(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な且つ改良されたインターロイキン−７薬物原料、対応する特異的免疫反応性抗体、並びにそれらを含む組成物、それらの製造及び使用法を提供する。【解決手段】ＩＬ−７をコードする最適化されたヌクレオチド配列、組換え発現ベクターを作製し、ＩＬ−７コンホーマーポリペプチドを製造する。組換えＩＬ−７の長期活性は主として特定のコンホーマーにより発現されるという予想外の発見、及び生物活性であるけれども、薬物原料及び／又は医薬品の仕様に通常含まれるであろう他のコンホーマー、潜在的生成物関連物質、生成物関連不純物及びプロセス関連不純物は、所望のＩＬ−７分子に対する免疫反応をトリガーすることができる。これを利用して組成物を作製して使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の３つのジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−４（Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２）；２−５（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９）及び３−６（Ｃｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１）を含む、精製された又は単離されたＩＬ−７コンホーマー。
【請求項２】
該ＩＬ−７コンホーマーが組換えヒトＩＬ−７コンホーマーである、請求項１に記載のＩＬ−７コンホーマー。
【請求項３】
該ＩＬ−７コンホーマーが配列番号２又は４のアミノ酸配列を含む請求項２に記載のＩＬ−７コンホーマー。
【請求項４】
該ＩＬ−７コンホーマーが組換えサルＩＬ−７コンホーマーである請求項１に記載のＩＬ−７コンホーマー。
【請求項５】
該ＩＬ−７コンホーマーが配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のＩＬ−７コンホーマー。
【請求項６】
該ＩＬ−７コンホーマーがグリコシル化されていない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＩＬ−７コンホーマー。
【請求項７】
該ＩＬ−７コンホーマーがグリコシル化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＩＬ−７コンホーマー。
【請求項８】
該ＩＬ−７コンホーマーがヘテロ二量体として肝細胞成長因子に会合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＬ−７コンホーマー。
【請求項９】
該ＩＬ−７コンホーマーが、ペプチドヒンジ領域によってＩｇＧ重鎖のＦｃ部分に機能的に付着しており、該ＩｇＧがヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＬ−７コンホーマー。
【請求項１０】
該ＩＬ−７コンホーマーが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡの一部に融合タンパク質として機能的に会合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＬ−７コンホーマー。
【請求項１１】
所望の生成物として、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＩＬ−７コンホーマーを含み、ＩＬ−７分子変異体又は生成物関連不純物を実質的に含まない、ＩＬ−７薬物原料。
【請求項１２】
所望の生成物として請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＬ−７コンホーマーを含み、ＩＬ−７分子変異体又は生成物関連不純物を実質的に含まないＩＬ−７薬物原料であって、該薬物原料中のＩＬ−７の総量が少なくとも９８重量%、好ましくは少なくとも９９．５重量%であるＩＬ−７薬物原料。
【請求項１３】
有効量の請求項１１又は１２に記載の薬物原料及び１種又はそれより多くの製薬学的に適合性の担体を含む、製薬学的組成物。
【請求項１４】
製薬学的に適合性の担体がスクロース、トレハロース及びアミノ酸から選ばれる、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項１５】
製薬学的に適合性の担体が適当な緩衝液中に含有されて等張性溶液を形成する、請求項１４に記載の製薬学的組成物。
【請求項１６】
該適当な緩衝液が５〜７．５、好ましくは６〜７、更に好ましくは６．５のｐＨ範囲を有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項１７】
該適当な緩衝液がクエン酸ナトリウム緩衝液及び酢酸アンモニウム緩衝液から選ばれる有機塩である、請求項１６に記載の製薬学的組成物。
【請求項１８】
該組成物が凍結乾燥された形態である、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項１９】
該組成物がタンパク質（好ましくはヒト血清アルブミン）及び／又は界面活性剤（好ましくはツイーン８０）を含む、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２０】
組み合わせて使用するため、別々に使用するため又は順次に使用するための、造血細胞成長因子、サイトカイン、抗原及びアジュバントから選ばれた免疫刺激剤、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項２１】
該造血細胞成長因子が幹細胞因子（ＳＣＦ）、特に溶解性形態のＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−１５及びＩＬ−２から選ばれる、請求項２０に記載の製薬学的組成物。
【請求項２２】
サイトカインがγインターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、Ｂ７−１、ＭＩＰ−２及びＭＩＰ−１αから選ばれる、請求項２０に記載の製薬学的組成物。
【請求項２３】
該抗原が、合成又は天然ペプチド、組み換えタンパク質、殺されたか、不活性化されたか又は弱毒化された病原生成物、脂質、これらの一部及びこれらの組み合わせから選ばれる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項２４】
該抗原がＨＩＶ、水痘帯状疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタイン−バールウイルス、１型又は２型単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、デングウイルス、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＥ型肝炎ウイルス、合胞体呼吸ウイルス（syncytium respiratory virus）、ヒトパピローマウイルス、結核菌、トキソプラズマ及びクラミジア由来の抗原から選ばれる請求項２３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２５】
該アジュバントが抗原の免疫原性を促進するか又は増加させそしてＴｈ１型免疫応答を誘発することができる任意の物質、混合物、溶質又は組成物、例えば、ＣｐＧ、ＱＳ２１、ＩＳＣＯＭ及びモノホスホリル脂質Ａから選ばれる、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項２６】
ＢもしくはＴリンパ球発生及び増殖の予防的もしくは治療的刺激のため、包括的もしくは特異的免疫再構成の増強のため、又は液性もしくは細胞性免疫応答の増強のためにヒト患者に投与するための、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項２７】
免疫不全患者の日和見感染を防止するか又は減少させるための、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項２８】
ヒト患者において、リンパ球新生刺激を延長するため及び／又は特異的免疫応答を生じさせるため及び／又は特異的免疫応答のレパートリーを広げるための、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項２９】
ヒト患者が免疫不全患者、がん患者、移植片を受けている患者、ウイルス又は寄生虫に感染した患者、高齢患者又は低いＣＤ４数値を有するすべての患者である請求項２６、２７又は２８に記載の製薬学的組成物。
【請求項３０】
薬物原料の有効量が約３〜３００μg/kg/日、好ましくは１０〜１００μg/kg/日
でありそして特に一日に一回から、一週二回又は三回、一週一回まで投与される、請求項１３〜２９のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項３１】
ＩＬ−７ポリペプチドをコードする核酸分子であって、変更されたシャイン・ダルガノ様配列を含む、核酸分子。
【請求項３２】
配列番号１、３、１２、１６、１８、２０又は２２から選ばれる配列を含む、核酸分子。
【請求項３３】
請求項３１又は３２に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項３４】
請求項３１又は３２に記載の核酸又は請求項３３に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項３５】
該組換え宿主細胞がヒト細胞又はバクテリア細胞である、請求項３４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３６】
エシェリシア・コリ又はバチルス・ブレビスである、請求項３５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３７】
チャイニーズ．ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ−２９３細胞系又はヒト間質細胞系又は上皮細胞系である、請求項３５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＬ−７コンホーマーと特異的に免疫反応性の抗体。
【請求項３９】
請求項１１及び１２のいずれか一項に記載のＩＬ−７薬物原料を製造する方法であって、
ａ）ＩＬ−７ポリペプチドを含むサンプルを提供すること、
ｂ）下記の３つのジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−４（Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２）；２−５（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９）及び３−６（Ｃｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１）を含むＩＬ−７コンホーマーを精製してＩＬ−７薬物原料を生成させること、及び
ｃ）場合により、該薬物原料において、該特定のＩＬ−７コンホーマーを測定又は定量すること
を含む方法。
【請求項４０】
該サンプルがＩＬ−７ポリペプチドを産生する組み換え原核生物又は真核生物宿主細胞から得られる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
該サンプルがＩＬ−７ポリペプチドをコードする原核生物宿主細胞の培養物であり（又は由来のものであり）そして更に、工程ｂ）の前に、
ｉ）該サンプルを処理して該ＩＬ−７ポリペプチドの完全な変性を引き起すこと、
ii）場合により工程ｉ）で得られる変性されたポリペプチドを精製すること、及び
iii）ポリペプチドをリフォールディングすること、
を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
工程ｉ）が変性剤緩衝液中に封入体を溶解することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
工程ii）を、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換又は逆相クロマトグラフィーにより行う、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＨＩＣブチルを使用して該疎水性クロマトグラフィーを実施する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
工程ii）を６〜９、好ましくは７〜８．５の両端を含めた範囲内にあるｐＨで行う、請求項４１〜４４のいずれかの方法。
【請求項４６】
該精製工程ｂがアフィニティークロマトグラフィーを行うことを含む、４１〜４５のいずれかの方法。
【請求項４７】
該アフィニティークロマトグラフィーを硫酸化多糖類のカラムで行う、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
硫酸化多糖類がデキストラン硫酸又はヘパリンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＩＬ−７コンホーマーが、薬物原料において、質量分析法、赤外分光法、ＮＭＲによって、円偏光二色性を決定することによって、該ＩＬ−７コンホーマーに対して生じた特異的モノクローナル抗体に対するアフィニティーを測定すること又はヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより特徴付けられ、そしてＩＬ−７受容体に対する該ＩＬ−７コンホーマーのＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ又はアフィニティーにより、及び単離されたコンホーマーに適用される場合にはタンパク質定量のいかなる方法によっても測定され又は定量される、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ＩＬ−７含有調製物における請求項１〜９のいずれか一つに記載のＩＬ−７コンホーマーの存在及び／又は相対的量を決定することを含む、ＩＬ−７含有調製物を制御する方法。
【請求項５１】
ＩＬ−７薬物原料又は製薬学的組成物を製造する方法であって、（ｉ）ＩＬ−７ポリペプチドをコードする組換え宿主細胞を培養し、（ii）該組換えポリペプチドを単離してＩＬ−７薬物原料を生成させ、そして（iii）場合により、該ＩＬ−７薬物原料をコンディショニングして治療又はワクチン用途に適当な製薬学的組成物を生成させることを含み、更に該薬物原料又は製薬学的組成物において、請求項１〜９のいずれか一項に定義されたＩＬ−７コンホーマーの量及び／又は品質を同定し、特徴付け又は測定する工程を含み、そして更に好ましくは、活性成分として該ＩＬ−７コンホーマーを約９５%より多く、好ましくは９８%より多く含む薬物原料又は製薬学的組成物を選ぶ工程を含む、方法。
【請求項５２】
組換え宿主細胞によるＩＬ−７発現が誘導性であるか、調節されるか又は一過性であり、それにより細胞培養段階とＩＬ−７発現段階を引き離すことができる、請求項４０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
該ＩＬ−７コンホーマーの量及び／又は品質が、トリプシン消化を伴う又は伴わない質量分析関連法、円偏光二色性、ＮＭＲ、ジスルフィド架橋のための特異的モノクローナル抗体分析及び／又はコンホメーション特徴付けにより決定される、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
長期のリンパ球生成刺激を誘発し及び／又は免疫応答を増幅するための製薬学的組成物の製造のための請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の方法により得られる、ＩＬ−７薬物原料の使用。
【請求項５５】
免疫不全に関連した疾患を防止又は処置するための製薬学的組成物の製造のための請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の方法により得られるＩＬ−７薬物原料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に免疫学及び分子生物学の分野に関する。更に特定的には、本発明は新規な改良されたインターロイキン７薬物原料、対応する特異的免疫反応性抗体、並びにそれらを含む組成物、それらの製造及び使用に関する。本発明は、治療目的で使用されるｒ−ｈＩＬ−７薬物原料の不純物プロフィルを特長付ける方法並びに哺乳動物ＩＬ−７をコードする最適化されたヌクレオチド配列、組換え発現ベクター及び該ポリペプチドを製造及び精製する方法も開示する。
【０００２】
発明の背景
Ｂ及びＴリンパ球は免疫応答の一次エフェクター細胞である。両細胞クラスは、各クラスの分化における識別可能な工程を表す前駆細胞（progenitor又はprecursor cells）を経由して哺乳動物骨髄における造血幹細胞から最終的に誘導されるものと考えられる。成熟Ｔ細胞は、多分、Ｔリンパ球発生の初期工程で骨髄から胸腺に移行する前駆細胞から、主として胸腺で発生する。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、インターフェロンγ、ＢＳＦ−２、ニューロロイキン（neuroleukin）、トランスフォーミング増殖因子β及びＩＬ−７を含む多数の因子が成熟した末梢Ｂ及びＴ細胞に対して活性である（ＥＰ０３１４４１５）。
【０００３】
「インターロイキン７」又は「ＩＬ−７」は、プレＢ細胞として知られている特殊化した前駆体を含む骨髄由来のリンパ球先祖又は前駆体の増殖を誘導することができる哺乳動物内因性分泌糖タンパク質である。もともと骨髄細胞系のストローマエレメント由来の、ＩＬ−７は、胸腺細胞、腸上皮細胞、角化細胞及び一般にすべてのリンパ組織によっても分泌される。ＥＰ０３１４４１５は哺乳動物インターロイキン７タンパク質及び該タンパク質をコードするＤＮＡを記載している。ＥＰ０３１４４１５に記載されている、グリコシル化を除いて、Escherichia coliにおいて産生された成熟ヒトＩＬ−７（ｒ−ｈＩＬ−７）は、１７，３８７ダルトンの分子量を示しそして種々のリンパ球集団の増殖に基づく特異的バイオアッセイにおける高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す。この分子の別の命名は「プレＢ細胞成長因子」及び「リンホポエチン１（lymphopoietin-1）」である。実際、もともと、ＩＬ−７はその主要な活性が前駆体Ｂ細胞増殖の誘導であるサイトカインとして開示された（Namen A.E.et al.; Journal of Experimental medicine; 1998; 167: 988-1002）。ＩＬ−７は、より最近では、Ｔ細胞発生の初期工程期間中の胸腺細胞（Ｔ細胞）の生存及び増殖に関与していることが開示された（Schluns K.S. et al.; Nature Immunology; 2000; 1(5): 426-432）。Fry及び協同研究者は、更に多因性作用において胸腺非依存性Ｔ細胞再生の強力なモジュレーターとしてＩＬ−７を同定した。（Fry T.J. et al.; Blood; 2001; 97(6): 1525-1533）。
【０００４】
かくして、ＩＬ−７は、Ｔ細胞前駆体の増殖の刺激、抗体分泌性Ｂ細胞の増殖の刺激、抗原駆動Ｔ細胞末梢増大（antigen driven T-Cell peripheral expansion）の刺激及びナイーブＴ細胞及び他の造血細胞型の産生において極めて有望な治療用途を有する。活性ＩＬ−７分子の特に興味深い治療用途は、リンパ球減少患者：がんを治療されている患者、骨髄又は幹細胞移植を受けた患者、後天性又は遺伝性免疫不全を示す患者、低いＣＤ４数値を有する高齢患者又はすべての患者の免疫再構成である。他の興味は、ＩＬ−７の新しいナイーブＣＤ４Ｔ細胞を産生させる能力又は特異的免疫応答を生成又は増加させるために特異的プールを増大する能力（ワクチン増強）にある。
【０００５】
その治療可能性の点から、生物学的に活性なＩＬ−７ポリペプチド及び対応する薬物原料を製造する技術を開発することに相当な興味がある。規制の当局の要求を満たしそして有効な治療用途に適したＩＬ−７薬物原料又は製薬学的組成物を製造することに多大の興味がある。
【０００６】
包括的又は特異的免疫再構成を刺激することを目的とした薬物原料又は製薬学的組成物は、長期間有効であるべきであり、これは、それがその自身の活性原理に対する特異的免疫反応をトリガーするべきではないことを意味する。
【０００７】
本発明は、意外にも、組換えヒトＩＬ−７の長期活性は主として特定の１−４；２−５；３−６コンホーマーにより発現されることを今や示す。本発明は更に、有効な薬物原料は主成分として上記コンホーマーを含有するべきであるのみならず、従来活性生成物と考えられた他のコンホーマー又はＩＬ−７分子変異体（molecular variants）を実質的に欠いているべきであることも示す。
【０００８】
