(57)【要約】【課題】  分散媒に分散させた際、沈降や二次凝集が生じることがなく、分散安定性に優れるため、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、抗体、ウイルス、タンパク質等の生体分子の抽出・分離・精製・濃縮に用いる磁性粒子を提供すること。【解決手段】  少なくとも磁性体を含有するとともに、表面がシリカにより被覆された粒子からなり、分散媒に分散させた前記粒子を沈降させ、前記分散媒と水とを置換した後、前記粒子を再分散させ再び沈降させる工程を、前記粒子を沈降させた分散媒の上澄み液の伝導率が３００μＳ／ｃｍ以下となるまで繰り返す精製処理が施され、生体分子の抽出、分離、精製又は濃縮に用いることを特徴とする磁性粒子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも磁性体を含有するとともに、表面がシリカにより被覆された粒子からなり、
分散媒に分散させた前記粒子を沈降させ、前記分散媒と水とを置換した後、前記粒子を再分散させ再び沈降させる工程を、前記粒子を沈降させた分散媒の上澄み液の伝導率が３００μＳ／ｃｍ以下となるまで繰り返す精製処理が施され、
生体分子の抽出、分離、精製又は濃縮に用いる
ことを特徴とする磁性粒子。
【請求項２】
超純水中又は１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液中におけるゼータ電位が絶対値で２５ｍＶ以上である請求項１に記載の磁性粒子。
【請求項３】
前記精製処理は、前記上澄み液の伝導率が３０μＳ／ｃｍ以下となるまで繰り返す請求項１又は２に記載の磁性粒子。
【請求項４】
前記シリカによる被覆は、少なくとも磁性体を含有する粒子の分散液に、アンモニア水を添加した後、オルトケイ酸テトラエチルを含む溶液を添加して反応させることにより形成される請求項１〜３のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項５】
前記表面がシリカにより被覆された粒子は、更にイオン性官能基を有する物質によりその表面が改質されている請求項１〜４のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項６】
前記イオン性官能基は、カルボキシル基である請求項５に記載の磁性粒子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の磁性粒子を分散媒に分散させてなることを特徴とする磁性粒子分散液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分散媒中で沈降や二次凝集が発生することがなく分散安定性に優れる磁性粒子、及び、該磁性粒子を用いた磁性粒子分散液に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、抗体、ウイルス及びタンパク質等の生体分子の抽出・分離・精製・濃縮等を行う方法として、磁性粒子を用いる方法が知られている。この磁性粒子を用いた生体分子の抽出方法等は、磁性粒子に目的の生体分子を吸着させた後、磁場を与えることにより磁性粒子を回収し、生体分子を抽出等する方法である。
例えば、磁性粒子を用いた生体分子の抽出等に関し、特許文献１には、磁性粒子の表面に炭素材料又は炭化物をコーティングしてなる粒子状担体が開示されている。
【０００３】
このような磁性粒子を用いた生体分子の抽出等において、磁性粒子は、通常、水又はアルコールを若干含む水溶液等の分散媒中に均一に分散した状態で使用される。しかしながら、磁性粒子は、磁性体を含むため密度が高く沈降しやすいものであった。また、磁性粒子同士の二次凝集も生じやすく、このような磁性粒子の二次凝集が生じると磁性粒子の沈降が一層発生しやすくなるため、磁性粒子を分散媒中に均一な状態で分散させることが困難となり、磁性粒子に生体分子を効率よく吸着させることができないという問題があった。
【０００４】
これに対し、磁性粒子の密度を低くすることにより、磁性粒子の沈降や磁性粒子同士の二次凝集等の問題が発生しにくくなることから、磁性体を密度の低い材料、例えばポリスチレン等ポリマーと混合することも考えられる。しかしながら、磁性粒子の密度を効果的に低下させようとすると、磁性粒子に含まれる磁性体の量をかなり減らす必要があり、そうすると磁性粒子の磁性が低下し、磁性粒子を磁石で回収する際の効率が低下するという新たな問題があった。
