(57)【要約】【課題】ＥＳ細胞から、任意の数の均一な大きさの胚様体を複数個同時に形成することのできる胚様体形成用マルチウェルプレートを提供すること。【解決手段】垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部（２）及び、略円形の開口部（３）を有する培養ウェル（１）を複数個備えるマルチウェルプレートであって、前記底部（２）内面の少なくとも曲面部分が親水性樹脂層を備えていると共に、前記底部（２）内面の曲率半径（Ｒ）が、１．０ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下であることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部及び、略円形の開口部を有する培養ウェルを複数個備えるマルチウェルプレートであって、
前記底部内面の少なくとも曲面部分が親水性樹脂層を備えていると共に、前記底部内面の曲率半径（Ｒ）が、１．０ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下であることを特徴とするマルチウェルプレート。
【請求項２】
前記開口部の直径は、４．０ｍｍ以上、１１．０ｍｍ以下である請求項１に記載のマルチウェルプレート。
【請求項３】
前記培養ウェルの容量は、８０μＬ以上、５００μＬ以下である請求項１又は２に記載のマルチウェルプレート。
【請求項４】
前記培養ウェルの側面の稜線を前記培養ウェルの底部を越えて延長した直線（ａ）と、前記開口部の中心から垂直に前記培養ウェルの底部を越えて延長した直線（ｂ）と、が交差する角度（θ）が４°以上、３０°以下である請求項１ないし３のいずれかに記載のマルチウェルプレート。
【請求項５】
前記親水性樹脂層は、水溶性樹脂を培養ウェル表面に接触させた後に非水溶性硬化皮膜に変性させることで形成される請求項１ないし４のいずれかに記載のマルチウェルプレート。
【請求項６】
前記水溶性樹脂は、側鎖に放射線反応性、感光性、熱反応性の中から選ばれる官能基を有するものである請求項５に記載のマルチウェルプレート。
【請求項７】
前記水溶性樹脂は、ポリ酢酸ビニルのけん化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールの中から選ばれる１種以上を含むものである請求項５又は６に記載のマルチウェルプレート。
【請求項８】
前記ポリ酢酸ビニルのけん化物は、該ポリ酢酸ビニル全体の２０〜１００ｍｏｌ％けん化したものである請求項７に記載のマルチウェルプレート。
【請求項９】
前記感光性の官能基は、窒素原子を含むものである請求項６に記載のマルチウェルプレート。
【請求項１０】
前記感光性の官能基は、アジド基を有するものである請求項６又は９に記載のマルチウェルプレート。
【請求項１１】
前記マルチウェルプレートに備えられた前記培養ウェルの数が４０個以上、１００個以下である請求項１ないし１０のいずれかに記載のマルチウェルプレート。
【請求項１２】
幹細胞から胚用体を形成し、その後前記胚葉体を培養するものに用いられる請求項１ないし１１のいずれかに記載のマルチウェルプレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルチウェルプレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
多種・多様な細胞に分化する能力を有するＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：人工多能性幹細胞）は現在、創薬・基礎医学分野における薬効評価や動物実験代替への応用、更には再生医療分野における組織を用いた移植治療の実現に向け様々な研究に用いられている。
【０００３】
このような分化万能細胞を用いたインビトロでの培養研究を行う上で、ＥＢ体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ：胚様体）と呼ばれる擬似的な胚の形成がファーストステップとなる。
【０００４】
また、評価・実験に用いるＥＢ体は実験精度の観点からＥＢ体の状態（サイズ、数、質）が均一であることが求められ、分化誘導に対する応答性を有したいわゆる質の良い状態でなおかつ均一な大きさのＥＢ体を複数個形成させてから評価に供することが重要となる。
【０００５】
