(57)【要約】      （修正有）【課題】新規組成物ならびに保存および投与に適した、高度に濃縮された、液体の、および凍結乾燥された、因子ＩＸ調合物の提供。【解決手段】因子ＩＸおよびアルギニンを含む組成物、より詳細には、約０.１ｍｇ／ｍｌないし１６０ｍｇ／ｍｌの因子ＩＸ、グリシン、界面活性剤、ならびに緩衝化剤および凍結保護剤からなる群より選択されるメンバーを含む組成物によって、濃縮プロセスおよび凍結乾燥プロセスの間の因子ＩＸ蛋白の安定性が向上し、活性レベルを維持でき、ならびに２ないし８℃で１年以上の長期保存中において安定な処方。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
因子ＩＸおよびアルギニンを含む組成物。
【請求項２】
約０.１ｍｇ／ｍｌないし１６０ｍｇ／ｍｌの因子ＩＸ、グリシン、界面活性剤、ならびに緩衝化剤および凍結保護剤からなる群より選択されるメンバーを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般的には、本発明は、因子ＩＸを含有する新規処方に関し、該処方としては、高度に濃縮された、凍結乾燥された、および液体の、因子ＩＸ含有処方が挙げられ、それらは、例えば静脈、皮下および皮内のごとき経路を包含する種々の経路による投与に適する。
【背景技術】
【０００２】
血漿糖蛋白である因子ＩＸを包含する血液凝固プロセスに関与する種々の因子が同定されている。因子ＩＸ欠乏は血友病の１のタイプ（Ｂ型）を特徴づける。伝統的には、この疾患の治療はヒト・血漿由来の因子ＩＸの蛋白濃縮物の静脈輸液を用いる。血液濃縮物の輸液は、ウイルス性肝炎およびＨＩＶのごとき種々の感染源、または血栓閉塞因子の伝達の危険性を包含している。組み換えＤＮＡ法により因子ＩＸを製造する別の方法が特許文献１に記載されている。ヒト因子ＩＸをコードしているｃＤＮＡが単離され、特徴づけられ、発現ベクター中にクローン化されている。例えば、非特許文献１〜３参照。よって、組み換えＤＮＡ法の進歩により、因子ＩＸ蛋白を製造することが可能となった。
【０００３】
保存および送達の両方に適したバルクおよび最終の両形態の因子ＩＸを得ることが望ましい。典型的には、蛋白精製プロセスは蛋白の濃縮を引き起こす。バルク蛋白としても知られるこの濃縮された蛋白は処方緩衝化剤中にあってもよい。次いで、典型的には約２ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの濃度のバルク蛋白を充填／仕上げ設備へと凍結輸送することができ、そこで適当な投与濃度に希釈され、投与用バイアルまたは投与に適したデバイス、例えばプレフィル可能（pre-fillable）シリンジに入れられる。理想的には、薬剤製品を液体状態のままとし、保存し、次いで、液体として投与する。別法として、薬剤製品を凍結乾燥、すなわちフリーズドライする。理想的には、凍結乾燥薬剤製品は十分な安定性を有し、長期保存、すなわち６カ月以上保存される。後に、患者への使用直前に適当な投与希釈剤を添加することにより凍結乾燥薬剤製品を復元する。
【０００４】
最終薬剤製品を液体のままとするか、あるいはフリーズドライするかの決定は、通常には、これらの形態となった蛋白薬剤の安定性による。蛋白安定性は、特に、イオン強度、ｐＨ、温度、凍結／融解サイクルの繰り返し、および剪断力への曝露のごとき因子により影響されうる。変性および凝集（可溶性および不溶性凝集物双方の生成）を包含する物理的不安定性ならびに化学的不安定性、例えば、加水分解、脱アミノ化および酸化の結果（少しの例を挙げたにすぎない）として活性蛋白は消失しうる。蛋白薬剤の安定性の一般的総説としては、例えば、非特許文献４参照。
【０００５】
蛋白不安定性の生じうる発生は広く認識されているが、特定の蛋白の特定の不安定性の問題を予想することは不可能である。これらの不安定性のいずれもが、より低い活性、増大した毒性および／または増大した免疫原性を有する蛋白、蛋白副産物、または誘導体の生成を引き起こす可能性がある。実際、蛋白沈殿は、血栓症、剤型および用量の不均一性、ならびに注射器の詰まりを引き起こす。さらに、因子ＩＸに特異的な数種の翻訳後修飾（例えば、Ｎ−末端のあるグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化および糖鎖付加）があり、それらは生物学的活性の維持において重要である可能性があり、貯蔵による変化に影響されうる。よって、いずれの蛋白の医薬処方の安全性および有効性も、その安定性に直接関係している。液体剤形における安定性の維持は、分子運動の可能性が著しく増大しているため、一般的には、凍結乾燥剤形とは異なり、それゆえ、分子相互作用の可能性が増大している。高い蛋白濃度においては凝集体を形成する傾向があるので、高度に濃縮された形態における安定性の維持もまた異なるものである。
【０００６】
液体処方を開発する場合、多くの要因を考慮する。短期間、すなわち６カ月未満では、一般的には液体の安定性は大きな構造変化、例えば変性および凝集を回避することにかかっている。これらの方法は蛋白に関する多くの文献に記載されており、安定化剤の多くの例がある（非特許文献５〜９参照）。１の蛋白を実際に安定化するのに効果的な作用剤は別の蛋白を脱安定化するように作用することがよく知られている。大きな構造変化に対して蛋白が安定化された場合、長期安定性（例えば、６カ月以上）のある液体処方の開発は、当該蛋白に特異的なタイプの分解からさらに安定化することにかかっている。より特別なタイプの分解としては、例えば、ジスルフィド結合乱雑化、オリゴ糖および／または特定残基の酸化、脱アミド化、環化等が挙げられる。個々の分解種を特定することは常に可能であるとは限らないが、微妙な変化をモニターして目的蛋白を特異的に安定化する賦形剤の能力をモニターするためのアッセイが開発されている。
【０００７】
安定性の考慮のほかに、一般的には、種々の世界的な医薬の規制機関の是認を得ているかまたは得るであろう賦形剤を選択する。処方がほぼ等張であり、処方のｐＨが注射／輸液時に生理学的に適当な範囲であることが非常に望ましく、さもなくば、患者に痛みおよび不快感を与えるかもしれない。使用バッファーの選択および量は所望ｐＨ範囲とするのに重要である。等張性を調節するために使用する作用剤の選択および量は、投与の簡便性を確立するのに重要である。
【０００８】
