(57)【要約】【課題】インテグリン媒介性の癌細胞増殖に関連する組成物および方法を提供すること。【解決手段】本発明は、インテグリンとの標的化された相互作用を介して癌細胞の増殖を低減するための、組成物および方法を開示する。詳細には、本発明は、癌細胞上のインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害する工程を包含する癌細胞の増殖を減少する方法を提供し、ここで、インテグリンレセプターは、インテグリンを含む。癌細胞は、黒色腫細胞、腺腫細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、癌腫細胞、形質細胞腫細胞、肉腫細胞、神経膠腫細胞、胸腺腫細胞、白血病細胞、皮膚癌細胞、網膜癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、結腸癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、脳腫瘍細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、頸部癌細胞、肝臓癌細胞、胃腸癌細胞ならびに頭部および頸部癌細胞からなる群より選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「癌遺伝子誘導性インテグリンシグナル伝達の遮断を介した癌細胞におけるアポトーシスを促進する因子」というタイトルの、２０００年１０月１２日に出願された、米国仮特許出願番号６０／２３９，７０５号に対する優先権を主張し、この出願は、本明細書中で、その全体において参考として援用され、そして「癌遺伝子誘導性インテグリンシグナル伝達の遮断を介した癌細胞におけるアポトーシスを促進する因子」というタイトルの、２０００年１０月２４日に出願された、米国仮特許出願番号６０／２４２，８１２号に対する優先権を主張し、この出願は、本明細書中で、その全体において参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（Ｉ．発明の背景）
癌細胞において、複数の癌遺伝子傷害が、悪性形質転換に協同する。このような協同は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と接触せずに、腫瘍細胞の生存および増殖を可能にし、腫瘍細胞の生存および増殖が、ＥＣＭによるインテグリンシグナル伝達の関与から独立するようになることを示唆する。
【０００３】
発癌は、複数の協同的な遺伝子傷害によって引き起こされ、細胞シグナル伝達および細胞周期制限点（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）制御の漸進的脱制御を導く。関連する変異は、癌遺伝子の活性化、または腫瘍抑制遺伝子機能の喪失をもたらす。代表的には、１つの癌遺伝子は、悪性形質転換を引き起こすには不十分である。なぜなら、この遺伝子は、細胞増殖を刺激するシグナルおよびこの細胞増殖を阻害するシグナルを同時に誘導するからである。結果として、細胞増殖は、制限されたままである。対照的に、協同的な癌遺伝子傷害は、増殖促進刺激を補強しながら、このような阻害シグナルを無能にするために協力して作用する。癌遺伝子傷害の協同は、複数のシグナルの統合を伴い、これは、細胞周期依存性キナーゼ複合体の調節に集中する（Ｌｌｏｙｄら、１９９７；Ｐｅｒｅｚ−Ｒｏｇｅｒら、１９９９；Ｒｏｐｅｒら、２００１；Ｓｅｗｉｎｇら、１９９７）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
組成物および方法が本明細書中に開示され、これは、種々の形質転換細胞型の生存を示し、細胞自律性（自己分泌）のインテグリンシグナル伝達活性を必要とする。この活性は、協同的な癌遺伝子傷害によって誘導され、そしてインテグリンレセプターおよびリガンド成分（例えば、インテグリンα６およびインテグリンβ４、ならびにラミニン５−γ２鎖）の誘導を伴う。インテグリンまたはラミニンのリガンド機能のブロックは、ＥＣＭの存在下で増殖する場合でさえ、形質転換細胞の急速なアポトーシスを誘導する。対照的に、正常細胞は、同じ処理に曝露される場合、生存可能なままである。
【０００５】
開示される組成物および方法は、癌遺伝子傷害の協同に関連し、これは、形質転換細胞が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と接触せずに増殖する能力を制御する。本明細書中に教示されるように、癌遺伝子が協同して、細胞自律性（自己分泌）インテグリンシグナル伝達ループを促進し、これは、種々の形質転換細胞型の生存に不可欠であることを証明する。このシグナル伝達ループが、対応する正常細胞において確立されないので、このループのシグナル伝達成分は、癌治療についての興味深い標的を構成する。
【０００６】
（ＩＩ．発明の要旨）
本発明の目的に従って、本明細書中に具現化され、そして広範に記載されるように、本発明は、１つの局面において、インテグリン媒介性の癌細胞増殖に関連する組成物および方法に関する。
【０００７】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法が、該癌細胞上のインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害する工程を包含し、ここで、該インテグリンレセプターが、インテグリンを含む、方法。
（項目２）前記インテグリンレセプターが、インテグリンＢ４を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）前記インテグリンレセプターが、インテグリンＡ６を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）前記インテグリンレセプターに結合するリガンドが、ラミニン５である、項目１に記載の方法。
（項目５）前記インテグリンレセプターが、Ａ６Ｂ４である、項目１に記載の方法。
（項目６）前記リガンドが、ラミニン５を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）前記リガンドが、ラミニン５のγ２サブユニットを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）項目１に記載の方法であって、ここで、インテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害する工程が、Ａ６インテグリンをリガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目９）項目１に記載の方法であって、ここで、インテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害する工程が、Ｂ４インテグリンをリガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目１０）項目１に記載の方法であって、ここで、インテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害する工程が、ラミニン５をリガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目１１）項目１に記載の方法であって、ここで、インテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害する工程が、γ２サブユニットをリガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目１２）癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法が、インテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用を減少する工程を包含する、方法。
（項目１３）項目１２に記載の方法であって、ここで、インテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用を減少する工程が、Ａ６インテグリンを、Ｂ４インテグリンと別のインテグリンまたはタンパク質分子との間の相互作用を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目１４）項目１２に記載の方法であって、ここで、インテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用を減少する工程が、Ｂ４インテグリンを、Ｂ４インテグリンと別のインテグリンまたはタンパク質分子との間の相互作用を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目１５）項目１２に記載の方法であって、ここで、インテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用を減少する工程が、ラミニン５を、リガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目１６）項目１２に記載の方法であって、ここで、インテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用を減少する工程が、γ２サブユニットを、リガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目１７）前記非インテグリンタンパク質が、増殖因子レセプターを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１８）前記非インテグリンタンパク質が、ヘミデスモソーム結合を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１９）前記非インテグリンタンパク質が、ＳＨ２ドメインを含む、項目１２に記載の方法。
（項目２０）前記非インテグリンタンパク質が、Ｓｈｃタンパク質を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）前記非インテグリンタンパク質が、ＩＲＳ−１タンパク質を含む、項目１２に記載の方法。
（項目２２）前記非インテグリンタンパク質が、ＩＲＳ−２タンパク質を含む、項目１２に記載の方法。
（項目２３）癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法が、該癌細胞によるインテグリンの産生を減少する工程を包含する、方法。
（項目２４）前記インテグリンの産生が、インテグリンの発現の誘導を導くシグナル伝達を阻害することによって減少される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）前記インテグリンの産生を減少する工程が、α６産生を阻害する工程を包含する、項目２３に記載の方法。
（項目２６）α６産生を阻害する工程が、α６  ｍＲＮＡに対するアンチセンス分子を使用する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）インテグリンの産生を減少する工程が、β４産生を阻害する工程を包含する、項目２３に記載の方法。
（項目２８）β４産生を阻害する工程が、β４  ｍＲＮＡに対するアンチセンス分子を使用する工程をさらに包含する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法が、該癌細胞によるインテグリンレセプターリガンドの産生を減少する工程を包含する、方法。
（項目３０）前記インテグリンレセプターリガンドの産生を減少する工程が、γ２産生を阻害する工程を包含する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）前記インテグリンレセプターリガンドの産生を減少する工程が、ラミニン産生を阻害する工程を包含する、項目２９に記載の方法。
（項目３２）前記インテグリンレセプターリガンドの産生を減少する工程が、ラミニン５産生を阻害する工程を包含する、項目２９に記載の方法。
（項目３３）癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法が、インテグリンシグナル伝達経路を妨害する工程を包含する、方法。
（項目３４）インテグリンシグナル伝達経路を妨害する工程が、前記細胞において、Ａ６インテグリンをリガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）インテグリンシグナル伝達経路を妨害する工程が、Ｂ４インテグリンをリガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、項目３３に記載の方法。
（項目３６）インテグリンシグナル伝達経路を妨害する工程が、ラミニン５をリガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、項目３３に記載の方法。
（項目３７）インテグリンシグナル伝達経路を妨害する工程が、γ２サブユニットをリガンド結合を阻害する組成物と接触させる工程を包含する、項目３３に記載の方法。
（項目３８）インテグリンシグナル伝達経路を妨害する工程が、前記癌細胞を、テーリン、パキシリン、ビンキュリン、ＣＡＳファミリータンパク質、ＣＲＸ、ＮＣＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ−２、グアニンヌクレオチド交換因子、ＳＯＳ、ＤＯＣＫ  １８０、Ｖａｖ、Ｓｙｋ、Ｐ−１−３キナーゼ、ＡＫＴ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、カスパーゼ９、Ｃｄｃ４２、ＰＡＫ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｒｈｏキナーゼ、Ｒａｓ、カベオリン、テトラスパニン、レセプター型プロテインチロシンホスファターゼ、ＳＨＰ−２、αアクチニン、フィラミン、サイトヘシン、β３エンドネキシン、ＩＣＡＰ−１、ＲＡＣＫ−１、ＣＩＢ、アクチン、レセプターチロシンキナーゼ、ＩＲＳ−１またはＩＲＳ−２のうちの少なくとも１つを妨害する分子と接触させる工程を包含する、項目３３に記載の方法。
（項目３９）インテグリンシグナル伝達経路を妨害する工程が、前記癌細胞を、インテグリンの翻訳後修飾を妨害する因子と接触させる工程を包含する、項目３３に記載の方法。
（項目４０）前記翻訳後修飾が、グリコシル化またはリン酸化である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）前記インテグリンが、Ａ６インテグリンを含む、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目４２）前記インテグリンが、Ｂ４インテグリンを含む、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目４３）ラミニン５−インテグリン相互作用を減少する工程をさらに包含する、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目４４）ラミニン５γ２インテグリン相互作用を減少する工程をさらに包含する、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目４５）前記癌細胞の増殖を減少する工程が選択的である、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目４６）前記癌細胞が、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞ではない、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目４７）前記癌細胞が、ＨＭＴ−３５２２細胞ではない、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目４８）前記癌細胞が、ＲＫＯ結腸癌腫株ではない、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目４９）前記癌細胞が、外因性のＢ４インテグリンを発現しない、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目５０）前記癌細胞を、低分子、ペプチド、ペプチド模倣物あるいはオリゴヌクレオチドまたはその合成アナログと接触させる工程をさらに包含する、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目５１）前記癌細胞が、ドミナントネガティブなβ４インテグリンと接触される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）前記癌細胞が、アンチセンス分子と接触される、項目５０に記載の方法。
（項目５３）前記アンチセンス分子が、細胞膜を横切ったトランスロケーションを可能にするリーダー配列に連結される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）前記リーダー配列が、インターナリゼーションを容易にする細胞表面タンパク質に結合する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）前記リーダー配列が、ＴＡＴまたはアンテナペディア、あるいはそれらのフラグメントである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）前記アンチセンス分子が、α６  ＲＮＡアンチセンス分子である、項目５２に記載の方法。
（項目５７）前記低分子、ペプチド、ペプチド模倣物あるいはオリゴヌクレオチドまたはその合成アナログが、キャリアに連結される、項目４７に記載の方法。
（項目５８）前記キャリアが、脂質キャリア、荷電キャリア、レトロウイルスキャリア、ＴＡＴまたはそのフラグメント、アンテナペディアまたはそのフラグメント、あるいはポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つである、項目５７に記載の方法。
（項目５９）前記癌細胞を、細胞シグナル伝達を調節する別の因子、化学療法剤と接触させるか、あるいは放射線処理または新脈管形成インヒビターで処理する工程をさらに包含する、項目１、１２、２３、２９、３３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）前記癌細胞の増殖を減少する工程がインビトロである、項目１、１２、２３、２９、３３のうちのいずれかに記載の方法。
（項目６１）前記癌細胞の増殖を減少する工程がインビボである、項目１、１２、２３、２９、３３のうちのいずれかに記載の方法。
（項目６２）前記癌細胞が、黒色腫細胞、腺腫細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、癌腫細胞、形質細胞腫細胞、肉腫細胞、神経膠腫細胞、胸腺腫細胞、白血病細胞、皮膚癌細胞、網膜癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、結腸癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、脳腫瘍細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、頸部癌細胞、肝臓癌細胞、胃腸癌細胞ならびに頭部および頸部癌細胞からなる群より選択される、項目１、１２、２３、２９、３３のうちのいずれかに記載の方法。
（項目６３）前記癌細胞が殺傷される、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目６４）前記癌細胞が、変異Ｒａｓを発現する、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目６５）前記癌細胞が、変異Ｒａｓおよび変異ｐ５３を発現する、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目６６）前記癌細胞が、変異Ｒａｓを発現し、そしてＡＫＴ／ＰＫＢタンパク質を活性化する、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目６７）前記癌細胞が、変異Ｒａｓ、変異ｐ５３を発現し、そしてＡＫＴ／ＰＫＢタンパク質を活性化する、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目６８）前記癌細胞が、変異ＡＰＣを発現する、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目６９）前記癌細胞が、変異Ｒａｓおよび変異ＡＰＣを発現する、項目１、１２、２３、２９、３３に記載の方法。
（項目７０）Ｂ４インテグリン、α６インテグリンおよびラミニン５のγ２サブユニットからなる群より選択される標的分子と結合する分子を単離する方法であって、該方法が、１）分子のライブラリを該標的分子と接触させる工程、および２）該標的分子を結合する分子を収集して、分子の濃縮集団を産生する工程、を包含する、方法。
（項目７１）前記分子の濃縮集団を用いて、工程１および２を反復する工程をさらに包含する、項目７０に記載の方法。
（項目７２）前記ライブラリが、低分子、ペプチド、ペプチド模倣物またはオリゴヌクレオチドを含む、項目７０に記載の方法。
（項目７３）癌を発達する被験体の危険性を評価する方法であって、該方法が、該被験体から得られる標的細胞に存在するＡ６の量を決定する工程を包含し、ここで、Ａ６レベルの増大の決定が、癌の危険性の増大に相関する、方法。
（項目７４）存在するＡ６量を、コントロール細胞における量と比較する工程をさらに包含する、項目７３に記載の方法。
（項目７５）前記標的細胞に存在するＡ６量を決定する工程が、該細胞におけるＡ６  ｍＲＮＡ量をアッセイする工程を包含する、項目７３に記載の方法。
（項目７６）前記細胞におけるｍＲＮＡ量をアッセイする工程が、Ａ６プローブを前記被験体のｍＲＮＡのサンプルとハイブリダイズする工程を包含する、項目７５に記載の方法。
（項目７７）前記細胞におけるｍＲＮＡ量をアッセイする工程が、Ａ６プライマーを前記被験体のｍＲＮＡのサンプルとハイブリダイズする工程を包含する、項目７５に記載の方法。
（項目７８）前記ｍＲＮＡ量をアッセイする工程が、前記プライマーを伴う核酸増幅反応を行う工程をさらに包含する、項目７７に記載の方法。
（項目７９）前記核酸増幅反応が、ｃＤＮＡを産生する逆転写を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）前記核酸増幅反応が、前記ｃＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応を行う工程をさらに包含する、項目７９に記載の方法。
（項目８１）前記標的細胞に存在するＡ６量を決定する工程が、該細胞におけるＡ６タンパク質量をアッセイする工程を包含する、項目７３に記載の方法。
（項目８２）癌を獲得する被験体の危険性を評価する方法であって、該方法が、該被験体から得られる標的細胞に存在するＢ４の量を決定する工程を包含し、ここで、Ｂ４レベルの増大の決定が、癌の危険性の増大に相関する、方法。
（項目８３）存在するＢ４量を、コントロール細胞における量と比較する工程をさらに包含する、項目８２に記載の方法。
（項目８４）癌を獲得する被験体の危険性を評価する方法であって、該方法が、該被験体から得られる標的細胞に存在するラミニン５の量を決定する工程を包含し、ここで、ラミニン５レベルの増大の決定が、癌の危険性の増大に相関する、方法。
（項目８５）存在するラミニン５量を、コントロール細胞における量と比較する工程をさらに包含する、項目８４に記載の方法。
（項目８６）癌を獲得する被験体の危険性を評価する方法であって、該方法が、該被験体から得られる標的細胞に存在するγ２サブユニットの量を決定する工程を包含し、ここで、γ２サブユニットレベルの増大の決定が、癌の危険性の増大に相関する、方法。
（項目８７）存在するγ２サブユニット量を、コントロール細胞における量と比較する工程をさらに包含する、項目８６に記載の方法。
（項目８８）患者において、癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法は、該患者に、該癌細胞上のインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害する組成物を投与する工程を包含し、ここで、該インテグリンレセプターが、インテグリンを含む、方法。
（項目８９）患者において、癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法は、該患者に、インテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用を減少する組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目９０）患者において、癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法は、該患者に、該癌細胞によるインテグリンまたはラミニンの産生を減少する組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目９１）患者において、癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法は、該患者に、インテグリンシグナル伝達経路を妨害する組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目９２）前記癌細胞増殖における減少が選択的である、項目８８〜９１に記載の方法。
（項目９３）前記投与する工程が、局所性または全身性である、項目８８〜９１のいずれかに記載の方法。
（項目９４）前記患者がさらに、細胞シグナル伝達を調節する因子、化学療法剤を投与されるか、あるいは放射線処置または新脈管形成インヒビターで処置される、項目８８〜９１のいずれかに記載の方法。
（項目９５）前記さらなる因子が、連続的または組み合わせて投与される、項目９４に記載の方法。
（項目９６）前記局所性に投与する工程が、癌細胞への直接適用である、項目９３に記載の方法。
（項目９７）前記癌細胞への直接適用が、手術の間に行われる、項目９６に記載の方法。
（項目９８）前記癌細胞への直接適用が、癌性組織に対して局所性に行われる、項目９７に記載の方法。
（項目９９）前記全身性投与が、皮下投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内投与またはボーラス投与によるか、あるいはカテーテルまたは類似の装置を通じた適用による、項目９４に記載の方法。
（項目１００）前記全身性投与が、長期放出処方を含む、項目９４に記載の方法。
（項目１０１）前記全身性投与が、経口投与による、項目９４に記載の方法。
（項目１０２）前記経口投与が、丸剤、カプセル、錠剤、液体または懸濁液を投与する工程を包含する、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）患者において、癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法は、患者に、タンパク質またはペプチドに対するコード配列を含むベクターを投与する工程を包含し、該タンパク質またはペプチドは、癌細胞上のインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害し、ここで、該コード配列が、哺乳動物細胞において機能するプロモーターの制御下である、方法。
（項目１０４）患者において、癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法は、患者に、タンパク質またはペプチドに対するコード配列を含むベクターを投与する工程を包含し、該タンパク質またはペプチドは、インテグリンレセプターサブユニットが、互いに相互作用するのを妨げるか、インテグリンレセプタークラスター相互作用を妨げるか、またはインテグリンレセプターサブユニットが、癌細胞上の他のタンパク質と相互作用するのを妨げ、ここで、該コード配列が、哺乳動物細胞において機能するプロモーターの制御下である、方法。
（項目１０５）患者において、癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法は、患者に、タンパク質またはペプチドに対するコード配列を含むベクターを投与する工程を包含し、該タンパク質またはペプチドは、インテグリンレセプターサブユニットが、互いに相互作用するのを妨げるか、インテグリンレセプタークラスター相互作用を妨げるか、またはインテグリンレセプターサブユニットが、癌細胞における他のタンパク質と相互作用するのを妨げ、ここで、該コード配列が、哺乳動物細胞において機能するプロモーターの制御下である、方法。
（項目１０６）患者において、癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法は、患者に、タンパク質またはペプチドに対するコード配列を含むベクターを投与する工程を包含し、該タンパク質またはペプチドは、インテグリンサブユニットまたはラミニンの産生を妨害し、ここで、該コード配列が、哺乳動物細胞において機能するプロモーターの制御下である、方法。
（項目１０７）患者において、癌細胞の増殖を減少する方法であって、該方法は、患者に、タンパク質またはペプチドに対するコード配列を含むベクターを投与する工程を包含し、該タンパク質またはペプチドは、細胞のインテグリンシグナル伝達経路を妨害し、ここで、該コード配列が、哺乳動物細胞において機能するプロモーターの制御下である、方法。
（項目１０８）前記癌細胞増殖における減少が選択的である、項目１０３〜１０７に記載の方法。
（項目１０９）前記ベクターが、癌細胞に直接投与される、項目１０３〜１０７に記載の方法。
（項目１１０）前記ベクターが、正常細胞に直接投与される、項目１０３〜１０７に記載の方法。
（項目１１１）前記ベクターが、ウイルスベクターまたはリポソームにパッケージされる、項目１０３〜１０７に記載の方法。
（項目１１２）前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、項目８８に記載の方法。
（項目１１３）前記ベクターが、全身性に投与される、項目１０３〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１４）前記直接投与が、局所性適用による、項目１０９に記載の方法。
（項目１１５）前記直接投与が、局所性適用による、項目１１１に記載の方法。
（項目１１６）前記直接投与が、手術の間に行われる、項目１１４に記載の方法。
（項目１１７）前記直接投与が、手術の間に行われる、項目１１５に記載の方法。
（項目１１８）前記患者が動物である、項目１０３〜１０７のいずれかに記載の方法。
（項目１１９）前記動物が哺乳動物である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）前記哺乳動物がヒトである、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）前記癌細胞が、黒色腫細胞、腺腫細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、癌腫細胞、形質細胞腫細胞、肉腫細胞、神経膠腫細胞、胸腺腫細胞、白血病細胞、皮膚癌細胞、網膜癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、結腸癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、脳腫瘍細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、頸部癌細胞、肝臓癌細胞、胃腸癌細胞ならびに頭部および頸部癌細胞からなる群より選択される、項目１０３〜１０７に記載の方法。
（項目１２２）前記患者がさらに、細胞シグナル伝達を調節する別の因子、化学療法剤、新脈管形成インヒビターのうちの少なくとも１つをさらに投与されるか、または放射線で処置される、項目１０３〜１０７のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１２３）前記細胞シグナル伝達を改変する他の因子、化学療法剤、新脈管形成インヒビターまたは放射線処置が、連続的、または組み合わせて施される、項目１２０に記載の方法。
本発明のさらなる利点は、部分的に、以下の説明に示され、そして部分的に、その説明から明らかであるか、または本発明の実施によって学ばれ得る。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲に特に示される構成要素および組み合わせによって実現および達成される。上述の一般的説明および以下の詳細な説明の両方が、例示的かつ説明的なだけであり、そして主張されるような本発明を制限しないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
（ＩＩＩ．図面の簡単な説明）
添付の図面（これは、本明細書に包含され、そして本明細書の一部分を構成する）は、本発明のいくつかの実施形態を例示し、そしてこの説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１Ａ】図１は、開示される関係および組成物を代表する一連の概略図を示す。正常細胞において、インテグリンレセプターは、適切な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リガンドによって関与される場合、プログラム細胞死（アポトーシス）を抑制するように伝達する。レセプター−リガンド相互作用が喪失される場合、この細胞は、生存シグナルの欠如に起因して、アポトーシスを受ける（図１−パネル１）。
【図１Ｂ】図１は、開示される関係および組成物を代表する一連の概略図を示す。癌細胞において、複数の癌遺伝子傷害が協同して、悪性形質転換を引き起こす。このような協同は、インテグリンレセプター−ＥＣＭ相互作用から独立して、腫瘍細胞の生存および増殖を可能にする。この性質は、足場非依存性と呼ばれている（パネル２）。
【図１Ｃ】図１は、開示される関係および組成物を代表する一連の概略図を示す。本発明者らは、足場非依存性の機械的基本原理を発見した。形質転換細胞は、ＥＣＭ依存性シグナル伝達についての要件を、生存について頼る代理のインテグリンシグナル伝達ループで置換する。結腸上皮細胞において、ＡＰＣ（大腸腺腫性ポリポーシス）またはｐ５３変異と組み合わせたＲａｓの活性化は、インテグリンレセプターおよびリガンド成分（例えば、インテグリンα６およびラミニンγ２鎖）の誘導を導く。結果として、α６／β４インテグリンレセプターのラミニン依存性活性化は、カスパーゼ活性を阻害するように伝達し、従って、アポトーシスを抑制するように伝達する（パネル３）。
【図１Ｄ】図１は、開示される関係および組成物を代表する一連の概略図を示す。インテグリンα６の除去、ラミニンリガンド機能またはα６／β４インテグリンレセプター機能は、ＥＣＭの存在下で増殖する場合でさえ、形質転換細胞のアポトーシスを誘導する。対照的に、非形質転換コントロール細胞は、同じ処理に曝露される場合に生存可能なままであり、これは、自己分泌インテグリンシグナル伝達への形質転換細胞の依存が、癌細胞表現型の独特の特徴であり得ることを示す。α６インテグリンの必須の役割は、種々の形質転換細胞型（間葉細胞およびＳＷ４８０ヒト結腸癌腫細胞を含む）に拡張する。従って、ラミニン／α６インテグリン媒介性シグナル伝達の阻害は、種々の細胞型において癌細胞に特異的な死を誘導するに重要な方法である（パネル４）。
【図２】図２は、癌遺伝子の協同が、アポトーシスから細胞を保護することを示す。図２Ａは、コントロール細胞、ＡＰＣｍ細胞、Ｒａｓ細胞、ＡＰＣｍ＋Ｒａｓ細胞を示し、これらは、トリプシン／ＥＤＴＡを用いてコラーゲンＩＶ基質から剥離され、そして３９℃で１２時間、ＲＰＭＩ  １０％  ＦＣＳにおいて２×１０５細胞／ｍｌで懸濁液中に保った。その後、ＴＵＮＥＬ分析を、ポリリジンで処理されるスライド上で行った。ｔｕｎｅｌ陽性細胞のパーセンテージを、免疫蛍光顕微鏡法によって決定した。図２Ｂは、コントロール細胞、ＡＰＣｍ細胞、Ｒａｓ細胞、ＡＰＣｍ  Ｒａｓ細胞、ＳＷ４８０細胞が、（Ａ）に記載されるように、剥離されそして懸濁液中に保たれたことを示す。ＳＷ４８０  β４  ｄｎ／Ｇａｌ４ＶＰＥＲ細胞は、β４インテグリンの４ＯＨ−タモキシフェン誘導性のドミナントネガティブ形態を発現する。細胞をペレット化し、そしてタンパク質抽出物を、３００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１％  ＮＰ４０；０．２５％  デオキシコール酸ナトリウム；１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＧＴＡ中において調製した。２００μｌの抽出物を、２μｌのカスパーゼ３蛍光計基質（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに１０分間インキュベートした。カスパーゼ活性のＶｍａｘを、１時間の３８０ｎｍでの励起後の４６０ｎｍでの蛍光の測定によって決定した。図２Ｃは、ラミニンγ１特異的ペプチドおよびラミニンγ２特異的ペプチドが、１００μｇ／ｍｌの濃度で、ＡＰＣｍｉｎ＋Ｒａｓ細胞に添加されたことを示す。カスパーゼ活性を、（Ｂ）のように測定した。図２Ｄは、カスパーゼ８活性およびカスパーゼ９活性が、カスパーゼ８特異的蛍光計基質およびカスパーゼ９特異的蛍光計基質（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、（Ｂ）のように測定されたことを示す。
