(57)【要約】【課題】  末梢動脈障害に起因する跛行を治療するための医薬品組成物を提供する。【解決手段】  ストレプトリジンＯおよびその活性断片を含む医薬品組成物。  ストレプトリジンＯは、薬学的に許容可能な賦形剤と共に使用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢動脈障害に起因する跛行の治療剤を製造するためのストレプトリジンＯの使用。
【請求項２】
ストレプトリジンＯを有効成分とし、かつ末梢動脈障害に起因する跛行の症状を軽減する医薬品組成物。
【請求項３】
前記ストレプトリジンＯの量が、０.００３２ユニット〜５０ユニットである請求項２に記載の医薬品組成物。
【請求項４】
前記ストレプトリジンＯの量が、０.０５ユニット〜１０ユニットである請求項２に記載の医薬品組成物。
【請求項５】
前記ストレプトリジンＯの量が、０.０１ユニット〜１.０ユニットである請求項２に記載の医薬品組成物。
【請求項６】
舌下投与用である請求項２乃至５のいずれかに記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する2003年１月23日に出願された米国特許出願第10/349,606号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は、ストレプトリジンＯの投与によって、結合組織異常、生殖線維症およびＣＤ４４受容体によって媒介される状態を含むさまざまな状態を治療する方法に関する。  本発明は、ストレプトリジンＯの投与によって神経毒剤の影響から神経細胞を保護する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
結合組織は、組織に形態及び強度を与える肉塊の細胞間の材料である。  この「粘着細胞」は、栄養源を組織に送達することに関与し、特定な組織の特別な機能で栄養源を組織に送達することに関与する。  結合組織は、何ダースものタンパク質からなる。  タンパク質は、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコプロテインを含む。  これらのタンパク質の組み合わせは、組織間で変動できる。  これらのタンパク質をコードする遺伝子は、欠損又は突然変異を停泊させることができる。  そして、それは選択された組織の特定の特性の結合組織の機能に影響を及ぼす。  後述するように、多くの異なる疾病状態がある。  そして、結合組織は、デュピュイトラン拘縮、強皮症、ペーロニー疾患、末梢動脈疾患による跛行、動物の乳腺炎を含む特定の疾患の病理学的発現において重要な役割を果たす。
【０００４】
その実施態様の内の一つによれば、本願発明は、デュピュイトラン拘縮、強皮症、ペーロニー疾患、下肢跛行を含む結合組織異常の治療のための方法に関する。  これらの疾患は、働く、身体及び性の活動を実行する、通常の生活水準を保持する、日常的な活動を実行するために、人々の能力で巨大な料金がかかる。  さらに、ウシのポスト慢性乳腺炎感染は、家畜類の生存度及び食物供給(特に酪農業)で巨大な経済関係を有する。
【０００５】
動脈疾患(PAD)は、心臓から遠い血管(通常、腕及び脚において)の損傷又は心臓から遠い血管の遮断を含む。  そして、主要な動脈の不完全又は完全な滅却から軟組織への痛覚、炎症及び虚血性の損傷によって特徴づけられる四肢のいくつかの臨床の遺伝的症候群を含む。  PADの最も特徴的な症状は、間欠性跛行である。  それは、運動による四肢の締めつけ、痛み及びしびれと言われる。  間欠性跛行は、運動連隊を終えることによって鎮静する。  跛行の症状は、アテローム性動脈硬化から生じる。  それは、コレステロール、脂肪、カルシウム及びフィブリン(血液凝固剤)からなるプラークが、動脈盤の内側で堆積する状態である。  動脈盤は、三層からなる：結合組織の層、平滑筋細胞及び弾性結合組織の第二層、並びに、血管内皮細胞の第三層。  これらの細胞に対する損傷は、動脈壁の血栓又は内膜の血小板接着、会合及び発生に至る。  この発生によって、単核細胞が動脈壁に貼着でき又はマクロファージに成熟させる。  一方、泡末細胞発生又は脂肪線条を生成するためにＬＤＬコレステロールを入れる。  動脈の内皮のライニングの中絶は、血小板が活性化されて、結合組織増殖及び脂質取込みに至る内膜に平滑な内側の筋細胞を入れさせる。  血管の動脈壁の結合組織の炎症及び増殖のサイクルは、動脈の内腔の狭細に至る。  そして、血流量を抑止する。
【０００６】
脚及び腕の末梢血管のアテローム性動脈硬化のためのリスク要因は、冠状動脈のアテローム性動脈硬化に対するものと同様である。  喫煙、糖尿、高血圧及び高コレステロールは、プラークの発生に至る。  肉塊が遮断周辺で小さい血管(側副血管)を発生するので、脚動脈のアテローム性動脈硬化をもつ大部分の人々は症状を有しない。  支持された活性については、側副血管は、脚の筋に充分な酸素を供給することができない。  したがって、痛みは、ふくらはぎ、上腿又はでん部筋に関連する。  より進んだ跛行において、痛みが、安静にしていても、起こる。  本症が未処置のままにされる場合、循環の欠如は、脚及び足の潰瘍に結果としてなる。  組織は壊疽になる。  そして、切断を必要とする。
【０００７】
跛行は、しばしば冠状血管及び頸動脈の動脈のアテローム性動脈硬化症の徴候である。
【０００８】
アテローム硬化性疾患の治療において、医師が、評価、リスク要因変異(禁煙及びコレステロール減少)、並びに、運動(頸動脈及び条件筋を刺激する)に注目しなければならない(カルメン他、Am Fam. Physician 61：1027-1034（2000);ガードナー他、JAMA274：975-980（1995);パターソン他、J. Vase. Surg. 25:312-319 (1997)参照）。  アスピリン、チクロピジン又はクロピドグレルのような抗血小板剤(血小板細胞の活性を補充することを防止する)は、24％に血管の死亡、心筋梗塞、発作のリスクを減少させる（Goldhaber他、Lancet 340：143-145（1992);Janzon他、J.Intern. Med. 227:301-308(1990); Lancet 348：1329-1339（1996)参照）。  運動及び医薬品ペントキシフィリンの組み合わせは、跛行を減勢するように見える(フード他、CMAJ 155：1053-1059(1996)）。  血小板凝集及び動脈の血管拡張神経を抑制する医薬品、シロスタゾール、ホスホジエステラーゼ阻害剤は、跛行を克服するために患者が実行できる運動する量及び質を増加させる(ドーソン他、Circulation 98：678-686(1998)）。  これらの医学の測定が、跛行の若干の改善を示すにもかかわらず、当業者によりよい末梢の動脈疾患を治療するための方法は必要とされる。
【０００９】
