ＢＬＧ／９５．１，Ｃｈａｐ．９，ｐ．６７−７４，Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，１９９５）に記載の力価測定アッセイ法に従うことが推奨された。
【０１３０】
ＦＤＡで実施された２型ＯＰＶを用いた実験（Ｄｒａｇｕｎｓｋｙら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２４：７７−８６，１９９６）では、ＴｇＰＶＲ２１マウスに、２型参照ワクチンＷＨＯ／ＩＩと共に、ＭＮＶＴに通過した３つのワクチンロットおよびＭＮＶＴに落ちた２つのロットを接種した。さらに、３つの実験サンプルを「良好な」ワクチンロットから得た。これらのサンプルのうち１つはＭＮＶＴを通過し、そして２つは落ちた。この結果は、ＭＮＶＴとＴｇＰＶＲ２１マウス試験との間の良好な相関を示した。
【０１３１】
いずれの１型ＯＰＶロットも繰り返してはＭＮＶＴに落ちなかったので、ＦＤＡは、ＭＮＶＴに１回は落ちたが繰り返した試験では通過した１つのワクチンロットおよび１つの実験通過調製物を使用した（Ｄｒａｇｕｎｓｋｙら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２４：７７−８６，１９９６）。ＴｇＰＶＲ２１マウスの脊髄にこのワクチンロットおよび通過サンプルを接種しても、これらの２つの調製物と米国参照ワクチンとの間を識別することはできなかった。この陰性の結果は、むしろ１型ＯＰＶの特色によるものである。第一に、Ｓａｂｉｎ  １株は、これら３つの血清型の中で最も安定であり、おそらく、マウスにおいて試験される「不良」の１型ＯＰＶロットは存在しない。いくつかの場合において、１型ワクチンロットは、ＭＮＶＴに落ちるが、この試験が繰り返された場合、通過することもある（Ｍａｒｓｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．８：３０３−３０９，１９８０；Ｌｏｖｅｎｂｏｏｋ，Ｉ．，データは公開されず）。当業者の中には、１型ＯＰＶについてサル試験を必要とすることに疑問を感じることさえもある。Ａｂｅら（１６）は、３８℃でウイルスを増殖させることにより１型ＯＰＶのサンプルを得た。これらの調製物は
、ＭＮＶＴおよびＴｇＰＶＲ２１マウス試験に落ち、ｒｃｔ４０マーカーが陰性から陽性に変化した。このことは、再度、３型を用いた彼らの研究（Ａｂｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
２１０：１６０−１６６，１９９５）と同様に、これらサンプルの神経毒性が、いかなる不良ワクチンに対して予期されるよりも高かったことを示している。これらの調製物について、ＭＮＶＴとＴｇＰＶＲ２１マウス試験との間の相関があったという事実は、１型ＯＰＶについてＴｇＰＶＲ２１  マウス試験に落ちたことが、マウスモデルの不適合性ではなく、株が製造条件下で増殖される場合のＳａｂｉｎ  １株の安定性によるものであるという意見を強める。
【０１３２】
過去数年間に蓄積されたデータの大部分の全体像は、脊髄接種ＴｇＰＶＲ２１マウスが、３型および２型のＯＰＶの神経毒性の評価のための適切なモデルを提供することを示唆する。このマウスモデルは、サルに代わることができるとみなされ得る。１型ＯＰＶについてマウス試験を適用できるかどうかは、未だなお解明されるべきである。ＴｇＰＶＲマウスの生産の確立、それらの病原体のない健康状態、およびサルに比較して費用が低いことが、ＯＰＶの神経毒性試験に対して大きな興味となる。
【０１３３】
（実施例８）
（Ｔｇ  ｃＨａ−ｒａｓ）
迅速発癌性試験を、ヒト表現型ｃ−ＨＲＡＳ遺伝子を有するトランスジェニック（Ｔｇ）マウス、すなわちＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ×Ｃ５７ＢＬ／６ＪＦ１−ＴｇＮ（ＨＲＡＳ）２またはＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスを用いて実施した。本研究を、迅速発癌性試験システムのためのモデルとしてのＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスの評価における第一の段階として実施した。種々の遺伝子毒性発癌物質の短期試験の結果は、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスが、コントロールの非Ｔｇマウスよりもこれらの発癌物質に対して感受性であることを示す。この第一段階評価研究によれば、コントロール非ＴｇマウスよりもＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて、種々の遺伝子毒性発癌物質での処理の後により高い確率で、より悪性の腫瘍がより急速に発症することおよびその発生率がより高いことが予期され得る。ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスは、迅速発癌性試験システムの開発のための動物モデルとしての候補の見込みがあるようである。
【０１３４】
基礎医学および臨床医学からのアプローチに加えて公衆衛生からのアプローチを通じて癌を克服するために絶え間ない努力がなされているが、癌はなお、多くの国において死亡原因の第一位となっている。多くのヒト癌は、周囲の化学発癌物質への曝露によって引き起こされ得ると考えられている。その危険性を少なくするために、発癌物質を同定し、取り除く大きな努力がなされてきた。ヒト発癌物質を同定するために、疫学的研究および実験動物を用いた発癌性試験が使用される。疫学的研究は非常に信頼性があり、おそらくヒト発癌物質を確認する唯一の方法であるが、このアプローチはとても遡及的であるので、多くの犠牲者が出現した後にのみ発癌物質の同定がなされ得る。
【０１３５】
発癌性試験は、開発のプロセスにおいて薬物の安全性を評価している場合、および周囲の発癌物質を同定している場合、不可欠である。現行の実験動物を用いる発癌性試験は、ヒトの危険性の評価に常に関連があるわけではない；マウスおよびラットが、それらの短い寿命期間および体長の小ささのために、一般に使用される。げっ歯類の発癌性試験は、２年より長くかかり、多数の動物を必要とするので、これは、動物試験のための広い場所、多数の実験技術者、および莫大な費用を必要とする。発癌性試験において陽性結果が得られた場合、新規な薬物の開発のための時間、骨折り、および費用が浪費されたと悟ることも珍しくはない。さらに、現在の環境には、試験されていない多くの化学物質があり、何千もの新規な化学物質が毎年合成される。発癌物質同定のプロセスを改善して、より多くの化学物質が評価され得るようにする必要があることが明らかである。従って、短期間内で発癌性を評価し得る迅速発癌性試験システムの開発は、新規薬物の開発および周囲の
