(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトエフェクター細胞のIgAのFc受容体に特異的に反応するモノクローナル抗体を含む、Fcα受容体（CD89）に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】特定の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域からなり、ヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。前記抗体は二重機能性抗体またはヘテロ抗体であって、標的ヒトエフェクター細胞（たとえばマクロファージ）に標的細胞（たとえば癌細胞、感染性物質など）を狙わせるのに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域CDR2配列が、配列番号２のアミノ酸残基５０乃至６６、配列番号６のアミノ酸残基５０乃至６６、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含み、
軽鎖可変領域CDR2配列が、配列番号４のアミノ酸残基５０乃至６６、配列番号８のアミノ酸残基５１乃至５７、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含む、下記のA-1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
（Ａ−１）  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号２のアミノ酸残基９９乃至１０８、及び配列番号６のアミノ酸残基９９乃至１０８からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号４のアミノ酸残基８９乃至９７、及び配列番号８のアミノ酸残基９０乃至９９からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ヒトCD８９に特異的に結合する、
単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
重鎖可変領域CDR1配列が、配列番号２のアミノ酸残基３０乃至３５、配列番号６のアミノ酸残基３１乃至３５、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含み、
軽鎖可変領域CDR2配列が、配列番号４のアミノ酸残基２４乃至３４、配列番号８のアミノ酸残基２４乃至３４、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
ヒトCD８９に特異的に結合し、
（a）前記重鎖可変領域が配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその保存的アミノ酸置換を含み、
（b）前記軽鎖可変領域が配列番号４に示されるアミノ酸配列又はその保存的アミノ酸置換を含む、
単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
ヒトCD８９に特異的に結合し、
（a）前記重鎖可変領域が配列番号６に示されるアミノ酸配列又はその保存的アミノ酸置換を含み、
（b）前記軽鎖可変領域が配列番号８に示されるアミノ酸配列又はその保存的アミノ酸置換を含む、
単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
（a）ヒト生殖細胞系列VH3-30.3遺伝子に由来する重鎖可変領域と、
（b）ヒト生殖細胞系列VKA27 遺伝子に由来する軽鎖可変領域と、
を含む、ヒトCD８９に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含むトランスフェクトーマであって、請求項１乃至５のいずれか一項又は前記Ａ−１、下記のＡ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ａ−７、Ａ−８、Ａ−９、Ａ−１０、Ａ−１１、Ａ−１２及びＡ−１３のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合断片を検出可能な量、産生する、トランスフェクトーマ。
（Ａ−２）  (i)配列番号2のアミノ酸残基30乃至35を含むCDR1、アミノ酸残基50乃至66を含むCDR2、及びアミノ酸残基99乃至108を含むCDR3、を含んでなる重鎖可変領域と、並びに(ii)配列番号4のアミノ酸残基24乃至34含むCDR1、アミノ酸残基50乃至56を含むCDR2、及びアミノ酸残基89乃至97を含むCDR3、を含んでなる軽鎖可変領域とを含み、ヒトCD89に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（Ａ−３）  (i)配列番号6のアミノ酸残基31乃至35を含むCDR1、アミノ酸残基50乃至66を含むCDR2、及びアミノ酸残基99乃至108を含むCDR3、を含んでなる重鎖可変領域と、並びに(ii)配列番号8のアミノ酸残基24乃至35を含むCDR1、アミノ酸残基51乃至57を含むCDR2、及びアミノ酸残基90乃至99を含むCDR3、を含んでなる軽鎖可変領域とを含み、ヒトCD89に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（Ａ−４）  配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、ヒトCD89に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（Ａ−５）  配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、ヒトCD89に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（Ａ−６）  Fab断片又は単鎖抗体である、請求項１乃至４のいずれか一項又は前記Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４及びＡ−５のいずれか一つに記載の抗体。
（Ａ−７）  少なくとも108 M-1の親和定数でヒトCD89に結合する、請求項１乃至４のいずれか一項又は前記Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４及びＡ−５のいずれか一つに記載の抗体。
（Ａ−８）  少なくとも109 M-1の親和定数でヒトCD89に結合する、請求項１乃至４のいずれか一項又は前記Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４及びＡ−５のいずれか一つに記載の抗体。
（Ａ−９）  抗体重鎖がIgG1重鎖であって、抗体軽鎖がκ軽鎖である、請求項１乃至４のいずれか一項又は前記Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４及びＡ−５のいずれか一つに記載の抗体。
（Ａ−１０）  (a)ヒト生殖細胞系列VH3-30.3遺伝子に由来する重鎖可変領域と、
(b)ヒト生殖細胞系列VKL18又はVKA27 遺伝子に由来する軽鎖可変領域と、
を含む、請求項１乃至４のいずれか一項又は前記Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ａ−７、Ａ−８及びＡ-９のいずれか一つに記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（Ａ−１１）  (a)ヒト生殖細胞系列VH3-30.3遺伝子に由来する重鎖可変領域と、
(b)ヒト生殖細胞系列VKL18又はA27遺伝子に由来する軽鎖可変領域と、を含み、補体を活性化させない、
ヒトCD89に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（Ａ−１２）  軽鎖可変領域がヒト生殖細胞系列VK L18 遺伝子に由来する、請求項５又は前記Ａ−１０に記載の抗体。
（Ａ−１３）  軽鎖可変領域がヒト生殖細胞系列VK A27 遺伝子に由来する、請求項５又は前期Ａ−１０乃至１１のいずれか一つに記載の抗体。
【請求項７】
IgA免疫複合体の沈降で特徴付けられる疾患が、慢性肝炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病（HSP）、ベルジュ病、及びIgA糸球体腎炎からなるグループから選択される、下記のＡ−１４又はＡ−１５に記載の使用。
（Ａ−１４）  請求項１乃至５のいずれか一項又は前記Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ａ−７、Ａ−８、Ａ−９、Ａ−１０、Ａ−１１、Ａ−１２及びＡ−１３のいずれか一つに記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の、IgA免疫複合体の沈降で特徴付けられる疾患の治療又は予防用の組成物を製造するための使用であって、前記抗体又はその抗原結合断片が、CD89に結合するIgAを阻害しない、使用。
（Ａ−１５）  (a)ヒト生殖細胞系列VH3-30.3遺伝子に由来する重鎖可変領域と、
(b)ヒト生殖細胞系列VKL18又はVKA27 遺伝子に由来する軽鎖可変領域とを、含み、ヒトCD89に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の、IgA免疫複合体の沈降で特徴付けられる疾患の治療又は予防用の組成物を製造するための使用。
【請求項８】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含む参照抗体と、CD８９への結合を交差競合する、単離された抗CD８９モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号２のアミノ酸残基９９乃至１０８、配列番号６のアミノ酸残基９９乃至１０８、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号４のアミノ酸残基８９乃至９７、配列番号８のアミノ酸残基９０乃至９９、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号２のアミノ酸残基５０乃至６６、及び配列番号６のアミノ酸残基５０乃至６６、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号４のアミノ酸残基５０乃至５６、及び配列番号８のアミノ酸残基５１乃至５７、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｅ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号２のアミノ酸残基３０乃至３５、及び配列番号６のアミノ酸残基３１乃至３５、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｆ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号４のアミノ酸残基２４乃至３４、及び配列番号８のアミノ酸残基２４乃至３５、及びその保存的アミノ酸置換からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、
抗CD８９モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
請求項１乃至４のいずれか一項又は前記Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５のいずれか一つに記載の抗体と、CD８９への結合を交差競合する、単離された抗CD８９抗体。
【請求項１０】
補体を活性化させない、ヒトCD８９に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、いずれも引用をもって内容全体を本出願に援用するものとする2001年2月12日に出願された米国特許仮出願第60/268,075号、および2001年11月5日に出願された米国特許仮出願第60/338,956号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
免疫グロブリンのFc部分に結合する受容体は、単球、マクロファージ、および多形核細胞の保護的機能の多くを起動させる上で重要である。これらの細胞上にあるIgGへの受容体（Fcγ受容体またはFcγR）については広く研究されており、これらの受容体に対するモノクローナル抗体が作製され、治療上有効であることが証明されている（たとえば欧州特許第255
249号「ヒト単核食細胞上の免疫グロブリンGへのFc受容体に対するモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies to Fc Receptor
for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes）」参照）。
【０００３】
IgA受容体（Fca受容体またはCD89）もエフェクター細胞の機能を促進することができる。リガンドがCD89に結合すると、食細胞および抗体を介して白血球およびCD89を有する細胞株における細胞毒性が惹起される。CD89はまた、エフェクター細胞のIgG受容体と共同して標的細胞の食作用を促進することができる。
【０００４】
CD89はIgAのFc部分に結合する受容体で、ヒトの体内で最も豊富なIgである(Kerr, M.A. 1990, Biochem. J.
271:285-296)。CD89は主に、多形核白血球（PMN）、単球、マクロファージ、好中球、および好酸球を含む細胞毒性免疫エフェクター細胞上に構成的に発現する(Morton,
H.C., et al., 1996 Critical Reviews in Immunology 16:423)。リンパ球の亜集団上、および糸球体間質細胞のCD89発現もまた報告されている(Morton,
H.C., et al., 1996 Critical Reviews in Immunology 16:423)。さらに、単球上およびPMN上におけるCD89発現は、TNF-α(Gesl,
A., et al., 1994 Scad. J. Immunol. 39:151-156; Hostoffer, R.W., et al., 1994,
The J. Infectious Diseases 170:82-87)、IL-1、GM-CSF、LPS、またはホルボールエステル(Shen L., et
al., J. Immunol. 152:4080-4086; Schiller, C.A. et al., 1994, Immunology,
81:598-604)によって促進されることがあるが、IFN-γおよびTGF-β1はFcαRI発現を低減する(Reterink, T.J.F., et
al., 1996, Clin. Exp. Immunol. 103:161-166)。
【０００５】
ヒトCD89のα鎖は、高度にグリコシル化された1型膜貫通分子で、IgGおよびIgEなどの受容体も含むIgスーパー遺伝子ファミリーに属する。第19番染色体上のある遺伝子は、FcαRIアルファ鎖の選択的にスプライスされた数種類のアイソフォーム(55-110
kDa; Morton, H.C., et al., 1996 Critical Reviews in Immunology 16:423)をコードする。骨髄球性CD89は、CD89シグナル伝達において役割を果たすことが示唆されているFcRγ鎖と関連していることが明らかになっている(Morton,
H.C. et al. 1995, J. Biol. Chem. 270:29781; Pfefferkorn, L.C., et al. 1995, J.
Immunol., 153:3228-3236, Saito, K. et al., 1995, J. Allergy Clin. Immunol.
96:1152)。
【０００６】
CD89は、抗原複合型および単量体IgA1およびIgA2の両方に結合し (Mazangera, R.L. et al., 1990
Biochem. J. 272:159-165)、FcγRおよびFc?RIがそれぞれIgGおよびIgEで飽和状態になるのと同じように、in vivoにおいて単量体IgAで飽和状態になっている受容体と一致する。骨髄エフェクター細胞上のCD89を、リガンド結合領域の中または外において、多量体IgA、IgA免疫複合体、またはエピトープに特異的なmAbによって架橋すると、脱顆粒、超酸化物の放出、炎症性サイトカインの分泌、飲食作用および貪食作用を刺激する(Patty,
C., A. Herbelin, A. Lihuen, J.F. Bach, and R.C. Monteiro. 1995 Immunology.
86:1-5; Stewart, W.W., R.L. Maz Yegera, L. Shen, and M.A. Kerr. 1994 J.
Leucocyte Biology. 56:481-487; Stewart, W.W., and M.A. Kerr. 1990. Immunology.
71:328-334; Shen, L. 1992. J. Leukocyte Biology. 51:373-378.)。このようなCD89によって惹起される生理学的な応答は、粘膜表面上の液性防御の第一線において重要であると考えられている(Morton,
H.C., M. van Egmond, and J.G.J. van de Winkel. 1996 Critical Reviews in
Immunology. 16:423)。
【０００７】
発明の概要
本願発明は、細胞毒性を誘導する分子であるヒトCD89の治療上の能力を利用するために改良した免疫治療物質を提供する。特に、本願発明は、ヒトCD89に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体とともに、このような抗体を含む治療用組成物、二重特異性抗体および分子複合体を提供する。
【０００８】
本願発明のある実施態様では、前記抗体はIgAによって阻害されることはなく、たとえばIgA結合部位以外の部位でCD89に結合する。別の実施態様では、前記抗体はIgA のCD89への結合を阻害し、たとえばIgA結合部位の中または近傍の部位でCD89に結合する。
【０００９】
本願発明の別の実施態様では、前記抗体にはさらにin vivoにおいて補体を活性化させず（たとえば補体が媒介する標的細胞の溶解を誘発しないなど）、治療中に現れる有害な副作用が減少するという利点がある。さらに別の実施態様では、前記抗体は、食作用または超酸化アニオンの分泌など、少なくとも１つのFc受容体が媒介するエフェクター細胞の活性を惹起する。
【００１０】
本願発明の別の実施態様では、前記抗体は、たとえばIgG1 重鎖およびκ軽鎖などを有するIgG1（たとえばIgG1k）抗体である。本願発明が包含するそのほかの抗体イソタイプには、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、およびIgEが含まれる。前記抗体は抗体全体、またはFab、F(ab')2、FvおよびFv鎖断片を含む前記抗体の抗原結合断片であってもよい。
【００１１】
本願発明の別の実施態様では、前記抗体はヒトIgG重鎖およびヒトκ軽鎖の核酸によってコードされており、これらの核酸にはそれぞれSEQ ID No. 1または 5、およびSEQ ID
No. 3または7に記載の可変領域のヌクレオチド配列、ならびにそれらの保存配列修飾が含まれる。別の実施態様では、前記ヒト抗体にはIgG重鎖およびκ軽鎖の可変領域が含まれ、それらにはそれぞれSEQ
ID No. 2または6、およびSEQ ID No. 4または8に示すアミノ酸配列ならびにそれらの保存配列修飾が含まれる。
【００１２】
本願発明のある抗体には、たとえばヒトモノクローナル抗体（mAb）14.1、7.4、および8.2（それぞれ14A8、7F12、および8D2ともよばれる）、または抗体14.1、7.4、もしくは8.2と同一のエピトープに結合する抗体、或いは抗体14.1、7.4、もしくは8.2と同一の機能的結合特性を有する抗体が含まれる。
【００１３】
本願発明のヒト抗体は、宿主細胞（たとえばCHO細胞またはリンパ球細胞）中に組換え的に産生するか、または前記抗体を発現するハイブリドーマ（すなわち、たとえば前記抗体をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを不死化細胞と融合させたものを有するトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物から得たB細胞を含む）に直接産生させることが可能である。
【００１４】
本願発明の別の実施態様では、本願発明のヒト抗体は以下にあげる特徴の１つ以上を特徴としてもよく、その特徴とは
(a)ヒトCD89への結合特異性、
(b)ヒトCD89への結合平衡会合定数（Ka）が少なくとも約107M-1であること、
(c)ヒトCD89からの解離定数（Kd）が約10-8S-1以下であること、
(c)in vivoにおいてCD89に結合した場合の、補体活性の欠失、
(d)ヒトIgA結合を阻害しない部位におけるヒトCD89への結合、
(e)SEQ ID No. 2または6に示されるアミノ酸配列およびその保存配列修飾を含む重鎖、およびSEQ ID No. 4または8に示されるアミノ酸配列およびその保存配列修飾を含む軽鎖、
である。
【００１５】
別の局面では、本願発明は、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。本願発明の抗体をコードする核酸を含む組換え発現ベクター、およびこのようなベクターでトランスフェクされた宿主細胞も、たとえばmAb14.1、7.4、または8.2の重鎖および軽鎖の可変並びに定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターなど、このような宿主細胞を培養することによって本願発明の抗体を作製する方法と同様に本願発明に包含される。
【００１６】
さらに別の局面では、本願発明は、たとえば本願発明のヒト抗CD89抗体を発現するトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物から単離されたB細胞を提供する。好ましくは、単離されたB細胞は、たとえばCD89抗原および／またはCD89発現細胞の精製もしくは濃縮調製物で免疫したトランスジェニックマウスなど、トランスジェニック非ヒト動物から得る。好ましくは、たとえばトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物は、本願発明の抗体の全体または一部分をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。単離されたB細胞は、不死化されてヒト抗CD89抗体のソース（たとえばハイブリドーマ）を提供する。
【００１７】
したがって、本願発明はまた、CD89に特異的に結合する本願発明のヒトモノクローナル抗体の産生が可能なハイブリドーマも提供する。ある実施態様では、前記ハイブリドーマには、本願発明の抗体の全体または一部分をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを不死化細胞と融合したものを有するトランスジェニックマウスなど、トランスジェニック非ヒト動物から得たB細胞が含まれる。本願発明のあるハイブリドーマには、14.1、7.4、および8.2が含まれる。
【００１８】
さらに別の局面では、本願発明は、CD89に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を発現するトランスジェニックマウス（本願明細書では”HuMab”ともよぶ）など、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。ある実施態様では、前記トランスジェニック非ヒト動物は、本願発明の抗体の全体または一部分をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスである。トランスジェニック非ヒト動物は、CD89抗原および／またはCD89を発現する細胞の精製または濃縮調製物で免疫することができる。好ましくは、たとえばトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物は、V-D-J組換えおよびイソタイプスイッチングによってCD89に対するヒトモノクローナル抗体の複数のイソタイプを産生することができる。イソタイプスイッチングは、たとえば古典的または非古典的イソタイプスイッチングなどによって生じることがある。
【００１９】
別の態様では、本願発明はCD89と特異的に反応するヒトモノクローナル抗体を産生する方法を提供する。ある実施態様では、前記方法には、たとえば本願発明の抗体の全体または一部分をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物をCD89抗原および／またはCD89発現細胞の精製または濃縮調製物で免疫するステップが含まれる。次に、前記動物のB細胞（たとえば脾B細胞など）を得て骨髄腫細胞と融合し、CD89に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死化ハイブリドーマ細胞を作製する。
【００２０】
さらに別の態様では、本願発明のヒト抗CD89抗体を誘導体化したり、たとえば別のペプチドまたはタンパク質など別の機能的分子（たとえば抗体またはFab’断片などの抗体断片）と結合または共発現させる。たとえば、本発明の抗体または抗原結合部分を、別の抗体（たとえば二重特異性または多重特異性抗体の産生）、細胞毒素、細胞性リガンドまたは抗原など、１つ以上の他の分子と機能的に結合（たとえば化学結合、遺伝子融合、または非共有結合など）させてもよい。本願発明の二重特異性および多重特異性抗体は、エフェクター細胞などのCD89発現細胞に、腫瘍細胞、自己抗体産生細胞、病原体感染細胞、またはそのほかの望ましくない細胞上にあるエピトープなどの特定の抗原を狙わせるのに有用である。そのほかの標的抗原には、可溶性抗原、またはたとえばウイルス、寄生体および細菌などの抗原と微生物の複合体が含まれる。
【００２１】
本願発明の多重特異性分子にはまた、三重特異性、四重特異性、およびそのほかの多重特異性分子が含まれる。ある実施態様では、多重特異性分子には、たとえば細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合する分子などの抗促進因子（EF）部分が含まれる。
【００２２】
従って、本願発明は、多様な抗体複合体、二重および多重特異性分子、および融合タンパク質を包含し、これらはすべてCD89発現細胞に結合し別の分子に前記細胞を狙わせるか、またはCD89に結合して他の分子もしくは細胞に結合するものである。
【００２３】
別の態様では、本願発明は、たとえば細胞毒性薬、酵素的に活性な毒素、もしくはそれらの断片などの治療成分、放射性異性体、または小分子抗癌薬に結合した本願発明のヒト抗CD89抗体を含む、複合体を提供する。
【００２４】
代替的には、本願発明のヒト抗体はこのような治療物質および細胞毒性物質と併用投与してもよいが、それらに結合していない。このような物質と同時に併用投与することもでき、またはこのような物質の前あるいは後に投与することもできる。このような物質には、G-CSF、GM-CSF、IL-2、またはIFN-αなどのサイトカイン、並びにドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミド
ヒドロキシウレアなどの化学療法剤を含んでもよい。本願発明のヒト抗体はまた、放射線療法と併せて投与してもよい。
【００２５】
別の局面では、本願発明は、たとえば薬学的に許容される担体およびCD89に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を少なくとも一つ含む薬学的および診断的な組成物／キットなどの組成物を提供する。ある実施態様では、前記組成物は好ましくは各々が異なるエピトープに結合するヒト抗体またはその抗原結合部分の組み合わせを含む。少なくとも１つの本願発明のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、少なくとも１つの本願発明の二重特異性または多重特異性分子の組み合わせを含む、たとえば薬学的組成物などの組成物も、本願発明の範囲内である。
【００２６】
CD89発現（たとえば過剰発現）に関連する疾患のin vivo治療および予防に用いるために、本願発明のヒト抗体を、たとえば注射や抗体を用いた臨床用製品の当業に公知のそのほかの経路など、いずれかの適切な投与経路を用いて、治療上有効な投与量を患者（たとえばヒト被験者）に投与する。
【００２７】
本願発明のヒト抗体を用いて、細胞表面上の受容体をキャップして消去するなどの方法によって、エフェクター細胞上のCD89レベルを調節することもできる。抗Fc受容体の混合物もこの目的のために用いることができる。
【００２８】
別の実施態様では、IgAのCD89への結合を遮断または阻害する本願発明のヒト抗体は、たとえば慢性肝炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑症（HSP）、IgA腎症（ベルジェ病）、またはIgA糸球体腎炎などの、循環IgA含有複合体および／またはIgA免疫複合体の沈殿を特徴とする疾患の治療に有用である。本願発明のヒト抗体は、このような疾患を罹患する患者に、in
vivoにおける内因性IgAのCD89への結合を阻害または下方調節するために投与することができる。
【００２９】
本願発明の二重特異性および多重特異性分子は、CD89を有する免疫細胞と特異的な標的細胞との両方に結合するその能力に基づいて、広範囲の疾患の治療に用いることができる。このような疾患には、自己免疫疾患および癌（たとえば膀胱、乳房、結腸、腎、卵巣、精巣、前立腺、肺、脳、直腸、膵、肝、中枢神経系、頭頸部、腎、骨、血液およびリンパ系）、ウイルス（たとえばHIV、HTLV、FELV）、原虫（たとえばトキソプラズマ・ゴンディイ：Toxoplasma
gondii）、真菌（たとえばカンジダ・アルビカンス：Candida albicans）、および細菌（たとえばスタフィロコッカス・アウレウス：Staphylococcus
aureus、ストレプトコッカス・ヘモリティカス：Streptococcus hemolyticus、およびマイコバクテリウム・チュベルカルシス：Mycobacterium
tuberculsis）などの病原体感染症が、それらに限定されることなく含まれる。本願発明の別の局面は、病原生物、感染細胞、病原生物の遺伝子産生物、または癌細胞を含むことによる疾患および癌に対するワクチン接種に有用な分子を提供する。これらの目的のために、本願発明は有用で効力のある抗原を、前記抗原を免疫システムに向かわせる結合決定因子に結合させる結合物質である組成物を提供する。
