(57)【要約】      （修正有）【課題】ステムループ構造を有するプローブにおいて、ステム部位の塩基配列に制限がなく、簡易に調製できる蛍光プローブを提供すること。【解決手段】式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有することを特徴とする蛍光プローブ。Ｒは蛍光性有機基、Ｘは蛍光性有機基とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基、Ｙは水素原子又は水酸基を表す。2010060394.tif 000009【選択図】図１
2010060394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステムループ構造を有するプローブにおいて、
式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有することを特徴とする蛍光プローブ。
【化１】
2010060394.tif 000008
Ｒは蛍光性有機基、Ｘは蛍光性有機基とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基、Ｙは水素原子又は水酸基、Ｏは酸素原子、Ｐはリン原子、Ｃは炭素原子、Ｈは水素原子、Ｎは窒素原子を表す。
【請求項２】
式（１）で表されるヌクレオチド単位をステム部位に有する請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
式（１）で表されるヌクレオチド単位を３’末端から２〜１０番目の塩基の位置に有する請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
蛍光性有機基とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基（Ｘ）が、炭素数１〜１８のアルキレン基を含んでなる請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
蛍光性有機基が、ピレン骨格、アントラセン骨格、ペリレン骨格、アクリドン骨格、クマリン骨格、イソクマリン骨格、キサントン骨格、チオキサントン骨格、フェナントレン骨格、ベンゾフェノン骨格、フルオレン骨格又はジフェニルチオエーテル骨格を有する有機基である請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
ステム部位の塩基の数が４〜１０である請求項１〜５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として少なくとも２個含有する請求項１〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光プローブを基材に固定化してなるマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステムループ構造を有する蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチドの末端にクエンチャー分子(蛍光消光分子）としてグアニン塩基を配置し、他端に蛍光分子を持つプローブが知られている（非特許文献１及び２）。
【非特許文献１】A.Friederich et al., FEBS Lett., 2007, 581, 1644
【非特許文献２】Y.Saito et al., Chem.Commun., 2007, 4492
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
非特許文献１に記載されたプローブでは、ポリヌクレオチドの末端にクエンチャー分子としてグアニン塩基を配置する必要があり、ステム部位の塩基配列に制限があるという問題がある。
本発明の目的は、ステムループ構造を有するプローブにおいて、ステム部位の塩基配列に制限がなく、簡易に調製できる蛍光プローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の蛍光プローブの特徴は、ステムループ構造を有するプローブにおいて、
式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有する点を要旨とする。
【化１】
2010060394.tif 000003
Ｒは蛍光性有機基、Ｘは蛍光性有機基とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基、Ｙは水素原子又は水酸基、Ｏは酸素原子、Ｐはリン原子、Ｃは炭素原子、Ｈは水素原子、Ｎは窒素原子を表す。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の蛍光プローブは、ポリヌクレオチドの末端にクエンチャー分子としてグアニン塩基を配置する必要がないため、ステム部位の塩基配列に制限がない。また、本発明の蛍光プローブは、クエンチャー分子を必要としないため、簡易に調製することができる。また、本発明の蛍光プローブの両末端は、蛍光性分子やクエンチャー分子で修飾する必要がないため、さらに任意の修飾を施したり、基材（チップ）へ固定してマイクロアレイを調製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明において、ステムループ構造とは、二重鎖を形成している部分をステム（茎）、折り返しの輪になっている部分をループ（輪）と見立てて呼ばれる構造を意味する(図１参照。)。ステムループ構造は、ｍＲＮＡの二次構造の一般的な構造の一つである。 
