(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍の影響のもとに内皮で転写段階で制御されている免疫グロブリンスーパーファミリーの新規な接着タンパク質を探索し、たとえば腫瘍や炎症などの種々の適応症の治療に使用するための分子の提供。【解決手段】コンフルエンシー制御接着分子２（ＣＲＡＭ−２）のアミノ酸配列と同一性を示すポリペプチド及び抗体。並びに炎症及び腫瘍の治療におけるその使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫グロブリンスーパーファミリーのサブファミリーに属する単離した形態の新規なポリペプチドであって、図３の上および下の列にそれぞれ示すマウスコンフルエンシー制御接着分子１または２（ＣＲＡＭ−１またはＣＲＡＭ−２）のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列ホモロジーを示すポリペプチド。
【請求項２】
図６に示すヒトＣＲＡＭ−１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは本質的に１００％相同なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリペプチドを有する細胞に対するターゲティング分子として使用するための請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
腫瘍における血管形成を抑制するのに使用するための請求項３または４に記載の抗体。
【請求項６】
炎症反応の治療に使用するための請求項３または４に記載の抗体。
【請求項７】
血管透過性の調節、とりわけ増大に使用するための請求項３または４に記載の抗体。
【請求項８】
血管透過性の増大が、薬剤を送達するために腫瘍において達成される、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
毒素、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、光活性化標識、リポソーム、薬剤および細胞よりなる群から選ばれた他の分子に結合される、請求項３ないし８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のポリペプチドと本質的に同じアミノ酸配列を有する、炎症反応の治療に使用するための可溶性ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有する、炎症反応の治療に使用するためのペプチド。
【請求項１２】
該アミノ酸配列の少なくとも一部が、細胞外ドメインＶＣ２、および／または膜近位細胞質配列：Ａ−［Ｙ，Ｑ］−［Ｒ，Ｓ］−［Ｒ，Ｋ］−Ｇ−［Ｃ，Ｙ］−Ｆを含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
血管透過性を調節するのに使用するための可溶性形態にある、請求項１、２、１１および１２に記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項１４】
完全なポリペプチドまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであって、該ポリペプチドが図３の上および下の列に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有するものである、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
完全なポリペプチドまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであって、該ポリペプチドが図６に示すヒトＣＲＡＭ−１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは本質的に１００％相同なアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
図６に示すヒトＣＲＡＭ−１のヌクレオチド配列と本質的に同一のヌクレオチド配列を有する、請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１４ないし１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがプライマー、プローブ、アンチセンスＲＮＡなどである、請求項１４ないし１７のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
デファレンシャルディスプレイ逆転写ＰＣＲを使用することを含み、その際、標的遺伝子に特異的な部分的にまたは完全に縮重したプライマーを１セット用いることを特徴とする、差異的に発現されたＤＮＡ配列の特異的な同定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管接着分子の新規なサブクラスの同定および種々の疾患の治療のためのこれら分子の機能の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚発生および生後の初期の発生期を通じて、内皮細胞は脈管形成および血管形成により増殖、分化して新たな血管を形成する。成体の生物では内皮は血管−組織バリヤーを定めており、細胞周期にない静止した細胞からなる。これらの極性化した細胞は互いに密着結合および接着結合により連結して細胞の連続した層を形成している。内皮層の機能は、組織ホメオスタシスの維持、繊維素溶解、血液凝固、血管緊張（vasotonus）および白血球の血管外遊出にある。これらの特性はすべて、接着分子の発現および機能の精妙な調律により制御されている。
【０００３】
炎症、腫瘍の増殖、創傷または血管形成といった病的な状況は血管内皮上の接着分子の数および機能に一時的な変化をもたらし、このことが血管のホメオスタシスの変化という結果となる。一例として、腫瘍は血管新生因子の局所濃度を増加させ、このことが細胞周期にない静止した内皮細胞から増殖する内皮へのスイッチを引き起こす。血管形成のスイッチ（angiogenic switch）は、ＩＬ−８、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、可溶性ＶＣＡＭ−１、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む幾つかの因子により引き起こされる。その結果、既存血管の内皮細胞は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分解して周囲の組織に侵入し、腫瘍の血管形成へと導く。
【０００４】
血管形成のスイッチの間に内皮遺伝子の発現は変化する。たとえば、内皮細胞をｂＦＧＦまたはＴＮＦαで処理すると内皮細胞遊出に関係する接着分子であるαｖβ３インテグリンの発現が４倍になる。さらに、血管形成のスイッチは内皮の炎症応答も変化させ、腫瘍への白血球の異常な移行に導く。通常は白血球は内皮に接着し内皮中を移行することによって血液から血管外遊出する。これらの機構は、セレクチン、インテグリンおよび免疫グロブリンスーパーファミリー接着分子が関与する多段階のプロセスで生じる。
腫瘍に関連する内皮では、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭおよびセレクチンはダウンレギュレーションされることが示されている。これら接着分子のダウンレギュレーションは、腫瘍が免疫系の細胞障害性細胞の侵入を回避する機構を表している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、腫瘍の影響のもとに内皮で転写段階で制御されている、免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｉｇ  Ｓｆ）の新規な接着タンパク質を探索することにある。
本発明のさらなる目的は、たとえば腫瘍や炎症などの種々の適応症の治療に使用するための、該新規な接着タンパク質に由来する分子を定めることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に至る研究に際して、内皮細胞株とメラノーマ細胞との同時培養の間に制御される転写物を同定するため実験マウスモデルを用いた。スクリーニング戦略をＩｇ  Ｓｆの接着分子に限定するため、「ターゲテッドデファレンシャルディスプレイ（Targeted Differential Display）」と称するＲＮＡ提示の新規な方法を開発した。この改変提示法の新規な点は１セットのみの縮重（degenerated）プライマーを用いることにある。実施例でも示すであろうように、驚くべきことに、このことが充分な特異性をもたらすことがわかった。
【０００７】
さらに詳細には、Ｉｇ  Ｓｆ成員のＣ２ドメインに見出される保存配列をターゲティングすべくデザインした、部分的に縮重したプライマー（本発明の場合、縮重のレベルは１セット内で２０４８〜４０９６の異なる形態のプライマーである）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのターゲテッドデファレンシャルディスプレイ法（Samaridis & Colonna (1997) Eur. J. Immunol. 27, 660-665）を行うのに用いた。
【０００８】
この知見に基づき、本発明は、デファレンシャルディスプレイ逆転写ＰＣＲの使用を含む、差異的に発現されたＤＮＡ配列の特異的な同定方法を提供するものであり、該方法において１セットの部分的または完全に縮重した標的遺伝子に特異的なプライマーを用いる。従来のＲＮＡ提示戦略の１つの主たる限界は、特異性が欠けていることである。この特異性を増大させる目的で、本発明者らは他の接着分子を探索するに際してＣ２ドメインを有する分子をコードする配列をターゲティングする縮重したプライマーを用いた。このことは幾つかのＩｇ  Ｓｆ接着分子のＣ２ドメインのアラインメント、およびＣ２ドメイン構造に参画しているシステイン残基周辺の線状アミノ酸コンセンサス：Ｙ−（ＲＱＹＳ）−Ｃ−ｘ−Ａ−Ｓ−Ｎ−ｘ２−Ｇの同定によって達成された。さらに一般的な意味において、このアプローチはまた他の配列の探索にも用いることができ、その際、最も頻繁なコンセンサス配列の１またはそれ以上の逆翻訳を、デファレンシャルディスプレイに使用する縮重プライマーをデザインするために用いる。
【０００９】
