(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍血管新生に関与するＡｎｇ−２（アンギオポエチン−２）活性を調節する、Ａｎｇ−２の特異的結合物質の提供。【解決手段】組換えＤＮＡ分子、タンパク質及び抗体の生産、ならびに組織培養及び細胞形質転換のための標準的な手法であり、特異的結合物質、及びその変異体及び誘導体をコードする核酸分子。該ペプチド及びその変異体及び誘導体はビヒクルに結合し、該ペプチド及びペプチ体をそれを必要とする被験対象に投与することにより、腫瘍を低減する方法、該特異的結合物質の有効量を、それを必要とする被験対象に投与することを含む、被験対象において血管新生を阻止する方法、被験対象において癌を治療する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
ＷＤＰＷＴ（配列番号６５）
を含み、５−５０アミノ酸の長さである、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項２】
アミノ酸配列：
ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６６）
を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項３】
アミノ酸配列：
Ｃｚ２ＷＤＰＷＴ（配列番号６７）
［式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である］
を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項４】
アミノ酸配列：
Ｃｚ２ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６８）
［式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である］
をさらに含む、請求項３に記載のポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項５】
式：
ａ１ａ２ａ３Ｃａ５ＷＤＰＷＴＣａ１２ａ１３ａ１４（配列番号６９）
［式中、
ａ１、ａ２及びａ３は、各々独立してアミノ酸残基であり；
ａ５は、アミノ酸残基であり；
ａ１２は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ａ１３は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ａ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項６】
式中、
ａ１はＶ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ａ２はＶ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ａ３はＡ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＨであり；
ａ８はＡ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｄ又はＥであり；
ａ１２はＳ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；
ａ１３はＬ、Ｔ又はＨであり；
ａ１４はＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＭである、
請求項５に記載のポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項７】
式中、
ａ１はＱであり；
ａ２はＥであり；
ａ３はＥであり；
ａ５はＤ又はＥであり；
ａ１２はＤ又はＥであり；
ａ１３はＨであり；及び
ａ１４はＭである、
請求項５に記載のポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項８】
式：
ｂ１ｂ２ｂ３ｂ４ｂ５ｂ６Ｃｂ８ＷＤＰＷＴＣｂ１５ｂ１６Ｂ１７ｂ１８ｂ１９ｂ２０（配列番号７０）
［式中、
ｂ１は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ２は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｂ３、ｂ４、ｂ５及びｂ６は、各々独立して、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ８は、アミノ酸残基であり；
ｂ１５は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ１６は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｂ１７は、存在しないか又は中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｂ１８、ｂ１９及びｂ２０は、各々独立して、存在しないか又はアミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項９】
式中、
ｂ１は、存在しないか又はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ２は、存在しないか又はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ３は、存在しないか又はＡ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｒ又はＨであり；
ｂ４は、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ５は、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ６は、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＨであり；
ｂ８は、Ａ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｄ又はＥであり；
ｂ１５は、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；
ｂ１６は、Ｌ、Ｔ又はＨであり；
ｂ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＭであり；
ｂ１８は、存在しないか又はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｙ、Ｑ、Ｄ、Ｅ又はＲであり；
ｂ１９は、存在しないか又はＶ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ又はＲであり；及び、
ｂ２０は、存在しないか又はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｋ又はＲである、
請求項８に記載のポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項１０】
式中、
ｂ１は、存在しないか又はＰ又はＴであり；
ｂ２は、存在しないか又はＩ又はＮであり；
ｂ３は、存在しないか又はＲ又はＩであり；
ｂ４は、Ｑであり；
ｂ５は、Ｅであり；
ｂ６は、Ｅであり；
ｂ８は、Ｄ又はＥであり；
ｂ１５は、Ｄ又はＥであり；
ｂ１６は、Ｈであり；
ｂ１７は、Ｍであり；
ｂ１８は、存在しないか又はＷ又はＰであり；
ｂ１９は、存在しないか又はＧ又はＥであり；及び、
ｂ２０は、存在しないか又はＶ又はＫである、
請求項８に記載のポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項１１】
配列番号４、及び配列番号７６から配列番号１１８（両端を含む）から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【表１】
2010189394.tif 000068
2010189394.tif 000069
【請求項１２】
請求項１、５、８又は１１に記載の少なくとも１個のペプチド及びビヒクルを含み、Ａｎｇ−２に結合することができる融合ポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項１３】
前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール群、糖質及びオリゴ糖の少なくとも１つである、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
環状である、請求項１、５、８又は１１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１、５、８又は１１に記載のポリペプチドの二量体又は多量体。
【請求項１６】
式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
［式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３であり；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４であり；
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上は、各々独立して、
（ａ）該ポリペプチドが５−５０アミノ酸の長さである、アミノ酸配列ＷＤＰＷＴ
（配列番号６５）；
（ｂ）アミノ酸配列ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６６）；
（ｃ）アミノ酸配列Ｃｚ２ＷＤＰＷＴ（配列番号６７）；及び
（ｄ）アミノ酸配列Ｃｚ２ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６８）；
［式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である］
から成る群より選択されるポリペプチドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーである］
から選択され、及び
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａ及びｂの少なくとも１つが１であることを条件として、各々独立して０又は１である］
を有する物質及びその多量体の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項１７】
ｚ２が、Ａ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｄ又はＥである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上が、各々独立して、配列番号４、及び配列番号７６から配列番号１１８（両端を含む）から成る群より選択されるポリペプチドを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
式：
Ｘ１−Ｆ１
又は、
Ｆ１−Ｘ２
の、請求項１６に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項２０】
式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１
の、請求項１６に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項２１】
式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の、請求項１６に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項２２】
式：
Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の、請求項１６に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項２３】
Ｆ１がＦｃドメイン又はそのフラグメントである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１、５、８又は１１に記載の組成物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
前記細胞が原核細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記細胞が真核細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
式：
Ｐｃ２Ｄｃ４Ｌｃ６ｃ７ｃ８ＬＹ（配列番号７１）
［式中、
ｃ２は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ４は、Ａ、Ｄ又はＥであり；
ｃ６は、酸性アミノ酸残基であり；
ｃ７は、アミノ酸残基であり；及び
ｃ８は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項３２】
ｃ２がＬ又はＭである、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
ｃ６がＤ又はＥである、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
式：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４Ｐｄ６Ｄｄ８Ｌｄ１０ｄ１１ｄ１２ＬＹｄ１５ｄ１６ｄ１７ｄ１８ｄ１９ｄ２０ｄ２１ｄ２２（配列番号７２）
［式中、
ｄ１は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ２は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ３は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｄ４は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ６は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｄ８は、Ａ、Ｄ又はＥであり；
ｄ１０は、酸性アミノ酸残基であり；
ｄ１１は、アミノ酸残基であり；
ｄ１２は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ１５は、存在しないか又は中性疎水性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ１６は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ１７は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｄ１８は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｄ１９は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ２０は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ２１は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ２２は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項３５】
式中、
ｄ１は、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｒ又はＨであり；
ｄ２は、Ｔ、Ｑ、Ｎ又はＫであり；
ｄ３は、Ｆであり；
ｄ４は、Ｍ、Ｑ、Ｅ又はＫであり；
ｄ６は、Ｌ又はＭであり；
ｄ８は、Ｄ又はＥであり；
ｄ１０は、Ｅであり；
ｄ１１は、Ｑ又はＥであり；
ｄ１２は、Ｔ又はＲであり；
ｄ１５は、Ｙ、Ｄ、Ｅ又はＫであり；
ｄ１６は、Ｑであり；
ｄ１７は、Ｗ又はＦであり；
ｄ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＴであり；
ｄ１９は、Ｌ、Ｆ又はＹであり；
ｄ２０は、Ｑ、Ｄ又はＥであり；
ｄ２１は、存在しないか、Ｑ又はＨであり；
ｄ２２は、存在しないか、Ａ、Ｌ、Ｇ、Ｓ又はＲである、
請求項３４に記載のポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項３６】
配列番号６、及び配列番号１１９から配列番号１４２（両端を含む）から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【表２】
2010189394.tif 000070
2010189394.tif 000071
【請求項３７】
請求項３１、３４又は３６に記載の少なくとも１個のペプチド及びビヒクルを含み、Ａｎｇ−２に結合することができる融合ポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項３８】
前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール群、糖質及びオリゴ糖の少なくとも１つである、請求項３７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
環状である、請求項３１、３４又は３６に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３１、３４又は３６に記載のポリペプチドの二量体又は多量体。
【請求項４１】
式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
［式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３であり；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４であり；
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上は、各々独立して請求項３１、３４又は３６に記載のポリペプチドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーである］
から選択され；及び
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａ及びｂの少なくとも１つが１であることを条件として、各々独立して０又は１である］
を有する物質及びその多量体の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項４２】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上が、各々独立して、配列番号６、及び配列番号１１９から配列番号１４２（両端を含む）から成る群より選択されるポリペプチドを含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
式：
Ｘ１−Ｆ１
又は、
Ｆ１−Ｘ２
の、請求項４１に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項４４】
式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１
の、請求項４１に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項４５】
式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の、請求項４１に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項４６】
式：
Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の、請求項４１に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項４７】
Ｆ１がＦｃドメイン又はそのフラグメントである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４８】
Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４９】
請求項３１、３４又は３６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５０】
請求項４９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５１】
請求項５０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
前記細胞が原核細胞である、請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
前記細胞が大腸菌細胞である、請求項５２に記載の宿主細胞。
【請求項５４】
前記細胞が真核細胞である、請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
式：
ＲＰｅ３ｅ４ｅ５ｅ６ｅ７Ｇ（配列番号７３）
［式中、
ｅ３は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｅ４は、酸性アミノ酸残基であり；
ｅ５は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｅ６は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｅ７は、中性疎水性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項５６】
ｅ３がＹ又はＣである、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ｅ４がＤ又はＥである、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ｅ６がＩ又はＭである、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
式：
ｆ１ｆ２ｆ３ｆ４ＲＰｆ７ｆ８ｆ９ｆ１０ｆ１１Ｇｆ１３ｆ１４ｆ１５ｆ１６ｆ１７ｆ１８ｆ１９ｆ２０（配列番号７４）
［式中、
ｆ１は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ２は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ３は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｆ４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ７は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ８は、酸性アミノ酸残基であり；
