(57)【要約】【課題】コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子励起の蛍光の観察を同一の装置において同時に行うことを可能とし、種々の観察方法により標本を観察する。【解決手段】極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源４と、極短パルスレーザ光を第１の光路６、第２の光路７、および第３の光路３７に分岐する分波装置５と、第１の光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１の周波数分散量を調節する第１の周波数分散装置９と、第２の光路７を導光されるパルスレーザ光Ｌ２の周波数を変換するフォトニッククリスタルファイバ１０、第３の光路３７を導光されるパルスレーザ光Ｌ３の周波数分散量を調節する第２の周波数分散装置３０と、各光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波装置８と、合波されたパルスレーザ光を標本Ａに照射する集光レンズ１３とを備えるレーザ顕微鏡装置１を採用する。【選択図】図１
2010060698.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光を第１の光路、第２の光路、および第３の光路に分岐する分岐手段と、
前記第１の光路と前記第２の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数分散量が略等しくなるようにパルスレーザ光の周波数分散量を調節する第１の周波数分散調節手段と、
前記第１の光路と前記第２の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、一方の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数を変換する周波数変換手段と、
前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光が標本面上において略フーリエ限界パルスに近づくように、前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を調節する第２の周波数分散調節手段と、
前記第１の光路、前記第２の光路、および前記第３の光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、
該合波手段により合波されたパルスレーザ光を前記標本に照射する照射手段と
を備えるレーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第１の光路と前記第２の光路の少なくとも一方に、前記第１の光路と前記第２の光路を導光されるパルスレーザ光の標本面上における時間的タイミングを調節する第１のパルスタイミング調節手段を備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光の標本面上における時間的タイミングを調節する第２のパルスタイミング調節手段を備える請求項１または請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項４】
前記周波数変換手段により周波数が変換されたパルスレーザ光のパルス幅をΔＴＰ、前記第１の光路を導光されるパルスレーザ光の光量が標本面上において極大となる時刻をＴ１、前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光の光量が標本面上において極大となる時刻をＴ３、前記第１の光路を導光されるパルスレーザ光の周期をＴＲとした場合に、
前記第２のパルスタイミング調節手段が、
ＴＲ＞｜Ｔ３−Ｔ１｜＞ΔＴＰ／２
となるように前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節する請求項３に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項５】
前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバである請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標本中の分子の特定の振動を利用し、分子からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、この散乱光を検出することで標本の観察を行うコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡は、標本の分子の特定の振動を利用しているため、蛍光顕微鏡のように、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がない。また、利用する振動を変更することで観察する分子を変更することができる。
【０００３】
従来、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の光源には、比較的狭い周波数帯域を有した２つの異なる周波数を有するピコ秒パルスレーザが用いられている。このような顕微鏡によれば、これら２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が、標本の分子の特定の振動周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が分子の特定の振動周波数に共鳴し、強いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が発生する。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、照射した２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数よりも高い周波数を有する（つまり短い波長を有する）。したがって、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光だけを分光的に選択して検出することで標本の分子の観察を行うことができる。
【０００４】
また、フェムト秒パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍に広がる極めて狭い空間において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、鮮明な蛍光画像を得ることができる多光子励起型のレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−５２０６１２号公報
【特許文献２】特開２００２−２４３６４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡において、標本の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させるためには、周波数帯域が狭い（または、パルス幅が比較的広い）ピコ秒パルスレーザ光を用いるのがよい。なぜならば、周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いてしまうことで、２つのパルスレーザ光の周波数差の中に、分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分も生じてしまうからである。それら分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分は、分子の特定の振動に共鳴したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に寄与しない。結果として、２つのパルスレーザ光のエネルギーを、分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために効率的に利用できなくなってしまう。
