(57)【要約】【課題】  ペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性を向上することができるペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法の提供。【解決手段】  極長鎖脂肪酸のβ酸化活性が低下したヒト由来の皮膚繊維芽細胞に、被検試薬と末端が標識された極長鎖脂肪酸を加えて培養し、培養後の水性代謝物中の標識量を測定するペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
極長鎖脂肪酸のβ酸化活性が低下したヒト由来の皮膚繊維芽細胞に、被検試薬と末端が標識された極長鎖脂肪酸を加えて培養し、培養後の水性代謝物中の標識量を測定するペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法。
【請求項２】
極長鎖脂肪酸のβ酸化活性が低下したヒト由来の皮膚繊維芽細胞が、副腎脳白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤＰ）の５１８番目のアルギニンがグルタミンに変異したＲ５１８ＱまたはＡＬＤｍＲＮＡの発現が欠損している１６３Ｔである請求項第１項記載のペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法。
【請求項３】
末端が標識された極長鎖脂肪酸が、[１-14Ｃ]リグノセリン酸である請求項第１項または第２項記載のペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法。
【請求項４】
更に対照として極長鎖脂肪酸のβ酸化活性が低下したヒト由来の皮膚繊維芽細胞に、被検試薬と末端が標識された長鎖脂肪酸を加えて培養し、培養後の水性代謝物中の標識量を測定する請求項第１項ないし第３項の何れかの項に記載のペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法。
【請求項５】
末端が標識された長鎖脂肪酸が［１-14Ｃ］パルミチン酸である請求項第４項記載のペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化剤に関し、更に詳細には、副腎脳白質ジストロフィー（adrenoleukodystrophy、ＡＬＤ）等炭素数２２以上の極長鎖脂肪酸の代謝が順調に行われないことにより生ずる疾患の治療のために有用なペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＬＤは男児２〜３万人に一人の頻度で現れる伴性劣性遺伝病で、中枢神経系の脱髄、副腎皮質不全を特徴とする神経変性疾患である。この病気は厚生労働省の特定疾患に指定されており、国内外でその発病メカニズムについて精力的に研究されているが、現在のところ発病前の骨髄移植以外に有効な治療法はなく、早急な治療薬の開発が望まれている。
【０００３】
ところで、細胞内に存在するペルオキシソームと呼ばれるオルガネラは脂肪酸のβ酸化や胆汁酸の合成など、脂質代謝に重要な働きをする。ＡＬＤ患者ではこのペルオキシソーム膜に存在する副腎脳白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤＰ）と呼ばれる膜タンパク質に異常があり、炭素数２２以上の極長鎖脂肪酸の代謝が順調に行われず、脳、副腎、血漿中に極長鎖脂肪酸が蓄積することが原因であることが知られている。
【０００４】
これまでに、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤であるスタチン系薬物が患者の血漿中の極長鎖脂肪酸の含量を減らすことが報告され、ＡＬＤ治療薬としての可能性が考えられているが（非特許文献１参照）、これは血漿中コレステロールの減少を反映している可能性がある。
【０００５】
最近、コレステロールの減少が転写因子ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）を活性化し、ＡＬＤＰ関連タンパク質（ＡＬＤＲＰ）の発現誘導が起こることが報告された（非特許文献２参照）。ＡＬＤＲＰはＡＬＤＰと相同性の高いペルオキシソーム膜ＡＢＣタンパク質であり、実際ＡＬＤＰの機能を代替できることが、トランスフェクションの実験で証明されている（非特許文献３参照）。しかし、スタチン系の薬物でも血漿中の極長鎖脂肪酸の含量は減るが、脳での極長鎖脂肪酸の含量は減らないという結果が報告されており（非特許文献４および５参照）、その効果についてはまだ結論が出ていない。
【０００６】
一方、尿素サイクル欠損症の患者に使われていた４-フェニルブチレートが極長鎖脂肪酸のβ酸化活性を上昇させることが報告され（非特許文献６参照）、また抗高脂血症薬としてよく知られているフィブラート系薬物はラット肝臓においてβ酸化を活性化する。これらはいずれもＡＬＤＲＰの発現誘導により活性が回復する可能性を示している。
【０００７】
しかしフィブラート系の薬物は血液脳関門を通過しないことから治療薬としては有効でない。脳におけるＡＬＤＲＰの発現誘導の仕組みは解明されていないが、血液脳関門を通過しＡＬＤＲ発現誘導する薬物がＡＬＤ治療薬として有効かもしれない。最近、ヒストン脱アセチル化酵素活性阻害薬トリコスタチンＡがＡＬＤＲＰの発現誘導なしに極長鎖脂肪酸のβ酸化活性を上昇することが報告され（非特許文献７参照）、未知の遺伝子の発現によりβ酸化系が活性化されている可能性が示された。
【０００８】
以上のように、ペルオキシソーム脂肪酸β酸化系に作用して極長鎖脂肪酸の代謝を促進させ、しかも安全性の高い物質はＡＬＤ等の患者の治療に有用であることが予想されるが、今までにこのような物質は見いだされていないのが現状であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Singh I., Pahan K., and Khan M. (1998) Lovastatin and sodium phenylacetate normalize the levels of very long chain fatty acids in skin fibroblasts of X-adrenoleukodystrophy. FEBS Lett., 426, 342-346.
