(57)【要約】【課題】この発明は、少なくとも一つのマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれに由来する一つのＣＤＲを含む、ＭＡｂ１１２９であるヒト抗呼吸シンシチアルウイルス抗体に関し、および、ＲＳＶ感染の予防および／または治療のためのヒト抗呼吸シンシチアルウイルス抗体の使用に関する。【解決手段】少なくとも１つのモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち、少なくとも１個のＣＤＲを含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植ヒト抗ＲＳＶ抗原抗体を提供することである。モノクローナル抗体はいずれの非ヒト動物から誘導されてもよいが、望ましくは、げっ歯類、またもっとも望ましくはマウスの、モノクローナル抗体である。望ましくは、そのマウスモノクローナル抗体は中和抗体である。また、望ましくはマウス抗体は抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける呼吸シンシチアルウイルスの下気道感染を防ぐための組成物であって、
前記組成物は、
前記呼吸シンシチアルウイルスに対する中和抗体を含み、
前記中和抗体は、
重鎖可変部および軽鎖可変部、並びに、ヒト重鎖定常部を含み、
前記重鎖可変部は、
配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
筋肉内注射用の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト−マウスキメラ抗呼吸シンシチアルウイルス抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この出願は１９９１年１２月２３日受理された米国出願番号０７／８１３，３７２号の一部継続出願である。
【０００３】
呼吸シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）は、入院幼児の急性呼吸器系疾患の主要な原因であり、地域診療では、入院児童のおよそ５倍の児童を治療するであろう。従ってこれは小児下気道感染のもっとも一般的な原因である。市中獲得型ＲＳＶ感染の大部分は１週間乃至１０日で自然治癒するが、多くの入院児童、とりわけ生後６ヶ月以内の幼児は補助換気を必要とする。
【０００４】
これまで効果的なワクチンを製造しようとする試みは不成功であった（非特許文献８）。ワクチン開発の上で、主要な障害は安全性である。すなわち、当初のホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンは、予防接種を受けた児童において、ウイルス暴露によるＲＳＶ下気道疾病の発症率と死亡率を増加させた（非特許文献５）。
【０００５】
最近薬品リバビリンがＲＳＶ肺炎および細気管支炎の治療用として許可された（非特許文献２，３）が、その価値は議論の的となっている（非特許文献４）。リバビリンは効能を示したが、この薬品は１８時間にわたりエアロゾル吸入で投与されねばならない。加えて治療を中止した後二次感染の水準は未治療の患者よりも著しく高い。
【０００６】
高力価のＲＳＶ免疫グロブリンが動物モデルのＲＳＶ感染の予防と治療双方に有効であることを研究が示した（非特許文献６，７）。ＲＳＶ免疫グロブリンで治療された感染動物は肺免疫複合体疾患の徴候を示さなかった。
【０００７】
たとえＲＳＶ高度免疫グロブリンが高リスク児童のＲＳＶ下気道感染の発症率および重症度の減少を示したにせよ、いくつかの欠点がその使用を制限する。第１の欠点は事前集中治療のため静脈アクセスを制限されるこれら児童への静脈内注入の必要性があることである。第２の欠点は、とりわけこれらの児童は免疫反応が十分に発揮し得ない心肺機能を持つため大量のＲＳＶＩＧが保護のために必要とされることである。第３の欠点は、静脈内注入はＲＳＶシーズン中は毎月通院を必要とし、それがこれら児童を院内感染の危険にさらすということである（非特許文献１）。最後の問題はこの製品の要求に合致するＲＳＶ高免疫グロブリンを生産する十分な供与体を選択するということが非常に困難であることがわかっていることである。現在の所僅かに約８％の供与体が高度免疫グロブリンの生産に適格な十分に高いＲＳＶ中和抗体力価を持つに過ぎない。
【０００８】
もう一つのアプローチは、高免疫グロブリンに代替するものとして高い特異的中和活性を持つモノクローナル抗体の開発である。その抗体の治療効能を相殺し又は免疫複合体病理を誘発するようなヒト抗げっ歯類抗体反応の発生を最小にするために、マウスやラット抗体よりもヒトモノクローナル抗体を使用することが、必須ではないとしても、望ましい。しかし所望の特異性を持つヒトモノクローナル抗体の生成は難しく、ヒト細胞系からの生産水準はしばしば低く、それがこの開発の妨げとなっている。
【０００９】
代替的なアプローチの一つは、マウスの重鎖・軽鎖可変領域をコードする遺伝情報をヒトの重鎖・軽鎖定常領域をコードする遺伝子に固定したヒト−マウスキメラ抗体の生産である。生成するマウス−ヒトハイブリッド抗体は、マウス配列由来の完全免疫グロブリンの約３０％を有している。従って、数多くの研究所がマウス可変領域とヒト定常領域でキメラ抗体を構築してきた（非特許文献１０−１８）が、マウス可変領域は未だ体内で異物と認識されている（非特許文献１９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ホール、シー.ビー.、ダグラス、アール.   ジー.、ガイマン、ジェイエム.他、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン、２９３巻：１３４３ページ、１９７５年
【非特許文献２】ホール、シー.ビー.、マクブライド、ジェイ.   ティー.、ウォルシュ、イー.イー.他、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン、３０８巻：１４４３ページ、１９８３年
【非特許文献３】ホール、シー.ビー.、マクブライド、ジェイ.   ティー.、ガラ、シー.エル.他、ＪＡＭＡ、２５４巻：３０４７ページ、１９８５年
【非特許文献４】ウォルド、イー.アール.、他、小児科ジャーナル、１１２巻：１５４ページ、１９８８年
【非特許文献５】カピキアン、エイ.ゼッド.、他、ミッチェル、アール.エイチ.、チャノック、アール.エム.他、疫学アメリカンジャーナル、８９巻：４０５ページ、１９６９年
【非特許文献６】プリンス、ジー.エイ.、他、ヘミング、ヴィ.ジー.、ホースウッド、アール.エル.他、ウイルス研究、３巻：１９３ページ、１９８５年
【非特許文献７】ヘミング、ヴィ.ジー.、プリンス、ジー.エイ.、ホースウッド、アール.エル.他、感染性疾病ジャーナル、１５２巻：１０８３ページ、１９８５年
【非特許文献８】ライト、ピー.エフ.、ベルジュ、アール.ビー.、他、感染と免疫、３７巻：３９７ページ、１９８２年
【非特許文献９】コンラッド、ディー.エイ.、クリステンセン、ジェイ.シー.他、小児感染性疾病ジャーナル、６巻：１５２ページ、１９８７年
【非特許文献１０】ロブーリョ、エイ.エフ.、ホゥイーラー、アール.エル.、トラング、ジェイ.他、全米科学アカデミー紀要、８６巻：４２２０ページ、１９８９年
【非特許文献１１】ステルプスキー、ゼット.、サン、エル.ケイ.、シアマン、シー.ダブリュ.他、全米科学アカデミー紀要、８５巻：４８５２ページ、１９８８年
【非特許文献１２】ブーリアン、ジー.エル.、ホズミ、エヌ.、エル.、シュルマン、エム.ジェイ.、ネイチャー、３１２巻：６４３ページ、１９８４年
【非特許文献１３】サン、エル.ケイ.、カーチス、ピー.、ラコヴィッツ−シュルチンスカ、イー.他、全米科学アカデミー紀要、８４巻：２１４ページ、１９８７年
【非特許文献１４】リュー、エイ.ワイ.、マック、ピー.ダブリュ.、チャンピオン、シー.   アイ.、ロビンソン、アール.アール.、遺伝子、５４巻：３３ページ、１９８７年
【非特許文献１５】モリソン、エス.エル.、ジョンソン、エム.ジェイ.、ハーセンバー、エル.エエイ.、オーイ、ヴイ.ティー.、全米科学アカデミー紀要、８１巻：６８５１ページ、１９８４年
【非特許文献１６】モリソン、エス.エル.、サイエンス、２２９巻：１２０２ページ、１９８５年
【非特許文献１７】サヘーガン、ビー.ジー.、ドライ、エイチ.、ザルツガーバー−ミュラー、ジェイ.、他、免疫学ジャーナル、１３７巻：１０６６ページ、１９８６年
