(57)【要約】    【課題】  骨粗しょう症、変形性関節症、褥瘡などの種々の疾病の抑制に有効なペプチド分子の本体、とりわけ腸管での体内への吸収が容易なジペプチド、前記ジペプチドを必須のジペプチドとして含有するコラーゲンペプチドおよび前記ジペプチドを必須の有効成分として含有する疾病抑制剤を提供する。    【解決手段】  本発明にかかるコラーゲンペプチドは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須のジペプチドとして含有することを特徴とする。本発明にかかるジペプチドは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有することを特徴とする。本発明にかかる疾病抑制剤は、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須の有効成分として含有することを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須のジペプチドとして含有する、コラーゲンペプチド。
【請求項２】
Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有する、ジペプチド。
【請求項３】
Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須の有効成分として含有する、疾病抑制剤。
【請求項４】
前記有効成分となるジペプチドがコラーゲンペプチドとして含有されるものである、請求項３に記載の疾病抑制剤。
【請求項５】
有効成分としてグルコサミンおよび／またはその塩も含む、請求項３または４に記載の疾病抑制剤。
【請求項６】
骨粗しょう症抑制剤である、請求項３から５までのいずれかに記載の疾病抑制剤。
【請求項７】
変形性関節炎抑制剤である、請求項３から５までのいずれかに記載の疾病抑制剤。
【請求項８】
褥瘡抑制剤である、請求項３から５までのいずれかに記載の疾病抑制剤。
【請求項９】
経口用である、請求項３から８までのいずれかに記載の疾病抑制剤。
【請求項１０】
関節局所への注入用である、請求項３から８までのいずれかに記載の疾病抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンペプチド、ジペプチドおよび疾病抑制剤に関する。詳しくは、特定の構造を有するジペプチドを必須のジペプチドとして含有するコラーゲンペプチドと、新規な構造を有するジペプチド、前記ジペプチドを必須の有効成分とする、骨粗しょう症、変形性関節炎、褥瘡などの抑制（本発明において、「抑制」という用語は、症状の発症を抑制する「予防」としての意味と、発症した症状を抑制する「治療」としての意味の双方を含む。）に有効な疾病抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗しょう症は、骨の絶対量の減少を生じているが骨の質的な変化を伴わない状態をいう。骨は絶えず吸収、形成されているものであり、吸収率と形成率に差を生じ、骨形成が負の平衡となれば骨粗しょうが起こる。骨の吸収は破骨細胞によって行われ、破骨細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨の吸収率は高くなる。一方、骨の形成は骨芽細胞によって行われ、骨芽細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨の形成率は高くなる。
変形性関節炎は、関節に慢性の退行性変化および増殖性変化が同時に起こり、関節の形態が変化する疾患である。関節軟骨が次第に磨耗または欠損し、骨が露出するようになる。関節軟骨は血管系が存在せず、特に関節摺動部軟骨細胞および肋軟骨組織の修復・再生は、血管が存在する骨組織と比較し困難である。特に、関節軟骨を支える骨組織が疎となると（骨粗しょう症）、関節部の機能に支障をきたし、結果として、変形性関節炎（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を発症する。
【０００３】
褥瘡は、長時間臥床している時に、骨の突出した部位の皮膚および軟部組織が、骨と病床との間で長時間の圧迫のために循環障害を起こし、壊死となった状態をいう。
上記のような症状に対するペプチドの効能としては、変形性関節炎に対する効能が報告されており、例えば、有効成分としてコラーゲンペプチド、グルコサミン塩を含み、ｐＨが２〜５である関節強化飲料（特許文献１参照）、コラゲナーゼ酵素を用いてコラーゲン成分またはゼラチン成分を分解することにより得られる、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのトリペプチドを有効成分とする慢性関節リウマチまたは変形関節症の改善剤（特許文献２参照）、コラーゲンおよびコラーゲンペプチドから選ばれた少なくとも１種と、アミノ糖と、ムコ多糖類およびウロン酸から選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴とする経口関節障害治療剤または機能性食品（特許文献３参照）などが知られている。
【特許文献１】特開２００２−１２５６３８号公報
【特許文献２】特開２００２−２５５８４７号公報
【特許文献３】特開２００３−４８８５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記従来の技術は、変形性関節炎の予防ないし治療に、コラーゲンや、様々なペプチド分子の混合物であるコラーゲンペプチド、あるいは、特定のトリペプチドが有効であることを示すのみであり、変形性関節炎のみならず、骨粗しょう症、褥瘡なども含めた広い意味での疾病を予防ないし治療するのに有効なペプチド構造はこれまで知られていない。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、従来とは視点を変え、骨粗しょう症、変形性関節症、褥瘡などの種々の疾病の抑制に有効なペプチド分子の本体、とりわけ、腸管での体内への吸収が容易で新規なジペプチドを探り出し、前記ジペプチドを必須の有効成分として含有する疾病抑制剤および前記ジペプチドを必須のジペプチドとして含有するコラーゲンペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、本願発明者が新規に見出したＨｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドが、腸管での体内吸収が容易であり、かつ、疾病抑制剤の有効成分として働くこと、具体的には、例えば、破骨細胞の分化と活性化を抑制し、骨芽細胞の分化と活性化を亢進し、軟骨細胞の変性を抑制してその分化を調節することを見出し、骨粗しょう症、変形性関節症の抑制に有効であることを見出すとともに、このジペプチドが皮膚真皮中のトロポコラーゲン量を回復させ褥瘡をも抑制することを見出し、これらの事実を確認して、本発明を完成した。
すなわち、本発明にかかるコラーゲンペプチドは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須のジペプチドとして含有する、ことを特徴とする。
【０００６】
本発明にかかるジペプチドは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有する、ことを特徴とする。
本発明にかかる疾病抑制剤は、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須の有効成分として含有する、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、骨粗しょう症、変形性関節症、褥瘡などの症状を有効に抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明にかかるコラーゲンペプチド、ジペプチドおよび疾病抑制剤について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
〔ジペプチド、コラーゲンペプチド〕
本発明にかかるジペプチドは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するものである。
本発明にかかるコラーゲンペプチドは、前記ジペプチドを必須のジペプチドとして含有するものである。例えば、後述するようにコラーゲンやゼラチンを酵素処理することにより得ることができる。
【０００９】
Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドは、ヒドロキシプロリン単位および／またはグリシン単位が化学修飾されていても良く、ヒドロキシプロリン単位については、水酸基が化学修飾されていても良い。
以上、本発明においては、「Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチド」とは、化学修飾したものも化学修飾していないものも含む。また、以下では、「Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチド」を単に「Ｈｙｐ−Ｇｌｙ」と表記することがある（他のペプチドについても同様とする）。
Ｈｙｐ−Ｇｌｙが化学修飾されている場合、弱酸性から中性で溶解可能にでき、後述する他の有効成分との相溶性向上なども期待できる。具体的には、ヒドロキシプロリン残基の水酸基については、Ｏ−アセチル化などの化学修飾、グリシン残基のα−カルボキシル基については、エステル化、アミド化などの化学修飾が挙げられる。後述する他の有効成分の種類などに応じて、適切な化学修飾を選択すれば良い。
【００１０】
前記Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、例えば、後述するように、コラーゲンやゼラチンを２段階に分けて酵素処理するか、アミノ酸から合成することにより得ることができ、化学修飾については、後述するような公知の手段が挙げられる。ただし、本発明にかかるジペプチドは、これらの方法以外の方法で得ても良く、例えば、下記２段階酵素処理法に代えて、１次酵素処理を省略した方法や、１次酵素処理および２次酵素処理を同時に行う方法であっても良いのである。
＜コラーゲンまたはゼラチンの２段階酵素処理＞
コラーゲンまたはゼラチンを一般的な方法で１次酵素処理した後に、２次酵素処理としてヒドロキシプロリダーゼ活性を有する酵素で反応させる２段階酵素処理によって、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチドを得ることができる。
【００１１】
この２段階酵素処理によれば、１次酵素処理によって、経口免疫寛容メカニズムを介した骨・軟骨組織の炎症緩和に有用な比較的分子量の大きなペプチドが生成し、２次酵素処理によって、例えば、ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するペプチド（ｘはプロリン以外のアミノ酸残基を表す。）であれば、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ残基とｘ残基間のペプチド結合（Ｈｙｐのアミノ基とｘのカルボキシル基に由来するペプチド結合）が切断されてＨｙｐ−Ｇｌｙが生成する。
前記コラーゲンとしては、特に限定するわけではないが、例えば、牛や豚などの哺乳動物由来のコラーゲンやサメや鯛などの魚類由来のコラーゲンが挙げられ、これらは、前記哺乳動物の骨、皮部分や前記魚類の骨、皮、鱗部分などから得ることができる。具体的には、前記骨、皮、鱗などに脱脂・脱灰処理、抽出処理などの従来公知の処理を施せば良い。
【００１２】
前記ゼラチンは、前記コラーゲンを熱水抽出などの従来公知の方法で処理することにより得ることができる。
前記コラーゲンやゼラチンの２段階酵素処理で用いる酵素としては、特に限定されないが、得られるジペプチドを特定保健用食品に利用する場合などを考慮すると、病原性微生物由来の酵素以外の酵素を用いることが好ましい。
１次酵素処理の処理条件としては、例えば、コラーゲンまたはゼラチン１００重量部に対して酵素０．１〜５重量部用い、３０〜６５℃で１〜７２時間処理することができる。
上記コラーゲンまたはゼラチンの１次酵素処理により得られるコラーゲンペプチドの平均分子量は、好ましくは２００〜２０００、より好ましくは２００〜１８００である。平均分子量が前記範囲にあれば、分子量の比較的大きなペプチドが充分に生成しているといえる。
【００１３】
１次酵素処理後に、必要に応じて酵素を失活させても良いが、この場合の失活温度としては、例えば、７０〜１００℃である。
前記１次酵素処理に用いる酵素としては、コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切断することが可能な酵素であれば、特に限定されないが、通常、タンパク質分解酵素あるいはプロテアーゼと呼ばれる酵素が用いられる。具体的には、例えば、コラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタルプロテアーゼなどが挙げられ、これらを単独で、あるいは複数組み合わせて用いることができる。前記チオールプロテアーゼとしては、植物由来のキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシン、動物由来のカテプシン、カルシウム依存性プロテアーゼなどが知られている。また、前記セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＤなどが、前記酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、キモトリプシンなどが知られている。
【００１４】
さらに、２次酵素処理では、例えば、酵素として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のヒドロキシプロリダーゼ活性およびプロリラーゼ活性を有する酵素を用いた酵素反応がなされる。この反応により、１次酵素処理物には含まれていなかったＨｙｐ−Ｇｌｙが生成する。
２次酵素処理の処理条件としては、例えば、１次酵素処理物１００重量部に対して酵素０．０１〜５重量部用い、３０〜６５℃で１〜７２時間処理することができる。
上記２次酵素処理により得られるコラーゲンペプチドの平均分子量は、好ましくは２００〜１５００、より好ましくは２００〜９００である。この２次酵素処理は、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの生成を主たる目的としており、１次酵素処理により得られるコラーゲンペプチドのうち、比較的大きなペプチドが過剰に加水分解されてしまわないように、前記平均分子量の範囲となるように２次酵素処理することが好ましい。