【図３】図３は、悪性細胞形質転換におけるインテグリン発現プロフィールおよびラミニン発現プロフィールの変更を示す。図３Ａは、インテグリン発現を示し、そして図３Ｂは、ラミニン発現を示す。この示される細胞集団を、３９℃でＲＰＭＩ  １０％  ＦＣＳにおいて、コラーゲンＩＶでコーティングされたディッシュ上で培養した。総ＲＮＡを、各々のサンプルについて１０６細胞から抽出し、そしてＲＴ−ＰＣＲ（ラミニン、α４、γ２およびＧＡＰＤＨ）またはＲＮａｓｅ保護について使用した。ＲＴ−ＰＣＲについて、ｃＤＮＡを、２８サイクル（線形範囲）のＰＣＲ増幅に供した。ＰＣＲ産物を、２％  アガロースゲル上で分析した。ＲＮａｓｅ保護について、１０μｇの総ＲＮＡを、１反応当たり使用した。産物を、４．５％  ポリアクリルアミド／１０Ｍ  尿素ゲル上で分析した。
【図４】図４は、α６／β４インテグリンが、ラミニンγ２鎖によって結合されて、Ｓｈｃ（ｓｒｃホモロジードメイン含有タンパク質）を活性化することを示す。図４Ａは、３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＰＢＳ中）をを用いてコラーゲンＩＶでコーティングされたディッシュから剥離された細胞が、示される抗体とともに１時間氷上でインキュベートされたことを示す。次いで、細胞を、γ１特異的ペプチドまたはγ２特異的ペプチドでコーティングした９６ウェルディッシュ上にプレーティングし、そして３０分間、ＲＰＭＩ培地において３９℃で接着させた。インキュベーション後、ウェルを、ＲＰＭＩを用いて洗浄した。１ウェル当たりの接着細胞のパーセンテージを、ウェルにおける細胞の溶解、および３７℃で５時間の基質、ｐ−ニトロフェノール−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドとのインキュベーション後のヘキソアミダーゼ活性によって測定した。図４Ｂは、示される細胞が、（Ａ）のように剥離され、そしてＰＢＳにおいて１０７細胞／ｍｌで再懸濁されたことを示す。氷上での１時間のインキュベーション後、細胞を、９００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によってペレット化し、そして１０μＭでホスファターゼインヒビター、過バナジン酸塩（ｐｅｒｖａｎａｄａｔｅ）を含むＲＰＭＩ中に再懸濁した。この細胞を、４０分間、β１インテグリン抗体およびβ４インテグリン抗体、ならびにラミニンγ２特異的ペプチドとともにインキュベートした。タンパク質抽出物を調製し、そして抗Ｓｈｃ抗体との免疫沈降に供した。ホスホチロシンを、ＩＰウェスタンブロットにおいて、ホスホチロシン特異的抗体を用いて検出した（上部パネル）。Ｓｈｃタンパク質のレベルを、同じ膜を再利用して、Ｓｈｃ特異的抗体を用いてモニターした（下部パネル）。
【図５】図５は、インテグリンα６／β４発現、およびラミニンγ２鎖発現が、形質転換細胞の生存に必須であることを示す。図５Ａ１は、示される細胞集団が、２のＭＯＩで組換えレトロウイルス（ピューロマイシン耐性遺伝子とともに、α６インテグリンについてのアンチセンスＲＮＡ、γ２ラミニン鎖についてのアンチセンスＲＮＡまたはβ４インテグリンドミナントネガティブ変異体を発現する）に感染されることを示す。ピューロマイシンを用いた選択の２週間後、コロニーを、ギムザを用いて染色し、そして計数した。ＡＰＣｍ＋Ｒａｓ  α６細胞およびＡＰＣｍ＋Ｒａｓ  ｐ３５細胞は、それぞれα６インテグリン鎖および抗アポトーシスバキュロウイルスｐ３５を発現する。ＡＰＣｍ＋Ｒａｓ細胞をまた、ラミニンγ２特異的ペプチドを用いてあらかじめコーティングされたディッシュ上にプレーティングした。図５Ａ２は、ＡＰＣｍ＋Ｒａｓハイグロ（ｈｙｇｒｏ）細胞、ＡＰＣｍ＋Ｒａｓ  Ｂｃｌ２細胞およびＡＰＣｍ＋Ｒａｓ  ｐ３５細胞が、それぞれ、ハイグロマイシン耐性マーカー、および抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ２またはｐ３５を発現することを示す。この細胞を、２のＭＯＩでレトロウイルス（β４インテグリンドミナントネガティブ変異体、およびピューロマイシン耐性遺伝子、またはピューロマイシン耐性遺伝子単独を保有する）に感染させた。細胞（１０５）を、肉眼で見えるコロニーを計数した後に、３９℃で２週間、軟寒天において維持した。図５Ａ３は、示される細胞集団が、２のＭＯＩで組換えレトロウイルス（Ａ１に記載されるように、薬物選択され、そして維持された）に感染されたことを示す。図５Ａ４は、示される細胞集団が、２のＭＯＩで組換えレトロウイルス（α６インテグリンについてのアンチセンスＲＮＡ、β４インテグリンドミナントネガティブ変異体、またはピューロマイシン耐性マーカーを発現する）に感染されたことを示す。細胞（１０５）を、Ａ２において記載されるように、軟寒天において維持し、そして評価した。図５Ｂは、α６インテグリンの細胞表面発現に対するα６アンチセンスＲＮＡ発現の効果が、抗α６ラットモノクローナル抗体、および二次抗体として、ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗ウサギ抗血清を用いたＦＡＣＳ分析によってモニターされたことを示す（上部パネル）。β４ドミナントネガティブ変異体の発現を、ＲＮＡｓｅ保護によって確認した。β４ドミナントネガティブｍＲＮＡのｃ末端を重複するプローブを用いて、同じサンプルにおいて、β４インテグリン発現およびβ４  ｄｎ発現を測定した（下部パネル）。図５Ｃは、癌遺伝子ＭｙｃおよびＲａｓを発現するレトロウイルスを用いて感染したａｒｆヌルマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を示す。次いで、細胞を、（Ａ）に示されるように、α６インテグリンについてのアンチセンスＲＮＡまたはβ４インテグリンドミナントネガティブ変異体を発現するレトロウイルスにさらに感染させた。ＭＥＦＳ  Ｒａｓ／Ｍｙｃ／Ａｒｆヌル＋α６センスは、α６インテグリン鎖を発現する。図５Ｄは、ＶＳＶ偽型ウイルスを用いて、（Ａ）に記載されるように感染させたＳＷ４８０ヒト結腸癌腫細胞を示す。感染細胞を、軟寒天において、ピューロマイシンを用いて選択した。クローンを、選択の��週間後に計数した。ＳＷ４８０  β４  ｄｎ／Ｇａｌ４ＶＰＥＲ細胞は、β４インテグリンの４ＯＨ−タモキシフェン誘導性のドミナントネガティブ形態を発現する。この細胞（１０５）を、軟寒天において２週間、４ＯＨ−タモキシフェンの存在下または非存在下で維持した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（ＩＶ．詳細な説明）
本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明およびそこに含まれる実施例、ならびに図およびその上記の説明および以下の説明を参照して、より容易に理解され得る。
【００１０】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が、開示されかつ記載される前に、本発明が、もちろん変化し得るものとして、別段の明記がない限り、特定の合成方法、特定の組換えバイオテクノロジー方法に限定されないか、または別段の明記がない限り、特定の試薬に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される術語が、特定の実施形態のみを記載する目的についてであり、そして限定されることが意図されないことがまた理解されるべきである。
【００１１】
（Ａ．定義）
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段指図しなければ、複数の指示物を含む。従って、例えば、「薬学的キャリア」への言及は、２つ以上のこのようなキャリアなどの混合物を含む。
【００１２】
範囲は、本明細書中において、「およそ」１つの特定の値からおよび／または「およそ」別の特定の値までとして表現され得る。このような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行する「およそ」の使用によって、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。各々の範囲の端点が、他の端点に関して、および他の端点から独立しての両方で重要であることがさらに理解される。
【００１３】
本明細書および上記の特許請求の範囲において、言及が、多くの用語に対して行われ、これは、以下の意味を有するように規定されるべきである：
「任意の」または「必要に応じて」は、引き続いて記載される事象または状況が、生じるかもしれないし、または生じないかもしれないことを意味し、そしてこの説明は、上記の事象または状況が生じる場合の例、およびそれが生じない場合の例を含むことを意味する。
【００１４】
「プライマー」は、プローブの部分集合であり、これは、いくつかの型の酵素的操作を支持し得、そして標的核酸とハイブリダイズし得、その結果、酵素的操作が生じ得る。プライマーは、当該分野で入手可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体もしくはアナログの任意の組み合わせから作製され得、これは、酵素的操作を妨げない。
【００１５】
「プローブ」は、例えば、ハイブリダイゼーションを通じて、代表的には配列特異的様式で、標的核酸と相互作用し得る分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該分野で良好に理解され、そして本明細書中で議論される。代表的には、プローブは、当該分野で入手可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体もしくはアナログの任意の組み合わせから作製され得る。
【００１６】
（Ｂ．組成物および方法）
インテグリンおよびインテグリンシグナル伝達に関連する組成物および方法が開示される。少なくともラミニン５のβ鎖およびγ鎖のアップレギュレーションを通じて、インテグリンα６、インテグリンβ４およびラミニン５が、癌細胞においてアップレギュレートされることが本明細書中で示される。インテグリンα６およびインテグリンβ４が相互作用して、インテグリンレセプター、Ａ６Ｂ４を形成する。このインテグリンレセプター、Ａ６Ｂ４は、ラミニン５と特異的に相互作用し、そしてラミニン５は、Ａ６Ｂ４と特異的に相互作用する。さらに、α６、β４またはラミニンγ２鎖の産生または機能への妨害が、α６、β４およびラミニンγ２鎖のアップレギュレーションに依存して、癌細胞の増殖を妨げるだけでなく、これが、同様に癌細胞を殺傷することが示される。α６およびβ４シグナル伝達は、インテグリンレセプター、Ａ６Ｂ４を通じて生じる。従って、Ａ６Ｂ４の形成への妨害は、Ａ６Ｂ４の機能（例えば、Ａ６Ｂ４のシグナル伝達）を妨害する。従って、α６、β４、ラミニン５、ラミニンγ２鎖またはＡ６Ｂ４の機能を妨害する組成物および方法が開示される。また、シグナル伝達に関与する分子の機能を妨害する組成物および方法が開示され、このシグナル伝達は、α６、β４、ラミニン５、ラミニンγ２鎖またはＡ６Ｂ４のいずれかに接続される。また、癌細胞の増殖を減少させるための方法、ならびに本明細書中に開示される組成物を用いて関係する癌細胞を殺傷する方法が開示され、この開示される組成物は、この機能、あるいはα６機能、β４機能、ラミニン５機能、ラミニンγ２鎖機能またはＡ６Ｂ４機能を妨害、減少または排除する。
【００１７】
癌細胞における２つの型の分子間の関係が、本明細書中に開示される。第一の型の分子は、インテグリンから構成されるインテグリンレセプターであり、そして第二の型の分子は、インテグリンを通じてインテグリンレセプターと相互作用するリガンドである。インテグリンレセプターとそのリガンドとの間に存在する特異性が存在する。本明細書中に開示される１つの局面は、細胞が、非癌状態から癌状態に行く場合、リガンド（または、リガンドの一部分（例えば、サブユニット））および同族のインテグリンレセプターの両方の同時アップレギュレーションが存在することである。この両方の型の分子の同時アップレギュレーションは、自己分泌ループ状態を作製し、ここで、このインテグリンレセプターによって制御されるシグナル伝達経路は、正常に生じるように、外因的に活性化されるよりはむしろ、自立的に活性化されるようになる。この両方の型の分子のアップレギュレーションは、より完全な形質転換細胞表現型を作製し、これにおいて、癌細胞の生存は、自己分泌ループに依存する。ここで、治療活性が、自己分泌ループにおける両方の点を標的化し得る。癌細胞におけるこの同時アップレギュレーションの特定の例が、本明細書中に開示される。例えば、ラミニン５（βおよびγ２鎖の両方がアップレギュレートされる）およびインテグリンレセプターα６β４；ラミニン１０／１１およびインテグリンレセプターα６β１およびα３β１。
【００１８】
本明細書中の実施例が、どのインテグリン、どのインテグリンレセプターおよびどのインテグリンリガンドが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の非存在下で増殖する能力の癌細胞への付与に関与するかを示すように、これらのインテグリン、インテグリンレセプターおよびリガンドを用いて、これらと相互作用する分子および／またはこれらの機能を妨害する分子を同定する方法がまた開示される。
【００１９】
（１．組成物）
開示される組成物を調製するために使用されるべき成分、ならびに本明細書中に開示される方法内で使用されるべき組成物自身が開示される。これらの物質および他の物質が、本明細書中に開示され、そしてこれらの物質の組み合わせ、部分集合、相互作用、群などが開示される場合、各々の種々の個々の特定の言及、およびこれらの化合物の集合的置換が明白に開示されないかもしれないが、各々は、本明細書中において、特に意図され、そして記載されることが理解される。例えば、特定のβ４またはα６が、開示および議論され、そして多くの分子に対して作製され得る多くの変更（β４またはα６に対する変更を含む）が議論される場合、特に意図されるのは、各々の組み合わせおよびあらゆる組み合わせ、ならびにこれらの変更の置換、および特にそうでないと示されない限り可能な変更の置換である。従って、分子Ａ、分子Ｂおよび分子Ｃのクラスが開示され、ならびに分子Ｄ、分子Ｅおよび分子Ｆのクラスならびに組み合わせ分子Ａ〜Ｄの例が開示される場合、各々が個々に列挙されない場合でさえ、各々が、個々にそして集合的に意図される。従って、組み合わせＡ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜ＥおよびＣ〜Ｆが開示されると考慮される。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせがまた開示される。従って、例えば、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜ＦおよびＣ〜Ｅの部分群が開示されると考慮される。この概念は、本出願のすべての局面に適用され、これは、開示される組成物の作製方法および使用方法における工程を含むがこれらに限定されない。従って、実施され得る種々のさらなる工程が存在する場合、各々のこれらのさらなる工程が、開示される方法の任意の特定の実施形態またはその実施形態の組み合わせとともに実施され得ることが理解される。
【００２０】
（ａ）インテグリンおよびそのリガンド）
適切な胚発生、組織ホメオスタシスおよび創傷治癒について、細胞増殖は、空間においてそして時間にわたっての両方で、しっかりと制御されなければならない。特に、細胞は、他の細胞および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とのその関係を理解し得なければならず、そしてこれらの位置合図を増殖の調節に影響を及ぼす生化学的シグナルに変換しなければならない。位置合図の認識を細胞内シグナル伝達経路の活性化に連結するその能力が原因で、接着レセプター（例えば、インテグリンおよびカドヘリン）は、この目的の達成に不可欠なようである。
【００２１】
インテグリンは、別個であるが重複する部分集合のＥＣＭタンパク質への結合によって、主に細胞接着をもたらす。正常細胞は、増殖、分化および生存について（例えば、ＣｌａｒｋおよびＢｒｕｇｇｅ、１９９５；  ＬｉｎおよびＢｉｓｓｅｌｌ、１９９３；Ｐａｒｉｓｅら、２０００）、血清由来のＥＣＭ成分との接触（足場依存性と呼ばれる現象）を必要とする。これは、インテグリンレセプターを通じたシグナル伝達を伴う（Ｈｙｎｅｓ、１９９２）。フィブロネクチンおよびラミニン、ならびに他のＥＣＭタンパク質は、インテグリンレセプターについてのリガンドとして作用することが公知である（Ａｋｉｙａｍａら、１９９０）。インテグリンは、α−β鎖ヘテロダイマーを形成する膜貫通タンパク質である。α鎖インテグリンおよびβ鎖インテグリンは、異なる遺伝子ファミリーのメンバーである。このヘテロダイマーのリガンド結合特異性は、α鎖遺伝子ファミリーメンバーおよびβ鎖遺伝子ファミリーメンバーの特定の組み合わせによって決定される（Ｈｙｎｅｓ、１９９２）。リガンド結合は、種々のシグナル伝達成分との相互作用を介したβ鎖の細胞質テイルを通じて、インテグリンレセプターのシグナル伝達を誘発する。
【００２２】
インテグリンは、共通のシグナル伝達経路ならびに亜集団特異的シグナル伝達経路を活性化する（ＣｌａｒｋおよびＢｒｕｇｇｅ、１９９５；ＧｉａｎｃｏｔｔｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）。特に、ほとんどのインテグリンは、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）を活性化するが、α１β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリンおよびα６β４インテグリンは、Ｓｈｃによって、Ｒａｓ細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）シグナル伝達経路に関連付けられる（Ｍａｉｎｉｅｒｏら、１９９７；Ｍａｉｎｉｅｒｏら、１９９５；Ｗａｒｙら、１９９６）。Ｓｈｃは、３つの形態、ｐ４６、ｐ５２およびｐ６６において発現されるＳＨ２−ＰＴＢドメインのアダプタータンパク質であり、これらのうちの２つ（ｐ４６およびｐ５２）は、Ｇｒｂ２／ＳＯＳ複合体の原形質膜への補充によって、種々のチロシンキナーゼをＲａｓに連結する（ＰａｗｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、１９９７）。ＳＯＳによる活性化の際に、Ｒａｓは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ＥＲＫに達するキナーゼカスケードを刺激する（Ｍａｒｓｈａｌｌ、１９９５）。ＥＲＫは、三元複合体転写因子（例えば、Ｅｌｋ−１およびＳａｐ−１／２）をリン酸化し、そして最初期遺伝子Ｆｏｓの転写を促進する（Ｔｒｅｉｓｍａｎ、１９９６）。初代内皮細胞およびケラチノサイトにおいて、マイトジェンおよびＳｈｃ結合インテグリンは、共同様式で協同して、Ｆｏｓプロモーターからの転写を促進する。従って、Ｓｈｃに結合されるインテグリンの連結は、これらの細胞が、マイトジェンに応答してＧ１を通じて進行することを可能にするが、一方、他のインテグリンの連結は、マイトジェンの存在下でさえも増殖阻止をもたらす（Ｍａｉｎｉｅｒｏら、１９９７；Ｗａｒｙら、１９９６）。Ｓｈｃは、ＥＣＭに応答して細胞周期進行を制御するバイナリースイッチのようである。さらに、インテグリンレセプターは、細胞生存を支持するＡＫＴ活性化を導く細胞内シグナル伝達を誘導することが示されている（ＬｅｅおよびＪｕｌｉａｎｏ、２０００）。
【００２３】
正常細胞と対照的に、癌細胞は、一般的に、ＥＣＭへの足場の非存在下において、生存および増殖し得（ＧｉａｎｃｏｔｔｉおよびＭａｉｎｉｅｒｏ、１９９４）、これは、腫瘍細胞の生存および増殖が、ＥＣＭを通じたインテグリンシグナル伝達の関与から独立するようになることを示唆する。
【００２４】
２世代目ラット胚線維芽細胞のＥＣＭへの足場の非存在下における増殖は、ＲａｓおよびＭｙｃ、またはＲａｓおよびアデノウイルスＥ１ａ癌遺伝子の協同作用を必要とする（Ｌａｎｄら、１９８３；Ｒｕｌｅｙ、１９８３）。同様に、マウス結腸上皮細胞は、懸濁液において増殖するために、活性化Ｒａｓおよびａｄｅｎｏｍｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ遺伝子（ＡＰＣｍｉｎ）の変異の両方を必要とする（Ｄ’Ａｂａｃｏら、１９９６）。
【００２５】
インテグリンは、細胞表面レセプター分子の大きなファミリーであり、これは、細胞間、および細胞と細胞外マトリックス間の相互作用を媒介するように機能する。インテグリンレセプターは、２つのサブユニット（αインテグリンおよびβインテグリン）から構成されるヘテロダイマーである。このヘテロダイマー形態は、細胞表面上で発現され、そして細胞膜を通じて、そして細胞のサイトゾルの中へ、細胞外マトリックスまたは他の細胞との相互作用から得られるシグナルを伝達するように作用する。生じるシグナル伝達は、レセプターとのリガンド相互作用により生じる。インテグリンレセプターは、多くのリガンド（コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンを含む）を有し得る。
【００２６】
現在、少なくとも１８の異なるαインテグリン、および少なくとも８の異なるβインテグリンが存在し、これらは、少なくとも２４の異なるαβヘテロダイマーを形成することが示されている。特定のインテグリン（例えば、β１）は、多くの異なるヘテロダイマーにおいて相互作用するが、多くのサブユニットは、その相互作用に対する構造的制限、または限られた数の潜在的なダイマーパートナーのみを提供する細胞発現パターンのいずれかのために、単一のヘテロダイマーのみ形成する。本明細書中に開示されるのは、インテグリンの部分集合、インテグリンレセプターおよびそのリガンドのサブセット間で生じる特異的関係である。この開示される関係は、α６インテグリンおよびβ４インテグリンによって形成される、α６β４レセプターに集中する。特に興味深いのは、α６β４レセプター、ラミニン５に対するリガンド間の関係である。このラミニンは、３つの鎖（α鎖、β鎖およびγ鎖）から構成される。ラミニン５とα６β４レセプターとの間の相互作用の特異性は、γ鎖によって制御される。ラミニン５は、α６β４インテグリンレセプターとのみ相互作用するγ２鎖を含む。
【００２７】
インテグリンα６は、７つのアミノ末端反復セグメントを有し、これは、７単位のβプロペラ、５つのＮ末端ＦＧ−ＧＡＰドメインおよび３つの二価陽イオン部位に折り畳まれ得る。この膜貫通ドメインの後に、短い細胞質テイルが続き、これは、Ａ形態およびＢ形態に選択的スプライシングされる。このα６インテグリン鎖はまた、反復単位ＩＩＩと反復単位ＩＶとの間の選択的スプライシングを示し、エキソンＸ２の存在または非存在をもたらす。インテグリンα６は、ジスルフィド結合される重鎖および軽鎖にプロセシングされる。ヒトα６  ｃＤＮＡの代表的な対立遺伝子は、配列番号１に示される。開示される機能的ドメイン、ならびにα６内部に含まれる他のドメインは、α６タンパク質の別個のフラグメント、ならびにそれをコードする核酸として別々に開示されると考慮されることが理解される。
【００２８】
インテグリンβ４は、ＭＩＤＡＳ様モチーフおよび４つのシステインリッチリピート、Ｎ末端細胞外ドメインにおける３つのＥＧＦ様ドメイン、膜貫通領域、ならびにフィブロネクチンＩＩＩ型リピートの２つの対を含む長い細胞質テイルを含む。後者は、選択的スプライシングを受け得る可変性セグメントによって接続される。インテグリンβ４はまた、細胞質テイルにおいて、タンパク質分解プロセシングを受け、１６５ｋＤフラグメントおよび１３０ｋＤフラグメントに転換される２００ｋＤの成熟形態を生じる。ヒトβ４  ｃＤＮＡの代表的な対立遺伝子は、配列番号５に示される。開示される機能的ドメイン、ならびにβ４内部に含まれる他のドメインは、β４タンパク質の別個のフラグメント、ならびにそれをコードする核酸として別々に開示されると考慮されることが理解される。
【００２９】
ラミニン５は、ラミニン鎖α３、β３およびγ２から構成される。ラミニン５は、より短いラミニンα３Ａ鎖またはより長いα３Ｂ鎖のいずれかを含み得る。ラミニン５はまた、そのα３Ａ鎖のＮ末端部分およびγ２鎖のＮ末端部分のタンパク質分解プロセシングによってトリミングされる。このラミニンγ２鎖は、Ｎ末端半分の内部に埋め込まれるラミニンＢドメイン（ドメインＩＶ）を有する、少なくとも６つのラミニンＥＧＦ様ドメイン（ドメインＩＩＩおよびドメインＶ）を含む。このＣ末端テイルは、コイルドコイルドメイン（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｄｏｍａｉｎ）を含む。このγ２鎖のＮ末端プロセシング部分は、インテグリンα６／β４レセプターへの結合およびこのレセプターの活性化に十分である。ヒトラミニン５−γ２  ｃＤＮＡの代表的な対立遺伝子は、配列番号１３に示される。開示される機能的ドメイン、ならびにラミニン５タンパク質およびラミニン５−γ２タンパク質内部に含まれる他のドメインは、ラミニン５タンパク質およびラミニン５−γ２タンパク質の別個のフラグメント、ならびにそれをコードする核酸として別々に開示されると考慮されることが理解される。
【００３０】
インテグリンシグナル伝達（例えば、α６インテグリンおよびβ４インテグリンに依存したインテグリンシグナル伝達）の阻害についての組成物および方法が開示される。例えば、インテグリンレセプターシグナル伝達（例えば、α６β４インテグリンレセプターからのシグナル伝達）を阻害する組成物および方法が開示される。インテグリンレセプターシグナル伝達が、インテグリンレセプターシグナルが完全に伝播されるのを妨げる様式で、例えば、分子（例えば、インテグリンレセプターに対するリガンド、またはこのインテグリンレセプターの下流のシグナル伝達分子）の妨害によって影響を及ぼされ得ることがまた理解される。インテグリンシグナル伝達およびインテグリン機能の阻害についての組成物および方法が、例えば、細胞の殺傷によって、インテグリンが発現される細胞の増殖を最終的に阻害する任意の組成物または方法であり得ることがまた理解される。この組成物および方法が、代表的には、３つの基本的な非限定クラスの機能レギュレーターに分類され得ることが理解され、これは、本明細書中で議論される。
【００３１】
（（１）クラス）
（（ａ）産生レギュレーター）
産生レギュレーターは、広範なクラスのインテグリン機能レギュレーターであり、これは、例えば、標的インテグリンのｍＲＮＡ合成または発現を阻害することによる標的インテグリンの産生、あるいは標的インテグリンのｍＲＮＡ分解（これは、標的インテグリンの翻訳を阻害する）を引き起こすことによる標的インテグリンに関する。産生レギュレーターは、インテグリン産生経路において任意の点を標的化する任意の型の分子であり得るが、代表的には、これらの型の組成物は、インテグリンのｍＲＮＡ発現またはインテグリンのタンパク質発現のいずれかを標的化する。例えば、β４インテグリン、α６インテグリンまたはラミニン５のγ２サブユニット（これは、本明細書中において、癌細胞においてアップレギュレートされることが示されており、そしてこれによりこの癌細胞が、ＥＣＭの非存在下において生存し得る）が、標的インテグリンである場合、β４インテグリンの代表的な産生レギュレーター、α６インテグリンの代表的な産生レギュレーターまたはラミニン５のγ２サブユニットの代表的な産生レギュレーターは、例えば、β４インテグリンのｍＲＮＡ、α６インテグリンのｍＲＮＡまたはラミニン５のγ２サブユニットのｍＲＮＡを標的化したアンチセンス分子である。産生レギュレーターがまた、本明細書中に開示される任意の分子を標的化し得るか、あるいは標的インテグリンまたはインテグリンレセプターに関連したシグナル伝達鎖内部にあることがまた理解される。例えば、標的インテグリンレセプターに対するリガンドの産生の阻害は、このレセプターのインテグリン機能を阻害する１つの方法である。従って、産生レギュレーターは、インテグリン産生の阻害または増強のいずれかを行い得る。
【００３２】
（（ｂ）インテグリンレギュレーターに対するインテグリン）
別の型のインテグリン機能レギュレーターは、インテグリン−インテグリンレギュレーターである。この型の機能レギュレーターは、代表的には、インテグリンが、機能的インテグリンレセプターを形成するために相互作用するのを妨げる。例えば、インテグリンレギュレーターに対するインテグリンは、β４がα６と相互作用するのを妨げて、α６β４インテグリンレセプターを形成する様式で、β４と相互作用する組成物であり得るか、またはα６がβ４と相互作用するのを妨げて、α６β４インテグリンレセプターを形成する様式で、α６と相互作用する組成物であり得る。インテグリン相互作用に対するインテグリンの機能レギュレーターが、インテグリンレセプター（α６インテグリンまたはβ４インテグリンを含む）に依存したシグナル伝達経路に影響を及ぼし得ることがまた意図される。インテグリンレギュレーターに対するインテグリンが、インテグリンが、相互作用し得る可能なインテグリンパートナーのすべてと相互作用するのを妨げることは必要とされず、これはただ、標的インテグリンの別の特定のインテグリンとの相互作用を妨げる。例えば、インテグリンα６は、β１インテグリンおよびβ４インテグリンと相互作用する。特定の実施形態において、この組成物は、α６β４相互作用を妨害するが、α６β１相互作用を妨害しない。
【００３３】
（（ｃ）他の分子レギュレーターに対するインテグリン）
第三のクラスの機能レギュレーターは、他の分子レギュレーターに対するインテグリンである。これらの組成物は、分子（例えば、低分子リガンド、あるいはインテグリンまたはインテグリンレセプターと相互作用する他のタンパク質）を特異的に妨害するように設計される。例えば、他の分子レギュレーターに対するインテグリンは、特定のインテグリンレセプター（例えば、α６β４レセプター）に対するリガンドを標的し得る。このα６β４レセプターに対するリガンドは、ラミニン５またはラミニンγ２鎖である。ラミニン５と相互作用し、その結果、α６β４とのラミニン５またはラミニンγ２鎖の相互作用が、阻害または減少される組成物が、特に本明細書中で意図される。同様に、他の分子（例えば、Ｓｈｃ分子）が存在し、これはまた、インテグリンと相互作用する（例えば、α６β４レセプター）。Ｓｈｃ分子と特異的に相互作用し、その結果、Ｓｈｃ分子とα６β４レセプターとの間の適切な相互作用を妨げる組成物が開示される。
【００３４】
（（２）型）
開示されるインテグリンおよびインテグリンレセプターの機能を調節し得る（例えば、阻害によって）分子の異なる一般的クラスがまさに存在するように、この調節を行う多くの異なる型の分子が存在する。例えば、任意の分子（これは例えば、開示されるインテグリン、インテグリンレセプター、または開示されるインテグリンおよびインテグリンレセプターによって産生されるシグナル伝達経路の調節を行い得る）が意図される。例えば、開示される組成物を阻害する抗体または低分子が、本明細書中において開示される。また、例えば、機能的核酸（例えば、種々の様式で、開示されるインテグリン機能を阻害し得るリボザイムまたはアンチセンス分子）が開示される。例示的な分子の非限定的なリストが、本明細書中において議論される。
【００３５】
（（ａ）抗体）
抗体は、例えば、開示されるインテグリンおよびインテグリンレセプターの機能、開示されるインテグリンレセプターと相互作用する分子、ならびに開示されるインテグリンレセプターのシグナル伝達経路における分子を調節するために使用され得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、任意のクラスの免疫グロブリン全体（すなわち、インタクトな抗体）を包含するがこれに限定されない。ネイティブな抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロテトラマーの糖タンパク質である。代表的には、各々の軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に結合されるが、一方、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各々の重鎖および軽鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各々の重鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ（Ｈ））、続いて多くの定常ドメインを有する。各々の軽鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ（Ｌ））、そしてその他端に定常ドメインを有する；この軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと並び、そしてこの軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界面を形成すると考えられる。任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明らかに異なる型（カッパ（ｋ）およびラムダ（ｌ）と呼ばれる）のうちの１つに割り当てられ得る。この重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。５つの主要なクラスのヒト免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）が存在し、そしてこれらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）にさらに分けられ得る。当業者は、マウスについてこれに相当するクラスを認識している。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【００３７】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり得る。ポリクローナル抗体は、代表的には、免疫原性チャレンジされている動物の血清に由来し、そしてモノクローナル抗体は、本明細書中で議論されるように誘導される。
【００３８】
用語「可変」は、可変ドメインの特定の一部分を示すよう本明細書中で使用され、これは、抗体間の配列が異なり、そしてその特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合および特異性において使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを通じて、通常等しく分配されない。これは、代表的には、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。この可変ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変領域は、各々４つのＦＲ領域を含み、これは、３つのＣＤＲによって接続されるβシート配置を広く採用し、ループ接続を形成し、そしていくつかの場合において、βシート構造の一部を形成する。各々の鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によってごく接近して存在し、そして他の鎖由来のＣＤＲは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）を参照のこと）。この定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与）を示す。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体またはそのフラグメント」は、キメラ抗体およびハイブリッド抗体を包含し、これは、二重または複数の抗原またはエピトープ特異性、およびハイブリッドフラグメントを含むフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなど）を含む。従って、その特異的抗原を結合する能力を保持する抗体のフラグメントが提供される。例えば、ＥｐｈＡ２結合活性を維持する抗体のフラグメントが、用語「抗体またはそのフラグメント」の意味の範囲に含まれる。このような抗体およびフラグメントは、当該分野で公知の技術によって作製され得、そして実施例に示される方法、ならびに抗体の産生についての一般的方法ならびに特異性および活性についての抗体のスクリーニングについての一般的方法において示される方法に従って、特異性および活性についてスクリーニングされ得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）を参照のこと）。
【００４０】
また、「抗体またはそのフラグメント」の意味の範囲に含まれるのは、例えば、米国特許第４，７０４，６９２号（この内容は、本明細書によって参考として援用される）に記載されるような抗体フラグメントおよび抗原結合タンパク質の結合体（単鎖抗体）である。単鎖二価抗体がまた提供される。
【００４１】