【非特許文献１８】タケダ、エス.、ナイトウ、ティー.、ハマ、ケイ.、ノマ、ティー.、ホンジョウ、ティー.、ネイチャー、３１４巻：４５２ページ、１９８５年
【非特許文献１９】カーソン、ディー.エイ.、フライマーク、ビー.ディー.、先端免疫学、３８巻：２７５ページ、１９８６年
【非特許文献２０】ビーラー、ジェイ.エイ.、他、ウイルス学ジャーナル、６３巻：２９４１−２９５０ページ、１９８９年
【非特許文献２１】ケーリン、他、ウイルス学、１４３巻：５６９−５８２ページ、１９８５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従ってこの発明の目的は、少なくとも１つのモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち、少なくとも１個のＣＤＲを含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植ヒト抗ＲＳＶ抗原抗体を提供することである。モノクローナル抗体はいずれの非ヒト動物から誘導されてもよいが、望ましくは、げっ歯類、またもっとも望ましくはマウスの、モノクローナル抗体である。望ましくは、そのマウスモノクローナル抗体は中和抗体である。また、望ましくはマウス抗体は抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体である。
【００１２】
ここで使用される「動物」という用語はもっとも広い意味で用いられ、ヒトを含む哺乳類を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
マウスモノクローナル抗ＲＳＶ抗原抗体から誘導される可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれうち少なくとも１つのＣＤＲの遺伝情報のみのヒト抗体への移植が、動物中のＲＳＶの予防および治療に有効であることを出願人である発明者は発見した。望ましくはマウス抗体は抗ＲＳＶ中和抗体である。また本発明によれば、上記マウス抗体は抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体を用いることができる。望ましくはマウス抗体は抗ＲＳＶ  Ｆ抗原中和抗体である。ヒト可変フレームワーク・セグメントをマウスＣＤＲと置換することにより、抗原であるＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合親和力と特異性を保持したまま、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の可能性を最小限にする。ＣＤＲ配列はヒトまたはマウスに特徴的なモチーフを含まないので、マウス抗体のＣＤＲを含むヒト抗体は、完全なヒト抗体から本質的に区別できない。その結果、ＲＳＶ  Ｆ抗原に対する結合親和力と特異性を保持したまま、ヒト抗体応答を最小限にする。
【００１４】
ヒト化抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体の開発は、マウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体から開始された。このタイプのマウス抗体の例は以下の通りである。ＭＡｂ  １４３６Ｃ，ＭＡｂ１１３，ＭＡｂ１１２，ＭＡｂ１５１，ＭＡｂ１２００，ＭＡｂ１２１４，ＭＡｂ１２３７，ＭＡｂ１１２９，ＭＡｂ１１２１，ＭＡｂ１１０７，ＭＡｂ１３１−１，ＭＡｂ４３−１，ＭＡｂ１１１２，ＭＡｂ１２６９，ＭＡｂ１２４３，ＭＡｂ１３３１Ｈ，ＭＡｂ１３０８Ｆ、およびＭＡｂ１３０２Ａ（非特許文献２１参照）。
【００１５】
この発明の一つの側面は、上記ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、マウス抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち３つのＣＤＲから構成されることを提供する。
【００１６】
上記複数のマウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体は、競合結合アッセイおよびウイルス逃避変異体に対する反応性プロフィルにより、１６個の異なったエピトープを含む３つのブロード抗原部位（Ａ，Ｂ，Ｃ）にマッピングされた（非特許文献２０参照）。抗原部位ＡおよびＣにあるエピトープは、天然に単離したもののうち最も種類が少なかった。
【００１７】
従ってこの発明のもう一側面は、ＡまたはＣの抗原部位に特異的な、少なくとも一つのマウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち、少なくとも１つのＣＤＲを含むヒト抗体を提供する。一つの側面において、この発明は、上記マウス抗体は、マウス抗体ＭＡｂ１３０８Ｆの抗原部位でもある抗原部位Ｃに特異的な、マウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体であること、を提供する。
【００１８】
この発明のこのような一つの実施例において、ヒト抗体は、マウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体ＭＡｂ１３０８Ｆの可変重鎖のＣＤＲを含む。ＭＡｂ１３０８Ｆの可変重鎖のＣＤＲは、３つのＣＤＲから構成され、以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、配列番号１７のアミノ酸番号３１から３５、アミノ酸番号４７から６６およびアミノ酸番号９８から１０６である。加えてこの実施例は、マウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体ＭＡｂ１３０８の可変軽鎖のＣＤＲを含む。ＭＡｂ１３０８の可変軽鎖のＣＤＲは、３つのＣＤＲから構成され、以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、配列番号２０のアミノ酸番号２４から３４、アミノ酸番号５０から５６およびアミノ酸番号８９から９７である。
【００１９】
この発明のもう一側面は、抗原部位Ｃに特異的である、少なくとも１つのマウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち少なくとも１つのＣＤＲを含むヒト抗体を提供する。望ましくは、この発明は、マウス抗体ＭＡｂ１１２９の抗原部位でもある抗原部位Ｃに特異的なマウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体を提供する。
【００２０】
この発明の実施例において、ヒト抗体は、マウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体ＭＡｂ１１２９の可変重鎖のＣＤＲを含む。ＭＡｂ１１２９の可変重鎖のＣＤＲは、３つのＣＤＲから構成され、以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、配列番号３１のアミノ酸番号３１から３７、アミノ酸番号５２から６７およびアミノ酸番号１００から１０９である。加えてこの実施例は、マウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体ＭＡｂ１１２９の可変軽鎖のＣＤＲを含む。ＭＡｂ１１２９の可変軽鎖のＣＤＲは、３つのＣＤＲから構成され、以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、配列番号３４のアミノ酸番号２４から３３、アミノ酸番号４９から５５およびアミノ酸番号８８から９６である。
【００２１】
加えて、出願人の発明の側面は、ＲＳＶ感染を予防し治療する一つの方法であり、この方法は、少なくとも１つのマウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体の可変重鎖および可変軽鎖のうち少なくとも１つのＣＤＲを含むヒト抗体の有効量を、動物に投与することによりなる。
【００２２】
また出願人の発明のもう一側面は、許容される薬理的担体と配合した上述したヒト抗体の有効投与量から構成される組成物である。許容される薬理的担体は、限定されないが、無毒緩衝液、充填剤、等張液などを含む。
【００２３】
出願人の発明による組成物は、局所的にあるいは全身に投与されてもよい。局所投与は、例えばヒト抗体組成物を含むエアロゾルの鼻腔内投与および吸入である。全身投与は、ヒト抗体組成物を静脈内あるいは筋肉内注射することにより達成されてもよい。