本発明の方法は、メラノーマ細胞または癌腫細胞の存在下でコンフルエンシー（集密さ；confluency）によって内皮細胞でダウンレギュレーションされる転写物の同定を可能とした。このｃＤＮＡは異常な構造特性を有するＩｇ  Ｓｆの新規な分子をコードしており、「コンフルエンシー制御接着分子（Confluency Regulated Adhesion Molecule）」としてＣＲＡＭ−１と名づけた。構造的に関連する分子であるＪＡＭ（白血球の血管外遊出に関係する）の最近の記載は、接着分子の新たなファミリーの存在を示唆していたが、そのうちＪＡＭおよびＣＲＡＭ−１は基本形であった。ＥＳＴデータベースを用いた配列の比較は、この分子ファミリーの第三の成員であるＣＲＡＭ−２のクローニングを可能とした。図１はＣＲＡＭ−１タンパク質およびＣＲＡＭ−２タンパク質をコードするマウスｃＤＮＡ配列を示す。本明細書ではＪＡＭとＪＡＭ−１、ＣＲＡＭ−１とＪＡＭ−２、およびＣＲＡＭ−２とＪＡＭ−３との名称は相互に同じ意味で用いる。
【００１０】
ＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２をコードする転写物の組織分布の比較は、これら分子が内皮および上皮の区画で優先的に発現されることを示しており、細胞−細胞接触部の維持における役割を示唆している。これら静止した内皮細胞の細胞−細胞相互作用は、血管の透過性、細胞周期、および内皮壁を横切る白血球の血管外遊出を制御している。
【００１１】
これら３つの分子の機能および相互作用をさらに解明するため、分子的なアプローチを用いた。この目的のため、可溶性の形態または膜結合形態のＣＲＡＭ−１、ＣＲＡＭ−２またはＪＡＭに融合したＦｌａｇタグおよびエンハンストグリーン蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescent Protein）（ＥＧＦＰ）からなるキメラ分子を構築した（図２に要約してある）。細胞株にトランスフェクションしたとき、ＣＲＡＭ−１およびＪＡＭのＥＧＦＰ融合産物は細胞−細胞接触部に局在し、これら分子の細胞−細胞コミュニケーションにおける役割が確認された。対照的に、ＣＲＡＭ−２は細胞表面上でより広範囲にわたって分布した。さらに、ＣＲＡＭ−１の可溶性構築物が白血球の経内皮移行をインビトロで阻止したのに対し、可溶性のＪＡＭは下限に近い作用しか示さなかった。以上を総合すると、これら結果は、血管の完全さの維持および内皮層の機能におけるこの接着分子の新規なサブファミリーの中心的な役割を示唆している。
【００１２】
これら知見に基づき、本発明は、ＣＲＡＭポリペプチドに基づく試薬を用いて慢性の炎症や腫瘍の進行などの医学的適応症に対処する新規な手段を提供する。
さらに詳細には、本発明は、ヒト免疫グロブリンスーパーファミリーのサブファミリーに属する単離した形態のポリペプチドに関するものであり、該ポリペプチドは図３の上側および第二の列にぞれぞれ示すようにマウスのコンフルエンシー制御接着分子１または２（ＣＲＡＭ−１またはＣＲＡＭ−２）のアミノ酸配列との少なくとも７０％の配列ホモロジーを示す。図４および図５は、それぞれ、アミノ酸レベルでのマウスＪＡＭ−２（ＣＲＡＭ−１）およびＪＡＭ−３（ＣＲＡＭ−２）間のアラインメントを示す。
【００１３】
ヒトまたは動物の生体内に見出されるＣＲＡＭポリペプチドは、増殖する細胞のマーカーである。ＣＲＡＭ発現は増殖している細胞ではアップレギュレーションされている。
本明細書に開示するのは、このファミリーの成員である２つの新規なマウスポリペプチドである。これらポリペプチドの配列情報に基づき、該ファミリーの他の成員をＰＣＲ、ＤＮＡライブラリー上でのクロスハイブリダイゼーション（crosshybridization）、抗体の交差反応性などのよく知られた手段により同定することができる。
【００１４】
配列情報は、アミノ酸配列かまたは該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のいずれであってもよい。
それゆえ、さらに詳細には本発明は、本質的に図６Ｂに示すアミノ酸配列または該配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を含む、ヒトの対応ポリペプチドに関する。
【００１５】
ヒトなどの他の種における該ファミリーの他の成員を同定するために本明細書に開示した２つのＣＲＡＭタンパク質の配列情報を用いることに加えて、これら２つのタンパク質およびその対応ファミリー成員はまた、誘導分子、たとえば本発明の（ポリ）ペプチドに対する抗体、または任意に可溶性の形態の該タンパク質の組換え等価物、または該ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドなどの調製に用いることもできる。適当なアミノ酸配列の部分は、とりわけ細胞外ドメイン：ＶＣ２、および膜近位細胞質配列（membrane proximal cytoplasmic sequence）：Ａ−［Ｙ，Ｑ］−［Ｒ，Ｓ］−［Ｒ，Ｋ］−Ｇ−［Ｃ，Ｙ］−Ｆである。
【００１６】
抗体および（ポリ）ペプチド型の誘導体に加えて、本発明はまた完全なポリペプチドまたはその一部をコードする配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにも関するものであり、該ポリペプチドは本明細書に開示するＣＲＡＭ−１タンパク質またはＣＲＡＭ−２タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有する。さらに詳細には、本発明は、図６に示すヒトＤＮＡ  ＣＲＡＭ−１配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは本質的に１００％相同なヌクレオチド配列に関する。
【００１７】
そのようなポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、たとえば、ＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、プライマー、プローブ、アンチセンスＲＮＡなどであってよい。
そのような分子はすべて、ヒトまたは動物の生体内に見出される元々のポリペプチドの機能を調節するため、または診断のために用いることができる。
たとえば腫瘍の場合の血管形成は抗体で抑制することができる。該抗体は、ＣＲＡＭポリペプチドを有する細胞のターゲティング分子として用いることができる。これら抗体はそれ自体として作用させることもできるし、あるいは他の分子、たとえば毒素、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、光活性化（photo-activatable）標識など、さらにリポソーム、細胞などに結合させることができる。
【００１８】
標識抗体は抗体の診断における使用に特に適しており、増殖している腫瘍での血管形成を位置付けるのに利用できる。さらに、毒素や放射性分子に結合させた抗体は、腫瘍中で増殖している血管をターゲティングすることにより腫瘍を特異的に殺傷するのに用いることができる。
ＣＲＡＭ型の分子は、リンパ管、およびリンパ節やパイエル斑などのリンパ器官中の高内皮細静脈（high endothelial venules）を除いて通常の脈管系では検出されないことがわかった。このことの利点は、たとえば抗ＣＲＡＭ抗体のターゲティングをたとえば腫瘍細胞に対して極めて特異的に行えることであり、それゆえ望ましくない副作用を回避できる。
【００１９】
さらに、本発明の（ポリ）ペプチドはまた血管形成性の血管上の分子に結合させてもよく、それにより血管形成を刺激もしくは抑制させてよい。
ＣＲＡＭポリペプチドと本質的に同じアミノ酸配列を有する可溶性の（ポリ）ペプチドは、血管内皮の炎症反応の治療に用いることができる。本発明に従い、白血球の経内皮移行がｓＣＲＡＭ−１−ＩＧ２ＤｏまたはＣＲＡＭ−１に対する抗体により抑制できることがわかった。それゆえ、この分子や類似の分子を用い、炎症において認められるような免疫反応を停止もしくは刺激することができる。
【００２０】
リンパ球の移行に限定されるＨＥＶの血管細胞上の分子のインビボでの特異的な発現は、リンパ球の移行または血管透過性に対するＣＲＡＭの刺激作用を支持するものである。それゆえ、この作用は通常、血管床（vascular bed）のシーリング（sealing）に関与する分子（ＣＲＡＭ−１、ＣＲＡＭ−２、ＪＡＭ、ＰＥＣＡＭ、ＶＥ−カドヘリン）の変調によるものであり得る。この知見は、本発明の組換えＣＲＡＭ分子（ポリ）ペプチドまたはＣＲＡＭ−１に対するモノクローナル抗体を送達することによる、内皮間の結合の制御を含む本発明の他の応用の基礎となる。
【００２１】
抗ＣＲＡＭ抗体はまた、増殖している細胞における細胞−細胞相互作用を阻止するのに用いることができる。このことは、血管のバリヤー機能に通常必要とされる細胞間接触の解体へと導く。この知見は、増殖している血管の透過性を増加させて、増殖している腫瘍、月経期後の子宮などの部位への薬剤の送達を増大させるのに用いることができる。それゆえ、細胞間接触の解体は、血管腫（血管内皮から生じる腫瘍）またはある種の速やかに増殖する癌腫などの抗原を有する腫瘍細胞の進行を阻止するのに用いることができる。
診断目的の使用のためには、標識抗体のみならずＣＲＡＭタンパク質を発現する内皮細胞で見出されるＣＲＡＭ  ＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な標識オリゴヌクレオチドを利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＣＲＡＭ−１タンパク質およびＣＲＡＭ−２タンパク質をコードするマウスｃＤＮＡ配列。ｍｕＣＲＡＭ−１をｐｃＤＮＡ３ベクターにサブクローニングし、Ｓｐ６プライマーおよびＴ７プライマーを用いてシークエンシングした。ｍｕＣＲＡＭ−２はＥＳＴライブラリーからＩＭＡＧＥクローンとして得られたものであり（Ａｃ：ＡＡ６９０８４３およびＷ８０１４５）、ｐＴ７Ｔ３−ＤＰａｃベクター中でＴ７プライマーおよびＴ３プライマーを用いてシークエンシングした。
【図２】実施例に使用した分子的手段の模式図。新規なファミリーの構造および重要な残基を上側最上部のパネルに示す。星印は３つの分子の細胞質部分の中の推定リン酸化部位を示す。Ｃ２ドメインの第二のカノニカルＣｙｓ残基はＪＡＭ配列では存在しない。下側には異なるキメラ分子が融合の位置および周辺残基とともに示してある。ＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１またはＣＲＡＭ−２配列に由来する分子の部分は白色の背景に示してある。
【図３】ＣＲＡＭ−１アミノ酸配列およびＣＲＡＭ−１アミノ酸配列のアラインメント。ギャップはダッシュで示してある。
【図４】マウスおよびヒトのＣＲＡＭ−１（ＪＡＭ−２）のアラインメント。
【図５】マウスおよびヒトのＣＲＡＭ−２（ＪＡＭ−３）のアラインメント。
【図６】ヒトＣＲＡＭ−１の核酸配列（上側のパネル）、ヒトＣＲＡＭ−１の全アミノ酸配列（中央のパネル）およびヒトＣＲＡＭ−２の部分アミノ酸配列。
