(57)【要約】【課題】空間的にインコヒーレントな物体光のホログラムを効率的に記録する。【解決手段】本発明のホログラム記録装置は、空間的にインコヒーレントな物体光のホログラムを記録するホログラム記録装置であって、物体（２０）から互いに反対の側へ射出する１対の物体光を個別に導光し、それら１対の物体光を所定面（５）で干渉させる１対の光学系（６、７）と、前記１対の物体光が前記所定面に形成する光強度分布を検出する検出手段とを備えることを特徴とする。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
空間的にインコヒーレントな物体光のホログラムを記録するホログラム記録装置であって、
物体から互いに反対の側へ射出する１対の物体光を個別に導光し、それら１対の物体光を所定面で干渉させる１対の光学系と、
前記１対の物体光が前記所定面に形成する光強度分布を検出する検出手段と、
を備えることを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項２】
請求項１に記載のホログラム記録装置において、
前記１対の光学系の一方による前記物体の基準位置の共役位置と、前記１対の光学系の他方による前記基準位置の共役位置とは、前記所定面の互いに反対の側に位置する
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項３】
請求項２に記載のホログラム記録装置において、
前記１対の光学系の一方による前記物体の基準位置の共役位置と、前記１対の光学系の他方による前記基準位置の共役位置とは、前記所定面に関して対称である
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項４】
請求項１〜請求項３の何れか一項に記載のホログラム記録装置において、
前記１対の光学系の一方による前記物体の結像倍率と、前記１対の光学系の他方による前記物体の結像倍率とは、等しい
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項５】
請求項１〜請求項４の何れか一項に記載のホログラム記録装置において、
前記物体の基準位置から前記所定面までの主光線の光路長は、前記１対の光学系の一方と他方との間で等しい
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項６】
請求項１〜請求項５の何れか一項に記載のホログラム記録装置において、
前記所定面へ入射可能な物体光のスペクトルを狭帯化する狭帯化手段を更に備える
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項７】
請求項１〜請求項６の何れか一項に記載のホログラム記録装置において、
前記１対の光学系の一方の光路を経る物体光と他方の光路を経る物体光との前記所定面における光路長差は、前記１対の光学系のＮＡ範囲内で前記物体光のコヒーレンス長以内に設定される
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項８】
請求項１〜請求項７の何れか一項に記載のホログラム記録装置において、
前記１対の物体光の光路長差を変化させながら前記検出手段による検出を繰り返す制御手段を更に備える
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項９】
請求項８に記載のホログラム記録装置において、
前記検出手段が前記繰り返しにより検出した複数の光強度分布に基づき複素振幅ホログラムを算出する算出手段を更に備える
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項１０】
請求項９に記載のホログラム記録装置において、
前記演算手段が算出した複素振幅ホログラムに基づき前記物体の像を復元する復元手段を更に備える
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０の何れか一項に記載のホログラム記録装置において、
前記物体に含まれる蛍光物質を励起する励起手段を更に備え、
