(57)【要約】【課題】代謝負荷の影響を最小限にし、生成物の必要性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｎｅｅｄ）を満たすために組み換え型タンパク質の産生量を制御し、かつ形質転換された宿主細胞の安定性を高めながら、複数の遺伝子またはオペロンをどのように容易かつ迅速にクローニングするかという解決されるべき問題が残っている。【解決手段】本発明は、ターミネーター配列にそれぞれ隣接する、少なくとも３つの異なる遺伝子またはオペロンのクローニングに有用な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、タンパク質発現のレベルを変えるためのグルコースイソメラーゼプロモーターの変異体を含有する、一連の低コピー数プラスミドを提供する。この材料および方法は、特に複数の遺伝子挿入が求められる場合の、微生物における遺伝子工学に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセスリウィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモータの変異体をコードする核酸配列を含み、該核酸配列が、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：２２、および配列番号：２３よりなる群から選択される配列のいずれかを含むことを特徴とする単離されたまたは組み換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２】
ストレプトマイセスリビウィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモータの変異体をコードする核酸配列を含み、該核酸配列が、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：２２、および配列番号：２３からなる群から選択されることを特徴とする単離されたまたは組み換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ストレプトマイセスリビウィダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモータの変異体をコードする核酸配列を含み、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：２２、および配列番号：２３の核酸配列を含むことを特徴とする単離されたまたは組み換え型のポリヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４】
請求項１に記載のストレプトマイセスリウィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモータの変異体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項５】
請求項１に記載のストレプトマイセスリビウィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモータの変異体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【請求項６】
請求項１に記載の、ストレプトマイセスリウィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモータの変異体をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞がＲＪ８ｎであることを特徴とする請求項６に記載の形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、少なくとも３つの異なる遺伝子またはオペロンをクローニングするために有用である制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、その各部位が、ターミネーター配列と、タンパク質発現のレベルを変えるための一組のプロモーターに隣接する、一連の低コピー数プラスミドに関する。本発明は、特に複数の遺伝子挿入が求められる場合の、微生物における遺伝子工学に有用である。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００２年４月２２日に出願された米国仮出願第６０／３７４９３１号の特典を主張する。本出願は、特願２００３−５８６３３４の分割出願である。
【０００３】
分子生物工学は、研究者が、遺伝情報の特定の単位を、ある生物から別の生物に導入する能力に基づく学問分野である。このプロセスは、クローニングとして知られ、有用な産物または商業的プロセスを生じるための組み換えＤＮＡ技術の技法に頼っている（非特許文献１）。
【０００４】
商業的プロセスは、多くの場合、クローン化された遺伝子によってコードされるタンパク質が、速い発現速度で生成されることを必要とする。あらゆるクローン化された遺伝子の最大限の発現を実現するための単独の戦略は存在しない。大抵のクローン化された遺伝子は、特有の分子特性をもち、相当な時間と労力を投資した末にようやく、許容されるレベルの発現をもたらす特定の一連の条件が発見される。
【０００５】
単に遺伝子をクローニングベクターに挿入するだけでは、必要とされるレベルでうまく発現されることが確実にはならない。速い発現速度の必要性に応えるため、転写、翻訳、タンパク質の安定性、酸素の制限、および宿主細胞からの分泌の状況を制御するいくつかの異なる遺伝因子を操作することによって、多くの特化された発現ベクターが作成されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するために操作されている分子的特徴には、以下が含まれる。（１）該当する転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、（２）リボソーム結合部位の強度、（３）クローン化された遺伝子のコピー数、および、その遺伝子が、プラスミド上にのっているか、それとも宿主細胞のゲノムに組み込まれているか、（４）合成された外来タンパク質の最終的な細胞位置、（５）その宿主生物における翻訳の効率、ならびに（６）その宿主細胞内のクローン化された遺伝子タンパク質（ｇｅｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の本質的な安定性。
【０００６】
さらに、宿主生物における外来ＤＮＡの導入および発現は、しばしば、通常の細胞機能を低下させる形で、その生物の代謝を変化させる。この現象は、外来ＤＮＡによって宿主に課せられる代謝負荷または負担が原因である。この代謝負荷は、以下を含めた様々な状態に起因する可能性がある。１）プラスミドコピー数の増加、２）タンパク質の過剰産生、３）輸送（ｅｘｐｏｒｔ）部位の飽和、および／または４）外来タンパク質それ自体による細胞機能の妨害。
【０００７】
上で示された障害のいくつかに対処するための技術は、既知である。いくつかのグループは、異なるＲＮＡポリメラーゼからの、あるいは異なるファージ種における、細胞成長の異なる段階での遺伝子を発現させるために連係する複数のプロモーター（特許文献１）を使用している（米国特許公報（特許文献２）；（非特許文献２）；（非特許文献３））。別のグループは、プラスミドベクターからのＤＮＡの出入りを容易にするために、タンデムリピート（ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｅｄ）マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）（（非特許文献４））を使用している。あるグループは、哺乳類の細胞における異なる遺伝子の発現のための異なるプロモーターの後ろに各々存在する３つのマルチクローニングサイトを有する高コピー数ベクターの使用を報告している（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許第１１８６８５６明細書
【特許文献２】米国特許第５，５４７，８６２号明細書
【特許文献３】国際公開第９，８２１，３４１号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，０１３，４９４号明細書
【特許文献５】国際公開第０１１２８３３号パンフレット
【特許文献６】米国特許第５，６３３，３６２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，８２１，０９２号明細書
【特許文献８】米国特許第５，６８６，２７６号明細書
【特許文献９】米国特許第６，０２５，１８４号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，５９９，６８９号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，１３６，５７６号明細書
【特許文献１２】国際公開第９９２８４８０号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】グリック、Ｂ．Ｒ．（Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．）；パステルナーク、Ｊ．Ｊ（Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｊ．Ｊ．）、分子生物工学および組み換えＤＮＡの原理と応用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）、第２版、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９８年）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２（５）：３０３〜３１６（１９８５年）
【非特許文献３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１８（１）：１５２〜１５４、１５６〜１５７（１９９５年）
【非特許文献４】遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１３９（１）：８３〜８６（１９９４年）
【非特許文献５】Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．、５７（１）：１〜１０（１９９８年）
【非特許文献６】特許出願におけるヌクレオチド及びアミノ酸配列の提示のための標準（Ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ａｎｎｅｘｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＰＯ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｎｏ．  ２  ｔｏ  ＯＪ  ＥＰＯ，１２／１９９２）
【非特許文献７】３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５ならびに付属書（Ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ）ＡおよびＢ（ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を含む出願の開示に関する要件（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ））
【非特許文献８】世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準（Ｓｔａｎｄａｒｄ）ＳＴ．２５（１９９８年）
【非特許文献９】ＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＰＯ  ａｎｄ  ＰＣＴ）（Ｒｕｌｅｓ  ５．２  ａｎｄ  ４９．５（ａ−ｂｉｓ），  ａｎｄ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２０８  ａｎｄ  Ａｎｎｅｘ  Ｃ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）
【非特許文献１０】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１〜３０３０（１９８５年）
【非特許文献１１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（Ｎｏ．２）：３４５〜３７３（１９８４年）
【非特許文献１２】特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）
【非特許文献１３】ダニエル（Ｄａｎｉｅｌ）他、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、２２：５５３（１９９９年）
【非特許文献１４】トラヤ（Ｔｏｒａｙａ）およびモリ（Ｍｏｒｉ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：３３７２（１９９９年）
【非特許文献１５】トモマツ（Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ）他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１：４１１０（１９９９年）
【非特許文献１６】ホーリー、Ｄ．Ｋ．（Ｈａｗｌｅｙ，Ｄ．Ｋ．）；マクルーア、Ｗ．Ｒ．（ＭｃＣｌｕｒｅ，Ｗ．Ｒ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１：２２３７〜２２５５（１９８３年）
【非特許文献１７】マディガン、Ｍ．Ｔ．（Ｍａｄｉｇａｎ，Ｍ．Ｔ．）；マルティンコ、Ｊ．Ｍ．（Ｍａｒｔｉｎｋｏ，Ｊ．Ｍ．）；パーカー、Ｊ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．）；ブロック微生物学（Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、第８版、プレンティスホール出版（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ）；ニュージャージー州アッパーサドルリバー（Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ）（１９９７年）
【非特許文献１８】ポッスル、Ｋ．（Ｐｏｓｔｌｅ，Ｋ．）；グッド、Ｒ．Ｆ．（Ｇｏｏｄ，Ｒ．Ｆ．）、細胞（Ｃｅｌｌ）、４１、５７７〜５８５（１９８５年）
【非特許文献１９】ヤンゲット（Ｙａｎｇｅｔ）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：２３３３０〜２３３３６（１９９５年）
【非特許文献２０】タカギ（Ｔａｋａｇｉ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１３：２０６３〜２０７４（１９８５年）
【非特許文献２１】ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８：４６３１（１９９０年）
【非特許文献２２】ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）のＬラムダレッド法（Ｌｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）（２０００）ＰＮＡＳ  ９７：６６４０〜６６４５