【非特許文献２】Weinhofer I., Foress-Petter S., Zigman M., and Berger J.(2002) Cholesterol regulates ABCD2 expression: implications for the therapy of X-linked adrenoleukodystrophy. Hum. Mol. Gen., 11, 2701-2708.
【非特許文献３】Netik A., Foress-Petter S., Holzinger A., Molzer B., Unter-rainer G., and Berger J. (1999) Adrenoleukodystrophy-related protein can compensate functionally for adrenoleukodystrophy protein deficiency (X-ALD):implications for therapy. Hum. Mol. Gene., 8, 907-913.
【非特許文献４】Cartier N., Guidoux S., Rocchiccioli F., and Aubourg P. (2000) Simvastatin dose not normalize very long chain fatty acids inadrenoleukodystrophy mice. FEBS Lett., 478, 205-208.
【非特許文献５】Yamada T., Shinnoh N., Taniwaki T., Ohyagi Y.,Asahara H., Horiuchi I., and Kira J. (2000) Lovastatin dose not correct theaccumulation of very long chain fatty acids in tissues of adrenoleukodystrophyprotein-deficient mice. J. Inherit. Metab. Dis., 23, 607-614.
【非特許文献６】Kemp S., Wei H.-M., Lu J.-F., Braiterman L. T.,McGuinness M. C., Moser A. B., Watkins P. A., and Smith K. D. (1998) Generedundancy and pharmacological gene therapy: Implica-tions for X-linked adrenoleukodystrophy. Nat. Med., 4, 1261-1268.
【非特許文献７】McGuinness, M. C. Zhang, H.-P. & Smith, K. D.Evaluation of pharmacological induction of fatty acid β-oxidationin X-linked adrenoleukodystrophy. (2001) Mol. GenetMetab., 74,256-263.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記現状に基づきなされたものであり、ペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性を向上することができるペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法および安全性の高いペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化剤の提供をその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＡＬＤ患者由来の皮膚繊維芽培養細胞の極長鎖脂肪酸のβ酸化が正常人に比べて約３０％まで減少しているのに着目し、まず、in vitroでのペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質のアッセイ系を確立した。
【００１２】
そして、このアッセイ系を用い、植物成分の中からペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質を探索した結果、特定のフラボノイド類やこれを含有する漢方方剤がペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化剤として利用しうることを見いだし、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち本発明は、次の式（Ｉ）
【化２】
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（式中、Ｒ1は、水酸基または低級アルコキシル基、Ｒ2は水素原子、水酸基または低級アルコキシ基、Ｒ3は水酸基、低級アルコキシル基または糖残基、Ｒ4は水素原子または水酸基を示し、Ｒ'およびＲ”は水素原子、水酸基または低級アルコキシ基を示す）
で表されるフラボノイド類を有効成分とするペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化剤を提供するものである。
【００１４】
また本発明は、極長鎖脂肪酸のβ酸化活性が低下したヒト由来の皮膚繊維芽細胞に、被検試薬と末端が標識された極長鎖脂肪酸を加えて培養し、培養後の水性代謝物中の標識量を測定するペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法を提供するものである。
【００１５】
本発明のペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化剤（以下、「β酸化活性化剤」という）の有効成分であるフラボノイド類は、次の方法によりスクリーニングされたものである。
