(57)【要約】【課題】キャピラリークロマトグラフィーにより２種類以上の物質が混合されてなる混合物から各物質を分離する方法を提供する。【解決手段】キャリア溶液として、水と親水性溶媒と疎水性溶媒との混合液を準備し、当該混合液を用いて、２種類以上の物質が混合されてなる混合物をオープンキャピラリーチューブに送液する。この際、キャリア溶液としては、疎水性溶媒である酢酸エチルと、水との他に、溶解パラメータが１０．２〜１１．８の範囲にある親水性溶媒を含むものが好適であり、このような親水性溶媒としては、アセトニトリル、エタノール、プロパノール等が挙げられ、本発明では、キャリア溶液の組成比を調整することにより各物質の溶出順序を変更させることが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリークロマトグラフィーによる２種類以上の物質が混合されてなる混合物から各物質を分離する方法であって、キャリア溶液として、水と親水性溶媒と疎水性溶媒との混合液を準備し、当該混合液を用いて、前記の２種類以上の物質が混合されてなる混合物をオープンキャピラリーチューブに送液することを特徴とする、キャピラリークロマトグラフィーを用いた混合物の分離方法。
【請求項２】
前記キャリア溶液が、疎水性溶媒である酢酸エチルと、水との他に、溶解パラメータが１０．２〜１１．８の範囲にある親水性溶媒を含むことを特徴とする請求項１記載の分離方法。
【請求項３】
前記親水性溶媒が、１−プロパノール、エタノール及びアセトニトリルから成るグループより選ばれたものであることを特徴とする請求項２記載の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャピラリークロマトグラフィーを用いた混合物の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分離工学の分野では、主にフューズドシリカキャピラリー（溶融石英ガラス製キャピラリー）がキャピラリーエレクトロクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、キャピラリー液体クロマトグラフィー、広内径(wide-bore)流体力学クロマトグラフィー等のマイクロフロー分離方法において使用されてきている。
【０００３】
例えば下記の非特許文献１には、キャピラリー液体クロマトグラフィーにおいて、相溶しやすいキャリア液に塩を添加することにより、層分離しやすい状態にして送液を行なうことが開示されており、キャリア溶液として、アセトニトリル／水＝８／２の混合液に０．１ＭのＮａＣｌを添加したものを使用した場合に、親水性物質と疎水性物質との混合物の分離が達成されることが開示されている。しかしながら、このような分離法の場合には、一定時間送液すると、キャピラリーチューブ内に塩が形成されて付着し、層流が乱れたり、管内圧力が上昇して分離性能が低下したり、チューブつまりが起き易い等の問題点があった。又、このような分離法は、水を多く含むキャリア溶液を用いると、親水性物質と疎水性物質との混合物の分離が行なえないという問題点もあった。
【０００４】
又、最近では、分離性能が改良されたキャピラリー電気泳動やキャピラリー液体クロマトグラフィー用のキャピラリーカラムとして、中空キャピラリー管の内壁面にイオン交換材等のコーティング層が設けられたものや、内壁面が表面処理されたものや、中空キャピラリー管内にゲルが充填されたもの等が種々使用されてきているが、これらはいずれも高価であるという欠点があった。
このような状況から、安価に混合物を精度良く分離することが可能なオープンキャピラリーチューブによる、混合物からの各物質の分離方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ぶんせき、２００３  ５、第２３４〜２４０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、キャピラリーの内壁に高価な特殊加工を施す必要がなく、又、電気泳動法のように電圧を印加しなくても混合物の分離が可能で、しかも、ゲル、界面活性剤、塩等の添加剤を必要とせずに、親水性物質と疎水性物質との混合物の分離が達成できる新しいマイクロフロー分離法を提供することを課題とする。