デュピュイトラン拘縮は、掌の皮膚の下の組織の痛くない肥厚及び拘縮である。  拘縮の原因は知られていない。  しかし、軽微な外傷及び遺伝の素因は、役割を果たすことができる。  一方又は両方の手は、影響を受けることができる。  薬指は多くの場合影響を受ける。  そして、小指、中指及びひとさし指が続く。  小さい、痛くない小結節は、結合組織において、発現して、結局、コード状バンドに発達する。  段階的に、他の小結節は、発現することができて、指の第１関節全体の拘縮を及ぶ。  皮膚の上に横たわることは、しわになり始める。  そして、組織の粗いコードは指に達する。  プロセスが続くように、これらのコードは、締まって、掌の方へ指を引き入れる。  薬指は通常最初に影響を受ける。  小指、中指及びひとさし指が続く。  問題は、痛みでなく、動きの制限及び生じる奇形である。  疾患の経過は、しばしば散在性で予測不可能である。  小結節及びコードの発生を起こすものは、正確に知られていない。  疾患が進行するにつれて、病気にかかった小結節は、正常組織周辺及び間でそれ自体を包む。
【００１０】
発生率は40才を超えてから増加する。  そして、男性は女性より影響を受ける。  面白いことに、リスク要因は、アルコール中毒症、癲癇、肺結核、糖尿及び肝疾患を伴う。  疾患のための治療は、病気にかかった組織を張着すること、暖水浴又は副木のために運動することを含む。  しばしば、これらの測定は、拘縮を示すだけで、拘縮を治療しない。  拘縮が続く場合、外科は、状態の厳しさによって、拘縮をリリースするために実行されることができる。  筋膜切除術、皮膚筋膜切除術、筋膜切開術及び切断を含むいくつかの技術が、使われる。  筋膜切除術は、筋膜組織を取り除くこと及びジグザグ方法で傷を縫合することより実行される矯正外科である(ビザ他、Romanian Journal of Hand and Reconstructive Microsurgy 5：9-13(2000)）。  皮膚筋膜切除術は、デュピュイトラン拘縮の進んだ状態の矯正手順である。  そこにおいて、皮膚、筋膜靱帯及び小結節は、取り除かれる。  取り除かれた皮膚は、植皮片と取り替えられる。  筋膜切開術は、靱帯が切断される合併した外科に適さない高齢患者のための医学手順である。  最後に、まれなケースで(靱帯が多くの時間で回復し、前の神経及び組織損傷が存在する指で）、指の切断は、オプションである。  外科が、普通、通常の運動を指に戻す一方、外科処置の後に疾患は再発し、神経損傷のリスクが各々の外科処置の後で増す。  したがって、デュピュイトラン拘縮を治療するより激しくない方法の必要は、残る。
【００１１】
ペーロニー疾患は、勃起の間、屈曲が生じることがありえる男根での結合組織の障害である。  疾患は、プラーク又は硬い塊(男根の拡張性組織を形成する)によって特徴づけられる。  それは、限局の炎症として始まって、それから硬化した瘢痕に成熟できる。  ペーロニー疾患の原因は、隔壁結合組織に起因することが可能である。  それは、男根の長さにわたる各々の拡張性シリンダの内膜を沿って並んで、そして、男根の上部及び下部にある。  男根が、異常に圧搾される又は撓曲する場合、弾性繊維にある隔壁が過度に広がる範囲は、直立力のある房のライニングを傷つけ、そして、小さい血管を破裂している。
【００１２】
更に高齢のヒトで、減弱された弾性、動脈の病気、糖尿又は根治的な前立腺切除術は、外傷の可能性を増やす。  事実、ペーロニー疾患は、毎年100,000名のヒトから26名のヒトに診断される;しかしながら、比率は、根治的な前立腺切除術の後でペーロニー疾患を発生する64人の患者から３人にまで増加する(ジャロウ他、J. of Urology 158：1388-1390(1997)）。
【００１３】
ペーロニー疾患をもつヒトは、痛みを伴う勃起又は関係の問題点のせいで、通常治療配慮を求める。  いかなる治療の目的は、ペーロニ−の患者を性的に活性に保つことである。  疾患及びその経過についての教育を提供することが、しばしば、必要とされるすべてである。  外科以外のいかなる治療も効果的であるという強い証拠は、ない。  専門家は、通常、疾患を安定させ、変形物が関係を防止する長期間のケースだけで外科を推薦する。  二つの最も一般的な手術法は、皮膚又は人工材料のパッチの配置及び男根の側から傷ついている組織の除去により追従されるプラークの除去又は増殖である。  両方の手順は、拡張性の機能の減失又は垂直の男根の短化を含む副作用の不利な点を有する。  しばしば、ペーロニー疾患のプラークが、６〜15ヵ月の期間にわたる治療なしで、縮退し又は消える。  このように、医学の専門家は、外科的にそれを修正することを試みる前に１〜２年待つことを提案する。  疾患の自生の改善は、60〜70％の患者に見られる。
【００１４】
単一の医療は、臨床的に証明されなかった。  一部の研究者は、経口で小規模の研究でペーロニー疾患をもつヒトにビタミンＥを与えた。  しかし、これらの研究は断定的でないと判明した。  また、類似した断定的でない成功は、パラ-アミノ安息香酸エステルの経口適用に帰された。  そして、物質がＢ-錯体分子の族に帰属した。  ジメチルスルホキシド、ステロイド及び直接プラークへのカルシウム拮抗薬のような薬剤を用いた注射治療が若干の医師によって使われる。  しかし、これらの技術のいずれも納得のいく結果をもたらさなかった。  効果的であることを証明される唯一の医療はタモキシフェンである。  そして、それは痛みを軽減することができて、男根のいかなる曲げも制限できる。  タモキシフェンの不利な点は、ペーロニー疾患が医薬品で最も多くの有効利用のために初期に診断されなければならないということである。  したがって、治療のための方法及びペーロニー疾患の予防のために当業者の欲望は残る。
【００１５】
強皮症は、結合組織の自己免疫性疾患である。  それは、多数の肉塊システム(例えば、胃腸管、呼吸、腎性、心血管、尿生殖系)に影響し、主に皮膚の肥厚及びこわばりによって特徴づけられる。  本症は、皮膚が影響される場合に、ときとして可視であってもよい。  あるいは、内部臓器だけが含まれるときとして不可視であってもよい。  しかし、その併発が、軽度の症状から致命的な症状まで変動できる非常に個々に区別された疾患である。  症状は、過剰の生産、並びに、Ｉ型及びII型コラーゲンの沈着によって、進行期の組織線維症及び微小血管系の滅却から生じる。  結合組織(例えば、グリコサミノグリカン、テネイシン、フィブロネクチン)で見つかる他の巨大分子は、線維症を経験している領域の炎症による生産は増加する。  血管の交互は、小動脈、細動脈及びキャピラリに影響を及ぼすことに対する偏向を示す。  小さい導管細胞骨格は、崩壊に至る構造上の欠損に影響を受ける。  次に、密接した接合部は変えられて、もはや機能的でない。  そして、内皮が導管内腔にすべり込むことができる。
【００１６】
米国の約300,000人のヒトにおいて、20〜50歳の間で通常疾患を呈している男性より多くの女性(４倍以上)で強皮症がある。  強皮症の症状は、下述する一つ以上を含む：レイノー現象(四肢のコールドに対する異常感受性)、手及び足の腫脹、関節の痛み及び堅苦しさ、皮膚の肥厚、関節拘縮、消化系及び胃腸管問題、シェーグレン症候群(乾式粘質膜)、経口、顔及び歯の問題、腎臓、心臓及び肺臓併発、非特異性の症状(例えば、極端な疲労)、一般化した衰弱、体重損失、筋、関節及び骨の漠然とした痛み。  強皮症で最も重大な副作用は肺高血圧症である。  その合併症は、死亡率で最もよくある原因である。  例えば、肺臓は、70〜80％の患者に影響を受けて、線維症又は血筋の変化を開発する。  それは、肺動脈の増加する圧力に至る(ハリソン他、Am. Rev. Respir. Dis. 144:706-713(1991);Silver他、Am. J: Med. 88:470-476（1990））。  線維症は、通常、肺臓の後(背)の領域の近くで、肺臓繊維密度の増加から始める。  線維症の後期段階は、線維のラインのネットワークの発生によって特徴づけられる。  これらの線維のラインは、結局、多数の小さいシストを含む領域に発達する。  末期効果は、時々、「ハチの巣状にする」ことをいい、逆にできない(Wallaert他、Am. Rev. Respir. Dis. 133:574-580(1986)）。
