(57)【要約】      （修正有）【課題】糖化、及び発酵により柑橘類外皮からエタノールを製造する方法の提供。【解決手段】（A）外皮を含む柑橘類由来原料を糖化処理する工程；及び(B)工程(A)で得られた処理物を、アルギン酸塩を含む担体にエタノール生産酵母を担持させてなる固定化酵母を用いたエタノール発酵処理に供してエタノールを得る工程；を含むエタノールの製造方法。前記工程(A)、及び工程(B)が同一槽内で行われる、エタノールの製造方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(A) 外皮を含む柑橘類由来原料を糖化処理する工程；及び
(B) 工程(A)で得られた処理物を、アルギン酸塩を含む担体にエタノール生産酵母を担持させてなる固定化酵母を用いたエタノール発酵処理に供してエタノールを得る工程；
を含むエタノールの製造方法。
【請求項２】
前記アルギン酸塩がアルギン酸カルシウムである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アルギン酸塩の重量平均分子量が2万〜20万である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記固定化酵母が、アルギン酸塩を含む担体にエタノール生産酵母を、該担体の乾燥重量1gに対してエタノール生産酵母106〜1012個の割合で担持されてなる請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記担体が略球状である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記担体が平均直径2〜5mmの略球状である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程(A)及び工程(B)が同一槽内で行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化及びエタノール発酵により柑橘類外皮からエタノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、農産・食品廃棄物からのバイオエタノール生産が注目され、トウモロコシ、麦等のでんぷん質系植物、サトウキビ、テンサイ等の糖質系植物、或いは木材等セルロース系植物などの炭水化物含有植物から、石油資源の代替としてエタノールが広く生産されるようになってきている。
【０００３】
植物バイオマスからエタノールを生産する方法としては、バイオマスの炭水化物をエタノール発酵が可能な単糖又は二糖に加水分解（糖化）し、その単糖をエタノール生産酵母によってエタノールに変換するのが一般的である。
【０００４】
炭水化物の糖化としては、一般的にはいわゆる酸分解法、酵素法の２つの方法が用いられている。酸分解法は、特許文献１及び２にあるように、バイオマスを希硫酸等の酸中で糖化させて糖を製造させるものである。一方、酵素法は、特許文献３〜８にあるように、バイオマスを酵素の作用により糖化させて糖を製造させるものである。
【０００５】
みかん等の柑橘類は大部分が生食用として利用されているが、一部はジュース、ジャム等に加工した上で利用されている。柑橘類外皮は加工する工程で多量に排出され、産業廃棄物として処理される。平成12年に施行された食品循環資源の再生利用等の促進に関する法律（食品リサイクル法）において、食品廃棄物の飼料・肥料、エタノールなどへの再生利用が取り組まれている。このように、現在では資源の有効活用の観点から、廃棄柑橘類外皮を資源として有効活用することが模索されている。
【０００６】
ところが、糖化及びエタノール発酵により柑橘類外皮からエタノールを製造する場合は、外皮に含まれるリモネンが酵母の成育を阻害することが知られている。このため、発酵を完全には阻害しない程度にまであらかじめリモネンを発酵前に低減させておく必要があった。例えば、糖化前に外皮を150℃〜160℃で蒸気爆砕（steam explosion）したり（非特許文献１）、又は糖化後に外皮に対してろ過操作を行い、残渣を除去するなどしてあらかじめリモネンを低減させた上で発酵を行ってエタノールを得たという報告がある。
【特許文献１】特開２００６−３３３７４９号公報
【特許文献２】特開２００６−０８８１３６号公報
【特許文献３】特開２００２−１８６９３８号公報
【特許文献４】特開２００５−０５８０５５号公報
【特許文献５】特開２００６−０７５００７号公報
【特許文献６】特開２００６−０８７３５０号公報
