(57)【要約】【課題】低温度かつ高ｐＨの条件下にある油脂含有排水を、微生物を用いて、安定して効率よく分解処理すること。【解決手段】土壌、堆肥、食品工場の排水処理施設等から微生物を採取し、油脂含有排水を低温度かつ高ｐＨの条件下で分解することができる微生物を探索した結果、油脂分解能を有し、１０℃かつｐＨ１０で発育可能な新規の微生物バークホルデリア・マルチボランスを見出した。さらに、この１０℃かつｐＨ１０で発育可能な新規の微生物菌株と、強い油脂分解能を有する他の新規の微生物菌株とを組み合わせて用いることにより、温度及びｐＨが変化することがある排水中に含まれる油脂を、効率よく分解することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
油脂分解能を有し、１０℃かつｐＨ１０で発育可能な微生物。
【請求項２】
バークホルデリア（Burkholderia）属に属するバクテリアであることを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）に属するバクテリアであることを特徴とする請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
油脂分解能を有するバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２）。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の油脂分解能を有する微生物を１種又は２種以上含有することを特徴とする油脂分解処理組成物。
【請求項６】
さらに、油脂分解能を有するバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８３）を含有することを特徴とする請求項５記載の油脂分解処理組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の油脂分解能を有する微生物を１種又は２種以上を用いることを特徴とする油脂含有排水の処理方法。
【請求項８】
バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２）とバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８３）とを組み合わせて用いることを特徴とする請求項７記載の油脂含有排水の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油脂分解能を有し、低温かつ高ｐＨ下で発育することができる油脂分解能を有する微生物、及び該微生物を用いた油脂含有排水の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品加工工場や厨房等の調理施設から排出される排水には、動物性又は植物性の油脂が含まれることが多い。これら排水中の油脂は、水環境保護のため適切な処理が要請されている。例えば、一日当たり平均排出水量が５０ｍ３以上の工場又は事業場排水については、ノルマルヘキサン抽出物質含有量として３０ｍｇ／Ｌを限度とする一律排水基準が定められている。多くの場合、このような油脂含有排水は、凝集剤が適宜添加され、加圧浮上槽やグリーストラップ等の特別な処理槽において油分が分離除去されている。
【０００３】
しかしながら、これらの物理化学的な方法では、油脂含有排水から分離された油脂を、槽から回収し、廃棄物として処理する必要が生じる。また、分離が不十分で槽内に油脂が蓄積し、配管が閉塞したり、難分解性の油脂固形物等が処理施設の後段へ流出するという問題がある。さらに、蓄積した油脂の腐敗により悪臭や虫が発生し不衛生が生じるという問題もある。そこで、これらの問題を解決するために、環境負荷が低く、ランニングコストに優れた油脂含有排水処理方法として、微生物による油脂分解処理が利用されている。
【０００４】
従来、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属し、非運動性グラム陰性でカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性を示す球状桿菌であって、油脂分解性を有する微生物（特許文献１参照）、油分解性能を有するアシネトバクター遺伝種（Acinetobacter genospecies）１０単菌で構成されるバイオ製剤（特許文献２参照）、酵母による含油脂排水処理において、酵母単独又は酵母どうしが生育する至適生育環境にするために酸性化剤又は塩基性化剤や塩素剤の薬剤を排水中に添加した場合でも、ｐＨの変動に強く、動植物油脂を高率に資化するヤロウィア（Yarrowia）属に属する酵母（特許文献３参照）、油脂、タンパク質、デンプンなどの分解能力に長け、単独でも、優れた排水浄化能力を発揮することができるバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）（特許文献４参照）等の多種の油脂分解微生物が知られている。また、高濃度油脂含有廃水を効率よく分解する糸状菌フサリウム・スピーシーズ（Fusarium sp.）