(57)【要約】【課題】バイオチップ材料として有用な新規な金属ナノ粒子複合体およびその製造方法、ならびに該金属ナノ粒子複合体を用いたバイオチップおよびその製造方法を提供する。【解決手段】表面がリン脂質分子で化学修飾された金属ナノ粒子に、機能性分子が、架橋リンカー部を介して化学結合していることを特徴とする金属ナノ粒子複合体。基板上に、前記金属ナノ粒子複合体が配置された複合体配置部を有するバイオチップ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面がリン脂質分子で化学修飾された金属ナノ粒子に、機能性分子が、架橋リンカー部を介して化学結合していることを特徴とする金属ナノ粒子複合体。
【請求項２】
前記金属ナノ粒子が金属ナノロッドである請求項１に記載の金属ナノ粒子複合体。
【請求項３】
前記機能性分子が、抗体、抗原、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、細胞骨格およびモータータンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の機能性タンパク質である請求項１または２に記載の金属ナノ粒子複合体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の金属ナノ粒子複合体の製造方法であって、
表面がリン脂質分子で化学修飾された金属ナノ粒子と、機能性分子とを、架橋リンカー剤を用いて化学結合させる工程を含むことを特徴とする金属ナノ粒子複合体の製造方法。
【請求項５】
前記架橋リンカー剤が、置換基を有していてもよいスクシンイミジル基と、含硫黄有機置換基とを有する請求項４に記載の金属ナノ粒子複合体の製造方法。
【請求項６】
基板上に、請求項１〜３のいずれか一項に記載の金属ナノ粒子複合体が配置された複合体配置部を有するバイオチップ。
【請求項７】
前記複合体配置部に、前記金属ナノ粒子複合体が１次元、２次元または３次元に配列した配列構造が形成されている請求項６に記載のバイオチップ。
【請求項８】
前記複合体配置部を複数有し、該複数の複合体配置部における機能性分子の種類および濃度、または機能性分子の種類もしくは濃度がそれぞれ異なる請求項６または７に記載のバイオチップ。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のバイオチップの製造方法であって、
基板上に、前記金属ナノ粒子複合体を構成する金属ナノ粒子を、その表面を化学修飾するリン脂質分子の自己組織化能を利用して展開させ、前記金属ナノ粒子複合体が１次元または２次元に配列した配列構造を形成する工程を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項１０】
前記金属ナノ粒子複合体が１次元または２次元に配列した配列構造を形成する工程を複数回繰り返すことにより、前記金属ナノ粒子複合体が３次元に配列した配列構造を形成する請求項９に記載のバイオチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属ナノ粒子複合体およびその製造方法、ならびに該金属ナノ粒子複合体を用いたバイオチップおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノメートルレベルのサイズを有する金属ナノ粒子は、当該金属ナノ粒子の自由電子と入射光の振動電場とが共鳴振動することにより、局在表面プラズモン吸収と呼ばれる特異な光特性を発現することが知られている。また、金属ナノ粒子を組織化した構造体では、近接した金属ナノ粒子間の局所的な電場強度が非常に大きくなることが見出されている（非特許文献１参照）。
最近、金属ナノ粒子のこれらの特性を利用した機能材料の研究開発が盛んになっており、バイオセンシング、電子材料、太陽電池、非線形光学材料、プラズモニック導波路等、幅広い分野での応用が指向されている。特にバイオセンシング分野においては、金属ナノ粒子を用いることにより、大型の装置を必要とせず、簡易に、短時間で、しかも安価に溶液中の生体分子の検出・診断等を行うことが可能として、種々の検討がなされている。
その理由の１つとして、金属ナノ粒子を基板表面で規則性良く集積した場合、その形状、配向、構造次元性等に由来する特異的な物性の発現が期待できることが挙げられる。
たとえば上述したように、金属ナノ粒子を組織化した場合、近接した金属ナノ粒子間の局所的な電場強度が非常に大きくなることから、該金属ナノ粒子間の間隙に吸着した分子の分光計測を行うと、スペクトルの光信号強度が極度に増強する表面増強効果が発現する。この性質は、高感度化を達成する重要な技術要素となる。
また、金属ナノ粒子としてロッド状のもの（金属ナノロッド）を用いれば、そのアスペクト比（［長軸方向の長さ］／［短軸方向の長さ（直径）］の比）を調節することにより、ターゲットとなる検出分子に応じて、局在表面プラズモン吸収波長を可視光から近赤外域まで自在に変化させることができる可変性を付与することができる。
これらの特性を利用することにより、金属ナノ粒子の吸収光、反射光、蛍光、赤外光、ラマン光、プラズモン共鳴等の簡単な分光学的手法から、検査対象とする目的物質を短時間で、高感度に定性・定量解析を行うことが可能となる。
【０００３】
近年、上述のような金属ナノ粒子の性質を利用して、金属ナノ粒子を基板上に規則的に配置し、それによって形成される組織化構造が精密に制御された金属ナノ粒子薄膜の開発が試みられている。
該金属ナノ粒子薄膜上に抗体、酵素等の生体分子を修飾すれば、生体分子間反応を、単分子単位の高感度で検査・診断することができるバイオセンサーを提供できると考えられている。また、ナノデバイス開発の分野においても、組織化した金属ナノ粒子薄膜は、新たな光電子物性を発現する新規なナノ基盤材料となり得る。特に金属ナノロッドを用いる場合、そのアスペクト比に応じて吸収波長の可変性を有するため、バイオセンシングの用途において、所望のターゲット分子に応じてセンシング波長を変更することで、選択性を発現させることができる。また、金属ナノ粒子を規則的に配列することで、局在表面プラズモンカップリングによる光や電場の増強効果が増大するため、単分子レベルの高感度センシング機能を付与することができる。
【０００４】
金属ナノ粒子を利用したバイオセンシングの具体例としては、たとえば、２種類のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を別々に固定化した金属ナノ粒子と、その標的となるＤＮＡとを混合すると、配列中の１塩基を、金属ナノ粒子のプラズモン吸収特性変化から簡単に見分けることができることが報告されている（非特許文献２参照）。また、１種類のＤＮＡ固定化金属ナノ粒子を用いた場合でも、その相補的なＤＮＡと高濃度の塩化ナトリウム溶液とを添加することにより、金属ナノ粒子の凝集形成能を意図的に制御し、１塩基のミスマッチを「非架橋型凝集反応」により識別する手法も提案されている（非特許文献３参照）。
また、金属ナノ粒子を用いた糖鎖の識別法も考案されている（非特許文献４参照）。この手法では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖で被覆した金属ナノ粒子にラクトース等の糖を結合させ、さらに該糖と特異的に結合するレクチンを加えることで、金属ナノ粒子の凝集・分散状態を変化させて糖鎖識別が行われる。該ＰＥＧ鎖は、金属ナノ粒子の溶液中での分散安定性をもたらす分散安定化剤としての役割とともに、該レクチンの非特異的吸着を防ぐための吸着抑制剤としての役割も担うよう、高度な粒子表面設計がなされている。
また、蛍光を発する半導体ナノ粒子を用いたバイオセンシングシステムも開発されている。たとえばＣｄＳナノ粒子の表面にビオチンを付加し、ビオチンを特異的に認識するストレプトアビジン（蛍光色素標識）を添加する。そしてＣｄＳを励起すると、ＣｄＳナノ粒子表面に吸着したストレプトアビジンを標識する蛍光色素へのみ蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ））が起こり、ビオチン−ストレプトアビジン間の反応が定量的に検出される（非特許文献５参照）。
【０００５】
一方、バイオチップは、巨大な市場価値をもたらすことが期待され、上記のようなバイオセンシング技術とともに、世界レベルで競争的な研究開発が試みられている。
一般に、次世代のバイオチップには、（１）高選択性（分子識別能の向上）、（２）高感度（分子レベルの診断・検出、信号増幅）、（３）ハイスループット（分離・精製等のプロセスの簡素化・分析時間の短縮）、（４）診断装置の低価格化・軽量化・小型化、等の高度な技術要素が要求される。
従来のバイオチップに用いられている検出法としては、電気化学的手法、ＥＬＩＺＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ））法、水晶振動子（Ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ（ＱＣＭ））法等が主流である。
これらのうち、電気化学的手法では、電極表面へ酵素や抗体、ＤＮＡ等の生体分子を、目的物質を特異的に認識する認識部位として固定化し、そこへ目的物質が結合した際に生じる電気化学的なシグナル変化や、酵素等の標識物質による信号増幅を検出し、定量を行う。また、ＥＬＩＺＡ法は、サンプル中に含まれる微量の目的物質を酵素標識または蛍光標識した抗体または抗原を用い、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法である。
しかし、これらの検出法は、いずれも、生体分子への標識作業を必要とし、作業が繁雑である。また、標識によって、生体分子認識能の阻害を招くことから、目的物質の微量測定や高感度測定が困難である。
一方、金属薄膜表面に目的物質が吸着する際のプラズモン共鳴角のシフト量を検出するＳＰＲ法や、振動数変化を検出するＱＣＭ法は、生体分子に酵素や蛍光分子を標識することなく（非標識）、目的物質の検出や定量を行える利点がある。
しかし、ＳＰＲ法は、感度向上のために大型の光学測定系や測定パラメータの最適化を必要とするなど、一連の検出操作が煩雑であるため、目的物質のオンサイトモニタリングには不適である。また、ＱＣＭ法は、簡単な装置で簡単に測定できるが、ノイズが大きく、高感度測定が実現しない。
