(57)【要約】【課題】ウイルス性慢性肝炎から肝臓癌の発症予防のための医薬を提供する。【解決手段】  3,7,11,15-テトラメチル-2,4,6,10,14-ヘキサデカペンタエン酸を有効成分として含む医薬であって、ウイルス性慢性肝炎からの肝臓癌の発症予防のための医薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
3,7,11,15-テトラメチル-2,4,6,10,14-ヘキサデカペンタエン酸を有効成分として含む医薬であって、ウイルス性慢性肝炎から肝臓癌の発症予防のための医薬。
【請求項２】
(2E,4E,6E,10E)-3,7,11,15-テトラメチル-2,4,6,10,14-ヘキサデカペンタエン酸を有効成分として含む請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
薬学的に許容されうる製剤担体を含有する医薬組成物の形態である請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
経口投与のための医薬組成物である請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
肝臓癌がウイルス性慢性肝炎からの初発の肝臓癌である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリプレニル系化合物を有効成分とするトランスフォーミング（形質転換）増殖因子-α（transforming growth factor-α；TGF-α：以下、本明細書において「TGF-α」と記載する場合がある。）発現抑制剤に関するものであり、該発現抑制による肝炎細胞又は肝硬変細胞の形質転換抑制剤、並びに肝癌の発症、再発（二次発癌）又は悪性化抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
平成１１年の悪性新生物による死亡数は29万6千人で死因の1位を占め、そのうち肝細胞癌による死者は3万人を超えている。その数は年々増えており、ここ20年間で約3倍に増加している。わが国で発生する肝細胞癌の主な原因として、90%以上はB型肝炎ウイルス（HBV：以下、本明細書において「HBV」と記載する場合がある。）又はC型肝炎ウイルス（HCV：以下、本明細書において「HCV」と記載する場合がある。）の持続感染（慢性肝炎）によるといわれている。また、肝癌はその治療後、年率約20〜25%の再発（二次発癌）が認められ、予後不良の疾患である。そのため、肝癌の早期発見、早期治療と共に、今後の重要な課題として慢性肝炎からの肝発癌の抑制並びに肝癌治療後の再発の抑制が挙げられる。
【０００３】
トランスフォーミング（形質転換）増殖因子-α（TGF-α）は、肝発癌及び肝癌細胞の悪性化（プロモーション／プログレッション）に深く関与していると考えられている増殖因子である。肝でのTGF-α発現レベルは、ウイルス性肝炎における炎症の重篤度に関連しており、また、肝炎ウイルスによる肝硬変でのTGF-αの過剰発現が肝炎ウイルスの複製に関係があることも報告されている。実際、HBV及びHCVの感染による慢性肝疾患患者の肝組織では、健常人に比べてTGF-αの発現が高まっていることが確認されており、また、肝癌患者における癌組織及び癌周囲の非癌部組織でもTGF-αの高い発現が認められることから、肝炎ウイルス感染から肝癌の発症・発達における過程でTGF-αが極めて重要な役割を果たしている可能性が示唆されている。
【０００４】
実験的には、ラット肝細胞のトランスフォーメーション（形質転換）はTGF-αの発現亢進に関連しており、肝化学発癌物質及び肝炎ウイルスにより形質転換した肝細胞でTGF-αが高レベルに発現することが確認されている。また、TGF-αを過剰発現させたトランスジェニックマウスでは、自然発生的に肝癌が高率に発症すると共に、本マウスにおいては化学発癌物質及び癌遺伝子による肝発癌の劇的な亢進が認められる。
このように、TGF-αは肝発癌及び肝癌細胞の悪性化に深く関与していることから、TGF-αを標的にして新しい肝癌治療戦略が成り立つことが提唱されている。
【０００５】
ウイルス性慢性肝炎患者から肝癌が発症する正確なメカニズムは明らかにされていないが、肝幹細胞（oval cell：以下、本明細書においてoval cellと記載する場合がある。）が重要な役割を担っている可能性が指摘されている。すなわち、oval cellは慢性肝炎もしくは肝硬変の患者において増殖が見られ、肝病変が重篤になる程にoval cellの数が多くなることが確認されている。これは、肝炎ウイルスが肝における慢性炎症を引き起こしてoval cellの分裂増殖活性を高めることによるが、肝炎ウイルスは同時にoval cellに対して発癌イニシエーターとしても作用している。これらのことより、肝炎ウイルスによりイニシエーションを受けたoval cellが、慢性炎症によって分裂増殖活性が亢進し（プロモーション）、癌化（発癌）するメカニズムが示唆されている。
