(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚の加齢徴候の現れを防ぐ、若しくは遅らせるための、又はその影響を弱めるための美容組成物の提供。【解決手段】皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化、又は刺激する美容上許容される少なくとも１種の活性剤の有効量を含む美容組成物。該活性剤としては、シトラス属、若しくはシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する植物、モリンダ属に属する植物、又はハイビスカス属に属する植物を含む群から選択される少なくとも１種の植物から得られる抽出物であることが好ましい。該活性剤としては、特に、シトラス属とフォーチュネラ属の交雑により得られるシトロフォーチュネラ属に属する少なくとも１種の雑種であるカラモンディン（シトロフォーチュネラ・ミクロカルパ）の果実の抽出物であることが好ましい。【選択図】図１
2010241803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はその影響を弱めるための美容組成物であって、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化若しくは刺激する美容上許容される少なくとも１種の活性剤を有効量含む組成物。
【請求項２】
損傷を受けた皮膚、特に紫外線により損傷を受けた皮膚をケアするための美容組成物であって、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化若しくは刺激する美容上許容される活性剤を有効量含む組成物。
【請求項３】
前記活性剤が、美容上許容される少なくとも１種の賦形剤もまた含む美容組成物に組み入れられることを特徴とする、請求項１又は２に記載の美容組成物。
【請求項４】
活性剤が、シトラス属、若しくはシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する植物、モリンダ属に属する植物、又はハイビスカス属に属する植物を含む群から選択される少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項５】
活性剤が、シトラス属とフォーチュネラ属の交雑により得られる、×シトロフォーチュネラ属に属する少なくとも１種の雑種、特にカラモンディン（×シトロフォーチュネラ  ミクロカルパ）から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項６】
活性剤がカラモンディンの果実の抽出物であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項７】
前記活性剤が、植物種のモリンダ  シトリフォリアに属する少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項８】
活性剤がモリンダ  シトリフォリアの果実の抽出物であることを特徴とする、請求項１〜４及び７のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項９】
前記活性剤が、植物種のハイビスカス  サブダリファに属する少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項１０】
活性剤がハイビスカス  サブダリファの花の抽出物であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項１１】
活性剤の濃度が、組成物の０．００１質量％と５質量％の間、好ましくは１質量％から３質量％であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項１２】
アコニターゼの活性の発現を活性化若しくは刺激する活性剤が、ホスホジエステラーゼを阻害する分子若しくは抽出物、好ましくはカフェインと関連する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項１３】
本発明による美容組成物が、セラム、ローション、エマルジョン、例えばクリーム、又は、代わりに、ヒドロゲル、好ましくは美顔用パックの形態に配合される、或いはスティック若しくはパッチの形態であり得ることを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の美容組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアアコニターゼを刺激することによる、抗加齢美容ケア方法に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、特に植物由来の、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する分子又は抽出物、美容組成物における活性剤としてのそれらの使用、及び該組成物を用いる美容ケア方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
加齢は多因子現象である。いくつかの理論が加齢に関して存在し、それらの中には、フリーラジカルの化学的特質及び遍在に基づくフリーラジカル理論がある（Ｈａｒｍａｎ  Ｄ．、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．、１９５６年；１１、２９８〜３００頁）。
【０００４】
これらのフリーラジカル（活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）としても知られている）は、外因起源のものであるか、又は、様々な細胞過程を通じて、特にミトコンドリア呼吸の間に、生成され得る（Ｃａｄｅｎａｓ  Ｅ．等、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２０００年；２９、２２２〜２３０頁）。