ｆ９は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｆ１０は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｆ１１は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｆ１３は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１５は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１６は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１７は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｆ１８は、中性疎水性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｆ１９は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及び
ｆ２０は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項６０】
式中、
ｆ１は、Ｓ、Ａ又はＧであり；
ｆ２は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
ｆ３は、Ｑ、Ｇ又はＤであり；
ｆ４は、Ｌ、Ｍ又はＱであり；
ｆ７は、Ｃ又はＹであり；
ｆ８は、Ｅ又はＤであり；
ｆ９は、Ｅ、Ｇ又はＤであり；
ｆ１０は、Ｉ又はＭであり；
ｆ１１は、Ｆ又はＬであり；
ｆ１３は、Ｃ又はＷであり；
ｆ１４は、Ｇ又はＰであり；
ｆ１５は、Ｔ又はＮであり；
ｆ１６は、Ｑ、Ｙ又はＫであり；
ｆ１７は、Ｎ、Ｄ又はＱであり；
ｆ１８は、Ｌ、Ｖ、Ｗ又はＲであり；
ｆ１９は、Ａ、Ｑ、Ｙ又はＩであり；及び、
ｆ２０は、Ｌ、Ａ、Ｇ又はＶである、
請求項５９に記載のポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項６１】
配列番号３、及び配列番号１４３から配列番号１４８（両端を含む）から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【表３】
2010189394.tif 000072
【請求項６２】
請求項５５、５９又は６１に記載の少なくとも１個のポリペプチド及びビヒクルを含み、Ａｎｇ−２に結合することができる融合ポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項６３】
前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール群、糖質及びオリゴ糖の少なくとも１つである、請求項６２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６４】
環状である、請求項５５、５９又は６１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
請求項５５、５９又は６１に記載の化合物の二量体又は多量体。
【請求項６６】
式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
［式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３であり；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４であり；
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上は、各々独立して請求項５５、５９又は６１に記載のポリペプチドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーである］
から選択され；及び
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａ及びｂの少なくとも１つが１であることを条件として、各々独立して０又は１である］
を有する物質及びその多量体の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項６７】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上が、各々独立して、配列番号３、及び配列番号１４３から配列番号１４８（両端を含む）から成る群より選択されるポリペプチドを含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
式：
Ｘ１−Ｆ１
又は、
Ｆ１−Ｘ２
の、請求項６６に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項６９】
式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１
の、請求項６６に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項７０】
式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の、請求項６６に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項７１】
式：
Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の、請求項６６に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項７２】
Ｆ１がＦｃドメイン又はそのフラグメントである、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７３】
Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７４】
請求項５５、５９又は６１のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７５】
請求項７４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７６】
請求項７５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７７】
前記細胞が原核細胞である、請求項７６に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
前記細胞が大腸菌細胞である、請求項７７に記載の宿主細胞。
【請求項７９】
前記細胞が真核細胞である、請求項７６に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
式：
Ｃｇ２Ｇｇ４ｇ５ＤＰＦＴｇ１０ＧＣｇ１３（配列番号７５）
［式中、
ｇ２は、酸性アミノ酸残基であり；
ｇ４は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｇ５は、Ｅ、Ｄ又はＱであり；
ｇ１０は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｇ１３は、酸性残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項８１】
ｇ２がＥ又はＤである、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
ｇ４がＶ又はＭである、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
ｇ１０がＦ又はＱである、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
ｇ１３がＤ又はＥである、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
式：
ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４Ｃｈ６Ｇｈ８ｈ９ＤＰＦＴｈ１４ＧＣｈ１７ｈ１８ｈ１９ｈ２０（配列番号１５８）
［式中、
ｈ１は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｈ２は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｈ３は、酸性アミノ酸残基であり；
ｈ４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｈ６は、酸性アミノ酸残基であり；
ｈ８は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｈ９は、Ｅ、Ｄ又はＱであり；
ｈ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｈ１７は、酸性アミノ酸残基であり；
ｈ１８は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｈ１９は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及び
ｈ２０は、存在しないか又はアミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項８６】
式中、
ｈ１は、存在しないか又はＡ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｋ又はＨであり；
ｈ２は、Ｌ、Ｆ又はＱであり；
ｈ３は、Ｄ又はＥであり；
ｈ４は、Ｗ又はＹであり；
ｈ６は、Ｄ又はＥであり；
ｈ８は、Ｖ又はＭであり；
ｈ１４は、Ｆ又はＱであり；
ｈ１７は、Ｄ又はＥであり；
ｈ１８は、Ｍ、Ｙ、Ｎ又はＫであり；
ｈ１９は、Ｌ又はＱであり；及び、
ｈ２０は、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｋ又はＲである、
請求項８５に記載のポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項８７】
配列番号５、及び配列番号１４９から配列番号１５７（両端を含む）から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【表４】
2010189394.tif 000073
【請求項８８】
請求項８０、８５又は８７に記載の少なくとも１個のペプチド及びビヒクルを含み、Ａｎｇ−２に結合することができる融合ポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項８９】
前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール群、糖質及びオリゴ糖の少なくとも１つである、請求項８８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９０】
環状である、請求項８０、８５又は８７に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
請求項８０、８５又は８７に記載のポリペプチドの二量体又は多量体。
【請求項９２】
式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
［式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３であり；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４であり；
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上は、各々独立して請求項８０、８５又は８７に記載のポリペプチドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーである］
から選択され；及び
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａ及びｂの少なくとも１つが１であることを条件として、各々独立して０又は１である］
を有する物質及びその多量体の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項９３】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上が、各々独立して、配列番号５、及び配列番号１４９から配列番号１５７（両端を含む）から成る群より選択されるポリペプチドを含む、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
式：
Ｘ１−Ｆ１
又は、
Ｆ１−Ｘ２
の、請求項９２に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項９５】
式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１
の、請求項９２に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項９６】
式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の、請求項９２に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項９７】
式：
Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の、請求項９２に記載の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項９８】
Ｆ１がＦｃドメイン又はそのフラグメントである、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９９】
Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載の組成物。
【請求項１００】
請求項８０、８５又は８７のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
請求項１００に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０３】
前記細胞が原核細胞である、請求項１０２に記載の宿主細胞。
【請求項１０４】
前記細胞が大腸菌細胞である、請求項１０３に記載の宿主細胞。
【請求項１０５】
前記細胞が真核細胞である、請求項１０２に記載の宿主細胞。
【請求項１０６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかに記載のポリペプチド、又はその変異体。
【請求項１０７】
配列番号５、配列番号６又は配列番号７のいずれかに記載のポリペプチド、又はその変異体。
【請求項１０８】
式：
（Ｘ１）ｑ−Ｆ１−（Ｘ２）ｒ
［式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１であり；
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１−（Ｌ２）ｔ−Ｐ２であり；
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１−（Ｌ２）ｔ−Ｐ２−（Ｌ３）ｕ−Ｐ３であり；及び、
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１−（Ｌ２）ｔ−Ｐ２−（Ｌ３）ｕ−Ｐ３−（Ｌ４）ｖ−Ｐ４であり；
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上は、各々独立して、
（ａ）該ポリペプチドが５−５０アミノ酸の長さである、アミノ酸配列ＷＤＰＷＴ（配列番号６５）；
（ｂ）アミノ酸配列ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６６）；
（ｃ）式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である、アミノ酸配列Ｃｚ２ＷＤＰＷＴ（配列番号６７）；
（ｄ）式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である、アミノ酸配列Ｃｚ２ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６８）；
（ｅ）式中、ｃ２は中性疎水性アミノ酸残基であり；ｃ４はＡ、Ｄ又はＥであり；ｃ６は酸性アミノ酸残基であり；ｃ７はアミノ酸残基であり；及びｃ８は中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基である、アミノ酸配列Ｐｃ２Ｄｃ４Ｌｃ６ｃ７ｃ８ＬＹ（配列番号７１）；
（ｆ）式中、ｅ３は中性極性アミノ酸残基であり；ｅ４は酸性アミノ酸残基であり；ｅ５は中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｅ６は中性疎水性アミノ酸残基であり；及びｅ７は中性疎水性アミノ酸残基である、アミノ酸配列ＲＰｅ３ｅ４ｅ５ｅ６ｅ７Ｇ（配列番号７３）；
（ｇ）式中、ｇ２は酸性アミノ酸残基であり；ｇ４は中性疎水性アミノ酸残基であり；ｇ５は中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｇ１０は中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及びｇ１３は酸性アミノ酸残基である、アミノ酸配列Ｃｇ２Ｇｇ４ｇ５ＤＰＦＴｇ１０ＧＣｇ１３（配列番号７５）；
（ｈ）配列番号１のポリペプチド；
（ｉ）配列番号２のポリペプチド；及び
（ｊ）配列番号７のポリペプチド；
から成る群より選択されるポリペプチドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーである］
から選択され、及び
ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ及びｖは、ｑ及びｒの少なくとも１つが１であることを条件として、各々独立して０又は１である］
を有する物質及びその多量体の組成物、及び生理的に許容されるその塩。
【請求項１０９】
医薬適合性のその担体と混合して請求項１、３１、５５又は８０に記載の組成物の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項１１０】
請求項１２、１６、３７、４１、６２、６６、８８又は９２に記載の組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において有害な血管新生を阻止する方法。
【請求項１１１】
請求項１２、１６、３７、４１、６２、６６、８８又は９２に記載の組成物の有効量を投与することを含む、被験対象において血管新生を治療する方法。
【請求項１１２】
請求項１２、１６、３７、４１、６２、６６、８８又は９２に記載の組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において血管新生を調節する方法。
【請求項１１３】
請求項１２、１６、３７、４１、６２、６６、８８又は９２に記載の組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において有害な血管新生を特徴とする腫瘍増殖を阻止する方法。
【請求項１１４】
請求項１２、１６、３７、４１、６２、６６、８８又は９２に記載の組成物の治療上有効な量及び化学療法剤を投与することを含む、哺乳類において癌を治療する方法。
【請求項１１５】
前記化学療法剤が、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１及びタキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）の少なくとも１つである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
請求項１２、１６、３７、４１、６２、６６、８８又は９２に記載の組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において血管透過性又は血漿漏出の少なくとも１つを調節する方法。
【請求項１１７】
請求項１２、１６、３７、４１、６２、６６、８８又は９２に記載の組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において、眼血管新生疾患、肥満、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、炎症性疾患、炎症性障害、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、新生物性疾患、骨関連疾患、又は乾癬の少なくとも１つを治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照してここに組み込まれる、２００１年１０月１１日出願の米国特許仮出願通し番号第６０／３２８，６２４号に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、アンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２）を認識し、アンギオポエチン−２に結合する特異的結合物質に関する。より明細には、本発明は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する特異的結合物質及びそのフラグメントの生産、診断的使用及び治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
既存の血管からの新しい血管の形成である血管新生は、多くの生理的及び病的過程にとって不可欠である。通常、血管新生はプロ及び抗血管新生因子によって厳密に調節されているが、癌、眼血管新生疾患、関節炎、及び乾癬などの疾患の場合には、その過程が消失してしまうことがある。Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１：２７−３１（１９９５）。
【０００４】
調節不全の又は有害な血管新生に関連することが知られている多くの疾患が存在する。そのような疾患は、網膜症（糖尿病性網膜症を含む）、加齢性黄斑変性、乾癬、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、リウマチ様又はリウマチ性炎症性疾患などの炎症性疾患、特に関節炎（慢性関節リウマチを含む）、又は慢性喘息、動脈又は移植後アテローム硬化症、子宮内膜症などの他の慢性炎症性疾患、及び新生物性疾患、例えばいわゆる固形腫瘍及び液状（又は造血系）腫瘍（白血病及びリンパ腫など）を含むが、これらに限定されない。有害な血管新生に関連する他の疾患は、当業者には明白である。
【０００５】
