(57)【要約】【課題】  哺乳類細胞において抗原タンパク質の発現量が高いウイルスベクターワクチンを提供すること。【解決手段】  哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子を組み込んだウイルスベクターワクチン。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子を組み込んだウイルスベクターワクチン。
【請求項２】
哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子がヒト化抗原遺伝子である請求項１記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項３】
抗原遺伝子がHIVの抗原遺伝子である請求項１又は２記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項４】
HIVがHIV-1である請求項３記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項５】
HIV-1がHIV-1 Clade Cである請求項４記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項６】
HIV-1の抗原遺伝子がHIV-1の構造遺伝子である請求項４又は５記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項７】
HIV-1の構造遺伝子がgag遺伝子である請求項６記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項８】
HIV-1の構造遺伝子がgag遺伝子及びenv遺伝子である請求項６記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項９】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求項１〜８のいずれかに記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項１０】
アデノウイルスベクターが複製機能欠損5型アデノウイルスである請求項９記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項１１】
アデノウイルスベクターがアデノウイルス5型と35型のキメラ型ベクターである請求項９又は１０記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項１２】
キメラ型ベクターが、アデノウイルス5型のファイバー部分を35型に置換したものである請求項１１記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項１３】
CAGプロモーターを含む請求項１〜１２のいずれかに記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項１４】
２個以上の抗原遺伝子が組み込まれている請求項１〜１３のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
２個以上の抗原遺伝子の各々がアダプター配列により結合されている請求項１４記載のウイルスベクターワクチン。
【請求項１６】
アダプター配列がIRES及び／又はF2Aである請求項１５記載のウイルスベクターワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスベクターワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)が同定されてから２０年余りが経過しているが、未だに完全なる治療法は確立されていない。
【０００３】
初の抗HIV薬としてアジドチミジン（AZT）が開発された後、次々に新しい抗HIV薬が開発され、1995年、複数の抗HIV薬を併用するHAART(Highly Active Anti-retrovial Therapy)が開始され、先進国ではエイズによる死亡者は激減した。
【０００４】
しかし、この治療法では、抗HIV薬の投与を中止すると、２〜３週間後にはHIVが再増殖してくる。また、薬剤耐性ウイルスも次々と現れ、これらに対応するために更に新しい抗HIV薬が必要になってくる。さらに、患者は、生涯、薬剤の投与を続けなくてはならず、それにかかる医療費も莫大なものである。
【０００５】
従って、有効かつ安価な治療法が求められている。
【０００６】
一方で、HIVワクチンの開発が行われてきた。開発されているワクチンはHIVサブユニットペプチドワクチン、DNAワクチン、組換えウィルスベクターワクチン(ワクシニアウィルス、アデノウィルス(Ad)、ラビウィルス、フラビウィルス、センダイウィルスやアデノ随伴ウィルス(AAV)を含む)や細菌ベクターワクチンがある。現在、世界で知られているHIVワクチンの中で、アデノウイルス5型ベクターを利用したワクチンは免疫原性が非常に強いワクチンであるが、アデノウイルス5型に対する中和抗体を持つ患者が多く、このような患者においてはあまり強い免疫誘導能ができないこと、アデノウイルス5型は肝障害性が非常に強いため、大量に投与することができないなどの問題があった（非特許文献１）。そこで、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換することによって、アデノウイルス5型に対する中和抗体を持つ患者にも有効で、かつ肝障害性が低いワクチンが作製された（特許文献１、非特許文献２）。
【０００７】
HIVワクチンに遺伝子導入される抗原遺伝子としては、gag遺伝子、env遺伝子などが使用されている。アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したベクター(Ad5/35ベクター)を用いたHIV-1  Clade Cに対するワクチンが開発されており、ワクチン抗原としては、ヒトIgGのFc断片が結合した野生型gagが使用された(非特許文献３)。また、ワクチン抗原の遺伝子として、哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して、同義置換したものを使用したDNAワクチンは、哺乳類細胞において、タンパク質の発現量が野生型と比べて高く、野生型よりも免疫原性が高いことが報告されている（非特許文献４）。
【０００８】
しかし、抗原遺伝子を同義置換したものをウイルスベクターワクチンに搭載した例は報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、哺乳類細胞において抗原タンパク質の発現量が高いウイルスベクターワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して同義置換した抗原遺伝子をウイルスベクターに組み込むことにより、哺乳類細胞における抗原タンパク質の発現量を野生型よりも増加させることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子を組み込んだウイルスベクターワクチン。
（２）哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子がヒト化抗原遺伝子である（１）記載のウイルスベクターワクチン。
（３）抗原遺伝子がHIVの抗原遺伝子である（１）又は（２）記載のウイルスベクターワクチン。
（４）HIVがHIV-1である（３）記載のウイルスベクターワクチン。
（５）HIV-1がHIV-1 Clade Cである（４）記載のウイルスベクターワクチン。
（６）HIV-1の抗原遺伝子がHIV-1の構造遺伝子である（４）又は（５）記載のウイルスベクターワクチン。
（７）HIV-1の構造遺伝子がgag遺伝子である（６）記載のウイルスベクターワクチン。
（８）HIV-1の構造遺伝子がgag遺伝子及びenv遺伝子である（６）記載のウイルスベクターワクチン。
（９）ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである（１）〜（８）のいずれかに記載のウイルスベクターワクチン。
（１０）アデノウイルスベクターが複製機能欠損5型アデノウイルスである（９）記載のウイルスベクターワクチン。
（１１）アデノウイルスベクターがアデノウイルス5型と35型のキメラ型ベクターである（９）又は（１０）記載のウイルスベクターワクチン。
（１２）キメラ型ベクターが、アデノウイルス5型のファイバー部分を35型に置換したものである（１１）記載のウイルスベクターワクチン。
（１３）CAGプロモーターを含む（１）〜（１２）のいずれかに記載のウイルスベクターワクチン。
（１４）２個以上の抗原遺伝子が組み込まれている（１）〜（１３）のいずれかに記載のウイルスベクター。
（１５）２個以上の抗原遺伝子の各々がアダプター配列により結合されている（１４）記載のウイルスベクターワクチン。
（１６）アダプター配列がIRES及び／又はF2Aである（１５）記載のウイルスベクターワクチン。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のウイルスベクターワクチンは、野生型の抗原遺伝子を使用したウイルスベクターワクチンよりも哺乳類細胞で抗原タンパク質の発現強度が高く、抗原タンパク質に対する細胞性免疫及び／又は液性免疫反応を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】HIV clade C gag遺伝子発現カセットの概略図。CMV: CMVエンハンサー下流にCMVプロモーター(CMV-IE);    CMVi: CMV-IE下流にイントロンA;    CAG: CMVエンハンサー下流にニワトリβ-アクチンプロモーター、さらに下流にβ-アクチンイントロン;    BGHpA: 牛成長ホルモンポリAシグナル;    RBGpA: ウサギβ-グロブリンポリAシグナル;       Native gag: 野生型HIV96ZM651.8gag遺伝子;   gagopt :ヒト化HIV96ZM651.8 gag遺伝子。
【図２】HIV clade C gag遺伝子発現の解析。HeLa細胞にDNA(2μg相当)を遺伝子導入(A)、またはAd5/35 vector (MOI:5)を作用させ(B)、48時間後western blotによりgag遺伝子の発現を解析した。野生型gagのロード量はDNAでは10倍,Adベクターでは50倍入れた。一次抗体として抗C-p24抗体あるいは抗β-actin抗体、二次抗体として抗マウスIgG抗体を使用した。 赤字はgag発現のrelative densityを示している。
