(57)【要約】      （修正有）【課題】パエシロマイセスバリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉｉ）を特異的、簡便かつ迅速に検出できる方法を提供する。【解決手段】下記の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセスバリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉｉ）の同定を行うパエシロマイセスバリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉｉ）の検出方法。（ａ）β−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列又はその相補配列。（ｂ）特定の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセスバリオッティの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）の同定を行うことを特徴とするパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）の検出方法。
（ａ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス  バリオッティの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項２】
同定を行うために、被検菌のβ‐チューブリン遺伝子領域の塩基配列を決定し、該領域の塩基配列中に前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列が含まれるか否かを確認することを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
同定を行うために、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の全部又は一部を増幅し、増幅産物の有無を確認することを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
前記増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって行う請求項３記載の検出方法。
【請求項５】
前記（ａ）又は（ｂ）に記載の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを、核酸プライマーとして用いて遺伝子増幅反応を行うことを特徴とする請求項４記載の検出方法。
（１）パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
【請求項６】
下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて前記ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を行う請求項４又は５記載の検出方法。
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項７】
下記（ｅ）のオリゴヌクレオチド、並びに（ｆ）のオリゴヌクレオチド及び／又は（ｇ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて前記ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を行う請求項４又は５記載の検出方法。
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項８】
前記増幅反応をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法によって行う請求項３記載の検出方法。
【請求項９】
配列番号１０〜１３又は配列番号１６〜１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いる請求項８記載の検出方法。
【請求項１０】
請求項８記載の検出方法であって、配列番号１０〜１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用い、さらに配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー及び／又は配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いる請求項８記載の検出方法。
【請求項１１】
請求項８記載の検出方法であって、配列番号１６〜１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用い、さらに配列番号２０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー及び／又は配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いる請求項８記載の検出方法。
【請求項１２】
パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）の検出に用いるための、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表されるＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス  バリオッティの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項１３】
下記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出用オリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス  バリオッティの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、前記配列番号５〜２１のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できるオリゴヌクレオチドである請求項１３記載のパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列から選択される標的領域の配列の５’側から順に、塩基配列領域としてＦ３、Ｆ２及びＦ１を選択し、
前記標的領域の３’側から順に、塩基配列領域としてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃを選択し、
前記Ｆ３、Ｆ２及びＦ１の相補的塩基配列を、それぞれＦ３ｃ、Ｆ２ｃ及びＦ１ｃとし、
前記Ｂ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃに相補的な塩基配列を、それぞれＢ３、Ｂ２及びＢ１としたとき、
下記の（ａ’）〜（ｆ’）のいずれかに該当する塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである請求項１３又は１４記載のパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出用オリゴヌクレオチド。
（ａ’）前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｂ’）前記Ｂ３領域を有する塩基配列
（ｃ’）前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｄ’）前記Ｆ３領域を有する塩基配列
（ｅ’）前記Ｂ１領域と前記Ｂ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
（ｆ’）前記Ｆ１領域と前記Ｆ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが核酸プライマーであることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか記載のパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記検出用オリゴヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）に記載の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか記載のパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出用オリゴヌクレオチド。
（１）パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む
（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が３０％〜８０％となる
（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い
（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５５℃〜６５℃となる
【請求項１８】
下記の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、下記の（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、下記の（ｅ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチド対、又は下記の（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチド群からなる群より選ばれる少なくとも１対又は１群で示されたパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出用オリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群。
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１９】
請求項１８記載のオリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群を含むパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出キット。
【請求項２０】
パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２１】
パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉｉ）をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２２】
パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２３】
パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれか記載のプライマーセットと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰと、
を含むパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）は自然界に広く分布する不完全真菌である。パエシロマイセス  バリオッティは生活環の中で厚膜胞子と呼ばれる二重の細胞壁からなる無性胞子を形成する。パエシロマイセス  バリオッティの厚膜胞子はストレス耐性が極めて高いことが知られており、一般的な真菌の熱及び薬剤での殺菌条件でも生存・増殖し、カビの発生原因となることが知られている。従って、パエシロマイセス  バリオッティは食品業界やトイレタリー業界において危害菌として重要視されている。このため、防腐・防黴体制の確立において、パエシロマイセス  バリオッティの検出・同定が極めて重要であると認識されている。
【０００３】
パエシロマイセス  バリオッティの検出及び同定法は、培養による形態学的な種分類が主である。この方法は形態学的な特徴が発生するまで培養を続ける必要があるため、最短でも１４日以上の長期間を必要とする。また、形態学的な同定には極めて高い専門性を必要とするため、判定者によって同定結果が異なる危険性が否定できず同定結果の信頼性に問題があった。従って、迅速性及び信頼性の問題を解決した検出・同定方法の確立が求められている。
【０００４】
菌類の迅速かつ信頼性の高い検出方法としては、遺伝子の特定の塩基配列を標的とした増幅法（たとえばＰＣＲ法やＬＡＭＰ法）が知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。しかし、パエシロマイセス  バリオッティに特異的な遺伝子領域が解明されていない。従って、パエシロマイセス  バリオッティを特異的かつ迅速に検出することが困難であるという問題を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平１１−５０５７２８号公報
【特許文献２】特開２００６−６１１５２号公報
【特許文献３】特開２００６−３０４７６３号公報
【特許文献４】特開２００７−１７４９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、食品業界やトイレタリー業界などにおいて危害菌とされているパエシロマイセス  バリオッティを特異的、簡便かつ迅速に検出できる方法を提供することを課題とする。また、本発明の課題は、この方法に適用可能なＤＮＡ、プライマーセット、オリゴヌクレオチド及び検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述のようにパエシロマイセス  バリオッティの検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたＰＣＲ法では擬陽性や擬陰性の結果が出る点である。そしてこれは、パエシロマイセス  バリオッティの遺伝子のデータベースが現在のところ脆弱であり、パエシロマイセス  バリオッティの種レベルで保存されている遺伝子領域が正確にわかっていないために、パエシロマイセス  バリオッティを特異的かつ迅速に検出・識別するための高感度のプライマーの設計等が困難となっていることが原因であると考えた。
【０００８】
このような課題に鑑み、本発明者等は、パエシロマイセス  バリオッティを特異的に検出・識別しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、パエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域（以下、「可変領域」ともいう）が存在することを見出した。また、この可変領域をターゲットとすることで、上記パエシロマイセス  バリオッティを特異的かつ迅速に検出できることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）の同定を行うことを特徴とするパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）の検出方法に関する。
（ａ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス  バリオッティの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【００１０】
また、本発明は、パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）の検出に用いるための、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表されるＤＮＡに関する。
【００１１】
また、本発明は、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出用オリゴヌクレオチドに関する。
【００１２】
また、本発明は、下記の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、下記の（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、下記の（ｅ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチド対、又は下記の（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチド群からなる群より選ばれる少なくとも１対又は１群で示されたパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出用オリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群に関する。
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００１３】
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群を含むパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出用キットに関する。
【００１４】
また、本発明は、パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットに関する。
【００１５】
また、本発明は、パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットに関する。
【００１６】
また、本発明は、パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットに関する。
【００１７】
また、本発明は、パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットに関する。
【００１８】
さらに、本発明は、前記の、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットのいずれかと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰと、
を含むパエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、食品業界やトイレタリー業界などにおいて危害菌とされているパエシロマイセス  バリオッティを特異的、簡便かつ迅速に検出できる方法を提供することができる。また、本発明によれば、この方法に適用可能なＤＮＡ、プライマーセット、オリゴヌクレオチド及び検出キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】パエシロマイセス  バリオッティIFM40913株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、本発明のプライマーセット１のプライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図２】パエシロマイセス  バリオッティIFM40913株及びIFM40915株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、本発明のプライマーセット２のプライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図３】実施例１における、本発明の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図４】実施例１における、本発明の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図５】実施例２における、リアルタイム濁度法によるパエシロマイセス  バリオッティの検出感度を示す図である。１はPaecilomyces variotii  IFM40913株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はPaecilomyces variotii  IFM40915株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、４はByssochlamys nivea  IFM51244株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、５はHamigera avellanea  IFM42323株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、７はTalaromyces luteus  IFM53242株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図６】実施例３における、リアルタイム濁度法によるパエシロマイセス  バリオッティの検出感度を示す図である。図６（ａ）において、１はPaecilomyces variotii  IFM40913株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はPaecilomyces variotii  IFM40915株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、３はByssochlamys fluva  IFM48421株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、７はNeosartorya ficheri  IFM46945株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、８はNeosartorya spinosa  IFM46967株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。