また、塩基とは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はウラシル（Ｕ）を意味する。
【０００７】
蛍光性有機基（Ｒ）としては蛍光を発する有機基であれば制限がないが、ピレン骨格、アントラセン骨格、ペリレン骨格、アクリドン骨格、クマリン骨格、イソクマリン骨格、キサントン骨格、チオキサントン骨格、フェナントレン骨格、ベンゾフェノン骨格、フルオレン骨格又はジフェニルチオエーテル骨格を有する有機基が好ましく、さらに好ましくはピレン骨格、アントラセン骨格、ペリレン骨格、アクリドン骨格、クマリン骨格、イソクマリン骨格、キサントン骨格、チオキサントン骨格又はフェナントレン骨格を有する有機基である。
【０００８】
蛍光性有機基（Ｒ）には、置換基を有してもよい。置換基を有すると、母骨格の吸収波長を長波長側にシフトさせることができる。シフトする程度（シフト値）は、置換基の種類等によって相違し、このシフト値については「有機化学のスペクトルによる同定法  第５版（R.M.Silverstein著、２８１頁、１９９３年東京化学同人発行）」に記載の表が参考となる。
置換基としては、水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基（メトキシ、イソプロポキシ及びブトキシ等）、炭素数１〜４のアシロキシ基（アセトキシ等）、炭素数１〜７のアシル基（アセチル及びベンゾイル等）、ニトロ基及びシアノ基等が挙げられる。
【０００９】
ピレン骨格を有する有機基としては、１−ピレニルカルボニルアミノ、１−ピレニルカルボニルオキシ及び１−ピレニル等が挙げられる。
【００１０】
アントラセン骨格を有する有機基としては、１−アントリルカルボニルアミノ、２−アントリルカルボニルアミノ、９−アントリルカルボニルアミノ、１０−ブトキシ−９−アントリルカルボニルアミノ、１−アントリルカルボニルオキシ、２−アントリルカルボニルオキシ、１−アントリル及び２−アントリル等が挙げられる。
【００１１】
ペリレン骨格を有する有機基としては、３−ペリレニルカルボニルアミノ、３−ペリレニルカルボニルオキシ及び３−ペリレニル等が挙げられる。
【００１２】
アクリドン骨格を有する有機基としては、１０−アクリドニルメチルカルボニルアミノ及び１０−アクリドニルメチルカルボニルオキシ等が挙げられる。
【００１３】
クマリン骨格を有する有機基としては、３−クマリニルカルボニルアミノ、３−クマリニルカルボニルオキシ、７−メトキシ−３−クマリニルカルボニルアミノ及び７−メトキシ−３−クマリニルカルボニルオキシ等が挙げられる。
【００１４】
イソクマリン骨格を有する有機基としては、３−イソクマリニルカルボニルアミノ、３−イソクマリニルカルボニルオキシ、７−メトキシ−３−イソクマリニルカルボニルアミノ及び７−メトキシ−３−イソクマリニルカルボニルオキシ等が挙げられる。
【００１５】
キサントン骨格を有する有機基としては、２−キサントニリルカルボニルアミノ、２−キサントニリルカルボニルオキシ、４−キサントニリルカルボニルアミノ、４−キサントニリルカルボニルオキシ、２−キサントニリル、４−キサントニリル、７−メトキシ−２−キサントニリル、２−メトキシ−４−キサントニリル、２−メトキシ−３−キサントニリル及び２，３−ジメトキシ−４−キサントニリル等が挙げられる。
【００１６】
チオキサントン骨格を有する有機基としては、２−チオキサントニリルカルボニルアミノ、２−チオキサントニリルカルボニルオキシ、４−チオキサントニリルカルボニルアミノ、４−チオキサントニリルカルボニルオキシ、２−チオキサントニリル、４−チオキサントニリル、７−メトキシ−２−チオキサントニリル、２−メトキシ−４−チオキサントニリル、２−メトキシ−３−チオキサントニリル及び２，３−ジメトキシ−４−チオキサントニリル等が挙げられる。
【００１７】
フェナントレン骨格を有する有機基としては、１−フェナントリルカルボニルアミノ、２−フェナントリルカルボニルアミノ、１−フェナントリルカルボニルオキシ、２−フェナントリルカルボニルオキシ、１−フェナントリル及び９−フェナントリル等が挙げられる。
【００１８】
ベンゾフェノン骨格を有する有機基としては、４−ベンゾイルフェニルカルボニルアミノ、４−ベンゾイルフェニルカルボニルオキシ及び４−ベンゾイルフェニル等が挙げられる。
【００１９】
フルオレン骨格を有する有機基としては、９−フルオレニルカルボニルアミノ、９−フルオレニルカルボニルオキシ及び９−フルオレニル等が挙げられる。
【００２０】
