(57)【要約】【課題】  穏やかな高体温条件を使用して有効物質を投与する方法において有用なリポソームを提供する。【解決手段】  活性物質を含むリポソームであって、リン脂質およびリゾ脂質を含む脂質二層膜を有し、リン脂質が脂質二層膜の一次脂質源であり、前記リゾ脂質が存在しない条件で生じるものと比較して、相転移温度で放出される活性物質のパーセンテージを増加させるのに十分な量で、リゾ脂質が二層膜中に含まれる。【選択図】  図１
2010138200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性物質を含むリポソームであって、リン脂質およびリゾ脂質を含む脂質二層膜を有し、リン脂質が脂質二層膜の一次脂質源であり、リゾ脂質が前記二層膜中に含まれており、リポソームの相転移温度で放出される活性物質のパーセンテージが、前記リゾ脂質が存在しない条件で生じるものと比較して増加するリポソーム。
【請求項２】
リン脂質およびリゾ脂質が、モル重量基準で９９：１〜７０：３０の比率で前記二層膜中に含まれる請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記リン脂質が、飽和アシル基を含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であり、前記リゾ脂質がモノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）である請求項１に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記活性物質が、リポソーム内部に捕捉されている請求項１に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記活性物質が、脂質二層膜内に捕捉されている請求項１に記載のリポソーム。
【請求項７】
５０ナノメートル〜４００ナノメートルの直径を有する請求項１に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記リポソーム二重層が、親水性ポリマーを用いて誘導されるリン脂質をさらに含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、およびポリビニルアルコールからなる群から選択される請求項８に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記活性物質が、薬理学的活性物質、香味用剤、診断用剤または栄養補給用剤である請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記薬理学的活性物質が、抗新生物薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、免疫抑制薬、抗生物質および抗感染薬からなる群から選択される請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１２】
前記活性物質が、メトトレキサート、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、エリプチシン、カプトテシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスプラチン、プレドニゾン、メチルプレドニゾンおよびイブプロフェンからなる群から選択される請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記活性物質が、パクリタキセルである請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記活性物質が、カプトテシンである請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
リン脂質および２モル％〜３０モル％のリゾ脂質を含み、リン脂質が脂質二層膜の一次脂質源である脂質二層膜を有するリポソーム。
【請求項１６】
前記リン脂質ががジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であり、前記リゾ脂質がモノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項１７】
前記脂質二層膜が、１０モル％〜２０モル％のリゾ脂質を含む請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項１８】
前記活性物質が、薬理学的活性物質、香味用剤、診断用剤または栄養補給用剤である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項１９】
前記活性物質が、抗新生物薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、免疫抑制薬、抗生物質および抗感染薬からなる群から選択される前記薬理学的活性物質である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２０】
前記活性物質が、メトトレキサート、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、エリプチシン、カプトテシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスプラチン、プレドニゾン、メチルプレドニゾンおよびイブプロフェンからなる群から選択される請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２１】
前記活性物質が、パクリタキセルである請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２２】
前記活性物質が、カプトテシンである請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２３】
リン脂質および１〜３０％のリゾ脂質を含む脂質二層膜有するリポソーム中に活性薬剤を捕捉することを含む高体温投与用の活性物質の調整方法であって、リン脂質が脂質二層膜の一次脂質源である調製方法。
【請求項２４】
前記脂質二層膜が、５モル％〜２０モル％のリゾ脂質を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記活性物質が、リポソーム内部に捕捉される請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記活性物質が、脂質二層膜内に捕捉される請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記前記リポソーム二重層が、親水性ポリマーを用いて誘導されるリン脂質をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、およびポリビニルアルコールからなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であり、前記リゾ脂質がモノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）である請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記活性物質が、薬理学的活性物質、香味用剤、診断用剤または栄養補給用剤である請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記活性物質が、抗新生物薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、免疫抑制薬、抗生物質および抗感染薬からなる群から選択される薬理学的活性物質である請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記活性物質が、メトトレキサート、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、エリプチシン、カプトテシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスプラチン、プレドニゾン、メチルプレドニゾンおよびイブプロフェンからなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記活性物質が、パクリタキセルである請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性物質が、カプトテシンである請求項２３に記載のリポソーム。
【請求項３５】
請求項１または請求項１５のいずれかに記載の複数のリポソームを含むリポソーム調製物。
【請求項３６】
前記リポソームが、生理食塩水中に分散されている請求項３５に記載のリポソーム調製物。
【請求項３７】
リゾ脂質モノマーを溶液中にさらに含む請求項３６に記載のリポソーム調製物。
【請求項３８】
前記リポソームが、直径５０ｎｍ〜直径４００ｎｍである請求項３５に記載のリポソーム調製物。
【請求項３９】
前記リポソームが、直径１００ｎｍ〜直径２００ｎｍである請求項３５に記載のリポソーム調製物。
【請求項４０】
リポソーム内部空間内に捕捉された活性物質を含むリポソームを製造する方法であって、（ａ）リゾ脂質を含むリン脂質フィルムを調製するステップと、