ＥＳ細胞からＥＢ体を形成する場合、接着培養ではＥＢ体は形成されず非特異的な分化を開始してしまうため、細胞が容器に接着しないような特殊な表面処理を施した培養容器を用い、完全な浮遊状態で培養する必要がある。
【０００６】
ＥＳ細胞を浮遊状態で培養するために最も広く用いられているのが懸垂培養（ハンギングドロップ培養）と呼ばれる方法である。ハンギングドロップ培養はその名のとおり、水滴状に垂れ下げた培養液の中で細胞を培養する方法である。すなわち、マルチウェルプレートの穴（ウェル）に、ミネラルオイルと緩衝液を添加し、マルチウェルプレートの蓋の各ウェル上に重なる位置にＥＳ細胞を含む培養懸濁液を液滴となるようにスポッティングし、マルチウェルプレートにかぶせて培養する。しかし、ハンギングドロップ法においては、ＥＢ体形成の成功率が低い、一度に形成できるＥＢ体の量が少ない、といった問題に加えて、形成されるＥＢ体のサイズが不揃いで、均一な状態のＥＢ体を得ることが困難である。
【０００７】
また特許文献１では、容器をポリプロピレン製のチューブとしてＥＳ細胞の接着を防ぎ、かつ容器の形状を円錐状にして底部にＥＳ細胞が集まりやすくすることで、ＥＢ体を簡便かつ効率的に形成させることが開示されている。しかしながら、ポリプロピレンは透明性が低く顕微鏡観察によるＥＢ体形成性の確認ができ難い点が大きな問題であり、更に容器一つで一つのＥＢ体しか形成されないので、均一な状態のＥＢ体を複数個得ることはやはり困難である。
【０００８】
また、特定のホスホリルコリン類似基を有する化合物を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器が開示されている（例えば、特許文献１参照）。当該特許文献には、ホスホリルコリン基が有する生体適合性を利用してＥＳ細胞を浮遊状態で培養することで、ＥＢ体が良好に形成されると記載されている。
更に９６穴のＵ底マルチウェルプレートを利用して複数のＥＢ体を同時に形成した技術（例えば、特許文献２参照）が開示されており、基材として現在幅広く使用されているＵ底タイプと呼ばれているウェルの断面形状が略Ｕ字状であり、底面が半径（Ｒ）３．１ｍｍ乃至３．４ｍｍの曲線を有する９６穴のマルチウェルプレートが用いられている。しかしながら、上記特許文献２に記載されている実施例には一つのプレートで同時に形成したＥＢ体のサイズの均一性や各々ウェル内に形成されたＥＢ体の数の均一性については触れられていない。
【特許文献１】特開２００４−２５４６２２号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／００１０１９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記こと情に鑑みてなされたものであり、均一な大きさ、且つ良質の胚様体を複数個同時に形成することのできるマルチウェルプレートを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような目的は、下記（１）から（１２）に記載の本発明により達成される。
（１）垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部及び、略円形の開口部を有する培養ウェルを複数個備えるマルチウェルプレートであって、
前記底部内面の少なくとも曲面部分が親水性樹脂層を備えていると共に、前記底部内面の曲率半径（Ｒ）が、１．０ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下であることを特徴とするマルチウェルプレート。
（２）前記開口部の直径は、４．０ｍｍ以上、１１．０ｍｍ以下である（１）に記載のマルチウェルプレート。
（３）前記培養ウェルの容量は、８０μＬ以上、５００μＬ以下である（１）又は（２）に記載のマルチウェルプレート。
（４）前記培養ウェルの側面の稜線を前記培養ウェルの底部を越えて延長した直線（ａ）と、前記開口部の中心から垂直に前記培養ウェルの底部を越えて延長した直線（ｂ）と、が交差する角度（θ）が４°以上、３０°以下である（１）ないし（３）のいずれかに記載のマルチウェルプレート。
（５）前記親水性樹脂層は、水溶性樹脂を培養ウェル表面に接触させた後に非水溶性硬化皮膜に変性させることで形成される（１）ないし（４）のいずれかに記載のマルチウェルプレート。
（６）前記水溶性樹脂は、側鎖に放射線反応性、感光性、熱反応性の中から選ばれる官能基を有するものである（５）に記載のマルチウェルプレート。