【００１６】
すなわち、極長鎖脂肪酸のβ酸化活性が低下したヒト由来の皮膚繊維芽細胞に、被検試薬と末端が標識された極長鎖脂肪酸を加えて培養し、培養後の水性代謝物中の標識量を測定することにより、スクリーニングを行うことができる。
【００１７】
極長鎖脂肪酸のβ酸化活性が低下したヒト由来の皮膚繊維芽細胞としては、ＡＬＤＰの５１８番目のアルギニンがグルタミンに変異したＲ５１８Ｑや、ＡＬＤｍＲＮＡの発現が欠損している１６３Ｔが挙げられる。
【００１８】
また、末端が標識された極長鎖脂肪酸としては、放射性[１-14Ｃ]リグノセリン酸等が挙げられ、培養後の水性代謝物としては、アセチルＣｏＡおよび酢酸が挙げられる。
【００１９】
なお、上記スクリーニングに当たっては、通常の脂肪酸における代謝を対照とすることが好ましく、末端が標識された長鎖脂肪酸、例えば、［１-14Ｃ］パルミチン酸を投与して同様に測定し、この値を極長鎖脂肪酸に対する値と比較することが望ましい。
【００２０】
以上のようにして、前記フラボノイド類（Ｉ）がβ酸化活性化剤の有効成分としてスクリーニングされたが、この式（Ｉ）において、低級アルコキシ基としては、メトキシ基等が、糖残基としてはグルコシル等がそれぞれ挙げられる。
【００２１】
本発明のフラボノイド類（Ｉ）で表されるフラボノイド類は、いずれも植物中に存在するものとして公知のものであるか、その簡単な誘導体であり容易に入手できるものである。具体的には、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル、７−グルコシルジオスメチン等のフラボン類、ケルセチン５,７,３',４'−テトラメチルエーテル、カンフェロール、イソラムネチン等のフラボノール類、ゲニステイン等のイソフラボノイド等が挙げられる。
【００２２】
上記フラボノイド類（Ｉ）は、常法に従い、適当な担体と組み合わせることによりβ酸化活性化剤とすることができ、副腎脳白質ジストロフィーや先天性ジカルボン酸代謝異常症の治療剤、あるいは高脂血症の治療、予防剤として使用することができる。
【００２３】
本発明のβ酸化活性化剤の投与形態は、特に限定されず、一般的な医薬の投与形態から適宜選択することができる。このような投与形態の例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤または液剤のような経口剤、または注射剤、坐剤、吸入剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２４】
本発明β酸化活性化剤の投与方法としては経口投与が最も好ましく、この場合の製剤中の化合物（Ｉ）の投与量としては、患者の年齢、性別、体重または疾患の程度により異なるが、通常、成人に対して、１日あたり１０〜１５０ｍｇの範囲であり、これを１日数回に分けて投与するのが好ましい。
【００２５】
経口投与に適する固形経口剤の調製は、本発明化合物を単独で使用するか、あるいは、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチまたは無機塩類のような賦形剤を用いて常法に従って製造することができる。前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤または香料等を適宜選択して使用することができる。
【００２６】
この固形経口剤の調製において使用される結合剤としては、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはマクロゴールを例示できる。また、崩壊剤としては、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースまたは低置換ヒドロキシプロピルセルロースを例示できる。更に、界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルまたはポリソルベート８０を例示できる。
【００２７】
更にまた、滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウムまたはポリエチレングリコールを、流動性促進剤としては、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウムまたはケイ酸マグネシウムをそれぞれ例示できる。
【００２８】
さらに、本発明のβ酸化活性化剤は、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤またはエリキシル剤の液状経口剤として投与することができる。このような剤形の場合には、矯味矯臭剤または着色剤を含有してもよい。
【００２９】
一方、本発明のβ酸化活性化剤は非経口剤とすることもできる。この場合のフラボノイド類（Ｉ）の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人に対して１日あたり５〜１５０ｍｇの範囲内であり、この投与量を、静注、点滴静注、皮下注射または筋肉注射により投与するのが好ましい。
【００３０】
非経口剤の調製に当たっては、フラボノイド類（Ｉ）を適当な希釈剤で希釈して用いることができる。希釈剤としては、一般に、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールを用いることができる。非経口剤には、さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤または安定剤を加えてもよい。
【００３１】
これらのうち、特に、注射剤は、保存安定性の観点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去して、凍結乾燥物として保存し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製して用いることもできる。注射剤には、さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。