【００３０】
ある実施態様では、前記患者は、化学療法剤、放射線、またはたとえばサイトカインなどのFcα受容体もしくはFcγ受容体などのFc受容体の発現或いは活性を、たとえば促進或いは阻害するなどの調節をする物質で、さらに治療される。治療中に投与する一般的なサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロン-γ（IFN-γ）、および腫瘍壊死因子（TNF）が含まれる。一般的な治療物質には、とりわけ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドヒドロキシウレアなどの抗新生物剤が含まれる。
【００３１】
さらに別の局面では、本願発明は、たとえばCD89関連疾患を診断するためなど、in vitroまたはin vivoにおいてサンプル中のCD89の存在を検出するための方法を提供する。ある実施態様では、テストするサンプルを、場合によって対照サンプルと共に、本願発明のヒトモノクローナル抗体（またはその抗体結合部分）に、前記抗体とCD89の複合体を形成することができる条件下において接触させることによって、これを実施する。その後、複合体の形成は（たとえばELISAなどを用いて）検出される。対照サンプルをテストサンプルと共に用いる場合、両方のサンプル中に複合体が検出され、サンプルの間に複合体形成の統計的な有意差が見られれば、テストサンプル中にCD89が存在することを示す。
【００３２】
本願発明のそのほかの特徴および利点は、以下の詳しい説明と実施例から明らかになるであろうが、それらが制限であると解釈されてはならない。本出願に引用したすべての参考文献、特許、および公開済み特許出願の内容は、引用をもってここに明示的に援用する。
【００３３】
発明の詳細な説明
本願発明はヒトIgA受容体（CD89）上に存在するエピトープに結合する、抗原結合部分を含む単離されたヒトモノクローナル抗体を提供する。ある実施態様では、前記ヒト抗体は、たとえばV-D-J組換えおよびイソタイプスイッチングを経ることによってCD89に対するヒトモノクローナル抗体（たとえばIgG、IgA、および／またはIgE）のイソタイプを複数産生することが可能なトランスジェニックマウスなど、非ヒトトランスジェニック動物において産生される。従って、本願発明の別の態様には、抗体、抗体断片、およびそれらの薬学的組成物だけではなく、モノクローナル抗体を産生する非ヒト動物、B細胞およびハイブリドーマも含まれる。in
vitroまたはin vivoのいずれかにおける、本願発明の抗体を用いたCD89発現細胞の検出方法、またはCD89発現細胞のエフェクター機能を誘導する方法（たとえば本願発明の抗CD89抗体および標的細胞上の抗原に対する別の抗体を含む二重特異性抗体を用いたCD89分子を架橋する方法など）も、本願発明に包含する。本願発明の抗体を用いた、CD89へのIgAの結合を遮断または阻害する方法も提供し、その方法は慢性肝炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑症（HSP）、IgA腎症（ベルジェ病）、またはIgA
糸球体腎炎などの、循環IgA含有複合体および／またはIgA免疫複合体の沈殿を特徴とする疾患など、内因性IgA異常を特徴とする疾患の治療に有用である。
【００３４】
本願発明をさらに容易に理解できるようにするために、いくつかの用語をまず定義する。さらなる定義については発明の詳細な説明全体に記載する。
【００３５】
本願明細書で用いられる「CD89」「ヒトIgA受容体」および「Fcα受容体」（FcαRI）という用語は交換可能に用いられ、第19番染色体上に位置する１つのα遺伝子（FcaRI）の遺伝子産生物を含むことを意図されている。この遺伝子は、選択的にスプライスされた55乃至110
kDaの膜貫通型イソフォームのいくつかをコードしていることが知られている。FcαRI（CD89）は単球／マクロファージ、好酸性顆粒球、および好中性顆粒球上に構成的に発現するが、非エフェクター細胞群には構成的に発現しない。FcαRIにはIgA1およびIgA2に中程度の親和性（?5x107M-1）があり、G-CSFまたはGM-CSFなどのサイトカインの接触によって増加する（Morton,
H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440）。FcαRI受容体は、以下の理由から本願発明に使用するのに好ましい誘導受容体である。その理由は、（１）たとえば単球、マクロファージ、好中球および好酸球などの免疫エフェクター細胞上に主に発現する、（２）大量に発現する（たとえば5,000乃至10,000個／細胞）、（３）細胞毒性活性の媒介物（たとえばADCC、食細胞）である、（４）自己抗原などの抗原の抗原提示の増強を媒介する、ためである。
【００３６】
本願明細書に用いられる「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識期および活性化期ではなく、免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を意味する。例示的な免疫細胞には、たとえばリンパ球（たとえばB細胞および細胞溶解性T細胞（CTL）を含むT細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞、および好塩基球などの骨髄またはリンパ由来の細胞が含まれる。エフェクター細胞の中には、特異的なFc受容体を発現し、特定の免疫機能を実行するものもある。好ましい実施態様では、エフェクター細胞は、抗体依存性細胞性細胞障害作用（ADCC）を誘導することができ、たとえばADCCを誘導することができる好塩基球などである。たとえば、FcRを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的な死滅、および免疫システムの他の成分に対する抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。そのほかの実施態様では、エフェクター細胞は標的抗原、標的細胞、または微生物を貪食することができる。エフェクター細胞上の特定のFcRの発現は、サイトカインなどの液性因子によって調節することができる。たとえば、G-CSFまたはGM-CSFがFcαRIの発現を上方調節することが明らかになっている。この促進された発現は、標的に対するFcαRIを含有する細胞のエフェクター機能を上昇させる。エフェクター細胞は標的抗原または標的細胞を貪食または溶解することができる。
【００３７】
「標的細胞」は、本願発明の組成物（たとえばヒトモノクローナル抗体、二重特異性または多重特異性分子）が標的とすることができる、対象（たとえばヒトまたは動物）における望ましくない任意の細胞を意味するものとする。ある実施態様では、前記標的細胞はCD89を発現または過剰発現する細胞である。別の実施態様では、標的細胞には腫瘍細胞が含まれる。標的とすることができる腫瘍細胞は、乳房、卵巣、前立腺、精巣、肺、結腸、直腸、膵、肝、中枢神経系、腎、頭部、頸部、骨、血液およびリンパ系の癌を含む、任意の癌の腫瘍細胞である。腫瘍細胞に加えて、前記エフェクター細胞も、自己免疫疾患の治療用のリンパ球を産生する自己抗体、またはアレルギーの治療用のIgE産生リンパ球を標的とすることができる。前記標的は、微生物（細菌もしくはウイルス）または可溶性抗原（リウマチ因子またはそのほかの自己抗体および毒素）であってもよい。微生物には、たとえばウイルス、細菌、真菌、原虫などの病原体も含むことを意図する。
【００３８】
「抗原」という用語は、天然もしくは合成の免疫原性物質、免疫原性物質の断片または一部分、ペプチドエピトープ、またはハプテンのいずれも意味する。「抗原」という用語はまた、複合体ではない形状の場合には非免疫原性であるが、複合体を形成した場合には免疫原性である物質も含まれる。「複合体ではない」という文言には、結合して本願発明の分子複合体を形成しない物質が含まれる。「複合体を形成した」という文言には、結合して本願発明の分子複合体を形成する物質が含まれる。
【００３９】
本願明細書に用いられる「成長を阻害する」（たとえば細胞について）という文言は、抗CD89抗体と接触させた場合の細胞の成長と、抗CD89抗体と接触させない場合の同じ細胞の成長と比較したときの測定可能な任意の減少を含み、たとえば少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、または100%の細胞成長の阻害を含むことを意図する。
【００４０】
本願明細書に用いられる「結合を阻害する」および「結合を遮断する」という文言（たとえばIgAなどのCD89リガンドのCD89への結合の阻害／遮断を意味する）は交換可能に用いられ、部分的および完全な阻害／遮断の両方を包含する。IgAのCD89への結合の阻害／遮断は、好ましくは、阻害または遮断なしでIgAがCD89に結合する場合に生じるエフェクター細胞機能の正常レベルまたはタイプを低下または変化させる。阻害および遮断には、抗CD89抗体と接触させた場合のIgAのCD89への結合親和性を抗CD89抗体に接触させない場合のリガンドと比較したときの測定可能な任意の減少を含み、たとえばCD89リガンドのCD89への結合の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、または100%の遮断も含むことを意図する。
【００４１】
本願発明書に記載の「抗体」という用語には、抗体全体および抗体結合断片（すなわち抗原結合部分）またはその１本鎖が含まれる。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に結合した少なくとも２本の重（H）鎖および２本の軽（L）鎖か、またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（VHと省略）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、CH1、CH2、およびCH3の３つの領域からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（VLと省略）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域はCLという１つの領域からなる。VHおよびVL領域はさらに、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変領域と、その中に散在するフレームワーク領域（FR）とよばれるより保存された領域とに分けることができる。VHとVLはそれぞれ３つのCDRと４つのFRからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に向けてFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序に並んでいる。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合領域が含まれる。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、宿主組織または免疫系の各種細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一の構成要素（Clq）を含む因子の結合を媒介することもある。
【００４２】
本願明細書に用いられる抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（たとえばCD89）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片によって発揮されることが明らかになっている。抗体の「抗原結合部分」という用語が包含する結合断片の例には、（i）Fab断片、VL、VH、CLおよびCH1領域からなる１価の断片、（ii）F(ab’)2断片、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合している２つのFab断片を含む２価の断片、(iii)VHおよびCH1領域からなるFd断片、(iv)抗体の１本の腕のVLおよびVH領域からなるFv断片、（v）VH領域からなるdAb断片(Ward
et al., (1989) Nature 341:544-546)、および（vi）単離された相補性決定領域（CDR）、を含む。さらに、Fv断片の２領域、VLおよびVHは別々の遺伝子でコードされているが、組換え法を用い、それらを１本のタンパク鎖にしてVLおよびVH領域をつなげて１価の分子を形成させることが可能な合成リンカーによって、結合させることができる（１本鎖Fv(scFv)として知られる；たとえば
Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。このような１本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。このような抗体断片は当業に公知の従来技術を用いて得られ、前記断片の用途に応じて完全な抗体と同様の方法でスクリーニングされる。
【００４３】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、化学的に活性な表面にある、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集団からなり、通常、特異的な３次元構造特性と共に特異的な電荷特性を有する。変性溶媒の存在下では高次構造のエピトープへの結合は失われるが非高次構造のエピトープはそうではない点で前者と後者は区別される。
【００４４】
「二重特異性分子」という用語には、たとえばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチドの複合体など、２つの異なる結合特異性を有する任意の物質が含まれることを意図する。たとえば、前記分子は、（a）細胞表面抗原、および（b）たとえばCD89などのエフェクター細胞の表面上にあるFc受容体と結合または相互作用することがある。「多重特異性分子」または「ヘテロ特異性分子」には、たとえばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチドの複合体など、２つを超える異なる結合特異性を有する任意の物質が含まれることを意図する。たとえば、前記分子は、（a）細胞表面抗原、（b）エフェクター細胞の表面上にあるFc受容体、および（c）少なくとも一つの別の構成要素と結合または相互作用することがある。したがって、本願発明には、CD89などの細胞表面抗原およびエフェクター細胞上のFc受容体などのそのほかの標的に向けられた、二重特異性、三重特異性、四重特異性、およびそのほかの多重特異性分子が、それらに限定されずに含まれる。
【００４５】
「二重特異性抗体（bispecific antibody）」という用語にはディアボディ（diabody：二重特異性抗体）も含まれる。ディアボディは、VHおよびVL領域が１本のポリペプチド鎖上に発現している２価の二重特異性抗体だが、同一の鎖上でこの２領域を対にするには短すぎるリンカーを用いているために、これらの領域は別の鎖の相補領域と対になって２つの抗原結合部位を作り出している(たとえばHolliger,
P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J.,
et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照)。
【００４６】
本願明細書に用いられる「ヘテロ抗体」という用語は、２つ以上の抗体、抗体結合断片（たとえばFab）、それらの誘導体、または抗原結合領域が結合し、少なくとも２つが異なる特異性を有するものを意味する。これらの異なる特異性には、エフェクター細胞上のFc受容体への結合特異性、およびたとえば腫瘍細胞などの標的細胞上の抗原またはエピトープへの結合特異性が含まれる。
【００４７】
本願明細書に用いられる「ヒト抗体」という用語には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれることを意図する。本願発明のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえばin vitroにおけるランダムなまたは部位特異的な変異誘発、またはin vivoにおける体細胞性の突然変異によって導入された突然変異）も含まれる。しかし、本願明細書に用いられる「ヒト抗体」という用語には、たとえばマウスなど別の哺乳類種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことは意図しない。
【００４８】
本願明細書に用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特性および特定のエピトープへの親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一の結合特性を示す抗体を意味する。ある実施態様では、前記ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、たとえばトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物から得たB細胞を含む、ハイブリドーマによって産生される。
【００４９】
本願明細書に用いられる「組換えヒト抗体」という用語には、（a）ヒト免疫グロブリン遺伝子に組換えた動物（たとえばマウス）から単離した抗体（以下のセクションIに詳述する）、（b）宿主細胞に導入した組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、（c）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離した抗体、および（c）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを用いる他の手段によって、調製、発現、作製、または単離した抗体、など、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたすべてのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし、ある実施態様では、このような組換えヒト抗体は、in
vitro突然変異（またはヒトIg配列を導入したトランスジェニック動物を用いた場合、in vivo体細胞突然変異）を起こすことがあり、そのため前記組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VHおよびVLに由来し関連している一方で、in
vivoにおけるヒト抗体生殖系列レパートリーに天然に存在しないこともある。
【００５０】
本願明細書に用いられる「異種抗体」は、このような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関連して定義される。この用語は、前記トランスジェニック非ヒト動物から構成されない生物であって、一般にトランスジェニック非ヒト動物以外の種に見いだされるものと一致する、アミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を意味する。
【００５１】
本願明細書に用いられる「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物に由来する軽鎖および重鎖を有する抗体を意味する。たとえば、マウス軽鎖を伴うヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例には、上述のキメラ抗体、およびヒト化抗体が含まれる。
【００５２】
本願明細書に用いられる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することを意図する（たとえば、CD89に特異的に結合する単離された抗体は、実質的にCD89以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ヒトCD89のエピトープ、イソフォーム、または変異種に特異的に結合する単離した抗体は、たとえば他の種（たとえばCD89種の相同体）など、他に関連する抗原と交差反応性を有することがある。さらに、単離した抗体は他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくても良い。本願発明のある実施態様では、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせを、明確な組成物中に混合する。
【００５３】
本願明細書で用いられる「特異的な結合」とは、所定の抗原に結合する抗体を意味する。一般に、前記抗体は、少なくとも約1 x 107M-1の親和性で結合し、所定の抗原との結合親和性は、所定の抗原または関係性の近い抗原以外の非特異的な抗原（たとえばBSA、カゼイン）への結合性の少なくとも２倍である。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という文言は、本願明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という文言と交換可能に用いられる。
【００５４】
本願明細書に用いられるIgG抗体への「高親和性」とは、少なくとも約107M-1の結合親和性であって、好ましくは少なくとも約108M-1であって、さらに好ましくは、たとえば最高1013M-1以上など、少なくとも約109M-1、1010M-1、または1011M-1以上である、結合親和性を意味する。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体イソタイプでは変化することがある。たとえば、IgMイソタイプへの「高親和性」結合とは、少なくとも約107M-1の結合親和性を意味する。
【００５５】
本願明細書に用いられる
“Kassoc”または”Ka”という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合定数を意味することを意図する。
【００５６】
本願明細書に用いられる“Kdis”または”Kd” という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離定数を意味することを意図する。
【００５７】
本願明細書に用いられる「イソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（たとえばIgMまたはIgG1）を意味する。
【００５８】
本願明細書に用いられる「イソタイプスイッチング」とは、抗体のクラスまたはイソタイプがあるIgクラスから別のIgクラスに変化する現象を意味する。
【００５９】
本願明細書に用いられる「非スイッチ型イソタイプ」は、イソタイプスイッチングが生じない場合に産生される重鎖のイソタイプクラスを意味し、前記非スイッチ型イソタイプをコードするCH遺伝子は典型的には、機能的に再編成されたVDJ遺伝子の直下流の第１のCH遺伝子である。イソタイプスイッチングは古典的または非古典的なイソタイプスイッチングに分類されてきた。古典的なイソタイプスイッチングは、導入遺伝子の少なくとも１つのスイッチ配列領域に関与する組換えイベントによって生じる。非古典的イソタイプスイッチングは、たとえばヒトσμおよびヒトΣμ間の相同性組換え（?関連欠失）などによって生じることがある。導入遺伝子間および／または染色体間組換えなどの代替的な非古典的スイッチング機序が、特にイソタイプスイッチングを生じて達成することがある。
【００６０】
本願明細書に用いられる「スイッチ配列」とは、スイッチ組換えで主要な働きをするDNA配列を意味する。「スイッチドナー」配列は典型的にはμスイッチ領域で、スイッチ組換えの間に消去されるコンストラクト領域の5’（すなわち上流）側であろう。「スイッチアクセプター」領域は、消去される構成領域と置換定常領域（たとえばγ、εなど）の間にあるだろう。組換えが常に生じる特異的な部位はないため、最終遺伝子配列は前記コンストラクトから予測することは一般にはできないだろう。
【００６１】
本願明細書に用いられる「グリコシル化パターン」とは、タンパク質、さらに具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合した炭化水素ユニットのパターンとして定義される。異種抗体のグリコシル化パターンは、当業者が導入遺伝子のCH遺伝子が由来する種よりも非ヒトトランスジェニック動物種に生じた前記グリコシル化パターンに類似していると認識する場合、非ヒトトランスジェニック動物種によって産生される抗体上で天然に存在するグリコシル化パターンに実質的に類似してと特徴付けられる。
【００６２】
本願明細書に用いられる、物体に適用される「天然に存在する」という用語は、ある物体を天然に発見することができるという事実を意味する。たとえば、天然の供給源から単離することができ、研究室で人為的に改変されたものではない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。
【００６３】
本願明細書に用いられる「再編成」という用語は、重鎖または軽鎖免疫グロブリン座位の構成を意味し、その構成において、Vセグメントは、完全なVHまたはVL領域を基本的にコードする構成中において、それぞれD-JまたはJセグメントのすぐ隣に位置する。再編成した免疫グロブリン遺伝子座は、生殖系列DNAとの比較によって同定することができ、再編成した座位は少なくとも１つの組換え７量体／９量体相同性要素を有するだろう。
【００６４】
Vセグメントに関して本願明細書に用いられる「非再編成」または「生殖系配置」という用語は、VセグメントがDまたはJセグメントのすぐ隣になるように組換えされていない配置を意味する。
【００６５】
本願明細書に用いられる「核酸分子」という用語は、DNA分子およびRNA分子を含むことを意図する。核酸分子は１本鎖または２本鎖であってよいが、好ましくは２本鎖DNAである。
【００６６】
CD89に結合する抗体または抗体部分（たとえばVH、VL、CDR3）をコードした核酸に関する、本願明細書に用いられる「単離された核酸分子」という用語は、前記抗体および抗体部分をコードするヌクレオチド配列がCD89以外の抗原と結合する抗体または抗体部分をコードするそのほかのヌクレオチド配列を含まない核酸分子を意味することを意図し、ここでのそのほかの配列はヒトゲノムDNAにおける当該核酸に天然に隣接している。ある実施態様では、ヒト抗CD89抗体またはその部分には、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列14.1、7.4、8.2とともに、SEQ
ID NO:1、3、5、7、および2、4、6、8に示される配列を有する重鎖（VH）および軽鎖（VL）可変領域が含まれる。
【００６７】
本願明細書に開示され請求されるとおり、SEQ ID NO:1乃至8に記載の配列には「保存的配列修飾」、すなわちヌクレオチド配列によってコードされた抗体、またはアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響を及ぼすことがない、または変化さることがないヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾が含まれる。このような保存的配列修飾には、ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。部位特異的突然変異誘発およびPCRを用いた突然変異誘発などの当業に公知の標準技術によって、SEQ
ID NO1乃至8に修飾を導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換したものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業で定義されている。このファミリーには、塩基性側鎖（たとえばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐鎖側鎖（たとえば、スレオニンバリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ヒト抗CD89抗体における予測された非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基に置換されることが好ましい。
【００６８】
代替的には、別の実施例では、突然変異は、飽和突然変異などによって抗CD89抗体コード配列の全体または部分にランダムに導入することができ、得られた修飾抗CD89抗体は結合活性についてスクリーニングに供される。
【００６９】
したがって、本願明細書に開示する（重鎖および軽鎖可変領域の）ヌクレオチド配列（すなわちSEQ ID NO: 1、3、5、および7）によってコードされる抗体、および／または本願明細書に開示する（重鎖および軽鎖可変領域の）アミノ酸配列（すなわちSEQ
ID NO:2、4、6、および8）を含む抗体には、保存的に修飾した類似の配列によってコードされる、または含有する実質的に類似の抗体が含まれる。このように実質的に類似の抗体を、SEQ
ID NO: 1乃至8としてここに開示した部分的な（すなわち重鎖および軽鎖可変領域）配列に基づいて作製する方法について、さらに後述する。
【００７０】
核酸について、「実質的な相同性」という用語は、２つの核酸、またはその中の指定の配列に適切なヌクレオチドを、適宜ヌクレオチド挿入または消去して、最適に整列させて比較した場合、ヌクレオチドの少なくとも約80%、通常は少なくとも約90%乃至95%、さらに好ましくはヌクレオチドの約98%乃至99.5%において同一であることを示す。代替的には、実質的な相同性は、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下において鎖の相補鎖にハイブリダイズする場合に存在する。
【００７１】
２つの配列の同一性の割合は、配列が共有する同一の位置の数の関数（すなわち、相同性の%=同一位置の数／位置数の合計 x 100）に、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップ数および各ギャップ長を考慮したものである。配列の比較および２つの配列の同一性の割合の決定は、後述の例に限定されない数学的アルゴリズムを用いて実行することができる。
【００７２】
２つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMPマトリックス、ならびにギャップ重み40、50、60、70または80および長さ重み1、2、3、4、5、または6を用いてもとめることができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性の割合は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれているE.
Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを用いて、PAM120重み残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いても求めることができる。さらに、２つのアミノ酸残基間の同一性の割合は、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman
and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) のアルゴリズムを用いて、ブロッサム62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかを用い、ギャップ重み16、14、12、10、8、6、または4、および長さ重み1、2、3、4、5、または6を用いて求めることもできる。
【００７３】
本願発明の核酸またはタンパク質配列はさらに、たとえば関連した配列を同定するために公的なデータベースに対する検索を実行するための「クエリ配列」として用いることもできる。このような検索はAltschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)
を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて行い、本願発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて行い、本願発明のアミノ酸配列に相同なタンパク質配列を得ることができる。比較のためのギャップのあるアラインメントを得るには、ギャップドBLASTをAltschul
et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載の通り使用することができる。BLASTおよびギャップドBLASTプログラムを使用する場合、各プログラム（XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照。
【００７４】
前記核酸は、全細胞、細胞ライセート中、または部分的に精製したまたは実質的に純粋な形状で存在することもある。核酸は、アルカリ／SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動、およびそのほかの当業に公知の方法を含む標準技術によって、たとえば他の細胞性核酸またはタンパク質などのそのほかの細胞成分またはそのほかの夾雑物を除去して精製した場合に、「単離された状態」または「実質的に純粋な状態」になる。F.
Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene
Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
【００７５】
cDNA、ゲノム、または混合物のいずれかから得られる本願発明の核酸組成物は、野生型配列に存在することが多いが（修飾された制限酵素認識部位を除く）、遺伝子配列を提供するために標準技術に従って変異導入されることもある。コード配列の場合、この変異導入は希望どおりにアミノ酸配列に作用することがある。特に、本願明細書に記載の野生型V、D、J、定常、スイッチおよびそのほかのこのような配列に実質的に相同な、または由来するDNA配列が考慮される（ここで「由来する」とは、ある配列が別の配列と同一であるかまたは修飾されていることを示す）。
【００７６】
別の核酸配列と機能的な関係におかれている場合に、核酸が「作動的に結合された」という。たとえば、プロモータまたはエンハンサは、配列の転写に作用する場合は、コード配列に作動的に結合されている。転写調節配列に関して、作動的に結合されたというのは、結合したDNA配列が近接しており、必要な場合には２つのタンパク質コード領域を隣接させてリーディングフレーム内に結合していいることを意味する。スイッチ配列の場合、作動的に結合されたというのは、その配列がスイッチ組換えに作用することができることを示す。
【００７７】
本願明細書に用いられる「ベクター」という用語は、結合している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味することを意図する。ベクターの1種が「プラスミド」で、それは別のDNAセグメントがライゲートされていてもよい円形の２本鎖DNAループを意味する。ベクターの別の種類はウイルスベクターで、別のDNAセグメントがウイルスゲノムにライゲートされていてもよい。あるベクターは、導入された宿主細胞中で自己複製することができる（たとえば複製が細菌に由来する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。そのほかのベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターはそれが連結された遺伝子の発現を方向付けることもできる。このようなベクターは、本願明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えDNA技術に用いられる発現ベクターは、プラスミドの形状をしていることが多い。プラスミドは最も一般的に用いられる形状のベクターであるため、本願明細書では「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられてよい。しかし、本願発明では、たとえばウイルスベクター（たとえば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターのそのほかの形状であって等価の機能を有するものも含むことを意図する。
【００７８】
本願明細書に用いられる「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を意味することを意図する。このような用語は、特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も意味することを意図することが理解されなければならない。突然変異または環境的な影響によって、後代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は事実上親細胞と同一ではないかもしれないが、本願明細書に用いられる「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞には、たとえばCHO細胞およびリンパ球細胞が含まれる。
【００７９】
本願発明の各種態様は、後述のサブセクションにさらに詳述する。
【００８０】
I. CD89に対するヒト抗体の産生
本願発明のモノクローナル抗体（mAb）は、たとえばKohler and Milstein (1975) Nature 256: 495に記載の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術など、従来のモノクローナル抗体の方法を含む、各種技術によって産生することができる。体細胞ハイブリダイゼーション技術が好ましいが、原理的には、たとえばウイルス性または発癌性Bリンパ球トランスフォーメーションなど、モノクローナル抗体を産生するためのそのほかの技術を用いることもできる。
【００８１】
ハイブリドーマを調製する好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、非常に確立した方法である。融合用の免疫した脾細胞の単離のための免疫化プロトコルおよび技術は当業に公知である。融合のパートナー（たとえばマウス骨髄腫細胞）および融合手順も既知である。
【００８２】
好ましい実施態様では、CD89に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。これらのトランスジェニックマウスは本願明細書では「HuMab」と呼び、非再編成ヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列とともに、内因性μおよびκ鎖座を不活化する標的突然変異をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子小座を含む(Lonberg,
et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859)。したがって、前記マウスは、マウスIgMまたはκの低発現が見られ、免疫化に応じて、導入したヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子にクラススイッチおよび体細胞突然変異が生じて高親和性ヒトIgGκモノクローナルを生じる(Lonberg,
N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of
Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern.
Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann.
N.Y. Acad. Sci 764:536-546)。HuMabマウスの調製は、後述のセクションIIおよび引用をもってその全体を本願明細書に援用するすべての内容であるTaylor,
L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993)
International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et
al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol.
152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N.
(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al.
(1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995)
Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann.
N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:
845-851に記載されている。さらに、引用をもってその全体を本願明細書に援用するすべての開示であるLonberg and Kay, and GenPharm
Internationalの米国特許第5,545,806号、5,569,825号、5,625,126号、5,633,425号、5,789,650号、5,877,397号、5,661,016号、5,814,318号、5,874,299号、および5,770,429号、Surani
et al.の米国特許第5,545,807号、1998年6月11日公告の国際特許出願第 WO 98/24884号、1994年11月10日公告のWO
94/25585号、1993年6月24日公告のWO 93/1227号、1992年12月23日公告のWO 92/22645号、1992年3月19日公告のWO
92/03918号を参照。代替的には、例２に記載のHCO12トランスジェニックマウスを用いてヒト抗CD89抗体を作製することができる。
【００８３】
HuMab免疫化
CD89に対する完全なヒトモノクローナル抗体を作製するために、HuMabマウスをLonberg, N. et al. (1994)
Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:
845-851 および第WO 98/24884号に記載されるように、CD89抗原および／またはCD89発現細胞の精製もしくは濃縮調製物で免疫してもよい。好ましくは、前記マウスに最初の注射を行うのは６乃至１６週齢であろう。たとえば、CD89抗原の精製または濃縮調製物（5乃至20mg）を用いてHuMabマウスの腹腔内において免疫することができる。CD89抗原の精製または濃縮調製物を用いた免疫化によって抗体が生じない場合、たとえば腫瘍細胞株などのCD89発現細胞で免疫して免疫応答を促進させることもできる。
【００８４】
各種抗原を用いた経験の積み重ねから、HuMabトランスジェニックマウスは、最初に完全フロイントアジュバントに入れた抗原で腹腔内において免疫し、その後、隔週に不完全フロイントアジュバントに入れた抗原で腹腔内において免疫する（最高で合計６回）場合に、最良の応答が得られることが示されている。前記免疫応答は、後眼窩からの採血によって得られた血漿サンプルを用いた免疫プロトコルの経過について監視することができる。前記血漿は、ELISAによってスクリーニングすることができ（後述）、抗CD89ヒト免疫グロブリンの力価が十分なマウスを融合に用いることができる。マウスは屠殺および脾臓の摘出の３日前に静脈内に抗原を追加免疫することができる。各抗原につき2乃至3回の融合を行う必要がある場合もある。各抗原を数匹のマウスに免疫するだろう。たとえば、HC07およびHC012系のHuMabマウス、合計12匹を免疫することができる。
【００８５】
CD89に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
前記マウス脾細胞は、標準プロトコルに基づいて、単離してPEGとともにマウス骨髄腫細胞株と融合することができる。次いで、得られたハイブリドーマを、抗原特異性抗体の産生についてスクリーニングする。たとえば、免疫化マウスから得られた脾リンパ細胞の単一細胞懸濁液を、50%PEGを用いて、P3X63-Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL1580）の数の１／６と融合する。平底マイクロタイタープレートに約2
x 105個の細胞を播蒔し、20% ウシクローン血清、 18% ”653” 調整培地、5% ORIGEN (IGEN社)、4 mM L-グルタミン、
1 mM L-グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、50 ユニット/ml ペニシリン、50
mg/ml ストレプトマイシン、50 mg/ml ゲンタマイシン、および1X HAT (シグマ社：融合から２４時間後にHAT を加える)を含有した選択培地中で２週間インキュベーションする。２週間後、HATをHTに交換した培地中で細胞を培養する。各ウエルを、ヒト抗CD89モノクローナルIgMおよびIgG抗体について、ELISAでスクリーニングする。大規模なハイブリドーマ成長が生じたら、通常10乃至14日後に培地を観察する。ハイブリドーマを分泌する抗体を再び播蒔し、再スクリーニングして、ヒトIgGについてまだ陽性であれば、抗CD89モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも２倍にサブクローニングすることができる。その後、安定したサブクローンをin
vitroで培養し、特徴付けのための抗体を組織培養培地中で少量産生する。
【００８６】
完全な抗体を発現するための部分的抗体配列の使用
抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（CDR）に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外の配列よりも、個々の抗体間の多様性に富んでいる。CDR配列はほとんどの抗体-抗原相互作用を引き起こしているため、天然に存在する特定の抗体の特性を模倣する組換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク配列に移植した天然に存在する特定の抗体から得たCDR配列を含む発現ベクターを作製することによって発現することが可能である(たとえば、Riechmann,
L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature
321:522-525; and Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A.
86:10029-10033参照)。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的なDNAデータベースから得ることができる。この生殖系列配列は、B細胞突然変異中にV（D）J結合によって形成された、完全に組み立てられた可変遺伝子を含まないため、成熟した抗体遺伝子配列とは異なるだろう。生殖系列遺伝子配列は、可変領域全体に均一に、個々の高親和性二次レパートリ抗体の配列とも異なるだろう。たとえば、体細胞突然変異はフレームームワーク領域のアミノ末端部分では比較的頻度が小さい。たとえば、体細胞突然変異はフレームームワーク領域１のアミノ末端部分、およびフレームワーク領域４のカルボキシ末端では比較的頻度が小さい。さらに、多くの体細胞突然変異は抗体の結合特性を顕著に変化させない。このため、もとの抗体と同様の結合特性を有する完全な組換え抗体を再生するために、特定の抗体のDNA配列全体を得る必要はない(すべての目的のために引用により本願明細書に援用する、1999年3月12日提出のPCT/US99/05535を参照)。CDR領域全体の部分的な重鎖および軽鎖は、典型的にはこの目的には十分である。この部分的配列を用いて、どの生殖系列可変および結合遺伝子セグメントが組換え抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。その後、生殖系列配列を用いて、可変領域の欠損部分を埋める。重鎖および軽鎖リーダー配列はタンパク質突然変異の間に切断され、最終的な抗体の特性には寄与しない。このため、発現コンストラクトのために相当する生殖系列リーダー配列を用いる必要がある。欠損配列を付け加えるために、クローニングしたcDNA配列を、ライゲーションまたはPCR増幅によって合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。代替的には、可変領域全体を、短く、重複しているオリゴヌクレオチドのセットとして合成し、PCR増幅で組み合わせて全体を合成した可変領域クローンを作製することもできる。このプロセスには、特定の制限酵素認識部位の消去もしくは包含、または特定のコドンの最適化などの利点がある。
【００８７】
ハイブリドーマから得た重鎖および軽鎖転写物のヌクレオチド配列を用いて、合成オリゴヌクレオチドの重複セットを設計し、天然の配列と同一のアミノ酸コード能力を有する合成V配列を作製する。合成重鎖およびκ鎖配列は、３つの点において天然の配列と異なることがある。繰り返しているヌクレオチド塩基のストリングが遮られてオリゴヌクレオチド合成およびPCR増幅が容易になる。最適な翻訳開始部位がコザックの規則に従って組み入れられている（Kozak,
1991, J. J. Biol. Chem. 266L198670198）。およびHindIII部位が翻訳開始部位の上流に組換えられている。
【００８８】
重鎖および軽鎖可変領域の両方のために、最適化したコード鎖配列、および対応する非コード鎖配列を、対応する非コードオリゴヌクレオチドのおよその中間点である30乃至50ヌクレオチドの大きさに切断する。したがって、各鎖について、前記オリゴヌクレオチドは150乃至400ヌクレオチドのセグメントにわたる重複した２本鎖セットに組み立てることができる。その後、そのプールを150乃至400ヌクレオチドのPCR増幅産生物を産生するためのテンプレートとして用いる。典型的には、単一可変領域オリゴヌクレオチドセットを２つのプールに分割し、別々に増幅して２つの重複PCV産物を作製するだろう。この重複産物をPCT増幅で組み合わせ、完全な可変領域を作製する。PCR増幅において、発現ベクター作製物に容易にクローニングすることができる断片を作製するための、重鎖および軽鎖領域の重複断片（κ軽鎖のBbsI部位、またはγ重鎖であればAgeI部位を含む）を含むことも望ましい。
【００８９】
次に、再構築された重鎖および軽鎖可変領域を、クローニングしたプロモータ、翻訳開始、定常領域、3’非翻訳、ポリアデニル化、および転写終了配列と組み合わせて、発現ベクターコンストラクトを作製する。重鎖および軽鎖の発現コンストラクトを、単一のベクターに挿入し、同時に、または連続に、または別々に宿主細胞にトランスフェクトし、その後融合して両方の鎖を発現する宿主細胞を形成することができる。
【００９０】
ヒトIgGκの発現ベクターを作製するために用いるプラスミドについて、以下に説明する。PCRで増幅したV重鎖およびVκ軽鎖cDNA配列を用いて完全な重鎖および軽鎖小遺伝子を再構築することができるように、前記プラスミドを作製した。このプラスミドを用いて、完全なヒトまたはキメラIgG1κまたはIgG4κ抗体を発現することができる。同様のプラスミドを、そのほかの重鎖イソタイプの発現用、またはλ軽鎖を含む抗体の発現用に作製することができる。
【００９１】
したがって、本願発明の別の局面では、本願発明のヒト抗CD89抗体14.1、7.4、または8.2の構造的な特徴を用いて、CD89への結合など、本願発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を有する構造的に関連したヒト抗CD89抗体を作製する。さらに具体的には、14.1、7.4、または8.2の１つ以上のCDR領域を、既知のヒトフレームワーク領域およびCDRと組換え的に組み合わせ、組換えを行ったさらなる本願発明のヒト抗CD89抗体を作製することができる。
【００９２】
したがって、別の実施態様では、本願発明は、抗CD89抗体を調製する方法であって、
（１）ヒト重鎖フレームワーク領域およびヒト重鎖CDRであって、少なくとも１つのヒト重鎖CDRが図１または３に示したCDRのアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、フレームワーク領域およびCDR（またはSEQ
ID NO. 2または6の対応するアミノ酸残基）、および（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域およびヒト軽鎖CDRであって、少なくとも１つのヒト軽鎖CDRが図２または４に示したCDRのアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、フレームワーク領域およびCDR（SEQ
ID NO. 4または8の対応するアミノ酸残基）、を含む抗体を調製するステップであって、
前記抗体がCD89に結合する能力を有するステップ、
を含む、方法を提供する。
【００９３】
CD89に結合する抗体の能力は、実施例に記載の方法（たとえばELISA）など、標準結合アッセイを用いて決定することができる。
【００９４】
抗体の重鎖および軽鎖CDR3ドメインが、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たしているということが当業に公知であるため、上述の本願発明の組換え抗体は、14.1、7.4、または8.2の重鎖および軽鎖CDR3を含むことが好ましい。前記抗体はさらに、14.1、7.4、または8.2のCDR2を含んでよい。本願発明はさらに、14.1、7.4、または8.2のCDR1を含んでよい。したがって、本願発明はさらに、（1）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖CDR1領域、ヒト重鎖CDR2領域、およびヒト重鎖CDR3領域であって、前記ヒト重鎖CDR3領域が図１または３（またはSEQ
ID NO. 2または6の対応するアミノ酸残基）に示された14.1、7.4、または8.2のCDR3から選択される領域、および（2）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖CDR1領域、ヒト軽鎖CDR2領域、ヒト軽鎖CDR3領域であって、前記ヒト軽鎖CDR3領域が図２または４（またはSEQ
ID NO. 4または8の対応するアミノ酸残基）に示された14.1、7.4、または8.2のCDR3から選択される領域であって、前記抗体がCD89に結合する領域を含む、抗CD89抗体を提供する。前記抗体はさらに、14.1、7.4、または8.2の重鎖CDR2および／または軽鎖CDR2を含んでもよい。前記抗体はさらに、14.1、7.4、または8.2の重鎖CDR1および／または軽鎖CDR1を含んでもよい。
【００９５】
好ましくは、上述の組換え抗体のCDR1、2および／または3は、本願明細書に開示した14.1、7.4、または8.2のアミノ酸配列と厳密に同一であるアミノ酸配列を含む。しかし、当業者は、14.1、7.4、または8.2と厳密に同一であるCDR配列からのいくらかの相異は、CD89への抗体の結合能力が効果的に維持されていても（たとえば保存的置換）、許容できるものであることを理解するだろう。したがって、別の実施態様では、前記組換え抗体は、14.1、7.4、または8.2の１つ以上のCDRとたとえば90%、95%、98%または99.5%同一である１つ以上のCDRから構成されていてもよい。
【００９６】
単純に結合しているCD89に加えて、上述のような組換え抗体は、
１）CD89を発現する生細胞への結合、
２）CD89への高結合親和性、
３）CD89上の固有のエピトープへの結合（相補的な活性を有するモノクローナル抗体を組み合わせて使用する場合に、同じエピトープへの結合を競合する可能性を取り除くため）、
４）CD89を発現する細胞のオプソニン化、および／または
５）ヒトエフェクター細胞の存在下における、CD89を発現する細胞の成長阻害、食作用、および／または死滅の媒介、
など、本願発明の抗体のそのほかの機能的特性の維持ができるかどうかで選択されることがある。
【００９７】
ヒトモノクローナル抗体のCD89への結合の特徴付け
本願発明のヒトモノクローナルCD89抗体の結合を特徴づけるために、免疫したマウスから採取した血清を、たとえばELISAなどによってテストすることができる。ELISAプロトコルの一般的な（しかしこれに限定されない）例では、マイクロタイタープレートを0.25μg/mlの精製CD89のPBS溶液でコートし、5%
ウシ血清アルブミンのPBS溶液でブロックする。CD89で免疫したマウスから採取した血漿の希釈液を各ウエルに加え、37℃で1乃至2時間インキュベートする。前記プレートをPBS/ツイーンで洗浄してから、アルカリホスファターゼに共役させたヤギ抗ヒトIgG
Fc特異性ポリクロナール試薬とともに、37℃で1時間インキュベートする。前記プレートを洗浄後、pNPP基質（1mg/ml）で展開し、405乃至650の光学密度で解析する。好ましくは、最高の力価を生じるマウスを融合に使用するであろう。
【００９８】
上述のELISAアッセイを使用して、CD89免疫原で陽性反応を示すハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。CD89に高結合活性で結合するハイブリドーマをサブクローンし、さらに特徴付けを行うだろう。親細胞の反応性（ELISAによる）を維持する各ハイブリドーマから得た１つのクローンを、-140℃で保存した5乃至10バイアル細胞バンクを作製するため、および抗体を精製するために選択することができる。
【００９９】
ヒト抗CD89抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを2リットルのスピナーフラスコで成長させてモノクローナル抗体を精製することができる。上清を濾過し、濃縮してからプロテインAセファロース（ファルマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）のアフィニティクロマトグラフィにかけることができる。溶出したIgGは、ゲル電気泳動でチェックし、高性能液体クロマトグラフィで純度を確認することができる。バッファ溶液をPBSに交換することができ、濃度を吸光係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。前記モノクローナル抗体をアリコートに分割して、-80℃で保存することができる。
【０１００】
選択したヒト抗CD89モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを決定するために、市販の試薬（ピアス社、イリノイ州ロックフォード）を使用して各抗体をビオチン化することができる。非標識のモノクローナル抗体およびビオチン化したモノクローナル抗体を用いた競合研究を、CD89でコートしたELISAプレートを用いて、上述の通り行うことができる。ビオチン化mAb結合は、ストレップ-アビジン-アルカリホスファターゼプローブを用いて検出することができる。
【０１０１】
