(57)【要約】【課題】微量の糖鎖を検出することができる、質量分析を用いた糖鎖の高感度測定法を提供する。【解決手段】（i）糖鎖分子を含む解析すべき試料と、アミノキノリンと酸性基含有物質とを含む液体物質である液体マトリックスと、添加剤としてのアンモニウム塩と、を溶媒中に含む混合液の液滴をターゲットプレート上に形成する工程と；（ii）前記混合液の液滴から前記溶媒を除去して、前記液滴の体積の減少とともに、前記ターゲットプレートと前記混合液の液滴とが接する面積を縮小させることによって、前記混合液中に含まれる前記解析すべき試料と前記イオン性液体と前記添加剤とを前記面積の一部へ集め、前記解析すべき試料と前記イオン性液体と前記添加剤とを含む混合物のフォーカススポットを得る工程と；（iii）前記混合物のフォーカススポットをＭＡＬＤＩ質量分析測定に供する工程と、を含む、糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）糖鎖分子を含む解析すべき試料と、
アミノキノリンと酸性基含有物質とを含む液体物質である液体マトリックスと、
添加剤としてのアンモニウム塩と、
を溶媒中に含む混合液の液滴をターゲットプレート上に形成する工程と、
（ii）前記混合液の液滴から前記溶媒を除去して、前記液滴の体積の減少とともに、前記ターゲットプレートと前記混合液の液滴とが接する面積を縮小させることによって、前記混合液中に含まれる前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤とを前記面積の一部へ集め、前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤とを含む混合物のフォーカススポットを得る工程と、
（iii）前記混合物のフォーカススポットをＭＡＬＤＩ質量分析測定に供する工程と、
を含む、糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項２】
前記工程（i）における前記アンモニウム塩が、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選ばれる、請求項１に記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項３】
前記工程（i）における前記アンモニウム塩としてリン酸アンモニウムを用いる場合、
前記工程（iii）における質量分析測定をネガティブモードで行い、［Ｍ−Ｈ］−イオンと、［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン及び／又は［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンと、からなるピークを検出することによって、前記解析すべき試料から前記糖鎖に由来するイオンを特異的に検出する、請求項２に記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項４】
前記アミノキノリンが、３−アミノキノリン及びその構造異性体からなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項５】
前記酸性基含有物質はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）からなる群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析装置を用いた糖鎖の高感度測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、ＭＡＬＤＩ質量分析測定に用いるターゲットとして、その表面に特殊な疎水性／親水性の皮膜処理が施されたものが販売されている。このような類のターゲットは、フォーカス（focusing）という現象を利用することによって試料とマトリックスとの混合結晶調製を可能にするものであり、フォーカスターゲットと呼称されている。フォーカスとは、試料とマトリックスとを溶媒中に含む液滴がターゲット上に滴下された後、時間経過によって当該液滴の体積減少とともにターゲット上における当該液滴の広がり面積の縮小が起き、それにより、当該液滴に含まれる不揮発分が、その広がり面積の中央付近へ集まる現象をいう。
このように試料とマトリックスとの液滴がフォーカスされることによって、高感度な測定が可能とされている。
【０００３】
フォーカスターゲットを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法の一例として、測定対象をタンパク質・ペプチドとした場合に、液体マトリックスである３−アミノキノリン/α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３−アミノキノリンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含む液体物質；3AQ/CHCA）をグリセロールとともに用い、さらに添加剤としてリン酸アンモニウムを加えることで、高感度な測定ができたことが報告されている。このような高感度測定は、リン酸アンモニウムを加えることで、マトリックスクラスターといった非特異的なイオンや付加イオンの形成を抑え、その結果、試料由来イオンの感度が上昇したことによって実現されるものであると考えられている（非特許文献１：Proteomics 2005, 5, 360-370参照）。
【０００４】
また、フォーカスターゲットを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法の他の一例として、測定対象を糖鎖とした場合に、液体マトリックスである１，１，３，３−テトラメチルグアニジン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸(G2CHCA)や、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン／ｐ−クマル酸(G3CA)を用いることによって、一般的に糖鎖の測定に使用されている固体マトリックスである２，５−ゲンシジン酸(DHB)よりも比較的高感度な測定ができたことが報告されている（非特許文献２：Anal. Chem. 2008, 80, 2171-2179参照）。
【０００５】
さらに、フォーカスターゲットを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法のさらなる他の一例として、測定対象を糖鎖とした場合に、液体マトリックスである３−アミノキノリン/α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（3AQ/CHCA）を用いることができることが開示されている（特許文献１：特開２００８−２６１８２５号公報参照）。
【０００６】
一方、通常のサンプルターゲットを用いたＭＡＬＤＩ質量分析においては、測定対象を糖鎖とした場合に、マトリックスとして固体塩であるハルミン、ハルマン、ノルハルマン、ハルマリンなどを用い、さらに添加剤として塩化アンモニウムを加えることで、好感度な測定ができたことが報告されている（非特許文献３：J. Mass Spectrom. Soc. Jpn.,  Vol. 55, No. 3, 2007, 137-144参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２６１８２５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistry）、２００８年、第８０巻、ｐ．２１７１−２１７９
【非特許文献２】プロテオミクス（Proteomics）、２００５年、第５巻、ｐ．３６０−３７０
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・ザ・マス・スペクトロメトリ・ソサイエティ・オブ・ジャパン（Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan）、２００７年、第５５巻、第３号、ｐ．１３７−１４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