さらに、これら従来の検出法は、いずれも、分子認識反応が行われた巨視的表面に対して信号強度を上げて検出を容易にすることを目的としており、次世代のバイオチップに求められる技術要素を満足させることは難しい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】山田淳監修、「プラズモンナノ材料の設計と応用技術」、第一刷、２００６年、シーエムシー出版
【非特許文献２】エヌ・エル・ロシ（Ｎ．Ｌ．Ｒｏｓｉ）ら、「ケミカル・レビュー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ）」、第１０５巻、２００５年、第１５４７−１５６２頁
【非特許文献３】ケイ・サトウ（Ｋ．Ｓａｔｏ）ら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、第１２５巻、２００３年、第８１０２−８１０３頁
【非特許文献４】エイチ・オオツカ（Ｈ．Ｏｔｓｕｋａ）ら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー」、第１２３巻、２００１年、第８２２６−８２３０頁
【非特許文献５】ワイ・ナガサキ（Ｙ．Ｎａｇａｓａｋｉ）ら、「ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）」、第２０巻、２００４年、第６３９６−６４００頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
金属ナノ粒子は、従来のバイオチップに用いられていた検出法における問題点を解決するバイオチップ材料として有望である。すなわち、上述したような特性を利用することにより、金属ナノ粒子の吸収光、反射光、蛍光、赤外光、ラマン光、プラズモン共鳴等の簡単な分光学的手法から、検査対象とする目的物質を、短時間で、高感度に定性・定量解析を行えるバイオチップを提供することが可能となる。また、基板上に、金属ナノ粒子を高密度に集積すれば、バイオチップ上の反応点も高密度に集積し、スループットの向上、バイオチップの小型化等が可能となる。
しかしながら、従来、バイオセンシング等への適用が検討されている金属ナノ粒子は、基板上への配置（金属ナノ粒子の並び方、配列構造の次元性、ナノメートルレベルでの粒子間隔等）の制御性が充分ではない。そのため、該金属ナノ粒子を基板上に高密度に集積させることは難しい。また、該金属ナノ粒子は、その表面が界面活性剤で被覆されるなど、生体分子の診断・検出等に用いるには生体適合性が低い問題もある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、バイオチップ材料として有用な新規な金属ナノ粒子複合体およびその製造方法、ならびに該金属ナノ粒子複合体を用いたバイオチップおよびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］表面がリン脂質分子で化学修飾された金属ナノ粒子に、機能性分子が、架橋リンカー部を介して化学結合していることを特徴とする金属ナノ粒子複合体。
［２］前記金属ナノ粒子が金属ナノロッドである［１］に記載の金属ナノ粒子複合体。
［３］前記機能性分子が、抗体、抗原、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、細胞骨格およびモータータンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の機能性タンパク質である［１］または［２］に記載の金属ナノ粒子複合体。
［４］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の金属ナノ粒子複合体の製造方法であって、
表面がリン脂質分子で化学修飾された金属ナノ粒子と、機能性分子とを、架橋リンカー剤を用いて化学結合させる工程を含むことを特徴とする金属ナノ粒子複合体の製造方法。
［５］前記架橋リンカー剤が、置換基を有していてもよいスクシンイミジル基と、含硫黄有機置換基とを有する［４］に記載の金属ナノ粒子複合体の製造方法。
［６］基板上に、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の金属ナノ粒子複合体が配置された複合体配置部を有するバイオチップ。
［７］前記複合体配置部に、前記金属ナノ粒子複合体が１次元、２次元または３次元に配列した配列構造が形成されている［６］に記載のバイオチップ。
［８］前記複合体配置部を複数有し、該複数の複合体配置部における機能性分子の種類および濃度、または機能性分子の種類もしくは濃度がそれぞれ異なる［６］または［７］に記載のバイオチップ。
［９］［６］〜［８］のいずれか一項に記載のバイオチップの製造方法であって、
基板上に、前記金属ナノ粒子複合体を構成する金属ナノ粒子を、その表面を化学修飾するリン脂質分子の自己組織化能を利用して展開させ、前記金属ナノ粒子複合体が１次元または２次元に配列した配列構造を形成する工程を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
［１０］前記金属ナノ粒子複合体が１次元または２次元に配列した配列構造を形成する工程を複数回繰り返すことにより、前記金属ナノ粒子複合体が３次元に配列した配列構造を形成する［９］に記載のバイオチップの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、バイオチップ材料として有用な新規な金属ナノ粒子複合体およびその製造方法、ならびに該金属ナノ粒子複合体を用いたバイオチップおよびその製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の金属ナノ粒子複合体の一実施形態を説明する模式図である。
【図２】本発明の金属ナノ粒子複合体の製造方法の一実施形態を説明する図である。
【図３】本発明のバイオチップにおいて、金属ナノ粒子複合体が一次元に配列した配列構造が形成されている場合の一実施形態を示す模式図である。
【図４】本発明のバイオチップにおいて、金属ナノ粒子複合体が二次元に配列した配列構造が形成されている場合の一実施形態を示す模式図である。
【図５】本発明のバイオチップにおいて、金属ナノ粒子複合体が二次元に配列した配列構造が形成されている場合の一実施形態を示す模式図である。
【図６】本発明のバイオチップにおいて、金属ナノ粒子複合体が三次元に配列した配列構造が形成されている場合の一実施形態を示す模式図である。
【図７】本発明のバイオチップにおいて、金属ナノ粒子複合体が三次元に配列した配列構造が形成されている場合の一実施形態を示す模式図である。
【図８】本発明のバイオチップにおいて、金属ナノ粒子複合体が三次元に配列した配列構造が形成されている場合の一実施形態を示す模式図である。
【図９】本発明のバイオチップがマイクロ流路型である場合の一実施形態を示す模式図である。
【図１０】本発明のバイオチップがマルチアレイ型である場合の一実施形態を示す模式図である。
【図１１】製造例１、製造例２、実施例１において製造した、金ナノロッド、リン脂質修飾金ナノロッドおよび金ナノロッド複合体それぞれの水分散液、ならびに使用したアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体原液の吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１２】製造例１、製造例２、実施例１において製造した、金ナノロッド、リン脂質修飾金ナノロッドおよび金ナノロッド複合体それぞれの水分散液、ならびに使用したアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体原液の蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図１３】製造例２、実施例１において製造した、リン脂質修飾金ナノロッドおよび金ナノロッド複合体それぞれの水分散液についてのフローサイトメトリー測定の結果を示すグラフである。
【図１４】実施例１において製造した金ナノロッド複合体の透過顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】実施例１において製造した金ナノロッド複合体のレーザー蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】試験例１において、生体分子間相互反応の検出を行った際に用いた測定系を説明する概略図である。
【図１７】試験例１において、生体分子間相互反応の検出を行った際の全反射蛍光顕微鏡写真である。
【図１８】試験例２において、生体分子間相互反応の時間変化観測を行った際の全反射蛍光顕微鏡写真である。
【図１９】試験例２において、生体分子間相互反応の時間変化観測を行った際の、反応時間に対する白色輝点数を示すグラフである。
【図２０】試験例２において、生体分子間相互反応の時間変化観測を行った際の、白色輝点数に対する平均輝度のヒストグラムを示すグラフである。
【図２１】試験例３（比較試験）の結果を示す全反射蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜金属ナノ粒子複合体＞
本発明の金属ナノ粒子複合体は、表面がリン脂質分子で化学修飾された金属ナノ粒子（以下、リン脂質修飾金属ナノ粒子ということがある。）に、機能性分子が、架橋リンカー部を介して化学結合しているものである。
ここで、本発明における「金属ナノ粒子」とは、粒子径が１〜９９９ｎｍの範囲内の金属粒子をいう。また、化学修飾、化学結合は、共有結合、イオン結合または水素結合による結合を示す。
【００１２】
［リン脂質修飾金属ナノ粒子］
リン脂質修飾金属ナノ粒子は、金属ナノ粒子の表面をリン脂質分子で化学修飾してなるものである。リン脂質分子でその表面が修飾されているため、リン脂質修飾金属ナノ粒子、および該リン脂質修飾金属ナノ粒子を有する金属ナノ粒子複合体は、水中または有機溶媒中での分散安定性が良好である。
【００１３】
リン脂質修飾金属ナノ粒子を構成する金属ナノ粒子を構成する金属としては、局在プラズモン共鳴が生じ得るものが好ましく、かかる金属としては、金、銀、銅、および金、銀、銅のうちの２種以上を含む合金などが利用できる。また、種類の異なる金属を用いた金属ナノ粒子を併用してもよい。
