(57)【要約】【課題】分離・精製する生体関連物質の捕捉量を多くすることができ、かつ、捕捉した生体関連物質の溶出が容易である、生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体およびその製造方法を提供する。【解決手段】生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体は、リガンドおよび親水性化合物が結合している担体であって、親水性化合物は、メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体の該官能基と、メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物とを反応させることにより、該担体に結合させたものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドおよび親水性化合物が結合している担体であって、
前記親水性化合物は、メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体の該官能基と、メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物とを反応させることにより、該担体に結合させたものである、生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体。
【請求項２】
前記親水性化合物は、１級アミノ基および２級アミノ基のいずれをも有さない、請求項１に記載のリガンド結合担体。
【請求項３】
前記親水性化合物はさらに水酸基を有する、請求項１または２に記載のリガンド結合担体。
【請求項４】
前記親水性化合物がメルカプト基を有する多価アルコールである、請求項３に記載のリガンド結合担体。
【請求項５】
前記リガンドが、プロテインＡまたはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを含むタンパクである、請求項１ないし４のいずれかに記載のリガンド結合担体。
【請求項６】
イムノグロブリンの分離または精製に使用される、請求項１ないし５のいずれかに記載のリガンド結合担体。
【請求項７】
メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体にリガンドを結合する工程と、
メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物と前記官能基とを反応させる工程と、
を含む、生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体の製造方法。
【請求項８】
前記親水性化合物は、１級アミノ基および２級アミノ基のいずれをも有さない、請求項７に記載のリガンド結合担体の製造方法。
【請求項９】
前記親水性化合物はさらに水酸基を有する、請求項７または８に記載のリガンド結合担体の製造方法。
【請求項１０】
前記親水性化合物がメルカプト基を有する多価アルコールである、請求項９に記載のリガンド結合担体の製造方法。
【請求項１１】
イムノグロブリンの分離または精製に使用されるリガンド結合担体の製造方法であって、
前記リガンドが、プロテインＡまたはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを含むタンパクである、請求項７ないし１０のいずれかに記載のリガンド結合担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リガンド結合担体を用いて生体関連物質を分離または精製する方法は、アフィニティークロマトグラフィーと呼ばれ、アフィニティークロマトグラフィーに用いられるリガンド結合担体は、目的の生体関連物質を特異的に捕捉する材料として広く用いられているが、さらに多くの捕捉量を有するリガンド結合担体が求められている。
【０００３】
例えば、非特異吸着を低減するために、カゼインやウシ血清アルブミンなどのタンパクを用いてブロッキングする方法が用いられてきた。しかしながら、これらのタンパクによるブロッキングは、分離または精製する生体関連物質へのタンパクの混入を招いたり、ロット再現性が悪かったりなどの問題があり、非特異吸着の低減効果も不十分である。また、これらのタンパクによるブロッキングでは、生体関連物質の捕捉量を増やすことはできない。
【０００４】
また、特許第３８０９１７７号には、アミノ基を有する粒子に対して、ホスホリルコリン基を有する化合物でブロッキングする方法が開示されているが、このブロッキング方法では、分離・精製する生体関連物質の溶出が遅く、時間的に非効率である上に、分離・精製する生体関連物質の濃度が溶出液によって希釈されてしまうという問題点がある。また、このブロッキング方法では、生体関連物質の捕捉量を増やすことはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３８０９１７７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、分離・精製する生体関連物質の捕捉量を多くすることができ、かつ、捕捉した生体関連物質の溶出が容易である、生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体およびその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様に係る生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体は、
リガンドおよび親水性化合物が結合している担体であって、
前記親水性化合物は、メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体の該官能基と、メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物とを反応させることにより、該担体に結合させたものである。
【０００８】
上記リガンド結合担体において、前記親水性化合物は、１級アミノ基および２級アミノ基のいずれをも有さないことができる。
【０００９】