図６（ｂ）において、９はNeosartorya glabra  IFM46949株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１０はNeosartorya hiratsukae  IFM47036株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１１はAlterraria alternate  IFM41348株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１２はAureobasidium pullulans  IFM41409株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１４はFusarium oxysporum  IFM50002株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１５はTrichoderma viride  IFM40938株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図７】実施例４における、本発明の（ｅ）〜（ｇ）のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）のβ−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列、すなわちパエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子配列中に存在するパエシロマイセス  バリオッティに特異的な領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス  バリオッティの同定を行い、パエシロマイセス  バリオッティを特異的に識別・検出する方法である。ここで、「可変領域」とは、β−チューブリン遺伝子中で塩基変異が蓄積しやすい領域であり、この領域の塩基配列は他の真菌との間で大きく異なる。本発明における「パエシロマイセス  バリオッティ」は、糸状不完全菌類のパエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）に属する。また、「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。
【００２２】
本発明のパエシロマイセス  バリオッティの検出方法において、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス  バリオッティの同定を行う。
（ａ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれかに記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス  バリオッティの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
上記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表されるβ-チューブリン遺伝子の可変領域はパエシロマイセス  バリオッティ固有の塩基配列であるため、他の通常の菌類のものとは明確に区別しうるものである。従って、本発明のパエシロマイセス  バリオッティの検出方法によれば、パエシロマイセス  バリオッティを特異的かつ迅速に検出できる。また、上記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表されるＤＮＡは、パエシロマイセス  バリオッティの検出に用いることができる。
【００２３】
パエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を配列番号１及び２に基づき説明する。なお、配列番号１で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM40913株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示し、配列番号２で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM40915株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。また、配列番号１及び２で示されたパエシロマイセス  バリオッティIFM40913株及びIFM40915株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の一部を図２に比較して記載した。配列番号１及び２で示された塩基配列のうち、５０位〜１００位までの領域、及び２８０位〜３４０位までの領域は真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、種間によって固有の塩基配列を有することを本発明者らが見出した。本発明は、これらのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列をターゲットとしたものである。
【００２４】
さらに、パエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を配列番号３〜４及び２２〜３３に基づき説明する。
配列番号３で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティEU037073株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号４で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM50293株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号２２で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティNBRC4855株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号２３で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM52147株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号２４で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM52145株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号２５で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM51028株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号２６で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM51195株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号２７で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM55619株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号２８で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティNBRC5479株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号２９で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM51027株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号３０で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティNBRC31967株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号３１で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティNBRC31685株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号３２で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティSUM3339株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号３３で示された塩基配列は、パエシロマイセス  バリオッティIFM50294株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
これらのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列も真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、種間によって固有の塩基配列を有することを本発明者らが見出した。本発明は、これらのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列もターゲットとする。
【００２５】
本発明の検出方法に用いるパエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列（可変領域の塩基配列）で表される核酸は、配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれか記載の塩基配列又はその相補配列で表される核酸である。
配列番号１〜４及び２２〜３３に記載の塩基配列及びその相補配列は、それぞれ、パエシロマイセス  バリオッティのIFM40913株、IFM40915株、EU037073株、IFM50293株、NBRC4855株、IFM52147株、IFM52145株、IFM51028株、IFM51195株、IFM55619株、NBRC5479株、IFM51027株、NBRC31967株、NBRC31685株、SUM3339株及びIFM50294株から単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。これらの配列はパエシロマイセス  バリオッティにおいて相同性が非常に高く、しかもパエシロマイセス  バリオッティ以外の菌類とは相同性が低いため、被検体がこれらの塩基配列を有しているか否かを確認することで、パエシロマイセス  バリオッティのみを特異的に識別・同定することが可能である。
また、配列番号１〜４及び２２〜３３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基か欠失、置換若しくは付加された塩基配列又はその相補配列で表される核酸を用いても、同様にパエシロマイセス  バリオッティのみを特異的に識別・同定することが可能である。
