(57)【要約】【課題】サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、バックグラウンドを低減し、高感度で抗原を検出することができる抗原の検出方法を提供する。【解決手段】試料中に含まれる抗原を検出対象とする抗原の検出方法であって、抗原に対する抗体を、化学反応によって抗体と可逆的に結合解離可能な置換基との反応により、固相の表面に結合させて固定化する抗体固定化工程と、抗原を含む試料と抗体を固定化した固相とを接触させ、抗原を抗体に結合させる抗原反応工程と、標識部分を含む抗原に対する標識化抗体を、抗体に結合させた抗原に結合させる標識化工程と、置換基により形成された結合部分の解離反応により、抗体と抗原と標識化抗体とを含む複合体を固相から分離する分離工程と、分離された複合体における標識部分を検出することによって、抗原を検出する検出工程と、を含む抗原の検出方法である。【選択図】図１
2010175444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる抗原を検出対象とする抗原の検出方法であって、
前記抗原に対する抗体を、化学反応によって前記抗体と可逆的に結合解離可能な置換基との反応を利用して、固相の表面に結合させて固定化する抗体固定化工程と、
前記抗原を含む試料と前記抗体を固定化した固相とを接触させ、前記抗原を前記抗体に結合させる抗原反応工程と、
標識部分を含む前記抗原に対する標識化抗体を、前記抗体に結合させた抗原に結合させる標識化工程と、
前記置換基により形成された結合部分の解離反応により、前記抗体と前記抗原と前記標識化抗体とを含む複合体を前記固相から分離する分離工程と、
前記分離された複合体における前記標識部分を検出することによって、前記抗原を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする抗原の検出方法。
【請求項２】
試料中に含まれる抗原を検出対象とする抗原の検出方法であって、
前記抗原に対する１次抗体を、化学反応によって前記１次抗体と可逆的に結合解離可能な置換基との反応を利用して、固相の表面に結合させて固定化する抗体固定化工程と、
前記抗原を含む試料と前記１次抗体を固定化した固相とを接触させ、前記抗原を前記１次抗体に結合させる抗原反応工程と、
２次抗体を前記１次抗体に結合させた抗原に結合させる抗体反応工程と、
標識部分を含む標識化抗体を、前記抗原に結合させた２次抗体に結合させる標識化工程と、
前記置換基により形成された結合部分の解離反応により、前記１次抗体と前記抗原と前記２次抗体と前記標識化抗体とを含む複合体を前記固相から分離する分離工程と、
前記分離された複合体における前記標識部分を検出することによって、前記抗原を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする抗原の検出方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗原の検出方法であって、
前記置換基が、ジヒドロキシボリル基であり、前記抗体に含まれる糖残基のジオール部分と前記ジヒドロキシボリル基との可逆的な反応により、前記抗体の固定化および前記複合体の分離を行うことを特徴とする抗原の検出方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原の検出方法であって、
前記標識部分が、酵素、蛍光物質および発光物質のうち少なくとも１つであることを特徴とする抗原の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）は、試料中に含まれる抗原などの目的物質を、酵素標識した抗体を用い、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法であり、免疫検査などにおいて汎用されている手法の１つである。ＥＬＩＳＡには、サンドイッチ法、競合法などが知られている。
【０００３】
これらのうち、サンドイッチＥＬＩＳＡの測定原理は例えば、以下の通りである。まず、樹脂基板やガラス基板などの固相の表面に、あらかじめ目的物質（抗原）に対する抗体を結合させて固定化しておき、これに試料を添加して、試料中の抗原を抗原抗体反応により固相表面の抗体に結合させる。未反応の抗原を洗い流した後、酵素標識した酵素標識化抗体を添加して、再び抗原抗体反応により、「固定化抗体／抗原／酵素標識化抗体」のサンドイッチ構造を形成する。ここで遊離の酵素標識化抗体を洗い流し、発色基質を添加すると、サンドイッチ構造の量（すなわち試料中の抗原の量）に比例して発色反応が起こる。生成した発色物質の吸光度を吸光度計などにより測定し、濃度既知の標準品を用いて作成した標準曲線から、試料中の抗原の量を定量することができる。
【０００４】
しかし、このサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、固相の表面などへの抗原や酵素標識化抗体の非特異吸着に起因するバックグラウンドが存在し、測定感度が悪くなる場合がある。特に、試料中の低濃度の抗原を定量する場合、測定すべきシグナルを分離することが困難となる。