【００１７】
合併症が存在する場合、強皮症を治療するための目的は更なる合併症(例えば、線維症)を防止して、羅病率を減勢することである。  第一の治療は、免疫系変化を抑制することからなる。  そして、それは本症に伴う多種多様な全身の羅病率の原因となってもよい。  皮膚肥厚は、Ｄ-ペニシラミン及びメトトレキサートで治療されることができる。  両方は、免疫抑制剤の影響を増加させ、コラーゲンの発生を減少する。  治療薬リラキシンは、全身性強皮症患者の皮膚肥厚の範囲及び厳しさを減勢している見込みを示した(サイボルト他、Ann. Inter. Med. 132:871-879（2000））。  リラキシンは、形質転換成長因子−β及びインターロイキン-１βを含むプロ線維性サイトカインの作用を弱め、真皮線維芽細胞コラゲナーゼの分泌を増加させる一方で、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤のレベルを減勢する(Unemori他、J. Biol. Chem. 265：10681-10685（1990））。  レイノー病は、カルシウム遮断薬又は局所の硝酸塩で治療されることができる。  胃腸症状は、制酸剤、ポンプ阻害剤及び緩下薬で治療されることができる。  より重症な合併症(肺臓又は肺高血圧症の線維症のような)は、より徹底的な測定を必要とする。  例えば、強皮症及び肺胞炎(肺臓の肺胞細胞の過敏炎症)は、肺臓組織に重症な損傷を引き起こすことがありえる。  シクロホスファミドのような治療薬での治療は、炎症を抑制するように作用するが、肺臓の強皮症のみに対して効果的でない。  むしろ、症状の両方のセットは必要である(White他、Ann. Intern. Med. 334：947-954（2000））。  肺高血圧症は、成育可能な治療オプションの欠如及び高い死亡率を有する全身性硬化症の比較的一般の合併症である。  これらの因子を考慮して、静脈内のエポプロステノールの用途は、いくらかの約束を示した(Badesch他、Ann. Intern. Med. 132:425-434 (2000)）。  しかし、強皮症と同様に静脈閉塞の疾患に苦しむ患者の肺水腫のような可能な鋭形で潜在的な運命の副作用による適用性を制限できる(Barst他、N. Eng. J. med. 132：296-301（1996））。  これらの治療の多数は、それらの実験的な段階にある。  そして、さまざまな強皮症合併症のための現在の治療は、患者に重要な副作用を経験するか、更なる合併症のためのリスクでそれらを載置するか、又は、症状のユニークなセットが充分な治療を提供することを必要とさせる。  このように、強皮症を治療するために改善された方法が、依然として、当業者に必要とされている。  ポスト慢性乳腺炎感染は、ウシの充分な乳汁分泌を防止できる結合組織異常である。  乳腺炎は、世界の全体にわたってかなりの乳ウシに影響を及ぼす乳房の炎症である。  三種類の主要な乳腺炎がある。  そして、三つの異なった段階の現像と一致する。  急性乳房炎は、通常、発熱、食欲不振及ぶ下部の乳汁生産に伴う発赤、熱、痛み、硬さ又は腫脹によって特徴づけられる。  二つの段階は、急性乳房炎の間にある。  急性乳房炎は以下を含む。  (１)乳首に感染及び少数の塊がある炎症性段階;(２)膿汁が発生し、形をなし始める感染段階。  エシェリキア属大腸菌、ストレプトコッカスディスガラクチアーゼ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカスウベリス、無色の藻及びコリネバクテリウムのようなバクテリアは、多数の媒介者(例えば、ハエ、流水、淀んだ水、水タンク、サイレージからの水流出液体、井水、肥料、乳首ディップ容器、搾乳機ライナー、乳首端スワブ及び給水タンク)を経た初期の感染を生じさせることがありえる。  これらのバクテリアは、乳腺に侵入することが可能で、そこにおいて拡大して、炎症性反応に結果としてなる有害物質を生産する。  一旦、感染が開始すると、乳首は感染し、その結果、乳汁が最初に黄色になり、その後水になる。  感染後、こぶ、傷害、硬化剤、傷害性乳首、失われた四分体、乳房皮膚結核及び乳汁生産中のドロップが起こる乳首のレベルで乳腺の反復発作の影響がある慢性乳腺炎は、起こる。
【００１８】
治療の注目は、感染のレベル及び乳腺炎の多くの反複発生が起こった方法に依る。  感染の初めに乳腺炎を診断することは、重要である。  慢性乳腺炎は、妨げるために、最も危険である。  慢性乳腺炎を有する動物は、乳首にしばしば永久的な損傷を得る。  そして、ウシは生産力を失って、傷害性乳首から充分なレベルで乳汁を放出することができない。
【００１９】
いくつかのバクテリアが乳房を感染させる能力を有するので、乳腺炎はコントロールすることは困難である。  ごく最近で最も効果的乳房炎管理測定を利用したよく運営された酪農群さえ、最初の90日の場所で炎症の高い感染率を直面する(Schrick他、Department of Animal Science Annual Report, テネシー大学、ノックスヴィル、プレスで）。  乳腺炎は、米国の乳生産者を直面していて、毎年約20億ドルがかかっている最も経済的に斬新な疾患と記載された(DeGraves and Fetrow, The Veterinary Clinics of North America-Food Animal Practice Update on Bovine Mastitis 9:421-434(1993)）。  このように、ウシが乳房に対する損傷が慢性乳腺炎からの合併症のために起こった後でさえ生産的な乳汁を呈し続けることができる治療の必要は当業者にある。
【００２０】
フィブロイドの形態の生殖の線維症(非癌性の腫瘍)は、女性の哺乳類、最も特に子宮及びファロピー管の繁殖器官に影響を及ぼす。  中でも、筋盤の範囲内で及び子宮の外表面に、フィブロイドは成長できる。  生殖の線維症は、妊娠を有する痛み、出血、尿路、膀胱及び腎臓感染、不妊症及び問題点を含むさまざまな症状に結果としてなることがありえる。  生殖のフィブロイドは、思春期の前に起こらなくて、しばしば閉経期の終結の後、症状を有する。  症状が生じない、又は、通常軽微な症状だけが生じるフィブロイドは、治療を必要としない。  より重症な症状が生じる生殖の線維症は、薬物投与(例えば、経口避妊薬又はゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト(GnRH-As)で治療される。  放射線学手順である子宮の類線維のそくせんのような非外科的治療は、フィブロイドを治療するために実行されることができる。  さらに、筋腫摘出術(受精受力を保持することを目的とする)又は子宮切除術(受精受力を保持しない)のような外科的療法を、行うことができる。  これらの治療にもかかわらず、生殖の線維症の治療のための追加的なオプションのために当業者の欲望は、残る。