（以下、配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれか記載の塩基配列又はその相補配列並びに配列番号１〜４及び２２〜３３のいずれか記載の塩基配列若しくはその相補配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス  バリオッティの検出に使用できる塩基配列をまとめて「本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列」ともいう。）
【００２６】
上記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス  バリオッティを同定する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
【００２７】
本発明の検出方法において、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス  バリオッティの同定を行うには、被検体のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、該遺伝子の塩基配列中に前記（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸の塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいてパエシロマイセス  バリオッティの同定を行うものである。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００２８】
本発明においては、上記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス  バリオッティを同定し検出を行うために、本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつ核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス  バリオッティの検出に使用できるものであればよい。すなわち、パエシロマイセス  バリオッティの検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でパエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２９】
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、配列番号５〜２１のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドがより好ましい。また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、配列番号５〜２１のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができる検出用オリゴヌクレオチドには、配列番号５〜２１のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列において１又は数個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号５〜２１のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００３０】
上記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００３１】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プライマー及び核酸プローブとして用いることができる。核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。
【００３２】
本発明の検出法においては、パエシロマイセス  バリオッティを同定、検出するために、配列番号５〜２１のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できるオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましく、配列番号５〜２１のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いるのがさらに好ましい。
【００３３】
被検体中のパエシロマイセス  バリオッティを検出するためには、配列番号５〜２１のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できるオリゴヌクレオチドを標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出法により検出すればよい。上記核酸プローブはパエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のパエシロマイセス  バリオッティを迅速かつ簡便に検出することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
【００３４】
さらに、本発明の検出方法において、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス  バリオッティの同定を行うためには、該塩基配列の全部又は一部の領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。当該領域を含むＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法、ＬＣＲ（Ligase  Chain  Reaction）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence-based  Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle  amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop  mediated  isothermal  amplification）法など通常の方法を用いることができる。しかし、本発明においては、ＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法を用いるのが好ましい。
【００３５】
本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いパエシロマイセス  バリオッティの検出を行う場合について説明する。
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドからなるプライマーとしては、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列から選択される領域であって、（１）パエシロマイセス  バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）に固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域を含む、（２）オリゴヌクレオチドのＧＣ含量がおよそ３０％〜８０％となる、（３）オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、（４）オリゴヌクレオチドのＴｍ値（融解温度：melting  temperature）がおよそ５５℃〜６５℃となる、の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３６】
上記（１）において「パエシロマイセス  バリオッティに固有の遺伝子の塩基配列が１０塩基前後連続して現れる領域」とは、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の中でも、異なる種間での塩基配列の保存性が特に低く（すなわち、パエシロマイセス  バリオッティの特異性が特に高く）、１０塩基前後にわたってパエシロマイセス  バリオッティに固有の塩基配列が連続して現れる領域を意味する。また、上記（３）において「オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い」とは、プライマーの塩基配列からプライマー同士が結合しないことが予想されることを言う。
【００３７】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドの塩基数としては、特に限定されないが、１３塩基〜３０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２３塩基であることがより好ましい。ハイブリダイズ時のオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、５５℃〜６５℃の範囲内であることが好ましく、５９℃〜６２℃の範囲内であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、３０％〜８０％が好ましく、４５％〜６５％がより好ましく、５５％前後であることが最も好ましい。
【００３８】
また、配列番号１又は２記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス  バリオッティの検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス  バリオッティの同定を行う場合、配列番号１及び２に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の５０〜１００位及び／又は２８０〜３４０位の塩基配列の全部又は一部、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列の全部又は一部を増幅することが好ましい。この場合、オリゴヌクレオチドの塩基数としては特に限定されないが、１３塩基〜３０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２３塩基であることがより好ましい。
ＰＣＲ法により増幅反応を行い、パエシロマイセス  バリオッティを検出するためには、下記の（ｃ）又は（ｄ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いるのがさらに好ましい。
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明のパエシロマイセス  バリオッティ検出用オリゴヌクレオチド対は、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対である。
配列番号５及び配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子領域に存在し、可変領域の一部分の塩基配列又はその相補配列と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス  バリオッティのＤＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
