(57)【要約】【課題】酵素反応から発生したシグナルを増幅する新規な方法を提供する。【解決手段】結合された酵素を有する複数の同一の微小球の部分集団を含む微小球の集団を供給し、該微小球が光学ファイバー束の独立したファイバー又はファイバーの群と光学的に結合するように、該微小球の集団に光学ファイバー束を供給し、該微小球の集団にアナライトを供給し、それにより光学シグナルを発生させ、該光学シグナルを検出し、該光学シグナルを組み合わせて、該酵素反応からの増幅されたシグナルを生成することにより、酵素反応から発生したシグナルを増幅する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素反応から発生したシグナルを増幅する方法であって、
結合された酵素を有する複数の同一の微小球の部分集団を含む微小球の集団を供給し、
該微小球が光学ファイバー束の独立したファイバー又はファイバーの群と光学的に結合するように、該微小球の集団に光学ファイバー束を供給し、
該微小球の集団にアナライトを供給し、それにより光学シグナルを発生させ、
該光学シグナルを検出し、
該光学シグナルを組み合わせて、該酵素反応からの増幅されたシグナルを生成する
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
該酵素は、官能基により該部分集団の微小球に結合されている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該官能基は、アミノ基又はカルボキシル基である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該官能基は、スルフヒドリル基である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該部分集団の微小球はリンカーを含み、該リンカーは該官能基を有する請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該リンカーは二官能性リンカーである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該酵素は、直接的に検出できるシグナルを発生する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該酵素は、間接的に検出できるシグナルを発生する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該酵素は、該光学的に検出できるシグナルを発生させるためにさらに処理される副生成物を生成する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
光学シグナルの組み合わせが生じる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該光学シグナルは、少なくとも５０の倍率で増幅される請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
アナライト検出限界は、少なくとも１００の倍率で減少される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、ガス状および液体状アナライトの検出のための分析化学センサー配列の光学応答標示またはそのＳＮ比を増加させる方法、とりわけ、酵素反応から発生したシグナルを増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的分析測定のための光吸収色素との組合せての光学ファイバーおよび光学ファイバーストランドの使用は、特に過去１０年間に迅速な発展を受けた。かかる目的および技術のための光学ファイバーの使用は、Ｍｉｌａｎｏｖｉｃｈら，「Ｎｏｖｅｌ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｉｂｅｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、オプティックスおよびエレクトロオプティックスについてのＳＰＩＥ第２８回年次国際技術シンポジウム、第４９４巻、１９８０； Ｓｅｉｔｚ，Ｗ．Ｒ．、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ａｎｄ Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ」 ｉｎ Ｃ．Ｒ．Ｃ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１９巻、１９８８、１３５−１７３頁； Ｗｏｌｂｅｉｓ，Ｏ．Ｓ．，「Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｓ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｍａｎ編集），Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）； Ａｎｇｅｌ，Ｓ．Ｍ． Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ２（４）：３８（１９８７）； Ｗａｌｔら，「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ」，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，第４０３巻，１９８９，２５２頁およびＷｏｌｆｉｂｅｉｓ，Ｏ．Ｓ． Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ，編集ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｒ，ＦＬ，１９９１，第２巻に記載されている。
【０００３】
インビトロ／インビボセンサーで光学ファイバーを使用する場合、１以上の光吸収性色素がその末梢端近くに位置する。典型的には、適当な源からの光を用いて、ファイバーの近接端を通って、色素を照射する。光学ファイバーの長さに沿っての光伝搬；およびこの伝搬した光の一部は末梢端に存在し、色素によって吸収される。光吸収性色素は固定化してもしなくてもよく；光学ファイバー自体に直接的に付着してもしなくてもよく；注目する１以上のアナライトを含有する流体試料に懸濁してもしなくてもよく；第２の光学測定での引き続いての使用に保持可能であってもなくてもよい。一旦、光が色素によって吸収されたならば、種々の波長および強度のいくらかの光は戻り、同ファイバーまたは収集ファイバーいずれかを通って検出系に運ばれ、そこで、それは観察され、測定される。光学ファイバーによって運ばれた光および光吸収性色素の特性の間の相互作用は定性的および定量的測定双方の基礎である。異なる分析目的のファイバーストランドおよび光学ファイバーの束で通常は用いられる多くの異なるクラスの光吸収性色素の中には、「発蛍光体」と呼ばれる吸収後に光を発するより通常の組成物および「色原体」と呼ばれる、光としてそれを発するよりもむしろ、光を吸収し、内部で吸収された光を熱に変換するものがある。
【０００４】
蛍光は、特定の波長で光（フォトン）を吸収し、次いでより長い波長の低エネルギーの光を発するいくつかの分子の能力に基づく物理的現象である。蛍光を発することができる物質は、多数の通常の特徴：１つの波長において光エネルギーを吸収する；励起されたエネルギー状態に達する；および引き続いてもう１つの光エネルギーで光を発する能力を有する。吸収および発光スペクトルは、各発蛍光体に個々のものであり、しばしば、わずかに重複する２つの別々の曲線としてグラフ表示される。同一蛍光発光スペクトルは、一般に、励起光の波長に拘わらず観察され、従って、励起光の波長およびエネルギーは限界内で変化することができ；しかし、発蛍光体によって発せられる光は常に同一発光スペクトルを提供する。最終的に、蛍光シグナルの強度は、発せられた光の量子収率として測定することができる。蛍光量子収率は、発蛍光体によって最初に吸収されたフォトンの数と比較した、発せられたフォトンの数の比率である。これらの特徴の各々に関するより詳細な情報については、以下の文献が推奨される：Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３； Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｄ．，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２； 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」：パート１”（Ｓ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｍａｎ編）ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，第７７巻，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８６； Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ， ＳｔｅｐａｎｏｖおよびＧｒｉｂｋｏｖｓｋｉｉ，ｌｉｔｔｌｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，１９６８。
【０００５】
定性的および定量的分析測定双方において、光学ファイバーセンサーを使用する最近の改良の多くは、光学ファイバーの末梢端に種々の光吸収色素を蒸着および／または固定化することが望ましいことに関する。このように、種々の異なる光学ファイバー化学センサーおよび方法が、ｐＨ測定、酸素検出、および二酸化炭素分析のごとき特異的分析測定および適用で報告されている。これらの発展は以下の文献によって例示されている：Ｆｒｅｅｍａｎら，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．５３：９８（１９８３）； Ｌｉｐｐｔｓｃｈら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．２０５：１，（１９８８）； Ｗｏｌｆｂｅｉｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２０２８（１９８８）； Ｊｏｒｄａｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９：４３７（１９８７）； Ｌｕｂｂｅｒｓら，Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｉａｔｏｒｓ １９８３； Ｍｕｎｋｈｏｌｍら，Ｔａｌａｎｔａ ３５：１０９（１９８８）； Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８：１４２７（１９８６）；Ｓｅｉｔｚ，Ｗ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５６：１６Ａ−３４Ａ（１９８４）； Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５２：８６４（１９８０）； Ｓａａｒｉら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５４：８２１（１９８２）； Ｓａａｒｉら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５５：６６７（１９８３）； Ｚｈｕｊｕｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．１６０：４７（１９８４）； Ｓｃｈｗａｂら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５６：２１９９（１９８４）； Ｗｏｌｆｂｅｉｓ，Ｏ．Ｓ．，「Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ」，編集ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８１，第２巻；およびＰａｎｔａｎｏ，Ｐ．，Ｗａｌｔ，Ｄ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４８１Ａ−４８７Ａ，第６７巻（１９９５）。
【０００６】
より最近では、単一の独立したファイバーオプチックス束を持つ複数色素の使用を可能としたファイバーオプチックスセンサーが構築されている。Ｗａｌｔ．らに対する米国特許第５，２４４，６３６号および第５，２５０，２６４号は、束の末梢端に対して複数の異なる色素を付着させる系を開示しており、これらの特許の各々の教示は本明細書の一部を構成する。開示された立体配置は、束の別々の光学ファイバーを、光学的に個々の色素を評価するのを可能とする。これは、２以上の色素からのシグナルを組み合わせた場合に生起する各色素からの復帰光における別々のシグナルをほどく問題を回避し、各色素は異なるアナライトに対して感受性であり、色素の発光スペクトルにおいて重要な重複がある。
【０００７】
より最近では、ファイバーオプチックスセンサーは、臭いを区別し、定量するための半選択的化学的センサーおよびパターン認識スキームの配列で使用されてきた。かかるアプローチは、デバイスまたは系を検知するデザインにおいて生物学的嗅覚の原理を実行するのに有用であった。バイオミメトリーのこの分野において、種々の技術がセンサー変換メカニズムに適用されてきた。例えば、表面音響波、導電性ポリマー、金属酸化物センサー電界効果トランジスター（ＭＯＳＦＥＴ）、ピエゾエレクトリックおよび水晶結晶ミクロバランスセンサー配列が追求されてきた。
【０００８】
かかる技術は臭検知に対する種々の物理的および化学的現象を利用する発明アプローチを提供するが、かかるデバイスの効果を制限するこれらの方法に対しては多数の制限がある。まず、単一配列内およびセンサー配列間の素子−対−素子再現性は、典型的には、不満足であり、かくして、センサー−対−センサーからの再キャリブレーションおよびネットワーク保持を要する。第２に、これらの方法のほとんどは、比較的遅い応答時間を有し、頻繁に、臭の存在に対する応答に数分要する。第３に、かかる方法は比較的高い検出限界および低い感度を有し、典型的には１０ｐｐｍ未満の臭レベルでは機能しない。第４に、かかる技術を具体化するデバイスは、典型的には、比較的大きい固有のサイズを要し、それにより、遠隔検知適用で使用されるセンサー配列のミニチュア化を制限する。最後に、これらの方法によるマルチセンサー配列の構築は複雑で、費用がかかり退屈な調製およびよく規定された配列内の個々のセンサーの設置を含む。
【０００９】
より最近では、これらの欠点の多くは、人工的鼻センサーデバイスおよび系におけるファイバーオプチックスセンサー配列の適用を介して克服された。Ｗａｌｔらに対する米国特許第５，３２０，８１４号および第５，５１２，４９０号（これらの特許の各々の教示は本明細書の一部を構成する）は、検知する受容体単位として機能し、スペクトル認識パターンを用いて種々の異なるアナライトおよびリガンドを検出することができる不均一な半分選択的薄いフイルムで形成されたファイバーオプチックス配列を開示する。この技術は、ファイバーオプチックス束における選択的光学ファイバーの末端をコートするポリマー色素組合せの配列を利用する蒸気検知系に適用されてきた。これらの発展は、さらにＤｉｃｋｎｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：６９７（１９９６）およびＷｈｉｔｅら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：２１９１（１９９６）に記載されている。
【００１０】
Ｗａｌｔらに対する４つの従前に引用されている特許の革新的特徴は、単一光学ファイバー束センサーの端部における複数の化学的機能の設置である。この立体配置は、典型的には小さい束を介して遠隔モニターできた分析的化学センサーを生じさせた。しかしながら、欠点は、センサーの端部における化学的機能性に関連する種々の化学を適用することにおける困難性であり；機能性は工程的連続様におけるセンサー端部に組み立てられた。これは遅いプロセスであり、実際には、数十の機能性が適用できたに過ぎない。
【００１１】
Ｗａｌｔらに対する米国特許出願第０８／８１８，１９９号（その教示は本明細書の一部を構成する）は、光学ファイバー配列センサーにおけるポリマー色素コーティング層に対する代替物としてのインフレートポリマー微小球の使用を開示する。このアプローチでは、ファイバーオプチックス束は標的アナライトの存在に対する異なる化学的および光学応答を有する種々の微小球ビーズセンサーを含有する色素−ポリマー微小球レイに対する代替物として働く。この発明の１つの革新的な特徴は、光学的応答性のコード化スキームを用いて各ビーズの機能性を同定する能力を保持しつつ異なる化学的機能性を担うビーズまたは微小球を一緒に混合することができるビーズベースの分析化学系を提供することにおけるものである。加えて、本発明は、別々のビーズまたは微小球が束内の区別されるファイバーまたはファイバーの群に光学カップリングさせることができる光学ファイバー束センサーを提供する。本発明の革新的特徴は別々の適用を有するが、一緒に実施すると、本発明は、化学センサー配列および化学的分析系に組み込むことができる、非常に多数の数千以上の別々の化学的センサー要素を支持することができる光学ファイバーセンサーを提供する。このアプローチは、多くの区別されるセンサータイプを含有する個々のセンサーおよび複雑なセンサー配列の迅速な製造および組み立てを提供する。また、該方法は、センサーのバッチおよびセンサー配列内の高い程度再現性および適合性を提供する。微小球において利用できる超微細サイジングのためさらなる利点が実現される。センサー配列の総じてのサイズが実質的にミリメーター下スケールまで低下させることができる。スケールにおけるこの減少は遠隔検知配列において特に有利である。
【００１２】
Ｗａｌｔらに対する米国特許第０８／８１８，１９９号に教示された化学的センサー配列における微小球センサー要素に適用する方法は多くの革新的特徴を有するが、この方法はある限界を有する。該方法は、センサー配列で使用されるビーズ部分集団のタイプおよび位置を同定するための複雑なマルチ工程ビーズコード化プロセスを要する。ビーズは、種々の比率で蛍光色素の組合せを使用することによってコード化される。コード化色素の選択は、励起光エネルギーへの暴露に際して異なる波長において光を発する色素に限定される。異なる比率の色素の組合せはビーズのコード化部分集団を提供するが、所与の色素ペアーまたは組合せでのビーズをコード化するのに利用できる色素比率の数は、ピーク重複からの発光スペクトルを混雑させるためかなり限定される。加えて、別々のレポーティング色素が、標的アナライトのためのユニークな特徴的な光学応答標示を得るのに必要である。かくして、コード化色素選択は、さらに、その発光波長が、アナライトの存在にユニークに応答するレポーティング色素と重複または干渉しない色素を選択することによって制限される。
【００１３】
