(57)【要約】【課題】免疫バランスの正常化のために、ＩＬ‐１７の分泌を抑制する方向で作用するとともに予期しない副次作用を惹起することなくアレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防又は改善効果を有する乳酸菌及びこれを用いた発酵乳製品、医薬又は飲食品を提供する。【解決手段】  マウス脾臓細胞のＴＧＦ−β＋ＩＬ−６刺激による試験と評価方法に従って試験を繰り返してＩＬ−１７の蛍光強度値が極めて低く、IFN−γ／ＩＬ−４が大きな乳酸菌Streptococcus thermophilusを見出した。アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の治療及び改善を期待する上で、Ｔｈ１７を誘導することなく免疫バランスを適正の状態に改善することが期待される。乳酸菌として発酵乳製品に使用できるとともに該乳酸菌を含有することによって医薬品や飲食品に使用することができる。【選択図】図１
2010115126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス脾臓細胞を、１×１０７個/mLで１×１０７ＣＦＵ/mLの濃度の乳酸菌を熱殺菌した乳酸菌試料と１mLの培地中で７２時間共培養し、上清中のインターロイキン１７（ＩＬ‐１７）、インターフェロンγ（ＩＦＮ‐γ）及びインターロイキン４（ＩＬ‐４）の産生量を測定した場合、ＩＬ‐１７の産生量が少ない乳酸菌Streptococcus thermophilus。
【請求項２】
上記Streptococcus thermophilusがStreptococcus thermophilus Ｎｏ．２８（出願人命名）であることを特徴とする請求項１に記載の乳酸菌Streptococcus thermophilus。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の乳酸菌Streptococcus thermophilusによって発酵した発酵乳製品。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の乳酸菌Streptococcus thermophilusを、ＩＬ−１７産生抑制の有効成分として含有する医薬又は飲食品。
【請求項５】
請求項３に記載の発酵乳製品を、ＩＬ−１７産生抑制の有効成分として含有する医薬又は飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫バランスを正常化する機能を有することによって、アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防又は改善効果を有する乳酸菌及びこれを用いた発酵乳製品、医薬又は飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
この種の乳酸菌Streptococcus thermophilusは、例えば発酵乳製造に際してそのスターターとして使用することが一般に知られているが、下記特許文献１によれば、Streptococcus thermophilus OH1(AHU1838)と命名された乳酸菌が、免疫バランスを正常化する機能を有して、アレルギー患者のＴｈ２側に偏向した免疫バランスを適正状態に改善することによって、アレルギー疾患の治療及び改善効果が期待されるとする。
【０００３】
即ち特許文献１は、多数の文献を引用し、ヘルパーＴ細胞はタイプ１ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）及びタイプ２ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の２つのサブタイプに分かれていること、これらが種々の免疫反応に関わる疾病をコントロールしていると考えられてきたこと、Ｔｈ１とＴｈ２は、相互機能的にバランスをとっており、このバランスが保たれていれば健康な状態にあるが、バランスが崩れると種々の疾患の発症及び進展につながると推測されていること、即ち、適正な状態のＴｈ１／Ｔｈ２バランスよりもＴｈ１側に偏向すると、糖尿病、肝障害、気道炎症、宿主対移植片反応、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、動脈硬化、乾癬、腎炎等が発症し、Ｔｈ２側に偏向すると、がん、免疫不全、喘息、皮膚炎、アレルギー疾患、腎炎、感染症等が発症するものと考えられてきたことを示して、アレルギー患者のＴｈ２側に偏向した免疫バランスを適正の状態に改善してくれることが示唆され、これらアレルギー疾患の治療及び改善について効果が期待される乳酸菌として、上記命名のものが有用であるとし、該乳酸菌乃至これを有効成分として用いた飲食物を提案している。
【０００４】
一方、本発明者らは、非特許文献１において、ビフィズス菌Bifidobacterium infantis JCM 1222Ｔが、Tｈ−１７抑制効果を呈することを報告している。これによれば、乳酸菌Lactobacillusについて２菌種及び上記ビフィズス菌３菌種のテスト結果では、２菌種の乳酸菌にはＴｈ−１７抑制効果が認められなかったが、上記ビフィズス菌に特にその抑制効果が認められたとする。