近年、バイオマーカー探索などといった研究分野において、ごく微量の糖鎖測定を可能にする技術の確立が要求されている。
しかし、これまで、一般的に使用されている糖鎖測定用マトリックスであるDHBでは感度が不十分であった。具体的には、フォーカスターゲットを用いた場合であっても、その感度はフェムトモルオーダー（ポジティブモード、ネガティブモード共に）である。
また、3AQ/CHCAが高感度測定を可能にするとはいっても、それ単独で糖鎖測定に用いられる場合、その感度はフェムトモルオーダー（ポジティブモードの場合）又はピコモルオーダー（ネガティブモードの場合）の範囲にとどまる。一方、当該3AQ/CHCAがグリセロールとともに用いられ且つ添加剤と組み合わされてタンパク質・ペプチド測定に用いられる場合においても、その感度はなおフェムトモルオーダー（ポジティブモード）の範囲内にとどまる。
【００１０】
そこで本発明の目的は、微量の糖鎖を検出することができる、質量分析を用いた糖鎖の高感度測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、アミノキノリンタイプの液体マトリックスを使用し、添加剤としてアンモニウム塩を組み合わせることによって、糖鎖の測定感度が飛躍的に上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
（i）糖鎖分子を含む解析すべき試料と、
アミノキノリンと酸性基含有物質とを含む液体物質である液体マトリックスと、
添加剤としてのアンモニウム塩と、
を溶媒中に含む混合液の液滴をターゲットプレート上に形成する工程と、
（ii）前記混合液の液滴から前記溶媒を除去して、前記液滴の体積の減少とともに、前記ターゲットプレートと前記混合液の液滴とが接する面積を縮小させることによって、前記混合液中に含まれる前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤とを前記面積の一部へ集め、前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤とを含む混合物のフォーカススポットを得る工程と、
（iii）前記混合物のフォーカススポットをＭＡＬＤＩ質量分析測定に供する工程と、
を含む、糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【００１３】
本明細書においては、上記（１）のように液体マトリックスとして用いることができる液状物質である「アミノキノリンと酸性基含有物質とを含む液体物質」を、「アミノキノリン／酸性基含有物質」と記載することがある。
【００１４】
「前記混合液の液滴から前記溶媒を除去」することに伴う「前記液滴の体積の減少」は、前記混合液が濃縮されること、すなわち混合液中の「前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤」の濃度が高くなることを意味する。本発明では、当該濃縮が、「前記ターゲットプレートと前記混合液の液滴とが接する面積を縮小させること」とともに起こる（この現象を「フォーカス現象」と記載することがある）ため、「前記混合液中に含まれる前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤を前記面積の一部へ集め」ることができる。混合液中の溶媒の大部分或いは全てが除去されれば、残渣として、「前記面積の一部」に、前記「混合物のフォーカススポット」が得られる。
すなわち、「解析すべき試料」と「液体マトリックス」と「添加剤」と「溶媒」とを含む「混合液」から、「溶媒」が除去されて残る残渣を「混合物」として得る。
【００１５】
「混合物のフォーカススポット」（フォーカススポット：focused spot）は、混合液中に含まれる解析すべき試料とイオン性液体と添加剤とが、前記広がり面積領域の一部を占める微小な面積領域（すなわち下記（６）における「混合物のフォーカススポットとターゲットプレートとが接する面積」に相当する領域）へ集積されることによって形成されたものである。
「混合物のフォーカススポット」は、ＭＡＬＤＩ質量分析に供されるべき調製物であって、すなわちレーザー光を照射されるべき対象物である。
【００１６】
（２）
前記アンモニウム塩が、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選ばれる、（１）に記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【００１７】
（３）
前記工程（i）における前記アンモニウム塩としてリン酸アンモニウムを用いる場合、
前記工程（iii）における質量分析測定をネガティブモードで行い、［Ｍ−Ｈ］−イオンと、［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン及び／又は［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンと、からなるピークを検出することによって、前記解析すべき試料から前記糖鎖に由来するイオンを特異的に検出する、（２）に記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【００１８】
すなわち、上記（３）の方法のように、液体マトリックスの添加剤としてリン酸アンモニウムを用いる場合には、質量分析測定をネガティブモードで行うと、解析すべき試料中に含まれる糖鎖のイオンが、［Ｍ−Ｈ］−イオンとしてだけでなく、［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンや［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンとしても検出される。当該［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン及び［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンは、糖鎖に特有のものとして検出され、糖鎖以外の分子種からは検出されない。
【００１９】
上記（３）の工程（iii）では、具体的には、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン；［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオン；又は、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンを検出する。［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンとの間には９８Ｄａ、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンとのに間は８０Ｄａの質量差がある。従って、糖鎖の検出・同定は、これら特徴的なピークが有する一定の質量差（すなわち、９８Ｄａ差；８０Ｄａ差；又は、９８Ｄａ差及び８０Ｄａ差の両方）の情報を利用することによって行うことができる。このことによって、解析すべき試料が糖鎖と糖鎖以外の分子との混合物であっても、糖鎖を容易に検出・同定することができる。
【００２０】
（４）
前記アミノキノリンが、３−アミノキノリン及びその構造異性体からなる群から選ばれる、（１）〜（３）のいずれかに記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【００２１】
「３−アミノキノリン」の「構造異性体」には、２−アミノキノリン、４−アミノキノリン、５−アミノキノリン、６−アミノキノリン、７−アミノキノリン、及び８−アミノキノリンが含まれる。
【００２２】
（５）
前記酸性基含有物質はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）からなる群から選ばれる、（１）〜（４）のいずれかに記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