多くのシグナル伝達系が血管新生の調節に関係付けられているが、最も広く特性付けられ且つ最も内皮細胞選択的な系は、Ｔｉｅ−２受容体チロシンキナーゼ（「Ｔｉｅ−２」又は「Ｔｉｅ−２Ｒ」（「ＯＲＫ」とも称される）と称される；マウスＴｉｅ−２は「ｔｅｋ」とも称される）及びそのリガンドであるアンギオポエチンを含む（Ｇａｌｅｓ，Ｎ．Ｗ．とＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１０５５−１０６６［１９９９］）。４つの既知のアンギオポエチンが存在する；アンギオポエチン−１（「Ａｎｇ−１」）からアンギオポエチン−４（「Ａｎｇ−４」）まで。これらのアンギオポエチンは「Ｔｉｅ−２リガンド」とも称される。（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ，８７：１１６１−１１６９［１９９６］；Ｇｒｏｓｉｏｓ，Ｋ．ら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，８４：１１８−１２０［１９９９］；Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．ら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［１９９９］；Ｋｏｂｌｉｚｅｋ，Ｔ．Ｉ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：５２９−５３２［１９９８］；Ｌｉｎ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：５５−６０［１９９７］；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．ら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，７９：２１３−２２３［１９９９］；Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３７５：７０−７４［１９９８］；Ｓｈｙｕ，Ｋ．Ｇ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８：２０８１−２０８７［１９９８］；Ｓｕｒｉ，Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ，８７：１１７１―１１８０［１９９６］；Ｓｕｒｉ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：４６８―４７１［１９９８］；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ，９６：１９０４−１９０９［１９９９］；Ｗｉｔｚｅｒｎｂｉｃｈｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１８５１４−１８５２１［１９９８］）。Ａｎｇ−１のＴｉｅ−２への結合は培養内皮細胞における受容体リン酸化を刺激するが、Ａｎｇ−２は、Ｔｉｅ−２受容体リン酸化を作動することと拮抗することの両方が認められている（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ら、［１９９６］、前出；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ら、［１９９７］、前出；Ｋｉｍ，Ｉ．，Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９（３９）：４５４９−４５５２（２０００）；Ｔｅｉｃｈｅｒｔ−Ｋｕｌｉｓｚｅｗｓｋａ，Ｋ．，Ｐ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９（３）：６５９−７０（２００１））。
【０００６】
マウスＴｉｅ−２とＡｎｇ−１ノックアウトの表現型は類似しており、Ａｎｇ−１が刺激するＴｉｅ−２リン酸化は、内皮細胞−支持細胞接着の維持を通して胎内での発生中の脈管のリモデリングと安定化を仲介することを示唆する（Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１８９７−１９０９［１９９４］；Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０−７４［１９９５］；Ｓｕｒｉ，Ｃ．ら、［１９９６］、前出）。脈管安定化におけるＡｎｇ−１の役割は成体において保存されると思われ、Ａｎｇ−１は成体では広く且つ構成的に発現される（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０［１９９７］；Ｚａｇｚａｇ，Ｄ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１５９：３９１−４００［１９９９］）。これに対し、Ａｎｇ−２の発現は主として血管リモデリングの部位に限定され、そこでＡｎｇ−２はＡｎｇ−１の機能を遮断し、それによって血管新生を助ける血管形成性の状態を誘導すると思われる（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．、［１９９７］、前出；Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１９９４−１９９８［１９９９］；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ら、［１９９７］、前出）。
【０００７】
数多くの公表試験が、報告されているところによれば、血管新生に関連した疾患状態における血管選択的Ａｎｇ−２発現を明らかにしている。これらの病的状態は、例えば乾癬、黄斑変性及び癌を含む（Ｂｕｎｏｎ，Ｇ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５５：１９６７−１９７６［１９９９］；Ｅｔｏｈ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：２１４５―２１５３［２００１］；Ｈａｎｇａｉ，Ｍ．ら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［２００１］；Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．ら、［１９９９］、前出；Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１６：７１３−７２０［２００１］；Ｏｔａｎｉ，Ａ．ら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１９１２−１９２０［１９９９］；Ｓｔｒａｔｍａｎｎ，Ａ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５３：１４５９−１４６６［１９９８］；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０３：３４−３４５［１９９９］；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５：１２２１−１２２５［１９９９］；Ｙｕａｎ，Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１６５−１７１［２００１］；Ｚａｇｚａｇ，Ｄ．ら、［１９９９］、前出）。これらの試験の大半が癌に焦点を合わせており、多くの腫瘍型が血管Ａｎｇ−２発現を提示すると思われる。病的血管新生におけるその発現と異なり、正常組織でのＡｎｇ−２発現は極めて限られている（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ら、［１９９７］、前出；Ｍｅｚｑｕｉｔａ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６０：４９２−４９８［１９９１］）。健常成人では、血管新生の３つの主要部位は卵巣、胎盤及び子宮である；これらは、Ａｎｇ−２  ｍＲＮＡが検出される正常（すなわち非癌性）組織の中の主要組織である。
【０００８】
一部の機能試験は、Ａｎｇ−２が腫瘍血管新生に関与することを示唆している。Ａｈｍａｄら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：１２５５−１２５９［２００１］）はＡｎｇ−２の過剰発現を述べており、報告によれば、それがマウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖の上昇に結びつくことを示している。報告によればＡｎｇ−２の過剰発現を腫瘍の血管分布過多に結びつけるデータを提示している、Ｅｔｏｈら、前出及びＴａｎａｋａら、前出も参照のこと。しかし、一方で、Ｙｕら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５８：５６３−５７０［２００１］）は、ルイス肺癌腫及びＴＡ３乳癌細胞におけるＡｎｇ−２の過剰発現が、対応する形質転換体を注入したマウスの生存を延長させたことを示すデータを報告している。
【０００９】
この数年間に、様々な公表文献が抗癌治療のための可能性のある標的としてＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２及び／又はＴｉｅ−２を示唆してきた。例えば、米国特許第６，１６６，１８５号、５，６５０，４９０号及び５，８１４，４６４号は各々、抗Ｔｉｅ−２リガンド抗体及び受容体の概念を開示している。Ｌｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］）は、可溶性Ｔｉｅ−２を発現するアデノウイルスをマウスに注入した；可溶性Ｔｉｅ−２は、報告によればマウスによって発現される腫瘍の数と大きさを低下させた。関連する試験では、Ｌｉｎら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０７２−２０７８［１９９７］は可溶性形態のＴｉｅ−２をラットに注入した；この化合物は、報告によればラットにおいて腫瘍の大きさを低減した。Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：３１８５−３１８９［１９９９］）は、Ｔｉｅ−２の細胞外ドメインを発現するヒト黒色腫細胞系を生成し、これらの細胞系をヌードマウスに注入して、可溶性Ｔｉｅ−２は腫瘍増殖及び腫瘍血管新生の「有意の阻害」をもたらすと結論した。この情報に鑑みて、及びＡｎｇ−１とＡｎｇ−２の両方がＴｉｅ−２に結合すると仮定して、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２又はＴｉｅ−２が抗癌治療のための魅力的な標的であるかどうかはこれらの試験からは明らかでない。
【００１０】
該分子の半減期を改善するための、Ｉｇ定常領域などの安定な血漿タンパク質へのある種のペプチドの融合が、例えば、２０００年５月４日公開のＰＣＴ特許公開公報ＷＯ００／２４７８２号に述べられている。
【００１１】
該分子の半減期を改善するための、Ｉｇ定常領域などの安定な血漿タンパク質への他又はそのフラグメントの融合は様々に記述されている（例えば、米国特許第５，４８０，９８１号；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：５５９０−５６００（１９９５）；Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６）；Ｖａｎ  Ｚｅｅ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：２２２１−２２３０（１９９６）；１９９８年９月１５日発行の米国特許第５，８０８，０２９号；Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｈａｒｖｉｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ．，１：９５−１０５（１９９５）；１９９７年７月３日公開のＷＯ９７／２３６１４号；１９９７年１２月１１日出願のＰＣＴ／ＵＳ９７／２３１８３号；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：５６１−５６９（１９９１）；１９９５年８月１０日公開のＷＯ９５／２１２５８号参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，１６６，１８５号
【特許文献２】米国特許第５，６５０，４９０号
【特許文献３】米国特許第５，８１４，４６４号
【特許文献４】国際公開第００／２４７８２号
【特許文献５】米国特許第５，４８０，９８１号
【特許文献６】米国特許第５，８０８，０２９号
【特許文献７】国際公開第９７／２３６１４号
【特許文献８】米国特許出願公開第９７／２３１８３号
【特許文献９】国際公開第９５／２１２５８号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１：２７−３１（１９９５）
【非特許文献２】Ｇａｌｅｓ，Ｎ．Ｗ．とＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１０５５−１０６６［１９９９］
【非特許文献３】Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ，８７：１１６１−１１６９［１９９６］
【非特許文献４】Ｇｒｏｓｉｏｓ，Ｋ．ら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，８４：１１８−１２０［１９９９］
【非特許文献５】Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．ら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［１９９９］
【非特許文献６】Ｋｏｂｌｉｚｅｋ，Ｔ．Ｉ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：５２９−５３２［１９９８］
【非特許文献７】Ｌｉｎ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］
【非特許文献８】Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：５５−６０［１９９７］
【非特許文献９】Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．ら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，７９：２１３−２２３［１９９９］
【非特許文献１０】Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３７５：７０−７４［１９９８］
【非特許文献１１】Ｓｈｙｕ，Ｋ．Ｇ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８：２０８１−２０８７［１９９８］
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【非特許文献１３】Ｓｕｒｉ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：４６８―４７１［１９９８］
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【非特許文献１５】Ｗｉｔｚｅｒｎｂｉｃｈｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１８５１４−１８５２１［１９９８］
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【非特許文献１７】Ｔｅｉｃｈｅｒｔ−Ｋｕｌｉｓｚｅｗｓｋａ，Ｋ．，Ｐ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９（３）：６５９−７０（２００１）
【非特許文献１８】Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１８９７−１９０９［１９９４］
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【非特許文献２０】Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０［１９９７］
【非特許文献２１】Ｚａｇｚａｇ，Ｄ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１５９：３９１−４００［１９９９］
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【非特許文献２３】Ｅｔｏｈ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：２１４５―２１５３［２００１］
【非特許文献２４】Ｈａｎｇａｉ，Ｍ．ら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［２００１］
【非特許文献２５】Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１６：７１３−７２０［２００１］
【非特許文献２６】Ｏｔａｎｉ，Ａ．ら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１９１２−１９２０［１９９９］
【非特許文献２７】Ｓｔｒａｔｍａｎｎ，Ａ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５３：１４５９−１４６６［１９９８］
【非特許文献２８】Ｔａｎａｋａ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０３：３４−３４５［１９９９］
【非特許文献２９】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５：１２２１−１２２５［１９９９］
【非特許文献３０】Ｙｕａｎ，Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１６５−１７１［２００１］
【非特許文献３１】Ｍｅｚｑｕｉｔａ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６０：４９２−４９８［１９９１］
【非特許文献３２】Ａｈｍａｄら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：１２５５−１２５９［２００１］
【非特許文献３３】Ｙｕら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５８：５６３−５７０［２００１］）
【非特許文献３４】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］
【非特許文献３５】Ｌｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０７２−２０７８［１９９７］
【非特許文献３６】Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：３１８５−３１８９［１９９９］
【非特許文献３７】Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：５５９０−５６００（１９９５）
【非特許文献３８】Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６）
【非特許文献３９】Ｖａｎ  Ｚｅｅ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：２２２１−２２３０（１９９６）
【非特許文献４０】Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９）
【非特許文献４１】Ｈａｒｖｉｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ．，１：９５−１０５（１９９５）
【非特許文献４２】Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：５６１−５６９（１９９１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
大部分の固形腫瘍は直径１ｍｍから２ｍｍを超えて増殖するためには新生血管形成を必要とするので、有効な抗Ａｎｇ−２治療は膨大な癌患者群に恩恵をもたらす。そのような治療は、網膜症、関節炎及び乾癬などの他の血管新生関連疾患においても、より広い適用を有すると考えられる。
【００１５】
Ａｎｇ−２を特異的に認識し、結合する新しい物質を特定することへの未開発の必要性が存在する。そのような物質は、Ａｎｇ−２活性に関連した疾患状態における診断スクリーニング及び治療処置のために有用である。
【００１６】
それ故、Ａｎｇ−２活性を調節する、Ａｎｇ−２の特異的結合物質を提供することが本発明の目的である。本発明のそのような物質は、ペプチ体（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、すなわち、そのペプチド部分がＡｎｇ−２に特異的に結合する、抗体のＦｃドメインなどの他の分子に融合したペプチドの形態をとる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、１つの実施形態では、Ａｎｇ−２に結合するペプチド（ここではポリペプチドとも称する）を対象とする。また、そのようなペプチドの変異体及び誘導体も本発明に包含される。
【００１８】
もう１つの実施形態では、本発明のペプチド及びその変異体及び誘導体はビヒクルに結合している。
【００１９】
もう１つの実施形態では、該ペプチドはＦｃドメインに融合していてもよく、それによってペプチ体を提供しうる。任意に、該ペプチ体は、例えば配列番号３から配列番号６、又は配列番号７６から配列番号１５７、ならびにそれらの変異体及び誘導体の少なくとも１個のペプチドを含む。さらに、該ペプチドは、配列番号６５から配列番号７５、及び配列番号１５８に示されている式に従った少なくとも１個のペプチドを含みうる。
【００２０】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、前記特異的結合物質、及びその変異体及び誘導体をコードする核酸分子を提供する。
【００２１】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、該ペプチ体、ならびにその変異体及び誘導体をコードする核酸分子を提供する。任意に、そのような核酸分子は配列番号３３から配列番号５３を含む。
【００２２】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、本発明の特異的結合物質の有効量を、それを必要とする被験対象に投与することにより、腫瘍を低減する方法を提供する。本発明はまた、本発明の特異的結合物質の有効量を、それを必要とする被験対象に投与することを含む、被験対象において血管新生を阻止する方法を提供する。本発明はさらに、本発明の特異的結合物質の有効量を、それを必要とする被験対象に投与することを含む、被験対象において癌を治療する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、アミノ酸配列ＷＤＰＷＴ（配列番号６５）を含み、５−５０アミノ酸の長さであって、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、ならびに生理的に許容されるその塩に関する。前記ポリペプチドはまた、アミノ酸配列：
ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６６）
及び生理的に許容されるその塩を含みうる。加えて、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列：
Ｃｚ２ＷＤＰＷＴ（配列番号６７）
［式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である］、及び生理的に許容されるその塩を含みうる。前記ポリペプチドはさらに、アミノ酸配列：
Ｃｚ２ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６８）
［式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である］、及び生理的に許容されるその塩
を含みうる。
【００２４】
もう１つの実施形態では、本発明は、式：
ａ１ａ２ａ３Ｃａ５ＷＤＰＷＴＣａ１２ａ１３ａ１４（配列番号６９）
［式中、
ａ１、ａ２及びａ３は、各々独立してアミノ酸残基であり；
