(57)【要約】      （修正有）【課題】生体高分子物質の相互作用検出方法を提供する。【解決手段】（ａ）（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物；を含む細胞を調製する工程；及び（ｂ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程を含む検出方法。生体細胞内で起こる物質結合及び相互作用を実時間で検出できる方法、及びその物質結合及び相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法。【選択図】図３
2010115192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むベイト（bait）とプレイ（prey）の相互作用を検出する方法：
（ａ）（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュール（translocation module）を含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物を含む細胞を調製する工程；及び
（ｂ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程。
【請求項２】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むベイト（bait）とプレイ（preｙ）の相互作用を検出する請求項１記載の方法：
（ａ）（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物を含む細胞を調製する工程；
（ｂ）信号物質（signaling material）で処理する工程；及び
（ｃ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程。
【請求項３】
前記移動モジュールがプロテインキナーゼＣ（protein kinase C）及びその変異体からなる群より選ばれる請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記プロテインキナーゼＣ及びその変異体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第１の標識物質が、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein，緑色蛍光蛋白質）、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein，緑色蛍光蛋白質変異体）、ＲＦＰ（Red Fluorescent Protein，赤色蛍光蛋白質）、ｍＲＦＰ（Monomeric Red Fluorescent Protein，赤色蛍光モノマー蛋白質）、ＤｓＲｅｄ（Discosoma sp. red Fluorescent Protein，ディスコソマ・エスピー由来赤色蛍光蛋白質)、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein，シアン蛍光蛋白質）、ＣＧＦＰ（Cyan Green Fluorescent Protein，シアン緑色蛍光蛋白質）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein，黄色蛍光蛋白質）、ＡｚＧ（Azami Green，アザミグリーン）、ＨｃＲ（HcRed, Heteractis crispa red Fluorescent Protein，ヘテラクティス・クリスパ由来赤色蛍光蛋白質）、及びＢＦＰ（Blue Fluorescent Protein，青色蛍光蛋白質）からなる群より選ばれる請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記第２の標識物質が、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）、ｍＲＦＰ（Monomeric Red Fluorescent Protein）、ＤｓＲｅｄ（Discosoma sp. red Fluorescent Protein）、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＣＧＦＰ（Cyan Green Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）、ＡｚＧ（Azami Green）、ＨｃＲ（HcRed, Heteractis crispa red Fluorescent Protein）、及びＢＦＰ（Blue Fluorescent Protein）からなる群より選ばれる請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
前記第１の構成物が、ＮＬＳ（nuclear localization signal；核局在化シグナル）配列またはＮＥＳ（nuclear export signal；核外搬出シグナル）配列をさらに含む請求項１または２記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＬＳ配列が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＥＳ配列が、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の構成物が、ＮＬＳ（nuclear localization signal）配列またはＮＥＳ（nuclear export signal）配列をさらに含む請求項１または２記載の方法。
【請求項１１】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むベイトとプレイの相互作用を検出する方法：
（ａ）（ｉ）ベイト、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）、またはｍＲＦＰ（Monomeric Red Fluorescent Protein）である第１の標識物質、及び配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及びＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）、ｍＲＦＰ（Monomeric Red Fluorescent Protein）、ＡｚＧ（Azami Green）及びＨｃＲ（HcRed, Heteractis crispa red Fluorescent Protein）からなる群より選ばれる第２の標識物質を含む第２の構成物；を含む細胞を調製する工程；
（ｂ）信号物質で処理する工程；及び
（ｃ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程。
【請求項１２】
前記信号物質での処理が、濃度５０ｎＭ〜５μＭのＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate, Phorbol ester，ホルボールエステル）での処理である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むベイトとプレイ間の相互作用を変化させる物質をスクリーニングする方法：
（ａ）（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物を含む細胞を調製する工程；
（ｂ）試験物質で処理する工程；及び
（ｃ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程。
【請求項１４】
前記相互作用の変化が、相互作用の阻害または増進である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
信号物質で処理する工程をさらに含む請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物を含む細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、（ｉ）プロモータと、プロモータに作動可能に連結されたベイト、第１の標識物質及び移動モジュールをコード化するヌクレオチドとを含む発現ベクター、及び（ｉｉ）プロモータ及びプロモータに作動可能に連結されたプレイ及び第２の標識物質をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換されたものである請求項１６記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、（ｉ）プロモータ及びこれと作動可能に連結されたベイト、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）またはｍＲＦＰ（Monomeric Red Fluorescent Protein）である第１の標識物質及び配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する移動モジュールをコードするヌクレオチドを含むベクター及び（ｉｉ）プロモータ及びこれと作動可能に連結されたプレイ及びＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）、ｍＲＦＰ（Monomeric Red Fluorescent Protein）、ＡｚＧ（Azami Green）及びＨｃＲ（HcRed, Heteractis crispa red Fluorescent Protein）からなる群より選ばれる第２の標識物質をコードするヌクレオチドを含むベクターで同時形質転換されたものである請求項１６記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、ＣＨＯ−ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｌ−９２９細胞、Ｒａｔ２細胞、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞、及びＭＤＣＫ細胞からなる群より選ばれる請求項１５項乃至１８のいずれか１項記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１５乃至１８項のいずれか１項記載の細胞を含むベイトとプレイの相互作用検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体高分子物質の相互作用の新規な検出方法に関する。より詳細には、（ａ）（ｉ）ベイト（bait）、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ（prey）及び第２の標識物質を含む第２の構成物；を含む細胞を調製する工程；及び（ｂ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程を含む検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の成長、分化、移動、死滅等は、蛋白質−蛋白質、蛋白質−核酸等の高分子物質等間の相互作用（interaction）によりなされる。細胞外部の信号は細胞膜の受容体を通過して細胞質内で多様な生化学的反応を介して細胞の核内に伝達され、そこで特定遺伝子等を発現させる。このような外部信号の細胞内伝達過程は、多くの工程の蛋白質間相互作用によりなされる。例えば、成長調節因子（growth factor）や、サイトカイン（cytokine）は、細胞表面の該当受容体（receptor）に結合し、この結合は受容体がクラスター（cluster）を形成するように誘導をする。このようなリガンドによる受容体のクラスターが、その受容体の細胞質内ドメインのクラスターを誘導することにより、細胞内信号伝達過程に関連した多様な蛋白質等との相互作用を誘発する。この信号伝達機構において、蛋白質キナーゼによる蛋白質のリン酸化、蛋白質ホスファターゼによる脱リン酸化等を介して信号を伝達できる中間体蛋白質を作り、結果としてその信号を転写活性化因子（transcriptional activator）に伝達する（Helden, C. H., Cell 80, 213-223(1995))。活性化された転写活性化因子はＤＮＡに結合し、特定の遺伝子を活性化させるＲＮＡポリメラーゼのような基本的な転写調節蛋白質（basal transcriptional regulator proteins）と相互作用する。このような相互作用は、発生過程の特定組織や外部刺激に反応して特異的に転写が起こるように調節することができる。この際、外部物質の侵入または内部活性蛋白質の遺伝子変異等により、特定蛋白質間の相互作用の非正常的な変異、阻害、促進等が起こるようになったことが病気（disorder）の原因と言える。従って、このような相互作用を調節できる物質は、直ちにそれに起因した病気に対する治療の方法を提供することができるのでこれに関する研究が継続されてきた。
【０００３】
生体分子物質間の相互作用、特にその結合特性を分析するための方法としては、架橋結合（cross-linking）、親和性クロマトグラフィー（affinity chromatography）、免疫沈降法（immunoprecipitation,ＩＰ）等の従来のイン・ビトロ（in vitro）法が使用されているものの、これらの方法は生産物（production）から蛋白質を分離及び精製しなければならず、試験管内の緩衝液の条件及び抽出された蛋白質の２次的変異等により、生体内で起きる実際の相互作用と相異した情報を提供し得る短所を有している。
【０００４】
このようなイン・ビトロ（in vitro）法の短所を補完するために、細胞内で直接行う酵母ツーハイブリッド法（yeast two-hybrid，Ｙ２Ｈ）、蛍光共鳴エネルギー転移法（fluorescence resonance energy transfer，ＦＲＥＴ）、蛍光蛋白質再構成法（bimolecular fluorescence complementation，Ｂｉ−ＦＣ）等が開発され、使用されているものの、これらの方法はそれぞれ次のような長所と短所とを有している。
【０００５】
Ｙ２Ｈ法の場合、免疫沈降法と共に現在最も広く使用されている方法として、遺伝子ライブラリを使用して大量のスクリーニングをなし得る長所はあるものの、膜蛋白質や転写酵素のような核蛋白質の検出が難しく、偽陽性（false positive）が高いという短所を有している。さらに、この方法は蛋白質間の相互作用を調節し得る物質を探すには使用が不適な短所がある。これはＹ２Ｈ法が２つの蛋白質間の相互作用があると、レポーター遺伝子からβ−カラクトシダーゼが発現され、培地上のＸ−ｇａｌ化合物を分解してコロニーが青色に変わるようになる方法を利用するものの、候補物質により青色から再び白色に変わるようになる選別方法自体が陰性選別（negative screening）であるため、実際に阻害効果を有する物質を看過することもある。また、判断自体が曖昧であるという短所があり、一般的な薬物スクリーニングには好ましくない。