前記（ｃ）及び（ｄ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列のうち、それぞれ６４位〜８５位まで、３０６位〜３２５位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス  バリオッティを特異的に検出することができる。
【００３９】
また、本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いパエシロマイセス  バリオッティを検出するためには、下記（ｅ）のオリゴヌクレオチド、並びに（ｆ）のオリゴヌクレオチド及び／又は（ｇ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び／又は配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いるのがさらに好ましく、配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いるのが特に好ましい。
（ｅ）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００４０】
また、本発明のパエシロマイセス  バリオッティ検出用オリゴヌクレオチド対（オリゴヌクレオチド群）は、前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｇ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、及び前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｇ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群である。
【００４１】
配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子領域に存在し、可変領域の一部分の塩基配列又はその相補配列と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス  バリオッティのＤＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
前記（ｅ）及び（ｆ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２２に記載の塩基配列のうち、それぞれ９８位〜１１６位まで、２６６位〜２８５位までの領域に対応する。（ｅ）及び（ｇ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２８に記載の塩基配列のうち、９２位〜１１０位まで、２６１位〜２８０位の領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス  バリオッティを特異的に検出することができる。
【００４２】
本発明におけるＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を約５９℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。
【００４３】
本発明において、ＰＣＲ法により増幅した遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、ＰＣＲ反応産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、ＰＣＲ反応産物の塩基配列を解読する方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間に蛍光物質を入り込ませ発光させる方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
検体にパエシロマイセス  バリオッティが含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的なＤＮＡ断片の増幅が認められる。具体的には、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約２５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められ、下記（ｅ）のオリゴヌクレオチド、並びに（ｆ）のオリゴヌクレオチド及び／又は（ｇ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約２００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、検体にパエシロマイセス  バリオッティが含まれているかを確認することができる。
【００４４】
本発明において可変領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法によって増幅させる場合、周期的な温度変化制御が不要となるため、等温での相補鎖合成反応が可能である。このため、検体中に含まれる特定の菌類を簡便かつ迅速に検出できる。
【００４５】
ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法で不可欠とされる周期的な温度変化制御が不要なループ媒介等温増幅法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）であって、鋳型となるヌクレオチドにプライマーの３’側をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能にする。このＬＡＭＰ法では、鋳型となる核酸の６つの塩基配列領域を認識する少なくとも４つのプライマーが必要とされる。これらのプライマーは、３’側が常に鋳型となるヌクレオチドにアニールするように設計されるため、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能することになり、高感度でかつ特異性の高い核酸の増幅反応が可能となる。
【００４６】
ＬＡＭＰ法に用いられるプライマーが認識する６つの塩基配列領域は、鋳型となるヌクレオチドの５’側から順にＦ３、Ｆ２、Ｆ１と呼び、３’側から順にＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃと呼び、さらに、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３の相補的な塩基配列をそれぞれＦ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃと呼び、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃの相補的な塩基配列をそれぞれＢ１、Ｂ２、Ｂ３と呼ぶ。
上記６つの塩基配列領域は、下記のように選定することができるが、本発明はこれに限定されるものではない。
対象となる菌種遺伝子の塩基配列のアライメントを行い、Primer  Explorer  V4（栄研化学HP）等のソフトウエアを用いて、複数のプライマーを設計する。それらを合成し、実際にLAMP反応を行い、パエシロマイセス  バリオッティを特異的に検出することができるプライマーを採用した。
詳細には、
１．  Clustal  Xなどのアラインメントソフトを用いて対象となる菌種の標的領域の塩基配列情報のアライメントファイルを作成する。
２．  アライメントファイル中の情報をもとにPrimer  Explorer  V4（栄研化学HP）を用いてプライマーを設計する。
３．  設計されたプライマーセットの候補の中からより安定（dimer構造をとりにくい）で、伸長方向の先端に変異（種特異的な変異）を多く含むプライマーセットを選択する。特にインナープライマーの伸長方向に多くの変異を含んでいると近縁な種とも区別ができる可能性が高まる。プライマーセットの候補ができない場合には、Tm値やプライマーの塩基数についての設定をゆるく幅を持たせるようにし設計する。
４．  実際に選択したプライマーセットを用いて試験を行い、有効性を確認する。有効性が確認された後、ループプライマーを設計し、より反応時間が短くなるようにする。
【００４７】
ＬＡＭＰ法に用いられるプライマーの設計は、まず、標的領域の塩基配列から上記の６つの塩基配列領域を決定し、その後、後述するインナープライマーＦ及びＢ並びにアウタープライマーＦ及びＢを設計する。
【００４８】
ＬＡＭＰ法に用いられる「インナープライマー」とは、標的塩基配列上のある特定のヌクレオチド配列領域を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’側に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’側に有するオリゴヌクレオチドのことをいう。このうち、前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下、ＦＩＰ）と呼び、前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列を含むプライマーをインナープライマーＢ（以下、ＢＩＰ）と呼ぶ。このインナープライマーは、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域の間、又はＢ２領域とＢ１ｃ領域の間に、塩基数０〜５０のいずれかの長さの任意の塩基配列を有していてもよい。
一方、「アウタープライマー」とは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」（例えば前記Ｆ２領域又はＢ２領域）の５'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｆ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマー及びＢ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーが挙げられる。ここで、Ｆ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下、Ｆ３プライマー）、Ｂ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＢ（以下、Ｂ３プライマー）と呼ぶ。
ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示であり、各プライマーにおけるＢとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示である。
【００４９】
ＬＡＭＰ法における核酸の増幅では、インナープライマー及びアウタープライマーに加え、さらにループプライマー（以下、ＬＦ、ＬＢ）を好ましく用いることができる。ループプライマーは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、このループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’側に含むプライマー（二本鎖を構成する各々について１つずつ）のことをいう。すなわち、ダンベル構造の５’側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いれば、核酸合成の起点が増加するため、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。
