(57)【要約】【課題】本発明は、光軸方向の分解能を向上させることの可能な光活性化限局顕微鏡及び光活性化限局観察方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明を例示する光活性化限局顕微鏡の一態様は、光活性化蛍光物質を含む被観察物（１０Ａ）上に活性化光を集光する集光手段（１７）と、前記活性化光の集光スポットで前記被観察物上の観察領域を走査する走査手段（１６）と、前記観察領域へ励起光を照射する励起手段（１２２）と、前記観察領域の蛍光強度分布を検出する検出手段（２０１）とを備え、前記活性化光のピークパワー及び中心波長は、前記集光スポットに位置する光活性化蛍光物質が多光子吸収により活性化する値に設定される。【選択図】    図１
2010102332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光活性化蛍光物質を含む被観察物上に活性化光を集光する集光手段と、
前記活性化光の集光スポットで前記被観察物上の観察領域を走査する走査手段と、
前記観察領域へ励起光を照射する励起手段と、
前記観察領域の蛍光強度分布を検出する検出手段と、
を備え、
前記活性化光のピークパワー及び中心波長は、
前記集光スポットに位置する光活性化蛍光物質が多光子吸収により活性化する値に設定される
ことを特徴とする光活性化限局顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の光活性化限局顕微鏡において、
前記活性化光の中心波長は、
前記励起光の波長より長い
ことを特徴とする光活性化限局顕微鏡。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の光活性化限局顕微鏡において、
前記活性化光の中心波長は、
前記蛍光の波長より長い
ことを特徴とする光活性化限局顕微鏡。
【請求項４】
請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の光活性化限局顕微鏡において、
前記活性化光の光源は、
フェムト秒パルスレーザ光源である
ことを特徴とする光活性化限局顕微鏡。
【請求項５】
光活性化蛍光物質を含む被観察物上に活性化光を集光する集光手順と、
前記活性化光の集光スポットで前記被観察物上の観察領域を走査する走査手順と
前記観察領域へ励起光を照射する励起手順と、
前記観察領域の蛍光強度分布を検出する検出手順と、
を含み、
前記活性化光のピークパワー及び中心波長は、
前記集光スポットに位置する光活性化蛍光物質が多光子吸収により活性化する値に設定される
ことを特徴とする光活性化限局観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光活性化限局顕微鏡及び光活性化限局観察方法に関する。なお、ここでは、ＰＡＬＭ（Photoactivation Localization Microscopy）又はＳＴＯＲＭ（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）の原理を利用した顕微鏡を「光活性化限局顕微鏡」と称し、ＰＡＬＭ又はＳＴＯＲＭの原理を利用した観察方法を「光活性化限局観察方法」と称す。
【背景技術】
【０００２】
近年提案された光活性化限局顕微鏡は、通常の共焦点顕微鏡よりも分解能の高い顕微鏡として知られている（非特許文献１、２等を参照。）。
【０００３】
光活性化限局顕微鏡の被観察物である細胞は、活性化されているときにのみ蛍光を発することが可能な蛍光分子（光活性化蛍光タンパクなど）で標識される。例えば、光活性化蛍光タンパクの一種であるＤｒｏｎｐａは、活性化光を照射すると励起光を吸収可能となり、不活性化光を照射すると褪色する。
【０００４】
光活性化限局顕微鏡は、被観察物に含まれる蛍光分子を活性化光の照射により適当な活性化密度で活性化し、被観察物に含まれる蛍光分子の分布を励起光の照射により検出し、さらに活性化中の蛍光分子を不活性化光（又は高強度の励起光）の照射により不活性化（又は褪色）させる。
【０００５】