【０００６】
ＦＲＥＴ法の場合、正確度は高いものの、蛍光共鳴エネルギーが転移するための蛍光蛋白質または蛍光物質の位置決定が難しいため、実験成功率が極めて低いと言う短所がある。Ｂｉ−ＦＣ法の場合、膜蛋白質や核蛋白質の検出に使用し得ると言う長所はあるものの、ＦＲＥＴ方法と同様に相補結合が起こるための蛋白質の相対的な位置を決定することが難しく成功率が低いと言う短所を有する。
【０００７】
従って、前記の方法の短所を克服するために、前記方法の他に様々な方法が提案されているが、効率的な生体物質結合検出方法が一貫して望まれている。特に、目的蛋白質と相互作用をする蛋白質を検出でき、また蛋白質間相互作用を阻害若しくは促進する調節物質をより効率的に探し得る検出システムが切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、生細胞内で起こる物質結合（binding）及び相互作用（interaction）を、外部信号に対する反応や体内の信号伝達機構により細胞内の特定領域を移動する移動モジュール、及び相互作用の一方の対象であるベイトを含む第１の構成物、及び相互作用のもう一方の対象であるプレイを含む第２の構成物を使用することによって、生細胞内のベイトとプレイの相互作用を実時間で検出することが可能であることを見出した。また、前記第１の構成物及び第２の構成物を標識物質によって標識することにより、生細胞内のベイトとプレイの相互作用を実時間で検出できることを見出した。
従って、本発明は互いに相互作用をするベイトとプレイを検出し得る新規な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の目的を達成するために本発明は、
（ａ）（ｉ）ベイト（bait）、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ（prey）及び第２の標識物質を含む第２の構成物；を含む細胞を調製する工程；及び
（ｂ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程
を含むベイト（bait）とプレイ（prey）の相互作用を検出する方法を提供する。
【００１０】
他の目的を達成するために、本発明は、
（ａ）（ｉ）ベイト（bait）、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ（prey）及び第２の標識物質を含む第２の構成物；を含む細胞を調製する工程；
（ｂ）信号物質を処理する工程；及び
（ｃ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程
を含むベイトとプレイ間の相互作用を変化させる物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００１１】
さらに他の目的を達成するために、本発明は、（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物を含む細胞を提供する。
【００１２】
さらに他の目的を達成するために、本発明は、前記細胞を含むベイトとプレイの相互作用検出用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、生細胞内で起こる物質結合（binding）及び相互作用を実時間で検出できる方法、及びこれを利用した相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法を提供する。本発明の方法は今まで知られたイン・ビトロ(in vitro)法（試験管内法及び生化学的方法）、抗体結合法（抗体沈殿法）、蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）、蛍光蛋白質再構成法（Ｂｉ−ＦＣ）及び蛍光干渉（ＦＣＳ）等の既存の生体物質の相互作用検出方法が有する不正確性及び複雑性等の短所を克服し、構成物全てに標識をすることにより、正確度を一層高めた従来の分析技術と差別化される新規な実時間無抗体分析方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の基本構成物及び分析指標を示す。
【図２】本発明の結合及び非結合に対する基本概念図を示す。
【図３】本発明の結合及び非結合分析の模式図を示す。
【図４】本発明の第１の構成物（Ａ）及び第２の構成物（Ｂ）等の構成の１例を示す。
【図５】第１の構成物及び第２の構成物の外部刺激による分布変化を示す。
【図６】ＰＭＡ濃度別第１の構成物（ｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクター）の分布変化を示したものである。
【図７】第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｂａｉｔ及びＴＭＡ−ｍＲＦＰ−Ｂａｉｔ、ＴＭＢ−ｍＲＦＰ−Ｂａｉｔ）の移動効率及び分布を示す。
【図８】第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ５３−ＮＥＳ）及び第２の構成物の分布を示す。
【図９】第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ５３−ＮＬＳ）及び第２の構成物の分布を示す。
【図１０】本発明の方法を利用して、ｐ５３蛋白質とＳＶ４０Ｔ蛋白質の結合を分析した結果を示す。
【図１１】ＫＲＳ（Lysyl-tRNA synthetase）とＪＴＶ１（p38）、Ｇａｇ及びラミニン受容体（Laminin receptor，ＬＲ）間の結合を分析した結果を示す。
【図１２】共焦点レーザー蛍光顕微鏡を利用して、ＲｅｌＡとＩｋＢの結合を実時間で分析した結果を示す。
【図１３】３種の蛋白質複合体の結合を分析した結果を示す。
【図１４】酵母ツーハイブリッド法（Ｙ２Ｈ）によりスクリーニングされた陽性結合候補を検証した結果を示す。
【図１５】ｐ５３蛋白質とｍｄｍ２蛋白質の結合及び抗癌剤ヌトリン３（nutlin 3）の結合阻害を分析した結果を示す。
【図１６】抗癌剤ヌトリン３の結合阻害濃度を分析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の内容をより詳細に説明する。
本発明は、細胞内で起こる生体物質間の相互作用を直接的に、さらに、実時間で分析できるようにするために、外部刺激または内在的な信号伝達機構によって起こる蛋白質の細胞内位置移動を利用したものである。つまり、外部刺激または内在的な信号伝達機構により移動する移動モジュールに相互作用の１つの対象となるベイトを融合し、これを追跡するための標識物質を含む第１の構成物を設計した。また、ベイトと相互作用するプレイ及びこれを追跡できるように、さらに他の標識物質を含む第２の構成物を設計し、前記第１の構成物及び第２の構成物が同時に存在するようにして、これらの相互作用を細胞内で直接的、さらに、実時間で分析できるようにした。
【００１６】
従って、本発明は
（ａ）（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物；を含む細胞を調製する工程；及び
（ｂ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程
を含むベイトとプレイの相互作用を検出する方法を提供する。
【００１７】
本発明において、ベイト、すなわち目的分子（bait，molecule of interest）及びプレイ、すなわち標的分子（prey，target molecule）とは、それぞれ相互作用の対象となる物質を指す。前記ベイト及びプレイは、それぞれ蛋白質、ポリペプチド、有機小物質（small organic molecule）、多糖類（polysaccharide）、またはポリヌクレオチドであり、好ましくは、蛋白質またはポリペプチドである。さらに、天然物（natural product）、合成化合物、化学物質、またはそれらの２個以上の物質の組合わせでもよい。相互作用の検出またはスクリーニングの目的では、ベイトは実験者が知っている物質を表わし、プレイは未知の物質を表わすものとして使用されるが、これに制限はされず、ベイトとプレイを互いに交換でき、それぞれ第１の構成物または第２の構成物の一部となり得る。
【００１８】
本発明において、第１の標識物質及び第２の標識物質は、当業者が検出可能な信号を発生させる物質を表し、この例としては、蛍光物質、リガンド、発光物、微小粒子（microparticle）（またはナノ粒子（nanoparticle））、レドックス分子、及び放射性同位元素等が挙げられる。蛍光物としては、これに制限はされないものの、蛍光蛋白質、フルオレシン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、フルオロシンイソチオシアネート等を使用できる。その内、蛍光蛋白質としては、当業界に公知のものを使用することができ、例えば、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein，緑色蛍光蛋白質）；ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein，緑色蛍光蛋白質変異体);ＲＦＰ（Red Fluorescent Protein，赤色蛍光蛋白質）；ｍＲＦＰ（Monomeric Red Fluorescent Protein，赤色蛍光モノマー蛋白質）；ＤｓＲｅｄ（Discosoma sp. red fluorescent protein，ディスコソマ・エスピー由来赤色蛍光蛋白質）；ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein，シアン蛍光蛋白質）；ＣＧＦＰ（Cyan Green Fluorescent Protein，シアン緑色蛍光蛋白質）；ＹＦＰ（Yellow fluorescent protein，黄色蛍光蛋白質）；ＡｚＧ（Azami Green，アザミグリーン）、ＨｃＲ（HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein，ヘテラクティス・クリスパ由来赤色蛍光蛋白質）、ＢＦＰ（Blue Fluorescent Protein，青色蛍光蛋白質）等が挙げられる。リガンドとしては、ビオチン誘導体等が挙げられ、発光物としては、これに制限はされないものの、アクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ等が挙げられる。微小粒子（microparticle）（またはナノ粒子（nanoparticle））としては、これに制限はされないものの、コロイド金、鉄、着色されたラテックス等が挙げられ、レドックス分子としては、これに制限はされないものの、フェロセン、ルテニウム錯化合物、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１，４−ベンゾキノン、ハイドロキノン等が挙げられる。放射性同位元素としては、これに制限はされないものの、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、186Ｒｅ等がある。しかしながら、前記例示の他に、標識物質の検出に使用できるものであればいずれのものでも使用できる。
【００１９】
本発明の第１の標識物質及び第２の標識物質は、好ましくは、蛍光蛋白質であり、さらに、好ましくは、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ（Discosoma sp. red fluorescent protein）、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＣＧＦＰ（Cyan Green Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）、ＡｚＧ（Azami Green）、ＨｃＲ（HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein）、またはＢＦＰ（Blue Fluorescent Protein）である。この際、第１の標識物質及び第２の標識物質は互いに区別できるようにするため、別個の蛍光蛋白質であることが好ましい。さらに、本発明の第１の標識物質及び第２の標識物質は、それぞれ配列番号９（ＥＧＦＰ）、配列番号１１（ｍＲＦＰ）、配列番号１３（ＡｚＧ）または配列番号１５（ＨｃＲ）で表示されるアミノ酸配列、または配列番号１０（ＥＧＦＰ）、配列番号１２（ｍＲＦＰ）、配列番号１４（ＡｚＧ）または配列番号１６（ＨｃＲ）で表示される塩基配列を有することがより好ましい。
【００２０】
本発明において、移動モジュールは、第１の構成物を細胞内の特定領域に移動させる機能を有する。前記の細胞内の特定領域への移動は、外部信号により誘発されたり、または内在的に起こり、細胞内の特定領域とは、細胞内構造物にして細胞内に存在する区分され（separate）、区別され（discreet）、同定可能（identifiable）要素を表す。前記細胞内の特定領域は、好ましくは細胞膜、核膜等の膜構造体、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、リソソーム等の細胞内小器官、またはその他の細胞内の特定領域である。
【００２１】
本発明の移動モジュールは、前記細胞内の特定領域によって、多様に適用できるものであり、好ましくは、プロテインキナーゼＣ（protein kinase C，ＰＫＣ）であり、当業界で公知のｃＰＫＣｓ（classical PKCs; PKC-alpha、PKC-beta、PKC-gamma）、ｎＰＫＣｓ（novel PKCs; PKC-delta、PKC-epsilon、PKC-eta、PKC-theta）、ａＰＫＣｓ（atypical PKCs；PKC-zeta、PKC-lambda/iota）、及びこれらの変異体が含まれる。これらは全て、Ｃ１ドメインという部分を共通に有し、ジアシルグリセロール（diacyl glycerol，ＤＡＧ）またはホルボールエステル（phorbol ester，ＴＰＡまたはＰＭＡ）がＣ１ドメインに結合することにより、細胞膜への位置移動が誘導される。本発明の移動モジュールとして好ましくは、ＰＫＣの変異体を使用することができ、前記変異体は内在的な信号伝達機構による干渉を最小化するために、ＰＫＣの内在的なリン酸化活性部位を除去した変異体であることがより好ましい。さらに、本発明の移動モジュールは、配列番号１（ＰＲＫＣＤ）、配列番号３（ＴＭＡ）、配列番号５（ＴＭＢ）または配列番号７（ＴＭＤ）で表示されるアミノ酸配列、または配列番号２（ＰＲＫＣＤ）、配列番号４（ＴＭＡ）、配列番号６（ＴＭＢ）または配列番号８（ＴＭＤ）で表示される塩基配列を有することがより好ましい。