（ｂ）活性物質および平衡量のリゾ脂質モノマーを含む水性調製物により前記リン脂質フィルムに水分補給して、リポソームを生成するステップとを含み、
前記リポソームの相転移温度で放出される活性物質のパーセンテージが、前記リゾ脂質を含まない条件で生成するものと比較して増加することを特徴とする方法。
【請求項４１】
前記水分補給ステップが、脂質混合物のゲル−液体結晶相転移温度より高い温度で実施される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
所望のサイズのリポソームを形成するステップ（ｂ）によって製造された前記リポソームを押し出すステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記リン脂質フィルムが、活性物質をさらに含む請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は熱感受性リポソームに関し、さらに詳細には、リン脂質および界面活性剤を含むリポソームであって、穏やかな高体温温度でその内容物を放出するリポソームに関する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所交付金ＮＩＨ ＧＭ４０１６および国立癌研究所ＳＰＯＲＥ交付金Ｐ５０−ＣＡ６８４３８の名のもとに米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明に対してある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
リポソームは、水性の内部区画を封入する少なくとも１つの脂質二重層からなる。リポソームは、膜のタイプおよびサイズにより特徴づけられる。小型単ラメラ小胞（smalll unilamellar vesicle; ＳＵＶ）は、単一の膜を有し、一般に０．０２〜０．０５μｍの範囲の直径を有する。大型単ラメラ小胞（large unilamellar vesicle; ＬＵＶ）は、一般に０．０５μｍより大きい。オリゴラメラ大型小胞および多重ラメラ大型小胞は、複数の、通常は同心の膜層を有し、一般に０．１μｍより大きい。幾つかの非同心膜を有するリポソーム、すなわち、１つの大型小胞内に含まれる幾つかの小型小胞は、多重小胞性小胞と呼ばれる。
【０００４】
従来のリポソームは、水性の内部空間に含まれる（水溶性活性物質）か、脂質二重層中に分配される（水不溶性活性物質）かのいずれかの、治療薬、薬剤または他の活性物質を輸送するように調剤される。同時係属出願ＳＮ０８／７９５，１００号には、脂質ニ層膜内にコレステロールを含有するリポソームであって、活性物質が脂質界面活性剤と一緒に凝集し、ミセルがリポソームの内部空間内に捕捉された(entrapped)リポソームが開示されている。
【０００５】
血流中で半減期が短い活性物質は、リポソームを介して配送するのに特に適する。たとえば、多くの抗腫瘍剤は、血流中で半減期が短く、従って、非経口使用を実現できないことが知られている。しかし、リポソームは、細網内皮系（reticuloendothelial system; ＲＥＳ）の細胞によってが血液から急速に除去されるのため、血流を介した活性物質の部位特異的配送にリポソームを使用することには制限がある。
【０００６】
リポソームは、通常は漏出性ではないが、リポソーム膜に穴が発生すると、膜が崩壊するか溶解すると、あるいは、膜の温度が相転移温度まで上昇すると、漏出性になる。リポソーム温度を相転移温度より上まで上昇させ、その結果、リポソーム内容物の放出を引き起こすための、対象者の標的部位における温度上昇（高体温）が、治療薬の選択的配送に使用されてきた。Ｙａｔｖｉｎｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０４：１８８（１９７９）（非特許文献１）。しかし、リポソームの相転移温度が正常組織の温度より著しく高い場合、この技術は制限される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙａｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０４：１８８（１９７９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記問題点に鑑み、穏やかな高体温条件に応答して、治療量の有効物質を配送できるリポソーム製剤を考案することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様は、活性物質を含有するリポソームである。リポソームの脂質二層膜は一次脂質源としてリン脂質を含み、リゾ脂質(lysolipid)が存在しない条件で発生するであろう場合と比較して、相転移温度にて放出される活性物質のパーセンテージを高める量で、リゾ脂質が二層膜内に含まれる。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、一次脂質源としてのリン脂質および２モル％〜３０モル％のリゾ脂質を含む脂質二層膜を有するリポソームである。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、高体温投与向けの活性物質を調製する方法である。この活性物質は、一次脂質源としてのリン脂質および１〜３０％のリゾ脂質を含む脂質二層膜を有するリポソーム内に捕捉されている。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、上述の複数のリポソームを含むリポソーム製剤である。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、リポソーム内部空間に活性物質を含むリポソームを製造する方法である。リゾ脂質を含むリン脂質フィルムを最初に調製し、次いで活性物質および平衡量のリゾ脂質モノマーを含む水性調製物で水分補給する。リゾ脂質は、リゾ脂質が存在しない条件で生じるであろうものと比較して、リポソーム膜の相転移温度で放出される活性物質のパーセンテージを高めるのに十分な量でリポソーム膜に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】リン脂質としてのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびリゾ脂質としてのモノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）を含む二層膜を有するリポソームを概略的に表す図である。リゾ脂質モノマーの配向ならびに脂質二重層の内層および外層の両者にそれらが存在することを示す。
【図２】ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ（９０：１０）を含有するＤＰＰＣリポソームの平均直径に及ぼす、押出通過の影響を示すグラフである。孔の大きさが０．１ｍＭの２つのポリカーボネート膜のスタックを、４５℃にて３００〜４００ｐｓｉの圧力で通過させると、平均サイズが７００ｎｍである多重ラメラ小胞が押し出された。
【図３】ＰＢＳの存在下、３７℃（白抜きの円）および４０℃（中黒の正方形）における、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ（９０：１０）を含むリポソーム内に捕えられた６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の放出を時間の関数として示すグラフである。
【図４】１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）の存在下、２０℃〜４５℃の温度における、様々な濃度のＤＰＰＣ：ＭＰＰＣリポソームからのＣＦの放出を示すグラフである。リポソームは、ＤＰＰＣのみ（白抜きの円）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ９８：２（中黒の正方形）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ９６：４（中黒の三角）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ９４：６（白抜きの三角）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ９３：７（中黒のダイアモンド形）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ９２：８（白抜きの正方形）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ９０：１０（中黒の円）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ８０：２０（中黒の三角）を含んでいた。
【図５Ａ】様々なＭＰＰＣ濃度がＤＰＰＣリポソームの相転移温度（Ｔｃ）に及ぼす影響を表す、熱移動サーモグラムを示す図である。３０℃〜４５℃の間で、２℃／分の加熱速度で、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）により、ＭＰＰＣ（１〜１０モル％）を含有するＤＰＰＣの凍結乾燥試料のＴｃを測定した。