精製した抗体のイソタイプを決定するために、イソタイプELISAを行うことができる。たとえば、マイクロタイタープレートのウエルを10μg/mlの抗ヒトIgで、4℃で一晩かけてコートすることができる。5%
BSAでブロックした後、前記プレートを10μg/mlのモノクローナル抗体または精製イソタイプ対照と、室温で2時間反応させる。次に前記ウエルをヒトIgG1またはヒトIgM特異性アルカリホスファターゼ共役プローブと反応させることができる。プレートを展開し、上述の通り解析する。
【０１０２】
モノクローナル抗体がCD89を発現する生細胞に結合することを示すために、フローサイトメトリを使用することができる。フローサイトメトリプロトコルの典型的には（しかしそれに限定されない）例では、CD89を発現する細胞株（標準成長条件で成長させたもの）を、0.1%Tween80および20%マウス血清を含むPBSに入れた各種濃度のモノクローナル抗体と混合し、37℃で1時間インキュベートする。前記細胞を洗浄後、一次抗体の染色と同一の条件下で蛍光標識抗ヒトIgG抗体と反応させる。サンプルは、単一の細胞上に生じる光および側方散乱特性を用いるFACScanによって解析することができる。蛍光顕微鏡を用いる代替的なアッセイもフローサイトメトリアッセイに（加えて、またはその代わりに）用いてもよい。細胞を上述の通り厳密に染色し、蛍光顕微鏡で調べることができる。この方法では、個々の細胞を可視化することができるが、抗原の濃度によっては感度が低下するかもしれない。
【０１０３】
抗CD89ヒトIgGは、さらにCD89抗原との反応性をウエスタンブロッティング法によってテストすることもできる。たとえば、CD89発現細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動後、単離した抗原をニトロセルロース膜に移し、20%マウス血清でブロックし、テストするモノクローナル抗体でプローブするだろう。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出し、BCIP/NBT基質錠（シグマ・ケミカル社、ミズーリ州セントルイス）で展開することができる。
【０１０４】
II. ヒトモノクローナル抗CD89抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物の作製
さらに別の局面では、本願発明は、好ましくは高親和性でCD89に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を発現する能力がある、たとえばトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物を提供する。好ましい実施態様では、たとえばトランスジェニックマウス（HuMabマウス）などの当該トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。ある実施態様では、たとえばトランスジェニックマウスなどの当該トランスジェニック非ヒト動物は、CD89抗原および／またはCD89を発現する細胞の精製または濃縮調製物で免疫している。好ましくは、たとえばトランスジェニックマウスなどの当該トランスジェニック非ヒト動物は、V-D-J組換えおよびイソタイプスイッチングを経て、CD89に対するヒトモノクローナル抗）の複数のイソタイプ（たとえばIgG、IgA、および／またはIgE）を産生する能力がある。イソタイプスイッチングは、たとえば古典的または非古典的イソタイプスイッチングによって生じてよい。
【０１０５】
異種抗体レパートリによる外来性の抗原刺激に応答するトランスジェニック非ヒト動物の設計には、異種免疫グロブリン導入遺伝子が、B細胞の発達の経路全体を通してトランスジェニック動物の機能を正しく収容する必要がある。好ましい実施態様では、異種重鎖導入遺伝子の正しい機能には、イソタイプスイッチングが含まれる。したがって、本願発明の導入遺伝子は、イソタイプスイッチング、および（1）高レベルで細胞の種類に特異的な発現、（2）機能的遺伝子再編成、（3）対立遺伝子排除の活性化およびそれに対する応答、（４）十分な一次レパートリの発現、（5）シグナル伝達、（６）体細胞超突然変異、（７）免疫応答中の導入遺伝子抗体座の支配、のうちの１つ以上を生じるように作製する。
【０１０６】
上述の要件すべてを満たす必要はない。たとえば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン座が機能的に破壊されている実施態様では、導入遺伝子は対立遺伝子排除を活性化する必要はない。さらに、導入遺伝子が機能的に再編成された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む実施態様では、機能的遺伝子の再編成の２番目の要件は、少なくともすでに再編成されている導入遺伝子の場合には不必要である。分子免疫学の背景は、引用によって本願明細書に援用されるFundamental Immunology, 2nd edition
(1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.を参照のこと。
【０１０７】
ある実施態様では、本願発明のヒトモノクローナル抗体を産生するために用いるトランスジェニック非ヒト動物は、前記トランスジェニック動物の生殖系列の再編成された、もしくは再編成されてない免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。前記重鎖導入遺伝子はそれぞれ、少なくとも１つのCH遺伝子を含む。さらに、前記重鎖導入遺伝子は機能的イソタイプスイッチ配列を含んでもよく、その配列は前記トランスジェニック動物のB細胞の中にある複数のCH遺伝子をコードする異種導入遺伝子のイソタイプスイッチングをサポートすることができる。このようなスイッチ配列は、導入遺伝子CH遺伝子の供給源となる種の生殖系列免疫グロブリン座の中に天然に存在する配列であることもあり、またはこのようなスイッチ配列は導入遺伝子コンストラクト（トランスジェニック動物）を受け取る種の中に生じる配列に由来することもある。たとえば、トランスジェニックマウスを作製するために用いるヒト導入遺伝子コンストラクトは、マウス重鎖座に天然に存在するスイッチ配列と同様の配列が組み込まれている場合、イソタイプスイッチング発生頻度が高くなることがある。これは、おそらく、マウススイッチ配列はマウススイッチリコンビナーゼ酵素システムとともに機能するために最適化されているのに対し、ヒトスイッチ配列はそうではないからであろう。スイッチ配列は、単離して従来のクローニング方法でクローニングしてもよく、または、免疫グロブリンスイッチ領域配列に関連する公開されている配列情報をもとに設計された重複合成オリゴヌクレオチドから、de
novo新たに合成してもよい(引用によって本願明細書に援用するMills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316
(1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989))。
【０１０８】
前述の各トランスジェニック動物の場合、機能的に再編成された異種重鎖および軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子は、かなりの割合のトランスジェニック動物のB細胞に見つけられる（少なくとも10%）。
【０１０９】
本願発明のトランスジェニック動物を作製するために使用する導入遺伝子には、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメント、１つの結合遺伝子セグメント、および少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含む重鎖導入遺伝子が含まれる。前記免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの結合遺伝子セグメント、および少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含む。前記軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、トランスジェニック非ヒト動物から構成されない種から得た免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子セグメントをコードするDNAに由来する、またはそれに相当するトランスジェニック非ヒト動物とは異種性である。本願発明のある局面では、前記導入遺伝子は、個々の遺伝子セグメントが非再編成であるように、すなわち機能的免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするように再編成されることがないように作製される。このような非再編成の導入遺伝子はV、D、およびJ遺伝子セグメントの組換え（機能的再編成）をサポートし、好ましくは、D領域遺伝子セグメントの全体または部分を、CD89抗原にさらされた場合にトランスジェニック非ヒト動物の中に得られる再編成免疫グロブリン重鎖に組み込むことをサポートする。
【０１１０】
代替的な実施態様では、前記導入遺伝子は非再編成の「小座位」を含む。このような導入遺伝子は典型的には、C、D、およびJセグメントの実質的な部分とともにV遺伝子セグメントのサブセットを含む。このような導入遺伝子コンストラクトの場合、たとえばプロモータ、エンハンサ、クラススイッチ領域、RNAプロセッシングのためのスプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列、および組換えシグナルなどの各種調節配列は、異種DNAに由来する対応する配列を含む。このような調節配列は本願発明で用いられる非ヒト動物と同一の種、またはそれに関連する種から得た導入遺伝子に組み込まれることがある。たとえば、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスに用いるための齧歯類免疫グロブリンエンハンサ配列を有する導入遺伝子と組み合わせることもある。代替的には、合成した調節配列を導入遺伝子に組み入れることもでき、その場合、このような合成した調節配列は、哺乳類のゲノムに天然に存在することが知られている機能的DNA配列と相同ではない。合成した調節配列は、たとえばスプライスアクセプター部位またはプロモータ／エンハンサモチーフの許容される配列を特定するなどのコンセンサスルールにしたがって設計する。たとえば、小座位には、天然に存在する生殖系列のIg座と比較して、非必須DNA部分（たとえば介入配列、イントロンまたはその部分）の少なくとも１つの内部（すなわちその部分の終端においてではない）欠損を有するゲノム免疫グロブリン座の部分を含む。
【０１１１】
本願発明の好ましい実施態様では、CD89に対するヒト抗体を作製するために用いるトランスジェニック動物は、その内容を引用することによって明確に本願明細書に援用する、WO
98/24884の例１２に記載の導入遺伝子をWO 98/24884の例５、６、８、および１４に記載の軽鎖導入遺伝子の単一のコピーを含有する動物、およびWO
98/24884の例１０に記載のJHを欠失した動物と交配させたその仔と交配させた導入遺伝子の、少なくとも１つ、典型的には２乃至１０、および時に２５乃至５０またはそれ以上のコピーを含む。動物はこれら３つの形質のそれぞれについてホモ接合性になるように交配する。このような動物は以下の遺伝子型を有する。それは、ヒト重鎖非再編成小座（WO
98/24884の例１２に記載）の単一のコピー（染色体のハプロイド１組あたり）、編成したヒトK軽鎖作製物（WO 98/24884の例１４に記載）の単一のコピー（染色体のハプロイド１組あたり）、および機能的JHセグメント（WO
98/24884の例１０に記載）のすべてを除去する内因性マウス重鎖座のそれぞれにおける欠失、である。このような動物は、JHセグメントの欠失（WO
98/24884の例１０に記載）についてホモ接合性のマウスと配合し、JH欠失についてホモ接合性であり、ヒト重鎖および軽鎖作製物についてはヘミ接合性である仔を生む。得られた動物に抗原を注射し、これらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生のために使用する。
【０１１２】
このような動物から単離したB細胞は、各遺伝子の単一のコピーしか含まないために、ヒト重鎖および軽鎖に関して単一特異的である。さらに、内因性マウス重鎖遺伝子のコピーは両方とも、WO
98/24884の例９および１２に記載の通り導入されたJH領域全体にわたる欠失のために非機能的であるために、ヒトまたはマウス重鎖に関して単一特異的であろう。さらに、再編成ヒトκ軽鎖遺伝子の単一コピーの発現が、かなりの割合のB細胞における内因性マウスκおよびλ鎖遺伝子の再編成を、対立遺伝子的およびイソタイプ的に排除するであろうため、相当の割合のB細胞はヒトまたはマウス軽鎖に関して単一特異的であろう。
【０１１３】
好ましい実施態様のトランスジェニックマウスには、重要なレパートリ、理想的には野生種マウスのレパートリに実質的に類似のレパートリの免疫グロブリンの産生が見られるであろう。したがって、たとえば、内因性Ig遺伝子が不活化されている実施態様では、免疫グロブリン濃度の合計が、血清中約0.1乃至10mg/mlのであって、好ましくは0.5乃至5
mg/mlであって、理想的には少なくとも約1.0 mg/mlであるだろう。IgGからIgMへのスイッチをもたらすことができる導入遺伝子がトランスジェニックマウスに導入された場合、成熟マウスにおける血清IgGとIgMの比は、好ましくは約10:1である。IgGとIgMの比は、未成熟マウスにおいてははるかに小さいだろう。一般に、約10%超、好ましくは40乃至80%の脾およびリンパ節B細胞は、ヒトIgGタンパク質のみを発現する。
【０１１４】
前記レパートリは、理想的には非トランスジェニックマウスに見られるレパートリである、通常は少なくとも約10%、好ましくは25乃至50%超に近いだろう。一般に、主にマウスゲノムに導入された異なるV、JおよびD領域の数によって、少なくとも約1000種類、好ましくは104乃至106種類以上の異なる免疫グロブリン（理想的にはIgG）が、産生されるだろう。これらの免疫グロブリンは、一般に、たとえばスタフィロコッカス・プロテインAなどの高度な抗原性タンパク質の約半分またはそれ以上を認識するだろう。一般に、前記免疫グロブリンには、少なくとも約107M-1、好ましくは少なくとも約109
M-1、さらに好ましくは少なくとも約1010 M-1、1011 M-1、1012
M-1、またはたとえば最大1013 M-1以上など、それ以上のあらかじめ選択した抗原に対する親和性が見られるだろう。
【０１１５】
ある実施態様では、所定のレパートリを有するマウスを作製し、所定の抗原のタイプに対する抗体の応答に現れるV遺伝子の選択を制限することが好ましい。所定のレパートリを有する重鎖導入遺伝子は、たとえばヒトにおける前記の所定の抗原タイプに対する抗体応答に優先的に用いられるヒトVH遺伝子を含んでもよい。代替的には、VH遺伝子の中には、様々な理由（たとえば、前記の所定の抗体への高度な親和性V領域をコードする可能性が低いか、体細胞突然変異および親和性シャープニングを経る傾向が少ないか、または特定のヒトに免疫原性がある、など）から、特定のレパートリから排除されるものもあってよい。したがって、各種重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含む導入遺伝子の再編成の前に、このような遺伝子セグメントは、たとえばハイブリダイゼーションまたはDNAシーケンシングなどによって、トランスジェニック動物以外の生物種に由来することを容易に同定することもできる。
【０１１６】
本願発明のトランスジェニックマウスは、上述の通りCD89抗原および／またはCD89発現細胞の精製または濃縮調製物で免疫することができる。前記マウスは導入遺伝子内スイッチ組換え（cisスイッチング）によってクラススイッチを起こすB細胞を産生し、CD89と反応する免疫グロブリンを発現するだろう。前記免疫グロブリンはヒト配列抗体であってよく、当該抗体において重鎖および軽鎖ポリペプチドはヒト導入遺伝子配列によってコードされており、その配列には体細胞突然変異およびV領域組換え結合とともに生殖系列コード配列によって誘導された配列を含んでよい抗体であってよく、これらのヒト配列免疫グロブリンは、他の非生殖系列配列が体細胞突然変異およびディファレンシャルなV-JおよびV-J-D組換え結合の結果として存在しているとしても、ヒトVLまたはVH遺伝子セグメントおよびヒトJLまたはJLセグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるといってよい。このようなヒト配列抗体について、各鎖の可変領域は一般に、少なくとも80%がヒト生殖系列V、J、および重鎖の場合はD遺伝子セグメントによってコードされており、高頻度で可変領域の少なくとも85%が導入遺伝子上に存在するヒト生殖系列配列によってコードされており、しばしば可変領域配列の90または95%以上が導入遺伝子上にて存在するヒト生殖系列配列によってコードされている。しかし、非生殖系列配列は体細胞突然変異ならびにVJおよびVDJ結合によって導入されているため、前記ヒト配列抗体は、マウスの生殖系列中のヒト導入遺伝子に見られるようなヒトV、D、またはJ遺伝子セグメントによってコードされていない可変領域配列のいくつかを高頻度に有しているだろう（定常領域配列の場合は頻度が低いだろう）。典型的には、このような非生殖系列配列（または個々のヌクレオチドの位置）はCDR内もしくは近傍、または体細胞突然変異がクラスターを形成することが知られている領域中においてクラスターを形成するだろう。
【０１１７】
所定の抗原に結合するヒト配列抗体はイソタイプスイッチングから生じることがあり、その結果ヒト配列γ鎖（γ1、γ2a、γ2Bまたはγ3）およびヒト配列軽鎖（Kなど）を含むヒト抗体を産生する。このようなイソタイプスイッチされたヒト配列抗体は、特に２次（または後続）抗原の刺激の後に、抗原による親和性の成熟およびB細胞の選択の結果、典型的には可変領域において、およびしばしばCDRの約10残基中またはそれ以内において、１つ以上の体細胞突然変異を含むことが多い。これら高親和性ヒト配列抗体は、少なくとも1
x 109M-1、典型的には少なくとも5 x 109 M-1、高頻度に1
x 1010M-1、および時に5 x 1010M-1乃至1 x 1011M-1またはそれ以上の結合親和性を有することがある。
【０１１８】
本願発明の別の局面は、高親和性（たとえば2 x 109M-1を超える）でCD89に結合するヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを作製するために用いることができるこのようなマウスから得たB細胞に関連する。したがって、本願発明の別の実施態様では、このようなハイブリドーマを用いて、CD89への結合の親和性定数（Ka）が少なくとも2
x 109M-1である免疫グロブリンを含む組成物であって、当該組成物において前記免疫グロブリンが、
（1）ヒトVL遺伝子セグメントおよびヒトJLセグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、および（2）ヒトCL遺伝子セグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する軽鎖定常領域、からなるヒト配列軽鎖と、
（1）ヒトVH遺伝子セグメント、場合によってはそのD領域、およびヒトJHセグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および（2）CH遺伝子セグメントによってコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する定常領域、からなるヒト配列重鎖、
を含む、組成物を作製する。
【０１１９】
CD89に対する高親和性ヒトモノクローナル抗体の作製は、ヒト免疫グロブリンを組み込んだ導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスのヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリを拡大する方法であって、前記のヒト免疫グロブリン組み込み導入遺伝子中に存在しないV領域遺伝子セグメントを含むV遺伝子導入遺伝子を前記ゲノムに導入するステップを含む前記方法によって、促進させる。前記V領域導入遺伝子は、ヒトゲノムに天然に存在するかもしれず、または組換え法によって別々に共にスプライスされているかもしれず、異常または除外V遺伝子セグメントに含まれているかもしれない、ヒトVHまたはVL（VK）遺伝子セグメントアレイの一部分を含む酵母人工染色体であることが多い。少なくとも５つ以上の機能的V遺伝子セグメントがYAC上に含まれていることが多い。このバリエーションの場合、Vレパートリ拡大方法によって作出されたトランスジェニックマウスであって、当該マウスにおいて前記マウスが、V領域導入遺伝子およびヒトIg導入遺伝子上にコードされているC領域上に存在するV領域遺伝子セグメントによってコードされる可変領域配列を含む免疫グロブリン鎖を発現するマウスを作製することが可能である。前記Vレパートリ拡大方法によって、少なくとも5つの別個のV遺伝子を有するトランスジェニックマウスを作製することができ、同様に少なくとも約24個以上のV遺伝子を含むマウスを作製することもできる。いくつかのV遺伝子セグメントは、非機能的（たとえば偽遺伝子など）であってよく、これらのセグメントは、必要な場合に当業者が実行できる組換え方法によって、維持または選択的に削除することもできる。
【０１２０】
一度、前記マウス生殖系列を、拡大Vセグメントレパートリを有する機能的YACを含み、JおよびC遺伝子セグメントを含むヒトIg導入遺伝子に実質的に存在しないように操作すると、その形質が増殖して、拡大したVセグメントレパートリを有する機能的YACを異なるヒトIg導入遺伝子を有するマウス生殖系列に組み込むなどの背景を含む、そのほかの遺伝的背景に組み込むことができる。拡大したVセグメントレパートリを有する複数の機能的YACを、ヒトIg導入遺伝子（または複数のヒトIg導入遺伝子）とともに働かせるために、生殖系列に組み込んでもよい。本願明細書ではYAC導入遺伝子と呼んでいるが、このような遺伝子はゲノムに組み込まれると、酵母菌の自己複製に必要な配列などの酵母配列を実質的に失うことがあり、このような配列は場合によっては、酵母菌の複製の必要がなくなった後（すなわち、マウスES細胞またはマウスプロ接合体への導入前）に遺伝子工学（たとえば制限切断、およびパルスフィールドゲル電気泳動、またはそのほかの適切な方法）によって除去することもある。ヒト配列免疫グロブリン発現の形質の拡大方法には、ヒトIg導入遺伝子を有する、および場合によっては拡大したVセグメントレパートリを有する機能的YACも有するトランスジェニックマウスの交配が含まれる。VHおよびVL遺伝子セグメントはYAC上に存在してもよい。前記トランスジェニックマウスは、ヒトIg導入遺伝子および／またはそのほかのヒトリンパ球タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、そのほかのヒト導入遺伝子を有する背景を含む、施術者が望むいずれの背景と交配してもよい。本願発明はまた、拡大したV領域レパートリのYAC導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスによって産生された高親和性ヒト配列免疫グロブリンも提供する。前述の内容は本願発明のトランスジェニック動物の好ましい実施態様を説明しているが、４つのカテゴリーに分類したそのほかの実施態様も意図される。
I. 再編成していない重鎖および再編成した軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子と含むトランスジェニック動物、
II. 再編成していない重鎖および再編成していない軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物、
III. 再編成した重鎖および再編成していない軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物、
IV. 再編成した重鎖および再編成した軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物。
【０１２１】
トランスジェニック動物のこれらのカテゴリーのうち、内因性軽鎖遺伝子（または少なくともK遺伝子）が相同的な組換え（またはそのほかの方法）によってノックアウトされている場合の好ましい選好順序はII>I>III>IVであって、および前記内因性軽鎖遺伝子がノックアウトされて対立遺伝子排除によって支配されなければならない場合にはI>II>III>IVである。
【０１２２】
III. CD89に結合する二重特異性／多重特異性分子
本願発明のさらに別の実施態様では、CD89に対するヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分は、誘導体化されるか、たとえば別のペプチドまたはタンパク質（たとえばFab’断片）などの別の機能的な分子へ結合し、複数の結合部位または標的エピトープに結合する二重特異性または多重特異性分子を生ずる。たとえば、本願発明の抗体または抗原結合部分は、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物質などの１つ以上の別の結合分子に機能的に結合することができる（たとえば化学カップリング、遺伝子融合、または非共有会合などによって）。前記抗体または抗体断片は、前記抗原がCD89発現免疫細胞を標的とするようにたとえば腫瘍抗原などの抗原に結合して、前記抗原の内部移行、および提示のプロセスを促進し、最終的には免疫応答を刺激することができる。
【０１２３】
したがって、本願発明には、少なくとも１つのCD89への第１の結合特異性、およびたとえば腫瘍細胞の標的エピトープなど標的細胞への第２の結合特異性を含む二重特異性および多重特異性分子が含まれる。CD89に対するマウス抗体および腫瘍抗原に対する第２の抗体を含む二重特異性抗体は、有効な抗腫瘍物質であることが証明されている。たとえばValerius,
T. et al. (1997) Blood 90:4485-4492 (G-CSF 療法と併用、または併用しないFcαRI x
HER-2/Neu 二重特異性抗体の抗腫瘍活性について記述)、Elsasser, D. et al. (1999) Anticancer Res. 19:1525-1528
(G-CSFまたはGM-CSFと併用、または併用しないFcαRI x EGFR二重特異性抗体の抗腫瘍活性についての記述)、Stockmeyer, B. et
al. (2000) J. Immunol. 165:5954-5961 (G-CSFまたはGM-CSF 療法と併用、または併用しないFcαRI
x CD20二重特異性抗体の抗腫瘍活性の記述); Stockmeyer, B. et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:103-111
(G-CSFまたはGM-CSF と併用、または併用しないFcαRI x CD20およびFcαRI x HER-2/neu二重特異性抗体の抗腫瘍活性について記述)、およびSundarapandiyan,
K. et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:113-123 (FcαRI x CD30 二重特異性抗体の抗腫瘍活性について記載)。本願発明の抗CD89抗体は、抗腫瘍物質と同一の種類の二重特異性コンストラクトに用いることができる。
【０１２４】
標的にすることができる腫瘍細胞は、乳癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膵癌、肝癌、中枢神経系癌、腎癌、頭部癌、頸部癌、骨癌、血液癌、およびリンパ系癌を含む、任意の癌の腫瘍細胞である。好ましい標的抗原には、癌胎児性抗原（CEA）、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、ムチン（mucine）抗原、EGF-R、HER2/neu、Her3、HER4、CD20、CD30、MAGE抗原、SART抗原、MUC1抗原、c-erb-2抗原およびTAG
72が含まれる。TAG72はたとえば乳腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍などに見られる。CEAに特異的な抗原結合領域は、MFE-23という名称のCasey et al.