【００２２】
一方、予備実験を介して蛋白質リン酸化酵素の他に、刺激により移動するＲａｓＧＲＰを含む多様な蛋白質とＣ１ドメイン等に対する移動効率を分析した結果、本発明のＰＫＣ全体（ＰＲＫＣＤで表示）またはＰＫＣの変異体（ＴＭＤで表示）を基本とした突然変異体等の移動効率が相対的に優れたものとして表れた（図７参照）。
【００２３】
一方、本発明の第１の構成物または第２の構成物は、さらに、核局在化シグナル（nuclear localization signal，ＮＬＳ）または核外搬出シグナル（nuclear export signal，ＮＥＳ）配列を含め得る。これはベイトまたはプレイの内在的な特性または実験に使用される個々の細胞株によって細胞内分布が異なるのを制御するためにさらに含め得る。ＮＬＳをさらに含む場合、第１の構成物及び第２の構成物が核質に均一に分布させることができ、ＮＥＳをさらに含む場合、第１の構成物及び第２の構成物が細胞質に均一に分布させることができる。これによって、ベイトとプレイの結合が起こる細胞内の場所が細胞質であるか、若しくは核質であるかを認識することもでき、細胞質または核質で結合が起こるように誘発することができる。ＮＬＳは、当業界に公知の配列（例えば、SV40 T Antigen（ＰＫＫＫＲＫＶ）、Yeast histon H2B（ＧＫＫＲＳＫＶ）、Human c-myc（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ）、Nucleoplasmin（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬ）、Human IL-5（ＫＫＹＴＤＧＱＫＫＫＣＧＥＥＲＲＲＶＮＱ）、Human RB（ＫＲＳＡＥＧＳＮＰＰＫＰＬＫＫＬＲ）、Human p53（ＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫＫＫＰ）)、または配列番号１７のアミノ酸配列が好ましく、さらに、配列番号１７のアミノ酸配列（ＧＳＧＤＥＶＥＧＶＥＥＶＡＫＫＫＳＫＫＥＫＤＫ）、またはこれをコードする配列番号１８（ｇｇｃｔｃｔｇｇｔｇａｔｇａａｇｔｃｇａａｇｇａｇｔｇｇａａｇａａｇｔａｇｃｔａａｇａａｇａａｇａｇｔａａａａａｇｇａａａａｇｇａｔａａａ）の塩基配列がより好ましい。さらに、ＮＥＳは、当業界に公知の配列（例えば、Annexin II（VHEILCK--LSLE）、ｍＮｅｔ（TLWQF-LLH--LLLD）、ｈＮｅｔ（TLWQF-LLQ--LLLD）、ＭＡＰＫＫ（ALQKK-LEE--LELD）、ＰＫＩ（ELALK-LAG--LDIN）、Ｒｅｖ（LQLPPLER--LTLD）、Ｄｓｋ−１（SLEGAVSEIS-LR）、Cyclin B1（YLCQAFSDVI-LA)、ＡＮＸ II（STVHEILCK--LSLE）、HIV-1 Rev（LQLPPLER--LTLD）、ＭＥＫ−１（ALQKK-LEE--LELD）、ＰＫＩ−α（ELALK-LAG--LDIN）、ＩｋＢ−α（IQQQLGQ--LTLE)、ＲａｎＢＰ１（KBAEKLEA--LSVR）、ＩＮＩ１（DQRVIIKLNAHVGNISLV））、または配列番号１９のアミノ酸配列が好ましく、さらに、配列番号１９（ＤＱＲＶＩＩＫＬＮＡＨＶＧＮＩＳＬＶ）のアミノ酸配列またはこれをコードする配列番号２０（ｇａｃｃａｇｃｇｃｇｔｃａｔｃａｔｃａａｇｃｔｇａａｃｇｃｃｃａｔｇｔｇｇｇａａａｃａｔｔｔｃｃｃｔｇｇｔｇ）の塩基配列がより好ましい。
【００２４】
第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布の検出は、標識物質によって当業界に公知の通常の検出方法により行える。例えば、標識物質が蛍光蛋白質の場合、蛍光顕微鏡を使用して第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出できる。
【００２５】
細胞内に存在する第１の構成物と第２の構成物は初期には、全て細胞質または核質に不規則に分布し（内在する情報伝達機構によりもともと移動する移動モジュールが、細胞内の特定領域に移動する。）、移動信号を受けた第１の構成物は移動モジュールにより、細胞膜に移動し、この際、ベイトと結合したプレイも細胞膜に移動する。一方、ベイトと結合しないプレイはもとの分布が変わらない。従って、前記のような概念により、プレイの細胞膜への移動の可否は、ベイトとプレイの結合を反映する（図２及び図３参照）。
【００２６】
その結果、本発明の方法は、生細胞内での生体分子の直接結合または複合体結合を映像分析を介して実時間で検出することを可能にし、従来の技術に比べて次のような有利な点を有する。
【００２７】
１）生細胞内で起こる全ての結合を対象に分析することができる。
２）組織、個体レベルの分析が可能である。
３）動物細胞、酵母、及びバクテリアでの適用が可能である。
４）ベイト及びプレイに対する抗原が不要である。
５）細胞全体を観測する他の方法とは異なり、細胞内の位置移動変化を分析尺度とすることにより分析の正確度が高い。
【００２８】
６）２次元的位置変化を分析することにより、３次元分析が不要である。
７）３次元分析が不要であることにより高価な共焦点顕微鏡を使用する必要がない。
８）多様な細胞小器官別結合分析が可能である。
９）生細胞内で起こる結合を検出することにより、イン・ビトロ（in vitro）法とは異なり、外部環境に影響を受けない。
１０）ベイトとプレイの結合を実時間で測定することが可能である。
【００２９】
１１）単一ベイトと複数個のプレイ間の複合体結合を検出することが可能である。
１２）検出の分析尺度がオール・オア・ノン（all or none）であるため偽陽性（false positive）を最小化できる。
１３）ベイトとプレイの遺伝子及び刺激物質のみを使用することにより、細胞外物質の細胞内流入による結合特性の干渉を原則的に排除する。
１４）移動モジュールの多様な変形を介して蛋白質結合の相互補完的検出が可能である。
１５）永久的な結合（permanent binding）、一時的な結合（transient binding）、及び瞬間的に発生する相互作用（interaction）の検出が可能である。
【００３０】
１６）今まで開発された信号伝達阻害剤の標的を特定化できる。
１７）阻害剤の標的特定化を介して阻害剤の特性再評価（drugre-positioning/re-purposing）が可能である。
１８）プレイのマスマーカーライブラリ（mass marker library）を使用して未知の生体物質に対する結合スクリーニングが可能である。
１９）ハイコンテントスクリーニング（High Contents Screening，ＨＣＳ）システムと連携した高効率システムを具現できる。
２０）無刺激位置移動特性を利用した分析の単純化が可能である。
２１）外部刺激の種類変更により信号伝達経路別の結合特性を分析できる。
２２）第１の構成物及び第２の構成物全てに標識物質を使用することにより、ベイトとプレイの相対定量が可能である。
２３）外部刺激または内在的な情報伝達機構によるプレイの移動に関連した実験的な誤謬に起因する偽陽性または偽陰性反応を顕著に減少させる。
【００３１】
上述した通り、移動モジュールは外部信号により細胞内の特定領域に移動する。従って、本発明のベイトとプレイの相互作用を検出する方法は、信号物質を処理する工程をさらに含む方法により実施し得る。
（ａ）（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物；を含む細胞を調製する工程；
（ｂ）信号物質を処理する工程；及び
（ｃ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程。
【００３２】
前記信号物質とは、本発明の移動モジュールの移動を誘導する外部信号を発生させる物質を表わす。例えば、本発明の移動モジュールとしてＰＫＣを使用する場合、前記信号物質としては、ＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate, ホルボールエステル（Phorbol ester））、ＴＰＡ（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）、ＰＤＢｕ（Phorbol 12,13-dibutyrate）、ＡＴＰ（Adenosine triphosphate）、トリデカン酸（tridecanoic acid）、アラキドン酸（arachidonic acid）、リノール酸（linoleic acid）、ＤｉＣ８、１３０Ｃ９３７、ＰＫＣ活性化関連成長因子（growth factor）、またはその他ＰＫＣ活性化物質等が挙げられる。
【００３３】
ＰＭＡの濃度は、好ましくは５０ｎＭ〜５μＭ、より好ましくは、１μＭで処理することができる。前記ＰＭＡの処理濃度が５０ｎＭ未満の場合、移動モジュールＰＫＣの移動が不十分であり、５μＭを超える場合、化学物質の過多処理による細胞死滅、信号干渉等の非正常的な現象が発生して好ましくない。
【００３４】
さらに、本発明は、
（ａ）（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物；を含む細胞を調製する工程；
（ｂ）試験物質で処理する工程；及び
（ｃ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程
を含むベイトとプレイ間の相互作用を変化させる物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００３５】
前記試験物質（test agent）とは、任意の物質（substance）、分子（molecule）、元素（element）、化合物（compound）、実在物（entity）またはこれらの組合わせを含む。例えば、これに制限はされないものの、蛋白質、ポリペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチド等を含む。さらに、天然物、合成化合物または化学化合物、または２個以上の物質の組合わせでもよい。特に指定されない限り、製剤（agent）、材料（substance）、物質（material）及び化合物（compound）は互換性（interchangeably）のある用語として使用される。
【００３６】
本発明の方法でスクリーニングまたは同定される試験物質としては、ポリペプチド、β−ターンミメティック（beta-turn mimetics）、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン（benzodiazepines）、オリゴメリックＮ−置換グリシン（oligomeric N-substituted glycines）、オリゴカルバミン酸塩（oligocarbamates）、単糖類（saccharides）、脂肪酸、プリン類、ピリミジン、またはこれらの誘導体、構造類似体または組合わせが挙げられる。前記試験物質は、合成または自然化合物のライブラリを含む広範囲で多様な起源から得られる。前記試験物質は、例えば、約５〜３０個、好ましくは５〜２０個、さらに好ましくは約７〜１５個のアミノ酸を有するペプチドである。前記ペプチドとしては、自然的に生成される蛋白質、ランダムペプチドまたは“バイアス化（biased）”ランダムペプチドのフラグメント（fragment）が挙げられる。
【００３７】
さらに、前記試験物質は“核酸”でもよい。核酸試験製剤としては、自然的に生成される核酸、ランダム核酸、または“バイアス化”ランダム核酸が挙げられる。例えば、原核または真核生物のゲノムのフラグメント（fragment）を前記核酸として使用できる。
【００３８】
さらに、前記試験物質は小分子化合物（例えば、約１，０００以下の分子量を有する分子）でもよい。小分子製剤をスクリーニングするための方法には、好ましくは、ハイスループットアッセイ（high throughput assay）が適用される。
【００３９】
ベイトとプレイ間の相互作用の変化は、相互作用の阻害または促進である。相互作用の阻害とは、ベイトとプレイ間の結合の阻害を表し、本発明の方法においては、試験物質を処理しなかった場合、第１の構成物と第２の構成物が同一または類似して移動するのに対し、試験物質を処理した場合、第２の構成物が移動しないこと（または移動する頻度、程度、強度の減少）から判断できる。相互作用の促進はベイトとプレイ間の結合の促進を表し、本発明の方法においては試験物質を処理しなかった場合、第２の構成物が移動しないのに対し、試験物質を処理した場合、第２の構成物が第１の構成物と同一または類似して移動すること（または移動する頻度、程度、強度の増加）から判断できる。
【００４０】
さらに、前記スクリーニング方法は、信号物質で処理する工程をさらに含めることができ、例えば、
（ａ）（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物；を含む細胞を調製する工程；
（ｂ）信号物質で処理する工程；
（ｃ）試験物質で処理する工程；及び
（ｄ）第１の構成物及び第２の構成物の細胞内分布を検出する工程
を含む方法でもあり得る。
しかしながら、信号物質での処理は試験物質処理前に実施される必要はなく、当業者が適当に調節して行える。
【００４１】
さらに、本発明は（ｉ）ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールを含む第１の構成物；及び（ｉｉ）プレイ及び第２の標識物質を含む第２の構成物を含む細胞を提供する。
【００４２】
前記細胞は動物、植物、酵母及びバクテリアの細胞であり、外部から導入される第１の構成物をたやすく受入れることができ、細胞質、核、及び細胞内小器官の境界がはっきり区別されているバクテリア以外の細胞が好ましい。より好ましくは、ＣＨＯ−ｋ１（ATCC CCL-61, Cricetulus griseus, チャイニーズハムスター（hamster, Chinese））、ＨＥＫ２９３（ATCC CRL-1573, Homo sapiens, ヒト（human））、ＨｅＬａ（ATCC CCL-2, Homo sapiens, ヒト（human））、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ATCC CRL-2266, Homo sapiens, ヒト（human））Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３（ATCC CCL-92, Mus musculus, マウス（mouse））、３Ｔ３−Ｌ１（ATCC CL-173, Mus musculus, マウス（mouse））、ＮＩＨ／３Ｔ３（ATCC CRL-1658, Mus musculus, マウス（mouse））、Ｌ−９２９（ATCC CCL-1, Mus musculus, マウス（mouse）)、Ｒａｔ２（ATCC CRL-1764, Rattus norvegicus, ラット（rat））、ＲＢＬ−２Ｈ３（ATCC CRL-2256, Rattus norvegicus, ラット（rat）)、ＭＤＣＫ（ATCC CCL-34, Canis familiaris）の場合もあり得る。さらに、その他に各種幹細胞、各種組織から抽出された細胞及び人為的に作られた細胞膜構造の模倣細胞でもよい。