【図５Ｂ】５Ａについて上述した通り、ＭＰＰＣ濃度がＤＰＰＣリポソームの相転移温度（Ｔｃ）に及ぼす影響を示すグラフである。このグラフは、転移の開始点（白抜きの円）、エンタルピーのピーク（中黒の円）、および転移の終点（白抜きの三角）を表す。
【図６Ａ】リポソーム（９０：１０ ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ）の示差走査熱量測定法のプロフィールと、図４に記載の累積放出実験で得られた６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）放出に関する示差放出プロフィール（中黒の円）とを比較するグラフである（過剰の熱移動：白抜きの正方形）。
【図６Ｂ】９０：１０ ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ リポソームからの示差放出プロフィールを示すグラフであって、白抜きの円は熱移動を表し、中黒の円は２５℃〜４５℃の温度でのＣＦの示差放出を表す。
【図７】ＰＢＳの存在下、３７℃（中黒の円）および４０℃（白抜きの円）における、捕捉されたドキソルビシン（ＤＸ）のリポソーム（９０：１０ ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ）からの放出を時間の関数として示すグラフである。
【図８】ＰＢＳの存在下、２５〜４５℃の温度で５分間インキュベートした、９０：１０ ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣを含むリポソームからの、捕捉されたＤＸの累積放出プロフィールを示すグラフである。
【図９Ａ】ＰＢＳの存在下で、捕捉された６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）のリポソーム（５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を組み込んだ９０：１０ ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ）からの放出を温度の関数として示すグラフである（３７℃−白抜きの円、３８℃−中黒の正方形、３９℃−中黒の三角、３９．５℃−白抜きの三角、および４０℃−中黒の円）。
【図９Ｂ】５０％ウシ血清の存在下で、捕捉された６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の、リポソーム（５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を組み込んだ９０：１０ ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣを含む）からの放出を温度の関数として示すグラフである（３７℃−白抜きの円、３８℃−中黒の正方形、３９℃−中黒の三角、３９．５℃−白抜きの三角、および４０℃−中黒の円）。
【図１０】ＰＢＳ（中黒の円）または５０％ウシ血清（白抜きの円）の存在下、２５〜４５℃の様々な温度における、捕捉された６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の、９０：１０ ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣを含むリポソームからの累積放出を示すグラフである。
【図１１Ａ】１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）の化学構造を示す図である。
【図１１Ｂ】１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）の化学構造を示す図である。
【図１１Ｃ】１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ポリ（エチレングリコール）２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の化学構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、周囲の環境の温度変化に感受性を有するリポソームを提供する。このようなリポソームの温度感受性は、加熱されるか（たとえば、高体温の臨床手法）身体の残りの部分より本質的に高温である（たとえば、炎症）、いずれかの標的部位におけるリポソームの内部水性空間内に捕捉された化合物の放出、および／または脂質二重層と関連した化合物の放出を可能にする。本発明のリポソーム二重層は、（一次すなわち主要脂質成分に加えて）リゾ脂質、または別の界面活性剤を含む。リゾ脂質または別の界面活性剤をリポソーム二重層に含めると、リポソーム温度が一次脂質成分のゲル−液体結晶相転移温度に達したとき、化合物の放出が増強する。リゾ脂質（または他の界面活性剤）が存在しても、リン脂質含むだけのリポソームで実現されるより僅かに低い温度で、リポソームからの薬剤の放出が起こる。リポソームが、対象者の身体の予め選択された標的部位に配送されるべき化合物を含む場合、本発明のリポソームは、薬剤配送に特に有用である。標的部位は、ゲル−液体結晶相転移温度以上になるように人工的に加熱される（高体温）か、自然発生的な原因（たとえば、炎症）のため、標的部位が身体の非標的部位より高い温度であってもよい（この場合、その温度は、使用されるリポソームのゲル−液体結晶相転移温度以上である）かのいずれかである。
【００１６】
リポソームを構成する一次脂質のゲル−液体結晶相転移温度（transition temperature; Ｔｃ）の範囲内の温度にてリポソームを数分間インキュベートすると、リポソーム二重層は透過性になり、リポソーム内に捕捉された溶質を周囲の溶液中に放出する。このような温度感受性リポソームに加えた高体温の臨床使用が提唱されている。たとえば、Ｙａｔｖｉｎｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２：１２９０（１９７８）を参照されたい。
【００１７】
米国特許第５，０９４，８５４号（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．）には、リポソーム内に捕捉された薬剤含有溶液の浸透圧が、温血動物の体液より１．２〜２．５倍高いリポソームが開示されている。リポソーム膜が放出物質を透過するようになる温度範囲は、４０℃〜４５℃の範囲であると述べられている。
【００１８】
米国特許第５，７２０，９７６号（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．）には、リポソーム内に含まれる薬剤を放出させるために、リポソーム表面を被覆するためのＮ−イソプロピルアクリルアミド／オクタデシルアクリレート／アクリル酸のコポリマーの使用について開示されている。２８℃より高い（ヒトの平均体温より十分低い）温度で、捕捉されている薬剤の放出が起きる。
【００１９】
治療目的で、あるいは治療薬または診断薬の配送を助けるために対象者の身体を加熱する方法は、当技術分野で周知である。高体温は、充実性腫瘍等の疾患部位を生理学的温度（たとえば、約３８℃〜約４５℃）より高い温度まで加熱することからなり、現在、主として放射線療法の補助療法として使用されている（Ｂａｔｅｓａｎｄ ＭｃＫｉｌｌｏｐ ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． ４６：５４７７（１９８６）、Ｈｅｒｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３，５１１（１９８３））。
【００２０】
本明細書で使用する用語「高体温(hyperthermia)」は、対象者の通常の温度と比較した対象者の身体、または対象者の身体の一部の温度の上昇を指す。このような上昇は、自然経過（炎症等）の結果であってもよく、治療目的もしくは診断目的で人工的に誘導された結果であってもよい。哺乳動物の場合、通常は、体組織による熱産生と熱損失との平衡を保つように作用する前視床下部の体温調節中枢により正常な体温が維持される。「高体温」は、熱消散不十分による、視床下部の設定点より高い体温の上昇を指す。高体温と対照的に、「発熱」は、体温調節中枢の変化に起因する体温の上昇を指す。１８〜４０才の健常者の総体的平均口腔温度は、３６．８±０．４℃（９８．２±０．７°Ｆ）である。たとえば、Ｈａｒｒｉｏｓｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｆａｕｃｉｔ ｅｔａｌ．， Ｅｄｓ．）１４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ．８４（１９９８）を参照されたい。
【００２１】
たとえば、腫瘍の治療用に、熱感受性リポソームと高体温の併用が提唱されている（Ｙａｔｖｉｎｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２：１２９０（１９７８））。局部高体温および熱感受性リポソームを使用して、抗腫瘍薬に対象者の腫瘍部位を標的とさせることにより、薬剤の望ましくない副作用を減少させ、治療成績を高めることができる。しかし、高体温による、疾患部位を標的としたリポソームの効力は、血流中でのリポソームの安定性（リポソームが循環系に投与されるとき）、および標的部位でリポソームにより放出される活性物質の量によって左右される。たとえば、Ｙａｔｖｉｎｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２：１２９０（１９７８）に記載のリポソームは、高体温の温度にてリポソームにより輸送される薬剤の一部を放出しただけであった。