【０００５】
呼吸の間に、呼吸鎖によって消費される全酸素の、少ないがかなりの量が、超酸化物ラジカルであるＯ２２−に変換され、これは、他の一層活性な酸素種、例えば、過酸化水素Ｈ２Ｏ２、並びにヒドロキシル及びペルオキシナイトライトラジカルの生成を招き得る（上で引用された、Ｃａｄｅｎａｓ等を参照）。
【０００６】
酸化ストレス条件下に、これらの活性種の生成は、タンパク質、ＤＮＡ及び脂質に酸素障害を、またミトコンドリアタンパク質の発現における変化を生じ、皮膚の加齢の進行に寄与する（Ｂｕｌｔｅａｕ等、Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ、２００６年、４１；６５３〜６５７頁）。
【０００７】
加齢の間に、細胞高分子の維持のためのシステムの有効性の低下、及び、ミトコンドリアにおけるＲＯＳの生成の一定の増加が認められる（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ等、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ、２００６年；４０、１２３９〜１２４３頁）。
【０００８】
ところで、ミトコンドリアは、呼吸鎖によって確立されるプロトン勾配の生成、及びクレブス回路によるＡＴＰの生成を含めて、多くの細胞機能において重要な役割を演じている（Ｌｉｕ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、２００２年；８０、７８０〜７８７頁）。
【０００９】
酸素障害の蓄積及び構造異常は、ミトコンドリアに、細胞の機能及び保全（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に必要なＡＴＰを産出するその能力の漸進的な低下を引き起こす（Ｆｒｅｎｚｅｌ等、１９８４年）。
【００１０】
アコニターゼは、クレブス回路の必須のミトコンドリア酵素であり、クエン酸をイソクエン酸に変換する。それはまた、ミトコンドリアＤＮＡの保存にも役割を果たす。このように、アコニターゼによって、このＤＮＡの安定性及び遺伝は、細胞の代謝状態に密接に結び付けられる（Ｃｈｅｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００７年；１０４、１３７３８〜１３７４３頁）。
【００１１】
アコニターゼの活性は、その鉄−硫黄中心［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋の保全に依存する（Ｂｅｉｎｅｒ等、Ｆａｓｅｂ  Ｊ、１９９３年；７、１４４２〜１４４９頁）。酸化剤による、その鉄−硫黄中心［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋の攻撃は、アコニターゼを不活性化する鉄−硫黄中心［３Ｆｅ−４Ｓ］＋の生成を引き起こす。
【００１２】
ミトコンドリアアコニターゼの活性の低下は、酸素障害及び細胞加齢の細胞内指標である。多くの変性障害もまた、酸化促進剤（ｐｒｏ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）のレベルの増加、及びミトコンドリアにおけるアコニターゼの活性の低下に関連している（Ｂｕｌｔｅａｕ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、４２、１４８４６〜１４８５５頁）。アコニターゼの不活性化は、特に、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の比の変化を引き起こす。具体的には、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨの産生は、アコニターゼの活性の低下のせいで、クレブス回路において低下するであろう（上で引用されたＨｕｍｐｈｒｉｅｓ等を参照；Ｎｕｌｔｏｎ−Ｐｅｒｓｓｏｎ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００１年、２７６、２３３５７〜２３３６１頁）。これらのＮＡＤ＋蓄積条件下に、ＲＯＳの増加が、還元された代謝物の自動酸化のために、観察される。このような不活性化はまた、損傷を受けたタンパク質の蓄積に寄与する、酸化反応のカスケードも開始させ得る（上で引用されたＨｕｍｐｈｒｉｅｓ等、２００６年を参照）。このように、加齢の間、このような細胞損傷の蓄積を防ぎ、またこれらのＲＯＳによって損傷を受けたアコニターゼの修復及び再活性化の過程を促進するためには、皮膚細胞におけるミトコンドリアアコニターゼの十分な度合いの活性を保つことが不可欠である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の発明者等は、７０歳のドナーから得た、培養ヒト皮膚線維芽細胞では、２０歳のドナーから得たものに比べて、ミトコンドリアアコニターゼの活性が約８５％だけ低化しており、年齢によるタンパク質の発現には如何なる変化もないことを実証していた。この発見から出発して、本発明者等は、ミトコンドリアアコニターゼを全て保護すること、及び、これらの老齢の培養線維芽細胞のミトコンドリアアコニターゼの活性を取り戻すことが、植物由来の分子又は抽出物により、該線維芽細胞を処理することによって可能であること、他方、若年のドナーの線維芽細胞に、この同じ処理を適用しても、ミトコンドリアアコニターゼの活性を修飾しないことを実証した。
【００１４】
ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激するこのような効果は、この酵素が、クレブス回路及びミトコンドリアＤＮＡの保存におけるその中心的な役割を維持すること、並びに、皮膚細胞の機能、特に代謝機能を保つことを可能にする。
【００１５】
