(57)【要約】【課題】スズ、鉛及びヒ素から選ばれる少なくとも一種を含有する有機金属化合物の検出方法及び有機金属化合物検出剤を提供する。【解決手段】スズ、鉛及びヒ素から選ばれる少なくとも一種を含有する有機金属化合物の存在下において進行する第１のタンパク質と第２のタンパク質との複合体形成に基づいて有機金属化合物を検出する有機金属化合物の検出方法である。第１のタンパク質としては、レチノイドＸ受容体又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γのリガンド結合領域を構成するアミノ酸配列から構成される第１の領域を有するタンパク質が用いられる。第２のタンパク質としては、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１のレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域を有するタンパク質が用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スズ、鉛及びヒ素から選ばれる少なくとも一種を含有する有機金属化合物の検出方法であって、前記有機金属化合物の存在下において進行する第１のタンパク質と第２のタンパク質との複合体の形成に基づいて前記有機金属化合物を検出する有機金属化合物の検出方法において、
前記第１のタンパク質は少なくとも第１の領域を有するタンパク質であり、前記第１の領域は、（ａ）レチノイドＸ受容体又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γのリガンド結合領域を構成するアミノ酸配列、若しくは（ｂ）該リガンド結合領域を構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成され、
前記第２のタンパク質は少なくとも第２の領域を有するタンパク質であり、前記第２の領域は、（ｃ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１のレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｄ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする有機金属化合物の検出方法。
【請求項２】
前記第２の領域は、（ｅ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１αのレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｆ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする請求項１に記載の有機金属化合物の検出方法。
【請求項３】
前記第２の領域は、（ｇ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１βのレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｈ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする請求項１に記載の有機金属化合物の検出方法。
【請求項４】
前記第１の領域は、（ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列、若しくは（ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、配列番号３に示すアミノ酸配列と同等の前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の有機金属化合物の検出方法。
【請求項５】
検出対象である前記有機金属化合物が下記一般式（１）に示される有機金属化合物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の有機金属化合物の検出方法。
【化１】
2010168322.tif 000012
（式中、Ｍｅは、Ｓｎ、Ｐｂ又はＡｓを示す。Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてもよく、それぞれ炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基又はフェニル基を示す。Ｒ３は、炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基、フェニル基又はハロゲン原子を示す。但し、Ｘ及びＲ３がともにハロゲン原子であり、かつＲ１及びＲ２がともに炭素数２〜７のアルキル基である場合を除く。）
【請求項６】
スズ、鉛及びヒ素のいずれかを含有する有機金属化合物を検出するための有機金属化合物検出剤において、
前記有機金属化合物の存在下において複合体を形成する第１のタンパク質と第２のタンパク質とを含有し、
前記第１のタンパク質は少なくとも第１の領域を有するタンパク質であり、前記第１の領域は、（ａ）レチノイドＸ受容体又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γのリガンド結合領域を構成するアミノ酸配列、若しくは（ｂ）該リガンド結合領域を構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成され、
前記第２のタンパク質は少なくとも第２の領域を有するタンパク質であり、前記第２の領域は、（ｃ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１のレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｄ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする有機金属化合物検出剤。
【請求項７】
前記第２の領域は、（ｅ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１αのレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｆ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする請求項６に記載の有機金属化合物検出剤。
【請求項８】
前記第２の領域は、（ｇ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１βのレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｈ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする請求項６に記載の有機金属化合物検出剤。
【請求項９】
前記第１の領域は、（ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列、若しくは（ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、配列番号３に示すアミノ酸配列と同等の前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする請求項６〜８のいずれか一項に記載の有機金属化合物検出剤。
【請求項１０】
下記一般式（１）に示される有機金属化合物の検出に用いられることを特徴とする請求項６〜９のいずれか一項に記載の有機金属化合物検出剤。
【化２】
2010168322.tif 000013
（式中、Ｍｅは、Ｓｎ、Ｐｂ又はＡｓを示す。Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてもよく、それぞれ炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基又はフェニル基を示す。Ｒ３は、炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基、フェニル基又はハロゲン原子を示す。但し、Ｘ及びＲ３がともにハロゲン原子であり、かつＲ１及びＲ２がともに炭素数２〜７のアルキル基である場合を除く。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機金属化合物の検出方法及び有機金属化合物検出剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
有機金属化合物として、例えば、トリブチルスズやトリフェニルスズをはじめとする有機スズ化合物は、船底防汚塗料、魚網防汚剤、ビニールの可塑剤等の有効成分として広く利用されている。しかし、近年において、有機スズ化合物は毒性が非常に強く、とくに一部の無脊椎動物に対しては低濃度で内分泌撹乱作用を示すことが明らかになり、環境に悪影響を及ぼす物質として認識されている。同じく鉛、ヒ素を含有する有機金属化合物も環境中における毒性が問題となっている。現在、環境調査等の目的で環境試料中における有機金属化合物、例えば有機スズ化合物の分析は主に非特許文献１に示される方法を用いて行なわれている。
【０００３】
具体的な方法は以下のとおりである。まず、環境試料等の試験試料に対して同位体標識した有機スズ化合物又は塩化トリペンチルスズをサロゲート物質として添加する。続いて、塩酸酸性下ヘキサンによる抽出処理及び濃縮処理し、臭化プロピルマグネシウムによるプロピル化を行なう。そして、プロピル体を有機溶媒で抽出し、フロリジルカラムでクリーンアップした後、濃縮処理してＧＣ−ＦＰＤ或いはＧＣ／ＭＳ−ＳＩＭ法で定量する。
【０００４】
しかしながら、非特許文献１に記載の方法は、試験試料の濃縮処理やプロピル化等の前処理が必要であることから非常に煩雑な方法である上、高度な技術や経験も要求されるものである。また、その分析には高価で大掛かりな機器が必要になる等の多くの欠点を有している。
【０００５】
