(57)【要約】【課題】一本の探針により探針−試料間距離一定モードで走査し形状イメージングを行うと共に電気化学イメージング行う、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡測定法、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡、その探針および探針の製造方法を提供する。【解決手段】中空基材の一端を先鋭化し先端部２５ｂとして先端を切断してなる先端面に、ファラデー電流の計測を行うＳＥＣＭ電極２６Ａを備えると共に、中空基材の中空部２５ａ１内に、中空部２５ａ１内を満たす電解質の先端面の開口２５ｃ１からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極２７を備えた探針２１を使用する。探針２１を、探針−試料間距離一定モードで試料表面に沿って相対的に走査移動し、ＳＩＣＭ電極２７で計測するイオン電流を距離制御フィードバック信号に利用しつつ、ＳＥＣＭ電極２６Ａで試料表面の電気化学イメージングを行うと共に、ＳＩＣＭ電極２７で試料表面の形状イメージングを行う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空基体の一端を先鋭化しかつ先端を切断して中空部に満たす電解質を流出する開口を有して形成された探針本体の先端面に、探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するＳＥＣＭ電極を備え、さらに上記中空部内に上記開口から流出する電解質のイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極を備えてなる探針を、上記ＳＩＣＭ電極で計測するイオン電流を距離制御フィードバック信号に利用しつつ、探針−試料間距離一定モードで試料表面に沿って相対的に走査移動し、上記ＳＥＣＭ電極で試料表面の電気化学イメージングを行うと共に、上記ＳＩＣＭ電極で試料表面の形状イメージングを行う、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡測定法。
【請求項２】
レーザー光を前記探針の中空基材を通して試料に照射して、上記電気化学イメージングと上記形状イメージングとともに光学測定を同時に行う、請求項１記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡測定法。
【請求項３】
中空基材の一端を引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し先端を切断し先端面に中空部を露出する開口を有する探針本体と、
上記探針本体に沿って絶縁状態に設けられた導電部が上記切断により上記探針本体の先端面に上記開口を取り巻くリング状又は上記開口に隣接して一定形状の露出した部分であって上記探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するＳＥＣＭ電極と、
上記中空部内に備えられていて該中空部内に満たされる電解質の上記開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極と、を有してなり、
ＳＥＣＭ電極とＳＩＣＭ電極に独立に電圧を印加されて上記ファラデー電流と上記イオン電流とを干渉を起こすことなく同時に検出する探針を備え、
該探針を、ＳＩＣＭ電極で計測したイオン電流を距離制御フィードバック信号に利用しつつ、探針−試料間距離一定モードで試料表面に沿って相対的に走査移動し、上記ＳＥＣＭ電極で電気化学イメージングを行うと共に、上記ＳＩＣＭ電極で形状イメージングを行う、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡。
【請求項４】
中空基材の先端部を引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し先端を切断し先端面に中空部を露出する開口を有する探針本体と、
上記切断により上記探針本体に沿って絶縁状態に設けられた導電部が上記探針本体の先端面に上記開口を取り巻くリング状又は上記開口に隣接して一定形状の露出電極であって上記探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するＳＥＣＭ電極と、
上記中空部内に備えられていて該中空部内に満たされる電解質の上記開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極と、を有してなり、
ＳＥＣＭ電極とＳＩＣＭ電極に独立に電圧を印加されて上記ファラデー電流と上記イオン電流とを干渉を起こすことなく同時に検出する、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項５】
前記探針本体が、一つの中空部を有する中空基材を使用してなり、中空基材の外周面を金属層で被覆され、さらに金属層の外周面を絶縁層で被覆された状態で、先端部がプラーにより先鋭化されかつ集束イオンビームで先端を切断されて平滑な先端面が形成され該先端面に中空部を露出する開口を有して形成された形態であり、
前記ＳＥＣＭ電極が、上記集束イオンビームの切断により上記探針本体の先端面に上記金属層が露出してなるリング状端面部であり、
前記ＳＩＣＭ電極が、上記中空部内に備えられていて該中空部内に満たされる電解質の上記開口からの流出量に応じたイオン電流を計測する構成である、請求項４に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項６】
前記探針本体は、一つの中空部を有する中空基材が使用され先端部がプラーにより先鋭化されかつ該中空部の内周面を覆って導電層が形成され、先端部が集束イオンビームで切断されて先端面が形成され該先端面に上記中空部を露出する開口を有する形態であり、
前記ＳＥＣＭ電極は、上記集束イオンビームの切断により上記探針本体の先端面に上記開口を取り囲んで形成された導電層のリング状の切断面部であり、
前記ＳＩＣＭ電極は、上記中空部内に備えられていて該中空部内に満たされる電解質の上記開口からの流出量に応じたイオン電流を計測する構成である、請求項４に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項７】
前記探針本体は、二つの中空部を有する中空基材を使用し一方の中空部に金属線を挿入し先端部をプラーで先鋭化しかつ集束イオンビームで切断して前記二つの中空部を露出する開口を有する先端面が形成されかつ前記一方の開口が前記金属線で閉塞された形態であり、
前記ＳＥＣＭ電極は、上記集束イオンビームの切断により上記探針本体の先端面に露出形成された金属線の切断面であり、
前記ＳＩＣＭ電極は、他方の中空部内に備えられ該中空部内に満たされる電解質の上記開口からの流出量に応じたイオン電流を計測する構成である、請求項４に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項８】
前記中空基材が、鉛ドープされたソーダガラス、ボロシリケイトあるいはクオーツキャピラリである、請求項４乃至７のいずれかに記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項９】
前記ＳＥＣＭ電極を形成する金属線が金あるいはプラチナからなる、請求項５又は７に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項１０】
前記ＳＩＣＭ電極を形成する金属線が銀／塩化銀電極からなる、請求項４乃至７のいずれかに記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項１１】
前記電解質が流出する前記中空部の開口径が１μｍ以下である、請求項７乃至１０のいずれかに記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項１２】
前記電解質が流出する中空部の開口径が１０ｎｍ〜１００ｎｍである、請求項４乃至７のいずれかに記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項１３】
前記ＳＥＣＭ電極の半径が１μｍ以下、前記ＳＩＣＭ電極を収容する中空部の開口径が１μｍ以下である、請求項７に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項１４】
前記ＳＩＣＭ電極を形成する金属線が銀／塩化銀電極からなる、請求項４又は１３のいずれかに記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。
【請求項１５】
中空部を有する中空基材の一端をプラーで引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、次いで集束イオンビームで先鋭化した先端を切断することにより上記中空部が露出する開口を先端面に備えた探針本体を形成すると共に、上記探針本体の形成と同時に又は形成後に上記探針本体に沿って導電部を絶縁状態に形成し上記切断により形成する先端面に同時に露出する切断面部をもって構成された上記探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するＳＥＣＭ電極を備え、前記中空部に電解質を満たすと共に該電解質の上記開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極を備える、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の製造方法。
