(57)【要約】【課題】微粒子複合体およびその製造法を提供する。【解決手段】略球形の粒子を形成する核酸様成分に複合体形成した粒子形成成分を含んでなる微粒子複合体であって、該粒子形成成分が核酸様成分含有粒子内部を包み込み、そのように包み込まれた内部容積が遊離水含有容積の約５０％未満(好ましくは２０％未満)である複合体が提供される。微粒子複合体の製造方法は、ａ)水および水混和性有機溶媒からなる単相組成物中、粒子形成成分(“ＰＦＣ”)と核酸様成分(“ＮＡＣ”)とを組合わせて混合物を形成する工程(ただし、ＰＦＣおよびＮＡＣは独立して分子として、またはミセルとして水性／有機溶媒系に可溶である)；およびｂ)該混合物中の有機溶媒量を減少させる工程からなる。本方法はＮＡＣとＰＦＣの微粒子複合体の形成に効果的である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
略球形の粒子を形成する核酸様成分に複合体形成した粒子形成成分(“ＰＦＣ”)を含んでなる微粒子複合体であって、該粒子形成成分が核酸様成分含有粒子内部を包み込み、そのように包み込まれた内部容積が遊離水含有容積の５０％未満である複合体。
【請求項２】
粒子形成成分がカチオン性脂質を含んでなる請求項１記載の複合体。
【請求項３】
該粒子が４０ｎｍないし１５００ｎｍのサイズ範囲である請求項１記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物工学、ヒト用医薬および動物薬、特に、核酸様化合物を生細胞に送達する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞への核酸導入は、最新の生物学研究、産業、および医薬において重要なプロセスである。機能的核酸の効率的生細胞送達は、遺伝子工学、組換えタンパク質生産、および遺伝子治療として知られる医療技術にとって必須の要件である。
【０００３】
例えば、遺伝子療法は、正常の機能的遺伝子物質を特定の細胞に移入し、不完全な、または欠陥のある遺伝子産物による異常を正すことに関わる。インビボ、インビトロ、またはエキソビボで遺伝子移行を容易にするために、様々な方法が開発されている。遺伝子療法を達成するために最も頻用される送達システムの一つは、ウイルスベクターであり、最も一般的なのはアデノウイルスおよびレトロウイルスベクターである。しかし、ウイルスベクターは本来的に、免疫原的および炎症性応答、発現カセットの大きさの制限、ウイルス感染またはウイルス遺伝子組込みの可能性などの問題を抱えている。非ウイルス送達システム、例えば、カチオン性リポソームとポリカチオンなどが、一般にウイルスベクターの欠点をもたない代替法として提供されている。
【０００４】
あるいは、遺伝子療法は、罹患細胞を正す、または除去する目的で、天然または合成のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを正常および／または病態細胞に移入することからなる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、細胞内タンパク質発現の不所望経路を遮断する。ポリヌクレオチド免疫感応物質、例えば、メチル化されたＧＣ対を有するポリ(Ｉ、Ｃ)もしくはオリゴ−およびポリヌクレオチドなどを用い、患者のウイルスまたは癌細胞に対する防御力を増大させる。リボザイムは罹患細胞、例えば、癌またはウイルス感染細胞において他のポリヌクレオチドを選択的に分解するのを触媒する核酸である。オリゴ−およびポリヌクレオチドが一般に低い細胞膜浸透性を有し、また迅速に体外に除去されるため、オリゴ／ポリヌクレオチド送達運搬体は、細胞内送達能が高く、かつ分解および／または体外への排除からの保護が可能なものであることが必要である。
【０００５】
理論的に、陽性荷電リポソームは陰性荷電核酸、例えば、プラスミドに、静電的相互作用を介して複合体形成することができる。今日、多くの公表文献は、リポソーム−プラスミドＤＮＡ複合体が培養細胞において遺伝子の効率的な一過性の発現に介在し得るが、インビボの形質導入効率は貧弱であることを述べている。ウイルスベクター製剤と異なり、リポソーム−ＤＮＡ複合体はそのサイズまたは活性に関して余り安定ではない。大過剰のカチオン性脂質がこれらの剤形にしばしば使用され、標的細胞に対し相当な毒性の一因となっている。
【０００６】
過去、小型の脂質−ＤＮＡ粒子は、デタージェント透析および駆逐に基づく方法により生産していた。脂質−ＤＮＡ粒子のその他の調製法は、脂質可溶性溶媒中のカチオン性脂質中和ＤＮＡを不混和２相系から溶媒抽出することに基づいており、引き続き水和し、無溶媒複合体の駆逐または超音波処理してサイズを縮小する。これらの製剤は中性脂質および／または親水性ポリマー誘導化脂質を包含させることにより調製し、循環系にかる粒子を長期存在させることが可能であるが、かかる製剤のインビボ形質導入活性は低い。
【０００７】
製造の規模拡大が容易であり、かつ小型、活性で、生体適合性の核酸担持粒子を製造し得る方法および材料の提供が望まれる。
【０００８】
遺伝子送達用の核酸複合体は一般に技術上既知である。
【０００９】
フィーラーら(Wheeler et al.)の米国特許第５,９７６,５６７および５,９８１,５０１号公報は、プラスミド水溶液と、カチオン性および非カチオン性脂質含有有機溶液とを接触させ、澄明な単相を生じることによる血清安定プラスミド−脂質粒子の調製法を開示している。フィーラーらの澄明な単相は、水性成分がマイクロエマルジョンの形態で存在する有機相を包含する(“逆相”法)。
【００１０】
チアリーら(Thierry et al.)の米国特許第６,０９６,３３５号公報は、球状のアニオン性生物活性物質、カチオン性構成分、およびアニオン性構成分からなる複合体であって、非水性親水性極性溶媒中、アニオン性およびカチオン性構成分(その一方は好ましくは脂質である)を混合し、当該混合物に過剰の水溶液を加え、次いで上記混合物に核酸などの球状アニオン性生物活性物質を加え、それによって層状の丸まった凝縮構造をもつ安定な特定の複合体を形成させることによる製造法を開示している。
【００１１】
アレンおよびスチュアート(Allen and Stuart)のＰＣＴ／ＵＳ９８／１２９３７(ＷＯ９８／５８６３０)は、カチオン性脂質の可溶化に適した脂質溶媒中でポリヌクレオチド−カチオン性脂質粒子を形成し、中性小胞形成脂質を当該粒子含有溶媒に加え、次いで脂質溶媒を蒸発させ、ポリヌクレオチドを取込ませたリポソームを形成する方法を開示している。
【００１２】
アレンおよびスチュアートの米国特許第６,１２０,７９８は、ポリヌクレオチド−脂質微粒子の形成法であって、ポリヌクレオチドを第一の、例えば、水性溶媒に溶解し、脂質を第二の、例えば、当該第一溶媒と混和し得る有機溶媒に溶解し、第三の溶媒を加えて単相を形成させ、さらに一定量の第一および第二溶媒を加えて２液相を形成させる方法を開示している。
【００１３】
バリーら(Bally et al.)の米国特許第５,７０５,３８５号公報およびツアンら(Zhang et al.)の米国特許第６,１１０,７４５号公報は、脂質−核酸粒子の製造法であって、非カチオン性脂質とカチオン性脂質を含んでなる溶液と核酸とを接触させて脂質−核酸混合物(ただし、該溶液は１５〜３５％の水と６５〜８５％の有機溶媒とからなる)を形成し、当該混合物の水性部分を除去して非水性脂質−核酸混合物を形成し、有機溶媒を除去して後に脂質−核酸複合体を薄膜の形態で残し、該薄膜に水和して粒子を形成する方法を開示している。
【００１４】
マオラーら(Maurer et al.)のＰＣＴ／ＣＡ００／００８４３(ＷＯ０１／０６５７４)は、荷電治療薬を完全に脂質に包膜した治療薬粒子の製造法であって、処理した脂質小胞、荷電治療薬、および不安定化剤とを組合せて、小胞を不安定化するが破壊はしない不安定化溶媒中に混合物を形成させ、次いで該不安定化剤を除去することからなり、その場合の小胞が治療薬の電荷と反対の電荷をもつ荷電脂質を含んでなり、また該小胞が小胞の凝集を遅延させる量の立体障害部分をもつ修飾脂質を含む方法を開示している。荷電治療薬はアニオン性薬、例えば、核酸でもよく、その場合の小胞はカチオン性脂質を含んでなる。
【００１５】
上記の方法では、一般に、有機溶媒と水からなる単相溶液(水性−有機溶液)中で核酸−脂質複合体を形成することを教示している。これらの方法は、核酸と脂質が独立して分子としてまたはミセルとして当該水性−溶媒に可溶であることも、または当該有機−水性溶液内のプラスミドが凝集状態にあることも教示していない。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の一側面は、微粒子複合体の製造方法であって、水および水混和性有機溶媒からなる単相組成物中、粒子形成成分と核酸様成分とを組合わせて混合物を形成する工程(ただし、粒子形成成分および核酸部分は独立して分子として、またはミセルとして水性／有機溶媒系に可溶である)；および該混合物中の有機溶媒量を減少させる工程；からなる方法である。本方法では核酸様成分と粒子形成成分とからなる微粒子複合体の形成をなし得る。かかる減少工程に際し、系は単相系であることが好ましく、単相系とはその液体成分が液−液界面を生じるような相分離を受けずに、むしろ単一の液相のままであることを意味する。
【００１７】
本発明のもう一つの側面は、略球形の粒子を形成する核酸様成分に複合体形成した粒子形成成分を含んでなる微粒子複合体であって、該粒子形成成分が核酸様成分含有粒子内部を取込み、そのように取込まれた内部容積が遊離水含有容積の約５０％未満である複合体である。
【００１８】
本発明のもう一つの側面は、水および微粒子複合体の粒子を含んでなる組成物であって、該複合体が略球形の粒子を形成する核酸様成分に複合体形成した粒子形成成分を含んでなり、各微粒子状粒子の内部容積がＮＡＣを含み、かつ遊離水含有容積の約５０％未満を有する組成物である。
【００１９】
さらに本発明のもう一つの側面は、核酸様成分を細胞に送達する方法であって、水と微粒子複合体を含んでなる組成物と該細胞を接触させる工程(ただし、その複合体は略球形の粒子を形成する核酸様成分に複合体形成させた粒子形成成分を含み、その場合に核酸に基づく部分を含む粒子の取込まれた内部は遊離水含有容積の約５０％未満である)；および
核酸に基づく部分が細胞へ侵入するのに十分な時間、接触を維持する工程；からなることを特徴とする方法である。
【００２０】
なおさらなる本発明の側面は、治療用核酸様成分を、それを必要とする患者に送達する方法であって、水と微粒子複合体を含んでなる組成物を投与することからなり、該複合体が略球状の粒子を形成する核酸様成分に複合体形成させた粒子形成成分を含んでなり、その場合に粒子の取込まれた内部が核酸様成分を含み、また粒子の取込まれた内部が遊離水含有容積の約５０％未満であることを特徴とする方法である。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの側面は、製品に関し、(ｉ)水および微粒子複合体の粒子を含んでなる組成物であって、該複合体が略球形の粒子を形成する核酸様成分に複合体形成した粒子形成成分を含んでなり、各粒子の取込まれた内部容積がＮＡＣを含み、かつ遊離水含有容積の約５０％未満を有する組成物；および(ii)治療投与または(細胞形質導入)に関する説明書；を含んでなる製品である。
【００２２】
さらに本発明のもう一つの側面は、式：Ａ−Ｘ−Ｂで示される電荷変更組成物である。
式中、
Ｘは生理学的または生物過程環境における因子に反応する際に不可逆的に解離し得る化学結合を表す；
Ａは結合Ｘの解離によりイオン荷電産物を生成する分子部分を表す；および
Ｂは結合Ｘの解離により、該組成物から分離して、Ａ−Ｘ−Ｂそれ自体よりもより陽性の残余イオン荷電産物を脱離する分子部分を表す。
該組成物は本発明の微粒子複合体を形成する上で特に有用である。
【００２３】
本発明のこれらの側面および他の側面、態様、目的および特徴、ならびに本発明を実施する上での最良の形態は、以下の本発明の詳細な説明を添付の図面と組合わせて参照することにより、より完全に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１はＤＤＡＢ、コレステロール、ＰＯＰＣ、およびＰＥＧ(２,０００)−ＤＳＰＥ(バクテリアプラスミドＤＮＡ１μｇあたり６／６／１２／０.１２ナノモル)から構成されるジェノスフェアーズ(GENOSPHERES)(商標)の凍結割断電子顕微鏡画像を表す。スケールバーは１００ｎｍである。
【図２】図２はＤＤＡＢ／コレステロール／ＰＯＰＣ(プラスミドＤＮＡ１μｇあたり６／６／１２ナノモル)から構成されるジェノスフェアーズの凍結割断電子顕微鏡画像を表す。矢印先端は粒子コアを囲む二層を示す滑らかな割断を指し示す。矢印は核酸含有コアの二層構造を示す割断平面“ジャンプ”を指し示す。
【図３】図３はインビトロでのＳＫ−Ｂｒ−３細胞の生存度に対するＤＮＡ１μｇあたりＤＤＡＢ１２ナノモルとＤＯＰＥ１２ナノモルを含有する従来のプラスミド−脂質複合体(黒円)、およびＤＮＡ１μｇあたりＤＤＡＢ６ナノモル、ＣＨＩＭ４.８ナノモルおよびＰＯＰＣ７.２ナノモルを含有するジェノスフェアーズ(白円)の濃度上昇の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
広い観点で本発明は粒子形成成分(“ＰＦＣ”)および核酸様成分(“ＮＡＣ”)から微粒子複合体を製造する新規方法に関する。該方法は２つの重要な側面を有する：(１)ＰＦＣおよびＮＡＣを水と水混和溶媒との単相組成物中で接触させること；および(２)ＰＦＣおよびＮＡＣが独立して分子としてまたはミセルとして水性／有機系に可溶であること。ＰＦＣおよびＮＡＣは単相組成物中で組合せて微粒子複合体を含有する混合物を形成し、次いで有機溶媒を除去する。微粒子複合体は、次いで、患者にＮＡＣを送達し、細胞に形質導入するために、または本開示と矛盾のない他の用途に使用する。以下の考察は本発明方法に採用する成分の詳細な性質についてさらに説明する。本明細書全体をとおして、本発明方法が形成する微粒子複合体は“ジェノスフェアー”(GENOSPHERE)または“ジェノスフェアーズ”(GENOSPHERES)ともいうが、本発明に特有の組成物をいうための特別の造語である。
【００２６】
１．核酸様成分(“ＮＡＣ”)
本発明に有用なＮＡＣは、例えば、それを生細胞へ送達したときに生じることの期待される生物学的または生理学的作用に従い選択する。かかる選択は分子生物学および医学の分野における当業者にとって周知である(参照例：Gene Therapy, Ed. by D. Lasic and N. Smyth-Templeton, Marcell Dekker, N.Y., 2000, 584 pp.)。ＮＡＣは核酸であるか、またはその構造と機能が共有結合した繰返し分子単位(モノマーともいう)の主鎖をもち、生物学的または生理学的作用を示す核酸類似のポリマー物質である。ＮＡＣは天然、修飾または合成塩基および主鎖要素を含み得る。ＮＡＣは天然または合成起源のものでもよく、また、核酸(すなわち、共有結合した繰返し分子単位の主鎖に結合した複数の核酸塩基からなるポリマー)、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然および合成オリゴヌクレオチド(アンチセンス・オリゴヌクレオチド、干渉性ＲＮＡおよび小型の干渉性ＲＮＡを含む)、核タンパク質、ペプチド、核酸、リボザイム、ＤＮＡ含有核タンパク質、未処理または部分的に脱タンパク質したウイルス粒子(ビリオン)など、ＤＮＡ以外のオリゴマーおよびポリマー性アニオン化合物(例えば、酸多糖類および糖タンパク質)などでもよい。好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは発現可能な遺伝子配列を有するＤＮＡである。アンチセンス・オリゴヌクレオチドはもう一つの好ましいタイプの核酸である。外来性ＮＡＣの生細胞への移入プロセスを表現するために、我々は“形質導入”という用語を使用するが、これは特定の種類のＮＡＣに、または形質導入されたＮＡＣが細胞中で果たし得る特定の機能に限定するものではない。形質導入は処置すべき被験者の体内細胞(インビボ)で、または被験者の外部で維持された細胞(インビボまたはエキソビボ)で実施し得る。“形質導入”および“送達”という用語は本発明の記載で互換して使用し得る。特定の応用に有利な場合には、構造、機能またはヌクレオチド配列に関して、ゲノスフェアーズは１種を超えるＮＡＣを含み得る。