本発明以前には、Ｃｙｓ：１−４；２−５；３−６コンホーマーの存在は仮想上のＧＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−４コンホメーション類似性に基づくコンピューターによるモデル化により仮想されていたけれども、ジスルフィド架橋Ｃｙｓ：１−６；２−５；３−４を示すＩＬ−７コンホーマーのみがトリプシン消化及び質量分析法により特長付けられた。この形態はＩＬ−７の主要な形態を構成すると考えられた。これと際立って対照的に、本発明は今やこのようなコンホーマーを実質的に欠いた新しいポリペプチド生成物及び製薬学的組成物を提唱する。本発明は、抗ＩＬ−７免疫応答のような望ましくない応答の危険の減少した高い生物学的活性を示すこのようなポリペプチド及び組成物を製造するための有利な製造及び精製方法も開示する。
【０００９】
かくして、本発明は、包括的又は特異的免疫応答を促進することができる、特に有利な長期ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す、上記した生成物関連物質又は不純物を欠いた該ヒトＩＬ−７の精製されたコンホーマーの製造及び使用の改良された方法を開示する。
【００１０】
発明の要約
本発明の第１の目的は、下記の３つのジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−４（Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２）；２−５（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９）；３−６（Ｃｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１）を含む精製されたＩＬ−７コンホーマーに関する。更に下記に開示されたとおり、ＩＬ−７コンホーマーは好ましくはヒト組換えＩＬ−７コンホーマーであり、そしてグリコシル化されていてもよく又はグリコシル化されていなくてもよい。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記したＩＬ−７コンホーマーを含みそして生成物関連不純物及び生成物関連物質、特にＩＬ−７の他のコンホーマー又は二量体を実質的に欠いている薬物原料にある。
【００１２】
本発明は、医薬品（"医薬生成物"））又は製薬学的組成物の製造における上記した薬物原料の使用にも関する。
【００１３】
本発明は更に、有効量の上記した薬物原料及び１種又はそれより多くの製薬学的に適合性の担体又は賦形剤を含む製薬学的組成物に関する。
【００１４】
本発明は、ＩＬ−７ポリペプチドをコードする核酸分子も提供する。この核酸分子は、生物学的に活性なＩＬ−７、特に本発明によるＩＬ−７コンホーマーの組換え宿主における発現のために最適化されているＩＬ−７ポリペプチドをコードする配列を含む。更に特定的には、核酸分子は、トランケーションされたＩＬ−７ポリペプチドの限定された発現を与えそして生物学的に活性なヒトＩＬ−７コンホーマーの生成の収率を増加させる。特定の配列は、突然変異又は不活性化されたシャイン−ダルガノ様配列を含む（例えば配列番号１）。他の特定の配列は、ポリペプチドの有効な分泌を引き起こすペプチドシグナルを含む（例えば配列番号３、１６、１８、２０又は２２）。本発明は、初めてサルＩＬ−７の核酸配列も開示しそして提供する（例えば、配列番号１２、２０又は２２）。
【００１５】
本発明は、更に、上記した核酸を含むベクター及び該核酸又は該ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。この核酸及びベクターは種々のコンピテント宿主細胞における組換え哺乳動物ＩＬ−７ポリペプチドを産生するのに及び遺伝子治療目的に使用することができる。
【００１６】
本発明は、本発明によるヒトＩＬ−７コンホーマーと特異的に免疫反応性の抗体、このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系及び該抗体を含む診断、アッセイ又は治療に適当な組成物も提供する。
【００１７】
本発明の更なる観点は、原核生物又は真核生物宿主細胞から上記した（組換え）ＩＬ−７コンホーマーを製造する方法及びサンプルにおけるＩＬ−７コンホーマーの存在を検出又は測定する方法又はサンプルを特長付ける方法である。
【００１８】
特定の観点では、上記したＩＬ−７コンホーマー又は薬物原料を製造する方法は、
ａ）ＩＬ−７ポリペプチドを含むサンプルを提供し、そして
ｂ）上記したＩＬ−７コンホーマーを精製する、
ことを含む。
【００１９】
本発明は、サンプル中の上記したＩＬ−７コンホーマーの存在を検出又は測定することを含む、サンプルを特長付け又は定性する方法にも関する。このような方法は、臨床的なロット又はバッチの正当性のバリデーションのために特に適しておりそして重要であり、それにより過剰のＩＬ−７分子変異体及び／又は生成物関連不純物を含むサンプルは捨てられるか又は更に処理される。
【００２０】
本発明の他の目的は、被験体における免疫応答を引き起こすか又は調節する、特に長期のリンパ球生成刺激を誘導する及び／又は免疫応答を増幅するための製薬学的組成物の製造のための上記した方法により得られるＩＬ−７コンホーマーの使用に関する。
【００２１】
本発明は免疫不全と関連した疾患を予防又は処置するための製薬学的組成物の製造のための、上記した方法により得られるＩＬ−７コンホーマーの使用にも関する。
【００２２】
本発明は更に、サルにおける実験的及び薬理学的使用のための手段としての本発明に記載のＩＬ−７コンホーマーの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】配列番号１を含むＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐｔａｃ−ｈＩＬ−７の構造を示す。
【図２】サルＩＬ−７をコードする配列（シグナルペプチドをコードするヌクレオチド番号４〜７５を欠いた配列番号１２に相当する）を含むＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐｔａｃ−ｓＩＬ７ｏｐｔの構造を示す。
【図３】配列番号３、配列番号１６又は配列番号１８を含有する哺乳動物発現ベクター（構成的発現）の構造を示す。
【図４】ヒト及びサルｃＤＮＡのアラインされたヌクレオチド配列を示す。
【図５】ヒト及びサルタンパク質のアラインされたアミノ酸配列を示す。
【図６】サルＩＬ−７ＰＣＲ生成物の電気泳動分析を示す。
【図７】最適化されたサルＩＬ−７ＰＣＲ生成物の電気泳動分析を示す。
【図８】ヒトＰＳ−ＩＬ−７ＰＣＲ生成物の電気泳動分析を示す。
【図９】精製された脱グリコシル化された組換えヒトＩＬ−７コンホーマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：クーマシーブルーで着色及び銀染色、を示す。
【図１０】プレＢ細胞系に対する哺乳動物（ヒト及びサル）ＩＬ−７タンパク質のバイオアッセイ分析を示す。
【図１１】種々の組換えＩＬ−７で処理された正常なサルの末梢血ＣＤ４Ｔ細胞数値を示す。
【図１２】抗ＩＬ−７抗体の検出のためのＩＬ−７処理されたサルの血清のウエスタンブロット分析を示す。
【図１３】種々の組換えＩＬ−７で処理された照射されたサルの末梢血ＣＤ４Ｔ細胞数値を示す。
【図１４】配列番号３、配列番号１６又は配列番号１８を含有する哺乳動物発現ベクターｐｈＴ−ＰＳＩＬ−７ｈ（テトラサイクリン誘導性発現）の構造を示す。
【図１５】配列番号３、配列番号１６又は配列番号１８を含有する哺乳動物発現ベクターｐＡＶｃ−ＰＳＩＬ−７ｈ（アデノウイルス一過性発現）の構造を示す。
【図１６】処理前の１００%値からの特異的マーカーの変化を示す。
【図１７】ヒトＩＬ−７配列（配列番号３、配列番号１６又は配列番号１８）及びヒトＢｃｌ−ＸＬ抗アポトーシス因子をコードする配列を含有する哺乳動物発現ベクターｐＢｕｄ−ｈＰＳＩＬ−７−ＢｃｌＸＬ（共発現ＩＬ−７／ＢｃｌＸＬ）の構造を示す。
【図１８】一過性トランスフェクションによるＨＥＫ２９３細胞におけるｈＩＬ−７発現を示す。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、下記の３つのジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−４（Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２）；２−５（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９）；３−６（Ｃｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１）を含む精製されたＩＬ−７コンホーマー、該ＩＬ−７コンホーマーを含む薬物原料及び製薬学的組成物、並びにそれらの製造方法及び治療的使用に関する。更に下記に開示されるとおり、ＩＬ−７コンホーマーは好ましくはヒト組換えＩＬ−７コンホーマーでありそしてグリコシル化されていても良くそしてグリコシル化されていなくてもよい。ヒト組換えＩＬ−７コンホーマーはグリコシル化されているのが好ましい。
【００２５】
本発明は、ＩＬ−７の中又は長期間ｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性がこれまで気がつかなかった分子の特定のコンホメーションに実質的に帰されうるという予想外の発見及び実質的に純粋な形態の該ＩＬ−７コンホーマーを含む製薬学的組成物を製造することにより高度に改良された治療効率が達成されるという予想外の発見に基づいている。
【００２６】
ＩＬ−７コンホーマー
本発明の第一の目的は、下記の３つのジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−４（Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２）；２−５（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９）；３−６（Ｃｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１）を含む精製された又は単離されたＩＬ−７コンホーマーにある。
【００２７】
ＩＬ−７一次配列（ヒト及びサル）は３つの分子内ジスルフィド架橋の形成に関与している６個の高度に保存されたシステインを含有する。Ｇｏｏｄｗｉｎにより最初に記載されたとおり、これらのジスルフィド架橋は生物活性のために必要であり、ＩＬ−７分子のβ−メルカプトエタノール処理はその活性を完全に消滅させる（Goodwin R.G. et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; 1989; 86: 302-306）。この点から、システイン残基位置のランクにしたがって、種々のコンホーマー
が可能であり、その中でも１−６；２−５；３−４又は１−４；２−５；３−６又は１−４；２−６；３−５又は１−５；２−４；３−６、に加えて、連続的架橋（contiguous bridges）を含む種々の他のコンホーマーが可能である。
【００２８】
種々のチームがタンパク質のコンホメーションモデルを示唆するためにコンピューター化学を使用した。二次構造予測プログラムから、Srinivasan及び協同研究者はＩＬ−７のヘリカル領域を提唱し、そしてＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４三次元構造との類似によって、下記の３つの架橋：１−４；２−５；３−６  の配置を示唆するタンパク質コンホメーションを提唱した（Srinivasan S.et al.; Protein Engeneering(supplement); 1993; 6: 107）。また相同性モデル化の研究によって、Ｋｒｏｅｍｅｒ及び協同研究者は、テンプレートとして役立ちそしてアップ−アップ−ダウン−ダウントポロジーにおいてそれらを相互に関連付けるヒトＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧＨの構造に対する相同性に基づいてｈＩＬ−７の３Ｄモデルを予測した。このよく知られたトポロジーにおいて、ヒトＩＬ−７の３Ｄモデルは、独特のジスルフィドパターン：１−４；２−５；３−６  ジスルフィドデザインの仮説が有利であった（Kroemer R.T.et al.; Protein Engeneering; 1996; 9(6): 493-498）。しかしながら、１９９７年に、組換え技術により産生されたヒトＩＬ−７のＭＡＬＤＩ質量分析法による分析から及びセリンをシステインに替える部位特異的突然変異誘発から、Cosenza及び協同研究者はＩＬ−４について実験的に決定された分子内ジスルフィド架橋とまったく同様にして位置：１−６；２−５；３−４への３つのジスルフィド架橋の配置を明らかにした（Cosenza L et al.; Protein Science; 2000; 9: 916-926 - Walter M.R.et al.; Journal of Bilogical Chemistry; 1992; 267: 20371-20376）。この研究において、組換えネイティブ分子のペプチド消化の質量分光分析は、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ１４１（１−６）ジスルフィド架橋の事実をはっきりと証明し、そして部位特異的突然変異誘発はＣｙｓ２−Ｃｙｓ１４１（１−６）及びＣｙｓ４７−Ｃｙｓ９２（３−４）架橋の生物活性のための重要な役割を証明した。これらの2つのシングル架橋を可能にする2つのＣｙｓ／ＳｅｒＩＬ−７突然変異体は3つのジスルフィド架橋分子１−６；２−５；３−４の２×１０−１０のＥＣ５０と比較してバイオアッセイにおいて良好な生物活性（４×１０−９及び２×１０−９ＭのＥＣ５０）を示すことができた。これらの実験的結果に基づいて、これらの3つのジスルフィド架橋１−６；２−５；３−４はヒトインターロイキン−７に割り当てられそして国際タンパク質データバンクに申請された（Swiss Prot P13232, PDB code 1IL-7）。
【００２９】
本発明は、今日までデータバンクに提出され、証明されそして受け入れられた上記の三次元構造は不正確でありそして組換えヒトＩＬ−７の長期活性は主として特定の１−４；２−５；３−６コンホーマーにより発現されることを今や示す。得られた実験結果は、ヒトＩＬ−７（ｈＩＬ−７）における以前に報告されたジスルフィド結合（Cosenza L et al.; Journal of Biochemical Chemistry; 1997; 272: 32995-33000）とは異なり、そして長期の活性なＩＬ−７組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４コンホーメーションとの相同性モデル化によりデザインされる他のモデルに記載の実質的に純粋な特定のＩＬ−７コンホーマーの存在を必要とすることを始めて示す。
【００３０】
本発明においては、「ＩＬ−７ポリペプチド」は、哺乳動物（例えばヒト又はサル）ＩＬ−７ポリペプチド、更に好ましくは、特に治療又はワクチンとして使用するためのヒトＩＬ−７ポリペプチド、又は特に非ヒト霊長類実験に使用するためのサルＩＬ−７ポリペプチドを表す。本発明の好ましいＩＬ−７ポリペプチドはＥＰ３１４４１５に記載のアミノ酸配列並びにそのいかなる天然変異体及びその相同体（homologs）も含む。ヒトＩＬ−７の配列は、遺伝子バンクで入手可能である。典型的な野生型タンパク質は１５２アミノ酸及び場合により追加のＮ末端メチオニン残基を含む（配列番号２、４、１７及び１９）。その変異体は、更に好ましくは、ＳＮＰｓ、スプライシング変異体等を含む天然の多型から生じる天然の対立遺伝子変異体を含む。特定の態様では、ＩＬ−７ポリペプチドという用語は、配列番号２、１３［配列番号１３はシグナルペプチド（アミノ酸番号：２〜２５）を含むか又は含まない］、１７、１９、２１又は２３の配列を有するポリペプチド及びその天然変異体を表すことを意味する。本発明で使用される特定のＩＬ−７ポリペプチドは好ましくは組換えＩＬ−７、更に好ましくは、配列番号２、４、１７又は１９のアミノ酸配列を含む組換えヒトＩＬ−７コンホーマーである。
【００３１】
ＩＬ−７の特定の「コンホーマー」は特定の三次元立体配置（configuration）を有するＩＬ−７ポリペプチドを表す。
【００３２】
本明細書で使用された「組換え体」という用語は、ポリペプチドが組換え発現系から得られるか又は誘導される、即ち、ＩＬ−７ポリペプチドをコードする核酸分子を含有するように工学的に作られた宿主細胞（例えば、微生物又は哺乳動物）の培養物から得られるか又は誘導されることを意味する。「微生物の（microbial）」は、バクテリア発現系で作られた組換えタンパク質を表す。
【００３３】
医学的使用（治療、予防等を含む）のための、ＩＬ−７コンホーマーは好ましくは組換えヒトＩＬ−７コンホーマーである。これについて、特定の態様では、特定のＩＬ−７コンホーマーは配列番号４, １７又は１９のアミノ酸配列を有しそしてジスルフィド架橋Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２、Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９及びＣｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１を含む。他の特定の態様では、特定のＩＬ−７コンホーマーは配列番号４、１７または１９のアミノ酸配列を有しそしてＮ末端位置に追加のメチオニンを含む（即ち、配列番号２）。
【００３４】
実験的使用を含む更なる使用のために、ＩＬ−７コンホーマーは組換えサルＩＬ−７コンホーマーであることができる。組換えサルＩＬ−７コンホーマーは好ましくは配列番号１３（配列番号１３はシグナルペプチド（アミノ酸番号：２〜２５）を含むか又は含まない）、配列番号２１又は２３のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明のＩＬ−７コンホーマーはグリコシル化されていても良く又はグリコシル化されていなくてもよい。多くの分泌されたタンパク質は翻訳後に共有結合した炭水化物単位を獲得する。グリコシル化は、しばしば、アスパラギン残基（コンセンサス配列：−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−、式中Ｘはプロリンを除くアミノ酸である、に位置している）を介して又はセリン／トレオニンアミノ酸側鎖を介して連結されて、それぞれＮ−グリコシド結合又はＯ−グリコシド結合を与える、オリゴ糖単位の形態にある。特定の分泌されたタンパク質に結合したオリゴ糖単位の構造及び数の両方共高度に可変性であることができ、これは１つの糖タンパク質に起因する広い範囲の見かけの分子量をもたらす。
【００３６】
マウスＩＬ−７（ｍＩＬ−７）、サルＩＬ−７（ｓＩＬ−７）及びヒトＩＬ−７（ｈＩＬ−７）は分泌された糖タンパク質であり、そして第１変異体においては、本発明のＩＬ−７コンホーマーはグリコシル化されている。コンホーマーは産生系及び条件に依存して種々の型のオリゴ糖単位を含むことができる。これらは、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、キシロース、グルクロン酸、イズロン酸及び／又はシアル酸であることができる。
【００３７】
特定の態様では、本発明のＩＬ−７コンホーマーは、適度に（moderately）グリコシル化される。好ましくは、グリコシル化は、ＣＨＯ型であり、なお更に好ましくは、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを安定に発現しそしてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロラーゼ活性の欠損を与えるＣＨＯグリコシル化突然変異体により産生される。このようなグリコシル化は、典型的には、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、キシロース、グルクロン酸、イズロン酸及び／又はシアル酸を含む。
【００３８】
他の好ましい態様では、ＩＬ−７コンホーマーはヒト型グリコシル化を含む。このようなグリコシル化された形態を産生させるために、ＩＬ−７コンホーマーは、典型的には、ヒト宿主細胞において組換え技術により産生され、ヒト宿主細胞はヒトストローマもしくは上皮細胞系、ＨＥＫ−２９３（ヒト胚腎臓）、ＨＥＲ（ヒト胚網膜）、ＨＥＫ（ヒト表皮角化細胞）、ヒト胸腺もしくはヒト皮質上皮細胞系、ヒト骨髄又はヒト骨髄間質細胞系から選ぶことができる。
【００３９】
他の変異体においては、ＩＬ−７コンホーマーはグリコシル化されていない。
【００４０】
ヒト炭水化物パターンを有する組換えヒトＩＬ−７コンホーマーは治療用途に高度に好ましい。
【００４１】
特定の態様では、本発明は、特定のＩＬ−７コンホーマーであって、配列番号４、１７又は１９のアミノ酸配列を有し、ジスルフィド架橋Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２、Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９及びＣｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１を含み、そしてヒトグリコシル化されているか、適度にグリコシル化されているか又はグリコシル化されておらず、更に好ましくは（ヒト型）グリコシル化されている特定のＩＬ−７コンホーマーに関する。他の態様では、コンホーマーの配列は、Ｎ末端に追加のメチオニン残基を含み（配列番号２）そしてグリコシル化されているか又はグリコシル化されていない。
【００４２】