【００２２】
本明細書で使用する活性物質の「高体温投与」は、高体温の存在しない条件で活性物質を投与して得られるであろう結果と比較して大量の活性物質を標的部位に配送するために、対象者の予め選択された標的部位における臨床的高体温の使用と併用した活性物質の投与を指す。
【００２３】
本発明のリポソームは、高体温範囲内（たとえば、約３８℃から約４５℃までの範囲）のゲル−液体結晶転移温度を有する脂質を含む。約３８℃〜約４５℃の相転移温度を有するリン脂質が好ましく、アシル基が飽和されているリン脂質がさらに好ましい。特に好ましいリン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である。ＤＰＰＣは、二層転移が４１．５℃の、一般的な飽和鎖（Ｃ１６）リン脂質である。（Ｂｌｕｍｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２：５４３６（１９８３）、Ａｌｂｏｎ ａｎｄ Ｓｔｕｒｔｅｖａｎｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：２２５８）。ＤＰＰＣおよび類似した転移温度または高い転移温度を有し、且つ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）（Ｔｃ＝４１．５℃）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）（Ｔｃ＝５５．１℃）のような）ＤＰＰＣと理想的に混合する他の脂質を含有する熱感受性リポソームについて、研究が行われてきた。ＫａｓｔｕｍｉＩｇａ ｅｔａｌ， Ｉｎｔｌ．Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，５７：２４１（１９８９）、Ｂａｓｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｕｒｏｌｏｇｙ， １３５：６１２（１９８５）、Ｇａｂｅｒ ｅｔａｌ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ． １２：１４０７（１９９５）。ＤＰＰＣおよびコレステロールを含有する熱感受性リポソームも記載されている。Ｄｅｍｅｌａｎｄ ＤｅＫｒｕｙｆｆ， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． ４５７：１０９（１９７６）。
【００２４】
本明細書で使用するリポソーム二重層中の「一次脂質」は、リポソーム二重層物質の主要脂質成分である。したがって、７０モル％のリン脂質および３０％のリゾ脂質を含むリポソーム二重層の場合、リン脂質が一次脂質である。
【００２５】
本発明のリポソームは、リゾ脂質等の、比較的水溶性の界面活性剤を、主として、二鎖リン脂質（たとえば、ＤＰＰＣ）等の比較的水溶性の分子を含む二重層に含む。界面活性剤が一次脂質成分のゲル相に含まれると、一次脂質のゲル−液体結晶相転移温度まで加熱したとき、結果として得られるリポソームからの内容物の放出が増強される。好ましい界面活性剤はリゾ脂質であり、特に好ましい界面活性剤はモノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）である。適切な界面活性剤は、二重層の一次脂質と適合するものであり、且つ脂質が溶解して液相になると脱着するものである。リン脂質二重層に使用するのに適したさらなる界面活性剤としては、パルミトイルアルコール類、ステアロイルアルコール類、パルミトイル、ステアロイル、ポリエチレングリコール、グリセリルモノパルミテート、グリセリルモノオレアート、セラミド類、ＰＥＧ−セラミド類、および治療用脂質などが挙げられる。治療用脂質としては、たとえば、Ｃ−１８エーテル結合リゾホスファチジルコリンなどがある。
【００２６】
本発明の好ましいリポソームは、二重層適合性リゾ脂質をリン脂質二重層に含み、脂質のみを含む（すなわち、リゾ脂質を含まない）リポソームを使用して達成されるであろう内容物の放出と比較して、リポソームからの内容物（たとえば、活性物質または治療薬）の放出を増強するのに十分な濃度のリゾ脂質が二重層中に存在する。内容物は、リポソームの内部に含まれてもよく、リポソーム膜内に含まれてもよい。「増強された放出」は、（ａ）所与の温度において、その温度でリン脂質のみを含む二重層を有するリポソームにより放出される内容物の量と比較して、より大きい割合の内容物が放出されるか、（ｂ）リン脂質のみを含む二重層を有するリポソームを使用したときに内容物の放出が起こるであろう温度より低い温度で、リポソームの内部に捕捉されている内容物が放出されるかのいずれかを意味する。
【００２７】
本発明は、穏やかな高体温を使用した臨床環境で達成することができる温度にて、捕捉されている内容物を放出するリポソームを提供する。本発明は、体温（３７℃）で極めて安定であるが、約３９℃を超えた温度で不安定になり、且つ捕捉されている化合物の増強された放出を示すリポソーム（ＴＨＥＲＭＯＳＯＭＥＳTM）を提供する。この温度範囲は、４２℃より高い温度で顕著な放出を示すに過ぎなかった多くの以前のリポソーム製剤より２〜３℃低い。さらに、本リポソーム製剤の、脂質と適合性リゾ脂質との組み合せは、純粋な脂質のみと比較して、僅かに低いゲル液体結晶相転移温度を有するが、ゲル液体結晶相転移温度はリゾ脂質を含むことにより広がらない、脂質／リゾ脂質混合物を提供する。
【００２８】
本発明の好ましいリポソームは、主として脂質を含み、且つ、リン脂質のみを含む二重層と比較して二重層のゲル液体結晶相転移温度を低下させる量のリゾ脂質を含む、二重層を有する。本発明の特に好ましいリポソームは、一次リン脂質としてのＤＰＰＣおよびリゾ脂質としてのＭＰＰＣを含み、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣの比率は、約９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５、９０：１０から、約８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、または５１：４９までである（モル比による）。
【００２９】
本発明は、狭い温度範囲にわたって活性物質が担体から放出される、脂質担体中の活性物質を配送するための斬新なシステムを提供する。穏やかに高体温の温度（すなわち、３９℃〜４１℃）まで標的部位を局所加熱することにより、活性物質を疾患部位に優先的に配送することが可能である。活性物質をゆっくり放出するにすぎず、熱感受性ではない従来のリポソームと比較して、あるいは、４２℃以上の温度に達するまで活性物質を放出しない熱感受性リポソームと比較して、本リポソームは、高体温と併用して、活性物質を疾患部位に向けて進めるのに適する。
【００３０】
１つの作用理論に拘束されたくないが、本発明者は、主としてリン脂質を含むリポソームからの内容物の放出をリゾ脂質（または他の界面活性剤）が増強する機序は、リゾ脂質は一般に混合ゲル相二重層内で理想的に混合されるが、一次アシル鎖転移温度で（すなわち、一次二重層脂質の転移温度で）二重層が溶解するとすぐにリゾ脂質が膜から脱着するため、微細構造レベル（微細領域境界）で欠陥が生じる方法と関連があると考える。リゾ脂質等の界面活性剤を含めると、リン脂質を含むだけの膜の相転移温度と比較して、リン脂質膜の相転移温度が低下する。ＤＰＰＣおよびＭＰＰＣを含むリポソームの場合、相転移温度は、ゲル相二重層内に含まれるＭＰＰＣの量によって低下し、達成することができる相転移温度の低下は、二重層中に安定して含めることが可能なＭＰＰＣの量によって制限される。ＤＰＰＣを含む膜は、１モル％のＭＰＰＣから、最高約２０モル％のＭＰＰＣまで、リポソーム内に含まれる活性物質等の他の条件によっては、３０モル％のＭＰＰＣ、４０モル％のＭＰＰＣ、あるいは５０モル％のＭＰＰＣでも安定して含むことができる。
【００３１】
リン脂質およびリゾ脂質等の界面活性剤を含むリポソーム二重層の場合、二重層の両相に界面活性剤が含まれることが好ましい。この概念を、ＤＰＰＣおよびＭＰＰＣを含むリポソームを概略的に表す図１に示す。ＭＰＰＣの分子は、リポソーム膜二重層の外相にも内相にも存在する。二重層の１つの相のみに界面活性剤を含むリポソームの場合、ゲル転移温度より高い温度にて時が経つと、（たとえば、液体結晶相において）二重層の両相への界面活性剤の再分配が起こる。
【００３２】
本発明の２（またはそれより多い）成分の相相溶性は、液体二重層構造の処理および安定性に影響を及ぼす。主としてＤＰＰＣ（二鎖リン脂質）を含むリポソームの場合、主要リン脂質の相溶性を最高に高め、且つ狭い溶解範囲を保持するために好ましいリゾ脂質はＭＰＰＣであるが、それは、ＭＰＰＣが１つのアシル鎖のみを有すること以外は二鎖リン脂質と同じであるためである（図１１Ａおよび１１Ｂ）。本発明者は、この二重層相溶性リゾ脂質を低濃度（好ましくは２〜２０モル％）で含めると、ＤＰＰＣのみを含むリポソームと比較して、主としてＤＰＰＣを含むリポソームは、一次脂質が溶解しはじめる点（すなわち、主要相転移の固相線）でさらに「漏出性」になることを発見した。１つの説明に拘束されたくないが、本発明者は、ゲル相二重層は微小結晶領域を含み、温度が脂質二重層のゲル−液体結晶相転移温度に近づくにつれて、微細構造の極微境界において、捕捉されている薬剤の膜透過性が高くなると考える。転移温度において、ゲル相微細構造内に溶解したリゾ脂質の脱着が、膜透過性を高める。相溶性分子をリポソーム二重層内に組み込むさらなる利点は、一次脂質の相転移温度が広がらずに、（二重層中のリゾ脂質濃度に応じて）約１℃以上低下することである。