本発明者等は、種々検討を行なった結果、ポリエチレンやポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））や、フューズドシリカ製のオープンキャピラリーチューブを使用し、水と親水性溶媒と疎水性溶媒とから成るキャリア溶液（油水混合キャリア溶液）を層流で送液した場合に、マイクロ空間を流動する溶媒中に新たな溶質の分離挙動が生じ、これによって上記課題が達成できることを見い出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決可能な本発明の分離方法は、キャピラリークロマトグラフィーによる２種類以上の物質が混合されてなる混合物から各物質を分離する方法であって、キャリア溶液として、水と親水性溶媒と疎水性溶媒との混合液を準備し、当該混合液を用いて、前記の２種類以上の物質が混合されてなる混合物をオープンキャピラリーチューブに送液することを特徴とする。
【０００８】
又、本発明は、上記の分離方法において、前記キャリア溶液が、疎水性溶媒である酢酸エチルと、水との他に、溶解パラメータが１０．２〜１１．８の範囲にある親水性溶媒を含むことを特徴とするものでもある。
更に本発明は、上記の分離方法において、前記親水性溶媒が、１−プロパノール、エタノール及びアセトニトリルから成るグループより選ばれたものであることを特徴とするものでもある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の分離方法の場合には、コーティングあるいはパッキング加工処理された高価なオープンキャピラリーチューブを使用しなくても、市販のオープンキャピラリーチューブをそのまま使用することができ、従来の分離方法に比べてコストの点で有利である。又、塩等を添加していないキャリア溶液を使用して混合物の分離が行なえるので、キャピラリーチューブ内に塩が析出せず、オープンキャピラリーチューブを頻繁に交換する必要がなく、経済的である。
更に、本発明では、キャピラリー内壁が親水性である場合にも疎水性である場合にも、キャリア溶液中の溶媒組成分布が生じ、キャリア溶液を構成する溶媒の組成比率を調節することによって、混合物中の親水性物質と疎水性物質の分離が行なえるだけでなく、両物質の溶出順序を変えることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の分離方法を実施するのに適した分離装置の構成の一例を示す図である。
【図２】（ａ）は、実施例１の測定（ポリエチレンキャピラリーチューブを使用）におけるフルオスフェア（登録商標）の吸収プロファイルであり、（ｂ）は、実施例１の測定におけるＦＩＴＣの吸収プロファイルであり、（ｃ）は、実施例１の測定におけるフルオスフェア（登録商標）とＦＩＴＣの混合物の吸収プロファイルである。
【図３】（ａ）は、実施例２の測定（フューズドシリカキャピラリーチューブを使用）において、キャリア溶液として水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（２：７：３）を用いた場合の、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物の吸収プロファイルであり、（ｂ）は、キャリア溶液として水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（１５：３：２）を用いた場合の、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物の吸収プロファイルである。
【図４】（ａ）は、実施例３の測定（ポリエチレンキャピラリーチューブを使用）において、キャリア溶液として水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（２：５：９）を用いた場合の、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物の吸収プロファイルであり、（ｂ）は、実施例３の測定において、キャリア溶液として水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（１５：３：２）を用いた場合の、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物の吸収プロファイルである。