【０００５】
バックグラウンドを低下させるためには、抗原を固相表面の抗体に結合させる前や、酵素標識化抗体を抗原に結合させる前に、ブロッキング剤などを用いて固相の表面などをブロッキングして非特異吸着を減少させる方法が一般的であるが、効果が不十分なものが多い。
【０００６】
一方、アミノフェニルボロン酸誘導体を結合した担体を、糖タンパク質の精製などに利用することが知られている。
【０００７】
例えば、非特許文献１では、糖タンパク質を精製するためにｍ−アミノフェニルボロン酸誘導体が結合したビーズ担体を用い、アフィニティクロマトとして使用している。非特許文献１では、ｍ−アミノフェニルボロン酸誘導体を、多種のタンパク質を含む試料から、糖タンパク質（抗体）のみを精製、抽出するために利用しており、サンドイッチＥＬＩＳＡおよびサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるバックグラウンド低減に関する記載はない。
【０００８】
非特許文献２では、磁性細菌由来の磁性粒子とｍ−アミノフェニルボロン酸とをＢｉｓ−（ｓｕｃｃｃｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅを用いて結合させている。そして、糖尿病関連マーカである糖タンパク（ＨｂＡ１ｃ）の選択的な分離、ＡＬＰラベルした抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いたＨｂＡ１ｃの発光検出を行っている。非特許文献２では、ｍ−アミノフェニルボロン酸を、磁性粒子に結合させて、糖タンパク抗原の結合に用い、抗体を用いた発光検出に使用しているが、サンドイッチＥＬＩＳＡおよびサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるバックグラウンド低減に関する記載はない。
【０００９】
非特許文献３では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサを用いるグリコアルブミンの定量において、表面プラズモン共鳴用の金表面にカルボキシル基を有するアルキルチオール分子を結合し、水溶性カルボジイミドとＮ−ヒドロキシサクシンイミドを用いて、カルボキシル基を活性化した後、ｍ−アミノフェニルボロン酸をアミドカップリングにより固定化したセンサチップを作製し、糖タンパクであるグリコアルブミン（ＧＡ）の定量を行っている。また、酸で処理してＧＡを除去し、センサチップを再生している。非特許文献３では、ｍ−アミノフェニルボロン酸を金表面に結合させて、グリコアルブミン（ＧＡ）の定量に用いているが、サンドイッチＥＬＩＳＡおよびサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるバックグラウンド低減に関する記載はない。
【００１０】
特許文献１では、糖化タンパク質を含むタンパク質サンプルをプレート上に物理吸着させ、化学的に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したフェニルボロン酸などのボロン酸誘導体を用いて、糖化タンパク質の量（割合）を比色定量している。特許文献１では、タンパク質の糖化部位に反応性を有する標識化したボロン酸誘導体を用いて、糖化タンパク質の定量を行っているが、サンドイッチＥＬＩＳＡおよびサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるバックグラウンド低減に関する記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平６−０６６８０７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、オンラインカタログ、糖タンパク質精製・検出、インターネット＜ＵＲＬ：http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/200808_06.shtml＞
【非特許文献２】Tanaka T． and Matsunaga T．、「Detection of HbA(1c) by boronate affinity immunoassay using bacterial magnetic particles」、Biosens Bioelectron．、Dec;16(9-12):1089-1094(2001)
【非特許文献３】藤井永治、外８名、「表面プラズモン共鳴センサーを用いるグリコアルブミンの定量」、BUNSEKI KAGAKU、Vol．52、No．5、pp311-317(2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、バックグラウンドを低減し、高感度で抗原を検出することができる抗原の検出方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、試料中に含まれる抗原を検出対象とする抗原の検出方法であって、前記抗原に対する抗体を、化学反応によって前記抗体と可逆的に結合解離可能な置換基との反応を利用して、固相の表面に結合させて固定化する抗体固定化工程と、前記抗原を含む試料と前記抗体を固定化した固相とを接触させ、前記抗原を前記抗体に結合させる抗原反応工程と、標識部分を含む前記抗原に対する標識化抗体を、前記抗体に結合させた抗原に結合させる標識化工程と、前記置換基により形成された結合部分の解離反応により、前記抗体と前記抗原と前記標識化抗体とを含む複合体を前記固相から分離する分離工程と、前記分離された複合体における前記標識部分を検出することによって、前記抗原を検出する検出工程と、を含む抗原の検出方法である。