前記１対の光学系は、前記励起により前記物体で生じた蛍光を前記物体光として前記所定面へ導光する
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１の何れか一項に記載のホログラム記録装置において、
前記物体を空間的にインコヒーレントな光で照明する照明手段を更に備え、
前記１対の光学系は、前記照明により前記物体で生じた回折光を前記物体光として前記所定面へ導光する
ことを特徴とするホログラム記録装置。
【請求項１３】
空間的にインコヒーレントな物体光のホログラムを記録するホログラム記録方法であって、
物体から互いに反対の側へ射出する１対の物体光を１対の光学系で個別に導光し、それら１対の物体光を所定面で干渉させる干渉手順と、
前記１対の物体光が前記所定面に形成する光強度分布を検出する検出手順と、
を含むことを特徴とするホログラム記録方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空間的にインコヒーレントな物体光のホログラムを記録するホログラム記録装置及びホログラム記録方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホログラフィー顕微鏡は、空間的にコヒーレントな照明光で物体を照明し、物体で生じた回折光を所定の参照光と干渉させ、それによって生じた干渉パターンを物体光のホログラムとして記録するものであって、生物試料など、微細構造を有する物体の三次元構造を観察するのに有効である。
【０００３】
一方、生物試料の有効な観察方法として蛍光観察がある。但し、蛍光は参照光と干渉させることはできないため、上記のホログラフィー顕微鏡で蛍光のホログラムを記録することはできない。そこで、インコヒーレントな物体光のホログラムを記録する非特許文献１、非特許文献２の技術が有効になる。
【０００４】
非特許文献１の技術では、試料上の１点から射出した蛍光のホログラムを記録するために、エアリーパターン状の強度パターンをもった励起光を試料へ照射し、その強度パターンを時間変調させたときの蛍光強度の変化を非結像型のセンサで検出している。
【０００５】
また、非特許文献２の技術では、試料上から射出した蛍光のホログラムを記録するために、空間的にインコヒーレントな光で試料上を照明し、試料における反射光をＳＬＭ（空間光変調素子）で回折し、その回折０次光と回折１次光とが成す干渉パターンをＣＣＤで撮像している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Scanning holographic microscopy of three-dimensional fluorescent specimens", J. Opt. Soc. Am. A, vol. 23, pp1699, 2006
【非特許文献２】"Digital spatially incoherent Fresnel holography", OPTICS LETTERS, vol. 32, pp912, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１の技術では、試料を光軸に垂直な面内で走査する必要があるので、ホログラムの記録に多大な時間がかかるという問題がある。
【０００８】
また、非特許文献２の技術では、光を分岐するためにＳＬＭを使用するので、ホログラムの三次元的分解能がＳＬＭの解像度に左右されるという問題がある。
【０００９】
そこで本発明は、空間的にインコヒーレントな物体光のホログラムを効率的に記録することのできるホログラム記録装置及びホログラム記録方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のホログラム記録装置を例示する一態様は、空間的にインコヒーレントな物体光のホログラムを記録するホログラム記録装置であって、物体から互いに反対の側へ射出する１対の物体光を個別に導光し、それら１対の物体光を所定面で干渉させる１対の光学系と、前記１対の物体光が前記所定面に形成する光強度分布を検出する検出手段とを備える。
【００１１】
