(57)【要約】      （修正有）【課題】より簡単かつ正確に胚の良否を判定する装置の提供。【解決手段】以下の各部からなる、胚の観察装置。画像取得部６１は、顕微鏡に標本として設置されている胚をカメラにより時系列に撮影した観察画像を取得し、観察部６２に供給する。観察部６２は、取得した観察画像に基づいて、胚の卵割を検出し、胚内の各細胞の分裂を追跡する。グレーディング部８１は、観察部６２から供給される卵割情報に基づいて、所定のタイミングで、胚内の同世代の各細胞の分裂に要した時間を求め、胚のグレーディング値を算出する。良否判定部８２は、所定のタイミングで、グレーディング値に基づいて胚の良否を判定する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚の生育を観察する胚観察装置において、
前記胚を時系列に撮影した画像に基づいて、前記胚の卵割を検出し、前記胚内の各細胞の分裂を追跡する観察手段と、
前記胚内の同世代の各細胞の分裂に要した時間に基づいて、前記胚の生育状態を評価する評価手段と
を含むことを特徴とする胚観察装置。
【請求項２】
前記評価手段は、前記胚内の同世代の各細胞の分裂に要した時間の分散値に基づいて、前記胚の生育状態を評価する
ことを特徴とする請求項１に記載の胚観察装置。
【請求項３】
前記評価手段は、前記胚内の各細胞が分裂するスピードに基づいて、前記胚の生育状態を評価する
ことを特徴とする請求項１に記載の胚観察装置。
【請求項４】
前記観察手段は、さらに、前記胚内の各細胞の大きさを検出し、
前記評価手段は、さらに、前記胚内の同世代の細胞の大きさに基づいて、前記胚の生育状態を評価する
ことを特徴とする請求項１に記載の胚観察装置。
【請求項５】
前記評価手段は、前記胚内の同世代の細胞の大きさの分散値に基づいて、前記胚の生育状態を評価する
ことを特徴とする請求項４に記載の胚観察装置。
【請求項６】
前記観察手段は、前記胚の外周のへこみを検出することにより前記胚の卵割を検出する
ことを特徴とする請求項１に記載の胚観察装置。
【請求項７】
前記観察手段は、前記胚の深さ方向にフォーカス位置を変化させながら前記胚を撮影した複数の画像に基づいて、前記胚の深さ方向において、フォーカスの合い具合を表すパラメータが極大となり、かつ、所定の閾値以上となるフォーカス位置を検出し、検出したフォーカス位置が複数ある場合、検出した各フォーカス位置の間において卵割が発生していると判定する
ことを特徴とする請求項１に記載の胚観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚観察装置に関し、特に、胚の生育を観察する胚観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、体外受精の成功率を上げるなどの目的で、受精卵（以下、単に卵とも称する）を撮影した画像内の胚の形態に基づいて、胚の状態を分類し、胚の生育状態を評価することが行われている。胚の生育状態の評価方法としては、例えば、Veeckによる分類法、Gardnerによる分類法などが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Baczkowski, T., Kurzawa, R. and Glabowski, W., Methods of embryo scoring in in vitro fertilization, Reprod, Biol. v4. p.5-22
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の分類法では、良好であると判定された胚においてDNA（Deoxyribo Nucleic Acid）の異常が検出されたり、不良であると判定された胚が正常に卵割を続けていくなどの誤判定が発生することが知られている。
【０００５】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、より簡単かつ正確に胚の良否を判定できるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一側面の胚観察装置は、胚の生育を観察する胚観察装置であって、前記胚を時系列に撮影した画像に基づいて、前記胚の卵割を検出し、前記胚内の各細胞の分裂を追跡する観察手段と、前記胚内の同世代の各細胞の分裂に要した時間に基づいて、前記胚の生育状態を評価する評価手段とを備える。
【０００７】
本発明の一側面においては、胚を時系列に撮影した画像に基づいて、前記胚の卵割が検出され、前記胚内の各細胞の分裂が追跡され、前記胚内の同世代の各細胞の分裂に要した時間に基づいて、前記胚の生育状態が評価される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、より簡単かつ正確に胚の良否を判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。
【００１０】
図１は、本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。この観察システムは、顕微鏡１１、操作部１２、コントローラ１３、カメラ１４、パーソナルコンピュータ１５、および観察モニタ１６から構成される。
【００１１】
顕微鏡１１には、図示せぬステッピングモータ等により駆動される電動ステージ２１が設けられている。この電動ステージ２１には、観察の対象となる細胞等の標本が入れられたガラスボトムディッシュやウェルプレートなどの容器が配置され、ユーザは、操作部１２を操作して、標本を適切に観察できるように電動ステージ２１を移動させる。なお、以下、電動ステージ２１の移動方向について、顕微鏡１１の左右方向をｘ軸方向、前後方向をｙ軸方向、上下方向をｚ軸方向と定義する。