【図７】縮重プライマーを用いたターゲテッドデファレンシャルディスプレイ。（Ａ）：Ｃ２  Ｉｇドメインに存在する配列をコードするＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。２つのプライマーはＳｅｒ残基をコードするコドンのために同じ配列をコードしている。縮重のレベルは、ＹＲＣＸＡＳをコードするプライマーについては４０９６の異なる形態、他のプライマーについては２０４８の形態である。（Ｂ）：ＹＹＣＸＡＳ１プライマーを用いて得られた放射性ＰＣＲ産物の提示を示す。各レーンは、ｔ−ｅｎｄ内皮細胞株（レーンｔ−ｅｎｄ）、Ｂ１６メラノーマ細胞株（レーンＢ１６）、またはこれら２つの細胞株の同時培養（中央のレーン）から得られたｃＤＮＡ上で行ったＰＣＲ産物の提示に対応する。矢印は、同時培養条件下でダウンレギュレーションされた転写物ＣＲＡＭ−１から得られた目的ＰＣＲ産物を示す。
【図８】（Ａ）コンフルエンシー制御接着分子１（ＣＲＡＭ−１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれから導かれるアミノ酸配列。推定の疎水性シグナルペプチド（第一）および膜貫通領域（第二）には下線を引いてある。予測されるＮ−グリコシル化部位（やり損ない（strikeout））、ジスルフィド結合を形成しやすいシステイン（括弧）および可能なリン酸化部位のＳｅｒ／Ｔｈｒ／Ｔｙｒ残基（太字）を示す。（Ｂ）マウスＣＲＡＭ−１タンパク質の構造モデル。細胞外部分は、２つの推定Ｎ−結合グリコシル化部位を有するＶＨおよびＣ２様Ｉｇドメインを示す。矢印は、ターゲテッドデファレンシャルディスプレイに用いた部分的に縮重したプライマー（ＹＹＣＸＡＳ１）によりターゲティングした領域を示す。
【図９】ＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２マウスタンパク質のアラインメント。同一の残基は黒く囲んであり、相同な残基は灰色に陰影を付してある。全体の同一性は、ＣＲＡＭ−２とＣＲＡＭ−１とで３６％、ＪＡＭとＣＲＡＭ−１とで３１％、ＪＡＭとＣＲＡＭ−２とで３３％；各ホモロジーは５２％、５２％および４９％である。ギャップは配列中にダッシュで示してある。ＶドメインおよびＣ２ドメインのカノニカル保存残基（ＣｙｓおよびＴｒｐ）は星印でマークしてある。
【図１０】ＲＴ−ＰＣＲにより種々の細胞株で検出した（Ａ）、またはノーザンブロットにより種々の組織で検出した（Ｂ）、ＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２をコードする転写物の発現。（Ａ）：ＲＴ−ＰＣＲは、ＴＮＦで処理した（レーン２および１１はＴＮＦ処理したｔ−ｅｎｄに対応する）または処理していない（レーン３、４、６、７、９、１２は、それぞれ、ｂ−ｅｎｄ．５、ｅ−ｅｎｄ．２、ｔ−ｅｎｄ  Ｖ＋＋Ｌ−、ｔ−ｅｎｄ  ＶｌｏｗＬ＋＋、ＴＭＥおよびｔ−ｅｎｄに対応する）内皮細胞株由来のｃＤＮＡで行う。レーン５および１０は腫瘍細胞株Ｂ１６（メラノーマ）およびＫＬＮ２０５（癌腫）に対応する。レーン８は非形質転換胸腺上皮細胞株ＭＴＥ４−１４に対応する。レーン１はクローン化ｃＤＮＡを含有するプラスミドでのＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２増幅の陽性コントロールである。（Ｂ）：マウスノーザンブロットへのＰ３２プローブのハイブリダイゼーションのオートラジオグラフ。各ハイブリダイゼーションに用いたプローブは左に示してある。ＪＡＭおよびＣＲＡＭ−１のハイブリダイゼーションシグナルは２ｋｂのサイズで検出できる。
【図１１】確立された細胞−細胞接触部へのＪＡＭ−２およびＪＡＭ−１の局在。Ａ：パラホルムアルデヒド固定化ＴＭＥ細胞に対して抗ＪＡＭ−２抗体（ａ）または抗ＪＡＭ−１抗体（ｂ）を用いて免疫細胞化学を行った。矢印は細胞−細胞接触部へのタンパク質の特異的な局在を示す。棒は１０μｍ。Ｂ：ＪＡＭ−２−ＥＧＦＰ（ａ）およびＪＡＭ−１−ＥＧＦＰ（ｂ）キメラ分子を、トランスフェクションした細胞間での細胞接触に特異的に局在させた。ＥＧＦＰ組換えタンパク質の富化は、トランスフェクションした細胞とトランスフェクションしていない細胞との間では観察されなかった（矢印の先）。棒は２０μｍ。Ｃ：ＴＭＥ内皮細胞の表面ビオチン化後のＪＡＭ−２の免疫沈降。抗ＰＥＣＡＭ抗体（レーン１）および抗ＪＡＭ−１抗体（レーン２）を、それぞれ、ＣＲＡＭ−ＸＩＸＨ３６抗体（レーン３）で免疫沈降するための陰性コントロールおよび陽性コントロールとして用いた。分子量は右に示してある。Ｄ：ＣＨＯトランスフェクション細胞からのＥＧＦＰ組換えタンパク質の免疫沈降。抗ＪＡＭ−２（レーン２、３、６）、抗ＪＡＭ−１（レーン１、４、５）を、トランスフェクションしていないＣＨＯ細胞（レーン１および２）、ＪＡＭ−１−ＥＧＦＰでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（レーン３および４）、またはＪＡＭ−２−ＥＧＦＰでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（レーン５および６）からのビオチン化溶解物を免疫沈降するのに用いた。分子量は右に示してある。
【図１２】ケモカインＳＤＦ−１の存在下または不在下でのＴＮＦ活性化内皮腫の単層を横切る脾細胞の移行。３種の内皮腫を用いた：野生型ｔ．ｅｎｄ．１、またはＣＲＡＭ−１もしくはＣＲＡＭ−２をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションしたｔ．ｅｎｄ．１。２つのモノクローナル抗体、Ｆ−２６またはＨ−２６（ともにマウスＣＲＡＭ−１に対するラットのＩｇＧ１モノクローナル抗体である）について、血管外遊出に及ぼす能力を試験した。
【図１３】コンフルエンシーの機能に対するＣＲＡＭ−１の制御。ＨＰＲＴ  ｃＤＮＡおよびＣＲＡＭ−１  ｃＤＮＡに特異的なプライマーの混合物を用い、半定量的なＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応を１．２％アガロースゲル上で行い、臭化エチジウムで染色する。レーン１、２および３は、それぞれ１００％、５０％および１０％のコンフルエンシーに対応する。ＣＲＡＭ−１に対する弱いシグナルが１００％コンフルエンシー（レーン１）において観察される。内皮細胞株（ｔ−ｅｎｄ．１およびＴＭＥ）自体または腫瘍細胞株ＫＬＮ２０５との混合物の培養条件を示してある。
【図１４】マウス組織でのＪＡＭ−２（ａ）、ＪＡＭ−１（ｂ）またはβ−アクチン（ｃ）転写物のノーザンブロット分析。胚の交尾後の（ｐｃ）ｍＲＮＡ調製物および成体のｍＲＮＡ調製物の結果を示してある。ハイブリダイゼーションシグナルのサイズを右に示す。
【図１５】ＪＡＭ−２、ＪＡＭ−１、ＺＯ−１およびＰＥＣＡＭ発現の免疫組織学的分析。腎臓の連続切片（ａ〜ｄ）または腸間膜リンパ節からの切片（ｅ〜ｌ）を、抗ＪＡＭ−２抗体（ａ、ｅ、ｉ）、抗ＪＡＭ−１抗体（ｂ、ｆ、ｊ）、抗ＺＯ−１抗体（ｃ、ｇ、ｋ）または抗ＰＥＣＡＭ抗体（ｄ、ｈ、ｌ）で染色した。各系列の写真（ａ〜ｄ、ｅ〜ｈ、およびｉ〜ｌ）は、ＣＣＤの同一のセッティングで得られた。
【図１６】内皮細胞上でのＪＡＭ−２発現。Ａ：内皮細胞株（ｔＥｎｄ．１、ｅＥｎｄ．２およびＴＭＥ）または扁平上皮癌細胞株（ＫＬＮ２０５）上でのＪＡＭ−２、ＪＡＭ−１、およびＰＥＣＡＭ発現のサイトフルオロメトリー分析。点線のプロフィルはＣＤ４に対する抗体を用いて得られた陰性コントロールを表す。Ｂ：新たに単離した内皮細胞上でのＪＡＭ−２のサイトフルオロメトリー分析。指示した器官をコラゲナーゼ／ディスパーゼ（dispase）消化により解離し、示したようにＤｉＩＡｃ−ＬＤＬ、ＣＤ３１および抗ＪＡＭ−２または抗ＪＡＭ−１抗体で染色した。ヒストグラムプロフィルは、ＤｉＩＡｃ−ＬＤＬ（ＦＬ−２）およびＣＤ３１（ＦＬ−３）に陽性の内皮細胞集団にゲートの開閉する（gating）ことにより得た。陰性のコントロールは、ＪＡＭ−１またはＪＡＭ−２に対する一次モノクローナル抗体を省くことにより得た。
【図１７】（Ａ）：細胞−細胞接触部の形成の間のＪＡＭ−２−ＥＧＦＰ局在。ＪＡＭ−２−ＥＧＦＰでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の単層形成の間に単一の蛍光写真を３分毎に１時間得た。最初の１８分間に得た写真を示す。時間０において星印は視野に存在する３つの細胞を認めている。時間６、１２および１８分では、矢印は新たに形成された細胞−細胞接触部へのＪＡＭ−２−ＥＧＦＰの再局在を強調している。（Ｂ）：創傷後のＪＡＭ−２−ＥＧＦＰの局在。矢印は創傷部位を示しており、矢印の先はＪＡＭ−２−ＥＧＦＰに富む膜プロセスを強調している。経過した時間を写真に示してある。棒は１０μｍ。
【図１８】ＪＡＭ−２発現はパラ細胞（paracellular）透過性を低下させる。（Ａ）：パラ細胞透過性の評価は、トランスフェクションしていないＣＨＯ細胞単層、Ｔａｃ（ｈｕＩＬ２Ｒα）または所定のＥＧＦＰ融合タンパク質（ＪＡＭ−１またはＪＡＭ−２）でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞でのＦＩＴＣ−デキストラン拡散により行った。ＣＨＯ細胞のＪＡＭ−２−ＥＧＦＰまたはＪＡＭ−１−ＥＧＦＰでのトランスフェクションは、パラ細胞透過性の有意な低減に導いた（それぞれ、５７．８％＋／−４．９および７０．８％＋／−３．６）のに対し、Ｔａｃでのトランスフェクションはパラ細胞透過性に有意の影響を及ぼさなかった（１００．４％＋／−４．４、ｐ＝０．９８７２）。結果をトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞に正規化した。
【図１９】既存の密着結合へのＪＡＭ−２−ＥＧＦＰ（Ａ）およびＪＡＭ−１−ＥＧＦＰ（Ｂ）のターゲティング。ＪＡＭ−２−ＥＧＦＰ（Ａ）またはＪＡＭ−１−ＥＧＦＰ（Ｂ）で安定にトランスフェクションした集密的なＭＤＣＫ細胞を抗オクルディンおよび抗ウサギＴｅｘａｓ／Ｒｅｄで染色した。基底レベルから先端レベルまでの各０．９μｍの一連の写真をＥＧＦＰ蛍光（ａ）またはオクルディン染色（ｂ）について示す。左側にある基底レベルは、一連の写真が＋３．６および＋４．５μｍの焦点で（右に向かって第四または第五の写真）密着結合レベルを含むように恣意的に定めた。
【図２０】白血球の経内皮移行に対する可溶性の組換えタンパク質の作用。（Ａ）：細胞外遊出を相対的な率で表し、処理していないｔ−ｅｎｄ細胞株で得られた値（破線、率１）に正規化した。１μｇのｓＪＡＭ−Ｉｇ２ｄｏ（白抜きの四角）または１μｇのｓＣＲＡＭ−１−Ｉｇ２ｄｏ（黒丸）の存在下で得られた結果を示す。率は５回の独立した血管外遊出実験の平均として計算してある。（Ｂ）：血管外遊出した細胞の表現型を、Ｆａｃｓ分析の後に抗ＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗Ｂ２２０−ＰＥで染色して得たパーセントから計算した細胞数として表してある。星印はコントロールと比べて有意の差異のある実験点を示す。