【０００５】
また、磁性粒子を用いた生体分子の抽出等に関し、生物分子と共有結合しうるような被膜で磁性粒子を被覆した磁気応答粒子も知られている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、通常、分散媒に分散させる粒子は、その粒径が大きくなればなる程沈降しやすくなる傾向にあり、特許文献２に開示された磁気応答粒子は、その周囲が生物分子と共有結合しうる被膜で被覆されているためその粒径が大きくなり、分散媒に分散させると沈降しやすいという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１２６５１０号公報
【特許文献２】特開昭６０−１５６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、分散媒に分散させた際、沈降や二次凝集が生じることがなく、分散安定性に優れる磁性粒子、及び、該磁性粒子を用いた磁性粒子分散液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、少なくとも磁性体を含有するとともに、表面がシリカにより被覆された粒子からなり、
分散媒に分散させた上記粒子を沈降させ、上記分散媒と水とを置換した後、上記粒子を再分散させ再び沈降させる工程を、上記粒子を沈降させた分散媒の上澄み液の伝導率が３００μＳ／ｃｍ以下となるまで繰り返す精製処理が施され、
生体分子の抽出、分離、精製又は濃縮に用いる
ことを特徴とする磁性粒子である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、水や有機溶媒のような分散媒に分散させて使用する際に、沈降や二次凝集が生じにくく、分散安定性に優れ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、抗体、ウイルス、タンパク質等の生体分子の抽出・分離・精製・濃縮、磁性を利用したドラッグデリバリーシステム、磁性流体・磁気粘性流体等に好適に用いることができる磁性粒子、及び、該磁性粒子を用いてなる磁性粒子分散液を提供することができる。
【００１０】
以下、本発明を詳述する。
本発明の磁性粒子は、超純水中又は１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液中におけるゼータ電位が絶対値で２５ｍＶ以上である。
本発明の磁性粒子のゼータ電位とは、固定層を有する固体（磁性粒子）が動くときの液体（分散媒）との間の電位差であり、微粒子の分散の特性を示すために通常用いられるパラメータである。なお、本発明の磁性粒子のゼータ電位の大きさを絶対値で規定したのは、本発明の磁性粒子のゼータ電位は、液体（分散媒）との関係で正又は負となることがあるからであり、本発明の磁性粒子のゼータ電位が電気的に同じ符号を持っていれば、磁性粒子同士の斥力が生じる。
【００１１】
本発明の磁性粒子の超純水中又は１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液中におけるゼータ電位の絶対値が２５ｍＶ未満であると、本発明の磁性粒子として磁性体の含有量が多く高密度のものや、一定以上の粒子径を有するものを用いた場合、分散媒に分散させると磁性粒子同士の斥力が小さくなって磁性粒子の沈降や磁性粒子同士の二次凝集が起こりやすくなり、磁性粒子の分散安定性が低下する。本発明の磁性粒子の超純水中又は１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液中におけるゼータ電位の絶対値は２８ｍＶ以上であることが好ましい。
【００１２】
本発明の磁性粒子としては特に限定されないが、少なくとも磁性体を含有するものである。
上記磁性体としては特に限定されず、例えば、超常磁性を示す鉄、ニッケル、コバルトやこれらを主成分とする化合物、又は、フェライトやマグネタイト等の酸化鉄素材料を挙げることができる。上記磁性体は、その粒径によって超常磁性を示したり、強磁性を示したりするものであり、これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１３】