必要に応じて、この抗体は、他の種において作製され、そしてヒトにおける投与のために「ヒト化」される。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、これは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含む。ヒト化抗体は、免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換される。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、移植されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列のいずれにおいても見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、実質的にすべての、少なくとも１つそして代表的には２つの可変ドメインを含み、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてすべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（代表的には、ヒト免疫グロブリンの一部分）を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２））。
【００４２】
非ヒト抗体のヒト化方法は、当該分野で周知である。一般的には、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からこの抗体に導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基といわれ、これは、代表的には、「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、齧歯類のＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列について置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法に従って行われ得る（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで、実質的にインタクトではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、代表的には、これにおいて、いくつかのＣＤＲ残基およびあるいはおそらくいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似の部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
【００４３】
ヒト化抗体の作製において使用されるべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少するために極めて重要である。「ベストフィット」方法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列が、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体についてのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受入れられる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１：２２９６（１９９３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体について使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３））。
【００４４】
抗原に対する高い親和性、および他の有利な生物学的性質を保持する抗体がヒト化されることがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを用いて、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、市販されており、そして当業者になじみ深い。選択される候補免疫グロブリン配列の可能性のある３次元コンホメーション構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このようにして、ＦＲ残基は、コンセンサス配列および移入配列から選択および結合され得、その結果、所望の抗体特性（例えば、標的抗原に対する親和性の増大）が達成される。一般に、このＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接およびほぼ実質的に関与する（１９９４年３月３日に公開されたＷＯ  ９４／０４６７９を参照のこと）。
【００４５】
免疫の際に、内因性の免疫グロブリン産物の非存在下において、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）が利用され得る。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））のホモ接合体欠失が、内因性の抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際に、ヒト抗体の産生をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）を参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリにおいて産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｔｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１））。
【００４６】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞をさらに提供する。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な集団の抗体から得られる抗体をいい、すなわち、この集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。このモノクローナル抗体は、本明細書中で、特に「キメラ」抗体を含み、ここで、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に同一またはこの配列に相同であるが、一方、残りの鎖は、別の種由来の抗体、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントにおいて、それらが所望の活性を示す限りは、対応する配列に同一またはこの配列に相同である（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）を参照のこと）。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）またはＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）によって記載されるような方法）を用いて調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物は、代表的には、免疫化因子を用いて免疫されて、この免疫化因子を特異的に結合する抗体を産生するリンパ球、またはこの抗体を産生し得るリンパ球を惹起する。あるいは、このリンパ球は、インビトロで免疫され得る。好ましくは、この免疫化因子は、ＥｐｈＡ２を含む。伝統的に、モノクローナル抗体の作製は、免疫原としての使用について、精製タンパク質またはペプチドの有効性に依存している。より最近、ＤＮＡベースの免疫化は、強力な免疫応答を惹起し、そしてモノクローナル抗体を作製する方法としての見込みを示した。このアプローチにおいて、ＤＮＡベースの免疫化が使用され得、ここで、ヒトＩｇＧ１との融合タンパク質として発現されるＥｐｈＡ２の一部分をコードするＤＮＡが、当該分野で公知の方法に従って、宿主動物に注入される（例えば、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＫＥら、Ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｌｔ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９８年１２月；１７（６）５６９〜７６；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＫＥら、Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ５  ｍｉｃｒｏｇ  ｏｆ  ＤＮＡ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２０００年８月；１９（４）：２９７〜３０２、これらは、抗体産生の方法について、本明細書中において完全に参考として援用される）。
【００４８】
精製タンパク質またはＤＮＡのいずれかを用いた免疫化に対する別のアプローチは、バキュロウイルスにおいて発現される抗原を使用することである。この系に対する利点として、作製の平易さ、高レベルの発現および翻訳後修飾が挙げられ、この翻訳後修飾は、哺乳動物系において見られる修飾に非常に類似する。この系の使用は、融合タンパク質として、ＥｐｈＡ２抗体のドメインの発現を含む。この抗原は、シグナル配列とＥｐｈＡ２抗体のヌクレオチド配列の成熟タンパク質ドメインとの間に、インフレームで遺伝子フラグメントを挿入することによって産生される。これは、ビリオンの表面上での外来タンパク質の提示をもたらす。この方法は、ウイルス全体を用いた免疫化を可能にし、標的抗原の精製の必要性を排除する。
【００４９】
一般的に、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が、ヒト起源の細胞が所望される場合、モノクローナル抗体の産生方法において使用されるか、あるいは脾臓細胞またはリンパ節細胞が、非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合、使用される。次いで、このリンパ球が、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて、不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）５９〜１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換哺乳動物細胞（齧歯類、ウシ、ウマおよびヒト起源の骨髄腫細胞を含む）である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が利用される。このハイブリドーマ細胞は、適切な培養培地で培養され得、これは、好ましくは、融合されない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む。例えば、この親細胞が、酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失する場合、このハイブリドーマについての培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する。好ましい不死化細胞株は、有効に融合する細胞株、選択される抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルでの発現を支持する細胞株、および培地（例えば、ＨＡＴ培地）に感受性の細胞株である。より好ましい不死化細胞株は、マウス骨髄腫細胞であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣａｌｉｆおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄから入手可能である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株がまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８７）５１〜６３頁）。
【００５０】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地が、ＥｐｈＡ２に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、このハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知であり、そして以下の実施例、またはＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）にさらに記載される。
【００５１】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、このクローンは、限界希釈またはＦＡＣＳソーティング手順によってサブクローニングされ得、そして標準的な方法によって増殖され得る。この目的のために適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、このハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腹水としてインビボで増殖され得る。
【００５２】
このサブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡセファロースクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水流体から単離または精製され得る。
【００５３】
このモノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、このＤＮＡは、発現ベクター中に配置され、次いでこのベクターは、宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、形質細胞腫細胞または骨髄腫細胞（これらの細胞は、別の状況では免疫グロブリンタンパク質を産生しない））にトランスフェクトされ、この組換え宿主細胞において、モノクローナル抗体の合成を獲得し得る。このＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりに、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインについてのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号）、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部分を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、改変され得る。必要に応じて、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインについて置換されるか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインについて置換されて、ＥｐｈＡ２に対する特異性を有する１つの抗原結合部位、および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラの二価抗体を作製する。
【００５４】
インビトロ方法がまた、一価抗体の調製に適切である。そのフラグメント（特に、Ｆａｂフラグメント）を産生するための抗体の消化が、当該分野で公知の慣用的技術を用いて果たされ得る。例えば、消化は、パパインを用いて行われ得る。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ  ９４／２９３４８、米国特許第４，３４２，５６６号、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）に記載される。抗体のパパイン消化は、代表的には、２つの同一の抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメントと呼ばれる）を産生し、その各々が、１つの抗原結合部位、および残りのＦｃフラグメントを有する。ペプシン処理は、フラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれる）を生じ、これは、２つの抗原結合部位を有し、そしてなお抗原を架橋し得る。
【００５５】
この抗体消化において産生されるＦａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の第一の定常ドメインを含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基（この抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む）の付加だけ、Ｆａｂフラグメントと異なる。このＦ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって結合される２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価フラグメントである。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中において、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を保有するＦａｂ’についての呼称である。抗体フラグメントは、本来、これらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた公知である。
【００５６】
この抗体の単離された免疫原性的に特異的なパラトープまたはフラグメントもまた提供される。この抗体の特異的免疫原性エピトープは、この分子の化学的破壊または機械的破壊によって、抗体全体から単離され得る。このように得られる精製フラグメントが試験されて、本明細書中に教示される方法によって、その免疫原性および特異性を決定する。この抗体の免疫反応性パラトープは、必要に応じて、直接合成される。免疫反応性フラグメントは、この抗体のアミノ酸配列に由来する少なくともおよそ２〜５連続アミノ酸のアミノ酸配列として規定される。
【００５７】
本発明の抗体を含むタンパク質の産生の１つの方法は、タンパク質化学技術によって、２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを互いに結合することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドが、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｏｙｌ））化学のいずれかを用いた現在利用可能な実験室設備を用いて化学合成され得る（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。当業者は、本発明の抗体に対応するペプチドまたはポリペプチドが、例えば、標準的な化学反応によって合成され得ることを容易に理解し得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドが、その合成樹脂から合成され得、そしてその合成樹脂から開裂されないが、一方、抗体の他のフラグメントは、この樹脂から合成され得、そしてこの樹脂から引き続いて開裂され、それによって、他のフラグメント上で機能的にブロックされる末端基を曝露する。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントが、それぞれそのカルボキシル末端およびアミノ末端でのペプチド結合を介して共有結合されて、抗体またはそのフラグメントを形成し得る（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ．およびＴｒｏｓｔ  Ｂ．編（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．、ＮＹ）。あるいは、このペプチドまたはポリペプチドは、上記のようにインビボで独立に合成される。一旦単離されると、これらの独立のペプチドまたはポリペプチドが結合されて、類似のペプチド縮合反応を介して、抗体またはそのフラグメントを形成し得る。
【００５８】
例えば、クローニングされたペプチドセグメントまたは合成のペプチドセグメントの酵素的結合は、比較的短いペプチドフラグメントの結合を可能にして、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチドまたはタンパク質ドメイン全体を産生する（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドのネイティブの化学結合が利用されて、より短いペプチドフラグメントから、大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築し得る。この方法は、２工程の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６〜７７９（１９９４））。第一の工程は、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の非保護ペプチドセグメントを用いる、非保護合成ペプチドαチオエステルの化学選択的反応であり、最初の共有結合産物として、チオエステル結合した中間体を与える。反応条件の変化を伴わずに、この中間体は、自発的な迅速な分子内反応を受けて、結合部位で、ネイティブのペプチド結合を形成する。タンパク質分子の総体的な合成に対するこのネイティブの化学結合方法の適用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の調製によって例示される（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら、（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７〜１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３〜３０（１９９４））。
【００５９】
あるいは、非保護ペプチドセグメントが化学結合され、ここで、この化学結合の結果としてペプチドセグメント間に形成される結合は、天然の結合ではない（非ペプチド結合）（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：２２１（１９９２））。この技術が使用されて、タンパク質ドメインのアナログ、ならびに完全な生物学的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成している（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２５７〜２６７頁（１９９２））。
【００６０】
本発明はまた、生物活性を有する抗体のフラグメントを提供する。本発明のポリペプチドフラグメントは、そのポリペプチドフラグメントを産生し得る発現系（例えば、アデノウイルス発現系またはバキュロウイルス発現系）において、このポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによって得られる組換えタンパク質であり得る。例えば、特定のハイブリドーマ由来の抗体の活性なドメインを決定し得、これは、この抗体のＥｐｈＡ２との相互作用に関連した生物学的効果を引き起こし得る。例えば、この抗体の活性または結合特異性または親和性のいずれかに寄与することが見出されないアミノ酸は、それぞれの活性における損失を伴わずに欠失され得る。例えば、種々の実施形態において、アミノ末端アミノ酸またはカルボキシ末端アミノ酸が、ネイティブの非免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子、あるいは改変された非免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子のいずれかから連続的に除去され、そしてそれぞれの活性が、多くの利用可能なアッセイのうちの１つにおいてアッセイされる。別の例において、抗体のフラグメントは、改変抗体を含み、ここで、少なくとも１つのアミノ酸が、特定の位置で、天然に存在するアミノ酸について置換されており、そしてアミノ末端アミノ酸またはカルボキシ末端アミノ酸、あるいはこの抗体の内部領域のいずれかの一部でさえ、ポリペプチドフラグメントまたは他の部分（例えば、ビオチン）で置換されており、これは、改変抗体の精製を容易にし得る。例えば、改変抗体は、ペプチド化学、または２つのポリペプチドフラグメントをコードするそれぞれの核酸の発現ベクターへのクローニングのいずれかを通じて、マルトース結合タンパク質に融合され得、その結果、このコード領域の発現が、ハイブリッドポリペプチドをもたらす。このハイブリッドポリペプチドは、アミロース親和性固体支持体上を通過させることによってアフィニティー精製され得、次いで、この改変抗体レセプターが、特定のプロテアーゼ第Ｘａ因子を用いてこのハイブリッドポリペプチドを開裂することによって、マルトース結合領域から分離され得る（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ、１９９６、１６４頁を参照のこと）。類似の精製手順が、同様に、真核生物細胞由来のハイブリッドタンパク質の単離のために利用可能である。
【００６１】
このフラグメント（他の配列に結合されるにせよされないにせよ）は、このフラグメントの活性が、非改変抗体または抗体フラグメントと比較して、有意に変更または減弱されないならば、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換または他の選択された改変を含む。これらの改変は、いくつかのさらなる性質（例えば、ジスルフィド結合し得るアミノ酸を除去または付加すること、その生体寿命を増大すること、その分泌特性を変更することなど）を提供し得る。いずれにせよ、このフラグメントは、生体活性性質（例えば、結合活性、結合ドメインでの結合の調節など）を保有するはずである。この抗体の機能領域または活性領域は、タンパク質の特定の領域の変異誘発、その後の発現、および発現されるポリペプチドの試験によって同定され得る。このような方法は、当業者に容易に明白であり、そしてこの抗原をコードする核酸の部位特異的突然変異誘発を含み得る。（Ｚｏｌｌｅｒ  ＭＪら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１０：６４８７〜５００（１９８２）。
【００６２】
種々のイムノアッセイ形式が使用されて、特定のタンパク質、改変体またはフラグメントに選択的に結合する抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが慣用的に使用されて、タンパク質、タンパク質改変体またはそのフラグメントに選択的に免疫反応性である抗体を選択する。選択的結合を決定するために使用され得るイムノアッセイの形式および条件の説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）を参照のこと。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。
【００６３】
また、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントの容器、およびＥｐｈＡ２レセプター分子へのこの抗体またはそのフラグメントの結合を検出するための１つ以上の試薬を含む抗体試薬キットが提供される。この試薬は、例えば、蛍光タグ、酵素タグまたは他のタグを含み得る。この試薬はまた、二次抗体または三次抗体、あるいは酵素反応のための試薬を含み得、ここで、この酵素反応は、可視化され得る産物を産生する。
【００６４】
（（ｂ）機能的核酸）
機能的核酸がまた使用されて、例えば、開示されるインテグリン、インテグリンレセプター、開示されるインテグリンレセプターと相互作用する分子、および開示されるインテグリンレセプターのシグナル伝達経路における分子の機能を調節し得る。
【００６５】
機能的核酸は、特定の機能（例えば、標的分子の結合または特定の反応の触媒）を有する核酸分子である。機能的核酸分子は、以下のカテゴリーに分けられ得、これは、限定されることを意味されない。例えば、機能的核酸は、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子（ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）および外部ガイド配列を含む。この機能的核酸分子は、標的分子によって保有される特定の活性のエフェクター（ａｆｆｅｃｔｏｒ）、インヒビター、モジュレーターおよびスティミュレーター（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として作用し得るか、またはこの機能的核酸分子は、任意の他の分子から独立し、新規の活性を保有し得る。
【００６６】
機能的核酸分子は、任意の高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは炭水化物鎖）と相互作用し得る。従って、機能的核酸は、例えば、β４インテグリンのｍＲＮＡ、または例えばα６インテグリンのゲノムＤＮＡと相互作用し得るか、あるいはこれらは、ポリペプチドラミニン５、またはラミニン５のγ２サブユニットと相互作用し得る。しばしば、機能的核酸は、標的分子と機能的核酸分子との間の配列相同性に基づいて、他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況において、この機能的核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、この機能的核酸分子と標的分子との間の配列相同性に基づかないが、むしろ、特定の認識が生じることを可能にする三次構造の構成に基づく。アンチセンス分子は、標準的な塩基対合または非標準的な塩基対合を通じて、標的核酸分子と相互作用するように設計される。このアンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介性のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解を通じて、この標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、このアンチセンス分子は、プロセシング機能を妨害するように設計され、この機能は、通常、標的分子に対して生じる（例えば、転写または複製）。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計され得る。この標的分子の最も接近可能な領域を見出すことによるアンチセンス有効性の最適化についての非常に多くの方法が存在する。例示的な方法は、ＤＭＳおよびＤＥＰＣを用いたインビトロ選択実験およびＤＮＡ改変研究である。アンチセンス分子が、１０−６未満の解離定数（Ｋｄ）でこの標的分子を結合することが好ましい。アンチセンス分子が、１０−８未満のＫｄで結合することがより好ましい。アンチセンス分子が、１０−１０未満のＫｄでこの標的分子を結合することがまたより好ましい。アンチセンス分子が、１０−１２未満のＫｄでこの標的分子を結合することがまた好ましい。アンチセンス分子の設計および使用を助ける方法および技術の代表的な見本は、以下の非限定的な米国特許のリストに見出され得る：第５，１３５，９１７号、第５，２９４，５３３号、第５，６２７，１５８号、第５，６４１，７５４号、第５，６９１，３１７号、第５，７８０，６０７号、第５，７８６，１３８号、第５，８４９，９０３号、第５，８５６，１０３号、第５，９１９，７７２号、第５，９５５，５９０号、第５，９９０，０８８号、第５，９９４，３２０号、第５，９９８，６０２号、第６，００５，０９５号、第６，００７，９９５号、第６，０１３，５２２号、第６，０１７，８９８号、第６，０１８，０４２号、第６，０２５，１９８号、第６，０３３，９１０号、第６，０４０，２９６号、第６，０４６，００４号、第６，０４６，３１９号および第６，０５７，４３７号。
【００６７】
アプタマーは、好ましくは特定の様式で標的分子と相互作用する分子である。代表的には、アプタマーは、１５〜５０塩基長の範囲の小さな核酸であり、これは、規定される二次構造および三次構造（例えば、ステムループまたはＧカルテット（ｑｕａｒｔｅｔ）に折り畳まれる。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｉｌｉｎｅ）（米国特許第５，５８０，７３７号）のような低分子、ならびに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）のような高分子を結合し得る。アプタマーは、１０−１２Ｍ未満の標的分子由来のＫｄで、非常に堅く結合し得る。アプタマーが、１０−６未満のＫｄでこの標的分子を結合することが好ましい。アプタマーが、１０−８未満のＫｄでこの標的分子を結合することがより好ましい。アプタマーが、１０−１０未満のＫｄでこの標的分子を結合することがまたより好ましい。アプタマーが、１０−１２未満のＫｄでこの標的分子を結合することがまた好ましい。アプタマーは、非常に高い程度の特異性でこの標的分子を結合し得る。例えば、この標的分子と、分子上の１つの位置のみで異なる別の分子との間の結合親和性において、１００００倍を超える差異を有するアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。このアプタマーが、バックグラウンドの結合分子とのＫｄよりも少なくとも１／１０低い標的分子とのＫｄを有することが好ましい。このアプタマーが、バックグラウンドの結合分子とのＫｄよりも少なくとも１／１００低い標的分子とのＫｄを有することがより好ましい。このアプタマーが、バックグラウンドの結合分子とのＫｄよりも少なくとも１／１０００低い標的分子とのＫｄを有することがより好ましい。このアプタマーが、バックグラウンドの結合分子とのＫｄよりも少なくとも１／１００００低い標的分子とのＫｄを有することが好ましい。例えば、ポリペプチドについての比較を行う場合、バックグラウンド分子が、異なるポリペプチドであることが好ましい。例えば、β４インテグリンアプタマーの特性を決定する場合、このバックグラウンドタンパク質は、ウシ血清アルブミンであり得る。種々の異なる標的分子を結合するためのアプタマーの作製および使用の方法についての代表的な例は、以下の非限定的な米国特許のリストに見出され得る：第５，４７６，７６６号、第５，５０３，９７８号、第５，６３１，１４６号、第５，７３１，４２４号、第５，７８０，２２８号、第５，７９２，６１３号、第５，７９５，７２１号、第５，８４６，７１３号、第５，８５８，６６０号、第５，８６１，２５４号、第５，８６４，０２６号、第５，８６９，６４１号、第５，９５８，６９１号、第６，００１，９８８号、第６，０１１，０２０号、第６，０１３，４４３号、第６，０２０，１３０号、第６，０２８，１８６号、第６，０３０，７７６号および第６，０５１，６９８号。
【００６８】
リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒し得る核酸分子である。従って、リボザイムは、触媒核酸である。リボザイムが、分子間相互作用を触媒ことが好ましい。多くの異なる型のリボザイムが存在し、これは、ヌクレアーゼ型反応または核酸ポリメラーゼ型反応を触媒し、この反応は、天然の系に見出されるリボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、限定されないが、以下の米国特許：第５，３３４，７１１号、第５，４３６，３３０号、第５，６１６，４６６号、第５，６３３，１３３号、第５，６４６，０２０号、第５，６５２，０９４号、第５，７１２，３８４号、第５，７７０，７１５号、第５，８５６，４６３号、第５，８６１，２８８号、第５，８９１，６８３号、第５，８９１，６８４号、第５，９８５，６２１号、第５，９８９，９０８号、第５，９９８，１９３号、第５，９９８，２０３号、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ  ９８５８０５８、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ  ９８５８０５７、ならびにＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ  ９７１８３１２）、ヘアピンリボザイム（例えば、限定されないが、以下の米国特許：第５，６３１，１１５号、第５，６４６，０３１号、第５，６８３，９０２号、第５，７１２，３８４号、第５，８５６，１８８号、第５，８６６，７０１号、第５，８６９，３３９号および第６，０２２，９６２号）、およびテトラヒメナリボザイム（例えば、限定されないが、以下の米国特許：第５，５９５，８７３号および第５，６５２，１０７号））に基づく。天然の系において見出されない多くのリボザイムもまた存在するが、これは、新規に特定の反応を触媒するように操作されている（例えば、限定されないが、以下の米国特許：第５，５８０，９６７号、第５，６８８，６７０号、第５，８０７，７１８号および第５，９１０，４０８号）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ基質またはＤＮＡ基質を開裂し、そしてより好ましくは、ＲＮＡ基質を開裂する。リボザイムは、代表的には、引き続く開裂とともに、標的基質の認識および結合を通じて、核酸基質を開裂する。この認識は、しばしば、標準的な塩基対相互作用または非標準的な塩基対相互作用に主として基づく。この性質は、リボザイムを、核酸の標的特異的開裂についての特に良好な候補物とする。なぜなら、この標的基質の認識は、標的基質の配列に基づくからである。種々の異なる反応を触媒するためのリボザイムの作製および使用の方法についての代表的な例は、以下の非限定的な米国特許のリストに見出され得る：第５，６４６，０４２号、第５，６９３，５３５号、第５，７３１，２９５号、第５，８１１，３００号、第５，８３７，８５５号、第５，８６９，２５３号、第５，８７７，０２１号、第５，８７７，０２２号、第５，９７２，６９９号、第５，９７２，７０４号、第５，９８９，９０６号および第６，０１７，７５６号。