ジフェニルチオエーテル骨格を有する有機基としては、４−フェニルチオベンゾイルアミノ及び４−フェニルチオベンゾイルオキシ等が挙げられる。
【００２１】
蛍光性有機基とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基（Ｘ）としては、式（１）で表されるヌクレオチド（修飾グアニン）がシトシン（Ｃ）とハイブリタイズしたとき、蛍光性有機基が修飾グアニン及びシトシンの塩基対に近づいて蛍光性有機基のπ電子が吸引される状態をとることができれば特に制限はないが、炭素数１〜１８のアルキレン基を含んでなることが好ましい。この結合基（Ｘ）には、エーテル結合、アミド結合、エステル結合、ウレタン結合及び／又はウレア結合等を含んでもよい。
【００２２】
Ｙが水素原子のときＤＮＡに対応し、一方、Ｙが水酸基のときＲＮＡに対応する。
【００２３】
本発明の蛍光プローブは、式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有すれば、その含有位置や含有数に制限はない。
【００２４】
式（１）で表されるヌクレオチド単位がステム部位に有すると、本発明の蛍光プローブは、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリタイズする前は蛍光を発しないが、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリタイズすると蛍光を発することとなる。一方、式（１）で表されるヌクレオチド単位がループ部位に有すると、本発明の蛍光プローブは、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリタイズする前は蛍光を発するが、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリタイズすると蛍光を発しないこととなる。これらのうち、式（１）で表されるヌクレオチド単位をステム部位に有することが好ましい。
【００２５】
式（１）で表されるヌクレオチド単位は、３’末端から２〜１０番目の塩基の位置に有することが好ましい。
【００２６】
ステム部位の塩基の数は特に制限ないが、４〜１０個が好ましい。
【００２７】
式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位の含有量は特に制限ないが、１個又は少なくとも２個含有することが好ましく、さらに好ましくは１個又は２〜４個含有することである。少なくとも２個有すると、蛍光が長波長側にシフトする蛍光があるため、検出が容易となりやすい。
【００２８】
式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有する蛍光プローブは、公知の方法で製造することができる。たとえば、特開２００８−１６２９１６公報に記載された方法により、２’−デオキシグアノシン又はグアノシンの８−炭素をハロゲン化してから、アセチレン化合物をカップリングした後、接触水素還元することにより、式（２）で表される８-置換グアニンを合成する。次いで、８−置換グアニンを原料の一つとして、ＤＮＡ自動合成機を用い、オリゴヌクレオチドを合成した後、このオリゴヌクレオチドと蛍光性有機基（Ｒ）を構成する前駆体とを反応させて本発明の蛍光プローブを製造することができる。
【００２９】
なお、式（２）で表される８-置換グアニンと蛍光性有機基（Ｒ）を構成する前駆体とを反応させて式（１）で表されるヌクレオチドを製造した後、このヌクレオチドを原料の一つとして、ＤＮＡ自動合成機を用い、本発明の蛍光プローブを製造してもよい。
【００３０】
【化２】
2010060394.tif 000004
【００３１】
Ｚは反応性置換基（アミノ基及びカルボキシル基等）、Ｑは反応性置換基（Ｚ）とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基を表し、Ｙ、Ｏ、Ｐ、Ｃ、Ｈ及びＮは式１と同じ意味である。なお、Ｑは式（１）のＸと同じ基が含まれる。
【００３２】
式（２）で表される８-置換グアニンのＺがアミノ基の場合、蛍光性有機基（Ｒ）を構成する前駆体として、蛍光有機基（Ｒ）をもつカルボキシスクシンイミドエステル又は蛍光有機基（Ｒ）をもつハロゲン化物等を用いることにより、蛍光有機基（Ｒ）がアミド結合又はアミノ結合により結合した蛍光プローブ又は式（１）で表されるヌクレオチドが得られる。
【００３３】
蛍光有機基（Ｒ）をもつカルボキシスクシンイミドエステルを用いる場合、反応溶媒（たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）やアルカリ触媒（たとえば、炭酸水素ナトリウム）を用いることが好ましい。反応温度は２５〜３８℃程度である。反応時間は１０〜２４時間程度である。
【００３４】
蛍光有機基（Ｒ）をもつハロゲン化物を用いる場合、反応溶媒（たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン及びトルエン）を用いることが好ましい。反応温度は２０〜３８℃程度である。反応時間は１〜１０時間程度である。