【請求項１６】
一つの中空部を有する中空基材の外周面に金属層を被覆形成し該金属層を前記導電部とし、次いで該金属層を覆う絶縁層を形成し、次いで先端部をプラーで引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、次いで集束イオンビームで先端部を切断することにより上記中空部が開口露出する先端面を備えた探針本体を形成すると共に、上記切断により形成する先端面に同時に露出する前記金属層のリング状の切断面部をもって構成されたＳＥＣＭ電極を備え、前記中空部に電解質を満たすと共に該電解質の上記開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極を備える、請求項１５に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の製造方法。
【請求項１７】
一つの中空部を有する中空基材の一端をプラーで引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、次いで上記中空部にブタンガスを充填して炭化させることにより上記中空部の内周面に炭素電極層を形成し該炭素電極層を前記導電部とし、次いで集束イオンビームで先端を切断することにより、上記中空基材を先鋭化した先端部を有しかつ中空部が露出する先端面を備えた探針本体として形成すると共に、該炭素電極層の上記探針本体の先端面に露出するリング状の端面部をもって構成されたＳＥＣＭ電極を備える、請求項１５に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の製造方法。
【請求項１８】
二つの中空部を有する中空基材の上記一方の中空部にＳＥＣＭ電極の形成用の前記導電部として金属線を挿入し、次いでプラーにより上記中空基材の先端部を上記金属線と共に引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、次いで集束イオンビームで先端部を切断することにより、上記他方の中空部が露出する開口を有する先端面を備えるとともに、該先端面に上記一方の中空部の開口を閉塞した状態に露出形成された前記金属線の切断面部にて形成されるＳＥＣＭ電極を備え、上記他方の中空部に電解質を満たすと共に該電解質の該中空部の開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極を備える、請求項１５に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の製造方法。
【請求項１９】
二つの中空部を有する中空基材の上記一方の中空部にＳＥＣＭ電極Ａの形成用の前記導電部として金属線を挿入すると共に、上記他方の中空部に易エッチング線を挿入し、次いでプラーにより上記中空基材の先端部を上記金属線及び易エッチング線と共に引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化しかつ中空部の先端を閉鎖した状態とし、次いで易エッチング線を挿入した上記他方の中空部の先端部を露出して易エッチング線をエッチングして除去し、次いで集束イオンビームで先端部を切断することにより、上記他方の中空部が露出する開口を有する先端面を備えるとともに、該先端面に上記一方の中空部の開口を閉塞した状態に露出形成された前記金属線の切断面部にて形成されるＳＥＣＭ電極を備え、上記他方の中空部に電解質を満たすと共に該電解質の該中空部の開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極を備える、請求項１６に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型プローブ顕微鏡の範疇に含まれるもので、一本の探針により探針−試料間距離一定モードで走査し形状イメージングを行うと共に電気化学イメージング行う、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡測定法、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡、その探針および探針の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９３１年にE.Ruskaにより電子を利用した走査型電子顕微鏡（Scanning Electric Microscope; ＳＥＭ）が開発された。ＳＥＭの分解能はオングストロームオーダーに達し、ウィルスやＤＮＡの測定が可能であり、生化学の発展に多大の影響を与えた。しかし、真空中で測定が行われるため、生物を『生きた状態』で観測することはできない。
【０００３】
走査型プローブ顕微鏡（Scanning Probe Microscope;ＳＰＭ）は、先端を非常に鋭く尖らせた微小な探針（プローブ）を用いて試料表面をなぞるように走査し、試料表面の状態を評価する分析システムである。１９８１年に開発された走査型トンネル顕微鏡（Scanning Tunnel Microscopy；ＳＴＭ）は、プローブのトンネル電流をフィードバックして垂直方向の分解能を原子・分子のレベルで制御でき、形状測定を行う。
【０００４】
ＳＰＭのバイオロジーへの応用は、1985年に原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscopy；ＡＦＭ）が開発されたことに端を発する。ＡＦＭは導電性のない試料の測定も可能であるため、液中での生物を生きた状態で観察可能である。そのため、リアルタイムでイメージングを行うことで、ナノメートルスケールの生体分子の動的挙動が観察できる。しかし、溶液中で１０ｎｍほどの厚さの生細胞の形状を高解像度で測定することは、現在でも困難とされている。さらにＡＦＭでは、極めて柔らかい試料や１０μｍ程度の表面凹凸のある試料の測定が困難である。
【０００５】
走査型電気化学顕微鏡(Scanning Electrochemical Microscopy； ＳＥＣＭ)は、プローブとしてマイクロ電極を用い、局所領域において試料表面に電極を近接させ電気化学反応種をファラデー電流として定量評価するものであり、微量で分解されやすい神経伝達物質や一酸化窒素の検出に有効である。この際、一定の電位に保持するため、充電電流の影響は現れない。また、局所的に化学反応を誘起させることが可能となり、生体試料の表面や代謝の評価に有効である。
【０００６】
電気化学測定は、時間分解能が非常に高く、in situで定量測定が可能であり、生体試料の計測に有効である。特に、マイクロ電極では、マクロ電極にはない次のような特徴を有する。
（１）酸化還元電位を印加した際にファラデー電流／充電電流が非常に大きく、高速・高感度な測定が可能である。
（２）測定電流が微小であるため、低電解質溶液中での測定が可能であり、ＩＲドロップを抑えられる。
（３）電子移動反応が十分に速い場合、電気化学反応種が球面拡散状態となり、定常電流が得られる。
【０００７】
しかし、ＳＥＣＭはマイクロ電極を用いるため、ＳＴＭやＡＦＭのような解像度を得ることはできない。ＳＥＣＭにおいて、解像度の向上には電極半径の微細化と電極を試料に近接させる必要がある。
【０００８】
ＳＥＣＭの測定は、試料が生成した物質を電極が検出するＧＣモードと、電極でのレドックス反応により生成した物質を試料が再生し、再び電極表面で反応が起こるＦＢモードに大別できる。
ＧＣモードは、はじめ溶液中に反応物が存在しないため、バックグラウンドの電流を非常に低くできる。そのため検出感度が非常に高い。また、酵素の反応時間とともに生成物が多くなるため、生成物を蓄積させることができる。細胞の代謝物（一酸化窒素、神経伝達物質）の検出は、ＧＣモードである。
ＦＢモードは、基質添加後の反応時間に影響を受けず、また、レドックスサイクルが電極−試料間距離に依存するため、解像度の高い測定が可能である。低濃度のメディエータを用いることで、電極でのメディエータの直接酸化電流を低く抑えることができる。金属パターンの測定や、親水性メディエータ（細胞膜を透過できない）を用いた細胞の形状測定がＦＢモードである。
【０００９】
電気化学反応種が溶液に均一に存在する系では、探針の高さを一定に保ち測定を行うと、試料表面の凹凸に対応してＦＢ効果が働き、形状測定が可能である。しかし、形状ではなく生細胞の代謝物などを測定する不均一系では、細胞の凹凸によるネガティブＦＢ効果を無視できなくなる。また、代謝物の濃度は距離に反比例するので、細胞からの距離が離れるほど低くなる。そのため電極を細胞に近接させる必要がある。しかし、電極が微細な場合に、電極を検出可能な距離、すなわち電極半径以下まで近接させることが困難となる。このように、微小電極を用いた検出物の高感度測定には望まないＦＢ効果の除去が不可欠であり、電極―サンプル間距離をできる限り近づけ、一定に保つ制御システムを導入する必要がある。
【００１０】
走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）は、先端を非常に鋭く尖らせた探針と試料との間に生じる作用を利用して探針と試料との距離を一定に保つ形状測定モードと、表面で生じる作用から表面状態を観察する表面観察モードとに大別される。表面観察モードによる測定では、探針を水平移動させるのが一般的であるが、凹凸の激しい生体試料では、できるだけ探針を試料に近接させる必要がある。そのため、一般的に、探針と試料との力学的な相互作用を利用して、探針を試料に対して一定距離に近接させ測定を行う形状測定モードが採用されている。
