(57)【要約】【課題】麻痺や記憶障害を引き起こす貝毒、魚毒、キノコ毒を簡便に高感度で検出する毒物の検出方法の提供。【解決手段】検体を培養細胞と共存させ、ついで電位依存性イオンチャンネルの開放化合物で培養細胞を刺激し、刺激により培養細胞から放出される化合物を、酸化酵素を用いた酵素発光法により検出することで、麻痺性貝毒などの貝毒、フグ毒など魚毒、キノコ毒などイオンチャンネル型受容体に作用する毒物を簡便、高感度に検出できる。【選択図】   図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を培養細胞と共存させた状態で、
電位依存性イオンチャンネル開放化合物を用いて当該培養細胞を刺激することで当該培養細胞から放出される化合物を、又は、
検体が培養細胞を刺激することで当該培養細胞から放出される化合物を、
酸化酵素を用いた酸素発光法により検出することを特徴とする検体の毒物検出方法。  
【請求項２】
培養細胞から放出される化合物がカテコールアミンであることを特徴とする請求項１記載の検体の毒物検出方法。
【請求項３】
カテコールアミンがドーパミンであることを特徴とする請求項２記載の検体の毒物検出方法。
【請求項４】
培養細胞がＰＣ１２細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検体の毒物検出方法。    
【請求項５】
毒物が麻痺性貝毒又はフグ毒であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の検体の毒物検出方法。
【請求項６】
培養細胞から放出される化合物がアミノ酸であることを特徴とする請求項１記載の検体の毒物検出方法。
【請求項７】
アミノ酸がグルタミン酸であることを特徴とする請求項６記載の検体の毒物検出方法。
【請求項８】
培養細胞がＣ６グリオーマ細胞であることを特徴とする請求項６又は７記載の検体の毒物検出方法。
【請求項９】
毒物が麻痺性貝毒、フグ毒、記憶喪失性貝毒、キノコ毒のいずれかであることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の検体の毒物検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞を用いる毒物の検出方法に関し、さらに、詳しくは、培養細胞を用いるイオンチャンネル、イオンチャンネル型受容体に作用する貝毒、魚毒、キノコ毒などの毒物の検出方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
フグ毒に代表される魚介類の毒（マリントキシン）の起源は、海洋性細菌、渦鞭毛藻、珪藻などである。
これらの細菌や植物プランクトンが生産する毒成分の食物連鎖により魚や貝は毒化される。
有毒フグは、ビブリオ属など海洋性細菌が産生するテトロドトキシンが食物連鎖により毒化したものである。
また、ボウシュウボラのような食用巻貝類の毒成分がテトロドトキシンであることが知られている。
テトロドトキシンは、神経細胞や筋肉細胞の表面に存在する電位依存性イオンチャンネル、特にナトリウムチャンネルにおけるナトリウムイオンの流入を妨害し麻痺を引き起こす。
【０００３】
麻酔性貝毒は、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）属、ギムノデニュウム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）属などの渦鞭毛藻類が産生するサキシトキシン、ゴニオトキシンなどが生物濃縮されカキ、ホタテ、アサリなどの貝が毒化したものである。
麻酔性貝毒もテトラドトキシンと同様にナトリウムチャンネルをブロックすることにより毒作用を発現する。
【０００４】
記憶喪失性貝毒は、シュードニッチア（Ｐｓｅｕｄｏｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属等の珪藻類が産生するドウモイ酸によりムラサキイガイ、マテガイなどが毒化したものである。
ドウモイ酸、カイニン酸、Ｌ−グルタミン酸などは興奮性アミノ酸である。
これらは中枢神経にあるＬ−グルタミン酸受容体のうちイオンチャネル型受容体の一つであるカイニン酸型受容体のアゴニストである。