本発明のホログラム記録方法を例示する一態様は、空間的にインコヒーレントな物体光のホログラムを記録するホログラム記録方法であって、物体から互いに反対の側へ射出する１対の物体光を１対の光学系で個別に導光し、それら１対の物体光を所定面で干渉させる干渉手順と、前記１対の物体光が前記所定面に形成する光強度分布を検出する検出手順とを含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、空間的にインコヒーレントな物体光のホログラムを効率的に記録することのできるホログラム記録装置及びホログラム記録方法が実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ホログラム観察装置の概略構成図である。
【図２】結像、干渉の様子を説明する図である。
【図３】検出面５上に形成される干渉パターンの模式図である。
【図４】ホログラムの記録に関するフローチャートである。
【図５】ホログラムの再生に関するフローチャートである。
【図６】縞画像（位相シフト量−π）を示す図である。
【図７】縞画像（位相シフト量−π／２）を示す図である。
【図８】縞画像（位相シフト量０）を示す図である。
【図９】縞画像（位相シフト量π／２）を示す図である。
【図１０】縞画像（位相シフト量π）を示す図である。
【図１１】一方の蛍光輝点の或る復元面における復元像を示す図である。
【図１２】他方の蛍光輝点の同じ復元面における復元像を示す図である。
【図１３】ホログラム観察装置の変形例を示す図である。
【図１４】ホログラム観察装置の別の変形例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［実施形態］
以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態は、ホログラム観察装置の実施形態である。このホログラム観察装置の観察対象（観察試料）は、蛍光試薬の添加された生物試料である。
【００１５】
先ず、本実施形態のホログラム観察装置の構成を説明する。図１は、ホログラム観察装置の概略構成図である。図１に示すとおりホログラム観察装置には、励起光源１、ハーフミラー２、ミラー３、結像光学系である正方向光学系６、結像光学系である負方向光学系７、ビームスプリッター４、フィルター８などが備えられる。また、図示省略したが、このホログラム観察装置には、検出面５へ配置される二次元画像検出器、二次元画像検出器に接続されるコンピュータ、観察試料２０を支持して光軸方向へ移動させるステージなども備えられる。
【００１６】
励起光源１は、観察試料２０に含まれる蛍光分子を効率的に励起する波長のレーザである。励起光源１から射出した光束は、ハーフミラー２を透過した後に正方向光学系６の一部のレンズを介して観察試料２０へ照射される。これによって、観察試料２０に含まれる個々の蛍光分子が励起され、それぞれ蛍光を発する。なお、観察試料２０中の互いに異なる蛍光輝点から発せられた蛍光同士は互いに干渉しないが、同じ蛍光輝点から発せられた光波は互いに干渉する。
【００１７】
個々の蛍光輝点から発せられた蛍光のうち、正方向光学系６の側へ進む蛍光（正方向の蛍光）は、正方向光学系６の一部のレンズを介してハーフミラー２へ入射し、そのハーフミラー２で反射した後、正方向光学系６の他の一部のレンズを介してビームスプリッター４へ向かう。ビームスプリッター４へ入射した正方向の蛍光は、ビームスプリッター４の分離面を透過した後、フィルター８を介して検出面５へ到達する。
【００１８】
一方、個々の蛍光輝点から発せられた蛍光のうち、負方向光学系７の側へ進む蛍光（負方向の蛍光）は、負方向光学系７の一部のレンズを介してミラー３へ入射し、そのミラー３で反射した後、負方向光学系７の他の一部のレンズを介してビームスプリッター４へ向かう。ビームスプリッター４へ入射した負方向の蛍光は、ビームスプリッター４の分離面を反射した後、フィルター８を介して検出面５へ到達する。
【００１９】
したがって、或る蛍光輝点から発生した正方向の蛍光及び負方向の蛍光は、その蛍光輝点の光軸方向の位置に依存する干渉パターンを検出面５上に形成する。そして、このような干渉パターンは、観察試料２０中の個々の蛍光輝点についてそれぞれ形成される。なお、個々の蛍光輝点に対応する個々の干渉パターンは、検出面５上でインコヒーレントに重ね合わさる（後述する図３を参照）。
