(57)【要約】【課題】副甲状腺ホルモンレセプターの提供と利用。【解決手段】副甲状腺ホルモンレセプターをコードしているＤＮＡ、組換え及び合成副甲状腺ホルモンレセプターポリペプチド及びその断片、副甲状腺ホルモンレセプター及びレセプター断片に対する抗体、候補化合物を副甲状腺ホルモンレセプターの作用に対するアンタゴニストあるいはアンタゴニスト効果についてスクリーニングする方法、及びこれらの化合物の利用による診断と治療法の提供。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の細胞レセプターをコードしているＤＮＡ配列からなる分離されたＤＮＡであって、前記レセプターが、図３に示されているアミノ酸配列に少なくとも３０％の同一性を持つアミノ酸配列を持つことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡ配列が図１に示されているアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）の本質的にすべてをコードしていることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が図３に示されているアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）の本質的にすべてをコードしていることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記分離されたＤＮＡが（８Ａ６）であって、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号６８５７０と呼ばれていることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が図６に示されているアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．４）の本質的にすべてをコードしていることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が、図１に示されているＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）とハイブリッドを形成することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が図３に示されているＤＮＡ配列（ＳＥＷ  ＩＤ  ＮＯ．３）とハイブリッドを形成することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列が図６に示されているＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）とハイブリッドを形成することを特徴とする方法。
【請求項９】
ベクターの精製標品であって、前記ベクターが副甲状腺ホルモンレセプターをコードしているＤＮＡ配列からなることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載されている分離されているＤＮＡを含む細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載されている細胞であって、前記細胞が前記の分離されているＤＮＡから上記細胞レセプターを発現する能力のあることを特徴とする方法。
【請求項１２】
本質的に均質な細胞群であって、その各々が請求項１に記載されている分離されたＤＮＡを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
分離されたＤＮＡが、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質を結合することの出来るポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列からなることを特徴とする方法。
【請求項１４】
ポリペプチドを生成する方法で、前記方法が以下のことからなることを特徴とする：
副甲状腺ホルモンレセプターあるいはその断片をコードしている分離されたＤＮＡを含む細胞を提供する方法、及び
前記ＤＮＡからポリペプチドの発現を可能にする条件下に前記細胞を培養する方法。
【請求項１５】
副甲状腺ホルモンレセプター遺伝子の１部からなる１本鎖ＤＮＡであって、前記部分が少なくとも１８核酸の長さであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載されている１本鎖ＤＮＡであって、前記部分が前記副甲状腺ホルモンレセプター遺伝子のすべてよりも短いことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載されている１本鎖ＤＮＡであって、上記ＤＮＡが標識されて検出可能であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
副甲状腺ホルモンレセプターｃＤＮＡの１部からなる１本鎖ＤＮＡであって、上記部分が少なくとも１８ヌクレオチドの長さであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載されている１本鎖ＤＮＡであって、前記ＤＮＡがアンチセンスであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
副甲状腺ホルモンレセプターをコードしている組換えＤＮＡ分子の発現によって生成される副甲状腺ホルモンレセプターを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載されている副甲状腺ホルモンレセプターの本質的に精製された標品を特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項５に記載されているＤＮＡの発現によって、生成される副甲状腺レセプターの本質的に精製された標品を特徴とする方法。
【請求項２３】
少なくとも６個のアミノ酸、そして副甲状腺ホルモンレセプターの完全なアミノ酸配列よりは少ないアミノ酸からなるポリペプチドであって、上記ポリペプチドが副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質を結合出来ることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載されているポリペプチドであって、上記副甲状腺ホルモンレセプターがヒト副甲状腺レセプターであることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載されているポリペプチドであって、上記断片が以下のものからなることを特徴とする方法。
（ａ）ＴＮＥＴＲＥＲＥＶＦＤＲＬＧＭＩＹＴＶＧ、
（ｂ）ＹＬＹＳＧＦＴＬＤＥＡＥＲＬＴＥＥＥＬ、
（ｃ）ＶＴＦＦＬＹＦＬＡＴＮＹＹＷＩＬＶＥＧ、
（ｄ）Ｙ−ＲＡＴＬＡＮＴＧＣＷＤＬＳＳＧＨＫＫＷＩＩＱＶＰ、
（ｅ）ＰＹＴＥＹＳＧＴＬＷＱＩＱＭＨＹＥＭ、
（ｆ）ＤＤＶＦＴＫＥＥＱＩＦＬＬＨＲＡＱＡ、
（ｇ）ＦＦＲＬＨＣＴＲＮＹ、
（ｈ）ＥＫＫＹＬＷＧＦＴＬ、
（ｉ）ＶＬＡＴＫＬＲＥＴＮＡＧＲＣＧＴＲＱＱＹＲＫＬＬＫ、あるいは
（ｊ）副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質を結合出来る（ａ）から（ｉ）の断片。
【請求項２６】
製剤上許容される担体中に、（ａ）副甲状腺ホルモンレセプターあるいは（ｂ）上記レセプターの断片からなるポリペプチドを含む治療混合物を特徴とする方法。
【請求項２７】
副甲状腺ホルモンレセプターと免疫複合体を形成することが出来る抗体を特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載されている抗体と製剤上許容される担体からなる治療混合物を特徴とする方法。
【請求項２９】
動物の血中カルシウムレベルを低減する方法であって、請求項２６に記載されている治療混合物を、上記動物に、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質による、上記動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化の阻害に効果的な用量で投与することからなることを特徴とする方法。
【請求項３０】
動物の血中カルシウムレベルを低減する方法であって、請求項２８に記載されている治療混合物を、上記動物に、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質による、上記動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化の阻害に効果的な用量で投与することからなることを特徴とする方法。
【請求項３１】
副甲状腺ホルモンレセプターへの結合に対し、副甲状腺ホルモンと競合する能力のある化合物を確認する方法であって、該方法が以下の内容からなることを特徴とする：
（ａ）請求項２３に記載されているポリペプチドを副甲状腺ホルモンと、候補化合物の（ｉ）存在下あるいは（ｉｉ）非存在下に接触させる、及び
（ｂ）上記候補化合物の存在下における上記ポリペプチドの副甲状腺ホルモンへの結合レベル（ｉ）を、上記候補化合物の非存在下における上記ポリポリペプチドの副甲状腺ホルモンへの結合レベル（ｉｉ）と比較する；上記候補化合物の存在下における結合レベルが、その非存在下よりも低い場合は、上記候補化合物は上記レセプターへの結合に対し、上記副甲状腺ホルモンと競合する能力のあることを示唆する。
【請求項３２】
副甲状腺ホルモンレセプターへの結合に対し、副甲状腺ホルモン関連蛋白質と競合する能力のある化合物を確認する方法であって、該方法が以下の内容からなることを特徴とする：
（ａ）請求項２３に記載されているポリペプチドを副甲状腺ホルモン関連蛋白質と、候補化合物の（ｉ）存在下あるいは（ｉｉ）非存在下に接触させる、及び
（ｂ）上記候補化合物の存在下における上記ポリペプチドの副甲状腺ホルモン関連蛋白への結合レベル（ｉ）を、上記候補化合物の非存在下における上記ポリペプチドの副甲状腺ホルモン関連化合物への結合レベル（ｉｉ）と比較する；
上記候補化合物の存在下における結合レベルが、その非存在下よりも低い場合は、上記候補化合物が上記レセプターへの結合に対し、上記副甲状腺ホルモン関連蛋白質と競合する能力のあることを示唆する。
【請求項３３】
副甲状腺ホルモンレセプターへの結合に対し、副甲状腺ホルモンと競合する能力のある化合物を確認する方法であって、該方法が以下の内容からなることを特徴とする：
（ａ）副甲状腺ホルモンを請求項１１に記載されている細胞と、候補化合物の（ｉ）存在下あるいは（ｉｉ）非存在下に組み合わせる、及び
（ｂ）上記候補化合物の存在下における上記副甲状腺ホルモンへの上記レセプターの結合レベル（ｉ）を、上記候補化合物の非存在下における上記副甲状腺ホルモンへの上記レセプター結合レベル（ｉｉ）と比較する；上記候補化合物の存在下における結合レベルが、その非存在下よりも低い場合は、上記候補化合物は上記レセプターへの結合に対し上記副甲状腺ホルモンと競合する能力のあることを示唆する。
【請求項３４】
副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質の細胞表面上の副甲状腺レセプターへの結合を阻害する能力のある化合物を特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載されている化合物と製剤上許容される担体からなる治療混合物を特徴とする方法。
【請求項３６】
副甲状腺ホルモンレセプターをコードしているＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列を確認する方法であって、 該方法が以下の内容からなることを特徴とする：
ゲノムあるいはｃＤＮＡライブラリーを提供し；
上記ライブラリーを請求項１８に記載されている１本鎖ＤＮＡと、上記１本鎖ＤＮＡ及び上記ライブラリー中の相同ＤＮＡ配列間にハイブリッド形成が可能なような条件下に接触させ；及び
上記ライブラリーから、上記１本鎖ＤＮＡとハイブリッドを形成しているクローンを割り出し確認する。そして、ハイブリッド形成は、上記クローンの中に、副甲状腺ホルモンレセプターをコードしているＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列の存在することを示唆する。
【請求項３７】
副甲状腺ホルモンレセプターあるいはその断片をコードしているＤＮＡ配列からなるトランス遺伝子を持つ形質転換されたヒト以外の脊椎動物を特徴とする方法。
【請求項３８】
以下の内容からなる診断法を特徴とする方法：
（ａ）動物から１回目の血液試料取り；
（ｂ）請求項３５に記載されている混合物を上記動物に投与し；
（ｃ）上記混合物の上記投与のあとに上記動物から２回目の血液試料を取り；
（ｄ）上記１回目の血液試料中のカルシウムレベルを上記２回目の血液試料中のものと比較し、上記２回目の血液試料中のカルシウムレベルが低い場合は、副甲状腺ホルモン関連の状態をの診断に役立つ。
【請求項３９】
請求項１に記載されている分離されたＤＮＡであって、上記ＤＮＡの配列が副甲状腺ホルモンレセプターをコードしていることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項２０に記載されている副甲状腺ホルモンレセプターを治療及び診断に用いることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項２３に記載されているポリペプチドを治療及び診断に用いることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項２７に記載されている抗体を治療及び診断に用いることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項２６に記載されている治療混合物を、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻害するための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低減するための治療に用いることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項２８に記載されている治療混合物を、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻害するための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低減するための治療に用いることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項２０に記載されている副甲状腺ホルモンレセプターを、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻害するための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低減するための治療に用いる薬剤の製造に利用することを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項２３に記載されているポリペプチドを、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻害するための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低減するための治療に用いる薬剤の製造に利用することを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項２７に記載されている抗体を、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質による動物の副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を阻害するための、あるいは、動物の血中カルシウムレベルを低減するための治療に用いる薬剤の製造に利用することを特徴とする方法。
【請求項４８】
患者における副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質によって仲介される高カルシウム血症状態を確認する方法であって、該方法が以下の内容からなることを特徴とする方法：
（ａ）患者からの１回目の血液試料中のカルシウムレベルを測定し、
（ｂ）請求項２８に記載されている治療混合物の投与後のある時期に患者から採取された２回目の血液試料中のカルシウムレベルを測定し、
（ｃ）２つの血液試料のカルシウムレベルを比較して、２回目の血液試料中のカルシウムレベルの方がより低い場合は、患者に副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質に関係のある状態であることを示唆する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ここに記載する研究の助成金は一部アメリカ合衆国政府によって提供されたものであり、同政府は本発明に対し一定の権利を保有する。