【図５】（ａ）は、実施例４の測定（フューズドシリカキャピラリーチューブを使用）において、キャリア溶液として水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（３：８：４）を用い、キャリア溶液の流速を０．２μＬ／分、０．５μＬ／分、０．８μＬ／分に変化させた場合の、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物の吸収プロファイルであり、（ｂ）は、異なる長さ（５０ｃｍ、１００ｃｍ、１５０ｃｍ）のキャピラリーチューブを用いた場合の、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物の吸収プロファイルである。
【図６】実施例４の測定（フューズドシリカキャピラリーチューブを使用）において、キャピラリーチューブの内径を５０μｍ、７５μｍ、１００μｍに変更した際の、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物の吸収プロファイルである。
【図７】実施例５の測定（ポリテトラフルオロエチレンキャピラリーチューブを使用）において、水：アセトニトリル：酢酸エチル＝１５：３：２のキャリア溶液を使用した際の分離実験結果を示す吸収プロファイルであり、（ａ）は、ペリレンとエオシンＹとの混合物についての吸収プロファイルで、（ｂ）は、１，１‐ビ‐２‐ナフトールとビス［Ｎ，Ｎ‐ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フルオレセインとの混合物についての吸収プロファイルで、（ｃ）は、ｐ‐ニトロアニリンと２，７‐ナフタレンジスルホン酸との混合物についての吸収プロファイルである。
【図８】実施例５の測定（ポリテトラフルオロエチレンキャピラリーチューブを使用）において、水：アセトニトリル：酢酸エチル＝２：９：４のキャリア溶液を使用した際の分離実験結果を示す吸収プロファイルであり、（ａ）は、ペリレンとエオシンＹとの混合物についての吸収プロファイルで、（ｂ）は、１，１‐ビ‐２‐ナフトールとビス［Ｎ，Ｎ‐ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フルオレセインとの混合物についての吸収プロファイルで、（ｃ）は、ｐ‐ニトロアニリンと２，７‐ナフタレンジスルホン酸との混合物についての吸収プロファイルである。
【図９】実施例６の測定（フューズドシリカキャピラリーチューブを使用）において、キャリア溶液として水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（３：８：４）を用いた場合の分離実験結果を示す吸収プロファイルであり、ａ）は、１ｍＭの２，６−ナフタレンジスルホン酸の吸収プロファイルであり、ｂ）は、１ｍＭの１−ナフトールの吸収プロファイルであり、ｃ）は、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合溶液の吸収プロファイルである。
【図１０】実施例６の測定（フューズドシリカキャピラリーチューブを使用）において、キャリア溶液として水／１‐プロパノール／酢酸エチル混合液（２：３：６）を用いた場合の分離実験結果を示す吸収プロファイルであり、ａ）は、１ｍＭの２，６−ナフタレンジスルホン酸の吸収プロファイルであり、ｂ）は、１ｍＭの１−ナフトールの吸収プロファイルであり、ｃ）は、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合溶液の吸収プロファイルである。
【図１１】実施例６の測定（フューズドシリカキャピラリーチューブを使用）において、キャリア溶液として水／エタノール／酢酸エチル混合液（２：２：６）を用いた場合の分離実験結果を示す吸収プロファイルであり、ａ）は、１ｍＭの２，６−ナフタレンジスルホン酸の吸収プロファイルであり、ｂ）は、１ｍＭの１−ナフトールの吸収プロファイルであり、ｃ）は、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合溶液の吸収プロファイルである。
【図１２】実施例６の測定（フューズドシリカキャピラリーチューブを使用）において、キャリア溶液として水／メタノール／酢酸エチル混合液（２：２：９）を用いた場合の分離実験結果を示す吸収プロファイルであり、ａ）は、１ｍＭの２，６−ナフタレンジスルホン酸の吸収プロファイルであり、ｂ）は、１ｍＭの１−ナフトールの吸収プロファイルであり、ｃ）は、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合溶液の吸収プロファイルである。