【００２４】
出願人の発明の好ましい一側面は、ヒト抗体として、多数のヒト抗ＲＳＶ  Ｆ抗原抗体のうち一部が、投与されるということである。これらの抗体は、ＲＳＶ  Ｆ抗原の同一もしくは異なるエピトープを標的するものでもよい。
【００２５】
加えて、この発明のヒト抗体は、患者にある呼吸シンシチアルウイルスを臨床的に診断するために使用してもよい。ＲＳＶ  Ｆ抗原に対して親和性があるので、これらのヒト抗体は、サンプル例えば体液にあるＲＳＶ  Ｆ抗原の存在および濃度を検出する既知の診断検定方法に利用することができる。この発明のヒト抗体は例えばラテックスビーズ、カラムなどのような固形支持物に付着あるいは結合してもよく、それは次いでＲＳＶ  Ｆ抗原を含むものと考えられるサンプルと接触されて用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質抗体のＶHのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は、移植前のヒトＨＶ３ＶH（配列番号１６)、ＣＤＲ移植ＶH（配列番号１７)、および移植されたＣＤＲ配列の元となったマウスＭＡｂ１３０８Ｆ  ＶHのＡＡ配列（配列番号１８)を表す。太字下線部はヒトＨＶ３  ＶHに移植されたＣＤＲを特定し、各々３つの領域は、それぞれＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を表す。
【図１Ｂ】図１Ａに接続する図である。
【図２Ａ】図２はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体のＶLのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＫ１０２ＶL（配列番号１９）、ＣＤＲ移植ＶL（配列番号２０）および移植されたＣＤＲ配列の元となったマウスＭＡｂ１３０８Ｆ  ＶL（配列番号２１）のＡＡ配列を示す。太字下線部はヒトＫ１０２  ＶLに移植されたＣＤＲ配列を特定し、各々３つの領域は、それぞれＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を表す。
【図２Ｂ】図２Ａに接続する図である。
【図３Ａ】図３はＨｕ１３０８ＶHを作るために使用されたオリゴヌクレオチドを示し、下線のある配列は特異的プライマー配列である（配列番号２２−２５）。
【図３Ｂ】図３Ａに接続する図である。
【図４Ａ】図４はＨｕ１３０８ＶLを作るために使用されたオリゴヌクレオチドを示し、下線のある配列は特異的なプライマー配列である（配列番号２６−２９）。
【図４Ｂ】図４Ａに接続する図である。
【図５】図５はヒト化(Humanized)１３０８のための発現ベクターのプラスミド構成を示す。
【図６】図６は中和パーセント対Ｃｏｓ  Ｈｕ１３０８ＦおよびＭｕ１３０８Ｆでの中和に対する反応当りＭＡｂ  ｎｇで表したＲＳＶの中和のグラフを示す。
【図７Ａ】図７はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質抗体のＶHのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＣＯＲ  ＶH（配列番号３０）、ＣＤＲ移植ＶH（配列番号３１）、および移植されたＣＤＲ配列の元となったマウスＭＡｂ１１２９  ＶHのＡＡ配列を示す（配列番号３２）。太字下線部はヒトＣＯＲ  ＶHに移植されたＣＤＲ配列を特定し、各々３つの領域は、それぞれＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を表す。
【図７Ｂ】図７Ａに接続する図である。
【図８Ａ】図８はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体のＶLのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＫ１０２ＶL（配列番号３３および配列番号４４）、ＣＤＲ移植ＶL（配列番号３４）、および移植されたＣＤＲ配列の元となったマウスＭＡｂ１１２９  ＶLのＡＡ配列（配列番号３５）を示す。太字下線部はヒトＫ１０２  ＶLに移植されたＣＤＲ配列を特定し、各々３個の領域は、それぞれＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を表す。
【図８Ｂ】図８Ａに接続する図である。
【図９Ａ】図９はヒト化１１２９ＶＨを構築するために使用されたオリゴヌクレオチドを示す（配列番号３６−４２）。
【図９Ｂ】図９Ａに接続する図である。
【図１０】図１０はＥＬＩＳＡ検定によるヒト化１１２９の結合度データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
出願人のＲＳＶを予防するヒト抗体の開発は、in vitroでＲＳＶを中和し、ＲＳＶによる下気道感染からコットンラットを保護することが示されたマウスモノクローナル抗体を生産するマウスハイブリドーマ（融合雑種腫瘍細胞）細胞から始まった。
【００２８】
抗原部位Ｃに特異的である一つの抗体がマウス−ヒトキメラ抗体を生産するために選択された。この抗体は次の基準に基づいて選択された。すなわち、（ｉ）テストされた多数の菌株と反応したこと（単離された１４個のうち少なくとも１３個）、（ｉｉ）他の抗Ｆ抗体で選択されたウイルス逃避突然変異体に対し中和活性を保持したこと、（ｉｉｉ）鼻腔内ルートによりコットンラットに低い用量で投与したときに、ウイルス攻撃に対しＲＳＶ増複を遮断したこと、である。選択された抗体はそれぞれの領域において抗体の間の肺疾患ウイルスを著しく減少させた。ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＣ領域に特異的なマウス抗体１３０８Ｆがヒト化の最初の対象として選択された。
【００２９】
要約すると、ヒト抗体は下記の通り構築された。すなわち、ＲＮＡがマウス抗体生産細胞系から抽出され、抗体をＲＳＶに結合させる原因のマウス可変領域が複製ならびに配列決定され、その結果、マウス抗体ＣＤＲ配列を同定した。次いで、マウス抗体の可変重鎖および軽鎖配列と最高の相同性を持つヒト可変重鎖および軽鎖フレームワーク配列が選択された。前記のようなヒトフレームワーク配列はマウス誘導ＣＤＲと最良に適合する可能性のあるものである。
【００３０】
マウス１３０８Ｆの可変重鎖は各種のヒト生殖系列遺伝子と比較され、ヒト生殖系列遺伝子ＨＶ３と最高の相同性を示した。それら２つの配列は、全体で６２％相同であり、フレームワーク領域では６５％相同であった。重要なことに、ＦＲ２の５′末端を除き、ＣＤＲセグメントとフレームワークとの結合部で良好な相同性がある。つぎに、マウス誘導可変重鎖ＣＤＲは可変重鎖ヒト生殖系列遺伝子ＨＶ３中に置換された。マウス配列とヒトの配列は、この２個の潜在的ＣＤＲ移植組合体の配列とともに、図１で示される。
【００３１】
ＶL領域に関する同様の分析がなされ、ヒト生殖系列Ｖ−Ｋａｐｐａ遺伝子Ｋ１０２との高い相同性を示すことを明らかにした。これらの配列のアラインメントは図２で示される。この場合、相同性は全体で６２％であり、フレームワーク領域では７３％であった。次いで、マウス由来の可変軽鎖ＣＤＲは、ヒト生殖系列遺伝子Ｋ１０２のヒト可変軽鎖中に置換された。それぞれの場合においてマウス配列と同一であるヒトＪ領域を選択してもよい。
【００３２】
もう一つの実施例において、マウス１１２９可変重鎖が各種のヒト可変領域アミノ酸配列と比較され、最高の相同性はヒト再配列ＣＯＲ配列（配列番号３０）と比較したものであった。２個のアミノ酸配列は全体で７５％相同であり、フレームワーク領域では８０％であった。重要なことに、ＣＤＲ分節およびフレームワークの結合部で良好な相同性が存在する。マウス誘導可変重鎖ＣＤＲは次いで可変重鎖ヒトＣＯＲ  ＶH配列（配列番号３０）中に置換された。マウスおよびヒト配列ならびにこの２個の潜在的ＣＤＲ移植組合体が図１で示される。
【００３３】
ＶL領域に関する同様の分析がなされ、ヒト生殖系列Ｋ１０２に対する高い相同性を示すことが明らかになった。これらの配列のアラインメントが図８で示される。この場合、相同性は全体で７３％であり、フレームワーク領域では８２％であった。マウス誘導可変軽鎖ＣＤＲは次いでヒト生殖系列Ｋ１０２のヒト可変軽鎖中に置換された。この場合マウス配列と類似するヒトＪ領域、ヒトＪＫ４が選択された。
【００３４】