これは、年輩の個人の皮膚細胞のミトコンドリアアコニターゼの活性の回復の結果であり、皮膚細胞の加齢を遅らせる効果が、抗加齢美容作用によって引き起こされる。
【発明の目的】
【００１６】
本発明の主な目的は、特に植物由来の、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する分子又は抽出物、美容組成物における活性剤としてのそれらの使用、及び該組成物を用いる美容ケア方法を提供することである。
【００１７】
本発明の主な目的は、また、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激することによる、抗加齢美容ケア方法を提供することである。
【００１８】
本発明の主な目的は、美容組成物における活性剤としての、美容上許容される（１つ又は複数の）分子、又は植物抽出物の使用を提示することである。
【００１９】
本発明の目的は、また、抗加齢美容組成物における活性剤としての、前記分子又は前記抽出物の使用、及び、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるために、又はその影響を遅らせるために、該組成物を用いる美容ケア方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】年齢によるミトコンドリアアコニターゼ活性の変動に関し、実施例２により、２０歳及び７０歳のドナーから得られたヒト線維芽細胞を培養し処理した後で測定されたものである：（Ａ）ミトコンドリアアコニターゼ活性の測定（実施例２、３節参照）；（Ｂ）ウェスタンブロット法（ＷＢ）によるミトコンドリアアコニターゼアッセイ（実施例２、４節参照）。
【図２】年齢によるミトコンドリアアコニターゼの活性部位の修飾に関し、実施例２により、２０歳及び７０歳のドナーから得られたヒト線維芽細胞を培養し処理した後で測定されたものである；免疫等電点電気泳動（ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ、ＩＥＦ）、次いでウェスタンブロット法による、ミトコンドリアアコニターゼの形態の分離及び測定（実施例２、５節）。
【図３】ミトコンドリアアコニターゼの活性の測定に関し、実施例２に従って培養し、次いで、美容活性剤により４８時間処理した、２０歳及び７０歳のドナーから得られたヒト線維芽細胞を培養した後で測定したものである（実施例２、３節参照）：ハイビスカス  サブダリファの抽出物、１．５％；カラモンディンの抽出物、２．５％；モリンダ  シトリフォリアの抽出物、２％。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
このように、本発明の主題の１つは、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はその影響を弱めるための美容ケア方法に関し、該方法は、それが、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化又は刺激する美容上許容される少なくとも１種の活性剤の有効量の、顔又は身体の皮膚の少なくとも一部への送達を含むことを特徴とする。
【００２２】
そして、本発明の別の主題は、また、損傷を受けた皮膚、特に紫外線により損傷を受けた皮膚をケアするための美容ケア方法を対象とし、該方法は、それが、皮膚のミトコンドリアアコニターゼの活性を活性化又は刺激する美容上許容される活性剤の有効量の、顔又は身体の皮膚の少なくとも一部への送達を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明の方法の１つの特定の特徴によれば、局所送達される活性剤は、美容上許容される少なくとも１種の賦形剤もまた含む美容組成物に組み入れられる。
【００２４】
ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する許容される美容活性剤は、天然又は合成由来の精製された分子であっても、或いは、代わりに、原材料、特に植物由来の原材料からの抽出プロセスの産物であってもよい。
【００２５】
本発明の特定の一実施形態によれば、前記美容活性剤は、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）属、若しくはシトラス属にそれらの少なくとも１種が属する植物種の交雑により得られる雑種に属する植物、モリンダ（Ｍｏｒｉｎｄａ）属に属する植物、又はハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ）属に属する植物を含む群から選択される少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなる。
【００２６】
本発明の別の特定の実施形態によれば、前記活性剤は、シトラス属とフォーチュネラ（Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ）属の交雑により得られる、×シトロフォーチュネラ（Ｃｉｔｒｏｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ）属に属する少なくとも１種の雑種、特にカラモンディン（Ｃａｌａｍｏｎｄｉｎ）（×シトロフォーチュネラ  ミクロカルパ（ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ））から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなる。
【００２７】
特定の一実施形態によれば、前記活性剤は、カラモンディンの果実の抽出物である。
【００２８】
本発明の別の特定の実施形態によれば、前記活性剤は、植物種のモリンダ  シトリフォリア（ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）に属する少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなる。