上記リガンド結合担体において、前記親水性化合物はさらに水酸基を有することができる。この場合、前記親水性化合物はメルカプト基を有する多価アルコールであることができる。
【００１０】
上記リガンド結合担体において、前記リガンドが、プロテインＡまたはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを含むタンパクである、請求項１ないし３のいずれかに記載のリガンド結合担体。
【００１１】
上記リガンド結合担体は、イムノグロブリンの分離または精製に使用されることができる。
【００１２】
本発明の一態様に係る生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体の製造方法は、
メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体にリガンドを結合する工程と、
メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物と前記官能基とを反応させる工程と、
を含む。
【００１３】
上記リガンド結合担体の製造方法において、前記親水性化合物は、１級アミノ基および２級アミノ基のいずれをも有さないことができる。
【００１４】
上記リガンド結合担体の製造方法において、前記親水性化合物は水酸基をさらに有することができる。この場合、前記親水性化合物はメルカプト基を有する多価アルコールであることができる。
【００１５】
上記リガンド結合担体の製造方法は、イムノグロブリンの分離または精製に使用されるリガンド結合担体の製造方法であって、前記リガンドが、プロテインＡまたはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを含むタンパクであることができる。
【発明の効果】
【００１６】
上記リガンド結合担体は、リガンドおよび親水性化合物が結合している担体であって、親水性化合物は、メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体の該官能基と、メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物とを反応させることにより、該担体に結合させたものであることにより、分離・精製する生体関連物質の捕捉量を多くすることができ、かつ、捕捉した生体関連物質の溶出が容易である。
【００１７】
上記リガンド結合担体によれば、例えば、イムノグロブリンの分離または精製に使用した場合、イムノグロブリンの捕捉量が多く、かつ、捕捉したイムノグロブリンの溶出が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の実施例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（リガンド１）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、発現ベクター（ｐＥＴＭ−１１）にそれぞれ挿入された、本発明の実施例１に係るイムノグロブリン結合タンパク質（リガンド１）をコードするＤＮＡフラグメントの構成を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の一実施形態に係る生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体およびその製造方法について、具体的に説明する。
【００２０】
１．リガンド結合担体
本実施形態に係る生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体（以下、単に「リガンド結合担体」ともいう。）は、リガンドおよび親水性化合物が結合している担体であって、親水性化合物は、メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体の該官能基と、メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物とを反応させることにより、該担体に結合させたものである。
【００２１】
本発明における「生体関連物質」には、生体に関連するあらゆる物質が含まれるが、例えば、「生体関連物質」は、生体に含まれる物質または生体に使用するための物質であり、より具体的には、遺伝子、タンパク質（例えば酵素、抗体、受容体など）、核酸、糖質、脂質、ビタミン、サイトカイン、ホルモン、低分子化合物などが挙げられる。
【００２２】
１．１．担体
本実施形態に係るリガンド結合担体として使用可能な担体は、メルカプト基と反応しうる官能基を有する。
【００２３】
１．１．１．官能基
メルカプト基と反応しうる官能基としては、例えば、エポキシ基、ビニル基、アセチレン基、イソシアネート基、Ｎ−置換マレイミド基、ｏ−フタルアルデヒド基、ベンゾフラザン基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化アセトアミド基、アジリジン基、トシル基、メシル基、トリフルオロメタンスルフォニル基などが挙げられる。多くのリガンドと穏和な条件で結合できる点から、メルカプト基と反応しうる官能基は好ましくは、エポキシ基、または、トシル基、メシル基、トリフルオロメタンスルフォニル基などのスルフォニル基であり、さらに非特異吸着が低い点から、最も好ましくは、エポキシ基である。
【００２４】
１．１．２．材質および構造
メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体（以下単に「担体」ともいう。）は、生体関連物質の捕捉量が多くなる点から、多孔性であることが好ましい。このような多孔性の担体は、多孔性ガラス、架橋アガロースゲル、またはビニル単量体の重合により得られる多孔性有機重合体から主に構成されていることが好ましい。担体の洗浄工程において必要とされる耐アルカリ性に優れており、かつ、生体関連物質を含む原液を高速で流すことができる点から、担体は多孔性有機重合体からなるのがより好ましい。
【００２５】
担体は、分離・精製する生体関連物質の捕捉量が多く、捕捉した生体関連物質の溶出も容易となることから、好ましくは、１０〜２０００ｎｍ、より好ましくは、３０〜５００ｎｍの細孔径最頻値を有する。細孔径最頻値とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径の最頻値（モード径）である。
