(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＨＩＶ免疫応答を導き出すように設計された人工融合タンパク質（ＡＦＰ）、並びにそれらのタンパク質をコードする核酸分子及び発現ベクターの提供。【解決手段】ＡＦＰは、様々なＨＩＶタンパク質、例えば部分配列であるＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖタンパク質由来のドメインを含むことができる。ＨＩＶＣＯＮは、ＨＩＶドメインがいくつかのＨＩＶクレードコンセンサス配列由来のものであり、例えば発現レベル又は実験動物の免疫応答の監視で役立つことができる、更なるドメインを含んでもよいＡＦＰである。細胞性免疫応答を誘導するために、好ましくはＤＮＡプライム―ＭＶＡブースト手法により、対象で抗ＨＩＶ免疫応答を誘導する組成物及び方法を含むことができる。【選択図】図１
2010189397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが少なくとも配列番号２又は配列番号４の一部若しくは断片に対応する、免疫原性ポリペプチドのライブラリー。
【請求項２】
複数の免疫原性ポリペプチドが、全体で配列番号２又は配列番号４の全長に対応することを特徴とする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
各ポリペプチドの一部が、重複するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
重複するアミノ酸が、少なくとも１１個のアミノ酸であることを特徴とする、請求項３に記載のライブラリー。
【請求項５】
ポリペプチドが、合成ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項６】
さらにアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項７】
アジュバントが、無機塩類、ポリヌクレオチド、ポリアルギニン、ＩＳＣＯＭ、サポニン、一リン酸化リピドＡ、イミキモド、ＣＣＲ−５阻害剤、毒素、ポリホスファゼン、サイトカイン、免疫調節タンパク質、免疫賦活性融合タンパク質、共刺激分子及びそれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項６に記載のライブラリー。
【請求項８】
動物で免疫応答を誘導する方法であって、１又は２以上の請求項１に記載の免疫原性ポリペプチドを、ライブラリーに対する免疫応答を誘導するための十分な量で前記動物に送達することを含む方法。
【請求項９】
ヒト対象にＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に１又は２回以上免疫原を投与することを含み、前記免疫原が、１又は２以上の請求項１に記載の免疫原性ポリペプチドを含み、ライブラリーが、前記対象においてＨＩＶ特異的ＣＴＬ免疫応答を誘導する十分な量で投与されるか、十分なレベルで発現することを特徴とする方法。
【請求項１０】
対象に少なくとも１回のＨＩＶ免疫原の初回用量と少なくとも１回のＨＩＶ免疫原のブースティング用量とを投与することを含み、少なくとも免疫原の１つが、１又は２以上の請求項１に記載の免疫原性ポリペプチドであれば各用量中の免疫原が同一であっても異なってもよく、前記免疫原が、前記対象においてＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導するための十分な量で投与されるか、十分なレベルで発現することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００５年２月２４日に出願の米国特許仮出願第６０／６５５７６４号の権益を主張する。
【０００２】
前述の出願、及びそこで引用されている全ての文書（「出願引用文書」）及びその出願引用文書中で引用又は参照されている全ての文書、及び本明細書で引用又は参照されている全ての文書（「本明細書引用文書」、及び本明細書引用文書中で引用又は参照されている全ての文書は、本明細書で指摘されているいかなる製品のための、又は本明細書で参照により組み込まれたいかなる文書中のいかなる製造元の指示書、説明書、製品規格及び製品シートとともに、本明細書で参照により組み込まれ、本発明の実施に際して使用することができる。
【０００３】
この研究は、一部、英国のMedical Research Councilからの補助金によって助成された。
【０００４】
本発明は、対象で抗ＨＩＶ免疫応答を導き出すように設計された人工融合タンパク質（ＡＦＰ）、並びにそれらのタンパク質をコードする核酸分子及び発現ベクターに関する。ＡＦＰ並びにこれらのタンパク質をコードする核酸及び発現ベクターは、抗ＨＩＶ免疫応答を起こすために、対象に単独で、又は組み合わせで投与することができる。本発明のＡＦＰは、様々なＨＩＶタンパク質、例えばＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ及びＶｉｆタンパク質からのドメインを含むことができる。ドメインを形成するＨＩＶタンパク質は、部分タンパク質配列であり、それらのタンパク質の正常活性の１つ又は複数に関して生物学的に不活性化されている。ＨＩＶＣＯＮは、ＨＩＶドメインが複数のＨＩＶクレードコンセンサス配列由来であるＡＦＰである。ＨＩＶＣＯＮは、例えばタンパク質発現レベル又は実験動物免疫応答をモニター（monitor）する際に役立つ、更なるドメインを含むこともできる。そのようなドメインは、任意選択でＡＦＰに含まれる。本発明の他の態様は、好ましくはＤＮＡプライム―ＭＶＡブースト手法を用いて、好ましくは細胞性免疫応答を誘導するために、対象で抗ＨＩＶ免疫応答を誘導するための組成物及び方法を含む。
【背景技術】
【０００５】
エイズ又は後天性免疫不全症候群はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に起因し、消耗症候群、中枢神経系変性及び、日和見感染症及び悪性腫瘍をもたらす重大な免疫抑制を含む、いくつかの臨床像を特徴とする。ＨＩＶは、ヒツジ及びウシ、ネコのビスナウイルス並びにサルの免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む、動物レトロウイルスのレンチウイルスファミリーのメンバーである。ＨＩＶ―１及びＨＩＶ―２と命名された２種類の密接に関連したＨＩＶが今までに同定され、その内、ＨＩＶ―１はエイズの断然と最も一般的な原因である。しかし、ゲノム構造及び抗原性が異なるＨＩＶ―２は、類似した臨床症候群を引き起こす。
【０００６】
感染性のＨＩＶ粒子は、ウイルスタンパク質のコア内に詰められた、それぞれ長さが約９．２ｋｂの２つの同一のＲＮＡ鎖からなる。このコア構造は、宿主細胞膜に由来するリン脂質二重層エンベロープによって囲まれ、それは、ウイルスによってコードされた膜タンパク質も含む（Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th edition, W.B. Saunders Company, 2000, p. 454）。ＨＩＶゲノムは、レトロウイルスファミリーの特有の５’―ＬＴＲ―Ｇａｇ―Ｐｏｌ―Ｅｎｖ―ＬＴＲ―３’構成を有する。ウイルスゲノムの各末端の末端反復配列（ＬＴＲ）は、宿主からの転写調節タンパク質のための結合部位の役目を果たし、宿主ゲノムへのウイルスの組込み、ウイルスの遺伝子発現及びウイルス複製を調節する。
【０００７】
ＨＩＶゲノムは、いくつかの構造調節タンパク質をコードする。Ｇａｇ遺伝子は、ヌクレオカプシドコア及びマトリックスのコア構造タンパク質をコードする。Ｐｏｌ遺伝子は、ウイルス複製に必要な逆転写酵素、インテグラーゼ及びウイルスのプロテアーゼ酵素をコードする。ｔａｔ遺伝子は、ウイルス転写産物の伸長のために必要なタンパク質をコードする。ｒｅｖ遺伝子は、スプライシングが不完全かスプライシングされていないウイルスＲＮＡの核外移行を促進するタンパク質をコードする。Ｖｉｆ遺伝子産物は、ウイルス粒子の感染性を強化する。ｖｐｒ遺伝子産物は、ウイルスＤＮＡの核内移行を促進して、Ｇ２細胞周期停止を調節する。ｖｐｕ及びｎｅｆ遺伝子は、宿主細胞ＣＤ４発現をダウンレギュレートして感染細胞由来のウイルスの放出を増強するタンパク質をコードする。Ｅｎｖ遺伝子は、１６０キロダルトン（ｋＤａ）前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳され、細胞プロテアーゼによって切断されて細胞感染のために必要である外部１２０ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）及び膜貫通４１ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）を生じる、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする（Abbas, pp. 454-456）。
【０００８】
ＨＩＶ感染は、ウイルス粒子上のｇｐ１２０が、標的細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ及び樹状細胞の細胞膜上のＣＤ４及びケモカイン受容体分子（例えばＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）と結合することから開始する。結合したウイルスは標的細胞と融合し、ＲＮＡゲノムを逆転写する。結果として生じるウイルスＤＮＡは細胞ゲノムに組み込まれ、新しいウイルスＲＮＡの生産、したがってウイルスタンパク質及び新しいビリオンの生産を指示する。これらのビリオンは感染細胞膜から出芽して、他の細胞で増殖性感染を確立する。この過程は、当初に感染した細胞も殺傷する。非感染性Ｔ細胞上のＣＤ４受容体は感染細胞の表面で発現されるｇｐ１２０と強い親和性を有するので、ＨＩＶは間接的に細胞を殺すこともできる。この場合、非感染細胞はＣＤ４受容体―ｇｐ１２０相互作用を通して感染細胞に結合し、融合して、生存することができないシンシチウムを形成する。免疫防御に重要であるＣＤ４＋Tリンパ球の破壊は、エイズ疾患進行の証明である進行性免疫機能障害の主な原因である。ＣＤ４＋Ｔ細胞の消失はほとんどの侵入者と闘う体の能力を深刻に害するが、そのことは、ウイルス、真菌類、寄生虫、及びマイコバクテリウムを含むある種の細菌に対する防御に特に重大な影響を及ぼす。
【０００９】
ＨＩＶ―１の異なる分離株が、３グループＭ（主）、Ｏ（外れ値）及びＮ（非Ｍ、非Ｏ）に分類された。ＨＩＶ―１ Ｍグループは、ＨＩＶの世界的流行を支配する（Gaschen et al., (2002) Science 296: 2354-2360）。ＨＩＶ―１ Ｍグループは、約７０年前にヒトでその拡大を開始してから（Korber et al., Retroviral Immunology, Pantaleo et al., eds., Humana Press, Totowa, NJ, 2001, pp. 1-31）、急速に多様化した（Jung et al., (2002) Nature 418: 144）。ＨＩＶ―１ Ｍグループは、いくつかの異なるクレード（サブタイプとしても知られる）、並びに循環組換え態（ＣＲＦ）として知られる、２つ以上のクレードの組み合わせから生じる変異体からなる。サブタイプは、少なくとも２５％独自のゲノムを有するものと定義される（AIDS epidemic update, December 2002）。１１のクレードが同定され、各サブタイプは１文字で指定される。個体が２つの異なるＨＩＶサブタイプに感染したときに見られるように、クレードが互いに結合して環境中での確立に成功すると、結果として生じるウイルスはＣＲＦとして知られる。これまでに、約１３のＣＲＦが同定された。ＨＩＶ―１クレードは、地理的好みも示す。例えば、２番目に最も一般的なクレードであるクレードＡは西アフリカで一般的であり、クレードＢはヨーロッパ、米国及びオーストラリアで一般的である。最も一般的なサブタイプであるクレードＣは、南アフリカ、インド及びエチオピアで広範囲に分布している（AIDS epidemic update, December 2002）。
【００１０】
ＨＩＶのこの遺伝的変異性は、ワクチン開発上の科学的難問となっている。ＨＩＶ―１は、高度に変異するウイルスであり、サブタイプ内の変異が２０％と高く、サブタイプ間の差がアミノ酸配列の３５％に達する（Thomson, M.M. et al (2002) Lancet Infect Dis. 2: 461-471）。一部の報告書はクレード交差免疫応答が検出されることを証明している（Cao, H. et al. (1997) J. Virol. 71: 8615-8623、Ferrari, G. et al. (1997) Blood 90: 2406-2416、Walker, B.D. et al. (2001) Nat. Immunol. 2: 473-475）が、他の研究はそれと一致していない（Burrows, S.R. et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 191-195、McMichael, A.J. et al (2002) Nat. Rev. Immunol. 2: 283-291）。したがって、非常に広いクレード交差反応性の明白な証拠が入手できるようになり、ワクチンが多くのエピトープに対して強いＴ細胞応答を誘導することが示されない限り、標的集団内でワクチンの免疫原をクレード及び／又はＣＲＦと一致させることは慎重になる。
【００１１】
生の弱毒化ウイルス、殺滅ウイルス又はウイルスサブユニットによる免疫化などのワクチン開発の伝統的な手法は、ＨＩＶに適当であると証明されていない。例えば、マカク―ＳＩＶモデルにおいて、生の弱毒ワクチンは持続感染を引き起こし、一部のマカクはエイズを起こす。更に、ウイルスの臨床分離株に有効な中和抗体を生成することは、困難であった。従来の及び新しい手法と液性及び／又は細胞性の免疫を導き出すように設計された新規免疫原との組み合わせが必要なことが判明する可能性があり、それらは活発に探索されている。
【００１２】
中和抗体で問題点に遭遇したので、ＨＩＶワクチン開発の他の手法は、細胞性免疫応答を誘導することである。そのような応答は、主に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって媒介される。ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られるＣＴＬは、少なくとも２つの異なる方法で生物の防御に関与する。ウイルス感染細胞を殺滅すること、及び、直接的又は間接的にウイルス複製の抑制に寄与する様々なサイトカイン及びケモカインを分泌することである。強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導及び維持は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球（ヘルパーＴ細胞）によって提供される「援助」を必要とする。
【００１３】
ＣＴＬは、表面及び内部の両方の構造的及び非構造的ＨＩＶタンパク質から生じるペプチドを認識する。抗体と異なり、それらは無細胞ＨＩＶが宿主細胞に感染することを予防することはできない。したがって、ワクチンによって誘導される予防的ＣＴＬは、迅速に作用しなければならない。そのためには、それらは十分な数でなければならない場合があり、そのことは、持続的なワクチン刺激又は規則的な再ワクチン接種を必要とする場合があり、又は必要としない場合がある。好ましくは、ワクチンによって誘導されたＣＴＬは、伝達するウイルス／クレードの初期の及び／又は大量のＨＩＶタンパク質を認識し、ＨＩＶが逃れるのを困難にするために機能的に保存されたタンパク質領域内の複数のＣＴＬエピトープを標的とし、標的細胞を効率的に殺滅しなければならない。
【００１４】
ＣＴＬを誘導するために、初回抗原刺激免疫化として免疫原をコードするプラスミドＤＮＡを使用し、続いて同じ免疫原をコードする組換えウイルスによるブースティング免疫化を行うプライムブースト（prime-boost）免疫化手法は、マウスでＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激する効力を証明した（Hanke et al., (1998a) Vaccine 16:439-445、Schneider et al., (1998) Nat. Med.4: 397-402、Kent et al., (1998) J. Virol. 72:10180-10188）。この手法は確認されて、ヒト以外の霊長類（Hanke et al, (1999) J. Virol 73:7524-7532、Allen et al., (2000a) J. Immunol. 164: 4968-4978、Amara et al., (2001) Science 292:69-74、Allen et al., (2002) J. Virol. 76:10507-10511、Shiver et al., (2002) Nature 415:331-335）及びヒト（McConkey et al., (2003) Nat. Med. 9: 729-35）のために拡張された。国際公開９８／５６９１９は、マラリア及び他の抗原、例えばウイルス及び腫瘍の抗原に対してＣＴＬ媒介性の免疫応答を起こすためのプライムブースト免疫化手法を開示する。この免疫化手法は異なるベクターで同じＣＴＬエピトープを送達する初回抗原刺激及びブースティング組成物を使い、ブースティング組成物のためのベクターは、複製に欠陥があるポックスウイルスベクターである。
【００１５】
ワクチン開発の他の態様は、複数のＨＩＶエピトープに特異的なＣＴＬ応答を誘導することができる製剤を見出すことである。そのようなワクチンはＨＩＶが逃れることを比較的困難にすることができ、ＨＩＶ複製を抑制するより高い可能性を提供するであろう。理論的に、別々のワクチンベクターによって個々に送達されるいくつかのより小さな免疫原は、単一のベクターから発現される１つの大きな複遺伝子性タンパク質よりも有利であり、その理由は、前者の免疫原は別々の抗原提示細胞に達することができ、それぞれは少なくとも１つの免疫優勢応答を誘導するからである（Singh, R.A. et al., (2002) J. Immunol. 168:379-391）。複遺伝子性タンパク質では、交差初回抗原刺激が免疫刺激で役割を果たさない限り、各成分は１つの細胞によって生産されるので提示を巡って他の成分と競合する。それ故に、導き出された免疫応答の幅及びワクチン開発及び生産の実際性の間で均衡が必要であり、前者はワクチン成分の数を増加させ、後者は減少させる。
【００１６】
ワクチン開発の他の態様は、ＨＩＶ変動性に対処することである。最初に、ワクチンはそれらの製剤で各クレード由来の１つのタンパク質を使って、ＨＩＶクレードを交替させることができた。第２に、免疫系は多くの異なるエピトープに応答する能力を有するので、２つ又は３つの最も一般的なＨＩＶクレードに由来する全ての免疫原の混合を用いることができた。しかし、他のワクチンの手法に関しては、エピトープの「免疫優勢」は、Ｔ細胞応答の幅を狭くすること、及びウイルス感染に応じた予防免疫を防ぐことができた（Yewdell, J.W. et al. (1999) Ann. Rev. Immunol. 17: 51-88）。
【００１７】
ウイルス感染の過程で、ＣＴＬ応答は、エピトープ認識のそれらのパターンにおける予測可能な偏向を発達させる。エピトープ認識の階層が発達し、大部分のＣＴＬ応答は非常に限定された数のエピトープを標的にする。この現象は、「免疫優勢」としても知られる。実験から得た証拠は、免疫優勢が、関連する細胞受容体、即ち主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に対する多様なエピトープ親和性、ウイルスによって生産されるエピトープの様々なコピー数、及び宿主細胞機構によるエピトープの処理における差など、多くの因子の結果として発達することを示唆する。したがって、エピトープ偏向の階層を回避することができるワクチン手法は、ウイルス感染に対して防御免疫応答を提供する広いＣＴＬ応答をもたらすことができた。
【００１８】
２、３の例外があるが、大部分の既知のＣＴＬエピトープは慢性感染個体で特定され、これらのエピトープへの応答はＨＩＶ感染から保護することがこれまでできなかった。しかし、他の研究は、支配的な応答が必ずしも最も保護的であるというわけではないことを示す（Gallimore, A. et al (1998) J. Exp. Med. 187: 1647-1657）。したがって、定義上全てのクレードに共通する保存タンパク質領域に基づいてＨＩＶ免疫原を開発することは、当技術分野で非常に望ましい進歩である（Wilson, C.C. et al. (2003) J. Immunol. 171: 5611-5623）。そのような免疫原は、自然界ではＨＩＶ感染細胞によって処理されるエピトープを必ずしも含まないが、保護的である可能性がある亜優占的又は隠れたエピトープを含む、保存タンパク質領域を含むことができた。亜優占的なエピトープに対して強い応答を誘導することができる免疫原は、免疫優性の問題を避けることができ、したがって、広いＴ細胞応答を誘導することができた。更に、クレード交差性又はクレード遍在性のＣＴＬ反応性は、そのような免疫原の局在化程度のより低い地理的使用を可能にすることができた。
【００１９】
この出願でのいかなる文書の引用又は特定も、そのような文書が本出願の先行技術として利用可能であることを承認するものではない。
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／６５５７６４号
【特許文献２】国際公開９８／５６９１９
【非特許文献１】Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th edition, W.B. Saunders Company, 2000, p. 454
【非特許文献２】Gaschen et al., (2002) Science 296: 2354-2360
【非特許文献３】Korber et al., Retroviral Immunology, Pantaleo et al., eds., Humana Press, Totowa, NJ, 2001, pp. 1-31
【非特許文献４】Jung et al., (2002) Nature 418: 144
【非特許文献５】AIDS epidemic update, December 2002
【非特許文献６】Thomson, M.M. et al (2002) Lancet Infect Dis. 2: 461-471
【非特許文献７】Cao, H. et al. (1997) J. Virol. 71: 8615-8623
【非特許文献８】Ferrari, G. et al. (1997) Blood 90: 2406-2416
【非特許文献９】Walker, B.D. et al. (2001) Nat. Immunol. 2: 473-475
【非特許文献１０】Burrows, S.R. et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 191-195
【非特許文献１１】McMichael, A.J. et al (2002) Nat. Rev. Immunol. 2: 283-291
【非特許文献１２】Hanke et al., (1998a) Vaccine 16:439-445
【非特許文献１３】Schneider et al., (1998) Nat. Med.4: 397-402
【非特許文献１４】Kent et al., (1998) J. Virol. 72:10180-10188
【非特許文献１５】Hanke et al, (1999) J. Virol 73:7524-7532
【非特許文献１６】Allen et al., (2000a) J. Immunol. 164: 4968-4978
【非特許文献１７】Amara et al., (2001) Science 292:69-74
【非特許文献１８】Allen et al., (2002) J. Virol. 76:10507-10511
【非特許文献１９】Shiver et al., (2002) Nature 415:331-335
【非特許文献２０】McConkey et al., (2003) Nat. Med. 9: 729-35
【非特許文献２１】Singh, R.A. et al., (2002) J. Immunol. 168:379-391
【非特許文献２２】Yewdell, J.W. et al. (1999) Ann. Rev. Immunol. 17: 51-88
【非特許文献２３】Gallimore, A. et al (1998) J. Exp. Med. 187: 1647-1657
【非特許文献２４】Wilson, C.C. et al. (2003) J. Immunol. 171: 5611-5623
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