【００４３】
さらに、本発明は本発明の第１の構成物及び第２の構成物を含む細胞を含む相互作用検出用キットを提供する。
【００４４】
本発明のキットとしては、前記第１の構成物及び第２の構成物を含む細胞以外に、標識物質の検出に使用される当業界に公知の道具及び／または試薬を含む。本発明のキットは、必要に応じて各成分等の混合に使用されるチューブ、ウェルプレート、使用方法を記載した取扱説明書等をさらに含め得る。
【００４５】
前記方法等で利用できる実験手順、試薬及び反応条件は従来当業界で通常的に知られていることを利用することができ、これは当業者に明らかなことである。
【００４６】
本発明で第１の構成物及び第２の構成物を含む細胞は、当業界に公知の分子生物学的方法により製造できる。これに制限はされないものの、発現ベクターによって第１の構成物及び第２の構成物が発現されるように、第１の構成物及び第２の構成物をそれぞれ発現し得る発現ベクター、または第１の構成物及び第２の構成物の両方を発現できる発現ベクターを細胞に導入する。このため、第１の構成物の場合、プロモータ（第１のプロモータ）及びこれと作動可能に連結されたベイト、第１の標識物質及び移動モジュールをコードするヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、第２の構成物の場合、プロモータ（第２のプロモータ）及びこれと作動可能に連結されたプレイ及び第２の標識物質をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、発現ベクターで第１の構成物及び第２の構成物が発現されるように、これを同時にまたは順次的に１つの細胞に導入する。この際、ベイト、第１の標識物質及び移動モジュールをコードするヌクレオチドで本発明の効果に伴う機能を発揮する限り、ベイト、第１の標識物質及び移動物質の順序は重要ではない。これはプレイ及び第２の標識物質をコードするヌクレオチドにおいても同様である。
【００４７】
前記“プロモータ”とは、特定の宿主細胞で作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、“作動可能に連結される（operably linked）”とは、１つの核酸断片が他の核酸断片と結合され、その機能または発現が異なる核酸断片により、影響を受けることをいう。さらに、前記プロモータは、転写を調節するための任意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。前記プロモータは、常時的に目的遺伝子の発現を構成的に誘導する構成的プロモータ（constitutive promoter）または特定した位置及び時期に目的遺伝子の発現を誘導する誘導的プロモータ（inducible promoter）を使用することができ、その例にはＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ（Hitoshi Niwa et al., Gene, 108: 193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 724-30, 2000）、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ（Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985）、Ｒｓｙｎ７プロモータ（米国特許出願第08/991,601号）、ライスアクチン（rice actin）プロモータ（McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171, 1990）、ユビキチンプロモータ（Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12: 619-632, 1989）、ＡＬＳプロモータ（米国特許出願第08/409,297号）等がある。この他にも米国特許第5,608,149号、第5,608,144号、第5,604,121号、第5,569,597号、第5,466,785号、第5,399,680号、第5,268,463号及び第5,608,142号等に開示されたプロモータを全て使用できる。
【００４８】
細胞へのそれぞれの発現ベクターの誘導は、当業界に公知のトランスフェクション（transfection）の方法、例えば、リン酸カルシウム法、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法、微細射出法（microprojectile bombardment）、エレクトロポレーション（electroporation）、粒子銃衝撃（particle gun bombardment）、シリコン炭化物ウィスカー（Silicon carbide whiskers）、超音波処理（sonication）、ＰＥＧ−媒介融合法（PEG-mediated fusion）、微細注入法（microinjection）、リポソーム媒介法（liposome-mediated method）、磁性ナノ粒子媒介法（magnetic nanoparticle-mediated method）等により実施し得る。
【００４９】
一方、本発明で使用される一般的な組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該分野に広く公知されており、下記の文献に記載されている（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor、NY(1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor、Laboratory: Cold Spring Harbor、NY(1984)；and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Green Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience(1987))。
【００５０】
以下、本発明の具体例について添付図面を参照して詳細に説明する。
図１は、本発明の基本構成物及び分析指標を示す。
１）第１の構成物は、移動モジュール、第１の標識物質及びベイトを含み、第１の構成物には１つ、または複数のベイトを含み得る。
２）第２の構成物は、第２の標識物質及びプレイを含み、第２の構成物には１つ、または複数のプレイを含み得る。
３）信号（Signal S）は、移動モジュールの移動を誘導する外部刺激（移動モジュールの位置変化を誘導する成長因子（growth factor）、血清因子（serum factor）、ＰＭＡ（ＴＰＡ）等）、内在的な刺激物質（ＤＡＧ，diacyl-glycerol）、外部または内在的なＡＴＰ及びカルシウムの濃度変化を含む。
４）相互作用分析指標は、ベイト及びプレイの内因的または外因的特性による第１の構成物と第２の構成物の細胞内の分布位置、分布位置の変化、各構成物等の細胞内移動特性、及び１つまたは複数の第１、第２の構成物による結合体同定を含む。
【００５１】
図２は、本発明における結合及び非結合の基本概念図を示す。細胞内に発現されたベイトとプレイの分布は全て細胞質または核質に不規則に分布し、移動信号に反応して、第１の構成物は移動モジュールにより、細胞膜に移動し（ベイト，赤色）、この際、ベイトと結合されたプレイも細胞膜に移動する（Ａ；プレイ，緑色）。これとは別にベイトと結合しないプレイは、もとの分布が変わらない（Ｂ；プレイ，緑色）。従って、前記のような概念により、プレイの細胞膜への移動はベイトとプレイの結合を反映することがわかる。
【００５２】
図３は、本発明の結合及び非結合分析模式図を示す。例えば、第１の構成物と第２の構成物がそれぞれコードされたプラスミドベクター（plasmid vector）を同時に同一の細胞内に導入する場合、細胞内では２つの構成物が過剰発現され（Ａ参照）、ベイトとプレイの内在的な結合特性により、結合がなされるものの、この状態では図２の通り、２種の蛍光標識が混在されていて結合可否を確認することができない（Ｂ参照）。ベイトとプレイの結合が発生したか否かを確認するために、外部刺激（１μＭ  ＰＭＡ）を加えることにより、移動モジュールが含まれた第１の構成物が細胞膜に移動するようになり、この際、ベイトと結合されたプレイも細胞膜に移動する（Ｃ参照）。従って、２種の標識蛍光の移動可否は結合の発生可否を判断する根拠に利用される。この際、第１の構成物及び第２の構成物全てにプレイを付着し、これを追跡することにより、第１の構成物または第２の構成物のどちらか一方にのみ標識物質を付着させるより、実験の正確性を高めることができる。つまり、第１の構成物にのみ標識物質を付着させる場合は、プレイがベイトに結合したか否かを確認することができず、第２の構成物にのみ標識物質を付着する場合は、プレイが外部刺激または内在的な変化により移動性を有する場合、ベイトとプレイが結合して移動したか否かを確認できないからである。
【００５３】
図４は、本発明で第１の構成物（Ａ）及び第２の構成物（Ｂ）の構成の１例を示した。（Ａ）第１の構成物は基本的に、移動モジュール（ＴＭＤ、ＴＭＡ、ＴＭＢ）、赤色蛍光蛋白質（ｍＲ；ｍＲＦＰ）または緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）等の蛍光蛋白質、及びベイト（bait）のマルチクローニング遺伝子配列（Bait）を含む。ベイトまたはプレイの細胞内位置を変化させる必要がある場合、核局在化シグナル（ＮＬＳ）または核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を追加して含め得る。（Ｂ）第２の構成物はプレイの移動を確認するための蛍光蛋白質（第１の構成物と区別可能な全ての蛍光蛋白質）とプレイ（prey）のマルチクローニング遺伝子配列（Prey）を含み、蛍光蛋白質としてはＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ、ＡｚＧ、ＨｃＲ等を使用し、目的と使用する分析装備（顕微鏡等）により今まで知られた蛍光蛋白質等を利用して区分が可能な多様な組合わせを構成することができる。
【００５４】
図５は、第１の構成物ベクター及び第２の構成物ベクターの外部刺激による分布変化を示したものである。ベイトがクローニングされていない（つまり、ベイトを含まない）基本第１の構成物（ＴＭＤ−ＥＧＦＰ−Ｂａｉｔ（Ａ、左側パネル）、（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｂａｉｔ（Ａ、右側パネル）とプレイを含まない基本第２の構成物（ＥＧＦＰ−Ｐｒｅｙ（Ｂ、左側パネル）、ｍＲＦＰ−Ｐｒｅｙ（Ｂ、右側パネル）をＣＨＯ−ｋ１細胞株に過剰発現させた後、外部刺激（１μＭ  ＰＭＡ）による構成物の分布位置を確認した。ＥＧＦＰまたはｍＲＦＰで蛍光標識された第１の構成物は外部刺激により、細胞膜に移動されたものの（Ａ参照）、移動モジュールを含まない第２の構成物は外部刺激により蛍光の分布が変化しなかった（Ｂ参照）。従って、第２の構成物の分布変化は他の要因（第１の構成物）により起こる受動的な現象であることがわかる。
【００５５】
図６は、ＰＭＡ濃度別第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ）の分布変化を示したものである。移動モジュールの移動特性を最適化するために、外部刺激として使用されたＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate）の最適濃度を決定するために、図５で使用された第１の構成物ベクター（ｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３）を使用した。詳細な実験方法は、図５と同様に行い、ＰＭＡの濃度を１ｎＭから５μＭまでそれぞれ処理した後、無作為に選定された蛍光を示す細胞を対象に赤色蛍光が細胞膜に移動された細胞の数を比較した。図に示された通り、ＩＣ50は３５ｎＭで測定され、５０ｎＭで９０％以上の移動現象が観察され、１００ｎＭ以上で処理した場合、細胞膜に移動された赤色蛍光の信号が増加する様相を示した。従って、本発明の実施例は全て大部分の細胞が反応し、移動量が十分な濃度である１μＭを使用して進行した。
【００５６】
図７は、第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ（右側パネル）及びＴＭＡ−ｍＲＦＰ（左側パネル）、ＴＭＢ−ｍＲＦＰ（中央パネル））の移動効率を比較したものである。第１の構成物のための最適の移動モジュールを決定するために、図５で使用された第１の構成物ベクター（ｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３）とＴＭＤの断片で構成されたｐＴＭＡ−ｍＲＦＰ−Ｃ３（ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターに移動モジュールであるＴＭＡを挿入したベクター、実施例２参照）及びｐＴＭＢ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクター（ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターに移動モジュールであるＴＭＢを挿入したベクター、実施例２参照）等間の移動効率を検査した。詳細な実験方法は図５と同様に行い、３種の構成物全て外部刺激により分布位置が変換され（Ａ参照）、分布位置が変換された細胞の数は統計学的な差がなかった。しかしながら、細胞膜に移動した蛍光の強度を測定した結果（Ａ及びＢの白色線参照）、移動モジュールＴＭＡとＴＭＢの細胞膜蛍光度は類似したものの、ＴＭＤの場合、細胞質（Ｃで表示）と細胞膜（Ｍで表示）部位の蛍光度の差が相対的にはっきりするばかりでなく、細胞膜部位の蛍光密度がＴＭＡとＴＭＢに比べて高く表れた。従って、本発明の実施例は全て移動特性及び移動効率が高いＴＭＤを使用して進行した。
【００５７】