この発明のもう１つの限定的特徴は、ビーズをコード化するプロセスがセンサーおよびセンサー配列をキャリブレートし、追跡する一連の測定を要することである。コード化は、最初に、まずビーズに励起光エネルギーを照射し、所与のコード化色素比率を有するセンサー配列内で特異的ビーズ部分集団のタイプおよび位置をモニターし、記録することによって達成される。次に、レポーター色素の存在下で励起光エネルギーで配列を照射しつつ、配列をアナライトに暴露する。レポーター色素の存在下でアナライトに応答するビーズをセンサー配列上にモニターし、マップする。加えて、特徴的光学応答標示をライブラリーに貯蔵する。この工程は、レポーター色素と組み合わせた注目する各アナライトにつき反復する。一旦、全てのビーズ部分集団をコード化し、その応答特性をモニターし、記録すると、全センサー配列は、各アナライトについての貯蔵された光学応答標示を用いて各センサー要素にインデックスを付すことによって各アナライトを解読しなければならない。ビーズの個々の部分集団を解読するこのプロセスは、非常に多数の部分集団が配列において配置され、それにより、各配列に必要なトレイニング時間を増加させる場合にさらなる工程を要する。
【００１４】
ビーズコード化、分子タッギングの利用、キャピラリーガスクロマトグラフィーおよび電子捕獲検出に対する他の別のアプローチは、Ｓｔｉｌｌら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１５５（１９９６）によって開示されている。しかしながら、かかる方法は範囲が限定されており、容易に分析可能な特異的化学的機能性および分子タッグを有する狭いクラスのビーズ材料にのみ適用されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，３２０，８１４号
【特許文献２】米国特許第５，５１２，４９０号
【特許文献３】米国特許出願第０８／８１８，１９９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｍｉｌａｎｏｖｉｃｈら，「Ｎｏｖｅｌ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｉｂｅｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、オプティックスおよびエレクトロオプティックスについてのＳＰＩＥ第２８回年次国際技術シンポジウム、第４９４巻、１９８０
【非特許文献２】Ｓｅｉｔｚ，Ｗ．Ｒ．、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ａｎｄ Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ」 ｉｎ Ｃ．Ｒ．Ｃ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１９巻、１９８８、１３５−１７３頁
【非特許文献３】Ｗｏｌｂｅｉｓ，Ｏ．Ｓ．，「Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｓ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｍａｎ編集），Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）
【非特許文献４】Ａｎｇｅｌ，Ｓ．Ｍ． Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ２（４）：３８（１９８７）
【非特許文献５】Ｗａｌｔら，「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ」，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，第４０３巻，１９８９，２５２頁およびＷｏｌｆｉｂｅｉｓ，Ｏ．Ｓ． Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ，編集ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｒ，ＦＬ，１９９１，第２巻
【非特許文献６】Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３
【非特許文献７】Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｄ．，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２
【非特許文献８】「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」：パート１”（Ｓ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｍａｎ編）ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，第７７巻，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８６
【非特許文献９】Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ， ＳｔｅｐａｎｏｖおよびＧｒｉｂｋｏｖｓｋｉｉ，ｌｉｔｔｌｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，１９６８
【非特許文献１０】Ｆｒｅｅｍａｎら，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．５３：９８（１９８３）
【非特許文献１１】Ｌｉｐｐｔｓｃｈら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．２０５：１，（１９８８）
【非特許文献１２】Ｗｏｌｆｂｅｉｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２０２８（１９８８）
【非特許文献１３】Ｊｏｒｄａｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９：４３７（１９８７）
【非特許文献１４】Ｌｕｂｂｅｒｓら，Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｉａｔｏｒｓ １９８３
【非特許文献１５】Ｍｕｎｋｈｏｌｍら，Ｔａｌａｎｔａ ３５：１０９（１９８８）
【非特許文献１６】Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８：１４２７（１９８６）
【非特許文献１７】Ｓｅｉｔｚ，Ｗ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５６：１６Ａ−３４Ａ（１９８４）
【非特許文献１８】Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５２：８６４（１９８０）
【非特許文献１９】Ｓａａｒｉら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５４：８２１（１９８２）
【非特許文献２０】Ｓａａｒｉら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５５：６６７（１９８３）
【非特許文献２１】Ｚｈｕｊｕｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．１６０：４７（１９８４）
【非特許文献２２】Ｓｃｈｗａｂら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５６：２１９９（１９８４）
【非特許文献２３】Ｗｏｌｆｂｅｉｓ，Ｏ．Ｓ．，「Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ」，編集ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８１，第２巻
【非特許文献２４】Ｐａｎｔａｎｏ，Ｐ．，Ｗａｌｔ，Ｄ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４８１Ａ−４８７Ａ，第６７巻（１９９５）
【非特許文献２５】Ｄｉｃｋｎｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３８２：６９７（１９９６）
【非特許文献２６】Ｗｈｉｔｅら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：２１９１（１９９６）
【非特許文献２７】Ｓｔｉｌｌら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１５５（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、酵素反応から発生したシグナルを増幅する新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、上記目的は、酵素反応から発生したシグナルを増幅する方法であって、結合された酵素を有する複数の同一の微小球の部分集団を含む微小球の集団を供給し、該微小球が光学ファイバー束の独立したファイバー又はファイバーの群と光学的に結合するように、該微小球の集団に光学ファイバー束を供給し、該微小球の集団にアナライトを供給し、それにより光学シグナルを発生させ、該光学シグナルを検出し、該光学シグナルを組み合わせて、該酵素反応からの増幅されたシグナルを生成することを含んでなる方法により達成することができる。
【００１９】
本発明の好ましい態様では、酵素は、官能基により部分集団の微小球に結合されている。好ましくは、官能基は、アミノ基又はカルボキシル基、若しくはスルフヒドリル基である。
【００２０】
本発明の別の好ましい態様では、部分集団の微小球はリンカーを含み、このリンカーは官能基を有しており、好ましくは、二官能性リンカーである。
酵素は、直接的又は間接的に検出できるシグナルを発生する。酵素は、光学的に検出できるシグナルを発生させるためにさらに処理される副生成物を生成する。
【００２１】
本発明の更に別の好ましい態様では、光学シグナルの組み合わせが生じる。光学シグナルは、少なくとも５０の倍率で増幅される。
また、アナライト検出限界は、少なくとも１００の倍率で減少される。
【００２２】
部品の構築および組合せの種々の新規詳細を含めた本発明の前記および他の特徴ならびに他の利点は、ここに、添付の図面を参照してより具体的に記載し、請求の範囲で規定する。本発明を具体化する特別の方法およびデバイスは例示の目的で示され、本発明の限定ではないことが理解されよう。本発明の原理および特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく種々のおよび多数の態様で使用することができる。
【００２３】
添付の図面において、参照文字は、異なる図面を通じて同一部品をいう。図面は必ずしもスケール通りではない。その代わりに、本発明の原理を説明する際に強調が為される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の自己解読微小球センサーを説明する模式的ダイアグラムである。
【図２】本発明のセンサー配列の調製、解読およびそれへの微小球の取り込みのプロセスフローダイアグラムである。
【図３】本発明のファイバーオプチックスセンサー配列における自己コード化された微小球部分集団の調製および設定を説明する模式的プロセスダイアグラムである。
【図４】本発明の方法によるマイクロウエルにおける微小球のファイバーオプチックス束および設置でのマイクロウエル形成を説明するプロセスフローダイアグラムである。
【図５】マイクロウエルキャビティーに挿入されたファイバーオプチックス束およびマイクロウエルの末梢端に形成されたマイクロウエルを説明する顕微鏡写真である。
【図６】タッピングおよび空気パルスによる撹乱前におよびそれに引き続いてのその対応するマイクロウエルにおける微小球の配列を示す顕微鏡写真である(微小球キャビティーにおける微小球の静電的結合を示す)。
【図７】本発明のファイバーオプチックスセンサーおよび関連する器具および制御系の模式的ダイアグラムである。
【図８】実施例７ないし１７の光学測定で使用される実験装置を説明する模式的ダイアグラムである。
【図９】トルエン蒸気への暴露に際してナイルレッド色素を侵潤させた多孔性シリカビーズの特徴的光学応答を示す図である。
【図１０】メタノール蒸気への暴露に際してナイルレッド色素を侵潤させた多孔性シリカビーズの特徴的光学応答を示す図である。
【図１１】トルエンおよびメタノール蒸気に対する暴露に際してナイルレッド色素を侵潤したＰＳ８０２コート多孔性シリカビーズの特徴的光学応答を示す図である。
【図１２】トルエンおよびメタノール蒸気に対する暴露に際してナイルレッド色素を侵潤したＰＤＰＯコート多孔性シリカビーズの特徴的光学応答を示す図である。
【図１３】酢酸エチル蒸気への暴露に際してナイルレッド色素を侵潤させた多孔性シリカビーズの特徴的光学応答標示を示す図である。
【図１４】メタノール蒸気のナイルレッド侵潤ＰＭＳビーズ部分集団測定においてシグナル−ノイズ比率を減少させるための光学応答シグナル合計の革新を示す図である。
【図１５】メタノール蒸気のＰＭＳビーズ部分集団測定におけるシグナル増強につき合計する光学応答シグナルの革新を示す図である。
【図１６】トルエンおよびメタノール蒸気への暴露に際して、ナイルレッド色素を侵潤させた２つのＰＳ８０２コート多孔性シリカビーズの特徴的光学応答標示を比較する図である。
【図１７】本発明の自己コード化されたファイバーオプチックスセンサー配列におけるナイルレッド侵潤多孔性シリカおよびＰＭＳビーズ部分集団を解読するのに使用されるメタノール蒸気に対する特徴的光学応答標示を比較する図である。
【図１８】本発明の自己コード化されたファイバーオプチックスセンサー配列におけるｎ−プロパノール蒸気に対するナイルレッド侵潤多孔性シリカおよびＰＭＳビーズ部分集団の特徴的光学応答標示を比較する図である。
【図１９】本発明の自己解読されたファイバーオプチックスセンサー配列におけるトルエン蒸気に対するナイルレッド侵潤多孔性シリカおよびＰＭＳビーズ部分集団の特徴的光学応答標示を比較する図である。
【図２０】トルエン蒸気に対する暴露に際しての、ＰＳ８０２コート多孔性シリカ、ポリメチルスチレンおよびポリメチルスチレン／ジビニルベンゼンビーズ部分集団のビーズ膨潤応答の差異を比較する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、基体の表面の独立した位置の微小球の集団を含む分析化学センサー配列を含む分析化学系を提供する。微小球集団内には別々の微小球部分集団があり、その各々は、ある場合には標的アナライトであり得る参照アナライトの存在下で励起光エネルギーによって照射されると、特徴的光学応答標示を供する。部分集団はランダムに一緒に混合されているが、各微小球の同一性および位置は、参照アナライトの存在下で励起光エネルギーによって照射されると、特徴的光学応答標示を介して測定される。
【００２６】
これは、配列の解読、すなわち、配列上の微小球の各部分集団の位置の同定を非常にシンプルに進行させる。好ましい態様において、微小球は、参照アナライト、一般的には蒸気のごとき流体に対して特徴的な、すなわち、ユニークな光学応答標示を呈する１以上のレポーター色素でコード化される。かくして、この態様において、参照アナライトへの全配列の暴露は、各部分集団の各微小球の位置の同定を可能とする。その結果、既知のアナライトに対して全センサー配列の応答を比較することによって、配列の個々のセンサー要素は、便宜には、１つのシンプルな測定において同時に解読される。本発明の分析化学センサー配列は、より複雑なマルチ工程コード化系の必要性を排除する。
【００２７】
次いで、センサー配列を用いて、例えば、微小球がオリゴヌクレオチドまたは別法として、化学官能基のごとき生活性剤を含む場合、標的アナライト、例えば、実質的に相補的標識オリゴヌクレオチドまたは注目する標的アナライトとの相互作用または結合に際して、微小球の光学特徴の変化を探すことによって、標的アナライトの存在を検出することができる。当業者に認識されるごとく、これは、一般的に光学シグナル変化の使用を介して、種々の方法で行うことができる。この変化は、多くの異なるメカニズムを介して起こり得る。数個の例は、微小球への色素タグドアナライトの結合、微小球上または微小球近くの色素種の生成、存在する色素種の破壊、微小球上の色素とのアナライトの相互作用に際しての光学特徴の変化、またはいずれかの他の光学的応答性の現象を含む。かくして、一旦オリゴヌクレオチドプローブの各種、または特定の化学官能性を有する微小球の位置が同定されたならば、次いで、配列を用いて、好ましくは微小球上の生活性剤または化学的官能性と特異的に会合する未知の存在を検出することができる。
【００２８】
別の好ましい態様において、標的アナライトを標識しない場合、配列中の各要素の光学応答を、種々のアナライトに対する特徴的光学応答標示は従前に測定され記録されているその対応する微小球部分集団タイプのための特徴的光学応答標示のライブラリーと比較することができ、未知のものの同一性は測定することができるか、あるいはセンサー配列を訓練して測定された応答を、次いで応答標示のライブラリーに添加される特定のアナライトと関連付ける。
【００２９】
本発明は、分析化学センサー配列の革新を具体化することによって、現在の技術のある種の制限を克服し、ここに、特異的微小球部分集団組成物とレポーター色素との相互作用によって特徴的光学応答標示が生産される。本発明の分析化学センサー配列において、標的アナライトに対する応答シグナルは、標的アナライトに対する応答標示、および配列内の全センサー配列および部分集団に対するコード化シグナル双方として働く。かくして、配列の解読は、標的アナライトの配列応答測定の間に１工程で達成され、標的アナライトを同定するのに使用された応答そのものを利用する。かくして、微小球コード化は、標的アナライトに対する微小球部分集団応答の性質によって配列に取り込まれる。
【００３０】
本発明において、部分集団の各微小球色素組合せは、液体または蒸気のごとき所与の流体に暴露されると、特徴的光学応答標示を有する。本発明の分析化学センサーは配列は自己コード化センサー配列であり、この概念は、特異的微小球マトリックス材料と組み合わせて色素のユニークな応答標示によって供される。かくして、センサー配列にランダムに分布した微小球部分集団は容易に同定でき、センサー配列を既知のテスト流体に暴露し、単に得られた光学応答標示を各微小球部分集団で得られたものにマッチングさせることによって配列中に設置後に迅速に同定し、位置決定することができる。このアプローチでは、微小球は自己コード化され、全センサー配列の応答標示は迅速に測定され、標的アナライトの測定のために貯蔵される。本発明の方法は、独立した光学応答標示を有する数千のセンサーを含有するセンサー配列の適用において特に有用である。
【００３１】