【図３】HIV clade C gag特異的なCD8陽性T細胞数の頻度。Balb/cマウス(N= 5)に各HIV96ZM651.8gag遺伝子発現カセットを搭載したAd5/35(1 x 108 pfu/mouse)を筋肉内投与した。ControlとしてLacZ遺伝子発現カセットを搭載したAd5/35 (1 x 108 pfu/mouse)を同様に投与した。免疫10日後、マウス末梢血を用いて、HIV96ZM651.8gag特異的な細胞性免疫反応の頻度を測定するためH-2K(d)/AMQMLKDTI Tetramer結合アッセイをした。なお、AMQMLKDTI（配列番号１４）はp24のエピトープとなるペプチドである。
【図４】CD8陽性T細胞の多機能的な解析(ICSアッセイ)。サイトカイン産生T細胞を解析するため図3の実験と同時に多機能的ICSアッセイを行った。マウス末梢血はHIV96ZM651.8 p24 peptide(AMQMLKDTI)（配列番号１４）により6時間刺激した。多機能的ICS アッセイはAPC-cy7-CD8, PE-IFN-g-PE, APC-TNF-α, FITC-CD107aを用いて行った。 +, 分泌能あり；-, 分泌能なしを示している。
【図５】HIV clade C gag特異的な液性免疫。免疫後4週目に採取した血清を用いてHIV clade C gag特異的な抗体価をELISAにより測定した。抗原として HIV96ZM651.8 p24タンパク質(1μg/ml) をコーティングし、血清は1/100から1/3200まで希釈した。clade C gag特異的な抗体価はHRP標識抗マウスIgG抗体により検出し,450nmでODを測定した。* p<0.01
【図６】HIV clade C gagoptとenvopt遺伝子発現カセットの概略図。CAG; CMVエンハンサー下流にトリβ-アクチンプロモーター、さらに下流にβ-アクチンイントロン;   RBGpA: ウサギβ-グロブリンポリAシグナル;    IRES: リボソーム内部認識部位;    F2A; フリン認識部位と2A自己修飾配列;   gagopt: ヒト化HIV96ZM651.8 gagコード遺伝子;    envopt : ヒト化HIV96ZM651.8 gp160遺伝子;    fusion: gagoptとenvoptが融合した遺伝子。
【図７】HIV clade C env遺伝子発現の解析。HeLa細胞にDNA(2μg相当)を遺伝子導入、またはAd5/35 vector (MOI:5)を作用させ(B)、 48時間後、western blotによりenv遺伝子の発現を解析した。一次抗体として抗C-gp120抗体、二次抗体として抗マウスIgG抗体を使用した。赤色の数字はenv発現のRelative densityを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子を組み込んだウイルスベクターワクチンを提供する。
【００１６】
哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子としては、哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して、同義置換した抗原遺伝子（ヒト化抗原遺伝子）などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００１７】
抗原遺伝子としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、インフルエンザウイルス、HCV、天然痘ウイルス、ヒトパピロ−マウイルス、ＥＢウイルス、白血病ウイルスなどのウイルス由来の抗原タンパク質をコードする遺伝子、結核菌等の細菌由来の抗原をコードする遺伝子などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００１８】
HIVは、Type-1とType-2に大きく分けられるが、いずれのTypeであってもよい。さらに、HIV-1は、AからKまで10種類のcladeに分類されているが、いずれのcladeであってもよい。
【００１９】
HIV-1の抗原遺伝子としては、HIV-1の構造遺伝子（gag遺伝子、env遺伝子及びpol遺伝子）、複製制御遺伝子（rev遺伝子、tat遺伝子、nef遺伝子、vif遺伝子、vpr遺伝子及びvpu遺伝子）を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
ウイルスベクターに組み込まれる抗原遺伝子は、抗原遺伝子領域の全部であっても、一部であってもよい。
【００２１】
HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子の配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知である（Goa, F., et al., J. Virol.70(3), 1651-1667(1996); Ratner, L., et al., Nature 313(6000), 277-284(1985); Jounai, N. et al., J. Gene Med., 5, 609-617(2003); Kim, F.M., et al., J. Virol.69(3), 1775-1761(1995); Rodenburg, C.M., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 17(2), 161-168(2001); Gao, F., et al., J. Virol. 72(7), 5680-5698(1998); Gao, F. et al., J. Virology 70(10), 7013-7029(1996)）。また、NCBIなどのジーンバンクからも遺伝子情報を入手できる（U51190, K03455, U39362, AF286224, U88822, U51188）。
【００２２】
哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して、HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子を同義置換することは知られており(Gao F, et al. AIDS Res Hum Retroviruses 2003 Sep;19(9):817-23. Haas J, et al. Curr Biol 1996 Mar 1;6(3):315-24.)、また、そのように同義置換された遺伝子はAIDS Research and Reference Reagent Program,アメリカ国立衛生研究所(NIH), Rochville, MD, USAから入手可能である。
【００２３】
ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター(Ad)、ワクシニアウィルス、ラビウィルス、フラビウィルス、センダイウィルス、アデノ随伴ウィルス(AAV)などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。これらのウイルスベクターのうち、複製機能欠損5型Adベクター（例えば、初期遺伝子E1及び／又はE3が除去されたアデノウイルス5型）は遺伝子導入性や免疫原性が高く、ヒトを使った臨床研究もされているベクターである。しかし、このウィルスは初期の接着分子としてコクサッキーウイルス-アデノウイルスレセプター(CAR)を使用しており、CARの発現が高い肝実質細胞への親和性が高く、肝臓にウィルスが蓄積する。このため、その毒性の高さが問題となっている。後述の実施例では、細胞に対する親和性に関わるファイバー部分のみを35型に置換したキメラ型Ad5/35ベクター(Gene Therapy (2005) 12, 1769-1777、国際公開WO2005/052165号パンフレット)を使用した。このAd5/35ベクターは、細胞への初期接着分子としてCARではなくほとんどのヒト細胞で発現しているCD46レセプターを使用している。この向性によって、Ad5よりも肝毒性が低いことが報告されている。さらに、Ad5/35はAd5と比較してヒトの樹状細胞に遺伝子導入効率が高く、抗体保有率の低いAd35のファイバーを有しているので、ワクチンとして有用性が高いベクターである。
【００２４】
抗原遺伝子は、ベクターとなるウイルスのライフサイクルに悪影響を及ぼさない限り、ウイルスベクターのいかなる部位に挿入されてもよい。例えば、アデノウイルス5型又はそのキメラウイルスに組み込む場合、抗原遺伝子はアデノウイルス5型のE1部位に挿入されるとよい。抗原遺伝子をウイルスベクターに組み込むには、例えば、CMVプロモーター、CMViプロモーター、CAGプロモーターなどのプロモーターの下流に、抗原遺伝子、次いでポリA遺伝子を含む発現カセットを用意し、その両端にウイルスベクターと同じ遺伝子を接続し、これを宿主細胞（例えば、HEK293細胞）にトランスフェクトすると、抗原遺伝子が挿入されたウイルスベクターが生成する。また、抗原遺伝子をアデノウイルス5型と35型のキメラウイルスベクター(例えば、Ad5/35ベクター)に組み込むには、例えば、CMVプロモーター、CMViプロモーター、CAGプロモーターなどのプロモーターの下流に、抗原遺伝子、次いでポリA遺伝子を含む発現カセットを用意し、Ad35ファイバーを持つE1/E3欠損Ad5のゲノムを持つプラスミド(pAdHM34)のE1部位に導入し、これを宿主細胞（例えば、HEK293細胞）にトランスフェクトすると、抗原遺伝子が挿入されたウイルスベクターが生成する。発現カセットには、さらに、複製起点、アンピシリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子（目的の遺伝子が導入されたことを示すマーカー）などが含まれていてもよいが、発現カセットには複製起点、アンピシリン耐性遺伝子は含まれなくてよい。これらの遺伝子はpAdHM34を大腸菌で増やしたり、pAdHM34を持つ大腸菌だけをセレクションするため、pAdHM34に含まれている。
【００２５】
ウイルスベクターには、２個以上の抗原遺伝子が挿入されてもよい。２個以上の抗原遺伝子の各々はアダプター配列により結合されるとよい。アダプター配列としては、IRES、F2Aなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００２６】
哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子を組み込んだウイルスベクター（組換えウイスルベクター）はワクチンとして利用することができる。
【００２７】
組換えウイスルベクターは、例えば、PBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水などに溶解し、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌した後、注射により被験者に投与されるとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、不活化剤、保存剤、アジュバント、乳化剤など）などを添加してもよい。組換えウイスルベクターは、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内などに投与することができ、また、経鼻、経口投与してもよい。
【００２８】
組換えウイスルベクターの投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり109〜1013ウイルス粒子、好ましくは1011〜1012ウイルス粒子の組換えウイルスベクターを、少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。
【００２９】
HIVの抗原遺伝子を組み込んだ組換えウイルスベクターをHIV治療用ワクチンとして利用する場合、さらに、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて用いてもよい。逆転写酵素阻害剤としては、アジドチミジン(AZT)、ジダノシン(ddl)、ラブミジン(3TC)、ネビラピン(NVP)などを挙げることができる。プロテアーゼ阻害剤としては、インジナビル(IDV)、サキナビル(SQV)、リトナビル(RTV)、ネルフィナビル(NFV)、テノフォビル(PMPA)などを挙げることができる。高活性抗レトロウイルス療法（Highly Active Anti-retroviral Therapy(HAART)）に用いられているものが好ましい。逆転写酵素阻害剤としては、アジドチミジン(AZT)、ジダノシン(ddl)、ラブミジン(3TC)、ネビラピン(NVP)などを挙げることができる。プロテアーゼ阻害剤としては、インジナビル(IDV)、サキナビル(SQV)、リトナビル(RTV)、ネルフィナビル(NFV)などを挙げることができる。高活性抗レトロウイルス療法（Highly Active Anti-retroviral Therapy(HAART)）に用いられているものが好ましい。組換えウイルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも１回、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を被験者に投与するとよい。例えば、組換えウイルスベクター投与の１〜３か月程度、好ましくは２か月程度前に、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を投与する。逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤の投与量は、「抗HIV治療ガイドライン」（平成15年度厚生労働省科学研究費補助金エイズ対策研究事業HIV感染症の医療体制の整備に関する研究班  2004年3月）の記載に準じるものであるとよい。
【００３０】
また、組換えウイルスベクターは、DNAワクチンなどの他のワクチンと組み合せて用いてもよい。例えば、組換えウイルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも１回、他のワクチンを被験者に投与する。HIV治療用の他のワクチンとしては、サブタイプBのHIV株であるHIVIIIBのrev遺伝子とenv遺伝子を含むDNAワクチン（pCAGrev/env, Jounai N. et al., J. Gene Med. 2003; 5: 609-617）などを挙げることができる。DNAワクチンの投与量は、5〜30 mgが適当であり、10〜20 mgが好ましい。
【００３１】
本発明のウイルスベクターワクチンは、HIV、インフルエンザウイルス、HCV、天然痘ウイルス、ヒトパピロ−マウイルス、ＥＢウイルス、白血病ウイルスなどのウイルス感染症、子宮頸がん、上咽頭がん、悪性リンパ腫などのがんウイルスの感染から発展するがんなどの治療用、さらには予防用ワクチンとしての有効性が期待できる。
【実施例】
【００３２】
＜要約＞
近年のHIVワクチンの開発はHIV clade Bが主流となっている。しかし，世界の半数以上のHIV感染者は発展途上国に多いclade Cに感染している。そのため、HIV-1 clade Cに対するワクチンの開発が早急に求められている。本研究では，HIV Clade Cに対する最適な免疫誘導能を有するワクチンを開発するため、様々な組換えAd5/35ベクターを作成し、マウスにおいて1)野生型とヒト化HIV clade C gag、2)ヒトサイトメガロウィルス(CMV)エンハンサー下流にCMVプロモーター(CMV-IE)とCMV-IE下流にイントロンAが導入されたプロモーター(CMVi)、CMVエンハンサー下流にβ-actinプロモーターと、さらに下流にβ-actinイントロン(CAG)、3)アダプター配列[リボソーム内部認識部位(IRES)、フリン認識部位と2A自己修飾配列(F2A)]あるいは融合遺伝子の下流遺伝子、これらの免疫誘導能を検討した。
【００３３】
その結果、ヒト化gag(gagopt)は野生型gagよりも強くgag特異的な細胞性免疫を誘導した。また、CAGが最も強く細胞性免疫を誘導した。さらに、アダプター配列もしくは融合遺伝子の下流に導入したenvタンパク質の発現強度はDNA plasmidでは、F2Aが最も高かったが、Ad5/35ベクターでは融合遺伝子が高かった。以上より、Ad5/35ベクターを使用する場合においてもヒト化HIV遺伝子は有効であり、HIV clade C遺伝子を使用した場合にも強力な免疫誘導能を示すことが示唆された。
【００３４】
＜緒言＞
ヒト免疫不全症候群(AIDS)の原因ウィルスであるヒト免疫不全ウィルス(HIV)は、Type-1とType-2に大きく分けられる。世界でのHIV感染者は、圧倒的にType-1 HIV(HIV-1)感染者が多い。HIV-1は、AからKまで10種類のcladeに分類されている。
【００３５】
世界におけるHIV-1感染者の半数以上がインド，中国，アフリカ南部等の発展途上国に多いclade Cに感染している。しかし、現在のHIV-1ワクチン開発の対象はアメリカやヨーロッパ等の先進国に感染者が多いclade Bである。そのため、clade Cに対するワクチンの開発が早急に求められている。
【００３６】
過去20年間に渡り、HIVワクチンの開発が行われてきた。開発されているワクチンはHIVサブユニットペプチドワクチン、DNAワクチン、組換えウィルスベクターワクチン(ワクシニアウィルス、アデノウィルス(Ad)、ラビウィルス、フラビウィルス、センダイウィルスやアデノ随伴ウィルス(AAV)を含む)や細菌ベクターワクチンがある。これらのワクチンの中で、複製機能欠損5型Adベクターは遺伝子導入性や免疫原性が高く、ヒトを使った臨床研究もされているベクターである。しかし、このウィルスは初期の接着分子としてコクサッキーウイルス-アデノウイルスレセプター(CAR)を使用しており、CARの発現が高い肝実質細胞への親和性が高く、肝臓にウィルスが蓄積する。このため、その毒性の高さが問題となっている。本研究では、細胞に対する親和性に関わるファイバー部分のみを35型に置換したキメラ型Ad5/35ベクターを使用した。このAd5/35ベクターは、細胞への初期接着分子としてCARではなくほとんどのヒト細胞で発現しているCD46レセプターを使用している。この向性によって、Ad5よりも肝毒性が低いことが報告されている。さらに、Ad5/35はAd5と比較してヒトの樹状細胞に遺伝子導入効率が高く、抗体保有率の低いAd35のファイバーを有しているので、ワクチンとして有用性が高いベクターである。
【００３７】
本研究では、遺伝子導入する抗原遺伝子としてgag遺伝子、env遺伝子使用した。gag遺伝子は、HIVのウィルス構造タンパク質であるgagをコードしている遺伝子である。gagタンパク質は最も変異が少なく、よく保存されている。env遺伝子はウィルスを覆う殻エンベロープタンパク質をコードする遺伝子で、中和抗体誘導能が高い。これらの遺伝子は哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して、同義置換したもの(ヒト化)を使用している。これにより、哺乳類細胞において、タンパク質の発現量が野生型と比べて高く、DNAワクチンにおいて野生型よりも免疫原性が高いことが報告されている。これらの遺伝子の発現プロモーターとしてCMV、CMVi、CAGを使用した。CMViとCAGはCMVよりもin vitro,in vivo共に下流の遺伝子の発現レベルが高いことが報告されている。また、この２つの遺伝子を一つのベクターで発現させるためにアダプター配列としてIRESとF2Aを使用した。IRESは最初、ポリオウィルスのnon-coding RNAから分離された。現在、脳心筋炎ウィルス由来のIRESは2つの遺伝子を一つのベクターで発現させるためのアダプター配列として広く遺伝子治療や遺伝子導入研究に使用されている。しかし、IRES下流の遺伝子発現量は上流の遺伝子発現量と比べてin vitro,in vivoで低い。F2Aはフリン認識部位と2A自己修飾配列が結合した配列である。2A自己修飾配列は口蹄疫ウィルス(FMDV)由来のオリゴペプチド配列であり、細胞内で自己分割される。以前、AAVベクターによりモノクローナル抗体の誘導のため、使用したF2Aは2A配列単独あるいはIRESよりも機能性のある完全長の抗体が誘導された。これらの知見は、Ad5/35ベクターを使用した場合における詳細な検討は行われていない。
【００３８】
本研究では、HIV-1 clade Cに対する最適な免疫誘導能を有するワクチンを開発するため、Ad5/35ベクターを使用し、マウスにおいて1)野生型gagとgagopt，2)CMV、CMViとCAG、3)IRESとF2A、融合遺伝子下流の遺伝子、これらの免疫原性を検討した。