【００３２】
その他の非経口剤としては、例えば、外用液剤、軟膏等の塗布剤または直腸内投与のための坐剤が挙げられ、これらの製剤は常法に従って製造することができる。
【００３３】
なお、ペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化剤として、漢方方剤、例えば柴胡桂枝湯、小柴胡湯またはそのエキスとすることができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のβ酸化活性化剤は、天然物由来のペルオキシソームの極長鎖脂肪酸のβ酸化活性を促進する物質を有効成分とするものであり、その作用も優れたものである。
【００３５】
従って、極長鎖脂肪酸の代謝が不十分な疾患、例えばＡＬＤ等の疾患の治療に有効である。またバイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルは長鎖脂肪酸のβ酸化も活性化することより、高脂血症の治療にも有効である。
【００３６】
また、本発明のペルオキシソーム脂肪酸β酸化系活性化物質の検出方法を用いれば、新しいペルオキシソーム脂肪酸β酸化系に作用する物質を効率的に検出することができ、既存の脂質代謝改善薬とは異なる新規な作用機序をもつ医薬品の開発が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】極長鎖脂肪酸β酸化を指標にした植物成分のスクリーニング結果を示す図面。
【図２】バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル濃度とβ酸化活性の関係を示す図面。
【図３】イムノブロッティングによりペルオキシソーム膜ＡＢＣタンパク質の発現を調べた結果を示す図面（写真）。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を上げ本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものではない。
【００３９】
なお、本実施例において、採用した細胞培養方法および脂肪酸β酸化活性の測定方法は次の通りである。
【００４０】
（  細胞培養方法  ）
細胞は健常人（Ｎ−Ｈ）及びＡＬＤ患者（Ｒ５１８Ｑ；５１８番目のアルギニンがグルタミンに変異したもの）由来の皮膚由来繊維芽細胞（信州大学医学部小児科、鈴木康之先生より供与）を用いた。培養にはダルベッコイーグル培地（Ｄ'ＭＥＭ、ICN Biomedicals Inc.）に牛胎児血清（１０％）(Filtron Pty Ltd.)、ペニシリン（７０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン(１４０μｇ／ｍｌ)を含む培地を用い、炭酸インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ2）で培養した。細胞は３日に一度、１／３〜１／５の細胞数を新鮮な培地に移して培養した。
【００４１】
（  脂肪酸β酸化活性の測定方法  ）
〜９０％コンフルエントの繊維芽細胞（Ｎ−Ｈ, Ｒ５１８Ｑ）を０.２５％ トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＮａＣｌ ４ｇ、ＫＣｌ ０.１５ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ ０.４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.０２ｇ、グルコース １ｇ、ＥＤＴＡ ０.１ｇ、トリプシン １.２５ｇ／５００ ｍｌ）を用いてプレートから剥がし、培地で懸濁した後、その一部を採取し血球計算盤でカウントした。
【００４２】
細胞数が０.６〜０.８×１０5細胞／ウエルになるように６ ウエル皿（ファルコン）の各ウエルに培養した。３７℃で６時間インキュベート後、培地を取り除き、各化合物（最終濃度２０μＭ）を含む新しい培地と交換した。さらに２４時間後、４８時間後に同様に培地交換を行った。
【００４３】
分子量既知の化合物はＤＭＳＯ (ジメチルスルホキシド)に２０ｍＭになるように可溶化して〜３０℃に保存した。分子量未知の化合物やエキスは８ｍｇ／ｍｌもしくは２０ｍｇ／ｍｌとなるように可溶化し、最終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加した。７２時間培養後、各生薬成分を含む培地(serum-free)で培地交換を行った。
【００４４】
１時間培養後培地を除き、同培地１ｍｌ と共に各ウエルに４ｎｍｏｌの基質（放射性脂肪酸）を加えた。基質は[１-14Ｃ]リグノセリン酸 (比放射活性５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ) 及び[１-14Ｃ]パルミチン酸(比放射活性 ５６ｍＣｉ／ｍｍｏｌ, いずれも Moravek から購入)を用いた。基質の調製は以下の通り行った。溶媒（エタノール）に窒素ガスを吹き付けて取り除いた後、αシクロデキストリンを含む緩衝液（０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ ８.０, １０ｍＭ α-シクロデキストリン）を加え、超音波処理によりエマルジョン化した。
【００４５】