【００３５】
蛍光有機基（Ｒ）をもつカルボキシスクシンイミドエステルは、公知の方法で得ることができ、たとえば、蛍光有機基（Ｒ）を持つカルボン酸（たとえば、１−ピレンカルボン酸、４−オキソ−４−ピレニルブタン酸、３−クマリンカルボン酸、１０−アクリドニル酢酸、３−ペリレンカルボン酸、２−アントラセンカルボン酸、１−アントラセンカルボン酸、９−アントラセンカルボン酸、３−キサントンカルボン酸、３−チオキサントンカルボン酸、９−フルオレンカルボン酸及び９−フェナントレンカルボン酸）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを反応させることにより得ることができる。
【００３６】
蛍光有機基（Ｒ）をもつハロゲン化物は、市場から容易に入手できるほか、公知の方法｛J.Am.Chem.Soc.(74)4296(1952)、Arch.Pharm.(Weinheim)326、451(1993)、Chem.Pharm.Bull.35(6)2545(1987)、Indian Journal of Chemistry(20)50(1981)、Chemische Berichte(49)2487(1916)、Journal of the Chemical Society(99)2047(1911)、J.Photochem.Photobio.A;Chem(159)173(2003)、第４版実験化学講座２１日本化学会編ｐ２７５、Tetrahedron:Asynmetry,18(8)1003(2007)、Organic Letters,8(6)1189(2006)、Journal of Organometallic Chemistry,691,p1389(2006)、Bull. Chem. Soc. Jpn.,(53)1385(1980)、The Journal of Organic Chemistry(65)3005(2000)、Journal of the American Chemical Society(69)1038(1941)、Organic synthesis, Coll.vol.5,918(1973)、第４版実験化学講座１９日本化学会編ｐ４２２、第４版実験化学講座２１日本化学会編ｐ１０６、第４版実験化学講座２０日本化学会編ｐ１、第４版実験化学講座１９日本化学会編ｐ４２２｝によって得ることができる。
【００３７】
本発明の蛍光プローブは、ポリヌクレオチドの末端にクエンチャー分子としてグアニン塩基を配置する必要がないため、ステム部位の塩基配列に制限がない。したがって、ステム部位及びループ部位を自由に設計できる。
また、本発明の蛍光プローブの両末端は、蛍光性分子やクエンチャー分子で修飾する必要がないため、さらに任意の修飾を施したり、基材（チップ）へ固定してマイクロアレイを調製することができる。たとえば、酵素に対し完全な耐性を持ち、粗抽出液中でのタンパク質結合を検出しうるペプチド核酸（ＰＮＡ）を本発明の蛍光プローブに応用すると、網羅的なＤＮＡ−タンパク質間の結合解析が可能となる。また、各種疾患に対応させたＰＮＡを本発明の蛍光プローブに応用すると、各疾患におけるプロモーター異常・遺伝子発現異常の高速解析を行うことが可能となる。
【実施例】
【００３８】
＜実施例１＞
特開２００８−１６２９１６号公報の実施例の記載に準じて、２’−デオキシグアノシン５．６８１ｇ（０．０２１ｍｏｌ）を蒸留水４００ｍｌに懸濁させ、Ｎ−ブロモコハク酸イミド４．１７ｇ（０．０２３ｍｏｌ）を加え、約２５℃で３０分間反応させた後、析出した固体を減圧濾過し、蒸留水で洗浄し、さらにアセトンで洗浄して、淡紫色固体（ｓ１）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた淡紫色固体（ｓ１）は、８−ブロモ−デオキシグアノシンであることを同定した。
【００３９】
淡紫色固体（ｓ１）３００ｍｇ（０．８６７ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、Ｎ−ヘキサ−５−イニルトリフルオロアセトアミド４９８ｍｇ（２．５８１ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）３３ｍｇ（０．１７３ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）９９ｍｇ（０．０８６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン１４８μＬ（１．４６３ｍｍｏｌ）を加え、５５℃で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール：体積比７／１）により精製して、白色固体（ｓ２）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた白色固体（ｓ２）は、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキサ−１−イニル）デオキシグアノシンであることを同定した。
