(57)【要約】【課題】レーザ光源の個体差や使用条件が変動してもその都度演算処理を行うことなく、簡易にコントラストの高い蛍光観察を行う。【解決手段】レーザ光Ｌを発生するレーザ光源２ａ〜２ｃと、該レーザ光源２ａ〜２ｃからのレーザ光Ｌを試料Ａに照射する照明光学系３〜６と、レーザ光Ｌが照射されることによって、試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆを集光する対物光学系６と、該対物光学系６により集光された蛍光Ｆをスペクトル分散させる分散手段１４と、スペクトル分散された蛍光Ｆの内の一部のスペクトル領域の蛍光Ｆを領域可変に選択する波長選択手段１６と、選択されたスペクトル領域の蛍光Ｆを検出する蛍光検出手段１７と、レーザ光源２ａ〜２ｃから発せられるレーザ光Ｌの波長特性を記憶する記憶手段１０とを備え、波長選択手段１６が、記憶手段１０に記憶されている波長特性に基づいて、スペクトル領域を設定する蛍光観察装置１を提供する。【選択図】図１
2010008279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を発生するレーザ光源と、
該レーザ光源からのレーザ光を試料に照射する照明光学系と、
該照明光学系によりレーザ光が照射されることによって、前記試料において発生した蛍光を集光する対物光学系と、
該対物光学系により集光された蛍光をスペクトル分散させる分散手段と、
該分散手段によりスペクトル分散された蛍光の内の一部のスペクトル領域の蛍光を領域可変に選択する波長選択手段と、
該波長選択手段により選択されたスペクトル領域の蛍光を検出する蛍光検出手段と、
前記レーザ光源から発せられるレーザ光の波長特性を記憶する記憶手段とを備え、
前記波長選択手段が、前記記憶手段に記憶されている波長特性に基づいて、前記スペクトル領域を設定する蛍光観察装置。
【請求項２】
前記記憶手段に記憶される波長特性が、レーザ光のピーク波長であり、
前記波長選択手段が、前記記憶手段に記憶されているレーザ光のピーク波長に対して所定のオフセットを加えた波長に基づいて、選択するスペクトル領域を選択する請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
前記記憶手段に記憶される波長特性が、レーザ光のスペクトルの重心波長であり、
前記波長選択手段が、前記記憶手段に記憶されているレーザ光のスペクトルの重心波長に対して所定のオフセットを加えた波長に基づいて、選択するスペクトル領域を選択する請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
前記記憶手段に記憶される波長特性が、レーザ光の波長範囲の両端近傍の波長である請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項５】
前記レーザ光の波長特性が、前記レーザ光源の出力レベルと対応づけて前記記憶手段に記憶されている請求項１から請求項４のいずれかに記載の蛍光観察装置。
【請求項６】
前記スペクトル領域を記憶手段に入力する領域入力手段を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の蛍光観察装置。
【請求項７】
前記レーザ光源が、波長特性の異なる複数のレーザ光を同時に発生する請求項１から請求項６のいずれかに記載の蛍光観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、レーザ光源からのレーザ光を試料に照射することにより発生した蛍光をスペクトル分散し、そのスペクトル列から任意の波長範囲の蛍光を検出するレーザ顕微鏡が知られている（特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−３５１７０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に開示されたレーザ顕微鏡は、蛍光波長の取り込み波長範囲をずらしながら得られた複数の画像をユーザに提示して、コントラストが高いと思われる取り込み波長範囲を決定するものであり、測定前に毎回同様のプロセスを行う必要があり、また、その都度演算処理に時間がかかるという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