各ウエルに基質を入れて３７℃で１時間培養後、６ウエル皿を氷上に１０分間放置した。培養液０.８ｍｌをマイクロチューブに移し、１５〜３０分間氷上に放置した後、１５０μｌの１０％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び２００μｌの３Ｎ過塩素酸溶液（ＰＣＡ）を加え撹拌した。３０分間氷上に放置した後、遠心（１２０００ｒｐｍ, １０分, ４℃）し、その上清を試験管に移した。ヘキサンを３ ｍｌ加え、３０秒間激しく撹拌した。２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、ヘキサン層を取り除き、水層にさらにヘキサンを加えもう一度同様に撹拌した。遠心後、水層０.５ ｍｌをバイヤルに移し、ＡＣＳ ＩＩ（アマシャムファルマシア）を５ｍｌ加えて液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。
【００４６】
６ウエル皿の細胞は、すぐにリン酸緩衝液（ＮａＣｌ ８０ｇ,  ＫＣｌ ２ｇ,  Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ ２８.８ｇ,  ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ ／１ L）で２回洗浄し、セルスクレーパーを用いて回収した。超音波により破砕した後、その一部をタンパク定量に用いた。タンパク定量は Bradford 法（Bio Rad）を用いた。標準タンパク質としてＩｇＧを使用した。
【００４７】
実  施  例  １
ＡＬＤ患者由来繊維芽細胞の極長鎖脂肪酸β酸化を指標にした植物成分の
スクリーニング：
極長鎖脂肪酸のβ酸化に対して植物成分が有効かどうかを調べるため、上記方法により培養した培養細胞液中に放射性［１-14Ｃ］リグノセリン酸と［１-14Ｃ］パルミチン酸を投与し、水溶性代謝物（アセチルＣｏＡ、酢酸）の放射能を測定することにより脂肪酸β酸化活性を測定した。
【００４８】
この結果、ＡＬＤ患者由来の皮膚繊維芽細胞（Ｒ５１８Ｑ：５１８番目のアルギニンがグルタミンに変異したＡＬＤＰ）は正常細胞に比べて、極長鎖脂肪酸のβ酸化活性は３０％程度まで減少していた（図１中、ＡＬＤ）。この患者由来の繊維芽細胞の極長鎖脂肪酸β酸化を指標にして、後記８０種類以上の天然物由来化合物についてスクリーニングを行った。
【００４９】
その中から効果が認められた１７種類と、最近ＡＬＤ治療薬としての可能性が報告されているＨＭＧ還元酵素阻害剤ロバスタチン（５μＭ）について２次スクリーニングを行なった。その結果、カンフェロール、ゲニステイン、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル、７−グルコシルジオメスチン、イソレムネチン、ケルセチン５,７,３'４'−テトラメチルエーテルに２０μＭの濃度で有意な効果が確認された（図１）。
【００５０】
効果があったフラボノイドのなかで、カンフェロール、ゲニステインにはチロシンキナーゼ阻害活性が報告されており、チロシンリン酸化タンパク質がβ酸化系に関与していることを示している可能性が考えられた。ペルオキシソーム膜ＡＢＣタンパク質がチロシンリン酸化されている可能性を以前報告しており、リン酸化とβ酸化活性が関係しているか興味深い。
【００５１】
一方、効果が認められたほとんどのフラボノイドは２０μＭの濃度で細胞の成長を３日間で４０〜６０％程度阻害した。しかし、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルだけは、細胞の成長をほとんど阻害せずに再現性よく極長鎖脂肪酸のβ酸化活性を上昇した。この効果は現在治療薬として試されているロバスタチンよりも高く、細胞毒性も低いことが予想された。
【００５２】
（  実験に使用した天然物由来化合物  ）
スコパリ酸Ａ（scoparic acid A）、スコパドルシ酸Ｂメチルエーテル（scopadulcic acid B）、スコパドルシ酸Ｇ（scopadulcic acid G）、ペオニフロリゲノン（paeoflorigenone）、ペオニフロル（paeoniflor）、ギンクゲチン（ginkgetin）、６−メトキシベンゾキサゾリノン（6-methoxybenzoxazolinone）、カタルパラクトン（catalpalactone）、α−ラパコン（α-lapachone）、メチル−α−ラパコン（α-lapachone-Me）、カーノゾル（carnosol）、フレデリン（friedelin）、オレアノイン酸,（oleanolic acid）、ベチュリン酸（beturinic acid）、スコパドルシアール（scopadulcial）、リナリン（linarin）、コスモシイン（cosmosiin）、スクッテラレイン（scutellarein）、ハイペリン（hyperin）、ケルシトリン（quercitrin）、ルチン（rutin）、７−グルコシルルテオリン（luteolin-7-glc）、イソケルシトリン（isoquercitrin）、ルテオリン（luteolin）、ジオスメチン（Diosmetin）、アピゲニン（apigenin）、カンフェロール（kaempferol）、ケルセチン（quercetin）、ミリセチン（myricetin）、ミリシトリン（myricitrin）、エリオジクチオール（eriodictyol）、ヘスペリジン（hesperidin）、ミスカンソシド（miscanthoside）、ジスチリン（distylin）、アスチルビン（astilbin）、フスチン（fustin）、ホーモノメチン（formononetin）、ソホリコシド（sopholicoside）、ゲニステイン（ｇenistein）、オリエンチン（orientin）、ビテキシン（vitexin）、エンビニン（embinin）、アメントフラボン（amentoflavone）、スェーチシン（swertisin）、イソケルシトリン（isoquercitrin）、リクイリチン（liquiritin）、フクゲチン（fukugetin）、オゴニン（wogonin）、プルニン（purunin）、ネオポンシリン（ neoponcirin）、バイカリン（baicalin）、バイカレイン（ baicalein）、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル（baicalein-5,6,7-Me）、ペクトリナリゲニン（pectolinarigenin）、ネルムロシド（nelumloside）、ケルシメリトリン（quercimeritrin）、スコパリン（scoparin）、ナスシシン（nascissin）、アリクラリン（aricularin）、レイノ−トリン（reynoutrin）、酢酸ルテオリン（luteolin-Ac）、クリソエリオール（chrysoeriol）、フォーチュネルリン（fortunellin）、７−アラビノシルジオスメチン（diosmetin-7-Ara）、７−グルコシルジオスメチン（diosmetin-7-Glc）、ペダリチン（pedalitin）、ユーパトリン（eupatrin）、シルシリオール（cirsiliol）、フェラムリン（phellamurin）アキシホリン（axifolin）、７−アラビノシルカンフェロール（kaempferol-3-Ara）、３−ガラクトシルカンフェロール（kaempferol-3-Gal,）、７−グルコシルカンフェロール（kaempferol-７-Glc）、アカシイン（acaciin）、シナイイン（cinaiin）、ロイホリン（rhoifolin）、カンフェリトリン（kaempferitrin）、グルコシルラムノシルカンフェロール（kaempferol-Glc-Rha）、シルシメリン（circimarin）、ペクトリナリン（pectolinarin）、ソルバニン（sorbanin）、イソラムネチン（isorhamnetin）、ケルセチン５,７,３',４'−テトラメチルエーテル（quercetin-5,7,3',4'-Me）
【００５３】
実  施  例  ２
（ａ）バイカレイン誘導体の活性化効果：
実施例１でバイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルに効果が認められたので、バイカレイン誘導体（バイカリン、バイカレイン）についてβ酸化活性を調べた。
【００５４】
バイカレインは、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルの５、６、７番の炭素と結合したメトキシ基が水酸基であるものであり、バイカリンはバイカレインの７番の炭素がグルクロン酸の１位とエーテル結合しているものである（Table １）。通常オウゴン（コガネバナの根）には、バイカレイン、バイカリンが多く含まれているが、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルはほとんど含まれておらず、本実験では化学的に合成したものを使用した（EXTRASYNTHESE社（フランス）から購入）。その結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
表１に示すように、バイカレインとバイカリンにはβ酸化活性化効果はほとんど認められず、また細胞の成長を阻害（３日間培養後の細胞総タンパク量を対照細胞と比較すると、バイカリンで７０％、バイカレインで２５％に低下）した。これに対してバイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル  は活性を２倍程度まで上昇した。
【００５７】
（ｂ）バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルの濃度依存性：
ＡＬＤ患者繊維芽細胞（Ｒ５１８Ｑ）を用いてバイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルの濃度依存性について調べた。各濃度のバイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルで３日間培養（毎日培地交換）し、β酸化活性を測定した。その結果、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル濃度の上昇に呼応してβ酸化活性が上昇し、３０μＭで最も活性化効果が認められた（図２）。
【００５８】
（ｃ）変異型の異なる患者由来繊維芽細胞への効果：
２種類のＡＬＤ患者由来繊維芽細胞Ｒ５１８Ｑ（ＡＬＤＰの５１８番目のアルギニンがグルタミンに変異したもの）と１６３Ｔ（ＡＬＤｍＲＮＡの発現が欠損している患者由来細胞株）を用いて、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル（２０μＭ）のパルミチン酸とリグノセリン酸のβ酸化に対する効果を調べた。この結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
2010029205.tif 000005
【００６０】
その結果、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルはパルミチン酸及びリグノセリン酸もβ酸化活性を２倍程度上昇させ、変異のタイプの異なる細胞でも有効なことが示された。
【００６１】
実  施  例  ３
ペルオキシソーム膜ＡＢＣタンパク質発現への影響：
ペルオキシソームは脂質代謝に重要なオルガネラで、特に極長鎖脂肪酸のβ酸化はミトコンドリアではおこなわれず、ペルオキシソームのみで行われる。現在哺乳動物のペルオキシソーム膜上には４つのＡＢＣタンパク質（ＰＭＰ７０, ＡＬＤＰ, ＡＬＤＲＰ, Ｐ７０Ｒ）の存在が報告されており、ＡＬＤ患者ではこのペルオキシソーム膜ＡＢＣタンパク質のひとつＡＬＤＰ機能不全が原因で脂質代謝異常が起こる。トランスフェクションの実験から、ＡＬＤＰの機能はＰＭＰ７０やＡＬＤＲＰが代用できることが報告されている。実際、フィブラート系の薬物や治療薬として期待されているスタチン系薬物も核内転写因子を介して、ＡＬＤＲＰやＰＭＰ７０の発現量を増加することが報告されている。
