(57)【要約】      （修正有）【課題】抗原性が低減され、ペプシン耐性が付与され、体内寿命が延長された、肝機能保護医薬品組成物として臨床的有用性の高いラクトフェリン複合体を提供する。【解決手段】2010138160.tif 000016(式中、ＬＦはラクトフェリン、ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基、ＰＯＬＹは分子量（数平均分子量）が１０，０００〜６０，０００（Ｄａ）であるポリ（アルキレングリコール）、ｎは１〜１０の整数、をそれぞれ表す）で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
2010138160.tif 000015
（式中、ＬＦはラクトフェリン、ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基、ＰＯＬＹは分子量（数平均分子量）が１０，０００〜６０，０００（Ｄａ）であるポリ（アルキレングリコール）、ｎは１〜１０の整数、をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体を含有することを特徴とする肝機能保護医薬品組成物。
【請求項２】
ラクトフェリンとの複合体におけるポリ（アルキレングリコール）の分子量がおおよそ４０，０００であることを特徴とする請求項１の肝機能保護医薬品組成物。
【請求項３】
分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体が、未修飾のラクトフェリンよりも肝細胞へ取り込まれやすいことを特徴とする請求項１又は２の肝機能保護医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体を含有することを特徴とする、肝機能保護用の医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体高分子の性質の調節などの目的のため、生体高分子とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非ペプチド性親水性高分子とをコンジュゲート化すること（以下「複合体化」、ＰＥＧ又はその類似化合物を用いる場合については「ＰＥＧ化」ということがある）が行われている。より具体的には、複合体化は、一般に、非ペプチド性親水性高分子の末端に活性基を付けてタンパク質等の分子表面に存在する官能基と反応させることにより行われる。
【０００３】
特に、タンパク質及びペプチドの複合体化は重要であり、非ペプチド性親水性高分子鎖でタンパク質の分子表面を部分的に覆うことにより、エピトープをシールドすることによる抗原性・免疫原性の低減、細網内皮系等による取り込みの低減、及びタンパク分解酵素による認識及び分解の防止などが研究されている。また、複合体化された物質について、生体内でのクリアランスが遅延し、体内寿命が延びることが知られている。その一方で、複合体化されたタンパク質などでは、非ペプチド性親水性高分子の存在によって活性部位が影響を受け、生物活性が低減されることも頻繁に観察されている。
【０００４】
複合体化による個々のタンパク質の活性の変動は、タンパク質ごとに異なっている。さらに、例えばインターフェロンについてはＰＥＧ化によってインビトロの抗ウイルス活性が減少する一方、ヒト腫瘍細胞における抗増殖活性が増加するというように、ＰＥＧ化によって、あるタンパク質が有する複数の特性について一律ではない影響が生じうる。したがって、望ましい特性を備えた複合体を得るための最適な条件等については、各タンパク質ごとに充分に検討されなければならない。
【０００５】
ラクトフェリン（以下、「ＬＦ」と略すことがある）は、主に哺乳動物の乳汁中に存在し、好中球、涙、唾液、鼻汁、胆汁、精液などにも見出されている、分子量約８０，０００の糖タンパク質である。ラクトフェリンは、鉄を結合することから、トランスフェリンファミリーに属する。ラクトフェリンの生理活性としては、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用などが知られている。さらに、最近、ラクトフェリンが脂質代謝改善作用、鎮痛・抗ストレス作用、アンチエイジング作用を有することも明らかにされている。このように、ラクトフェリンは、多様な機能を示す多機能生理活性タンパク質であり、健康の回復又は増進のため、医薬品や食品などの用途に使用されることが期待されており、ラクトフェリンを含む食品は既に市販されている。
【０００６】
ラクトフェリンは、経口的に摂取した場合、胃液中に存在する酸性プロテアーゼのペプシンにより加水分解を受け、ペプチドに分解されるため、ラクトフェリン分子としてはほとんど腸管まで到達することができない。しかし、ラクトフェリン受容体は消化管では小腸粘膜に存在することが知られており、最近、ラクトフェリンが腸管から体内に取り込まれて、生物活性を発現していることが明らかにされている。そのため、ラクトフェリンの持つ生物活性を発揮させるには、ラクトフェリンを胃液中でのペプシンによる加水分解を受けない状態で腸管まで到達させることが重要である。
【０００７】
また、ラクトフェリンはレセプターを介してエンドサイトーシスによって肝細胞に取り込まれることが知られている（非特許文献１：Suzuki et al., 2002）。Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ＧａＩＮ）／ＬＰＳ誘発肝障害モデルに対し、ウシラクトフェリンがサイトカイン分泌抑制作用に基づく肝保護作用を示すことが報告されている（非特許文献２：Matsumoto et al., 2004）。
【０００８】
ラクトフェリンに関しても、ＰＥＧ化された複合体についての報告がある（非特許文献３： C. O. Beauchamp et al. Anal. Biochem. 131: 25-33 (1983)）。この文献には、直鎖型のＰＥＧとＬＦとの複合体が５〜２０倍延長された体内寿命を有していたことが記載されているが、ＰＥＧ化されたＬＦの生物活性、ＰＥＧ化の程度、均一性などについては何ら記載されていない。
【０００９】
特開平２００７−７０２７７号公報（特許文献１）には、ラクトフェリンが有する鉄の結合能が保持されており、鉄結合能に基づくラクトフェリンの重要な生物活性が保持されている、分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体が記載されている。この複合体は、ペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼに対する抵抗性を有しており、体内寿命が長く、体内で長時間にわたって生物活性を発揮することができ、さらなる腸溶化のための製剤的な処理を行わなくても充分に腸内に到達しうること、また、この複合体は、特定の位置に一定の数の非ペプチド性親水性高分子が結合しているため、品質が均一であり、製造管理・品質管理の点でも有利であり、医薬品成分としての使用に特に適していること、が記載されている。しかし、分岐型親水性高分子とラクトフェリンとの複合体が、肝細胞に対してどのような作用を示すかは記載されていない。
【００１０】
【特許文献１】特開平２００７−７０２７７号公報
【非特許文献１】Suzuki, Y. A. and Lonnerdal, B. 2002. Characterization of mammalian receptors for lactoferrin. Biochem. Cell. Biol. 80, 75-80.