【００１５】
２次酵素処理後に酵素を失活させる必要があるが、失活温度としては、例えば、７０〜１００℃である。
前記２段階酵素処理により得られた加水分解物、もしくは、前記２段階酵素処理および発酵により得られた発酵生成物は、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ以外のアミノ酸やペプチド成分も含む混合物であるので、Ｈｙｐ−Ｇｌｙもしくはその塩を得る場合には、必要に応じて、分画・精製を行うようにしても良い。分画・精製の方法としては、特に制限はなく、例えば、限外濾過や、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィーや、これらを組み合わせた方法などのような従来公知の方法にすれば良い。具体的には、例えば、以下のようにして分画・精製することができる。すなわち、まず、前記加水分解物あるいは発酵生産物の約２ｇ／１０ｍＬをイオン交換カラム（例えば、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）やＳＰトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）など）に２回に分けて負荷して、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収する。次いで、回収した画分を前記イオン交換カラムとは逆のイオン交換基を有するカラム（例えば、ＳＰトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）やＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）など）に負荷して、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収する。次に、この画分をゲル濾過カラム（例えば、セファデックスＬＨ−２０カラム（ファルマシア社製）など）に負荷し、３０％メタノール水溶液で溶出して化学合成品であるＨｙｐ−Ｇｌｙが溶出する位置に相当する画分を回収する。本画分については、逆相カラム（例えば、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  ５μＣ１８  ３００Åカラム（ウォーターズ社製）など）を装填した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、０．１％トリフルオロ酢酸を含む３２％以下のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配により分画する。そして、回収したＨｙｐ−Ｇｌｙ画分を減圧乾固することにより、高純度のＨｙｐ−Ｇｌｙを得ることができる。
【００１６】
＜アミノ酸からの合成＞
アミノ酸からＨｙｐ−Ｇｌｙを合成することができる。
Ｈｙｐ−Ｇｌｙの合成法としては、一般的に、（１）固相合成法と（２）液相合成法（例えば、特開２００３−１８３２９８号公報参照）があり、前者の場合は、さらに（Ａ）Ｆｍｏｃ法と（Ｂ）Ｂｏｃ法の方法が知られているが、Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、いずれの方法で合成してもよい。
固相法を一例として、以下に詳しく説明する。
ヒドロキシプロリンを担体ポリスチレンに固定し、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基あるいはＢｏｃ基を使用する公知の固相合成法により合成することができる。すなわち、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いた脱水反応によってＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）基でアミノ基を保護したヒドロキシプロリンにグリシンを結合（ペプチド結合）させた後、固相を溶媒でよく洗い、残ったグリシンなどを除去する。この後、固相に結合しているヒドロキシプロリン残基の保護基を除去（脱保護）することにより、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを合成することができる。
【００１７】
＜化学修飾＞
Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、化学修飾が施されているものであっても良い。化学修飾の具体的手段や処理条件は、通常のペプチドの化学修飾技術が適用される。
ヒドロキシプロリン残基の水酸基の化学修飾については、例えば、Ｏ−アセチル化は水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることなどにより、行うことができる。
グリシン残基のα−カルボキシル基の化学修飾について、例えば、エステル化はメタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気することなどにより、アミド化はカルボジイミドなどを作用させることにより、行うことができる。
【００１８】
化学修飾のその他の具体例として、特公昭６２−４４５２２号公報や特公平５−７９０４６号公報等に記載の化学修飾技術が適用できる。
〔疾病抑制剤〕
本発明にかかる疾病抑制剤は、必須の有効成分としてＨｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを含む。疾病抑制剤としては、骨粗しょう症抑制剤、変形性関節炎抑制剤、褥瘡抑制剤などが好適に挙げられる。
本発明にかかる疾病抑制剤は、本発明にかかるジペプチドを有効成分として含むほか、本発明にかかるコラーゲンペプチドが含む本発明にかかるジペプチドを有効成分とするものであっても良い。そして、この場合においては、前記疾病抑制剤が、アミノ酸から化学合成したＨｙｐ−Ｇｌｙや、コラーゲンやゼラチンの加水分解物であるコラーゲンペプチドから単離したＨｙｐ−Ｇｌｙを含有する態様だけでなく、前記コラーゲンペプチドからＨｙｐ−Ｇｌｙを単離せずにコラーゲンペプチドの形のまま含有する態様であってもよい。本発明にかかる疾病抑制剤は、このように、コラーゲンペプチドのまま含有させる形態も含めて、本発明にかかるジペプチドを有効成分とするものであり、これらのジペプチドを、コラーゲンペプチドの形で用いる場合を含めて併用することも可能である。
【００１９】
前記本発明にかかる疾病抑制剤全量に対し、前記Ｈｙｐ−Ｇｌｙを、０．００１重量部以上の割合で配合することが好ましい。より好ましくは０．０１重量部以上の割合で配合する。０．００１重量部未満では本願発明の効果が充分に発現されないおそれがある。
さらに、本発明にかかる疾病抑制剤を患部に直接注入して用いる場合、前記Ｈｙｐ−Ｇｌｙの含量が１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましい。
本発明にかかる疾病抑制剤は、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを生理食塩水などで希釈したものであっても良く、充分に本発明の効果を得ることができるが、前記Ｈｙｐ−Ｇｌｙ以外に、本発明の効果を害しない範囲で、適宜他の有効成分や製剤用の成分を含有させても良い。
【００２０】
前記他の有効成分としては、グルコサミンおよび／またはその塩、コンドロイチン硫酸などが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。中でも、グルコサミンおよび／またはその塩は、Ｈｙｐ−Ｇｌｙによる疾病抑制効果を向上させる働きがあるため好ましい。
また、前記他の有効成分として、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ以外のペプチドやアミノ酸を含んでいても良く、例えば、比較的分子量の大きなペプチドは、慢性リウマチ性関節炎などに対して、経口免疫寛容メカニズムによる骨・軟骨組織の炎症を緩和するという効果を奏するので有用である。Ｈｙｐ−Ｇｌｙ以外のペプチドやアミノ酸を含有させるためには、コラーゲンやゼラチンを加水分解してＨｙｐ−Ｇｌｙを含有するコラーゲンペプチドを得た後、このコラーゲンペプチドを、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを単離せずに、そのまま使用すればよい。
【００２１】
さらに、前記他の有効成分として、骨塩の沈着促進の目的で、カルシウムや糖転移ヘスペリジンなどを用いることができ、コラーゲンの合成・沈着促進などの目的でビタミンＣなどを用いることもできる。
前記他の有効成分の配合量としては、疾病抑制剤全量に対して、０．００１〜２０重量部で用いることが好ましく、０．０１〜２０重量部の割合で用いることがより好ましい。特に、グルコサミンおよび／またはその塩の配合量を、疾病抑制剤全量に対して、５〜１５重量部とすることが好ましい。５重量部未満ではＨｙｐ−Ｇｌｙの効果を向上させる効果が充分に発揮されないおそれがあり、１５重量部を超えると尿や糞中に排出され、過剰摂取となるおそれがある。
【００２２】
製剤化のための成分としては、例えば、結晶性セルロースなどの賦形剤などを用いることができ、その形態などに応じて適切な量を設定すれば良い。
本発明にかかる疾病抑制剤の使用形態としては、例えば、経口投与により摂取したり、患部へ直接注入したり、といった形態が挙げられる。Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、腸管で迅速に吸収され、アミノ酸への分解もほとんど起こらないため、経口投与による摂取が好適である。
経口投与の場合には、Ｈｙｐ−Ｇｌｙと前記他の有効成分や製剤用の成分を混合したものを、従来公知の方法により、打錠成型によって錠剤としたり、その他、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などの任意の形態に調製することもできる。
【００２３】
患部へ直接注入する場合には、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを生理食塩水などで希釈したものを用いるが、必要に応じて、さらに、前記他の有効成分を用いても良く、その濃度としては、上述の如く、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの含量を１ｍｍｏｌ／Ｌ以上とすることが好ましい。
本発明にかかる疾病抑制剤に必須の有効成分として含有されるジペプチドは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するものであり、アミノ酸、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ以外の構造を有するジペプチド、Ｈｙｐ−Ｇｌｙに他のアミノ酸が結合したトリペプチド以上のペプチドなどとは異なる。前記Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを含有させることで、優れた疾病抑制効果（骨粗しょう症、変形性関節炎、褥瘡などの症状の抑制効果）が発現される。
【００２４】
以上のことは、後述する実施例中の性能評価試験において、具体的に立証されている。
〔他のジペプチドとの併用〕
Ｈｙｐ−Ｇｌｙの疾病抑制効果は、他のジペプチドと併用することで相乗的に高めることができる場合がある。
例えば、Ｈｙｐ−ＧｌｙとＰｒｏ−Ｈｙｐを併用することで、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの疾病抑制効果を相乗的に高めることができる。
さらに、例えば、変形性関節炎などの疾病に対しては、Ａｌａ−Ｈｙｐを併用することで、その効能を相乗的に高めることができる。
【００２５】
本発明にかかるコラーゲンペプチドとして、例えば、Ｈｙｐ−ＧｌｙとＰｒｏ−Ｈｙｐをともに含有するコラーゲンペプチドを得るためには、基本的には、Ｈｙｐ−Ｇｌｙについて説明した２段階酵素処理法と同様の方法で、２次酵素処理で用いる酵素の種類のみを変更すればよい。このような酵素としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属など由来のプロリダーゼ活性およびヒドロキシプロリダーゼ活性を有する酵素が挙げられる。
本発明にかかる疾病抑制剤において、Ｈｙｐ−ＧｌｙとＰｒｏ−Ｈｙｐを併用する場合、両者の含有比率の好ましい範囲は、両者の合計を１００重量％とするとき、Ｈｙｐ−Ｇｌｙが５０〜９０重量％、Ｐｒｏ−Ｈｙｐが１０〜５０重量％である。
【００２６】
また、Ｈｙｐ−Ｇｌｙと他のジペプチドを併用する場合、前記本発明にかかる疾病抑制剤全量に対するジペプチドの配合割合は、例えば、ジペプチドの合計量が、０．００１重量部以上の割合であることが好ましい。より好ましくは０．０１重量部以上の割合で配合する。さらに、本発明にかかる疾病抑制剤を患部に直接注入して用いる場合、ジペプチドの合計含量が１０μｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましい。
他のジペプチドを併用することによる相乗効果について、本発明の疾病抑制剤が抑制し得る代表的な上記症状、すなわち、骨粗しょう症、変形性関節炎、褥瘡を例として、具体的に説明する。
【００２７】
骨粗しょう症は、前述のように、骨の吸収が破骨細胞によって行われ、破骨細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨の吸収率は高くなる一方で、骨の形成が骨芽細胞によって行われ、骨芽細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨の形成率は高くなる。したがって、破骨細胞の分化および活性化を抑制し、骨芽細胞の分化および活性化を亢進することで、骨粗しょう症を抑制することができる。そして、本発明者の知見によれば、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、破骨細胞、骨芽細胞の分化および活性化において、次のような働きを示す。