【００１５】
また、本発明は、試料中に含まれる抗原を検出対象とする抗原の検出方法であって、前記抗原に対する１次抗体を、化学反応によって前記１次抗体と可逆的に結合解離可能な置換基との反応を利用して、固相の表面に結合させて固定化する抗体固定化工程と、前記抗原を含む試料と前記１次抗体を固定化した固相とを接触させ、前記抗原を前記１次抗体に結合させる抗原反応工程と、２次抗体を前記１次抗体に結合させた抗原に結合させる抗体反応工程と、標識部分を含む標識化抗体を、前記抗原に結合させた２次抗体に結合させる標識化工程と、前記置換基により形成された結合部分の解離反応により、前記１次抗体と前記抗原と前記２次抗体と前記標識化抗体とを含む複合体を前記固相から分離する分離工程と、前記分離された複合体における前記標識部分を検出することによって、前記抗原を検出する検出工程と、を含む抗原の検出方法である。
【００１６】
また、前記抗原の検出方法において、前記置換基が、ジヒドロキシボリル基であり、前記抗体に含まれる糖残基のジオール部分と前記ジヒドロキシボリル基との可逆的な反応により、前記抗体の固定化および前記複合体の分離を行うことが好ましい。
【００１７】
また、前記抗原の検出方法において、前記標識部分が、酵素、蛍光物質および発光物質のうち少なくとも１つであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、試料中に含まれる抗原を検出対象とするサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、化学反応によって可逆的に結合解離可能な置換基との反応を利用して固相の表面に結合させた抗体と試料中に含まれる検出対象の抗原と標識化抗体とを含む複合体を形成させ、その複合体を固相から分離して、標識部分を検出することにより、バックグラウンドを低減し、高感度で抗原を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態に係る抗原の検出方法の一例の概略を示す模式図である。
【図２】抗体中に存在する糖鎖の構造種（ヒトＩｇＧの例）を示す図である。
【図３】固相（基板）に結合したｍ−アミノフェニルボロン酸誘導体と抗体糖残基中のシスジオール基との結合および解離を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る抗原の検出方法におけるバックグラウンドの低減を説明するための模式図である。
【図５】固相（基板）に結合したＩＤＡ基、ＴＥＤ基と抗体のＦｃ領域に含まれるイミダゾール基との結合および解離を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る抗原の検出方法の他の例の概略を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００２１】
本発明の実施形態に係る抗原の検出方法の一例の概略を図１に示す。本実施形態に係る抗原の検出方法は、試料中に含まれる抗原を検出対象とする。まず、検出対象の抗原に対する抗体と化学反応によって可逆的に結合解離可能な置換基Ｘを有する化合物Ｒ−Ｘを、樹脂基板やガラス基板などの固相１０の表面に結合させて、抗体固定化用固相１２を作製する（抗体固定化用固相作製工程）。次に、抗原に対する抗体１４を、置換基Ｘとの反応により固相１０の表面に結合させて固定化する（抗体固定化工程）。この結合は、置換基Ｘと、抗体１４に含まれる、化学反応によって可逆的に置換基Ｘと結合解離可能な置換基と、の反応により形成され、結合部分１６を生じる。次に、抗原１８を含む試料と、抗体１４を固定化した固相１０とを接触させ、抗原抗体反応により抗原１８を抗体１４に結合させる（抗原反応工程）。次に、標識部分２２を含む、抗原１８に対する標識化抗体２０を、抗体１４に結合させた抗原１８に抗原抗体反応により結合させる（標識化工程）。次に、置換基Ｘにより形成された結合部分１６の解離反応により、抗体１４と抗原１８と標識化抗体２０とを含む抗体−抗原−標識化抗体複合体２４を固相１０から分離する（分離工程）。そして、分離された複合体２４における標識部分２２を検出することによって、検出対象の抗原１８を検出する（検出工程）。なお、各工程の間には、未反応物などを除去するための洗浄工程を含んでもよい。必要に応じて、抗体固定化用固相作製工程、抗体固定化工程、抗原反応工程などにおいて、固相表面や未反応部分をブロッキング剤などによりブロッキングするブロッキング工程を含んでもよい。
【００２２】