【００１１】
ＳＥＣＭは、試料表面の近傍の化学的な変化を高解像度で観察するための顕微鏡であり、試料が設置されている電気化学セルおよび四つの電極、即ち、プローブとしてのtip電極、試料側の電極、対極（auxiliary）及び参照（reference）電極とそれらの電極信号の検出・制御用のバイポテンショスタットとを含んで構成され、試料表面の近傍を微小探針でスキャンし、微小探針で起こる反応を画像化し、又は反応速度の定量を行うなどのために使用する顕微鏡である。
【００１２】
ＳＥＣＭは、二次元ステージに載置した試料に対応する上方の任意の高さに探針（プローブ）を位置させ、コンピュータ制御でステージを駆動し試料を二次元方向に走査し、探針で試料表面の近傍をスキャンし、試料の局所領域の化学反応に関する定量的な情報を微小探針で得ることができ、または微小探針で局所領域に化学反応を誘起することができかつ化学反応の定量的な情報を微小探針で得ることができ、微小探針で得られた定量的な情報についてバイポテンショスタットを用い、酸化還元反応下での局所的情報を直流電気信号で検出し、電気化学イメージングを行い、すなわち、画像化・視覚化を行い、電気化学計測、データ解析を行う顕微鏡である。
ＳＥＣＭは、生体・細胞サンプル、細胞及び生体膜の機能評価、半導体などの材料の評価・表面観察・修飾加工、局部腐食、液／液界面を経由するイオン・電子移動反応、電極表面研究など、幅広い分野の研究で応用されてきた。
【００１３】
ＳＥＣＭは、特に、局所領域の電気化学反応種の定量に有効であり、生体試料をその場で測定できるため、生体分子の機能評価に応用されてきた。ＳＥＣＭによる電気化学測定は、時間分解能が非常に優れているため、リアルタイムで細胞表面の状態を評価可能であるが、細胞表面の局所領域における試薬に対する応答を評価するには、局所領域での試薬のインジェクションを同時に行う必要がある。生体試料の測定においても距離制御は重要であり、できる限り電極を試料表面に近接させる必要がある。
【００１４】
ＳＥＣＭは、溶液中で電気化学測定を行う際、試料形状の影響を受けずに測定するには電極一試料間距離を一定にする必要があるが、高性能な距離制御機能を有していない。ＳＥＣＭは、形状測定モードにおいては、溶液中で電気化学測定を行う際、力学的相互作用が極めて低感度になるので、高性能な距離制御機能を有していないから高精密な電気化学イメージングが行えなかった。即ちＳＥＣＭ研究では、ＳＰＭのカテゴリーの中では例外的に、ほとんどの画像が距離制御機構を用いない高さ一定モードで取得されてきた。
【００１５】
ＳＥＣＭでは、constant current 距離制御が行われてきた。constant current 距離制御は、ＸＹ座標の変化に合わせて測定されるファラデー電流の電流値が一定となるように電極をＺ方向に対して距離制御を行いながら走査する。ＳＥＣＭでは、距離制御のためのプローブの加工が必要なく、電極の微細化、すなわち、電極半径およびＲＧを小さくすることにより形状測定の解像度が向上する。
Constant Current距離制御の弱点は、導電性と絶縁性の混在した試料の測定ができないこと、ファラデー電流がフィードバック信号に使用されてしまうため、凹凸以外に試料表面の情報を取得できないこと、試料表面に電極を近接させる際に、従来の力学的相互作用を利用した距離制御システムが、試料に対してダメージを与える虞があること、が挙げられる。
【００１６】
そこで従来から、ＳＥＣＭについて、高性能な距離制御機能を保有させる研究が行われている（非特許文献１〜１０）。
非特許文献１には、SchuhmannらがＳＥＣＭにシアフォース距離制御を取り入れたが、生細胞のイメージングには成功していないことが報告されている。非特許文献２には、Macphersonらは、原子間力顕微鏡に用いられる距離制御をＳＥＣＭに導入したが、ＡＦＭプローブの形状の影響で表面の状態を詳細に捉えることが困難であることが報告されている。非特許文献３には、Wipfらにより、インピーダンス距離制御も考案されたが、電極が微小になると距離制御が困難となることが報告されている。
【００１７】
非特許文献４には、イオン電流計測用電極に一定電位を印加し、探針を試料に近接させると溶液抵抗が上昇し探針−試料間距離がイオン電流値に依存して変化する現象が観測されるため、その距離範囲でイオン電流値が一定になるよう探針を試料と並行に、Ｘ−Ｙ平面、すなわち水平方向に走査することにより試料の形状イメージングを得ることができる、という報告がなされている。ところが、イオン電流値の安定性、探針の強度、探針−試料間の距離制御機構など技術的困難が多く、一般的に使用されるには至っていなかった。
【００１８】
非特許文献５には、1997年からKorchevらが精力的に走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（Scanning ion-conductance microscope； ＳＩＣＭ）のイメージングの改良に取り組んだことが報告されている。ＳＩＣＭは、１９８９年にHansmaにより発明されたイメージング技術であり、探針として、ガラスキャピラリに、電解液を充填し後方から電極を挿入したイオン電流計測用電極を用いている。
【００１９】
現在では、ＡＦＭでも取得困難な、極めて柔らかく、表面の高低差が著しい試料の形状を取得することが可能となったことが非特許文献６で報告されている。
【００２０】
ナノピペットをプローブとして用いてピペット先端部のイオン流をイオン電流として捉え、その信号をフィードバック制御することで溶液中の細胞表面の形状測定を完全に非接触で行うことが可能である。この特徴からＳＮＯＭ（走査型近接場光学顕微鏡）との融合技術が開発されたことが非特許文献７で報告されている。
【００２１】
本発明の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡およびその探針に対応する、電気化学計測とイオン電流計測の同時取得の検討およびそれを可能とする探針の開発の試みは、これまでに報告例がある（非特許文献８、非特許文献９）。非特許文献８でBardらにより、また非特許文献９でBaurらにより、それぞれプローブの先端部の形状が類似した探針電極についての報告がされているが、ナノメートルオーダーの先端径を実現するには至っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ludwig, M.; Kranz, C.; Schuhmann, W.; Gaub, H. E., Review of Scientific Instruments 1995, 66, 2857-2860.
【非特許文献２】Macpherson, J. V.; Unwin, P. R.; Hillier, A. C.; Bard, A. J., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6445-6452.
【非特許文献３】Kurulugama, R. T.; Wipf, D. O.; Takacs, S. A.; Pongmayteegul, S.; Garris, P. A.; Baur, J. E., Anal. Chem. 2005, 77, 1111-1117.
【非特許文献４】Hansma P. K.  et al, Science 1989, 243, 641-643.
【非特許文献５】Korchev Y. E.  et al, Biophys. J. 1997, 73, 653-658.
【非特許文献６】Novak P.  et al, Nature Methods, 2009, 6, 279-281.
【非特許文献７】Korchev, Y. E.; Raval, M.; Lab, M. J.; Gorelik, J.; Edwards, C. R. W.; Rayment, T.; Klenerman, D. Biophys. J. 2000, 78, 2675-2679.
【非特許文献８】Walsh, D.A.; Fernandez, J. L.; Mauzeroll, J.; Bard, A. J. *, Anal. Chem., 2005, 77, 5182-5188.
【非特許文献９】Spaine, T. W.; Baur, J. E., Anal. Chem. 2001, 73, 930-938.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明者らも、探針の製作において、イオン電流と酸化還元電流の同時取得を試みた。その結果、ナノメートルスケールの微細な開口を有するプローブの作製は極めて困難であった。また、プローブの外面に金属層を形成するスパッタリングを行う際に、ガラス表面が疎水化するため、プローブの空洞部の電解質と測定溶液とを導通させることが困難であった。そのため、再現性の良い微小電極を有する探針の製作が困難であった。また従来の距離制御を行わない高さ一定モードＳＥＣＭでは、数１０マイクロメートル四方のイメージング領域で単一細胞レベルの測定が空間分解能の限界であった。
【００２４】
上述したように、ＳＥＣＭを用いた電気化学測定を単一細胞の局所領域で行うには、高感度化が不可欠であり、拡散する電気化学反応種を計測するため、電極を微細化することと電極を試料表面に近接させることとが必要である。
【００２５】