発癌物質の同定の効率を改善するために必須である。
【０１３６】
迅速発癌性試験システムを開発するために、発癌物質に対して感受性である動物が不可欠である。プロトオンコジーンを有するトランスジェニック（Ｔｇ）動物および／または腫瘍抑制遺伝子を欠く動物は、正常動物よりも種々の発癌物質に対して感受性であると期待される。なぜなら、発癌性は、おそらくプロトオンコジーンおよび／または腫瘍抑制遺伝子の不活性化の結果として、選択的増殖利点を獲得してクローン増殖を受けた感受性細胞において、遺伝的および後成的な損傷によって駆動される多段階プロセスであるからである。
【０１３７】
ｒａｓファミリー遺伝子は、細胞増殖の調節に関与し、種々のヒト腫瘍において（Ｌｏｗｙら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：８５１−８９１，１９９３；Ｂｏｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：４６８２−４６８９，１９８９；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  ９８：１３−２４，１９９２）ならびに実験動物モデルにおいて（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  ９８：１３−２４，１９９２；Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１８５：２９３−３０８，１９８７）、体性点変異によって活性化される。点変異によるｒａｓファミリー遺伝子の活性化は、ヒト腫瘍の約３０％で観察される。従って、ヒトｃ−ＨＲＡＳ遺伝子を有するＴｇマウスは、迅速発癌性試験のための動物モデルとしての候補であり得る。
【０１３８】
迅速発癌性試験のための動物モデルとしてのヒトｃ−ＨＲＡＳ  遺伝子を有するＴｇマウスの有用性および制限に関する共同の評価研究が、本発明者らの施設、数社の日本製薬企業、および米国国立環境衛生科学研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ＮＩＥＨＳ）（Ｒ．Ｒ．Ｍａｒｏｎｐｏｔ博士および  Ｒ．Ｗ．Ｔｅｎｎａｎｔ博士）で現在進行中である。Ｔｇマウスの有用性および制限を評価するために、遺伝学的かつ微生物学的に規定されたＴｇマウスを大量に生産および供給するためのシステムが不可欠である。このあらましにおいて、本発明者らは、ｃ−ＨＲＡＳ遺伝子を有するＴｇマウスの種々の発癌物質に対する発癌性応答を調査することにより実施した本発明者らの現行の評価研究を導入し、そしてこの応答と、コントロールの非トランスジェニック（非Ｔｇ）マウスの応答および２年バイオアッセイの結果とを比較する。
【０１３９】
ヒトプロトタイプｃ−ＨＲＡＳ遺伝子を有するＴｇマウスの特徴：プロトタイプヒトｃ−ＨＲＡＳ  遺伝子を有するＴｇマウスはもともとＫａｔｓｕｋｉおよびその同僚（財団法人実験動物中央研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ）（ＣＩＥＡ））によって確立された（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）；このマウスは、この遺伝子をそれ自身のプロモーター領域と共に有し、この遺伝子は、プロトタイプｃ−ＨＲＡＳ遺伝子産物（すなわちｐ２１）をコードし、この産物は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換する能力がない（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）。各Ｔｇマウスのゲノムに、縦列の並びで、５または６コピーのヒトｃ−ＨＲＡＳ遺伝子が組み込まれる（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）。トランスジーンは、腫瘍および正常組織において発現され、免疫ブロット分析によって検出されるｐ２１の総量は、非ＴｇマウスにおけるよりもＴｇマウスにおいて２〜３倍高い（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）。Ｔｇマウスの正常組織においては、トランスジーンの変異は検出されない（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）。ｒａｓＨ２マウス（Ｃ５７ＢＬ／６×ＢＡＬＢ／ｃＦ２）の約５０％が、生誕１８ヶ月後以内に自発腫瘍を発生させた（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）。この腫瘍
保持マウスの約６０％が、血管肉腫を有する（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）。肺腺癌、皮膚乳頭腫、ハーダー腺癌、およびリンパ腫もまた、１８ヶ月齢で見られるが、よりずっと低い発生率である（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）。しかし、いずれの腫瘍も前新生物病変も、６ヶ月齢のｒａｓＨ２  マウスのＦ２トランスジェニック子孫では見られない（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）。
【０１４０】
本研究で使用したＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスの遺伝的バックグラウンドは、トランスジェニックの雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび雌性ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスのＦ１であった。トランスジェニック雄性Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの８回より多くのｒａｓＨ２マウスの戻し交雑によって確立した。このトランスジーンを有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄を、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ雌マウスと交雑した。このＦ１子孫を、ポリメラーゼ連鎖反応またはサザンブロット分析によって、ヒトプロトタイプｃ−ＨＲＡＳ遺伝子の存在についてスクリーニングした。ヒトｃ−ＨＲＡＳ遺伝子を有するＦ１マウス、すなわちＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ×Ｃ５７ＢＬ／６ＪＦ１−ＴｇＮ（ＨＲＡＳ）２（ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２）マウス（ＣＩＥＡで生産、７〜９週齢）を発癌性試験のために使用した。同腹子の間で、ヒトｃ−ＨＲＡＳ遺伝子を有さないマウス（ＣＢ６Ｆ１）を非Ｔｇコントロールとして使用した。本研究においては、多数のＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスが、規格化された実験動物の形態で必要とされるので、実地開発が必要である。この開発において使用される構想およびシステムは、この問題の最初の概説においてＮｏｍｕｒａにより詳細に記載される。