【０００５】
その他、マリントキシンとして、ナトリウムチャネルを開き放しにするシガトキシンやパリトキシン、カルシウムチャネルを開き放しにするマイトトキシンなどが知られている。
【０００６】
食品衛生法上のフグ毒、麻酔性貝毒の検出は、マウスの生死で判定するマウスアッセイ法である。
麻酔性貝毒については、例えば、これ以外に培養神経細胞を用いるバイオアッセイ（特許文献１）、麻酔性貝毒抗体を用いる酵素免疫測定（特許文献２）、液体クロマトグラフィ−蛍光検出法（特許文献３）が知られている。
【０００７】
一方、ＰＣ１２細胞やＣ６細胞などの培養細胞を電位依存性イオンチャンネルの開放化合物で刺激し、刺激により培養細胞から放出されるアミンやグルタミン酸を、チラミンオキシダーゼやグルタミン酸オキシダーゼなどの酸化酵素を用いて酸化し、生成する過酸化水素と反応するルミノールの発光を検出する方法が知られている（非特許文献１、非特許文献２）。
【特許文献１】特開２００１−１７１９６
【特許文献２】特開２００３−１２６９９
【特許文献３】特開平０９−１３３６６９
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２３，  ８１−８４（２００７）
【非特許文献２】Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ８０（１０），  ３７６２−３７６８（２００８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
マウスアッセイ法は公定法であるが、多量のマウスを必要であり手間と時間を要する。特許文献１の培養神経細胞を用いるバイオアッセイ法は、細胞を用いており確度が向上するものの生存細胞を染色するなど手間がかかる。
特許文献２の酵素免疫法は、抗体を用いるため、特定の毒素の検出・定量に優れ、時間の短縮を図ることができるが、抗体作製などに手間・時間を要し、酵素免疫法の手順などは煩雑である。
特許文献３液体クロマトグラフィ−蛍光検出法は、種々の毒素を判別・定量できるがやはり手間がかかる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
非特許文献２に記載されたＣ６細胞刺激により放出されるグルタミン酸をグルタミン酸オキシダーゼで酸化させ、生成する過酸化水素と反応させたルミノールの発光を検出する方法で麻痺性貝毒の検出を試みた結果、麻痺性貝毒を高感度に検出できることを見出した。
さらに、研究を進め、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストであるキノコ毒であるイボテン酸が検出できること、また、非特許文献１に記載された細胞刺激により放出されるドーパミンを、チラミンオキシダーゼで酸化させ、生成する過酸化水素と反応するルミノールの発光を検出する方法も高感度に麻痺性貝毒を検出できる方法であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明に係る検体の毒物検出方法は、検体を培養細胞と共存させた状態で、電位依存性イオンチャンネル開放化合物を用いて当該培養細胞を刺激することで当該培養細胞から放出される化合物を、又は、検体が培養細胞を刺激することで当該培養細胞から放出される化合物を、酸化酵素を用いた酸素発光法により検出することを特徴とする。
【００１１】
培養細胞としては、ヒトまたは動物の神経系細胞から樹立された細胞株であれば特に限定されないが、例えば、ラット褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞（ＣＲＬ−１７２１）、ヒト神経芽腫由来のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＣＲＬ−２２６６）、マウス神経芽腫とラットグリオーマのハイブリドーマ由来のＮＧ１０８−１５細胞（ＨＢ−１２３１７）、マウス神経芽腫由来のＮ２Ａ細胞（ＣＣＬ−１３１）、ラット神経膠芽腫（ラットグリオーマ）由来のＣ６細胞（ＣＣＬ−１０７、ＪＣＲＢ９０９６）などを挙げることができる。
好ましいものとして、ＰＣ１２細胞およびＣ６細胞が挙げられる。
【００１２】