【００６９】
三重鎖形成する機能的核酸分子は、二本鎖核酸または一本鎖核酸のいずれかと相互作用し得る分子である。三重鎖分子が、標的領域と相互作用する場合、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、これにおいて、ワトソン・クリック型塩基対合およびフーグスティーン型塩基対合の両方に依存して、複合体を形成する３つの鎖のＤＮＡが存在する。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で標的領域を結合し得るので好ましい。三重鎖形成分子が、１０−６未満のＫｄでこの標的分子を結合することが好ましい。三重鎖形成分子が、１０−８未満のＫｄでこの標的分子を結合することがより好ましい。三重鎖形成分子が、１０−１０未満のＫｄでこの標的分子を結合することがまたより好ましい。三重鎖形成分子が、１０−１２未満のＫｄでこの標的分子を結合することがまた好ましい。種々の異なる標的分子を結合するための三重鎖形成分子の作製および使用の方法についての代表的な例は、以下の非限定的な米国特許のリストに見出され得る：第５，１７６，９９６号、第５，６４５，９８５号、第５，６５０，３１６号、第５，６８３，８７４号、第５，６９３，７７３号、第５，８３４，１８５号、第５，８６９，２４６号、第５，８７４，５６６号および第５，９６２，４２６号。
【００７０】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子を結合する分子であり、そしてこの複合体は、ＲＮａｓｅＰ（これは、この標的分子を開裂する）によって認識される。ＥＧＳは、選択されるＲＮＡ分子を特異的に標的化するように設計され得る。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを助ける。細菌のＲＮＡｓｅＰが補充されて、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、実質的に任意のＲＮＡ配列を開裂し得る（ＹａｌｅによるＷＯ  ９２／０３５６６ならびにＦｏｒｓｔｅｒおよびＡｌｔｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：４０７〜４０９（１９９０））。
【００７１】
同様に、ＲＮＡの真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓａｅＰ指向性開裂が利用されて、真核生物細胞内の所望の標的を開裂し得る（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｖａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８００６〜８０１０（１９９２）；ＹａｌｅによるＷＯ  ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ  ９５／２４４８９；ＹｕａｎおよびＡｌｔｍａｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５９〜１６８（１９９５）、ならびにＣａｒｒａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７〜２６３１（１９９５））。種々の異なる標的分子の開裂を容易にするためのＥＧＳ分子の作製および使用の方法についての代表的な例は、以下の非限定的な米国特許のリストに見出され得る：第５，１６８，０５３号、第５，６２４，８２４号、第５，６８３，８７３号、第５，７２８，５２１号、第５，８６９，２４８号および第５，８７７，１６２号。
【００７２】
（（ｃ）低分子）
低分子がまた使用されて、例えば、開示されるインテグリン、インテグリンレセプター、開示されるインテグリンレセプターと相互作用する分子、および開示されるインテグリンレセプターのシグナル伝達経路における分子の機能を調節し得る。当業者は、この型の低分子を作製する方法、そして低分子レギュレーターの単離についての例示的なライブラリおよび方法が、本明細書中に開示されることを理解する。
【００７３】
（ｂ）開示される組成物／コンビナトリアル化学を用いたスクリーニングによって同定される組成物）
（（１）コンビナトリアル化学）
開示される組成物は、任意のコンビナトリアル技術についての標的として使用されて、所望の様式で、開示される組成物（例えば、β４インテグリン、α６インテグリンまたはラミニン５のγ２サブユニット）と相互作用する分子または高分子性分子を同定し得る。本明細書中に開示される核酸、ペプチドおよび関連分子は、コンビナトリアルアプローチについての標的として使用され得る。また、コンビナトリアル技術またはスクリーニング技術を通じて同定される組成物が開示され、これにおいて、本明細書中に開示される組成物（例えば、配列番号１〜１９に示されるまたはその部分）が、コンビナトリアルプロトコルまたはスクリーニングプロトコルにおける標的または試薬として使用される。
【００７４】
コンビナトリアル技術またはスクリーニング方法において、開示される組成物を用いる場合、特定の所望の性質（例えば、標的分子の機能の阻害または刺激）を有する分子（例えば、高分子性分子）が同定されることが理解される。開示される組成物（例えば、β４インテグリン、α６インテグリンまたはラミニン５のγ２サブユニット）を用いる場合に同定および単離される分子もまた開示される。従って、開示される組成物（例えば、β４インテグリン、α６インテグリンまたはラミニン５のγ２サブユニット）を含むコンビナトリアルアプローチまたはスクリーニングアプローチを用いて産生される産物もまた、本明細書中に開示されると見なされる。
【００７５】
コンビナトリアル化学は、代表的には反復プロセスにおいて、低分子または別の高分子のいずれかを結合し得る低分子または高分子の単離のためのすべての方法を含むがこれらに限定されない。タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび糖は、高分子の例である。例えば、所定の機能（触媒またはリガンド結合）を有するオリゴヌクレオチド分子が、ランダムオリゴヌクレオチドの複合混合物から単離され得、これは、「インビトロ遺伝学」と言われている（Ｓｚｏｓｔａｋ、ＴＩＢＳ  １９：８９、１９９２）。ランダム配列および規定された配列を保有する分子の大きなプールが合成され、そしてこの複合混合物（例えば、１００μｇの１００ヌクレオチドＲＮＡにおいて、およそ１０１５の個々の配列）が、いくつかの選択工程および富化工程に供される。固体支持体上のリガンドに結合した分子の反復サイクルのアフィニティークロマトグラフィーおよびＰＣＲ増幅を通じて、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）は、１０１０個のＲＮＡ分子のうちの１つが、低分子色素を結合するように折り畳まれると見積もった。このようなリガンド結合挙動を有するＤＮＡ分子が、同様に単離されている（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９２；Ｂｏｃｋら、１９９２）。当業者に公知の低有機分子、タンパク質、抗体および他の高分子についての類似の目的に向けられる技術が存在する。小さな有機ライブラリ、オリゴヌクレオチドまたは抗体に基づくにせよ基づかないにせよ、所望の活性についての分子のスクリーニングセットは、広範に、コンビナトリアル化学といわれる。コンビナトリアル技術は、分子間の結合相互作用の規定、および特定の結合活性を有する分子の単離に特に適切であり、これはしばしば、この高分子が核酸である場合、アプタマーと呼ばれる。
【００７６】
新規の活性または改変活性のいずれかを有するタンパク質の単離のための多くの方法が存在する。例えば、ファージディスプレイライブラリが使用されて、特定の標的と相互作用する多数のペプチドを単離している（例えば、米国特許第６，０３１，０７１号；同第５，８２４，５２０号；同第５，５９６，０７９号および同第５，５６５，３３２号（これらは、少なくともファージディスプレイに関連する材料、およびコンビナトリアル化学に関連した方法について、本明細書中において参考として援用される）を参照のこと）。
【００７７】
所定の機能を有するタンパク質の単離のための好ましい方法が、ＲｏｂｅｒｔおよびＳｚｏｓｔａｋによって記載される（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４（２３）１２９９７〜３０２（１９９７））。このコンビナトリアル化学方法は、タンパク質の機能能力および核酸の遺伝能力を結合する。ＲＮＡ分子が作製され、これにおいて、ピューロマイシン分子が、このＲＮＡ分子の３’末端に共有結合される。この改変ＲＮＡ分子のインビトロ翻訳は、翻訳されるべきＲＮＡによってコードされる正確なタンパク質を生じる。さらに、ピューロマイシン（伸長されることができないペプチジルアクセプター）の結合に起因して、伸長するペプチド鎖は、ＲＮＡに結合されるピューロマイシンに結合される。従って、このタンパク質分子は、この分子をコードする遺伝物質に結合される。正常なインビトロ選択手順がここで行われて、機能的ペプチドを単離し得る。一旦、ペプチド機能についての選択手順が完結すると、伝統的な核酸操作手順が行われて、選択された機能的ペプチドをコードする核酸を増幅する。遺伝物質の増幅後、新規のＲＮＡが、３’末端のピューロマイシンとともに転写され、新規のペプチドが翻訳され、そして選択の別の機能的回が行われる。従って、タンパク質選択は、核酸選択技術とまさに同様の反復様式で行われ得る。翻訳されるペプチドは、ピューロマイシンに結合されるＲＮＡの配列によって制御される。この配列は、最適翻訳（すなわち、停止コドンを有さないなど）について操作されるランダム配列由来の配列であり得るか、またはこれは、既知のペプチド機能の改善または変更を捜すための既知のＲＮＡ分子の縮重配列であり得る。核酸の増幅およびインビトロ翻訳についての条件は、当業者に周知であり、そして好ましくは、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋにおけるように行われる（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４（２３）１２９９７〜３０２（１９９７））。
【００７８】
ペプチドを単離するように設計されるコンビナトリアル方法についての別の好ましい方法は、Ｃｏｈｅｎらに記載される（Ｃｏｈｅｎ  Ｂ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５（２４）：１４２７２〜７（１９９２））。この方法は、ツーハイブリッド技術を利用および改変する。酵母ツーハイブリッドシステムは、タンパク質：タンパク質相互作用の検出および分析に有用である。このツーハイブリッドシステム（最初は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて記載された）は、目的のタンパク質に特異的な新規の調節分子の同定のための強力な分子遺伝学技術である（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５〜６（１９８９））。Ｃｏｈｅｎらは、この技術を改変し、その結果、合成ペプチド配列と操作ペプチド配列との間の新規の相互作用が同定され得、これは、選択された分子を結合する。この型の技術の利点は、選択が、細胞内環境において行われることである。この方法は、酸性の活性化ドメインに結合されるペプチド分子のライブラリを利用する。選択されたペプチド（例えば、β４またはα６またはγ２またはラミニン５の一部分）が、転写活性化タンパク質（例えば、Ｇａｌ４）のＤＮＡ結合ドメインに結合される。この型の系に対してツーハイブリッド技術を行うことによって、β４またはα６またはγ２またはラミニン５の一部分を結合する分子が同定され得る。
【００７９】
変化する結合特異性（これは、フィブロネクチンモチーフに基づく）を有し得る点において、抗体のように作用し得る分子が存在する。このフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）は、小さな自律性のフォールディング単位である。このＦＮ３ドメインは、リガンド（例えば、動物のタンパク質）を結合する非常に多くのタンパク質において見出され得る。ＦＮ３のβサンドイッチ構造は、免疫グロブリンドメインの構造に密接に類似する。ＦＮ３変異体は、所望の標的を結合する、本明細書中に開示されるコンビナトリアルアプローチ（例えば、ファージディスプレイ）を用いて単離され得る。代表的には、ＦＮ３分子のライブラリは、２つの表面ループにおいてランダム化（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）されている。従って、ＦＮ３は、新規の結合タンパク質の操作についての少なくとも足場として使用され得る（Ｋｏｉｄｅ  Ａ、Ｂａｉｌｅｙ  ＣＷ、Ｈｕａｎｇ  Ｘ、Ｋｏｉｄｅ  Ｓ．、「Ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９８；２８４、１１４１〜１１５１（これは、少なくともフィブロネクチンベースの新規の結合タンパク質に関連する物質について、本明細書中で参考として援用される）。
【００８０】
当業者に周知の方法論を使用して、種々のコンビナトリアルライブラリと組み合わせて、これらの低分子または高分子が単離され得、そして特徴付けられ得、この分子は、所望の標的に結合するか、またはこの標的と相互作用する。これらの化合物の相対的な結合親和性が比較され得、そして競合結合研究（これは、当業者に周知である）を用いて、最適化合物が同定され得る。
【００８１】
所望の標的を結合する分子を単離するためのコンビナトリアルライブラリの作製、およびコンビナトリアルライブラリのスクリーニングについての技術は、当業者に周知である。代表的な技術および方法は、以下の米国特許において見出され得るが、これらに限定されない：第５，０８４，８２４号、第５，２８８，５１４号、第５，４４９，７５４号、第５，５０６，３３７号、第５，５３９，０８３号、第５，５４５，５６８号、第５，５５６，７６２号、第５，５６５，３２４号、第５，５６５，３３２号、第５，５７３，９０５号、第５，６１８，８２５号、第５，６１９，６８０号、第５，６２７，２１０号、第５，６４６，２８５号、第５，６６３，０４６号、第５，６７０，３２６号、第５，６７７，１９５号、第５，６８３，８９９号、第５，６８８，６９６号、第５，６８８，９９７号、第５，６９８，６８５号、第５，７１２，１４６号、第５，７２１，０９９号、第５，７２３，５９８号、第５，７４１，７１３号、第５，７９２，４３１号、第５，８０７，６８３号、第５，８０７，７５４号、第５，８２１，１３０号、第５，８３１，０１４号、第５，８３４，１９５号、第５，８３４，３１８号、第５，８３４，５８８号、第５，８４０，５００号、第５，８４７，１５０号、第５，８５６，１０７号、第５，８５６，４９６号、第５，８５９，１９０号、第５，８６４，０１０号、第５，８７４，４４３号、第５，８７７，２１４号、第５，８８０，９７２号、第５，８８６，１２６号、第５，８８６，１２７号、第５，８９１，７３７号、第５，９１６，８９９号、第５，９１９，９５５号、第５，９２５，５２７号、第５，９３９，２６８号、第５，９４２，３８７号、第５，９４５，０７０号、第５，９４８，６９６号、第５，９５８，７０２号、第５，９５８，７９２号、第５，９６２，３３７号、第５，９６５，７１９号、第５，９７２，７１９号、第５，９７６，８９４号、第５，９８０，７０４号、第５，９８５，３５６号、第５，９９９，０８６号、第６，００１，５７９号、第６，００４，６１７号、第６，００８，３２１号、第６，０１７，７６８号、第６，０２５，３７１号、第６，０３０，９１７号、第６，０４０，１９３号、第６，０４５，６７１号、第６，０４５，７５５号、第６，０６０，５９６号および第６，０６１，６３６号。
【００８２】
コンビナトリアルライブラリは、多くの異なる合成技術を用いて、広範な分子のアレイから作製され得る。例えば、以下を含むライブラリ：縮合された２，４−ピリミジンジオン（米国特許第６，０２５，３７１号）、ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号および同第５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４）、ヒドロキシアミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）、糖質（米国特許第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、環式（ｃｙｃｌｉｃｓ）（米国特許第５，９５８，７９２号）、バイアリール（ｂｉａｒｙｌ）アミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環式テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントインおよびチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドールおよびイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）置換された２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）、含有タグ（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許第５，７１２，１４６号）、モルホリノサブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号および同第５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許第５，６１８，８２５号）ならびにベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）。
【００８３】
α６β４形成の阻害についてのα６に類似の分子のスクリーニングは、Ａ６Ｂ４レセプターの形成を阻害し得る所望の化合物を同定および単離する方法である。例えば、開示される組成物（例えば、α６インテグリンまたはβ４インテグリン）は、本明細書中で開示される選択スキームにおける標的として使用され得、ついで、相対するインテグリンが、競合インヒビターとして使用されて、所望の分子を単離し得る。例えば、分子のライブラリが、β４インテグリンとインキュベートされ得、このβ４インテグリンは、固体支持体に結合される。この固体支持体が洗浄されて、未結合分子を除去し得、次いで、この固体支持体が、例えば、α６インテグリンと、すべてのβ４結合部位を飽和する濃度でインキュベートされ得る。この固体支持体の洗浄後のフロースルーにおいて収集される分子は、α６−β４相互作用に競合する様式で、β４インテグリンと相互作用する分子について濃縮される。同様に、標的インテグリンまたはより好ましくは、標的インテグリンレセプター（例えば、α６β４レセプター）に結合したこの固体支持体がまた、例えば、ラミニン５またはラミニン５のγ２サブユニットを用いて、β４インテグリン上のγ２結合部位のすべてを飽和する濃度で洗浄され得る。これらの条件下での洗浄物の収集は、β４γ２部位で、β４インテグリンと競合的に相互作用する分子について濃縮される分子の集団を生じる。別の例は、以下である：マイクロタイタープレート上の固体支持体に標的を結合する。方眼のある部分集合のライブラリメンバー（または１つの化合物）の存在下で、リガンドとインキュベートし、洗浄し、リガンド結合の減少によって、競争相手を同定する。α６β４および／またはβ４の例示的な解離が、α６、ならびに他のα６βｘレセプター（例えば、α６β１）に等しく適用可能であることが理解される。
【００８４】
また、Ｂ４インテグリン、α６インテグリンおよびラミニン５のγ２サブユニットからなる群より選択される標的分子と結合する分子の単離方法が開示され、この方法は、１）分子のライブラリを標的分子と接触させる工程、および２）分子の濃縮集団を産生する標的分子を結合する分子を収集する工程、を包含する。
【００８５】
この分子の濃縮集団を用いて、工程１および２を反復する工程をさらに包含する方法が開示され、ここで、このライブラリは、低分子、ペプチド、ペプチド模倣物またはオリゴヌクレオチドを含む。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、コンビナトリアル方法およびライブラリが、伝統的なスクリーニング方法およびライブラリ、ならびに反復工程において使用される方法およびライブラリに含まれる。
【００８７】
（（２）コンピュータ支援設計）
開示される組成物は、任意の分子モデリング技術についての標的として使用されて、開示される組成物の構造を同定し得るか、あるいは潜在的な分子または実際の分子（例えば、低分子）のいずれかを同定し得、これは、所望の様式で、開示される組成物と相互作用する。本明細書中で開示される核酸、ペプチドおよび関連分子は、任意の分子モデリングプログラムまたはアプローチにおける標的として使用され得る。
【００８８】
モデリング技術において開示される組成物を用いる場合、特定の所望の性質（例えば、標的分子の機能の阻害または刺激）を有する分子（例えば、高分子）が同定されることが理解される。開示される組成物（例えば、β４）を用いる場合に同定および単離される分子がまた開示される。従って、開示される組成物（例えば、β４インテグリン、α６インテグリンまたはラミニン５）を伴う分子モデリングアプローチを用いて産生される産物がまた、本明細書中に開示されると見なされる。
【００８９】
従って、選択の分子を結合する分子を単離する１つの方法は、合理的設計を介する。これは、構造情報およびコンピュータモデリングを通じて達成される。コンピュータモデリングテクノロジーは、選択される分子の三次元の原子構造の視覚化、およびこの分子と相互作用する新規の化合物の合理的設計を可能にする。この三次元構築物は、代表的には、選択される分子のＸ線結晶学的分析またはＮＭＲイメージング由来のデータに基づく。分子動力学は、力の場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムは、新規化合物が、どのように標的分子に結合するかの予測を可能にし、そしてこの化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能にして、結合特異性を改善する。分子−化合物相互作用が、小さな変化が一方または両方において作製される場合の状態の予測は、分子力学ソフトウェアおよび計算機集中コンピュータを必要とし、これらは、通常、分子設計プログラムとユーザーとの間に、ユーザーフレンドリーな、メニューが駆動されるインターフェースが結合される。
【００９０】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡである。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化関数および分子動力学関数を行う。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび分析を行う。ＱＵＡＮＴＡは、互いの分子の挙動の相互作用性構築、改変、視覚化および分析を可能にする。
【００９１】
多くの論文が、特定のタンパク質と相互作用性の薬物のコンピュータモデリングを概説する（例えば、Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｆｅｎｎｉｃａ９７、１５９〜１６６；Ｒｉｐｋａ、Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４〜５７（１９８８年６月１６日）；ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、１９８９  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９、１１１〜１２２；ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ、ＯＳＡＲ；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １８９〜１９３頁（Ａｌａｎ  Ｒ、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ、１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６、１２５〜１４０および１４１〜１６２；ならびに核酸成分についてのモデル酵素に関しては、Ａｓｋｅｗら、１９８９  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１、１０８２〜１０９０）。化学薬品を映し、そしてグラフィック描写する他のコンピュータプログラムが、会社（例えば、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、ＣａｎａｄａおよびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ）から入手可能である。これらは、特定のタンパク質に特異的な薬物に対する適用について最初に設計されるが、これらは、一旦ＤＮＡまたはＲＮＡの特定の領域が同定されると、このＤＮＡまたはＲＮＡの特定の領域に特異的に相互作用する分子を設計するように適応され得る。
【００９２】
結合を変更し得る化合物の設計および作製に関して上記に記載されるが、また、基質結合または酵素活性を変更する化合物について、既知の化合物（天然の産物または合成の化学薬品、およびタンパク質を含む生物学的に活性な物質を含む）のライブラリをスクリーニングし得る。
【００９３】
（ｃ）核酸）
核酸ベースの本明細書中で開示される種々の分子が存在し、これは、例えば、核酸（例えば、β４およびラミニン５のγ２サブユニットをコードする核酸）、ならびに種々の機能的核酸を含む。この開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物から構成される。これらの分子および他の分子の非限定的な例は、本明細書中で議論される。例えば、ベクターが細胞において発現される場合、この発現されるｍＲＮＡは、代表的には、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵから構成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外因性送達を通じて細胞または細胞環境に導入される場合、このアンチセンス分子が、この細胞環境において、このアンチセンス分子の分解を減少するヌクレオチドアナログから構成されることが有利であることが理解される。
【００９４】
（（１）ヌクレオチドおよび関連分子）
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオチド内結合を作製するそのリン酸部分および糖部分を通じて、互いに結合され得る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【００９５】
ヌクレオチドアナログは、塩基部分、糖部分またはリン酸部分のいずれかに対するいくつかの型の改変を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する改変は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕの天然の改変または合成の改変、ならびに異なるプリン塩基またはピリミジン塩基（例えば、ウラシル−５−イル（ψ）、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）および２−アミノアデニン−９−イル）を含む。改変塩基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）４−チオウラシル、８−ハロ置換アデニンおよびグアニン、８−アミノ置換アデニンおよびグアニン、８−チオール置換アデニンおよびグアニン、８−チオアルキル置換アデニンおよびグアニン、８−ヒドロキシ置換アデニンおよびグアニンならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ置換ウラシルおよびシトシン、特に５−ブロモ置換ウラシルおよびシトシン、５−トリフルオロメチル置換ウラシルおよびシトシンならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン。さらなる塩基改変は、例えば、以下において見出され得る：米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３。特定のヌクレオチドアナログ（例えば、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリンおよびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）。５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増大し得る。塩基改変は、例えば、糖改変（例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル）と結合されて、独特の性質（例えば、二重鎖安定性の増大）を達成し得る。非常に多くの米国特許（例えば、第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，���１７号；および第５，６８１，９４１号（これらは、塩基改変の範囲を詳述および記載する））が存在する。これらの特許の各々は、本明細書中で参考として援用される。
【００９６】
ヌクレオチドアナログはまた、この糖部分の改変を含み得る。糖部分に対する改変はリボースおよびデオキシリボースの天然の改変、ならびに合成の改変を含む。糖改変としては、２’位での以下の改変：ＯＨ−；Ｆ−；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキルまたはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニルまたはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルまたはＮ−アルキニル；あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルが挙げられるがこれらに限定されず、ここで、このアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、またはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルで置換されるかもしれないし、または置換されないかもしれない。２’糖改変としてはまた、以下：−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、ｎおよびｍは、１〜およそ１０である。
【００９７】
２’位での他の改変としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキルＯ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ２、ＮＨ３、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質の改善についての基、オリゴヌクレオチドの薬力学的性質の改善についての基、および類似の性質を有する他の置換基。類似の改変がまた、糖上の他の位置（特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位または２’−５’結合されるオリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位）で作製され得る。改変糖はまた、架橋環酸素（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｒｉｎｇ  ｏｘｙｇｅｎ）（例えば、ＣＨ２およびＳ）を含む糖を含む。ヌクレオチドの糖アナログはまた、糖模倣物（例えば、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分）を有し得る。非常に多くの以下の米国特許が存在し、これらは、このような改変糖構造の調製を教示する：第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号（これらの各々は、本明細書中において、その全体において参考として援用される）。
【００９８】
ヌクレオチドアナログはまた、リン酸部分で改変され得る。改変リン酸部分は、改変され得、その結果、２つのヌクレオチド間の結合が、以下を含む改変リン酸部分を含むがこれらに限定されない：ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ）（３’−アミノホスホルアミダイトおよびアミノアルキルホスホルアミダイトを含む）、チオノ（ｔｈｉｏｎｏ）ホスホルアミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノ（ｂｏｒａｎｏ）ホスフェート。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸結合または改変リン酸結合が、３’−５’結合または２’−５’結合を介したものであり得、そしてこの結合が、反転極性（例えば、３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’）を含み得ることが理解される。種々の塩形態、混合塩形態および遊離酸形態がまた含まれる。非常に多くの米国特許が、改変リン酸を含むヌクレオチドの作製および使用の方法を教示し、そしてこの米国特許は、以下を含むがこれらに限定されない：第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；および第５，６２５，０５０号（これらの各々は、本明細書中において参考として援用される）。
【００９９】
必要とされるヌクレオチドアナログは、１つの改変のみを含むが、また、この部分のうちの１つまたは異なる部分間に、複数の改変を含み得ることが理解される。
【０１００】
ヌクレオチド置換物は、ヌクレオチドに対する類似の機能的性質を有する分子であり、これは、リン酸部分（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））を含まない。ヌクレオチド置換物は、ワトソン・クリック様式またはフーグスティーン様式で核酸を認識する分子であるが、これは、リン酸部分以外の部分を介して互いに結合される。ヌクレオチド置換物は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に一致し得る。
【０１０１】
ヌクレオチド置換物は、置換されるリン酸部分および／または置換される糖部分を有するヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド置換物は、標準的なリン原子を含まない。リン酸についての置換物は、例えば、短鎖アルキルまたは短鎖シクロアルキルのヌクレオシド内結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド内結合、あるいは１つ以上の短鎖ヘテロ原子または短鎖複素環式のヌクレオシド内結合であり得る。これらは、以下を有する置換物を含む：モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合されるＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素を有する他の骨格。非常に多くの米国特許が、これらの型のリン酸置換の作製および使用の方法を開示し、そしてこれは、以下を含むがこれらに限定されない：第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。
【０１０２】
ヌクレオチドの糖部分およびリン酸部分の両方が、例えば、アミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置換され得ることがまた、ヌクレオチド置換物において理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子の作製および使用の方法を教示し、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される（また、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００を参照のこと）。
【０１０３】