【００４０】
白色固体（ｓ２）３７６ｍｇ（０．７２１ｍｍｏｌ）を無水エタノール１５ｍｌに溶解し、パラジウムカーボン５０ｍｇを加え、系内を水素置換した後、約２５℃で１４時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール：体積比７／１）により精製して、白色固体（ｓ３）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた白色固体（ｓ３）は、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキシル）デオキシグアノシンであることを同定した。
【００４１】
白色固体（ｓ３）１９５ｍｇ（０．４２２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタール１ｍｌ（５．８３５ｍｍｏｌ）を加えた後、５０℃で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール：体積比７／１）で精製して、白色固体（ｓ４）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた白色固体（ｓ４）は、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキシル）デオキシグアノシンのプリン骨格の２位のアミノ基をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールで保護した化合物であることを同定した。
【００４２】
アルゴン雰囲気下、白色固体（ｓ４）１５２ｍｇ（０．２９４ｍｍｏｌ）を無水ピリジン１０ｍｌに溶解し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド１２０ｍｇ（０．３５４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン７．２ｍｇ（０．０５９ｍｍｏｌ）を加えた後、約２５℃で１時間攪拌した。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン：体積比８９／１０／１）により精製して、白色固体（ｓ５）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた白色固体（ｓ５）は、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキシル）デオキシグアノシンのプリン骨格の２位のアミノ基をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールで保護し、デオキシリボース骨格の５’位の水酸基をジメメトキシトリチル基で保護した化合物であることを同定した。
【００４３】
アルゴン雰囲気下、白色固体（ｓ５）５２ｍｇ（０．０５９ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン４６０μｌに溶解し、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ）１９６μｌ（０．０８８ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト２８μｌ（０．０８９ｍｍｏｌ）を加えた後、約２５℃で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認してから、反応液を分液ロートに移して、飽和重曹水及び蒸留水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、反応溶媒を減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）で濾過し、濾液を減圧蒸留して、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキシル）デオキシグアノシンのプリン骨格の２位のアミノ基をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールで保護し、デオキシリボース骨格の５’位の水酸基をジメメトキシトリチル基で保護し、デオキシリボース骨格の３’位の水酸基を２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトで保護した化合物（ｓ６）を得た。
【００４４】
化合物（ｓ６）を原料の一部として、ＤＮＡ自動合成機（３４００ＤＮＡ／ＲＮＡ  シンセサイザ、アプライドバイオシステムズ社）を用いて、オリゴヌクレオチド（ｗ１）｛5'-TGACGAGTATCCAAGATTGAATCwTCA-3’：wは化合物（ｓ６）に対応する。｝を合成した。
【００４５】