その結果、ヒト抗体が発現され、遺伝子操作が抗体の結合特性を大幅に改変しなかったことを確認するために、元となったマウス抗体と比較して特性を調べる。
【００３５】
出願人はここで実施例を提示するが、それは請求されるべきこの発明を詳細に説明するためのものであり、この発明を限定するものではない。
【００３６】
［実施例１］  抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体１３０８ＦのｃＤＮＡクローニングおよび配列決定
対象となった抗体のＶHおよびＶLのｃＤＮＡコピーは下記の通り生成された。第１鎖ｃＤＮＡ反応は、ＡＭＶ逆転写酵素と、特定の重鎖あるいは軽鎖アイソタイプの定常領域をコードするｍＲＮＡのセグメントに相補的なリン酸化オリゴヌクレオチドプライマーと、を用いて行われた。１３０８Ｆにとっては、アイソタイプはｇａｍｍａｌ、Ｋａｐｐａであり、特異的オリゴヌクレオチドはマウスｇａｍｍａｌ遺伝子のＣＨ１領域のコドン１２９−１３７に相補的である5'AGCGGATCCAGGGGCCAGTGGATAGAC（配列番号１）であり、またマウスＣ−Ｋａｐｐａ遺伝子のコドン１１６−１２２に相補的である5'TGGATGGTGGGAAGATG（配列番号２）を用いた。このプライマーは可変領域に隣接するｍＲＮＡのセグメントにアニール化する。第２鎖ｃＤＮＡ合成はガブラーおよびホフマンにより記述されたように（遺伝子、２５巻、２６３ページ、１９８３年）、リボヌクレアーゼＨおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて行われ、次いで平滑末端が生産されることを確かにするためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより行われた。
【００３７】
シグナル            Ｖ    Ｊ      Ｃ        ｍＲＮＡ
第１  鎖  ｃＤＮＡ
第２  鎖  ｃＤＮＡ
【００３８】
ｄｓ−ｃＤＮＡはｐＵＣ１８に連結され、後者は制限エンドヌクレアーゼで消化されアルカリ性ホスファターゼで処理された。大腸菌ＤＨ５ａをハナハンの方法により形質転換するためにライゲーションが使用された（分子生物学ジャーナル、１６６巻、５５７ページ、１９８３年）。第１鎖ｃＤＮＡプライマーおよびＶ領域の間に位置するＣ領域配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブが、所望のｃＤＮＡセグメントを運ぶ形質転換細胞を同定するためコロニーハイブリッド形成で使用された。特異的プローブ配列はそれぞれマウスＣＨ１領域のコドン１２１−１２５に相補的であるGGCCAGTGGATAGAC（配列番号３）およびＣ−Ｋａｐｐａのコドン１１０−１１５に相補的であるTACAGTTGGTGCAGCA（配列番号４）であった。ハイブリッド形成で陽性を示したコロニーから単離された候補プラスミドは、ｃＤＮＡ挿入断片を放出させるために制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いた断片化により分析された。４００−５００塩基対の挿入断片をもつものが次のＤＮＡ配列決定に供された。
【００３９】
ｃＤＮＡ挿入断片は、二本鎖両方についてＤＮＡ配列を決定するために、Ｍ１３  ｍｐ１８とｍｐ１９に挿入された。生成された組換えバクテリオファージ由来の一本鎖ＤＮＡは単離され、ジデオキシ鎖終結法により配列化された（全米科学アカデミー紀要、７４巻、５４６３ページ、１９７７年）。
【００４０】
１３０８Ｆハイブリドーマから分離された、転位され体細胞変異されたＶ遺伝子ｃＤＮＡの対が１３０８Ｆ抗体中の遺伝子と同じ機能を果たすかを確認するため、一本鎖Ｆｖ遺伝子が生成され、哺乳類細胞で発現・分泌され、次いでＲＳウイルスへの結合を検定された。次いで競合結合実験が結合部位の確認を示すために用いられた。
【００４１】
［実施例  ２］  ヒト１３０８Ｆ  ＶHおよびＶLのデザインおよびアセンブリ
ＶHおよびＶLのＣＤＲ領域は、カバット（３８）に記述された通りアミノ酸配列を既知の配列と比較することで確認された。抗原結合部位の構造を保持するコンフォメーションで、マウス由来ＣＤＲ配列を最良に受け入れるヒトフレームワーク配列を選択するために、下記の戦略が採用された。まず、配列操作プログラムのウイスコンシンパッケージ中のワードサーチプログラムを用いてジェンバンクおよびＮＢＲＦタンパク質データバンク双方からの既知のヒト配列と、マウスＶHおよびＶL領域が、比較される（核酸研究、１２巻、３８７ページ）。次いで、さらに、フレームワーク領域の類似性、とりわけフレームワークとＣＤＲ領域との連結点での類似性に基づいて、いくつかの最良のヒトＶ領域が分析された（図１および２参照）。
【００４２】
それぞれヒトＶ領域のリーダー配列を含むＣＤＲ移植ＶH領域が、長さ１００−１３７ヌクレオチドにわたる、４個のオーバーラップするオリゴヌクレオチドを用いて新規に合成された（図３参照）。オリゴヌクレオチドはまず対に組合せとなるようアニール化を許され、オーバーラッピング領域を含む約２００塩基対の二本鎖ＤＮＡ断片を生成するようＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ伸張された。断片は次いで混合され、一つの断片の３′末端および他の断片の５′末端でプライマーを使用するＰＣＲを受けた。これらの条件下で形成され得る唯一の生成物は全長ＶHセグメントである。特異的プライマー配列を図３で下線を付して示す。エンドヌクレアーゼＳａｃＩ部位は、それをヒト定常領域遺伝子セグメントに結合させるために、ＶH配列の３′末端に含まれていた。
【００４３】
ＣＤＲ移植ＶL領域は同様の方法で合成された（図４参照）。この実施例では、もとの２００塩基対断片は別個に増幅され別個のプラスミドに挿入された。アミノ末端をコードする断片はＮｃｏＩ−ＳｍａＩ断片としてｐＵＣ１８誘導体にクローニングされ、一方、カルボキシル末端をコード化する断片はＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローンされた。両断片は次いで接合部のＳｍａＩ部位を介して結合された。用いたオリゴヌクレオチドを図４で示す。ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、それをヒトＣ−Ｋａｐｐａ遺伝子と連結させるために遺伝子分節の３′末端近くに含まれた。
【００４４】
［実施例  ３］  １３０８Ｆ発現のためのベクター構築
ヒト化ＶHを表すＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片がヒトｃ−Ｇａｍｍａｌ  ｃＤＮＡを表すＳａｃＩ−ＮｏｔＩ断片と結合され、ｐＳ１８に挿入された（ｐＳ１８はｐＵＣ１８に、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位の間のポリリンカー領域に組み込んだものである）。ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ断片上のヒト化１３０８Ｆ−ｇａｍｍａｌ遺伝子は、次いで、ポリＡ追加部位を保有するｐＳＪ３７由来のＰｖｕＩ−ＮｏｔＩ断片、および、ＳＶ４０複製起点とｄｈｆｒ遺伝子とＣＭＶ即時型初期プロモーターとを保有するｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ｐＣＭＶ由来のＰｖｕＩ−ＳａｃＩ断片、と組合される。生成するプラスミドはｐＳＪ６０と名付けられた。
【００４５】
ヒト化ＶLを表すＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ｐＳ１８のヒト化ｃ−Ｋａｐｐａ  ｃＤＮＡを表すＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片と結合された。Ｓａ１Ｉ−ＮｏｔＩ断片のヒト化１３０８Ｆ−Ｋａｐｐａ遺伝子は、次いで、ポリＡ追加部位を保有するｐＳＪ３７由来のＰｖｕＩ−ＮｏｔＩ断片、および、ＳＶ４０複製起点とｄｈｆｒ遺伝子とＣＭＶ即時型初期プロモーターとを含むｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ｐＣＭＶから得たＰｖｕＩ−ＳａｌＩ断片と結合された。生成するプラスミドはｐＳＪ６１と名付けられた。
【００４６】