【００３９】
＜材料と方法＞
DNAプラスミドの構築
野生型HIV-1 clade C (96ZM651.8 )gag遺伝子はvT331( AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health, Rockville, MDより分与)からPCR法により増幅された。ヒト化HIV96ZM651.8 gag遺伝子(gagopt)とHIV96ZM651.8 env遺伝子(envopt)はp96ZM651gag-optと p96ZM651gp160-opt(NIHから分与)からそれぞれPCR法により増幅された。増幅された野生型gag断片はCMVi（Gene 272 (2001) 149-156のpCMVL3-1 (Table 1)、内容はp.150 materials and methodsの2.1. Plasmidsに記載されている。）を持つpHMCMV10(大阪大 水口 裕之先生より分与)に導入された(pCMVi-Nativegag)。増幅されたgagopt断片はCMVを持つpHMCMV6(大阪大 水口 裕之先生より分与)とpHMCMV10、さらにCAGを持つpCA5(大阪大 水口 裕之先生より分与)にそれぞれ導入された(pCMV-gagopt、pCMVi-gagopt、pCAG-gagopt)。gagopt-IRES-envoptを作製するために、gagopt断片とenvopt断片はpIRES(Clontech, CA , USA)に導入された。その後、gagopt-IRES-envoptはpCA5に導入された(pCAG-IRES)。gagop-F2A-envoptを作製するために、F2AはRAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号１０）を基にcDNAオリゴが合成され、gagoptとenvoptがF2Aにより結合された。作製したgagopt-F2A-envoptはCAGを持つpCAGGSに導入された。その後、CAG-gagopt-F2A-envopt断片はpHM5(大阪大 水口 裕之先生より分与)に導入された(pCAG-F2A)。さらに、gagopt-envoptを作製するために、gagopt断片とenvopt断片は直接結合させた。その後、gagopt-envopt断片はpCA5に導入させた(pCAG-fusion)。
【００４０】
Ad5/35ベクターの作製
pCMV-gagopt、pCMVi-Nativegag、pCMVi-gagopt、pCAG-gagopt、pCAG-IRES、pCAG-fusion、pCAG-F2Aは制限酵素I-CeuIとPI-SceIにより、それぞれの遺伝子発現カセットはベクターから切り出され、Ad35ファイバーを持つE1/E3欠損Ad5のゲノムを持つプラスミド(pAdHM34)(大阪大 水口 裕之先生より分与)のE1部位に導入された。それぞれの遺伝子発現カセットを搭載した組換えプラスミドは遺伝子導入試薬であるSuperfect(QIAGEN社)を使って低継代数のHEK293細胞に遺伝子導入させた。2週間後、細胞を回収し、凍結融解を5回行うことによって、組換えウィルスを抽出した。次に、HEK293細胞を用いて組換えウィルスを大量培養し、 超音波装置を用いてウィルスを抽出した。その後、CsCl法によりウィルスを精製した。精製した組換えウィルスはDT Cueriel et al.法を用いウィルス力価(VP)とTCID50法を用いplaque forming unit(PFU)を測定した。
【００４１】
Western blot解析
それぞれの遺伝子発現カセットを搭載したプラスミドDNAとAd5/35ベクターのgagあるいはenvタンパク質の発現を確認するため、 HeLa細胞を使用した。プラスミドDNA(2μg)をHeLa細胞に遺伝子導入試薬であるlipofectamineTM 2000(invitrogen社)を用いて遺伝子導入し、組換えAdベクターは5moiで感染させた。48時間後、PBS(−)(0.2％ Potassium Dihydrogenphosphate, 0.11% Disodium Hydrogenphosphate, 0.8% Sodium Chloride, 0.02% Potassium Chloride)で2回洗浄し，細胞を回収した。次に、細胞にExtraction Buffer (10mM Tris-HCl, 0.14M NaCl, 1mM Dithiothreitol, 2mM Phenylmethanesulfonylfluoride, 0.5% Nonidet P-40, 3mM MgCl2)を200μl加え、30分間氷上に静置した。静置後、14000rpm、30分間、4℃で遠心分離し、上清を回収した。この上清に200μlの2×SDS buffer (125mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue, and 10% beta-mercaptoethanol)を加え、10分間熱処理し、Western blot用のサンプルとした。このサンプルは8％ポリアクリルアミドゲルを用いて泳動した。その際、野生型gagのサンプルはプラスミドDNAでは10倍、Adベクターでは50倍ロードし、泳動した。その後、ImmobilonTM Transfer Menbranes(MLLIPORE社)に転写した。このメンブレンをBlocking Buffer(5％ skim milk, PBS-T(PBS(-), 0.05%Tween 20)で4℃、16時間、シェイキングした。一次抗体として、抗p24抗体(ハイブリドーマから作製)、抗p120抗体(ハイブリドーマから作製)あるいは内部コントロールとして抗β-actin抗体(AC-15, SIGMA社)を1時間反応させた。その後、3回PBS-Tで洗浄し、2次抗体として1/1000希釈したHorseradish peroxidase(HRP)標識抗マウスIgG抗体(Cappel社)を１時間反応させた。次に、3回PBS-Tで洗浄し、メンブランにImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP  Substrate(MILLIPRE社)を5分間反応させ、HyperfilmTM(Amersham. Buckinghamshire. UK)に感光した。感光したフィルムはImageJ softwareを用いて解析し、Relative densityを算出した。
【００４２】
組換えAd5/35ベクターによるマウスへの免疫
ケタラール(三共エール薬品社)/セラクタール(バイエルメディカル. Japan)を用いて，Balb/cマウス(8週齢，♀，5匹/群)に麻酔した。その後、マウスの大腿部に108pfu/mouse相当の組換えAd5/35ベクターを投与した。また、ネガティブコントロールとして，LacZ遺伝子を搭載したAd5/35ベクターも同量投与した。投与後、10日、4週目に眼窩採血し、血液、血清サンプルをそれぞれ得た。
【００４３】
テトラマーアッセイ
HIV clade C gag特異的なCD8陽性T細胞の頻度を測定するため、phycoerythrin(PE)標識H-2Kd/Cp24テトラマー(ペプチド:AMQMLKDTI（配列番号１４）)を使った。このテトラマーはNational Institute of Allergy and Infectious Disease MHC Tetramer Core Facility (Yerkes Reglonal Primate Research Center, Atlanta, GA, USA)で作製された。まず、組換えAd5/35ベクター投与後10日目の血液サンプル 100μlに0.1μlのテトラマーと0.25μlのfluorescein isothicyanate(FITC)標識抗マウスCD8a抗体(0.5mg/ml,Ly-2,eBioscience社)を加え30分間、室温で反応させた。次に、OptiLyse B Lysing solution(BECKMAN COULTER社)を100μl加え、10分間静置後、1mlの滅菌水を加え、さらに10分間静置した。その後、staining buffer(3%FCS,0.09% NaN3,PBS)で2回洗浄し、flow cytometry(Becton Dickinson,Franklin Lakes, NJ)を用いて解析した。
【００４４】
多機能細胞内サイトカイン染色解析(multi-ICSアッセイ)
HIV clade C gag特異的で多機能的なCD8陽性T細胞数を測定するため，multi-ICSアッセイを行った。組換えAd5/35ベクター投与後10日目の血液サンプル 200μlに2mlの1x Lysing Buffer(BD Bioscience社)を加えて15分間反応させ，赤血球を取り除いた。その後、2回 RPMI培地(10％Fetal calf serum, 5ml Pen Strep(GIBCO社)、RPMI-1640(Wako社))で洗浄し、1mlのRPMI培地に懸濁した。次に、PSSM-8(SHIMADZU BIOTECH:KYOTO JAPAN)のプロトコールに従い作製したHIV96ZM651.8 p24ペプチド(AMQMLKDTI)（配列番号１４） 10μg/mlと1μlのFITC標識抗マウスCD107a抗体(0.5mg/ml,1D4B, SouthernBiotech, Birmingham, USA)を加えて、5%CO2、37℃、1時間培養した。その後、1μlのGolgiStop(1μl/ml,BD BioScience社)を加え，さらに 5%CO2、37℃、5時間培養した。培養後、2回Staining Bufferを用いて洗浄し、0.5μlのallophycocyanin (APC) -Cy7標識抗マウスCD8a抗体(0.2mg/ml, BioLegend, San Diego, CA)を加え、4℃、30分間反応させた。2回staining bufferを用いて洗浄後、250μlのCytofix/cytoperm solution(BD Bioscience社)を加え、4℃、15分間静置し、2回1x Perm/Wash solution(BD Bioscience社)で洗浄した。次に、1μlのPE標識抗マウスインターフェロン(IFN)-γ抗体(0.2mg/ml, XMG1.2, eBioscience社)と1μlのAPC標識抗マウス腫瘍壊死因子(TNF)-α抗体(0.2mg/ml,XMG1.2, eBioscience社)を加え、4℃、30分間反応させた。その後、2回1x Perm/Wash solution(BD Bioscience社)で洗浄し、flow cytometry(Moflo, BECKMAN COULTER社)を用いて解析した。