【００１２】
また、カメラ１４は、顕微鏡１１の視野内の標本を被写体として撮像し、その結果得られた画像（以下、観察画像と称する）をパーソナルコンピュータ１５に供給する。そして、パーソナルコンピュータ１５は、カメラ１４からの観察画像を観察モニタ１６に供給して表示させる。これにより、ユーザは観察モニタ１６に表示される観察画像を見ることで、顕微鏡１１の視野内にある標本を観察することができる。
【００１３】
コントローラ１３は、操作部１２を操作することによりユーザが登録した、タイムラプス観察における標本の観察位置を示す観察位置情報を記録する。コントローラ１３は、記録した観察位置情報をパーソナルコンピュータ１５に供給する。
【００１４】
パーソナルコンピュータ１５は、コントローラ１３から供給された観察位置情報を記録し、この観察位置情報に基づいて、タイムラプス観察のための制御を行う。すなわち、パーソナルコンピュータ１５は、記録している観察位置情報に基づいて、一定の時間間隔でコントローラ１３に、登録された観察位置への電動ステージ２１の移動を指示する。そして、コントローラ１３は、パーソナルコンピュータ１５の指示に応じて、登録された観察位置に電動ステージ２１を移動させ、パーソナルコンピュータ１５は、観察位置における標本の画像をカメラ１４から取得して記録する。
【００１５】
なお、以下、顕微鏡１１は、正立型の顕微鏡であり、カメラ１４は、電動ステージ２１の上方から標本を撮影するものとする。
【００１６】
図２は、パーソナルコンピュータ１５が、所定の制御プログラムを実行することにより実現される胚観察部５１の機能的構成の例を示すブロック図である。
【００１７】
胚観察部５１は、画像取得部６１、観察部６２および評価部６３を含むように構成され、胚の生育を観察し、胚の生育状態を評価する機能を実現する。
【００１８】
画像取得部６１は、観察部６２からの指令に基づいて、カメラ１４を制御し、電動ステージ２１上に標本として設置されている卵（受精卵）を撮影させる。画像取得部６１は、カメラ１４により撮影された卵の観察画像を取得し、観察部６２に供給する。
【００１９】
観察部６２は、卵検出部７１、垂直方向卵割検出部７２、水平方向卵割検出部７３、および、細胞認識部７４を含むように構成され、卵および卵内の胚を時系列に撮影した観察画像に基づいて、胚の卵割を検出し、胚内の各細胞の分裂を追跡する。
【００２０】
卵検出部７１は、画像取得部６１を介して、観察画像をカメラ１４から取得する。卵検出部７１は、図４などを参照して後述するように、取得した観察画像内の卵の検出処理を行う。卵検出部７１は、観察画像内の卵の位置を示す情報、および、卵の検出に用いた観察画像を垂直方向卵割検出部７２に供給する。
【００２１】
垂直方向卵割検出部７２は、図５などを参照して後述するように、胚内の細胞が垂直方向に分裂する場合の卵割の検出処理を行う。垂直方向卵割検出部７２は、検出結果に応じて、卵および胚を垂直方向に分割する卵割境界面を設定する。また、垂直方向卵割検出部７２は、設定した卵割境界面により卵を分割することにより単位領域を設定する。垂直方向卵割検出部７２は、設定した卵割境界面および単位領域を示す情報を水平方向卵割検出部７３に供給する。
【００２２】
水平方向卵割検出部７３は、画像取得部６１を介して、フォーカス位置が異なる複数の観察画像をカメラ１４から取得する。水平方向卵割検出部７３は、図１１などを参照して後述するように、取得した複数の観察画像に基づいて、単位領域毎に、胚内の細胞が水平方向に分裂する場合の卵割の検出処理を行う。水平方向卵割検出部７３は、検出結果に応じて、卵および胚を水平方向に分割する卵割境界面を設定する。水平方向卵割検出部７３は、観察画像における卵および胚の位置、並びに、垂直方向卵割検出部７２および水平方向卵割検出部７３により設定された卵割境界面の位置を示す情報を細胞認識部７４に供給する。また、水平方向卵割検出部７３は、卵割の検出に用いた観察画像を細胞認識部７４に供給する。
【００２３】
細胞認識部７４は、設定された卵割境界面に基づいて、観察画像内の胚内の細胞を個々に認識する。細胞認識部７４は、認識した各細胞を一意に識別するために各細胞にラベルを割り当てる。また、細胞認識部７４は、取得した観察画像に基づいて、認識した各細胞の大きさを検出する。細胞認識部７４は、各細胞に割り当てたラベル、並びに、各細胞の位置および大きさを示す卵割情報を評価部６３に供給する。
【００２４】
評価部６３は、グレーディング部８１および良否判定部８２を含むように構成され、細胞認識部７４から取得した卵割情報に基づいて、胚の生育状態を評価する。
【００２５】
グレーディング部８１は、細胞認識部７４から取得した卵割情報を時系列に記録する。また、グレーディング部８１は、時系列に記録した卵割情報に基づいて、胚の生育状態をグレード分けするグレーディング処理を行う。グレーディング部８１は、グレーディング処理により算出したグレーディング値を良否判定部８２に供給する。
【００２６】
良否判定部８２は、グレーディング部８１により算出されたグレーディング値に基づいて、胚の良否を判定する。良否判定部８２は、判定結果を示す情報を外部に出力する。
【００２７】
次に、図３のフローチャートを参照して、図１の観察システムにより実行される胚観察処理について説明する。なお、この処理は、例えば、電動ステージ２１上に観察対象となる卵が標本として設置され、ユーザが操作部１２を操作することにより、コントローラ１３を介して、パーソナルコンピュータ１５に胚観察処理の実行の指令を入力したとき、開始される。なお、以下、人の受精卵を観察対象とする場合の処理について説明する。
