(57)【要約】【課題】NADPHオキシダーゼは、ヒトケラチン細胞において、活性酸素発生に大きく寄与する酵素であり、特に紫外線照射後の活性酸素発生では主要な酵素である。また、同酵素は、加齢、炎症にも関与しているので、同酵素の制御を可能にする天然物を基にした組成物の提供は、紫外線、加齢による皮膚障害や肌荒れの予防、正常化に効果的かつ安全な皮膚外用剤・化粧料となる。【解決手段】有効成分として、グルタミン、グルタミン酸またはグルタミン酸塩、グリシンおよび水溶性糖類を含有する水性組成物、それを用いた皮膚外用剤、化粧料およびこれらの添加剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン、グルタミン酸およびグルタミン酸塩よりなる群から選択される１種またはそれを超えるアミノ酸1-50mMと、
グリシン1-10mMと、
グルコースおよびマルトースよりなる群から選択される１種または２種の水溶性糖類20-250mMとを含有することを特徴とする水性組成物。
【請求項２】
水溶性糖類が、グルコースである請求項１記載の水性組成物。
【請求項３】
医療用皮膚外用剤である請求項１記載の水性組成物。
【請求項４】
化粧料である請求項１記載の水性組成物。
【請求項５】
化粧料添加剤である請求項１記載の水性組成物。
【請求項６】
育毛剤である請求項１記載の水性組成物。
【請求項７】
育毛剤添加剤である請求項１記載の水性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチン細胞において、NADPHオキシダーゼ阻害作用を有する医療用皮膚外用剤、化粧料、育毛剤またはそれらに使用する添加剤として有用な水性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、NADPHオキシダーゼは、炎症、種々の疾病や老化に大きくかかわる酵素として注目を集めている（非特許文献１）。ケラチン細胞では、紫外線照射によってNADPHオキシダーゼ活性が上昇し、活性酸素の発生が亢進することが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Physiol. Rev., Vol.87: pp.245−313, 2007
【非特許文献２】J. Invest. Dermatol., Vol.128: pp.214-222, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このようなNADPHオキシダーゼの活性は制御することが望ましいが、安全で長期使用が可能な天然物を用いたNADPHオキシダーゼの阻害物質は未だ発見されておらず、ケラチン細胞での同酵素の制御は未解決のままであった。
【０００５】
かかる課題に鑑み、本発明者らは、生体の持つ自己防衛反応に抗炎症作用の存在を考え、外傷から進行した敗血症のような高度炎症病態時に血中に増加する遊離アミノ酸（Ann. Surg., Vol.192: pp.78-85, 1980）およびグルコース（Nutrition, Vol.13 (Suppl.1):45S-51S, 1997）に着目し、それらの単独および組み合わせによるNADPHオキシダーゼ抑制効果を検討した。
【０００６】
本発明は、紫外線AおよびB（UVA、UVB）刺激下、およびUVAまたはUVB無刺激下のケラチン細胞において、NADPHオキシダーゼ阻害作用を有する水性組成物（グルタミン酸またはグルタミン酸塩、グリシン、水溶性糖類が有効成分）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ケラチン細胞において細胞NADPHオキシダーゼ活性を阻害し、同酵素に由来する活性酸素によって惹起される皮膚の傷害、炎症、色素沈着、老化、癌化、脱毛などを抑制する作用を有する医療用皮膚外用剤、化粧料、育毛剤などを得るべく、ヒトの炎症状態時に増加する遊離アミノ酸および水溶性糖類を検討した結果、グルタミン酸またはグルタミン酸塩、グリシンおよび特定の水溶性糖類の組み合わせにより、紫外線刺激の有無にかかわらず、同酵素への優れた阻害作用が示されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］グルタミン、グルタミン酸およびグルタミン酸Naよりなる群から選択される１種またはそれを超えるアミノ酸1-50mMと、