【０１４１】
雄および雌のＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスの体重は、対応する非Ｔｇマウスの８０〜９０％であった。試験した器官（脳、甲状腺、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、副腎、精巣、および卵巣）に関して、Ｔｇマウスの器官：体重比は、非Ｔｇマウスに類似した。血液生化学データおよび血液学データは、Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスとの間で有意な差異はなかった。７７週齢の雄および雌のＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスの生存率はそれぞれ、５３％および３２％であった。ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスの約５０％が血管肉腫のために死亡し、そしてその死亡動物のうち約２０％が、肺腺癌および／または肺腺腫を有していた。このことは、ｒａｓＨ２マウスにおける以前の結果（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１１９５−１２００，１９９０）と一致する。本研究においては、６ヶ月の発癌性実験の間に、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて少数のみの自発肺腺腫が観察されたが他の自発肺腫瘍は観察されなかった。この実験は、遅くとも３５週齢までで終結した（３５週齢のＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスの生存率は９５％以上であった）。ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて自発腫瘍の発生率が低いことにより、本発明者らは、このマウスを、迅速発癌性試験のためのツールとして使用することができる。
【０１４２】
迅速発癌性試験：迅速発癌性試験に関するこれらの研究は、本発明者らの施設および数社の日本製薬企業でなされている（表１）。
【０１４３】
（表１．日本においてＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスを用いた迅速発癌性試験の結果）
【０１４４】
【表４】
2010029219.tif 000011
４ＮＱＯ＝４−ニトロキノリン−１−オキシド；ＭＮＮＧ＝Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン；ＭＮＵ＝Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソ尿素；ＤＥＮ＝Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソ尿素；ＭＡＭ＝メチルアゾキシメタノール；４ＨＡＱＯ＝４−ヒドロキシアミノキノリン−１−オキシド。
１国立医薬品食品衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ＮＩＨＳ）。２山之内製薬株式会社。３中外製薬株式会社。４三共株式会社。５ＣＩＥＡ。６米国−日本共同研究。
ａ参考文献９；ｂ未公開データ；ｃ統計学的に有意でない。
【０１４５】
４−ニトロキノリン−１−オキシド（４ＮＱＯ）（水溶性の遺伝子毒性発癌物質）は、マウスにおいて、皮膚（Ｎａｋａｈａｒａら、Ｇａｎｎ  ４８：１２９−１３６，１９５７）および口腔（Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  １６：４２４−４３２，１９９４）の扁平上皮癌、肺腫瘍（Ｉｎａｙａｍａ，Ｙ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７７：３４５−３５０，１９８６）を誘発することが公知である。４ＮＱＱ処理ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウス（雄および雌）の約９０％が、体重１ｋｇ当たり１５ｍｇの４ＮＱＯの単回皮下（ｓ．ｃ．）注射の１６週後に皮膚乳頭腫を有した（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。皮膚の扁平上皮癌は、４ＮＱＯ処理ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいてのみ観察され、コントロール非Ｔｇマウスにおいては観察されなかった。４ＮＱＯ処理非Ｔｇマウスおよびビヒクル処理動物においては、いかなる皮膚腫瘍も観察されなかった。４ＮＱＯはまた、肺腫瘍を誘発した。肺腺癌は、４ＮＱＯ処理ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいてのみ観察され、対応する非Ｔｇマウスにおいては観察されなかった（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。また、４ＮＱＯ処理ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおける肺腺腫の発生率も、対応する非Ｔｇマウスよりも高かった（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。
【０１４６】
シクロホスファミド（抗新生物剤）は、げっ歯類およびヒトにおいて発癌性である（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ，ＩＡＲＣ  ｖｏｌ  ２６，ｐ  １６５−２０２，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，１９８１）。主要標的器官は、膀胱、肺、乳腺、およびリンパ系である（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ，ＩＡＲＣ  ｖ