すなわち、まず、破骨細胞の分化および活性化のメカニズムについて説明すると、初めに、（ｉ）複数の前駆破骨細胞が融合して多核巨細胞に分化する。この分化を触媒する酵素はＴＲＡＰ（Ｔｅｒｔａｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：酒石酸耐性酸性リン酸エステル分解酵素）である。続いて、（ｉｉ）前記多核巨細胞（破骨細胞）が骨組織を溶解・分解する。前記メカニズムにおいて、Ｈｙｐ−Ｇｌｙは主として（ｉ）を抑制し、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは（ｉ）、（ｉｉ）の両方を抑制する。したがって、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを併用することにより、これらが相乗的に作用して、より優れた効果を発揮することが示唆される。
【００２８】
また、骨芽細胞は、骨基質（Ｉ型コラーゲン）を合成・分泌し、この骨基質を、ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：アルカリ性リン酸エステル分解酵素）が石灰化（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２：水酸化アパタイト）することにより、骨化を亢進する。このとき、Ｈｙｐ−Ｇｌｙが、前記ＡＬＰ活性を亢進し、さらにＰｒｏ−Ｈｙｐを併用することで相乗効果によりＨｙｐ−Ｇｌｙの亢進効果が促進され、それぞれのジペプチドを単独で用いるよりも優れた亢進効果を発現させることができる。
変形性関節炎は、（ｉ）細胞増殖期、（ｉｉ）軟骨細胞分化／成熟期、（ｉｉｉ）肥大化軟骨細胞への分化（変性）期、（ｉｖ）石灰化およびこれを経たのちのアポトーシス（プログラム化された細胞死）の４期に順次分けられるが、（ｉ）、（ｉｉ）においては、主としてＰｒｏ−Ｈｙｐが軟骨細胞への分化の亢進とその維持に寄与し、さらに（ｉｉ）ではＨｙｐ−Ｇｌｙが前駆関節軟骨細胞の分化を調節し、肥大化軟骨細胞への分化（変性）を触媒し、かつ、特異マーカーでもあるＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：アルカリ性リン酸エステル分解酵素）の活性を抑制することにより、（ｉｉｉ）への移行を阻害する。ここで、本発明者の知見によれば、さらにＡｌａ−Ｈｙｐを併用することで、（ｉｉ）におけるＨｙｐ−Ｇｌｙの作用、すなわち、前駆関節軟骨細胞の分化の調節と、ＡＬＰ活性の抑制が相乗的に高まる。このように、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−Ｈｙｐを併用し、さらに好ましくはＡｌａ−Ｈｙｐをも併用することにより、相乗的に軟骨細胞の変性を抑制し、関節細胞の表現型を維持させることにより変形性関節症の抑制に寄与することが示唆される。
【００２９】
褥瘡の発症と治癒過程は、（ｉ）炎症反応期、（ｉｉ）増殖期（肉芽形成期）、（ｉｉｉ）安定期の３期に順次分けられる。
すなわち、皮膚が損傷を受けると、（ｉ）の炎症反応期において組織の断裂と血管の断裂が起こり、局所に出血するが、血液中の凝固因子などの作用と血管の収縮により止血する。ついで、リンパ球、単核球などが浸出液として血管から抜け出し、傷口へと移動する（細胞遊走）。ここで、Ｐｒｏ−Ｈｙｐがリンパ球および単核球の細胞遊走を促進する機能を発揮する。単核球はマクロファージとなり、これがさらにさまざまな化学物質を放出して、次のシグナルの発生源となる。また、内因性コラゲナーゼ（例えば、ＭＭＰ−１３）により皮膚真皮中のコラーゲン線維が分解される。
【００３０】
つぎに、（ｉｉ）の増殖期において、マクロファージの活動で放出された化学物質や前述の内因性コラゲナーゼにより生じたコラーゲン分解断片ペプチド（例えば、Ｐｒｏ−ＨｙｐとＨｙｐ−Ｇｌｙ）が刺激となり、線維芽細胞が呼び寄せられ、膠原線維（コラーゲン：トロポコラーゲンが主成分）が生成される。線維芽細胞、毛細血管、コラーゲンが共同作業を行い、傷口へ進出し、欠損面を埋め、創面を癒合する（肉芽組織形成）。ここで、Ｐｒｏ−ＨｙｐとＨｙｐ−Ｇｌｙの両者が相乗的にコラーゲン合成を亢進して肉芽組織形成を促進するが、特に（ｉｉ）の増殖期の初期過程で主にＰｒｏ−Ｈｙｐが生理機能を発揮し、後期過程で主にＨｙｐ−Ｇｌｙが生理機能を発揮する。肉芽組織が形成されると、基底層以外の非増殖細胞が移動して一層の上皮細胞層を形成する。そして、この層の下に創縁から基底層の細胞が移動・増殖し、多層の上皮を形成した結果、上皮化が完成する。
【００３１】
最後に、（ｉｉｉ）の過程では、線維芽細胞の活性が平常に戻り、コラーゲンの生成が少なくなり、生成量と分解量がバランスを保ちながら定常状態に移行し、治癒を完成する。
本発明にかかるコラーゲンペプチドに含有されるジペプチドの上記のごとき働きは、後述する実施例中の性能評価試験における各種効果の実証からも示唆されている。
〔Ｐｒｏ−Ｈｙｐ〕
上に述べたＰｒｏ−Ｈｙｐは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙと併用する場合だけでなく、単独で用いた場合においても、骨粗しょう症、変形性関節炎、褥瘡などの症状を抑制する作用がある。
【００３２】
以下では、このＰｒｏ−Ｈｙｐについて、詳細に説明するが、Ｈｙｐ−Ｇｌｙに関しての上述の説明と重複する内容が多いため、主に相違点について説明することとする。
Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、プロリン単位および／またはヒドロキシプロリン単位が化学修飾されていても良く、特に、ヒドロキシプロリン単位については、カルボキシル基と水酸基のいずれか、または、両方が化学修飾されていても良い。
以上、本明細書において、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチド」、あるいは、これを略記して「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ」というとき、このものは化学修飾したものも化学修飾していないものも含む。
【００３３】
Ｐｒｏ−Ｈｙｐが化学修飾されている場合、弱酸性から中性で溶解可能にでき、他の有効成分との相溶性向上なども期待できる。具体的には、プロリン残基のα−アミノ基については、ポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化などの化学修飾、ヒドロキシプロリン残基のα−カルボキシル基については、エステル化、アミド化などの化学修飾、ヒドロキシプロリン残基の水酸基については、Ｏ−アセチル化などの化学修飾が挙げられる。他の有効成分の種類などに応じて、適切な化学修飾を選択すれば良い。
【００３４】
前記Ｐｒｏ−Ｈｙｐを疾病抑制剤に配合する割合や、さらに、この疾病抑制剤を関節局部への注入用として用いる場合におけるＰｒｏ−Ｈｙｐの含量については、Ｈｙｐ−Ｇｌｙで述べた割合や含量と同様でよい。
前記Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙと同様に、例えば、コラーゲン、ゼラチンを２段階に分けて酵素処理するか、アミノ酸から合成することにより得ることができ、化学修飾については、後述するような公知の手段が挙げられる。
Ｐｒｏ−Ｈｙｐを得るための酵素処理法としては、基本的には、Ｈｙｐ−Ｇｌｙについて説明した２段階酵素処理法と同様の方法で良いが、２次酵素処理には、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属など由来のアミノペプチダーゼＰおよびプロリダーゼ活性を有する酵素を用いるようにする。
【００３５】
Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙと同様に、アミノ酸から合成することができるが、この場合、上で説明したＨｙｐ−Ｇｌｙの合成法において、単に、ヒドロキシプロリンに代えてプロリンを用い、グリシンに代えてヒドロキシプロリンを用いればよい。
先に述べたとおり、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、化学修飾が施されているものであっても良い。化学修飾の具体的手段や処理条件は、通常のペプチドの化学修飾技術が適用される。
プロリン残基のα−アミノ基の化学修飾について、例えば、ポリペプチジル化はＮ−カルボン酸無水物などとの反応により、スクシニル化あるいはマレイル化はｐＨ８付近で無水コハク酸あるいは無水マレイン酸などと反応させることにより、アセチル化は中性付近でＮ−ヒドロキシスクシンイミドアセテートなどと反応させることにより、脱アミノ化は亜硝酸などを作用させることにより、ベンゾイル化は塩化ベンゾイルまたは無水安息香酸などを作用させることにより、アルキルスルホニル化あるいはアリルスルホニル化はベンゼンスルホニルクロライド、ｐ−トルエンスルホニルクロライド、メタンスルホニルクロライドなどと反応させることにより、ジニトロフェニル化あるいはトリニトロフェニル化は２，４−ジニトロフルオロベンゼン、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸などを作用させることにより、カルバミル化あるいはフェニルカルバミル化はシアン酸などを作用させることにより、チオール化はＮ−アセチルホモシスティンチオラクトン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、チオパラコン酸、Ｓ−アセチルチオイタマル酸無水物などを作用させることにより、行うことができる。
【００３６】
ヒドロキシプロリン残基のα−カルボキシル基の化学修飾について、例えば、エステル化はメタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気することなどにより、アミド化はカルボジイミドなどを作用させることにより、行うことができる。
ヒドロキシプロリン残基の水酸基の化学修飾については、例えば、Ｏ−アセチル化は水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることなどにより、行うことができる。
化学修飾のその他の具体例として、特公昭６２−４４５２２号公報や特公平５−７９０４６号公報等に記載の化学修飾技術が適用できる。
有効成分としてＰｒｏ−Ｈｙｐを含む疾病抑制剤の詳細については、有効成分としてＨｙｐ−Ｇｌｙを含む疾病抑制剤に関して述べたことと共通するので、説明を省略する。
【００３７】
〔Ａｌａ−Ｈｙｐ〕
上に述べたＡｌａ−Ｈｙｐは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙと併用する場合だけでなく、単独で用いた場合においても、変形性関節炎などの症状を抑制する作用がある。
以下では、このＡｌａ−Ｈｙｐについて、詳細に説明するが、Ｈｙｐ−ＧｌｙやＰｒｏ−Ｈｙｐに関しての上述の説明と重複する内容が多いため、主に相違点について説明することとする。
Ａｌａ−Ｈｙｐは、アラニン単位および／またはヒドロキシプロリン単位が化学修飾されていても良く、特に、ヒドロキシプロリン単位については、カルボキシル基と水酸基のいずれか、または、両方が化学修飾されていても良い。
【００３８】
以上、本明細書において、「Ａｌａ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチド」、あるいは、これを略記して「Ａｌａ−Ｈｙｐ」というとき、このものは化学修飾したものも化学修飾していないものも含む。
Ａｌａ−Ｈｙｐが化学修飾されている場合、弱酸性から中性で溶解可能にでき、他の有効成分との相溶性向上なども期待できるが、基本的には、上述のＰｒｏ−Ｈｙｐと同様の化学修飾が可能である。すなわち、アラニン残基のα−アミノ基については、上述のＰｒｏ−Ｈｙｐにおけるプロリン残基のα−アミノ基と同様の化学修飾、ヒドロキシプロリン残基のα−アミノ基および水酸基については、上述のＰｒｏ−Ｈｙｐにおけるヒドロキシプロリン残基のα−アミノ基および水酸基と同様の化学修飾が可能である。他の有効成分の種類などに応じて、適切な化学修飾を選択すれば良い。
【００３９】
前記Ａｌａ−Ｈｙｐを疾病抑制剤に配合する割合や、さらに、この疾病抑制剤を関節局部への注入用として用いる場合におけるＡｌａ−Ｈｙｐの含量については、Ｈｙｐ−Ｇｌｙで述べた割合や含量と同様でよい。
前記Ａｌａ−Ｈｙｐは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙと同様に、例えば、コラーゲン、ゼラチンを２段階に分けて酵素処理するか、アミノ酸から合成することにより得ることができ、化学修飾については、後述するような公知の手段が挙げられる。
Ａｌａ−Ｈｙｐを得るための酵素処理法としては、基本的には、Ｈｙｐ−Ｇｌｙについて説明した２段階酵素処理法と同様の方法で良いが、２次酵素処理には、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属など由来のプロテイナーゼ活性およびヒドロキシプロリラーゼ活性を有する酵素を用いるようにする。
【００４０】
Ａｌａ−Ｈｙｐは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙと同様に、アミノ酸から合成することができるが、この場合、上で説明したＨｙｐ−Ｇｌｙの合成法において、単に、ヒドロキシプロリンに代えてアラニンを用い、グリシンに代えてヒドロキシプロリンを用いればよい。
先に述べたとおり、Ａｌａ−Ｈｙｐは、化学修飾が施されているものであっても良い。化学修飾の具体的手段や処理条件は、通常のペプチドの化学修飾技術が適用される。アラニン残基のα−アミノ基については、上述のＰｒｏ−Ｈｙｐにおけるプロリン残基のα−アミノ基と同様に、ヒドロキシプロリン残基のα−アミノ基および水酸基については、上述のＰｒｏ−Ｈｙｐにおけるヒドロキシプロリン残基のα−アミノ基および水酸基と同様にして化学修飾すれば良い。
【００４１】
有効成分としてＡｌａ−Ｈｙｐを含む疾病抑制剤の詳細については、有効成分としてＨｙｐ−Ｇｌｙを含む疾病抑制剤に関して述べたことと共通するので、説明を省略する。
【実施例】
【００４２】
以下に、本発明にかかるジペプチドまたはこれを含むコラーゲンペプチドの性能評価試験と、前記ジペプチドを有効成分とする疾病抑制剤の配合例によって、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下では、便宜上、「重量部」を単に「部」と、「重量％」を「％」と記すことがある。
〔ジペプチド〕
＜実施例１＞
前述の固相法によりＨｙｐ−Ｇｌｙを合成した。
【００４３】