【００３３】
本発明の混合成分リポソームを形成する方法は、リン脂質、適当な界面活性剤（たとえば、リゾ脂質）、および関心のある活性物質を含むゲル相リポソームの製作を含む。後述の通り、他の相相溶性成分、たとえば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを任意に含めてもよい。本組成物は、二重層が脂質相である場合、処理温度にて、二重層がゲル相である場合、生理学的温度にて、界面活性剤が膜を不安定にしないようなパーセンテージのリゾ脂質を含む。正常なヒト体温より僅かに高い温度で二重層は不安定且つ透過性になり、捕捉されている物質をリポソーム内部から急速に放出する。
【００３４】
本発明によるリポソームは、当技術分野で周知の様々な技術のいずれかによって製作することができる。たとえば、米国特許第４，２３５，８７１号、ＰＣＴ出願公告ＷＯ９６／１４０５７号； Ｎｅｗ ＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬＰｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０），ｐａｇｅｓ ３３−１０４；Ｌａｓｉｃ ＤＤ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， １９９３；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）を参照されたい。当技術分野における従来の方法を使用して、本発明のリポソーム内に活性物質を捕捉することが可能である。本発明の目的を妨げない限り、本発明のリポソーム組成物を製作する際に、酸化防止剤当の安定剤および他の添加物を使用してもよい。
【００３５】
本発明のリポソーム中に含まれる界面活性剤（たとえば、リゾ脂質）の量は、（ゲル相生成物を生成するための冷却前の）リポソームの処理中に生じる液相で、膜を不安定にするのに不十分である。本発明によるリポソームを生成する際に、膜中のリゾ脂質濃度を激減させるであろう濃度勾配を避けるために、液相膜の処理中、リポソーム内外の界面活性剤モノマーの濃度を維持することが好ましい。これは、モノマー型の界面活性剤を十分量含む（たとえば、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の）水性媒体中で、予め混合した混合物からリポソーム懸濁液を調製することによって達成される。
【００３６】
本発明のリポソーム製剤を作る方法は、当技術分野で周知の適当な有機溶剤中で、二重層成分を適切な比率で混合することを含む。次いで、この溶剤を蒸発させて、乾燥した脂質フィルムを生成する。平衡量の界面活性剤および所望の活性物質を含む水溶液を使用して、このフィルムに（脂質混合物の相転移温度より高い温度にて）再度水分を加える。水分を加えた後に生成されるリポソームを押し出し、当技術分野で周知の所望のサイズのリポソームを形成する。たとえば、８０：２０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣを含むリポソームを製造する場合、この脂質混合物の相転移温度（３９℃）より高い温度で、再度水分を加える。脂質フィルムに再度水分を加えるのに使用される水溶液は、リゾ脂質モノマーの平衡量（たとえば、ＭＰＰＣの臨界ミセル濃度に等しい濃度）を含む。
【００３７】
従来のリポソームは、肝臓および脾臓（網内系すなわちＲＥＳの器官）のマクロファージにより速やかに取り込まれるため、血液循環中で半減期が比較的短いという難点があり、したがって、漏出しやすい腫瘍組織に蓄積しない。急速なＲＥＳ取り込みを逃れ、循環時間が増加したリポソーム調製品が考案された。ＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソーム（ＳｅｑｕｕｓＩｎｃ．， ＭｅｎｌｏＰａｒｋ ＣＡ）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされた脂質を脂質二重層中に約５モル％含む。たとえば、Ａｌｌｅｎ，ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ， ８９：４０５（１９８９）； Ａｌｌｅｎｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０６６：２９（１９９１）； Ｋｌｉｂａｎｏｖｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ２６８：２３５（１９９０）； Ｎｅｅｄｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１０８：４０（１９９２）； Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４６０（１９９１）；Ｗｕ ｅｔａｌ．， ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ ５３：３７６５（１９９３）； Ｋｌｉｂａｎｏｖａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｊ． ＬｉｐｏｓｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１（１９９２）； Ｌａｓｉｃａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｉｎ： Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９５）を参照されたい。ポリマーがグラフトされた脂質を小胞膜中に含むリポソームに関する、Ｍａｒｔｉｎらに付与された米国特許第５，２２５，２１２号、Ｚａｌｉｐｓｋｙらに付与された米国特許第５，３９５，６１９号も参照されたい。リポソーム外面上にポリマーが存在すると、ＲＥＳの器官によるリポソーム取り込みが減少する。
【００３８】
ＲＥＳによるリポソーム取り込みを減少させ、その結果、リポソームの循環時間を増加させるために、当技術分野で周知の通り、ポリマーがグラフトされた脂質を含むように、本発明のリポソームを製剤することが可能である。適当なポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、およびポリビニルアルコール等の親水性ポリマーが挙げられる。
【００３９】
活性物質 本明細書で使用される、リポソーム「内部の」活性物質またはリポソーム「内に捕捉された」活性物質は、脂質二重層内に分配されて、小胞膜それ自身の内部に含まれるものと比較して、リポソームの内部空間に含まれるものである。本明細書で使用される、リポソームの脂質二重層「内部の」活性物質または脂質二重層「内に捕捉された」活性物質は、リポソームの内部空間に含まれているのと対照的に、脂質二重層の一部として輸送される。活性物質は、当技術分野で周知の通り、活性物質の水溶液を含むがその限りではない、リポソームに使用するのに適したいずれの形態であってもよい。本発明のリポソーム内の活性物質の水溶液は、所期の対象者の体液と同じ浸透圧であってもよく、高い浸透圧であってもよく（米国特許第５，０９４，８５４号参照）、当技術分野で周知の通り、この水溶液は、沈殿した活性物質を多少含んでもよい。リポソームの内部に封入するのに好ましい活性物質は、水溶性の弱塩基の薬剤である。
【００４０】
ある一定の活性物質（たとえば、麻酔薬）を本発明のリポソーム内に組み込むと、活性物質を含まない類似したリポソームで見られるであろうものと比較して、リポソームからの内容物の放出がさらに変化（増強もしくは抑制）したり、リポソームの転移温度が変化する可能性がある。
【００４１】
所望の標的部位における高体温と熱感受性リポソームを併用したドキソルビシン、シスプラチンおよびメトトレキサート等の抗新生物薬または抗腫瘍薬の投与が報告されている。たとえば、Ｍａｇｉｎａｎｄ ＷｅｉｎｓｔｅｉｎＩｎ： ＬｉｐｏｓｏｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．３， （ＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓＧ．，ｅｄ．）ｐ．１３７， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ（１９９３）； Ｇａｂｅｒｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ． Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｃｓ， ３６（５）：１１７７（１９９６）を参照されたい。
【００４２】
本発明で使用するのに適した活性物質としては、治療薬および薬理学的活性物質、栄養補給用分子、化粧品、診断用剤および画像用造影剤などがある。本明細書で使用される活性物質は、活性物質の薬理学的に許容できる塩類を含む。適当な治療薬としては、たとえば、抗新生物薬、抗腫瘍薬、抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、駆虫薬、および抗寄生虫化合物などが挙げられる。リポソーム製剤に適した親油性薬誘導体の調製方法は当技術分野で周知である（たとえば、治療薬の、リン脂質の脂肪酸鎖への共有結合について記述している、Ａｎｓｅｌｌに付与された米国特許第５，５３４，４９９号を参照）。
