(57)【要約】【課題】顕微鏡装置を構成する光学系により生じる偏光状態の変化を補正することが可能な顕微鏡装置を提供する。【解決手段】顕微鏡装置１００を、照明光Ｌ１を射出する光源１と、ＮＡが１以上の領域を透過する照明光Ｌ１を試料３０に照射する対物レンズ４と、照明光Ｌ１を直線偏光状態に変換するポラライザ５と、ポラライザ５を透過した照明光Ｌ１を対物レンズ４の瞳面４ａに集光する集光レンズ６と、試料３０を出射し、対物レンズ４を透過した観察光Ｌ２を集光して試料３０の像Ｉを結像する結像レンズ８と、透過する光の偏光面がポラライザ５と直交するように配置されたアナライザ９と、ポラライザ５と集光レンズ６との間に配置された第１のコンペンセータ７と、から構成とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光を射出する光源と、
所定のＮＡより大きい位置を透過する前記照明光を試料に照射する対物レンズと、
前記光源と前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光を直線偏光状態に変換するポラライザと、
前記ポラライザを透過した前記照明光を前記対物レンズの瞳面に集光する集光レンズと、
前記試料を出射し、前記対物レンズを透過した観察光を集光して前記試料の像を結像する結像レンズと、
前記結像レンズと前記像との間に配置され、透過する光の偏光面が前記ポラライザと直交するように配置されたアナライザと、
前記集光レンズと前記ポラライザとの間に配置され、前記照明光が通過する光学素子による前記照明光の楕円偏光化を補正して、前記試料に照射する前記照明光の直線偏光状態を維持する第１のコンペンセータと、を有する顕微鏡装置。
【請求項２】
前記照明光は、前記対物レンズにおけるＮＡが１以上の領域を透過する請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記対物レンズを透過した前記照明光の偏光状態を検出する照明光検出部と、
前記照明光検出部で検出された前記照明光の楕円偏光化の程度を算出する楕円偏光化状態算出部と、を有し、
前記楕円偏光化状態算出部で算出された前記照明光の楕円偏光化のずれ量を打ち消すように、前記第１のコンペンセータにより前記照明光に位相差を与える請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記第１のコンペンセータは、バビネ−ソレイユの補償器で構成された請求項１〜３いずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第１のコンペンセータは、ブレース−ケーラーの補償器で構成された請求項１〜３いずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記結像レンズと前記アナライザとの間に配置され、前記対物レンズによる前記観察光の楕円偏光化を補正する第２のコンペンセータを有する請求項１〜５いずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記第２のコンペンセータの補正量は、前記第１のコンペセータと同じ量とする請求項６に記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記第２のコンペンセータは、バビネ−ソレイユの補償器で構成された請求項６または７に記載の顕微鏡装置。
【請求項９】