精製されたコンホーマーは、モノマーの形態にあることができ、又は選ばれた特定の化合物と会合しているか又は複合していてもよい。これに関して、特定の態様では、ＩＬ−７コンホーマーは、ヘテロ二量体として肝細胞成長因子（「ＨＧＦ」）に会合している。ヘテロ二量体は、化学的に、複合化（complexation）により又は組換え技術により（即ち、遺伝的融合により）得ることができる。
【００４３】
他の特定の態様では、ＩＬ−７コンホーマーは、典型的にはペプチドヒンジ領域によってＩｇＧ重鎖のＦｃ部分に機能的に結合している（functionally attached）。このような融合分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで潜在的に増加した安定性及び半減期を有する。ＩｇＧ部分は最も好ましくはヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。
【００４４】
他の特定の態様では、ＩＬ−７コンホーマーは、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）又はＨＳＡの一部に融合タンパク質として機能的に会合している（functionally associated）。このような融合分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで潜在的に増加した安定性及び延長された半減期を有する。
【００４５】
薬物原料及び製薬学的組成物
本発明は、所望される生成物として上記したＩＬ−７コンホーマーを含む薬物原料であって、ＩＬ−７生成物関連物質及び生成物関連不純物を実質的に含まない薬物原料にも関する。
【００４６】
好ましい薬物原料は更にプロセスに関連した不純物を実質的に含まない。
【００４７】
本願においては、「薬物原料」という用語は、医薬の活性成分として使用するのに適当な生成物を指す。本発明による「薬物原料」は、本来複合生成物である、即ち、その製造方法（例えば組換えＤＮＡ技術）の結果として複合生成物である。
【００４８】
本発明は、有効な治療及びワクチン増強効果を生じさせるために、ＩＬ−７薬物原料又は製薬学的組成物は、主要分子種として、１−４；２−５；３−６ジスルフィド架橋に従ってリフォールディングされた（refolded）コンホーマーを含有するべきであることを今や開示する。他の生物活性コンホーマー、ｒ−ｈＩＬ−７分子変異体、例えば、１−６；２−５；３−４が存在しそして長期の使用及び／又は反復投与について文献に記載されているけれども、本発明により得られた結果は、これらの生成物は、ＩＬ−７の好ましいコンホメーションに対して新しいエピトープを提示しそして中和免疫応答を誘導し易い生成物関連不純物として挙動するであろうということを今や初めて証明する。
【００４９】
本発明は、組換えＩＬ−７含有製薬学的組成物の特定の場合に、普通は薬物原料及び／又は医薬品の仕様に含まれるであろう他の潜在力のある生成物関連物質及び生成物関連不純物は、生物活性であるけれども、ＩＬ−７の強力なワクチンエンハンシング特性のため新しいエピトープのように挙動するという事実も開示する。かくして、これらの生成物は所望のＩＬ−７分子に対する免疫反応をトリガーすることができるので、厳密に最小にされるべきである。
【００５０】
特異的バイオアッセイにおける生物活性は、組換えタンパク質の活性を治療的使用のために適合させるための極めて重要な結果である（生物工学的薬物原料及び製品についての仕様、試験方法及び承認基準に関するICI Q6B, Harmonized Tripartite Guideline参照。１９９９年８月１８日に連邦官報（Federal Register）に公表され、６４ＦＲ  ４４９２８頁（ＦＤＡ）として発行されそして１９９９年３月にCommittee for Proprietary Medicinal Productsによりヨーロッパで採用され、ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／３６５／９６として発行された。）。生物活性は、実際、製造バッチ放出のための活性の仕様として通常保持される活性の唯一の試験である。生物活性仕様を満たすことは、組換えタンパク質薬物原料／医薬製品がヒトにおいて活性であることを通常保障する。種々の他のｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルが組換えタンパク質の活性を試験するために実施されるけれども、異種ヒト組換えタンパク質は試験される動物種における同種タンパク質（homologous protein）とは異なるので、動物における長期活性の評価は妨げられる。
【００５１】
ヒトにおける組換えタンパク質の長期使用の以前の経験は、高度に免疫反応性の「プロセス関連」夾雑物、例えばＤＮＡ、内毒素及び宿主タンパク質を欠いた修飾されていないタンパク質配列の投与は、長期活性を許容しそして免疫反応を中和することなく利益を与えることを示す。所望の生成物の分子変異体（ＩＣＩ  Ｑ６Ｂガイドラインに定義された）である生成物関連物質及び生成物関連不純物は、それらが有意な生物活性を有するかぎりは、薬物原料／医薬品組成物の相対的に高い百分率で許容される。ＩＣＩ国際ガイドラインＱ６Ｂは、「生成物関連物質は、活性でありそして医薬品の安全性及び有効性に対する有害な効果を及ぼさない、製造及び／又は貯蔵期間中に形成された所望の生成物の分子変異体である。これらの変異体は所望の生成物に匹敵する性質を有しそして不純物とは考えられない」ということを規定している。それに鑑みると、種々の生成物関連物質及び／又は生成物関連不純物、ＩＬ−７の分子変異体は、もし生物活性であるならば、バイオアッセイに基づいてバッチ放出を許可されるであろう。本発明は、これらのガイドライン及び普通の実施とは極めて対照的に、ＩＬ−７の特定の場合には、これらの分子変異体は、それらの生物活性がどうであれ、ｒ−ｈＩＬ−７所望の生成物及び／又は内因性ヒトＩＬ−７に対して免疫応答を誘発しそして組換えタンパク質の長期の治療的利益を無効にするであろうということを今や開示する。これは、主として、新しいエピトープのように挙動するこれらの分子変異体の、ＩＬ−７の強力なワクチンエンハンシング能力との連関によるものである。これらの分子変異体の中でも、本発明は、例えば、分子の不適当なリフォールディングから生じるコンホーマー、脱アミド化形態、二量体及びハイパーグリコシル化された形態（hyperglycosylated forms）、及び更に一般的には、好ましい特定的に同定された分子種とは異なるため免疫反応を誘発し易い分子生物活性変異体（molecular bioactive variants）には特に注意を払うべきであることを今や開示する。
【００５２】
特に、サルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行うことによって（実施例で報告されたとおり）、本発明者は、有効な薬物原料は主成分として前記したＩＬ−７コンホーマーを必要としそして他のコンホーマー又は生成物関連不純物を実質的に含まざるべきであることを証明することができた。このような結果は、すべての化合物が生物活性であるｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイ又はＩＬ−７がＢ細胞に対して非常に強いリンパ球生成効果を有するげっ歯類動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいては達成されなかったであろう。サルＩＬ−７をクローニングしそして本発明の薬物原料又は先行技術に開示された複合生成物を使用してサルでｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行うことにより、本発明者は、意外にも、特定のコンホーマーが活性でありそして精製された形態で使用する必要があることを証明した。
【００５３】
かくして、本発明の特定の目的は、所望の生成物として上記したＩＬ−７コンホーマーを含み、ＩＬ−７生成物関連物質及び生成物関連不純物を実質的に含まない薬物原料にある。
【００５４】
本明細書で使用した「実質的に含まない」という用語は、薬物原料が有意な又は不利な量の生成物関連物質、生成物関連不純物及びプロセス関連不純物を含有しないことを示す。更に具体的には、薬物原料は、生成物関連物質、生成物関連不純物及びプロセス関連不純物を５%未満、更に好ましくは３%未満、なお更に好ましくは２%未満しか含有するべきではない。最も好ましい薬物原料は、生成物関連物質及び／又は生成物関連不純物を１%未満しか含有するべきではなくそしてプロセス関連不純物を痕跡量しか含有するべきではない。
【００５５】
ＩＬ−７生成物関連物質は、例えば、他のＩＬ−７コンホーマー及び／又はＩＬ−７のいかなる活性なもしくは不活性なペプチド又はポリペプチド断片も含むＩＬ−７分子変異体を表す。
【００５６】
ＩＬ−７関連不純物は、例えば、モノ又はビ−ジスルフィド架橋、連続的（contiguous）ジスルフィド架橋及び、例えば下記の、Ｃｙｓ：１−６；２−５；３−４の如きいかなるジスルフィド架橋組み合わせも及び隣接ジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−２；３−４；５−６を含むヒトＩＬ−７ポリペプチドを含む。他のＩＬ−７関連不純物は、ハイパーグリコシル化ＩＬ−７を含む異常なグリコシル化形態、酵母−グリコシル化（yeast-glycosylated）ＩＬ−７、トランケーションされたＩＬ−７、脱アミド化組換えＩＬ−７、ＩＬ−７を含む二量体又は多量体、酸化されたメチオニン形態又はその組み合わせを含む。
【００５７】
それらの生物学的活性がどうであれ、これらのＩＬ−７分子変異体及びＩＬ−７関連不純物は厳密に最小にされるか又は除かれるべきである。
【００５８】
プロセス関連不純物はＤＮＡ、内毒素、細胞破片等を含む。
【００５９】
上記した如き不純物は、組換えＤＮＡプロセスによりしばしば発生される。しかしながら、それらの最終生成物活性に対する影響は必ずしも評価されておらず、そしてそれらの除去のための有効な方法は必ずしも利用可能ではない。本発明は、ＩＬ−７を生成する慣用の組換え法も上記した種々の不純物を発生させることを今や証明する。本発明は更に特定的には、種々のＩＬ−７分子変異体が存在しそして種々のアミノ酸配列が存在することを証明する。更に、本発明者はＩＬ−７の最も強力な中又は長期間ｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性は、３つの特定のジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−４（Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２）；２−５（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９）；３−６（Ｃｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１）を有する特定のコンホーマーにより担われていることを発見した。ジスルフィド架橋が欠けている場合又は不適切なジスルフィド架橋はＩＬ−７活性を極めて有意に減少させうる。更に、このような不純物の存在は、ヒト又は非ヒト霊長類に投与すると免疫反応性である分子を生成させ、かくして本発明のＩＬ−７コンホーマーの治療的利益を損なう。
【００６０】
かくして、好ましい薬物原料はＩＬ−７の総重量が本発明に記載のＩＬ−７コンホーマー少なくとも９５重量%、好ましくは少なくとも９８重量%、更に好ましくは少なくとも９９．５重量%を含む薬物原料である。
【００６１】
本発明は有効量の上記した薬物原料及び１種又はそれより多くの製薬学的に適合性又は許容できる担体、賦形剤又は希釈剤を含む製薬学的組成物にも関する。
【００６２】
本発明は、上記した実質的に純粋なＩＬ−７コンホーマーを含む製薬学的組成物はＩＬ−７のワクチン性及びその抗原特異的免疫応答を刺激する能力を明らかに増加させることを示す。かくして、本発明は、ＩＬ−７関連不純物が除去されそして上記した特定のコンホーマーが使用されるとき、高度に有効な生物学的製剤が得られることを証明する。
【００６３】
製薬学的に適合性又は生理学的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤は、中性〜僅かに酸性の、等張性の、緩衝化された塩類の、溶液又は懸濁液から及び更に好ましくはスクロース、トレハロース及びアミノ酸から選ぶことができる。製薬学的に適合性の担体は、好ましくは適当な緩衝液中に含有されて等張溶液を形成する。ＩＬ−７の多数の分子変異体、例えば、組換えられた酵母株から産生されたハイパーグリコシル化組換えタンパク質、低イオン強度で産生されたＩＬ−７二量体及び脱アミド化形態は、生物活性であるけれども、厳密に最小化されるべきである。製造及び貯蔵期間中、分子を高い又は中程度に高いｐＨ：８〜１０にさらすと、脱アミド化形態の形成をトリガーする。ｐＨ８．５〜９で室温で数日間の貯蔵はこれらの脱アミド化された分子種の出現を誘発する。高いｐＨを含む工程は、ブロセス期間中最小にするのが好ましく、そして僅かに酸性の緩衝液ｐＨ５〜７中に貯蔵されるならば、組換えタンパク質の安定性は改良される。適当な緩衝液は、５〜７．５、好ましくは６〜７のｐＨ範囲、更に好ましくは約６．５のｐＨを有するのが好ましく、そして好ましくはクエン酸ナトリウム緩衝剤又は酢酸アンモニウム緩衝剤から選ばれる有機塩である。製薬学的組成物は、懸濁液、溶液、ゲル、粉末、固体等の形態にあることができる。組成物は好ましくは凍結乾燥された形態である。実際、生成物は、希釈剤及び溶解保護剤（lyo-protectors）として適当な賦形剤溶液（例えば１／１〜１０／１、好ましくは２／１〜６／１の糖／薬物原料質量比の範囲の、例えばスクロース及び／又はトレハロース）を使用して凍結乾燥物として配合することができる。
【００６４】
組成物は、安定剤、例えば、糖、アミノ酸、タンパク質、界面活性剤等を含むことができる。組成物はリン酸塩、塩化物等を含むいかなる塩類溶液（saline solutions）も含むことができる。適当な投与量は試験により決定することができる。
【００６５】
本発明に記載の特定の製薬学的組成物は、活性薬物原料の外に、タンパク質及び／又は界面活性剤を含む。タンパク質のこれらの存在又はいかなる天然起源の他の高分子量の分子のこれらの存在もＩＬ−７を宿主免疫系にさらすのを減少させ、したがって二次効果を回避する。更に好ましくは、タンパク質は、例えばヒト起源のいかなるタンパク質も被験体において非免疫原性である。タンパク質の最も好ましい例はヒト血清アルブミンである。界面活性剤は、既知の界面活性剤、例えば、ツイーン（Tween）製品、好ましくは、ツイーン８０から選ぶことができる。本発明の特定の組成物は、ヒト血清アルブミン（好ましくは２〜５mg/ml）又はツイーン８０（典型的には０．００５%）又は、組成物の投与後の医薬品の局所的持続性によりＩＬ−７免疫原性を防止することができるいかなる他の物質、例えば、張力活性物質（tensioactive substance）も含む。
【００６６】
本発明の組成物における活性成分の実際の投与レベルは、特定の組成物及び投与方法について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るように適合させることができる。ゆえに、選ばれた投与レベルは、所望の治療効果、投与の経路、所望の治療期間及び他のファクターに依存する。一般に、皮下経路により投与される３〜３００μg/kg、好ましくは１０〜１００μg/kgの投与量は、好ましくは、１日１回〜１週間に１回、場合により週２回、好ましくは４８時間毎に１回より多くない頻度で投与されるかぎりは、生物学的効果を誘発することが予想されうる。
【００６７】
しかしながら、いかなる特定の患者についても特定の用量レベルは、体重、一般的健康、性、食事、投与の時間及び経路、吸収及び分泌の速度、他の薬との組み合わせ及び処置されるべき特定の疾患の重症度に依存するであろうということは理解されるべきである。ＩＬ−７の特定の場合には、用量レベルを調節する前に患者の免疫状態に特に注意を払うべきである。例えば、末梢ＣＤ４Ｔ細胞数値により判定して、患者がより多く免疫抑制されていればいるほど、リンパ球数値の相対的増加を誘発するのに必要な用量はより少ない。ひどく免疫抑制されている霊長類においては、１日当たり６０μg/kgの皮下用量はＴ細胞数値の強い増加を生じさせる（×３〜×５、用量に依存方式で）が、普通のリンパ球数値を有する霊長類では、２〜５倍リンパ球数値を増加させるには例えば３００μg/kgのようなより高い用量が必要である。皮下投与後、組換えＩＬ−７は霊長類において驚くべき長い血中半減期を有する。その細胞サイクリングに対する効果は２４〜２８時間持続し、１日１回〜１週間１回までの注射による有効な治療計画を可能とする。
【００６８】
本発明に記載の製薬学的組成物は、患者の免疫再生（immune regeneration）を得るため及び／又は刺激するためだけには、１日１回〜１週間１回まで、場合により週２回、好ましくは４８時間毎に１回より多くない頻度で投与されるのが好ましい。
【００６９】
好ましい経路は非経口経路である。非経口経路は、腫瘍内、更に好ましくは、静脈内又は皮下投与である。それは、動脈内、腹腔内又は筋肉内注射も含む。しかしながら、患者の健康状態及び反応性に依存して、いかなる他の投与経路も意図することができることは理解されるべきである。
【００７０】
製薬学的組成物は、追加の活性成分、例えば、好ましくは、組み合わせた使用、別々の使用又は順次の使用のための、造血細胞成長因子、サイトカイン、抗原性分子（抗原）及びアジュバントから選ばれた免疫刺激剤を含むことができる
【００７１】
このような追加の活性成分は、組み合わせた使用、別々の使用又は順次の使用のために、ＩＬ−７と組み合わせて又は別々に配合することができる。第１の態様では、活性成分を同じ容器（recipient or vessel）中で一緒に配合する。他の好ましい態様では、それらは別々に、即ち、別の容器中で、調整される（conditioned）。この態様に従えば、成分は、別々に、例えば同時に又は順次に（例えば、異なる注射部位又は異なる時点で）投与して、最も有効な生物学的効果を生じさせることができる。上記したとおり、１つ又は２つの活性成分の反復投与を行うこともできる。
【００７２】
これに関して、本発明は、組み合わせて使用するため、別々に使用するため又は順次に使用するための、上記した実質的に純粋なＩＬ−７コンホーマーと免疫刺激剤及び抗原性分子から選ばれる活性成分を含む製薬学的組成物に関する。アジュバントは好ましくは別々に配合される。
【００７３】
造血細胞成長因子は、好ましくは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、特にＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−１５及びＩＬ−２の可溶性形態から選ばれる。ワクチン増強のためのサイトカインの典型的な例は、Ｔｈ１型免疫応答を誘発及び／又は刺激するサイトカインを含む。このサイトカインは、好ましくは、γインターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、Ｂ７−１、ＭＩＰ−２及びＭＩＰ−１αから選ばれる。他の因子、例えば、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、インターロイキン及び／又はホルモンをＩＬ−７と組み合わせて使用して追加の治療的利益を得ることができることは理解されるべきである。
【００７４】
本発明の特定の組成物は、上記した実質的に純粋なＩＬ−７コンホーマー及び幹細胞因子、特にその可溶性形態、ＩＬ−１５及び／又はＦｌｔ−３リガンド及び／又はＦＧＦ１０を含む。
【００７５】
本発明の他の特定の組成物は、上記した実質的に純粋なＩＬ−７コンホーマー及び、γインターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ−１αから選ばれるサイトカインを含む。
【００７６】
本発明の他の特定の組成物は、上記した実質的に純粋なＩＬ−７コンホーマー、幹細胞因子及びサイトカインを含む。
【００７７】
上記したとおり、製薬学的組成物は、組み合わせて使用するため、別々に使用するため又は順次に使用するための１種又はそれより多くの抗原（又は抗原性分子）を更に含むことができる。抗原は、いかなる合成又は天然のペプチド、組換えタンパク質、殺された、不活性化された又は弱められた病原体産生物、微生物、寄生虫、脂質等、その一部及びその組み合わせであることができる。抗原は、完全なタンパク質、又はそのすべてのエピトープ含有断片又は一部、特にＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子によって免疫系に提示されるペプチドであることができる。抗原はいかなるウイルス抗原、バクテリア抗原、寄生虫抗原、腫瘍抗原等であってもよい。抗原の特定の例は、ＨＩＶ、水痘帯状疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタイン−バールウイルス、１型又は２型単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、デングウイルス、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ又はＥウイルス、合胞体呼吸ウイルス（syncytium respiratory virus）、ヒトパピローマウイルス、結核菌、トキソプラズマ及びクラミジア由来の抗原を含む。
