(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病性網膜症の予防的および治療的処置のための方法、および眼炎症の予防的および治療的処置のための方法を提供する。【解決手段】糖尿病性網膜症または眼炎症をそれぞれ予防的または治療的に処置するのに十分な量のタンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターを、動物（例えば、哺乳動物、特にヒト）へ投与すること。タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターは、好ましくはゲニステインあるいはそのアナログまたはプロドラッグ、あるいは前述のもののいずれかの薬学的に受容可能な塩である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性網膜症の動物を予防的または治療的に処置する方法であって、該糖尿病性網膜症の動物を予防的または治療的に処置するのに十分な量のタンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターを、該動物へ投与することを含む、方法。
【請求項２】
眼炎症の動物を予防的または治療的に処置する方法であって、該眼炎症の動物を予防的または治療的に処置するのに十分な量のタンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターを、該動物へ投与することを含む、方法。
【請求項３】
タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターが、式
【化１】
2010168389.tif 000004
〔ここでＶ、ＷおよびＸは、ヒドロ、アルコキシ、ヒドロキシル、ハロ、エステル、エーテル、カルボン酸基、カルボン酸基の薬学的に許容し得る塩、および−ＳＲ（ここでＲは水素またはアルキル基である）からなる群より選択され、Ｙは、酸素、硫黄、Ｃ（ＯＨ）、およびＣ＝Ｏからなる群より選択され、Ｚは、ヒドロおよびＣ（Ｏ）ＯＲ1（ここでＲ1はアルキルである）からなる群より選択される。〕の化合物、あるいはそのタンパク質チロシンキナーゼを阻害するプロドラッグまたは薬学的に許容し得る塩である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ハロ基が、フッ素、塩素および臭素からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
エステルがＣ1−Ｃ6エステルである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
エーテルがＣ1−Ｃ6エーテルである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
カルボン酸基の薬学的に許容し得る塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
アルキル基がＣ1−Ｃ6アルキル基であり、アルコキシ基がＣ1−Ｃ6アルコキシ基である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターがゲニステインである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ゲニステインが全身投与される、請求項１および３〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ゲニステインが約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ゲニステインが約１５ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ゲニステインが経口または注射によって投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ゲニステインが糖尿病前症性網膜症期に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ゲニステインが非増殖性糖尿病性網膜症期に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ゲニステインの投与が糖尿病性黄斑浮腫を予防する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ゲニステインの投与が糖尿病性黄斑浮腫を処置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ゲニステインが増殖性糖尿病期に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
増殖性糖尿病期の間の新血管形成の間に発生した瘢痕組織を眼から外科的に除去する前、その間またはその後に、ゲニステインが投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
眼炎症が疾患由来のものである、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
眼炎症が細菌感染またはウイルス感染由来のものである、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
眼炎症が眼手術由来のものである、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
眼手術が、白内障手術、網膜手術、屈折矯正手術、または角膜手術である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
角膜手術が角膜移植である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
角膜移植が角膜移植片拒絶反応を生じる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
眼炎症が非糖尿病性黄斑浮腫である、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ゲニステインが、局所的、結膜下、眼球後方、眼周辺、網膜下、脈絡膜上または眼内に投与される、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ゲニステインが、合計約０．１ｍｇ〜合計約５ｍｇの量で眼内投与される、請求項３〜９および２０〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ゲニステインが、合計約０．５ｍｇ〜合計約１ｍｇの量で眼内投与される、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、糖尿病性網膜症の予防的および治療的処置のための方法、および眼炎症の予防的および治療的処置のための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
米国において１４００万を超える人々が糖尿病に罹患している。糖尿病に罹患している全ての人々は、網膜合併症の危険がある。しかし、Ｉ型、すなわちインスリン依存性糖尿病の人々は、ＩＩ型、すなわち非インスリン依存性糖尿病の人々に比べて、重い視力低下(vision loss)のより高い危険に直面している。
【０００３】
最初に、糖尿病の人々における高い血液グルコースレベルは、彼らの眼において成長因子の増加を引き起こす。この状態は、「糖尿病前症性網膜症期」として知られ、予防的に処置されなければ網膜症に至ることがある。
【０００４】
網膜症は、大部分の糖尿病の人々に、生涯にわたってかなりの程度悪影響を与える（Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ，ＭＭＷＲ  ４２（１０）：１９１−１９５（１９９３））。それは、現在２０〜７４歳の米国人における失明の主要な原因であり、米国における糖尿病の人々の約３分の１において視力を悪化させると予想されている。米国において各年、４０，０００ほどの新規な失明のケースが、糖尿病の人々の間で生じている（ＣＤＣ、未発表データ、１９９３）。糖尿病の人々は、一般人口よりも２５倍網膜症によって失明しやすい。
【０００５】
糖尿病性網膜症は、２期、すなわち、非増殖性期（これは、典型的には最初に生じる）および増殖性期を有する。非増殖性期、これは「背景糖尿病性網膜症」とも呼ばれ、基底膜の肥厚、網膜周細胞の損失、微小血管異常、網膜内毛細血管瘤、網膜出血（「ドットブロット(dot blot)」出血としても知られている）、網膜浮腫（特に糖尿病性黄斑浮腫）、網膜虚血または網膜灌流の低下に関連した毛細血管閉鎖（すなわち、血管発達の不全）ならびに軟性白斑および硬性白斑によって特徴付けられる。増殖性期、これは概算で７００，０００の米国人に悪影響を与えており（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｉｓｓ．Ｓｔａｔｅ  Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．３６（７）：２０１−２０８（１９９５））、網膜または網膜もしくは乳頭の内表面上の視神経から、あるいは硝子体腔内への新血管形成および線維血管(fibrovascular)成長（すなわち、神経膠要素および線維要素を含む瘢痕）によって特徴付けられる。