ａ５は、アミノ酸残基であり；
ａ１２は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ａ１３は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ａ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態では：
ａ１は、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ａ２は、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ａ３は、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＨであり；
ａ５は、Ａ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｄ又はＥであり；
ａ１２は、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；
ａ１３は、Ｌ、Ｔ又はＨであり；
ａ１４は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＭである。
【００２５】
より好ましい実施形態では、ａ１はＱであり；ａ２はＥであり；ａ３はＥであり；ａ５はＤ又はＥであり；ａ１２はＤ又はＥであり；ａ１３はＨであり；及びａ１４はＭである。
【００２６】
ここでの小文字とその上付き数字（ａ１及びｂ１など）の使用はアミノ酸の位置を特定することを意図しており、所与のアミノ酸についての１文字略語を示すことを意図しないことは明白である。１文字アミノ酸略語はここでは大文字で表わす。
【００２７】
本発明はさらに、式：
ｂ１ｂ２ｂ３ｂ４ｂ５ｂ６Ｃｂ８ＷＤＰＷＴＣｂ１５ｂ１６Ｂ１７ｂ１８ｂ１９ｂ２０（配列番号７０）
［式中、
ｂ１は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ２は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｂ３、ｂ４、ｂ５及びｂ６は、各々独立して存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ８は、アミノ酸残基であり；
ｂ１５は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ１６は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｂ１７は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｂ１８、ｂ１９及びｂ２０は、各々独立して存在しないか又はアミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態では：
ｂ１は、存在しないか又はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ２は、存在しないか又はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ３は、存在しないか又はＡ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｒ又はＨであり；
ｂ４は、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ５は、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ６は、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＨであり；
ｂ８は、Ａ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｄ又はＥであり；
ｂ１５は、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；
ｂ１６は、Ｌ、Ｔ又はＨであり；
ｂ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＭであり；
ｂ１８は、存在しないか又はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｙ、Ｑ、Ｄ、Ｅ又はＲであり；
ｂ１９は、存在しないか又はＶ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ又はＲであり；及び、
ｂ２０は、存在しないか又はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｋ又はＲである。
【００２８】
より好ましい実施形態では、ｂ１は存在しないか又はＰ又はＴであり；ｂ２は存在しないか又はＩ又はＮであり；ｂ３は存在しないか又はＲ又はＩであり；ｂ４はＱであり；ｂ５はＥであり；ｂ６はＥであり；ｂ８はＤ又はＥであり；ｂ１５はＤ又はＥであり；ｂ１６はＨであり；ｂ１７はＭであり；ｂ１８は存在しないか又はＷ又はＰであり；ｂ１９は存在しないか又はＧ又はＥであり；及びｂ２０は存在しないか、Ｖ又はＫである。
【００２９】
本発明が、好ましくは、配列番号４、及び配列番号７６から配列番号１１８（両端を含む）から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、ならびに生理的に許容されるその塩にかんすることも明白である。それらのペプチド配列を下記に示す：
【００３０】
【表１】
2010189394.tif 000002
2010189394.tif 000003
＊一部のペプチド及び／又はペプチ体は接頭辞「ＴＮ」、「ＴＮ８」又は「ＴＮ１２」をフラグメント含みうること、及びこの接頭辞は所与のペプチ体に関して存在してもよく又は存在しなくてもよいことは明白である。従って、例えば「ＴＮ８−Ｃｏｎ４」及び「Ｃｏｎ４」の語はここでは交換可能に使用される。
【００３１】
もう１つの実施形態では、本発明は、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
［式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２であり；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３であり；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４であり；
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上は、各々独立してここで述べるポリペプチドを含む］
から選択される］
を有する物質及びその多量体の組成物に関する。例えば、好ましい実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立して、配列番号３から配列番号６、及び／又は配列番号７６から配列番号１５７のポリペプチドを含みうる。
【００３２】
もう１つの実施形態では、前記組成物は、式：
Ｘ１−Ｆ１
又は、
Ｆ１−Ｘ２
及び生理的に許容されるその塩であり、式中、Ｘ１、Ｆ１及びＸ２はここで定義するとおりである。もう１つの実施形態では、前記組成物は、式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１
及びその生理的に許容されるその塩であり、式中、Ｌ１、Ｆ１及びＰ１はここで定義するとおりである。さらにもう１つの実施形態では、前記組成物は、式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
及び生理的に許容されるその塩であり、式中、Ｌ１、Ｆ１、Ｐ１、Ｐ２、及びｃ及びｄはここで定義するとおりである。さらにもう１つの実施形態では、前記組成物は、式：
Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
及び生理的に許容されるその塩である。好ましい実施形態では、Ｆ１はＦｃドメイン又はそのフラグメントである。
【００３３】
本発明はさらに、式：
Ｐｃ２Ｄｃ４Ｌｃ６ｃ７ｃ８ＬＹ（配列番号７１）
［式中、
ｃ２は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ４は、Ａ、Ｄ又はＥであり；
ｃ６は、酸性アミノ酸残基であり；
ｃ７は、アミノ酸残基であり；及び
ｃ８は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態では、ｃ２はＬ又はＭである。もう１つの好ましい実施形態では、ｃ６はＤ又はＥである。
【００３４】
本発明はさらに、式：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４Ｐｄ６Ｄｄ８Ｌｄ１０ｄ１１ｄ１２ＬＹｄ１５ｄ１６ｄ１７ｄ１８ｄ１９ｄ２０ｄ２１ｄ２２（配列番号７２）
［式中、
ｄ１は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ２は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ３は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｄ４は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ６は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｄ８は、Ａ、Ｄ又はＥであり；
ｄ１０は、酸性アミノ酸残基であり；
ｄ１１は、アミノ酸残基であり；
ｄ１２は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ１５は、存在しないか又は中性疎水性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ１６は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ１７は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｄ１８は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｄ１９は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ２０は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ２１は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ２２は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態では：
ｄ１は、Ｔ，Ｓ，Ｑ，Ｒ又はＨであり；
ｄ２は、Ｔ，Ｑ，Ｎ又はＫであり；
ｄ３は、Ｆであり；
ｄ４は、Ｍ，Ｑ，Ｅ又はＫであり；
ｄ６は、Ｌ又はＭであり；
ｄ８は、Ｄ又はＥであり；
ｄ１０は、Ｅであり；
ｄ１１は、Ｑ又はＥであり；
ｄ１２は、Ｔ又はＲであり；
ｄ１５は、Ｙ，Ｄ，Ｅ又はＫであり；
ｄ１６は、Ｑであり；
ｄ１７は、Ｗ又はＦであり；
ｄ１８は、Ｌ，Ｉ，Ｍ又はＴであり；
ｄ１９は、Ｌ，Ｆ又はＹであり；
ｄ２０は、Ｑ，Ｄ又はＥであり；
ｄ２１は、存在しないか、Ｑ又はＨであり；
ｄ２２は、存在しないか、Ａ，Ｌ，Ｇ，Ｓ又はＲであり；
好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号６、及び配列番号１１９から配列番号１４２（両端を含む）から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができる。配列番号６、及び配列番号１１９から配列番号１４２を下記に示す：
【００３５】
【表２】
2010189394.tif 000004
【００３６】
本発明はまた、式：
ＲＰｅ３ｅ４ｅ５ｅ６ｅ７Ｇ（配列番号７３）
［式中、
ｅ３は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｅ４は、酸性アミノ酸残基であり；
ｅ５は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｅ６は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｅ７は、中性疎水性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態では、ｅ３はＹ又はＣである。もう１つの好ましい実施形態では、ｅ４はＤ又はＥである。さらにもう１つの好ましい実施形態では、ｅ６はＩ又はＭである。
【００３７】
本発明はさらに、式：
ｆ１ｆ２ｆ３ｆ４ＲＰｆ７ｆ８ｆ９ｆ１０ｆ１１Ｇｆ１３ｆ１４ｆ１５ｆ１６ｆ１７ｆ１８ｆ１９ｆ２０（配列番号７４）
［式中、
ｆ１は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ２は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ３は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｆ４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ７は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ８は、酸性アミノ酸残基であり；
ｆ９は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｆ１０は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｆ１１は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｆ１３は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１５は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１６は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１７は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｆ１８は、中性疎水性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｆ１９は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及び
ｆ２０は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態では、
ｆ１は、Ｓ、Ａ又はＧであり；
ｆ２は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
ｆ３は、Ｑ、Ｇ又はＤであり；
ｆ４は、Ｌ、Ｍ又はＱであり；
ｆ７は、Ｃ又はＹであり；
ｆ８は、Ｅ又はＤであり；
ｆ９は、Ｅ、Ｇ又はＤであり；
ｆ１０は、Ｉ又はＭであり；
ｆ１１は、Ｆ又はＬであり；
ｆ１３は、Ｃ又はＷであり；
ｆ１４は、Ｇ又はＰであり；
ｆ１５は、Ｔ又はＮであり；
ｆ１６は、Ｑ、Ｙ又はＫであり；
ｆ１７は、Ｎ、Ｄ又はＱであり；
ｆ１８は、Ｌ、Ｖ、Ｗ又はＲであり；
ｆ１９は、Ａ、Ｑ、Ｙ又はＩであり；及び、
ｆ２０は、Ｌ、Ａ、Ｇ又はＶである。
【００３８】
より好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３、及び配列番号１４３から配列番号１４８（両端を含む）から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。配列番号３、及び配列番号１４３から配列番号１４８は下記の通りである。
【００３９】
【表３】
2010189394.tif 000005
【００４０】
さらにもう１つの局面では、本発明は、式：
Ｃｇ２Ｇｇ４ｇ５ＤＰＦＴｇ１０ＧＣｇ１３（配列番号７５）
［式中、
ｇ２は、酸性アミノ酸残基であり；
ｇ４は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｇ５は、Ｅ、Ｄ又はＱであり；
ｇ１０は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｇ１３は、酸性残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態では、ｇ２はＥ又はＤである。もう１つの好ましい実施形態では、ｇ４はＶ又はＭである。さらにもう１つの実施形態では、ｇ１０はＦ又はＱである。さらにもう１つの実施形態では、ｇ１３はＤ又はＥである。
【００４１】
本発明はさらに、式：
ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４Ｃｈ６Ｇｈ８ｈ９ＤＰＦＴｈ１４ＧＣｈ１７ｈ１８ｈ１９ｈ２０（配列番号１５８）
［式中、
ｈ１は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｈ２は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｈ３は、酸性アミノ酸残基であり；
ｈ４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｈ６は、酸性アミノ酸残基であり；
ｈ８は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｈ９は、Ｅ、Ｄ又はＱであり；
ｈ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｈ１７は、酸性アミノ酸残基であり；
ｈ１８は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｈ１９は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及び
ｈ２０は、存在しないか又はアミノ酸残基である］
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態では、
ｈ１は、存在しないか又はＡ，Ｌ，Ｍ，Ｇ，Ｋ又はＨであり；
ｈ２は、Ｌ，Ｆ又はＱであり；
ｈ３は、Ｄ又はＥであり；
ｈ４は、Ｗ又はＹであり；
ｈ６は、Ｄ又はＥであり；
ｈ８は、Ｖ又はＭであり；
ｈ１４は、Ｆ又はＱであり；
ｈ１７は、Ｄ又はＥであり；
ｈ１８は、Ｍ，Ｙ，Ｎ又はＫであり；
ｈ１９は、Ｌ又はＱであり；及び、
ｈ２０は、Ｍ，Ｔ，Ｇ，Ｓ，Ｄ，Ｋ又はＲである。
【００４２】
より好ましい実施形態では、本発明は、配列番号５、及び配列番号１４９から配列番号１５７（両端を含む）から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。配列番号５、及び配列番号１４９から配列番号１５７を下記に示す。
【００４３】
【表４】
2010189394.tif 000006
極めて好ましい実施形態では、本発明は、式：
（Ｘ１）ｑ−Ｆ１−（Ｘ２）ｒ
［式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１であり；
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１−（Ｌ２）ｔ−Ｐ２であり；
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１−（Ｌ２）ｔ−Ｐ２−（Ｌ３）ｕ−Ｐ３であり；及び、
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１−（Ｌ２）ｔ−Ｐ２−（Ｌ３）ｕ−Ｐ３−（Ｌ４）ｖ−Ｐ４であり；
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又はそれ以上は、各々独立して、
（ａ）該ポリペプチドが５−５０アミノ酸の長さである、アミノ酸配列ＷＤＰＷＴ（配列番号６５）；
（ｂ）アミノ酸配列ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６６）；
（ｃ）式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である、アミノ酸配列Ｃｚ２ＷＤＰＷＴ（配列番号６７）；
（ｄ）式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である、アミノ酸配列Ｃｚ２ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６８）；
（ｅ）式中、ｃ２は中性疎水性アミノ酸残基であり；ｃ４はＡ、Ｄ又はＥであり；ｃ６は酸性アミノ酸残基であり；ｃ７はアミノ酸残基であり；及びｃ８は中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基である、アミノ酸配列Ｐｃ２Ｄｃ４Ｌｃ６ｃ７ｃ８ＬＹ（配列番号７１）；
（ｆ）式中、ｅ３は中性極性アミノ酸残基であり；ｅ４は酸性アミノ酸残基であり；ｅ５は中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｅ６は中性疎水性アミノ酸残基であり；及びｅ７は中性疎水性アミノ酸残基である、アミノ酸配列ＲＰｅ３ｅ４ｅ５ｅ６ｅ７Ｇ（配列番号７３）；
（ｇ）式中、ｇ２は酸性アミノ酸残基であり；ｇ４は中性疎水性アミノ酸残基であり；ｇ５は中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｇ１０は中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及びｇ１３は酸性アミノ酸残基である、アミノ酸配列Ｃｇ２Ｇｇ４ｇ５ＤＰＦＴｇ１０ＧＣｇ１３（配列番号７５）；
（ｈ）配列番号１のポリペプチド；
（ｉ）配列番号２のポリペプチド；及び
（ｊ）配列番号７のポリペプチド；
から成る群より選択されるポリペプチドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーである］
から選択され、及び
ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ及びｖは、ｑ及びｒの少なくとも１つが１であることを条件として、各々独立して０又は１である］
を有する物質及びその多量体の組成物、及び生理的に許容されるその塩に関する。
【００４４】
本発明はさらに、ここで述べるような少なくとも１個のペプチド及びビヒクルを含み、Ａｎｇ−２に結合することができる融合ポリペプチド、及び生理的に許容されるその塩に関する。前記融合ポリペプチドにおいて、そのビヒクルは、好ましくはＦｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール群、糖質及びオリゴ糖の少なくとも１つである。アルブミン等のような他の適切なビヒクルは当業者に認識され、本発明の範囲内に包含される。
【００４５】
当業者は、様々な分子を特異的結合物質構造に挿入できることを認識する。そこで、所与の分子を、特異的結合物質の所望活性を保持しながら、例えば特異的結合物質のペプチドとビヒクル部分の間に、又はペプチド部分自体の中に挿入することができる。例えば、Ｆｃドメイン又はそのフラグメント、ポリエチレングリコール又はデキストランなどの他の関連分子、脂肪酸、脂質、コレステロール群、低分子量糖質、ペプチド、細胞傷害性物質、化学療法剤、ここで述べるような検出可能成分（蛍光物質、放射性同位体などの放射性標識を含む）、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉（又は他の）ＲＮＡ、酵素、ホルモン等のような分子を容易に挿入することができる。このような挿入に適する他の分子は当業者によって認識され、本発明の範囲内に包含される。これは、例えば、任意に適切なリンカーによって連結された、２個の連続アミノ酸の間に所望分子を挿入することを含む。例として、Ｃｏｎ４（Ｃ）ペプチ体配列：