前記第２のコンペンセータは、ブレース−ケーラーの補償器で構成された請求項６または７に記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生物学の研究において、全反射を利用した照明（ＴＩＲＦ照明）が蛍光色素の励起方法に多く用いられ、これを利用した全反射照明蛍光顕微鏡装置（ＴＩＲＦ顕微鏡）に係る発明が提案されている（例えば、特許文献１参照）。また、偏光を利用して複屈折性を有する試料の観察に用いられる偏光顕微鏡装置が知られている。このような偏光顕微鏡装置は、照明側と結像側に２つのポラライザ（偏光子）がその透過軸（光学軸）を直交させた状態で配置されて構成されており（この配置を「クロスニコル」と呼ぶ）、これらの２つのポラライザ（偏光子）の間に偏光状態を変化させる物、すなわち複屈折性を有する試料を配置し、偏光状態を変化させて結像側のポラライザ（偏光子）（これを「検光子（アナライザ）」と呼ぶ）を通り抜けた光を観察することにより試料の特性を観察するように構成されている。
【特許文献１】特開２００４−８５７９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１を含めた従来の手法では、ＴＩＲＦ照明若しくは落射照明における照明光や観察光の偏光状態を維持する方法が明示されていない。したがって、照明光学系のレンズ及び対物レンズ等の光学素子を偏光が通過するときに、これらのレンズの影響で、位相変化などの偏光状態の変化が生じていた。その結果、直線偏光が楕円偏光化してしまい、画像のコントラスト低下を起こすと言う課題があった。この偏光状態の変化は、特に、レンズに施されたコーティング（反射防止膜等）の影響により顕著である。
【０００４】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、集光レンズとポラライザとの間にコンペンセータを配置することにより、集光レンズや対物レンズ等の光学系を構成する光学素子による照明光の楕円偏光化を補正して、この集光レンズや対物レンズを透過した照明光の直線偏光状態を維持することで、偏光状態の良い照明を実現することができる顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を解決するために、本発明に係る顕微鏡装置は、照明光を射出する光源と、所定のＮＡより大きい位置を透過する照明光を試料に照射する対物レンズと、光源と対物レンズとの間に配置され、照明光を直線偏光状態に変換するポラライザと、ポラライザを透過した照明光を対物レンズの瞳面に集光する集光レンズと、試料を出射し、対物レンズを透過した観察光を集光して試料の像を結像する結像レンズと、結像レンズと像との間に配置され、透過する光の偏光面がポラライザと直交するように配置されたアナライザと、集光レンズとポラライザとの間に配置され、照明光が通過する光学素子による照明光の楕円偏光化を補正して、試料に照射する照明光の直線偏光状態を維持する第１のコンペンセータと、から構成される。
【０００６】
また、本発明に係る顕微鏡装置において、照明光は、対物レンズにおけるＮＡが１以上の領域を透過することが好ましい。
【０００７】
また、本発明に係る顕微鏡装置は、対物レンズを透過した照明光の偏光状態を検出する照明光検出部と、照明光検出部で検出された照明光の楕円偏光化の程度を算出する楕円偏光化状態算出部と、を有し、楕円偏光化状態算出部で算出された照明光の楕円偏光化のずれ量を打ち消すように、第１のコンペンセータにより照明光に位相差を与えることが好ましい。
【０００８】
このとき、本発明に係る顕微鏡装置において、第１のコンペンセータは、バビネ−ソレイユの補償器で構成されることが好ましい。
【０００９】
あるいは、本発明に係る顕微鏡装置において、第１のコンペンセータは、ブレース−ケーラーの補償器で構成されることが好ましい。
【００１０】
また、本発明に係る顕微鏡装置において、結像レンズとアナライザとの間に配置され、対物レンズによる観察光の楕円偏光化を補正する第２のコンペンセータを有することが好ましい。
【００１１】
また、本発明に係る顕微鏡装置において、第２のコンペンセータの補正量は、第１のコンペセータと同じ量とすることが好ましい。
【００１２】