（７）前記水溶性樹脂は、ポリ酢酸ビニルのけん化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールの中から選ばれる１種以上を含むものである（５）又は（６）に記載のマルチウェルプレート。
（８）前記ポリ酢酸ビニルのけん化物は、該ポリ酢酸ビニル全体の２０〜１００ｍｏｌ％けん化したものである（７）に記載のマルチウェルプレート。
（９）前記感光性の官能基は、窒素原子を含むものである（５）に記載のマルチウェルプレート。
（１０）前記感光性の官能基は、アジド基を有するものである（６）又は（７）に記載のマルチウェルプレート。
（１１）前記マルチウェルプレートに備えられた前記培養ウェルの数が４０個以上、１００個以下である（１）ないし（１０）のいずれかに記載のマルチウェルプレート。
（１２）幹細胞から胚用体を形成し、その後前記胚葉体を培養するものに用いられる（１）ないし（１１）のいずれかに記載のマルチウェルプレート。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、上記こと情に鑑みてなされたものであり、均一な大きさ、且つ良質の胚様体を複数個同時に形成することのできる胚様体形成用マルチウェルプレートを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部及び、略円形の開口部を有する培養ウェル（を複数個備えるマルチウェルプレートであって、
前記底部内面の少なくとも曲面部分が親水性樹脂層を備えていると共に、前記底部内面の曲率半径（Ｒ）が、１．０ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下であることを特徴とするマルチウェルプレートである。
【００１３】
本発明で使用するマルチウェルプレートは樹脂材料で成形することができる。この樹脂材料は、上記マルチウェルプレートをディスポーザブルタイプにすることができるのに加え、種々の形状を容易に成形できるものである。上記樹脂材料としては、例えば、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、エチレン-プロピレン共重合体等のポリオレフィン系樹脂または環状ポリオレフィン系樹脂、ポリスチレン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン系樹脂等のポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂等のメタクリル系樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリサルホン樹脂、ポリエーテルサルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、ポリアクリロニトリル等のアクリル系樹脂、プロピオネート樹脂等の繊維素系樹脂等が挙げられる。これらの中でもマルチウェルプレートに求められる成形性、透明性、放射線耐性の点においてポリスチレン樹脂が特に好ましい。
【００１４】
上記樹脂材料の重量平均分子量は、特に限定されないが、１０，０００以上５００，０００以下が好ましく、特に２０，０００以上１００，０００以下が好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、マルチウェルプレートの成形性に優れる。
上記重量平均分子量は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー法（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  システム、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＦ−８００  カラム、何れも昭和電工社製、溶出溶媒：テトラヒドロフラン）を用いて測定することができる。
【００１５】
上記樹脂材料には成形性向上、耐候性向上を目的として、本発明の目的を損なわない範囲で、例えば、炭化水素系、脂肪酸アミド系の滑剤やフェノール系、アミン系の酸化防止剤等の添加剤を添加することができる。
【００１６】
上記樹脂材料から本発明のマルチウェルプレートを製造する場合、例えば射出成形、ブロー成形、インジェクションブロー成形により、製造することができる。