伝統的には、因子ＩＸのごとき大型の不安定な蛋白は、予防的にまたは出血に対応して静脈から投与される。静脈から投与されると、蛋白は血流中で直接利用可能である。不幸なことに、特に高齢者においては閉塞および／またはフィブリン形成をはじめとする繰り返し注射に関連する副作用が存在しうる。そのうえ、患者の静脈が特に細い場合、例えば小児においては必要な治療用量を達成することが困難でありうる。
【０００９】
現在、キャリヤ蛋白不含で血漿由来である２種の市販の因子ＩＸ処方がある。アルファ・セラピューティク・コーポレイション（Alpha Therapeutic corporation）は凍結乾燥したAlphaNine（登録商標）ＳＤを提供しており、ヘパリン、デキストロース、ポリソルベート８０、およびトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートを含む。この調合物は２ないし８℃の温度に保存される。上記のごとく、ヘパリンは抗−凝血剤であるのでヘパリンが避けられ、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェートは粘膜を刺激するので、この処方は理想的とはいえない。アーマー・ファーマシューティカル・カンパニー（Armour Pharmaceutical Company）の凍結乾燥されたMononin（登録商標）はヒスチジン、塩化ナトリウムおよびマンニトールを含み、同様に２ないし８℃に保存される。包装に添付された説明書には該処方を室温で１カ月以上保存しないよう書かれている。液体の因子ＩＸ製品ならびに高度に濃縮された因子ＩＸ製品は現在市販されていない。SchwinnのＰＣＴ／ＥＰ９０／０２２３８には、因子ＩＸ、０.９Ｍサッカロース、０.５Ｍリジン、および０.００３Ｍ塩化カルシウムが開示されているが、４〜８℃においてわずか数週間しか安定でなく、それゆえ、市販のための製造には不適である。不幸なことに、この処方は高張であり、ｐＨは快適な投与の範囲外であり、それゆえ、注射に不適である。
【００１０】
皮下、筋肉内または皮内投与のごとき投与形態が患者にとり簡便である。因子ＩＸの皮下投与は非特許文献１０および特許文献２に記載されている。Berrettiniの文献においては免疫製品が用いられた。すなわち、ImmunineTM、因子ＩＸ、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および１１８Ｕ／ｍｇの濃度のアンチスロンビンＩＩＩが用いられた。その製品は循環系中に輸送されにくく、輸送されてもゆっくりであると報告され、その著者は、皮下注射は血友病Ｂの患者の出血の治療または予防には信頼性がなく、より濃縮された形態でさえも臨床的効能に関して許容できないものであると結論した。Brownlee（上記文献）には、１０〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のMononineTM因子ＩＸ処方が開示されている。低い循環レベルしか得られず、その９頁には、４時間後には因子ＩＸ注射部位の両側の皮膚に大きなクロットが形成され、重症の傷が生じたと記載されている。そのようなことは、不純な製品を用いた場合に観察される。
【００１１】
血友病Ｂのイヌ（非特許文献１１）および１人の血友病Ｂ患者（非特許文献１２）において、血漿由来の因子ＩＸ（ｐＦＩＸ）が皮下投与された（イヌにおいては１５〜４７Ｕ／ｋｇの用量、患者においては３０Ｕ／ｋｇの用量）。これにより、イヌにおける血漿因子ＩＸは用量依存的であり、０.８ないし７.６％の範囲であり、筋肉内投与が高レベルとなった。血友病患者においては、血漿因子ＩＸ活性は６時間以内に１％に達しただけであり、この活性レベルは３６時間持続した。低濃度の血漿由来の因子ＩＸは複数部位（１０箇所）に大体積注射を必要とした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４，７７０，９９９号
【特許文献２】WO93/07860
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Choo et al., Nature, 299:178-180 (1982)
【非特許文献２】Fair et al., Blood 64:194-204 (1984)
【非特許文献３】Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 79:6461-6464 (1982)
【非特許文献４】Manning, et al., Pharmaceutical Research, 6:903-918 (1989)
【非特許文献５】"Strategies to Suppress Aggregation of Recombinant Keratinocyte Growth Factor during Liquid Formulation Development", B. L. Chen et al., J. Pharm. Sci. 83(12):1657-1661 (1994)
【非特許文献６】"Formulation Design of Acidic Fibroblast Growth Factor", P. K. Tsai et al., Pharm. Res. 10(5):649-659 (1993)
【非特許文献７】"The Stabilization of Beta-Lactoglobulin by Glycne and NaCl", Tsutomu Arakawa, Biopolymers 28:1397-1401 (1989)
【非特許文献８】"Structural stability of lipase from wheat germ", A. N. Rajashwara and V. Prakash, Internat. J. of Peptide & Prot. Res. 44:435-440 (1994)
【非特許文献９】"Thermal Stability of Human Immunoglobulins with Sorbitol", M. Ganzalez et al., Vox Sang 68:1-4 (1995)
【非特許文献１０】Berrettini, Am. J. Haematol. 47:61(1994)
【非特許文献１１】Brinkhous, et al., FASEB 7:117 (1993)