【００２３】
前記混合物のフォーカススポットと前記ターゲットプレートとが接する面積は、形成された直後の前記混合液の液滴と前記ターゲットプレートが接する面積の８０％以下に縮小されうる。
【００２４】
上記の縮小率（８０％以下）について、その下限値としては特に限定されるものではないが、例えば０．００１％である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によると、微量の糖鎖を検出することができる、質量分析を用いた糖鎖の高感度測定が可能になる。例えばポジティブモードでアトモルオーダー、ネガティブモードでフェムトモルオーダーの検出感度での糖鎖測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例２において、液体マトリックスの添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合のネガティブイオンモード測定を行って得られたマススペクトルにおける、糖鎖特異的な８０Ｄａ及び９８Ｄａの質量差を有するピークを示す。
【図２】実施例３において、液体マトリックスの添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合のネガティブイオンモード測定を行って得られたマススペクトルにおける、糖鎖特異的な８０Ｄａの質量差を有するピークを示す。
【図３】分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−と８０Ｄａの質量差で検出されるピーク［Ｍ＋７９］−が、糖鎖由来のものであることを確認する質量分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
［１．混合液の液滴調製］
［１−１．液体マトリックス］
［１−１−１．液体マトリックスの種類］
本発明においては、マトリックスとして、室温で液体状のマトリックス（すなわち液体マトリックス）を用いる。
液体マトリックスとしては、アミノキノリンと酸性基含有物質とから構成される液体物質（アミノキノリン／酸性基含有物質）を用いる。
アミノキノリンとしては、具体的には、３−アミノキノリン及びその構造異性体が挙げられる。当該構造異性体には、２−アミノキノリン、４−アミノキノリン、５−アミノキノリン、６−アミノキノリン、７−アミノキノリン、及び８−アミノキノリンが含まれる。
【００２８】
酸性基含有物質としては、特に限定されず、酸性基含有有機物質であってもよいし、酸性基含有無機物質であってもよい。
酸性基含有有機物質としては、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、ｐ−クマル酸、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、３−ヒドロキシピコリン酸、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸（フェルラ酸）、カフェイン酸（３，４−ジヒドロキシケイ皮酸）、５−メトキシサリチル酸、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、ニコチン酸、ピコリン酸、３−アミノピコリン酸、３−ヒドロキシピコリン酸、２−アミノ安息香酸、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸、６−アザ−２−チオチミン、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン、１，４−ジヒドロ−２−ナフトエ酸、３−インドールアクリル酸、インドール−２−カルボン酸、チオグリコール酸などから選択されうる。好ましくは、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸や２，５−ジヒドロキシ安息香酸が選択される。
酸性基含有無機物質は、例えば、リン酸、ホウ酸、硫酸、ケイ酸などから選択されうる。
【００２９】
［１−１−２．液体マトリックスの調製］
液体マトリックスの調製方法としては特に限定されるものではない。具体的な調製方法としては、当該液状物質をマトリックスとして用いる質量分析分野や、当該液状物質を、有機合成反応の溶媒、液−液抽出における液相、ガスクロマトグラフィーにおける固定相、その他の化学的・生化学的等の用途として用いるさまざまな分野において、当業者によって調製されてきた方法に準じることができる。
【００３０】
例えば、もっとも簡便な調製法の一つとしては、液体マトリックスを構成するアミノキノリンの由来元となるアミノキノリン類と、酸性基含有物質の由来元となる酸物質とを混合して反応させる方法が挙げられる。
【００３１】
双方の物質を反応させるためには、酸物質をアミノキノリン類に加えても良いし、アミノキノリン類を酸物質に加えても良い。当該双方の物質の反応は、溶媒中で行うことができる。そのため、酸物質及びアミノキノリン類の少なくとも一方を予め溶液として調製して、酸物質をアミノキノリン類に加えても良いし、アミノキノリン類を酸物質に加えても良い。或いは、溶媒に酸物質及びアミノキノリン類を同時に加えても良い。
【００３２】
互いに反応させるべきアミノキノリン類と酸物質との比は、モル比で表して１００：１〜１：１０、好ましくは２０：１〜１：１と設定することができる。溶媒中どのような濃度で双方の物質を反応させるかについては、当業者が適宜決定すればよい。
【００３３】
溶媒中で反応させた場合は、反応後、溶媒を除去することができる。溶媒の除去は、留去、好ましくは減圧下における留去によって行うことができる。溶媒の除去を行った後、液状の物質を液体マトリックスとして得ることができる。或いは、液体マトリックス調製に用いる溶媒と、液滴に含ませるべき溶媒とが同じである場合は、当該溶媒の全てを除去しないことも許容する。
【００３４】
［１−１−３．混合液中の液体マトリックスの濃度］
混合液中における液体マトリックスの濃度は、当業者が適宜決定することができるものである。液体マトリックスの好ましい濃度は特に限定されず、使用するターゲットプレートの表面状態に対して、相対的に決めることができる。
【００３５】
例えば、後述の１−５で挙げるように、表面処理として物理的処理又は化学的処理が施されたターゲットプレートを使用する場合は、混合液中の不揮発分として含まれる物質の種類や、当該不揮発分の総量などの要因によって変動しうるものであるが、混合液中、１００μＭ〜３０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜１０Ｍ、更に好ましくは１０ｍＭ〜１Ｍとすることができる。
【００３６】
［１−２．解析すべき試料］
［１−２−１．解析すべき試料の種類］
本発明においては、糖鎖分子を含む試料を解析すべき試料とする。
糖鎖分子としては特に限定されない。例えば、中性糖鎖、硫酸化糖鎖やシアル化糖鎖（シアロ糖鎖）などの酸性糖鎖、及びそれらの修飾体が挙げられる。当該修飾体としては、当業者が扱いうるあらゆる修飾糖鎖が含まれる。例えば糖鎖のラベル化体などが挙げられ、そのごく一例として、ピリジルアミノ化糖鎖が挙げられる。
解析すべき試料中には、上記例示した糖鎖分子が単独で又は複数種が混合されて含まれてよい。
【００３７】
解析すべき試料は、上記の糖鎖分子を単独で含むもののほか、糖鎖以外の非糖鎖分子が含まれたものであってもよい。当該非糖鎖分子としては、生体分子であってもよいし、合成分子であってもよい。生体分子としては、タンパク質、ペプチド、脂質など、及びそれらの修飾体などが挙げられる。合成分子としては、解析すべき試料の調製工程において含まれうる又は生じうるいかなるものも含まれる。例えば、当該調製工程終了までに用いた試薬分子、脱離した修飾基などに由来する分子が挙げられる。
解析すべき試料中には、非糖鎖分子が含まれる場合、上記例示した非糖鎖分子が単独で又は複数種が混合されて含まれてよい。
【００３８】
［１−２−２．解析すべき試料の調製］