【００２７】
２．水混和性有機溶媒
水混和性有機溶媒は、下記のＰＦＣ／ＮＡＣの組合せ工程および有機溶媒量減少工程のために選定された条件下に、すなわち、約０.０１容量％から約６０容量％までの全範囲で、水との完全な混和性(単一液相または単相)を維持する。
【００２８】
本工程の水混和性有機溶媒は、好ましくはアルコールまたは非プロトン性溶媒であり、好ましくは生物製剤での使用に適した溶媒である。アルコール溶媒の例は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、２−ブタノール、tert−ブタノール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、メチルセロソルブ(エチレングリコールモノメチルエーテル)、メチルカルビトール(ジエチレングリコールモノメチルエーテル)などである。メタノール、エタノールまたはtert−ブタノールが好ましく、エタノールが特に好ましい。非プロトン性溶媒は、エーテル、エステル、ケトン、ニトリル、アミド、またはスルホキシドである。好ましい非プロトン性溶媒は、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、またはジメチルスルホキシドである。
【００２９】
３．粒子形成成分(“ＰＦＣ”)
ＰＦＣは一般にカチオン性脂質などの脂質と、カチオン性脂質以外のＰＦＣとの組合せからなる。カチオン性脂質はその分子が電離によりｐＨ約３〜約１０の範囲、好ましくは約４〜約９の生理的ｐＨ範囲で実効陽性イオン電荷を生じ得るものである。かかるカチオン性脂質は、例えば、単一の炭化水素鎖を有するカチオン性両親媒性物質などのカチオン性界面活性剤を包含する。特許および科学文献は核酸形質導入増強性を有する多くのカチオン性脂質について記載している。これらの核酸形質導入増強性カチオン性脂質は、例えば、１,２−ジオレイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニオ)プロパンクロリド、ＤＯＴＭＡ(米国特許第４,８９７,３５５号公報)；ＤＯＳＰＡ(参照：Hawley-Nelson, et al., Focus 15(3): 73 (1993))；Ｎ,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド、またはＤＤＡＢ(米国特許第５,２７９,８３３号公報)；１,２−ジオレイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニオ)プロパンクロリド−ＤＯＴＡＰ(Stamatatos et al., Biochemistry 27: 3917-3925 (1988))；グリセロールに基づく脂質(参照：Leventis et al., Biochem. Biophys. Acta 1023: 124 (1990); アルギニル−ＰＥ(米国特許第５,９８０,９３５号公報)；リジニル−ＰＥ(Puyal et al., J. Biochem. 228: 697 (1995))、リポポリアミン(米国特許第５,１７１,６７８号公報)およびコレステロールに基づく脂質(ＷＯ９３／０５１６２；米国特許第５,２８３,１８５号公報)；ＣＨＩＭ(１−(３−コレステリル)オキシカルボニルアミノメチルイミダゾール)などである。形質導入用のカチオン性脂質は、例えば、ベールの文献(Behr, Bioconjugate Chemistry, 5:382-389 (1994))に概説がある。好適なカチオン性脂質はＤＤＡＢ、ＣＨＩＭ、またはその組合せである。カチオン性界面活性剤であるカチオン性脂質の例は、(Ｃ１２〜Ｃ１８)アルキル−および(Ｃ１２〜Ｃ１８)アルケニル−トリメチルアンモニウム塩、Ｎ−(Ｃ１２〜Ｃ１８)アルキル−および(Ｃ１２〜Ｃ１８)アルケニル−ピリジニウム塩などである。
【００３０】
カチオン性脂質以外のＰＦＣは一般にそれ自体が単層および／または二層に集合し得るものであるか、またはかかる集合を補助するものであり、例えば、中性リン脂質(例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン)、酸性リン脂質(例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル−イノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン)、スフィンゴ脂質(例えば、スフィンゴミエリン)、ビス−アルキルリン酸エステル(例えば、リン酸ジセチル)、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪酸ジグリセリド、高級アルキル−ポリ(オキシエチレン)エーテル；高級アシルポリ(オキシエチレン)エステル、高級アルキルポリオールエステル(界面活性剤ともいう；参照：バッケム製品カタログ；バッケム(BACHEM)カリフォルニア・インク、１９９９、１２９〜１３０ページ)、高級アシル−ポリオールエステル、ステロール(例えば、コレステロール)、その誘導体、またはその混合物である。
【００３１】
その他のＰＦＣとしては、カチオン荷電したポリマー(ポリカチオン)であるある種の粒子形成ポリマー、例えば、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(ビニルピリジン)、Ｎ−修飾ポリ(アクリルアミド)、およびそのＮ−アルキル化(例えば、四級化)誘導体；ポリ(アミノ酸)−ポリ(リジン)、ポリ(アルギニン)、ポリ(オルニチン)、およびそれらを含むコポリマー；塩基性タンパク質、例えば、ヒストン、プロタミン、塩基性線維芽細胞増殖因子、または合成ペプチドなどである(Boulikas and Martin, Int. J. Oncology 10:317-322 (1997); Li and Huang, Gene Therapy 4: 891-900 (1997); Sorgi et al. Gene therapy 4: 961-968 (1997); Murphy et al. Nucleic Acid Res. 29: 3694-3704 (2001); Hoganson et al. Human Gene Therapy 9: 2565-2575 (1998))。粒子形成ポリマーは中性またはポリアニオン性であるか、またはその組合せでもよい。中性粒子形成ポリマーは、例えば、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、乳酸とグリコール酸とのコポリマー、またはポリ(シアノアクリル酸エステル)である。(Cohen et al. Gene Therapy 7: 1896-1905 (2000); Wang et al. J. Controlled Release, 57: 9-18 (1999); Lambert et al. Int. J. Pharmaceutics 214: 13-16 (2001))。説明の便宜上、本発明方法と物質の開示では１種類のＰＦＣを参照しているが、かかる参照はＰＦＣ単独または他のＰＦＣとの組合せも包含するものと認められる。一般に、カチオン粒子形成ポリマーを使用する場合には、脂質は優先的に中性および／またはアニオン性とする；カチオン性脂質を使用する場合は、粒子形成ポリマーは優先的に中性および／またはアニオン性のものとする。
【００３２】
４．ＰＦＣとＮＡＣの組合せ
この工程でＰＦＣは所望の微粒子複合体を形成するために十分な条件下でＮＡＣと組合わせる。選択したＮＡＣは水と上記のように選択した水混和性有機溶媒からなる単一液相(すなわち、単相)の溶液中でＰＦＣと組合わせる。単相組成物は以下に検討するように光学的澄明性に関わりなく、液−液界面のないことを特徴とする混合物である。ＰＦＣとＮＡＣは技術上既知の方法により組合わせる。得られる水性／有機溶媒混合物中に存在する有機溶媒の容量パーセントは、本工程に使用するＮＡＣとＰＦＣのタイプにより変わる。このパーセントは約１０容量％ないし約６０容量％の範囲であり、一般に約５５容量％までである。本プロセスが起こる温度範囲は水性／有機溶媒混合物の凝固点以上で、有機溶媒の沸点以下である；この温度は外界気圧条件下、約０℃から１００℃を超えない範囲で一般に変わる。外気温を超える温度、例えば、３０℃ないし７０℃の範囲が好ましく、取分け、約４０℃ないし約６５℃の範囲が好ましい。
【００３３】
好適な一方法は、実質的に水性の媒体中ＮＡＣの溶液を調製し、ＰＦＣは有機溶媒中の溶液として調製し、２つの溶液を、例えば、機械的混合により、該混合物中、有機溶媒の必要含量を提供する容量比で組合わせることからなる。得られる混合物中の有機溶媒含量は、好ましくは、ＮＡＣの部分的脱水および／または濃縮に備えるが、ＮＡＣは溶解状態に維持する；また、同時に、有機含量はＰＦＣを可溶化し、非小胞形態、例えば、ミセルの形態とする。
【００３４】
もう一つの好適な方法は、水と第一容量パーセントの水混和性有機溶媒とを含む単一液相のＮＡＣ溶液を調製し、水と第二容量パーセントの水混和性有機溶媒とを含む単一液相のＰＦＣ溶液を調製し、以下に特定するように、これら２つの溶液を、例えば、機械的混合により、該混合物中、有機溶媒の必要含量を提供する容量比で組合わせることからなる。これら２つの溶液中の有機溶媒の第一および第二容量パーセントは、好ましくは同じである。第一(ＮＡＣ)溶液中の有機溶媒の容量％は、好ましくは、例えば、核酸分子が濃縮および／または低水和の形態へ遷移し易くするように選択し、一方、第二(ＰＦＣ)溶液中の有機溶媒の容量パーセントは、例えば、液体をミセルなどの非小胞形態に可溶化する。従って、優れた技術者は核酸溶液と脂質溶液の有機溶媒含量、ならびに得られる混合物中の含量を、核酸の脱水および／または濃縮を容易にする必要性と、脂質可溶化の必要性の両者を満足させるように選択することとなる。
【００３５】
第三の好適な方法によると、ＰＦＣは正味の形態で、好ましくは広い表面積をもつ形態で提供されるが、例えば、不溶性基板上に薄膜を析出させ、次いでＮＡＣ脱水／濃縮および／またはＰＦＣ可溶化の必要性を満足する容量パーセントで水と水混和性有機溶媒を含む単一液相のＮＡＣ溶液と接触させる；このパーセントはより詳しくは以下に定義する。正味のＰＦＣとＮＡＣ溶液との接触は、好ましくは機械的な撹拌、例えば、接触操作を行う容器のゆるやかな回転または往復運動により実施し、その結果としてＰＦＣは溶解し、好ましくは濃縮状態でＮＡＣと接触し、微粒子複合体の形成を確かなものとする。撹拌は一般にすべての正味のＰＦＣが実質的に溶解するまで継続する。
【００３６】
本発明方法には１種を超える粒子形成成分を使用することができる。この場合、ＰＦＣの一つは他のものよりもＮＡＣとの高い親和性を有する。例えば、カチオン性脂質を中性の粒子形成脂質とともに使用する場合、上記の方法を組合わせて使用することが有利であり得る。一般に、高い親和性を有する成分、例えば、カチオン性脂質などは上記の２つの溶液法により核酸と組合せ、得られる混合物はさらに非カチオン性粒子形成脂質などの第二粒子形成成分と正味の状態で、第二成分が溶解するまでゆっくりと撹拌しながら接触させる。
【００３７】
一部の例では、ＮＡＣ水溶液にＮＡＣの、例えば、小球形へのさらなる濃縮を促進するのに十分な量の核酸縮合化合物を導入することが有利であり得る；このことについてはここでより詳細に検討する。かかる核酸縮合化合物は技術上既知である。例示としては、ポリアミン(スペルミン、スペルミジン)およぼカチオン性色素(例えば、アクリジン誘導体)である。
【００３８】
得られるＮＡＣ／ＰＦＣ溶液の有機溶媒は、好ましくは、核酸などのＮＡＣ、および脂質などのＰＦＣの両方が独立して分子としてまたはミセルとして可溶である容量濃度で存在する。すなわち、ＮＡＣとＰＦＣとの組合せ後に生じる有機−水性単相は、分子状またはミセル状溶液の形態で、ＮＡＣおよびＰＦＣの両方が溶解に際し存在する必要なく、ＮＡＣまたはＰＦＣのいずれかを溶解し得る。好ましくは、有機溶媒の含量、および／またはＮＡＣおよびＰＦＣを組合わせる温度が低下するとき、ＰＦＣは自己集合性非ミセル濃縮相、例えば、二層、逆方向六方晶液晶または非晶質相などを形成する。水性環境において二層などの定序凝縮相、立方晶、または離液液晶として知られる逆方向六方相などを形成するＰＦＣが特に好適である。かかるＰＦＣは既知である(参照例：D. Lasic, Liposomes: From Physics to Applications, 1993)。水性環境中二層形成するＰＦＣは、一般に小胞などの封じ込め構造を形成する。単相において有機溶媒濃度を低下させることで自己集合凝縮相を形成するＰＦＣの能力は、ＮＡＣの存在如何とは関係がない。水性環境において自己集合非ミセル凝縮相を形成するＰＦＣの典型的な種類については、文献に記載されている：Donald M. Small, Handbook or Lipid Research, Volume 4, The Physical Chemistry of Lipids: From Alkanes to Phospholipids(脂質の物理化学：アルカンからリン脂質まで), Plenum Press, 1986, Chapter 4；その教示を参照により本明細書の一部とする。これらの典型的なＮＡＣはクラスＩ不溶性非膨潤性両親媒性物質(界面に広がり安定な単層を形成する；水不溶性であるか、または溶解性が極めて低い)およびクラスII−不溶性膨潤性両親媒性物質(拡がって界面で安定な単層を形成する；不溶性ではあるが水中で膨潤して離液液晶を形成する)。かかるＰＦＣの典型例はこのセクション３に開示する。上記のスモール(Small)は脂質である両親媒性物質を教示しているが、凝縮定序相の同じ理化学的特徴は、ポリマーからなるＰＦＣにより達成し得ることが認められている。理論により制限されることなく、そのように選択した場合、単相の有機溶媒濃度は核酸分子の周りのＰＦＣ分子の転位を容易にし、細胞の形質導入に有利な性質をもつ微粒子複合体を形成すると我々は信ずる。
【００３９】
脂質は一般に十分に高濃度の可溶化界面活性剤、例えば、オクチルグルコシド、コレート(コラン酸アニオン)、およびデオキシコレート(デオキシコラン酸アニオン)などの存在下に水中でミセル溶液を形成することが知られている。この技術には核酸水溶液中に核酸−脂質複合体を形成するために、脂質可溶化剤として界面活性剤を使用することが開示されているが、その場合、結局は界面活性剤は除去して粒子形成を実施する(参照例：Wheeler et al.：米国特許第５,９７６,５６７)。しかし、本発明では、界面活性剤の性質をもつ分子をジェノスフェアー(GENOSPHERE)粒子の成分として使用し得るが、選択した有機−水性単相中の脂質をミセルまたは分子溶液とするための可溶化界面活性剤は、その必要性が大幅に削減されるか、または完全に除かれる。
【００４０】