【００２６】
担体は、生体関連物質の捕捉量が多くなる点から、その乾燥時の比表面積は、好ましくは１ｍ２／ｇ以上、より好ましくは１０ｍ２／ｇ以上、生体関連物質の溶出の容易さとのバランスの点から、最も好ましくは、５０〜５００ｍ２／ｇである。
【００２７】
担体の形態としては、例えば、モノリスカラムとして使用できるバルクの形態、カラム充填剤として使用できる粒子の形態、フィルターとして使用できるシートの形態が挙げられる。分離・精製のスケールアップの容易さ、担体の製造コントロールの容易さから、好ましい担体の形態は、粒子である。
【００２８】
以上の条件を満たす担体として最も好適な例は、エポキシ基を有する多孔性有機重合体粒子であり、より具体的には、架橋性ビニル単量体と分子中にエポキシ基を含有するビニル単量体との共重合体である多孔性有機重合体粒子である。
【００２９】
上記架橋性ビニル単量体としては、芳香族ポリビニル単量体、脂肪族ポリビニル単量体が好適であり、芳香族ポリビニル単量体としては、ジビニルベンゼンが好ましく、脂肪族ポリビニル単量体としては多価（メタ）アクリレート化合物が好ましい。
【００３０】
多価（メタ）アクリレート化合物としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレートなどが挙げられ、トリメチロールプロパントリメタクリレートが特に好ましい。
【００３１】
上記、分子中にエポキシ基を含有するビニル単量体としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール等の（メタ）アクリル酸エステル類；ビニルベンジルグリシジルエーテル等の芳香族ビニル化合物等が挙げられ、グリシジルメタクリレートが特に好ましい。
【００３２】
このような多孔性有機重合体粒子は、公知のシード重合、懸濁重合などにより製造することができる。シード重合法として、特公昭５７−２４３６９号公報記載の二段膨潤重合法も好適に用いられる。重合に際しては、上記単量体の他、水、ポロジェンを必須成分とし、重合開始剤、高分子分散剤、界面活性剤、塩、シード粒子などを必要に応じて使用する。ポロジェンとしては、脂肪族あるいは芳香族炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等の有機溶剤が挙げられる。
【００３３】
このような有機溶剤としては、例えば、トルエン、エチルベンゼン、クメン、ｎ−プロピルベンゼン、ｎ−ブチルベンゼン、ｔ−ブチルベンゼン、ｓｅｃ−ブチルベンゼン、ｉｓｏ−ブチルベンゼン、キシレン、エチルトルエン、シメン、ｔ−ブチルトルエン、ジイソプロピルベンゼン、メシチレン、シクロヘキサン、オクタン、イソオクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジメチル、メチルエチルケトン、２−オクタノン、３−オクタノン、４−オクタノン、ジイソブチルケトン、２−ノナノン、３−ノナノン、４−ノナノン、５−ノナノン、２−デカノン、３−デカノン、４−デカノン、５−デカノン、２−ウンデカノン、３−ウンデカノン、４−ウンデカノン、５−ウンデカノン、６−ウンデカノン、ホロン、イソホロン、アセトフェノン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられ、好ましくは、炭素数２以上のアルキル基を有する芳香族炭化水素類を主成分とする溶剤、炭素数８以上のケトン類を主成分とする溶剤、最も好ましくは、２−オクタノンおよび／またはジイソブチルケトンを主成分とする溶剤である。単量体の組成に応じて、上記ポロジェンの量と種類を選定することにより、所望の細孔径分布と比表面積を得ることができる。
【００３４】
１．２．リガンド
生体関連物質と特異的に結合しうるリガンド（以下単に「リガンド」ともいう。）としては、標的物に対して適度なアフィニティーを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクロナール抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
【００３５】
イムノグロブリンの分離または精製に好適なリガンドとしては、プロテインＡまたはプロテインＧであり、さらに好ましくはプロテインＡまたはプロテインＡの部分ドメインを含むタンパクであり、最も好ましくは、プロテインＡまたはプロテインＡの部分ドメインの末端に、４個以上の連続するヒスチジン単位を含むペプチドを付加したタンパクである。
【００３６】
好ましいプロテインＡとしては、スタフィロコッカス属細菌由来のプロテインＡである。プロテインＡの部分ドメインとは、プロテインＡを構成するＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインのうちの、１つ以上４以下の構成ドメインである。
【００３７】
末端に特定のペプチドを付加したタンパクは、リコンビナントタンパクを作製する公知の方法によって得られる。末端に４個以上の連続するヒスチジン単位を含むペプチドを付加したタンパクは、上記担体への導入が容易で、導入後の活性が高いうえに、酸・アルカリなど化学的な安定性にも優れる。４個以上の連続するヒスチジン単位は、リガンドタンパクの末端に付加されるペプチドの任意の位置に組み込まれていればよい。連続するヒスチジン単位は、好ましくは４〜８個、最も好ましくは６個である。
【００３８】
４個以上の連続するヒスチジン単位を含むペプチドを付加したタンパクは、上記担体への結合量が多いため、本実施形態に係る担体にリガンドとして使用することにより、イムノグロブリンを多く捕捉することができる。このようなタンパクとしては、例えば、後述する一般式（１）または（２）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質が挙げられる。
【００３９】
１．２．１．イムノグロブリン結合タンパク質
好ましいリガンドの一例であるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質１」ともいう。）は、下記一般式（１）で表される。