現在、意外にも、選択されたＨＩＶタンパク質、例えばＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖの最も高度に保存された領域から選択された配列は、ＨＩＶクレード及びＣＲＦによって限定されないＨＩＶに対する免疫応答を誘導することができることが発見された。本発明は、したがって、ある実施形態では、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖ由来のＨＩＶ配列を含む人工融合タンパク質（以下、「ＡＦＰ」）を提供し、それらの配列はＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖの最も高度に保存された領域を含むことができ、それらはクレード、ＣＲＦ並びに支配的なＣＴＬエピトープの存在及び存在量にかかわりなく選択される。また、ＡＦＰを発現する単離された核酸、ＡＦＰを発現する核酸を含むことができる発現ベクター及び宿主細胞、ＡＦＰの発現方法、並びに対象でＡＦＰに対して免疫応答を誘導するための方法も提供される。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明の一態様は、ＨＩＶ Ｇａｇドメイン、１つ又は複数のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン、ＨＩＶ Ｖｉｆドメイン及び１つ又は複数のＨＩＶ Ｅｎｖドメインを含むＡＦＰを提供する。一実施形態では、ＡＦＰが所定のＨＩＶクレードに対して免疫応答を誘導するように、ＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖのそれぞれを選択することができる。代替の実施形態において、ＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、異なるＨＩＶクレードのＨＩＶコンセンサス配列から選択することができる。好ましくは、ＨＩＶクレードは、クレードＡ、Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ及びＤからなる群から選択することができる。
【００２２】
他の実施形態はＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖのそれぞれのアミノ酸配列に関し、それらはＨＩＶクレードの間で約０％から約１０％異なることができる。好ましくは、配列はクレードの間で約０％から約８％、より好ましくはクレードの間で約０％から約６％変動する。
【００２３】
他の実施形態において、ドメインはＮからＣ末端の間に、天然のタンパク質を再現しない任意の順序で存在することができる。好ましくは、ドメインはＮからＣ末端の間に、ＨＩＶ Ｇａｇドメイン、第１のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン、ＨＩＶ Ｖｉｆドメイン、第２のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン、第１のＨＩＶ Ｅｎｖドメイン、第３のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン及び第２のＨＩＶ Ｅｎｖドメインの順序で存在することができる。ドメインは、介在配列に伴い、又は伴わず結合することができる。
【００２４】
ＨＩＶ Ｇａｇドメインは、好ましくは、配列番号２のアミノ酸１〜１３５に対応する、ＨＩＶ単離株由来のアミノ酸配列又はＨＩＶコンセンサス配列を含むことができる。ＨＩＶ Ｇａｇドメインは３つのＨＩＶ Ｇａｇサブドメインを含むことができ、それらは同じＨＩＶクレード由来でも又は異なるＨＩＶクレード由来でもよい。好ましい一実施形態において、最初のＨＩＶ Ｇａｇサブドメインは配列番号２のアミノ酸１〜５６を含むことができ、その配列はＨＩＶクレードＣ由来である。第２のＨＩＶ Ｇａｇサブドメインは好ましくは配列番号２のアミノ酸５７〜９６を含み、その配列はＨＩＶクレードＤ由来でよい。第３のＨＩＶ Ｇａｇサブドメインは好ましくは配列番号２のアミノ酸９７〜１３５を含み、その配列はＨＩＶクレードＡ由来でよい。
【００２５】
ＨＩＶ Ｐｏｌドメインは好ましくは３つのＨＩＶ Ｐｏｌドメインを含むことができ、最初のＨＩＶ Ｐｏｌドメインは好ましくは配列番号２のアミノ酸１３６〜３９３を含むことができ、第２のＨＩＶ Ｐｏｌドメインは好ましくは配列番号２のアミノ酸４２２〜４８４を含むことができ、第３のＨＩＶ Ｐｏｌドメインは好ましくは配列番号２のアミノ酸５２２〜７２３を含むことができる。好ましくは、各ＨＩＶ Ｐｏｌドメインは、少なくとも２つのＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインを含むことができる。この少なくとも２つのＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインは、同じか異なるＨＩＶクレード由来であることができる。第１のＨＩＶ Ｐｏｌドメインの第１のＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインは、好ましくは配列番号２のアミノ酸１３６〜２６５を含むことができ、その配列はＨＩＶクレードＢ由来でよい。第１のＨＩＶ Ｐｏｌドメインの第２のＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインは、好ましくは配列番号２のアミノ酸２６６〜３９３を含むことができ、その配列はＨＩＶクレードＣ由来でよい。第２のＨＩＶ Ｐｏｌドメインの第１のＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインは、好ましくは配列番号２のアミノ酸４３２〜４６７を含むことができ、その配列はＨＩＶクレードＡ由来でよい。第２のＨＩＶ Ｐｏｌドメインの第２のＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインは、好ましくは配列番号２のアミノ酸４６８〜４９４を含むことができ、その配列はＨＩＶクレードＢ由来でよい。第３のＨＩＶ Ｐｏｌドメインの第１のＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインは、好ましくは配列番号２のアミノ酸５２２〜５５６を含むことができ、その配列はＨＩＶクレードＤ由来でよい。第３のＨＩＶ Ｐｏｌドメインの第２のＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインは、好ましくは配列番号２のアミノ酸５５７〜６２９を含むことができ、その配列はＨＩＶクレードＡ由来でよい。第３のＨＩＶ Ｐｏｌドメインの第３のＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインは、好ましくは配列番号２のアミノ酸６３０〜６７６を含むことができ、その配列はＨＩＶクレードＢ由来でよい。第３のＨＩＶ Ｐｏｌドメインの第４のＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインは、好ましくは配列番号２のアミノ酸６７７〜７２３を含むことができ、その配列はＨＩＶクレードＣ由来でよい。
【００２６】
ＨＩＶ Ｖｉｆドメインは好ましくは配列番号２のアミノ酸３９４〜４２１を含み、その配列はＨＩＶクレードＤ由来でよい。第１のＨＩＶ Ｅｎｖドメインは好ましくは配列番号２のアミノ酸４８５〜５２１を含むことができ、第２のＨＩＶ Ｅｎｖドメインは好ましくは配列番号２のアミノ酸７２４〜７７７を含むことができる。第１のＨＩＶ Ｅｎｖドメインは好ましくはＨＩＶクレードＣ由来であることができ、第２のＨＩＶ Ｅｎｖドメインは好ましくはＨＩＶクレードＤ由来であることができる。
【００２７】
本発明は、配列番号２のアミノ酸１〜７７７を含むＡＦＰも提供する。本発明のＡＦＰは、実験動物でＡＦＰに対する免疫応答をモニターするために、１つ又は複数のヒト以外のＣＴＬドメイン、例えばＳＩＶ ｔａｔ ＣＴＬエピトープ、ｐｂ９エピトープ、Ｐ１８―Ｉ１０エピトープ及びＳＩＶ ｇａｇ ｐ２７エピトープからなる群から選択されるものを更に含むこともできる。本発明のＡＦＰは、Ｐｋ、Ｆｌａｇ、ＨＡ、ｍｙｃ、ＧＳＴ又はＨｉｓエピトープからなる群から選択されるマーカードメインを更に含むこともできる。本発明の更なる態様は、配列番号２のアミノ酸１〜８０６を含むＡＦＰを提供する。
【００２８】
本発明の他の態様は、本発明のＡＦＰをコードするヌクレオチド配列を有することができる、単離された核酸を提供する。更に、本発明は、少なくとも１つの核酸制御配列に作動可能に結合し、本発明のＡＦＰをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現ベクターも提供する。本発明の核酸及びベクターは、遺伝子ワクチン、即ちヒトなどの対象に本発明のＡＦＰをコードする核酸を送達し、その結果ＡＦＰが次に対象で発現されて免疫応答を導き出すワクチンを提供するために特に役立つ。
【００２９】
発現ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、媒介昆虫、酵母ベクター又は細菌ベクターでよい。好ましくは、プラスミドベクターはpTH又はpTHrである。
【００３０】
ウイルスベクターは、アルファウイルスレプリコンベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、又は他の任意の適当なウイルスベクターでもよい。ベクターがポックスウイルスベクターである場合、ポックスウイルスベクターはワクシニアウイルス及びアビポックスウイルスからなる群から選択される。ポックスウイルスは、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ又はＡＬＶＡＣなどの弱毒化ポックスウイルスでよい。
【００３１】
発現ベクターは、生きている弱毒化サルモネラ又は赤痢菌のベクターなどの細菌ベクターでもよい。
【００３２】
好ましい実施形態において、核酸制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーターでよい。
【００３３】
好ましくは、本発明のＡＦＰをコードするコドンは、ＡＦＰが発現される標的対象又は宿主細胞の高発現遺伝子のものでよい。対象は、有利にはヒトである。ある実施形態において、発現ベクターpTH又はpTHrはＨＩＶＣＯＮコード配列を含むことができ、それぞれ、pTH.HIVCON又はpTHr.HIVCONと呼ばれる。代わりに発現ベクターＭＶＡを用いることができ、その結果MVA.HIVCONと呼ばれる核酸が生じる。
【００３４】
本発明の更なる態様は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３５】
本発明は、ＡＦＰを調製する方法も提供し、その方法は、（ａ）ＡＦＰを発現する時間及び条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、及び（ｂ）ＡＦＰを回収することを含むことができる。
【００３６】
他の態様はＡＦＰを動物に導入し、動物で発現させる方法を提供し、その方法は、動物内に本発明の発現ベクターを送達することによって、動物でＡＦＰの発現を得ることを含むことができる。
【００３７】
動物細胞でＡＦＰを発現するための方法も提供され、その方法は、（ａ）本発明の発現ベクターを動物細胞に導入すること、及び（ｂ）ＡＦＰを発現するのに十分な条件下でそれらの細胞を培養することを含むことができる。
【００３８】
本発明の更なる態様は動物で免疫応答を誘導する方法を提供し、その方法は、動物内に本発明の発現ベクターを送達することを含むことができ、ＡＦＰはＡＦＰに対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで発現される。
【００３９】
ヒト対象でＨＩＶに対して免疫応答を誘導する方法も提供され、その方法は、対象に１回又は複数回免疫原を投与することを含むことができ、その免疫原は（ｉ）本発明のＡＦＰ、（ii）ＡＦＰをコードする核酸、及び（iii）ＡＦＰをコードする発現ベクターからなる群から選択され、ＡＦＰは、対象でＨＩＶ特異ＣＴＬ免疫応答を誘導するのに十分な量で投与されるか十分なレベルで発現される。好ましくは、対象は免疫原、又は免疫原をコードするベクター若しくは核酸を、少なくとも２週又は少なくとも４週の間隔で少なくとも２回投与される。他の実施形態は、全体の免疫化療法の一部として同時に、又は異なる時間に投与される他のＨＩＶ免疫原を提供する。
【００４０】
本発明の他の態様はヒト対象でＨＩＶに対して免疫応答を誘導する方法を提供し、その方法は対象にＨＩＶ免疫原の少なくとも１つの初回抗原刺激量及びＨＩＶ免疫原の少なくとも１つのブースティング用量を投与することを含むことができ、各用量の免疫原は同じでも異なってもよく、但し、免疫原の少なくとも１つは本発明のＡＦＰであるか、又はＡＦＰをコードする核酸若しくは発現ベクターであり、それらの免疫原は対象でＨＩＶ特異Ｔ細胞免疫応答を誘導するのに十分な量で投与されるか、又は十分なレベルで発現される。
【００４１】
各用量の間隔は、少なくとも２週又は少なくとも４週でよい。好ましくは、pTHr.HIVCONは初回抗原刺激用量として１回又は複数回投与され、MVA.HIVCONはブースティング用量として１回又は複数回投与される。代替の実施形態は、初回抗原刺激の２用量を投与すること及びブースティングの２用量を投与することを含み、初回抗原刺激用量のために使用する免疫原はプラスミドベクターであり、ブースティング用量のために使用する免疫原はウイルスベクターである。ウイルスベクターは、ＭＶＡベクターでよい。各初回抗原刺激用量は、pTHr.HIVA、pTHr.RENTA及びpTHr.HIVCONからなる群から選択されるベクターの混合物でよく、各ブースティング用量はMVA.RENTA、MVA.HIVA及びMVA.HIVCONからなる群から選択されるベクターの混合物でよい。
【００４２】
本発明の他の態様は、本発明のＡＦＰ、又はＡＦＰをコードする核酸、又はＡＦＰをコードする発現ベクター、及び薬剤として許容される担体を含む免疫原性組成物を提供する。組成物は、無機塩類、ポリヌクレオチド、ポリアルギニン、ＩＳＣＯＭ、サポニン、一リン酸化リピドＡ、イミキモド（imiquimod）、ＣＣＲ―５阻害剤、毒素、ポリホスファゼン、サイトカイン、免疫調節タンパク質、免疫賦活性融合タンパク質、共刺激分子及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアジュバントを更に含むことができる。そのような組成物は、ＨＩＶに対するワクチンとして役立つことができる。本発明の核酸及びベクターは、遺伝子ワクチン、即ちヒトなどの対象に本発明のＡＦＰをコードする核酸を送達し、その結果ＡＦＰが次に対象で発現されて免疫応答を導き出すワクチンを提供するために特に役立つ。
【００４３】
本発明は、配列番号２又は配列番号４の少なくとも８〜１５の連続したアミノ酸を含む複数のポリペプチドを含む免疫原性ポリペプチドのライブラリーも提供し、各免疫原性ポリペプチドは配列番号２又は配列番号４の断片の少なくとも一部と対応する。一実施形態では、複数の免疫原性ポリペプチドは、合計で配列番号２又は配列番号４の全長に対応する。好ましくは、ライブラリー内の各ポリペプチドの一部は、特に少なくとも１１アミノ酸がオーバーラップするアミノ酸配列を含む。
【００４４】
本発明の他の態様は、ＭＨＣクラスＩタンパク質を発現する細胞で本発明の免疫原性ポリペプチドのライブラリーからＨＩＶに対するＣＴＬエピトープを特定する方法を提供し、その方法は、本発明のライブラリーと細胞を接触させる段階と、ライブラリーを細胞のＭＨＣタンパク質と選択的に結合する段階と、ＭＨＣと選択的に結合するライブラリーのポリペプチドを単離する段階と、ポリペプチドの配列決定をすることによってＣＴＬエピトープを特定する段階とを含むことができる。細胞は、抗原提示細胞、好ましくは脾細胞でよい。細胞は、ヒト細胞でよい。細胞がヒト細胞である場合、ＭＨＣクラスＩタンパク質はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である。一実施形態では、選択的結合は、フローサイトメトリーで測定される。他の実施形態において、ポリペプチドはクロマトグラフィーによって単離される。
【００４５】
この開示、及び特に請求項及び／又はパラグラフにおいて、「含む（comprises）」、「含まれる（comprised）」、「含んでいる（comprising）」のような用語は、米国特許法でそれに帰属された意味を有することができ、例えば、それらは「含む（includes）」、「含まれる（included）」、「含んでいる（including）」のようなものを意味することができること、並びに、「基本的にそれからなっている（consisting essentially of）」及び「基本的にそれからなる（consists essentially of）」などの用語は、米国特許法でそれらに帰属された意味を有し、例えば、それらは明示的に引用されていない要素を許容するが、先行技術で見られる要素、又は本発明の基本的若しくは新規な特性に影響を及ぼす要素を排除することに注意する。
【００４６】
これら及び他の実施形態が開示されているか、以下の詳細な説明から明らかであり、及びそれに含まれる。
【００４７】
例示のために示すが、本発明を記載されている特定の実施形態に限定するものではない以下の詳細な説明は、添付の図面とともに最も良く理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
「免疫原」は、免疫系によって認識されて免疫応答を誘導する物質を指す。この文脈において使用される類似用語は、「抗原」である。
【００４９】
本発明との関連で「対象」は、脊椎動物、例えば哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類でよく、より有利には、ヒト、或いはウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ又はブタ、又はウマ、又は七面鳥、カモ若しくはニワトリなどの鳥類さえ含む、伴生種、又は家畜、又は食物生産動物、又は飼料生産動物、又は畜産動物、又は獲物、又はレース用動物、又はスポーツ用動物である。好ましくは、脊椎動物はヒトである。
【００５０】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「ポリペプチド断片」は、本明細書で互換的に使用することができ、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは線状でも分枝状でもよく、修飾されたアミノ酸又はアミノ酸アナログを含むことができ、また、アミノ酸以外の化学分子が介在してもよい。それらの用語は、自然に又はインターベンションによって、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピデーション、アセチル化、リン酸化又は他の任意の操作若しくは修飾、例えば標識又は生理活性成分とのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸ポリマーも含む。
【００５１】
「単離された」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その自然環境でそれが結合する物質を実質的に含まないものであってよい。実質的に含まないとは、これらの物質を少なくとも５０％、有利には少なくとも７０％、より有利には少なくとも８０％、更により有利には少なくとも９０％含まないことを意味する。
【００５２】
本発明は、ヒト対象でＨＩＶに対する免疫応答を促進するためのＡＦＰに関する。これらのＡＦＰは、複数のＨＩＶドメインを含む非天然のタンパク質である。本発明のＡＦＰは、細胞又は実験動物でＡＦＰの発現レベルを、及び／又は実験動物でＡＦＰに対する免疫応答をモニターするために役立つ１つ又は複数の更なるドメインを任意選択で含んでもよい。
【００５３】
詳細には、本発明のＡＦＰは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖ配列を含む。これらの配列は、（ａ）ＨＩＶ Ｇａｇドメイン、（ｂ）１つ又は複数のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン、（ｃ）ＨＩＶ Ｖｉｆドメイン及び（ｄ）１つ又は複数のＨＩＶ Ｅｎｖドメインを含む。ＨＩＶドメインのアミノ酸配列は、ＡＦＰが主に所定のＨＩＶクレードに対して免疫応答を誘導するように選択することができる。例えば、ＨＩＶクレードＡに対する免疫応答を所望する場合は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖのアミノ酸配列は、好ましくは、それらの各タンパク質のクレードＡコンセンサス配列である。好ましくは、本発明のＡＦＰは、ＨＩＶに対するクレード交差性又はクレード遍在性の免疫原を提供するために、いくつかの異なるクレードの中から選択されるＨＩＶドメインを含む。
【００５４】
より詳しくは、本明細書で使用される「人工融合タンパク質」又は「ＡＦＰ」は天然のものではないタンパク質又はポリペプチド（これらの用語は、互換的に使用される）であり、即ち、ＡＦＰは設計工程の産物であり、設計されたＡＦＰ全体は本来生物のゲノム中にコードされない。本発明のＡＦＰは、非天然の様式で配列される少なくとも２つの異なるタンパク質ドメインを有する必要があり、即ち、２つのドメインは単一タンパク質で通常見られない様式で配列される（又は、互いに融合される）。異なるタンパク質に由来するドメインについては、配列（又は、結合順序）は弾力的である。２つのドメインが同じタンパク質又は単一のポリタンパク質、例えばウイルスのポリタンパク質由来である場合、それらのドメインはそれらのドメインが由来する生物のゲノム中のタンパク質にコードされているので、それらのドメインと結合する元の一次構造と異なる一次線状構造を提供する方法で結合される。例えば、単一タンパク質からの連続ドメインは、逆順に結合することができるか、又は介在ドメインによって分離することができる。例えば、ＡＦＰは、例えばタンパク質を半分に切断し、それらの断片のコード配列を再配置する（又は融合する）ことによって作ることができ、その結果、タンパク質のカルボキシ末端で通常見られる配列が今はＡＦＰのアミノ末端にあり、元のアミノ末端アミノ酸はタンパク質の中にある。
【００５５】
ＡＦＰのドメインは、共有結合、例えばペプチド結合により、又は化学リンカーの挿入により、又は非共有結合、例えばイオン結合を含めた任意の手段で連結することができるが、これらに限定されない。好ましくは、ＡＦＰのドメインは共有結合で連結される。本明細書で使用されるように、「ドメイン」はタンパク質又はポリペプチドからのアミノ酸の領域又は配列を意味するが、その領域又は配列が特定の構造的又は機能的単位を形成するかどうかとは関係ない。「ドメイン」は、１つ又は複数の「サブドメイン」を含むこともでき、それらはタンパク質の部分又はタンパク質若しくはペプチドの断片を含むことができる。しかし、ドメイン又はサブドメインとして特定のアミノ酸を選択することは、そのドメイン又はサブドメインがタンパク質又はポリペプチドの構造的及び／又は機能的単位でもあること、又は、その構造若しくは機能に基づいて選択されることを妨げない。
【００５６】
ドメインの大きさは、２、３（１０未満）から数百のアミノ酸でよく、実際のドメインサイズは特定のドメインがＡＦＰに含まれることを根拠にする。例えば、スペーサの役目を果たすドメインは２〜３個のアミノ酸から１０〜１５個のアミノ酸であることができ、アミノ酸の正確な数は必要に応じて、例えば、クローニング部位を促進するために、コード配列の読み枠内でのフレームシフトを避けるために、ドメイン間に特定の距離を提供するために、又は、これら若しくは他の理由の任意の組み合わせのために決定される。他の例として、単一のエピトープをコードする場合は、その機能がＣＴＬエピトープをコードするドメインは５から１２のアミノ酸でよく、複数のエピトープをコードする場合は数百のアミノ酸でよい。所望により、ＡＦＰ中のドメインはタンパク質全体又はタンパク質全体の修飾バージョンからなることができ、これも、そのドメインがＡＦＰに含まれる理由によって決定される。
【００５７】
ドメインのアミノ酸配列は、本発明の個々のドメインの性質で決定され、以下で詳細に記載される。この点に関しては、それらの配列としては、天然の配列、修飾された配列、コンセンサス配列などがある。配列の修飾は、１つ又は複数のアミノ酸の削除、挿入又は変更によって達成することができる。新しいドメインは、アミノ酸の正常な配置を変えることによって、例えばタンパク質の異なる部分を移すことによって、作製することができる。
【００５８】
本発明のＡＦＰ中のＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＥｎｖドメインのアミノ酸配列は、特定のクレードに対する免疫応答を優先的に起こさせるために、その特定のクレードのコンセンサス配列由来でよい。代わりに、ドメインのアミノ酸配列は、選択されたクレード内で保存され、それに特有のアミノ酸配列を用いて、他のＨＩＶクレードのいずれかに対する免疫応答を起こさせるように選択することができる。ＨＩＶクレードには、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫが含まれる。ＣＲＦ由来のコンセンサス配列も使用できる。
【００５９】