こうした問題点を解決する方法として、特定の核内受容体と転写共役因子との相互作用を利用した有機スズ化合物の検出方法が提案されている（特許文献１）。核内受容体は、細胞核内での転写を調節する受容体であり、リガンドが結合して活性化されると、転写共役因子群をリクルートして複合体を形成し、基本転写因子の転写を活性化する。一方、トリブチルスズやトリフェニルスズ等の有機スズ化合物が特定の核内受容体に対してアゴニスト活性を示すことが知られている。特許文献１に記載の検出方法は、こうした作用を利用したものであり、有機スズ化合物のアゴニスト活性に基づいて形成される核内受容体と転写共役因子の複合体を検出することによって、間接的に有機スズ化合物を検出するものである。なお、特許文献１に記載の方法では、核内受容体としてレチノイドＸ受容体を用いるとともに、転写共役因子としてＴＩＦ２を用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−６５２４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】環境庁水質保全局水質管理課「外因性内分泌攪乱化学物質調査暫定マニュアル（水質、底質、水生生物）」平成１０年１０月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この発明は、本研究者らによる鋭意研究の結果、核内受容体として、レチノイドＸ受容体又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γを用いるとともに、転写共役因子としてペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１を用いた場合にも、有機金属化合物を検出できることを見出したことに基づいてなされたものである。その目的とすることは、スズ、鉛及びヒ素から選ばれる少なくとも一種を含有する有機金属化合物を高感度に検出することができる有機金属化合物の検出方法及び有機金属化合物検出剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために請求項１に記載の有機金属化合物の検出方法は、スズ、鉛及びヒ素のいずれかを含有する有機金属化合物の検出方法であって、前記有機金属化合物の存在下において進行する第１のタンパク質と第２のタンパク質との複合体の形成に基づいて前記有機金属化合物を検出する有機金属化合物の検出方法において、前記第１のタンパク質は少なくとも第１の領域を有するタンパク質であり、前記第１の領域は、（ａ）レチノイドＸ受容体又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γのリガンド結合領域を構成するアミノ酸配列、若しくは（ｂ）該リガンド結合領域を構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成され、前記第２のタンパク質は少なくとも第２の領域を有するタンパク質であり、前記第２の領域は、（ｃ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１のレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｄ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする。
【００１０】
請求項２に記載の有機金属化合物の検出方法は、請求項１に記載の発明において、前記第２の領域は、（ｅ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１αのレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｆ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする。
【００１１】
請求項３に記載の有機金属化合物の検出方法は、請求項１に記載の発明において、前記第２の領域は、（ｇ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１βのレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｈ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする。
【００１２】
請求項４に記載の有機金属化合物の検出方法は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発明において、前記第１の領域は、（ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列、若しくは（ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、配列番号３に示すアミノ酸配列と同等の前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする。
【００１３】
請求項５に記載の有機金属化合物の検出方法は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発明において、検出対象である前記有機金属化合物が下記一般式（１）に示される有機金属化合物であることを特徴とする。
【００１４】
【化１】
2010168322.tif 000002
（式中、Ｍｅは、Ｓｎ、Ｐｂ又はＡｓを示す。Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてもよく、それぞれ炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基又はフェニル基を示す。Ｒ３は、炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基、フェニル基又はハロゲン原子を示す。但し、Ｘ及びＲ３がともにハロゲン原子であり、かつＲ１及びＲ２がともに炭素数２〜７のアルキル基である場合を除く。）
請求項６に記載の有機金属化合物検出剤は、スズ、鉛及びヒ素のいずれかを含有する有機金属化合物を検出するための有機金属化合物検出剤において、前記有機金属化合物の存在下において複合体を形成する第１のタンパク質と第２のタンパク質とを含有し、前記第１のタンパク質は少なくとも第１の領域を有するタンパク質であり、前記第１の領域は、（ａ）レチノイドＸ受容体又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γのリガンド結合領域を構成するアミノ酸配列、若しくは（ｂ）該リガンド結合領域を構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成され、前記第２のタンパク質は少なくとも第２の領域を有するタンパク質であり、前記第２の領域は、（ｃ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１のレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｄ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする。
【００１５】
請求項７に記載の有機金属化合物検出剤は、請求項６に記載の発明において、前記第２の領域は、（ｅ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１αのレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｆ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする。
【００１６】
請求項８に記載の有機金属化合物検出剤は、請求項６に記載の発明において、前記第２の領域は、（ｇ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１βのレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｈ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする。
【００１７】
請求項９に記載の有機金属化合物検出剤は、請求項６〜８のいずれか一項に記載の発明において、前記第１の領域は、（ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列、若しくは（ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、配列番号３に示すアミノ酸配列と同等の前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されることを特徴とする。
【００１８】
請求項１０に記載の有機金属化合物検出剤は、請求項６〜９のいずれか一項に記載の発明において、下記一般式（１）に示される有機金属化合物の検出に用いられることを特徴とする。
【００１９】
【化２】
2010168322.tif 000003
（式中、Ｍｅは、Ｓｎ、Ｐｂ又はＡｓを示す。Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてもよく、それぞれ炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基又はフェニル基を示す。Ｒ３は、炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基、フェニル基又はハロゲン原子を示す。但し、Ｘ及びＲ３がともにハロゲン原子であり、かつＲ１及びＲ２がともに炭素数２〜７のアルキル基である場合を除く。）
【発明の効果】
【００２０】
本発明の有機金属化合物の検出方法及び有機金属化合物検出剤によれば、スズ、鉛及びヒ素から選ばれる少なくとも一種かを含有する有機金属化合物を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明を酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法に適用した場合の概念図。
【図２】本発明をＣｏＡ−ＢＡＰ法に適用した場合の概念図。