解析すべき試料の具体例としては、糖鎖分子単体を水などの溶媒に溶解して得られる試料、糖鎖分子調製を行った後、調製された糖鎖分子を分離又は精製を行って得られる試料、糖鎖分子調製を行った後、調製された糖鎖分子を分離・精製することなく得られる試料などが挙げられる。
【００３９】
糖鎖分子調製を行った後、調製された糖鎖分子を分離・精製することなく得られる試料は、通常、糖鎖分子と非糖鎖分子とが混合されたものとして得られる。このような糖鎖分子調製の方法としては、当業者に公知のいかなる方法も含まれる。例えば、糖鎖合成法や、糖鎖含有分子を少なくとも脱糖鎖処理に供する方法が挙げられる。
【００４０】
糖鎖含有分子を少なくとも脱糖鎖処理に供する方法の具体例としては、糖タンパク質や糖ペプチドなどの糖鎖含有分子を、必要に応じペプチド鎖の断片化処理に供して、脱糖鎖処理に供する方法が挙げられる。ペプチド鎖の断片化処理としては、酵素的手法（例えばタンパク質分解酵素による消化法）及び化学的手法（例えばブロモシアンなどの試薬による化学的分解法）を問わない。脱糖鎖処理としても、酵素的手法（脱糖鎖酵素による分解法）及び化学的手法（例えばピリジルアミノ化法などの糖鎖切り出し法）を問わない。
【００４１】
［１−２−３．混合物中の解析すべき試料の濃度］
混合液中の解析すべき試料の量としては、特に限定されるものではない。例えば、液体マトリックス５０ｎｍｏｌに対し、試料の量は、１ａｍｏｌ以上、例えば約数ａｍｏｌ〜数百ｐｍｏｌ、具体的には１ａｍｏｌ〜５００ｐｍｏｌの広い範囲で許容される。
【００４２】
［１−３．添加剤］
［１−３−１．添加剤の種類］
添加剤としては、アンモニウム塩が用いられる。アンモニウム塩としては特に限定されるものではないが、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、過塩素酸アンモニウム、臭化アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、フッ化アンモニウム、過マンガン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩；及びクエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどの有機カルボン酸のアンモニウム塩などが挙げられる。
【００４３】
［１−３−２．混合液中の添加剤の濃度］
混合液中の添加剤の量としては、特に限定されるものではない。例えば、液体マトリックス５０ｎｍｏｌに対し、４ｐｍｏｌ〜４μｍｏｌ、或いは１ｎｍｏｌ〜５００ｎｍｏｌの量で用いることができる。
【００４４】
［１−３−３．添加剤がもたらしうる作用］
添加剤がもたらす作用として考えられるものの例として、マトリックスクラスターなどの非特異的なイオンや付加イオンの形成抑制が挙げられる。このような例を含めた添加剤の作用は、検出すべき糖鎖由来イオンの感度が顕著に上昇するという効果の一因となっていると考えられる。
【００４５】
上記添加剤の中でも、リン酸アンモニウムを用いた場合は、ネガティブイオンモードでの質量分析測定工程において、糖鎖由来イオンが、特定の質量差を有する特徴的なピークを呈するものとして特異的に検出される（後述３−１）という効果をもたらす。
【００４６】
［１−４．溶媒］
［１−４−１．溶媒の種類］
混合液中に用いられる溶媒としては、特に限定されるものではなく、当業者が適宜決定することができる。例えば、上記解析すべき試料、液体マトリックス、及び添加剤の全てを溶解することができる溶媒を選択することができる。より具体的は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルムなどの有機溶媒、及び水から１種又は複数種を選択して用いることができる。例えば、アセトニトリル−水系が好ましい。
【００４７】
［１−４−２．溶媒の組成］
溶媒中には水が含まれていることが好ましい。例えば、溶媒全体の１０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％を占めるように、水を含ませることができる。溶媒中に水が含まれることは、後述のフォーカス効果を特に効果的に得ることができる点、より再現性良くフォーカススポットを調製することができるという点などから好ましい。
【００４８】
［１−４．液滴の体積］
上述のように、混合液は、上記溶媒中に、液体マトリックスが１００μＭ〜３０Ｍ、解析すべき試料が液体マトリックス５０ｎｍｏｌに対し１ａｍｏｌ〜５００ｐｍｏｌとなる量、添加剤が液体マトリックス５０ｎｍｏｌに対し４ｐｍｏｌ〜４μｍｏｌとなる量で含まれる組成を有するものとして調製されうる。
１個のフォーカススポットを形成するための混合液の液滴の体積としては、特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。
ターゲットプレート上にウェルが設けられている場合、混合液の液滴は、ウェル内に形成することができる。この場合、液滴は、当該ウェル内に収まる程度の体積をもって形成される。具体的には、１０ｎＬ〜１０μＬ程度、例えば０．５μＬ程度の液滴を形成することができる。
【００４９】
［１−５．ターゲットプレート］
ターゲットプレートとしては、後述２−２に記載のフォーカス現象を起こすことが可能なもの（すなわちフォーカスターゲット）であれば特に限定されない。通常ＭＡＬＤＩ質量分析に使用されるステンレス鋼ターゲットプレートなどや、化学的及び／又は物理的に表面処理がなされたターゲットプレートなど、さまざまなものを使用することができる。
【００５０】
化学的に表面処理がなされたものとしては、ターゲットプレート上の各ウェルの中心部が親水性処理、当該中心部以外の周辺部が疎水性処理されているものが挙げられる。親水性処理の態様としては、親水性膜による表面皮膜処理、疎水性処理の態様としては、疎水性膜による表面皮膜処理が挙げられる。例えば、ウェルにおいて、ターゲットプレート上に疎水性膜が設けられ、当該中心部のみ、さらに親水性膜が当該疎水性膜の上に設けられている膜構造を有するものや、ウェルにおいて、ターゲットプレート上に親水性膜が設けられ、当該周辺部のみ、さらに疎水性膜が当該親水性膜の上に設けられている膜構造を有するものなどが挙げられる。表面皮膜処理を行うための方法は特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法によって行われる。詳しくは２−３で後述するが、このようなターゲットプレートを用いることによって、フォーカス現象を効果的に起こすことができる。
【００５１】
物理的に表面処理がなされたものとしては、ターゲットプレート表面の表面粗さを所望の程度にする処理がなされたものが挙げられる。そのような表面処理としては、例えば、研磨処理や鏡面仕上げ処理が挙げられる。例えば、ターゲットプレート表面の表面粗さがより小さいものは、フォーカス現象をより効果的に起こすという観点から好ましい。
【００５２】
本発明におけるターゲットプレートとしては、当業者によって適宜調製されたものを使用してもよいし、市販のものを使用してもよい。市販のターゲットプレートとしては、（株）島津製作所、ハドソン・サーフィス・テクノロジー（Hudson Surface Technology）社、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社、ブルカー・ダルトニクス（Bruker Daltonics）社、マステック（MassTech）社、アマシャム・バイオサイエンス（Amersham Bioscience）社などから市販されているものが挙げられる。
【００５３】
［１−６．混合液の液滴調製方法］
混合液の液滴をターゲットプレート上に形成する具体的方法としては特に限定されない。たとえば、まず液体マトリックス及び添加剤を含む溶液と、試料溶液とを別々に調製し、両溶液を任意の順番で混合することができる。例えば、両溶液を別々に調製した後、当該両溶液を互いに混合させて混合液を得て、得られた混合液をターゲットプレート上に滴下することによって、混合液の液滴を形成することができる。また、両溶液のうち、試料溶液をターゲットプレート上に滴下して試料溶液の液滴を形成し、形成された試料溶液の液滴に液体マトリックス−添加剤溶液を滴下することによってターゲットプレート上で両溶液を混合し、混合液の液滴を形成することができる。この場合、試料溶液と液体マトリックス溶液との滴下順序を逆にしても良い。