【００２９】
特定の一実施変形形態によれば、前記活性剤は、モリンダ  シトリフォリアの果実の抽出物である。
【００３０】
本発明のさらに別の特定の実施形態によれば、前記活性剤は、植物種のハイビスカス  サブダリファ（ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）に属する少なくとも１種の植物から得られる植物抽出物を含む、或いは本質的にそれからなる。
【００３１】
特定の一実施変形形態によれば、前記活性剤は、ハイビスカス  サブダリファの花の抽出物である。
【００３２】
抽出物の調製に用いられる植物原料は、その植物の全部、或いはその植物の一部（例えば、根、根茎又は地上部分、特に、茎、葉、花、種子、果実若しくは花芽）であり得る。
【００３３】
それは、有利には、前記の種の１つの果実の全部又は果実の一部からなり得る。
【００３４】
好ましい抽出物は、植物種のハイビスカス  サブダリファの花から得られる。このような抽出物は、例えば、グリーンテック（Ｇｒｅｅｎｔｅｃｈ）社によって、Ａｃｉｄｅｓ  ｄｅ  Ｆｌｅｕｒｓ（登録商標）の名称で販売されている。
【００３５】
好ましい抽出物は、カラモンディンの果実から得られる。
【００３６】
別の好ましい抽出物は、モリンダ  シトリフォリアの果実から得られる。このような抽出物は、例えば、ソラビア（Ｓｏｌａｂｉａ）社によって、シトリフォリン（Ｃｉｔｒｉｆｏｌｉｎｅ）（登録商標）の名称で販売されている。
【００３７】
抽出ステップ自体の前に、植物原料は、乾燥及び／又は粉砕されていてもよい、又は、代わりに、新たに収穫された状態であってもよい。
【００３８】
抽出物は、当業者に知られている様々な抽出方法により調製され得る。
【００３９】
抽出は、溶媒なしに、例えば、特に果実の全部又は果実の一部を圧搾することによって実施され得る。
【００４０】
しかし、有利には、抽出は、選ばれた植物原料を極性溶媒又は極性溶媒の混合物に接触させることによって、特に、適切な溶媒又は溶媒混合物による前記植物原料の浸漬、柔化（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）、煎出によって実施される。
【００４１】
極性溶媒は、有利には、水、Ｃ１〜Ｃ４アルコール（特に、エタノール又はブタノール）、グリコール（グリセロール、ブチレングリコール及びプロピレングリコールから優先的に選択される）、並びにこれらの混合物から選択される。
【００４２】
好ましい混合物は、少なくとも１０ｖ／ｖ％のアルコール又はグリコールを含み、残りの部分は水からなる、少なくとも１種のアルコールと水、又は少なくとも１種のグリコールと水の混合物である。
【００４３】
抽出はまた、植物原料若しくは植物抽出物を部分的に若しくは完全に脱色する又はそれを精製することを目的とした、例えば、非極性溶媒又は溶媒混合物の溶液による植物原料又は抽出物の処理による、或いは、抽出物を活性炭粒子と接触させることからなる処理による、或いは、代わりに、超臨界ＣＯ２による処理による、植物原料若しくは植物抽出物の処理からなる追加のステップを任意選択で含んでいてもよい。
【００４４】
抽出は、抽出溶媒の部分的又は完全な除去ステップによって完了され得る。第１の場合には、抽出物は通常、かなりの量の有機溶媒が取り除かれた水性濃縮液が得られるまで濃縮され、第２の場合には、乾燥残留物が得られる。代わりに、抽出ステップからの生成物は、粉末状に、凍結乾燥されても、噴霧乾燥されてもよい。
【００４５】
粉末は、本発明による美容組成物に、得られたままの形態で使用されても、又は極性溶媒若しくは極性溶媒の混合物に分散又は溶解されてもよく、或いは、代わりに、固体担体に吸着させてもよい。
【００４６】
本発明の一実施変形形態によれば、ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する薬剤は、該薬剤及び美容上許容される少なくとも１種の賦形剤を含む美容組成物の形で、この組成物を身体若しくは顔の皮膚に、又は外皮に付けることによって、局所送達される。
【００４７】
本発明による美容組成物は、所望の効果を生むのに有効な量の本発明の抽出物を含む。
【００４８】
本発明のいずれの態様でも、用語「有効量」は、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるのに、又はその影響を弱めるのに、必要とされる量に少なくとも等しい量を意味する。
【００４９】
有利には、本発明による美容組成物は、ミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する活性剤としての組成物を０．００１質量％から５質量％、好ましくは０．０１質量％から３質量％の間含む。
【００５０】
有利には、本発明の組成物は、また、本発明のものに類似の、及び／又は本発明のものを補足する美容効果を有する他の活性成分、並びに、顔料、染料、ポリマー、界面活性剤、レオロジー作用剤、芳香剤、電解質、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、保存剤、及びこれらの混合物から特に選択され得る少なくとも１種の美容上許容される賦形剤も含み得る。
【００５１】
本発明による美容組成物は、セラム（ｓｅｒｕｍ）、ローション、クリーム、ヒドロゲル、好ましくは美顔用パック（ｍａｓｋ）の形態で配合されても、或いはスティック若しくはパッチの形態であってもよい。
【００５２】
最後に、本発明は、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はそれらを処置するための美容活性剤としての、上で定義された活性剤の使用に関し、該美容剤は皮膚細胞のミトコンドリアアコニターゼの活性を刺激する。
【００５３】