【０００６】
増殖性期は、ルベオーシス(rubeotic)緑内障または新血管形成緑内障へと至ることがある。黄斑浮腫は、いずれの期でも起こり得、網膜新血管形成からの合併症と共に、糖尿病に関連する視力低下を引き起こす２つの主要な網膜の問題である。
【０００７】
糖尿病性網膜症の病理学期は十分に説明されているが、糖尿病性網膜症に内在する分子現象は、あまり理解されていない。これは、一部には、この疾患が個人間で差はあるが１０〜３０年に渡って進行するという事実による。
【０００８】
血糖および高血圧の厳重な制御ならびに糖尿病の眼科スクリーニングは、この疾患を予防するのに有益のようである。現在の処置は、眼科医による定期的な観察、レーザー光凝固および硝子体切除からなる。
【０００９】
眼炎症（例えば、黄斑浮腫）は、疾患、細菌感染またはウイルス感染、眼手術（これは白内障手術、網膜手術、屈折矯正手術、および角膜手術（例えば、角膜移植）を含む）などの結果として起こり得る。眼炎症はまた、角膜移植片拒絶反応の結果として起こり得る。
【００１０】
眼炎症は、現在コルチコステロイドによって処置される。このような処置の不利な点は、白内障、眼内圧の増加、角膜溶融、全身性合併症、高血圧、大腿骨先端部の無菌壊死、心臓血管疾患、顔面の毛および多くのその他のものである。非ステロイド抗炎症性化合物もまた、投与される。このような化合物の不利な点としては、特定の血液疾患、消化性潰瘍、胃痛(gastric distress)、および出血を伴う血小板機能不全、ならびにその他のものが挙げられる。黄斑中心に脅威を与えるかまたはそれを含む黄斑浮腫は、病巣黄斑光凝固を用いて処置される。小さな（直径５０μｍ）中強度のレーザーバーンは、黄斑の漏出領域を標的とする（Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｍｅｒ．Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ５１（４）：７８５−７９６（１９９５））。黄斑浮腫が残存する場合、再処置が必要なときもある。
【００１１】
重いか非常に重い非増殖性網膜症に罹患している患者、および増殖性網膜症の危険性が高いか、あるいは初期のまたは進行した増殖性網膜症に既に罹患している患者は、散乱または汎網膜光凝固を用いて処置される。汎網膜光凝固は、網膜の中央周辺部および周辺部に１，５００〜２，０００のレーザーバーン（これは直径５００μｍである）を含む（Ｍｕｒｐｈｙ（１９９５）、前出）。
【００１２】
糖尿病の微小血管合併症の発症に関する最もよく実証された生化学的機構は、ソルビトール経路である。ソルビトール経路では、酵素であるアルドースレダクターゼは、グルコースのソルビトールへの変換およびガラクトースのガラクチトールへの変換を触媒する。アルドースレダクターゼは、グルコースに対して低い基質親和性を有する。従って、グルコース濃度が正常である場合、この経路は不活性である。高血糖症の間、ソルビトール経路は活性になる。ソルビトール経路の活性化は、網膜周細胞にとって重要であり、例えば、これはグルコース浸透のためにインスリンを必要としない。同様に、網膜毛細血管細胞は、十分な量のアルドースレダクターゼを含むようである（Ｆｅｒｒｉｓ，Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ ：７９−８９（１９９３））。
【００１３】
糖尿病性網膜症および眼炎症の高い罹患率を考慮すると、糖尿病性網膜症および眼炎症の有効な予防的および治療的処置の必要性が依然としてある。従って、本発明の主要な目的は、糖尿病性網膜症を予防的および治療的に処置するための方法（糖尿病前症性網膜症期、非増殖性糖尿病性網膜症期、および増殖性糖尿病性網膜症期での処置を含む）を提供することである。本発明の別の主要な目的は、眼炎症（例えば、黄斑浮腫（例えば、疾患、細菌感染またはウイルス感染、あるいは眼手術（例えば、白内障手術、網膜手術、屈折矯正手術、および角膜手術（例えば、角膜移植）など、とりわけ角膜移植片拒絶反応）に関連するもの））を予防的および治療的に処置するための方法を提供することである。本発明のこれらおよび他の目的は、本明細書中で提供する詳細な説明から明らかとなる。
【００１４】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、糖尿病性網膜症の予防的および治療的処置のための方法（糖尿病前症性網膜症期、非増殖性糖尿病性網膜症期、および増殖性糖尿病性網膜症期での処置を含む）に関する。本発明はまた、眼炎症の予防的および治療的処置のための方法に関する。本方法は、タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターの投与を含む。好ましくは、タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターは、以下の式の化合物である：
【００１５】
【化１】
2010168389.tif 000002
【００１６】
ここでＶ、ＷおよびＸは、ヒドロ、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、エステル、エーテル、カルボン酸基、カルボン酸基の薬学的に許容し得る塩、および−ＳＲ（ここでＲは水素またはアルキル基である）からなる群より選択され、Ｙは、酸素、硫黄、Ｃ（ＯＨ）、およびＣ＝Ｏからなる群より選択され、Ｚは、ヒドロおよびＣ（Ｏ）ＯＲ1（ここでＲ1はアルキルである）からなる群より選択される。好ましくは、アルコキシはＣ1−Ｃ6アルコキシである。好ましくは、ハロは、フッ素、塩素または臭素である。好ましくは、エステルはＣ1−Ｃ6エステルである。好ましくは、エーテルはＣ1−Ｃ6エーテルである。好ましいカルボン酸基の薬学的に許容し得る塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられる。好ましくは、アルキル基はＣ1−Ｃ6アルキル基である。望ましくは、タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターはゲニステイン(genistein)である。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、チロシンリン酸化が非虚血性微小血管糖尿病性網膜症の初期において増加すること、およびタンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビター、特にゲニステインが糖尿病性網膜症の予防に有効であるという知見を根拠とする。従って、本発明は、糖尿病性網膜症の予防的および治療的処置のための方法（糖尿病前症性網膜症期、非増殖性糖尿病性網膜症期、および増殖性糖尿病性網膜症期での処置を含む）を提供する。さらに、本発明は、眼炎症の予防的および治療的処置のための方法を提供する。「予防的」とは、糖尿病性網膜症（特に、糖尿病性黄斑浮腫）または眼炎症に対する全体的または部分的保護を意味する。「治療的」とは、糖尿病性網膜症または眼炎症自体の改善、およびさらなる糖尿病性網膜症または眼炎症に対する全体的または部分的保護を意味する。眼炎症の予防的および治療的処置のための本発明の方法は、疾患、細菌感染またはウイルス感染、あるいは眼手術（例えば、白内障手術、網膜手術、屈折矯正手術、および角膜手術（例えば、角膜移植）など、とりわけ角膜移植片拒絶反応）による眼炎症（例えば、黄斑浮腫）の処置に特に有用である。この点に関して、本発明の方法はまた、例えば、白内障後またはレーザー嚢切開術に関連した網膜浮腫（Ｉｒｖｉｎｅ−Ｇａｓｓ症候群）、ぶどう膜炎、分岐または中央静脈の閉塞、局所的なエピネフリンの使用、重症高血圧、放射線網膜症、周中心窩末梢血管拡張症(telangectasia)および網膜色素変性の処置に有用である。
【００１８】
本方法は、眼炎症または網膜症の網膜を予防的または治療的に処置するのに十分な量の、タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターを投与することを含む。タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターは、それが安全かつ有効である限り、本発明の方法において使用することができる。ここで、「ＰＴＫインヒビター」は、このような化合物を言及するために使用され、タンパク質チロシンキナーゼ経路の任意の点および全ての点でこの経路に影響を与える全ての化合物を包含することが意図される。
【００１９】
好ましくは、ＰＴＫインヒビターは、ゲニステイン（５，７−ジヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）または薬学的に許容し得る、タンパク質チロシンキナーゼ経路を阻害するそのアナログまたはプロドラッグ、あるいは前述のもののいずれかの薬学的に許容し得る塩である。従って、ＰＴＫインヒビターは、以下の式の化合物であり得る：
【００２０】
【化２】
2010168389.tif 000003
【００２１】