Ｍ−Ｆｃ−ＧＧＧＧＧＡＱＱＥＥＣＥＷＤＰＷＴＣＥＨＭＬＥ（配列番号２３）
において、当業者は、Ａｎｇ−２に結合するペプチドの能力を保持しながら、所望構造及び／又は機能を達成するために、例えば２個の隣接グルタミン（「ＱＱ」）残基の間に所望分子を容易に挿入することができる。従って、この配列は次のように修飾されうる：
Ｍ−Ｆｃ−ＧＧＧＧＧＡＱ−［分子］−ＱＥＥＣＥＷＤＰＷＴＣＥＨＭＬＥ
所望する場合は適切な分子を付加することができる。前記分子が、次のようなビヒクルとペプチドの間の、適切な側鎖上を含むその分子上の多くの位置に：
Ｍ−Ｆｃ−［分子］−ＧＧＧＧＧＡＱＱＥＥＣＥＷＤＰＷＴＣＥＨＭＬＥ
又は当業者が所望する他の何らかの位置に挿入できることは、さらに認識される。他の適切な実施形態は当業者には明白である。
【００４６】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、ここで述べるような、本発明の特異的結合物質（ペプチド及び／又はペプチ体を含むが、これらに限定されない）をコードするポリヌクレオチドに関する。当業者は、アミノ酸配列が既知である場合、その対応するヌクレオチド配列は既知の手法を用いて容易に決定できることを認識する。例えば、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｄ．，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．（１９８６）参照。本発明のペプチドをコードする例示ヌクレオチド配列を下記に示す。当業者は、２個以上のコドンが所与の１個のアミノ酸をコードすることがあり、それ故本発明は、本発明のペプチド及び／又はペプチ体をコードするあらゆるヌクレオチド配列に関することを認識する。
【００４７】
【表５】
2010189394.tif 000007
2010189394.tif 000008
2010189394.tif 000009
2010189394.tif 000010
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【００４８】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１個のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。もう１つの実施形態では、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、好ましくは原核細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞など）又は真核細胞であることは認識される。
【００４９】
本発明はまた、医薬適合性のその担体と混合して、ここで述べる組成物の有効量を含有する医薬組成物に関する。
【００５０】
本発明はまた、ここで述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において有害な血管新生を阻止する方法に関する。本発明はまた、ここで述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において血管新生を調節する方法に関する。本発明はさらに、ここで述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において有害な血管新生を特徴とする腫瘍増殖を阻止する方法に関する。加えて、本発明は、ここで述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量及び化学療法剤を投与することを含む、哺乳類において癌を治療する方法に関する。好ましい実施形態では、前記化学療法剤は、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１及びタキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）の少なくとも１つである。しかしながら、他の適切な化学療法剤及び他の癌治療が使用できることは認識される。
【００５１】
本発明はまた、ここで述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において血管透過性又は血漿漏出の少なくとも１つを調節する方法に関する。本発明はさらに、ここで述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において、眼血管新生疾患、肥満、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、炎症性疾患、炎症性障害、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、新生物性疾患、骨関連疾患、又は乾癬の少なくとも１つを治療する方法に関する。
【００５２】
本発明の特異的結合物質が、調節不全の又は有害な血管新生に関連する多くの疾患を治療するために使用できることは認識される。そのような疾患は、網膜症（糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性を含む）などの眼新生血管形成、乾癬、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、リウマチ様又はリウマチ性炎症性疾患などの炎症性疾患、特に関節炎（慢性関節リウマチを含む）、又は慢性喘息、動脈又は移植後アテローム硬化症、子宮内膜症などの他の慢性炎症性疾患、及び新生物性疾患、例えばいわゆる固形腫瘍及び液状腫瘍（白血病など）を含むが、これらに限定されない。特異的結合物質の投与によって治療できるさらなる疾患は、当業者には明白である。そのような付加的疾患は、肥満、血管透過性、血漿漏出、及び骨粗しょう症を含む骨関連疾患を含むが、これらに限定されない。それ故、本発明はさらに、調節不全の又は有害な血管新生に関連するこれらの疾患を治療する方法に関する。
【００５３】
本発明の他の実施形態は、ここで提供する開示から容易に明白である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明のペプチ体ＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で処置した、Ａ−４３１腫瘍を有するマウスにおける腫瘍容積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図２】２ｘＣｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ又はＬ１−２１−Ｎペプチ体のいずれかの５０μｇ用量で処置した野生型マウスにおけるペプチ体濃度（ｙ軸）対投与後の時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図３】本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は対照ペプチ体で処置した、Ａ−４３１腫瘍を有するマウスにおける腫瘍容積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図４】本発明によるペプチ体Ｃｏｎ４−Ｃ又は対照ペプチ体で処置した、又は未処置の、培養Ａ−４３１細胞のインビトロ増殖を示すグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図５】本発明によるペプチ体Ｃｏｎ４−Ｃ、ペプチ体Ｌ１−７−Ｎ、ペプチ体Ｌ１−２１−Ｎ、又はペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、抗Ａｎｇ−２抗体（Ａｂ５３６）、又はＦｃで処置したＣｏｌｏ２０５腫瘍細胞における腫瘍容積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図６】種々の用量の本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はＦｃで処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍を有するマウスにおける腫瘍容積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図７】本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ又は対照ペプチ体で処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍を有するマウスにおける腫瘍容積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。図７はまた、これらのペプチ体についてのＣＤ３１染色面積／総腫瘍面積のグラフも示す。詳細は実施例の中で述べる。
【図８】本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は対照ペプチ体で処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍を有するマウスにおける腫瘍容積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。このグラフは、抗Ａｎｇ−２ペプチ体は、投与がいつ開始されたかに関わりなく、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍増殖を阻止しうることを示している。
【図９】Ａ４３１及びＣｏｌｏ−２０５異種移植モデルの両方において、抗体Ａｂ５３６又はペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃを使用して雌性ヌードマウスにおいて得られた完全応答（ＣＲ）率の要約である。詳細は実施例の中で述べる。
【図１０Ａ】本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又は２ｘＣｏｎ４−Ｃとタキソテールの組合せ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又はＰＢＳプラスタキソテールで処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍を有するマウスにおける腫瘍容積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１０Ｂ】本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又は２ｘＣｏｎ４−Ｃと５−ＦＵの組合せ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又はＰＢＳプラス５−ＦＵで処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍を有するマウスにおける腫瘍容積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１１Ａ】本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又は対照ペプチ体で処置したラットにおけるアジュバント誘発性関節炎モデル、又は正常又は関節炎対照での、足腫脹レベル（ＡＵＣ±ＳＥ）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１１Ｂ】本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又は対照ペプチ体で処置したラットにおけるアジュバント誘発性関節炎モデル、又は正常又は関節炎対照での、足骨無機質密度（ＢＭＤ）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１１Ｃ】本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又は対照ペプチ体で処置したラットにおけるアジュバント誘発性関節炎モデル、又は正常又は関節炎対照での、体重変化のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１２】ラットにおけるＶＥＧＦ誘導の角膜血管新生の阻止を示す２つのグラフである。最初のグラフは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＶＥＧＦプラスリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又はＶＥＧＦプラス本発明のペプチ体Ｃｏｎ４−Ｃで処置したラットにおいて測定された血管の数を示す。２番目のグラフは、ＢＳＡ、ＶＥＧＦプラスリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又はＶＥＧＦプラス本発明のペプチ体Ｃｏｎ４−Ｃで処置したラットにおける血管面積（ｍｍ２）を示す。詳細は実施例の中で述べる。
【図１３Ａ】本発明によるペプチ体ＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及び１２−９−３−Ｃ、ならびに対照ペプチ体、Ｔｉｅ２−Ｆｃ、Ｃ２Ｂ８又は５Ｂ１２についての、それぞれ完全長Ａｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）、ｈＡｎｇ−２のＮ末端、及びｈＡｎｇ−２のＣ末端に関するエピトープマッピングデータ（Ｏ．Ｄ．３７０）である。詳細は実施例の中で述べる。
【図１３Ｂ】本発明によるペプチ体ＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及び１２−９−３−Ｃ、ならびに対照ペプチ体、Ｔｉｅ２−Ｆｃ、Ｃ２Ｂ８又は５Ｂ１２についての、それぞれ完全長Ａｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）、ｈＡｎｇ−２のＮ末端、及びｈＡｎｇ−２のＣ末端に関するエピトープマッピングデータ（Ｏ．Ｄ．３７０）である。詳細は実施例の中で述べる。
【図１３Ｃ】本発明によるペプチ体ＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及び１２−９−３−Ｃ、ならびに対照ペプチ体、Ｔｉｅ２−Ｆｃ、Ｃ２Ｂ８又は５Ｂ１２についての、それぞれ完全長Ａｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）、ｈＡｎｇ−２のＮ末端、及びｈＡｎｇ−２のＣ末端に関するエピトープマッピングデータ（Ｏ．Ｄ．３７０）である。詳細は実施例の中で述べる。
【図１４】Ｓａｐｉｄｙｎｅ  ＫｉｎＥｘＡアッセイを使用した、本発明によるペプチ体２ｘＣｏｎ４−Ｃの結合親和性（ＫＤ）を示す。詳細は実施例の中で述べる。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
章の見出しは、ここでは構成のためにのみ使用するものであり、いかなる意味においても記述する対象を限定するものと解釈されるべきではない。
【００５６】
組換えＤＮＡ分子、タンパク質及び抗体の生産、ならびに組織培養及び細胞形質転換のためには、標準的な手法が使用しうる。酵素反応及び精製手法は、典型的には製造者の仕様書に従って、又はＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ［１９８９］）に述べられているような従来の手順を用いてこの技術分野に置いて一般的に実施されるように、又はここで述べるように実施する。特定の定義が与えられていない限り、ここで述べる分析化学、合成有機化学、及び医薬及び製薬化学に関して使用する術語、及び実験手順及び手法は、周知であり且つこの技術分野で一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、製薬調製、製剤及び送達、及び患者の処置のためには、標準的な手法が使用しうる。
【００５７】
定義
この明細書を通じて使用する用語は、特定の場合に限って異なる記載がない限り、下記のように定義される。
【００５８】
「Ａｎｇ−２」の、米国特許第６，１６６，１８５号の図６に示されているポリペプチド（「Ｔｉｅ−２リガンド−２」）又はそのフラグメントならびに対立遺伝子変異体、スプライス変異体、誘導体、置換、欠失及び／又は挿入変異体、融合ペプチド及びポリペプチド、及び種間相同体を含む関連ポリペプチドを意味する。Ａｎｇ−２ポリペプチドは、作製される方法に依存して、付加的な末端残基、例えばリーダー配列、標的配列、アミノ末端メチオニン、アミノ末端メチオニン及びリシン残基、及び／又はタグ又は融合タンパク質配列を含んでいてもよく又は含んでいなくてもよい。
【００５９】
Ａｎｇ−２又はＡｎｇ−２特異的結合物質に関連して使用するとき「生物学的に活性な」の語は、Ａｎｇ−２又はＡｎｇ−２特異的結合物質の特徴を示す少なくとも１つの活性を有するペプチド又はポリペプチドを意味する。Ａｎｇ−２の特異的結合物質は、Ａｎｇ−２の少なくとも１つの生物活性に関するアゴニスト、アンタゴニスト、又は中和又は遮断活性を有しうる。
【００６０】
「特異的結合物質」の語は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する分子、好ましくはタンパク質様分子、及びここで定義するようなその変異体及び誘導体を意味する。特異的結合物質は、Ａｎｇ−２に選択的に結合するタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質又は低分子量化合物でありうる。好ましい実施形態では、本発明に従った特異的結合物質は、単独の又は既知の手法によって提供される他のアミノ酸配列との組み合わせでの、ペプチド又はペプチ体、ならびにそのフラグメント、変異体又は誘導体である。そのような手法は、酵素的開裂、化学的開裂、ペプチド合成又は組換え手法を含むが、これらに限定されない。本発明のＡｎｇ−２特異的結合物質は、Ａｎｇ−２の生物活性及び／又は他のＡｎｇ−２に関連する活性を調節する、例えば阻害する又は促進するＡｎｇ−２の部分に結合することができる。
【００６１】
ここで使用する「変異体」の語は、アミノ酸残基が、該結合物質についての天然に生じる（又は少なくとも既知の）アミノ酸配列に挿入されている、アミノ酸配列から欠失している及び／又は置換されている、ペプチド及びポリペプチドを含む。本発明の変異体は下記で述べるような融合タンパク質を含む。
【００６２】
「誘導体」は、挿入、欠失又は置換変異体とは異なる方法で化学修飾されている結合物質を含む。
【００６３】
「Ａｎｇ−２に特異的に結合する」とは、その親和性（例えばここで述べるようなアフィニティーＥＬＩＳＡ又はＢＩＡコアによって測定される）又はその中和能力（例えばここで述べる中和ＥＬＩＳＡアッセイ又は同様のアッセイによって測定される）が、他の何らかのアンギオポエチン又は他のペプチド又はポリペプチドに対する親和性又は中和能力よりも少なくとも１０倍高いが、任意に５０倍、１００倍、２５０倍又は５００倍又は、少なくとも１０００倍高いように、成熟、完全長又は部分長ヒトＡｎｇ−２ポリペプチド又はそのオーソローグを認識し、それに結合する、本発明の特異的結合物質（ペプチ体、又はそのペプチド部分など）の能力を意味し、但し、そのペプチ体のペプチド部分は、そのようなアッセイにおける評価のためのヒトＦｃ部分に最初に融合する。
【００６４】
「エピトープ」の語は、特異的結合物質、例えばペプチ体によって、その結合物質の抗原結合領域の１又はそれ以上において、認識されうる又は結合されうる分子の部分を意味する。エピトープは通常、例えばアミノ酸又は糖質側鎖などの、分子の化学的に活性な表面分属から成り、特異的三次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。ここで使用するエピトープは、隣接又は非隣接のいずれでもよい。
【００６５】
「阻害及び／又は中和エピトープ」の語は、ペプチ体などの特異的結合物質によって結合されたとき、インビボ、インビトロ又はインサイチューで、そのようなエピトープを含む分子、細胞又は生物の生物活性の喪失（又は少なくとも生物活性の低下）をもたらすエピトープである。本発明に関して、中和エピトープは、Ａｎｇ−２の生物活性領域に位置するか又は生物活性領域に結合している。代替的に、「活性化エピトープ」の語は、抗体などの本発明の特異的結合物質によって結合されたとき、Ａｎｇ−２の活性化又は少なくともＡｎｇ−２の生物活性立体配座の維持をもたらすエピトープである。
【００６６】
「ペプチ体フラグメント」の語は、完全な無傷ペプチ体未満のものを含むペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００６７】
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等のような生物学的物質に関して使用するとき「天然に生じる」の語は、天然に認められ、人間によって修飾されていないものを意味する。
【００６８】
Ａｎｇ−２又はＡｎｇ−２の特異的結合物質に関して使用するとき「単離された」の語は、その自然環境において認められる少なくとも１つの汚染ポリペプチド又は化合物を含まない、好ましくはその治療的又は診断的使用に干渉する他の汚染哺乳類ポリペプチドを実質的に含まない化合物を意味する。
【００６９】
Ａｎｇ−２ペプチ体又はそのフラグメント、又はＡｎｇ−２の他の何らかのタンパク質様特異的結合物質に関して使用するとき「成熟」の語は、リーダー又はシグナル配列を持たないペプチド又はポリペプチドを意味する。本発明の結合物質が、例えば原核宿主細胞において発現されるとき、「成熟」ペプチド又はポリペプチドは、アミノ末端メチオニン、又は１個又はそれ以上のメチオニン及びリシン残基などの付加アミノ酸残基も含みうる（しかし、やはりリーダー配列を持たない）。このようにして生産されるペプチド又はポリペプチドは、これらの付加アミノ酸残基を除去して又は除去せずに使用することができる。
【００７０】
Ａｎｇ−２の特異的結合物質に関して使用するとき「有効量」又は「治療上有効な量」の語は、Ａｎｇ−２の１つ又はそれ以上の生物活性のレベルの観察可能な変化を支持するために有用な又は必要な、特異的結合物質の量を意味する。その変化は、Ａｎｇ−２活性のレベルの上昇又は低下のいずれかでありうる。好ましくは、その変化はＡｎｇ−２活性の低下である。
【００７１】
「ペプチ体」の語は、少なくとも１個のペプチドに結合した抗体Ｆｃドメインを含む分子を意味する。ペプチ体の生産は、２０００年５月４日公開のＰＣＴ特許公開広報ＷＯ００／２４７８２号に概説されている。
【００７２】
ここで使用する「変異体」の語は、アミノ酸残基が、その分子についてのアミノ酸配列に挿入されている、アミノ酸配列から欠失している及び／又は置換されている、本発明のペプチ体のようなペプチド又はペプチド−ビヒクルの組合せなどの分子を含む。１個又はそれ以上のアミノ酸が挿入されている変異体は、下記で述べるような融合タンパク質を含む。
【００７３】
「誘導体」は、挿入、欠失又は置換変異体とは異なる方法で化学修飾されている、ペプチ体のようなペプチド及び／又はペプチド−ビヒクルの組合せを含む。
【００７４】