ループプライマーの塩基配列は、上記ダンベル構造の５’側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的領域の塩基配列又はその相補鎖から選択されてもよく、他の塩基配列でもよい。また、ループプライマーは１種類であっても、２種類であってもよい。
【００５０】
上記の少なくとも４種以上のプライマーを用いて標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅すれば、当該ＤＮＡ断片を特異的かつ効率的に検出可能な量まで増幅することが可能である。このため、増幅産物の有無を確認することによって、特定の菌類を検出することができる。
【００５１】
ＬＡＭＰ法に用いることができるプライマーは、１５塩基以上であることが好ましく、２０塩基以上であることがさらに好ましい。また、各プライマーは、単一の塩基配列のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数の塩基配列のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００５２】
また、ＬＡＭＰ法に用いることができるアウタープライマーは、標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅するためにＰＣＲ法にも使用できる。ＰＣＲ法では、上記プライマーを用いて、検体中のβ−チューブリン遺伝子を鋳型に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを行えば、目的とするＤＮＡ断片を増幅させることが可能である。
【００５３】
次に、パエシロマイセス  バリオッティをＬＡＭＰ法により検出する場合に好ましく用いられるプライマーセットについて説明する。パエシロマイセス  バリオッティを特異的に検出するために、下記のプライマーセット（プライマーセット１）を用いるのがより好ましい。
パエシロマイセス  バリオッティ検出用プライマーセット１
LPae1F3プライマー：ACGATCCTATAGGCAGACCA（配列番号１０）
LPae1B3プライマー：CCAGCGGCCTATTTATTGGT（配列番号１１）
LPae1FIPプライマー：CGTCTCTCTCGATTCCGTGTCGCCTTGACGGCTCTGGTGT（配列番号１２）
LPae1BIPプライマー：CTCCGACCTTCAGCTCGAGCGGAGCGTTCCTCTTGGGAT（配列番号１３）
パエシロマイセス  バリオッティを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、下記のプライマーを用いるのが好ましい。
パエシロマイセス  バリオッティ検出用ループプライマー
LPae1LFループプライマー：TCCCCAGATATCGTGTACTTAC（配列番号１４）
LPae1LBループプライマー：ACTTCAACGAGGTAGTTGTTG（配列番号１５）
図１に、パエシロマイセス  バリオッティIFM40913株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【００５４】
本発明においては、下記のプライマーセット（プライマーセット２）を用いてパエシロマイセス  バリオッティをＬＡＭＰ法により検出することも好ましい。
パエシロマイセス  バリオッティ検出用プライマーセット２
LPae2F3プライマー：CGATATCTGGGGATGCTTCG（配列番号１６）
LPae2B3プライマー：CGTCCATGGTACCAGGCT（配列番号１７）
LPae2FIPプライマー：ATGCGCTCGAGCTGAAGGTCCGGAATCGAGAGAGAGACGACT（配列番号１８）
LPae2BIPプライマー：TGATCCCAAGAGGAACGCCCCACGAGGAACGTACTTCTTGCC（配列番号１９）
パエシロマイセス  バリオッティを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、下記のプライマーを用いるのが好ましい。
パエシロマイセス  バリオッティ検出用ループプライマー
LPae2LFループプライマー：GGAGGAGCCATTGTAGCTAA（配列番号２０）
LPae2LBループプライマー：GAGCTCACCAATAAATAGGCC（配列番号２１）
図２に、パエシロマイセス  バリオッティIFM40913株及びIFM40915株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【００５５】
本発明のパエシロマイセス  バリオッティ検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号１４及び配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。
また、本発明の別のパエシロマイセス  バリオッティ検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号２０及び配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。
上記プライマーセットを用いることにより、パエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の標的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にパエシロマイセス  バリオッティが存在すると判断できる。
【００５６】
また、本発明のパエシロマイセス  バリオッティ検出用オリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子の塩基配列から選択される標的領域の５’側から、塩基配列領域としてＦ３、Ｆ２及びＦ１を選択し、前記標的領域の３’側から、塩基配列領域としてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃを選択し、前記Ｂ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃの相補的塩基配列を、それぞれＢ３、Ｂ２及びＢ１とし、前記Ｆ３、Ｆ２及びＦ１に相補的な塩基配列を、それぞれＦ３ｃ、Ｆ２ｃ及びＦ１ｃとしたとき、下記の（ａ’）〜（ｆ’）のいずれかに該当する塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
（ａ’）前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｂ’）前記Ｂ３領域を有する塩基配列
（ｃ’）前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｄ’）前記Ｆ３領域を有する塩基配列
（ｅ’）前記Ｂ１領域と前記Ｂ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
（ｆ’）前記Ｆ１領域と前記Ｆ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＬＡＭＰ法で用いられるプライマーとしてだけではなく、ＰＣＲ法等のプライマー、核酸検出用プローブなどとしても用いることができる。
【００５７】
標的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により増幅させる場合に用いられる酵素は、通常用いられるものであれば特に制限はないが、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素が好ましい。このような酵素としては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。本発明に用いることができる酵素は、ウイルスや細菌等から精製されたものでもよく、遺伝子組換え技術によって作製されたものでもよい。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換等の改変をされたものでもよい。
【００５８】
標的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により増幅させるときの温度に特に制限はないが、５５〜６８℃が好ましく、６０〜６５℃がより好ましい。
【００５９】
標的領域を含むＤＮＡ断片の増幅は通常の方法により確認することができる。前記標的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法によって増幅させる場合には、例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドをプローブに用いてハイブリダイゼーションを行ったり、蛍光性インターカレーター法（特開２００１−２４２１６９号公報）で検出したり、あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲルで電気泳動してバンドとして検出することもできる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムが算出される。ピロリン酸マグネシウムが算出されると、反応液が肉眼で確認できる程度にまで白濁する。この白濁を指標として、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器を用いて検出できる。例えば、分光光度計を用いて４００ｎｍにおける吸光度の変化を確認することによって、核酸の増幅反応を検出することができる（国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。
【００６０】
本発明において、標的領域を含むＤＮＡ断片の増幅のために用いられるプライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、公知の方法を使用して合成できる。
【００６１】
本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
検体からＤＮＡを調製する方法としては、パエシロマイセス  バリオッティの検出を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００６２】
本発明のプライマーを用いて標的領域を含むＤＮＡ断片の増幅を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。