【００４０】
Ｒ１−ｒ−Ｒ２  ・・・・・（１）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの末端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【００４１】
好ましいリガンドの他の一例であるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質２」ともいう。）は、下記一般式（２）で表される。
【００４２】
Ｒ２−ｒ−Ｒ１  ・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個の連続したＨｉｓを含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、前記連続したＨｉｓの先端がｒ（ｒ＝０の場合Ｒ２）と結合する。）、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｒは０〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【００４３】
上記一般式（１）および上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列、ｒで表されるアミノ酸配列、およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＣｙｓから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことが好ましい。この場合、上記アミノ酸配列中に同一または異なるドメインｔが複数含まれていてもよい。
【００４４】
また、上記一般式（１）および上記一般式（２）において、ｒで表されるアミノ酸配列中に例えばＴＥＶプロテアーゼなどのプロテアーゼ切断部位を含んでいてもよい。
【００４５】
タンパク質１または２を構成するアミノ酸の総個数は通常７０〜１０００であり、粒子に結合させる用途に使用する場合、８０〜６００であるのが好ましい。
【００４６】
本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位をいい、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質をいう。
【００４７】
１．２．１．１．イムノグロブリン結合ドメイン
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。これらのドメインのアミノ酸配列は例えば、Moks T, Abrahms L, et al.,Staphylococcal
protein A consists of five IgG-binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, 637-643のFig.1に記載されている。タンパク質１または２は、複数の同一または異なる種類のイムノグロブリン結合ドメインを有していてもよい。
【００４８】
また、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、天然型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよいし、または、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよい。ここで、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合ドメインと同等のものとして扱うことができ、例えば、天然型のプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を保持することが好ましい。
【００４９】
１．２．１．２．タンパク質１または２の製造
タンパク質１または２を製造するための標準技術としては、例えば、Frederick M. AusbelらによるCurrent Protocols In Molecular BiologyやSambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されてい
る公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。例えば、タンパク質１または２は、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。すなわち、目的の改変タンパク質をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、当該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、タンパク質１または２を大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、細菌中に核酸を導入することにより細菌を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
【００５０】
具体的には、プロテインＡの１個のイムノグロブリン結合ドメインは約６０個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であるため、例えば、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応によって繋げてプラスミドベクターに挿入することにより、目的の発現ベクターを取得することができる。その際に、当該タンパク質を大腸菌で効率良く発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた核酸配列を採用することは、当業者によって一般的に行われる方法である。また、後述する本発明の実施例に示しているようにStraphylococcus aureusのゲノムＤＮＡからＰＣＲ技術を用いて所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を構築することが可能である。
【００５１】