「フラグメント」の語は、該ペプチド及び／又はペプチド−ビヒクルの組合せの完全長アミノ酸配列未満を含むペプチド又はペプチド−ビヒクルの組合せを意味する。そのようなフラグメントは、例えば、アミノ末端のトランケーション、カルボキシ末端のトランケーション、及び／又は該ペプチド又はペプチド−ビヒクルの組合せのアミノ酸配列からの残基の内部欠失から生じうる。フラグメントは、代替的ＲＮＡスプライシングから又はインビボ又はインビトロでのプロテアーゼ活性から生じうる。そのようなフラグメントはまた、化学的ペプチド合成法によって、ペプチド、ペプチド−ビヒクルの組合せ、又はＦｃ部分及び／又はペプチ体のペプチド部分をコードするポリヌクレオチドを修飾することによっても構築しうる。
【００７５】
「Ｆｃ」の語は、本発明のビヒクルの１つの種類を意味し、単量体又は多量体の、全抗体のタンパク質分解性消化から生じる抗体の非抗原結合フラグメントの配列を含む。本発明におけるＦｃのソースは、好ましくは全面的にヒトＦｃであり、免疫グロブリンのいずれかでありうるが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。しかし、ここでは、部分的にヒトであるＦｃ分子又はヒト以外の種から得られるＦｃ分子も包含される。Ｆｃは、共有結合（すなわちジスルフィド結合）及び非共有結合によって二量体又は多量体形態へと連結されうる単量体ポリペプチドで作られる。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニットの間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に依存して１−４の範囲をとる。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である［Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９］ここで使用する「天然Ｆｃ」の語は、単量体、二量体及び多量体形態の総称である。
【００７６】
「Ｆｃドメイン」の語は、天然Ｆｃ及びＦｃ変異体分子及び上記で定義した配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃに関しては、「Ｆｃドメイン」の語は、全抗体から消化されたか又は他の手段によって生産されたかに関わらず、単量体又は多量体形態の分子を含む。
【００７７】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用するとき「多量体」の語は、共有結合によって、非共有結合によって、又は共有結合と非共有結合の両方の相互作用によって結合された２つ又はそれ以上のポリペプチド鎖を有する分子を意味する。ＩｇＧ分子は典型的には二量体を形成する：ＩｇＭは五量体；ＩｇＤは二量体；及びＩｇＡは単量体、二量体、三量体又は四量体を典型的に形成する。多量体は、Ｆｃの天然Ｉｇソースの配列及び生じる活性を利用することによって又はそのような天然Ｆｃを誘導体化する（下記で定義する）ことによって形成しうる。
【００７８】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用するとき「二量体」の語は、共有結合によって又は非共有結合によって結合された２つのポリペプチド鎖を有する分子を意味する。
【００７９】
「ビヒクル」の語は、治療タンパク質の分解を防ぐ及び／又は半減期を上昇させる、毒性を低下させる、免疫原性を低下させる、又は生物活性を上昇させる分子を意味する。例示的ビヒクルは、Ｆｃドメインならびに線状重合体（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリシン、デキストラン等）；分枝重合体（例えば１９８１年９月１５日発行のＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらへの米国特許第４，２８９，８７２号；１９９３年７月２０日発行のＴａｍへの米国特許第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月２８日公開のＦｒｅｃｈｅｔらによるＷＯ９３／２１２５９号参照）；脂質；コレステロール群（ステロイドなど）；糖質又はオリゴ糖；又はサルベージ受容体に結合する何らかの天然又は合成タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含む。ビヒクルについては下記でさらに説明する。
【００８０】
「誘導体化する」及び「誘導体」又は「誘導体化された」の語は、それぞれ、（１）化合物が環状部分、例えば化合物内のシステイニル残基間の架橋を有する；（２）化合物が架橋する又は架橋部位を有する、例えば化合物がシステイニル残基を有しており、それ故培養中又はインビボで架橋二量体を形成する；（３）１又はそれ以上のペプチジル結合が非ペプチジル結合によって置換される；（４）Ｎ末端が−ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシニミド基、又は置換又は非置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−［式中、Ｒ及びＲ１及び環置換基は下記で定義するとおりである］によって置換される；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２又は−ＮＲ３Ｒ４［Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は下記で定義するとおりである］によって置換される；及び（６）個々のアミノ酸部分が、選択側鎖又は末端残基と反応することができる物質での処理を通して修飾される、工程及び生じる化合物を含む。誘導体については下記でさらに説明する。
【００８１】
「ペプチド」の語は、約３−約７５アミノ酸の分子を意味し、約５−５０アミノ酸の分子が好ましく、８−４０アミノ酸分子がより好ましく、約１０−２５アミノ酸の分子が最も好ましい。ペプチドは、天然に生じる又は人工の（すなわち非天然に生じる）アミノ酸配列でありうる。例示的ペプチドは、ペプチドライブラリー（例えばファージディスプレイライブラリー）において実施されるような、ここで述べる方法のいずれかによって生成されるか、化学合成によって生成されるか、タンパク質の消化によって誘導されるか、又は組換えＤＮＡ手法を用いて生成されうる。
【００８２】
「薬理的に活性な」の語は、そのように記述される物質が、医学的パラメータ（例えば血圧、血球算定、コレステロールレベル）又は疾患状態（例えば癌、自己免疫疾患等）に影響を及ぼす活性を有すると判定されることを意味する。
【００８３】
「アンタゴニストペプチド」又は「阻害因子ペプチド」の語は、対象とする関連タンパク質の生物活性を遮断する又は何らかの方法で生物活性に干渉する、若しくは対象とする関連タンパク質の既知のアンタゴニスト又は阻害因子と同等の生物活性を有するペプチドを意味する。従って、「Ａｎｇ−２アンタゴニストペプチド」の語は、Ａｎｇ−２拮抗作用特性を有すると特定できる又は推論できるペプチドを含む。
【００８４】
さらに、本発明の化合物の生理的に許容される塩も本明細書に包含される。「生理的に許容される塩」とは、医薬適合性であることが知られている又は後ほど発見されるあらゆる塩を意味する。一部の特定例は、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；塩酸塩及び臭化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩；硫酸塩；クエン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；及びシュウ酸塩、メシレート及びリン酸塩である。
【００８５】
ペプチ体
本発明の１つの局面は、Ａｎｇ−２ペプチ体の開発に関する。タンパク質リガンドとその受容体の相互作用はしばしば比較的大きな界面で起こる。しかし、ヒト成長ホルモンとその受容体に関して明らかにされたように、その界面の少数の鍵となる残基だけが結合エネルギーの大部分に寄与する。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：３８３−６（１９９５）。タンパク質リガンドのバルクは単に、正しいトポロジーで結合エピトープを表示するか又は結合に無関係な機能を助ける。それ故、「ペプチド」長の（一般に２−４０アミノ酸）の分子は、所与の大きなタンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合することができる。そのようなペプチドは、大型タンパク質リガンドの生物活性を模倣しうるか（「ペプチドアゴニスト」）、又は競合結合を通して、大型タンパク質リガンドの生物活性を阻害しうる（「ペプチドアンタゴニスト」）。
【００８６】
ファージディスプレイテクノロジーはそのようなペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを特定する上での強力な方法として出現した。例えば、Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４（１９９０）；１９９３年６月２９日発行の米国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日発行の米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月１１日発行の米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日発行の米国特許第５，３３８，６６５号；１９９９年７月１３日発行の米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日公開のＷＯ９６／４０９８７号；及び１９９８年４月１６日公開のＷＯ９８／１５８３３号（その各々が参照してここに組み込まれる）参照。ペプチドファージディスプレイライブラリーでは、線状ファージのコートタンパク質との融合によってランダムなペプチド配列を表示することができる。表示されたペプチドは、所望する場合は、受容体の抗体固定化細胞ガイドメインに対してアフィニティー溶出することができる。アフィニティー精製と再増殖の連続的な実施によって保持されたファージを濃縮しうる。最良結合ペプチドを配列決定して、１又はそれ以上の構造的に関連するファミリーのペプチドの中で鍵となる残基を特定することができる。例えば、その中で２つの異なるファミリーが特定された、Ｃｗｉｒｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１６９６−９（１９９７）参照。そのペプチド配列はまた、どの残基がアラニンスキャニングによって又はＤＮＡレベルでの突然変異誘発によって安全に置換しうるかを示唆すると考えられる。最良結合因子の配列をさらに至適化するために、突然変異誘発ライブラリーを作製して、スクリーニングしてもよい。Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４（１９９７）。
【００８７】
タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析も、大型タンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを示唆するために使用しうる。そのような分析においては、結晶構造が大型タンパク質リガンドの決定的に重要な残基の同一性と相対的方向を示唆することができ、それらからペプチドを設計しうる。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：１２６６−７０（１９９７）参照。これらの分析方法はまた、受容体タンパク質とファージディスプレイによって選択されたペプチドの間の相互作用を検討するためにも使用でき、そのような検討は、結合親和性を高めるためのペプチドのさらなる修飾を示唆しうる。
【００８８】
他の方法も、ペプチド研究においてファージディスプレイにひけをとらない。ペプチドライブラリーをｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端に融合して、大腸菌において発現させることができる。もう１つの大腸菌に基づく方法は、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合によって細胞の外膜上に表示させる。以下、これら及び関連する方法を集合的に「大腸菌ディスプレイ」と称する。もう１つの方法では、ランダムなＲＮＡの翻訳をリボソーム放出の前で停止させて、それらの関連ＲＮＡがまだ結合しているポリペプチドのライブラリーを生じさせる。以下、これ及び関連する方法を集合的に「リボソームディスプレイ」と称する。他の方法は、ＲＮＡへのペプチドの化学結合を使用する。例えば、ＲｏｂｅｒｔｓとＳｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３（１９９７）参照。以下、これ及び関連する方法を集合的に「ＲＮＡペプチドスクリーニング」と称する。ペプチドがポリエチレンロッド又は溶媒透過性樹脂などの安定な非生物学的物質上に固定されている、化学的に誘導されるペプチドライブラリーが開発された。もう１つの化学的に誘導されるペプチドライブラリーは、スライドガラス上に固定されたペプチドを走査するために写真平板法（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）を使用する。以下、これら及び関連する方法を集合的に「化学的ペプチドスクリーニング」と称する。化学的ペプチドスクリーニングは、Ｄ−アミノ酸及び他の非天然類似体、ならびに非ペプチドエレメントの使用を可能にするという点で有利である。生物学的方法と化学的方法の両方がＷｅｌｌｓとＬｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：３５５−６２（１９９２）に総説されている。
【００８９】
概念的には、ファージディスプレイ及び上述した他の方法を用いてあらゆるタンパク質のペプチドミメティックを発見しうる。これらの方法は、エピトープマッピングのため、タンパク質−タンパク質相互作用における重要アミノ酸の特定のため、及び新しい治療物質の発見のための手がかり（ｌｅａｄ）として使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｔｅｓｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：６１６−２１（１９９６）参照。ペプチドライブラリーは現在、エピトープマッピングなどの免疫学的試験において最も頻繁に使用されている。Ｋｒｅｅｇｅｒ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １０（１３）：１９−２０（１９９６）参照。
【００９０】
ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって特定されるペプチドは、治療薬としてよりはむしろ治療薬の開発における「手がかり」とみなされてきた。他のタンパク質及びペプチドと同様に、それらは腎ろ過によって、細網内皮系における細胞クリアランス機序によって、又はタンパク質分解によって、インビボで速やかに除去されると考えられる［Ｆｒａｎｃｉｓ、前出］。その結果、この技術分野では現在、化学的ライブラリースクリーニングを通してはそれほど容易に又はそれほど速やかに特定されなかったである薬剤標的の有効性を確認するため又は有機化合物の設計のためのたたき台として、ペプチドを使用する［Ｌｏｗｍａｎ、前出；Ｋａｙら、前出］。この技術分野は、そのようなペプチドが血管新生に対する治療薬をより容易に生み出すことができるプロセスから恩恵を受ける。
【００９１】
ペプチ体の構造
本発明に従って調製される組成物では、ペプチドは、そのペプチドのＮ末端又はＣ末端を通してビヒクルに結合されうる。そこで、本発明のビヒクル−ペプチド分子は下記の５つの式及びその多量体によって表わしうる：
【００９２】
【表６】
2010189394.tif 000016
式中、
Ｆ１は、ビヒクル（好ましくはＦｃドメイン）であり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及び、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立してここで述べる薬理的に活性なペプチドの配列であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーである］
から選択され；及び
「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」及び「ｆ」は、「ａ」及び「ｂ」の少なくとも１つが１であることを条件として、各々独立して０又は１である。
【００９３】
ペプチド
本発明は、Ａｎｇ−２に選択的に又は特異的に結合するペプチドを考慮する。いかなる数のそのようなペプチドも本発明に関連して使用しうる。ファージディスプレイは、特に、ランダムペプチドのライブラリーからのアフィニティー選択を使用していかなる遺伝子産物のいかなる部位についてのペプチドリガンドも特定できることが示されたように、本発明において使用するためのペプチドを生成する上で有用である。Ｄｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３０２５−３０（１９９３）。
【００９４】
本発明におけるペプチドは、この技術分野において開示されている方法のいずれかによって作製しうる。１文字アミノ酸略語を使用する。何らかの配列（及び特定の場合に異なる規定がない限り、本明細書全体を通じて）中の「Ｘ」は、２０の天然に生じるアミノ酸残基のいずれか又は何らかの非天然に生じるアミノ酸（下記の「変異体」の章で述べる）が存在しうることを意味する。これらのペプチドのいずれかは、リンカーと共に又はリンカーなしで、縦列に（すなわち連続的に）連結されていてもよく、縦列連結の例は表に示されている。リンカーは「Ｌ」として列挙されており、ここで述べるリンカーのいずれであってもよい。明瞭にするために縦列反復配列とリンカーはダッシュで分けて示している。システイニル残基を含むいずれのペプチドも、もう１つ別のＣｙｓ含有ペプチドと架橋することができ、そのいずれか又は両方がビヒクルに連結していてもよい。２個以上のＣｙｓ残基を有するペプチドは、ペプチド内ジスルフィドも形成しうる。これらのペプチドのいずれもがここで述べるように誘導体化しうる。カルボキシル末端がアミノ基でキャップされうる誘導体については、そのキャップアミノ酸は−ＮＨ２である。アミノ酸残基がアミノ酸残基以外の成分で置換される誘導体については、その置換基はＳで表わされ、参照してここに組み込まれる、Ｂｈａｔｎａｇａｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９（１９９６）、及びＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２（１９９７）に述べられている成分のいずれかを意味する。すべてのペプチドは、特に異なる記載がない限り、ペプチド結合を通して連結される。
【００９５】
ビヒクル
１つの実施形態では、本発明は、そのペプチドのＮ末端、Ｃ末端又はアミノ酸残基の１個の側鎖を通して少なくとも１つのビヒクル（Ｆ１、Ｆ２）に結合する少なくとも１個のペプチドを提供する。多数のビヒクルも使用しうる；例えば各々の末端のＦｃ、又は１つの末端のＦｃと他方の末端又は側鎖のＰＥＧ基。
【００９６】
Ｆｃドメインは１つの好ましいビヒクルである。Ｆｃドメインは、ペプチドのＮ又はＣ末端に、又はＮ末端とＣ末端の両方で融合しうる。
【００９７】
上述したように、Ｆｃ変異体は本発明の範囲内の適切なビヒクルである。天然Ｆｃは、サルベージ受容体への結合が維持されることを条件として、本発明に従ったＦｃ変異体を形成するために広汎に修飾しうる。例えばＷＯ９７／３４６３１号及びＷＯ９６／３２４７８号参照。そのようなＦｃ変異体においては、本発明の融合分子には必要でない構造的特徴又は機能的活性を提供する天然Ｆｃの１又はそれ以上の部位を除去しうる。これらの部位は、例えば残基を置換するか又は欠失させる、残基をその部位に挿入する、又はその部位を含む部分を切り取ることによって除去しうる。挿入又は置換残基は、ペプチドミメティック又はＤ−アミノ酸などの変化したアミノ酸であってもよい。Ｆｃ変異体は多くの理由から望ましいと考えられ、そのいくつかを下記で述べる。例示的Ｆｃ変異体は次のような分子及び配列を含む：
【００９８】
１．ジスルフィド結合の形成に関与する部位が除去されている。そのような除去は、本発明の分子を生産するために使用する宿主細胞中に存在する、他のシステイン含有タンパク質との反応を回避しうる。このために、Ｎ末端のシステイン含有セグメントを切り取るか、又はシステイン残基を欠失させる又は他のアミノ酸（例えばアラニル、セリル）で置換しうる。システイン残基が除去されているときでも、一本鎖Ｆｃドメインはなお、非共有結合的に結合保持される二量体Ｆｃドメインを形成することができる。
【００９９】
２．天然Ｆｃが、選択宿主細胞とより適合性になるように修飾されている。例えば、プロリンイミノペプチダーゼなどの大腸菌内の消化酵素によって認識されうる、典型的天然ＦｃのＮ末端近くのＰＡ配列を除去しうる。また、特にその分子が大腸菌などの細菌細胞において組換え発現されるときは、Ｎ末端メチオニル残基を付加してもよい。
【０１００】
３．選択宿主細胞において発現されたときのＮ末端の異質性を防ぐために天然ＦｃのＮ末端の一部が除去されている。このために、Ｎ末端の最初の２０アミノ酸残基のいずれか、特に１、２、３、４及び５番の位置のものを欠失させうる。
【０１０１】
４．１又はそれ以上のグリコシル化部位が除去されている。典型的にグリコシル化される残基（例えばアスパラギン）は細胞溶解応答を付与しうる。そのような残基を欠失させるか又は非グリコシル化残基（例えばアラニン）で置換しうる。
【０１０２】
５．Ｃ１ｑ結合部位などの、相補物との相互作用に関与する部位が除去されている。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させるか又は置換しうる。相補物の集積は本発明の分子にとって有益ではないと考えられ、それ故そのようなＦｃ変異体で回避しうる。
【０１０３】
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を及ぼす部位が除去されている。天然Ｆｃは、本発明の融合分子には必要でないある種の白血球との相互作用のための部位を有すると考えられ、そのため除去しうる。
【０１０４】
７．ＡＤＣＣ部位が除去されている。ＡＤＣＣ部位はこの技術分野において既知である。例えば、ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位に関してはＭｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）参照。これらの部位もやはり、本発明の融合分子には必要でないため、除去しうる。
【０１０５】
８．天然Ｆｃが非ヒト抗体から誘導されるときは、天然Ｆｃをヒト化しうる。典型的には、天然Ｆｃをヒト化するために、非ヒト天然Ｆｃ中の選択残基を、ヒト天然Ｆｃにおいて通常認められる残基で置換する。抗体のヒト化のための手法はこの技術分野において周知である。
【０１０６】
選択的ビヒクルは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、又はサルベージ受容体に結合することができる小分子（例えばペプチドミメティック化合物）である。例えば、Ｐｒｅｓｔａらへの１９９８年４月１４日発行の米国特許第５，７３９，２７７号に述べられているポリペプチドをビヒクルとして使用することができる。ペプチドはまた、ＦｃＲｎサルベージ受容体への結合に関してファージディスプレイから選択することもできる。そのようなサルベージ受容体結合化合物も「ビヒクル」の意味に包含され、本発明の範囲内である。そのようなビヒクルは、高い半減期（例えばプロテアーゼによって認識される配列を避けることによって）及び低い免疫原性（例えば抗体ヒト化において発見されるような、非免疫原性配列を優先することによって）のために選択すべきである。