【図１３】実施例６の測定（フューズドシリカキャピラリーチューブを使用）において、キャリア溶液として水／ジオキサン／酢酸エチル混合液（４：１１：１１）を用いた場合の分離実験結果を示す吸収プロファイルであり、ａ）は、１ｍＭの２，６−ナフタレンジスルホン酸の吸収プロファイルであり、ｂ）は、１ｍＭの１−ナフトールの吸収プロファイルであり、ｃ）は、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合溶液の吸収プロファイルである。
【図１４】実施例７の測定（フューズドシリカキャピラリーチューブを使用）において、キャリア溶液として、水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（５：５：３）を用い、（Ｒ）−（＋）−１，１’−ビ−２−ナフトールと（Ｓ）−（−）−１，１’−ビ−２−ナフトールとの混合物の分離実験結果を示す吸収プロファイルであり、ａ）は、上記キャリア溶液に２ｍＭのシクロデキストリンを添加した際の吸収プロファイルであり、ｂ）は、シクロデキストリンが添加されていないキャリア溶液を用いた際の吸収プロファイルである。
【図１５】本発明の分離方法におけるキャピラリーチューブ内の層流の状態を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の分離方法を用いて親水性物質と疎水性物質を含む混合物の分離を行なう際には、キャリア溶液として、水と親水性溶媒と疎水性溶媒との混合液が使用され、このような成分から成るキャリア溶液がオープンキャピラリーチューブ内に送液される。この際、特に好ましいキャリア溶液組成としては、酢酸エチル（疎水性溶媒）と水の他に、両溶媒に分配する親水性溶媒（中間溶媒）を含有するものが挙げられ、溶解パラメータが９．８〜１２．９の範囲であるものが選択される。このような中間溶媒としては、溶解パラメータが１１．８であるアセトニトリル、１１．２であるエタノール、１０．２であるプロパノール等が挙げられる。尚、酢酸エチルの溶解パラメータは８．６で、水の溶解パラメータは２１．０である。特に好ましいキャリア溶液は、酢酸エチル‐アセトニトリル‐水混合液である。
【００１２】
本発明では、親水性物質と疎水性物質の種類に応じて、キャリア溶液中の親水性溶媒（水）と疎水性溶媒の組成比が選択され、親水性溶媒を多く含むキャリア溶液を用いた場合と、疎水性溶媒を多く含むキャリア溶液を用いた場合とで、分離液中の物質の溶出順序が変わる。即ち、親水性溶媒を多く含むキャリア溶液を用いた場合には疎水性物質よりも親水性物質の方が早く溶出され、疎水性溶媒を多く含むキャリア溶液を用いた場合には親水性物質よりも疎水性物質の方が早く溶出される。
【００１３】
本発明の分離方法（キャピラリークロマトグラフィー）を実施するための装置は、図１に示されるように、一定流速でキャピラリー内にキャリア溶液を供給するためのマイクロシリンジポンプ１と、分離用カラムとしてのオープンキャピラリーチューブ２と、オープンキャピラリーチューブ２から排出される排出液中に含まれる物質を検出可能な検出器３とを具備する。この際、マイクロシリンジポンプ１としては市販品が利用でき、オープンキャピラリーチューブ２についても、５０μｍ〜２００μｍ程度の内径を有する市販のポリエチレン製、ポリテトラフルオロエチレン製あるいはフューズドシリカ製オープンキャピラリーチューブがそのまま利用でき、検出器３としては、一般に市販の紫外可視分光光度計が使用されるが、化学発光検出器や蛍光分光光度計も使用可能である。尚、図１の分離装置には、マイクロシリンジポンプ１とオープンキャピラリーチューブ２とを連結するためのジョイント４が設けられており、検出器３の排出側には、分離された液を回収するための分離液回収部（図示されていない）が存在している。
【００１４】
本発明の分離方法においては、疎水性溶媒（有機相）を多く含むキャリア溶液を使用した場合、キャピラリー内壁付近と中央付近でキャリア溶液中の不均一な溶媒組成分布が生じて有機相がキャピラリーの中心部を流れ、水（水相）がキャピラリー内壁に沿って流れ、キャピラリー内壁に沿って流れる水相が、キャピラリーの中心部分付近の有機相よりも遅く移動することにより、有機相に存在し平均流速で移動する疎水性物質の移動速度に比べて、水相に存在する親水性物質の移動速度の方が遅く、両物質の分離に必要な移動速度の差が得られて両物質の分離が達成される。