図８は、本発明構成物の分析効率を強化するために、第１の構成物の発現部位を細胞質に限定させるＮＥＳ配列の有効性を検証した結果を示すものである。ＮＥＳ配列の効果を確認するために、ＮＥＳ配列が含まれた第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｂａｉｔ−ＮＥＳ）の基本ベクター（ｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３−ＮＥＳベクター）を作製し、第２の構成物（ＥＧＦＰ−Ｐｒｅｙ−ＮＥＳ）基本ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｃ３−ＮＥＳベクター）と共に、ＨＥＫ−２９３細胞株に過剰発現させた。ＮＥＳ配列を含む第１の構成物は、細胞全体に均一に分布する第２の構成物とは別に、細胞質でのみ主に観察され（Ａ参照）、ＰＭＡで３分間処理した結果、細胞質に均一に分布していた第１の構成物は細胞膜に移動したものの、ＮＥＳ配列を含まない第２の構成物は位置の変化を示さなかった（Ｂ参照，左側パネル：第１の構成物，中央パネル：第２の構成物，右側パネル：融合（Merge）写真）
【００５８】
図９は、本発明物の分析効率を強化するために、第１の構成物の発現部位を核質に限定させるＮＬＳ配列有効性を検証した結果を示すものである。ＮＬＳ配列の効果を確認するために、ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｂａｉｔ−ＮＬＳ（ｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３−ＮＬＳベクター）及びＥＧＦＰ−Ｐｒｅｙ−ＮＬＳ（ｐＥＧＦＰ−Ｃ３−ＮＬＳベクター）基本ベクターを作製し、ＨＥＫ−２９３細胞株に過剰発現させた。ＮＬＳ配列を含む第１の構成物と第２の構成物は核質において主に観察され（Ａ参照）、ＰＭＡで３分間処理した結果、核質に均一に分布していた第１の構成物及び第２の構成物は全て第１の構成物は核膜に移動したものの、移動モジュールがない第２の構成物は位置の変化を示さなかった（Ｂ参照，左側パネル：第１の構成物，中央パネル：第２の構成物，右側パネル：融合写真）
【００５９】
図１０は、ｐ５３蛋白質とＳＶ４０Ｔ蛋白質の結合を本発明の方法によって分析した結果を示すものである。ベイト（ｐ５３蛋白質）とプレイ（ＳＶ４０Ｔ蛋白質）の結合を検証するために、ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ５３（第１の構成物）とＥＧＦＰ−ＳＶ４０Ｔ（第２の構成物）を作製してＣＨＯ−ｋ１細胞株に過剰発現させた。ＰＭＡで３分間処理した結果、細胞内に均一に分布していた２つの蛋白質等（Ａ）は、細胞膜に移動（Ｂ）した（赤色蛍光：移動モジュール及びｐ５３蛋白質，緑色蛍光：ＳＶ４０Ｔ蛋白質）。従って、これら２種の蛋白質が細胞内で結合状態を維持していることを確認することができた（左側パネル：第１の構成物，中央パネル：第２の構成物，右側パネル：融合写真）。
【００６０】
図１１は、リシル−ｔＲＮＡ合成酵素（Lysyl-tRNA synthetase，ＫＲＳ）とＪＴＶ１（ｐ３８）、グリコサミノグリカン（Ｇａｇ）及びラミニン受容体（Laminin receptor，ＬＲ）間の結合を分析した結果を示すものである。ＫＲＳ蛋白質と結合することと予測されるｐ３８、Ｇａｇ及びＬＲの結合を確認するために、ＫＲＳを第２の構成物に、ｐ３８、Ｇａｇ及びＬＲを第１の構成物に含め、ＨＥＫ−２９３細胞株に過剰発現させた後、ＰＭＡ処理前と後の細胞内の各蛍光の分布を分析した。（Ａ）ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ３８とＡｚＧ−ＫＲＳの場合、外部刺激に反応して全て細胞膜に強く移動し、ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｇａｇ（Ｂ）とＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＬＲ（Ｃ）の場合、標識された緑色蛍光の移動が観察されなかった。従って、ＫＲＳは、３種の蛋白質のうち、ｐ３８と結合することが確認できた（左側パネル：第１の構成物，中央パネル：第２の構成物，右側パネル：融合写真）。
【００６１】
図１２は、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を利用してＲｅｌＡとＩｋＢの結合を実時間で分析した結果を示すものである。細胞内で複合体を形成するとされるＲｅｌＡとＩｋＢを、それぞれＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＲｅｌＡ、ＥＧＦＰ−ＩｋＢの形態に作製して、ＣＨＯ−ｋ１細胞株に過剰発現させた後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を利用して１０秒間隔で動映像を撮影した。ＰＭＡを処理する前（０ｍｉｎ）には２つの蛋白質による各蛍光が全て細胞質に均一に分布しているものの、ＰＭＡを処理した後、約１０秒〜１分が経過する時点から蛍光顕微鏡を利用して２つの蛍光の細胞膜への移動を観察することができた。従って、生細胞における２つの蛋白質の細胞内結合を実時間で分析が可能であることを確認することにより、移動刺激の他多様な刺激を介した細胞信号伝達機構研究にも有用な方法を提供できることを確認できた（左側パネル：第１の構成物，中央パネル：第２の構成物，右側パネル：融合写真）。
【００６２】
図１３は、３種の蛋白質複合体の結合を分析したものである。図１２の２種の蛋白質（ＲｅｌＡ及びＩｋＢ）は細胞内でｐ５０という蛋白質と共に、ＮＦｋＢ−ＩｋＢ複合体をなすものとして知られている。本実験では複数個の蛋白質結合を分析できるか否かを検証するために、ｐ５０蛋白質とさらに他の蛍光蛋白質であるＨｃＲｅｄ（ＨｃＲ）を結合させ、第２の構成物ＨｃＲ−ｐ５０を作製した。３種の構成物をＨＥＫ−２９３細胞株に過剰発現させ、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を利用して結合を観察した。３種の蛋白質による各蛍光信号（赤色、緑色及び青色）は全てＰＭＡを処理する前には細胞質及び核質に均一に分布していたものの（Ａ）、ＰＭＡを処理した後（Ｂ）には、全て細胞膜に移動し、分布の変化を観察することができた。この結果は、本発明の構成物を利用して、少なくとも３個以上の複数個の蛋白質で構成された複合体を、同時に分析し得ることを意味するものである（左側１番目パネル：第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＲｅｌＡ），左側２番目パネル：第２の構成物１（ＥＧＦＰ−ＩｋＢ），左側３番目パネル：第２の構成物２（ＨｃＲ−ｐ５０），右側パネル：融合写真）。
【００６３】
図１４は、酵母ツーハイブリッド法（Ｙ２Ｈ）によりスクリーニングされた陽性結合候補を検証した結果を示す。蛋白質間相互作用のスクリーニング方法として一般的である酵母ツーハイブリッド法に用いて、蛋白質結合候補を再検証するために、ベイトとしてＯｍｐＡ蛋白質を含む第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＯｍｐＡ）と、プレイ候補物質としてＥＥＦ１Ａ、ＦＡＭ１４Ｂ、及びＤＤＸ３１を含む第２の構成物（ＥＧＦＰ−ＥＥＦ１Ａ、ＥＧＦＰ−ＦＡＭ１４Ｂ、及びＥＧＦＰ−ＤＤＸ３１）を作製した。ベイトとそれぞれのプレイ候補物質の組合わせをＨＥＫ−２９３細胞株に過剰発現させ、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を利用して結合を観察した。ＰＭＡ処理前には細胞内に均一に発現されていた蛍光はＰＭＡ処理により、移動モジュールが含まれたＯｍｐＡ蛋白質は全て細胞膜に移動し（赤色）、これと結合すると予測されるプレイ候補物質を示す緑色蛍光のうち、ＥＥＦ１Ａ（Ａ）とＦＡＭ１４Ｂ（Ｂ）は、細胞質にそのまま残っていたものの、ＤＤＸ３１（Ｃ）は細胞膜に移動した。従って、酵母ツーハイブリッド法によって、３種の結合候補物質のうち、１つだけが結合することを確認することができ、この結果は酵母ツーハイブリッド法の偽陽性問題を解決できる技術として使用できることを示すものである（左側パネル：第１の構成物，中央パネル：第２の構成物，右側パネル：融合写真）。
【００６４】
図１５は、ｐ５３蛋白質とｍｄｍ２蛋白質の結合及び抗癌剤ヌトリン３（nutlin 3）による結合阻害を分析した結果を示すものである。本発明の新薬開発における有効性を検証するために、抗癌剤の結合阻害実験を行った。このために、ｐ５３蛋白質を含む第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ５３Ｎ）と、ｍｄｍ２蛋白質を含む第２の構成物（ＡｚＧ−ｍｄｍ２Ｎ）を作製し、これらの構成物をＨＥＫ−２９３細胞株に過剰発現させ、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を利用して結合を観察した。まず、ｐ５３Ｎとｍｄｍ２Ｎの結合可否を検証するために、ヌトリン３で処理していない細胞を対象に、ＰＭＡの処理前と処理後とを比較した（Ａ）。その結果、ＰＭＡ処理前には、細胞質に均一に分布していた２つの蛋白質が、ＰＭＡ処理により細胞膜に移動した。これによって２つの蛋白質が結合していることを確認した。次に、抗癌剤ヌトリン３の結合阻害効果を検証するために、２０ｎＭヌトリン３を培養液に添加して２０分間培養した後、ＰＭＡ処理前と処理後の蛍光分布を実時間で観察した（Ｂ）。ヌトリン３で前処理した細胞の場合、移動モジュールとｐ５３Ｎで構成された第１の構成物（赤色）は細胞膜に移動したものの、移動モジュールが含まないｍｄｍ２Ｎと蛍光蛋白質だけで構成された第２の構成物（緑色）は細胞膜への蛍光移動が観察されなかった。従って、本発明は、抗癌剤であるヌトリン３によりｐ５３とｍｄｍ２の結合が阻害されることを確認することができ、蛋白質またはペプチドの結合阻害のスクリーニングに有効であることが示された（左側パネル：第１の構成物，中央パネル：第２の構成物，右側パネル：融合写真）。
【００６５】
図１６は、抗癌剤ヌトリン３の結合阻害濃度を分析した結果を示すものである。図１５において結合阻害が確認された抗癌剤ヌトリン３の最適処理濃度を分析するために、濃度別結合阻害効果を分析した。ヌトリン３は０、０．５、１、５、１０、２５、５０、１００、２００ｎＭに調製した。ヌトリン３の濃度に伴う結合阻害効果は５ｎＭからはっきり表れ始め、１０ｎＭでは５０％以上の細胞において、２つの蛋白質の結合が阻害され、２５ｎＭでは９０％以上の細胞で結合が観察されなかった。この結果は、５００ｎＭより極めて少ない濃度においても抗癌剤のような結合阻害剤の結合阻害効果を正確に検出することができることを示す。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００６７】
実施例１：動物細胞株及び形質転換
＜１−１＞動物細胞株及びその培養
ＣＨＯ−ｋ１（ATCC CCL-61, Cricetulus griseus, チャイニーズハムスター（hamster, Chinese））、ＨＥＫ２９３（ATCC CRL-1573, Homo sapiens, ヒト（human））、ＨｅＬａ（ATCC CCL-2, Homo sapiens, ヒト（human））、及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ATCC CCL-2266, Homo sapiens, ヒト（human））細胞株を使用し、これらの動物細胞株の培養条件は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）社の細胞株培養方法（indtruction）に従った。ただし、ＣＨＯ−ｋ１細胞はＦー１２培養液を使用し、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はＤＭＥＭ培養液を使用し、その他の培養条件は同様である。各細胞の培養方法は下記の通りである（当業者の目的により細部的な培養条件は異なり得る。）。２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％ウシ胎仔血清（fetal bovine serum，ＦＢＳ，v/v）、１００units／ｍｌペニシリン（penicillin）、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（streptomycin）を含むｐＨ７．４の培養液（Ｆ−１２及びＤＭＥＭ）内で各細胞株を、３７℃、５％ＣＯ2が維持される培養器で培養した。
【００６８】
＜１−２＞細胞株の形質転換
本発明の実施例で使用された細胞内遺伝子導入方法は、一般的に使用されるリポソームを用いた方法（liposome-based techniques）の１つであるＥｘＧｅｎｅ  ５００(Fermentas Life Science）を使用し、遺伝子の濃度等遺伝子導入のための全ての条件は製造社の指針により行った。より具体的に、継代培養されている細胞をカバースリップが入っている１２−ウェルプレートに移して分株を行い、１日培養した後、０．９ｍｌの新しい培養液に交換した。約１μｇ程度の形質転換試料を０．１ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に添加し、十分に撹拌した後、３．３μｌのＥｘＧｅｎｅ試薬を添加して１５秒間ボルテックス（vortex）して混合した。この溶液を常温で１０分間放置した後、細胞が成長しているカバースリップが入っている１２−ウェルプレートの各ウェル（well）に添加して１８時間培養することによって、細胞は形質転換された。
【００６９】
実施例２：第１の構成物及び第２の構成物のデザイン及び作製
＜２−１＞第１の構成物の設計及び作製
本発明で第１の構成物とは、細胞質において均一に発現されている蛋白質を細胞膜に移動させる移動モジュール、顕微鏡を利用した分析を可能にする蛍光蛋白質、及びベイトを結合させてできる融合配列で構成される。
【００７０】
第１の構成物（図４のＡ参照）を発現するベクターは、以下のように作製した。移動モジュールは、下記のような鋳型（template）とプライマーを使用してＰＣＲを行って作製し、これをｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（GenBank accession No. U57607; Clontech catalog No. #6082-1，配列番号２１）と、ｐｍＲＦＰ−Ｃ３ベクター（ｍＲＦＰ；GenBank accession No. DQ903889，配列番号２２）のＮｈｅＩ／ＡｇｅＩ位置に挿入して作製した。
【００７１】