例えば、本発明のキットには、ＬＡＭＰ法に用いることができる上記プライマーセット（好ましくは、配列番号１０〜１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセット、配列番号１０〜１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセット、配列番号１６〜１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセット、又は配列番号１６〜２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセット）と、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰとを含有する。好ましくは、前記プライマーセット、ループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド（好ましくは配列番号７及び８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー）、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素などのＤＮＡポリメラーゼと、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして含有される。本発明のキットには、本発明のプライマーによってＬＡＭＰ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
また、本発明のパエシロマイセス  バリオッティ検出用キットは、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対、前記の（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対、前記の（ｅ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記の（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチド群からなる群より選ばれる少なくとも１対又は１群で示された検出用オリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群を核酸プライマーとして含有するものである。このキットは、ＰＣＲ法によりパエシロマイセス  バリオッティを検出する方法に好ましく用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のプライマーによってＰＣＲ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
【００６３】
本発明の方法によれば、検体の調製工程から菌類の検出工程までを約６０〜１２０分という短時間で行うことが可能である。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６５】
実施例１  ＰＣＲ法によるパエシロマイセス  バリオッティの検出
（１）標的遺伝子の解析
下記の方法によりパエシロマイセス  バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。
ポテトデキストロース寒天斜面培地にて供試菌を２５℃で７日間、暗所培養した。菌体からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ（株）社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD製）を用いて、プライマーとしてBt2a（5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'、配列番号３４）、Bt2b（5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'、配列番号３５）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を使用した。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度９５℃、アニーリング温度５９℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto  SegTM  G−50（Amersham  Pharmacia  Biotech社製）を使用し精製した。ＰＣＲ産物は、BigDye（登録商標）terminator  Ver.  1.1（Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetiｃ  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC  Ver.4”（Genetyx社製）を使用した。
【００６６】
（２）プライマーの調製
上記で得られたパエシロマイセス  バリオッティのβチューブリン配列、同様にして決定したハミゲラ  アベラネラ（Hamigera avellanea）、タラロマイセス  フラバス（Talaromyces  flavus）、タラロマイセス  ルテウス（Talaromyces  luteus）、タラロマイセス  トラキスパーマム（Talaromyces  trachyspermus）、ビソクラミス  ニベア（Byssochlamys nivea）、ビソクラミス  フルバ（Byssochlamys fulva）のβチューブリン配列及び各種菌類の公知のβチューブリン配列をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウェア（Clustal  W)を用いてアライメント解析を行い、パエシロマイセス  バリオッティに特異的な塩基配列領域を決定した（配列番号１〜４及び２２〜３３）。決定した領域のうち、３’末端側でパエシロマイセス  バリオッティの特異性が特に高い領域から、１）種固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含む５組のプライマー対を設計し、シグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩性製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【００６７】
（３）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちパエシロマイセス  バリオッティとその他の耐熱性菌及び一般カビとしては、表１及び表２に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて一般カビは２５℃、耐熱性菌は３０℃で７日間培養した。
【００６８】
【表１】
2010004881.tif 000002
【００６９】
【表２】
2010004881.tif 000003
【００７０】
（４）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００７１】
（５）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Pae1Fプライマー）等のフォワードプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Pae1Rプライマー）等のリバースプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９８℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)６３℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。
【００７２】
（６）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、紫外線下で蛍光を検出することにより増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果５組設計したプライマーセットのうち配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を用いた場合、パエシロマイセス  バリオッティのゲノムＤＮＡを含む試料では、設計したプライマー対から予想されるサイズに遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス  バリオッティのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を用いた場合のアガロースゲルの電気泳動図を図３及び図４に示す。なお、図３は表１に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図４は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果パエシロマイセス  バリオッティのゲノムＤＮＡを含む試料では、約２５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス  バリオッティのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。
【００７３】
以上の結果から、配列番号５及び６記載の本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、パエシロマイセス  バリオッティを特異的に検出できることがわかる。さらに、本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列を基にして、パエシロマイセス  バリオッティを特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るパエシロマイセス  バリオッティ検出用オリゴヌクレオチドを容易に設計できることがわかる。
【００７４】
実施例２  ＬＡＭＰ法によるパエシロマイセス  バリオッティの検出
（１）プライマーの設計及び合成
上記実施例１で特定したパエシロマイセス  バリオッティに特異的な塩基配列領域（配列番号１〜４及び２２〜３３）をもとに、配列番号１０〜１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号１０及び１１；５ｐmolスケール、配列番号１２及び１３；４０ｐmolスケール、配列番号１４及び１５：２０ｐmolスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【００７５】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちパエシロマイセス  バリオッティとその他の耐熱性菌としては、表３に記載の菌類を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて３０℃で７日間培養した。
【００７６】
【表３】
2010004881.tif 000004
【００７７】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、下記のＬＡＭＰ反応に用いた。