これらの活性化、励起、検出、不活性化（又は褪色）を繰り返すことにより取得される複数の画像には、互いに近接していた複数の蛍光分子の像が個別に反映される。よって、これら複数の画像を適切に合成すれば、被観察物上の蛍光強度分布を高い分解能（例えば１０ｎｍの分解能）で観察することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Samuel T. Hess et al. "Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy", Biophysical Journal, December, 2006, Vol. 91, pp. 4258-4272
【非特許文献２】Eric Betzig et al. "Imaging Intracellular Flourescent Proteins at Nanometer Resolution" SCIENCE, Vol. 313, 15 September 2006, pp. 1642-1645
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、この光活性化限局顕微鏡にて高い分解能が得られるのは、光軸と垂直な面内（標本面内）のみに限られていた。
【０００８】
そこで本発明は、光軸方向の分解能を向上させることの可能な光活性化限局顕微鏡及び光活性化限局観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明を例示する光活性化限局顕微鏡の一態様は、光活性化蛍光物質を含む被観察物上に活性化光を集光する集光手段と、前記活性化光の集光スポットで前記被観察物上の観察領域内を走査する走査手段と、前記観察領域へ励起光を照射する励起手段と、前記観察領域の蛍光強度分布を検出する検出手段とを備え、前記活性化光のピークパワー及び中心波長は、前記集光スポットに位置する光活性化蛍光物質が多光子吸収により活性化する値に設定される。
【００１０】
本発明を例示する光活性化限局観察方法の一態様は、光活性化蛍光物質を含む被観察物上に活性化光を集光する集光手順と、前記活性化光の集光スポットで前記被観察物上の観察領域内を走査する走査手順と、前記観察領域へ励起光を照射する励起手順と、前記観察領域の蛍光強度分布を検出する検出手順とを含み、前記活性化光のピークパワー及び中心波長は、前記集光スポットに位置する光活性化蛍光物質が多光子吸収により活性化する値に設定される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、光軸方向の分解能を向上させることの可能な光活性化限局顕微鏡及び光活性化限局観察方法が実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１実施形態のシステムの構成図である。
【図２】Ｄｒｏｎｐａの特性を説明する図である。
【図３】各部の光学的特性を説明する図である。
【図４】第１実施形態のイメージング期間における各部のタイミングチャートである。
【図５】レーザスポットＡｉを説明する図である。
【図６】レーザスポットＡｉで生じる現象を説明する図である。
【図７】２回目以降のイメージング時にレーザスポットＡｉで生じる現象を説明する図である。
【図８】第２実施形態のシステムの構成図である。
【図９】第２実施形態のイメージング期間における各部のタイミングチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として光活性化限局顕微鏡システムを説明する。
【００１４】
図１は、本実施形態のシステムの構成図である。図１に示すとおり本システムにはレーザユニット１２と、レンズ１４と、ダイクロイックミラー１５と、１対のガルバノミラーを備えたスキャナ１６と、対物レンズ１７と、結像レンズ１８と、ピンホール絞り１９と、レンズ２０と、バリアフィルタ２１１と、光電子増倍管（ＰＭＴ）２０１と、ステージ１１と、コントロールユニット３０とが備えられる。このうちピンホール絞り１９は、対物レンズ１７の焦点に対して光学的に共役な位置に配置されている。
【００１５】