また、金属ナノ粒子としては、ロッド状の形状のもの、すなわち金属ナノロッドが好ましい。金属ナノロッドでは、アスペクト比に応じて吸収特性が変化するため、高い波長選択性が発現する。したがって、金属ナノロッドの形状を変えることによって測定波長を選択することができる。さらに、金属ナノロッドの長軸面または短軸面の吸収波長の違いを利用した偏光特性を発揮させることもできる。
ただし本発明はこれに限定されず、金属ナノ粒子の形状は、略球状などであっても構わない。金属ナノロッド以外の金属ナノ粒子を用いた場合でも、上記と同様の効果を発揮する。
金属ナノロッドは、アスペクト比が１より大きいことが好ましい。特に、粒子のナノサイズ効果による光特性が顕著に発現することから、金ナノロッドのアスペクト比が１〜５であることが好ましい。
また、金属ナノロッドは、直径が数ｎｍ〜数十ｎｍ、長さが数ｎｍ〜数百ｎｍのものが好ましい。
金属ナノロッドとしては、特に、上記効果に優れることから、金ナノロッドが好ましい。
【００１４】
金属ナノ粒子は、公知の方法を利用して作製できる。
たとえば金ナノロッドは、（１）化学還元と光反応を組み合わせた方法（たとえばワイ・ニイドメ（Ｙ．Ｎｉｉｄｏｍｅ）ら、「ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」、２００３年、第２３７６−２３７７頁を参照）、（２）化学還元で作製した金ナノシードをロッド状に成長させる化学合成法（たとえばティ・ケイ・ソウ（Ｔ．Ｋ．Ｓａｕ）ら、「ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）」、第２０巻、２００４年、第６４１４−６４２０頁を参照）等により合成することができる。
特に、（１）の方法では、極めて短時間で、均一な形状の金ナノロッドを容易に合成でき、また、同じ合成条件下において高い再現性が得られることから好ましい。
【００１５】
以下、（１）の方法についてより詳細に説明する。
この方法では、まず、金塩溶液を化学還元する。
出発原料である金塩溶液としては、例えば、ハロゲン化金水溶液やシアン化金水溶液などが挙げられる。金塩溶液の濃度は、１〜１０ｍＭ程度が好ましい。
金塩溶液には、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドなどの界面活性剤を含有させることが好ましい。界面活性剤の添加により、金ナノロッド１１の表面に界面活性剤が吸着し、金ナノロッドの凝集を防ぎ、安定して水溶液中に分散させることができる。界面活性剤の濃度は、２０〜１００ｍＭであることが好ましい。界面活性剤濃度が２０ｍＭ未満であると、金ナノロッド１１の分散安定性が不足して、凝集しやすくなる傾向にある。また、１００ｍＭを超えると、得られる溶液の粘性が高くなり、金ナノロッド成長反応速度の低下、成長粒子の不均一化、取り扱い性低下などが生じるおそれがある。
また、金塩溶液には、アセトンおよび／またはシクロヘキサンが含まれることが好ましい。アセトンは、光反応の開始剤の役割を担ってロッド成長反応を促進するとともに、光照射による金ナノロッド成長速度を調節できる。また、アセトンの添加量を適宜選択することにより、所望のアスペクト比を有する金ナノロッドの収量を変化させることができる。金塩溶液がシクロヘキサンを含む場合には、金ナノロッドの収率を高め、アスペクト比を均一化することができる。
上記金塩溶液の化学還元は、上記金塩溶液に還元剤を添加することにより実施できる。
還元剤としては、金クラスター（ナノ粒子の成長核）の生成割合が低いものが好ましく、具体的には、アスコルビン酸、クエン酸およびその塩などが好ましい。還元剤の添加量は、金塩が還元されるのに充分な量であればよい。
【００１６】
上記化学還元後、光反応を行う。光反応は、還元剤を添加した金塩溶液に紫外線などの光を照射し、金ナノロッドを得る反応である。
ここで、光照射においては、金微粒子の成長反応が特定の結晶面に偏る現象を誘起する物質、すなわち金ナノロッド１１の長軸方向の成長を促進する物質（以下、成長促進物質という。）を添加することが好ましい。成長促進物質としては、硝酸銀、塩化銀、臭化銀などの銀塩が好ましい。前記銀塩の添加濃度が高いほど長軸の長い金ナノロッドが得られるが、過剰の銀塩の添加は反応速度を低下させる傾向にある。このことから、銀塩の添加濃度は、１μＭ〜１ｍＭ程度であることが好ましい。
光反応においては、光照射時間、光照射強度、照射光波長を適宜選択して金ナノロッドの生成量と形状を制御することができる。照射光の波長は、金ナノロッド成長に効果的であることから、３００ｎｍ以下の紫外線であることが好ましく、２５４ｎｍ付近の紫外線であることがより好ましい。光源としては、例えば、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、超高圧水銀ランプ、キセノンランプなどを利用できる。さらに、所望の波長帯の光（例えば２５４ｎｍ）のみを選択的に透過させるバンドパスフィルターを光源と試料の間に配置してもよい。バンドパスフィルターを光源と試料の間に配置して光照射すれば、金ナノロッド成長反応をより促進させることができる。
【００１７】
光反応後には、精製を行ってもよい。金塩溶液に界面活性剤を含有させた場合、上記の工程を経て得られた、金ナノロッドを含む水溶液は、過剰の界面活性剤を含んでおり、この後のリン脂質修飾金ナノロッドの形成を阻害することがある。したがって、精製によって過剰な界面活性剤を取り除けば、リン脂質修飾金ナノロッドの形成阻害を防止できる。
精製としては、遠心分離、上澄み除去、純水洗浄の操作を繰り返すことが好ましい。さらに、遠心分離操作は、５℃以上１５℃未満、１分間当たり５０００回転以上、１０分間以上の条件で行うことが好ましい。このような条件では、遠心分離後、上澄み溶液中への金ナノロッドの浮遊量が抑えられ、金ナノロッドの回収量を高めることができる。ただし、この精製過程を３回以上繰り返し行うと、金ナノロッド表面にある界面活性剤が完全に剥がれ落ちて、金ナノロッドが水溶液中に安定に分散できなくなる傾向を示す。
【００１８】
［リン脂質修飾金属ナノ粒子の作製］
リン脂質修飾金属ナノ粒子は、特開２００６−１７９３９５号公報や、エイチ・ナカシマ（Ｈ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ）ら、「ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）」、第２４巻、２００８年、第５６５４−５６５８頁に記載の方法を参照して作製できる。たとえば、上記（１）の方法で調製した金ナノロッドを含む水溶液と、リン脂質分子を任意の濃度で水または有機溶媒中に分散した分散液とを混合、撹絆することにより作製できる。
金ナノロッドを上記（１）の方法で調製した場合、該金ナノロッド表面には、調製時に添加したカチオン性の界面活性剤（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド等）が静電的に配位しているが、金との化学結合力がより高いリン脂質分子を加えることにより、表面での配位子交換反応が起こる。このため、金ナノロッド表面を容易にリン脂質分子で化学修飾することができる。
リン脂質分子を有機溶媒中に分散させる場合、該有機溶媒としては、水と混和しない極性有機溶媒、例えば、クロロホルムや塩化メチレンなどのハロゲン系溶媒を用いることが好ましい。リン脂質分子やリン脂質修飾金ナノロッド１３は、この種の有機溶媒中に容易に分散する。
【００１９】
リン脂質修飾金属ナノ粒子の作製に用いるリン脂質分子としては、金属ナノ粒子表面に容易に化学修飾できることから、末端に、置換基として、金属ナノ粒子を構成する金属と反応し得る反応基を有するものが好ましい。
ここで、本明細書および特許請求の範囲において、「反応し得る」とは、化学結合を形成し得ることを意味する。
該反応基としては、金属ナノ粒子を構成する金属に応じて、従来、当該金属の表面処理等に用いられている化合物における反応基として用いられているものが利用できる。
たとえば金属ナノ粒子が金ナノ粒子である場合、金との化学結合力が高いことから、含硫黄有機置換基が好ましい。該含硫黄有機置換基としては、金と反応してＡｕ−Ｓ結合を形成し得るものであればよく、特に限定されないが、反応性に優れることから、メルカプト基（−ＳＨ）を含む有機基、チオアセチル基、スルフィド基およびジスルフィド基からなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましい。これらの中でも、メルカプト基を含む有機基が好ましく、特に、メルカプトアルキル基が好ましい。
該リン脂質分子としては、特に、下記一般式（１２−１）で表されるリン脂質分子が好ましい。該式（１２−１）で表されるリン脂質分子は、末端の−ＳＨが金と反応してＡｕ−Ｓ結合を形成する。
【００２０】
【化１】
2010175327.tif 000002
［式中、Ｒｓは含硫黄有機置換基であり、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に直鎖状の脂肪族炭化水素基であり、Ｘ１はアルカリ金属または水素原子である。］
【００２１】
式（１２−１）中、Ｒｓにおける含硫黄有機置換基としては前記と同様のものが挙げられる。Ｒｓとしては、メルカプト基を含む有機基が好ましく、メルカプトアルキル基がより好ましく、直鎖状のメルカプトアルキル基が好ましい。該メルカプトアルキル基としては、たとえば、ＨＳ−（ＣＨ２）ｒ−［式中、ｒは１〜２０の整数である。］が挙げられる。
Ｒ１、Ｒ２における直鎖状の脂肪族炭化水素基は、飽和であってもよく、不飽和であってもよく、飽和の脂肪族炭化水素基、すなわちアルキル基が好ましい。該脂肪族炭化水素基の炭素数は、特に限定されないが、通常、８〜２４が好ましく、１４〜１８がより好ましい。この脂肪族炭化水素基の炭素鎖の長さを調節することにより、本発明の金属ナノ粒子複合体を配列させて配列構造を形成する際、隣接する金属ナノ粒子複合体間の間隔を調節することができ、該炭素鎖が長いほど、隣接する金属ナノ粒子複合体間の間隔は広くなる。たとえば該炭素鎖について、炭素数８〜２４の間で任意の長さを選択すると、配列構造中の前記金属ナノ粒子複合体間の間隔を１〜５ｎｍ程度に調節できる。