【非特許文献２】Matsumoto, S., Tanaka, K. 2004. Protective effect of lactoferrin against induction of fulminant hepatic failure induced by D-galactosamine and Lipopolysaccharide in rats. Milk Science, 53, 265-272.
【非特許文献３】C. O. Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131: 25-33 (1983)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、抗原性が低減されており、ペプシン耐性が付与されており、体内寿命が延長された、臨床的有用性の高い分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体の、新たな用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、分岐型非ペプチド性親水性高分子で修飾されたラクトフェリン（複合体）が、肝細胞に取り込まれやすく、優れた肝機能保護作用を示すことを知見することにより完成されたものである。
【００１３】
すなわち、本発明は、
〔１〕  以下の式：
【００１４】
【化１】
2010138160.tif 000002
【００１５】
（式中、ＬＦはラクトフェリン、ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基、ＰＯＬＹは分子量（数平均分子量）が１０，０００〜６０，０００（Ｄａ）であるポリ（アルキレングリコール）、ｎは１〜１０の整数、をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体を含有することを特徴とする肝機能保護医薬品組成物；
〔２〕  ラクトフェリンとの複合体におけるポリ（アルキレングリコール）の分子量がおおよそ４０，０００であることを特徴とする前記〔１〕の肝機能保護医薬品組成物；
〔３〕  分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体が、未修飾のラクトフェリンよりも肝細胞へ取り込まれやすいことを特徴とする請求項１又は２の肝機能保護医薬品組成物、
を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
肝臓は、糖質、タンパク質及び脂質の合成及び貯蔵、老廃物の生成、胆汁の生成及び分泌、循環血液量の調節などの重要な役割を担う臓器であり、人体において最も大切な臓器の１つである。肝臓疾患には、多種多様な病因、病態があるが、脂肪肝まで含めると、成人の３０％が何らかの肝機能障害を持つといわれている。したがって、このような肝臓疾患の予防及び肝細胞の保護は重要である。
【００１７】
本発明によれば、分岐型の非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体を用いることにより、未修飾ラクトフェリン量よりも低用量で顕著な作用を有する肝細胞保護用の医薬品組成物が提供され、それによりこのような肝機能障害の予防及び／又は治療を効率的に行うことができる。また、本発明の医薬品組成物において有効成分として含有される複合体のラクトフェリンは、他の治療・予防手段と比べ、治療・予防効果が確実に発現する一方で、非常に安全性が高く、多量に又は長期間継続的に投与又は摂取したとしても副作用を呈することがない。したがって、ラクトフェリン複合体を有効成分とする本発明の医薬品組成物は、長期連用しても高度に安全である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の医薬品組成物に含有される複合体は、
以下の式：
【００１９】
【化２】
2010138160.tif 000003
【００２０】
（式中、ＬＦはラクトフェリン、ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基、ＰＯＬＹは分子量（数平均分子量）が１０,０００〜６０,０００（Ｄａ）であるポリ（アルキレングリコール）（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ｎは１〜１０の整数、をそれぞれ表す）
で示される。
【００２１】
ＰＯＬＹ部分は、それぞれ直鎖状であってもよく、分岐及び／又はペンダント基などを有していてもよい。
【００２２】
本発明の医薬品組成物に含有される複合体において使用される「ラクトフェリン」（ＬＦ）は、ヒト及び種々の動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等から得られる天然又は天然型のラクトフェリン分子そのもののほか、遺伝子組換え型（一部のアミノ酸が置換された改変型を含む）ラクトフェリン、及びラクトフェリンの活性フラグメントなどのラクトフェリンの機能的等価物であってもよく、鉄イオンの有無又はその含有量、由来する生物種などを問わない。したがって、本発明に関して用語「ラクトフェリン」は、特に示さない限り、これらの種々のラクトフェリンをも包含する意味で用いられる。
【００２３】
本発明においては、これらのラクトフェリンの１種又は２種以上を適宜選択して用いることができる。入手の容易性、経済性などの観点から、代表的にはウシ由来のラクトフェリン、特に牛乳から単離精製されたラクトフェリンなどが好都合に用いられる。
【００２４】
ラクトフェリンと結合される分岐型非ペプチド性親水性高分子としては、一般に、一方の末端にラクトフェリンの官能基と反応して共有結合を形成しうる官能基を有し、分岐しており（即ち高分子鎖を２個又はそれ以上有しており)、生体に対して適合可能又は薬理学的に不活性なものが用いられる。なお、「非ペプチド性」とは、ペプチド結合を含まないこと、又は実質的に含まない（高分子の性質に影響しない程度の低頻度（例えば高分子を構成する全モノマー単位数の１〜５％程度）で含みうる）ことを意味する。
【００２５】
例えば、分岐型非ペプチド性親水性高分子としては、
【００２６】
以下の式：
【００２７】
【化３】
2010138160.tif 000004
【００２８】
（式中、ＮＨＳ及びＰＯＬＹは、上記と同じである）