【００２０】
検出面５の入射側に配置されたフィルター８は、その検出面５へ入射可能な蛍光の波長域を、蛍光スペクトルのピーク波長及びその近傍波長域のみに制限する狭帯化フィルターである（例えば中心波長６００ｎｍ）。これによって、同一の蛍光輝点から発せられた２つの蛍光の間の干渉性を高めることができる。
【００２１】
検出面５に配置された二次元画像検出器は、検出面５上に生じた干渉パターンの全体を撮像し、それによって取得した画像（縞画像）をコンピュータへ送出する。コンピュータは、その縞画像をホログラムとして保存する。
【００２２】
なお、ステージが観察試料２０を移動させると、検出面５上の干渉パターンが変化する。ここでは、ステージによる観察試料２０の移動パターンを５段階のステップ移動とし、以下、そのステップ移動の中心（３段階目）に相当するステージの位置をステージの基準位置と定める。
【００２３】
ここで、ホログラム観察装置の光学系が満たすべき条件は、以下の条件（ａ）〜（ｄ）である。
【００２４】
（ａ）観察試料２０の基準面９の正方向光学系６による共役面１０と、基準面９の負方向光学系７による共役面１１とは、図２に詳しく示すとおり光軸方向にずれている。この場合、同一の蛍光輝点から発せられた正方向の蛍光Ｌ１０による点像Ｉ１０と負方向の蛍光Ｌ１１による点像Ｉ１１とが光軸方向にずれることになり、そのズレ量は、その蛍光輝点の基準面９からのズレ量に依存する。したがって、蛍光Ｌ１０の波面Ｗ１０と蛍光Ｌ１１の波面Ｗ１１とが検出面５上に形成する干渉パターンには、その蛍光輝点の光軸方向の位置情報が反映される。
【００２５】
（ｂ）二次元画像検出器の配置先（検出面５）は、図２に示すとおり共役面１０、１１の中間点である。この場合、同一の蛍光輝点に対応する波面Ｗ１０、Ｗ１１のサイズが検出面５上で等しくなるので、複素振幅ホログラムの演算（後述）を簡略化することができる。
【００２６】
（ｃ）正方向光学系６の結像倍率と負方向光学系７の結像倍率とは等しい。この場合、同一の蛍光輝点に対応する波面Ｗ１０、Ｗ１１が横ずれしなくなり、しかもその横ずれの無い状態は、ステージ移動時にも保たれるので、複素振幅ホログラムの演算（後述）を簡略化することができる。また、点像Ｉ１０から検出面５までの距離と点像Ｉ１１から検出面５までの距離とが等しくなるので、それによっても演算の簡略化が可能である。
【００２７】
（ｄ）ステージが基準位置にあるときにおける基準面９から検出面５までの主光線の光路長は、正方向の蛍光Ｌ１０と負方向の蛍光Ｌ１１との間で等しい。このように設定しておけば、同一の蛍光輝点に対応する蛍光Ｌ１０、Ｌ１１に含まれる全ての光線の光路長差を一定以下にし、それら蛍光Ｌ１０、Ｌ１１の干渉性を保つことができる。
【００２８】
そして、以上の条件（ａ）〜（ｄ）によると、個々の蛍光輝点に対応する個々の干渉パターンは、図３に模式的に示すとおり、外周にいくほどピッチの細かくなる同心円状パターンＰとなる。
【００２９】
また、図３に示した個々の同心円状パターンＰの中心位置は、個々の蛍光輝点の光軸と垂直な方向の位置を示し、個々の同心円状パターンＰは、個々の蛍光輝点の基準面９からの距離情報を含む。また、上記したステージが移動すると、個々の同心円状パターンＰの位相のみが変化する。よって、本実施形態のホログラム観察装置は、観察試料２０から射出した蛍光の複素振幅ホログラムを周知の位相シフト法によって簡単に取得することができる。
【００３０】
なお、二次元画像検出器のピクセルサイズは、例えば６μｍに設定される。また、二次元画像検出器のピクセル数は、例えば２０００×２０００に設定される。また、正方向光学系６、負方向光学系７の各々の像側ＮＡは、例えば０．０２５に設定される。また、正方向光学系６、負方向光学系７の各々の物体側ＮＡは、高い分解能を得るために例えば０．５に設定される。また、正方向光学系６、負方向光学系７の各々の結像倍率は、例えば２０倍に設定される。
【００３１】
次に、或る１つの蛍光輝点に対応する１つの同心円状パターンＰを詳しく説明する。図２に示したとおり１つの同心円状パターンＰは、正方向の蛍光Ｌ１０の波面Ｗ１０と、負方向の蛍光Ｌ１１の波面Ｗ１１とが成すものであり、このうち一方の蛍光（図２では蛍光Ｌ１０）は、点像Ｉ１０に向かって収束する収束光束であり、他方の蛍光（図２では蛍光Ｌ１１）は、点像Ｉ１１で集光した後に発散する発散光束である。