【００６２】
そこで、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル処理によるこれらペルオキシソーム膜ＡＢＣタンパク質の発現量をイムノブロッティングにより確認した。このイムノブロッティングは、下記方法により、患者由来の細胞についてトリトンＸ−１００可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写後、各ＡＢＣタンパク質のＣ末ペプチド抗体を反応させることにより行った。
【００６３】
すなわち、上記の脂肪酸β酸化の測定時と同様の方法で、正常細胞（Ｎ−Ｈ）はＤＭＳＯのみで、患者由来細胞（Ｒ５１８Ｑ）はＤＭＳＯのみとバイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルを最終濃度２０μＭ もしくは ３０μＭ含む培地で、１０ｃｍシャーレに各４枚ずつ７２時間培養した。途中２４時間毎に培地交換した。
【００６４】
細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄した後、セルスクレーパーを用いて２ｍｌチューブに回収した。これに緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ７.４, １ｍＭ ＥＤＴＡ, １０％ (v／v) グリセロール, １％ (v／v) ＴｒｉｔｏｎＸ−１００, １００ ｍＭ ＮａＣｌ, ５ ｍＭ ＩＡＡ）、４プロテア-ゼ阻害剤（ペプスタチンＡ、ロイペプチン、キモスタチン、アンチパイン）, １ｍＭ ＰＭＳＦ（フッ化メチルスルホニルフォスフェート）を加えて４℃で３０分間ゆっくり撹拌し、０.０１容量の１Ｍ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を加えて、４℃で２０分間、１４,０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００６５】
その上清の一部を用いてタンパクを定量した。タンパク定量は Bradford 法（Bio Rad）を用い、標準タンパク質としてＩｇＧを使用した。試料からのトリトンＸ−１００等の除去は、Wessel＆Fluggeの方法（WesselD., and Flugge U. I.； Anal. Biochem., 138,141-143.(1984)）により行なった。
【００６６】
この上清について４倍容量のメタノールを加え撹拌した後、遠心（９０００×ｇ、１０秒）し、さらにこれにクロロホルムを２倍容量加え撹拌した。遠心（９０００×ｇ、１０秒）後、３倍容量の水を加え撹拌した。遠心（９０００×ｇ、１分）後、上清のみ慎重に取り除き、３倍容量のメタノールを加え撹拌した。遠心（９０００×ｇ、２分）後、沈澱を乾燥し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料バッファーに１００℃、５分間で可溶化した。
【００６７】
ポリアクリルアミドグラディエントゲル（７〜１５％）を作成し、１レーン２００μｇになる様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは泳動バッファー (０.０５Ｍ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ,０.３８Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ, ０.１％ ＳＤＳ)を用い、２０ｍＡの定電流で３時間泳動した。泳動後、転写バッファー (２５ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、０.７Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ)を用い、１５０ｍＡの定電流を３時間流してＰＶＤＦ膜（バイオラッド）にブロッティングした。
【００６８】
ブロッティング後、抗原抗体反応を行った。ＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ (２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ７.６, １３７ｍＭ ＮａＣｌ, ０.１％Ｔｗｅｅｎ ２０)、で１時間インキュベ-トし、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、１次抗体２次抗体による反応を行なった。その後、ＥＣＬ−ｐｌｕｓ (ファルマシア)で発色させた。１次抗体にはヒトＡＬＤＰ（Ｃ末２４残基 九州大山田先生から供与）、ヒトＰＭＰ７０（Ｃ末１５残基）に対するウサギ血清、及びヒトＡＬＤＲＰ (Ｃ末１４残基)を用い、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ファルマシア）を用いた。
【００６９】
またイムノブロッティングした後のＰＶＤＦ膜を異なる抗体で検出するために、抗体除去を行った。すなわちＰＶＤＦ膜を抗体除去バッファー（２％ ＳＤＳ, ６２.５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ６.７, １０％(Ｖ／Ｖ)グリセロール , １００ｍＭ β−メルカプトエタノール）で７０℃、３０分間振騰した。そのあと、ＴＢＳ−Ｔで１０分間インキュベートを２回行った。この後の操作は上記と同様に行った。検出及び定量にはルミノイメ−ジアナライザ−ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（富士フィルム）を用いた。この結果を図３に示す。
【００７０】