【０１０７】
上述したように、ポリマービヒクルもＦ１及びＦ２について使用しうる。ビヒクルとして有用な化学的成分を結合するための様々な手段が現在使用可能であり、例えば、その全体が参照してここに組み込まれる、「Ｎ末端化学修飾タンパク質組成物と方法（Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開広報ＷＯ９６／１１９５３号参照。このＰＣＴ出願は、中でも特に、タンパク質のＮ末端への水溶性ポリマーの選択的結合を開示している。
【０１０８】
好ましいポリマービヒクルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ群はいかなる好都合な分子量でもよく、線状又は分枝のいずれでもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤａ」）から約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ−約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ−約１０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ群は一般に、ＰＥＧ成分上の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）を通して、本発明の化合物上の反応基（例えばアルデヒド、アミノ又はエステル基）へのアシル化又は還元的アルキル化によって本発明の化合物に結合する。
【０１０９】
合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、溶液中でコンジュゲート結合を形成することを通して、各々他方に対して相互に反応性である特殊な官能性を担う、ペプチドとＰＥＧ成分を結合することから成る。前記ペプチドは、この技術分野で知られているような従来の固相合成によって容易に作製できる。そのペプチドを特定部位で適切な官能基によって「前活性化」する。その前駆物質を精製し、ＰＥＧ成分と反応させる前に十分に特性付ける。ペプチドとＰＥＧの連結は通常水相で起こり、逆相分析用ＨＰＬＣによって容易にモニターできる。ＰＥＧ化したペプチドは分取ＨＰＬＣによって容易に精製でき、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱着質量分析によって特性付けることができる。
【０１１０】
多糖類ポリマーは、タンパク質修飾のために使用しうるもう１つの種類の水溶性ポリマーである。デキストランは、主としてａ１−６結合によって連結された個々のサブユニットのグルコースから成る多糖類ポリマーである。デキストラン自体は多くの分子量範囲内で入手可能であり、約１ｋＤａ−約７０ｋＤａの分子量で容易に入手できる。デキストランは、それだけで又はもう１つ別のビヒクル（例えばＦｃ）と組み合わせて、ビヒクルとして本発明において使用するのに適した水溶性ポリマーである。例えば、ＷＯ９６／１１９５３号及びＷＯ９６／０５３０９号参照。治療用又は診断用免疫グロブリンに複合したデキストランの使用が報告されている；例えば、参照してここに組み込まれる、欧州特許出願公開第０３１５４５６号参照。デキストランを本発明に従ってビヒクルとして使用するときは、約１ｋＤａ−約２０ｋＤａのデキストランが好ましい。
【０１１１】
リンカー
いかなる「リンカー」基も任意である。存在するときは、主としてスペーサーとして働くので、その化学構造は決定的に重要ではない。リンカーは、好ましくはペプチド結合によって共に連結されたアミノ酸で構成される。そこで、好ましい実施形態では、リンカーはペプチド結合によって連結された１個から２０個のアミノ酸で構成され、それらのアミノ酸は２０の天然に生じるアミノ酸から選択される。当業者には十分に理解されるように、これらのアミノ酸の１個又はそれ以上がグリコシル化されていてもよい。より好ましい実施形態では、１個から２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンから選択される。さらに一層好ましくは、リンカーは、グリシン及びアラニンなどの立体障害されないアミノ酸が大部分を占めて構成される。それ故、好ましいリンカーは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）８）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンである。ＧｌｙとＡｌａの組合せも、ここではＫ１と称する、本文中の実施例において示すアミノ酸配列を有するリンカーと同様に好ましい。
【０１１２】
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−［式中、ｓ＝２−２０］などのアルキルリンカーが使用できる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えばＣ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等などの非立体障害基によってさらに置換されうる。例示的な非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカーであり、１００−５０００ｋＤａ、好ましくは１００−５００ｋＤａの分子量を有する。ペプチドリンカーは、上述したのと同様にして誘導体を形成するように変化させうる。
【０１１３】
変異体及び誘導体
特異的結合物質の変異体及び誘導体は本発明の範囲内に包含される。挿入、欠失及び置換変異体が変異体に包含される。本発明の個々の特異的結合物質が１、２又は３種類すべての変異体を含みうることは明白である。挿入及び置換変異体は、天然アミノ酸、非通常アミノ酸（下記で述べるような）、又はその両方を含みうる。
【０１１４】
一例では、天然に生じる又は非通常アミノ酸のいずれかの、１個又はそれ以上のアミノ酸残基が、ペプチド又はペプチ体のアミノ酸配列を補足する挿入変異体が提供される。挿入は、タンパク質のいずれか一方又は両方の末端に位置するか、又はペプチ体アミノ酸配列の内部領域内に位置しうる。いずれか一方又は両方の末端に付加残基を有する挿入変異体は、例えば、融合タンパク質及びアミノ酸タグ又は標識を含むタンパク質を包含しうる。挿入変異体は、１個又はそれ以上のアミノ酸残基がペプチド又はペプチ体アミノ酸配列に付加されているペプチド及びペプチ体、又はそのフラグメントを含む。
【０１１５】
本発明の変異体産物はまた、リーダー又はシグナル配列が除去されており、生じるタンパク質が付加アミノ末端残基を有し、そのアミノ酸が天然又は非天然でありうる、成熟ペプチド及びペプチ体を包含する。−１のアミノ酸位置に付加メチオニル残基を有する特異的結合物質（ペプチ体など）（Ｍｅｔ−１−ペプチ体）が、−２及び−１の位置に付加メチオニン及びリシン残基を有する特異的結合物質（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−）と同様に考慮される。付加Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ残基（又は一般に１個又はそれ以上の塩基性残基）を有する変異体は、細菌宿主細胞における組換えタンパク質生産の増強のために特に有用である。
【０１１６】
本発明はまた、特定発現系の使用から生じる付加アミノ酸残基を有する特異的結合物質変異体を包含する。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合産物の一部として所望ポリペプチドを発現する市販のベクターを使用することにより、所望ポリペプチドからＧＳＴ成分を開裂した後、−１アミノ酸位置に付加グリシン残基を有する所望ポリペプチドが提供される。ポリ−ヒスチジンタグが、一般にアミノ酸配列のカルボキシ及び／又はアミノ末端でアミノ酸配列に組み込まれているものを含む、他のベクター系における発現から生じる変異体も考慮される。
【０１１７】
挿入変異体はまた、ペプチド又はペプチ体のアミノ及び／又はカルボキシ末端がもう１つ別のポリペプチド、そのフラグメント又は一般に何らかの特定タンパク質配列の一部であるとは認識されないアミノ酸に融合している融合タンパク質も包含する。そのような融合タンパク質の例は、免疫原性ポリペプチド、免疫グロブリン定常領域などの長い循環半減期を有するタンパク質、マーカータンパク質、所望ペプチド又はペプチ体の精製を容易にするタンパク質又はポリペプチド、及び多量体タンパク質の形成を促進するポリペプチド配列（二量体の形成／安定性において有用なロイシンジッパーモチーフなど）である。
【０１１８】
この種の挿入変異体は一般に、Ｎ又はＣ末端で第二ポリペプチドの全部又は一部に連結された天然分子の全部又は実質的な部分を有する。例えば、融合タンパク質は、典型的には異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にする他の種からのリーダー配列を使用する。もう１つの有用な融合タンパク質は、その融合タンパク質の精製を容易にするための、抗体エピトープなどの免疫学的に活性なドメインの付加を含む。融合の接合点又はその近くに開裂部位を含むことは、精製後の外来性ポリペプチドの除去を容易にする。他の有用な融合は、酵素からの活性部位などの機能的ドメイン、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル又は膜貫通領域の連結を含む。
【０１１９】
本発明において使用しうる様々な市販の融合タンパク質発現系が存在する。特に有用な系は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、及び６ｘＨｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。これらの系は、そのペプチド又はペプチ体の活性に有意の影響を及ぼさないと考えられる、少数の付加アミノ酸だけを担う組換えペプチド及び／又はペプチ体を生産することができる。例えば、ＦＬＡＧ系と６ｘＨｉｓ系は、そのいずれもが、抗原性が低いことが知られており、ポリペプチドのその天然立体配座への折りたたみに有害な作用を及ぼさない短い配列だけを付加する。有用と考えられるもう１つのＮ末端融合は、タンパク質又はペプチドのＮ末端領域におけるＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。そのような融合は、タンパク質の発現又は活性の有益な上昇をもたらしうる。
【０１２０】
他の融合系は、所望ペプチド又はペプチ体から融合パートナーを切り出すことが望ましいポリペプチドハイブリッドを生産する。１つの実施形態では、融合パートナーは、プロテアーゼについての特異的認識配列を含むペプチド配列によって組換えペプチ体に連結される。適切な配列の例は、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）又は第Ｘａ因子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｒｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって認識されるものである。
【０１２１】
本発明はまた、トランケート型組織因子（ｔＴＦ）と組み合わせて、本発明のペプチ体又はペプチドの全部又は一部を含む融合ポリペプチドを提供する。ｔＴＦは、米国特許第５，８７７，２８９号；同第６，００４，５５５号；同第６，１３２，７２９号；同第６，１３２，７３０号；同第６，１５６，３２１号；及び欧州特許第ＥＰ０９８８０５６号に述べられているように、腫瘍血管凝固物質として働くヒト凝固誘導タンパク質のトランケート型形態から成る。抗Ａｎｇ−２ペプチ体又はペプチド、又はそのフラグメントへのｔＴＦの融合は、標的細胞への抗Ａｎｇ−２の送達を促進する。
【０１２２】
もう１つの局面では、本発明は、ペプチド又はペプチ体内の１個又はそれ以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は、ペプチ体の一方又は両方の末端において、又はペプチ体アミノ酸配列内の１個又はそれ以上の残基の除去から、実施することができる。欠失変異体は必然的にペプチド又はペプチ体のすべてのフラグメントを含む。
【０１２３】
さらにもう１つの局面では、本発明は、本発明のペプチド及びペプチ体の置換変異体を提供する。置換変異体は、１個又はそれ以上のアミノ酸残基が除去されて、天然又は非天然に生じる、１個又はそれ以上の代替アミノ酸で置換されているペプチド及びペプチ体を含む。置換変異体は、その２個の分子がある程度のパーセンテージの同一アミノ酸を有するという点で、もとのペプチド又はペプチ体に「類似」するペプチド又はペプチ体を生じる。置換変異体は、ペプチド又はペプチ体内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個のアミノ酸の置換を含み、置換の数は該ペプチド又はペプチ体のアミノ酸の１０％又はそれ以上まででありうる。１つの局面では、置換は本来保存的であるが、本発明は非保存的である置換も包含し、また非通常アミノ酸も含む。
【０１２４】
関連ペプチド及びペプチ体の同一性及び類似性は既知の方法によって容易に算定できる。そのような方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；及びＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に述べられているものを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
２個のペプチド又はペプチ体、又はポリペプチドとペプチドの関連性又はパーセント同一性を決定するための好ましい方法は、検討する配列の間で最大の対合を与えるように設計する。同一性を決定するための方法は、公的に使用可能なコンピュータプログラムの中に述べられている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出（１９９０））より公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用しうる。
【０１２６】
２個のアミノ酸配列を整列化するための一部の整列スキームは、２つの配列の短い領域だけの対合を生じることがあり、この小さな整列領域は、その２つの完全長配列の間に有意の関係がない場合でも、非常に高い配列同一性を有しうる。従って、一部の実施形態では、選択した整列方法（ＧＡＰプログラム）は、比較する標的ポリペプチドの完全長の少なくとも１０％に及ぶ整列化、すなわち少なくとも４００アミノ酸の配列を比較する場合は少なくとも４０個の隣接アミノ酸、少なくとも３００−約４００アミノ酸の配列を比較する場合は３０個の隣接アミノ酸、２００−約３００アミノ酸の配列を比較する場合は少なくとも２０個の隣接アミノ酸、約１００−２００アミノ酸の配列を比較する場合は少なくとも１０個の隣接アミノ酸を生じる。
【０１２７】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、パーセント配列同一性を決定しようとする２個のポリペプチドを、それらのそれぞれのアミノ酸が最適対合するように（アルゴリズムによって決定される「対合スパン」）整列する。一部の実施形態では、ギャップ開始ペナルティー（典型的には３Ｘ平均対角線として算定される；「平均対角線」は、使用する比較マトリックスの対角線の平均値である；「対角線」は、個々の比較マトリックスによって各々完全なアミノ酸対合に割り当てられるスコア又は数値である）及びギャップ伸長ペナルティー（通常ギャップ開始ペナルティーの１／１０である）、ならびにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスをこのアルゴリズムと共に使用する。一部の実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５（３）（１９７８）；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）参照）もこのアルゴリズムによって使用される。
【０１２８】
一部の実施形態では、ポリペプチド配列比較のためのパラメータは次のものを含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関して有用でありうる。一部の実施形態では、上記のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用したポリペプチド比較のためのデフォルトパラメータ（末端ギャップについてのペナルティーなし）である。
【０１２９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド分子配列（アミノ酸配列に対して）比較についてのパラメータは次のものを含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、前出（１９７０）；
比較マトリックス：対合＝＋１０、不適正対合＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関しても有用でありうる。上記のパラメータは、ポリヌクレオチド分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【０１３０】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９、１９９７年９月に述べられているものを含む、他の例示的なアルゴリズム、ギャップ開始ペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較マトリックス、類似性の閾値等も使用しうる。行うべき個々の選択は当業者には明白であり、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡなどの、実施する特定の比較、及びそれに加えて、比較を所与の配列の対の間で行うか（この場合は一般にＧＡＰ又はＢｅｓｔＦｉｔが好ましい）又は１個の配列と配列の大きなデータベースの間で行うか（この場合はＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＡが好ましい）に依存する。
【０１３１】
ここで使用するとき、２０の通常アミノ酸及びそれらの略語は慣例的用法に従う。参照してここに組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ―Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂとＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編集、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））参照。
【０１３２】
アミノ酸はＬ型又はＤ型立体化学のいずれかを有しており（Ｇｌｙを除く、ＧｌｙはＬでもＤでもない）、本発明のポリペプチド及び組成物は立体化学の組合せを含みうる。しかし、Ｌ立体化学が好ましい。本発明はまた、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端への配列が逆転している逆分子（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を提供する。例えば、正常配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する分子の逆は、Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１である。本発明はまた、上記のように、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端への配列が逆転しており、且つ通常「Ｌ」鏡像異性体である残基が「Ｄ」立体異性体に変化しているレトロ逆分子を提供する。
【０１３３】
２０の通常アミノ酸、α−、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸などの非天然アミノ酸、及び他の非通常アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）も、本発明のポリペプチドのための適切な成分でありうる。非通常アミノ酸の例は、限定を伴わずに次のものを含む：アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノへプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、ジアミノイソ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似アミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）。
【０１３４】
同様に、特に異なる規定がない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５’側方向と称する。発生期ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向を転写方向と称する；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写産物の５’側から５’末端までにある、ＤＮＡ鎖上の配列領域を「上流配列」と称する；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写産物の３’側から３’末端までにある、ＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」と称する。
【０１３５】
アミノ酸残基がそれらの共通の側鎖特性に基づくクラスに分類できることは認識される：
【０１３６】
１．中性疎水性：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）及びメチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）。
【０１３７】
２．中性極性：グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｕ；Ｑ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）及びノルロイシン。
【０１３８】
３．酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）。
【０１３９】
４．塩基性：リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）。
【０１４０】
Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４），ｐ．１１参照。
【０１４１】
保存的アミノ酸置換は、典型的には生物系における合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非通常アミノ酸残基を包含しうる。これらは、限定を伴わずに、ペプチドミメティック及び他の逆又は逆転形態のアミノ酸成分を含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つの成員がもう１つ別のクラスの成員に交換されることを含みうる。
【０１４２】