ＳＮ４０株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２３７）や、該微生物を油脂含有廃水に接触させる廃水処理方法や、さらに油脂分解能を有するバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）ＤＷ２−１株を併用する廃水処理方法（特許文献５参照）、油脂濃度が２％以上である高濃度の油脂を含む排水、あるいは油脂そのものを処理できる、バークホルデリア属に属し、５０℃の高温で好気的に油脂を資化し得る微生物を用いた油脂の資化方法（特許文献６参照）、油脂分解能力が高く、曝気槽へ直接投入することにより工程や操作を簡略化し、現状の廃水処理施設のままでの油脂含有廃水の処理に適した、シュードモナス・セパシア  ＬＭ２−１（Pseudomonas cepaciaＬＭ２−１）株を処理槽に添加する油脂含有廃水の処理方法（特許文献７参照）、油脂濃度の高い油脂含有排水に対して、常温で高い油脂分解効率を示す微生物バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＴＰＩ２１菌株（特許文献８参照）が知られている。
【０００５】
さらに、実際の排水処理施設では、一般的な微生物の生育温度や油脂分解温度と比較して排水温度が低い場合があることから、低温度の油脂含有廃水の処理を可能とする微生物に関する技術がある。１０〜２２℃の低温域において油脂分解能を有するシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物や該微生物を油脂含有排水に添加する排水の処理方法（特許文献９参照）や、分解槽内の温度変化に影響されること無く、広い温度域にわたって液状及び固形状の油脂、その他の有機物を好気的に分解することができるバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）や該微生物を排水に接触させる排水の処理方法（特許文献１０参照）が知られている。また、廃水を実際に処理する場合の温度条件である１０〜２０℃程度の低温度域を含む、温度４〜４０℃で生育することができるシュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）株であって、油脂分解能力、及び脱窒能力を有する高機能脱窒油脂分解菌（特許文献１１参照）や、窒素あるいはリン等の添加を要することなく、３０℃以下の低い温度でも高い油脂分解率を得ることができるロドトルラ・パシフィカ（Rhodotorula pacifica）と、クリプトコッカス・ローレンティ（Cryptococcus laurentii）とを含む混合微生物（特許文献１２参照）や、広範囲な動植物性油脂・油に対して十分な分解能を有するだけでなく、特にラードに対しても有効な分解能を有し、かつ、冬季・寒冷地の低温条件下でもその活性を有する油脂分解性のシュードモナス（Pseudomonas）属微生物（特許文献１３参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−０２４０５１号公報
【特許文献２】特開２００３−２５１３９６号公報
【特許文献３】特開２００６−０４２７７４号公報
【特許文献４】特開２００８−１８２９０６号公報
【特許文献５】特開２００８−２２０２０１号公報
【特許文献６】特開平９−８５２８３号公報
【特許文献７】特開平１１−４７７８９号公報
【特許文献８】特開２００４−２４２５５３号公報
【特許文献９】特開２０００−２７０８４５号公報
【特許文献１０】特開２００２−１２５６５９号公報
【特許文献１１】特開２００５−１１７９７３号公報
【特許文献１２】特開２００８−１４２０４２号公報
【特許文献１３】特開２００８−２２０２２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
食品加工場や厨房から排出される油脂含有排水は、一般的な微生物の生育温度より低温度であるだけでなく、排水の起源の違いや洗剤等の薬品の流入によりｐＨも大きく変化することがある。従来知られている微生物では、高ｐＨ条件下に含まれている油脂を分解処理することは困難であり、また、ｐＨが変化した場合に油脂分解処理効率が低下するため安定した処理を行えないという問題があった。そのため、油脂含有排水の分解処理効率を改善するために、微生物の投入量や投入回数を増やしたり、排水の状態を制御する等の措置が必要であり、微生物による油脂含有排水の処理を安定して効率よく行うためには、使用する微生物のｐＨに対する生育及び分解特性についても考慮する必要がある。本発明の課題は、低温度かつ高ｐＨの条件下にある油脂含有排水を、微生物を用いて、安定して効率よく分解処理することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記の課題を解決するため、土壌、堆肥、食品工場の排水処理施設等から微生物を採取し、油脂含有排水を低温度かつ高ｐＨの条件下で分解することができる微生物の探索を重ねた。その結果、油脂分解能を有し、１０℃かつｐＨ１０で発育可能な新規の微生物を見出した。さらに、この１０℃かつｐＨ１０で発育可能な新規の微生物菌株と、強い油脂分解能を有する他の新規の微生物菌株とを組み合わせて用いることにより、温度及びｐＨが変化することがある排水中に含まれる油脂を、効率よく分解できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、（１）油脂分解能を有し、１０℃かつｐＨ１０で発育可能な微生物や、（２）バークホルデリア（Burkholderia）属に属するバクテリアであることを特徴とする上記（１）に記載の微生物や、（３）バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）に属するバクテリアであることを特徴とする上記（２）に記載の微生物や、（４）油脂分解能を有するバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２）に関する。