【００７８】
本発明の特定の目的は、組み合わせて使用するため、別々に使用するため又は順次に使用するための上記した実質的に純粋なＩＬ−７コンホーマー及び抗原性分子を含む組成物に関する。組成物は、組み合わせて使用するため、別々に使用するため又は順次に使用するための上記に開示した１種又はそれより多くの免疫刺激剤を更に含むことができる。
【００７９】
本発明の更なる特定の目的は、上記したＩＬ−７コンホーマーを含む製薬学的組成物であって、被験体において抗原特異的免疫応答を得るため及び／又は刺激するために、同時に、数日前に又は順次に１種又はそれより多くの抗原性分子と共に投与される製薬学的組成物に関する。
【００８０】
本発明の更なる特定の目的は、被験体において抗原特異的免疫応答を引き起こすか又は高める方法であって、被験体に該抗原（又はそのエピトープ含有断片）及び上記したＩＬ−７コンホーマーを含む製薬学的組成物を投与することを含む方法に関する。製薬学的組成物は、被験体において抗原特異的免疫応答を得るため及び／又は刺激するために、同時に、数日前に又は順次に該抗原と共に投与することができる。
【００８１】
他の好ましい態様では、本発明の組成物は更にアジュバントを含む。アジュバントは、抗原の免疫原性を促進するか又は増加させそしてＴｈ１型免疫応答を誘発することができるすべての物質、混合物、溶質又は組成物、例えば、ＣｐＧ、ＱＳ２１、ＩＳＣＯＭ及びモノホスホリル脂質Ａから選ぶことができる。このようなアジュバントは、哺乳動物被験体、特にヒトにおける抗原（１つ又は複数）に対する特異的免疫応答を生じさせ及び／又は増幅するのに特に適している。アジュバントは、好ましくは、所望の抗原（１種又は複数）と共に、ＩＬ−７含有組成物とは別々に及び／又は別の注射部位で調整されそして投与されるのが好ましい。
【００８２】
本発明は、Ｂ又はＴリンパ球発生及び増殖の予防的又は治療的刺激のため又は免疫応答の増強のためにヒト患者に非経口投与するための、有効量の本発明に記載のヒトＩＬ−７コンホーマーを適当な希釈剤、賦形剤又は担体と混合して含む製薬学的組成物にも関する。本発明の製薬学的組成物は長期のリンパ球生成刺激及び／又は増幅された免疫応答を誘発する。
【００８３】
本発明に記載の製薬学的組成物は、Ｂ又はＴリンパ球発生及び増殖の予防又は治療的刺激のため、包括的及び／又は特異的免疫再構成の増強のため、又は体液性及び／又は細胞性免疫応答の増強のためにヒト患者において使用することもできる。
【００８４】
本発明に記載の好ましい特定の製薬学的組成物は、免疫不全患者における日和見感染を防止又は減少させるのに使用するためのものである。
【００８５】
本発明に記載の他の特定の製薬学的組成物は、リンパ球生成刺激を延長するため及び／又は主要エピトープ（dominant epiotopes）に対するのみならず副主要エピトープ（sub-dominant epitopes）又は免疫原性のより少ないエピトープに対する特異的免疫応答も生じさせるために使用するためのものであり、ここでエピトープはＴ細胞受容体に対する低いアフィニティーを有し、これはヒト患者において特異的免疫応答のレパートリーを広くすることを可能とする。
【００８６】
本発明は、被験体、例えば、免疫不全患者、がん患者、移植片を受けている患者、、ウイルス又は寄生虫に感染した患者、低いＣＤ４数値を有する高齢患者又はすべての患者等における予防的又は治癒的免疫応答を生じさせるのに特に適している。
【００８７】
製造方法及び手段
本発明の他の観点は、上記組成物、特に上記ＩＬ−７コンホーマー及び薬物原料をその製薬学的使用のために十分な量及び品質において製造するための適当な構築物及び方法を提供することである。
【００８８】
この点で、本発明は、ＩＬ−７ポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列は生物学的に活性なＩＬ−７、特に上記したＩＬ−７コンホーマーの組換え宿主における発現のために最適化されている、核酸分子を今や開示する。更に特定的には、核酸分子は、切頭されたＩＬ−７ポリペプチドの限定された発現を与えそして生物学的に活性なヒトＩＬ−７コンホーマーの製造の収率を増加させる。
【００８９】
ヒト及びサルＩＬ−７をコードするＤＮＡ配列（ゲノム又はｃＤＮＡ）は、「ＡＴＧ」開始コドンの後の位置４９に、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）における第２開始コドンとして挙動する第２推定「ＡＴＧ」を含有する。実際、この第２「ＡＴＧ」は、「擬シャイン・ダルガノ」配列（リボソーム結合部位）により先行される。最適化された生成物を創りだすために、出願人はこの推定第２開始コドンを不活性化し、それによりｒ−ｈＩＬ−７のアミノ末端トランケーションされた形態の潜在的生成を有意に減少させることに着手した。このような最適化された配列を生成させるために、コード配列におけるヌクレオチドを突然変異させて、得られるコードされたｒ−ＩＬ−７アミノ酸配列を修飾することなく、「ＳＤ様」配列を不活性化させた。
【００９０】
かくして、本発明の更なる目的は、ヒトＩＬ−７ポリペプチドをコードする核酸分子であって、更に特定的には「ＳＤ様」配列の（即ち、配列番号２のメチオニン残基１８をコードする配列の位置４９に位置した推定第２開始コドンの）不活性化により、アミノ末端トランケーションされたポリペプチドの生成を回避する修飾された配列を含有する核酸分子に関する。
【００９１】
推定第２開始コドンの不活性化は、更に好ましくは、配列番号１のメチオニン１８をコードするＡＴＧコドンに先行する５コドンの少なくとも１つにおいて、即ち、アミノ酸配列ＴｙｒＧｌｕＳｅｒＶａｌＬｅｕをコードするコドン１３〜１７において、配列を修飾することにより達成されうる。特定の態様では、配列は、配列番号１又は２の位置１５のセリンをコードするコドンを変更することにより修飾される。更に特定的には、好ましい配列では、このコドンはＡＧダブレットを含有しないように修飾される。適当なコドンは、例えば、ＴＣＣ、ＴＣＴ、ＴＣＡ及びＴＣＧから選ぶことができる。配列番号１、３、１６及び１８において、ＴＣＣコドンが使用された。位置１３（配列番号１の番号付けに基づいて）のＴｙｒをコードするコドンは、ＴＡＣ又はＴＡＴから選ぶことができる。位置１４（配列番号１の番号付けに基づいて）のＧｌｕをコードするコドンはＧＡＧ及びＧＡＡから選ぶことができる。位置１６（配列番号１の番号付けに基づいて）のＶａｌをコードするコドンはＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ及びＧＴＧから選ぶことができる。最後に、位置１７（配列番号１の番号付けに基づいて）のＬｅｕをコードするコドンはＣＴＧ、ＣＴＡ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＴＴＡ及びＴＴＧから選ぶことができる。上記したコドンのすべての組み合わせが可能である。変更されたＤＳ様配列の特定の例は配列番号１のヌクレオチド３７〜５１に相当する。
【００９２】
本発明の特定の好ましい核酸分子は配列番号１の配列を含みそして組換えヒトＩＬ−７ポリペプチドをコードする。
【００９３】
本発明の他の特定の好ましい態様は、生成されたポリペプチドの分泌を引き起こすシグナル配列を更に含む上記した核酸分子に関する。シグナル配列は、ヒトＩＬ−７タンパク質の天然のシグナル配列、又はすべての異種シグナル配列から選ぶことができる。このような配列は、他の分泌されたタンパク質、例えば、ヒト成長ホルモン、由来のものであることができ、人工又は合成のものであることができる。好ましいシグナルペプチドは、ヒト成長因子又はヒト成長ホルモンの天然のシグナルペプチド、及び更に好ましくは、ヒトエリスロポエチンの天然のシグナルペプチドであることができる。なお更に好ましいシグナルペプチドは、合成シグナルペプチド、例えば、ＨＭＭ３８である。好ましい配列はコンピテント哺乳動物宿主細胞において機能的な配列である。このような改良された配列の特定の例は配列番号３、１６又は１８を含む。この配列は改良された発現のためのリーダー配列及び不活性化ＳＤ様配列を含む。
【００９４】
本発明の他の目的は、グリコシル化されていてもよく又はグリコシル化されていなくてもよい上記した核酸配列によりコードされたポリペプチドに関する。
【００９５】
本発明の好ましい目的は、上記したポリペプチドであって、該ポリペプチドの三次構造が下記の３つのジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−４；２−５；３−６を含むポリペプチドに関する。
【００９６】
本発明は、更に、上記した核酸を含むベクター及び該核酸又はベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。核酸及びベクターは種々のコンピテント宿主細胞において組換えヒトＩＬ−７ポリペプチドを産生するため及び遺伝子治療目的に使用することができる。
【００９７】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド、エピソーム等であることができる。好ましいベクターはウイルスベクター（例えば、組換えアデノウイルス）及びプラスミドであり、これらは商業的に入手可能なバックボーン、例えば、ｐＢＲ、ｐｃＤＮＡ、ｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＶＩＴＲＯ等に基づいて作成することができる。ベクターは、典型的には、最適化されたコード核酸からのＩＬ−７ポリペプチドの発現を制御又は媒介するための調節エレメント又は配列を含む。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、組織特異的シグナル、ペプチドシグナル、イントロン、ターミネーター、ポリＡ配列、ＧＣ領域等又はそれらの組み合わせから選ぶことができる。このような調節エレメント又は配列は哺乳動物、植物、バクテリア、酵母、バクテリオファージ又はウイルス遺伝子由来のものであるか又は人工的ソース由来のものであることができる。原核生物発現（例えばＥ．ｃｏｌｉ）のための有用なプロモーターは、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ｐＴ７）、ＴＡＣプロモーター（ｐＴＡＣ）、Ｔｒｐプロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔｒｅプロモーター、ＰｈｏＡプロモーターを含む。哺乳動物細胞における発現のための適当なプロモーターは、ウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＬＴＲ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＴＫ、ｐＣＡＧ等）、ドメスチック遺伝子プロモーター（例えば、Ｅ１ｆα、ニワトリβアクチン、ユビキチン、ＩＮＳＭ１等）、ハイブリッドプロモーター（例えば、アクチン／グロビン等）等を含む。ベクターは１つより多くのプロモーターを含むことができる。プロモーターは誘導性であるか又は調節されることができる。例えば、誘導性プロモーター又は調節されるプロモーターの使用は、生産段階から培養物を引き離すことにより産生の良好な制御を可能とする。誘導性プロモーター又は調節されたプロモーターは、文献に見出すことができ、例えば、テトラサイクリン系（Tetracycline system）、ジェネスイッチ系（Geneswitch system）、エクジソン系（Ecdysone system）、エストラジオール系（Oestradiol system）、ＲＵ４８６系（RU486 system）、クメート系（Cumate system）、メタロチオネインプロモーター等であることができる。他の系は電流又はマイクロ波に基づいており、例えば、ウルトラソンズフォーカライジス（Ultra sons focalises）等である。これらの系は本発明に記載のＩＬ−７ポリペプチドの発現を制御するのに使用することができる。
【００９８】
ＩＬ−７は、抗アポトーシス因子（例えば、ｉｅｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸＬ等）と共に共発現されうる。ｃＤＮＡ（該ＩＬ−７及び該抗アポトーシス因子をコードする）は同じプロモーターの下流に、しかしＩＲＥＳ配列により分離されて配置されることができ、又はそれらの各々はそれ自身の下流に配置されることができる。
【００９９】
ベクターは更に複製の起点及び／又はマーカー遺伝子を含むことができる、これらは慣用の配列から選ぶことができる。
【０１００】
ベクターは、更に異なる方法で構成されうるこれらの異なるエレメントの種々の組み合わせを含むことができる。
【０１０１】
したがって、本発明は、上記した核酸又はベクターを含む組換え宿主をも提供する。宿主細胞は、いかなる原核細胞及び真核細胞からも選ぶことができ、典型的には、哺乳動物細胞（特に、ヒト、げっ歯類、イヌの細胞）、バクテリア細胞（特にＥ．ｃｏｌｉ、バチルス．ブレビス（Bacillus Brevis）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtillis））、酵母細胞、植物細胞及び昆虫細胞から選ぶことができる。産生の目的で酵母、植物又は昆虫細胞が使用される場合には、該細胞で得られる産生物は、好ましくはグリコシル化されていない産生物を産生させるために処理工程にかける。これらの宿主細胞は血清を含まない培地に適合させることができる。産生はトランスジェニック動物において達成することもできる。
【０１０２】
好ましい組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞及びバクテリア細胞並びにそれらの誘導体又は突然変異体から選ばれる。適当な宿主細胞の特定の例は、タンパク質のグリコシル化されていない産生を与えるバクテリアを含む。バクテリア（例えば、Escherichia coli）においては、組換えＩＬ−７は一般に封入体として発現される。この宿主は特に有利であり、更に特定的には、配列番号１の配列を含むベクターと共に使用することができる。
【０１０３】
適当な宿主細胞の多く例は、タンパク質のグリコシル化された産生を与える哺乳動物細胞を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞、ヒト表皮角化細胞（ＨＥＫ）、ヒトストローマ又は上皮細胞、ＰＥＲＣ６等を挙げることができる。このような哺乳動物細胞において、ＩＬ−７は機能的シグナルペプチド配列を使用して分泌されたタンパク質として産生されうる。これらの宿主は、更に特定的には、配列番号３、１６又は１８の配列を含むベクターと共に使用することができる。
【０１０４】
本発明の特定の目的は、配列番号１を含む核酸分子を含む原核生物宿主細胞である。
【０１０５】
本発明の他の特定の目的は、配列番号３, １２、１６、１８、２０又は２２を含む核酸分子を含む真核生物宿主細胞である。
【０１０６】
本発明の他の特定の目的は、配列番号１３のアミノ酸２６−１５２を含むＩＬ−７ポリペプチドをコードする核酸分子を含む原核生物又は真核生物宿主細胞である。
【０１０７】
本発明の更なる目的は、上記したＩＬ−７コンホーマーと免疫反応性の抗体に関する。このような抗体は、動物を免疫し、そして血清を集め（ポリクローナル）又は脾臓細胞からハイブリドーマを調製する（モノクローナル）ことを含む慣用の方法に従って産生することができる。抗体の断片（例えば、Ｆａｂ′）又は誘導体（例えば、ＳｃＦｖ）は既知の生物学的方法及び化学的方法により生成させることができる。好ましい抗体は上記したＩＬ−７コンホーマーと特異的に免疫反応性である、即ち、下記の3つのジスルフィド架橋：Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２、Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９及びＣｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１を含まないＩＬ−７ポリペプチドに実質的に結合することなくＩＬ−７コンホーマーに結合することができる。このような他の抗原に対する非特異的又はあまり有効でない結合が観察されうるけれども、このような非特異的結合は本発明の特定のコンホーマーに対する特異的結合から区別することができる。
【０１０８】
抗体は、好ましくは、サル、マウス又はヒト起源であるか又はヒト化されている。
【０１０９】
本発明は上記したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系にも関する。
【０１１０】
このような抗体は、多数のリンホカインが関与するアッセイ又は実験においてＩＬ−７コンホーマーを検出するか又はＩＬ−７生物学的活性を中和するのに有用である。このようなモノクローナル抗体を含む診断、アッセイ又は治療に適当な組成物も本発明の目的である。
【０１１１】
本発明は、サンプルから最適化されたＩＬ−７核酸を生成又は増幅する方法であって、
ｉ）ＩＬ−７遺伝子又はコード配列を含有するサンプルを提供し、
ii）該サンプルを、最適化された配列、特に位置４９における機能的第２開始コドンを欠いた配列を生成するプライマーの対と接触させ、そして
iii）最適化されたＩＬ−７核酸を生成又は増幅する、
ことを含む方法も提供する。
【０１１２】
サンプルはゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができる。
【０１１３】
遺伝子の増幅は、それ自体既知の技術、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ又は他の増幅技術により生じさせることができる。増幅は、通常、フォーワード配列がＤＮＡの５′端部とハイブリダイゼーションしそしてリバース配列が同じＤＮＡの３′端部とハイブリダイゼーションすることを特長とするプライマーの対の使用を必要とする。プライマーの特定のサンプルは下記のとおりである：
対１：配列番号５及び配列番号６、
対２：配列番号７及び配列番号６、及び
対３：配列番号８及び配列番号６。
【０１１４】
このような特定の核酸プライマーは本発明の更なる目的を表す（例えば、配列番号５〜８）。
【０１１５】
他のプライマー、例えば、増幅工程で使用するための最適化されたＩＬ−７遺伝子の断片、及び特に、フォーワード配列とリバース配列を含むプライマーの対であって、該対の該プライマーが突然変異されたＩＬ−７遺伝子の領域とハイブリダイゼーションしそして該ＩＬ−７遺伝子の少なくとも一部の増幅を可能とするプライマーの対が当業者によりデザインされうることは理解されるべきである。
【０１１６】
本発明の他の目的は、工業的規模で、医薬品グレードの上記した実質的に純粋なＩＬ−７コンホーマーを製造するために使用することができる方法に関する。この方法は治療的使用に適当な組換えＩＬ−７コンホーマーの高い収率をもたらす。本発明は、ＩＬ−７含有組成物を制御して、上記したＩＬ−７コンホーマーの量の存在を決定する新規な方法も提供する。
【０１１７】
特定の観点では、上記したＩＬ−７コンホーマー又は薬物原料を製造する方法は、
ａ）ＩＬ−７ポリペプチドを含むサンプルを提供し、そして
ｂ）上記したＩＬ−７コンホーマーを精製する、
ことを含む。
【０１１８】
工程ａ）で使用されるサンプルは、ＩＬ−７ポリペプチドを含有するいかなる生物学的サンプルであってもよい。これは、例えば、細胞上澄液、生物学的流体、細胞抽出物、組織サンプル等を含む。好ましいサンプルは、組換えＩＬ−７ポリペプチド、更に好ましくは、組換えヒト又はサルＩＬ−７ポリペプチド、なお更に好ましくは組換えヒトＩＬ−７ポリペプチドを産生する組換え宿主細胞の細胞上澄液である。
【０１１９】
最も好ましいサンプルは、上記した最適化されたＩＬ−７をコードする核酸分子、更に特定的には、配列番号１、３、１２、１６、１８、２０又は２２を含むポリヌクレオチドを含有する組換え宿主細胞の細胞上澄液である（から得られる）。
【０１２０】
ＩＬ−７の純度を増加させるため、封入体からＩＬ−７を放出するため、細胞デブリス又は他の特定の物体を除去する等のために、サンプルを種々の処理又は条件に付すことができる。このような処理の典型的な例は、遠心、ろ過及び／又は清澄化を含む。このようにしてサンプルをＩＬ−７ポリペプチドに富ませることができる。
【０１２１】
この方法の収率又は効率を増加させるために、正しく折りたたまれたＩＬ−７ポリペプチドを含有するサンプル又は正しく折りたたまれたＩＬ−７ポリペプチドに富んだサンプルを生成させることが高度に望ましい。
【０１２２】
これに関して、サンプルがＩＬ−７ポリペプチドをコードする原核生物宿主細胞の培養物である（又は由来のものである）場合には、サンプルの特定の処理が必要である。このような処理は、
ｉ）該サンプルを処理して該ＩＬ−７ポリペプチドの完全な変性を引起し、
ii）場合により工程ｉ）で得られた変性されたポリペプチドを精製し、そして
iii）ポリペプチドをリフォールディングする、
ことを含む。
【０１２３】
