(57)【要約】【課題】本発明は、血圧降下ペプチド及びその製造方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ただし、ＸａａはＰｒｏ、Ａｒｇ以外のアミノ酸）で示されるトリペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造方法である。本発明のトリペプチドは、化学合成することもでき、また、天然の生物資源から単離することもできる。天然の生物資源としては、特に、タンパク質を豊富に含む藻類のスピルリナが適している。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ただし、ＸａａはＰｒｏ、Ａｒｇ以外のアミノ酸）で示されるトリペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項２】
前記ＸａａがＧｌｎである請求項１に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含む血圧降下剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する機能性補助食品。
【請求項５】
Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ただし、ＸａａはＰｒｏ、Ａｒｇ以外のアミノ酸）で示されるトリペプチドをスピルリナから単離することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【請求項６】
前記ＸａａがＧｌｎである請求項４に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧降下ペプチド及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は生活習慣病の中でも発症率の高い疾患の１つで、肥満、高脂血症、糖尿病との合併により重篤な症状を呈することもあり、その効果的な治療が強く望まれている。
これまでに知られている高血圧の治療薬として、例えば、利尿薬、カルシウム拮抗薬、ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬、β遮断薬などが存在する。降圧利尿薬は、古くから広く使用されているが、低カリウム血症や、耐糖能の悪化などの副作用を誘発する可能性が示唆されていたため、糖尿病の患者などに対しては、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（以下、ＡＣＥ）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬などが第一次的な選択薬として使用されることが多い。
【０００３】
ＡＣＥは、レニン−アンジオテンシン系において作用する酵素で、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩに変換する機能を持つ。ＡＣＥの作用によって生成したアンジオテンシンＩＩは、レニン−アンジオテンシン系の最終生理活性物質であるが、血管壁、副腎、腎臓などの細胞膜に存在するアンジオテンシンＩＩ受容体を介して、血管収縮、カテコールアミンの分泌、ナトリウムの再吸収の促進など、血圧調節や体液及び電解質の恒常性の維持などの重要な機能を担う物質である。しかしながら、何らかの原因によって、血圧調節機能のバランスが崩れると、アンジオテンシンＩＩによる血圧上昇作用が異常亢進し、高血圧の常態が持続され、いわゆる、高血圧症の発症が惹起される。以上のような、ＡＣＥの活性に着目すると、これを抑制的に調節する物質が高血圧症の治療に有効であると考えられ、これまでに、カプトプリル、テプロタイドなどの、非ペプチド性又はペプチド性ＡＣＥ阻害剤が抗高血圧治療薬として開発されている。
【０００４】
カプトプリルは、ＡＣＥと酵素学的に類似しているカルボキシペプチダーゼＡの阻害薬をモデルとして開発されたもので、強力なＡＣＥ阻害活性を示すものであるが、腎機能障害等の副作用を引き起こすなどの問題点が指摘されている。
一方、ペプチド性のＡＣＥ阻害剤としては、ヘビ毒成分から分離された幾つかのペプチドにＡＣＥ阻害活性が認められ、その中の６アミノ酸からなるペンタペプチドに最も強い阻害活性が見られたが、このペプチドはペプチダーゼによって消化されてしまうため、医薬としての使用には適するものではなかった。ペンタペプチドの他に、９アミノ酸からなるペプチド（テプロタイド）にもＡＣＥ阻害活性が認められ、静注による降圧効果を確認されたが、経口投与においては、有効性が認められなかった。
【０００５】
テプロタイドの開発以降、ペプチド性のＡＣＥ阻害剤に関する研究が活発に行われるようになり、これまでに、ＡＣＥ阻害効果を示す、より低分子で経口投与によっても薬理効果を発揮するペプチドが多数報告されている。例えば、Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（配列番号２）（特許文献１）、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号２０）、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号２２）（以上、特許文献２）などのペンタペプチド、Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号３）、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（配列番号２１）などのテトラペプチド（以上、特許文献２）、Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（配列番号４）、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号５）（以上、特許文献２）、Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（配列番号６）（特許文献３）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号７）（特許文献４及び５）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号８）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（配列番号９）（以上非特許文献１）及びＡｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（配列番号１０）（