【００４５】
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)法によるHIV clade gag特異的抗体の検出
HIV96ZM651.8 p24タンパク質を1μg/mlになるように0.1M biocarbonate buffer(pH9.0)に溶解してよく混合した後、96well ELISA plate( NUNC:TOKYO JAPAN)に100μl/well加えて、4℃、16時間静置した(コーティング)。その後、コーティングしていたタンパク質を除き、Blocking buffer(1% BSA, PBS-T)を用いて37℃、2時間静置した(ブロッキング)。次に、4週目に採血して得た血清をblocking bufferで希釈した(1/100〜1/3200)。Blocking bufferを取り除いた後、希釈した血清を100μl/well移し、37℃、2時間静置した。3回PBS-Tを用いて洗浄し、1/1000希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(Cappel社)を100μl/well加えて、37℃、2時間静置した。5回PBS-Tを用いて洗浄後、発色液(0.1M クエン酸 buffer(10mM citric acid, 25mM Na2HPO4, pH5.6), 1.3mg/ml OPD(α-フェニレンジアミノ二塩酸塩:Wako社)、0.1％過酸化水素)100μl/well加えて、遮光し、室温で15分間反応させた(発色)。1M H2SO4を50μl/well加えて、反応を停止させ、Benchmark Plus(Bio-Rad社)で450nmの吸光度を測定した。
【００４６】
統計解析
すべての値は±standard error(S.E.)として示した。実験データの統計解析はStatView softwareを用いて、t検定を行った。統計解析において、P < 0.05で有意性を認めた。
【００４７】
＜結果＞
HIV clade C gag遺伝子の発現解析
野生型gag発現カセット及びgagopt発現カセットの概略図は[図1]に示した。これらの発現カセットを搭載したplasmidDNA及びAd5/35ベクターはHeLa細胞にそれぞれ遺伝子導入、感染させ、HIV96ZM651.8 gagタンパク質の発現をwestern blottingによって確認した。各レーンに見られたバンドは抗Cp24モノクローナル抗体によって検出された(図 2)。各バンドをImageJ softwareを用いて解析した。野生型gagとgagopt及びプロモーター間におけるgagopt、それぞれの発現強度を比較するため、Relative densityを算出した[図2(A)(B)]。その結果、野生型gagとgagoptの発現強度を比較すると、plasmidベクターでは36倍、Ad5/35ベクターでは221倍とgagoptの発現強度が高かった。一方、プロモーター間におけるgagoptの発現強度を比較すると、plasmidベクターでは同程度だったが、Ad5/35ベクターでは若干CAGプロモーターが高かった。
【００４８】
HIV clade C gag特異的な免疫原性の比較
野生型gagとgagopt及びプロモーター間におけるgagoptの免疫原性を比較するために、それぞれのHIV-1 Clade C gag発現カセットを搭載したAd5/35ベクターをマウスに投与し、さらにコントロールとしてLacZ遺伝子を搭載したAd5/35ベクターも投与した。免疫後10日目に、HIV-1 Clade C gag特異的な細胞性免疫反応をテトラマーアッセイとmulti-ICSアッセイにより検出した。テトラマーアッセイの結果、それぞれの投与群におけるgag特異的なCD8陽性リンパ球の頻度は [図3]のようになり、Ad-CMVi-Native gag投与群はcontrol群と同程度だった。統計解析した結果、gagoptは野生型gagよりも有意的に高かった (P < 0.01)。またプロモーター間で比較すると、CAGプロモーターが最も有意的に高かった(versus CMV:P <0.01, versus CMVi:P < 0.05)。
【００４９】
次に、multi-ICSアッセイの結果、それぞれの投与群におけるIFN-γ分泌(1function)、IFN-γ+TNF-α分泌あるいはIFN-γ+CD107a分泌(2function)、さらに IFN-γ+TNF-α+CD107a分泌(3function)するCD8陽性細胞の頻度は[図 4]のようになり、Ad-CMVi-Native gag投与群はcontrol群と同程度だった。統計解析した結果gagoptは野生型gagよりも1function・2function・3functionすべてにおいて有意的に高かった(P < 0.01)。プロモーター間で比較すると、CAGプロモーターが1function(P < 0.01)及び2function(P < 0.05)において有意的に高かった。しかし、3functionにおいて、有意差はなかった。
【００５０】
免疫後4週目に、それぞれのHIV clade C gag特異的な抗体価を測定するため、ELISAを行った。採取した血清は1/100から1/3200まで希釈された。それぞれの免疫群及び希釈率における抗体価は[図5]のようになり、Ad-CMVi-Native gag投与群はcontrol群と同程度だった。統計解析した結果、どの希釈率においても、gagoptは野生型gagよりも有意的に高かった(P < 0.01)。一方、プロモーター間で比較するとCAGはCMVよりもどの希釈率においても有意的に低かったが、CMViとは有意差はなかった。
【００５１】
HIV clade C env遺伝子の発現の解析
gagタンパク質とenvタンパク質を1つのプロモーターで同時に発現させるためにアダプター配列として、IRESあるいはF2Aを用い、gagopt-IRES-envopt とgagopt-F2A-envoptを作製した。またこの2つの遺伝子を融合タンパクとして発現させるgagopt-envoptも作製した。それぞれの遺伝子の発現カセットの概略図は[図6]に示した。それぞれの遺伝子発現カセットはDNA plasmidベクター及びAd5/35ベクターに組込んだ。これらの遺伝子カセットを搭載したDNA plasmidとAd5/35ベクターをHeLa細胞に遺伝子導入あるいは感染させ、envタンパク質の発現はwestern blottingによって確認した。各レーンに見られたバンドは抗Cgp120抗体によって検出した[図7]。各レーンのバンドはImageJ softwareを用いて解析した。それぞれのサンプルにおけるenvタンパク質の発現強度を比較するため、Relative densityを算出した[図7(A)(B)]。結果、DNA pladmidではIRES:fusion:F2Aが1:6:12となり、pCAG-F2Aが最も値が高く、pCAG-fusionの2倍、pCAG-IRESの12倍となった。一方、Ad5/35ベクターではIRES:fusion:F2Aが1:1.6:1.1となり、fusion
が最も高かった。
【００５２】
＜考察＞
本研究ではHIV-1 Clade Cに対する最適な免疫誘導能を有するワクチンを開発するため、Ad5/35ベクターを使用し，マウスにおいて1)HIV Clade Cの野生型gagとgagopt、2)CMV、CMViとCAG、3)IRESとF2A、融合遺伝子(fusion)の下流に導入した遺伝子の発現強度を検討した。その結果、1)gagoptが野生型gagよりも高い細胞性及び液性免疫を誘導した。2)CAGはHIV Clade C gag特異的な細胞性免疫の量及び質共にCMVとCMViよりも高かったが、液性免疫ではCMVとCMViよりも低かった。3)下流に導入したenvのタンパク質の発現強度を比較すると、DNA  plasmidではF2Aが最も強かったが、Ad5/35ベクターでは若干fusionが強かった。
【００５３】
現在、およそ20の防御用のHIVワクチンとおよそ20の治療用HIVワクチンが臨床試験されており、このうちのいくつかは臨床試験第II相に入っている(http://aidsinfo.nih.gov/Vaccines/) 。これらのワクチンの多くは北米やヨーロッパ、日本などの先進国に流行しているHIVのsubtypeである clade Bを対象としている。しかし、世界のおよそ半数以上がインド、中国、アフリカ南部等の発展途上国に流行しているHIVのsubtypeであるClade Cに感染している。そのため、clade Cに対するワクチンの開発が求められている。
【００５４】
本研究では、HIV clade C 野生型gagとgagoptにおけるgagタンパク質の発現強度をHeLa細胞で確認し、gagoptで発現強度が高い結果を得た。これは、微生物におけるコドンの使用頻度とヒトにおけるコドンの使用頻度は異なっており、ヒトのコドン使用頻度を考慮し、同義置換したgagoptはヒト細胞においてgagタンパク質の発現が強化されているためであると考えられる。また、gagoptを使用したDNAワクチンにおいて免疫原性が高いことが報告されている。しかし、Adベクターを用いた野生型gagとgagoptの免疫原性の比較は行われていない。DNA plasmidとウィルスベクターにおけるgagタンパク質のRelative densityの結果を比較すると、ウィルスベクターにおいて値が高かった。これは、DNA plasmidよりもウィルスベクターの遺伝子導入効率が高いことによると考えられる。
【００５５】