電位依存性イオンチャンネルの開放化合物としては、ベラトリジン、シガトキシンなどの電位依存性ナトリウムチャンネルの活性化剤、マイトトキシンなどの電位依存性カルシウムチャンネルの活性化剤が挙げられる。
好ましいものとして、ベラトリジン、シガトキシンなどの電位依存性ナトリウムチャンネルの活性化剤が挙げられる。
【００１３】
放出される化合物として、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンなどのカテコールアミン；グルタミン酸などのアミノ酸が挙げられる。
【００１４】
酸化酵素としては、チラミンオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チラミダーゼ、アドレナリンオキダーゼ、ジアミンオキダーゼ、ヒスタミナーゼなどのアミンオキシダーゼおよびグルタミン酸オキダーゼが挙げられる。
好ましいものとしてチラミンオキシダーゼおよびグルタミン酸オキシダーゼが挙げられる。
【００１５】
本発明は、酸化酵素により生成した過酸化水素の量を化学発光法により検出することで毒物を検出及び定量することができる。
過酸化水素の検出に用いる化学発光法は、公知の方法をそのまま利用できるが、例えば、ルミノール、ルシゲニンまたはロフィンを発光基質として用いる化学発光法が挙げられる。
【００１６】
発光基質としてルミノールを用いる化学発光法において、触媒として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、微生物（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｒａｍｏｓｕｓ）由来ペルオキシダーゼ、カタラーゼなどのヘム酵素；ヘモグロビン、ミオグロビン、シトクロムｃなどのヘムタンパク質；プロトヘム（ペルオキシダーゼやヘモグロビンの補欠分子族部分）のどの低分子のヘミン；鉄錯体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などの金属錯体から成る群から選ばれる少なくとも１種を用いてもよい。
【００１７】
本発明の方法における酸化酵素の使用量は、分析に要求される感度等を考慮して適宜決定されるが、例えば、３０  ｆｍｏｌ（１ｎＭで３０μＬ）〜３０  ｐｍｏｌ（１μＭで３０μＬ）のカテコールアミン（ドーパミン）当たり、１μｇ（０．１  ｍｇ／ｍＬを１０μＬ）〜１５０μｇ（５  ｍｇ／ｍＬを３０  μＬ）の範囲とすることが適当である。
また、３０  ｆｍｏｌ（１ｎＭで３０μＬ）〜３０  ｐｍｏｌ（１μＭで３０μＬ）のＬ−グルタミン酸の検出定量に当たっては、グルタミン酸オキシダーゼの使用量を１μｇ（０．２  ｍｇ／ｍＬを５μＬ）〜１００μｇ（５  ｍｇ／ｍＬを２０  μＬ）の範囲とすることが適当である。
【００１８】
化学発光法で使用する発光基質、触媒などの使用量は、使用される試薬の種類や分析に要求される感度等を考慮して適宜決定される。
【００１９】
本発明の方法は、多数の試料を並行して分析する方法に特に有効であり、例えば、マルチマイクロウェルプレートの各マイクロウェルにおいて本発明の方法を実施することことで、多数の試料を並行して分析することができる。
具体的には、２４ウェルプレートまたは９６ウェルプレートの各マイクロウェルに細胞を一晩接着培養した後、培地を交換する形で、例えば、ルミノール溶液、ペルオキシダーゼ溶液、チラミンオキシダーゼ溶液および緩衝溶液を適当な濃度になるよう適量取り、発光検出型プレートリーダーにセットし、オートインジェクターを用いてウェルに毒物または毒物を含む溶液をインジェクションし、その際の発光を経時観測し、そのピーク強度を計測することで、毒物を検出、定量することができる。
【００２０】
電位依存性イオンチャンネル開放化合物にて培養細胞を刺激する方法で検出される毒物は、カキ、ホタテ、アサリなどの麻痺性貝毒であるサキシトキシン、ゴニオトキシンなど；フグ毒のテトロドトキシンなどのナトリウムチャンネルの阻害作用を有する化合物などが挙げられる。
【００２１】