【００１０】
また、（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の油脂分解能を有する微生物を１種又は２種以上含有することを特徴とする油脂分解処理組成物や、（６）さらに、油脂分解能を有するバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８３）を含有することを特徴とする上記（５）記載の油脂分解処理組成物や、（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の油脂分解能を有する微生物を１種又は２種以上を用いることを特徴とする油脂含有排水の処理方法や、（８）バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２）とバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８３）とを組み合わせて用いることを特徴とする上記（７）記載の油脂含有排水の処理方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の微生物は、低温度かつ高ｐＨの条件下において発育するため、該条件下において、従来の微生物と比較して、長時間かつ高い効率の油脂分解を行うことができる。特に、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２）及びバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１７８３）は、植物油やラード等の各種油脂に対し高い分解能力を有し、前記バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２）は、１０℃かつｐＨ１０の条件下で発育し、該条件下で長時間かつ高い効率の油脂分解を行うことができる。また、該菌株は、発育可能温度及びｐＨの範囲が広いため、分解しようとする油脂や油脂を含む液体等の温度及びｐＨが変動しても、分解活性が低下することなく、安定して効率よく油脂分解を行うことができる。
【００１２】
本発明の油脂含有排水の処理方法よると、低温度かつ高ｐＨの油脂含有排水を、安定して効率よく分解処理することができる。特に、新規菌株バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２）と新規菌株バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８３）とを組み合わせて用いる油脂の分解処理方法によると、植物油やラード等の多種類を含み、温度又はｐＨが変動する油脂含有排水を、安定して効率よく分解処理することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】モデル排水中の油脂の分解試験の結果を示す図である。
【図２】排水処理実験装置による油脂分解試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の微生物としては、油脂分解能を有し、１０℃かつｐＨ１０で発育可能な微生物であれば特に制限されず、本発明において、油脂分解能とは、油脂を資化する能力を意味し、ここで油脂としては、固体（脂、脂肪）及び液体（油、脂肪油）のいずれであってもよく、例えば、豚脂、牛脂、牛酪、魚油、鯨油等の動物性油脂、コーン油、ごま油、菜種油、大豆油、米油、綿実油、落花生油、べに花油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油等の植物性油脂（植物油）、鉱油、合成油等を挙げることができる。
【００１５】
本発明の微生物の油脂分解能は、例えば、既知量の油脂を添加した培地に微生物を接種し、所望の条件下で培養した後、油脂をノルマルへキサン等の有機溶媒で抽出して培地中の残存油脂量を測定し、油脂の添加量に対する残存量の割合を算出して評価することができる他、定法に従い、油脂を１％（ｗ／ｗ）含む寒天培地上に微生物を接種し、所定の温度及びｐＨ下で４８時間培養して、形成されるクリアゾーンの直径を測定することにより評価することができる。例えば、該クリアゾーンの直径が１０ｍｍ以上である場合、微生物が油脂分解能を有すると判断される。
【００１６】
本発明において発育可能とは、所定の培養条件において微生物が生育ないし増殖が認められることをいう。例えば、トリプトソイブイヨン等の増菌培地に、吸光光度計（波長６６０ｎｍ）の吸光値が０．０５未満となる濃度の微生物を接種し、４８時間培養後の吸光値が０．３以上となる場合は、該微生物が良好な発育を示すと判断される。本発明の発育可能な微生物とは、油脂を唯一の炭素源として発育可能なものに制限されるものではなく、油脂以外の炭素源を資化して生育ないし増殖を示すものであってもよい。