本発明は内分泌レセプターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモン作用発現の重要な段階は、ホルモンと標的細胞の原形質膜表面上にあるレセプターとの相互作用である。ホルモン−レセプター複合体の形成によって、細胞外シグナルを細胞内に導入して種々の生物学的反応を顕現化することが可能となる。例えば、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）のようなホルモンの、その細胞表面レセプターへの結合はレセプターの高次構造の変化を誘発し、その結果、レセプターと導入分子、即ち、その一成分が（ＧＳ  ）である刺激性グアニンヌクレオチド（ＧＴＰ）結合蛋白質との連携が起こる。この連携はアデニル酸シクラーゼを刺激し、次いで蛋白質のリン酸化、ステロイドの合成と分泌、及びイオンフラックスの調節のような他の細胞の過程を刺激する。アルギニンバソプレッシン（ＡＶ）、アンギオテンシンＩＩ、及びノルエピネフリンを含む他のホルモンの、その細胞表面レセプターへの結合の結果、（ＧＰ  ）のような別のタイプのＧＴＰ結合蛋白質成分の活性化をもたらし、次いで酵素ホスホリパーゼＣの活性を刺激する。ホスホリパーゼＣによる加水分解の生成物は、細胞内カルシウムの動員と蛋白質のリン酸化を含む細胞内現象の複雑なカスケードを引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）はカルシウムの恒常性の主要な調節物質であり、その重要な標的細胞は骨と腎臓に存在する。カルシウム濃度の調節は、胃腸、筋肉、神経、神経筋、及び心臓血管などの系の正常な機能のために必要である。ＰＴＨの合成と分泌は、主として血漿のカルシウムレベルによって制御される：低レベルでホルモンの合成と分泌の両方を刺激し、高レベルは抑制する。次いでＰＴＨは、直接的または間接的に、３つのカルシウム交換部位、即ち、腸、骨、及び腎臓におけるカルシウムの血中への流入を促進することによって血漿カルシウムレベルを維持する。ＰＴＨは腎臓における活性型ビタミンＤの生合成を助成することによってカルシウムの胃腸からの正味の吸収に寄与する。ＰＴＨは造骨細胞を阻害し、また、間接的に、骨吸収細胞である破骨細胞の分化を促進することによって骨からのカルシウム再吸収を促進する。このホルモンは、また、腎臓に対する少なくとも３つの効果：尿細管のカルシウム再吸収の刺激、リン酸クリアランスの向上、及び活性型ビタミンＤの合成を完結する酵素量の増大促進を仲介する。ＰＴＨによるレセプター仲介のホスホリパーゼＣの活性化も報告されてはいるが（Ｈｒｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ７９：２３０，１９８７）、ＰＴＨはこれらの効果を主としてレセプター仲介によるアデニル酸シクラーゼの活性化を通じて発揮する。
【０００４】
カルシウム恒常性の崩壊は多くの臨床的障害（例えば、重症な骨の疾患、貧血、腎障害、潰瘍、筋障害、及び神経障害）を引き起こすことがあり、普通は、副甲状腺ホルモンのレベルの変化を起こすような状態に起因するものである。高カルシウム血症は血漿カルシウムレベルの上昇を特徴とする症状である。それは、しばしば、副甲状腺の病変（例えば、腺腫、増殖、または癌腫）の結果としてＰＴＨの生産過剰が起こる一次性副甲状腺機能亢進症に関連している。もう一つのタイプの高カルシウム血症、悪性の体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）はもっとも普通の腫瘍の症候群である。それは大抵の場合、腫瘍（鱗状、腎臓、卵巣または膀胱の癌種）によるＰＴＨとアミノ酸相同性を共有する新しいクラスの蛋白質ホルモンの生成に起因するようである。これらのＰＴＨ関連蛋白質（ＰＴＨｒＰ）は一見、ＰＴＨの腎臓と筋肉に対する作用のあるものを模倣し、これらの組織におけるＰＴＨレセプターと相互作用すると信じられている。ＰＴＨｒＰは、通常、ケラチノサイト、脳、下垂体、副甲状腺、副腎皮質、髄質、胎児の肝臓、造骨細胞様細胞、及び授乳期の乳腺を含む多くの組織に少量見出だされる。多くのＨＨＭ悪性腫瘍において、ＰＴＨｒＰは循環系に高レベルで見出だされ、ＨＨＭ関連の高カルシウムレベルを生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は脊椎動物の細胞のレセプター、望むべくは、副甲状腺ホルモンレセプターをコードしているＤＮＡ配列からなる分離されたＤＮＡを特徴とする。このレセプターは、図３に示されているアミノ酸配列（配列番号：  ３）に対し少なくとも３０％（望ましいのは少なくとも５０％、更に望ましいのは少なくとも６０％、そして最も望ましいのは少なくとも７５％）同一のアミノ酸配列を持つものである：即ち、２つのアミノ酸配列間で（標準の方法を用いて）最近似部位を求める場合、前者の配列のアミノ酸殘基の少なくとも３０％が後者の配列のアミノ酸殘基と同一ということである。“分離された”とは、このＤＮＡが、本発明のＤＮＡが由来する（何であれ）生物に本来あるゲノム内で、本発明のＤＮＡをコードしている遺伝子に直接隣接している遺伝子のコーディング配列を全く持たないということを意味する。分離されたＤＮＡは一本鎖、または２本鎖でもよく、また、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えハイブリッドＤＮＡ、あるいは合成ＤＮＡでもよい。それは自然に存在する細胞のレセプター（例えば、ＰＴＨレセプター）をコードしているＤＮＡ配列と同一かも知れず、あるいは、このような配列とは、１つあるいはそれ以上のヌクレオチドの欠落、付加、または、置換によって異なるかも知れない。本発明の一本鎖ＤＮＡは、一般に少なくとも８ヌクレオチドの長さを持ち（望ましいのは、少なくとも１８ヌクレオチドの長さ、そして更に望ましいのは３０ヌクレオチドの長さ）、遺伝子あるいはｃＤＮＡの全長に及ぶこともある。これらはハイブリッド形成プロ−ブとして用いるため、検出され易いように標識されていることが望ましく、また、アンチセンスのこともあり得る。出来れば、この分離されたＤＮＡは高度緊縮条件下に、図１（配列番号：１）、図２（配列番号：２）、図３（配列番号：３）、あるいは図６（配列番号：４）に示されているＤＮＡ配列の全体、あるいは一部とハイブリッドを形成することが望ましい。“高度緊縮”とは、例えばヒト腎臓のＰＴＨレセプターｃＤＮＡの分離のための以下に記載されているような条件を意味する（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９も参照のこと、ここには引用して組み込まれている）。最も望ましいのは動物が哺乳類（オッポサム、ラットあるいははヒト）であり、ＤＮＡ配列が図１（配列番号：１）、図２（配列番号：２）、図３（配列番号：３）、あるいは図６（配列番号：４）に示されているアミノ酸配列を本質的にすべてコードしており、あるいはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号６８５７０あるいは６８５７１と名付けられているプラスミドの１つのコーディング配列によってコードされていることである。本発明のＤＮＡは、この発明の細胞レセプター（例えば、副甲状腺ホルモンレセプター）、あるいはそのレセプターの断片をコードするＤＮＡ配列を含むあるベクター［それは精製票品（例えば、ライブラリ−を形成するベクターの混合物から分離されたあるベクター）として提供されるかも知れない］に、及びそのベクター��あるいは上記の分離されたＤＮＡ）を含む細胞、または本質的に相同な細胞集団（例えば、原核細胞、あるいは哺乳動物細胞のような真核細胞）に組み込まれることもあり得る。“本質的に相同”とは、少なくとも９９％の細胞が本発明のベクター（あるいは、場合によっては分離されたＤＮＡ）を含むことを意味する。望ましいのは、このベクター（例えば、Ｒ１５Ｂ）が副甲状腺ホルモンレセプターの発現を（例えば、ベクターを移入され、あるいはベクターで形質転換された細胞に）指示する能力を持つことである。
【０００６】
別の観点から見ると、本発明は、細胞レセプターをコードしている組換えＤＮＡ分子の発現によって生成される細胞レセプター、望むべくは副甲状腺ホルモンレセプター（あるいはその本質的に精製された標品）を特徴とする。“本質的に精製された標品”とは、それが自然状態下で結合している蛋白質や脂質を実質的には含まない標品のことである。
【０００７】
関連した観点からは、本発明は、自然状態下に存在するこの発明の細胞レセプターの断片を含むポリペプチドを特徴とする。望ましいのは、このポリペプチドが、副甲状腺ホルモンあるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質と結合する能力を持つ自然状態下に存在する副甲状腺ホルモンレセプターの断片を含むことである。好適な実施態様では、この断片は少なくとも６つのアミノ酸の長さで、以下のグループから選ばれた配列を持つ：
（ａ）ＴＮＥＴＲＥＲＥＶＦＤＲＬＧＭＩＹＴＶＧ；（配列番号：５）
（ｂ）ＹＬＹＳＧＦＴＬＤＥＡＥＲＬＴＥＥＥＬ；（配列番号：６）
（ｃ）ＶＴＦＦＬＹＦＬＡＴＮＹＹＷＩＬＶＥＧ；（配列番号：７）
（ｄ）Ｙ−ＲＡＴＬＡＮＴＧＣＷＤＬＳＳＧＨＫＫＷＩＩＱＶＰ；（配列番号：８）
（ｅ）ＰＹＴＥＹＳＧＴＬＷＱＩＱＭＨＹＥＭ；（配列番号：９）
（ｆ）ＤＤＶＦＴＫＥＥＱＩＦＬＬＨＲＡＱＡ；（配列番号：１０）
（ｇ）ＦＦＲＬＨＣＴＲＮＹ；（配列番号：１１）
（ｈ）ＥＫＫＹＬＷＧＦＴＬ；（配列番号：１２）
（ｉ）ＶＬＡＴＫＬＲＥＴＮＡＧＲＣＤＴＲＱＱＹＲＫＬＬＫ；（配列番号：１３）  あるいは
（ｊ）断片（即ち、少なくとも６殘基の長さを持つが、全体よりは短い部分）あるいは（ａ）−（ｉ）の類似体（アナログ）で、副甲状腺ホルモン、あるいは副甲状腺ホルモン関連蛋白質［ここで“類似体（アナログ；analog）”とは、それが類似体であるペプチドと少なくとも５０％（そして望ましいのは少なくとも７０％）同等の配列を持つペプチドを指す］を結合する能力を持つもの。出来れば、本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ分子の発現によって生成されるか、または合成品（即ち、生物学的よりも化学的な手段によって組み立てられた）であることが望ましい。本発明はこのようなポリペプチドを生成する方法を提供し、この方法には、本発明の細胞レセプター、あるいはレセプターの断片をコードしている分離されたＤＮＡを含む細胞を提供すること、及びこの細胞を、分離されたＤＮＡからポリペプチドの発現を可能にするような条件下で培養することが含まれる。
【０００８】
本発明は、また、この発明の細胞レセプター（出来ればヒトのＰＴＨレセプターのような副甲状腺ホルモンレセプター）と免疫複合体を形成する能力のある抗体（単クローン性または多クローン性）及び抗体の精製標品を特徴とする。このような抗体は、抗原として（１）本発明の細胞レセプターの断片を含むポリペプチド、あるいは（２）細胞表面上に存在する本発明の細胞レセプターを用いることによって生成される。この抗体は、出来れば、本発明の細胞レセプターの活性（即ち、レセプターにそのリガンドが結合する時、レセプターによって本来引き起こされるカスケード反応の一部を構成するもの）を中和（即ち、部分的に、または完全に阻害する）する能力を持つことが望ましい。好適な実施態様において、本発明の抗体は副甲状腺ホルモンレセプターと免疫複合体を形成する能力を持ち、ＰＴＨレセプターの生物学的活性（即ち、アデニル酸シクラーゼの活性化、あるいはホスホリパーゼＣの刺激）を中和することが出来る。
【０００９】
また本発明には、製剤上許容出来る担体中に、（ａ）本発明の細胞レセプター、（ｂ）本発明の細胞レセプターの断片を持つポリペプチド、あるいは（ｃ）本発明の細胞レセプターに対する抗体を含む治療混合物が包含される。これらの治療混合物は、本発明の細胞レセプターのリガンドによる過剰刺激を特徴とする種々の疾病を処置する手段を提供する。好適な実施態様において、本発明のポリペプチドにはＰＴＨレセプター、ＰＴＨレセプターの断片、及びＰＴＨレセプターと免疫複合体を形成する抗体が含まれる。これらのポリペプチド及び抗体は、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰに関連する高カルシウム血症の症例を、これとは関連のないものと識別するための診断用薬として有用である。
【００１０】
本発明の核酸プロ−ブは、遺伝子工学の一般研究者が、細胞レセプター同族体、あるいは本発明の細胞レセプターに関連した、いかなる動物由来にせよ、その細胞レセプターを同定し、クローン化することを可能にし、本発明の配列の有用性を拡大する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１はオポッサムの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプタークローン、ＯＫ−Ｈをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（配列番号：１）。
【図１Ｂ】図１はオポッサムの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプタークローン、ＯＫ−Ｈをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（配列番号：１）。
【図１Ｃ】図１はオポッサムの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプタークローン、ＯＫ−Ｈをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（配列番号：１）。
【図２Ａ】図２はオポッサムの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプタークローン、ＯＫ−Ｏをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（配列番号：２）。
【図２Ｂ】図２はオポッサムの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプタークローン、ＯＫ−Ｏをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（配列番号：２）。
【図２Ｃ】図２はオポッサムの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプタークローン、ＯＫ−Ｏをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（配列番号：２）。
【図３Ａ】図３はラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのクローン、Ｒ１５Ｂをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（配列番号：３）。
【図３Ｂ】図３はラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのクローン、Ｒ１５Ｂをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（配列番号：３）。
【図３Ｃ】図３はラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのクローン、Ｒ１５Ｂをコードしている核酸とアミノ酸の配列の表示である（配列番号：３）。
【図４】図４はクローンＯＫ−Ｏ及びＲ１５ＢからのｃＤＮＡにコードされている推定アミノ酸配列の比較である。
【図５】図５はＯＫ−Ｏ、ＯＫ−ＨとＲ１５Ｂの推定アミノ酸配列を配列相同性に従って並べて比較したものである。
【図６Ａ】図６はヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている核酸とアミノ酸配列の表示である（配列番号：４）。
【図６Ｂ】図６はヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている核酸とアミノ酸配列の表示である（配列番号：４）。
【図６Ｃ】図６はヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている核酸とアミノ酸配列の表示である（配列番号：４）。
【図６Ｄ】図６はヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている核酸とアミノ酸配列の表示である（配列番号：４）。
【図７】図７はラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのｃＤＮＡ、ヒトのゲノムＤＮＡクローン及びヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている２つのｃＤＮＡクローンの略図である。
【図８】図８はヒトの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの推定アミノ酸配列の疎水性プロットである。予測される貫膜ドメインＩ〜ＶＩＩが示されている；Ａ、Ｂ、Ｃは追加の疎水性部位を示す。
【図９】図９はＯＫ−Ｈを移入したＣＯＳ細胞へのＰＴＨｒＰの結合を示すグラフである。
【図１０】図１０はＯＫ−Ｈを移入したＣＯＳ細胞におけるＮｌｅＰＴＨによる細胞内遊離カルシウムの刺激を示すグラフである。
【図１１】図１１はＯＫ−Ｏを移入したＣＯＳ細胞へのＰＴＨｒＰの結合を示すグラフである。
【図１２】図１２はＯＫ−Ｏを移入したＣＯＳ細胞におけるＮｌｅＰＴＨによる細胞内遊離カルシウムの刺激を示すグラフである。
【図１３】図１３はＲ１５Ｂを移入したＣＯＳ細胞へのＰＴＨｒＰの結合を示すグラフである。
【図１４】図１４はＲ１５Ｂを移入したＣＯＳ細胞におけるＮｌｅＰＴＨによる細胞内遊離カルシウムの刺激を示すグラフである。
【図１５】図１５はＯＫ−Ｈ、ＯＫ−Ｏ、あるいはＲ１５Ｂを移入したＣＯＳ細胞におけるＮｌｅＰＴＨによるイノシトールリン酸代謝の刺激を示すグラフである。
【図１６】図１６はＣＤＭ−８、ＯＫ−Ｈ，Ｒ１５Ｂを移入したＣＯＳ細胞におけるＮｌｅＰＴＨによるサイクリックＡＭＰ刺激を示すグラフである。