本発明は、上述した点に鑑みて案出されたもので、生体素子（試料）の局所領域の生体反応（化学的な変化）を高解像度で画像化して観察することができると共に、生体素子（試料）の局所領域の表面形状を高解像度で画像化して観察することができる走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡およびその探針を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、探針について、先端径、リング電極径、絶縁層の膜厚などのパラメータを最適化し、先端面にＳＥＣＭ電極だけでなく、中空部を露出させイオン電流計測のための開口を形成し中空部内にＳＩＣＭ電極を備え、さらに、探針の先端の微小電極と試料との距離を制御する際のフィードバック信号としてイオン電流を利用することとした。その結果、本発明者らは、ＳＩＣＭの距離制御システムをＳＥＣＭに取り入れることができ、ＳＥＣＭにＳＩＣＭを融合させ、探針の微小な先端に形成したＳＥＣＭ電極及び開口を試料に対して完全非接触に近接させることが可能であり、ＳＩＣＭに基づく高分解能を有する形状イメージングと電気化学イメージングの同時取得が可能な微小電極を有する探針の製作に成功し、距離制御による電気化学測定の高感度化と局所領域での試薬のインジェクションを実現した。
【００２７】
上記構成により、ｎｍオーダのＳＥＣＭ−ＳＩＣＭ探針（機能複合型探針）を実現でき、かつ、イオン電流を利用したフィードバック距離制御システムにより探針と試料とを非接触・近接状態に距離一定として走査できるので、細胞表面の局所領域の形状計測と電気化学計測とをクロストークなく、高解像度の電気化学イメージングと形状イメージングとを同時に行えて、細胞表面の局所領域の評価が可能となった。
【００２８】
本発明の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡測定法は、中空基体の一端を先鋭化しかつ先端を切断して中空部に満たす電解質を流出する開口を有して形成された探針本体の先端面に、探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するＳＥＣＭ電極を備え、さらに上記中空部内に上記開口から流出する電解質のイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極を備えてなる探針を、上記ＳＩＣＭ電極で計測するイオン電流を距離制御フィードバック信号に利用しつつ、探針−試料間距離一定モードで試料表面に沿って相対的に走査移動し、上記ＳＥＣＭ電極で試料表面の電気化学イメージングを行うと共に、上記ＳＩＣＭ電極で試料表面の形状イメージングを行う、ことを特徴とする。
【００２９】
本発明の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡は、中空基材の先端部を引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し先端を切断し先端面に中空部を露出する開口を有する探針本体と、探針本体に沿って絶縁状態に設けられた導電部が上記切断により探針本体の先端面に上記開口を取り巻くリング状又は開口に隣接して一定形状の露出した部分であって探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するＳＥＣＭ電極と、中空部内に備えられていて該中空部内に満たされる電解質の開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極とを有してなり、ＳＥＣＭ電極とＳＩＣＭ電極に独立に電圧を印加されてファラデー電流とイオン電流とを干渉を起こすことなく同時に検出する探針を備え、該探針を、ＳＩＣＭ電極で計測したイオン電流を距離制御フィードバック信号に利用しつつ、探針−試料間距離一定モードで試料表面に沿って相対的に走査移動し、ＳＥＣＭ電極で電気化学イメージングを行うと共に、ＳＩＣＭ電極で形状イメージングを行う、ことを特徴とする。
【００３０】
本発明の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針は、中空基材の先端部を引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し先端を切断し先端面に中空部を露出する開口を有する探針本体と、切断により探針本体に沿って絶縁状態に設けられた導電部が探針本体の先端面に上記開口を取り巻くリング状又は開口に隣接して一定形状の露出電極であって探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するＳＥＣＭ電極と、中空部内に備えられていて該中空部内に満たされる電解質の開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極とを有してなり、ＳＥＣＭ電極とＳＩＣＭ電極に独立に電圧を印加されてファラデー電流とイオン電流とを干渉を起こすことなく同時に検出する、ことを特徴とする。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、空洞とリング型の電極を同心状に有するタイプと、先鋭化した先端部の先端面に中空部の開口と電極とを有するダブルバレル型のタイプの２種類の探針の開発に成功した。２種類の探針の詳細については、実施形態において説明する。
【００３１】
本発明の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の製造方法は、中空部を有する中空基材の一端をプラーで引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、次いで集束イオンビームで先鋭化した先端を切断することにより中空部が露出する開口を先端面に備えた探針本体を形成すると共に、探針本体の形成と同時に又は形成後に探針本体に沿って導電部を絶縁状態に形成し切断により形成する先端面に同時に露出する切断面部をもって構成された探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するＳＥＣＭ電極を備え、中空部に電解質を満たすと共に該電解質の開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極を備える、ことを特徴とする。
【００３２】
探針本体の先端部の切断は、熱封止、研磨あるいは集束イオンビーム(focused ion beam；ＦＩＢ)を採用できるが、中でもＦＩＢの採用が好ましい。中空基材の先鋭化した先端部についてＦＩＢを利用して切断するＳＥＣＭ電極は、数百ナノメートルの電極を再現性よく作製することが可能である。ガラス表面の疎水化の問題については、界面活性剤を電解質に微量に加えることで解消した。これにより、再現性よく微小電極が作製可能であり、電極を試料に対して非接触で近接させる距離が安定して得られ、このため、局所領域において試薬のインジェクションを行う距離が安定し、その際の生体試料の応答を電気化学的に安定して検出可能である。
【００３３】
本発明によれば、イオン電流を利用したフィードバック距離制御システムにより探針と試料とを従来のＳＥＣＭでは実現できなかったナノメートルオーダーの非接触の至近距離に一定に保てるので、細胞など柔らかい試料の電気化学計測とイオン電流計測とを同時に行える探針を安定して製造することができ、ナノメートルオーダーの電気化学イメージングと形状イメージングとを同時に行うことができる。
【００３４】
本発明によれば、さらに局所インジェクションにより、生体試料の応答を電気化学的に検出可能であり、さらに、ＳＩＣＭシステムでは、局所領域に、イオン、タンパク質、ＤＮＡ、試薬などをインジェクション可能であり、ＳＥＣＭと融合させることで、局所刺激に対応した応答を検出可能となる。
【００３５】
本発明によれば、電気化学計測とイオン電流計測とを同時に行える探針を実現したものであり、さらに、イオン電流を距離制御フィードバック信号に利用したので、探針−試料間距離の距離制御、並びに形状イメージの空間分解能が、先端径（直径）に依存しほぼ同等となる。例えば、先端径（直径）１０ｎｍであれば、探針−試料間距離がほぼ１０ｎｍになり、形状イメージの空間分解能がほぼ１０ｎｍとなり、また先端径（直径）１μｍであれば、探針−試料間距離がほぼ１μｍになり、形状イメージの空間分解能がほぼ１μｍとなる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、生体素子（試料）の局所領域の生体反応（化学的な変化）をナノメートルオーダーの高解像度で画像化して観察することができると共に、生体素子（試料）の局所領域の表面形状をナノメートルオーダーの高解像度で画像化して観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の一実施形態に係る走査型電気化学イオンコンダクタンスの模式的な全体構成図である。
【図２】（ａ）は、上記一実施形態に係る走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の先端部の模式的な断面図であり、（ｂ）は端面図である。
【図３】図２の探針による試料表面の電気化学イメージングを行う状態を示す図である。
【図４】図２の探針の開口より電解質などのイオン流に基づくイオン電流を計測してリング型の探針と試料との距離を算出しイオン電流をステージのＺ軸のフィードバック信号に利用して形状イメージングを行う状態を示す図である。
【図５】（ａ）は、他の実施形態に係る走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の先端部の模式的な断面図であり、（ｂ）は端面図である。