その結果、ＰＭＰ７０は患者由来細胞（Ｒ５１８Ｑ）でも認められるが、ＡＬＤＰは認められなかった。またＡＬＤＲＰの発現はいずれにも認められなかった。バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルを処理した細胞では特にＡＬＤＰやＡＬＤＲＰの発現は検出されなかった。ＰＭＰ７０は患者では若干低下し、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルの処理で少し上昇した。
【００７１】
以上の結果、極長鎖脂肪酸のβ酸化活性が上昇するのはＡＬＤＰやＡＬＤＲＰの発現量が増加するためとは考えにくい。一方、ＰＭＰ７０はバイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルで若干上昇が認められたことから、ＡＬＤＰの代わりに機能を担っている可能性が考えられるが、発現量から考えてその可能性は低いと考えられる。
【００７２】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより各ＡＢＣタンパク質やβ酸化系の酵素について発現量を調べた。その結果、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル処理による大きな各ＡＢＣタンパク質のｍＲＮＡ発現量の変化は認められなかった。
【００７３】
実  施  例  ４
漢方方剤による効果：
バイカレイン、バイカリン等のフラボノイド類はオウゴン（コガネバナの根）に多く含まれていることが報告されている。そこでオウゴン抽出液及びオウゴンを多く含む後記漢方方剤およびそのエキスが極長鎖脂肪酸のβ酸化活性に有効かどうかを調べた。
【００７４】
各漢方方剤のオウゴン含有率は、柴胡加竜骨牡蛎湯（０％）、黄連解毒湯（３３％）、三黄瀉心湯（４４％）、大柴胡湯（１１％）、防風通聖散（７％）、柴胡桂枝湯（９％）、小柴胡湯（１２％）、清肺湯（１２％）である。
【００７５】
その結果、柴胡桂枝湯、小柴胡湯の漢方方剤エキスで有意な効果が認められた。しかし、オウゴンの含有率との相関関係は認められなかった。今回、ＤＭＳＯのみの対照に比べて、漢方方剤エキス０時間処理でも活性の上昇が認められた。漢方方剤エキスにはサポニンなどの界面活性作用をもつものが含まれているが、この様な物質がヘキサン抽出等のβ酸化アッセイプロトコールに影響しているものと推定された。しかし、このアーティファクト（artifact）を考慮に入れても、効果は確認された。
【００７６】
極長鎖脂肪酸の代謝異常は、極長鎖脂肪酸のβ酸化活性に対する長鎖脂肪酸のβ酸化活性の比「リグノセリン酸の代謝量／パルミチン酸の代謝量」を指標として示すことができ、その値が０.２５５以下でＡＬＤと診断される。
【００７７】
先程の結果から特に有効と思われる柴胡桂枝湯エキスを処理すると、ＡＬＤ細胞では最初０.２３４であったが、処理日数に従い値が上昇した。また正常なヒト由来の細胞でも最初は０.４２２であるが活性が上昇した。以上のことから漢方エキスの中にもペルオキシソームの脂質β酸化を活性化する有効なものが存在することを見出した。
【００７８】
（  漢方方剤及びエキスの調製  ）
漢方方剤（柴胡加竜骨牡蛎湯、黄連解毒湯、三黄瀉心湯、大柴胡湯、防風通聖散、柴胡桂枝湯、小柴胡湯、清肺湯）は、刻み生薬により調製した。
【００７９】
漢方方剤エキスは、漢方方剤について、一日分の構成生薬をそれぞれ量り取り、イオン交換水９００ ｍｌを加え熱時２０分間抽出し、得られた抽出液をろ過した後、４０℃で減圧下濃縮し、残渣をさらに凍結乾燥することにより得た。
【作用】
【００８０】
本発明により、フラボノイド類、例えばバイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル処理において患者由来繊維芽細胞の極長鎖脂肪酸のβ酸化活性が濃度依存的に有意に上昇することが見出された。この活性化効果はロバスタチンよりも有効で、しかもロバスタチンに比べて細胞の成長への影響は少ない。
【００８１】
バイカレインは生体内に入るとバイカリンに代謝され、排泄されることが知られている。これに対してバイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルは水酸基がメトキシ基になっているため、代謝を受けにくく、またバイカレイン、バイカリンに比べて脂溶性が高いと考えられる。効果の違いはこの脂溶性の上昇のため細胞膜を通過しやすくなったためか、代謝を受けにくくなったためと推察される。
【００８２】
これらの事実は、バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテルの治療薬としての可能性を考える上で好都合である。バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル処理した細胞では、ロバスタチンで報告されている様なＡＬＤＲＰの発現量に上昇は認められなかった。患者由来の細胞ではＡＬＤＰが存在しなくても、正常の３０％程度の極長鎖脂肪酸のβ酸化活性は存在していること、極長鎖脂肪酸がペルオキシソームのみで代謝を受けることから考えて、ＡＬＤＰ非依存性の代謝経路が存在していると考えられる。バイカレイン５,６,７−トリメチルエーテル処理により未知遺伝子の発現が誘導され、ＡＬＤＰ非依存性の代謝経路のどこかを活性化している可能性が考えられる。今後、この作用メカニズムについて検討していく必要がある。  
【００８３】
今回、数種の漢方方剤エキスにも同様な効果が認められた。漢方方剤は実際にヒトにも処方されているものであり、すぐに治療薬として使用できる可能性がある。
以    上
【図１】
2010029205.tif 000006
【図２】
2010029205.tif 000007
【図３】
2010029205.tif 000008