このとき、本発明に係る顕微鏡装置において、第２のコンペンセータは、バビネ−ソレイユの補償器で構成されることが好ましい。
【００１３】
あるいは、本発明に係る顕微鏡装置において、第２のコンペンセータは、ブレース−ケーラーの補償器で構成されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る顕微鏡装置を以上のように構成すると、偏斜の落斜照明と偏光とで照明を行う場合に、照明光学系に備えた第１のコンペンセータによって照明光が通過する光学素子による照明光の楕円偏光化を補正して、照明光の直線偏光状態を維持することで、偏光状態の良い照明を実現することができ、蛍光偏光観察を高いコントラストで行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。図１は、本実施の形態の顕微鏡装置１００における光学系の配置を示している。この顕微鏡装置１００は、光源１から放射された照明光（レーザー光）Ｌ１を対物レンズ４を介して試料３０に落射照明する照明光学系２と、試料３０から放射された観察光Ｌ２を対物レンズ４で集光して結像する観察光学系３とから構成されており、全反射照明を利用して試料３０から放射される蛍光（観察光Ｌ２）によりこの試料３０の像を観察するものである。
【００１６】
この顕微鏡装置１００を構成する照明光学系２は、光源１から射出された略平行光束である照明光Ｌ１を試料３０に照射する対物レンズ４と、光源１と対物レンズ４との間に配置され、照明光Ｌ１を直線偏光状態に変換するポラライザ５と、このポラライザ５を透過した照明光Ｌ１を対物レンズ４の瞳面４ａに集光する集光レンズ６と、ポラライザ５と集光レンズ６との間に配置された第１のコンペンセータ７と、を有して構成される。一方、観察光学系３は、試料３０を出射した観察光Ｌ２を集光して略平行光束にする対物レンズ４と、この対物レンズ４を透過した観察光Ｌ２を集光して試料３０の像Ｉを結像する結像レンズ８と、結像レンズ８と像Ｉとの間に配置され、透過する光の偏光面がポラライザ５と直交するように配置されたアナライザ９と、結像レンズ８とアナライザ９との間に配置された、第２のコンペンセータ１０とを有して構成される。
【００１７】
観察対象となる試料３０は、図示しないステージ上に置かれたシャーレ３１内に、培養液３２とともに収容されている。試料３０の上面に、カバーグラス３３が貼り付けられ、このカバーグラス３３と対物レンズ４との間は、液浸用の油３４が満たされている。
【００１８】
図２に示すように、この顕微鏡装置１００において、光源１から放射された照明光（レーザー光）Ｌ１は、径の小さな光束として対物レンズ４の外周部、具体的には開口数（ＮＡ）が１以上の領域を通過して試料３０を偏射照明するように構成されている。このとき、この照明光Ｌ１が試料３０に照射されるときの光軸とのなす角度は、カバーグラス３３と試料３０との境界で全反射が発生するような角度に設定されている。但し、照明光Ｌ１はこの境界で全て反射されるのではなく、一部のごくわずかの光はカバーグラス３３から試料３０側へにじみ出る。この境界側へにじみ出た光がエバネッセント光で、試料３０の深さ方向へにじみ出す量は使用する光源の波長程度となる。そこで、エバネッセント光を照明光として利用した場合、照明範囲は使用する光源の波長程度の深さに限られることから、蛍光（観察光Ｌ２）を発する部分が極めて狭くそれ以外は蛍光を発しなくなり、通常の落射照明時と異なりバックグラウンドとなる蛍光が非常に少なくなる。従って、全反射照明では極めて高いＳ／Ｎ比を実現でき、特に、細胞膜表面の観察やカバーグラス表面付近に局在する蛍光色素一分子の可視化に有効である。
【００１９】