【００１７】
本発明のマルチウェルプレートに備えられた培養ウェルの数は、４０個以上、１００個以下であることが好ましい。培養ウェルの数を上記範囲とすることで、胚様体形成のための培地交換等の培養操作を良好なものとすることができる。
【００１８】
上記培養ウェルの断面底部を略Ｕ字形状とすることで細胞がウェル底部に集まりやすくなり、胚様体が効率よく形成させることができる。
更に当該底部内面の少なくとも局面部分が親水性樹脂層を備えていることで、細胞の接着を防止することができる。
親水性樹脂層の形成方法は特に限定するものではないが、水溶性樹脂を培養ウェル表面に接触させた後に非水溶性硬化皮膜に変成させて形成されていることが好ましく、そうすることにより、特に細胞の接着が少ない親水性樹脂層を得ることができ、胚様体を効率よく形成することができる。
【００１９】
本発明のマルチウェルプレートに用いられる水溶性樹脂とは、水分子とのイオンもしくは水素結合により水和し、その結果として水に溶解するものであり、言い換えれば、水溶性樹脂とは水に溶解するために分子内の主鎖に対して必要充分な量のイオン性もしくは極性の側鎖を持つ樹脂であり、且つ２５℃の水１００ｇに対して１．０ｇ以上溶解可能なものをいう。
【００２０】
上記水溶性樹脂の平均重合度は、特に限定されないが、１００以上、１０，０００以下が好ましく、特に２００以上、５，０００以下が好ましい。平均重合度が１００以上であると、均一な皮膜を成形することができ、また、平均重合度が１０，０００以下であれば作業性に適した水溶性の粘度とすることができる。
【００２１】
水溶性樹脂としては、例えば、ポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリペンタエリスリトールトリアクリレート、ポリペンタエリスリトールテトラアクリレート、ポリジエチレングリコールジアクリレート、およびそれらを構成するモノマー同士の共重合体、また２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体等が挙げられる。これらの中でもポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールの中から選ばれる１種以上と上記反応基からなる構造が好ましい。これにより、ＥＳ細胞に対する刺激を抑制し、ＥＢ体の形成速度、形成率、および形成したＥＢ体の質を向上することができる。
【００２２】
ここで、ポリ酢酸ビニルのケン化物とは、例えば、ポリビニルアルコールまたはビニルアルコールと他の化合物との共重合体をいう。さらには、例えば、ビニルアルコールと、親水基変性、疎水基変性、アニオン変性、カチオン変性、アミド基変性またはアセトアセチル基のような反応基変性させた変性酢酸ビニルのケン化物等も含まれる。
【００２３】
また、上記ポリ酢酸ビニルのケン化物を用いる場合、上記ポリ酢酸ビニルのケン化物のケン化度は特に限定されないが、該ポリ酢酸ビニル全体の２０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％以下が好ましく、特に５０ｍｏｌ％以上、９５ｍｏｌ％以下が好ましい。上記ポリ酢酸ビニルのケン化度が上記範囲内であると、ＥＢ体の形成速度、形成率、および形成したＥＢ体の質を特に向上することができる。
【００２４】
上記水溶性樹脂は、２０℃における粘度が１ｍＰａ・ｓ以上、１０ｍＰａ・ｓ以下に、好ましくは２ｍＰａ・ｓ以上、７ｍＰａ・ｓ以下となるよう溶媒を用いて調製されたものを使用することが好ましい。その際に使用する溶媒は水もしくは溶解度を高めるために、水と有機溶媒との混合物を使用することができる。水溶性樹脂の粘度が上記範囲内であると、細胞の接着量が少なく、細胞凝集塊形成効果が特に優れる。充分な細胞の接着低減効果により、良好な胚様体の形成性が得られる。被覆層の厚みとしては、１００ｎｍ以上５，０００ｎｍ以下が好ましく、１５０以上１，０００ｎｍ以下がより好ましい。
被覆層の厚みを上記下限値以上にすることにより細胞が基材から受ける物理的な刺激をより抑えることができ、厚みを上記上限値以下とすることにより被覆層に取り込まれる蛋白質の量を少なくし、蛋白質を介した細胞の接着を抑えることにより胚様体の形成率がより向上させることができる。
【００２５】