ここでＶ、ＷおよびＸは、ヒドロ、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、エステル、エーテル、カルボン酸基、カルボン酸基の薬学的に許容し得る塩、および−ＳＲ（ここでＲは水素またはアルキル基である）からなる群より選択され、Ｙは、酸素、硫黄、Ｃ（ＯＨ）、およびＣ＝Ｏからなる群より選択され、Ｚは、ヒドロおよびＣ（Ｏ）ＯＲ1（ここでＲ1はアルキルである）からなる群より選択される。好ましくは、アルコキシはＣ1−Ｃ6アルコキシである。好ましくは、ハロは、フッ素、塩素または臭素である。好ましくは、エステルはＣ1−Ｃ6エステルである。好ましくは、エーテルはＣ1−Ｃ6エーテルである。好ましいカルボン酸基の薬学的に許容し得る塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられる。好ましくは、アルキル基はＣ1−Ｃ6アルキル基である。望ましくは、タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターはゲニステインである。
【００２２】
プロドラッグは、ゲニステインの薬学的に許容し得る任意のプロドラッグ、ゲニステインのタンパク質チロシンキナーゼ経路を阻害するアナログ、または前述のいずれかの薬学的に許容し得る塩であり得る。しかし、当業者は、使用されるプロドラッグが、網膜内またはその周囲で活性なＰＴＫインヒビターに変換され得るものでなければならないことを理解する。好ましいプロドラッグは、ゲニステイン、ゲニステインのタンパク質チロシンキナーゼ経路を阻害するアナログ、または前述のいずれかの薬学的に許容し得る塩の脂質溶解性を増加させるプロドラッグである。好ましいプロドラッグは、Ｖ、ＷおよびＸの１つ以上が、独立して、エステル（例えばピバル酸）で誘導体化されたものである。
【００２３】
上式の化合物は、広く市販入手可能である。例えば、ゲニステインは、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手可能である。市販入手可能でない化合物は、当該分野で公知の有機合成法を用いて容易に調製することができる。
【００２４】
本発明による化合物の特定のアナログ、プロドラッグまたは薬学的に許容し得る塩が、予防的または治療的に網膜症を処置できるかどうかは、実施例１で使用したラットモデルにおけるその効果によって決定することができる。あるいは、タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターのアナログ、プロドラッグおよび薬学的に許容し得る塩は、内皮細胞増殖のインビトロ研究によって、および糖尿病性網膜症の他のモデル（例えば、ストレプトゾトシン）において試験することができる。タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターのアナログ、プロドラッグおよび薬学的に許容し得る塩は、臨床試験によって（例えば、炎症の細胞性および体液性メディエーターの定量によって）、または眼炎症の予防的および治療的処置における効能のための実施例２に示す方法を用いて試験することができる。
【００２５】
さらに、カラードップラー画像診断(color Doppler imaging)は、眼の病理における薬物の作用を評価するために使用することができる（Ｖａｌｌｉら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ  ２０９（１３）：１１５−１２１（１９９５））。カラードップラー画像診断は、最近の超音波診断の進歩であり、構造の同時２次元画像診断および血流の評価を可能にする。従って、網膜症および眼炎症は、このような技術を用いて分析することができる。
【００２６】
ＰＴＫインヒビターは、本発明の方法で使用するために、所望であれば、適切なマトリクス、例えば、ポリマー性マトリクスに結合させることができる。ポリマー結合化合物がインビボで使用される場合、ポリマーが生物学的に許容し得るならば、任意の広範囲のポリマーを本発明の文脈において使用することができる（例えば、米国特許第５，３８４，３３３号および同第５，１６４，１８８号を参照のこと）。
【００２７】
ゲニステインの利点は、非常に安全かつ有効であることである。例えば、ゲニステインを糖尿病の脂肪過多のＺｕｃｋｅｒラットに経口投与した場合、ゲニステインは、エレクトロレティノグラフィーによって測定して、６ヶ月の期間にわたって７５ｍｇ／ｋｇ／日〜３００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の投薬量で、網膜に対して無毒であったことが見出された。さらに、ゲニステインの経口投与は、雄ラットおよび雌ラットについて、食物摂取および体重に対する影響がなかったことが見出された。また、経口投与したゲニステインは、雌ラットにおいて卵巣および子宮の重量に対して影響がなかったことが見出された。
【００２８】
ＰＴＫインヒビター（好ましくは、ゲニステイン、ゲニステインのタンパク質チロシンキナーゼ経路を阻害するアナログ、ゲニステインのタンパク質チロシンキナーゼ経路を阻害するプロドラッグ、または前述のいずれかの薬学的に許容し得る塩である）は、任意の適切な経路によって、本発明の方法に従って投与することができる。適切な投与経路としては、全身的（例えば経口または注射によって）、局所的、眼内、眼周辺（例えば、テノン膜下(subTenon's)）、結膜下、網膜下、脈絡膜上および眼球後方が挙げられる。ＰＴＫインヒビターを投与する様式は、網膜症または眼炎症の処置が予防的または治療的であるかに一部依存する。ＰＴＫインヒビターを網膜症または眼炎症の治療的処置のために投与する様式は、それぞれ網膜症または眼炎症の原因に一部依存する。
【００２９】
例えば、糖尿病が網膜症の主要な原因であれば、ＰＴＫインヒビターは、糖尿病前症性網膜症の状態が検出されるとすぐに予防的に投与することができる。糖尿病に起因し得る網膜症の予防的処置のために、ＰＴＫインヒビターは、好ましくは全身的に（例えば、経口または注射によって）投与される。非増殖性糖尿病性網膜症の治療的処置のために、ＰＴＫインヒビターは、全身的に（例えば、経口または注射によって）、または眼内に投与することができる。増殖性糖尿病性網膜症は、ＰＴＫインヒビターを眼内、局所的、結膜下または眼周辺（例えば、テノン膜下）に投与することによって、治療的に処置することができる。ＰＴＫインヒビターは、増殖性糖尿病期の間の新血管形成の間に発生した瘢痕組織を眼から外科的に除去する前、その間またはその後の網膜症の予防的または治療的処置のために、好ましくは眼内、局所的、結膜下または眼周辺（例えば、テノン膜下）に投与される。
【００３０】
同様に、疾患、細菌感染またはウイルス感染、眼手術（例えば、白内障手術、網膜手術、屈折矯正手術、および角膜手術（例えば、角膜移植）など、およびとりわけ角膜移植片拒絶反応）が、眼炎症（例えば、黄斑浮腫）の主要な原因であるので、ＰＴＫインヒビターは、疾患または感染が検出されるかあるいは眼手術が完了するとすぐに治療的に投与することができる。ＰＴＫインヒビターは、疾患または感染が検出される前、あるいは眼手術の前、その間またはその後に予防的に投与することができる。眼炎症の予防的処置について、ＰＴＫインヒビターは、好ましくは眼内または網膜下に投与される。この点に関して、生体分解性でかつ生体吸収性である眼内デバイス／インプラント（例えば、ＶｉｔｒａｓｅｒｔTM）の使用は、ＰＴＫインヒビターの徐放を達成するために使用することができる。
【００３１】
ＰＴＫインヒビターは、好ましくは、動物（例えば、哺乳動物、特にヒト）が網膜症または眼炎症の危険にある（予防的処置）か、または網膜症または眼炎症を発症し始めた（治療的処置）ことを確定した後、できるだけ早く投与される。処置は、使用される特定のＰＴＫインヒビター、投与されるＰＴＫインヒビターの量、投与経路、ならびにもし網膜症または眼炎症が実際に発症している時はその原因および程度に一部依存する。
【００３２】
当業者は、ＰＴＫインヒビターの適切な投与方法（本発明の方法に有用である）が利用可能であることを理解する。特定のＰＴＫインヒビターを投与するために１より多い経路を使用することができるが、特定の経路は、別の経路よりも、より即時かつより効果的な反応を提供することができる。従って、記載した投与経路は、単なる例示であり、決して限定するものではない。
【００３３】
本発明に従って動物（特に、ヒト）に投与される用量は、合理的な時間枠にわたって動物に所望の応答をもたらすのに十分な量とすべきである。当業者は、投薬量が、種々の因子（使用される特定のＰＴＫインヒビターの強さ、動物の年齢、種、病気または疾患の状態、および体重、ならびに、網膜症によってまさに影響を受けようとしているまたは実際に影響を受けた網膜の量、または眼炎症の量および位置を含む）に依存することを理解する。用量のサイズはまた、投与の経路、時期および頻度、ならびに特定のＰＴＫインヒビターの投与に伴うかもしれない任意の悪い副作用の存在、性質および程度、および所望の生理学的効果によって決定される。当業者は、種々の病気または疾患の状態（特に、慢性の病気または疾患の状態）が、複数回投与を含む延長した処置を必要とするかもしれないことを理解する。
【００３４】