【００４３】
腫瘍もしくは新生物成長の治療において、適当な化合物はアントラサイクリン系抗生物質（たとえば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、カリノマイシン、Ｎ−アセチルアドリアマイシン、ルビダゾン、５−イミドダウノマイシン、Ｎ３０アセチルダウノマイシン、およびエピルビシン）および植物アルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、エリプチシンおよびカンプトテシン）を含んでもよい。他の適当な薬剤としては、パクリタキセル（ＴＸＯＬ（登録商標）；イチイの樹皮から単離されたジテルペン類であり、タキサン環構造を有する新しいクラスの治療薬の代表である）およびドセタキソル(docetaxol)（タキソテール）、ミトタン、シスプラチン、およびフェネステリンなどが挙げられる。
【００４４】
本発明に使用するのに適した炎症治療薬としては、ステロイド類および非ステロイド系抗炎症性化合物、たとえば、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、パラメタゾン、１１−フルドロコルチゾール、トリアムシノロン、ベタメタゾンおよびデキサメタゾン、イブプロフェン、ピロキシカム、ベクロメタゾン；メトトレキサート、アザリビン、エトレチナート、ソラリン；アスピリン等のサリチル酸エステル類、およびサイクロスポリン等の免疫抑制薬が挙げられる。抗炎症性コルチコステロイド類および抗炎症性免疫抑制薬サイクロスポリンは共に極めて親油性であり、本発明に使用するに適している。
【００４５】
本発明のリポソームに使用するのに適したさらなる薬理学的物質としては、麻酔薬（たとえば、メトキシフルラン、イソフルラン、エンフルラン、ハロタン、およびベンゾカイン）、抗潰瘍薬（たとえば、シメチジン）、バルビツール酸塩等の抗痙攣薬、アゾチオプリン（免疫抑制薬および抗リウマチ薬）、筋弛緩薬（たとえば、ダントロレンおよびジアゼパム）などがある。
【００４６】
本リポソーム調製品に使用するのに適した撮像剤としては、超音波造影剤、放射性造影剤（たとえば、放射性同位元素または放射性同位元素を含有する化合物、ヨードオクタン類、ハロカーボン類、およびレノグラフィン）、または磁気造影剤（たとえば、常磁性化合物）などがある。
【００４７】
本発明のリポソームに組み込むのに適した栄養剤としては、香味化合物（たとえば、シトラール、キシリトール）、アミノ酸類、糖類、タンパク質、炭水化物、ビタミン類および脂肪などがある。栄養剤の組み合せも適する。
【００４８】
投与およびリポソームサイズ リポソームの、対象者の血流中への配送または皮下投与を含むがその限りではない当業者に周知の方法を使用して、本発明のリポソームを投与することが可能である。本発明によるリポソームが高体温と一緒に使用される場合、リポソームを治療部位に配送する結果となる任意の適当な方法でリポソームを投与することが可能である。たとえば、リポソームを静脈内投与し、それによって、正常な血流により腫瘍の部位に導くことが可能である。この部位を加熱すると、リポソーム膜が相転移温度に加熱され、その結果、腫瘍の部位にてリポソーム内容物が優先的に放出される。
【００４９】
腫瘍または新生物の治療が望ましい場合、リポソームに封入された活性物質の血流を介した効果的な配送には、リポソームが連続した（しかし「漏出性の」）内皮層、およびその下にある、腫瘍に血液を供給する血管を取り囲む基底膜を貫通できることが必要である。小さいサイズのリポソームは、内皮細胞関門、および下にある、毛細管を腫瘍細胞と隔てる基底膜を通って腫瘍中に浸出する時に有効なことが確認されている。たとえば、Ｍａｒｔｉｎらに付与された米国特許第５，２１３，８０４号を参照されたい。
【００５０】
本明細書で使用される「充実性腫瘍」は、（白血病等の、血液原性腫瘍と対照的に）血流以外の解剖学的部位で成長するものである。充実性腫瘍は、成長している腫瘍組織に栄養を与えるために、小血管および毛細管の形成を必要とする。
【００５１】
本発明によれば、選り抜きの抗腫瘍薬または抗新生物薬が本発明によるリポソーム内に捕捉され、このリポソームは、内皮関門および基底膜関門を貫通することが判っているサイズになるように調剤される。このようにして得られるリポソーム製剤を、このような治療を必要としている対象者に、非経口的に、好ましくは静脈内投与により、投与することができる。腫瘍成長領域内の血管系の透過性の急性増大を特徴とする腫瘍が、本方法による治療に特に適する。リポソームの投与に続いて、リポソーム内容物を放出する結果になる温度まで、治療部位を加熱する。
【００５２】
炎症の部位特的治療が望ましい場合、活性物質の効果的なリポソーム配送には、リポソームが長い血液半減期を有すること、ならびに連続した内皮細胞層、および下にある、炎症部位に近接する血管を取り囲む基底膜を貫通できることが必要である。小さいサイズのリポソームは、内皮細胞関門を通って関連した炎症領域に内に浸出する時に有効なことが確認されている。たとえば、Ｗｏｏｄｌｅらに付与された米国特許第５，３５６，６３３号を参照されたい。本発明によれば、選り抜きの抗炎症薬が本発明によるリポソーム内に捕捉され、このリポソームは、内皮関門および基底膜関門を貫通することが判っているサイズになるように調剤される。このようにして得られるリポソーム製剤を、このような治療を必要としている対象者に、非経口的に、好ましくは静脈内投与により、投与することができる。炎症領域内の血管系の透過性の急性増大を特徴とし、且つ温度の局所上昇を特徴とする炎症が、本方法による治療に特に適する。
【００５３】
さらに、本発明のリポソームを使用して、血流を介して抗感染薬を感染部位に配送できることも十分に理解されるであろう。ＰＣＴ特許出願公告ＷＯ９３／１９７３８号には、親水性ポリマーを用いて誘導される小胞形成性脂質を含み、且つ０．０７〜０．２μｍの範囲のサイズを有するリポソームが記載されている。
本発明によれば、本発明による膜を有するリポソーム内に選り抜きの抗感染薬が捕捉され、結果として得られるリポソーム製剤が対象者に非経口的に、好ましくは静脈内投与により、投与される。必要に応じて、感染部位にて局所高体温を誘導し、その部位にて、リポソーム内容物を優先的に放出させることが可能である。
【００５４】
調製物におけるリポソームのサイズは、中に含まれる活性物質および／または所期の標的によって異なってもよい。直径０．０５〜０．３μｍのリポソームは、腫瘍投与に適していると報告されている（Ａｌｌｅｎらに付与された米国特許第５，５２７，５２８号）。当技術分野で周知の方法に従って、また、中に含まれる活性物質および所望の作用を考慮に入れて、本発明によるリポソームのサイジングを実施することが可能である（たとえば、Ｍａｒｔｉｎらに付与された米国特許第５，２２５，２１２号、Ａｌｌｅｎらに付与された米国特許第５，５２７，５２８号を参照）。本発明の好ましい実施形態は、直径１０μｍ未満のリポソーム、または直径１０μｍ未満の複数のリポソームを含むリポソーム調製物である。本発明のさらに好ましい実施形態では、リポソームは直径約０．０５μｍまたは約０．１μｍから、直径約０．３μｍまたは約０．４μｍまでである。リポソーム調製物は、異なるサイズのリポソームを含んでもよい。
【００５５】
本発明の別の好ましい実施形態では、リポソームは、直径約５０ｎｍ、１００ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍまたは１５０ｎｍから、約１７５ｎｍ、１８０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍまでである。
【００５６】
本発明の１つの態様では、選択されたサイズ範囲内で、実質的に一様なサイズを有するように、リポソームを調製する。１つの効果的なサイジング方法は、選択された孔の大きさを有する一連のポリカーボネート膜を通過させてリポソームの水性懸濁液を押し出すことを含み、膜の孔の大きさは、膜を通して押出されることにより生じるリポソームの最大サイズとおおよそ一致する。たとえば、米国特許第４，７３７，３２３号（１９８８年４月１２日）を参照されたい。
【００５７】
本発明のさらなる態様では、リポソームの水性調製物を提供するために、リポソームを生理食塩水またはＰＢＳ中に分散する。界面活性剤がリポソーム二重層から溶液中に失われるのを減少させるかまたは防止するために、水性調製物は、リポソーム二重層に含まれる平衡量の界面活性剤をさらに含んでもよい。ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣを含むリポソームは、約１ｍＭ〜約５ｍＭのＭＰＰＣモノマーを含む生理食塩水またはＰＢＳ中に含まれてもよい。
【００５８】
本発明によるリポソーム内に捕捉されるか、本発明によるリポソームにより輸送される有効物質の量は、当業者に明白になるであろうが、治療用量および活性物質の単位用量によって変化する。しかし、一般に、本発明のリポソーム調製物は、可能な活性物質の最大量がリポソームによって輸送されるように設計される。本発明のリポソームは、どんなタイプのものであってもよいが、ＬＵＶが特に好ましい。