グリシン1-10mMと、
グルコースおよびマルトースよりなる群から選択される１種または２種の水溶性糖類20-250mMとを含有することを特徴とする水性組成物；
［２］水溶性糖類が、グルコースである前記［１］記載の水性組成物；
［３］医療用皮膚外用剤である前記［１］記載の水性組成物；
［４］化粧料である前記［１］記載の水性組成物；
［５］化粧料添加剤である前記［１］記載の水性組成物；
［６］育毛剤である前記［１］記載の水性組成物；および
［７］育毛剤添加剤である前記［１］記載の水性組成物
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明で用いるグルタミン、グルタミン酸またはグルタミン酸塩、グリシンおよび水溶性糖類を組み合わせると、それぞれを単独で適用する場合と比してNADPHオキシダーゼ阻害作用が高められる。また、グルタミン、グルタミン酸またはグルタミン酸塩、グリシンおよび水溶性糖類は、いずれも従来から使用されており、その安全性が確認されているものである。
したがって、本発明によれば、安全かつ効果的なNADPHオキシダーゼ阻害剤を提供することができ、それを用いて、NADPHオキシダーゼの亢進により生じる皮膚の傷害、炎症、色素沈着、老化、癌化、脱毛等を抑制する作用を有する医療用皮膚外用剤、化粧料、育毛剤を提供することができ、種々の生理学的な症状を安全かつ効果的に改善することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、グルタミン、グルタミン酸およびグルタミン酸塩よりなる群から選択される１種またはそれを超えるアミノ酸と、グリシンと、グルコースおよびマルトースよりなる群から選択される１種または２種の水溶性糖類とを含有する水性組成物を提供する。
【００１１】
本発明の水性組成物に用いるグルタミン、グルタミン酸またはグルタミン酸塩は、天然物より抽出／精製などの操作を経て得られたものであっても、または、微生物や培養細胞を用いた発酵学的または遺伝子工学的手法により得られたものであってもよい。
グルタミン酸塩としては、例えば、グルタミン酸のNa塩などが挙げられる。
【００１２】
また、グルタミン酸はグルタミンよりグルタミナーゼによって生成され、そのグルタミナーゼは皮膚細胞中にも存在することが知られているので、グルタミン酸に代えてグルタミンを使用する場合も、グルタミン酸と同様の効果が期待できる。したがって、本発明では、グルタミンもグルタミン酸またはグルタミン酸塩の代替品として使用することができる。
【００１３】
本発明の水性組成物に用いるグルタミン、グルタミン酸またはグルタミン酸塩の濃度は、それらの１種またはそれを超えるアミノ酸の合計濃度として、水性組成物に基づいて通常1-50mM、好ましくは2-40mM、より好ましくは6-30mM、最も好ましくは10-20mMである。グルタミン、グルタミン酸またはグルタミン酸塩の水性組成物中における濃度が1mM未満の場合は有効なNADPHオキシダーゼ阻害作用が奏されず、皮膚傷害抑制、抗炎症、色素沈着抑制、老化防止、癌化防止、脱毛防止などの効果を有効に発揮させることができない。一方、50mMを超えてもそれ以上の効果を期待することができない。
【００１４】
本発明の水性組成物に用いるグリシンの濃度は、水性組成物に基づいて通常1-10mM、好ましくは2-8mM、より好ましくは2.5-7mM、最も好ましくは3-6mMである。グリシンの水性組成物中における濃度が1mM未満の場合は有効なNADPHオキシダーゼ阻害作用が奏されず、皮膚傷害抑制、抗炎症、色素沈着抑制、老化防止、癌化防止、脱毛防止などの効果を有効に発揮させることができない。一方、10mMを超えてもそれ以上の効果を期待することができない。
【００１５】
本発明の水性組成物に用いる水溶性糖類としては、グルコースのような単糖類、マルトースのような二糖類が挙げられ、これらは単独でも２種以上を組み合わせて用いることができる。本発明の水性組成物における水溶性糖類の濃度は、水性組成物に基づいて通常20-250mM、好ましくは30-200mM、より好ましくは40-175mM、最も好ましくは50-150mMである。水溶性糖類の水性組成物中における濃度が20mM未満の場合は有効なNADPHオキシダーゼ阻害作用が奏されず、皮膚傷害抑制、抗炎症、色素沈着抑制、老化防止、癌化防止、脱毛防止などの効果を有効に発揮させることができない。一方、250mMを超えてもそれ以上の効果を期待することができない。