工程ｉ）はＩＬ−７ポリペプチドの変性を引起すためのサンプルの処理を含む。変性は、ポリペプチドにおけるすべての三次構造、例えばジスルフィド架橋又は他の分子内結合の破壊及び減少を表す。変性処理は、封入体を変性剤緩衝液に溶解させて、完全に変性され、可溶化されたタンパク質にすることを含む。変性は、グアニジン塩酸塩又は尿素、ＥＤＴＡ、βメルカプトエタノール又はジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む緩衝液により得られうる。適当な投与量は当業者により決定することができそして必要な変性のレベルに依存する。当該技術分野で知られている他の変性条件もまた単独で又は組み合わせて適用することができる。変性の好ましいレベルは、ＩＬ−７のすべてのジスルフィド架橋の破壊に相当する。好ましい完全な変性プロトコールは８Ｍグアニジン塩酸塩緩衝液を使用する。タンパク質の正しい折りたたみの前にタンパク質の完全な変性を可能とするために高いアニジン塩酸塩モル濃度が好ましい。この変性の工程は、例えば、電気泳動の如き当該技術分野で知られている分析技術により制御することができる。
【０１２４】
精製工程ii）は、それ自体は知られているが、完全に活性なＩＬ−７ポリペプチドコンホーマーを生成させるのにこの組み合わせではこれまで使用されたことのない異なる技術により行うことができる。これらの技術は、更に好ましくは、単独又は種々の組み合わせにおける、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーから選ばれる。このような方法は、その後のリフォールディング工程の回収を低下させるＤＮＡ及び不純物（脂質等）を除去することを可能とする。好ましい態様では、工程ii）は疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を含む。このようなクロマトグラフィーは、種々の支持体及びフォーマットを使用し、好ましくはＨＩＣブチルを使用し、好ましくは変性条件において行うことができる。この工程を行うために、好ましいｐＨ範囲は６〜９、好ましくは７〜８．５の範囲に、これらの値も包含して、含まれる。工程ii）は、いかなる支持体においても、好ましくはバッチで又は適当なゲルを使用するカラムで行うことができる。
【０１２５】
リフォールディング工程iii）は、ＩＬ−７ポリペプチドの再生（renaturation）及び好ましくは再酸化、及び典型的には、ろ過（例えば、ゲルろ過）及び限外ろ過により行われる更なる脱塩工程を含む。好ましい態様では、リフォールディングは活性な新規なコンホーマーを望まれない形態から分離するためのイオン交換クロマトグラフィー工程を含む。最も好ましい態様では、リフォールディングは、活性な新規なコンホーマーを望まれない形態から分離するために、精製されたポリペプチドを選ばれたアフィニティークロマトグラフィー支持体と接触させる工程を含む。この非常に有利な工程は正しくリフォールディングされたＩＬ−７の溶離のために選択的である。
【０１２６】
本発明の特定の態様では、リフォールディング工程iii）は、工程ii）で得られた溶液を硫酸化された多糖類のポリマーを含むカラムに通すことを含む。硫酸化された多糖
は好ましくはデキストラン硫酸又はヘパリンであり、そしてマトリックスはセファロース、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製でよく使用される他のタイプのものである。好ましいマトリックスはヘパリンセファロースである。この方法は、更に所望のＩＬ−７コンホーマーを溶離する追加の工程を含むことができる。
【０１２７】
特定の態様では、上記アフィニティーカラムは、ポリペプチドを精製するため及びリフォールディングするための両方に、即ち、工程ii）及び工程iii）を同時に行うために使用することができる。
【０１２８】
サンプルがＩＬ−７ポリペプチドをコードする真核生物宿主細胞の培養物である（由来のものである）場合には、上記処理工程ｉ）〜iii）を行う必要がないことがある。実際、このような状況においては、サンプルは、他の生成物関連物質及び不純物と複雑に混合しているけれども、正しく折りたたまれたＩＬ−７タンパク質を含むことができる。これは、特に、組換え真核生物宿主細胞が培養培地中にＩＬ−７ポリペプチドの発現及び分泌を引起す核酸分子を含む場合に真実である。
【０１２９】
この場合に、サンプルは直接精製工程ｂ）に付すことができる。
精製工程ｂ）は、医薬関連物質、例えば、他のコンホーマー、脱アミド化形態、タンパク質の二量体、ＤＮＡ、内毒素等を含む残留不純物を除去するために、１つ又はそれより多くの精製工程、例えば、ろ過又は限外ろ過工程、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等を含むことができる。クロマトグラフィー工程は、フロースルー方式（flow through mode）、捕集方式（capture mode）又は流線形方式（streamline mode）で達成することができる。
【０１３０】
好ましい態様では、精製工程ｂ）は樹脂に固定化された硫酸化された多糖類（例えば、デキストラン硫酸又はヘパリン）を含む特定のゲルを充填したカラムによってサンプルをローディングすることを含む。
【０１３１】
他の特定の態様では、精製工程は、樹脂に固定化されたモノクローナル抗ＩＬ−７抗体を含む特定のゲル（例えば、デキストラン硫酸又はヘパリン）を充填したカラムによってサンプルをローディングすることを含む。
【０１３２】
これらの方法は、上記した実質的に純粋な完全に活性なヒトＩＬ−７コンホーマーの再現可能な且つ効率的な生成を可能にする。この方法は、ＩＬ−７の全量に対して少なくとも９５重量%、好ましくは少なくとも９８重量%、更に好ましくは少なくとも９９%又は９９．５重量%もの純度で組換えＩＬ−７コンホーマーを得ることができるので、特に有利である。更に、上記精製方法は、ヒトＩＬ−７以外のポリペプチド、特に、動物ＩＬ−７（例えばサルＩＬ−７）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５等を含む１つ又はそれより多くのジスルフィド架橋を有する他のサイトカインに適用することができる。
【０１３３】
上記した方法の各工程は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を含む分析方法により制御することができる。トリプシン消化後のペプチドマッピング分析により遺伝子及び／又はアミノ酸配列を決定すること、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ及び／又は質量分析法により分子量を決定すること、例えば逆相ＨＰＬＣにより疎水性を決定すること及び／又は例えばカチオン交換クロマトグラフィーＨＰＬＣ又は等電点電気泳動分析により電荷を決定することにより、最適化されたＩＬ−７の一次構造を制御しそして特徴付けることができる。
【０１３４】
特定の態様では、本発明は、上記したＩＬ−７コンホーマーを製造する方法であって、少なくとも下記の工程：
ａ）組換え原核生物宿主細胞により産生されたＩＬ−７ポリペプチドを含むサンプルを提供し、
ａ′）該サンプルを処理して該ＩＬ−７ポリペプチドの完全な変性を引起し、
ａ″）場合により工程ａ″)で得られた変性されたポリペプチドを精製し、
ａ″′)ポリペプチドをリフォールディングし、そして
ｂ）ポリペプチドを精製して上記したコンホーマーを生成させる、
工程を含む方法に関する。
【０１３５】
他の特定の態様では、本発明は、上記したＩＬ−７コンホーマーを製造する方法であって、少なくとも下記の工程：
ａ）組換え真核生物宿主細胞により産生されたサンプルであって、リフォールディングされたＩＬ−７ポリペプチドを含むサンプルを提供し、そして
ｂ）生成物関連物質又は不純物を除去するために１つ又はそれより多くの精製工程を実施する、
工程を含む方法に関する。
【０１３６】
本発明の更なる態様は、組換え宿主細胞によるＩＬ−７発現が誘導性であるか、調節されているか又は一過性であり、それにより細胞培養時期とＩＬ−７発現時期とを引き離すことができる、上記したＩＬ−７製造方法に関する。更に特定的には、特定の態様では、組換え細胞の成長、増大（expansion）及び／又は培養期間中ＩＬ−７発現を抑制するか又は最小にして、いかなるＩＬ−７媒介の潜在的毒性作用もなしに大量の組換え宿主細胞の産生を可能とすることができる。次いでＩＬ−７発現を細胞培養物内で（又はそのサンプル上で）誘導して組換えＩＬ−７の効率的な合成及び放出を可能とすることができる。
【０１３７】
かくして、本発明の目的は、組換えＩＬ−７ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え宿主細胞を培養しそして産生された組換えＩＬ−７ポリペプチドを回収することを含む、組換えＩＬ−７ポリペプチドを製造する方法であって、該核酸分子は該ＩＬ−７ポリペプチドの調節された発現又は誘導性発現を与え、それにより該ＩＬ−７ポリペプチドの発現を組換え細胞成長期間中は抑制するか又は最小にすることができ、そして産生相期間中は誘導することができる、方法にもある。核酸は、典型的には、培養培地中に含有されるか又は加えられた特定の作用物質の存在下又は不存在下に抑制又は活性化されうる誘導性プロモーターを含む。この方法は上記したＩＬ−７コンホーマーを製造するのに特に適している。
【０１３８】
種々の調節された発現系又は誘導性発現系が当該技術分野で開示されており、これらは哺乳動物宿主細胞において機能的でありそして本発明で使用することができる。これらはテトラサイクリン  ＴｅｔＯｎ／Ｏｆｆ系、誘導性作用物質としてのミフェプリストン（Mifepristone）及びＧＡＬ４−Ｅ１ｂプロモーターによるジェネスイッチ（Geneswitch）系、エクジソン（Ecdyson）系（ポナステロンＡ又はムリステロンＡ、昆虫ステロイドホルモンの類似体による誘導）（Invitron）、メタロチオネインプロモーター（亜鉛により誘導できる）、エストラジオール系、ＲＵ４８６系、ウルトラソンズフォーカライザー（Ultra sons focalizers）、クメート系（Cumate system）（Q-mate; Qbiogen）、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系等を含む。これらの調節発現系又は誘導性発現系は、種々の細胞、例えば、誘導後に組換えＩＬ−７を発現するようにデザインされた組換えベクターで形質転換された、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ、ＨＥＫ、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−２９３、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−Ｈｅｌａ、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−  ＣＨＯ又はＴ−ＲＥＸ（登録商標）−Ｊｕｒｋａｔ細胞系において使用することができる。
【０１３９】
別法として、一過性トランスフェクションを使用してＩＬ−７産生から細胞増殖を分離することができる。この点について、効率的な遺伝子デリバリーベクターを使用して細胞の増殖時にＩＬ−７コード配列を細胞に導入する。更に好ましくは、一過性トランスフェクションのためのベクター系は、ウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルス又はエピソームベクター［例えば、ｐＣＥＰＨ（Invitrogene）、ｐＴＴ（ＩＲＢ；Durocher Y.et al.Nucl.Acids.Res., 2002, 30(2)）又はＭＡＲ配列を使用する］である。アデノウイルス（及び他のウイルスベクター、例えば、ＡＡＶｓ）は当該技術分野で知られている技術に従って産生することができる。典型的には、Ｅ１欠失アデノウイルスは、Ｅ１補完細胞系（E1-complementary cell line）、例えば、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲＣ６細胞等において産生される。このような一過性トランスフェクション方法は、培養されている種々の哺乳動物細胞、例えば、Ａ５４９、Ｈｅｌａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ又はＣＨＯ形質転換細胞（実施例Ａ4で開示された）において実施することができる。本発明で使用するのに適当な別の一過性発現方法は、例えば、次の文献：Durocher Y. et Nucl.Acids.Res., 20002, 30(2)にＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ又はＨＥＫ２９３細胞において開示されている。
【０１４０】
好ましい態様では、本発明の製造方法は、得られる生成物中に含有される上記した特定のＩＬ−７コンホーマーを特徴付けそして測定又は定量する追加の工程ｃ）を含む。所望のＩＬ−７コンホーマーの物理的及び生物学的特徴付けは、質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、赤外分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、円偏光二色性を決定すること、特異的バイオアッセイにおけるＩＬ−７コンホーマーの生物学的活性の評価、該ＩＬ−７コンホーマーに対して生じた特異的モノクローナル抗体に対するアフィニティーを測定すること、又はヘパリンアフィニティーＨＰＬＣにより得ることができる。一旦特徴付けされると、該コンホーマーの定量を、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ、ＩＬ−７受容体に対する該ＩＬ−７コンホーマーのアフィニティー、及び単離されたコンホーマーに適用される場合のタンパク質定量のすべての方法により行うことができる。
【０１４１】
この点について、本発明は、サンプル、特に、製薬学的製剤中のＩＬ−７コンホーマー及び／又は関連不純物の量を同定及び／又は測定する方法も提供しそしてこの方法にも関する。このような特徴付け方法は、製薬学的バッチの品質制御において治療的使用を申請するためにタンパク質を最初に特徴付け及び定性するのに使用することができる。実際、本発明は、完全に生物学的に活性なＩＬ−７コンホーマーが存在すること及び他のコンホーマー又はＩＬ−７ペプチド断片のような不純物の存在は極めて望ましくない副作用を発生させることがあることを今や証明する。したがって、本発明は、本発明の特定のＩＬ−７コンホーマーの存在及び／又は相対的量を決定するための、ＩＬ−７含有製剤を特徴付けそして制御する方法を初めて提唱する。好ましい方法は、ウエスタンブロット、サイズ排除ＨＰＬＣ、大腸菌タンパク質（ＥＣＰ）アッセイ、バクテリア内毒素アッセイ、リムルス遊走細胞溶解物試験（Limulus Ameobocyte Lysate test）（ＬＡＬ試験）、ＤＮＡ定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、ヘパリンアフィニティーＨＰＬＣ、ビシンコニン酸アッセイ（Bicinchoninic Acid Assay）（ＢＣＡ）法、アミノ酸アッセイ（ＡＡＡ）法、ＥＬＩＳＡ、紫外線吸収及び／又はバイオアッセイを使用する。これらの方法は単独で又は種々の組み合わせにおいて使用することができる。
【０１４２】
本発明は、ＩＬ−７薬物原料又は製薬学的組成物を製造する方法であって、（ｉ）ＩＬ−７ポリペプチドをコードする組換え宿主細胞を培養し、（ii）該組換えポリペプチドを単離してＩＬ−７薬物原料を生成させ、（iii）該ＩＬ−７薬物原料を調整して治療又はワクチンに使用するのに適当な製薬学的組成物を生成させることを含み、更に、該薬物原料又は製薬学的組成物中の上記したＩＬ−７コンホーマーの量及び／又は品質を同定、特徴付け又は測定する工程、及び更に好ましくは、活性成分として該ＩＬ−７コンホーマーを約９５重量%より多く、好ましくは９８%より多く含む薬物原料又は製薬学的組成物を選択する工程を含む方法を提供する。
【０１４３】
特徴付け工程は、種々の技術、好ましくは、トリプシン消化を伴うか又は伴わない質量分析関連法、円二色法、ＮＭＲ、ジスルフィド架橋についての特異的モノクローナル抗体分析及び／又はコンホメーション特徴付けにより行うことができる。分子変異体及び生成物関連不純物の同定は、好ましくは、脱アミド化形態のための二次元電気泳動、等電点電気泳動及びイオン交換クロマトグラフィー、二量体又は多量体形態のためのサイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び、トランケーションされた形態及び酸化されたメチオニン形態を含む種々の形態のための予備消化を伴うか又は伴わない逆相ＨＰＬＣから選ばれる１つ又はそれより多くの方法を使用することにより行われる。
【０１４４】
上記工程は、上記ＩＬ−７コンホーマー約９５重量%より多く、好ましくは約９６%、９８%又は９９．５%より多くを含む組成物のみが保持される、臨床的又は製薬学的組成物の品質制御に特に適している。
【０１４５】
本発明の他の目的は、免疫不全に関連した疾患を予防又は処置し、特に長期のリンパ球生成刺激を誘発し、免疫応答、特に抗原特異的免疫応答を引起し及び／又は増幅するための製薬学的組成物を製造するための、上記した方法で得られた単離したＩＬ−７ポリペプチドコンホーマー又は組換えＩＬ−７コンホーマーの使用に関する。
【０１４６】
本発明の更なる目的は、サルにおける実験的又は薬理学的使用のための手段としてのＩＬ−７コンホーマーの使用に関する。
【０１４７】
本発明は、少なくとも、最適化されたＩＬ−７遺伝子に特異的なプライマー及び場合により核酸増幅反応のためのプライマーの対及び／又はプローブ及び／又は試薬、及び／又は上記した抗体を含む上記の方法を実施するためのキットにも関する。あるいは、キットは、上記したＩＬ−７ポリペプチドを生成させるための試薬、例えば、最適化された核酸、ベクター、組換え宿主細胞、及び／又はこのような製剤の精製又は品質制御のためのプロトコール又は試薬を含むことができる。
【０１４８】
本発明の他の観点及び利点は、下記の実施例に記載されるであろう。これらの実施例は本発明を説明するものであるとみなされるべきであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１４９】
実施例
実施例Ａ．最適化されたヒト（ｈ）及びサル（ｓ）ＩＬ−７コードヌクレオチド配列の構築及び発現
Ａ１．大腸菌発現（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１）
１．１．ヒトＩＬ−７コードヌクレオチド配列の構築
ヒトＩＬ−７コードｃＤＮＡ配列を、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有する下記の特異的オリゴヌクレオチドプライマー：
−配列番号：５：ＩＬ７５′
５′ＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＣ３′
ＮｄｅＩ
−配列番号：６：ＩＬ７３′
５′ＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡ３′
ＢａｍＨＩ
を使用してヒト胎盤ｃＤＮＡ（BioChain Inc）からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Mullis et al.;  1987; Methods in Enzymology; 155: 335-350）により増幅した。
【０１５０】
ヒトＩＬ−７コードＤＮＡ配列は、「ＡＴＧ」開始コドンの後の位置４９に、大腸菌における第２開始コドンとして挙動することができる第２推定「ＡＴＧ」を与える。何故ならば、この第２「ＡＴＧ」は、「擬シャイン・ダルガノ」配列（リボソーム結合配列）により先行されるからである。ｒ−ｈＩＬ−７のアミノ末端トランケーションされた形態の生成の可能性を回避するために、この「ＳＤ様」配列のヌクレオチドのいくらかを突然変異させ（得られるコードされたｒ−ｈＩＬ−７アミノ酸配列を修飾することなく）、それにより大腸菌細胞中での発現のための１つ又はそれより多くの好ましいコドン（１つ又は複数）を含有する改良されたメチオニル−ＩＬ−７コードＤＮＡ配列を生成させる。
【０１５１】
ＩＬ−７コードＤＮＡ配列におけるＳＤ様配列の抑制を、下記のオリゴヌクレオチドプライマー：
−配列番号：７：ｍｕｔｌＬ７５′
５′ＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＴＡＡＡＧ
Ｎｄｅｌ
ＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＴＡＣＧＡＧＴＣＣＧＴＴＣＴＧ３′
−配列番号：６：ＩＬ７３′
５′ＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡ３′
ＢａｍＨＩ
を使用して部位特異的突然変異誘発ＰＣＲにより行った。
【０１５２】
ＳＤ様配列の増幅及び抑制は、上記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して１つの工程により実現することができる。
【０１５３】
ＰＣＲ生成物を、臭化エチジウムの存在下にポリアクリルアミド又はアガロースゲル電気泳動及び紫外線照射により刺激されるＤＮＡバンドの蛍光による可視化によりアッセイした。ＩＬ−７ＰＣＲ断片に相当するサイズの１つの主要生成物バンドを単離しそしてＴＡ−クローニング法を使用してプラスミドベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）に挿入した。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。ポジティブクローンを選択するために、プラスミド．ミニプレプ．アイソレーション法（Plasmid Miniprep Isolation techniques)(Biorad）によりカナマイシン耐性の培養された個々のバクテリアクローンから調製されたプラスミドＤＮＡを制限マッピングにより分析しそして配列決定プライマーとしてｐＣＲＩＩＴＯＰＯユニバーサルプライマー（Invitrogen）を使用して非対称ＰＣＲ生成物ＤＮＡのジデオキシ配列決定（Sanger et al.; 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; 74: 5463-5467）により確認した。