【図６】（ａ）は、他の実施形態に係る走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の先端部の模式的な断面図であり、（ｂ）は端面図である。
【図７】図６の探針による試料表面の電気化学イメージングを行う状態を示す図である。
【図８】図６の探針の開口より電解質などのイオン流に基づくイオン電流を計測してダブルバレル型の探針と試料との距離を算出しイオン電流をステージのＺ軸のフィードバック信号に利用して形状イメージングを行う状態を示す図である。
【図９】（ａ）は図２の探針の先端部の電子顕微鏡像、（ｂ）は図２の探針の先端面をさらに拡大した電子顕微鏡像、（ｃ）は図２の探針のサイクリックボルタモグラムである。
【図１０】（ａ）は導電性基板のファラデー応答特性曲線を示すグラフであり、（ｂ）は導電性基板のイオン電流応答特性曲線を示すグラフである。
【図１１】実施例３に係り、（ａ）は西洋ワサビペルオキシダーゼパターンの形状イメージ、（ｂ），（ｃ）は電気化学イメージである。
【図１２】実施例４に係り、（ａ），（ｃ）はグルコースオキシダーゼ固定化基板の形状イメージ、（ｂ），（ｄ）は電気化学イメージである。
【図１３】実施例５に係り、（ａ），（ｂ），（ｃ）は異なる部位のラット心筋細胞の形状イメージおよび電気化学イメージである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ詳細に説明する。
【００３９】
〔第１の実施形態：顕微鏡の全体の構成及び顕微鏡測定法〕
図１に示すように、この実施形態に係る走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡(走査型ＳＥＣＭ−ＳＩＣＭ顕微鏡ともいう。)１は、Ｘ−Ｙ方向に移動するＸ−Ｙステージ２と、Ｘ−Ｙステージ２上に備えられた容器３と、容器３の底面に置かれる試料Ｔが設置される電気化学セル４と、探針２１と、試料電極（Sample Electrode）５と、対極６（Counter Electrode）と、参照電極（Reference Electrode）７と、それらの電極信号の検出・制御用のバイポテンショスタット８と、探針２１をＺ軸方向に移動制御するＺステージ９と、Ｘ−Ｙステージ２及びＺステージ９を移動制御しかつバイポテンショスタット８の制御信号に基づいて画像表示する制御装置（ＰＣ）１０と、を含んで構成される。バイポテンショスタット８は、一つの溶液系に対極６と参照電極７及び二つの作用電極を挿入し、参照電極７のターミナル電位に対する作用電極のターミナル電位をそれぞれ任意に規制して、各作用電極を流れる電流を測定し、測定情報を制御装置（ＰＣ）１０へ出力する。
【００４０】
この実施形態では、制御装置１０は、Ｘ−Ｙステージ２を駆動して探針２１を試料Ｔに対して相対的に走査したとき、探針２１の先端面の開口２５ｃ１から流出する電解質に含まれるイオン電流をＳＩＣＭ電極２７で計測し（図２参照）、このイオン電流を距離制御フィードバック信号に利用し、距離Ｚステージ９で探針２１をＺ軸方向に移動制御して探針２１と試料Ｔとの隙間が一定に保たれるようにする。
【００４１】
探針２１は、詳細な構成については後述するが、適用できるタイプが複数ある。例えば、図２に示す探針２１は、中空基体の一端をナノメートルオーダーに先鋭化しかつ先端を切断して中空部２５ａ１に満たす電解質を流出する開口２５ｃ１を有して形成された探針本体２５Ａの先端面に、探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測する直径１μｍ以下のＳＥＣＭ電極２６Ａを備え、さらに上記中空部２５ａ１内に上記開口２５ｃ１から流出する電解質のイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極２７を備えてなる。
【００４２】
上記構成のＳＥＣＭ−ＳＩＣＭ顕微鏡１によれば、探針２１を、ＳＩＣＭ電極２７で計測するイオン電流を距離制御フィードバック信号に利用しつつ、探針−試料間距離一定モードで試料Ｔの表面に沿って相対的に走査移動し、ＳＥＣＭ電極２６Ａで探針−試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測し試料表面の電気化学イメージングを行うと共に、ＳＩＣＭ電極２７でイオン電流を計測し試料表面の形状イメージングを行う。
【００４３】
この構成によれば、探針−試料間距離の距離制御、並びに形状イメージの空間分解能は、先端径（直径）に依存しほぼ同等となる。例えば、先端径（直径）１０ｎｍであれば、探針−試料間距離がほぼ１０ｎｍになり、形状イメージの空間分解能がほぼ１０ｎｍとなり、また先端径（直径）１μｍであれば、探針−試料間距離がほぼ１μｍになり、形状イメージの空間分解能がほぼ１μｍとなる。
【００４４】
容器３には、メディエータとして低濃度、例えばフェロセンメタノールを０．５ｍＭ含む測定溶液が充填される。
【００４５】
ＳＥＣＭおよびＳＩＣＭのフィルタリング速度をそれぞれ４０Ｈｚ、１ｋＨｚとして測定を行うのが良い。Ｘ−Ｙステージ２には、Physic Instruments(PI)社の６２１．２ＣＬを用いることができ、またＺステージ９には、Physic Instruments(PI)社のピエゾ素子を駆動源とする６２１．ＺＣＬを用いることができ、ステージコントローラからピエゾ素子を駆動する電圧を印加する。ステージコントローラの制御および電流信号の制御装置（ＰＣ）１０への取り込みは、Digital Signal Processor （ＤＳＰ）を用いることができる。ＤＳＰは、ＰＩ制御の演算処理を予め書き込むことで、ＰＣを介さずにフィードバック制御を行うことが可能であり、制御を高速化できる。
【００４６】
走査型ＳＥＣＭ‐ＳＩＣＭ顕微鏡は、Ｘ−Ｙステージ２に載置した試料Ｔに対応する上方の任意の高さに探針２１（プローブ）を位置させ、コンピュータ制御でＸ−Ｙステージ２を駆動して試料Ｔを二次元方向に走査し、探針２１で試料Ｔの表面の近傍をスキャンする。電気化学測定系には、バイポテンショスタット８として、通常のバイポテンショスタットの性能を持ちかつ高い時間分解能、即ち速い応答時間で電流計測を可能とする、２ｃｈのパッチクランプアンプ(Axon Instruments社のCurrent Amplifier, Multiclamp 700B)を用いる。ＳＥＣＭ電極２６Ａは、試料Ｔの局所領域の化学反応に関する定量的な情報を微小な探針２１で得ることができ、または探針２１で局所領域に化学反応を誘起することができかつ化学反応の定量的な情報を得ることができる。探針２１で得られた定量的な情報についてバイポテンショスタット８を用い、酸化還元反応下での局所的情報を直流電気信号で検出し、電気化学イメージングを行うことができる。すなわち、ＰＣ１０の表示装置にイメージを表示し視覚化を行い、電気化学計測、データ解析を行うことができる。
【００４７】
なお、ステージ９がなくステージ２がＸ−Ｙ−Ｚ方向に移動するＸ−Ｙ−Ｚステージとして構成されていても良いし、あるいはステージ２がなくステージ９が探針２１をＸ−Ｙ−Ｚ方向に移動するＸ−Ｙ−Ｚステージとして構成されていても良い。
【００４８】
〔第２の実施形態：探針２１の構成及び製造方法〕
図２〜図４に示すように、この実施形態の探針２１は、探針本体２５Ａと、ＳＥＣＭ電極２６Ａと、ＳＩＣＭ電極２７とを有してなる。
【００４９】
探針本体２５Ａは、一つの中空部２５ａ１を有する中空基材を使用してなる。探針本体２５Ａは、中空基材の一端を炭酸ガスプラーあるいは熱引きプラーにより引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化しかつ先端を集束イオンビームにより垂直に切断してなる先端部２５ｂを有する。探針本体２５Ａの先端部２５ｂの先端面には中空部２５ａ１を露出する開口２５ｃ１を有する。
探針本体２５Ａを構成する中空基材には、鉛ドープされたソーダガラス、ボロシリケイトあるいはクオーツキャピラリを用いると、プラーによる引き伸ばしが良好に行われうる。
【００５０】
ＳＥＣＭ電極２６Ａは、探針本体２５Ａに沿って絶縁状態に設けられた導電部の、探針本体２５Ａの先端面の開口２５ｃ１を取り巻く状態に露出してなるリング状端面部でなる。この実施形態では、リング状端面部は、探針本体２５Ａを構成する中空基材の外周面を導電層２６ａで被覆され、さらに導電層２６ａの外周面を絶縁層２８で被覆された状態で、プラーにより中空基材の先端部２５ｂと一体に先鋭化されかつ集束イオンビームで先端を切断されることにより、探針本体２５Ａの先端面の開口２５ｃ１を取り巻く状態に露出してなる。
導電層２６ａは、金属層であるのが好ましく、この実施形態では金（Ａｕ）又はプラチナ（Ｐｔ）を薄膜形成技術で、例えばスパッタリングにより２００ｎｍの膜厚となるように形成してなる。絶縁層２８は、この実施形態では電着塗装により薄膜形成する好ましく、具体的には、被膜を形成するポリマーが、例えば、ポリアクリル酸であるように電着により１０ｎｍ〜１μｍの厚さとなるように形成することが好ましい。膜厚は蒸着膜の場合は蒸着時間により、電着膜の場合は電流または電着時間により制御する。絶縁層はパリレンＣを用いてもよい。
ＳＥＣＭ電極２６Ａは、該ＳＥＣＭ電極２６Ａと試料Ｔの表面との間の電気化学反応に起因するファラデー電流を検出する。
【００５１】
ＳＩＣＭ電極２７は、中空部２５ａ１内に、この実施形態では銀線に塩化銀を析出させた銀／塩化銀電極を備えてなり、ＳＥＣＭ電極２６Ａと独立に電圧を印加されて、該中空部２５ａ１内に満たされる電解質の開口２５ｃ１からの流出量に応じたイオン電流を、ファラデー電流の検出と干渉を起こすことなく検出する。