本発明のさらなる利点は、それが、生活性剤（すなわち、核酸および抗体のごとき化合物）の合成が配列上のそれらの位置から離されることを可能とする、すなわち、生活性剤は微小球上で合成でき、次いで、微小球はパターン化された表面にランダムに分布する。参照アナライトに対する既知の応答を有する色素を存在させることによって、自己コード化されるので、これは、配列が後に「解読」できる、すなわち、配列が作成された後、配列上の個々のサイトの位置とその特定のサイトにおける微小球または生活性剤との相関を作成することができることを意味する。これは、微小球が配列上にランダムに分布でき、先行技術のイン・サイチュ合成またはスポッティング技術いずれかと比較して、迅速で安価なプロセスである。一旦配列に微小球を負荷すれば、配列は解読できるか、あるいは使用でき、後記にてより詳細に概説するごとく、テスト後に十分にまたは部分的に解読される。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、超微細な多孔性のミクロビーズまたは微小球が個々のセンサーとして利用される。ミクロン−スケールのセンサーの利用は改良されたセンサー応答および感度を提供する。センサー寸法の減少は、拡散の長さおよび個々のセンサーとアナライトとの相互作用の時間を実質的に減少させ、センサー感度を増強させ、検出限界を低下させつつ、センサー応答をかなり短くする。
【００３３】
本発明のもう１つの態様において、センサー配列は、光学ファイバー束の末梢端に配されたビーズまたは微小球の部分集団よりなり、ここに、別々のビーズまたは微小球は、束内の独立したファイバーまたはファイバーの群に光学的に結合させることができる。典型的には、かかるファイバーオプチックス束は数千の独立したファイバーよりなるので、かくして、本発明は、励起光エネルギーによって照射されつつアナライトに暴露された場合に各々が特徴的光学応答を有する、非常に多数の、数千の独立した種々の部分集団のセンサー配列レメントを支持できる光学ファイバーセンサーを提供する。
【００３４】
１つの好ましい態様において、ファイバーオプチックス束基体の末梢端は化学的にエッチングされて、独立したファイバーの端部においてキャビティーまたはマイクロウエルを生じさせる。好ましい態様において、ビーズの各１つは、束の光学ファイバーの末端で形成される別々のマイクロウエル内に位置する。これらのマイクロウエルは光学ファイバーのコアをクラッッドに関して非等方的にエッチングすることによって形成される。得られたエッチングされたキャビティーは、個々のミクロビーズセンサーを収容するための、および個々のビーズセンサーとファイバー束における独立した光学ファイバーとの光学的カップリングを提供するための寸法とされる。典型的なファイバーオプチックス束は数千の独立したファイバーを含有するので、この態様は、センサー配列中の数千のセンサーの個々の光学的カップリングを提供し、それにより、配列内の各ビーズ部分集団に対する非常に多数の独立したセンサー測定を提供する。
【００３５】
利用できる非常に多数のビーズセンサー部分集団および各部分集団内の対応して非常に多数のセンサー要素のため、本発明の重要な革新は、単一センサー配列における数千の独立したセンサー応答測定を提供することにある。これは、各センサー配列ビーズ部分集団内のセンサービーズから取られた多数の独立した測定の特徴的光学応答標示の合計および増幅を提供することによって、本発明のもう１つの有意な革新を可能とする。このアプローチは、そのいずれもそれ自体特別に感受性ではない上皮層で見いだされるほとんど数千の異なる受容体細胞タイプのグルーピングの各々中の数千の受容体細胞からの組み合わされたシグナルが臭に対する高度に増幅された検知応答に導く、ヒト嗅覚の現実の挙動を直接的に模倣する［Ｊ．Ｓ．Ｋａｕｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：７９−９５（１９９１）］。
【００３６】
かくして、本発明は、ヒト嗅覚系で見いだされる革新的臭増幅プロセスを具体化して、非常に多数のセンサー配列要素の低レベル応答を合計することによって、アナライトに対するセンサー配列感度を有意に増強させる。低蒸気濃度においていくつかの微小球からの応答を合計することによって、シグナル−ノイズ比の実質的な改良が達成され、１０以上の因子を超える。この革新は大きさのオーダにわたってセンサー配列の検出限界の低下に導く。本発明のセンサー配列によって供される感度の増強は、一般に、合計に利用可能な多数の独立したセンサー微小球応答の平方根に直接的に比例することが知られている。かかる増強にて、ｐｐｍに近づく検出限界が達成できる。
【００３７】
好ましい態様において、センサー微小球は、好ましくは微小球内に浸透したまたは捕獲されたレポーター色素を用いて自己コード化される。レポーター色素は、色原体または発蛍光体であり得るが、好ましくは、特徴的に強い光学シグナルのため、解読に対して良好なシグナル−ノイズを提供する蛍光色素である。必要ではないが、自己コード化は、特徴的かつ区別つれる発光を有する２以上のレポーティング色素を利用し、励起光エネルギーでの照射に際して、ピーク強度比を測定することによって達成することができる。
【００３８】
もう１つの態様において、本発明は、所定の化学的特異性で設計された化学的センサー配列に関する。この態様において、所望のサイトを微小球の表面に付着させることによって、さらなる化学的機能性を各センサー部分集団に取り込むことができる。もう１つの態様において、センサー配列は束における、束上のまたは束近くの化学的官能性を担う微小球の集団を有する。標的アナライトと相互作用する個々のまたは多数の微小球に関連した光学標示変化をモニターする能力は、そこで、イメージプロセッシング技術を用いて、使用者により手動で、または自動で分析が行われる近接端への伝達のため、別々の光学ファイバーまたはファイバーオプチックス束のファイバーの群にこれらの標示変化を光学的にカップリングさせることによって提供される。
【００３９】
各センサーは、それがマイクロウエル内の微小球の部分集団の異なる分布を有する限り、異なるが、陽性の光学応答または標示を呈する微小球のみが解読を要する注目する標的アナライトに変化する。従って、センサー製造よりもむしろ分析に負担がかかる。さらに、配列中の微小球およびファイバーは微小球であり得るので、シグナル発生から生起する蛍光領域は極端に均一であり、商業的に入手可能な顕微鏡分析ソウトウエアを用いて自動的に分析することができる。かかるイメージプロセッシングソウトウエアは、異なるスペクトル領域を自動的に規定し、数秒内に各領域内のセグメントの数を計数することができる。
【００４０】
従って、本発明は、個々のサイトを含む表面を持つ少なくとも第１の基体を含む配列組成物を提供する。ここに「配列」とは、配列様式での、複数の生活性剤または化学的官能基を意味し；配列のサイズは、組成物および配列の未来敵使用に依存するであろう。約２つの異なる生活性剤（すなわち、異なる微小球）から数１００万の剤を含有する配列を作成することができ、非常に大きなファイバーオプチックス配列が可能である。他の化学的官能性を含む同様の配列も構築することができる。一般に、配列は、微小球および基体のサイズ、ならびに配列の目的使用に応じて、２から１０億以上の生活性剤または化学的官能性もと多くを含み、かくして、非常に高い密度、高い密度、中程度の密度、低密度および非常に低い密度の配列を作成することができる。非常に高密度の配列についての好ましい範囲は、約１０，０００，０００ないし約２，０００，０００，０００要素であり、約１００，０００，０００ないし約１，０００，０００，０００が好ましい。高密度配列は約１０，０００ないし約１０，０００，０００要素の範囲であり、約１，０００，０００ないし約５，０００，０００が特に好ましい。約１０，０００ないし約５０，０００範囲の中程度の密度配列が好ましくは、約２０，０００ないし約３０，０００が特に好ましい。低密度配列は一般に１０，０００要素未満であり、約１，０００ないし約５，０００が好ましい。非常に低密度の配列は１，０００要素未満であり、約１０ないし約１０００が好ましくは、約１００ないし約５００が特に好ましい。いくつかの態様において、本発明の組成物は配列様式でなくてもよく；すなわち、ある態様においては、単一の生活性剤を含む組成物は同様に作成することができる。加えて、ある配列においては、複数の基体を異なるまたは同一の組成で使用することができる。かくして、例えば、大きな配列はより小さい複数の基体を含むことができる。
【００４１】
加えて、本組成物の１つの利点は、特にファイバーオプチックス技術を介して、極端に高い密度の配列を作成できることである。かくして、例えば、２００ｎｍのビーズを用いることができ、非常に小さなファイバーが知られているので、１ｍｍ2ファイバーオプチックス束において２５０，０００の異なるファイバーおよびビーズもと多くを有することが可能であり、得られる０．５ｃｍ2当たり１５，０００，０００より大の個々のビーズおよびファイバーの密度である。
【００４２】
組成物は基体を含む。「基体」または「固体支持体」または本明細書中で他の文法的に同等のものは、微小球の付着または会合に適した区別される個々のサイトを含有するように修飾でき、少なくとも１つの検出方法に適用可能ないずれの材料も意味する。当業者に認識されるように、可能な基体の数は非常に多く、限定されるものではないが、ガラスおよび修飾され機能化されたガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン等を含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリカ−ベースの材料（ケイ素および修飾されたケイ素を含む）、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光学ファイバー束、および種々の他のポリマーを含む。一般に、基体は光学検出を可能とし、認識できるように蛍光を発しない。
【００４３】
一般に、基体は平坦または平面であるが、当業者に認識されるように、他の立体配置の基体も同様に使用することができる；例えば、微小球への試料アクセスを可能としかるプラスチックの多孔性ブロツクに微小球を包埋させ、かつ検出用の共焦点顕微鏡を用いて、三次元立体配置を用いることができる。同様に、微小球は、フロースルー試料分析のためにチューブの表面内部に置いて、試料容量を最小化することができる。好ましい基体は、後記する光学線束、およびガラス、ポリスチレンおよび他のプラスチックおよびアクリルのごとき平面基体を含む。
【００４４】
基体の少なくとも１つの表面は、後の微小球の会合のために区別される個々のサイトを含有するように修飾される。これらのサイトは、微小球がウエル中にあるように、物理的に改変されたサイト、すなわち、微小球を保持できる基体中のウエルまたは小さな窪みのごとき物理的立体配置、または他の力（磁気的または圧縮的）、化学的に官能化されたサイトのごとき化学的に改変されたまたは活性なサイト、静電気的に改変されたサイト、疎水性／親水的に官能化されたサイト、接着スポット等の使用を含むことができる。
【００４５】
該サイトはパターン、すなわち、規則的なデザインまたは立体配置であってよく、またはランダムに分布してもよい。好ましい態様は、サイトがＸ−Ｙ座標面にアドレスすることができるように規則的パターンのサイトを利用する。この意味での「パターン」は反復単位セル、好ましくは、基体上で微小球の高密度を可能とするものを含む。しかしながら、これらのサイトは独立したサイトでなくてもよい。すなわち、例えば、いずれかの位置の微小球の付着を可能とする接着性または化学的官能性の均一な表面を使用することができる。すなわち、基体の表面は修飾されて、それらのサイトが他のサイトと隣接するか隣接しないかに拘わらず、個々のサイトにおける微小球の付着を可能とする。かくして、基体の表面は、単一関連微小球を有することができるにすぎない独立したサイトが形成されるように修飾することができ、基体の表面は修飾され、微小球はいずれの個所にも降りることができるが、それらは独立したサイトで終了する。
【００４６】
好ましい態様において、基体の表面はウエル、すなわち、基体の表面中の窪みを含有するように修飾される。これは、限定されるものではないが、フォトリソグラティー、スタンピング技術、成型技術およびミクロエッチングを含めた種々の技術を用いて当該分野で知られているようになすことができる。当業者に認識されるように、使用される技術は基体の組成および形状に依存する。
【００４７】
好ましい態様においては、物理的改変を基体の表面に行ってサイトを生じさせることができる。好ましい態様において、基体はファイバーオプチックス束であり、基体の表面はファイバー束の末端である。この態様において、ウエルは個々のファイバーを含むファイバーオプチックス束の末端または末梢端で作成される。この態様において、個々のファイバーのコアは、小さなウエルまたは窪みがファイバーの一端で形成されるように、クラッドに対してエッチングされる。ウエルの所要の深さはウエルに添加されるべき微小球、例えばビーズのサイズに依存するであろう。
【００４８】
一般的には、この態様においては、微小球はウエル中で共有結合していないが、ウエルは一般的には後記するごとくさらに化学的に官能化することができ、架橋剤を用い、または物理的バリアーを用いることができ、すなわち、微小球上のフイルムまたは膜である。
【００４９】
好ましい態様において、基体の表面は、本発明の微小球を基体上の独立したサイトまたは位置に共有結合的にまたは非共有結合的に付着させるのに用いることができる化学的に修飾されたサイトを含有するように修飾される。この意味において「化学的に修飾されたサイト」は、限定されるものではないが、一般的には対応する反応性官能基を含有する、微小球を共有結合的に付着させるのに使用できる、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基を含めた化学的官能基のパターンの付加；（接着剤の付加または接着剤の直接的付加のための先行化学的機能化によって）微小球に結合するのに使用することができる接着剤のパターンの付加；微小球の静電的付着のための、すなわち、微小球がサイトとは反対の荷電基を含む場合の、（化学的官能性化と同様の）荷電基のパターンの付加；実験条件下で同様に疎水性または親水性の微小球の付加の結果、ヒドロ親和性ベースでサイトへの微小球の会合となるように、サイトを差分的に疎水性または親水性とする化学的官能基のパターンの付加を含む。例えば、水性系における疎水性ビーズでの疎水性サイトの使用は、優先的にサイトへのビーズの会合を駆動する。前記で概説したごとく、この意味での「パターン」は、独立したサイトにおけるビーズの付着を可能とする表面の均一な処理、ならびに独立したサイトが得られる表面の処理の使用を含む。当業者に認識されるように、これは、種々の方法で達成することができる。
【００５０】
本発明の組成物は、さらに、微小球の集団を含む。ここに「集団」とは、配列につき前記で概説した複数の微小球を意味する。集団内には別々の部分集団があり、これは、単一の微小球または複数の同一の微小球であり得る。すなわち、いくつかの態様では、後記でより詳細に概説するごとく、配列は各生活性剤につき単一の微小球のみを含有することができる；好ましい態様は複数の各タイプの微小球を利用する。
【００５１】
本明細書中の「微小球」または「ビーズ」または「パターン」または文法的同等体は小さな区別される粒子を意味する。ビーズの組成物は、生活性剤のクラスおよび合成の方法に依存して、変化するであろう。適当なビーズ組成物は、ペプチド、核酸、および限定されるものではないが、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル、炭素、黒鉛、二酸化チタン、ラテックスまたはセファロース(Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ)のごとき架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセルおよびテフロンを含めた有機サイトを用いることができる。
【００５２】
合成ビーズは、種々の縮合またはビニル前駆体モノマーを重合または共重合することによって、または組み合わせたポリマー合成によって、製造することができる。かかるポリマーは、リン酸トリトリル（ＴＴＰ）、リン酸トリフェニル（ＴＴＰ）またはフタル酸ジブチル（ＤＢＰ）のごとき可塑剤の添加によってさらに修飾することができる。センサー配列部分集団で使用される特に有用な色素解読ビーズ候補は、種々の蒸気アナライトへの暴露に際しての膨潤、その化学的構造による特徴的極性の差異、または種々の蒸気アナライトでの特徴的な化学的吸収応答いずれかを呈するポリマーおよびコポリマー材料である。ビーズ材料として候補ポリマーをプレスクリーニングし、所望の膨潤に基づいて候補を評価することにおいて、２つの特に有用な文献はＲ．Ａ．ＭｃＧｉｌｌら，Ｃｈｅｍｔｃｈ，９月２４日，１９９６，２７−３７頁およびＪ．Ｗ．Ｇｒａｔｅら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６８：９１３−７（１９９６）である。
【００５３】
種々のビーズ化学を非常に多様なセンサービーズ部分集団を製造するのに利用することができる。例えば、以下の組成物は候補ビーズ材料であることが判明している：シリカ、ポリ（エチレングリコール）、ポリカプロラクトン、ポリ（１，４−ブチレンアジペート）、ＰＤＰＯ［ポリ（２，６−ジメチル−１，４−フェニレンオキシド）］、ＰＳ０７８．５［トリエトキシシリル−修飾ポリブタジエン（トルエン中５０％）］、ＰＳ０７８．８［トルエン中ジエトキシメチルシリル−修飾ポリブタジエン］、ＣＰＳ２０６７［アクリルオキシプロピルメチル−シクロシロキサン］、ＰＳ８０２［（８０−８５％）ジメチル−（１５−２０％）（アクリルオキシプロピル）メチルシロキサンコポリマー］、ＰＳ９０１．５ポリ（アクリルオキシプロピル−メチル）シロキサン］、ＰＳ８５１［（９７−９８％）ジメチル−（２−３％）（メタクリルオキシプロピル）メチルシロキサンコポリマー］、ＰＡＢＳ［ポリ（アクリロニトリル−ブチジエン−スチレン）］、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（スチレン−アクリロニトリル７５：２５）、アクリルオキシプロピルメチルシロキサン−ジメチルシランコポリマー、メチルスチレン、ポリスチレン、アクリルポリマー、およびポリ（メチルスチレン／ジビニルベンゼン）。Ｃ8、Ｃ18およびフェニルヘキシルを含むビーズのごとき、フェノメネックスカラムで使用される種々の結合相に適合した商業的に入手可能なシリカビーズのごとき他の吸着剤はセンサービーズマトリックスとして有用である。アルミナおよびゼオライトのごとき無機材料も利用することができる。識別可能で適切な膨潤挙動、極性および化学的吸収特性を有するポリマーおよびコポリマーもまたビーズ候補材料として予測される。特に有用なビーズ候補材料は、出典明示して本明細書の一部とみなすＷａｌｔらに対する米国特許第５，５１２，４９０号の表７、表８および表１０にリストされているラポリマー、コポリマー、およびポリマー化モノマーを含む。別の態様において、いずれかの合成されたまたは商業的に入手可能なビーズ材料は、さらに、表面処理またはコーティングいずれかを適用して特徴的な光学応答標示を修飾することによって修飾することができる。例えば、多孔性シリカビーズを利用する場合、Ｎ−オクタデシルトリエトキシシランまたは３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートをシラン化処理として適用することができる。一般に、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ  ＩＮからの「Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」はビーズ材料の選択において助けとなるガイドである。