最後にｐＳＪ６０およびｐＳＪ６１は軽鎖および重鎖ならびに発現シグナルを含む単一プラスミドに組合された。これは軽鎖を保有するｐＳＪ６１由来のＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩ断片と、長鎖を保有するｐＳＪ６０由来のＰｖｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片とを、結合させ単離することによって、ｐＳＪ６６を生成して達成された（図５参照）。
【００４７】
［実施例  ４］  ｐＳＪ６０およびｐＳＪ６１を用いたＣＯＳ  ｌ細胞の形質移入
形質移入は下記の調製を伴うマッカッチャンおよびパガーノの方法に従って行われた（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．、４１巻：３５１−３５６ページ、１９６８年）。ＣＯＳ  １細胞（ＡＴＣＣ．ＣＲＬ１６５０）は胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、ジブコ＃２００−６１４０）およびＬ−グルタミン２ｍＭ（ＢＲＬ＃３２０−５０３０）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、ジブコ＃３２０−１９６５）内で組織培養フラスコ７５ｃｍ2のＣＯ2、５％加湿培養器で維持され、細胞が密に達した時の１：２０の分割比で継代させられた。形質移入の４８時間前に、５個の１００ｍｍ組織培養皿がＤＭＥＭ１２ｍｌ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン−ストレプトマイシン１％（Ｐ−Ｓ、ジブコ＃６００−５０７０）内で皿当り１．５×１０6細胞で接種された。形質導入当日、プラスミドｐＳＪ６０およびｐＳＪ６１各１２０ｕｇが組合され、エタノール沈殿され、トリス緩衝食塩水２．５ｍｌで無菌再懸濁された。再懸濁ＤＮＡは、混合しながらＤＥＡＥデキストラン１ｍｇ／ｍｌ（ファルマチア＃１７−０３５０−０１）およびクロロキン２５０ｕＭ（シグマ＃Ｃ６６２８）を含むＤＭＬＥＭ、１０ｍｌに、滴状で加えられた。培地は１００ｍｍ皿のＣＯＳ  １細胞から除去され、細胞は一度ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、ジブコ＃３１０−４１９０）で洗浄され、ニューセラム１０％（コラボレイティブ・リサーチ＃５５０００）で補充されたＤＭＥＭ２．５ｍｌが各プレートに加えられた。ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン混合物２．５ｍｌが各プレートに加えられ、プレートはＤＮＡを混合するために渦動され、そして培養器に戻された。培養器で４時間後、上澄みが細胞から吸引され、細胞は１回Ｄ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。細胞は３分間１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５ｍｌを加えたＤ−ＰＢＳで室温でショックを与えられた。ＤＭＳＯが細胞から吸引され細胞はＤ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。ＤＭＥＭ／Ｌ−グルタミン２ｍＭ／Ｐ−Ｓ１％の１４ｍｌが各プレートに加えられた。プレートは培養器に戻された。
【００４８】
形質移入の３日後、培地はプレートから除去され、プールされ、−２０℃で貯蔵された。細胞は収穫され、プールされ、２個がＤＭＥＭ／ニューセラム１０％、４０ｍｌおよび２個がＤＭＥＭ／ＦＢＳ１０％／Ｌ−グルタミン２ｍＭ、４０ｍｌの４個の１５０ｃｍ2組織培養フラスコ内で接種された。培地は収集され、細胞が７、１０および１４日に再補給された。このようにして全体で１２５ｕｇのヒト化１３０８抗体がＦＢＳを補充した培地３１０ｍｌで蓄積されニューセラムで補充された培地２４０ｍｌで８５ｕｇが蓄積された。
【００４９】
［実施例  ５］  ｐＳＪ６６を用いるＣＯＳ  １細胞の形質移入
形質移入４８時間前、５個の組織培養皿がＤＭＥＭ１２ｍｌ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン−ストレプトマイシン１％（Ｐ−Ｓ、ジブコ＃６００−５０７０）内で皿当り１．５×１０6細胞で接種された。形質導入当日、ｐＳＪ６６プラスミド１２５ｕｇでエタノール沈殿されトリス緩衝食塩水１．０ｍｌで無菌再懸濁された。再懸濁ＤＮＡは混合しながらＤＥＡＥデキストラン１ｍｇ／ｍｌ（ファルマチア＃１７−０３５０−０１）およびクロロキン２５０ｕＭ（シグマ＃Ｃ６６２８）を含むＤＭＥＭ４．０ｍｌに滴状で加えられた。培地は１００ｍｍ皿のＣＯＳ  １細胞から除去され、細胞はダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で１度洗浄され、ニューセラム１０％（コラボレイティブ・リサーチ＃５５０００）を補充したＤＭＥＭ２．５ｍｌが各プレートに加えられた。ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン混合物２．５ｍｌが各プレートに滴状に加えられ、プレートはＤＮＡを混合するため渦動され、それから培養器に戻された。培養器で４時間後、上澄みが細胞から吸引され、細胞はＤ−ＰＢＳ５ｍｌで１度洗浄された。細胞は３分間Ｄ−ＰＢＳにジメチルスルホキシド１０％（ＤＭＳＯ）を加え室温でショックを与えられた。ＤＭＳＯが細胞から吸引され、細胞はＤ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。ＤＭＥＭ／ＦＢＳ１０％／Ｌ−グルタミン２ｍＭ／Ｐ−Ｓ１％の１４ｍｌが各プレートに加えられプレートは培養器に戻された。
【００５０】
形質導入３日後培地はプレートから除去され、プールされ、−２０℃で貯蔵された。細胞が収穫され、プールされ、２個がＤＭＥＭ、ニューセラム１０％の４０ｍｌ、２個がＤＭＥＭ、ＦＢＳ１０％／Ｌ−グルタミン２ｍＭの４０ｍｌの４個の５０ｃｍ2織培養フラスコに接種された。培地は収集され、細胞が７、１０および１４日に再補給された。このようにして合体で１９０ｕｇのヒト化１３０８Ｆ抗体がＦＢＳで補充された培地３１０ｍｌで蓄積されまたニューセラムで補充されまた培地２４０ｍｌに１２０ｕｇが蓄積された。
【００５１】
ＣＯＳ  １細胞から培地に分泌されたヒト化１３０８Ｆ抗体の濃度は捕捉エリザを用いて決定された。９６ウエルプレート上に被覆されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃがヒト化抗体を捕捉するために使用された。クロモーゲン基質で開発されたペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒト全ＩｇＧが次いで結合抗体を検出するために使用された。精製ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ調製物が検定を目盛り化するために使用された。
【００５２】
［実施例  ６］  ヒト化１３０８Ｆを用いるＲＳＶの中和
方法：
ＲＳＶは、ＣＯＳ細胞上澄みからのヒト化１３０８Ｆあるいは精製マウスモノクローナル抗体のいずれかで中和された。これは５０プラーク形成単位のＲＳＶを抗体の連続２倍希釈液で１時間３７℃で培養することにより行われた。２４ウエルパネルのＨｅｐ２細胞の密集単層が抗体処理ウイルス、未処理対照ウイルス、およびモック感染対照の１００μｌで感染された。１．５時間３７℃で加湿され、ＣＯ2５％で培養され、またＥＭＥＭ１．５ｍｌ、ＦＢＳ１％、およびメチルセルロース１％で上塗りされた。細胞は固められ４日目にグルタルアルデヒドおよびクリスタルバイオレットで染色された。プラークは三重ウエルで計数され中和パーセントとしてプロットされた。図６で示されるこの結果はウエル当り５乃至１０ｎｇでの精製マウス１３０８Ｆモノクローナル抗体およびヒト化１３０８Ｆモノクローナル抗体のいずれもが、ＲＳＶプラークを同様に５０％減少させた結果を示している。
【００５３】
［実施例  ７］ＣＤＲ移植Ａ部位抗体１１２９の生成