【図１７】図１７はヒトの腎臓（ＡとＣ）及びラットの骨（ＢとＤ）のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを一過性に発現しているＣＯＳ細胞への １２５Ｉ−標識ＰＴＨ（１−３４）（ＡとＢ）及び １２５Ｉ−標識ＰＴＨｒＰ（１−３６）（ＣとＤ）の結合を示すグラフである。競合するリガンドには、ＰＴＨ（１−３４）（□）、ＰＴＨｒＰ（１−３６）（＊）、ＰＴＨ（３−３４）（■）、ＰＴＨ（７−３４）（＋）が含まれる。データは特異的結合のパーセントとして示され、少なくとも３つの独立した実験の平均値±標準偏差を表すものである。
【図１８】図１８はヒトの腎臓のレセプターを一過性に発現しているＣＯＳ細胞における細胞内ｃＡＭＰの蓄積刺激を示すグラフである。データは平均値±標準偏差を示し、少なくとも３つの独立した実験を表すものである。
【図１９】図１９はヒトの腎臓（Ａ）とＳａＯＳ−２細胞（Ｂ）から作られた総ＲＮＡ（〜１０μｇ／レーン）のノーザンブロット分析の表示である。ブロットはヒト腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている完全長のｃＤＮＡとハイブリッドを形成した。２８Ｓと１８Ｓのリボソ−ムＲＮＡバンドの位置が示されている。
【図２０】図２０はヒトのゲノムＤＮＡをＳｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ（〜１０μｇ／レーン）で消化したもののサザーンブロット分析を示す。ブロットはヒトの腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている完全長のｃＤＮＡとハイブリッドを形成した。
【図２１】図２１はＲ１５Ｂによってコードされているラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの細胞膜における配置提案の略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の他の特徴と利点は、以下の好適な実施態様の説明と請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１３】
材料と方法
一般：［Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］ｂＰＴＨ（１−３４）アミド（ＰＴＨ（１−３４））、［Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］ｂＰＴＨ（３−３４）アミド（ＰＴＨ（３−３４））及び［Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］ｂＰＴＨ（７−３４）アミド（ＰＴＨ（７−３４））はＢａｃｈｅｍ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡから購入した；［Ｔｙｒ３６］ＰＴＨｒＰ（１−３６）アミド（ＰＴＨｒＰ（１−３６））は記載（Ｋｅｕｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１７：１２３０，１９８５）されているように，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  ４２０Ａを用いて合成した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＥＤＴＡ／トリプシン及びゲンタマイシンはＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）から；牛胎児血清（ＦＢＳ）はＨｉｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｌｏｇａｎ，  ＵＴから入手した。ヒト腎臓の総ＲＮＡはスエーデン、ウプサラ、大学病院のＰｅｒ  Ｈｅｌｌｍａｎｎ氏によって提供された。オリゴヌクレオチドプライマーはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０Ｂ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて合成した。制限酵素類、クレノウ酵素、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡから購入した。子牛アルカリホスファターゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  ドイツから購入した。すべての他の試薬は入手可能の最高純度のものであった。
【００１４】
細胞
使用された細胞には、ＣＯＳ細胞、ＯＫ細胞、ＳａＯＳ−２細胞、ＣＨＯ細胞、ＡｔＴ２０細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞及びＵＭＲ−１０６細胞が含まれ、Ａｍｅｒｉｃａｎｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）、受託番号、夫々、ＣＲＬ１６５０、ＣＲＬ６５５１、ＨＴＢ８５、ＣＣＬ６１、ＣＣＬ８９、ＣＬ１０１及びＣＲＬ１１６１を含む種々の供給源から入手した。ＲＯＳ１７／２及びＲＯＳ  １７／２．８はＧｉｄｅｏｎ  Ｒｏｄａｎ博士（Ｍｅｒｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，  ＰＡ）を含むいくつかの供給源から入手した。ＭＣ−３Ｔ３細胞はマウスの骨細胞から誘導されるが、滋野長平博士（医化学、医学部、京都大学、京都、日本）を含む種々の供給源からも入手出来る。
【００１５】
すべての細胞は湿度９５％の空気、ＣＯ２  ５％を含む気相で培養され、牛胎児血清（Ｍ．Ａ．  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を５％、あるいは、１０％添加したハムＦ−１２培地、あるいはＤＭＥＭ培地（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏ．）で単層培養として維持された。培地は３乃至４日ごとに交換され、細胞は２乃至３週ごとに標準の方法を用い、トリプシン処理によって継代培養された。
【００１６】
クローニング
ラット及びオポッサムのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしているｃＤＮＡクローンの分離：
総ＲＮＡは、最初にラットの骨肉腫（ＲＯＳ）細胞（ＲＯＳ  １７／２．８）とオポッサムの腎臓（ＯＫ）細胞から、グアニジンイソチオシアネートを用いる標準法（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：  １３１３，１９７７；  Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：  ５２９４，１９７９）と塩化セシウム密度勾配遠心法（Ｇｉｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：  ２６３３，１９７４）によって分離された。次いでポリＡ＋ＲＮＡｓ（ｍＲＮＡｓ）は、ＡｖｉｖとＬｅｄｅｒ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：１４０８７，  １９７２）の方法により、総ＲＮＡｓをオリゴｄＴカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を通した後回収された。ＲＯＳ  １７／２．８  ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーは、ポリＡ＋ＲＮＡからＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）  ２５：  ２６３，  １９８３）の方法を用いて作られた。オリゴｄＴをプライマーとする、及びランダムプライマーをプライマーとするｃＤＮＡは、夫々、ポリＡ＋ＲＯＳ  １７／２．８及びＯＫ細胞のｍＲＮＡから合成された（ＡｖｉｖとＬｅｄｅｒ，前記）。ｃＤＮＡはＢｓｔＸ１リンカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）に連結され、５−２０％の酢酸カリウム密度勾配遠心（３時間、５５，０００ｘｇ）によってサイズ選別が行われた。サイズ選別されたｃＤＮＡは、次いで、非自己アニーリングＢｓｔＸ１制限部位を用いてプラスミドベクター、ｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入された。その結果得られたプラスミドライブラリーは、次に、より大きなヘルパープラスミド、ｐ３を持つＥ．ｃｏｌｉ（ＭＣ１０６１／Ｐ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するのに用いられた。ｐ３プラスミドは、２つの遺伝子にアンバ−変異を持ち、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性をコードしている。アンピシリン及びテトラサイクリンを用いると、ｐ３とｐｃＤＮＡ  Ｉ内に含まれているｔＲＮＡサプレッサー遺伝子の両方を持つ細胞のみが成長することが出来た。変異した細菌は、次いで集密状態まで培養され、プラスミドｃＤＮＡは標準技法（例えば、Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  １９８９を参照のこと）により分離された。これらＤＮＡは、次いでＤＥＡＥ−デキストラン溶液に取り込まれ、予め“サイドフラスコ”（Ｎｕｎｃ、  デンマーク）中で７５％の集密度にまで培養されたアフリカミドリザルの腎臓（ＣＯＳ）細胞に移入するのに用いられた。
【００１７】
ＲＯＳあるいはＯＫ細胞の機能的に完全な副甲状腺ホルモン／副甲状腺ホルモン関連蛋白質（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ）のレセプターを発現する能力のあるプラスミドを含むＣＯＳ細胞のスクリーニングは、Ｇｅａｒｉｎｇらの方法（ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８：  ３６７６，  １９８９）に従い、これにサイドフラスコ中でのＤＥＡＥ−デキストラン移入を含むいくらかの変法を加えて行った。移入して４８時間後、細胞は既述の方法（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：  １０２８，  １９８８）を用い、ただし例外として、インキュベーションの時間と温度は、夫々、２時間と室温に変更して、 １２５Ｉ−標識［Ｔｙｒ３６］ＰＴＨｒＰ（１−３６）アミドとの結合能を検査された。洗浄後、細胞は１．２５％のグルタールアルデヒドで固定され、１％のゼラチンで洗浄された。サイドフラスコの先を折った後、残りの顕微鏡用スライドをＮＴＢ−２写真用乳液（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）に浸した。４℃で３−４日間反応後、スライドは現像、固定され、そして０．０３％のトルエンブルーで染色された。各スライドのスクリーニングは光学顕微鏡（オリンパス）下で行われた。ＲＯＳ細胞からのプラスミド−ＤＮＡの１プール及びＯＫ細胞からのプラスミド−ＤＮＡの２プール、（１０，０００個の独立クローン）から、夫々、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを発現している３−４個の移入されたＣＯＳ細胞が得られた。これらのプールは後に再分割された。サブプールはＣＯＳ細胞に移入するのに用いられ、そして個々のクローンは、放射性リガンドを結合することの出来るレセプター蛋白質を発現たことが確認された。  
【００１８】
ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをエンコードするｃＤＮＡとゲノムＤＮＡクローンの分離
ラムダＧＴ１０中のヒト腎臓のオリゴｄＴをプライマーとするｃＤＮＡライブラリー（１．７ｘ１０６ 独立クローン）及びＥＭＢＬ３（Ｓｐ６／Ｔ７）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）中のヒト胎盤ＤＮＡのゲノムライブラリー（２．５ｘ１０６ 独立クローン）は、３２Ｐ−標識（ランダムプライマーをプライマーとする標識キット、ベーリンガー、マンハイム、ドイツ）されたＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ  １．８ｋｂの制限酵素断片で、ラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコーディング配列の大部分をコードしているものとのプラークハイブリッド形成法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２版、１０８−１１３頁、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ、  １９８９）によってスクリーニングされた（図３）。ニトロセルロースフィルターは、５０％ホルムアミド、４ｘクエン酸ナトリウム生理食塩水（ＳＳＣ；   1ｘＳＳＣ：  ３００ｍＭＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．０）、２ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（最終濃度）を含む前ハイブリッド形成溶液中、４２℃で４時間インキュベートした。ハイブリッド形成は、同じ溶液中で４２℃で１８−２４時間行われた。フィルターは、２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで室温で３０分間、次いで、 1ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４５℃で３０分間洗浄した。フイルムは、増強スクリーンを用い、−８０℃で１８−２４時間、露出した。
【００１９】
各ライブラリーから、約百万個のクローンがスクリーニングされた。陽性のクローンはプラーク法で精製され、ラムダファージＤＮＡが分離された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  上記）。クローン化された挿入断片は、ファージＤＮＡから、制限酵素エンドヌクレアーゼ  ＨｉｎｄＩＩおよびＥｃｏＲＩ（ラムダＧＴ１０ライブラリー）、あるいはＸｈｏＩおよびＳｓｔＩ（ＥＭＢＬ３ライブラリー）を用いて取り出され、次いで適当な脱リン酸化された制限酵素部位を用いてｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）中にサブクローンされた。ＣｓＣｌ２（密度勾配）で精製されたサブクローンの配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７４：５４６３、  １９７７）の方法に従い、ジデオキシ  ターミネーション法（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  バージョン  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  キット、  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）によって行われた。
【００２０】
逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
３μｇのヒト腎臓由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を７３．５μｌの水の中で１００℃で３０秒インキュベートし、氷冷して反応を静め、２０μｌの５ｘＲＴ緩衝液（１ｘＲＴ緩衝液：４０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．２、４０ｍＭＫＣｌ、６．６ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトールと各５ｍＭのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ））、２μｌ（４単位）のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、１μｌ（８０ｐｍｏｌ／μｌ）のヒトｃＤＮＡプライマーＨ１２（５´−ＡＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴ−３´；配列番号：１４）と８０単位のトリ骨髄芽球炎ウイルスの逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓｔ．  Ｐｅｒｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＦＬ）に加えた。反応混合物を４２℃で４０分間インキュベートした。次いで、１０分の１容の最初の鎖を合成する反応混合物は、ＰＣＲにより、３ｍＭＭｇＳＯ４ 、２００μＭのｄＮＴＰ、２単位のＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）と各２μＭの正方向と逆方向のプライマー（ＰＣＲの条件：変性、１分間、９４℃；アニーリング、１分間、５０℃；延長、７２℃で３分間；４０サイクル）を含む最終容量１００μｌの中で増幅された。
２つの独立したＰＣＲは、以下の２つの異なった正方向のプライマーを用いて行われた：ｉ）２つの以前にクローン化されたＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター
Ｇ    ＣＣ