ｏｌ  ２６，ｐ  １６５−２０２，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，１９８１）。１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドの２５週間の間、週に２回の慢性的な経口投与は、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスおよび非Ｔｇマウスにおいて肺腫瘍を誘発した（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。腺癌は、１匹のシクロホスファミド処理雄性ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいてのみ観察され、対応する非Ｔｇマウスやビヒクル処理動物では観察されなかった。シクロホスファミド処理ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおける肺腺腫の発生率は、対応する非Ｔｇマウスとは有意な差異はなかった。他の器官（例えば、膀胱、乳腺、およびリンパ系）においては、いかなる腫瘍も観察されなかった（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。
【０１４７】
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）はアルキル化剤であり、マウスを含む種々の動物種において発癌性である（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ，ＩＡＲＣ  ｖｏｌ  ４，ｐ  １８３−１９５，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，１９７４）。噴門洞および食道は、経口投与後のＭＮＮＧの標的器官である（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ，ＩＡＲＣ  ｖｏｌ  ４，ｐ１８３−１９５，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，１９７４）。２．５ｍｇのＭＮＮＧ／マウスの単回経口投与は、１００％の雄性および雌性のＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて噴門洞乳頭腫を誘発したが、非Ｔｇマウスでは、ＭＮＮＧ処理の１３週後、１１％の雌および０％の雄しか乳頭腫を発生させなかった（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。ＭＮＮＧ投与の２６週後にあっても、扁平上皮癌が、ＭＮＮＧ処理ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスでのみ観察されたが、対応する非Ｔｇマウスでは観察されなかった（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。
【０１４８】
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）は、種々の動物種において発癌性であり、種々の部位（例えば、皮膚、噴門洞、リンパ系、および肺）に腫瘍を誘発する（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ，ＩＡＲＣ  ｖｏｌ  １７，ｐ１１７−２５５，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，１９７８）。ＭＮＵの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射（７５ｍｇ／ｋｇの投薬量で１回または１５ｍｇ／ｋｇの投薬量で５回（５日連続して１日に１回）のいずれか）は、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて種々のタイプの腫瘍を誘発した（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。対応する非Ｔｇマウスと比較して、ＭＮＵ処理後のＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて、皮膚乳頭腫の有意に高い発生率が見られた（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。ＭＮＵは、皮膚乳頭腫を、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて高い発生率で誘発したが、非Ｔｇマウスでは、少なくとも１４週間の観察の間は、皮膚乳頭腫も過形成も誘発しなかった。ＭＮＵ処理ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスはまた、高い発生率で噴門洞乳頭腫を発生させたが、ＭＮＵ処理非Ｔｇマウスは乳頭腫を発生させなかった（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。噴門洞扁平上皮癌もまたＭＮＵ処理ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスでのみ観察され、非Ｔｇマウスでは観察されなかった。Ａｎｄｏら（Ａｎｄｏ，ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５２：９７８−９８２，１９９２）は、ＭＮＵの単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射後、ｒａｓＨ２マウスにおいて、対応する非Ｔｇマウスに比較して噴門洞および皮膚の乳頭腫の発生率が高いことを報告した。リンパ腫の発生率は、７５ｍｇ／ｋｇのＭＮＵで１回処理した雄性ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて、対応する非Ｔｇマウスにおける応答と比較して高かった（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。
【０１４９】
