(57)【要約】【課題】電気化学的な方法にてレドックス複合抗体の濃度を測定する際、被検試料中の抗体および共存している他のたんぱく質成分が順次電極に付着し、本来電極に接近できるはずの抗体が電極に接近できず電流値が低下してしまうという課題があった。【解決手段】抗体または抗体フラグメントとレドックス種を光により開裂するリンカーにより接合した複合体を含む被検試料を導入する工程１と、前記工程１の後に光を照射することにより前記リンカーを開裂させる工程２と、前記工程２の後にたんぱく質を吸着する工程３と、前記工程３の後に前記工程２により開裂された前記レドックス種の濃度を電気化学的手法により測定する工程４と、を備えることを特徴とする抗体濃度測定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体または抗体フラグメントとレドックス種を光により開裂するリンカーにより接合した複合体を含む被検試料を導入する工程１と、
前記工程１の後に光を照射することにより前記リンカーを開裂させる工程２と、
前記工程２の後にたんぱく質を吸着する工程３と、
前記工程３の後に前記工程２により開裂された前記レドックス種の濃度を電気化学的手法により測定する工程４と、を備えることを特徴とする
抗体濃度測定方法。
【請求項２】
前記リンカーが、o-ニトロベンジルオキシカルボニル基を含んでいることを特徴とする請求項１記載の抗体濃度測定方法。
【請求項３】
前記工程３が陰イオン交換膜、あるいは、水分子および前記レドックス種を透過する間隙を有するニトロセルロースあるいはポリスチレンから構成される吸着であることを特徴とする請求項１記載の抗体濃度測定方法。
【請求項４】
前記レドックス種がフェロセン誘導体であり、
前記測定が、くし型電極による電気化学的手法であることを特徴とする請求項１記載の抗体濃度測定方法。
【請求項５】
抗体または抗体フラグメントとレドックス種をある特定の光を照射することにより開裂するリンカーにより接続した複合体を含む被検試料を導入する被検試料導入部と
前記被検試料導入部と連通した流路に対し、前記流路の断面の全面を透過するよう外部からの光を透過する窓部と
前記窓部より下流側に位置し、たんぱく質を吸着する吸着部と、
前記吸着部より下流側に位置し、前記窓部を透過した光により開裂された前記レドックス種との電子を授受する電極を備える電極設置部と、
前記電極設置部より下流に位置し前記被検試料導入部と前記開裂試薬担持部と前記吸着部と前記電極設置部と連通している排気口と
を備えるバイオセンサと、
前記バイオセンサを着脱自在に接続し、前記バイオセンサの前記電極における電流を計測する計測部と、前記窓部の全面にあらかじめ定めた光を投光する投光部とを備えることを特徴とする測定部とを
備えることを特徴とする抗体濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中の抗体濃度を測定する方法、およびそれを用いた測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の濃度を測定する方法としては、電気化学的な方法として特許文献１に開示の技術がある。この方法では、レドックス活性高分子で化学修飾された抗体を用いて抗原−抗体反応の電流値を電気化学的に測定し、この測定値より抗原量を定量する。抗原−抗体反応の進行に必要な時間保持後、Ｇ電極の電位をレドックス活性基が酸化する電位、Ｃ電極の電位をこれをもとに還元する電位とし、Ｇ電極に流れる電流量を計測する。このときの電流値は、抗原−抗体反応によって生成した免疫複合体の濃度および拡散係数に比例するため、抗原量の直接の定量が可能となる。
【特許文献１】特開平９−２５７７９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら上記方法を一般の被検試料に適用しようとすると被検試料中の抗体および共存している他のたんぱく質成分が順次電極に付着し、本来電極に接近できるはずの化学修飾抗体が電極に接近できず電流値が低下してしまうという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記従来の問題点を解決するために、鋭意研究の結果、抗体とレドックス種の複合体より光開裂を用いてあらかじめレドックス種を分離し、測定より以前に抗体を含むたんぱく質成分を除去することで強度を落とすことなく電気化学的に抗体−レドックス種複合体の濃度を定量できるという発想に至り、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明の抗体濃度測定方法は、