（上述）コーディング末端に基づく変性プライマーＲＫ−１（５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＣＣＣＧＧＡＴ−３´；配列番号：１５）、及び、ｉｉ）ヒトゲノムクローンＨＰＧ１の５´−非コーディング領域に基づくプライマーＲＫ−２（５´−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＧＣＧＧＴ−３´；配列番号：１６）。両ＰＣＲ反応はヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのコーディング領域の７１３〜７３１番目のヌクレオチドを現す逆プライマーＨ２６（５´−ＡＧＴＡＴＡＧＣＧＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡ−３´）を用いた（図４）。ＰＣＲの生成物はクレノー酵素により末端を平滑にされ、ＥｃｏＲＶで切断されて、脱リン酸されたｐｃＤＮＡＩにクローン化された。
【００２１】
ノーザンブロット分析：総ＲＮＡはＳａＯＳ−２細胞及びヒト腎臓からグアニジウムチオシアネート法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：５２９４，  １９７９）によって抽出された。ノーザンブロット分析のため、〜１０μｇの総ＲＮＡが１．５％／３７％ホルムアルデヒドゲル上での電気泳動にかけられ、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ，  Ｋｅｅｎｅ，  ＮＨ）にブロットされた。ハイブリッド形成条件はファージライブラリースクリーニングの条件と同じであった（上記参照）。フィルターは、０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの最終洗浄条件で３０分間、６０℃で洗浄し、オートラジオグラフィ−のために露出した。
【００２２】
サザンブロット分析：ヒトゲノムＤＮＡはＳＤＳ／プロテイナーゼＫ法（Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：３２，  １９７３）を用いて生成された。サザーン分析のため、〜１０μｇのＤＮＡがＳｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ及びＸｈｏＩによって消化され、０．８％アガロースゲル上の電気泳動にかけられ、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌ，  Ｋｅｅｎｅ，  ＮＨ）にブロットされた。ハイブリッド形成条件はファージライブラリースクリーニングの条件と同じであった（上記参照）。フィルターは、０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの最終洗浄条件で３０分間、５５℃で洗浄し、オートラジオグラフィーのために露出した。
【００２３】
機能分析
ＣＯＳ細胞に発現されたクローン化レセプターの機能的諸性質を特徴づける試験には以下のものが含まれた：
Ｉ）ＰＴＨとＰＴＨｒＰの断片及び類似体の結合、
ＩＩ）ＰＴＨとＰＴＨｒＰの断片及び類似体によるサイクリックＡＭＰ蓄積の刺激、
ＩＩＩ）ＰＴＨとＰＴＨｒＰの断片及び類似体による細胞内の遊離カルシウムの増大、及び
ＩＶ）ＰＴＨとＰＴＨｒＰの断片及び類似体によるイノシトールリン酸代謝の活性化。方法論は次の通りである：
【００２４】
ラジオレセプターアッセイ
［Ｎｌｅ８ ，Ｎｌｅ１８，Ｔｙｒ３４］ｂＰＴＨ−（１−３４）アミド（ＮｌｅＰＴＨ）及び［Ｔｙｒ３６］ＰＴＨｒＰ（１−３６）アミド（ＰＴＨｒＰ）は  Ｎａ １２５Ｉ（担体なし、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）により既報（Ｓｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２５４：６９８０，  １９７９）に従ってヨード化され、逆相ＨＰＬＣによって精製された。簡略に述べると、標識されたペプチドは０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶かされ、Ｃ１８Ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）にかけられ、０．１％ＴＦＡ中６０％アセトニトリル溶液によって溶出された。凍結乾燥後、ラジオリガンドは、次いで、Ｃ１８−μＢｏｎｄａｐａｋカラム（３．９ｍｍｘ３０ｃｍ。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）にかけられ、０．１％ＴＦＡ中３０−５０％のアセトニトリルの直線密度勾配を用い、２ｍｌ／分の流速で３０分かけて溶出した。ラジオリガンドは、２つのピ−クに別れて溶出した；最初のピークは約３８％のアセトニトリルのところで溶出し、より高い総結合と特異的結合を示したので、この研究に用いられた。比活性は５００±７５ｍＣｉ／ｍｇで、これは平均のヨード−ペプチド比１に相当する。
【００２５】
ＣＯＳ−７細胞は１５ｃｍのプレートで、ＤＭＥＭ、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン中、８０−９０％の密集度まで培養された。ＤＥＡＥ／デキストラン法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記）により１−２μｇのプラスミドＤＮＡを移入した２４時間後、細胞をトリプシン処理し、多穴プラスチック皿（直径１６あるいは３５ｍｍ、Ｃｏｓｔａｒ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）に、細胞濃度５ｘ１０４  細胞／ｃｍ２  で再配分した。細胞数は移入後わずかに増加したのみであった。更に培養を４８時間続けた後、ラジオレセプターアッセイが行われた。培養培地は、研究開始直前、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．７）、１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ２ 、５ｍＭＫＣｌ、０．５％熱変性牛胎児血清（ＧＩＣＢＯ）、５％熱変性ウマ血清（ＫＣ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，  Ｌｅｎｅｘａ，  ＫＳ）を含む緩衝液と交換された。特に指示のない限り、研究は、細胞をこの緩衝液中、１５℃、４時間、４ｘ１０5 ｃｐｍ／ｍｌ（９．６ｘ１０−１１ Ｍ）の １２５Ｉ−標識のＮｌｅＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰとインキュベートして行われた。
【００２６】
インキュベーションは、緩衝液を吸引除去し、粘着性細胞を含む培養皿を０．９％ＮａＣｌ溶液で繰り返し（３回）、１５秒間にわたって洗浄することによって終焉させた。細胞に結合した放射能は、各ウエルに連続（３回）１ＮＮａＯＨ（２００μｌ）を加えることによって回収された。室温で３０分後、このＮａＯＨはガラス管に移された。二回目、三回目の１ＮＮａＯＨ（２００μｌ）による抽出を、一回目のものと合わせ、総放射能はγ−スペクトロメター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，  ＩＬ）で測定された。細胞を含まぬ培養皿へのトレイサーの付着は、たとえ容器が培養培地とプレインキュベーションされても、無視出来る程度であった（加えられた総カウントの０．２％以下）。
【００２７】
ｃＡＭＰ蓄積の測定
細胞内ｃＡＭＰの蓄積は既述（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１１２９，  １９８６）のようにして測定された。２４穴プレート内の細胞を０．１％ＢＳＡと２ｍＭＩＢＭＸを含む培地で洗浄した。次いで、細胞はＰＴＨまたはＰＴＨｒＰと１５分間、３７℃でインキュベートした。上清を除き、細胞は直ちにプレート全体をドライアイス粉末中に置くことによって凍結した。細胞内ｃＡＭＰは１ｍｌの５０ｍＭＨＣｌ中で細胞を融かすことによって抽出され、抗ｃＡＭＰ抗体（例、Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を用い、特異的ラジオイムノアッセイによって分析された。ｃＡＭＰの代わりにトレーサーとして用いられたｃＡＭＰ類似体（２´−Ｏ−モノサクシニル−アデノシン３´：５´−サイクリックモノリン酸トシルメチルエステル、Ｓｉｇｍａより購入）は、クロラミンＴ法によりヨウ素化された。遊離のヨウ素は、ヨウ素化されたｃＡＭＰ類似体をＣ１８Ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）に吸着することによって除去した。
ｄＨ２Ｏで洗浄後、ヨウ化ｃＡＭＰ類似体はＳｅｐ−ｐａｋカートリッジから４０％アセトニトリル（ＡＣＮ）と０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって溶出された。ヨウ化ｃＡＭＰ類似体は凍結乾燥され、１ｍｌの０．１％ＴＦＡにもどし、Ｃ１８逆相ＦＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に注入された。カラムを０．１０％ＡＣＮの１％ＴＦＡ溶液で平衡化し、０．１％ＴＦＡ中、１０−３０％ＡＣＮの密度勾配で溶出した。この操作によりモノヨウ化ｃＡＭＰ類似体を、非ヨウ化ｃＡＭＰ類似体から分離することが可能となる。トレーサーは−２０℃で保存する時は、４ヶ月までは安定である。アッセイに用いられた標準品、アデノシン３´，５´りん酸はＳｉｇｍａから購入した。試料（１−１０μｌのＨＣｌ抽出液）あるいは標準品（０．０４−１００ｆｍｏｌ／チュ−ブ）を５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で希釈し、トリエチルアミンと無水酢酸の混合物（容量比  ２：１）１０μｌでアセチル化した。アセチル化後、ｃＡＭＰ抗血清を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ及び１％正常ウサギ血清中に作られた原液（１：４０００）から加えた。トレーサーは、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈して加えられた（２０，０００ｃｐｍ／チューブ）。アッセイは４℃で一晩インキュベートした。結合したトレーサーは１００μｌのヤギの抗ウサギ抗血清（１：２０、ＰＢＳ中）及び１ｍｌの７％ポリエチレングリコール（分子量５０００−６０００）を加えて沈殿させ、２０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心した。上清を除き、結合した放射能をγ−カウンター（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ）で測定した。標準曲線はＭｉｃｒｏｍｅｄｉｃから提供された４−パラメーターＲＩＡプログラムを用いて算定した。典型的な例では、アッセイ感度は０．１ｆｍｏｌ／チューブで、トレーサーの５０％を置換する標準濃度は５ｆｍｏｌ／チューブである。
【００２８】
ｃＡＭＰ蓄積をアッセイする別法では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡを移入されたＣＯＳ細胞は、プラスチックポリスマンによって、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭＭｇＣｌ、０．５ｍＭエチレングリコールビス（２−アミノエチル）Ｎ，Ｎ´−四酢酸（ＥＧＴＡ）（Ｓｉｇｍａ）と１ｍＭジチオトレイトール（Ｓｉｇｍａ）を含む溶液中に集められる。細胞は緊密に合ったダウンスホモジェナイザーの２０ストロークでホモジェナイズし、１３，０００ｘｇで１５分間４℃で遠心する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，  ５４１２型，  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｓｔｂｕｒｇ，  ＮＹ）。原形質膜を含むペレットはダウンスホモジェナイザーで数ストロークにより同じ緩衝液に再度懸濁し、更に同緩衝液で希釈して蛋白質濃度を、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．１９３：  ２６５，  １９５１）で測定して約１．２ｍｇ／ｍｌとする。約３０μｇ（２５μｌ）の膜を、種々の濃度のホルモン、または媒体のみと１０分間、３７℃（最終容量、１００μｌ）で、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．８ｍＭＡＴＰ、４ｘ１０６ ｃｐｍ［α−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）、９ｍＭテオフィリン、４．２ｍＭＭｇＣｌ２ 、２６ｍＭＫＣｌ、０．１２％ＢＳＡ、及び５ｍＭクレアチンりん酸（Ｓｃｈｗａｒｔｚ／Ｍａｎｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ，  ＮＹ）とクレアチンホスホキナーゼ（Ｓｃｈｗａｒｔｓ／Ｍａｎｎ）を含むＡＴＰ再生系とインキュベートする。インキュベーションは、膜懸濁液を加えることによって開始され、１００μｌの２０ｍＭｃＡＭＰ、約５０，０００ｃｍｐの［  ３Ｈ］ｃＡＭＰと８０ｍＭＡＴＰを含む溶液を加えることによって終了させる。反応混合物を煮沸し、生成された［３２Ｐ］ｃＡＭＰはイオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０  Ｗ−Ｘ４，Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＣＡ）とアルミナ（Ｓｉｇｍａ）上の連続カラムクロマトグラフィーによって精製される。［３２Ｐ］ｃＡＭＰはβ−シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）で、［３２Ｐ］ｃＡＭＰの回収に対する補正をして測定される。
【００２９】
細胞内遊離カルシウムの測定
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡを移入された細胞の細胞内カルシウムレベルの測定は、Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（Ｆｕｒａ−２のアセトメトキシエステル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）を負荷した細胞を用いて行われた。方法論の詳細は以下の通りである：
ＣＯＳ細胞を塗布したカバーガラスを、Ｆｕｒａ−２  ＡＭを負荷し、以下のものを含む（ｍＭ濃度）緩衝液中でインキュベートした：ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ´−［２−エタンスルホン酸］），２０；ＣａＣｌ２ ，１；  ＫＣｌ，５；  ＮａＣｌ，１４５；  ＭｇＳＯ４ ，０．５；ＮａＨＣＯ３ ，２５；  Ｋ２ＨＰＯ４，１．４；  グルコース，１０；およびＦｕｒａ−２  ＡＭ（１−［２−（５´−カルボキシオキサゾール−２´−イル）−６−アミノベンゾフラン−５−オキシ］−２−（２´−アミノ−５´−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル），０．５；  ３７℃でｐＨ７．４、９５％空気と５％ＣＯ２ とを４５分間通した。Ｆｕｒａ−２  ＡＭを負荷した細胞は、次いで、以下のものを含む（ｍＭ濃度で）修正クレブス・ヘンゼライト（ＫＨ）緩衝液で洗浄した：  ＨＥＰＥＳ、  ２０；  ＣａＣｌ２ ，  １；  ＫＣｌ，  ５；  ＮａＣｌ，  １４５；ＭｇＳＯ４ 、  ０．５；  Ｎａ２ＨＰＯ４ ，  １；  グルコース、  ５；  ｐＨ７．４。エステルの開裂が起きたことをチェックするために、Ｆｕｒａ−２  ＡＭインキュベーション後、時間を変えて励起スペクトルを測定した。インキュベーション開始後５分で、励起スペクトルは約３６０ｎｍにピークがあり、Ｆｕｒａ−２  ＡＭの不完全な加水分解を反映していたが、３０分を越えると、励起スペクトルはＦｕｒａ−２の特徴である約３４５ｎｍにピークがあった。
個々の細胞の蛍光を測定するために、カバーガラスを顕微鏡の組織チャンバー（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ＭＤ）に置いた。チャンバーは、シリコンラバーシールを持つテフロン製の浅い、傾斜のついたコンパートメントからなっていた。カバーガラスはチャンバーの底の役割をした。カバーガラスを所定の場所に密着させるシリコンラバーには、ヒーター／クーラーリングが封じ込められていた。温度はヒーターに０−７．４ボルトを加えることによって、２２℃〜３７℃の間で変動させた。温度を特定しない限り、実験は３７℃で施行された。チャンバーは倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＩＭ−３５，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，  ＮＹ）の載物台に載せた。Ｆｕｒａ−２の蛍光のために、コンデンサー（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｔｅｎａｔｉｏｎａｌ（ＰＴＩ）  Ｉｎｃ．，  ＮＪ）の焦点におかれた７５ワットのキセノンアーク灯で励起された。鏡板が透過光分割器と交番する回転チョッパーによって交番される回折格子単色光分光器が、波長選定に使用された。単色光分光器の出力は結集されて一本の共通の光路を形成し、調節可能な虹彩を通して発光源のハウジングを励起した。次いで、光は石英レンズを、そして１００倍のニコン蛍光対物レンズを通して二色性の鏡を通過した。光量子計算ＰＭＴ装置による検出が光の出力測定に使用された。データの分析は、ＭＳ−ＤＯＳ操作系を用いるＩＢＭ互換性ＡＴ／２８６コンピュータにＰＴＩソフトウエアを使用して行った。データは圧縮二者択一性形式に保存、操作された。