【００２３】
下記実施例において、ＪＡＭとＪＡＭ−１、ＣＲＡＭ−１とＪＡＭ−２、ＣＲＡＭ−２とＪＡＭ−３とは相互に同じ意味で用いてある。
【実施例】
【００２４】
材料および方法
細胞株
胸腺（ｔＥｎｄ．１）および胚（ｅＥｎｄ．２）内皮腫細胞株（Williamsら、1989, Cell 57: 1053-1063）はW. Risau博士およびB. Engelhardt博士（Max Planck Institute、バード−ノイハイム、ドイツ）により提供された。ＳＶ４０形質転換リンパ節内皮細胞株ＴＭＥはA. Hamann博士により提供された（Harderら、1991, Exp. Cell. Res. 197: 259-267）。扁平上皮癌ＫＬＮ２０５、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、およびミエローマ細胞株Ｓｐ２／０はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。ＣＨＯを除いて細胞はすべて、１０％ＦＣＳ（PAA Laboratories、リンツ、オーストリア）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（すべてGibco BRL、ペーズリー、スコットランド）を添加したＤＭＥＭ（Gibco BRL）で増殖させた。ＣＨＯ細胞は、上記を添加したNut.Mix.F-12（ＨＡＭ）培地で増殖させた。付着した細胞はＰＢＳ／０．１５ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄し、ついでトリプシン／ＥＤＴＡ中、３７℃で５分間インキュベートすることにより剥がした。
【００２５】
提示、クローニングおよび配列分析
同時培養実験のため、５×１０５のｔ．Ｅｎｄ．１細胞を２．５×１０４のＢ１６Ｆ１０ミエローマ細胞とともに１０ｃｍ組織培養皿で６４時間増殖させた。コントロールとして５×１０５のｔ．Ｅｎｄ．１細胞および２．５×１０５のＢ１６Ｆ１０細胞を同条件で別々に増殖させて６４時間後に集密的な単層という結果となった。トリゾール試薬を用い、製造業者（Gibco BRL、ペーズリー、スコットランド）の指示に従って全ＲＮＡをペトリ皿中で直接抽出した。オリゴｄＴ（１６−ｍｅｒ）プライマーおよびスーパースクリプト逆転写酵素（Gibco BRL、ペーズリー、スコットランド）を用い、ｃＤＮＡを５μｇの全ＲＮＡから調製した。
【００２６】
ハウスキーピング（housekeeping）ＨＰＲＴ  ｃＤＮＡに特異的なプライマーを用い、１：５に希釈した１μｌのｃＤＮＡについてＰＣＲを２７サイクル行うことによってｃＤＮＡの品質および量をチェックした。ついで、Ｃ２ドメインで最も頻繁に認められるアミノ酸配列：ＹＲＣＸＡＳ、ＹＱＣＸＡＳ、およびＹＹＣＸＡＳをコードする下記の縮重プライマー：
【化１】
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【化２】
2010233572.tif 000003
および
【化３】
2010233572.tif 000004
を用いてデファレンシャルＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、２μｌの希釈ｃＤＮＡ；２．５μｌの１０ＸゴールドスターＰＣＲ緩衝液；２μｌのＭｇＣｌ２；２μｌの縮重プライマー０．３ｍＭ；０．５μｌのｄＮＴＰ  ０．１ｍＭ；０．１μｌのαＰ３３  ｄＡＴＰ  １０ｍＣｉ／ｍｌ（Amersham Pharmacia Biotech、デューベンドルフ、スイス）；１５．６５μｌのＨ２Ｏ；０．２５μｌのゴールドスターＴａｑポリメラーゼ（Eurogentech、セライング、ベルギー）を使用することからなっていた。
【００２７】
ＰＣＲのパラメータは以下の通りであった：９４℃で４５秒、５０℃で９０秒、および７２℃で４５秒を４０回繰り返した。ホルムアミド／ＥＤＴＡ負荷緩衝液を加え、９４℃で２分間変性させた。ついで、ＰＣＲ生成物を６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、コダックＯＭ−Ｍａｔを用いてオートラジオグラフィーを得た。バンドの強度を比較した。
【００２８】
差異的に発現されたバンドを乾燥したポリアクリルアミドゲルから切り出し、以前に記載されたようにして（LiangおよびPardee、1992, Science, 257: 967-970）沸騰およびエタノール沈殿させることにより断片を回収した。ついで、Ｐ３３−ＡＴＰなしで濃度を高めたｄＮＴＰ（２μＭの代わりに０．２ｍＭ）を用いてＰＣＲ生成物を再度増幅させた。再度増幅させた生成物を、以前に記載されたようにして（Sambrook, FritschおよびManiatis; Molecular cloning；第２版；コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー・プレス；１９８９）ｐＧｅｍ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Promega Corp、ワリセレン、スイス）にクローニングした。
【００２９】
２つの独立したクローンの核酸配列を、サーモシークエンス蛍光標識プライマーサイクルシークエンシングキット（Amersham Pharmacia Biotech、デューベンドルフ、スイス）およびＬＩ−ＣＯＲ  ＤＮＡ分析システム（MWG-Biotech GmbH、エーベルスベルク、ドイツ）を用いて決定した。
【００３０】
ＪＡＭ−３の同定
配列分析および比較は、ＥｘＰＡＳｙモレキュラーバイオロジーサーバーで利用できるアプリケーション、すなわちＢｌａｓｔ、Ｐｒｏｓｉｔｅ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔにより行った。ＣＲＡＭ−１に相同な３つの異なるＥＳＴが同定された（受け入れ番号ＡＡ７２６２０６、ＡＡ０５２４６３およびＡＡ１７５９２５）。これらのいずれも完全長の転写物をコードしておらず、開始のＡＴＧ配列を含んでいた。それゆえ、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅のための５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲシステム、バージョン２．０を用い、製造業者（Gibco BRL、ペーズリー、スコットランド）の指示に従って５’コード配列を得た。
【００３１】
使用した３つのプライマーは、ＥＳＴ配列に基づいて以下のようにデザインした：第一の鎖の合成のための
【化４】
2010233572.tif 000005
２つのネステッド（nested）ＰＣＲのための
【化５】
2010233572.tif 000006
および
【化６】
2010233572.tif 000007
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ生成物をｐＧｅｍ−Ｔベクターにクローニングした。ＣＲＡＭ−１の完全長のコード配列を得るため、クローニングした５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ生成物およびＥＳＴ（受け入れ番号ＡＡ７２６２０６）をＨｐａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐＧｅｍ−ｔベクターにライゲートした。完全長のＣＲＡＭ−２のクローニングも同様の配列比較および５’ＲＡＣＥ法に基づいて行った。ＣＲＡＭ−２をコードする完全長のｃＤＮＡは、最終的にＥＳＴ受け入れ番号：ＡＡ６９０８４３およびＷ８０１４５から得た。これら２つのクローンは３’の非翻訳領域の長さが異なっている。
【００３２】
ノーザンブロット
細胞および組織からの全ｍＲＮＡをトリゾール（Life technologies AG、バーゼル、スイス）を用い、製造業者の指示に従って抽出した。２５０μｇの全ＲＮＡからオリゴテックスｍＲＮＡ精製キット（Qiagen、チューリッヒ、スイス）を用いてポリＡ＋ｍＲＮＡを抽出した。胚のポリＡノーザンブロットはCLONTECH（P. H. Stehelin and Cie AG、バーゼル、スイス）から購入した。リボプローブはｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen、リーク、オランダ）から調製し、ＪＡＭ−１およびＪＡＭ−２の免疫グロブリンドメインをコードする配列またはβアクチンの完全長コード配列を含んでいた。ハイブリダイゼーションは５０％ホルムアミドを含有する緩衝液中で６２℃にて行った。ついで、ブロットを２回洗浄し（０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６７℃）、コダックＸ−Ｏｍａｔ上、−８０℃でオートラジオグラフィーを得た。
【００３３】
コンフルエンシー実験
ＪＡＭ−２  ｍＲＮＡレベルに及ぼす内皮細胞のコンフルエンシーの影響を調べた。２×１０５のＴＭＥ内皮細胞を６ｃｍ、１０ｃｍおよび１５ｃｍの直径の培養皿で培養して６４時間後に１０〜１００％の範囲の異なるレベルのコンフルエンシーに達した。トリパンブルー排除およびカウンティングによりチェックした６４時間後の細胞数はすべての場合に同じであり、ペトリ皿の表面積に無関係であった。
【００３４】
半定量的ＰＣＲ反応またはノーザンブロッティングを用いて種々の条件での転写物の相対量を決定した。ＪＡＭ−２転写物の検出には下記プライマーペア：
【化７】
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および
【化８】
2010233572.tif 000009
を用い、７５０ｂｐの増幅生成物を得た。内部コントロールとしてＨｐｒｔ  ｃＤＮＡに特異的な下記プライマーを用い、３５０ｂｐの長さの断片を増幅させた：
【化９】
2010233572.tif 000010
および
【化１０】
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【００３５】
発現ベクターの構築
ＥＧＦＰをコードする配列をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ部位を用いてｐＥＧＦＰ−１ベクター（CLONTECH、P. H. Stehelin and Cie AG、バーゼル、スイス））からｐｃＤＮＡ３中にサブクローニングし、それゆえｐｃＤＮＡ３／ＥＧＦＰと名付けた。ＪＡＭ−２およびＪＡＭ−１の細胞質ドメインをそれぞれコードする配列で見出された３’制限部位、ＨｐａＩおよびＳｃａＩを用い、２つの配列をｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen、リーク、オランダ）中のＥＧＦＰのＮ末端で融合させた。ＪＡＭ−２またはＪＡＭ−１をコードする挿入物を、それぞれＳｃａＩＩ／ＨｐａＩ消化またはＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｃａＩ消化を用いてｐＧｅｍｔまたはｐＲｃ／ＣＭＶから切り出した。