検体が培養細胞を刺激することで検出される毒物は、例えば、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体アゴニストであるキノコ毒のイボテン酸など；カイニン酸型受容体のアゴニストである麻痺性貝毒のドウモイ酸など；シガトキシンやパリトキシンなどのナトリウムチャンネルを活性化する化合物；マイトトキシンなどのカルシウムチャネルを活性化する化合物が挙げられる。
【発明の効果】
【００２２】
従来の方法に比して、マウスを用いないこと、高価な機器を用いないこと、手間がかからないこと、煩雑さがないことなどから、本発明方法は簡便で優れた方法である。
また、ＰＣ１２細胞から放出されるドーパミンを検出するアッセイ系は、ナトリウムチャネルを遮断する麻痺性貝毒のサキシトキシンやゴニオトキシンなどの検出だけでなく、同様の作用を示すフグ毒のテトロドトキシン、ナトリウムチャネルを開き放しにするシガトキシンやパリトキシン、あるいはカルシウムチャネルを開き放しにするマイトトキシンなどの海産物毒素の検出にも有効である。
Ｃ６グリオーマから放出されるグルタミン酸を検出するアッセイ系は、上記のイオンチャネルに作用する海産物毒素の検出の他、カイニン酸型グルタミン酸受容体のアゴニストである記憶喪失性貝毒であるドウモイ酸やＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストであるキノコ毒であるイボテン酸の検出にも有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明に係る電位依存性イオンチャンネル開放化合物にて培養細胞を刺激する態様として、ＰＣ１２細胞をベラトリジンで刺激し、ＰＣ１２細胞から放出されるドーパミンを、チラミンオキダーゼとルミノール発光を組み合わせた酵素発光法で測定する、麻痺性貝毒の検出方法が挙げられる。
【００２４】
また、Ｃ６細胞をベラトリジンで刺激し、Ｃ６細胞から放出されるグルタミン酸をグルタミン酸オキダーゼとルミノール発光を組み合わせた酵素発光法で測定する、麻痺性貝毒の検出方法が挙げられる。
【００２５】
本発明に係る検体が培養細胞を刺激する態様として、Ｃ６細胞を用い、検体の刺激によりＣ６細胞から放出されるグルタミン酸をグルタミン酸オキダーゼとルミノール発光を組み合わせた酵素発光法で測定する、記憶喪失性貝毒およびキノコ毒の検出方法が挙げられる。
【００２６】
また、Ｃ６細胞を用い、検体の刺激によりＣ６細胞から放出されるグルタミン酸をグルタミン酸オキダーゼとルミノール発光を組み合わせた酵素発光法で測定する、シガトキシンやパリトキシンなどのナトリウムチャンネルを活性化する化合物やマイトトキシンなどのカルシウムチャネルを活性化する化合物の検出方法が挙げられる。
さらに別の好ましい態様として、ＰＣ１２細胞を用い、検体の刺激によりＰＣ１２細胞から放出されるドーパミンをチラミンオキダーゼとルミノール発光を組み合わせた酵素発光法で測定する、シガトキシンやパリトキシンなどのナトリウムチャンネルを活性化する化合物やマイトトキシンなどのカルシウムチャネルを活性化する化合物の検出方法が挙げられる。
次に、本発明について、以下の実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００２７】
［実施例１］
・ＰＣ１２細胞を用いるゴニオトキシンの検出。
＜培地の調製＞
オートクレーブ滅菌の済んだ超純水にダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）２．０ｇを十分に溶かした後、炭酸水素ナトリウム０．７４ｇを溶かした。
次にクリーンベンチ内に移し、恒温漕で３７℃にしたウマ血清（ＧＩＢＣＯ社製）２０ｍＬ（１０％−ｖ／ｖ）、ウシ胎児血清（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍＬ（５％−ｖ／ｖ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯＢＡＬ社製）２ｍＬ（１％−ｖ／ｖ）を加える。
ボトルトップフィルターで濾過滅菌を行い、乾熱滅菌を行った２００ｍＬメディウムビンに溶液を移した。
作製した培地は３５ｍｍディッシュに２  ｍＬほど移し、１日培養してコンタミネーションしていないことを確認してから使用した。
【００２８】
＜細胞培養＞
調製したＤＭＥＭ培地を用いて、２５ｃｍ２の細胞培養用フラスコで培養した。