電解質には例えばＣｌイオンが含まれていることが好ましい。その他、局所インジェクションにより、生体試料の応答を電気化学的に検出するために、電解質には、他のイオン、タンパク質、ＤＮＡ、試薬などを含めて電気泳動を利用してインジェクションが可能であるようにすることが望ましい。
【００５２】
電解質が流出する中空部２５ａ１の開口２５ｃ１の径は、１μｍ以下であることが好ましく、さらに、１０ｎｍ〜１００ｎｍであることが一層好ましい。
これらの寸法は、探針２３の最適化のパラメータであり、探針−試料間の距離制御、並びに形状イメージの空間分解能は、イオン電流を距離制御フィードバック信号に利用することと相俟って、開口２５ｃ１の直径に依存しほぼ同等となる。例えば、開口２５ｃ１の直径が１０ｎｍであれば、探針−試料間距離がほぼ１０ｎｍになり、形状イメージの空間分解能がほぼ１０ｎｍとなり、また開口２５ｃ１の直径が１μｍであれば、探針−試料間距離がほぼ１μｍになり、形状イメージの空間分解能がほぼ１μｍになる。
【００５３】
図３は、探針２１のリング型のＳＥＣＭ電極２６Ａにより試料表面の電気化学計測を行い電気化学イメージングを行う状態を示す図である。ＳＥＣＭ電極２６Ａは、試料の局所領域の表面に近接させると電気化学反応種をファラデー電流として酸化還元電流を観測することができる。探針２を試料Ｔから一定距離以上遠ざけると、探針２１のＳＩＣＭ電極２７において得られる電流は定常状態になる。探針２１を試料Ｔに近づけると、ＯのポジティブフィードバックによりＳＩＣＭ電極２７において得られる電流が増加し、探針２１を試料Ｔから遠ざけると、Ｏの拡散が妨げられＳＩＣＭ電極２７において得られる電流が減少する。
【００５４】
図４は、ＳＩＣＭ電極２７に係り、探針２１の先端開口２５ｃ１より流出する電解質に含まれるイオン流に基づくイオン電流を計測し、イオン電流をステージのＺ軸のフィードバック信号に利用し探針−試料間距離を一定となるように制御して試料表面の形状イメージングを行う状態を示す図である。探針２１は、探針２１の中空部２５ａ１が探針２１の先端で露出しており、イオン電流計測や薬剤導入−回収が可能である。
【００５５】
生細胞のように柔らかい試料の測定を行うための、ＳＩＣＭの距離制御は、２ｃｈのパッチクランプアンプを用いることで、ＳＩＣＭ極、ＳＥＣＭ極の電流のフィルタリング速度、ならびに印加電位を、それぞれ独立に設定することができ、ＳＩＣＭおよびＳＥＣＭのフィルタリング速度をそれぞれ１ｋＨｚ、４０ｋＨｚとして測定を行うようにすると、低電流（ｎＡ−ｐＡ）を高速（１ｋＨｚ以上）で検出することができ、もってＳＩＣＭの距離制御を行うことができて、生細胞のように柔らかい試料のＳＩＣＭイメージングを行うことができる。バイポテンショスタット８では、応答速度が非常に遅く（１−１０Ｈｚ）測定が困難であるので、ＳＩＣＭの距離制御は行えない。
【００５６】
この実施形態の探針２１は以下のように製造することができる。
まず、一つの中空部２５ａ１を有する中空基材２５Ａ’の外周面に導電層２６ａをスパッタリングにより被覆形成し、次いで該導電層２６ａを電着塗装のための一方の電極として該導電層２６ａを覆う絶縁層２８を形成し、次いで先端部をプラーで引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、次いで集束イオンビームで先端部を切断することにより中空部２５ａ１が開口２５ｃ１にて露出する先端面を備えた探針本体２５Ａを形成すると共に、上記切断により形成する先端面に同時に露出する金属層２４のリング状の切断面部をもって構成されたＳＥＣＭ電極２６Ａを備え、中空部２５ａ１に電解質を満たすと共にＳＩＣＭ電極２７を備える。
ＦＩＢは、探針２１で試料表面の観察を行いながら探針２１の先端部の切断が可能なため、特定の大きさのリング型電極を再現性よく作製可能となった。さらに、開口２５ｃ１と導電層２６ａの直径が非常に小さく、しかも探針２１の端面に形成されているため、試料Ｔに対して探針２１をアプローチさせやすく、試料Ｔに近接するリング部分の面積も、従来のコーンタイプに比べ広いため、試料の表面状態の測定に有効である。
これに対し、従来のＳＥＣＭ顕微鏡における探針の製造方法によれば、電着塗料の収縮を利用して開口の回りにコーン形状にＳＥＣＭ電極を露出形成していたので、ＳＥＣＭ電極を再現性よく露出させることは困難であった。また、コーン形状の電極は、理論的な解析が困難であり、試料に近接する電極面積が狭いため、表面状態を顕著に捉えることができなかった。
【００５７】
〔第３の実施形態：探針２２の構成及び製造方法〕
（内周リング型ＳＥＣＭ電極とＳＩＣＭ電極との複合機能探針）
図５に示すように、この実施形態の探針２２は、探針本体２５Ａと、開口２５ｃ１の内周に設けられるＳＥＣＭ電極２６Ｂと、ＳＩＣＭ電極２７とを有してなる。
【００５８】
探針本体２５ＡとＳＩＣＭ電極２７は、第２の実施形態の探針本体２５ＡとＳＩＣＭ電極２７の構成と同一である。探針本体２５Ａは、一つの中空部２５ａ１を有する中空基材を使用し、一端２５ｂをプラーあるいは熱引きプラーにより引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化しかつこの先端部２５ｂの先端を集束イオンビームにより垂直に切断してなる先端面に開口２５ｃ１を有している。ＳＩＣＭ電極２７は、中空部２５ａ１内に、この実施形態では銀／塩化銀電極を備えてなる。
【００５９】
ＳＥＣＭ電極２６Ｂは、第２の実施形態のＳＥＣＭ電極２６Ａの構成と相違している。ＳＥＣＭ電極２６Ｂは、探針本体２５Ａの中空部２５ａ１内に薄膜状に形成された導電部２６ｂの、開口２５ｃの内周縁に露出してなるリング状端面部である。この導電部２６ｂは、炭素層であり、具体的には、中空基材の一端がプラーにより先鋭化された後にブタンガスを導入し炭化して薄膜状に形成されている。
【００６０】
探針２２は以下のように製造することができる。
一つの中空部２５ａ１を有する中空基材の一端をプラーで引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、次いで上記中空部２５ａ１にブタンガスを充填して炭化させることにより中空部２５ａ１の内周面に導電部として炭素層２６ｂを被覆形成し、次いで集束イオンビームで中空基材の先端部２５ｂの先端を切断することにより、先鋭化した先端部２５ｂを有しかつ先端面に中空部２５ａ１が露出する開口２５ｃ１を備えた探針本体２５Ａとしている。そして、炭素層２６ｂの、探針本体２５Ａの先端面に露出するリング状の端面部をもってＳＥＣＭ電極２６Ｂを構成している。
【００６１】
〔第４の実施形態：ダブルバレル型の探針２３の構成及び製造方法〕
図６（ａ），（ｂ）に示すように、探針２３は、一の実施形態に係るダブルバレル型の探針であり、ダブルバレル型の探針本体２５Ｂと、ＳＥＣＭ電極２６Ｃと、ＳＩＣＭ電極２７とを有してなる。
【００６２】
探針本体２５Ｂは、隔壁によって分割された二つの中空部２５ａ２，２５ａ３を有する中空基材により形成されている。探針本体２５Ｂは、中空基材の一端を炭酸ガスプラーあるいは熱引きプラーにより引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化した先端部２５ｂを有しかつ先端を集束イオンビームにより垂直に切断してなる先端面を有する。探針本体２５Ｂの先端面には一方の中空部２５ａ２を露出する開口２５ｃ２を有する。
探針本体２５Ｂを構成するダブルバレル型の中空基材には、鉛ドープされたソーダガラス、ボロシリケイトあるいはクオーツキャピラリを用いる。
【００６３】
ＳＥＣＭ電極２６Ｃは、探針本体２５Ｂの先端面の他方の開口を閉塞し面一に露出してなる導電線２６ｃの端面部である。ＳＥＣＭ電極２６Ｃは、導電線２６ｃが探針本体２５Ｂの他方の中空部２５ａ３に挿入されて探針本体２５Ｂによって絶縁状態に設けられ、この状態で、プラーにより中空基材の先端部２５ｂと一体に先鋭化されることで、導電線２６ｃの断面が中空部２５ａ３の先鋭化による縮径断面に対応した異形となり、かつ集束イオンビームで先端を切断されることにより形成された露出断面部である。
導電線２６ｃは、この実施形態では金（Ａｕ）又はプラチナ（Ｐｔ）の線が用いられている。
図７に示すように、ＳＥＣＭ電極２６Ｃは、該ＳＥＣＭ電極２６Ｃと試料Ｔの表面との間の電気化学反応に起因するファラデー電流を検出する。
【００６４】
ＳＩＣＭ電極２７は、中空部２５ａ２内に、この実施形態では銀／塩化銀電極を備えてなり、図８に示すように、ＳＥＣＭ電極２６Ｃと独立に電圧を印加されて、該中空部２５ａ２内に満たされる電解質の開口２５ｃ２からの流出量に応じたイオン電流を、ファラデー電流の検出と干渉を起こすことなく検出する。
【００６５】
探針２３は、探針本体２５Ｂの先端外径が１．５μｍ以下であり、ＳＥＣＭ電極２６Ｃの直径が１μｍ以下、開口２５ｃ２の直径が１μｍ以下であることが望ましい。
これらの寸法は、探針２３の最適化のパラメータであり、探針−試料間の距離制御、並びに形状イメージの空間分解能は、イオン電流を距離制御フィードバック信号に利用することと相俟って、開口２５ｃ２の直径に依存しほぼ同等となる。例えば、開口２５ｃ２の直径が１０ｎｍであれば、探針−試料間距離がほぼ１０ｎｍになり、形状イメージの空間分解能がほぼ１０ｎｍとなり、また開口２５ｃ２の直径が１μｍであれば、探針−試料間距離がほぼ１μｍになり、形状イメージの空間分解能がほぼ１μｍになる。
【００６６】
この実施形態の探針２３は以下のように製造することができる。