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−６１５１２号公報
【非特許文献１】日本農芸化学会２００８年度大会講演要旨集  絹田ゆき他「乳酸菌によるIL−１７産生抑制」（平成２０年３月５日発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１の上記Streptococcus thermophilus OH1(AHU1838)と命名された乳酸菌は、一応、免疫バランスを正常化し、Ｔｈ２側に偏向した免疫バランスを適正状態に改善することによって、上記アレルギー疾患の治療及び改善効果を呈する可能性が認められるが、しかし近年、Ｔｈ１に分類されてきた細胞に働きの違う細胞が含まれていることが明らかとなり、タイプ１７ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７）と命名されるに至っており、このＴｈ１７が分泌するインターロイキン１７、即ちＩＬ‐１７は、激しい炎症を引きおこすサイトカインであり、炎症性腸疾患患者の腸組織や血清中で濃度が高まっていることが報告されており、従って、アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の治療及び改善を期待する上で、Ｔｈ１７を誘導することなく免疫バランスを適正の状態に改善する必要があるところ、上記乳酸菌にこのＩＬ−１７の産生抑制効果があるか否かが明らかではない。
【０００７】
また非特許文献１の上記Bifidobacterium infantis JCM 1222Ｔは、ビフィズス菌であるところ、ビフィズス菌は、一般に酵母エキスなどの栄養素を添加しないと乳を発酵することができず、また酸素がある条件下では死滅していくため発酵乳や発酵乳を含有する飲食品等の製品製造に用いるには障害が多いという問題点が残されている。
【０００８】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、その解決課題とするところは、Ｔｈ１７が分泌するＩＬ−１７の産生抑制効果を有することにより、予期しない副次作用を惹起することなく、アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防又は改善効果を与えることのできる乳酸菌を提供するにあり、また該乳酸菌を用いた発酵乳及びこれを用いた発酵乳製品、医薬又は飲食品を提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者らは、上記課題に沿って鋭意研究したところ、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Streptococcus  thermophilus）種の各種菌株を、身体全体の免疫バランスを正常化する作用について詳細に検討し、免疫バランスの改善に関してより効果の高い乳酸菌を選択することによって、ある種の乳酸菌Streptococcus thermophilusが、マウス脾臓細胞を、１×１０７個/mLで１×１０７ＣＦＵ/mLの濃度の乳酸菌を熱殺菌した乳酸菌試料と１mLの培地中で７２時間共培養し、上清中のＩＬ‐１７、インターフェロンγ（ＩＦＮ‐γ）及びインターロイキン４（ＩＬ‐４）の産生量について、ＩＬ−１７の産生抑制効果を呈するとともにＩＬ−４に対して大きなＩＦＮ−γの産生促進効果を呈することから、該乳酸菌Streptococcus thermophilusが、ＩＦＮ−γ増強による抗アレルギー作用を発揮し得るとともにＩＬ−１７を抑制することで副次作用を惹起する可能性が極めて少なく、アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防乃至改善効果を期待し得る事実を見出して本発明をするに至ったものであって、即ち請求項１に記載の発明を、マウス脾臓細胞を、１×１０７個/mLで１×１０７ＣＦＵ/mLの濃度の乳酸菌を熱殺菌した乳酸菌試料と１mLの培地中で７２時間共培養し、上清中のインターロイキン１７（ＩＬ‐１７）、インターフェロンγ（ＩＦＮ‐γ）及びインターロイキン４（ＩＬ‐４）の産生量を測定した場合、ＩＬ‐１７の産生量が少ない乳酸菌Streptococcus thermophilusとしたものである。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、出願人は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託予定の、出願人においてStreptococcus thermophilus NO.28と命名した乳酸菌が、特に上記ＩＬ‐１７、ＩＬ−４の産生抑制効果を顕著に呈するとともにＩＦＮ−γの産生促進効果を顕著に呈することから、これを、上記Streptococcus thermophilusがStreptococcus thermophilus  NO.28（出願人命名）であることを特徴とする請求項１に記載の乳酸菌Streptococcus thermophilusとしたものである。
【００１１】