本発明者らは、ボロン酸誘導体などの、検出対象の抗原１８に対する抗体１４と化学反応によって可逆的に結合解離可能な置換基Ｘを有する化合物を利用して、糖タンパク質の１種である抗体１４のＥＬＩＳＡ反応基板（固相１０）への固定化を行い、固相１０の表面に結合させた抗体１４と試料中に含まれる検出対象の抗原１８と標識化抗体２０とを含む複合体２４を形成させ、その複合体２４を固相１０から分離して、標識部分２２を検出することにより、バックグラウンドを低減し、高感度で抗原１８を検出することができることを見出した。
【００２３】
抗体には、図２に示すように、マンノース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコースアミンなどの糖残基が含まれる。例えば、ｍ−アミノフェニルボロン酸などのボロン酸誘導体は、ｐＨ＞８の条件、例えば、ｐＨ８〜８．５の条件などで、抗体に含まれる糖残基のジオール部分と５員環複合体を形成して結合する。そこで、図３に示すように、固相１０の表面に、例えば、ｍ−アミノフェニルボロン酸などのボロン酸誘導体を結合させ、その後、ボロン酸誘導体のジヒドロキシボリル基と抗体に含まれる糖残基のジオール部分との反応により５員環複合体を形成させて、抗体を固定化する。ｐＨを下げたり（例えば、ｐＨ≦６）、Ｔｒｉｓ、ソルビトールなどを含むバッファ中では、結合部分（図３の例では５員環の部分）を解離することができる。
【００２４】
図４の左側に示すように、抗原反応工程、標識化工程などにおいて、抗原１８や標識化抗体２０が固相１０の表面に非特異吸着すると、抗原１８と標識化抗体２０との複合体である抗原−標識化抗体複合体２６や、標識化抗体２０が、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいてバックグラウンドの原因となる。しかし、本方法により、固相１０の表面に結合した抗原−標識化抗体複合体２６および標識化抗体２０と、ボロン酸誘導体などを介して固相１０の表面と結合している、測定すべきシグナルを有する抗体−抗原−標識化抗体複合体２４とを分離することが可能となる。サンドイッチＥＬＩＳＡの最終ステップで、必要に応じて未反応の標識化抗体を洗浄除去した後、分離バッファを加えることにより、抗体−抗原−標識化抗体複合体２４を集めて、標識部分２２を検出すれば、固相の表面などへの抗原や標識化抗体の非特異吸着に起因するバックグラウンドを大幅に低減させることが可能となる。したがって、高感度測定が可能となり、試料中の低濃度（例えば、１×１０−１３〜１×１０−１２ｇ／ｍＬ程度）の抗原を定量する場合でも測定すべきシグナルを分離することができる。また、固相の表面などへの非特異吸着が存在しても、測定に影響がほとんどないため、固相表面への特殊な表面処理などをしなくても感度よく測定することができる。
【００２５】
このように、本発明の実施形態に係る抗原の検出方法では、サンドイッチＥＬＩＳＡでのバックグラウンド低減のために、例えば、アミノフェニルボロン酸などのボロン酸誘導体と糖ジオール部分との結合解離反応を利用している。抗体−抗原−標識化抗体複合体２４の分離には、Ｔｒｉｓバッファなどのバッファを用い、温和な条件で行うことができ、適切な解離条件を選択すれば、標識化抗体２０に含まれる酵素、蛍光物質、発光物質などの標識部分２２にはほとんど影響を与えることがない。
【００２６】
以下、各工程について、詳細に説明する。
【００２７】
＜I．抗体固定化用固相作製工程＞
抗体固定化用固相作製工程では、検出対象の抗原１８に対する抗体１４と化学反応によって可逆的に結合解離可能な置換基Ｘを有する化合物Ｒ−Ｘを、固相１０の表面へ結合させる。
【００２８】
抗体固定化用固相１２を作製するための固相１０の担体形状としては、例えば、板状、ビーズ状、ウェル状、チューブ状、試験管形状などが挙げられる。
【００２９】
また、固相１０の材質としては、例えば、ガラス；セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリンなどの多糖類またはその誘導体；シリカゲル；多孔性セラミックス；金、銀などの貴金属などの金属；金属酸化物；エチレン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸、メタクリル酸エステル、スチレン、メチルスチレン、ブタジエン、イソプレン、アクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルなどの重合体もしくは共重合体などの樹脂、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレンなど、またはこれらに公知の手段によりカルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、チオール基などの反応性官能基を導入したものなどが挙げられる。
【００３０】
抗体固定化用固相１２を作製するための固相１０としては、例えば、ストレプトアビジンを表面に固定したもの（下記Ｉ−１のａ参照）、求電子性官能基を表面に有するもの（下記Ｉ−１のｂ参照）、シランカップリングなどによってアミノ基を表面に露出させたもの（下記Ｉ−１のｃ、Ｉ−２のａ参照）、カルボキシル基を表面に有するもの（下記Ｉ−１のｄ参照）などを利用することができる。