二つの中空部２５ａ２，２５ａ３を有する中空基材の上記一方の中空部２５ａ３にＳＥＣＭ電極２６Ｃを形成するための導電線２６ｃを挿入し、次いでプラーにより中空基材の先端部２５ｂを導電線２６ｃと共に引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、次いで集束イオンビームで先鋭化した先端部２５ｂの先端を切断することにより、先端面に上記他方の中空部２５ａ２が露出する開口２５ｃ２を備えるとともに、該先端面に上記一方の中空部２５ａ３の開口を閉塞した状態に露出形成された導電線２６ｃの切断面部にて形成されるＳＥＣＭ電極２６Ｃを備え、上記他方の中空部２５ａ２に電解質を満たすと共に該電解質の開口２５ｃ２からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極２７を備える。
【００６７】
〔第５の実施形態：ダブルバレル型の探針の製造方法〕
図６（ａ），（ｂ）に示す探針２３について、他の製造方法について説明する。
第１工程：二つの中空部を有する中空基材の一方の中空部にＳＥＣＭ電極２６Ｃを形成するための金属線、例えば金線（Ａｕ）又はプラチナ線（Ｐｔ）を挿入すると共に、他方の中空部に易エッチング線、例えば銅線（Ｃｕ）を挿入する。
第２工程：プラーにより中空基材の先端部を金属線及び易エッチング線と共に引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化しかつ金属線を挿入した側の中空部の先端を閉鎖した状態とする。
第３工程：易エッチング線を挿入した上記他方の中空部２５ａ２の先端部を露出して易エッチング線をエッチングにより除去する。易エッチング線は銅以外であっても、銀、金または白金であっても電解エッチング法により開口を作製することができる。
第４工程：集束イオンビームで中空基材の先端部を切断することにより、易エッチング線を除去した側の中空部２５ａ２を先端面で露出させる開口２５ｃ２を備えるとともに、金属線を挿通した側の中空部の開口を該金属線で閉塞した状態として、該金属線の切断面部にて形成されるＳＥＣＭ電極２６Ｃを備える。
第５工程：易エッチング線を除去した側の中空部２５ａ２に、電解質を満たすと共に該電解質の該中空部の開口２５ｃ２からの流出量に応じたイオン電流を計測するＳＩＣＭ電極２７を備える。
【００６８】
さらに具体的に実施例により本発明を説明する。
【実施例１】
【００６９】
〔チップの形状〕
従来のプローブの作製は、電着塗料の収縮を利用して開口２５ｃを形成していたが、ＳＥＣＭに用いる電極部を再現性よく露出させることは困難であった。また、コーン形状の電極は、理論的な解析が困難であり、試料に近接する電極面積が狭いため、表面状態を顕著に捉えることができなかった。
そこで、ＦＩＢを用いて探針本体を構成する中空基体の先鋭化した先端部について、先端面を形成するための切断を行った。ＦＩＢは、プローブで試料表面の観察を行いながら切断が可能なため、特定の大きさのリング型電極を再現性よく作製可能となった。さらに、絶縁部と金属部が非常に小さいため、基板に対してプローブをアプローチさせやすく、試料に近接するリング部分の面積もコーンに比べ広いため、試料の表面状態の測定に有効である。
【００７０】
〔測定システム〕
電気化学測定系には、２ｃｈのパッチクランプアンプ(Axon Instruments社のCurrent Amplifier, Multiclamp 700B)を用いた。ここでは、２ｃｈのパッチクランプアンプバイポテンショスタット８の場所に、上記２ｃｈのパッチクランプアンプをそのまま置き換えて使用した。
ＳＩＣＭの距離制御には、低電流（ｎＡ−ｐＡ）を高速（１ｋＨｚ以上）で検出する必要があり、バイポテンシオスタットでは、応答速度が非常に遅く（１−１０Ｈｚ）、生細胞のように柔らかい試料の測定が困難であった。さらに、２ｃｈのパッチクランプアンプでは、ＳＩＣＭ極、ＳＥＣＭ極の電流のフィルタリング速度、ならびに印加電位を、それぞれ独立に設定できる。
本測定では、ＳＩＣＭおよびＳＥＣＭのフィルタリング速度をそれぞれ１ｋＨｚ、４０Ｈｚとして測定を行った。電極走査系にはピエゾステージを用いた。
Physic Instruments(PI)社の６２１．２ＣＬをＸ−Ｙステージ、６２１．ＺＣＬをＺステージとし、ステージコントローラから電圧を印加した。ステージコントローラの制御および電流信号のＰＣへの取り込みは、Digital Signal Processor （ＤＳＰ）を用いた。
ＤＳＰは、ＰＩ制御の演算処理を予め書き込むことで、ＰＣを介さずにフィードバック制御を行うことが可能であり、制御を高速化できる。
【００７１】
〔測定プログラム〕
ステップ（１）       はじめに試料から十分に離れた位置でプローブを高い状態に保ち初期電流値を決定（測定時間２ｍｓ）
ステップ（２）       ＰＩ制御により、プローブを試料に対して近接（近接スピード５０μｍ／ｓ）
ステップ（３）       （２）を初期電流値から１％減少する点まで繰り返す（所要時間１０−２００ｍｓ）
ステップ（４）       ＳＥＣＭ測定（５０ms）
ステップ（５）       プローブを上昇後（上げ幅０．５−１０μｍ、上昇後ピエゾが動くまでの待ち時間２ｍｓ）
ステップ（６）       ＸＹ方向へプローブを移動（ピエゾが移動するまでの待ち時間１０ｍｓ）
この動作を繰り返すことで各測定点において探針−基板間距離が１点に定め、形状イメージ（ｚ座標のプロット）を取得した。この測定では、プローブの上下運動に要する時間が非常に長い。ＤＳＰボードを導入することで、１イメージを６分で取得可能となった。
【００７２】
〔探針の構造及び製造方法〕
鉛ドープされたソーダガラス管の先端部を熱引きプラーを用いて先鋭化し、内径０．８６μｍ、外径１．５０μｍの鉛ドープされたソーダガラス管とする。次に、ソーダガラス管との周囲に、スパッタリングにより２００ｎｍの金層を形成する。次に、銀ペーストを接着剤として用いて、金層に導線を接続する。次に、白金線を対極に用いて、アノーディック電着塗料ＥＬＥＣＯＡＴ ＡＥ−Ｘ（株式会社シミズ製）（塗膜を形成するポリマーはポリアクリル酸）に浸す。電着は二電極式で行う。すなわち、参照電極、対極用の２本のケーブルで白金線をポテンシオスタットにつなぎ、金層を陽極、白金線を陰極にして、２Ｖの直流電圧を１２０秒間印加し、金層上に絶縁性電着塗料層を形成する。次に、水洗後、オーブンに入れ、１５０℃、３０分間の熱処理を行い、電着塗料膜をしっかりと固化、乾燥させる。次に、絶縁層を形成後に、フォーカスイオンビームにより、先端部を切断することでリング型の電極の形成と、中空の空洞部を露出させる。
上記の探針の製造方法により作成した電極の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す図９（ａ），（ｂ）によれば、リング電極と中空の空洞部を確認することができた。開口径、リング電極径、絶縁層径の直径はそれぞれ３００nm、５００nm、８００nmとなっている。さらに、作成された微小電極を、サイクリックボルタモグラム（ＣＶ）より評価した。作製した電極を、０．５ｍＭのフェロセンメタノール及び０．１ＭのＫＣｌ溶液中に浸し、電圧をかけ、流れる電流の大きさを調べた。結果を図９（ｃ）に示す。微小電極に特有に見られる定常電流を確認できた。ＳＥＣＭ−ＳＩＣＭ探針のイオン電流観測側に銀／塩化金電極を挿入した場合、銀イオンが溶け出してファラデー電流観測側のリング電極に析出しＣＶに銀の酸化／還元スパイクピークが観測されることがある。これを回避するために、アクリルアミドゲルを充填した細いチューブに銀／塩化銀を挿入し、それを探針後方から挿入してもよい。銀／塩化金電極の変わりに白金線などを用いても実質上測定は可能である。
ＦＩＢは、探針で試料表面の観察を行いながら探針先端部を切断が可能なため、特定の大きさのリング型電極を再現性よく作製可能となった。また探針作製の歩留まりは９０％以上であった。さらに、絶縁被膜層と金属層が非常に小さいため、試料に対してプローブをアプローチさせやすく、試料に近接するリング部分の面積もコーンに比べ広いため、試料の表面状態の測定に有効である。
【実施例２】
【００７３】
作成した探針の電極の評価としてアプローチカーブを測定した。メディエータとして、０．５ｍＭのフェロセンメタノールを用いた。プローブを基板から離した状態から近接させ、その際のファラデー電流およびイオン電流をそれぞれ同時に測定した。測定の結果を図９に示す。導電性基板に対して電極をアプローチさせると、ファラデー電流は増加し、イオン電流は減少した。ファラデー電流の増加は、導電性基板と電極との間でフェロセンメタノールの酸化還元反応が起こるためである。一方、絶縁性基板の場合には、ファラデー電流とイオン電流ともに減少が見られた。ファラデー電流の減少は、電極と基板が近接することで、電極表面にアクセスするメディエータが減少することに起因している。このようにファラデー電流は、基板の導電性によりアプローチカーブの挙動が大きく異なり距離制御の信号に適さない。イオン電流は、試料表面の導電性に影響を受けずに、電極と基板との距離にのみ依存して変化することから、距離制御に有効であるといえる。初期電流値からの減少量を閾値とし、例えば１％と設定してフィードバック制御することにより距離制御が可能となる。また、同時に取得されたファラデー電流が基板の状態を反映していることから、イオン流がファラデー電流の測定に影響を与えないことが確認できた。
以上の結果から、ＳＥＣＭ−ＳＩＣＭ用の探針は、イオン電流計測と電気化学計測の両方を干渉することなく独立に実施可能な機能複合型の探針として構成されていることが確認できた。
【実施例３】
【００７４】