で示されるものを使用することができる。
【００２９】
このような分岐型非ペプチド性親水性高分子は、公知の方法で合成することもできるが、既に各種のものが市販されている。ＰＯＬＹ部分の分子量（数平均分子量）としては、一般に約５００〜約２００，０００、好ましくは約２,０００〜約１００，０００、特に好ましくは約１０，０００〜約６０，０００（Ｄａ）、最も好ましくは約４０，０００（Ｄａ）程度である。
【００３０】
本発明の医薬品組成物に含有される複合体は、分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとを、公知のいずれかの方法でそれぞれの官能基を反応させることによって共有結合させることにより製造することができる。
【００３１】
好ましくは、ラクトフェリンと分岐型非ペプチド性親水性高分子とが、１：１〜１：１００のモル比で反応液中に添加される。ラクトフェリン：分岐型非ペプチド性親水性高分子の混合モル比は、さらに好ましくは１：３〜１：６０、最も好ましくは１：５〜１：５４の範囲内である。
【００３２】
また、反応工程は、一般的にpH４以上、温度０〜４０℃、時間１分〜２４時間、好ましくは、pH６以上、温度４〜４０℃、時間１０分〜２４時間の条件下で行われる。即ち、反応液のpHは、好ましくはpH６以上であり、さらに好ましくはpH６〜９である。反応時間及び反応温度は相互に密接に関連して変化させることができるが、一般に反応温度が高い場合は時間を短く、温度が低い場合は時間を長くすることが好ましい。例えば、反応pHが７付近の場合、ラクトフェリン：分岐型非ペプチド性親水性高分子のモル比が１：１０の条件下では、２５℃において約１時間、あるいは１６℃又は４℃において２４時間反応させることにより、特に良好な結果（均一な複合体化など）が得られる。また、ラクトフェリン：分岐型非ペプチド性親水性高分子のモル比が１：１の条件下では、２５℃において約１０分、１６℃においては約１０分〜約４０分以内、４℃においては約１時間〜約２時間以内の反応により、特に良好な結果が得られる。
【００３３】
上記のようにして製造された複合体は、まずヘパリンのような陽イオン交換担体（樹脂）に吸着させて濃縮し、続いて、得られた濃縮物をゲルろ過担体（樹脂）に適用することによって容易に精製することができる。具体的には、例えば最初に複合体を含有する試料をヘパリンカラムに適用して複合体をカラムに吸着させ、高塩濃度の緩衝液で溶出して濃縮された複合体を含有する溶出液を集める。次に、この溶出液をゲルろ過カラムに適用し、脱塩及び所望の緩衝液への置換を行うことができる。必要に応じて、透析、限外ろ過などの公知の方法で溶出液を適宜さらに濃縮することができる。また、別の実施態様においては、市販されている陽イオン交換性のゲルろ過担体を使用することによって、上記陽イオン交換担体処理及びゲルろ過担体処理による二工程の濃縮・精製工程を一工程で行うこともできる。
【００３４】
このようにして上記のような好ましい方法により製造された複合体は、ラクトフェリンが有する鉄の結合能が保持されており、したがって、少なくとも鉄結合能に基づくラクトフェリンの重要な生物活性が保持されている。また、分岐型非ペプチド性親水性高分子の結合によって、ペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼに対する抵抗性を有しているため、体内寿命が長く、体内で長時間にわたって生物活性を発揮することができる。さらに、複合体化によって胃でのペプシンによる消化分解を受けにくくなっているため、さらなる腸溶化のための製剤的な処理を行わなくても、充分に腸内に到達しうる。
【００３５】
また、このようにして製造された複合体は、特定の位置に一定の数の非ペプチド性親水性高分子が結合するため、品質が均一であり、製造管理・品質管理の点でも有利であり、医薬品成分としての使用に特に適している。
【００３６】
本発明の医薬品組成物は、上記のように製造された複合体に、生理学的又は薬学的に許容され得る添加剤として、製薬産業において日常的に使用されている賦形剤、崩壊剤、滑沢剤等の不活性な基剤及び／又は添加物を配合することによって製造することができる。このような医薬品組成物に含有させることができる各種成分及び剤型は当業者には充分に公知である。
【００３７】
例えば賦形剤としては、乳糖、蔗糖、グルコース、ソルビトール、ラクチトールなどの単糖類又は二糖類、コーンスターチ、ポテトスターチのような澱粉類、結晶セルロース、無機物としては軽質シリカゲル、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウムなどがある。しかし、還元性の単糖類及び二糖類は、ラクトフェリンのε−アミノ基との間でアミノカルボニル反応を起こし、タンパク質を変性させる。特に、水分、鉄イオンの存在下では、急速なアミノカルボニル反応が進行するので、使用は控えるべきである。また、崩壊剤としては澱粉類、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボシキメチルセルロース・ナトリウム塩、ポリビニルピロリドンなどがある。また、滑沢剤としてはショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムなどを使用することができる。
【００３８】
さらに、本発明の医薬品組成物には、公知の薬学的有効成分をも含有させることができる。
【００３９】
本発明の医薬品組成物は、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤等の任意の剤形として使用することができる。また、必要に応じて凍結乾燥製剤として用いることもできる。本発明の医薬品組成物は、腸溶性の製剤の形態にすると特に有利である。このような各種製剤の製造方法は、当業者には充分公知である。なお、本発明に関して「医薬品組成物」という場合、人間に対して適用するもののほか、獣医学的に動物に対して適用するもの（獣医薬）をも含む。
【００４０】
本発明の医薬品組成物の投与経路としては、公知のいずれの経路であってもよく、例えば経口、経皮、注射、経腸、直腸内等の任意の経路を選択することができる。好ましくは経口投与である。
【００４１】