【００３６】
ついで、ＡｇｅＩで消化し、充填により平滑末端にし、さらにＨｉｎｄＩＩＩまたはＳａｃＩＩ酵素で消化したｐｃＤＮＡ３／ＥＧＦＰベクターにコード配列をクローニングした。このことにより、ＪＡＭ−２についてはＤＧＶ２９１、ＪＡＭ−１についてはＱＰＳ２８５のアミノ酸位置での融合部位という結果となった。ＣＨＯ細胞のトランスフェクションは以前に記載されたようにして行った（Ballestremら、1998, J. Cell. Sci. 111: 1649-1658）。
【００３７】
透過性アッセイに用いた安定なトランスフェクタントは、トランスフェクションしたＣＨＯ細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地で２週間増殖させることにより選択した。耐性コロニーは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置、Becton Dickinson、マウンテンビュー、カリフォルニア）によるＥＧＦＰ蛍光強度および顕微鏡観察（Axiovert、ツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ）による蛍光の局在について単離、チェックした。
時間経過ビデオ顕微鏡観察を、Axiovert蛍光顕微鏡および画像形成のためのOpenlabソフトウエアを用いて行った。
【００３８】
哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen、リーク、オランダ）をＦｌａｇ−タグ（G. Wiedle、病理学部、ＣＭＵ、ジュネーブ）コード配列を組込んで改変した。ＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２タンパク質の可溶形のコード配列を含むＦｌａｇ−タグ構築物をＰＣＲにより調製した。いずれの場合もフォアウォードプライマーはＡＴＧ開始領域に適合するようにデザインした。リバースプライマーは、１つのＩｇ可溶形のヒンジ領域をコードする配列か、または２つのＩｇドメイン可溶性分子のＣ２ドメインと膜貫通ドメインとの間の領域をコードする配列でデザインした。すべてのリバースプライマーは、Ｆｌａｇ−タグ改変ベクター中に直接インフレームでクローニングするためのＸｂａＩ制限部位を含む３’伸長を有していた。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲで用いて、頻繁に起る突然変異を回避した（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア、米国）。ついで、ＰＣＲ断片をＸｂａＩで消化し、ｐｃＤＮＡ−３  Ｆｌａｇ−タグベクター（ＥｃｏＲＩで消化し、クレノーで充填し、ついでＸｂａＩで消化したもの）中にクローニングした。
【００３９】
試薬および免疫蛍光分析
以下のモノクローナル抗体を用いた：抗ＰＥＣＡＭ（ＧＣ５１、ラットＩｇＧ２ａ；ＥＡ−３、ラットＩｇＧ１）および抗ＪＡＭ（Ｈ２０２．１０６．７．４、ラットＩｇＧ１）（Malergueら、1998, Mol. Immunol. 35: 1111-1119; Pialiら、1993, Eur. J. Immunol. 23: 2464-2471）。
ＪＡＭ−２に対するＣＲＡＭ抗体のパネルは、標準法および免疫原として組換えの可溶性分子（Aurrand-Lionsら、1996, Immunity 5: 391-405）を用いて実験室で生成させた。選択したハイブリドーマは、組換えの可溶性ＪＡＭ−２分子を特異的に認識する抗体の産生についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。陽性のクローンは、ＪＡＭ−２  ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞でさらに試験した（示していない）。
【００４０】
ＣＲＡＭ抗体は、ＣＲＡＭ−２５Ｆ２４がＩｇＧ２ｂサブクラスであるのを除いて全てＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａイソ型である。抗体の精製は、プロテインＧセファロースカラム（Amersham Pharmacia Biotech、デューベンドルフ、スイス）上で製造業者の指示に従って行った。ＣＲＡＭ−１９Ｈ３６モノクローナル抗体は免疫沈降に用い、一方、ＣＲＡＭ−１８Ｆ２６は免疫組織化学の試薬として用いた。同様の結果はＣＲＡＭ−４Ｈ３１およびＣＲＡＭ−１７Ｄ３３モノクローナル抗体を用いても得られた。
免疫蛍光分析は、ＦＩＴＣまたはテキサスレッド（Jackson Immunoresearch、Milan AG、La Roche、スイス）に結合させた二次試薬をそれぞれサイトフルオロメトリーおよび免疫組織化学に用いて行った。
【００４１】
免疫組織化学の場合、試料を冷（−２０℃）メタノールで５分間固定した。試料をＰＢＳ、ゼラチン０．２％、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％中で再水和し、洗浄前に一次抗体とともに一夜インキュベートし、ついでテキサスレッドに結合した適当な二次試薬で暴露した。新鮮な内皮細胞の分析の場合には、新たに切り出した組織の解離を確立された手順（Kramerら、1984, J. Cell. Biol. 99: 692-698）に従ってコラゲナーゼ／ディスパーゼ消化を用いて行った。解離した細胞を、抗ＣＲＡＭ−１９およびヤギ抗ラット−ＦＩＴＣプローブで染色する前にＤｉＩ−アセチル化ＬＤＬ（Molecular Probe Europe BV、ライデン、オランダ）で３７℃にて２時間染色した。３回洗浄後、細胞をビオチン化抗ＣＤ３１（Pharmingen）およびストレプトアビジンＲｅｄ６７０（Life technologies AG、バーゼル、スイス）で染色した。
ＪＡＭ−１発現またはＪＡＭ−２発現を、２つの内皮細胞マーカー：アセチル化ＬＤＬ（ＦＬ−２）およびＣＤ３１（ＦＬ−３）について陽性の細胞で分析した。陰性のコントロールは一次抗体を省くことにより得た。
【００４２】
免疫沈降
免疫沈降は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ１００、０．５％ＮＰ４０、溶解のためのプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche Diagnostics Ltd.、ロートクロイツ、スイス）を用い、以前に記載されたようにして行った（Aurrand-Lionsら、1997, Cellular Immunology, 176: 173-179）。免疫沈降、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、およびニトロセルロースメンブレンへの移動後、ペルオキシダーゼ（Jackson Immunoresearch）およびＥＣＬ（Amersham Pharmacia Biotech、英国）に結合したストレプトアビジンを用いてビオチン化タンパク質を暴露した。
【００４３】
透過性アッセイ
透過性はトランスウエルチャンバ（６．５ｍｍの直径、ＰＣフィルター、０．４μｍの孔径、Costar Corp.）を用いて測定した。簡単に説明すると、１×１０４のトランスフェクションしたまたはトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞を、０．２％ゼラチンで前以て３０分間コーティングしたフィルター上でコンフルエンシーまで培養した。５日後、培地をＦＣＳ不含の前以て温めたＮｕｔ／Ｆ１２培地（下のチャンバは５００μｌ、上のチャンバは２００μｌ）に変えた。ＦＩＴＣ−デキストラン（ＭＷ３８,９００、Sigma Chemical Co.）を上のチャンバに１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。
１時間後、チャンバを取り出し、Cytofluor IIを用いて蛍光を下のチャンバで直接読み取った。５つの独立したチャンバの平均蛍光強度を計算し、Statviewソフトウエアおよびｔ−検定不対（unpaired）比較を用いて比較した。実験を正規化するため、野生型のＣＨＯ細胞で得た平均蛍光強度の値を１００％とした。
【００４４】
可溶性分子のトランスフェクションおよび精製
可溶性のＩｇ１ＤｏおよびＩｇ２Ｄｏ  Ｆｌａｇｔａｇ／ｐｃＤＮＡ−３構築物による２９３Ｔ、Ｂｏｓｃ２３の一過性のトランスフェクションまたはＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクションを、リポフェクタミン試薬を用い、製造業者（Gibco BRL、ペーズリー、スコットランド）の指示に従って行った。トランスフェクション後、１０日の期間の間、２日毎に上澄み液を回収した。抗Ｆｌａｇ抗体に共有結合させたＭ２ビーズ（Kodak、ニューヘブン、米国）を、プロテアーゼインヒビター混合物を含有するＰＢＳ（Boehringer Mannheim、ドイツ）で２回洗浄した。ついで、ビーズをトランスフェクションした細胞からの上澄み液とともに４℃で３時間インキュベートした。プロテアーゼインヒビターを含有するＰＢＳで５回洗浄した後、カラムにビーズを充填し、組換え分子を１０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ３．４を用いて製造業者の指示に従って溶出した。ついで、組換えタンパク質を含む溶出フラクションをCentricon-10（Millipore）で濃縮し、ＰＢＳに対して透析した。
最終的なタンパク質濃度はマイクロＢＣＡアッセイ（Biorad）を用いて決定した。ついで、精製した生成物をポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動に供し、ついでクーマシーブルー染色を行ってその純度を分析した。
【００４５】
血管外遊出アッセイ
内皮細胞を横切る白血球の血管外遊出を以前に記載されたようにして行った（Wheerasingheら、1998, J. Cell. Biology, 142: 595-607）。簡単に説明すると、１×１０５のｔ−ｅｎｄ細胞を１μｇの可溶性組換え分子：ｓＪＡＭ２ｄｏまたはｓＣＲＡＭ−１  ２ｄｏの存在下、トランスウエルユニット（ポリカーボネートフィルター、５μｍ孔径、costar）中で２日間培養した。２日後、リンパ節またはパイエル斑から得た１×１０６の白血球を上側の区画に加え、血管外遊出した細胞の数を実験の間、１時間毎にモニターした。４時間後、５つの独立したウエルから得た血管外遊出細胞をプールし、Ｂ細胞およびＴ細胞マーカーＢ２２０およびＣＤ３についてサイトフルオロメトリー分析に供した。Facscalibur器械およびCell-Quest分析プログラム（Becton-Dickinson）を用いて結果を得た。