【０１５４】
ＭｅＴ−ヒトＩＬ−７ポリペプチドをコードする最終発現ベクターを構築するために、ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで消化し、そして得られる断片、ｒ−ｈＩＬ−７コードＤＮＡ配列をｐｔａｃベクターのＢａｍＨＩ制限部位とＮｄｅｌ制限部位との間に挿入した。
【０１５５】
この発現プラスミドは、ｐＢＲ３２２由来の古典的ｐＥＴベクターにおいて、Ｔ７プロモーターをｔａｃプロモーターにより置き換えることにより構築された。この目的で、マトリックスとしてｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ（Biolabs）及びオリゴヌクレオチド：
配列番号：９：ｐｔａｃ１
５′ＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴ３′
ＢｇＩＩＩ
配列番号：１０：ｐｔａｃ２
５′ＡＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧ
ＸｂａＩ
３′
を使用してｔａｃプモーターを最初に増幅した。
【０１５６】
得られるＰＣＲ断片をアガロースゲルにローディングしてその正しいサイズをチェックした。次いで、それをＢｇＩＩＩ及びＸｂａＩにより消化しそして同じ酵素により加水分解されたｐＥＴ９ａ（Novagen）に挿入した。得られるライゲーション生成物をＴＯＰ１０（Invitrogen）コンピテント細胞中に形質転換させそしてそれらのカナマイシン耐性に基づいて選択した。次いで得られるｐｔａｃベクターをいくつかの酵素による消化及び配列決定プライマーとしてオリゴヌクレオチドｐｔａｃ１及びｐｔａｃ２を使用する配列決定分析によりチェックした。
【０１５７】
ｒ−ｈＩＬ−７断片を含有するライゲーション生成物をＴＯＰ１０コンピテント細胞中に形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、ベクターに保有された抗生物質（カナマイシン）耐性マーカー遺伝子に基づいた。ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを培養した細胞から単離し、制限マッピングにより選択しそして配列決定プライマーとしてｐＥＴユニバーサルプライマー（Novagen）及びｐｔａｃ特異的プライマー：
配列番号：１１：ｐｔａｃプロモータープライマー
５′ＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡ３′
を使用する配列決定分析により正しいＤＮＡ配列が確認された。
【０１５８】
ｐｔａｃ−ｈＩＬ−７（図１参照）と呼ばれる、配列番号１を含む大腸菌最終発現プラスミドを大腸菌ＪＭ１０１細胞（ＡＴＣＣ）にサブクローニングした。
１．２  サルＩＬ−７コードヌクレオチド配列の構築
ａ）５′領域を含むサルＩＬ−７ｃＤＮＡの増幅及び配列決定
サル（アカゲザル（Macaca Mulatta Rheusus monkey））ＩＬ−７コードｃＤＮＡ配列は、ＰＣＲ増幅（Mullis et al.; 1987; Methods in Enzymology; 155: 335-350）を使用してアカゲザル腎臓ｃＤＮＡ（BioChain Inc）から得られた。基本的ストラテジーは、ヒトＩＬ−７ｃＤＮＡを増幅するのに使用した特定のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５：ＩＬ７５′及び配列番号６：ＩＬ７３′）によるＰＣＲによりサルＩＬ−７ｃＤＮＡを増幅することであった。ゲル電気泳動で１つのバンドが現れた（図６参照）。非対称ＰＣＲｓ及び配列決定はサルＩＬ−７配列を得ることを可能とする。ヒト及びサルＩＬ−７ＤＮＡ及びアミノ酸配列間の配列相同分析は、それぞれ、ＤＮＡ（図４参照）配列で９８．１%の相同性−同一性、及びアミノ酸（図５参照）配列で９６．６%の相同性−同一性を示した。
【０１５９】
ｂ）サルＩＬ−７コードヌクレオチド配列の構築
ヒトＩＬ−７配列と同様に、サルＩＬ−７コードＤＮＡ配列は、「ＡＴＧ」開始コドンの後の位置４９に、大腸菌における第２開始コドンとして挙動することができる第２推定「ＡＴＧ」を与える。何故ならば、この第２「ＡＴＧ」は、「擬シャイン・ダルガノ」配列（リボソーム結合配列）により先行されるからである。ｒ−ｓＩＬ−７のアミノ末端トランケーションされた形態（amino-terminal truncated form）の生成の可能性を回避するために、「ＳＤ様」配列のヌクレオチドのいくらかを然変異させ（得られるコードされたｒ−ｓＩＬ−７アミノ酸配列を修飾することなく）、それにより大腸菌細胞中での発現のための１つ又はそれより多くの好ましいコドン（１つ又は複数）が含有する改良されたメチオニル−ＩＬ−７コードＤＮＡ配列を生成させた。
【０１６０】
ＳＤ様配列を欠いたサルＩＬ−７コードＤＮＡ配列の増幅を、オリゴヌクレオチドプライマー：配列番号７：ｍｕｔｌＬ７５′及び配列番号６：ＩＬ７３′を使用して部位特異的突然変異誘発ＰＣＲにより行った。
【０１６１】
ＰＣＲ生成物を、臭化エチジウムの存在下にポリアクリルアミド又はアガロースゲル電気泳動及び紫外線照射により刺激されるＤＮＡバンドの蛍光による可視化によりアッセイした。ＩＬ−７ＰＣＲ断片に相当するサイズの１つの主要生成物バンド（図７参照）を単離しそしてＴＡ−クローニング法を使用してプラスミドベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）に挿入した。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。ポジティブクローンを選択するために、プラスミド．ミニプレプ．アイソレーション法によりカナマイシン耐性の培養された個々のバクテリアクローンから調製されたプラスミドＤＮＡを、制限マッピングにより分析しそして配列決定プライマーとしてｐＣＲＩＩＴＯＰＯユニバーサルプライマー（Invitron）を使用して非対称ＰＣＲ生成物ＤＮＡのジデオキシ配列決定（Sanger et al.; 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; 74: 5463-5467）により確認し、約７００塩基含有ｓＩＬ−７配列を得た。
【０１６２】
ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＮｄｅｌで消化し、そして得られる断片、ｒ−ｓＩＬ−７コードＤＮＡ配列を、やはりＢａｍＨＩ制限部位とＮｄｅｌ制限部位で消化された実施例１．１に記載されたｐｔａｃベクターに挿入した。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０コンピテント細胞中に形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、ベクターに保有された抗生物質（カナマイシン）耐性マーカー遺伝子に基づいていた。ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを培養した細胞から単離し、制限マッピングにより選択し、そして一方ではＴ７ターミネーターユニバーサルプライマーをそして他方では配列決定プライマーとしてｐｔａｃプロモータープライマーを使用する配列決定分析により確認した。
【０１６３】
ｐｔｃａ−ｓＩＬ７ｏｐｔ（図２参照）と呼ばれる、配列番号１2を含む大腸菌最終発現プラスミドを大腸菌ＪＭ１０１細胞中にサブクローニングした。
【０１６４】
Ａ２．哺乳動物発現（ＢＨＫ細胞発現又はＣＨＯ細胞発現又はＨＥＫ−２９３細胞発現）：
対象：天然ＩＬ−７ペプチドシグナルに５′端部で連結されたＩＬ−７ｃＤＮＡ断片のｃＤＮＡの一部を増幅する試みにおけるプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトＩＬ−７コードｃＤＮＡ配列を、ヒト胎盤ｃＤＮＡ（BioChain Inc）からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Mullis et al.;  1987; Methods in Enzymology; 155: 335-350）により増幅した。
【０１６５】
制限エンドヌクレアーゼ認識配列及びコザック配列を含有する下記のオリゴヌクレオチドを使用した：
−配列番号８：ＰＳＩＬ７５′
５′ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＡＧＧＴＡＴ
ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋｏｚａｋ配列
ＡＴＣＴＴＴＧＧＡＣ３′
−配列番号６：ＩＬ−７３′
５′ＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡ３′
ＢａｍＨＩ
【０１６６】
ＰＣＲ生成物を、臭化エチジウムの存在下のポリアクリルアミド又はアガロースゲル電気泳動及び紫外線照射により刺激されるＤＮＡバンドの蛍光による可視化（図8参照）によりアッセイした。「ｈＰＳＩＬ−７ｃＤＮＡ」と命名されたＩＬ−７ＰＣＲ断片に相当するサイズの生成物バンドを単離しそしてＴＡ−クローニング法を使用してプラスミドベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）に挿入した。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０コンピテント細胞中に形質転換した。ポジティブクローンを選択するために、プラスミド．ミニプレプ．アイソレーション法（Biorad）によりアンピシリン耐性の培養された個々のバクテリアクローンから調製されたプラスミドＤＮＡを、制限マッピングにより分析しそして配列決定プライマーとしてｐＣＲＩＩＴＯＰＯユニバーサルプライマーを使用して非対称ＰＣＲ生成物ＤＮＡのジデオキシ配列決定（Sanger et al.; 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; 74: 5463-5467）により確認した。
【０１６７】
ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、そして得られる断片、「ｈＰＳＩＬ−７  ｃＤＮＡ」断片を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で消化されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターポリリンカー（Invitron）に挿入した。このベクターはクローンの選択及び増幅のための遺伝子を含む。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０コンピテント細胞中に形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、ベクターに保有された抗生物質（アンピシリン）耐性マーカー遺伝子に基づいていた。ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを培養された細胞から単離し、制限マッピングにより選択し、そして配列決定プライマーとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ユニバーサルプライマー（Invitrogen）を使用する配列決定分析により確認した。発現系は、天然のヒトＩＬ−７遺伝子配列の翻訳から予想されるＩＬ−７タンパク質を発現するようにデザインされた。組換えベクター含有細胞の選択はベクターに保有された抗生物質（大腸菌中のクローニングにはアンピシリン、そして哺乳動物細胞中の発現にはネオマイシン）耐性マーカー遺伝子に基づいてなされた。
【０１６８】
配列番号３を含む哺乳動物（ＨＥＫ−２９３、ＣＨＯ又はＢＨＫ）発現ベクターはｐｃＤＮＡ−ｈＰＳＩＬ−７と呼ばれる（図３参照）。ＨＥＫ−２９３又はＣＨＯトランスフェクションされた細胞中でのヒトＩＬ−７の発現は、発現ベクターｐｃＤＮＡ−ｈＰＳＩＬ−７を使用して達成された。ＢｇｌＩＩによる線状化の後、発現ベクター、ｐｃＤＮＡ−ｈＰＳＩＬ−７を、当業者に知られている方法を使用して哺乳動物宿主細胞中にトランスフェクションした。安定な形質転換細胞を確立するために使用された選択性マーカーはＧ４１８（Invitrogen）であった。
【０１６９】
Ａ３．誘導性哺乳動物発現（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−２９３、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−ＨｅＬａ、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−ＣＨＯ、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−Ｊｕｒｋａｔ細胞系）：
ヒトＩＬ−７コードｃＤＮＡ配列を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによる消化によりｐｃＤＮＡ−ｈＰＳＩＬ−７から単離した。得られる「ｈＰＳＩＬ−７  ｃＤＮＡ」断片をアガロースゲルで精製し、そして同じ酵素で加水分解されたｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Invitrogen）に挿入した。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０Ｆ′コンピテント細胞（Invitrogen）中に形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、ベクターに保有された抗生物質（アンピシリン）耐性マーカー遺伝子に基づいていた。ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを培養された細胞から単離し、制限マッピングによりチェックし、そしてユニバーサルＣＭＶフォーワードプライマー及びＢＧＨリバースプライマーを使用する配列決定分析により確認した。
【０１７０】
発現系は、テトラサイクリン又は類似物による誘導の後、天然のヒトＩＬ−７遺伝子配列の翻訳から予想されるＩＬ−７タンパク質を発現するようにデザインされた。
【０１７１】
組換えベクター含有細胞の選択はベクターに保有された抗生物質（大腸菌中のクローニングにはアンピシリン、そして哺乳動物細胞中の発現にはゼオシン）耐性マーカー遺伝子に基づいてなされた。
【０１７２】
誘導性哺乳動物発現ベクターはｐｈＴ−ＰＳＩＬ７ｈと呼ばれる（図１４参照）。ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−２９３、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−ＨｅＬａ、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）−ＣＨＯ又はＴ−ＲＥＸ（登録商標）−Ｊｕｒｋａｔトランスフェクションされた細胞中でのヒトＩＬ−７の発現は、発現ベクターｐｈＴ−ＰＳＩＬ７ｈを使用して達成された。ＰｖｕＩによる線状化の後、発現ベクターｐｈＴ−ＰＳＩＬ７ｈを、当業者に知られている方法を使用して哺乳動物宿主細胞中にトランスフェクションした。安定な形質転換細胞を確立するために使用された選択性マーカーはゼオシン（Invitrogen）であった。
【０１７３】
第一選択の後、細胞におけるＰＳＩＬ７配列コピー数を高めるために、安定なクローンは同じプラスミド又は同じ種類のプラスミド（選択マーカーにより異なる）：ｐｃＤＮＡ５／ＴＯに挿入されたＰＳＩＬ７（Invitrogen）、により再トランスフェクションされた。
【０１７４】
Ａ４．Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ又はＣＨＯ細胞におけるアデノウイルスを介する一過性哺乳動物発現
ＥｃｏＲＶとＭｌｕＩ制限部位間の問題のｃＤＮＡ（その天然のペプチドシグナルに連結されたＩＬ−７ｃＤＮＡ）を増幅する試みにおいてプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトＩＬ−７コードｃＤＮＡ配列を、ｐｃＤＮＡ−ｈＰＳＩＬ−７からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Mullis et al.;  1987; Methods in Enzymology; 155: 335-350）により増幅した。
【０１７５】
下記のオリゴヌクレオチドを使用した：
【表１】
2010115203.tif 000002
−配列番号１４：ＰＳＩＬ７ＥｃｏＲＶ５′
５′ＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＡＧＧＴＡ３′
ＥｃｏＲＶ
−配列番号１５：ＰＳＩＬ７ＭｌｕＩ３′
【表２】
2010115203.tif 000003
【０１７６】
生成物を臭化エチジウムの存在下のアガロースゲル電気泳動及び紫外線照射により刺激されるＤＮＡバンドの蛍光による可視化によりアッセイした。ｈＰＳＩＬ−７ｃＤＮＡの予測されたサイズに相当する得られる生成物バンドを単離しそしてＴＡ−クローニング法を使用してプラスミドベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）に挿入した。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０Ｆ′コンピテント細胞中に形質転換した。ポジティブクローンを選択するために、培養された個々のバクテリアクローンから調製されたプラスミドＤＮＡミニプレパレーション（Biorad）を制限マッピングにより分析しそしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯユニバーサルプライマーを使用するジデオキシ配列決定（Sanger et al.; 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; 74: 5463-5467）により確認した。
【０１７７】
ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ及びＭｌｕＩで消化した。得られる「ｈＰＳＩＬ−７  ｃＤＮＡ」断片をｐＡｄｅｎｏＶａｔｏｒ−ＣＭＶ５（ＣｕＯ）（Q biogene）に挿入しそして同じ酵素で加水分解した。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０Ｆ′コンピテント細胞（Invitrogen）中に形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、ベクターに保有された抗生物質（カナマイシン）耐性マーカー遺伝子に基づいていた。ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを培養された細胞から単離し、制限マッピングにより選択し、そして下記のプライマーを使用する配列決定分析により確認した。
−配列番号１６：ｐＣＭＶ５
５′ＣＡＣＴＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣ３′
−配列番号１７：ｐＳＶ４０ｐｏｌｙＡ
５′ＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴ３′
【０１７８】
組み換えアデノウイルスベクターの構築のために、得られたｐＡＶｃ−ＰＳＩＬ７ｈ（図１５参照）をＰｍｅＩにより線状化し、アガロースゲルで精製しそしてＢＪ５１８３コンピテント細胞（Q Biogene）中にｐＡｄｅｎｏＶａｔｏｒΔＥ１／Ｅ３と共に共形質転換した。組み換えプラスミド含有細胞の選択は、ベクターに保有された抗生物質（カナマイシン）耐性マーカー遺伝子に基づいていた。ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを培養された細胞から単離し、制限マッピングによりチェックした。次いで組換えアデノウイルスベクターを、ＬＢ／カナマイシンプレート上にプレートされたＤＨ５αコンピテント細胞の形質転換及び細胞培養物からのＤＮＡのミディプレパレーション（Macherey Nagel）により増幅する。
【０１７９】
無菌のＰａｃＩ線状化組換えアデノウイルスＤＮＡ（ＡｄＶｃ−ＰＳＩＬ７ｈ  ＤＮＡ）を使用して、ＱＢＩ−２９３Ａ細胞、組換えアデノウイルスを補充しそして組換えウイルス粒子を産生するのに有効な細胞、をトランスフェクションする。
【０１８０】
Ａ５．ＩＬ−７及びＢｃＩＸＬの哺乳動物共発現（ＢＨＫ細胞発現又はＣＨＯ細胞発現又はＨＥＫ−２９３細胞発現）
ヒトＩＬ−７コードｃＤＮＡ配列を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによる消化によりｐｃＤＮＡ−ｈＰＳＩＬ−７から単離した。得られる「ｈＰＳＩＬ−７  ｃＤＮＡ」断片をアガロースゲルで精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ  制限部位で消化されたｐＢｕｄＣＥ４．１ベクター（Invitrogen）に、ｐＣＭＶプロモーターの下流で挿入した。