水溶性樹脂を培養ウェル内面に被覆させる方法としては、例えば、上記水溶性樹脂溶液を培養ウェル内面に分注した後、容器を傾けて溶液を排出する方法を用いることができる。その様な方法で培養ウェル内面に水溶性樹脂を接触させた後、培養ウェル内面に残留した水溶性樹脂溶液を乾燥させることで水溶性樹脂被覆層を形成することができる。
【００２６】
本発明の製造方法においては、上記工程後に、上記水溶性被覆層を硬化させて非水溶性硬化皮膜層に変性する非水溶性硬化皮膜変性工程を有することを特徴とする。上記水溶性被覆層を非水溶性硬化皮膜層とすることで、密度の高いイオン性もしくは極性の側鎖を持つ表面を構築することができる。この表面に構築されたイオン性もしくは極性の側鎖は、培養液と接触した際に、静電相互作用もしくは水素結合により水分子と水和し、培養ウェル表面は実質的に水分子の密な水和層となり、この水和層はＥＳ細胞に対する基材表面からの刺激を抑制し、質的に良好なＥＢ体が迅速に形成されることとなる。こうすることで、培養液を接触させた際に、水溶性樹脂の被覆層が溶解、遊離することを防ぎ、胚様体形成用容器として必要な耐水性を獲得することができる。
【００２７】
上記水溶性皮膜層を硬化させる方法としては特に限定するものではなく、側鎖に硬化させるための官能基、例えば放射線反応性、感光性、熱反応性の官能基を有する水溶性樹脂を用いることができる。例えば、感光性の官能基であれば、ジアゾ基、アジド基、シンモナイル基等が挙げられ、また、熱反応性および放射線反応性の官能基であれば、ビニル基、エポキシ基等を挙げることができる。これらの中でも硬化処理を迅速におこなうことができ、簡易な設備で硬化させることができる感光性の官能基を有する水溶性樹脂が特に好ましい。
【００２８】
光照射により硬化させる場合の光源は、特に限定するものではなく、照度が５．０ｍＷ／ｃｍ2程度の超高圧水銀灯または０．１ｍＷ／ｃｍ2程度のＵＶランプを使用することができる。光照射による硬化は照度と照射時間で制御することができるため、照度の低い光源を用いる場合は照射時間を長くすればよく、反応性の高い感光基を選択した場合は蛍光灯下で硬化させることも可能である。例えば、５．０ｍＷ／ｃｍ2の超高圧水銀灯を使用した場合は１ないし１０秒の照射で、０．１ｍＷ／ｃｍ2のＵＶランプを使用した場合は３ないし１０分の照射で充分に硬化させることができる。
【００２９】
上記感光性の官能基としては、アジド基を含む官能基が特に好ましい。これにより、実用的な２３０〜５００ｎｍの波長で反応させることができ、更に優れた解像性により皮膜の形成性を向上することができる。このように、表面に予め水溶性樹脂被覆層を形成し、該被覆層を硬化させて非水溶性硬化皮膜層に変性する工程によって上記の厚みの被覆層を得る。
【００３０】
水溶性樹脂を使用するもう一つの利点としては、硬化後に表面を水で洗浄することで、未反応の樹脂を容易に洗い流すことができるという点である。もし、硬化反応性が悪い等の原因で溶出物が確認された場合は、硬化後に洗浄工程を入れることにより、溶出物を低減し、更に良好な胚様体形成率を得ることができる。
【００３１】
上記に加えて培養ウェル（１）の垂直方面における断面が略Ｕ字形状であって、該底部（２）内面の曲率半径（Ｒ）が１．０ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下であることが特徴である。
上記親水性樹脂層と略Ｕ字形状の底部（２）及び内面の曲率半径（Ｒ）を上記範囲とすることで、プレート内の各培養ウェル（１）で形成されるＥＢ体がより球状に近い均一な状態となり、培養ウェル（１）毎に１個のＥＢ体が形成される割合を増加させることができる。
ＥＢ体の形成は細胞間のインタラクションによるものであるため、ＥＢ体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成する場合には、細胞が培養器から強い刺激を受けない状態であることが必須であるが、細胞密度が低い例えば平底のディッシュでそのような状態にしてＥＢ体を形成させた場合には、形成されるＥＢ体のサイズや形状、及び質を任意にコントロールすることは困難であり、結果として様々な状態のＥＢ体が複数個形成されることとなる。
【００３２】
本発明のマルチウェルプレートにおいては、該底部内面の曲率半径（Ｒ）を３．０ｍｍ以下とすることにより細胞同士が充分な密度で集まる為、前述の効果を得ることができる。