Ｎ，Ｎ−ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）は、種々の動物種において発癌性である（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ，ＩＡＲＣ  ｖｏｌ  １７，ｐ  ８３−１２４，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，１９７８）。ＤＥＮの主要標的器官は、肝臓、肺、および噴門洞である（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ，ＩＡＲＣ  ｖｏｌ  １７，ｐ  ８３−１２４，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，１９７８）。９０ｍｇ／ｋｇのＤＥＮ単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射は、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいてのみ、ＤＥＮ投与の３ヵ月後という早期に、噴門洞扁平上皮癌および肺腺癌を引き起こした（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。ＤＥＮ投与の６ヵ月後、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおける両タイプの悪性腫瘍の発生率とも、実質上増大した（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ
１７：２４５５−２４６１，１９９６）。６ヶ月の観察期間の間、ＤＥＮ処理非Ｔｇマウスでは、これらの腫瘍は観察されなかった。ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおける肺腺腫の発生率は、ＤＥＮ投与の３ヵ月後では、非Ｔｇマウスと同様であった。ＤＥＮ投与の６ヶ月後、腺腫の発生率は、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスよりも非Ｔｇマウスにおいて有意に高かった。このことは、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて肺腺癌の発生が増大したこと（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）に対応する。
【０１５０】
ビニルカルバメート（ウレタンの代謝物）は、肺および肝臓の新生物を誘発することが公知である（Ｍａｓｓｅｙら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １６：１０６５−１０６９，１９９６；Ｍａｒｏｎｐｏｔら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １０１：１２５−１５６，１９９５）。６０ｍｇ／ｋｇのビニルカルバメートの単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射は、肺の腺腫および腺癌を、それぞれ１００％および５０％のＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２  マウスにおいて、この発癌物質投与の１６週後に誘発した（Ｍａｒｏｎｐｏｔら、原稿準備中）。また、非Ｔｇマウスも９０％より多い発生率で肺腺腫を発生させたが、腫瘍の増加は、対応するＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおけるよりも低かった。肺腺癌の発生率は、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおけるよりも非Ｔｇマウスにおいてずっと低かった。前者のマウスでは約９０％が脾臓血管肉腫を有したが、非Ｔｇマウスでは発生しなかった。
【０１５１】
メチルアゾキシメタノール（ＭＡＭ）は、げっ歯類で発癌性であり、結腸腫瘍（Ｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７１：１１８１−１１８７，１９８４；Ｄｅｓｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１５：３３５−３３９，１９８９）、肺腫瘍（Ｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７１：１１８１−１１８７，１９８４）、および肛門周囲扁平上皮癌（Ｋｕｍａｇａｉら、Ｇａｎｎ  ７３：３５８−３６４，１９８２）を誘発する。２０ｍｇ／ｋｇ／週（６週間）のＭＡＭの１回の皮下（ｓ．ｃ．）注射は、初めのＭＡＭ投与２４週後に、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて、皮膚乳頭腫、結腸腺腫様ポリープ、直腸の扁平上皮癌、および胃乳頭腫を引き起こしたが、非Ｔｇマウスでは引き起こさなかった（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２４５５−２４６１，１９９６）。皮膚乳頭腫は、肛門および陰嚢に制限された。このことは、異なる系統の非Ｔｇマウスでの以前の報告（Ｋｕｍａｇａｉら、Ｇａｎｎ  ７３：３５８−３６４，１９８２）と一致する。ＭＡＭで処理したＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスおよび非Ｔｇマウスにおいて、同様の肺腺腫発生率が観察された。
【０１５２】
４−ヒドロキシ−アミノキノリン−１−オキシド（４ＨＡＱＯ，１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）（遺伝子毒性発癌物質）の単回静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、噴門洞および皮膚の乳頭腫をＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて誘発したが、これらの腫瘍は、非Ｔｇマウスにおいては、少なくとも発癌物質の投与２６週内ではほとんど観察されなかった。この発生率は低かったが、他の腫瘍（例えば、白血病および胸腺腫）がＴｇマウス
のみで観察された。４ＨＡＱＯ処理Ｔｇマウスも非ＴＧマウスも、膵臓外分泌部（これまで、この発癌物質の標的組織であると考えられていた（Ｒａｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌ．２：１−１０，１９８７））においては腫瘍を発生させなかった。これらの迅速発癌性試験の結果を上記の表１に要約し、そして迅速発癌性試験に使用した化学物質のリストを表２に示す。
【０１５３】
（表２．迅速発癌性試験のための化学物質リスト）
【０１５４】
【表５】
2010029219.tif 000012
太字の化学物質=迅速発癌性試験済みまたは現在試験中
a参考文献9; b米国−日本共同研究; ｃCIEAで迅速発癌性試験実施済みまたは実施予定。