所定の混合物について選択した有機溶媒の特定濃度は、有機溶媒、ＰＦＣ、およびＮＡＣの性質、該成分を組合わせる際の温度、水性成分のイオン強度、および混合物中のＰＦＣおよび／またはＮＡＣの濃度に左右される。一旦、有機溶媒、ＮＡＣ、水性成分、およびＰＦＣを本発明の特定の適用要件に従って選択した場合、本明細書を手引書とし得る優れた技術者は、技術上既知の簡単な溶解試験を実施することにより、有機溶媒の必要な濃度を容易に確立し得よう。例えば、溶解試験を実施するために、ＮＡＣおよびＰＦＣをそれぞれに有機溶媒濃度を数段階とする有機−水性単相中に(別個の容器中で)選択した温度で混和し、溶解した核酸および／または脂質の分子としての、またはミセルとしての性質を動的光散乱により決定することができる；この場合、分子またはミセルの溶解性は、ＰＦＣの場合、粒径が約３０ナノメートル(ｎｍ)未満、一般には２０ｎｍ以下のものが優位を占めることで判断し、一方、ＮＡＣの場合には溶解した粒子が所定のＮＡＣの緻密な球体の計算サイズに適合することで、粒子が分子として溶解したと判断する。光散乱強度は、ミセルまたは特に分子状の(真の)溶液が、粒子、小胞、フィラメント、または凝集したＮＡＣまたはＰＦＣ相からなる他の要素を含むものよりも実質的に低い光散乱を有するので、同様に使用し得る。技術的に既知の他の方法、例えば、ＮＭＲ、ＥＳＲプローブ、および蛍光プローブ法も、ミセルまたは分子状溶液以外の状態で、ＮＡＣまたはＰＦＣの存在を検出するために使用し得る。参照例：R. Haugland, 1996, Handbook of Fluorescent Probes (蛍光プローブ便覧)、Molecular Probes, Inc., Oregon, USA。
【００４１】
混合物中の有機溶媒量は、ＮＡＣおよびＰＦＣが得られる水性−有機溶媒単相にミセルとして、または分子状に独立して可溶化するように選択する。一般に、この量は約１０容量％ないし約６０容量％、好ましくは３０容量％ないし５５容量％、最も好ましくは約４５容量％ないし約５５容量％である。ＰＦＣが脂質であり、ＮＡＣが核酸である場合、該脂質は一般にカチオン性脂質からなり、その量は核酸１塩基あたり約０.２ないし約３.０分子、より好ましくは核酸１塩基あたり約０.５ないし約２.０分子に等価の量である。非カチオン性脂質の量は、好ましくは以下に記載するように、混合物中の有機溶媒含量を減少させるに従って、脂質二層の形成を促進する量とする。非カチオン性脂質の特定量は、この脂質の性質、選択したカチオン性脂質、核酸、および有機溶媒に左右される。一般に、非カチオン性脂質はカチオン性脂質量に対し、０.２ないし１０.０のモル比で、好ましくは０.５ないし５.０のモル比で存在すればよい。ステロールは非カチオン性脂質の１００％までの量で存在すればよい。例えば、ホスファチジルコリンなどのリン脂質が存在する場合、例えば、コレステロールなどのステロールは一般に非カチオン性脂質の５０モル％までを構成する。核酸溶液および脂質(溶液中または正味の形態)は、好ましくは外気温以上の温度で、かつ溶液中に存在する脂質の相遷移の最高温度で組合わせるが、有機溶媒の沸点以下の温度、好ましくは約３０℃ないし約８０℃、さらにより好ましくは約４０℃ないし約７０℃、最適には約５０℃ないし６５℃の温度で組合わせる。ＮＡＣおよびＰＦＣを組合わせる正確な温度はまた、選択した単相中の両成分の分子状またはミセルとしての溶解にも必要である。この温度は、例えば、上記の溶解試験によって決定し得る。
【００４２】
液相の水性成分は、好ましくは低イオン強度のもの、すなわち、生理学的値(１４４ｍＭ−ＮａＣｌの強度)以下、より好ましくは５０ｍＭ−ＮａＣｌの強度以下、最も好ましくは１０ｍＭ−ＮａＣｌの強度未満のものである。イオン強度は溶液中の全イオン濃度にそのイオン電荷の二乗を掛けた値の総計の２分の１と定義される(参照：Cantor and Schimmal, Biophysical Chemistry, Part 2, Freeman, N.Y. 1980, p.677)。特定の理論に制限されることなく、ＰＦＣ／ＮＡＣ組合せ工程での低イオン強度が、粒子の凝集と沈殿の危険性を低減し、この工程に際して存在すべき立体的に安定化する脂質成分の必要性を除くものと我々は信じる。また、水性成分は、所望のｐＨを維持するために、一般的には約３.０ないし約１０.０の範囲に、より好ましくは約４.０ないし約９.０の生理的ｐＨに維持するために、緩衝物質を含んでいてもよい。緩衝物質の量は上記イオン強度の範囲内でイオン強度を低目に維持するように選択する。
【００４３】
５．混合物中の有機溶媒量の低下
前記の考察に従い、ＮＡＣとＰＦＣを組合わせた後、混合物中の有機溶媒量を低下させ、ジェノスフェアーズを形成させる。脂質を含んでなるＰＦＣの場合、有機溶媒量の低下は凝縮したＮＡＣ／ＰＣＦコア周辺の液体二層形成を促進し、ジェノスフェアーズの形成と安定化に効果的であると信じられる。従って、有機溶媒量はＮＡＣ−ＰＦＣ複合体が自己集合して粒子を形成する点までまず優先的に低下させる。もし、例えば、粒径測定により証明されるように、ＮＡＣ−ＰＦＣ粒子の形成は単相工程で起こり、有機溶媒の除去は任意であって、例えば、形質導入製剤の生物適合性改善の目的に役立つ。もしＰＦＣが脂質を含有するならば、有機溶媒量は好ましくは二層の形成が達成されるまでまたはそれ以下まで低下させる。一般に、この量は約２０容量％未満である。最も好ましくは、有機溶媒は本質的にすべて、例えば、約０.０１容量％以下まで除去する；しかし、核酸を皮膚細胞に送達するなど、一部の局所適用例では、医薬的に許容し得る溶媒を使用し、組成物中の溶媒(例えば、エタノール)のパーセントを維持するのが有利である。有機溶媒の削減は技術上利用し得る如何なる手段、例えば、透析、ゲルクロマトグラフィー、吸収、減圧留去、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、凍結乾燥、またはその組合せなどにより達成する。ジェノスフェアーズは保存または最終使用のために適切な媒体に移入することを可能とする。混合物中の有機溶媒含量を低減させる前に、あるいはその途上に、媒体のイオン強度は、例えば、濃厚塩溶液を加え、混合することにより生理的値(１４４ｍＭ−ＮａＣｌの強度)にもっていくことができる。予想外に、本発明のジェノスフェアーズは凝集防止ポリマー−脂質接合体(conjugate)が存在しなくても、生理塩溶液中での凝集に対して安定であることが判明した。
【００４４】
技術が教示する一部の有機−水性系においては、マイクロエマルジョンにおけるなど、系が光学的に澄明(“澄明な単相”)と思われる場合でも、液−液界面は存在し得る。本発明においては、単相(単一液相)有機−水性組成物はその光学的清澄性に関係なく、液−液界面の存在しないことが特徴である。該混合物の単相形態は維持されていながら、混合物中の有機溶媒含量は低下させ、１相を超える液相の形成を回避する。１相を超える液相の形成は、液／液界面の出現により明らかとなり、しばしば(マイクロ)エマルジョンの形成または第二液相の分離に導く。第二液相の形成を回避することは、ＰＦＣが液／液界面に移行すること、および／または有機相に富む第二相に取込まれることを防止する；両方の現象はＮＡＣ／ＰＦＣ微粒子の正当な集合にとって不利な現象である。第二液相の形成は水性液体との混和性が不完全なハロゲン化炭化水素、例えば、クロロホルムにより促進され得る。
【００４５】
有機溶媒を除去する温度は、好ましくはＮＡＣとＰＦＣを組合わせた温度である。しかし、該温度は先ず外気温とするか、または４〜８℃の冷凍温度より下の温度とする。低相転移温度(Ｔｍ)の脂質、例えば、不飽和脂肪酸鎖をもつもの(Ｔｍ＜４℃)を使用する場合、後者がより適当である。
【００４６】
さらに、細胞特異的リガンドおよび補助成分(下記セクション７に記載)は、上記接触工程に際し、ジェノスフェアーズ形成前またはジェノスフェアーズ形成後にジェノスフェアーズに加えることができる。ジェノスフェアーズはＮＡＣを欠くいずれかの脂質凝集体から、例えば、密度勾配遠心分離により任意に精製し得る。最後に、ジェノスフェアーズは下記のように適切な媒体に移行させるか、または保存のために凍結乾燥し、さらに最終使用のためには生物学的に許容し得る媒体(例えば、水、生理的水溶液、または他の注射可能なビークル)で再構成し得る。生物分布および組織浸透を目的とする薬剤は、ジェノスフェアー製剤に添加することができる。これらはマンニトールまたは血管作用性物質である(参照例：Rosenecher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol.93, pp.7236-7241)。
【００４７】
６．微粒子複合体の構造的物理的性質
本発明により形成されるジェノスフェアーのサイズは、約４０ないし約１５００ｎｍの範囲内、好ましくは約５０〜５００ｎｍの範囲、最も好ましくは約２０〜５０ｎｍの範囲である。このサイズを選択したことで、ジェノスフェアーを体内に投与したときに、それが血管から悪性腫瘍などの疾患組織に浸透して、治療用の核酸をそこに運搬するのを有利に助ける。ジェノスフェアーの特徴的な有利な性質は、そのサイズが、例えば、動的光散乱法で測定したときに、インビトロの細胞培養培地または血漿などの細胞外生体液の存在下で実質的に増大しないということである。
【００４８】
電子顕微鏡での解析は、ジェノスフェアーの構造を決定するために有用である。ジェノスフェアー粒子のかかる解析は、図１および図２に示すようなＮＡＣ−含有コアとそのコアを取り巻く殻を明らかにする。殻は凍結割断電子顕微鏡標本において平滑な割断面を生じた場合、小胞形成脂質の二層に特徴的な構造的挙動を示す。従って、小胞形成ＰＦＣ、例えば、殻の脂質は好ましくはコアを取り巻く１つ以上の二層において自己組織化する。例えば、殻のカチオン性脂質含量は、もし存在するとしても僅かであり、その結果、ジェノスフェアーが強いポリアニオン、例えば、ヘパリン、ポリリン酸、またはコンドロイチン硫酸などと反応したとき、ジェノスフェアーの解離は最小であり、ジェノスフェアーからの核酸の放出は３０％未満、一般にはジェノスフェアーの総核酸含量の１０％未満である。ジェノスフェアーズの有利な特徴は、ＰＦＣ、例えば、カチオン性脂質含量が、ジェノスフェアー全体では高いが、ジェノスフェアーの殻ではより低いということである。ジェノスフェアー殻のカチオン性脂質含量が低いということは、例えば、体内で細胞を囲むポリアニオン性物質によるジェノスフェアーの解離を防止し、血中でのジェノスフェアーの凝集と血液タンパク質による“オプソニン作用”を低下させる；オプソニン作用は体内から核酸担持粒子を急速に排除する原因となることが知られている。従って、より多くの核酸が標的細胞に到達し得る。同時に、粒子中カチオン性脂質の高い全含量が核酸の送達量を増大させる。
【００４９】
殻はコアに密着して取り巻くので、コアと殻の間には外来の小型分子(溶質)を保持するスペースが僅かしかない。一般に、殻に取込まれた内部空間の水性含量は、粒径から計算される量の５０％未満、より好ましくは２０％以下である。後者の値は粒子内に含まれる核酸の水和層に固定された水の予測量に相当する。従って、水性媒体中のジェノスフェアーズは、一般に、皮膜に包まれた核酸により固定された水和水に近似する量の皮膜に包まれた水を含有する。
【００５０】
脂質ＰＦＣを含有するジェノスフェアーズのもう一つの予期せざる物理的性質は、その浮遊密度の均一性であり、一般に１.０２５〜１.０６ｇ／ｃｍ３の範囲内に入る。スクロース密度勾配遠心分離によると、様々な条件下で調製されたジェノスフェアーズは、１.０２５〜１.０５５ｇ／ｍＬの領域に浮遊密度に相当する一本の鋭いバンドを示したが、一方、従来技術が教示する核酸−脂質粒子は、一般に浮遊密度の分布が広く、粒子内の脂質含量の不均一性を明らかに示し、分画遠心分離によるさらなる精製を必要とする(米国特許第５,９７２,６００号公報；Xu et al., Biophys. J. 77: 341-353 (1999))。それに対して、ジェノスフェアーズの均一な浮遊密度は粒子内の脂質と核酸含量の均一性を明らかに示し、より良好な製造制御と標準化という利点を示す。
【００５１】
７．細胞標的リガンドとの会合
本発明により製造されたジェノスフェアーは、それと関連してジェノスフェアーが細胞に入るのを容易にするリガンド、すなわち、細胞特異的リガンドをも任意に含んでいる。該リガンドは化学的部分、例えば、分子、官能基、またはそのフラグメントであり、選択細胞と特異的に反応する一方、他の細胞とはあまり反応せず、ジェノスフェアーに、ＮＡＣ、例えば、核酸を選択細胞に選択的に移入するという利点を与える。“反応する”ということは、細胞または組織に結合親和性を有するということ、または細胞内に取込み得ることを意味し、その場合の結合親和性は技術上の既知手段、例えば、ＥＬＩＳＡなどの標準的インビトロアッセイ法、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、表面プラスモン共鳴などにより検出可能である。通常、リガンドは特定の分子部分(分子、官能基、または細胞もしくは組織と会合した分子複合体などのエピトープ)に結合して二者の結合対を形成する。結合対において、いずれか一方がリガンドであり、他方がエピトープであり得ることも認められる。かかる結合対は技術上既知である。代表的な結合対は、抗体−抗原、ホルモン−レセプター、酵素−基質、栄養(例えば、ビタミン)−輸送タンパク質、増殖因子−増殖因子レセプター、炭水化物−レクチン、および相補性配列を有する２つのポリヌクレオチドである。リガンドのフラグメントはリガンドと見なされ、そのフラグメントが適切な細胞表面エピトープに結合する能力を保持する限り、本発明に使用し得る。好ましくは、リガンドは免疫グロブリンの抗原結合配列を含んでなるタンパク質またはペプチドである。より好ましくは、リガンドはＦｃ配列を欠く抗原結合抗体フラグメントである。かかる好適なリガンドは免疫グロブリンのＦabフラグメント、免疫グロブリンのＦ(ab)２フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント、または一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントなどである。これらのフラグメントは酵素により誘導するか、または組換えにより生成させる。その機能的側面において、リガンドは好ましくは内部組込み可能なリガンドである；すなわち、例えば、エンドサイトーシスの過程によって、選択細胞が内部に取込むリガンドである。同様に、置換またはその他の変更を含むが、エピトープ結合能を保持するリガンドは使用し得る。リガンドは病因となる細胞、例えば、悪性細胞または感染因子を認識するように有利に選択する。細胞表面のエピトープに結合するリガンドが好ましい。特に好適な一群のリガンドは、多くの腫瘍でその細胞表面に過剰発現するチロシンキナーゼ増殖因子レセプターと結合対を形成するリガンドである。代表的なチロシンキナーゼ増殖因子は、ＶＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、ＩＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、ＴＧＦ−αレセプター、ＴＧＦ−βレセプター、ＨＢ−ＥＧＦレセプター、ＥrbＢ２レセプター、ＥrbＢ３レセプター、およびＥrbＢ４レセプターである。ジェノスフェアーズを用いて癌の処置を行うような場合、ＥＧＦレセプターvIIIおよびＥrbＢ２(ＨＥr２)レセプターが特に好適である；その理由は、これらのレセプターが悪性細胞により特異的でありながら、正常細胞には殆ど特異性がないからである。あるいは、リガンドは遺伝的訂正、または有益な遺���子導入による遺伝的変更を必要とする細胞、例えば、肝細胞、上皮細胞、遺伝的に不全の臓器における内分泌細胞、インビトロ胎児細胞、生細胞、幹細胞、生殖細胞、ハイブリッド細胞、または工業プロセスで使用する細胞などを認識するように選択する。
【００５２】