本発明による医薬品組成物の効果的な投与量は、投与される対象の種類や年齢、体重、身体的な状態等によって異なり、それらに応じて各々に適した量で投与することができる。哺乳類に対して投与する場合、例えば、０．００１〜１０g/kg/日、好ましくは０．０１〜５g/kg/日とすることができる。ヒトに投与する場合、一般的には、有効成分量として、一日あたり５０mg〜１５，０００mg、望ましくは３００mg〜６，０００mgの量である。一般に、本発明による医薬品組成物は、公知の有効ラクトフェリン量と比較して有意に少ない用量（例えばラクトフェリン量換算で１／２〜１／２０量）とすることができ、同等の用量で用いるのであれば投与回数を減らすことが可能である。
【００４２】
このような一日あたりの用量を一度に又は分割して、肝細胞保護、肝疾患又は症状の予防、治療又は状態の改善が必要とされている対象に対し、投与することができる。
【００４３】
また、本発明の医薬品組成物は、他の薬剤と併用してもよい。
【００４４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
１．  ＰＥＧ−ＬＦの調製
ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）は、MG Nutritionals（Melbourne, Australia）から入手した。ＰＥＧ化試薬として使用した、２０ｋＤａ分岐型ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導剤（ＰＥＧ−ＮＨＳ；  SUNBRIGHT GL2-200GS2）及び４０ｋＤａ分岐型ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導剤（ＰＥＧ−ＮＨＳ；  SUNBRIGHT GL2-400GS2）は、NOF Corp.（東京）から購入した。ヘパリンセファロース６高速カラム及びＰＤ−１０脱塩カラムは、GE Healthcare（Uppsta, Sweden）から購入した。
【００４６】
ＰＥＧ化反応のために、ｂＬＦと分岐鎖２０ｋＤａ又は４０ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳ試薬とを、分子量比率で１：１０となるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中に混和した。最終タンパク濃度は０．５mg/mlであった。この反応混合液を２５℃で１時間反応させ、０〜４℃に冷却することにより反応を停止させた。１０mMリン酸ナトリウムでｐＨ７．６に調整した後、反応混合液をヘパリンセファロース６高速カラムの吸着剤へ投入した。カラム容量の５倍量の１０mMリン酸ナトリウムで洗浄することによって過剰なＰＥＧ化試薬を除去した。反応生成物であるＰＥＧ化されたラクトフェリン（以下、２０ｋＤａ及び４０ｋＤａ分岐型ＰＥＧ試薬を使用したものを、それぞれ、「２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ」及び「４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ」という）を３００mM塩化ナトリウム溶液で溶出し、修飾されていないｂＬＦは１Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出した。流速は、ともに２mL/minとした。溶出した２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ又は４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦを、ＰＤ−１０カラムを用いて脱塩し、Centriplus（商品名、CENTRIPLUS YM-50、MILLIPORE社）で濃縮した。タンパク濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとしてBradford protein assay法にて測定した。
【００４７】
２．  四塩化炭素誘発肝障害モデルに及ぼすＰＥＧ化ＬＦの効果
四塩化炭素誘発肝障害モデルは、ラット（又はマウス）に四塩化炭素・オリーブ油混合液５mL/kg（四塩化炭素として１mL/kg）を皮下投与することにより誘発される急性肝障害モデルである。四塩化炭素による肝障害は、四塩化炭素（ＣＣｌ４）が薬物代謝酵素により分解されて生じるＣＣｌ３・（フリーラジカル）が、肝細胞のタンパク質、脂質などと共有結合して非可逆的変化を与え、また、膜脂質の過酸化を引き起こすことにより、細胞の変性壊死をもたらすものであるといわれている（槫林陽一（1990）：１４．１  肝臓疾患用薬の探索、代謝性医薬品の探索、医薬品の探索III、医薬品の開発  ９巻（斎藤  洋、野村靖幸編集）、２２７〜２４１頁、廣川書店、東京）。このモデルでは、投与６時間後から肝細胞の脂肪変性及び壊死が認められ、これは投与２４〜３６時間に最も顕著になるといわれている。また、投与後１２〜４８時間にトランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）活性及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の酵素漏出が最高値を示すとされている（槫林、1990、前出）。
【００４８】
したがって、この実験では、血清ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＳＯＤ活性の測定、肝組織の病理組織学的解析、及び抗一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）抗体を一次抗体とした免疫組織化学的解析を実施した。
【００４９】
５週齢のＷｉｓｔａｒ−Ｉｍａｍｉｃｈｉ系雄ラットを、動物繁殖研究所（茨城）から導入した。動物は、室温２２±２℃、１２時間の明暗サイクル（明期０７：００〜１９：００）下で飼育し、標準固形飼料（ＣＥ−２、日本クレア、東京）を自由摂食にて給餌した。これら動物の取り扱いならびに実験方法については、鳥取大学実験動物委員会で承認されている。
【００５０】
動物を６群に分けた（ｎ＝５）。Ｉ群は無処置の正常対照群とした。II群は四塩化炭素（ＣＣｌ４）処置のみの対照群とした。これら２群の動物には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  ３０mg/kgを腹腔内投与した。
【００５１】