、レーザ光源の個体差や使用条件が変動してもその都度演算処理を行うことなく、簡易にコントラストの高い蛍光観察を行うことができる蛍光観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源からのレーザ光を試料に照射する照明光学系と、該照明光学系によりレーザ光が照射されることによって、前記試料において発生した蛍光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された蛍光をスペクトル分散させる分散手段と、該分散手段によりスペクトル分散された蛍光の内の一部のスペクトル領域の蛍光を領域可変に選択する波長選択手段と、該波長選択手段により選択されたスペクトル領域の蛍光を検出する蛍光検出手段と、前記レーザ光源から発せられるレーザ光の波長特性を記憶する記憶手段とを備え、前記波長選択手段が、前記記憶手段に記憶されている波長特性に基づいて、前記スペクトル領域を設定する蛍光観察装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光が照明光学系によって試料に照射されることにより試料において蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は対物光学系によって集光された後、分散手段によってスペクトル分散され、所定の波長範囲にわたるスペクトル列となる。波長選択手段の作動により、スペクトル分散された蛍光の内の一部のスペクトル領域の蛍光が選択され、蛍光検出手段により検出される。
【０００８】
この場合において、波長選択手段は、記憶手段に記憶されているレーザ光の波長特性に基づいて、選択するスペクトル領域を設定するので、蛍光検出手段によってレーザ光が検出されないように適正なスペクトル領域を設定することができる。これにより、観察の都度に演算処理を行うことなく、簡易にコントラストの高い蛍光観察を行うことができる。
【０００９】
上記発明においては、前記記憶手段に記憶される波長特性が、レーザ光のピーク波長であり、前記波長選択手段が、前記記憶手段に記憶されているレーザ光のピーク波長に対して所定のオフセットを加えた波長に基づいて、選択するスペクトル領域を選択することとしてもよい。
このようにすることで、レーザ光のピーク波長を記憶手段に記憶するだけで済み、少ない記憶容量で、簡易に適正なスペクトル領域を設定することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記記憶手段に記憶される波長特性が、レーザ光のスペクトルの重心波長であり、前記波長選択手段が、前記記憶手段に記憶されているレーザ光のスペクトルの重心波長に対して所定のオフセットを加えた波長に基づいて、選択するスペクトル領域を選択することとしてもよい。
このようにすることで、レーザ光のスペクトルの重心波長を記憶手段に記憶するだけで済み、少ない記憶容量で、簡易に適正なスペクトル領域を設定することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記記憶手段に記憶される波長特性が、レーザ光の波長範囲の両端近傍の波長であることとしてもよい。
このようにすることで、蛍光検出手段によってレーザ光が検出されないような適正なスペクトル範囲をより直接的に設定することができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記レーザ光の波長特性が、前記レーザ光源の出力レベルと対応づけて前記記憶手段に記憶されていてもよい。
このようにすることで、レーザ光源の出力レベルが変動しても、蛍光検出手段によってレーザ光が検出されないような適正なスペクトル範囲を設定することができ、簡易にコントラストの高い蛍光観察を行うことができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記スペクトル領域を記憶手段に入力する領域入力手段を備えていてもよい。
このようにすることで、領域入力手段によって入力したスペクトル領域を記憶手段に記憶することができ、ユーザが任意に所望のスペクトル領域を設定することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記レーザ光源が、波長特性の異なる複数のレーザ光を同時に発生することとしてもよい。