【００２８】
ステップＳ１において、胚観察部５１は、観察画像を取得する。具体的には、卵検出部７１は、観察画像を取得するように画像取得部６１に指令する。カメラ１４は、画像取得部６１の制御の基に、観察画像を撮影し、撮影した観察画像を、画像取得部６１を介して卵検出部７１に供給する。
【００２９】
ステップＳ２において、卵検出部７１は、卵検出処理を実行する。ここで、図４のフローチャートを参照して、卵検出処理の詳細について説明する。
【００３０】
ステップＳ２１において、卵検出部７１は、観察画像に分散フィルタを適用する。ここで、分散フィルタとは、所定の大きさのフィルタ窓内の輝度の分散を算出するフィルタである。従って、分散フィルタは、フィルタ窓内に何らかの物体が存在し、その物体の輝度のバラツキが大きいほど大きな値を返し、フィルタ窓内に何も存在しなければ０を返す。卵検出部７１は、観察画像の全ての領域に分散フィルタを適用する。
【００３１】
ステップＳ２２において、卵検出部７１は、観察画像を二値化する。すなわち、卵検出部７１は、分散フィルタを施した後の観察画像の各画素の画素値を、所定の閾値を用いて二値化する。これにより、観察画像内の物体が存在する部分と存在しない部分とが区別して表示される。
【００３２】
ステップＳ２３において、胚観察部５１は、二値化画像に基づいて、観察画像内の物体を検出する。卵検出部７１は、検出した物体を個々に区別できるように、各物体にそれぞれ異なるラベルを割り当てる。
【００３３】
ステップＳ２４において、卵検出部７１は、検出した各物体の面積とモーメント（画像のモーメント）を算出する。
【００３４】
ステップＳ２５において、卵検出部７１は、検出した物体の中から卵を選定する。具体的には、卵検出部７１は、各物体の面積とモーメントに基づいて、標準的な人の受精卵の大きさおよび形状に最も近い物体を卵として選定する。卵検出部７１は、観察画像内の卵の位置を示す情報、および、画像処理を施す前の観察画像を垂直方向卵割検出部７２に供給する。その後、卵検出処理は終了する。
【００３５】
図３に戻り、ステップＳ３において、垂直方向卵割検出部７２は、垂直方向卵割検出処理を実行する。ここで、図５のフローチャートを参照して、垂直方向卵割検出処理の詳細について説明する。
【００３６】
ステップＳ４１において、垂直方向卵割検出部７２は、観察画像のノイズを除去する。すなわち、垂直方向卵割検出部７２は、卵検出部７１から取得した観察画像に、ローパスフィルタを適用し、高調波成分のノイズを除去する。
【００３７】
ステップＳ４２において、垂直方向卵割検出部７２は、観察画像のエッジを抽出する。例えば、垂直方向卵割検出部７２は、観察画像に二次微分フィルタを適用することにより、観察画像のエッジを抽出する。
【００３８】
ステップＳ４３において、垂直方向卵割検出部７２は、観察画像を二値化する。すなわち、垂直方向卵割検出部７２は、エッジ抽出を行った後の観察画像の各画素の画素値を、所定の閾値を用いて二値化する。これにより、観察画像内のエッジ部分とエッジ以外の部分とが区別して表示される。
【００３９】
ステップＳ４４において、垂直方向卵割検出部７２は、二値化画像に基づいて、胚の外周を検出する。具体的には、垂直方向卵割検出部７２は、二値化画像に基づいて、卵検出部７１により検出された観察画像の卵内の領域において、抽出されたエッジにより囲まれた物体を胚として認識し、エッジの外枠の部分を、胚の外周（細胞膜）として認識する。
【００４０】
ステップＳ４５において、垂直方向卵割検出部７２は、胚の外周の極座標を算出する。例えば、図６に示されるように、左側の卵１０１内の胚１０２が、右側に示されるように、細胞Ｃ１と細胞Ｃ２に卵割した場合について考える。なお、図６は、卵１０１を上から見た図である。
【００４１】
垂直方向卵割検出部７２は、胚１０２の中心Ｏを求め、胚１０２の外周の各点の座標を、中心Ｏを中心とする極座標（θ，ｒ）により表す。図７は、図６の右側の胚１０２の外周の極座標のグラフであり、横軸が偏角θ、縦軸が動径ｒを示している。
【００４２】
ステップＳ４６において、垂直方向卵割検出部７２は、胚の外周の極座標の微分波形に基づいて、胚の外周のへこみを検出する。具体的には、垂直方向卵割検出部７２は、胚の外周の極座標を偏角θにより微分した微分波形（以下、極座標微分波形と称する）を求める。例えば、図７の胚の外周の極座標の波形は、図６の右側の胚１０２の外周の各へこみの頂点ＤＰ１および頂点ＤＰ２における偏角θ１および偏角θ２において極小となる。従って、例えば、偏角θ１の近傍の極座標微分波形は、図８に示されるように、偏角θ１の少し前の偏角θａで極小となった後、偏角θ１で０になり、偏角θ１の少し後の偏角θｂで極大となる。
【００４３】
垂直方向卵割検出部７２は、極座標微分波形において、所定の偏角θの範囲内（例えば、５度以内）で値が極小から極大となり、かつ、その極小値と極大値の絶対値がともに所定の閾値以上となる区間を抽出する。そして、垂直方向卵割検出部７２は、抽出した区間において、極座標微分波形が０になる偏角θに対応する胚の外周上の点およびその近傍を、胚の外周のへこみとして検出する。なお、抽出した区間内において、極座標微分波形が０になる偏角θが複数存在する場合、例えば、その区間の中心に最も近い偏角θに対応する胚の外周上の点およびその近傍が、胚の外周のへこみとして検出される。例えば、図６の右側の胚１０２の場合、図９に示されるように、頂点ＤＰ１およびその近傍がへこみＤ１として検出され、頂点ＤＰ２およびその近傍がへこみＤ２として検出される。
【００４４】
ステップＳ４７において、垂直方向卵割検出部７２は、検出したへこみの数が１より大きいか否かを判定する。検出したへこみの数が１より大きいと判定された場合、処理はステップＳ４８に進む。