【非特許文献２３】ワン（Ｗａｎｇ）他、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７６：７０９１〜７０９５（１９９４年）
【非特許文献２４】ララソン（Ｌａｒａｓｏｎ）他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０：１１０１（１９９３年）
【非特許文献２５】アルバーチン（Ａｌｂｅｒｔｙｎ）他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４：４１３５（１９９４年）
【非特許文献２６】ノーベック（Ｎｏｒｂｅｃｋ）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：１３８７５（１９９６年）
【非特許文献２７】サムブルック、Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ、Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）、およびマニアティス、Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；コールドスプリングハーバー研究所出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９年）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））
【非特許文献２８】Ｔ．Ｊ．シルハベイ（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクウィスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）
【非特許文献２９】オーズベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）他、グリーンパブリッシングアソシエイツアンドワイリーインターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）によって出版された、分子生物学  最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９８７年）
【非特許文献３０】Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ  ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ  Ｎ．コスティロ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン  Ｗ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス  Ａ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル  Ｒ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス  フィリップス（Ｇ．  Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）（１９９４年））
【非特許文献３１】トーマス  Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウアーアソシエイツインコーポレイティッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９年）
【非特許文献３２】フォレージ（Ｆｏｒａｇｅ）およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）によるＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、５６９：２４９（１９７９年）
【非特許文献３３】ヴァン・ダイク（Ｖａｎ  Ｄｙｋ）他、応用環境微生物学（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１８０：７８５〜７９２（１９９５）
【非特許文献３４】ヴァン・ダイク（Ｖａｎ  Ｄｙｋ）およびロッソン（Ｒｏｓｓｏｎ）分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．１０２：生物発光の方法および手順（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、８５（１９９８年）
【非特許文献３５】リン（Ｌｙｎｎ）他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８３：５２９〜５４１（１９８５年）
【非特許文献３６】ワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）およびダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）、ＰＮＡＳ、９７（１２）：６６４０〜６６４５（２０００年）
【非特許文献３７】ファラボウ（Ｆａｒａｂａｕｇｈ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７４（５６７３）：７６５〜７６９（１９７８年）
【非特許文献３８】アマン（Ａｍａｎｎ）他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２５：１６７〜１７８（１９８３年）
【非特許文献３９】サトクリフ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）、生物学専門家によるコールドスプリングハーバーシンポジウム（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．）４３：７７〜９０（１９７９年）
【非特許文献４０】ポッスル、Ｋ．（Ｐｏｓｔｌｅ，Ｋ．）およびグッド、Ｒ．Ｆ．（Ｇｏｏｄ，Ｒ．Ｆ．）、細胞（Ｃｅｌｌ）、４１：５７７〜５８５（１９８５年）
【非特許文献４１】タカギ（Ｔａｋａｇｉ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１３（６）：２０６３〜２０７２（１９８５年）
【非特許文献４２】ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）他、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８：５２８〜５３５、（１９９０年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらの技術にもかかわらず、代謝負荷の影響を最小限にし、生成物の必要性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｎｅｅｄ）を満たすために組み換え型タンパク質の産生量を制御し、かつ形質転換された宿主細胞の安定性を高めながら、複数の遺伝子またはオペロンをどのように容易かつ迅速にクローニングするかという解決されるべき問題が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本出願人等は、産生生物における遺伝子発現のレベルを変えることが可能な新規のグルコースイソメラーゼプロモーター配列を作成した。本出願人等は、遺伝子工学のための一連のプラスミドを構築するために、変異体ＧＩプロモーターを含有する発現カセットを、ｐＣＬ１９２０から得られた低コピー数プラスミドに組み込んだ。転写ターミネーターは、このコンストラクトの外部に位置する他のプロモーターからの転写から、関連するプロモーターを隔てる。
【００１２】
本出願人等はまた、複数のレアな（ｒａｒｅ）制限酵素のためのクローニングサイトを含有し、さらに、このコンストラクトにおけるクローニング、または別のプラスミドまたはベクター骨格へのこのコンストラクトの導入を容易にするユニークな（ｕｎｉｑｕｅ）ヌクレオチド配列を構築した。このユニークなクローニングサイトは、様々な強度の適切なプロモーターの制御下で発現される遺伝子またはオペロンの導入を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、以下を包含する。
１．配列番号：９〜２８からなる群から選択され、ストレプトマイセスリウィダンスグルコースイソメラーゼプロモーターの変異体をコードする単離されたまたは組み換え型の核酸分子；
２．配列番号：９〜２８のいずれかのヌクレオチド配列を含み、ストレプトマイセスリウィダンスグルコースイソメラーゼプロモーターの変異体をコードする単離されたまたは組み換え型の核酸分子；
３．配列番号：９〜２８のヌクレオチド配列を含み、ストレプトマイセスリウィダンスグルコースイソメラーゼプロモーターの変異体をコードする単離されたまたは組み換え型の核酸分子のライブラリ；
４．上で述べた種々のＧＩプロモーター変異体の核酸分子を含む発現カセット；および
５．上で述べた種々のストレプトマイエスリウィダンスグルコースイソメラーゼプロモーターの変異体をコードする核酸分子を含むキット。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも３つの転写ターミネーターと、いずれか２つの転写ターミネーター間に位置する少なくとも１つのクローニングサイトを含むＤＮＡコンストラクトである。このＤＮＡコンストラクトの好ましい実施形態は、転写ターミネーターｔｏｎＢ、ｔｈｒＡ、またはａｓｐＡを含み、クローニングサイトは、ＡｖｒＩＩ、ＮｈｅＩ、ＢｆａＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＢｓａＪＩ、およびＳｔｙＩからなる群から選択される。好ましいクローニングサイトは、ＮｈｅＩまたはＡｖｒＩＩである。こうしたコンストラクトのライブラリもまた、本発明に包含される。
【００１５】
本発明には、次のＤＮＡコンストラクトが含まれる。
配列番号：３０からなるｐＳＹＣＯ１０９ｍｃｓプラスミド、
配列番号：３１からなる短い（ｓｈｏｒｔ）１．５ＧＩプロモーター、
配列番号：３２からなる短い１．２０ＧＩプロモーター、
配列番号：７０からなるｐＡＨ１０５プラスミド、
配列番号：７１からなるｐＳＹＣＯ１０１プラスミド、
配列番号：７２からなるｐＳＹＣＯ１０３プラスミド、
配列番号：７３からなるｐＳＹＣＯ１０６プラスミド、
配列番号：７４からなるｐＳＹＣＯ１０９プラスミド、
配列番号：７８からなるｐＳＣＹＯ１０６ｍｃｓプラスミド、および
配列番号：７９からなるｐＲＪ５０プラスミド。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩ、ＮｈｅＩ、ＰａｃＩ、ＲｓｒＩＩ、ＮｓｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＭｌｕＩ、ＡｇｅＩ、ＳａｐＩ、およびＳｎａＢＩに特異的な制限認識部位配列を含有するマルチクローニングサイトを有するベクターである。このベクターのある実施形態は、配列番号：７７のヌクレオチド配列である。
【００１７】
この発明の遺伝物質には、上で述べた核酸分子およびこのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含有する形質転換された宿主細胞が含まれる。
【００１８】
（配列表および生物寄託の簡単な説明）
本出願人等は、（非特許文献６）に従って、また、（非特許文献７に従って、また、（非特許文献８）および（非特許文献９）に従って、８３配列を提供した。これらの配列の説明（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）は、（非特許文献１０）および（非特許文献１１）に記載されたＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準（これらを参照によって本明細書に組み込む）に従って定義される通りのヌクレオチド配列特性についての１文字のコード、およびアミノ酸についての３文字のコードを含む。
【００１９】
配列番号：１は、野生型ストレプトマイセスリウィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼ（ＧＩ）プロモーターのヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号：２〜８は、ＧＩプロモーターの飽和ミュータジェネシス（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。配列番号：３〜８においては、「Ｎ」は、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧのいずれかに相当する。
【００２１】
配列番号：９〜２８は、ＧＩプロモーター変異体のヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号：２９は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｙｑｈＤ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号：３０は、ｐＳＹＣＯ１０９ｍｃｓプラスミドのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号：３１は、短い１．５ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号：３２は、短い１．２０ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号：３３は、短い野生型ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号：３４〜３７は、短いＧＩプロモーターの組み込みを伴う、ｙｑｈＤの増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２８】
配列番号：３８〜３９は、ｙｑｈＤ破壊を構築するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２９】
配列番号：４０〜４３は、ｙｑｈＤの破壊を確認するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００３０】
配列番号：４４〜４６は、短い野生型ＧＩプロモーターへの染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）ｐｐｃプロモーターの置き換えのために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００３１】
配列番号：４７は、マルチクローニングサイトおよびターミネーターのヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号：４８は、ｐＨＫ２８−２６プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号：４９〜５０は、ｄｈａＢ３を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００３４】
配列番号：５１〜５２は、ｄｈａＢ１を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００３５】