【非特許文献１２】Liles, et al., Thromb. Haemost. 73:1986a (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
適当な皮下投与処方を処方することに関連する１の大きな問題は、蛋白を凝集させることなく、そして処方中に不純物を濃縮することなく、十分高い蛋白濃度を達成することである。凝集物形成および不純物はともに免疫原性を増大させる。現在利用可能な製品を用いて適当用量の因子ＩＸを皮下投与するには、複数注射部位の利用を必要とする。このことは、患者を大いに不愉快にし、患者にとり不便である。因子ＩＸを皮下投与で実際に送達するには、因子ＩＸを少なくとも１０００Ｕ／ｍｌまたはそれ以上にまで濃縮し、それを安定な非凝集剤形として提供することが必要である。かかる濃縮形態は現在利用できない。
【００１５】
理想的には、処方は、１年以上の因子ＩＸの安定性および広範な蛋白濃度（例えば、０.１ｍｇ／ｍｌないし１６０ｍｇ／ｍｌ以上、すなわち、２０Ｕｍｌないし５６０００Ｕ／ｍｌ以上）における適合性を与えるべきである。このことにより投与方法に多様性が生じ、例えば高い蛋白濃度を必要としうる皮下、皮内、または筋肉内投与、あるいは低い蛋白濃度を用いることのある静脈内投与が可能となる。一般的には、より高濃度の形態は小体積投与を可能にし、患者の観点から非常に望ましい。投与および使用に関して、液体処方はと輸血乾燥処方と比べて多くの利点を有する。したがって、濃縮プロセスおよび凍結乾燥プロセスの間の因子ＩＸ蛋白の安定性を向上させ、活性レベルを維持する方法、ならびに２ないし８℃で１年以上の長期保存中において安定な処方を提供する方法に対する必要性が当該分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の１の態様は、新規組成物、ならびにバルク蛋白として有用あるいは投与に有用な、高度に濃縮された、凍結乾燥された、および液体の、因子ＩＸ調合物の提供方法を提供する。これらの組成物は、凍結されているかまたは液体であり、少なくとも６カ月、好ましくは３６ないし６０カ月安定である。そして、−１００℃ないし４０℃、−８０℃ないし０℃、および−２０℃ないし１０℃の範囲で保存可能である。本発明組成物は因子ＩＸ、浸透圧調節剤、凍結保護剤、よび所望により緩衝化剤および／またはさらに因子ＩＸを安定化する他の賦形剤を含む。因子ＩＸの濃度は約０.１ないし約１６０ｍｇ／ｍｌ（約２０ないし少なくとも５６０００Ｕ／ｍｌと等価）であり、１ないし１６０ｍｇ／ｍｌ（２５０ないし５６０００Ｕ／ｍｌ）および０.１ないし１０ｍｇ／ｍｌ（２５ないし２５００Ｕ／ｍｌ）が好ましく、最も好ましい範囲は投与経路による。浸透圧調節剤は、塩類、糖類、ポリオール類、およびアミノ酸類を包含するが、これらに限らない。適当なアミノ酸は、約１０ないし５００ｍＭの濃度のアルギニン、グリシンおよびヒスチジンを包含し、約１０ないし３００ｍＭおよび約１０ないし２００ｍＭの濃度のものが好ましい。適当な凍結保護剤は、ポリオール類、例えばマンニトールおよびスクロースを包含し、約１ないし４００ｍＭの濃度範囲であり、約５ないし２００ｍＭおよび２０ないし１００ｍＭが好ましい。組成物は、ポリソルベート（例えばツイン）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごとき界面活性剤またはデタージェントを含有していてもよく、それらは凍結中の凍結保護剤としても役立ちうる。界面活性剤は約０.００５ないし１％の範囲であり、約０.００５ないし０.１％および約０.００５ないし０.０２％が好ましい。組成物は、生理学的に適当なｐＨ、例えば約５.８ないし８.０の範囲、好ましくは約６.２ないし７.２および６.５ないし７.０の範囲を維持するために適当な緩衝化剤を含有していてもよい。好ましくは、緩衝化剤は、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、マレイン酸酢酸アンモニウム、トリス、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびジエタノールアミンを包含するが、クエン酸ナトリウム／カリウムが好ましく、好ましいｐＨは約６.５ないし７.５であり、濃度範囲は約１〜１００ｍＭであり、５ないし５０ｍＭおよび１０ないし２５ｍＭが好ましい。少量のＥＤＴＡのごときキレート剤を含めてもよく、その濃度は０.０５ないし５０ｍＭ、または０.０５ないし１０ｍＭ、または０.１ないし５ｍＭであり、約１ないし５ｍＭが好ましい。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、最終剤形における投与、例えば静脈内、皮下、皮内、または筋肉内経路の投与に適した因子ＩＸ処方を提供する。典型的には、大量のバルク薬剤を凍結し、必要ならば、バルク薬剤を小型バイアル中に入れる製造所に輸送することができる。所望ならば、最終剤形を、希釈されｐＨを調節された形態とすることができる。典型的には、バルク薬剤は、最終薬剤よりも高濃度の蛋白を含み、等張である必要はない。最終薬剤は、上記のごとく因子ＩＸ、浸透圧調節剤、凍結保護剤および所望により緩衝化剤および／または因子ＩＸをさらに安定化する他の賦形剤を含む。最終薬剤処方は少なくとも６カ月、好ましくは３６ないし６０カ月安定で、−１００℃ないし４０℃、−２０℃ないし３７℃、および２℃ないし８℃の範囲の温度で保存可能である。賦形剤の濃度は約２５０ないし４２０ミリオスモラルの複合浸透圧を生じる。好ましい処方は、約０.１ないし１６０ｍｇ／ｍｌ以上（２０Ｕ／ｍｌないし５６０００Ｕ／ｍｌ以上）の濃度の因子ＩＸ、緩衝化剤としてクエン酸ナトリウム、凍結保護剤および浸透圧調節剤としてマンニトール、スクロース、およびグリシンのいくぶんかの混合物、およびＥＤＴＡ（約１ないし５ｍＭ）のごときキレート剤および／または少量のポリソルベート（０.００５％ないし０.０２％）を含む。他の好ましい処方は、因子ＩＸ（０.１ないし１６０ｍｇ／ｍｌ以上）、グリシン、界面活性剤および／またはバッファー（例えば、ヒスチジン）および／または凍結保護剤（例えば、ポリソルベート）を含む。
【００１８】