すなわち、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）１０部を用いた脱水反応によってＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）基でアミノ基を保護したヒドロキシプロリン４５部にグリシン４５部を結合（ペプチド結合）させた後、固相を溶媒（エチルアルコール）でよく洗い、残ったグリシンなどを除去した。この後、固相に結合しているヒドロキシプロリン残基の保護基をトリフルオロ酢酸の温浸により除去（脱保護）することにより、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを合成した。
このジペプチド合成には、Ｌｉｂｅｒｔｙペプチド合成システム（ＣＥＭ社製）を使用した。
【００４４】
＜実施例２＞
実施例１のＨｙｐ−Ｇｌｙ、および、後述する参考例１−１のＰｒｏ−Ｈｙｐの１：１混合物（重量基準）を実施例２とした。
＜実施例３＞
実施例１のＨｙｐ−Ｇｌｙ、後述する参考例１−１のＰｒｏ−Ｈｙｐ、および、後述する参考例１−２のＡｌａ−Ｈｙｐの１：１：１混合物（重量基準）を実施例３とした。
＜参考例１−１＞
上記Ｈｙｐ−Ｇｌｙの合成法において、ヒドロキシプロリンをプロリン、グリシンをヒドロキシプロリンに変更する以外は同様にして、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを合成し、これを参考例１−１とした。
【００４５】
＜参考例１−２＞
上記Ｈｙｐ−Ｇｌｙの合成法において、ヒドロキシプロリンをアラニン、グリシンをヒドロキシプロリンに変更する以外は同様にして、Ａｌａ−Ｈｙｐを合成し、これを参考例１−２とした。
＜比較例１＞
上記Ｈｙｐ−Ｇｌｙの合成法において、ヒドロキシプロリンをロイシン、グリシンをヒドロキシプロリンに変更する以外は同様にして、Ｌｅｕ−Ｈｙｐを合成し、これを比較例１とした。
【００４６】
＜比較例２＞
上記Ｈｙｐ−Ｇｌｙの合成法において、ヒドロキシプロリンをフェニルアラニン、グリシンをヒドロキシプロリンに変更する以外は同様にして、Ｐｈｅ−Ｈｙｐを合成し、これを比較例２とした。
＜比較例３＞
上記Ｈｙｐ−Ｇｌｙの合成法において、ヒドロキシプロリンをセリン、グリシンをヒドロキシプロリンに変更する以外は同様にして、Ｓｅｒ−Ｈｙｐを合成し、これを比較例３とした。
【００４７】
〔トリペプチド〕
＜比較例４＞
上記Ｈｙｐ−Ｇｌｙの合成法において、ヒドロキシプロリンをプロリン、グリシンを実施例１で合成したＨｙｐ−Ｇｌｙに変更する以外は同様にして、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを合成し、これを比較例４とした。
〔アミノ酸〕
＜比較例５，６＞
アミノ酸であるプロリンを比較例５、ヒドロキシプロリンを比較例６とした。
【００４８】
〔コラーゲンペプチド〕
＜実施例４＞
以下に示す方法に従って、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを含有する豚皮由来のコラーゲンペプチド（ＰＣ）を得、これを実施例４とした。
豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の温水４Ｌに溶解させ、６０℃に温度調節した後、１次反応として、黄色コウジカビ由来プロテアーゼ１０ｇを添加し、ｐＨ５．０〜６．０、温度４５〜５５℃で１２０分間保持することにより酵素加水分解処理を行った。次いで、２次酵素反応として、これにヒドロキシプロリダーゼ活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ抽出酵素を終濃度１．５％で添加し、これを可溶化した後、５０℃で６時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、豚皮由来のコラーゲンペプチド（ＰＣ）を得た。
【００４９】
このＰＣを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。すなわち、ＴＬＣプレート（商品名「Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆ」、メルク社製）に、水に可溶化したＰＣを、１０μｇ滴下し（スポット原点）乾燥させた後、溶媒（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２）で展開した。このプレートを風乾した後、イサチン−酢酸亜鉛発色液（イサチン１ｇ，酢酸亜鉛１．５ｇをイソプロパノール１００ｍＬに加温して溶かし、冷却後酢酸１ｍＬを加えて調整）を同プレートに噴霧することにより、上記で得られたＰＣの青色のスポットのＲｆ値（［スポット原点から発色スポットまでの距離］÷［スポット原点から溶媒展開フロントまでの距離］）が、同一プレートにスポットした内部マーカーであるＨｙｐ−ＧｌｙとＰｒｏ−Ｈｙｐのうち、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの青色スポットのＲｆ値と一致すること、すなわち、このＰＣがＨｙｐ−Ｇｌｙを含むことを確認した。
【００５０】
なお、アミノ酸配列が既知の豚皮由来のＩ型コラーゲン（重量（Ｘ）ｇ）に含まれるＨｙｐ−Ｇｌｙの配列の和（Ｙ）をカウントし、下記式より該Ｉ型コラーゲン全体中の理論含有量を求めたところ、２０．０重量％であった。
（（Ｈｙｐ−Ｇｌｙの数（Ｙ））×（Ｈｙｐ−Ｇｌｙの重量（分子量）））／（全配列の重量（Ｘ））
以上のことから、前記ＰＣは、理論的に、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを最大２０．０重量％含むものである。
＜実施例５＞
魚鱗由来ゼラチンを用いたこと以外は、前記ＰＣの製造と同様の操作により、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを含有する魚鱗由来のコラーゲンペプチド（ＦＣ）を得、これを実施例５とした。
【００５１】
このＦＣを前記ＰＣの場合と同様にＴＬＣにより分析したところ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの存在が確認された。
なお、アミノ酸配列が既知の魚鱗由来のＩ型コラーゲン（重量（Ｘ）ｇ）に含まれるＨｙｐ−Ｇｌｙの配列の和（Ｙ）をカウントし、下記式より該Ｉ型コラーゲン全体中の理論含有量を求めたところ、２３．５重量％であった。
（（Ｈｙｐ−Ｇｌｙの数（Ｙ））×（Ｈｙｐ−Ｇｌｙの重量（分子量）））／（全配列の重量（Ｘ））
以上のことから、前記ＦＣは、理論的に、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを最大２３．５重量％含むものである。
【００５２】
＜実施例６＞
以下に示す方法に従って、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを含有する豚皮由来のコラーゲンペプチド（ＰＣ−ＣＰ）を得、これを実施例６とした。
豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させたのち、４０℃に冷却し、１次酵素反応として、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｎ２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で２４時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで２次酵素反応として、この反応液にヒドロキシプロリダーゼ活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ抽出酵素を終濃度１．０％で添加し、これを可溶化した後、ｐＨ４．０、５０℃で６時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＰＣ−ＣＰを得た。
【００５３】
また、このＰＣ−ＣＰを前記ＰＣの場合と同様にＴＬＣにより分析したところ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの存在が確認された。
なお、アミノ酸配列が既知の豚皮由来のＩ型コラーゲン（重量（Ｘ）ｇ）に含まれるＨｙｐ−Ｇｌｙの配列の和（Ｙ）をカウントし、下記式より該Ｉ型コラーゲン全体中の理論含有量を求めたところ、２０．０重量％であった。
（（Ｈｙｐ−Ｇｌｙの数（Ｙ））×（Ｈｙｐ−Ｇｌｙの重量（分子量）））／（全配列の重量（Ｘ））
以上のことから、前記ＰＣ−ＣＰは、理論的に、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを最大２０．０重量％含むものである。
【００５４】
＜実施例７＞
以下に示す方法に従って、Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐを含有する豚皮由来のコラーゲンペプチド（ＰＣ−ＰＨ）を得、これを実施例７とした。
豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の温水４Ｌに溶解させ、６０℃に温度調節した後、１次酵素反応として、黄色コウジカビ由来プロテアーゼ１０ｇを添加し、ｐＨ５．０〜６．０、温度４５〜５５℃で１２０分間保持することにより酵素加水分解処理を行った。次いで、２次酵素反応として、これにプロリダーゼ活性およびヒドロキシプロリダーゼ活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ抽出酵素を終濃度１．５％で添加し、これを可溶化した後、ｐＨ４．５〜５．５、温度４５〜５０℃で６時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液を１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＰＣ−ＰＨを得た。
【００５５】
また、このＰＣ−ＰＨを前記ＰＣの場合と同様にＴＬＣにより分析したところ、ＰＣ−ＰＨの青色スポットのＲｆ値が、Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐの各青色スポットのＲｆ値と一致し、ＰＣ−ＰＨがＨｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐをともに含有することが確認された。
＜比較例７＞
前記したＰＣ−ＣＰの製造における１次酵素反応のみを行って、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのいずれも含有しないコラーゲンペプチド（ＰＣ−ＣＰ−Ｃｏｎｔ）を得、これを比較例７とした。
【００５６】
すなわち、豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させたのち、４０℃に冷却し、１次酵素反応として、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｎ２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で２４時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで、酵素加水分解処理で得られた溶液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＰＣ−ＣＰ−Ｃｏｎｔを得た。
【００５７】
また、このＰＣ−ＣＰ−Ｃｏｎｔを前記ＰＣの場合と同様にＴＬＣにより分析したところ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのいずれの存在も確認できなかった。
〔性能評価試験〕
上記実施例１〜７、参考例１−１，１−２、比較例１〜７にかかる各ジペプチド、トリペプチド、アミノ酸、コラーゲンペプチドを用いて行った各性能評価試験の詳細を以下に示す。
＜評価試験１−１：破骨細胞の分化および活性化の抑制＞
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｙ．らの破骨細胞分化培養法［Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｍｅｔａｂ．（２００４）２２：ｐ．３１８−３２８］に準じて評価した。
【００５８】
すなわち、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ，Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐの１：１混合物を用い、それぞれをマウス初代骨髄細胞培養液に終濃度６２５μＭとなるように添加し、培養から６日後にマーカー酵素である酒石酸耐性酸性リン酸エステル加水分解酵素（ＴＲＡＰ）の各抑制活性を調べた。同様にして、他のジペプチド（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ，Ａｌａ−Ｈｙｐ，Ｌｅｕ−Ｈｙｐ，Ｐｈｅ−Ｈｙｐ，Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）、トリペプチド（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）、アミノ酸（Ｐｒｏ，Ｈｙｐ）を用いたときのＴＲＡＰ抑制活性を調べた。さらに、対照として、ペプチド無添加（ブランク）のときのＴＲＡＰ抑制活性も調べた。
また、さらに、各種ペプチド、アミノ酸による破骨細胞の分化および活性化の抑制度を、次のＰｉｔアッセイにより評価した。すなわち、破骨細胞を象芽片上で培養するＰｉｔアッセイは、Ｋａｋｕｄｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ（１９９６）．Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｍｅｔａｂ．１４：１２９−１３６に準じて実施した。具体的には以下のとおりである。
【００５９】
若令マウス腸管骨由来の破骨細胞の前駆細胞と骨髄ストローマ細胞含有浮遊液を、１０％ＤＭＳＯ存在下、−８０℃で凍結保存して、成熟破骨細胞を死滅させた。
この細胞２．０×１０５を、象牙片をセットした９６ウエルプレートの各ウエルに播きこみ、各被験ペプチドを培養液に添加して３７℃、５％ＣＯ２で約１週間培養した。その後、シリコン製ラバーポリスマンで象牙片から細胞を除去した後、酸ヘマトキシリン溶液で象牙片を数分間染色した。この時、ＴＲＡＰ染色によりＴＲＡＰ染色陽性多核巨細胞（破骨細胞）数を計測し、対照（ブランク）でのその細胞数に対する相対数を算出した。その後、顕微鏡下にて破骨細胞によるＰｉｔ数（吸収窩の数）を計測し、ブランク（対照）に対する相対比によって各被験ペプチドの破骨細胞の活性抑制度を表示した。