【００５４】
ここで、液体マトリックス及び添加剤を含む溶液の調製は、液体マトリックスと、それとは別途用意された添加剤とを互いに混合する方法によって行っても良いし、液体マトリックスの調製の途中で添加剤を加え、液体マトリックスの調製完了と同時に、液体マトリックス及び添加剤を含む溶液が調製されるという方法によって行ってもよい。液体マトリックスの調製法の例として述べた上述の１−１−２の方法（すなわちアミノキノリン類と酸性基含有物質とを混合する方法）を元にする場合、酸性基含有物質と添加剤とをあらかじめ混合させた後、当該混合された酸性基含有物質をアミノキノリン類と混合させることができる。
【００５５】
一方、液体マトリックス溶液と、添加剤溶液と、試料溶液とを別々に調製し、同様に任意の順番で混合することもできる。
【００５６】
形成されたターゲットプレート上の混合液液滴は、ある程度の広がり面積をもってターゲットプレートと接している。以下、液滴とターゲットプレートとが接する面積を、液滴の広がり面積と記載することがある。
【００５７】
［２．試料−液体マトリックス−添加剤混合物のフォーカススポット形成］
［２−１．フォーカススポット］
試料−液体マトリックス混合物は、解析すべき試料と、液体マトリックスと、添加剤を溶媒中に含む混合液の液滴をターゲットプレート上に形成する工程と、形成された前記混合液の液滴から前記溶媒を大部分又は全部除去し、前記混合液中の不揮発分（すなわち少なくとも試料と液体マトリックスと添加剤）を残渣として得る工程とによって得ることができるものである。本発明においては、当該混合物を、フォーカススポットの形状で得る。
【００５８】
（フォーカススポット：focused spot）は、ターゲットプレート上の混合液中に含まれる解析すべき試料と液体マトリックスと添加剤とが、当該混合液のターゲットプレート上における広がり面積領域の一部を占める微小な面積領域へ集積されること（すなわち後述２−２のフォーカス現象）によって形成されたものである。
【００５９】
通常、このように形成された混合物すなわちフォーカススポットは、当該広がり面積領域の一部において盛り上がった微小な塊状の形態で存在する。ここで塊状とは、フォーカス現象を経ることなく形成された場合の混合物が有する扁平な形状に比べ、厚さがより大きく（すなわちターゲットプレート面からの高さがより高く）、面がより狭い（すなわちターゲットプレートとの接触面積がより小さい）形状、すなわちより盛り上がった形状をいう。通常、ターゲットプレートにおけるウェル面積より狭い面積の領域において、当該混合物が、集積或いは堆積したように盛り上がった微小な塊の状態で調製される。このような形状の混合物を、混合物のフォーカススポットと記載することがある。
【００６０】
［２−２．フォーカス現象］
本発明のフォーカススポットは、以下のような過程を経て形成される。
ターゲットプレート上の混合液の液滴から溶媒が除去されるに伴い、液滴の体積が減少する。溶媒の除去としては、溶媒の自然蒸発を含む。これにより、混合液中の不揮発分（試料、液体マトリックス及び添加剤が少なくとも含まれる）の濃度が高くなる。すなわち混合液液滴が濃縮される。それに伴い、混合液液滴の広がり面積を縮小させる。混合液液滴の濃縮と混合液液滴の広がり面積の縮小とが相伴って起こるため、濃縮がより進行すれば、当該広がり面積領域のより小さい面積領域へ、混合液中の不揮発分がより濃い濃度で集められる。混合液中の溶媒の大部分或いは全てが除去されることによって濃縮が完了すれば、残渣として、試料−液体マトリックス−添加剤混合物の微小な濃縮スポットが当該広がり面積の一部に残る。この状態は、室温下及び真空下でも維持される。
【００６１】
本発明においては、混合液液滴の濃縮とともに混合液液滴の広がり面積の縮小が起きる現象を、混合液中に含まれる不揮発分が、混合液液滴の広がり面積の一部へ集まることから、フォーカス現象と呼ぶ。フォーカス現象を利用することの利点は、試料−液体マトリックス−添加剤混合物を小さい面積領域に集中させることができることにある。混合物が小さい面積領域に集中することは、レーザーを照射するポイントに存在する試料を密にすることであるため、高感度計測を可能にする。しかも、そのようにして得られた塊状混合物の表面は比較的均質な状態で保たれているため、混合物スポットの場所によるイオン化の偏りがほとんどないコンディションで計測を行うことが可能である。
【００６２】
［２−３．フォーカスの度合い］
フォーカス現象によってターゲットプレート上の液滴がどの程度縮小するかに関する具体的な量としては特に限定されるものではない。例えば、混合物のフォーカススポットとターゲットプレートとが接する面積が、形成された直後の混合液の液滴とターゲットプレートが接する面積の８０％以下、好ましくは５０％以下、更に好ましくは１０％以下に縮小されれば、当該フォーカス効果は特に効果的に得られたといえる。当該縮小率の下限値としては特に限定されるものではないが、例えば０．００１％である。
【００６３】
すでに述べたように、フォーカス現象によって、試料−液体マトリックス−添加剤混合物が小さい面積領域に集中するため、レーザーを照射するポイントに存在する試料が密になり、従って高感度計測をおこなうことが可能になる。
このため、形成された直後の混合液の液滴の広がり面積がフォーカス現象によってより小さい面積に縮小すると（すなわちより大きいフォーカス効果を得ると）、より密に凝集した試料−液体マトリックス−添加剤混合物が得られる。このことは、高感度計測の点から好ましい。
【００６４】
本発明におけるフォーカス効果を効果的に得るためのアプローチの一例として、試料、液体マトリックス及び添加剤を含む混合液中の液体マトリックス濃度を考慮することができる。この場合、例えば前述１−１−３で挙げたように、液体マトリックス濃度をより低く設定することができる。
当該アプローチの他の一例として、使用する溶媒の種類を考慮することができる。この場合、例えば前述１−４−２で挙げたように、混合液調製に用いられる溶媒における水の割合をより多く設定することができる。
【００６５】
当該アプローチの更なる他の一例として、ターゲットプレートの表面の状態を考慮することができる。この場合、例えば前述１−５で挙げたように、ターゲットプレート上の各ウェルの中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されているものや、ターゲットプレートの表面粗さがより小さいものを用いることができる。
【００６６】
ウェルの中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されているターゲットプレートを使用する場合は、ウェル上に滴下する混合液を、当該疎水性処理部分よりも相対的に親水性となる組成のものとして調製することができる。すなわち、混合液調製に用いられる溶媒における親水性溶媒の割合をより多く設定することができる。例えば、前述と同様、混合液調製に用いられる溶媒における水の割合をより多く設定することができる。
【００６７】
このような混合液は、ウェル上に滴下されたときに、その広がり面積が、ウェル中央部の親水性部分とその周辺部の疎水性部分との両方にまたがるような量で用いられることが通常である。そして、その液滴は、溶媒除去に伴う自身の体積の減少とともに、疎水性部分との接触から逃れるように、親水性部分の範囲内のみにその広がり面積が収まるように縮小する。親水性−疎水性表面処理を施したターゲットプレートを用いた場合は、このように、液滴がターゲットプレート上の疎水性部分との接触から逃れるように動く作用を生じることによって、フォーカス現象をより効果的に生じさせる。
【００６８】
［３．質量分析測定］
上記の混合物のフォーカススポットは、ＭＡＬＤＩ質量分析に供される。すなわち、質量分析においては、当該フォーカススポットにレーザー光が照射される。
［３−１．検出イオン種］