イオン電流を利用した形状イメージングと微小電極を利用した電気化学イメージングの同時取得について、以下のように実施した。
測定対象として、西洋ワサビペルオキシダーゼをスポット−固定化した酵素固定化基板を用いた。酵素固定化基板の作製法は以下のとおりである。
１ｍｇ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ， １０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、１ｍｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４Ｌ ２５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）、１００μＬミリＱ水を混合し、ガラスキャピラリに充填してスポット−固定化した。
イオン電流を測定する銀塩化銀電極に対して、＋２００ｍＶ ｖｓ． Ａｇ／ＡＧＣｌの電位を印加し、ファラデー電流を測定する微小電極には、＋０．０５Ｖ ｖｓ． Ａｇ／ＡＧＣｌの電位を印加した。測定溶液は、メディエータとして０．１Ｍ ＫＣｌ及び０．５ｍＭフェロセンメタノールを含むリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）を用いた。ＨＲＰの基質である過酸化水素を添加すると、ＨＲＰの酵素反応により、フェロセンメタノールが酸化される。酸化されたフェロセンメタノールを微小電極により還元し、その際の電流を測定する。同時に、イオン電流を利用したフィードバック制御により、ＨＲＰのスポット形状を測定した。
結果を図１１に示す。図１１（ａ）は、西洋ワサビペルオキシダーゼパターンの形状イメージであり、（ｂ），（ｃ）は電気化学イメージである。
イオン電流を用いた距離制御により、ＨＲＰスポットの形状を観察することができた（図１１（ａ））。
また、電気化学測定においては、ＨＲＰの基質である過酸化水素を加える前には、ＨＲＰパターン上で電流変化を見ることができないが（図１１（ｂ））、過酸化水素を添加すると、ＨＲＰの酵素反応によりフェロセンメタノールが酸化され、電極によりフェロセンメタノールを還元し、その際の還元電流を検出することができた（図１１（ｃ））。
以上より、イオン電流をフィードバック信号に利用しながらファラデー電流を計測することで、形状イメージングと電気化学イメージングとを同時に取得することが可能となった。
【実施例４】
【００７５】
イオン電流を利用した形状イメージングと微小電極を利用した電気化学イメージングの同時取得について、以下のように実施した。
測定対象として、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）のスポット−固定化した酵素固定化基板を用いた。酵素固定化基板の作製法は以下のとおりである。
１ｍｇグルコースオキシダーゼ（２５００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、１ｍｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４μＬ ２５％ グルタルアルデヒド（ＧＡ）、１００μＬミリＱ水を混合し、ガラスキャピラリに充填してスポット−固定化した。
イオン電流を測定する銀塩化銀電極に対して、＋２００ｍＶ ｖｓ． Ａｇ／ＡＧＣｌの電位を印加し、ファラデー電流を測定する微小電極には、＋０．５Ｖ ｖｓ． Ａｇ／ＡＧＣｌの電位を印加した。測定溶液は、メディエータとして０．５ｍＭのフェロセンメタノールを含むリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）を用いた。電極反応によりフェロセンメタノールを酸化する。ＧＯｘの基質であるグルコースを添加すると、ＧＯｘの酵素反応により、酸化体のフェロセンメタノールが還元される。還元されたフェロセンメタノールを微小電極により再び酸化し、その際の電流を測定する。同時に、イオン電流を利用したフィードバック制御により、ＧＯｘのスポット形状を測定した。
結果を図１２に示す。（ａ），（ｃ）はグルコースオキシダーゼ固定化基板の異なる位置の形状イメージ、（ｂ），（ｄ）は、（ａ），（ｃ）に対応する電気化学イメージである。
イオン電流を用いた距離制御により、ＧＯｘスポットの形状を観察することができた。また、グルコースを添加すると、ＧＯｘの酵素反応により酸化体のフェロセンメタノールが還元され、電極によりフェロセンメタノールを再び酸化し、その際の酸化電流を検出することができた（図１２（ａ））。ＧＯｘの測定においては、フェロセンメタノールの酸化還元が、電極とＧＯｘの間で繰り返される。そのため、電極をＧＯｘにできる限り近づけることが望まれ、イオン電流をフィードバック信号に利用しながらファラデー電流を計測することで、２５０ｎｍの酵素パターンを検出することに成功した（図１２（ｂ））。また同様の実験で電極とＧＯｘとの距離を１００ｎｍとすると、酵素パターンのコントラストが著しく低下し（図１２（ｄ−１））、６００ｎｍとするとパターンを確認することができなかった（図１２（ｄ−２））。以上より、イオン電流を利用した距離制御がＳＥＣＭの測定感度向上に貢献していることが言える。
【実施例５】
【００７６】
イオン電流を利用した形状イメージングと微小電極を利用した電気化学イメージングの同時取得について、以下のように実施した。
測定対象として、ラット心筋細胞を用いた。ラット心筋細胞に関して、酸素、フェロシアン化カリウム、フェロセンメタノールの透過性を評価した。
イオン電流を測定する銀塩化銀電極に対して、＋２００ｍＶ ｖｓ． Ａｇ／ＡＧＣｌの電位を印加し、ファラデー電流を測定する。微小電極に対しては、酸素、フェロシアン化カリウム、フェロセンメタノール、それぞれについて、−０．５Ｖ ｖｓ． Ａｇ／ＡＧＣｌ、＋０．５Ｖ ｖｓ． Ａｇ／ＡＧＣｌ、＋０．５Ｖ ｖｓ． Ａｇ／ＡＧＣｌの電圧を印加して測定を行った。電極反応により、酸素、フェロシアン化カリウム、フェロセンメタノールを還元あるいは酸化し、その電流応答により、イメージングを行った。測定溶液は、メディエータとして０．５ｍＭのフェロセンメタノールを含むリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）を用いた。
結果を図１３に示す。（ａ），（ｂ），（ｃ）のそれぞれの左側の写真はラット心筋細胞の異なる位置の形状イメージであり、（ａ）の右側の写真は酸素の細胞透過性を示す電気化学イメージであり、（ｂ）の右側の写真はフェロシアン化カリウムの細胞透過性を示す電気化学イメージであり、（ｃ）の右側の写真はフェロセンメタノールの細胞透過性を示す電気化学イメージである。
イオン電流を用いた距離制御により、ラット心筋細胞の形状を観察することができた。また、電気化学測定では、化学物質の細胞透過性の違いを検出することができた。細胞を透過可能な化学物質（酸素、フェロセンメタノール）の検出では、細胞上において化学物質が細胞を透過することで、化学物質の物理的な拡散阻害が弱まり、細胞上と基板上で電流応答に違いが見られる。しかし、透過性のない化学物質（フェロシアン化カリウム）では、電流応答に違いが見られない。このような測定を行うには、電極と試料との距離を常に一定に保つ必要があり、凹凸の激しい心筋細胞の測定は困難とされてきた。以上より、イオン電流を利用した距離制御がＳＥＣＭによる細胞膜透過性評価に貢献していることが言える。
【００７７】
〔その他の実施形態及び実施例〕
本発明は上記の実施形態及び実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲の技術的範囲には、発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々、設計変更した形態が含まれる。
【００７８】
上記の実施形態では、図示しないが、レーザー光を前記探針２１の中空基材を通して試料に照射して、上記電気化学イメージングと上記形状イメージングとともに光学測定を同時に行うことを含むものである。
【００７９】
上記の実施形態では、ＳＥＣＭ電極２６Ａのファラデー電流の計測に基づく電気化学イメージングについて、探針２１の開口２５ｃから流出する電解質中に特定のイオン、タンパク質、薬剤、ＤＮＡなどを含ませて、電気泳動現象を利用して生体素子に局所的にインジェクションを行いながら、生体素子の変化や応答について電気化学イメージングを行うことを含むものである。
【符号の説明】
【００８０】
１…走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡
Ｔ…試料
２１，２２，２３…探針
２５Ａ，２５Ｂ…探針本体
２５ａ１，２５ａ２，２５ａ３…中空部
２５ｂ…先端部
２５ｃ１，開口２５ｃ２…開口
２６Ａ，２６Ｂ，２６Ｃ…ＳＥＣＭ電極
２６ａ…導電層
２６ｂ…炭素層
２６ｃ…導電線
２７…ＳＩＣＭ電極
２８…絶縁層
【図１】
2010261923.tif 000003
【図２】
2010261923.tif 000004
【図３】
2010261923.tif 000005
【図４】
2010261923.tif 000006
【図５】
2010261923.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
2010261923.tif 000011
【図９】
2010261923.tif 000012
【図１１】
2010261923.tif 000013
【図１２】
2010261923.tif 000014
【図１３】
2010261923.tif 000015