配列番号：５３〜５４は、ｄｈａＴ欠失を作成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００３６】
配列番号：５５〜５６は、リンカーを作成するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００３７】
配列番号：５７は、制限部位によって隔てられる３つの転写ターミネーターをコードするヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号：５８〜５９は、配列番号：６０を作成するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００３９】
配列番号：６０は、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ部位に隣接する３つの転写ターミネーターをコードするヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号：６１〜６２は、配列番号：６０を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００４１】
配列番号：６３〜６６は、発現カセットを増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００４２】
配列番号：６７は、ｐＣＲ−ｐＣＬ１９２０を作成するために使用される二重鎖リンカーのヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号：６８〜６９は、ｐＴｒｃ９９Ａ由来のｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００４４】
配列番号：７０は、ｐＡＨ１０５プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号：７１は、ｐＳＹＣＯ１０１プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号：７２は、ｐＳＹＣＯ１０３プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号：７３は、ｐＳＹＣＯ１０６プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号：７４は、ｐＳＹＣＯ１０９プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号：７５〜７６は、配列番号：７７を形成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００５０】
配列番号：７７は、次の酵素：ＮｈｅＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＡｇｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＮｓｉＩ、ＭｌｕＩ、およびＳａｐＩのための制限認識部位を含有する複数のクローニング断片のヌクレオチド配列である。
【００５１】
配列番号：７８は、ｐＳＣＹＯ１０６ｍｃｓプラスミドのヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号：７９は、ｐＲＪ５０プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号：８０〜８１は、ｏｒｆオペロンを増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００５４】
配列番号：８２〜８３は、実施例４において形質転換体を確認するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００５５】
本出願人等は、（非特許文献１２）の条項に従って、以下の生物寄託を行った。
【００５６】
【表１】
2010268807.tif 000002
【００５７】
本明細書では、「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国（Ｕ．Ｓ．Ａ）２０１１０〜１１０９  バージニア州マナサス市大学通り（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）１０８０１にあるアメリカンタイプカルチャーコレクション国際寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を意味する。「ＡＴＣＣ番号」は、ＡＴＣＣに寄託中の培養株に対する受託番号である。
【００５８】
記載された寄託物は、示された国際寄託機関で、少なくとも３０年間保持されることとなり、これを開示している特許の付与後に一般に利用できることとなる。寄託の有効性は、関係官庁の決定によって付与された特許権を逸脱して対象となる発明を実施するためのライセンスを意味する訳ではない。
【００５９】
本出願人等は、少なくとも３つのユニークなクローニングサイトを含有し、各クローニングサイトが、転写ターミネーターおよび強度の異なるプロモーターによって互いに作動可能に隔てられている一連のコンストラクトを作成することによって、ここで述べた問題を解決した。異なる強度のプロモーターは、ストレプトマイセスリウィダンスグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）プロモーター（配列番号：１）の変異体である。発現カセット中の変異体ＧＩプロモーターを、産生土台としてのＳＹＣＯプラスミドと組み合わせることにより、非常に様々なバイオプロセス計画における生体触媒の開発に有用なシステムが提供される。
【００６０】
本発明は、遺伝子発現のレベルを制御するベクターへの、内在または外因性遺伝子またはオペロンの容易かつ安定な組み込みを可能にする。複数の遺伝子またはオペロンを発現するために単一のプラスミドを使用すると、従来の方法において遺伝子産物を生じるために必要とされる、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主中の複数のプラスミドを維持するのに必要な抗生物質マーカーの数が減少する。本発明の使用は、代謝負荷の影響を最小限にし、組み換え型タンパク質の産生量を最適化し、形質転換された宿主細胞の安定性を高めることができる。本発明は特に、産物形成のために、２つ以上の遺伝子またはオペロンの発現が必要とされる可能性がある場合のバイオプロセスにおける遺伝子工学に有用である。
【００６１】
本出願人等は、遺伝子発現のレベルの変化を可能にする新規のＧＩプロモーター配列を作成した。本出願人等は、遺伝子工学のための一連のプラスミドを構築するために、ｐＣＬ１９２０から得られた低コピー数プラスミドに、変異体ＧＩプロモーターを含有する発現カセットを組み込んだ。転写ターミネーターは、このコンストラクトの外部に位置する他のプロモーターからの転写から、関連するプロモーターを隔てる。
【００６２】
本出願人等はまた、少なくとも１０のレアな制限酵素のためのクローニングサイトを含有し、さらに、このコンストラクトにおけるクローニング、または別のプラスミドまたはベクター骨格へのこのコンストラクトの導入を容易にするユニークなヌクレオチド配列を構築した。このユニークなクローニングサイトは、様々な強度の適切なプロモーターの制御下で発現される遺伝子またはオペロンの導入を可能にする。さらに、任意のコンストラクトは、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ、ｐＳＣ１０１、または当分野の技術者によって知られておりかつ予想できるその他のものを含めた任意の数のプラスミド骨格への容易な組み込みのためのユニークなクローニングサイトに隣接することが可能である。
【００６３】
本出願人等は、特許請求の範囲に記載される材料を用いて形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ中でのグルコースからの１，３−プロパンジオール（３Ｇ）の生合成における、本発明の特有の有用性を実証した。発現カセットは、本明細書で述べる通りの低コピー数プラスミド内に構築され、１，３−プロパンジオールの生成のための遺伝子を、このベクターにクローニングした。本発明を用いて、他の発現システムにおける遺伝子発現を変えることが可能である。
【００６４】
（定義）
特許請求の範囲および明細書を説明するために、以下の定義および略語を用いる。
【００６５】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと省略される。
【００６６】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと省略される。
【００６７】
用語「宿主細胞」または「宿主生物」は、外来または異種遺伝子あるいは内在遺伝子の複数のコピーを受け入れ、それらの遺伝子を発現して活性な遺伝子産物を生じることが可能な微生物を意味する。
【００６８】
用語「ＤＮＡコンストラクト」または「コンストラクト」は、ＤＮＡの人為的に構築されたフラグメントを意味する。
【００６９】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の制御配列を含めて、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを意味する。「天然の（ｎａｔｉｖｅ）遺伝子」」は、独自の制御配列を有する、天然においてみられるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、本来共にみられない制御配列およびコード配列を含む、天然の遺伝子ではない任意の遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、別の起源から得られた制御配列およびコード配列、または同じ起源から得られるが、本来みられるのとは異なる方式で配列された制御配列およびコード配列を含む可能性がある。「内在遺伝子」は、生物のゲノム中の本来の位置の天然の遺伝子を意味する。「外来」、「外因性」、または「異種」遺伝子は、宿主生物中に通常はみられないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は、他の生物に挿入された天然の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。「遺伝子コンストラクト」は、１種または複数の特定のタンパク質の発現をコードする核酸フラグメントを意味する。遺伝子コンストラクトにおいては、遺伝子は本来、天然、キメラ、または外来であり得る。
【００７０】
用語「単離された核酸」は、天然の配列を本来伴う他の成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、および／または起源とする種由来の隣接するゲノム配列）から実質上分離された核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合されたポリマー）を意味する。この用語には、組み換え型またはクローン化されたＤＮＡ単離体および化学的に合成された類似体または異種システムによって生物学的に合成された類似体が含まれる。
【００７１】
用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードする（ｃｏｄｉｎｇ）」は、遺伝子が、転写および翻訳の機構を介して、アミノ酸配列を生じるプロセスを意味する。ある特定のアミノ酸配列をコードするプロセスには、コードされるアミノ酸を変化させない塩基変化、あるいは１つまたは複数のアミノ酸は変化してもよいが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の機能特性には影響を与えない塩基変化を含む可能性があるＤＮＡ配列が含まれる。したがって、本発明が、特定の例示的な配列以上のものを包含することは言うまでもない。配列に対する改変、例えば、得られるタンパク質分子の機能特性には実質上影響を与えないサイレントな変化を引き起こす、配列における欠失、挿入、または置換なども考えられる。例えば、遺伝暗号の縮重を反映する、あるいは、任意の部位での化学的に等価なアミノ酸の産生をもたらす遺伝子配列の変化が考えられる。したがって、アミノ酸アラニン、すなわち疎水性アミノ酸に対するコドンは、別の、より少ない疎水性残基（グリシンなど）、あるいはより多い疎水性残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換されてもよい。同様に、負の電荷をもつある残基から別の負の電荷をもつ残基への置換（アスパラギン酸からグルタミン酸へなど）、または正の電荷をもつある残基から別の正の電荷をもつ残基への置換（リジンからアルギニンへなど）をもたらす変化も、生物学的に等価な生成物を生じると考えることができる。タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化はまた、タンパク質の活性を変えるとは考えられない。場合によっては、変化の、タンパク質の生物学的活性に関する影響を研究するために、配列の変異体を作成することが、実際のところは望ましいかもしれない。提示された改変はそれぞれ、十分に当技術分野の範囲内であり、コードされる産物における生物学的活性の保持の決定も同様である。さらに、当分野の技術者は、この発明に包含される配列もまた、厳密な条件下（０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃）で、本明細書に例示される配列とハイブリダイズする能力によって定義されるということを理解する。
【００７２】
用語「発現」は、ある遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの、その遺伝子産物への転写および翻訳を意味する。
【００７３】
用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を意味する。
【００７４】
用語「転写ターミネーター」または「ターミネーター」は、タンパク質合成を終わらせる遺伝因子を意味する。
【００７５】
用語「オペロン」は、同調的に調節される遺伝子群を意味する。
【００７６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、遺伝子産物を意味するために同義的に用いられる。
【００７７】
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、細胞の中枢的な代謝の一部ではなく、通常環状の二重鎖ＤＮＡ分子の形である遺伝子を多くの場合保有する追加的な染色体要素を意味する。こうした要素は、いずれかの起源から得られた一本鎖または二重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ、またはヌクレオチド配列（直鎖状または環状）であり得る。こうした要素は、適切な３’非翻訳配列に加えて、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を、細胞に導入することが可能な独自の構築物に連結または再結合されているいくつかのヌクレオチド配列を含有する。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、この外来遺伝子の他に、ある特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを意味する。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、この外来遺伝子の他に、宿主中でのこの遺伝子の高められた発現を可能にする要素を有する特定のベクターを意味する。