【００３２】
よって、検出面５上で同心円状パターンＰの中心から距離ｒだけ離れた位置における蛍光Ｌ１０、Ｌ１１の光路長差Ｌは、点像Ｉ１０、点像Ｉ１１と検出面５との間隔ｄに対して近似的に式（１）で表される。
【００３３】
【数１】
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なお、式（１）で表される光路長差Ｌは、蛍光Ｌ１０、Ｌ１１の一方が平面波であった場合の光路長差の２倍に相当する。
【００３４】
また、同心円状パターンＰのピッチｐは、外周部ほど細かくなり、同心円状パターンＰの中心から距離ｒだけ離れた位置におけるピッチｐは、間隔ｄと、蛍光Ｌ１０、Ｌ１１の波長λとに対して、式（２）で表される。
【００３５】
【数２】
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したがって、仮に、本実施形態のホログラムを通常の再生方法（平面波状の再生光を想定した再生方法）で再生したならば、ｚ＝ｄの位置に復元されるべき点像が、ｚ＝ｄ／２の位置に復元されてしまう（なお、ここでいう「ｚ」は、検出面５を基準とした光軸方向の位置のことである。）。
【００３６】
そこで、本実施形態のホログラムを再生する際には、通常の再生方法（平面波状の再生光を想定した再生方法）で復元像を得た後、その復元像のｚ座標を２倍に伸張する必要がある（後述するステップＳ８）。
【００３７】
また、復元される点像の径、すなわち復元の分解能は、同心円状パターンＰの最小ピッチｐ（外周部のピッチｐｍｉｎ）と波長λとに依存する。よって、復元の分解能を高めるには、式（２）においてｒ／ｄをなるべく大きくすればよい。
【００３８】
但し、ｒ／ｄを大きくすると、式（１）における光路長差Ｌが大きくなり、同一の蛍光輝点から発せられた蛍光Ｌ１０、Ｌ１１の干渉性が低下する。よって、干渉性を考慮したならば、光路長差Ｌは、蛍光のコヒーレンス長以内に収められるべきである。なお、ここではコヒーレンス長を、「光路長差の変化時に得られる干渉強度変化カーブの包絡線の半値半幅」と定義する。
【００３９】
したがって、本実施形態では、間隔ｄは、式（１）で表される光路長差Ｌがコヒーレンス長以内になるような値に定められることが望ましい。例えば、前述したとおり正方向光学系６、負方向光学系７の各々の像側ＮＡが０．０２５に設定された場合に、フィルター８の波長幅は５ｎｍに設定され、ステージが基準位置にあるときにおける間隔ｄは５７．６ｍｍに設定される。その場合、基準面９上の蛍光輝点に対応する２つの蛍光Ｌ１０、Ｌ１１の光学系ＮＡ外周部での光路長差Ｌは、コヒーレンス長と合致する。よって、互いに干渉させるべき光波の干渉性を保ちながら分解能を高めることができる。
【００４０】
次に、ホログラム観察装置によるホログラムの記録動作を説明する。図４は、ホログラム観察装置によるホログラムの記録動作のフローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。
【００４１】
ステップＳ１：ホログラム観察装置は、励起光源１を駆動して観察試料２０に含まれる蛍光分子を励起すると共に、二次元画像検出器を駆動して縞画像Ｖを取得し、その縞画像Ｖをコンピュータのメモリへ格納する。
【００４２】
ステップＳ２：ホログラム観察装置は、縞画像Ｖの取得枚数が予め決められた枚数（ここでは５とする。）に達したか否かを判別し、達していなければステップＳ３へ移行し、達していればステップＳ４へ移行する。
【００４３】
ステップＳ３：ホログラム観察装置は、ステージを移動させてからステップＳ１へ戻る。したがって、ステップＳ１〜Ｓ３のループは、ステージを移動させながら５回繰り返される。なお、ステージの１ステップ当たりの移動量は、前述した同心円状パターンＰの位相シフト量δがπ／２となるような移動量（λ／８）である。したがって、ステップＳ１〜Ｓ３のループの繰り返しにより、位相シフト量δｊの互いに異なる５枚の縞画像Ｖｊ（ｊ＝−２、−１、０、１、２）が取得されることになる。