また、本発明の磁性粒子をＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、抗体、ウイルス及びタンパク質等の生体分子の抽出等に使用する場合、本発明の磁性粒子には、更に上記生体分子を吸着可能な物質が含まれていてもよい。
上記生体分子を吸着可能な物質としては特に限定されず、例えば、特定の生体分子を吸着しうる官能基を持った物質、シリカ、炭素材料等公知の物質を挙げることができる。
【００１４】
本発明の磁性粒子の超純水中又は１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液中におけるゼータ電位の絶対値を２５ｍＶ以上とする方法としては特に限定されず、例えば、合成後の上述した磁性体からなる微粒子（以下、原微粒子ともいう）の表面を化学的に改質した後、この表面改質後の微粒子（以下、改質微粒子ともいう）の表面の精製を充分に行う方法等を挙げることができる。
【００１５】
上記原微粒子の表面を化学的に改質する方法としては特に限定されず、例えば、イオン性官能基を有する物質を上記原微粒子の表面に付着させる方法等を挙げることができる。
【００１６】
上記イオン性官能基としては特に限定されず、例えば、シラノール基、カルポキシル基、スルホン酸基、リン酸基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基等を挙げることができる。
また、上記イオン性官能基を有する物質としては特に限定されず、例えば、シリカ、オルトケイ酸テトラエチル等のケイ酸化合物、クエン酸、リンゴ酸、グリシン、グルタミン、システイン、アデノシン３’−リン酸、グアノシン３’−リン酸、スルホサリチル酸等を挙げることができる。
【００１７】
上記改質微粒子の表面を精製する方法としては特に限定されず、例えば、分散媒に分散させた上記改質微粒子を遠心分離機等により沈降させ、分散媒を水と置換し、超音波処理等により再分散させ、再び遠心分離機等により上記改質微粒子を沈降させる工程を、上記改質微粒子を沈降させた分散媒の上澄み液の伝導率が一定値以下となるまで繰り返し行う方法等を挙げることができる。
【００１８】
このような改質微粒子の精製は、上記分散媒の上澄み液の伝導率が好ましくは３００μＳ／ｃｍ以下、より好ましくは３０μＳ／ｃｍ以下となるまで行う。上記分散媒の上澄み液の伝導率が３００μＳ／ｃｍを超えると、上記改質微粒子の表面の精製が不充分であり、得られる本発明の磁性粒子の超純水中又は１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液中におけるゼータ電位の絶対値が２５ｍＶ以上とならないことがある。
【００１９】
上記改質微粒子の表面を精製することにより、上記改質微粒子の表面に緩く物理的に結合した改質物を充分に取り除くことができる。このように改質微粒子の表面を精製することも、本発明の磁性粒子のゼータ電位の絶対値を大きくすることに大きく寄与するものと考えられる。
【００２０】
上記原微粒子の表面改質、及び、上記改質微粒子の精製処理を行うことにより、超純水中又は１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液中におけるゼータ電位の絶対値が２５ｍＶ以上である本発明の磁性粒子を得ることができる。なお、本発明では、上記原微粒子の表面改質、及び、上記改質微粒子精製処理を行った後、更に上記イオン性官能基を有する物質により表面改質を行ってもよい。本発明の磁性粒子のゼータ電位の絶対値がより大きくなり、沈降や二次凝集等がより生じにくくなるからである。
【００２１】
また、原微粒子の表面が磁性物質からなる磁性粒子の場合、磁石等を近づけることにより磁化され、粒子同士が接触して凝集しやすくなる。この現象は、一旦磁化されると残留磁力が生じるためと考えられ、磁石を近づける工程を何回も繰り返すと、凝集がひどくなって分散媒に分散させた磁性粒子が沈降する傾向にある。
【００２２】
このような現象を防止するためには、本発明の磁性粒子の表面を非磁性物質により被覆することが好ましい。
このような構造の磁性粒子、即ち、超純水中又は１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液中におけるゼータ電位の絶対値が２５ｍＶ以上であり、かつ、その表面が非磁性物質により被覆されている磁性粒子も本発明の１つである。
