(57)【要約】【課題】生体試料からの微弱な発光を長期間観察しても生体試料の鮮明な発光画像を得る。【解決手段】培養環境に維持され光を発する生体試料Ａを配置するための可動式のステージ６と、生体試料Ａの光学像を投影する観察光学系９と、該観察光学系９をその光軸方向に移動させる観察光学系移動手段１０と、観察光学系９で投影された生体試料Ａの発光像を取得する画像取得部１１と、該画像取得部１１による画像取得のタイミングを制御する画像取得部制御手段５と、画像取得部１１で取得された発光画像を蓄積する画像保存部５と、該画像保存部５に蓄積された発光画像のうち、同一の光軸方向位置に観察光学系９が配置され、異なる時刻に取得された複数枚の発光画像の輝度値を積算して積算画像を作成する画像積算手段１２とを備える生体試料観察装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養環境に維持され光を発する生体試料を配置するための可動式のステージと、
前記生体試料の光学像を投影する観察光学系と、
該観察光学系をその光軸方向に移動させる観察光学系移動手段と、
前記観察光学系で投影された前記生体試料の発光像を取得する画像取得部と、
該画像取得部による画像取得のタイミングを制御する画像取得部制御手段と、
前記画像処理部で取得された発光画像を蓄積する画像保存部と、
該画像保存部に蓄積された発光画像のうち、同一の光軸方向位置に観察光学系が配置され、異なる時刻に取得された複数枚の発光画像の輝度値を積算して積算画像を作成する画像積算手段とを備える生体試料観察装置。
【請求項２】
前記画像積算手段が、所定枚数の発光画像を積算し、前記積算画像の輝度値が所定の数値を超えた場合に、前記所定枚数より少ない枚数の前記発光画像を積算する請求項１に記載の生体試料観察装置。
【請求項３】
前記観察光学系が異なる光軸方向位置に配置されて取得された時間軸上の同一のデータ点における一連の前記積算画像の中から、最も鮮明な画像を選択する画像選択手段を備える請求項１または請求項２に記載の生体試料観察装置。
【請求項４】
前記画像選択手段が、前記積算画像内の任意の部位のみにフォーカスの合った積算画像を選択する請求項３に記載の生体試料観察装置。
【請求項５】
前記発光画像に含まれるバックグラウンドノイズを除去する画像調節手段を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体試料観察装置。
【請求項６】
照明光学系を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の生体試料観察装置が、前記ステージ上の前記生体試料に赤外光を照明する生体試料観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞生物学や分子生物学の分野では、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）や生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポータとして働かせて細胞内の特定部位や機能蛋白質に蛍光標識または発光標識を付し、それらの生細胞内での動態を経時的に観察する必要が高まっている。
【０００３】
ＧＦＰを用いる観察ではこれを発光させるために生体試料に強い励起光を照射する必要が、この励起光により生体試料はダメージを受けやすく、１〜２時間の観察が限界である。一方、ルシフェラーゼは自己発光するため励起光は不要であり、５日間程度の観察が可能である。そのため生細胞内の蛋白質や遺伝子などを長期間経時的に観察したい場合、非常に有用な手段である。
【０００４】
従来、このルシフェラーゼ遺伝子を導入した生細胞の発光画像を取得するには、ルシフェラーゼの発光が非常に微弱であるため、非常に高価な冷却ＣＣＤカメラを用いて数十分から１時間程度の長い露光時間が必要であるうえ、低解像度の画像しか得られなかった。しかし、特許文献１に記載の観察装置および観察方法により、比較的安価な冷却ＣＣＤカメラでも１〜２０分程度の露光時間で、生細胞の形状が認識可能な高解像度の発光画像を取得できるようになった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１１３９６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１の観察装置および観察方法により露光時間が大幅に短縮されたものの、数分〜数十分の露光時間は必要であり、これは蛍光観察と比べると依然として長い。
【０００７】