適切な用量および投薬量計画は、当業者に公知の従来の範囲決定技術によって決定することができる。一般に、処置は、化合物の最適用量よりも少量の投薬量で開始される。その後、投薬量は、その状況下で最適の効果に達するまで、少量ずつ増加される。本発明の方法は、典型的には、全身的に投与する場合、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１５ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与を含む。眼内投与は、典型的には、合計約０．１ｍｇ〜合計約５ｍｇ、好ましくは合計約０．５ｍｇ〜合計約１ｍｇの投与を含む。局所投与の好ましい濃度は、１００μＭである。
【００３５】
本発明の方法において使用するための組成物は、好ましくは、薬学的に許容し得る担体と、網膜症または眼炎症を予防的または治療的に処置するのに十分な量のＰＴＫインヒビターとを含有する。担体は、従来使用されているいずれのものでもよく、物理化学的考慮（例えば、溶解性および化合物との反応性の欠如）および投与経路によってのみ制限される。当業者は、以下に記載した医薬組成物に加えて、ＰＴＫインヒビターが、ポリマー性組成物、包接錯体（例えば、シクロデキストリン包接錯体）、リポソーム、ミクロスフェア、マイクロカプセルなどとして処方することができることを理解する（例えば、米国特許第４，９９７，６５２号、同第５，１８５，１５２号および同第５，７１８，９２２号を参照のこと）。
【００３６】
ＰＴＫインヒビターは、薬学的に許容し得る酸付加塩として処方することができる。医薬組成物に使用するための薬学的に許容し得る酸付加塩の例としては、鉱酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸）、および有機酸（例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホン酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸））が挙げられる。
【００３７】
本明細書中に記載する薬学的に許容し得る賦形剤、例えば、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は、当業者に周知であり、一般の人々が容易に入手可能である。薬学的に許容し得る担体は、ＰＴＫインヒビターに対して化学的に不活性であるもの、および使用状況下で有害な副作用または毒性を有しないものであることが好ましい。
【００３８】
賦形剤の選択は、一部、特定のＰＴＫインヒビターによって、ならびに組成物を投与するために使用する特定の方法によって、決定される。従って、広範な種々の本発明の医薬組成物の適切な処方物が存在する。以下の処方物は、単なる例示であり、決して限定するものではない。
【００３９】
注射可能な処方物は、本発明の方法によれば好ましいものである。注射可能な組成物用の有効な薬学的担体の要件は、当業者に周知である（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＢａｎｋｅｒおよびＣｈａｌｍｅｒｓ編、２３８−２５０頁（１９８２）、およびＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ、第４版、６２２−６３０頁（１９８６）を参照のこと）。このような注射可能な組成物は、筋肉内、静脈内、または腹腔内に投与されるのが好ましい。
【００４０】
局所処方物は、当業者に周知である。このような処方物は、本発明の文脈において、皮膚への適用に適している。パッチ、角膜シールド（例えば、米国特許第５，１８５，１５２号を参照のこと）、および眼用溶液（例えば、米国特許第５，７１０，１８２号を参照のこと）ならびに軟膏（例えば、点眼薬）の使用もまた、当業者の範囲内である。
【００４１】
経口投与に適切な処方物は、以下のものからなり得る：（ａ）液体溶液、例えば、有効量の化合物が希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはオレンジジュース）に溶解したもの；（ｂ）カプセル剤、小袋剤(sachet)、錠剤、ロゼンジ剤、およびトローチ剤、これらはそれぞれ所定量の活性成分を、固体または顆粒として含む；（ｃ）粉末剤；（ｄ）適切な液体中の懸濁液；および（ｅ）適切な乳濁液。液体処方物は、薬学的に許容し得る界面活性剤、懸濁化剤、または乳化剤を添加して、または添加しないで、希釈剤（例えば、水およびアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコール））を含んでもよい。カプセル剤形態は、通常の硬質または軟質シェル型(hard- or soft-shelled)ゼラチンタイプのものであり得、例えば、界面活性剤、滑沢剤、および不活性充填剤（例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウムおよびコーンスターチ）を含む。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、微結晶性セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、グアルガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロース(croscarmellose)ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝化剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、および薬理学的に適合性の賦形剤のうちの１種以上を含むことができる。ロゼンジ剤形態は、香味料（通常、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム）中に活性成分を含有することができ、ならびにパステル剤は、不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴム）中に活性成分を含有し、乳濁液、ゲルなどは、活性成分に加えて、当該分野で公知の賦形剤を含有する。
【００４２】
非経口投与に適切な処方物としては、水性および非水性の、等張性の無菌注射溶液が挙げられ、これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および処方物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができ、ならびに水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられ、この無菌懸濁液は、懸濁化剤、可溶化剤、粘稠化剤、安定化剤、および保存剤を含むことができる。インヒビターは、薬学的に許容し得る界面活性剤（例えば、石鹸または洗剤）、懸濁化剤（例えば、ペクチン、カーボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース）、または乳化剤および他の薬学的アジュバントを添加してまたは添加しないで、薬学的担体（例えば、無菌液体または液体混合物）中の生理学的に許容し得る希釈剤中で投与することができ、この希釈剤としては、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール、またはヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、ジメチルスルホキシド、グリセロールケタール（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル（例えば、ポリ（エチレングリコール）４００）、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステルまたはグリセライド、またはアセチル化脂肪酸グリセライドが挙げられる。非経口処方物に使用することができるオイルとしては、石油、動物油、植物油または合成油が挙げられる。オイルの特定の例としては、ピーナッツ油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラタム、および鉱物油が挙げられる。
【００４３】
非経口処方物に使用するのに適した脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは適切な脂肪酸エステルの例である。
【００４４】
非経口処方物に使用するのに適した石鹸としては、脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩、およびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な界面活性剤としては、（ａ）カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、およびアルキルピリジニウムハライド、（ｂ）アニオン性界面活性剤、例えば、スルホン酸アルキル、アリール、およびオレフィン、硫酸アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセライド、およびスルホスクシネート、（ｃ）非イオン性界面活性剤、例えば、脂肪酸アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー、（ｄ）両性界面活性剤、例えば、アルキル−ｐ−アミノプロピオネート、および２−アルキル−イミダゾリン４級アンモニウム塩、および（ｅ）それらの混合物が挙げられる。