ステージ１１には標本１０Ａが支持される。標本１０Ａは、光活性化蛍光タンパクの一種であるＤｒｏｎｐａによって標識された細胞試料である。図２に示すとおり、Ｄｒｏｎｐａの活性化波長（一光子励起により活性化する波長）は４０５ｎｍ、不活性化波長は４８８ｎｍ、励起波長は５６０ｎｍ、蛍光波長は６００ｎｍである。
【００１６】
図１に示したレーザユニット１２には、このような特性のＤｒｏｎｐａに適合する活性化用光源１２１と、励起用光源１２２と、不活性化用光源１２３とが備えられる。
【００１７】
活性化用光源１２１は、活性化光として、例えば１ｋＨｚの周波数でフェムト秒パルスレーザ光を射出するフェムト秒パルスレーザ光源であり、その活性化光の波長（中心波長）は、図３に示すとおりＤｒｏｎｐａの活性化波長（４０５ｎｍ）の２倍（８１０ｎｍ）に設定されている。
【００１８】
励起用光源１２２は、励起光としてレーザ光を射出するレーザ光源であり、その励起光の波長は、図３に示すとおりＤｒｏｎｐａの励起波長（５６０ｎｍ）と同じに設定されている。
【００１９】
不活性化用光源１２３は、不活性化光としてレーザ光を射出するレーザ光源であり、その不活性化光の波長は、図３に示すとおりＤｒｏｎｐａの不活性化波長（４８８ｎｍ）と同じに設定されている。
【００２０】
活性化用光源１２１の射出光路（活性化光の光路）には、ダイクロイックミラー１０１と、レンズ１３とが順に配置されており、このレンズ１３がレーザユニット１２の射出口を構成している。ダイクロイックミラー１０１の特性は、波長が８１０ｎｍの近傍である光を透過し、他の波長の光を反射する特性に設定されている。よって、活性化用光源１２１から射出した活性化光（８１０ｎｍの近傍）は、ダイクロイックミラー１０１を透過した後、レンズ１３を介してレーザユニット１２の外部へ射出する。
【００２１】
励起用光源１２２の射出光路（励起光の光路）には、ダイクロイックミラー１０２が配置されている。ダイクロイックミラー１０２の特性は、波長が５６０ｎｍである光を反射し、他の波長の光を透過する特性に設定されている。よって、励起用光源１２２から射出した励起光（５６０ｎｍ）は、ダイクロイックミラー１０２を反射した後に、ダイクロイックミラー１０１を反射し、活性化光と同じ光路を辿ってレーザユニット１２の外部へ射出する。
【００２２】
不活性化用光源１２３の射出光路（不活性化光の光路）には、全反射ミラー１０３が配置されている。よって、不活性化用光源１２３から射出した不活性化光（４８８ｎｍ）は、全反射ミラー１０３を反射し、ダイクロイックミラー１０２を透過し、ダイクロイックミラー１０１を反射し、活性化光と同じ光路を辿ってレーザユニット１２の外部へ射出する。
【００２３】
なお、以上の活性化用光源１２１、励起用光源１２２、不活性化用光源１２３から射出する活性化光、励起光、不活性化光は、コントロールユニット３０によって個別かつ高速にオン／オフ可能である。よって、レーザユニット１２から射出するレーザ光は、活性化光（８１０ｎｍの近傍）、励起光（５６０ｎｍ）、不活性化光（４８８ｎｍ）の間で高速に切り替え可能である。因みに、レーザユニット１２から射出するレーザ光は、活性化光と励起光との混合光、又は不活性化光と励起光との混合光に設定されることも可能である。
【００２４】
レーザユニット１２から射出したレーザ光は、レンズ１４を介して径の太い光束となり、ダイクロイックミラー１５へ入射する。ダイクロイックミラー１５の特性は、波長が８１０ｎｍの近傍、５６０ｎｍ、４８８ｎｍである光を反射し、波長が６００ｎｍの近傍である光を透過する特性に設定されている。よって、レーザユニット１２から射出した活性化光、励起光、不活性光は、何れもダイクロイックミラー１５を反射し、スキャナ１６及び対物レンズ１７を順に介した後、標本１０Ａに向けて集光する。
【００２５】
レーザユニット１２から射出したレーザ光が活性化光であるときには、レーザ光の照射領域（レーザスポット）に存在する未活性の蛍光分子が活性化される。また、レーザユニット１２から射出したレーザ光が励起光であるときには、そのレーザスポット中に存在する活性化中の蛍光分子が励起され、蛍光が発生する。また、そのレーザユニット１２から射出したレーザ光が不活性化光であるときには、そのレーザスポット中に存在する活性化中の蛍光分子が褪色する。
【００２６】