HIVに対する免疫よるウィルス抑制において、細胞性免疫反応が重要であることが知られている。これは、ウィルス特異的なCD8陽性T細胞反応がウィルスの初期増殖を起こす急性感染時に起こるからである。さらに、HIVのコアタンパク質であるgagに特異的なT細胞反応はHIVの感染者において、ウィルス増殖の抑制に関係していると報告されている。そこで本研究では、それぞれのHIV Clade C gag発現カセットを搭載したAd5/35ベクターをマウスに筋肉内投与し、HIV Clade C gag特異的な細胞性免疫反応の比較を行った。細胞性免疫反応を測定するために、テトラマーアッセイ及びmulti-ICSアッセイを行った。テトラマーアッセイは抗原ペプチド・主要組織適合性抗原(MHC)複合体を四量体化したMHCテトラマーを用いて抗原特異的なT細胞の細胞数や頻度を直接定量する。一方、ICSアッセイは免疫系細胞を抗原ペプチドによって刺激することによって、抗原ペプチド特異的な細胞内のサイトカイン産生能を解析することができる。さらに、多くの標識抗体を用いることによって、抗原特異的な細胞のサイトカイン産生、脱顆粒、増殖能等、多機能的に解析することができる(multi-ICSアッセイ)。HIV長期未発症者は、多くの機能を有するHIV特異的なCD8陽性T細胞を有しており、単独の機能よりも多機能的にCD8陽性T細胞を解析することは重要である。本研究では解析するサイトカインとしてIFN-γとTNF-α、さらに脱顆粒マーカーであるCD107aを用いた。テトラマーアッセイ及びmulti-ICSアッセイの結果、gagoptでgag特異的なCD8陽性T細胞性の量及び質共に野生型gagよりも有意的に高かった。これはgagタンパク質の発現強度が高いものほど、誘導されるgag特異的なCD8陽性T細胞反応が高くなったと考えられる。一方、プロモーター間で比較すると、CAGを使用したものでgag特異的なCD8陽性T細胞性の量及び質共に有意的に高かった。これは、抗原タンパク質を発現する細胞によるのではないかと考えられる。今回、Ad5/35ベクターをマウスの筋肉内に投与した。つまり、抗原タンパク質は筋肉細胞内で発現していると考えられる。以前、CAGは筋肉細胞内においてCMVやCMViよりも遺伝子の発現が強いと報告されている。このように、抗原タンパク質の発現が強いと、誘導される細胞性免疫の量及び質共に上昇するのではないかと考えられる。
【００５６】
免疫後四週目において、gag特異的な抗体価を測定した。抗体価を比較した結果、gagoptは野生型gagよりも抗体価が高かった。これにおいても、gagoptはgagタンパク質の発現が強いことによると考えられる。一方、プロモーター間で比較すると、細胞性免疫反応とは異なり、CAGがCMVとCMViよりも抗体価が低かった。これは、細胞性免疫反応が優位となり、液性免疫反応が低くなってしまったのではないかと考えられる。しかし、CD4T細胞が細胞性免疫に機能するTh1あるいは液性免疫に機能するTh2に分化しているのかを調べる等、更なる検討が必要である。
【００５７】
本研究では、一つのベクターでgagoptだけでなく抗体の誘導能が高いenvoptも発現させる方法として、アダプター配列であるIRES及びF2Aを使用あるいは2つの遺伝子を直接結合させた(fusion)。それぞれ作製した遺伝子発現カセットをもつDNA plasmid及びAd5/35ベクターをHeLa細胞でenvタンパク質の発現強度を比較した。その結果、DNA plasmidにおいてF2Aの使用が最も強く、IRESが最も弱かった。DNA plasmidにおける2つ目の遺伝子の発現強度の違いは、IRESとF2Aにおける発現様式の違いによると考えられる。IRES下流の遺伝子は上流にあるプロモーターによる発現ではなく、IRES配列にリボソームが結合することによって下流の遺伝子が翻訳される。つまり、IRES依存の発現様式をとる。一方、F2Aはプロモーターによって、1番目の遺伝子と2番目の遺伝子はF2Aペプチドで結合した一つのタンパク質として翻訳される。その後、F2Aペプチドは分割され、2つのタンパク質は別々になる。つまりCAP依存の発現様式をとり、2つ目の遺伝子発現はIRES依存よりCAP依存の発現が強いという報告と一致した。しかし、F2Aペプチドの2AペプチドはFMDV由来のペプチドであるので、臨床応用を考えた場合、安全性に問題がある。一方、Ad5/35ベクターにおける、envの発現強度を見ると、fusionが最も強く、F2AとIRESは同程度となり、DNA plasmidの結果と一致しなかった。これは、Ad5/35ベクターではIRES下流、fusion下流の遺伝子の発現が増強されるあるいはF2A下流の遺伝子の発現が低下するなど考えられるが、LacZ遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を用いて、更なる検討が必要である。
【００５８】
本研究において、Ad5/35ベクターにおいてCAGとgagoptの組み合わせがgag特異的な細胞性免疫の量及び質共に最適であることがわかった。このAd5/35-CAG-gagoptは、新しいHIVワクチンとして臨床への応用のみならず、CAG-gagoptの発現カセットは他のAdベクターへの応用が可能であると考えている。
【００５９】
本発明は、Ad5/35ベクター以外のウイルスベクター、HIV-1のgag遺伝子以外の抗原遺伝子にも応用可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、医薬品分野、特にワクチンとして利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
<配列番号１>
野生型HIV96ZM651.8gag遺伝子のDNA配列。
atgggtgcgagagcgtcaatattaagagggggaaaattagataaatgggaaaaaattaggctaaggccagggggaaagaaacgctatatgataaaacacctagtatgggcaagcagggagctggaaagatttgcgcttaaccctggccttttagaaacatcagaaggctgtaaacaaataatgaaacagctacaaccagctcttcagacaggaacggaggaacttagatcattatacaacacagtagcaactctctattgtgtacatgaaggggtagaggtacgagacaccaaggaagccttagacaggatagaggaagaacaaaacaaaattcagcaaaaaatacagcaaaaaacacagcaagcggctgacggaaaggtcagtcaaaattatcctatagtgcagaatctccaagggcaaatggtacaccagaaactatcacctagaactttgaatgcatgggtaaaagtaatagaagaaaaagcttttagcccagaggtaatacccatgtttacagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgttaaatacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagatactatcaatgaggaggctgcagaatgggatagattacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccaaatgagagaaccaaggggaagtgatatagcaggaactactagtaccctccaagaacagatagcatggatgacaagtaatccccctattccagtgggagacatctataaaagatggataattctggggttaaataaaatagtaagaatgtatagccctgtcagcattttggacataaaacaagggccaaaggaaccctttagagactatgtagaccggttcttcaaaactttaagagctgaacaggctacacaagaagtaaaaaattggatgacagacaccttgttggtccaaaatgcaaacccagattgcaagaccattttaaaagcattaggaccaggggctacattagaagaaatgatgacagcatgtcaaggagtgggaggacctagccacaaagcaagagtgttggctgaggcaatgagccaaacaaatagtgtaaacatactgatgcagaaaagcaattttaaaggaaataaaagaatggttaaatgttttaactgtggtaaggaagggcacatagccagaaattgcagggcccctaggaaaaagggctgttggaaatgtggaaaggagggacaccaaatgaaagactgtactgagaggcaggctaattttttagggaaaatttggccttcccacaagggaaggccagggaatttccttcagaacaggccagagccaacagccccaccagcagagagcttcaggttcgaggagacaacccccgctccgaagcaggagtcgaaagacagggaagccttaacttccctcaaatcactctttggcagcgaccccttgtctcaataa
<配列番号２>
野生型HIV96ZM651.8gag遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列。
MGARASILRGGKLDKWEKIRLRPGGKKRYMIKHLVWASRELERFALNPGLLETSEGCKQIMKQLQPALQTGTEELRSLYNTVATLYCVHEGVEVRDTKEALDRIEEEQNKIQQKIQQKTQQAADGKVSQNYPIVQNLQGQMVHQKLSPRTLNAWVKVIEEKAFSPEVIPMFTALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEAAEWDRLHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTSNPPIPVGDIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIKQGPKEPFRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLAEAMSQTNSVNILMQKSNFKGNKRMVKCFNCGKEGHIARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQNRPEPTAPPAESFRFEETTPAPKQESKDREALTSLKSLFGSDPLSQ
<配列番号３>
ヒト化HIV96ZM651.8gag遺伝子のDNA配列。