【０００７】
一方、多光子励起型のレーザ顕微鏡においては、蛍光の励起効率をより高め、かつ、標本に与えるダメージをより軽減して観察を行うことを目的として、周波数帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）フェムト秒レーザ光が使用され、加えて、フーリエ限界パルスに近い状態で使用される。上記理由から、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡と多光子励起型のレーザ顕微鏡の両観察方法は、使用するパルスレーザ光の仕様が相違するため、同一の顕微鏡装置によって達成することが困難である。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察および多光子蛍光観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を同時に観察することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光を第１の光路、第２の光路、および第３の光路に分岐する分岐手段と、前記第１の光路と前記第２の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数分散量が略等しくなるようにパルスレーザ光の周波数分散量を調節する第１の周波数分散調節手段と、前記第１の光路と前記第２の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、一方の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数を変換する周波数変換手段と、前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光が標本面上において略フーリエ限界パルスに近づくように、前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を調節する第２の周波数分散調節手段と、前記第１の光路、前記第２の光路、および前記第３の光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、該合波手段により合波されたパルスレーザ光を前記標本に照射する照射手段とを備えるレーザ顕微鏡装置を採用する。
【００１０】
本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、レーザ光源から射出されたフェムト秒パルスレーザ光やアト秒パルスレーザ光といった極短パルスレーザ光が、分岐手段により第１の光路、第２の光路、および第３の光路に分岐される。
第１の光路と第２の光路を導光されるパルスレーザ光は、その周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、一方の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数が周波数変換手段により変換される。そして、第１の光路と第２の光路を導光されたパルスレーザ光を合波手段により合波し、合波されたパルスレーザ光を照射手段により標本に照射することで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
【００１１】
また、第１の周波数分散調節手段により周波数分散を与えることで、パルスレーザ光の周波数成分を時間軸上に分散させることができる。このため、フェムト秒レーザ光のように比較的広い周波数帯域を有するパルスレーザ光であっても、時間軸上の各時刻において、比較的狭い周波数帯域を有しているとみなすことができる。さらに、第１の周波数分散調節手段により、第１の光路と第２の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を略等しくすることで、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光の周波数差を一定にすることができる。これにより、２つのパルスレーザ光のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。
【００１２】
また、第２の周波数分散調節手段により、第３の光路を導光されるパルスレーザ光が標本面上において略フーリエ限界パルスに近づくようにその周波数分散量を調節し、照射手段により標本に照射することで、多光子励起光効果を効率的に発生させることが可能となる。また、レーザ光源からの極短パルスレーザ光の周波数を変換せずに、極短パルスレーザ光のまま標本に照射することで、周波数変換に伴う光量の低下を防止することができ、多光子励起光効果を効率的に発生させることが可能となる。
【００１３】
以上のように、本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、１台のレーザ光源から射出された極短パルスレーザ光を第１の光路、第２の光路、および第３の光路に分岐し、第１の光路と第２の光路を導光されるパルスレーザ光を用いてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を取得すると同時に、第３の光路を導光されるパルスレーザ光を用いて多光子蛍光画像を取得することができる。これにより、試料内で同一時間内に発生する事象をマルチモーダルに観察可能となり、試料内の情報をより詳細に取得することができる。
【００１４】
上記発明において、前記第１の光路と前記第２の光路の少なくとも一方に、前記第１の光路と前記第２の光路を導光されるパルスレーザ光の標本面上における時間的タイミングを調節する第１のパルスタイミング調節手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、第１のパルスタイミング調節手段により、標本中の特定分子の特定の振動周波数に一致させるように第１の光路と第２の光路を導光されるパルスレーザ光のタイミングを調節することができる。これにより、特定分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させることが可能となる。また、第１の光路と第２の光路を導光されるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節し、前記２つのパルスレーザ光の周波数差が特定分子の異なる振動の周波数あるいは、標本中の別の分子の振動の周波数に対応するように任意に調節することも可能である。
【００１５】