【０００６】
また、動物を用いた多くの肝化学発癌実験においても、肝癌が脱分化した肝細胞に由来していることを示す報告がある一方で、肝癌細胞のフェノタイプがoval cellと類似していることからoval cellを発生源とする肝発癌の可能性が指摘されている。
【０００７】
oval cellとTGF-αとの関連についての研究報告も多い。TGF-αはoval cellの細胞分裂促進物質（mitogen）であり、oval cell自身あるいは周囲肝組織で産生されたTGF-αがそのレセプターである上皮増殖因子レセプター（epidermal growth factor receptor；EGFR）を介してoval cellの増殖を刺激する。また、ヒトにおけるウイルス性慢性肝炎で著明に認められるoval cellは、肝炎ウイルス感染の標的細胞であると同時にTGF-αの発現亢進を伴うことが確認されており、肝炎ウイルスが発癌の初期段階に作用（イニシエーション）し、TGF-αがその後のプロモーターとして関与することにより、oval cell自身が肝癌細胞へと移行する可能性が考えられる。
【０００８】
このように、oval cellにおけるウイルスの存在とTGF-α発現の相互作用が、oval cellを癌化に導くための重要な因子であると考えられる。同時に、oval cell周囲の肝炎／肝硬変組織で過剰発現しているTGF-αも、レセプターを介してoval cellの癌化を促進させている可能性が高い。これらのことより、ウイルス性慢性肝炎で認められるoval cell内のTGF-α発現を低下させると共に、肝炎／肝硬変組織におけるTGF-α発現を抑制することは、肝癌の先駆細胞としてのoval cellを沈静化させて肝発癌の制御に結びつく、極めて重要なメカニズムと考えられる。
【０００９】
以上述べたように、TGF-αは肝炎及び肝硬変細胞の形質転換、並びに肝臓における発癌及び肝癌細胞の悪性化に密接に関連しており、肝臓中の肝組織細胞及びoval cellにおいて過剰発現状態にあるTGF-αを制御することが、肝炎及び肝硬変細胞の形質転換抑制、並びに肝臓における発癌及び肝癌細胞の悪性化抑制に繋がる可能性が高い。
【００１０】
ポリプレニル系化合物の一つである(2E,4E,6E,10E)-3,7,11,15-テトラメチル-2,4,6,10,14-ヘキサデカペンタエン酸（開発コード「NIK-333」）は、レチノイン酸結合蛋白及びレチノイン酸受容体に対して親和性を示すことや、肝癌細胞における分化誘導作用及びアポトーシス誘導作用が知られている。臨床においては、NIK-333は一年間の長期投与により肝癌根治治療後の再発を有意に抑制したことから、肝癌再発抑制作用を有することが確認されている。さらに、上記の投与中、肝機能障害及び他のレチノイドに見られる副作用は殆ど認められず、安全な薬剤である（引用文献：N.Eng.J.Med. 334、1561-1567 (1996)）。
【００１１】
ポリプレニル系化合物が株化肝癌細胞のTGF-α の発現を抑制することは既に報告されている（引用文献：Biochem.Biophys.Res.Commun. 219、100-104 (1996)）。しかしながら、ポリプレニル系化合物が生体肝組織において、肝化学発癌物質投与により肝組織中で発現亢進したTGF-αを抑制すること、並びに肝癌の先駆細胞と考えられているoval cellにおけるTGF-α発現を抑制することは全く知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明はTGF-αの発現抑制による肝炎及び／又は肝硬変細胞の形質転換抑制剤、並びに肝臓における発癌抑制剤及び癌悪性化抑制剤等を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、肝炎及び／又は肝硬変細胞の形質転換抑制剤（肝炎又は肝硬変の悪性化抑制剤）、並びに肝臓における発癌抑制剤及び癌悪性化抑制剤を見出すべく種々研究を重ねてきた。その結果、ポリプレニル系化合物が、肝化学発癌物質により形質転換した肝組織細胞におけるTGF-αの発現を抑制し、さらに肝癌の先駆細胞としての可能性が強く示唆されているoval cellにおけるTGF-αの発現を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、ポリプレニル系化合物を有効成分とするTGF-αの発現抑制剤に関するものであり、ポリプレニル系化合物を有効成分として含む肝炎及び／又は肝硬変細胞の形質転換抑制剤（肝炎又は肝硬変の悪性化抑制剤）に関するものである。さらに、本発明は、ポリプレニル系化合物を有効成分として含むTGF-αの発現抑制による肝炎細胞又は肝硬変細胞の形質転換抑制剤、並びに肝癌の発症、再発（二次発癌）、又は悪性化の抑制剤に関するものである。