【００１７】
本発明の油脂分解能を有し、１０℃かつｐＨ１０で発育可能な微生物は、好ましくはバークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌であり、より好ましくは、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）であり、さらに好ましくは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託（寄託日  平成２１年３月１２日）されているバークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｂ株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２）である。バークホルデリア・マルチボランスの菌学的性質としては、グラム染色：−、細胞の形状：桿菌・ＳＲ伸長、運動性：−、好気条件での発育：＋、嫌気条件での発育：−、カタラーゼ：＋、オキシダーゼ：−、ブドウ糖分解性：−を例示することができる。
【００１８】
本発明の微生物は、温度が１０℃、かつｐＨが１０の条件下で増殖することができるものであればよく、発育可能なｐＨ条件の範囲としては、好ましくは７〜１０の高ｐＨ、より好ましくは４〜１０、さらに好ましくは３〜１１である。また、発育可能な温度条件の範囲としては、好ましくは１０〜２０℃の低温度、より好ましくは１０〜３０℃、さらに好ましくは１０〜４０℃、さらに好ましくは５〜５５℃である。
【００１９】
本発明の油脂分解処理組成物としては、上記本発明の微生物を含む組成物であれば特に制限されないが、本発明の微生物に加えて、油脂分解能を有する微生物、例えばバークホルデリア属に属する油脂分解能を有する微生物、特にバークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８３）の他、バチルス属細菌（Bacillus sp.）、シュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）、マイクロコッカス属細菌（Micrococcus sp.）等の廃水処理に常用される公知の微生物を含有することもできる。本発明の油脂分解処理組成物に含まれる本発明の微生物等の形態としては、適当な担体に固定化されていてもよく、培地ないしバッファーに添加された菌懸濁液の形態でもよい。また、本発明の微生物等が含まれる培養液ないしバッファーを、適宜濃縮・凍結乾燥等して得られる形態でもよく、さらに、担体に加えてｐＨ調整剤、分散剤等の添加物が配合された粉末又は液体の微生物製剤の形態の組成物であってもよい。
【００２０】
本発明の油脂含有排水の処理方法としては、本発明の微生物と油脂含有排水（廃水）を接触させ、油脂を分解処理する工程を含む方法である限り特に制限されず、回分式であっても連続式であってもよい。上記油脂含有排水（廃水）としては、例えば、油脂が含まれる工場・事業場からの排水や廃水、一般家庭排水、下水等を例示することができる。特に、本発明の処理方法は、油脂が高い濃度で含まれることが想定される食品加工場、食肉工場、厨房等から排出される油脂含有排水（廃水）の処理に好適に用いられる。本発明の微生物と油脂含有排水（廃水）を接触させる工程には、例えば、微生物を含有する活性汚泥として接触させる場合や、加圧浮上槽やグリーストラップ等の処理槽へ微生物を投与して接触させる場合等が含まれる。本発明の油脂の分解処理方法において、微生物は、適当な担体に固定化されていてもよく、培養液として投与されてもよく、凍結乾燥等の処理を経た菌体として直接投与されてもよい。また、凝集剤やｐＨ調整剤等が併用されてもよく、曝気処理、温度やｐＨの制御が行われてもよい。本発明の微生物は、分解しようとする油脂や油脂を含む液体等の温度及びｐＨが変動しても、分解活性が低下することなく、安定した油脂分解活性を示すことから、環境や排水の起源の変化に伴い温度及びｐＨが変動する排水に含まれる油脂を長期的に連続分解するのに好適である。
【００２１】
また、油脂の分解処理方法において、本発明の微生物は単独で用いてもよいが、本発明の微生物と油脂分解能を有する微生物、例えばバークホルデリア属に属する油脂分解能を有する微生物、特にバークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８３）を併用することもできる。これらの微生物は、処理される油脂の存在下で共生できることが好ましく、本発明の微生物の油脂分解活性を阻害しないことが好ましい。また、油脂分解能を有する微生物以外の他の微生物を用いることもできる。かかる微生物としては、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌、マイクロコッカス属細菌、バークホルデリア属細菌（Burkholderia sp.）等の廃水処理に常用される公知の微生物が例示されるが、細菌に制限されず黴、酵母等であってもよい。特に、本発明のバークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２）と、バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８３）とを組み合わせて用いる分解処理は、油脂の種類が多岐で、温度及びｐＨが変動する場合でも、高い効率で安定して油脂を分解できる点で好ましい。また、上記バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株に代えて、例えば、バークホルデリア・マルチボランスに属し、３０℃においてｐＨ４〜１０で発育する菌株、ｐＨ７において１０〜５０℃で発育する菌株、ｐＨ１０において１０〜５０℃で発育する菌株等も有効に用いることもできる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００２３】