そして、レーザスポットで発生した蛍光（６００ｎｍの近傍）は、そのレーザスポットを形成したレーザ光の光路を逆向きに辿り、対物レンズ１７及びスキャナ１６を順に介した後、ダイクロイックミラー１５を透過し、結像レンズ１８、ピンホール絞り１９、レンズ２０を順に介してバリアフィルタ２１１へ入射する。バリアフィルタ２１１の特性は、波長が６００ｎｍの近傍である光を透過し、他の波長の光を除去する特性に設定されている（図３参照）。よって、その蛍光はバリアフィルタ２１１を透過し、ＰＭＴ２０１にて電気信号（蛍光量を示す蛍光信号）に変換される。
【００２７】
ここで、スキャナ１６が駆動されると、レーザスポットが標本１０Ａ上の観察領域内（対物レンズ１７の視野内）を二次元状に走査する。よって、例えばコントロールユニット３０は、レーザスポットが各位置にあるときに活性化光→励起光→不活性化光をこの順で点灯させてＰＭＴ２０１から蛍光信号を読み出し、各位置について読み出された各蛍光信号に基づけば、観察領域の蛍光画像を取得することができる（イメージング）。
【００２８】
また、コントロールユニット３０は、このイメージングを同じ観察領域について十分な回数だけ繰り返し、それによって得られた複数の蛍光画像の各々を先鋭化（個々の輝点の輝度分布をガウス関数でフィッティング）してから積算（又は平均化）し、観察用の蛍光画像を作成する。
【００２９】
図４は、第１実施形態のイメージング期間における各部のタイミングチャートである。図４において符号Ｔで示すのはスキャナ１６による１画素分の走査期間であって、ＰＭＴ２０１の駆動周期に相当する（１０−３秒程度）。ＰＭＴ２０１は、１画素分の走査期間Ｔ中に電荷を蓄積し、１画素分の蛍光信号を生成する。
【００３０】
図４（Ａ）に示すとおり、活性化光が点灯されるのは、１画素分の走査期間Ｔの最初の期間Ｔａのみであり、図４（Ｂ）に示すとおり、励起光が点灯されるのは、１画素分の走査期間Ｔの全期間であり、図４（Ｃ）に示すとおり、不活性化光が点灯されるのは、１画素分の走査期間Ｔの最後の期間Ｔｂのみである。
【００３１】
前述したとおり、期間Ｔａに点灯される活性化光は、フェムト秒パルスレーザ光である。そのパルス幅は例えば１０−１５秒であり、そのパルス周波数は例えば１ｋＨｚであり、そのパルスのピークパワー（単位時間当たりのパルスエネルギー）は、レーザスポットに存在する未活性の蛍光分子を二光子吸収により適切な活性化密度で活性化させる値（１００ｍＷ近傍の適当な値）に設定される。
【００３２】
二光子吸収に必要なパワーは極めて大きいので、図５に示すとおりレーザスポットＡｉのうち活性化される蛍光分子の分布域（活性化領域）は、光の集中する中央領域Ａａのみである。この中央領域Ａａの光軸方向のサイズ及び光軸と垂直な標本面内のサイズは、活性化光ＬＢの回折限界よりも小さく、１０−６ｍ程度である（１画素分の走査期間Ｔにおけるレーザスポットの移動量は、そのサイズと同じに設定されている。）。
【００３３】
また、二光子吸収に必要なパワーは極めて大きいので、その中央領域Ａａにおいて活性化される蛍光分子の配置密度はさほど高くない。その中央領域Ａａにおいて活性化される蛍光分子の最小配置ピッチは、２００ｎｍ程度である（前述した適切な活性化密度は、例えば、最小配置ピッチがこの値となるような活性化密度のことである。）。
【００３４】
よって、或る画素に関する１画素分の走査期間Ｔの最初に活性化光が点灯されると、図６（Ａ）に示すとおりレーザスポットＡｉの中央領域Ａａに所定密度で点在する複数の未活性の蛍光分子Ｍａのみが活性化され、活性化された複数の蛍光分子Ｍａは、図６（Ｂ）に示すとおりその時点で点灯されている励起光により励起され、蛍光を発する。なお、励起光の照射領域は、レーザスポットＡｉのほぼ全域であるが、蛍光を発する蛍光分子の存在域は、中央領域Ａａのみに限局される。その後、１画素分の走査期間Ｔの最後に不活性化光が点灯されると、図６（Ｃ）に示すとおり中央領域Ａａにおいて蛍光を発していた複数の蛍光分子Ｍａの各々が褪色する。
【００３５】
したがって、１画素分の走査期間ＴにＰＭＴ２０１が蓄積する電荷、すなわち前記画素に関する蛍光信号の抽出元は、レーザスポットＡｉの全域ではなく、レーザスポットＡｉの中央領域Ａａに限局される。