ＴＭＤ移動モジュールは、鋳型としてｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＰＲＫＣＤベクター（GenBank accession No. BC043350；オープンバイオシステム（Openbiosystem，http://www.openbiosystems.com/）より入手；Catalog No.EHS1001-410108-BC043350）を使用し、プライマーとして配列番号２３（ＰＲＫＣＤ−Ｆ；５’−ＧＡＡＧＣＴＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＧＴＴＣＣＴＧＣ−３’）及び配列番号２４（ＰＲＫＣＤ−Ｒ；５’−ＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＧＡＡＴＴＴＧＧ−３’）を使用してＰＣＲを行い作製した。さらに、ＴＭＡ移動モジュールは、鋳型としてｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＰＲＫＣＤベクターを使用し、プライマーとして配列番号２５（ＴＭＡ−Ｆ；５’−ＧＡＡＧＣＴＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣ−３’）及び配列番号２６（ＴＭＡ−Ｒ；５’−ＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＣＣＧＣ−３’）を使用してＰＣＲを行い作製した。ＴＭＢ移動モジュールは、鋳型としてｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＰＲＫＣＤベクターを使用し、プライマーとして配列番号２７（ＴＭＢ−Ｆ；５’−ＧＣＡＧＣＴＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧ−３’）及び配列番号２８（ＴＭＢ−Ｒ；５’−ＧＣＡＡＣＣＧＧＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ−３’）を使用してＰＣＲを行い作製した。
【００７２】
＜２−２＞突然変異を含む第１の構成物の設計及び作製
第１の構成物に含まれた移動モジュールは、プロテインキナーゼより誘導されることから、本質的にリン酸化機能を有しており、このようなリン酸化機能は移動モジュールの役割ばかりでなく、内在的なリン酸化機能を介して構成物が過剰発現された細胞の信号伝達機構と、蛋白質相互作用を阻害または干渉させる可能性を有している。従って、本発明では移動モジュールが有するリン酸化機能を除去するために突然変異を誘導した。本発明に使用されたキナーゼは、リン酸化機能において極めて重要な部位として知られる３１１番目のアミノ酸（チロシン，tyrosine）をフェニルアラニン（phenylalanine）に（Ｙ３１３Ｆ）、３７８番目のアミノ酸（リジン，lysine）をアルギニン（arginine）にそれぞれ置換するために、ＰＣＲによる突然変異誘導方法を使用して、最終的にＴＭＤ移動モジュールを作製した。
【００７３】
このため、１番目のＰＣＲ条件で、正方向プライマー（ＰＫＣＤ−Ｆ；５’−ＧＡＡＧＣＴＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＧＴＴＣＣＴＧＣ−３’，配列番号２９）と変形された（modified）逆方向プライマー（Ｙ３１３Ｆ−Ｒ；５’−ＧＡＡＡＣＣＣＴＧＡＡＡＴＡＴＣＣＣＡＡＣ−３’、配列番号３０）を利用して遺伝子を増幅し、２番目のＰＣＲ条件で、変形された正方向プライマー（Ｙ３１３Ｆ−Ｆ；５’−ＧＴＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＣ−３’、配列番号３１）と逆方向プライマー（ＰＫＣＤ−Ｒ；５’−ＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＧＡＡＴＴＴＧＧ−３’、配列番号３２）を利用して遺伝子を増幅した。１番目と２番目のＰＣＲから得た遺伝子増幅物を鋳型にして、正方向と逆方向プライマーを利用して３番目のＰＣＲ増幅を実施した。ここで得られる遺伝子は、塩基配列ＴＡＴがＴＴＴに置換されたＹ３１３Ｆ突然変異となり、これを鋳型にして、ＡＡＧがＡＧＧに置換されたＫ３７８Ｒ突然変異を作製した。この際、正方向プライマー（配列番号２９）、逆方向プライマー（配列番号３２）、変形された正方向プライマー（Ｋ３７８Ｒ−Ｆ；５’−ＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＣＴＣＡＡＧ−３’，配列番号３３）及び変形された逆方向プライマー（Ｋ３７８Ｒ−Ｒ；５’−（ＣＴＴＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡ−３’，配列番号３４）を使用した。
【００７４】
＜２−３＞第１の構成物へのＮＬＳ及びＮＥＳの付着
生体内に存在する蛋白質は固有の分布特性（標的（targeting））を有していて、ベイトとプレイは細胞内小器官に標的位置を有する。この場合、第１の構成物と第２の構成物の位置移動を感知し難いこともある。従って、ベイトとプレイの結合を実験で確認するためには、実験が可能な細胞質または核質で分布位置を制御する必要があり、このため、蛋白質を細胞質に分布位置を誘導するための核外搬出シグナル（nuclear exclusion signal，ＮＥＳ）と核質に分布位置を誘導するための核局在化シグナル（nuclear localization signal，ＮＬＳ）を使用して、ベイトとプレイの細胞内分布位置を制御できるベクターを作製した。
【００７５】
さらに、これら位置制御用ベクターは、ベイトとプレイの結合が細胞質で起こるのかまたは核質で起こるのかを認識できる機能を同時に有する。つまり、ベイトとプレイが細胞質で結合した後、細胞質に移動する特性を有する場合、ＮＥＳがそれぞれ含まれた第１の構成物と第２の構成物の組合わせでは、第２の構成物が第１の構成物と結合して、ＰＭＡ処理により細胞膜に移動し得るものの、ＮＬＳがそれぞれ含まれた構成物等の組合わせでは第１の構成物のみが核膜に移動され、第２の構成物の移動は起こらない。反対に、ベイトとプレイが核質でのみ結合が起こる特性を有する場合、ＮＬＳが含まれた構成物の組合わせでは、ＰＭＡ処理により各構成物等が全て核膜に移動されるものの、ＮＥＳを含む構成物の組合わせにおいては、第１の構成物は細胞膜への位置移動が誘導されるものの、第２の構成物は位置移動が起こらないようになる。
【００７６】
ＮＬＳを有する第１の構成物と第２の構成物は、下記のプライマーを使用して、一般的なＰＣＲクローニング方法を連続的に行って作製した。１次ＰＣＲは、鋳型としてｐｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターを使用し、プライマーとして配列番号３５（ＮＬＳ−Ｆ−１：５’−ＡＧＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＴＡＧＡＴＡＡＣＴＧＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＣ−３’）及び配列番号３６（ＮＬＳ−Ｒ：５’−ＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣ−３’）を使用して行った。２次ＰＣＲは、得られたＰＣＲ増幅物を再度鋳型として使用し、プライマーとして配列番号３７（ＮＬＳ−Ｆ−２：５’−ＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡ−３’）及び配列番号３６（ＮＬＳ−Ｒ）を使用して行った。同一の方法で、配列番号３８（ＮＬＳ−Ｆ−３：５’−ＴＣＣＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＧＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’）及び配列番号３６（ＮＬＳ−Ｒ）のプライマーで３次ＰＣＲを、さらに、配列番号３９（ＮＬＳ−Ｆ−４：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＧＡＡＧＧ−３’）及び配列番号３６（ＮＬＳ−Ｒ）で４次ＰＣＲを行って得られた最終遺伝子断片を、第１の構成物ベクターまたは第２の構成物ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｐａＩ位置に挿入して作製した。
【００７７】
ＮＥＳを有する第１の構成物と第２の構成物は、下記のプライマーを使用して、ＮＬＳの作製と同一の方法で作製した。１次ＰＣＲは、鋳型としてｐｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターを使用し、プライマーとして配列番号４０（ＮＥＳ−Ｆ−１：５’−ＧＴＧＧＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＧＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＣ−３’）及び配列番号４１（ＮＥＳ−Ｒ：５’−ＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣ−３’）を使用して行った。２次ＰＣＲは、得られたＰＣＲ増幅物を再度鋳型として使用し、プライマーとして配列番号４２（ＮＥＳ−Ｆ−２：５’−ＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴ−３’）及び配列番号４１（ＮＥＳ−Ｒ）を使用して行い、同一の方法により配列番号４３（ＮＥＳ−Ｆ−３：５’−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣ−３’）及び配列番号４１（ＮＥＳ−Ｒ）のプライマーを利用して３次ＰＣＲを行って得られた最終遺伝子断片を第１の構成物ベクターまたは第２の構成物ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｐａＩ位置に挿入して作製した。
【００７８】
＜２−４＞第２の構成物の設計及び作製
第２の構成物は、第１の構成物のベイトと結合する内在的な特性を有するプレイの移動を分析するための標識物質を含む。第２の構成物は第１の構成物に使用された標識物質とは異なる蛍光、すなわち緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ，ＡｚＧ）、赤色蛍光蛋白質（ｍＲＦＰ）、及び赤外線蛍光蛋白質（ＨｃＲ）を使用して第１の構成物と同一の方法で作製した。第２の標識物質として、ＥＧＦＰを使用するときは、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（Clontech）を使用し、ｍＲＦＰを使用するときは、ｐｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターを使用し、ＡｚＧを使用するときは、ｐＡｚＧ−Ｃ３ベクターを使用し、ＨｃＲを使用するときは、ｐＨｃＲ−Ｃ３ベクターを使用し、各原本Ｃ３ベクターはｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクターのＥＧＦＰ遺伝子配列部位を、各ＡｚＧ、ＨｃＲ遺伝子で下記の通り置換することにより作製された。
【００７９】
ｐＡｚＧ−Ｃ３ベクターの場合、鋳型としてｐＰＭ−ｍＡＧ１ベクター（ＭＢＬより入手，catalog No. AM-V0203; Karasawa. S., et al. 2003. J. Biol. Chem. 278, 34167-34171）を使用し、プライマーとして配列番号４４（ＡｚＧ−Ｆ：５’−ＧＧＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴ−３’）及び配列番号４５（ＡｚＧ−Ｒ：５’−ＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡＣＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクターのＥＧＦＰ塩基配列と置換してＡｇｅＩ／ＮｏｔＩ位置に挿入して作製した。
【００８０】
ｐＨｃＲ−Ｃ３ベクターの場合、鋳型としてｐＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ−Ｎ１（Avrogenより入手, catalog No. FP204; Gurskaya et al., 2001, FEBS Lett. 507, 16-20）を使用し、プライマーとして配列番号４６（ＨｃＲ−Ｆ：５’−ＧＣＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧ−３’）及び配列番号４７（ＨｃＲ−Ｒ：５’−ＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＡＧＧＴＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクターのＥＧＦＰ塩基配列と置換してＡｇｅＩ／ＮｏｔＩ位置に挿入して作製した。
【００８１】
実施例３：第１の構成物及び第２の構成物の移動特性の確認
＜３−１＞構成物の発現確認及び移動特性分析
第１の構成物及び第２の構成物ベクターが導入された細胞が成長しているカバースリップ（cover slip）を流体器（perfusion chamber）に固定し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（カルザイスＬＳＭ５１０）の載物台に装着し、外部刺激前と外部刺激（１μＭ  ＰＭＡ（Phorbolester）処理）後の構成物ベクターに対する映像を撮影した。
【００８２】
共焦点レーザー蛍光顕微鏡のレーザーは、４８８ｎｍのＡｒｇｏｎレーザー（ＥＧＦＰまたはＡｚＧ）、５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザー（ｍＲＦＰ）及び５６１ｎｍのＤＰＳＳレーザー（ＨｃＲ）を使用して蛍光標識を励起（excitation）させ、各蛍光標識で発生する蛍光信号は、バンドパス（band path）フィルターＢＰ５０５−５３０（ＥＧＦＰまたはＡｚＧ）、ロングパス（Long path）フィルターＬＰ５６０またはＢＰ５６０−６３０（ｍＲＦＰ）及びロングパス（Long path）フィルターＬＰ６５０（ＨｃＲ）を使用し、各蛍光等間の干渉を完全に除去した後、映像を撮影した。
【００８３】
その結果、図５に示した通り、外部刺激後、移動モジュール（ＴＤＭ）が含まれた第１の構成物ベクターによる緑色または赤色蛍光は、細胞膜に移動されるものの（図５Ａ参照）、移動モジュールを含まない第２の構成物ベクターによる緑色または赤色蛍光は、刺激前と同一に細胞質に均一に分布していることを確認することができた（図５Ｂ参照）。従って、第２の構成物ベクターは外部刺激に反応せず、第２の構成物の細胞膜への移動は、必ずベイトとプレイの結合を前提とすることが分かった。