【００５４】
特定のセンサー配列においてセンサー配列要素を形成するのに使用される部分集団の選択は、主として、センサーの分析目的および検出で標的化される特異的アナライトに基づいて測定される。典型的には、微小球部分集団は、標的アナライトの存在下で励起光エネルギーによって照射する場合、その特徴的光学応答標示の区別できる差異に基づいて選択される。自己コード化センサー配列を製造するにおいて、レポーティング色素を浸透させ、参照アナライトおよび標的アナライト双方の存在下で、励起光エネルギーによって照射した場合、特徴的光学応答標示を有する微小球部分集団が選択される。かくして、センサー配列で好ましい微小球材料は、励起光エネルギーによって照射した場合にアナライトの存在下で特徴的光学応答標示を生じる微小球部分集団における物理的または化学的差異に基づいてプレ選択される。
【００５５】
ビーズ材料極性、化学的構造、化学的官能性、微小球表面積、微小球孔サイズ、微小球膨潤特徴、または化学的吸着挙動のごとき特徴は、別々にまたは組み合わせて、所与の微小球部分集団の特徴的光学応答標示に寄与する。１つの態様において、蒸気および液体アナライトを含めた流体に浸透するまたは半透性のビーズ材料が好ましい。もう１つの態様において、蒸気または液体アナライトのごとき流体と接触するに際して膨潤するビーズ材料が好ましい。一般に、ユニークな極性、構造、孔サイズ、表面積、官能性または吸着特徴を有するビーズ材料は本発明のセンサービーズ材料で特に有用である。
【００５６】
微小球は、特徴的ビーズマトリックス材料と組み合わせて、ビーズを同定するのに使用でき、かくして、参照アナライトへの暴露に際して、付着された生活性剤を同定するのに使用できる光学応答標示を提供するレポーティング色素を含む。すなわち、微小球の部分集団（すなわち、各センサー要素）は、微小球のその部分集団のユニークな生活性剤または化学的機能性を同定するのに使用することができるユニークな光学応答標示または光学タグを含む；ユニークな特徴的光学応答標示を含むビーズは、異なる光学応答標示を持つ他の位置におけるビーズから区別することができる。ここに概説するごとく、各生活性剤は、その生活性剤を含むいずれの微小球も参照アナライトまたは流体への暴露に際して特徴に基づいて同定可能であるように、会合したユニークな光学応答標示を有するであろう。後記にてより詳細に概説するごとく、例えば、もう１つのレベルの同定を用いる場合、例えば、異なるサイズのビーズを用いる場合、または配列に異なるバッチのビーズを順次負荷する場合、光学応答標示を再使用または複製することができる。
【００５７】
化学的色素インジケーターの選択は、本発明のファイバーオプチックスセンサー配列系のデザインにとり同等に重要である。好ましい態様において（図１参照）、少なくとも１つの色素１１を微小球１０に取り込む。好ましい態様において、この色素１１は、センサー配列中の微小球部分集団位置を同定するための解読色素、および注目する標的アナライトを検出するためのレポーティング色素双方として作用する。別の態様において、２以上の色素をコード化レポーター色素として利用することができる。好ましい態様において、少なくとも１つの色素を解読色素として用い、レポーティング色素としての分析の間に別の色素を添加する。２以上のコード化色素を使用する１つの態様において、色素対に対するピーク強度の比率は、微小球部分集団をコード化するのに使用することができ、別のレポーター色素を分析の間に付加することができる。別の態様において、アクリロイルフルオレセインのごとき共役色素を利用することができ、ここに、色素を直接的に合成ポリマーまたはコポリマービーズ材料に配合するのが望ましい。
【００５８】
レポーター色素１１は色原体タイプまたは発蛍光体タイプのいずれかであり得るが、蛍光色素が好ましい。何故ならば、蛍光シグナルの強度は解読する場合に良好なシグナル−ノイズ比率を提供するからである。最も好ましい態様では、極性−感受性色素またはソルバトクロミック色素が利用される。ソルバトクロミック色素は、その吸収または発光スペクトルがその周囲の環境の極性に対して感受性であり、それによって改変される。典型的には、これらの色素は局所的極性の変化のためピンク色発光波長を呈する。かかる波長シフトを引き起こす極性変化は、特定のセンサー微小球部分集団で使用される微小球マトリックス、または標的アナライトの存在によって導入することができる。極性の変化は、ビーズタイプの部分集団をコード化するのに、および特異的標的アナライトを検出するのに有用な特徴的光学応答標示を生じる。１つの好ましいソルバトクロミック色素、ナイルレッド（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）は、局所的環境極性の変化に伴ってその発光波長ピークにおいて大きなシフトを呈する。加えて、ナイルレッドは広範囲の溶媒に可溶性であり、光化学的に安定であり、比較的強い蛍光ピークを有する。当該分野で通常に知られており、本発明で色素として使用することができるさらなる色素はＷａｌｔらに対する米国特許第５，５１２，４９０号で見いだすことができ、そのうち表３、表４、表５、表６および表１１は本明細書の一部を構成する。
【００５９】
微小球検知要素の異なる部分集団は、種々の組成のポリマーマトリックスにナイルレッドを一体化させることによって本発明のセンサー配列で製造することができる。種々の極性、疎水性、孔サイズ、柔軟性および膨潤傾向の異なるポリマーマトリックスから作成した微小球部分集団にナイルレッドを配合することによって、個々の流体の分子と異なって反応するセンサー微小球のユニークな部分集団が生産され、有機流体に暴露した場合に異なる蛍光応答を生じる。この結果、種々のアナライトに暴露した場合に特徴的光学応答標示を有する各微小球部分集団がもたらされる。
【００６０】
好ましい態様において、色素は微小球の表面に共有結合される。これは、微小球の表面上の官能基を用い、生活性剤の付着につき後記で一般的に概説したごとくになすことができる。当業者に認識されるごとく、これらの付着は色素に対する効果を最小化するためになされる。
【００６１】
好ましい態様において、色素は、一般的には、ビーズマトリックスまたはビーズの孔に色素を捕獲することによってビーズと共有結合的に会合させる。
【００６２】
１つの態様において、色素は微小球よりはむしろ生活性剤に付加されるが、これは一般的には好ましくはない。
【００６３】
図２は、センサー微小球部分集団およびセンサー微小球配列の調製を説明するプロセスダイアグラムである。工程５０において、種々の微小球部分集団の懸濁液は商業的に入手可能なビーズ材料または好ましいポリマー材料から作成された合成ビーズ材料から個々に調製される。この工程では、ビーズはプレ洗浄され、実施例２および実施例３で使用されるシラン化溶液のごときカップリング剤で表面処理され、あるいは実施例６で使用されるＴＴＰ、ＴＰＰまたはＤＢＰのごとき可塑剤で処理される。微小球部分集団を調製するにおいて、各ビーズグルーピングは、典型的には、分散を強化するための界面活性剤または分散剤の添加を含み得る適当な溶媒に分散される。例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートは界面活性剤として特に有用であることが判明している。
【００６４】
色素溶液は、引き続いての同定のために微小球部分集団の各々をタギングまたはコード化し、後の解読工程でセンサー配列において部分集団にインデックスを付すために調製される５１。最も好ましい態様において、単一の色素は、色素をコード化するセンサー微小球部分集団として、および標的アナライトの存在を検出するのに使用されるアナライトレポーティング色素として働く。もう１つの態様において、色素はセンサービーズ部分集団をコード化するためにだけ働き、さらなる色素は標的アナライトの検出用レポーター色素として働く。１つの態様において、２以上の色素が微小球部分集団に配合され、色素対のピーク強度比をセンサー微小球部分集団をコード化するために使用することができる。典型的には、単一のソルバトクロミック色素をコード化色素およびレポーティング色素として使用する。好ましい態様においては、ナイルレッド色素（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を用いる。各微小球部分集団へ色素を配合するには、工程５０で調製されたビーズの懸濁液を、工程５１で調製された色素溶液と工程５２で混合する。好ましくは、工程５２においては、ビーズまたは微小球は、微小球を膨潤させる有機溶媒中に溶解させた色素を含む色素溶液中に入れる。工程５４においては、ビーズを洗浄し、遠心しまたは濾過して、過剰の色素を除去する。微小球は、典型的には、水、メタノール、または微小球を膨潤させないいずれかの適当な溶媒中で洗浄し、ここに、色素は依然として可溶性である。これは、微小球から色素をすすぐことなく、残存する色素をすすぎ去ることを可能とする。別の態様において、過剰の色素の除去に続き、化学的サイトまたは官能基をビーズ表面に付着させることができる。
【００６５】
ビーズは球形である必要は無く；不規則な粒子を用いることもできる。多孔性および非多孔性ビーズを利用することができるが、レポーター色素を浸透させ、レポーター色素、生活性剤等の付着のための表面積の増加のため、微小球センサーの応答性および感受性を増強させるのに好ましい。ビーズサイズは、ナノメーター、すなわち１００ｎｍからミリメーター、すなわち１ｍｍの範囲であり、約０．２ミクロンないし約２００ミクロンのビーズが好ましく、約０．５ないし約５ミクロンが特に好ましいが、いくつかの態様では、より小さいビーズを用いることができる。図１は、ビーズ孔１２内に捕獲されたレポーティング色素１１を含む典型的なビーズまたは微小球センサー１０の構成を説明する。
【００６６】
本発明の鍵となる構成は、ビーズがアッセイの間に移動しないように、基体の表面の独立したサイトにおけるビーズの会合または付着を可能とする基体／ビーズ対合の使用であることに注意すべきである。
【００６７】
本発明は、ビーズベースの分析化学系を具体化し、ここに、ビーズまたは微小球は種々の無機または有機材料から製造され、ここに、各材料は、励起光エネルギーで照射しつつ、参照アナライトへの暴露に際して、センサー配列内の特別のビーズの同一性および位置を保証するのを可能とする特徴的一時的光学応答標示によって同定することができる。本発明は、励起光エネルギーのいずれかの源の利用を提供し、特異的波長に限定されない。励起光の主要な要件は、それが、所与のビーズ組成物に会合したレポーター色素の照射に際して、特徴的波長の発光された光を生じることである。
【００６８】
好ましい態様において、微小球は、さらに、生活性剤を含む。「候補生活性剤」または「生活性剤」または「化学的機能性」または「結合リガンド」とは、本明細書で用いるごとく、本発明の微小球に付着させることができるいずれかの分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小さな有機分子、多糖、ポリヌレオチド等を記載することを意味する。本発明の組成物は、２つの主要な用途を有する。好ましい態様において、後記にてより詳細に記載されるごとく、組成物は特定の標的アナライトの存在；例えば、酵素、抗体、または抗原のごとき、特定のヌクレオチド配列または特定のタンパク質の存在または不存在を検出するのに使用される。別の好ましい態様において、組成物は、特定の標的アナライトに結合させるための、生活性剤、すなわち、薬物候補をスクリーニングするのに使用される。
【００６９】
生活性剤は多数の化学的クラスを含むが、典型的には、それらは、有機分子、好ましくは、１００を超えて約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物である。生活性剤はタンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの機能的化学基を含む。生活性剤は、しばしば、１以上の前記官能基で置換された環状炭素または複素環構造および／または芳香族またはポリ芳香族構造を含む。生活性剤は、ペプチド、核酸、多糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造アナログまたは組合せを含めた生体分子の中で見いだされる。特に好ましいものは核酸およびタンパク質である。
【００７０】
生活性剤は合成および天然化合物のライブラリーを含めた広い範囲の源から得ることができる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現を含めた、広い範囲の有機化合物および生体分子のランダムおよび指向された合成で多数の手段が利用できる。別法として、細菌、菌類、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが入手でき、容易に生産される。加えて、天然または合成により生産されたライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生物化学的手段を介して容易に修飾される。公知の薬理剤を、アシル化、アルキル化、エステル化および／または増幅のごとき指向されたまたはランダムな化学的修飾に付して、構造的アナログを生成させることができる。
【００７１】
好ましい態様において、生活性剤はタンパク質である。ここに「タンパク質」とは、少なくとも２つの共有結合されたアミノ酸を意味し、これはタンパク質、ポリペプチド、オルゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は天然に生じるアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチドミメティック構造よりなることができる。かくして、本明細書で用いる「アミノ酸」または「ペプチド残基」は天然に生じるおよび合成のアミノ酸を共に意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは本発明の目的のアミノ酸と考えられる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｌ）立体配置である。好ましい態様において、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−立体配置である。もし非天然側鎖が用いられれば、非アミノ酸置換基を用いて、例えば、インビボ分解を防止し、または遅らせることができる。
【００７２】
１つの好ましい態様において、生活性剤は天然に生じるタンパク質または天然に生じるタンパク質の断片である。かくして、例えば、タンパク質、タンパク質性細胞抽出物のランダムまたは指向された消化物を含有する細胞抽出物が使用することができる。このようにして、原核生物および真核生物タンパク質のライブラリーを、ここに記載する系をスクリーニングするのに作成することができる。この態様で特に好ましいものは、細菌、菌類、ウイルス、および哺乳動物のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【００７３】
好ましい態様において、生活性剤は約５ないし約３０個のアミノ酸のペプチドであり、約５ないし約２０個のアミノ酸が好ましく、約７ないし約１５個が特に好ましい。ペプチドは、前記で概説した天然に生じるタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または「バイアス化」されたランダムペプチドであり得る。「ランダム化された」または文法的に同等のものは、ここでは、各核酸およびペプチドが、各々、ランダムヌクレオチドおよびアミノ酸より実質的になることを意味する。一般的にこれらのランダムペプチド（または後記する核酸）は、化学的に合成されるので、それらはいずれかのヌクレオチドまたはアミノ酸をいずれかの位置に取り込むことができる。合成プロセスは、ランダム化タンパク質または核酸を生成させ、配列の長さにわたって可能な組合せの全てまたはほとんどの形成を可能とし、かくして、ランダム化された生活性タンパク質性剤のライブラリーを形成するように設計することかできる。
【００７４】
好ましい態様において、生活性剤のライブラリーが使用される。ライブラリーは、標的アナライトに対して恐らくは十分な範囲の結合を行うための生活性剤の十分に構造的に多様な集団を提供するはずである。従って、相互作用ライブラリーは、そのメンバーの少なくとも１つが標的アナライトに対する親和性をそれに与える構造を有するように、十分に大きくなければならない。相互作用ライブラリーの必要な絶対的サイズを正確に計るのは困難であるが、天然は免疫応答に関してヒントを提供し；１０7〜１０8の異なる抗体の多様性は生物が直面する最も可能な抗原と相互作用する十分な親和性との少なくとも１つの組合せを提供する。公表されたイン・ビトロ選択技術は、１０7〜１０8のライブラリーサイズが標的に対する親和性を持つ構造を見いだすのに十分であることを示している。かくして、好ましい態様において、少なくとも１０6、好ましくは少なくとも１０7、より好ましくは少なくとも１０8、最も好ましくは少なくとも１０8の異なる生活性剤が主題の方法で同時に分析される。好ましい方法はライブラリーサイズおよび多様性を最大化させる。
【００７５】
１つの態様において、ライブラリーは十分にランダム化され、いすれかの位置における配列優先性または一定性はない。すなわち、配列内のいくつかの位置は一定に保持されるか、または限定された数の可能性から選択される。例えば、好ましい態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、架橋のためのシステイン、ＳＨ−３ドメインのためのプロリン、リン酸化サイトのためのセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジンの生成に向けて、またはプリン等に対して、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体障害的に片寄った（小または大）残基の規定されたクラス内でランダム化される。
【００７６】