【００３１】
化合物Ｒ−Ｘとしては、検出対象の抗原１８に対する抗体１４と化学反応によって可逆的に結合解離可能な置換基Ｘを有するものであり、任意の置換基Ｒの部分で固相１０の表面に結合させることができるものであればよく、特に制限はない。
【００３２】
置換基Ｘとしては、例えば、ジヒドロキシボリル基、イミノジアセテート（ＩＤＡ）基とその誘導体、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基とその誘導体などが挙げられる。これらのうち、抗体に含まれるマンノース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコースアミンなどの糖残基のジオール部分と温和な条件で５員環複合体を形成して結合し、温和な条件で解離することが可能なジヒドロキシボリル基が好ましい。
【００３３】
【化１】
2010175444.tif 000003
ＩＤＡ基（例えば、＊部分で固相１０と結合）
【００３４】
【化２】
2010175444.tif 000004
ＴＥＤ基（例えば、＊部分で固相１０と結合）
【００３５】
置換基Ｘがジヒドロキシボリル基の場合は、抗体に含まれる糖残基のジオール部分とジヒドロキシボリル基との反応により、例えば図３のように結合部分として５員環（１，３，２−ジオキサボロラン環）が形成されて、抗体が固定化され、その結合部分の解離によって、抗体−抗原−標識化抗体複合体が分離されることになる。
【００３６】
置換基ＸがＩＤＡ基、ＴＥＤ基の場合は、抗体のＦｃ領域に含まれるヒスチジンリッチ（イミダゾール基）部分とＩＤＡ基、ＴＥＤ基（例えば、ＩＤＡ基、ＴＥＤ基のＮｉ２＋イオン、Ｃｕ２＋イオンなどの金属イオン（Ｍ２＋など）との金属錯体）との反応により、例えば図５のように結合部分が形成されて、抗体が固定化され、その結合部分の解離によって、抗体−抗原−標識化抗体複合体が分離されることになる。
【００３７】
ジヒドロキシボリル基を有するボロン酸誘導体（化合物Ｒ−Ｘ）としては、ジヒドロキシボリル基を構造上有していればよく、特に制限はないが、例えば、（３−アミノフェニル）ボロン酸、（４−アミノフェニル）ボロン酸、（１−アミノ−２−フェニルエチル）ボロン酸、［３−［（アミノカルボニル）アミノ］フェニル］ボロン酸、［２−（ハイドロキシアミノ）フェニル］ボロン酸、［４−（ハイドロオキシアミノ）フェニル］ボロン酸塩酸塩などが挙げられる。アミノ基を有するボロン酸誘導体が好ましく使用され、特にアミノ基を有するフェニルボロン酸誘導体が好ましく使用される。
【００３８】
フェニルボロン酸誘導体としては、例えば、適当なスペーサ長を有するＮＨＳエステル−ビオチンを用いて作製されたビオチン誘導体（下記Ｉ−１のａ参照）、ｍ位などにＮＨＳエステル構造を有するもの、シランカップリング剤の構造を有するものなどを使用することができる。また、ｍ−アミノフェニルボロン酸を適当なスペーサ長を有するＢｉｓ−ＮＨＳエステル化合物を利用して直接、アミノ基を表面に有する基板上に結合することもできる（下記Ｉ−１のｃ参照）。
【００３９】
固相１０表面へのフェニルボロン酸誘導体などの結合は、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、物理吸着のうちの１つ、またはこれらの組み合わせであり、好ましくは共有結合、イオン結合、水素結合のうちの１つ、またはこれらの組み合わせである。
【００４０】
以下に、樹脂基板、ガラス基板へのフェニルボロン酸誘導体の結合の方法の例を示すが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
［Ｉ−１．樹脂基板（プラスチックなど）へのフェニルボロン酸誘導体の結合］
ａ．市販ストレプトアビジン固定化プレートの利用による結合
水溶性のビオチンラベル化剤（例えば、Ｄｏｊｉｎｄｏ．Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＣ５  Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ、ＰＩＥＲＣＥ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、下記構造式参照）をＰＢＳバッファ中で反応させ、ｍ位にビオチン化されたフェニルボロン酸誘導体を得る。このビオチン化されたフェニルボロン酸誘導体を、ストレプトアビジン固定化プレート上にて反応させ、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成させて、基板上にフェニルボロン酸を固定化する。市販ストレプトアビジン固定化プレートは、Ｎｕｎｃ社などから購入することができる。反応温度、反応時間などの反応条件は、適宜選択すればよい。
【００４２】
【化３】
2010175444.tif 000005
Biotin-AC5 Sulfo-OSu（Sulfo-NHS-LC-Biotin）
【００４３】