本発明においては、質量分析測定は、ポジティブイオンモードで行ってもよいし、ネガティブイオンモードで行ってもよい。
【００６９】
特に、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合にネガティブイオンモードで質量分析測定を行うと、解析すべき試料中に含まれる糖鎖のイオンが、以下のような一定の質量差を持つ特徴的なピークとして検出される。
【００７０】
具体的には、糖鎖イオンは、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−とともに、そのリン酸付加イオン［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−や当該リン酸付加イオンが脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−としても検出される。より具体的には、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン；［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオン；又は、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンとして検出される。
当該［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン及び［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンは、糖鎖に特有のものとして検出され且つ糖鎖以外の分子種からは検出されない、すなわち糖鎖特異的なピークである。
【００７１】
ここで、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンとの間には９８Ｄａ、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンとの間には８０Ｄａの質量差がある。従って、糖鎖の検出は、これら特徴的なピークが有する一定の質量差（すなわち、９８Ｄａ差；８０Ｄａ差；又は、９８Ｄａ差及び８０Ｄａ差の両方）の情報を利用することによって行うことができる。また。このような質量差の情報の取得に当たっては、当該質量差を自動判定するプログラムなどを使用することができる。
このことによって、解析すべき試料が糖鎖と糖鎖以外の分子との混合物であっても、特徴的な質量差を有するピークを検出することによって、糖鎖の識別を容易に行うことが可能である。また、当該ピークに基づいて、例えば多段階ＭＳ測定（すなわちＭＳの２乗以上のＭＳ測定）を行うことよって、当該識別された糖鎖を同定することが可能である。
【００７２】
［３−２．質量分析装置］
質量分析装置としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法による装置であれば特に限定されない。例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型）質量分析装置（例えば（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ(R)シリーズ）などが挙げられる。このような質量分析装置の具体例としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ型）質量分析装置（例えば（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ(R)−ＱＩＴ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ型）質量分析装置（例えば（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ(R)−ＴＯＦ２）などが挙げられる。
【実施例】
【００７３】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。以下において、％で表される量は、体積を基準として示す。
【００７４】
［実施例１−ポジティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３−アミノキノリンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含む液状物質；３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のポジティブイオンモードで分析を行った。
【００７５】
中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖としては、以下の２種類をそれぞれ検討した。
ＰＡ化糖鎖01（Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ、二分枝構造）  分子量1718
ＰＡ化糖鎖04（Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ、四分枝構造）  分子量2448
上記ＰＡ化糖鎖はMilliQに溶解し、さまざまな濃度の水溶液に調製した。
【００７６】
液体マトリックスとしては、３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤としては、下記の３種を用いた。この実施例においては、３ＡＱ／ＣＨＣＡと添加剤とはあらかじめ互いに混合された混合液（以下、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液と記載する）として調製された。具体的には、以下のように調製した。
【００７７】
1) ５０％アセトニトリル水溶液５４０μＬに、１００ｍＭの下記a、b又はcの添加剤水溶液６０μＬを加え１０ｍＭ  添加物の５０％アセトニトリル水溶液を調整し、さらにα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）１０ｍｇを加えることによって、添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液を調製した。
2) 上記1)で得られた添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液１５０μＬに、３−アミノキノリン（３ＡＱ）２０ｍｇを加え、３ＡＱ／ＣＨＣＡと添加剤との混合液を調製した。
3) 上記2)で得られた混合液を、５０％アセトニトリル水溶液を用いて１／１０の濃度に希釈した。
【００７８】
３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液調製に使用された添加剤水溶液は、以下のとおりである。
a. １００ｍＭリン酸アンモニウム  分子量115
b. １００ｍＭ塩化アンモニウム    分子量53.5
c. １００ｍＭ硫酸アンモニウム    分子量132
【００７９】
試料水溶液と３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液とを１：１の体積比で混合し、Pre mix（すなわち、試料、液体マトリックス及び添加剤を含む混合液）を調製した。
【００８０】
ターゲットプレートとして、ハドソン・サーフィス・テクノロジー（Hudson Surface Technology, Inc. (HST)）社製、μfocusターゲットを用いた。このターゲットプレートは、各ウェル（円形）の中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されている。この実施例では、疎水性処理された中心部の直径が1000μmであるものを用いた。このターゲットプレートのウェルに、上記調製されたPre mixを1μL滴下し、自然乾燥させることにより、フォーカススポットを得た。
【００８１】
糖鎖濃度の異なるそれぞれのフォーカススポットについて、（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴを用い、positive, mid massモードで質量分析測定を行った。