【特許文献７】特開２００６−１０１８２９号公報
【特許文献８】特開２００７−１５１４３３号公報
【非特許文献１】Mark R. Wilkins et.al.，Simultaneous saccharification and fermentation of citrus peel waste by Saccharomyces cerevisiae to produce ethanol，Process Biochemistry，42，p1614-1619，2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
柑橘類外皮には発酵を阻害するリモネンが含まれるため、糖化及び発酵により柑橘類外皮からエタノールを製造する場合は、このリモネンによる悪影響を軽減させる必要があったが、非特許文献１の方法をはじめ従来の方法では、煩雑でコストがかかるという欠点があった。
【０００８】
そこで、本発明は、糖化及び発酵により柑橘類外皮からエタノールを製造するに際し、より簡便かつ低コストでリモネンによる悪影響を軽減する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、アルギン酸塩を含む担体に酵母を担持させてなる固定化酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、前記のリモネンによる悪影響を軽減させることができることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、さらに改良を重ねることにより完成したものである。すなわち、本発明は以下の通りである。
項１．(A) 外皮を含む柑橘類由来原料を糖化処理する工程；及び
(B) 工程(A)で得られた処理物を、アルギン酸塩を含む担体にエタノール生産酵母を担持させてなる固定化酵母を用いたエタノール発酵処理に供してエタノールを得る工程；
を含むエタノールの製造方法。
項２．
前記アルギン酸塩がアルギン酸カルシウムである、項１に記載の製造方法。
項３．
前記アルギン酸塩の重量平均分子量が2万〜20万である、項１に記載の製造方法。
項４．
前記固定化酵母が、アルギン酸塩を含む担体にエタノール生産酵母を、該担体の乾燥重量１ｇに対してエタノール生産酵母106〜1012個の割合で担持されてなる項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
項５．
前記担体が略球状である、項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
項６．
前記担体が平均直径2〜5mmの略球状である、項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
項７．
前記工程(A)及び工程(B)が同一槽内で行われる、項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のエタノール製造方法は、アルギン酸塩を含む担体にエタノール生産酵母を担持させてなる固定化酵母を利用して発酵させることにより、柑橘類外皮中に含まれるリモネンによる発酵阻害作用を軽減することができる。このため、本発明は、柑橘類外皮からエタノールを糖化及び発酵によって高効率かつ簡便に製造する方法を提供することができる。
【００１１】
また本発明のエタノール製造方法は、柑橘類外皮を原料としてエタノールを製造することができる。このため、本発明は、産業廃棄物となっている柑橘類外皮を有効活用する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のエタノールの製造方法は、外皮を含む柑橘類由来原料を糖化処理する工程(A)と、この処理物を固定化酵母によりエタノール発酵処理する工程(B)とを含む。以下、工程ごとに分けて本発明を詳述する。
【００１３】
１．工程(A)について
工程(A)は、外皮を含む柑橘類由来原料を糖化処理する工程である。
【００１４】
柑橘類としては、例えば温州みかん、夏みかん、オレンジ、伊予柑、グレープフルーツ、レモン、ライム、柚子、及び八朔等が挙げられる。
【００１５】
外皮には、少なくとも果皮が含まれていればよく、さらにアルベト層（白い海綿状の部分）が含まれていてもよい。
【００１６】
外皮を含む柑橘類由来原料（以下、単に「柑橘類由来原料」と略記することもある。）としては、外皮に加えてさらにじょうのう膜を含むものも用いることができる。また、柑橘類から果汁を搾汁した残りの粕も用いることができる。さらに柑橘類を丸ごと破砕した破砕物も用いることができる。