これとは逆に、水（水相）を多く含むキャリア溶液を使用した場合、キャピラリー内壁付近と中央付近でキャリア溶液中の不均一な溶媒組成分布が生じて水相がキャピラリーの中心部を流れ、疎水性溶媒（有機相）がキャピラリー内壁に沿って流れ、キャピラリー内壁に沿って流れる有機相が、キャピラリーの中心部分付近の水相よりも遅く移動することにより、水相に存在し平均流速で移動する親水性物質の移動速度に比べて、有機相に存在する疎水性物質の移動速度の方が遅く、両物質の分離に必要な移動速度の差が得られて両物質の分離が達成される。
図１５は、本発明の分離方法におけるキャピラリーチューブ内の層流条件下での分離挙動を示す図である。
以下、本発明の実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
実施例１：フルオレセインイソチオシアネートとカルボキシレートポリマー粒子の混合物についての分離実験
分離カラムとして、ポリエチレンキャピラリーチューブ（内径：２００μｍ、外径：５００μｍ、長さ：５０ｃｍ、夏目製作所製）を準備し、このキャピラリーチューブを、図１に示されるようにして、マイクロシリンジポンプ（ＭＦ−９０９０、Bioanalytical Systems, Inc.）及び、検出器としての吸収スペクトル測定装置（ＳＰＤ−６ＡＶ分光光度計、島津製作所製）と接続し、分離装置を作製した。一方、キャリア溶液としては、水／アセトニトリル／酢酸エチルの混合液（１５：３：２（体積比））を準備した。
広内径流体力学クロマトグラフィーを用い、フューズドシリカキャピラリーにて分離を行なった場合に拡散性物質と非拡散性物質の挙動に差は見られるが、原理的に完全分離は困難であると考えられるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とカルボキシレートポリマー粒子（FluoSpheres（登録商標）、粒子径１．０μｍ）の混合物を用いた。
【００１６】
そして、キャピラリーチューブの入口に直接、上記の分離液（キャリア溶液と分析対象物の混合物）を導入した後、キャピラリーチューブの入口をジョイントを介してマイクロシリンジに接続し、シリンジをマイクロシリンジポンプにセットした。上記キャリア溶液を流速４．０μＬ／ｍｉｎでキャピラリー内を送液し、層流条件下で分離実験を行なった。尚、分離された物質を検出するための紫外線波長は２５４ｎｍとした。
この分離実験の結果を図２に示す。図２の（ａ）は、フルオスフェア（登録商標）単独の吸収プロファイルであり、（ｂ）は、ＦＩＴＣ単独の吸収プロファイルであり、（ｃ）は、フルオスフェア（登録商標）とＦＩＴＣの混合物の吸収プロファイルである。
【００１７】
図２（ｃ）に示されるように、分離カラムがポリエチレンキャピラリーチューブである本発明のマイクロフロー分離方法を使用することによって、従来のフューズドシリカキャピラリーを使用した場合には分離が困難であったＦＩＴＣとフルオスフェア（登録商標）の混合物を各物質に分離することができた。本発明のマイクロフロー分離方法による上記混合物の分離については、以下のように考察される。
非拡散性物質であるカルボキシレートポリマー粒子が、層流条件下において、平均流速の２倍の最大速度を持つパラボラ型の流速分布を有する一方、拡散性物質であるＦＩＴＣは平均流速でキャピラリー内を移動していく。そして、ポリエチレンキャピラリー内壁の疎水性によりキャピラリー内壁付近と中央付近でキャリア溶液中の不均一な溶媒組成分布が生じ、その結果、親水性溶媒である水を多く含むキャリア溶液を使用した場合には、キャピラリー内壁付近に有機相が形成され、中央付近に水相が形成され、カルボキシレート基を有するカルボキシレートポリマー粒子は水相に存在するため、流速分布の最大速度付近に分布し、平均流速で移動するＦＩＴＣとの分離が改善されたものと考えられる。
【００１８】
実施例２：２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合物についての分離実験（Ｉ）
分離カラムとして、フューズドシリカキャピラリーチューブ（内径：５０μｍ、長さ：１２０ｃｍ、有効長：１００ｃｍ）を使用し、実施例１の場合と同様にして図１に示される構成の分離装置を作製した（検出波長：；２５４ｎｍ）。