なお、この顕微鏡装置１００の照明光学系２には、光源１からの照明光Ｌ１の透過と遮断を制御するシャッター１１と、略平行光束である照明光Ｌ１を一定の径の平行光束に拡張するためのエキスパンダーレンズ１２と、照明光Ｌ１の光量を調節するＮＤフィルタ１３と、ポラライザ５を透過した直線偏光状態の照明光Ｌ１の方位を変えるための波長板（１／２波長）１４と、光軸の平行移動を行うハービングガラス１５，１６と、集光レンズ６により集光された照明光Ｌ１を対物レンズ４の方向に反射する第１のミラー１７と、が設けられている。また、観察光学系３には、対物レンズ４を透過した略平行光束である観察光Ｌ２を通過させる絞り１８と、この絞り１８を通過した観察光Ｌ２を結像レンズ８の方向に反射する第２のミラー１９と、が設けられている。ここで、ハービングガラス１５，１６や第１のミラー１７は、図示しない適宜の駆動機構により光軸と平行な方向への移動及び固定が可能に構成されている。
【００２０】
このような顕微鏡装置１００では、図１に示すように、光源１から射出した略平行光束である照明光Ｌ１は、シャッター１１を通過した後、エクスパンダーレンズ１２によって所定の径の平行光束に拡張され、ＮＤフィルタ１３を透過し、ポラライザ５によって直線偏光状態に変換される。このポラライザ５を透過した直線偏光状態の照明光Ｌ１は、波長板１４によって方位が変えられた後、第１のコンペンセータ７を透過し、集光レンズ６によって集光され、ハービングガラス１５，１６により光軸からの位置が調整された後、第１のミラー１７によって反射され、対物レンズ４に向かう。このようにして、照明光Ｌ１は集光レンズ６によって対物レンズ４の瞳面４ａに集光され、対物レンズ４を介して上述のように試料３０を照明する。
【００２１】
対物レンズ４を介して試料３０に照射される照明光Ｌ１により、試料３０内の蛍光物質が蛍光（観察光）を発するが、この観察光Ｌ２を結像レンズ８で集光して試料３０の像Ｉを結像させて観察する。この場合、試料３０を出射した観察光Ｌ２は、対物レンズ４を透過した後、絞り１８を通過し、第２のミラー１９によって反射され、結像レンズ８により集光される。集光された観察光Ｌ２は、さらに、第２のコンペンセータ１０及びアナライザ９を透過し、撮像面上に像Ｉを結像する。
【００２２】
このような顕微鏡装置１００において、ポラライザ５とアナライザ９とは、その透過軸が直交するように配置されており（上述の「クロスニコル」）、これらのポラライザ５とアナライザ９との間に偏光状態（偏光面の傾き及びリタデーション）を変化させる物体がなければ、ポラライザ５を透過した直線偏光はアナライザ９を透過することができない。一方、試料３０から発せられた蛍光（観察光Ｌ２）は偏光状態が異なるので、アナライザ９を通り抜け、観察者はその像Ｉを観察することができる。
【００２３】
しかし、上述のように、ポラライザ５とアナライザ９との間に配置された集光レンズ６や対物レンズ４を偏光が通過することで、これらのレンズの影響で照明光Ｌ１や観察光Ｌ２に偏光状態の変化が生じ、アナライザ９からの照明光Ｌ１の漏れなどにより画像のコントラストの低下を生じてしまう。特に高倍の対物レンズ４においては、図２（ａ）に示すように試料３０側に近いレンズのレンズ面には、曲率が強い面が含まれ、そのようなレンズ面に塗布される反射防止膜は光軸から離れた位置（ＮＡが１以上の光線が通過する位置）では所定の膜厚が確保できないケースが多い。そのため、ＮＡが１以上の領域を透過する光線は楕円偏光化の程度が著しくなるため、補正が必要となる。このようなことから、本実施形態に係る顕微鏡装置１００においては、第１及び第２のコンペンセータ７，１０を用いてこれらの集光レンズ９及び対物レンズ１３で生ずる偏光状態の変化を補正するように構成されている。この補正のための、第１及び第２のコンペンセータ７，１０の位置の調整方法について以下に説明する。
【００２４】