Ｘ１におけるアルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム等が挙げられる。
式（１２−１）で表されるリン脂質分子の具体例としては、たとえば、下記化学式で表される１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォチオエタノールのナトリウム塩が挙げられる。
【００２２】
【化２】
2010175327.tif 000003
【００２３】
［機能性分子］
本発明において、機能性分子としては、当該機能分子との間に特異的に何らかの相互作用（たとえば化学結合の形成、吸着等）を生じる特異結合物質が存在し得るもの、すなわち、検体となる試料中の目的物質や候補目的物質（たとえば、生体に由来するタンパク質、ペプチド、低分子化合物等の生体分子）と特異的に結合または吸着できるものであり、且つリン脂質修飾金ナノ粒子に固定可能なものであれば、いかなる分子も利用できる。
機能性分子としては、生体分子間の特異的な結合能を活かしたバイオチップを開発できるという観点から、機能性タンパク質が好ましい。機能性タンパク質としては、抗体、抗原、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、細胞骨格およびモータータンパク質からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
ただし本発明において、機能性分子は機能性タンパク質に限定されず、上記のように、特異的に結合する特異結合物質が存在し得、且つリン脂質修飾金属ナノ粒子に固定可能なものであれば全ての分子が利用できる。タンパク質以外の機能性分子としては、たとえば糖鎖化合物、ＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）等が挙げられる。
【００２４】
［架橋リンカー部］
架橋リンカー部は、架橋リンカー剤に由来する部分であり、架橋リンカー剤を、リン脂質修飾金属ナノ粒子および機能性分子と反応させることにより形成される。
架橋リンカー剤としては、機能性分子と反応し得る基（以下、反応基（Ｐ）という。）と、リン脂質修飾金属ナノ粒子と反応し得る基（以下、反応基（Ｑ）という。）と、を有するものが用いられる。
【００２５】
反応基（Ｐ）は、化学結合させる機能性分子の構造に応じて適宜設定すればよい。たとえば、機能性分子として機能性タンパク質を用いる場合、従来、タンパク質の化学修飾等に用いられている化合物における反応基として用いられているものが利用できる。
本発明において、機能性分子として機能性タンパク質を用いる場合、反応基（Ｐ）としては、スクシンイミジル基が好ましい。スクシンイミジル基は、タンパク質の構造内のアミノ基、特にＮ末端のアミノ基と効率よくカップリング反応して共有結合を形成する。
該スクシンイミジル基は、スルホン酸（塩）基（−ＳＯ３Ｘ２［Ｘ２はアルカリ金属または水素原子である。］）等の置換基を有していてもよい。
反応基（Ｐ）としては、特に、スルホン酸（塩）基を有していてもよいスクシンイミジル基が好ましい。
【００２６】
反応基（Ｑ）としては、前記リン脂質分子の説明で、金属ナノ粒子を構成する金属と反応し得る反応基として挙げたものと同様のものが挙げられる。金との化学結合力が高いことから、含硫黄有機置換基が好ましく、特に、メルカプト基を含む有機基、チオアセチル基、スルフィド基およびジスルフィド基からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。これらの中でも、メルカプト基を含む有機基またはジスルフィド基が好ましく、メルカプトアルキル基またはジスルフィド基がより好ましい。
【００２７】
本発明において、架橋リンカー剤としては、置換基を有していてもよいスクシンイミジル基と、含硫黄有機置換基とを有するものが好ましく、スルホン酸（塩）基を有していてもよいスクシンイミジル基と、含硫黄有機置換基とを有するものがより好ましい。かかる架橋リンカー剤としては、たとえば、下記一般式（１４−１）で表される化合物が挙げられる。
【００２８】
【化３】
2010175327.tif 000004
［式中、Ｘ２はアルカリ金属または水素原子であり、ｍは１または０であり、Ｒ３は水素原子または−Ｓ−Ｒ５（Ｒ５は１価の有機基である。）であり、Ｒ４は２価の有機基である。］
【００２９】
Ｘ２におけるアルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム等が挙げられ、ナトリウムが好ましい。
Ｒ４における２価の有機基としては、たとえば、アルキレン基が挙げられる。該アルキレン基は直鎖状であることが好ましい。該アルキレン基の炭素数は、水への溶解性を考慮すると、１〜１２が好ましい。該アルキレン基においては、炭素鎖中に、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−等の、ヘテロ原子を含む２価の基が介在していてもよい。
Ｒ５における１価の有機基としては、特に限定されないが、末端に、含窒素環式基を有することが好ましい。含窒素環式基としては、たとえば、前記スクシンイミジル基、２−ピリジル基等が挙げられる。
【００３０】
式（１４−１）で表される化合物の具体例としては、たとえば、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（下記化学式（１４ａ）、以下、ＤＴＳＳＰという。）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（下記化学式（１４ｂ）、以下、ＤＳＰという。）、スルホスクシンイミジル  ６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート（下記化学式（１４ｃ）、以下、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰという。）、スクシンイミジル  ６−（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート（下記化学式（１４ｄ）、以下、ＬＣ−ＳＰＤＰという。）、Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（下記化学式（１４ｅ）、以下、ＳＰＤＰという。）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−ＭＵＡ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応生成物（下記化学式（１４ｆ）、以下、ＭＵＡ−ＮＨＳという。）等が挙げられる。ＭＵＡ−ＮＨＳは、たとえば、１１−ＭＵＡとＮＨＳとを、１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）触媒存在下でカップリング反応させることにより合成できる。
これらのうち、ＤＴＳＳＰ、ＤＳＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰまたはＳＰＤＰを架橋リンカー剤として使用する場合、任意に、硫黄含有還元剤でありクレランド試薬としても知られるジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用い、−Ｓ−Ｓ−部分を−ＳＨに還元することが好ましい。これにより、より効率的に金表面に化学結合させることができる。ＤＴＴは、トレオ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブタンジオールとも称され、化学式：ＨＳ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨで表される。
架橋リンカー剤としては、水への溶解性や反応効率を考慮すると、ＤＴＳＳＰが好ましい。
【００３１】
【化４】
2010175327.tif 000005
【００３２】
以下、本発明の金属ナノ粒子複合体の第一の実施形態を、図面を用いて説明する。本実施形態は、金属ナノ粒子複合体を構成する金属ナノ粒子が金ナノロッドであり、機能性分子が抗体である例である。
図１（ａ）に、本実施形態の金属ナノ粒子複合体（金ナノロッド複合体１０）の模式図を示す。
金ナノロッド複合体１０は、金ナノロッド１１の表面をリン脂質分子１２で化学修飾してなるリン脂質修飾金ナノロッド１３に、架橋リンカー部１４を介して、抗体１５が化学結合してなる。
リン脂質分子１２は、親水部（図中、大きい方の○）と、該親水部に結合した２本の直鎖状の疎水部と、前記親水部と金ナノロッド１１表面とを連絡する連結部（図中、小さい方の○）とから構成される。図１（ｂ）に、前記で挙げた１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォチオエタノールのナトリウム塩を用いた場合に形成されるリン脂質分子１２の構造を示す。
抗体１５は、折れ曲がった構造の２本の重鎖と、各重鎖に結合した２本の軽鎖とから構成されるＹ字型の構造を有し、抗体１５の、軽鎖が結合している側の２つの末端の一方に架橋リンカー部１４の一端が結合している。
【００３３】
［金属ナノ粒子複合体の製造方法］
金属ナノ粒子複合体は、たとえば、リン脂質修飾金属ナノ粒子と、機能性分子とを、架橋リンカー剤を用いて化学結合させる工程を含む製造方法により製造できる。
上記工程は、たとえば、以下の（Ａ）または（Ｂ）の手順で実施できる。
（Ａ）：機能性分子と架橋リンカー剤とを反応させ、その後、リン脂質修飾金属ナノ粒子と反応させる。
（Ｂ）：リン脂質修飾金属ナノ粒子と架橋リンカー剤とを反応させ、その後、機能性分子と反応させる。
【００３４】
（Ａ）の手順による金属ナノ粒子複合体の製造方法を、図２を用いて説明する。なお、以下に説明する図面において、前記図１に示した構成要素に対応する構成要素には、同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。
この例では、まず、抗体１５’および架橋リンカー剤１４’をそれぞれ任意の濃度で含む溶液（リン酸バッファー溶液等）を混合し、数時間、室温でインキュベートする。これにより反応が完了し、抗体１５’の一端に架橋リンカー剤１４’の一端が結合する。