キャリア溶液としては、疎水性溶媒よりも親水性溶媒（水）を多く含む混合液（水：アセトニトリル：酢酸エチル＝１５：３：２（体積比））と、親水性溶媒（水）よりも疎水性溶媒を多く含む混合液（水：アセトニトリル：酢酸エチル＝２：７：３（体積比））の２種類を準備し、流速は０．２μＬ／分とした。分析対象物としては、親水性物質の２，６−ナフタレンジスルホン酸と、疎水性物質の１−ナフトールとの混合物を用いた。
【００１９】
そして、キャピラリーチューブの入口に直接、上記の分離液を導入した後、キャピラリーチューブの入口をジョイントを介してマイクロシリンジに接続し、シリンジをマイクロシリンジポンプにセットした。上記の２種類のキャリア溶液をそれぞれ上記流速でキャピラリー内を送液し、層流条件下（平均線速度：４．２ｍｍ／ｓ）で分離実験を行なった。
この分離実験の結果を図３に示す。ａ）は、キャリア溶液として水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（２：７：４）を用いた場合の、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物の吸収プロファイルであり、ｂ）は、キャリア溶液として水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（１５：３：２）を用いた場合の、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物の吸収プロファイルである。
【００２０】
図３（ａ）及び（ｂ）に示されるように、キャリア溶液として水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（１５：３：２）を用いた場合にも、水／アセトニトリル／酢酸エチル混合液（２：７：４）を用いた場合にも、２，６‐ナフタレンジスルホン酸と１‐ナフトールの混合物から各物質を分離することができた。そして、本発明では、キャリア溶液の組成比を変えることによって、親水性物質と疎水性物質の溶出順序を変更できることがわかった。
上記の実験結果から、図３（ａ）の場合には、キャリア溶液中に多く含まれる疎水性溶媒（有機相）がキャピラリーの中心部を流れ、水（水相）がキャピラリー内壁に沿って流れ、キャピラリー内壁に沿って流れる水相が、キャピラリーの中心部分付近の有機相よりも遅く移動することにより、有機相に存在し平均流速で移動する１−ナフトールに対し、水相に存在する２，６−ナフタレンジスルホン酸の移動の方が遅く、両物質の分離に必要な移動速度の差が得られるものと考えられる。これに対して、図３（ｂ）の場合には、キャピラリー内の水相と有機相の位置が図３（ａ）とは逆になり、キャピラリー内壁付近の有機相が、キャピラリーの中心部分付近の水相よりも移動が遅く、有機相に存在する１−ナフトールに対し、水相に存在する２，６−ナフタレンジスルホン酸が早く移動して、図３（ａ）の場合とは逆の溶出順序になるものと考えられる。
【００２１】
実施例３：２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合物についての分離実験（ＩＩ）
分離カラムとして、ポリエチレンキャピラリーチューブ（内径：２００μｍ、長さ：７０ｃｍ、有効長：５０ｃｍ）を使用し、図１に示される構成の分離装置を作製した（検出波長：；２５４ｎｍ）。
キャリア溶液としては、水：アセトニトリル：酢酸エチル＝１５：３：２（体積比）の混合液と、水：アセトニトリル：酢酸エチル＝２：５：９（体積比）の混合液の２種類を準備し、流速８．０μＬ／分とした。尚、分析対象物としては、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合物を用いた。
【００２２】
実施例２の場合と同様にして上記混合物の分離を行なったところ、図４（ａ）に示されるように、疎水性溶媒を多く含む混合液を用いた場合には２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとを完全に分離することはできなかったが、図４（ｂ）に示されるように、キャリア溶液として水（親水性溶媒）を多く含む混合液を用いることによって両物質を分離することができた。尚、この場合においても、実施例２の場合と同様に、キャリア溶液の組成比が変わることによって、親水性物質と疎水性物質の溶出順序が逆になることが確認された。
