(57)【要約】【課題】  天然物質や化学物質などの発がんについての危険性や安全性の検定などに際して有用な、発がんプロモーション活性の評価方法を提供すること。【解決手段】  哺乳類動物（ヒトを除く）に発がん物質を６〜１０週間投与した後、被験物質を１〜３週間投与し、肝臓に発生した胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ陽性細胞巣および／またはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ陽性細胞巣の面積が大きいほど発がんプロモーション活性が高いと判断することを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の発がんプロモーション活性を評価する方法であって、哺乳類動物（ヒトを除く）に発がん物質を６〜１０週間投与した後、被験物質を１〜３週間投与し、肝臓に発生した胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ陽性細胞巣および／またはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ陽性細胞巣の面積が大きいほど発がんプロモーション活性が高いと判断する方法。
【請求項２】
発がん物質として３’−メチル−４−ジメチルアミノアゾベンゼン、４−ジメチルアミノアゾベンゼン、ｏ−アミノアゾトルエンから選択される少なくとも１つを投与する請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然物質や化学物質などの発がんについての危険性や安全性の検定などに際して有用な、発がんプロモーション活性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは依然として日本における主要な死亡原因の１つであり、近年、食品添加物などに利用されている天然物質や化学物質などの発がんについての危険性や安全性への関心がますます高まっている。がんの発生過程は、イニシエーションとプロモーションの２段階からなるとされているが、現在、発がんプロモーション活性の評価方法としては、試験開始時に発がん物質であるＮ，Ｎ’−ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を発がんイニシエーターとしてラットの腹腔内に投与し、２週間標準食（ＭＦ飼料など）を摂取させた後、被験物質添加食に切り替え、試験開始から３週間後に２／３の部分肝切除を行い、試験開始から８週間後に肝臓に発生した胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−Ｐ）陽性細胞巣の面積を測定する方法が標準的に採用されている（非特許文献１）。しかしながら、この方法は、ラットに対して部分肝切除を行う必要があるので手間がかかることから、より簡便に発がんプロモーション活性の評価を行うことができる方法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｉｔｏ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３；９４：３−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、従来の方法に比較してより簡便に行うことができる発がんプロモーション活性の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、発がんイニシエーションのための発がん物質と被験物質の投与スケジュールを巧みに組み合わせることにより、ラットに対して部分肝切除を行うことなく、発がんプロモーション活性の評価を行うことができることを知見した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の被験物質の発がんプロモーション活性を評価する方法は、請求項１記載の通り、哺乳類動物（ヒトを除く）に発がん物質を６〜１０週間投与した後、被験物質を１〜３週間投与し、肝臓に発生したＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣および／またはＧＧＴ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）陽性細胞巣の面積が大きいほど発がんプロモーション活性が高いと判断することを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、発がん物質として３’−メチル−４−ジメチルアミノアゾベンゼン、４−ジメチルアミノアゾベンゼン、ｏ−アミノアゾトルエンから選択される少なくとも１つを投与することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、従来の方法に比較してより簡便に行うことができる発がんプロモーション活性の評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例における各種の被験物質の発がんプロモーション活性を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の被験物質の発がんプロモーションに対する活性を評価する方法は、哺乳類動物（ヒトを除く）に発がん物質を６〜１０週間投与した後、被験物質を１〜３週間投与し、肝臓に発生したＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣および／またはＧＧＴ陽性細胞巣の面積が大きいほど発がんプロモーション活性が高いと判断することを特徴とするものである。