非特許文献２）などのトリペプチド、さらに、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（配列番号１１）（特許文献６）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号１２）（非特許文献２）、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（配列番号１３）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（配列番号１４）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（配列番号１５）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ（配列番号１６）、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号１７）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１８）及びＡｓｎ−Ｐｈｅ（配列番号１９）（以上非特許文献３）などのジペプチドが報告されている。
【０００６】
また、ペプチド性のＡＣＥ阻害剤については、安価かつ簡便で、安全性の高い調製方法の確立も経済効率等に鑑みると非常に重要な問題である。ペプチドを生産する方法としては、化学的に合成する方法や、生物材料等から単離する方法が一般的である。上記ペプチドのうち、例えば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔなどはスケソウダラの皮膚から（非特許文献１）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ及びＡｓｐ−Ｇｌｙは大豆から（非特許文献２）、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ及びＡｓｎ−Ｐｈｅはガーリックから（非特許文献３）の単離が報告されており、また、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＴｙｒ−Ｐｒｏについては、乳酸菌を利用した安全性を考慮した効率的な単離方法が報告されている（特許文献４〜７を参照のこと）。
医薬又は機能性補助食品等として利用するためのペプチドを生物資源から調製する場合、大量かつ安価に調製することを考慮するのみならず、毒性等、安全面においても十分に配慮する必要がある。そのために、ペプチドを調製するための生物資源の選択及び該ペプチドの調製方法については、依然として改善の余地が残されている。
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｙｕｎら，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，３６：１１５５−１１６２．
【非特許文献２】Ｗｕら，Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２００２，３５：３６７−３７５．
【非特許文献３】Ｓｕｅｔａら，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，９：４１５−４１９．
【特許文献１】特開平５−１０９７号
【特許文献２】特開平３−１２０２２５号
【特許文献３】特開平５−３０６２９５号
【特許文献４】特許第２７８２１４２号
【特許文献５】特許第２７８２１５３号
【特許文献６】特許第３３６４５７９号
【特許文献７】ＷＯ２００６／００４１０５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を行ったところ、ＡＣＥ阻害活性を有し、血圧降下作用を示すペプチドの調製に成功し、本発明を完成するに至った。
よって、本発明は、ＡＣＥ阻害活性を有し、血圧降下作用を示すペプチド、並びに、該ペプチドを有効成分として含むＡＣＥ阻害剤及び血圧降下剤の提供を目的とする。
さらに、本発明は、該ペプチドを含む機能性補助食品の提供を目的とする。
また、本発明は、ＡＣＥ阻害活性を有し、血圧降下作用を示すペプチド、並びに、該ペプチドを有効成分として含むＡＣＥ阻害剤及び血圧降下剤の調製方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドの調製を行うにあたり、その生物資源としてスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）を選択した。
スピルリナとは、藍藻類のネンジュモ目ユレモ属スピルリナ科に属する一群の藻類のことである。現在知られているスピルリナの中には、良質のタンパク質を豊富に含むものが存在し、将来の食料難に対する栄養源として期待され、栄養補助食品等としても製品化されている。発明者らは、このようなスピルリナの特徴に着目し、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを、大量かつ安価に調製するための安全性の高い生物資源としてスピルリナを選択し、これまで報告されていない血圧降下作用を持つ新規のペプチドの調製に成功した。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）本発明の第１の形態は、「Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ただし、ＸａａはＰｒｏ、Ａｒｇ以外のアミノ酸）で示されるトリペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤」である。
（２）本発明の第２の形態は、「前記ＸａａがＧｌｎである上記（１）に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤」である。
（３）本発明の４の形態は、「上記（１）又は（２）に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含む血圧降下剤」である。
（４）本発明の第４の形態は、「上記（１）又は（２）に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する機能性補助食品」である。
（５）本発明の第５の形態は、「Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ただし、ＸａａはＰｒｏ、Ａｒｇ以外のアミノ酸）で示されるトリペプチドをスピルリナから単離することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法」である。