【図３】試験例１における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図４】試験例１における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図５】試験例１における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図６】試験例１における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図７】試験例１における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図８】試験例１における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図９】試験例２における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１０】試験例２における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１１】試験例２における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１２】試験例２における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１３】試験例２における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１４】試験例２における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１５】試験例３における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１６】試験例３における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１７】試験例３における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１８】試験例３における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図１９】試験例３における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図２０】試験例３における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図２１】試験例４における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図２２】試験例４における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図２３】試験例４における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図２４】試験例４における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図２５】試験例４における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図２６】試験例４における有機金属化合物濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性の関係を示すグラフ。
【図２７】（ａ）は試験例５における有機金属化合物濃度と大腸菌アルカリホスファターゼ活性の関係を示すグラフ、（ｂ）は比較例２における有機金属化合物濃度と大腸菌アルカリホスファターゼ活性の関係を示すグラフ、（ｃ）は比較例３における有機金属化合物濃度と大腸菌アルカリホスファターゼ活性の関係を示すグラフ、（ｄ）は比較例４における有機金属化合物濃度と大腸菌アルカリホスファターゼ活性の関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の有機金属化合物検出剤及び有機金属化合物の検出方法を具体化した実施形態を詳細に説明する。
まず、本発明に用いられる、有機金属化合物の検出原理について説明する。本発明は、核内受容体と転写共役因子との相互作用を利用している。
【００２３】
核内受容体は、細胞核内での転写を調節する受容体であり、リガンドが結合して活性化されると、転写共役因子群をリクルートして複合体を形成し、基本転写因子の転写を活性化する。具体的には、核内受容体は、リガンドの存在下においてリガンドと結合するとともに、その構造を変化させる。この構造変化によって、核内受容体は転写共役因子と複合体を形成し得る構造となり、核内受容体−転写共役因子複合体を形成する。一方、本研究者らによって、スズ、鉛及びヒ素から選ばれる少なくとも一種を含有するトリブチルスズやトリフェニルスズ等の有機金属化合物（以下、単に有機金属化合物とする。）が特定の核内受容体のアゴニストとなり、同有機金属化合物の存在下において、核内受容体−転写共役因子複合体が形成されることが見出されている。こうした核内受容体、転写共役因子、及び有機金属化合物の相互作用を利用し、有機金属化合物のアゴニスト活性に基づいて形成される核内受容体−転写共役因子複合体の形成を検出することによって、間接的に有機金属化合物を検出することができる。
【００２４】
＜有機金属化合物検出剤について＞
本実施形態の有機金属化合物検出剤は、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを含有する。それらは、有機金属化合物の存在下において互いに複合体を形成する。本発明の有機金属化合物検出剤にて検出可能な有機金属化合物は、例えば、下記一般式（１）で示される。
【００２５】
【化３】
2010168322.tif 000004
（式中、Ｍｅは、Ｓｎ、Ｐｂ又はＡｓを示す。Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてもよく、それぞれ炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基又はフェニル基を示す。Ｒ３は、炭素数２〜７のアルキル基、シクロアルキル基、フェニル基又はハロゲン原子を示す。但し、Ｘ及びＲ３がともにハロゲン原子であり、かつＲ１及びＲ２がともに炭素数２〜７のアルキル基である場合を除く。）
上記一般式（１）に示される有機金属化合物としては、例えば、臭化トリエチルスズ（ＴＥＴＢｒ）、塩化トリプロピルスズ（ＴＰｒＴＣｌ）、塩化トリペンチルスズ（ＴＰｅＴＣｌ）、水酸化トリシクロヘキシルスズ（ＴＣｈＴＯＨ）、塩化トリブチルスズ（ＴＢＴＣｌ）、テトラブチルスズ（ＴｅＢＴ）、二塩化ジフェニルスズ（ＤＰＴＣｌ２）、水酸化トリフェニルスズ（ＴＰＴＯＨ）、臭化トリブチルスズ（ＴＢＴＢｒ）、水素化トリブチルスズ（ＴＢＴＨ）、塩化トリフェニルスズ（ＴＰＴＣｌ）、トリブチルビニルスズ（ＴＢＶＴ）、トリフェニル鉛（ＴＰＬ）、及びトリフェニルアルシン（ＴＰＡｓ）が挙げられる。
【００２６】
まず、第１のタンパク質について説明する。第１のタンパク質は、少なくとも下記に示される第１の領域を有するタンパク質であり、上記有機金属化合物に対する結合能、及び有機金属化合物依存的に第２のタンパク質と複合体を形成するための複合体形成能を有する。上記第１の領域は、（ａ）レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）のリガンド結合領域（ＬＢＤ）を構成するアミノ酸配列、若しくは（ｂ）該ＬＢＤを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、上記有機金属化合物に対する結合能及び上記複合体形成能を有するアミノ酸配列から構成されている。
【００２７】
ＲＸＲ（ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、ビタミンＡの代謝物である９−シスレチノイン（９ｃＲＡ）をリガンドとする核内受容体であり、貝類から脊椎動物まで種を超えてよく保存されている。また、ＲＸＲには、ＲＸＲα、ＲＸＲβおよびＲＸＲγの３つのサブタイプが存在するが、サブタイプ間においてもＬＢＤを構成するアミノ酸配列のホモロジーは非常に高いことが確認されている。
【００２８】
ＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ）は、殆どの脊椎動物において発現している核内受容体の一種であり、細胞内代謝と細胞内分化に関与していると考えられているＰＰＡＲのサブタイプの一つである。とくにＰＰＡＲγは、インスリン抵抗性の糖尿病治療薬であるチアゾリジン系治療薬をアゴニストとすることが知られており、糖尿病治療のターゲットのひとつとなっている。
【００２９】
また、上記第１の領域は、上記有機金属化合物をアゴニストとし得るＲＸＲ及びＰＰＡＲγであれば、如何なる生物種由来、如何なるサブタイプのＲＸＲ及びＰＰＡＲγのＬＢＤを構成するアミノ酸配列から構成されていてもよい。一例として、ヒトＲＸＲαのＬＢＤ（２０１−４６２ａ．ａ．）を構成するアミノ酸配列、及びヒトＰＰＡＲγのＬＢＤ（２０５−５０５ａ．ａ）を構成するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に記載する。
【００３０】
また、上記第１の領域は、有機金属化合物に対する結合能及び上記複合体形成能を有しているアミノ酸配列であれば、野生型ＲＸＲ及び野生型ＰＰＡＲγのＬＢＤを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加された変異型のアミノ酸配列から構成されていてもよい。その場合、野生型ＲＸＲ及び野生型ＰＰＡＲγのＬＢＤを構成するアミノ酸配列と比較して、その有機金属化合物に対する結合能及び複合体形成能が１０％以上であることが好ましい。
【００３１】
変異型のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号３に記載するアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３に記載するアミノ酸配列は、ヒトＲＸＲαの完全長アミノ酸配列における３１６位のアルギニン（Ｒ３１６）及び３２６位のロイシン（Ｌ３２６）をそれぞれアラニンに置換した変異型ＲＸＲ（ＲＸＲ３１６Ａ／３２６Ａ）のリガンド結合領域（２０１−４６２ａ．ａ．）を構成するアミノ酸配列である（特開２００８−０４４９０２号公報参照）。ＲＸＲ３１６Ａ／３２６Ａは、ヒトＲＸＲαのＬＢＤに変異を加えたものであり、トリブチルスズやトリフェニルスズといった有機スズ化合物との反応性を保持したまま、内因性のリガンドである９ｃＲＡ等に対する反応性を欠損した変異型ＲＸＲである。