リガンドは技術上利用し得る何らかの適切な方法でジェノスフェアーに付着していてもよい。付着は吸着または複合体形成によるなどの共有または非共有結合でよい。付着は、好ましくは、リガンドに接合し得る親油性の分子部分が関与し、共有結合または非共有結合を形成する；これを“アンカー”という。アンカーは脂質ミセル、二層、および他の凝縮相などの親油性環境に親和性を有し、それによって脂質−核酸微粒子にリガンドを付着させる。親油性アンカーを介してリガンドを付着させる方法は技術上既知である(参照例：F. Schuber, “Chemistry of ligand-coupling to liposome”, in: Liposomes as Tools for Basic Research and Industry (“リポソームに対するリガンド結合の化学”、基礎研究および産業用ツールとしてのリポソーム)、ed. by J.R. Philippot and F. Schuber, CRC Press, Boca Raton, 1995, p.21-37)。一般に、リガンド接合を提供するために有効な一定量の親油性アンカーは、ジェノスフェアー形成に先立ち、またはその間に、ＰＦＣ、例えば、脂質に含ませる。あるいは、アンカーとリガンドの接合体を先ず形成させ、次いでジェノスフェアー形成前に脂質に添加してジェノスフェアーズに取込ませるか、またはジェノスフェアーの形成後にジェノスフェアーズの水性懸濁液に接合体を添加することにより取込ませる。リガンドをジェノスフェアーズに付着させる特に適切な方式は、中間親水性ポリマーリンカーを介して親油性アンカーに接合したリガンドを使用することによる。従って、リガンドはジェノスフェアー表面上を自由に移動し、細胞表面の接近困難なエピトープとさえ反応し得る。親水性ポリマー中間リンカーを介して親油性アンカーに接合したリガンドは、水性媒体中、接合リガンドとジェノスフェアーズの同時インキュベーションに際して形成した本発明の核酸−脂質ジェノスフェアーズと有利に安定に会合することになる(米国特許第６,２１０,７０７号公報)。
【００５３】
８．形質導入増強成分
ジェノスフェアーズはさらに細胞に形質導入する機能にとって有益な他の成分を含んでいてもよい。これらは形質導入増強成分、すなわち、外来性ＮＡＣを生細胞に送達するのを改善するジェノスフェアーズと会合した因子とみなすことができる。これら有益な形質導入増強成分は、制限するものではないが、エンドソーム逸脱剤(参照例：Drummond et al., Progress in Lipid Research, 2000, vol.39, p.409-60; Kichler et al., Bioconjugate Chem., 1997, vol.8, p.213-221; Lee and Huang, J. Biol. Chem., 1996, vol.271, p.8481-8487)、核移行因子(参照例： Antopolsky et al., Bioconjugate Chem., 1999, vol.10, p.598-606; Branden et al., Nature Biotechnology, 1999, vol.17, p.784-787; Pouton, Adv. Drug. Del. Rev., 1998, vol.34, p.51-64; Sebestyen et al., Nature Biotechnology, 1998, vol.16, p.80-85; Zanta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, vol.96, p.91-96)、細胞質ゾルへの移行を高める誘発手段(参照例：Reddy and Low, J. Controlled Release, 2000, vol.64, p.27-37; Drummond and Daleke, Chem. Phys. Lipids 1995, vol.75, p.27-41; Kirpotin et al., FEBS Lett., 1996, vol.388, p.115-118; Thompson et al., Biochim. Biophys. Acta, 1996, vol.1279, p.25-34; Rui et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, v.120, p.11213-11218)、ｐＨ感受性化合物(参照例：Lee and Huang, J. Biol. Chem. 1996, vol.271, p.8481-8487; Leroux et al., J. Controlled Release, 2001, vol.72, p.71-84)、熱および放射線−引き金放出(例：Gaber et al., Pharm. Res., 1995, vol.12, p.1407-16; Gaber et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1996, vol.36, p.1177-1187; Kong et al., Cancer Res., 2000, vol.60, p.6950-6957; Needham and Dewhirst, Adv. Drug Delivery. Rev., 2001, vol.53, p.285-305; Yatvin et al., Science 1978, vol.202, p.1290-3; Saalman et al., Biochim. Biophys. Acta, 1991, vol.1064, p.124-130)および膜融合増強または膜融合誘導化合物などの膜融合プロモーター(参照例：Glushakova et al., Biochim. Biophys. Acta, 1992, vol.1110, p.202-208; Kichler et al., Bioconjugate. Chem. 1997, vol.8, p.213-221; Simoes et al., Gene Therapy, 1999, vol.6, p.1798-1807; Wagner, Adv. Drug Delivery Rev., 1999, vol.38, p279-289)、細胞内核酸放出−増強または−誘発成分、転写因子、およびプロモーター−変調化合物(参照例：Kaiser and Toborek, J. Vascular Res., 2001, vol.38, p.133-43; Jain and Gewirtz, J. Mol. Medicine, 1998, vol.76, p.709-714)などである。かかる有益な成分の例および使用方式は、上に引用した科学刊行物に記載があり、また遺伝子および核酸の細胞送達技術において既知である。
【００５４】
９．親水性ポリマー使用による表面修飾
ジェノスフェアーズは選択肢として凝集に対してジェノスフェアーズをさらに安定化するために有効な量の両親媒性脂質をも含む。両親媒性脂質は好ましくは親水性ポリマー−脂質接合体、より好ましくはポリ(エチレングリコール)−脂質接合体である。ポリ(エチレングリコール)−脂質接合体は好ましくは、リン脂質、スフィンゴ脂質、ジアシルグリセロール、またはステロールのポリ(エチレングリコール)接合体である。該接合体のポリ(エチレングリコール)部分は、分子量が２５０〜２０,０００、好ましくは５００〜１０,０００、より好ましくは１,０００〜５,０００である。両親媒性脂質の凝集防止量はジェノスフェアーのＰＦＣ含量の５モル％未満、一般には１モル％未満であり、好ましくはジェノスフェアーの脂質含量の０.０５モル％と０.５モル％の間である。また、有効な両親媒性脂質は、脂肪アルコールのポリオキシエチレンエーテルまたは脂肪酸のポリオキシエチレンエステルであり、その量は総脂質の１０モル％未満、一般的には５モル％未満である。かかる脂肪アルコール／脂肪酸ポリオキシエチレン化合物の例は界面活性剤(tenzides)であり、それらは商品名、トゥイーン２０(モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン)、トゥイーン８０(モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン)、トゥイーン６０(モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン)、およびＢＲＩＪ−３５(ポリオキシエチレン(２３)モノラウリルエーテル)である。両親媒性脂質は脂質溶液または核酸様化合物溶液に加え、次いでそれらを組合わせる；あるいは、好適な方法において、両親媒性脂質は、ＮＡＣおよびＰＦＣを含有する有機−水性単相から有機溶媒を除去する前または後に形成したジェノスフェアーズに加え、かかる脂質がジェノスフェアーズの表面脂質層に“アンカー”結合するか、または脂質層と組み合わさるために十分な時間インキュベートする。驚くべきことに、０.２５モル％という低い量で両親媒性脂質を添加すると、フィルターの無菌化を経てジェノスフェアーズの通過が劇的に改善され、ジェノスフェアーズを用いる医薬の工業的規模拡大と生産を著しく向上させる。
【００５５】
ジェノスフェアーズの薬物動態性の改善、例えば、それらの血液循環時間の延長などの必要性が生じた場合、両親媒性脂質をこの目的のためにジェノスフェアーの組成物に包含させることができる。この場合、両親媒性脂質、好ましくはポリ(エチレングリコール)−脂質などの親水性ポリマー−脂質接合体の量は、総ＰＦＣの１モル％を超える量、より好ましくは総ＰＦＣの１モル％ないし２０モル％、最適にはジェノスフェアーの総ＰＦＣの３モル％ないし１０モル％である。ジェノスフェアー上の表面付着ポリマーの量が形質導入活性を妨害する場合、放出可能なポリマー部分をもつポリマー−脂質接合体を使用する(Zalipsky and Gabizon, 米国特許第６,３６５,１７９号公報；Zalipsky, 米国特許第６,３４２,２４４号公報)か、またはインビボでジェノスフェアーから解離し得る接合体(Semple et al., 米国特許第６,２８７,５９１号公報；Holland et al., 米国特許第５,８８５,６１３号公報)を使用し得る。両親媒性の循環延長脂質は、例えば、分子量５００未満のオリゴ(エチレングリコール)部分をもつ、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、またはジアシルグリセロールのオリゴ(エチレングリコール)誘導体などのオリゴ(オキシアルキレン)脂質誘導体である。この場合、より長い循環時間を達成するために、かかる脂質のモル比は全脂質含量に基づき２０モル％を超える量である。両親媒性ポリマー−脂質接合体の循環を引き延ばす性質は技術上既知である。循環延長脂質のもう一つの例はオリゴ−グリセロール脂質誘導体、ホスファチジルグリセロール、糖リン脂質、およびホスファチジルイノシトールである。
【００５６】
１０．電荷変更脂質の使用
カチオン性脂質およびポリマーなどのカチオン性粒子形成成分は、核酸との形質導入活性複合体を有利に形成する。しかし、かかる複合体の薬物動態性質は、血液または血漿に典型的な略中性のｐＨでカチオンに荷電するため、しばしば貧弱であり、従って、これら複合体の被験者に対する系統的投与の有効性が減少する。この欠点を克服する一つの方法は、電荷変更脂質などの電荷変更粒子形成成分をジェノスフェアーに含ませることである。電荷変更脂質はイオン電荷がその分子環境の変化とともに変化するイオン化可能な脂質である。
【００５７】
既知型の電荷変更脂質は滴定可能な脂質である。滴定可能な脂質は、ｐＨ３〜１０の範囲の変化、一般的には４〜９の生理的範囲での変化とともにそのイオン電荷の値を変化させる。滴定可能な脂質はカチオン性でもアニオン性でもよい。カチオン性の滴定可能な脂質は低ｐＨでその正電荷を増加させ、中性または高ｐＨで低下させる。カチオン性の滴定可能な脂質は、一級、二級、または三級の親油性アミン(１,２−ジオレオイルオキシ−３−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロパン(ＤＯＤＡＰ)、１,２−ジミリストイルオキシ−３−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロパン(ＤＭＤＡＰ)、１,２−ジステアロイルオキシ−３−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロパン(ＤＳＤＡＰ)、ステアリルアミン、ジメチルアミノプロピルカルバモイル−コレステロール(ＤＣ−Ｃhol)および親油性イミダゾール誘導体である(Solodin et al., Biochemistry, 34: 13537-13544 (1995))。アニオン性の滴定可能な脂質は低ｐＨでその負電荷を低下させ、中性または高ｐＨで増加させる。アニオン性の滴定可能な脂質の例は、脂肪酸、二酸ジアシルグリセロールエステル(３−スクシニル−１,２−(Ｃ１２−Ｃ１８)−ジアシルグリセロール、３−グルタリル−１,２−(Ｃ１２−Ｃ１８)−ジアシルグリセロール)、ニ酸コレステリルエステル(コレステリルヘミコハク酸エステル)、Ｎ−グルタリル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニル−ホスファチジルエタノールアミン、および両親媒性(チオ)ラクトン(Ｎ−(Ｃ１２−Ｃ１８)−アシルホモシステインチオラクトン)などである。特に有用なアニオン性の滴定可能な脂質は１,２−ジオレオイルグリセリル−３−ヘミコハク酸エステル(ＤＯＧＨＥＭＳ)およびコレステリル−３−ヘミコハク酸エステル(ＣＨＥＭＳ)ならびにそれらのグルタリル類似体である。血液循環(ｐＨ７.２〜７.４)にある場合、かかる脂質を含有するジェノスフェアーズのイオン電荷が中性または陰性であることが、血中におけるより高い持続性と腫瘍などの疾患組織への分布にとって好ましい；細胞が巻き込んでいる場合には、細胞性エンドソームが酸性化環境であるため(ｐＨ５.０〜６.５)、電荷は細胞原形質への核酸の侵入を好むより陽性となる。カチオン性の滴定可能な脂質はジェノスフェアーズの全カチオン性脂質の１００モル％まで、好ましくは５０モル％を構成し得る。アニオン性の滴定可能な脂質はカチオン性ポリマーまたは脂質のモル量よりも少ないモル量で存在し、好ましくは、核酸電荷に対し過剰なカチオン性脂質電荷を中和するために必要な量に等しいか、またはそれよりも多い量で存在する。滴定不可のカチオン性脂質と滴定可能なアニオン性脂質との組合せは、ジェノスフェアーズのＰＦＣ中、滴定可能なカチオン性脂質を使用したときのように、電荷変更の性質を賦与する上で同様に有効である。
【００５８】
１１．“ケージ”電荷変更脂質とポリマーの使用
滴定可能なカチオン性および／またはアニオン性脂質の使用が場合により本発明組成物において有利であるが、その使用は分子環境の変化に応答してイオン電荷が変化するという可逆的性質により、また電荷変更過程におけるｐＨ以外の因子の使用が可能ではないという事実により制限を受ける。従って、本発明によると、ある分類の両親媒性化合物、例えば、脂質およびポリマーは、形質導入すべき細胞内またはその周囲に存在する因子に応答して、中性の電荷からカチオン性電荷を、またはアニオン性電荷から中性電荷を、またはアニオン性電荷からカチオン性電荷を不可逆的に生じる性質をもつように導入される。これらの発明化合物は“ケージ”電荷変更化合物という。電荷変更の“不可逆的”特性は、電荷の変化がある因子に応答して起こった場合、当初の電荷はかかる因子が除かれても元に戻らないことを意味する。例えば、滴定可能なカチオン性脂質またはポリマーは、酸性ｐＨなどの電荷変更因子が中性に逆戻りした場合、そのカチオン形態から未変化形態へと逆戻りする；本発明による低ｐＨに感受性の“ケージ”カチオン性脂質はそうならない。これらの“ケージ”電荷変更化合物は取分けジェノスフェアーズなどの核酸送達システムでの使用に適しているが、さらに他の薬物送達システムおよび種々の生物工学的応用においても有用であり、
一般構造：Ａ−Ｘ−Ｂ
を有する。
【００５９】
ただし、式中、Ｘは例えば形質導入すべき細胞に、またはその周りに存在するような所望の生理学的または生物過程環境において不可逆的に解離し得る化学結合(“解離する”結合)である；Ａは当該結合Ｘの解離により、当該薬物送達システム内で会合したままでイオン電荷をもつ荷電産物を生成する分子部分である；また、ＢはＸの解離により当該薬物送達システムから解離する分子部分であって、その場合の当該残余産物のイオン電荷がＡ−Ｘ−Ｂ化合物それ自体よりもより陽性である分子部分である。
【００６０】