【００８４】
＜３−２＞第１の構成物の移動と外部刺激物質の最適濃度の確認
第１の構成物のうち、ｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターを利用した、外部刺激物質であるＰＭＡ（Phorbol ester）の濃度に伴う移動効率を測定するために、ＣＨＯ−ｋ１細胞に第１の構成物の発現ベクターを形質転換させ、過剰発現させた後、１８時間培養して、１、５、１０、２０、４０、５０、８０、１００ｎＭ、１、５μＭのＰＭＡで処理した。５分間ＰＭＡを処理した後、３．８％ホルムアルデヒド（formaldehyde）で細胞を固定して、共焦点顕微鏡（Confocal microscope, Carl Zeiss LSM 510）を介して、赤色蛍光が発現された２００個の細胞を無作為で選定し、濃度別赤色蛍光の細胞膜分布細胞の数を測定した。
【００８５】
その結果、図６に示した通り、５０ｎＭで９０％以上の細胞において、移動現象が観察され、１００ｎＭ以上で処理した場合、細胞膜に移動した赤色蛍光の信号が増加する様相を示した。従って、５０ｎＭ〜５μＭの濃度で処理するのが好ましいものの、大部分の細胞が反応し、移動量が十分な濃度である１μＭで処理することが効果的であることが分かった。
【００８６】
実施例４：第１の構成物及び第２の構成物を利用した細胞内結合の実時間分析
＜４−１＞ｐ５３蛋白質とＳＶ４０Ｔ抗原の細胞内結合分析
潜在的発癌性遺伝子として知られているｐ５３と、これに結合するものとして知られているＳＶ４０Ｔ抗原間の結合について、現在ＩＰを利用した結合同定システムとして商用化されたものがある。ここに本発明の基本的な結合検出機能を検証するために、同一の蛋白質等を対象に分析を実施した。ｐ５３とＳＶ４０Ｔ抗原に対する細胞内結合を検証するために、ｐ５３蛋白質が融合された第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ５３）及びＳＶ４０Ｔ抗原が融合された第２の構成物を次のように製造した。
【００８７】
第１の構成物ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ５３は、鋳型としてｐＧＢＫ−ｐ５３−ＧＡＬ４ベクター（ｐ５３；GenBank accession No. AF161020）を使用し、プライマーとして配列番号４８（ｐ５３−Ｆ：５’−ＧＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＣＧＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧ−３’）及び配列番号４９（ｐ５３−Ｒ：５’−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＡＣＴＴ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクター（ｍＲＦＰ−Ｃベクターに移動モジュールであるＴＭＤ配列を挿入したベクター、実施例２参照）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【００８８】
第２の構成物ＥＧＦＰ−ＳＶ４０Ｔは、鋳型としてｐＧＡＤＴ７−ＳＶ４０Ｔ−ＧＡＬ４ベクター（ＳＶ４０Ｔ；GenBank accession No. BC014270）を使用し、プライマーとして配列番号５０（ＳＶ４０Ｔ−Ｆ：５’−ＧＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＡＧ−３’）及び配列番号５１（ＳＶ４０Ｔ−Ｒ：５’−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【００８９】
前記第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ５３）と、第２の構成物（ＥＧＦＰ−ＳＶ４０Ｔ）を前記実施例＜１−２＞に記載した方法（ExGene 500）により、ＣＨＯ−ｋ１細胞に導入して発現させた。１８時間の培養を経て、１μＭ  ＰＭＡを５分間処理後、２つの構成物の蛍光分布を実施例＜３−１＞の通り観察した。
【００９０】
その結果、図１０に示した通り、移動モジュールが結合したベイトｐ５３蛋白質による赤色蛍光（左側パネル）と、プレイであるＳＶ４０Ｔが結合した緑色蛍光（中央パネル）がＰＭＡ処理後に、細胞膜に移動することが分かった。一方、ＳＶ４０Ｔが結合していない第２の構成物のみを発現させた対照群では、同一の実験で細胞膜への移動が見られなかったことから（結果は図示せず）、プレイＳＶ４０Ｔはベイトｐ５３と細胞内で結合し、移動モジュールが結合したベイトの分布変化によってプレイの分布変化が発生したため、２つの蛋白質は細胞内で結合していることを確認できた。
【００９１】
＜４−２＞ＫＲＳ蛋白質とｐ３８（ＡＩＭＰ２）蛋白質の細胞内結合の分析
多機能性疾病誘発遺伝子として知られている、リシル−ｔＲＮＡ  シンセターゼ（Lysyl-tRNA synthetase，ＫＲＳ）は、ｐ３８／ＡＩＭＰ２蛋白質及び少なくとも３個の異なるアミノアシル−ｔＲＮＡ  シンセターゼ（Aminoacyl-tRNA synthetase，ＡＲＳｓ）と複合体をなしているものとして知られている（J. Cell Science. 2004, 117, 3725-3734参照）。従って、ＫＲＳ蛋白質とｐ３８蛋白質の細胞内結合の実時間分析の可能性、多様な動物細胞内での実験可能性、蛍光標識の多様性、及びベイトとプレイとの交換可能性を確認するために、ＫＲＳと結合するものとして知られているｐ３８と、潜在的な結合蛋白質と予測されるＧａｇ及びＬＲを利用して細胞結合を分析した。
【００９２】
このため、第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ３８、ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＧａｇまたはＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＬＲ及び第２の構成物（ＡｚＧ−ＫＲＳ）を下記の通り作製した。この際、第２の構成物の蛍光は、ＥＧＦＰの代わりにＡｚＧ（Azami Green）を適用した。
【００９３】
第１の構成物ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ３８は、鋳型としてｐＧＥＸ−４Ｔ１−ｐ３８ベクター（ｐ３８；GenBank accession No. NM 006303）を使用し、プライマーとして配列番号５２（ｐ３８−Ｆ：５’−ＧＴＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＣＧＡＴＧＴＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧ−３’）及び配列番号５３（ｐ３８−Ｒ：５’−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【００９４】
ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｇａｇは、鋳型としてｐＧＥＸ−４Ｔ１−Ｇａｇベクター（Ｇａｇ；GenBank accession No. NM_002295）を使用し、プライマーとして配列番号５４（Ｇａｇ−Ｆ：５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＴＡ−３’）及び配列番号５５（Ｇａｇ−Ｒ：５’−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＴＴ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【００９５】
さらに、ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＬＲは、鋳型としてｐＥＴ２８ａ−ＴＥＶ−ＬＲベクター（ＬＲ；GenBank accession No. NM 002295）を使用し、プライマーとして配列番号５６（ＬＲ−Ｆ：５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＴＧＡＴＧＴ−３’）及び配列番号５７（ＬＲ；Ｒ：５’−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【００９６】
第２の構成物であるＡｚＧ−ＫＲＳの場合、鋳型としてｐＥＴ２８ａ（GenBank accession No. NM_005548）を使用し、プライマーとして配列番号５８（ＫＲＳ−Ｆ：５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＣＧ−３’）及び配列番号５９（ＫＲＳ−Ｒ：５’−ＧＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＴＧ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＡｚＧ−Ｃ３ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩＩ位置に挿入して作製した。
【００９７】
前記にて製造した第１の構成物及び第２の構成物をＨＥＫ２９３細胞株に形質転換し、培養液としてＤＭＥＭを使用したことを除いては、前記実施例＜４−１＞の通りにして蛍光を確認した。
【００９８】
その結果、図１１に示した通り、第１の構成物に使用された３種の蛋白質の細胞膜移動現象は全て観察され（左側パネル）、ＫＲＳと結合するものとして知られているｐ３８（図１１Ａ参照）の場合、ＫＲＳが結合した第２の構成物が細胞膜に移動したものの、この他の潜在的な結合蛋白質と予測されたＧａｇ（図１１Ｂ参照）とＬＲ（図１１Ｃ参照）では、そのような移動現象が観察されなかった（中央パネル）。従って、ＫＲＳ蛋白質はｐ３８蛋白質とは結合するものの、ＧａｇまたはＬＲ蛋白質とは結合しないことを確認することができ、ＥＧＦＰの代わりにＡｚＧ蛍光蛋白質を使用したことに問題がないことを確認した。
【００９９】
＜４−３＞ＲｅｌＡ蛋白質と阻害蛋白質ＩｋＢの細胞内結合の実時間分析
ＴＮＦ−ａｌｐｈａにより、調節されるＮＦｋＢ及びＩｋＢ蛋白質の相互作用は、細胞内で多様な細胞信号伝達経路に関与するものと知られている。多様な経路において、特に注目されているのは、生体内で発生する各種の危害性信号に対応する炎症誘発と密接な関連性を有していることである。従って、ＮＦｋＢ複合体のうち、多機能性炎症関連遺伝子であるＲｅｌＡ蛋白質と阻害蛋白質であるＩｋＢの結合可否を検証することと同時に外部刺激後、細胞固定技法でなく生細胞を利用した直接分析可能性を確認するために、実時間分析技法（time-laps）を利用して実験を実施した。
【０１００】
このため、第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＲｅｌＡ）と第２の構成物（ＥＧＦＰ−ＩｋＢ）を下記の通り作製した。
【０１０１】
第１の構成物ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＲｅｌＡは、鋳型としてｐＥＹＦＰ−ＲｅｌＡベクター（ＲｅｌＡ；GenBank accession No. NM_021975）を使用し、プライマーとして配列番号６０（ＲｅｌＡ−Ｆ：５’−ＧＧＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＣ−３’）及び配列番号６１（ＲｅｌＡ−Ｒ：５’−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＧ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【０１０２】
第２の構成物ＥＧＦＰ−ＩｋＢは、鋳型としてｐｃＤＮＡ３−ＩｋＢベクター（ＩｋＢ；GenBank accession No. NM-020529）を使用し、プライマーとして配列番号６２（ＩｋＢ−Ｆ：５’−ＧＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧ−３’）及び配列番号６３（ＩｋＢ−Ｒ：５’−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＴＣＡＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＡＡ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【０１０３】
前記にて作製した第１の構成物及び第２の構成物を、ＣＨＯ−ｋ１細胞株に形質転換し、これを前記実施例＜４−１＞に記載の通り、０分、１分、２分及び３分目に蛍光を観察した。
【０１０４】
その結果、図１２に示した通り、第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＲｅｌＡ）は、０分目には細胞内に均一に分布していたが、時間が経つにつれて漸次的に細胞膜に移動し（左側パネル）、第２の構成物（ＥＧＦＰ−ＩｋＢ）も０分目には細胞内に均一に分布するが、時間が経つにつれて、第１の構成物と共に細胞膜に移動することが分かった（中央パネル）。特に、各構成物はＰＭＡ処理後、約１０秒から細胞膜に移動する現象が観察され始めて（結果は図示せず）、大部分の細胞において３分以内に移動が完了した。このような移動現象は前述及び後述の全実施例においても同様の結果が観察された（結果は図示せず）。
【０１０５】
＜４−４＞多機能性炎症関連遺伝子ＮＦｋＢ複合体（ＲｅｌＡ／ｐ５０／ＩｋＢ）細胞内結合分析
ＮＦｋＢ複合体は、基本的にＮＦｋＢ（ＲｅｌＡ／ｐ５０）と陰性調節因子であるＩｋＢ蛋白質が複合体を成すものとして知られている。本実験ではこの複合体を構成するＲｅｌＡ、ｐ５０、及びＩｋＢの３種の蛋白質の結合を同定できるかを検証した。
【０１０６】
このため、第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＲｅｌＡ）及び２種の第２の構成物（ＥＧＦＰ−ＩｋＢ及びＨｃＲ−ｐ５０）を下記の通り作製した。この際、蛍光標識としては、第１の構成物にはｍＲＦＰを使用し、第２の構成物にはＥＧＦＰ及びｍＲＦＰと区分できるＨｃＲ（ＨｃＲｅｄ）を使用した。
【０１０７】