抗体または抗体フラグメントとレドックス種を光により開裂するリンカーにより接合した複合体を含む被検試料を導入する工程１と、
前記工程１の後に光を照射することにより前記リンカーを開裂させる工程２と、
前記工程２の後にたんぱく質を吸着する工程３と、
前記工程３の後に前記工程２により開裂された前記レドックス種の濃度を電気化学的手法により測定する工程４と、を備える抗体濃度測定方法であることを特徴とする。
【０００６】
このようにすることによって、電気化学的手法により測定する前に、光開裂により抗体とレドックス種をあらかじめ分離してたんぱく質を除去でき、電極近傍にたんぱく質を接近させなくできるとともにレドックス種のみを測定できる。
【０００７】
また、たんぱく質を吸着する工程では同時に抗体が吸着されることになるが、それより前に抗体とレドックス種を開裂させることでレドックス種を分離でき、電極によってたんぱく質の妨害を受けずにレドックス種の酸化還元反応に伴う電流を検出することができる。
【０００８】
本発明の抗体濃度測定方法は、前記リンカーが、o-ニトロベンジルオキシカルボニル基を含んでいることを特徴とする。
【０００９】
このようにすることによって、照射すべき光の波長をあらかじめ定めておいた上で、リンカーを効率的に開裂することができる。リンカーがo-ニトロベンジルオキシカルボニル基を含んでいる場合、o-ニトロベンジルオキシカルボニル基を開裂させるために、好ましくは３５０ｎｍのピーク波長を使用することができる。照射光の強度は、検体に含まれているレドックス種の最大濃度と開裂に必要な時間から逐次設定することができる。
【００１０】
また、本発明の抗体濃度測定方法は、前記工程３が陰イオン交換膜による吸着であることを特徴とする。
【００１１】
このようにすることによって、開裂した際に発生する抗体や、共存しているたんぱく質成分が負に帯電している性質をもとに吸着することができ、さらに下流へのたんぱく質と抗体の流れを阻止することができる。
【００１２】
また、前記工程３が、ニトロセルロースあるいはポリスチレンから構成され、水分子および前記レドックス種を透過する間隙を有する材料による吸着であることを特徴とする。
【００１３】
このようにすることで、被検試料中に存在するたんぱく質および工程２にて開裂された抗体分子を吸着することができる。一般に分子量の大きい分子ほどファンデルワールス力が大きく、表面に物理吸着をしやすいと言われている。工程２にて開裂されたレドックス種は抗体分子と比較して十分小さい分子であることから、ニトロセルロースあるいはポリスチレンあるいは陰イオン交換膜との相互作用は十分無視できるため、吸着することはなく、そのまま間隙を透過する。
【００１４】
また、本発明の抗体濃度測定方法は、前記レドックス種がフェロセン誘導体であることを特徴とする。
【００１５】
このようにすることによって、電極に印加した電位を制御することにより酸化還元反応を起こすことができ、電流値として濃度を測定できる。特にＧ電極の電位をレドックス活性基が酸化する電位、Ｃ電極の電位をこれをもとに還元する電位とし、Ｇ電極に流れる電流量を計測するとレドックスサイクルによる電流増幅効果を得ることができ、見かけ上さらに大きな電流を得ることができてより好ましい。
【００１６】
なお、フェロセン誘導体としては、フェロセンカルボン酸やフェロセン酢酸、フェロセンカルバルデヒドなどがあげられる。
【００１７】
また、前記抗体フラグメントは、Fabフラグメント、Fcフラグメント、scFvフラグメントなどで規定でき、抗体から派生するさまざまな形態に広く適用することができる。
【００１８】
また、本発明の測定装置は、抗体または抗体フラグメントとレドックス種をある特定の光を照射することにより開裂するリンカーにより接続した複合体を含む被検試料を導入する被検試料導入部と
前記被検試料導入部と連通した流路に対し、前記流路の断面の全面を透過するよう外部からの光を透過する窓部と
前記窓部より下流側に位置し、たんぱく質を吸着する吸着部と、
前記吸着部より下流側に位置し、前記窓部を透過した光により開裂された前記レドックス種との電子を授受する電極を備える電極設置部と、
前記電極設置部より下流に位置し前記被検試料導入部と前記窓部と前記吸着部と前記電極設置部と連通している排気口と
を備えるバイオセンサと、