【００３６】
また、２回目以降のイメージングでも、同じ画素に関する蛍光信号が取得されるが、その蛍光信号の抽出元も、レーザスポットＡｉの中央領域Ａａのみに限局される。
【００３７】
但し、同じ画素に関する蛍光信号であっても、２回目以降のイメージングで取得される蛍光信号に反映されるのは、図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に示すとおり、先行するイメージングで活性化されなかった蛍光分子Ｍａ’の蛍光量である。
【００３８】
したがって、全ての蛍光分子が褪色するまでイメージングを繰り返し、その間に取得された複数の蛍光画像を積算（又は平均化）すれば、観察領域の各位置の蛍光分子量を正確に反映した、良好な観察用の蛍光画像が得られる。
【００３９】
以上、本システムでは、活性化光のピークパワー及び中心波長を最適化することにより、蛍光信号の抽出元をレーザスポットＡｉの極めて小さい中央領域Ａａ（活性化光の回折限界以下）に限局するので、その分解能は、従来の光活性化限局顕微鏡のそれよりも格段に高まる。
【００４０】
図５に模式的に示したとおり中央領域Ａａは、標本面内だけでなく光軸方向にかけても限局されている。したがって、本システムの分解能向上の効果は、標本面内だけでなく光軸方向にも現れ、標本１０Ａにおいて観察対象となる層の厚さは、従来の光活性化限局顕微鏡における厚さよりも格段に薄くなる。
【００４１】
なお、本システムではＰＭＴ２０１の前段にピンホール絞り１９が配置されたが、本システムの分解能は、中央領域Ａａのサイズによって規定される（つまり活性化光のピークパワーによって規定される）のであって、ピンホール絞り１９の開口サイズによって規定される訳ではない。因みに、本システムにおいてピンホール絞り１９が配置された目的は、ノイズの原因となりうる迷光がＰＭＴ２０１へ入射することを防止することにある。
【００４２】
よって、本システムにおいてＰＭＴ２０１に対する迷光の入射が問題とならない場合には、ピンホール絞り１９を省略してもよい。
【００４３】
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態を説明する。本実施形態は、第１実施形態のシステムの変形例である。ここでは、第１実施形態と同じ要素には同じ符号を付し、第１実施形態との相違点のみを説明する。
【００４４】
図８は、本実施形態のシステムの構成図である。図８に示すとおり本システムは、第１実施形態にシステムにおいて、レーザユニット１２の代わりにレーザユニット１２’が配置され、ＰＭＴ２０１及びレンズ２０及びピンホール絞り１９の代わりにＣＣＤ等の撮像素子２０１’が配置され、レーザユニット１２’とは別に励起用光源１２２が設けられ、ダイクロイックミラー２３、レンズ２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、１７ａ、１７ｂを付加したものである。
【００４５】
このうち撮像素子２０１’の撮像面は、対物レンズ１７の焦点面に対して光学的に共役な位置に配置されている。
【００４６】
また、ダイクロイックミラー１５の特性は、波長が８１０ｎｍの近傍、４８８ｎｍである光を反射し、波長が６００ｎｍの近傍、５６０ｎｍである光を透過する特性に設定されている。
【００４７】
図８に示したレーザユニット１２’には、活性化用光源１２１と不活性化用光源１２３とが備えられ、これらの光源は何れも第１実施形態で説明したものと同じである。また、レーザユニット１２’とは別に設けられた励起用光源１２２も、第１実施形態で説明したものと同じである。
【００４８】
活性化用光源１２１の射出光路（活性化光の光路）には、ダイクロイックミラー１０１と、レンズ１３とが順に配置されており、このレンズ１３がレーザユニット１２’の射出口を構成している。活性化用光源１２１から射出した活性化光（８１０ｎｍの近傍）は、ダイクロイックミラー１０１を透過した後、レンズ１３を介してレーザユニット１２’の外部へ射出する。
【００４９】
不活性化用光源１２３の射出光路（不活性化光の光路）には、全反射ミラー１０２が配置されている。よって、不活性化用光源１２３から射出した不活性化光（４８８ｎｍ）は、全反射ミラー１０２を反射し、ダイクロイックミラー１０１を反射し、活性化光と同じ光路を辿ってレーザユニット１２’の外部へ射出する。