第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＲｅｌＡ）とＩｋＢを含む第２の構成物（ＥＧＦＰ−ＩｋＢ）は、前記実施例＜４−３＞と同一のものを使用し、さらに他の第２の構成物（ＨｃＲ−ｐ５０）は、鋳型としてｐＤＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＮＦｋＢ１ベクター（ＮＦｋＢ１；GenBank accession No. BC006231）を使用し、プライマーとして配列番号６４（ｐ５０−Ｆ：５’−ＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＴＡＴＴ−３’）及び配列番号６５（ｐ５０−Ｒ：５’−ＧＣＴＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＡＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＴＡＧＡ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＨｃＲ−Ｃ３ベクターのＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩ位置に挿入して作製した。
【０１０８】
前記にて作製した第１の構成物及び２種の第２の構成物を、ＨＥＫ２９３細胞株に形質転換し、これを前記実施例＜４−１＞に記載の通り、蛍光を確認した。
【０１０９】
その結果、図１３に示した通り、第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＲｅｌＡ、赤色）と第２の構成物（ＥＧＦＰ−ＩｋＢ、緑色）及び第２の構成物（ＨｃＲ−ｐ５０、青色）が全て同一にＰＭＡ刺激により、細胞膜に移動したことが確認できた。一方、移動モジュールを含む第１の構成物がない対照群（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ）では、ＰＭＡ刺激により分布変化が表れないことが確認された（結果は図示せず）。
【０１１０】
このような実験結果は、第１の構成物を含む３種の蛋白質複合体の結合ばかりでなく、第１の構成物の蛍光標識を除いて、ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ、ＨｃＲｅｄ及びＢＦＰの４種の複合体の結合可否を、一般的に使用される蛍光顕微鏡または共焦点レーザー蛍光顕微鏡を使用して検証することができ、様々な蛍光蛋白質種とＭｅｔａ（Carl Zeiss）またはＳｐｅｔｒａｌ（Leica）蛍光顕微鏡を使用して、第１の構成物の他に少なくともＢＦＰ、ＣＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、及びＦａｒ−Ｒｅｄの５種の蛋白質複合体を同時に検証し得ることを意味する。
【０１１１】
実施例５：酵母ツーハイブリッド法（Ｙ２Ｈ）によりスクリーニングされた候補物質の検証
酵母ツーハイブリッド法（Ｙ２Ｈ，yeast two-hybrid）は、現在、生細胞内の蛋白質結合をスクリーニングする最も一般的な方法として使用されているばかりでなく、今まで知られた新薬標的スクリーニング方法のうち、多くの部分を占めている代表的な方法である。しかしながら、酵母ツーハイブリッド法は、偽陽性（false-positive）が高く、酵母を使用するという短所が有り、新薬標的及び新薬候補検証に弱点を有していることが周知の事実である。従って、本実験例では酵母ツーハイブリッド法により、スクリーニングされた候補物質を検証し得る方法としての本発明の適用性を分析した。
【０１１２】
抗生剤耐性菌であるスーパーバクテリア関連ＯｍｐＡ（GenBank accession No. AY485227）蛋白質とヒト蛋白質ライブラリ（human protein library）に対してＹ２Ｈ法でスクリーニングした結果、４種の陽性クローンを確認することができた（全体ライブラリースクリーニングクローン：１．１８８×１０5クローン；第１次パッチ（patch）／ストリーク（streak）スクリーニング：１３７クローン；第２次再形質転換（re-transformation）スクリーニング：５４クローン；第３次プレイオートアクティベーションテスト（prey auto-activation test）スクリーニング：１４クローン；第４次ヌクレオチドシークエンシングコンファメーション（nucleotide sequencing confirmation）：４クローン）。
【０１１３】
陽性として表れた前記４種のクローンのうち、ＥＥＦ１Ａ１（GenBank accession No. BC009875）、ＦＡＭ１４Ｂ（GenBank accession No. BC015423）、及びＤＤＸ３１（GenBank accession No. AK027002）に対しては、ＯｍｐＡ蛋白質との結合可否を検証した。このため、第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＯｍｐＡ）及び第２の構成物（ＥＧＦＰ−ＥＥＦ１Ａ、ＥＧＦＰ−ＦＡＭ１４Ｂ、及びＥＧＦＰ−ＤＤＸ３１）を下記の通り作製した。
【０１１４】
第１の構成物ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ＯｍｐＡは、鋳型としてｐＥＴ２８ａ−ＯｍｐＡ（GenBank accession No.:AY185227）ベクターを使用し、プライマーとして配列番号６６（ＯｍｐＡ−Ｆ：５’−ＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＧＣＡＣ−３’）及び配列番号６７（ＯｍｐＡ−Ｒ：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【０１１５】
第２の構成物等の内、ＥＧＦＰ−ＥＥＦ１Ａは、鋳型としてｐＯＴＢ７−ＥＥＦ１Ａ（GenBank accession No. BC009875）ベクターを使用し、プライマーとして配列番号６８（ＥＥＦ１Ａ−Ｆ：５’−ＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＴＣＡ−３’）及び配列番号６９（ＥＥＦ１Ａ−Ｒ：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＣＴＴ−３’）を使用し、ＥＧＦＰ−ＦＡＭ１４Ｂは、鋳型としてｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＦＡＭ１４Ｂ（GenBank accession No.:BC015423）ベクターを使用し、プライマーとして配列番号７０（ＦＡＭ１４Ｂ−Ｆ：５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧ−３’）及び配列番号７１（ＦＡＭ１４Ｂ−Ｒ：５’−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＧＧＧＴＧＡＡＣ−３’）を使用し、ＥＧＦＰ−ＤＤＸ３１は、鋳型としてｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３−ＤＤＸ３１ベクターを使用し、プライマーとして配列番号７２（ＤＤＸ３１−Ｆ：５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴ−３’）及び配列番号７３（ＤＤＸ３１−Ｒ：５’−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＧ−３’）を使用して、それぞれＰＣＲ増幅した後、各ＰＣＲ増幅物をｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【０１１６】
前記にて作製した第１の構成物及び第２の構成物を、ＨＥＫ２９３細胞株に形質転換し、これを前記実施例＜４−１＞に記載の通り、蛍光を確認した。
【０１１７】
その結果、図１４に示した通り、ＥＥＦ１Ａ１（Ａ）と、ＦＡＭ１４Ｂ（Ｂ）の場合、ＯｍｐＡが結合した第１の構成物に従い細胞膜に移動せず、実際にはＯｍｐＡと結合していなかったことが分かり（偽陽性）、ＤＤＸ３１（Ｃ）は、ＯｍｐＡが結合し第１の構成物に従って細胞膜に移動して、ＯｍｐＡとの結合について陽性であることが確認された。従って、本発明の方法は、酵母ツーハイブリッド法に比べて高い正確性を有することが分かり、前記方法による陽性結合を再検証し得ることを確認することができた。
【０１１８】
実施例６：実時間分析を利用した抗癌剤の効能の検証
潜在的発癌性遺伝子として知られるｐ５３蛋白質は、少なくともｍｄｍ２蛋白質の結合により、発癌が促進されるものとして知られており、これを阻害し得る物質であるヌトリン３が強力な抗癌剤として使用できることが多くの研究を介して確認された。ビアコア社の表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance technology，ＳＰＲ）技術を使用してイン・ビトロ（in vitro）で実施した結合阻害実験によれば、ｐ５３とｍｄｍ２の結合は、最小限１μＭ以上のヌトリン３を使用した時、９０％以上の結合阻害効果を表し、５０％の阻害が起こる濃度（ＩＣ50；median inhibitory concentration）は、９０ｎＭであると測定された（Vassilev, L. T. et al., Science 303, 844-848）。
【０１１９】
本実験では、ｐ５３（GenBank accession No. NM_00546)とｍｄｍ２の相互作用及び結合阻害剤ヌトリン３の結合阻害実験を、ヒトの生細胞株において行った。このため、第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ５３Ｎ）及び第２の構成物（ＡｚＧ−ｍｄｍ２Ｎ）を下記の通り作製した。
【０１２０】
第１の構成物（ＴＭＤ−ｍＲＦＰ−ｐ５３Ｎ）は、鋳型としてｐＧＥＸ−４Ｔ１−ｐ５３Ｎベクター（ｐ５３，GenBank accession No. NM_ 00546）を使用し、プライマーとして配列番号７４（ｐ５３Ｎ−Ｆ：５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＡＧＡＴ−３’）及び配列番号７５（ｐ５３Ｎ−Ｒ：５’−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＴ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物を第１の構成物ベクター（ｐＴＭＤ−ｍＲＦＰ−Ｃ３ベクター）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【０１２１】
第２の構成物ＥＧＦＰ−ｍｄｍ２Ｎは、鋳型としてｐＧＥＸ−４Ｔ１−ｍｄｍ２Ｎベクター（ｍｄｍ２；GenBank accession No. NM-002392）を使用し、プライマーとして配列番号７６（ｍｄｍ２Ｎ−Ｆ：５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＣＡＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＣ−３’）及び配列番号７７（ｍｄｍ２Ｎ−Ｒ：５’−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＣＴＡＣＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＧＡＴ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ増幅物をｐＡｚＧ−Ｃ３ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入して作製した。
【０１２２】
前記にて作製した第１の構成物及び第２の構成物を、ＨＥＫ３９３細胞株に形質転換し、これを前記実施例＜４−１＞に記載の通り、蛍光を確認した。ヌトリン３は０、０．５、１、５、１０、２５、５０、１００、２００ｎＭに調製して処理し、実施例＜３−２＞に記載の通り、５分間ヌトリン３を処理した後、３．８％ホルムアルデヒド（formaldehyde）で細胞を固定して、共焦点顕微鏡（Confocal microscope, Carl Zeiss LSM 510）を介して、赤色蛍光が発現された２００個の細胞を無作為で選定して濃度別赤色蛍光の細胞膜分布細胞の数を測定した。
【０１２３】
その結果、図１５に示した通り、ｍｄｍ２（緑色、中央パネル）は、外部刺激（ＰＭＡ）によりｐ５３（赤色、左側パネル）と共に、生細胞内で細胞膜へ移動したものの（図１５Ａ参照）、阻害剤ヌトリン３を処理した場合、その分布が変わらない結果を示した（図１５Ｂ参照）。これはヌトリン３を処理しない場合、ｍｄｍ２がｐ５３と結合するものの、ヌトリン３を処理した場合、ｍｄｍ２とｐ５３の結合が阻害されたことを表す。この結果は、本発明が生細胞内で起こる蛋白質相互作用を直接分析可能であることを示すものであり、結合と関連した新薬発掘技法として有用であることを示す。
【０１２４】
さらに、図１６に示した通り、赤色蛍光を示す２００個の細胞を無作為に選定して、細胞膜に分布する赤色蛍光の数を各濃度において測定した結果、組替え蛋白質を使用したヒトの生細胞株（ＨＥＫ２９３）に対するイン・ビトロ(in vitro)実験において、９０％以上の結合阻害効果が表れる濃度が１μＭに対し（Vassilev, L. T. et. al., 2004, Science 303, 844-848）、２０ｎＭで９５％以上の結合阻害効果が表れるものと分析され、本発明の分析感度が既存のイン・ビトロ(in vitro)実験と比べて５０倍以上の分析精密度を有することを確認できた。従って、このような結果は、本発明が、イン・ビトロ(in vitro)実験を介した結合阻害実験から出た結果による細胞または個体を介した研究及び人間を対象とした臨床実験の危険性を排除し得る技術を提供できることを意味する。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
以上説明した通り、本発明は、生細胞内において起こる物質間の結合及び相互作用を実時間検出できる方法及びその相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法を提供する。本発明の方法は、今まで知られたイン・ビトロ(in vitro)法（試験管内法及び生化学的方法）、抗体結合法（抗体沈殿法）、蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）、及び蛍光蛋白質再構成法（Ｂｉ−ＦＣ）及び蛍光干渉（ＦＣＳ）等の既存の生体物質の相互作用検出方法が有する不正確性及び複雑性等の短所を克服する。正確度を一層高めるため両方の構成物に標識をすることによって、本発明は新規な実時間無抗体分析方法を提供する。
【図１】
2010115192.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図１６】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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