【０１８１】
ヒトＢｃｌＸＬコードｃＤＮＡ配列を、プライマーとして下記のオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトＲａｊｉリンパ腫細胞ｃＤＮＡ（Clontech）からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Mullis et al.;  1987; Methods in Enzymology; 155: 335-350）により増幅した。
−配列番号１４：ＢｃｌＸＬ５′ＮｏｔＩ
５′ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＧＧ３′
ＮｏｔＩ
−配列番号１５：ＢｃｌＸＬ３′ＢｓｔＢＩ
５′ＡＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＴＣＣＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴＧ３′
ＢｓｔＢＩ
【０１８２】
ＰＣＲ生成物を、臭化エチジウムの存在下にポリアクリルアミド又はアガロースゲル電気泳動及び紫外線照射により刺激されるＤＮＡバンドの蛍光による可視化によりアッセイした。ＢｃｌＸＬ  ＰＣＲ断片に相当するサイズの生成物バンドを単離しそしてＴＡ−クローニング法を使用してプラスミドベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）に挿入した。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０コンピテント細胞中に形質転換した。ポジティブクローンを選択するために、プラスミド．ミニプレプ．アイソレーション法（Ｂｉｏｒａｄ）により培養された個々のアンピシリン耐性バクテリアクローンから調製されたプラスミドＤＮＡを制限マッピングにより分析しそして配列決定プライマーとしてｐＣＲＩＩＴＯＰＯユニバーサルプライマーを使用して非対称ＰＣＲ生成物ＤＮＡのジデオキシ配列決定（Sanger et al.; 1977; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; 74: 5463-5467）により確認した。
【０１８３】
ポジティブクローンからのプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ及びＢｓｔＢＩにより消化しそして得られる断片を、ＮｏｔＩ及びＢｓｔＢＩ制限部位で消化されたｐＢｕｄＣＥ４．１−ｈＰＳＩＬ−７ベクターに、ｐＥＦ１αプロモーターの下流で  挿入した。
【０１８４】
配列番号３、１６又は１８を含む得られる哺乳動物（ＨＥＫ−２９３、ＣＨＯ又はＢＨＫ）発現ベクターはｐＢｕｄ−ｈＰＳＩＬ−７−ＢｃｌＸＬと呼ばれる（図１７参照）。
【０１８５】
実施例Ｂ．組換えＩＬ−７を産生する大腸菌の醗酵
組換え（ヒト又はサル）ＩＬ−７の産生のための醗酵を、実施例Ａ１に記載の発現プラスミドｐｔａｃ−ｈＩＬ−７又はｐｔａｃ−ｓｌＬ７ｏｐｔで形質転換された大腸菌ＪＭ１０１宿主株を使用して８０リットルの醗酵槽（New Brunswick）で行った。
【０１８６】
接種培養物１Ｌをバッチ培地ＮＲＪ18（ｐＨ7）50Ｌを含有する醗酵槽に無菌で移した。培養物をバッチ方式で増殖させた（温度３７℃、攪拌：１００〜５００rpm Ｄ．Ｏ２：３０%）。醗酵の産生相は、Ｄ．Ｏ２が０%に達した後培養物のＯＤ−６００が約４０になるまでＩＰＴＧ（２００mg/L）により誘導された。醗酵槽内容物を集めそして少なくとも３０分間冷却して２０℃以下の温度に到達させた。７０μmフィルター（ＰＡＬＬ  ＲＩＦ−７００）を使用して培養培地をろ過して沈殿を除去し、そして４℃で３０分間５０００ｇでの遠心（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ６）により細胞を収穫した。
【０１８７】
誘導性クローンでは、１０日間の培養の期間中、細胞は毎日灌流反応器から取り去られそしてバッチ反応器においてテトラサイクリンにより誘導される。
【０１８８】
実施例Ｃ．組換えｈＩＬ−７を産生するＨＥＫ−２９３細胞の醗酵
最善の安定なポジティブクローンを、実施例Ａ２における如く、いくつかの培地スクリーニングにより血清なしの懸濁培養に適合させて、高い細胞密度培養における生産性及び増殖のために最適化されたクローンを産生させた。灌流システムを備えた３リットルのバイオリアクター中で細胞培養を行った。細胞を１０百万／mlの濃度に増殖させた。反応器を約３Ｌ／日の連続灌流速度で１０日間操作した。組換えタンパク質を含有するおおよそ３０Ｌの血清なしの培養培地を発生させそしてｒ−ｈＩＬ−７の精製のための出発物質として使用した。
【０１８９】
実施例Ｄ．大腸菌中で発現された組換えＩＬ−７生成物の精製
収穫された細胞を、実施例Ｂにおける如く、トリス２０mM／ＥＤＴＡ１０mM緩衝液（ｐＨ８）中に懸濁させそして４℃で４５分間１６９００ｇで遠心した。2回引き続く洗浄／遠心サイクルの後、封入体画分を回収した。
【０１９０】
この封入体画分を希釈して５〜６mg/mlのタンパク質濃度を得そして可溶化緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩−１mMＥＤＴＡ−１%ｂ−メルカプトエタノール−０．５%ＤＭＤＡＰ−１０mMリン酸ナトリウム−ｐＨ８）中に可溶化して、タンパク質の完全な還元、変性及び可溶化を与えた。溶液をリン酸ナトリウム緩衝液６．２５mM中に１．６倍希釈しそして１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７に調節した。グアニジン塩酸塩の最終濃度は５Ｍに達した。
【０１９１】
可溶化された封入体を予備ろ過し、次いでローディング緩衝液（６．２５mMリン酸ナトリウム−５Ｍグアニジン塩酸塩−１．７Ｍ硫酸アンモニウム−ｐＨ７）と平衡化させたＨＩＣ  Ｂｕｔｙｌ６５０Ｍ（Toso haas）カラムにローディングした。サンプルを適用しそして同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、溶離緩衝液（６．２５mMリン酸ナトリウム−５Ｍグアニジン塩酸塩、ｐＨ７）１００%で一工程で溶離を行った。すべての画分を集め、プールし、そして６．２５mMリン酸ナトリウムｐＨ７、５Ｍグアニジン塩酸塩緩衝液中に希釈することによりＯ．Ｄ．２８０＝０．５に調節した。この工程期間中、種々の汚染物、中でもその後のリフォールディング工程の回復（recovery）を低下させるＤＮＡを除去した。リフォールディング緩衝液中への希釈によりＩＬ−７を再生させ：ＨＩＣからのプールされた画分を、８３．３mMトリス緩衝液、０．１６%ツイーン８０、０．５MＬ−アルギニン、０．１６６mM酸化グルタチオン及び１．６mM還元グルタチオンｐＨ８．５中に２．５倍希釈した。受容緩衝液を攪拌しながら、２時間の期間にわたり、線形方式で希釈プロセスを行った。再生工程は固体支持体上で固定して行うことができた。
【０１９２】
再生されたＩＬ−７を、膜ろ過又は溶離緩衝液（２０mMリン酸ナトリウム、０．２ＭＬ−アルギニン、ｐＨ７）と平衡化されたＧ２５セファデックス（Pharmacia）カラムに２回でローディングしそして溶離してその後のアフィニティー支持体に対するｒ−ＩＬ−７の適切なローディングを可能とした。
【０１９３】
Ｇ２５工程から得られたタンパク質ピークを、ローディング緩衝液（２０mMリン酸ナトリウム、５０mM塩化ナトリウム、ｐＨ７）と平衡化されたヘパリン．セファロース．ファスト．フロー（Heparin Sepharose Fast Flow）（Pharmacia）カラムにローディングした。サンプルを適用しそしてローディング緩衝液によるカラムの洗浄の後、二工程で溶離を行った。最初に、２５%の溶離緩衝液（２０mMリン酸ナトリウム、１M塩化ナトリウム、ｐＨ７）／ローディング緩衝液の一定の比を２０カラム容積に対して適用した。次いで、リフォールディングされたＩＬ−７を６０%の溶離緩衝液／ローディング緩衝液で一工程で溶離した。この工程の強い選択性は正しくリフォールディングされたｒ−ＩＬ−７コンホーマーの溶離をもたらした。
【０１９４】
内毒素を含む残留不純物の大部分を除去するために、画分をｐＨ５に調節し、そしてカルボキシメチル．セラミック（Carboxymethyl Ceramic）（BioSepra）カラムに付した。ＣＭＣカラムをローディング緩衝液（５０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ５）と平衡化させた。サンプルを適用しそして洗浄緩衝液（５０mM酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム０．２Ｍ、ｐＨ６）によるカラムの洗浄の後、緩衝液（５０mM酢酸ナトリウム、０．８Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６）で一工程で溶離を行った。仕上げ工程は、脱塩のためのＧ２５セファデックス精製工程、続いてＱセファロース．ファスト．フロー（Q Sepharose Fast Flow）（QFF Pharmacia）も含むことができ、これは種々の残留汚染物を保持した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：クーマシーブルーで着色し及び銀で染色する、を示す図９に示されたとおりフロースルー（flow through）において不純物なしにＲ−ＩＬ−７薬物原料を回収した。
【０１９５】
実施例Ｅ．ＨＥＫ−２９３細胞で発現された組み換えヒトＩＬ−７生成物の精製
実施例Ｃで報告された発現系ＨＥＫ−２９３−ｐｃＤＮＡ−ｈＰＳＩＬ−７の増殖により発生した粗細胞培養流体を、従来の方法又はストリームラインイオン交換法を使用して処理した。
【０１９６】
ストリームライン法では、粗細胞培養流体を、醗酵槽からストリームラインイオン交換又はヘパリン、又はスルホプロピル（ＳＰ）又は
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）の拡大した床に移し、次いでＩＥＸ及びＨＩＣの組み合わせに移す。仕上げ工程はろ過及び濃縮を含むことができる。従来の方法では、ろ過と濃縮［マイクロフィルトレーション（０．４５μm）限外ろ過／ダイアフィルトレーション］工程の組み合わせを使用して粗細胞培養流体を清澄化して生成物を単離した。得られるタンパク質溶液を、種々の組み合わせにおけるイオン交換組み合わせ及びヘパリン．セファロース［ファスト．フロー（Pharmacia）カラム］にローディングして生成物を精製した。
【０１９７】
仕上げ工程は、残留不純物除去するための疎水性相互作用交換（Hydrophobic Interaction Exchange（ＨＩＣ）及びろ過／限外ろ過（ＵＦ）又はカルボキシメチル．セラミック（BioSepra）精製工程、次いで脱塩するためのＧ２５セファデックス精製工程、次いで種々の残留汚染物を保持したＱ  セファロース．ファスト．フロー（QFF Pharmacia）を含むこともできる。Ｒ−ＩＬ−７薬物原料は最後の精製工程のフロースルーにおいて不純物なしに回収された。
【０１９８】
実施例Ｆ．生成物制御及び仕様
Ｆ１．薬物原料制御及び仕様
【表３】
2010115203.tif 000004
【０１９９】
Ｆ２．実施例ロットＸｒ−．ｈＩＬ−７バッチ結果
【表４】
2010115203.tif 000005
【０２００】
このコンホーマーの特徴付け及び構造の証明は、アミノ酸分析、トリプシン消化後のペプチドマッピング、アミノ末端部の配列、分子量の質量分析法（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ）コントロール、ジスルフィド架橋の質量分析法コントロール及びタンパク質プロフィル：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、カチオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣによる、を含んでいた。
【０２０１】
Ｆ３．ペプチドマッピング
ペプチド配列はｒ−ｈＩＬ−７トリプシン消化の予想される配列と合致した。
【表５】
2010115203.tif 000006
【０２０２】
Ｆ４．質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：タンパク質分子量
１つの電荷を有するタンパク質の平均質量（Ｍ＋Ｈ）＋。測定は１７５１８．４Ｄａの理論値に対して１７５１７．６Ｄａの分子量を与えた。
【０２０３】
Ｆ．質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：スルフヒドリル基
１回帯電されたモノアイソトピックペプチドの質量（Ｍ＋Ｈ）＋
【表６】
2010115203.tif 000007
【０２０４】
実施例Ｇ．組換えＩＬ−７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物学的活性アッセイ
大腸菌中で発現され（実施例Ａ１）、実施例Ｄにおける如く精製されそして特徴付けされた哺乳動物（ヒト及びサル）ＩＬ−７をアッセイしそしてＣＢＡ／Ｃ５７ＢＬマウスからの骨髄細胞由来の細胞系、プレＢ細胞系ＰＢ１（DSMZ, Deutsche Sammulung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Brawnschweig, Germany）と名づけられたＩＬ−７依存性細胞系の増殖を刺激するそれらの能力についてマウスＩＬ−７（R&D System）と比較した。
【０２０５】
部分変性工程を使用する精製プロセスから発生された、又は脱アミド化された形態もしくは二量体形態約２０%を発生させるために化学的に処理された精製されたｒ−ＩＬ−７により発生された、不純物を含んだヒト及びサルｒ−ＩＬ−７をアッセイした。
【０２０６】
ＰＢ−１細胞系は連続した成長及び生存性について外因性ＩＬ−７ＩＰに完全に依存している。これらの培養された細胞系へのｒ−ＩＬ−７の添加は、用量依存性増殖を刺激して、存在するｒ−ＩＬ−７のレベルの定量的決定を可能とする。増殖の量はトリチウム化されたチミジン３Ｈ−ＴｄＲで３７℃で４時間各マイクロウエルを「パルシングする」ことにより測定した。プレＢ細胞を分裂させると、３Ｈ−ＴｄｒをそれらのＤＮＡに取り込むであろう。次いで各ウエルからの細胞は、ＤＮＡをトラップするガラス繊維フィルターディスク上に収穫される。特異的に結合した放射能の量を液体シンチレーションカウンターで測定する。各ウエルについてカウント／分（ｃｐｍ）の数は、ＩＬ−７に応答して活性化されたプレＢ細胞による増殖の量に直接比例している。
【０２０７】
すべてのＩＬ−７タンパク質は、図１０に示されたとおりネズミプレＢ細胞に対して活性であった。
【０２０８】
実施例Ｈ．血清中の組換えＩＬ−７に対する抗体の検出のためのアッセイ
ヒト組換えＩＬ−７は、サルのモデルに対して異種でありそして組換えヒトＩＬ−７コンホーマー（上記した如き）に対する中和抗体を誘発することができる。これらの抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抑制剤として機能することができそして薬物原料の免疫抑制治療効果に寄与することができる。これに基づいて、純粋な（本発明に記載の）ｒ−ｈＩＬ−７又はｒ−ｓＩＬ−７又は次の実施例に記載された「不純物を含んだ」（"impure"）ｒ−ｓＩＬ−７で処理された動物の血清及び血漿において抗ＩＬ−７抗体を調べた。
【０２０９】
体液中の抗体の検出に使用された方法は、サイトカインバイオアッセイ、イムノメトリックアッセイ（immunometric assay）、ラジオリガンドアッセイ及び種々のブロッティング技術を含むことができる。
【０２１０】
抗ｒ−ＩＬ−７抗体の血漿定量は、ＥＬＩＳＡ技術を使用して達成されそして抗ｒ−ＩＬ−７抗体の血清学的検出はウエスタンブロット法を用いて達成された。これらの技術は当業者には知られている。
【０２１１】
Ｈ１．ＥＬＩＳＡ法
ＥＬＩＳＡストリッププレートを０．７５μg/mlのツイーンを含有するブロッキング緩衝液中に希釈されたｒ−ＩＬ−７（ヒト又はサル）でコーティングした。４℃で一夜インキュベーションした後、プレートの飽和を室温で１時間ブロッキング緩衝液で行った。すべての溶液を除去しそしてプレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、プレートをアッセイに使用する用意をした。
【０２１２】
予備免疫及び免疫血漿の逐次希釈を行いそしてウエルに分配した。プレートを３７℃で１時間インキュベーションした。ポジティブコントロール（ビオチニル化されたＩＬ−７抗体）及びネガティブコントロール（プラシボサルの血清）も特定のウエルにおいて試験した。次いでプレートを洗浄緩衝液により洗浄し、そして血清及びネガティブコントロールについてはブロッキング緩衝液／ツイーン中に希釈されたＩｇＧサル−ＨＲＰで３０分間室温でインキュベーションした。ポジティブコントロールウエルをブロッキング緩衝液／ツイーン中のストレプトアビジンＨＲＰとインキュベーションした。溶液を除去した後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄しそしてＯＰＤ基質溶液と１５分まで室温でインキュベーションし、続いて各ウエルに硫酸を加えて反応を停止させた。
次いで、吸光度を４９２nmで読み取った。
【０２１３】
Ｈ２．ウエスタンブロット法
組換え（ヒト又はサル）ＩＬ−７をニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜に移した。次いで膜を処理された動物の血清（１／１００又は１／２００の希釈率）インキュベーションし、又はポジティブコントロールについては抗ＩＬ−７抗体（抗ヒトＩＬ−７抗体：ＡＢ２０７  ＮＡ、Ｒ＆Ｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）とインキュベーションした。溶液を除去した後、膜を洗浄しそして二次抗体：抗サルＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＳＩＧＭＡ  Ａ１９２９）と、又はポジティブコントロールについては抗ヤギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＳＩＧＭＡ  Ａ４１８７）とインキュベーションした。次いで、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＳＩＧＭＡ）を使用して顕色（revelation）を行った。
【０２１４】
実施例Ｌ．正常な非ヒト霊長類におけるＣＤ４Ｔ細胞数値に対するｒ−ＩＬ−７のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
大腸菌中で発現され（実施例Ａ１）、実施例Ｄにおける如く精製されそして特徴付けされた組換えＩＬ−７（ヒト及びサル）及び「不純物を含んだ」ｒ−ｓＩＬ−７（実施例Ｇで定義された）を正常な霊長類におけるｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性について試験した。この霊長類モデルは、薬物原料のａ）長期活性及び分子変異体及び／又は医薬生成物関連不純物で汚染された同じ薬物原料の免疫原性を試験するための唯一の可能なモデルであった。げっ歯類で同じ効果を試験しても結論は出ないであろう。何故ならば、第一に、げっ歯類配列は霊長類配列に比べて重要な欠失を示し、第二に、げっ歯類においては、ＩＬ−７はＢ細胞に対して強いリンパ球生成効果を有し、これはＴ細胞リンパ球生成効果をマスクしやすい又はこの効果の明らかに特徴的な分析を妨害しやすいからである。この理由で、ヒトにおける免疫原性製剤の非倫理的な試験を回避しながら、霊長類における効果を証明するために、我々はサルＩＬ−７をクローニングし、発現しそして精製しそしてそれをサルにおいて試験しなければならなかった。
【０２１５】
若いアカゲザル（Young Macaca rhesus monkeys）を４つのグループ（１〜４）において調べた。各グループは３匹の動物を含んでいた。
●  グループ１のサルはプラシボ（ＩＬ−７希釈剤）を受け取った。
●  グループ２のサルは、皮下注射により一日１回投与される１５０μg/kgの用量で４週間ｒ−ｈＩＬ−７（本発明に記載の）を受け取った。
●  グループ３のサルは、皮下注射により一日１回投与される１５０μg/kgの用量で４週間ｒ−ｓＩＬ−７（本発明に記載の）を受け取った。
●  グループ４のサルは、１５０μg/kgの用量レベルで「不純物を含んだ」ｓ−ｒＩＬ−７の１日１回の皮下投与を４週間受け取った。
すべての動物を６週間：４週間の処理期間及び２週間の可逆性期間にわたり調べた。
【０２１６】
ＩＬ−７処理の前及び後（０日目（処理前）、７、１４、２１、２８、３５及び４２日目に）ケタミン抑制下に動物から末梢血標本を集めた。ＣＤ4細胞性（cellularity）をＦＡＣＳｃａｎ細胞分析システム（Becton Dickinson）で検査した。血清サンプルをウエスタンブロット分析により抗体の存在について検査しそして実施例Ｈに記載のごとくＥＬＩＳＡ分析により確認した。血液ＣＤ４Ｔ細胞数値を図１１に示す：各グループについて血液ＣＤ４Ｔ細胞数値の中央値として表される。
【０２１７】