薬物送達システム内において、Ｘは薬物送達システムのイオン電荷の永続的変化が望ましい生理的環境の変化に応答して、または薬物送達システムのイオン電荷を変化させるように設計した外部刺激に基づき、解離する。かかる生理的環境の変化の例はｐＨの変化、例えば、細胞内のエンドソーム小胞の酸性化などの酸性化、または酵素、代謝産物、外来化合物などの作用、または触媒もしくは反応剤として作用し、結合Ｘの解離に影響する内在性もしくは外来性物理的因子(熱、電離放射線、光)の作用などである。酵素は例えば、加水分解酵素(エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ)、リパーゼ、オキシダーゼまたはレダクターゼなど、薬物を送達すべき細胞もしくは組織に、またはその周りに存在するか、または核酸送達の面では該核酸を形質導入すべき細胞に、またはその周りに存在するものである。
【００６１】
Ｘは加水分解、脱離、酸化、または還元などの化学的過程により優先的に解離する。加水分解および脱離が好適である。かかる解離結合の好適なタイプは以下の例示のとおりである：
【表１】
2010094128.tif 000002
【００６２】
解離する結合Ｘは共有結合でも非共有結合でもよい。非共有解離可能結合Ｘは、組換えタンパク質精製のためにアフィニティクロマトグラフィーにおいて既知のニトリロトリアセテート−ニッケル(II)−オリゴ(ヒスチジン)などの金属イオンキレートである。金属イオンキレート結合のもう一つの例は、白金などの遷移金属(II)のビス−アンミノ−ビス−カルボン酸複合体である。かかる結合はＥＤＴＡまたはＤＴＰＡなどの強力なキレート化剤との交換反応により、一般的には１ｍＭ以下の濃度で解離する。解離する非共有結合のもう一つの例はｐＨの変化に応答して解離するオキサゾール−ヒドロキシフェニルヒドロキサム酸複合体である。
【００６３】
核酸送達との関わりにおいて、Ａは一般に結合Ｘを適応させるためのさらなる機能性をもつカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーである。技術上既知のカチオン性脂質はＡを基礎として使用することができる。取分け適切なのは１個を超えるカチオン性基をもち、そのカチオン基の１個のみが反応してＡ−Ｘ−Ｂ構築物を形成するカチオン性脂質である。この分子は中性ないし弱アルカリ性ｐＨ(ｐＨ＞７.０)の水性媒体において比較的安定であるが、細胞によるエンドサイトーシスを受けた場合、エンドソームの酸性環境において、急速に加水分解され、２個の正荷電イオン性基をもつ当初のカチオン性脂質を再生する。Ｂは一般に官能基であり、親水性解離産物を生成し、好ましくはアニオン電荷を有する。従って、結合Ｘの解離に先立って、Ａ−Ｘ−ＢにおけるＡの全カチオン電荷は低下するか、またはＢのアニオン電荷と置換わる。結合Ｘの解離の後、Ｂが離脱し、そのアニオン電荷の効果を減じ、結果として、残った産物Ａのカチオン電荷を増大させる。例えば、１個のアミノ基と１個の四級アンモニウム基をもつカチオン性脂質において、該アミノ基は無水シトラコン酸(無水２−メチルマレイン酸)により便宜的に修飾して、シトラコン酸分子中の第二カルボン酸基の存在による全体として中性の電荷を有する“ケージ”カチオン性脂質を形成する。あるいは、Ｂはイオン電荷をもたないが、結合Ｘの解離により放出されたときに、アミノ基などのカチオン基を後に残す。それ故、結合Ｘ解離の結果としてＡのカチオン電荷が増加することは、Ａ−Ｘ−Ｂに予めカチオン性電荷が存在しなかった状況をも包含すると理解される。解離の不可逆的特性を確実なものとするために、Ｂは選択肢として自己犠牲的官能基、すなわち、さらに解離した後により小さなフラグメントに分解する官能基を含む。自己犠牲的化学基は技術上既知である。かかる基の例は、光感受性ＣＭＮＢおよびＮＶＯＣ基(上記)および加水分解感受性のアセトキシメチルエステル基である。
【００６４】
以下はＸ(“ケージ”カチオン性脂質)の解離によりカチオン性脂質または核酸結合カチオン性ポリマーを形成する典型的な構築物Ａ−Ｘ−Ｂである。
【００６５】
“ケージ”カチオン性脂質(Ｎα−シトラコニル)アルギニル−コレステロール。カチオン性脂質アルギニル−コレステロールは、コレステロールを化学当量のＮ(α)−tert−ブトキシカルボニル(ｔＢＯＣ)−Ｌ−アルギニンにより、ジメトキシエタン中、触媒としての等モル量の４−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)の存在下にエステル化し、次いで４Ｎ−ＨＣｌ／ジオキサン中、保護基を除去することにより調製する。ジオキサン除去後、アルギニル−コレステロールを２,６−ジアミノピリジンに溶解し、無水シトラコン酸と０〜４℃で一夜反応させる。(Ｎα−シトラコニル)アルギニル−コレステロールを反応混合物から、シリカゲル上、０.１％ジイソプロピルアミンの存在下に、クロロホルム中メタノールの上昇勾配によるカラムクロマトグラフィーにより精製する。この脂質は中性ｐＨにて生理的条件下に実効電荷０を有するが、細胞のエンドサイトーシス小胞内などの緩和な酸性媒体(ｐＨ４.５〜５.５)中での加水分解により、カチオン性アルギニル−コレステロール(実効電荷、２＋)を可逆的に生成する。
【００６６】
“ケージ”カチオン性脂質１,２−ジオレオイル−３−(Ｎα−シトラコニル)アルギニル−グリセロール。カチオン性脂質１,２−ジオレオイル−３−アルギニル−グリセロールは、１,２−ジオレオイルグリセロール(ジオレイン)およびｔＢＯＣ−アルギニンから調製し、上記同様無水シトラコン酸により修飾する。得られる脂質１,２−ジオレオイル３−(Ｎα−シトラコニル)アルギニル−グリセロールは中性ｐＨにて生理的条件下に実効電荷０を有するが、ｐＨ４.５〜５.５の緩和な酸性条件下での加水分解によりジ−カチオン性脂質１,２−ジオレオイル３−アルギニル−グリセロール(実効イオン電荷２＋)を不可逆的に生じる。同様に、１位および２位に他の脂肪酸残基をもつＮ(α)−シトラコニル−アルギニル−１,２−ジアシルグリセロール類が調製される。
【００６７】
“ケージ”カチオン性脂質１,２−ジアシルオキシ−３−シトラコニルアミノ−プロパン。１,２−ジ(Ｃ１０−Ｃ１８)アシルオキシ−３−アミノ−プロパンを無水２,６−ジアミノピリジン中、過剰の無水シトラコン酸と４〜６℃で一夜インキュベートする。アミド産物を０.１％ジイソプロピルアミン含有クロロホルム中メタノールの上昇勾配によりシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより単離する。この脂質は生理的条件において中性ｐＨの下で実効電荷−１(アニオン性)であるが、細胞性エンドソームおよび／またはリソソームにおけるように、緩和な酸性ｐＨ、例えば、ｐＨ４.５〜５.５に接触した場合、不可逆的にカチオン性脂質１,２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン(実効イオン電荷＋１)を形成する。
【００６８】
“ケージ”カチオン性脂質１,２−ジオレイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−(２−(Ｎ’−シトラコニルアミノ)エチル)アンモニオ−プロパンは、ジカチオン性脂質１,２−ジオレイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−(２−アミノエチル)アンモニオ−プロパンから同様の条件下でのシトラコニル化により調製する。この中性脂質(中性ｐＨの生理条件下に実効電荷０)は緩和な酸性ｐＨ、例えば、ｐＨ４.５〜５.５での加水分解により、ジカチオン性の１,２−ジオレイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−(２−アミノエチル)アンモニオ−プロパンに不可逆的に戻る。
【００６９】
“ケージ”カチオン性脂質１,２−ジミリストイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−(２−ホスホリルオキシ)エチル)アンモニオ−プロパン。１,２−ジミリストイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−(２−ヒドロキシエチル))アンモニオ−プロパンを無水ピリジン中、過剰のオキシ塩化リンと室温で一夜反応させる。反応混合物を氷で冷やし、水で処理し、脂質を塩化メチレンで抽出し、求める化合物はクロロホルム中メタノールの上昇勾配によるシリカゲル上のクロマトグラフィーにより単離する。この脂質は実効電荷が中性のｐＨでマイナス１であるが、細胞リソソームに存在する酵素など、ホスファターゼ酵素の作用により、カチオン性の形質導入増強脂質、１,２−ジミリストイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−(２−ヒドロキシエチル))アンモニオ−プロパンに戻る。
【００７０】
“ケージ”カチオン性脂質１,２−ジミリストイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−(２−ジチオカルボニルオキシ)エチル)アンモニオ−プロパン。１,２−ジオレイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−(２−ヒドロキシエチル))アンモニオ−プロパンを過剰の二硫化炭素と微細に磨砕した水酸化ナトリウムとともに無水テトラヒドロフラン中、室温で４時間撹拌する。反応混合物を水−氷混合物に注入し、塩化メチレンで抽出する。抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、求める化合物はクロロホルム中メタノールの上昇勾配によるシリカゲル上のクロマトグラフィーにより単離する。この脂質は実効電荷が中性のｐＨでゼロであるが、脱離反応によりそのジチオカーボネート(キサントゲン酸エステル)を失い、細胞性エンドソームおよび／またはリソソームに存在する低ｐＨ(例えば、ｐＨ４.５〜５.５)に接触したとき、カチオン性の形質導入増強脂質、１,２−ジオレイルオキシ−３−(Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−(２−ヒドロキシエチル))アンモニオ−プロパンに戻る。
【００７１】
同じ代表的な合成方法が、ハロゲン化・Ｎ,Ｎ−ジ(Ｃ１２−Ｃ１８)−アルキル−Ｎ−メチル−Ｎ−(ヒドロキシアルキル)アンモニウムおよびハロゲン化・Ｎ,Ｎ−ジ(Ｃ１２−Ｃ１８)−アルキル−Ｎ−メチル−Ｎ−(アミノアルキル)アンモニウムなどの親となる四級アンモニウム化合物から、上記の方法によりこれらの化合物のヒドロキシ基またはアミノ基の修飾により、“ケージ”カチオン性脂質を調製するために採用し得る。これらの親化合物は技術上形質導入増強脂質であることが知られている(米国特許第６,３３３,４３３号公報；米国特許第５,９９４,３１７号公報)。
【００７２】
同様に、“ケージ”カチオン性ポリマーは、アミノ基含有カチオン性ポリマーから、ピリジン中、無水シトラコ酸との反応により調製され、ジェノスフェアーズなどの形質導入増強組成物を製造するために使用する。
【００７３】
本明細書に記載の“ケージ”電荷変更化合物は、いずれかの送達システム、特に、核酸送達システムに使用でき、通常カチオン性脂質および／またはポリマーを含んでなり、その場合、脂質またはポリマーの一部または全部が“ケージ”電荷変更脂質またはポリマーである。ジェノスフェアーズにおいて、全体として中性またはアニオン性電荷を有する“ケージ”電荷変更脂質は、小胞形成非カチオン性脂質の一部または全部と置換わる；もし“ケージ”電荷変更脂質の全体の電荷が陽性であるなら、それはジェノスフェアーのカチオン性脂質含量の一部またはすべてに置換わり得る。それ故、標的の細胞または組織、すなわち、形質導入すべき細胞を含む細胞または組織に到達するまで、被験者に投与したジェノスフェアーは正電荷の低レベルを維持し、血漿タンパク質との不安定化相互作用および身体からの非特異的食作用クリアランスを低下させる。電荷変更因子(例えば、細胞内エンドソームまたはリソソームコンパートメントの酸性ｐＨ)が存在する標的細胞に到達することにより、または標的組織の細胞外に存在する組織酵素の作用により、かかるジェノスフェアーにおける形質導入増強化イオン性脂質の量が有利に増加する。
【００７４】
１２．ジェノスフェアーズの剤形と投与
被験者に投与するか、または細胞に適用するために、本発明のジェノスフェアーズは生物適合液状媒体、より好ましくは水溶液中で有利に製剤化し得る。その機能との関係で、媒体は好ましくは薬理学的に許容し得る媒体である。かかる薬理学的に許容し得る媒体は当業者既知である。かかる剤形は技術上既知の様々な方法で達成し得る。かかる方法の例は、制限されるものではないが、透析、限外濾過、接線フロー濾過、およびゲルクロマトグラフィーである。
【００７５】
より良好な保存のために、製造した組成物はディープフリーズするか、または凍結乾燥し得る。この場合、該組成物は凍結保存剤、例えば、糖、ポリオール、または親水性ポリマーを含んでいることが好ましい。適当な凍結保存剤は、制限されるものではないが、グルコース、スクロース、トレハロース、マルトース、マンノース、ラクトース、マンニトール、グリセロール、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリアクリルアミド(ＰＡＡ)、フィコール(FICOLL)(架橋スクロースポリマー)、デキストラン、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールである。本発明のジェノスフェアーズは形質導入剤として活性を保ち、凍乾品から再構成しても凝集することがないことは、予想外の発見であった。
【００７６】
ジェノスフェアーズは技術上既知の如何なる方法でも細胞に投与することができる。インビトロの過程では、ジェノスフェアーズは一般に核酸を送達すべき細胞を含む培養物に加える。ジェノスフェアーズの細胞侵入はポリ(エチレングリコール)などの一定の膜活性化合物の投与により、または放電などの物理的刺激により介助し得る。患者の身体などの生体への投与のために、例えば、医療を目的として、ジェノスフェアーズは非経口注射により、例えば、静脈内、動脈内に、あるいは封じ込まれた体腔に、皮膚または外部と繋がる体腔に局所的に、または経口的に投与することができる。かかる投与用の剤形は当業者既知である。核酸分解酵素に対抗するためにジェノスフェアーズが提供する保護のお陰で経口投与が可能である。結果として、ジェノスフェアーズは腸内リンパ球様構造、例えば、パイエル板および腸間膜リンパ節などに入ると思われ、そこでＤＮＡワクチンとして作用し、ジェノスフェアー皮膜が包み込むＤＮＡがエンコードするタンパク質に対し免疫応答を誘発する。
【００７７】
１３．可溶化核酸縮合非イオン性物質の使用