他の型の分子（結合体）を、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに結合して、例えば、細胞取り込みを増強し得る。結合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学結合され得る。このような結合体は、以下を含むがこれらに限定されない：脂質部分（例えば、コレステロール部分）（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３〜６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４、４、１０５３〜１０６０）、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６〜３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３、２７６５〜２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３〜５３８）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９１、１０、１１１１〜１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７〜３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ、１９９３、７５、４９〜５４）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１〜３６５４；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７〜３７８３）、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９〜９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１〜３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９〜２３７）、あるいはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３〜９３７）。非常に多くの米国特許が、このような結合体の調製を教示し、そしてこれは、以下の米国特許を含むがこれらに限定されない：第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号および第５，６８８，９４１号（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドが、本明細書中に開示されるヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物、または本明細書中に特に説明されない関連分子の任意の組み合わせから作製され得ることが理解される。
【０１０５】
ワトソン・クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物のワトソン・クリック面との少なくとも１つの相互作用である。このヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物のワトソン・クリック面は、プリンベースのヌクレオチド、プリンベースのヌクレオチドアナログまたはプリンベースのヌクレオチド置換物のＣ２部分、Ｎ１部分およびＣ６部分を含み、そしてピリミジンベースのヌクレオチド、ピリミジンベースのヌクレオチドアナログまたはピリミジンベースのヌクレオチド置換物のＣ２部分、Ｎ３部分、Ｃ４部分を含む。
【０１０６】
フーグスティーン相互作用は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのフーグスティーン面上で生じる相互作用であり、これは、二重鎖ＤＮＡの主溝に曝露される。このフーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＣ６位置に、Ｎ７位置および反応基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【０１０７】
（（２）配列）
β４インテグリンまたはラミニン５−γ２遺伝子またはα６インテグリンに関連する種々の配列が存在し、これらは、それぞれ、以下のＧｅｎｂａｎｋ登録番号、６４５３３７９、４５５７６７４およびＡＨ００６６３４を有する。これらの配列および他の配列は、本明細書中において、その全体において参考として援用され、ならびに個々のサブ配列については、その中に含まれる。
【０１０８】
配列番号１（β４インテグリン）に示され、そしてＧｅｎｂａｎｋ登録番号６４５３３７９を有する１つの特定の配列が、本明細書中において、種々の点で例として使用されて、開示される組成物および方法を例示する（または、別の特定の配列が、例として使用される場合）。特に別段の指示がない限り、この配列に関連する説明が、β４インテグリン、または本明細書中に開示される任意の他の分子（例えば、α６インテグリンまたはラミニン５のサブユニット（例えば、γ２））に関連する任意の配列に対して適用可能であることが理解される。当業者は、配列不一致および配列差異を分析する方法、ならびに特定の配列に関連する組成物および方法を、他の関連配列（すなわち、β４インテグリンの配列）に適合させる方法を理解する。プライマーおよび／またはプローブが、本明細書中で開示され、そして当該分野で公知の情報が与えられると、任意のβ４インテグリン配列について設計され得る。
【０１０９】
（（３）プライマーおよびプローブ）
プライマーおよびプローブを含む組成物が開示され、これは、例えば、α６遺伝子もしくはα６ｍＲＮＡ、β４遺伝子もしくはβ４ｍＲＮＡ、または本明細書中で開示されるようなラミニン５リガンド遺伝子もしくはラミニン５リガンドｍＲＮＡのγ２サブユニット、ならびに配列番号１、３、５、７、９、１１および１３に示される配列またはこの配列のフラグメントのいずれかについてのプライマーまたはプローブと相互作用し得る。特定の実施形態において、このプライマーが使用されて、ＤＮＡ増幅反応を支持する。代表的には、このプライマーは、配列特異的様式で伸長され得る。配列特異的様式におけるプライマーの伸長は、任意の方法を含み、ここで、核酸分子の配列および／または組成物（これに対して、プライマーが、ハイブリダイズされるか、またはそうでなければ結合される）が、このプライマーの伸長によって産生される産物の組成物または配列を指向するか、あるいはこの組成物または配列に影響を与える。従って、配列特異的様式におけるプライマーの伸長は、以下を含むがこれらに限定されない：ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写または逆転写。配列特異的様式においてプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。特定の実施形態において、このプライマーは、ＤＮＡ増幅反応（例えば、ＰＣＲまたは直接シークエンス法）について使用される。特定の実施形態において、このプライマーがまた、非酵素的技術を用いて伸長され得ることが理解され、ここで、例えば、このプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが改変され、その結果、これらは、化学的に反応して、配列特異的様式においてプライマーを伸長する。代表的には、この開示されるプライマーは、例えば、β４遺伝子、α６遺伝子もしくはラミニン５−γ２サブユニット遺伝子とハイブリダイズするか、または例えば、β４遺伝子領域、α６遺伝子領域もしくはラミニン５−γ２サブユニット遺伝子領域とハイブリダイズするか、あるいは、これらは例えば、β４遺伝子の補体、α６遺伝子の補体もしくはラミニン５−γ２サブユニット遺伝子の補体とハイブリダイズするか、または、β４遺伝子領域の補体、α６遺伝子領域の補体もしくはラミニン５−γ２サブユニット遺伝子領域の補体とハイブリダイズするか、あるいは例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３に示される配列またはこの配列のフラグメントのいずれかとハイブリダイズする。
【０１１０】
β４遺伝子、α６遺伝子またはラミニン５−γ２サブユニット遺伝子との相互作用についてのプライマーまたはプローブのサイズは、例えば、特定の実施形態において、プライマーの所望の酵素的操作（例えば、ＤＮＡ増幅、あるいはプローブまたはプライマーの単なるハイブリダイゼーション）を支持する任意のサイズであり得る。β４遺伝子、α６遺伝子またはラミニン５−γ２サブユニット遺伝子についての代表的なプライマーまたはプローブ、あるいは例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３に示される配列またはその配列のフラグメントのいずれかについてのプライマーまたはプローブが、少なくともおよそ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５，１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００または４０００ヌクレオチド長である。
【０１１１】
他の実施形態において、β４遺伝子、α６遺伝子またはラミニン５−γ２サブユニット遺伝子についてのプライマーまたはプローブ、あるいは例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３に示される配列またはその配列のフラグメントのいずれかについてのプライマーまたはプローブが、およそ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５，１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００または４０００ヌクレオチド長未満であり得るか、またはこのヌクレオチド長に等しい。
【０１１２】
β４遺伝子、α６遺伝子またはラミニン５−γ２サブユニット遺伝子についてのプライマー、または、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３に示される配列またはその配列のフラグメントのいずれかについてのプライマーが、例えば、代表的に使用されて、所望の領域を含む増幅ＤＮＡ産物を産生する。一般に代表的には、この産物のサイズは、３ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド内に正確に決定され得るようなサイズである。
【０１１３】
特定の実施形態において、この産物は、少なくともおよそ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５，１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００または４０００ヌクレオチド長である。
【０１１４】
他の実施形態において、この産物は、およそ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５，１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００または４０００ヌクレオチド長未満であるか、またはこのヌクレオチド長に等しい。
【０１１５】
（ｄ）配列類似性）
本明細書中で議論される場合、用語、相同性および同一性の使用は、類似性と同じことを意味することが理解される。従って、例えば、この用語、相同性が、２つの非天然配列の間で使用される場合、これが、これらの２つの配列間の進化的関係を必ずしも示されず、むしろ、これらの核酸配列間の類似性または関連性に目を向けることが理解される。２つの進化的に関連性の分子間の相同性の決定についての方法の多くは、これらが進化的に関連するか否かに関係なく、配列類似性を測定する目的のために、任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に慣用的に適用される。
【０１１６】
一般に、本明細書中で開示される遺伝子およびタンパク質の任意の既知の改変体および誘導体、または生じ得る改変体および誘導体を規定する１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性に関して、改変体および誘導体を規定することを介することが、理解される。本明細書中で開示される特定の配列のこの同一性はまた、本明細書中の他の場所で議論される。一般に、本明細書中で開示される遺伝子およびタンパク質の改変体は、代表的には、陳述される配列またはネイティブ配列に対して、少なくともおよそ７０パーセント、７１パーセント、７２パーセント、７３パーセント、７４パーセント、７５パーセント、７６パーセント、７７パーセント、７８パーセント、７９パーセント、８０パーセント、８１パーセント、８２パーセント、８３パーセント、８４パーセント、８５パーセント、８６パーセント、８７パーセント、８８パーセント、８９パーセント、９０パーセント、９１パーセント、９２パーセント、９３パーセント、９４パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセントまたは９９パーセントの相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸（例えば、遺伝子）の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、この相同性は、その相同性がその最も高いレベルになるように、２つの配列の整列後に計算され得る。
【０１１７】
相同性の計算の別の方法は、公開されたアルゴリズムによって行われ得る。比較についての配列の最適整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所性相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＬ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または視察によって行われ得る。
【０１１８】
同じ型の相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８〜５２、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６〜７７１０、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６、１９８９（これは、少なくとも核酸整列に関連する物質について、本明細書中で参考として援用される）において開示されるアルゴリズムによって、核酸について得られ得る。これらの方法のいずれかが、代表的には使用され得ること、そして特定の場合において、これらの種々の方法の結果が異なり得ることが理解されるが、当業者は、同一性がこれらの方法のうちの少なくとも１つで見出される場合、この配列が、陳述される同一性を有すると言われ、そして本明細書中で開示されることを、理解する。
【０１１９】
例えば、本明細書中で使用される場合、別の配列に対して特定の相同性パーセントを有すると示される配列は、上記の計算方法のいずれか１つ以上によって計算される、示される相同性を有する配列を指す。例えば、第一の配列は、たとえこの第一の配列が、他の計算方法のいずれかによって計算された場合に、第二の配列に対して８０パーセントの相同性を有さない場合であってさえ、この第一の配列が、Ｚｕｋｅｒ計算方法を用いて、第二の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合には、第二の配列に対して、本明細書中で規定される場合、８０パーセントの相同性を有する。別の例として、第一の配列は、たとえこの第一の配列が、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ計算方法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ計算方法、Ｊａｅｇｅｒ計算方法または他の計算方法のいずれかによって計算された場合に、第二の配列に対して８０パーセントの相同性を有さない場合であってさえ、この第一の配列が、Ｚｕｋｅｒ計算方法ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ計算方法の両方を用いて、第二の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合には、第二の配列に対して、本明細書中で規定される場合、８０パーセントの相同性を有する。なお別の例として、第一の配列は、その第一の配列が、各々の計算方法を用いて、第二の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合（しかし、実際問題として、この異なる計算方法は、しばしば、異なる計算上の相同性パーセンテージをもたらす）、本明細書中で規定される場合、８０パーセントの相同性を有する。
【０１２０】
機能的フラグメントならびに抗原性フラグメント、ならびに開示される組成物の選択プロトコルにおいて使用され得るフラグメントもまた開示されることもまた、理解される。例えば、インテグリンは、他のインテグリンと相互作用するドメインを有する。特定の実施形態において、本明細書中に開示される選択プロトコルにおいて、例えば、β４インテグリンのインテグリン結合ドメインフラグメントだけ利用することが有利であり得る。選択標的として、β４インテグリンのこのドメインを使用することによって、例えば、この選択プロトコルは、β４インテグリンのこのドメインを結合する分子について偏らせられる。
【０１２１】
（ｅ）ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション）
用語、ハイブリダイゼーションは、代表的には、少なくとも２つの核酸分子（例えば、プライマーまたはプローブ、および遺伝子）間の配列由来性相互作用を意味する。配列由来性相互作用は、ヌクレオチド特異的様式で、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体との間で生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡが、配列由来性相互作用である。代表的には、配列由来性相互作用は、そのヌクレオチドのワトソン・クリック面またはフーグスティーン面上で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多くの条件およびパラメータによって影響を及ぼされる。例えば、反応の塩濃度、ｐＨおよび温度はすべて、２つの核酸分子がハイブリダイズするか否かに影響を及ぼす。
【０１２２】
２つの核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションについてのパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として既定され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程のいずれかまたは両方の、温度および塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分が、そのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）よりもおよそ１２〜２５℃低い温度での高いイオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）におけるハイブリダイゼーション、その後の、洗浄温度がＴｍよりもおよそ５℃〜２０℃低いように選択される温度と塩濃度との組み合わせでの洗浄を、包含し得る。この温度および塩条件は、予備実験において経験的に容易に決定され、この予備実験において、フィルター上に固定された参照ＤＮＡのサンプルが、目的の標識核酸とハイブリダイズされ、次いで、異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される。ハイブリダイゼーション温度は、代表的には、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、およびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションについて、より高い。この条件は、ストリンジェンシーを達成するために上記のように使用され得るか、または当該分野で公知のように使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５４：３６７、１９８７（これは、少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連する物質について、本明細書中で参考として援用される）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションについての好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥにおける（水溶液中での）およそ６８℃でのハイブリダイゼーション、その後の６８℃での洗浄であり得る。所望であれば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される相補性の程度が減少するに従って、そしてさらに、可変性が調べられる任意の領域のＧ−Ｃ豊富性またはＡ−Ｔ豊富性に依存して減少され得る。同様に、所望であれば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される相同性が増大するに従って、そしてさらに、高い相同性が、当該分野ですべて公知のように所望される任意の領域のＧ−Ｃ豊富性またはＡ−Ｔ豊富性に依存して増大され得る。
【０１２３】
選択的ハイブリダイゼーションを規定する別の方法は、もう一方の核酸に結合したそれらの核酸のうちの一方の量（パーセンテージ）に注目することによる。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、限定核酸のうちの少なくともおよそ６０パーセント、６５パーセント、７０パーセント、７１パーセント、７２パーセント、７３パーセント、７４パーセント、７５パーセント、７６パーセント、７７パーセント、７８パーセント、７９パーセント、８０パーセント、８１パーセント、８２パーセント、８３パーセント、８４パーセント、８５パーセント、８６パーセント、８７パーセント、８８パーセント、８９パーセント、９０パーセント、９１パーセント、９２パーセント、９３パーセント、９４パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントが、非限定核酸に結合される場合である。代表的には、この非限定プライマーは、例えば、１０倍過剰または１００倍過剰または１０００倍過剰である。この型のアッセイは、限定プライマーおよび非限定プライマーの両方が、例えば、そのＫｄの１／１０もしくは１／１００もしくは１／１０００である場合、あるいはこの核酸分子のうちの１つのみが、そのＫｄの１／１０もしくは１／１００もしくは１／１０００であるか、または１つの核酸分子もしくは両方の核酸分子が、そのＫｄを超える、条件下で行われ得る。
【０１２４】
選択的ハイブリダイゼーションを規定する別の方法は、所望の酵素的操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で酵素的に操作される、プライマーのパーセンテージに注目することによる。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、そのプライマーのうちの少なくともおよそ６０パーセント、６５パーセント、７０パーセント、７１パーセント、７２パーセント、７３パーセント、７４パーセント、７５パーセント、７６パーセント、７７パーセント、７８パーセント、７９パーセント、８０パーセント、８１パーセント、８２パーセント、８３パーセント、８４パーセント、８５パーセント、８６パーセント、８７パーセント、８８パーセント、８９パーセント、９０パーセント、９１パーセント、９２パーセント、９３パーセント、９４パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントが、酵素的操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合であり、例えば、この酵素的操作が、ＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、そのプライマー分子の少なくともおよそ６０パーセント、６５パーセント、７０パーセント、７１パーセント、７２パーセント、７３パーセント、７４パーセント、７５パーセント、７６パーセント、７７パーセント、７８パーセント、７９パーセント、８０パーセント、８１パーセント、８２パーセント、８３パーセント、８４パーセント、８５パーセント、８６パーセント、８７パーセント、８８パーセント、８９パーセント、９０パーセント、９１パーセント、９２パーセント、９３パーセント、９４パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントが伸長される場合である。好ましい条件はまた、製造業者によって示唆される条件、または当該分野において、この操作を行う酵素に適切であると示される条件を含む。
【０１２５】
ただ相同性に関して、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションレベルの決定について、本明細書中に開示される種々の方法が存在することが、理解される。これらの方法および条件が、２つの核酸分子間の異なるパーセンテージのハイブリダイゼーションを提供し得るが、別段の指示がない限り、この方法のいずれかのパラメータを満たすことが十分であることが、理解される。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要とされた場合、そして、これらの方法のいずれか１つにおいて必要とされるパラメータの範囲内でハイブリダイゼーションが生じる限りは、その８０％のハイブリダイゼーションは、本明細書中に開示されると見なされる。
【０１２６】
組成物または方法が、集合的にかまたは単独的にかのいずれかでハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のうちのいずれか１つを満たす場合、これが、その組成物または方法が本明細書中に開示される組成物または方法であることを当業者が理解することが、理解される。
【０１２７】
（ｆ）細胞への組成物の送達）
開示される組成物および方法は、しばしば、細胞への組成物の送達を伴う。例えば、α６  ｍＲＮＡまたはγ２  ｍＲＮＡに対して指向されるアンチセンス分子は、任意の方法を介して細胞に送達され得る。多くの例示的な方法が、本明細書中に開示される。特定の実施形態において、非核酸分子（例えば、β４インテグリンに対する抗体、α６インテグリンに対する抗体、またはγ２に対する抗体、あるいは低分子、またはペプチド）が存在し、そして細胞に送達され得ることもまた、理解される。これらの分子の送達は、任意の手段によって生じ得、そしてこのような送達についての例示的な組成物および方法が、本明細書中に開示される。
【０１２８】
インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞に核酸を送達するために使用され得る多くの組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物は、主に、以下の２つのクラスに分けられ得る：ウイルスベースの送達系、および非ウイルスベースの送達系。例えば、この核酸は、多くの直接送達系（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドを介してか、あるいは細胞またはキャリア（例えば、カチオン性リポソーム）における遺伝物質の送達を介して、送達され得る。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、または物理機械的方法（例えば、エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散）を含むトランスフェクションに適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、１４６５〜１４６８（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、８１５〜８１８（１９９１）によって記載される。このような方法は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される組成物および方法を用いた使用に容易に適応可能である。特定の場合において、この方法が改変されて、大きなＤＮＡ分子と特異的に機能する。さらに、これらの方法が使用されて、キャリアの標的特徴を使用することによって、特定の疾患および細胞集団が標的化され得る。
【０１２９】
（（１）核酸ベースの送達系）
移入ベクターは、細胞に遺伝子を送達するためにか、または遺伝子を送達するために一般的ストラテジーの一部分（例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部分）として、使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）であり得る（Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３〜８８（１９９３））。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、分解を伴わずに、開示される核酸（例えば、γ２アンチセンス産生分子）を細胞に輸送する因子であり、そしてこれが送達される細胞においてその遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、この送達ベクターは、ウイルスまたはレトロウイルスのいずれかに由来する。ウイルスベクターは、例えば、以下である：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養ウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含む）。ベクターとしての使用に適するようにするこれらのウイルスの性質を共有する、任意のウイルスファミリーもまた、好ましい。レトロウイルスは、マウスモロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、およびＭＭＬＶのベクターとして望ましい性質を発現するレトロウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝子ペイロード（すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子）を保有し得、そしてこの理由のために、レトロウイルスベクターは通常使用されるベクターである。しかし、レンチウイルスベクター以外に、これらは、代表的には、非増殖性細胞において有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、そして操作しやすく、高い力価を有し、そしてエアロゾル処方物中において送達され得、そして非分裂細胞をトランスフェクトし得る。ポックスウイルスベクターは大きく、そして挿入遺伝子のためのいくつかの部位を有し、これらは、熱安定性であり、そして室温で保存され得る。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって惹起される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されているウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン８またはインターロイキン１０についてのコード領域を保有する。
【０１３１】
ウイルスベクターは、細胞中に遺伝子を導入するための化学的方法または物理的方法よりも高い処理能力（遺伝子を導入するための）を有し得る。代表的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド化に必要な逆方向末端反復配列、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作される場合、ウイルスは、代表的には、１つ以上の初期遺伝子を除去され、そして除去されたウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットがウイルスゲノムに挿入される。この型の構築物は、およそ８ｋｂまでの外来遺伝物質を保有し得る。この除去される初期遺伝子の必要な機能は、代表的には、トランスでこの初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞株によって、供給される。
【０１３２】
（（ａ）レトロウイルスベクター）
レトロウイルスは、あらゆる型、亜科、属、または親和性を含む、レトロウイルス科に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般的に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８５、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２２９−２３２頁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９８５）により記載されており、これは本明細書中で参考として援用される。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用する方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９０／０２８０６およびＷＯ  ８９／０７１３６；およびＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））において記載されており、これらの教示は、本明細書中において参考として援用される。
【０１３３】
レトロウイルスは、本質的には、核酸である積荷を中に包んだパッケージである。この核酸である積荷は、それと共にパッケージングシグナルを有し、このパッケージングシグナルは、複製された娘分子が効率的にパッケージコートに包まれることを保証する。このパッケージシグナルに加えて、複製のため、および複製されたウイルスのパッケージングのために、シスで必要な多くの分子が存在する。代表的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの産生に関与する、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含む。標的細胞に転移されるべき外来性ＤＮＡにより置換されるのは、代表的には、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、代表的には、パッケージコートへの組み込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写に必要なエレメント（逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するためのプライマー結合部位を含む）、ＤＮＡ合成の間にＲＮＡ鎖のスイッチを導く末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２鎖合成のためにプライミング部位としてはたらく３’ＬＴＲの５’側のプリンリッチ配列、および宿主ゲノム中へのＤＮＡ状態のレトロウイルスの挿入を可能にするＬＴＲ末端付近の特定配列を含む。ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来性配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写され、そして複製時に新規レトロウイルス粒子にパッケージングされることを可能にする。この核酸の量は、各転写物の大きさに依存して、１つ〜多くの遺伝子の送達に十分である。挿入物中に他の遺伝子とともに正または負いずれかの選択マーカーを含むことが、好ましい。
【０１３４】
ほとんどのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージングタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）が除去されているので、それらのベクターは、代表的には、それらをパッケージング細胞株の中に配置することによって産生される。パッケージング細胞株は、複製機構およびパッケージング機構を含むレトロウイルスでトランスフェクトまたは形質転換されたがパッケージングシグナルを欠く、細胞株である。選択されたＤＮＡを保有するベクターがこれらの細胞株にトランスフェクトされた場合、目的の遺伝子を含むベクターは、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって、複製され、そして新規レトロウイルス粒子中にパッケージングされる。その機構のためのゲノムは、必要なシグナルを欠くので、パッケージングされない。
【０１３５】
（（ｂ）アデノウイルスベクター）