ｂ．求電子性官能基を有する市販プレートの利用による結合
ＰＥＧポリマ構造を含むスペーサを介して求電子性官能基が存在しているプレートを用いて、ｍ−アミノフェニルボロン酸（下記構造式参照）含有溶液とインキュベートさせることにより、同化合物のアミノ基と結合させることができる。反応温度、反応時間などの反応条件は、適宜選択すればよい。なお、未反応の官能基はトリエタノールアミンバッファなどでブロッキングしてもよい。求電子性官能基を有するプレートは、Ｎｕｎｃ社から購入することができる（Ｎｕｎｃイモビライザ（求電子性官能基：アミノ基））。
【００４４】
【化４】
2010175444.tif 000006
ｍ−アミノフェニルボロン酸
【００４５】
ｃ．アミノ基を有する市販プレートの利用による結合
アミノ基を表面に有するプレートを用いる場合、両端にＮＨＳ活性エステルを有する２官能性化合物（例えば、ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（下記構造式参照）など）を用い、ｍ−アミノフェニルボロン酸のアミノ基とプレート上のアミノ基とをリンカを介して結合させる。また、両端にフォルミル基を有するグルタルアルデヒド（下記構造式参照）を用い、プレート上のアミノ基と一方のフォルミル基とでアルジミンを形成させ、同様にｍ−アミノフェニルボロン酸のアミノ基と他方のフォルミル基と反応させてアミノフェニルボロン酸をプレートに結合させてもよい。反応温度、反応時間などの反応条件は、適宜選択すればよい。
【００４６】
【化５】
2010175444.tif 000007
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate
【００４７】
【化６】
2010175444.tif 000008
Glutaraldehyde
【００４８】
ｄ．カルボキシル基を有する市販プレートの利用による結合
カルボキシル基を有するプレートを用いる場合、プレート上のカルボキシル基に、水溶性のカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（下記構造式参照））を反応させ、活性中間体を得た後、ｍ−アミノフェニルボロン酸をさらに反応、結合させる。反応温度、反応時間などの反応条件は、適宜選択すればよい。
【００４９】
【化７】
2010175444.tif 000009
EDAC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminoethyl)carbodiimide
【００５０】
アミノ基、カルボキシル基を表面に有するプレートは、例えば、住友ベークライト社（例えば、住友ベークライト社  ＥＬＩＳＡプレート、Ａタイプ、Ｃタイプ）およびＮｕｎｃ社（例えば、Ｎｕｎｃ  コバリンクＮＨモジュール）から入手できる。なお、基板上の未反応活性化官能基は上記ｂ項と同様の方法でブロッキングしてもよい。
【００５１】
［Ｉ−２．ガラス基板へのフェニルボロン酸誘導体の結合］
ａ．アミノ基を有するガラスプレートの利用による結合
ガラス表面にアミノ基を有するプレートを使用する場合、上記Ｉ−１のｃの方法を利用することができる。同プレートは市販スライドグラスを十分洗浄後、３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（下記構造式参照）などのシランカップリング剤を用いて作製が可能である。
【００５２】
【化８】
2010175444.tif 000010
3-aminopropyltriethoxysilane
【００５３】
次に、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による操作の具体例を以下に説明する。以下に説明する各工程における手法は一例であって、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法における、あらゆる方法を適宜用いることができる。
【００５４】
＜ＩＩ．サンドイッチＥＬＩＳＡ＞
［１．抗体固定化工程］
抗体固定化工程では、検出対象の抗原１８に対する抗体１４を、化学反応によって抗体１４と可逆的に結合解離可能な置換基との反応により、固相１０の表面に結合させて固定化する。
【００５５】
例えば、検出対象の抗原に対する抗体（例えば、ポリクローナル抗体）を、ｐＨ８．０〜８．５程度のバッファ（例えば、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）で希釈し、Ｉ項で作製した抗体固定化用固相上に添加して、固定化を行うことができる。反応時間は通常、室温（通常、２０〜３０℃）で２０分間程度であるが、抗体量により変化する場合がある。また、必要であれば、未反応のボロン酸を、グルコースなどの単糖類などを加えてブロッキングしてもよい。
【００５６】
なお、上記例では、抗体と化学反応によって可逆的に結合解離可能な置換基Ｘを有する化合物Ｒ−Ｘを、固相の表面へ結合させた後、抗体を固定化しているが、抗体と化学反応によって可逆的に結合解離可能な置換基Ｘを有する化合物Ｒ−Ｘと、抗体とを反応させた後、固相の表面に結合させて固定化してもよい。