【００４４】
ステップＳ４：ホログラム観察装置のコンピュータは、ステップＳ１〜Ｓ３にて取得した５枚の縞画像Ｖを後述する位相シフト法の式（式（９））へ当てはめることにより複素振幅ホログラムＨを算出し、それをコンピュータのメモリへ保存し、フローを終了する。
【００４５】
次に、上記したステップＳ４において取得される複素振幅ホログラムＨを数式で説明する。
【００４６】
先ず一般に、物体側に点物体が存在するときに光学系が像側に生起させる複素振幅分布Ｓ（ｘ’、ｙ’、ｚ’）は、式（３）で表される。
【００４７】
【数３】
2010249639.tif 000005
但し、（ｘ’、ｙ’）は、光軸と垂直な面内の座標であり、ｚ’は、結像点を基準とした光軸方向の座標であり、ｆは光学系の焦点距離であり、（ξ、η）は光学系の瞳座標であり、（ｕ、ｖ）は瞳座標（ξ、η）を焦点距離ｆで規格化したものであり、ｐ（ｕ，ｖ）は光学系の瞳関数である。なお、ここでは瞳関数ｐ（ｕ、ｖ）を、理想的な瞳関数（光学系のＮＡ内では１）とする。
【００４８】
よって、本実施形態のホログラム観察装置において、基準面９上に或る１つの蛍光輝点が存在するとき（つまり正方向光学系６が共役面１０上に点像Ｉ１０を形成するとき）に、正方向光学系６が検出面５上に生起させる複素振幅分布は、式（３）においてｚ’＝−ｄ０とおいたものに相当する。ここで、ｄ０は共役面１０、１１と検出面５との間隔である。
【００４９】
同様に、本実施形態のホログラム観察装置において、基準面９上に或る１つの蛍光輝点が存在するとき（つまり負方向光学系７が共役面１１上に点像Ｉ１１を形成するとき）に、負方向光学系７が検出面５上に生起させる複素振幅分布は、式（３）においてｚ’＝ｄ０とおいたものに相当する。
【００５０】
したがって、本実施形態のホログラム観察装置において、検出面５から任意の距離ｚだけ離れた位置に点像が形成されるときに、正方向光学系６が検出面５上に生起させる複素振幅分布Ｓａと、負方向光学系７が検出面５上に生起させる複素振幅分布Ｓｂとは、それぞれ式（４）、（５）のとおり表される。
【００５１】
【数４】
2010249639.tif 000006
【００５２】
【数５】
2010249639.tif 000007
したがって、本実施形態のホログラム観察装置において、検出面５からｚだけ離れた位置に点像が形成されるときに、その検出面５上に生起する同心円状パターンＰの強度分布Ｑ（ｘ、ｙ、ｚ）は、式（６）のとおり表される。
【００５３】
【数６】
2010249639.tif 000008
さらに、同心円状パターンＰの前述した位相シフト量δｊを考慮すれば、その同心円状パターンＰの強度分布Ｑｊ（ｘ、ｙ、ｚ）は、式（７）のとおり表される。
【００５４】
【数７】
2010249639.tif 000009
また、上記したステップＳ１において取得される縞画像Ｖｊ（ｘ、ｙ）は、同心円状パターンＰの強度分布Ｑｊ（ｘ、ｙ、ｚ）と、観察試料２０における蛍光輝点の分布Ｉ（ｘ、ｙ、ｚ）とのコンボリューション、すなわち式（８）で表される。
【００５５】
【数８】
2010249639.tif 000010
また、上記したステップＳ４において使用される位相シフト法の式は、式（９）のとおりである。
【００５６】
【数９】
2010249639.tif 000011
したがって、上記したステップＳ４において取得される複素振幅ホログラムＨ（ｘ、ｙ）は、式（１０）のとおり表される。
【００５７】
【数１０】
2010249639.tif 000012
したがって、上記したステップＳ４において取得された複素振幅ホログラムＨ（ｘ、ｙ）を式（１１）に当てはめれば、復元面の高さ（ｚ座標）がｚＲであるときの復元像Ｒ（ｘＲ、ｙＲ）を得ることができる。なお、この式（１１）によるホログラム再生方法は、通常のホログラム再生方法（平面波状の再生光を想定した再生方法）に相当する。
【００５８】
【数１１】
2010249639.tif 000013
次に、ホログラム観察装置によるホログラムの再生動作を説明する。図５は、ホログラム観察装置によるホログラムの再生動作のフローチャートである。なお、このフローチャートは、コンピュータによって実行される。以下、各ステップを順に説明する。
【００５９】