複製欠損アデノウイルスの構築は、記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。これらのウイルスをベクターとして使用する利点は、これらのベクターは最初の感染細胞内で複製し得るが、新規の感染性ウイルス粒子を形成することができないので、これらのベクターが他の細胞型に広がり得る程度が限定されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多くの他の組織部位への直接のインビボ伝達の後に、高い効率の遺伝子転移を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ、Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特異的な細胞表面レセプターに結合し、その後そのウイルスが、野生型アデノウイルスまたは複製欠損アデノウイルスと同じ様式で、レセプター媒介性エンドサイトーシスによってインターナライズされることによって、遺伝子形質導入を達成する（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４��；Ｖａｒｇａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【０１３６】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子を除去したアデノウイルスに基づくベクターであり得、そしてこれらのビリオンはヒト２９３細胞株のような細胞株において産生される。別の好ましい実施形態において、Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子の両方が、そのアデノウイルスゲノムから除去される。
【０１３７】
（（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター）
別の型のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスは、好ましいベクターである。なぜなら、このパルボウイルスは、多くの細胞型に感染し得、そしてヒトに対して非病原性であるからである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送し得、そして野生型ＡＡＶは、第１９染色体中に安定に挿入されることが知られている。この部位特異的組込み性質を含むベクターが、好ましい。この型のベクターの特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡによって作製されたＰ４．１Ｃベクターであり、このベクターは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／またはマーカー遺伝子（例えば、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子）を含み得る。
【０１３８】
別の型のＡＡＶウイルスにおいて、そのＡＡＶは、１対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、それらの逆方向末端反復は、異種遺伝子に作動可能に連結した細胞特異的発現を指示するプロモーターを含む、少なくとも１つのカセットに隣接する。この文脈における異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスに本来ない、あらゆるヌクレオチド配列または遺伝子を指す。
【０１３９】
代表的には、そのＡＡＶおよびＢ１９コード領域は除去されており、安全な非細胞毒性ベクターを産生する。そのＡＡＶ  ＩＴＲまたはその改変は、感染性および部位特異的組込みを与えるが、細胞毒性は与えず、そしてそのプロモーターは、細胞特異的発現を指示する。米国特許第６，２６１，８３４号が、ＡＡＶベクターに関連する材料に関して、本明細書中で参考として援用される。
【０１４０】
従って、本発明のベクターは、実質的な毒性を伴わずに哺乳動物染色体に組込み可能な、ＤＮＡ分子を提供する。
【０１４１】
ウイルスおよびレトロウイルス中に挿入された遺伝子は、通常は、望ましい遺伝子産物の発現を調節するのを助けるために、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的には、転写開始部位に対して比較的固定された位置にある場合に機能する、１つまたは複数のＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、そして上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
【０１４２】
（（ｄ）ペイロードの大きなウイルスベクター）
大きなヒトヘルペスウイルスを用いた分子遺伝学的実験により、ヘルペスウイルスによる感染を許容する細胞において、大きな異種ＤＮＡフラグメントをクローニングし、増殖させ、そして確立し得る手段が、提供された（Ｓｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１、１９９４；ＣｏｔｔｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：６３３−６４４、１９９９）。これらの大きなＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ））は、＞１５０ｋｂのヒト異種ＤＮＡのフラグメントを特定の細胞に伝達する能力を有する。ＥＢＶ組換え体は、感染したＢ細胞において大きなＤＮＡフラグメントをエピソームＤＮＡとして維持し得る。個々のクローンは、遺伝的に安定であるように見える３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入物を保有した。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶによる感染の間に構成的に発現される特定のＥＢＶ核タンパク質（ＥＢＮＡ１）を必要とする。さらに、これらのベクターは、大量のタンパク質がインビトロで一過性産生され得るトランスフェクションのために使用され得る。ヘルペスウイルスアンプリコン系もまた、＞２２０ｋｂのＤＮＡフラグメントをパッケージングし、そしてＤＮＡをエピソームとして安定に維持し得る細胞に感染させるために、使用され得る。
【０１４３】
他の有用なシステムとしては、例えば、複製ワクシニアウイルスベクターおよび宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターが、挙げられる。
【０１４４】
（２）非核酸ベースの系）
開示された組成物は、様々な方法で標的細胞に送達され得る。例えば、その組成物は、エレクトロポレーションを介してか、またはリポフェクションを介してか、またはリン酸カルシウム沈殿を介して、送達され得る。選択される送達機構は、部分的には、標的細胞の型、および例えば、その送達がインビボまたはインビトロで生じるか否かに、依存する。
【０１４５】
従って、その組成物は、開示された核酸およびタンパク質またはベクターに加えて、例えば、脂質（例えば、リポソーム（カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール））またはアニオン性リポソーム）を含み得る。リポソームは、望ましい場合は、特定の細胞の標的化を容易にするタンパク質を、さらに含み得る。化合物とカチオン性リポソームとを含む組成物の投与は、標的器官に向かう血液に投与され得るか、または気道の細胞を標的化するために気管内に吸入され得る。リポソームに関して、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと。さらに、この化合物は、マクロファージのような特定の細胞型へ標的化され得るマイクロカプセルの成分としてか、またはマイクロカプセルからのその化合物の拡散またはその化合物の送達が特定の速度または投与量のために設計されているマイクロカプセルの成分として、投与され得る。
【０１４６】
患者の細胞中への外来性ＤＮＡの投与および取り込み（すなわち、遺伝子形質導入またはトランスフェクション）を包含する上記の方法において、細胞へのその組成物の送達は、様々な機構を介し得る。１つの例として、送達は、市販のリポソーム調製物（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））および当該分野で標準的な手順に従って開発される他のリポソームを用いて、リポソームを介し得る。さらに、本発明の核酸またはベクターを、エレクトロポレーション（その技術は、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能な）によって、およびＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）によって、インビボで送達され得る。
【０１４７】
その材料は、溶液または懸濁液の（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞中に組み込まれた）状態であり得る。これらは、抗体、レセプター、またはレセプターリガンドを介して、特定の細胞型に標的化され得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：４４７−４５１（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６０：２７５−２８１（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５８：７００−７０３（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：３−９（１９９３）；Ｂｅｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５：４２１−４２５（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １２９：５７−８０（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：２０６２−２０６５（１９９１））。これらの技術は、様々な他の特定の細胞型に使用され得る。特に、ビヒクルとしては、「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」リポソームおよび他の抗体結合リポソーム（結腸癌への脂質媒介性薬物標的化を含む）、細胞特異的リガンドを介するレセプター媒介性ＤＮＡ標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、およびインビボにおけるマウス神経膠腫の高度に特異的な治療的レトロウイルス標的化が、挙げられる。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へと標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９：６２１４−６２２０（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１０４：１７９−１８７（１９９２））。一般的に、構成的またはリガンド誘導性のいずれかであるエンドサイトーシスの経路に、レセプターが関与する。これらのレセプターは、クラスリン被覆小孔にてクラスター形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、そのレセプターが分別される酸性化エンドソームを通り、次いで細胞表面へとリサイクルされるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームで分解されるかのいずれかである。そのインターナリゼーション経路は、種々の機能（例えば、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子の除去、ウイルスおよび毒素の日和見的侵入、リガンドの解離および分解、ならびにレセプターレベルの調節）を提供する。多くのレセプターは、細胞型、レセプター濃度、リガンドの型、リガンド結合価、およびリガンド濃度に依存して、１つより多くの細胞内経路に従う。レセプター媒介性エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構は、概説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６、３９９−４０９（１９９１））。
【０１４８】
宿主細胞ゲノムに組み込まれるべき、細胞へと送達される核酸は、代表的には組込み配列を含む。これらの配列は、特にウイルスベースの系を使用する場合、しばしば、ウイルス関連配列である。これらのウイルス組込み系はまた、リポソームのような非核酸ベースの送達系を用いて、その伝達系に含まれる核酸が宿主ゲノムに組込まれ得るように、送達される核酸中に組込まれ得る。
【０１４９】
宿主ゲノム中への組込みのための他の一般的な技術としては、例えば、宿主ゲノムとの相同的組換えを促進するように設計された系が挙げられる。これらの系は、代表的には、ベクター核酸と標的核酸との間で組換えが起こり、送達された核酸が宿主ゲノム中へと組込まれるのに十分な相同性を宿主細胞ゲノム中の標的配列と有する、発現されるべき核酸に隣接する配列に依存する。相同的組換えを促進するのに必要なこれらの系および方法は、当業者に公知である。
【０１５０】
（３）インビボ／エキソビボ
上記で記載したように、組成物を、薬学的に受容可能なキャリア中で投与し得、そして当該分野で周知の種々のメカニズムによって、インビボおよび／またはエキソビボで、患者細胞に送達し得る（例えば裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシスなど）。
【０１５１】
エキソビボ方法を使用する場合、当該分野で周知の標準的なプロトコールによって、細胞または組織を除去し得、そして体外で維持し得る。組成物を、例えばリン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはプロテオリポソームのような、任意の遺伝子移入メカニズムを介して細胞に導入し得る。次いで、形質導入された細胞を、細胞または組織の型に標準的な方法によって、患者に注入（例えば、薬学的に受容可能なキャリア中で）または同位置に移植して戻し得る。種々の細胞の患者への移植または注入に関して、標準的な方法が公知である。特定の実施形態において、インテグリンシグナル伝達インヒビターを産生する構築物は、構成的なプロモーターよりも誘導可能なプロモーターによって駆動される。誘導可能な系は、開示された構築物の発現に対して特定の利点を提供する。任意の誘導可能な系を使用し得る。また、本明細書中で、および実施例で記載される、誘導可能な系を含む細胞が、開示される。これらの細胞を、広範な種々のアッセイおよびインビボ設定におけるモデル系として使用し得る。
【０１５２】
ｇ）発現系
細胞に送達される核酸は、典型的には発現調節系を含む。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系に挿入された遺伝子は、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるために、通常プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的には転写開始部位に関して比較的固定された位置において機能する、ＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、そして上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
【０１５３】
（１）ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞においてベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスのようなウイルスゲノムから、または異種由来哺乳動物プロモーター、例えばβアクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得る（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして簡便に得る（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２））。もちろん、宿主細胞または関連する種由来のプロモーターも、本明細書中で有用である。
【０１５４】
エンハンサーは、一般的に転写開始部位から固定されない位置で機能するＤＮＡ配列をさし、そして転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））、または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン中（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））およびコード配列自身の中（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））であり得る。それらは、通常１０ｂｐと３００ｂｐとの間の長さであり、そしてそれらは、シスで機能する。エンハンサーは、付近のプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、しばしば転写の調節を媒介する応答エレメントを含む。プロモーターもまた、転写の調節を媒介する応答エレメントを含み得る。エンハンサーが、しばしば遺伝子発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列が現在哺乳動物遺伝子から知られているが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）、典型的には、一般的な発現のために真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１５５】
プロモーターおよび／またはエンハンサーを、その機能を引き起こす光または特定の化学的事象のいずれかによって特異的に活性化し得る。系を、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンのような試薬によって調節し得る。γ線照射のような放射線照射、またはアルキル化化学療法薬物への曝露によって、ウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法もまた、存在する。
【０１５６】
特定の実施形態において、プロモーター領域および／またはエンハンサー領域は、転写される転写単位領域の発現を最大にするために、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用し得る。特定の構築物において、プロモーター領域および／またはエンハンサー領域は、それが特定の時に特定の細胞型においてのみ発現されるとしても、全ての真核生物細胞型で活性である。この型の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１５７】
全ての特定の調節エレメントをクローニングし得、そして黒色腫細胞のような特定の細胞型で選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用し得ることが示された。グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターを、グリア細胞起源の細胞において遺伝子を選択的に発現するために使用した。
【０１５８】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡの発現に影響を与え得る、転写の終止に必要な配列を含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終止部位を含む。転写単位もまたポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写された単位がｍＲＮＡのように処理および輸送される可能性を増加させることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。導入遺伝子構築物において相同なポリアデニル化シグナルを使用することが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから得られ、そして約４００塩基から構成される。転写単位が、単独で、または構築物からの発現またはその安定性を改善する上記の配列と組合わせて、他の標準配列を含むこともまた、好ましい。
【０１５９】
（２）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達されたか、そして一旦送達されると発現されたか否かを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質である。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン、およびピューロマイシンである。そのような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入される場合、形質転換した哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置いた場合に生存し得る。２つの広く使用されている、選択レジメンの異なるカテゴリーが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝、および補充された培地と独立して増殖する能力を欠く変異細胞株の使用に基づく。２つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の添加なしに増殖する能力を欠く。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠くので、欠けているヌクレオチドが補充された培地中に提供されなければ生存できない。培地への添加の代替は、それぞれの遺伝子を欠く細胞にインタクトなＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を導入して、よって、それらの増殖必要条件を変えることである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、補充されていない培地で生存できない。
【０１６１】
第２のカテゴリーは、優勢選択（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）であり、それは任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、そして改変体細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは、典型的には宿主細胞の増殖を停止させるために薬物を使用する。新規遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を発現し、そして選択を生き残る。そのような優勢選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。３つの例は、適当な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンそれぞれに対する耐性を与えるために真核生物細胞の制御下に特定の細菌遺伝子を使用する。他は、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューロマイシンを含む。
【０１６２】
ｈ）ペプチド
（１）タンパク質改変体
本明細書中で議論されるように、公知であり、そして本明細書中で企図される、例えばβ４インテグリンタンパク質、α６インテグリンタンパク質、およびγ２ラミニン５タンパク質の多くの改変体が存在する。公知の機能的ホモログ改変体に加えて、β４、α６およびγ２ならびに他の開示されたタンパク質の誘導体が存在し、これらはまた、開示された方法および組成物において機能する。タンパク質改変体および誘導体は、当業者に十分に理解され、そしてアミノ酸配列の修飾を含み得る。例えば、アミノ酸配列の修飾は、典型的には３つのクラス：置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体の１つ以上に分類される。挿入は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、および単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は通常、アミノ末端またはカルボキシル末端の融合のものより小さい挿入であり、例えば、１から４残基の次数である。免疫原性融合タンパク質誘導体は、免疫原性を与えるのに十分大きなポリペプチドを、標的配列にインビトロでの架橋によって融合することによって、または融合物をコードするＤＮＡで形質転換した組換え細胞培養によって作成される。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。典型的には、約２から６残基のみが、タンパク質分子内のいずれか１つの部位で欠失される。これらの改変体は、通常タンパク質をコードするＤＮＡにおいてヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、それによって改変体をコードするＤＮＡを産生し、その後そのＤＮＡを組換え細胞培養中で発現する。公知の配列を有するＤＮＡにおいて予め決定した部位で置換変異を作成する技術、例えばＭ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発は周知である。アミノ酸配列の置換は、典型的には単一残基であるが、１度に多くの異なる位置で起こり得る。挿入は、通常約１から１０アミノ酸残基の次数であり、そして欠失は約１から３０残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは隣接する対で、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入で行なわれる。置換、欠失、挿入またはその任意の組合わせを組合わせて最終構築物に達し得る。変異は、配列をリーディングフレームの外に置いてはならず、そして好ましくはｍＲＮＡ二次構造を産生し得る相補的領域を作成しない。置換改変体は、少なくとも１つの残基が除去され、そして異なる残基がその場所に挿入されたものである。そのような置換は、一般的に以下の表１および２に従って行なわれ、そして保存的置換と呼ばれる。
【０１６３】
【表１】
2010189445.tif 000002
【０１６４】
【表２】
2010189445.tif 000003
表２のものよりも保存的でない置換を選択すること（すなわち（ａ）置換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造（例えば、シートまたはらせん配置）、（ｂ）標的部位の分子の荷電または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ、の維持に対する影響をより有意に変える残基を選択すること）によって、機能または免疫学的同一性における実質的な変化が産生される。一般的にタンパク質の性質に最も大きな変化を産生することが予期される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリンまたはスレオニン）が、疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、またはアラニン）に（またはそれによって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基に（またはそれによって）置換される；（ｃ）正に帯電した側鎖を有する残基（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）が、負に帯電した残基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）に（またはそれによって）置換される；または（ｄ）大きな側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、側鎖を有さないもの（例えば、この場合グリシン）に（またはそれによって）置換される、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化の部位の数を増加させるものである。
【０１６５】
例えば、１つのアミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似した別のものと置換することは、当業者に保存的置換として公知である。例えば、保存的置換は、１つの疎水性残基を別のものと、または１つの極性残基を別のものと置換する。置換は、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組合わせを含む。明確に開示された配列の各々の、そのような保存的に置換された改変体は、本明細書中で提供されるモザイクポリペプチドに含まれる。
【０１６６】
置換変異誘発または欠失変異誘発を、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）の部位を挿入するために使用し得る。システインまたは他の不安定な残基の欠失も望ましくあり得る。潜在的なタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換を、例えば、塩基性残基の１つを欠失させるか、またはグルタミン残基またはヒスチジン残基で置換することによって達成し得る。
【０１６７】
特定の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ）残基およびアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ）残基は、しばしば翻訳後に対応するグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｙｌ）残基およびアスパラギン酸（ａｓｐａｒｙｌ）残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱い酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリシンの水酸化、セリン残基およびスレオニン残基の水酸基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、７９−８６頁（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびいくつかの場合において、Ｃ−末端カルボキシルのアミド化を含む。
【０１６８】
本明細書中で開示されたタンパク質の改変体および誘導体を規定する１つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性／同一性に関して改変体および誘導体を規定することによることが理解される。例えば、配列番号５は、β４インテグリンｃＤＮＡの特定の配列を記載し、そして配列番号６はβ４インテグリンタンパク質の特定の配列を記載する。記載された配列に対して少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、本明細書中で開示されるこれらおよび他のタンパク質の改変体が、特に開示される。当業者は、２つのタンパク質の相同性をどのように決定するかを容易に理解する。例えば、２つの配列を相同性が最も高いレベルになるように整列した後、相同性を計算し得る。
【０１６９】
相同性を計算する別の方法を、公開されたアルゴリズムによって行ない得る。比較のために最適な配列の整列を、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性探索方法によって、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、または観察によって実施し得る。
【０１７０】
同じ型の相同性を、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６、１９８９において開示されたアルゴリズムによって、核酸に関して得ることができ、これらは少なくとも核酸整列に関連する資料に関して本明細書中で参考として援用される。
【０１７１】
保存的変異および相同性の記載を、改変体が保存的変異である、特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する実施形態のような、任意の組合わせで一緒に組合わせ得ることが理解される。
【０１７２】
本明細書は種々のタンパク質およびタンパク質配列を議論するので、それらのタンパク質配列をコードし得る核酸も開示されることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列、すなわち１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸、およびタンパク質配列の開示された改変体および誘導体をコードする縮重核酸を含む全ての核酸を含む。従って、特定の核酸配列の各々は、本明細書中で書かれないかもしれないが、各々および全ての配列は、開示されたタンパク質配列を通して実際に本明細書中で開示および記載されることが理解される。例えば、配列番号６に記載されるタンパク質配列をコードし得る多くの核酸配列の１つを、配列番号５に記載される。配列番号６に記載される同じタンパク質配列をコードする別の核酸配列が、配列番号１６に記載される。さらに、例えば、配列番号２の開示された保存的誘導体が、配列番号１７に示され、ここで位置３４のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に変化している。この変異に関して、例えば、配列番号１７に記載される特定のポリペプチドをコードする２つの縮重核酸配列を述べる、配列番号１８および配列番号１９を含む、β４インテグリンのこの特定の誘導体をコードする全ての核酸配列もまた開示されることが、理解される。アミノ酸配列は、生物中でどの特定のＤＮＡ配列がそのタンパク質をコードするか示さない（開示されたタンパク質の特定の改変体が本明細書中で開示される）が、そのタンパク質が生ずる特定の生物においてそのタンパク質をコードする公知の核酸配列もまた公知であり、そして本明細書中で開示および記載される。
【０１７３】
ｉ）薬学的キャリア／薬学的産物の送達
上記で記載したように、組成物、例えばα６機能、β４機能、またはγ２機能を阻害する組成物をまた、薬学的に受容可能なキャリア中で、インビボで投与し得る。「薬学的に受容可能な」によって、生物学的でないか、さもなくば所望されない物質を意味する。すなわち、その物質を、いかなる所望されない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる薬学的組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核酸またはベクターに沿って患者に投与し得る。キャリアは、当業者に周知であるように、活性成分の任意の分解を最低にするように、そして患者における任意の不利な副作用を最低にするように自然と選択される。
【０１７４】
組成物を、経口的に、非経口的に（例えば静脈内）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外的に、局所的などに投与し得るが、局所鼻腔内投与または吸入による投与が、典型的には好ましい。本明細書中で使用される場合、「局所鼻腔内投与」は、１つのまたは両方の外鼻孔を通じた鼻および鼻腔通路への組成物の送達を意味し、そしてスプレーメカニズムまたは小滴メカニズムによる、または核酸またはベクターのエアロゾル化を介した送達を含み得る。多数の動物を同時に処理する場合に、後者が有効であり得る。吸入による組成物の投与は、スプレーまたは小滴メカニズムによる送達を介して鼻または口を通し得る。送達はまた、挿管を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に直接的であり得る。必要とされる組成物の正確な量は、患者の種、年齢、体重および一般的な状態、治療されるアレルギー障害の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、投与様式などに依存して、患者ごとに異なる。従って、全ての組成物に関して正確な量を明確に述べるのは不可能である。しかし、適当な量は、本明細書中の教示を考慮して、日常的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
【０１７５】
組成物の非経口投与は、もし使用されるなら、一般的に注射によって特徴付けられる。注射可能物を、液体溶液または懸濁液、注射前の液体中における懸濁溶液に適切な固体形態、またはエマルションのいずれかとして、慣用的な形態で調製し得る。非経口投与のより最近見直されたアプローチは、一定の投与量が維持されるような、徐放（ｓｌｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ）系または徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）系の使用を含む。例えば米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと、これは本明細書中で参考として援用される。