（６）本発明の第６の形態は、「前記ＸａａがＧｌｎである上記（５）に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法」である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のペプチドは、優れたＡＣＥ阻害活性を示し、また、経口投与により有効な血圧降下作用を発揮する。
【００１１】
本発明の方法を用いると、ＡＣＥ阻害活性を有する本発明のペプチドを大量かつ安価に、また、安全性の高い状態で調製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の実施形態の１つは、Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏで示されるトリペプチド（以下、本発明のトリペプチドと称する）を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤である。ここで、Ｘａａは、Ｐｒｏ及びＡｒｇ以外のアミノ酸を示し、例えば、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ及びＧｌｎなどが好ましく、特に、Ｇｌｎが好ましい。本発明のトリペプチドは、如何なる方法によって調製したものであってもよく、例えば、化学的に合成する方法や大腸菌等の宿主生物中において遺伝子工学的手法により発現させる方法、あるいは、天然の生物資源などから単離する方法など、当業者によって選択可能な任意の方法によって調製することができる。例えば、天然の生物資源から単離する場合においては、当業者によって任意の生物資源を選択することができるが、できるだけ、豊富にタンパク質を含んだ生物資源が好ましい。特に、本発明の方法として示されるように、藍藻類のネンジュモ目ユレモ属スピルリナ科に属する一群の藻類のうち、タンパク質を豊富に含むもの（例えば、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓなど）が本発明のトリペプチドの単離には適している。スピルリナ属の藻類を入手するには、天然環境から採取してもよいが、市販されているものを購入することもできる。
【００１３】
本発明のトリペプチドを生物資源等から単離する場合、生物資源の細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過等により、タンパク質を豊富に含む可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から本発明のトリペプチドを単離するには、適当なプロテアーゼにより、タンパク質を加水分解してペプチドを調製してから精製を進めるのが好ましい。ここで用いるプロテアーゼとしては、特に限定はしないが、例えば、アルカリ性プロテアーゼであるアルカラーゼなどが好適に利用可能である。プロテアーゼ処理を行った画分からの本発明のトリペプチドの単離は、当該技術分野において公知の分離・精製法を適切に組み合わせて実施することができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、本発明のトリペプチドを含む、高血圧症による異常な血圧上昇の治療のための医薬（血圧降下剤）（以下、本発明の医薬と称する）である。本発明の医薬の有効成分としては、本発明のトリペプチドのほか、薬理学的に許容されるその塩を用いてもよい。本発明の医薬は、本発明のトリペプチド及び薬理学的に許容されるその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記物質と１又は２以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。
【００１５】
医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のトリペプチドを水等に懸濁させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水或いはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
また、本発明の医薬は、経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。
【００１６】
医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機又は有機物質、或いは固体又は液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００１７】
経口投与用の固形製剤（機能性補助食品として使用する場合も含む）を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸− メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００１８】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０ 、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００１９】
本発明の医薬は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００２０】
本発明の医薬は、医薬組成物としてキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る薬剤組成物がキットとして供給される場合、該薬剤組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
【００２１】
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスクなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよく、あるいは、キットの製造者等によって指定されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００２２】
本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止及び／又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は０．０１〜１０００ｍｇ（有効成分重量）程度であり、一日１回又は数回に分けて、或いは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量０．００１〜１００ｍｇ（有効成分重量）を連続投与又は間欠投与することが望ましい。