【００５０】
励起用光源１２２の射出光路（励起光の光路）には、レンズ２２ａ、２２ｂ、２２ｃが配置されている。レンズ２２ａ、２２ｂは倍率変換を行うために用いられており、レンズ２２ｃは、ビーム径をゆるく絞るために用いられている。
【００５１】
なお、以上の活性化用光源１２１から射出する活性化光と、不活性化用光源１２３から射出する不活性化光とは、コントロールユニット３０によって個別かつ高速にオン／オフ可能である。よって、レーザユニット１２’から射出するレーザ光は、活性化光（８１０ｎｍの近傍）及び不活性化光（４８８ｎｍ）の間で高速に切り替え可能である。また、励起用光源１２２から射出する励起光も、コントロールユニット３０によってオン／オフ可能である。
【００５２】
レーザユニット１２’から射出したレーザ光（活性化光及び不活性化光の少なくとも一方）は、レンズ１４を介して径の太い光束となり、スキャナ１６、レンズ１７ａ、１７ｂ、ダイクロイックミラー１５、及び対物レンズ１７を順に介した後、標本１０Ａに向けて集光し、レーザスポットを形成する。
【００５３】
励起用光源１２２から射出した励起光は、レンズ２２ａ、２２ｂ、２２ｃを介してゆるやかに集光する光束となり、ダイクロイックミラー２３へ入射する。ダイクロイックミラー２３の特性は、波長が５６０ｎｍである光を反射し、波長が６００ｎｍの近傍である光を透過する特性に設定されている。よって、ダイクロイックミラー２３へ入射した励起光は、ダイクロイックミラー２３を反射し、ダイクロイックミラー１５を透過し、対物レンズ１７へ入射する。ここで、対物レンズ１７へ向かう励起光の集光点は、対物レンズ１７の瞳面上に一致している。よって、対物レンズ１７へ入射した励起光は、対物レンズ１７の先端から平行光束となって射出し、標本１０Ａ上の観察領域（対物レンズ１７の視野）の全域を一括に照射する。
【００５４】
ここで、活性化光がオンされているときには、レーザスポット内に存在する未活性の蛍光分子が活性化される。また、励起光がオンされているときには、観察領域内に存在する活性化中の蛍光分子が励起され、蛍光が発生する。また、不活性化光がオンされているときには、そのレーザスポット内に存在する活性化中の蛍光分子が褪色する。
【００５５】
そして、観察領域で発生した蛍光（６００ｎｍの近傍）は、対物レンズ１７を介した後、ダイクロイックミラー１５、２３を順に透過し、結像レンズ１８及びバリアフィルタ２１１を介して撮像素子２１０’の撮像面上に結像する。撮像素子２１０’は、その撮像面上に形成された蛍光像を撮像して蛍光画像信号を生成する。なお、撮像素子２１０’のシャッタ（電子シャッタ等）は、コントロールユニット３０によって制御される。
【００５６】
ここで、スキャナ１６が駆動されると、レーザスポットが標本１０Ａ上の観察領域内（対物レンズ１７の視野内）を二次元状に走査する。よって、例えばコントロールユニット３０は、１フレーム分の走査期間中、レーザスポットが各位置にあるときに活性化光→励起光→不活性化光をこの順で点灯させると共に、その１フレーム分の走査期間中に撮像素子２０１’のシャッタを開放しておけば、１フレーム分の走査期間中に撮像素子２０１’が生成した蛍光画像信号を、観察領域の蛍光画像として取得することができる（イメージング）。
【００５７】
また、コントロールユニット３０は、このイメージングを同じ観察領域について十分な回数だけ繰り返し、それによって得られた複数の蛍光画像の各々を先鋭化（個々の輝点の輝度分布をガウス関数でフィッティング）してから積算（又は平均化）し、観察用の蛍光画像を作成する。
【００５８】
図９は、第２実施形態のイメージング期間における各部のタイミングチャートである。図９において符号Ｔで示すのはスキャナ１６による１画素分の走査期間であって、符号Ｔ’で示すのはスキャナ１６による１フレーム分の走査期間である。本実施形態では、撮像素子２０１’のシャッタ開放期間（＝電荷読み出し周期）が、１フレーム分の走査期間Ｔ’と同じに設定される。
【００５９】