そこに、任意の濃度のリン脂質修飾金ナノロッド１３溶液を添加する。すると、抗体１５’の末端に結合した架橋リンカー剤１４’の他端がリン脂質修飾金ナノロッド１３と反応し、金ナノロッド複合体１０が形成される。
【００３５】
上記反応後、さらに、精製を行ってもよい。たとえば遠心分離、上澄み除去、バッファー溶液への再分散、純水洗浄等の操作を繰り返し行うことで、目的物質以外の未反応物質や不純物を除去することができる。
【００３６】
＜バイオチップ＞
本発明のバイオチップは、基板上に、前記本発明の金属ナノ粒子複合体が配置された複合体配置部を有するものである。
基板としては、シリコン、ガラス、石英、サファイヤ、マイカ、ＩＴＯ、金、白金、銅、シリコン窒化物、インジウムリン等の無機材料；ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン等の有機材料など、様々な材料の固体基板を何ら制限なく利用することができる。また、ガラス基板等の無機基板の表面に撥水ポリマーコート等の表面処理が施されたものも利用できる。
当該バイオチップの使用時、倒立型顕微鏡を検出に用いる場合は、基板上部に試料を配し、基板下部から検出を行うため、白色光に対して透明な材質からなるものが好ましい。
また、基板は、加工性に優れた材料であることが好ましい。
また、基板は、直径約十ｎｍ程度の金ナノロッド複合体１０を基板表面で精密に配向させるためには、ナノメートルスケールでの平坦性を有するものが好ましい。
基板の厚さは特に限定されないが、通常０．１〜２０ｍｍ程度である。
【００３７】
基板上に複合体配置部を形成する方法は、特に限定されず、公知の方法が適用可能である。
本発明においては、リン脂質分子の自己組織化能を利用して、基板上に、前記リン脂質修飾金属ナノ粒子を展開させる方法が好適に用いられる。
このとき、基板上に展開させるリン脂質修飾金属ナノ粒子は、機能性分子が化学結合した状態であってもよく、化学結合していない状態であってもよい。つまり、下記方法（１）のように、機能性分子が化学結合したリン脂質修飾金属ナノ粒子、つまり本発明の金属ナノ粒子複合体を、基板上に展開させてもよく、下記方法（２）のように、機能性分子が化学結合していない状態のリン脂質修飾金属ナノ粒子を基板上に展開させた後、または該展開と同時に、該リン脂質修飾金属ナノ粒子に機能性分子を化学結合させ、金属ナノ粒子複合体としてもよい。
方法（１）：基板上に、前記金属ナノ粒子複合体を、前記リン脂質分子の自己組織化能を利用して、基板上に展開させる工程を含む方法。
方法（２）：基板上に、リン脂質修飾金属ナノ粒子を、前記リン脂質分子の自己組織化能を利用して展開させる工程（２−１）と、
前記リン脂質修飾金属ナノ粒子と、機能性分子とを、架橋リンカー剤を用いて化学結合させる工程（２−２）とを含む方法。
方法（２）において、工程（２−１）と工程（２−２）とは同時に行ってもよく、工程（２−１）を行った後、工程（２−２）を行ってもよい。
【００３８】
リン脂質分子の自己組織化能を利用した、金属ナノ粒子複合体またはリン脂質修飾金属ナノ粒子の展開は、たとえば、金属ナノ粒子複合体またはリン脂質修飾金属ナノ粒子を水等の分散媒に分散させ、該分散液を基板上に配し、乾燥させて分散媒を除去することにより実施できる。このようにして複合体配置部を形成した場合、該複合体配置部においては、乾燥過程において、リン脂質修飾金属ナノ粒子同士が、リン脂質分子の自己組織化（分子間相互作用）により連結し、集積化する。
分散液を基板上に配する方法としては、特に限定されず、公知の方法、たとえばキャスト法、スピンコート法、ラングミュアー・ブロジェット（ＬＢ）法などを用いることができる。
このとき、下記（ａ）〜（ｅ）等の要件を調節することにより、基板上における該リン脂質修飾金属ナノ粒子の集積構造（配列方向や構造次元性）を精密に制御することができる。
（ａ）基板の表面特性（親水性、疎水性）。
（ｂ）基板に対する分散媒の化学的親和力や表面張力。
（ｃ）分散液の基板への展開方法（展開手法、展開回数、展開方向等）。
（ｄ）分散液の乾燥条件（乾燥温度、乾燥速度等）。
（ｅ）リン脂質分子の構造
【００３９】
たとえば、カバーガラスなどの親水基板表面では、金属ナノ粒子複合体またはリン脂質修飾金属ナノ粒子は、リン脂質分子の自己組織化能により、その表面に沿って展開し、金ナノロッド同士が重なり合うことなく単層の配列構造を形成する。
また、配列させる金属ナノ粒子複合体またはリン脂質修飾金属ナノ粒子の粒子間間隔は、金属ナノ粒子表面に修飾するリン脂質分子の炭化水素鎖長に応じて容易に制御可能である。
該配列構造中の前記金属ナノ粒子複合体間の間隔は、１〜５ｎｍに調節されていることが好ましい。
【００４０】
また、スピンコート法を用いて分散液を展開させる場合、金属ナノ粒子複合体またはリン脂質修飾金属ナノ粒子は、比較的低密度で基板上に配置される。
この場合、金属ナノ粒子複合体が１次元に配列した配列構造を形成できる。ここで、「１次元に配列した配列構造」とは、基板上に、金属ナノ粒子複合体が１層１列に集積、配列した配列構造を示す。
図３に、本発明のバイオチップにおいて、金属ナノ粒子複合体が１次元に配列した配列構造が形成されている場合の一実施形態を示す。
本実施形態のバイオチップ３１においては、基板２１上の一部の領域に、複数のリン脂質修飾金ナノロッド１３が、それぞれ基板２１面に対して平行に、長軸面を接して一列に配列した１次元配列構造が形成され、他の領域に、複数のリン脂質修飾金ナノロッド１３が、それぞれ基板２１面に対して平行に、各短軸面を接して一列に配列した１次元配列構造が形成されている。各１次元配列構造においては、リン脂質修飾金ナノロッド１３の一部または全部に、架橋リンカー部（図示せず）を介して抗体１５が結合して金ナノロッド複合体１０を形成している。
このように、リン脂質修飾金ナノロッド１３の長軸面または短軸面のいずれかが接して連結された１次元配列構造を形成する場合、金ナノロッド１１の長軸面または短軸面のいずれかに選択的にリン脂質分子１２を導入しておくことにより、その連結方向を、縦あるいは横のいずれかに変化させることができる。
【００４１】
また、キャスト法やＬＢ法を用いて分散液を展開させる場合、金属ナノ粒子複合体またはリン脂質修飾金属ナノ粒子は、比較的高密度で基板上に配置される。
この場合、金属ナノ粒子複合体が２次元に配列した配列構造を形成できる。ここで、「２次元に配列した配列構造」とは、基板上に、１層２列以上に集積、配列した配列構造を示す。
図４〜５に、本発明のバイオチップにおいて、金属ナノ粒子複合体が２次元に配列した配列構造が形成されている場合の一実施形態を示す。
図４に示すバイオチップ３２においては、基板２１上に、複数のリン脂質修飾金ナノロッド１３が、それぞれ基板２１面に対して平行に、１層、Ｘ方向に６列×Ｙ方向に４列で配列した２次元横配列構造が形成されている。該２次元横配列構造においては、リン脂質修飾金ナノロッド１３の一部または全部に、架橋リンカー部（図示せず）を介して抗体１５が結合して金ナノロッド複合体１０を形成している。
図５に示すバイオチップ３３においては、基板２１上に、複数のリン脂質修飾金ナノロッド１３が、それぞれ基板２１面に対して垂直に、１層、長軸面を接して集積した２次元縦配列構造が形成されている。該２次元縦配列構造においては、リン脂質修飾金ナノロッド１３の一部または全部に、架橋リンカー部（図示せず）を介して抗体１５が結合して金ナノロッド複合体１０を形成している。
図４〜５に示すような、金属ナノロッド複合体１０が基板２１に対して垂直または平行に配向する配向構造は、主に、上記要件（ａ）と（ｂ）とが主に影響するので、これらの要件を精密に制御することにより、所望の配向構造を選択的に作製することができる。たとえば、マイクロ流路またはナノ流路を用い、前記分散液を一定方向から流して堆積していくことで、各金属ナノロッド複合体１０が、基板２１に対して平行に、一定方向に配列した配向構造を形成することができる。
【００４２】
また、上記１次元または２次元に配列した配列構造を形成する工程を繰り返すことにより、金属ナノ粒子複合体が３次元に配列した配列構造を形成することができる。ここで、「３次元に配列した配列構造」とは、基板上に、２層以上に集積、配列した配列構造を示す。
図６〜８に、本発明のバイオチップにおいて、金属ナノ粒子複合体が３次元に配列した配列構造が形成されている場合の一実施形態を示す。
図６に示すバイオチップ３４においては、基板２１上に、複数のリン脂質修飾金ナノロッド１３が、それぞれ基板２１面に対して平行に、１層、５×４列に配列した２次元横配列構造が、いずれも同じ配列方向で４層積層された３次元配列構造が形成されている。該３次元横配列構造においては、リン脂質修飾金ナノロッド１３の一部または全部に、架橋リンカー部（図示せず）を介して抗体１５が結合して金ナノロッド複合体１０を形成している。
図７に示すバイオチップ３５においては、基板２１上に、複数のリン脂質修飾金ナノロッド１３が、それぞれ基板２１面に対して垂直に、６×８列に配列した２次元縦配列構造が２層積層された３次元配列構造が形成されている。該３次元横配列構造においては、リン脂質修飾金ナノロッド１３の一部または全部に、架橋リンカー部（図示せず）を介して抗体１５が結合して金ナノロッド複合体１０を形成している。
図８に示すバイオチップ３６においては、基板２１上に、複数のリン脂質修飾金ナノロッド１３が、それぞれ基板２１面に対して平行に、短軸面を接して配列した２次元横配列構造と、長軸面を接して配列した１次元または２次元配列構造とが、交互に６層積層された３次元配列構造（３次元いかだ構造）が形成されている。該３次元横配列構造においては、リン脂質修飾金ナノロッド１３の一部または全部に、架橋リンカー部（図示せず）を介して抗体１５が結合して金ナノロッド複合体１０を形成している。
この際、より精密に配向構造を制御するために、マイクロ流路またはナノ流路を用い、前記分散液を一定方向から流して堆積していくことで、より精密に配向構造を制御することができる。たとえば、前記分散液を一定方向に流すことで１層目を形成し、その後、分散液を流す方向を９０度変化させて２層目を形成し、これをさらに繰り返すことにより、図８に示すような、１層毎に縦列横列が交互に変化した３次元いかだ構造を構築することができる。