【００７８】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」は、任意の長さのＤＮＡを、特定かつユニークな内部位置で切断する酵素の群を意味する。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ中に切れ目（ｃｕｔ）を作成することによって、その後のスプライシング、またはＤＮＡの断片の内部位置への挿入を可能にする。用語「制限部位」または「制限認識部位」は、「認識」され、任意の制限酵素によって切断されるＤＮＡ分子中の（塩基対の）ヌクレオチド配列を意味する。
【００７９】
制限酵素部位に適用される場合の用語「レアな」は、遺伝子中の任意の配列の出現頻度の低さを意味する。この明細書の目的のための、レアな制限酵素部位の好ましい群は、ＡｓｃＩ、ＮｈｅＩ、ＰａｃＩ、ＲｓｒＩＩ、ＮｓｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＭｌｕＩ、ＡｇｅＩ、ＳａｐＩ、およびＳｎａＢＩである。
【００８０】
用語「クローニングサイト」は、ＤＮＡを挿入することができる、ベクター上の位置を意味する。用語「マルチクローニングサイト」または「ｍｃｓ」は、ベクター上の定められた位置（制限部位）での挿入を可能にするいずれかの１つまたはいくつかの異なる制限酵素部位を含有する合成のＤＮＡ配列を意味する。用語「ユニークなクローニングサイト」は、任意のＤＮＡ配列を伴って一度だけ現れるクローニングサイトを意味する。
【００８１】
ベクターの要素の相対的位置を述べる際、当該の要素の任意の部位または位置は、他の２つの要素を隔てるＤＮＡの中間の距離に位置するならば、他の２つの要素「の間」である。環状ベクターの場合では、当該の要素の任意の部位または位置は、ベクター上の他の２つの部位を隔てる最短の長さのＤＮＡ内に位置するならば、他の２つの要素「の間」である。任意の部位または位置は、当該の要素の部位または位置の前または後に位置する別の要素に「隣接する」と呼ばれる。
【００８２】
用語「遺伝子改変」は、形質転換または変異によって遺伝材料を変化させるプロセスを意味する。用語「形質転換」および「形質移入」は、核酸の組み込み後の、細胞における新たな遺伝子の獲得を意味する。この獲得される遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれる、あるいは染色体外の複製配列として導入することができる。用語「形質転換体」は、形質転換の産物を意味する。
【００８３】
用語「グリセロールデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ酵素」は、グリセロール分子を生成物３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに異性化または転換することができるコエンザイムＢ12依存性酵素活性に関与する１つまたは複数のポリペプチドを意味する。本発明の目的では、デヒドラターゼ酵素には、それぞれグリセロールと１，２−プロパンジオールという好ましい基質をもつグリセロールデヒドラターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ０９７７１、Ｕ３０９０３）およびジオールデヒドラターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ４５０７１）が含まれる。肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ  ２５９５５のグリセロールデヒドラターゼは、遺伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ３０９０３）によってコードされる。これらのｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３遺伝子はそれぞれ、グリセロールデヒドラターゼ酵素のα、β、γサブユニットをコードする。グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼは、コエンザイムＢ12を利用する複合体（α2β2γ2サブユニット構成をとる）である。
【００８４】
グリセロールヒドラターゼおよびジオールヒドラターゼは、グリセロールおよびある種の他の基質によって、メカニズムに基づく自殺失活（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ）を受けやすい（非特許文献１３）。用語「デヒドラターゼ再活性化因子」は、デヒドラターゼ活性の再活性化に関与するタンパク質を意味する。用語「デヒドラターゼ再活性化活性」、「デヒドラターゼ活性の再活性化」、または「デヒドラターゼ活性の再生」は、基質の触媒作用が可能でないデヒドラターゼを、基質の触媒作用が可能なものに転換する事象、またはデヒドラターゼの失活を妨げる事象、またはｉｎ  ｖｉｖｏのデヒドラターゼ酵素の有効半減期を延長する事象を意味する。デヒドラターゼ再活性化因子として使用されるものとして、２種のタンパク質が同定されている（特許文献３）（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許公報（特許文献４）参照のこと）およびその中の参考文献；（非特許文献１３）；（非特許文献１４）；ならびに（非特許文献１５）を参照のこと）。
【００８５】
用語「オキシドレダクターゼ」または「１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ」は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの還元を触媒することが可能な酵素活性に関与する１つまたは複数のポリペプチドを意味する。１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼには、例えば、ｄｈａＴ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｕ０９７７１、Ｕ３０９０３）によってコードされるポリペプチドがある。あるいは、ｙｑｈＤ、すなわちクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）中の遺伝子ａｄｈＢ（ＮＡＤＨ依存性ブタノールデヒドラターゼ２と推定される）に対して４０％の同一性をもつＥ．ｃｏｌｉオープンリーディングフレームは、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼとして機能するポリペプチドをコードする（特許文献５）。
【００８６】
ｐＳＹＣＯプラスミド（ｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、ｐＳＹＣＯ１０９、ｐＳＹＣＯ１０６ｍｃｓ、およびｐＳＹＣＯ１０９ｍｃｓ）によって発現される酵素はすべて、グリセロールデヒドラターゼ、デヒドラターゼ再活性化因子、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３−ホスファターゼを発現するのに必要な遺伝子を含むと言うことができる。
【００８７】
用語「発酵性の炭素基質」および「発酵性の炭素源」は、本発明の宿主生物によって代謝されることが可能な炭素源、特に、単糖、少糖、多糖、グリセロール、ジヒドロキシアセトン、および一炭素基質、またはそれらの混合物からなる群から選択される炭素源を意味する。
【００８８】
（強度の異なるＧＩプロモーター変異体を用いた遺伝子発現システム）
有効な遺伝子発現システムに最低限必要なものは、クローン化された遺伝子の上流にあるプロモーター（ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する、ＤＮＡ上の部位）の存在である。しばしば、強力なプロモーター、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼに対して高い親和性を有し、その結果、隣接する下流領域が高度にまたは高頻度で転写されるものが使用される。
【００８９】
プロモーターにおいては、プロモーター強度（下流遺伝子が転写されるレベル）の主な配列的決定因子は、最も高度に保存される塩基対である。この保存される配列から外れたプロモーターは、転写開始の頻度を下げる（非特許文献１６）。
【００９０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターは、転写開始部位の約１０および３５塩基対上流に位置する保存されるＤＮＡ配列の２領域を含有することが示されている。プロモーターの中で、１２塩基対が最も高度に保存されることが判明した。これらの塩基は、およそ３５塩基対上流部を含むＴＴＧＡＣＡ、いわゆる−３５領域、およびおよそ１０塩基対上流部を含むＴＡＴＡＡＴ、いわゆる−１０領域である。−１０領域と−３５領域との間の最適間隔は、１７塩基対である。この間隔が、１７塩基対により近い場合、プロモーターは、より強力であるが、間隔が１５および２０塩基対であるプロモーターは、不完全な機能を保持する。
【００９１】
本出願人等は、ストレプトマイセスリウィダンスグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）プロモーターの変異体を組み込んだ一連のコンストラクトを作成した。このコンストラクトは、必要とされる様々なレベルの遺伝子発現を調整する能力を与える一連の異なる強度を有するプロモーター変異体のライブラリまたはキットを構成する。ストレプトマイセスグルコースイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．９）は、グルコース−６−リン酸の、フルクトース−６−リン酸のへの転換を触媒する。ホスホグルコースイソメラーゼ（ｐｇｉ）をコードする遺伝子の転写は、特徴的な−１０シグネチャ配列（ＡＡＴＡＡＴ）および特徴的な−３５シグネチャ配列（ＴＴＧＡＣＡ）を含有するプロモーターによって制御される。プロモーターの−３５領域において飽和ミュータジェネシスを実施したとしても、−３５領域から約１２２ｂｐ上流のＳｐｅＩ制限部位への変化は、発現された遺伝子活性に影響を与えた。さらに、−１０と、このプロモーターの末端との間の２５ｂｐ欠失は、ＳｐｅＩ制限部位への変化を伴っても、酵素活性の８６％の保持を可能にした。こうした詳細な結果は、これまで報告されていなかった。
【００９２】
ＲＮＡ合成の転写終結は、ＤＮＡ上の特定の塩基配列で起こり、転写の終結を制御する。ＤＮＡ上の通常の終結配列は、中央の非繰り返し部分（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｏｎ−ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔ）と共に逆位繰り返し配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）を含有するものである。こうしたＤＮＡ配列が転写されると、ＲＮＡは、鎖内の塩基対合によるステム−ループ構造を成すことができる。それに続いて、ＲＮＡにおけるこうしたステム−ループ構造が、ウリジンを通る（ｒｕｎ  ｏｆ）とき、これは、有効な転写ターミネーターとなる。他の終結部位は、ＧＣ−リッチ配列の後にＡＴ−リッチ配列が続く領域である。こうした種類の構造は、いずれの追加因子を加えずとも転写の終結を招き、これらは時として内因性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）ターミネーターまたはｒｈｏ非依存性ターミネーターと呼ばれる。
【００９３】
他のタイプのターミネーター配列は、機能するために、ＲＮＡポリメラーゼの他に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲｈｏのようなタンパク質因子を必要とすることが発見されている。Ｒｈｏは、ＲＮＡポリメラーゼにもＤＮＡにも結合しないが、ＲＮＡに固く結合し、ＲＮＡポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体に向かって鎖を下に移動する。ＲＮＡポリメラーゼが、Ｒｈｏ依存性終結部位で停止すると、Ｒｈｏは、ＲＮＡおよびポリメラーゼを、ＤＮＡから離れさせることができ、転写を終結させる。転写終結に関与する他のタンパク質は、Ｒｈｏのように、ＲＮＡ結合タンパク質である。すべての場合において、終結に関与する配列は、ＲＮＡのレベルで作用する。しかし、ＲＮＡは、ＤＮＡから転写されるので、転写終結は、根本的には、ＤＮＡ上の特定のヌクレオチド配列によって決定される（非特許文献１７）。
【００９４】
本出願人等は、３つの異なるターミネーター配列が、連係して配置された終結領域を構築した。これらの３つのターミネーターは、遺伝子またはオペロンのクローニングに有用なユニークな制限酵素部位に隣接する。ｔｏｎＢターミネーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｏｎＢ遺伝子と、反対の遺伝子との間に見られる両方向性のｒｈｏ依存性転写ターミネーターである（非特許文献１８）。構造が、他のｒｈｏ依存性ターミネーターと同様のｔｈｒアテニュエーターは、Ｅ．ｃｏｌｉスレオニンオペロンの転写の終結を容易にする（非特許文献１９）。ｒｈｏ依存性ターミネーターの構造特性をもつａｓｐＡターミネーターは、Ｅ．ｃｏｌｉアスパルターゼオペロンの転写の終結を容易にする（非特許文献２０）。
【００９５】
自律的な自己複製遺伝因子として、プラスミドは、自身を、クローン化されたＤＮＡを運ぶための潜在的なベクターにするための基本的属性をもつ。天然に存在するプラスミドは、高性能のクローニングベクターに必要とされるいくつかの重要な特徴をしばしば欠いている。こうした特徴には、（１）小さなサイズ（外因性ＤＮＡの宿主への効率的な導入のために不可欠）、（２）インサートＤＮＡをクローン化することができるユニークな制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および（３）クローニングベクター−インサートＤＮＡコンストラクトを保有する受容細胞を識別するための１つまたは複数の選択可能な遺伝マーカーが含まれる。したがって、プラスミドクローニングベクターは、遺伝子改変される必要がある（非特許文献１）。
【００９６】
ｐＣＬ１９２０／２１ベクターは、ｌａｃプロモーター／オペレーターを保有する５８０ｂｐ  ＢｓｔＵＩフラグメント、マルチクローニングサイト、およびｐＧＢ２、すなわちＥ．ｃｏｌｉ中でスペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性を与える、ｐＳＣ１０１から得られたプラスミドにおけるポリリンカー領域の代わりにクローン化されたｐＵＣ１９のｌａｃＺフラグメントを含有する一対の低コピー数プラスミドである。ｐＣＬ１９２０／２１ベクター（５コピー／細胞）は、ｐＣＬ１９２０／２１ベクターとｐＵＣベクター（２００コピー／細胞）との間のプラスミドコピー数において、４０倍の違いがある。したがって、ｐＣＬ１９２０／２１ベクターは、菌株中で形質転換を行った場合に、プロモーター−オペレーターの下流に挿入された遺伝子の調節された低レベル発現を可能にする。これらはまた、高コピー数で有害となり得る遺伝子のクローニングにも有用であるだろう。ｐＣＬ１９２０／２１ベクターは、ＣｏｌＥ１から得られたプラスミドと適合性があるので、これらを、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣから得られたプラスミドと共に、安定な共形質転換体（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を形成するために使用できる（非特許文献２１）。