前記バイオセンサを着脱自在に接続し、前記バイオセンサの前記電極における電流を計測する計測部と、前記窓部の全面にあらかじめ定めた光を投光する投光部とを備えることを特徴とする測定部と、を備えることを特徴とする。
【００１９】
このようにすることによって、被検試料の光開裂性のリンカーをバイオセンサの窓部を通じてくまなく開裂し、たんぱく質や抗体の電極付着の影響を受けることなく抗体の濃度に比例した電流値を測定できる測定装置を得ることができる。また、使用者の観点からは、被検試料を導入させる作業のみで自動的に測定まで実施できるため、簡便な測定を実現することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の計測方法および測定装置によれば、抗体やたんぱく質の付着による電流低下を防止でき、大きな電流値を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について図を参照しながら説明する。
【００２２】
（実施の形態１）
図１は本発明の測定方法での処理フローを示した図である。
【００２３】
まず、被検試料として、抗体とレドックス種をリンカーにより接続した複合体を含むものを準備する。この被検試料を電気化学的に測定するための電極を備えたデバイスに導入する（Ｓ１０１）。次に、被検試料に対し光を照射してこの被検試料内の抗体とレドックス種を開裂させ（Ｓ１０２）、その後たんぱく質を吸着させる（Ｓ１０３）。
【００２４】
この吸着工程には物理吸着を利用する。一般に分子量の大きい分子ほどファンデルワールス力が大きく、表面に物理吸着をしやすいと言われている。被検試料中に存在するたんぱく質および開裂された抗体分子は数千〜数万Da以上の分子量であるため物質の表面に物理吸着しやすい。また、開裂されたレドックス種は抗体分子と比較して十分小さい分子であることから、表面との相互作用を十分無視できるため、吸着することはなくそのまま透過する。
【００２５】
この後に開裂されたレドックス種を測定する（Ｓ１０４）。たんぱく質を吸着する工程では同時に抗体が吸着されることになるが、それより前に抗体とレドックス種を開裂させることでレドックス種を分離でき、電極によってたんぱく質の妨害を受けずにレドックス種の酸化還元反応に伴う電流を検出することができる。
【００２６】
またレドックス活性基の抗体への化学修飾については、o-ニトロベンジルカルボニル基（化１）によりリンカーを構成して修飾される。抗体およびレドックス種との結合は、o-ニトロベンジルカルボニル基のうち、ニトロ基のオルト位に配位したアルキル基の炭素原子（化１中Ａ）と共有結合する形で、たとえば抗体との結合にはマレイミド基（化２）を介して抗体のSH基（システインの側鎖に存在）と複合体を合成でき、また、レドックス種としてはフェロセン誘導体が考えられ、たとえばフェロセンモノカルボン酸（化３）と複合体を合成できる。合成後の全体構造の例を化４に示す。化４中、Ａｂが抗体を示す。
【００２７】
化４の一部であるo-ニトロベンジルオキシカルボニル基は、３５０ｎｍのピーク波長の光を照射することにより開裂する。化４が開裂してフェロセンモノカルボン酸を放出する反応式を化５に示す。化５に示すように、化４のうちo-ニトロベンジルカルボニル基のニトロ基のオルト位の炭素と、これと共有結合しているフェロセンカルボン酸の酸素原子が開裂することでo-ニトロベンジルカルボニル基はo-ニトロソベンジルアルデヒド基となり、その結果としてフェロセンモノカルボン酸が放出される。
【００２８】
なお、ここで抗体との結合に化２を用いてSH基を活用して修飾する方法を示した。ここでの化学修飾は、抗体の認識部位を避けた形で行うのが最も良好な方法であるが、最終的にレドックス種と開裂させた上でレドックス種のみを電気化学的に測定することから、開裂後に抗体が特異的な結合機能を維持している必要はなく、必ずしもこの修飾方法に限らず、後述する別の修飾方法も取ることができる。たとえば、抗体のNH2基（アルギニン、リシン、ヒスチジンの側鎖に存在）と共有結合する置換基としてSCN基、ClO2S基が、抗体のカルボキシル基（アスパラギン酸、グルタミン酸の側鎖に存在）と共有結合する置換基としてBrH2C基、IH2C基が、抗体のOH基（チロシン、セリン、トレオニンの側鎖に存在）と共有結合する置換基としてClOC基が同様の目的に使用できる。
【００２９】
なお、フェロセン誘導体としては、フェロセンカルボン酸やフェロセン酢酸、フェロセンカルバルデヒドなどがあげられ、光開裂を起こす置換基（上記ではo-ニトロベンジルカルボニル基）と共有結合することができる置換基であれば使用できる。