【００４６】
脾細胞を用いた血管外遊出アッセイでは、３×１０５の内皮細胞をトランスウエルユニット（ポリカーボネートフィルター、８μｍ孔径、costar）に植えて細胞を１８時間かけて単層を形成させた。上側の区画の培地を除き、脾臓からフィコール遠心分離により新たに調製した１×１０６の白血球（１００μｌ）を上側の区画に加えた。下側の区画の培地にＳＤＦ−１を加え（最終濃度：４０ｎＭ）、下側の区画と上側の区画の間でケモカイン勾配を確立した。抗体を用いた実験では、精製抗体１８−Ｆ２６または１９−Ｈ３６を１０μｇ／ｍｌの濃度で脾細胞とともに上側の区画に加えた。４時間後、血管外遊出した白血球（下側の区画中）を回収し、カウントした。結果を添加量の％として表した。
【００４７】
結果
ターゲテッドデファレンシャルディスプレイ
内皮細胞中の遺伝子の制御はその環境に依存する。本発明は、内皮が腫瘍細胞と接触したときに制御を司る遺伝子の同定に向けられていた。この目的のため、メラノーマ腫瘍細胞（Ｂ１６）と内皮腫細胞株（ｔ−ｅｎｄ）との同時培養を用いたインビトロアッセイを開発した。混合物から抽出した全ＲＮＡを鋳型として用いてデファレンシャルＰＣＲスクリーニングに供するｃＤＮＡを調製した。内皮またはメラノーマ細胞単独で培養して得られたｃＤＮＡはコントロールとして用いた。３つの異なるパターンを比較して同時培養条件により制御される転写物を同定した。Ｉｇスーパーファミリーの細胞表面分子をコードする配列に分析を限定するため、Ｉｇスーパーファミリー分子中のＣ２ドメインのＣ末端システインの周辺の配列をターゲティングする部分的に縮重したプライマーを用いた。最も再現性のあるパターンのＰＣＲ生成物が配列ＹＹＣｘＡＳ１をコードするプライマーを用いて得られた（図７Ａ）。この改良されたＲＮＡ提示法は、「ターゲテッドデファレンシャルディスプレイ（Targeted Differential Display）」としてＴＤＤと名付けた。
【００４８】
ＴＤＤの繰返し行った実験で１６の差異的に発現された遺伝子が同定された。クローニング、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析の後、１６のＰＣＲ生成物のうちの３つがＩｇスーパーファミリーの未知の成員をコードしている可能性のある候補であった。これら３つの候補のうちの一つ（ＣＲＡＭ−１）を選んでさらに調べた。別々に増殖させたときには、ｔ−ｅｎｄ．１内皮細胞およびＢ１６メラノーマ細胞は高レベルのＣＲＡＭ−１転写物を発現した。しかしながら、同時培養条件下ではＣＲＡＭ−１発現のレベルはダウンレギュレーションされた（図７Ｂ）。ＣＲＡＭ−１に対応する３５０ｂｐ長の断片の翻訳は、アミノ酸配列ＹＹＣｘＡＳを示し、ＩｇＣ２ドメインの終了に続いて膜貫通領域に対応する（signed）１８アミノ酸の疎水性ストレッチを含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示していた。
【００４９】
ＣＲＡＭ−１、免疫グロブリンスーパーファミリーの成員
ＰＣＲ生成物の配列とヌクレオチドデータベースとの配列比較は、マウスのＥＳＴデータベースで相同な配列および同一の配列を明らかにした。ＥＳＴの存在は、ＰＣＲ生成物がインビボで発現される配列に対応することを示していた。３つのＥＳＴがその５’末端に３００ｂｐ長の配列を含んでおり、それがＴＤＤ生成物中の３００ｂｐと同一であることがわかった。各ＥＳＴの３’末端はポリＡテールを含んでいた。ＥＳＴは全部で長さが１２７０ｂｐで、ＣＲＡＭ転写物の３’末端に対応していた。転写物の５’末端はＥＳＴ  ｃＤＮＡクローンにはなかったので、５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより得た。その結果得られた仮定されたＣＲＡＭ−１  ｃＤＮＡの１９８０ヌクレオチドの完全長コード配列を図８Ａに示す。５’末端から１６ｂｐ下流に翻訳開始の強いコンセンサス部位（ＧＡＣＡＴＧＧ）が存在し、それに続いて３１０アミノ酸のタンパク質が予測される単一のＯＲＦが存在していた。仮想の開始メチオニンに続く３１アミノ酸領域はシグナルペプチドの特徴を有していた。開裂部位はＡｌａ３１−Ｖａｌ３２であると予測された。
【００５０】
マウスＣＲＡＭ−１タンパク質の推定構造を図８Ｂに示してあり、可変重鎖および定常２型様免疫グロブリンドメイン（Pfam、The Sanger Centre and Blast）を有する細胞外領域からなっており、２つの可能なＮ−結合グリコシル化部位（アミノ酸１０４および１９２）を有している。疎水性分析（Tmpred, ISREC）は、位置２４２−２６０の間の膜貫通領域を予測した。仮定された細胞質ドメインは４９アミノ酸からなり、多数の高度に保存されたＳｅｒ／ＴｈｒおよびＴｙｒリン酸化部位を含んでいた（図８Ａ、イタリック体の残基）。Prositeプログラムを用いた既知のパターンのサーチは、プロテインキナーゼＣとしてＳＳＫ／ＳＹＫを、ＣＫ２としてＳＫＱＤ／ＴＳＥＥを、チロシンキナーゼリン酸化の特性としてＫＱＤＧＥＳＹ／ＫＨＤＧＶＮＹを同定した。
【００５１】
ＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２は新規なスーパーファミリーを定める
幾つかのタンパク質がＣＲＡＭ−１と高いホモロジーを示した。Ｉｇスーパーファミリーの２つの成員：ヒトＡ３３抗原およびマウス神経細胞接着分子Ｎ−ＣＡＭの一部が、それぞれＣＲＡＭ−１と４１％および４６％のホモロジーを有することがわかった。Ｉｇ  Ｓｆの他の成員であるＪＡＭは、ＣＲＡＭ−１と類似の構造を有し、３４％のアミノ酸配列同一性および５４％のホモロジーを有していた。ＪＡＭとＣＲＡＭ−１との間の有意の同一性を利用して第三の密接に関連する配列、すなわちＣＲＡＭ−２をＥＳＴデータベースで見出した。これら３つの分子の間の同一性は、Ｉｇスーパーファミリーに分子の新たなサブファミリーが存在することを示唆していた（図９）。このホモロジーはＶドメインおよびＣ２ドメインの全体の構造のみならず（図９のＣ５４〜Ｃ１１８およびＣ１４７〜Ｃ２３５）細胞質ドメイン内部の配列にも関わっていた。興味深いことに、これら３つの分子間で最も変化している領域は、Ｖドメインの開始部（位置４０〜６０）および近位の細胞質部分（位置２８０〜３００）に認められた。これら２つの領域の機能は、Ｉｇスーパーファミリーの他の成員におけるリガンド結合およびシグナル伝達に関与する配列に対応しており、細胞−細胞コミュニケーションにおけるＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２の役割を示唆していた。
【００５２】
ＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２  ｍＲＮＡの組織分布
由来の異なる細胞での３つの転写物の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出した。試験した内皮細胞株、上皮細胞株および殆どの腫瘍細胞株はすべて陽性であったが、発現の程度は転写物により異なっていた（図１０Ａ）。ＣＲＡＭ−１の最も高い発現レベルはＳＶ４０で形質転換したＨＥＶ細胞株ＴＭＥ（レーン９）および胚の内皮細胞株ｅ−ｅｎｄ２（レーン４）で見出された。ＣＲＡＭ−２およびＪＡＭ転写物は一層制限された分布を示し、ＣＲＡＭ−１転写物といっしょに成体の内皮細胞株で見出された（レーン３、７、９および１２）。特に、ＪＡＭおよびＣＲＡＭ−２転写物は内皮細胞のＴＮＦ処理により強くダウンレギュレーションされたが、ＣＲＡＭ−１転写物のレベルは変化しなかった（レーン２および１１）。興味深いことに、胚内皮細胞株（レーン４）またはｔ−ｅｎｄの血管形成変異を表す成体内皮細胞株（レーン６）はＪＡＭまたはＣＲＡＭ−２を発現しなかった。
【００５３】
ＪＡＭ−２転写物の組織分布をノーザンブロッティングにより調べ、ＪＡＭ−１と比較した（図１４）。ＪＡＭ−２転写物は２ｋｂの長さで、胚組織、並びに成体動物のパイエル斑、リンパ節、腎臓および精巣で大いに発現された。１．８ｋｂの推定スプライス変異体が精巣で検出された。ＪＡＭ−２転写物の発現は、肺、脾臓および胸腺では低かった。ＪＡＭ−１およびＪＡＭ−２の相対的な豊富さを胚発生の間に比較した：ＪＡＭ−２をコードするｍＲＮＡは早くも交尾後７．５日で検出されたのに対し、ＪＡＭ−１  ｍＲＮＡは胚発生の期間を通じて検出されなかった。
これらの結果は、ＣＲＡＭ−１が胚発生の間に広く発現され、成体の組織では上皮または内皮区画に限定された発現を示すことを示唆している。このことは、ＣＲＡＭ−１が細胞の極性化された組織化の確立および維持において役割を果たしているという考えと一致するものである。
【００５４】
４５ｋＤのタンパク質であるＪＡＭ−２はその細胞−細胞接触部への局在のためにホモフィリックな相互作用に依存する
ＨＥＶ由来細胞株ＴＭＥは最も高いレベルのＪＡＭ−２を発現したので、この内皮細胞株を用いてＪＡＭ−２の細胞内局在をさらに調べ、ＪＡＭ−１の局在と比較した。内皮細胞の表面上のＪＡＭ−２タンパク質の局在は細胞−細胞接触部に限られていた（図１１Ａ、ａ）。ＪＡＭ−２の染色はＪＡＭ−１で観察されるものよりも弱く、細胞間の膜伸長ではより顕著ではなかった。
【００５５】
つぎに、細胞−細胞接触部に存在するＪＡＭ−２がＪＡＭ−２とホモフィリックに相互作用するのかあるいは隣接する細胞上の他の分子とヘテロフィリックに相互作用するのかを調べた。この目的のため、ＪＡＭ−２タンパク質をグリーン蛍光タンパク質に融合し（ＪＡＭ−２−ＥＧＦＰ）、構築物をＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。ＪＡＭ−２−ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞がコンフルエンシーに達したとき、両細胞が該タンパク質を発現している細胞−細胞接触部ではＪＡＭ−２のみが観察された（図１１Ｂ）のに対し、該タンパク質を発現する細胞と発現しない細胞との接触ではＪＡＭ−２が欠けていた（図１１Ｂ、ａ、矢印の先で示す）。同じ結果はキメラ分子ＪＡＭ−１−ＥＧＦＰで細胞をトランスフェクションしたときにも得られた（図１１Ｂ、ｂ）。このことは、ＪＡＭ−２またはＪＡＭ−１のいずれも、細胞−細胞接触部に局在するにはホモフィリックな相互作用が必要であることを示していた。
【００５６】
ＪＡＭ−２を生化学的に特徴付けるため、それぞれＴＭＥ細胞株によってまたはトランスフェクションしたＣＨＯ細胞によって発現された（図１１ＣおよびＤ）、ＪＡＭ−２またはＥＧＦＰキメラタンパク質の免疫沈降を行った。抗ＪＡＭ−２抗体、ＣＲＡＭ−１９Ｈ３６は、ＴＭＥ細胞溶解液からの４５ｋＤの単一のバンドを免疫沈降させた。