【０１７６】
物質は、溶液、懸濁液（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）中であり得る。これらを、抗体、レセプター、またはレセプターリガンドを介して特定の細胞型に標的化し得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：４４７−４５１（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６０：２７５−２８１（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５８：７００−７０３（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：３−９（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５：４２１−４２５（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃｋｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １２９：５７−８０（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：２０６２−２０６５（１９９１））。「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」および他の抗体結合リポソーム（結腸癌に対する脂質媒介薬物標的化を含む）、細胞特異的リガンドによるＤＮＡのレセプター媒介標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、およびインビボにおけるマウス神経膠種細胞の高度に特異的な治療的レトロウイルス標的化のようなビヒクル。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に対して標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９：６２１４−６２２０（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１０４：１７９−１８７（１９９２））。一般的に、レセプターは、構成的またはリガンド誘発性のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関与する。これらのレセプターは、クラスリン被覆小孔に密集し、クラスリン被覆小胞によって細胞へ入り、レセプターが分類される酸性化エンドソームを通り、次いで、細胞表面へリサイクルされるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームで分解される。内部移行経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的侵入、リガンドの解離および分解、ならびにレセプターレベルの調節のような、種々の機能を果たす。多くのレセプターは、細胞型、レセプター濃度、リガンドの型、リガンド結合価、およびリガンド濃度に依存して、１つより多い細胞内経路に従う。レセプター媒介エンドサイトーシスの分子メカニズムおよび細胞メカニズムが概説された（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６、３９９−４０９（１９９１））。
【０１７７】
（１）薬学的に受容可能なキャリア
抗体を含む組成物を、薬学的に受容可能なキャリアと組合わせて治療的に使用し得る。
【０１７８】
薬学的キャリアは当業者に公知である。これらは、最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝化溶液のような溶液を含む、ヒトへの薬物の投与のために標準的なキャリアである。組成物を、筋肉内または皮下に投与し得る。他の化合物を、当業者によって使用される標準的な手順によって投与する。
【０１７９】
薬学的組成物は、選択された分子に加えてキャリア、濃縮剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、界面活性剤などを含み得る。薬学的組成物はまた、抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬などのような、１つ以上の活性成分を含み得る。
【０１８０】
薬学的組成物を、局所または全身性処置が所望であるか否かに依存して、および治療される領域に依存して、多くの方法で投与し得る。投与は、局所的（眼内、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口的、吸入による、または非経口的（例えば、静脈内点滴による）、皮下、腹腔内、または筋肉内注射であり得る。開示された抗体を、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、膣内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、または経皮的に投与し得る。
【０１８１】
非経口投与のための調製物は、滅菌した水溶液または非水性溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性キャリアは、生理食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、体液および栄養素補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒｓ）、電解質補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒｓ）（リンガーデキストロースに基づくもののような）などを含む。保存剤および他の添加剤（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなど）も存在し得る。
【０１８２】
局所投与のための処方物は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体および粉末を含み得る。慣用的な薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、濃縮剤などが必要であり得るかまたは所望され得る。
【０１８３】
経口投与のための組成物は、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤を含む。濃縮剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が所望され得る。
【０１８４】
組成物のいくつかは、潜在的に、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸のような無機酸、ならびに葉酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸のような有機酸との反応によって、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、およびモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンのような有機塩基との反応によって形成される、薬学的に受容可能な酸添加塩または塩基添加塩として投与され得る。
【０１８５】
（（２）治療的使用）
組成物を投与するための投与量範囲は、障害の症状が影響される、望ましい効果が産生されるのに十分大きなものである。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等のような有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきではない。一般的に、投与量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度によって変化し、そして当業者によって決定され得る。いかなる反対の徴候（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）が起こった場合にも、投与量は、個々の医師によって調整され得る。投与量は変化し得、そして１日または数日間にわたって、毎日１回またはそれ以上の投与で投与され得る。
【０１８６】
特定の薬学的機能を有さないが、例えば細胞染色体中での変化を追跡するために、または診断的ツールの送達のために使用し得る他の組成物を、薬学的産物に関して記載したものと同様の方法で送達し得る。
【０１８７】
（ｊ）チップおよびマイクロアレイ）
少なくとも１つのアドレス（ａｄｄｒｅｓｓ）が、本明細書中で開示された任意の核酸配列で示される配列または配列の一部であるチップが開示される。少なくとも１つのアドレスが、本明細書中で開示された任意のペプチド配列で示される配列または配列の一部であるチップも開示される。
【０１８８】
少なくとも１つのアドレスが、本明細書中で開示された任意の核酸配列で示される配列または配列の一部の改変体であるチップも開示される。少なくとも１つのアドレスが、本明細書中で開示された任意のペプチド配列で示される配列または配列の一部の改変体であるチップも開示される。
【０１８９】
（ｋ）コンピューター読み取り可能な媒体）
開示された核酸およびタンパク質を、ヌクレオチドまたはアミノ酸からなる配列として提示し得ることが理解される。これらの配列を示す様々な方法が存在し、例えばヌクレオチドグアノシンをＧまたはｇで提示し得る。同様に、アミノ酸バリンをＶａｌまたはＶで提示し得る。当業者は、存在する様々な方法のいずれかで、あらゆる核酸またはタンパク質配列を示すまたは表現する方法を理解し、それらはそれぞれ本明細書中において開示されたとみなされる。これらの配列を、市販で入手可能なフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスク、または他のコンピューター読み取り可能な媒体のような、コンピューター読み取り可能な媒体に提示することが、本明細書中で特に企図される。開示された配列の二進コード表示も開示される。当業者は、コンピューター読み取り可能な媒体を理解する。すなわち、核酸またはタンパク質配列が記録、格納または保存されるコンピューター読み取り媒体を理解する。
【０１９０】
本明細書中で述べた配列に関する配列および情報を含む、コンピューター読み取り可能な媒体が開示される。配列が配列番号１〜１９を含まない、本明細書中で述べた配列に関する配列および情報を含む、コンピューター読み取り可能な媒体も開示される。
【０１９１】
（ｌ）キット）
本明細書中で開示された方法を実施するにおいて使用し得る試薬を得るキットが、本明細書中で開示される。キットは、本明細書中で議論されるか、または開示された方法の実施に必要もしくは有用であることが理解される、あらゆる試薬または試薬の組み合せを含み得る。例えば、キットは本方法の特定の実施形態で議論された増幅反応を実施するためのプライマー、および企図されたようにプライマーを使用するために必要な緩衝液および酵素を含み得る。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、および１３などで示される配列にハイブリダイズするプライマーまたはプローブを含む、結腸癌のような癌にかかる患者のリスクを評価するためのキットが開示される。
【０１９２】
（ｍ）類似の機能を有する組成物）
本明細書中で開示される組成物は、γ２機能の阻害またはα６インテグリンの結合、またはβ４機能の阻害のような、特定の機能を有することが理解される。開示された機能を実施するための特定の構造的要件が、本明細書中で開示され、そして開示された構造と関連する、同じ機能を実行し得る様々な構造が存在すること、およびこれらの構造は最終的には同じ結果、例えばα６β４シグナル伝達の刺激もしくは阻害、またはα６β４シグナル伝達経路の妨害を達成することが理解される。
【０１９３】
（２．組成物の作製方法）
本明細書中で開示された組成物および、開示された方法を実施するのに必要な組成物は、他に特に述べなければ、その特定の試薬または化合物に関する当業者に公知のあらゆる方法を用いて作製され得る。
【０１９４】
（ａ）核酸合成）
例えば、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドのような核酸を、標準的な化学的合成方法を用いて作製し得るか、または酵素的方法またはあらゆる他の公知の方法を用いて産生し得る。そのような方法は、標準的な酵素消化に続くヌクレオチドフラグメントの単離（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）第５、６章を参照のこと）から、例えばＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成機（例えばＭｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００  自動化合成機、またはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を用いたシアノエチルホスホロアミダイト法による、純粋な合成方法までの範囲であり得る。オリゴヌクレオチドを作製するのに有用な合成方法はまた、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）（ホスホトリエステルおよび亜リン酸トリエステル方法）、およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：６１０−６２０（１９８０）（ホスホトリエステル方法）に記載される。タンパク質核酸分子を、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）によって記載されたもののような、公知の方法を用いて作製し得る。
【０１９５】
（ｂ）ペプチド合成）
開示されたタンパク質、または配列番号６のフラグメントのような、開示されたタンパク質のフラグメントを産生する１つの方法は、タンパク質化学技術によって、２つまたはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学のいずれかを用いて、現在入手可能な実験室装置を用いて化学的に合成し得る。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。当業者は、開示されたタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドを、例えば標準的な化学反応によって合成し得ることを容易に認識し得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成し、そしてその合成樹脂から切断され得ないことがあるのに対して、一方ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントを合成し得、そして続いて樹脂から切断し、それによって他のフラグメント上の機能的にブロックされた末端基を露出し得る。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントを、そのカルボキシルおよびアミノ末端それぞれにおいてペプチド結合によって共有結合させて、抗体またはそのフラグメントを形成し得る（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭおよびＴｒｏｓｔ  Ｂ編（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．、ＮＹ（これらは少なくともペプチド合成に関連する資料に関して本明細書中で参考として援用される））。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを、本明細書中で記載するようにインビボで独立に合成する。いったん単離したら、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを、同様のペプチド縮合反応によって連結して、ペプチドまたはそのフラグメントを形成し得る。
【０１９６】
例えば、クローニングされたペプチドセグメントまたは合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションは、比較的短いペプチドフラグメントが、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチドまたはタンパク質ドメイン全体を産生するように結合することを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドのネイティブ化学的ライゲーションを利用して、より短いペプチドフラグメントから大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築し得る。この方法は、２工程化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６−７７９（１９９４））。最初の工程は、最初の共有結合産物として、チオエステル結合中間体を与える、未保護合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の未保護ペプチドセグメントの化学選択的反応である。反応条件を変化させずに、この中間体は、自発的な、迅速な分子内反応を起こして、ライゲーション部位でネイティブのペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【０１９７】
あるいは、未保護ペプチドセグメントを化学的に連結する。ここで化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成された結合は非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：２２１（１９９２））。この技術を使用して、タンパク質ドメインの合成アナログおよび完全な生物学的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成した（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２５７−２６７頁（１９９２））。
【０１９８】
配列番号６、β４インテグリンのような、開示されたタンパク質およびポリペプチドを、あらゆる伝統的な組換え生物工学方法を用いて作製し得る。そのような方法の例を、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにおいて見出し得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋらは少なくともタンパク質および抗体の産生に関する資料に関して本明細書中で参考として援用される。
【０１９９】
（ｃ）組成物を作製するプロセス）
組成物を作製するプロセス、および組成物に至る中間体を作製するプロセスが開示される。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、および１３の核酸が開示される。合成化学的方法および標準的分子生物学的方法のような、これらの組成物を作製するために使用し得る様々な方法が存在する。これらおよび他の開示された組成物を作製する方法が特に開示されていることが理解される。
【０２００】
配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３で述べた配列を含む核酸分子またはそのフラグメント、およびその核酸の発現を制御する配列を、作動可能な様式で連結することを含むプロセスによって産生された核酸分子が開示される。
【０２０１】
配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３で述べた配列またはそのフラグメントと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む核酸分子、およびその核酸の発現を制御する配列を、作動可能な様式で連結することを含むプロセスによって産生された核酸分子も開示される。
【０２０２】
配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３で述べた配列またはそのフラグメントを含む核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸分子、およびその核酸の発現を制御する配列を、作動可能な様式で連結することを含むプロセスによって産生された核酸分子が開示される。
【０２０３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４で述べたペプチドまたはそのフラグメントをコードする配列を含む核酸分子、およびその核酸分子の発現を制御する配列を、作動可能な様式で連結することを含むプロセスによって産生された核酸分子が開示される。
【０２０４】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４で述べたペプチドまたはそのフラグメントと８０％の同一性を有するペプチドをコードする配列を含む核酸分子、およびその核酸分子の発現を制御する配列を、作動可能な様式で連結することを含むプロセスによって産生された核酸分子が開示される。
【０２０５】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４で述べたペプチドまたはそのフラグメントと８０％の同一性を有するペプチドをコードする配列を含む核酸分子、およびその核酸分子の発現を制御する配列を、作動可能な様式で連結することを含むプロセスによって産生された核酸が開示される。ここで配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４で述べた配列またはそのフラグメントからのあらゆる変化は保存的変化である。
【０２０６】
細胞を開示された核酸のいずれかで形質転換するプロセスによって産生された細胞が開示される。細胞を天然に存在しない開示された核酸のいずれかで形質転換するプロセスによって産生された細胞が開示される。
【０２０７】
開示された核酸のいずれかを発現するプロセスによって産生された、開示された任意のペプチドが開示される。開示された核酸のいずれかを発現するプロセスによって産生された、天然に存在しない開示された任意のペプチドが開示される。天然に存在しない開示された核酸のいずれかを発現するプロセスによって産生された、開示された任意のペプチドが開示される。
【０２０８】
動物中の細胞を、本明細書中で開示された核酸分子のいずれかでトランスフェクトするプロセスによって産生された動物が開示される。動物中の細胞を、本明細書中で開示された核酸分子のいずれかでトランスフェクトするプロセスによって産生された動物が開示され、ここで動物は哺乳動物である。動物中の細胞を、本明細書中で開示された核酸分子のいずれかでトランスフェクトするプロセスによって産生された動物も開示され、ここで哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、または霊長類である。
【０２０９】
動物に本明細書中で開示された細胞のいずれかを加えるプロセスによって産生された動物もまた開示される。
【０２１０】
（ｄ）選抜プロトコールから作製された産物）
特定のインテグリンα６β４において、インテグリン機能、インテグリンレセプター機能の機能的調節剤、およびインテグリンレセプターに関連するシグナル伝達経路の機能的調節剤として作用する分子を得る方法も開示される。
【０２１１】
分子のライブラリを配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４で述べたタンパク質またはそのフラグメントと相互作用させること、結合しなかった分子を除去すること、および少なくとも１つの配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４で述べたタンパク質またはそのフラグメントと結合した分子を回収することを含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４で述べたタンパク質またはそのフラグメントと相互作用する分子を単離する方法が開示される。
【０２１２】
（３．組成物を使用する方法）
（ａ）研究ツールとして組成物を使用する方法）
組成物を、例えばコンビナトリアルケミストリープロトコールまたは他のスクリーニングプロトコールにおける標的として使用して、Ａ６Ｂ４およびＡ６Ｂ１シグナル伝達経路に関連する望ましい機能的性質を有する分子を単離し得る。
【０２１３】
開示された組成物をまた、結腸癌のような、癌のような疾患に関連する診断的ツールとして使用し得る。
【０２１４】
開示された組成物を、本明細書中で議論されたように、マイクロアレイにおける試薬として、または既存のマイクロアレイをプローブもしくは分析する試薬として使用し得る。開示された組成物を、単一ヌクレオチド多型を単離または同定するためのあらゆる公知の方法において使用し得る。組成物をまた、例えば異なる機能を有するβ４対立遺伝子の対立遺伝子分析、特にこれはβ４のシグナル伝達および機能に関連するので、対立遺伝子分析を決定するあらゆる方法において使用し得る。組成物をまた、チップ／マイクロアレイに関連するスクリーニングアッセイのあらゆる公知の方法において使用し得る。組成物をまた、例えば関連性を研究するために、または開示された組成物に関連する分子モデル分析を行なうために、開示された組成物のコンピューター読み取り可能な実施形態を用いるあらゆる公知の方法において使用し得る。
【０２１５】
（ｂ）癌に影響を与える方法）
本明細書中で開示されたように、開示された関係は癌細胞が増殖を続ける能力に重要であるので、開示された組成物を、癌細胞の増殖に影響を与えるために使用し得る。α６、β４、またはラミニン５のγ２鎖いずれかの産生を阻害するアンチセンス構築物のような、開示された組成物は、癌細胞の増殖を抑制する。実際、組成物は癌細胞の増殖を抑制しうるのみならず、組成物は、本明細書中で示すように、癌細胞を殺傷し得る。
【０２１６】
癌は、様々な細胞性事象によって引き起こされ、そのうちα６インテグリン（アップレギュレートされる）、β４インテグリン（アップレギュレートされる）およびγ２（アップレギュレートされる）に関連する特定の事象は、癌細胞の持続的な生存を可能にし、そしてこれらアップレギュレートされた分子の阻害は、癌細胞の増殖を阻害し、そしてそれを殺傷することが理解される。しかし、非癌細胞を発癌性にし得る他の公知の事象が存在する。例えば、Ａｂｌ、Ｒａｓ、ＥＧＦレセプター、ＥｒＢ−２、ＡＰＣ、ベータカテニン、Ａｒｆ、Ｍｄｍ２、ｐ５３、Ｒｂ、Ｍｙｃは、発癌に関与することが知られており、そしてこれら分子のいくつか（例えばＲａｓ、ＡＰＣの喪失、ｐ５３の喪失）は、α６β４レセプターによって媒介される、開示された標的シグナル伝達経路に直接関連する。本明細書中に開示された組成物を、開示された関係を標的化する治療薬として使用し得るように、他の標的（例えばＡｂｌ、Ｅｒｂ−２）が存在し、それに対して医薬品組成物が開発されている（例えば、それぞれＧｌｉｖｅｃ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）。
【０２１７】
開示された抗癌組成物を、他の抗癌組成物と組み合せて使用し得ることが理解される。同じシグナル伝達経路において、異なる分子を標的とする抗癌組成物を使用することで、およびまたはそれに加えて、本明細書中で開示されたものとは異なるシグナル伝達経路における分子を標的化することによって、大きな利点を得ることができる。従って、癌細胞の増殖に影響を与え得る、実際に癌細胞を殺傷し得る開示された組成物を、他のあらゆる化学療法、放射線照射、または他のあらゆる抗癌治療と組み合せて使用し得る。
【０２１８】
癌細胞におけるインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害することを含む、癌細胞の増殖を抑制する方法が開示され、ここでインテグリンレセプターはインテグリンを含む。
【０２１９】
インテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用を抑制することを含む、癌細胞の増殖を抑制する方法も開示される。
【０２２０】
インテグリンがお互いに相互作用すること、インテグリンがクラスター化すること、またはインテグリンが癌細胞に関連する他のタンパク質と相互作用することを抑制することを含む、癌細胞の増殖を選択的に抑制する方法も開示される。
【０２２１】
癌細胞によるインテグリンの産生を抑制することを含む、癌細胞の増殖を抑制する方法が開示される。
【０２２２】
癌細胞によるインテグリンレセプターリガンドの産生を抑制することを含む、癌細胞の増殖を抑制する方法も開示される。
【０２２３】
インテグリンシグナル伝達経路を阻害することを含む、癌細胞の増殖を抑制する方法が開示される。
【０２２４】
癌細胞におけるインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害することを含む、癌細胞を選択的に殺傷する方法、またはその増殖を抑制する方法も開示され、ここでインテグリンレセプターはＢ４インテグリンを含む。
【０２２５】
癌細胞におけるインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害することを含む、癌細胞を選択的に殺傷する方法、またはその増殖を抑制する方法が開示され、ここでリガンドはラミニン５を含む。
【０２２６】
癌細胞におけるインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害することを含む、癌細胞を選択的に殺傷する方法、またはその増殖を抑制する方法も開示され、ここでリガンドはラミニンＬ５のγ２サブユニットを含む。
【０２２７】
癌細胞におけるインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害することを含む、癌細胞を選択的に殺傷する方法、またはその増殖を抑制する方法が開示され、ここでインテグリンレセプターはα６インテグリンを含む。
【０２２８】
インテグリンレセプターサブユニットがお互いに相互作用することを阻害すること、インテグリンのクラスター化を阻害すること、またはインテグリンレセプターサブユニットが癌細胞における他のタンパク質と相互作用することを阻害することを含む、癌細胞を選択的に殺傷する方法、またはその増殖を抑制する方法がさらに開示され、ここでインテグリンレセプターはＢ４インテグリンを含む。
【０２２９】
癌細胞によるラミニンの産生を抑制することを含む、癌細胞を選択的に殺傷する方法、またはその増殖を抑制する方法が開示され、ここでラミニンはラミニン５、および／またはγ２のようなラミニン５の任意のサブユニットを含む。
【０２３０】
インテグリンシグナル伝達経路を阻害することを含む、癌細胞を選択的に殺傷する方法、またはその増殖を抑制する方法も開示され、ここでインテグリンシグナル伝達経路はＢ４インテグリンまたはα６インテグリンまたはβ１インテグリンまたはラミニンまたはラミニン５またはラミニン５のγ２サブユニットを含む。
【０２３１】
インテグリンレセプターがインテグリンＢ４を含む、および／またはインテグリンレセプターがインテグリンＡ６を含む、および／またはインテグリンレセプターに結合するリガンドがラミニン５である、および／またはインテグリンレセプターがＡ６Ｂ４である、および／またはリガンドがラミニン５を含む、および／またはリガンドがラミニン５のγ２サブユニットを含む、および／またはインテグリンレセプターへのリガンド結合の阻害が、Ａ６に対するアンチセンス分子を用いることによって起こらない、および／またはインテグリンレセプターへのリガンド結合の阻害が、Ａ６インテグリンを、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリンレセプターへのリガンド結合の阻害が、Ｂ４インテグリンを、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリンレセプターへのリガンド結合の阻害が、ラミニン５を、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリンレセプターへのリガンド結合の阻害が、γ２サブユニットを、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用の抑制が、Ｂ４−デルタ−ｃｙｔを用いることによって起こらない、および／またはインテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用の抑制が、Ａ６に対するアンチセンス分子を用いることによって起こらない、および／またはインテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用の抑制が、Ａ６インテグリンを、Ｂ４インテグリンと他のインテグリンまたはタンパク質分子との間の相互作用を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用の抑制が、Ｂ４インテグリンを、Ｂ４インテグリンと他のインテグリンまたはタンパク質分子との間の相互作用を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用の抑制が、ラミニン５を、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用の抑制が、γ２サブユニットを、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／または非インテグリンタンパク質が成長因子レセプターを含む、および／または非インテグリンタンパク質が半接着斑連結部（ｈｅｍｉ−ｄｅｓｏｍｏｓｏｍｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を含む、および／または非インテグリンタンパク質がＳＨ２ドメインを含む、および／または非インテグリンタンパク質がＳｈｃタンパク質を含む、���よび／または非インテグリンタンパク質がＩＲＳ−１タンパク質を含む、および／または非インテグリンタンパク質がＩＲＳ−２タンパク質を含む、および／またはインテグリン産生の阻害が、Ａ６に対するアンチセンス分子を用いることによって起こらない、および／またはインテグリンの産生がインテグリン発現の誘導を引き起こすシグナル伝達を阻害することによって抑制される、および／またはインテグリン産生の抑制がα６産生の阻害を含む、および／またはα６産生の阻害がα６  ｍＲＮＡに対するアンチセンス分子を用いることをさらに含む、および／またはインテグリン産生の抑制がβ４産生の阻害を含む、および／またはβ４産生の阻害がβ４  ｍＲＮＡに対するアンチセンス分子を用いることをさらに含む、および／またはインテグリンレセプターリガンド産生の抑制がγ２産生の阻害を含む、および／またはインテグリンレセプターリガンド産生の抑制がラミニン産生の阻害を含む、および／またはインテグリンレセプターリガンド産生の抑制がラミニン５産生の阻害を含む、および／またはインテグリンシグナル伝達経路の阻害がＢ４−デルタ−ｃｙｔを用いることによって起こらない、および／またはインテグリンシグナル伝達経路の阻害がＡ６に対するアンチセンス分子を用いることによって起こらない、および／またはインテグリンシグナル伝達経路の阻害が、細胞中のＡ６インテグリンを、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリンシグナル伝達経路の阻害が、Ｂ４インテグリンを、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリンシグナル伝達経路の阻害が、ラミニン５を、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリンシグナル伝達経路の阻害が、γ２サブユニットを、リガンド結合を阻害する組成物と接触させることを含む、および／またはインテグリンシグナル伝達経路の阻害が、癌細胞を、タリン、パキシリン、ビンキュリン、ＣＡＳファミリータンパク質、ＣＲＸ、ＮＣＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ−２、グアニンヌクレオチド交換因子（ｇｕａｎｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ）、ＳＯＳ、ＤＯＣＫ  １８０、Ｖａｖ、Ｓｙｋ、Ｐ−Ｉ−３キナーゼ、ＡＫＴ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、カスパーゼ９、Ｃｄｃ４２、ＰＡＫ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｒｈｏキナーゼ、Ｒａｓ、カベオリン、テトラスパン（Ｔｅｔｒａｓｐａｎ）、レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ、ＳＨＰ−２、アルファアクチニン、フィラミン、サイトヘシン（Ｃｙｔｏｈｅｓｉｎ）、β３−エンドネキシン（ｅｎｄｏｎｅｘｉｎ）、ＩＣＡＰ−１、ＲＡＣＫ−１、ＣＩＢ、アクチン、レセプターチロシンキナーゼ、ＩＲＳ−１、またはＩＲＳ−２の少なくとも１つを阻害する分子と接触させることを含む、および／またはインテグリンシグナル伝達経路の阻害が、癌細胞を、インテグリンの翻訳後修飾を阻害する薬剤と接触させることを含む、および／または翻訳後修飾がグリコシル化またはリン酸化である方法も開示される。