また、上述したように、タンパク質１または２は、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上（好ましくは２〜５個）を含む多量体タンパク質であってもよい。この様な多量体タンパク質をコードするｃＤＮＡは、１個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするｃＤＮＡを所定の個数、直列に連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミドに挿入して利用することにより、イムノグロブリン結合ドメインを２個以上含む多量体タンパク質を容易に製造することができる。
【００５２】
１．２．１．３．作用効果
本実施形態に係るリガンド結合担体が、タンパク質１または２をリガンドとして用いた場合、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、従来の担体と比較してイムノグロブリン結合タンパク質の保持量が多く、かつ、イムノグロブリン結合タンパク質の保持能に優れている。これにより、目的の生体関連物質の捕捉量を多くすることができる。
【００５３】
１．３．親水性化合物
親水性化合物は非特異吸着を低減できる点で、水酸基を有するのが好ましい。また、親水性化合物は、担体への結合量を多くできることから、炭素数３〜１２であることが好ましい。
【００５４】
メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物としては、好ましくは、メルカプト基を有する炭素数３〜１２のアルコール類、メルカプト基を有する炭素数３〜１２のフェノール類であり、より好ましくは、６−メルカプト−１−ヘキサノール、２−メルカプトエタノール、１−メルカプト−２−プロパノール、３−メルカプト−１−プロパノール、３−メルカプト−２−ブタノール、チオグリセロール（３−メルカプト−１，２−プロパンジオール）、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール、ジチオエリスリトール、１，４−ジチオ−Ｌ−トレイトールおよび４−ヒドロキシチオフェノールであり、中でも、メルカプト基を有する炭素数３〜１２のアルコールが好ましく、さらに好ましくは、メルカプト基を有する炭素数３〜１２の多価アルコールであり、最も好ましくは、安全性が高く非特異吸着がより少ない点でチオグリセロールである。
【００５５】
ここで、親水性化合物とは、２５℃の水１００ｇに５ｇの化合物を混ぜたときに、透明に溶解するものをいう。
【００５６】
メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物は、非特異吸着を低減する点、ならびに、生体関連物質が捕捉されているリガンド結合担体から生体関連物質を溶出により速やかに回収できる点で、１級アミノ基および２級アミノ基のいずれをも有さないことが好ましい。
【００５７】
また、メルカプト基を有する親水性化合物の分子量は、好ましくは５０００以下、さらに好ましくは１０００以下、最も好ましくは８０〜２００である。親水性化合物の分子量が５０００を超えると、リガンドと生体関連物質とのアフィニティーが阻害されて、生体関連物質の捕捉量が少なくなる場合がある。これらの理由から、カゼインやウシ血清アルブミンのようなタンパクは、親水性化合物として好ましくない。
【００５８】
本実施形態に係るリガンド結合担体は、メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物を用いてブロッキングされているため、ブロッキングしない場合や、モノエタノールアミン等のアミノ基を含有する親水性化合物でブロッキングした場合と比較して、生体関連物質の捕捉量が多い。
【００５９】
１．４．製造
本実施形態に係るリガンド結合担体は、メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体にリガンドを結合する工程と、メルカプト基を有する炭素数３〜１２の親水性化合物と前記官能基とを反応させる工程と、を含む製造方法により得ることができる。
【００６０】
メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体に、リガンドおよび親水性化合物を結合する際には、前記親水性化合物に先んじてリガンドを担体に結合してもよいし、あるいは、リガンドおよび前記親水性化合物を同時に担体に結合してもよい。
【００６１】
リガンドおよび親水性化合物の結合条件は、官能基の種類、リガンドの種類、親水性化合物の種類により異なるが、当業者にとっての公知の方法を採用することができる。
【００６２】
２．実施例
以下、本実施形態にかかる、生体関連物質を分離または精製するためのリガンド結合担体およびその製造方法を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
【００６３】
２．１．評価方法（イムノグロブリン捕捉量）
ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速６０ｃｍ／ｈｒにおけるヒトＩｇＧ抗体の捕捉量を測定した。カラム容量は１ｍＬ、ヒトＩｇＧ抗体（ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）は２５ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用し、溶出先端５％ブレークスルーのときのヒトＩｇＧ抗体吸着量および担体体積からイムノグロブリン捕捉量を求めた。
【００６４】
２．２．実験例
２．２．１．実施例１
（ｉ）メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体の合成
グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１１０ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）７３ｇをジイソブチルケトン（三井化学社製）２００ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）９７ｇに溶解させ、２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）２．４ｇを添加し、有機モノマー溶液を調製した。