【００４５】
ステップＳ４８において、垂直方向卵割検出部７２は、胚の外周のへこみの位置と数に応じて、垂直方向の卵割境界面を設定する。例えば、図９に示される例の場合、垂直方向卵割検出部７２は、頂点ＤＰ１と頂点ＤＰ２を結ぶ境界線Ｌ１を通りｚ軸に平行な面、すなわち、境界線Ｌ１を通り卵１０１および胚１０２を垂直方向に分割する面を、卵割境界面に設定する。
【００４６】
また、例えば、図１０に示されるように、胚１０２の細胞Ｃ１が細胞Ｃ１１と細胞Ｃ１２に分裂し、細胞Ｃ２が細胞Ｃ１３と細胞Ｃ１４に分裂し、胚１０２の外周において新たにへこみＤ１１とへこみＤ１２が検出された場合、垂直方向卵割検出部７２は、へこみＤ１１の頂点ＤＰ１１とへこみＤ１２の頂点ＤＰ１２を結ぶ境界線Ｌ１１を通りｚ軸に平行な面、すなわち、境界線Ｌ１１を通り卵１０１および胚１０２を垂直方向に分割する面を、新たに卵割境界面に設定する。
【００４７】
ステップＳ４９において、垂直方向卵割検出部７２は、卵割境界面に基づいて単位領域を設定する。すなわち、垂直方向卵割検出部７２は、観察画像内の卵が写っている領域を、設定した卵割境界面により分割し、分割後の各領域を単位領域に設定する。例えば、図９の例の場合、卵１０１は、境界線Ｌ１を通る卵割境界面により、単位領域Ｒ１と単位領域Ｒ２に分割される。また、例えば、図１０の例の場合、卵１０１は、境界線Ｌ１を通る卵割境界面および境界線Ｌ１１を通る卵割境界面により、単位領域Ｒ１１乃至Ｒ１４に分割される。垂直方向卵割検出部７２は、設定した卵割境界面および単位領域を示す情報を水平方向卵割検出部７３に供給する。その後、垂直方向卵割検出処理は終了する。
【００４８】
一方、ステップＳ４７において、検出したへこみの数が１以下であると判定された場合、処理はステップＳ５０に進む。
【００４９】
ステップＳ５０において、垂直方向卵割検出部７２は、垂直方向の卵割は発生していないと判定する。そして、垂直方向卵割検出部７２は、観察画像内の卵が写っている領域全体を単位領域に設定する。垂直方向卵割検出部７２は、設定した単位領域を示す情報を水平方向卵割検出部７３に供給する。その後、垂直方向卵割検出処理は終了する。
【００５０】
図３に戻り、ステップＳ４において、胚観察部５１は、水平方向卵割検出処理を実行する。ここで、図１１のフローチャートを参照して、水平方向卵割検出処理の詳細について説明する。
【００５１】
ステップＳ７１において、胚観察部５１は、フォーカス位置が異なる観察画像を複数取得する。具体的には、水平方向卵割検出部７３は、観察画像の取得を画像取得部６１に指令する。画像取得部６１は、電動ステージ２１をｚ軸方向に所定の間隔で移動させながら、各位置において、カメラ１４に観察画像を撮影させる。これにより、卵（胚）の深さ方向（ｚ軸方向）のフォーカス位置が異なる複数の観察画像が撮影される。カメラ１４は、撮影した複数の観察画像を、画像取得部６１を介して水平方向卵割検出部７３に供給する。
【００５２】
ステップＳ７２において、水平方向卵割検出部７３は、未処理の単位領域を１つ選択し、注目領域に設定する。
【００５３】
ステップＳ７３において、水平方向卵割検出部７３は、注目領域内の検出パラメータを算出する。例えば、水平方向卵割検出部７３は、各観察画像ごとに、注目領域内のコントラスト値の総和、または、注目領域内の輝度の微分値の総和を、検出パラメータとして算出する。
【００５４】
ステップＳ７４において、水平方向卵割検出部７３は、検出パラメータが極大となり、かつ、閾値以上となるフォーカス位置を抽出する。具体的には、水平方向卵割検出部７３は、カメラ１４のフォーカス位置に対する注目領域における検出パラメータの分布を求める。水平方向卵割検出部７３は、求めた分布において、検出パラメータが極大となり、かつ、所定の閾値以上となるフォーカス位置を抽出する。
【００５５】
ここで、図１２を参照して、ステップＳ７３およびＳ７４の処理の具体例について説明する。なお、図１２は、卵１５１を横から見た図であり、垂直方向がｚ軸方向である。また、図１２の方向から見て、卵１５１内の胚１５２は、細胞Ｃ５１および細胞Ｃ５２に分裂しており、垂直方向の卵割境界面は設定されていない。なお、図１２の実線の丸で囲まれた部分は、胚１５２の外周の水平方向の広がりが極大となる部分を示している。
【００５６】
上述したように、電動ステージ２１をｚ軸方向に移動させながら観察画像を撮影することにより、胚１５２の深さ方向にフォーカス位置が異なる複数の観察画像が得られる。胚１５２は半透明で丸みを帯びた形状をしているため、電動ステージ２１の上方から胚１５２を撮影した場合、カメラ１４のフォーカス位置が、胚１５２の水平方向の幅が極大となる位置Ｆ５１またはＦ５２と一致するとき、観察画像における胚１５２の外周のボケが極小となり、カメラ１４のフォーカス位置が胚１５２に対して適切になる。
【００５７】
上述した２種類の検出パラメータは、いずれも観察画像内の被写体へのフォーカスの合い具合を表すパラメータである。従って、注目領域のｚ軸方向（胚の深さ方向）において、検出パラメータが極大となり、かつ、閾値以上となるカメラ１４のフォーカス位置を抽出することにより、胚１５２の水平方向の幅が極大となる位置Ｆ５１およびＦ５２（以下、フォーカス位置Ｆ５１およびフォーカス位置Ｆ５２と称する）を検出することができる。
【００５８】
ステップＳ７５において、水平方向卵割検出部７３は、抽出したフォーカス位置の数が１を超えるか否かを判定する。抽出したフォーカス位置の数が１を超えると判定された場合、処理はステップＳ７６に進む。
【００５９】