このように長時間露光するとその間に細胞自身が垂直方向（フォーカス方向）に移動してフォーカスがずれてしまい、鮮明な画像が得られないことがある。また、長期間の観察中に細胞がフォーカス方向に移動して観察面から像が消えてしまい、長時間かけて行った観察が無駄になってしまう恐れがある。さらに、観察の対象が時計遺伝子の場合、光に対して反応するため、従来の明視野像を使ったオートフォーカスは、実験結果に大きな影響が及ぼすため利用できないという課題がある。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、微弱な光を発する生体試料を長期間観察しても生体試料の鮮明な発光画像を得ることができる生体試料観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、培養環境に維持され光を発する生体試料を配置するための可動式のステージと、前記生体試料の光学像を投影する観察光学系と、該観察光学系をその光軸方向に移動させる観察光学系移動手段と、前記観察光学系で投影された前記生体試料の発光像を取得する画像取得部と、該画像取得部による画像取得のタイミングを制御する画像取得部制御手段と、前記画像処理部で取得された発光画像を蓄積する画像保存部と、該画像保存部に蓄積された発光画像のうち、同一の光軸方向位置に観察光学系が配置され、異なる時刻に取得された複数枚の発光画像の輝度値を積算して積算画像を作成する画像積算手段とを備える生体試料観察装置を提供する。
【００１０】
本発明によれば、生体試料を載せたステージを移動させて観察範囲を決め、観察光学系移動手段により観察光学系を光軸方向に移動させるとともに、生体試料の発光像を観察光学系により画像取得部に投影し、画像取得部制御手段により所定のタイミングで画像取得部を動作させる。これにより、フォーカス面が異なり撮影時刻の異なる複数枚の発光画像が取得される。これらの発光画像は画像保存部に蓄積され、画像積算手段により輝度が積算されることにより、複数の異なるフォーカス面のコントラストの増強された積算画像が作成される。
【００１１】
このようにすることで、各発光画像のコントラストは低くてもよく、生体試料の発光が微弱であっても短い露光時間で発光画像を取得することができる。したがって、発光画像内の生体試料の発光像が、露光中に生体試料が移動して不鮮明になることがなく、生体試料にフォーカスの合った鮮明な発光画像を得ることができる。
【００１２】
また、短い露光時間で異なるフォーカス面の発光画像を取得するようにすることで、各フォーカス面の発光画像を細かい時間間隔で収集することができる。これにより、観察期間中に生体試料がフォーカス方向に移動しても、いずれかのフォーカス面では生体試料にフォーカスが合った発光画像が取得される。そして、異なるフォーカス面の積算画像の中から生体試料にフォーカスの合ったものを選択することで、長期間生体試料を観察しても、すべての観察時刻において生体試料にフォーカスが合ったコントラストの高い発光画像を実験結果として得ることができる。
【００１３】
上記発明においては、前記画像積算手段が、所定枚数の発光画像を積算し、前記積算画像の輝度値が所定の数値を超えた場合に、前記所定の枚数より少ない枚数の発光画像を積算してもよい。
【００１４】
このようにすることで、積算の結果輝度値が飽和していると判断された場合には、より少ない枚数の発光画像を積算することにより、解析に適切なコントラストの積算画像を作成し、より正確に解析することができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記観察光学系が異なる光軸方向位置に配置されて取得された時間軸上の同一のデータ点における一連の前記積算画像の中から、最も鮮明な画像を選択する画像選択手段を備えていてもよい。
実験者が最も鮮明であると判断したものを選択してもよいが、例えば、一般の画像解析ソフトなどを使用して論理的な手法で鮮明さを判断し選択することにより、より正確に積算画像を解析することができると同時に、実験者の手間を省き負担を軽減することができる。
【００１６】
また、その際に前記画像選択手段が、前記積算画像内の任意の部位のみにフォーカスの合った積算画像を選択してもよい。
このようにすることで、所望の観察部位にのみに関した解析をより正確に行うことができる。
【００１７】
また、上記発明においては、前記発光画像に含まれるバックグラウンドノイズを除去する画像調節手段を備えていてもよい。
このようにすることで、発光画像を積算してもバックグラウンドノイズが目立つことがなく、また、バックグラウンドノイズに影響されるような微弱な光であっても、コントラストの高い発光画像を得るので、発光画像または積算画像をより正確に解析することができる。