［菌株のスクリーニング］
本発明の油脂分解能を有し、低温かつ高ｐＨ下で発育することができる微生物を得るため、以下の（１）菌株の分離、（２）寒天培地での各油脂の分解能評価、（３）発育特性試験、（４）モデル排水中の油脂分解試験、により段階的にスクリーニングを行った。
【００２４】
（１）菌株の分離
菌株の分離は、ａ）直接分離法、及びｂ）集積培養法の２種類の手法により行った。
ａ）直接分離法
日本各地の土壌、及び食品残渣から作製された堆肥等４９箇所から採取した試料を滅菌蒸留水に懸濁し、１０倍に希釈した後、標準寒天培地（肉エキス５．０ｇ／Ｌ、ペプトン１０．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、カンテン１５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０：日水製薬株式会社製）に塗抹して、３０℃で４８時間培養した。培養後、出現したコロニーの中から８７９株を分離した。
ｂ）集積培養法
食品工場の浄化槽に設置された加圧浮上槽、及び食堂等に設置されたグリーストラップ内等１２箇所の排水から採取した試料を滅菌蒸留水に懸濁し、１０倍に希釈した後、植物油（サラダ油：昭和産業株式会社製）を２．５％（ｗ／ｗ）及びラードを２．５％（ｗ／ｗ）添加したトリプトソイブイヨン培地（ペプトン１５．０ｇ／Ｌ、ダイズペプトン５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、カンテン１５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２：日水製薬株式会社製）により１０℃で２４時間培養した。発育した菌株を繰り返し前記の培地で培養して、活発に発育が認められた２２８株を分離した。
【００２５】
（２）寒天培地での各油脂の分解能評価
標準寒天培地（肉エキス５．０ｇ／Ｌ、ペプトン１０．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、カンテン１５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０：日水製薬株式会社製）に油脂として、トリブチリン、植物油（サラダ油：昭和産業株式会社製）、又はラードをそれぞれ１％（ｗ／ｗ）添加した分解能評価用の培地を作製し、各培地表面に直径５ｍｍのウェルを無菌的にあけ、該ウェルに吸光値０．２（波長６６０ｎｍ）に調整した上記の分離菌株の懸濁液３０μＬをそれぞれ注入して、３２℃で４８時間培養した。培養後、油脂が分解されることにより形成されるクリアゾーンの大きさを指標として油脂分解能を評価した。クリアゾーンを形成しなかったものを「−」、クリアゾーンを形成したものは、直径１０ｍｍ未満を「＋」、直径１０ｍｍ以上２０ｍｍ未満を「＋＋」、直径２５ｍｍ以上を「＋＋＋」の4段階で評価し、その結果を表１に示した。
【００２６】
【表１】
2010214310.tif 000002
【００２７】
上記のａ）直接分離法で得られた８７９株、及びｂ）集積培養法で得られた２２８株のうち、トリブチリン、植物油、及びラードの２種以上について油脂の分解能評価が「＋＋＋」であった計２０菌株を選択し、以下の発育特性試験に供した。
【００２８】
（３）発育特性試験
ｐＨをそれぞれ４、５、７、９、１０に調整したトリプトソイブイヨン（カゼイン製ペプトン１７．０ｇ／Ｌ、ダイズ製ペプトン３．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．５ｇ／Ｌ  ブドウ糖２．５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．３：日水製薬株式会社製）１０ｍＬに、吸光値０．２（波長６６０ｎｍ）に調整した分離菌２０株の各菌懸濁液１００μＬを添加し、３０℃で４８時間培養してｐＨに対する発育特性を評価した。同様にしてｐＨを７．０に調整したトリプトソイブイヨン（日水製薬株式会社製）１０ｍＬに、分離菌２０株の菌懸濁液１００μＬを添加し、温度１０、２０、３０、４０、５０℃でそれぞれ４８時間培養して温度に対する発育特性を評価した。発育特性の評価は、上記の各培養後の菌株の発育程度を波長６６０ｎｍにおける吸光度を指標として評価した。吸光値０．０を発育なし「−」、０．０〜０．３未満を発育「＋」、０．３以上を発育「＋＋」の３段階で評価し、その結果を表２に示した。また、上記（２）の油脂の分解能の評価結果について、「＋」を１点としてトリブチリン、植物油、ラードの分解程度を計算し、菌株毎の油脂分解能を点数で示した。
【００２９】
【表２】
2010214310.tif 000003
【００３０】