ポリＡ＋ＲＮＡがオリゴ−ｄｔセルロースを用いて２×１０7マウス１１２９ハイブリドーマ細胞の溶解液から精製された。第１鎖ｃＤＮＡは、ｐＡ＋ＲＮＡ１ｕｇから、ランダムヘキサマープライマー、ＡＭＶ逆転写酵素、ｐＡ＋ＲＮＡ１ｕｇ、ｐＨ８．５のトリス塩酸５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2．８ｍＭ、ＫＣｌ、３０ｍＭ、ジチオスレイトール１ｍＭ、ｄＮＴＰ１ｍＭ、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤２５単位、ランダムヘキサマー３３ｕＭおよびＡＭＶ逆転写酵素１０単位を用いて、１時間４２℃で合成された。１１２９ＶＬ領域からのｃＤＮＡはオリゴヌクレオチドＳＪ４１およびＳＳ１１を用いるＰＣＲで増幅された（表１を参照）。１１２９ＶＨ領域からのｃＤＮＡは同様にオリゴヌクレオチドＳＪ４２およびＳＪ１０を用いて増幅された（表１を参照）。
【００５４】
表 １
SJ10
AGCGGATCCAGGGGCCAGTGGATAGAC （配列番号１）
SJ11
GATGGATCCAGTTGGTGCAGCATC （配列番号５）
SJ41
CACGTCGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA （配列番号６）
SJ42
CGGAATTCAGGTIIAICTGCAGIAGTC(A,T)GG （配列番号７）
[I = デオキシ-イノシン]
SJ53
CCCAAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTG （配列番号８）
SJ154
GGCGTCGACTCACCATGGACATGAGGGTCC(C/T)CGCTCAGC （配列番号９）
SJ155 (H1129L CDR 1)
GTCACCATCACTTGCAAGTGCCAGCTGAGTGTAGGTTACATGCACTGGTACC
AGCAG （配列番号１０）
SJ157 (H1129L CDR 3)
GCAACTTATTACTGCTTTCAGGGGAGTGGGTACCCATTCACGTTCGGAGGGG
GG （配列番号１１）
SJ168
GTGACCAACATGGACCCTGCTGATACTGCCAC （配列番号１２）
SJ169
CCATGTTGGTCACTTTAAGGACCACCTGG （配列番号１３）
SJ170
CCAGTTTACTAGTGTCATAGATCAGGAGCTTAGGGGC （配列番号１４）
SJ171
TGACACTAGTAAACTGGCTTCTGGGGTCCCATCAAGG （配列番号１５）
【００５５】
ＰＣＲ条件
第１鎖ｃＤＮＡ０．５ｕＬ、ｐＨ８．３トリス塩酸１０ｍＭ、ＫＣｌ、５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2、１．５ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ゼラチン０．００１％、各プライマー１ｕＭ、ＤＮＡ鋳型１ｎｇおよびアンプリターク（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕ（パーキン・エルマー−シータス）。９４°１分、５５°２分、７２°２分パーキン・エルマー４８０サーモサイクラーで２５サイクル。生成するＤＮＡ断片は次いでフェノール／クロロホルム（１／１）で１回抽出され、エタノール２．５量で沈殿され、適切な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液で再懸濁され、クローニングのための付着末端を生成させるために制限エンドヌクレアーゼで消化された。生成断片は次いでアガロースゲル１％の電気泳動で分離された。臭化エチジウムでゲルを染色した後、断片は除去されフェノールの存在下で凍結および抽出によりアガロースから精製された。
【００５６】
断片は次いで制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化され、プラスミドｐＵＣ１８にクローンされた。挿入断片は次いで修飾されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ、ユーエス・バイオケミカル）を用いるジデオキシヌクレオチド鎖末端法により配列決定された。
【００５７】
翻訳化された配列はヒト抗体タンパク質配列と比較された。ＶＬはＫ１０２軽鎖ともっとも相同性があり、またＶＨはＣｏｒ  ＶＨ領域（配列番号３０）ともっとも相同性があることが分かった。１１２９Ｆｖ領域は、１１２９ＶＬとＶＨ配列の由来の残基を、ＭＣＰＣ６０３抗体の結晶構造での対応する残基座標へ置換することによりモデル化された。残基は視覚的なモデルの検査で折りたたみ構造あるいは溶媒接触に不可欠であるとして確認された。
【００５８】
不可欠な配列であり、なおかつ、マウスおよびヒト配列で異なるいくつかの残基は、Ｆｖの完全性を維持するため、すなわち結合部位を維持するために、マウス残基として残された。この残基はＶＨ領域では３１、８３、１１３および１１６であり、ＶＬ領域では４７であった。生成配列は図７および８で示される。
【００５９】
設計されたヒト１１２９ＶＨはＰＣＲを用いて結合された合成オリゴヌクレオチドＳＪ１４７−ＳＪ１５３（図９）を用いて構築された。このＰＣＲの生成物は次いでＮｃｏＩおよびＳａｃＩで消化され、プラスミドベクターｐＳＪ４０にクローニングされた。ここでｐＳＪ４０は、あるフレームがＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片として挿入される場合に、フレーム外のｌａｃＺ１セグメントが、フレーム内Ｖ領域セグメントに融合してフレーム内に保持されるｐＵＣ１８派生物である。５個の突然変異が単一５０塩基対領域に密集している挿入断片を含むプラスミドが、次いでＰＣＲおよびプライマーＳＪ１６８およびＳＪ１６９を用いて、これらの改変の修復を受けた。表１参照。
【００６０】
ＶＬはヒト１３０８Ｆ軽鎖遺伝子の部位指向突然変異誘発により生成された。オリゴヌクレオチド、表１参照（ＣＤＲ１）およびＳＪ１５７（ＣＤＲ３）はＨ１３０８Ｌ遺伝子を別個に突然変異を起こさせるために使用された。突然変異誘発は、大腸菌株ＢＷ３１３（ｄｕｔ−、ｕｎｇ−）によって生成され次いで大腸菌株ＤＨ５（ｄｕｔ＋、ｕｎｇ＋）に形質転換された、ウラシルを含む一本鎖ＤＮＡ鋳型とＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて実行された。２個の突然変異体は結合され、ＣＤＲ２は、オリゴヌクレオチドＳＪ１７０、ＳＪ１５４、表１参照、（５′末端）およびＳＪ１７１、ＳＪ５３、表１参照、（３′末端）を用いる組換えＰＣＲにより導入された。ＣＤＲ移植ＶＨおよびＶＬは、プラスミドｐＳＪ８１およびｐＳＪ１０５となるＨ１３０８ＦＶ領域セグメントにとって代るＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片として、それぞれｐＳＪ６０（実施例３参照）およびｐＳＪ６１（実施例３参照）に挿入された。加えてマウスＶＨおよびＶＬ  ｃＤＮＡ分節は、発現ベクターｐＳＪ７５およびｐＳＪ８４を生成するためにそれぞれ同様にヒトＣ−ＧａｍｍａｌおよびＣ−Ｋａｐｐａに接続された。
【００６１】
［実施例  ８］  ＨＵ１１２９一過性発現
ＣＯＳ  １細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６５０）は胎仔ウシ血清１０％（ＦＢＳ、ジブコ＃２００−６１４０）およびＬ−グルタミン２ｍＭ（ジブコ＃３２０−５０３０）を補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、ジブコ＃３２０−１９６５）で７５ｃｍ2組織培養フラスコの加湿ＣＯ2５％培養器で維持され、密集到達直前に１：２０の分割比で継代された。
【００６２】