【０１５５】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異誘発アッセイ陰性発癌物質であるエチレンチオ尿素は、ラットおよびマウスにおいて甲状腺新生物を誘発することが公知である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１０１：２６４−２６６，１９９３）。発癌性試験のために、雌性マウスのみを使用した。マウスに、０．１％または０．３％のエチレンチオ尿素を含む食餌を、２８週間与えた。０．１％の濃度のエチレンチオ尿素は、甲状腺腫瘍を、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいても非Ｔｇマウスにおいても誘導しなかったが、０．３％エチレンチオ尿素は、Ｔｇマウスの２６％、および非Ｔｇマウスの２０％において、甲状腺腺腫を誘発した。また、甲状腺癌の発生率は同様であり（Ｔｇマウスで９％、そして非Ｔｇマウスで４％）、Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスとの間に有意な差異は観察されなかった。
【０１５６】
ＤＥＮ（Ａｎｄｏ，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：９７８−９８２，１９９２）お
よびビニルカルバメート（Ｍａｒｏｎｐｏｔら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １０１：１２５−１５６，１９９５）は共に、肝腫瘍の強力な誘発因子として公知である。しかしながら、これらの化合物で処理したＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスおよびコントロール非Ｔｇマウスはともに、肝腫瘍を発生しなかった。マウスにおいて、多重遺伝子座が肝腫瘍発生を制御することが報告されている（Ｇａｒｉｂｏｌｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２０９−２１１，１９９３；Ｍａｎｅｎｔｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２３：１１８−１２４，１９９４）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃ３Ｈマウス（肝臓癌形成に対して非常に感受性である系統（Ｄｉｗａｎら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７：２１５−２２０，１９８６；Ｄｒａｇａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６２９９−６３０３，１９９１））に比較して、化学的に誘発された肝臓癌形成に対して相対的に低い感受性を有する（Ｄｉｗａｎら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７：２１５−２２０，１９８６；Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １３：２４２７−２４３３，１９９２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、肝臓癌形成に対して非常に耐性であり、雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスと雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスとのＦ１雑種は、肝臓癌形成に対して低い感受性を有することが公知である（Ｍａｒｏｎｐｏｔら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １０１：１２５−１５６，１９９５，Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １３：２４２７−２４３３，１９９２）。従って、ＣＢ６Ｆ１マウス（雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスと雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスとのＦ１雑種）は、肝臓癌形成に対して、相対的に低い感受性を有するという可能性が非常に高いようである。
【０１５７】
ＨＲＡＳ遺伝子の活性化が、いくつかのマウス系統（例えば、Ｃ３ＨおよびＢ６Ｃ３Ｆ１）の肝腫瘍において頻繁に検出される（Ｍａｒｏｎｐｏｔら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １０１：１２５−１５６，１９９５）。しかしながら、ＨＲＡＳ変異の頻度は、ＤＥＮまたはビニルカルバメートのいずれかで誘発されたＢ６ＣＦ１マウスの肝腫瘍では非常に低い（Ｍａｒｏｎｐｏｔら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １０１：１２５−１５６，１９９５）。ＨＲＡＳの変異は、肝臓癌形成に対して高い感受性を有するマウス系統において、有意に肝腫瘍誘発の一因となり得るが、低い感受性を有するマウス系統においてはそうではない（Ｍａｒｏｎｐｏｔら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １０１：１２５−１５６，１９９５）。
【０１５８】
皮膚の乳頭種／扁平上皮癌、噴門洞の乳頭種／扁平上皮癌、およびいくつかの他のタイプの腫瘍が、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて明らかに観察されたが、発癌物質のタイプに関係なく、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおけるシクロホスファミド、ＭＮＵ、ＤＥＮ、またはＭＡＭによって誘発された肺腺腫の発生率および多発性は、非Ｔｇマウスにおける対応する発癌物質によって誘発された腫瘍に関連した発生率および多発性よりも有意に高いものではなかった。発癌物質曝露後、種々のマウス系統間で、肺腫瘍発生率において有意な差異がある（Ｍａｌｋｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ５４：２４１−２７１，１９８９）。Ａ／Ｊ（肺発癌に対して非常に感受性である）とＣ５７ＢＬ／６Ｊ（肺発癌に対して耐性）との間の組換え近交系の遺伝学的研究の結果は、３つの遺伝子座が、これらの系統における肺腫瘍形成に対する感受性における差異に寄与することを示唆した（Ｍａｌｋｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．