【００５７】
［２．洗浄工程］
定法と同様に、ＰＢＳバッファ（ｐＨ８．０前後）などにより洗浄を実施してもよい。これにより、未反応の抗体などを除去することができる。
【００５８】
［３．ブロッキング工程］
必要に応じて、定法と同様に、ＢＳＡ（ＰＢＳバッファなどで溶解）などのブロッキング剤で固相表面のブロッキングを行ってもよい。ブロッキングは、抗原抗体反応に関与しないタンパク質などで固相表面を覆い、後の工程で作用させる抗原や抗体などが固相表面に吸着されるのを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤は、糖鎖を含まないタンパク質から構成されるものが好ましい。なお、抗体固定化工程において、ＢＳＡなどのブロッキング剤を添加することによって、抗体固定化およびブロッキングを同時に行うこともできる。
【００５９】
［４．洗浄工程］
ブロッキング工程後に、ＰＢＳＴバッファ（ＰＢＳ＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）などを用いて、洗浄を実施してもよい。これにより、未結合のブロッキング剤などを除去することができる。ブロッキングを行わない場合は、本洗浄工程を省略することができる。
【００６０】
［５．抗原反応工程］
抗原反応工程では、検出対象となる抗原１８を含む試料と、抗体１４を固定化した固相１０とを接触させ、抗原１８を抗体１４に反応させ、結合させる。
【００６１】
反応時間は反応温度により調節すればよい。反応時間は、例えば、反応温度３７℃程度の場合、数分以上（例えば、５〜１２０分）、反応温度４℃程度の場合、一晩（例えば、６〜１２時間）である。
【００６２】
［６．洗浄工程］
抗原反応工程後に、４の洗浄工程と同様に、ＰＢＳＴバッファ（ＰＢＳ＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）などを用いて、洗浄を実施してもよい。これにより、未反応の抗原などを除去することができる。
【００６３】
［７．標識化工程］
標識化工程では、標識部分２２を含む、抗原１８に対する標識化抗体２０を、抗体１４に結合させた抗原１８に結合させる。
【００６４】
標識化抗体（酵素標識抗体、蛍光標識抗体など）としては、糖鎖を含まないモノクローナル抗体、組み換え抗体などを用いることが好ましい。反応時間は反応温度により調節すればよい。反応時間は、例えば、反応温度３７℃程度の場合、数分以上（例えば、５〜１２０分）、反応温度４℃程度の場合、一晩（例えば、６〜１２時間）である。
【００６５】
標識部分２２としては、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な標識（例えば、磁性ナノ粒子）、電気的に検出可能な標識（例えば、フェロセン部位を有する高分子）、電気化学的に検出可能な標識（例えば、ルテニウム錯体）などが挙げられ、検出感度、取り扱い性などの点から、酵素、蛍光物質および発光物質のうち少なくとも１つが好ましい。
【００６６】
蛍光物質としては、選択された波長の紫外光、可視光などの放射線による照射に応答して蛍光または燐光を発する物質であればよく、特に制限はないが、例えば、蛍光色素としてフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体など、あるいは蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質とその変異体などが挙げられる。
【００６７】
発光物質としては、例えば、ルミノール誘導体、イソルミノール誘導体、ジオキセタン誘導体、アクリジニウム誘導体などの化学発光物質などが挙げられる。
【００６８】
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどが挙げられる。
【００６９】
酵素としては、発色反応などを利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。
【００７０】
［８．洗浄工程］
標識化工程後に、４の洗浄工程と同様に、ＰＢＳＴバッファ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）などを用いて、洗浄を実施してもよい。これにより、未反応の標識化抗体などを除去することができる。
【００７１】
［９．分離工程］
分離工程では、置換基Ｘにより形成された結合部分１６の解離反応により、抗体１４と抗原１８と標識化抗体２０とを含む抗体−抗原−標識化抗体複合体２４を固相１０から分離する。
【００７２】
例えば、分離バッファ（例えば、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〜８．５）を添加して、室温（通常、２０〜３０℃）で２０分間程度インキュベートする。次いで溶液を一部または全量回収する。分離バッファとしては、ソルビトールを含むバッファを用いてもよい。また、液のｐＨを下げて（例えば、ｐＨ≦６）、分離を行ってもよい。
【００７３】