【００１６】
本発明の組成物は、所望の成分を混合、溶解する等の自体公知の方法で、直接的には水性組成物として調製することができ、また、その水性組成物から慣用されている界面活性剤、油剤、増粘剤、溶剤、湿潤剤、他の有効成分、甘味料、着色料、香料、保存料などを加えて、粉末、顆粒、錠剤等の固体、ペースト状、軟膏、溶液、懸濁液、乳化液などの剤形の医療用皮膚外用剤、化粧料、化粧料添加剤、育毛剤、育毛剤添加剤などとすることができる。
【００１７】
また、グルタミン、グルタミン酸またはグルタミン酸塩、グリシンおよび水溶性糖類をそのまま混合して、抗NADPHオキシダーゼ剤としての化粧料・育毛剤添加剤とすることができ、この添加剤における各成分の配合濃度は、化粧料や育毛剤として調製した際に上記の水性組成物中の濃度となる濃度である。
【実施例】
【００１８】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるわけではない。
実施例1-3では、外傷から進行した敗血症のような高度炎症病態時、血中に増加する遊離アミノ酸3種、アラニン、グルタミン酸およびグリシンを選択し、同じく増加するグルコースとの組み合わせを含めて、in vitro各種条件下でのNADPHオキシダーゼ活性への作用を検討した。
また、実施例4-5では、実施例1-3によって求められたアミノ酸とグルコースとを組み合わせた効果をヒト被験者で検討した。
【実施例１】
【００１９】
ヒトケラチン細胞（倉敷紡績株式会社）を表に示す濃度のグルタミン酸Na、グリシン、グルコースおよびアラニン存在下で72時間培養後、UVAを10J照射、Carcinogenesis, Vol.27: pp.1692-1698, 2006に記載された方法に従って処理し、15分後のNADPHオキシダーゼ活性を測定した。また、同時にMTTアッセイを行い、その比によって活性細胞あたりのNADPHオキシダーゼ活性を比較した。処置1-16において各成分単独でのNADPHオキシダーゼ／MTTの最低値を求め、処置17-21において最低値となる組み合わせを検討した。
【００２０】
グルタミン酸0.1mM、グリシン0.1mM、グルコース6mMおよびアラニン0.1mMは培養液に既存で、グルタミン酸はグルタミン酸Naを添加した。処置1-4、5-8、9-12、13-16および17-21はそれぞれ同一の培養細胞を用いてn=4にて同時に実験した。処置1、5、9、13および17の値を各々1.00として、同時実験のサンプル値との比の平均値を求めた。結果を表1に示す。
【００２１】
【表１】
2010241739.tif 000002
その結果、グルタミン酸塩、グリシンおよびグルコースには各々単独で若干のNADPHオキシダーゼ阻害作用が認められ、それぞれ特定の濃度範囲の組み合わせにより、相乗的なNADPHオキシダーゼ阻害増強作用が認められた。
【実施例２】
【００２２】
ヒトケラチン細胞（倉敷紡績株式会社）を表に示す濃度のグルタミン酸Na、グリシン、グルコースおよびアラニン存在下で72時間培養後、UVBを80mJ照射、Carcinogenesis, Vol.27: pp.1692-1698, 2006に記載された方法に従って処理し、15分後のNADPHオキシダーゼ活性を測定した。また、同時にMTTアッセイを行い、その比によって活性細胞あたりのNADPHオキシダーゼ活性を比較した。処置1-16において各成分単独でのNADPHオキシダーゼ／MTTの最低値を求め、処置17-21において最低値となる組み合わせを検討した。
【００２３】
グルタミン酸0.1mM、グリシン0.1mM、グルコース6mMおよびアラニン0.1mMは培養液に既存で、グルタミン酸はグルタミン酸Naを添加した。処置1-4、5-8、9-12、13-16および17-21はそれぞれ同一の培養細胞を用いてn=4にて同時に実験した。処置1、5、9、13および17の値を各々１.00として、同時実験のサンプル値との比の平均値を求めた。結果を表2に示す。
【００２４】
【表２】
2010241739.tif 000003
その結果、グルタミン酸塩、グリシンおよびグルコースには各々単独で若干のNADPHオキシダーゼ阻害作用が認められ、それぞれ特定の濃度範囲の組み合わせにより、相乗的なNADPHオキシダーゼ阻害増強作用が認められた。