ステップＳ７６において、水平方向卵割検出部７３は、抽出したフォーカス位置に基づいて、注目領域における胚の分割位置を設定する。例えば、図１２の例のように、胚１５２が上下に分割している場合、細胞Ｃ５１と細胞Ｃ５２の境界においてへこみが生じる。そのへこみの位置は、細胞Ｃ５１の水平方向の幅が極大となるフォーカス位置Ｆ５１と、細胞Ｃ５２の水平方向の幅が極大となるフォーカス位置Ｆ５２の間に存在する。そこで、水平方向卵割検出部７３は、検出されたフォーカス位置Ｆ５１とＦ５２の間において卵割が発生していると判定し、ｚ軸方向においてフォーカス位置Ｆ５１とＦ５２の中央にある位置Ｄ５１を胚１５２の分割位置に設定する。その後、処理はステップＳ８１に進む。
【００６０】
一方、ステップＳ７５において、抽出したフォーカス位置の数が１以下であると判定された場合、処理はステップＳ７７に進む。
【００６１】
ステップＳ７７において、水平方向卵割検出部７３は、検出パラメータが最大となるフォーカス位置を検出する。
【００６２】
ステップＳ７８において、水平方向卵割検出部７３は、検出したフォーカス位置が、初期ベストフォーカス位置よりカメラ１４に近い位置にあるか否かを判定する。なお、初期ベストフォーカス位置とは、胚が水平方向に卵割していない場合に、胚の水平方向の幅が最大となり、カメラ１４のフォーカスが最も適切になると想定される位置であり、胚の高さの方向（ｚ軸方向）の中央に設定される。水平方向卵割検出部７３が、検出したフォーカス位置が、初期ベストフォーカス位置から所定の距離以上カメラ１４に近い位置にあると判定した場合、処理はステップＳ７９に進む。
【００６３】
ステップＳ７９において、水平方向卵割検出部７３は、初期ベストフォーカス位置を、注目領域における胚の分割位置に設定する。その後、処理はステップＳ８１に進む。
【００６４】
ここで、図１３および図１４を参照して、ステップＳ７７乃至Ｓ７９の処理の具体例について説明する。図１３は、卵１６１を横から見た図であり、垂直方向がｚ軸方向である。なお、図１３の方向から見て、卵１６１内の胚１６２は、細胞Ｃ６１乃至Ｃ６３の３つの細胞に分裂している。また、卵１６１において、垂直方向卵割検出処理により、卵割境界面Ｂｖ６１が設定され、単位領域Ｒ６１と単位領域Ｒ６２が設定されている。さらに、初期ベストフォーカス位置ＢＦ６１は、胚１６２の高さ方向の中央に設定される。
【００６５】
卵１６１を上方向から撮影した場合、細胞Ｃ６１および細胞Ｃ６２により、細胞Ｃ６３が隠れてしまうため、細胞Ｃ６３の外周のエッジの検出が困難になる。その結果、水平方向の卵割を見逃してしまう恐れがある。なお、図中、胚１６２の外周の水平方向の広がりが極大となる部分のうち、実線の丸で囲まれた部分は、上方向から観察できる部分を示し、点線の丸で囲まれた部分は、上方向からの観察が困難な部分を示している。
【００６６】
一方、この場合、単位領域Ｒ６１において、胚１６２の水平方向の外周が最大となり、検出パラメータが最大となるフォーカス位置Ｆ６１が、初期ベストフォーカス位置ＢＦ６１よりカメラ１４に近い位置となる。従って、水平方向卵割検出部７３は、フォーカス位置Ｆ６１が初期ベストフォーカス位置ＢＦ６１よりカメラ１４に近い位置にあることにより、単位領域Ｒ６１において水平方向の卵割が発生しており、下に細胞が隠れていると判定し、単位領域Ｒ６１における分割位置を、初期ベストフォーカス位置ＢＦ６１に設定する。
【００６７】
単位領域Ｒ６２についても同様に、水平方向卵割検出部７３は、フォーカス位置Ｆ６２が初期ベストフォーカス位置ＢＦ６１よりカメラ１４に近い位置にあることにより、単位領域Ｒ６２において水平方向の卵割が発生しており、下に細胞が隠れていると判定し、単位領域Ｒ６２における分割位置を、初期ベストフォーカス位置ＢＦ６１に設定する。
【００６８】
また、図１４は、卵１７１を横から見た図であり、垂直方向がｚ軸方向である。なお、図１４の方向から見て、卵１７１内の胚１７２は、細胞Ｃ７１乃至Ｃ７４の４つの細胞に分裂している。また、卵１７１において、垂直方向卵割検出処理により、卵割境界面Ｂｖ７１が設定され、単位領域Ｒ７１と単位領域Ｒ７２が設定されている。なお、図中、胚１７２の外周の水平方向の広がりが極大となる部分のうち、実線の丸で囲まれた部分は、上方向から観察できる部分を示し、点線の丸で囲まれた部分は、上方向からの観察が困難な部分を示している。
【００６９】
この場合、単位領域Ｒ７１については、フォーカス位置Ｆ７１，Ｆ７２の２つのフォーカス位置が抽出されるため、ステップＳ７６において、ｚ軸方向においてフォーカス位置Ｆ７１とフォーカス位置Ｆ７２の中央にある位置Ｄ７１が分割位置に設定される。
【００７０】
一方、単位領域Ｒ７２については、上方向から撮影した場合、細胞Ｃ７３により細胞Ｃ７４が隠れてしまい、細胞Ｃ７４の外周のエッジが困難であり、フォーカス位置Ｆ７３のみ抽出される。しかし、フォーカス位置Ｆ７３は、初期ベストフォーカス位置ＢＦ７１よりカメラ１４に近いため、ステップＳ７９の処理において、初期ベストフォーカス位置ＢＦ７１が、単位領域Ｒ７２における分割位置に設定される。
【００７１】
図１０に戻り、一方、ステップＳ７８において、検出したフォーカス位置が、初期ベストフォーカス位置よりカメラ１４に近い位置にないと判定された場合、処理はステップＳ８０に進む。
【００７２】
ステップＳ８０において、水平方向卵割検出部７３は、注目領域において、水平方向の卵割は発生していないと判定する。その後、処理はステップＳ８１に進む。
【００７３】
ステップＳ８１において、水平方向卵割検出部７３は、全ての単位領域を処理したか否かを判定する。まだ処理していない単位領域があると判定された場合、処理はステップＳ７２に戻り、ステップＳ８１において、全ての単位領域を処理したと判定されるまで、ステップＳ７２乃至Ｓ８１の処理が繰り返し実行される。これにより、全ての単位領域において、ｚ軸方向の分割位置を設定する処理が実行される。