【００５９】
リポソーム内容物の放出の評価 捕捉された蛍光プローブ、６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の放出による熱感受性リポソームの特性決定が、Ｍｅｒｌｉｎ，Ｅｕｒ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２７（８）：１０３１（１９７９）に報告されている。消光濃度（５０ｍＭ）にてＣＦをリポソーム内に捕えると、リポソーム内に捕捉されたＣＦに関する蛍光は全く認められなかった。しかし、ＣＦが懸濁液で希釈されることによりプローブがリポソームから放出されると、強い蛍光が現れた。このようにして、様々な温度でリポソームから放出されるプローブの量を、蛍光に基づいて定量することが可能である。Ｍｅｒｌｉｎ，Ｅｕｒ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．， ２７（８）：１０３１（１９７９）は、ドキソルビンシン（ＤＸ）を封入している熱感受性リポソームについて研究し、従来の熱感受性リポソームと比較して、血流中での循環時間を増加させるために、二重層中にＰＥＧを付加した(pegylated)脂質を組み込んだ。Ｍａｒｕｙａｍａｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １１４９：１７（１９９３）も参照されたい。
【００６０】
以下の実施例は、本発明を説明するために述べるものであって、本発明を制限するものと考えてはならない。
【００６１】
例１温度感受性リポソームの調製 様々なモル濃度のリゾ脂質モノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）を含むＤＰＰＣリポソームを調製して特性決定した。膜透過性変化に関するマーカーの役割を果たすために、水性蛍光プローブ６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を、リポソーム内に捕えた。当技術分野で周知の方法を使用して、リポソーム内にＣＦを組み込んだ（たとえば、Ｌｉｐｏｓｐｍｅｓ：Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（１９９０）， Ｅｄｉｔｏｒ： Ｒ．Ｒ．Ｃ． Ｎｅｗ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＮＹを参照されたい）。リポソーム成分をクロロホルム（適当な有機溶剤）に溶解し、回転式蒸発器を使用して、真空下、４５℃にて溶剤を蒸発させ、丸底フラスコの内壁上に、脂質の均質な薄いフィルムを形成した。脂質フィルムを、真空下で、さらに２５時間乾燥させ、確実に、痕跡量のクロロホルムを完全に除去した。
【００６２】
５０ｍＭのＣＦおよび１ｍＭのＭＰＰＣを含む１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）の水溶液で、４５℃にて、この脂質フィルムに水分を補給した。効率的に水分補給をするために、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズを使用して、水性媒体の存在下で脂質を穏やかに腐食し、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）の濁った懸濁液を生成した。このようにして生成されたＭＬＶは、７００ｎｍという平均サイズを有しており、Ｈｏｐｅｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ８１２：５５−６５（１９８５））によって開発された方法に説明されている通りに、３００〜４００ｐｓｉの圧力下、４５℃にて（すなわち、脂質もしくは脂質混合物のゲル−液体結晶温度より高い）、０．１μｍの２つのポリカーボネート膜フィルターのスタックを通して押し出すと、所望の１４０ｎｍサイズの押出技術による大型単ラメラ小胞（ＬＵＶＥＴ）が得られた。各押出通過後に、ＰｈｏｔｏｎＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＰＣＳ， Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｎ４ ｐｌｕｓ）で小胞の平均直径を測定した。
【００６３】
図２からわかるように、リポソームのサイズは、連続した膜通過と共に減少し、３回通過後に最小サイズに達した。
【００６４】
リポソーム内容物の放出 ＰＢＳの存在下、インキュベーション温度（２５〜４５℃）の関数として、捕捉された水溶性蛍光分子（ＣＦ）の、小胞の水性内部から周囲の溶液への％放出を測定することにより、例１に記載の通りに調製された、様々なモル分率のＭＰＰＣを含むリポソーム製剤のｉｎｖｉｔｒｏ安定性および熱感受性を評価した。リポソーム内に捕えられたＣＦの蛍光は、高濃度のために自己消光したが、リポソームから放出されて懸濁媒体で希釈されると、ＣＦは強い蛍光を発した。インキュベーション後、リポソームから放出されたＣＦの量を決定するために適当に希釈した後、励起波長（λｅｘ）=４７０ｎｍおよび発光波長（λｅｍ）＝５２０ｎｍにて試料の蛍光強度を測定した。１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えることにより、リポソーム試料を崩壊した後に得られる、捕えられた物質の放出総量と比較することによって、個々の温度におけるインキュベーションによる相対的％蛍光強度を算出した。
【００６５】
純粋なＤＰＰＣを含むリポソームおよび２、４、６、８、１０または２０モル％のＭＭＰＣを含むＤＰＰＣ：ＭＣＣＰ混合物を含むリポソームについて、２０℃〜４５℃の温度範囲全域で、この実験を実施した。
【００６６】
生理学的温度（３７℃）および高体温温度（４０℃）で、本発明のリポソームから時間の関数として放出された、捕えられたＣＦの量を測定した。リポソームを、ＰＢＳ中で様々な時間間隔でインキュベートし、蛍光強度測定法により、λｅｘ=４７０ｎｍおよびλｅｍ＝５２０ｎｍにてＣＦの放出を測定した。９０：１０ ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ組成物の代表的な加熱を図３に示す。３７℃で、ＣＦの％放出は無視できるほど僅かであった。しかし、４０℃でインキュベーションを続けると、捕えられたＣＦの約６０％が５分以内に放出され、この温度でさらにインキュベーシトしたとき、さらなる内容物の放出は、僅かに増加しただけであった。したがって、所与の温度で、加熱の５〜１０分以内に、内容物のほとんどが放出される。
【００６７】
図４は、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）の存在下、２０℃〜４０℃の温度で５分間インキュベートしたリポソームからのＣＦの放出を示す図である。蛍光強度測定法により、λｅｘ=４７０ｎｍおよびλｅｍ＝５２０ｎｍにて、ＣＦの放出を測定した。得られた値を、ＣＦの全放出（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をリポソーム試料に加えてリポソームを溶解し、捕えられた全てのＣＦを放出させることにより実行される）後に得られる値と比較することにより、放出されたＣＦの％を算出した。純ＤＰＰＣリポソームは３９．５℃まで安定であったが、リン脂質の転移温度付近で透過性になり、ＣＦの一部の放出を引き起こした。しかし、純ＤＰＰＣリポソームから放出されたＣＦの量は、全内容物の約２０％に過ぎなかった。対照的に、ＤＰＰＣ二重層中のＭＰＰＣ濃度が上昇するにつれて、リポソームはＣＦの放出増加を示し、１０モル％および２０モル％のＭＰＰＣを含む二重層を有するリポソームで、最大の放出が起きた。
【００６８】
以上の結果から、１０モル％という少量のＭＰＰＣをＤＰＰＣリポソームの膜イ組み込むと、放出されるＣＦの量は、（ＤＰＰＣのみのリポソームで見られる放出と比較して）４という係数で増加することがわかる。
【００６９】
放出開始温度が僅かに低い温度に移動し、１０モル％および２０モル％のＭＰＰＣを含むリポソームの場合、約３８℃で開始するため、温度放出プロフィールから、ＭＰＰＣをＤＰＰＣリポソーム膜に組み込むさらなる利点もわかる。これらのリポソームでは、放出プロフィーが鋭く、１℃程度、すなわち、１０％ＭＰＰＣリポソームの場合、３８．５℃〜４０℃の間の温度上昇後に最大量のＣＦが放出される。
【００７０】
以上の実験から、ＤＰＰＣで作られたリポソーム二重層にＭＰＰＣを含めると、リポソームの内部から放出される内容物の量が増加し、放出が起きる温度範囲が、穏やかな高体温範囲である３８．５℃〜４０℃の範囲に移動することがわかる。
【００７１】
２０モル％を超えるＭＰＰＣ濃度を含むＤＰＰＣリポソームでは、リポソームは本質的に不安定になり、したがって、脂質相転移より高い温度で（すなわち、リポソームの処理中に生じる脂質二重層の液相で）、捕えられた物質を保持できなくなる。このように高濃度のＭＰＰＣは、転移温度より低い温度で、ゲル相二重層も不安定にする可能性がある。先に示した通り、ＭＰＰＣが多く含まれるにつれて、膜の機械的強度が低下し（Ｎｅｅｄｈａｍｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７３：２６１５（９９７））、リン脂質に対するＭＰＰＣのモル比が５０モル％を超えると、二重層は、ついには純粋なミセル懸濁液に変化する（Ｚｈｅｌｅｖｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．（印刷中、１９９８））。熱感受性リポソームの１つの好ましい比率は、９０：１０ ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣである。