【００１０】
本発明において利用することができる哺乳類動物（ヒトを除く）としては、ラットやマウスなどの齧歯類を例示することができる。
【００１１】
哺乳類動物（ヒトを除く）への発がん物質と被験物質の投与は、経口から行うことが可能であり、例えば基礎食と共に自由摂取させたり、それ自体を食餌として自由摂取させることで行えばよい。基礎食への発がん物質や被験物質の添加量は、例えば０．０１〜０．５％とすることが望ましい。
【００１２】
発がん物質としては、３’−メチル−４−ジメチルアミノアゾベンゼン（３’−Ｍｅ−ＤＡＢ）の他、４−ジメチルアミノアゾベンゼン（ＤＡＢ）やｏ−アミノアゾトルエンを好適に用いることができる。これらの発がん物質は、悪性度の低い前がん細胞群を誘発することから、被験物質の発がんプロモーション活性の評価を行いやすい点において望ましい。
【００１３】
ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の面積は、例えば抗ＧＳＴ−Ｐ抗体を用いた自体公知の免疫組織化学的染色法によって細胞に存在するＧＳＴ−Ｐを染色することで、また、ＧＧＴ陽性細胞巣の面積は、例えば基質としてγ−グルタミル−４−メトキシ−２−ナフチルアミド（ＧＭＮＡ）を用いた自体公知の活性染色法によって細胞に存在するＧＧＴを染色することで、それぞれ測定することができるが、本発明者が開発した特開２００７−１８１４４４号公報に記載の以下の方法によれば、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の面積とＧＧＴ陽性細胞巣の面積の測定を同時にかつ高精度に行うことができる。
【００１４】
（１）哺乳類動物（ヒトを除く）の体内から肝臓を摘出して２〜６ｍｍ厚にスライスしてからアセトン固定する工程。
（２）アセトン固定した肝臓切片から２０〜３０μｍ厚の切片を連続的に複数枚調製する工程。
（３）調製した連続切片の１枚の面に対して抗ＧＳＴ−Ｐ抗体を用いて免疫組織化学的染色を行うとともに、このようにして免疫組織化学的染色を行った面と鏡面関係にある連続切片のもう１枚の面に対してＧＧＴの活性染色を基質溶液中で行う工程。
（４）染色を行った２枚の連続切片の鏡像面をタングステンランプよりも熱発生量が少ない光源を用いた照明下でデジタル顕微鏡撮影する工程。
（５）得られた鏡像面のデジタル画像でＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣が存在するポイントからその面積を測定するとともに、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣が存在するポイントとＧＧＴ陽性細胞巣が存在するポイントを比較し、共通するポイントからＧＧＴ陽性細胞巣の面積を測定する工程。
【００１５】
被験物質の発がんプロモーション活性は、肝臓に発生したＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣やＧＧＴ陽性細胞巣の面積が大きいほどが高い、即ち、発がんについての危険性が高いと判断することができるが（逆に言えば当該面積が小さいほど発がんについての安全性が高いと判断することができる）、発がん物質と被験物質の合計投与期間の全期間にわたって発がん物質を投与するプロトコルをコントロールとして採用し、コントロールにおける肝臓に発生したＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣やＧＧＴ陽性細胞巣の面積と比較することで、より正確にその判断を行うことができる。ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の面積の増大はがん化する細胞の増殖能の目安となる。また、ＧＧＴは前がん細胞やがん細胞のマーカー酵素であるので、ＧＧＴ陽性細胞巣の面積の増大は正常細胞からがん細胞への形質転換および／または悪性化の目安となる。従って、例えば、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の面積はコントロールと同程度でも、ＧＧＴ陽性細胞巣の面積がコントロールよりも大きければ、発がんプロモーション活性は高いと判断することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１７】
実施例１：
（実験方法）