【００４５】
非経口処方物は、典型的には、溶液中に約０．５〜約２５重量％の活性成分を含む。保存剤および緩衝剤を使用してもよい。注射部位での刺激を最小限にするかまたは除去するために、このような組成物は、約１２〜約１７の親水親油バランス（ＨＬＢ）を有する１種以上の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。
【００４６】
このような処方物中の界面活性剤の量は、典型的には、約５〜約１５重量％の範囲である。適切な界面活性剤としては、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノオレイン酸ソルビタン）およびエチレンオキシドと疎水性基剤との高分子量付加体が挙げられ、この付加体は、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される。非経口処方物は、単回用量または多回用量のシールされた容器（例えば、アンプルおよびバイアル）中に存在することができ、使用直前に注射用の無菌液体賦形剤（例えば、水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時調合注射溶液および懸濁液は、前述した種類の無菌粉末剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。
【００４７】
このような組成物は、眼内処方物、徐放処方物またはデバイスとして処方することができる（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号を参照のこと）。例えば、ゼラチン、硫酸コンドロイチン、ポリリン酸エステル、例えば、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）、またはポリ乳酸−グリコール酸（種々の割合で）を、徐放処方物を処方するために使用することができる。インプラント（例えば、米国特許第５，４４３，５０５号、同第４，８５３，２２４号および同第４，９９７，６５２号を参照のこと）、デバイス（例えば、米国特許第５，５５４，１８７号、同第４，８６３，４５７号、同第５，０９８，４４３号および同第５，７２５，４９３号を参照のこと）、例えば移植可能デバイス（例えば、機械式レザバー、眼内デバイスまたは眼内導管（例えば、直径１００μ〜１ｍｍ）を有する眼外デバイス）、あるいは上記ポリマー性組成物からなるインプラントまたはデバイスを使用することができる。
【００４８】
本発明の方法はまた、他の薬学的に活性な化合物の併用投与を含むことができる。「併用投与」とは、上記のＰＴＫインヒビターの投与の前、それと同時（例えば、同じ処方物中または別の処方物中のＰＴＫインヒビターと組み合わせて）、またはその後の投与を意味する。例えば、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、またはトリアムシノロン(triamcinalone)アセトニド）、または非コルチコステロイド抗炎症性化合物（例えば、イブプロフェンまたはフルビプロベン(flubiproben)）を併用投与することができる。同様に、ビタミンおよびミネラル（例えば、亜鉛）、抗酸化剤（例えば、カロチノイド（例えば、キサントフィルカロチノイド様ゼアキサンチンまたはルテイン））、および微量栄養素を併用投与することができる。さらに、他のタイプのタンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターとしては、天然タンパク質チロシンキナーゼインヒビター（例えば、ケルセチン、ラベンダスチンＡ(lavendustin A)、エルブスタチン(erbstatin)およびへルビマイシンＡ(herbimycin A)）および合成タンパク質チロシンキナーゼインヒビター（例えば、チロホスチン(tyrphostin)（例えば、ＡＧ４９０、ＡＧ１７、ＡＧ２１３（ＲＧ５０８６４）、ＡＧ１８、ＡＧ８２、ＡＧ４９４、ＡＧ８２５、ＡＧ８７９、ＡＧ１１１２、ＡＧ１２９６、ＡＧ１４７８、ＡＧ１２６、ＲＧ１３０２２、ＲＧ１４６２０およびＡＧ５５５）、ジヒドロキシ−およびジメトキシベンジリデンマロノニトリル、ラベンダスチンＡのアナログ（例えば、ＡＧ８１４およびＡＧ９５７）、キナゾリン（例えば、ＡＧ１４７８）、４，５−ジアニリノフタルイミド、およびチアゾリジンジオン）が挙げられ、これらを、ゲニステインまたはそのアナログ、プロドラッグまたは薬学的に許容し得る塩と併用投与することができる（Ｌｅｖｉｔｚｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１７８２−１７８８（１９９５）；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ７：３６５−３８４（１９９２）を参照のこと）。この点に関して、ゲニステインの潜在的に有用な誘導体としては、Ｍａｚｕｒｅｋら、米国特許第５，６３７，７０３号に記載のものが挙げられる。成長因子に対する中和タンパク質（例えば、所定の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ（例えば、Ａｉｅｌｌｏら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２：１０４５７−１０４６１（１９９５）を参照のこと）、またはホスホチロシン（Ｄｈａｒら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：５１９−５２５（１９９０））に対して特異的であるモノクローナル抗体）を併用投与することができる。併用投与することができる他の種々の化合物としては、タンパク質キナーゼＣのインヒビター（例えば、米国特許第５，７１９，１７５号および同第５，７１０，１４５号を参照のこと）、サイトカインモジュレーター、増殖の内皮細胞特異的インヒビター（例えば、トロンボスポンジン(thrombospondin)）、内皮細胞特異的阻害性成長因子（例えば、ＴＮＦα）、抗増殖性ペプチド（例えば、ＳＰＡＲＣおよびプロルフェリン(prolferin)様ペプチド）、グルタメートレセプターアンタゴニスト、アミノグアニジン、アンギオテンシン変換酵素インヒビター（例えば、アンギ��テンシンＩＩ）、カルシウムチャネル遮断薬、Ψ−テクトリゲニン(tectorigenin)、ＳＴ６３８、ソマトスタチンアナログ（例えば、ＳＭＳ  ２０１−９９５）、モノシアロガングリオシド(monosialoganglioside)ＧＭ１、チクロピジン、神経栄養性成長因子、メチル−２，５−ジヒドロキシシンナメート、血管形成インヒビター（例えば、組換えＥＰＯ、スルホニル尿素経口血糖減少剤（例えば、グリクラジド(gliclazide)（非インスリン依存性糖尿病））、ＳＴ６３８（Ａｓａｈｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  ３０９：１０−１４（１９９２））、サリドマイド、ニカルジピン(nicardipine)塩酸塩、アスピリン、ピセアタノール(piceatannol)、スタウロスポリン(staurosporine)、アドリアマイシン、エピダースタチン(epiderstatin)、（+）−アエロプリシニン(aeroplysinin)−１、フェナゾシン、ハロメチルケトン、抗脂肪血症剤（例えば、エトフィブレート(etofibrate)）、クロルプロマジンおよびスピングホシン(spinghosines)、アルドースレダクターゼインヒビター（例えば、トルレスタット(tolrestat)）、ＳＰＲ−２１０、ソルビニル(sorbinil)または酸素、ならびにレチノイン酸およびそのアナログ（Ｂｕｒｋｅら、Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  １７（２）：１１９−１３１（１９９２）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．５４：１５１−１９４（１９９２））が挙げられる。セレノインドール（２−チオインドール）および関連するジスルフィドセレニド（例えば、Ｄｏｂｒｕｓｉｎら、米国特許第５，４６４，９６１号に記載のもの）は、有用なタンパク質チロシンキナーゼインヒビターである。全身性体液鬱滞（例えば、心臓血管疾患または腎臓疾患および重篤な全身性高血圧による）を示す患者は、利尿薬物、透析薬物、心臓薬物および抗高血圧剤でさらに処置することができる。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、もちろんその範囲をいかようにも限定しないと解釈されるべきである。
【００５０】
（実施例１）
本実施例は、チロシンリン酸化が非虚血性微小血管糖尿病性網膜症の初期において増加し、そしてゲニステインがこのようなチロシンリン酸化を阻害することを示す。
【００５１】