ステップＳ５：コンピュータは、メモリに保存された複素振幅ホログラムＨを読み出し、それを上記した式（１１）に当てはめることにより、復元面の高さがｚＲであるときの復元像Ｒを算出する。
【００６０】
ステップＳ６：コンピュータは、復元像Ｒの算出枚数が所定枚数に達したか否かを判別し、達していなければステップＳ７へ移行し、達していればステップＳ８へ移行する。
【００６１】
ステップＳ７：コンピュータは、復元面の高さｚＲを変更してからステップＳ５へ戻る。よって、ステップＳ５〜Ｓ７のループは、復元面の高さｚＲを変更しながら所定回数だけ繰り返され、その結果、三次元データＲ（ｘＲ、ｙＲ、ｚＲ）が取得されることになる。但し、式（１１）によるホログラム再生方法は、通常のホログラム再生方法（平面波状の再生光を想定した再生方法）に相当するので、次のステップＳ８における補正処理が必要である。
【００６２】
ステップＳ８：コンピュータは、ステップＳ５〜Ｓ７にて取得した三次元データＲ（ｘＲ、ｙＲ、ｚＲ）のｚ軸を２倍に伸張し、補正後の三次元データＲ（ｘＲ、ｙＲ、ｚＲ’）を取得する。補正後の三次元データＲ（ｘＲ、ｙＲ、ｚＲ’）が、観察試料２０の三次元蛍光像を正しく表す。
【００６３】
ステップＳ９：コンピュータは、ステップＳ８で取得した補正後の三次元データＲ（ｘＲ、ｙＲ、ｚＲ’）を画像化し、観察試料２０の三次元蛍光像として不図示のモニタへ表示し、フローを終了する。
【００６４】
以上、本実施形態のホログラム観察装置は、観察試料２０の正方向に射出した蛍光と負方向に射出した蛍光とを別々の光学系で同一の検出面５へ導き干渉させるので、観察試料２０に含まれる個々の蛍光輝点の三次元位置情報を１枚の縞画像へ反映させることができる。したがって、本実施形態のホログラム観察装置は、蛍光のホログラムを効率的に記録することができる。
【００６５】
また、本実施形態のホログラム観察装置は、条件（ａ）〜（ｄ）を満たすので、従来と同様の位相シフト法を適用することが可能である。したがって、本実施形態のホログラム観察装置は、蛍光の複素振幅ホログラムを簡単に得ることができる。
【００６６】
また、本実施形態のホログラム観察装置では、二次元画像検出器へ入射可能な蛍光の波長域を狭めるフィルター８が用いられており、しかも、光学系ＮＡ内での光路長差Ｌが蛍光のコヒーレンス長以内に設定されるので、互いに干渉させるべき光波が確実に干渉する。したがって、本実施形態のホログラム観察装置は、蛍光のホログラムを高精度に記録することができる。
【００６７】
また、本実施形態のホログラム観察装置は、本実施形態のホログラム観察装置が記録した複素振幅ホログラムを適正な演算処理によって再生するので、観察試料２０の正しい三次元蛍光像を簡単に得ることができる。
【００６８】
なお、本実施形態のホログラム観察装置において、観察試料２０の厚さ（ｚ方向の高さ）が大きかった場合には、ステージの基準位置（すなわちステップ移動の中心）を複数通りに変位させながら、前述した記録動作（ステップＳ１〜Ｓ４）を繰り返せばよい。
【００６９】
［実施例］
以下、ホログラム観察装置の実施例（光学設計データに基づくシミュレーション結果）を説明する。
【００７０】
本実施例において、光学系の仕様は、前述した実施形態で例示したものと同じである。また、本実施例では、微小な２つの蛍光輝点が存在している観察試料２０を想定し、それらの蛍光輝点は、光軸に垂直な面内で（ｘｙ方向にかけて）０．１４４ｍｍだけ離れており、かつ光軸方向（ｚ方向）にかけて５μｍだけ離れているものとした。
【００７１】
本実施例では、以上の設定下で、位相シフトを行い、５枚の縞画像Ｖを取得した。取得された５枚の縞画像Ｖは、図６〜図１０に示すとおりであった。これら５枚の縞画像Ｖの間では、同心円状パターンの位相が異なる。
【００７２】
また、本実施例では、これら５枚の縞画像Ｖから複素振幅ホログラムＨを算出し、さらに一方の蛍光輝点の点像の近傍に復元面を設定し、その複素振幅ホログラムＨからその復元面における復元像を算出した。なお、本実施例では、一方の蛍光輝点の復元像と、他方の蛍光輝点の復元像とを別々に算出した。
【００７３】
算出された一方の蛍光輝点の復元像、他方の蛍光輝点の復元像は、それぞれ図１１、図１２に示すとおりであった。なお、図１１、１２の各々の横座標は、各々の蛍光輝点の復元像が中央に位置するように設定されている。