【００１８】
また、上記発明においては、照明光学系を備える前記生体試料観察装置が、前記ステージ上の前記生体試料に赤外光を照明してもよい。
経時観察を開始する前に、観察光学系の光軸方向位置を調節して観察の対象にフォーカスを合わせる必要がある。これを明視野観察で行う場合、可視光に対して反応する機能性物質を観察の対象とするときは、可視光を照射すると実験結果に影響を及ぼす可能性がある。しかしこのような場合においても、赤外光を照射することで生体試料に刺激を与えずに影響を抑えながらその明視野像を観察することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生体試料からの微弱な発光を長時間観察しても生体試料の鮮明な発光画像を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の一実施形態に係る生体試料観察装置１について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
図１は本実施形態に係る生体試料観察装置１の概略図である。生体試料観察装置１は倒立型顕微鏡本体２と、光源３を含む照明光学系４と、コンピュータ５とにより構成されている。
【００２１】
倒立顕微鏡本体２は、生体試料Ａを載せ水平面を移動可能な手動または電動のステージ６と、対物レンズ７と結像レンズ８とを含む観察光学系９と、電動フォーカス部１０と、ＣＣＤカメラ１１とを備えている。
電動フォーカス部１０はコンピュータ５に接続され、該コンピュータ５で電動フォーカス部１０を制御することにより、対物レンズ７の移動範囲および移動ステップ量を制御して動作させるようになっている。
【００２２】
ＣＣＤカメラ１１は、その撮像面が結像レンズ８の結像面と一致するように配置され、コンピュータ５に接続されている。ＣＣＤカメラ１１の露光時間や画像取得のタイミングはコンピュータ５で制御され、電動フォーカス部１０の動作と連動して画像を取得する。そして、取得された発光画像データはコンピュータ５に送られて蓄積される。
【００２３】
光源３はコンピュータ５に接続され、その光量はコンピュータ５により制御される。
また、コンピュータ５は、一般に使用される画像解析用ソフトウェア１２を備えており、これを用いて蓄積された発光画像の積算や選択などの画像解析を行う。
また、生体試料観察装置１の一部または全体は、外部からの光を遮断するように、暗箱１３に覆われている。
【００２４】
このように構成された本実施形態に係る生体試料観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態においては、生体試料観察装置１を使用して、発光蛋白質を導入した生細胞を生体試料Ａとして用い、発光蛋白質および生細胞の動態について３日間経時観察する実験について説明する。
【００２５】
本実施形態に係る生体試料装置１を用いて発光蛋白質を導入された生細胞の経時観察を行うには、数日間培養可能な環境内、例えば、培養装置１４内に保持された生細胞を含む培養容器Ｂをステージ６に載せて観察の対象とする生細胞を選択し、これにフォーカスが合うように対物レンズ７の光軸方向位置を決める。このときに、生細胞をステージ６に載せる時点では発光蛋白質からの発光強度が極めて微弱であるために確認することができないので、照明光学系４を動作させて生細胞に光を照射し、明視野観察を行ってフォーカス位置を調節する。
【００２６】
次に、３日間の観察期間中に生細胞がフォーカス方向（Ｚ方向）に移動することを想定し、対物レンズ７の移動範囲および１回の移動ステップ量を設定する。具体的には、例えば、初期に設定したフォーカス面を基準面：Ｚ＝０μｍとして、移動範囲を−２０μｍ≦Ｚ≦＋２０μｍ、移動ステップ量を１０μｍと設定する。
【００２７】
なお、移動範囲および移動ステップ量は、使用する対物レンズ７の倍率や観察対象とする生体試料Ａの大きさに応じて観察者が任意に設定することが望ましい。また、本実施形態の目的は生体試料Ａの３次元画像を構築することではないので断層を細かくする必要はない。
【００２８】
続いて、ＣＣＤカメラ１１の露光時間を決める。発光蛋白質が発する光の強度により最適な露光時間は異なり、露光時間が長すぎるとＣＣＤカメラ１１の受光素子において輝度が飽和してしまい、露光時間が短かすぎると必要な輝度が得られず発光蛋白質からの発光を画像上で認識できなくなる。そのため、予備実験を行い最適な露光時間を見積もっておくことが望ましい。