【０２３２】
インテグリンがＡ６インテグリンを含み、そして／またはインテグリンがＢ４インテグリンを含み、そして／またはラミニン５−インテグリン相互作用を減少させる工程をさらに含み、そして／またはラミニン５γ２インテグリン相互作用を減少させる工程さらに含み、そして／または癌細胞が正常ｐ５３を含み、そして／または癌細胞の増殖がＡＫＴ／ＰＫＢに依存せず、そして／または癌細胞増殖を減少させる工程が選択的であり、そして／または癌細胞がＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞でなく、そして／または癌細胞がＨＭＴ−３５２２細胞でなく、そして／または癌細胞がＲＫＯ結腸癌系統でなく、そして／または癌細胞が異種Ｂ４インテグリンを発現せず、そして／または癌細胞を小分子、ペプチド、ペプチド模倣物あるいはオリゴヌクレオチドまたはその合成アナログと接触させることをさらに含み、そして／または癌細胞をドミナントネガティブβ４インテグリンと接触させ、そして／または癌細胞をアンチセンス分子と接触させ、そして／またはアンチセンス分子を、細胞膜を横切る移動を可能にするリーダー配列に連結し、そして／またはそのリーダー配列がインターナリゼーションを促進する細胞表面タンパク質に結合され、そして／またはそのリーダー配列がＴＡＴまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）あるいはそれらのフラグメントであり、そして／またはそのアンチセンス分子がα６ＲＮＡアンチセンス分子であり、そして／または小分子、ペプチド、ペプチド模倣物あるいはオリゴヌクレオチドまたはその合成アナログをキャリアに連結し、そして／またはそのキャリアが脂質キャリア、荷電キャリア、レトロウイルスキャリア、ＴＡＴまたはそのフラグメント、アンテナペディアまたはそのフラグメント、あるいはポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つであり、そして／または癌細胞を、細胞シグナル伝達を調節する薬剤と接触させるか、化学療法薬剤と接触させるか、または放射線または血管新生インヒビターで処置することをさらに含み、そして／または癌細胞増殖を減少させる工程がインビトロであり、そして／または癌細胞増殖を減少させる工程がインビボであり、そして／または癌細胞が、黒色腫、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、形質細胞腫、肉腫、神経膠腫、甲状腺腫（ｔｈｙｏｍａ）、白血病、皮膚癌、網膜癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、肝臓癌、胃腸癌、ならびに頭部および頸部癌細胞からなる群から選択され、そして／または癌細胞が殺傷され、そして／または癌細胞が変異Ｒａｓを発現し、そして／または癌細胞が変異Ｒａｓおよび変異ｐ５３を発現し、そして／または癌細胞が変異Ｒａｓを発現し、そしてＡＫＴ／ＰＫＢタンパク質を活性化する、そして／または癌細胞が変異Ｒａｓ、変異ｐ５３を発現し、そしてＡＫＴ／ＰＫＢタンパク質を活性し、そして／または癌細胞が変異ＡＰＣを発現し、そして／または癌細胞が変異Ｒａｓおよび変異ＡＰＣを発現する、方法もまた開示される。
【０２３３】
癌細胞におけるインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害する組成物を患者に投与することを含む、患者において癌細胞の増殖を減少させる方法が開示され、ここでインテグリンレセプターはインテグリンを含む。
【０２３４】
インテグリン−インテグリン相互作用、インテグリンレセプタークラスター化相互作用、またはインテグリン−非インテグリンタンパク質相互作用を減少させる組成物を患者に投与することを含む、患者において癌細胞の増殖を減少させる方法も開示される。
【０２３５】
癌細胞によるインテグリンまたはラミニンの産生を減少させる組成物を患者に投与することを含む、患者において癌細胞の増殖を減少させる方法も開示される。
【０２３６】
インテグリンシグナル伝達経路を阻害する組成物を患者に投与することを含む、患者において癌細胞の増殖を減少させる方法がさらに開示される。
【０２３７】
癌細胞増殖の減少が選択的であり、そして／または投与が局所的または全身性であり、そして／または患者に細胞シグナル伝達を調節する薬剤をさらに投与するか、化学療法薬剤をさらに投与するか、または患者を放射線または血管新生インヒビターで処置し、そして／またはさらなる薬剤を連続的にまたは組み合せて投与し、そして／または局所投与が癌細胞に対する直接適用であり、そして／または癌細胞に対する直接適用を手術中に行い、そして／または癌細胞に対する直接適用を癌組織に対して局所的に行い、そして／または全身性投与が皮下、腹腔内、動脈内、静脈内、またはボーラス投与によるものであるか、またはカテーテルまたは同様の装置を介した適用によるものであり、そして／または全身性投与が長期放出処方物を含み、そして／または全身性投与が経口投与により、そして／またはその経口投与が丸剤、カプセル、錠剤、液体または懸濁液を投与することを含む、方法もまた開示される。
【０２３８】
癌細胞におけるインテグリンレセプターへのリガンド結合を阻害するタンパク質またはペプチドをコードする配列を含むベクターを患者に投与することを含む、患者において癌細胞の増殖を減少させる方法が開示され、ここでコード配列は、哺乳動物細胞で機能するプロモーターの制御下にある。
【０２３９】
インテグリンレセプターサブユニットが互いに相互作用することを阻害するか、インテグリンレセプターのクラスター化相互作用を阻害するか、またはインテグリンレセプターサブユニットが癌細胞上の他のタンパク質と相互作用することを阻害するタンパク質またはペプチドのコード配列を含むベクターを患者に投与することを含む、患者において癌細胞の増殖を減少させる方法も開示され、ここでコード配列は、哺乳動物細胞で機能するプロモーターの制御下にある。
【０２４０】
インテグリンレセプターサブユニットが互いに相互作用することを阻害するか、インテグリンレセプターのクラスター化相互作用を阻害するか、またはインテグリンレセプターサブユニットが癌細胞中の他のタンパク質と相互作用することを阻害するタンパク質またはペプチドのコード配列を含むベクターを患者に投与することを含む、患者において癌細胞の増殖を減少させる方法がさらに開示され、ここでコード配列は、哺乳動物細胞で機能するプロモーターの制御下にある。
【０２４１】
インテグリンサブユニットまたはラミニン産生を阻害するタンパク質またはペプチドのコード配列を含むベクターを患者に投与することを含む、患者において癌細胞の増殖を減少させる方法も開示され、ここでコード配列は、哺乳動物細胞で機能するプロモーターの制御下にある。
【０２４２】
細胞のインテグリンシグナル伝達経路を阻害するタンパク質またはペプチドのコード配列を含むベクターを患者に投与することを含む、患者において癌細胞の増殖を減少させる方法がさらに開示され、ここでコード配列は、哺乳動物細胞で機能するプロモーターの制御下にある。
【０２４３】
癌細胞増殖の減少が選択的であり、そして／またはベクターを癌細胞に直接投与し、そして／またはベクターを正常細胞に直接投与し、そして／またはベクターをウイルスベクターまたはリポソームにパッケージングし、そして／またはベクターがレトロウイルスベクターであり、そして／またはベクターを全身的に投与し、そして／または直接投与が局所適用によるものであり、そして／または直接投与が局所適用によるものであり、そして／または直接投与が手術中に行なわれ、そして／または直接投与が手術中に行なわれ、そして／または患者が哺乳動物、マウス、ウサギ、霊長類、チンパンジー、サル、ゴリラ、およびヒトなどの動物であり、そして／または癌細胞が黒色腫、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、形質細胞腫、肉腫、神経膠腫、甲状腺腫、白血病、皮膚癌、網膜癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、肝臓癌、胃腸癌、ならびに頭部および頸部癌細胞からなる群から選択され、そして／または患者に、細胞シグナル伝達を調節する別の薬剤、化学療法薬剤を投与するか、または血管新生インヒビターの少なくとも１つを投与するか、または患者を放射線で処置し、そして／または細胞シグナル伝達を調節する別の薬剤、化学療法薬剤、血管新生インヒビターまたは放射線での処置を連続的にまたは組み合せて投与する、方法もまた開示される。
【０２４４】
（ｃ）遺伝子改変および遺伝子破壊の方法）
開示された組成物および方法は、遺伝子の改変または破壊の事象を受け得る得る任意の動物における、標的化された遺伝子の破壊および改変に使用し得る。遺伝子改変および遺伝子破壊とは、哺乳動物の生殖細胞系を介してその改変を伝播させる様式での、哺乳動物のような動物における遺伝子または染色体ストレッチの選択的な除去または変化を含む、方法、技術および組成物をいう。一般的に、例えば、本明細書中で記載されたように、細胞中に含まれる特定の染色体の領域と相同的組換えをおこすように設計されたベクターで、細胞を形質転換する。相同的組換え事象は、周辺のＤＮＡと共に（例えば、インフレームで）導入された外来性ＤＮＡを有する染色体を産生し得る。この型のプロトコールは、点変異のような非常に特異的な変異を、その細胞に含まれるゲノムに導入することを可能にする。この型の相同的組換えを行なう方法が、本明細書中で開示される。
【０２４５】
哺乳動物細胞において相同的組換えを行なう１つの好ましい特徴は、望ましい組換え事象が低頻度で生じることに起因して、これらの細胞が培養され得ることである。
【０２４６】
一旦、細胞を本明細書中で記載した方法で産生すると、幹細胞技術またはクローニング技術のいずれかによって、この細胞から動物を産生し得る。例えば、核酸がトランスフェクトされた細胞が、その生物体の幹細胞である場合、この細胞を、トランスフェクションおよび培養後に、生殖系列細胞における遺伝子の改変または破壊を含む生物体を産生するために使用し得、それを、次いで、その全ての細胞に遺伝子の改変または破壊を有する別の動物を産生するために使用し得る。その全ての細胞に遺伝子の改変または破壊を含む動物を産生する他の方法において、クローニング技術を使用し得る。これらの技術は、一般的にトランスフェクトした細胞の核を取り出し、融合または置換のいずれかによって、トランスフェクトした核を卵母細胞と融合し、次いで、それを操作して動物を産生し得る。ＥＳ技術の代わりにクローニングを使用する手順の利点は、ＥＳ細胞以外の細胞をトランスフェクトし得ることである。例えば、培養が非常に容易である線維芽細胞を、トランスフェクトされそして遺伝子の改変または破壊の事象を有する細胞として使用し得、そして次いで、この細胞から誘導された細胞を、動物全体をクローニングするために使用し得る。望ましい分子、例えば、Ａ６またはインテグリンあるいはラミニン５のγ２鎖の発現を条件的に欠失させる、条件的ノックアウトも作製され得る。
【０２４７】
（ｄ）癌を診断する方法）
開示された情報および開示された分子を用いて癌を診断する方法が開示される。特に、リガンドおよび同族のインテグリンレセプターまたは同族のインテグリンの両方の組み合わせのアップレギュレーションに依存する診断方法が開示される。本明細書中で開示される診断方法の全ては、任意の開示された組成物とともに使用され得るが、それらはまた、組み合わせて使用され得ることが理解され、ここで、例えば、リガンドおよびインテグリンレセプターの両方がモニターされ、そして癌の発現と関連付けられる。
【０２４８】
被験体から得た標的細胞中に存在するＡ６の量を決定することを含む、被験体が癌を発現する危険性を評価する方法が開示され、ここで、Ａ６の増加したレベルの決定は、増加した癌の危険性と相関する。
【０２４９】
被験体から得た標的細胞中に存在するＢ４の量を決定することを含む、被験体癌を発生する危険性を評価する方法が開示され、ここで、Ｂ４の増加したレベルの決定が、増加した癌の危険性と相関する。
【０２５０】
被験体から得た標的細胞中に存在するラミニン５の量を決定することを含む、被験体が癌を発生する危険性を評価する方法が開示され、ここで、ラミニン５の増加したレベルの決定が、増加した癌の危険性と相関する。
【０２５１】
被験体から得た標的細胞中に存在するγ２サブユニットの量を決定することを含む、被験体が癌を発生する危険性を評価する方法が開示され、ここで、γ２サブユニットの増加したレベルの決定が、増加した癌の危険性と相関する。
【０２５２】
存在するＡ６の量をコントロール細胞における量と比較することをさらに含む方法もまた開示され、ここで、標的細胞に存在するＡ６の量の決定が、細胞におけるＡ６  ｍＲＮＡの量をアッセイすることを含み、そして／または細胞におけるｍＲＮＡの量をアッセイすることが、Ａ６プローブを被験体のｍＲＮＡサンプルにハイブリダイズさせることを含み、そして／または細胞におけるｍＲＮＡの量をアッセイすることが、Ａ６プライマーを被験体のｍＲＮＡサンプルにハイブリダイズさせることを含み、そして／またはｍＲＮＡの量をアッセイすることが、プライマーを含む核酸増幅反応を行なうことをさらに含み、そして／またはその核酸増幅反応が、逆転写して、ｃＤＮＡを産生することを含み、そして／または核酸増幅反応が、ｃＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、そして／または標的細胞に存在するＡ６の量の決定が、細胞におけるＡ６タンパク質の量をアッセイすることを含み、そして／または存在するＢ４の量をコントロール細胞における量と比較することをさらに含み、そして／または存在するラミニン５の量をコントロール細胞における量と比較することをさらに含み、そして／または存在するγ２サブユニットの量をコントロール細胞における量と比較することをさらに含む。
【実施例】
【０２５３】
（Ｃ．実施例）
本出願を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の全体としての開示が、本発明が属する技術状態をより完全に記載するために、本出願に参考として援用される。開示された参考文献はまた、その参考文献に依存する文章中で議論されるそれらの参考文献中に含まれる内容について、本明細書中で参考として個々におよび明確に援用される。
【０２５４】
本発明の範囲からも精神からも逸脱することなく、本発明において様々な改変および変化がなされ得ることが、当業者に明らかである。本発明の他の実施態様が、明細書および本明細書中で開示された本発明の実施を考慮して、当業者に明らかである。本明細書および実施例は、単に例示とみなされ、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【０２５５】
以下の実施例は、本願において特許請求される化合物、組成物、物品、装置および／または方法がどのように作製および評価されるかの完全な開示および説明を提供するために示され、そして本発明の単なる例示として意図され、そして本発明者らが本発明とみなす範囲を制限することを意図しない。数（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するために努力がなされたが、いくらかの誤差および変位が考慮される。他に示されなければ、部分は、重量による部分であり、温度は、℃で示されるか、または周囲温度であり、そして圧力は、大気圧または大気圧付近である。
【０２５６】
（１．実施例１  ＥＣＭ非存在下で増殖のためにα６β４レセプターシグナル伝達に依存する結腸上皮細胞）
インテグリンα６およびインテグリンβ４およびラミニンγ２鎖は、インビボで腫瘍細胞が生存するために不可欠である。本明細書中で開示されるデータは、インテグリンα６媒介シグナル伝達、インテグリンβ４シグナル伝達、およびラミニンγ２シグナル伝達の阻害が、正常細胞を傷つけることなく、癌細胞においてプログラム細胞死を誘発するための有効なアプローチを構成し得ることを示す。ヒト癌細胞系統におけるインテグリンα６依存性シグナル伝達、インテグリンβ４依存性シグナル伝達、およびラミニンγ２依存性シグナル伝達の除去が、これを支持する。
【０２５７】
Ｄ’Ａｂａｃｏら（１９９６）によって導入されたマウス結腸上皮形質転換系を使用した。この系において、コントロール細胞（コントロール）、活性化ｒａｓ癌遺伝子を含む細胞（Ｒａｓ）、ＡＰＣ遺伝子における欠失を含む細胞（ＡＰＣｍｉｎ）、または両方の変化をともに含む細胞（Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ）を、組織培養物におけるその増殖特徴に関して比較し得る。細胞を、条件的不死化を可能にするγインターフェロン誘導性プロモーターの制御下にあるＳＶ４０ラージＴの温度感受性対立遺伝子を含むトランスジェニックマウスから誘導した（Ｊａｔら、１９９１）。全ての実験を、γインターフェロンの非存在下で非許容性の温度に細胞を維持して行った。以前に示したように（Ｄ’Ａｂａｃｏら、１９９６）、活性化ＲａｓおよびＡＰＣｍｉｎ変異を有する細胞のみが、基層への固定無しで、軟寒天中でコロニーを形成し得た。他の細胞集団は全て、これらの条件下でコロニーを形成しなかった。
【０２５８】
懸濁液において、コントロール、Ｒａｓ、ＡＰＣｍｉｎ、およびＲａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ結腸上皮細胞（Ｄ’Ａｂａｃｏら、１９９６）におけるｔｕｎｅｌ染色細胞の頻度（図２Ａ）およびカスパーゼ３活性（図２Ｂ）を測定した。両方のアッセイは、Ｒａｓ−ＡＰＣｍｉｎ細胞におけるアポトーシスの強力な抑制を示し、これは、ＲａｓおよびＡＰＣｍｉｎが、明らかなＥＣＭ接触の非存在下において、細胞死の妨害に協同作用することを示す。活性化Ｒａｓは、セリン−スレオニンキナーゼＡＫＴの活性化によって、細胞をアポトーシスから保護し得る（Ｋａｕｆｆｍａｎｎ−Ｚｅｈら、１９９７；Ｋｈｗａｊａら、１９９７）。しかし、Ｒａｓ細胞およびＲａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞は両方とも、同等レベルのＡＫＴリン酸化を示し（示さず）、Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ協同作用の関連標的としてのＡＫＴを排除する。
【０２５９】
癌細胞はインテグリンシグナル伝達と非依存的に生存すると考えられてきたが、それらは、頻繁に、高レベルのα３またはα６インテグリンレセプターおよび／またはそのリガンドを発現する（Ｄｅｄｈａｒら、１９９３；Ｋｅｎｎｅｌら、１９８９；Ｋｏｓｈｉｋａｗａら、１９９９；Ｌｏｈｉら、２０００；Ｎｅｊｊａｒｉら、１９９９；Ｖａｎ  ＷａｅｓおよびＣａｒｅｙ、１９９２）。これらのインテグリンは、浸潤および転移に役割を果たしていると推測される（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、１９９９；Ｓｈａｗら、１９９７）。ＲａｓおよびＡＰＣｍｉｎ変異は、インテグリンおよびＥＣＭ成分のｍＲＮＡ発現パターンにおける変化を誘導する。α６インテグリン単独の誘導は、Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞に特異的であった（図３Ａ）。それに加えて、本発明者らは、ＲａｓおよびＲａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞において誘導されたラミニンα５、γ２およびβ２鎖の上昇された発現を見出した（図３Ｂ）。これらの鎖は、ラミニン５、１０および１１の成分であり（ＭａｌｉｎｄａおよびＫｌｅｉｎｍａｎ、１９９６）、これら、インテグリンレセプターα６／β４およびα３／β１のリガンドである（Ｋｉｋｋａｗａら、２０００；Ｎｉｅｓｓｅｎら、１９９４）。これらの結果は、ＲａｓおよびＡＰＣｍｉｎ変異が、協同してインテグリンレセプターのオートクライン活性化を誘導し得ることを示す。
【０２６０】
α６インテグリンは、β１またはβ４インテグリンのいずれかとともに機能的なレセプターを形成し得（ＣｌａｒｋおよびＢｒｕｇｇｅ、１９９５）、病巣接着（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）キナーゼ（ＦＡＫ）またはＳＨ２ドメインアダプターＳｈｃのような下流のエフェクターにシグナル伝達を導く（ＧｉａｎｃｏｔｔｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）。逆に、β４インテグリンはα６インテグリンにのみ結合する（ＣｌａｒｋおよびＢｒｕｇｇｅ、１９９５）。形質転換された結腸上皮細胞において、α６インテグリンはインテグリンβ４と共に機能し、ラミニンγ２鎖に結合してＳｈｃを活性化する（図４を参照のこと）。α６インテグリンの誘導と一致して、Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞のみが、α６およびβ４インテグリン特異的方式でラミニンγ２特異的ペプチドに結合し得る。対照的に、ラミニンγ１鎖から誘導されたα３／β１およびα６／β１特異的ペプチドは、コントロール細胞にのみ結合する（図４Ａ）。それに加えて、Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞においてのみ、β４特異的抗体（Ｍａｉｎｉｅｒｏら、１９９５）およびラミニンγ２特異的ペプチドによるインテグリンα６／β４レセプターのクラスターに応答して、Ｓｈｃがリン酸化される（図４Ｂ）。いずれの場合においても、ｐ５２Ｓｈｃが主要なリン酸化形態である。さらに、Ｓｈｃのリン酸化はドミナントネガティブβ４インテグリン変異体の発現に応答して阻害されるので、α６インテグリンがＳｈｃの活性化に必要である。この変異体は、細胞質性シグナル伝達ドメインを欠くが、α６インテグリンに選択的に結合して、リガンドに結合し、シグナル伝達欠損α６／β４インテグリンをなお形成する（Ｓｐｉｎａｒｄｉら、１９９３）（図４Ｂ）。
【０２６１】
α６インテグリンおよびγ２ラミニンに特異的なアンチセンスＲＮＡ、ならびにドミナントネガティブβ４インテグリンを発現させ、そして結果は、インテグリンα６、インテグリンβ４、およびラミニンγ２の発現が、Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ、Ｒａｓ、ＡＰＣおよびコントロール細胞におけるＲａｓ＋ＡＰＣｍｉｎの生存に関連することを示した。３つの構築物は全て、軟寒天において（示さず）、およびプラスチックに接着した場合（図５Ａ１）に、Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞の増殖を効果的に阻害する。対照的に、ｗｔ、ＲａｓおよびＡＰＣｍｉｎ細胞の増殖は、この処理によって影響を受けない（図５Ａ１）。重要なことに、３つの阻害構築物のいずれかに曝露されたＲａｓ＋ＡＰＣ細胞のコロニー形成は、カスパーゼ活性およびアポトーシスの強力なインヒビターである、バキュロウイルスｐ３５の同時発現によってレスキューされ得る（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆら、１９９８）（図５Ａ１）。同様に、外来性インテグリンα６  ｍＲＮＡの同時発現は、α６アンチセンスＲＮＡによって阻害されたＲａｓ−ＡＰＣｍｉｎ細胞の増殖を効果的にレスキューする（図５Ａ１）。これは、α６アンチセンスＲＮＡ発現細胞の細胞表面におけるα６インテグリン発現のレスキューによって反映される（図５Ｂ）。さらに、異所性のα６インテグリン発現も、ドミナントネガティブβ４インテグリンによって誘導されるアポトーシスをレスキューする（図５Ａ１）。後者は、一定レベルで発現される（図５Ｂ）。予測されるように、ラミニンγ２アンチセンスＲＮＡを発現する細胞は、インテグリンα６の過剰発現によってレスキューされ得なかったが、ラミニンγ２ペプチドでコートした皿にプレートした場合には有意なレスキューを示した（図５Ａ１）。同様に、このペプチドは、より低いカスパーゼ３活性によって示されるように、懸濁液中でのＲａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞の生存を増加させる（図２Ｃ）。まとめると、Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞の生存は、α６／β４インテグリンおよびラミニンγ２鎖の発現に依存する。逆に、これら遺伝子活性の阻害は、形質転換された細胞の選択的な殺傷を引き起こす。
【０２６２】
データはまた、Ｒａｓ−ＡＰＣｍｉｎ細胞におけるα６β４インテグリンレセプターシグナル伝達の欠如による細胞死が、ミトコンドリアの損傷およびカスパーゼ９活性の誘導を含む細胞死シグナル伝達経路に非依存的であることを示す。代わりに、このデータは、α６インテグリン含有インテグリンレセプターによる腫瘍細胞生存の制御下での、Ｆａｓ／ＴＮＦレセプター／デスドメインタンパク質／カスパーゼ８経路（ＫｒｕｉｄｅｒｉｎｇおよびＥｖａｎ、２０００）の関与を示す。
【０２６３】
α６／β４インテグリンレセプターシグナル伝達活性を欠く、コントロール、ＡＰＣｍｉｎおよびＲａｓ細胞は、懸濁液に維持した場合、高レベルのカスパーゼ８活性を示し、一方同時に、カスパーゼ９活性は、検出され得ない（図２Ｄ）。
【０２６４】
Ｒａｓ−ＡＰＣｍｉｎ細胞は、カスパーゼインヒビターバキュロウイルスｐ３５によってアポトーシスからレスキューされ得るが（図５Ａ１、Ａ２、および上記）、ドミナントネガティブβ４インテグリンの発現によって誘導された細胞死は、生存因子Ｂｃｌ２の発現によって妨げられ得ない（図５Ａ２を参照のこと）。Ｂｃｌ２は、ミトコンドリアの損傷、シトクロムＣの放出およびカスパーゼ９の活性化を引き起こすＢＨ３−ドメインキラータンパク質に結合し、そして中和する（Ｌｕｏら、１９９８）。
【０２６５】
α６／β４インテグリンレセプターシグナル伝達活性を欠き、そしてＥＣＭ接触の存在下で生存し得ないＲａｓ細胞、および生存のためにα６β４インテグリンレセプターシグナル伝達に依存するＲａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞は、同等レベルのＡＫＴリン酸化を示す（データは示さず）。これは、ＡＫＴが、α６／β４インテグリンレセプターシグナル伝達の重要な標的として作用しないを示す。ＡＫＴは、Ｂａｄ、ＢＨ３−ドメインキラータンパク質のリン酸化および不活性化によって細胞の生存を促進することが記載されている（Ｄａｔｔａら、１９９９）。
【０２６６】
（２．実施例２  ＥＣＭ非存在下での増殖のためにα６β４レセプターシグナル伝達に依存する他の癌細胞）
ホモ接合性ＡＲＦヌル変異と共にＲａｓおよびＭｙｃ癌タンパク質を発現する、高度に形質転換された初代マウス胚線維芽細胞の生存（Ｋａｍｉｊｏら、１９９７）は、α６インテグリンの発現および機能に依存し（図５Ｃ）、従って、このれは、この原理が、形質転換された間葉細胞にも適用し得ることを示す。さらに、活性化Ｒａｓ（Ｆｕｊｉｔａら、１９８８）、増幅されたｃ−Ｍｙｃ（Ｃｈｅｒｉｆら、１９８８）、変異ＡＰＣ対立遺伝子（Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕら、１９９５）およびｐ５３変異（Ａｂａｒｚｕａら、１９９５）のような複数の癌遺伝子変異を有するヒト結腸癌細胞系統ＳＷ４８０は、アンチセンスのインテグリンα６ＲＮＡおよびラミニンγ２ＲＮＡ、およびドミナントネガティブβ４インテグリンによって効果的に殺傷される（図４Ｄ）。同様に、インテグリンα６の除去でさえ、活性ＳＶ４０ラージＴの存在下でＲａｓ／ＡＰＣｍｉｎ細胞のアポトーシスを導く（示さず）。従って、異なる型の高度に形質転換された細胞の生存は、ａｒｆ、ｐ５３またはｒｂのような主要な腫瘍サプレッサー遺伝子の状態と無関係に、α６インテグリンの発現、β４インテグリンの発現およびラミニン５の発現に依存し、そして少なくともｓｗ４８０細胞、マウス結腸上皮細胞、およびｒａｓ／ＡＰＣｍｉｎ細胞に関しては、α６、β４およびラミニン５／γ２が必要である。インテグリンシグナル伝達、例えば、Ａ６Ｂ４インテグリンレセプターシグナル伝達の除去に対する形質転換された細胞の感受性は、その明らかな普遍性において極めて注目すべきである。
【０２６７】
癌遺伝子変異は、協同してオートクラインインテグリンシグナル伝達に関与する。重要なことに、α６インテグリン、β４インテグリンおよびラミニンγ２鎖を含む、このシグナル伝達機構は、形質転換された結腸上皮細胞において生存機構の不可欠な要素となる。それに加えて、線維芽細胞およびヒト結腸癌細胞もまた、生存のためにインテグリンα６に依存する。対照的に、低レベルでα６インテグリンを発現する、正常細胞および部分的に形質転換した細胞は、生存のためにこのポリペプチドを必要としない。従って、インテグリンシグナル伝達阻害は、癌細胞の選択的な殺傷を引き起こし得る。
【０２６８】
ラミニン−インテグリンレセプターシグナル伝達ループもまた、癌遺伝子破壊の他の組み合わせによって形質転換された細胞の生存に関与する。レトロウイルス感染を介して、マウス結腸上皮細胞（Ｄ’Ａｂａｃｏら、１９９６；上記も参照のこと）へ、ドミナントネガティブｐ５３（Ｌｌｏｙｄら、１９９７）と共に活性化Ｒａｓを導入することが、これを支持する。以下の感染細胞の４つの異なるポリクローナルプールを、薬物選択によって誘導した：１）ネオマイシン（ｎｅｏ）またはブレオマイシン（ｂｌｅｏ）薬物耐性マーカーをそれぞれ有する２つのレトロウイルスで感染させた、コントロール（ｂｌｅｏ／ｎｅｏ）細胞；２）Ｒａｓ／ｎｅｏウイルスおよびｂｌｅｏマーカーを有するウイルスで感染させた、Ｒａｓ細胞；３）ＤＮｐ５３／ｂｌｅｏウイルスおよびｎｅｏマーカーを有するウイルスで感染させた、ＤＮｐ５３細胞；４）Ｒａｓ／ｎｅｏウイルスおおびＤＮｐ５３／ｂｌｅｏウイルスで感染させた、Ｒａｓ／ＤＮｐ５３細胞。
【０２６９】
結腸上皮細胞は、γインターフェロンプロモーター制御下で温度感受性ＳＶ４０ラージＴを含むので、全ての細胞集団を、γインターフェロン存在下、許容温度（３３℃）にて薬物選択した。さらなる実験を全て、Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞に関して上記で記載したように、γインターフェロン非存在下で、ＳＶ４０ラージＴの非許容温度で行った。
【０２７０】
Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ細胞と同様に、Ｒａｓ／ＤＮｐ５３細胞のみが、軟寒天中でＥＣＭ接触の非存在下で増殖し得たが、ｂｌｅｏ／ｎｅｏ細胞、Ｒａｓ／ｂｌｅｏ細胞およびＤＮｐ５３／ｎｅｏ細胞のいずれの細胞も増殖し得なかった（示さず）。さらに、ＲａｓおよびＤＮｐ５３は、懸濁液中のカスパーゼ３活性の抑制において（図２Ｂ）、およびα６インテグリン発現の誘導において（図４Ａ）、協同作用する。１回の軟寒天増殖で継代させたＲａｓ／ＤＮｐ５３細胞において、α６インテグリンはさらに高いレベルで発現され、ＥＣＭ接触非存在下で生存する細胞の能力とα６インテグリン発現との間の関連性を示す。Ｒａｓ／ＤＮｐ５３細胞において、コントロールと比較した場合、β４インテグリンの発現レベルも増加する（図４Ａ）。予測されたように、ラミニンγ２鎖の発現が、Ｒａｓ／ｂｌｅｏ細胞およびＲａｓ／ＤＮｐ５３細胞において誘導される（図４Ｂ）。
【０２７１】
α６インテグリンおよびγ２ラミニンに特異的なアンチセンスＲＮＡ、ならびにドミナントネガティブβ４インテグリンを、Ｒａｓ／ＤＮｐ５３細胞、Ｒａｓ／ｂｌｅｏ細胞、ＤＮｐ５３／ｎｅｏ細胞よびｎｅｏ／ｂｌｅｏ細胞で発現させた。３つの構築物は全て、プラスチックに接着させた場合、Ｒａｓ／ＤＮｐ５３細胞の増殖を効果的に阻害する。対照的に、ｎｅｏ／ｂｌｅｏ細胞、Ｒａｓ／ｂｌｅｏ細胞およびＤＮｐ５３／ｎｅｏ細胞の増殖は、この処理によって影響を受けない（図５Ａ３）。アンチセンスα６インテグリンまたはドミナントネガティブβ４インテグリンもまた、軟寒天中でＲａｓ／ＤＮｐ５３細胞の増殖を阻害する（図５Ａ４）。
【０２７２】
インテグリンα６の発現もまた、初代マウス結腸陰窩上皮細胞において、活性化ＲａｓおよびＤＮｐ５３によって誘導され得る（示さず）。さらに、本発明者らのコントロール結腸上皮細胞へのＲａｓおよびＭｙｃ癌タンパク質の導入もまた、α６発現の誘導を導き（示さず）、これは、α６インテグリン発現の誘導が、別個の癌遺伝子協同パラダイムの不可欠な要素であり得ることを示唆する。
【０２７３】
（ａ）試験する細胞型）
本明細書中で記載されるように、α６インテグリンおよびラミニンを高レベルで発現する、様々な癌および形質転換細胞型が存在する（Ｄｅｄｈａｒら、１９９３；Ｋｏｓｈｉｋａｗａら、１９９９；Ｌｏｈｉら、２０００；Ｖａｎ  ＷａｅｓおよびＣａｒｅｙ、１９９２）。本明細書中で開示されるように、線維芽細胞以外に以下の細胞系統が、α６およびβ４インテグリンの発現、およびラミニンγ２鎖の発現を必要とする：（１）ヒト結腸癌細胞系統ＳＷ４８０（データは示さず）、（２）Ｒａｓ＋ＡＰＣｍｉｎ形質転換マウス結腸上皮細胞（図３Ａを参照のこと）。ホモ接合型Ａｒｆヌル変異と組み合せて活性化ＲａｓおよびＭｙｃによって形質転換されたたマウス線維芽細胞は、その生存のためにα６発現を必要とする。これらの細胞は、インテグリンβ４を発現しないが、β１インテグリンを発現し、これは、形質転換された線維芽細胞におけるα６／β１レセプターの重要性を示す。
【０２７４】
（ｂ）阻害剤のｘｘｘ誘導性発現）
腫瘍におけるα６インテグリンおよびラミニンγ２鎖依存性シグナル伝達を阻害するために、セクションＣで記載した、調節可能なα６インテグリンおよびラミニンγ２アンチセンスｍＲＮＡの発現、ならびに調節可能なβ４インテグリンドミナントネガティブポリペプチドの発現を使用した。これらインヒビターの構成的な発現は、組織培養中で迅速な細胞死を引き起こす。対照的に、アンチセンスｍＲＮＡまたはドミナントネガティブβ４インテグリンの誘導性発現を有するクローン細胞系統の樹立は、そのような制限を最小限にする。
【０２７５】
ドキシサイクリン（ｄｏｘ）誘導性逆方向テトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）が、インビトロおよびインビボで、一時的に調節される様式で、導入遺伝子を過剰発現するためにしばしば使用される（Ｅｆｒａｔら、１９９５；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５；Ｒａｙら、１９９７）。しかし、これらの系は、しばしば、ｄｏｘ投与非存在下での遺伝子発現レベルによって損なわれる。テトラサイクリン制御転写サイレンサー（ｔＴＳ）、ｔｅｔリプレッサーおよびｋｉｄ−１転写リプレッサーのＫＲＡＢ−ＡＢドメインを含む融合タンパク質は、ドキシサイクリンによって阻害される。組織培養物において（Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂら、１９９９）およびトランスジェニックマウスにおいて（Ｚｈｕら、２００１）示されるように、ｔＴＳは、ｒｔＴＡに基づく系において導入遺伝子の発現の制御を強化し、すなわち、ｔＴＳは、ｒｔＴＡ調節遺伝子の誘導性を変化させることなく、漏出性の基礎発現を効果的に排除する。従って、遺伝子発現の最適な「オフ／オン」制御は、ｔＴＳおよびｒｔＴＡとの組み合せの使用によって達成され得る。完全な発現系は、ＣＬＯＮＴＥＣＨから商業的に入手可能である。この系を、全ての誘導性細胞系統の調製に使用し得る。
【０２７６】
エストロゲン依存性トランス活性化因子ＧａｌＥＲ−ＶＰ１６およびＧａｌ４
ＤＮＡ結合部位（Ｂｒａｓｅｌｍａｎｎら、１９９３）の制御下にあるプロモーターを含む、別の調節可能な系が、使用され得る（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｏｇｅｒら、１９９７）。この特定の実験設定を本明細書中で使用して、ＳＷ４８０結腸癌細胞におけるβ４インテグリンドミナントネガティブ変異体の誘導が、カスパーゼ３の活性によって測定されるように、インビトロでアポトーシスを誘導することを示した（図２Ｂ）。しかし、インビボでの使用のために、抗エストロゲン４ＯＨ−タモキシフェンに対する応答を保持しながらエストロゲンに対する感受性を排除する点突然変異を、ＧａｌＥＲ−ＶＰ１６トランス活性化因子に導入しなければならない（Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄら、１９９５）。４ＯＨ−タモキシフェンは、別の調節可能なトランス活性化因子ＭｙｃＥＲキメラの活性を、インビボで可逆的に調節することが示されている（Ｐｅｌｅｎｇａｒｉｓら、１９９９）。
【０２７７】
代表的には、誘導性の細胞系統をまず、調節可能なプロモーターに連結させたアンチセンスまたはドミナントネガティブ構築物で、４つの試験細胞系統を安定にトランスフェクトする。続いて、この活性化因子を導入し、そしてサプレッサー（例えば、ｒｔＴＡおよびｔＴＳ（上記を参照のこと））を、異なる選択マーカーを有する組換えレトロウイルスを用いた感染によって導入する。
【０２７８】
【表３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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