無水ジメチルホルムアミド１ｍｌに、１−ピレンカルボン酸５０ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）を溶解し、水溶性カルボジイミド｛１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩｝３８ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド２８ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を加えた後、約２５℃で１２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム）で精製して、１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステルを得た。
【００４６】
オリゴヌクレオチド（ｗ１）４．２ｍｇ（０．５μｍｏｌ）に、１．０Ｍ−炭酸水素ナトリウム水溶液３００μｌを加えてから、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１００μｌに溶解した後、１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステル２．０ｍｇ（５．８μｍｏｌ）を加えて、３７℃で約１２時間攪拌して、塩基ｗのプリン骨格の８位に結合基（Ｘ）を介してピレン骨格が結合したオリゴヌクレオチド（ｗ２）を合成した。
【００４７】
合成終了後、固相担体から切り出された溶液を０．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し替え、３７℃で１８時間加熱して、脱保護を行った。ついで、約２５℃に冷却してから、０．５ｍｌエッペンドルフチューブに超純水１９μｌを加えた後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、約２万Ｇ、１分間）して、高速液体クロマトグラフィー（ＰＵ−２０８０−ｐｕｌｓ、ＪＡＳＣＯ）で精製した。精製後、凍結乾燥して、本発明の蛍光プローブ（１）｛5'-TGACGAGTATCCAAGATTGAATCmTCA-3’：mは式（３）で表される化合物に対応する。｝を得た。
【００４８】
本発明の蛍光プローブ（１）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ、株式会社島津製作所）による質量分析（親ピーク８６３４．９４）、高速液体クロマトグラフィー（FLOW２．０ｍｌ／ｍｉｎ、AF buffer／ＣＨ３ＣＮ：３〜２０％（４５min）、Size１０×１５０ｍｍ、CHEMCONBOND 5-ODS-H、図２）及び酵素分解による各ヌクレオチドの含有率の解析の結果から確認した。
【００４９】
【化３】
2010060394.tif 000005
【００５０】
以上の化学反応を以下にまとめた。
【化４】
2010060394.tif 000006
【００５１】
なお、ＴＡＦはトリフルオロアセチル基を表し、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を表し、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。
【００５２】
＜実施例２＞
無水ジメチルホルムアミド１ｍｌに、４−オキソ−４−ピレニルブタン酸５０ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）を溶解し、水溶性カルボジイミド｛１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩｝３８ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド２３ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）を加えた後、約２５℃で１２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム）で精製して、４−オキソ−４−ピレニルブタン酸スクシンイミドエステルを得た。
【００５３】
「１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステル２．０ｍｇ（５．８μｍｏｌ）」を「４−オキソ−４−ピレニルブタン酸スクシンイミドエステル２．０ｍｇ、（５．０μｍｏｌ）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の蛍光プローブ（２）｛5'-TGACGAGTATCCAAGATTGAATCnTCA-3’：nは式（４）で表される化合物に対応する。｝を得た。
【００５４】
本発明の蛍光プローブ（２）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ、株式会社島津製作所）による質量分析（親ピーク８６９１．００）、高速液体クロマトグラフィー（FLOW２．０ｍｌ／ｍｉｎ、AF buffer／ＣＨ３ＣＮ：３〜２０％（４５min）、Size１０×１５０ｍｍ、CHEMCONBOND 5-ODS-H、図３）及び酵素分解による各ヌクレオチドの含有率の解析の結果から確認した。
【００５５】