【００２３】
さらに、本発明には、高血圧症などにおける血圧の異常な上昇、及び高血圧症によって引き起こされる他の疾患又は疾病の治療方法も含まれる。
ここで「治療」とは、血圧の異常な上昇を示す哺乳動物、あるいは、血圧上昇によって引き起こされる疾患に罹患した哺乳動物において、その高血圧状態又は病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって高血圧状態又は疾患の諸症状等の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする治療的処置の意味として使用される。
また、ここで「疾患」とは、高血圧症の他、虚血性心疾患、脳卒中、腎不全及び、これらの疾患の予備的病態をも含む意味として使用される。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、本発明のトリペプチドを含有する機能性補助食品である。機能性補助食品とは、一般に、体調を整える効果をもつとされる加工食品のことであるが、ここでは、特に、高めの血圧を低下させる効果を持つ食品類を指し、特定保健用食品、栄養機能性食品などの保健機能食品を含む機能性補助食品（栄養補助食品）一般を網羅する意味として定義される。
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
１．アルカラーゼ消化物の調製 
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓの乾燥粉末（２０ｇ）（Ｉｎｎｅｒ  Ｍｏｎｇｏｌｉａ  Ｒｅｉｕｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｎａ．）を水１６０ｍＬにけん濁し、凍結融解を５回おこなってから３分間の超音破砕し、６，０００×ｇで３０分遠心分離した。この溶液をｐＨ８．５に調製してからａｌｃａｌａｓｅ  ２．４  Ｌ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ）を０．０４（ｖ／ｖ）で加えて５０℃で１０時間反応させた。ｐＨ４．０にして反応を停止させ２０分間氷冷した後、６，０００×ｇで１０分遠心分離した。０．４５μｍ  Ｓｕｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ  Ｃｏ．ＵＳＡ）に通してから異なる分画サイズの限外ろ過膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｏ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分画し（１０，０００ＭＷＣＯ膜で酵素を除去し、５，０００及び３，０００ＭＷＣＯ膜を用いてさらにろ過を行った）、ＡＣＥ阻害活性を蛍光共鳴エネルギー移動法により測定した（Ｃａｒｍｏｎａら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，２００６，１：１９７１−６を参照のこと）。その結果、０−３０００ＭＷＣＯの分画に最も強いＡＣＥ阻害活性が見られた（表１）。
【００２６】
【表１】
2010138133.tif 000003
【００２７】
２．ＡＣＥ阻害ペプチドの精製
分画分子量３，０００以下の画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌを緩衝液として溶出し、得られた各画分の吸光度（２２０ｎｍ）と、ＡＣＥ阻害活性を測定した（図１）。次に、最も強いＡＣＥ阻害活性の画分をＣＯＳＭＯＳＩＬ  ＭＳ−ＩＩ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（ナカライテスク株式会社）を用い、０．１％  トリフルオロ酢酸，１％  アセトニトリル溶液を基本とした溶媒を使用し、アセトニトリル濃度を高める濃度勾配により精製を行った。得られた活性のピーク画分を、再度、ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ＭＳ−ＩＩ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎにかけ、濃度勾配を変えて、さらに精製を行った（図２）。
３．ＡＣＥ阻害ペプチドの物理化学的及び生化学的解析
精製したＡＣＥ阻害ペプチドの分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｋｒａｔｏｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）で測定し、そのアミノ酸配列をエドマン分析法（ＳＨＩＭＡＤＺＵ，Ｊａｐａｎ）により決定した。その結果、ＡＣＥ阻害ペプチドとしてＩｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（ＩＱＰ）が同定された（図３）。ＩＱＰは、ＡＣＥを競合的に阻害する（ＩＣ５０＝５．８μＭ，Ｋｉ＝７．６μＭ）。
さらに、消化器系の種々の消化酵素（ペプシン、キモトリプシン、トリプシン）をＩＱＰに反応させたときの安定性を評価した。各種酵素による反応溶液を１０，０００ＭＷＣＯ膜でろ過後、４℃、６，０００ｇで遠心し、酵素を除去した。遠心後の上清をＨＰＬＣ逆相クロマトグラム（Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，粒子サイズ  ５μｍ，ＹＭＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）にかけた。カラムは、０．１％  トリフルオロ酢酸，１％  アセトニトリル溶液を基本とした溶媒を使用し、アセトニトリル濃度を高める濃度勾配により溶出を行った。逆相クロマトグラムの保持時間とＩＱＰ強度がほとんど変化しなかったことから（図４Ａ、Ｂ、ＣとＤを比較）、ＩＱＰは、経口投与あるいは摂食の場合でも安定に存在することが示された（図４）。
【００２８】
４．ＡＣＥ阻害ペプチドの血圧降下作用
本発明のペプチド（ＩＱＰ）の血圧降下作用について検討を行った。高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）（日本チャールス・リバー株式会社）にＩＱＰを経口投与（摂取）し、加重平均最大血圧及び加重平均最小血圧の１週間及び１日の変動を測定した。