【００９７】
本発明のプラスミドは、物質の制御された生物生産のための様々な宿主中で使用することができる。
【００９８】
（転写レベルを変化させるための、任意の内在遺伝子またはオペロンの、染色体に位置する天然のプロモーターの置き換え）
遺伝子またはオペロンの転写レベルを変化させるために、任意の内在遺伝子またはオペロンに関連した、染色体に位置する天然のプロモーターを置き換える方法において、特許請求の範囲に記載されるプロモーター変異体（配列番号：３１および３２を含むコンストラクト）を使用することができる。その結果は、タンパク質生成レベルの変化である。置き換えられるプロモーターは、（非特許文献２２）または同等の方法が実施可能であるどんな微生物におけるどんな遺伝子であってもよい。
【００９９】
この方法では、標的遺伝子の５’コード領域に作動可能に連結された分岐的に配置された（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｌｙ−ａｒｒａｎｇｅｄ）非天然のプロモーターに作動可能に連結された選択可能なマーカーを含むキメラＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成される。この合成は、以下を用いて行われる。（１）一対の化学的に合成されたプライマー、（ａ）以下を含む第１のプライマー、（ｉ）置き換えられる天然の標的プロモーターの遠位のＤＮＡ領域、（ｉｉ）非天然のプロモーター、および（ｉｉｉ）選択可能なマーカーの３’または５’末端由来のＤＮＡ領域；および（ｂ）以下を含む第２のプライマー、（ｉ）標的とされる挿入部位の近位のＤＮＡ領域、および（ｉｉ）第１のプライマーに使用される選択可能なマーカーの逆の末端由来のＤＮＡ領域；ならびに（２）選択可能なマーカーをコードするＤＮＡテンプレート。この産物を、（非特許文献２２）（上記）の方法を用いて、任意の宿主細胞の染色体の標的部位で、上で合成されたＤＮＡ生成物に組み込む。このプロトコルの結果は、１つまたは複数の天然の標的プロモーターが、非天然のプロモーターを保有する、ＰＣＲで合成されたキメラ分子に置き換えられることである。
【０１００】
この方法の拡張形態を用いて、生体触媒の性能に対する遺伝子発現レベルの変化の影響を評価することができる。
【０１０１】
（Ｅ．ｃｏｌｉ中でのグルコースからの１，３−プロパンジオール（３Ｇ）の生合成）
グルコースから１，３−プロパンジオール（３Ｇ）を生合成するために、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、本発明のプラスミドを使用することができる。ここでの例としては、特許請求の範囲に記載される発明を具体化する産生生物の構築、および発酵性の炭素基質を１，３-プロパンジオールに転換するために必要な遺伝機構が挙げられる。
【０１０２】
１，３−プロパンジオール生成に関与する遺伝子には、デヒドラターゼ遺伝子（通常グリセロールまたはジオールデヒドラターゼ）、およびオキシドレダクターゼ、ならびに構築において、あるいはデヒドラターゼ酵素の安定性の維持において補助することが期待される他のタンパク質が含まれる。これらの遺伝子は、宿主細胞に導入された導入遺伝子であってもよいしまたは内在遺伝子であってもよい。これらの遺伝子のうちの少なくとも１つは、導入遺伝子であり、産生細胞に導入されることとなる。炭素基質を１，３−プロパンジオールに転換するための酵素経路をコードする必要な遺伝子を含有する組み換え型生物は、当技術分野でよく知られた技術を用いて構築することができる。その後、１，３−プロパンジオールを生成するために、この形質転換された産生細胞を、適切な条件下で増殖させる。
【０１０３】
Ｅ．ｃｏｌｉ中での１，３−プロパンジオールの生成は、これまでに記載されている（米国特許公報（特許文献６）；米国特許公報（特許文献７）；米国特許公報（特許文献８）；米国特許公報（特許文献９）；米国特許公報（特許文献４）；米国特許公報（特許文献１０）；米国特許公報（特許文献１１））。組み換え型Ｅ．ｃｏｌｉによる、グルコースからの１，３−プロパンジオールの生成には、多くの異なる遺伝子の発現が必要である。グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）および１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの天然の宿主から単離し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αまたはＦＭ５；肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株ＡＴＣＣ  ２５９５５；Ｋ．オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）株ＡＴＣＣ  ８７２４またはＭ５ａ１、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＹＰＨ４９９、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＴＳ１１５、およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株ＦＳ１などの宿主株を形質転換するために使用した。
【０１０４】
肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、シトロバクターフレウンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、およびクロストリジウムパステウリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）では、グリセロールデヒドラターゼの３つの構造的サブユニットをコードする遺伝子（ｄｈａＢ１〜３またはｄｈａＢ、Ｃ、およびＥ）は、固有の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（ｄｈａＴ）に隣接して位置する。これらの微生物の間では、遺伝機構は、多少異なるが、これらの遺伝子は、ｏｒｆＸおよびｏｒｆＺ（グリセロールデヒドラターゼのためのデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子）と、ｏｒｆＹおよびｏｒｆＷ（機能が知られていない遺伝子）も含むグループにまとめられる。これらの微生物の固有の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴのもの）は、ＩＩＩ型アルコールデヒドロゲナーゼのファミリーに属することが知られており、各々は、保存される鉄結合モチーフを示し、１，３−プロパンジオールと３−ＨＰＡの、ＮＡＤ+／ＮＡＤＨに関連する相互転換が優先される。しかし、１，３−プロパンジオールと３−ＨＰＡの、ＮＡＤ+／ＮＡＤＨに関連する相互転換はまた、効率の劣る動力学パラメータを有するとしても、デヒドラターゼ酵素に特に関連しないアルコールデヒドロゲナーゼ（例えばウマ肝臓およびパン酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１））によって触媒される。グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）とジオール［１，２−プロパンジオール］デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）は、関連性があるが、別の遺伝子によってコードされる別の酵素である。クレブシエラオキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）およびサルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のジオールデヒドラターゼ遺伝子も、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子と同様であり、ｏｒｆＸおよびｏｒｆＺと類似の遺伝子を含むグループにまとめられる（（非特許文献１３）；（非特許文献１４）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０２６２７０）。
【０１０５】
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＤＡＲ１、ＧＰＤ１）が、Ｓ．ディアスタティクス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）からクローン化および配列決定された（非特許文献２３）。ＤＡＲ１遺伝子を、シャトルベクターにクローニングし、これを、そこでの発現により活性な酵素が生成されるＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。（非特許文献２３）（上記）は、ＤＡＲ１は、細胞の浸透圧環境によって調節されることを認めているが、この遺伝子が、組み換え型の微生物中で１，３−プロパンジオール生成を高めるために、どのように用いられるかということは示していない。
【０１０６】
他のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素も単離されている。例えば、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からクローン化および配列決定されている（非特許文献２４）。（非特許文献２５）は、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＰＤ１のクローニングを教示する。（非特許文献２３）（上記）と同様に、（非特許文献２５）と（非特許文献２４）のどちらも、この遺伝子の調節の浸透圧感受性を認めているが、この遺伝子が、組み換え型の微生物中で１，３−プロパンジオールの生成にどのように用いられるかということは示していない。
【０１０７】
Ｇ３ＰＤＨと同様に、グリセロール−３−ホスファターゼも、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離され、このタンパク質は、ＧＰＰ１およびＧＰＰ２遺伝子によってコードされると確認された（非特許文献２６）。Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子と同様に、ＧＰＰ２も、浸透圧感受性であると思われる。
【実施例】
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態を示す以下の実施例で、本発明をさらに明らかにする。これらの実施例および上記の論考から、当分野の技術者は、この発明の本質的特性を把握することが可能であり、また、その趣旨および範囲から逸脱せずに、本発明の様々な変更および修飾を行って、これを、様々な使用および条件に適合させることが可能である。
【０１０９】
（一般的な方法）
実施例中で使用される標準の組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野でよく知られており、（非特許文献２７）によって、また、（非特許文献２８）によって、また、（非特許文献２９）によって記載されている。
【０１１０】
細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法は、当技術分野でよく知られている。以下の実施例における使用に適した技術は、（非特許文献３０）中で、または、（非特許文献３１）中で述べられた通りである。菌細胞の増殖および維持のために使用される試薬、制限酵素、および材料はすべて、別段の指定がない限り、アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ディフコ研究所（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、ギブコ／ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））、またはシグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手した。
【０１１１】
略語の意味は、以下の通りである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「Ｍ」はモル（ｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）を意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味する。
【０１１２】
（実施例１）
（グルコースイソメラーゼプロモーター変異体の構築）
ストレプトマイセスリウィダンスグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）プロモーター（配列番号：１）は、特徴的な−１０シグネチャ配列（ＡＡＴＡＡＴ）と、特徴的な−３５シグネチャ配列（−３５Ｔ、−３４Ｔ、−３３Ｇ、−３２Ａ、−３１Ｃ、−３０Ａ）を含有する。混合された塩基のオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＭＰ３８（後に実施例６で述べる通り）中のＧＩプロモーターの−３５領域の飽和ミュータジェネシスを、標準のＰＣＲによって実施した。６つの下流プライマー（配列番号：３〜８）（−３５領域における単一箇所での、Ｎと名付けられた４種すべての可能な塩基の等量混合物をそれぞれが含有する）のうちの１つと、上流プライマー（配列番号：２）を、６つのそれぞれのＰＣＲ反応において組み合わせた。この上流プライマーはまた、ＥｃｏＲＩ部位のすぐ後のＳｐｅＩ制限部位（ＡＣＴＡＧＴ）をＡｖｒＩＩ制限部位（ＣＣＴＡＧＧ）に変える２つの単一の塩基対変化を組み込んでいる。６種のＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化させ、それぞれＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＭＰ３８に連結した。連結生成物をＥ．ｃｏｌｉに組み込んで形質転換させ、組み換えプラスミドを、ＳｐｅＩからＡｖｒＩＩへの転換による制限分析を介して同定し、ヌクレオチド配列決定にかけた。組み換えプラスミドのみに、起こりうる−３５領域の変化があることが予想された。２４種の可能な組み換え体の結果（６箇所で４塩基）のうち、１８種が得られ、そのうちの１３種は、−３５領域に変化を示した（表１）。
【０１１３】
【表２】
2010268807.tif 000003
【０１１４】
−３５領域における可能な１８の変化のうち、５つは単離されなかったが、これらもまた、クローン化されたあるいは染色体にコードされた天然および非天然の遺伝子またはオペロンの発現レベルを変えるのに有用である。これらの５種の追加のＧＩプロモーター変異体を、表２に記述する。
【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
（実施例２）
（グリセロールデヒドラターゼ活性の測定によるグルコースイソメラーゼプロモーター変異体の分析）