【００１７】
糖化処理に際してはまず、柑橘類由来原料を細切又は粉砕等の前処理に供しておいてもよい。これらの前処理によって柑橘類由来原料の大きさを5mm角以下に調節しておくことが好ましい。柑橘類由来原料の大きさをこの範囲内に調節しておけば、その後の糖化が円滑に進行するため、より短時間でエタノールを製造することが出来る。
【００１８】
糖化処理とは、柑橘類由来原料に含まれる炭水化物を分解することによって、エタノール生産酵母が炭素源として利用可能な糖を得ることをいう。そのような糖としては、柑橘類由来原料に含まれる炭水化物を分解することによって得られる単糖、又は二糖、好ましくはグルコース、若しくはフルクトース等の単糖が挙げられる。
【００１９】
糖化処理の方法としては、酵素法又は酸分解法等の、炭水化物を糖化する公知の方法を使用することができる。
【００２０】
酵素法とは、炭水化物を含む原料から酵素の働きを利用して糖を得る方法である。使用する酵素としては、例えば、セルラーゼ、ペクチナーゼ、及びベータグルコシダーゼが挙げられる。アクレモニウム（Acremonium）属菌由来のセルラーゼが好ましい。
【００２１】
中でも柑橘類外皮の細胞壁を効率的に分解するという観点ではセルラーゼが好ましい。これらの酵素は一種単独で使用してもよく、また二種以上を任意に混合して使用してもよい。
【００２２】
酵素法による糖化処理の条件は、使用する酵素の種類、及び活性等の特性に応じて適宜設定される。例えば、次が挙げられる：酵素濃度0.2〜2.0FPU／ml；柑橘類由来原料濃度50〜200g乾燥重量／l；pH4〜5；温度30℃〜50℃；処理時間0.5時間以上、好ましくは0.5〜120時間、より好ましくは1〜72時間、よりさらに好ましくは1〜48時間。なお、酵素活性の単位であるFPU（Filter Paper Unit、ろ紙分解活性）は、セルロース分解酵素活性に関するInternational Union of pure and Applied Chemists (IUPAC) の標準測定法（Ghose, T. (1984), Measurement of Cellulase Activity, Commission on Biotechnology, International Union of Pure and Applied Chemistry, New Delhi, India.；Ghose, T. K. (1987), Pure Appl. Chem. 59, 257-268.等）、又はそれと同等の方法に基づいて測定することができる。またpHについては適当な緩衝液を使用することで調整することができる。
【００２３】
酸分解法とは、炭水化物を含む原料から酸加水分解により糖を得る方法である。酸分解法としては、濃硫酸を用いる方法（濃硫酸法）、及び希硫酸を用いる方法（希硫酸二段糖化法）等の公知の方法を用いることができる。希硫酸二段糖化法においては、まず、第一段階において希硫酸によりヘミセルロースを糖化した後、糖化液と残ったセルロース分の固体とを分け、次に、第二段階において条件を変えてセルロースを希硫酸で糖化する。
【００２４】
上記の糖化処理は、1回のみ実施してもよいし、糖化処理後の処理液を用いて複数回繰り返し実施してもよい。
【００２５】
糖化処理の方法としては、糖化処理を行った後の処理液をそのまま次の工程(B)の発酵処理に供することができるため、酵素法が好ましい。
【００２６】
糖化処理は、柑橘類由来原料の炭水化物のうち好ましくは少なくとも50%が、より好ましくは少なくとも70％が、さらにより好ましくは少なくとも90％がエタノール生産酵母に利用可能な糖に分解されるまで実施される。
【００２７】
かくして工程(A)により得られた処理物には、エタノール生産酵母が利用可能な糖の他、発酵阻害物質であるリモネン等が含まれている。
【００２８】
２．工程(B)について
工程(B)は、工程(A)で得られた処理物を、アルギン酸塩を含む担体にエタノール生産酵母を担持させてなる固定化酵母を用いたエタノール発酵処理に供してエタノールを得る工程である。
【００２９】
以下、エタノール生産酵母を担持する前の担体（単に「担体」という。）と区別するために、エタノール生産酵母を担持してなる担体、すなわちゲル化されたアルギン酸塩にエタノール生産酵母を担持させた担体のことを「固定化酵母担体」という。
【００３０】