前培養は、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータでコンフルエントになるまで置いた。  この際、３日ごとに培地交換を行った。
【００２９】
＜Ｌｏｃｋｅ’ｓ溶液の調製＞
超純水を用いて、１４５ｍＭ塩化ナトリウム、５．６ｍＭ塩化カリウム、２．３ｍＭ塩化カルシウム、３．６ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５．６ｍＭグルコース、５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）を溶かし、０．１Ｍ  水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．４にし、メスアップした。
【００３０】
＜酵素発光法による検出＞
ＰＣ１２細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように９６ウェルプレートに播き、二晩接着させた。
２日後、培地を全て取り除きＬｏｃｋｅ’ｓ溶液で２回洗浄し、各ウェルにＬｏｃｋｅ’ｓ  （ｐＨ７．４）  １３０μＬ、０．０５ｍＭ  ルミノール（和光純薬製）２０μＬ、１ｍｇ／ｍＬ  チラミンオキシダーゼ（旭化成社製）２０μＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ  ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）２０μＬ、各濃度のゴニオトキシン１／４（ゴニオトキシン１および４の混合物）を添加し１０分間インキュベーション後、１００μＭ（最終濃度）のベラトリジンを測定の５秒後に１０μＬインジェクションした。
【００３１】
＜結果＞
ＰＣ１２細胞を播いた９６ウェルプレートにＧＴＸ１／４を添加し１０分間インキュベーション後、発光測定を開始した。
測定開始５秒後に１００μＭのベラトリジンをインジェクトすると数秒以内に発光のピークが見られたが、図１及び図２に示すように１０ｎＭのＧＴＸ１／４を添加したものはＧＴＸ１／４を添加していないコントロールに比べ、発光の減少が見られた。
また、１００ｎＭのＧＴＸ１／４を添加したものは完全に発光が見られなくなり、ＰＣ１２細胞のベラトリジン刺激によるドーパミン放出を完全に阻害した。
【００３２】
［実施例２］
・Ｃ６細胞を用いるイボテン酸およびドウモイ酸の検出。
＜細胞培養＞
ラットＣ６グリオーマ細胞（ＪＣＲＢ９０９６）  はヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪）から入手した。
細胞は、Ｔ−２５  フラスコ中で１５％  （ｖ／ｖ）  ウマ血清、  ２．５％  （ｖ／ｖ）  ウシ胎児血清、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０  培地（ギブコ社製）を用い、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターで培養した。
継代操作は４日ごとに行った。
細胞を用いた刺激応答計測実験を行う場合は、２４時間前に細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で播いて一晩接着させた。
【００３３】
＜薬剤・毒素類の調製＞
薬剤・毒素類は要時調製し、希釈にはハンクス溶液（ｐＨ  ７．４）を用いた。
ベラトリジンはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解後、最終的にはＤＭＳＯが１％以下になるよう、ハンクス溶液で希釈して用いた。
その他の試薬もすべてハンクス溶液で調製した。
【００３４】
＜グルタミン酸オキシダーゼ＞  
グルタミン酸オキシダーゼはヤマサ製のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  由来のものを用いた。
この酵素の基質特異性（ｐＨ  ７．４、３７℃における  ）は、Ｌ−グルタミン酸に対する活性を１００％として、Ｌ−アスパラギン酸は０．６％、他のアミノ酸に対しては０％であった。
【００３５】