ＧＩプロモーター変異体の影響を測定するためのレポーターとして、グリセロールデヒドラターゼ（ＧＤＨ；ｄｈａＢ１〜３によってコードされる）活性を使用した（表３）。−３５領域の変化がない場合であっても、ＳｐｅＩをＡｖｒＩＩに転換する２つの塩基対の変化が原因で、ＧＤＨ活性は、有意に落ちることが認められた（例えば，Ｐ１．６）。Ｐ３．４は、−３５の変異を受けていないが、−１０領域のすぐ後の２５塩基対の欠失があり、ほぼ野生型（８６％）プロモーターの長さであることも測定された。
【０１１７】
基質としてグリセロールまたは１，２−プロパンジオールを使用して、無細胞抽出液におけるデヒドラターゼ活性を求めた。無細胞抽出液は、フレンチプレスを用いた細胞破壊、それに続く細胞残渣の遠心分離によって調製された。この分析法は、アルデヒドのメチルベンゾ−２−チアゾロンヒドラゾンを用いた反応に基づくものであり、（非特許文献３２）によって記載されている。
【０１１８】
【表４】
2010268807.tif 000005
【０１１９】
（実施例３）
（ルクス（ＬＵＸ）測定を用いたＧＩプロモーター変異体の分析）
ＧＩプロモーター変異体から誘導された発現のレベルを測定するために、第２のタイプのレポーターを使用した。細菌の生物発光は、５つの構造遺伝子（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥ）の産物が協力して光を生じる現象である。ｌｕｘＤ産物は、前駆体からＣ１４脂肪酸を産生する。このＣ１４脂肪酸は、ＡＴＰ依存性の反応で活性化され、細菌の生物発光を細胞のエネルギー状態につなげるｌｕｘＥ産物の作用を介してアシル−酵素複合体となる。このアシル−酵素（ｌｕｘＥ産物）は、伝達物質（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｇｅｎｔ）として働き、アシル基をｌｕｘＣ産物に供与する。その後、このアシル−ＬｕｘＣ二成分複合体は、ＮＡＤＰＨが、アシル複合体をＣ１４アルデヒドに還元する電子対およびプロトン供与体として働く反応中に還元される。この反応は、細胞の還元力を細菌の発光につなげる。この光生成反応は、ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの産物）によって触媒され、光を生じる。発光のエネルギーは、アルデヒドによって、脂肪酸転換およびＦＭＮＨ2酸化に供給され、光生成と細胞のエネルギー状態との間に別のつながりをもたらす。
【０１２０】
プフォトラブダスルミネスケンス（Ｐｈｏｔｏｒａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｎｓｃｅｎｓ）ｌｕｘＡＢ遺伝子は、ＧＩプロモーター変異体強度のレポーターとして使用された（非特許文献３３）。Ｐ．ルミネスケンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｎｓｃｅｎｓ）ｌｕｘＡＢ遺伝子を保有し、３’および５’末端のＳｐｅＩ部位とｌｕｘＡの開始コドンで改変されたＮｃｏＩ部位を含有するＰＣＲフラグメントを、ｐＭＣＳ５（モビテック（ＭｏｂｉＴｅｃ）、ドイツ国ゲッティンゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））のＳｐｅＩ部位にサブクローニングし、ｐＪＴ１３を得た。次いで、ＳｗａＩ／ＮｃｏＩ末端を有する遺伝子ソーイング（ＳＯＥｉｎｇ）ＰＣＲに基づくカナマイシンカセットを、ＳｗａＩ／ＮｃｏＩで消化したｐＪＴ１３にサブクローニングし、ｐＪＴ１４．ＨＩＧＨＣＯＰＹ、すなわち高コピーｌｕｘＡＢプロモータープローブを作成した。次いで、ｐＪＴ１４．ＨＩＧＨＣＯＰＹを、ＳｐｅＩを用いて消化し、ｌｕｘＡＢ：：カナマイシンカセットを生じ、これをｐＲＪ５０（配列番号：７９）のユニークなＮｈｅＩ部位（ＳｐｅＩと適合性がある）にサブクローニングし、ｐＪＴ１４．ＬＯＷＣＯＰＹ．１、すなわち低コピーｌｕｘＡＢプロモータープローブを作成した。ＧＩプロモーター１．６、１．５、１．２０、および天然のものを、ｐＪＴ１４．ＨＩＧＨＣＯＰＹおよびｐＪＴ１４．ＬＯＷＣＯＰＹとしてのＮｏｔＩ／ＮｃｏＩフラグメントにクローニングし、高コピーコンストラクト、それぞれｐＪＴ１８、ｐＪＴ１９、ｐＪＴ２０、およびｐＪＴ２５、ならびに低コピーコンストラクト、それぞれｐＪＴ２１．１、ｐＪＴ２２．１、ｐＪＴ２３．１、およびｐＪＴ２６．１を作成した。次いで、これらのプラスミドを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物発光測定のための選択したＥ．ｃｏｌｉ株に組み込んで形質転換させた。
【０１２１】
Ｅ．ｃｏｌｉレポーター株のブロス培養液、アルデヒド基質としてのｎ−デカナール、および光度計を用いる光度分析（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）によって、（非特許文献３４）によって記載された通りに、プロモーター強度を測定した。Ｅ．ｃｏｌｉクローンを、新鮮（ｆｒｅｓｈ）寒天平板から、適切な抗生物質を含む標準のルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）液体増殖培地を含有する試験管に植え付け、３７℃で約１６時間、（攪拌しながら）好気的に増殖させた。次いで、細胞を、新鮮な培地２５ｍＬを含有する１００ｍＬフラスコ中で継代培養し、同じ条件下で約８〜１０時間増殖させた。次いで、各培養液からアリコート（２００μＬ）を採取し、それぞれ６００ｎｍでの光学濃度測定（スペクトラマックス１９０プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０  Ｐｌａｔｅｒ  Ｒｅａｄｅｒ）、モレキュラーデバイス株式会社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州サンバレー（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））および光度計測定（ルミノスキャンアセント  タイプ３９２（Ｌｕｍｉｎｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＴＡｙｐｅ  ３９２）、ラボシステムズ（ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）、フィンランド国ヘルシンキ（Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ））のための、９６ウェルの透明プレートおよび白色プレートに乗せた。光度分析の読み取りのために、各ウェルに外因性アルデヒド（ｎ−デカナール）２μＬを加え測定を行った。これらの測定から得られた結果を、表４に列挙する。これらの光度分析測定は、グリセロールデヒドラターゼ分析によって示されるものと同様の、プロモーター強度のレベルを示す。
【０１２２】
【表５】
2010268807.tif 000006
【０１２３】
（実施例４）
（異なるレベルの遺伝子発現を実現するための短縮されたＧＩプロモーター配列の使用）
株ＲＪ８ｎ（ｙｑｈＤ−）を作成するために、染色体上でｙｑｈＤ遺伝子が破壊された株ＲＪ８ｎ中のｐＳＹＣＯ１０９ｍｃｓプラスミド（実施例８で述べる通り、配列番号：３０）由来のＥ．ｃｏｌｉ  ｙｑｈＤ（配列番号：２９）の発現のレベルを変えるために、実施例１〜３で説明および使用されたＧＩプロモーター配列の一部を用いた。
【０１２４】
ｙｑｈＤのための３つの発現カセットを構築した。これらのカセットは、（ｉ）短い１．５ＧＩ（配列番号：３１）、短い１．２０ＧＩ（配列番号：３２）、または短い野生型ＧＩ（配列番号：３３）と呼ばれる短縮されたＧＩプロモーターのうちの１つ；（ｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＬＰ２３（特許文献１２）由来のｙｑｈＤ；および（ｉｉｉ）スレオニンターミネーター（非特許文献３５）を含有する。短縮されたＧＩプロモーターのうちの１つを含有し、ＲｓｒＩＩ制限部位も組み込む短い１．５ＧＩ（配列番号：３４）、短い１．２０ＧＩ（配列番号：３５）、または短い野生型ＧＩ（配列番号：３６）のためのフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）合成プライマーと、スレオニンターミネーターを含有し、ＳａｃＩ部位を含むｙｑｈＤ（配列番号：３７）のためのリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーとを使用するＰＣＲ増幅によって、ｙｑｈＤ遺伝子を、ゲノムＫＬＰ２３  ＤＮＡから単離した。プラスミドｐＳＹＣＯ１０９ｍｃｓをＲｓｒＩＩ／ＳａｃＩで消化し、ＲｓｒＩＩ／ＳａｃＩで消化したＰＣＲ産物をプラスミドに連結した。この連結混合物を、電気穿孔法によってＲＪ８ｎ（ｙｑｈＤ−）株に組み込んで形質転換させ、各株の酵素活性レベルを比較した（表５）。
【０１２５】
ｙｑｈＤによって表される酵素活性は、還元当量（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）源としてのＮＡＤＰＨと同様の割合で、アルデヒドである３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）およびブタナールを還元することとなる。３−ＨＰＡは、市販品として入手できないので、一般に、ブタナールが使用される。この分析混合物は、総体積１ｍＬ中に、２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ブタナール、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、および分析対象となる無細胞抽出液からの約０．０１ｍｇのタンパク質を含有していた。タンパク質サンプルを加えた後の、ＮＡＤＰＨの初速度の酸化の後、３４０ｎｍ（Δε＝６．２２ｍＭ-1）での吸収の変化を測定した。活性の単位は、１０ｍＭ  ブタナールの存在下で、３５℃で１分かけて１マイクロモルのＮＡＤＰＨを酸化するのに必要な量と定義される。種々の株の活性を、以下の表５に示すと、より長いＧＩプロモーター変異体によって与えられた発現のレベルと一貫性があった。
【０１２６】
【表６】
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【０１２７】
ＲＪ８ｎ（ｙｑｈＤ−）を作成するために、レッド仲介型の（Ｒｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）相同組み換えについて（非特許文献３６）によって記載された通りの手順を用いて、ｙｑｈＤ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５中で破壊した。フォワードＰＣＲプライマーＨ１：：６５７４（配列番号：３８）（ｙｑｈＤに相同な４２ｂｐの配列およびｐＫＤ１３に対するプライマー結合部位Ｐ１を含有する）およびリバースＰＣＲプライマーＨ２：：６７０６（配列番号：３９）（相同な４７ｂｐのｙｑｈＤ配列およびｐＫＤ１３に対するプライマー結合部位Ｐ４を含有する）を調製した。テンプレートとしてのｐＫＤ１３を用いるＰＣＲ増幅によって、各末端にｙｑｈＤ配列、それに続いてカナマイシン耐性（ｋａｎＲ）マーカーと隣接するＦＲＴ（ＦＬＰ認識標的）部位を有するＰＣＲ産物が生じた。このＰＣＲ産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５細胞に組み込んで電気形質転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ）させ、カナマイシン耐性形質転換体を選択した。ｙｑｈＤ遺伝子に隣接するプライマーｙｑｈＤＵＰ（配列番号：８２）およびｙｑｈＤＤＮ（配列番号：８３）を用いるＰＣＲによって、形質転換体における適切な挿入が確認された。ラムダレッドシステム（Ｌａｍｂｄａ  Ｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を含有する温度感受性プラスミドを、４２℃でのこれらの株の増殖によって除去した。
【０１２８】
ｙｑｈＤ：：ｋａｎ破壊を、Ｐ１形質導入によって、ＲＪ８ｎに移し、ｋａｎＲ遺伝子（Ｖｅｃ６１；配列番号：４２およびＶｅｃ６０；配列番号：４３）の内部のプライマーと対になるｙｑｈＤＵＰ２（配列番号：４０）およびｙｑｈＤＤＮ２（配列番号：４１）プライマーを用いるＰＣＲによって確認した。カナマイシンマーカーを除去するために、組み込み体を、温度感受性レプリコン、すなわちＦＬＰリコンビナーゼのための遺伝子を含有するｐＣＰ２０を用いて形質転換した。ＦＬＰリコンビナーゼは、隣接するＦＲＴ（ＦＬＰ認識標的）部位で、カナマイシンマーカーを切除する。その後、ｐＣＰ２０を除去するために、カナマイシン感受性細胞を、４２℃で増殖させる。生じた株は、ＲＪ８ｎ（ｙｑｈＤ−）であった。
【０１２９】
（実施例５）
（ＧＩプロモーターへの、Ｅ．ｃｏｌｉホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ染色体プロモーターの置き換え）
実施例５では、短い野生型ＧＩプロモーター（配列番号：３３）による、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ゲノムにおける本来のｐｐｃ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼをコードする）プロモーターの置き換えを述べる。
【０１３０】
（ｐｐｃプロモーター置き換えのためのオリゴヌクレオチドの設計）
本来のｐｐｃプロモーターの上流領域と相同な８０ｂｐ配列、パン酵母ＦＲＴ部位に隣接する、クロラムフェニコール耐性をコードする遺伝子（ｃａｔ）、短い野生型ＧＩプロモーター配列（配列番号：３３）、および本来のｐｐｃプロモーターの＋１転写開始部位の下流領域と相同な４０ｂｐ配列を含有するカセットを、ＰＣＲによって増幅するために、２つのオリゴヌクレオチド（ｐｐｃＦ、配列番号：４４およびｐｐｃＲ、配列番号：４５）を設計した。
【０１３１】
ｐｐｃＲプライマー（配列番号：４５）は、１００ヌクレオチド長であり、以下を含む。Ｐ１（本来のｐｐｃプロモーター）転写開始の＋１から、ｐｐｃの４１ｂｐ上流のＡＴＧまでの完全な配列、−３５の４ｂｐ上流から−１０の９ｂｐ下流までの短い野生型ＧＩプロモーター配列（配列番号：３３）、およびｐＫＤ３（（非特許文献３６）、上記）、すなわち２つのＦＲＴ部位に隣接するｃａｔ遺伝子を含有するＲ６Ｋプラスミドのプライミング部位（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｓｉｔｅ）。ｐｐｃＦプライマー（配列番号：４４）は、１００ヌクレオチド長であり、本来のｐｐｃプロモーターの上流の８０ｂｐの配列およびｐＫＤ３のプライミング部位を含む。
【０１３２】
プライマーｐｐｃＦおよびｐｐｃＲ（配列番号：４４および４５）は、テンプレートとしてプラスミドｐＫＤ３を使用して、プロモーター置き換えカセットを増幅するために使用された。この１．１５ｋｂのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動、続いてキアクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（キアゲン株式会社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））によって精製した。
【０１３３】
（直鎖ＤＮＡを用いた相同組み換えによる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ゲノムへの本来のｐｐｃプロモーターの置き換え）