【００２１】
さまざまな細胞の活性を調整する表面受容体のCD44属は、本願発明において興味がある。  CD44受容体タンパク質は、約37kDの分子量を有する膜内外グリコプロテインであり、基底膜に対するマトリックス接着リンパ球活性化の役割があり、そして、上皮細胞極性の維持の役割がある。  このように、CD44受容体タンパク質は、リンパ節帰巣受容体として公知であり、「軟骨関連プロテイン」に同族である。  ヒアルロン酸(HA)は、そのリガンドの内の一つである。  CD44受容体の発現変化は、さまざまな癌の腫瘍進行及び転移を伴うと考えられている。  さらに、HAの減少は、脳又は脊髄に外傷に追従している軸索の回帰を抑制する傷害性神経系の瘢痕組織の発生を促進することにおいて、危険な役割を果たす。  対照的に、HAの高分子量形態の蓄積は、さまざまな神経変性疾患の病因に関与できる。  そして、多発性硬化症及びアルツハイマー型痴呆を含む。  また、線維性星状細胞上のCD44受容体が多発性硬化症において、上方制御されるように見えるという診察は、本願発明に興味がある。  したがって、医薬品及び方法がCD44受容体上のヒアルロン酸の影響と同様にCD44受容体の生物学的活性によって介入する願望は、存在する。  さらに、神経防護作用剤が、生育環境及び代謝プロセスの結果として生体内の結果の天然及び合成の神経毒剤に対して、神経細胞を保護する必要は存在する。
【００２２】
ストレプトリジンＯは、グループＡβ−溶血性連鎖球菌から誘導されたろ過可能溶血素のグループのうちの一つである。  具体的には、ストレプトリジンＯは、60kDペプチドである。  そして、還元状態で溶血性であるが、酸化反応に機能させなくされる。  グループＡ連鎖球菌は、ストレプトリジンＯを生じる。  ケラチン合成細胞(皮膚細胞)のプロ炎症性反応の誘起が、連鎖球菌の粘着及びストレプトリジンＯの産出を伴うと思われる(ルイス他、Mol. Microbiol. 27：337-346(1997);Cunningham, M.W.、Clin. Microbiol. 13:470-511 (2000)）。  具体的には、それが上皮細胞のCD44に結合したので、グループＡ連鎖球菌のヒアルロン酸莢膜は、重要な粘着因子であってもよい(シュレイガー他、J. Clin. Investig. 101:1708-1716 (1998)）。  ストレプトリジンＯは、ケラチン合成細胞のCD-44受容体と相互作用することができて、連鎖球菌が血流量を入れることができるために、コラーゲンを溶解できる。  ストレプトリジンＯが、透過細胞のための分析的試薬として一般に当業者に、使われる(例えば、ラージン他、Proc. Nat'l Acad. Sci. (米国）91：7722-7726(1994)）。
【００２３】
それは、グループＡβ-溶血性連鎖球菌を有する従来の感染は、運動障害の次の発生に結合されると報告された。  Taranta,他、Am. J. Med., 20：170-175(1956)。  さらに、グループＡβ溶血性連鎖球菌感染症を有する患者が、自分自身の神経の組織に対して抗体を生じ、この種の抗体が、連鎖球菌感染症により刺激されるという報告がある。  Kiessling他、Pediatrics, 92：39-43（1993）。  面白いことに、障害性の運動に結果としてなる中枢神経系欠乏をもつ患者は、高い抗ストレプトリジンＯ抗体力価を有する。  そして、それらの抗体は、ミエリン塩基性タンパク(多発性硬化症の疑われた原因物質)と交差反応する。
【００２４】
共同所有されている米国特許第5,576,289号及び第5,736,508号は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。  米国特許第5,576,289号は、多発性硬化症及び自閉症を含む運動性欠損によって特徴づけられる疾病状態の治療のための方法でストレプトリジンＯの使用を開示する。  米国特許第5,736,508号は、瘢痕化の治療のための方法でストレプトリジンＯの使用を開示する。  しかしながら、これら開示は、ストレプトリジンＯが、結合組織異常(例えば、デュピュイトラン拘縮、強皮症、ペーロニー疾患、アニマルの乳腺炎及び末梢動脈疾患による跛行)を治療するために用いる有効性を示していない。  ストレプトリジンＯが、生殖の線維症で神経防護作用の効果又は治療の効果を有する、又は、それが、CD44受容体に結合するヒアルロン酸を抑制する効果を有する若しくはCD44媒介プロセスを抑制する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
ある実施形態によれば、本願発明は、ストレプトリジンＯを投与することによって結合組織異常を治療するための方法を提供する。  具体的には、本願発明は、結合組織異常の一つ以上の症状を治療するために効果的な量のストレプトリジンＯを、苦しんでいる患者に投与することによって、デュピュイトラン拘縮、強皮症、ペーロニー疾患、動物の乳腺炎及び末梢の動脈疾患による跛行のような結合組織異常の症状を軽減するための方法を提供する。  ここで使用しているように、ストレプトリジンＯは、CD44受容体と相互作用する又はCD44受容体媒介プロセスを抑制する能力のようなストレプトリジンＯの生物学的活性を保持する活性片、類似体及びそれらの誘導体、並びに、ストレプトリジンＯホモ分子を含む。
【００２６】
ある実施態様によれば、本願発明は、デュピュイトラン拘縮、強皮症、ペーロニー疾患、動物の乳腺炎及び末梢の動脈疾患による跛行のような結合組織異常で苦しんでいる患者に、ストレプトリジンＯの効果的な量を投与することを含む。  正確な投薬量は、患者で変動して、当業者で直ちに決定されることができる。  それにもかかわらず、ストレプトリジンＯは、好ましくは、１日約0.0032ユニット以上50ユニット以下(２ユニット/0.05ml）で投与される。  そして、好ましくは、液状ビヒクルで処方される。  そして、単一のドロップとして、約４ユニットの濃度で提供される。  ストレプトリジンＯの単一のドロップは、0.05〜10ユニットである。  より好ましくは、１ドロップのストレプトリジンＯは、単一のドロップとして、２ユニットである。  ストレプトリジンＯは、より好ましくは、１日約0.01ユニット以上10ユニット以下で投与され、又は、さらに好ましくは、１日約0.1ユニット以上８ユニット以下で投与される。  投与の好ましい経路は、舌下であり、作用すると思われるカプセル剤、錠剤、噴霧剤、局所ローション剤、クリーム、パッチによって、又は、皮内若しくは真皮穿刺によって、口の、口の飲薬、肛門、膣筋、鼻の、病巣内、皮下、皮内、筋肉内、クモ膜下、静脈内、吸入又は局所を含む他の経路であってもよい。
【００２７】