静脈内および皮下経路の両方（例えば、静脈内投与、次いで、皮下投与）を用いる、高度に濃縮された因子ＩＸの投与方法も本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、因子ＩＸを含有する新規処方に関し、該処方としては、高度に濃縮された、凍結乾燥された、および液体の、因子ＩＸ含有処方が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で用いる「因子ＩＸ」は、血漿由来のものおよび組み換えもしくは合成的に製造されたものの両方を包含する。因子ＩＸ濃度は、便利には、ｍｇ／ｍｌまたはＵ／ｍｌで表し、通常には、１ｍｇは >１５０Ｕ±１００Ｕまたはそれより大である。活性１ユニットは、正常ヒト血漿１ミリリットル中の因子ＩＸクロッティング活性量と定義される。比活性は蛋白濃度に対するクロッティング活性濃度の割合であり、Ｕ／ｍｇ蛋白で表される。一般的には、血友病患者は、正常ヒト血漿において見いだされる活性の <１ないし２５％の因子ＩＸクロッティング活性を有する。
【００２１】
本明細書で用いる「特定された量」は、±約１０％、例えば、約５０ｍＭは５０ｍＭ±５ｍＭを包含し、例えば、４％は４％±０.４％を包含する等である。
【００２２】
本明細書の用語「浸透圧調節剤」は、溶液の浸透圧に影響する作用剤を包含する。浸透圧調節剤の例は、アルギニン、ヒスチジン、およびグリシンのごときアミノ酸類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびクエン酸ナトリウムのごとき塩類、およびスクロース、グルコース、およびマンニトールのごとき糖類などを包含するが、これらに限らない。
【００２３】
用語「凍結保護剤」は、一般的には、凍結乾燥によるストレスに対する安定性を蛋白に付与する作用剤を包含するが、凍結保護剤は一般的な安定性も付与することもあり、例えば、保存中において凍結乾燥によらないストレスからバルク薬剤を保護することもある。典型的な凍結保護剤は、ポリオ−ル類、およびマンニトールおよびスクロースのごとき糖類、ならびにポリソルベート、またはポリエチレングリコールのごとき界面活性剤等を包含する。凍結保護剤の好ましい濃度は約０.２ないし４％（重量／体積）の範囲であるが、比較的高濃度、例えば５％以上も適当である。使用レベルは臨床的慣例によって制限される。バルク薬剤の上限濃度は最終投与濃度よりも高くてもよく、例えば、５％以上であってもよい。「界面活性剤」は、一般的には、気／液界面により誘導されるストレスおよび液／表面により誘導されるストレス（例えば、蛋白凝集物を生じる）から蛋白を保護する作用剤を包含し、例えば約０.００５ないし１％（体積／体積）のポリソルベート−８０（ツイン）、または例えばＰＥＧ８０００のごときポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごときデタージェントを包含しうる。蛋白安定性を維持するためには比較的高濃度、例えば０.５％までが適当である。しかしながら、実際の使用レベルは臨床的慣例により制限される。
【００２４】
用語「緩衝化剤」は、凍結乾燥前に溶液のｐＨを許容範囲に維持する薬剤を包含し、ヒスチジン、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム塩）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ジエタノールアミン等を包含しうる。一般的には、濃度上限は、容易に当業者に理解されるように、「バルク」蛋白については「投与」蛋白形態よりも高い。例えば、緩衝剤濃度は、数ミリモラーないしその溶解度の上限までであってよく、例えば、ヒスチジンは２００ｍＭ程度であってよく、当業者は、適切な生理学的適当濃度の達成／維持を考慮するであろう。パーセンテージは、固体をいう場合には重量／重量であり、混合されて溶液となっている液体をいう場合には重量／体積である。例えば、スクロースについては乾燥重量スクロース／溶液体積であり、ツインについては１００％ストックの体積／溶液の体積である。用語「等張」、３００±５０ｍＯｓＭは、凍結乾燥前の蛋白溶液の浸透圧の測定値を意味する。生理学的浸透圧の維持は、前希釈を行わない注射可能な投与処方について重要である。しかしながら、バルク処方については、使用前に溶液が等張にされる限り、より高濃度が有効に用いられうる。用語「賦形剤」は、良好な凍結乾燥ケーク特性を与える医薬上許容される薬剤（増量剤）、ならびに蛋白の乾燥保護および凍結保護を行い、ｐＨの維持を行い、生物学的活性（蛋白安定性）の実質的保持を維持しておくために貯蔵中に蛋白の正しいコンホーメーションを提供する薬剤を包含する。
【００２５】
下記実施例は本発明の実施を説明する。これらの実施例は説明のためだけのものであり、権利請求された本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例１はクロッティング活性に対するカルシウム添加およびｐＨの影響を説明する。実施例２は高分子量凝集物（ＨＭＷ）の形成に対する個々の緩衝化剤の影響を説明する。実施例３は高濃度の因子ＩＸに関する本発明の使用を説明する。実施例４は因子ＩＸの安定化における賦形剤相互作用の複雑性を説明する。実施例５は凍結／融解安定性に関連して、種々の処方中の因子ＩＸについて説明する。実施例６は長期間保存の影響を説明し、実施例７および８は高度に濃縮された形態およびそれらの使用を説明する。
【実施例１】
【００２６】
実施例１−カルシウムイオンの影響
組み換え因子ＩＸの製造はＵＳＰＮ４７７０９９９（Kaufmanら）に記載されている。１の適当な精製方法はHrinda, et al., Preclinical Studies of a Monoclonal Antibody-Purified Factor IX, MononineTM Seminars in Hematology, 28(3):6 (July 1991)に記載されている。他の製造方法は、Tharakan, et al., "Physical and biochemical properties of five commercial resins for immunoaffinity purification of factor IX." Journal of Chromatography 595:103-111 (1992);およびLiebman, et al., "Immunoaffinity purification of factor IX (Christmas factor) by using conformation-specific antibodies directed against the factor IX-metal complex." Proc. Nat. Acad. Sci., USA 82:3879-3883により記載されたコンホーメーション特異的モノクローナル抗体の使用、ならびに例えばHashimoto, et al., "A Method for Systematic Purification from Bovine Plasma of Six Vitamin K-Dependent Coagulation Factors: Prothrombin, Factor X, Factor IX, Protein C, and Protein Z."J. Biochem. 