開示された方法では、粒子形成剤の分子および／またはミセル溶解に作用する水混和性有機溶媒を用いてジェノスフェアーを製造すると記載しているが、場合によっては、高水溶性の一定の非カチオン性物質が有機溶媒の代わりに、あるいはそれに加えて使用し得ることを特記する。有利なことに、かかる非カチオン性溶解化物質は、核酸分子の凝縮にも作用する。好ましくは、かかる非カチオン性溶解化物質は、実質的に分子として溶解する濃度で存在するが、粒子形成剤、例えば、脂質をミセルまたは分子の形態に溶解するのにも効果がある。この可溶化物質が界面活性剤である必要はない、すなわち、それ自体が主体的にミセルとして溶解する必要はない。従って、本発明はかかる非カチオン性可溶化物質の水溶液を用いてジェノスフェアーズを製造する方法を提供する。該方法は、(ｉ)核酸と粒子形成剤とを非カチオン性可溶化物質の水溶液中で組合わせる工程であって、当該粒子形成成分をミセルまたは分子の形態に可溶化する工程、および選択肢として(ii)核酸含有粒子を形成させるために当該可溶化物質の量を低減させる工程からなる。粒子形成成分は脂質、粒子形成ポリマー、または両者の組合せを含んでなる。一般に、核酸と粒子形成剤は重量で約１％ないし約９０％の可溶化物質含有溶液中、より好ましくは約５％ないし約８０％の可溶化物質、最も好ましくは約５％ないし約６０％の可溶化物質含有溶液中で組合わせる。かかる可溶化非カチオン性物質は、例えば、親水性ポリマーまたはポリオールである。好適な親水性ポリマーは、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリルアミド)、ポリビニルアルコール、デキストランおよびその他のポリ(無水ヘキソース)、そのコポリマー、またはその誘導体である。好適なポリオールは糖(スクロース、フルクトース、ラクトース)、固体ポリアルコール(エリスリトール、トレイトール、ソルビトール、マンニトール、グルシトール)およびその誘導体である。親水性ポリマーは一般に分子量範囲が４００ないし２,０００,０００のものである。特に好適な非カチオン性核酸縮合親水性ポリマーの一つはポリ(エチレングリコール)である。ポリ(エチレングリコール)は核酸に縮合し、かつ水溶液中、脂質などの疎水性化合物を可溶化することが知られている(Lerman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 68: 1886-1890; Louie and Server, J. Mol. Biol. 242: 547-558 (1994))。分子量約２００ないし約２,０００,０００のポリ(エチレングリコール)が適当であるが、４００〜２０,０００の範囲が好適である。
【００７８】
非カチオン性可溶化物質により本発明のジェノスフェアーズを製造するためには、本明細書に記載の方法と同じ方法を用い、非カチオン性可溶化物質、例えば、親水性ポリマーまたはポリオールを、水混和性有機溶媒のすべてまたは一部と置き換える。核酸と粒子形成剤との組合せの後、非カチオン性可溶化物質の量を低減するためには、透析、限外濾過、またはサイズ排除に基づく方法が好適である。得られたジェノスフェアーズは本明細書の前セクションに記載したように製剤化し、利用する。
【００７９】
１４．脂質封入核タンパク質とウイルスの作製
本発明は全体または部分的に集合したウイルス粒子などの核タンパク質の脂質二層包膜に適用し得る。ウイルスは自然に適応するが、核酸をその宿主細胞に形質導入するための効率の高いベクターである医療遺伝子送達ベクターとしてのウイルスは、身体の免疫反応により妨害されて、身体の酵素による分解を受けるため、ウイルスが本来親和性を有する細胞に限られてしまう。これらの欠点は、もしウイルスが、例えば、被験者の身体環境からウイルスを遮断する脂質二層に取り込まれているならば克服することができる。ウイルスを脂質二層に皮膜保護する方法は技術上既知である。その方法は脂質二層封入小胞(リポソーム)への受動的取り込み、およびビリオンとリポソームのインキュベーションである(米国特許第５,９６２,４２９号公報；Fasbender et al., J. Biol. Chem. 272: 6479-6489; Hodgson and Solaiman, Nature Biotechnology 14: 339-342 (1996))。本発明の有機−水性単相を使用するジェノスフェアーの製剤化法は、所望の組成物の１つ以上の脂質二層にビリオン(ウイルス)を高収率、高効率に取り込ませるのに適している。理論に制限されずに、我々はビリオンの表面と接触した酸性タンパク質が、ジェノスフェアーのカチオン性脂質／カチオン性ポリマー成分との錯体形成に適しており、中性脂質成分による二層形成のための“骨格”として作用する。典型的なタイプのウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、およびバクテリオファージである。ジェノスフェアーの皮膜形成にとって好適な分類のウイルスはアデノウイルスとアデノ関連ウイルスである。ジェノスフェアー製剤化の上記技法はすべて一般的にウイルスの皮膜形成に適しており、ウイルスは核酸に置き換えられる。ビリオンのサイズは一般に核酸分子のサイズよりも大きいので、ウイルス皮膜内取り込みジェノスフェアー中の脂質量はウイルス表面上、１個のみないし２〜３個を収容するように削減する。熟練した技術者は既知の参考文献に一覧表となっている脂質分子あたりの二層表面積に基づき、特定ビリオンの脂質量を容易に選択し得る(例えば、Marsh, Handbook of Lipid Bilayers(脂質二層ハンドブック))。取分け有利な点は、ビリオン皮膜形成のためにリガンド標的ジェノスフェアー法を使用することであるが、それによって天然のウイルス向性を特定の治療または他の応用が望まれるものに変えることができるからである。天然のウイルス向性を標的とするある種病因細胞に変えることが望ましいことは、技術的にも認識されている(参照例：米国特許第６,０６０,３１６号公報)。
【実施例】
【００８０】
実施例１
本実施例ではアルコールと水性溶媒の混合物中、溶媒−縮合核酸を用いてジェノスフェアーズを調製する方法について説明する。ＣＭＶ初期プロモーターの下にルシフェラーゼレポーター遺伝子をもつｐＵＣ−由来バクテリアプラスミドＤＮＡ(ｐＣＭＶＬuc、１００μｇ)をエタノールと５％デキストロース水溶液(容量で１：１、５００μｌ)に溶かし、５０℃に加熱した。カチオン性脂質(ＤＤＡＢ、６００ｎｍｏｌ)と中性脂質(ＰＯＰＣ、１.２μｍｏｌ、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６ｎｍｏｌ)をクロロホルム溶液中で混合し、ロータリーエバポレーションにより乾燥した。乾燥した脂質をエタノール(２５０μｌ)に溶かし、引き続き５％水性デキストロース(２５０μｌ)と混合した。エタノール：５％水性デキストロース(１：１)の脂質溶液を次いで５０℃に加熱し、ＤＮＡ溶液を脂質溶液に迅速に注入し、数秒間の迅速なピペット処理により混合した。この方法ではエタノールと水の単相中に脂質−ＤＮＡ複合体を調製する。次いで、エタノールをロータリーエバポレーションまたは脱イオン化蒸留水に対する透析により除去した。得られた粒子はピコ−グリーン(Pico-Green)ＤＮＡ色素(モレキュラー・プローブス・インク(Molecular Probes, Inc.))を使用する色素接触性アッセイによると＞９５％のＤＮＡを含み、サイズ分布(動的光散乱により定量)は直径１２０〜３５０ｎｍの範囲である。
【００８１】
実施例２
本実施例では実施例１記載の方法の変法について説明するが、この場合、縮合ＤＮＡはカチオン性脂質の乾燥薄膜に加え、次いで、中性脂質で被覆する。この方法では、ｐＣＭＶＬucプラスミドＤＮＡ(１００μｇ)をエタノールと５％デキストロース水溶液(容量で１：１、１ｍｌ)の混合物に溶解し、５５℃に加熱した。クロロホルムに溶かしたカチオン性脂質(ＤＤＡＢ、１００μｇ)をガラスバイアルの底でロータリーエバポレーションにより乾燥した。次いで、ＤＮＡの単相溶液を乾燥したカチオン性脂質相に加え、脂質が溶液に移行し、ＤＮＡと組合わさって、目視で凝集塊の兆候のないカチオン性脂質−ＤＮＡ複合体を形成した。第二のバイアルには、中性脂質(ＰＯＰＣ：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１.２μｍｏｌ、およびＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６ｎｍｏｌ)をロータリーエバポレーションにより有機溶液から薄膜として沈殿させた。エタノール：５％デキストロース単相(１ｍｌ)中のカチオン性脂質−ＤＮＡ複合体を、次いで、乾燥した中性脂質を容れた容器に注入し、５５℃で撹拌して中性脂質を溶液に移行させた。次いで、ロータリーエバポレーションにより、または脱イオン水に対する透析によりエタノールを除去した。得られた粒子はサイズ分布が７５〜２５０ｎｍの範囲であった。
【００８２】
実施例３
本実施例ではスクロース密度勾配によるジェノスフェアーズの単離方法について説明する。５ｍｌの透明遠沈管(１３×５１ｍｍ)に１５％スクロース溶液(３.５ｍｌ)を容れ、次いで、凍結融解を交互に６回以上繰り返して、連続スクロース密度勾配(０〜３０％スクロース、１〜１.１２７ｇ／ｍｌ)を形成した。該複合体を勾配の最上部に層にして載せ、ベックマン(Beckman)ＳＷ５０.１スイングバケット・ローターにより、４℃にて４〜１６時間、２１２,０００×ｇで遠心分離した。遊離の脂質を勾配の最上部から抽出し、ＤＮＡを底部から、また該複合体を１.０４および１.０６ｇ／ｍＬの間、一般的には１.０４６と１.０５５ｇ／ｍＬの間の密度に対応するシャープなバンドから回収した。
【００８３】
実施例４
カチオン性脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズを実施例１に従い調製した；ただし、ＤＤＡＢは以下のカチオン性脂質に置換えた：塩化１,２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモノ−プロパン(ＤＯＴＡＰ)；１,２−ジオレオイル−sn−３−グリセロ(エチルホスホリル)コリン(ＤＯＥＰＣ)；１,２−ジミリストイル−sn−３−グリセロ(エチルホスホリル)コリン(ＤＭＥＰＣ)；１−パルミトイル−２−オレオイル−３−グリセロ(エチルホスホリル)コリン(ＰＯＥＰＣ)；１,２−ジステアロイル−３−グリセロ(エチルホスホリル)コリン(ＤＳＥＰＣ)；Ｎ−アルギニル−１,２−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(Ａrg−ＤＯＰＥ)。得られるＤＮＡ−脂質粒子は実施例１のものと同じ特性を有していた。
【００８４】
実施例５
カチオン性脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズを実施例２に従い調製した；ただし、ＤＤＡＢはＮ−アルギニル−１,２−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(Ａrg−ＤＯＰＥ)に置換えた。得られるＤＮＡ−脂質粒子は実施例２のものと同じ特性を有していた。
【００８５】
実施例６
カチオン性脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズを実施例２に従い調製した；ただし、コレステロールイミダゾール誘導体(ＣＨＩＭ)を中性脂質成分に添加し、その際の比率(プラスミドＤＮＡ１マイクログラムあたり)は以下のとおりとした：ＤＤＡＢ、６００ｎｍｏｌ；ＰＯＰＣ、１５００ｎｍｏｌ；ＣＨＩＭ、１０００ｎｍｏｌ；ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６ｎｍｏｌ。得られるカチオン性脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズは実施例２のものと同じ特性を有していた。
【００８６】
実施例７
カチオン性脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズを実施例２に記載の方法により形成した；ただし、コレステロール(Ｃhol)は混合物の中性脂質成分としてＰＯＰＣに添加し、その際の比率(プラスミドＤＮＡ１マイクログラムあたり)は以下のとおりとした：ＤＤＡＢ、６００ｎｍｏｌ；ＰＯＰＣ、１５００ｎｍｏｌ；Ｃhol、１０００ｎｍｏｌ；ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６ｎｍｏｌ。得られるジェノスフェアーズは実施例２のものと同じ特性を有している。
【００８７】
実施例８
カチオン性脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズを実施例１に記載の方法により形成した；ただし、混合物の中性脂質成分としてＰＯＰＣの代わりに、１,２−ジパルミトイル−３−sn−ホスホコリン(ＤＰＰＣ)または１,２−ジステアロイル−３−sn−ホスホコリン(ＤＳＰＣ)を使用し、その際の比率(プラスミドＤＮＡ１マイクログラムあたり)は以下のとおりとした：ＤＤＡＢ、６００ｎｍｏｌ；ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ、１５００ｎｍｏｌ；Ｃhol、１０００ｎｍｏｌ；ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６ｎｍｏｌ。得られるジェノスフェアーズは実施例１のものと同じ特性を有している。
【００８８】
実施例９
脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズを実施例２に記載の方法により形成した；ただし、エタノールの代わりにジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、または第三級ブタノールを使用し、脂質−およびＤＮＡ−可溶化水性−有機単相を形成した。得られるジェノスフェアーズは実施例１のものと同じ特性を有している。
【００８９】
実施例１０
脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズを実施例１に記載の方法により形成した；ただし、水性−有機単相においてはエタノールはメタノールに置換えた。得られるジェノスフェアーズは実施例１のものと同じ特性を有している。
【００９０】
実施例１１
葉酸−ＰＥＣ−ＤＳＰＥ(全中性脂質の１モル％)を中性脂質混合物に取り込み、クロロホルムを除去することにより、葉酸標的脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズを実施例１に記載の方法により形成した。葉酸レセプター過剰発現ヒト鼻咽頭癌細胞(ＫＢ３１およびＫＢ８５細胞株、ＡＴＣＣ)における葉酸標的ジェノスフェアーズの形質導入効率は、非標的化ジェノスフェアーズよりも数倍大きかった。
【００９１】
実施例１２
ＨＥＲ２を標的とする脂質−ＤＮＡジェノスフェアーズは、高度に内部取込みさせた組換え抗−ＨＥＲ２一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントＦ５に末端付着させたＰＥＧ−ＤＳＰＥを取り込ませることにより形成した。Ｆ５−ＰＥＧ−ＤＳＰＥのミセル水溶液を、予め調製した非標的ジェノスフェアーズと５５℃で３０分間インキュベートした。非標的ジェノスフェアーズは実施例１記載どおりに調製した。ＨＥＲ２−標的化非標的ジェノスフェアーズのＨＥＲ２過剰発現ヒト乳癌細胞(ＳＫ−Ｂｒ−３、ＢＴ−４７４；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから)への形質導入効率は、非標的ジェノスフェアーズよりも３２倍大きかったが、ＨＥＲ２発現の低い細胞株(ＭＣＦ−７、ＡＴＣＣ)では、ＨＥＲ２標的および非標的化ジェノスフェアーズの形質導入効率は同じであった。
【００９２】
実施例１３
脂質−ＤＮＡジェノスフェアーズを実施例２記載の方法により形成したが、プラスミドＤＮＡの代わりに、１９塩基ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを入れた。得られる脂質−オリゴヌクレオチド粒子は実施例２のものと同じ特性を有していた。
【００９３】
実施例１４
１４Ｃ−スクロースによるジェノスフェアーズの水性スペースの定量。実施例２に記載の方法に従い、脂質−プラスミドＤＮＡジェノスフェアーズをプラスミドＤＮＡから形成し、蛍光脂質ローダミン−ＰＥを加えるとともに、ＤＮＡ１マイクログラムあたり、以下の脂質を含有させた。組成は：ＤＤＡＢ、６００ｎｍｏｌ；水素化ダイズホスファチジルコリン(ＨＳＰＣ)、１２００ｎｍｏｌ；ＰＥＧ(ＭＷ２,０００)−ＤＳＰＥ、６ｎｍｏｌ；Ｃhol、６００ｎｍｏｌ；蛍光標識脂質ローダミン−ＰＥ、１００ｎｍｏｌ。ジェノスフェアーズは水性スペースマーカーとしての１４Ｃ−標識スクロースの存在下に形成した。ジェノスフェアーズは４％アガロースゲル(セファロース４Ｂ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック)カラムのサイズ排除クロマトグラフィーにより溶液から分離し、ジェノスフェアーズの内部水性スペース内に取込まれたスクロースを放射活性の計測により定量し、内部水性スペースの容積を計算した。ジェノスフェアーズ内の内部水性スペースは、同様サイズの脂質小胞について幾何学的に計算した内部水性スペース理論値の１５〜２５％であった。