コンセンサス配列の最も単純な形態は、一組の整列したタンパク質配列中のタンパク質の各位置で、最も頻繁に起こるアミノ酸を選択することによって作製することができる。このように、比較されるタンパク質の数が増加するにつれて、コンセンサス配列も変わる。異なるクレード由来のＨＩＶタンパク質のコンセンサス配列は、Los AlamosのＨＩＶデータベースによって定期的に更新され、一般人は容易に利用できる。更なるＨＩＶ分離株が分析され、クレード分類が変化するにつれて、これらの編集物は経時的に変化する可能性があるが、この変化は本発明でのコンセンサス配列の使用に影響を及ぼさない。これらの発表されたコンセンサスの配列のいずれか、又は所望の配列群に由来する任意のコンセンサス配列を、本発明で使用することができる。
【００６０】
本発明のドメインについて、同等の、対応する又は相関する（これらの用語は、互換的に使用される）アミノ酸を選択するために、当業者は、候補ＨＩＶ分離株又はコンセンサス配列を配列番号２の示されたアミノ酸と一列に並べることによって、対応する配列を決定することができ、配列のその領域でのアミノ酸の削除及び挿入が可能になる。そのような整列は、既知のＨＩＶ変動のために、正確に同じ長さのアミノ酸配列を与えることができないことは、公知である。したがって、同等配列のドメインは、小さな挿入及び欠失に対応するために、大きさが一般的に１〜１５個のアミノ酸（又はより少なく、好ましくは１〜１０個若しくは１〜５個のアミノ酸、より好ましくは１、２若しくは３個のアミノ酸）である。そのような挿入及び欠失は同等配列の内部又は末端で起こることができるが、但し、そのような長さの変更は、当業者が候補ＨＩＶ配列及び配列番号１の示された部分の間の整列を最大にする際に得るであろうものである。手動の方法又はコンピュータ化アルゴリズムを含む整列手法は、当業者に公知である（Altschul, S.F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410）。
【００６１】
ＡＦＰのドメインは、ＡＦＰの免疫原性にかなりの影響を及ぼすことなく、様々な異なる方法で配列することができる（例えば、Ｎ末端からＣ末端への線状順序で、又は化学的架橋を通して）。したがって、ＡＦＰは、免疫原性を保存し、個々のドメインの必要な特性を保存し（例えば、関連した生物的活性を廃棄する）、天然のタンパク質を再形成しない、任意の順序で配列されたドメインを有することができる。
【００６２】
ＡＦＰは、従来の化学的手法、例えば固相合成によって合成することができ、又は組換えＤＮＡ技術によって生産することができるが、後者が好ましい。個々に生産されたドメインは、精製して、化学的架橋又は当技術分野で知られている他のいかなる方法によっても結合することができる。タンパク質を生産するための合成方法、組換えＤＮＡ技術、及び化学架橋方法は、当業者に公知である。それ故に、本発明は、ＡＦＰを発現させてＡＦＰを回収するのに十分な時間及び条件下で、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって（下記参照）ＡＦＰを調製する方法を含む。ＡＦＰを回収し、且つ／又は均一に精製するために有用な方法は、当業者が決定することができる。そのような方法としては、中でも塩化セシウム遠心、オリゴヌクレオチドアフィニティークロマトグラフィ、エタノール沈殿がある。
【００６３】
本発明のＡＦＰのドメイン及び介在配列は、以下で詳細に記載する。また、本発明の好ましい一実施形態であるＨＩＶＣＯＮの記載を以下に記す。
【００６４】
ＡＦＰのＨＩＶ Ｇａｇドメインは好ましくは３つのサブドメインを含むが、Ｇａｇ配列が天然のタンパク質を形成しない限り、１つ、２つ又は任意の数のサブドメインを含むことができる。ＨＩＶ Ｇａｇサブドメインは、好ましくは４つの最も一般的なＨＩＶクレードＡ〜Ｄの間で、Ｇａｇタンパク質の最も高度に保存された領域の配列と相関し、ＨＩＶクレードＡ〜Ｄ全域にわたる変動は約６％未満である。ＨＩＶ Ｇａｇ配列は支配的なＣＴＬエピトープを含む必要はないが、当業者は、標的の細胞性免疫応答を導き出すか刺激するために、支配的なＣＴＬエピトープが豊富である配列を容易に特定して組み込むことができる。理論に縛られるものではないが、亜優占エピトープの存在が、支配的なエピトープの使用で観察される免疫優性効果をおそらく誘導することなく、防御免疫応答を導き出すか刺激することができると思われる。好ましい一実施形態において、本発明のＨＩＶ Ｇａｇ配列は、支配的なＣＴＬエピトープの存在及び存在度にかかわりなく選択される。
【００６５】
ＨＩＶ Ｇａｇ配列は同じクレードから選択することもでき、それによって本発明のＡＦＰの標的を、特定のクレードが一般的である特定の標的集団にする。ＨＩＶ Ｇａｇドメインは、クレード全域にわたって約６％を超えるかそれ未満の変動を示す配列を含む１つ又は複数のＧａｇサブドメインを含むことができる。Ｇａｇ配列は、約０〜１０％、好ましくは約０〜８％、より好ましくは約０〜６％異なることができる。ＨＩＶクレード及び送達される標的集団の間でＧａｇ配列が高度に保存されて所望の変動を示し、且つ、所望の免疫原性を保存する限り、本発明のＡＦＰでは任意のＨＩＶ Ｇａｇ配列を使用することができる。更に、ＨＩＶ Ｇａｇ配列は、ＡＦＰ内で天然のＧａｇタンパク質を生成するような構造又は配置にするべきでない。
【００６６】
本発明の好ましい一実施形態であるＨＩＶＣＯＮは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸１〜１３５を有するＨＩＶ Ｇａｇドメインを含む。本発明のＨＩＶ Ｇａｇドメインは、３つのサブドメインをＨＩＶＣＯＮに含む。ＨＩＶＣＯＮ中の３つのＧａｇサブドメインのそれぞれは、下記アミノ酸を含む。Ｇａｇサブドメイン１は、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸１〜５６を含む。Ｇａｇサブドメイン２は、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸５７〜９６を含む。Ｇａｇサブドメイン３は、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸９７〜１３５を含む（表１も参照）。
【００６７】
本発明のＡＦＰは好ましくは３つのＰｏｌドメインを含むが、選択されたＰｏｌ配列が天然のタンパク質を形成しない限り、又はそれに加えて若しくはその代わりに、それらの配列がそれらの所望の免疫原性を保持し、それらの配列がＰｏｌ酵素活性を修復しない限り、任意の数のドメイン（したがって、ドメイン内のサブドメイン）を含むことができる。そのような酵素活性には、逆転写酵素、インテグラーゼ、プロテアーゼ及びＲＮアーゼＨが含まれる。第１及び第２のＰｏｌドメインは、それぞれ好ましくは２つのＰｏｌサブドメインを含み、第３のＰｏｌドメインは好ましくは４つのＰｏｌサブドメインを含む。好ましくは、Ｐｏｌ配列は最も高度に保存され、ＨＩＶクレードＡ〜Ｄにわたって６％未満異なる配列と相関する。ＨＩＶ Ｐｏｌドメインは支配的なＣＴＬエピトープを含む必要はないが、本発明は支配的なＣＴＬエピトープが豊富である配列を選択することも企図する。好ましくは、ＨＩＶ Ｐｏｌドメインは、支配的なＣＴＬエピトープの存在及び存在度にかかわりなく選択される。
【００６８】
ＨＩＶ Ｐｏｌ配列は同じクレード及び／又はＣＲＦから選択することもでき、それによって本発明のＡＦＰの標的を特定の標的集団にする。代わりに、ＨＩＶ Ｐｏｌ配列は、異なるクレード又はＣＲＦから選択することもできる。ＨＩＶ Ｐｏｌドメインは、ＨＩＶクレード全域にわたって約６％を超えるかそれ未満の変動を示す配列を含む１つ又は複数のＧａｇサブドメインを含むことができる。ＨＩＶ Ｐｏｌ配列は、約０〜１０％、好ましくは約０〜８％、より好ましくは約０〜６％異なることができる。ＨＩＶクレード及び送達される標的集団の間でＨＩＶ Ｐｏｌ配列が高度に保存されて所望の変動を示す限り、本発明のＡＦＰでは任意のＨＩＶ Ｐｏｌ配列を使用することができる。更に、選択されたＨＩＶ Ｐｏｌ配列は、プロテアーゼ、インテグラーゼ、ＲＮアーゼ及び逆転写酵素の１つ又は全ての酵素活性が欠けていなければならない。
【００６９】
本発明の好ましい一実施形態であるＨＩＶＣＯＮは、対応する３つのＨＩＶ Ｐｏｌドメインを含む。第１のＰｏｌドメインは配列番号２又は配列番号４のアミノ酸１３６〜３９３に相関する２つのサブドメインを含み、第２のＰｏｌドメインは配列番号２又は配列番号４のアミノ酸４２２〜４８４に相関する２つのサブドメインを含み、第３のＰｏｌドメインは配列番号２又は配列番号４のアミノ酸５２２〜７２３に相関する４つのサブドメインを含む。各Ｐｏｌサブドメインのアミノ酸は、表１にまとめて示す。
【００７０】
本発明のＡＦＰのＨＩＶ Ｖｉｆドメインは、好ましくは４つの最も一般的なＨＩＶクレードＡ〜Ｄの間で、最も高度に保存された領域又はＶｉｆの領域の配列から選択され、クレード全体の変動は約６％未満である。ＨＩＶ Ｖｉｆ配列は支配的なＣＴＬエピトープを含む必要はなく、代わりに亜優占的なＣＴＬエピトープを含むことができる。当業者は、特定の標的集団で細胞性免疫応答を標的にするために、支配的なＣＴＬエピトープが豊富であるＶｉｆ領域を容易に置換することができる。好ましくは、本発明のＨＩＶ Ｖｉｆ配列は、支配的なＣＴＬエピトープの存在及び存在度にかかわりなく選択される。
【００７１】
本発明のＡＦＰに存在する他のＨＩＶ配列と比較して、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列は、多岐にわたるＨＩＶクレード及びＣＲＦから選択することができる。ＨＩＶ Ｖｉｆドメインは、ＨＩＶクレード全体で約６％を超えるかそれ未満の変動を示す配列を含むことができる。好ましくは、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列は、約０〜１０％、好ましくは約０〜８％、より好ましくは約０〜６％異なることができる。ＨＩＶクレード及び送達される標的集団の間でＶｉｆ配列が高度に保存されて所望の変動を示す限り、本発明のＡＦＰでは任意のＨＩＶ Ｖｉｆ配列を使用することができる。選択されたＨＩＶ Ｖｉｆ配列は、所望の免疫原性も保存するべきである。
【００７２】
本発明の好ましい一実施形態であるＨＩＶＣＯＮは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸３９４〜４２１を有するＨＩＶ Ｖｉｆドメインを含む。
【００７３】
好ましくは本発明のＡＦＰは、少なくとも２つのＥｎｖドメインを含む。好ましくはＥｎｖドメインは、最も高度に保存され、ＨＩＶクレードＡ〜Ｄにわたって６％未満の変動を示す配列と相関する。ＨＩＶ Ｅｎｖドメインは支配的なＣＴＬエピトープを含む必要はないが、本発明は支配的なＣＴＬエピトープが豊富であるＥｎｖ配列を選択することも企図する。そのような置換は、特定のクレード又はＣＲＦが支配的である特定の集団を標的にすることができる強化された細胞性免疫応答を起こすことができた。好ましくは、ＨＩＶ Ｅｎｖドメインは、支配的なＣＴＬエピトープの存在及び存在度にかかわりなく選択される。
【００７４】
特定のＨＩＶクレードを標的にしたＡＦＰの設計では、ＨＩＶ Ｅｎｖ配列はそのＨＩＶクレード又はＣＲＦから選択することもでき、それによって本発明のＡＦＰの標的を特定の標的集団にする。ＨＩＶ Ｅｎｖ配列は、ＨＩＶクレード全体で約６％未満の変動を示す配列を含むことができる。Ｅｎｖ配列は、約０〜１０％、好ましくは約０〜８％、より好ましくは約０〜６％異なることができる。ＨＩＶクレード及び送達される標的集団の間でＥｎｖ配列が高度に保存されて所望の変動を示し、且つ、所望の免疫原性を保存する限り、本発明のＡＦＰでは任意のＨＩＶ Ｅｎｖ配列を使用することができる。
【００７５】
表１は、本発明の好ましい一実施形態であるＨＩＶＣＯＮの各ＨＩＶドメインを示し、各ドメインのサブドメイン及び配列番号２に対応する適当なアミノ酸を含む。同じアミノ酸配列が、配列番号２の同じ位置で見られる。
【００７６】
【表１】
2010189397.tif 000003
【００７７】
本発明のＡＦＰは、ＡＦＰの特性評価及びモニターに役立つように、更なる非ＨＩＶドメインを有することができる。好ましくは、そのようなドメインはＡＦＰのＮ末端及び／又はＣ末端にあるが、それらはＡＦＰのＨＩＶドメインの間に挿入することもできる。例えば、更なるドメインは、ポリペプチドの処理に影響を及ぼす細胞内又は細胞外のシグナル若しくは部位（例えば、プロテアーゼ切断部位、細胞内局在化若しくは輸送のためのシグナル配列、又はそのような他の配列）、タンパク質精製を助ける部位、及び／又はタンパク質局在化を助ける部位をコードすることができる。タンパク質精製又は局在化に有用な部位としては、親和性結合を可能にする配列がある。例えば、当技術分野で公知である抗体によって認識されるエピトープ（例えば、それらには限定されないが、Ｐｋ、Ｆｌａｇ、ＨＡ、ｍｙｃ、ＧＳＴ又はＨｉｓ）を含めることができる（Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998）。本発明のある実施形態では、例えば配列番号４のＨＩＶＣＯＮ免疫原においては、Ｐｋエピトープタグが使用される。これは、モノクローナル抗体（ｍＡＢ）によって結合されるエピトープである。このエピトープはＰｋ又はＰｋタグと呼ばれ（ｍＡｂクローン「ｋ」から）、ＳＶ５ウイルスリンタンパク質Ｐ由来である。Ｐｋエピトープのアミノ酸配列は、IPNPLLGLD（配列番号６）であり、配列番号４の最後の９個のアミノ酸（アミノ酸７９８〜８０６）である。更なるドメインは実験動物（例えばサル又はマウスのＣＴＬエピトープ）で免疫原性であることもでき、それによって、発達研究、前臨床試験、及び、おそらく、臨床応用の間にＡＦＰをモニターする更なる方法を提供する。そのような更なる免疫原性ドメインを使用する場合、ＨＩＶ特異免疫応答の刺激に対する干渉又は競合を避けるために、そのようなドメインの数は最小にするべきであり、好ましくは多くても３つ又は４つにする。
【００７８】
好ましい一実施形態において、ＡＦＰは１つ又は複数の実験動物、例えばマウス、ヒト以外の霊長類（チンパンジー、アカゲザル及び他の猿などを含む）、ウサギ、ラット又は他の適当な実験動物の免疫系によって認識される少なくとも１つのヒト以外のＣＴＬエピトープを有するドメインを有する。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子は、これらのエピトープペプチドをＴ細胞に提示する。アカゲザル（Macaca mulata）については、ＭＨＣ分子はＭａｍｕと呼ばれ、マウスの場合、それは伝統的にＨ―２と呼ばれ、ヒトの場合は、それはＨＬＡと呼ばれる。ヒト以外のＣＴＬエピトープが含有することは、実験試験動物を使った、異なるバッチのＡＦＰの特質、再現性及び／又は安定性の評価を可能にする。そのようなエピトープの例としてはアミノ酸配列STPESANL（配列番号７）があり、それは、アカゲザルＣＴＬによって認識されるサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ｔａｔタンパク質由来のＭａｍｕ―Ａ＊０１制限エピトープ（以下、「ＳＩＶ ｔａｔ ＣＴＬエピトープ」、Allen et al., (2000b) Nature 407:386-390）である。他の例はSYIPSAEKI（配列番号８）であり、それはPlasmodium berghei由来のマウスＨ―２Ｋｄ制限ＣＴＬエピトープであって、ｐｂ９エピトープとも呼ばれる（Romero et al., (1989) Nature 341: 323-326）。他の適当なエピトープが知られており、アミノ酸配列ACTPYDINQML（配列番号９）がその例であって、アカゲザルＣＴＬによって認識されるＳＩＶ Ｇａｇ ｐ２７由来のエピトープ（本明細書では「ＳＩＶ Ｇａｇ ｐ２７エピトープ」と呼ぶ）を含む。ACTPYDINQML（配列番号９）エピトープは、配列番号４のＨＩＶＣＯＮ免疫原に存在する（アミノ酸位置７７８〜７８８。図５を参照）。他の適当なエピトープはCTPYDINQM（配列番号１０）（ｐ１１Ｃ、Ｃ―Ｍ）であり、Ｍａｍｕ―Ａ＊０１ ＭＨＣによってＣＤ８Ｔ細胞に提示されるＳＩＶ gag ｐ２７エピトープである。CTPYDINQM（配列番号１０）エピトープは、配列番号４のＨＩＶＣＯＮ免疫原に存在する（アミノ酸位置７７９〜７８７。図５を参照）。他の適当なエピトープは配列RGPGRAFVTI（配列番号１１）を有し、それは、Ｐ１８―Ｉ１０エピトープとしても知られるＨＩＶ ｇｐ４１タンパク質由来のマウスＨ―２ｋ制限ＣＴＬエピトープであり、本明細書では「Ｐ１８―Ｉ１０エピトープ」と呼ぶ。RGPGRAFVTI（配列番号１１）エピトープは、配列番号４のＨＩＶＣＯＮ免疫原に存在する（アミノ酸位置７９０〜７９８。図５を参照）。適当なヒト以外のＣＴＬエピトープは既知であるか、又は、実験動物でＣＴＬを特定することが知られている手法を使って、当業者が容易に決定することができる。
【００７９】
ＡＦＰは、発現の検出、位置確認、ＡＦＰ量の定量及び／又はＡＦＰの精製を可能にするために、小さなタグ又はマーカーであるドメインを含むこともできる。適当なタグとしては、それらには限定されないが、ｍＡｂによって認識されるエピトープ、例えばＰｋ ｍＡｂによって認識されるエピトープIPNPLLGLD（配列番号６）がある（Hanke et al., (1992) J. Gen. Virol. 73:653-660）。IPNPLLGLD（配列番号６）エピトープは、配列番号４のＨＩＶＣＯＮ免疫原に存在する（アミノ酸位置７９９〜８―６。図５を参照）。他の適当なタグとしては、ＨＡ抗体によって認識されるエピトープYPYDVPDYA（配列番号１２）、Ｆｌａｇ抗体によって認識されるエピトープDYKDDDDK（配列番号１３）、ＶＳＶ―Ｇ Ｔａｇ抗体によって認識されるエピトープYTDIEMNRLGK（配列番号１４）、及びＧｌｕ―Ｇｌｕ抗体によって認識されるエピトープEYMPME（配列番号１５）がある。当業者は、ＡＦＰに含有させるために、適当なタグ及びマーカーを容易に選択することができる。
【００８０】
ＡＦＰのＨＩＶドメインは、タンパク質中で連続していてもよい。代わりに、それらは介在アミノ酸配列によって分離されていてもよい。介在アミノ酸配列は、通常、非ＨＩＶ配列であるが、少数の更なるＨＩＶアミノ酸を含むこともできる。存在する場合、介在配列は長さが介在配列ドメインにつき１〜２０個のアミノ酸であって、好ましくは１０個未満のアミノ酸、より好ましくは２〜５個のアミノ酸である。例えば、介在配列はＡＦＰの発現レベルを最適化するリンカー、スペーサ又は他の配列であってもよい。介在配列は、免疫原性の最適化のために用いることができる。介在配列は、有用な制限部位を含ませるために、又はＡＦＰのドメインが間違いなく「インフレーム」（例えば、組換えで生産されたＡＦＰのために）で連結されるために、便利な手段として加えることもできる。
【００８１】
本発明のＡＦＰの１例は、ＨＩＶＣＯＮである。ＨＩＶＣＯＮは７７７個のアミノ酸を有するＡＦＰであり、７つのＨＩＶドメイン（配列番号２、図３）及び、任意選択で、３つの更なるドメイン（配列番号４、図５、の場合のように）を有する。ＨＩＶＣＯＮの概略図を図１に示す。ＨＩＶＣＯＮタンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＨＩＶ Ｇａｇドメイン、第１のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン（２つのＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインを含む）、ＨＩＶ Ｖｉｆドメイン、第２のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン（２つのＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインを含む）、第１のＨＩＶ Ｅｎｖドメイン、第３のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン（４つのＨＩＶ Ｐｏｌサブドメインを含む）、第２のＨＩＶ Ｅｎｖドメイン及び、任意選択で、ＳＩＶ ｐ２７ ＣＴＬエピトープ、マウスＣＴＬエピトープＰ１０―Ｉ１８及びｍＡｂエピトープＰｋを含む。ＨＩＶＣＯＮは、介在配列を含まない。ＨＩＶＣＯＮ配列番号４（及び、最後の３つのドメインを除く配列番号２）の８０６個のアミノ酸のためのドメインの相互関係は、Ｎ末端からＣ末端にかけて以下の通りである。
・アミノ酸１〜１３５、ＨＩＶ Ｇａｇドメイン
・アミノ酸１３６〜３９３、第１のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン（両方のサブドメインを含む）
・アミノ酸３９４〜４２１、ＨＩＶ Ｖｉｆドメイン
・アミノ酸４２２〜４８４、第２のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン（両方のサブドメインを含む）
・アミノ酸４８５〜５２１、第１のＨＩＶ Ｅｎｖドメイン
・アミノ酸５２２〜７２３、第３のＨＩＶ Ｐｏｌドメイン（４つ全てのサブドメインを含む）
・アミノ酸７２４〜７７７、第２のＨＩＶ Ｅｎｖドメイン
・アミノ酸７７８〜７８８、ＳＩＶ Ｇａｇ ｐ２７ ＣＴＬエピトープ
・アミノ酸７８９〜７９８、マウスＣＴＬエピトープＰ１８―Ｉ１０、及び
・アミノ酸７９９〜８０６、ｍＡｂエピトープＰｋ
【００８２】
ＨＩＶＣＯＮ内のＨＩＶドメインは、ＨＩＶ―１クレードＡ〜Ｄコンセンサス配列由来である。各ドメイン中の各サブドメインを含む各ドメインに対応するアミノ酸、並びにそれらの対応するＨＩＶクレードは、表１で示す。
【００８３】
本発明の他の態様は、全体で本発明のＡＦＰの全長に、有利には配列番号２又は配列番号４に対応する配列を含むポリペプチド及びポリペプチドライブラリーに関する。代わりに、ポリペプチド又はポリペプチドのライブラリーが、本発明のＡＦＰの、有利には配列番号２又は配列番号４の一部又は断片に対応することができる。本発明のポリペプチドライブラリーは、とりわけ、抗原提示細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩなどの細胞受容体と結合する、ＡＦＰの特定の配列又はエピトープを詳細に解明して更に定義するために使用することができる。ポリペプチドライブラリーは短いアミノ酸配列のプールを含むことができ、それらは単一アミノ酸から１００個のアミノ酸の大きさ、又はそれよりも長くてよい。しかし、ＭＨＣ受容体は長さが約８〜１５アミノ酸の短いアミノ酸配列を認識することは、当技術分野で公知である。したがって、配列番号２又は配列番号４の８から１５個のアミノ酸、好ましくは１５個の連続したアミノ酸であるポリペプチドを合成することが好ましい。
【００８４】
各ポリペプチドは、重複する配列を伴い、又は伴わず合成することができる。一部の応用では、特にエピトープの特定の配列が所望のとき、ポリペプチド中の重複配列の存在は、配列番号２又は配列番号４の全てのアミノ酸配列がポリペプチドライブラリーに含まれることを確実とすることができる。重複する配列は、ポリペプチドの長さに応じて１〜１５個のアミノ酸を含むことができる。本発明の好ましい実施形態では、各ポリペプチドは１５個の連続したヌクレオチドを含み、アミノ酸のうちの１１個は重複する。
【００８５】
ポリペプチドの合成は、化学的ペプチド合成、固相合成などによるインビトロでよく、又は、短いアミノ酸配列をコードするＲＮＡの無細胞インビトロ翻訳（例えば、それらには限定されないが、ウサギ網状赤血球溶解物、小麦麦芽抽出物）を通してもよい。代わりに、ポリペプチドはプロデューサー細胞内で、関心のポリペプチドをコードする核酸配列から組換えで合成することができる。ポリペプチドの精製は、当技術分野で公知の方法、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、既知のエピトープがポリペプチド配列中に含まれて利用できるモノクローナル及び／又はポリクローナル抗体によって認識される場合は免疫沈降反応、イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、等電集束法、ゲル電気泳動、又は各精製段階でポリペプチドを追跡するモニター手法を使うこれらの方法の組み合わせによって実行することができる。
【００８６】
各ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４の特定の部分又は断片に対応し、ライブラリー内の全てのポリペプチドの総計は配列番号２又は配列番号４の全長に対応する。このことは、関心のＣＴＬエピトープを特定するためにアミノ酸配列全体を「スキャンする」ために、配列番号２又は配列番号４の全てのアミノ酸配列がライブラリー内のポリペプチドに包含されることを確実にするためである。ポリペプチドは合成されて、それらの配列類似性に従ってプールされる。次いでプールされたポリペプチドのライブラリーを使用して、本発明のＡＦＰを投与された細胞若しくは対象で、又は感染細胞若しくは感染した対象で、ＨＩＶに対するＣＴＬ反応の特異性を決定することができる。
【００８７】
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩタンパク質を発現する細胞で本発明のポリペプチドライブラリーからＨＩＶに対するＣＴＬエピトープを特定する方法も提供し、その方法は、本発明のライブラリーと細胞を接触させる段階と、ライブラリーを細胞のＭＨＣタンパク質と選択的に結合する段階と、ＭＨＣと選択的に結合するライブラリーのポリペプチドを単離する段階と、ポリペプチドの配列決定をすることによってＣＴＬエピトープを特定する段階とを含む。