好ましい態様において、生活性剤は核酸である（一般に、ここでは「プローブ核酸」または「候補プローブ」）である。ここでの「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的に同等のものは、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有するが、ある場合には、後記で概説するごとく、例えば、ホスホルアミダイト（Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４９（１０）；１０２５およびその中の文献； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）； Ｓｐｒｉｎｚｌら，Ｅｎｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１：５７９（１９７７）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）； Ｓａｗａｉら，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８０５（１９８４）， Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０；４４７０（１９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら，Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ，２６：１４１（１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、およびペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１９８５（１９９２）； Ｍｅｉｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３１：１００８（１９９２）； Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）； Ｃａｒｉｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：２０７（１９９６），これらの全てが本明細書の一部を構成する）を含む別の骨格を有してもよい核酸アナログが含まれる。他のアナログ核酸は陽性骨格（Ｄｅｎｐｃｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６０９７（１９９５））；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号；第５，６３７，６８４号；第５，６０２，２４０号；第５，２１６，１４１号および第４，４６７，８６３号； Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｌら，Ａｎｇｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ，３０：４２３（１９９１）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：４４７０（１９８８）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１３：１５９７（１９９４）；Ｃｈａｐｔｅｒｓ２ ａｎｄ ３，ＡＳＣ シンポジウムシリーズ５８０，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，編集Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｌ ａｎｄ Ｐ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ； Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，４：３９５（１９９４）； Ｊｅｆｆｓら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，３４：１７（１９９４）； Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，３７：７４３（１９９６）��および非リボソーム骨格（米国特許第５，２３５，０３３号および第４５，０３４，５０６号，および第６および７章，ＡＳＣ シンポジウムシリーズ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，編集Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｌおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋに記載されているものを含む）を含む。１以上の炭素環糖を含有する核酸もまた核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，（１９９５） １６９−１７６頁）。いくつかの核酸アナログがＲａｗｌｓ，Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ，Ｊｕｎｅ ２，１９９７，３５頁に記載されている。これら文献の全てが本明細書の一部を構成する。リボソーム−ホスフェート骨格のこれらの修飾は、かかる標識のごときさらなるサイトの付加を容易とし、または生理学的環境におけるかかる分子の安定性および半減期を増加させるためになされる。加えて、天然に生じる核酸およびアナログの混合物は作成することができる。別法として、異なる核酸の混合物、および天然に生じる核酸およびアナログの混合物を作成することができる。核酸は特定されるごとく一本鎖または二本鎖であってよく、あるいは二本鎖または一本鎖配列の双方の部分を含有することができる。核酸はＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドであることができ、ここに、核酸はデオキシリボ−およびリボ−核酸のいずれかの組合せ、ウラシル、アデニン、チミジン、シトシン、ギアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニジンを含めた塩基、およびニトロピロールおよびニトロインドール等のごとき塩基対アナログを含有する。
【００７７】
タンパク質について一般的に前記したごとく、核酸生活性剤は天然に生じる核酸、ランダム核酸、または「バイアス化」されたランダム核酸であり得る。例えば、原核生物または真核生物の消化物をタンパク質につき前記で概説したごとくに使用することができる。
【００７８】
一般に、本発明のプローブは、標的および本発明のプローブのハイブリダイゼーションが起こるように、標的配列（前記したごとく、試料の標的アナライト配列または他のプローブ配列）に相補的に設計される。この相補性は、完全である必要は無く；標的配列および本発明の一本鎖核酸の間のハイブリダイゼーションと干渉するいずれかの数の塩基対ミスマッチがあり得る。しかしながら、もし突然変異の数が余りにも多くてハイブリダイゼーションが最もストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下で起こり得るならば、配列は相補的標的配列ではない。かくして、「実質的に相補的な」とは、プローブが標的配列に十分に相補的で選択された反応条件下でハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は当該分野で知られている；例えば、本明細書の一部を構成するＭａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９およびＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編参照。ストリンジェントな条件は配列−依存的であり、異なる条件において異なるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対するかなりのガイドが、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３）に見いだされる。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度ｐＨにおいて特異的配列についての熱融解点（Ｔm）よりも約５−１０℃低く選択される。該Ｔmは標的に相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔmにおいて、プローブの５０％が平衡時に占められる）。ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０ないし８．３において、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には、０．０１ないし１．０Ｍナトリウムイオン濃度であり、該温度は短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも大）では少なくとも約６０℃である。また、ストリンジェント条件は、ホルムアミドのごとき脱安定化剤の添加で達成することができる。もう１つの態様において、よりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件が使用される；例えば、当該分野で知られているように、中程度または低いストリンジェンシーを用いることができる；ＭａｎｉａｔｉｓおよびＡｕｓｕｂｅｌ、前掲、およびＴｉｊｓｓｅｎ参照。
【００７９】
本明細書における「標的配列」または文法的同等のものは、核酸の一本鎖上の核酸配列を意味する。標的配列は遺伝子の一部、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡその他を含めたＲＮＡであってよい。それはいずれの長さであってもよく、より長い配列がより特異的であることが理解される。当業者に理解されるように、相補的標的配列は多くの形態を取り得る。例えば、それは長い核酸配列、すなわち、遺伝子またはｍＲＮＡの全てまたは一部、とりわけ、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限断片に含有されていてもよい。後記で十分概説されるように、プローブは、試料中の標的配列の存在または不存在を測定するために標的配列にハイブリダイズされる。一般に、この用語は当業者に理解されるであろう。
【００８０】
好ましい態様において、生活性剤は有機化学部分、文献で入手可能な種々のものである。
【００８１】
好ましい態様において、各ビーズは、単一タイプの生活性剤よりなるが、複数の個々の生活性剤は好ましくは各ビーズに付着される。同様に、好ましい態様は、ユニークな生活性剤を含有する１を超える微小球を利用する、すなわち、微小球の部分集団の使用によって系に作られた縮重があり、部分集団中の各微小球は同一の生活性剤を含有する。
【００８２】
当業者に認識されるように、生活性剤は直接ビーズ上に合成されるか、あるいはそれらは作成され、次いで、合成後に付着させることができる。好ましい態様において、リンカーを用いて、生活性剤をビーズに付着させて、良好な付着、十分な柔軟性を可能として、標的分子との良好な相互作用を可能とし、また望ましくない結合反応を回避する。
【００８３】
好ましい態様において、生活性剤はビーズ上に直接的に合成される。当該分野で知られているように、化学化合物の多くのクラスは、ペプチド、有機部分および核酸のごとく、現在は固体支持体上に合成される。現在の合成技術を調節してビーズを用いるのは比較的直裁的な方法である。
【００８４】
好ましい態様においては、生活性剤がまず合成され、次いで、ビーズに共有結合される。当業者に認識されるように、これは、生活性剤の組成およびビーズに依存してなされる。チオール、アミン、カルボキシル等のごとき化学的に反応性の基である種のポリマーのごとき固体支持体表面を機能性化することは、当該分野で一般的に知られている。従って、使用者による所望の機能性の付与を容易とする表面化学を有する「ブランク」微小球を用いることができる。ブランク微小球用のこれらの表面化学のいくつかの例を表１にリストする。
【００８５】
これらの官能基を用いて、一般的に、公知の化学を用い、いずれかの数の異なる生活性剤をビーズに付加することができる。例えば、炭水化物を含有する生活性剤をアミノ−機能性化支持体に付着させることができ、標準的な技術を用い、炭水化物のアルデヒドを作成し、次いで、アルデヒドを表面のアミノ基と反応させる。別の態様において、スルフヒドリルリンカーを用いることができる。システイン含有タンパク質性剤を支持体に付着させるのに用いることができるＳＰＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチルおよびピリジルジスルフィドのごとき当該分野で知られている多数のスルフヒドリル反応性リンカーがある（例えば、本明細書の一部を構成する１９９４年のＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙカタログ、架橋剤についての技術セクション、１５５−２００頁参照）。別法として、生活性剤上のアミノ基を、表面のアミノ基への付着に用いることができる。例えば、ホモ二機能性およびヘテロ二官能性リンカーを含めた非常に多数の安定な二官能性基が当該分野でよく知られている（Ｐｉｅｒｃｅカタログおよびハンドブック、１５５−２００頁）。さらなる態様において、（表面からのまたは生活性剤からの）カルボキシル基はよく知られたリンカーを用いて誘導体化させることができる（Ｐｉｅｒｃｅカタログ参照）。例えば、カルボジイミドはアミンのごとき良好な求核試薬による攻撃のためのカルボキシル基を活性化する（本明細書の一部を構成するＴｏｒｃｈｉｌｉｎら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，７（４）：２７５−３０６（１９９１）参照）。また、例えば、ポリマーへの抗体の付着のための、当該分野で知られている他の技術を用い、タンパク質性生活性剤を付着させることもできる（Ｓｌｉｎｋｉｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２：３４２−３４８（１９９１）； Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら，前掲； Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら，Ｂｉｏｃｎｊ．Ｃｈｅｍ．３：３２３−３２７（１９９２）； Ｋｉｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１７６−６１８５（１９９４）；およびＷｉｌｂｕｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：２２０−２３５（１９９４）参照、その全てが本明細書の一部を構成する）。生活性剤は前記リストしたものを含めて、種々の方法で付着させることができる。重要なことは、付着の方法が生活性剤の機能性を有意には改変しないことである；すなわち、生活性剤は、その標的との相互作用を可能とするように柔軟な方法で付着させるべきである。
【００８６】
【表１】
2010249826.tif 000002
【００８７】
微小球上に酵素を固定化する特異的技術は当該分野で知られている。１つの場合において、ＮＨ2表面化学微小球を用いる。表面活性化は、６．９のｐＨを供するリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭ）中の２．５％グルタルアルデヒド（１３８ｍＭ、ＮａＣｌ、２．７ｍＭ、ＫＣｌ）で達成される。これは、室温でほぼ２時間撹拌ベッドで撹拌される。次いで、微小球を超純粋＋０．０１％ツイーン(Tween)２０（界面活性剤）−０．０２％ですすぎ、ｐＨ７．７のＰＢＳ＋０．０１％ツイーン２０で再度すすぐ。最後に、好ましくは、０．４５μｍのアミコンミクロピュアフィルターを用いて予備濾過した後、酵素を溶液に添加する。
【００８８】
前記した、工程５０ないし５４の方法によって、所望の数の微小球部分集団を調製した後、典型的には、該部分集団を工程５５で組み合わせて、工程５６で配列基体上に部分集団混合物を分散させるに先立ちセンサー配列要素として用いるための部分集団のランダム混合物を得る。好ましい態様において、図３は、ファイバーオプチックス束センサー配列中への自己コード化センサー微小球部分集団を調製および設置を説明する模式的プロセスダイアグラムを示す。別の態様において、工程５５は省略することができ、センサー微小球部分集団の各々を、所定の位置にある配列基体上に別々にかつ順次に位置させることができる。
【００８９】
かくして、一旦、少なくとも１つの生活性剤および自己コード化レポーター色素を含む微小球を作成すれば、微小球を基体の表面の独立したサイトに付加する。これは多数の方法でなすことができるが、一般的には、微小球の独立したサイト上へまたはサイトへ会合させることを可能とするであろう条件下でビーズを表面に添加することを含む。ビーズの表面への会合は、例えば、化学的付着サイトが基体およびビーズ双方に付加される場合、ビーズを表面に結合させることを含む；静電性またはヒドロ親和性（荷電している場合）、疎水性または親水性を、結合の基礎として用いる；接着剤の使用のごとき物理的であるが非共有結合的付着；または空間的付着、例えば、ウエル内のビーズの局所化。いくつかの態様において、例えば、配列上での架橋剤、フイルムまたは膜の使用を介して、最初の局所化の後により永久的な付着を行うのが好ましいであろう。
【００９０】
後記で概説する種々の匹敵するプロセスを用い、微小球系を光学ファイバー束の末梢端に付着させることができる。微小球は束の端部近くに位置させるのが重要である。これは、各光学ファイバーにおける光の戻りが圧倒的に単一微小球から来ることを保証する。この特徴は、個々の微小球の光学応答標示の応答性によって微小球の機能性を含む反応を同定するのを可能とするのに、また、それらの微小球に含有された色素／ビーズ組を解読するのを可能とするのに必要である。しかしながら、接着または付加技術は微小球をアナライトから化学的に隔離しなければならない。
【００９１】
図７は、本発明の光学ファイバーセンサー２００および関連する制御系２１０を示す模式的ブロックダイアグラムである。ファイバーオプチックスセンサー２００は、典型的には、数千の別々のクラッドの独立したファイバーから構築されたファイバーオプチックス束２０２（Galileo Electro-Optics, Stuebridge, MA)を含み、光が個々のファイバーの間で混合しないように各々のファイバーは直径が数ミクロンにすぎない。ある範囲の個々のファイバーまたはある範囲の個々のファイバーの直径を有するいずれの適当なファイバーオプチックス束２０２も使用することができる。微小球またはビーズセンサー配列１００は、束の末梢端２１２に付着させ、近接端２１４は、焦点合わせ用の配列１００の垂直位置決定のための通常のｚ−翻訳顕微鏡ステード２１６、および光学トレインを持つ配列１００の水平整列のためのｘ−ｙミクロポジショナー２１８(Burleigh Instruments, Fishers, NY）に受容される。これらの２つの構成要素は、顕微鏡対物レンズ２２０用の束２０２の近接端２１４を位置決定するのに強調して作用する。対物レンズ２２０によって集められた光は、４位置二色キューブホイール２２２を持つ反射光蛍光アタッチメントへと通過する。該アタッチメントは対物レンズ２２０を通って７５ワットのキセノンアーク灯２２４から光を挿入して、ファイバー束２０２にカップリングさせるのを可能とする。光源２２４からの光は、集光レンズ２２６によって集光され、次いで、フィルターおよびシャッターホイール２２８によって濾過されおよび／または遮断される。