【００４３】
リン脂質は非常に流動的な分子であるため、上記のようにして金属ナノ粒子複合体を複合体配置部に配置した後、機能性分子が破壊されない程度の熱処理を行うことによって、金属ナノ粒子複合体を再配列化させることも可能である。
【００４４】
上記のように、複合体配置部において、前記金属ナノ粒子複合体が１次元、２次元または３次元に配列した配列構造が形成されているバイオチップは、金属ナノ粒子の配向構造が精密に制御されているため、隣接する金属ナノ粒子間において、表面プラズモンカップリング現象により局所的な強電場が発現する。この金ナノ粒子間に配した検体分子の分光信号、たとえばラマン分光、蛍光分光、赤外分光、反射光、近接場光、表面プラズモン分光等の光信号が飛躍的に増幅して観測される。このため、かかるバイオチップを用いれば、単分子スケールでの高感度観測が可能となる。
従来の手法では、試料分子そのものを検出する場合や、蛍光色素ラベル化した生体組織中の色素分子を検出する場合、１分子あたりの信号強度が微弱であり、しかも消光作用のため観測が不安定となり、１検出点をさほど縮小することはできなかった。
しかし本発明においては、単分子レベルの高感度化が期待できるため、単一生体分子の組織内での動的挙動の追跡や、単一分子あたりの生体分子間相互作用の検出、定量が可能となる。
上記のような、プラズモンカップリングによる光信号の増強効果が得られることから、本発明のバイオチップは、該増強効果を利用し、増強された光信号を検出することによりターゲット分子の診断・検出・定量等を行う光増強検出型のバイオチップとして使用することが好ましい。これにより、ターゲット分子の診断・検出・定量等を、単分子レベルの高感度で実施できる。
また、本発明のバイオチップにおいては、上記のような、プラズモンカップリングによる光信号の増強効果を考慮すると、前記配列構造中の前記金属ナノ粒子複合体間の間隔が１〜５ｎｍに調節されていることが好ましい。該粒子間間隔は、上述したように、金属ナノ粒子表面に修飾するリン脂質分子の炭化水素鎖長に応じて容易に制御可能である。
【００４５】
本発明のバイオチップは、複合体配置部を複数有することが好ましい。また、該複数の複合体配置部に、それぞれ、有する機能性分子の種類および濃度、または機能性分子の種類もしくは濃度が異なる金属ナノ粒子複合体が配置されていることが好ましい。
通常、生体分子を診断・検出する場合、試料中には多検体の分子が含まれる。そのため、バイオチップには、該多検体の分子を同時に、短時間で、分子選択的に判定、定量するために、素子構造化が望まれる。すなわち、バイオチップに、検体とする生体分子のハイスループットスクリーニング機能を付与することが望まれる。
本発明においては、複合体配置部を複数設け、該複数の複合体配置部に、それぞれ、有する機能性分子の種類および濃度、または機能性分子の種類もしくは濃度が異なる金属ナノ粒子複合体を配置することで、このようなハイスループットスクリーニング機能を付与することができる。
【００４６】
かかるバイオチップの素子構造としては、たとえば、マイクロ流路型、マルチアレイ型等が挙げられる。
マイクロ流路型の素子構造では、基板上に、複合体配置部のほか、試料を配置する試料配置部、該試料配置部と複合体配置部とを連絡するマイクロ流路とが設けられる。また、その他、必要に応じて、試薬を配する試薬配置部、配線等が設けられる。
図９に、本発明のバイオチップがマイクロ流路型の素子構造を有する場合の一実施形態を示す。本実施形態のバイオチップ３７においては、基板２１上に、３つの試料配置部２２と、１つの試薬配置部２３と、１つの検出部２４（ドレイン）とが設けられ、検出部２４内には、異なる種類の抗体ａ〜ｃがそれぞれリン脂質修飾金ナノロッド１３に化学結合してなる金ナノロッド複合体が配置された複合体配置部２５ａ〜２５ｃが設けられている。
また、各試料配置部２２と、試薬配置部２３と、複合体配置部２５とは、マイクロ流路２６により連絡されている。ここで、「マイクロ流路」とは、マイクロメートルサイズの流路幅を有する流路を示す。該流路幅は、１〜１００μｍ程度が好ましい。マイクロ流路２６は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の材料を用いて既知の方法で容易に作製できる。
また、基板２１上には、マイクロ流路２６を横断して、配線２７が設けられている。該配線２７を介して、電圧印加装置を接続することにより、マイクロ流路２６内を流通する試料に対し、電圧を印加し、それによる反応を生じさせることができる。
かかるマイクロ流路型のバイオチップ３７を用いた診断・検出は、たとえば以下の手順で実施できる。まず、３つの試料配置部２２にそれぞれ異なる試料Ａ〜Ｃを配する。すると、各試料がマイクロ流路内に流入して混合される。この混合試料に対し、任意に電圧の印加、試薬の混合等を行い、該混合試料中の（不純物を除去した）反応生成物のみを分離し、これを複合体配置部２５ａ〜２５ｃに流入させる。このとき、試料中に、たとえば抗体ａと反応するターゲット分子が存在すると、該ターゲット分子は、複合体配置部２５ａ内の金ナノロッド複合体に結合する。そのため、各複合体配置部２５ａ〜２５ｃの分光測定を、オプティカルプローブ等を用いて行うと、複合体配置部２５ａにおいてのみ、表面増強効果による光強度の増大が観測される。
このようなマイクロ流路型のバイオチップを用いることにより、試料中に含まれるターゲット分子を、分子選択的に、高感度に同定・定量・診断することが可能となる。
【００４７】
マルチアレイ型の素子構造では、基板上に、それぞれ独立した複合体配置部が複数設けられる。
図１０に、本発明のバイオチップがマルチアレイ型の素子構造を有する場合の一実施形態を示す。本実施形態のバイオチップ３８においては、基板２１上、短辺方向に８列×長辺方向３列ずつ、それぞれ異なる種類の抗体ａ〜ｅがリン脂質修飾金ナノロッド１３に化学結合した金ナノロッド複合体が配置された、ドット形状の複合体配置部２５ａ〜２５ｅが形成されている。また、各複合体配置部２５ａ〜２５ｅにおいては、短辺方向で、各金ナノロッド複合体の配置数、つまり各複合体配置部中の抗体の濃度が段階的に変えられている。
かかるマルチアレイ型のバイオチップ３８は、たとえば、それぞれ異なる抗体種が結合した金属ナノロッド複合体をそれぞれ異なる抗体濃度で有する分散液を基板上にスポッティングすることにより作製できる。
ここで用いる基板は特に限定されず、上述したような多種の材質の基板、たとえばカバーガラス、スライドガラス、撥水ポリマーコート化ガラス、シリコン基板等、のなかから適宜選択して使用できる。
スポッティングの手法は、特に限定されず、前記で分散液を基板上に配する方法として挙げた公知の手法が利用できる。たとえばキャスト法を利用したスポッティング方法としては、溶液吐出ディスペンサーを用いる方法、キャピラリー法（基板上に前記分散液を押しつけ、キャピラリー効果により塗布する方法）、インクジェット法等が挙げられる。
かかるマルチアレイ型のバイオチップ３８を用いた診断・検出は、たとえば、各試料配置部にそれぞれ対象試料を配し、各複合体配置部について、上記と同様、オプティカルプローブを用いた分光測定を行うことにより実施できる。たとえば試料が、抗体ａに対する二次抗体を蛍光標識したものを含む場合、該二次抗体は、抗体ａがリン脂質修飾金ナノロッド１３に化学結合した金ナノロッド複合体に結合するため、該複合体が配置された複合体配置部２５ａにおいて、表面増強効果による蛍光スペクトルの光強度の増大が観測される。
このようなマルチアレイ型のバイオチップを用いることにより、試料中に含まれる複数のターゲット分子を、同時に、高効率で、高感度にスクリーニング検出することが可能となる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
＜製造例１（金ナノロッドの製造）＞
塩化金（ＩＩＩ）酸（２ｍＭ）およびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（８０ｍＭ）を溶解させた３ｍＬの水溶液中に、アセトン（６５μＬ）、シクロヘキサン（４５μＬ）および成長促進物質である硝酸銀（１０ｍＭ水溶液）を１００μＬ滴下した。さらに、塩化金酸の還元剤であるアスコルビン酸（４０ｍＭ水溶液）を２００μＬ添加し、１０分間室温で撹搾して透明な金塩溶液を得た。
次いで、この金塩溶液を、１ｃｍ石英セルに移し、撹拝しながらＵＶ光源（ＵＶ  ＬＩＧＨＴ  ＳＯＵＲＣＥ，ＨＯＹＡ−ＳＣＨＯＴＴ，ＨＬＳ  １００ＵＭ）を用い１０分間光照射した。その際、紫外透過フィルター（シグマ光機、ＵＴＶＡＦ−５０Ｓ−３３Ｕ）を用いて可視領域の光をカットし、２５４ｎｍ付近の特定波長のみ照射した。これにより、金ナノロッドが分散した水分散液を得た。該金ナノロッドは、ロッド径１０ｎｍ程度、ロッド長４０ｎｍ程度（平均アスペクト比３．９）であった。
該金ナノロッドは、数日経過後も凝集することなく安定に水中に分散していた。これは、表面が界面活性剤であるヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドで被覆されているためと推測される。
【００４９】
＜製造例２（リン脂質修飾金ナノロッドの製造）＞
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォチオエタノール（ナトリウム塩）に純水を添加し、超音波処理（室温、１０〜１５分）を施すことにより、リン脂質分子が分散した水分散液（リン脂質分子濃度１ｍＭ）を調製した。この水分散液１００μＬを、金ナノロッド含有液１００μＬ中に滴下し、１０〜１５分間室温で撹絆して、リン脂質修飾金ナノロッドの水分散液を得た。
該リン脂質修飾金ナノロッドは、数日経過後も凝集することなく安定に水中に分散していた。これは、表面がリン脂質分子で被覆されているためと推測される。
なお、ここで使用した金ナノロッド含有液は、製造例１で得た金ナノロッド水分散液を、金表面を極力露出させて複合化反応の効率を高めるため、あらかじめ遠心分離（１００００回転／分、１５分、１０℃）、上澄み液除去、純水中への再分散の処理を２度繰り返し行い、過剰な界面活性剤を除去・精製したものである。
【００５０】
製造例１で得た金ナノロッドの水分散液および製造例２で得たリン脂質修飾金ナノロッドの水分散液それぞれについて、以下の評価を行った。