【００８８】
本発明の方法で役立つ細胞は、抗原提示細胞である。抗原提示細胞はＭＨＣクラスＩタンパク質を発現し、それらは主に感染に対してＴリンパ球媒介反応を導き出すエピトープの結合及び制限に関係する。ＭＨＣクラスＩ分子は通常ウイルスである病原体由来のペプチドをＣＤ８＋ＣＴＬに提示するが、それらは、それらが特異的に認識するいかなる細胞も殺すように特殊化される。そのような抗原提示細胞としては、それらには限定されないが、樹状細胞、マクロファージ、単球、単核細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び脾細胞がある。それらの細胞はＨＩＶに感染した対象に由来することもでき、又は、インビトロでウイルス又はウイルス配列に感染又はトランスフェクションした細胞でもよい。好ましくは、細胞は本発明のＡＦＰを免疫接種又は投与されている。既にＡＦＰ又は他のＨＩＶ配列又はウイルスを投与されたこれらの細胞は、好ましくは細胞又は組織培養条件下で、本発明のライブラリーと接触させる。ヒト細胞を使用するときは、ＭＨＣクラスＩ受容体はヒト白血球抗原又はＨＬＡである。本発明は、ヒト以外の、好ましくは実験用の動物種の細胞、例えば、それらには限定されないが、ヒトＭＨＣ又はＨＬＡで一過性又は安定的にトランスフェクションされるサル細胞、ラット細胞又はマウス細胞も包含する。ヒトＨＬＡを発現する実験動物の例は、Carmon, L., et al (2002) J. Clin. Invest. 110: 453-462で記載されるＨＨＤ遺伝子導入マウスである。異なるＨＬＡ／ＭＨＣサブタイプ及び対立遺伝子は、本発明の免疫原性ポリペプチド及び関心の特定集団で支配的であることが知られている特定のＨＬＡ／ＭＨＣ対立遺伝子の間の相互作用の性質を更に解明するために使用することができる。代わりに、それぞれＭＨＣの異なる対立遺伝子を発現する多くの異なる対象に由来する細胞を、本発明の方法で使用することができる。
【００８９】
次に本発明のライブラリーは、通常、培地へのライブラリーの添加によって、細胞表面に存在するＭＨＣクラスＩ受容体と選択的に結合することが可能になる。ライブラリーの特定のポリペプチドの選択的な結合の後、ＭＨＣクラスＩと結合するポリペプチドが単離及び配列決定され、それによってＣＴＬエピトープが特定される。細胞のＭＨＣクラスＩ受容体への関心のポリペプチドの選択的結合は、フローサイトメトリーによってモニターすることができるが、受容体―ポリペプチド相互作用の結合定数を求めることによってもモニターすることができる。このことは、当技術分野で知られている標準の酵素反応速度アッセイによって達成することができる。好ましくは、フローサイトメトリー（当技術分野では蛍光活性化細胞選別、ＦＡＣＳとしても知られている）が使用される。細胞表面ＭＨＣ受容体へのペプチド結合を測定するために間接的ＦＡＣＳを使う方法は、Carmon, L., et al (2002) J. Clin. Invest. 110: 453-462で記載されている。簡潔には、本発明のポリペプチドライブラリーを加えた細胞は、抗ＭＨＣ抗体とインキュベートされる。洗浄後、蛍光タグ（即ち、とりわけフルオレセインイソチオシアネート）を有する二次抗体を抗ＭＨＣ抗体に結合した後、結合抗体の量をＦＡＣＳ分析で測定する。
【００９０】
得られた関心のポリペプチドは当技術分野で公知の手法によって、例えば、それらには限定されないが、逆相高速液体クロマトグラフィー、アセトン沈殿、硫安塩析、トリフルオロ酢酸沈殿、及び本明細書で述べられているクロマトグラフィー方法で単離することができる。次いで単離されたポリペプチドは、ＭＨＣに対する結合配列の正確な境界を決定するために、配列決定を施す。当技術分野で公知の配列決定方法としては、それらには限定されないが、エドマン分解（Ｎ末端配列決定としても知られている）、タンデム型質量分析、及びマトリックスアシスティドレーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）がある。
【００９１】
本発明は、本発明のライブラリーを使用してＣＴＬエピトープを特定する方法のハイスループットな自動化も包含する。免疫蛍光法による抗ＭＨＣ抗体の結合の以降の検出のために、１つ又は複数のポリペプチドライブラリーを、固体支持体、例えばセルロース、又はシリコンアレイの上で合成することができる。ＭＨＣクラスＩ受容体とのポリペプチドの結合に対応する相対蛍光は自動的に測定することができるので、適当なＣＴＬエピトープについて何百又は何千のポリペプチド配列を効率的にスクリーニングすることが可能になる。
【００９２】
本発明の免疫原性ポリペプチドは、例えば、本発明のＡＦＰに対してモノクローナル及びポリクローナル抗体を宿主動物内で生産するために、体液性反応を導き出すための免疫原又は抗原として使用することもできる。このような宿主動物としては、それらには限定されないが、ウサギ、マウス及びラットを挙げることができる。免疫性応答を増加させるために宿主種に従って様々なアジュバントを使用することができ、例としては、それらには限定されないが、フロイント（完全及び不完全な）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメットゲラン菌）などの潜在的に有用なヒトアジュバント及びCorynebacterium parvumがある。
【００９３】
本発明の他の態様は、本発明のＡＦＰをコードする核酸分子に関する。本明細書で使用される「核酸分子」又は「核酸」は、任意のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を意味し、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド又は合成核酸を含むが、これらには限定されない。核酸は一本鎖、又は、部分的若しくは完全に二本鎖（二重鎖）でよい。二重鎖核酸は、ホモ二本鎖でもヘテロ二本鎖でもよい。本発明の核酸分子はＡＦＰをコードするヌクレオチド配列を有し、ＡＦＰ遺伝子が発現される（又は発現される予定の）対象の高度に発現される遺伝子で使用されるコドンを用いるように設計することができる。一般的に、核酸は単一の読取り枠（ＯＲＦ）として、つまり、イントロンを含まない、ＡＦＰのコード配列全体を有する。
【００９４】
異なる細胞は、特定のコドンのそれらの使用法が異なる。このコドンバイアスは、特定の細胞型内の特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の相対存在度における偏りに対応する。ＨＩＶ及び他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは多数の稀なコドンを使い、一般的に用いられる哺乳類のコドンに対応させるためにこれらを変化させることによって、細胞内での免疫原の発現増強を達成することができる。対応するｔＲＮＡの相対存在度と一致させるために配列中のコドンを変化させることによって、ＡＦＰの発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型で稀であることが知られているコドンを故意に選択することによって、ＡＦＰの発現を減少させることが可能である。このように、ある程度の更なる翻訳調節が利用できる。コドン最適化の全体的な影響は、例えばＡＦＰがウイルスベクターから発現される場合はウイルスの力価の増加、及び、対象での安全性の改善がある。コドン利用表は、哺乳動物細胞並びに様々な他の生物体について、当技術分野で公知である。
【００９５】
好ましい一実施形態において、ＡＦＰをコードするコドンは「ヒト化」コドンであり、即ち、コドンはＨＩＶによって多用されるコドンの代わりに、高度に発現されるヒト遺伝子中にしばしば現れるそれらである（Andre et al., J. Virol. 72:1497-1503, 1998）。そのようなコドン利用は、ヒト細胞でのＡＦＰの効率的な発現を可能にする。他の実施形態では、例えば、ＡＦＰが細菌、酵母又は他の発現系で発現される場合、コドン利用パターンが変更されて、ＡＦＰが発現している生物体で高度発現遺伝子に対するコドンバイアスを表す。コドン利用パターンは、多くの種の高度発現遺伝子について文献で知られている（例えば、Nakamura et al., (1996) Nucl. Acids Res. 24: 214-215、Wang et al, (1998) Mol. Biotechnol 10: 103-106、McEwan et al. (1998) Biotechniques 24:131-136）。
【００９６】
ＨＩＶＣＯＮの核酸配列を、最後の３つの更なるドメインをコードするヌクレオチドを有する代替形態（配列番号３）及び有さない代替形態（配列番号１又は配列番号５）で提供する。本発明の一実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１又は配列番号５で提供されるＨＩＶＣＯＮコード配列をコードするヌクレオチドを含む（配列番号１のヌクレオチド１又は配列番号５のヌクレオチド３０から始まって、終止コドンまで続く）。本発明の他の実施形態では、本発明の核酸は、配列番号３で提供されるＨＩＶＣＯＮコード配列をコードするヌクレオチドを含み、それは３つの更なるエピトープを含むヌクレオチドを含む（配列番号３のヌクレオチド１から始まって、終止コドンまで続く）。本発明の他の実施形態では、本発明の核酸は、それぞれ図２、４及び６で示すように、基本的に配列番号１、配列番号３又は配列番号５の配列からなる。
【００９７】
本発明のＡＦＰをコードする核酸分子を発現ベクターに組み込んで、対象を免疫接種するために、又は、一般的にタンパク質生産又はＲＮＡ生産のためにタンパク質をインビトロで発現させるために使用することができる。
【００９８】
本明細書で使用されるように、「ベクター」は、１つの環境から別の環境への実体の移動を可能にするか助長する手段である。例示のために、組換えＤＮＡ技術で使用する一部のベクターは、ＤＮＡの断片（例えば異種ＤＮＡ又はｃＤＮＡ部分）などの実体の標的細胞への移動を可能にする。本発明は、ウイルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクター、ＤＮＡプラスミドベクター又はそれらの組換え体を含むことができる組換えベクターを包含する。
【００９９】
ベクター内での発現のための外来性ＤＮＡ（例えば、関心のエピトープ及び／又は抗原及び／又は治療剤をコードする）及びそのような外来性ＤＮＡを提供する文書に関し、並びに核酸分子の発現を強化するための転写及び／又は翻訳因子の発現に関し、及び、とりわけ「関心のエピトープ」、「治療的」、「免疫応答」、「免疫学的応答」、「防御免疫応答」、「免疫組成物」、「免疫原性組成物」及び「ワクチン組成物」などの用語に関して、１９９９年１１月２３日発行の米国特許第５９９００９１号、並びに国際公開９８／００１６６及び国際公開９９／６０１６４、並びにその中で引用されている文書、並びにその特許及びそれらのＰＣＴ出願の手続きの記録文書が参照され、それらの全ては本明細書で参照により組み込まれている。このように、米国特許第５９９００９１号並びに国際公開９８／００１６６及び国際公開９９／６０１６４、並びにその中で引用されている文書、並びにその特許及びそれらのＰＣＴ出願の手続きの文書又は記録、並びに本明細書で引用されるか、さもなければ参照により組み込まれる他の文書は、本発明の実施に際して参考にすることができ、また、その中で引用されている全ての外来性の核酸分子、プロモーター及びベクターは、本発明の実施に際して使用することができる。この点に関しては、米国特許第６７０６６９３号、同第６７１６８２３号、同第６３４８４５０号、米国特許出願１０／４２４４０９、１０／０５２３２３、１０／１１６９６３、１０／３４６０２１、及びＰＣＴ／ＵＳ９８／１６７３９から１９９９年２月２５日に公開された国際公開９９０８７１３にも言及している。
【０１００】
発現ベクターは当技術分野で公知であり、本発明については、タンパク質の転写及び翻訳を指示する調節又は核酸制御配列に「作動可能に結合した」タンパク質コード配列を有するという共通した特徴を共有する。本明細書で使用されるように、ＡＦＰコード配列及び核酸制御配列は、それらがＡＦＰコード配列の発現又は転写及び／又は翻訳を核酸制御配列の影響下又は制御下に置くように共有結合している場合、「作動可能に結合した」と言われる。「核酸制御配列」は任意の核酸要素でよく、例えば、それらには限定されないが、プロモーター、エンハンサー、ＩＲＥＳ、イントロン、及び、核酸配列又はそれに作動可能に結合したコード配列の発現を指示する本明細書記載の他の要素でよい。５’遺伝子発現配列の核酸制御配列、例えばプロモーターの誘導がＡＦＰ配列の転写をもたらし、また、２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさず、（２）抗原配列の転写を指示するプロモーター領域の能力に干渉せず、（３）タンパク質に翻訳される対応ＲＮＡ転写物の能力に干渉しないならば、２つのＤＮＡ配列は作動可能に結合していると言われる。このように、核酸制御配列がそのＡＦＰ核酸配列の転写をもたらすことができ、得られた転写産物が所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳されるならば、その核酸制御配列はそのＡＦＰ核酸配列に作動可能に結合するであろう。
【０１０１】
発現ベクター中のプロモーター、エンハンサーなどの核酸制御配列は、宿主に対してしばしば異種性である。用語「プロモーター」は、本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼIIの開始部位のまわりに集まり、また、作動可能にＡＦＰに結合されたときにＡＦＰ発現へ導く、一群の転写調節モジュールに言及するために使用する。プロモーターは、通常、それぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡから成り、転写性活性化タンパク質のために１つ又は複数の認識部位を含む、別々の機能モジュールから構成される。プロモーター中の少なくとも１つのモジュールが転写開始点の位置を決める働きをすることができ、他のモジュールは転写開始の頻度を調節することができる。「エンハンサー」は、同じＤＮＡ分子内の離れた所に位置するプロモーターからの転写を増加させる、遺伝因子と説明することができる。プロモーターと同様に、エンハンサーは多くの個々のモジュールから構成されることができ、それぞれは１つ又は複数の転写タンパク質と結合する。プロモーター及びエンハンサーは細胞内で転写を活性化するという同じ一般機能を有するが、それらの機能の間には明らかな相違がある。エンハンサーは、定義上、離れた所の転写を刺激し、特定の部位での転写開始を指示する必要はない。一方、プロモーターのモジュールは、特定の部位からの特定の向きの転写開始を指示しなければならない。
【０１０２】
発現ベクター内でのＡＦＰヌクレオチド配列の発現は、このように構成プロモーター又は誘導性プロモーターの管理下にあることができるが、それは宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激、例えば、それらには限定されないが、テトラサイクリンのような抗生物質、エクジソンのようなホルモン類又は重金属にさらされたときだけ転写を開始する。動物などの多細胞生物の場合、プロモーターは特定の組織又は臓器に特異的であってもよい。本発明の様々な実施形態としての、ベクターの構築で用いることができる様々なプロモーター及びエンハンサー因子は、米国特許第６８３５８６６号で述べられ、その内容は本明細書で参照により組み込まれている。更に、Eukaryotic Promoter Database（ＥＰＤＢ）に従う任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせを、本発明のＡＦＰの発現を促進するために使用することができる。
【０１０３】
発現ベクターは、細菌、真菌類、酵母、動物（哺乳動物、特にヒトを含む）、鳥類、昆虫、植物などを含む多くの生物体について公知であり、利用することができる。動物には、それらには限定されないが、哺乳動物（ヒト、霊長類、その他）、商用の又は飼育動物（魚類、ニワトリ、乳牛、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、七面鳥、その他）、研究動物（マウス、ラット、ウサギ、その他）及びペット（イヌ、ネコ、インコ及び他のペット用の鳥類、魚類、その他）が含まれる。
【０１０４】
したがって、本発明の発現ベクターは、タンパク質が発現されるかＲＮＡが生産されるかに従って転写及び／又は翻訳の核酸制御配列に作動可能に結合した、本発明のＡＦＰのコード配列を有する。本発明の発現ベクターは、ＡＦＰをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの生産を含む、特定の宿主細胞でＡＦＰ又はＡＦＰをコードする核酸の発現を達成するために役立つ。同様に、本発明の発現ベクターとしては、宿主対象にＡＦＰ（タンパク質又は核酸として）を送達するために役立つ、プラスミド、リポソーム、微生物及びウイルスのベクターが挙げられる。
【０１０５】
本発明の発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクター、昆虫ベクター、酵母ベクター、哺乳動物細胞ベクターなどがある。発現ベクターが複製又は自己増幅できるかは、使用するベクター及びその選択理由次第である。特定された状況下でＡＦＰを発現するための要件を考慮すると、そのような特性は当業者が容易に決定することができる。
【０１０６】
本発明の発現ベクターとしては、実験動物、哺乳動物、好ましくはヒト対象でのＡＦＰの発現のために使用されるものがある。これらのベクターは、コードされたＡＦＰに対して免疫応答を刺激するために、動物、哺乳動物又はヒト対象に免疫接種をするために特に役立つ。この点に関して有用な発現ベクターとしては、細菌ベクター、ウイルスベクター、プラスミド、及び核酸（プラスミド又はウイルス由来の）を使うリポソーム製剤がある。細菌ベクターについては、好ましいベクターは、宿主内での細菌担体の増殖を予防するために、又は疾患若しくは他の有害な病理学的影響につながることのない自己制御増殖だけを可能にするように弱毒化される。死菌も役立つ。宿主内での使用安全性を提供するためにも、ウイルスベクターは好ましくは弱毒化されるか、又は複製に欠陥がある。プラスミドを使用するときは、ヒトで機能する複製起点が欠けていてもよい。
【０１０７】
ある好ましい実施形態において、pTH又はpTHrベクターが使用される。pTHベクターの構築は、Hanke et al, 1998 Vaccine 16, 426-435で記載される。pTHは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）系統ＡＤ１６９ゲノムの発現効率的エンハンサー／プロモーター／イントロンＡカセットを含む（Whittle et al, 1987 Protein Eng. 1, 499-505、Bebbington 1991 Methods 2, 136-145）。プロモーター領域の後には、ウシ成長ホルモン遺伝子のｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）由来のポリリンカー及びポリアデニル化シグナルが続く。形質転換細菌にアンピシリン抵抗性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子及び原核生物の二本鎖ＤＮＡ複製起点Ｃｏ１Ｅ１の両方は、プラスミドpUC19に由来する。pTHベクターは、哺乳動物細胞の複製起点を含まない。
【０１０８】
pTHrベクターは、ベータラクタマーゼ／アンピシリン耐性遺伝子の削除によって、pTHに由来する。そのベクターは、Cobra Pharmaceuticals社（Keele, UK）によって開発された、プラスミド上の抗生物質耐性遺伝子の存在の必要なしでプラスミド運搬細菌を選択するリプレッサ―滴定系を使って、細菌内で増殖させられる（米国特許第５９７２７０８号及びWilliams et al, 1998 Nucl. Acids Res. 26, 2120-2124を参照）。pTHrベクターは抗生物質耐性遺伝子の多数のコピーを、ワクチン接種を受けた人に導入しないので、特にヒトでの使用に最適である。したがって、一実施形態では、本発明のＨＩＶＣＯＮ免疫原をコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡワクチンとしてヒトにベクターを投与するために、pTHrベクターに組み込まれる。
【０１０９】
ヒト、哺乳動物又は実験動物での使用に安全ないかなるプラスミドベクターも、並びに、原核生物又は真核生物の発現系からのタンパク質精製に役立ついかなるプラスミドベクターも、本発明に従う使用が企図される。
【０１１０】
ウイルスの発現ベクターは当業者に公知であり、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、レトロウイルス及びポックスウイルス、例えばアビポックスウイルス、弱毒化ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、及び、特に、修飾された種痘疹アンカラウイルス（ＭＶＡ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＶＲ―１５６６）などのウイルスがある。そのようなウイルスは、発現ベクターとして使用されたとき、選択されたヒト宿主では生来非病原性であるか、又は、選択された宿主でそれらを非病原性にするために変更されている。例えば、複製に欠陥があるアデノウイルス及びアルファウイルスは公知であり、遺伝子送達ベクターとして使用することができる。好ましいウイルスベクターはＭＶＡであり、それはほとんどの哺乳動物細胞で複製することのない、高度に弱毒化されたワクシニア株である（Mayr et al., (1975) Infection 105:6-14）。ＡＦＰはＭＶＡの多くの部位にクローニングすることができ、対象、特にヒト対象に免疫接種をして、コードされたＡＦＰに対してＨＩＶ特異免疫応答を起こさせるために使用することができる。役立つＭＶＡクローニング部位としては、例えば、チミジンキナーゼ及び欠失III座がある（Chakrabarti et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3403-3409、Meyer, H. et al (1991) J. Gen. Virol. 72: 1031-8、Altenburger, W. et al (1989) Arch. Virol. 105(1-2): 15-27）。
【０１１１】
ある種のポックスウイルス、例えばＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ及びアビポックスウイルスは、鳥類の種又は鳥類の細胞系、例えばニワトリの胚の線維芽細胞でのみ生産的に複製することができるか、継代培養することができる点に注意しなければならない。鳥類の宿主細胞から収集された組換えポックスウイルスは、ワクシニアウイルスによる哺乳動物の接種に類似した方法で鳥類外の脊椎動物、例えば哺乳動物に接種されたときに接種病変を生じるが、アビポックスウイルスの生産的な複製はない。そのような接種された鳥類外の脊椎動物でＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ及びアビポックスウイルスなどのある種のポックスウイルスが生産的に複製することができないにもかかわらず、接種動物が組換えポックスウイルスの抗原決定基に、更に、その中の外来性の遺伝子にコードされた抗原決定基に対しても免疫学的に応答するのに十分なウイルス発現は起こる。このように、一実施形態では、ある種のポックスウイルス又はウイルスベクター（上で開示されるような）を使用するときは、ニワトリの胚の線維芽細胞がウイルスベクター複製を許容する細胞として好ましい。
【０１１２】
組換えウイルスベクター及び組換えウイルスは、本発明のＡＦＰに作動可能に結合したプロモーターを含むことができる。ポックスウイルスのベクターに含まれるとき、プロモーターは有利にはポックスウイルス起源であり、特に、ワクシニアウイルスのプロモーター７．５Ｋ、Ｉ３Ｌポックスウイルスプロモーター、１１Ｋポックスウイルスプロモーター（米国特許第５０１７４８７号）、４２Ｋポックスウイルスプロモーター、Ｈ６ポックスウイルスプロモーター、チミジンキナーゼポックスウイルスプロモーター、Ｅ３Ｌポックスウイルスプロモーター、Ｋ３Ｌポックスウイルスプロモーター又は合成ポックスウイルスプロモーターであることができる。プロモーターは、有利には「初期の」プロモーターでよい。「初期の」プロモーターは当技術分野で公知であり、デノボタンパク質合成がない場合、迅速且つ一過性に発現される遺伝子の発現を促進するプロモーターと定義される。プロモーターは、「強力な」又は「弱い」プロモーターでもよい。用語「強力なプロモーター」及び「弱いプロモーター」は当技術分野で公知であり、プロモーターでの転写開始の相対頻度（１分あたりの回数）によって定義することができる。「強力な」又は「弱い」プロモーターは、ポックスウイルスＲＮＡポリメラーゼとのその親和性によっても定義される。
【０１１３】