【００３０】
また、レドックス種としてフェロセン誘導体を示したが、必ずしも金属が鉄である必要はなく、コバルトセンやニッケロセンなどの他のメタロセンなど、酸化還元活性を持ち、かつ光開裂を起こす置換基（上記ではo-ニトロベンジルカルボニル基）と共有結合することができる置換基であれば同様の目的に使用できる。
【００３１】
【化１】
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【００３２】
【化２】
2010175252.tif 000004
【００３３】
【化３】
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【００３４】
【化４】
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【００３５】
【化５】
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【００３６】
図２は本発明の測定方法を搭載した抗体濃度測定装置のうち、バイオセンサの分解構成図を示したものである。上が正面図、下が側面図であり、基板２１３とカバー２０６を接着する前の分解図である。
【００３７】
バイオセンサ２００は、開裂層２０２、吸着層２０３、電極設置部２０４をこの順番に基板２１３上の同一面に備え、開裂層２０２、吸着層２０３、電極設置部２０４の横面を塞ぎそのほかの部分を空けることで被検試料を導入する。導入部２０１および排気口２１４はカバー２０６をかぶせた空間の開口部で得られ、開裂層２０２側が導入部２０１、電極設置部２０４側が排気口２１４である。空間部の寸法は適宜設定すれば良いが、たとえば、２０ｍｍ×０．５ｍｍの開口部になっている。
【００３８】
また、基板２１３のうち、開裂層２０２に面する部分を窓部２０７として備え、後述する光を透過するよう実質上透明な材料にて構成する。なお、被検試料中のリンカーをくまなく開裂できるよう、窓部２０７は、少なくとも空間部の断面を全て網羅し、空間部を通過する試料に光が照射されるようにするよう設計されなければならない。また、被検試料中に含まれる物質による光の減衰の影響を抑え、抗体−レドックス複合体にまんべんなく照射するため、窓部２０７は空間部の断面に対して短軸方向（図２中Ａ方向）に垂直な面に設計されることが好ましい。また、窓部２０７と対面するカバー２０６の対面する部分には光を反射する材料を用いると、投光された光に伴うエネルギーを開裂に使用されるエネルギーに有効に使用でき、さらに好ましい。
【００３９】
電極設置部２０４は３本の電極から構成され、電極は、例えば長手方向の長さを１ｍｍとし短手方向の長さを１μｍ、厚さが数十Åの短冊形の金電極を電極同士のギャップを１μｍとして１０００対並べた２つのくし型電極２０５，２０８として作製し、排気口２１４側よりリード線２０９，２１０により外部からそれぞれ異なる電位を印加できるようになっている。また、これとは別に参照電極２１１として金電極を作製し、リード線２１２により電位を印加できるようにする。参照電極の被検試料との接触面にはＡｇ／ＡｇＣｌを塗布し、参照電極とする。なお、図２ではリード線２０９，２１０，２１２は被検試料によって汚染されないよう、基板２１３を貫通して基板２１３の裏面へ配線している。基板２１３とカバー２０６は図中１点鎖線により接着され、バイオセンサの完成となる。
【００４０】
図３は本発明の測定方法を搭載した抗体濃度測定装置を示したものである。上が正面図、下が側面図である。
【００４１】
抗体濃度測定装置は、バイオセンサ２００および測定部３００から構成される。
【００４２】
測定部３００は、電極設置部２０４からのリード線２０９、２１０、２１２と導通し、かつバイオセンサ２００を着脱自在に接続できるコネクタ３０２、コネクタ３０２からの電流値を計測する計測部３０３、窓部２０７に光を照射する投光部３０４、計測部３０３により計測された結果を表示する表示部３０５を備える。
【００４３】
まず、バイオセンサ２００を測定部３００にガイド３０１を沿わせる形で挿入し、コネクタ３０２を介して取り付ける。取り付けた形としては、投光部３０４と窓部２０７が近接するように設計されている。次に測定部３００の電源３０６を入れる。リード線２０９、２１０、２１２はコネクタ３０２を介し計測部３０３へと接続されている。するとこれに連動して投光部３０４が起動し、窓部２０７に後述する光を照射する。次に、導入部２０１にフェロセンカルボン酸を修飾した抗体を含む被検試料を接触させることで、毛細管現象によって開裂層２０２に導入される。