［吸収スペクトル測定］
各水溶液の吸収スペクトル（波長３００〜９００ｎｍ）を測定した。結果を図１１に示す。
図１１に示すように、金ナノロッドは、６９０．５ｎｍ、５２２．０ｎｍに２つの吸収極大を示した。それらはそれぞれロッドの長軸、短軸に由来する局在表面プラズモン吸収に対応するピークである。
一方、リン脂質修飾金ナノロッドは、ロッドの長軸、短軸に対応するピークがそれぞれ６９４．０ｎｍ、５２９．５ｎｍに観測され、金ナノロッドと比較して、各ピークが若干、長波長側にシフトしていた。また、ピークがブロード化しており、この結果から、水中において、凝集体が形成されていることが示唆された。すなわち、リン脂質修飾金ナノロッドの水分散液は、リン脂質分子の相互作用により、隣接するリン脂質修飾金ナノロッド同士が凝集した凝集粒子を含んでいると推測される。
なお、図１１のグラフに示す吸光度は、各水溶液について測定された吸光度を、長波長側のピークトップで規格化した値である。
【００５１】
［動的光散乱測定］
また、各水分散液について、動的光散乱測定を行い、各水溶液中の金ナノロッドおよびリン脂質修飾金ナノロッドそれぞれの粒径分布を観測した。
その結果、金ナノロッドの平均粒径は７８．４ｎｍであり、リン脂質修飾金ナノロッドの平均粒径は１７３．０ｎｍであった。
動的光散乱測定による粒径分布測定では、実際の粒子径よりも若干大きな平均粒径値を示す傾向があるが、この点を鑑みても、リン脂質修飾金ナノロッドの平均粒径は、金ナノロッドに比して大幅に大きく、リン脂質修飾金ナノロッドが水中で凝集粒子を形成している可能性が示唆された。
【００５２】
＜実施例１（金ナノロッド複合体の製造）＞
（１−１：架橋リンカー剤による抗体末端の修飾）
蛍光色素アレクサがラベル化された抗ＩｇＧ抗体（アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体）の原液（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），２．０ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ分注し、１５０μＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳバッファー、０．１Ｍ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に溶解して、タンパク質濃度０．１ｍｇ／２００μＬの溶液を調製した。
また、架橋リンカー剤であるＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルフォスクシンイミジルプロピオネート）を純水注に溶解し、１０．０ｍＭの溶液を調製した。
これら２つの溶液を混合した後、緩やかに振とうし、室温（２３℃）で３時間インキュベートした。これにより、反応生成物として、架橋リンカー剤で末端が修飾された抗ＩｇＧ抗体（架橋リンカー修飾抗ＩｇＧ抗体）を含む溶液を得た。
【００５３】
（１−２：複合体化）
製造例２で得た金ナノロッド水分散液５０μＬと、上記（１−１）で得た溶液５０μＬとを混合した後、緩やかに振とうし、室温で終夜インキュベートした。その後、遠心分離（１００００回転／分、１５分、１０℃）、上澄み液除去、リン酸緩衝液中への再分散の処理を数度繰り返し行い、未反応の抗ＩｇＧ抗体や不純物を除去する精製を行うことで、金ナノロッド複合体の水分散液を得た。
【００５４】
得られた金ナノロッド複合体の水分散液について、以下の評価を行った。
［吸収スペクトル測定］
該水分散液の吸収スペクトル（波長３００〜９００ｎｍ）を測定した。結果を図１１に示す。
図１１に示すように、金ナノロッド複合体は、局在表面プラズモンに由来する吸収ピークが７０１．５ｎｍと５３０．０ｎｍに観測された。ピークの形状は製造例２で得たリン脂質修飾金ナノロッドと同様であった。
なお、図１１のグラフに示す吸光度は、金ナノロッド、リン脂質修飾金ナノロッドおよび金ナノロッド複合体それぞれの水溶液について測定された吸光度を、長波長側のピークトップで規格化した値である。
また、この金ナノロッド複合体の製造に用いたアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体原液は、４９４．５ｎｍに吸収ピークを有していたが、金ナノロッド複合体の水分散液については、４９４．５ｎｍに明確な吸収ピークは確認されなかった。これは、金ナノロッドに対して表面修飾されたアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体の濃度が低いため、金ナノロッドの吸光度に隠れている可能性があり、明確にピークとして確認できないためではないかと推測される。
【００５５】
［蛍光強度測定］
該水分散液の蛍光スペクトル（波長４５０〜７００ｎｍ）を測定した。また、参考として、金ナノロッド水分散液、リン脂質修飾金ナノロッド水分散液およびアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体原液についても同様の測定を行った。結果を図１２に示す。
図１２に示すように、金ナノロッド複合体では、５１６．０ｎｍに極大をもつ蛍光ピークが観測され、リン脂質修飾金ナノロッドにアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体がカップリングされたことが確認された。
一方、金ナノロッドおよびリン脂質修飾金ナノロッドは蛍光特性を示さず、アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体自体は、５１３ｎｍに蛍光ピークを有していた。
なお、図１２のグラフに示す蛍光強度は、金ナノロッド複合体水分散液およびアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体の原液について測定された蛍光強度を、ピークトップで規格化した値である。
【００５６】
［フローサイトメトリー測定］
該水分散液のフローサイトメトリー測定を行った。また、参考として、リン脂質修飾金ナノロッド水分散液についても同様の測定を行った。フローサイトメトリーでは、Ｘ軸に表記する前方散乱強度より、液中をフローする試料中の単粒子の粒径分布が観測され、また、Ｙ軸に表記する蛍光強度より、各単粒子における蛍光分子成分の有無が観測される。
リン脂質修飾金ナノロッドの測定結果を図１３（ａ）〜（ｂ）、金ナノロッド複合体の測定結果を図１３（ｃ）〜（ｄ）に示す。
これらの結果から、リン脂質修飾金ナノロッドでは、各粒子に対して蛍光成分は観測されなかったが、金ナノロッド複合体では、若干の粒径の増大とともに、蛍光成分を有するナノ粒子が観測され、リン脂質修飾金ナノロッドにアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体がカップリングされたことが確認された。
【００５７】
［顕微鏡観測］
図１４に、金ナノロッド複合体の透過顕微鏡写真（図１４（ａ）、観測：白色光下、１０倍対物レンズ使用）および蛍光顕微鏡写真（図１４（ｂ）、励起：水銀ランプ、観測：緑色領域の蛍光フィルターを使用、１０倍対物レンズ使用）を示す。また、図１５に、金ナノロッド複合体のレーザー蛍光顕微鏡写真（励起：４８８ｎｍアルゴンレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルターを使用、図１５（ａ）は１０倍対物レンズ使用、図１５（ｂ）はその部分拡大像。）を示す。
各観測においては、５μＬの金ナノロッド複合体水分散液をスライドガラス上に滴下し、乾燥させたものを試料として用いて観測を行った。
図１４（ａ）の透過顕微鏡像では、縞状に乾燥した金ナノロッド複合体が観測され、図１４（ｂ）の蛍光顕微鏡像では、透過顕微鏡像で確認された、金ナノロッド複合体の乾燥縞に沿って、緑色の蛍光を発する像が観測された。このことからも、アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体とリン脂質修飾金ナノロッドとのカップリングが実証された。また、図１４（ｂ）において、金ナノロッド複合体の乾燥縞以外の領域に蛍光成分が見られないことから、未反応のアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体は水分散液中に混在せず、精製の過程でほぼ除去されていることが確認された。
同様に、図１５（ａ）のレーザー蛍光顕微鏡像においても、より鮮明に、蛍光成分を有する金ナノロッド複合体の様子が観測された。図１５（ｂ）の部分拡大像では、大きなドット状の粒子が観測され、金ナノロッド複合体の凝集成分が存在することが示唆された。
【００５８】
＜実施例２（バイオチップの製造）＞
製造例２で得たリン脂質修飾金ナノロッド水分散液５μＬを、カバーガラス上に滴下し、室温・大気中にて乾燥処理を施し、溶媒を除去した。続いて、リン脂質修飾金ナノロッド水溶液を滴下した位置に、６０〜１００μＬのリン酸緩衝液を滴下した後、そこに、架橋リンカーで末端を修飾したＩｇＧ（ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ、一次抗体）溶液５μＬを添加し、３０分〜１時間、室温にてインキュベートした。することにより、ＩｇＧがリン脂質修飾金ナノロッドに化学結合した金ナノロッド複合体が表面に配置されたバイオチップを作製した。この後、バイオチップ表面に対し、未反応の前記ＩｇＧを除去するため、数度、リン酸緩衝液を用いて洗浄操作を行った。
なお、ここで用いた、架橋リンカーで末端を修飾したＩｇＧ（ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ、一次抗体）溶液は、実施例１の（１−１）において、アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体の代わりにＩｇＧ（ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ、一次抗体）を用いた以外は同様にして調製した。
カバーガラスなどの親水基板表面では、上述したように、リン脂質修飾金ナノロッドは、リン脂質分子の自己組織化能により、その表面に沿って展開し、金ナノロッド同士が重なり合うことなく単層の配列構造を形成する。そのため、上記のような処理を行うことで、リン脂質修飾金ナノロッドを２次元に、高密度に集積させることができる。