上記発明において、前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光の標本面上における時間的タイミングを調節する第２のパルスタイミング調節手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、第２のパルスタイミング調節手段により、第１の光路と第２の光路を導光されるパルスレーザ光を標本に照射して発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と、第３の光路を導光されるパルスレーザ光を標本に照射して発生する蛍光との時間的タイミングを調節することができる。
【００１６】
上記発明において、前記周波数変換手段により周波数が変換されたパルスレーザ光のパルス幅をΔＴＰ、前記第１の光路を導光されるパルスレーザ光の光量が標本面上において極大となる時刻をＴ１、前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光の光量が標本面上において極大となる時刻をＴ３、前記第１の光路を導光されるパルスレーザ光の周期をＴＲとした場合に、前記第２のパルスタイミング調節手段が、ＴＲ＞｜Ｔ３−Ｔ１｜＞ΔＴＰ／２となるように前記第３の光路を導光されるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することとしてもよい。
【００１７】
このようにすることで、第１の光路と第２の光路を導光されるパルスレーザ光を標本に照射して発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と、第３の光路を導光されるパルスレーザ光を標本に照射して発生する蛍光とを時間的にずらして発生させることができる。これにより、各観察画像を生成するために不要な観察光を排除することができ、ノイズが小さく高画質なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像および多光子蛍光画像を得ることができる。
【００１８】
上記発明において、前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバであることとしてもよい。
周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有する極短パルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調整することが可能となる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を同時に観察することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図１から図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体３とを備えている。
【００２１】
レーザ光源装置２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を３つに分岐する分波装置（分岐手段）５と、分波装置５により分岐された３つのフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３をそれぞれ通過させる３つの光路６，７，３７と、３つの光路６，７，３７を通過してきた３つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’，Ｌ３’を合波する合波装置（合波手段）８とを備えている。
【００２２】
第１の光路６には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節する第１の周波数分散装置（第１の周波数分散調節手段）９が設けられている。
第１の周波数分散装置９は、例えば、板厚の変化する楔状のガラス板のように所定の周
波数分散特性を有する材質からなる部材（図示略）であってもよい。部材が本来持つ周波
数分散特性により、部材を通過するフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に所定の周波数分散を
与えることができる。また、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１の通過する位置の部材の厚み
を変化させることにより、与える周波数分散量が調整できる。また、周波数分散装置９は
、所望の分散量を得るように調製された光ファイバであってもよい。
【００２３】
第２の光路７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２を通過させるフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１０と、フォトニッククリスタルファイバ１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を調節する第１の光路調節装置（第１のパルスタイミング調節手段）１１とが設けられている。
【００２４】
フォトニッククリスタルファイバ１０は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変更、および／または、拡大したパルスレーザ光Ｌ２’を生成し、光路６，７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。
【００２５】
第１の光路調節装置１１は、例えば、ミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２’の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光Ｌ２’のパルスの時間的タイミングを調整することができる。
【００２６】
第３の光路３７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ３に与える周波数分散量を調節する第２の周波数分散装置（第２の周波数分散調節手段）３０と、第２の周波数分散装置３０通過後のパルスレーザ光Ｌ３’の光路長を調節する第２の光路調節装置（第２のパルスタイミング調節手段）３１とが設けられている。
【００２７】
第２の周波数分散装置３０は、第２の周波数分散装置３０を通過したパルスレーザ光Ｌ３’が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくような分散量を設定することができるようになっている。これにより、レーザ光源４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によってパルスレーザ光Ｌ３のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのパルスレーザ光Ｌ３が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することが可能となる。
【００２８】
第２の周波数分散装置３０は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光Ｌ３は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路３７上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、第２の周波数分散装置３０を通過するパルスレーザ光Ｌ３’に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記一対のプリズム対の代わりに一対の回折格子対（図示略）を用いてもよい。