本発明はまた、皮膚の加齢の徴候の現れを防ぐ若しくは遅らせるための、又はそれらを処置するための美容組成物の製造のための、本発明の美容活性剤の使用に関する。
【００５４】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明的記述から明瞭に分かってくるであろう、この説明は、本発明のいくつかの実施例（これらは、純粋に例示の目的で記載され、本発明の範囲の限定を決して生じない）に関連させて記載されている。
【００５５】
以下の記述及び実施例において、特に断らなければ、全てのパーセンテージは、質量基準で記載されており、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧である。
【実施例】
【００５６】
実施例１−試験を実施するために用いられるカラモンディン抽出物の調製
カラモンディン（×シトロフォーチュネラ  ミクロカルパ）の抽出物を、植物の果実全体を圧搾することによって調製する。
濾過し、次いで、遠心した後、果肉を、水とポリグリセロールの混合物により抽出する。
得られる抽出物は、３５〜４５質量％の固形分を含み、実施例２の試験に用いられ、また、美容組成物、特に実施例３のそれの製造にも用いられる。
【００５７】
実施例２−ヒト線維芽細胞におけるミトコンドリアアコニターゼ活性の測定
材料及び方法
１．ヒト線維芽細胞の培養及び処理
【００５８】
・  試験された抽出物
−  実施例１によるカラモンディンの抽出物
−  ハイビスカス  サブダリファの花の水性抽出物、グリーンテック社によって、Ａｃｉｄｅｓ  ｄｅ  Ｆｌｅｕｒｓ（登録商標）の名称で販売されている、２２〜２５質量％の固形分を含む
−  モリンダ  シトリフォリアの葉の水−グリコール抽出物、ソラビア社によって、シトリフォリン（登録商標）の名称で販売されている、１．５質量％から１．８質量％の固形分を含む。
【００５９】
・  培地及び試薬
線維芽細胞培養培地
ＤＭＥＭ  １／ｍｌのグルコース（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））
＋１０％のＳＶＦ
＋１％のピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ（ギブコ）
【００６０】
活性剤の保存溶液
保存溶液は、市販の溶液からＤＭＥＭ培地で調製する（％は、抽出溶液に関するパーセンテージとして表す）。
−  ハイビスカス  サブダリファの抽出物、培地中、６質量％
−  モリンダ  シトリフォリアの抽出物、培地中、６質量％
−  カラモンディンの抽出物、培地中、６質量％、すなわち、約２．４質量％の固形分。
【００６１】
ａ−細胞培養及び処理
２０歳のドナー及び７０歳のドナーの形成外科から得られた初代培養のヒト線維芽細胞、１２次継代。
【００６２】
０日での継代培養
１５×１０５線維芽細胞／（７５ｃｍ２のディッシュ）、ｎ＝３、ＤＭＥＭ培地（１０ｍｌ／ディッシュ）
【００６３】
５日目の処理
保存溶液を、ＤＭＥＭ培地で希釈して、下記の濃度とする：
−  ハイビスカス  サブダリファの抽出物、培地中、１．５質量％
−  モリンダ  シトリフォリアの抽出物、培地中、２質量％
−  培地中２．５質量％のカラモンディン抽出物、すなわち、約１質量％の固形分。
【００６４】
７日目の細胞の回収
ミトコンドリアの調製
ＰＢＳにより２回すすぎ
氷ベッド上；２ｍｌのホモジェネート化緩衝液中に回収。
【００６５】
ｂ−ミトコンドリアの分離
３２個のＴ７５ディッシュを各ドナーに用いる。集密した細胞を、２回、ｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２−０．１３ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＮａ２ＰＯ４及び１．４ＭのＫＨ２ＰＯ４）により洗い、擦り取ることによって引き離し、次いで、４℃、１５００×ｇで５分間遠心する。細胞ペレットをＰＢＳ緩衝液により洗い、再遠心し、次いで氷の中に置く。ペレットを冷ホモジェネート化緩衝液（０．３Ｍのマンニトール、０．１％のＢＳＡ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ＫＯＨによりｐＨ７．４に調整、ペレット容積の５倍量）に分散させ、２ｍｌのガラスホモジェナイザーにより氷上でホモジェネートにする。細胞懸濁液を、４℃、１０００×ｇで１０分間遠心する。上澄みを、４℃、１００００×ｇで１５分間再遠心する。上澄みは、細胞質画分を含み、ペレットはミトコンドリア画分に相当する。ミトコンドリア画分を、冷ホモジェネート化緩衝液により２回洗う。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法に従って測定する。
【００６６】
２．タンパク質アッセイ（ブラッドフォード法）
ａ−検量範囲の製剤
ＢＳＡ保存溶液：５０μｇ／ｍｌ（バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）；標準タンパク質）
【００６７】
【表１】
2010241803.tif 000003
【００６８】
２００μｌのクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーＧ２５０を各チューブに加える。このブルーは、保存溶液の５倍希釈によって、用時調製する。
【００６９】
ｂ−試料の調製
−  タンパク質濃度＞３ｍｇ／ｍｌの場合、細胞抽出物は、１００倍に希釈し、次いで、１００ｍｌの希釈液を取る。
＋７００μｌのミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水
＋２００μｌのブルー
【００７０】
−  タンパク質濃度＜３ｍｇ／ｍｌ場合、１０μｌの細胞抽出物を取る。
＋７９０μｌのミリＱ水
＋２００μｌのブルー
【００７１】
ｃ−試料アッセイ