III群にはｂＬＦ（未修飾）  ３０mg/kgを腹腔内投与した。IV群には上記１．で製造した２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ  ３０mg/kgを腹腔内投与した。Ｖ群には上記１．で製造した４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ  ３０mg/kgを腹腔内投与した。これらの（ＣＣｌ４を除く）薬物の投与は、すべて３日間連続して行った。
【００５２】
Ｉ群を除く他の群には、３日目にｂＬＦ（未修飾）、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ又は４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦを投与した１時間後に  ＣＣｌ４（１mg/kg, ＣＣｌ４とオリーブ油が１：１となるように混合したもの）を経口投与した。ＣＣｌ４投与の２４時間後に動物を安楽死させ、血液及び肝臓を採取した。
【００５３】
＜血清中の肝逸脱酵素の測定＞
採取した血液を、室温にて１時間放置し、その後、１０００×ｇで１０分間遠心分離し、血清を分離した。血清中のＧＰＴ及びＧＯＴ濃度をＵＶ法（ＧＰＴ又はＧＯＴアッセイキット、Wako, Japan）にて測定した。抗酸化活性を、「SOD activity detection kit」（Wako, Japan）を用いたニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元法により評価した。
【００５４】
ＣＣｌ４誘導による血清中ＧＯＴ及びＧＰＴの上昇に対するＰＥＧ−ｂＬＦの効果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2010138160.tif 000005
【００５６】
４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ又は２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦの前投与により、ＧＯＴとＧＰＴの上昇は有意に抑制された（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。一方、未修飾ｂＬＦの前投与は、わずかにＧＯＴ又はＧＰＴ上昇を抑制する傾向にあったが、有意差は認められなかった（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＞０．０５）。この４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ及び２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦの効果は、未修飾ｂＬＦに対しても有意であった（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦは、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦよりもさらに有意な効果をもたらした（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。
【００５７】
また、血清ＳＯＤ活性の増大も、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ群が最も顕著であり、次いで２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ群、未修飾ｂＬＦ群と続き、各群間には有意差が認められた。
【００５８】
＜病理組織学的検索＞
肝組織を１０％（V/V）緩衝ホルマリンで固定した後、常法に従い、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行った。肝臓の病理学的所見は、Frenchら（2000）（French, S. W., Miyamoto, K., Ohta, Y., Geoffrion, Y., 2000. Pathogenesis of experimental alcoholic liver disease in the rat. Methods Achiev. Exp. Pathol. 13, 181-207）の方法に準拠してスコア化した。すなわち、０＝鏡検にて著変なし；１＝２５％以下の局所的な肝細胞の障害；２＝２５〜５０％の局所的な肝細胞の障害；３＝拡散しているが局所的な肝細胞の障害；４＝全体的な肝細胞の壊死。組織学的検索は、ブラインドテストとして実施した。
【００５９】
ＣＣｌ４誘導による肝障害の組織学的所見を表２に示す。
【００６０】
【表２】
2010138160.tif 000006
【００６１】
ＣＣｌ４処置群の肝細胞における障害は、脂肪変性及び肝細胞壊死として観察された。脂肪変性と肝細胞壊死は、ＣＣｌ４処置後、急性に認められた。４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ及び２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦは、脂肪変性と壊死に基づく障害スコアを軽減した。また、脂肪変性には個体差が認められた。組織学的解析は、ＣＣｌ４誘導による肝毒性に対して、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ及び２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦが、未修飾ｂＬＦよりも、さらに有意な抑制効果を有することを示していた（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。特に４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦでは顕著であった（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。
【００６２】
病理組織学的に、肝小葉中心性変性は４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ群が最も軽度で、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ群、未修飾ｂＬＦ群の順で重篤度は明らかに増大していた。