【００７４】
一方、ステップＳ８１において、全ての単位領域を処理したと判定された場合、処理はステップＳ８２に進む。
【００７５】
ステップＳ８２において、水平方向卵割検出部７３は、設定した分割位置の数と位置に応じて、水平方向の卵割境界面を設定する。例えば、図１２の例の場合、分割位置Ｄ５１を通り、胚１５２を水平方向に分割する面が、卵割境界面に設定される。また、例えば、図１３の例の場合、分割位置である初期ベストフォーカス位置ＢＦ６１を通り、胚１６２を水平方向に分割する面が、卵割境界面に設定される。さらに、例えば、図１４の例の場合、単位領域Ｒ７１については、分割位置Ｄ７１を通り、胚１７２を水平方向に分割する面が、卵割境界面に設定され、単位領域Ｒ７２については、分割位置である初期ベストフォーカス位置ＢＦ７１を通り、胚１７２を水平方向に分割する面が、卵割境界面に設定される。
【００７６】
水平方向卵割検出部７３は、観察画像における卵および胚の位置、並びに、垂直方向卵割検出部７２および水平方向卵割検出部７３により設定された卵割境界面の位置を示す情報を細胞認識部７４に供給する。なお、このとき、水平方向卵割検出部７３は、初期ベストフォーカス位置に基づいて設定した卵割境界面と他の卵割境界面とを区別して、細胞認識部７４に通知する。また、水平方向卵割検出部７３は、画像処理を施す前の、フォーカス位置が異なる複数の観察画像を細胞認識部７４に供給する。その後、水平方向卵割検出処理は終了する。
【００７７】
図３に戻り、ステップＳ５において、細胞認識部７４は、細胞認識処理を実行する。ここで、図１５のフローチャートを参照して、細胞認識処理の詳細について説明する。
【００７８】
ステップＳ１０１において、細胞認識部７４は、卵割境界面に基づいて、胚内の各細胞を認識する。具体的には、細胞認識部７４は、観察画像に写っている胚を、垂直方向および水平方向の卵割境界面に基づいて分割することにより、胚内の細胞の数および位置を認識する。
【００７９】
また、細胞認識部７４は、認識した各細胞を一意に識別するためにラベルを割り当てる。なお、細胞認識部７４は、所定の間隔で胚内の各細胞の認識処理を行っており、胚内の各細胞の分裂を追跡することが可能であり、胚内の各細胞がどの細胞から分裂したかを把握することができる。そこで、細胞認識部７４は、母細胞が同じ細胞を容易に認識できるようにラベルを割り当てる。
【００８０】
例えば、上述した図９の例の場合、細胞認識部７４は、細胞Ｃ１および細胞Ｃ２に、それぞれ異なる２進数のラベル００００およびラベル１０００を割り当てる。そして、胚１０２が、図９に示される状態から図１０に示される状態に変化した場合、細胞認識部７４は、細胞Ｃ１１にはラベル００００を割り当て、細胞Ｃ１２にはラベル０１００を割り当て、細胞Ｃ１３にはラベル１０００を割り当て、細胞Ｃ１４にはラベル１１００を割り当てる。すなわち、細胞Ｃ１１と細胞Ｃ１２のラベルは、同じ親細胞Ｃ１から分裂したことが分かるように、１桁目が同じ値０に設定され、２桁目が異なる値０または１に設定される。また、細胞Ｃ１３と細胞Ｃ１４のラベルは、細胞Ｃ１１と細胞Ｃ１２の親細胞Ｃ１とは異なる親細胞Ｃ２から分裂したことが分かるように、１桁目が同じ値１に設定され、２桁目が異なる値０または１に設定される。
【００８１】
なお、細胞のラベリングの方法は、この方法に限定されるものではなく、各細胞を一意に識別でき、かつ、各細胞の親細胞を容易に識別できる方法を適用すればよい。
【００８２】
ステップＳ１０２において、細胞認識部７４は、水平方向卵割検出部７３から取得した複数の観察画像に二次微分フィルタを適用し、各観察画像のエッジを抽出する。
【００８３】
ステップＳ１０３において、細胞認識部７４は、各細胞の大きさを求める。具体的には、細胞認識部７４は、エッジを抽出した各観察画像に基づいて、ステップＳ１０１において認識した各細胞の形状をより詳細に認識し、各細胞の大きさを求める。細胞認識部７４は、各細胞に割り当てたラベル、並びに、各細胞の位置および大きさを示す卵割情報をグレーディング部８１に供給する。グレーディング部８１は、卵割情報を取得した時刻とともに記録する。その後、細胞認識処理は終了する。
【００８４】
図３に戻り、ステップＳ６において、グレーディング部８１は、胚のグレーディングを行うタイミングであるか否かを判定する。胚のグレーディングを行うタイミングでないと判定された場合、処理はステップＳ７に進む。なお、胚のグレーディングを行うタイミングとしては、例えば、胚観察処理を開始してから所定の時間が経過したタイミング、前回グレーディングを行った時点から所定の時間が経過したタイミング、一世代前の細胞の分裂が開始されてから所定の時間が経過したタイミング、一世代前の全ての細胞の分裂が終了したタイミングなどが考えられる。
【００８５】
ステップＳ７において、卵検出部７１は、卵割の検出を行うタイミングであるか否かを判定する。卵割の検出を行うタイミングでないと判定された場合、処理はステップ６に戻り、ステップＳ６において、胚のグレーディングを行うタイミングであると判定されるか、ステップＳ７において、卵割の検出を行うタイミングであると判定されるまで、ステップＳ６およびＳ７の処理が繰り返し実行される。なお、卵割の検出を行うタイミングは、例えば、所定の時間間隔ごとに設定される。
【００８６】
一方、ステップＳ７において、卵割の検出を行うタイミングであると判定された場合、処理はステップＳ１に戻り、ステップＳ６において、胚のグレーディングを行うタイミングであると判定されるまで、ステップＳ１乃至Ｓ７の処理が繰り返し実行される。
【００８７】