５週齢のＳＤラット雄（日本国Ｃｌｅａ社より購入）に、発がんイニシエーターとして発がん物質である３’−Ｍｅ−ＤＡＢを０．０５％添加した基礎食（ＭＦ飼料、以下同じ）を８週間自由摂取させた後、被験物質を添加した基礎食または被験物質自体を食餌として２週間自由摂取させた。試験開始から１０週間後にラットの体内から肝臓を摘出し、３〜５ｍｍ厚にカミソリ刃を用いてスライスし、得られた肝臓切片を冷アセトン液（１００％）に浸漬して固定化し、８℃で冷蔵庫保存した。２日後にアセトン液を交換し、さらに２日後に７０％アセトン／３０％水の混合液に交換し、８℃で冷蔵庫保存した。
次に、アセトン固定した肝臓切片から２５μｍ厚の切片をマイクロスライサー（Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ  １５００：米国Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ社）を用いて連続的に４枚調製した。
次に、連続切片の１枚の面に対する抗ＧＳＴ−Ｐ抗体を用いた免疫組織化学的染色を、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００２；２３：１１９３−８に記載の方法に従って、１次抗体としてウサギ抗ＧＳＴ−Ｐポリクローナル抗体（日本国Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、２次抗体としてペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ，ＨＲＰ，ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ：日本国Ｄａｋｏ社）、ペルオキシダーゼの基質として３，３’−ジアミノベンジジンを用いて行った。なお、切片の洗浄操作は、先端口径５ｍｍのゴムキャップを付けた広口ピペットで切片を吸い上げて洗浄液（リン酸緩衝液）に連続的に移し替えるという手法を採用し、能率的に行った。また、抗ＧＳＴ−Ｐ抗体を用いた免疫組織化学的染色を行った面と鏡面関係にある連続切片のもう１枚の面に対するＧＧＴの活性染色を、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９６９；１７：５１７−２６に記載の方法に従って、２２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液にＧＭＮＡ、グリシルグリシン、ＮａＣｌ、４’−アミノ−２’，５’−ジエトキシベンズアニリドのジアゾニウム塩をそれぞれの濃度が０．５７ｍＭ、３．３ｍＭ、９３ｍＭ、０．５２ｍＭになるように添加して調製した基質溶液（ｐＨ７．６）に切片を浸漬し、時折溶液をかき混ぜながら１５〜２０分間室温にて反応を行った後、切片を０．１Ｍ硫酸銅水溶液に２分間浸漬することでアゾ染色カップリング反応を完結させてから食塩水で洗浄して行った（洗浄操作は上述した手法を採用）。
次に、光源に白色ＬＥＤを搭載したデジタル顕微鏡撮影装置として日本国Ｎｉｋｏｎ社のＣＯＯＬ  ＳＣＯＰＥを用い、スライドガラス上に載置した染色標本の鏡像面のデジタル撮影を行った。
最後に、得られた鏡像面のデジタル画像のうちのＧＧＴ染色標本の画像を左右反転させ、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣が存在するポイントとＧＧＴ陽性細胞巣が存在するポイントの比較を行い、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００２；２３：１１９３−８に記載の方法に従ってデータ解析を行った。
【００１８】
（実験結果）
ＧＳＴ−Ｐ染色標本とＧＧＴ染色標本の鏡像面の２箇所の拡大画像を図１に示す（右：ＧＳＴ−Ｐ染色標本，左：ＧＧＴ染色標本）。なお、図１において、Ｃｏｎｔｒｏｌは３’−Ｍｅ−ＤＡＢを０．０５％添加した基礎食を１０週間自由摂取させたコントロールの結果（非特異的染色）、ＥＴは被験物質としてＤ，Ｌ−メチオニンを０．２５％添加した基礎食を投与した結果、ＥＥは同、１７α−エチニルエストラジオールを０．０２％添加した基礎食を投与した結果、ＣＭＤは同、コリン−メチオニン欠乏食を食餌として基礎食の代わりに投与した結果、ＢＩＴＣは同、ベンジルイソチオシアネートを０．２５％添加した基礎食を投与した結果である。図１から明らかなように、ベンジルイソチオシアネートを投与した場合、コントロールに比較してＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の面積が非常に大きく（図１に示した細胞巣は９０００個を超える細胞から構成されている）、また、そのうちの８７％がＧＧＴ陽性であることから（ＧＧＴ陽性細胞巣）、ベンジルイソチオシアネートの発がんプロモーション活性は非常に高いことがわかった。同様に、Ｄ，Ｌ−メチオニンと１７α−エチニルエストラジオールについても、発がんプロモーション活性が高いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は、従来の方法に比較してより簡便に行うことができる発がんプロモーション活性の評価方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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