第２の光路調節装置３１は、第１の光路調節装置１１と同様の構成を有しており、パルスレーザ光Ｌ３’のパルスの時間的タイミングを調整するようになっている。
【００２９】
顕微鏡本体３は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置２から出射されたパルスレーザ光Ｌ４を２次元的に走査するスキャナ１２およびレンズ群２０と、スキャナ１２により走査されたパルスレーザ光Ｌ４を標本Ａ面に集光する集光レンズ（照射手段）１３と、標本Ａにおいて発生し、集光レンズ１３によって集光された蛍光を検出する第１の光検出器１４と、標本Ａを透過する方向に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を集光する集光レンズ１５と、集光レンズ１５により集光されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する第２の光検出器１６とを備えている。
【００３０】
図中、符号１７はダイクロイックミラー、符号１８はステージである。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５により集光され第２の検出器１６で検出されてもよい。また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は集光レンズ１３により集光され第１の検出器１４で検出されてもよい。
【００３１】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
まず、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を取得する際の作用について以下に説明する。
レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、分波装置５により３つの光路６，７，３７に分岐される。
【００３２】
第１の光路６に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、第１の光路６上に配置されている第１の周波数分散装置９を通過させられることにより、周波数分散量を与えられる。一方、第２の光路７に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２は、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過させられることにより、第１の光路６のフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが変更、および／または、拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’）となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２’にはフォトニッククリスタルファイバ１０を通過することにより所定の周波数分散が与えられる。
【００３３】
ここで、パルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量と、パルスレーザ光Ｌ２’の周波数分散量とが相違する場合、図２（ａ）に示されるように、時間軸上においてパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分布の傾きが相違する。この場合、２つの光路６，７を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’は時間軸上の各時刻において異なり、一定に保たれない。この状態においては、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを、標本Ａ中の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に効率よく利用することができない。
【００３４】
そこで、第１の周波数分散装置９を作動させて、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える分散量が、第２の光路７のフォトニッククリスタルファイバ１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’に与えられる分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節する。すなわち、図２（ａ）の矢印Ｐ１に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。
【００３５】
また、２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のパルスの時間的タイミングによっては、図２（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しない場合がある。そこで、第１の光路調節装置１１を作動させて、第２の光路７を通過するパルスレーザ光Ｌ２’を時間軸方向に遅延させる。すなわち、図２（ｂ）に矢印Ｐ２で示されるように、パルスレーザ光Ｌ２’の時間的なパルスタイミングを調節する。これにより、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。
【００３６】
以上のように第１の周波数分散装置９および第１の光路調節装置１１を作動させることで、図３に示されるように、合波装置８に到達する２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分散量と周波数差Ω’が調節される。その後、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’とパルスレーザ光Ｌ３’とは、合波装置８によって合波され、パルスレーザ光Ｌ４となる。
【００３７】
このように合波されたパルスレーザ光Ｌ４は、顕微鏡本体３に入射させられ、スキャナ１２によって２次元的に走査された後、レンズ群２０と集光レンズ１３を介して標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ４が集光された各位置において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
【００３８】
標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、標本Ａを挟んで集光レンズ１３とは反対側に配置された集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ４の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第２の光検出器１６により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００３９】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、フェムト秒レーザ光を出射するレーザ光源４を用いて、フォトニッククリスタルファイバ１０により周波数が変換されたパルスレーザ光Ｌ２’をポンプ光、周波数が変換されていないパルスレーザ光Ｌ１’をストークス光として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
【００４０】