【００７４】
図１１に示すとおり、一方の蛍光輝点の復元像はシャープに復元されているが、図１２に示すとおり、他方の蛍光輝点の復元像はぼけて復元されている。よって、各蛍光輝点の復元像に各蛍光輝点のｚ方向の位置情報が反映されていることは、明白である。
【００７５】
［変形例１］
なお、上述した実施形態では、干渉パターンの位相をシフトさせるために観察試料２０を光軸方向に移動させる方法が採用されたが、偏光を利用してもよい。その場合、上述した実施形態の装置を図１３のとおりに変形するとよい。
【００７６】
図１３に示すとおり、本変形例では正方向光学系６の単独光路中に偏光子３１及び１／４波長板３３が配置され、負方向光学系７の単独光路中に偏光子３２及び１／４波長板３４が配置され、正方向光学系６及び負方向光学系７の共通光路中に偏光子３５が配置される。
【００７７】
このうち、偏光子３１の方位と偏光子３２の方位とは揃えられている。なお、励起光が直線偏光の場合、それらの方位は、励起光の偏光方向に揃えられていることが望ましい。
【００７８】
また、１／４波長板３３の方位と、１／４波長板３４の方位との組み合わせは、正方向の光路と負方向の光路との間で反対回りの円偏光が得られるように設定される。
【００７９】
したがって、本変形例では、偏光子３５の方位を変化させるだけで、互いに干渉させるべき正方向の蛍光と負方向の蛍光との光路長差が変化し、干渉パターンの位相が変化する。
【００８０】
［変形例２］
また、上述した実施形態では、観察すべき物体光を蛍光としたが、インコヒーレントな他の光であってもよい。例えば、インコヒーレントな光で照明された観察試料で発生する散乱回折光であってもよい。その場合は、上述した実施形態の装置を、図１４のとおりに変形するとよい。
【００８１】
図１４に示すとおり、本変形例の基本的な構成は上述した実施形態の構成と同じであるが、励起光源１の代わりに、空間的にインコヒーレントな光を射出するインコヒーレント光源４０が配置される。インコヒーレント光源４０は、例えば、ＨｅＮｅレーザと、その射出側に配置された回転拡散板とを備えた光源である。
【００８２】
また、インコヒーレント光源４０の光軸は、他の光学系の光軸から外されており、これによって、観察試料２０に向かう照明光に角度をつけ、観察試料２０を透過した照明光（直接光）が負方向光学系７へ入射するのを防いでいる（斜光照明）。
【００８３】
したがって、本変形例において二次元画像検出器に到達できるのは、観察試料２０で発生した散乱回折光のみとなる。よって、散乱回折光による干渉パターンを、前述した実施形態における干渉パターン（蛍光による干渉パターン）と同様に検出することが可能となる。
【００８４】
一般に、空間的にコヒーレントな照明を用いたホログラフィー顕微鏡などではコヒーレント散乱ノイズが問題となることが多いが、本変形例のように意図的に空間コヒーレンスを落としておけば、この問題を回避できる。
【００８５】
なお、本変形例では、正方向の散乱回折光の強度と負方向の散乱回折光の強度とが同じになるとは限らないので、正方向の光路と負方向の光路との少なくとも一方へ減光フィルターを挿入し、検出面５へ入射可能な正方向の散乱回折光の強度と負方向の散乱回折光の強度とのバランスを保ってもよい。両者のバランスを保てば、干渉パターンのコントラストを高くすることができる。
【００８６】
なお、本変形例に限らず、上述した実施形態においても、正方向の蛍光の強度と負方向の蛍光の強度とバランスが悪い場合には、これと同じ方法（減光フィルタを挿入する方法）を適用してもよい。
【符号の説明】
【００８７】
１…励起光源、２…ハーフミラー、３…ミラー、４…ビームスプリッター、５…検出面、６…正方向光学系、７…負方向光学系、８…フィルター、９…基準面、１０、１１…共役面、２０…観察試料、３１、３２、３５…偏光子、３３、３４…１／４波長板、４０…インコヒーレント光源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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