本発明は、突然変異したウイルスプロモーターも提供する。理論に束縛されないが、ウイルスベクターから発現される潜在的に毒性の異種配列の高レベルの発現は、安定したウイルス組換え体の形成を排除することができると思われる。したがって、本発明は、突然変異ウイルスプロモーターの使用も包含し、その例としては、ウイルスベクターから発現したＡＦＰ配列の発現レベルが野生型プロモーターの下での異種配列の発現レベルと比較して低くなるように、ポックスウイルス組換え体が所望の場合に役立つ突然変異Ｈ６ポックスウイルスプロモーターがある。突然変異Ｈ６プロモーターは、弱いプロモーターと考えられる。
【０１１４】
突然変異プロモーターは、点突然変異を含むことができる。本発明は、野生型プロモーターと比較して転写開始の頻度を減らす点突然変異を含む、Ｈ６以外のプロモーターを使用することもできる。更に、他のタイプの突然変異プロモーターが、本発明で使用するために適当である（Davison, A. et al (1989) J. Mol. Biol. 210: 749-769、Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508、Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198、Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836も参照）。
【０１１５】
本発明のウイルスベクター又はウイルスは、ＡＦＰの転写及び翻訳を制御するために、追加の配列を更に含むことができる。例えば、ポックスウイルスベクターに含まれる場合、そのような配列はＴ５ＮＴ終結認識シグナルを含むことができ、それは初期ＲＮＡ転写の終結のためのポックスウイルスＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る。
【０１１６】
本発明のＡＦＰはアデノウイルス組換え体としても送達することができ、その例としては、Ｅ１が欠陥体であるか削除された、Ｅ３が欠陥体であるか削除された、及び／若しくはＥ４が欠陥体であるか削除されたアデノウイルスベクター、又は、全てのウイルス遺伝子が削除された「ガットレス」アデノウイルスベクターがある。アデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ３又はＥ４遺伝子の突然変異、又はこれら若しくは全てのアデノウイルス遺伝子の欠失を含むことができる。Ｅ１に欠陥があるアデノウイルス突然変異体は非許容細胞で複製に欠陥があると言われており、また少なくとも高度に弱毒化されているので、Ｅ１突然変異はベクターの安全域を上昇させる。Ｅ３突然変異は、アデノウイルスがＭＨＣクラスＩ分子を下方制御するメカニズムを崩壊させることによって、抗原の免疫原性を強化する。Ｅ４突然変異は後期遺伝子発現を抑制することによってアデノウイルスベクターの免疫原性を低減し、それによって、反復再接種で同じベクターを利用することを可能にする。本発明は、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ１及びＥ３、並びにＥ１及びＥ４に欠失又は突然変異のあるアデノウイルスベクターを包含する。本発明は、ヒトＡｄ５系統のアデノウイルスも包含する。
【０１１７】
「ガットレス」アデノウイルスベクターは、本発明のＡＦＰを発現するために使用することもできる。その複製は、ヘルパーウイルス及びＥ１ａ及びＣｒｅを発現する特別なヒト２９３細胞系を必要とするが、この条件は自然環境中では存在しない。ベクターからは全てのウイルス遺伝子が奪われているので、ワクチン担体としてのベクターは非免疫原性であって、再ワクチン接種のために複数回接種をすることができる。「ガットレス」アデノウイルスベクターは、導入遺伝子を収容するために３６ｋｂの空間も含むので、細胞への多数の異種遺伝子の同時送達を可能にする。ＲＧＤモチーフなどの特定の配列モチーフは、その感染性を強化するために、アデノウイルスベクターのＨ―Ｉループに挿入することができる。この配列は、ある種の細胞間マトリックス及び接着タンパク質とインテグリンと呼ばれる細胞表面受容体のスーパーファミリーとの相互作用のために、必須であることが示された。ＲＧＤモチーフの挿入は、免疫不全状態の対象に有利に役立つ可能性がある。アデノウイルス組換え体は、上述のものなど、アデノウイルスベクターのいずれかに、特定の導入遺伝子又は導入遺伝子の断片をクローニングすることによって構築される。
【０１１８】
ＡＦＰの送達に役立つ他のウイルスベクターとしては、アルファウイルスベクター、特にセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）のレプリコンに基づくものがある（例えば、Smerdou et al., (2000) Gene. Ther. Regul. 1:33-63、Lundstrom et al., (2002) Technol. Cancer Res. Treat. 1: 83-88、Hanke 2003を参照）。アルファウイルスレプリコンは有用な発現ベクターであって、転写及び一次ＲＮＡ転写産物の細胞核から細胞質への輸送、輸送されたＲＮＡの細胞質内増幅、及び本発明のＡＦＰなどの異種核酸配列のＲＮＡ発現のために必須である、アルファウイルスゲノムＲＮＡの部分を含むＲＮＡ又はＤＮＡを指すことができる。このように、レプリコンは、アルファウイルスＲＮＡの細胞質内増幅と下位ゲノムＲＮＡ及び本発明のＡＦＰの発現のために必要とされる非構造タンパク質をコード及び発現する。更に、アルファウイルスレプリコンは、キャプシドに包まれてアルファウイルス粒子又はビリオンを生成することができないことが好ましい。このことは、アルファウイルス構造遺伝子の１つ又は複数が、好ましくは、例えば１ヘルパー又は２ヘルパーのアルファウイルスベクター系で起こるように、構造遺伝子の全てが欠けているレプリコンによって達成することができる。好ましい一実施形態において、アルファウイルスレプリコンは、真核生物の発現カセットから転写し、真正のアルファウイルス様５’及び３’末端を有するＲＮＡ分子にプロセシングすることができる。
【０１１９】
アルファウイルスレプリコン及びそれらを含んでいる発現ベクターは当技術分野で公知であり、広範囲にわたるアルファウイルスレプリコンを含む多くのベクターが記載されている。そのようなレプリコンの例は、例えば、米国特許第５７３９０２６号、同第５７６６６０２号、同第５７８９２４５号、同第５７９２４６２号、同第５８１４４８２号、同第５８４３７２３号及び同第６５３１３１３号、並びにPolo et al., (1998) Nature Biotechnol. 16: 517-518及びBerglund et al., (1998) Nature Biotechnol. 16: 562-565で見られる。アルファウイルスレプリコンは、任意のアルファウイルス又はアルファウイルス核酸配列の任意の混合物から調製することができる。この点に関しては、好ましいアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、ＳＦＶ、ＶＥＥ又はロスリバーウイルスに由来する。
【０１２０】
他のウイルス発現ベクターとしては、フラビウイルス（国際公開０２／０７２８３５）、例えば黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び日本脳炎ウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス（米国特許第５５０５９４１号）、鶏痘ウイルス（Ｋｅｎｔ）及びカナリア痘ウイルスなどのアビポックスウイルス（Clements-Mann et al., (1998) J. Infect. Dis. 177: 1230-1246、Egan et al., (1995) J. Infect. Dis. 171: 1623-1627、米国特許第６３４０４６２号）、例えば弱毒化アビポックスウイルス、例えばＴＲＯＶＡＣ（米国特許第５７６６５９９号）及びＴＲＯＶＡＣ（米国特許第７７５６１０３号）、ポリオウイルス（米国特許第６７８０６１８号、同第６２５５１０４号、国際公開９２／０１４４８９）及びライノウィルスなどのピコルナウイルス、ヘルペスウイルス（国際公開８７／０００８６２、国際公開８７／０４４６３、国際公開９７／０１４８０８）、例えば水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ；国際公開９７／００４８０４）、ＮＹＶＡＣ（病原性を低減するために１８個の遺伝子欠失が選択されたニューヨークワクシニアウイルス）（Hel et al., (2001) J. Immunol. 167: 7180-7191、米国特許第５４９４８０７号、同第５７６２９３８号、同第５３６４７７３号）、アデノウイルス（ＡｄＶ；国際公開９５／０２６９７、国際公開９５／１１９８４、国際公開９５／２７０７１、国際公開９５／３４６７１）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ；米国特許第４７９７３６８号、同第５４７４９３５号）、インフルエンザウイルス（国際公開０３／０６８９２３、国際公開０２／００８４３４、国際公開００／０５３７８６）、カリフラワーモザイクウイルス（米国特許第４４０７９５６号）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）（Palmer et al, (1999) Arch. Virol. 144: 1345-1360、国際公開９３／００３１６１）及びブルータングウイルスのＮＳ１小管（Adler et al., (1998) Med. Microbial. Immunol. (Berl) 187: 91-96）がある。これらのベクターの多くは直ちに利用でき、それらの使用に適用できる条件は当業者に公知である。
【０１２１】
本発明の発現ベクターには、実験動物、哺乳動物又はヒト対象への投与のための細菌性発現ベクターも含まれる。そのような細菌性発現ベクター（弱毒化された浸潤性細菌）は、本発明のＡＦＰをコードするプラスミド又は発現カセットを含む細菌である。発現カセットは、細菌又は真核細胞で発現を促進することができる。前者では、発現は細菌細胞を宿主に導入する前に達成され、後者においては発現は宿主内で起こり、宿主細胞の機構によって促進される。米国特許第５８７７１５９号、同第６１５０１７０号、同第６５００４１９号及び同第６５３１３１３号は、増殖性感染を確立するか疾患を引き起こすことなく動物細胞に侵入し、このように、ＡＦＰの発現を得るために真核細胞へのＡＦＰをコードする発現カセットの導入を可能にする細菌ベクターを記載する。
【０１２２】
適当な細菌性発現ベクターとしては、ウシ結核菌、バシラスカルメットゲラン（ＢＣＧ）、及びサルモネラ（特に下痢症状のためのワクチンとして開発中のサルモネラの「二重ａｒｏ」突然変異体）、赤痢菌（Shata et al., (2000) Mol. Med. Today 6: 66-71を参照）、ナイセリア及びリステリア・モノサイトゲネスの弱毒株がある。好ましいチフス菌株には、ＣＶＤ９０８Δａｓｄ、ＣＶＤ９０８ΔｈｔｒａＡ及びＣＶＤ９１５が含まれる。ＣＶＤ９０８Δａｓｄサルモネラ株は、アスパラギン酸からのジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成のために必要な酵素であるアスパラギン酸ｂ―セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードするａｓｄ遺伝子の欠失によって、ＣＶＤ９０８（Tacket et al., (1992) Vaccine 10: 443-446）に由来する。ＣＶＤ９０８ΔｈｔｒＡは、ｈｔｒＡ遺伝子が削除されたチフス菌株である。この突然変異は、その株を更に弱毒化する熱ショック遺伝子をノックアウトする（Tacket et al., (1997) Infect. Immunol. 65:452-456）。ＣＶＤ９１５はｇｕａＢＡ遺伝子座の欠失を有してその弱毒化を引き起こしている、弱毒化チフス菌株である（Pasetti et al., Clin. Immunol. 92:76-89, 1999）。この株は、動物試験で、ＤＮＡワクチンの送達のために優れていることが示された。好ましい赤痢菌株は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ＣＶＤ１２０７である。この株は、その免疫原性を保存しながらもそれを十分に弱毒化するｓｅｎ、ｓｅｔ、ｖｉｒＧ及びｇｕａＢＡ遺伝子の欠失を有する（Kotloff et al., Infect. Immunol. 68:1034-1039, 2000）。
【０１２３】
本発明の発現ベクターは、本発明のＡＦＰの調製及び精製のためにも使用する。ベクターは、この点に関しては一般的に細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞で使用する。ＡＦＰをコードする核酸分子の発現を指示する核酸制御配列は、そこから発現が指示される宿主細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫、又は哺乳動物の細胞）に基づいて選択される。特定の宿主細胞及び発現ベクターのための適当な核酸制御配列は公知である。ＡＦＰを含む発現ベクターは、当技術分野で公知の方法によってこれらの細胞に導入することができるが、それらはとりわけ、細胞型及び発現の期間が一時的であるか又は安定しているかどうかによって決まる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞のために通常利用されるが、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃又はエレクトロポレーションは多くの真核細胞のために使用される。当業者に公知である、任意のトランスフェクション、感染、形質転換、又は、原核生物若しくは真核生物であるにせよ細胞に発現ベクターを導入するための適当な手法を使用することができる。
【０１２４】
本発明のＡＦＰの発現に役立つ、当業者に公知の多数の大腸菌ベクター及び細胞がある。使用に適した他の微生物宿主としては、枯草菌などの桿菌、サルモネラ属、セラチア属などの他の腸内細菌、並びに様々なシュードモナス種がある。これらの原核生物宿主は、主に宿主細胞で作動可能な発現制御配列を一般に含む発現ベクターを支持することができる。ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター系又はファージλからのプロモーター系などの様々な公知のプロモーターは、任意の数存在してもよい。プロモーターは一般的に発現を制御し、それはオペレータ配列と共同でよく、また、例えば転写及び翻訳の開始及び完了のためのリボソーム結合部位配列を有する。必要に応じて、アミノ末端メチオニンは、タンパク質の５’及びインフレームでのＭｅｔコドンの挿入によって提供することができる。細菌での使用に好ましいベクターとしては、QIAGEN社からはpQE70、pQE60及びpQE9が、Stratagene Cloning Systems社からはpBluescriptベクター、Phagescript（商標）ベクター、pNH8A、pNH16a、pNF118A、pNH46Aが、Pharmacia Biotech社からはptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5がある。他の発現ベクター系は、βガラクトシダーゼ（p-gal；pEX）、マルトース結合タンパク質（pMAL）及びグルタチオンSトランスフェラーゼ（pGST）（例えば、Smith, (1988) Gene 67: 31-40及びAbath. (1990) Peptide Research 3: 167-168を参照）に基づいている。
【０１２５】
本発明のＡＦＰの発現を指示するために、酵母細胞を使用することもできる。ある状況下で望ましい酵母系を利用する酵母発現系にはいくつかの利点があり、例としては、ジスルフィド対合、翻訳後修飾、タンパク質分泌、及びプロテアーゼ切断部位がＡＦＰコード配列の上流側に挿入されるときの容易な単離がある。Saccharomyces cerevisiaeのプレ―プロα因子リーダー部位（ＭＦａ―Ｉ遺伝子によってコードされる）は、酵母からのタンパク質分泌を指示するために常用される（Brake et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4642-4646、米国特許第４８７０００８号）。プレ―プロα因子のリーダー部位は、シグナルペプチド及び、ＫＥＸ２遺伝子によってコードされる酵母プロテアーゼのための認識配列を含むプロ部分を含む。この酵素は、Ｌｙｓ―Ａｒｇジペプチド切断シグナル配列のカルボキシル側で、前駆体タンパク質を切断する。ＡＦＰコード配列は、プレ―プロα因子リーダー部位に、インフレームで融合することができる。この構築物は、次に強い転写プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーター、アクチン又は糖分解プロモーターの管理下に置くことができる。代わりに、金属イオン（即ち、メタロチオネインプロモーターとも呼ばれるＣＵＰ１プロモーター）、グルコース、ガラクトース（即ち、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０）、又は他の糖類の有無に依存するものなど、誘導可能なプロモーターを使用することもできる。融合タンパク質コード配列の後に翻訳終止コドンが来ることができ、その後には転写終止シグナルが来ることができる。酵母での発現に役立つベクターとしては、２環状プラスミド（Broach, J.R. et al, (1979) Gene 8(1): 121-33）及び動原体性プラスミド（Hsiao, C.L. and Carbon, J. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. 78(6): 3760-4）があるが、これらに限定されるものではない。
【０１２６】
組換え体タンパク質の効率的な翻訳後修飾及び発現は、昆虫細胞のバキュロウイルス系において達成することもできる（"Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.、国際公開９２／００５２６４）。これらの系は、当技術分野においては公知である。
【０１２７】
特に哺乳動物対象への投与のためにタンパク質を精製するときは、哺乳動物細胞は本発明のＡＦＰの発現及び精製のために役立つ。哺乳動物細胞内でのタンパク質の発現に役立つベクターは、発現を指示するためにしばしば強いウイルスプロモーターを有するが、ヒト細胞で発現を指示することに役立つ他の配列、例えばエンハンサー、ポリアデニル化シグナル及び、本発明のＡＦＰの転写、翻訳、即ち内部リボソームの導入部位（ＩＲＥＳ）、及び／又はプロセシングを促進するための他のシグナル配列を含むこともできる。ＩＲＥＳ要素の使用が必要となる可能性がある本発明のある実施形態では、ＩＲＥＳ要素はウイルスに、例えばピコルナウイルスファミリー（ポリオ及び脳心筋炎）のＩＲＥＳ及びＣ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳに、又は、哺乳類のＢｉＰ ＩＲＥＳなどの哺乳動物のｍＲＮＡに由来することができる。その代わりに又はそれに加えて、ＤＮＡワクチン又は免疫原性組成物中のプラスミドは、対象宿主細胞で、異種ｔＰＡシグナル配列、例えばヒトｔＰＡ及び／又は安定化イントロン、例えばウサギβグロビン遺伝子のイントロンIIをコードするヌクレオチド配列を、更に含有及び発現することができる。
【０１２８】
インビトロ精製のために使用するとき、ベクターに応じて、それらには限定されないが、とりわけアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ゼオシン、カナマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコールなどの抗生物質耐性をコードする選択マーカーが存在してもよい。抗生物質耐性遺伝子を用いない選択系も、発現ベクター及び哺乳動物宿主系で使用することができる。ＡＦＰの発現の指示のために使用することができるプロモーター配列としては、それらには限定されないが、強いウイルスプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのプロモーター、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からのプロモーター、アデノウイルス５Ｅ２コラゲナーゼプロモーターのようなアデノウイルスからのプロモーター、βアクチンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、並びに複合プロモーター、例えば、とりわけＥＦ―ｌａ／ＨＴＬＶプロモーター（InVitrogen社製）及びＦｅｒＨ又はＦｅｒＬコアプロモーターで構成されるフェリチン複合プロモーター（InVitrogen社製）がある。好ましい真核生物発現ベクターの中には、Stratagene社から入手可能なpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI及びpSGが、Pharmacia社から入手可能なpSVK3、pBPV、pMSG及びpSVLがある。ＡＦＰコード配列は、無傷のタンパク質を合成することができる哺乳動物細胞系に導入することができ、それらは当技術分野で開発されており、例としては、それらには限定されないが、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、骨髄腫及びＰＥＲ．Ｃ６細胞系がある。トランスフェクション細胞内の発現ベクター由来のＲＮＡの存在は、ノーザンブロット分析によって確認することができ、ｃＤＮＡ又はタンパク質コード配列に対応する反対側の鎖ＲＮＡの生産は、それぞれサザン及びノーザンブロット分析によって確認することができる。
【０１２９】
細胞形質転換手法及び遺伝子送達方法（遺伝子を送達するためにインビボで使用されるものなど）は、当技術分野で公知である。そのようないかなる手法も、本発明のＡＦＰをコードする核酸又は発現ベクターをそれぞれ細胞又は対象に送達するために使用することができる。
【０１３０】
本発明のＡＦＰは、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞から、当技術分野で公知の手法で精製することができる。例えばＡＦＰの精製又は濃縮は、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、等電集束法、ゲル電気泳動、又は各精製段階でＡＦＰの分布を並びにＡＦＰの純度を追跡するモニター手法を使うこれらの方法の組み合わせによって実行することができる。前述の精製段階のいくつか又は全部は、様々な組み合わせで、又は、他の公知の方法と併用して、実質的に精製、単離された本発明のＡＦＰを提供するために使用することもできる。ＡＦＰがモノクローナル又はポリクローナル抗体によって認識されるエピトープを含む場合は、免疫親和性精製を単独で、又は、上記の手法と併用することができる。免疫アフィニティークロマトグラフィーについては、ＡＦＰ（又は、ＡＦＰを含む細胞抽出物若しくは他の混合物）は、抗原性ペプチドに特異的な抗体をＡＦＰと結合させる樹脂を含むカラムを通すことによって精製することができる。免疫親和性精製は、親和性試薬が固体支持体に結合しているときは、一括して行うこともできる。これらの手法は当技術分野においては公知である。
【０１３１】
IV. 免疫原性組成物及びアジュバント
他の態様において、本発明は、本発明のＡＦＰ、核酸又は発現ベクターを薬剤として許容される担体との混合で含む、免疫原性組成物を提供する。そのような担体は、免疫学的な使用のためにも許容される。本発明の免疫原性組成物は、エイズの予防、改善又は治療のためのＨＩＶに対する予防的又は治療的なワクチンの１つ又は複数の成分として、ＨＩＶに対して免疫応答を刺激するために役立つ。本発明の核酸及びベクターは、遺伝子ワクチン、即ちヒトなどの対象に本発明のＡＦＰをコードする核酸を送達し、その結果ＡＦＰが次に対象で発現されて免疫応答を導き出すワクチンを提供するために特に役立つ。
【０１３２】
本発明の組成物は、注射可能な懸濁液、溶液、スプレー剤、シロップ剤又はエリキシルでよい。そのような組成物を調製するために、所望の程度の純度を有する本発明のＡＦＰ、核酸又は発現ベクターを、１つ又は複数の薬剤として許容される担体及び／又は賦形剤と混合する。担体及び賦形剤は、組成物の他の成分と適合するという意味において「許容される」ものでなければならない。許容される担体、賦形剤又は安定剤は使用される投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、その例としては、それらには限定されないが、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール若しくはそれらの組み合わせ、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３―ペンタノール及びｍ―クレゾール）、低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、ショ糖、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えばＺｎ―タンパク質複合体）、及び／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性活性剤がある。