請求項３に記載の発明は、該乳酸菌を、常法に従って発酵乳製品のスターターとして使用することによって、上記アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防乃至改善効果を期待し得るヨーグルト等の発酵乳製品とすることが可能となるから、該乳酸菌を用いた発酵乳製品を提供するように、これを、請求項１又は２に記載の乳酸菌Streptococcus thermophilusによって発酵した発酵乳製品としたものである。
【００１２】
請求項４に記載の発明は、該乳酸菌を含有することによって、同じく上記アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防乃至改善効果を期待し得る医薬又は飲食品とすることが可能となるから、該乳酸菌を用いた医薬又は飲食品を提供するように、これを、請求項１又は２に記載の乳酸菌Streptococcus thermophilusを、ＩＬ−１７産生抑制の有効成分として含有する医薬又は飲食品としたものである。
【００１３】
請求項５に記載の発明は、上記発酵乳製品を含有することによって、同じく上記アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防乃至改善効果を期待し得る医薬又は飲食品とすることが可能となるから、該発酵乳を用いた医薬又は飲食品を提供するように、これを、請求項３に記載の発酵乳製品を、ＩＬ−１７産生抑制の有効成分として含有する医薬又は飲食品としたものである。
【００１４】
本発明はこれらをそれぞれ発明の要旨として上記課題解決の手段としたものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は以上のとおりに構成したから、請求項１に記載の発明は、ＩＬ−１７の産生抑制効果を呈するとともにＩＬ−４に対して大きなＩＦＮ−γの産生促進効果を呈することから、ＩＦＮ−γ増強による抗アレルギー作用を発揮し得るとともにＩＬ−１７を抑制することで副次作用を惹起する可能性が極めて少なく、アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防乃至改善効果を期待し得る乳酸菌Streptococcus thermophilusを提供できる。
【００１６】
請求項２に記載の発明は、特にＩＬ‐１７の産生抑制効果を顕著に呈するとともにＩＦＮ−γの産生促進効果を顕著に呈する乳酸菌として、出願人命名にして寄託予定の乳酸菌Streptococcus thermophilus NO.28を提供することができる。
【００１７】
請求項３に記載の発明は、該乳酸菌を、常法に従って発酵乳製品のスターターとして用いて、上記アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防乃至改善効果を期待し得るヨーグルト等の発酵乳製品を提供することができる。
【００１８】
請求項４に記載の発明は、該乳酸菌を用いて、これを含有することによって、同じくアレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防乃至改善効果を期待し得る医薬又は飲食品を提供することができる。
【００１９】
請求項５に記載の発明は、上記発酵乳製品を用いて、これを含有することによって、同じくアレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防乃至改善効果を期待し得る医薬又は飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下本発明を更に具体的に説明すれば、本発明の乳酸菌は、Streptococcus thermophilusであり、該乳酸菌Streptococcus thermophilusは、マウス脾臓細胞を、１×１０７個/mLで１×１０７ＣＦＵ/mLの濃度の乳酸菌を熱殺菌した乳酸菌試料と１mLの培地中で７２時間共培養し、上清中のインターロイキン１７（ＩＬ‐１７）、インターフェロンγ（ＩＦＮ‐γ）及びインターロイキン４（ＩＬ‐４）の産生量を測定した場合、ＩＬ‐１７の産生量が少ない、即ちＩＬ−１７産生抑制効果を備えたものであり、上記寄託予定のStreptococcus thermophilus Ｎｏ．２８を、特に好適とするものである。
【００２１】
これら乳酸菌Streptococcus thermophilus 乃至同Ｎ０．２８は、例えば栃木県那須地区採取の生乳から常法に従って分離した菌株中から、後述のマウス脾臓細胞刺激試験と評価方法に従って発明者らが見出した乳酸菌であり、該乳酸菌は、ＩＬ−１７の産生抑制効果を呈するとともにＩＬ−４に対して大きなＩＦＮ−γの産生促進効果を呈し、ＩＦＮ−γ増強による抗アレルギー作用を発揮し得るものとして、Ｔｈ１７を誘導することなく免疫バランスを適正の状態に改善することが可能となり、特にStreptococcus thermophilus NO.28は、上記ビフィズス菌Bifidobacterium infantis JCM 1222Ｔより更に高いＩＬ−１７の産生抑制効果を呈して、好ましい免疫バランスを得ることが可能となる。
【００２２】