(1994) J. Immunol. Methods 179:105 およびChester et al. (1994) Lancet
343:455に記述されている１本鎖抗体に由来してよい。抗HER2/neu抗体は520C9細胞株によって産生される(Ring et al. 1991 J.
Immunol. 28: 915-917)。抗体H425は抗EGF-R抗体M425のヒト化版である。TAG 72に対する抗体は、付与済みのヨーロッパ特許第
365 997号に関連する公開PCT出願第WO 93/11161号、公開PCT出願第WO 90/04410号、公開PCT 出願第WO 93/12231号および公開PCT出願WO
89/01783に記載のモノクローナル抗体cc49である。さらに他の抗原は、たとえばHLA-DR、CD74、CD79、CD20、CD30、CD37、およびCD19などのB細胞リンパ腫に関連する抗原であってよい。他の血液疾患に関連する抗原も本願発明の範囲内である。したがって、本願発明はまた、白血病またはリンパ腫などの血液細胞障害を治療する方法も提供する。
【０１２５】
乳癌および卵巣癌は性ホルモンに依存する癌であってよい。乳腫瘍はたとえばHER-2、-3、および-4などのヒトEGF様受容体ファミリー（HER）などの、異常に発現した受容体によって特徴づけられていると考えられる。本願発明はHER抗原のこれらの実施態様に限定されない。天然のHERリガンド、ヘレグリンは、癌の間に１つ以上のHER受容体を発現する乳腫瘍細胞を標的とする手段として、たとえば二重特異性抗体（BsAb）または多重特異性分子などのヒトモノクローナル抗体に組み込まれてよい。さらに、ヘレグリン分子は、たとえば各HER-2、-3、または-4の単量体の組み合わせなどを含む、ヘテロ二量体HER受容体の結合決定因子である。ある実施態様では、モノクローナル抗体は米国特許第5,367,060号に示されたヘレグリンβ2のアミノ酸171乃至239を含む。ヘレグリンβ2の他の部分とともに、米国特許第5,367,060号に開示される分子など他のヘレグリン分子の部分も使用することができる。
【０１２６】
本願発明の抗体または抗原結合部分は、中枢神経系の腫瘍の治療のために使用することもできる。正常な哺乳類の胎仔の発育中に発現するネスチンタンパク質を、脳癌の形態の大半を含む中枢神経系の腫瘍上に発現させる（McKay, D.G. Ronald,U.S.
Patent No. 5,338,839, 8/16/94）。ネスチンはまた、皮膚上の黒色腫、および他の臓器に転移した検出および治療が困難な黒色腫上(V.A.
Florenes, R. Holm, O. Myklebost, U. Lendahl, O. Fodstad, Cancer Res. 54: 354-6,
1994)にも発現する。脳腫瘍を治療するための本願発明の分子は、脊髄注射または細針送達によって、直接中枢神経系か、または直接脳へ送達することが好ましい。転移癌の場合、好ましい送達経路は、循環器に直接注射するか、または本願明細書に記載のex
vivo血液法であろう。
【０１２７】
本願発明の方法を例示する上での他の腫瘍タイプは、ウィルムス腫瘍(A.J. Buckler, K.M. Call, T.M. Glaser, D.A. Haber, D.E. Housman,
C.Y. Ito, J. Pelletier, Rose, E.A. Rose, U.S. Patent No. 5,350,840) という、患者において、通常２つの完全な遺伝子コピーが見られる遺伝子の単一コピーの中に体細胞突然変異が生じたために発症する小児腎癌であるが、これらに限定されない。ウィルムス腫瘍は全症例の95%が外科的に治癒することができ、結合物質は外科的な患者のための補助治療手段として適切であると想定されている。当該組成物および本願発明の方法が適切である、既知の癌関連タンパク質の他の例には、胃腸癌に関連するもの(R.
Fishel et al., 国際出願WO 95/14085, 05/26/95号)、化学療法中の多剤耐性の発症を特徴とするもの(J.M. Croop et
al., 米国特許第5,198,344号)、および当業者が解析用に用いることができる配列であるRb、ras、およびc-mycなどの当業者に公知の数多くの発癌性遺伝子が含まれる。本願発明の組成物は、たとえば、腫瘍の転移を増強すると考えられるマトリックス・メタロプロテイナーゼなどの分泌酵素の阻害に好適である(Liotta,
L.A., et al., (1991), Cell, 64:327-336)。後者の実施態様では、前記マトリックス・メタロプロテイナーゼの結合決定因子を有する結合物質、およびFcαRにとっての同様の物質によって、これらの酵素のin
situ活性の阻害およびクリアランスが容易になるだろう。標準の外科療法および化学療法とともに使用する場合、前記組成物は癌の再発を低減し長期の生存を促進すると予測される。
【０１２８】
腫瘍細胞に加えて、前記エフェクター細胞は、自己免疫疾患の治療をするリンパ球、またはアレルギーを治療するためのIgE産生リンパ球を産生する自己抗体を標的にすることができる。本願発明の結合物質で治療することができる自己免疫疾患には、糖尿病、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性リウマチ様関節炎、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、および湿疹様皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物刺傷に対する反応によるアレルギー反応、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚紅斑性狼瘡、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病境界反応、性癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少、再発性多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブンス-ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス病眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症が含まれる。したがって、自己免疫性疾患は、たとえば自己免疫疾患を罹患する対象に、ヒトCD89に特異的な少なくとも１つの抗原結合領域を有する抗体、および自己免疫細胞上のエピトープに特異的な抗原結合領域を投与するなどによって、治療することができる。ある実施態様では、前記標的エピトープは自己抗体上のエピトープである。したがって、表面上に自己抗体を有する休眠状態のBリンパ球を標的とし、Bリンパ球とCD89を発現するエフェクター細胞を架橋する多重特異性抗体によって破壊して、エフェクター細胞の機能を誘導し、前記リンパ球を溶解させることができる。
【０１２９】
同様に、CD89への少なくとも１つの結合特異性、およびIgEを産生するリンパ球上のエピトープへの少なくとも１つの結合特異性を有する抗体を用いて、アレルギーを治療することができる。対象のアレルギーを治療するために使用する抗体も、IgE抗体上のエピトープに特異的な抗原結合領域を少なくとも１つ有する結合物質であってよい。したがって、このような結合物質は、CD89を発現するエフェクター細胞と、表面がIgEでコートされた好塩基球およびマスト細胞などの標的細胞を結合させて、前記標的細胞を溶解することができる。このような治療法によって、抗原とIgE分子の結合を妨げることもでき、その結果たとえばヒスタミンなどのアレルギーに関与する、これら媒介因子の細胞によって分泌を妨げることもできる。さらに、前記抗体は、可溶性IgEに結合し、IgEとマスト細胞および好塩基球の結合を妨げることもできる。
【０１３０】
前記標的はまた、微生物（細菌もしくはウイルス）または可溶性抗原（リウマチ因子もしくはその他の自己抗体および毒素など）であってもよい。微生物には、たとえばウイルス、細菌、真菌、原虫などの病原体が含まれることを意図する。微生物は、病原体が感染した細胞など、微生物が感染した細胞を標的とすることによって標的とすることもできる。
【０１３１】
したがって、本願発明はたとえば、少なくとも１つのCD89に特異的な抗原結合領域、および少なくとも１つの微生物上のエピトープに特異的な抗原結合領域を有する、本願発明の二重特異性分子の有効量を、感染症に罹患した対象に投与するなどによって、感染症を治療する方法を提供する。「感染症」という用語には、まとめて「病原体」と呼ばれる発病性の生物である細菌、ウイルス、真菌、および原虫のうち１つ以上の種によって引き起こされる疾患が含まれることを意味する。本願発明において、病原体は、ヒト結核菌（マイコバクテリウム・チュベルキュロシス）、ライ菌（M.
レプレ）、緑膿菌（シュードモナス・エルギノサ）、赤痢菌（シゲラ・ジセンテリア）、チフス菌（サルモネラ・チフィ）、パラチフス菌（S. パラチフィ）、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）、溶血性連鎖球菌（ストレプトコッカス・ヘモリチカス）、ヘモフィラス・ニューモニエ、大腸菌（エシェリキア・コリ）血清型0157、クラミジア種、ヘリコバクター種、HIV-1,-2、および
-3、HTLV、FELV、HSV-I および-II、B型肝炎ウイルス（たとえばHBV主要表面抗原）、非A型非B型非C型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス（EBV糖タンパク質）、ポックスウイルス、狂犬病ウイルス、コウジカビ種、赤痢アメーバ、ジアルジア種、ニューキャッスル病ウイルス、トキソプラズマ・ゴンディイ、およびカンジダ・アルビカンスに例示されるが、これらに限定されない。タンパク質のスクリーニングおよびin
vitroにおけるペプチドのアッセイによってこれらの生物から固有のエピトープを入手するステップは、当業に公知である。したがって、本願発明の好ましい抗体は、これらの微生物のいずれかにあるエピトープ特異的な抗原結合領域を少なくとも１つ有する。
【０１３２】
好ましい実施例では、前記抗体は、たとえばHIVのgp41など、HIVウイルスのエンベロープ糖タンパク質に特異的な抗原結合領域を有する。gp120またはCD4に特異的な抗体も本願発明の範囲内である。ある実施態様では、前記抗体はヒト抗HIV-1
IgG mAb、DZ33に由来する。
【０１３３】
IgAは粘膜性防御に重要な役割を果たしており、CD89は粘膜領域から得た単球およびマクロファージなどのエフェクター細胞上に認められている(Shen,
L. and Collins, J. (1989) Immunology 68:491参照)。たとえば、肺などの粘膜表面にある単球およびマクロファージは、CD89を発現することが明らかになっている(Shen,
L. and Collins, J. (1989) Immunology 68:491)。したがって、本願発明は、粘膜領域から微生物または望ましくない任意の細胞を除去する方法を提供する。このような方法は、粘膜部位が侵入してくる生物の入り口になることが多いという点と、超酸化物が強力な微生物剤であるという点から、特に有用である。たとえば超アニオンなどの酸素代謝物は、殺菌効果および静菌効果を有することが示されている。
【０１３４】
標的エピトープへの抗原結合領域はまた、増殖因子または分化因子などの受容体へのリガンドであってもよく、成長または分化因子への受容体を有する細胞を前記結合物質の標的とすることができる。たとえば、本願発明の抗体は、上皮増殖因子受容体（EGF-R）と相互作用することができる、上皮増殖因子（EGF）、または少なくともその一部分もしくは修飾体を含んでよい。前記抗体はまた、ヘレグリンの結合部分を含んでもよい。本願発明の別の好ましい実施態様では、前記リガンドはボンベシン、ガストリン放出ペプチド（GRP）、リトリン、ニューロメジンB、またはニューロメジンCなどの小さいペプチドである。前記ペプチドの配列は、その内容を引用によって本願明細書に援用する、米国特許第5,217,955号に見つけることができる。前記リガンドはまた、これらのペプチドのいずれかの修飾体であってもよい。前記修飾は、前記受容体への結合を増加させるか、受容体への結合を減少させるか、または結合に影響しない。前記リガンドの修飾はまた、前記リガンドが細胞増殖を刺激するのではなく阻害するように、アゴニストをアンタゴニストへ形質転換させることもできる。前記リガンドの修飾は、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、置換、または修飾であってよい。
【０１３５】
ターゲティング用のエフェクター細胞は、ヒト白血球、好ましくはマクロファージであってよい。他の細胞には、単球、およびそのほかのIgA受容体を有する細胞が含まれる。望ましい場合には、ターゲティング用のエフェクター細胞は、治療を受ける宿主から採取してよい。
【０１３６】
標的のエフェクター細胞、すなわち本願発明の結合物質でコートされたエフェクター細胞は、生理学的に許容される溶液の細胞懸濁液として投与することができる。投与する細胞数は108乃109個程度であってよいが、治療の目的によって変化するだろう。一般に、前記の量は、標的細胞に局在化し、抗体依存性細胞障害（ADCC）による標的細胞の死滅に作用するのに十分な量であろう。投与経路も様々であってよい。腫瘍療法の場合、たとえば、腫瘍の局在化に応じて、標的のエフェクター細胞は静脈内注射で投与してもよく、または直接腫瘍部位に投与してもよい。たとえば、卵巣癌の場合は直接腹腔に投与してよい。
【０１３７】
本願発明の二重特異性および多重特異性分子は、第３の結合特異性を含んでよい。ある実施態様では、前記の第３の結合特異性とは、たとえば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、その結果標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子などの抗促進因子（EF）部分である。「抗促進因子部分」はたとえば抗原または受容体など特定の分子に結合し、その結果Fc受容体または標的細胞抗原の結合決定因子の作用を促進する抗体、機能的抗体断片またはリガンドであってよい。前記「抗促進因子部分」は、Fc受容体または標的細胞抗原に結合してよい。代替的には、前記抗促進因子部分は、第１および第２の結合特異性が結合する物質とは異なる物質に結合することができる。たとえば、前記抗促進因子部分は、細胞障害性T細胞（たとえばCD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1または前記標的細胞に対する高い免疫応答を生じる免疫細胞を介して）に結合することができる。
【０１３８】
ある実施態様では、本願発明の二重特異性および多重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体、またはFab、Fab'、F(ab')2、Fv、または１本鎖Fvなどの抗体の断片を含む。前記抗体はまた、軽鎖または重鎖の二量体、またはその内容を引用することによって本願明細書に援用するLadner
et al. U.S. Patent No. 4,946,778, issued August 7, 1990に記載のFvまたは１本鎖作製物など、その任意の最小断片であってもよい。
【０１３９】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本願発明の二重特異性および多重特異性分子に用いることができる他の抗体は、マウス、キメラ、およびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１４０】
キメラマウス-ヒトモノクローナル抗体（すなわちキメラ抗体）は、当業に公知の組換えDNA技術によって作製することができる。たとえば、マウス（またはそのほかの種の）モノクローナル抗体分子のFc定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で切断し、マウスFcをコードする領域を除去して、ヒトFc定常領域をコードする遺伝子の等価の部分に置換する(Robinson
et al., 国際特許公報第PCT/US86/02269号、Akira, et al., ヨーロッパ特許出願第184,187号、Taniguchi, M.,
ヨーロッパ特許出願第171,496号、 Morrison et al., ヨーロッパ特許出願第173,494号、Neuberger et al., 国際特許出願第WO
86/01533号、Cabilly et al. 米国特許出願第4,816,567号、Cabilly et al., ヨーロッパ特許出願第125,023号、Better
et al. (1988 Science 240:1041-1043)、Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443、Liu et
al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526、Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218、Nishimura
et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005、Wood et al. (1985) Nature 314:446-449、およびShaw
et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559参照)。
【０１４１】
前記キメラ抗体は、さらに、ヒトFv可変領域と等価の配列と結合する抗原に直接関与しないFv可変領域の配列に交換することによってヒト化することができる。ヒト化キメラ抗体の一般的な総説は、Morrison,
S. L., 1985, Science 229:1202-1207 and by Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214に提供されている。その方法には、少なくとも１つの重鎖または軽鎖から得た免疫グロブリンFv可変領域の全体または部分をコードする核酸配列を分離、操作、および発現するステップが含まれる。このような核酸の供給源は当業に公知であり、たとえば、抗GPIIbIIIaハイブリドーマ産生抗体である7E3から得ることもできる。次に、前記キメラ抗体またはその断片をコードする組換えDNAを、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。代替的に、適切なヒト化抗体をCDR置換によって作製することもできる。米国特許第5,225,539号、Jones
et al. 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534、およびBeidler
et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060。
【０１４２】
あるヒト抗体のCDRすべてを、非ヒトCDRの少なくとも一部分と交換してもよく、前記CDRのいくつかだけを非ヒトCDRと交換してもよい。ただし、CDRは、ヒト化抗体をFc受容体に結合させるのに必要な数だけ交換する必要がある。
【０１４３】
抗体は、ヒト抗体のCDRの少なくとも一部分を非ヒト抗体に由来するCDRと交換することができる、任意の方法によってもヒト化することができる。Winterは、本願発明のヒト化抗体を調製するために使用してもよい方法を記述しており
(1987年3月26日に提出された英国特許出願第GB 2188638A号)、その内容は本願明細書に引用することにより明確に援用される。前記ヒトCDRは、国際特許出願第WO
94/10332 号、発明の名称Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on
Human Mononuclear Phagocytesに記載のとおり、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を用いて非ヒトCDRと交換してもよい。
【０１４４】
特定のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているキメラまたはヒト化抗体も本願発明の範囲内である。特に、好ましいヒト化抗体は、前記抗体への結合性が向上するように、フレームワーク領域においてアミノ酸が置換されている。たとえば、マウスCDRを有するヒト化抗体では、前記ヒトフレームワーク領域に位置するアミノ酸は、マウス抗体の対応する位置にあるアミノ酸と交換することができる。このような置換は、ヒト化抗体の抗原への結合性を向上する場合があるということが知られている。アミノ酸を付加、欠失、または置換した抗体を、本願明細書では、修飾抗体または改変抗体とよぶ。
【０１４５】
修飾抗体という用語には、前記抗体の部分を欠失、付加、または置換するなどによって修飾されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体も含むことを意図する。たとえば、抗体の定常領域を欠失させ、たとえば血清半減期などの半減期、前記抗体の安定性または親和性を増加させるために定常領域と交換することによって、抗体を修飾することができる。どのような修飾も、二重特異性および多重特異性分子が少なくとも１つのCD89に特異的な抗原結合領域を有し、少なくとも１つのエフェクター機能を誘導する限り、本願発明の範囲内である。
【０１４６】
本願発明の二重特異性および多重特異性分子は、化学的な技術(たとえばD. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807参照),、「ポリドーマ」技術
(米国特許第4,474,893号, to Reading)、または組換えDNA技術を用いて作製することができる。
【０１４７】
特に、本願発明の二重特異性および多重特異性分子は、当業に公知の方法、および本願明細書に提供された実施例に記載の方法を用いて、たとえば抗標的細胞などの構成要素の結合特異性および抗CD89結合特異性とを共役させることによって調製することができる。たとえば、二重特異性および多重特異性分子の各結合特異性を別々に作り出し、互いに共役させることができる。前記結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤または架橋剤を使用して共有結合を作り出すことができる。架橋剤の例には、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセタート（SATA）、5,5’-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）、o-フェニレンジマレイミド（oPDM）、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオナート（SPDP）、スルホスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロハキサン-1-カルボキシラート（スルホ-SMCC）が含まれる（たとえばKarpovsky
et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu,
MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:8648））。そのほかの方法には、Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132)、Brennan
et al. (Science (1985) 229:81-83), およびGlennie et al. (J. Immunol. (1987) 139:
2367-2375)が記述の方法が含まれる。好ましい共役剤は、SATAおよびスルホ-SMCCで、どちらもピアス・ケミカル社（イリノイ州ロックフォード）から入手することができる。
【０１４８】
前記結合特異性が抗体（たとえば２つのヒト化抗体）である場合、２つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフィド結合を介して共役させることができる。特に好ましい実施態様では、前記ヒンジ領域を、奇数の、好ましくは１つのスルフィド残基を共役前に含むように修飾する。
【０１４９】
代替的には、両方の結合特異性とも、同一のベクターにコードされ、同一の宿主細胞に発現させて組み立てることができる。この方法は、二重特異性および多重特異性分子がmAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 またはリガンドx Fab 融合タンパク質である場合に、特に有用である。たとえば二重特異性分子などの本願発明の二重特異性および多重特異性分子は、１本鎖二重特異性抗体、１つの１本鎖抗体および結合決定因子を含む１本鎖二重特異性分子、または２つの結合決定因子を含む１本鎖二重特異性分子であってよい。二重特異性および多重特異性分子はまた、１本鎖分子であってもよく、または少なくとも２つの１本鎖分子を含んでもよい。二重および多重特異性分子の調製方法は、たとえば米国特許第5,260,203号、米国特許第
5,455,030号、米国特許第 4,881,175号、 米国特許第 5,132,405号、米国特許第 5,091,513号、 米国特許第 5,476,786号、
米国特許第 5,013,653号、 米国特許第 5,258,498号、および米国特許第 5,482,858号に記載されている。
【０１５０】
二重特異性および多重特異性分子の特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、放射線免疫検定法（RIA）、FACS法、生物検定法（たとえば成長阻害）、またはウエスタン・ブロット法によって確認することができる。一般に、これらの各検定法は目的の複合体に特異的な標識した試薬（たとえば抗体）を用いて、目的のタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。たとえば、FcR抗体複合体は、たとえば抗体-FcR複合体を認識し特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて、検出することができる。代替的には、前記複合体は様々なそのほかの免疫検定法のいずれかを用いて検出することができる。たとえば、前記抗体を放射標識し、放射線免疫検定法（RIA）に用いることができる（たとえば、引用を持って本願明細書に援用するWeintraub,