表２に示される３種類の油脂の分解能の点数の合計が、９点以上の５菌株、及び８点以上でかつ１０℃及びｐＨ１０で発育が認められた３菌株の計８菌株を選択し、以下の油脂分解試験に供した。
【００３１】
（４）モデル排水中の油脂の分解試験
トリプトソイブイヨン（日水製薬株式会社製）に植物油を０．１％（ｗ／ｗ）添加し、乳化した溶液をモデル排水とし、このモデル排水４００ｍＬに吸光値０．２（波長６６０ｎｍ）に調整した分離菌８株の各菌懸濁液４００μＬを添加し、２５℃で４８時間振とう培養した。培養後のモデル排水に残存する油脂含量として、ノルマルヘキサン抽出物量を定法（昭和４９年環境庁告示第６４号付表４）に従い測定し、その結果を図１に示した。５３０ｍｇ／Ｌの初期油脂濃度は、培養後、４００ｍｇ／Ｌ（No.621）、３６０ｍｇ／Ｌ（No.714）、４１０ｍｇ／Ｌ（No.732）、３８０ｍｇ／Ｌ（No.807）、２１０ｍｇ／Ｌ（No.815）、１８０ｍｇ／Ｌ（No.S73）、５１０ｍｇ／Ｌ（No.S74）、４３０ｍｇ／Ｌ（No.S171）に減少した。モデル排水中のノルマルヘキサン抽出物量を著しく低減させた菌株を油脂分解能が高い菌株とし、Ｎｏ．８１５株及びＮｏ．Ｓ７３株を選択した。これらの菌株は各種油脂の分解能力が高く、排水に含まれる油脂の分解能力にも優れていた。Ｎｏ．Ｓ７３株に関しては、上記特徴に加え、１０℃及びｐＨ１０の環境下でも発育する菌株であった。
【００３２】
［菌株の同定（形態学的性質及び生理学的性質）］
油脂分解能が高いＮｏ．８１５株及びＮｏ．Ｓ７３株について、形態学的性質及び生理学的性質を解析し、その結果を表３に示した。
【００３３】
【表３】
2010214310.tif 000004
【００３４】
［菌株の同定（遺伝学的性質）］
また、Ｎｏ．Ｓ７３株及びＮｏ．８１５株からゲノムＤＮＡを抽出し、常法に従い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく遺伝学的解析を行った。決定された油脂分解微生物Ｎｏ．Ｓ７３株の１６ＳｒＲＮＡをコードする塩基配列と、Ｎｏ．８１５株の１６ＳｒＲＮＡをコードする塩基配列は同一で、これらを配列表の配列番号１に示す。相同性検索の結果、これらの配列は、バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）の配列と９９．８％という最も高い相同性を示したことから、単離された微生物は、バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）に近い菌種であると同定された。
【００３５】
上記の菌種の同定結果から、単離したＮｏ．Ｓ７３株は、バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｂ株、Ｎｏ．８１５株は、バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｈ株と命名した。バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｂ株は、平成２１年３月１２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８２として寄託し、バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｈ株は、同じく平成２１年３月１２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７８３として寄託した。 
【００３６】
[排水処理実験装置による油脂分解試験]
７００Ｌ容の排水処理実験装置を用い、より実際の排水処理に近い系で上記２菌株による油脂含有排水処理の実証試験を実施した。排水処理実験装置内であらかじめバークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｂ株及びバークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｈ株の２菌株を十分に増殖させ、そこに排水のＢＯＤが約２０００ｍｇ／Ｌ、ノルマルヘキサン抽出物量が約２００ｍｇ／Ｌになるように表４で示した有機物および無機塩類を添加し、４８時間処理を行った。処理開始後、０、６、２４、４８時間目に採水を行い、排水中の油脂含量としてノルマルヘキサン抽出物量を定法（昭和４９年環境庁告示第６４号付表４）に従い測定し、その結果を図２に示した。処理開始直後に１８０ｍｇ／Ｌであったノルマルヘキサン抽出物量は、６時間後に１２０ｍｇ／Ｌ、２４時間後に７１ｍｇ／Ｌ、４８時間後には１７ｍｇ／Ｌに低下し、実際の排水処理に近い系でも排水中の油脂含量を効果的に低下させることが確認できた。
【００３７】
【表４】
2010214310.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の微生物、及び該微生物を用いた油脂の分解処理方法は、工場や事業場等の排水に含まれる油脂の分解処理に用いることができる。
【図１】
2010214310.tif 000006
【図２】
2010214310.tif 000007
【配列表】
2010214310000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月24日(2009.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