97:1347-1355 (1985)およびBajaj, P. et al. Prep. Biochem. 11:397 (1981) "Large-scale preparation and biochemical characterization of a new high purity factor IX concentrate prepared by metal chelate affinity chromatography", P.A. Feldman et a., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5:939-948 (1994)により記載された慣用的なクロマトグラフィー法を包含する。さらにもう１つの精製方法は１９９５年６月７日出願のＵＳＳＮ０８／４７２８２３に記載されており、参照により本明細書に記載されているものとみなす。
【００２７】
十分に特徴づけられた因子ＩＸの特性はＣａ２＋イオン結合能である。構造の研究は、Ｃａ２＋結合はより安定な構造を付与し、分子が動く可能性を減少させることを示している（"Structure of the Metal-free γ-Carboxyglutamic Acid-rich Membrane Binding Region of Factor IX by two-dimensional NMR Spectroscopy", S. J. Freedman, B. C. Furie, B. Furie, and J. D. Baleja, J. Biol. Chem. 270(14):7980-7987 (1995); "Structure of the Calcium Ion-Bound γ-Carboxyglutamic Acid-rich Domain of Factor IX," S. J. Freedman B. C. Furie, B. Furie, and J. D. Baleja, Biochemistry 34:12126-12137 (1994); "The Structure of a Ca2+-Binding Epidermal Growth Factor-like Domain: Its Role in Protein-Protein Interactions", S. Rao, P. Handford, M. Mayhew, V. Knott, G. Brownlee, and D. Stuart, Cell 82:131-141 (1995); "Structure of Ca2+ Prothrombin Fragment 1 Including the Conformation of the Gla Domain", M. Soriano-Garcia, C. H. Park, A. Tulinsky, K. G. Ravichandran, and E. Skrzypczak-Jankun, Biochem. 28:6805-6810 (1989)）。おそらく、より低い可動性はより低い分子相互作用性と符号しており、それゆえ、分解プロセスの可能性が減少するのであろう。驚くべきことに、このことは真相ではないことが明かとなる。
【００２８】
下表１に示す処方に試料を調製する。組み換え因子ＩＸ濃度〜０.５ｍｇ／ｍｌ（１００Ｕ／ｍｌ）、浸透圧３００±５０ミリオスモラル。すべての試料は組み換え形態の因子ＩＸを含有する。安定化剤としてのＣａ２＋利用可能性を調べるために、１セットの試料を表１に示す処方として調製した。試料Ａの処方は市販血漿由来の凍結乾燥因子ＩＸ（MononineTM）に用いる処方である。すべての試料は組み換え形態の因子ＩＸを含有する。
【００２９】
表１
試料処方
試料  ｐＨ  バッファー（１０ｍＭ）  塩（浸透圧調節剤）    他の賦形剤
Ａ    ７.０  ヒスチジン            0.066M NaCl(0.385%)  １６５ｍＭマンニトール
Ｂ    ７.０  ヒスチジン            260mMグリシン        ２９ｍＭ    スクロース
Ｃ    ７.０  ヒスチジン            250mMグリシン，      ２９ｍＭスクロース
5mM Ca2+ 
Ｄ    ７.５  トリス              260mMグリシン        ２９ｍＭスクロース
Ｅ    ７.５  トリス              250mMグリシン，      ２９ｍＭスクロース
5mM Ca2+ 
Ｆ    ７.５  ジエタノールアミン    260mMグリシン        ２９ｍＭスクロース
Ｇ    ７.５  ジエタノールアミン    250mMグリシン，      ２９ｍＭスクロース
5mM Ca2+
【００３０】
各処方中の因子ＩＸの試料を４℃で２.５カ月保存した。蛋白濃度およびクロッティング活性について試料をアッセイした。Pittman, D., et al., Blood 79:389-397 (1992)の方法に従って因子ＩＸ欠損血液を用いて因子ＩＸ活性を決定する。蛋白濃度に対するクロッティング活性、すなわち比活性をユニット／ｍｇ蛋白で表し、表２に示す。許容できる比活性は、一般的には、初発比活性よりも２０％高くならないものとする。なぜなら、通常、高い比活性は活性化様のイベントを示し、それは血栓連座を有する可能性がある。
【００３１】
表２
因子ＩＸ比活性
試料      開始時      ２.５カ月
Ａ      ２１９.９    １６１.３
Ｂ      １９１.８    １５３.２
Ｃ      ２３９.４    ９６４.１
Ｄ      ２０９.３    １３５.８
Ｅ      ２１２.１    １９５６.９
Ｆ      １９０.１    １２３.５
Ｇ      ２１７.３    ２５７０.８
【００３２】