試料は、渦流撹拌（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）によってホモジェネートにし、５分間放置した後、次に、５９５ｎｍの波長の光学濃度を、分光光度計で読み取る。
【００７２】
３．ミトコンドリアアコニターゼ活性のアッセイ
ａ−試薬
−  ２５ｍＭ、ｐＨ７．５のトリス緩衝液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
−  クエン酸ナトリウム（シグマ）
−  イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（シグマ）
−  ＭｎＣｌ２（シグマ）
【００７３】
ｂ−ミトコンドリアアコニターゼ活性のアッセイの原理
ミトコンドリアアコニターゼ活性を、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ＋０．６ｍＭのＭｎＣｌ２及び０．０５％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００中、０．２ｍＭのＮＡＤＰ＋、５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１単位／ｍｌのイソクエン酸デヒドロゲナーゼを含む反応媒体中、３４０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量する。
【００７４】
アッセイのために、５０μｇのミトコンドリアタンパク質を、２５℃で、１．０ｍｌの反応媒体に加える。３４０ｎｍでの測定を、１ｃｍのセルで、５分間隔で記録し、ミトコンドリアアコニターゼ活性は、約５分間に渡る３４０ｎｍでの吸光度の直線的増加により計算する。活性は、６．２２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１のＮＡＤＰＨの対するモル吸光係数を用いること、及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼによる、１分子のクエン酸の１分子のＮＡＤＰＨへの変換を仮定することによって得る。
【００７５】
４．ウェスタンブロット法（ＷＢ）によるミトコンドリアアコニターゼアッセイ
ａ−アッセイの原理
タンパク質電気泳動を、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（Ｎａｔｕｒｅ，１９７０年；２７７、６８０頁）に従って、不連続緩衝液で、変性及び還元条件下に、１ｍｍから１．５ｍｍの厚さのポリアクリルアミドミニゲルで実施する。１２％のＴ及び２．７％のＣを含むゲルにより、低分子量タンパク質（２０から１２０ｋＤａ）のタンパク質が分離される。８％のＴ及び２．７％のＣを含むゲルにより、高分子量タンパク質（３５から２５０ｋＤａ）が分離される。
ゲルの製造に必要な溶液は、付録Ａに記載されている。
【００７６】
分離ゲル
ゲルは、泳動の少なくとも２時間前に注ぐ。
ゲルの注入は、濃縮ゲルのために用意されたコームの最下部から約０．５ｍｍまで、ピペットを用いて実施する。無水エタノールを表面に加えて、均一なベースラインを得る（±１ｍｌ／ゲル）。
【００７７】
濃縮ゲル
エタノールを取り除く。２．５ｍｌのゲルを、ポリエチレン製のパスツール全容（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ピペット（バイオラッド）を用いて注ぎ、次いで、コームを挿入する。ゲルは１時間後に重合している。
【００７８】
ｂ−試料の調製
ミトコンドリアタンパク質を、還元レムリ条件下に、１２％のＴを含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。試料（２５〜４０μｇのタンパク質）を、付着物緩衝液中、１００℃で５分間、還元する。試料及びマーカーを付着させた後、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのグリシン、２ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ８．４の緩衝液（０．１％のＳＤＳを含む）中、２００Ｖで１時間、泳動を実施する。
【００７９】
ｃ−電気泳動
付着
試料は９５℃で５分間加熱する。
付着させる容積は、所望の量のタンパク質に応じて決まる（１ｍｍのゲルで、最大容積＝２５μｌ、１．５ｍｍのゲルで４０μｌ）。基準量は１０μｇのタンパク質であり、１０μｌに相当する；次いで、それは、標的タンパク質の発現に合わせて変える。
【００８０】
コームは取り除く。２００ｍｌの１×泳動緩衝液を、ゲル上に、２つのゲルの間の中央コンパートメントに、次いで、４分の１のレベルまでタンクに注ぐ。
【００８１】
試料、及び１０μｌのプレステインド低分子量コントロール（バイオラッド、プレステインド  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準ローレインジ（Ｌｏｗ  Ｒａｎｇｅ））又は高分子量コントロール（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、フルレインジレインボー（Ｆｕｌｌ  Ｒａｎｇｅ  Ｒａｉｎｂｏｗ））は、マイクロピペットに取り付けた、しだいに細くなる先端部を用いて付着させる。
【００８２】
泳動
電気泳動は、室温で、２００Ｖで実施する。この電気泳動は、泳動の先端がゲルを出た時に停止する（約４０分間の泳動）。
【００８３】
膜へのタンパク質のセミ−ドライ転写
２枚の厚い濾紙（バイオラッド）及びセルロース膜（バイオラッド）を、トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）転写緩衝液（ＰＮＡＳ、１９７９年、７６（９）４３５０〜４頁）（付録Ｂを参照）に浸す。
【００８４】
セミ−ドライ転写装置（ビイオラッド）で、湿った厚い１枚の濾紙をアノードに置く。
【００８５】