【００６３】
＜免疫組織化学的解析＞
組織化学的解析には、抗一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウサギポリクローナル抗体（Dakocytomation, Kyoto, Japan）を一次抗体として使用した。ｓｓＤＮＡ検出用の切片は、０．０１M  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を約１ml添加し、９５℃で５分間処置することにより、抗原活性を除去した。切片を、再ワックス処理し、脱水し、Ｔｗｅｅｎ添加０．０５Mトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ；ｐＨ７．６）で洗浄後、１％（V/V）過酸化水素処理、再度ＴＢＳＴによる洗浄を行った。その後、一次抗体を添加し、室温で３０分間反応させ、ＴＢＳＴによる洗浄後、「Simple Stain MAX-PO (Multi)」（商品名、Nichirei, Tokyo, Japan）を添加し、室温で３０分間反応させた。さらに、ＴＢＳＴで洗浄した後、０．０１％（V/V）過酸化水素を含む３，３´−ジアミノベンジジン溶液で発色させた。ＴＢＳＴで洗浄した後、Ｍａｙｅｒ’ｓ  ヘマトキシリンで対染色した。
【００６４】
鏡検（×４００）は、複数視野にわたって１，０００個以上の肝細胞を計測した。アポトーシスの指標は、肝細胞総数のうち、核消失のみられる％とした（Korkolopoulou, P. A., Konstantinidou, A. E., Patsouris, E. S., Christodoulou, P. N., Thomos-Tsagli, E. A., Davaris, P. S. 2001. Detection of apoptotic cells in archival tissue from diffuse astrocytomas using a monoclonal antibodies to single-stranded DNA. J. Pathol. 193, 377-382）。
【００６５】
全てのデータは、平均±ＳＥで表示した。群間の有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔによって行い、Ｐ＜０．０５を有意水準とした。
【００６６】
結果を表２に示す。４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ又は２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦでの前処置は、アポトーシスも有意に抑制していた（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。特に、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦは、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦよりも、さらに有意に抑制した（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５；表２）。
【００６７】
即ち、肝細胞における抗ｓｓＤＮＡ抗体陽性率（アポトーシス％）は、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ群が最も低値を示し、次いで２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ群、未修飾ｂＬＦ群と続き、各群間には有意差が認められた。
【００６８】
３．肝細胞へのＰＥＧ化ＬＦ取り込みに関する免疫組織化学的解析
実験には、６週齢のＷｉｓｔａｒ−Ｉｍａｍｉｃｈｉ系雄ラットを動物繁殖研究所（茨城）から導入した。動物は、室温２２±２℃、１２時間の明暗サイクル（明期０７：００〜１９：００）下で飼育し、標準固形飼料（ＣＥ−２、日本クレア、東京）を自由摂食にて給餌した。これら動物の取り扱いならびに実験方法については、鳥取大学実験動物委員会で承認されている。
【００６９】
２５％（W/W）ウレタン（４g/kg、ｓｃ）麻酔下にて、外頸静脈にカニューレを装着した。４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ、未修飾ｂＬＦ又はＢＳＡ溶液（１０％（W/W）となるように生理食塩水に溶解）を、外頚静脈に留置したカテーテルを用いて、１０mg/kgとなるように投与した（ｎ＝５）。投与１０分後にラットを安楽死させ、肝臓を採取した。
【００７０】
＜免疫組織化学的解析＞
肝左葉を切除し、１０％（V/V）ホルマリンで固定した後、パラフィン包埋した。５μmの切片を作製し、抗ウシラクトフェリンヤギポリクローナル抗体（Bethyl Laboratories, Montgomery, USA）を用いて免疫染色を行った。
全てのデータは平均±ＳＥで表示した。群間の有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔによって行い、Ｐ＜０．０５を有意水準とした。
【００７１】
肝細胞へのＰＥＧ化ＬＦ取り込みに関する免疫組織化学的解析の結果を、表３に示す。
【００７２】
【表３】
2010138160.tif 000007
【００７３】
免疫組織学的解析により、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ又は未修飾ｂＬＦを投与した全ての動物において、肝細胞の細胞質に抗ｂＬＦ抗体陽性の小胞が認められた。この肝細胞１個あたりに存在する小胞数には、群間で有意差は認められなかったが、小胞の直径は、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ＞２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ＞未修飾ｂＬＦの順に大きく、各群間に有意差が認められた（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。
【００７４】
４．Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ＧａＩＮ）／ＬＰＳ誘発肝障害モデルに及ぼすＰＥＧ化ＬＦの効果（１）