また、ステップＳ６において、胚のグレーディングを行うタイミングであると判定された場合、処理はステップＳ８に進む。
【００８８】
ステップＳ８において、グレーディング部８１は、グレーディング処理を実行する。ここで、図１６のフローチャートおよび図１７を参照して、グレーディング処理の詳細について説明する。
【００８９】
まず、図１７を参照しながら、正常な胚と異常な胚の違いについて説明する。図１７は、人の受精卵の卵割の様子を模式的に示す図である。卵割前の胚を第０世代とすると、第０世代の胚が分裂することにより、第１世代の２つの細胞が生成される。そして、第１世代の各細胞がそれぞれ２つに分裂し、第２世代の４つの細胞が生成され、第２世代の各細胞がそれぞれ２つに分裂し、第３世代の８つの細胞が生成され、第３世代の各細胞がそれぞれ２つに分裂し、第４世代の１６個の細胞が生成される。すなわち、胚内の各細胞はそれぞれ２つに分裂し、世代を重ねるごとに、胚内の細胞の数は２倍ずつ増えていく。
【００９０】
正常な胚においては、同じ世代の細胞が分裂するスピードはほぼ同じであり、ほぼ同じタイミングで分裂する。従って、図１７に示されるような細胞の系統図を時系列に沿って作成した場合、系統図はほぼ左右対称に伸びていき、卵割が行われているタイミングを除いて、胚内には同じ世代の細胞のみ存在する。また、正常な胚においては、同じ世代の細胞の大きさはほぼ同じになる。従って、卵割が行われているタイミングを除いて、胚内の細胞の大きさはほぼ均等になる。
【００９１】
一方、異常な胚においては、同じ世代の細胞が分裂するスピードがばらついたり、一部の細胞の分裂が停止したりする。従って、図１７に示されるような細胞の系統図を時系列に沿って作成した場合、系統図が左右対称に伸びていかず、胚内には異なる世代の細胞が混在する。また、異常な胚においては、同じ世代の細胞の大きさに差が生じる。従って、胚内の細胞の大きさは、均等にはならずバラツキが生じる。
【００９２】
図１６のグレーディング処理においては、この正常な胚と異常な胚の特徴の違いに基づいて、胚のグレーディングを行う。
【００９３】
ステップＳ１２１において、グレーディング部８１は、一世代前の細胞が分裂に要した時間に基づいてグレーディングを行う。具体的には、グレーディング部８１は、記録している卵割情報に基づいて、一世代前の各細胞が、現在の世代の細胞に分裂するのに要した時間（以下、分裂時間と称する）を算出する。そして、グレーディング部８１は、一世代前の各細胞の分裂時間に基づいて、換言すれば、一世代前の各細胞が分裂したスピードに基づいて、現時点の胚のグレーディング値Ａを求める。グレーディング値Ａは、例えば、一世代前の各細胞の分裂時間が全て正常な範囲内に入っている場合、すなわち、一世代前の各細胞の分裂スピードが全て正常である場合、最も小さくなり、分裂時間が正常な範囲に入っていない細胞の数が多いほど、また、正常な分裂時間との差が大きくなるほど、大きくなる。
【００９４】
ステップＳ１２２において、グレーディング部８１は、細胞の大きさに基づいてグレーディングを行う。具体的には、グレーディング部８１は、卵割情報に基づいて、胚内においてフラグメンテーションと認められる大きさの細胞の割合を算出する。そして、グレーディング部８１は、算出した割合に基づいて、現時点の胚のグレーディング値Ｂを求める。グレーディング値Ｂは、例えば、フラグメンテーションと認められる大きさの細胞の割合が小さいほど、小さくなり、割合が大きいほど、大きくなる。なお、細胞の大きさとは、面積に基づくもの、あるいは形状に基づくものなどを指している。
【００９５】
ステップＳ１２３において、グレーディング部８１は、一世代前の細胞が分裂に要した時間の分散値や平均値などの統計量に基づいてグレーディングを行う。具体的には、グレーディング部８１は、卵割情報に基づいて、一世代前の各細胞の分裂時間の分散値や平均値などの統計量を算出する。そして、グレーディング部８１は、一世代前の各細胞の分裂時間の分散値に基づいて、現時点の胚のグレーディング値Ｃを求める。グレーディング値Ｃは、例えば、一世代前の各細胞の分裂時間の分散値が小さいほど、小さくなり、分散値が大きいほど、大きくなる。
【００９６】
ステップＳ１２４において、グレーディング部８１は、現在の世代の各細胞の大きさの分散値や平均値などの統計量に基づいてグレーディングを行う。具体的には、グレーディング部８１は、卵割情報に基づいて、現在の世代の各細胞の大きさの分散値や平均値などの統計量を算出する。そして、グレーディング部８１は、現在の世代の各細胞の大きさの分散値に基づいて、現時点の胚のグレーディング値Ｄを求める。グレーディング値Ｄは、例えば、現在の世代の各細胞の大きさの分散値が小さいほど、小さくなり、分散値が大きいほど、大きくなる。
【００９７】
ステップＳ１２５において、グレーディング部８１は、グレーディング値を積算する。具体的には、グレーディング部８１は、これまでの胚のグレーディング値の積算値に、今回のグレーディング処理により算出したグレーディング値Ａ乃至Ｄを積算する。グレーディング部８１は、積算したグレーディング値を良否判定部８２に供給する。その後、グレーディング処理は終了する。
【００９８】
また、グレーディング部８１は、ユーザの設定によりグレーディング値Ａ乃至Ｄのうち、適宜２つ以上のグレーディング値を選び、積算してもよい。さらにまた、グレーディング部８１は、グレーディング値Ａ乃至Ｄのうち１つを選択し、出力してもよい。
【００９９】