すべての動物はこのプロトコールを生き残りそしてＩＬ−７治療に対する不利な反応なしにＩＬ−７投与を許容した。
【０２１８】
投与された種々のＩＬ−７は正常なサルの血液ＣＤ４Ｔ細胞数値に対する適度の効果を有していた：末梢血ＣＤ４Ｔ細胞数値は１４日から３５日まで１．４〜２．１倍増加しそして、プラシボグループに比較してグループ３（ｒ−ｓＩＬ−７で処理された）において４２日目に処理前の値より高く維持されており、そしてＣＤ４細胞性は、グループ２（ｒ−ｈＩＬ−７で処理された）及び４（「不純物を含んだ」  ｒ−ｓＩＬ−７製剤で処理された）では２週間から６週間までに増加し始め、次いで減少した。
【０２１９】
それぞれ「ｒ−ｈＩＬ−７及び不純物を含んだ」ｒ−ｓＩＬ−７を皮下注射により受け取った後第２週の期間中これらの２つのグループのサル（２及び４）の血清において抗ＩＬ−７抗体が検出された（図１２参照）。これらの正常なサルにおいて、異種又は不純物を含んだＩＬ−７薬物原料の反復した注射は、抗ＩＬ−７抗体の出現をトリガーしそして同時にこれはＩＬ−７リンパ球生成効果の強い減少を生じさせた。
【０２２０】
実施例Ｊ．照射されたサルにおけるｒ−ｓＩＬ−７のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
大腸菌中で発現され（実施例Ａ１）、実施例Ｄにおける如く精製されそして特徴付けされた組換えサルＩＬ−７及び「不純物を含んだ」ｒ−ｓＩＬ−７（実施例Ｇで定義された）を免疫抑制された霊長類における中又は長期間ｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性について試験した。若いアカゲザルを３つのグループ（１〜３）において調べた。各グループは３匹の動物を含んでいた。
【０２２１】
すべてのサルは全身照射を受けた（ＴＢ１）（6.１Ｇｙ）。
サルは下記の治療方式を受けた：
●グループ１はプラシボ（ＩＬ−７希釈剤）を受け取った。
●グループ２は、皮下注射により一日１回投与される７０μg/kgの用量で、ｒ−ｓＩＬ−７（本発明に記載の）を、照射後１４日目に開始して４週間受け取った。
●  グループ３は、７０μg/kgの用量レベルで「不純物を含んだ」ｒ−ｓＩＬ−７の１日１回の皮下投与を、照射後１４日目に開始して４週間受け取った。
【０２２２】
すべての動物を１０週間：即ち、照射後の血液学的回復期間の２週間、ＩＬ−７処理期間の４週間及び追跡期間の４週間にわたり調べた。
【０２２３】
処理前の０、７及び１４日、処理されている２１、２８、３５及び４２日、照射後の４９, ５６, ６３及び７０日にケタミン拘束下の動物からＣＤ４Ｔ細胞数値のために末梢血標本を集めた。
【０２２４】
ＣＤ4細胞性をＦＡＣＳｃａｎ細胞分析システム（Becton Dickinson）で検査しそして血清サンプルを実施例Ｈに述べたＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット法を使用して抗体の存在について検査した。
【０２２５】
すべての動物はこのプロトコールを生き残りそしてＩＬ−７治療に対する不利な反応を生じなかった。
【０２２６】
図１３に示されたとおり、ＩＬ−７投与は、未処理コントロールグループに比べてグループ２及び３の免疫が弱められたサルの末梢血中のＣＤ４Ｔ細胞を有意に（４．２倍）増加させた。「不純物を含んだ」ｒ−ｓＩＬ−７の皮下投与で処理されたグループ３は、ＩＬ−７処理の３〜４週間後に始まるＩＬ−７のｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的効果の減少を示す。
【０２２７】
ＩＬ−７処理の開始の後毎週これらの動物の血清中の抗ＩＬ−７抗体を測定した。ｒ−ｓＩＬ−７（本発明に記載の）で処理されたグループ２において１０週間（処理後８週間）まで抗ＩＬ−７抗体は検出されなかった。これに反して、不純物を含んだ製剤で処理されたグループ３は、６週間（ＩＬ−７処理開始後の４週間）たつやいなや検出可能な抗体を示した。１０週間では、抗体は明らかに存在しそして外因性ＩＬ−７はリンパ球生成効果を持たなかった。
【０２２８】
実施例Ｋ．正常なシノモルグスサルにおける薬力学的パラメーター及び総リンパ球数値に対する組換えヒトＩＬ−７のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
大腸菌中で発現され（実施例Ａ１）、実施例Ｄにおける如く精製されそして特徴付けされた組換えヒトＩＬ−７（ｒ−ｈＩＬ−７）を、薬力学的パラメーター及び正常なシノモルグスサルにおける総リンパ球数値に対するｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性について試験した。
【０２２９】
４匹の正常な雌のシノモルグスサルは１００μg/kgの用量レベルで可溶性ｒ−ｈＩＬ−７の皮下ボーラス一回の注射（subcutaneous bolus single injection）を受け取った。
【０２３０】
すべての動物を９６時間にわたり調べた。
【０２３１】
実験室調査（血液学及び免疫細胞表現型）を、ｒ−ｈＩＬ−７一回の注射の前及び注射後６、２４、４８、７２及び９６時間に行った。
【０２３２】
リンパ球サブセットの細胞性及び免疫表現型を、種々の組み合わせにおけるＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ１２７、Ｋｉ６７及びＢｃｌ２を含む高度に特異的な細胞表面抗体マーカーを使用するフローサイトメトリーにより検査した。
【０２３３】
リンパ球数値及び特異的マーカーの観察された変動を次の表及び図として示されたヒストグラムにおいて報告する。
【表７】
2010115203.tif 000008
【０２３４】
ｒ−ｈＩＬ−７の一回の注射の後：
−末梢血中のリンパ球数値、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの明らかな減少が６時間という早期にそして７２時間まで観察された。細胞数値は注射の約９６時間後ベースラインの値に戻った。末梢リンパ球数値のこの低下はＴリンパ球の血液からリンパ組織に向けての初期ＩＬ−７誘発輸送（early IL-7 induced trafficking）と合致している。
−末梢リンパ球によるＩＬ−７受容体α鎖（ＣＤ１２７）発現の著しいしかし一過性の減少が注射の後４８時間の期間観察され、これはＩＬ−７の一回の投与に応答するＩＬ−７受容体のダウンモジュレーションを反映する。ＣＤ１２７発現は４８時間に再び現れ始め、注射の９６時間後ベースラインの値に向けて戻った。
−細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７発現の遅延したしかし有意な増加が注射後７２／９６時間までＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方で観察された。
−アポトーシス抑制のマーカーであるＢｃｌ−２の遅延した増加が観察され、ＩＬ−７活性に関与していることが証明された。
【０２３５】
３つの後者のマーカーの変動は、ｒ−ｈＩＬ−７の一回の注射が、４８時間にわたり有意な効果をともなって、７２／９６時間まで検出可能なＴ細胞の応答を誘発したことを示す。末梢血リンパ球数値から評価されるとおり、細胞表現型のこれらの変化はＴ細胞ホーミングにより部分的にマスクされる。
【０２３６】
これらのデータから、ｒ−ｈＩＬ−７の一日一回の投与は最も適切な投与治療方式ではないと思われる。一日おき〜週一回がヒトのためのより適切な投与治療方式であると思われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年2月26日(2010.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−７コンホーマーを含む製薬学的組成物であって、該コンホーマーが、下記の３つのジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−４（Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２）；２−５（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９）及び３−６（Ｃｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１）を含み、該組成物が実質的にＩＬ−７分子変異体又は産生物関連不純物を含まず、そして該組成物中の該ＩＬ−７コンホーマーの総量がＩＬ−７の総量の少なくとも９８重量%である製薬学的組成物。
【請求項２】
該ＩＬ−７コンホーマーが組換えヒトＩＬ−７コンホーマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該ＩＬ−７コンホーマーが配列番号２又は４のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
該ＩＬ−７コンホーマーが組換えサルＩＬ−７コンホーマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
該ＩＬ−７コンホーマーが配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
該ＩＬ−７コンホーマーがグリコシル化されていない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
該ＩＬ−７コンホーマーがグリコシル化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
該ＩＬ−７コンホーマーがヘテロ二量体として肝細胞成長因子に会合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
該ＩＬ−７コンホーマーが、ペプチドヒンジ領域によってＩｇＧ重鎖のＦｃ部分に機能的に付着しており、該ＩｇＧがヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
該ＩＬ−７コンホーマーが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡの一部に融合タンパク質として機能的に会合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
別のＩＬ−７コンホーマーを実質的に含まない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
該組成物中の該ＩＬ−７コンホーマーの総量がＩＬ−７の総量の少なくとも９９．５重量%である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
スクロース、トレハロース及びアミノ酸から選ばれる製薬学的に適合性の担体をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
適当な緩衝液中に含有されて等張性溶液を形成する製薬学的に適合性の担体を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
該適当な緩衝液が５〜７．５、好ましくは６〜７、更に好ましくは６．５のｐＨ範囲を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
該適当な緩衝液がクエン酸ナトリウム緩衝液及び酢酸アンモニウム緩衝液から選ばれる有機塩である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
該組成物が凍結乾燥された形態である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
該組成物がタンパク質（好ましくはヒト血清アルブミン）及び／又は界面活性剤（好ましくはツイーン８０）を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
組み合わせて使用するため、別々に使用するため又は順次に使用するための、造血細胞成長因子、サイトカイン、抗原及びアジュバントから選ばれた免疫刺激剤、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
該造血細胞成長因子が幹細胞因子（ＳＣＦ）、特に溶解性形態のＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−１５及びＩＬ−２から選ばれる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
サイトカインがγインターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、Ｂ７−１、ＭＩＰ−２及びＭＩＰ−１αから選ばれる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
該抗原が、合成又は天然ペプチド、組み換えタンパク質、殺されたか、不活性化されたか又は弱毒化された病原生成物、脂質、これらの一部及びこれらの組み合わせから選ばれる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
該抗原がＨＩＶ、水痘帯状疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタイン−バールウイルス、１型又は２型単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、デングウイルス、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＥ型肝炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパピローマウイルス、結核菌、トキソプラズマ及びクラミジア由来の抗原から選ばれる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
該アジュバントが抗原の免疫原性を促進するか又は増加させそしてＴｈ１型免疫応答を誘発することができる任意の物質、混合物、溶質又は組成物、例えば、ＣｐＧ、ＱＳ２１、ＩＳＣＯＭ及びモノホスホリル脂質Ａから選ばれる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
ＢもしくはＴリンパ球発生及び増殖の予防的もしくは治療的刺激のため、包括的もしくは特異的免疫再構成の増強のため、又は液性もしくは細胞性免疫応答の増強のためにヒト患者に投与するための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項２６】
免疫不全患者の日和見感染を防止するか又は減少させるための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項２７】
ヒト患者において、リンパ球新生刺激を延長するため及び／又は特異的免疫応答を生じさせるため及び／又は特異的免疫応答のレパートリーを広げるための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
【請求項２８】
免疫不全患者、がん患者、移植片を受けている患者、ウイルス又は寄生虫に感染した患者、高齢患者又は低いＣＤ４数値を有するすべての患者であるヒト患者に使用するための、請求項２５、２６又は２７に記載の製薬学的組成物。
【請求項２９】
薬物原料の有効量が約３〜３００μg/kg/日、好ましくは１０〜１００μg/kg/日でありそして特に一日に一回から、一週二回又は三回、一週一回まで投与される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製薬学的組成物を製造する方法であって、
ａ）ＩＬ−７ポリペプチドを含むサンプルを提供すること、
ｂ）下記の３つのジスルフィド架橋：Ｃｙｓ：１−４（Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ９２）；２−５（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１２９）及び３−６（Ｃｙｓ４７−Ｃｙｓ１４１）を含むＩＬ−７コンホーマーを精製してＩＬ−７薬物原料を生成させること、及び
ｃ）場合により、該薬物原料において、該特定のＩＬ−７コンホーマーを測定又は定量すること
を含む方法。
【請求項３１】
該サンプルがＩＬ−７ポリペプチドを産生する組み換え原核生物又は真核生物宿主細胞から得られる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該サンプルがＩＬ−７ポリペプチドをコードする原核生物宿主細胞の培養物であり（又は由来のものであり）そして更に、工程ｂ）の前に、
ｉ）該サンプルを処理して該ＩＬ−７ポリペプチドの完全な変性を引き起すこと、
ii）場合により工程ｉ）で得られる変性されたポリペプチドを精製すること、及び
iii）ポリペプチドをリフォールディングすること、
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
工程ｉ）が変性剤緩衝液中に封入体を溶解することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程ii）を、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換又は逆相クロマトグラフィーにより行う、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＨＩＣブチルを使用して該疎水性クロマトグラフィーを実施する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
工程ii）を６〜９、好ましくは７〜８．５の両端を含めた範囲内にあるｐＨで行う、請求項３２〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
該精製工程ｂがアフィニティークロマトグラフィーを行うことを含む、請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
該アフィニティークロマトグラフィーを硫酸化多糖類のカラムで行う、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
硫酸化多糖類がデキストラン硫酸又はヘパリンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＩＬ−７コンホーマーが、薬物原料において、質量分析法、赤外分光法、ＮＭＲによって、円偏光二色性を決定することによって、該ＩＬ−７コンホーマーに対して生じた特異的モノクローナル抗体に対するアフィニティーを測定することによって又はヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより特徴付けられ、そしてＩＬ−７受容体に対する該ＩＬ−７コンホーマーのＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ又はアフィニティーにより、及び単離されたコンホーマーに適用される場合にはタンパク質定量のいかなる方法によっても測定され又は定量される、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＩＬ−７含有調製物における請求項１〜９のいずれか一つに記載のＩＬ−７コンホーマーの存在及び／又は相対的量を決定することを含む、ＩＬ−７含有調製物を制御する方法。
【請求項４２】
ＩＬ−７薬物原料又は製薬学的組成物を製造する方法であって、（ｉ）ＩＬ−７ポリペプチドをコードする組換え宿主細胞を培養し、（ii）該組換えポリペプチドを単離してＩＬ−７薬物原料を生成させ、そして（iii）場合により、該ＩＬ−７薬物原料をコンディショニングして治療又はワクチン用途に適当な製薬学的組成物を生成させることを含み、更に該薬物原料又は製薬学的組成物において、請求項１〜９のいずれか一項に定義されたＩＬ−７コンホーマーの量及び／又は品質を同定し、特徴付け又は測定する工程を含み、そして更に好ましくは、活性成分として該ＩＬ−７コンホーマーを約９５%より多く、好ましくは９８%より多く含む薬物原料又は製薬学的組成物を選ぶ工程を含む、方法。
【請求項４３】
組換え宿主細胞によるＩＬ−７発現が誘導性であるか、調節されるか又は一過性であり、それにより細胞培養段階とＩＬ−７発現段階を引き離すことができる、請求項３１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
該ＩＬ−７コンホーマーの量及び／又は品質が、トリプシン消化を伴う又は伴わない質量分析関連法、円偏光二色性、ＮＭＲ、ジスルフィド架橋のための特異的モノクローナル抗体分析及び／又はコンホメーション特徴付けにより決定される、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
長期のリンパ球生成刺激の誘発及び／又は免疫応答の増幅における使用のための、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の方法により得られる、製薬学的組成物。
【請求項４６】
免疫不全に関連した疾患を防止又は処置することにおける使用のための、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の方法により得られる製薬学的組成物。
【外国語明細書】
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