【００５７】
みかけの分子量は還元条件下および非還元条件下で同じであり（示していない）、ＪＡＭ−２のアミノ酸配列から導かれる予測された分子量に対応しており、各Ｎ−グリコシル化部位は５ｋＤに相当した。Ｈ２０２−１０６抗ＪＡＭ特異的抗体を用いたＪＡＭ−１の免疫沈降は、より低分子量（〜４２ｋＤ、レーン２）の単一バンドという結果となり、抗ＪＡＭ−２抗体と抗ＪＡＭ−１抗体との間の可能な交差反応性が排除された。
【００５８】
表面ビオチン化後のＪＡＭ−１−ＥＧＦＰタンパク質またはＪＡＭ−２−ＥＧＦＰタンパク質の免疫沈降は、それぞれ７０ｋＤおよび７３ｋＤの単一の広いバンドという結果となり、これら分子がＣＨＯトランスフェクション細胞の表面で発現されていることを示していた（図１１Ｄ、レーン４および６）。ＥＧＦＰは分子量が２８ｋＤなので、これら分子量は予測されたものであった。
【００５９】
密着性および白血球の移行
分子が内皮細胞単層の完全さにどのような影響を及ぼすかおよび分子が血管内皮の機能をどのように制御しているかを理解するため、白血球の経内皮移行アッセイを組換え可溶性ＪＡＭまたはＣＲＡＭ−１の存在下で行った。内皮細胞をｓＪＡＭ−Ｉｇ２ＤｏまたはｓＣＲＡＭ−Ｉｇ２Ｄｏの存在下で２日間培養した。おそらく細胞−細胞接触部形成の機構での分子過剰（molecular redundancy）のため、単層の完全さはこの期間の間に影響を受けなかった。血管外遊出アッセイを１μｇの組換え可溶性分子の存在下で行った。図２０Ａに示すように、血管外遊出細胞の数はｓＪＡＭ−Ｉｇ２Ｄｏの存在によって（白抜きの四角）最初の３時間の間に殆ど影響を受けなかった。４時間後、血管外遊出細胞の数はコントロール（破線）と比べて増大した。対照的に、ｓＣＲＡＭ−Ｉｇ２Ｄｏの存在（黒丸）は血管外遊出細胞の数を大きく低下させた。
【００６０】
白血球の集団は不均質であるので、ｓＣＲＡＭ−Ｉｇ２Ｄｏは特定の白血球亜集団に作用するのか、あるいは特異性なしに血管外遊出が阻止するのかを評価した。この目的のため血管外遊出細胞をリンパ球マーカーＣＤ３およびＢ２２０で標識した（図２０Ｂ）。
顕著にも、ｓＣＲＡＭ−Ｉｇ２Ｄｏは非リンパ性白血球、すなわち骨髄系細胞の血管外遊出を特異的に阻害した（中央のパネル、斜線のカラム）。対照的に、ｓＪＡＭ−Ｉｇ２Ｄｏは他の細胞亜集団に影響を及ぼすことなく血管外遊出したＴ細胞の数をわずかに増大させた（左のパネル、白いカラム）。
【００６１】
さらに、ＣＲＡＭ−１でトランスフェクションした内皮腫細胞を血管外遊出アッセイに用いたとき、血管外遊出の増大が観察された（図１２）のに対し、ＣＲＡＭ−２のトランスフェクションは血管外遊出に影響を及ぼさなかった。ＳＤＦ−１をアッセイに加えたとき、白血球の経内皮移行は２０％に達した。これはＣＲＡＭ−１に対するモノクローナル抗体により部分的に阻止された。
これらの結果は、内皮細胞間でのＣＲＡＭ−１の連動（engagement）が内皮層の機能を制御していることを示している。このファミリーの分子は内皮細胞がコンフルエンシーに達したときにバリヤーになるであろうことが予想された。この目的のため、ＣＲＡＭ−１転写物の制御を異なる培養条件下での内皮細胞で調べた。
【００６２】
ＣＲＡＭは高コンフルエンシーによってダウンレギュレーションされる
ＣＲＡＭ−１をコードする転写物はＴＮＦによっては制御されないが内皮を腫瘍細胞とともに同時培養したときにはダウンレギュレーションされるので、コンフルエンシーアッセイを用いてこの制御をさらに調べた。低コンフルエンシーでは細胞は活発に細胞周期を繰返しＣＲＡＭ−１相互作用は起らなかったが、高コンフルエンシーでは細胞は分裂しなくなりＣＲＡＭ−１は連動した（engaged）。ＣＲＡＭ−１  ｍＲＮＡ発現のレベルを半定量ＲＴ−ＰＣＲにより種々の細胞密度で決定した。図１３に示すように、ＣＲＡＭ−１転写物の発現レベルはコンフルエンシーが達成されるときに低減した（図１３のレーン１、２、３はそれぞれ１００％、５０％および１０％のコンフルエンシーに対応する）。この効果はｔ−ｅｎｄ細胞では殆ど検出できなかったが、ＣＲＡＭ−１を高度に発現するＴＭＥ細胞では一層顕著であった。
【００６３】
内皮でのＣＲＡＭ−１のダウンレギュレーションはまた、内皮細胞をＫＬＮ２０５癌腫細胞（それ自体はＣＲＡＭ−１を発現しない）とともに同時培養したときにも促進された。このことはＣＲＡＭ−１発現と細胞周期との関連性を確認するものであった。なぜなら腫瘍細胞は接触によって内皮細胞の増殖速度を増大させると記載されていたからである。ＫＬＮ２０５癌腫細胞で得られた結果がＢ１６メラノーマ腫瘍を用いた本発明者らの最初のスクリーニング戦略に使用したものと同一であったことは注目される。このことは、腫瘍が内皮の挙動に影響を及ぼす一般的な機構を示している。
【００６４】
ＪＡＭ−２は胚発生の間に高度に発現され、成体の組織ではＨＥＶおよび内皮細胞の亜集団に限定される
ＪＡＭ−２の組織分布を一層明確に定めるため、最も高いレベルのＪＡＭ−２転写物が発現された腎臓および腸間膜リンパ節切片で免疫組織学的分析を行った（図１５）。腎臓の皮質領域では管間構造の特異的な染色が抗ＰＥＣＡＭ（ＧＣ５１）モノクローナル抗体または抗ＪＡＭ−２（ＣＲＡＭ−ＸＶＩＩＩＦ２６）モノクローナル抗体で検出されたのに対し、抗ＺＯ−１または抗ＪＡＭ−１は管状上皮細胞を優先的に染色した（示していない）。
【００６５】
それゆえ、本発明者らは骨髄中に沈み込み（dip down into）橈骨静脈または直脈管内皮構造に対応する血管構造に着目した。この目的のため、連続切片を行い、該血管構造を抗ＰＥＣＡＭ染色で同定した（図１５ｄ）。隣接する切片の等価な領域で線状の内皮間染色が抗ＪＡＭ−２、抗ＪＡＭ−１または抗ＺＯ−１で検出された（それぞれ、図１５ａ、ｂおよびｃ）。腸間膜リンパ節の切片では、高内皮細静脈（ＨＥＶ）の典型的な染色が抗ＪＡＭ−２モノクローナル抗体で得られた（図１５ｅ）。ＨＥＶはまた、ＪＡＭ−１、ＺＯ−１またはＰＥＣＡＭを発現することがわかったが（図１５ｆ、ｇおよびｈ）、染色の細胞内局在は微妙に異なっていた（図１５ｅ〜ｈ、挿入写真）。腸間膜リンパ節の皮質領域では、被膜下静脈洞（subcapsular sinuses）の典型的な染色がすべての抗体で観察され（図１５ｉ〜ｌ）、求心性のリンパ管の染色に対応していた。それゆえ、ＣＲＡＭ−１８Ｆ２６抗ＪＡＭ−２モノクローナル抗体による染色は、ある種の内皮細胞または血管形成に密接に関連する構造に限られている。
【００６６】
内皮細胞の染色が図１５に示す写真を説明するかどうかを明らかにするため、ＪＡＭ−２発現のサイトフルオロメトリー分析を種々の細胞株または解離した組織から新たに単離した内皮細胞で行った。内皮細胞株（ｔＥｎｄ．１、ｅＥｎｄ．２およびＴＭＥ）は細胞表面で低レベルのＪＡＭ−２を発現し、種々のレベルのＪＡＭ−１を発現した（図１６Ａ）。
【００６７】
新たに単離した内皮細胞のサイトフルオロメトリー分析は、コラゲナーゼ／ディスパーゼで器官を解離した後に得た細胞懸濁液を３つずつ染色することにより行った。内皮細胞は、ＰＥＣＡＭ／ＣＤ３１およびアセチル化ＬＤＬの両者で染色した細胞のゲートを開閉することにより同定した（Voytaら、1984, J. Cell. Biol. 99: 2034）。この二重陽性細胞集団でのＪＡＭ−２またはＪＡＭ−１染色は、図１６Ｂに示してある。腎臓およびパイエル斑ではＣＤ３１およびアセチル化ＬＤＬについて陽性の単離細胞はすべてＪＡＭ−２についても染色され、少なくともこれら器官では内皮細胞がＪＡＭ−２をインビボで発現したことを意味していた。リンパ節から得た細胞で染色を行った場合には、ＪＡＭ−２発現は細胞の亜集団でのみ見出され、この組織内での内皮細胞表現型の不均質性の可能性を反映していた。
以上を総合すると、サイトフルオロメトリー分析および免疫組織化学的分析の結果は、ＪＡＭ−２がＪＡＭ−１とともに腎臓、パイエル斑およびリンパ節の内皮細胞により同時に発現されることを示している。
【００６８】
細胞−細胞接触部へのＪＡＭ−２の動的局在
ＪＡＭ−２が細胞−細胞接触部に特異的に局在する機構を詳細に吟味するため、時間経過ビデオ顕微鏡観察を用いた。蛍光キメラ分子で安定にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞をトリプシン処理し、画像化のためにチャンバスライドにプレーティングした。細胞拡張後、ＪＡＭ−２−ＥＧＦＰの表面発現は均一ではなく、むしろ細胞−細胞接触部に群集していた（図１７Ａ、星印で示す細胞）。新たな細胞−細胞接触部の形成の間に細胞結合へのＪＡＭ−２−ＥＧＦＰの再局在が観察され、この新たな細胞−細胞接触部を形成している細胞間の新たな接触点で強い蛍光シグナルが検出された（矢印）。キメラタンパク質は接触している細胞間の膜突起で豊富にみられ、１２分または１８分後に認められる「ジッパー様」写真へと導いた。興味深いことに、一次細胞−細胞接触部でのＪＡＭ−２の局在は新たな膜接触の形成の間にも失われなかった（右上のコーナーの細胞接触を参照）。この知見は、ＪＡＭ−２−ＥＧＦＰが新たな細胞接触に特異的に再局在されること、および連動（engagement）によりその局在は安定であることを示していた。
【００６９】
ＪＡＭ−２の局在の要件にさらに取り組むため、細胞単層を創傷した後に時間経過ビデオ顕微鏡観察を行った（図１７Ｂ）。端を傷つけた細胞はその完全な接触部位ではＪＡＭ−２を染色したが（矢印の先）、傷ついた部位ではＪＡＭ−２局在を喪失し（矢印）、ＪＡＭ−２の膜局在を維持するには反対側細胞上のリガンドによるＪＡＭ−２の連動が必要であることを示していた。創傷から９０分経過すると、創傷と接している細胞は創傷領域内に移動し始めた。興味深いことに、これら細胞は、鮮やかに蛍光を発する、すなわちＪＡＭ−２陽性の膜突起を介して隣接細胞との接触を維持していた（矢印の先）。これら結果は、ＪＡＭ−２のホモフィリックな相互作用が細胞−細胞接触部の確立または維持に役割を果たしているという仮説を支持していた。
【００７０】
ＪＡＭ−２は単層の密着性を増大させ、密着結合複合体に関与している
細胞−細胞連結に関与している多数の分子が細胞単層のパラ細胞（paracellular）透過性を制御していることが示されているので、ＪＡＭ−２もまたこの機能に影響を及ぼし得るか否かを試験した。ＪＡＭ−２−ＥＧＦＰのトランスフェクションはＦＩＴＣデキストランへのパラ細胞透過性を低下させ、ＣＨＯ細胞単層のシーリングを４２．５％改善した；一方、関係のない分子Ｔａｃのトランスフェクション（ＩＬ２Ｒ  α）はＣＨＯトランスフェクション細胞のパラ細胞透過性を有意に低下させなかった（図１８）。ＪＡＭ−１−ＥＧＦＰのトランスフェクションもまたＣＨＯトランスフェクション細胞単層のパラ細胞透過性を低下させた。
これら結果は、これらキメラ分子が、極性化上皮細胞における密着結合などの細胞内の特別の区画に関与し得るかという問題を提起した。
【００７１】