７５：９７１−９７４，１９８５）。Ｋｉ−ｒａｓオンコジーンは、これらの感受性遺伝子座の１つとして提唱されているが（Ｙｏｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５８０４−５８０８，１９９２；Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１５８９−１５９３，１９９４）、各マウス系統の肺腺腫感受性（例えばＡ／Ｊは感受性であり、ＢＡＬＢ／ｃは中間であり、Ｃ５７ＢＬ／６は耐性である）は、このＫｉ−ｒａｓ遺伝子における多型とよく相関している（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１５８９−１５９３，１９９４）。本研究で使用したＣＢ６Ｆ１マウスは、相対的に高い肺腺腫感受性を有し得る。他方で、肺腺癌は、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいてのみ発生したが、種々の発癌物質に
応答して、全くか、またはほんのわずかしか発生しなかった。このことは、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスが、コントロールＣＢ６Ｆ１マウスと比較して、幾分かのさらなる肺腺腫の悪性進行をいくぶんかさらに加速させ得ることを示す。
【０１５９】
これらの結果は、コントロール非ＴｇマウスよりもＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスにおいて、種々の遺伝子毒性発癌物質での処理の後により高い確率で、より悪性の腫瘍がより急速に発症することおよびその発生率がより高いことが予期され得ることを示す。これらの初期評価研究は、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスが、迅速発癌性試験システムの開発のための動物モデルとしての候補の見込みがあるようであることを示した。
【０１６０】
着眼点：変異原性が発癌性の主要なメカニズム決定因子であるが、これは、発癌性のために十分でも必要でもない。非変異原性化学物質のおよそ３分の１が発癌性であることが示されており、そして変異原性化学物質のおよそ３分の１が２年げっ歯類バイオアッセイにおいて発癌性でなかった（Ａｓｈｂｙら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２５７：２２９−３０６，１９９２；Ｚｅｉｇｅｒｓ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｕｔａｇｅｎ  １６（Ｓｕｐｐｌ．１８）：１−１４，１９９０）。２種のげっ歯類において腫瘍を誘発する化学物質は、１種のみにおいて腫瘍を誘発する化学物質よりも、異なる種間の遺伝的可変性によって影響を受けないことが、提唱されている（Ｔｅｎｎａｎｔ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８６：１１１−１１８，１９９３）。従って、トランス種の発癌物質の方が、単一種の発癌物質よりも、ヒトに対して危険であるようである。
【０１６１】
トランス種発癌物質に関して、本発明者らは、１５のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異誘発アッセイ陽性発癌物質（４ＮＱＯ、シクロホスファミド、ＭＮＮＧ、ＭＮＵ、ＤＥＮ、ビニルカルバメートＭＡＭ、４ＨＡＱＯ、プロカルバジン、チオテパ、ＮＮＫ、フェナセチン（ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎ）、４，４’−チオジアニリン、４−ビニル−１−シクロヘキセンジエポキシド、およびｐ−クレシジン）および６つのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異誘発アッセイ陰性発癌物質（エチレンチオ尿素、１，４−ジオキサン、エチルアクリレート、シクロスポリン、フルフラル、およびベンゼン）の迅速発癌性試験を完了したか、または既に開始している（表２）。これらの発癌物質の中で、シクロホスファミド、プロカルバジン、チオテパ、フェナセチン、シクロスポリン、およびベンゼンは、ヒト発癌物質として分類されるか（グループ１）、またはヒトにおいておそらく発癌性である（グループ２Ａ）。本発明者らは、少なくともさらに２つのｓａｌｍｏｎｅｌｌａ陽性トランス種発癌物質（クペロンおよびメルファラン）およびさらに１つのｓａｌｍｏｎｅｌｌａ陰性発癌物質（ジエチルスチルベストロール）を用いて試験を実施する予定である（表２）。メルファランおよびジエチルスチルベストロールは、ヒト発癌物質として分類される。これらの発癌物質の６ヶ月発癌性試験は、このＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスが、遺伝子毒性発癌物質および／または非遺伝子毒性発癌物質の迅速かつ正確な同定のための動物モデルとして有用であるか否かをさらに評価し得る。
【０１６２】
ヒト発癌物質同定における偽陽性の誤りは、適切な薬物開発の妨げとなり得、そして社会的な困惑を引き起こし得るので、発癌物質の推定過剰はできる限り回避しなければならない。従って、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウスが、非発癌物質に対して陰性反応を生じるか否かを明らかにしなければならない。１つのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異誘発アッセイ陽性非発癌物質（ｐ−アニシジン）および１つのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異誘発アッセイ陰性非発癌物質（レゾルシノール）の迅速発癌性試験が現在進行中である（表２）。この後、本発明者らは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ陽性非発癌物質およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ陰性非発癌物質に対してより傾注すべきである。本発明者らは、少なくとも４つのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ陽性非発癌物質（８−ヒドロキシキノリン、４−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミン、および２−クロロメチルピリジン）および３つのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ陰性非発癌物質（ロテノン、キシレン、二硫化テトラエチルチウラム）を用いた研究をＣＩＥＡで実