形質移入は以下の修正を加えたマッカッチャンおよびパガーノの方法（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．、４１巻：３５１−３５６ページ、１９６８年）に従って行われた。形質移入の２４時間前に、１００ｍｍ組織培養皿（コーニング＃２５０２０）はＤＭＥＭ１４ｍｌ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭで皿当り２×１０6ＣＯＳ  １細胞で播種された。形質導入当日、実施例７からのＨｕ１１２９重鎖プラスミド（ｐＳＪ８１）１０ｕｇが実施例７からのＨｕ１１２９Ｋａｐｐａ軽鎖プラスミドｐＳＪ１０５の１０ｕｇと組合され、ＤＮＡはエタノール沈殿されトリス緩衝食塩水１．０ｍｌで無菌再懸濁された。再懸濁ＤＮＡは混合しながらＤＥＡＥデキストラン１ｍｇ／ｍｌ（ファルマチア＃１７０３５０−０１）およびクロロキン２５０ｕＭ（シグマ＃Ｃ６６２８）を含むＤＭＥＭ４．０ｍｌに滴状で加えられた。培地はＣＯＳ１細胞皿から除去され、細胞単層は１回ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、ジブコ＃３１０−４１９０）１０ｍｌで洗浄され、またニューセラム１０％（コラボレイティブ・リサーチ＃５５０００）およびＬ−グルタミン２ｍＭを補充したＤＭＥＭ２．５ｍｌが各プレートに加えられた。ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン混合物２．５ｍｌが各プレートに滴状で加えられ、プレートはＤＮＡを混合するために渦動され、培養器に戻された。ＤＮＡ吸着期間８時間後にプレートが培養器から除去され、上澄みがプレートから吸引された。細胞はプレート当りＤ−ＰＢＳ内でＤＭＳＯ、１０％の５ｍｌの追加で３分室温でショックを与えられ、その後ＤＭＳＯが細胞から吸引され細胞は１度Ｄ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。ＤＭＥＭ１５ｍｌ、ニューセラム１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ（生産培地）が各プレートに加えられ、プレート培養器に戻された。
【００６３】
形質移入７２時間後、コンディション培地がプレートから回収され−２０℃で貯蔵され、生産培地１５ｍｌがプレートに加えられプレートは培養器に戻された。９６時間後配置がプレートから収集され−２０℃で貯蔵された。
【００６４】
［実施例  ９］  Ｈｕ１１２９の定量化
ＣＯＳ  １細胞により培地に分泌されたＨｕ１１２９の定量化はサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）を用いて行われた。要約すると、ナンク・マクシソープ・イムノプレート（ナンク＃４３９４５４）が室温で３時間ｐＨ９．６の重炭酸ナトリウム０．１Ｍ内でヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（カッペル＃５５０７１）０．５ｕｇ／ｍｌの５０ｕｌ／ウエルで被覆された。ウエルは３回ｐＨ７．４リン酸ナトリウム０．０１Ｍ、ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、トウィーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）０．１％で洗浄された。プレートへの非特異的タンパク質結合は室温で３０分ＰＢＳ内の脱脂粉乳３％（Ｗ／Ｖ）の２００ｕｌ／ウエルの処理で遮断された。精製ヒトＩｇＧ１  Ｋａｐｐａ標準（シグマ＃１−３８８９）はＰＢＳ−Ｔ内１００ｎｇ／ｍｌで作られ１：２から１．５６ｎｇ／ｍｌまで連続的に希釈され、各５０ｕｌが検定プレートの二重ウエルに加えられた。ＣＯＳ  １細胞上澄みはＰＢＳ−Ｔで希釈され、二重の５０ｕｌサンプルがプレートに加えられた。室温培養で１時間後、ウエルは空にされ３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄された。結合Ｈｕ１１２９抗体の存在を検出するために、ホースラディッシュ共役親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（全分子、カッペル＃３６０１−００８１）がＰＢＳ−Ｔ内で１：１０００で希釈され、５０ｕｌがこの検定プレートの各ウエルに加えられ室温で１時間培養された。プレートは３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄され、クロモーゲン基質ＴＭブルー（ＴＳＩ＃ＴＭ１０２）１００ｕｌが各ウエルに加えられた。プレートは室温で１０分暗条件で培養され、Ｈ2ＳＯ4、４．５Ｍのウエル当り５０ｕｌの追加で反応が停止された。プレートはモレキュラー・デバイシズ・ヴイマックス・マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読みとられ、データ分析はソフトマックス・ソフトウエア（モレキュラー・デバイス）を用いてＩＢＭ  Ｐ／Ｓモデル８０コンピューターを実行させて、達成された。
【００６５】
生産の最初の７２時間の間に、ＣＯＳ  １細胞はＨｕ１１２９、０．０６ｎｇ／ｍｌ、全体で０．９ｕｇを生産した。次の９６時間の生産でＣＯＳ  １細胞はＨｕ１１２９、０．９９ｕｇ／ｍｌ、全体で１４．８５ｕｇを生産した。
【００６６】
［実施例  １０］  Ｈｕ１１２９結合検定
Ｈｕ１１２９の結合検定は、以下の変更を加えた、捕捉ＥＬＩＳＡで、基本的には定量化ＥＬＩＳＡにより、達成された。プレートは０．５ｕｇ／ウエルでＭｕ１３３１抗体を使って被覆され、ウエルはＰＢＳ−Ｔ内で脱脂乳３％でブロッキングされ、ＲＳＶ感染ＨＥＰ２細胞溶解液が各ウエルに加えられ室温で１時間培養された。検定の残りは、希釈サンプルをウエルに追加することで開始する定量化検定に関して行われた。結果は、ＯＤ、対、抗体濃度の二重の交互プロットを用いて、交互プロットからＭ１１２９ＨｕＧａｍｍａｌ、Ｋａｐｐａ抗体の１０ｎＭとの比較により０．７ｎＭのＨ１１２９分子に対する見かけのＫｄを決定することにより、分析された。
【００６７】
Ｈ１１２９およびｃｈ１１２９抗体についてのＲＳＶ中和検定が下記の手順に従って実施された：
１．覆いのある９６ウエル・コスター細胞培養プレートの包装を解く。
２．成長培地（ＧＭ）を３７℃に温める。
３．ＭＡ１０４細胞を３７℃で解凍する。ＧＭを用いて、〜１５０，０００細胞／ｍＬに希釈する。細胞を混合しウエル当り２００μｌに調合する。
４．細胞を３７℃、ＣＯ2５％で培養し、感染前一晩加湿する。
５．ＲＳＶ株を維持液（ＭＭ）で１０，０００ｐｆｕ／ｍＬまで希釈する。
６．ＭＭで希釈した抗体の等量を希釈ＲＳＶの等量と混合する。３７℃、ＣＯ2５％で培養し、感染前１時間加湿する。
７．ＭＡ１０４細胞のレプリケートウエルを抗体およびウイルス混合物２００μｌで感染させる。レプリケートウエルをウイルスおよびモック感染対照で感染させる。
８．プレートをセロハンで包み３７℃、湿度９５％、およびＣＯ2、５％で５日培養する。
９．ＲＳＶのためのＥＬＩＳＡ：各ウエルを吸引し、アセトン／ＰＢＳ８０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）１００μｌを加え室温で３０分培養する。
１０．各ウエルを吸引し、薄流フードの鉄板上で３０分空気乾燥する。
１１．ＰＢＳ、トウィーン２０、０．０５％を用いて４回洗浄する。
１２．各ウエルでＲＳＶ  Ｆタンパク質にモノクローナル抗体１００μｌを加える。３７℃で１時間培養する。
１３．ＰＢＳ、トウィーン２０、０．０５％を用いて４回洗浄する。
１４．ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウス抗体血清１００μｌを各ウエルに加える。３７℃で１時間培養する。
１５．ＢＰＳ、トウィーン２０、０．０５％を用いて４回洗浄する。
１６．新鮮に調製されたＡＢＴＳおよび過酸化物１：１混合物１００μｌを各ウエルに加える。ウイルス対照の不透明度（４０５ｎｍ）がモック感染対照のそれの５乃至１０倍になるまで室温で培養する。
【００６８】
付録：
成長培地（ＧＭ）：最小必須培地（イーグル）およびアールＢＳＳ、
グルタミン２ｍＭ
イーグル可欠アミノ酸、最終０．１ｍＭ、
胎仔ウシ血清１０％（ｖ／ｖ）、
ペニシリン５０単位／ｍｌ、
ストレプトマイシン５０ｍｃｇ／ｍｌ、
維持液（ＭＭ）：血清を１乃至２％に減少させた前記のもの。
ＭＡ１０４細胞株は成長培地を用いてＴ１５０フラスコ内で成長する。株はＤＭＳＯ、１０％および成長培地内で１．８ｍＬガラス瓶当り３×１０6細胞で凍結される。ＬＮ2冷蔵庫で貯蔵される。
ＲＳＶ株：Ｔ１５０フラスコのＭＡ１０４（サル腎臓）あるいはＨｅｐ２細胞内で成長する。密集Ｔ１５０当り〜０．２ｍｌ（〜１００，０００ｐｆｕ）ウイルス株を加える。室温で１時間吸着。次いで胎仔ウシ血清１％を加えた維持液２０ｍＬを加える。３７℃で４−５日培養する。１００％ｃｐｅの直前にスクレーピングにより細胞を収集する。細胞を回転で落し、上澄み１０ｍＬを残して全て除去する。細胞ペレットを凍結（ドライアイス−エタノール浴）解凍し、ボルテックスさせ、再凍結しウイルス株をＬＮ2冷蔵庫で貯蔵する。
ＥＬＩＳＡ抗体緩衝液：ＰＢＳ、トウィーン２０、０．０５％（Ｗ／Ｖ）、ヤギ血清２．０％（Ｖ／Ｖ）およびゼラチン０．５％（Ｗ／Ｖ）。
ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体：ＥＬＩＳＡ抗体緩衝液で〜１：５０００まで希釈されたケミコンＭａｂ８５８−１抗ＲＳＶ融合タンパク質。