ＳＨＲの血圧測定直後にＩＱＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与し（その日の１１：００ａｍに投与）、１週間の血圧変動を調べた。ＩＱＰを投与した場合、加重平均最大血圧（図５Ａ）、加重平均最小血圧（図６Ａ）ともに、日毎に低下していくのに対し（図５Ａ及び図６Ａ、ＩＱＰ）、生理食塩水の投与では、血圧の低下は認められなかった。また、ＩＱＰの血圧降下作用は、ポジティブコントロールとして用いたカプトプリル（１０ｍｇ／ｋｇ）とほぼ同等の効果を示した。
ＩＱＰ投与による一日の血圧変動についても同様に測定を行った（図５Ｂ及び図６Ｂ）。ＳＨＲの血圧測定直後にＩＱＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与し（１１：００ａｍに投与）、その後１時間毎に血圧を測定し、その変動を調べた。ＩＱＰを投与した場合、加重平均最大血圧（図５Ｂ）、加重平均最小血圧（図６Ｂ）ともに時間毎に低下し、ペプチド投与後４〜６時間後の血圧低下が最も大きかった（図５Ａ及び図６Ａ、ＩＱＰ）。これに対し、生理食塩水の投与では、血圧の低下はみられなかった。また、一日における血圧降下作用についても、カプトプリル（１０ｍｇ／ｋｇ）とほぼ同等の効果を示した。
【００２９】
５．血中ＡＣＥ活性に対する影響
前述のように本発明のペプチド（ＩＱＰ）は、優れた血圧降下作用を示すが、この作用が実際に血中のＡＣＥ活性を阻害することを介して発揮されていることを以下のように確認した。ＩＱＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与後、ＳＨＲから血液を採取し、その血清中のＡＣＥ、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩＩの存在量をＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡ測定には、それぞれＡＣＥ  ｈｕｍａｎ ｑｕａｎｔｉｋｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）、Ｒａｔ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（株式会社  免疫生物研究所）、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）を使用した。その結果、ＡＣＥ及びアンジオテンシノーゲンの血清存在量は、コントロール（図７Ａ及びＢ、生理食塩水）との比較において有意差は認められなかったのに対し、ＡＣＥの作用によって生じるアンジオテンシンＩＩの存在量は、コントロールと比較して有意に減少していることが解った（図７Ｃ）。
以上のことから、本発明のペプチドは、ＡＣＥ活性阻害を介して血圧降下作用を発揮していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、ＡＣＥ活性を阻害し、血圧降下作用を示すペプチドを提供する。従って、本発明は、高血圧症及びその合併症等の治療分野における利用の他、日常の健康管理に供される機能性補助食品の分野において有効に利用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ１０／３０によるゲルろ過プロファイルを示す。横軸は溶出画分の画分番号（チューブ番号）を、縦軸は各画分の吸光度（２２０ｎｍ）を示す。
【図２】ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ＭＳ−ＩＩ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎからの溶出プロファイルを示す。横軸は溶出画分の画分番号（チューブ番号）を、縦軸は各画分の吸光度（２２０ｎｍ）を示す。
【図３】ＡＣＥ阻害ペプチドの質量分析の結果を示す。
【図４】ＡＣＥ阻害ペプチドの各種消化酵素に対する安定性を調べた。Ａ：０．２ｍＬのペプチド溶液（１．５ｍＭミリＱ中）を０．２ｍＬの０．０５％（ｗ／ｖ）ペプシン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，０．１Ｍ  ＫＣｌ−ＨＣｌ、ｐＨ２．０）で、３７℃、６時間処理し、１Ｎ  ＮａＯＨを添加してｐＨを７．０に調整した。Ｂ：０．２ｍＬのペプチド溶液（１．５ｍＭミリＱ中）を０．２ｍＬの０．０５％（ｗ／ｖ）キモトリプシン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，０．１Ｍ  Ｋ３ＰＯ４、ｐＨ８．０）で、３７℃、６時間処理し、６Ｎ  ＨＣｌを添加してｐＨを７．０に調整した。Ｃ：トリプシンを用いて、Ｂと同様に処理を行った。Ｄ：消化酵素無処理のコントロール
【図５】加重平均最大血圧に対するＩＱＰの影響を測定した結果である。Ａ：ＳＨＲへＩＱＰを経口投与後、加重平均最大血圧の１週間の変動を記録した結果を示す。加重平均最大血圧は、測定した最大血圧を平均心拍数で除した値として算出し、ポスト−ホック  シェッフェ  テストによる分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を行った。グラフ中のアルファベットは有意差を表しており、異なるアルファベットが付与されたデータポイント間には有意差があることを示している。ａｂが付与されたデータポイントは、ａまたはｂが付与されたデータポイントのどちらとも有意差が認められない。ｐ＜０．０５が統計的有意とした。
【図６】加重平均最小血圧に対するＩＱＰの影響を測定した結果である。Ａ：ＳＨＲへＩＱＰを経口投与後、加重平均最小血圧の１週間の変動を記録した結果を示す。加重平均最小血圧は、測定した最小血圧を平均心拍数で除した値として算出し、ポスト−ホック  シェッフェ  テストによる分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を行った。グラフ中のアルファベットについては、図５の説明を参照のこと。ｐ＜０．０５が統計的有意とした。
【図７】ＩＱＰ投与後の血清中におけるＡＣＥ（Ａ）、アンジオテンシノーゲン（Ｂ）、アンジオテンシンＩＩ（Ｃ）の存在量をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。グラフ中のアルファベットについては、図５の説明を参照のこと。ｐ＜０．０５が統計的有意とした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月9日(2009.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
前記ＸａａがＧｌｎである請求項５に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。