６対の同腹仔のＺｕｃｋｅｒラット（すなわち、６匹の引退した糖尿病の脂肪過多の繁殖雄Ｚｕｃｋｅｒ（ＺＤＦ、ｆａ／ｆａ）ラットおよび６匹の引退した脂肪の少ない繁殖雌Ｚｕｃｋｅｒ（ｆａ／+）ラット）を得た（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。糖尿病の脂肪過多のＺｕｃｋｅｒラットは、網膜毛細血管の基底膜肥厚、周細胞の損失、毛細血管の細胞過多、および内皮細胞間接合の増加を含む微小血管網膜症を発症する（Ｄａｎｉｓら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：２３６７−２３７１（１９９３）；およびＤｏｓｓｏら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３３：１３７−１４４（１９９０））。糖尿病の脂肪過多のＺｕｃｋｅｒラットにおいて起こることが知られている微小血管の変化は、ＶＥＧＦおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のレベルの上昇、ならびにＰＴＫ経路、特にホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）およびミトゲン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を含む経路の活性化に関連する。同腹仔の各対は、６ヶ月齢〜７ヶ月齢であった。ラットには、Ｐｕｒｉｎａ５００８ラット食の食餌を与えた。この動物を、Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈについて、Ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（ＡＲＶＯ）  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔに従って処置した。平均血中グルコース値は、死亡時にグルコースオキシダーゼアッセイによって測定して、糖尿病の脂肪過多のＺｕｃｋｅｒラットについて５００ｍｇ／ｄｌよりも大きく、コントロールの脂肪の少ないラットについて１２０ｍｇ／ｄｌであった（Ｄａｎｉｓら（１９９３）、前出）。
【００５２】
ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後、ゲニステイン（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解し、これを、５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、糖尿病の脂肪過多のＺｕｃｋｅｒラットおよび脂肪の少ないラット（非処置群）に腹腔内注射した。２時間後、注射を繰り返した。
【００５３】
２４時間後、心臓内ペントバルビタールの注射によって、動物を屠殺した。次いで、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムをラットの眼に注射して、ホスファターゼ活性を阻害し、眼を摘出し、そして前上葉区を切除した。ピンセットを用いて硝子体を除去し、網膜を網膜色素性上皮／脈絡膜から剥離し、そして視神経から切断した。網膜組織を、１２５μｌの氷冷溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００μｇ／ｍｌ  フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、０．３μｇ／ｍｌ  ＥＤＴＡ、０．７μｇ／ｍｌ  ぺプスタチンＡ、０．５μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、および５０μＭ  フッ化ナトリウム）を有するチューブに置いた。網膜組織をガラスホモジナイザーで均質化し、次いで、等量の２Ｘ  ＳＤＳサンプル緩衝液（１６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％  ＳＤＳ、３０％  グリセロール、５Ｂβ−メルカプトエタノール(mcercaptoethanol)、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、０．０１％  ブロモフェノールブルー）を加えた。網膜ホモジネートを、９５℃で５分間煮沸し、そして１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを集め、そして−８０℃で保存した。これらの全部の網膜サンプルを、ゲル電気泳動およびウェスタン免疫ブロット分析のために使用した。
【００５４】
タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ法によって測定した。合計のタンパク質プロフィールは、糖尿病の脂肪過多のＺｕｃｋｅｒラットの網膜が、脂肪の少ないコントロールと比較して、６７ｋＤａでより強く染色したバンドを有したことを明らかにした。ゲニステインでの処置は、糖尿病の脂肪過多のＺｕｃｋｅｒラットにおいて６７ｋＤａのバンドの染色の量を減少させた。合計のタンパク質プロフィールにおける他のバンドは、ゲニステインでの処置にかかわりなく、変化していないようであった。
【００５５】
抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０；１：５００希釈；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）、抗ＰＣＮＡ抗体（１：２００希釈）、抗ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ抗体（１：１００希釈；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ抗体（１：５００希釈；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を、ウェスタン免疫ブロット分析の第１の抗体として使用した。西洋わさびぺルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体または抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を、第２の抗体として使用した。アビジン−ＨＲＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ビオチン化された分子マーカーを検出した。
【００５６】
網膜組織サンプルを、免疫沈降緩衝液（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５％  ＮＰ−４０）に加え、そして均質化した。８，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心分離後、上澄みを得た。タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ法によって測定した。次いで、２０μｇのアガロース結合ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、各ミリグラムの網膜ホモジネートに加えた。網膜ホモジネートを、４℃で一晩振とうしながら、アガロース結合ホスホチロシン抗体とインキュベートした。遠心分離（８，０００ｒｐｍで１０分間）によってペレットを集め、そして細胞溶解緩衝液で３回リンスした。網膜ホモジネート１ミリグラムあたり１５０μｌの１Ｘ  ＳＤＳサンプル緩衝液中にペレットを再懸濁し、そして９５℃で５分間煮沸した。これらの免疫沈降したサンプルを、ゲル電気泳動のために使用した。
【００５７】
タンパク質の量が等量の網膜サンプルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ装置を用いて、４〜２０％勾配のミニゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、一定の２００Ｖで３５分間電気泳動した。ブロードレンジのビオチン化した（６．５〜２００ｋＤａ）分子量タンパク質マーカーおよび予備染色した（１８．５〜１０６ｋＤａ）分子量タンパク質マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、サンプルと同時に電気泳動にかけた。電気泳動後、クマシーブリリアントブルー染料での全タンパク質染色のため、またはウェスタン免疫ブロット分析のために、ゲルを処理した。
【００５８】
ゲル電気泳動後、ゲルを４５％メタノールと１０％酢酸の水性溶液中に３０分間固定した。次いで、それらを飽和ピクリン酸溶液に短時間含浸し、そして０．２５％水性クマシーブリリアントブルー（Ｒ−２５０）で最低２時間染色した。ゲルを１０％酢酸溶液中で脱染色した。この手順を３回繰り返した。
【００５９】