該乳酸菌Streptococcus  thermophilusを得ることは、下記の方法に準じて行うことによって可能となるところ、本発明者らは、乳酸菌Streptococcus  thermophilus２００株について、以下のマウス脾臓細胞刺激試験と評価方法に従って試験を繰り返して上記活性を有するStreptococcus thermophilusを選択したので、これを示すと次の通りである。
【００２３】
菌株は、グリコ乳業株式会社保有のStreptococcus thermophilusを用いた。すべての菌株を、Ｍ１７培地（Becton, Dickinson Co,  Sparks, Md, USA）を用いて３７℃で１７〜６５時間静置培養した。これらの培養物は、３，０００×g、１０分、４℃の遠心分離によって回収し、蒸留水で３回洗浄した。菌体は、１００℃、５０分間の熱処理によって殺菌し、凍結乾燥して保存した。
【００２４】
マウス脾臓細胞刺激試験は、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を１０％（V/V）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０μＭ  ２‐メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを加えた１ｍｌのＲＰＭＩ‐１６４０培地に懸濁し、該培地を適宜希釈し１０７個／ｍｌとした脾臓細胞懸濁液に、２ｎｇのＴＧＦ‐β、２０ｎｇのＩＬ‐６及び加熱殺菌した乳酸菌（加熱殺菌前の菌数１０７ＣＦＵ）を培地に加え、３７℃で７２時間培養した。
【００２５】
培養後、上清中のＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐４、ＩＬ‐１７をＢｉｏ‐Ｐｌｅｘ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いたマイクロビーズ法によって検出し、蛍光強度値を決定した。ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐６及び乳酸菌を加えなかったものを無刺激対照、ＴＧＦ‐β及びＩＬ‐６は加えるが乳酸菌を加えなかったものを陰性対照とした。
【００２６】
その評価方法は、上記の試験の結果に基づいて、免疫系の細胞に対してＩＬ‐１７産生を抑制する性質が高いこと及びＩＦＮγ産生を誘導する性質が高く且つＩＬ‐４産生が低く保たれるものであることに着目し、ＩＬ−１７のサイトカイン濃度、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４の蛍光強度値を測定し、Ｔｈ１サイトカインのＩＦＮ−γとＴｈ２サイトカインのＩＬ−４の比率を算出した。
【００２７】
本発明者らが行った乳酸菌Streptococcus thermophilus２００株についての結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2010115126.tif 000003
【００２９】
このうちＩＬ−１７レベル（ＩＬ−１７蛍光強度値が１０，５００以下）が小さいもの、ＩＮＦ‐γの蛍光強度値／ＩＬ‐４の蛍光強度値の比（ＩＮＦ‐γ／ＩＬ‐４が３５０以上）が大きいものをスクリーニングしてそれぞれ上位１０株を選択した。上位１０株のＩＬ−１７レベルを示すと、Ｎｏ．８は２５４８．０、Ｎｏ．１０は６８７９．０、Ｎｏ．１１は１０４７７．５、Ｎｏ．１５は３８７７．０、Ｎｏ．１８は４１１８．０、Ｎｏ．１９は４４８６．０、Ｎｏ．２７は１０２０６．０、Ｎｏ．２８は１２９８．５、Ｎｏ．２９は７８０８．０、Ｎｏ．３１は１０４４５．０であり、上位１０株のＩＮＦ‐γ／ＩＬ‐４を示すと、Ｎｏ．８は５２５．６、Ｎｏ．１０は４８０．５、Ｎｏ．１１は５３８．４、Ｎｏ．１５は３５３．１、Ｎｏ．１６は４７３．９、Ｎｏ．１８は４９６．０、Ｎｏ．１９は５９９．３、Ｎｏ．２８は６４４．０、Ｎｏ．２９は５２９．８、Ｎｏ．３５は３５４．４であった。なお無刺激対照のＩＬ‐１７の蛍光強度値及びＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐４は、それぞれ１４２７、１０．５であった。また、陰性対照のＩＬ‐１７の蛍光強度値及びＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐４は、それぞれ３２７０６、１４．７であった。各上位１０株のＩＬ‐１７の蛍光強度値のグラフ（コントロールと対比）を図１に、ＩＮＦ‐γ／ＩＬ‐４のグラフ（同）を図２に示す。
【００３０】
ＩＬ−１７の蛍光強度値及びＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐４が共に上位１０株に入った乳酸菌Streptococcus thermophilusは、８、１０、１１、１５、１８、１９、２９の７株であり、これら７株は、ＩＬ−１７の蛍光強度値が低いことによって、ＩＬ−１７の産生抑制効果が顕著に認められるとともにＩＮＦ‐γ／ＩＬ‐４を大きく亢進することによって、ＩＦＮ−γの産生促進効果が顕著に認められるものであった。これらの中でも、乳酸菌Streptococcus thermophilus Ｎｏ．２８の蛍光強度値は１２９８．０、蛍光強度比は６４４．０であり、該乳酸菌Streptococcus thermophilusのＩＬ−１７の産生抑制、ＩＮＦ‐γの産生促進効果は、無刺激対照と同程度に格別顕著であった。