このようにすることで、複数の異なる波長特性のレーザ光が試料に同時に照射され、各レーザ光の波長特性に基づいて設定されたスペクトル領域の蛍光のみが蛍光検出手段によって検出される。複数のレーザ光の波長特性の間に配置される適正なスペクトル領域を設定することにより、蛍光検出手段によってレーザ光が検出されないようにして簡易にコントラストの高い蛍光観察を行うことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、レーザ光源の個体差や使用条件が変動してもその都度演算処理を行うことなく、簡易にコントラストの高い蛍光観察を行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置１について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、レーザ光源ユニット２と、該レーザ光源ユニット２からのレーザ光Ｌを２次元的に走査するスキャナ３と、該スキャナ３により走査されたレーザ光Ｌを集光する瞳投影レンズ４、結像レンズ５および対物レンズ６と、該対物レンズ６によりレーザ光Ｌが試料Ａに集光されることにより、試料Ａにおいて発生し、対物レンズ６、結像レンズ５、瞳投影レンズ４およびスキャナ３を介して戻る蛍光Ｆを、レーザ光Ｌの光路から分岐するビームスプリッタ７と、該ビームスプリッタ７により分岐された蛍光Ｆを検出する検出光学系８と、これらを制御する制御ユニット９と、記憶ユニット１０とを備えている。
【００１７】
レーザ光源ユニット２は、複数の異なる波長のレーザ光Ｌを発生する３つのレーザ光源２ａ〜２ｃと、これらのレーザ光源２ａ〜２ｃからレーザ光Ｌの光路を合流させるミラー２ｄおよびダイクロイックミラー２ｅ，２ｆを備えている。
スキャナ３は、例えば、対向して配置される２個一対のミラー３ａ，３ｂを相互に交差する方向に揺動させる、いわゆる近接ガルバノミラーである。
【００１８】
検出光学系８は、ビームスプリッタ７により分岐された蛍光Ｆを集光する共焦点レンズ１１と、対物レンズ６の焦点位置と光学的に共役な位置関係に配置される該共焦点レンズ１１の集光位置に配置されたピンホール１２と、該ピンホール１２を通過した蛍光Ｆを集光して略平行光にする集光レンズ１３と、該集光レンズ１３により集光された蛍光Ｆをスペクトル分散させる分散手段１４と、スペクトル分散された蛍光Ｆを集光する集光レンズ１５と、スペクトル分散された蛍光Ｆの内、部分的なスペクトル領域の蛍光Ｆを通過させるように、集光レンズ１５による蛍光Ｆの結像位置に配置され開口幅を変更可能なスリット１６ａを有する波長選択手段１６と、該波長選択手段１６のスリット１６ａを通過した蛍光Ｆを検出する光検出器１７とを備えている。
【００１９】
分散手段１４は、蛍光Ｆをスペクトル分散させる回折格子１４ａと、該回折格子１４ａを分散方向に揺動させて、波長選択手段１６に向かうスペクトル列の位置をスペクトルの配列方向に変化させる揺動機構１４ｂとを備えている。
【００２０】
制御ユニット９は、レーザ光源ユニット２、スキャナ３、ピンホール１２、波長選択手段１６、光検出器１７および揺動機構１４ｂに接続されている。
記憶ユニット１０は、図２に示されるように、レーザ光源ユニット２の各レーザ光源２ａ〜２ｃの波長特性を出力レベルに対応づけて記憶している。具体的には、レーザ光源２ａ〜２ｃの波長特性としては、各レーザ光源２ａ〜２ｃの実際のピーク波長Ｂ１を記憶している。
【００２１】
また、記憶ユニット１０は、各蛍光指示薬の標準取り込み波長範囲Ｂ２を記憶している。さらに、記憶ユニット１０には、外部入力手段１８が設けられ、レーザ光源２ａ〜２ｃの実際のピーク波長Ｂ１を、出力レベル毎に入力することができるようになっている。
【００２２】
制御ユニット９は、レーザ光源２ａ〜２ｃの出力レベルが変動すると、該出力レベルに対応づけて記憶ユニット１０に記憶されているレーザ光源２ａ〜２ｃのピーク波長Ｂ１を読み出すとともに、読み出されたピーク波長Ｂ１を所定の波長分Ｂ３だけ長波長側にオフセットさせた波長を算出するようになっている。そして、制御ユニット９は、算出された波長を蛍光Ｆの取り込み開始波長とし、記憶ユニット１０に記憶されている標準取り込み波長範囲Ｂ２にわたる蛍光Ｆが、光検出器１７に検出されるように波長選択手段１６および揺動機構１４ｂを制御するようになっている。