また、活性化光が点灯されるのは、第１実施形態と同様、１画素分の走査期間Ｔの最初の期間Ｔａのみであり、励起光が点灯されるのは、第１実施形態と同様、１画素分の走査期間Ｔの全期間であり、不活性化光が点灯されるのは、第１実施形態と同様、１画素分の走査期間Ｔの最後の期間Ｔｂのみである。また、期間Ｔａにおける活性化光のスポットのピークパワーやパルス波形なども、第１実施形態のそれと同じである。
【００６０】
そして、本システムのコントロールユニット３０は、全ての蛍光分子が褪色するまでこのイメージングを繰り返し、その間に取得された複数の蛍光画像を積算（又は平均化）することにより観察用の蛍光画像を取得する。
【００６１】
以上、本システムでは、励起光のスポットで観察領域を走査する代わりに、拡がりを持った励起光で観察領域の全域を一括に照射しているので、１フレーム分の走査期間中の各時点における励起光の照射範囲は、第１実施形態のそれよりも広くなっている。
【００６２】
しかし、本システムにおいても第１実施形態のシステムと同様、走査用のレーザスポットとして、適切なピークパワー及び波長を有した活性化光のスポットを使用するので、１フレーム分の走査期間中の各時点における蛍光の発生元は、第１実施形態のシステムと同様、微小な領域（図５の中央領域Ａａ）のみに限局される。したがって、本システムでも、第１実施形態のシステムと同等の高い分解能が期待できる。
【００６３】
なお、本システムでは、１フレーム分の走査期間中に撮像素子２０１’のシャッタを開放し続けているので、撮像素子２０１’の各画素にノイズ光が入射し、ＳＮ比が低下する虞がある。
【００６４】
よって、本システムのコントロールユニット２０は、ＳＮ比の低下を防ぐために、撮像素子２０１’の電荷読み出し周期を、１フレーム分の走査期間と同じにする代わりに１画素分の走査期間と同じに設定してもよい。
【００６５】
なお、その場合、１フレーム分の走査期間内に多数枚の蛍光画像が取得されるので、コントロールユニット３０は、それらの蛍光画像の各々から、各々の走査位置（スポット位置）に対応する画素又は画素ブロックの蛍光信号を参照し、それらの蛍光信号を基にして１フレーム分の蛍光画像を作成すればよい。
【００６６】
［各実施形態への補足］
なお、上述した何れかの実施形態のシステムは、光軸方向の分解能が高いので、標本１０Ａの三次元蛍光像を取得するのに適している。三次元蛍光像を取得する場合、コントロールユニット３０は、ステージ１１の光軸方向の高さをステップ状に変化させ、その高さが各値にあるときに観察用の蛍光画像の取得を行えばよい。このようにして取得された複数枚の観察用の蛍光画像は、標本１０Ａの互いに異なる層の蛍光像を示す。
【００６７】
また、上述した何れかの実施形態のシステムでは光活性化蛍光タンパクとしてＤｒｏｎｐａが使用されたが、他の光活性化蛍光タンパク、例えば活性化される前後で蛍光波長の異なるＫａｅｄｅが使用されてもよい。
【００６８】
何れの光活性化蛍光タンパクが使用された場合であっても、１画素分の走査期間Ｔにおける各光の点灯パターンは、使用された光活性化蛍光タンパクの特性に適合したものとなる。例えば、本システムではＤｒｏｎｐａを使用したので、活性化された蛍光分子が蛍光を発した直後に不活性化光を照射したが、他の光活性化蛍光タンパクが使用された場合は、その限りではない。
【００６９】
［前述した一態様への補足］
なお、前記活性化光の中心波長は、前記励起光の波長より長くてもよい。
【００７０】
また、前記活性化光の中心波長は、前記蛍光の波長より長くてもよい。
【００７１】
また、前記活性化光の光源は、フェムト秒パルスレーザ光源であってもよい。
【符号の説明】
【００７２】
１２，１２’…レーザユニット、１４…レンズ、１５，２３…ダイクロイックミラー、１６…スキャナ、１７…対物レンズ、１８…結像レンズ、１９…ピンホール絞り、２０，２２ａ，２２ｂ，２２ｃ，１７ａ，１７ｂ…レンズ、２１１…バリアフィルタ、２０１…光電子増倍管（ＰＭＴ）、１１…ステージ、３０…コントロールユニット，２０１’…撮像素子（ＣＣＤ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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