カルシウム含有試料、すなわちＣ、ＥおよびＧは２.５カ月保存後において高い比活性を有する。このことは、Ｃａ２＋の包摂によるものであり、因子ＩＸは活性化様分子への変換を受けることが示される。活性化因子ＩＸは、残基Ｒ１４５−Ａ１４６およびＲ１８０−Ｖ１８１において開裂された後クロッティングを触媒しうる因子ＩＸである。通常には、因子ＩＸは無傷の蛋白として循環し、クロッティングカスケードの開始が存在しないならばその活性型に変換されない。活性化ｒｈＦＩＸを有するものに注射することは血栓連座を有する可能性がある。それゆえ、濃度５ｍＭのＣａ２＋の包摂は安定性を失わせるものであり、避けるべきである。
【実施例２】
【００３３】
実施例２：  ＨＭＷ形成に対するバッファー選択の影響
表１に類似および表１のバッファー／賦形剤混合物中に処方した、カルシウム不含かつｐＨ７.０の試料の平均比活性は４℃で８カ月保存した後において１１２.５±１０.５Ｕ／ｍｇであるが、ｐＨ７.５のものはわずか８４.０±２２.１Ｕ／ｍｇであり、微妙なｐＨシフトが長期間の因子ＩＸ安定性の維持にとり重要であることが示される。
【００３４】
表３にまとめたような１セットの等張実験処方中に因子ＩＸを調製する。各緩衝化剤といくつかの異なる賦形剤との組み合わせのものもあり、５ｍＭ未満のＥＤＴＡを含むものもある。因子ＩＸ濃度は約１ｍｇ／ｍｌ（平均１６１Ｕ／ｍｌ）である。存在する高分子量物質（ＨＭＷ）の量およびクロッティング活性について試料をアッセイする。有意な量（>３％）のＨＭＷの形成は望ましくなく、製品の安全性および有効性に対して影響を与えうる因子ＩＸの物理的分解を示すものである。皮下投与した場合、凝集蛋白はより免疫原性があるので、ＨＭＷは皮下投与には特に望ましくない。Morein, B. and K. Simons, Vaccine 3:83. Subumit vaccines against enveloped viruses: Virosomes, micells, and other protein complexes (1985);およびAntibiotics: A laboratory manual, (page 100), E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988。
【００３５】
表３
試料処方
緩衝化剤（１０〜１５ｍＭ）                            賦形剤
リン酸塩                                アルギニン−ＨＣｌ、塩化ナトリウム
（リン酸ナトリウムまたはカリウム        グリシン、スクロース、マンニトール
のいずれか，ｐＨ７.０）                グルコース
クエン酸塩
（クエン酸ナトリウム，                  ソルビトール、グルコース、グリシン、
ｐＨ６.０〜６.５）                    スクロース、アルギニン−ＨＣｌ
酢酸アンモニウム                        マンノース、マンニトール、
（ｐＨ６.５〜７.０）                    塩化ナトリウム、アルギニン−ＨＣｌ
マレイン酸                              グリシン、マンノース
（ｐＨ６.５）
【００３６】
表４はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により測定した、ＨＭＷ形成に対する異なる緩衝化剤の影響を示す。試料を３０℃で６週間保存した。表４は、６週目の値から開始時の値を差し引いて得たＨＭＷ／全蛋白 x １００％として示す平均増加量を掲載する。
【００３７】
表４
ＨＭＷ形成の増加％
緩衝化剤                    平均増加（全体に対する％）
リン酸塩                            ４.２１
クエン酸塩                          ０.８０
酢酸アンモニウム                    ３.４２
マレイン酸                          １.６７
【００３８】
平均すると、クエン酸塩により緩衝化された試料は、他の賦形剤を含有したにもかかわらず最少量のＨＭＷを形成した。適当なハッファーは２％よりも増加させないものである。
【００３９】
凝集物はモノマー蛋白よりも免疫原性であることが広く知られており、一般的には静脈内処方には許容されない。しかしながら、凝集物は皮下、皮内または筋肉内処方にはさらに望ましくない。なぜなら、これらの投与経路はより多くの免疫応答を生じさせる可能性があるからである。
【００４０】
すべての処方を４℃で６カ月以上保存し、クロッティング活性についてアッセイする。種々の糖類を含有する試料についての残存活性の平均量は非常に様々であり、スクロース含有試料は平均して初発活性の７１％を維持し、マンニトールは５３％、グルコースは５２％、そしてマンノースはわずか２７％であった。驚くべきことに、他の賦形剤の添加にもかかわらず、因子ＩＸ活性の維持においてすべての糖類が等しく有効とはいえない。
【実施例３】
【００４１】
実施例３：  高濃度における安定性
高濃度の因子ＩＸ含むもう１つの処方のセットを調製する。表５掲載の処方において試料を調製する（８ｍｇ／ｍｌ（２０００Ｕ／ｍｌ））。すべては１５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有し、ｐＨ６.８に緩衝化される（界面活性剤不含）。ＢＧ４はわずかに高張であり、残りは等張である。
【００４２】
表５
試料処方
ＢＧ１    ２％スクロース、２％アルギニン−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
ＢＧ２    ４％スクロース、１％グリシン、１ｍＭ ＥＤＴＡ
ＢＧ３    １.５％アルギニン−ＨＣｌ、１％グリシン
ＢＧ４    ５％アルギニン−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
ＢＧ５    ４％スクロース、１％グリシン
【００４３】