【００９２】
束２０２からの末梢端２１２から戻る光は、アタッチメント２２２によって通過し、次いで、遮断され、第２のホイール２３４によって濾過される。次いで、光を電荷カツプルドデバイト（ＣＣＤ）カメラ２３８上に結像させる。通常のコンピューター２３８がイメージングプロセッシングソフトウェアを行って、ＣＣＤカメラ２３６からの情報を加工し、また、恐らくは、第１および第２シャッターおよびフィルターホイール２２８、２３４を制御する。マッキントッシュまたはＩＢＭ−コンパチブルパーソナルコンピューターを、インスツルメンテーションおよびデータ獲得を制御するために利用することができる。該インスツルメンテーションおよび、ファイバーオプチックスセンサー２００を除外して、ファイバーオプチックスセンサー２００の近接端２１４に配置された光学装置は、Bronkら, Anal. Chem. 67(17):2750-2752(1995)およびBronkら, Anal. Chem. 66:3519(1994)によってより完全に開示されている。
【００９３】
ビーズセンサー配列１００は、種々のコンパチブルプロセスを用い、光学ファイバー束２０２の末梢端に付着させることができる。微小球１０は束の端部塚国位置させるのが重要である。これは、各独立した光学ファイバー中で戻る光が圧倒的に単一微小球のみから来ることを保証する。この特徴は、ビーズのタイプおよび位置を共に同定する目的で自己コード化微小球部分集団を解読し、微小球部分集団内の個々の微小球の光学標示の応答性を可能とし、シグナル−ノイズを低下させ、シグナル増強を改良するための各部分集団内の個々のビーズ応答の合計を提供するのに必要である。しかしながら、ビーズの接着または付着はアナライトから微小球を化学的に隔離し、または光学的測定に緩衝してはならない。
【００９４】
図５Ａおよび５Ｂは、ビーズをセンサー配列基体に付着させる好ましい方法を説明する顕微鏡写真である。マイクロウエル２５０は、ファイバーオプチックス束２０２の末梢端２１２に形成され、微小球１０はマイクロウエルのキャビティー２５０に挿入される。マイクロウエル２５０はファイバーオプチックス束２０２の各光学ファイバー２５２の中心に形成される。図５Ｂに示すように、マイクロウエル２５０のサイズは、微小球１０がマイクロウエル２５０内に置くことができるように、微小球１０のサイズに協調される。かくして、束２０２の各光学ファイバー２５２はそのウエルに含有された単一微小球１０からの光を運ぶ。結果として、束２０２の端部をＣＣＤ配列２３６上にイメージすることによって、微小球１０の光学標示は個々に応答性である。
【００９５】
図４は、いかにして、マイクロウエル２５０が形成され、微小球１０がマイクロウエル中に置かれるかを説明する。１つの態様において、断面ほぼ３．７μｍのコアを有するほぼ２０，６００の個々の光学ファイバーを含む１ｍｍ六方充填イメージングファイバー束２０２を使用した（Galileo Fibers, Sturbridge, MAからのPart No. ET26）。典型的には、各ファイバーのコアは、ガラス硬度およびファイバー製造の間の延伸の結果として六角形形状である。しかしながら、ある場合において、該形状は円であり得る。
【００９６】
工程２７０において、ファイバー束２０２の近接端２１４および末梢端２１２は、順次、１２μｍ、９μｍ、３μｍ、１μｍおよび０．３μｍラッギングフイルム上に仕上げられる。引き続いて、該端部を通常の原子力顕微鏡でスクラッチにつき調べる。工程２７２において、束２０２の末梢端２１２上でエッチングを行う。６００μｌのｄＨ2Ｏおよび１００μｌのＨＦ（フッ化水素酸）を含む０．２グラムＮＨ4Ｆ（フッ化アンモニウム）の溶液、５０％ストック溶液を用いることができる。末梢端２１２は特定時間、好ましくはほぼ８０秒間この溶液中でエッチングする。
【００９７】
この溶液からの除去に際して、束の端部を脱イオン水に直ちに入れて、工程２７４におけるいずれのさらなるエッチングも停止させる。次いで、ファイバーを流れている水道水中ですすぐ。この段階で、音波処理は、好ましくは、数秒間行って、いずれの塩生成物も反応から除去する。次いで、ファイバーを風乾する。
【００９８】
図５Ａおよび５Ｂに示すごとく、前記手法は、好都合には束２０２の各ファイバーについてのクラッド２５６に関してファイバーコア２５４の異方性エッチングによつてマイクロウエルを生じる。該マイクロウエルはコア２５４の直径ほぼ３．７μｍを有する。この直径は、試料中において、使用される微小球の直径、３．１μｍよりもわずかに大きくなるように選択される。コア２５４の純粋なシリカはフッ化水素酸の存在下でゲルマニウムドープしたシリカクラッド２５６よりも速くエッチングされるゆえに、選択的エッチングが起こる。
【００９９】
次いで、多数の異なる技術に従って、工程２７６において、微小球はマイクロウエル２５０中に置かれる。微小球の設置は、末梢端２１２上の微小球の所望のランダムに混合された部分集団を含有する溶液を滴下し、束を音波処理して微小球をマイクロウエル中に沈降させ、次いで、微小球溶媒を蒸発させることによって達成することができる。別法として、部分集団を束端部に系列的に添加することができる。次いで、端部に滴下したスルホネート化Nafionの希釈溶液を用いることによって、微小球１０をマイクロウエル２５０に固定することがでる。溶媒の蒸発に際して、Nafionの薄膜が微小球上に形成され、所定の位置に保持される。このアプローチは、ＦＩＴＣ機能性を担うｐＨ指示のために微小球を固定するのに適合する。固定された微小球の得られた配列は、水素イオンに対するスルホネート化Nafionの透過性のため、そのｐＨ感受性を保持する。しかしながら、Nafionはほとんどの水溶性種に対して不透過性であるので、このアプローチは一般的には使用することができない。同様のアプローチを異なるポリマーで使用することができる。例えば、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、またはポリヒドロキシメチルメタクリレート（ポリＨＥＭＡ）の溶液をNafionの代わりに使用でき、水性種に対する所要の浸透性を供する。
【０１００】
もう１つの態様において、別の固定アプローチは、その対応するマイクロウエル２５０に各微小球１０を捕獲するために微小球膨潤を使用する。このアプローチにおいては、末梢端２１２上のマイクロウエル配列の存在下で、非膨潤性溶媒に懸濁させた微小球を音波処理することによって、微小球をまずマイクロウエル２５０に分布される。マイクロウエル中に入れた後、マイクロウエルがその中で膨潤する水性緩衝液に微小球を実質的に暴露させ、それにより、物理的にそれらをマイクロウエル中に捕獲する。この特定の態様によって、１つの通常に知られている微小球材料はテンタゲル、スチレン−ポリエチレングリコールコポリマーである。これらの微小球はヘキサンのような非極性溶媒中では膨潤できず、より極性のまたは水性の媒体への暴露に際して２０−４０容量％膨潤する。ある態様において、この固定アプローチは望ましいであろう。というのは、それは微小球自体の拡散または透過性特性を有意には損なわないからである。
【０１０１】
図６Ａおよび６Ｂは、その最初の設置前および次いでのタッピングおよび空気パルスへの暴露後におけるマイクロウエル２５０中の典型的な微小球１０を示す。図６Ａおよび６Ｂは、特異的固定技術なくしてさえ機械的撹乱によるマイクロウエルからの微小球の認識できる損失がないことを示す。この効果は、恐らくは、微小球および光学ファイバーの間の静電力によるものであろう。これらの力はマイクロウエル内の微小球に結合する傾向がある。かくして、ほとんどの環境において、微小球のためにいずれの化学的または機械的固定も必要ではないであろう。
【０１０２】
配列の全てのサイトが微小球を含まなくてもよいことに注意すべきである；すなわち、空である基体表面のいくつかのサイトがあり得る。加えて、１を超える微小球を含有するいくつかのサイトがあり得るが、これは好ましくはない。
【０１０３】
ある態様においては、例えば、化学的付着がなされる場合、微小球を非ランダムまたは秩序だった方法で付着させることができる。例えば、光活性化付着リンカーまたは光活性化接着剤またはマスクを用い、微小球の規定された集団が降ろされるように、配列上の選択されたサイトを順次付着に適したものとすることができる。
【０１０４】
加えて、配列のサイズはユニークな光学応答標示の数によって設定されるので、ユニークな光学応答標示の組を「再使用」して、非常に多数のテストサイトを可能とすることができる。これはいくつかの方法で；例えば、配列内の位置的コード化スキームを用いることによって行うことができ；異なるサブ束は光学応答標示の組を再使用することができる。同様に、１つの態様はコード化様式のサイズとしてビーズを利用し、かくして、各ビーズサイズにつきユニークな光学応答標示の組の再使用を可能とする。別法として、配列にビーズを順次に部分的負荷することも、光学応答標示の再使用を可能とする。
【０１０５】
好ましい態様において、空間的または位置的コード化系がなされる。この態様においては、利用されるサブ束またはサブ配列（すなわち、全配列の一部）がある。電話システムと類似して、各サブ配列は、サブ配列の位置によって離された、他のサブ配列の同一タグ（すなわち、電話番号）を有することができる「エリアコード」である。かくして、例えば、同一ユニーク色素／ビーズ組合せを束間で再使用することができる。かくして、１００の異なるサブ配列と組み合わせた５０のユニークなタグの使用は、５０００の異なる生活性剤の配列を形成することができる。この態様においては、１つの束をもう１つの束から同定できることが重要であり、一般に、これは手動で、あるいはマーカービーズ、すなわち、各サブ配列用のユニークなタグを含有するビーズの使用を介してなされる。
【０１０６】
別の態様において、微小球サイズのごときさらなるコード化パラメーターを付加することができる。例えば、異なるサイズのビーズの使用は、光学応答標示の組の再使用を可能とすることができ；すなわち、微小球のコード化寸法を拡大するために異なるサイズの微小球を使用することができる。異なるファイバー直径または断面積を持つ画素を含有する光学ファイバー配列を製造することができ；別法として、各々が個々のファイバーの異なる断面積を持つ２以上のファイバーオプチックス束を一緒に付加して、より大きな束を形成することができ；あるいは、同一サイズ断面積のファイバーを持つが異なるサイズのビーズでの光学ファイバー束を使用することができる。異なる直径では、最大ウエルに最大微小球を充填でき、次いで、全てのサイズのウエルが次いで充填されるまで、より小さなウエルに順次より小さな微小球を移動させる。このようにして、同一色素／ビーズ組合せを用いて、異なるサイズの微小球をコード化し、それにより、配列に存在する異なるオリゴヌクレオチド配列または化学的機能性の数を拡大し得る。ファイバーオプチックス基体につき概説したが、これならびに本明細書で概説した他の方法を、同様に、他の基体および他のアタッチメント様式で使用することができる。
【０１０７】
好ましい態様において、コード化および解読は、配列への微小球の順次の負荷によって達成される。空間的コード化につき前記で概説したごとく、この態様においては、光学応答標示を「再使用」するこどができる。この態様においては、各々が異なる生活性剤を含む微小球（または、各々が異なる生活性剤を含む部分集団）のライブラリーを、複数のサブライブラリーに分割する；例えば、所望の配列のサイズおよびユニークなタグの数に応じて、各々が全ライブラリーのおおざっぱに１０％を含む１０のサブライブラリーを作成でき、各サブライブラリーはほぼ同一のユニークタグを含む。次いで、最初のサブライブラリーをウエルを含むファイバーオプチックス的束に付加し、その光学応答標示を用い、各生活性剤の位置を測定する。次いで、第２のサブライブラリーを付加し、各光学応答標示の位置を再度測定する。この場合のシグナルは、「第１の」光学応答標示および「第２の」光学応答標示を含み；２つのマトリックスを比較することによって、各サブライブラリーにおける各ビーズの位置を測定することができる。同様に、第３、第４等のサブライブラリーを順次付加して、配列が充填されるのを可能とする。
【０１０８】
かくして、微小球および表面に独立したサイトを持つ基体を含む本発明の組成物を利用して、配列は大きなスペクトルの化学的機能性からなる。具体的には、本発明で使用するのに適合し得る先行技術センサーは、４つの広い分類の微小球センサー：１）基本的インジケーター化学センサー；２）酵素ベースのセンサー；３）免疫−ベースのセンサー（その双方は広い一般的クラスのタンパク質センサーの一部である）；および４）ゲノ−センサーを含む。
【０１０９】
好ましい態様においては、生活性剤を用いて化学化合物を検出する。多数の基本的なインジケーターセンサーが、以前から示されている。その例には、以下のものが含まれる。
【表２】
2010249826.tif 000003
【０１１０】
【表３】
2010249826.tif 000004
表３に掲げた化学物質の各々は、以下にさらに詳しく記載するように、標的アナライトの存在下に光学的相互伝送可能なシグナルまたは光学的特性を直接生成する。
【０１１１】
酵素系微小球センサーは、その性能が証明されており、微小球について明示することができる。その例には、以下のものが含まれる。
【表４】
2010249826.tif 000005
【０１１２】
一般に、上にさらに詳しく記載したように、酵素感受性化学物質アナライトの存在による標的アナライトの結合に対する光学的シグナルの誘導された変化は、この種の化学的官能基では間接的に起こる。微小球結合酵素(例えばグルコースオキシダーゼ)は、標的アナライト(例えばグルコース)を分解し、共基質(例えば酸素)を消費するか、またはある種の副生成物(例えば過酸化水素)を生成する。次いで、酸素感受性色素を使用してシグナル変化を開始する。
【０１１３】
免疫系微小球センサーは、農薬、除草剤、ＰＣＢ、ＰＡＨなどの環境汚染物質の検出についてその性能が証明されている。加えて、これらセンサーは、次のような対象の診断に使用されている：例えば細菌[例えば、癩病、コレラ、リンパ炎（lyme）およびターブルクロシス（turburculosis）]、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、単純ヘルペス、サイトメガロウイルス）、真菌（例えば、アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコックス症）、マイコプラズマ（例えば肺炎マイコプラズマ）、原虫類（例えば、アメーバ症、トキソプラズマ症）、リケッチア（例えばロッキー山紅斑点熱）および妊娠試験。
【０１１４】
微小球ゲノセンサーも調製することができる。これらは、代表的には、プローブ配列を微小球表面化学物質に、一般にNH2基によって結合することによって構築される。蛍光色素分子(例えばフルオレセイン)を、溶液中の標的配列に結合する。その光学的相互伝送可能なシグナル変化は、標的配列の微小球への結合によって起こる。これにより、溶液全体よりも微小球周囲の色素濃度が高くなる。性能が証明された数種のプローブおよび標的配列（Ferguson, J.A.ら, Nature Biotechnology, 14巻, Dec. 1996参照）を、以下の表５に示す。
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
さらに、ゲノセンサーが、ラベルとしてハイブリダイゼーションインジケーターの使用に基づきうることに注意すべきである。ハイブリダイゼーションインジケーターは、通常は可逆的に二本鎖核酸と結合しているのが好ましい。ハイブリダイゼーションインジケーターには、挿入体(インターカレーター)および副および／または主グローブ結合部分が含まれる。好ましい態様においては、挿入体を使用してよい(挿入は二本鎖核酸の存在下でのみ起こるのが普通であるので、標的ハイブリダイゼーションの存在下でのみラベルが発光するであろう)。
【０１１７】
本発明は、上記種類のセンサーのいずれかまたは全てを用いて行うことができる。当業者には理解されるように、センサーの種類および組成は、標的アナライトの組成に依存して広範囲に変化するであろう。即ち、センサーを、核酸、タンパク質(酵素センサーおよび免疫センサーを含む)、脂質、炭水化物などを検出するように調製することができる。同様に、これらのセンサーは、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などの生活性剤を含むことができる。さらに、単一配列センサーは、多種類のアナライト用の異なる結合リガンドを含むことができる。例えば、ＨＩＶのための配列センサーは、ウイルスゲノムの直接検出のための複数の核酸プローブ、ウイルス粒子の直接検出のためのタンパク質結合リガンド、抗ＨＩＶ抗体の検出のための免疫成分などを含むことができる。
【０１１８】
微小球ズおよび基体に加えて、本発明の組成物は、他の成分、例えば光源、レンズやフィルターなどの光学成分、検出器、データ分析のためのコンピューター成分などを含むことができる。
【０１１９】
本発明の配列は、基体表面に対する微小球のランダム蓄積を「解読」して、全位置での生活性剤の同定を可能にすることができるように、生活性剤の同定に関する情報が配列中に形成されるように構築する。これは、種々の方法により行うことができる。
【０１２０】
好ましい態様においては、微小球を基体上に負荷し、次いで配列を解読する(分析を行う前に)。これは、対照アナライトに暴露したときの配列上の各々のサイトにおける微小球に結合した光学応答標示を検出することによって行う。これは、光学標示の組の「再使用」について上で一般的に説明したように、唯一の光学標示を使用するときには全てを一度に、または連続的に行うことができる。
【０１２１】
一旦製造され、必要なら解読されると、組成物は、多数の用途において使用できるようになる。予備的な事柄として、本発明は、配列要素の部分集団を有するセンサー配列の特徴的な光学応答標示におけるＳＮ比を減少させる方法を提供する。この方法は、ａ）配列内の各センサー部分集団中の各センサー要素の存在位置を同定するために配列を解読し、ｂ）配列内の各センサー要素の特徴的な光学応答標示を測定し、ｃ）配列中の各センサー要素について、光学応答標示のベースラインを調節し、ｄ）センサー部分集団それぞれの中の全センサー要素のベースライン調節済み特徴的な光学応答標示を合計し、ｅ）部分集団それぞれの中の全センサー要素のベースライン調節済み特徴的な光学応答標示の合計として、各センサー部分集団の特徴的な光学応答標示を報告することを含んでなる。この方法により、ＳＮ比は少なくとも約１０の倍率で増加されることになる。好ましくは、約１００の倍率である。
【０１２２】
同様に、本発明は、配列要素の部分集団を有するセンサー配列の特徴的な光学応答標示を増幅する方法を提供し、この方法は、ａ）配列内の各センサー部分集団中の各センサー要素の存在位置を同定するために配列を解読し、ｂ）配列内の各センサー要素の特徴的な光学応答標示を測定し、ｃ）配列中の各センサー要素について、光学応答標示のベースラインを調節し、ｄ）センサー部分集団それぞれの中の全センサー要素のベースライン調節済み特徴的な光学応答標示を合計し、ｅ）部分集団それぞれの中の全センサー要素のベースライン調節済み特徴的な光学応答標示の合計として、各センサー部分集団の特徴的な光学応答標示を報告することを含んでなる。好ましい態様では、シグナルは、少なくとも約５０の倍率で増幅され、アナライトの検出限界は、少なくとも約１００のファクターで減少する。