一旦、泳動が完了すると、濃縮ゲルを取り除き、分離ゲルをセルロース膜に合わせる。ゲルを含む膜を、１枚の前記濾紙の上に置く。２枚目の濾紙をゲル上に置く。
【００８６】
「サンドイッチ」の作製中、転写を妨げないように、ガラス棒を用いて空気の泡を全て取り除くように注意する。装置を、カソードをなす蓋により閉じる。タンパク質の転写は、１０Ｖ、９０分間で実施する。
【００８７】
ポンソーレッド（Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｒｅｄ）による染色
転写の良否を調べるために、タンパク質をポンソーレッド（シグマ）により染色する。セルロース膜をミリＱ水によりすすぎ、次いで、ポンソーレッドの浴に、撹拌しながら１０分間一度浸す。次に、タンパク質のバンドにだけ着色が残るまで、ミリＱ水のいくつかの浴で洗う。膜をプラスチックの袋に入れ、スキャンする。タンパク質のバンドは、転写されたタンパク質の全量を求めるために定量され得る。
【００８８】
非特異的結合部位のブロッキング
膜は、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（付録Ｂ参照）中５％のスキムミルク（Ｒｅｇｉｌａｉｔ）からなる、非特異的結合部位をブロッキングするための溶液（２０ｍｌ／膜）中、４℃で一夜、又は室温で９０分間、撹拌する。
【００８９】
免疫検出
抗体の参照事項及び最適希釈は付録Ｃに記載する。
【００９０】
非特異的部位をブロッキングした後、膜はＰＢＳ−Ｔ中で素早くすすぐ。この膜を、抗体に応じて５％（ｍ／ｖ）のミルクを含む又は含まないＰＢＳ−Ｔで最適濃度に希釈した一次抗体に、撹拌しながら、室温で６０分間、又は４℃で一夜接触させる。
【００９１】
次いで、結合していない過剰の遊離抗体を除去するために、それを、ＰＢＳ−Ｔ中で３回、各１０分間、素早くすすぐ。次に、それを、室温で撹拌しながら、ＰＢＳ−Ｔ又は５％ミルク（５ｍｌ）で希釈した、ペルオキシダーゼに結合した適切な２次抗体に接触させる。４５分間のインキュベーションの後、それを、２回素早くすすぎ、次いで、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液により５回、各５分間洗い、最後に、１×ＰＢＳにより洗う。水気を切った後、それを、タンパク質側を上にして、台所用ラップフィルム（サラン（ＳＡＲＡＮ））の上に置く。
【００９２】
膜を、ペルオキシダーゼの基質としてルミノールを用いる高感度化学発光検出キット（アマシャム；ＥＣＬウェスタンブロッティング）を用いて可視化する。ペルオキシダーゼ及び増幅剤の作用の下で、ルミノールは酸化され、過渡励起状態に移る。基底状態への復帰は、光子の放出によって起こり、これらの光子が、膜上に置かれたオートラジオグラフィーフィルムに当たる。
【００９３】
検出キットの２つの溶液の各々の１ｍｌ（すなわち２ｍｌ、膜を覆うのに必要とされる最小容積）を一緒に混合する。混合物を直ちに膜の上に均一に注ぎ、室温で正確に１分間、接触させておく。水気を切った膜を、サランラップフィルムで包み、光から保護されたカセットに入れ、次いで、プレフラッシュしたオートラジオグラフィーフィルム（アマシャム、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）ＥＣＬ）により覆う。５分間の露光の後、オートラジオグラフィーフィルムは可視化される。所望のシグナルを最適にするために、必要であれば、新しいフィルムが露光されてもよい（１時間の露光時間まで）。バンドは、ゲルズアナリスツ（Ｇｅｌｓ  Ａｎａｌｙｓｔｓ）３．０１ソフトウェアにより定量する。
【００９４】
５．ＩＥＦによるミトコンドリアアコニターゼアッセイ
この技法により、ミトコンドリアアコニターゼの３つの形態、活性形態［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋、不活性形態［３Ｆｅ−４Ｓ］＋、及びアポ酵素形態が、それらの等電点に従って分離される。
【００９５】
５０μｇのミトコンドリアタンパク質を、ｐＨ３〜１０のＩＥＦゲル（バイオラッド）上に付着させる。泳動は、１００Ｖで１時間；２５０Ｖで１時間及び５００Ｖで３０分間、クライテリオン（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）システム（バイオラッド）で実施する。泳動の後、ゲルをニトロセルロース膜に転写し、抗−ミトコンドリアアコニターゼウェスタンブロット法を、４節に記載のプロトコールに従って実施する。
【００９６】
結果
ミトコンドリアアコニターゼ活性を、これらの培養細胞からミトコンドリアを分離後、評価した。加齢と共にミトコンドリアアコニターゼ活性が低下することが実証される。
【００９７】
これらの測定は、２０歳のドナーと比較して、７０歳のドナーのミトコンドリアでは、ミトコンドリアアコニターゼの活性が約８５％低下していることを示す（図１参照）。
【００９８】
しかし、この酵素の発現、すなわち、若年及び老年の線維芽細胞に存在する酵素の量には有意な相違はない（図１参照）。
【００９９】
老齢の線維芽細胞で示されるミトコンドリアアコニターゼ活性の低下が、この酵素のＦｅ−Ｓ中心の酸素障害に帰因しなかったかどうかを調べるために、酵素の３つの構造形態（アポ酵素、活性形態及び不活性形態）を、等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ、ＩＥＦ）によって、それらの等電点に従って分離した。この方法を用いて、アポ酵素に年齢による違いが示されるが、他の形態には違いがない（図２参照）。
【０１００】
本発明者等は、ミトコンドリアアコニターゼの活性が、培養したヒト皮膚線維芽細胞で、年齢と共に低下することを示した。この活性の低下は、年齢によるこのタンパク質の発現の変化を伴わない。
【０１０１】
この結果から出発して、本発明者等は、異なる年齢のこれらのドナーから得られる皮膚線維芽細胞におけるミトコンドリアアコニターゼの活性への、試験された活性剤の効果を評価した（図３及び表１参照）。