工程(A)で得られた処理物はそのまま工程(B)に供してもよいし、必要に応じて濃縮等の前処理工程に供してから工程(B)に供してもよい。工程(A)により得られた処理物をそのまま工程(B)に供する場合は、工程(A)及び工程(B)を同一槽内で行ってもよいし、別々の槽内で行ってもよい。同一槽内で行えば、二槽を使用する場合に比べて設備費用を抑えることができるためより経済的である。
【００３１】
工程(A)で得られた処理物は前述のとおりエタノール生産酵母が利用可能な糖を含んでいる。これら糖が固定化酵母により資化されて、エタノールが生産する。
【００３２】
また、この処理物には発酵阻害物質であるリモネン等が含まれているが、固定化酵母を用いることで、このリモネンによる発酵阻害を回避することができる。このため、工程(A)により得られた処理物をリモネン除去等の処理工程を経ないで工程(B)に供することができる。
【００３３】
（１）固定化酵母担体について
アルギン酸塩は、水溶液中でゲル状となってエタノール生産酵母を担持可能なものであればよい。特にアルギン酸カルシウムは、水に難溶性であり水溶液中で安定であるため、これを担体として作製した固定化酵母担体は長時間使用でき、一度使用した後でも再利用することができる。また、アルギン酸カルシウムは操作が容易であり、かつ廉価である。よって、アルギン酸カルシウムが好ましい。
【００３４】
アルギン酸塩の重量平均分子量は、水溶液中でゲル状となってエタノール生産酵母を担持可能な範囲内であればよい。例えば2万〜20万が好ましい。
【００３５】
重量平均分子量の測定方法としては、ゲル・パーミエーション・カラムクロマトグラフィー（GPC）法が用いられる。
【００３６】
担体にエタノール生産酵母を担持させる方法は限定されないが、例えば、アルギン酸にはカルシウム等の特定の塩を加えるとゲル化するという特徴があるのでこれを利用して次のような方法で担持させることもできる。まず、アルギン酸とエタノール生産酵母とを水溶液中で懸濁し、次に、この懸濁液に対してカルシウムを添加してアルギン酸カルシウムのゲルを生成させることにより、このゲル中にエタノール生産酵母を封じ込める。
【００３７】
担体として例えばアルギン酸カルシウムを使用する場合は、固定化酵母は例えば次のようにして作成することができる。まず、水にアルギン酸ナトリウムを加えて攪拌し水に良く馴染ませてから加熱溶解する。さらに冷却してアルギン酸ナトリウム水溶液を調製する。また別途、エタノール生産酵母を水に加えて均一に懸濁し、エタノール生産酵母の懸濁液を用意しておく。このように調製したアルギン酸ナトリウム水溶液とエタノール生産酵母の懸濁液とを互いに混合し、十分攪拌する。最後に、別途あらかじめ用意し冷却しておいた塩化カルシウム水溶液中に、上記のアルギン酸ナトリウム−エタノール生産酵母混合液をピペット等で一滴ずつ滴下することで、球状のアルギン酸カルシウムのゲルにエタノール生産酵母が島状（酵母が分散した状態）に分布した固定化酵母担体を得ることができる。
【００３８】
担体に担持させる酵母の数については限定されないが、担体の乾燥重量１ｇに対して1.0×106〜1012細胞が好ましく、1.0×108〜1010細胞がより好ましく、1.0×109〜1010細胞がさらに好ましい。
【００３９】
固定化酵母担体の形状は、限定されないが、例えば、球状、フィルム状、又はメッシュ状等が挙げられる。メッシュ状の担体は、芯材となるメッシュ網に対して担体を被覆させること等により成形することができる。特に、表面積を大きくすることができるとともに、発酵反応時に反応溶液を攪拌する際に均一に分布させやすいので、エタノール発酵の効率という観点からは球状が好ましい。
【００４０】
固定化酵母担体を球状とする場合その平均直径は限定されないが、2〜5mmであれば好ましく、2〜4mmであればより好ましく、3〜4mmであればさらにより好ましい。固定化酵母担体の平均直径が5mm以下であれば固定化酵母担体の表面積が適度に大きくなるためエタノール発酵がより活発に行われる。また、固定化酵母担体の平均直径が2mm以上であれば固定化酵母担体が破損しにくい。
【００４１】
（２）エタノール生産酵母について