【００６０】
結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2010106003.tif 000002
【００６２】
＜評価試験１−２：骨芽細胞の分化および活性化の亢進＞
骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養液に、デキサメタゾン（終濃度１ｎｍｏｌ／Ｌ）、β−グリセロリン酸（終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌ）、アスコルビン酸（終濃度１００μｇ／ｍＬ）をそれぞれ加えた後、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ，Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐの１：１混合物を用い、これらを前記培養液に終濃度２．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、培養から１０日後に骨芽細胞の分化および石灰化のマーカー酵素であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の各亢進活性を調べた。同様にして、他のジペプチド（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ，Ａｌａ−Ｈｙｐ，Ｌｅｕ−Ｈｙｐ，Ｐｈｅ−Ｈｙｐ，Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）、トリペプチド（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）、アミノ酸（Ｐｒｏ，Ｈｙｐ）を用いたときのＡＬＰ亢進活性を調べた。さらに、対照として、ペプチド無添加（ブランク）のときのＡＬＰ亢進活性も調べた。結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
2010106003.tif 000003
【００６４】
＜評価試験１−３：軟骨細胞の変性の抑制＞
Ｈｙｐ−Ｇｌｙ，Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐの１：１混合物、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−ＨｙｐおよびＡｌａ−Ｈｙｐの１：１：１混合物を用い、各ジペプチドを前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５培養液に終濃度２．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、培養から５日後に肥大化軟骨および石灰化のマーカー酵素であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の各抑制活性を調べた。同様にして、他のジペプチド（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ，Ａｌａ−Ｈｙｐ，Ｌｅｕ−Ｈｙｐ，Ｐｈｅ−Ｈｙｐ，Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）、トリペプチド（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）、アミノ酸（Ｐｒｏ，Ｈｙｐ）を用いたときのＡＬＰ活性を調べた。さらに、対照として、ペプチド無添加（ブランク）のときのＡＬＰ活性も調べた。結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】
2010106003.tif 000004
【００６６】
＜評価試験１−４：皮膚真皮中のトロポコラーゲン量の回復＞
ウィスター系雄ラット（１４０ｇ）を、３日間、市販固形食（ＴｙｐｅＭＦ、オリエンタル酵母社製）により予備飼育した後、カゼイン食に切り替え、３日後に皮膚創傷を発症させた。
前記皮膚創傷は、ラットの腹部に除毛処理を３日間施すことにより発症させるようにし、具体的には、ラットにネンブタール（４ｍｇ／０．０８ｍＬ／１００ｇＢＷ）を腹腔内投与して麻酔した後、腹部（約３×５ｃｍ）に対しバリカンによる毛刈りを行った。さらに、市販の除毛剤（Ｅｐｉｌａｔ除毛クリーム、カネボウ社製）を塗付し、５分間放置した後、剃刀で丁寧に剃った。この処理は、皮膚試料の採取開始の３日前から１日１回、３日間連続して行った。
【００６７】
試験群を、カゼイン食群、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ群，（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）＋（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）群（Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐの１：１混合物），ＰＣ群，ＦＣ群，ＰＣ−ＣＰ群，ＰＣ−ＰＨ群に分け、各群ごとに、除毛処理当日（除毛処理後０日目）、除毛処理から１日後、除毛処理から２日後、除毛処理から４日後における、皮膚創傷回復過程の皮膚コラーゲン量の推移(総コラーゲン量当たりの比率)を測定した。
各群の食餌組成を表４に示す。
【００６８】
【表４】
2010106003.tif 000005
【００６９】
上記食餌組成でラットを飼育するようにし、飼育期間を通して食餌および水は自由摂取とした。
さらに、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ群，（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）＋（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）群（Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐの１：１混合物），ＰＣ群，ＦＣ群，ＰＣ−ＣＰ群，ＰＣ−ＰＨ群では、食餌に配合した各Ｈｙｐ−Ｇｌｙ，ＰＣ，ＦＣ，ＰＣ−ＣＰ，ＰＣ−ＰＨと同一のものを１０ｇ精秤し、蒸留水２０ｍＬで保温溶解したものを各試験群のラットに１日１回正午にゾンデを用いて胃内投与した。
各群の皮膚創傷回復過程の皮膚コラーゲン量の推移(総コラーゲン量当たりの比率)の測定結果を表５に示す。
【００７０】
【表５】
2010106003.tif 000006
【００７１】
ここで、皮膚可溶性コラーゲンの定量は、下記のようにして行った。
皮膚下の脂肪を可能な限り除去しながら処理皮膚と未処理皮膚をトリミングした。解剖用はさみで丹念に細切し、約０．２から０．３ｇを精秤し、１４ｍＬ容遠沈管に採取した。これに冷０．４５Ｍ塩化ナトリウム溶液４ｍＬを加えてポリトロンホモゲナイザー（ｓｐｅｅｄ  Ｎｏ４）で２０秒間、氷冷しながらホモゲナイズした。さらに、冷０．４５Ｍ塩化ナトリウム溶液２ｍＬを加えて、冷蔵室内で回転撹拌機（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて２４時間の抽出を行った。抽出液を冷却遠心機で２０，０００ｇ、２０分間遠心して上清液を採取し、中性塩可溶性コラーゲン画分とした。遠心残渣に冷０．５Ｍ酢酸を６ｍＬ加え、同様に２４時間の抽出を行った。０．５Ｍ酢酸抽出液を冷却遠心機で２０，０００ｇ、２０分間遠心して上清液を採取し、酸可溶性コラーゲン画分とした。その遠心残渣は不溶性コラーゲン画分とした。
【００７２】
中性塩可溶性コラーゲン画分と酸可溶性コラーゲン画分の各５ｍＬには同じ容積の濃塩酸５ｍＬを加え、不溶性コラーゲン画分には濃塩酸１ｍＬを加え６０℃で５分間加温溶解させ、さらに６Ｎ塩酸２ｍＬで３回洗浄しながらガラス製加水分解用試験管に移し、１１０℃で２４時間、加水分解を行った。
そして、各コラーゲン画分の加水分解液中に含まれるヒドロキシプロリン量を比色定量することにより、各コラーゲン画分の定量を行い、これら各コラーゲン画分の総和に対する前記中性塩可溶性コラーゲン画分の相対比を算出した。
上記ヒドロキシプロリン量の比色定量は、Ｆｉｒｓｃｈｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｌｌ法により行い、具体的には、以下のようにして行った。
【００７３】
試料溶液２ｍＬに２−プロパノール２ｍＬを加え、十分に撹拌した。ここに酸化剤であるクロラミンＴ液０．５ｍＬを加えて正確に４分間放置した後、氷冷した。ここにｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液５ｍＬを加えて、十分に撹拌した後、沸騰水浴中で正確に２分間加熱した。その後、直ちに氷冷し、１時間放置した後、波長５７５ｎｍで比色定量した。
なお、クロラミンＴ液は、クロラミンＴ（５ｇ）を蒸留水５０ｍＬに溶解調整し、冷蔵保存しておき、使用直前に酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１：４に希釈して用いた。また、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液（エーリッヒ溶液）は、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド粉末２０ｇに濃塩酸２２ｍＬを加えて沸騰水中で加熱溶解し、直ちに氷水中にて冷却し、２−プロパノール１２２ｍＬを加えて撹拌溶解し調製した。
【００７４】
＜評価試験１−５：腸管吸収性＞
ウィスター系雄ラット（１７０ｇ）を一晩絶食させて実験に供した。検体試料には、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−Ｈｙｐ，Ａｌａ−Ｈｙｐ，Ｓｅｒ−Ｈｙｐを各２１５ｎｍｏｌ／１０ｍＬ用い胃内投与した。
試験方法としては、ラットの心臓と門脈にカニューレを装着して１方向性灌流を行った。灌流液としては、ＮａＣｌ  ９．０ｇ、５．７５％ＫＣｌ  ８ｍＬ、１０．５５％ＫＨ２ＰＯ４  ２ｍＬ、１９％ＭｇＳＯ４  ２ｍＬ、ＮａＨＣＯ３  ２．７３ｇ、グルコース３．４３ｇ、水１２５５ｍＬからなるクレブス−リンガー重炭酸液（ＫＲＢ液，ｐＨ７．４）に、前記ＫＲＢ液５００ｍＬに対して牛血清アルブミン１０ｇ、デキサメタゾン（０．１２３ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ、ノルアドレナリン（０．０２４ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを加えたものを用いた。
【００７５】
門脈から採取された灌流試料溶液５．０ｍＬに３０％スルフォサリチル酸を０．５ｍＬ加え、激しく撹拌し、冷蔵庫で一晩放置した。この試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、除タンパク質を行った。遠心上澄液について、その０．５ｍＬ中のヒドロキシプロリン量を比色定量することにより、遊離型Ｈｙｐ量を得た。
さらに、前記遠心上澄液３．０ｍＬをネジ口試験管に秤取し、これに当量の濃塩酸を加え、１１０℃で２４時間加水分解した。エバポレーターで濃縮乾固し、塩酸を除去し、５ｍＬの蒸留水に溶解し、飽和水酸化リチウム溶液を数滴加えてｐＨ５〜７に調整し、１０ｍＬに定容した。この溶液２ｍＬについて、ヒドロキシプロリン量を比色定量することにより、総Ｈｙｐ量を得た。加水分解後の総Ｈｙｐ量から、加水分解前の遊離型Ｈｙｐ量を差し引いて得られる値がペプチド態Ｈｙｐ量となる。このペプチド態Ｈｙｐ量から、検体試料の各ジペプチドがラット門脈灌流液中に吸収された定量値をまず確認した。
【００７６】
上記において、ヒドロキシプロリン量の比色定量は、評価試験１−４で具体的に説明したＦｉｒｓｃｈｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｌｌ法により行った。
さらに、ラット門脈灌流液中に回収されたジペプチド、すなわち、腸管吸収された各Ｈｙｐ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−Ｈｙｐ，Ａｌａ−Ｈｙｐ，Ｓｅｒ−Ｈｙｐの同定、定量を下記によるＨＰＬＣ分析および質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて行った。
（ＨＰＬＣ分析）
灌流液中のジペプチドの分析を逆相ＨＰＬＣ分析により行った。ＨＰＬＣ装置としては、送液ポンプ、デカッサ、オートサンプラ、カラムオープン、紫外部分光光度計、プリンター、システムコントローラーから構成される日本分光社製のＬＣＳＳ−９０５システムを用いた。逆相カラムは、Ｎｏｖａ  Ｐａｋ  Ｃ１８（３．９×１５０ｍｍ）を用いた。
【００７７】
０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル−水系のリニアグラディエント移動層を用い、試料注入量は７０μＬ、流速は１ｍＬ／ｍｉｎであった。
（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析）
ＨＰＬＣ装置としてはＵ９８０ＨＰＬＣ（日本分光社製）を用い、この装置はＯＤＳ（Ｃ１８）カラム（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８，２×２５０ｍｍ、Ｋａｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ  Ｌｔｄ社製）を装着している。移動相溶媒としては、０．２％蟻酸含有アセトニトリル−水系とし、リニアグラディエントにより４０分間で０％から４０％アセトニトリルまで濃度を上昇させ、１００％アセトニトリルで１０分間洗浄を行った。試料注入量は１０μＬであり、カラム温度は４０℃であった。
【００７８】
ＭＳ分析は、４チャンネルのＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ法によるＱｕａｔｔｒｏ  ＬＣ質量分光光度計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）によるＭＳ／ＭＳ方式で行った。すなわち、ＨＰＬＣからの溶出液を［Ｍ＋Ｈ］＋であるｍ／ｚとそのフラグメントイオン種のｍ／ｓでモニターした。Ｐｒｏ−Ｈｙｐについては［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：２２９．１＞１３２．１を、Ｓｅｒ−Ｈｙｐについては［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：２１９．１＞１３２．１を、Ａｌａ−Ｈｙｐについては［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：２０３．１＞１３２．１を、Ｈｙｐ−Ｇｌｙについては［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：１８９．１＞８６．１を、それぞれ用いてモニターした。