【００３０】
細胞内のカルシウム濃度は次式に従って計算された：  ［Ｃａ２＋］ｉ＝Ｋｄ（Ｒ−Ｒｍｉｎ）／（Ｒｍａｘ−Ｒ）Ｂ、ここで、Ｒは３４０と３８０ｎｍにおける細胞の蛍光の比であり；ＲｍａｘとＲｍｉｎは、夫々、飽和量のカルシウムと実際上ゼロのカルシウムの存在下の、Ｆｕｒａ−２の３４０と３８０ｎｍ励起波長における蛍光強度の比であり；Ｂは３８０ｎｍにおけるゼロカルシウム存在下のＦｕｒａ−２の蛍光の、飽和量のカルシウム存在下の蛍光に対する比であり；ＫｄはＦｕｒａ−２のカルシウムに対する解離常数である。Ｒｍａｘを測定するために、実験の終末にイオノマイシンをＦｕｒａ−２を負荷した細胞に加えて細胞外（１ｍＭ）と細胞内環境の間のＣａ２＋を平衡化した。次いで、Ｒｍｉｎを計算するために、１ｍＭのＥＧＴＡを細胞浸液に加えた。異なった温度では異なった解離常数が用いられた：  ３４−３７℃においては２２４ｎＭ、及び２４−２７℃においては１３５ｎＭである。
【００３１】
イノシトールりん酸の測定
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを移入されたＣＯＳ細胞におけるイノシトールりん酸の代謝レベルは既報の方法を用いて測定された（Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６５：  ４９３４，  １９９０）。
【００３２】
結果
分子的性質
２つの別個のクローン（ＯＫ−Ｈ及びＯＫ−Ｏ）は、ともにＯＫ細胞のｃＤＮＡライブラリーから分離されたが、およそ２キロベースの長さを持っていた。これらのクローンの決定されたヌクレオチド配列と予想されるアミノ酸配列は、夫々、図１（配列番号：１）及び図２（配列番号：２）に示されている。ＲＯＳ細胞のｃＤＮＡライブラリーから分離されたＲ１５Ｂクローンは、およそ４キロベースの長さであった。ラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの決定されたヌクレオチド配列と予想されるアミノ酸配列は図３（配列番号：３）に示されている。
【００３３】
３つのｃＤＮＡクローンは、イニシエーターメチオニンとして有望な候補者と予想されるメチオニン残基をコードしているコドンを持つという範疇によって完全な長さのものと思われる。これらメチオニンコドンの後ろには、“シグナル−ペプチド”配列であることを示唆する性質を持つアミノ酸配列（ＤＮＡから演繹して）が続く。３つのレセプターｃＤＮＡはすべて、Ｇ−蛋白質関連のレセプターに典型的なモデル、推定の７回−貫膜モデルへの“適合”を可能にする位置に終止コドンを持つ。最も重要なことは、３つのクローン化されたレセプターが、すべて、リガンドと結合して活性化された時、細胞内のエフェクターを活性化する能力を有することである。これらの諸性質は、分離された３つのクローンすべてが、完全長のｃＤＮＡをエンコードすることを示唆する。
【００３４】
図４は、ＯＫ−Ｏ及びＲＯＳ  １５ＢからのｃＤＮＡによってコードされているアミノ酸配列間の高度の相同性を示す。これら２つのレセプター間には、全体で８７％の相同性があり、７７．８％のアミノ酸の一致がある。このアミノ酸の長い範囲にわたっての高度の一致は、ＰＴＨレセプターのアミノ酸配列が進化の上で高度に保持されていることを証明している。これは、ＯＫ−ＯとＲ１５Ｂ両者からのデータをヒトを含む他の動物種に外挿することを可能にする。
【００３５】
図５は、３つのクローン化されたｃＤＮＡすべての推定アミノ酸配列を配列相同性に従って一線に整列させたものである。ＯＫ−Ｈ配列はＯＫ−ＯとＣ−末端尾部を除き同一である。ここでＯＫ−Ｏ配列は全部で５８５アミノ酸残基を持つが、ＯＫ−Ｈ配列は５１５アミノ酸で止まっている。これは、ＯＫ−Ｏ配列と比べてＯＫ−Ｈ配列に欠けているただ１個のヌクレオチド（Ｇ）に起因し、前者におけるフレ−ムシフトと早期の終止コドンの原因となっている。ＯＫ−ＯとＯＫ−Ｈが２つの別個の遺伝子の産物か、あるいは実験室の人為産物かは不明である。
【００３６】
Ｇ蛋白質に共役したレセプターのいくつかは、イントロン無しの遺伝子によってコードされている（Ｋｏｂｉｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：７５，  １９８７；  Ｋｏｂｉｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６２：７３２１，  １９８７；  Ｈｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  ６：７０，  １９９２；  Ｋｏｂｉｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：６５０，  １９８７；  Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：５２７，  １９８７；  Ｓｕｎａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：８０，  １９９０）。ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡを単離するために、ヒトｃＤＮＡライブラリーとヒトゲノムライブラリーの両者を、ラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのコーディング領域の大部分を代表するプローブ（ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ）を用いてスクリーニングした（図３）。ヒト腎臓のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの結果、クローンＨＫ−１が分離されるに至った（図６）［配列番号：４］。ラムダＧＴ１０の２つのＥｃｏＲＩクローニングサイトの１つが、ライブラリー構成の結果、除去されたことが判明したので、ｃＤＮＡ挿入断片及び３７ｋｂ（左）ラムダアームの〜２５０ｂｐを含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩファージ断片をｐｃＤＮＡＩの相当する制限部位にサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定の結果、クローン化されたｃＤＮＡは、３´コーディング領域の〜１０００ｂｐと、Ａの多い３´−末端を含む３´非コーディング領域の〜２００ｂｐを含むことが判明した。ＸｈｏＩ部位に対する５´側コーディング領域は、次いでライブラリーを再スクリーニングするのに使用され、クローンＨＫ−２の分離を導いたが、これは、ｐｃＤＮＡＩへのサブスクリーニング後、コーディング領域の〜１４００ｂｐを含むことが判明した。ライブラリーの第三のスクリーニングに対しては、ＨＫ−２のＰｖｕＩＩ／ＰｓｔＩが用いられた；  分離されたクローンＨＫ−３はＨＫ−２と同一であることが判明した。
【００３７】
ゲノムライブラリーのスクリーニング（〜１０６   ｐｆｕ）の結果、４つの独立したクローンが分離された。これらのクローンの制限酵素消化断片のサザーンブロット分析を正常ゲノムＤＮＡのそれとの比較した結果、１つの１５ｋｂのゲノムクローン、ＨＰＧ１（また、ＨＧ４Ａとも呼ばれる）は、ＳｓｔＩで消化された正常のヒトゲノムＤＮＡからの、ハイブリッドを形成するＤＮＡ種と同じサイズのＳｓｔＩ／ＳｓｔＩ断片を含むことが判明した（下記参照）。ＳｓｔＩ／ＳｓｔＩ断片を構成するハイブリッドを形成する２．３ｋｂのＳｓｔＩ／ＳｓｔＩＤＮＡ断片と、〜８ｋｂＸｈｏＩ断片は、共にｐｃＤＮＡＩにサブクローニングされた。さらにＳｓｔＩ／ＳｓｔＩＤＮＡ断片のサザーンブロット分析の結果、ある〜１０００ｂｐのＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩ断片がヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの一部をコードしており、これが、後に、推定のシグナルペプチドと〜１０００ｂｐのイントロンによって中断されている５´−非コーディング領域をコードしているエキソンを代表していることが判明した（図７）。
【００３８】
コーディング領域の残る〜４５０ヌクレオチドを分離するために、ヒト腎臓からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＨ１２でプライミングの後、逆転写した（図７）。一本鎖合成後、２つの独立したＰＣＲを以下の２つの別個の正方向プライマーを用いて行った：  ｉ）２つの以前にクローン化されたＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター、ＯＫ−ＯとＲ１５Ｂの５´−コーディング末端に基づく変性プライマーＲＫ−１，及び、ｉｉ）ＨＰＧ１の５´−非コーディング領域に基づくプライマーＲＫ−２である。Ｈ−２６が両反応の逆プライマーとして用いられた。サザーンブロットおよび制限地図分析によって、ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている増幅されたＤＮＡの予想されたサイズが確認された。ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰの５´−末端をコードしている平滑末端のＰＣＲ生成物は、脱リン酸されたＥｃｏＲＶ部位を用いてｐｃＤＮＡＩにクローン化された。各ＰＣＲクローンの配列分析によって、それらの５´ヌクレオチドの違いは正方向プライマーの配列の違いによることが確認されたが、それ以外は同一の配列であることが明らかとなった。ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡの両鎖のヌクレオチド配列決定により、５９３アミノ酸残基を持つ蛋白質をコードしている開放読取り枠が明らかとなった（図６、配列番号：４）。
【００３９】
完全長のヒト腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡ、ＨＫｒｋは、ＰＣＲクローン＃２とＨＫ−２のＢａｍＨＩ／ＰｖｕＩＩ断片を用いて構成された。ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターをコードしている完全長のｃＤＮＡを用いて、ヒト腎臓とＳａＯＳ−２細胞からの総ＲＮＡ（〜１０μｇ／レーン）のノーザンブロット分析の結果、〜２．５ｋｂの１つの主要なハイブリッドを形成するＤＮＡ種が明かにされた（図１９）。正常のヒトゲノムＤＮＡのＸｈｏＩ消化物は、同じ完全長のｃＤＮＡ（図２０）でプローブされると、１つの主要な約５．５ｋｂのハイブリッドを形成する種と、弱くハイブリッドを形成する４と８ｋｂの２つのＤＮＡ種が現れた。これらのデータは、ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターが単一の遺伝子の産物であることを示唆している。完全長のクローンは、次いで、機能的及び生物学的諸性質検討のため、上述の方法によりＣＯＳ細胞に一過性に発現された。
【００４０】
ヒトのレセプターのオッポサム腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター及びラット骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターとの比較により、夫々、８１％と９１％のアミノ酸配列の同一性が明らかになり、結果として非常に類似した疎水性プロットを示した（図８）。すべての細胞外システインは、推定シグナルペプチドにおける２つのシステイン残基を含めて、すべての可能性のある細胞外のＮ−グルコシル化部位のように、保存されている。ヒトの腎臓とラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰの間で同一でないアミノ酸のいくつかは、ヒトとオポッサムのレセプターの間では保存されていることが判明した。これらの保存されているアミノ酸残基は、５１位のＡｒｇからＬｅｕ、５８位のＡｒｇからＴｒｐ、２６２位のＡｒｇからＨｉｓ、３５８位のＡｓｐからＨｉｓ、４２２位のＩｌｅからＴｈｒ、及び、４２７位のＴｈｒからＬｅｕである。
【００４１】
生物学的諸性質の検討
オポッサムとラットのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの生物学的性質の機能的特性の検討は一過性に移入されたＣＯＳ細胞において、放射性リガンドとして   １２５Ｉ−ＰＴＨｒＰと １２５Ｉ−ＮｌｅＰＴＨの両方を用いるラヂオレセプターアッセイ法により、また、リガンドによるｃＡＭＰの蓄積、細胞内遊離カルシウムの増加、及びイノシトールりん酸代謝の促進を測定するバイオアッセイにより、上記の方法によって行われた。
【００４２】
図９はＯＫ−Ｈを発現しているＣＯＳ細胞が、 １２５Ｉ−ＰＴＨｒＰを結合することを示している。これらのデータは、また、無傷のＰＴＨ（１−３４）、またはアミノ末端で短縮されている（即ち、３−３４及び７−３４類似体、これらは８位と１８位にメチオニンの代わりにＮｌｅ置換を、そして３４位のフェニルアラニンの代わりにチロシン置換を持っている）ＰＴＨ類似体が結合の競合阻害剤として用いられた場合、ＰＴＨｒＰの結合が阻害されることを示している。同様に、ＯＫ−Ｈを発現しているＣＯＳ細胞への １２５Ｉ−ＮｌｅＰＴＨの結合は、ＰＴＨｒＰあるいはＰＴＨｒＰ断片が競合阻害剤として用いられた時、阻害された。これらのデータは、ＰＴＨとＰＴＨｒＰは共にＯＫ−Ｈによってコードされているレセプターに結合することを示唆している。
【００４３】
図１０は、ＯＫ−Ｈを発現しているＣＯＳ細胞が、ＮｌｅＰＴＨに暴露されると細胞内の遊離カルシウムの濃度を増大するが、ＯＫ−ＯあるいはＲ１５Ｂレセプターを発現し（図１２と図１４）、ＮｌｅＰＴＨで刺激されているＣＯＳ細胞と比べると、増加は程度が低いか（平均＝３９ｎｍ）、あるいは全く無いことを示している。ＯＫ−ＯあるいはＲ１５Ｂを発現しているＣＯＳ細胞とは異なり、ＯＫ−Ｈを発現しているＣＯＳ細胞はＮｌｅＰＴＨで刺激された時、イノシトールりん酸の代謝の増加は検出されない（図１５）。
【００４４】
図１１はＯＫ−Ｏを発現しているＣＯＳ細胞が、 １２５Ｉ−ＰＴＨｒＰを結合することを示している。これらのデータは、また、ＰＴＨｒＰの結合が、無傷のＰＴＨ（１−３４）、またはアミノ末端で短縮されている（即ち、３−３４及び７−３４類似体、これらは８位と１８位にメチオニンの代わりにＮｌｅ置換を、そして３４位にフェニルアラニンの代わりにチロシン置換を持つ）ＰＴＨ類似体が結合の競合阻害剤として用いられた場合、阻害されることを示している。同様に、ＯＫ−Ｈを発現しているＣＯＳ細胞への １２５Ｉ−ＮｌｅＰＴＨの結合は、ＰＴＨｒＰあるいはＰＴＨｒＰ断片が競合阻害剤として用いられた時、阻害された。これらのデータは、ＰＴＨとＰＴＨｒＰが共にＯＫ−Ｏによってコードされているレセプターに結合することを示唆している。
【００４５】
図１２はＯＫ−Ｏを発現しているＣＯＳ細胞が、ＮｌｅＰＴＨとＰＴＨｒＰによる刺激後、細胞内の遊離カルシウム濃度及びイノシトールりん酸の代謝速度を増大することを示している（図１５）。
【００４６】
図１３はＲ１５Ｂを発現しているＣＯＳ細胞が、 １２５Ｉ−ＰＴＨｒＰを結合することを示している。これらのデータは、また、ＰＴＨｒＰの結合が、無傷のＰＴＨ（１−３４）、またはアミノ末端で短縮されている（即ち、３−３４及び７−３４類似体、これらは８位と１８位にメチオニンの代わりにＮｌｅ置換を、そして３４位にフェニルアラニンの代わりにチロシン置換を持つ）ＰＴＨ類似体が結合の競合阻害剤として用いられた場合、阻害されることを示している。同様に、ＯＫ−Ｈを発現しているＣＯＳ細胞への １２５Ｉ−ＮｌｅＰＴＨの結合は、ＰＴＨｒＰあるいはＰＴＨｒＰ断片が競合阻害剤として用いられた時、阻害された。これらのデータは、ＰＴＨとＰＴＨｒＰが共にＲ１５Ｂによってコードされているレセプターに結合することを示唆している。
【００４７】
図１４は、Ｒ１５Ｂを発現しているＣＯＳ細胞が、ＯＫ−Ｏを発現しているＣＯＳ細胞が刺激された場合と同程度に細胞内カルシウム濃度を増大することを示している。
【００４８】
図１５は、Ｒ１５ＢあるいはＯＫ−Ｏを発現しているＣＯＳ細胞が、ＮｌｅＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰによる細胞の刺激後、イノシトール三りん酸（ＩＰ３ ）とイノシトール二りん酸（ＩＰ２ ）蓄積の急速な増加によって証明されるように、フォスファチジルイノシトールの加水分解速度を増大することを示している。逆に、ＯＫ−Ｈを発現しているＣＯＳ細胞は、ＮｌｅＰＴＨ、あるいはＰＴＨｒＰによる刺激後も、イノシトール三りん酸とイノシトール二りん酸の蓄積にいかなる増加も検出出来なかった。これらのデータは、Ｒ１５ＢとＯＫ−ＯによってコードされているＰＴＨレセプターはホスホリパーゼＣに、恐らくＧｐ を介して共役していることを示唆する。ＯＫ−ＯとＯＫ−Ｈの間の唯一の違いはＣ末端尾部にあるので、これらのデータはＯＫ−ＯとＲ１５ＢによってコードされているＰＴＨレセプターのＣ末端はホスホリパーゼＣの活性化に関与していることを強く示唆する。
【００４９】