本願発明は、デュピュイトラン拘縮、強皮症、ペーロニー疾患、末梢の動脈疾患による跛行及び乳腺炎のような結合組織異常の症状を軽減するために、被検者若しくは患者に投与するためにストレプトリジンＯ及びそれらの活性断片の医薬品組成物を提供する。  ここで、ストレプトリジンＯが、薬学的許容可能賦形剤との組み合わせで前記結合組織障害の一つ以上の症状を治療するために効果的な量である。  ストレプトリジンＯは、当業者に公知である水、塩類溶液、アルブミン、デキストロース又は他の任意の薬学的許容可能賦形剤を含むが、これらに限定されず、多くの薬学的教養可能賦形剤で処方されることができる。  ストレプトリジンＯは、好ましくは１日約0.0032ユニット以上50ユニット以下(２ユニット/0.05ml)で投与される。  そして、好ましくは液状ビヒクルで処方される。  そして、単一のドロップとして約４ユニットの濃度で提供される。  ストレプトリジンＯの単一のドロップは、0.05〜10ユニットである。  より好ましくは、１ドロップのストレプトリジンＯは、単一のドロップとして約２ユニットである。  ストレプトリジンＯは、より好ましくは、１日約0.01ユニット以上10ユニット以下で投与され、又は、さらに好ましくは、１日約0.1ユニット以上８ユニット以下で投与される。  投与の好ましい経路は、舌下であり、作用すると思われる口の、口の飲薬、皮下、皮内、筋肉内、クモ膜下、静脈内、吸入又は局所を含む他の経路であってもよい。
【００２８】
さらに、本願発明の実施態様によれば、限定を意図するものではないが、腎臓、肝臓、心臓、肺臓、膵臓及び他の器官の線維症のような線維症状態の症状を軽減するための方法が提供される。  そして、線維症状態は、更に子宮の線維症及びファロピー管線維症のような生殖性線維症状態を含む。  方法は、苦しんでいる被検者に、ストレプトリジンＯ及びそれらの活性断片を、不妊症及び月経の不規則を含む生殖性線維症の一つ以上の症状を治療することに効果的な量で投与することを含む。  この方法は、全ての種類の哺乳類の被検者に、特にウマ及びヒトに適用されることができる。  当業者は、遂行される治療、被検者のサイズ及び投与のモードに基づいて投与のための適当な投薬量を直ちに決定することができる。  それにもかかわらず、好ましい投薬量は、ストレプトリジンＯは、約0.0032ユニット以上約50ユニット以下で投与されること、より好ましくは、約0.05ユニット以上約10ユニット以下で投与されること、特に好ましくは、約0.01ユニット以上約1.0ユニット以下で投与されることを含む。
【００２９】
ストレプトリジンＯは、限定を意図するものではないが、当業者に公知である水、塩類溶液、アルブミン、デキストロース又は他の任意の薬学的許容可能賦形剤も含む多くの薬学的許容可能賦形剤において、生殖線維症で苦しむ被検者に投与するために処方されることができる。  ストレプトリジンＯは、好ましくは、１日約0.0032ユニット以上50ユニット以下(２ユニット/0.05ml)の投薬量である。  そして、好ましくは、液状ビヒクルで処方される。  そして、単一のドロップとして、約４ユニットの濃度で提供される。  ストレプトリジンＯの単一のドロップは、0.05〜10ユニットの範囲である。  より好ましくは、１ドロップのストレプトリジンＯは、単一のドロップとして、約２ユニットである。  ストレプトリジンＯは、より好ましくは、１日約0.01ユニット以上10ユニット以下で投与され、又は、さらに好ましくは、１日約0.1ユニット以上８ユニット以下で投与される。
【００３０】
ヒト投与の好ましい経路は舌下であり、作用すると思われる口の、口の飲薬、皮下、皮内、筋肉内、クモ膜下、静脈内、吸入又は局所を含む他の経路であってもよい。  ウマのような非ヒト以外の動物のために、投与の好ましいモードは、投薬量(0.2cc)につき２ユニットの投薬量で皮下投与によってである。
【００３１】
また、神経防護作用量のストレプトリジンＯを投与するステップを含む、被検者を神経毒剤及び状態の影響から保護する方法が、本願発明により提供される。  神経毒剤は、ニューロンを損傷し又は破壊することができて、そして、生育環境に存在する天然及び合成剤を含み、神経毒の性状を有する天然代謝産物を更に含むことである。  神経毒の状態は、化学由来のものに限定されず、照射及び温熱の状態に損害を与えることを含む。  さらに、ストレプトリジンＯの投与は、ニューロンに引き起こされる既存の損傷の改善において、有益でもよい。
【００３２】
ストレプトリジンＯは、一般に、哺乳動物及び特にヒトに神経防護作用効果のために投与されることができる。  本願発明によれば、ストレプトリジンＯが、舌下、口の、口の飲薬、皮下、皮内、クモ膜下、筋肉内、静脈内、吸入及び局所からなる群から選択されるモードにより投与されることができる。  当業者は、遂行される治療、被検者のサイズ及び投与のモードに基づいて投与のための適当な投薬量を直ちに決定することができる。  それにもかかわらず、好ましい投薬量は、ストレプトリジンＯは約0.0032ユニット以上約50ユニット以下で投与されること、より好ましくは、約0.05ユニット以上約10ユニット以下で投与されること、特に好ましくは、約0.01ユニット以上約1.0ユニット以下で投与されることを含む。
【００３３】
また、CD44受容体媒介プロセス(限定を意図するものではないが、一般に、ヒアルロン酸の流通及び配向、そして、創傷治癒に関係させるようなものを含む)を抑制するために効果的な量のCD44受容体を表している細胞に対してストレプトリジンＯを投与することを含む、CD44受容体媒介プロセスを抑制する方法が、本願発明により提供される。  本願発明のストレプトリジンＯを有する治療に影響されやすくてもよい他のCD44媒介プロセスは、過形成/癌腫、中咽頭の扁平上皮癌、乳癌及び汎細気管支炎を含む。  特に、本願発明は、CD44受容体に結合しているヒアルロン酸を抑制する方法を提供する。  そして、本願発明の方法は、結合しているヒアルロン酸を抑制するために効果的な量のCD44受容体を表している細胞にストレプトリジンＯを投与することを提供する。  本願発明の方法は、CD44受容体媒介プロセスを抑制することが望ましく、ヒトを含む被検者に、ストレプトリジンＯの投与により実施されることができる。  本願発明によれば、ストレプトリジンＯが、舌下、口の、口の飲薬、皮下、皮内、クモ膜下、筋肉内、静脈内、吸入及び局所からなる群から選択されるモードにより投与されることができる。  当業者は、遂行される治療、被検者のサイズ及び投与のモードに基づいて投与のための適当な投薬量を直ちに決定することができる。  それにもかかわらず、好ましい投薬量は、ストレプトリジンＯは約0.0032ユニット以上約50ユニット以下で投与されること、より好ましくは、約0.05ユニット以上約10ユニット以下で投与されること、特に好ましくは、約0.01ユニット以上約1.0ユニット以下で投与されることを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本願発明は、薬学的許容可能賦形剤(水、塩類溶液、アルブミン及びデキストロースを含む)で少量のストレプトリジンＯの口の、口の飲薬、肛門で、膣筋で、鼻で、病巣内で、皮下で、皮内で、筋注、髄こう内、経静脈、吸入又は局所投与を含むが、これに限らず、任意の投与のモードによって、結合組織異常の症状をもつ患者を治療する方法を提供する。  本願発明の方法により治療されることができる線維症状態のためのポテンシャルを有する内部臓器は、呼吸器：肺臓、喉頭、咽頭、鼻、洞様血管、エウスタキオ管、細気管支(COPD、気腫);胃腸管：腸管の接着、腸管のフィブロイド、「臓器」、食道、肝臓、消化管、痔核、直腸の瘢痕化、胆嚢管; 循環及び心臓系心臓、心膜(心嚢）、乏血、静脈瘤、アンギナ胸筋、膵臓、リンパ節; 生殖の尿の腎臓、子宮及び子宮内膜、ポリープ(膣筋及び尿道)、男根、膣、ファロピー管、尿道、膀胱、前立腺、子房; 神経：脊髄、末梢神経、眼、硬膜外麻酔及び硬膜下(脳被覆)、耳の眼房、皮膚潰瘍、瘢痕、熱傷、座瘡シスト、他のシスト、強皮症; 筋/骨格：靭帯及び関節、骨格筋を含む。  具体的に、本願発明は、掌及び限られた日常的な手を有する機能の皮膚の下で組織の肥厚及び拘縮の症状を治療することを含むが、これに限らず、デュピュイトラン拘縮を治療するための方法を提供する。