また、２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、時間軸上の各時刻において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることで、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを効率的に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に利用することができる。このように発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を時間積算することにより、明るいコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００４１】
また、第１の光路調節装置１１により、２つの光路６，７を通過して合波装置８に入射されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の時間的なタイミングを調節することで、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、標本Ａの分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。これにより、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差Ω’を任意に調整することができるため、標本Ａ中の別の分子の振動周波数に一致させることも可能となる。
【００４２】
また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ１０を使用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
また、第１のパルスタイミング調節手段として、ミラー（リフレクタ）を有する第１の光路調節装置１１を採用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
【００４３】
なお、合波装置８以降の光学系により、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分散量が変化した場合や時間的なパルスタイミングが変化した場合は、標本Ａ面上において再度、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致するように、周波数分散量と時間的なパルスタイミングを調節してもよい。
【００４４】
また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出されてもよい。
【００４５】
次に、多光子蛍光画像を取得する際の作用について以下に説明する。
この場合には、第３の光路３７に設けられた第２の周波数分散装置３０を作動させることにより、図４（ａ）に矢印Ｐ３に示すように、第３の光路３７を通過するパルスレーザ光Ｌ３’に与える周波数分散量を調節する。具体的には、図４（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ３’が標本Ａ面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光Ｌ３’の周波数分散量を設定する。このように設定されたパルスレーザ光Ｌ３’を含むパルスレーザ光Ｌ４を集光レンズ１３により標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起効果を効率よく発生させ、明るい蛍光を得ることができる。
【００４６】
標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１３によって集光された後、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ４の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第１の光検出器１４により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出されてもよい。
【００４７】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、第２の周波数分散装置３０により、第３の光路３７を導光されるパルスレーザ光Ｌ３’が標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節することで、多光子励起光効果を効率的に発生させることが可能となる。また、レーザ光源４からの極短パルスレーザ光の周波数を変換せずに、極短パルスレーザ光のまま標本Ａに照射することで、周波数変換に伴う光量の低下を防止することができ、多光子励起光効果を効率的に発生させることが可能となる。また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、ＳＨＧ光（第二高調波光）観察も行うことができる。
【００４８】
ここで、上述のように発生させたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と多光子蛍光とが同時に発生する条件では、一方の観察光が他の観察光のノイズとなってしまうことがある。
そこで、本実施形態においては、第３の光路３７に設けられた第２の光路調節装置３１を作動させて、第３の光路３７を導光されるパルスレーザ光Ｌ３’を時間軸方向に遅延させる。具体的には、図５に示されるように、第２の光路調節装置３１が、以下の（１）式を満たすように第３の光路を導光されるパルスレーザ光Ｌ３’の時間的タイミングを調節する。
ＴＲ＞｜Ｔ３−Ｔ１｜＞ΔＴＰ／２・・・（１）
【００４９】
なお、上記の（１）式において、ΔＴＰは、フォトニッククリスタルファイバ１０により周波数が変換されたパルスレーザ光Ｌ２’のパルス幅である。Ｔ１は、第１の光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’の光量が標本Ａ面上において極大となる時刻である。Ｔ３は、第３の光路３７を導光されるパルスレーザ光Ｌ３’の光量が標本Ａ面上において極大となる時刻である。ＴＲは、第１の光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’の周期である。
【００５０】
このようにすることで、第１の光路６と第２の光路７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を標本Ａに照射して発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と、第３の光路３７を導光されるパルスレーザ光Ｌ３’を標本Ａに照射して発生する蛍光とを時間的にずらして発生させることができる。これにより、各観察画像を生成するために不要な信号光を排除することができ、ノイズが小さく高画質なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像および多光子蛍光画像を得ることができる。