【００２３】
上記非磁性物質としては特に限定されず、例えば、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸等の有機物；硫化亜鉛、シリカ、チタニア、セリア等の無機物；銀、金、ニッケル等の金属等を挙げることができる。
【００２４】
また、上記非磁性物質により被覆された本発明の磁性粒子は、更に上述したイオン性官能基を有する物質によりその表面が改質されていてもよい。本発明の磁性粒子のゼータ電位の絶対値をより大きなものとすることができるからである。
【００２５】
本発明の磁性粒子は、超純水中又は１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液中におけるゼータ電位の絶対値が２５ｍＶ以上と大きく、分散媒に分散させた際の磁性粒子間の斥力が大きいため、充分な磁性を有し、かつ、その密度が高かったり、粒径の大きなものであっても、分散媒に分散させた場合に沈降や粒子同士の二次凝集が起こりにくく、分散安定性に優れたものとなる。
【００２６】
本発明の磁性粒子は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、抗体、ウイルス、タンパク質等の生体分子の抽出・分離・精製・濃縮に用いる磁性粒子、磁性を利用したドラッグデリバリーシステムに用いる磁性粒子、及び、磁性流体・磁気粘性流体に用いる磁性粒子のように、水や有機溶媒等の分散媒に分散させて使用する磁性粒子として用いる場合に効果的である。
本発明の磁性粒子を分散媒に分散させてなる磁性粒子分散液もまた、本発明の１つである。
【００２７】
本発明の磁性粒子分散液において、上記分散媒としては特に限定されず、例えば、水；メタノール、エタノール、プロピルアルコール等の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級ケトン；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の低級エーテル；酢酸メチル、酢酸エチル、蟻酸ブチル等の低級エステル；ジメチルフォルムアミド、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素等を挙げることができる。なかでも、環境への負荷が小さいことから水が好ましい。これらの分散媒は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２８】
また、本発明の磁性粒子分散液において、上記分散媒は分散剤を含んでいてもよい。上記分散剤としては特に限定されず、例えば、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム等公知のものを挙げることができる。
【００２９】
本発明の磁性粒子分散液は、本発明の磁性粒子を分散媒に分散させてなるため、上記磁性粒子として、高密度で充分な磁性を有するとともに粒径の大きなものを用いることができ、磁性粒子の沈降や磁性粒子同士の二次凝集等が発生することがなく、磁性粒子の分散安定性に優れるとともに、外部磁場をかけることにより上記磁性粒子を好適に回収することができる。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
表面改質フェライト粒子の合成
平均粒径約１３０ｎｍのフェライト粒子（堺化学工業社製、ＭＺＦ−８２００）１ｇをデシケータ中に数日間放置して充分に乾燥させた後、エタノール（和光純薬社製、特級）１２０ｍＬを添加し、３０Ｗの超音波処理機に６０分間かけて分散させた。超純水８ｍＬと２８％アンモニア水（ナカライテスク社製、特級）２５ｍＬを添加し、３０分間よく攪拌した。
続いて激しく攪拌しながら室温下でオルトケイ酸テトラエチル１２ｇとエタノール６０ｍＬとの混合溶液を添加し、３時間反応させてフェライト粒子を表面改質した表面改質フェライト粒子を得た。
【００３２】
表面改質フェライト粒子の精製