ガラス製バイアルおよびガラス製プレフィル可能シリンジの両方に試料を４℃で８、１０および１３カ月保存して気／液界面またはシリコン化栓／溶液界面の量が製品の安定性に影響するかどうかを調べる。３つの時点すべてにおいて、バイアルおよびシリンジ間ではいずれの安定性アッセイによっても有意な相違は見られない。いくつかの分析方法による結果を表６に示す。「活性の回収率」は、残存クロッティング活性量を「開始時」すなわち実験開始時に存在するクロッティング活性量に対するパーセンテージとして表したものである。「ＨＭＷ」は上記定義に同じ。「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」はポリアクリルアミドゲル電気泳動であり、ゲルをスキャンし、バンドを定量する。逆相ＨＰＬＣを用いて製品の均一性を評価し、ピーク比の変化は製品の変化、例えば、オリゴ糖の酸化を示しうる。
【００４４】
【表１】
2010189433.tif 000002
このような高濃度（８ｍｇ／ｍｌ；２０００Ｕ／ｍｌ）の因子ＩＸの場合でさえ、これらの処方は有効である。１３カ月におけるある種の試料について観察された活性の上昇は、対照と比較すると、アッセイのばらつきの範囲内である。
【実施例４】
【００４５】
実施例４：  賦形剤相互作用
表７に示す因子ＩＸ処方のもう１つのセット（すべてがクエン酸塩を含有）を調製する。すべての処方は等張であり、濃度１ないし２ｍｇ／ｍｌ（平均２０８ないし４８１Ｕ／ｍｌ）の因子ＩＸを含有し、１０ｍＭないし１５ｍＭのクエン酸ナトリウムをｐＨ調節剤として使用し、ｐＨを６.８に調節する。
【００４６】
表７
試料処方
主賦形剤                          組み合わせて使用された物質
（濃度範囲，重量／体積％）
マンニトール              アルギニン−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、グリシン、
（５５〜２７５ｍＭ，１〜５％）    ツイン８０、スクロース、
ＮａＣｌ、ＫＣｌ
アルギニン−ＨＣｌ        マンニトール、ＥＤＴＡ、スクロース、
（４７〜２３７ｍＭ，１〜５％）    グリシン、ツイン−８０、
グルコース
グリシン                  マンニトール、アルギニン−ＨＣｌ、
（６６〜３０６ｍＭ，              グルコース、ツイン８０、ＥＤＴＡ
０.５〜２.３％）
スクロース                マンニトール、アルギニン−ＨＣｌ、
（２９〜２３４ｍＭ，１〜８％）    グリシン、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、
ツイン−８０
グルコース                アルギニン−ＨＣｌ、グリシン、ＮａＣｌ、
（５５〜２７８ｍＭ，１〜５％）    ＫＣｌ、ＥＤＴＡ
ＮａＣｌ                  スクロース、グルコース、マンニトール、
（１００ｍＭ，０.５８％）        ＥＤＴＡ
ＫＣｌ                    グルコース、マンニトール
（１００ｍＭ，０.７５％）
【００４７】
試料を４℃で保存し、いくつかの時点でアッセイする。４℃で８カ月保存後、９種の試料は出発材料の〜１００％のクロッティング活性を維持している。これ９種の処方を表８に示す（すべては１５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有し、
ｐＨ６.８、かつ等張である）。
【００４８】
表８
１    ４％スクロース、１.４％グリシン、０.００５％ツイン−８０
２    １％マンニトール、２％アルギニン−ＨＣｌ、０.５％グリシン
３    ２.２％アルギニン−ＨＣｌ、０.７５％グリシン
４    ３％マンニトール、１％グリシン
５    ３％マンニトール、１％グリシン、１ｍＭ ＥＤＴＡ
６    ３％マンニトール、１.５％アルギニン、０.００５％ツイン８０
７    ３.３％アルギニン−ＨＣｌ
８    ２％マンニトール、２％スクロース、１.４％アルギニン
９    ４％スクロース、１.４％グリシン、１ｍＭ ＥＤＴＡ
【００４９】
類似の賦形剤を類似の割合で含有するいくつかの処方は、それにもかかわらず、驚くべきことに、ほとんど同様にクロッティング活性を維持しない。例えば、２.３％グリシンのみはわずか８６％８６％のクロッティング活性を示し、４％スクロース、２％アルギニン（ツイン含有および不含、ならびにＥＤＴＡ含有および不含の両方）は８７〜８９％のクロッティング活性を示した。
【００５０】
他の安定性を示すアッセイの結果を表８の９種の処方について示す。比活性をＵ／ｍｇで示し、許容範囲は２００ないし３５０Ｕ／ｍｇである。ＳＥＣ−ＨＭＷはサイズ排除クロマトグラフィーにより決定された高分子量凝集物の測定値であり、皮下、皮内、または筋肉内処方には１％未満が好ましい。「Ｃ末端クリップ」は逆相クロマトグラフィーにより測定された分解種の測定値であり、１％未満が好ましい。
【００５１】
【表２】
2010189433.tif 000003
【００５２】
表８および９に示す好ましい処方によれば、２種のより好ましい処方は以下のものを包含する：（両方とも、１５ｍＭクエン酸塩でｐＨ６.８に緩衝化され、等張である）  ３％マンニトール、１.５％アルギニン−ＨＣｌ、および３.３％アルギニン−ＨＣｌ。
【実施例５】
【００５３】
実施例５：  凍結／融解サイクルの影響
理想的には、最終剤形に用いるのと類似の処方をバルク蛋白に使用する。このことは、長期間の保存によるストレスに対して因子ＩＸを安定化するのと同じ処方が、バルク蛋白が通常遭遇するストレスに対して因子ＩＸを安定化するのに適していることを必要とする。
【００５４】
下表１０に示す処方中に試料を調製する。蛋白濃度は〜２ｍｇ／ｍｌ（５００Ｕ／ｍｌ）であり、浸透圧は３００±５０ミリオスモラルである。すべては１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有し、ｐＨ６.８であり、すべては０.００５％ツイン８０（ポリソルベート）含有および不含として調製される。
【００５５】
表１０
試料処方
Ａ    ２.５％アルギニン−ＨＣｌ、２.２％スクロース
Ｂ    １.８％グリシン、２％スクロース
Ｃ    １.８％アルギニン−ＨＣｌ、２.４％マンニトール
Ｄ    ２.２％グリシン、０.２％マンニトール
Ｅ    ２.７％アルギニン−ＨＣｌ、０.８％マンニトール
Ｆ    ２％アルギニン−ＨＣｌ、２％スクロース、０.９％マンニトール
Ｇ    １.８％アルギニン−ＨＣｌ、２％マンニトール、０.８％スクロース
【００５６】