【０１３３】
免疫原性又は免疫学的な組成物は、水中油型乳濁液の形で製剤化することもできる。水中油型乳濁液は、例えば、軽質流動パラフィン油（European Pharmacopea型）、スクアラン、スクアレン、EICOSANE（商標）若しくは四テトラコンタンなどのイソプレノイド油、アルケンのオリゴマー化から生じる油、例えばイソブテン若しくはデセン、線状アルキル基を含む酸若しくはアルコール類のエステル、例えば植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリレート／カプラート）、グリセリルトリ（カプリレート／カプラート）若しくはプロピレングリコールジオレアート、分枝脂肪酸若しくはアルコール類のエステル、例えばイソステアリン酸エステル、をベースにすることができる。油は、乳濁液をつくるために、有利には乳化剤と併用する。乳化剤は、非イオン性界面活性剤、例えばソルビタン、マンニドのエステル（例えば無水マンニトールオレアート）、グリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、及び、エトキシル化されてもよいオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸、及び、ポリオキシプロピレン―ポリオキシエチレンコポリマーブロック、例えばＬ１２１などのPluronic（登録商標）製品でよい。アジュバントは、Provax（登録商標）（IDEC Pharmaceuticals社製、San Diego、CA）という商品名で市販されているものなどの、乳化剤、ミセル形成剤及び油の混合物でよい。
【０１３４】
本発明の免疫原性組成物は、追加の物質、例えば湿潤剤若しくは乳化剤、緩衝剤又はワクチンの効果を強化するアジュバントを含むことができる（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, (ed.) 1980）。
【０１３５】
アジュバントとしては、それらには限定されないが、無機塩類（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ（ＳＯ４）２、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン又は炭素）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むか含まないポリヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、例えばChuang, T.H. et al, (2002) J. Leuk. Biol. 71(3): 538-44、Ahmad-Nejad, P. et al (2002) Eur. J. Immunol. 32(7): 1958-68に記載されているもの）、ポリＩＣ若しくはポリＡＵ酸、ＣｐＧを含むか含まないポリアルギニン（当技術分野ではＩＣ３１としても知られる、Schellack, C. et al (2003) Proceedings of the 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology、Lingnau, K. et al (2002) Vaccine 20(29-30): 3498-508を参照）、JuvaVax（商標）（米国特許第６６９３０８６号）、ある種の天然物質（例えば結核菌からのワックスＤ、Cornyebacterium parvum、百日咳菌若しくはブルセラ菌属のメンバーで見られる物質）、フラゲリン（Ｔｏｌｌ様受容体５リガンド、McSorley, S.J. et al (2002) J. Immunol. 169(7): 3914-9を参照）、ＱＳ２１、ＱＳ１７及びＱＳ７などのサポニン（米国特許第５０５７５４０号、同第５６５０３９８号、同第６５２４５８４号、同第６６４５４９５号）、一リン酸化リピドＡ、特に、３―デ―Ｏ―アシル化一リン酸化リピドＡ（３Ｄ―ＭＰＬ）、イミキモド（imiquimod）（当技術分野ではＩＱＭとしても知られ、Aldara（登録商標）として市販されている、米国特許第４６８９３３８号、同第５２３８９４４号、Zuber, A.K. et al (2004) 22(13-14): 1791-8）、並びにＣＣＲ５阻害剤ＣＭＰＤ１６７（Veazey, R.S. et al (2003) J. Exp. Med. 198: 1551-1562を参照）がある。
【０１３６】
水酸化アルミニウム又はリン酸塩（ミョウバン）は、一般的に０．０５〜０．１％のリン酸緩衝食塩水溶液で用いられる。特にＤＮＡワクチンと併用することができる他のアジュバントは、コレラトキシン、特にＣＴＡ１―ＤＤ／ＩＳＣＯＭ（Mowat, A.M. et al (2001) J. Immunol. 167(6): 3398-405を参照）、ポリホスファゼン（Allcock, H.R. (1998) App. Organometallic Chem. 12(10-11): 659-666、Payne, L.G. et al (1995) Pharm. Biotechnol. 6: 473-93）、サイトカイン、例えば、それらには限定されないが、ＩＬ―２、ＩＬ―４、ＧＭ―ＣＳＦ、ＩＬ―１２、ＩＧＦ―１、ＩＦＮ―α、ＩＦＮ―β及びＩＦＮ―γ（Boyer et al., (2002) J. Liposome Res. 121: 137-142、国際公開０１／０９５９１９）、免疫調節タンパク質、例えばＣＤ４０Ｌ（ＡＤＸ４０、例えば国際公開０３／０６３８９９を参照）及びナチュラルキラー細胞のＣＤ１ａリガンド（ＣＲＯＮＹ又はα―ガラクトシルセラミドとしても知られる、Green, T.D. et al, (2003) J. Virol. 77(3): 2046-2055を参照）、免疫グロブリンのＦｃ断片に融合したＩＬ―２などの免疫賦活融合タンパク質（Barouch et al., Science 290:486-492, 2000）、並びに共刺激分子Ｂ７．１及びＢ７．２（Ｂｏｙｅｒ）であり、これらの全てはタンパク質として、又はＤＮＡの形で、本発明のＡＦＰをコードするものと同じ発現ベクターに、又は別の発現ベクターに投与することができる。
【０１３７】
本発明で使用することができるサイトカインとしては、それらには限定されないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ―ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ―ＣＳＦ）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１α（ＩＬ―１α）、インターロイキン１β（ＩＬ―１β）、インターロイキン２（ＩＬ―２）、インターロイキン３（ＩＬ―３）、インターロイキン４（ＩＬ―４）、インターロイキン５（ＩＬ―５）、インターロイキン６（ＩＬ―６）、インターロイキン７（ＩＬ―７）、インターロイキン８（ＩＬ―８）、インターロイキン９（ＩＬ―９）、インターロイキン１０（ＩＬ―１０）、インターロイキン１１（ＩＬ―１１）、インターロイキン１２（ＩＬ―１２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）及び形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）がある。サイトカインは、本発明の免疫原性又はワクチンの組成物と同時投与及び／又は逐次投与することができると理解される。このように、例えば、本発明において増殖されるウイルスは、外来性の核酸分子を含むことができ、適当なサイトカイン、例えばワクチン接種をするか又は免疫学的応答を導き出す宿主に適合させたサイトカイン（例えばヒトに投与される組成物のためのヒトサイトカイン）を、インビボで発現することができる。
【０１３８】
免疫原性組成物はＡＦＰ、核酸又は発現ベクターを所望の作用点へ導入して、適当で制御可能な速度でそれを放出するように設計することができる。徐放性製剤の調製法は、当技術分野で公知である。例えば、徐放性製剤は、免疫原及び／又は免疫原性組成物を複合又は吸収するポリマーを用いて生産することができる。徐放性製剤は、所望の放出制御特性又は放出プロフィールを提供することが知られている、適当な巨大分子（例えば、ポリエステル類、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又は硫酸プロタミン）を使って調製することができる。徐放性製剤による作用の持続時間を制御する他の可能な方法は、有効成分をポリエステル類、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、これらの酸のコポリマー又はエチレンビニルアセテートコポリマーなどのポリマー材の粒子に組み込むことである。代わりに、これらの有効成分をポリマー粒子に組み込む代わりに、コロイド薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンで、例えばコアセルベーション手法又は界面重合によって調製されたマイクロカプセルに、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセルに、これらの材料を閉じ込めることが可能である。そのような手法は、New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (eds.), University Park Press, Baltimore,  Md., 1978及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th editionで開示されている。
【０１３９】
本発明の免疫原性組成物中の本発明のＡＦＰ、核酸及び発現ベクター（まとめて、免疫原）の適当な投薬量は、当業者ならば容易に決定することができる。例えば、免疫原の投薬量は、投与経路及び対象の大きさに従い異なることができる。本発明のＡＦＰの適当な用量は、とりわけＡＦＰの分子量、送達経路、送達手段及びレシピエントの体重に従って、約１〜１０μｇから約５０００ｍｇの範囲にあることができ、一般的には約５００ｐｇから約１００ｍｇの範囲である。本発明の核酸の適当な用量は、とりわけ、タンパク質送達で評価される要因に加えて核酸分子の大きさに従って、約１μｇ〜約１００ｍｇの範囲であることができ、より一般的には約１０〜１００μｇから約１〜１０ｍｇの範囲である。本発明の発現ベクターの送達のための投薬量は、更に発現ベクターの性質に依存する。ベクターがＲＮＡ又はＤＮＡ分子（脂質又は他の送達粒子に組み込まれた１つ又は複数のプラスミドを含む）であるならば、投薬量中の発現ベクターの量は本発明の核酸のそれと類似する。細菌の発現ベクターの投薬量は、コロニー形成単位（ｃｆｕ）によって都合よく表される。用量は好ましくは約１０４〜約１０１０ｃｆｕの範囲、より好ましくは約１０６〜約１０１０ｃｆｕ、並びに約１０８〜約１０９ｃｆｕの範囲である。ウイルスの発現ベクターの投薬量は、ベクターの性質、例えばベクターがアルファウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ポックスウイルス、レトロウイルス、その他であるかどうかによって決まる。これらの用量のいずれも、単位投薬量に基づいて、又は、対象のキログラム体重あたりの量として計算することができる。
【０１４０】
ウイルスベクターの投与用量は公知であり、必要に応じて当業者が決定することができる。例示すると、剤が複製欠陥アデノウイルスなどのウイルスベクターである場合、投薬量は約１０６〜約１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲であることができ、好ましくは約１０８〜約１０１０ｐｆｕの間である。組換え体ＡＡＶを使う安定して効率的なトランスダクションについては、投薬量はグラム体重につき約１×１０５ＩＵ（感染単位）のＡＡＶからグラム体重につき約１×１０９ＩＵのＡＡＶ、好ましくはグラム体重につき約１×１０６ＩＵのＡＡＶからグラム体重につき約１×１０７ＩＵのＡＡＶであることができる。ポックスウイルス及びＭＶＡについては、約１０５〜約１０１０ｐｆｕの投薬量が役立ち、約１０７〜約１０８ｐｆｕの投薬量がしばしば使用される。
【０１４１】
他の適当な用量は、当業者が決定することができる。適当な用量を決定するために、当業者は対象の免疫応答を従来の免疫学的手法で判定して、投薬量を適宜調節することができる。そのような手法としては、例えば、それらには限定されないが、クロム放出試験、四量体結合アッセイ、ＩＦＮ―γ ELISPOTアッセイ及び細胞内サイトカインアッセイ、並びに他の免疫学的な検出アッセイ、例えばHarlowで詳述されるものがある。
【０１４２】
本発明は、本発明の発現ベクターを動物細胞に導入してＡＦＰを発現するのに十分な条件下でそれらの細胞を培養することによる、動物細胞で本発明のＡＦＰを発現させる方法を提供する。発現ベクターは、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、感染、エレクトロポレーション、微粒子銃、その他などを含む任意の適当な方法によって導入することができるが、これらに限定されない。そのような手法は、当技術分野で標準である。発現ベクターを導入した後に、少なくともＡＦＰが発現されるまで細胞生存能力を維持するために、細胞は適当な培養条件（即ち、暫くの間適当な条件で）の下で維持される。場合によっては、例えばアルファウイルスレプリコンベクターでは、ＡＦＰの発現はＡＦＰをコードするＲＮＡ分子の生産を含む。
【０１４３】
更に、本発明は、動物内に本発明の発現ベクターを送達することによって動物でＡＦＰの発現を得ることによる、本発明のＡＦＰを動物に導入し、発現させる方法を提供する。腸管外、皮下、表皮、口内、経口、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、粘膜、局所、又は他の送達方法、例えばPowderjectによる微粒子銃方法（ヘリウムガスによって実行される皮膚への無針送達系）を含む任意の送達方法を使用することができる。そのような技術は、当業者には周知である。発現ベクターは、安定性及び送達効率を改善するために必要に応じて製剤化することができる。発現ベクターが送達されると、ＡＦＰのＯＲＦは転写（必要な場合）、翻訳されて、コードされたＡＦＰを発現する。当業者は、インビトロ及びインビボでの転写及び翻訳の方法に精通している。
【０１４４】
動物細胞及び動物でＡＦＰを発現するためのそのような方法は、例えばＡＦＰ発現のメカニズム、ＡＦＰの局在化、ＡＦＰ発現に応じて影響又は誘導されるシグナル伝達経路のメカニズム及び様々な核酸調節因子のＡＦＰ発現及び局在化に及ぼす影響を研究するための臨床用、診断用又は他の研究用手段として役立つ。
【０１４５】
本発明に従い、本発明のＡＦＰ、核酸及び発現ベクターは、動物で免疫応答を、特に、ＨＩＶ特異ＣＴＬ免疫応答を誘導するための免疫原の役目を果たすことができる。それ故に、本明細書で使用されるように、免疫原は動物内に送達されて、直接又は間接的に免疫応答（液性又は細胞性の）を誘導する分子である。ＨＩＶ免疫原はＨＩＶに対する応答を誘導し、その応答は細胞性でも液性でもよい。ＨＩＶＣＯＮ、ＲＥＮＴＡ及びＨＩＶＡは、ＨＩＶタンパク質免疫原の例である（ＨＩＶＡについては国際公開０１／４７９５５を、ＲＥＮＴＡについては国際出願／ＵＳ２００４／０３７６９９を参照）。pTHr.HIVCON、pTHr.RENTA及びpTHr.HIVAは、ＤＮＡ又はプラスミドベクターのＨＩＶ免疫原の例である。MVA.HIVCON、MVA.RENTA及びMVA.HIVAは、ウイルスベクターのＨＩＶ免疫原の例である。
【０１４６】
本方法は、これらの免疫原を単独使用した場合、又は他のＨＩＶ免疫原と併用した場合、並びにアジュバントと併用した場合若しくはしなかった場合の免疫応答を研究するために、実験動物を免疫接種するときの研究手段として役立つ。より詳しくは、本方法はヒトのＨＩＶの予防的又は治療的な阻止、改善又は治療のためのものである。予防的に提供されるとき、特に高リスク対象においては、本方法は理想的にはＨＩＶ感染症のいかなる徴候にも先立って、又は、エイズによるいかなる症状にも先立って対象に投与される。免疫原の予防的投与は、ヒト対象においてエイズを阻止又は弱毒化する役目を果たすことができる。治療的に提供される場合は、本方法はエイズ症状の改善及び治療の役目を果たすことができ、有利には感染後できるだけ早い時期に、好ましくはエイズのいかなる症状の出現前に使用されるが、病徴の開始時に（又は、後に）も使用することができる。
【０１４７】
組換え体ベクターは、本発明のＡＦＰをコードする核酸分子を発現する。詳細には、ＡＦＰを単離して特徴を明らかにし、ベクター組換え体に挿入することができる。得られた組換え体ベクターは、対象に免疫接種又は予防接種をするために使用される。対象内でのＡＦＰの発現は、ＡＦＰの発現産物に対する免疫応答を対象内で起こすことができる。このように、本発明の組換え体ベクターは、保護的であることができるがその必要はない免疫応答を誘導する手段を提供する、免疫組成物又はワクチンで使用することができる。
【０１４８】
免疫応答を誘導又は刺激するために、本発明のＡＦＰ若しくは発現ベクター又は本発明のＡＦＰは、コードされたＡＦＰがＡＦＰに対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで発現されるように、又は、ＡＦＰがＡＦＰに対する免疫応答を誘導するのに十分な量で提供されるように、対象に１回又は複数回送達される。それらに限定されないが筋肉内、静脈内、皮内、粘膜及び局所の送達を含む、いかなる送達方法を使用することができる。そのような技術は、当業者には周知である。送達方法のより具体的な例は、筋肉内注射、皮内注射及び皮下注射である。しかし、送達は注入法に限定される必要はない。更に、動物組織へのＤＮＡの送達は、カチオンのリポソーム（Watanabe et al., (1994) Mol. Reprod. Dev. 38: 268-274、及び国際公開９６／２００１３）、動物筋組織への裸のＤＮＡの直接注入（Robinson et al., (1993) Vaccine 11:957-960、Hoffman et al., (1994) Vaccine 12: 1529-1533、Xiang et al., (1994) Virology 199: 132-140、Webster et al., (1994) Vaccine 12: 1495-1498、Davis et al., (1994) Vaccine 12: 1503-1509及びDavis et al., (1993) Hum. Mol. Gen. 2: 1847-1851）、又は「遺伝子銃」技術を用いたＤＮＡの皮内注射（Johnston et al., (1994) Meth. Cell Biol. 43:353-365）によって達成された。代わりに、送達経路（特に細菌の発現ベクター、例えば弱毒化サルモネラ菌又は赤痢菌種について）は、経口、鼻腔内、又は他の任意の適当な経路によるものでよい。送達は、肛門、膣又は口の粘膜などの粘膜表面を通しても達成される。
【０１４９】
免疫化スケジュール（又は、体系）は、動物（ヒトを含む）については公知であり、特定の対象及び免疫原（ＡＦＰであるにせよ発現ベクターであるにせよ）について容易に決定することができる。それ故に、免疫原は対象に１回又は複数回投与することができる。好ましくは、免疫原の投与の間に設定された時間的間隔がある。この間隔は各対象で異なるが、一般的に、１０日〜数週間の範囲であり、しばしば２、４、６又は８週である。ヒトについては、間隔は一般的に２〜６週である。免疫化体系は、一般的に１〜６回の免疫原の投与を有するが、１回又は２回又は４回と少ない回数でもよい。免疫応答を誘導する方法は、免疫原と一緒にアジュバントを投与することを含むこともできる。場合によっては、年１回、年２回、又は他の長い間隔（５〜１０年）の追加免疫で、最初の免疫化プロトコルを補うことができる。
【０１５０】
本方法は、様々なプライムブースト体系、特にＤＮＡプライムＭＶＡブースト体系を含む。これらの方法では、１回又は複数回の初回刺激免疫化の後に、１回又は複数回のブースティング免疫化が続く。実際の抗原は各免疫化について同じでも異なってもよく、免疫原の種類（例えばタンパク質又は発現ベクター）、経路及び免疫原の製剤は変えることができる。例えば、発現ベクターが初回刺激及びブースティング段階で使用される場合、それは同じか異なる種類でよい（例えばＤＮＡ又は細菌又はウイルスの発現ベクター）。役立つプライムブースト体系の１つは４週間隔で２回の初回刺激免疫化を提供し、続いて最後の初回刺激免疫化の４及び８週間後に２回のブースティング免疫化が提供される。初回刺激及びブースティング体系を提供するために本発明のＤＮＡ、細菌及びウイルスの発現ベクターを用いて包含される、いくつかの置換及び組み合わせがあることは、当業者にとって容易に明らかとなるはずである。
【０１５１】
本発明の具体的な実施形態は、本発明のＡＦＰ、本発明の核酸及び／又は本発明の発現ベクターを対象に１回又は複数回投与することによってヒトでＨＩＶに対して免疫応答を誘導する方法を提供し、ＡＦＰは、対象でＨＩＶ特異ＣＴＬ免疫応答を誘導するのに十分な量で投与されるか十分なレベルで発現される。そのような免疫化は、所望の免疫化体系に従って少なくとも２、４又は６週（又は、それ以上）の時間的間隔で複数回繰り返すことができる。
【０１５２】
この方法は、そのような他の抗原をコードするタンパク質又は発現ベクターなどと組み合わせて用いることができる。組成物は単独で投与することができ、又は、他のＨＩＶ免疫原及び／又はＨＩＶ免疫原性組成物と、例えば、「他」の免疫学的、抗原性又はワクチン又は治療的な組成物と同時投与若しくは逐次投与することによって、本発明の多価性又は「混合」又は組み合わせの組成物及びそれらを使用する方法を提供する。また、投与の成分及び方法（逐次的又は同時投与）、並びに投薬量は、特定の対象の年齢、性別、体重、種及び状態、投与経路などの要因を考慮に入れて決定することができる。
【０１５３】
併用するときは、他のＨＩＶ免疫原は全体の免疫化体系の一部として、例えば、プライムブースト体系又は他の免疫化プロトコルの一部として、同時に、又は異なる時間に投与することができる。他の多くのＨＩＶ免疫原は当技術分野で公知であり、そのような好ましい免疫原の１つはＨＩＶＡ（国際公開０１／４７９５５で記載される）であり、それはプラスミドの上の（例えばpTHr.HIVA）、又はウイルスベクター中の（例えばMVA.HIVA）タンパク質として投与することができる。他のそのようなＨＩＶ免疫原はＲＥＮＴＡ（国際出願ＵＳ２００４／０３７６９９で記載される）であり、それもプラスミド上の（例えばpTHr.RENTA）、又はウイルスベクター内の（例えばMVA.RENTA）タンパク質として投与することができる。
【０１５４】
例えば、ヒト対象でＨＩＶに対して免疫応答を誘導する１方法は、ＨＩＶ免疫原の少なくとも１つの初回抗原刺激量及びＨＩＶ免疫原の少なくとも１つのブースティング用量を投与することを含み、各用量の免疫原は同じでも異なってもよく、但し、免疫原の少なくとも１つは本発明のＡＦＰ、本発明のＡＦＰをコードする核酸又は本発明のＡＦＰをコードする発現ベクターであり、それらの免疫原は対象でＨＩＶ特異免疫応答を誘導するのに十分な量で投与されるか、又は十分なレベルで発現される。ＨＩＶ特異免疫応答は、ＨＩＶ特異ＣＴＬ免疫応答を含むことができる。そのような免疫化は、間隔を置いて、好ましくは少なくとも２〜６週の間隔で行うことができる。
【０１５５】
この方法に従い、pTHr.HIVCONは初回抗原刺激用量として１回又は複数回投与されるか、又は、MVA.HIVCONはブースティング用量として１回又は複数回投与され、初回抗原刺激用量はpTHr.HIVCONであってもそうでなくてもよい。この方法で他のＨＩＶ免疫原を使う例として、初回抗原刺激量はpTHr.HIVCONでよく、ブースティング用量はMVA.HIVCON、MVA.RENTA、MVA.HIVA、又はMVA.HIVCON、MVA.RENTA及びMVA.HIVAの混合物、及びそれらの組み合わせでよい。初回刺激又はブースティング用量で混合物が使用される場合、投与のために成分は調合することができるか、別々に投与することができる。別々に投与される場合、成分は互いに２〜６週の間隔で投与される複数の別個の初回刺激又はブースティング用量として、逐次的に投与することもできる。この方法の免疫化体系の１例は、０週時及び４週時に２つの初回抗原刺激量を投与することであり、各用量はpTHr.HIVCON及びpTHr.RENTA又はpTHr.HIVAの混合物であり、続いて、８週時及び１２週時に２つのブースティング用量が投与され、各用量はMVA.HIVCON、MVA.RENTA及びMVA.HIVAの混合物である。
【０１５６】
本発明の方法によって誘導される免疫応答は、当技術分野で公知の標準手法によって評価することができる。ＣＴＬ応答については、そのような手法としては、それらには限定されないが、細胞内ＩＦＮ染色アッセイ、四量体アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Beattie, T. et al (2004) AIDS 18(11): 1595-8）及び５１Ｃｒ放出アッセイがある。ＣＴＬ検出法の体系的比較は、Sun, Y. et al (2003) J. Immunol. Meth. 272(1-2): 23-34及びShacklett, B.L. (2002) J. Clin. Immunol. 130(2): 172-82で見られる。他の免疫応答は、Harlowで記載されているように調査することができる。