【００５１】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、１台のレーザ光源４から射出された極短パルスレーザ光を第１の光路６、第２の光路７、および第３の光路３７に分岐し、第１の光路６と第２の光路７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を用いてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を取得すると同時に、第３の光路３７を導光されるパルスレーザ光Ｌ３’を用いて多光子蛍光画像を取得することができる。これにより、２つの観察画像を用いてマルチモーダルな観察を行うことができ、試料内の情報をより詳細に取得することができる。
【００５２】
なお、本実施形態の変形例として、図６に示すように、第２の周波数分散装置３０をレーザ光源４と分波装置５との間に設けることとしてもよい。この場合において、第２の周波数分散装置３０は、分波装置５により分岐されたパルスレーザ光Ｌ３が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくような周波数分散量をパルスレーザ光Ｌ３に与える。レーザ光源４と分波装置５との間に第２の周波数分散装置３０を配置することで、レーザ光源４の波長変更時や環境要因に伴う光軸変動の影響による第２の周波数分散装置３０内のアライメントずれを抑える事ができ、結果的に安定的な分散補償が可能となる。
【００５３】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、主に図７から図９を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１が第１の実施形態と異なる点は、レーザ光源４から発せられた極短パルスレーザ光をファイバに入射させて分岐する点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置５１について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００５４】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１は、図７に示されるように、レーザ光源装置５２と、レーザ光源装置５２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体３とを備えている。
【００５５】
レーザ光源装置５２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐する分波装置（分岐手段）５と、分波装置５により分岐された２つのフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２，Ｌ１３をそれぞれ通過させる２つの光路７，５４と、２つの光路７，５４を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ２’，Ｌ１３’を合波する合波装置（合波手段）８とを備えている。
【００５６】
光路５４には、パルスレーザ光Ｌ１３に与える周波数分散量を調節する第２の周波数分散装置（第２の周波数分散調節手段）３０と、パルスレーザ光Ｌ１３を導光するとともに所定の周波数分散量を与えるファイバ５５とが設けられている。
【００５７】
ファイバ５５は、入射したパルスレーザ光Ｌ１３を２つの光路６，３７に分岐するスプリッタ３５と、第１の光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１に所定の周波数分散量を与えるとともにパルスの時間的タイミングを調整する分散・パルスタイミング調節装置５７と、第３の光路３７を導光されるパルスレーザ光Ｌ３に所定の周波数分散量を与えるとともにパルスの時間的タイミングを調整する分散・パルスタイミング調節装置５９と、導光されてきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ３’を合波してパルスレーザ光Ｌ１３’を生成するファイバカプラ３８とを機能として備えている。
【００５８】
第２の周波数分散装置３０は、第３の光路３７を導光されるパルスレーザ光Ｌ３’が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくような周波数分散量を設定することができるようになっている。これにより、レーザ光源４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によってパルスレーザ光Ｌ３のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのパルスレーザ光Ｌ３が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができるようになっている。
【００５９】
第２の光路７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２を通過させるフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１０と、フォトニッククリスタルファイバ１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を調節する第１の光路調節装置（第１のパルスタイミング調節手段）１１とが設けられている。
【００６０】
フォトニッククリスタルファイバ１０は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変更、および／または、拡大したパルスレーザ光Ｌ２’を生成し、光路６，７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。
【００６１】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置５１の作用について以下に説明する。
レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、分波装置５により２つの光路７，５４に分岐される。
【００６２】
光路５４に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１３は、第２の周波数分散装置３０により所定の周波数分散量が与えられ、ファイバ５５に入射させられる。この際、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１３には、第２の周波数分散装置３０により、パルスレーザ光Ｌ３が標本Ａ上において略フーリエ限界に近いパルス幅となるような負の周波数分散量が与えられる。
【００６３】
ファイバ５５に入射したフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１３は、スプリッタ３５により２つの光路６，３７に分岐される。２つの光路６，３７を通過するパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ３は、各光路長に応じた周波数分散量が与えられるとともに、各光路長に応じて時間的なタイミングが調節される。このように周波数分差量および時間的なタイミングが調節されたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ３’はファイバカプラ３８により合波される。
【００６４】