atgggcgcccgcgccagcatcctgcgcggcggcaagctggacaagtgggagaagatccgcctgcgccccggcggcaagaagcgctacatgatcaagcacctggtgtgggccagccgcgagctggagcgcttcgccctgaaccccggcctgctggagaccagcgagggctgcaagcagatcatgaagcagctgcagcccgccctgcagaccggcaccgaggagctgcgcagcctgtacaacaccgtggccaccctgtactgcgtgcacgagggcgtggaggtgcgcgacaccaaggaggccctggaccgcatcgaggaggagcagaacaagatccagcagaagatccagcagaaaacccagcaggccgccgacggcaaggtgagccagaactaccccatcgtgcagaacctgcagggccagatggtgcaccagaagctgagcccccgcaccctgaacgcctgggtgaaggtgatcgaggagaaggccttcagccccgaggtgatccccatgttcaccgccctgagcgagggcgccaccccccaggacctgaacaccatgctgaacaccgtgggcggccaccaggccgccatgcagatgctgaaggacaccatcaacgaggaggccgccgagtgggaccgcctgcaccccgtgcacgccggccccatcgcccccggccagatgcgcgagccccgcggcagcgacatcgccggcaccacaagcaccctgcaggagcagatcgcctggatgaccagcaacccccccatccccgtgggcgacatctacaagcgctggatcatcctgggcctgaacaagatcgtgcgcatgtacagccccgtgagcatcctggacatcaagcagggccccaaggagcccttccgcgactacgtggaccgcttcttcaagaccctgcgcgccgagcaggccacccaggaggtgaagaactggatgaccgacaccctgctggtgcagaacgccaaccccgactgcaagaccatcctgaaggccctgggccccggcgccaccctggaggagatgatgaccgcctgccagggcgtgggcggccccagccacaaggcccgcgtgctggccgaggccatgagccagaccaacagcgtgaacatcctgatgcagaagagcaacttcaagggcaacaagcgcatggtgaagtgcttcaactgcggcaaggagggccacatcgcccgcaactgccgcgccccccgcaagaagggctgctggaagtgcggcaaggagggccaccagatgaaggactgcaccgagcgccaggccaacttcctgggcaagatctggcccagccacaagggccgccccggcaacttcctgcagaaccgccccgagcccaccgccccccccgccgagagcttccgcttcgaggagaccacccccgcccccaagcaggagagcaaggaccgcgaggccctgaccagcctgaagagcctgttcggcagcgaccccctgagccagtaa
<配列番号４>
CMV(CMV-IE)プロモーターのDNA配列。
CGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATT
<配列番号５>
CAGプロモーターのDNA配列。
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGC
この配列中、
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGがCMV-IE enhancer、
GTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCがchicken b-actin promoter、
CCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCがβ-actin intronの配列である。
<配列番号６>
牛成長ホルモンポリAシグナルのDNA配列。
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
<配列番号７>
ウサギβ-グロブリンポリAシグナルのDNA配列。
aattcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgccatatgctggctgccatgaacaaaggtggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatgaagatc
<配列番号８>
IRESのDNA配列。
AATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCCG
<配列番号９>
F2AのDNA配列。
CGCGCCAAGCGCGCCCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGTCCAACCCCGGCCCC
<配列番号１０>
F2Aのアミノ酸配列。
RAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
<配列番号１１>
野生型HIV96ZM651.8gp160遺伝子のDNA配列。
atgagagtgagggagatactgaggaattggcaacgatggtggacatggggcatcttaggcttttggatgttaatgatttgtaatgtgtgggggaacttgtgggtcacagtctattatggggtacctgtgtggaaagaagcaaaaactactctattctgtgcatcagatgctaaatcatatgagaaagaagtgcataatgtctgggctacacatgcctgtgtacccacagaccccaacccacaagaaatagttttgggaaatgtaacagaaaattttaacatgtggaaaaatgacatggtggatcagatgcatgaggatataatcagtttatgggatcaaagcctaaagccatgtgtaaagttgaccccactctgtgtcactttaaattgtacagaggttaatgttaccagaaatgttaataatagcgtggttaataataccacaaatgttaataatagcatgaatggagacatgaaaaattgctctttcaacataaccacagaactaaaagataagaaaaagaatgtgtatgcacttttttataaacttgatatagtatcacttaatgagactgacgactctgagactggcaactctagtaaatattatagattaataaattgtaatacctcagccctaacacaagcctgtccaaaggtctcttttgacccaattcctatacattattgtgctccagctggttatgcgattctaaagtgtaataataagacattcaatgggacaggaccatgccataatgtcagcacagtacaatgtacacatggaattaagccagtggtatcaactcaactactgttaaatggtagcctagcagaagaagggataataattagatctgaaaatctgacaaacaatgtcaaaacaataatagtacatcttaatagatctatagaaattgtgtgtgtaagacccaacaataatacaagacaaagtataagaataggaccaggacaaacattctatgcaacaggagacataataggagacataagacaagcacattgtaacattagtaggactaactggactaagactttacgagaggtaaggaacaaattaagagaacacttccctaataaaaacataacatttaaaccatcctcaggaggggacctagaaattacaacacatagctttaattgtagaggagaatttttctattgcaatacatcgggcctgtttagtataaattatacagaaaataatacagatggtacacccatcacactcccatgcagaataagacaaattataaatatgtggcaggaagtaggacgagcaatgtacgcccctcccattgaaggaaacatagcatgtaaatcagatatcacagggctactattggttcgggatggaggaagcacaaatgatagcacaaataataacacagagatattcagacctgcaggaggagatatgagggacaattggaggagtgaattgtataagtataaagtggtagaaattaagccattgggaatagcacccactgaggcaaaaaggagagtggtggagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctgtgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaataacgctgacggcacaggccagacaagtgttgtctggtatagtgcaacagcaaagcaatttgctgagggctatagaggcgcaacagcatctgttgcaactcacggtctggggcattaagcagctccagacaagagtcctggctatagaaagatacctaaaggatcaacagctcctaggactttggggctgctctggaaaactcatctgcaccactgctgtgccttggaacatcagttggagtaataaatctaaaacagatatttgggataacatgacctggatgcagtgggatagagaaattagtaattacacaaacacaatatacaggttgcttgaggactcgcagagccagcaggagcaaaatgaaaaagatttattagcattggacagttggaacaatctgtggaattggtttgacataacaaaatggctgtggtatataaaaatatttataatgatagtaggaggcttaataggtttgagaataatttttgctgtactctctatagtgaatagagttaggcagggatactcacctttgtcgtttcagacccttatcccgaacccaagggaacccgacaggccaggaagaatcgaagaagaaggtggagagcaagacaaagagagatccgtgcgattagtgagcggattcttagcacttgcctgggacgacctacggagcctgtgcctcttcagctaccaccgattgagagacttcatattggtgacagcgagagcggtggagcttctgagacgcagcagtctcaagggactacagagggggtgggaagcccttaagtatctgggaagtcttgtgcagtattggggtctggagctaaaaaagagtgctattagtctacttgataccatagcaatagcagtagctgaaggaacagataggattatagaattaatacaaggaatttgtagagctatccgcaacgtacctagaagaataagacagggctttgaaacagctttgctataa