【実施例３】
【００２５】
ヒトケラチン細胞（倉敷紡績株式会社）を表に示す濃度のグルタミン酸Na、グリシン、グルコースおよびアラニン存在下で72時間培養後、UV非照射のまま、Carcinogenesis, Vol.27: pp.1692-1698, 2006に記載された方法に従って処理し、15分後のNADPHオキシダーゼ活性を測定した。また、同時にMTTアッセイを行い、その比によって活性細胞あたりのNADPHオキシダーゼ活性を比較した。処置1-16において各成分単独でのNADPHオキシダーゼ／MTTの最低値を求め、処置17-21において最低値となる組み合わせを検討した。
【００２６】
グルタミン酸0.1mM、グリシン0.1mM、グルコース6mMおよびアラニン0.1mMは培養液に既存で、グルタミン酸はグルタミン酸Naを添加した。処置1-4、5-8、9-12、13-16および17-21はそれぞれ同一の培養細胞を用いてn=4にて同時に実験した。処置1、5、9、13および17の値を各々1.00として、同時実験のサンプル値との比の平均値を求めた。結果を表3に示す。
【００２７】
【表３】
2010241739.tif 000004
その結果、グルタミン酸塩、グリシンおよびグルコースには各々単独で若干のNADPHオキシダーゼ阻害作用が認められ、それぞれ特定の濃度範囲の組み合わせにより、相乗的なNADPHオキシダーゼ阻害増強作用が認められた。
【実施例４】
【００２８】
NADPHオキシダーゼ阻害効果が認められたグルタミン酸塩、グリシンおよびグルコースの混合液を実際の化粧品として使用するに当たり、グルコースの皮膚分配係数が0.5であること（Pharm. Res., Vol.23: pp.1227-1234, 2006）、グルタミン酸塩およびグリシンは脂溶性アミノ酸に比べて膜の透過度が低いこと（Amino Acids, Vol.6: pp.213-229, 1994）、外用剤として塗布されたグルタミン酸塩、グリシンおよびグルコースの皮膚組織での消失が明確でないことを考慮して、実施例1-3で示した至的濃度の約2-3倍量の成分を配合して医療用皮膚外用剤を調製し、試験に供した。
【００２９】
あれ肌症の女性24名（22-34歳）を6群に分け、1群4名で20日間、就寝前に20mMグルタミン酸Na、6mMグリシンまたは2重量％（100mM）グルコースの水溶液を単独、あるいは３種成分の混合液を顔面に塗布し、使用前後での皮膚状態の自発的感触を官能評価した。また、アラニン単独（6mM）および3種の成分の混合液にアラニンを添加した水溶液での効果も評価した。その結果を表4に示す。
【００３０】
【表４】
2010241739.tif 000005
その結果、グルタミン酸塩、グリシンおよびグルコースには各々単独で若干のNADPHオキシダーゼ阻害作用が認められ、それぞれ特定の濃度範囲の組み合わせにより、相乗的なNADPHオキシダーゼ阻害増強作用が認められた。
グルタミン酸、グリシンおよびグルコースの混合液で効果の改善が認められたが、さらにアラニンの添加ではその効果は増強されなかった。
【実施例５】
【００３１】
健康な男子8名（29-57歳）の参加者のうち、4名の片腕に2重量％（100mM）グルコース、20mMグルタミン酸Naおよび6mMグリシンの混合水溶液を塗布し、別の腕には各々2名に2重量％（100mM）グルコースまたは20mMグルタミン酸Naを塗布し、また、残りの4名に上記3種類の成分に6mMグリシンを添加した水溶液を片腕に塗布、別の腕にはグリシン6mMまたはアラニン6mMを塗布し、8名全員を日光に2時間暴露した。その後、混合液を塗布した腕には混合液を、別の腕には日光暴露前に塗布した単独液を2時間ごとに3回塗布し、翌日の皮膚の発赤状態を観察した。その結果を表5に示す。
【００３２】
【表５】
2010241739.tif 000006
グルコース・グルタミン酸・グリシン混合液で炎症・発赤が軽減されたが、アラニンの添加でその効果は増強されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上記載したごとく、本発明による優れたNADPHオキシダーゼ阻害作用を有するグルタミン、グルタミン酸またはグルタミン酸塩、グリシンおよび水溶性糖類の含む水性組成物は、皮膚外用剤、化粧料、育毛剤およびこれらの添加剤として有用である。