油脂分解能を有し、１０℃かつｐＨ１０で発育可能な微生物。
【請求項２】
バークホルデリア（Burkholderia）属に属するバクテリアであることを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）に属するバクテリアであることを特徴とする請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
油脂分解能を有するバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２）。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の油脂分解能を有する微生物を１種又は２種以上含有することを特徴とする油脂分解処理組成物。
【請求項６】
さらに、油脂分解能を有するバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３）を含有することを特徴とする請求項５記載の油脂分解処理組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の油脂分解能を有する微生物を１種又は２種以上を用いることを特徴とする油脂含有排水の処理方法。
【請求項８】
バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２）とバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３）とを組み合わせて用いることを特徴とする請求項７記載の油脂含有排水の処理方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
すなわち、本発明は、（１）油脂分解能を有し、１０℃かつｐＨ１０で発育可能な微生物や、（２）バークホルデリア（Burkholderia）属に属するバクテリアであることを特徴とする上記（１）に記載の微生物や、（３）バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）に属するバクテリアであることを特徴とする上記（２）に記載の微生物や、（４）油脂分解能を有するバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２）に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
また、（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の油脂分解能を有する微生物を１種又は２種以上含有することを特徴とする油脂分解処理組成物や、（６）さらに、油脂分解能を有するバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３）を含有することを特徴とする上記（５）記載の油脂分解処理組成物や、（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の油脂分解能を有する微生物を１種又は２種以上を用いることを特徴とする油脂含有排水の処理方法や、（８）バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２）とバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３）とを組み合わせて用いることを特徴とする上記（７）記載の油脂含有排水の処理方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の微生物は、低温度かつ高ｐＨの条件下において発育するため、該条件下において、従来の微生物と比較して、長時間かつ高い効率の油脂分解を行うことができる。特に、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２）及びバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３）は、植物油やラード等の各種油脂に対し高い分解能力を有し、前記バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２）は、１０℃かつｐＨ１０の条件下で発育し、該条件下で長時間かつ高い効率の油脂分解を行うことができる。また、該菌株は、発育可能温度及びｐＨの範囲が広いため、分解しようとする油脂や油脂を含む液体等の温度及びｐＨが変動しても、分解活性が低下することなく、安定して効率よく油脂分解を行うことができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の油脂含有排水の処理方法よると、低温度かつ高ｐＨの油脂含有排水を、安定して効率よく分解処理することができる。