Ｄ−ガラクトサミン誘発肝障害モデルは、肝機能改善物質の評価に利用できるモデルの１つであり、明らかな急性肝機能障害を示す。ラットにＤ−ガラクトサミンを投与すると、投与６時間後から肝細胞壊死が認められ、投与後１８〜２４時間にトランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）活性が最高値を示すとされている。ガラクトサミンによる肝障害のメカニズムは、未解明であるが、ガラクトサミンがＵＤＰ−ガラクトサミンからＵＤＰ−グルコサミンとなり、ＵＴＰを捕捉することにより、肝細胞内のＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルクロン酸が減少する結果、核酸、タンパク質及び脂質代謝能が阻害されるものと考えられている（槫林、1990、前出）。
【００７５】
上記１.で製造した分岐型４０ｋ−ＰＥＧ−ＬＦを、Ｗｉｓｔａｒ−Ｉｍａｍｉｃｈｉ系ラット（６週齢、雄）に１０mg/kgで３日間腹腔内投与した。２日目の夕方から１６時間、ラットを絶食し、４０ｋ−ＰＥＧ−ＬＦの３回目の投与１時間後にＧａＩＮ／ＬＰＳ混合溶液（ＧａＩＮ  ４００mg/kg＋ＬＰＳ  ５０μg/kg）を腹腔内投与し、その６時間後に肝臓、血液をサンプリングし、血清ＧＯＴ（IU/L）、血清ＧＰＴ（IU/L）を測定した。
【００７６】
結果を表４に示す。正常コントロールの肝酵素は、ＧＯＴ  ８６．８２±３．１３  IU/L、ＧＰＴ  ３９．８３±４．８５  IU/Lであった。
【００７７】
【表４】
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【００７８】
４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ投与群は、血清ＧＯＴ、ＧＰＴの顕著な上昇抑制を示した。病理組織学的に生理食塩水投与群の肝臓では炎症性細胞浸潤及び肝細胞壊死が重篤であったが、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ投与群の肝臓における当該病変の程度は明らかに軽減されていた。
【００７９】
以上の結果を総合すると、ＣＣｌ４誘発肝障害モデルに対する肝保護作用及び肝細胞への取り込み状況とも、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＬＦが最も顕著で、次いで２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ群、未修飾ｂＬＦ群と続くことが判明した。よって、本発明の医薬品組成物に含有される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体であるＰＥＧ化ＬＦが示した抗酸化作用に起因した肝保護作用の増大の要因には、ＰＥＧ化ＬＦの肝細胞への取り込み能の増大が関与していることが推察された。
【００８０】
ＬＦはレセプターを介してエンドサイトーシスによって肝細胞に取り込まれることが知られているが、ＰＥＧ化によって肝細胞内へ取り込まれるＬＦ量が増大することは本研究によって初めて明らかにされた。
【００８１】
Ｄ−ＧａＩＮ／ＬＰＳ誘発肝障害モデルに対し、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦが既報例（Matsumoto et al., 2004）で示されている未修飾ＬＦ量よりも低用量で著効を示した。よって、本発明の医薬品組成物に含有される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体、特に４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦは、ＬＦが有するサイトカイン分泌抑制作用に基づく肝保護作用を増強することが示唆された。
【００８２】
５．Ｄ−ＧａＩＮ／ＬＰＳ誘発肝障害モデルに及ぼすＰＥＧ化ＬＦの効果（２）
Ｄ−ＧａｌＮ／ＬＰＳ誘発肝障害モデルラットに及ぼすＰＥＧ化ＬＦの炎症性サイトカイン分泌抑制効果について、未修飾ｂＬＦの効果との詳細な比較検討を行った。
【００８３】
＜手法＞
絶食したラット（Ｗｉｓｔａｒ−Ｉｍａｍｉｃｈｉ系、雄、７週齢）に、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ、４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ、未修飾ｂＬＦ（各２０mg/kg)、又は生理食塩水を３日間、１日１回腹腔内投与した。３日目の投与１時間後にＧａＩＮ／ＬＰＳ混合溶液（ＧａＩＮ  ６００mg/kg＋ＬＰＳ  ２００μg/kg）を腹腔内投与した。２、４、及び８時間後に血液と肝臓のサンプリングを実施した。
【００８４】
実験群は、以下のとおりであった。
生理食塩水投与群  （ｎ＝８）
生理食塩水＋ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与群  （ｎ＝８）
未修飾ｂＬＦ＋ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与群  （ｎ＝８）
２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ＋ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与群  （ｎ＝８）
４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ＋ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与群  （ｎ＝８）
【００８５】
＜評価方法＞
（１）  血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）
ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与後８時間の血清をサンプルとし、測定キット（商品名「トランスアミナーゼＣII−テストワコー」、和光純薬、大阪、日本）を用いてＡＳＴ及びＡＬＴを測定した。
（２）  肝組織の病理組織学的所見
上記と同様にしてＧａＩＮ／ＬＰＳ投与後投与後８時間における肝臓のパラフィン包埋切片を作製し、ＨＥ染色を施して観察した。