エタノール生産酵母はエタノールを生産することができる酵母であればよく特に限定されない。例えば、パン酵母 、ワイン酵母 （ブドウ酒１号酵母、ブドウ酒３号酵母、ブドウ酒４号酵母等）、清酒酵母（協会７号酵母、協会９号酵母等）、ビール酵母等市販されている酵母を適宜使用することができる。その他食品に不適合とされる酵母であっても使用することができる。より具体的には、例えば、サッカロマイセス属に属する酵母を適宜使用することができる。サッカロマイセス属に属する酵母としては例えば、次のものが挙げられる：サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）；サッカロマイセス・フォルモセンシス（S. formosensis）；サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis）；サッカロマイセス・エリプソイデュウス（S. ellipsoideus）；サッカロマイセス・サケ（S. sake)。エタノール生産効率が特に優れているという点で、サッカロマイセス属が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエがより好ましい。これらの酵母は一種単独で使用してもよく、また二種以上を任意に混合して使用してもよい。
【００４２】
（３）エタノール発酵処理条件について
エタノール発酵処理の条件は、前述するエタノール生産酵母が生育可能であり、かつエタノール発酵が可能な範囲内であればよく、使用するエタノール生産酵母の種類、及び活性等の特性に応じて適宜設定される。例えば、次が挙げられる。まず糖化処理後の処理液を、単糖濃度が1〜10 w/v%となるように調整した上で、これに対してエタノール生産酵母を濃度1.0×104〜108細胞／ml、好ましくは1.0×104〜106細胞／mlとなるように添加し、pH4〜6、温度25℃〜35℃で、0.5時間以上、好ましくは0.5〜120時間、より好ましくは1〜72時間、よりさらに好ましくは1〜48時間処理する。pHについては適当な緩衝液を使用することで調整することができる。
【００４３】
雰囲気についても、使用するエタノール生産酵母の種類、及び活性等の特性に応じて、嫌気条件下又は好気条件下のいずれかが適宜選択される。
【００４４】
エタノール発酵処理においては、エタノール生産酵母の生育補助剤を、工程(A)の処理物と混合することにより添加してもよい。工程(A) の処理物に含まれる糖は炭素源として利用できるため、生育補助剤のうち炭素源は必須ではないが、エタノール生産効率を上げるため必要に応じて添加してもよい。生育補助剤としての炭素源としては、次が挙げられる：通常微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等。また、窒素源として、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム 硝酸塩等；燐酸及びカリウム源として、燐酸カリウム、燐酸アンモニウム、塩化カリウム等；微量金属として、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩；さらに必要に応じて、コーンスチープリカー 、カゼイン、酵母 エキス、ペプトン等の有機物等を、それぞれ必要に応じて添加してもよい。
【００４５】
３．同持糖化発酵について
本発明のエタノールの製造方法は、工程(A)及び工程(B)を同一槽内で、かつ同時に行ってもよい（同時糖化発酵）。すなわち、同一槽内において、酵素と固定化酵母担体を同時に柑橘類由来原料に対して加えることにより、糖化と発酵を該槽内において同時に行わせ、エタノールを製造する。同時糖化発酵によれば、糖化と発酵を順次行う場合に比べて全体の処理時間を短縮できる。
【００４６】
柑橘類由来原料、及び柑橘類由来原料から工程(A)を経て得られる処理物はエタノール生産酵母の生育に必要な成分を含んでいるため、同時糖化発酵を行う槽内にエタノール生産酵母の生育補助剤を別途添加することは必須ではない。しかしながら、より効率的にエタノールを生産するため必要に応じて生育補助剤をさらに添加してもよい。特に同時糖化発酵の開始直後においては、工程(A)により生成する糖の蓄積量が比較的少ないため、特に炭素源をはじめそのような生育補助剤を必要に応じて添加してもよい。生育補助剤としては、先述したものと同様のものを用いることができる。
【００４７】
同時糖化発酵の処理条件は、使用する酵素及びエタノール生産酵母の種類、及び活性等の特性に応じて、糖化及びエタノール発酵の双方を進行させることができる範囲内において適宜設定できる。さらに、工程(A)における糖の生成速度が、工程(B)における糖の資化速度を上回ったほうが酵母の生育にとってより好ましい場合もあるため、糖の生成速度が糖の資化速度を上回る範囲内において適宜設定してもよい。例えば、具体的には次が挙げられる：柑橘類由来原料濃度50〜200g乾燥重量／l；酵素濃度0.2〜2.0FPU／ml；酵母濃度1.0×104〜108細胞／ml、好ましくは1.0×104〜106細胞／ml；pH4〜5；温度30℃〜35℃；処理時間0.5時間以上、好ましくは0.5〜120時間、より好ましくは1〜72時間、よりさらに好ましくは1〜48時間。pHについては適当な緩衝液を使用することで調整することができる。