ｐＫＤ４６（（非特許文献２２）、上記）と、γ、βを発現しているレッド（Ｒｅｄ）−リコンビナーゼプラスミドと、アラビノースプロモーターの制御下にあるｅｘｏとを含有するコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５細胞を、０．５μｇの上記の１．１５ｋｂ直鎖ＤＮＡを用いて電気形質転換させ、得られた形質転換体を、クロラムフェニコール耐性についてスクリーニングした（１５μｇ／ｍＬ）。この組み換え株を、プライマーｐｐｃＦおよびｓｅｑｐｐｃＲ（配列番号：４６）を用いるＰＣＲによって確認した。カセットの非特異的組み込みは、ＰＣＲ産物をもたらさないのに対し、適正な組み換え体は、１．２５−ｋｂ  ＰＣＲ産物をもたらす。短い野生型ＧＩプロモーターの配列は、ｓｅｑｐｐｃＲプライマー（配列番号：４６）を用いた１．２５−ｋｂ  ＰＣＲ産物の配列決定によって確認された。
【０１３４】
（酵素活性の測定）
ＭＧ１６５５およびＭＧ１６５５（短い野生型ＧＩ−ｐｐｃ）におけるＰＥＰカルボキシラーゼ活性を、以下の分析を用いて、超遠心を行った無細胞抽出液について測定し、表６に示した。この短い野生型ＧＩプロモーターの制御下にあるＰＰＣの活性は、本来のプロモーターの制御下にあるよりも３倍以上高かった。
【０１３５】
０．１１Ｍ  トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ８．５）、ＮＡＤＨ（０．２２ｍＭ）、硫酸マグネシウム（１１．１ｍＭ）、炭酸水素ナトリウム（１１．１ｍＭ）、アセチル−ＣｏＡ（０．２５ｍＭ）、リンゴ酸ＤＨ（ＭａｌａｔｅＤＨ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、５０μＬの６Ｕ細胞抽出液、および０．０３  ホスホエノールピルビン酸（１．１１ｍＭ）を含有する混合物において、３４０ｎｍでの減少（ＮＡＤＨの消費が原因）を測定した。活性を求めるために、次の式を用いた。
【０１３６】
【数１】
2010268807.tif 000008
【０１３７】
【表７】
2010268807.tif 000009
【０１３８】
（実施例６）
（肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｄｈａレギュロン由来の遺伝子を用いた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の形質転換に使用するための発現プラスミドの構築）
（発現ベクターｐＴａｃＩＱの構築）
ｌａｃＩQ遺伝子（非特許文献３７）と、ｔａｃプロモーター（非特許文献３８）を、ｐＢＲ３２２（非特許文献３９）のＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＴａｃＩＱを調製した。マルチクローニングサイトおよびターミネーター配列（配列番号：４７）を、ＥｃｏＲＩからＳｐｈＩまでのｐＢＲ３２２配列と置き換えた。
【０１３９】
（グリセロールデヒドラターゼ遺伝子（ｄｈａＢ１、２、３、Ｘ）のサブクローニング）
５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＸｂａＩ部位を組み込んだプライマー（配列番号：４９〜５０）を用いるＰＣＲによって、ｐＨＫ２８−２６（配列番号：４８）から、ｄｈａＢ３遺伝子のオープンリーディングフレームを増幅した。この産物を、ｐＬｉｔｍｕｓ２９（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））にサブクローニングし、ｄｈａＢ３を含有するプラスミドｐＤＨＡＢ３を作成した。
【０１４０】
領域（ｐＨＫ２８−２６由来のｄｈａＢオペロンのｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、およびｄｈａＢＸに対する完全なコード領域を含有する）を、制限酵素ＫｐｎＩおよび  ＥｃｏＲＩを用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））にクローニングし、プラスミドｐＭ７を作成した。
【０１４１】
ＡｐａＩおよびＸｂａＩを用いてプラスミドｐＭ７を消化し、５．９−ｋｂフラグメントを精製し、プラスミドｐＤＨＡＢ３由来の３２５−ｂｐ  ＡｐａＩ−ＸｂａＩフラグメントを用いてこれを連結することによって、ｄｈａＢＸ遺伝子を除去し、ｐＭ１１（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３を含有する）を作成した。
【０１４２】
５’末端にＨｉｎｄＩＩ部位およびコンセンサスリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、３’末端にＸｂａＩ部位を組み込んだプライマー（配列番号：５１〜５２）を用いるＰＣＲによって、ｐＨＫ２８−２６から、ｄｈａＢ１遺伝子のオープンリーディングフレームを増幅した。この産物を、ｐＬｉｔｍｕｓ２８（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））にサブクローニングし、ｄｈａＢ１を含有するプラスミドｐＤＴ１を作成した。
【０１４３】
ｐＭ１１（ｄｈａＢ１遺伝子、ｄｈａＢ２遺伝子、およびｄｈａＢ３遺伝子の一部を含有する）由来のＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＤＴ１に挿入し、ｄｈａＢ発現プラスミド、ｐＤＴ２を作成した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント（ｐＤＴ２由来のｄｈａＢ（１、２、３）遺伝子を含有する）を、ｐＴａｃＩＱに挿入し、ｐＤＴ３を作成した。
【０１４４】
（１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｈａＴ）のサブクローニング）
ｐＨＫ２８−２６のＫｐｎＩ−ＳａｃＩフラグメント（１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＴ）遺伝子を含有する）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋にサブクローニングして、プラスミドｐＡＨ１を作成した。テンプレートＤＮＡとしてのｐＡＨ１と、５’末端にＸｂａＩ部位、３’末端にＢａｍＨＩ部位を組み込まれた合成プライマー（配列番号：５３−５４）とを用いるＰＣＲによって、ｄｈａＴ遺伝子を増幅した。この産物を、ＳｒｆＩ部位でｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にサブクローニングし、ｄｈａＴを含有するプラスミドｐＡＨ４およびｐＡＨ５を作成した。プラスミドｐＡＨ４は、ｄｈａＴ遺伝子を、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ中のｌａｃプロモーターからの発現に対して正しい向きで含有し、ｐＡＨ５は、ｄｈａＴ遺伝子を、逆向きに含有する。ｐＡＨ４（ｄｈａＴ遺伝子を含有する）由来のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＴａｃＩＱに挿入し、プラスミドｐＡＨ８を作成した。ｐＡＨ８（ＲＢＳおよびｄｈａＴ遺伝子を含有する）由来のＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋に挿入し、ｐＡＨ１１を作成した。
【０１４５】
（ｄｈａＴおよびｄｈａＢ（１、２、３）のための発現カセットの構築）
ｄｈａＴおよびｄｈａＢ（１、２、３）のための発現カセットを、標準の分子生物学方法を用いて、先に述べた個々のｄｈａＢ（１、２、３）およびｄｈａＴサブクローンから構築した。ＳｐｅＩ−ＳａｃＩフラグメント（ｐＤＴ３由来のｄｈａＢ（１、２、３）遺伝子を含有する）を、ｐＡＨ１１に、ＳｐｅＩ−ＳａｃＩ部位で挿入して、ｐＡＨ２４を作成した。配列番号：５５−５６から作成したＳａｌＩ−ＸｂａＩリンカーを、制限酵素ＳａｌＩ−ＸｂａＩで消化したｐＡＨ５に挿入して、ｐＤＴ１６を作成した。このリンカーは、ＸｂａＩ部位を破壊する。その後、ｐＤＴ１６からの由来の１−ｋｂ  ＳａｌＩ−ＭｌｕＩフラグメントを、ｐＡＨ２４に挿入し、現存するＳａｌＩ−ＭｌｕＩフラグメントと置き換えて、ｐＤＴ１８を作成した。ｐＤＴ１８由来のＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントとｐＭ７由来のＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＣＬ１９２０（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＸ０８５４２８）に挿入することによって、ｐＤＴ２１を構築した。ストレプトマイセスリウィダンス（配列番号：１）由来のグルコースイソメラーゼプロモーター配列を、ＰＣＲによってクローン化し、ｐＬｉｔｍｕｓ２８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＤＴ５を構築した。ｐＤＴ５のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント（ＧＩプロモーターを含有する）を、ｐＣＬ１９２０（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＸ０８５４２８）のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ部位に挿入することによって、ｐＣＬ１９２５を構築した。
【０１４６】
（ストレプトマイセスグルコースイソメラーゼプロモーターの制御下にあるグリセロールデヒドラターゼのための発現ベクターの構築）
ｐＤＴ２４から、ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメント（ｄｈａＴを含有する）を欠失させ、ｐＲＮ１０５を作成した。ｐＤＴ２１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｌｕＩフラグメントとｐＤＴ２１のＭｌｕＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＣＬ１９２５のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位にクローニングすることによって、ｐＤＴ２４プラスミドを構築した。ｐＲＮ１０５テンプレートから、ＰＣＲ産物（ユニークなＨｐａＩ制限部位からｄｈａＸの末端までのｄｈａＸの３’領域を含み、５’末端のＨｐａＩ制限部位と３’末端のＸｂａＩ制限部位を組み込む）を作成し、ｐＲＮ１０５中の現存するＨｐａＩ／ＸｂａＩ制限フラグメントと置き換えるために使用して、ｐＭＰ３７を作成した。ｐＤＴ２９テンプレートから、ＰＣＲ産物（開始コドンのすぐ上流のユニークなＨｉｎｄＩＩＩ制限部位からｄｈａＢ１内のユニークなＮｏｔＩ制限部位までのｄｈａＢ１の５’領域を含み、５’末端のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位と３’末端のＮｏｔＩ制限部位を組み込む）を作成し、ｐＲＮ１０５中の小さなＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメントと置き換えるために使用して、ｐＲＪ２５を作成した。ｐＤＴ２９は、ｐＨＫ２８−２６のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＣＬ１９２５のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって構築されていた。小さなＨｐａＩ／ＸｂａＩ制限フラグメント（ｐＭＰ３７由来のｄｈａＸの５’領域を含有する）を、ｐＲＪ２５由来の大きなＸｂａＩ／ＨｐａＩ制限フラグメントに連結して、ｐＭＰ３８（その中でストレプトマイセスリウィダンスグルコースイソメラーゼプロモーター（配列番号：１）が、天然のリボソーム結合部位を用いて、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｄｈａＢ１−３、Ｘオペロンを発現させる）を作成した。
【０１４７】
（実施例７）
（１，３−プロパンジオールの生成のためのＳＹＣＯプラスミドの構築）
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主中でグルコースから１，３−プロパンジオールを生成するために、異なる起源からのいくつかのオペロンを、発現させることができる。これらには、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ、およびグリセロールデヒドラターゼ活性をコードする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ）由来のｄｈａオペロン（ｄｈａＲ、ｄｈａＴ、ｄｈａＸ、およびｄｈａＢ１〜３を含有する）、および同様に肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ）由来のｏｒｆオペロン（ｏｒｆＹＸＷを含有する）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来のＤＡＲ１およびＧＰＰ２を含有するオペロンなどの起源から得ることができる。発酵中の株の安定性を保つためには、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主中のプラスミドをできるだけ少なく保つことが好ましい。このため、単一のプラスミドで少なくとも３つの異なるオペロンのクローニングが可能であるように、一連のプラスミドを構築した。ＲＮＡポリメラーゼの読み過ごし（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を防ぐために、３つの転写ターミネーターを用いて、ユニークなクローニングサイトと隣接させた。これらの転写ターミネーターには、ｔｏｎＢターミネーター、ｔｈｒアテニュエーター、およびａｓｐＡターミネーターが含まれていた。ｔｏｎＢターミネーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｏｎＢ遺伝子と、反対の遺伝子との間に位置する両方向性のｒｈｏ依存性ターミネーターである（非特許文献４０）。ｔｈｒアテニュエーターは、Ｅ．ｃｏｌｉスレオニンオペロンの転写終結を容易にする（非特許文献３５）。ａｓｐＡターミネーターは、Ｅ．ｃｏｌｉアスパルターゼオペロンの転写終結を容易にする（非特許文献４１）。
【０１４８】
（ユニークなクローニングサイトに隣接する３つの転写ターミネーターを含むｐＲＪ５０の構築）
ＰＣＲ仲介型の（ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）オーバーラップ伸長法（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（非特許文献４２）を用いて、合成ＤＮＡフラグメント（ｔｏｎＢ、ｔｈｒ、およびａｓｐＡ転写ターミネーター（配列番号：５７）、ならびにいくつかの制限部位を含む）を構築した。３’末端で２５塩基対にわたって互いに相補する２種の１００塩基オリゴヌクレオチド（配列番号：５８−５９）をアニーリングして、１７５塩基ＤＮＡフラグメント（配列番号：６０）を作成した。２種の追加のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：６１−６２）を用いて、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限部位に隣接するこの１７５塩基フラグメントをさらに増幅した。この１７５塩基対のＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで消化したプラスミドｐＣＬ１９２５にサブクローニングし、ｐＲＪ５０（配列番号：７９）を作成した。