【０１５７】
本発明は、インビボ及び／又はインビトロ及び／又はエキソビボで（例えば、後者の２つは、例えばそこから単離後、本発明に従う投与を受けた細胞、宿主から、例えば、そのような細胞の任意選択での拡大の後）遺伝子産物及び／又は免疫学的生成物及び／又は抗体を生産するための方法を含む、ベクターを作製、使用するための組成物及び方法、並びにそのような遺伝子及び／又は免疫学的生成物及び／又は抗体の、特にＨＩＶに対する中和抗体（Haigwood, N.L. and Stamatatos, L. (2003) 17 (Suppl 4: S67-71でレビューされる）の、例えば診断法（Truong, H.M. and Klausner, J.D. (2004) MLO Med Lab Obs. 36(7): 12-13, 16, 18-20でレビューされる）、アッセイ、療法、治療法、などでの使用を包含する。得られた中和抗体は、ＨＩＶ、ＳＩＶ又はＳＩＶ／ＨＩＶハイブリッドに対する免疫原性又は免疫学的な応答を強化又は調整するために、別々に、又は本発明のＡＦＰと併用することができる。中和抗体は特定のクレード又はＣＲＦに特異的に仕立てることができ、又はクレード遍在性であってもよい。本発明のＡＦＰは、より詳細には、特定のＨＩＶタンパク質配列に対するクレード交差性又はクレード遍在性の中和抗体を開発する際に、使用することができる。
【０１５８】
本発明は、研究場面でのＡＦＰ発現ベクターの使用も含む。ベクターは、例えば、関心の異種配列から発現した遺伝子産物に対する細胞応答を、又は、関心の異種配列によってコードされたタンパク質によって媒介されるシグナル伝達経路を研究するために、関心の細胞又は細胞系をトランスフェクト又は感染させるために使用することができる。そのようなシグナル伝達経路としては、ＨＩＶタンパク質の発現に応答して、サイトカイン発現、又は遺伝子、例えばそれらには限定されないが、細胞受容体又は細胞表面マーカータンパク質、即ちＣＤ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ５、ＭＨＣクラスＩ及びIIのアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを挙げることができる。
【０１５９】
研究場面では、実験アッセイ及び手法によって容易に検出することができるリポーター遺伝子を含む組換え体ベクター又はウイルスを設計することがしばしば有利である。リポーター遺伝子は当技術分野で公知であり、それらには限定されないが、とりわけアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ゼオシン、カナマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコールなどの抗生物質に対する耐性遺伝子を含むことができる。リポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＺ遺伝子（β―ガラクトシダーゼをコードする）、ルシフェラーゼ及びβ―グルクロニダーゼを含むこともできる。
【０１６０】
本発明は、更に、例えばインビトロでタンパク質を生産するための、又は、治療、予防、診断若しくは試験のための抗原性、免疫学的若しくはワクチンの組成物を生成するための、ＡＦＰの発現生成物及びその使用に関し、加えて、ＤＮＡプローブ、アンチセンスＲＮＡ分子、小さな干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム及びＰＣＲプライマーの構築で役立つ組換え体ベクターからのＤＮＡに関する。本発明は、本明細書で記載されるＡＦＰ（上記参照）を使って合成ペプチドを生産することも包含する。本発明は、環境中に、即ち循環集団又は地域で、又は単一個体中で見られる新規の又は既存のＨＩＶの単離株、クレード及びＣＲＦを特定するためのＡＦＰの使用を含むことができる（Ito, Y. et al (2003) J. Clin. Microbiol. 41(5): 2126-31）。また、本発明のＡＦＰを使用して、例えば、ＨＩＶに感染した細胞又は対象において、今日利用できる抗ＨＩＶ薬剤及び療法に対しての応答の特異性又は抵抗性のメカニズムを判定することができる。抗ＨＩＶ薬剤の効力は、対象又は対象の個体群に存在するＨＩＶのクレード又はＣＲＦにしばしば依存する。このように、本発明のクレード交差性又はクレード遍在性のＡＦＰを有利に利用して、全てのＨＩＶクレード又はＣＲＦに適用することができる新規の又は最適化された抗ＨＩＶ薬剤又は療法を開発することができる。更に、今日利用できる抗ＨＩＶ薬剤及び療法、例えば、なかでもＡＺＴ、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤及びそれらの併用療法の効力は、とりわけ、ＡＦＰを発現する細胞又は対象に薬剤又は療法を投与することによって調整又は最適化することができる。
【０１６１】
本発明のＡＦＰは、別々に、又は、ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）、中和抗体などの薬剤治療体系又は療法を含む既存の抗ＨＩＶ療法と並行して使用することができるが、これらの例に限定されない。
【０１６２】
本発明のＡＦＰは、ヒト以外の霊長類で治療的又は予防的な免疫原性又は免疫学的な応答を起こすために、ＳＩＶ又はＳＩＶ／ＨＩＶハイブリッドからの配列を含むように変更又は修飾することもできる。本発明のＡＦＰは、ＨＩＶのヒト以外の動物モデルに含まれるように修飾することができる。当業者は、保護的であることができるがその必要はない免疫応答を誘導するために、ＳＩＶ配列及びＣＴＬエピトープを含むように、本発明のＡＦＰを容易に修飾することができる。
【０１６３】
例示的な実施形態により本明細書で開示される発明の原理の変更を当業者が加えることができることは理解及び予想することができ、そのような修飾、変更及び置換は本発明の範囲内に含まれるものとする。本明細書で引用した全ての特許及び刊行物は、本明細書で参照により組み込まれる。
【０１６４】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を例示する目的で提示され、いかなる様式でも本発明を限定するものではない。
［実施例］
【実施例１】
【０１６５】
ＨＩＶＣＯＮプラスミドの構築
ＨＩＶＣＯＮ ＯＲＦ（配列番号１、図２及び配列番号５、図６を参照）を、ＨＩＶタンパク質の高度保存ドメインに由来するキメラタンパク質をコードするように設計した。ＨＩＶＣＯＮキメラタンパク質はＨＩＶの１４個の最も保存されたタンパク質ドメインを含み、ドメインは４つの主要なＨＩＶクレードＡ〜Ｄの間で６％未満の変動を有する。ＨＩＶＣＯＮ ＯＲＦは、Ｍａｍｕ―Ａ＊０１（ＳＩＶ Ｇａｇ ｐ２７）エピトープ、マウスＰ１８―Ｉ１０（Ｈ―２Ｋ）エピトープ及びｍＡｂエピトープＰｋを含むこともできる、ＨＩＶＣＯＮ遺伝子断片中に含まれる。ＨＩＶＣＯＮ遺伝子断片（geneART社製、ドイツ）は、好ましいヒトアミノ酸コドン利用を用いて合成した（Andre, S. et al (1998) J. Virol. 72(2): 1497-1503）。ＨＩＶＣＯＮ ＯＲＦは、１２ヌクレオチドのコンセンサスコザック配列の後にくる（Kozak, (1987) Nucleic Acid Res. 15: 8125-8148）（配列番号５、図６を参照）。１４個の保存されたＨＩＶタンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列を、Ｍａｍｕ―Ａ＊０１エピトープ、Ｈ―２Ｋ（Romero et al）によって提示されるＰ１８―Ｉ１０エピトープ、及びＣ末端の保存タンパク質断片と融合したｍＡｂエピトープＰｋと互いに直接融合して、配列番号３のＨＩＶＣＯＮコード配列を形成した（図４）。遺伝子合成の正確度を検査するために、全体の合成遺伝子断片の配列決定をした。合成エラーが検出された場合は、部位特異的突然変異誘発を使って不適切なヌクレオチドを正しいヌクレオチドで置換した。pTH発現ベクターを生成するために、ＨＩＶＣＯＮ遺伝子断片をプラスミドpTH（Hanke 1998a）に挿入した。全ての組換えＤＮＡ操作は、標準手順を使って実施した（Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989）。
【０１６６】
本明細書で提示した実験では、pTH.HIVCONベクターを使用した。しかし、ヒト患者での使用のためには、pTHr.HIVCON発現ベクターを生成するために、pTHからのβラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）が除去される（例えば、BspHI部位でプラスミドを切り取って、ＨＩＶＣＯＮを含む線状断片を再連結することによって）ことが好ましい点に留意する必要がある。pTHr.HIVCONプラスミドは細菌の選択のために栄養要求性リプレッサ−滴定系を使い、いかなる抗生物質耐性遺伝子も有していない（Williams et al., (1998) Nucleic Acid Res. 26: 2120-2124、米国特許第５９７２７０８号）。pTHrベクターでは、ＨＩＶＣＯＮ転写は、ヒトサイトメガロウイルス株ＡＤ １６９に由来する効率的なエンハンサー／プロモーター／イントロンＡカセット（Whittle et al., (1987) Protein Eng. 1: 499-505）及びウシのポリアデニル化部位（Goodwin et al., (1992) J. Biol. Chem. 267: 16330-16334）によって制御される。そのようなpTHr.HIVCONベクターは、特にヒトに用いられるベクターとして、即ちＧＭＰ臨床ワクチンに役立つ。
【０１６７】
ＨＩＶＣＯＮΔＨは、ＨＩＶＣＯＮ遺伝子の免疫優勢マウスＰ１８―Ｉ１０エピトープ（そのコード配列は配列番号３に存在し、そのアミノ酸配列は配列番号４のヌクレオチド位置７８９〜７９８のものである）がＰＣＲによって削除されたＨＩＶＣＯＮ遺伝子のバージョンである。ＨＩＶＣＯＮと同様に、ＨＩＶＣＯＮΔＨをpTHプラスミドに挿入してpTH.HIVCONΔH発現ベクターが得られた。
【実施例２】
【０１６８】
MVA.HIVCON及びMVA.HIVCONΔHの調製
ＨＩＶＣＯＮ断片を、XmaIを使ってpTHr.HIVCONから切り取り、組換えMVA.HIVCONの調製で使用するベクターpSC11.HIVCONを生産するために、トランスファーベクターpSC11（Chakrabarti）のXmaI部位に連結する。プラスミドpSC11.HIVCONは、β―ガラクトシダーゼ遺伝子を有する。
【０１６９】
ＨＩＶＣＯＮΔＨ断片をXmaIを使ってpTHr.HIVCONΔHから切り取り、組換え体MVA.HIVCONΔHの調製で使用するベクターpSC11.HIVCONΔHを生産するために、トランスファーベクターpSC11（Chakrabarti）のXmaI部位に連結する。プラスミドpSC11.HIVCONΔHは、β―ガラクトシダーゼ遺伝子を有する。
【０１７０】
ＨＩＶＣＯＮ又はＨＩＶＣＯＮΔＨをコードする断片を、組換え体MVA.HIVCON又はMVA.HIVCONΔH（Chakrabarti）のスクリーニング、滴定及び安定性試験を促進するためにβ―ガラクトシダーゼ遺伝子を同時送達するプラスミドpSC11を使って、ｐ７．５初期／後期ワクシニアプロモーターの下のウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入する。このマーカー酵素はヒト腸内細菌によって通常発現され、MVA.HIVAのワクチン接種を受けた健康なＨＩＶ非感染ボランティアが含まれたいくつかの治験で、安全であることが示された。
【０１７１】
簡潔には、組換え体MVA.HIVCON又はMVA.HIVCONΔHビリオンは、感染多重度（ＭＯＩ）１の親のＭＶＡに感染させた、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン及びグルタミンを添加した（ＤＭＥＭ１０）Dulbeco's Modified Eagle's Medium（ＤＭＥＭ）で増殖させたニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞から作製し、Superfectin（Qiagen社製、ドイツ）を使ってエンドトキシンを含まない３μｇのpSC11.HIVCONでトランスフェクションする。組換え体は、Ｘ―ｇａｌ（５―ブロモ―４―クロロ―３―インドリル―ｂＤ―ガラクトシド）の存在下で、β―ガラクトシダーゼの青色呈色反応によって同定される。組換え体は５ラウンドのプラーク精製にかけ、その後マスターウイルス株を増殖させ、３６％ショ糖クッションで精製、滴定して、使用するまで−８０℃で保存する。ＨＩＶＣＯＮ又はＨＩＶＣＯＮΔＨの正しいＯＲＦの存在は、MVA.HIVCON又はMVA.HIVCONΔH感染細胞中のタンパク質の配列決定及び免疫蛍光法検出によって確認される。
【実施例３】
【０１７２】
ヒト細胞内のＨＩＶＣＯＮ及びＨＩＶＣＯＮΔＨの発現
ＨＩＶＣＯＮ及びＨＩＶＣＯＮΔＨの発現は、pTH.HIVCON又はpTH.HIVCONΔHで一過性にトランスフェクションさせたヒトの２９３Ｔ細胞又はＨＥＫ２９３細胞で評価した。ＨＩＶＣＯＮ及びＨＩＶＣＯΔｄＨの発現は、ＭＯＩが５のMVA.HIVCON又はMVA.HIVCONΔHに感染させたヒト２９３Ｔ細胞で評価した。
【０１７３】
免疫蛍光法研究については、ポリ―Ｌ―リジン（７０，０００〜１５０，０００の分子質量;Sigma社製）で前処理した無菌のスライドを含む６穴プレートに、２９３Ｔ細胞を接種した（スライドにつき２×１０５細胞）。２４時間後に、細胞単層はpTH.HIVCON又はpTH.HIVCONΔHでトランスフェクションした。ＭＶＡ構築物からの発現をモニターするためには、細胞単層はＭＯＩが５のMVA.HIVCON又はMVA.HIVCONΔHに感染させる。５％ＣＯ２及び３７℃での２４時間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してそれらの膜を穿孔した。スライドはＦＣＳの２％リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液により４℃で１時間ブロックし、指定の一次ｍＡｂの１:２００希釈溶液と一晩、４℃でインキュベートした。ｍＡｂは、Ｐｋタグ（Serotec社製、オックスフォード、英国）に対するものであった。インキュベーションの後、スライドはＰＢＳで一度洗浄して、Alexa Fluor（登録商標）594コンジュゲート抗マウス二次抗体の１:５００希釈溶液（Molecular Probes社製、オレゴン、アメリカ合衆国）と一晩、４℃でインキュベートした。スライドは再びＰＢＳで一度洗浄し、ＤＡＰＩ（４、６―ジアミジノ―２―フェニルインドール２ＨＣｌ）核染色液（Vectashield（登録商標）封入剤、Vector Laboratories、米国、に溶解）で染色して、ツァイス社製の免疫蛍光顕微鏡で４０×の倍率で撮影した。
【０１７４】
免疫蛍光の結果は、ＨＩＶＣＯＮ及びＨＩＶＣＯＮΔＨの発現はＰｋエピトープに対するｍＡｂを使ってヒト細胞で検出可能であることを示す。図７は、２９３Ｔ細胞内でのＨＩＶＣＯＮ及びＨＩＶＣＯＮΔＨの発現を示す。ヒト２９３Ｔ（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）又はＨＥＫ ２９３（Ｅ）細胞における、pTH.HIVCONプラスミドＤＮＡ（Ａ）、pTH.HIVCONΔHプラスミドＤＮＡ（Ｂ）、MVA.HIVCON（Ｃ）、MVA.HIVCONΔH（Ｄ）、及びAd.HIVCON（Ｅ）由来のＨＩＶＣＯＮタンパク質の発現は、免疫蛍光法及びＨＩＶＣＯＮのＰｋタグに対するｍＡｂを使用して検出した。核は青（白黒では淡灰色に見える）で示され、Ｐｋは緑（白黒ではブライト／白色に見える）（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）又は赤（白黒ではブライト／白色に見える）（Ｅ）で示される。
【実施例４】
【０１７５】
MVA.HIVCON及びMVA.HIVCONΔHの遺伝的安定性
挿入されたＨＩＶＣＯＮ又はＨＩＶＣＯＮΔＨのＯＲＦ及びβ―ｇａｌ遺伝子の遺伝的安定性は、ＣＥＦ細胞でのMVA.HIVCON及びMVA.HIVCONdHの７回のブラインド逐次継代培養によって確認される。元の（継代培養０）及び最終的な（継代培養７）ウイルス株を次に用いて２反復のウェルを感染させ、その１つのウェルはいかなるＭＶＡプラーク（空のＭＶＡ及びMVA.HIVCON又はMVA.HIVCONdH）を検出するためにニュートラルレッドで染色し、他のウェルは、挿入されたβ―ｇａｌ遺伝子（MVA.HIVCON又はMVA.HIVCONdH）を検出するために、５―ブロモ―４―クロロ―３―インドリル―β―Ｄ―ガラクトピラノシド（Ｘ―ｇａｌ）でそれぞれ染色する。２つの力価の比較は、MVA.HIVCON及びMVA.HIVCONdHがこのアッセイの感度より上で安定していることを示唆する。継代培養０及び７からのウイルス株に感染させたＣＥＦ細胞の免疫蛍光分析は、ＨＩＶＣＯＮ又はＨＩＶＣＯＮｄＨの発現レベルが同等であることを示す。
【実施例５】
【０１７６】
組換えhuAd5-GFP.HIVCONベクターの構築
ＨＩＶＣＯＮワクチン遺伝子を、pAdEasy1アデノウイルスベクター系（Hermeking, H. (1997) Mol. Cell 1: 3-11、He, T.C. et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95(5): 2509-14）を使ってＡｄ５に挿入する。この系は大腸菌ＢＪ５１８３細菌細胞の効率的な相同組換え機構を使用して（Nakamura, N. et al (2000) Mol. Cell Biol. 20(23): 8969-8982）、同時形質転換されたアデノウイルス骨格プラスミドベクターpAdEasy1及び関心の遺伝子を有するシャトルベクターpAd-TrackCMVの間の二重組換え事象によって、組換えアデノウイルスゲノムを生成する。ウイルスの生産は、ウイルス骨格に組み込まれた遺伝子によってコードされる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の助けを借りて、便利に追跡される。この系は、このように空のアデノウイルスによる汚染のリスクなしで、均質なウイルスの作製を可能にする。
【０１７７】
ＧＦＰ及びＨＩＶＣＯＮ遺伝子を有するいくつかのPmeI線状化組換えアデノウイルスＤＮＡを用いて、６穴プレートの７０〜８０％の集密度のＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションから８日後に、ウェルを削り取り、遠心分離して、２ｍｌのハンクス均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Sigma社製）で再懸濁する。次に細胞はドライアイス／メタノール浴槽中で凍結融解を４回繰返し、各ウイルス上清の５０％を用いて、ＨＥＫ２９３細胞の５０〜７０％集密度のＴ―２５フラスコを再感染させる。再感染の２〜３日後に、ウイルスを同じように再び収集して、Ｔ―７５フラスコ、その後、Ｔ―１７５フラスコを感染させるために用いる。精製前にこれを１０日間にわたって数ラウンド繰り返す。
【０１７８】
AdGFP-HIVCONの精製は、メーカーの説明書に従ってAdenopure1精製キット（Puresyn社製、米国）を使用して実施する。手短に言えば、AdGFP-HIVCONに感染させた４つのＴ―１７５ｃｍ２フラスコを削り取り、ドライアイス／メタノール浴槽中で凍結融解を３回繰返し、細胞破片のペレット化後に得られた上清を独自の緩衝液製剤で吸収装置膜を通して高度精製アデノウイルス調製物を単離する。ウイルスの力価は、７０〜８０％集密度のＨＥＫ２９３細胞を接種した６穴プレート内の精製されたAdGFP-HIVCONの連続希釈、及び感染後２４時間のＧＦＰ発現細胞の計数によって決定される。
【実施例６】
【０１７９】
マウスにおけるＨＩＶＣＯＮ免疫原性
pTH.HIVCONの免疫原性は、Ｐ１８―Ｉ１０エピトープを使ってマウスで評価した。５〜６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの２群に対し、全身麻酔の下でエンドトキシンを含まないpTH.HIVCONのＰＢＳ溶液の５０gを、前脛骨筋に注入した。１０日後に動物を屠殺して、それらの脾臓を取り出した。個々の脾臓は、２ｍｌ注射器ゴムプランジャーを使い、細胞ストレーナ（Falcon社製）を通して処理した。各動物由来の脾細胞を２回洗浄して、１０ｍｌのリンパ球培地（１０％ＦＣＳペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５ｍＭの２―メルカプトエタノールを加えたＲＰＭＩ１６４０）で懸濁した。一括ＣＴＬ培養のために８ｍｌの脾細胞懸濁液を使用した。
【０１８０】
一括ＣＴＬ培養物を調製するために、８ｍｌの脾細胞懸濁液を加湿インキュベーター内で２ｐｇ／ｍｌのＰ１８―Ｉ１０ペプチドと３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。ＣＴＬアッセイの当日、細胞をＲＰＭＩで３回洗浄し、５１Ｃｒ放出アッセイでエフェクター細胞として用いるためにＲ１０（１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０）で１ｍｌにつき１０７細胞の密度で再懸濁した。
【０１８１】
各バッチの脾細胞について、標的細胞の添加後のエフェクター対標的の比率を２００:１と３:１の間にするために、エフェクター細胞はＲ１０培地を使って９６穴プレート（Costar社製）のＵ底ウェル内で２倍に希釈した。２ｐｇ/ｍｌのＰ１８―Ｉ１０ペプチドを含むか含まないＲ１０培地中の五千の５１Ｃｒ標識Ｐ８１５標的細胞をエフェクターに加えて、混合物を３７℃で５時間インキュベートした。自然発生及び全体のクロミウム放出は、それぞれ培地単独、又は５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ―１００添加培地内に標的細胞を含むウェルから推定した。比溶解率は、（（試料放出−自然発生放出）／（全体の放出−自然発生放出））×１００として計算した。自然発生放出は、毎分の全体のカウント数の５％未満であった。
【０１８２】
図８において、左パネルはペプチドパルス化（充実円）又は非パルス化（開放円）標的細胞による５１Ｃｒ放出アッセイにおいて対照としてpTHr.HIVAで免疫化したマウスの結果を示し、右パネルはpTHr.HIVCONで免疫化したマウスの結果を示す。全ての動物は免疫化に応答し、相対的に高いレベルの溶解活性が検出された。
【実施例７】
【０１８３】
ＨＩＶＣＯＮ免疫原に対するマウスＴ細胞応答の実証
pTH.HIVCONをＢＡＬＢ／ｃマウスに投与したときの、ＨＩＶＣＯＮ免疫原に対して誘導されたＴ細胞応答を検討した。ＨＩＶＣＯＮのＰ１８―Ｉ１０エピトープに対する特異免疫応答の誘導は、エキソビボ細胞内サイトカイン染色アッセイを使って証明された。このアッセイのために、ＨＩＶＡ又はＨＩＶＣＯＮで処理したマウスから単離されたマウス脾細胞を、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ４９ｄ ｍＡｂの存在下で、適当なＰ１８―Ｉ１０ペプチドパルス化Ｐ８１５細胞で、５％ＣＯ２及び３７℃で９０分間刺激した。次にブレフェルジンＡを加えてサイトカイン分泌を阻止し、試料は更なる６時間インキュベートした後に、ＥＤＴＡ及びＦＡＣＳ固定液で反応を終了した。細胞を透過性化し、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＣＤ８及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ＩＦＮ―γ ｍＡｂ（BD PharMingen社製）とインキュベートして、ＦＡＣＳを用いて分析した。
【０１８４】
図９の結果は、ＨＩＶＣＯＮ免疫原によって誘導されたＣＴＬ応答を実証する。ＩＦＮ―γを生産するＣＤ８＋脾細胞の割合を、ＨＩＶＡ又はＨＩＶＣＯＮ免疫原で処理したマウスから単離されてＰ１８―Ｉ１０ペプチドで刺激したマウス脾細胞について示す。結果は、ＨＩＶＣＯＮ免疫原によって誘導されたＩＦＮ―γ生産ＣＤ８＋細胞の割合は、対照の免疫原ＨＩＶＡで免疫化された動物と比較してpTH.HIVCONで免疫化された動物で約２倍高いことを更に実証する。グラフのＣｏｎＡカラムのＣＤ８＋細胞の割合は、ＣＴＬ誘導のための陽性対照としての役目を果たす。
【実施例８】
【０１８５】
ＨＩＶＣＯＮに対する広いマウスＴ細胞応答の実証