なお、照明光束が通常の落射照明のように光路全体になると、対物レンズ４を構成するレンズ全体を通過することになる。その場合、レンズの異なる位置で、異なる位相変化が生じ、これらが合成されてしまう。この状態では、一つのコンペンセータで位相補償することは困難である。これに対して、本実施形態の顕微鏡装置１００においては、図２のように、照明光束の大きさを限定し、対物レンズ４の外周部の一部の領域（具体的には、図２に斜線で示すＮＡが１以上の領域）を透過するように構成されているため、対物レンズ４等による影響はほぼ同じ量となり、一つのコンペンセータで補償することが可能となる。すなわち、照明光学系２と観察光学系３とに一つずつ配置した第１及び第２のコンペンセータ７，１０により照明光Ｌ１及び観察光Ｌ２の楕円偏光化を補正することにより、偏光状態の良い照明及び観察を実現するものである。
【００２５】
照明光学系２に配置された第１のコンペンセータ７は、対物レンズ４等による照明光Ｌ１の楕円偏光化を補正するために、この対物レンズ４等による楕円偏光化の量を打ち消すような楕円偏光化の程度となるように照明光Ｌ１を楕円偏光化するものであり、これにより対物レンズ４を透過した照明光Ｌ１の直線偏光状態を維持する。また、観察光学系３に配置された第２のコンペンセータ１０は、対物レンズ４により楕円偏光化された観察光Ｌ２を元の直線偏光状態に補正するものである。なお、本光学系１００による照明光Ｌ１の楕円偏光化は、位相量にして１／１０波長程度であるため、第１及び第２のコンペンセータ７，１０として、バビネ−ソレイユの補償器、若しくは、ブレース−ケーラーの補償器などを用いるのが良い。
【００２６】
ここで、図３を用いてバビネ−ソレイユの補償器及びブレース−ケーラーの補償器の原理について説明する。バビネ−ソレイユの補償器は、図３（ａ）に示すように、右水晶Ｌと、２つのプリズムに分割された左水晶Ｒ１，Ｒ２とから構成される。ここで、右水晶Ｌと、左水晶Ｒ１，Ｒ２とは、厚さの等しい２枚の、光学軸に平行に研磨した水晶板Ｌ，Ｒを光学軸が直交する方向に配置、左水晶ＲをプリズムＲ１，Ｒ２に分割した構造になっている。そして、左水晶Ｒ１，Ｒ２の一方を光学軸方向に移動させることにより、この補償器を通過する光の楕円偏光化量を調整するように構成されている。一方、ブレース−ケーラーの補償器は、非常に小さな位相差を測定するものであり、波長板Ｃとして位相差ε＝（１／２０〜１／６０）×（２π／λ0）を持つマイカ板を使用する。このブレース−ケーラーの補償器は、図３（ｂ）に示すように、光学軸が直交するように配置された偏光板Ｐ，Ａの間に波長板Ｃを挿入し、この波長板Ｃを回転させて未知の直線複屈折材料Ｍの位相差を測定するものであるが、この原理を応用することにより、通過する光線の楕円偏光化量を調整することができる。
【００２７】
なお、本実施形態の顕微鏡装置１００においては、第１及び第２のコンペンセータ７，１０は、それぞれアクチュエータなどの適宜の駆動部５１，５２により、光軸を回転中心として回転可能に構成されている。これらの駆動部５１，５２の動作を制御する制御部５０では、照明光Ｌ１や観察光Ｌ２の楕円偏光化の状態に応じて駆動部５１，５２を駆動して、楕円偏光化を打ち消す方向に第１及び第２のコンペンセータ７，１０を回転させて補正を行うように構成されている。
【００２８】
このような本実施形態の顕微鏡装置１００は、更に、対物レンズ４を透過した照明光Ｌ１を検出する照明光検出部４０を有している。この照明光検出部４０と対物レンズ４との間には、駆動部５３により回転可能に制御された偏光板４１が配置されている。この駆動部５３の動作の制御は制御部５０により行われるが、この制御部５０は、照明光検出部４０で検出された照明光Ｌ１の楕円偏光化の量を算出する楕円偏光化状態算出部としての機能も有している。そして、制御部５０では、駆動部５３を動作させて偏光板４１を回転させて照明光Ｌ１の楕円偏光化の量を算出し、算出された照明光Ｌ１の楕円偏光化の量を打ち消すように、駆動部５１，５２を動作させて第１及び第２のコンペンセータ７，１０の位置を調整するよう構成されている。以下に、制御部（楕円偏光化状態算出部）５０による調整の手順を説明する。