B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand
Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照）。放射性同位体は、γ線カウンターもしくはシンチレーションカウンターなどの方法によって、またはオートラジオグラフィによって検出することができる。
【０１５１】
IV. 結合アッセイ
本願発明の抗体またはその抗原結合部分がヒトCD89などのCD89に特異的に結合することを示すために、いくつかのアッセイを行うことができる。たとえば、様々な細胞に対する前記抗体の結合と、IgAの結合とを比較する結合アッセイを実施でき、ここでの細胞のいくつかはIgAが結合し（たとえば単球およびマクロファージ）、またいくつかはIgAが結合しない（たとえばK-562細胞）。本願発明の抗体は、実質的にIgAと同一の細胞セットと結合するはずである。前記抗体およびIgAを用いた競合結合実験は、両方の物質が同一のエピトープを認識するかどうかを示すだろう。結合実験は、とりわけ、フローサイトメトリー実験、間接的免疫蛍光アッセイ、またはELISAであってよい。さらに、IgAおよび前記抗体は、同一の細胞を形成する同様の分子量を有するタンパク質を免疫沈降するはずである。さらに、CD89を有する細胞ライセートをIgAで前処理すると、前処理をしない場合よりも前記抗体で免疫沈降するタンパク質の量が少なくなるはずである。同様に、前記細胞ライセートを前記抗体で前処理すると、前処理をしない場合よりもIgAで免疫沈降するタンパク質の量が少なくなるはずである。同一の抗原が本願発明の抗体またはその抗原結合部分およびIgAによって認識されることを示すための他のテストは、当業に公知である。さらに、ヒトCD89などCD89はクローニングされているので、組換えCD89もしくはその部分、またはCD89を発現するようにトランスフェクトした細胞を用いて、CD89に対する抗体の結合を明らかにすることができる。
【０１５２】
ある実施態様では、本願発明の抗体は、前記抗体が標的細胞とエフェクター細胞を連結する場合、エフェクター細胞により標的細胞の食作用を刺激する。たとえば、CD89に特異的な少なくとも１つの抗原結合領域を有する本願発明の好ましい二重特異性抗体、および標的細胞上のエピトープへの１つの抗原結合領域は、標的細胞の食作用を誘導することができる。事実、抗赤血球F(ab)’2に連結したMy43（マウス抗CD89抗体）のヘテロ抗体が単球による赤血球の食作用を媒介することが示されている。
【０１５３】
食作用アッセイは以下のように行うことができる。たとえば雄ウシ赤血球（OE）（10μl）などの濃縮標的細胞を、ロゼット形成が最大になるような所定の濃度のF(ab)’2-Ig複合体20μlと、10℃で16時間混合する。ヘテロ抗体でコートしたOEを洗浄し、4x107細胞／mlに調節して、2x106細胞／mlの同一容量の骨髄細胞と混合する。この混合物を37℃で10分間インキュベートし、前記細胞をペレットにしてさらに20分間インキュベートし、取り込まれていないOEを4℃で緩衝塩化アンモニウムを用いて溶解する。食作用は、ライト・ギムザ（シグマ社）染色したサイトスピンプレパラートを顕微鏡で観察してアッセイすることができる。２組のスライドの細胞数は、少なくとも200個になる。食作用は、1個以上の赤血球が取り込まれている細胞の割合によって定量化することができる。
【０１５４】
好ましい抗体は、エフェクター細胞上のCD89に結合すると、前記エフェクター細胞中に酸化爆発、すなわち超酸化アニオンの産生を引き起こす。たとえば、My43（マウス抗CD89抗体）はインターフェロンγ処理したU937細胞によって超酸化アニオンの産生を引き起こすことが示された。
【０１５５】
超酸化物アッセイは、固相上または溶液中で行うことができる。固相超酸化物アッセイは、以下のように行うことができる。平底6穴PVC組織培養プレート（ファルコン・プラスティクス・バクスター社、マサチューセッツ州ベッドフォード）を、1ウエル当たり1ml のポリL-リシン（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）の100mg/ml
PBS溶液で、室温で30分間処理してよい。吸引乾燥後、グルタールアデヒド（2%、シグマ社）を加えて、室温で15分間インキュベートしてよい。PBSで４回洗浄後、望ましい量のIgを含有するPBS
1mlを加え、室温で２時間インキュベートしてよい。それから、前記ウエルをPBSで洗浄し、100mMグリシン/0.1% BSAのPBS溶液で満たして、4℃で18時間インキュベートしてよい。その後、PBSで２回、クレブス・リンガー・ヘペス緩衝塩溶液（KRH）で１回洗浄してよく、3x10+6細胞／ウエルを1mM
KCNおよび1mg/mnlウマ心フェリチトクロムc（シグマ社）を含有するKRHに加えた。前記細胞を5分間、100 x gで前記プレートに遠心沈殿させ、37℃でインキュベートしてよい。PMA（シグマ社）を所定の最終濃度になるように陽性対象に加える。30分後、その内容物を取り出し、遠心沈殿させ、その上清をダイナテック分光光度計（ダイナテックラブズ社、バージニア州シャンティリー）で550nmにおいて測定することができる。
【０１５６】
懸濁超酸化物アッセイは、以下の通り行うことができる。細胞をmAbとともに4℃で45分間インキュベートし、その後、KRH中で洗浄し、1mM KCNおよび1mg/mlウマ心フェリチトクロムc（シグマ社）を含有するKRHに再懸濁し、開始温度37℃でインキュベーションすることができる。PMA（シグマ社）を陽性対象に加え、所定の濃度にしてよい。30分後、前記サンプルを取り出し、遠心沈殿させ、その上静をダイナテック分光光度計（ダイナテックラブズ社）で550nmにおいて測定することができる。
【０１５７】
V. 抗体複合体／免疫毒素複合体
別の局面では、本願発明は、細胞毒素、薬物または放射性同位体などの治療部分に結合させたヒト抗CD89モノクローナル抗体またはその断片に関する。細胞毒素に結合させる場合、これらの抗体は「免疫毒素複合体」と呼ばれる。細胞毒素または細胞毒素物質には、細胞に有害な（たとえば死滅させる）いずれの物質も含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシンとその類似体または相同体が含まれる。治療物質には、抗代謝物質（たとえばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化物質（たとえばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、およびロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンC、およびシス-ジクロロジアミン白金（II）（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（たとえば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（たとえばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（AMC））、および有糸分裂阻害物質（たとえばビンクリスチン、およびビンブラスチン）が、それらに限定されずに含まれる。本願発明の抗体は、たとえば放射性ヨウ素などの放射性同位体に結合させて、癌などのCD89関連疾患を治療するための細胞毒性放射性医薬品を生成することができる。
【０１５８】
本願発明の抗体複合体を用いて、特定の生物学的応答を改変することができ、前記薬物部分は古典的な化学治療剤に限定されることを意図しない。たとえば、前記薬物部分は、望ましい生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、たとえば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素などの酵素活性毒素もしくはその活性断片、腫瘍壊死因子もしくはインターフェロンγなどのタンパク質、またはたとえばリンホカイン、インターロイキン1（IL-1）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン6（IL-6）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、またはそのほかの増殖因子などの生物学的応答改変物質が含まれてもよい。
【０１５９】
このような治療部分を抗体に結合させる手法はよく知られており、たとえばArnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of
Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,
Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)、Hellstrom et al.,
"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd
Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)、 Thorpe,
"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review",
in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et
al. (eds.), pp. 475-506 (1985)、 "Analysis, Results, And Future Prospective
Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in
Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.),
pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., "The Preparation And
Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev.,
62:119-58 (1982)などを参照されたい。
【０１６０】
VI. 薬学的組成物
別の態様では、本願発明は、たとえば、薬学的に許容される担体とともに調製した本願発明のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の単体または組み合わせを含有する薬学的組成物などの組成物を提供する。好ましい実施態様では、前記組成物には本願発明の複数（たとえば２つ以上）の単離されたヒト抗体または抗原結合部分の組み合わせが含まれる。好ましくは、前記組成物の抗体またはその抗原結合部分のそれぞれは、CD89のあらかじめ選択された別のエピトープに結合する。
【０１６１】
ある実施態様では、前記組成物は本願発明の二重または多重特異性分子の単体または組み合わせを含む（たとえば標的細胞への少なくとも１つの結合特異性、およびCD89の少なくとも１つの結合特異性）。
【０１６２】
本願発明の薬学的組成物はまた、併用療法、すなわち別の薬剤と組み合わせて投与することもできる。たとえば、併用療法には少なくとも１つ以上の抗腫瘍剤または他の従来の療法を併用した本願発明の組成物が含まれる。
【０１６３】
本願明細書に用いられる「薬学的に許容される担体」には、すべての溶媒、懸濁媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合の類似物が含まれる。好ましくは、前記担体は、静脈、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または皮内投与（たとえば注射または注入による）に適切である。投与経路により、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性および多重特異性分子は、酸および前記化合物を不活化する可能性がある他の自然条件の作用から化合物を保護するために、物質でコーティングしてもよい。
【０１６４】
「薬学的に許容の塩」は、親化合物の望ましい生物学的活性を有する塩を意味し、望ましくない毒物学的作用はない(たとえばBerge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照)。このような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無毒性無機酸およびリンなどから誘導される塩とともに、脂肪族系モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸ならびにその類似物などの無毒性有機酸が含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウムなどのアルカリ土類金属から誘導される塩とともに、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカインなどの無毒性有機アミンから誘導された塩が含まれる。
【０１６５】
本願発明の組成物は、当業に公知の各種の方法によって投与することができる。当業者に理解されるとおり、投与経路および／または形態は、望まれる結果によって変化するであろう。前記活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル封入送達システムを含む制御放出製剤など、急速な放出から前記化合物を保護するであろう担体とともに調製することができる。酢酸ビニルエチレン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性生物適合性ポリマーを使用してもよい。このような製剤の調製方法の多くは、特許化されているか、または一般に当業に公知である。たとえば Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.
Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New
York, 1978参照。
【０１６６】
本願発明の化合物をある投与経路で投与するために、不活性化を防止する物質で前記化合物をコートするかまたは前記化合物と同時に投与する必要があることもある。たとえば、前記化合物は、たとえばリポソームまたは希釈剤などの適切な担体に入れて対象に投与することもある。薬学的に許容の希釈剤には、食塩水および緩衝水溶液が含まれる。リポソームには、水中油中水CGFエマルションとともに従来のリポソームが含まれる(Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol.
7:27)。
【０１６７】
薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または懸濁液、および滅菌注射用溶液または懸濁液の即時調合用滅菌粉末が含まれる。このような媒質および薬学的に活性な物質用の薬剤は、当業に公知である。従来の溶媒または薬剤が前記活性化合物と適合性がない場合を除き、本願発明の薬学的組成物にそれらを使用することが考慮される。添加活性化合物もまた、前記組成物に組み込むことができる。
【０１６８】
一般に治療用組成物は、滅菌されており製造および保存条件下において安定でなければならない。前記組成物は溶液、マイクロエマルション、リポソームまたは高薬物濃度に適切なそのほかの順序づけられた構造物として調剤することができる。前記担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または懸濁媒であってよい。たとえば、レクチンなどのコーティング剤の使用、懸濁液の場合は所定の粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、たとえば糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの等張剤が前記組成物に含まれることが好ましいだろう。前記注射用組成物は、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収遅延剤を前記組成物に含むことによって、吸収を持続させることができる。
【０１６９】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に入れた所定量の前記活性化合物に、上述の成分１つまたは組み合わせを組み入れ、滅菌マイクロ濾過を行うことによって調製することができる。一般に、懸濁液は前記活性化合物を塩基性懸濁媒を含む滅菌賦形剤および上述の成分から選択された他の所定の成分に組み入れて調製する。滅菌注射用溶液の調製用滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥（lyophilization）であって、この方法により活性成分とあらかじめ滅菌濾過したその溶液から得たさらなる望ましい成分を得る。
【０１７０】
投与計画は最高に望ましい応答（たとえば治療応答）が得られるようにする。たとえば、単回のボーラス投与でもよく、時間をかけて数回に分割して投与してもよく、または治療状況の緊急度によって投与量を漸減もしくは漸増させてもよい。非経口組成物を、投与の簡便性および投与量の均一化のために投与単位剤形に調製することは、特に有益である。本願明細書で用いられる投与単位剤形とは、治療する対象への単回投与量に適した物理的に離散した単位を意味し、各単位には、望ましい治療効果を得るために計算しあらかじめ決めた量の活性化合物を所定の薬学的担体と併せて含有する。本願発明の投与単位剤形の詳細は、（a）前記活性化合物の固有の特性および実現すべき特定の治療効果、ならびに（b）個々における治療の感受性に対するこのような活性化合物を混合する技術に固有の限界、によって支配され、これらに直接依存する。
【０１７１】
薬学的に許容される抗酸化剤の例には（1）アスコルビン酸、塩酸システイン、二流酸ナトリウム、メタ二流酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（2）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、およびアルファトコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、（3）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ETDA）、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸などの金属キレート剤、が含まれる。
【０１７２】
治療用組成物の場合、本願発明の製剤には、経口、経鼻、局所（口腔内および舌下を含む）、直腸、経膣、および／または非経口投与に適したものが含まれる。前記製剤は、都合の良いように単位投与剤形であってもよく、製薬業に公知のいずれの方法で調製してもよい。担体物質と混合して単回投与剤形を作製することができる活性成分の量は、治療の対象および投与の特定の形態によって変化するだろう。担体物質と混合して単回投与剤形を作製することができる活性成分の量は、一般に、前記組成物が治療効果を生じる量であろう。一般に、100%のうち、この量は活性成分が約0.01%乃至約99%の範囲内であって、好ましくは約0.1%乃至約70%であって、最も好ましくは約1%乃至約30%であろう。
【０１７３】
経膣投与に適切な本願発明の剤形には、当業に適切であることが知られている担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー剤形も含まれる。本願発明の成分の局所または経皮投与には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が含まれる。前記活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要であれば保存剤、緩衝剤、または推進剤と混合してもよい。
【０１７４】
本願明細書に用いられる「非経口投与」および「非経口的に投与する」という文言は、経腸および局所投与ではない投与形態で、通常、注射による投与形態を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管穿刺、皮下、皮内、関節内、皮膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射ならびに注入が、これらに限定されずに含まれる。
【０１７５】
本願発明の薬学的組成物に使用されてもよい適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティング物質の使用、懸濁液の場合には所定の粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１７６】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の存在は、上述の滅菌手順および、たとえばパラベン、クロロブタノール、およびソルビン酸フェノールなどの各種抗菌剤および抗真菌剤の含有を療法とも行うことによって、確実に防止することもできる。また、糖、および塩化ナトリウムなどの等張剤を前記組成物に含むことが望ましい場合もある。さらに、注射用薬学的剤形の吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を混合することで持続させてもよい。
【０１７７】
本願発明の化合物がヒトおよび動物に医薬品として投与される場合、単体で、またはたとえば0.001%乃至99.5%（さらに好ましくは0.1乃至90%）の活性成分を薬学的に許容の担体と併せて含有する薬学的組成物として投与することができる。
【０１７８】
選択した投与経路にかかわらず、適切に水和した形態で使用されることがある本願発明の化合物および／または本願発明の薬学的組成物は、当業に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に調製される。
【０１７９】
本願発明の薬学的組成物に入っている活性成分の実際の投与量は、特定の患者に対する望ましい治療応答、組成物、および投与形態が、前記患者に対して有毒にならないように達成されるために効果的な前記活性成分の量が得られるように変化させてもよい。選択された投与量は、本願発明に用いられる特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療、そのほかの薬物、化合物および／または使用される特定の組成物と併用する物質の作用時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態、および既往歴、ならびに医学業界に公知の同様の要因を含む、各種の薬物動態学的要因に依存するだろう。
【０１８０】
当業において通常の技術を有する医師または獣医師は、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。たとえば、医師または獣医師は、望ましい治療効果を実現するために、薬学的組成物に入れた本願発明の化合物の用量を必要量よりも少量から開始し、望ましい効果が達成されるまで投与量を漸増することができる。一般に、本願発明の組成物の適切な一日用量は、治療効果を生じるために有効な最低用量である化合物の量であろう。このような有効用量は、一般に上述の要因に依存する。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好ましく、好ましくは標的部位に最も近い部分に投与する。望ましい場合には、治療用組成物の有効な一日用量を２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上に分けて、一日のうちに適切な間隔を置き、必要に応じて単位投与剤形にして投与してもよい。本願発明の化合物を単体で投与することも可能だが、前記化合物を薬学的製剤（組成物）として投与することが好ましい。
【０１８１】
治療用組成物は当業に知られる医療機器で投与することができる。たとえば、好ましい実施態様では、本願発明の治療用組成物は米国特許第5,399,163号、5,383,851号、5,312,335号、5,064,413号、4,941,880号、4,790,824号、または4,596,556に開示される機器などの無針皮下注射器で投与することができる。本願発明に有用な公知のインプラントおよびモジュールの例には、制御された速度で医薬品を投与するための埋込型マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号、皮膚を通して医薬品を投与するための治療用機器を開示する米国特許第4,486,194号、正確な注入速度で医薬品を送達するための医薬品注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号、連続薬物送達のための可変フロー埋込型注入装置を開示する米国特許第4,447,224号、マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,439,196号、浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,475,196号、が含まれる。これらの特許は引用により本願明細書に援用する。このようなインプラント、送達システム、およびモジュールは、他にも数多く当業に知られている。
【０１８２】
ある実施態様では、本願発明のヒトモノクローナル抗体は、in vivoにおいて適切に分布するように調製することができる。たとえば、血液脳関門（BBB）は多くの高度に疎水性の化合物を通過させない。本願発明の治療用化合物を確実にBBBを通過させるために（望ましい場合に）、たとえばリポソーム内などに調製することができる。リポソームの作製方法は、たとえば米国特許第4,522,811号、5,374,548号、および5,399,331号を参照のこと。前記リポソームは、薬物送達ターゲティングを促進する、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される1つ以上の成分を含んでよい(たとえばV.V.
Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。例示的なターゲティング成分には、葉酸またはビオチン（たとえば米国特許第5,416,016
号to Low et al.参照）、マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun.
153:1038）、抗体 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al.
(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)、界面活性タンパクA受容体 (Briscoe et al.
(1995) Am. J. Physiol. 1233:134)、本願発明の製剤を含んでもよい異なる種、および本願発明の分子の成分、p120
(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含む。K. Keinanen; M.L. Laukkanen
(1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。本願発明のある実施態様では、本願発明の治療用化合物をリポソーム中に調製し、さらに好ましい実施態様では、前記リポソームはターゲティング部分を含む。最も好ましい実施態様では、前記リポソーム中の治療用化合物は、腫瘍または感染部位に最も近い部位にボーラス注射することによって送達する。前記組成物は、注射器に入れやすいようにある程度流動的でなければならない。前記組成物は製造および保存状況下において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の夾雑物の活動が防止されていなければならない。
【０１８３】
「治療上有効な投与量」は、未治療の対象と比較した腫瘍成長が少なくとも約20%、さらに好ましくは少なくとも約40%、よりさらに好ましくは少なくとも約60%、さらによりさらに好ましくは少なくとも約80%阻害されることが好ましい。化合物が癌を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測できる動物モデルシステムにおいて評価することができる。代替的には、組成物のこの特性は、当業の医師に知られるアッセイによるin
vitroの阻害など、前記化合物の阻害能力を調べることによって評価することができる。治療用化合物の治療上有効な量は、腫瘍サイズを減少させるか、または対象の症状を軽減することができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重度、および選択した特定の組成物もしくは投与経路などの要因に基づいて、このような量を決定することができるだろう。
【０１８４】
前記組成物は、滅菌されており、注射器による送達ができる程度に流動性がなければならない。前記担体は、水に加えて等張緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物であってよい。たとえばレシチンなどのコーティング剤の使用、懸濁液の場合には所定の粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、たとえば糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを前記組成物に含むことが好ましい。注射用組成物は、たとえばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収遅延剤を前記組成物に含むことによって長時間吸収させることができる。
【０１８５】
前記活性化合物が上述の通り適切に保護される場合、前記化合物はたとえば不活性希釈剤または吸収性の食用担体とともに経口投与してもよい。
【０１８６】
VII. 本願発明の用途および方法
本願発明の組成物（たとえばCD89に対するヒトモノクローナル抗体およびその誘導体／複合体）には、in vitro およびin invoにおける診断用および治療用の用途がある。たとえば、これらの分子は、たとえばin
vitro もしくはex vivoにおける培養液中の細胞、またはたとえばin vivoにおける対象の細胞に、各種障害を治療、予防、もしくは診断するために投与することができる。本願明細書に用いられるように、「対象」という用語にはヒトおよび非ヒト動物が含まれる。好ましいヒト動物には、CD89の発現、典型的には異常発現（たとえば過剰発現）を特徴とする傷害を有するヒト患者が含まれる。
【０１８７】
たとえば、前記組成物はCD89を介する疾患を診断するためにin vitroまたはin vivoにおいて用いることができる。本願発明の抗体は、CD89の量、または膜表面上にCD89を含む細胞の量を検出し、特定の疾患の症状にどの量が関連しているのかを検出するために用いることができる。代替的には、前記抗体は、特定の疾患の症状の予防または軽減に関連している可能性があり、CD89が前記疾患の媒体であることを示唆するCD89の機能を阻害または遮断するために用いることができる。これは、前記抗体とCD89の間に複合体を形成することができる条件下において、サンプルおよび対照サンプルを抗CD89抗体と接触させることによって実現する。前記抗体とCD89の間に形成されたいずれの複合体も検出し、前記サンプルと前記対照を比較する。
【０１８８】
別の実施態様では、本願発明のヒト抗体またはその結合部分は、前記細胞表面の受容体のキャッピング又は除去などによって、エフェクター細胞上のCD89量を調節するために用いることができる。抗Fc受容体抗体の混合物もこの目的のために用いることができる。
【０１８９】
さらに、自己免疫疾患、癌、または上述の二重性または多重性ヒト抗体への病原性感染症などの障害を治療する方法も、本願発明の範囲内である。このような抗体には、少なくとも１つのCD89への結合特異性および少なくとも１つの標的抗原への抗原結合領域への結合特異性が含まれる。別の実施態様では、前記抗体には、同一の標的抗原および／または受容体の異なるエピトープへの抗原結合領域への結合特異性に対する第３の結合特異性が含まれる。対象における不必要な細胞、すなわち標的細胞、または抗原の除去方法には、前記対象を本願発明の二重特異性または多重特異性抗体で治療するステップが含まれる。ある実施態様では、このような方法には、対象から採取した血液または血液細胞のサンプルのアリコートを得るステップ、薬学的に許容される担体に入れた本願発明の二重特異性または多重特異性抗体の治療上有効な用量でex
vivoにおいて前記血液または血液細胞を処理するステップ、および前記対象へ処理した血液または血液細胞を戻すステップが含まれる。好ましくは血液のサンプルの細胞は単離して培養液中で増殖させ、さらに好ましくは血液のサンプルの細胞はCD89の数または活性を上昇させる物質で処理する。このような物質には、サイトカイン、リンホカイン、またはたとえばG-CSF、GM-CSF、IFN-γ、TNF、などの増殖因子ならびにIL-2、IL-10、およびIL-12などのインターロイキンが含まれる。
【０１９０】
別の実施態様では、本願発明は、癌抗原、病原体上に発見された抗原、または病原体に感染した細胞に対して対象を免疫する方法を提供する。このような方法には、CD89への結合特異性、および病原性感染性生物、または感染細胞の抗原、または癌細胞のエピトープへの対象の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を含む組成物を、薬学的に許容の担体に入れて投与するステップを含む。代替的には、前記組成物は病原性感染性生物、または感染細胞の抗原、または癌細胞の１つ以上の抗原に結合している抗CD89抗体を含んでよい。
【０１９１】
別の実施態様では、IgAのCD89への結合を遮断または阻害する本願発明のヒト抗体は、たとえば慢性肝炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑症（HSP）、IgA腎症（ベルジェ病）、またはIgA-糸球体腎炎などの、循環IgA含有複合体および／またはIgA免疫複合体の沈降を特徴とする疾患など、異常な内因性IgAを特徴とする疾患の治療に使用する。本願発明のヒト抗CD89抗体は、このような障害を罹患する患者に、内因性IgAのCD89への結合を阻害または下方調節するために、投与することができる。たとえば、機序によって制限されることは意図しないが、本願発明の抗CD89抗体の投与により、CD89が遮断され、内因性の異常IgAが受容体に結合できなくなり、望ましくないエフェクター機能を誘導できないようにすることができる。
【０１９２】
別の実施態様では、本願発明のヒトモノクローナル抗体は、補体による細胞溶解を誘導しないか、または最小限しか誘導しないという利点があり、したがって、たとえば座瘡などの補体の活性化による障害を引き起こす副作用が小さい。
【０１９３】
本願発明の組成物（たとえばヒト抗体、多重性および二重性分子）を投与する適切な方法は、抗体を用いる療法の専門家には知られている。前記分子の適切な投与量は、前記対象の年齢および体重、並びに使用される特定の薬物に依存するだろう。前記分子は、Goldenberg, D.M. et al. (1981) Cancer Res. 41: 4354-4360, and in EP
0365 997に記載されるように131I、90Y、105Rhなどの放射性核種に結合させることができる。本願発明の組成物は抗感染剤と結合させることもできる。
【０１９４】
ヒト抗CD89抗体またはその抗原結合断片はまた、たとえばサイトカインまたは化学療法剤などの別の治療用物質と併用投与することもでき、またはたとえば放射線などたとえば抗癌療法などの他の既知の療法と併用することもできる。このような治療用物質には、とりわけ、それら単体では対象に毒性があるまたは亜毒性がある量においてのみ作用するG-CSF、GM-CSF、IL-2、IFN-γおよびIFN-αなどのサイトカイン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドヒドロキシウレアなどの抗新生物剤が含まれる。シスプラチンは４週間に１回100mg/m2を静脈内投与し、アドリアマイシンは２１日に１回60乃至75mg/m2を静脈内投与する。本願発明のヒト抗CD89抗体またはその抗原結合断片と化学療法剤との併用投与は、ヒト腫瘍細胞への細胞毒性作用を生じる異なる機序によって機能する２種類の抗癌剤を提供する。このような併用投与によって、薬剤耐性の発生または前記抗体に反応しなくなる腫瘍細胞の抗原性の変化によって生じる問題を解決することができる。
【０１９５】
補体に結合するIgG1、-2、もしくは-3 または IgMの部分などの補体結合部位を有する本願発明の組成物（たとえばヒト抗体、多重性および二重性分子）は、補体の存在下においても使用することができる。ある実施態様では、本願発明の結合物質を用いた標的細胞を含む細胞群のex
vivoにおける治療、および適切なエフェクター細胞には、補体または補体を含有する血清を添加することができる。本願発明の結合物質でコーティングした標的細胞の食作用は、補体タンパク質を結合させることによって向上させることができる。別の実施態様では、本願発明の組成物（たとえばヒト抗体、多重性および二重性分子）でコーティングした標的細胞は、補体によって溶解することもできる。さらに別の実施態様では、本願発明の組成物は補体を活性化しない。
【０１９６】
本願発明の組成物（たとえばヒト抗体、多重性および二重性分子）はまた、補体と共に投与してもよい。したがって、ヒト抗体、多重性または二重性分子、および血清または補体を含む組成物は本願発明の範囲内である。これらの組成物は、前記補体が前記ヒト抗体、多重性または二重性分子の近隣に位置する場合に有益である。代替的には、本願発明のヒト抗体、多重性または二重性分子、および前記補体または血清は、別々に投与してもよい。
【０１９７】
また、本願発明の組成物（たとえばヒト抗体、多重性および二重性分子）と使用説明書を含むキットも本願発明の範囲内である。前記キットはさらに、補体、または本願発明の１つ以上のさらなるヒト抗体（たとえば第１のヒト抗体とは異なるCD89抗原のエピトープに結合する補体活性を有するヒト抗体）など、少なくとももう１つの試薬を含有することができる。
【０１９８】
本願発明の組成物（たとえばヒト抗体、多重性および二重性分子）はまた、それらの細胞を標識することを目的としてCD89を発現する細胞を標的とすることに使用することができる。このように使用するために、前記結合物質を検出することができる分子に結合させてよい。したがって、本願発明はCD89を発現するex
vivoまたはin vitro細胞の位置を特定する方法を提供する。検出可能な標識は、たとえば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクタであってよい。
【０１９９】
ある実施態様では、本願発明はサンプル中のCD89抗原の存在を検出する方法、またはCD89抗原の量を測定する方法を提供し、当該方法には前記抗体またはその部分とCD89の複合体が形成される条件下において、前記サンプルおよび対照サンプルとヒトモノクローナル抗体またはCD89に特異的に結合するその抗原結合部分とを接触させるステップを含む。その後、複合体の形成を検出し、その場合、前記サンプルと対照サンプルの複合体形成の違いが、前記サンプル中のCD89抗原の存在の指標となる。
【０２００】
さらに別の実施態様では、本願発明はin vivoまたはin vitroにおけるFc発現細胞の存在を検出するか、またはその量を定量化する方法を提供する。前記方法には、（i）対象に、検出可能なマーカーと結合させた本願発明の組成物（たとえば多重性および二重性分子）またはその断片を投与するステップ、（ii）前記対象を、Fc発現細胞を含有する領域を同定するために、前記の検出可能なマーカーを検出する手段に曝露するステップ、を含む。
【０２０１】
本願発明は、以下の実施例によってさらに具体化されるが、それらは本願発明を制限するものと解釈されてはならない。本願明細書全体に引用されたすべての図、ならびにすべての参考文献、特許、および公開された特許出願は、引用によりここに明白に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】HuMAb 14.1のVH領域のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。CDR領域も描かれている。HuMAb14.1VH領域に使用された生殖系列セグメントには、VH 3-30.3、D 6-13、およびJH4bが含まれる。
【図２】HuMAb 14.1のVK領域のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。CDR領域も描かれている。HuMAb14.1VK領域に使用された生殖系列セグメントには、VKL18およびJK3が含まれる。
【図３】HuMAb 8D2のVH領域のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。CDR領域も描かれている。HuMAb 8D2 VH領域に使用された生殖系列セグメントには、VH3-30.3、D 7-27、および JH3bが含まれる。
【図４】HuMAb 8D2のVK領域のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。CDR領域も描かれている。HuMAb 8D2 VK領域に使用された生殖系列セグメントには、VKA27 およびJK2が含まれる。
【実施例】
【０２０３】
例１ CD89に対する完全なヒトモノクローナル抗体を産生するためのトランスジェニック（Cmu標的）マウスの作製
CMDターゲティングベクターの作製
プラスミドpICEmuは、Balb/Cゲノムラムダファージライブラリから得た、mu遺伝子全般にわたるマウスIg重鎖座位のEcoRI/XhoI断片を含有する(Marcu
et al. Cell 22: 187, 1980)。このゲノム断片をプラスミドpICEMI9HのXhoI/EcoRI部位にサブクローニングした(Marsh
et al; Gene 32, 481-485, 1984)。pICEmuに含まれる前記重鎖配列は、muイントロンエンハンサーの3’側にちょうど位置するEcoRI部位の下流から、前記mu遺伝子の最後の膜貫通エキソンの約1kb下流に位置するXhoI部位まで及ぶが、muスイッチ反復領域のほとんどがE.
coliの継代によって消えてしまっている。
【０２０４】
ターゲティングベクターは、以下の通り作製した。1.3kb HindIII/SmaI断片をpICEmuから切り出し、HindIII/SmaI切断pBluescript（ストラタジーン社、カリフォルニア州ラジョラ）にサブクローニングした。このpICEmu断片は、Cmu1の5’側から約1kbのところに位置するHindIII部位からCmu1内に位置するSmaI部位まで及ぶ。得られたプラスミドは、SmaI/SpeIで切断して、Cmu1
3’側にあるSmaI部位から最後のCmuエキソンのちょうど下流に位置するXbaI部位まで及ぶpICEmuから得た約4kbのSmaI/XbaI断片を挿入した。得られたプラスミドpTAR1を、SmaI部位で直線化し、ネオ発現カセットを挿入した。このカセットは、マウスホスホグリセレートキナーゼ（pgk）プロモーターの転写制御下にあるネオ遺伝子からなり（XbaI/TaqI
断片、Adra et al. (1987) Gene 60: 65-74）、pgkポリアデニル化部位を含む（PvuII/HindIII fragment;
Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28: 299-308）。このカセットはプラスミドpKJ1から得たもので（Tybulewicz
et al. (1991) Cell 65: 1153-1163に記載）、ここからネオカセットをEcoRI/HindIII断片として切り出し、EcoRI/HindIII切断pGEM-7Zf(+)にサブクローニングしてpGEM-7(KJ1)を生成した。ネオカセットは、EcoRI/SalI切断によってpGEM-7(KJ1)から切り出し、末端を平滑化してゲノムCmu配列とは反対側に位置するプラスミドpTAR1のSmaI部位にサブクローニングした。得られたプラスミドをNot
Iで直線化して、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）カセットを挿入し、Mansour et al. (1988) Nature 336:
348-352に記述されるように相同性組換え体を有するESクローンを濃縮した。このカセットは、Tybulewicz et al. (1991) Cell
65: 1153-1163に記述されるように、マウスpgkプロモーターおよびポリアデニル化部位によって囲まれたtk遺伝子のコード配列からなる。得られたCMD標的ベクターには、重鎖座位との相同性が合計約5.3kb含まれ、突然変異mu遺伝子を生成するようにデザインされており、この遺伝子に、第１のCmuエキソンの固有のSmaI部位にあるネオ発現カセットを挿入した。ターゲティングベクターをPvuIで直線化し、プラスミド配列内で切断され、その後、ES細胞に電気穿孔した。
【０２０５】
標的ES細胞の作製および解析
AB-1 ES 細胞(McMahon, A. P. and Bradley, A., (1990) Cell 62:
1073-1085) は、基本的に(Robertson, E. J. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic
Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford:
IRL Press, p. 71-112)に記載の分裂不活性SNL76/7 支持細胞層 (ibid.) 上に増殖させた。直線化したCDMターゲティングベクターをHasty
et al. (Hasty, P. R. et al. (1991) Nature 350: 243-246)が記述した方法によってAB-1細胞に電気穿孔で挿入した。電気穿孔した細胞を、100mmの皿に1-2
x 106 細胞/皿の濃度で播蒔した。24時間後、G418（活性成分200μg/ml）およびFIAU（5 x 10-7 M）を培地に加え、8乃至9日間かけて薬物耐性クローンを成長させた。クローンを収集し、トリプシン処理して２分割し、さらに増殖させた。その後、各クローンに由来する細胞の半分を冷凍し、もう半分をベクターと標的配列の相同組換えについて解析した。
【０２０６】
DNA解析はサザンブロットハイブリダイゼーションにより行った。DNAはLaird et al. (Laird, P. W. et
al., (1991) Nucleic Acids Res. 19 : 4293)が記述の通り前記クローンから単離した。単離したゲノムDNAをSpeIで切断し、915
bp SacI断片、プローブA（図１参照）でプローブしてmuイントロンエンハンサーおよびmuスイッチ領域の間の配列とハイブリダイズした。プローブAは、野生種座位から得た9.9
kb SpeI断片、およびCMDターゲティングベクターと相同的に組換えたmu座位から得た診断用7.6 kbバンドを検出する。サザンブロット解析でスクリーニングした1132
G418およびFIAU耐性クローンのうち、３つがmu座位における相同組換えを示唆する7.6 kb SpeIバンドを示した。これら３つのクローンをさらにBglI、BstXI、およびEcoRI酵素で切断し、前記ベクターがmu遺伝子に相同性を導入したことを確認した。プローブAでハイブリダイズした場合、BglI、BstXI、およびEcoRIで切断した野生型DNAのサザンブロットはそれぞれ15.7、7.3、および12.5
kbの断片を生成し、その一方で、標的mu対立遺伝子の存在は7.7、6.6、および14.3 kbの断片で示唆される。SpeIの切断によって検出された３つの陽性クローンはすべて、ネオカセットがCmu1エキソンに挿入されたことを示す、予想どおりのBglI、BstXI、およびEcoRI制限断片を示した。
【０２０７】
突然変異したmu遺伝子を有するマウスの作製
３つの標的ESクローンを264,272番および408番で切断し、解凍して、Bradley (Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas
and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach )Oxford:
IRL Press, p. 113-151)に記載の通りC57BL/6J胚盤胞に注射した。注射した胚盤胞を偽妊娠したメスの子宮に移し、挿入したES細胞に由来する細胞および宿主胚盤胞の混合物を提示するキメラマウスを作製した。ES細胞のキメラへの寄与の程度は、黒色C57BL/6J
背景に対するES細胞株由来のアグーチコート呈色の量によって視覚的に見積もることができる。クローン272および408はキメラの発生率が低かった（すなわちアグーチ色素沈着の割合が低かった）が、クローン264のオスキメラの発生率は高かった。これらのキメラをC57BL/6Jメスと交配して、ES細胞ゲノムの生殖系列の伝達を示すアグーチの仔を作製した。標的mu遺伝子のスクリーニングは、尾部の生検で採取したBglI切断DNAのサザンブロット解析によって行った（ES細胞DNAの解析について上述したとおり）。約50%のアグーチ仔が、ハイブリダイズしている7.7
kb BglIバンドとともに15.7 kbの野生型バンドを示し、標的mu遺伝子の生殖系列伝達を示した。
【０２０８】
mu遺伝子の機能的不活化のためのトランスジェニックマウスの解析
Cum1へのネオカセットの挿入がIg重鎖遺伝子を不活化したかどうかを調べるために、クローン264キメラを、JH遺伝子セグメントが欠失するために重鎖の発現が不活化されるJHD突然変異についてホモ接合性のマウスと交配させた(Chen
et al, (1993) Immunol. 5: 647-656)。４匹のアグーチ仔が生まれた。１ヶ月齢のこれらの仔マウスから血清を採取し、ELISAでマウスIgMが存在するかどうかをアッセイした。４匹の仔のうち２匹のIgMが完全に欠損していた（表１参照）。尾部生検で採取したDNAを、BglIで切断してからプローブAとハイブリダイゼーションしたもの、およびStuIで切断して475
bp EcoRI/StuIフラグメント（同上）でハイブリダイゼーションしたものを、サザンブロット解析して４匹の仔マウスの遺伝子型を特定したところ、血清IgMを発現しない動物は、重鎖座位の１つの対立遺伝子がJHD突然変異を有し、もう１つの対立遺伝子がCmu1突然変異を有する動物であることが立証された。JHD突然変異についてヘテロ接合のマウスは野生型の血清Ig濃度を示す。これらのデータから、Cmu1突然変異がmu遺伝子の発現を不活化することが明らかである。
【０２０９】
【表１】
2010004888.tif 000002
表１は、CMD及びJHD突然変異を両方とも有するマウス（CMD/JHD）、JHD突然変異についてヘテロ接合のマウス（+/JHD）、野生型（129Sv
x C57BL/6J）F1マウス（+/+）、及びJHD突然変異についてホモ接合のB細胞欠失マウスについて、ELISAによって検出された血清IgM濃度を示す。
【０２１０】
例２ CD89に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するためのHCO12トランスジェニックマウスの作製
HCO12ヒト重鎖導入遺伝子
HCO12導入遺伝子は、pHC2の80kb導入断片（Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6:
579-591）、およびpVx6の25kb導入断片を同時に注射して作製した。プラスミドpVx6は以下のように作製した。
【０２１１】
生殖系列ヒトVH1-18（DP-14）遺伝子とともに約2.5kbの5’フランキング、および5kbの3’フランキングゲノム配列を含む8.5 kb
HindIII/SalI DNA断片をプラスミドベクターpSP72（プロメガ社、ウイスコンシン州マジソン）にサブクローニングし、プラスミドp343.7.16を生成した。生殖系列ヒトVH5-51
(DP-73)遺伝子とともに約5kbの5’フランキング、および1kbの3’フランキングゲノム配列を含む7 kb BamHI/HindIII DNA断片をpBR322をベースにしたプラスミドクローニングベクターpGP1f(Taylor
et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295) にクローニングし、p251fを生成した。pGP1f、pGP1kに由来する新規のクローニングベクターをEcoRV/BamHIで切断し、生殖系列ヒトVH3-23（DP47）遺伝子とともに約4kbの5’フランキングおよび1kbの3’フランキングゲノム配列を含む10
kb EcoRV/BamHI DNA断片にライゲートした。得られたプラスミドp112.2RR.7をBamHI/SalIで切断して、7kbのp251fの精製BamHI/SalI導入断片にライゲートした。得られたプラスミドpVx4をXhoIで切断し、p343.7.16の8.5
kb XhoI/SalI導入断片とライゲートした。
【０２１２】
VH1-18遺伝子をそのほかの２つのV遺伝子と同一方向にしたクローンを得た。このクローンをpVx6で切断してからNotIで切断して、Hogan
et al. (B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2nd
edition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY) に記載の通り、精製した26kb導入断片をモル比１：１のpHC2の80kb精製NotIインサートとともに１日半のF2胚の前核
(C57BL/6J x DBA/2J) に同時に注射した。Vx6 およびHC2の両方から得た配列を含むトランスジェニックマウスの３つの独立した株を、注射した胚から成長させたマウスから確立した。これらの株は(HCO12)14881、
(HCO12)15083、および (HCO12)15087と命名する。この３つの各株を、例１に記載のCMD突然変異、JKD突然変異（Chen et al.