図３に戻り、ステップＳ９において、良否判定部８２は、胚の良否を判定するタイミングであるか否かを判定する。胚の良否を判定するタイミングでないと判定された場合、処理はステップＳ６に戻り、ステップＳ９において、胚の良否を判定するタイミングであると判定されるまで、ステップＳ１乃至Ｓ９の処理が繰り返し実行される。なお、胚の良否を判定するタイミングとしては、例えば、胚観察処理を開始してから所定の時間が経過したタイミング、胚のグレーディングを所定の回数行ったタイミング、胚内の細胞が所定の世代（例えば、第３世代あるいは第４世代）まで分裂したタイミング、グレーディング値の積算値が所定の閾値を超えたタイミングなどが考えられる。
【０１００】
一方、ステップＳ９において、胚の良否を判定するタイミングであると判定された場合、処理はステップＳ１０に進む。
【０１０１】
ステップＳ１０において、良否判定部８２は、胚の良否を判定する。例えば、良否判定部８２は、グレーディング値の積算値が所定の閾値未満である場合、観察中の胚が正常であると判定し、グレーディング値の積算値が所定の閾値以上である場合、観察中の胚が異常であると判定する。良否判定部８２は、判定結果を示す情報を外部に出力する。その後、胚観察処理は終了する。
【０１０２】
以上のように、胚内の各細胞の分裂を所定の時間間隔で追跡することにより、胚の生育状態をより正確に把握することができ、胚の良否を正確に判定することができる。また、複雑な画像処理や演算を行うことなく、簡単に胚の良否を判定することができる。
【０１０３】
なお、本発明は、胚が８分割または１６分割した時点で、良否判定を行うことを想定している。
【０１０４】
また、胚の卵割の検出方法は、上述した方法に限定されるものではなく、他の検出方法を用いるようにしてもよい。ここで、図１８を参照して、胚の卵割の検出方法の他の例について説明する。なお、図１８には、図６と同じ卵１０１が示されている。
【０１０５】
例えば、まず、胚１０２の外周を円近似した円２０１を求める。そして、胚１０２の外周が円２０１の内側に入り込んだ部分のうち、円２０１との距離が、極大となり、かつ、所定の閾値以上となる点（いまの場合、頂点ＤＰ１および頂点ＤＰ２）を検出し、検出した点の近傍をへこみとして検出するようにしてもよい。
【０１０６】
さらに、胚の良否の判定に用いるグレーディング値の種類は、上述した例に限定されるものではなく、グレーディング値の種類を増減させたり、例えば、胚の外周がへこんでいる位置の偏り、胚の分裂位置を示す境界線の長さの偏りなど、他の判定要素に基づくグレーディング値を用いるようにしてもよい。
【０１０７】
上述した胚観察部５１の一連の処理は、ハードウエアにより実行することもできるし、ソフトウエアにより実行することもできる。一連の処理をソフトウエアにより実行する場合には、そのソフトウエアを構成するプログラムが、専用のハードウエアに組み込まれているコンピュータ、または、各種のプログラムをインストールすることで、各種の機能を実行することが可能な、例えば汎用のコンピュータ（例えば、パーソナルコンピュータ１５）などに、プログラム記録媒体からインストールされる。
【０１０８】
なお、コンピュータが実行するプログラムは、本明細書で説明する順序に沿って時系列に処理が行われるプログラムであっても良いし、並列に、あるいは呼び出しが行われたとき等の必要なタイミングで処理が行われるプログラムであっても良い。
【０１０９】
また、本明細書において、システムの用語は、複数の装置、手段などより構成される全体的な装置を意味するものとする。
【０１１０】
さらに、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明を適用した観察システムの一実施の形態を示す図である。
【図２】胚観察部の機能的構成の例を示すブロック図である。
【図３】胚観察処理を説明するためのフローチャートである。
【図４】卵検出処理を説明するためのフローチャートである。
【図５】垂直方向卵割検出処理を説明するためのフローチャートである。
【図６】胚の外周のへこみの検出方法の例を説明するための図である。
【図７】胚の外周の極座標の例を示すグラフである。
【図８】胚の外周の極座標の微分波形の例を示すグラフである。
【図９】垂直方向の卵割の検出方法の例を説明するための図である。
【図１０】垂直方向の卵割の検出方法の他の例を説明するための図である。
【図１１】水平方向卵割検出処理を説明するためのフローチャートである。
【図１２】水平方向の卵割の検出方法の例を説明するための図である。
【図１３】水平方向の卵割の検出方法の他の例を説明するための図である。
【図１４】水平方向の卵割の検出方法のさらに他の例を説明するための図である。
【図１５】細胞認識処理を説明するためのフローチャートである。
【図１６】グレーディング処理を説明するためのフローチャートである。
【図１７】人の胚の系統図の例を示す図である。
【図１８】胚の外周のへこみの検出方法の他の例を説明するための図である。
【符号の説明】
【０１１２】
１１  顕微鏡,  １３  コントローラ,  １４  カメラ,  １５  パーソナルコンピュータ,  ２１  電動ステージ,  ５１  胚観察部,  ６１  画像取得部,  ６２  観察部,  ７１  卵検出部,  ７２  垂直方向卵割検出部,  ７３  水平方向卵割検出部,  ７４  細胞認識部,  ８１  グレーディング部,  ８２  良否判定部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2010004789.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2010004789.tif 000017
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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