【００１５】
別の観点からは、上記の医薬の製造のためのポリプレニル系化合物の使用；ヒトを含む哺乳類動物においてTGF-αの発現抑制により肝炎細胞又は肝硬変細胞の形質転を抑制する方法であって、並びにTGF-αの発現抑制により肝臓における発癌又は癌細胞の悪性化を抑制する方法であって、ポリプレニル系化合物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；並びに肝炎細胞又は肝硬変細胞の形質転換を抑制する方法であって、並びに肝臓における癌の発症、再発（二次発癌）、又は悪性化を抑制する方法であって、抑制を必要とするヒトを含む哺乳類動物にポリプレニル系化合物の抑制有効量を投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】第１図は、無処置動物の肝組織の写真を示す。TGF-α陽性を示すoval cellの発現は全く認められない。
【図２】第２図は、対照群（肝化学発癌物質3'-MeDABのみを投与）の肝組織に発現したoval cellが、細胞質内に強いTGF-α陽性所見（濃褐色の染色部分はTGF-αが発現していることを示す）を示す写真である。
【図３】第３図は、3’-MeDABにより発現したoval cellがNIK-333 80mg/kg/day投与によりTGF-α弱陽性を呈し（濃褐色の染色部分が第２図に比べて少ないことを示す）、TGF-α発現が低下していることを示す写真である。
【図４】第４図は、無処置動物の肝組織の写真を示す。TGF-αの発現は殆ど認められない。
【図５】第５図は、対照群（肝化学発癌物質DENのみを投与）の非腫瘍部肝組織におけるTGF-α発現を示した写真である。中心静脈周囲の肝組織にTGF-αの強い陽性所見（濃褐色の染色部分はTGF-αが発現していることを示す）が認められる。
【図６】第６図は、DENにより中心静脈周囲の肝組織に発現したTGF-αが、NIK-333 80mg/kg/day投与によりほぼ陰性化した像（濃褐色の染色部分が殆ど見られないことを示す）を示す写真である。
【図７】第７図は、無処置動物の肝組織の写真を示す。TGF-αの発現は殆ど認められない。
【図８】第８図は、DEN投与による対照群の非腫瘍部肝組織におけるTGF-α発現を示す写真である。中心静脈周囲の肝組織にTGF-αの強い陽性所見（濃褐色の染色部分はTGF-αが発現していることを示す）が認められる。
【図９】第９図は、DENにより中心静脈周囲の肝組織に発現したTGF-αが、NIK-333 80mg/kg/day投与によりほぼ陰性化した像（濃褐色の染色部分が殆ど見られないことを示す）を示す写真である。
【図１０】第１０図は、無処置動物の肝組織の写真を示す。TGF-α陽性を示すoval cellの発現は認められない。
【図１１】第１１図は、3'-MeDAB投与により対照群の肝組織に発現したoval cellが、細胞質内に強いTGF-α陽性所見を示す像（濃褐色の染色部分はTGF-αが発現していることを示す）を示す写真である。
【図１２】第１２図は、3'-MeDABにより発現したTGF-α強陽性のoval cellの数が、NIK-333 80mg/kg/day投与により減少していることを示す像（濃褐色に染まる細胞の数が第１１図に比べて少ないことを示す）を示す写真である。
【図１３】第１３図は、無処置動物の肝組織の写真を示す。明らかなTGF-α陽性所見を示す細胞は認められない。
【図１４】第１４図は、D-ガラクトサミン塩酸塩投与により対照群の肝組織に発現したoval cellが、細胞質内に強いTGF-α陽性所見を示す像（濃褐色の染色部分はTGF-αが発現していることを示す）を示す写真である。
【図１５】第１５図は、D-ガラクトサミン塩酸塩により発現したoval cellが、NIK-333 200mg/kg/day投与によりTGF-α弱陽性を呈する像（濃褐色の染色部分が第１４図に比べて少ないことを示す）を示す写真である。TGF-α発現が低下していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に使用されるポリプレニル系化合物としては、ポリプレニルカルボン酸である3,7,11,15-テトラメチル-2,4,6,10,14-ヘキサデカペンタエン酸、ゲラニルゲラノイン酸（GGA：geranyl geranoic acid）、フィタン酸（phytanic acid）などを挙げることができ、更にポリプレニルカルボン酸エステル、ビタミンＫ1、ビタミンＫ2などを挙げることができる。好ましい化合物としてはポリプレニルカルボン酸、特に3,7,11,15-テトラメチル-2,4,6,10,14-ヘキサデカペンタエン酸を挙げることができ、最も好ましい化合物として(2E,4E,6E,10E)-3,7,11,15-テトラメチル-2,4,6,10,14-ヘキサデカペンタエン酸（NIK-333）を挙げることができる。