図１６は、Ｒ１５ＢとＯＫ−Ｈを発現しているＣＯＳ細胞が、ＮｌｅＰＴＨによる刺激後、ｃＡＭＰ蓄積を増大することを示している。同様の結果は、ＯＫ−Ｏを発現しているＣＯＳ細胞においても得られた。ｃＤＭ１８ベクターのみを移入されたＣＯＳ細胞ではｃＡＭＰ刺激は認められなかった。これらのデータは、アデニル酸シクラーゼに共役しているＰＴＨレセプターは、レセプターのＣ末端の細胞質側の完全長の尾部を必要としないことを示唆している。これらのデータは、ＯＫ及びＲＯＳ細胞のｃＤＮＡライブラリーの双方からクローン化された３つのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのすべてが、両ペプチドのアミノ末端リガンドを同等に結合することを示唆している。リガンドによるこれらすべてのレセプターの活性化は、アデニル酸シクラーゼを、恐らくはグアニンヌクレオチド結合蛋白質（Ｇ−蛋白質）の１つの活性化を通じて、刺激する（細胞内ｃＡＭＰの増加によって測定されるように）。Ｇ−蛋白質は、三量体ペプチド構造を持ち、そのうち、サブユニットの１つ、アルファーは、夫々、別個であるが、他の２つ、ベーターとガンマは同一か、または相同性が高い。これらＧ−蛋白質の１つ、（ＧＳ ）はＧ−アルファー“刺激性”（Ｇ−アルファーｓ）を含み、これはアデニル酸シクラーゼの活性化に関与する。
【００５０】
リガンドのＯＫ−Ｈへではなく、ＯＫ−ＯとＲ１５Ｂへの結合もまた、細胞内の遊離カルシウムを増加してイノシトールりん酸の代謝を刺激する。これらの性質は、ＯＫ−ＯとＲ１５Ｂレセプターのリガンドによる活性化は、共に第二の細胞内エフェクター、ホスホリパーゼＣの刺激をもたらすことを強く示唆している。これら活性化されたレセプターとホスホリパーゼＣとの共役機構は、ＧＳ とは全く異なるＧ−蛋白質であるらしい。対照的に、カルボキシ末端で切り詰められている活性化されたＯＫ−Ｈレセプターは、活性化された時のその性質が、ホスホリパーゼＣを活性化しないか、あるいはホスホリパーゼＣを効果のない活性化をすることを示唆する。
【００５１】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのカルボキシ末端尾部の生化学的役割は、鋳型としてＲ１５Ｂを、そして４８１位に終止コドンを挿入された上流プライマーとを用いる標準ＰＲＣ技法により、カルボキシ末端短縮ラットレセプターＲ４８０を構成することによって、さらに検討された。簡略に述べると、上流プライマーはラットｃＤＮＡ配列（図３；  配列番号：  ３を見よ）の１４９４−１５１３番のヌクレオチドに基づく合成オリゴヌクレオチドで、これに終止コドンとＸｂａＩクローニング部位が加えられたものであった。３０回のＰＣＲサイクルが行われ、各サイクルは変性９２℃、１分；アニーリング６０℃、１分；延長７２℃１分からなっていた。生成物はＮｓｉＩとＸｂａＩによって切断され、ゲル電気泳動によって精製された。Ｒ１５Ｂは、ＸｂａＩとＮｓｉＩによって順次消化され、精製されたＰＣＲ生成物は、次いで、ＸｂａＩ−ＮｓｉＩで切断されたＲ１５Ｂベクターに連結された。その結果出来たプラスミド、Ｒ４８０は細菌中で増幅され、配列が決定された。
【００５２】
Ｒ４８０は、５９１アミノ酸残基を持つレセプター中のものと同一な４８０のアミノ酸をコードしている。この短縮ｃＤＮＡはＣＯＳ−７（一過性発現）とＣＨＯ細胞（安定発現）に発現された。短縮レセプター、Ｒ４８０と自然型レセプター、ＲＢを発現しているＣＯＳ−７とＣＨＯ細胞は共にＰＴＨ（１−３４）を同等の親和性を持って結合する。活性化されると、Ｒ４８０は、正常型レセプターと同様にＣＯＳ−７とＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ蓄積を刺激した。正常型レセプターとは対照的に、Ｒ４８０はＰＴＨで刺激された時、ＣＯＳ−７細胞、あるいはＣＨＯ細胞にも［Ｃａ２＋］イオンの増加を仲介しなかった。これらのデータは、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターによるホスホリパーゼＣとアデニル酸シクラーゼの活性化に対する分子的要求性はお互いに異なっていることを示唆し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのカルボキシ末端尾部のホスホリパーゼＣとの、しかしアデニル酸シクラーゼとではない、共役における主要な役割を指摘している。勿論、活性化されたＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターが追加のＧ−蛋白質および／または細胞内のエフェクター分子を活性化する可能性もまたある。
【００５３】
クローン化されたヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを移入されたＣＯＳ−７細胞の分析によって、放射標識ＰＴＨ（１−３４）とＰＴＨｒＰ（１−３６）（〜２００，０００  ｃｐｍ）が発現されたレセプターに、Ｒ１５Ｂ（特異的結合：夫々、８．１＋３．５％と７．１＋４．１％）を発現しているＣＯＳ−７細胞に対して観察されたのと同様の効率（特異的結合：夫々、１０．１±３．７％と７．６±６．０％）で結合することが明らかとなった。発現されたヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターは、ラット骨のレセプターよりも２倍高い見掛けのＫｄでＰＴＨ（１−３４）と結合した：  〜５ｎＭ対〜１０ｎＭ（図１７）。しかしながら、それらの高度のアミノ酸相同性にも拘らず、２つのレセプターはＰＴＨ（３−３４）とＰＴＨ（７−３４）に対する親和性に著しい差異を表した。ＰＴＨｒＰ（１−３６）はヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターに対し、ラットのレセプターに対するよりも２から４倍低い親和性を示した（ＨＫｒＫに対する〜３５ｎＭ対Ｒ１５Ｂに対する〜１０ｎＭ）。このことはＰＴＨｒＰ（１−３６）がラジオリガンドとして用いられた時の方が、さらに著明であった。ＰＴＨ（３−３４）及びＰＴＨ（７−３４）に対する親和性は、発現されたＨＫｒＫの方がＲ１５Ｂよりも７から３５倍も高かった（ＰＴＨ（３−３４）に対して、夫々、〜７ｎＭ対〜４５ｎＭ；ＰＴＨ（７−３４）に対して、夫々、〜６０ｎＭ対〜２０００ｎＭ）。いずれかのレセプターを発現しているＣＯＳ細胞において、ＰＴＨ（１−３４）とＰＴＨｒＰ（１−３６）は共に細胞内の遊離カルシウムとｃＡＭＰの蓄積を同程度に刺激した（図１８）。
【００５４】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの関係
ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのアミノ酸配列は、ラット、真獣類動物からの骨ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターと比べて、非常に高度の保存を示すが、オポッサム、有袋動物のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターとの配列の相同性はそれほど著明ではない。オポッサムの腎臓及びラットの骨のレセプターのように、ヒトの腎臓のレセプターは、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰで刺激された時、細胞内のｃＡＭＰと遊離のカルシウムの増加を誘引する。ヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターとオポッサム及びラットの同族体間の高度の相同性にも拘らず、一過性に発現されたヒトのレセプターは、ラットの骨のレセプターとは異なった機能的特徴を持っている。これには、ＰＴＨ（１−３４）に対するやや高い親和性とＰＴＨｒＰ（１−３６）に対する著しく低い親和性が含まれる。より高い親和性はＰＴＨ（３−３４）と特にＰＴＨ（７−３４）に対して認められ、そのヒトのレセプターに対する親和性はラット骨レセプターと比較して約３５倍も高かった。これらの発見は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ類自体の将来の開発に重要な意味を持つかも知れない、それは種得異的な組織は、インビトロでアンタゴニスト（とアゴニスト）の有効性検査に対する適当な組織であることを予言するからである。
【００５５】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの他のレセプターに対する関係
ＰＴＨとＰＴＨｒＰレセプターの生化学的諸性質は、これらがＧ−蛋白質連携の膜レセプターとして知られている膜レセプター分子群のメンバーであることを示唆している。よく調べられているＧ−蛋白質レセプターの構造的特徴は、それらがすべて、数個の連続した疎水性アミノ酸からなる少なくとも７つの領域を持ち、これらの領域の各々が原形質膜を貫通するのに十分な長さのものであることである。
【００５６】
Ｇ−蛋白質連繋の膜レセプターの１つのサブファミリー、糖ペプチドレセプターサブファミリーと呼ばれるものには、糖ペプチドホルモン（甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、及び絨毛性性腺刺激ホルモン）によって結合され、活性化されるレセプターが含まれる。これらのレセプターは、すべて以下のような特徴がある：（１）リガンド結合ドメインの一部またはすべてを含むと思われる広範な推定アミノ末端細胞外ドメイン（３００アミノ酸残基よりも大）を持ち、（２）著しいアミノ酸相同性を、殊に、７つの推定貫膜ドメインに示すことである。もう１つのサブファミリー、アドレナリン作動性／ムスカリン作動性サブファミリーと呼ばれるものには、カテコールアミン、神経筋伝達物質、及びレチノールのような小分子のリガンドによって活性化されるレセプターが含まれる。これらのレセプターは、すべて、特に７つの推定貫膜ドメインにおける著しいアミノ酸相同性に加えて、比較的短い（２５−７５アミノ酸）推定アミノ末端細胞外ドメインが特徴である。これらのレセプターのリガンドによる活性化には、多数の貫膜ドメインの内の少なくとも幾つかが関与すると思われ、レセプターのアミノ末端部が関与するとは思われない。
【００５７】
ラットのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（図３）の推定アミノ酸配列から推論され得るいくつかの構造的特徴は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰが１つのＧ−蛋白質連繋のレセプターであることを示唆している。アミノ末端は、１つの疎水性ドメイン及び３つの連続したロイシン残基を含むシグナルペプチドの特性を示す。この２０−２８アミノ酸残基からなるアミノ酸範囲は、他の糖蛋白質レセプターの細胞外ドメインに先行するアミノ末端のように、リーダー配列として役立つのかも知れない。また、推定貫膜ドメインを代表する７つの疎水性部分の集団がある（図１９）。
【００５８】
オポッサムの腎臓、ラットの骨、及びヒト腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの予想されるアミノ酸配列は、これらがＧ−蛋白質連繋のレセプターサブファミリーのいずれにもうまく当て嵌まらないことを示唆している。ラット及びヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの糖ペプチドレセプター及びアドレナリン作動性／ムスカリン作動性サブファミリーとの全般的相同性はおよそ１０から２０％であるが、貫膜ドメイン内の相同性はこれより幾分高い。後のことは、これらの領域に出て来る疎水性アミノ酸のすべては限られているので、当然のことと予想される。２０％相同性は、これらサブファミリーの夫々のメンバーとして一般に受け入れられているレセプター間で見出だされる相同性よりも遥かに低い。加えて、これらの配列には、限られた領域にさえ、強い相同性（即ち、正確に合っているうアミノ酸配列）として特徴付けられるようなものを持つ部分は全く存在しない。
【００５９】
新たに特性が解明されたセクレチン及びカルシトニンレセプターとの最近の比較（Ｉｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：１６３５，  １９９１；  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１０２２，  １９９１）によって、これらのレセプターとＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの間には３０から４０％の同一性のあることが判明している。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターはカルシトニンレセプターより１００個以上アミノ酸が長いけれども、オポッサム腎臓のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（配列番号：２）とブタ腎臓のカルシトニンレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ  受託番号  Ｍ７４４２０）のアミノ酸配列の間には〜３２％の一致がある。推定貫膜ドメインＶＩＩの１８アミノ酸のうち１７の範囲は同一である。また、４つのＮ−連結グルコシル化部位のうち２つ、及び８つの細胞外システインとして可能性のあるもののうち７つの位置が保存されている。２つのレセプター間の主要な差異は、それらのＮＨ２ −末端とＣＯＯＨ−末端のドメインにあると思われる。ラットのセクレチンレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ  受託番号  Ｘ５９１３２）とヒトのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのアミノ酸配列の比較により、推定貫膜ドメインＶＩＩの２５のアミノ酸のうち２１の範囲が一致していて、これら２つのレセプター間には４３％の相同性のあることが示唆されている。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ、カルシトニン、及びセクレチンのレセプター間の類似性は、こいれらが７回膜貫通のＧ蛋白質に共役してアデニル酸シクラーゼを活性化するレセプターの新しいファミリーを代表することを示唆している。これらレセプターのアミノ酸配列が与えられれば、この道の専門家はこれらの配列を比較し、一致して核酸プローブ設計に役立つ領域を求め、このファミリーに属する他のレセプターの確認と分離に用いることが出来るであろう。
【００６０】
クローンの寄託
特許手続きの目的のための微生物寄託についての国際的承認に関するブダペスト条約の約条の下に、ｃＤＮＡ発現プラスミドＲ１５Ｂ、ＯＫ−Ｏ及びＯＫ−Ｈ；ファージＨＰＧ１；及びヒトのクローンの一部を含むプラスミド（名称８Ａ６）が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）に寄託され、そこでは、夫々の受託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８５７１，６８５７２，６８５７３，４０９９８，及び６８５７０を付けられている。申請者の指定代理人、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、ＡＴＣＣがこの寄託の永続性と、もし、特許が許可された場合には、その容易な分譲を提供する寄託所であることを申し立てる。このように寄託物質の分譲に関するすべての制限は、特許の許可と共に改変されることなく撤去される。物質は特許申請の未決期間中は、３７  ＣＦＲ  １．１４及び３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．１２２の下、コミッショナーによって資格ありと決定された者に分譲される。寄託された物質はあらゆる必要な注意を払って維持され、寄託されたプラスミドの試料提供に対する最も新しい要請後少なくとも５年間、そして、いかなる場合でも、寄託の日付後、少なくとも３０年の期間、あるいは特許の実行期間、いずれか長い方の期間、生存状態で、汚染されないように保存を継続する。申請者の指定代理人は、もし、寄託物の状態のために、要請があっても寄託所が試料を提供出来ないならば、寄託物を取り替える責任のあることを認める。
【００６１】
ポリペプチド
本発明によれば、ポリペプチドには、図１−３及び６に夫々、示されているオポッサム、ラット及びヒトの副甲状腺ホルモンレセプター、及びいかなる他の自然界に存在するレセプターにせよ、これらのレセプターをクローン化して発現するのに用いられたものに類似の方法により、あるいは、ここに記述されている配列の１つの全体または１部をプローブとして利用する方法によって生成され得るものを含む。さらに、副甲状腺ホルモン、または副甲状腺ホルモン関連蛋白質に対する結合能のあるＰＴＨレセプターの類似体あるいは断片も本発明の範囲内にある。
【００６２】
興味ある特異なレセプター類似体には、同類アミノ酸置換によってのみ異なる、例えば、同じクラスの他の代わりに１アミノ酸の置換（例えば、グリシンの代わりにバリン；リジンの代わりにアルギニン、等）、あるいは、１つ、またはそれ以上の非同類アミノ酸の置換、欠失、また副甲状腺ホルモン、または副甲状腺ホルモン関連蛋白質に結合するレセプターの能力を破壊しない位置にされた挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を持つ完全長、あるいは部分長のレセプター蛋白質が含まれる。
【００６３】
特に関心のある特異なレセプター断片には、これらに限られるわけではないが、レセプターの部分で、一次アミノ酸配列からＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ法（例えば、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４７：２５１，  １９７８参照）のような疎水性／親水性計算法を用いて細胞外であると推定されたものが含まれる。親水性ドメイン、特に少なくとも１０個のアミノ酸からなる疎水性区間（参照、貫膜ドメイン）は、細胞外ドメインの有力な候補者として現れて来る。図２１は、１つのＰＴＨレセプターの細胞外、細胞内及び貫膜ドメインの予測される配置を図示している。