<配列番号１２>
野生型HIV96ZM651.8gp160遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列。
MRVREILRNWQRWWTWGILGFWMLMICNVWGNLWVTVYYGVPVWKEAKTTLFCASDAKSYEKEVHNVWATHACVPTDPNPQEIVLGNVTENFNMWKNDMVDQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLNCTEVNVTRNVNNSVVNNTTNVNNSMNGDMKNCSFNITTELKDKKKNVYALFYKLDIVSLNETDDSETGNSSKYYRLINCNTSALTQACPKVSFDPIPIHYCAPAGYAILKCNNKTFNGTGPCHNVSTVQCTHGIKPVVSTQLLLNGSLAEEGIIIRSENLTNNVKTIIVHLNRSIEIVCVRPNNNTRQSIRIGPGQTFYATGDIIGDIRQAHCNISRTNWTKTLREVRNKLREHFPNKNITFKPSSGGDLEITTHSFNCRGEFFYCNTSGLFSINYTENNTDGTPITLPCRIRQIINMWQEVGRAMYAPPIEGNIACKSDITGLLLVRDGGSTNDSTNNNTEIFRPAGGDMRDNWRSELYKYKVVEIKPLGIAPTEAKRRVVEREKRAVGIGAVFLGFLGAAGSTMGAASITLTAQARQVLSGIVQQQSNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGLWGCSGKLICTTAVPWNISWSNKSKTDIWDNMTWMQWDREISNYTNTIYRLLEDSQSQQEQNEKDLLALDSWNNLWNWFDITKWLWYIKIFIMIVGGLIGLRIIFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTLIPNPREPDRPGRIEEEGGEQDKERSVRLVSGFLALAWDDLRSLCLFSYHRLRDFILVTARAVELLRRSSLKGLQRGWEALKYLGSLVQYWGLELKKSAISLLDTIAIAVAEGTDRIIELIQGICRAIRNVPRRIRQGFETALL
<配列番号１３>
ヒト化HIV96ZM651.8gp160遺伝子のDNA配列。
atgcgcgtgcgcgagatcctgcgcaactggcagcgctggtggacctggggcatcctgggcttctggatgctgatgatctgcaacgtgtggggcaacctgtgggtgaccgtgtactacggcgtgcccgtgtggaaggaggccaagaccaccctgttctgcgccagcgacgccaagagctacgagaaggaggtgcacaacgtgtgggccacccacgcctgcgtgcccaccgaccccaacccccaggagatcgtgctgggcaacgtgaccgagaacttcaacatgtggaagaacgacatggtggaccagatgcacgaggacatcatcagcctgtgggaccagagcctgaagccctgcgtgaagctgacccccctgtgcgtgaccctgaactgcaccgaggtgaacgtgacccgcaacgtgaacaacagcgtggtgaacaacaccaccaacgtgaacaacagcatgaacggcgacatgaagaactgcagcttcaacatcaccaccgagctgaaggacaagaagaagaacgtgtacgccctgttctacaagctggacatcgtgagcctgaacgagaccgacgacagcgagaccggcaacagcagcaagtactaccgcctgatcaactgcaacaccagcgccctgacccaggcctgccccaaggtgagcttcgaccccatccccatccactactgcgcccccgccggctacgccatcctgaagtgcaacaacaagaccttcaacggcaccggcccctgccacaacgtgagcaccgtgcagtgcacccacggcatcaagcccgtggtgagcacccagctgctgctgaacggcagcctggccgaggagggcatcatcatccgcagcgagaacctgaccaacaacgtcaagaccatcatcgtgcacctgaaccgcagcatcgagatcgtgtgcgtgcgccccaacaacaacacccgccagagcatccgcatcggccccggccagaccttctacgccaccggcgacatcatcggcgacatccgccaggcccactgcaacatcagccgcaccaactggaccaagaccctgcgcgaggtgcgcaacaagctgcgcgagcacttccccaacaagaacatcaccttcaagcccagcagcggcggcgacctggagatcaccacccacagcttcaactgccgcggcgagttcttctactgcaacaccagcggcctgttcagcatcaactacaccgagaacaacaccgacggcacccccatcaccctgccctgccgcatccgccagatcatcaacatgtggcaggaggtgggccgcgccatgtacgccccccccatcgagggcaacatcgcctgcaagagcgacatcaccggcctgctgctggtgcgcgacggcggcagcaccaacgacagcaccaacaacaacaccgagatcttccgccccgccggcggcgacatgcgcgacaactggcgcagcgagctgtacaagtacaaggtggtggagatcaagcccctgggcatcgcccccaccgaggccaagcgccgcgtggtggagcgcgagaagcgcgccgtgggcatcggcgccgtgttcctgggcttcctgggcgccgccggcagcaccatgggcgccgccagcatcaccctgaccgcccaggcccgccaggtgctgagcggcatcgtgcagcagcagagcaacctgctgcgcgccatcgaggcccagcagcacctgctgcagctgaccgtgtggggcatcaagcagctgcagacccgcgtgctggccatcgagcgctacctgaaggaccagcagctgctgggcctgtggggctgcagcggcaagctgatctgcaccaccgccgtgccctggaacatcagctggagcaacaagagcaagaccgacatctgggacaacatgacctggatgcagtgggaccgcgagatcagcaactacaccaacaccatctaccgcctgctggaggacagccagagccagcaggagcagaacgagaaggacctgctggccctggacagctggaacaacctgtggaactggttcgacatcaccaagtggctgtggtacatcaagatcttcatcatgatcgtgggcggcctgatcggcctgcgcatcatcttcgccgtgctgagcatcgtgaaccgcgtgcgccagggctacagccccctgagcttccagaccctgatccccaacccccgcgagcccgaccgccccggccgcatcgaggaggagggcggcgagcaggacaaggagcgcagcgtgcgcctggtgagcggcttcctggccctggcctgggacgacctgcgcagcctgtgcctgttcagctaccaccgcctgcgcgacttcatcctggtgaccgcccgcgccgtggagctgctgcgccgcagcagcctgaagggcctgcagcgcggctgggaggccctgaagtacctgggcagcctggtgcagtactggggcctggagctgaagaagagcgccatcagcctgctggacaccatcgccatcgccgtggccgagggcaccgaccgcatcatcgagctgatccagggcatctgccgcgccatccgcaacgtgccccgccgcatccgccagggcttcgagaccgccctgctgtaa
<配列番号１４>
p24ペプチドのアミノ酸配列。
AMQMLKDTI
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００６２】
【非特許文献１】Vogels R et al. Replication-deficient human adenovirus type 35 vectors for gene transfer and vaccination: efficient human cell infection and bypass of preexisting adenovirus immunity. J Virol 2003; 77: 8263-8271
【非特許文献２】K-Q Xin et al., Gene Therapy (2005) 12, 1769-1777
【非特許文献３】Vaccine 2007;25:3809-3815
【非特許文献４】Gao F, et al. AIDS Res Hum Retroviruses 2003 Sep;19(9):817-23.
【特許文献】
【００６３】
【特許文献１】国際公開第WO 2005/052165号パンフレット
【図１】
2010168288.tif 000003
【図２】
2010168288.tif 000004
【図３】
2010168288.tif 000005
【図４】
2010168288.tif 000006
【図５】
2010168288.tif 000007
【図６】
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【図７】
2010168288.tif 000009
【配列表】
2010168288000001.app