このような温和な条件で固相１０から抗体−抗原−標識化抗体複合体２４の分離を行うことにより、標識化抗体２０に含まれる酵素、蛍光物質、発光物質などの標識部分２２にほとんど影響を与えることがない。
【００７４】
［１０．検出工程］
検出工程では、分離された複合体２４における標識部分２２を検出することによって、抗原１８を検出する。分離工程で回収した溶液について、標識部分に応じて、酵素活性、蛍光強度などを測定する。酵素活性測定でバッファ交換が必要な場合は、スピンカラムなどを用いると迅速に行うことができる。
【００７５】
標識部分が酵素の場合は、分離工程で回収した溶液に発色基質を添加すると、抗体−抗原−標識化抗体複合体２４の量（すなわち試料中の抗原の量）に比例して発色反応が起こる。生成した発色物質の吸光度を吸光度計などにより測定し、濃度既知の標準品を用いて作成した標準曲線から、試料中の抗原の量を定量することができる。
【００７６】
本発明の実施形態に係る抗原の検出方法の他の例の概略を図６に示す。本実施形態に係る抗原の検出方法は、図１の方法において、さらに２次抗体を用いる方法である。まず、検出対象の抗原に対する抗体（１次抗体）と化学反応によって可逆的に結合解離可能な置換基Ｘを有する化合物Ｒ−Ｘを、樹脂基板やガラス基板などの固相１０の表面に結合させて、抗体固定化用固相１２を作製する（抗体固定化用固相作製工程）。次に、抗原に対する抗体（１次抗体）１４を、置換基Ｘとの反応により固相１０の表面に結合させて固定化する（抗体固定化工程）。この結合は、置換基Ｘと、抗体（１次抗体）１４に含まれる、化学反応によって可逆的に置換基Ｘと結合解離可能な置換基と、の反応により形成され、結合部分１６を生じる。次に、抗原１８を含む試料と、抗体（１次抗体）１４を固定化した固相１０とを接触させ、抗原抗体反応により抗原１８を抗体（１次抗体）１４に結合させる（抗原反応工程）。次に、抗原１８に対する２次抗体２８を、抗体（１次抗体）１４に結合させた抗原１８に抗原抗体反応により結合させる（抗体反応工程）。次に、標識部分２２を含む、２次抗体２８に対する標識化抗体２０を、抗原１８に結合させた２次抗体２８に結合させる（標識化工程）。次に、置換基Ｘにより形成された結合部分１６の解離反応により、抗体（１次抗体）１４と抗原１８と２次抗体２８と標識化抗体２０とを含む１次抗体−抗原−２次抗体−標識化抗体複合体３０を固相１０から分離する（分離工程）。そして、分離された複合体３０における標識部分２２を検出することによって、検出対象の抗原１８を検出する（検出工程）。なお、各工程の間には、未反応物などを除去するための洗浄工程を含んでもよい。必要に応じて、抗体固定化用固相作製工程、抗体固定化工程、抗原反応工程、抗体反応工程などにおいて、固相表面や未反応部分をブロッキング剤などによりブロッキングするブロッキング工程を含んでもよい。
【００７７】
図１の方法では、検出対象の抗原に対する抗体ごとに標識を施さなくてはならない（図１の例では標識化抗体２０）が、二次抗体を用いることにより、異なる検出対象の抗原に対して、準備する標識化抗体が一種類でよいためコストが低減する。
【００７８】
［抗体反応工程］
図６の方法における抗体反応工程では、抗原１８に対する２次抗体２８を、抗体（１次抗体）１４に結合させた抗原１８に結合させる。このとき、２次抗体２８は、固相１０に固定化した抗体（１次抗体）１４とは別の抗体であり、抗原１８の抗体（１次抗体）１４とは異なる部位に結合するものである。
【００７９】
例えば、１次抗体とは別の、検出対象の抗原に対する２次抗体（例えば、ポリクローナル抗体）を、反応させる。反応時間は反応温度により調節すればよい。反応時間は、例えば、反応温度３７℃程度の場合、数分以上（例えば、５〜１２０分）、反応温度４℃程度の場合、一晩（例えば、６〜１２時間）である。
【００８０】
［洗浄工程］
抗体反応工程後に、４の洗浄工程と同様に、ＰＢＳＴバッファ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）などを用いて、洗浄を実施してもよい。これにより、未反応の２次抗体などを除去することができる。
【００８１】
本実施形態に係る抗原の検出方法において検出対象となる抗原としては特に制限はないが、例えば、感染症関連抗原、癌マーカー、ホルモンなどが挙げられる。
【００８２】
本実施形態に係る抗原の検出方法は、試料中に含まれる抗原などの目的物質を、標識化した抗体を用い、特異性の高い抗原抗体反応を利用して検出する方法であり、抗原などの目的物質を定量的に検出することが可能であり、免疫検査などにおいて用いることができる。
【符号の説明】
【００８３】
１０  固相、１２  抗体固定化用固相、１４  抗体（１次抗体）、１６  結合部分、１８  抗原、２０  標識化抗体、２２  標識部分、２４  抗体−抗原−標識化抗体複合体、２６  抗原−標識化抗体複合体、２８  ２次抗体、３０  １次抗体−抗原−２次抗体−標識化抗体複合体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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