抗マウス血清：ＥＬＩＳＡ抗体緩衝液で〜１：５０００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ（重鎖特異性）に共役されたフィッシャーホースラディッシュペルオキシダーゼ。
【００６９】
結果を図１０で示す。結果は、２５ｎｇ／ｍｌがこの検定で中和５０％を達成し、一方ｃｈ１１２９抗体４５ｕｇ／ｍｌがこの実験で中和５０％のために必要とされたことを示している。一連の６個の異なる検定によって、Ｈ１１２９の５０％中和の平均値は１７ｎｇ／ｍｌであった。対照として、また効能を比較するために、われわれはまたＲＳＶに対する高い中和力価を持つ個人の血漿から作られたポリクローナルヒトＩｇＧ調製品を検定した。この調製品（ＲＳＶｉｇと名付けられる（ｌｏｔ＃４））は３回の実験によって２．３ｕｇ／ｍｌの５０％中和平均値を示した。かくしてＨ１１２９はこの実験で強化ポリクローナル調製品に比べて１００倍大きい効能を持っている。
【００７０】
［実施例  １１］  ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによるヒト化ＲＳＶ  Ｍａｂのカイネティクス分析
ヒト化ＲＳＶ  ＭａｂおよびＲＳＶ  Ｆタンパク質の間の相互作用のカイネティクスがファルマシアＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサーを用いる表面プラスモン共鳴により調査された。Ｃ末端切断型Ｆタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスは、カイネティクス調査のための豊富な抗原の情報源を提供した。上澄み（分泌Ｆタンパク質を含む）は、コンカナバリンＡおよびＱセファロースカラムを用いた連続クロマトグラフィーにより約２０倍に濃縮された。プールされた画分はクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）１０ｍＭに対して透析され、約０．１ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。Ｆタンパク質（１００ｍｌ）の画分がＢＩＡコアセンサーチップに対してアミン結合された。固定された量はＨ１１２９あるいはＨ１３０８Ｆのいずれかで飽和された時にシグナルの約２０００応答単位（Ｒｍａｘ）を与えた。これは、結合手順に従ったＦタンパク質調製物において等数の「Ａ」および「Ｃ」抗原部位が存在することを示していた。２個の無関係の関連性のないＭａｂｓ（ＲＶＦＶ  ４Ｄ４およびＣＭＶ  Ｈ７５８）は固定されたＦタンパク質とは何らの相互作用を示さなかった。典型的なカイネティクス調査は、トウィーン２０、０．０５％を含むＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ／トウィーン）内での異なった濃度（２５−３００ｎＭ）でＭａｂ３５ｍｌを注入することを含んでいた。フローレートは５ｍｌ／分を維持し７分結合相を提供した。Ｍａｂの注入に続き、フローは解離速度を決定するために３０分でＰＢＳ／トウィーン緩衝液で置換した。センサーチップは塩酸１０ｍＭの２分パルスを持つサイクルの間で再生された。再生段階は固定Ｆタンパク質の結合能力に最少の損失（サイクル当り４％の損失）しか生じさせなかった。この小さな減少は、結合および解離のための速度定数の計算値を変更しなかった。
【００７１】
Ｆタンパク質への結合に対する各種Ｍａｂの親和性は、解離を示す第１次定数の、結合を示す第２次速度定数に対する割合（Ｋd＝Ｋdiss／Ｋassoc）から計算された。Ｋassocの値は下記の率方程式に基づいて計算された。
（１）dR/dt=Kassoc[Mab]Rmax-(Kassoc[Mab]+Kdiss)R
【００７２】
ここでＲおよびＲｍａｘはそれぞれ時間ｔおよび無限大での応答単位である。Ｒの関数としてのｄｒ／ｄｔのプロットは（Ｋassoc［Ｍａｂ］＋Ｋdiss）の傾きを与える。これらの傾きは［Ｍａｂ］と線形に関連しているため、Ｋassoc値は、傾き  対  ［Ｍａｂ］の再プロットから導き出すことができる。新しい線の傾きはＫassocと等しい。Ｋdiss値はＹ切片から推定することができるが、より正確な値はＫdissの直接測定で決定された。
Ｍａｂの注入相に続き、ＰＢＳ／トウィーン緩衝液はセンサーチップを横切って流れる。
この時点から［Ｍａｂ］＝０となる。方程式（１）はかくして
（２）dr/dt=KdissあるいはdR/R=Kdissdt
に変形される。方程式（２）の積分は
（３）１ｎ（Ｒｏ／Ｒｔ）＝Ｋdissｔ
となり、ここでＲｏとＲｔはそれぞれ時間ゼロ（解離相の開始）および時間ｔでの応答単位である。最後にｔの関数としてのＩｎ（Ｒｏ／Ｒｔ）はＫdissの傾きを与える。
【００７３】
【表１】
2010241819.tif 000002
【００７４】
［実施例  １２］  ヒト化Ｍａｂを用いたコットンラットのin vivo保護
Ｈ１１２９およびＨ１３０８Ｆは筋肉内投与された際にコットンラットの肺組織内で感染を減少する能力をそれぞれ検査された。コットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス、グループ当り４動物、平均重量１００グラム）がメトキシフルレンで麻酔され、筋肉内注射により抗体溶液１．０ｍｌを与えられた（最終濃度はそれぞれ５ｍｇ／ｋｇ、１．６７ｍｇ／ｋｇおよび０．５６ｍｇ／ｋｇの用量を生じる）。対照動物はウシ血清アルブミンを注射された。１日後、動物は再び麻酔され、ＲＳＶのロング菌株、１０5.0プラーク形成単位（ＰＦＵ）の鼻腔内点滴により攻撃（免疫性をテスト）された。ウイルス攻撃の４日後、すべての動物は二酸化炭素窒息により屠殺された。肺が採取されハンクス平衡食塩水１０部（ｗｔ／ｖｏｌ）でホモゲナイズされた。生成懸濁液はウイルス量をプラーク検定により定量化された。
【００７５】
以下に示されるこれら実験の結果は、Ｈ１１２９およびＨ１３０８ＦがＲＳＶ攻撃１日前に注射されると、コットンラットの肺でのウイルス力価を減少するのに有効であることを示している。
【００７６】
【表２】
2010241819.tif 000003
【００７７】
ここで描かれ記載された図面は、この発明をより詳細に説明することを意図しており、どのような方法であってもこの発明を限定することを意図するものではない。
【図１Ａ】
2010241819.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2010241819.tif 000007
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
2010241819000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月2日(2010.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける呼吸シンシチアルウイルスの下気道感染を防ぐための組成物であって、
前記組成物は、
前記呼吸シンシチアルウイルスに対する中和抗体を含み、
前記中和抗体は、
重鎖可変部および軽鎖可変部、並びに、ヒト重鎖定常部およびヒト軽鎖定常部を含み、
前記重鎖可変部は、
配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
筋肉内注射用の組成物。
【請求項２】
ヒトにおける呼吸シンシチアルウイルスの下気道感染を防ぐための組成物であって、
前記組成物は、
前記呼吸シンシチアルウイルスに対する中和抗体を含み、
前記中和抗体は、
重鎖可変部および軽鎖可変部、並びに、ヒト重鎖定常部およびヒト軽鎖定常部を含み、
前記重鎖可変部は、
配列番号３１のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変部は、
配列番号３４のアミノ酸配列を含む、
筋肉内注射用の組成物。
【請求項３】
ヒトにおける呼吸シンシチアルウイルスの下気道感染を防ぐための組成物であって、
前記組成物は、
前記呼吸シンシチアルウイルスに対する中和抗体の重鎖を含み、
前記重鎖は、
重鎖可変部とヒト重鎖定常部を含み、
前記重鎖可変部は、
配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
筋肉内注射用の組成物。
【外国語明細書】
2010241819000001.pdf