pTH.HIVCON、pTHr.HIVCON、MVA.HIVCON若しくはhuAd5-GFP.HIVCONの形のＨＩＶＣＯＮが、又は、pTH.HIVCONΔH、pTHr.HIVCONΔH若しくはMVA.HIVCONdΔHの形のＨＩＶＣＯＮΔＨがＢＡＬＢ／ｃマウスに投与されたときの、ＨＩＶＣＯＮ又はＨＩＶＣＯＮΔＨ免疫原に対して誘導されるＴ細胞応答の幅を検討する。ＨＩＶＣＯＮのＰ１８―Ｉ１０エピトープ又は特定のエピトープに対する特異免疫応答の誘導は、エキソビボ細胞内サイトカイン染色アッセイを使って証明される。このアッセイのために、ＨＩＶＣＯＮ又はＨＩＶＣＯＮｄＨで処理したマウスからマウス脾細胞を単離し、その後、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ４９ｄ ｍＡｂの存在下で、適当なＰ１８―Ｉ１０ペプチド又はペプチドプールパルス化Ｐ８１５細胞で、５％ＣＯ２及び３７℃で９０分間刺激する。次にブレフェルジンＡを加えてサイトカイン分泌を阻止し、試料は更なる６時間インキュベートした後に、ＥＤＴＡ及びＦＡＣＳ固定液で反応を終了する。細胞を透過性化し、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ８及びＦＩＴＣコンジュゲート抗ＩＦＮ―γ ｍＡｂ（BD PharMingen社製）とインキュベートして、ＦＡＣＳを用いて分析する。
【０１８６】
結果は、複数のＣＴＬ特異性が免疫原によって誘導され、ＨＩＶＣＯＮ又はＨＩＶＣＯＮｄＨで免疫化したマウス由来のＩＦＮ―γを生産するＣＤ８＋脾細胞の割合は、ナイーヴな（非免疫化）マウス由来のＩＦＮ―γを生産するＣＤ８＋脾細胞の割合よりも有意に高いことを実証する。
【０１８７】
ペプチドプールは、ＨＩＶＣＯＮ免疫原の全長にわたって１１個のアミノ酸が重複する１５量体ペプチドからなる。各プールは、ＨＩＶＣＯＮ免疫原全長からの約５０〜１００個のアミノ酸をカバーするペプチドを含むことができる。
【実施例９】
【０１８８】
インビトロＣＦＳＥ増殖アッセイ
pTH.HIVA又はpTH.HIVCONで免疫化したマウス由来の、Ｐ１８―Ｉ１０ペプチドで再刺激した脾細胞の増殖能をモニターするために、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色アッセイを用いた。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、１００μｇのＤＮＡの筋肉内への単回投与で免疫化した。脾細胞を１０日後に収集し、単離した脾細胞は最終濃度２μＭのＣＦＳＥ（Molecular Probes社製）により、３７℃で１０分間染色した。反応は、ウシ胎仔血清の添加によって中止した。細胞は３回洗浄し、リンパ球培地で再懸濁して、２μｇ／ｍｌのＰ１８―Ｉ１０ペプチドで再刺激した。脾細胞培養物は３７℃及び５％ＣＯ２で５日間インキュベートし、FACScan（BD社製）で分析し、データ分析はCellQuestソフトウェア（BD社製）を使用して実施した。図１０で提示される結果は、pTH.HIVCONで免疫化されたマウス由来の脾細胞は、pTH.HIVA又はConA（陽性対照）で再刺激された脾細胞と同様に、及び、Ｐ１８―Ｉ１０（陰性対照パネル）で再刺激されなかった脾細胞と対照的に、培養内で複数世代にわたって増殖し続けることを実証する。
【実施例１０】
【０１８９】
ヒトＨＬＡを発現するトランスジェニックＨＨＤマウスにおけるＨＩＶＣＯＮの免疫原性
種間ＨＬＡ―Ａ２モノ鎖を発現するトランスジェニックＨＨＤマウスは、以前に記載されている（Pascolo et al. (1997) J Exp Med 185:2043-2051）。これらのマウスは、潜在的なヒトワクチンのＨＬＡ―Ａ２．１制限ＣＴＬ応答の研究のための、応用自在のマウスモデルを構成する。ＨＨＤトランスジェニック動物は、二重ノックアウトバックグラウンドＨ―２Ｄｂ−／−β２ｍ−／−で、種間組換えトランスジェニック分子、Ｎ末端ヒトβ２ｍ―ＨＬＡ―Ａ２．１（α１α２）―マウスＨ―２Ｄｂ（α３）、膜貫通、及び細胞質ドメインＣ末端を発現する。ＨＩＶＣＯＮ ＡＦＰに特異的な新規ＨＬＡ―Ａ２制限ＣＴＬエピトープを特定するために、２つの手法がとられる。第１に、ＨＬＡ―Ａ２タンパク質とよく結合することのできる潜在的ペプチドを特定するために、予測アルゴリズムが用いられる（Tourdot et al. (2000) Eur J Immunol 30:3411-3421）。第２に、１１個のアミノ酸が重複し、ＨＩＶＣＯＮ ＡＦＰの全長にわたる１５量体ペプチドのライブラリーを設計する。１５量体ペプチドのライブラリーは、配列重複に基づいて、実施される機能性アッセイの数を低減するいくつかのペプチドプールに分配される。予測に基づくペプチド及び１５量体ライブラリーペプチドの両方を合成して、標準のタンパク質合成手法によって精製する。これらのペプチドは、細胞表面ＭＨＣ分子の安定化によってペプチド結合を測定するアッセイで、ＨＨＤ単鎖と結合するそれらの能力を試験する（Carmon et al. (2002) J Clin Invest 110:453-462）。所望のＣＴＬ応答を誘導するペプチドプールの同定後、ペプチドプールの分画によりＣＴＬ応答を誘導する個々のペプチドが特定される。
【０１９０】
ＨＨＤマウスは、全身麻酔の下でpTH.HIVCONのＰＢＳ溶液により筋肉注射で免疫化する。一括ＣＴＬ培養のための脾細胞は、基本的に実施例５で記載されているように調製する。広いＣＴＬ応答を誘導する予測ベースのペプチド及びライブラリーペプチドの能力は、エキソビボ細胞内サイトカイン染色アッセイ（基本的に実施例６で記載されるもの）及びＣＴＬ誘導性の標的細胞の細胞溶解を測定するインビトロ細胞傷害性アッセイ（基本的に実施例５で記載されるもの）を含む、様々な方法で評価される。
【０１９１】
最初に、ＢＡＬＢ／ｃにおけるpTH.HIVCON及びMVA.HIVCONワクチンの免疫原性を、Ｃ末端のＨ―２Ｄｄ制限エピトープRGPGRAFVTI（Ｈと呼ばれる）を使って確認する。ＨＩＶＣＯＮタンパク質全域にわたって重複するペプチドを使って、様々なマウス系統で免疫原性エピトープの出現頻度を推定する。上記エピトープはＨ―２ｄハプロタイプでは免疫優勢が強いので、Ｈエピトープが削除されたＨＩＶＣＯＮｄＨワクチンを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスでの実験を実施する（実施例１）。ＨＬＡ―Ａ２（ＨＨＤ）及びＨＬＡ―Ｂ２７トランスジェニックマウス由来の免疫脾細胞も、重複するＨＩＶＣＯＮペプチドでパルス化した適当なＨＬＡ分子と一致させた標的細胞で試験する。代わりに、ＨＬＡトランスジェニックマウス由来のＨＩＶＣＯＮ誘導Ｔ細胞を、ＨＬＡと一致させ、植物性凝集素（ＰＨＡ）でブラストしたＨＩＶ―１感染ヒトＣＤ４＋細胞で試験する。第２に、ヒト以外の霊長類におけるＤＮＡ―ＭＶＡ／ＨＩＶＣＯＮの免疫原性を検討する。第３に、重要な実験は、ＨＩＶに感染した個体がＨＩＶＣＯＮ由来のペプチドを認識することができる応答を示すかどうか評価することである。このことは、新鮮な又は培養拡張のＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色又は、自家Ｂ―ＬＣＬが利用できる場合はキリング（殺滅）アッセイで実施される。ＨＩＶに感染した個体の陽性応答は、ＨＩＶ感染細胞が実際に保存ＨＩＶ領域由来のエピトープを処理して提示することを実証するであろう。
【実施例１１】
【０１９２】
ヒト以外の霊長類における免疫原性
ＭＨＣクラスＩのＭａｍｕ―Ａ＊０１対立遺伝子に陽性のアカゲザル（Macaca mulatta）を、ＤＮＡプライム―ＭＶＡブースト体系で免疫化する。３頭のマカク（サル１〜３）は０週時及び４週時にプラスミドpTHr.HIVCONによる免疫化を受け、続いて２０週時及び２４週時に組換えMVA.HIVCONによる免疫化を受ける。２頭のマカク（サル４及び５）は同じ初回刺激免疫化を受けるが、８週時及び１２週時に組換えMVA.HIVCONでブーストされる。免疫化は、筋肉内送達される０．５ｍｌの１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．７、及び０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ中の各１ｍｇのプラスミド、又は皮内送達（ｉ．ｄ．）される０．１ｍｌの１４０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．７、中の各５×１０７ｐｆｕのＭＶＡからなる。ＨＩＶＣＯＮワクチンは、動物の腕に送達される。全ての免疫化及び静脈穿刺はケタミンによる鎮静下で実施され、動物は定期的に臨床検査を受ける。
【０１９３】
サルのＰＢＭＣは、Lymphoprep（商標）クッション遠心（Nycomed Pharma AS社製）を使ってヘパリン添加血から単離される。ＰＢＭＣは、ペプチド特異拡張のために、ＳＩＶ Ｇａｇ（CTPDYNQM）タンパク質に由来するペプチドと２週間培養する。Ｍａｍｕ―Ａ＊０１／Ｇａｇのための四量体ＭＨＣ／ペプチド複合体は、ほかで記載されているように調製する。免疫原性は、ｄａｙ３にｈｕＩＬ―２を添加して、３７℃及び５％ＣＯ２で２週間Ｇａｇペプチドで再刺激したＰＢＭＣを用いて評価した。アッセイ当日に、細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートＭａｍｕ―Ａ＊０１／ペプチド四量体複合体及びマウス抗ｈｕＣＤ８―ＰｅｒＣＰ ｍＡｂ（BD PharMingen社製）と反応させて、ＦＡＣＳによって分析する。
【０１９４】
ＨＩＶＡ及びＲＥＮＴＡ免疫原に由来するＭａｍｕ―Ａ＊０１制限及び重複ペプチドを使って、ＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＨＩＶＣＯＮワクチンに対する多重特異的応答をエキソビボで検出する。ＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、Ｍａｍｕ―Ａ＊０１制限エピトープペプチド及びＨＩＶＣＯＮタンパク質全域にわたって重複するペプチドプールのために新たに単離されたＰＢＭＣ（２２週時に引き抜かれる）を使って、ＤＮＡ初回抗原刺激―ＭＶＡブースト動物で実施される。MABTECHキット（Mabtech社製）の手順及び試薬を使用する。簡潔には、ＰＢＭＣをLymphoprepクッションで単離して、示されたペプチド又はペプチドプールと３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。放出されたＩＦＮ―γはアッセイウェルの底で固定化されたｍＡｂによって捕獲され、酵素に結合した第２のｍＡｂ及び発色基質の組み合わせによって可視化される。スポットはＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Autoimmun Diagnostika社製、ドイツ）を使って数え、１０６個の脾細胞あたりのスポット形成単位として表す。
【０１９５】
サルの一括ＣＴＬ培養のために、８×１０６個の単離ＰＢＭＣを３７℃及び５％ＣＯ２で１時間、１００μlのＲ２０中の１０μｍのペプチド（又は、ペプチドプール）で再刺激し、２つの２４穴プレートウェル内の２５ｎｇ／ｍｌのｈｕＩＬ―７を添加した合計４ｍｌのＲ２０で再懸濁する。ｄａｙ３に、Lymphocult-T（Biotest社製）を、１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で加える。ｄａｙ８に、５×１０６個のペプチドパルス化照射自家Ｂリンパ芽細胞系（Ｂ―ＬＣＬ）を培養物に加え、続いてｄａｙ１１にLymphocult-Tを加える。細胞溶解性試験をｄａｙ１４に実施した。
【０１９６】
５１Ｃｒ放出アッセイについては、エフェクター細胞をＵ底ウェル９６穴プレート（Costar社製）内で順番に２倍希釈して、エフェクター対標的の比率を５０:１、２５:１及び１２:１にする。ペプチド（Ｇａｇ）又はペプチドプール（ＨＩＶＣＯＮのために）でパルス化した（２μｇ／ｍｌ）かパルス化していない五千個の５１Ｃｒ標識自家Ｂ―ＬＣＬをエフェクターに加えて、３７℃で６時間インキュベートする。比溶解率をマウス溶解アッセイに関して計算する。自然発生放出は、全体のカウントの２０％未満の全ての試料のためのものである。
【実施例１２】
【０１９７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＩＶＣＯＮワクチンの免疫原性。
個々のワクチン成分の免疫原性を示す図１１（Ａ）を参照。個々の動物由来の脾細胞は、ＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩエピトープを使うＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＩＦＮ―γの生産についてエキソビボで試験した。実験は、高い用量のMVA.HIVCON及びAd.HIVCONワクチンを用いた以外は、上記（図１１（Ｂ）のデータ）のように実施された図１１（Ｂ）を参照。図１１（Ｃ）は、上と同様にＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、様々なプライム―ブーストワクチン接種療法と比較した個々のワクチン成分の免疫原性を実証する。図１１（Ｄ）は、ＤＮＡプライム―ＭＶＡブーストワクチン接種療法と比較した、個々のワクチン成分の免疫原性を実証する。個々の動物由来の脾細胞をＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩペプチドとの培養で５日間再刺激し、ペプチドパルス化（充実）又は非パルス化（開放）標的について５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。
【実施例１３】
【０１９８】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＩＶＣＯＮ及びＨＩＶＣＯＮΔＨワクチンの免疫原性。
個々の動物由来の脾細胞は、ＨＩＶＣＯＮ配列全体にわたる重複ペプチドのプールを使うＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＩＦＮ―γの生産についてエキソビボで試験した。動物は、０週時に１００μｇのpTH.HIVCONで、２週時に１０８ＰＦＵのAd.HIVCONで、８週時に１０７ＰＦＵのMVA.HIVCONで免疫化した。動物は、１０週時に屠殺した。結果を図１２（Ａ）に示す。０週時に１００μｇのpTH.HIVCONΔHで、２週時に１０７ＰＦＵのMVA.HIVCONμHで免疫化した動物を用いた以外は、類似の実験を実施した。動物は、４週時に屠殺した。結果を図１２（Ｂ）に示す。プール１、３及び４中の反応性ペプチド類が特定された。
【実施例１４】
【０１９９】
ＨＬＡ―Ａ２トランスジェニックマウスＨＨＤにおけるＨＩＶＣＯＮワクチンの免疫原性。
個々の動物由来の脾細胞は、ＨＩＶＣＯＮ配列全体にわたる重複ペプチドのプールを使うＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＩＦＮ―γの生産についてエキソビボで試験した。動物は、０週時に１００μｇのpTH.HIVCONで、２週時に１０８ＰＦＵのAd.HIVCONで、８週時に１０７ＰＦＵのMVA.HIVCONで免疫化した。動物は、１０週時に屠殺した。結果を図１３に示す。プール３及び４中の反応性ペプチド類が特定された。
【０２００】
このように本発明の好ましい実施形態を詳細に記載したが、その精神又は範囲から逸脱することなくその多くの明らかな変更が可能であるので、添付の請求項によって規定される本発明は、上の記載で示した特定の詳細によって限定されるものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】ＨＩＶＣＯＮ免疫原の概略図である。ＨＩＶＣＯＮ免疫原は、ＨＩＶタンパク質の高度に保存されたドメインに由来するキメラタンパク質である。各配列ドメインの起源遺伝子はボックス内に示し、（コンセンサス配列の）起源クレードは下で示す。Ｇａ＝Ｇａｇ、Ｐｏ＝Ｐｏｌ、Ｖｉ＝Ｖｉｆ、Ｅｎ＝Ｅｎｖ。図で示すＨＩＶＣＯＮのバージョンは、最後のＥｎｖドメインに続いて１つのサルＣＴＬエピトープ（Ｍａｍｕ）、１つのマウスＣＴＬエピトープ（Ｐ１８―Ｉ１０、以下で説明し、図ではＨ―２で示す）及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）エピトープ（Ｐｋ）を有する。本明細書で記載されているＨＩＶＣＯＮ免疫原の他のバージョンは、これらの最後の３つの更なるドメインを有することができず、代わりに最後のＥｎｖドメインで終わる。
【図２】配列番号１のヌクレオチド配列であり、最後のＥｎｖドメインに続いて３つの更なるエピトープ（サルＣＴＬエピトープ（Ｍａｍｕ）、マウスＣＴＬエピトープ（Ｐ１８―Ｉ１０／Ｈ２）及びｍＡｂエピトープＰｋ）を含まないＨＩＶＣＯＮ免疫原をコードする２３３４個のヌクレオチドの配列を示す図。配列番号１は第１のATG（第１のメチオニンをコードする）で始まり、最後のＥｎｖドメインの最後のアミノ酸をコードするヌクレオチドの後の終止コドン（TAG）で終わる。
【図３】配列番号２のアミノ酸配列であり、配列番号１によってコードされる７７７個のアミノ酸の免疫原を示す図。このＨＩＶＣＯＮ免疫原は、最後のＥｎｖドメインに続いて３つの更なるエピトープ（サルＣＴＬエピトープ（Ｍａｍｕ）、マウスＣＴＬエピトープ（Ｐ１８―Ｉ１０／Ｈ２）及びｍＡｂエピトープＰｋ）を含まない。
【図４】配列番号３のヌクレオチド配列であり、最後のＥｎｖドメインに続いてサルＣＴＬエピトープ（Ｍａｍｕ）、マウスＣＴＬエピトープ（Ｐ１８―Ｉ１０／Ｈ２）及びｍＡｂエピトープ（Ｐｋ）を含むＨＩＶＣＯＮ免疫原をコードする２４２１ｂｐのヌクレオチド配列を示す図。最初の２３３１個のヌクレオチドは、配列番号１の２３３１個のコードヌクレオチドと同じである（即ち、最後の終止コドンを除いた配列番号１の配列）。最後の９０ヌクレオチドは、サルＣＴＬエピトープ（Ｍａｍｕ）、マウスＣＴＬエピトープ（Ｐ１８―Ｉ１０／Ｈ２）及びｍＡｂエピトープ（Ｐｋ）をコードするヌクレオチドである。
【図５】配列番号４のアミノ酸配列であり、最後のＥｎｖドメインに続いてサルＣＴＬエピトープ（Ｍａｍｕ）、マウスＣＴＬエピトープ（Ｐ１８―Ｉ１０／Ｈ２）及びｍＡｂエピトープ（Ｐｋ）を含むＨＩＶＣＯＮ免疫原をコードする８０６個のアミノ酸の免疫原を示す図。最初の７７７アミノ酸は、配列番号２と同じである。最後の２９個のアミノ酸は、サルＣＴＬエピトープ（Ｍａｍｕ）、マウスＣＴＬエピトープ（Ｐ１８―Ｉ１０／Ｈ２）及びｍＡｂエピトープ（Ｐｋ）をコードするアミノ酸である。
【図６】配列番号５のヌクレオチド配列であり、ＨＩＶＣＯＮ免疫原をコードする２３８２個のヌクレオチドの配列を示す図。最初の１８ヌクレオチドは、２つの制限部位（SmaI/XmaI部位及びXbaI部位）を含む。これらの部位は、本明細書で記載されるpTH又はpTHrベクターなどのベクターに対して、ＨＩＶＣＯＮコード配列を挿入／除去するために使用することができる。次の１２個のヌクレオチドは、コザックコンセンサスリーダー配列CACCATG（下線付き）を含む。ヌクレオチド３０〜２３６４は図２（配列番号１）のＨＩＶＣＯＮコード配列であり、図３（配列番号４）のＨＩＶＣＯＮ免疫原をコードし、即ち、更なる３つのエピトープは加えられない。ヌクレオチド３０〜２３６４は、太字体で示す。最後の１８個のヌクレオチドは、本明細書で記載されるpTH又はpTHrベクターなどの様々なベクターに対して、ＨＩＶＣＯＮコード配列を挿入／除去するために用いることができる、２つの制限部位（SmaI/XmaI部位及びXbaI部位）を含む。
【図７】２９３Ｔ細胞内でのＨＩＶＣＯＮ及びＨＩＶＣＯＮΔＨの発現を示す図である。ヒト２９３Ｔ（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）又はＨＥＫ ２９３（Ｅ）細胞における、pTH.HIVCONプラスミドＤＮＡ（Ａ）、pTH.HIVCONΔHプラスミドＤＮＡ（Ｂ）、MVA.HIVCON（Ｃ）、MVA.HIVCONΔH（Ｄ）、及びAd.HIVCON（Ｅ）由来のＨＩＶＣＯＮタンパク質の発現は、免疫蛍光法及びＨＩＶＣＯＮのＰｋタブに対するｍＡｂを使用して検出した。核は青（白黒では淡灰色に見える）で示され、Ｐｋは緑（白黒ではブライト／白色に見える）（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）又は赤（白黒ではブライト／白色に見える）（Ｅ）で示される。
【図８】ＨＩＶＣＯＮのＰ１８―Ｉ１０エピトープに対するＴ細胞応答の惹起によって評価された、pTHr.HIVCONの免疫原性を示すキリングアッセイを示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、１００μｇのＤＮＡの筋肉内への単回投与で免疫接種した。脾細胞を１０日後に収集し、Ｐ１８―Ｉ１０ペプチドとの培養で５日間再刺激し、５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。図は、Ｐ１８―Ｉ１０ペプチドパルス化（充実円）又は非パルス化（開放円）標的細胞を使ってpTHr.HIVA（左パネル）又はpTHr.HIVCON（右パネル）で免疫接種したマウスについての、５１Ｃｒ放出アッセイにおけるエフェクター標的細胞比の関数としての比溶解パーセンテージをグラフィカルに例示する。
【図９】ＨＩＶＡ又はＨＩＶＣＯＮ免疫原で処理され、Ｐ１８―Ｉ１０ペプチドで刺激された（充実バー）か刺激されなかった（開放バー）マウスから単離されたマウス脾細胞における、ＩＦＮ―γを生産するＣＤ８＋脾細胞のパーセンテージのＦＡＣＳ分析の棒グラフ。
【図１０】インビトロ増殖アッセイの結果を示す図。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、１００μｇのＤＮＡの筋肉内への単回投与で免疫接種した。脾細胞を１０日後に収集し、ＣＦＳＥで染色し、Ｐ１８―Ｉ１０ペプチドとの培養で５日間再刺激して、ＦＡＣＳカリバー（Calibur）で分析した。ＦＡＣＳデータ収集は、リンパ球及びＣＤ８＋集団でゲートされた。代表的なマウスからのデータを示す。
【図１１】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＩＶＣＯＮワクチンの免疫原性を示す図。（Ａ）個々のワクチン成分の免疫原性。個々の動物由来の脾細胞は、ＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩエピトープを使うＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＩＦＮ―γの生産についてエキソビボで試験した。（Ｂ）Ａと同様であるが、MVA.HIVCON及びＡｄ．ＨＩＶＣＯＮワクチンに関しては高い用量。（Ｃ）上と同様にＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、様々なプライム―ブーストワクチン接種療法と比較した個々のワクチン成分の免疫原性。（Ｄ）ＤＮＡプライム―ＭＶＡブーストワクチン接種療法と比較した、個々のワクチン成分の免疫原性。個々の動物由来の脾細胞をＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩペプチドとの培養で５日間再刺激し、ペプチドパルス化（充実）又は非パルス化（開放）標的について５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。
【図１２】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＩＶＣＯＮ及びＨＩＶＣＯＮΔＨワクチンの免疫原性を示す図。（Ａ）個々の動物由来の脾細胞は、ＨＩＶＣＯＮ配列全体にわたる重複ペプチドのプールを使うＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＩＦＮ―γの生産についてエキソビボで試験した。動物は、０週時に１００μｇのpTH.HIVCONで、２週時に１０８ＰＦＵのAd.HIVCONで、８週時に１０７ＰＦＵのMVA.HIVCONで免疫接種した。動物は、１０週時に屠殺した。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、０週時に１００μｇのpTH.HIVCONΔHで、２週時に１０７ＰＦＵのMVA.HIVCONμHで免疫接種した動物を用いた。動物は、４週時に屠殺した。プール１、３及び４中の反応性ペプチド類が特定された。
【図１３】ＨＬＡ―Ａ２トランスジェニックマウスＨＨＤにおけるＨＩＶＣＯＮワクチンの免疫原性を示す図。個々のＨＨＤ動物由来の脾細胞は、ＨＩＶＣＯＮ配列全体にわたる重複ペプチドのプールを使うＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＩＦＮ―γの生産についてエキソビボで試験した。動物は、０週時に１００μｇのpTH.HIVCONで、２週時に１０８ＰＦＵのAd.HIVCONで、８週時に１０７ＰＦＵのMVA.HIVCONで免疫接種した。動物は、１０週時に屠殺した。プール３及び４中の反応性ペプチド類が特定された。
【図１】
2010189397.tif 000004
【図２】
2010189397.tif 000005
【図３】
2010189397.tif 000006
【図４】
2010189397.tif 000007
【図５】
2010189397.tif 000008
【図６】
2010189397.tif 000009
【図７】
2010189397.tif 000010
【図８】
2010189397.tif 000011
【図９】
2010189397.tif 000012
【図１０】
2010189397.tif 000013
【図１１】
2010189397.tif 000014
【図１２】
2010189397.tif 000015
【図１３】
2010189397.tif 000016
【配列表】
2010189397000001.app