【００４８】
次に、図１を参照して本発明の柑橘類由来原料からの同時糖化発酵によるエタノール製造方法の一例について説明する。図１は、同時糖化発酵によるエタノール製造工程の一例を示す図である。
【００４９】
槽内には攪拌子等を任意の箇所、好ましくは底部付近に設けて内容物を攪拌させるようにすると好ましい。このことにより、柑橘類由来原料、酵素、柑橘類由来原料から糖化処理により製造した糖、及び固定化酵母担体が均一に分散し互いに十分に接触し合うため、それぞれの反応時間が短くなり、短時間でエタノールを製造できる。
【００５０】
さらに、図２を参照して本発明の柑橘類由来原料からの同時糖化発酵によるエタノール製造方法に用いる装置について説明する。
【００５１】
まず、粉砕器１に柑橘類由来原料を投入し、柑橘類由来原料を粉砕して微細化する。
【００５２】
粉砕した柑橘類由来原料は糖化・発酵タンク３に送られる。この糖化・発酵タンク３に固定化酵母担体、酵素、緩衝液を添加し、攪拌子４にて内容物を攪拌混合する。攪拌混合することにより、柑橘類由来原料が酵素により糖化され、グルコース、フルクトース等の糖に分解されるとともに、製造した糖が固定化酵母により発酵されてエタノールが製造する。糖化・発酵タンク３には温度調整器５が設けられており、酵母の活性の高い温度に調節し、エタノール製造を短時間で行うことができる。糖化・発酵タンク３内では緩衝液の量にも依るがアルコール濃度が3〜5％重量程度になる。
【００５３】
糖化及び発酵が終わると糖化・発酵タンク３内の内容物はポンプ６で吸引され、遠心分離機７に送られる。
【００５４】
遠心分離機７によって内容物が固体と液体に分離され、液体は蒸留器８に送られる。一方の固体は残渣として取り出される。残渣は肥料等として再利用ができる。
【００５５】
蒸留器８に送られた液体は蒸留されてエタノールを抽出することができる。残りの水分は、排水として下水に流すことができる。
【００５６】
４．エタノールの利用について
本発明の製造方法により得られたエタノールは、エタノール発酵処理が行われた後の処理液から、公知の方法により精製される。精製方法としては例えば、蒸留、及び膜分離法が挙げられる。この精製されたエタノールは各種公知の方法で利用することができる。特に、カーボンニュートラルなエタノールとして好ましく利用される。
【００５７】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
製造例１：固定化酵母担体の作製
酵母としてサッカロマイセス・セルビシエ（産業技術総合研究所特許生物寄託センターFERM BP-754）を、グルコース1w/v%、ペプトン0.5 w/v %、酵母エキス0.3 w/v %、及び麦芽エキス0.3 w/v %を含んだ培地で予め培養した。定常期に達した酵母を遠心分離器にて培養液から回収し、得られた濃縮酵母を固定化酵母の作製に用いた。
【００５９】
水100ｇに重量平均分子量2万〜20万のアルギン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）6ｇを加えて攪拌し、水に良く馴染ませてから加熱溶解した。さらに冷却してアルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。また別途、エタノール生産酵母を水に加えて均一に懸濁し、エタノール生産酵母の懸濁液を用意しておいた。アルギン酸ナトリウムの乾燥重量1gに対して1.0×109〜1010細胞のサッカロマイセス・セルビシエを、上のように調製したアルギン酸ナトリウム水溶液に懸濁し、十分攪拌した。最後に、別途あらかじめ用意し冷却しておいた0.3モル塩化カルシウム水溶液（和光純薬工業株式会社）中に、上記のアルギン酸ナトリウム−酵母混合液をピペット等で一滴ずつ滴下することで、球状のアルギン酸カルシウムのゲルにエタノール生産酵母が島状（酵母が分散した状態）に分布した固定化酵母担体を得た。固定化酵母担体は略球状であり、その平均直径は3mm程度であった。
【００６０】
試験例：柑橘類由来原料に含まれるリモネンによる発酵阻害活性の検討