【００１８】
本発明で使用されるポリプレニル系化合物は、公知の方法（日本国特許公報昭63-32058号、J. Chem. Soc. (C), 2154項, 1966年）により合成することができる。
【００１９】
本発明のTGF-α発現抑制剤は、通常、ポリプレニル系化合物を含む医薬組成物を調製し、経口又は非経口のいずれか適当な投与方法により投与することができる。経口投与に適する医薬組成物の形態としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、軟カプセル剤、丸剤、散剤、液剤などが挙げられ、非経口投与に適する医薬組成物の形態としては、例えば、注射剤、坐剤などが挙げられる。これらの医薬組成物は、ポリプレニル系化合物又はその薬理学上許容し得る塩と通常の製剤担体の1種又は2種以上とを用いて常法により調製することができる。
【００２０】
例えば、経口投与に適する医薬の場合には、製剤担体として、乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ショ糖などの賦形剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの崩壊剤、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、硬化油などの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アラビアゴムなどの結合剤、グリセリン、エチレングリコールなどの湿潤剤、その他必要に応じて界面活性剤、矯味剤などを使用して所望の医薬組成物を調製することができる。
【００２１】
また、非経口投与に適する医薬の場合には、製剤担体として、水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、寒天、トラガラントガムなどの希釈剤を用いて、必要に応じて溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤などを使用することができる。
【００２２】
本発明のTGF-α発現抑制剤の投与量は、特に限定されないが、例えば、成人1日あたり経口投与の場合には50〜1200mg、好ましくは300〜900mg、非経口の場合は1日1〜1200mg、好ましくは5〜900mgの範囲である。上記の投与量をそれぞれ1日1〜3回に分けて投与することにより所望の抑制効果が期待できる。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の実施例では、ポリプレニル系化合物として(2E,4E,6E,10E)-3,7,11,15-テトラメチル-2,4,6,10,14-ヘキサデカペンタエン酸（以下、「NIK-333」と呼ぶ。）を用いた。
【００２４】
実施例１
ラットでの肝化学発癌物質３'−メチル−４−ジメチルアミノアゾベンゼン（3'-
Methyl-4-dimethylaminoazobenzene：3'-MeDAB）によるTGF-α陽性のoval cell誘発に対する効果
動物はFischer系雄性ラット（F344/N Slc、6週齢）を用い、肝化学発癌物質3’-MeDABを固型飼料に0.06%の割合に調製した飼料を4週間投与し、oval cellを誘発した。NIK-333はダイズ油に懸濁し、80 mg/kgの用量を3'-MeDABと併行して4週間（1回/日）経口投与した。なお、対照群にはダイズ油（5 mL/kg）を経口投与した。3'-MeDAB投与開始4週間後に麻酔下にて肝臓を摘出し10%ホルマリン固定後パラフィン包埋を行い、抗TGF-α抗体を用いた免疫組織染色を施し、TGF-α発現の程度を顕微鏡で観察した。
【００２５】
第１図〜第３図は、3'-MeDAB の4週間投与により誘発されたTGF-α陽性のoval cell誘発に対し、NIK-333の 80mg/kg/dayを4週間同時投与した場合の抑制効果を示した写真である（抗TGF-α抗体による免疫組織学的染色）。なお、同様な所見は同時に行われた他の動物においても得られている。
【００２６】
第１図は、無処置動物の肝組織を示す。TGF-α陽性を示すoval cellの発現は全く認められない。
第２図は、対照群(3'-MeDABのみを投与)の肝組織に発現したoval cellにおける細胞質内の強いTGF-α陽性所見を示す。
【００２７】
第３図は、3'-MeDABにより発現したoval cellが、NIK-333 80mg/kg/day投与によりTFG-α弱陽性を呈し、TGF-α発現が低下していることを示す。
上記と同一の試験における別の部位の写真撮影を行い、第１０図〜第１２図に示す結果を得た。