【００７９】
灌流液を最終濃度３％のスルフォサリチル酸処理し、除タンパク質を行った。上清液を凍結乾燥し、乾燥粉末１０ｍｇを蒸留水に溶解し、陽イオン交換樹脂カラム処理し、アンモニア溶出画分を得た。この画分の溶媒を除去し、蒸留水に溶解し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析した。
結果は、表６に示すとおりであった。
【００８０】
【表６】
2010106003.tif 000007
【００８１】
＜評価試験１−６＞
１０週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、下記表７に示す組成で各々飼料を経口摂取させた。
【００８２】
【表７】
2010106003.tif 000008
【００８３】
この試験においては、表７中、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ添加群として、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（［Ｈｙｐ−Ｇｌｙ］群）を用い、［（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）＋（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）］添加群として、Ｈｙｐ−ＧｌｙとＰｒｏ−Ｈｙｐの１：１混合物（［（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）＋（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）］群）を用いた。マウスを３週間後に屠殺し、各群の大腿骨・脛骨関節部のμＣＴ（卓上型マイクロＣＴスキャナ  ＳＫＹＳＣＡＮ１１７２、ＳＫＹＳＣＡＮ社製）像から関節腔の幅を測定し、非脱灰ヘマトキシリン染色切片からマトリクス構造評価および細胞状態を評価した。比較のために、表７中の（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ）添加群として、プロリンとヒドロキシプロリンの遊離アミノ酸混合物を用いた遊離アミノ酸混合物添加群（［Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ］群）を用いて、同様の操作、評価を行った。
【００８４】
結果を表８に示す。
【００８５】
【表８】
2010106003.tif 000009
【００８６】
＜評価試験１−７＞
Ｈｙｐ−Ｇｌｙ単独（［Ｈｙｐ−Ｇｌｙ］群）、Ｈｙｐ−ＧｌｙとＰｒｏ−Ｈｙｐの１：１混合物（［（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）＋（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）］群）のそれぞれについて、終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように生理食塩水に可溶化したのち、濾過滅菌した。これらの溶液０．５ｍｌを、１０週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに上記表７の組成で飼料を３週間与えたＣ群に対して、その左大腿骨・脛骨関節腔に注射した。１週間後に屠殺し、左右の大腿骨−脛骨関節腔部の非脱灰マイヤーヘマトキシリン染色切片を作成し、病理評価した。同様にして、注射した後、３週間後に屠殺した場合についても、左右の大腿骨−脛骨関節腔部の非脱灰マイヤーヘマトキシリン染色切片を作成し、前記評価試験１−６でのＮ群の病理切片と比較して病理評価した。
【００８７】
結果を表９に示す。
【００８８】
【表９】
2010106003.tif 000010
【００８９】
＜性能評価試験の結果の考察＞
上記結果に見るように、対照（ブランク）との比較から、Ｈｙｐ−Ｇｌｙが、破骨細胞の分化と活性化を抑制し（表１）、骨芽細胞の分化と活性化を亢進し（表２）、軟骨細胞の変性を抑制してその分化を調節し（表３）、皮膚真皮中のトロポコラーゲン量を回復させる（表５）ことが分かる。そして、その効果は、比較例にかかる他のペプチド、アミノ酸、トリペプチドよりも優れている。
また、Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ，Ａｌａ−Ｈｙｐと比較して、極めて迅速にかつ安定的に（アミノ酸に分解されずに）腸管吸収されることが分かる（表６）。
【００９０】
そして、表８，９に示す結果からは、本発明にかかるジペプチドであるＨｙｐ−Ｇｌｙ単独の場合またはＰｒｏ−Ｈｙｐとの併用の場合において、関節軟骨の変性を抑制したり、あるいは、関節軟骨の再生を促進したりすることが分かる。
さらに、Ｈｙｐ−ＧｌｙとＰｒｏ−Ｈｙｐを併用した場合には、それぞれ単独の効果から期待される以上の効果が発揮されていることが分かり、その相乗効果が認められる（表１〜３，５）。特に、骨芽細胞の活性化の亢進（表２）、軟骨細胞の変性抑制（表３）においては、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ単独、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ単独のいずれよりも優れた効果を発揮している。
【００９１】
軟骨細胞の変性抑制（表３）については、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＨｙｐおよびＡｌａ−Ｈｙｐの３者併用の場合が、他のいずれよりも優れた結果を示しており、Ａｌａ−Ｈｙｐをも併用することによる顕著な相乗効果が認められる。
なお、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、表１におけるプラスティックシャーレ上での評価や、表２の「ＡＬＰの相対値（％）」の評価では、Ｈｙｐ−Ｇｌｙのような顕著な効果は認められないが、表１における象牙片上での評価から、破骨細胞の分化および活性化を抑制することは明らかであり、したがって、骨粗しょう症の抑制に有効であることが分かる。さらに、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、表３に見るように、軟骨細胞の変性を抑制する効果にも優れていることが分かる。
【００９２】
表３に示す結果からは、Ａｌａ−Ｈｙｐが、単独で、軟骨細胞の変性抑制に有効であることも分かる。
また、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙと同様に、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ，Ａｌａ−Ｈｙｐと比較して、極めて迅速にかつ安定的に（アミノ酸に分解されずに）腸管吸収されることが分かる（表６）。
〔疾病抑制剤〕
上記に述べた本発明にかかるジペプチドまたはコラーゲンペプチドを用いて、本発明にかかる疾病抑制剤を得た。それらの配合例を以下に示す。
【００９３】
＜実施例８〜１３＞
表１０に示す配合で、各材料を混合し、賦形剤としての結晶性セルロースを、表１０に記載の配合全体に対して１０部の割合で用いて、常法により打錠成形することにより、経口用として用いうる、実施例８〜１３にかかる疾病抑制剤を得た。なお、表１０におけるＨｙｐ−Ｇｌｙは実施例１、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは参考例１−１の合成ジペプチドであり、ＰＣ，ＦＣ，ＰＣ−ＣＰ，ＰＣ−ＰＨはそれぞれ実施例４〜７、ＰＣ−ＣＰ−Ｃｏｎｔは比較例７のコラーゲンペプチドである。
【００９４】
【表１０】
2010106003.tif 000011
【００９５】
＜実施例１４＞
上記実施例４のＰＣを用いてチュアブルタイプのタブレットを製造した。
具体的には、下記配合成分を混合し、打錠成型器を用いて、一粒０．８ｇのチュアブルタイプのタブレットを調製した。このチュアブルタイプのタブレットは、全量を１００重量％としたとき、約１０．０重量％のＨｙｐ−Ｇｌｙを有効成分として含有するものであった。
ＰＣ                                      ５０．０ｋｇ
アスコルビン酸                            １０．０ｋｇ
ミクロカルマグＳ（エスケーフーヅ社製）      ４．６ｋｇ
マビット（林原社製）                      １９．０ｋｇ
結晶セルロース                            １０．０ｋｇ
乳化剤                                      ３．２ｋｇ
アスパルテーム                              ０．５ｋｇ
発酵乳パウダー                              １．４ｋｇ
粉末香料                                    １．０ｋｇ
クエン酸                                    ０．３ｋｇ
＜実施例１５＞
実施例４のＰＣを用い、下記配合成分を混合して、１００〜１４０ｍＬのお湯に溶解させて飲用する粉末コンソメスープ（１袋６．０ｇ）を調製した。この粉末コンソメスープは、全量を１００重量％としたとき、約７．０重量％のＨｙｐ−Ｇｌｙを有効成分として含有するものであった。
ＰＣ                                      ３５．０ｋｇ
チキンエキスパウダー                      ２５．０ｋｇ
食塩                                      １８．０ｋｇ
ブドウ糖                                    ７．７ｋｇ
乳酸カルシウム                              ７．０ｋｇ
グルタミン酸ナトリウム                      ４．０ｋｇ
オニオンエキスパウダー                      １．０ｋｇ
ＨＶＰ                                      １．０ｋｇ
ビーフフレーバー                            ０．５ｋｇ
５’−リボヌクレオチド２ナトリウム          ０．５ｋｇ
ホワイトペッパー                            ０．２ｋｇ
ターメリック                                ０．１ｋｇ
＜実施例１６＞
実施例４のＰＣを用い、下記配合成分を混合して、１００〜１５０ｍＬの水に溶解させて飲用する粉末ジュース（１袋１３．０ｇ）を調製した。この粉末ジュースは、全量を１００重量％としたとき、約８．０重量％のＨｙｐ−Ｇｌｙを有効成分として含有するものであった。
ＰＣ                                      ４０．４ｋｇ
アスコルビン酸ナトリウム                    １．２ｋｇ
エリスリトール                            ５２．０ｋｇ
アセスルファムＫ                            ０．１ｋｇ
アスパルテーム                              ０．１ｋｇ
クエン酸ナトリウム                          ０．８ｋｇ
クエン酸（結晶）                            ４．６ｋｇ
マスカットフレーバー                        ０．８ｋｇ
＜実施例１７＞
実施例４のＰＣを用い、下記配合成分に従い、精製水に他の配合成分を溶解し、ｐＨ３．５、Ｂ’×９．０％に調製したのち、１１０℃で３０秒加熱殺菌処理を施し、１０℃に冷却してから紙パックに無菌充填して、清涼飲料水（１パック１２５ｍＬ）を調製した。この清涼飲料水は、全量を１００重量％としたとき、約０．５重量％のＨｙｐ−Ｇｌｙを有効成分として含有するものであった。
ＰＣ                                        ２．５ｋｇ
ビタミンミックスＤＮ（ＢＡＳＦジャパン社製）０．１ｋｇ
エリスリトール                              ５．５ｋｇ
アセスルファムＫ                            ０．０１５ｋｇ
アスパルテーム                              ０．００５ｋｇ
クエン酸                                  約０．６ｋｇ
フルーツミックスフレーバー                  ０．１６Ｌ
ライチフレーバー                            ０．０４Ｌ
精製水                              残量（合計が１００．０ｋｇになるように設定）
＜実施例１８＞
まず、下記配合成分のうちの精製水（Ｂ）に実施例４のＰＣおよびゼラチンを浸漬して３０分間膨潤させたのち、８０℃達温３０分間加熱して完全に溶解させ、ゼラチン溶液とした。次に、下記配合成分のうちの精製水（Ａ）にミルクオリゴ糖、粉末麦芽還元糖、エリスリトール、および難消化性デキストリンを溶解させ、煮詰めた後、アスパルテーム、前記ゼラチン溶液、予め精製水（Ａ）の一部に溶解させたクエン酸（結晶）、ペパーミントフレーバー、ミントフレーバー、レモンフレーバー、およびベニバナ黄色素を添加し、Ｂ’×７９〜８１％に調製したのち脱泡し、スターチモールドに充填して室温で２４時間乾燥させ、グミゼリー（１粒４ｇ）を調製した。このグミゼリーは、全量を１００重量％としたとき、約１．０重量％のＨｙｐ−Ｇｌｙを有効成分として含有するものであった。
ＰＣ                                        ５．０ｋｇ
ミルクオリゴ糖                            ４１．０ｋｇ
粉末麦芽還元糖                            ３１．０ｋｇ