【００７８】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ１Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ１Ｂ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ１ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ１ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ１ＬＦループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ１ＬＢループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、及び上記で調製した鋳型ＤＮＡ  １μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。
【００７９】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【００８０】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図５に示す。
その結果、パエシロマイセス  バリオッティのゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始２３分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、その他の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後４０分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始４５分前後から、パエシロマイセス  バリオッティ以外のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これは経時的にプラマー同士の非特異的な反応が発生したため、あるいは反応時間が長いと、ターゲット以外の部分にも少数のプライマーが反応してしまったためと考えられる。
【００８１】
実施例３  ＬＡＭＰ法によるパエシロマイセス  バリオッティの検出
（１）プライマーの設計及び合成
上記実施例１で特定したパエシロマイセス  バリオッティに特異的な塩基配列領域（配列番号１〜４及び２２〜３３）をもとに、配列番号１６〜２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号１６及び１７；５ｐmolスケール、配列番号１８及び１９；４０ｐmolスケール、配列番号２０及び２１：２０ｐmolスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【００８２】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちパエシロマイセス  バリオッティとその他の耐熱性菌及び一般カビとしては、表４に記載の菌類を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて一般カビは２５℃、耐熱性菌は３０℃で７日間培養した。
【００８３】
【表４】
2010004881.tif 000005
【００８４】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、下記のＬＡＭＰ反応に用いた。
【００８５】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ２Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ２Ｂ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ２ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ２ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ２ＬＦループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＰａｅ２ＬＢループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、及び上記で調製した鋳型ＤＮＡ  １μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。
【００８６】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【００８７】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図６に示す。
その結果、パエシロマイセス  バリオッティのゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始２０分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、その他の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後５０分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始６０分前後から、パエシロマイセス  バリオッティ以外のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これは経時的にプラマー同士の非特異的な反応が発生したため、あるいは反応時間が長いと、ターゲット以外の部分にも少数のプライマーが反応してしまったためと考えられる。
【００８８】
実施例４  ＰＣＲ法によるパエシロマイセス  バリオッティの検出
（１）プライマーの調製
上記実施例１で特定したパエシロマイセス  バリオッティに特異的な塩基配列領域（配列番号１〜４及び２２〜３３）のうち、３’末端側でパエシロマイセス  バリオッティの特異性が特に高い領域から、１）種固有の塩基配列が数塩基前後存在している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして配列番号７〜９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含む５組のプライマー対を設計し、シグマ  アルドリッチ  ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
【００８９】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちパエシロマイセス  バリオッティとその他の耐熱性菌としては、表５に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて３０℃で７日間培養した。
【００９０】
【表５】
2010004881.tif 000006
【００９１】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００９２】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、Ｐｒｅ  Ｍｉｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１５μｌ、無菌蒸留水１１μｌを混合し、配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Pae4Fプライマー、２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Pae4R-1プライマー、２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ及び配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Pae1R-2プライマー、２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌを加え、３０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。その他４組のプライマー対についても同様にＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００９３】
（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２．５μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ｉｎ  １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、紫外線下で蛍光を検出することにより増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果、５組のプライマーセットのうち配列番号７〜９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いた場合、パエシロマイセス  バリオッティのゲノムＤＮＡを含む試料では、設計したプライマー対から予想されるサイズに遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス  バリオッティのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。配列番号７〜９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いた場合のアガロースゲルの電気泳動図を図７に示す。図中の番号は表５記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、パエシロマイセス  バリオッティのゲノムＤＮＡを含む試料では、約２００ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、上記パエシロマイセス  バリオッティの菌株のゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。
【００９４】
以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、パエシロマイセス  バリオッティを特異的に検出できることがわかる。さらに、本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列を基にして、パエシロマイセス  バリオッティを特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るパエシロマイセス  バリオッティ検出用オリゴヌクレオチドを容易に設計できることがわかる。
【００９５】
実施例１〜４の結果から、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にパエシロマイセス  バリオッティを検出することが可能である。
【図１】
2010004881.tif 000007
【図２】
2010004881.tif 000008
【図５】
2010004881.tif 000009
【図６】
2010004881.tif 000010
【図３】
2010004881.tif 000011
【図４】
2010004881.tif 000012
【図７】
2010004881.tif 000013
【配列表】
2010004881000001.app