【００３２】
なお、内因性のリガンドに対する結合性が低い点から、上記第１の領域は、（ｉ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列（ＲＸＲ３１６Ａ／３２６ＡのＬＢＤを構成するアミノ酸配列）、若しくは（ｊ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列（ｉ）において、一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、アミノ酸配列（ｉ）と同等（それに準ずるレベルも含む）の有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体形成能を有するアミノ酸配列から構成されることが好ましい。
【００３３】
また、第１のタンパク質は第１の領域のみから構成されるタンパク質であってもよいし、第１の領域に加えて、精製用タグ領域、固定化用タグ領域、検出用タグ領域、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域、ＲＮＡポリメラーゼ等の他の領域を備える融合タンパク質であってもよい。精製用タグ領域としては、例えば、ヒスチジンタグ、ｃ-Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＦＡＬＧタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質が挙げられる。固定化用タグ領域としては、例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質が挙げられる。検出用タグ領域としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質が挙げられる。転写活性化領域としては、例えば、ＧＡＬ４の転写活性化領域が挙げられる。ＤＮＡ結合領域としては、例えば、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域、λリプレッサー（λファージのＣＩタンパク質：λＣＩ）が挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットが挙げられる。また、これら各領域の配置構成はどのような配置構成であってもよい。なお、ＲＸＲ或いはＰＰＡＲγそのものを第１のタンパク質として用いてもよい。
【００３４】
上記第１のタンパク質は、ポリペプチド合成法や組み換えＤＮＡ等の公知の遺伝子工学技術によって作製することができる。例えば、第１のタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子をベクターに導入するとともに、それを宿主細胞において発現させることにより、第１のタンパク質を産生することができる。
【００３５】
次に第２のタンパク質について説明する。第２のタンパク質は、少なくとも下記に示される第２の領域を有するタンパク質であり、有機金属化合物依存的に第１のタンパク質と複合体を形成する複合体形成能を有する。上記第２の領域は、（ｃ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１（ＰＧＣ１）のレセプター・インタラクション・ドメイン（ＲＩＤ）を構成するアミノ酸配列、若しくは（ｄ）該ＲＩＤを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、上記複合体形成能を有するアミノ酸配列から構成されている。
【００３６】
ＰＧＣ１（ＰＰＡＲγ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １）は、核内受容体であるＰＰＡＲγに結合し、その転写活性を増強させる転写共役因子として同定された蛋白であり、ＰＧＣ１α、ＰＧＣ１βの２種類のサブタイプが存在する。ＰＧＣ１α及びＰＧＣ１βは共に、褐色脂肪細胞、心臓、腎臓、筋肉、脳などエネルギーを多く消費する組織で強く発現している。そして、ＰＧＣ１αは絶食や運動、寒冷曝露などによりその発現が誘導され、ミトコンドリア合成及び機能増加によりエネルギー産生を促進させる事が知られている。一方、ＰＧＣ１βは肝臓において、脂肪酸やトリグリセリドの合成を調節する事が知られている。
【００３７】
一例として、ヒトＰＧＣ１αのＲＩＤを構成するアミノ酸配列（１−１８８ａ．ａ）及びヒトＰＧＣ１βのＲＩＤを構成するアミノ酸配列（１−２６４ａ．ａ．）をそれぞれ配列番号４及び５に記載する。
【００３８】
また、上記第２の領域は、上記複合体形成能を有しているアミノ酸配列であれば、野生型ＰＧＣ１のＲＩＤ構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加された変異型のアミノ酸配列から構成されていてもよい。その場合、野生型ＰＧＣ１のＲＩＤ構成するアミノ酸配列と比較して、上記複合体形成能が１０％以上であることが好ましい。
【００３９】
なお、有機金属化合物をより低濃度で検出できるという点から、上記第２の領域は、（ｅ）ＰＧＣ１αのＲＩＤを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｆ）アミノ酸配列（ｅ）において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、アミノ酸配列（ｅ）と同等（それに準ずるレベルも含む）の上記複合体形成能を有するアミノ酸配列から構成されることが好ましい。さらに、側鎖にフェニル基を有する有機金属化合物との混在下において、下記一般式（２）に示す有機金属化合物を選択的に検出可能であるという点から、（ｇ）上記第２の領域は、（ｇ）ＰＧＣ１βのＲＩＤを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｈ）アミノ酸配列（ｇ）において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、アミノ酸配列（ｇ）と同等（それに準ずるレベルも含む）の上記複合体形成能を有するアミノ酸配列から構成されることが好ましい。
【００４０】
【化４】
2010168322.tif 000005
（式中、Ｍｅは、Ｓｎ、Ｐｂ又はＡｓを示す。Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なっていてもよく、それぞれ炭素数２〜７のアルキル基又はシクロアルキル基を示す。）
また、第２のタンパク質は第２の領域のみから構成されていてもよいし、第２の領域に加えて、精製用タグ領域、固定化用タグ領域、検出用タグ領域、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域、ＲＮＡポリメラーゼ等の他の領域を備える融合タンパク質であってもよい。精製用タグ領域としては、例えば、ヒスチジンタグ、ｃ-Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＦＡＬＧタグ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質が挙げられる。固定化用タグ領域としては、例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質が挙げられる。検出用タグ領域としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質が挙げられる。転写活性化領域としては、例えば、ＧＡＬ４の転写活性化領域が挙げられる。ＤＮＡ結合領域としては、例えば、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域、λリプレッサー（λファージのＣＩタンパク質：λＣＩ）が挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットが挙げられる。また、これら各領域の配置構成はどのような配置構成であってもよい。なお、ＰＧＣ１そのものを第２のタンパク質として用いてもよい。
【００４１】
第２のタンパク質は、ポリペプチド合成法や組み換えＤＮＡ等の公知の遺伝子工学技術によって作製することができる。例えば、第２のタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子をベクターに導入するとともに、それを宿主細胞において発現させることにより、第２のタンパク質を産生することができる。
【００４２】
＜有機金属化合物の検出方法について＞
次に、本実施形態の有機金属化合物検出剤を用いた有機金属化合物の検出方法について説明する。本実施形態の有機金属化合物の検出方法は以下のとおりである。まず、上記第１のタンパク質に対して、上記第２のタンパク質及び試験試料（被検体）を作用させる。このとき、試験試料中に有機金属化合物が存在する場合には、第１のタンパク質は、有機金属化合物と結合するとともに、その構造を変化させる。この構造変化によって、第１のタンパク質は、第２のタンパク質と結合し得る構造となり、第１のタンパク質−第２のタンパク質複合体を形成する。この複合体の形成を検出することにより、試験試料中に存在する有機金属化合物を検出する。こうした複合体の形成は、レポーターアッセイ、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）法、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、大腸菌ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、コアクチベーター−大腸菌アルカリホスファターゼ（Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＣｏＡ−ＢＡＰ）法、核内受容体・コファクターアッセイシステム（ＲＣＡＳ）法等の公知の方法により定量的に測定することができる。また、第１のタンパク質又は第２のタンパク質そのものを、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）等の蛍光物質で標識し、その蛍光物質に基づいて上記複合体の形成を検出する方法を採用することもできる。
【００４３】