この実施例における糖鎖の検出限界を、後述の比較例１及び比較例２の結果とともに、下記の表１（測定結果Ａ）に示す。
【００８２】
［比較例１］
この比較例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスの代わりに固体マトリックスである２，５−ジヒドロ安息香酸（ゲンシジン酸；ＤＨＢ）を用い、添加剤は用いなかった場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のポジティブイオンモードで分析を行った。
【００８３】
具体的には、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液の代わりに、５０％アセトニトリル水溶液にＤＨＢを３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して調製したＤＨＢ混合液を用いたことを除いては、実施例１と同じ操作を行った。
この実施例における糖鎖の検出限界を、実施例１及び後述の比較例２の結果とともに、下記の表１（測定結果Ａ）に示す。
【００８４】
［比較例２］
この比較例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤は用いなかった場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のポジティブイオンモードで分析を行った。
【００８５】
具体的には、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液の調製の際に、添加剤水溶液を加える代わりに、５０％アセトニトリル水溶液を加えたことを除いて、実施例１と同じ操作を行った。
この比較例における糖鎖の検出限界を、実施例１及び比較例１の結果とともに、下記の表１（測定結果Ａ）に示す。
【００８６】
【表１】
2010249576.tif 000003
【００８７】
測定結果Ａより、ポジティブモードでの糖鎖測定においては、従前、ペプチド・タンパク質の高感度測定を可能にする添加剤として報告されていたリン酸アンモニウムだけでなく、塩化アンモニウムや硫酸アンモニウムを添加剤として用いた場合も、アトモルオーダーの高感度測定が可能であることが示された。
また、液体マトリックスを用いた糖鎖測定において添加剤を加えることによって、添加剤を加えなかった場合に比べ、２００〜２，０００倍の高感度で測定を行うことが可能であることが示された。
さらに、本発明の方法では、一般的に糖鎖測定用のマトリックスとして広く使用されている固体マトリックスＤＨＢを用いた場合に比べ、１００〜１，０００倍の高感度で測定を行うことが可能であることが示された。
【００８８】
［実施例２−ネガティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノー４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間／飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
【００８９】
中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖としては、以下について検討した。
ＰＡ化糖鎖01（Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ、二分枝構造）  分子量1718
当該ＰＡ化糖鎖はMilliQに溶解し、水溶液を調製した。
【００９０】
液体マトリックスとしては、３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤としては、リン酸アンモニウムを用いた。この実施例においては、３ＡＱ／ＣＨＣＡとリン酸アンモニウムとはあらかじめ互いに混合された混合液として調製された。具体的には、以下のように調製した。
【００９１】
1) １０ｍＭ  リン酸アンモニウムの５０％アセトニトリル水溶液６００μＬに、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）１０ｍｇを加えて、添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液を調製した。
2) 上記1)で得られた添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液１５０μＬに、３−アミノキノリン（３ＡＱ）２０ｍｇを加え、３ＡＱ／ＣＨＣＡとリン酸アンモニウムとの混合液を調製した。
3) 上記2)で得られた混合液を、５０％アセトニトリル水溶液を用いて１／１０の濃度に希釈した。
【００９２】
試料水溶液と３ＡＱ／ＣＨＣＡ−リン酸アンモニウム混合液とを１：１の体積比で混合し、Pre mix（すなわち、試料、液体マトリックス及び添加剤を含む混合液）を調製した。
【００９３】
ターゲットプレートとして、ハドソン・サーフィス・テクノロジー（Hudson Surface Technology, Inc. (HST)）社製、μfocusターゲットを用いた。このターゲットプレートは、各ウェル（円形）の中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されている。この実施例では、疎水性処理された中心部の直径が1000μmであるものを用いた。このターゲットプレートのウェルに、上記調製されたPre mixを1μL滴下し、自然乾燥させることにより、フォーカススポットを得た。
このとき、フォーカススポット１個におけるＰＡ化糖鎖の量は５００ｆｍｏｌである
【００９４】
得られたフォーカススポットについて、（株）島津製作所ＡＸＩＭＡ(R)−ＴＯＦ２を用い、negative, linearモードで質量分析測定を行った。
ＭＳ測定の結果得られたマススペクトルを図１に示す。図１において、横軸は（質量／電荷）を表し、縦軸はイオンの相対強度を表す（以下、全てのマススペクトルにおいて同じ）。図１が示すように、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−に加えて、当該分子量関連イオンのリン酸付加体［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−（すなわち［Ｍ＋９７］−）と、当該リン酸付加体が脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−（すなわち［Ｍ＋７９］−）とが検出された。すなわち、８０Ｄａ及び９８Ｄａの質量差を有する特徴的なピークが観測された。
【００９５】
［実施例３−ネガティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
【００９６】
中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖としては、以下について検討した。
ＰＡ化糖鎖01（Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ、二分枝構造）  分子量1718
当該ＰＡ化糖鎖はMilliQに溶解し、さまざまな濃度の水溶液に調製した。
なお、当該ＰＡ化糖鎖の構造は、以下のとおりである。（式中、ＰＡはピリジルアミノ基を示す。）
【００９７】
【化１】
2010249576.tif 000004
【００９８】
液体マトリックスとしては、３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤としては、リン酸アンモニウムを用いた。この実施例においては、３ＡＱ／ＣＨＣＡとリン酸アンモニウムとはあらかじめ互いに混合された混合液として調製された。具体的には、以下のように調製した。