【００６４】
特定のＰＴＨレセプター断片の例には、Ｒ１５Ｂクローンの推定アミノ酸配列に由来する以下ののアミノ酸配列（標準の一文字記号で示されている）が含まれている：
細胞外ドメイン：
ＲＰ−１：  ＴＮＥＴＲＥＲＥＶＦＤＲＬＧＭＩＹＴＶＧ  （配列番号：５）
ＲＰ−２：  ＹＬＹＳＧＦＴＬＤＥＡＥＲＬＴＥＥＥＬ    （配列番号：６）
ＲＰ−３：  ＶＴＦＦＬＹＦＬＡＴＮＹＹＷＩＬＶＥＧ    （配列番号：７）
ＲＰ−４：  Ｙ−ＲＡＴＬＡＮＴＧＣＷＤＬＳＳＧＨＫＫＷＩＩＱＶＰ  （配列番号：８）
ＲＰ−５：  ＰＹＴＥＹＳＧＴＬＷＱＩＱＭＨＹＥＭ  （配列番号：９）
ＲＰ−６：  ＤＤＶＦＴＫＥＥＱＩＦＬＬＨＲＡＱＡ  （配列番号：１０）
細胞内ドメイン：
ＲＰｉ−７：  ＦＦＲＬＨＣＴＲＮＹ  （配列番号：１１）
ＲＰｉ−８：  ＥＫＫＹＬＷＧＦＴＬ  （配列番号：１２）
ＲＰｉ−９：  ＶＬＡＴＫＬＲＥＴＮＡＧＲＣＤＴＲＱＱＹＲＫＬＬＫ  （配列番号：１３）
これらの断片はＫｅｕｔｍａｎｎらの方法（Ｅｄｎｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１７：  １２３０，  １９８４）によって合成され，ＨＰＬＣによって精製された。
【００６５】
ポリペプチドの発現
本発明によるポリペプチドは、本発明の細胞レセプターの一部または全体をコードしている配列を持つ組換え核酸から、なにか適切な発現系、例えば、適当な宿主細胞（原核あるいは真核）の、適当な発現伝達体（例、ｐｃＤＮＡＩ）内の組換え核酸による突然変異を用いて、発現することにより生成することが可能である。正確にいかなる細胞を用いるかは、本発明にとって重要ではない。しかしながら、本発明のポペプチドがＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの全体または一部を含む場合には、以下の宿主細胞が好適である：ＣＯＳ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＯＫ細胞、ＡｔＴ２０細胞、及びＣＨＯ細胞。移入の方法及び発現伝達体の選択は選ばれた宿主系に依存する。哺乳類細胞の移入の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）に記載されており、発現伝達体は、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｐ．Ｈ．  Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  補遺、  １９８７）に論じられているものから選んでもよい。安定に移入された細胞は、レセプターＤＮＡを宿主細胞の染色体に組み込むことによって作ることが出来る。適当なＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ，ｐｃＤＮＡＩ−Ｎｅｏ、あるいは他の適切なプラスミドに挿入され、次いで、細胞は，このプラスミドにより、ｐｓＶ−２−Ｎｅｏ、あるいはｐｓＶ−２−ＤＨＦＲとの共同移入をして、あるいはしないで、標準電気が孔、りん酸カルシウム、及び／あるいはＤＥＡＥ／デキストラン技法によって移入される。移入された細胞の選択は、累進的に上昇するレベルのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，  ＧＩＢＣＯ）、そしてもし必要ならば、メトトレキサートを用いて行われる。
【００６６】
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列は、また、原核宿主細胞にも発現することが出来る。細胞のレセプター、あるいはレセプター断片をコードしているＤＮＡは、原核細胞宿主における発現をもたらすことの出来る制御シグナルに作動可能に連結されたベクター上を運ばれる。もし希望ならば、コーディング配列は、その５´−末端に、発現された蛋白質の宿主細胞の周辺腔への分泌をもたらし、それによって蛋白質の回収とその後の精製を容易にすることの出来る既知のシグナル配列をなにかコードしている配列を含むもとも出来る。最も頻繁に用いられる原核細胞は種々のＥ．  ｃｏｌｉの株である。しかし、他の微生物の株もまた使用してよい。プラスミドベクターは、複製起点、選択可能のマーカー、及び宿主微生物に適合する株に由来する制御配列を含むものが用いられる。例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉは、ｐＢＲ３２２、これはＢｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｇｅｎｅ  ２：  ９５，  １９７７）によって、３つの自然界に存在するプラスミド、そにうち２つはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株から、１つはＥ．  ｃｏｌｉから分離されたものであるが、に由来する断片を用いて構成されたプラスミドであるが、その誘導体を用いて変異させることが出来る。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性由来の遺伝子を含み、そのため、希望する発現ベクターの構築において、保持され、あるいは破壊され得る多数の選択可能なマーカーを提供する。一般に用いられる原核細胞の制御配列（また、“調節因子”とも呼ばれる）は、ここでは、随意的にオペレーター、リボソーム結合部位配列と共に、転写開始のためのプロモーターを含むものと定義される。蛋白質の発現を指令するために一般に用いられるプロモーターには、ラムダー由来のＰＬプロモーター及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｉｍａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８，  １９８１）ばかりでなく、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクト−ス（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８：  １０５６，  １９７７）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ，  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８：  ４０５７，１９８０）も含まれる。
【００６７】
本発明の細胞レセプター蛋白質は、以下のような性質を持っているので、細胞内に発現すると、それは細胞膜へ、部分的には膜を貫通して移動し、その結果、その一部は膜に埋め込まれて止まり、一部は細胞外に伸展し、一部は細胞内に止まる。このような埋め込まれた細胞レセプターを持つ形質転換された細胞は、それ自身、本発明の方法の中で用いられてもよく、あるいは、レセプター蛋白質は膜から抽出され、精製されることも可能である。
【００６８】
無傷の蛋白質を細胞膜に繋ぎ止める責任を負う蛋白質の疎水性部分を欠くペプチド断片は、発現しても、膜に埋め込まれることは期待されない。これらが細胞内に止まるか、あるいは細胞外培地に分泌されるかは、分泌を促進する機構（例えば、シグナルペプチド）が含まれているか、否かによる。もし、分泌されれば、本発明のポリペプチドは培地から収穫することが出来る。もし、そうでなければ、細胞は解体して、所期のポリペプチドは細胞の全内容から分離しなければならない。発現される可能性のあるポリペプチドの特殊例は、限界はないが、以下のものが含まれる：
１）図３に示されるようなラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの、推定リーダー配列を含む、アミノ酸１−１９２からなるアミノ末端部分。
２）図３に示されるようなラットの骨のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの、推定リーダー配列を除外した、アミノ酸２７−１９２からなるアミノ酸末端部分。  ３）図３に示されるようなラットの骨の完全長のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター。
４）ＰＲ−１（上記のような）。
５）ＰＲ−２（上記のような）。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて容易に精製することが出来る。これらのポリペプチドの抗体、あるいはレセプター特異的リガンド（例、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターに対するホルモンＰＴＨとＰＴＨｒＰ）は、セファロース  ４  ＣＮＢｒ−活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のような固相支持体に共有結合し、本発明のポリペプチドをなんらかの混入物質から分離するのに用いてもよい。一般的には、１ｍｇのリガンドあるいは抗体がＣＮＢｒで活性化されたセファロースと４℃で１７−２０時間（振盪下）インキュベートされる。セファロースは、１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８）で洗浄して過剰の活性部位をブロックする。セファロース−ＰＴＨ、セファロース−ＰＴＨｒＰ、あるいはセファロース−抗体は、次いで、粗ポリペプチドとりん酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）中、４℃で２時間インキュベートされる（振盪下）。セファロースは、次いで、一般的にはカラムに充填され、入念にＰＢＳで洗浄され（一般的にはカラム容の１０倍）、水で希釈した塩酸（ｐＨ１．８５）で溶出される。溶出液は、次いで、凍結乾燥により濃縮され、その純度は、例えば、逆層ＨＰＬＣで検査される。
【００７０】
抗細胞レセプター抗体
本発明の細胞レセプターあるいはレセプター断片は、専門家にはよく知られているなにか通常の方法によって、ポリクローナル抗体を産生する方法、及びモノクローナル抗体を産生する方法を含め、抗体を産生するのに用いることが出来る。例えば、ＰＴＨレセプターの推定アミノ酸配列は、他のＧ蛋白質連鎖レセプターに見出だされる領域に類似した細胞外と細胞内と思われる領域（図２１を見よ）を点々配置した数個の貫膜（即ち、疎水性）ドメインを持つと思われる蛋白質構造を示している。この情報は、レセプター蛋白質の、細胞外に露出している見込みがあり、従ってｉｎ  ｖｉｖｏで抗体に提示されるであろう領域の選択を手引きするために用いることが出来る。このような領域の１つ、あるいはさらに多くを表現する短いペプチドを合成し（例えば、化学的に、あるいは組換えＤＮＡ技法により）、ポリクローナル、あるいはモノクローナル抗体を産生するために動物（例えば、ウサギ、あるいはマウス）を免疫するのに用いることが出来る。例えば、上記のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのペプチドのあるもの（ＲＰ−１、ＲＰ−５、及びＲＰ−６）は、標準の技法を用いて化学的に合成され、以下の手順によりウサギにポリクローナル抗体を産生するのに用いられた：
【００７１】
完全フロイントアジュバントで乳化された所定のペプチドの標品をウサギに皮内に注射する。追加免疫は、不完全あるいは完全アジュバントで、１月間隔で注射される。
抗体価は２つの方法のいずれかを用いて評価される。第一に、抗体を１％正常ウサギ血清で連続希釈し、１２５Ｉ−標識ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター断片と常法（例えば、Ｓｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  上記）により２４時間、４℃でインキュベーションする。結合した１２５Ｉ−標識ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター断片は、非結合のものから、１００μｌの第二抗体（抗ウサギＩｇＧ、  Ｓｉｇｍａ）を２０倍に希釈したもの及び１ｍｌの５％ポリエチレングリコールを加え、次いで、２０００ｒｐｍで３０分、４℃で遠心することによって分離される。上清を除去し、ペレットをγカウンターで、放射活性の分析をする。第二の方法では、自然型の（例えば、ＲＯＳ  １７／２．８、ＯＫ、ＳａＯＳ−２細胞）あるいは組換え（Ｒ１５Ｂ、ＯＫ−ＯあるいはＯＫ−Ｈを移入されたＣＯＳ細胞あるいはＣＨＯ細胞）ＰＴＨ／ＰＴＹＨｒＰレセプターを発現している細胞系が、連続希釈された抗体と４℃、２０℃、あるいは３７℃で１−４時間インキュベートされる。細胞をＰＢＳで（３回）洗浄し、 １２５Ｉ−標識（ＮＥＭ、  Ｄｕｐｏｎｔ）あるいはＦＩＴＣ−標識（Ｓｉｇｍａ）の第二抗体と２時間、４℃でインキュベートする。洗浄後（ＰＢＳで３回）、細胞は０．１ＭＮａＯＨで溶解してγカウンターで測定されるか（もし、 １２５Ｉ−標識の第二抗体が用いられた時）、あるいは１％パラフォルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡法で検査された（もし、ＦＩＴＣ−標識の第二抗体が用いられた時）。
【００７２】
抗体を生成するもう１つの方法は、抗原として細胞（例えば、レセプターをコードしているＤＮＡを移入されたＣＯＡ細胞のような哺乳類の細胞）の表面に発現されている本発明の無傷の細胞レセプター蛋白質を利用する。このような細胞は、常法、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン移入法により、細胞レセプターの高度の発現をコードし、且つ、指令することの出来るベクターを用いて生成することが出来る。例えば、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターに特異的なモノクローナル抗体は以下の手順で生成される。
【００７３】
ラットの組換えＰＴＨレセプターを細胞表面に高度に発現している無傷のＣＯＳ細胞をＢａｌｂ−ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）の腹腔内（ＩＰ）に注射する。マウスは４週ごとにＩＰ注射により追加免疫を受け、融合の３日前に、静脈内（ＩＶ）追加免疫により超免疫される。このマウスから脾臓細胞を分離し、ミエローマ細胞と常法により融合する。ハイブリドーマは、標準のヒポキサンチン／アミノプテリン／チミン（ＨＡＴ）培地で常法に従って選別される。ＰＴＨレセプターを認識する抗体を分泌するハイブリドーマは、最初、細胞あたりＰＴＨレセプターのコピーを元来豊富に発現する細胞系（ＰＯＳ１７／２．８あるいはＯＫ細胞）で、標準の免疫的技法を用いてスクリーニングして確認される。ＰＴＨレセプターに結合することの出来る抗体を生成するこれらのハイブリドーマは培養して、サブクローニングされる。次いでモノクローナル抗体の性質を新たに検討するために、ラヂオレセプター及びｃＡＭＰ刺激アッセイを用いる二次スクリーニングを行うことが出来る（以下参照）。
【００７４】
ＰＴＨレセプターアンタゴニスト及びアゴニストのスクリーニング
本発明のポリペプチド及び抗体ならびに他の化合物は、ＰＴＨ競合性、及びアンタゴニスト的あるいはアゴニスト的な性質について、ここに記載のアッセイを用いてスクリーニングすることが出来る。
【００７５】
一例をあげると、無傷の細胞上のＰＴＨレセプターを認識するこれらの抗体は、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰとＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターへの結合に対し競合する能力についてスクリーニングされる。細胞表面にＰＴＨレセプターを発現している細胞は、 １２５Ｉ−ＰＴＨ類似体である １２５Ｉ−ＮｌｅＰＴＨあるいは １２５Ｉ−ＰＴＨｒＰと、試料のポリクローナルあるいはモノクローナル抗体の存在下、４時間、１５℃でインキュベートされる。使用される抗体は、粗抗血清、細胞培地、あるいは腹水由来のものか、あるいは精製された形のものである。インキュベーション後、細胞は結合緩衝液（例えば、生理食塩水）で洗浄、融解され、ガンマ−カウンターを用いて放射活性を定量分析される。ＰＴＨレセプターへのＰＴＨ類似体の結合を低減する抗体は、競合的、低減しないものは非競合的と分類される。
【００７６】
抗体及びポリペプチドを含め、化合物は、それらのアゴニストあるいはアンタゴニストとしての性質につき、上記のｃＡＭＰ蓄積、細胞内カルシウム、及び／あるいはイノシトールりん酸のアッセイを用いてスクリーニングすることが出来る。細胞表面上にＰＴＨレセプターを発現している細胞は、ＰＴＨ、ＰＴＨレセプター抗体、あるいは両者を組み合わせたものと、２ｍＭＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチル−キサンチン、Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の存在下、５−６０分間、３７℃でインキュベートされる。サイクリックＡＭＰの蓄積は、上述のように、特異的ラジオイムノアッセイによって測定される。ＰＴＨレセプターへの結合に対してＰＴＨと競合し、且つ、ＰＴＨのｃＡＭＰ蓄積に対する効果を阻害する化合物は、競合的ＰＴＨアンタゴニストと見做される。反対に、ＰＴＨレセプターへのＰＴＨの結合と競合しないが、なお、ＰＴＨによるｃＡＭＰ蓄積促進を阻害する（恐らくは、レセプター活性化部位を妨害することにより）化合物は、非競合的アンタゴニストと見做される。ＰＴＨレセプターへの結合に対しＰＴＨと競合し、ＰＴＨの存在あるいは非存在下にｃＡＭＰの蓄積を刺激する化合物は競合的アゴニストである。ＰＴＨレセプターへの結合に対してＰＴＨと競合しないが、ＰＴＨの存在あるいは非存在下に、なお、ｃＡＭＰ蓄積を刺激する能力があるか、あるいはＰＴＨ単独によって観察されるよりも高い蓄積を刺激する化合物は、非競合的アゴニストと見做される。