上記実施例２〜３から、キャピラリーチューブの内壁が親水性の場合は、水相が内壁付近となるよう、有機溶媒リッチのキャリア溶液を用いることにより、水相に存在する親水性物質とチューブ内壁との相互作用により、親水性物質の溶出を遅らせることができるため、親水性／疎水性物質をよりよく分離できることがわかった。反対に、キャピラリーチューブの内壁が疎水性の場合は、水リッチのキャリア溶液を用いた方が、移動速度の差を大きくすることができるため有利である。
【００２３】
実施例４：２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合物についての分離実験（ＩＩＩ）
キャリア溶液の流速が分離に与える影響、キャピラリーチューブの長さ、内径が分離に与える影響について調査した。
流速の影響を調べる実験においては、分離カラムとして、フューズドシリカキャピラリーチューブ（内径：５０μｍ、長さ：７０ｃｍ、有効長：５０ｃｍ）を使用し、キャリア溶液として、水：アセトニトリル：酢酸エチル＝３：８：４（体積比）の混合液を準備し、流速を０．２μＬ／分、０．５μＬ／分、０．８μＬ／分に変化させた。又、キャピラリーチューブの長さの影響を調べる実験においては、上記のキャピラリーチューブの有効長を５０ｃｍ、１００ｃｍ、１５０ｃｍに変更し、キャピラリーチューブの内径の影響を調べる実験においては、有効長１００ｃｍのフューズドシリカキャピラリーチューブで、内径が５０μｍ、７５μｍ、１００μｍのものをそれぞれ準備し、内径５０μｍの場合の流速は０．５μＬ／分、内径７５μｍの場合の流速は１．０μＬ／分、内径１００μｍの場合の流速は２．０μＬ／分とし（線速度：０．２５ｍ／分）、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合物の分離実験を行なった。
【００２４】
その結果、図５（ａ）、（ｂ）及び図６に示されるように、キャリア溶液の流速、キャピラリーチューブの長さ及び内径を変更しても、最初に検出されるピークはキャリア溶液の平均流速で溶出する場合の検出時間に検出され、２つ目のピークはそれより遅れて検出されることがわかった。
【００２５】
実施例５：ポリテトラフルオロエチレン製オープンキャピラリーチューブを用いた各種混合物の分離実験
内径１００μｍの市販のポリテトラフルオロエチレン製オープンキャピラリーチューブ（長さ：９０ｃｍ有効長：７０ｃｍ）を準備し、キャリア溶液としては、水：アセトニトリル：酢酸エチル＝１５：３：２（体積比）の混合液と、水：アセトニトリル：酢酸エチル＝２：９：４（体積比）の混合液の２種類を準備し、流速は０．８μＬ／分とした。
尚、分離用混合試料としては、下記の３種類の試料を準備した。
（ａ）ペリレンとエオシンＹとの混合物
（ｂ）１，１‐ビ‐２‐ナフトールとビス［Ｎ，Ｎ‐ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フルオレセインとの混合物
（ｃ）ｐ‐ニトロアニリンと２，７‐ナフタレンジスルホン酸との混合物
【００２６】
上記（ａ）〜（ｃ）の混合物の分離実験を行なったところ、図７及び図８に示されるように、ポリテトラフルオロエチレン製オープンキャピラリーチューブを用いた場合にも、各物質を分離することができた。そして、混合物（ａ）〜（ｃ）のいずれの分離においても、水を多く含むキャリア溶液（水：アセトニトリル：酢酸エチル＝１５：３：２）を使用した場合には疎水性物質よりも親水性物質の方が早く溶出され（図７参照）、逆に、有機溶媒成分を多く含むキャリア溶液（水：アセトニトリル：酢酸エチル＝２：９：４）を使用した場合には親水性物質よりも疎水性物質の方が早く溶出された（図８参照）。
【００２７】
実施例６：酢酸エチルと水の両方に分配する親水性溶媒（中間溶媒）を添加した場合の分離実験
酢酸エチルと水の両方に分配する溶媒として、アセトニトリル、１−プロパノール、エタノール、メタノール、ジオキサンをそれぞれ添加した系の分離実験を行い、Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄの溶解パラメータδより中間溶媒の適応範囲について検討した。尚、この溶解パラメータは、Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄによって導入された正則溶液論により定義された値であり、下記式により計算され、上記の各溶媒の溶解パラメータは、水が２１．０、酢酸エチルが８．６、メタノールが１２．９、アセトニトリルが１１．８、エタノールが１１．２、プロパノールが１０．２、ジオキサンが９．８である。
【００２８】