【０１２３】
一般に、標的アナライトを含む試料（標的アナライトの検出のため、または標的アナライトの結合パートナーのスクリーニングのいずれであっても）を、少なくとも１種の生活性剤に標的アナライトを結合するのに適した条件、すなわち、一般に生理学的条件において、配列に添加する。そして、標的アナライトの存在または不存在が検出される。当業者なら理解できるように、検出は、種々の方法で、一般には光学シグナルの変化を用いることにより、行なうことができる。この変化は、多くの異なるメカニズムにより生じ得る。いくつかの例として、色素標識されたアナライトを微小球に結合すること、微小球上または近傍で色素種を生成すること、存在する色素種を分解すること、微小球上の色素とアナライトとの相互作用による光学シグナルの変化、または他の光学的応答性（interrogatable）現象が挙げられる。
【０１２４】
好ましい態様では、光学シグナルにおける変化は、検出可能な標識（ラベル）、好ましくは蛍光色素のような光学的標識により直接または間接的に標識された標的アナライトの結合の結果、生じる。例えば、タンパク質標的アナライトを使用する場合、このアナライトは、蛍光物質により直接標識され、あるいは、例えば標識された抗体を使用して間接的に標識され得る。同様に、核酸は、この技術分野で知られているように、例えばＰＣＲ増殖中に、蛍光色素により容易に標識することができる。また、標的配列を結合する場合、内位添加（intercalating）色素（例えば、臭化エチジウム）を添加し、その後結合されたターゲットの存在をプローブ配列に知らせる（signal）ことができる。生活性剤に標的アナライトを結合する際、そのサイトに新しい光学シグナルが生成され、そのシグナルを検出することができる。
【０１２５】
ある場合には、上記のように、酵素のような標的アナライトが、光学的に直接または間接的に検出できる種（例えば、蛍光性生成物）を生成する。
【０１２６】
更に、ある態様では、光学応答標示の変化は、光学的シグナルに基づいていることがある。例えば、ある化学的標的アナライトと微小球上のある蛍光色素との相互作用により、光学応答標示が変化し、異なる光学シグナルを発生することがある。例えば、フルオロホア（fluorophore）誘導レセプタを使用でき、この場合、配位子の結合がシグナルを変化させる。
【０１２７】
当業者には知られているように、ある態様では、標的アナライトの存在または不存在は、表面増強ラマン分光、表面プラスモン、放射能を含む、他の光学的または非光学的シグナルの変化を用いて行なえる。
【０１２８】
分析は、当業者には理解されるように、種々の実験条件下で行なうことができる。スクリーニングアッセイでは、多様な他の試薬が包含され得る。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進するおよび／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少するのに使用される、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤などのような試薬が包含される。その他にも、分析の効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などを用いることができる。成分の混合物は、必要な結合を生じる任意の方法で添加される。この技術分野で知られているように、種々のブロッキングおよび洗浄工程が利用され得る。
【０１２９】
好ましい態様では、試料溶液における標的アナライトの存在または不存在を調べるために、組成物を使用する。「標的アナライト」または「アナライト」あるいは本明細書においてこれらと同等の用語は、結合パートナーについて検出または評価できる、あらゆる原子、分子、イオン、分子イオン、化合物または粒子を意味する。当業者なら理解できるように、多数のアナライトを本発明において使用することができる。基本的に、生活性剤を結合できる、または結合パートナー（すなわち、薬剤候補）を見つけ出せるあらゆる標的アナライトを使用することができる。
【０１３０】
適当なアナライトは、生体分子を含む有機および無機分子を包含する。標的アナライトの検出を行なう場合、適当な標的アナライトには、環境汚染物（農薬、殺虫剤、毒素などを含む）、化学物質（溶媒、ポリマー、有機物質などを含む）、治療用分子（治療用および濫用薬剤、抗生物質などを含む）、生体分子（ホルモン、サイトカイン、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜抗原、および受容体（例えば、神経、ホルモン、栄養および細胞表面受容体）またはこれらの配位子などを含む）、全細胞（原核生物細胞（例えば、病原性バクテリア）および、哺乳類腫瘍細胞を含む真核生物細胞）、ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなどを含む）、並びに胞子などが包含される。特に好ましいアナライトは、核酸およびタンパク質である。
【０１３１】
好ましい態様において、標的アナライトはタンパク質である。当業者には理解できるように、本発明を用いて検出できるまたは結合パートナーを評価できる可能性のあるタンパク質様標的アナライトは、多数存在する。適当なタンパク質標的アナライトには、（１）免疫グロブリン、（２）酵素（および他のタンパク質）、（３）ホルモンおよびサイトカイン（その多くは、細胞受容体の配位子として機能する）、および（４）他のタンパク質が包含される。
【０１３２】
特に好ましい態様では、標的アナライトは核酸である。これらの分析は、非常に広い用途において使用することができる。
【０１３３】
好ましい態様では、プローブは遺伝子診断において使用される。例えば、プローブは、非ポリープ性（nonpolyposis）大腸癌、ＢＲＣＡ１胸部癌遺伝子、Ｐ５３（種々の癌に関連する遺伝子）、ＡｐｏＥ５遺伝子（アルツハイマー症のより大きい危険性を示し、容易な患者の前症候スクリーニングを可能にする）、嚢胞性ファイバー形成遺伝子（cystic fibrous gene）における突然変異、またはこの技術分野で周知の他のプローブが包含される。
【０１３４】
別の態様では、ウイルスおよび細菌の検出は、本発明の複合体を用いて行なわれる。この態様では、プローブは、種々の細菌およびウイルスからの標的配列を検出するように設計される。例えば、現在の血液スクリーニング技術は、ＨＩＶ抗体の検出に依存している。本発明が開示する方法によれば、ＨＩＶ核酸配列、特に高度に保存されたＨＩＶ配列を検出するために、臨床サンプルを直接スクリーニングすることが可能になる。加えて、これにより、抗ウイルス治療の有効性を評価する改良された方法として、患者の体内でのウイルスの循環を直接モニターすることが可能となる。同様に、白血病、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩに付随したウイルスを、このような方法で検出することができよう。結核、クリミジアおよび他の性交感染症のような細菌感染も検出することができよう。
【０１３５】
好ましい態様において、本発明の核酸は、水および食品中の毒性細菌用プローブとして使用される。例えば、このようなサンプルを処理し、細菌を溶解させて核酸を放出し、次いで、細菌株（例えば、サルモネラ、カンピロバクター、ビブリオコレラ、ライシュマニア、エシェリチアコリの腸内毒性株のような病原性菌株、および在郷軍人病バクテリア）を認識するように設計されたプローブを用いる。同様に、生体治療法を、本発明の組成物を使用して評価することもできるであろう。
【０１３６】
さらなる態様において、プローブは、犯行現場のＤＮＡを被害者および容疑者から採取した試料と照合するための法医学的「ＤＮＡ識別（fingerprinting）」のために使用することができる。
【０１３７】
さらに別の態様では、配列中のプローブは、ハイブリダイゼーションによる配列決定に使用することもできる。
【０１３８】
また、本発明は、標的核酸配列中の突然変異またはミスマッチを検出するための方法として使用することができる。例えば、最近では、多形ＤＮＡマーカーを使用した遺伝子変異と表現型との関係の分析に焦点があてられている。これまでの研究では、多形位置（positional）マーカーとして、ショート・タンデム・リピート（short tandem repeats；ＳＴＲｓ）が用いられてきた。しかし、最近、シングルヌクレオチド多形体（single nucleotide polymorphisms；ＳＮＰｓ）に注目が集まっている。これは、ヒトゲノムＤＮＡ中キロベース（kilobase）あたり１を越える平均頻度で発生する。ある種のＳＮＰｓ、特に暗号配列中および周囲にあるものは、治療上適切な表現型変異体の直接の原因であるらしい。治療上重要な表現型の原因となる周知の多形が数多くある。例えば、アポＥ２／３／４変異体は、アルツハイマー症および他の疾病の異なる相対リスクに関連している（Cordor et al., Science 261 (1993)参照）。ＳＮＰ座の複合ＰＣＲ増殖およびその後のオリゴヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションは、少なくとも数百のＳＮＰの同時遺伝子型決定（genotyping）のための正確で信頼性のある方法であることが示されている（Wang et al., Science, 280:1077 (1998)、およびSchafer et al., Nature Biotechnology 16:33-39 (1998)参照）。本発明の組成物は、先行技術の配列と容易に置換えることができるであろう。
【０１３９】
好ましい態様において、本発明の組成物は、標的分子に結合する、好ましくはその機能を改変する試薬を見出すための生活性剤をスクリーニングするのに使用される。上述のごとく、当業者には理解されるように、広範な種類の異なる分析フォーマットが使用されている。一般に、結合パートナーが望まれている標的アナライトは、標識され、生活性剤による標的アナライトの結合は、ビーへラベルを補充することになり、それが後に検出される。
【０１４０】
好ましい態様では、生活性剤および標的アナライトの結合は特異的である。すなわち、生活性剤は、標的アナライトに特異的に結合する。本明細書における「特異的結合」は、アナライトと披検試料の他の成分または汚染物とを区別するのに十分な特異性をもって、剤がアナライトに結合することを意味する。しかしながら、当業者なら理解できるように、高度には特異的でない結合を用いてアナライトを検出することができる。例えば、システムにおいて、異なる結合配位子、例えば異なる配位子の配列を用い、特定のアナライトの検出を、「エレクトロニック・ノーズ」が機能するのと同様に、結合配位子のパネルへの結合の「標示」を介して行なう。この方法は、化学的アナライトの検出に特に有用である。結合は、非特異的結合を除去するための洗浄工程を含む分析の条件下で、結合を維持できるのに十分な程度でなければならない。しかし、ある態様では、例えば低アフィニティ結合パートナーを検出するためには、洗浄工程は望ましくない。ある態様では、例えばある種の生体分子を検出する場合、結合配位子に対するアナライトの解離定数は、約１０-4〜１０-6Ｍ-1未満、好ましくは約１０-5〜１０-9Ｍ-1未満、より好ましくは約１０-7〜１０-9Ｍ-1未満である。
【０１４１】
以下に挙げる実施例は、上記した本発明を使用する方法をさらに詳しく説明し、本発明の種々の態様の実施を意図する最良の態様を記載するものである。これらの実施例が、いかなる意味においても本発明の真の範囲を限定するものではなく、例示の目的のみで挙げたものであることは理解されるであろう。これに引用した全ての参照は、その全てが本明細書の一部を構成する。
【０１４２】
実施例
特定の蒸気アナライトおよび励起光エネルギーに対するセンサービーズおよびセンサー配列の反応の特徴的な一時的光学反応データ測定を、Whiteら[Anal.Chem. 68: 2191-2202 (1996)]により開示された確立された方法および装置設計に従って行った。図８に、実施例７〜１７に報告したデータ測定に用いた実験装置および装置設計を模式的に示す。
【０１４３】
通常の測定においては、ファイバーオプチックス束２０２の近接端２１４を、ファイバーチャック３００中に配置し、オリンパス(Olympus)顕微鏡に基づく画像システムを用いて見えるように確保した。他の態様においては、通常のオリンパス顕微鏡のスライドプラットホームおよびスライドクランプを、ガラスカバースリップなどの代替センサー配列基体を配置するために使用した。エピ-イルミネーター(照明装置)を装着したオリンパス顕微鏡３２０を、光学測定のために使用した。この顕微鏡３２０には、オリンパス２０×および４０×およびツァイス(Zeiss)１００×対物レンズを装着した。オメガ(Omega)５６０ＤＣＲＰ二色性鏡３３０を用いて、７５Ｗキセノンアークランプ３４０からの濾過された励起光エネルギーをセンサー配列１００に向け、放射された光エネルギー(センサー配列１００中のセンサービーズ１０の各々に起因する特徴的な光学応答標示による)がＣＣＤフレームトランスファーカメラ３１０によって記録されるようにした。アークランプ３４０から放射される励起光エネルギーを、オメガ５３５ＢＰ４０組込み励起光フィルター／シャッター３５０によって濾過した。センサー配列１００のセンサービーズ１０から放射された光エネルギーを、ＣＣＤフレームトランスファーカメラ３１０の前にあるオメガ６４０ＢＰ２０組込み放射光フィルター／シャッター３６０によって濾過した。
【０１４４】
通常、実験は、近接端２１４にファイバーオプチックス束２０２によって運ばれるセンサー配列１００中の個々のセンサービーズの特徴的な光学応答標示の蛍光反応画像のビデオカメラフレームを集めることからなる。これらビーズおよび配列の画像を、ＣＣＤフレームトランスファーカメラ３１０[プリンストン・インスツルメンツ(Princeton Instruments, Trenton, NJ)のモデルＴＥ５１２ＥＦＴ]によって記録する。予め選択した数の画像フレームを捕捉し、コンピューターシステム４００[８１００ＡＶマッキントッシュパワーＰＣに装備されたプリンストン・インスツルメンツＮＵＢusカメラインターフェースカードを含んでなる]に送る。カメラフレーム割合は、任意の所望の値に設定することができ、通常は８０〜２５０ｍｓ／フレームの範囲内である。以下に、図９〜１６に示したデータを得る際に用いたフレーム割合(データ点の間の時間)を挙げる。特定したフレーム割合は、データ点の間の特定の時間間隔に相当する。
【０１４５】
【表６】
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【０１４６】
通常の空気希釈嗅覚測定器および真空制御された蒸気供給システム５００[嗅覚の研究に広く知られかつ使用されており、Kauerら(J.Physiol. 272: 495-516 (1977))に記載されている]を用いて、アナライト蒸気および空気キャリアーガスの制御されたパルスを、マイクロウエル２５０中に固定化されたセンサービーズ１０の配列を含むファイバーオプチックスセンサー配列１００の末梢端２１２またはセンサービーズ基体のいずれかに適用した。
【０１４７】
飽和した蒸気試料を生成させるために、通常、空気キャリアーガス流を、アナライトをしみ混ませた濾紙を入れた５ｍｌのカートリッジに通す。飽和蒸気および清浄キャリアーガス流の相対的流速を調節することによってアナライト希釈が得られる。通常、１００ｍｌ／分の流速を、センサー配列に対する混合ガス流のために用いる。この流速においては、２秒間のパルスが、約３.３ｍｌのアナライト蒸気(キャリアーガスを伴う)を供給するであろう。一般に、アナライト蒸気の圧力および希釈ファクターに依存して、蒸気パルスは１０-7〜１０-5モルのアナライトを含有する。
【０１４８】
蒸気パルスは、通常、第１１フレームから始まって第１１〜第３０フレーム中に供給した。蒸気パルスの期間は、使用した特定のフレーム割合によって変化し、通常は２〜３秒間の範囲内であった。ベースライン対照測定は、高純度のウルトラ・ゼロ(Ultra Zero)グレードの空気を用いて行った。空気パルス測定は、蒸気キャリアーガスによるあらゆるビーズ反応を明らかにするように行った。
【０１４９】
データ処理
一時的な一連のセンサービーズまたはセンサー配列の画像の収集に続いて、ＩＰＬab画像処理ソフトウエア[シグナル・アナリティクス(Signal Analytics, Vienna, VA)]を用いて、個々のファイバー(このファイバーはその末梢端のところで１つのセンサービーズに結合している)に対応する各ピクセル(画素)上にセグメントを描かせる。平均蛍光強度を、配列中の各フレーム中のこれらセグメントの各々について測定した。これは、蒸気パルス反応およびベースライン空気パルス反応の両方に対して行う。それぞれを複数回行った平均を出して、必要ならデータの質を改善することができる。次いで、空気パルスデータを、蒸気パルスデータから差引いて、空気単独によるバックグラウンドを差引く。得られたデータをプロットして、全ての所望のビーズに対する一時的な強度反応を得ることができる。好ましい態様においては、センサー配列データを、Whiteら[Anal.Chem. 68: 2193-2202 (1996)]が開示した方法に従って、神経網(ニューラルネットワーク)分析に用いる。
【０１５０】
全てのデータ操作は、単純なオペレータースクリプト(これは、ソフトウエアと共に含まれる規格化された画像またはデータ処理ルーチンを呼び起こす)を用いて、ＩＰＬabプログラム環境内で行う。これらのスクリプトおよびルーチンは、データ収集部分およびデータ分析部分からなる。
【０１５１】
データ収集部分においては、以下のような３つのセグメントまたはループが存在する。
ループ１
これは各センサーのベースライン蛍光を与える。このループを短縮または延長して、特定のアナライトに対する特定のセンサービーズまたはセンサー配列のより遅いかまたはより速い反応時間に調節することができる。実施例７〜１７に対しては、このループを５〜１０フレームに設定した。
【０１５２】
ループ２
これは蒸気暴露ループである。蒸気パルスをこのループ開始の直前にスクリプトの命令によって適用する。この命令が取付けたソレノイドバルブに５ボルトのパルスを送り、これが真空ラインのスイッチをオフにし、これにより、蒸気試料のノズル末端からの放出が可能になる。通常、このループは２０フレームの期間である。実施例７においては、１０フレームの期間を用いた。
【０１５３】
ループ３
これはセンサー回収ループである。別の５ボルト引金パルスをソレノイドに送り、これがスイッチを最初の位置に戻し、真空システムに溶媒蒸気の収集を再開させ、それを運び出し廃棄させる。通常、このループは３０フレームの期間である。実施例７においては、１５フレームの期間を用いた。
【０１５４】
データ分析