ウェスタン免疫ブロット分析のために、トランスブロットＳＤ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、ゲルをニトロセルロース膜（Ｃｏｓｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）上に電気ブロットした。チロシンリン酸化タンパク質の検出のための膜を、室温で１時間、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１５０Ｍｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中の３％ウシ血清アルブミンとインキュベートした。他のタンパク質の検出のための膜を、室温で１時間、ＴＢＳ中の２％無脂ドライミルク（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とインキュベートした。次いで、各膜を、４℃で一晩、第１の抗体溶液とインキュベートした。次いで、膜をＴＢＳでリンスし、そして室温で２時間、ＨＲＰ結合ラット抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）または抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１：１，０００希釈）およびアビジン−ＨＲＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１：１０，０００希釈）とインキュベートした。０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳおよびＴＢＳのみを用いた最終リンスシリーズの後、膜を、増強された化学ルミネセンス（ＥＣＬ）免疫検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）と反応させ、そしてＸ線フィルムに曝露した。各ウェスタン免疫ブロット分析を、少なくとも３回繰り返した。
【００６０】
総合的に、糖尿病の網膜におけるチロシンリン酸化タンパク質は、脂肪の少ないコントロールと比較して、５０、６６、９７および１１６ｋＤａで増加した。ゲニステイン処置した糖尿病のラットは、非処置群と比較して、各分子量で染色の減少を示した。
【００６１】
免疫沈降したチロシンリン酸化タンパク質のウェスタン免疫ブロット分析は、脂肪の少ないコントロールと比較して、糖尿病のラットにおいて、８５ｋＤａでＰＩ３−Ｋのチロシンリン酸化の増加を示した。チロシンリン酸化ＰＩ３−Ｋ染色バンドは、ゲニステインでの処置後、特に糖尿病のラットにおいて減少した。
【００６２】
４４ｋＤａでのチロシンリン酸化ＭＡＰＫは、脂肪の少ないコントロールと比較して、糖尿病のラットにおいて増加した。ＰＩ３−Ｋと同様に、処置群におけるＭＡＰＫのレベルもまた、非処置動物群と比較して減少した。
【００６３】
２対のラットを、網膜中のＰＣＮＡの免疫組織化学的分析のために使用した。ケタミンおよびキシラジンを用いた深い麻酔下で、４匹のラットを、１ｍＭのオルトバナジン酸塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で心臓を通して(transcardially)灌流し、続いて固定のために０．１Ｍ  ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで灌流した。次いで、眼を取り出し、同じ固定液中に３０分間浸漬した。前上葉区を除去し、後上葉区を５％から１５％までの段階的スクロース溶液に２時間移し、そして２０％スクロース溶液中、４℃で一晩インキュベートした。凍結保護後、眼をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）中で成型し、そしてイソペンタン中、ドライアイスで凍結させた。後上葉区を８μｍの切片に切断した。
【００６４】
切片を３％過酸化物で処理して、内在するぺルオキシダーゼを遮断し、そして２％正常ウマ血清と２０分間インキュベートした。０．１Ｍ  ＰＢＳ中で３回リンスした後、切片を、抗ＰＣＮＡ抗体（１：１，０００希釈）と４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、切片を０．１Ｍ  ＰＢＳ中でリンスし、そしてビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ；１：５００希釈）と室温で３０分間インキュベートし、次いで過酸化物標識化ストレプトアビジン（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；１：５００希釈）とインキュベートした。スライドを３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理して、可視化した。各スライドセットを同時に試験し、３つの異なるセットを研究した。グリセリンゼリー（７％ゼラチン、５４％グリセリン、０．７％フェノール）と共にマウントした後、Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を用いて顕微鏡写真を撮った。
【００６５】
糖尿病の脂肪過多のＺｕｃｋｅｒラットの網膜において、３６ｋＤａでのＰＣＮＡのレベルは、脂肪の少ないラットと比較して増加した。ゲニステインは、非処置群と比較してこの増加を減少させたが、脂肪の少ないコントロールのレベルまでは低下させなかった。
【００６６】
脂肪の少ないコントロールと比較した場合、神経線維ならびに内核層および外核層中の細胞の核における強い陽性免疫反応を、糖尿病の脂肪過多のＺｕｃｋｅｒラットにおいて観察した。しかし、ゲニステイン処置した糖尿病のラットにおいては、より少ない免疫陽性細胞を検出した。糖尿病のラットの網膜を、抗ＰＣＮＡ抗体の代わりに非免疫マウスＩｇＧとインキュベートすると、免疫反応を示さなかった。
【００６７】
上記の結果は、ゲニステインが、糖尿病のラットの網膜において、ホスホチロシンの増加したレベルを全体として減少させ、かつリン酸化ＰＩ３−Ｋ、ＭＡＰＫおよびＰＣＮＡの増加したレベル（これは、細胞が、複製のための用意ができていることを示す）を減少させたことを示す。これらの結果は、ゲニステインが、視覚変化前の糖尿病の動物の網膜においてＰＴＫ経路の活性化を阻害することができ、その結果、糖尿病性網膜症を予防することができることを示唆する。
【００６８】
（実施例２）
本実施例は、タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターの、眼炎症を予防的および治療的に処置する能力を示す。
【００６９】
ヘルビマイシンＡ（ＨＡ）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ株によって産生されるベンゼノイドアンサマイシン(ansamycin)抗生物質である。それは、チロシンキナーゼレセプターの触媒部分にしっかりと結合し、かつそれはタンパク質チロシンリン酸化の強力かつ特異的なインヒビターであり、タンパク質メッセンジャーのリン酸化および続く細胞の活性化を防止し、かつ細胞増殖を阻害する。
【００７０】
実験室での動物のケアの原則（ＮＩＨ刊行Ｎｏ．８６−２３、１９８５年改訂）に従った。全ての研究について、色素性ウサギ、体重２．５〜３ｋｇを使用した。動物を、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）とのカクテルを用いて麻酔し、瞳孔を局所１％トロピカミドおよび０．５％フェニレフリンを用いて拡張させた。
【００７１】
ＳＦ６ガスの注入によって硝子体の液状化を行った。前眼房の穿刺（０．１ｍｌ）後、純粋なＳＦ６ガス（０．３ｍｌ）を注入した。硝子体の液状化を最大にするために、３０ゲージのニードルを下位に挿入した。本発明者らは、冷凍固定を行わず、ガス−液体交換も行わなかった。従って、関連する合併症を回避した。
【００７２】
ウサギ真皮線維芽細胞を、無菌条件下で調製したウサギ臀部バイオプシー材料から得た。初期培養物を、空気中５％二酸化炭素の湿潤雰囲気下で７２時間、３０％ウシ胎児血清、抗生物質（ペニシリンＧナトリウム、硫酸ストレプトマイシン）および抗真菌剤（アンホテリシンＢ）を有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でインキュベートした。次いで、培地を、１０％ウシ胎児血清、上記抗生物質および抗真菌剤を有するＤＭＥＭに替えた。培養物を１週間継代培養した。それらを３．５ｍｌの０．０４％トリプシンと４分間インキュベートし、停止培地中の細胞を集めることによって、細胞を採取した。分散した細胞を１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁させた。０．０５ｍｌのアリコートの細胞計数後、０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水中２．５×１０4細胞の最終濃度に達するように懸濁液を希釈した。
【００７３】
ＳＦ６ガスの注入から１４日後、顕微鏡制御下で、鼻上(superonasal)四半部における角膜強膜縁の後方３ｍｍに３０ゲージのニードルを挿入した。ニードルのべベルを上方に向けて、０．１ｍｌの無菌リン酸緩衝化生理食塩水中に懸濁した２．５×１０4個の同一源のウサギ真皮線維芽細胞を、視神経の先端のちょうど前方に注入した。これを全てのウサギの両眼に行った。ウサギを即座に１時間あおむけにして、細胞を硝子体表面上に固定させた。
【００７４】