1) １０ｍＭ  リン酸アンモニウムの５０％アセトニトリル水溶液６００μＬに、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）１０ｍｇを加えて、添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液を調製した。
2) 上記1)で得られた添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液１５０μＬに、３−アミノキノリン（３ＡＱ）２０ｍｇを加え、３ＡＱ／ＣＨＣＡとリン酸アンモニウムとの混合液を調製した。
3) 上記2)で得られた混合液を、５０％アセトニトリル水溶液を用いて１／１０の濃度に希釈した。
【００９９】
試料水溶液と３ＡＱ／ＣＨＣＡ−リン酸アンモニウム混合液とを１：１の体積比で混合し、Pre mix（すなわち、試料、液体マトリックス及び添加剤を含む混合液）を調製した。
【０１００】
ターゲットプレートとして、ハドソン・サーフィス・テクノロジー（Hudson Surface Technology, Inc. (HST)）社製、μfocusターゲットを用いた。このターゲットプレートは、各ウェル（円形）の中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されている。この実施例では、疎水性処理された中心部の直径が1000μmであるものを用いた。このターゲットプレートのウェルに、上記調製されたPre mixを1μL滴下し、自然乾燥させることにより、フォーカススポットを得た。
【０１０１】
糖鎖濃度の異なるそれぞれのフォーカススポットについて、（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴを用い、negative, mid massモードで質量分析測定を行った。
ＭＳ測定の結果得られたマススペクトルを図２に示す（フォーカススポット中の糖鎖の濃度が5pmolの場合）。図２が示すように、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−に加えて、当該リン酸付加イオンが脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−（以下、［Ｍ＋７９］−と記載する）が検出された。すなわち、８０Ｄａの質量差を有する特徴的なピークが観測された。
【０１０２】
さらに、当該［Ｍ−Ｈ］−をプリカーサイオン（Pre）としてＭＳ２測定を行った結果と、当該［Ｍ＋７９］−をプリカーサイオン（Pre）としてＭＳ２測定を行った結果とを、図３に示す（フォーカススポット中の糖鎖の濃度が5pmolの場合）。
【０１０３】
図３の［Ｍ＋７９］−をプリカーサイオンとするＭＳ２において、Gal（MW 180）、GlcNAc（MW 221)、Man（MW 180)が脱離したフラグメントイオンをいくつか検出し、それらフラグメントイオン全てが、［Ｍ−Ｈ］−をプリカーサイオンとするＭＳ２におけるフラグメントイオンと対応し、且つ、当該対応するフラグメントイオン間のm/z差は全て８０であったことが示された。すなわち、［Ｍ＋７９］−は糖鎖にリン酸が付加したイオンであり、リン酸は付加したまま断片化されていることを意味する。
従って、［Ｍ＋７９］−は糖鎖のイオンであることが確認できた。
【０１０４】
この実施例における糖鎖の［Ｍ＋７９］−イオンの検出限界を、後述の比較例３及び比較例４の結果とともに、下記の表２（測定結果Ｂ）に示す。
【０１０５】
［比較例３］
この比較例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスの代わりに固体マトリックスである２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）を用い、添加剤は用いなかった場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
具体的には、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液の代わりに、５０％アセトニトリル水溶液にＤＨＢを３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して調製したＤＨＢ混合液を用いたことを除いては、実施例３と同じ操作を行った。
この実施例における糖鎖の検出限界を、実施例３及び後述の比較例４の結果とともに、下記の表２（測定結果Ｂ）に示す。
【０１０６】
［比較例４］
この比較例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤は用いなかった場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
具体的には、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液の調製の際に、添加剤水溶液を加える代わりに、５０％アセトニトリル水溶液を加えたことを除いて、実施例３と同じ操作を行った。
この比較例における糖鎖の検出限界を、実施例３及び比較例３の結果とともに、下記の表２（測定結果Ｂ）に示す。
【０１０７】
【表２】
2010249576.tif 000005
【０１０８】
測定結果Ｂより、ネガティブモードでの糖鎖測定においては、フェムトモルオーダーの高感度測定が可能であることが示された。
また、液体マトリックスを用いた糖鎖測定において添加剤を加えることによって、添加剤を加えなかった場合に比べ、１，０００倍の高感度で測定を行うことが可能であることが示された。
さらに、本発明の方法では、一般的に糖鎖測定用のマトリックスとして広く使用されている固体マトリックスＤＨＢを用いた場合に比べ、１００倍の高感度で測定を行うことが可能であることが示された。
【０１０９】
［実施例４−ネガティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間／飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
中性糖鎖としては、実施例１〜３で用いた中性ＰＡ化糖鎖のＰＡ非ラベル化体を用いた。試料として当該ＰＡ非ラベル化体を用いたことを除いては、実施例２と同じ操作を行った。
【０１１０】
ＭＳ測定の結果、この実施例においては、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−に加えて、当該分子量関連イオンのリン酸付加体［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−（すなわち［Ｍ＋９７］−）と、当該リン酸付加体が脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−（すなわち［Ｍ＋７９］−）とが検出された。すなわち、８０Ｄａ及び９８Ｄａの質量差を有する特徴的なピークが観測された（データ示さず）。
【０１１１】
［実施例５−ネガティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
中性糖鎖としては、実施例１〜３で用いた中性ＰＡ化糖鎖のＰＡ非ラベル化体を用いた。試料として当該ＰＡ非ラベル化体を用いたことを除いては、実施例３と同じ操作を行った。
【０１１２】
ＭＳ測定の結果、この実施例においては、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−に加えて、当該分子量関連イオンのリン酸付加体［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−（すなわち［Ｍ＋９７］−）と、当該リン酸付加体が脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−（すなわち［Ｍ＋７９］−）とが検出された。すなわち、８０Ｄａ及び９８Ｄａの質量差を有する特徴的なピークが観測された（データ示さず）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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