【００３５】
さらに、本願発明は、少量のストレプトリジンＯの投与による末梢動脈疾患による跛行を治療するための方法を提供する。  また、本願発明は、締めつけ、痛み、しびれ感、循環の欠如及び／又は四肢の痛みのような間欠性跛行症状を含むが、これに限らず、末梢動脈障害の症状を治療することに役立つ。
【００３６】
また、本願発明は、少量のストレプトリジンＯの投与によるペーロニー疾患の症状をもつ患者を治療するための方法を提供する。  また、本願発明は、関係を有する痛みを伴う勃起又は問題を含むが、これに限らず、ペーロニー疾患の症状を治療することに充分なペーロニー疾患合併症を治療することに役立つ。
【００３７】
また、本願発明は、少量のストレプトリジンＯの投与による強皮症の症状をもつ患者を治療するための方法を提供する。  また、本願発明の方法は、レイノー病、手及び足の腫脹、関節の痛み及び堅さ、皮膚の肥厚、関節拘縮、消化性及び胃腸管課題、シェーグレン症状、顔及び歯の課題、腎臓病、心疾患、肺疾患、極端な疲労、全身性衰弱、体重損失、筋、関節及び骨での漠然とした痛み、並びに、肺高血圧症を含むが、これに限定されず、強皮症合併症を治療するために役立つ。
【００３８】
また、本願発明は、少量のストレプトリジンＯの投与によるウシの慢性乳腺炎の症状を治療するための方法を提供する。  また、本願発明の方法は、ウシの発熱、食欲不振及び低い乳汁生産に伴う発赤、熱、痛み、硬さ又は腫脹によって特徴づけられる乳腺炎合併症の治療に役立つ。
【００３９】
本願発明は、ストレプトリジンＯの効果的な量の投与によって、子宮及びファロピー管線維症を含む生殖線維症の症状を治療するための方法を提供する。
【００４０】
本願発明は、ストレプトリジンＯの効果的な量の投与によって、神経細胞の神経毒剤の負の影響の保全のための神経防護作用方法を提供する。
【００４１】
さらに、本願発明は、プロセスを抑制するために効果的な量のCD44受容体を表している細胞へのストレプトリジンＯの投与を含む、CD44受容体媒介状態で媒介するための方法を提供する。  また、CD44受容体に結合するヒアルロン酸を抑制するために効果的な量のCD44受容体を表している細胞にストレプトリジンＯを投与することを含む、CD44受容体に結合するヒアルロン酸を抑制するための方法が提供される。
【００４２】
以下の実施例は、さまざまな本願発明の態様を例示する。  実施例１〜８は、結合組織異常の治療に関して本願発明の方法を例示する。  そして、実施例８は、ウシ乳房炎を治療する方法を例示する。  実施例９及び10は、生殖線維症で苦しむ被検者にストレプトリジンＯを投与する方法を例示する。  実施例11及び12は、神経細胞を神経毒剤の影響から保護する方法を例示する。  実施例13は、ヒトケラチン合成細胞CD44受容体のヒアルロン酸とストレプトリジンＯとの間で実行される競合阻害アッセイの結果を示す。
【実施例】
【００４３】
実施例１
85歳の女性患者は、末梢動脈疾患によるふくらはぎ痛で苦しんだ。  彼女は、１ドロップ(２ユニット/0.05ml)のストレプトリジンＯの舌下投与による１日２〜４回で治療を開始した。  治療前に、彼女は、彼女のふくらはぎに痛みを感じることなく、３分間歩くことができるだけだった。  治療後、彼女は、彼女のふくらはぎで痛みがない９分間歩くことができた。
【００４４】
実施例２
80歳の女性患者は、彼女の右側の末梢動脈疾患による下肢痛みで苦しんだ。  彼女は、１ドロップ(２ユニット/0.05ml)のストレプトリジンＯの舌下投与による１日４回で治療療法を開始した。  治療療法で、彼女の痛みは、軽減された。
【００４５】
実施例３
72歳の男性は、彼の医師によって、末梢動脈疾患による下腿痛みと診断された。  彼は、１ドロップ(２ユニット/0.05ml)の割合及び量でストレプトリジンＯの舌下投与による１日４回で治療を開始した。  治療療法は、かなり脚痛みを減少させて、更に彼のエネルギー、作業能力を改良し、彼の全体的な生活の質を改良した。
【００４６】
実施例４
67歳の男性は、片方の手がデュピュイトラン拘縮と診断された。  彼は、１ドロップ(２ユニット/0.05ml)の割合及び量でストレプトリジンＯの舌下投与による１日４回で治療を開始した。  １４日の治療後、疾患の症状は、各々の新規な治療で次第に軽減した。
【００４７】
実施例５
64歳の男性は、彼の医師によって、両方の手がデュピュイトラン拘縮と診断された。  彼は、１ドロップ(２ユニット/0.05ml)の割合及び量でストレプトリジンＯの舌下投与による１日４回で治療を開始した。  １４日の治療後、疾患の症状は、両方の手で各々の新規な治療で次第に軽減した。
【００４８】
実施例６
57歳の男性患者は、彼の医師によって、ペーロニー疾患と診断された。  彼は、１ドロップ(２ユニット/0.05ml)の割合及び量でストレプトリジンＯの舌下投与による１日３回で治療を開始した。  ３０日の治療後、彼の男根の拘縮の改善は、患者及びそれらの医師により注目された。
【００４９】
実施例７
男性患者は、彼の医師によって、ペーロニー疾患と診断された。  彼は、１ドロップ(２ユニット/0.05ml)の割合及び量でストレプトリジンＯの舌下投与による１日３回で治療を開始した。  ３０日の治療後、彼の男根の拘縮の改善は、患者及びそれらの医師により注目された。
【００５０】
実施例８
ウシ(乳腺炎に一つ以上の四分体を失った)は、１ドロップ(２ユニット/0.05ml)のストレプトリジンＯの舌下投与による３０日間１日２回で治療された。  乳腺炎のために損害を受ける四分体は、回復し、治療後、乳汁を生産した。
【００５１】
実施例９
この実施例によれば、ストレプトリジンＯは、妊娠することができなかった生立をもつヒトの27歳の女性に投与された。  被検者は、子宮及びファロピー管で類線維の瘢痕化で苦しむと診断されて、妊娠しているようになることが20％の可能性より少なくいとして評価された。  具体的には、ストレプトリジンＯは、１ドロップ(２ユニット/0.05ml)の舌下投与による１日４回で投与された。  被検者は、治療の開始の６週以内で妊娠しているようになって、健康な子供を出産した。
【００５２】
実施例１０
この実施例によれば、ストレプトリジンＯは、腺周囲又は子宮の線維症で苦しむと診断される10匹の雌ウマに投与された。  雌ウマは、卵着床を防止する腺周囲又は子宮の線維症、及び／又は、例えば、成長胚に対応するには不充分な子宮の拡大の結果としていくつかの妊娠後、不妊性になる。