以下では、一例として、本発明の有機金属化合物の検出方法を酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法及びＣｏＡ−ＢＡＰ法に具体化した場合について図１及び図２に基づいて説明する。
本発明を酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法に具体化して適用する場合、第１のタンパク質として、第１の領域とＧＡＬ−４のＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）とを有する融合タンパク質が用いられるとともに、第２のタンパク質として、第２の領域とＧＡＬ−４の転写活性化領域（ＡＤ）とを有する融合タンパク質が用いられる（図１参照）。
【００４４】
酵母中において上記第１及び第２のタンパク質を発現させると、第１のタンパク質はそのＧＡＬ４−ＤＢＤの作用によって、認識配列である上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合する。このとき、評価系内に有機金属化合物が存在すると、この有機金属化合物依存的に第１のタンパク質と第２のタンパク質とが複合体を形成する。そして、第２のタンパク質に含有されるＧＡＬ４−ＡＤの作用によって、ＵＡＳの下流に位置するレポーター遺伝子の発現が誘導される。一方、評価系内に有機金属化合物が存在しない場合には、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが複合体を形成しないため、レポーター遺伝子の発現は誘導されない。したがって、レポーター遺伝子の発現量を測定することにより評価系内に存在する有機金属化合物を分析することができる。
【００４５】
本発明をＣｏＡ−ＢＡＰ法に具体化して適用する場合、第１のタンパク質として、第１の領域と固定化用タグ領域とを有する融合タンパク質が用いられるとともに、第２のタンパク質として、第２の領域と検出用タグ領域としてのＢＡＰ領域とを有する融合タンパク質が用いられる（図２参照）。
【００４６】
まず、第１のタンパク質を、その固定化用タグ領域を利用してマイクロプレート等の固相上に固定化する。ここに、有機金属化合物の存在下、第２のタンパク質を加えると、有機金属化合物依存的に第１のタンパク質と第２のタンパク質とが複合体を形成する。続いて、第１のタンパク質と複合体を形成しなかった遊離状態の第２のタンパク質を除去した後、第２のタンパク質のＢＡＰ活性に基づいて上記複合体量を測定することにより評価系内に存在する有機金属化合物を分析する。ＢＡＰ活性の測定は、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐ（ＮＰＰ）を用いて行なわれる。遊離状態の第２のタンパク質を除去した後、ＮＰＰを添加すると、複合体を形成する第２のタンパク質のＢＡＰ活性により、ＮＰＰは発色性の生成物（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）に加水分解される。この生成物の発色度合を測定することによりＢＡＰ活性を測定する。
【００４７】
次に本実施形態における作用効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態の有機金属化合物の検出方法及び有機金属化合物検出剤では、有機金属化合物の存在下において複合体を形成する第１のタンパク質と第２のタンパク質とを用いている。そして、第１のタンパク質として、少なくとも第１の領域を有するタンパク質であり、第１の領域が、（ａ）レチノイドＸ受容体又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γのリガンド結合領域を構成するアミノ酸配列、若しくは（ｂ）該リガンド結合領域を構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されるタンパク質を用いている。
【００４８】
そして、第２のタンパク質として、少なくとも第２の領域を有するタンパク質であり、第２の領域が、（ｃ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベーター１のレセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｄ）該レセプター・インタラクション・ドメインを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、前記複合体の形成能を有するアミノ酸配列、から構成されるタンパク質を用いている。
【００４９】
これにより、試験試料中に存在する有機金属化合物の定量的な測定を簡易かつ安価に行なうことができる。とくに、本構成によれば、有機金属化合物を高感度に検出することができる。
【００５０】
（２）本実施形態の有機金属化合物の検出方法及び有機金属化合物検出剤では、第２のタンパク質として、（ｅ）ＰＧＣ１αのＲＩＤを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｆ）該ＲＩＤを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、上記複合体形成能を有するアミノ酸配列、から構成される第２の領域を有するタンパク質を用いている。これにより、より低濃度の有機金属化合物の検出が可能となる。
【００５１】
（３）本実施形態の有機金属化合物の検出方法及び有機金属化合物検出剤では、第２のタンパク質として、（ｇ）ＰＧＣ１βのＲＩＤを構成するアミノ酸配列、若しくは（ｈ）該ＲＩＤを構成するアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、上記複合体形成能を有するアミノ酸配列、から構成される第２の領域を有するタンパク質を用いている。これにより、有機金属化合物の中でも特定の有機金属化合物を特異的に検出することが可能となる。例えば、有機金属化合物としてＴＢＴＣｌ及びＴＰＴＣｌがともに存在する評価系において、ＴＢＴＣｌのみを特異的に検出することができる。
【００５２】
（４）本実施形態の有機金属化合物の検出方法及び有機金属化合物検出剤では、第１のタンパク質として、（ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列、若しくは（ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、配列番号３に示すアミノ酸配列と同等の前記有機金属化合物に対する結合能及び前記複合体形成能を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、から構成される第１の領域を有するタンパク質を用いている。これにより、内因性リガンドの検出を抑制しつつ、有機金属化合物の検出が可能となる。
【００５３】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・  本実施形態の有機化合物検出剤を含有するキットとして適用してもよい。
・  有機金属化合物検出剤において、第１のタンパク質と第２のタンパク質は、同一剤中に配合されても、別々に保存されてもよい。
【００５４】
・  有機金属化合物検出剤は溶媒に溶解された溶液の形態でも、粉末の形態でもよい。
・  有機金属化合物の検出方法において、被検体、第１のタンパク質及び第２タンパク質の配合順は特に問わない。
【００５５】
・  有機金属化合物検出剤及び有機金属化合物の検出方法において、第１のタンパク質と第２のタンパク質の濃度は、検出方法及び被検体の濃度等に応じ適宜設定可能である。
【実施例】
【００５６】
次に、各試験例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明する。
＜本発明を酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法に適用した試験＞
本試験では、有機金属化合物検出剤に含有される、第１のタンパク質として第１の領域とＧＡＬ−４のＤＮＡ結合領域とを有する融合タンパク質を用いるとともに、第２のタンパク質として第２の領域とＧＡＬ−４の転写活性化領域とを有する融合タンパク質を用いている。以下では、ＤＮＡ結合領域をＤＢＤ、転写活性化領域をＡＤとして記載する。なお、本試験では、レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼを用いるとともに、ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＯＮＰＧ）を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性（発現量）を測定している。このＯＮＰＧはβ−ガラクトシダーゼにより加水分解されることによって発色を示す物質（ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）を生成するものであり、生成物の発色を測定することによってβ−ガラクトシダーゼの活性を測定することができる。
【００５７】
［１］第１のタンパク質を発現するプラスミドの構築
（ＧＡＬ４−ＲＸＲ：ＧＡＬ４−ＤＢＤとＲＸＲのＬＢＤとを有する融合タンパク質）
配列番号１に示すアミノ酸配列から構成される第１の領域とＧＡＬ４−ＤＢＤとを有するタンパク質を発現するプラスミドを構築した。
【００５８】
ヒトＲＸＲαをコードする配列をヒト絨毛ガン細胞株ＪＥＧ−３細胞由来のｃＤＮＡを鋳型とし、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＰＣＲを行うことで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入した。挿入した配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されているものと一致することを確認した後、ヒトＲＸＲα配列を挿入したプラスミドを鋳型としてヒトＲＸＲαのＬＢＤ（２０１−４６２ａ．ａ．）配列を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＰＣＲを行うことで増幅するとともに、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉサイトを利用して、ｐＧＢＫＴ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入し、プラスミドを構築した。