【００６５】
次に、４２５０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）１７ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）１．７ｇおよび塩化ナトリウム８５ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液を調製した。
【００６６】
次いで、得られた有機モノマー溶液および水溶液をバッフル付き７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼、冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、３５０ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、８５℃で５時間攪拌を行った。
【００６７】
次いで、反応液を冷却したのち、イソプロピルアルコールおよび水で粒子を洗浄し、さらに粒子の水分散体を超音波洗浄機で分散した後、上清の微小粒子をデカンテーションで除く操作を３回繰り返した後、真空乾燥機にて乾燥を行い、メルカプト基と反応しうる官能基を有する担体１（１０３ｇ）を得た。水銀ポロシメーター（島津製作所社製  オートポアＩＶ９５０）を用いて、この担体１を測定したところ、細孔径測定レンジ０．５〜５０００ｎｍにおいて、細孔径最頻値は２２７ｎｍ、比表面積は１６６ｍ２／ｇであった。
【００６８】
（ｉｉ）リガンドの作製
プロテインＡ中のＤドメインとＡドメインからなる部分ドメインのＮ末端側に、ＭＫＨＨＨＨＨＨＰ−のアミノ酸配列末端を有するペプチドを付加したタンパクを、プラスミドＤＮＡを用いた遺伝子組み換え法により、リコンビナントタンパクとして得た。これをリガンド１（配列番号１）とする。リガンド１の具体的な調製方法を以下に説明する。リガンド１は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析により、それぞれアミノ酸配列が一致したことにより、図１に示すアミノ酸配列を有することが確認された。
【００６９】
（ａ）ＰＣＲ増幅および制限酵素の消化
Straphylococcus aureus（ＡＴＣＣ，  １０８３２）由来のプロテインＡ（Ｄドメイン＋Ａドメイン）のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。プライマー（表１参照）は、後述するサブクローニングを補助するために対応する制限酵素部位を有するように設計された。
【００７０】
リガンド１をコードするＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（New-England Bio Lab製）によって消化されて、ベクターｐＥＴＭ−１１（図２参照、kind gift of D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germanyから入手）に挿入された。
【００７１】
なお、図２に示される発現ベクターは選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【００７２】
また、図２に示されるリガンド１のアミノ酸配列において、「Ｔｅｖ」はＴＥＶ（Tobacco Etch Virus）プロテアーゼ認識部位（アミノ酸配列：ＥＮＬＹＦＱＧ）を示す。ＴＥＶプロテアーゼはアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧを認識し、ＱとＣの間を切断する。
【００７３】
上記制限酵素は、リガンド１の挿入配列に基づく１対のプライマーを設計することにより導入された。また、ＰＣＲ増幅は、表１に示されるプライマー（配列番号２および３）を用いて行われた。
【００７４】
【表１】
2010189290.tif 000002
【００７５】
Straphylococcus aureusのgenomic ＤＮＡテンプレート（５００ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、各プライマー５ｐｌ、１０×Ｐｆｕ緩衝液（Fermentas製）５μｌ、およびＰｆｕポリメラーゼ（Fermentas製）（５ユニット／μｌ）１μｌを含むＰＣＲ増幅溶液に滅菌水を加えて、最終的な液の体積を５０μｌとした。ＰＣＲ増幅の条件は以下の通りである：９４℃で１分、次に９４℃で３０秒、５６℃で１分、７２℃で１分の３０サイクル、最後に７２℃で１０分。このＰＣＲ反応をＰＸ２  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＣＲ装置（Thermo Electron Corporation製）にて行った。
【００７６】
（ｂ）ライゲーションおよび形質転換
制限酵素で消化されたＤＮＡフラグメントのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolab製）１００−２００ユニット／ｍｌおよび５×リガーゼ緩衝液（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolab）社製）を用いて１２℃で１２−１６時間行われた。プラスミドの形質転換のために、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５−α株細胞（New England Biolab製）を使用した。
【００７７】
（ｃ）プラスミドＤＮＡの調製および配列解析
陽性コロニーを選択し、ミニプレップキット（Mini Prep Kit）（キアゲン（Qiagen）社製）によってプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡについて、挿入されたＤＮＡフラグメントが正しい配列であるかどうかを確認するために、3730 NDA Sequencer（Applied Biosystems製）で配列解析を行った。
【００７８】
（ｄ）リガンド１の発現および精製