【００５３】
腺周囲又は子宮の線維症で苦しむと診断される10匹の雌ウマは、投薬量(0.2cc)につき、２ユニットの投薬量で、ストレプトリジンＯの皮下投与により治療された。  ウマは、２週間、１日２回のストレプトリジンＯの投与により治療され、その後、１週間、１日に１投薬量で治療された。  治療前後で、子宮内膜生検による最初の３匹のウマの組織病理評価の結果を、表１に記載している。  子宮内膜生検は、最悪の場合であるカテゴリIIIを有するカテゴリIIA、IIB及びIIIを通ってカテゴリＩ(基本的に正常)のグレードがある。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
最初の３匹のウマは、ストレプトリジンＯの投与の後で飼育された。  ２匹のウマは、子を産む(50日を超える生活胚を担持した)ことにおいて、問題なかった。  第４のウマが、飼育されないが、子宮内膜生検によって定まる子宮の線維症を減勢したとわかった。  次の６匹のウマで、組織病理評価は利用できなかった。  しかし、３匹は本願発明の療法後、過大評価した。
【００５６】
実施例１１
この実施例によって、ストレプトリジンＯの神経防護作用効果は、神経神経-筋共生培養(A skanas and Engel, Neurology 25：58-67 (1975)によって開発された)を利用しているグルタメート中毒モデルで決定された。  この培養は、ラット脊髄コード外植体及び後根神経節を有する細い溝のあるヒト筋肉繊維神経支配を創作することを可能にする。  共生培養の15日後、筋肉繊維は、自生の収縮活動を示す。  この共生培養において、神経毒剤(例えば、グルタメート又は過酸化水素)を使用した中毒によって、細胞死を誘発することは、その後、可能である。  この種の中毒は、依存している時間である。  そして、運動神経の生育性及び官能性は、二つのパラメータから研究されることができる：筋収縮活動及びアポトーシス誘起(細胞質ヒスタミン関連のＤＮＡフラグメントの数量化に基づいて、ＥＬＩＳＡ方法によって定量化される）。
【００５７】
グルタメートは、哺乳類のCNSの主興奮性の神経伝達物質である。  しかし、その受容体の過剰刺激によって、神経変性が生じる。  経験的プロトコルによれば、神経-筋共生培養で、培地の10mMのグルタメートは、１日後、収縮活動を減少させ、１週後にアポトーシスによって、運動神経細胞死を導く。  この運動神経細胞死は、筋肉繊維退化を誘発する。
【００５８】
この実施例によれば、二つの濃度のストレプトリジンＯ(0.01％及び１％(条件につき４ウェル))は、確立した神経-筋共生培養で、９日間培養された。  条件付きの培養媒体は、毎日交換された。  培養は、それから、10mMのグルタメート又は800μMの過酸化水素(H2O2)で、浸けられ、そして、(１)収縮の頻度の数量化によって、(２)アポトーシスの数量化で測定される細胞死レベルによって、神経毒性効果が評価された。
【００５９】
細胞の収縮頻度は、それから、0.01％及び１％のストレプトリジンＯを有する培養の有無にかかわらず、培養の前、１時間、24時間、48時間及び72時間の中毒の後で、それぞれ画像分析ソフトウェアにより、測定及び記録された。  結果は、100％として表される培養の前に、収縮頻度と比較して収縮頻度のパーセンテージとして与えられる。  二つの共生培養は試験された(生成物SO 0.01％及び１％(条件につき４ウェル)と、グルタメート10mM及びH2O2 800μM）。  これらの結果は、ストレプトリジンＯが、24時間、48時間及び72時間後に、安定期になる収縮頻度の劇的な増加の原因となったことを示す。
【００６０】
10mMの濃度のグルタメートの24時間の培養の後、選択された筋肉繊維の収縮頻度の増加が、観察された。  10mMグルタメート濃度の48時間の培養の後、筋肉繊維の収縮頻度は、その基本レベルより低いレベルに達するために減少した。  ストレプトリジンＯ培養と組み合わせる10mMグルタメート中毒の後の収縮頻度は、最初の24時間の間、増加した。  そして、48時間後に、グルタメート中毒より高いままだった。
【００６１】
筋肉繊維(条件につき４ウェル)の収縮頻度のストレプトリジンＯの影響は、10mM L-グルタメートと１時間、24時間、48時間及び72時間の中毒の後で、神経-筋共生培養から選択される。  具体的には、データは、100％として表される培養の前の正常化されたコントロール反応と比較して、二つの濃度(0.01％及び１％)で示される。
【００６２】
図１に示される結果は、収縮頻度(0.01％のストレプトリジンＯを有する)は、コントロール反応の約250％の安定期に着くために、劇的に増加し、そして、１％のストレプトリジンＯ濃度のそれは、さらにより大きい収縮頻度に増加することを例示した。
【００６３】
100％(条件につき分析される４つの繊維)として表される培養の前に正常化されたコントロール反応と比較して10mM L-グルタメートに浸かる神経筋共生培養の収縮頻度の二つの濃度(0.01％及び１％)のSOの影響を、図２に示している。  図２は、10mM L-グルタメートの１時間及び24時間の培養の後の収縮頻度が、劇的に増加したことを示して、広い標準偏差を示す。  48時間の培養の後、筋肉繊維の収縮頻度は、その基本レベル(100％)を回復するために減少した。
【００６４】
１時間の培養期間の後、10mM L-グルタメート中毒の後の0.01％のストレプトリジンＯの影響は、コントロール反応の約150％まで増加を示して、24時間後に200％まであった。
【００６５】
48及び72時間後に、収縮頻度は、コントロール反応の120％以上に達した。  10mMのグルタメートの存在下で１時間の培養期間の後で、１％のSO149が、コントロール反応の約200％まで増加につながって、24時間の後と同じであった。  48時間後に、収縮頻度は150％に達した。  そして、それは72時間後に基本レベル(コントロール反応の100％)に回復した。
【００６６】
これらの結果は、10mMのグルタメート中毒の後、ストレプトリジンＯが筋刺激効果及び神経防護作用効果を有することを示す。  細胞アポトーシス数量化により分析される。
【００６７】
実施例１２
この実施例によれば、ストレプトリジンＯの神経防護作用効果が、過酸化水素中毒(800μM)及びグルタメート(10mM L-グルタメート)中毒の９日後で細胞アポトーシスの数量化により分析された。  負及び正のアポトーシスコントロールが、それぞれ(ａ)培養媒体、(ｂ)グルタメート10mM、(ｃ)H202 800μMであり、アポトーシスは、Cell Death Detection ＥＬＩＳＡ kit'&apos; （ロシュ）を使用して評価された。
【００６８】
具体的には、神経筋共生培養のアポトーシスの発生は、以下の９日後に405nmで光学密度を測定した：(ａ)二つの濃度(0.01％及び１％)でストレプトリジンＯの培養、(ｂ)10mMのLグルタメート及び800μMの過酸化水素の中毒、(ｃ)二つの濃度0.01％及び１％のストレプトリジンＯと組み合わせる10mMのLグルタメート及び800μMの過酸化水素の培養。
【００６９】