＜酵素発光法を用いたＣ６細胞からのグルタミン酸放出のリアルタイム測定＞
ラットグリオーマＣ６細胞を培養したウェル中の培地を取り除き、２回ハンクス溶液で洗浄後、ハンクス溶液（ｐＨ  ７．４）  ２０５  μＬ、ペルオキシダーゼ溶液（６４Ｕ／ｍＬ≒０．２５ｍｇ／ｍＬ）３０μＬ、ルミノール溶液（０．０５ｍＭ）３０μＬ、およびＬ−グルタミン酸オキシダーゼ溶液（１７Ｕ／ｍＬ≒２ｍｇ／ｍＬ）５μＬを各ウェルに入れ、発光検出器を備えたプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ，  ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）にセットし、１０分間インキュベートした。  細胞の刺激は、その後、適当な濃度のイボテン酸溶液またはドウモイ酸を３０  μＬ、オートインジェクターで各ウェルにインジェクトすることにより行い、ウェルごとにグルタミン酸の放出を示す発光強度の時間変化を３０秒間モニタリングした。
計測後その発光ピーク強度を読み取り（多くの場合、数秒以内にピークが観測された）、刺激薬物あるいは毒素の濃度とプロットして、その濃度依存性をみた（図３、図４）。
【００３６】
＜結果＞
記憶喪失性貝毒であるドウモイ酸をＣ６細胞に投与した際のグルタミン酸放出を酵素発光法で観測した。
図３（ｂ）に示すように１〜１０ｎＭの濃度範囲でドウモイ酸が検出可能であった。
キノコ毒であるイボテン酸をＣ６細胞に投与した際のグルタミン酸放出を酵素発光法で観測した。
図４（ｂ）に示すように１〜１００ｎＭの濃度範囲でイボテン酸が検出可能であった（図４）。
【００３７】
［実施例３］
・Ｃ６細胞を用いるゴニオトキシンの検出
Ｃ６細胞を接着培養した各ウェルに、培地を取り除いて洗浄した後、ハンクス溶液（ｐＨ  ７．４）  １７５μＬ、ペルオキシダーゼ溶液（６４Ｕ／ｍＬ≒０．２５ｍｇ／ｍＬ）３０μＬ、ルミノール溶液（０．０５ｍＭ）３０μＬ、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（１７Ｕ／ｍＬ≒２ｍｇ／ｍＬ）５μＬ、そして適当な濃度のゴニオトキシン２／３（ゴニオトキシン２および３の混合物）を溶かしたハンクス溶液３０μＬを入れ、発光検出器を備えたプレートリーダーにセットする。
そして１０分間、このゴニオトキシン入り測定液中でインキュベートした後、０．５μＭベラトリジン３０μＬのインジェクションにより刺激を行った際の発光強度変化（減少する）を測定した。（図５）
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明方法により、麻痺や記憶障害を引き起こす貝毒、魚毒、キノコ毒を簡便に高感度で検出することができる。
従って、本発明方法は、マリントキシンに限らず、天然物の神経毒の検出方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ゴニオトキシン１／４を表示濃度で投与して１０分間インキュベーションしたＰＣ１２細胞をベラトリジン刺激した際のドーパミン放出の酵素発光観測結果を示す。
【図２】ベラトリジン刺激により引き起こされるＰＣ１２細胞からのドーパミン放出に及ぼすゴニオトキシン１／４の阻害効果結果を示す。
【図３】（ａ）ドウモイ酸投与によるＣ６細胞からのグルタミン酸放出の発光観測結果を示す。（ｂ）グルタミン酸放出に対応する発光強度のドウモイ酸濃度依存性を示す。
【図４】（ａ）イボテン酸投与によるＣ６細胞からのグルタミン酸放出の発光観測結果を示す。（ｂ）グルタミン酸放出に対応する発光強度のイボテン酸濃度依存性を示す。
【図５】Ｃ６細胞をベラトリジン刺激した際のＬ−グルタミン酸の放出に及ぼすゴニオトキシン２／３の阻害効果結果を示す。（ａ）種々の濃度（１〜１０μＭ）のゴニオトキシン２／３の存在、非存在下におけるＣ６細胞からのＬ−グルタミン酸放出の酵素発光モニタリング結果を示す。（ｂ）０．５μＭベラトリジンで刺激した際のＬ−グルタミン酸放出のゴニオトキシン２／３による阻害の濃度依存性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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