【００５９】
（ＧＡＬ４−変異ＲＸＲ：ＧＡＬ４−ＤＢＤと変異ＲＸＲのＬＢＤとを有する融合タンパク質）
配列番号３に示すアミノ酸配列から構成される第１の領域とＧＡＬ４−ＤＢＤとを有するタンパク質を発現するプラスミドを構築した。
【００６０】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ  ２  ｃｈａｐｔｅｒ  １３に記述されている、ＰＣＲを用いた部位特異的変異導入法により、ヒトＲＸＲαの３１６番目のアルギニンがアラニンとなるように変異が導入されたＲＸＲ  ＬＢＤを作成した。同様にして、３２６番目のロイシンがアラニンとなるようにさらに変異を導入し、これをｐＧＢＫＴ７に挿入し、プラスミドを構築した（具体的な変異導入方法については、特開２００８−０４４９０２号公報を参照）。
【００６１】
［２］第２のタンパク質を発現するプラスミドの構築
（ＧＡＬ４−ＰＧＣ１α：ＧＡＬ４−ＡＤとＰＧＣ１αのＲＩＤとを有する融合タンパク質）
配列番号４に示すアミノ酸配列から構成される第２の領域とＧＡＬ４−ＡＤとを有するタンパク質を発現するプラスミドを構築した。
【００６２】
ヒトＰＧＣ１αのＲＩＤ（１−１８８ａ．ａ．）をコードする配列を、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ  ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＰＣＲを行うことで増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に挿入した。挿入した配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されているものと一致することを確認した後、Ｓｍａ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉを用いて配列を切り出し、ｐＧＡＤ４２４（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入し、プラスミドを構築した。
【００６３】
（ＧＡＬ４−ＰＧＣ１β：ＧＡＬ４−ＡＤとＰＧＣ１βのＲＩＤとを有する融合タンパク質）
配列番号５に示すアミノ酸配列から構成される第２の領域とＧＡＬ４−ＡＤを有するタンパク質を発現するプラスミドを構築した。
【００６４】
ヒトＰＧＣ１βのＲＩＤ（１−２６４ａ．ａ．）をコードする配列を、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ  ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄを用いてＰＣＲを行うことで増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−に挿入した。挿入した配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されているものと一致することを確認した後、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉを用いて配列を切り出し、ｐＧＡＤ４２４に挿入し、プラスミドを構築した。
【００６５】
［３］酵母へのトランスフォーメーション
酵母（Ｙ１９０株）をＹＰＤＡ培地１５ｍＬ（１トランスフォーメーションあたり）で３０℃、１６〜２４時間培養後、遠心分離処理（室温、３０００ｒｐｍ、５分）により、集菌し、Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、酢酸リチウム／ＴＥ溶液で洗浄後、１５０μＬの酢酸リチウム／ＴＥ溶液で懸濁した。懸濁した酵母を１．５ｍＬチューブに移し、各第１のタンパク質を発現するプラスミド及び各第２のタンパク質を発現するプラスミドをそれぞれ１μｇ相当量、キャリアーＤＮＡ溶液（ウシ胸腺ＤＮＡ、ＳＩＧＭＡ）を７μＬ添加し、酢酸リチウム／ＴＥ／ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液８５０μＬを加え、よく混和した。第１のタンパク質と第２のタンパク質の組合せを表１に示す。
【００６６】
【表１】
2010168322.tif 000006
混和後、３０℃で３０分、４２℃で１５分インキュベートした後、遠心分離処理（室温、３０００ｒｐｍ、３分）を行い、酢酸リチウム／ＴＥ／ＰＥＧ溶液を除去した。沈殿を５００μＬの超純水で懸濁し、再度、遠心分離処理（室温、３０００ｒｐｍ、３分）を行い、上清を除去した。その後、２００μＬの酢酸リチウム／ＴＥで再懸濁し、ＳＤ-Ｌ／−Ｔプレートに塗布した。プレートは適当な大きさのコロニーが得られるまで（２〜４晩）３０℃でインキュベートし、コロニーが生えたプレートはβ−ガラクトシダーゼ活性の測定時まで４℃で保存した。
【００６７】
［４］β−ガラクトシダーゼ活性の測定
第１のタンパク質を発現するプラスミド及び第２のタンパク質を発現するプラスミドを導入した酵母を１５ｍＬのＳＤ-Ｌ／−Ｔ培地に植菌した後、３０℃で一晩培養し、前培養液とした。前培養液を１５０μＬとり、９６ウェルプレートに移し、プレートリーダーで６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）を測定した上で、前培養液をＯＤ６００＝０．０５となるようにＳＤ-Ｌ／−Ｔ培地で希釈し、希釈液２５０μＬを１．５ｍＬチューブに移した。
【００６８】
そして、有機金属化合物を含有する試験試料を２．５μＬ加え、混和した後、３０℃で４時間培養した。培養後、培養液を１５０μＬとり、９６ウェルプレートに移し、プレートリーダーでＯＤ６００を測定した。残りの培養液１００μＬを遠心分離処理（室温、１５，０００ｒｐｍ、５分）し、上清を除き、１ｍｇ／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ（生化学バイオビジネス株式会社製）を含むＺ−ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）を２００μＬ加え、混和した後、３７℃で３０分静置し、酵母を溶解した。
【００６９】
なお、試験試料中には、塩化トリメチルスズ（ＴＭＴＣｌ）、ＴＥＴＢｒ、ＴＰｒＴＣｌ、ＴＰｅＴＣｌ、ＴＣｈＴＯＨ、水素化トリオクチルスズ（ＴＯＴＨ）、三塩化モノブチルスズ（ＭＢＴＣｌ３）、二塩化ジブチルスズ（ＤＢＴＣｌ２）、ＴＢＴＣｌ、ＴｅＢＴ、四塩化スズ（ＳｎＣｌ４）、三塩化フェニルスズ（ＭＰＴＣｌ３）、ＤＰＴＣｌ２、ＴＰＴＯＨ、ＴＢＴＢｒ、ＴＢＴＨ、ＴＰＴＣｌ、ＴＢＶＴ、トリフェニル鉛（ＴＰＬ）、トリフェニルビスマス（ＴＰＢｉ）、ＴＰＡｓのうちのいずれか一つの有機金属化合物がそれぞれ含有されている。また、各試料溶液中における有機金属化合物の濃度は、１×１０−８〜１×１０−４Ｍの範囲で調整されている。なお、内因性リガンドである９ｃＲＡを含有する試験試料についても同様の試験を行なった。
【００７０】
酵母の溶解を確認した後、４ｍｇ／ｍＬのＯＮＰＧを含むＺ−ｂｕｆｆｅｒを４０μＬ加えて混和し、３０℃で発色反応を開始させ、３０分後に１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液を１００μＬ加えて反応を停止させた。遠心分離処理（室温、１５０００ｒｐｍ、５分）後、上清１５０μＬを９６ウェルプレートに移し４１５ｎｍの吸光度（ＯＤ４１５）を測定し、以下の式を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性（β−ｇａｌ活性）を算出した。
【００７１】
β−ｇａｌ活性＝１０００×ＯＤ４１５／｛ＯＤ６００×菌量（ｍｌ）×反応時間（分）｝
その結果をグラフ化したものを図３〜２６に示す。なお、図３〜８は試験例１の結果を、図９〜１４は試験例２の結果を、図１５〜２０は試験例３の結果を、図２１〜２６は試験例４の結果をグラフ化したものをそれぞれ示している。
【００７２】
図３〜２６に示すように、試験試料に含有される有機金属化合物がＴＥＴＢｒ、ＴＰｒＴＣｌ、ＴＰｅＴＣｌ、ＴＣｈＴＯＨ、ＴＢＴＣｌ、ＴｅＢＴ、ＤＰＴＣｌ２、ＴＰＴＯＨ、ＴＢＴＢｒ、ＴＢＴＨ、ＴＰＴＣｌ、ＴＢＶＴ、ＴＰＬ、ＴＰＡｓである場合、その有機金属化合物の濃度依存的にβ−ガラクトシダーゼ活性が上昇する傾向を示した。したがって、本発明の有機金属化合物検出剤及び検出方法により、ＴＥＴＢｒ、ＴＰｒＴＣｌ、ＴＰｅＴＣｌ、ＴＣｈＴＯＨ、ＴＢＴＣｌ、ＴｅＢＴ、ＤＰＴＣｌ２、ＴＰＴＯＨ、ＴＢＴＢｒ、ＴＢＴＨ、ＴＰＴＣｌ、ＴＢＶＴ、ＴＰＬ、ＴＰＡｓを定量的に検出可能であることが確認された。
【００７３】
また、第１のタンパク質としてＧＡＬ４−変異ＲＸＲを用いるとともに第２のタンパク質としてＧＡＬ４−ＰＧＣ１βを用いた試験例４では、ＴＰｒＴＣｌ、ＴＰｅＴＣｌ、ＴＣＨＴＯＨ、ＴＢＴＣｌ、ＴＢＴＢｒ、ＴＢＴＨに対する反応性と比較してフェニル基を側鎖にもつＴＰＴＯＨ、ＴＰＴＣｌに対する反応性が著しく乏しいことが分かる。この結果から試験例４は下記一般式（２）示される有機金属化合物の検出に適していることが示唆される。
【００７４】
【化５】
2010168322.tif 000007
（式中、Ｍｅは、Ｓｎ、Ｐｂ又はＡｓを示す。Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又はビニル基を示す。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なっていてもよく、それぞれ炭素数２〜７のアルキル基又はシクロアルキル基を示す。）
したがって、試験例４、又は試験例４と同等の結合活性を有する有機金属化合物検出剤を用いる（とくに、ＰＧＣ１βのＲＩＤを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域を有する第２のタンパク質を用いる）ことで、上記一般式（２）に示す有機金属化合物と側鎖にフェニル基を有する有機金属化合物とが混合されている試験試料を評価する場合に、上記一般式（２）に示す有機金属化合物を特異的に検出することができると考えられる。つまり、ＴＢＴＣｌとＴＰＴＣｌとが混合される試験試料においては、ＴＢＴＣｌを特異的に検出することができる。