組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（リガンド１）を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞（STRATAGENE製）内にて１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。
【００７９】
得られたリガンド１は、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）粒子、キアゲン社製）によって精製された。精製されたリガンド１は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥバイオサイエンス社製）によって、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液中でさらに精製された。
【００８０】
（ｉｉｉ）担体と、リガンドおよび親水性化合物との結合
３００ｍｇの担体１と、７０．２ｍｇのリガンド１とが１８ｍＬのリン酸バッファー（ｐＨ６．８）に分散した混合液を調製し、４℃で２４時間転倒混和し、リガンド１を担体１に結合させた。次いで、０．５ｍｏｌ／Ｌチオグリセロール（親水性化合物）と０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムとからなる水溶液２０ｍＬで２回洗浄した後、０．５ｍｏｌ／Ｌチオグリセロールと０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムとからなるｐＨ８．３のバッファー水溶液２０ｍＬ中、室温で４時間転倒混和し、残余のエポキシ基をブロッキングした。２０％エタノール水溶液で洗浄して、３２０ｍｇのリガンド結合担体１を得た。
【００８１】
（ｉｖ）評価（イムノグロブリン捕捉量の測定）
リガンド１を内径０．５ｃｍ、高さ５ｃｍのカラムに充填し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるイムノグロブリン（ヒトＩｇＧ抗体）の捕捉量を測定した。ヒトＩｇＧ抗体（ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）は２５ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのヒトＩｇＧ抗体吸着量およびリガンド１の体積から算出したリガンド結合担体１のイムノグロブリン（ヒトＩｇＧ抗体）捕捉量は、４５ｍｇ／ｍＬであった。
【００８２】
２．２．２．実施例２
実施例１で０．５ｍｏｌ／Ｌチオグリセロールと０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムとからなるｐＨ８．３のバッファー水溶液の代わりに、０．５ｍｏｌ／Ｌの３−メルカプト−１−プロパノールと０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムとからなるｐＨ８．３のバッファー水溶液を使用した以外は、実施例１と同様にして、リガンド結合担体２を得た。実施例１と同様の方法にて評価されたリガンド結合担体２のイムノグロブリン捕捉量は、４０ｍｇ／ｍＬであった。
【００８３】
２．２．３．比較例１（メルカプト基を有さない親水性化合物を使用した例）
実施例１で０．５ｍｏｌ／Ｌチオグリセロールと０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムとからなるｐＨ８．３のバッファー水溶液の代わりに、０．５ｍｏｌ／Ｌモノエタノールアミンと０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムとからなるｐＨ８．３のバッファー水溶液を使用した以外は、実施例１と同様にして、リガンド結合担体３を得た。実施例１と同様の方法にて評価されたリガンド結合担体３のイムノグロブリン捕捉量は、３８ｍｇ／ｍＬであった。
【００８４】
また、比較例１では、リガンド結合担体３からイムノグロブリンを溶出する際に使用した溶出液の量が、実施例１および２のリガンド結合担体１および２を用いた場合と比較して多く、溶出に要する時間も実施例１および２と比較して長かった。その原因として以下の点が考えられる。すなわち、比較例１では、アミノ基を含有する親水性化合物（モノエタノールアミン）を使用して残余のエポキシ基のブロッキングを行ったため、比較例１のリガンド結合担体３には、モノエタノールアミンの１級アミノ基とエポキシ基とが反応して生じた２級アミノ基が存在する。イムノグロブリンを捕捉したリガンド結合担体３からイムノグロブリンを溶出するために溶出液のｐＨを低下させる際、この２級アミノ基がプロトンを捕捉するため、ｐＨの低下が遅くなる結果、イムノグロブリンの溶出に必要な溶出液の量が多くなり、溶出に要する時間が長くなったと推察される。
【００８５】
２．２．４．比較例２（親水性化合物を使用しない例）
実施例１で０．５ｍｏｌ／Ｌチオグリセロールと０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムとからなるｐＨ８．３のバッファー水溶液の代わりに、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含むｐＨ８．３のバッファー水溶液を使用した以外は、実施例１と同様にして、リガンド結合担体４を得た。実施例１と同様の方法にて評価されたリガンド結合担体４のイムノグロブリン捕捉量は、３６ｍｇ／ｍＬであった。この結果から、比較例２では親水性化合物を使用しなかったため、残余のエポキシ基のブロッキングが不充分となり、残留したエポキシ基による非特異吸着が生じた結果、イムノグロブリン捕捉量が少なかったと推測される。
【００８６】
本実施形態に係る説明は以上である。本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらなる種々の変形が可能である。また本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【図１】
2010189290.tif 000003
【図２】
2010189290.tif 000004
【配列表】
2010189290000001.app