【数１】
2010249632.tif 000002
【００２９】
分離対象混合物として、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合物（モル比１：１）を準備し、キャピラリーチューブとしては、フューズドシリカキャピラリーチューブ（内径７５μｍ、外径１５０μｍ、全長１１０ｃｍ、有効長９０ｃｍ）を使用し、紫外線可視吸光光度計の検出波長は２５４ｎｍとした。
キャリア溶液として用いたのは、以下の５種類である。
１）水‐アセトニトリル‐酢酸エチル（容積比３：８：４）
２）水‐１‐プロパノール‐酢酸エチル（容積比２：３：６）
３）水‐エタノール‐酢酸エチル（容積比２：２：６）
４）水‐メタノール‐酢酸エチル（容積比２：２：９）
５）水‐ジオキサン‐酢酸エチル（容積比４：１１：１１）
【００３０】
図９〜図１３に、上記の５種類のキャリア溶液を使用した際の分離実験結果を示す。図９〜図１３において、ａ）は、１ｍＭの２，６−ナフタレンジスルホン酸の吸収プロファイルであり、ｂ）は、１ｍＭの１−ナフトールの吸収プロファイルであり、ｃ）は、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールとの混合溶液の吸収プロファイルである。
図９〜図１３の結果に示されるように、酢酸エチルと水の両方に分配する溶媒として、アセトニトリル、１‐プロパノール及びエタノールを使用した場合には、２，６−ナフタレンジスルホン酸と１−ナフトールの分離が確認できた。
分離が確認できた中間溶媒の溶解パラメータδは、アセトニトリル１１．８、１‐プロパノール１０．２、エタノール１１．２であった。又、分離が確認できなかったメタノール、ジオキサンの溶解パラメータはそれぞれ、１２．９、９．８であった。
以上の実験結果より、油水混合キャリアを検討するにあたって中間溶媒には、溶解パラメータが１０．２〜１１．８の範囲内にある溶媒で分離が達成されると示唆された。
【００３１】
実施例７：光学異性体の分離実験
分離カラムとして、フューズドシリカキャピラリーチューブ（内径：５０μｍ、外径：１５０μｍ、長さ：７０ｃｍ、有効長：５０ｃｍ）を使用し、以下の分析条件にて１，１’−ビ−２−ナフトールのＲ体とＳ体（いずれも疎水性）の混合物の分離実験を行なった。
尚、キャリア溶液としては、水：アセトニトリル：酢酸エチル＝５：５：３（体積比））の混合液に２ｍＭのβ−シクロデキストリンを添加したものと、水：アセトニトリル：酢酸エチル＝５：５：３（体積比））の混合液の２種類を準備した。
サンプル：（±）−１，１’−ビ−２−ナフトール（２ｍＭ）
流速：０．１７μｌ／分
サンプル注入：落差法（３０ｃｍ×１０ｓ）
検出：３００ｎｍ吸収
【００３２】
図１４（ａ）に示されるように、キラルセレクターとして、内側が疎水性で、外側が親水性の環状オリゴ糖であるβ−シクロデキストリン（Ｓ体を優先的に包接する）が添加された水：アセトニトリル：酢酸エチル混合キャリア溶液を用いた場合には、Ｓ体のみを親水性とできるため、（Ｒ）−（＋）−１，１’−ビ−２−ナフトールと（Ｓ）−（−）−１，１’−ビ−２−ナフトールとを分離することができたが、図１４（ｂ）に示されるように、β−シクロデキストリンが添加されていないキャリア溶液を用いた場合には、１，１’‐ビ‐２‐ナフトールのラセミ体を分離することができなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の分離方法の場合、キャピラリーチューブの内壁に特殊な加工を施さなくても、市販されているオープンキャピラリーチューブをそのまま利用して混合物の分離を実施することができ、又、本発明で使用されるキャリア溶液には塩が含まれていないので、キャピラリーチューブ内での塩析出の恐れがなく、親水性溶媒と疎水性溶媒の組成比率を調節することにより各種混合物の分離に対応可能で、当該組成比率を変更することで親水性物質と疎水性物質の溶出順序を変えることもでき、キャピラリークロマトグラフィーを用いた本発明の分離方法は産業上非常に有用である。
【符号の説明】
【００３４】
１  マイクロシリンジポンプ
２  オープンキャピラリーチューブ
３  検出器
４  ジョイント
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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