施する予定である（表２）。上述の化学物質の中の６つの化学物質を、日本および米国で同時に試験したか、または試験予定である（表３）。
【０１６３】
（表3  CB6F1-HRAS2マウスを用いる短期(26週)発癌性試験に関する米国−日本共同研究）
【０１６４】
【表６】
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会社1=山之内製薬株式会社
会社2=協和発酵工業株式会社。
【０１６５】
欧州連合、米国、および日本における化学物質の発癌能の評価のための現行の規制要件は、２種のげっ歯類における長期げっ歯類発癌性研究を約定している。長期バイオアッセイの費用、それらの広大な動物使用、乏しい基礎メカニズム、およびヒト危険性評価についての相対的に低い関連性のために、日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ）（ＩＣＨ）において、２種のげっ歯類を用いる２年発癌性試験間の必要性が、ヒト安全性を弱めることなく減じられ得るか否かが考慮されてきた。発癌物質同定のための短期バイオアッセイモデルとしてのｐ５３−ノックアウトマウスまたはＴＧ．ＡＣマウス（ｖ−Ｈａ−ｒａｓトランスジェニックマウス）のいずれかの使用についての検証に関する近年の研究が、ＮＩＥＨＳでＴｅｎｎａｎｔおよびその同僚によって実施されている（Ｔｅｎｎａｎｔら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１０３：９４２−９５０，１９９５）。現時点では、種々のトランスジェニック動物の間で、ｐ５３−ノックアウトマウス、ＣＢ６Ｆ１−ＨＲＡＳ２マウス、およびＴＧ．ＡＣマウスは、化学発癌物質の同定のための短期バイオアッセイモデルの最も有望な候補であるようである。なぜなら、有用性の可能性を示す相当量のデータが既に蓄積されているからである。Ｔｇマウスを用いる迅速発癌性試験システムの有用性および制限はまだなお十分に評価されていないが、潜在的な発癌物質を検出するためのＴｇマウスの使用は、ＩＣＨのガイドラインの一部としての議論の論題である。現在の２種のげっ歯類を使用する２年発癌性試験は１種（おそらくラット）を使用する２年試験、さらに短期のバイオアッセイおよびメカニズム研究に取って代わられる。
【０１６６】
（実施例９  ｒａｓＨ２マウスにおける再現性および反復性ある発癌性応答）
ｒａｓＨ２マウスモデルが、演出型レベルで再現性および反復性のある振舞いを備えるか否かを確認するため、特定の発癌物質に対する発癌性応答を多数の施設で調べ、腫瘍発生の発生率を施設間で比較した。
【０１６７】
（材料および方法）
発癌物質：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）（アルキル化剤および遺伝子毒性発癌物質）を陽性コントロール発癌物質として使用した。陽性コントロール群中のマウスに、クエン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ４．５）中に溶解した７５ｍｇ／ｋｇのＭＮＵの単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を与えた。７５ｍｇ／ｋｇの用量は、以前の用量発見研究に基づ
いて確立した。
【０１６８】
マウス：１９９７に、ｒａｓＨ２系統の核コロニー中のマウスをＣ５７ＢＬ／６に戻し交雑し、そして戻し交雑の世代はＮ１４を超えた。本研究では、１９９７〜１９９０年において財団法人実験動物中央研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ）（日本）によって生産されたＣＢ６Ｆ１−Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスを使用した。
【０１６９】
施設：マウスを、１１の異なる施設（三共製薬株式会社、田辺製薬株式会社、エーザイ株式会社、帝国臓器製薬株式会社、第一製薬株式会社、塩野義製薬株式会社、大日本製薬株式会社、三菱、藤沢薬品工業株式会社、ワイス株式会社、および日本新薬株式会社）に供給した。各施設での全ての作業を、ＩＬＳＩ、ＡＣＴ（国際生命科学協会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、発癌性試験の代替（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ））プロジェクトとしてＣＩＥＡのＵｓｕｉ氏によって実施した。
【０１７０】
（結果）
噴門洞、皮膚、および膣における腫瘍（例えば、扁平上皮腫瘍）、ハーダー腺（Ｈａｒｄｒｉａｎ  ｇｌａｎｄ）における癌、肺における腺腫、ならびに悪性リンパ腫の発生率は、ＭＮＵ処理ｒａｓＨ２マウスにおいて増大した。噴門洞腫瘍（図２５）および悪性リンパ腫（図２６）の高くて、一貫した発生率が、施設間で観察された。陽性コントロールとしてのＭＮＵに対するｒａｓＨ２マウスの発癌物質の振舞い全体が、質的および量的にも一貫した確固とした陽性応答に基づいて十分であると判断された（Ｕｓｕｉ，Ｔ．，ら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２９（Ｓｕｐｐｌ．）：９０−１０８，２００１）。
【０１７１】
明細書全体の全体にわたって引用した全ての参考文献、および本明細書中に引用した参考文献は、参考として本明細書中に援用される。本発明はそれらの特定の実施形態に関して説明されているが、種々の変更がなされ、そして均等が本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく置換され得ることを、当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、組成物、プロセスなどを採用するために、多くの改変がなされ得る。全てのこのような改変は、本明細書に添付した特許請求の範囲の範囲内である。
【０１７２】
表Ａは、本願のための実験において使用した材料および方法を示すチャートである。
【０１７３】
【表７】
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（配列表）
【化１】
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【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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