一方、第２の光路７に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２は、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過させられることにより、第１の光路６のフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが変更、および／または、拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’）となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２’にはフォトニッククリスタルファイバ１０を通過することにより所定の周波数分散が与えられ、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数と略等しくなるように調節される。また、第１の光路調節装置１１により、第２の光路７を通過するパルスレーザ光Ｌ２’の時間的なパルスタイミングが調節される。
【００６５】
このように周波数分散量および時間的なパルスタイミングが調節されたパルスレーザ光Ｌ１３’とパルスレーザ光Ｌ２’は、合波装置８によって合波されてパルスレーザ光Ｌ４となり、顕微鏡本体３に入射させられて標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ４が集光された各位置において、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。また、パルスレーザ光Ｌ３’を含むパルスレーザ光Ｌ４を標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起効果を効率よく発生させ、明るい蛍光を得ることができる。
【００６６】
このように発生させたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光および蛍光を第１の検出器１４および第２の光検出器１６により検出することで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像および多光子蛍光画像を同時に得ることができる。
【００６７】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１によれば、１台のレーザ光源４から射出された極短パルスレーザ光を分波装置５およびファイバ５５を用いて第１の光路６、第２の光路７、および第３の光路３７に分岐し、第１の光路６と第２の光路７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を用いてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を取得すると同時に、第３の光路３７を導光されるパルスレーザ光Ｌ３’を用いて多光子蛍光画像を取得することができる。
【００６８】
また、第１の光路６と第３の光路３７との分波および合波をファイバ５５内で行うことにより、分波装置５および合波装置８の構成を簡易なものとすることができる。
また、第１の光路６と第３の光路３７の光路長を変化させることで、各パルスレーザ光の周波数分散量および時間的なパルスタイミングの調整を容易に行うことができ、装置構成を簡略化することができる。
【００６９】
なお、本実施形態の第１の変形例として、図８に示すように、第２の周波数分散装置３０をレーザ光源４と分波装置５との間に設けることとしてもよい。レーザ光源４と分波装置５との間に第２の周波数分散装置３０を配置することで、安定的な分散補償を可能にするとともに、レーザ光源４から出射される極短パルスレーザ光の波長変更時にも容易にアライメントを行うことが可能となる。
【００７０】
また、本実施形態の第２の変形例として、図９に示すように、第１の光路６、第２の光路７、および第３の光路３７の分波および合波をファイバ５５内で行うこととしてもよい。このようにすることで、分波装置５および合波装置８の構成をさらに簡易なものとすることができる。また、各光路長を変化させることで、各パルスレーザ光の周波数分散量および時間的なパルスタイミングの調整を行うことができ、装置構成を簡略化することができる。
【００７１】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、第１の周波数分散装置９として、周波数分散量が固定のものを複数用意し、段階的に切り替える方式や、挿脱可能方式により、フェムト秒パルスレーザ光に与える周波数分散量を切り替える構成を採用してもよい。
【００７２】
また、各光路に、減光フィルタのような光量調節手段（図示略）を配置することにしてもよい。これにより、各光路を通過してくるパルスレーザ光の発生強度を調整して、各観察画像の画質を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】図１のレーザ顕微鏡装置の第１の光路および第２の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）調整前、（ｂ）周波数分散量調整後をそれぞれ示している。
【図３】図１のレーザ顕微鏡装置の第１の光路および第２の光路を導光されるパルスレーザ光のパルスの時間的タイミング調整後の周波数の時間分布を示すグラフである。
【図４】図１のレーザ顕微鏡装置の第３の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、多光子励起の蛍光観察時におけるパルスレーザ光の周波数分散量の（ａ）調整前、（ｂ）調節後のそれぞれの状態を示している。
【図５】コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と多光子蛍光の時間的なタイミングを説明する図である。
【図６】図１のレーザ顕微鏡装置の変形例を示すブロック図である。
【図７】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図８】図７のレーザ顕微鏡装置の第１の変形例を示すブロック図である。
【図９】図７のレーザ顕微鏡装置の第２の変形例を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００７４】
Ａ  標本
Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ１３  フェムト秒パルスレーザ光
Ｌ１’，Ｌ２’，Ｌ３’，Ｌ１３’  パルスレーザ光
Ω，Ω’  周波数（差）
１，５１  レーザ顕微鏡装置
２，５２  レーザ光源装置
３  顕微鏡本体
４  レーザ光源
５  分波装置（分岐手段）
６  第１の光路
７  第２の光路
８  合波装置（合波手段）
９  第１の周波数分散装置（第１の周波数分散調節手段）
１０  フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
１１  第１の光路調節装置（第１のパルスタイミング調節手段）
１３  集光レンズ（照射手段）
３０  第２の周波数分散装置（第２の周波数分散調節手段）
３７  第３の光路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2010060698.tif 000008
【図７】
2010060698.tif 000009
【図８】
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【図９】
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