【００２９】
本実施形態においては、予備実験の結果、最適な露光時間が１０分であったとする。従来の発光蛋白質の観察においては最適な露光時間１０分で撮影するが、本実施形態においては、露光時間を、最適な露光時間１０分のｎ分の１（ｎは自然数）に設定する。具体的には、例えば、ｎを５とし、１回の撮影において２分間露光して１枚の発光画像を取得することにする。
【００３０】
このように動作を設定した対物レンズ７とＣＣＤカメラ１１を作動させて観察を行うと、Ｚ＝−２０，−１０，０，＋１０，＋２０μｍのＸＹ平面にフォーカスの合った５枚の発光画像群が取得される。この一連の工程を１サイクルとすると、１サイクルの所要時間は１０分である。
【００３１】
このサイクルを所定のインターバル時間で繰り返し、３日間発光画像の取得を続ける。本実施形態においては、インターバル時間を０分とする。つまり、１度の実験で取得される全発光画像枚数は、１サイクル（１０分間）で取得する発光画像枚数：５枚×１時間で行うサイクル数：６回×１日：２４時間×実験期間：３日間で、合計２１６０枚となる。
【００３２】
次に、この２１６０枚の発光画像の解析方法について説明する。
説明のため、図２に示されるように、取得された全発光画像を、撮影した時間方向をＸ方向、フォーカス方向をＹ方向として２次元に並べる。
【００３３】
はじめに、得られた発光画像のコントラストを、最適な露光時間１０分で取得したときのコントラストと同等にするため、同一のフォーカス面における複数枚の発光画像の輝度値を積算して積算画像を作成する。本実施形態においては、露光時間２分で各発光画像を取得しているので、５枚の発光画像を積算する。
【００３４】
具体的には、図３（ａ）に示されるように、フォーカス面Ｙ１において時間方向に連続して並ぶ５枚の発光画像Ｘ１Ｙ１〜Ｘ５Ｙ１内の各画素の輝度を積算して１枚の積算画像Ｘ’１Ｙ１を作成する。フォーカス面Ｙ１の残りの発光画像についても同様に、Ｘ６〜Ｘ１０（Ｘ’２），Ｘ１１〜Ｘ１５（Ｘ’３），…というように時間方向に連続する時間データ点を５点ごとに区切って積算画像を作成する。さらに、フォーカス面Ｙ２〜Ｙ５についても同様に積算画像を作成すると、図３（ｂ）に示されるように、各時間データ点Ｘ’１〜Ｘ’８６において、５枚の異なるフォーカス面Ｙ１〜Ｙ５の積算画像が並ぶ２次元の積算画像のデータが得られる。
【００３５】
なお、この場合に、例えば、ＣＣＤカメラ１１が１２ビットカメラであった場合、輝度値は４０９５が飽和値であり、積算画像において輝度が飽和してしまうと正確な数値解析ができない。したがって、１３ビット以上、例えば、１６ビットの画像として積算画像を扱う必要がある。
【００３６】
次に、図４（ａ）に示されるように、時間データ点Ｘ’１において、異なるフォーカス面Ｙ１〜Ｙ５の５枚の積算画像の中から、例えば、コントラスト法や山登り法などの画像解析方法を用いて、最もフォーカスの合った積算画像Ｘ’１Ｙ３（ＸＹ１）を抽出する。同様に、残りの時間データ点Ｘ’２〜Ｘ’８６においても１枚ずつ選択し、図４（ｂ）に示されるように、選択された積算画像ＸＹ１〜ＸＹ８６を時間方向に並べると、３日間の経時観察によって取得された２１６０枚の発光画像の解析結果を得る。
【００３７】
このように、本実施形態によれば、取得された発光画像の輝度を積算してコントラストを増強し、最適な輝度に調節された積算画像を作成する。したがって、各発光画像のコントラストは低くてもよく、生細胞からの発光が微弱であっても、短い露光時間で発光画像を取得することができる。これにより、各発光画像内の生細胞の像が、露光中にフォーカス方向に移動して不鮮明になることなく、フォーカスの合った鮮明な発光画像を得ることができるという利点がある。
【００３８】
また、このように短い露光時間で撮影することにより、細かい時間間隔でフォーカス面を移動させて各フォーカス面の発光画像を収集することができる。これにより、観察期間中に生細胞がフォーカス方向に移動しても、いずれかのフォーカス面では生細胞にフォーカスの合った発光像が取得される。そして、フォーカス面の異なる積算画像の中から、生細胞にフォーカスに合ったものを選択し、それらを時間方向に並べて実験結果とする。
【００３９】
これにより、生細胞を３日間経時観察しても、いずれの観察時刻においてもコントラストが高くフォーカスの合った鮮明な生細胞の発光画像を得ることができる。
【００４０】
また、本実施形態によれば、生体試料観察装置１全体または生体試料Ａを含む一部を暗箱１３で覆うことにより、外部からの光の影響を低減し、精度良く安定して微弱な発光を検出することができる。