エリスリトール                              ５．０ｋｇ
難消化性デキストリン                        ５．０ｋｇ
アスパルテーム                              ０．０５ｋｇ
ゼラチン（ＡＰＨ２５０、新田ゼラチン社製）  ７．０ｋｇ
クエン酸（結晶）                            １．２ｋｇ
ペパーミントフレーバー                      ０．６Ｌ
ミントフレーバー                            ０．２Ｌ
レモンフレーバー                            ０．７Ｌ
ベニバナ黄色素                              適量
精製水（Ａ）                              ２０．０Ｌ
精製水（Ｂ）                              １８．０Ｌ
＜実施例１９＞
実施例１のＨｙｐ−Ｇｌｙを滅菌済みの生理的食塩水で２．５ｍＭの濃度となるよう可溶化することにより、患部への注入用として用いうる、実施例１９にかかる疾病抑制剤を得た。
【００９６】
―Ｐｒｏ−Ｈｙｐに関する参考データ―
以下では、参考として、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを含有するコラーゲンペプチドやＰｒｏ−Ｈｙｐの効果について示す。
まず、性能評価試験に用いたＰｒｏ−Ｈｙｐを含有するコラーゲンペプチドについて説明する。コラーゲンペプチドは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを含む２種の豚皮由来のコラーゲンペプチド（以下では、それぞれを、「ＰＣ」、「ＰＣ−ＣＡ」と略記する。）、本発明にかかるＰｒｏ−Ｈｙｐを含む魚鱗由来のコラーゲンペプチド（以下では、「ＦＣ」と略記する。）と、比較のために、Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐを含まない２種の豚皮由来のコラーゲンペプチド（以下では、それぞれを、「ＰＣ−Ｃｏｎｔ」、「ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ」と略記する。）を準備した。
【００９７】
＜ＰＣ＞
豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の温水４ｋｇに溶解させ、６０℃に温度調整した後、１次酵素反応として、黄色コウジカビ由来プロテアーゼ１０ｇを添加し、ｐＨ５．０〜６．０、温度４５〜５５℃で１２０分間保持することにより酵素加水分解処理を行った。次いで、２次酵素反応として、これにアミノペプチダーゼＰおよびプロリダーゼ活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ抽出酵素を終濃度０．５％で添加し、これを可溶化したのち、５０℃で６時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＰＣを得た。
【００９８】
このＰＣを、薄層クロマトグラフィーに供した。すなわち、薄膜クロマトグラフィープレート（商品名「ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＦ」、メルク社製）に、水に可溶化したＰＣを、１０μｇ滴下したのち、溶媒（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２）で展開した。このプレートを風乾してイサチン・酢酸亜鉛試薬を噴霧したのち、青色のスポットによってＮ末端がＰｒｏであるペプチドの存在を確認するとともに、上記で得られたＰＣの青色スポットのＲｆ値（［スポット原点から発色スポットまでの距離］÷［スポット原点から溶媒フロントまでの距離］）が、同一プレートにスポットした内部マーカーであるＨｙｐ−ＧｌｙとＰｒｏ−Ｈｙｐのうち、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの各青色スポットのＲｆ値と一致すること、すなわち、このＰＣがＰｒｏ−Ｈｙｐを含むことを確認した。
【００９９】
＜ＦＣ＞
魚鱗由来ゼラチンを用いたこと以外は、前記ＰＣの製造と同様の操作により、ＦＣを得た。
また、このＦＣを前記ＰＣと同様に薄膜クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの存在が確認された。
＜ＰＣ−ＣＡ＞
豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させたのち、４０℃に冷却し、１次酵素反応として、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｎ−２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で２４時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで２次酵素反応として、この反応液にアミノペプチダーゼＰおよびプロリダーゼ活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ抽出酵素を終濃度０．２５％で添加、ｐＨ４．０、５０℃で６時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加温処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いてろ過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理を施した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＰＣ−ＣＡを得た。
【０１００】
前記乾燥重量２ｇのＰＣ−ＣＡを１０ｍＬの水に溶解させたものを、カラム（「ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ」、東ソー社製；１６×６５０ｍｍ）に２回に分けて負荷して、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収した。次いで、回収した画分をカラム（「ＳＰトヨパール６５０Ｍ」、東ソー社製；１６×６５０ｍｍ）に負荷し、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収した。次に、この画分をカラム（「セファデックスＬＨ−２０」、ファルマシア社製；２６×９００ｍｍ）に負荷し、３０％メタノール水溶液で溶出した。９ｍＬ／フラクションで分画し、化学合成品であるＰｒｏ−Ｈｙｐが溶出する位置に相当する画分を回収した。得られた画分をカラム（「μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  ５μＣ１８  ３００Å」、ウォーターズ社製；３．９×１５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで、０．１％トリフルオロ酢酸を含む０〜３２％以下のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配溶出（流速１ｍＬ／ｍｉｎ、０〜３２％の勾配を１８分間で行う）により分画し、化学合成品であるＰｒｏ−Ｈｙｐが溶出する位置に相当する保持時間に溶出されるピーク部分を分取した。そして、分取液を減圧乾固することにより、白色粉末を得た。得られた白色粉末の構造を、エドマン法によるタンパク質構造解析装置（「プロテインシークエンサー４９１型」、アプライドバイオシステムズ社製）により解析したところ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの存在が確認された。
【０１０１】
＜ＰＣ−Ｃｏｎｔ＞
前記したＰＣの製造における１次酵素反応のみを行って、ＰＣ−Ｃｏｎｔを得た。
すなわち、豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の温水４ｋｇに溶解させ、６０℃に温度調整した後、黄色コウジカビ由来プロテアーゼ１０ｇを添加し、ｐＨ５．０〜６．０、温度４５〜５５℃で１２０分保持することにより酵素加水分解処理を行った。次いで、酵素加水分解処理で得られた溶液を８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理を施した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥することにより、粉末化したＰＣ−Ｃｏｎｔを得た。
【０１０２】
このＰＣ−ＣｏｎｔをＰＣと同様に薄膜クロマトグラフィーにより分析したところ、青色のスポットが確認されず、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのいずれの存在も確認できなかった。
＜ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ＞
前記したＰＣ−ＣＡの製造における１次酵素反応のみを行って、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔを得た。
すなわち、豚皮コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させ４０℃に冷却した後、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｎ−２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で２４時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで、酵素加水分解処理で得られた溶液を８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、その後、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いてろ過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理を施した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥することにより、粉末化したＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔを得た。
【０１０３】
このＰＣ−ＣＡ−ＣｏｎｔをＰＣと同様に薄膜クロマトグラフィーにより分析したところ、青色のスポットが確認されず、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのいずれの存在も確認できなかった。
＜評価試験２−１＞
前記ＰＣ（ＰＣ群）、ＦＣ（ＦＣ群）およびＰＣ−ＣＡ（ＰＣ−ＣＡ群）を用い、各コラーゲンペプチドを前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５培養液に終濃度０．１％となるように添加し、培養から５日後に肥大化軟骨および石灰化のマーカー酵素であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の各抑制活性を調べた。比較のために、ペプチド無添加（Ｎ群）のときのＡＬＰ抑制活性、終濃度０．１％のペプトン（Ｐｅ群）を用いたときのＡＬＰ抑制活性、前記ＰＣ−Ｃｏｎｔ（ＰＣ−Ｃｏｎｔ群）、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ（ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ群）を用いたときのＡＬＰ抑制活性も調べた。結果を表１１に示す。
【０１０４】
【表１１】
2010106003.tif 000012
【０１０５】
＜評価試験２−２＞
固相法により合成したジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ（ピー・エッチ・ジャパン社製）（［Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］群）を用い、添加量を２．５ｍＭとし、比較として、ペプチド無添加（Ｎ群）、遊離アミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙ群）、プロリン（Ｐｒｏ群）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ群）、プロリンとヒドロキシプロリンの遊離アミノ酸混合物（［Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ］群）、グリシンとプロリンとヒドロキシプロリンの遊離アミノ酸混合物（［Ｇｌｙ＋Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ］群）と、固相法により合成したトリペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（ピー・エッチ・ジャパン社製）（［Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ］群）を用いたこと以外は、評価試験２−１と同様にして、ＡＬＰの抑制活性を調べた。結果を表１２に示す。
【０１０６】
【表１２】
2010106003.tif 000013
【０１０７】
＜評価試験２−３＞
１０週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、表１３に示す組成で各々飼料を経口摂取させた。この試験においては、表１３中、コラーゲンペプチド添加群として、前記ＰＣ（ＰＣ群）、ＦＣ（ＦＣ群）およびＰＣ−ＣＡ（ＰＣ−ＣＡ群）を用いるとともに、比較として、前記ＰＣ−Ｃｏｎｔ（ＰＣ−Ｃｏｎｔ群）、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ（ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ群）を用いた。マウスを３週間後に屠殺したのち、各群の大腿骨・脛骨関節部の非脱灰ヘマトキシリン染色切片から、マトリクス構造評価および細胞状態を評価し、関節腔の幅を測定した。
【０１０８】
結果を表１４、表１６に示す。表１４に示す値（病理学的スコアー）は、表１５に示す基準で各マウスの関節軟骨のマトリクス構造および細胞状態を評価し、それらの値を平均した値である。