【００７７】
使用例
本発明のポリペプチド、抗体、及び他の化合物は、本発明の細胞レセプターとその特異的リガンド間の相互作用に関連すると特徴づけられるような疾病の診断、分類、予後、及び／あるいは処置に有用である。例えば、高カルシウム血症及び低カルシウム血症のいくつかの型は、ＰＴＨ及びＰＴＨｒＰとＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（複数）間の相互作用に関連している。高カルシウム血症は、血清のカルシウムレベルに異常な上昇のある状態である；  それは、しばしば、副甲状腺機能亢進症、骨粗鬆症、乳腺、肺、及び前立腺の癌腫、食道の頭部及び頚部の類表皮癌、多発性骨髄腫、及び副腎腫を含む他の病気に関連している。低カルシウム血症は、血清カルシウムレベルが異常に低い状態であり、例えば、甲状腺手術後に起こる有効ＰＴＨの不足から生じることがある。
【００７８】
初めの例では、本発明の化合物は、診断薬の製造に用いられ、これらは、高カルシウム血症を診断し、種々の高カルシウム状態を区別する、即ち、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰによって媒介される高カルシウム血症（例えば、副甲状腺機能亢進症及び悪性の体液性高カルシウム血症）を、これらの因子を含まぬ病気（例えば、骨に直接接触している悪性腫瘍の存在によって媒介される局所的骨軟化症、及び破骨細胞活性化因子（インターロイキン）、リンホトキシン、カルシトリオール、タイプＥプロスタグランディン、及びビタミンＤ様ステロールのような体液性因子の増大によって媒介されるいくつかの希少型悪性腫瘍関連の高カルシウム血症）から区別するために用いられる。
【００７９】
診断の１つの方法においては、血清の総カルシウム及び／あるいはイオン化されたカルシウムのレベルは、本発明のＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰアンタゴニストの投与の前後に常法によって測定される。ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰ関連の高カルシウム血症は、本発明のアンタゴニストの投与後の血清カルシウムレベルの低下として検出することが出来る。対照的に、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰ以外の因子によって媒介される高カルシウム血症状態に対しては、血清カルシウムレベルはアンタゴニストの投与後でさえ、不変のままの筈である。
【００８０】
本発明の他の診断的応用として、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰに関連する癌、例えば、悪性の体液性高カルシウム血症に関連する癌、を診断するために、及び、癌治療の間、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰのレベルを監視するために、生物的試料中のＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰのレベルの測定が可能でなる。この方法には、本発明の組換え副甲状腺ホルモンレセプターの、組織試料に存在するＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰへの結合を、ここに記述されている結合アッセイを用いて、測定することが含まれている。結合のレベルは、直接測定することも出来る（例えば、放射標識をしたＰＴＨレセプターを用い、内在性ＰＴＨに結合する放射能をアッセイすることによって）。代わりに、試料（例えば、組織切片）へのＰＴＨレセプターの結合は、組織切片をＰＴＨレセプターに特異的な抗体で、標準の免疫技法（Ｃｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ５：３３９，  １９８６）を用い染色して追跡することが出来る。
【００８１】
第三の診断的アプローチでは、細胞系を（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７に記載されている方法により）適当なプロモーターに連結されたＰＴＨレセプター遺伝子で安定に移入することが出来る。代わりに、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターは、真核のベクター、即ち、ｐｃＤＮＡＩから発現され、そして変異ＤＨＦＲ遺伝子を共移入して、メトトレキサート選択（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ８０：２４９５−２４９９、  １９８３）を経てさらに遺伝子の増幅を可能にすることが出来る。遺伝子のこのような高度の発現によって、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰに超感受性である不滅の細胞系が生成される。このような細胞は、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰの血液レベルを検出するための特に有用な手段を提供する。このような細胞系は、上昇したＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰレベルを伴う状態（例えば、上記の状態）、あるいは、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰの異常に低いレベルを伴う状態（例えば、上記の状態）の診断に用いることが出来る。このような細胞系は、また、高カルシウム血症あるいは低カルシウム血症の治療の間に、夫々、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰレベルの退行あるいは増昇の監視に有用である。
【００８２】
高カルシウム血症の疑いのある患者は、本発明の化合物を用いて治療してもよい。症状は突如として現れることがあり、逆転しなければ致命的なこともあり得るので早急な介入が重要である。１つの応用において、血清カルシウムレベルは、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰのアンタゴニストを含む、即座の治療の１コースで安定化する。この様なアンタゴニストには、ＰＴＨレセプター媒介による細胞の活性化に介入することが決定されている（ここに記述のアッセイにより）本発明の化合物が含まれる。アンタゴニストを投与するために、適当な抗体あるいはペプチドは、一般に、生理食塩水のような適当な担体中に調剤することによって薬剤の製造に用いられ、ＰＴＨレセプターへのＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰの結合に対し適切な競合を提供する用量で、静脈内注射される（例えば、血清カルシウムレベルを１０ｍｇ／ｄｌ以下に下げるのに十分な用量）。代表的な用量は、一日当たり、体重１ｋｇにつき、抗体あるいはペプチド、１ｎｇから１０ｍｇである。治療は、許容カルシウムレベル（即ち、レベルは１０．１ｍｇ／ｄｌ以下）の長期維持のため、必要な時は反復してもよい。これは、高カルシウム血症の切っ掛けとなる、根底にある病状の緊急処置に必要かも知れない、あるいは、それは、例えば、骨粗鬆症のような病状の長期にわたる処置に用いてもよい。
【００８３】
他の応用において、本発明の方法に従ってアゴニストであると特徴付けづけられている本発明の化合物は、治療上、例えば、副甲状腺の部分的あるいは完全な外科的除去からおこる低カルシウム血症の処置に用いられる。アゴニストは、適当な担体（例えば、生理食塩水）中で調剤され、血清のカルシウムを許容レベル（即ち、およそ８ｍｇ／ｄｌ）までの上昇をもたらす用量で、出来れば静脈内投与されるのが望ましい。有用な用量範囲は、１日、体重１ｋｇ当たり、アゴニスト１ｎｇから１０ｍｇである。適切な血清カルシウムレベルを維持するために必要な場合、処置を繰り返すことも出来る。長期の処置は、副甲状腺切除を受けた患者に必要なことがある。
【００８４】
本発明の核酸もまた治療のために用いることが出来る。ＰＴＨレセプターｍＲＮＡ（あるいはＰＴＨレセプターｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡを表現する核酸構成）にアンチセンスであるオリゴヌクレオチドは、抗癌治療として用いられることもある。このアプローチは、例えば、ＰＴＨレセプター、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰの量あるいは活性を増大するゲノムの再配列あるいは増幅から生じる高カルシウム血症に対して有用である。この方法には、ｉｎ  ｖｉｖｏで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞に挿入することが含まれている。アンチセンス鎖は、内在性ＰＴＨレセプターｍＲＮＡとハイブリッドを形成して、蛋白質の翻訳を妨害し、それによって、この様な細胞におけるＰＴＨレセプターの生成を低下させ、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ関連の腫瘍増殖を抑制する。アンチセンスの設計及び宿主細胞への挿入方法は、例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．特許番号４，７４０，４６３に記載されており、ここでは引用して組み込まれている。本発明のＯＫ−Ｈ，ＯＫ−Ｏ及びＲ１５ＢＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターの生化学的特徴の検討は、ＰＴＨのそのレセプターとの相互作用によって引き起こされることが現在知られている２つの伝達経路は別個のものであり、分別されるかも知れないことを示している。これらレセプターの予想アミノ酸配列は、イノシトールりん酸代謝を検出可能な程度に活性化するようには見えないＯＫ−Ｈは、ＯＫ−ＯあるいはＲ１５Ｂよりも７０アミノ酸分短いことを示唆している。本発明の配列とここに開示されている情報を用いて、いかなる動物種からのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター遺伝子にせよ、これをクローン化、次いで改変して（例えば、部位特異的変異誘発により）、ホスホリパーゼＣを活性化しないＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを生成することが出来る。このことは、骨の再吸収及び骨の造成を含め、ＰＴＨによって仲介される種々の作用を分別する可能性を示すものであり、骨粗鬆症のような骨の疾病の治療に対して大きな重要性を持つ。
【００８５】
ＰＴＨレセプターをコードしている本発明の核酸は、また、選択された組織特異的プロモーター及び／あるいはエンハンサーに連鎖し、その結果生じたハイブリッド遺伝子を、常法により（例えば、Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．特許番号４，７３６，８６６に記述され、ここには参照して組み込まれているような）、初期の分化段階にある動物の胚（例えば、受精した卵母細胞）に導入して形質転換した動物を作り出し、選択した組織（例えば、骨のオステオカルシンプロモーター）にＰＴＨレセプターを高レベルで発現することが出来る。この様なプロモーターは、形質転換動物におけるＰＴＨレセプターの組織特異的発現を指令するために用いられる。利用されるＰＴＨレセプターの型は、用いられる動物種のものに類似のＰＴＨレセプターをコードしている型、あるいは、それは、別種のＰＴＨレセプター類自体をコードすることも出来る。１つの特例において、形質転換されたニワトリが、ニワトリの輸卵管に高レベルの発現を指令するプロモーターからＰＴＨレセプターを発現するように工作された。このような動物は、高いカルシウム含量と、従ってより固い殻を持つ卵を産むことが期待される。
【００８６】
他の実施態様
他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内にある。例えば、本発明の核酸には、トリ、あるいは有袋類、げっ歯類、またはヒトのような哺乳類を含むいかなる脊椎動物種にせよ、これらから本来分離された遺伝子、あるいはｃＤＮＡあるいはＲＮＡを包含する。オポッサム、ラット、及びヒトのような多様な動物種からのＰＴＨレセプターに対して証明された高度の相同性は、ここに開示されたＰＴＨレセプターの分離方法が、多様な動物種からの関連した細胞レセプターの分離に広く応用されることを示唆している。
【図１Ａ】
2010004889.tif 000002
【図１Ｂ】
2010004889.tif 000003
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2010004889.tif 000005
【図２Ｂ】
2010004889.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2010004889.tif 000014
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2010004889.tif 000019
【図１０】
2010004889.tif 000020
【図１１】
2010004889.tif 000021
【図１２】
2010004889.tif 000022
【図１３】
2010004889.tif 000023
【図１４】
2010004889.tif 000024
【図１５】
2010004889.tif 000025
【図１６】
2010004889.tif 000026
【図１７】
2010004889.tif 000027
【図１８】
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【図１９】
2010004889.tif 000029
【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月15日(2009.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1、3及び4からなる群より選択される全長アミノ酸配列よりは少ないアミノ酸を含むポリペプチドであって、各々、配列番号1、3または4のアミノ酸配列からなるポリペプチドの抗原性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項1記載のポリペプチドであって、
(a)TNETREREVFDRLGMIYTVG(配列番号5)、
(b)YLYSGFTLDEAERLTEEEL(配列番号6)、
(c)VTFFLYFLATNYYWILVEG(配列番号7)、
(d)Y-RATLANTGCWDLSSGHKKWIIQVP(配列番号8)、
(e)PYTEYSGTLWQIQMHYEM(配列番号9)、
(f)DDVFTKEEQIFLLHRAQA(配列番号10)、
(g)FFRLHCTRNY(配列番号11)、
(h)EKKYLWGFTL(配列番号12)、又は
(i)VLATKLRETNAGRCDTRQQYRKLLK(配列番号13)、
を含むポリペプチド。
【請求項３】
副甲状腺ホルモンまたは副甲状腺ホルモン関連蛋白質と結合し得るポリペプチドである、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
副甲状腺ホルモンレセプターへの結合において副甲状腺ホルモンと競合する能力のある化合物を同定する方法であって、
(a)候補化合物の存在下及び非存在下のそれぞれにおいて、請求項3記載のポリペプチドを副甲状腺ホルモンと接触させる工程、及び
(b)前記候補化合物の存在かにおける前記ポリペプチドの副甲状腺ホルモンへの結合レベルを、前記候補化合物の非存在下における前記ポリペプチドの副甲状腺ホルモンへの結合レベルと比較する工程を含み、
前記候補化合物の存在下における結合レベルが、候補化合物の非存在下における結合レベルよりも低い場合に、前記候補化合物が前記レセプターへの結合において前記副甲状腺ホルモンと競合する能力のあることが示される方法。
【請求項５】
副甲状腺ホルモンレセプターへの結合において副甲状腺ホルモン関連蛋白質と競合する能力のある化合物を同定する方法であって、
(a)候補化合物の存在下又は非存在下で請求項3記載のポリペプチドを副甲状腺ホルモン関連蛋白質と接触させる工程、及び
(b)前記候補化合物の存在下における前記ポリペプチドの副甲状腺ホルモン関連蛋白質への結合レベルを前記候補化合物の非存在下における前記ポリペプチドの副甲状腺ホルモン関連蛋白質への結合レベルと比較する工程を含み、
前記候補化合物の存在下における結合レベルが、候補化合物の非存在下の結合レベルよりも低い場合に、前記候補化合物が前記レセプターへの結合において前記副甲状腺ホルモン関連蛋白質と競合する能力のあることが示される方法。
【請求項６】
薬学的に許容される担体中に請求項3記載のポリペプチドを含む高カルシウム血症治療用組成物。
【請求項７】
請求項6記載の治療用組成物であって、哺乳動物の血液中のカルシウムレベルを低減させる効果的な投与量又は、副甲状腺ホルモンまたは副甲状腺ホルモン関連蛋白質による副甲状腺ホルモンレセプターの活性化を抑制し得る効果的な投与量に構成されている、高カルシウム血症治療用組成物。