また、コンピュータ５に蓄積された発光画像を、同一のコンピュータ５を使用して解析するにより、画像処理や解析の結果のデータを観察条件とともに保存しておくことができる。
【００４１】
なお、上記実施形態においては、発光画像に含まれるバックグラウンドノイズを除去する画像調節手段を備えていてもよい。
実験の前に予め、ＣＣＤカメラ１１の撮像部位にキャップをはめるなどして遮光し、実験内で行う１回の露光時間（上記実施形態の場合、２分間）でバックグラウンド画像を取得しておく。そして、画像解析用ソフトウェア１２などを用いてそのバックグラウンド画像の平均輝度値や輝度のヒストグラムのピーク値などを算出し、それをバックグラウンドノイズ値として設定する。
【００４２】
このバックグラウンドノイズ値を取得された各発光画像の各画素の輝度値から一様に引き算すると、各発光画像に含まれるバックグラウンドノイズが除去される。このようにすることで、積算画像を作成したときにバックグラウンドノイズが目立つことなく、また、バックグラウンドノイズに影響されるような微弱な発光であってもコントラストの良い発光画像が得られ、より正確な解析が可能となる。
【００４３】
また、上記実施形態においては、異なるフォーカス面の積算画像の中から鮮明な積算画像を選択する際に、解析を行いたい部位にのみフォーカスの合った積算画像を選択してもよい。
例えば、生細胞にのみフォーカスの合った積算画像を選択することにより、所望の観察部位である生細胞のみに関した解析をより正確に行うことができる。
【００４４】
また、上記実施形態においては、前記積算手段が、所定枚数の発光画像を積算し、前記積算画像の輝度値が所定の数値を超えた場合に、前記所定枚数より少ない枚数の発光画像を積算してもよい。
上記実施形態においては、５枚の発光画像を積算して積算画像を作成した。その後に、輝度値の最大値に対してある輝度値、具体的には、例えば、画像が１２ビットであれば輝度値の最大値は４０９５であり、これに対して３８００という数値や、最大輝度値の９０％の値を指定し、積算画像の輝度値がこれを超えていないか確認する。
【００４５】
そして、積算画像内にこれを超える部位があれば、１枚減らして４枚の発光画像を積算することにして、再度すべての発光画像を積算する。このようにすることで、積算画像の輝度を解析に適した範囲に調節し、積算画像をより正確に解析することができる。
【００４６】
また、積算画像の輝度値の確認をする時に、積算画像内の指定する部位についてのみ輝度値を確認してもよい。
例えば、生細胞の領域についてのみ輝度値の確認を行って積算する発光画像の枚数を調節することにより、所望の観察部位である生細胞についてより正確に解析することができる。
【００４７】
また、上記実施形態においては、照明光学系の光源が赤外光源であってもよい。
対物レンズ７のフォーカス位置を調節する際、一般に使用されるような可視光の明視野像を使ったオートフォーカス機能を用いると、例えば、時計遺伝子のような光に反応する生体物質を観察の対象とする場合には実験結果に大きな影響を及ぼしてしまう。しかし、このような場合でも、赤外光による明視野像を用いることにより、生体試料Ａへの影響を抑えながらフォーカス位置を調節することができる。
【００４８】
また、上記実施形態においては、明視野観察の代わりに、生細胞に蛍光蛋白質を発現させ、図示しない蛍光観察光学系を用いた蛍光観察により、対物レンズ７のフォーカス位置を調節してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体試料観察装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の生体試料観察装置を用いた経時観察により得られる発光画像の概念図である。
【図３】図１の生体試料観察装置による画像積算を説明する図である。
【図４】図１の生体試料観察装置による画像選択を説明する図である。
【符号の説明】
【００５０】
１  生体試料観察装置
２  倒立型顕微鏡本体
３  光源
４  照明光学系
５  コンピュータ（画像取得部制御手段、画像保存部）
６  ステージ
７  対物レンズ
８  結像レンズ
９  観察光学系
１０  電動フォーカス部（観察光学系移動手段）
１１  ＣＣＤカメラ（画像取得部）
１２  画像解析用ソフトウェア（画像積算手段、画像選択手段）
１３  暗箱
１４  培養装置
Ａ  生体試料
Ｂ  培養容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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