各処方中の因子ＩＸの試料を５回の凍結−融解サイクルに供して、蛋白凝集物の形成を引き起こす凍結により誘導される変性に対する感受性を調べた。一連の凍結−融解サイクルは、凍結および長期間の保存の間に観察されうる凝集物形成増加に対する蛋白の感受性の有用な指標である。存在するＨＭＷ量について試料をアッセイする。ツイン−８０（０.００５％）含有および不含試料は最小限の凝集（０.１５％未満のＨＭＷ増加）を示す。
【００５７】
本明細書のすべてのデータによれば、下記の２種の処方（成分の範囲として示す）もまた好ましい。
【００５８】
処方１：
クエン酸ナトリウム  ０.００７５Ｍ〜０.０４Ｍ  ０.１９％〜１％ ｗ／ｖ
アルギニン（−ＨＣｌ）  ０.１３Ｍ〜０.１６Ｍ  ２.８％〜３.３％ ｗ／ｖ
スクロース  ０〜０.０６Ｍ  ０〜２％ ｗ／ｖ
ポリソルベート−８０  ０〜０.００００３８２Ｍ  ０〜０.００５％ ｗ／ｖ
因子ＩＸ  ６００〜５６０００ユニット／ｍｌ  ０.１〜１６０ｍｇ／ｍｌ
【００５９】
処方２：
クエン酸ナトリウム  ０.００７５Ｍ〜０.０４Ｍ  ０.１９％〜１％ ｗ／ｖ
アルギニン（−ＨＣｌ）  ０.０６Ｍ〜０.０７Ｍ  １.３％〜１.５％
スクロース  ０〜０.０２Ｍ  ０〜０.７％
マンニトール  ０.１６５Ｍ  ３％
ポリソルベート−８０  ０〜０.００００３８２Ｍ  ０〜０.００５％ ｗ／ｖ
因子ＩＸ  ６００〜５６０００ユニット／ｍｌ  ０.１〜１６０ｍｇ／ｍｌ
【実施例６】
【００６０】
実施例６：  ４℃での長期保存の影響
１５ｍＭクエン酸ナトリウム（０.３８％）、０.１６Ｍアルギニン（３.３％），ｐＨ６.８中に因子ＩＸを２ｍｇ／ｍｌ（５００Ｕ／ｍｌ）として処方し、４℃で１年間保存する。活性の回収率は９５％であり、％ＨＭＷは０.３２％である。１５ｍＭクエン酸ナトリウム、３％マンニトール、１.５％アルギニン，ｐＨ６.８中に因子ＩＸを２ｍｇ／ｍｌとして処方し、４℃で１年間保存する。活性の回収率は７６％であり、％ＨＭＷは０.３６％である。活性の損失は脱アミド化によるものである。
【００６１】
１５ｍＭクエン酸ナトリウム、１％＝２９ｍＭスクロース、３％＝０.１４ＭアルギニンＨＣｌ中に因子ＩＸを２ｍｇ／ｍｌとして処方し、４℃で１年間保存する。活性の回収率は８６％であり、％ＨＭＷは０.２７である。
【実施例７】
【００６２】
実施例７：  高蛋白濃度および凍結−融解の影響
１０ｍＭヒスチジン、２６０ｍＭグリシン、１％スクロース、０.００５％ツイン−８０，ｐＨ７.０中に因子ＩＸを４０００Ｕ／ｍｌ、８０００Ｕ／ｍｌ、１６０００Ｕ／ｍｌおよび３００００Ｕ／ｍｌ以上（すなわち、１６ないし１２０ｍｇ／ｍｌ以上）として処方する。因子ＩＸをCentricon-10中で遠心濃縮し、次いで、YM-10膜を用いるAmiconスターセル（stir cell）中でスターセル濃縮する。蛋白の濃縮に用いる他の方法、特に、分子量に基づいて蛋白種を保持および排除する膜を用いる方法、例えば十字流濾過を用いることができる。さらに、検出可能な凝集蛋白（ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定されるＨＭＷ）は、これらの異常に高い蛋白濃度においてさえ生成しない。
【００６３】
次いで、試料について凍結融解を繰り返すと、驚くべきことに、ＨＭＷの許容レベル（≦１％）がやはり維持される。MononineTMおよびAiphanineTMのごとき市販血漿由来の因子ＩＸ製品（上記４頁１〜１１行目）は、たとえ因子ＩＸ濃度が非常に低いとしても、しばしば１０％またはそれ以上のＨＭＷを含有していることに鑑みると、このことは驚くべきことである。かかる高％ＨＭＷは潜在的な免疫原性のため、皮下、皮内または筋肉内投与には不適である。
【００６４】
さらにそのうえ、因子ＩＸをMononineTMと同じ処方に処方し、凍結および融解の繰り返しサイクルに供する場合、有意量（〜１５％）のＨＭＷが生じる。実施例５に示すデータを考慮すると、このデータは、因子ＩＸの安定性に対する処方の驚くべきかつ予期しなかった効果を示すものである。
【実施例８】
【００６５】
実施例８：  高度に濃縮された因子ＩＸ
高度に濃縮された因子ＩＸは、皮下、皮内または筋肉内投与した場合に効果的である。高度に濃縮（すなわち、４０００Ｕ／ｍｌないし５６０００Ｕ／ｍｌ以上）された因子ＩＸの処方を用いると、以下に説明するように単一部位での小体積の皮下注射が可能である。
【００６６】
２６０ｍＭグリシン、１０ｍＭヒスチジン、２９ｍＭ（１％）スクロース、および０.００５％ポリソルベート中４０００ＩＵ／ｍｌの濃度の因子ＩＸを用いて３つの実験群を評価した。群Ｉにおいて、イヌに２００Ｕ／ｋｇ（０.０５ｍｌ／ｋｇ）の因子ＩＸを静脈投与した。群ＩＩにおいて、イヌに２００Ｕ／ｋｇ（０.０５ｍｌ／ｋｇ）の因子ＩＸを皮下投与した。群ＩＩＩにおいて、イヌに、最初に５０Ｕ／ｋｇ（０.０１２５ｍｌ／ｋｇ）を静脈投与し、２４時間後２００Ｕ／ｋｇ（０.０５ｍｌ／ｋｇ）の因子ＩＸを皮下投与した。静脈投与された因子ＩＸは、注射５分以内に２４０％の因子ＩＸ活性を生じ、５日目に６.４％にまで低下した（ここに、１００％＝プールされたヒト血漿標準）。皮下投与された因子ＩＸ活性は５分で０.９％、３時間で１０％、５日で５.８％であった。静脈投与、次いで、２４時間後に皮下投与を組わせると、皮下投与３時間後に２５％の血漿因子ＩＸ活性、皮下投与５日後に９.１％の因子ＩＸ活性を生じた。皮下投与物の生体利用率は４３％と算出された。皮下投与された因子ＩＸは、投与３時間後以内に治療レベルの因子ＩＸ活性を生じる。静脈および皮下投与の組み合わせは、即時的な凝固薬保護を生じ、皮下投与の有効性を改善する。また、高度に濃縮された形態の因子ＩＸを、上記実施例１〜５に記載した処方に処方して、効果的に投与に使用することもできる。
【００６７】
本発明を特定の方法、処方、および組成物に関して説明したが、当業者は本発明を考慮して変更および修飾を行うであろうことが理解される。
【００６８】
上の説明的な実施例において説明した本発明における多くの修飾および変更は当業者により行われると考えられ、その結果、添付した請求の範囲にあるような限定のみが本発明に課せられるべきである。したがって、添付した請求の範囲は、権利請求されている本発明の範囲中にあるかかる均等な変更のすべてを包含するものと解される。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、医薬品の分野等において利用可能である。