【０１０２】
結果は、若年ドナー（２０歳）からの未処理線維芽細胞におけるミトコンドリアアコニターゼの活性（これが１００％のレベルをなす）に対するパーセンテージとして表される。
【０１０３】
【表２】
2010241803.tif 000004
表１：２０及び７０歳のドナーからの線維芽細胞のミトコンドリアアコニターゼ活性
【０１０４】
これらの結果は、これらの抽出物による処理が、酸化作用に対してミトコンドリアアコニターゼを保護することを可能にすることを示す。これらの抽出物により、２０歳のドナーからの線維芽細胞を処理した後４８時間で、ミトコンドリアアコニターゼの有意の活性化はない。他方、７０歳のドナーからの線維芽細胞への同じ処理により、酵素は完全に保護されるという結果が得られる。
【０１０５】
美容配合物の例
実施例３：カラモンディン抽出物を含む美容組成物
実施例１で得られた抽出物を、得られたままの形態で、下の美容組成物に用いる。
【０１０６】
−  カラモンディンの植物抽出物（実施例１）                            １％
−  界面活性剤（アルラセル（Ａｒｌａｃｅｌ）（登録商標）１６５ＶＰ）  ５％
−  ９５％セチルアルコール                                            １％
−  ステアリルアルコール                                              １％
−  蜜蝋                                                              １．５％
−  オイル（パールリーム（Ｐｅｒｌｅａｍ）（登録商標））              ８．５％
−  グリセリドトリカプラート／カプリラート                            ３％
−  シリコーンオイル（ジメチコン１００ＣＳ）                          １％
−  ポリマー（ケルトロール（Ｋｅｌｔｒｏｌ）（登録商標））            ０．３５％
−  水酸化ナトリウム                                                  ０．０４％
−  ＥＤＴＡ四ナトリウム粉末                                          ０．１％
−  保存剤                                                            ０．５％
−  水                                                            １００となる量
【０１０７】
美容組成物は、様々な成分を１ステップ又は複数ステップで一緒に混合することによって、当業者に知られている通常の仕方で調製する。
【０１０８】
この組成物は、先に示された抗加齢美容効果を得るために、数週間、毎日、顔に付けられ得るナイトクリームである。
【０１０９】
付録Ａ
Ｉ−不連続緩衝液法において、変性及び還元条件下に、電気泳動ゲルのために用いられた緩衝液及び溶液
【０１１０】
モノマー溶液：
アクリルアミド／ビスアクリルアミド、３０％Ｔ、２．６７％Ｃ（バイオラッド）
【０１１１】
分離ゲル緩衝液：トリス−ＨＣｌ、１．５Ｍ、ｐＨ８．８
【表３】
2010241803.tif 000005
【０１１２】
濃縮ゲル緩衝液：０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８
【表４】
2010241803.tif 000006
【０１１３】
１０×泳動緩衝液：０．２５Ｍのトリス  ｐＨ８．３、１．９２Ｍのグリシン；１％のＳＤＳ
【表５】
2010241803.tif 000007
【０１１４】
過硫酸アンモニウム：（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ８：（シグマ）  １０％（ｗ／ｖ）、すなわち、１００ｍｇ／ｍｌ
【０１１５】
２×レムリ還元性試料緩衝液：０．０６Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８；２．３％のＳＤＳ；１０％のグリセロール；０．０２％のブロモフェノールブルー
【表６】
2010241803.tif 000008
【０１１６】
１０×ブロモフェノールブルー（飽和溶液）：
スパチュラ先端量のブロモフェノールブルーを、５ｍｌの２×レムリ緩衝液に分散させる。撹拌、超音波処理、次いで遠心後、上澄みを回収する。
【０１１７】
ＩＩ−電気泳動ゲル
−  １２％Ｔ分離ゲルの調製
【表７】
2010241803.tif 000009
【０１１８】
−  ８％Ｔ濃縮ゲルの調製
【表８】
2010241803.tif 000010
【０１１９】
付録Ｂ
転写及び免疫検出のための溶液
【０１２０】
トービン転写緩衝液
２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；１９２ｍＭのグリシン；２０％のメタノール
【表９】
2010241803.tif 000011
【０１２１】
ＰＢＳ−Ｔ緩衝液
１０×ＰＢＳ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の１０倍希釈
＋０．１％のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（シグマ）
【０１２２】
ポンソーレッド（シグマ）
０．１％（ｗ／ｖ）溶液、５％の酢酸溶液中
【０１２３】
付録Ｃ
１次及び２次抗体のリスト
【０１２４】
【表１０】
2010241803.tif 000012
【図１】
2010241803.tif 000013
【図２】
2010241803.tif 000014
【図３】
2010241803.tif 000015
【外国語明細書】
2010241803000001.pdf