【００７２】
例３ＤＰＰＣ／ＭＰＰＣ混合物の相転移挙動および放出温度との相関関係 本発明のリポソームの透過性に関係した生物物理学的機序を研究するために示差走査熱量測定（ＤＳＣ）研究を実施し、本リポソームの示唆熱量測定的サーモグラムを作成して、相転移温度を決定した。これらの結果を、累積放出プロフィール（図４に示す）から得られる放出対温度走査と比較した。図５Ａおよび５Ｂは、ＤＰＰＣ二重層中に含まれるＭＰＰＣ濃度が増加するリポソーム調製物に関する熱移動サーモグラムを表す図である。これらのサーモグラムから、最高１０％のＭＰＰＣが二重層に含まれても、転移温度は依然として広がらないままであったことがわかる。より高いレベルの分析では、図５Ｂは、ＤＰＰＣ二重層におけるＭＰＰＣ組成が零から１０モル％に増加すると、転移温度のピークが４１．９℃から４１．０４℃まで変化することを示す。転移の開始点と終点、すなわち過剰の熱移動ピーク線より下および上の固相線および液相線として表される転移の幅も示す。
【００７３】
本発明の示差走査サーモグラムを、示差放出プロフィールと比較することが可能である。図６Ａは、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ９０：１０リポソームからの累積放出プロフィール対温度、および同じ温度範囲に関する熱移動サーモグラムを示す図である。図６Ｂは、放出プロフィールの鋭さおよび熱移動サーモグラムに関連して最大放出が起きる温度を強調する、示差放出を示す図である。この比較に関して顕著なものは、示差放出プロフィールから得られた内容物のピーク放出が、ＤＳＣで得られた転移エンタルピーにおけるピークより０．９℃低かったことである。Ｔｃ以前の温度における捕えられた物質の放出は、ピーク温度ではなくサーモグラムの「固相」線で放出が起きていることに原因があると考えられる。このような挙動の１つの理由は、二重層ネットワークの微小領域境界に「第1の欠陥」（溶解欠陥）が出現するとすぐに、捕えられた物質の放出が起きることである。１つの理論に拘束されたくないが、本発明者は、転移温度が近づくと、溶解する微小構造の第1の部分は、固体膜の粒状境界にあると推測する。リゾ脂質を含まない水性層に取り囲まれると、リゾ脂質はゲル層内に捕捉されるが、膜が溶解し始めると脱着することができる。そうすると、欠陥透過性を強化し、純粋な脂質のみのリポソームより効果的に内容物が放出される。
【００７４】
例４ドキソルビシンの捕捉および放出 ｐＨ勾配駆動封入プロトコール（Ｌ．Ｄ． Ｍａｙｅｒｅｔ ａｌ（１９８９）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．， ４２：４７３４）を使用して、本発明のリポソーム（ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ９０：１０）の内部水性容量内にドキソルビシン（ＤＸ）を捕捉した。簡単に説明すると、９０：１０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣの脂質組成物をクロロホルムに溶解し、真空下、４５℃で、回転式蒸発器を使用して、溶剤を蒸発させた。さらに真空デシケータ内で一晩乾燥させた後で得られる脂質フィルムに、３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．００）で水分補給し、生じた多重ラメラ小胞を、５０℃にて、３００〜４００ｐｓｉの圧力を使用して、孔の大きさが０．１μＭの２つのポリカーボネート膜フィルターを通過させて押し出した。押し出されたリポソームを室温まで冷却し、０．５ＭＮａ2ＣＯ3溶液を使用して、ｐＨを７．５〜８．０に上げた。
【００７５】
押し出されたリポソームを６０℃で５分間インキュベートした後、その懸濁液に、予熱したＤＸを加えた。さらに、間欠的に渦巻き攪拌しながら、試料を６０℃にて１０分間加熱した。捕えられなかった薬剤を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ゲルを使用したミニカラム遠心分離により除去した。
【００７６】
ＰＢＳの存在下、３７℃および４０℃における、時間の関数としての、ＤＸのリポソームからの放出、ならびに、２５〜４５℃の間の様々な温度における、捕えられたＤＸのリポソームからの累積放出プロフィールにより、ＤＸを捕えたリポソームを特性決定した。図７は、３７℃および４０℃における、捕えられたＤＸのリポソームからの放出を、時間の関数として表す図であり、リポソームを３７℃および４０℃で３０分間インキュベートし、適当に希釈した後、λｅｘ＝４７０ｎｍおよびλｅｍ＝５８５ｎｍで、放出されたＤＸの蛍光強度を測定した。これらの値を、６−カルボキシフルオレセイン（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をリポソーム試料に加えることにより得られる）の放出総量に関する値と比較することによって、％放出を算出した。図７からわかる通り、３７℃にて３０分インキュベートした後、ＤＸの約１４％が放出され、４０にて３０分インキュベートした後、ＤＸの７３％が放出された。
【００７７】
図８に示す通り、ＣＦを使用した上記研究（例１〜３）の場合と同様、２５〜４５℃の間の様々な温度で試料を５分間インキュベートし、放出されたＤＸを蛍光強度測定法で測定することにより、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ９０：１０リポソームに捕えられたＤＸの累積放出を測定した。結果から、３９℃までは、ＤＸの約２３％を放出し、４０℃で６５％の放出を達成することがわかった。
【００７８】
例５リポソーム二重層におけるＰＥＧ包含 本発明のリポソームを改変して、ＲＥＳにより認識されにくくし、その結果、それらの血液循環中における半減期を高めた。
【００７９】
５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（分子量２０００）をリポソーム組成物中に組み込むことにより、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ ９０：１０を含むリポソームの表面を改変した（図１１Ｃ）。したがって、これらのリポソームの改変された組成物は、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（８５．９３５：９．５４５：４．５２０）であった。
【００８０】
例６リポソーム内容物の放出に与える体液の影響 ＰＢＳまたは５０％ウシ血清のいずれかが存在する条件下、水性内部リポソーム領域内に捕えられたＣＦの放出プロフィールを研究することにより、例５に記載の、表面が改変されたリポソームを特性決定した。例３に記載の通りに、放出されたＣＦの蛍光強度をλｅｘ＝４７０ｎｍおよびλｅｍ＝５２０ｎｍで測定し、％放出を算出した。
【００８１】
図９Ａは、ＰＢＳの存在下、３７℃および４０℃で、捕えられたＣＦの時間の関数としての放出を示す図である。図９Ｂは、５０％ウシ血清の存在下、３７℃および４０℃で、捕えられたＣＦの時間の関数としての放出を示す図である。本発明の、表面が改変されたリポソーム製剤は、ＰＢＳおよび血清の存在下、生理学的温度（３７℃）で安定であり、それぞれ、１％および７％のＣＦ放出を示した。しかし、これらのリポソームを４０℃でインキュベートすると、５分間インキュベートした後、捕えられたＣＦの６４％（ＰＢＳ中）および７６％（血清中）の放出を示し、３０分間インキュベートした後、７７％（ＰＢＳ中）および９２％（血清中）の放出を達成した。ＰＢＳおよび５０％ウシ血清の存在下、捕えられたＣＦのリポソームからの累積放出プロフィ−ルは、それぞれ５８％および７３％の放出を示した（図１０）。１つの理論に拘束されたくないが、血清の存在下で増強されたＣＦ放出は、血清中のある特定の低分子量血液成分とリポソーム表面との相互作用に原因があると考えることができた。
【００８２】
前述の例は本発明を説明するものであって、本発明を制限するものと考えてはならない。本発明は、上記のクレーム、および中に含まれるクレームの等価物により記載される。
【図１】
2010138200.tif 000003
【図２】
2010138200.tif 000004
【図３】
2010138200.tif 000005
【図４】
2010138200.tif 000006
【図５Ａ】
2010138200.tif 000007
【図５Ｂ】
2010138200.tif 000008
【図６Ａ】
2010138200.tif 000009
【図６Ｂ】
2010138200.tif 000010
【図７】
2010138200.tif 000011
【図８】
2010138200.tif 000012
【図９Ａ】
2010138200.tif 000013
【図９Ｂ】
2010138200.tif 000014
【図１０】
2010138200.tif 000015
【図１１Ａ】
2010138200.tif 000016
【図１１Ｂ】
2010138200.tif 000017
【図１１Ｃ】
2010138200.tif 000018