【０１０９】
【表１３】
2010106003.tif 000014
【０１１０】
【表１４】
2010106003.tif 000015
【０１１１】
【表１５】
2010106003.tif 000016
【０１１２】
【表１６】
2010106003.tif 000017
【０１１３】
さらに、前記Ｎ群、Ｃ群およびＰＣ群について、ＣＴ装置（Ｘ線ＣＴラシータ、ＡＬＯＫＡ社製）による骨計測を行った。結果を表１７に示す。
【０１１４】
【表１７】
2010106003.tif 000018
【０１１５】
＜評価試験２−４＞
１０週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、上記表１３に示す組成で各々飼料を経口摂取させた。この試験においては、表１３中、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ添加群として、化学合成試薬であるジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ（ＢＡＣＨＥＭ社製）（［Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］群）を用いた。マウスを３週間後に屠殺し、各群の大腿骨・脛骨関節部のμＣＴ（卓上型マイクロＣＴスキャナ  ＳＫＹＳＣＡＮ１１７２、ＳＫＹＳＣＡＮ社製）像から関節腔の幅を測定し、非脱灰ヘマトキシリン染色切片からマトリクス構造評価および細胞状態を評価した。また、比較のために、表１３中の（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ）添加群として、プロリンとヒドロキシプロリンの遊離アミノ酸混合物を用いた遊離アミノ酸混合物添加群（［Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ］群）を用いて、同様の操作、評価を行った。
【０１１６】
結果を表１８に示す。
【０１１７】
【表１８】
2010106003.tif 000019
【０１１８】
＜評価試験２−５＞
固相法により合成したジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ（ピー・エッチ・ジャパン社製）（［Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］群）を、終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように生理食塩水に可溶化したのち、濾過滅菌した。この溶液０．５ｍｌを、１０週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに上記表１３の組成で飼料を３週間与えたＣ群に対して、その左大腿骨・脛骨関節腔に注射した。１週間後に屠殺し、左右の大腿骨−脛骨関節腔部の非脱灰マイヤーヘマトキシリン染色切片を作成し、病理評価した。同様にして、注射した後、３週間後に屠殺した場合についても、左右の大腿骨−脛骨関節腔部の非脱灰マイヤーヘマトキシリン染色切片を作成し、前記評価試験２−４でのＮ群の病理切片と比較して病理評価した。
【０１１９】
結果を表１９に示す。
【０１２０】
【表１９】
2010106003.tif 000020
【０１２１】
＜性能評価試験の結果の考察＞
Ｐｒｏ−Ｈｙｐを含むＰＣ、ＦＣ、ＰＣ−ＣＡは、Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｈｙｐのいずれも含まないＰＣ−Ｃｏｎｔ、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔよりも、優れた関節軟骨再生促進効果を発現していることが、上記評価試験２−１、２−３の結果（表１１、１４および１６）から分かる。
また、評価試験２−２、２−４では、合成ジペプチドであるＰｒｏ−Ｈｙｐ単独での優れた関節軟骨再生促進効果が示されており、他方、プロリン、ヒドロキシプロリン、グリシンやそれらの混合物およびＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙでは関節軟骨再生促進効果は認められない（表１２、１８）。
【０１２２】
評価試験２−５においても、合成ジペプチドであるＰｒｏ−Ｈｙｐ単独での優れた関節軟骨再生促進効果が示されている（表１９）。
〔疾病抑制剤〕
上記に述べたＰｒｏ−Ｈｙｐまたはこれを含有するコラーゲンペプチドを用いて、疾病抑制剤を得た。参考として、それらの配合例を以下に示す。
＜参考例２−１〜２−３＞
表２０に示す配合で、各材料を混合し、賦形剤としての結晶性セルロースを、表２０に記載の配合全体に対して１０部の割合で用いて、常法により打錠成形することにより、経口用として用いうる、参考例２−１〜２−３にかかる疾病抑制剤を得た。なお、表２０におけるＰｒｏ−Ｈｙｐは上記性能評価試験で使用したＢＡＣＨＥＭ社製の合成ジペプチドであり、ＰＣ、ＰＣ−Ｃｏｎｔ、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔは上記性能評価試験で使用した各コラーゲンペプチドである。
【０１２３】
【表２０】
2010106003.tif 000021
【０１２４】
＜参考例２−４＞
実施例１４において、実施例４のＨｙｐ−Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）に代えて、上記性能評価試験で使用したＰｒｏ−Ｈｙｐを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）を用いたこと以外は、実施例１４と同様にして、一粒０．８ｇのチュアブルタイプのタブレットを調製した。このチュアブルタイプのタブレットは、全量を１００重量％としたとき、約４．５重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。
なお、アミノ酸配列が既知の豚皮由来のＩ型コラーゲン（重量（Ｘ）ｇ）に含まれるＰｒｏ−Ｈｙｐの配列の和（Ｙ）をカウントし、下記式より該Ｉ型コラーゲン全体中の理論含有量を求めたところ、９．０重量％であった。
（（Ｐｒｏ−Ｈｙｐの数（Ｙ））×（Ｐｒｏ−Ｈｙｐの重量（分子量）））／（全配列の重量（Ｘ））
以上のことから、前記ＰＣは、理論的に、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを最大９．０重量％含むものである。
【０１２５】
下記参考例２−５〜２−８も、本参考例２−４と同様に、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを最大９．０重量％含む前記ＰＣを各種用途に用いた場合の配合例である。
＜参考例２−５＞
実施例１５において、実施例４のＨｙｐ−Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）に代えて、上記性能評価試験で使用したＰｒｏ−Ｈｙｐを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）を用いたこと以外は、実施例１５と同様にして、１００〜１４０ｍＬのお湯に溶解させて飲用する粉末コンソメスープ（１袋６．０ｇ）を調製した。この粉末コンソメスープは、全量を１００重量％としたとき、約３．２重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。
【０１２６】
＜参考例２−６＞
実施例１６において、実施例４のＨｙｐ−Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）に代えて、上記性能評価試験で使用したＰｒｏ−Ｈｙｐを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）を用いたこと以外は、実施例１６と同様にして、１００〜１５０ｍＬの水に溶解させて飲用する粉末ジュース（１袋１３．０ｇ）を調製した。この粉末ジュースは、全量を１００重量％としたとき、約３．６重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。
＜参考例２−７＞
実施例１７において、実施例４のＨｙｐ−Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）に代えて、上記性能評価試験で使用したＰｒｏ−Ｈｙｐを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）を用いたこと以外は、実施例１７と同様にして、清涼飲料水（１パック１２５ｍＬ）を調製した。この清涼飲料水は、全量を１００重量％としたとき、約０．２重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。
【０１２７】
＜参考例２−８＞
実施例１８において、実施例４のＨｙｐ−Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）に代えて、上記性能評価試験で使用したＰｒｏ−Ｈｙｐを含むコラーゲンペプチド（ＰＣ）を用いたこと以外は、実施例１８と同様にして、グミゼリー（１粒４ｇ）を調製した。このグミゼリーは、全量を１００重量％としたとき、約０．４５重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。
＜参考例２−９＞
表２０に示す参考例２−１の配合において、ＰＣ−Ｃｏｎｔ、カルシウムおよびビタミンＣを用いなかったこと以外は同様の配合で各材料を混合し、これを生理食塩水で５ｍｍｏｌ／Ｌに希釈することにより、関節局所への注入用として用いうる、参考例２−９にかかる疾病抑制剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明にかかるコラーゲンペプチドは、例えば、骨粗しょう症、変形性関節炎、褥瘡などの症状を予防ないし治療するための疾病抑制剤の有効成分となるジペプチドを含有しているので、このような効能を有する健康食品、医薬品などとして好適に使用することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月22日(2010.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須の有効成分とする、骨粗しょう症抑制剤である、疾病抑制剤。
【請求項２】
Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須の有効成分とする、変形性関節炎抑制剤である、疾病抑制剤。
【請求項３】
Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須の有効成分とする、褥瘡抑制剤である、疾病抑制剤。
【請求項４】
有効成分としてグルコサミンおよび／またはその塩も含む、請求項１から３までのいずれかに記載の疾病抑制剤。
【請求項５】
経口用である、請求項１から４までのいずれかに記載の疾病抑制剤。
【請求項６】
関節局所への注入用である、請求項１から４までのいずれかに記載の疾病抑制剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、疾病抑制剤に関する。詳しくは、特定の構造を有するジペプチドを必須の有効成分とする、骨粗しょう症、変形性関節炎、褥瘡などの抑制（本発明において、「抑制」という用語は、症状の発症を抑制する「予防」としての意味と、発症した症状を抑制する「治療」としての意味の双方を含む。）に有効な疾病抑制剤に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
しかし、上記従来の技術は、変形性関節炎の予防ないし治療に、コラーゲンや、様々なペプチド分子の混合物であるコラーゲンペプチド、あるいは、特定のトリペプチドが有効であることを示すのみであり、変形性関節炎のみならず、骨粗しょう症、褥瘡なども含めた広い意味での疾病を予防ないし治療するのに有効なペプチド構造はこれまで知られていない。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、従来とは視点を変え、骨粗しょう症、変形性関節症、褥瘡などの種々の疾病の抑制に有効なペプチド分子の本体、とりわけ、腸管での体内への吸収が容易で新規なジペプチドを探り出し、前記ジペプチドを必須の有効成分として含有する疾病抑制剤を提供することにある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、本願発明者が新規に見出したＨｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドが、腸管での体内吸収が容易であり、かつ、疾病抑制剤の有効成分として働くこと、具体的には、例えば、破骨細胞の分化と活性化を抑制し、骨芽細胞の分化と活性化を亢進し、軟骨細胞の変性を抑制してその分化を調節することを見出し、骨粗しょう症、変形性関節症の抑制に有効であることを見出すとともに、このジペプチドが皮膚真皮中のトロポコラーゲン量を回復させ褥瘡をも抑制することを見出し、これらの事実を確認して、本発明を完成した。  
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
すなわち、本発明にかかる疾病抑制剤は、骨粗しょう症抑制剤、変形性関節症抑制剤もしくは褥瘡抑制剤であって、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須の有効成分として含有する、ことを特徴とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
以下、本発明にかかる疾病抑制剤と、本発明の疾病抑制剤に用いられる必須の有効成分としてのジペプチド、および、該ジペプチドを含有するコラーゲンペプチド（以下、「本発明にかかるジペプチド」、および、「本発明にかかるコラーゲンペプチド」と言うことがある。）について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
〔ジペプチド、コラーゲンペプチド〕
本発明にかかるジペプチドは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの構造を有するものである。
本発明にかかるコラーゲンペプチドは、前記ジペプチドを必須のジペプチドとして含有するものである。例えば、後述するようにコラーゲンやゼラチンを酵素処理することにより得ることができる。