データ分析部分においては、先に収集した「フォーカス」画像から取得した予め選択したセグメントを、収集した画像の配列に移す。これらのセグメント(使用者が抜取る)は、平均ピクセル強度を、画像フィールド中の特定領域において測定することを可能にする。通常、これらはファイバーオプチックスセンサー配列の個々のピクセル(このそれぞれがビーズを含む)から抜取る。次いで、スクリプトが、各フレームを進むループに入り、各セグメント内の平均ピクセル強度を測定し、その値をデータカラム中に置く。次いで、得られたカラムをプロットして、所望の各ビーズの一時的な反応を得ることができる。しかし、プロットの前に、各ビーズ反応のデータをその最初の点で割ることによって、反応を「規格化」する。即ち、全ての反応を標準化して、１.０の値で始めることができる。
【０１５５】
ビーズ反応の集計
各ビーズの部分集団内の多数のセンサービーズからの光学反応シグナルを、各時間点での全ての反応のベースライン調整した強度値を単純に加えることによって集計して、全ビーズ反応の合計からなる新しい一時的な反応を得ることができる。シグナルの集計は、リアルタイムに、またはデータ取得後のデータ換算および分析中に行うことができる。１つの態様においては、シグナルの集計を、光学反応データを収集した後に、市販のスプレッドシートプログラム[エクセル、マイクロソフト(Redmond, WA)]を用いて行う。典型的な操作においては、規格化した光学反応を、全てのデータ点から整数１.０を差引くことによって、０.０の値から出発するように調整する。このようにすることにより、一緒に集計したときであってもベースライン-ループデータを０に維持することが可能になり、ランダムな反応シグナルノイズを相殺する。しかし、蒸気パルス-ループ一時的領域は、蒸気パルスの前に陽性、陰性または中性のいずれかの特徴的な反応変化を示し、ＣＣＤカメラ中の電荷蓄積による最初の数データ点におけるドリフトに伴うノイズを克服するためにベースライン調整を必要とすることが多い。ドリフトが存在しないときには、通常、各ビーズセンサーの第１データ点からのベースラインを、同じビーズの全反応データから差引く。ドリフトが観察されたときには、各ビーズセンサーの最初の１０データ点からの平均ベースラインを、同じビーズの全反応データから差引く。このベースライン調整を行うことによって、複数のビーズ反応を一緒に加えたときに、ベースラインを０にしたままこれらを増幅することができる。全てのビーズが蒸気パルスに同時に反応するので、これらの全てが正確に同じ時間にパルスに遭遇し、これらの反応を覆うために必要な記録または調整は存在しない。連続した時間間隔における全データ点を単純に加えることによって、累計反応データが得られる。次いで、この最終的なカラム(特定の時間間隔における全データ点の合計からなる)を、個々のビーズ反応と比較またはプロットして、図１４および１５に示すように、改善されたシグナルとノイズの比率またはシグナル増強の程度を調べることができる。
【実施例】
【０１５６】
（実施例１）  多孔性シリカ／ナイルレッドビーズの調製
約０.５ｃｍ3の名目上３.２ミクロン直径の市販の多孔性シリカビーズを、ＬＵＮＡカラム[フェノメネックス(Phenomenex, Torrance, CA)]から取出した。ビーズ試料を濾紙上に置き、真空濾過を用いて、０.５ｍｌのナイルレッド(Nile Red)[イーストマン・コダック(Eastman Kodak, Rochester, NY)]溶液(トルエン中１ｍｇ／ｍｌ)をビーズ上に注いだ。ナイルレッドは直ちにシリカビーズによって吸収され、ビーズを深紫色に変えた。これらビーズをトルエンで繰返し洗浄して、あらゆる過剰の吸着されなかったナイルレッドを除去した。ビーズを時計皿上で一晩乾燥した。次いで、ビーズを、本発明の方法に従ってファイバーオプチックス束をエッチングすることによって得たマイクロウエル中に配置した。
【０１５７】
（実施例２）  ＰＤＰＯポリマー被覆した多孔性シリカビーズの調製
シラン化溶液を、９８０μlのエタノール／水(９５％エタノール、５％超純水、酢酸でｐＨ４.９に調整)中の２０μlのＮ-オクタデシル-トリエチルオキシシランから調製した。実施例１のＬＵＮＡ多孔性シリカビーズを、過剰のシラン化溶液中に約１０分間分散させ、連続して渦巻き撹拌した。粒子をエタノールで３回すすぎ、１２０℃のオーブン中にて一晩(約１２時間)乾燥した。
ＰＤＰＯ、即ちポリ(２,６-ジメチル-１,４-フェニレンオキシド)[アルドリッチ(Aldrich, Milwaukee, WI)]およびナイルレッドの保存溶液を、０.０９ｇのＰＤＰＯおよび１.０ｍｌのクロロホルムから調製した。ポリマーを完全に溶解させた後、クロロホルム中の１ｍｇ／ｍｌナイルレッドの一部１００μlを添加した。得られた溶液を連続的に渦巻き撹拌して均一な分散液とした。
過剰のＰＤＰＯ／ナイルレッドを、シラン化した多孔性ビーズの小部分に添加した(約１００μlのポリマー／色素溶液を約１ｍｇのビーズに)。この試料を約３時間渦巻き撹拌し、次いで洗浄した。過剰のポリマー色素を除去し、次いでビーズを塩化メチレンで２〜３回繰返して洗浄し、続いて水中の０.０１％ポリオキシエチレン-ソルビタンモノラウレート、即ちツイーン(Tween)２０[J.T.Baker, Cleveland, OH]で洗浄した。洗浄したビーズを、０.０１％ツイーン２０／超純水の溶液に集めた。単一の小滴を顕微鏡カバースリップ上に置き、光から保護して乾燥させた。
【０１５８】
（実施例３）  ポリシロキサンポリマーで被覆した非多孔性シリカ／ナイルレッドビーズの調製
初めに、市販の非多孔性の３.１μｍのシリカビーズ[バングス・ラボラトリー(Bangs Laboratory, Fishers,IN)]を、過剰のシラン化溶液、即ちアセトン中の３-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート(アルドリッチ)の１０容量％溶液中で一晩シラン化した。過剰のシラン化溶液をデカンテーションし、ビーズを、超純粋なアセトンを用いて２〜３回繰返してすすいだ(渦巻き撹拌し、洗浄の間に遠心した)。このビーズを、過剰のナイルレッド溶液(トルエン中１ｍｇ／ｍｌ)中に約３時間浸漬し、表面が完全に飽和するように渦巻き撹拌した。このビーズ溶液を遠心し、過剰の色素溶液をデカンテーションした。次いで、７.９ｍｇのベンゾインエチルエーテル[ポリサイエンシーズ社(Polysciences Inc., Warrington, PA)]、２５０μlのトルエン中のナイルレッドの保存液、および２５０μlの(１５〜２０％アクリルオキシプロピルメチルシロキサン)８０〜８５％ジメチルシロキサンコポリマー[ゲレスト社(Gelest Inc., Tullytown, PA)]の混合物を、ビーズに添加した。このビーズ懸濁液を渦巻き撹拌して、粒子を均一に被覆した。得られた懸濁混合物を、約３５０ｒｐｍで撹拌しながら、約１００ｍｌの超純水中の０.１％ツイーン２０に滴下した。１０秒間ずつの合計して３０秒間の紫外線励起によって重合を行った。この試料溶液を一晩撹拌した。この懸濁液を、２３０ミクロンのふるいに通し、次いで５μｍのふるいに通した。濾液を３０００ｒｐｍで約５分間遠心し、ビーズを遠心管中に集め、超純水中の０.０１％ツイーン２０で洗浄した。単一の小滴を顕微鏡カバースリップ上に置き、光から保護して乾燥させた。
【０１５９】
（実施例４）  ナイルレッドを含む(１５〜２０％アクリルオキシプロピルメチルシロキサン)８０〜８５％ジメチルシロキサンコポリマーのビーズの調製
約２５ｍｌの超純水＋２５ｍｌのエタノールを、１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、撹拌棒を用いて約３５０ｒｐｍで撹拌した。５００μlの(１５〜２０％アクリルオキシプロピルメチルシロキサン)８０〜８５％ジメチルシロキサンコポリマー、２００μlのナイルレッド溶液(クロロホルム中１ｍｇ／ｍｌ)、および２５０μlの塩化メチレンの混合物を調製し、撹拌した水／エタノール溶液に滴下した。塩化メチレン中の５.５ｍｇのＡＩＢＮ、即ちＮ,Ｎ'-アゾビス-イソブチルニトリル(２,２'-アゾビス-２-メチルプロプリオ-ニトリル)[ファルツ・アンド・バウアー社(Phaltz & Bauer, Inc.)]の溶液を、撹拌分散液に添加した。この混合物をアルゴンを用いて約１時間脱ガスし、次いで約７０℃に加熱した。約３時間の加熱の後、２０ｍｌの超純水中の０.０１％ツイーン２０を混合物に添加した。加熱と撹拌を約１２時間続けた。この混合物を２３０ミクロンのふるいに通し、次いで固体を５０００ｒｐｍまでの遠心によって集めた。得られたビーズを、超純水中の０.０１％ツイーン２０の溶液に集めた。ビーズ懸濁液の単一小滴を顕微鏡カバースリップ上に置き、光から保護して乾燥させた。
【０１６０】
（実施例５）  ナイルレッド染色したポリ(メチルスチレン／ジビニルベンゼン)ビーズ
約１ｍｇの市販の３.１５μｍのポリマービーズ(８７％メチルスチレン、１３％ジビニルベンゼン、アミン官能化表面を有する)[バングス・ラボラトリーズ(Bangs Laboratories, Fishers, IN)]を、１ｍｌのメタノール中で、渦巻き撹拌し、約３０００ｒｐｍで遠心し、溶媒をデカンテーションすることによって洗浄した。このビーズを褐色バイアルに移し、約１００μlのナイルレッド溶液(トルエン中１ｍｇ／ｍｌ)を添加した。この試料を渦巻き撹拌し、揺動振盪器に入れて、一晩撹拌した。この懸濁液を微量遠心管に移し、デカンテーションした溶媒が透明になるまでメタノールで洗浄した。このビーズを、約０.５ｍｌの超純水中の０.０１％ツイーン２０の溶液に集めた。単一小滴を顕微鏡カバースリップ上に置き、光から保護して乾燥させた。
【０１６１】
（実施例６）  ナイルレッドを導入した可塑剤修飾したポリ(メチルスチレン／ジビニルベンゼン)ビーズ
約１ｍｇの市販の３.１５μｍのポリマービーズ(８７％メチルスチレン、１３％ジビニルベンゼン、アミン官能化表面を有する)[バングス・ラボラトリーズ]を、実施例５に従ってメタノールですすぎ、褐色バイアルに移した。ポリマーに対して約２〜４０重量％の可塑剤、即ちトリトリルホスフェート(ＴＴＰ)、トリフェニルホスフェート(ＴＰＰ)およびジブチルフタレート(ＤＢＰ)[アルドリッチ]を、ナイルレッド溶液(トルエン中１ｍｇ／ｍｌ)と共に、ビーズ試料に添加し、被覆し、渦巻き撹拌し、次いで揺動振盪器上で約１２時間振盪した。このビーズを微量遠心管に移し、メタノール中のナイルレッドで洗浄し、次いでデカンテーションした溶媒が透明になるまでメタノールで繰返し洗浄した。このビーズを、超純水中の０.０１％ツイーン２０の溶液に集めた。懸濁液の単一小滴を顕微鏡カバースリップ上に置き、光から保護して乾燥させた。
【０１６２】
（実施例７）
実施例１の方法によって調製した多孔性シリカビーズを、上記した実験方法に従って評価して、トルエン蒸気に対する特徴的な光学応答標示を調べた。結果を図９に示すが、この図には、トルエン蒸気のパルスに対する６２個の個々のビーズセンサーの一時的な光学反応が示されている。
【０１６３】
（実施例８）
実施例５の方法によって調製したポリ(メチルスチレン／ジビニルベンゼン)ビーズを評価して、メタノール蒸気に対する特徴的な光学応答標示を調べた。結果を図１０に示すが、この図には、メタノール蒸気のパルスに対する３９個の個々のビーズセンサーの一時的な光学反応が示されている。
【０１６４】
（実施例９）
実施例４の方法によって調製した(１５〜２０％アクリルオキシプロピルメチルシロキサン)８０〜８５％ジメチルシロキサンコポリマービーズを評価して、トルエンおよびメタノールの両蒸気に対する特徴的な光学応答標示を調べた。結果を図１１に示すが、この図には、トルエン蒸気のパルスおよびメタノール蒸気のパルスに対する個々のビーズセンサーの一時的な光学反応が示されている。
【０１６５】
（実施例１０）
実施例２の方法によって調製したＰＤＰＯポリマー被覆した多孔性シリカビーズを評価して、トルエンおよびメタノールの両蒸気に対する特徴的な光学応答標示を調べた。結果を図１２に示すが、この図には、トルエン蒸気のパルスおよびメタノール蒸気のパルスに対する個々のビーズセンサーの一時的な光学反応が示されている。
【０１６６】
（実施例１１）
実施例１の方法によって調製した多孔性シリカビーズを、上記した方法に従って、ファイバーオプチックス束の末梢端にあるエッチングしたマイクロウエルに導入した。得られたセンサー配列を評価して、酢酸エチル蒸気に対するビーズ部分集団の特徴的な光学応答標示を調べた。結果を図１３に示すが、この図には、酢酸エチル蒸気のパルスに対する２１８個の個々のビーズセンサーの一時的な光学反応が示されている。
【０１６７】
（実施例１２）
本発明のシグナル集計法を、実施例５の方法によって調製し、実施例８の方法によって試験したポリ(メチルスチレン／ジビニルベンゼン)ビーズに対して行った実験測定値の分析において評価した。結果を図１４に示すが、この図においては、単一センサービーズ(ビーズ＃１)に対する標準化された一時的な光学反応が、試験した全３９ビーズの集計した反応と比較されている。図１４に示されるように、本発明のシグナル集計法は、単一センサービーズ測定において生じる実験的ノイズを大きく減少させ、分析測定のシグナルとノイズの比率において大きな改善(１０倍またはそれ以上)を与える。
【０１６８】
（実施例１３）
本発明のシグナル集計法を、実施例５の方法によって調製し、実施例８の方法によって試験したポリ(メチルスチレン／ジビニルベンゼン)ビーズに対して行った実験測定値の分析において評価した。結果を図１５に示すが、この図においては、３９個のセンサービーズのそれぞれに対する一時的な光学反応の実際の相対強度が、シグナル集計によって得られる一時的な光学反応の相対強度と比較されている。図１５に示されるように、シグナル集計によって大きなシグナル増強が得られ、これに対応して、標的アナライトの検出限界において大きな改善(１００倍まで)が得られる。
【０１６９】
（実施例１４）
実施例３の方法によって調製したポリシロキサン被覆した多孔性シリカビーズを評価して、トルエンおよびメタノールの両蒸気に対する特徴的な光学応答標示を調べた。結果を図１６に示すが、この図には、トルエンおよびメタノールの両方に対する２個のビーズセンサーの一時的な光学反応が示されている。図１６に示す結果は、特定のアナライトに対するビーズセンサーの特徴的な光学応答標示を利用することによって、ビーズセンサーのこの部分集団が２種類の所望のアナライトを区別することができることを示す。
【０１７０】
（実施例１５）
実施例１の方法によって調製した多孔性シリカビーズおよび実施例５の方法によって調製したポリ(メチルスチレン／ジビニルベンゼン)ビーズの５０／５０混合物を、上記した本発明の方法に従って、ランダムに分散させ、ファイバーオプチックス束の末梢端にあるエッチングしたマイクロウエル中に導入した。得られたセンサー配列を評価して、メタノール蒸気に対するビーズ部分集団の特徴的な光学応答標示を調べた。５３５ｎｍの励起フィルターおよび６００ｎｍの放射フィルターをこの実験に用いた。結果を図１７に示すが、この図には、メタノール蒸気のパルスに対する３個の多孔性シリカビーズセンサーおよび６個のＰＭＳビーズセンサーの標準化された一時的な光学反応が示されている。この実施例においては、ビーズ部分集団の特徴的な放射光ピークの形状が、それぞれの部分集団の識別可能な特徴的な応答標示を与える。図１７は、本発明の革新的な自己コード化の特徴を示すものであり、この図では、ビーズの同一性(アイデンティティー)および位置が、対照蒸気アナライトの単一測定において決定される。
【０１７１】
（実施例１６）
実施例１５の方法によって得た自己コード化ファイバーオプチックスセンサー配列を、ｎ-プロパノール蒸気のパルスに対する、配列の多孔性シリカおよびＰＭＳセンサービーズ部分集団の特徴的な一時的光学応答標示を測定することによって評価した。結果を図１８に示すが、この図には、ｎ-プロパノール蒸気のパルスに対する３個の多孔性シリカビーズセンサーおよび６個のＰＭＳビーズセンサーの一時的な光学反応が示されている。この実施例においては、ビーズ部分集団の特徴的な放射光強度が、それぞれの部分集団の識別可能な特徴的な応答標示を与える。図１８は、異なるビーズ部分集団の別個の特徴的な一時的光学応答標示を用いて特定の所望のアナライトを検出することの利点を示す。センサー配列中のビーズセンサーの同一性および位置が実施例１５の方法によって解読されたことに注意すべきである。実施例１５の方法によるセンサー配列の自己コード化および本実施例１６の方法によって為されるセンサー配列測定を組合わせることによって、このセンサー配列が、ｎ-プロパノールからメタノールを検出および識別するように調整された。
【０１７２】
（実施例１７）
実施例１５の方法によって得た自己コード化ファイバーオプチックスセンサー配列を、トルエン蒸気のパルスに対する、配列の多孔性シリカおよびＰＭＳセンサービーズ部分集団の特徴的な一時的光学応答標示を測定することによって評価した。結果を図１９に示すが、この図には、トルエン蒸気のパルスに対する３個の多孔性シリカビーズセンサーおよび６個のＰＭＳビーズセンサーの一時的な光学反応が示されている。図１９は、異なるビーズ部分集団の特徴的な一時的光学応答標示を用いて特定の所望のアナライトを検出することの利点を示す。センサー配列中のビーズセンサーの同一性および位置が実施例１５の方法によって解読されたことに注意すべきである。実施例１５の方法によるセンサー配列の自己コード化、実施例１６の方法によって為されるセンサー配列測定、および本実施例１７の方法によって為されるセンサー配列測定を組合わせることによって、このセンサー配列が、メタノール、ｎ-プロパノールおよびトルエンからなる標的アナライトの群を検出および識別するように調整された。
【０１７３】
（実施例１８）
実施例４の方法によって得たＰＳ８０２ビーズセンサー、実施例５の方法によって得たポリメチルスチレン／２％ジビニルベンゼンビーズセンサー、および市販のポリメチルスチレンビーズ[バングス・ラボラトリーズ]の試料を、顕微鏡カバースリップ基体上に分散させた。空気中で各ビーズ部分集団を平衡化した後、各部分集団を飽和トルエン蒸気のパルスに暴露し、同時に励起光エネルギーをビーズに照射した。トルエン蒸気に対する各ポリマー種の膨潤反応によるビーズ寸法の変化を、図７の装置を用いてモニターした。ビーズの反応を、ＣＣＤカメラによるビーズ画像寸法の変化の捕捉およびビーズの時間変化する蛍光画像の撮影によって記録した。図２０は、３種類のビーズ部分集団の膨潤反応の相違を、空気中での各ビーズ種の最初の蛍光画像と、トルエン蒸気に暴露した後の各ビーズ種の後の画像との比較によって示すものである。種々のポリマー候補材料の膨潤反応特性のこのような測定は、本発明の自己コード化センサー配列におけるビーズセンサー成分として使用するためのビーズセンサー材料を予備スクリーニングする際に有用である。
【０１７４】
本発明を、その好ましい態様を参照しながら具体的に示し、説明したが、特許請求の範囲に規定される本発明の思想および範囲から逸脱することなく、その形態および細部に種々の変更を行いうることは当業者の理解するところであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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