【００４４】
吸引された被検試料が開裂層２０２に到達すると、窓部２０７を透過した光によりo-ニトロベンジルカルボニル基が開裂され、抗体とレドックス種であるフェロセンカルボン酸に分解される。リンカーがo-ニトロベンジルオキシカルボニル基の場合、上記光の波長として好ましくは３５０ｎｍのピーク波長を使用することができる。
バイオセンサ２００は、開裂層２０２より下流側に吸着層２０３を備える。
【００４５】
吸着層２０３のひとつの例としては、陰イオン交換膜がある。レドックス種と抗体の複合体の開裂後は、抗体が正に帯電しやすく、プラスに電荷を帯びた抗体分子は膜に吸着しやすくなる。すなわち、上記の開裂後の抗体は吸着され、レドックス種は吸着されないことになる。
【００４６】
また、吸着層２０３の別の例としては、ポリスチレン微粒樹脂、ニトロセルロース不識布、ガラスビーズ、金属微粒子などを担持したろ過層である。このようにすることで、抗体が吸着層２０３に吸着し、レドックス種は吸着しない。なお、ここで具備するろ過層としては、テフロン（登録商標）、ポリプロピレンなど、たんぱく質を吸着しない素材でなければ機能する。なお、吸着層２０３は少なくとも水分子とレドックス種を透過する間隙を有していなければいけない。
【００４７】
その後、レドックス種はさらに下流に移動し、電極設置部２０４により電気化学的にレドックス種の測定を行う。
【００４８】
計測部３０３からコネクタ３０２を介して、くし型電極の一方の対２０５には参照電極２１１の電位を基準電位として＋０．５Ｖを、もう一方の対２０８には−０．２Ｖを印加しておく。これらの電位は、フェロセンカルボン酸の酸化電位（約０．３７Ｖ：対Ａｇ／ＡｇＣｌ）および還元電位（約０．３０Ｖ：対Ａｇ／ＡｇＣｌ）を内包する電位の範囲であればこれに限らない。このように両電極に電位を印加することで、開裂層２０２で開裂され電極設置部２０４に到達したフェロセンカルボン酸分子が、隣接するくし型電極２０５，２０８間でレドックスサイクルを起こし、大きな電流値を得ることができる。なお、ここではレドックス種としてフェロセンカルボン酸を用いたが、これに限らず、フェロセンモノカルボン酸と同様にo-ニトロベンジル基と同じ位置に共有結合して、かつ電極上において酸化還元反応を起こす物質であれば、光照射により開裂を起こすことから同様に使用することができる。
【００４９】
このようにして、レドックス種の濃度に伴う電流値を計測し、これをあらかじめ作成しておいた検量線データ（電流値と抗体濃度の相関式、１次式の相関式）にて変換することで抗体濃度を表示部３０５にて表示する。このようにして抗体の濃度を知ることができる。あらかじめ抗体を吸着して除去することで、抗体の電極に付着することを防止し、十分な電流強度を得ることができる。
【００５０】
また、使用者の観点からは、被検試料を導入させる作業のみで自動的に測定まで実施できるため、簡便な測定を実現することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明に係る測定方法は、検体試料中の抗体分子とたんぱく質をあらかじめ除去してレドックス種のみ電気化学的手法により測定できることから、電流低下を引き起こすことなく抗体濃度を定量できる方法およびこれを搭載した測定装置として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の実施の形態１に係る測定方法の処理フローを示す図
【図２】同処理フローを実現するバイオセンサの分解構成図
【図３】同処理フローを実現する抗体測定装置の構成図
【符号の説明】
【００５３】
２００  バイオセンサ
２０１  導入部
２０２  開裂層
２０３  吸着層
２０４  電極設置部
２０５  くし型電極
２０６  カバー
２０７  窓部
２０８  くし型電極
２０９  リード線
２１０  リード線
２１１  参照電極
２１２  リード線
２１３  基板
２１４  排気口
３００  測定部
３０１  ガイド
３０２  コネクタ
３０３  計測部
３０４  投光部
３０５  表示部
３０６  電源
【図１】
2010175252.tif 000008
【図２】
2010175252.tif 000009
【図３】
2010175252.tif 000010