【００５９】
＜実施例３（マルチアレイ型バイオチップの製造）＞
アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体原液の代わりに抗ＩｇＧ抗体（二次抗体）溶液を用いた以外は実施例１と同様にして、リン脂質修飾金ナノロッドに抗ＩｇＧ抗体がカップリングされた金ナノロッド複合体の水分散液を得た。
この水分散液を１０ｎＬずつ、溶液吐出ディスペンサーを用い、縦横１ｍｍの間隔で基板（材質：スライドガラスまたはシリコン、長辺７５ｍｍ×短辺２５ｍｍ）上に吐出し、室温・大気中にて乾燥処理を施した。このとき、該水分散液は、基板の長辺方向に５スポット、短辺方向に１０スポットずつ、計５０スポット吐出した。乾燥後の各ドットはいずれも約２００μｍ程度の直径を有していた。また、隣接するドットは重なり合うことなく、位置制御性良くマルチアレイ化されていた。
別途、抗ＩｇＧ抗体を４種の異種抗体（抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＭ抗体）に変更した以外は上記と同様にして、４種の金ナノロッド複合体の水分散液を得た。これらの水分散液を、それぞれ、上記基板上に、上記と同様に５０スポットずつ吐出し、室温・大気中にて乾燥処理を施した。
これにより、基板上に、５種類の抗体がそれぞれ固定化されたスポットを５０スポットずつ、計２５０スポット有するマルチアレイ型バイオチップを得た。
【００６０】
＜試験例１（バイオチップを用いた生体分子間相互反応の検出）＞
実施例２で作製したバイオチップを用い、図１６に概略を示す全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）を用いた測定系にて、以下の手順で、抗体間の生体分子間相互反応の検出を行った。
バイオチップ６１上に、６０〜１００μＬのリン酸緩衝液を滴下して液滴６２を形成した。該液滴６２に、アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体の原液（実施例１で用いたものと同じ）を５μＬ滴下した。この滴下を行ってから０分後および３０分後の液滴６２を、ＴＩＲＦＭにて観察した（励起：４８８ｎｍアルゴンレーザー、対物レンズ：１５０倍）。
図１６に示す測定系においては、反射鏡としてダイクロイックミラー６３を用い、油浸対物レンズによる落射照明で対物レンズ６４の顕微鏡側の中心から外れた場所に励起光を入射させ、イマージョンオイル６５とバイオチップ６１の境界面で全反射を発生させる。すると、この境界面にエバネッセント場が形成され、液滴６２側の所定の厚さの範囲にのみ励起光が照射される。そのため、該励起光が照射された範囲内で発生した蛍光を測定することができる。本実施例においては、液滴６２内の、バイオチップ６１との界面より１００ｎｍ以内の領域（ナノ界面）の蛍光を測定した。
【００６１】
結果を図１７に示す。図１７（ａ）、（ｃ）はそれぞれ０分後、３０分後のＴＩＲＦＭ写真を示す。各写真中において、黒色部分はバイオチップ６１のカバーガラス表面、灰色部分は、ＩｇＧ（一次抗体）が結合した金ナノロッド複合体、白色輝点部分は、アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体（二次抗体）を示す。図１７（ｂ）、（ｄ）はそれぞれ、０分後、３０分後に得られたイメージング像中のコントラストに閾値を設け、白色輝点部分のみを抽出した像である。
図１７（ａ）、（ｂ）に示すように、反応開始時には白色輝点は全く確認されないが、図１７（ｃ）、（ｄ）に示すように、反応開始から３０分後には、バイオチップ上に、抗アレクサラベル化ＩｇＧ抗体に由来する白色輝点が多数観測された。この白色輝点の大きさ、径の均一性、測定系の分解能から考えると、白色輝点の各点は、バイオチップ６１表面において、単分子単位のアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧを有する金ナノロッド複合体にのみ選択的に吸着した様子を示しているものと思われる。
この結果から、上記バイオチップを用いれば、生体分子間反応の検出を、位置選択的に、且つ単分子レベルの高感度で行えることが示された。
【００６２】
＜試験例２（生体分子間相互反応の時間変化観測）＞
試験例１において、アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体の原液を滴下してから１５分後、４５分後、７５分後および９０分後の液滴６２を、試験例１と同様に、ＴＩＲＦＭにて観察することにより、バイオチップ６１表面へのアレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体の結合反応の経時的観測を行った。
図１８（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ１５分後、４５分後、７５分後および９０分後に得られたイメージング像中のコントラストに閾値を設け、白色輝点部分のみを抽出した像である。各図中に白色輝点数を併記する。これらの結果に示すように、反応開始から時間が経過するにつれて、白色輝点数が増加することが確認された。
また、このとき計測された白色輝点の数から、反応時間に対する白色輝点数の変化をプロットしたグラフを図１９に示す。該グラフから、上記バイオチップを用いた場合、時間経過とともに該バイオチップ表面に吸着する二次抗体数の変化を定量的に解析できることが明確である。
また、図２０に、反応時間毎に、各白色輝点に対する平均輝度（輝度は、オリンパス社製ＴＩＲＦＭ装置に搭載された画像解析ソフト「メタモルフ（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）」により解析した。）のヒストグラムをグラフ化した図を示す。該グラフに示すように、反応時間が経過しても、各白色輝点はほぼ安定な輝度を示していた。
これらの結果から、本発明のバイオチップおよびこれを用いた測定系では、非接触の検出、診断、定量等が可能であり、そのため、生体分子の構造破壊や消光がなく、単一分子レベルの高感度な測定を、長時間、安定に行うことが可能であることが示された。
【００６３】
＜試験例３（比較試験）＞
製造例２で得たリン脂質修飾金ナノロッド（抗体付与なし）のみの水分散液５μＬを、カバーガラス上に滴下し、室温・大気中にて乾燥処理を施し、溶媒を除去した。
該カバーガラス表面上に、１００μＬのリン酸緩衝液を滴下して液滴を形成し、該液滴に、アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体の原液（実施例１で用いたものと同じ）を５μＬ滴下した。この滴下を行ってから３０分後の液滴を、試験例１と同様に、ＴＩＲＦＭにて観察した。その結果、図２１（ａ）に示すように、反応開始から３０分後においても、白色輝点はナノ界面に観測されなかった。
この結果から、リン脂質修飾金ナノロッドが抗体と複合体を形成していない場合、アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体６６を高感度に検出することができないことが確認された。これは、図２１（ｂ）に示すように、アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体６６がリン脂質修飾金ナノロッド１３に結合しないため、表面増強効果による光強度の増大が生じないためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の金属ナノ粒子複合体は、金属ナノ粒子表面がリン脂質分子で化学修飾されているため、生体適合性が高く、また、基板上への配置の制御性も高く、基板上に高密度に集積化させることが可能であるため、バイオチップ用として有用である。該バイオチップは、生体分子の診断・検査チップとして利用できる。
また、本発明の金属ナノ粒子複合体は、安定なナノ粒子であり、耐久性に優れ、たとえばレーザー照射後の退色が抑制される。そのため、ターゲットとする生体分子のバイオチップ上での動態を長時間、安定に観察することができる。
また、本発明によれば、分子認識部として抗体や酵素、膜タンパク質等の機能性タンパク質が固定化されたバイオチップを提供することができる。該バイオチップを用いることにより、抗体反応（抗体−抗体反応、抗原−抗体反応）、酵素反応等の生体反応を観察することができる。
また、本発明においては、金属ナノ粒子特有の性質である光電子信号の増強効果を活用し、単分子レベルの分解能を有する高感度バイオセンシング機能が付与されたバイオチップを提供できる。
また、本発明のバイオチップにおいては、上記機能性タンパク質のみならず、ＤＮＡや細胞を固定することもできる。
そのため、様々な生体分子間の相互作用や細胞代謝物質を検出するセンサーの役割と、生体分子の定量的解析を可能とするハイスループットスクリーニング素子としての機能とを兼ね備えたものとすることができる。
さらに、本発明の金属ナノ粒子複合体は、生体適合性が高いことから、細胞などの生体組織内に導入可能である。そのため、特定の細胞を非破壊で染色できる細胞ラベリング材料（生体マーカー）として利用できる。また、上記のように、耐久性に優れることから、ターゲットとする生体分子の細胞内動態を長時間、安定に観察することができる。そのため、本発明の金属ナノ粒子複合体を生体マーカーとして用いることにより、高感度バイオイメージング解析が可能となる。
【符号の説明】
【００６５】
１０…金ナノロッド複合体、１２…リン脂質分子、１３…リン脂質修飾金ナノロッド、１４…架橋リンカー部、１５…抗体、２１…基板、２２…試料配置部、２３…試薬配置部、２４…検出部、２５ａ〜２５ｅ…複合体配置部、２６…マイクロ流路、２７…配線、３１〜３８…バイオチップ、６１…バイオチップ、６２…液滴、６３…ダイクロイックミラー、６４…対物レンズ、６５…イマージョンオイル、６６…アレクサラベル化抗ＩｇＧ抗体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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