群１では、ＨＡの最終眼内濃度を約２０μｇとするために、線維芽細胞の注入から１時間後（予防的）、各ウサギ（ｎ＝１８）の一方の眼に、０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水中の２３μｇのＨＡを注入した。コントロール眼として、各ウサギのもう片方の眼に、０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水を注入した。群２では、線維芽細胞の注入から２日後（治療的）、各ウサギ（ｎ＝１０）の一方の眼に、０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水中の２３μｇのＨＡを注入し、他方、もう片方の眼に、０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水を注入し、コントロールとした。群３では、線維芽細胞の注入から１時間後および再び２日後、各ウサギ（ｎ＝９）の一方の眼に、１１．５μｇのＨＡ（眼中１０μｇ）を注入し、他方、もう片方の眼に、０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水を注入した。
【００７５】
線維芽細胞注入から３日後、各眼を間接検眼鏡検査によって試験し、眼底写真を撮った。硝子体腔の曇りによって判定される炎症は、眼底写真によって軽いまたは重いに類別した。重い炎症は、写真において、視神経先端付近の延髄翼の有髄の「刷子縁」の可視化を妨害するのに十分な曇りを生じた。
【００７６】
線維芽細胞注入から３日後、炎症の重篤度（硝子体の曇りによって判定した）は、コントロール眼と処置眼との間で有意に異なっていた。群１では、重い炎症は、コントロール眼では４７．１％に対し、処置眼では０％（ｐ＜０．０１）存在した。群３では、重い炎症は、コントロール眼では７７．８％に対し、処置眼では２２．２％（ｐ＜０．０５）存在した。群２では、重い炎症は、コントロール眼では５０％に対し、処置眼では１０％（ｐ＞０．０５）存在した。
【００７７】
要約すると、炎症の指標である硝子体の曇りは、ＨＡで処置した眼では減少した。本実施例は、タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターの、眼炎症を予防的および治療的に処置する能力を示す。
【００７８】
特許、特許出願、文献刊行物などを含む、本明細書で引用した全ての参考文献は、それらの全体を本明細書中で参考として援用する。
【００７９】
本発明を好ましい実施態様を強調して記載したが、好ましい化合物および方法のバリエーションを使用してもよいこと、および本明細書に明確に記載されているのとは別の方法で本発明を実施してもよいことが意図されることは、当業者には明らかである。従って、本発明は、上記請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲内に含まれる全ての変更を含む。
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月2日(2010.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性網膜症の動物を予防的または治療的に処置するための医薬であって、該糖尿病性網膜症の動物を予防的または治療的に処置するのに十分な量のタンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターを有効成分として含み、該タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターが、式
【化１】
2010168389.tif 000005
〔ここでＶ、ＷおよびＸは、ヒドロ、アルコキシ、ヒドロキシル、ハロ、エステル、エーテル、カルボン酸基、カルボン酸基の薬学的に許容し得る塩、および−ＳＲ（ここでＲは水素またはアルキル基である）からなる群より選択され、Ｙは、酸素、硫黄、Ｃ（ＯＨ）、およびＣ＝Ｏからなる群より選択され、Ｚは、ヒドロおよびＣ（Ｏ）ＯＲ１（ここでＲ１はアルキルである）からなる群より選択される。〕の化合物、あるいはそのタンパク質チロシンキナーゼを阻害するプロドラッグまたは薬学的に許容し得る塩である、医薬。
【請求項２】
眼炎症の動物を予防的または治療的に処置するための医薬であって、該眼炎症の動物を予防的または治療的に処置するのに十分な量のタンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターを有効成分として含み、該タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターが、式
【化２】
2010168389.tif 000006
〔ここでＶ、ＷおよびＸは、ヒドロ、アルコキシ、ヒドロキシル、ハロ、エステル、エーテル、カルボン酸基、カルボン酸基の薬学的に許容し得る塩、および−ＳＲ（ここでＲは水素またはアルキル基である）からなる群より選択され、Ｙは、酸素、硫黄、Ｃ（ＯＨ）、およびＣ＝Ｏからなる群より選択され、Ｚは、ヒドロおよびＣ（Ｏ）ＯＲ１（ここでＲ１はアルキルである）からなる群より選択される。〕の化合物、あるいはそのタンパク質チロシンキナーゼを阻害するプロドラッグまたは薬学的に許容し得る塩である、医薬。
【請求項３】
ハロ基が、フッ素、塩素および臭素からなる群より選択される、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
エステルがＣ１−Ｃ６エステルである、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項５】
エーテルがＣ１−Ｃ６エーテルである、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項６】
カルボン酸基の薬学的に許容し得る塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項７】
アルキル基がＣ１−Ｃ６アルキル基であり、アルコキシ基がＣ１−Ｃ６アルコキシ基である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項８】
タンパク質チロシンキナーゼ経路のインヒビターがゲニステインである、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項９】
ゲニステインが全身投与される、請求項１〜８のいずれかに記載の医薬。
【請求項１０】
ゲニステインが約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与されるものである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
ゲニステインが約１５ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与されるものである、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１２】
ゲニステインが経口または注射によって投与されるものである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１３】
ゲニステインが糖尿病前症性網膜症期に投与されるものである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１４】
ゲニステインが非増殖性糖尿病性網膜症期に投与されるものである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１５】
ゲニステインの投与が糖尿病性黄斑浮腫を予防するものである、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
ゲニステインの投与が糖尿病性黄斑浮腫を処置するものである、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１７】
ゲニステインが増殖性糖尿病期に投与されるものである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１８】
増殖性糖尿病期の間の新血管形成の間に発生した瘢痕組織を眼から外科的に除去する前、その間またはその後に、ゲニステインが投与されるものである、請求項１７に記載の医薬。
【請求項１９】
眼炎症が疾患由来のものである、請求項２〜８のいずれかに記載の医薬。
【請求項２０】
眼炎症が細菌感染またはウイルス感染由来のものである、請求項２〜８のいずれかに記載の医薬。
【請求項２１】
眼炎症が眼手術由来のものである、請求項２〜８のいずれかに記載の医薬。
【請求項２２】
眼手術が、白内障手術、網膜手術、屈折矯正手術、または角膜手術である、請求項２１に記載の医薬。
【請求項２３】
角膜手術が角膜移植である、請求項２２に記載の医薬。
【請求項２４】
角膜移植が角膜移植片拒絶反応を生じる、請求項２３に記載の医薬。
【請求項２５】
眼炎症が非糖尿病性黄斑浮腫である、請求項２〜８のいずれかに記載の医薬。
【請求項２６】
ゲニステインが、局所的、結膜下、眼球後方、眼周辺、網膜下、脈絡膜上または眼内に投与されるものである、請求項１〜２５のいずれかに記載の医薬。
【請求項２７】
ゲニステインが、合計約０．１ｍｇ〜合計約５ｍｇの量で眼内投与されるものである、請求項２〜８および１９〜２６のいずれかに記載の医薬。
【請求項２８】
ゲニステインが、合計約０．５ｍｇ〜合計約１ｍｇの量で眼内投与されるものである、請求項２７に記載の医薬。
【外国語明細書】
2010168389000001.pdf
2010168389000002.pdf
2010168389000003.pdf