通常の遊離酵母、及び本発明で使用する固定化酵母に対し、柑橘類外皮に含まれるリモネンが与える影響を検証した。
【００６１】
リモネン（ナカライテスク株式会社）をそれぞれ、0v/v%、0.1v/v%、0.25v/v%、0.5v/v%、1.0v/v%の濃度で溶解した酵母生育培地中において、通常の遊離酵母（産業技術総合研究所特許生物寄託センターFERM BP-754）と実施例１で作製した固定化酵母担体を用いてエタノール発酵を行った。酵母生育培地の組成は次の通りである：グルコース（和光純薬工業株式会社）1.0 w/v %；ペプトン（和光純薬工業株式会社）0.5 w/v %；酵母エキス（和光純薬工業株式会社）0.3 w/v %；麦芽エキス（和光純薬工業株式会社）0.3 w/v %。遊離酵母を5mg乾燥重量／l、固定化酵母担体を40粒／lそれぞれ酵母生育培地に添加した。発酵条件は、嫌気条件下、温度30℃、pH5.0である。
【００６２】
図２は各培地において生産されたエタノール量を示している。遊離酵母によるエタノール生産は、培地中のリモネン濃度の増加に伴って急激に減少し、リモネン濃度が0.5 v/v %以上となるとエタノールが生産されない。一方、固定化酵母によるエタノール生産は、リモネン濃度が1.0v/v %でも影響を受けなかった。
【００６３】
以上の結果から、柑橘類外皮に含まれるリモネンによって、通常の遊離酵母による発酵が阻害されるのに対し、本発明の固定化酵母による発酵は阻害されないことが分かった。
【００６４】
実施例２：みかんを用いた同時糖化発酵
市販のみかんの外皮を5mm程度に微塵切りにし、10ｇ秤量（湿重量；乾燥重量2gに相当）培養フラスコに入れた。続いて市販のセルラーゼ（明治製菓製アクレモニウムセルラーゼ330FPU／g protein）を25mg、pH5の酢酸緩衝液を10ml添加し、さらに実施例１で作製した固定化酵母担体を20粒添加した。この培養フラスコを30℃、嫌気条件の下、振とうさせながら、同時糖化発酵を所定時間行った。同様の条件で固定化酵母の代わりに通常の遊離酵母108細胞を添加して比較した。
【００６５】
それぞれの液中の糖濃度、及びエタノール濃度は液体クロマトグラフィで定量測定した。その結果を図４に示す。
【００６６】
固定化酵母を用いたフラスコにおいて、セルラーゼによって柑橘類外皮の糖化が進行し、2時間後まではグルコースの量が増加し、その後減少していることがわかる。グルコースの量が減少するとともにエタノール生産量が増加しており、グルコースがエタノール発酵に供され、エタノールが生産されていることが確認できる。一方、遊離酵母を用いたフラスコにおいてはグルコースの減少が認められず、エタノールの生産量は微量であった。
【００６７】
実施例３：その他各種柑橘類を用いた同時糖化発酵
図５は、市販のオレンジ、グレープフルーツ、レモンの外皮を材料に固定化酵母の同時糖化発酵を行った結果である。処理条件は実施例２と同様である。いずれの材料においてもエタノールの製造が認められ、固定化酵母の有効性が確認できた。同時に行った遊離酵母を用いた実験では、全ての材料でエタノール製造は検出限界以下であった。
【００６８】
これらから、固定化酵母を用いることで、糖化された柑橘類外皮に含まれるリモネンによる発酵阻害を受けることなくエタノールを生産できることを確認できた。またさらに、柑橘類外皮を原料として同時糖化発酵を行うことができることを確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の柑橘類外皮からの同時糖化発酵によるエタノール製造方法の一例を示した図である。
【図２】本発明の同時糖化発酵に用いる装置の一例の概略図である。
【図３】遊離酵母及び固定化酵母を別々に用い、リモネン存在下でエタノールを生産させた場合のエタノール生産量をそれぞれ示したグラフである。
【図４】遊離酵母及び固定化酵母を別々に用い、みかん外皮を原料とする同時糖化発酵を行った場合のエタノール生産量をそれぞれ示したグラフである。
【図５】固定化酵母を用い、種々の柑橘類外皮を原料とする同時糖化発酵を行った場合のエタノール生産量を示したグラフである。
【符号の説明】
【００７０】
１  破砕器
２  緩衝液（pH調整液）
３  糖化・発酵タンク
４  撹拌子
５  温度調整器
６  ポンプ
７  遠心分離器
８  蒸留器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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