特に、新規菌株バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２）と新規菌株バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３）とを組み合わせて用いる油脂の分解処理方法によると、植物油やラード等の多種類を含み、温度又はｐＨが変動する油脂含有排水を、安定して効率よく分解処理することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の油脂分解能を有し、１０℃かつｐＨ１０で発育可能な微生物は、好ましくはバークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌であり、より好ましくは、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）であり、さらに好ましくは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託（寄託日  平成２１年３月１２日）されているバークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｂ株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２）である。バークホルデリア・マルチボランスの菌学的性質としては、グラム染色：−、細胞の形状：桿菌・ＳＲ伸長、運動性：−、好気条件での発育：＋、嫌気条件での発育：−、カタラーゼ：＋、オキシダーゼ：−、ブドウ糖分解性：−を例示することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の油脂分解処理組成物としては、上記本発明の微生物を含む組成物であれば特に制限されないが、本発明の微生物に加えて、油脂分解能を有する微生物、例えばバークホルデリア属に属する油脂分解能を有する微生物、特にバークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３）の他、バチルス属細菌（Bacillus sp.）、シュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）、マイクロコッカス属細菌（Micrococcus sp.）等の廃水処理に常用される公知の微生物を含有することもできる。本発明の油脂分解処理組成物に含まれる本発明の微生物等の形態としては、適当な担体に固定化されていてもよく、培地ないしバッファーに添加された菌懸濁液の形態でもよい。また、本発明の微生物等が含まれる培養液ないしバッファーを、適宜濃縮・凍結乾燥等して得られる形態でもよく、さらに、担体に加えてｐＨ調整剤、分散剤等の添加物が配合された粉末又は液体の微生物製剤の形態の組成物であってもよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
また、油脂の分解処理方法において、本発明の微生物は単独で用いてもよいが、本発明の微生物と油脂分解能を有する微生物、例えばバークホルデリア属に属する油脂分解能を有する微生物、特にバークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３）を併用することもできる。これらの微生物は、処理される油脂の存在下で共生できることが好ましく、本発明の微生物の油脂分解活性を阻害しないことが好ましい。また、油脂分解能を有する微生物以外の他の微生物を用いることもできる。かかる微生物としては、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌、マイクロコッカス属細菌、バークホルデリア属細菌（Burkholderia sp.）等の廃水処理に常用される公知の微生物が例示されるが、細菌に制限されず黴、酵母等であってもよい。特に、本発明のバークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｂ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２）と、バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３）とを組み合わせて用いる分解処理は、油脂の種類が多岐で、温度及びｐＨが変動する場合でも、高い効率で安定して油脂を分解できる点で好ましい。また、上記バークホルデリア・マルチボランスＳＢ−Ｈ株に代えて、例えば、バークホルデリア・マルチボランスに属し、３０℃においてｐＨ４〜１０で発育する菌株、ｐＨ７において１０〜５０℃で発育する菌株、ｐＨ１０において１０〜５０℃で発育する菌株等も有効に用いることもできる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
上記の菌種の同定結果から、単離したＮｏ．Ｓ７３株は、バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｂ株、Ｎｏ．８１５株は、バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｈ株と命名した。バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｂ株は、平成２１年３月１２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８２として寄託し、バークホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）ＳＢ−Ｈ株は、同じく平成２１年３月１２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７８３として寄託した。