【００２３】
次に、このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１の作用について説明する。
レーザ光源ユニット２から発せられたレーザ光Ｌは、ビームスプリッタ７により反射されてスキャナ３に入射される。スキャナ３において２次元的に走査されたレーザ光Ｌは、瞳投影レンズ４、結像レンズ５および対物レンズ６を介して試料Ａに照射され、試料Ａ内に存在している蛍光物質を励起して蛍光Ｆを発生させる。
【００２４】
試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ６によって集光された後、結像レンズ５、瞳投影レンズ４およびスキャナ３を介して同じ光路を戻り、ビームスプリッタ７によってレーザ光Ｌの光路から分岐される。そして、レーザ光Ｌから分岐された蛍光Ｆは共焦点レンズ１１により集光されることにより、その集光位置に配置されているピンホール１２を通過した蛍光Ｆのみが集光レンズ１３によって略平行光に変換され、分散手段１４に入射される。
【００２５】
分散手段１４を構成している回折格子１４ａは、蛍光Ｆを波長毎に分散させて一方向に並ぶスペクトル列を形成する。そして、集光レンズ１５によって集光され、スリット１６ａを通過した波長範囲の蛍光Ｆのみが光検出器１７によって検出される。
【００２６】
この場合において、光検出器１７への蛍光Ｆの取り込み波長範囲Ｂ２は、波長選択手段１６に備えられたスリット１６ａの開口幅と回折格子１４ａの角度とによって決定される。すなわち、スリット１６ａの開口幅は、そこを通過する蛍光Ｆの波長範囲の大きさを決定し、回折格子１４ａの角度は、蛍光Ｆの波長範囲の位置を決定する。
【００２７】
制御ユニット９は、記憶ユニット１０に記憶されているレーザ光源ユニット２のレーザ光源２ａ〜２ｃ毎の実際のピーク波長Ｂ１に基づいて、蛍光Ｆの取り込み波長範囲Ｂ２を算出し、波長選択手段１６および分散手段１４を制御する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、レーザ光源２ａ〜２ｃの実際の波長特性であるピーク波長Ｂ１を記憶しているので、図２に示されるように、レーザ光源２ａ〜２ｃの個体差によりピーク波長Ｂ１が異なっても、実際に搭載されているレーザ光源２ａ〜２ｃに適合した蛍光取り込み波長範囲Ｂ２を適正に設定することができる。
【００２８】
また、本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、レーザ光Ｌのピーク波長Ｂ１が出力レベルに対応づけて記憶されているので、使用条件によって出力レベルが変動しても、各出力レベルの変化に応じた適正な蛍光取り込み波長範囲Ｂ２をリアルタイムに設定することができる。したがって、レーザ光Ｌが光検出器１７によって検出されてしまう不都合の発生を防止することができる。
【００２９】
光検出器１７により検出された蛍光取り込み波長範囲Ｂ２の蛍光Ｆの強度は、スキャナ３によるレーザ光Ｌの走査位置と対応づけて記憶されることにより、事後的に、２次元的な蛍光画像を構築するために利用される。したがって、本実施形態によれば、コントラストの高い蛍光画像を簡易に取得することができるという利点がある。
【００３０】
なお、本実施形態においては、記憶ユニット１０に記憶しておくレーザ光Ｌの波長特性として、レーザ光Ｌのピーク波長Ｂ１を出力レベル毎に記憶することとしたが、これに代えて、図３に示されるように、ピーク波長Ｂ１におけるレーザ光Ｌの強度に対して十分に低い強度（例えば、１／１００００）となる波長特性の裾野の波長α，βを、記憶しておくことにしてもよい。このようにすることで、記憶ユニット１０に記憶されている波長αを蛍光取り込み波長範囲Ｂ２の開始波長に設定するだけで、光検出器１７がレーザ光Ｌを検出しないようにすることができ、より簡易かつ直接的に、コントラストの高い蛍光画像を取得することができる。
【００３１】
特に、レーザ光源２ａ〜２ｃとしてレーザダイオードが用いられる場合には、図３に示されるように、出力レベルが低いとスペクトル幅が広がってしまうため、ピーク波長Ｂ１を記憶しておいて所定の波長Ｂ３分オフセットした波長を蛍光取り込み開始波長としたのでは、比較的高い強度のレーザ光Ｌが光検出器１７に取り込まれてコントラストが低下してしまうので、波長特性の裾野の波長αを記憶しておくことが効果的である。