また、底部内面の曲率半径（Ｒ）が３．０ｍｍ以上である従来のマルチウェルプレートに比べて、ウェル形状が底部（２）に向けて細くなるため、底部（２）から同じ高さで培地を吸引した場合の培地交換効率（培地全体量に対する吸引除去する培地量の割合）に優れる点も本発明の大きな特徴の一つである。
【００３３】
更に、曲率半径（Ｒ）を１．０ｍｍ以上とすることにより、培養時に発生する死細胞が底面への凝集が高密度になりすぎることなく倒立顕微鏡による顕鏡性に優れる為、培養ウェル内の細胞または胚様体の観察を正確に行うことができる。
【００３４】
また、前述の略円形の開口部（３）の直径を４．０ｍｍ以上とすることでマルチディスペンサーを使用する場合の操作性に優れ、１１．０ｍｍ以下とすることでマルチウェルプレート１枚あたり４８個以上の複数の培養ウェルを備えることができる。
【００３５】
培養ウェル（１）の容量は８０μＬ以上、５００μＬ以下であることが好ましい。こうすることで、１ウェルあたり１個のＥＢ体を形成するに必要充分な量の培地を添加することができる。
より好ましくは８０μＬ以上、２００μＬ以下である。こうすることで、培地や試薬の使用量を減らすことができる。
【００３６】
図１に示すように、上記培養ウェル（１）の側面の稜線を上記培養ウェルの底部（２）を越えて延長した直線（ａ）と、上記開口部（３）の中心から垂直に前記培養ウェルの底部（２）を越えて延長した直線（ｂ）と、が交差する角度（θ）が４°以上、３０°以下であることが好ましい。こうすることで、培地中の細胞がより底部（２）に集まりやすくなり、更に培地交換の際のディスペンサーチップ操作も容易となる。より好ましくは、５°以上、１５°以下である。こうすることで略Ｕ字形状の底部（２）と側面がよりなだらかにつながる形状となり培地中の細胞が更に集まりやすくなり、より良好な形状のＥＢ体を形成させることができる。
【００３７】
培養容器の必須条件である滅菌に関しては、例えば、エチレンオキサイドガス滅菌、感熱滅菌、蒸気滅菌、放射線滅菌等が挙げられるが、γ線あるいは電子線を用いた放射線滅菌が好ましく、大量生産を行う場合は放射線透過性の点でγ線滅菌が特に好ましい。
放射線の吸収線量については特に限定するものではないが、吸収線量が低すぎると滅菌性は確保されず、高すぎると細胞培養容器および被覆層が劣化してしまう場合がある。
【００３８】
本発明のマルチウェルプレートにおける放射線の吸収線量としては、１ｋＧｙ以上、５０ｋＧｙ以下が好ましく、５ｋＧｙ以上、３０ｋＧｙ以下が特に好ましい。これによって本発明の培養容器の特性を充分に保持したまま滅菌性を付与することができる。
【００３９】
次に、本発明のマルチウェルプレートを用いた本発明の胚様体の形成方法について説明する。
線維芽細胞等のフィーダー上で培養した未分化のＥＳ細胞を、必要に応じて血清や成長因子等の添加物を加えた既知の培養液に任意の濃度で分散させた細胞懸濁液を本発明の培養容器に播種し、炭酸ガスインキュベーター等の環境下で培養することで、通常２日〜７日間で胚様体の形成が確認される。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１）
樹脂材料としてポリスチレン樹脂（ＰＳジャパン社製、ＨＦ７７）を用いて、射出成形により９６穴マルチウェルプレートを成形した。得られたマルチウェルプレートにプラズマ処理装置（ＢＲＡＮＳＯＮ／ＩＰＣ社製  ＳＥＲＩＥＳ７０００）を用いてプラズマ処理（酸素プラズマ５分）を行い、前処理としてマルチウェルプレート表面に濡れ性を付与した。
得られたマルチウェルプレートの形状は、横１２７．６ｍｍ、縦８５．８ｍｍ、高さ２０．２ｍｍ、ウェルの開口部直径は７．０ｍｍ、底部内面の曲率半径２．３ｍｍ、深さ１１．０ｍｍ、であった。また、上記培養ウェル（１）の側面の稜線を上記培養ウェルの底部（２）を越えて延長した直線（ａ）と、開口部（３）の中心から垂直に上記培養ウェルの底部（２）を越えて延長した直線（ｂ）と、が交差する角度（θ）は、８．７°であった。
次に、水溶性樹脂として側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（東洋合成工業社製  ＡＷＰ、水溶性樹脂の平均重合度１６００、感光基の導入率０．６５ｍｏｌ％）をアルミ箔で遮光をしたガラス容器中で、２５容量％エタノール水溶液に溶解し、１．０重量％の溶液を調整した。