1993, EMBO J. 12: 811-820）、および(KCo5)9272導入遺伝子（Fishwild et al. 1996, Nature
Biotechnology 14: 845-851）を含むマウスと交配させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびκ軽鎖座位の破壊についてホモ接合の背景を持つヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖導入遺伝子を発現する。
【０２１３】
例３ CD89に対するヒトモノクローナル抗体および二重性の生成
ヒト抗CD89モノクローナル抗体は、組換え可溶性CD89抗原でHCO12マウスを免疫することによって作製した。
【０２１４】
特に、HCO12マウスは、初めに完全フロインドアジュバントに乳化させた抗原20μgで免疫し、次いで不完全フロインドアジュバントでさらに２回免疫した。マウスの免疫は、２週間に１回、腹腔内注射にて行った。
【０２１５】
最後の免疫から１０日後、ヒトIgG抗CD89力価をELISAで測定した（後述の通り）。十分な力価（抗CD89 IgG応答）が発達したマウスを、脾臓摘出の３日前および２日前に抗原23mgで静脈内に追加免疫した。応答するマウスから得た脾臓を摘出し、細胞を１個ずつばらばらに分散させた。
【０２１６】
抗CD89抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、抗CD89抗体を含有する血漿を有するマウスから採取した脾細胞をP3X63-Ag8.653細胞（ATCCにATCC
CRL 1580非分泌マウス骨髄細胞の名称で寄託）およびPEGに融合させた。ハイブリドーマの成長後、ハイブリドーマを含んでいる各ウエルを、抗ヒトIgG ELISAを用いてヒトIgGの産生についてスクリーニングした。
【０２１７】
陽性ハイブリドーマを、以下の特性（１）ヒトIgG1κ 抗体の産生、（２）可溶性組換えCD89への結合、および（３）CD89発現免疫細胞への結合、についてスクリーニングし、それに基づいて選択した。３つの陽性クローン7.4
(7F12)、8.2 (8D2) および14.1 (14A8)がこれらの基準に当てはまることがわかった。
【０２１８】
固相ELISAを用いたアッセイを、結合研究に用いた。簡単に説明すると、可溶性組換えCD89のPBS溶液で96穴マイクロタイタープレート（1μg/ml）をコーティングし、室温で一晩インキュベートした。その後、このプレートをPBS-0.2%Tween20（PBST）で洗浄し、ニワトリ血清アルブミンのPBST溶液で室温で1時間ブロックした。抗CD89産生ハイブリドーマの上清または精製抗体（のPBS溶液）をウエルに加え、室温で２時間インキュベートした。このプレートを上述のPBSTで洗浄してからHRP複合ヤギ抗ヒト
50μlとともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、100μlのABTS(150 mg 2,2'-アジノ-ビス (3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸
を0.1 Mクエン酸500 mlに入れた溶液, pH 4.35)/H2O2 (10 μl 30% H2O2
／ABTS溶液 10 ml)クロマゲン／基質溶液を各ウエルに加え、前記サンプルをマイクロプレートリーダーで波長405nmで測定した。
【０２１９】
CD89に結合するヒトIgGを産生するハイブリドーマのイソタイプを、ELISAを用いてさらに特徴づけた（ヒトκ）（上述のプロトコルに同じ）。
【０２２０】
３つの細胞株、7.4、8.2 および14.1は、ヒトIgG1κイソタイプを有する可溶性CD89に結合する抗体の産生に基づいて選択した。抗体は、セルマックス・バイオリアクター（Cellmax
bioreactor）（セルコ社、カリフォルニア州ラグナヒルズ）から、1乃至5%のフィータルクローン（Fetalclone）（ハイクローン社、ユタ州ローガン）を含有するHyQ-CCM1培地を用いて分離し、カラムクロマトグラフィで精製した。精製した抗体を、蛍光イソチアナート（FITC）で標識するために、0.3M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5に対して広範囲に透析した。保存FITC溶液を、DMSO
1ml中に固体FITCを1mg溶解して調製した。保存FITCを、抗体タンパク質1mgにつきFITC 50μgになるような量だけ、定常的に混合しながら滴下して加えた。FITCを加えてから、前記溶液を暗闇中、室温で1乃至3時間インキュベートした。FITC標識抗体を、PBS中に平衡化させたセファデックスG-10カラムでゲル濾過して分離した。
【０２２１】
精製した抗体は、以下の例に記載のとおり、結合特異性および活性についてさらに特徴付けを行った。
【０２２２】
例４ CD89に対するヒトモノクローナル抗体の特徴付け
I. 結合／特異性研究
ハイブリドーマの上清から精製し、ELISA(たとえば7.4、8.2 および14.1)の検出でD89への著しい結合を示したモノクローナル抗体 (Mabs) を、後述の通りフローサイトメトリー(FACS解析)を用いてさらにテストし、以下のCD89発現細胞（１）ヒトCD89
(“2a1.6/CD89 細胞”)を発現するようにトランスフォームしたマウス2a1.6 細胞、（２）ヒトPMNL細胞(“HuPMN”)、および(３) ヒトCD89を発現するトランスジェニックマウスから単離したPMNL細胞(“FcαRITg
MsPMN”)、への結合を確認した。
特に、MAb 14.1が、FcαRI リガンド結合ドメインを遮断するMy43（マウスIgM）などの既知のマウス抗CD89 Mabsとは区別されるIgA結合部位の外にあって、細胞外領域２の中にあるCD89
(FcαRI) を認識することを確認した(Shen, L. et al., 1989 J. Immunol. 143: 4117)。
【０２２３】
PMNL 分離
ヒトPMNLの分離は、ヘパリン化した健常志願者の静脈血を、Ficoll-Histopaque（シグマ社）密度勾配遠心分離によって行った。サイトスピン標本で測定したPMNLの純度は95%を超え、細胞の生存度は>98%だった（トリパンブルー排除によって測定）。
マウスPMNL分離の前に、マウスに15μgのポリエチレングリコール顆粒球コロニー刺激成長因子（PEG-G-CSF、カリフォルニア州サウザンドオークス、アムジェン社Dr.
J. Andersonの提供による）を注射し、PMNL数を増やした。３日後、後眼窩叢から採血した。赤血球を低張性溶解して除去し、残った白血球を10% FCSを添加したRPMI
1640培地（ギブコBRL社、ニューヨーク州グランドアイランド）で３回洗浄した。FACSsan（ベクトンディキンソン、カリフォルニア州サンジョゼ）でFACS解析を行い、白血球が〜55%
PMNL、-40% 白血球、〜3%単球、および〜1%コシノフィルからなることがわかった。トリパンブルー排除によって測定した細胞の生存度は常に>95%だった。
【０２２４】
FACS解析１（結合研究）
50 μl抗体希釈液を50μlの Facsバッファに入れた50,000 2a1.6/CD89に加え、4℃で30分間インキュベートした。その後、100μl
Facsバッファで３回洗浄し、ウサギ（Fab2）抗HuIgG-FITCとともに4℃で30分間インキュベートして、Facsバッファ100μlで３回洗浄した。その細胞を200ml
Facsバッファに再懸濁させた。蛍光をFacscalibur（ベクトン・ディキンソン社）で測定した。
【０２２５】
FACS解析２（特異性研究１）
1mg/mlのFacsバッファ 25μlを、Facsバッファ50μlに入れた50,000個の2al.6/CD89細胞に加え、4℃で15分間インキュベートした。抗体希釈液25μlを加え、4℃で30分間インキュベートし、Facsバッファ100μlで３回洗浄した。その細胞をウサギ（Fab2）抗Hu
IgG-FITCとともに4℃で30分間インキュベートし、Facsバッファ100μlで３回洗浄し、Facsバッファ200μlに再懸濁した。蛍光をFacscalibur（ベクトンディキンソン社）で測定した。
【０２２６】
FACS解析３（特異性研究２）
抗体希釈液50μlを、50?μlのFacsバッファに溶解した50,000個の2al.6/CD89細胞、および対照細胞のJurkat/IIIa、CHO/IIIbNA.2、CHO/IIIbNA.1、2a1.6/CD64
またはSLC細胞に加え、4℃で30分間インキュベートして、Facsバッファ100μlで３回洗浄した。その後、細胞をウサギ（Fab2）抗Hu IgG-FITCとともに4℃で30分間インキュベートし、Facsバッファ100μlで３回洗浄した。細胞をFacsバッファ200μlに再懸濁した。蛍光をFacscalibur（ベクトンディキンソン社）で測定した。
【０２２７】
Facs解析４（全血結合研究）
抗体希釈液50μlを、ヒト、マウスまたはCD89Tgマウスの全血50μlに加え、4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACS溶解バッファで溶解し、4℃でインキュベートして、100μl
Facsバッファで３回洗浄して、ウサギ（Fab2）抗Hu IgG-FITCとともに4℃で30分間インキュベートし、Facsバッファ100μlで３回洗浄した。その後、細胞をFacsバッファ200μlに再懸濁した。蛍光をFacscalibur（ベクトンディキンソン社）で測定した。
【０２２８】
II. 競合研究
Mabs 14.1および7.4の、ヒトIgAおよびMab My43（マウス抗CD89抗体）のCD89への結合の阻害能力を、後述のようなブロッキング研究および阻害ELISAでテストした。
【０２２９】
IgAと同様に、MY43は天然のリガンド結合部位でCD89と結合し、IgAの結合と競合する。Mab14.1および7.4の、MabA77およびA59（天然リガンドIgAの結合部位の外側に結合する）のCD89への結合の阻害能力もテストした。
【０２３０】
Mab14.1はIgAおよびMY43結合を阻害しなかったが、A77およびA59のCD89への結合は阻害し、天然リガンドの結合部位の外側に結合することが明らかになった。
【０２３１】
Mab7.4はIgA、MY43、A77、またはA59のCD89への結合を阻害せず、天然リガンドの結合部位には結合するが、14.1とは異なる部位であることが明らかになった。
【０２３２】
ブロッキング研究
抗体希釈液25μlを、50μlのFacsバッファに入れた50,000個の2al.6/CD89細胞に加え、4℃で15分間インキュベートした。最適下限の濃度のA77-FITC、A59-PEまたはMY43
25μlを加え、４℃で３０分間インキュベートし、100μlのFacsバッファで３回洗浄した。MY43で処理された細胞をウサギ（Fab2）抗Hu
IgG-FITCとともに4℃で30分間インキュベートし、Facsバッファ100μlで３回洗浄した。その後、細胞をFacsバッファ200μlに再懸濁した。蛍光をFacscalibur（ベクトンディキンソン社）で測定した。
【０２３３】
阻害ELISA
96穴ELISA（平）底プレートを100μl/ウエルの可溶性組換えCD89（1μl/ml）のPBS溶液でコートし、室温で一晩インキュベートした。そのELISAプレートを空けて、100
μl /ウエル PBS/0.05% Tween 1% ニワトリ血清 (PBST/Ch)とともに、室温で60分間インキュベートした。そのプレートを空けて、過剰の抗体（50μl/ウエル）とともに10分間インキュベートし、１０分間かけてPBST/Chに希釈した。50?μl/ウエルのaIgA2溶液を用量反応のPBST/Chに加え、室温で60分間インキュベートした。その後、そのプレートをPBS/0.05%
Tween（PBST）で３回洗浄し、4E8-ビオチン 100μl/ウエル（マウス抗IgA）とともに室温で60分間インキュベートした。そのプレートをPBSTで3回洗浄し、PBST/Ch
100?μl/ウエルに溶解したStrep-HRPとともに室温で60分間インキュベートし、PBSTで３回洗浄し、ABTSでELISAを展開した。波長405nmの光学密度をBio-tekリーダーで測定した。
【０２３４】
III. 免疫沈降研究
Mab 14.1 および7.4が、可溶性組換えCD89 (sCD89)を免疫沈降させることがわかった。
【０２３５】
簡単に説明すると、ProtGセファロースファーストフローカラムをPBSで３回洗浄した。sCD89をあらかじめ、PBSに入れた洗浄ビーズで２時間４℃で混入物を除去した。あらかじめ混入物を除去したCD89を抗体、マウスIgG、またはヒトIgGとともに４℃で２時間インキュベートした。そのCD89/IgG溶液をProt
Gで、４℃で１時間洗浄し、その後、PBSで５回洗浄した。そのサンプルをSDS-PAGEサンプルバッファに再懸濁し、SDS-PAGE勾配ゲルにかけて、そのゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。
【０２３６】
IV. 親和性研究
Mab 14.1 および7.4の親和性の動力学、つまり結合平衡会合定数（Ka）、および解離定数（Kd）を、後述のように測定した。
【０２３７】
Mab14.1のKaは約1.5 x109、およびKdは約6.8 x 10-10だった。
【０２３８】
MAb7.4のKaは約2.0 x108、およびKdは約5.1 x 10-9だった。
【０２３９】
親和性動力学の測定は、BIAcoreアッセイを用い、sCD89をチップに固定して様々な濃度のMabをそのチップ上にフローさせた。Mab捕捉アッセイも、MAb上にsCD89をフローさせて行った。抗原およびヒトIgGの固定は、アミンカップリングで行った。チップとバッファを含むキットはBIAcore社から購入した。フィッティングにはラングミュアモデルを用いた。データ解析は装置に付随するソフトウエア上で用いることができるモデルを用いて行った。
【０２４０】
例５ CD89に対するヒトモノクローナル抗体の活性
I. カルシウム流入研究
Mab14.1を以下の通りテストし、カルシウム流入を誘発することを明らかにした。Mab7.4ではカルシウム流入は誘発されなかった。
【０２４１】
無血清培地1.52mlに再懸濁させた3e6細胞を３回洗浄した後、38μlのSNARF-1および38μlのFLUO-3を加えた。その細胞を暗所において37℃でインキュベートし、無血清の温かい（37℃）培地5mlを加えて、さらに5分間37℃でインキュベートした。その細胞を、無血清培地で２回洗浄し、抗体抗FcaR1でコーティングして、再び洗浄した。Ca++動員バッファに入れた細胞を再懸濁させて、フローサイトメトリに24秒間かけて、基準レベルを確立した。次に、架橋抗体抗HuIgG-Fc細胞を加え、４分間モニターした。使用した細胞は、陰性対照を確立するために、抗FcaR1とともにインキュベートしなかった。
【０２４２】
II. ヒトC1q結合研究
Mab14.1および7.4の、ELISAにおけるおよびCD89発現細胞に結合した場合（FACS解析）におけるhC1qの固定能力を、以下のサブセクションに記載の通りELISAおよびFACSでテストした。
【０２４３】
Mab14.1は、ELISAの場合はhC1qを固定することができ、細胞に結合している場合には弱く固定することができた。Mab7.4はELISAではhC1qを固定できたが、細胞に結合している場合には固定できなかった。これらMabは細胞に結合するとhC1qを固定できず、その状況はin
vivoでも同様であるため、たとえば補体カスケードが開始する（その結果標的細胞溶解を引き起こす）のが望ましくない状況など、治療に用いるには特に有用である。
【０２４４】
ELISA解析
簡単に説明すると、96穴ELISA（平）底プレートを、100μl/ウエルのPBSに入れたヒトIgG（3?μg/ml）（hIgG1、hIgG2、hIgG3およびhIGg4を対照として用いた）でコーティングし、室温で一晩インキュベートしてから空にし、100μl/ウエルのリン酸塩/NaCl/ゼラチン/ツイーンバッファ
(C1q-ELISA 希釈剤)で室温で60分間インキュベートした。そのプレートを空にしてから、20μg/ml（100μl/ウエル）をC1a-ELISA希釈剤で希釈したものとともに室温で60分間インキュベートし、C1q-ELISA希釈剤で３回洗浄した。次に、C1q-ELISA希釈剤で希釈したウサギ抗hC1q
100μl/ウエルを入れたプレートを室温で60分間インキュベートしC1q-ELISA希釈剤で３回洗浄し、C1q-ELISA希釈剤で希釈したPO複合ブタ抗Rb
IgG-Fc 100μl/ウエルで室温で60分間インキュベートした。そのプレートをC1q-ELISA希釈剤で３回洗浄した。ELISAをABTSで展開し、波長405nmの光学密度をBio-tekリーダーで測定した。
【０２４５】
FACS解析
C1q-Facsバッファに入れた抗体希釈液25μlを、Facsバッファ＋NaCl（C1q-Facsバッファ） 50μlに入れた50,000個の2a1.6/cd89細胞に加え、4℃で15分間インキュベートし、そこにC1q-Facsバッファに入れたhC1q（20μg/ml）25μlを加えて、4℃で30分間インキュベートした。その細胞を100μl
のC1q-Facsバッファで３回洗浄し、ウサギ抗hC1q-Fitcで4℃で30分間インキュベートして、100μl のC1q-Facsバッファで３回洗浄した。その細胞をC1q-Facsバッファ200μlに再懸濁した。蛍光をFacscalibur（ベクトンディキンソン社）で測定した。
【０２４６】
等価物
当業者であれば、ごく普通の実験を用いるのみで、ここに説明した本願発明の特定の実施態様の等価物を数多く認識し、または確認できることであろう。このような等価物は、以下の請求の範囲の包含するところである。
【図１】
2010004888.tif 000003
【図２】
2010004888.tif 000004
【図３】
2010004888.tif 000005
【図４】
2010004888.tif 000006
【配列表】
2010004888000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月9日(2009.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域とＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体とＣＤ８９への結合を交差競合する、単離された抗ＣＤ８９モノクローナル抗体であって、
（ａ）  重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号：２のアミノ酸残基９９乃至１０８、配列番号：６のアミノ酸残基９９乃至１０８、およびその保存的アミノ酸置換基からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号：４のアミノ酸残基８９乃至９７、配列番号：８のアミノ酸残基９０乃至９９、およびその保存的アミノ酸置換基からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）  重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号：２のアミノ酸残基５０乃至６６、配列番号：６のアミノ酸残基５０乃至６６、およびその保存的アミノ酸置換基からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｄ）  軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号：４のアミノ酸残基５０乃至５６、配列番号：８のアミノ酸残基５１乃至５７、およびその保存的アミノ酸置換基からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｅ）  重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号：２のアミノ酸残基３０乃至３５、配列番号：６のアミノ酸残基３１乃至３５、およびその保存的アミノ酸置換基からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、および
（ｆ）  軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号：４のアミノ酸残基２４乃至３４、配列番号：８のアミノ酸残基２４乃至３５、およびその保存的アミノ酸置換基からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、
単離された抗ＣＤ８９抗体。