【００３２】
また、記憶ユニット１０に記憶しておくレーザ光Ｌのピーク波長Ｂ１に代えて、レーザ光Ｌのスペクトルの重心波長を記憶しておいてもよい。ここで、スペクトルの重心波長は、レーザ光Ｌのスペクトル範囲全体にわたって積分した値の半分となる波長である。これによりピーク波長Ｂ１を記憶しておく場合と同様の効果を得ることができる。
【００３３】
また、本実施形態においては、記憶ユニット１０に記憶するレーザ光Ｌの波長特性として、記憶ユニット１０に設けられた外部入力手段１８によって、各レーザ光源２ａ〜２ｃの実際のピーク波長Ｂ１を入力することとしたが、これに代えて、図４に示される手法により、蛍光観察装置１に備えられた光検出器１７により波長特性を検出することにしてもよい。
【００３４】
すなわち、まず、レーザ光源２ａ〜２ｃの出力レベルを設定し（ステップＳ１）、波長選択手段１６のスリット１６ａの開口幅をピンホール１２の開口径等に応じた分解能に合わせて設定し（ステップＳ２）、回折格子１４ａを揺動させて波長を一方向に走査して光検出器１７により検出されるレーザ光Ｌの強度を順次測定する（ステップＳ３）。これにより、レーザ光Ｌのスペクトル分布を得ることができる。そして、レーザ光Ｌのスペクトル分布の内、ピーク波長Ｂ１またはピーク波長Ｂ１に対して十分に低い強度となる波長α，βを出力レベルに対応づけて記憶ユニット１０に記憶する（ステップＳ４）。
【００３５】
全ての出力レベルに対して波長特性を測定したか否かを判定し（ステップＳ５）、測定されていない場合には、出力レベルを変更してステップＳ２〜Ｓ５を繰り返す（ステップＳ６）。そして、全てのレーザ光源２ａ〜２ｃについて波長特性を測定したか否かを判定し（ステップＳ７）、終了していない場合には、レーザ光源２ａ〜２ｃを変更してステップＳ１〜Ｓ７を繰り返す（ステップＳ８）。全てのレーザ光源２ａ〜２ｃについて波長特性が測定された場合には処理を終了する。
【００３６】
また、本実施形態においては、図５に示されるように、波長の異なる複数（例えば、３個）のレーザ光源２ａ〜２ｃからのレーザ光Ｌを同時に試料Ａに照射し、かつ、試料Ａに複数の蛍光指示薬を導入して観察することにしてもよい。この場合には、分散手段１４、集光レンズ１５、波長選択手段１６および光検出器１７を波長毎に設ける。図中、符号２０，２１はビームスプリッタ、符号２２はミラーである。
【００３７】
そして、蛍光取り込み波長範囲Ｂ２としては、図６に示されるように、１つのレーザ光Ｆのピーク波長Ｂ１に対して長波長側の裾野の波長α２を取り込み開始波長とし、より長波長側のレーザ光Ｌのピーク波長Ｂ１から短波長側の裾野の波長β３を取り込み終了波長とするように波長範囲Ｂ２を設定すればよい。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を示すブロック図である。
【図２】図１の蛍光観察装置の記憶ユニットに記憶されたピーク波長に基づく蛍光取り込み波長範囲の設定例を示すグラフである。
【図３】図２の変形例であって、記憶ユニットに波長特性の裾野の波長を記憶する場合の蛍光取り込み波長範囲の設定例を示すグラフである。
【図４】図１の蛍光観察装置を用いたレーザ光の波長特性の測定方法を示すフローチャートである。
【図５】図１の蛍光観察装置の変形例を示すブロック図である。
【図６】図５の蛍光観察装置による蛍光取り込み波長範囲の設定例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３９】
Ａ  試料
Ｆ  蛍光
Ｌ  レーザ光
１  蛍光観察装置
２ａ〜２ｃ  レーザ光源
３  スキャナ（照明光学系）
４  瞳投影レンズ（照明光学系）
５  結像レンズ（照明光学系）
６  対物レンズ（照明光学系、対物光学系）
１０  記憶ユニット（記憶手段）
１４  分散手段
１６  波長選択手段
１７  光検出器（蛍光検出手段）
１８  外部入力手段（領域入力手段）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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