【００７５】
また、試験例２及び４の結果から、第１のタンパク質としてＧＡＬ４−変異ＲＸＲを用いた場合には、内因性リガンドである９ｃＲＡを検出しないことが確認された。
（比較試験）
比較試験として、ヒトＴＩＦ２のＲＩＤを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域とＧＡＬ４−ＡＤとを有する融合タンパク質を作製し、これを第２のタンパク質の代わりに用いるとともにＧＡＬ４−変異ＲＸＲを第１のタンパク質として用いた場合における検出試験を行なった。本試験における第１のタンパク質と第２のタンパク質との組合せを比較例１とする。
【００７６】
まず、ヒトＴＩＦ２のＲＩＤを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域とＧＡＬ４−ＡＤを有するタンパク質を発現するプラスミド（ＧＡＬ４−ＴＩＦ２）を構築した。ヒトＴＩＦ２のＲＩＤ（５７３−８２０ａ．ａ．）をコードする配列を、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ  ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄを用いてＰＣＲを行うことで増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−に挿入した。挿入した配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されているものと一致することを確認した後、ｐＧＡＤ４２４に挿入し、プラスミドを構築した。
【００７７】
酵母へのトランスフォーメーション及びβ−ガラクトシダーゼ活性の測定は、上記と同様の方法を用いて行なった。本試験では、算出したβ−ガラクトシダーゼ活性をグラフ化するとともに、同グラフから各有機金属化合物を検出しはじめる濃度、つまり検出可能最小濃度（Ｍ）を求め、試験例２を用いた場合との比較を行なった。その結果を表２〜表４に示す。
【００７８】
【表２】
2010168322.tif 000008
【００７９】
【表３】
2010168322.tif 000009
【００８０】
【表４】
2010168322.tif 000010
表２〜４の結果から、ＴＩＦ２のＲＩＤを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域を有する第２のタンパク質を用いた比較例１と比較して、ＰＧＣ１αのＲＩＤを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域を有する第２のタンパク質を用いた試験例２では、各有機金属化合物に対する検出可能最小濃度が１０〜１００倍低いことが確認された。したがって、試験例４、又は試験例４と同等の結合活性を有する有機金属化合物検出剤を用いた場合（とくに、ＰＧＣ１αのＲＩＤを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域を有する第２のタンパク質を用いた場合）には、従来技術において用いられているＴＩＦ２由来のＲＩＤを用いた場合と比較して、より高感度に有機金属化合物を検出することができることが示唆される。
【００８１】
＜本発明をＣｏＡ−ＢＡＰ法に適用した試験＞
本試験では、第１のタンパク質として第１の領域と固定化用タグ領域とを有する融合タンパク質を用いるとともに、第２のタンパク質として第２の領域と検出用タグ領域とを有する融合タンパク質を用いている。なお、本試験では、固定化用タグ領域としてＧＳＴを用いるとともに、検出用タグ領域としてＢＡＰを用いている。
【００８２】
［１］第１のタンパク質を発現するプラスミドの構築
（ＧＳＴ−ＰＰＡＲγ：ＧＳＴ領域とＰＰＡＲγのＬＢＤとを有する融合タンパク質）
配列番号２に示すアミノ酸配列から構成される第１の領域とＧＳＴ領域とを有するタンパク質を発現するプラスミドを構築した。
【００８３】
ヒト脂肪組織由来Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．社製）をテンプレートとし、逆転写酵素ＲｅｖＴｒａＡｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒト脂肪組織由来ｃＤＮＡを得た。次に、得られたヒト脂肪組織由来ｃＤＮＡをテンプレートとし、ＤＮＡポリメラーゼ  ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄを用いてＰＣＲを行い、ヒトＰＰＡＲγＬＢＤ（２０５−５０５ａ．ａ．）をコードする配列を増幅した。増幅したＤＮＡ断片は塩基配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されているものと一致することを確認するとともに、Ｓｍａ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉサイトを利用してｐＧＥＸ−４Ｔ−１に挿入してプラスミドを構築した。
【００８４】
[２]大腸菌による大量発現及び精製
作製したプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にトランスフォームした。これを、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢプレートに植菌し、３７℃で一晩培養した。生えてきたコロニーのうちの１つを回収し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地でＯＤ６００＝０．４まで３７℃にて振盪培養した。その後、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ナカライテスク社製）を終濃度１．０ｍＭになるように添加し、３０℃で３時間振盪培養し、ＧＳＴ−ＰＰＡＲγを大量発現させた。
【００８５】
次に、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して集菌したペレットを、１／１００ｃｕｌｔｕｒｅ  ｖｏｌｕｍｅのＢｕｆｆｅｒ１（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）に再懸濁し、−８０℃で一晩放置した。室温にて融解した菌液にＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加し室温に２０分間放置した。ここに、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  （ナカライテスク社製）を加えた後、Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０社製）を用いて、菌液が半透明になるまで氷上で菌体を超音波破砕した。この大腸菌破砕液に、終濃度０．５ＭになるようにＫＣｌを加え、遠心分離処理（１２０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、可溶性画分を得た。１Ｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅに対して１ｍＬベットヴォリュームのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥ  ヘルスケアバイオサイエンス社製）を予めＢｕｆｆｅｒ５（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）で平衡化しておき、ここに可溶性画分を加え、１時間以上、４℃にてインキュベートした。
【００８６】
その後、樹脂および遠心上清を全てカラムに詰め、Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈが落ちたことを確認したのち、ベットヴォリュームの１０倍量のｂｕｆｆｅｒ５で樹脂を洗浄した。そして、樹脂に残った水分を、遠心分離処理（７００ｒｐｍ、４℃、１０秒）することにより除いた。ベットヴォリュームの３倍量のＢｕｆｆｅｒ１に溶解させたＧＳＨ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（還元型グルタチオン／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）をカラムに添加し、ＧＳＴ−ＰＰＡＲγを樹脂から溶出させた。
【００８７】
［３］第２のタンパク質を発現するプラスミドの構築
（ＢＡＰ−ＰＧＣ１α：ＢＡＰ領域とＰＧＣ１αのＲＩＤとを有する融合タンパク質）
配列番号４に示すアミノ酸配列から構成される第２の領域とＢＡＰ領域とを有するタンパク質を発現するプラスミドを構築した。
【００８８】
大腸菌Ｋ１２株由来  ＢＡＰ  ８配列をＸｈｏ  Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉ  サイトを利用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−に挿入し、ｐＢＳ−ＢＡＰとした。ｐＢＳ−ＢＡＰをＳａｌ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉで処理してＢＡＰ  ８配列を切り出し、ｐＥＴ２８ａＳＫＰＨ（ｐＥＴ２８ａのマルチクローニングサイトのＳａｌ  Ｉ-Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトに、ＳＫＰＨ配列（５’-ＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＡ-３’）を挿入することで、新たにＫｐｎ  ＩおよびＰｓｔ  Ｉサイトを創出したプラスミド）のＳａｌ  Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉサイトに挿入し、ｐＥＴ−ＢＡＰとした。
【００８９】