（３）  肝組織におけるアポトーシス細胞の存在率
ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与後８時間における肝臓のパラフィン包埋切片にＴＵＮＥＬ染色を施し、形態計測ソフト（Leica Application Suite, Leica Microsystems Ltd., Heerbrugg, Switzerland）を用いて肝細胞１０００個あたりのＴＵＮＥＬ染色陽性細胞の存在率（アポトーシスインデックス；  ％）を算定した。
（４）  血清ＴＮＦ−α、血清ＩＬ−６、血清ＩＬ−１０、血清ＮＯ
ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与後２、４、８時間の血清サンプルを用い、測定キットを用いてＴＮＦ−α濃度（商品名「Rat TNF-α Immunoassay kit」、コスモバイオ、東京、日本）、ＩＬ−６濃度（商品名「Rat IL-6 Immunoassay kit」  Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, USA）、ＩＬ−１０濃度（商品名「Rat IL-10 Immunoassay kit」  Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, USA）、及びＮＯ濃度（商品名「Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit」  BIOMOL, Plymouth Meeting, PA, USA）を測定した。
（５）  統計学的検討
統計ソフト（GraphPad PRISM , GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用い、Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔによるｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ  （ＡＮＯＶＡ）を実施し、各試験群間の有意差判定を行った。Ｐ＜０．０５をもって統計学的有意差が生じたとした。以下の表５〜１０においては、数値はすべて平均±ＳＥで示されている。
【００８６】
＜結果＞
（１）  血清ＡＳＴ及び血清ＡＬＴ
結果を表５に示す。
【００８７】
【表５】
2010138160.tif 000009
【００８８】
ＡＳＴ及びＡＬＴは、ＧａＩＮ／ＬＰＳ処置により顕著に上昇したが、ＰＥＧ化ｂＬＦの前投与により有意に抑制された（表５）。一方、未修飾ｂＬＦの前投与によっては、有意な抑制は観察されなかった。
【００８９】
（２）  肝組織の病理組織学的所見
ＧａＩＮ／ＬＰＳ処置により激烈な壊死性病変及び出血性病変が惹起されていた。当該病変は、未修飾ｂＬＦ前投与により軽微に抑制され、ＰＥＧ化ｂＬＦ前投与により著明に抑制された。
【００９０】
（３）  肝組織におけるアポトーシス細胞の存在率（アポトーシスインデックス）
結果を表６に示す。
【００９１】
【表６】
2010138160.tif 000010
【００９２】
生理食塩水＋ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与群では、肝組織におけるアポトーシス細胞の存在率は高値を示した。未修飾ｂＬＦ前投与群のアポトーシス細胞の存在率は生理食塩水＋ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与群と同程度であったが、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ前投与群においては細胞のアポトーシスが低減された。４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ前投与により、顕著に抑制されていた（表６）。
【００９３】
（４）  血清ＴＮＦ−α、血清ＩＬ−６、血清ＩＬ−１０及び血清ＮＯ
血清ＴＮＦ−αの結果を表７に示す。
【００９４】
【表７】
2010138160.tif 000011
【００９５】
ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与後２時間及び８時間において、ＰＥＧ化ｂＬＦ群は未修飾ｂＬＦ投与群より統計学的に有意にＴＮＦ−α産生を抑制していた（表７）。
【００９６】
血清ＩＬ−６の結果を表８に示す。
【００９７】
【表８】
2010138160.tif 000012
【００９８】
ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与後２時間、４時間、及び８時間において、ＰＥＧ化ｂＬＦ群は未修飾ｂＬＦ投与群よりも統計学的に有意にＩＬ−６産生を抑制していた（表８）。
【００９９】
血清ＩＬ−１０の結果を表９に示す。
【０１００】
【表９】
2010138160.tif 000013
【０１０１】
ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与後２時間及び８時間において、ＰＥＧ化ｂＬＦ群は未修飾ｂＬＦ投与群よりも統計学的に有意にＩＬ−１０産生を促進していた（表９）。
【０１０２】
血清ＮＯについての結果を表１０に示す。
【０１０３】
【表１０】
2010138160.tif 000014
【０１０４】
ＧａＩＮ／ＬＰＳ投与後８時間において、ＰＥＧ化ｂＬＦ群は未修飾ｂＬＦ投与群よりも統計学的に有意にＮＯ産生を抑制していた（表１０）。
【０１０５】
血清ＴＮＦ−α、血清ＩＬ−６、血清ＩＬ−１０、及び血清ＮＯに関しては、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ及び４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ｂＬＦ間に有意差は認められなかった。
【０１０６】
以上の結果から、ＰＥＧ化ＬＦは、ＧａＩＮ／ＬＰＳによって誘導された炎症を未修飾のｂＬＦより顕著に強く抑制することが明らかとなった。当該機序には、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＮＯの産生抑制及びＩＬ−１０の産生亢進が大きく関与していることが示唆された。