【化５】
2010060394.tif 000007
【００５６】
＜実施例３＞
化合物（ｓ６）及び１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステルを用いて、実施例１と同様にして、本発明の蛍光プローブ（３）｛5'-TGACAGGTATCCAAGATTGAACTmTCA-3’：mは式（３）で表される化合物に対応する。｝を得た。
【００５７】
本発明の蛍光プローブ（３）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ、株式会社島津製作所）による質量分析（親ピーク８６３４．９４）、高速液体クロマトグラフィー（FLOW２．０ｍｌ／ｍｉｎ、AF buffer／ＣＨ３ＣＮ：３〜２０％（４５min）、Size１０×１５０ｍｍ、CHEMCONBOND 5-ODS-H）及び酵素分解による各ヌクレオチドの含有率の解析の結果から確認した。
【００５８】
＜実施例４＞
化合物（ｓ６）及び１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステルを用いて、実施例１と同様にして、本発明の蛍光プローブ（４）｛5'-AGCAGCTGTATCCAAGATTGAAAmCTmCT-3’：mは式（３）で表される化合物に対応する。｝を得た。
【００５９】
本発明の蛍光プローブ（４）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ、株式会社島津製作所）による質量分析（親ピーク９１２４．２６）、高速液体クロマトグラフィー（FLOW２．０ｍｌ／ｍｉｎ、AF buffer／ＣＨ３ＣＮ：３〜２０％（４５min）、Size１０×１５０ｍｍ、CHEMCONBOND 5-ODS-H）及び酵素分解による各ヌクレオチドの含有率の解析の結果から確認した。
【００６０】
＜蛍光分光分析＞
エッペンドルフチューブに、塩化ナトリウム水溶液及びリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加え、それぞれの最終濃度が０．１Ｍ及び５０ｍＭとなるように超純水を加えて濃度調整した後、評価試料（蛍光プローブ）と相補的な塩基配列をもつオリゴデオキシヌクレオチド１００μＭを最終濃度が２．５μＭになるようにして加えてから、攪拌し遠心分離した。評価試料（蛍光プローブ）を７０℃で１０分間アニーリングを行い、蛍光スペクトルを測定した。
また、相補的な塩基配列をもつオリゴデオキシヌクレオチドを用いなかったこと以外、上記と同様にして蛍光スペクトルを測定した。
【００６１】
測定結果を図４〜１１に示す。図４〜９から明らかなように、本発明の蛍光プローブは、相補的な塩基配列とハイブリタイズすると蛍光を出すが、相補的な塩基配列とハイブリタイズしないと蛍光を出さないか、一定波長において蛍光を出さなかった。すなわち、ハイブリタイズの有無によって広い波長範囲で蛍光強度が著しく相違した。
また、図１０及び１１から明らかなように、本発明の蛍光プローブに、式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として２個含むものは、ハイブリタイズの有無によって、長波長側で蛍光強度が著しく相違した。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の蛍光プローブとターゲットＤＮＡとがハイブリタイズする前は蛍光を出さないが、ハイブリタイズすることによって蛍光を発することを模式的に示した概念図である。
【図２】実施例１で得た本発明の蛍光プローブ（１）の高速液体クロマトグラフィーチャートである。
【図３】実施例２で得た本発明の蛍光プローブ（２）の高速液体クロマトグラフィーチャートである。
【図４】実施例で評価した本発明の蛍光プローブ（１）の蛍光スペクトルである（励起光３４７ｎｍ）。
【図５】実施例で評価した本発明の蛍光プローブ（１）の励起スペクトルである（測定波長４３２ｎｍ）。
【図６】実施例で評価した本発明の蛍光プローブ（２）の蛍光スペクトルである（励起光３７０ｎｍ）。
【図７】実施例で評価した本発明の蛍光プローブ（２）の励起スペクトルである（測定波長４５７ｎｍ）。
【図８】実施例で評価した本発明の蛍光プローブ（３）の蛍光スペクトルである（励起光３５０ｎｍ）。
【図９】実施例で評価した本発明の蛍光プローブ（３）の励起スペクトルである（測定波長４００ｎｍ）。
【図１０】実施例で評価した本発明の蛍光プローブ（４）の蛍光スペクトルである（励起光３５０ｎｍ）。
【図１１】実施例で評価した本発明の蛍光プローブ（４）の励起スペクトルである（測定波長４００ｎｍ）。
【符号の説明】
【００６３】
１  蛍光性有機基
２  ハイブリタイズしたときの蛍光スペクトル
３  ハイブリタイズしていないときの蛍光スペクトル
４  目的物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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