上述のマルチウェルプレートを前記アルミ箔で遮光したガラス容器に１分間、浸漬した後、取り出し、ディッシュを裏返して溶液を充分廃棄し、４０℃で６０分一次乾燥した後、ＵＶランプで２５０ｎｍのＵＶ光を０．１ｍＷ／ｃｍ2×３分間照射して水溶性樹脂を硬化した後、純水で３回繰り返し洗浄し、乾燥後、γ線を吸収線量１０ｋＧｙで照射（ラジエ工業株式会社）して、本発明のマルチウェルプレートを得た。
得られたマルチウェルプレートの表面には、上記水溶性樹脂で形成される層が厚さ４５０ｎｍで形成されていた。なお、層の厚さは液体窒素中で破断したマルチウェルプレートの破断面を電子顕微鏡（ＦＥＩ社製  Ｑｕａｎｔａ４００Ｆ）を用いて測定した。
【００４２】
（実施例２）
樹脂材料として環状オレフィン共重合系樹脂（ポリプラスチックス社製、ＴＯＰＡＳR  ６０１３）を用いた以外は実施例１と同様にした。
得られたマルチウェルプレートの表面には、上記側鎖に第１の官能基を有する水溶性樹脂で形成される層が厚さ５００ｎｍで形成されていた。
【００４３】
（比較例１）
実施例１の工程からプラズマ処理による濡れ性の付与以降、水溶性樹脂への浸漬、及びＵＶランプによる硬化、洗浄、乾燥までの工程を除き、マルチウェルプレートを得た。また、上記培養ウェル（１）の側面の稜線を上記培養ウェルの底部（２）を越えて延長した直線（ａ）と、開口部（３）の中心から垂直に上記培養ウェルの底部を越えて延長した直線（ｂ）と、が交差する角度（θ）は、１．５°であった。
【００４４】
（比較例２）
成形品に市販品のマルチウェルプレートを使用した以外は実施例１と同じ工程にてマルチウェルプレートを得た。
市販品のマルチウェルプレートは、住友ベークライト社製  ＭＳ−３０９ＵＲを使用し、形状は横１２７．６ｍｍ、縦８５．８ｍｍ、高さ２０．２ｍｍ、ウェルの開口部直径は７．０ｍｍ、底部内面の曲率半径３．１ｍｍ、深さ１１．０ｍｍであった。
【００４５】
得られた容器について、以下の評価を行った。評価項目と得られた結果を表１に示す。
【００４６】
１．ＨｅｐＧ２細胞を用いた培地交換効率の評価
ＨｅｐＧ２細胞を１×１０4個／ｍＬの濃度で培地（ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ＋ウシ胎児血清１０％）に懸濁し、１００μＬ／ウェルの濃度で播種し、炭酸ガスインキュベーター培養を続けた。
３日後に凝集塊の形成を認めた後に８連マルチディスペンサーを用いて各ウェルの１／２容量（５０μＬ）及び４／５容量（８０μＬ）の培地交換を行い、培地交換後に吸引除去されずウェル内に残っている凝集塊の数を計測した。
【００４７】
２．マウスＥＳ細胞を用いたＥＢ体形成評価
定法に従いフィーダー（マウス線維芽細胞）上で培養したマウスＥＳ細胞を２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、実施例１、２および比較例１、２に２ｍＬづつ播種し、５％の炭酸ガス雰囲気下で培養し、５日後に形成された胚様体の形状を比較した。
胚様体の形状比較は、プレート内各々のウェルに形成した胚様体形状を以下のランクに分けて評価を行った。
Ａ：ウェル内に単一かつ球状の胚様体が存在した。
Ｂ：ウェル内に単一であるがいびつな形状の胚様体が存在した。
Ｃ：ウェル内に複数の胚様体が存在した。
Ｄ：胚様体が形成されず細胞が壁面に接着伸展した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
表１の結果から明らかなように、ＨｅｐＧ２細胞を用いた培地交換効率の評価において、
本発明のマルチウェルプレートを用いた実施例１および実施例２においては、何れも８０％以上のウェルで単一かつきれいな球状の均一な胚様体の形成が認められた。また、４／５の培地交換においてもほぼ１００％近くのウェルに凝集塊が残っており、培地を効率的に交換できることが示された。
一方、比較例１では全てのウェルで細胞は接着・伸展し、胚様体の形成はず、比較例２では１／２の培地交換後には１００％のウェルに凝集塊が残っていたが４／５の培地を交換すると凝集塊の残留率は大幅に落ちて５９％であった。
また、胚様体形成性の比較において、比較例２では全てのウェルで胚様体の形成が確認されたが、形状がいびつなものが多く、一部ウェル内に複数の胚様体の形成が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ウェル形状断面図の一例である。
【符号の説明】
【００５１】
１．培養ウェル
２．底部
３．開口部
【図１】
2010094045.tif 000004