【００９４】
実施例１５
種々有機溶媒量でのジェノスフェアーズの形成。ＤＤＡＢ(１.２μｍｏｌ)、コレステロール(０.８μｍｏｌ)、ＰＯＰＣ(２.４μｍｏｌ)および蛍光カチオン性脂質ＤiＩＣ１８(３)(Ｎ,Ｎ−ビス−ヘキサデシル−インドカルボシアニン・二塩酸塩；モレキュラー・プローブス・インク、オレゴン、米国)(０.００４４μｍｏｌ)を第一容量(Ｖ１)の１００％エタノールに溶かしてＰＦＣ溶液を形成させた。プラスミドｐＣＭＶＬuc(０.２ｍｇ)を第二容量(Ｖ２)の５％水性デキストロースに溶解し、ＮＡＣ保存液を形成させた。ＮＡＣ溶液およびＰＦＣ溶液を５５℃で混合し、１０分間インキュベートした。混合物を室温とし、エタノールは再生セルロース膜(分子量カットオフ、１２〜１４,０００Ｄ)により１Ｌの１５０ｍＭ塩化ナトリウム／蒸留水に対する一夜透析により除去した。大きな沈殿物の塊があれば、一夜の重力沈降と傾斜により除去した。沈降しないＰＦＣ−ＮＡＣ微粒子を含む傾斜取得した液体は４〜６℃に１７日間保存した。傾斜サンプル中のＮＡＣ−ＰＦＣ粒径は、ガウスのサイズ分布分析による準弾性光散乱(ナイコンプ(Nicomp)Ｃ−３７０粒子径分析計)により決定した。沈降しない微粒子に取込まれたＮＡＣ量は、０.５％双性イオン界面活性剤、ツビッタージェント(ZWITTERGENT)３−１４(フルカ(Fluka)、米国)、５％ＤＭＳＯの存在下に該粒子を溶解して、蛍光色素結合アッセイ(ピコグリーン、モレキュラー・プローブス・インク、オレゴン、米国)により製造者の説明書に従い定量した。粒子中のＰＦＣ量は、フルオロログ−２ホトン計測蛍光分光光度計(ホーベン・イボン(Joben-Yvon)、フランス)により、標準曲線法を用い、ＤiＩＣ１８(３)蛍光(５５０ｎｍにて励起；５６５ｎｍにて発光)から定量した。その結果を以下の表に要約する：
【００９５】
【表２】
2010094128.tif 000003
【００９６】
ジェノスフェアーズの特性化
１．スクロース勾配遠心分離におけるジェノスフェアーズの密度測定
スクロース勾配遠心分離法については文献に記載されている(Xu, et al., Biophys. J., v.77, p.341-351 (1999))。
【００９７】
表１はスクロース勾配遠心分離により定量されたプラスミドＤＮＡ含有ジェノスフェアーズの見かけ上の浮遊密度を示す。サンプルを連続線状スクロース勾配、０〜３５％スクロース上に層として置き、４℃で１６時間遠心分離した。最終精製ジェノスフェアーズ製品を表すＤＮＡ含有の単一の薄いバンドが１２〜１４％スクロースに形成されたが、これは密度１.０４６５〜１.０５４９ｇ／ｃｃに相当するものである。粒径は動的光散乱により測定した。勾配から回収したジェノスフェアーズ中のＤＮＡおよび脂質を分析すると、ＤＮＡ１μｇあたり３.７：７.３(ｎｍｏｌ：ｎｍｏｌ)の比でＤＤＡＢとＰＯＰＣとを含む組成物であることを示す。
【００９８】
【表３】
2010094128.tif 000004
【００９９】
表２は別の実験でスクロース密度勾配精製後のプラスミドＤＮＡ含有ジェノスフェアーズの回収(ＤＮＡに基づく)およびサイズを示す。ジェノスフェアーズの回収率は７５％以上であり、粒径は４０〜１７０ｎｍの範囲であった。
【表４】
2010094128.tif 000005
【０１００】
２．ジェノスフェアーズの凍結割断電子顕微鏡写真
ＤＤＡＢ／コレステロール／ＰＯＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ(ＤＮＡ１μｇあたり６／６／１２／０.１２ｎｍｏｌ)から構成されるジェノスフェアーズの凍結割断電子顕微鏡写真像を図１に示す。図２はＤＤＡＢ／コレステロール／ＰＯＰＣ(ＤＮＡ１μｇあたり６／６／１２ｎｍｏｌ)からのジェノスフェアーズの凍結割断電子顕微鏡写真像を示す。両画像ともに滑らかな表面割断面と均一なサイズ分布をもつ類似の構造を示す。
【０１０１】
図２は脂質層とＤＮＡコアの構造を明らかにしている。露出した滑らかな凸状の割断面(矢印先端)は、コア中のＤＮＡと相互作用する大部分がカチオンの脂質を含み得る脂質二層の内部半分の疎水性末端に相当する。多数の凹面(矢印)がＤＮＡカチオン相互作用の弱い領域の割れ目と思われる割断のジャンプを示す。
【０１０２】
３．ＤＮアーゼに対するジェノスフェアーズ内の核酸の安定性
プラスミドＤＮＡのみ(“裸の”ＤＮＡ)、プラスミド−リポソーム複合体およびジェノスフェアーズを、界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)の存在下または不存在下にＤＮアーゼで処理し、消化されたＤＮＡにつき、０.８％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムにより染色して観察した。表３はゲル上で評価したＤＮアーゼによるＤＮＡの消化の程度を示す。ＤＮＡのみのレーンには未変化のＤＮＡが残っていなかった。プラスミド−リポソーム複合体は部分的に脂質が保護していた。それに対し、異なる組成のジェノスフェアーズでは、そのＤＮＡが脂質により完全に保護されていた。
【０１０３】
【表５】
2010094128.tif 000006
【０１０４】
４．遺伝子担体のインビトロ細胞毒性
カチオン性脂質は陰性膜性分に結合することにより膜統合性を変化させることが知られている。このような膜に対するクラスター電荷の強力な結合が、膜に修復不能の欠陥を生じ、細胞死に至らしめる。ＳＫ−Ｂｒ−３細胞は、ｐＵＣ−由来バクテリアプラスミドをＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ小単層リポソームとの混合により調製したプラスミド−リポソーム複合体に、またはジェノスフェアーズに、増殖培地中、５時間接触させ、新鮮な培地中で８０時間ポスト−インキュベートした。細胞の生存度は常套のテトラゾリウムアッセイにより評価した。図３に示すように、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥプラスミド−リポソーム複合体は、ＩＣ５０(５０％細胞毒用量)が９μＭ−ＤＤＡＢであり、一方、ＤＤＡＢ／ＣＨＩＭ／ＰＯＰＣ(６：４.８：７.２)で作製したジェノスフェアーズはこれらの細胞で有意に毒性が弱く、ＩＣ５０が９０μＭ−ＤＤＡＢであった。
【０１０５】
５．インビトロ形質導入
表４はマーカー遺伝子の発現により形質導入効率を比較するものであり、この場合はジェノスフェアーズと従来法で調製したプラスミド−リポソーム複合体のルシフェラーゼ(細胞タンパク質１ｍｇあたりのルシフェラーゼのｎｇ)を比較する。ＳＫＢｒ−３細胞を、形質導入の２４時間前に、２４穴プレート中に１００,０００細胞／ウエル塗布し、ＣＭＶ初期プロモーターの制御の下にルシフェラーゼ遺伝子をもつ包膜プラスミドＤＮＡ含有ジェノスフェアーズをウエルあたり１.０μｇのＤＮＡとして添加し、１０％血清含有細胞増殖培地１ｍｌ中、６時間インキュベートした。ジェノスフェアーズ含有培地を次いで除き、細胞を新たな増殖培地中で２４時間インキュベートした。細胞が産生したルシフェラーゼ量を細胞溶解液につき、ルシフェリン−ＡＴＰ法による発光法により定量し、ホタル・ルシフェラーゼの市販製品(ベリンがー・マンハイムＡＧ)に対し標準化した。細胞タンパク質の量は市販のキット(バイオ−ラッド(Bio-Rad))を用い、ブラッドフォード(Bradford)の色素結合法により定量した。ジェノスフェアーズおよびプラスミド−脂質複合体は共に同じ脂質組成、ＤＤＡＢ／ＣＨＩＭ／ＰＯＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ(ＤＮＡ１μｇあたり、６ｎｍｏｌ：４.８ｎｍｏｌ：７.２ｎｍｏｌ：０.０６ｎｍｏｌ)を有していた。同じ脂質組成を有するにもかかわらず、ジェノスフェアーズは、予め形成したリポソームとプラスミドＤＮＡとをインキュベートすることにより調製したプラスミド−脂質複合体よりも、より高レベルの形質導入を生じた。ＨＥＲ２−標的ジェノスフェアーズとプラスミド−脂質複合体は、ジェノスフェアーズまたはプラスミド−脂質複合体と抗−ＨＥＲ２ Ｆab−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ接合体とを同時インキュベートし、結果としてＦab−ＰＥＧ−脂質接合体をジェノスフェアーズの表面脂質層に、またはプラスミド−脂質複合体の脂質成分内に捕捉することにより調製した。凍結乾燥したジェノスフェアーズの再構成サンプルは、形質導入したことにより最も活性となることに注目すべきである。同じ脂質組成のプラスミド−リポソーム複合体に比較して、特に優れた形質導入効率を有するジェノスフェアーズについても証明される。ジェノスフェアーズのマーカー遺伝子発現(ルシフェラーゼ)は、従来のプラスミド−脂質複合体におけるよりも６５倍大きかった。再構成した凍結乾燥ジェノスフェアーズは、その発現が、標的化した従来の複合体の３００倍に上昇した。抗−ＨＥＲ２ Ｆab’−標的化ジェノスフェアーズは、各剤形において、非標的化システムに比べ、ＨＥＲ２−過剰発現細胞の形質導入効率を１０倍上昇させる。
【０１０６】
【表６】
2010094128.tif 000007
【０１０７】
表５はＨＥＲ２レセプター−発現ＳＫＢｒ−３細胞に対する種々の抗−ＨＥＲ２免疫ジェノスフェアーズのインビトロ標的化を示す。ジェノスフェアーズの表面に抗−ＨＥＲ２ Ｆab’−抗体フラグメントからなる免疫ジェノスフェアーズは、ジェノスフェアーズと抗ＨＥＲ２ Ｆab−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ接合体を同時インキュベートし、Ｆab−ＰＥＧ−脂質接合体をジェノスフェアーズの表面脂質層に捕捉させることにより調製した。表面付着抗−ＨＥＲ２抗体フラグメントはジェノスフェアーズのエンドサイトーシスを誘発し、従って、細胞内部部位へのプラスミドの導入を誘発する。標的化リガンドの付着は形質導入レベルを４〜３７倍上昇させる。
【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
ホスファチジルエタノールアミンを“ヘルパー”脂質として含有するカチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体で造られたインビトロ形質導入システムが、培養細胞においてより高い形質導入効率をもつことがすでに確立されている。“ヘルパー”脂質としてのホスファチジルエタノールアミンの代わりにホスファチジルコリンからなるカチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体が、非常に低いインビトロ形質導入効率を示すと一般に信じられているのに反し、本発明により調製するジェノスフェアーズは、ホスファチジルコリンを含み、ホスファチジルエタノールアミンを含まないにも関わらず、意外にも高いインビトロ形質導入効率を有する。このことは、ホスファチジルエタノールアミンの多形性が、カチオン脂質に基づくジェノスフェアーズ送達システムにおいて高い形質導入活性をもつことを必要としないことを説明する。
【０１１０】
表６は(初期ＣＭＶプロモーターの制御の下に)マーカールシフェラーゼ遺伝子を担持するプラスミドＤＮＡを形質導入したＳＫＢｒ−３細胞によるルシフェラーゼの発現(細胞タンパク質ｎｇ／ｍｇ)を、ジェノスフェアーズおよび再構成凍結乾燥ジェノスフェアーズと比較したプラスミド−リポソーム複合体を用いて、示す。水混和性有機溶媒の選定はエタノール限られなかった；ｔ−ブタノールとメタノールも同様に適していた。凍結乾燥がなければ、プラスミド−リポソーム複合体の形質導入活性は、プラスミド−リポソーム複合体と同じ脂質組成をもつジェノスフェアーズのわずか１０％であった。スクロース、マンニトールまたはトレハロースなどの凍結保護剤の存在下に凍結乾燥したジェノスフェアーズは、より高い形質導入活性を示す。
【０１１１】
【表８】
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a) ５％水性デキストロースと混合、容量にて１：１
【０１１２】
インビボ形質導入
表７はプラスミド−リポソーム複合体または異なる脂質組成のジェノスフェアーズ(注射あたり１００μｇのＤＮＡ)に製剤化したルシフェラーゼ・マーカー遺伝子含有プラスミドＤＮＡの単回腫瘍周囲注射２４間後の免疫不全ヌードマウスにおけるＨ１５７ヒト肺癌異種移植でのルシフェラーゼ発現を示す。０.２〜１.０ｃｍ３の大きさの腫瘍が癌細胞移植後に皮下に増殖した。並行実験データを呈示する(コンマにて仕分け)。従来の脂質に基づく遺伝子担体、例えば、プラスミド−リポソーム複合体(ＤＤＡＢ／Ｃhol；１２：１２)は過剰の正の電荷を担持し、肺で非常に高い発現を示すが、腫瘍では発現しない。肺におけるジェノスフェアーズの非特異的形質導入活性は、これらの製剤においてカチオン性脂質の接触を著しく低下させるため、大きく低下する。少量のＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むジェノスフェアーズは肺での形質導入をさらに低下させると思われる。結果は、ジェノスフェアーズがプラスミド−リポソーム複合体と比べて、所望の組織に対する本質的な特異性に加えて、ジェノスフェアーズが腫瘍においてより高い形質導入を与えるという明瞭な全体的傾向を示している。培養細胞におけるように、再構成凍結乾燥ジェノスフェアーズは、非加工処理ジェノスフェアーズに比べて、１０倍を超えるより大きな遺伝子発現を矛盾なく示す。
【０１１３】
【表９】
2010094128.tif 000010
【０１１４】
表８はジェノスフェアーズまたはプラスミド−リポソーム複合体の腫瘍周囲注射後の免疫不全ヌードマウスにおけるヒト乳癌腫瘍異種移植(ＢＴ−４７４)でのルシフェラーゼ発現を示す。実験条件は表７の条件と同様である。レポーター遺伝子は腫瘍周囲に局所的に送達されたが、肺における従来のプラスミド−リポソーム複合体(ＤＤＡＢ/Ｃhol、１２：１２；ＤＮＡ１μｇあたりのｎｍｏｌ：ｎｍｏｌ)からのルシフェラーゼ発現は腫瘍におけるよりも３０倍高いままであった。それに対し、異なる脂質組成のジェノスフェアーズが介在した遺伝子移行は、いずれの動物においても肺と比べて腫瘍の方が高く、腫瘍での発現値は従来のプラスミド−リポソーム複合体が介在する発現に比べて３倍ないし７７倍高い範囲にあった。
【０１１５】
【表１０】
2010094128.tif 000011
【０１１６】
表９は様々な組成のジェノスフェアーズの腫瘍周囲注射後のマウスにおけるＨ−１５７ヒト肺癌腫異種移植でのルシフェラーゼ遺伝子発現を示す。実験条件は表７の条件と同様である。この一連の実験では、３つの明瞭な傾向が見られた：(１)ＤＯＴＡＰは首尾一貫してＤＤＡＢより良好である；(２)ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥの包含は遺伝子の移行を低下させる；(３)凍結乾燥は肺と腫瘍両方において、２〜５倍首尾一貫して遺伝子の移行を促進する。
【０１１７】
【表１１】
2010094128.tif 000012
【０１１８】
表１０はジェノスフェアーズまたはプラスミド−リポソーム複合体に製剤化したルシフェラーゼ−エンコードプラスミドＤＮＡを、Ｈ−１５７ヒト肺癌腫の皮下異種移植片を担持するヌードマウスに静脈内投与した後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現を示す。腫瘍は表７の手法に従って、免疫不全ヌードマウスで増殖させた。ジェノスフェアーズはマウス１匹あたり１００μｇのＤＮＡとして静脈内注射した。ＤＤＡＢ／ＣＨＩＭ／ＰＯＰＣの凍結乾燥ジェノスフェアーズ、ならびにＤＤＡＢ／コレステロールのプラスミド−リポソーム複合体は、肺において高い形質導入活性を生じた。ジェノスフェアーズの静脈内送達は腫瘍の形質導入が検出(ＵＤ)できなかった。