この問題に答えるため、ＥＧＦＰキメラタンパク質をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションし、その細胞内局在を密着結合マーカー：オクルディンと比較した。図１９Ａに示すように、０．９μｍ毎の連続写真をＥＧＦＰ蛍光について分析し、オクルディン染色と比較したところ、ＪＡＭ−２−ＥＧＦＰは密着結合レベルでの細胞−細胞接触部で特に豊富にみられた。基底部レベルでは（左）、ＥＧＦＰ蛍光の細胞内の点が観察された。ＪＡＭ−１−ＥＧＦＰでトランスフェクションしたＭＤＣＫ細胞の同様の分析（図１９Ｂ）は、オクルディンとの同様の同時局在を示した。それにも拘らず、密着結合のレベルではＪＡＭ−１−ＥＧＦＰ蛍光の分布はＪＡＭ−２−ＥＧＦＰで観察されるものに比べて連続性が低かった。
【００７２】
検討
この実施例は、接着分子のＩｇスーパーファミリーの成員をコードする制御された転写物を同定するための新規なスクリーニング戦略の使用を報告するものである。ここには、この方法を用いて新規な分子ＣＲＡＭ−１を制御された転写物としてクローニングすることを記載してある。腫瘍の存在下で増殖させた内皮細胞で観察される制御は、半定量的なＲＴ−ＰＣＲによって確認され、細胞の増殖期に依存することが示されている。変化する細胞のコンフルエンシー条件下での差異的な発現のため、「コンフルエンシー制御接着分子−１」としてＣＲＡＭ−１の名称が採用された。
【００７３】
ここではまた、ＣＲＡＭ−２と称するＣＲＡＭ−１と密接に関連する配列をも記載してある。ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２は接着分子の新規なサブファミリーの基本形を表しており、これはまた最近記載された分子ＪＡＭをも含む（Chretienら、1988, Eur. J. Immunol. 28, 4049-4104; Malergueら、1998, Mol. Immunol. 35, 1111-1119）。
ＣＲＡＭ−１およびＪＡＭは細胞−細胞接触部で内皮組織および上皮組織によって優先的に発現され、極性化層に特別の性質を付与する。経内皮移行アッセイにおける組換え可溶性分子の作用およびＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２の制御は、これら３つの分子が血管生理学の維持において重要な役割を果たしていることを示している。
【００７４】
ターゲテッドデファレンシャルディスプレイ（ＴＤＤ）と名付けた新規なスクリーニング戦略は、目的のｃＤＮＡを選択的に増幅するうえで有効な技術であることがわかった。ＴＤＤは、Ｃ２様Ｉｇドメインの保存された領域Ｙ(Ｙ／Ｑ／Ｒ)ＣＸＡＳに選択的なターゲティングを付与するための部分的に縮重したプライマーの使用を開発することに成功した。繰返し行った実験は、再現性のある提示パターンに導いた。１６の差異的に発現された転写物のうち、３つが保存されたＩｇ配列に対して有意のホモロジーを有する遺伝子に対応している。この特異性の増大によって、古典的なＲＮＡのフィンガープリンティングおよびデファレンシャルディスプレイのすでに知られている技術の主たる困難性をどうにか克服できる。
【００７５】
ＲＮＡフィンガープリンティングは長い間、差異的に発現された遺伝子の同定に用いられてきた。しかしながら、配列に特異的なプライマーを用いるため、この方法は選択され既に知られているタンパク質の転写物しか検出することがない。他方、ＲＮＡ提示はランダムプライマーを用い、転写物の非特異的な増幅を含んでいる。この場合の目的は、比較のために供出された２つの生物系の間でのｍＲＮＡレベルの差異を正確に指摘することである。ＴＤＤはＲＮＡフィンガープリンティングの特異性をデファレンシャルＲＮＡディスプレイの縮重と組み合せて選択性という結果となる改良されたスクリーニング法である。関連する転写物をターゲティングするため、この技術はスクリーニングに要する時間を有意に短くするものである。それゆえ、特定のタンパク質ファミリーの新規の成員の同定が可能となる。このことは、報告された非特異的なスクリーニング戦略実質的な改良点である。
【００７６】
これらの共通する特性を用い、ＪＡＭ、ＣＲＡＭ−１およびＣＲＡＭ−２の機能を調べるために組換えタンパク質を構築した。本実施例ではｓＪＡＭ−Ｉｇ２ＤｏおよびｓＣＲＡＭ−１−Ｉｇ２Ｄｏの作用をインビトロ血管外遊出アッセイで記載してある。骨髄細胞の移行に対する特異的な阻止作用はｓＣＲＡＭ−１−Ｉｇ２Ｄｏでは観察することができたが、ｓＪＡＭ−Ｉｇ２Ｄｏはリンパ球に対してわずかな作用しか示さなかった。
【００７７】
ＪＡＭ転写物およびＣＲＡＭ−２転写物は同様の組織分布およびＴＮＦの影響下で同様の発現の制御を示し、これらが同様の生理機構により作用することを示していた。対照的に、ＣＲＡＭ−１転写物はＴＮＦによって制御されず、むしろ内皮細胞の増殖速度または密度によって制御される。実際、細胞周期にある細胞でのＣＲＡＭ−１転写物の過剰発現および静止細胞でのダウンレギュレーションは、この分子が連続単層の確立に関与していることを示している。細胞の集密な単層でのその機能は、内皮細胞層および関連する特性の維持である。異なる白血球集団が免疫応答部位に移行しなければならないので、非リンパ球はＣＲＡＭ−１に依存した機構で移行し、一方、リンパ球はＪＡＭまたはＣＲＡＭ−２により移行すると考えられる。この場合、免疫応答は異なる可溶性組換え分子の組み合せを用いることにより調節できる。
【図２−１】
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【図２−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年5月6日(2010.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫グロブリンスーパーファミリーのサブファミリーに属するポリペプチドであって、
ａ）  配列番号２１に示すマウスコンフルエンシー制御接着分子２（マウスＣＲＡＭ−２）のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）  配列番号２１に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、リンパ球の移行を刺激するか、又は細胞単層のパラ細胞（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）透過性を低下させる、上記ポリペプチド；
ｃ）  配列番号２３に示すヒトコンフルエンシー制御接着分子２（ヒトＣＲＡＭ−２）のアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｄ）  配列番号２３に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、リンパ球の移行を刺激するか、又は細胞単層のパラ細胞透過性を低下させる、上記ポリペプチド、
からなる群から選ばれた、上記ポリペプチド。
【請求項２】
医薬として使用するための、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
白血球の経内皮移行を抑制する能力がある可溶性ポリペプチドであって、
ａ）  配列番号２１に示すマウスコンフルエンシー制御接着分子２（マウスＣＲＡＭ−２）のＶ及びＣ２ドメインと少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、又は
ｂ）  配列番号２１に示すマウスＣＲＡＭ−２のアミノ酸１〜２３３、
を含む、上記可溶性ポリペプチド。
【請求項４】
医薬として使用するための、請求項３に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項５】
炎症反応の治療において使用するための、請求項４に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドであって、
ａ）  配列番号１９で示されるマウスコンフルエンシー制御接着分子２（マウスＣＲＡＭ−２）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）  完全なポリペプチド又はその一部をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２１に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、リンパ球の移行を刺激するか、又は細胞単層のパラ細胞（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）透過性を低下させるポリペプチドである、上記ポリヌクレオチド；
ｃ）  配列番号２３に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｄ）  完全なポリペプチド又はその一部をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２３に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、リンパ球の移行を刺激するか、又は細胞単層のパラ細胞透過性を低下させるポリペプチドである、上記ポリヌクレオチド、
からなる群から選ばれた、上記ポリヌクレオチド。
【請求項７】
医薬として使用するための、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体であって、白血球の経内皮移行を抑制する能力がある、上記抗体。
【請求項９】
毒素、放射性標識又は薬剤に結合される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
医薬として使用するための、請求項８又は９に記載の抗体。
【請求項１１】
活性成分として請求項８又は９に記載の抗体を含む、腫瘍における血管形成の抑制のための、炎症反応の治療のための、白血球の経内皮移行を抑制するための、血管透過性の調節のための、薬剤の送達のために腫瘍における血管透過性を増大するための、又は腫瘍細胞の進行を阻止するための、医薬組成物。
【請求項１２】
活性成分として請求項３に記載の可溶性ポリペプチドを含む、炎症反応の治療のための、白血球の経内皮移行を抑制するための、又は血管透過性を調節するための、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項８に記載の抗体又は請求項６に記載のポリヌクレオチドの診断のためのインビトロの使用であって、該抗体又は該ポリヌクレオチドが標識された、上記インビトロの使用。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドを有する細胞のターゲティング分子としての、請求項８又は９に記載の抗体の使用。