得られた表面改質フェライト粒子の分散液を遠心分離機にかけて表面改質フェライト粒子を沈降させた。上澄み液を取り去り新たにエタノールを添加して超音波処理して表面改質フェライト粒子を分散させた上で、再び遠心分離機にかけて沈降させた。この工程を繰り返し３回行い、更にエタノールを超純水に代えて行い、最終的に上澄み液の伝導度が３０μＳ／ｃｍ以下になるまで表面改質フェライト粒子を精製した。得られた表面精製フェライト粒子のゼータ電位を下記の方法により測定した。結果を表１に示した。
【００３３】
（ゼータ電位の測定）
得られた表面精製フェライト粒子に超純水を添加し、５ｗｔ％の分散液を調製し、該分散液について、電気泳動光散乱光度計（大塚電子社製、ＥＬＳ−８００）により分散している表面精製フェライト粒子のゼータ電位を測定した。なお、測定においては、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（１０ｍＷ）を光源とし、このレーザーによる散乱光のドップラー・シフト量を求めることにより表面精製フェライト粒子の電気泳動速度を求め、その値からゼータ電位を求めた。
【００３４】
（沈降性評価）
得られた表面精製フェライト粒子に超純水を添加し、５ｗｔ％の分散液を調製した。内径６ｍｍの細長い試験管に高さが３０ｍｍになるように分散液を入れ、３０分超音波処理機にかけた後、表面精製フェライト粒子が沈降して上澄み層ができる様子を肉眼で１０分間観察した。なお、上澄み層かどうかは、試験管内の分散液を通して、反対側が透けて見えるか見えないで判断した。結果を表１に示した。また、表１中○は、上澄み層が形成されていないことを示し、×は上澄み層が形成されていることを示す。
【００３５】
続いて、市販の強力な磁石を使って一旦凝集させた表面精製フェライト粒子を３０分超音波処理機にかけて再分散させ、再度沈降性評価を行った。結果を表１に示した。なお、表１中○は、上澄み層が形成されていないことを示し、×は上澄み層が形成されていることを示す。
【００３６】
（実施例２）
実施例１で得られた、表面精製フェライト粒子１ｇを充分乾燥させた上で、エタノール１００ｍＬを添加し、超音波処理機に６０分間かけて分散させた。その後、シランカップリング剤（日本ユニカー社製、Ａ−１８７）０．２５ｇを、少量のエタノール／水＝９／１の溶液に溶かし、酢酸（ナカライテスク社製）でｐＨ＝約４に調整したものを添加し、６０分間攪拌しながら反応させた。
その後、遠心分離機で表面精製フェライト粒子を回収し、シャーレの上に広げて、１１０℃の乾燥機で６０分間乾燥させ、エタノールを用いて３度洗浄して表面精製フェライト粒子を精製した。
【００３７】
その後、グリシン（和光純薬工業社製、特級）０．１６ｇを、水２０ｍＬ、微量のアンモニア水に溶解したものを添加し、５０℃で３０分間攪拌しながら反応させ、カルボキシル基表面改質フェライト粒子を作製した。
その後、超純水を使用して、上澄み液の伝導度が３０μＳ／ｃｍ以下になるまでカルボキシル基表面改質フェライト粒子の精製を行った。
そして、実施例１と同様にカルボキシル基表面改質フェライト粒子のゼータ電位の測定及び沈降性評価を行った。結果を表１に示した。
続いて、市販の強力な磁石を使って一旦凝集させたカルボキシル基表面改質フェライト粒子を３０分超音波処理機にかけて再分離させ、再度沈降評価を行った。結果を表１に示した。
【００３８】
（比較例１）
フェライト粒子を、エタノールで３度洗浄し、更に超純水を用いて、上澄み液の伝導度が３０μＳ／ｃｍ以下になるまで粒子を精製した。
そして、実施例１と同様に比較例１に係るフェライト粒子のゼータ電位及び沈降性評価を行った。結果を表１に示した。
続いて、市販の強力な磁石を使って一旦凝集させた比較例１に係るフェライト粒子を３０分超音波処理機にかけて再分離させ、再度沈降評価を行った。結果を表１に示した。
【００３９】
（比較例２）
実施例１で、オルトケイ酸テトラエチル１２ｇとエタノール６０ｍＬとの混合溶液を添加し、３時間反応させたところを、３分間反応させた以外は、実施例１と同様に行った。日本フィリップス社製、ＥＤＡＸ−ＤＸで元素分析を行ったところ、Ｓｉのピークが確認されて、フェライト粒子の表面が改質されたことが確認できた。
そして、実施例１と同様に比較例２に係る表面改質フェライト粒子のゼータ電位及び沈降性評価を行った。結果を表１に示した。
続いて、市販の強力な磁石を使って一旦凝集させた比較例２に係る表面改質フェライト粒子を３０分超音波処理機にかけて再分離させ、再度沈降評価を行った。結果を表１に示した。
【００４０】
【表１】
2010123984.tif 000002