【００２９】
まず、第１のミラー１７を光軸方向に移動させることで、照明光Ｌ１の照射方向を変化させて、照明光検出部４０によりこの照明光Ｌ１を検出可能な状態にする（この状態の照明光を透過光Ｌ３と呼ぶ）。偏光板４１を透過した透過光Ｌ３を照明光検出部４０で受光し、透過光Ｌ３の長軸と短軸の信号強度を測定する。制御部５０ではこの信号強度の情報をもとに楕円偏光化の量を算出し、この楕円偏光化の量を打ち消す方向に、駆動部５３を駆動させて偏光板４１を少量回転させる。さらに、この回転後の信号強度を照明光検出部４０測定し、制御部５０で楕円偏光化の程度を再び算出し、この楕円偏光化の程度に応じて偏光板４１を回転させる。
【００３０】
このように、照明光検出部４０で信号強度を測定し、制御部５０により算出された楕円偏光化の程度に応じて偏光板４１を回転させることを繰り返し、最終的に楕円偏光化の程度が「ほぼ０」となる位置まで偏光板４１を回転させる。そして、駆動部５１，５２により、この偏光板４１の回転量と同じ量だけ第１及び第２のコンペンセータ７，１０を回転させることにより、対物レンズ４や集光レンズ６等による照明光Ｌ１及び観察光Ｌ２の楕円偏光化を補正して、照明光Ｌ１や観察光Ｌ２の直線偏光状態を維持することができる。その結果、偏斜の落斜照明と偏光とで照明を行う場合に、偏光状態の良い照明を実現することができ、蛍光偏光観察を高いコントラストで行うことができる。ここで、補正のために、第１のコンペセータ７の回転量と第２のコンペンセータ１０の回転量とを同じ量とするのは、照明光や観察光の偏光状態の変化は主に対物レンズ４により発生し、この対物レンズ４による照明光Ｌ１及び観察光Ｌ３に対する楕円偏光化の量は、ほぼ同じ値だと想定されるからである。なお、楕円偏光化量を測定して第１及び第２のコンペンセータ７，１０の位置を調整した後は、第１のミラー１７を元の位置に戻して試料３０の観察が行われる。
【００３１】
また、上記の実施の形態では、代表的な偏光顕微鏡光学系について述べた。しかし、この発明は偏光顕微鏡に限定されるものではなく、偏光を利用する各種光学機器、例えばエリプソメータ、微分干渉顕微鏡などの偏光特性の変化を補償することが可能である。また、上述の実施形態は一例に過ぎず、上述の構成に限られるものでなく、本発明の効果範囲内において適切に変更が可能である。また、以上の説明では、第１のコンペンセータ７により照明光学系２における照明光Ｌ１の楕円偏光化量を補正し、第２のコンペンセータ１０により観察光学系３における観察光Ｌ２の楕円偏光化量の補正を行ったが、第１のコンペンセータ７だけを設けた構成にしても良いことは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の顕微鏡装置の光学系の構成を示す説明図である。
【図２】ＮＡが１以上の領域を透過する照明光を説明するための説明図であり、（ａ）は対物レンズを側面から見た際の照明光の経路を示し、（ｂ）は対物レンズを上面から見た際の照明光の経路を示す。
【図３】第１及び第２のコンペセータの原理を説明するための説明図であって、（ａ）はバビネ−ソレイユの補償器の構成を示し、（ｂ）はブレース−ケーラーの補償器の構成を示す。
【符号の説明】
【００３３】
１  光源    ４  対物レンズ    ４ａ  瞳面    ５  ポラライザ
６  集光レンズ    ７  第１のコンペンセータ
８  結像レンズ    ９  アナライザ    １０  第２のコンペンセータ
３０  試料    Ｌ１  照明光    Ｌ２  観察光
４０  照明光検出部    ５０  制御部（楕円偏光化状態算出部）
１００  顕微鏡装置
【図１】
2010060854.tif 000003
【図２】
2010060854.tif 000004
【図３】
2010060854.tif 000005