第１０図は、無処置動物の肝組織を示す。TGF-α陽性を示すoval cellの発現は認められない。
第１１図は、3'-MeDAB投与により対照群の肝組織に発現したoval cellにおける細胞質内の強いTGF-α陽性所見を示す。
第１２図は、3'-MeDABにより発現したTGF-α強陽性のoval cellの数が、NIK-333 80mg/kg/day投与により減少していることを示す。
【００２８】
実施例２
ラットでの肝化学発癌物質Ｎ−ニトロソジエチルアミン（N-Nitrosodiethylamine：DEN）投与後の非腫瘍部肝組織におけるTGF-α発現に対する効果
動物はFischer系雄性ラット（F344/N Slc、6週齢）を用い、肝化学発癌物質DENを5週間飲水投与（濃度：40 ppm）し、その後15週間通常の飲水で飼育し肝細胞癌を誘発した。NIK-333はダイズ油に懸濁し、80 mg/kgの用量をDEN投与終了1週間後より14週間（1回/日）経口投与した。なお、対照群にはダイズ油（5mL/kg）を経口投与した。DEN投与開始20週間後に麻酔下にて肝臓を摘出し、10%ホルマリン固定後パラフィン包埋を行い、抗TGF-α抗体を用いた免疫組織染色を施し、TGF-α発現の程度を顕微鏡で観察した。
【００２９】
第４図〜第６図は、DENの5週間処置後に1週間休薬し、続いてNIK-333 80mg/kg/
dayを14週間投与した場合の非腫瘍部肝組織におけるTGF-α発現に対する抑制効果を示す写真である（抗TGF-α抗体による免疫組織染色）。なお、同様な所見は同時に行われた他の動物においても得られている。
【００３０】
第４図は、無処置動物の肝組織を示す。TGF-αの発現は殆ど認められない。
第５図は、対照群（DENのみを投与）の非腫瘍部肝組織におけるTGF-α発現を示す。中心静脈周囲の肝組織にTGF-αの強い陽性所見が認められる。
第６図は、DENにより中心静脈周囲の肝組織に発現したTGF-αが、NIK-333 80mg/kg/day投与によりほぼ陰性化した結果を示す。
上記と同一の試験における別の部位の写真撮影を行い、第７図〜第９図に示す結果を得た。
【００３１】
第７図は、無処置動物の肝組織を示す。TGF-αの発現は殆ど認められない。
第８図は、DEN投与による対照群の非腫瘍部肝組織におけるTGF-α発現を示す。中心静脈周囲の肝組織にTGF-αの強い陽性所見が認められる。
第９図は、DENにより中心静脈周囲の肝組織に発現したTGF-αが、NIK-333 80mg/kg/day投与によりほぼ陰性化した結果を示す。
【００３２】
実施例３
ラットでのD-ガラクトサミン塩酸塩により誘発したoval cellにおけるTGF-α発現に対する効果
動物はSD系雄性ラット（Crj/CD(SD)、6週齢）を用い、生理食塩水で200mg/mLに調製したD-ガラクトサミン塩酸塩5mL/kgを1回腹腔内投与し、oval cellを誘発した。NIK-333はダイズ油に懸濁し、200mg/kgの用量を1〜6日間経口投与した。なお、対照群にはダイズ油（2mL/kg）を経口投与した。投薬開始翌日より7日目まで経時的に麻酔下にて肝臓を摘出し、10%ホルマリン固定後パラフィン包埋を行い、抗TGF-α抗体を用いた免疫組織染色を施し、TGF-α発現の程度を顕微鏡で観察した。
【００３３】
第１３図〜第１５図は、D-ガラクトサミン塩酸塩の1回投与により誘発されたoval cellにおけるTGF-α発現に対し、NIK-333の 200mg/kg/dayを4日間投与した場合の抑制効果を示す写真である（抗TGF-α抗体による免疫組織染色）。なお、同様な所見は同時に行われた他の動物においても得られている。
【００３４】
第１３図は、無処置動物の肝組織を示す。明らかなTGF-α陽性所見を示す細胞は認められない。
第１４図は、D-ガラクトサミン塩酸塩投与により対照群の肝組織に発現したoval cellにおいて、細胞質内に強いTGF-α陽性が認められた結果を示す。
第１５図は、D-ガラクトサミン塩酸塩により発現したoval cellが、NIK-333 200mg/kg/day投与によりTGF-α弱陽性を呈し、TGF-α発現が低下している結果を示す。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
ポリプレニル系化合物は、肝炎細胞又は肝硬変細胞の形質転換、あるいは肝臓における発癌又は癌細胞の悪性化に関与しているTGF-αを抑制することから、肝炎又は肝硬変細胞の形質転換抑制として、例えば肝炎細胞又は肝硬変の悪性化抑制剤として用いることができ、並びに肝臓における癌の発症、再発（二次発癌）、又は悪性化の抑制剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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