【０１４９】
（ｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、およびｄｈａＢ（１、２、３、Ｘ）のための発現カセットの構築）
ＰＣＲ仲介型のオーバーラップ伸長法として知られている技術によって、遺伝子ｄｈａＴの最初の５つと最後の５つのコドン（＋終止コドン）以外の全てを欠失させたプラスミドｐＤＴ２９の誘導体を構築した。テンプレートとしてｐＤＴ２９を用いて、２つの第１のＰＣＲ産物を、以下のプライマーを用いて作成した。
配列番号：６３＝５’ＧＡＣ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＣＧＴ  ＣＧＣ３’；
配列番号：６４＝５’ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＴＴＡ  ＡＣＧ３’；
配列番号：６５＝５’ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＴＡＧ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＴＡＣ３’；
配列番号：６６＝５’ＣＧＧ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＣＴＧ３’。
【０１５０】
配列番号：６５を配列番号：６６と対にして、５’ｄｈａＢ１（ユニークなＳｃａＩ部位まで）、ｏｒｆＹのすべて、およびｄｈａＴの最初の５つのコドンを含む核酸を包含する９３１ｂｐの産物を作成した。配列番号：６３を、配列番号：６４と対にして、ｄｈａＴの最後の５つのコドン（＋終止コドン）、ｏｒｆＸのすべて、ｏｒｆＷのすべて、および５’ｄｈａＲ（ユニークなＳａｐＩ部位まで）を含む核酸を包含する１３４８ｂｐの産物を作成した。配列番号：６４の５’末端の１５塩基は、配列番号：６５の１５塩基部分の逆の相補体であるテール（ｔａｉｌ）を構成する。同様に、配列番号：６５の５’末端の１１塩基は、配列番号：６４の１１塩基部分の逆の相補体であるテールを構成する。したがって、この２つの第１のＰＣＲ産物を、ＰＣＲによるアニーリング（２６−ｂｐテールオーバーラップを介する）および伸長後に連結して、２２５３ｂｐの第３の核酸生成物を作成した。この第３のＰＣＲ産物を、ＳａｐＩおよびＳｃａＩで消化して、同様にＳａｐＩおよびＳｃａＩで消化したｐＤＴ２９に連結し、ｄｈａＴ内の大きなインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）欠失以外はｐＤＴ２９と同じであるプラスミドｐＫＰ３２を作成した。
【０１５１】
（異なるＧＩプロモーター変異体を含有する、ｏｒｆＷＸＹおよびｄｈａＢ１〜３の発現のためのプラスミドの構築）
ｐＫＰ３２由来のｏｒｆオペロンを、５’末端のＨｉｎｄＩＩＩおよび３’末端のＡｖｒＩＩを用いてＰＣＲで増幅（配列番号：８０−８１）し、ｐＬｉｔｍｕｓ２８（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））中のＨｉｎｄＩＩＩとＡｖｒＩＩとの間にサブクローニングして、ｐＫＰ３８を作成した。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメント（ｐＭＰ３８／１．６由来のＧＩ変異体プロモーターＰ１．６（配列番号：９）を含有する）を、ｐＫＰ３８中のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの間にサブクローニングして、ｐＫＰ３９を作成した。ＡｖｒＩＩ／ＸｂａＩ制限フラグメント（ｐＭＰ３８／１．６由来のｄｈａＢ発現カセットを含有する）を、ｐＬｉｔｍｕｓ２８（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））中のＡｖｒＩＩとＸｂａＩの間にサブクローニングして、ｐＭＰ３９を作成した。ＡｖｒＩＩ／ＸｂａＩ制限フラグメント（ｐＭＰ３９由来のｄｈａＢ発現カセットを含有する）を、ｐＲＪ５０のＡｖｒＩＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＣＯ１１を作成した。ＡｖｒＩＩ制限フラグメント（ｐＫＰ３９由来のｏｒｆ発現カセットを含有する）を、ｐＳＹＣＯ１１のＮｈｅＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＣＯ１２を作成した。プラスミドｐＳＹＣＯ１１とｐＳＹＣＯ１２は、ｐＳＹＣＯ１１が、ｏｒｆオペロンを含有しないこと以外は同じである。
【０１５２】
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメント（ｐＭＰ３８／１．５由来のＧＩ変異体プロモーターＰ１．５（配列番号：１０）を含有する）を、ｐＫＰ３８中のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの間にサブクローニングして、ｐＫＰ４０を作成した。ＡｖｒＩＩ制限フラグメント（ｐＫＰ４０由来のＰ１．５によって制御されるｏｒｆオペロンを含有する）を、ｐＳＹＣＯ１１のＮｈｅＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＣＯ１３を作成した。ＡｖｒＩＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメント（Ｐ１．６およびｐＳＹＣＯ１３中のｄｈａＢ１の５’末端を含有する）を、ｐＭＰ３８／１．５由来の対応するＡｖｒＩＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメントで置き換えて、ｐＳＹＣＯ１９を作成した。
【０１５３】
（転写ターミネーターによってそれぞれ隔てられた３つのオペロンを用いた、ｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、およびｐＳＹＣＯ１０９ベクターの構築）
二重鎖の核酸リンカー（配列番号：６７）を、ｐＣＬ１９２０（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＸ０８５４２８）中のＸｂａＩ制限部位とＳｍａＩ制限部位の間にサブクローニングして、ｐＣＲ−ｐＣＬ１９２０を作成した。ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））から得られたｔｒｃプロモーター、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の、ＤＡＲ１およびＧＰＰ２のコード配列、およびターミネーターｒｒｎＢＴ１Ｔ２（ｐＴｒｃ９９Ａ由来）を含む、ｐＡＨ４８中のグリセロール経路発現カセットを、ＰＣＲで増幅（配列番号：６８−６９）し、ｐＣＲ−ｐＣＬ１９２０のＳｒｆＩ制限部位にサブクローニングして、ｐＡＨ１０５（配列番号：７０）を作成した。
【０１５４】
ＰｖｕＩＩ（２）／ＰｖｕＩＩ（４）制限フラグメント（ｐＡＨ１０５由来のＤＡＲ１／ＧＰＰ２発現カセットを含有する）を、ｐＳＹＣＯ１２のＢｓｔ１１０７Ｉ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＣＯ１０１（配列番号：７１）を作成した。ＤＡＲ１／ＧＰＰ２オペロンは、ｏｒｆオペロンおよびｄｈａＢオペロンに対して逆の方向である。ＮｈｅＩ制限フラグメント（ｐＡＨ１０５由来のＤＡＲ１／ＧＰＰ２発現カセットを含有する）を、ｐＳＹＣＯ１９のＸｂａＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＣＯ１０３（配列番号：７２）を作成した。
【０１５５】
プラスミドｐＳＹＣＯ１０３は、（ａ）サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から得られた一組の２つの外因性遺伝子（ＤＡＲ１（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）およびＧＰＰ２（グリセロール−３−ホスファターゼをコードする遺伝子））；（ｂ）肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から得られた一組の３つの外因性遺伝子（ｄｈａＢ１（グリセロールデヒドラターゼの「α」サブユニットをコードする遺伝子）、ｄｈａＢ２（グリセロールデヒドラターゼの「β」サブユニットをコードする遺伝子）、およびｄｈａＢ３（グリセロールデヒドラターゼの「γ」サブユニットをコードする遺伝子））；ならびに（ｃ）肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から得られた一組の２つの外因性遺伝子（ｄｈａＢＸ（デヒドラターゼ再活性化因子の「α」サブユニットをコードする遺伝子）およびｏｒｆＸ（デヒドラターゼ再活性化因子の「β」サブユニットをコードする遺伝子）を含む。ｐＳＹＣＯ１０３においては、ＤＡＲ１／ＧＰＰ２オペロンは、ｏｒｆオペロンおよびｄｈａＢオペロンに対して同じ方向である。
【０１５６】
ＮｈｅＩ制限フラグメント（ｐＡＨ１０５由来のＤＡＲ１／ＧＰＰ２発現カセットを含有する）を、ｐＳＹＣＯ１２のＸｂａＩ部位にサブクローニングし、ｐＳＹＣＯ１０６（配列番号：７３）を作成した。ＤＡＲ１／ＧＰＰ２オペロンは、ｏｒｆオペロンおよびｄｈａＢオペロンに対して同じ方向である。ｐＳＹＣＯ１０６中のＰｍｌＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメントを除去し、ｐＳＹＣＯ１０６由来のオーバーラップするＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメントで置き換えて、ｏｒｆＷの３’末端の近くに１４１塩基対の欠失をもたらし、ｐＳＹＣＯ１０９（配列番号：７４）を作成した。
【０１５７】
（実施例８）
（クローニングに有用な１０個のレアな制限酵素部位を有する新規のヌクレオチド配列）
さらなる遺伝子、オペロン、またはカセットのクローニングのために、また、このプラスミドから別のプラスミドにカセットを導入するための部位として有用な１０個のレアな制限エンドヌクレアーゼ部位をコードするように、新規のヌクレオチド配列を設計した。ＳｐｅＩを用いてｐＳＹＣＯ１０６を制限し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）を用いて末端を埋め、再連結することによって、プラスミドｐＳＣＹＣＯ１０６ΔＳを構築した。このｐＳＹＣＯ１０６ΔＳを、ＥｃｏＲＩで消化して、ベクター骨格を単離し、その後、連結によって再び環状にしてｐＳｐＲＥＰｄｓを形成した。オリゴヌクレオチド（配列番号：７５〜７６）を、６０℃でアニーリングし、ＫｐｎＩ／ＳｔｕＩで消化した。この複数のクローニング断片（配列番号：７７）は、以下の酵素の認識部位を含有する。ＮｈｅＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＡｇｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＮｓｉＩ、ＭｌｕＩ、およびＳａｐＩ。このフラグメントを、ゲル精製（ｇｅｌ−ｐｕｒｉｆｙ）し、ｐＳｐＲＥＰｄｓにクローニングして、ｐＳｐＲＥＰｍｃｓを形成した。このｐＳｐＲＥＰｍｃｓを、ＥｃｏＲＩを用いて直鎖化し、このＥｃｏＲＩフラグメント（ｐＳＹＣＯ１０６ΔＳおよびｐＳＹＣＯ１０９由来の経路（ｐａｔｈｗａｙ）遺伝子を含有する）を、ｐＳｐＲＥＰｍｃｓに連結して、それぞれｐＳＹＣＯ１０６ｍｃｓ（配列番号：７８）とｐＳＹＣＯ１０９ｍｃｓ（配列番号：３０）を形成した。
【０１５８】
（実施例９）
（Ｅ．ｃｏｌｉ株ＲＪ８ｎ／ＰＳＹＣＯ１０１を用いる１，３−プロパンジオールの生成）
プラスミドｐＳＹＣＯ１０１（配列番号：７１）を用いて電気的にコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＪ８ｎ細胞を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ株、ＲＪ８ｎ／ｐＳＹＣＯ１０１を得た。
【０１５９】
発酵槽に接種するために、５０ｍｇ／Ｌ  スペクチノマイシンを含有する２ＹＴ培地（１０ｇ／Ｌ  酵母エキス、１６ｇ／Ｌ  トリプトン、および１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）中で、ＲＪ８ｎ／ｐＳＹＣＯ１０１を前培養した。培養株は、２Ｌ  エルレンマイヤーフラスコ内の培地５００ｍＬに入れた凍結ストック（凍害保護物質として１０％グリセロール）から出発し、２５０ｒｐｍの振盪機中、３５℃で、ＯＤ550が、約１．０に到達するまで増殖させ、発酵槽に接種するために使用した。
【０１６０】
以下の成分を、発酵容器中で共に滅菌した。４５ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、１２ｇ  クエン酸一水和物、１２ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、３０ｇ  酵母エキス、１．８ｇ  クエン酸鉄ＩＩＩアンモニウム、消泡剤としての５ｍＬ  Ｍａｚｕ  ＤＦ２０４、１．２ｇ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、７．２ｍＬ硫酸、および６０ｍＬの微量元素溶液。滅菌後、２０〜２８％  ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨを６．８に上げ、以下の成分を加えた。０．３０ｇ  スペクチノマイシン、およびグルコース（６７重量％供給から）。微量元素の溶液は、以下を含有していた（ｇ／Ｌ）。クエン酸、Ｈ2Ｏ（４．０）、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ（３．０）、ＮａＣｌ（１．０）、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．１０）、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（０．１０）、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．１０）、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（０．０１０）、Ｈ3ＢＯ3（０．０１０）、およびＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ（０．０１０）。接種後、体積は、６．０Ｌであり、グルコース濃度は、１０ｇ／Ｌであった。
【０１６１】
上で述べた培地を用いて、１５Ｌの攪拌されるタンク発酵槽を準備した。温度を３４℃に制御し、アンモニア水溶液（２０〜２８重量％）を用いてｐＨを６．８に制御した。溶解酸素（ＤＯ）コントロールを、１０％に設定し、背圧を、０．５バールに制御した。あまり例のない逸脱以外は、グルコースを、６７％（重量）供給で、１０ｇ／Ｌと２５ｇ／Ｌの間に維持した。１０時間の発酵時間の経過後、１０ｍｇ  ビタミンＢ12を加え、１時間後に同時供給（０．０１６７ｍｇ／ｍＬ溶液の２．６４ｍｇ／時）を開始した。６４時間後、９９ｇ／Ｌのタイターの１，３−プロパンジオールが得られた。
【配列表】
2010268807000001.app
【外国語明細書】
2010268807000001.pdf