結果は、ストレプトリジンＯ 0.01％を有する培養内のアポトーシスからの細胞死のレベルが、コントロール培養(0.3 OD)とほぼ同様であることを示した。  グルタメート中毒は、コントロール培養とほぼ同様であったアポトーシスから、細胞死レベルを示した。  グルタメート及びSO 0.01％又は１％の培養を有する培養内のアポトーシスからの細胞死レベルは、コントロール培養と類似していた。  過酸化水素中毒は、細胞死レベルが僅かにコントロール培養より高いことを示した。  過酸化水素及び0.01％又は１％の培養の濃度のストレプトリジンＯを有する細胞死レベルは、過酸化水素に浸ける培養と類似していた。  これらの結果は、ストレプトリジンＯの神経防護作用効果が抗アポトーシス効果に関連がないことを示唆する。
【００７０】
実施例１３
この実施例によれば、競合阻害アッセイが、ヒトケラチン合成細胞CD44受容体のヒアルロン酸とストレプトリジンＯとの間で担持された。  ストレプトリジンＯは５つの異なるケラチン合成細胞の培地で培養された。  そして、メラニン細胞ヒト一次培養は、細胞毒性を誘発しなかった。  しかしながら、同じ培養条件で、１×及び0.1×濃度のストレプトリジンＯは、メラニン細胞細胞発育ではなく、ケラチン合成細胞細胞発育の増加を誘発した。
【００７１】
鏡検分析を使用しているケラチン合成細胞の細胞表面マーカのストレプトリジンＯの発生率の評価は、モノクローナル抗体により実行される免疫蛍光法標識化で測定された。  ストレプトリジンＯが、５つのケラチン合成細胞マーカー(CD44、CD47、CD40、CD49-ｃ及びMMP-２)に影響を及ぼすことがわかった。  特に、１×、0.1×、および0.01×のストレプトリジンＯは、プラシーボを有する染色の減失と比較した26時間の培養の後のケラチン合成細胞のCD44の形質発現を保持するように見えた。
【００７２】
CD44がヒアルロン酸(HA)受容体であったと観察された。  CD44-HA機能のストレプトリジンＯの影響を決定するために、競合阻害アッセイは、ケラチン合成細胞CD44受容体のヒアルロン酸(HA)とストレプトリジンＯとの間で実行された。  具体的には、ケラチン合成細胞CD44受容体のヒアルロン酸(HA)とストレプトリジンＯ(MIL001)との間の競合阻害は、01-010細胞培養(15,000ケラチン合成細胞/ウェル)で試験された。  この培養は、(１)ストレプトリジンＯ濃度(0.01×)、及び(６)６つの異なるヒアルロン酸(HA)濃度(０％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、および、0.01％）、そして、３つの異なる培養時間(１、20及び44時間)で処理された。  阻害は、顕微鏡分析を使用している抗ヒトCD44モノクローナル抗体により実行される免疫蛍光法標識化で測定された。
【００７３】
具体的には、正常ヒトケラチン合成細胞は、第一継代の間、KGM培地(BioWhittaker博士)で解凍されて、種をまかれた。  サブ集合で、角化細胞は、ウェルにつき15,000ケラチン合成細胞を有する扁平な底のマイクロタイタープレートのKGM培地によりトリプシン処理され、列挙されて、培養された。  培養は、湿った５％CO2雰囲気の37℃で培養された。
【００７４】
0.01×で希釈されたストレプトリジンＯ 100×(200ユニット)は、細胞種入れ後、24時間、96ウェルマイクロプレートで(コントロールプラシーボを添加するか添加しないで)、そして、１時間、20時間及び44時間、培養で保持された。  0.1％、0.05％、0.01％、0.005％及び0.001％のヒアルロン酸溶液の異なる濃度は、異なる培養ウェルで１/10に希釈された。  そして、ウェルに添加された。  各々の培養の時間(１時間、20時間及び44時間)終了後に、ケラチン合成細胞が洗浄されて、エタノール/酢酸(95/５)で５分間、−20℃で準備された。  その後、細胞は、広範囲に緩衝液によって洗浄されて、ラベル(Caltag Laboratories)をつけられるヒトCD44テストフィコエリトリンに、モノクローナル抗体で染色するまで、４℃で格納された。
【００７５】
定量的結果分析は、それから各々の培養に行われた。  この定量分析は、HA濃度の機能として、プラシーボ又はMIL001 0.01×を有するCD44免疫染色の傾向を与える。  結果は、プラシーボサンプルのために、CD44染色は、２より高いHA濃度0.001％及び0.01％で増加されることを示す。  しかしながら、0.005％で、染色は、より低いHA濃度と同様である。
【００７６】
培養の１時間後及び20時間後の結果は、CD44受容体に結合するヒアルロン酸を抑制することに関して、ストレプトリジンＯとプラシーボとの統計学的に有意の違いを示さなかった。
【００７７】
44時間の培養の後の結果は、CD44形質発現が、プラシーボより、０％のヒアルロン酸の存在下のMIL001 0.001×で強くて、ストレプトリジンＯがケラチン合成細胞でCD44形質発現を増加することを確認することを示す。  CD44染色は、0.0001％のヒアルロン酸と、MIL001 0.001×の混合液で強い。  しかし、プラシーボで観察されるレベルに戻るヒアルロン酸の他の濃度で減少する。  このように、ヒアルロン酸は、プラシーボと比較してCD44受容体発現を増加するために示されたMIL001 0.001×で、ストレプトリジンＯの影響を抑制する。
【００７８】
44時間の競合後の結果は、低濃度のヒアルロン酸(0.0001％及び0.0005％)が、ヒアルロン酸の非共存と比較して、CD44受容体発現を増加させることを示す。  それから、CD44の形質発現は、高いHA濃度で減少するが、負コントロール(プラシーボ+ HA ０％)よりまだ高い。
【００７９】
さらに、どんなヒアルロン酸濃度が培養に存在しても、MIL001 0.001×のストレプトリジンＯで培養されるサンプルで、CD44受容体発現はヒアルロン酸の非存在下で得られた結果と比較して定常的である。  換言すれば、ヒアルロン酸は、MIL001 0.001×でストレプトリジンＯの存在下で、培養のケラチン合成細胞でCD44受容体発現に、影響を及ぼさない。
【００８０】
さらに、結果は、HAがMIL001 0.01×培養によって誘発されるケラチン合成細胞でCD44受容体の増加発現を抑制して、これにより、44時間の培養の後でCD44受容体結合のためのストレプトリジンＯ(MIL001)とヒアルロン酸(HA)との間で競合を示すことを示す。
【００８１】
本願発明の実行において、多数の修正変更は、それの好ましい実施形態を考慮して、当業者に行われる。  したがって、本願発明の範囲にある限定は、添付の請求の範囲において理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】グルタメート中毒モデルの神経筋共生培養の陣痛頻度におけるストレプトリジンＯの影響を示すグラフである。
【図２】グルタメート中毒モデルの神経筋共生培養の陣痛頻度におけるストレプトリジンＯの影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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