次に、ヒト肝臓組織由来Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．社製）をテンプレートとし、逆転写酵素ＲｅｖＴｒａＡｃｅを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒト肝臓組織由来ｃＤＮＡを得た。これをテンプレートとし、ＤＮＡポリメラーゼ  ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄを用いてＰＣＲを行い、ヒトＰＧＣ１α  ＲＩＤ（１−１８８ａ．ａ．）をコードする配列を増幅した。増幅したＤＮＡ断片は塩基配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されているものと一致することを確認し、それぞれＢａｍＨ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉサイトを用いてｐＥＴ−ＢＡＰに挿入し、プラスミドを構築した。
【００９０】
（ＢＡＰ−ＴＩＦ２：ＢＡＰ領域とＴＩＦ２のＲＩＤとを有する融合タンパク質）
（ＢＡＰ−ｐ３００：ＢＡＰ領域とｐ３００のＲＩＤとを有する融合タンパク質）
（ＢＡＰ−ＳＲＣ１：ＢＡＰ領域とＳＲＣ１のＲＩＤとを有する融合タンパク質）
また、比較試験を行なうために、ヒトＴＩＦ２のＲＩＤ、ヒトｐ３００のＲＩＤ、又はヒトＳＲＣ１のＲＩＤを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域とＢＡＰ領域とを有する融合タンパク質を作製した。ｐ３００及びＳＲＣ１は、ＰＣＧ１やＴＩＦ２と同様に転写共役因子として機能することが知られているタンパク質であり、それぞれＲＩＤを有している。
【００９１】
ヒトＴＩＦ２のＲＩＤ（５７３−８２０ａ．ａ．）、ヒトｐ３００のＲＩＤ（１−１９９ａ．ａ．）、又はヒトＳＲＣ１のＲＩＤ（５６５−８２４ａ．ａ．）をコードする配列をヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ  ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄを用いてＰＣＲを行うことで増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に挿入した。以下、ＢＡＰ−ＰＧＣ１αの作成時と同様の操作を行い、ＢＡＰ−ＴＩＦ２、ＢＡＰ−ｐ３００、又はＢＡＰ−ＳＲＣ１を発現するプラスミドを作製した。
【００９２】
[４]大腸菌による大量発現及び精製
作製した各プラスミドをそれぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にトランスフォームし、２０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢプレートに植菌し、３７℃で一晩培養した。生えてきたコロニーのうち１つをピックアップし、２０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ培地でＯＤ６００＝０．４まで３７℃にて振盪培養した。以下、ＧＳＴ−ＰＰＡＲγと同様の操作を行い、可溶性画分を得た。
【００９３】
次に、１Ｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅに対して２ｍＬベットヴォリュームの  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｒｅｓｉｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を予めＢｕｆｆｅｒ５で平衡化しておき、ここに可溶性画分を加えた。さらに終濃度５ｍＭになるようＩｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ７．０、和光純薬社製）を加え、１時間以上、４℃にてインキュベートした。樹脂および遠心上清を全てカラムに詰め、Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈが落ちたことを確認したのち、ベットヴォリュームの１０倍量のＢｕｆｆｅｒ１に溶解させた２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ７．０）で樹脂を洗浄した。そして、樹脂に残った水分を、遠心分離処理（７００ｒｐｍ、４℃、１０秒）することにより除いた。ベットヴォリュームの３倍量のＢｕｆｆｅｒ１に溶解させた２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ７．０）をカラムに添加し、各タンパク質（ＢＡＰ−ＰＧＣ１α、ＢＡＰ−ＴＩＦ２、ＢＡＰ−ｐ３００、ＢＡＰ−ＳＲＣ１）を樹脂から溶出させた。
【００９４】
［５］ＢＡＰ活性の測定
第１のタンパク質であるＧＳＴ−ＰＰＡＲγを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）で２０μｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ  Ｐｌａｔｅ  ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ  Ｓｕｒｆａｃｅ）に１ウェルあたり１００μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することで、ＧＳＴ−ＰＰＡＲγをプレートに固定化した。その後、１ウェルあたり２００μＬのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  グリセロール、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）でプレートを３回洗浄した。
【００９５】
洗浄後、第２のタンパク質（ＢＡＰ−ＰＧＣ１α、ＢＡＰ−ＴＩＦ２、ＢＡＰ−ＢＡＰ−ｐ３００、ＢＡＰ−ＳＲＣ１から選ばれるいずれか一つ）をＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）で３０μｇ／ｍＬに希釈し、タンパク質固定化プレートに１ウェルあたり１００μＬずつ添加した。第１のタンパク質と第２のタンパク質の組合せを表５に示す。
【００９６】
【表５】
2010168322.tif 000011
さらに、試料溶液を１μＬずつ添加し、４℃で１時間以上静置した。なお、試験試料中には、有機金属化合物としてＴＰＴＣｌが含有されている。また、試料溶液中における有機金属化合物の濃度は、１×１０−１１〜１×１０−４Ｍの範囲で調整されている。なお、ＰＰＡＲγに対してアゴニスト活性を有する物質として知られているロジグリタゾン（Ｒｏｓｉ）を含有する試験試料についても同様の試験を行なった。
【００９７】
その後、２００μＬのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂで３回洗浄した。洗浄後、ＮＰＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０ｍＭ  ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を１ウェルあたり１００μＬ添加し、３７℃で酵素反応させた。適当な時間静置した後、プレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果をグラフ化したものを図２７に示す。図２７（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ試験例５、比較例２〜４の結果をグラフ化したものである。
【００９８】
図２７の結果から、第２のタンパク質として、ＴＩＦ２、ｐ３００、又はＳＲＣ１のＲＩＤを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域を有するタンパク質を用いた比較例２〜４は、ＴＰＴＣｌを被検体としたときのＢＡＰ活性がロジグリタゾンを被検体としたときのＢＡＰ活性と同等程度、或いはそれ以下の値を示した（図２７（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）参照）。これに対して、第２のタンパク質として、ＰＧＣ１αを構成するアミノ酸配列から構成される第２の領域を有するタンパク質を用いた試験例５は、ＴＰＴＣｌを被検体としたときのＢＡＰ活性がロジグリタゾンを被検体としたときのＢＡＰ活性よりも高い値を示した（図２７（ａ）参照）。したがって、第２のタンパク質において、ＰＧＣ１αのＲＩＤを構成するアミノ酸配列から第２の領域を構成することは、他の転写共役因子のＲＩＤを構成するアミノ酸配列から第２の領域を構成することと比較して、有機金属化合物を精度よく検出する上で非常に有効であることが示唆される。
【図１】
2010168322.tif 000014
【図２】
2010168322.tif 000015
【図３】
2010168322.tif 000016
【図４】
2010168322.tif 000017
【図５】
2010168322.tif 000018
【図６】
2010168322.tif 000019
【図７】
2010168322.tif 000020
【図８】
2010168322.tif 000021
【図９】
2010168322.tif 000022
【図１０】
2010168322.tif 000023
【図１１】
2010168322.tif 000024
【図１２】
2010168322.tif 000025
【図１３】
2010168322.tif 000026
【図１４】
2010168322.tif 000027
【図１５】
2010168322.tif 000028
【図１６】
2010168322.tif 000029
【図１７】
2010168322.tif 000030
【図１８】
2010168322.tif 000031
【図１９】
2010168322.tif 000032
【図２０】
2010168322.tif 000033
【図２１】
2010168322.tif 000034
【図２２】
2010168322.tif 000035
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2010168322.tif 000038
【図２６】
2010168322.tif 000039
【図２７】
2010168322.tif 000040
【配列表】
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