【００３１】
上記結果に基づき、乳酸菌Streptococcus  thermophilus NO.28について、更にＩＬ−１７の産生抑制効果、即ちＴｈ１７分化抑制活性の再現性を確認するために、ＥＬＩＳＡで再アッセイを行った。その際、同じくＴｈ１７分化抑制活性が確認されているビフィズス菌Bifidobacterium infantis JCM 1222Ｔとともにアッセイを行った。
【００３２】
その結果を図３に示す。乳酸菌Streptococcus thermophilus NO.28及びビフィズス菌Bifidobacterium infantis JCM 1222ＴはともにＩＬ−１７の産生を抑制するものであったが、乳酸菌Streptococcus thermophilus Ｎｏ．２８は、ビフィズス菌Bifidobacterium infantis JCM 1222Ｔより、更に強力なＴｈ１７分化抑制活性があることが認められた。
【００３３】
乳酸菌Streptococcus thermophilusによるＩＬ−１７の蛍光強度値が小さいことは、ＩＬ−１７の産生抑制効果が大きい、即ちＴｈ１７分化抑制活性が強力であること、ＩＮＦ‐γ／ＩＬ‐４が大きいことは、該ＩＮＦ‐γの産生促進効果が大きい、即ち同じくＴｈ１７分化抑制活性が強力であること、ＩＬ−１７の産生抑制効果が大きく、従ってＴｈ１７分化抑制活性が強力であることは、Ｔｈ１７を誘導することなく免疫バランスを適正の状態に改善するに有効であり、またＩＮＦ−γの産生促進効果が大きいことは、その抗アレルギー作用が認められ、従って該乳酸菌Streptococcus thermophilusは、アレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防又は改善効果を与えると認められる。このときＩＬ−１７の蛍光強度値は上記１０５００以下、概ね１００００程度、ＩＮＦ‐γ／ＩＬ‐４は３５０以上のものについては、これらアレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防又は改善効果を期待することができるから、上記スクリーニングにより双方をクリヤーした上記７株が、上記課題に沿う有効な乳酸菌Streptococcus thermophilusであるとすることができる。またこれら乳酸菌Streptococcus thermophilusは、そのＮｏ．２８を含めて、発酵乳のスターターとして用いられてきた実績があり、またＩＦＮ−γ増強による抗アレルギー作用を発揮し、ＩＬ−１７を抑制することで副次作用を惹起するものとは認められず、またビフィズス菌のように、例えば乳発酵に酵母エキスなどの栄養素を添加する必要がなく、発酵乳や発酵乳を含有する飲食品等の製品製造に用いるに好適であると認められる。
【００３４】
これら乳酸菌Streptococcus thermophilusは、その菌株として、これを冷凍乾燥した乳酸菌粉末乃至その抽出物、破砕物等の加工品として市場に供給すること、該乳酸菌Streptococcus thermophilusによって発酵した発酵乳製品とすること、該Streptococcus thermophilusを、ＩＬ−１７産生抑制の有効成分として含有する医薬又は飲食品とすること、上記発酵乳製品を、ＩＬ−１７産生抑制の有効成分として含有する医薬又は飲食品とすることが可能である。このように発酵乳製品とし、医薬又は飲食品とすることによって、簡易に摂取してアレルギー症状、アレルギー疾患乃至炎症性疾患の予防又は改善効果を期待し得る商品とすることができる。
【００３５】
発酵乳製品は、上記乳酸菌Streptococcus thermophilusをスターターとして、常法に従って乳等を発酵してその製造を行えばよく、このとき発酵乳製品は、ヨーグルト、ヨーグルト飲料、発酵乳を加工した乳酸菌飲料等とすることができる。
【００３６】
医薬又は飲食品は、上記乳酸菌Streptococcus thermophilusを、常法に従って医薬ベース、飲食品ベースに添加して、その製造を行えばよく、このとき医薬は、単独の有効成分又は他の有効成分と同時の有効成分とすること、錠剤、液剤、粉剤乃至カプセル等の形態のものとすることができ、また飲食品は、ジュース、茶等の清涼飲料、ゲル化乃至固形の菓子、レトルト食品等の如くに各種の飲料乃至食品として、各種の形態のものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＩＬ−１７の蛍光強度値を示すグラフである。
【図２】ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４を示すグラフである。
【図３】ＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図１】
2010115126.tif 000004
【図２】
2010115126.tif 000005
【図３】
2010115126.tif 000006