【０１１９】
【表１２】
2010094128.tif 000013
【０１２０】
実施例１６
ジェノスフェアーズの保存条件と安定性
プラスミドＤＮＡ１ｍｇを、等量のエタノールと５％水性デキストロースからなる単相２ｍＬ中、６μｍｏｌのＤＤＡＢ、１５μｍｏｌのＰＯＰＣ、１０μｍｏｌのコレステロール、および０.２１μｍｏｌのＤＳＰＥ−ＰＥＧ(ＭＷ２,０００)を含む液体混合物と５５℃で組合わせた。エタノールは５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａバッファー(ｐＨ７.４)に対し、室温にて徹底的透析により除去した。製剤の最終容量は約３.６ｍＬであった。このサンプルを０.２ｍＬずつに分割し、等容量の保存液、１０％(ｗ／ｗ)デキストロース、１０％(ｗ／ｗ)スクロース、または２０％(ｗ／ｗ)スクロースを加えた。次いで、サンプルを４〜６℃で液状にて保存するか、または−８０℃で凍結するか、または一夜凍結乾燥し、固体として４〜６℃で１週間保存した。次いで、凍結サンプルは室温で融解し、凍乾サンプルは水で当初のＤＮＡ濃度に再構成した。粒子径は動的光散乱により測定し、ＤＮＡ露出は接触性アッセイにより測定した。これらのパラメータは予め保存した粒径の値(重量平均±標準偏差(ＳＤ)、７１.３ｎｍ±２９.３ｎｍ)と比較し、色素接触性は１０.０％であった。データを以下の表に要約する：
【０１２１】
【表１３】
2010094128.tif 000014
【０１２２】
実施例１７
ジェノスフェアーズおよびリポソームの浮遊密度
以下の脂質成分(プラスミドＤＮＡ１ｍｇあたり)を用いて、実施例１６の記載に従いジェノスフェアーズを調製した：
組成１：ＤＤＡＢ６μｍｏｌ；ＰＯＰＣ、１５μｍｏｌ、コレステロール、１０μｍｏｌ；ＰＥＧ(ＭＷ２,０００)−ＤＳＰＥ、０.０６μｍｏｌ。
組成２：ＤＤＡＢ６μｍｏｌ；ＰＯＰＣ、２５μｍｏｌ、コレステロール、６μｍｏｌ；ＣＨＥＭＳ、９μｍｏｌ；ＣＨＩＭ１.６７μｍｏｌ；ＰＥＧ(ＭＷ２,０００)−ＤＳＰＥ、０.０６μｍｏｌ。
脂質組成１を有するリポソーム(核酸含まず)は、同じ手法であるがプラスミドＤＮＡを除外した手法で調製した。
【０１２３】
スクロース勾配は廃棄可能ポリアロマー遠沈管(１３×５１ｍｍ)に４ｍＬの１５％(ｗ／ｗ)スクロース水溶液を容れ、遠沈管を５サイクルの凍結・融解に付すことにより調製した。ジェノスフェアーズ、ＤＮＡ不含有リポソーム、または遊離のプラスミドＤＮＡの一部(０.２ｍＬ)を勾配チューブの最上部に添加し、チューブを１８０,０００×ｇ、２０℃で８時間遠沈した。粒子の局在はファイバーオプティック光源を用いるチューブの接線発光に基づく光散乱により検出した。粒子は明瞭に境界を示すバンドを形成した。連続分割部分(フラクション)０.２ｍＬずつを上から下に順に勾配から抜き出し、屈折率により定量したスクロース濃度から、ＣＲＣ理化学ハンドブック(Handbook of Chemistry and Physics)４４版の表を使用してフラクション密度を計算した。フラクション中のＤＮＡはピコグリーン(PicoGreen)色素結合アッセイにより定量した。異なる脂質組成をもつに関らず、ジェノスフェアーズサンプルは共に密度１.０２５〜１.０３８をもつ同じ勾配領域に位置していたが、ＤＮＡ不含有リポソームは密度１.０１４〜１.０１６に位置していた。遊離のＤＮＡはチューブ低部近くのフラクションに見出された。
【０１２４】
実施例１８
ＰＥＧ−ＰＥ誘導体含有ジェノスフェアーズ：ＤＮＡ包膜内取り込み、濾過性、および標的化形質導入
ジェノスフェアーズは以下の脂質組成(プラスミドＤＮＡ１ｍｇあたり)により調製した。
組成１：ＤＯＴＡＰ６μｍｏｌ；ＰＯＰＣ、１５μｍｏｌ、コレステロール、１０μｍｏｌ
組成２：ＤＯＴＡＰ６μｍｏｌ；ＰＯＰＣ、１５μｍｏｌ；ＣＨＩＭ、８μｍｏｌ；１,２−ジオレオイルグリセロールヘミサクシネート(ＤＯＧＨＥＭＳ)２μｍｏｌ；ＤＯＰＥ、２μｍｏｌ。
【０１２５】
さらに、該組成は種々量(総脂質の０〜４モル％)のＰＥＧ−脂質ＰＥＧ−ＤＭＰＥまたはＰＥＧ−ＤＳＰＥ(ＰＥＧ分子量２,０００)を含む。該脂質は保存エタノール溶液から計り分け、１００％エタノールで０.５ｍｌとした。この溶液に、０.５ｍｌの５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａバッファー(ｐＨ７.４)(組成１)または５ｍＭ−ＭＥＳ−Ｎａバッファー(ｐＨ５.５)(組成２)のいずれかを加えた。プラスミドＤＮＡ(１００μｇ；ＣＭＶプロモーター制御の下にルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む)はそれぞれのバッファー溶液中０.５ｍｌとし、１００％エタノール０.５ｍｌと混合した。脂質溶液およびＤＮＡ溶液を５５℃で１０分間インキュベートし、同温度で混合し、外界温度まで冷却した。冷却後、１４４ｍＭ−ＮａＣｌに対し、室温で徹底的透析によりエタノールを除去した。
【０１２６】
ＨＥＲ２−標的剤形を得るために、製剤の分割部分は、高取り込み可能な抗−ＨＥＲ２scＦｖ抗体フラグメントＦ５Ｃysとマレイミド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥから、ニールセンら(Nielsen et al., 2002)記載のように調製した接合体とともに、リン脂質１μｍｏｌあたり１５μｇのＦ５タンパク質の比で、３７℃で一夜インキュベートした。同じ条件下に等量のＰＥＧ−ＤＳＰＥを対照(非標的化)製剤に加えた。
【０１２７】
剤形サンプルを孔径０.４５−μｍの界面活性剤不含有酢酸セルロース無菌フィルターに加圧通過させた。濾過効率は当該フィルターを通過したジェノスフェアーズ−包膜取り込みＤＮＡの割合として計算した。
【０１２８】
濾過サンプル中のＤＮＡ接触度合いをピコグリーン(Ｒ)色素接触性アッセイにより測定した。ＰＥＧ−脂質不含サンプル中の濾過粒子が低収率であるため、色素接触性アッセイによってはこれらのサンプルで測定されなかった(ｎ.ｄ.)。粒径はニコンプ(Nicomp)Ｃ３７０装置(パーティクル・サイズ・システムズ)により固体粒子ガウス重量平均モードを用い、動的光散乱によって測定した。
【０１２９】
ジェノスフェアーズ−包膜取り込みプラスミドＤＮＡの形質導入活性は、上記セクション５のジェノスフェアーズの特性化に記載したプロトコールを用いて、ＨＥＲ２−過剰発現細胞(ＳＫ−Ｂｒ−３)の培養により測定した。形質導入効率は総細胞溶解液タンパク質１ｍｇあたり、生成したルシフェラーゼのｎｇとして表した。
【０１３０】
結果を以下の表に要約する：
【表１４】
2010094128.tif 000015
【表１５】
2010094128.tif 000016
【０１３１】
(総リン脂質の)０.２５モル％という少量のＰＥＧ−脂質の添加が、０.４５−μｍフィルターを通過するジェノスフェアーズの割合を劇的に増加させたが、粒径は６０〜１００ｎｍのままであり、ＰＥＧ−脂質が表面上に非特異的に吸着する粒子の傾向を低下させたことを証明している。細胞内取り込み可能な抗−ＨＥＲ２抗体フラグメントにより標的化した剤形は、非標的化のものよりもＨＥＲ２−過剰発現細胞において１〜３桁大きい導入遺伝子発現を示した。
【０１３２】
実施例１９
ポリエトキシル化非イオン性界面活性剤(トウィーン−６０(登録商標))の添加により調製されたジェノスフェアーズ
プラスミドＤＮＡを脂質組成物に包膜したジェノスフェアーズ(ＤＮＡ１重量部あたり：ＤＤＡＢ６モル部；ＰＯＰＣ１５モル部；ＣＨＩＭ８モル部；ＤＯＧＨＥＭＳ２モル部；およびＤＯＰＥ２モル部)は、無水エタノールと５％水性デキストロースの１：１(容量)混合物中のＤＮＡ溶液等容量、および無水エタノールと５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａバッファー(ｐＨ７.４)の１：１(容量)混合物中の脂質溶液を６０℃で組合わせることにより調製した。ＤＮＡ溶液と脂質溶液とを組合わせた後、ポリエトキシ化非イオン性界面活性剤、ポリ(オキシエチレン)ソルビタン・モノステアレート(商品名トウィーン−６０)の１０％(ｗ／ｗ)水性保存液を該混合物に加え、トウィーン−６０／総脂質、１：１０のモル比とした。該混合物を外気温とし、１４４ｍＭ水性ＮａＣｌに対して徹底的に透析し、エタノールを除去した。本明細書にすでに記載した動的光散乱により測定した場合、生じたＤＮＡ−脂質粒子の粒径は９６.０±４２.３ｎｍ(平均±ＳＤ)であった。包膜取込みＤＮＡ濃度２０.６ｍｇ／ｍＬ(＊)での粒子は、加圧下に、孔径０.２μｍのポリエーテルスルホンフィルターを通過した。濾液中のＤＮＡ濃度は１６.４ｍｇであり、濾過効率が７９.６％であることを示した。このように、少量のポリエトキシル化非イオン性界面活性剤(総脂質の１／１０)を添加するだけの工程を加えることで調製したジェノスフェアーズは、驚くべきことにさらに滅菌濾過フィルターをも通過可能であり、製造上重要な利点を提供する。
【０１３３】
実施例２０
トウィーン添加により調製したジェノスフェアーズに対する血漿への接触の影響
下記表に示すように(ＤＮＡ１重量部あたりの各脂質のモル部)、プラスミドＤＮＡと脂質を含むジェノスフェアーズは、実施例Ｄに従って調製したが、ＤＯＧＨＥＭＳ含有ジェノスフェアーズの場合には、ＨＥＰＥＳ−Ｎａ(ｐＨ７.４)の代わりにｐＨ５.５のＭＥＳ−Ｎａバッファーを用いた。製剤は０.２μｍのポリエーテルスルホン滅菌フィルターを加圧下に通すことにより滅菌した。濾過滅菌製剤は、遠心分離と０.２μｍ滅菌濾過により澄明とした等容量のヒトドナー血漿と無菌的に混合した。この混合物を３７℃でインキュベートした；一部分を１時間後、２４時間後、および４９時間後に引き抜き、粒径をＤＬＳにより、またＤＮＡ接触をピコグリーン(登録商標)ＤＮＡ−結合色素接触性アッセイにより分析した。純粋な血漿は粒径４０ｎｍ未満のみの内在性粒子の存在を示し、４０ｎｍ以上の平均粒径をもつサイズ分布ピークはジェノスフェアーズに帰するものであった。データを以下の表に要約する。
【０１３４】
組成１：ＤＯＴＡＰ６；ＰＯＰＣ１５；Ｃhol １０
組成２：ＤＯＴＡＰ６；ＰＯＰＣ１５；Ｃhol ８；ＤＯＰＥ２
組成３：ＤＯＴＡＰ６；ＰＯＰＣ１５；Ｃhol ８；ＤＯＧＨＥＭＳ２；ＤＯＰＥ２
【表１６】
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【０１３５】
粒子凝集の程度は組成１および２での血漿において認められたが、負に荷電したｐＨ滴定可能な脂質ＤＯＧＨＥＭＳを含む組成３は、血漿における凝集に対して驚くほどより安定であった。これら３種の組成すべてにおいて、粒子はＤＮＡ接触増加の存在しないことによって証明されるように、分解に対して安定であった。
【０１３６】
実施例２１
トウィーン添加により調製したジェノスフェアーズの形質導入活性
ルシフェラーゼレポーター遺伝子をエンコードするプラスミドＤＮＡおよび以下の脂質を含むジェノスフェアーズを上記実施例２０の記載に従って調製した。脂質(ＤＮＡ１重量部あたりのモル部)：ＤＯＴＡＯ６；ＰＯＰＣ１５；コレステロール８；ＤＯＧＨＥＭＳ２；ＤＯＰＥ２。得られるＤＮＡ−脂質粒子の粒径は、動的光散乱によると８３.２±４１.８ｎｍ(平均±ＳＤ)であった。ＨＥＲ２標的ジェノスフェアーズ剤形は、ニールセンら(Nielsen et al., 2002)記載のように調製した抗−ＨＥＲ２scＦｖ抗体フラグメントＦ５Ｃyとマレイミド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥとの接合体と該粒子とを、リン脂質１μｍｏｌあたりＦ５タンパク質１５μｇの比で、５７℃にて１時間インキュベートすることにより得た。該ジェノスフェアーズは０.２ｕｍポリエーテルスルホンフィルターを通して滅菌し、色素接触性アッセイによるＤＮＡ接触、およびＨＥＲ２−過剰発現乳癌細胞(ＳＫ−ＢＲ−３)での形質導入活性について、本明細書に記載したとおりにアッセイした。その結果を以下の表に要約する：
【０１３７】
【表１７】
2010094128.tif 000018
【０１３８】
実施例２２
ｐＨ滴定可能脂質含有ジェノスフェアーズの特性化
カチオン性、中性、およびｐＨ滴定可能脂質含有ジェノスフェアーズは、エタノール／５％水性デキストロース(１：１、容量による)中のプラスミドＤＮＡ溶液、および同じ混合溶媒中の下記表の剤形に示した脂質を等容量ずつ５８℃で組合せ、次いで同温度での真空蒸発によるエタノールの除去と、引続く５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ、５％スクロース(ｐＨ７.０)または５ｍＭ−ＭＥＳ−Ｎａ、５％スクロース(ｐＨ５.５)に対して記載どおりの透析により調製した。粒径は動的光散乱により測定した。粒子の界面動電位(ゼータ電位)は、動的光散乱装置(ゼータ粒度測定器；モルヴァン(Malvern)))により、上記のバッファーにさらに５ｍＭ−ＮａＣｌを含有するバッファーにおける電気泳動度から測定した。結果を以下の表に要約する(ｎ.ｄ．−測定せず)：
【表１８】
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【０１３９】
ＣＨＥＭＳおよびＤＯＧＨＥＭＳなどのｐＨ−滴定可能アニオン性脂質をカチオン性脂質とともに含有するジェノスフェアーズは、中性のｐＨでアニオン性であるか、または略中性である一方で、細胞性エンドソームとリソソームに特徴的な低ｐＨ(ｐＨ５.５)に接触したとき、正の電荷を獲得した。
【０１４０】
実施例２３
溶液の分子的またはミセルの特性測定における光散乱および粒径分析の使用
以下の脂質からなる粒子形成成分(ＤＯＴＡＰ６モル部、ＰＯＰＣ１５モル部、コレステロール１０モル部、およびＰＥＧ−ＤＳＰＥ(ＰＥＧ分子量２０００)０.１６モル部)をエタノール−水混合物(１：１、容量比)に溶解し、０.２μｍ孔径の０.２μｍ膜フィルターで濾過し、ごみと粒状汚染物を除去した。濾液を凍結乾燥し、種々容量パーセントのエタノールを含む５％水性デキストロースに再溶解し、総脂質濃度を２.１ｍＭとなるようにした。溶液はニコンプＣ３７０動的光散乱粒径分析計(パーティクル・サイズ・システムズ・インク)を用いる恒温キュベットに容れ、５５℃で、次いで２３℃で平衡化した。光散乱強度は実験全般において、定常増幅器ゲインで記録された光子計数頻度から推定した。粒径は準弾性光散乱によりガウスの近似モード(カイ二乗因子３未満について)にて、または小胞についてはニコンプ(Nicomp)サイズ分布分析アルゴリズムにて決定し、体積平均・平均直径±標準偏差として、またはそれぞれのヒストグラムピークについては平均直径とそれに次ぐ相対質量分画(％)としてそれぞれ表した。粒径計算に必要な粘度と屈折率の値は、滴下球粘度計測により、また公開されているエタノール−水屈折率表からそれぞれ決定した。その結果を以下の表に要約する：
【０１４１】
【表１９】
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【０１４２】
５５℃およびエタノール含量４０容量％以上で、光散乱強度は劇的に下降し、粒径が測定できなかった；このことはこれらの条件下で、またＮＡＣが無ければ、粒状の凝集層が存在しないこと、すなわち、ＰＦＣが分子としてまたはミセルとして溶解したことを意味する。
【０１４３】
本発明について特定の態様に関連して記載したが、当業者には本発明から離れること無く種々の変更および修飾がなし得ることは明らかである。本発明の範囲は、従って、それに関わる等価の範囲をすべて勘案して決定すべきである。すべての論文および文献の開示は、特許の出願および公開も含めて、目的の如何を問わず参照により本明細書の一部とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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