そのような変更を行う場合、一部の実施形態によれば、アミノ酸の疎水親水指数を考慮しうる。各々アミノ酸は、そのヒドロパシー（疎水親水性）及び電荷特性に基づいて疎水親水指数を割り当てられている。それらは：イソロイン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【０１４３】
タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する上でのアミノ酸疎水親水指数の重要性はこの技術分野において理解されている。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。一部のアミノ酸は、類似した疎水親水指数又はスコアを有する他のアミノ酸に置換されうること、そしてそれでもなお同様の生物活性を保持しうることが知られている。疎水親水指数に基づいて変更を行う場合、一部の実施形態では、その疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。一部の実施形態では、±１以内であるものが含まれ、また一部の実施形態では、±０．５以内であるものが含まれる。
【０１４４】
また、類似アミノ酸の置換は、特に、本発明の場合のように、それによって創造される生物学的に機能性のペプチ体又はペプチドが免疫学的実施形態における使用を意図される場合は、疎水性に基づいて有効に実施しうることも、この技術分野において理解されている。一部の実施形態では、その隣接アミノ酸の親水性に支配される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性と抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１４５】
次のような親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；及びトリプトファン（−３．４）。類似親水性値に基づいて変更を行う場合、一部の実施形態では、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、一部の実施形態では、±１以内であるものが含まれ、また一部の実施形態では、±０．５以内であるものが含まれる。また、親水性値に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを特定しうる。これらの領域は「エピトープコア領域」とも称される。
【０１４６】
例示的アミノ酸置換を下記の表２に示す。
【０１４７】
【表７】
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【０１４８】
当業者は、周知の手法を使用してここで述べるようなポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。一部の実施形態では、当業者は、活性にとって重要ではないと考えられる領域を標的することにより、活性を破壊することなく変更しうる分子の適切な領域を特定しうる。一部の実施形態では、類似ペプチド又はポリペプチド間で保存される分子の残基及び部分を特定することができる。一部の実施形態では、生物活性にとって又は構造にとって重要と考えられる領域でさえも、生物活性を破壊することなく又はポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。
【０１４９】
加えて、当業者は、活性又は構造にとって重要である類似ポリペプチド内の残基を特定する構造−機能試験を検討することができる。そのような比較に鑑みて、類似タンパク質内の活性又は構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質内のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測上の重要アミノ酸残基に関して化学的に類似するアミノ酸置換を選択しうる。
【０１５０】
当業者はまた、類似ポリペプチドにおける構造に関連付けて三次元構造及びアミノ酸配列を分析することができる。そのような情報に鑑みて、当業者は、その三次元構造に関する抗体のアミノ酸残基の整列を予測しうる。一部の実施形態では、当業者は、タンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残基に根本的な変化を加えないことを選択しうる。そのような残基は他の分子との重要な相互作用に関与すると考えられるからである。さらに、当業者は、各々の所望アミノ酸残基における１個のアミノ酸置換を含む試験変異体を生成しうる。次のその変異体を、当業者に既知の活性検定を使用してスクリーニングすることができる。そのような変異体は、適切な変異体についての情報を収集するために使用できる。例えば、特定アミノ酸残基への変更が活性の破壊、望ましくない活性低下、又は不適切な活性をもたらすことを発見した場合は、そのような変更を有する変異体を回避しうる。言い換えると、そのような常用実験から収集した情報に基づいて、当業者は、単独で又は他の突然変異と組み合わせて、さらなる置換を避けるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【０１５１】
多くの学術公表文献が二次構造の予測に当てられている。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕら、Ｂｉｏｃｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）参照。さらに、二次構造の予測を助けるためにコンピュータプログラムが現在使用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、ホモロジーモデリングに基づく。例えば、３０％以上の配列同一性又は４０％以上の類似性を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、しばしば類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の成長は、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の潜在的な折りたたみの数を含む、二次構造の高い予測能力を提供した。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）参照。所与のポリペプチド又はタンパク質内には限られた数の折りたたみが存在すること及びひとたび重要な数の構造が解明されれば、構造予測は劇的により正確になると示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
【０１５２】
二次構造を予測するさらなる方法は、「スレッディング法」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、及び「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，前出（１９９９）、及びＢｒｅｎｎｅｒ，前出（１９９７））を含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、ペプチ体変異体は、Ｎ−結合グリコシル化部位などの１又はそれ以上のグリコシル化部位が該ペプチ体に付加されたグリコシル化変異体を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ［式中、Ｘで表わされるアミノ酸残基はプロリン以外のいかなるアミノ酸残基でもよい］によって特徴付けられる。この配列を創造するためのアミノ酸残基の置換又は付加は、Ｎ−結合糖鎖の付加のための潜在的な新しい部位を提供する。代替的に、この配列を排除する置換は既存のＮ−結合糖鎖を除去する。また、１又はそれ以上のＮ−結合グリコシル化部位（典型的には天然に生じるもの）を排除し、１又はそれ以上の新しいＮ−結合部位を創造するＮ−結合糖鎖の再配列も提供される。
【０１５４】
本発明はまた、アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換以外の又はそれらに加えて、修飾を担うペプチ体を含む「誘導体」を提供する。好ましくは、その修飾は本来共有結合であり、例えば、重合体、脂質、他の有機及び無機成分との化学結合を含む。本発明の誘導体は、ペプチ体の循環半減期を上昇させるように作製しうるか、又は所望細胞、組織又は器官を標的するペプチ体の能力を改善するように設計しうる。
【０１５５】
例示的な誘導体は、次の修飾の１又はそれ以上が為されている成分を含む：
・ペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合の１つ又はそれ以上が、−ＣＨ２−カルバメート結合［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］；ホスホネート結合；−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］結合；尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］結合；−ＣＨ２−第二級アミン結合；又はアルキル化ペプチジル結合［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−［式中、Ｒ６は低級アルキルである］］などの非ペプチジル結合によって置換されている。
【０１５６】
・Ｎ末端が、−ＮＲＲ１基；−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基；−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基；−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基；−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基［式中、Ｒ及びＲ１は、ＲとＲ１の両方同時に水素ではないことを条件として、水素又は低級アルキルである］；ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）基；フェニル環上に低級アルキル、低級アルコキシ、クロロ及びブロモから成る群より選択される１個から３個の置換基を有するベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−基に誘導体化されているペプチド；及び
・遊離Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２［式中、Ｒ２は、低級アルコキシ及び−ＮＲ３Ｒ４［式中、Ｒ３及びＲ４は水素及び低級アルキルから成る群より独立して選択される］から成る群より選択される］に誘導体化されているペプチド。「低級」とは、１個から６個の炭素原子を有する基を意味する。
【０１５７】
・さらに、個々のアミノ酸の修飾は、該ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択した側鎖又は末端残基と反応することができる有機誘導体化試薬と反応させることによって、本発明のポリペプチド又は組成物に導入しうる。下記はその例示である：
リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応しる。これらの物質による誘導体化はリシニル残基の電荷を逆転させる作用を持つ。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬は、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロホウ水素化物；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応を含む。
【０１５８】
アルギニル残基は、１個又はいくつかの慣用試薬、中でも特にフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応によって修飾しうる。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａの故に、アルカリ性条件下で反応を実施することを必要とする。さらに、これらの試薬はリシンの基ならびにアルギニングアニジノ基と反応しうる。
【０１５９】
チロシン残基の特異的修飾はそれ自体広汎に検討されており、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関心が寄せられている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成しうる。
【０１６０】
カルボニル側鎖（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって代替的に修飾しうる。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換しうる。
【０１６１】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミド化される。選択的に、これらの残基を弱酸性条件下で脱アミド化しうる。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
【０１６２】
二官能性物質による誘導体化は、ペプチド又はそれらの機能性誘導体を水不溶性支持マトリックス又は他の高分子担体に架橋するために有用である。一般的に使用される架橋剤は、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）などのジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドを含む。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生じる。代替的に、臭化シアン活性化糖質などの反応性水不溶性マトリックス及び米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号に述べられている反応性基質がタンパク質の固定化のために使用しうる。
【０１６３】
他の可能な修飾は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化及び、一部の場合は、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１６４】
そのような誘導体化した成分は、好ましくは、該化合物の抗血管新生作用、溶解度、吸収、生物学的半減期等を含む１つ又はそれ以上の特徴を改善する。代替的に、誘導体化成分は、誘導体化されない化合物と同じか又は基本的に同じ特徴及び／又は特性を有する化合物を生じうる。それらの成分は、選択的に、該化合物の望ましくない副作用等を排除しうる又は減じうる。
【０１６５】
本発明の化合物はＤＮＡレベルでも変化させうる。該化合物のいずれかの部分のＤＮＡ配列を、選択する宿主細胞とより適合性のコドンに変更しうる。好ましい宿主細胞である大腸菌については、最適化コドンはこの技術分野において既知である。選択宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングの助けとなる、制限部位を排除する又は沈黙化制限部位を含むようにコドンを置換することができる。前記の配列変化のいずれかを含むようにビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列を修飾しうる。従って、ここで論じるすべての修飾、置換、誘導体化等は、ペプチド、ペプチド二量体及び多量体、リンカー及びビヒクルを含む、本発明のすべての局面に等しく適用される。
【０１６６】
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である類似ポリペプチド内の残基を特定する構造−機能試験を検討することができる。そのような比較に鑑みて、類似タンパク質内の活性又は構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質内のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測上の重要アミノ酸残基に関して化学的に類似するアミノ酸置換を選択しうる。
【０１６７】
当業者はまた、類似ポリペプチドにおける構造に関連付けて三次元構造及びアミノ酸配列を分析することができる。そのような情報に鑑みて、当業者は、その三次元構造に関する抗体のアミノ酸残基の整列を予測しうる。当業者は、タンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残基に根本的な変化を加えないことを選択しうる。そのような残基は他の分子との重要な相互作用に関与すると考えられるからである。さらに、当業者は、各々の所望アミノ酸残基における１個のアミノ酸置換を含む試験変異体を生成しうる。次のその変異体を、当業者に既知の活性検定を使用してスクリーニングすることができる。そのようなデータは、適切な変異体についての情報を収集するために使用できる。例えば、特定アミノ酸残基への変更が活性の破壊、望ましくない活性低下、又は不適切な活性をもたらすことが発見された場合は、そのような変更を有する変異体は回避される。言い換えると、そのような常用実験から収集した情報に基づいて、当業者は、単独で又は他の突然変異と組み合わせて、さらなる置換を避けるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【０１６８】
多くの学術公表文献が二次構造の予測に当てられている。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕら、Ｂｉｏｃｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）参照。さらに、二次構造の予測を助けるためにコンピュータプログラムが現在使用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、ホモロジーモデリングに基づく。例えば、３０％を超える配列同一性又は４０％を超える類似性を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、しばしば類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の成長は、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の潜在的な折りたたみの数を含む、二次構造の高い予測能力を提供した。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）参照。所与のポリペプチド又はタンパク質内には限られた数の折りたたみが存在すること及びひとたび重要な数の構造が解明されれば、構造予測は劇的により正確になると示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
【０１６９】
二次構造を予測するさらなる方法は、「スレッディング法」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、及び「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅ，前出及びＢｒｅｎｎｅｒ，前出）を含む。
【０１７０】
本発明はさらに、誘導体特異的結合物質、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；及び同第４，１７９，３３７号に述べられているような、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどの１個又はそれ以上の水溶性ポリマー結合物を含むように共有結合修飾されたペプチ体を包含する。この技術分野で既知のさらなる他の有用なポリマーは、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース又は他の糖質ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）及びポリビニルアルコール、ならびにこれらのポリマーの混合物を含む。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有結合修飾されたペプチ体である。水溶性ポリマーは、特定位置で、例えばペプチ体のアミノ末端で結合しうるか、又はポリペプチドの１つ又はそれ以上の側鎖にランダムに結合しうる。特異的結合物質、例えばペプチ体、及び特にヒト化抗体についての治療能力を改善するためのＰＥＧの使用は、２０００年１０月１７日発行のＧｏｎｚａｌｅｓらへの米国特許第６，１３３，４２６号に述べられている。
【０１７１】
本発明はまた、該化合物のペプチド及び／又はビヒクル部分を誘導体化することを考慮する。そのような誘導体は、化合物の溶解度、吸収、生物学的半減期等を改善しうる。それらの成分は、代替的に、該化合物の望ましくない副作用等を排除しうる又は減じうる。例示的な誘導体は次のような化合物を含む：
【０１７２】
１．該化合物又はその何らかの部分が環状である。例えば、ペプチド部分を、ジスルフィド結合の形成によって環化できる、２個又はそれ以上のＣｙｓ残基を含むように（例えばリンカー内に）修飾しうる。
【０１７３】
２．該化合物が架橋している又は分子間で架橋できるようになっている。例えば、ペプチド部分を、１個のＣｙｓ残基を含み、それによって同様の分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるように修飾しうる。該化合物はまた、そのＣ末端を通して架橋していてもよい。
【０１７４】
３．１又はそれ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合が非ペプチジル結合によって置換されている。例示的な非ペプチジル結合は、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−第二級アミン、及びアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−［式中、Ｒ６は低級アルキルである］］である。
【０１７５】
４．Ｎ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端はアシル化されるか又は置換アミンに変更されうる。例示的なＮ末端誘導体基は、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシニミド、又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）、［式中Ｒ及びＲ１は、各々独立して水素又は低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ及びブロモから成る群より選択される１個から３個の置換基である］を含む。
【０１７６】
５．遊離Ｃ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端はエステル化されるか又はアミド化される。例えば、この技術分野で記述されている方法を使用して、Ｃ末端で本発明の化合物に（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加しうる。同様に、この技術分野で記述されている方法を使用して、Ｃ末端で本発明の化合物に−ＮＨ２を付加しうる。例示的なＣ末端誘導体基は、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２［式中、Ｒ２は、低級アルコキシ又は−ＮＲ３Ｒ４［式中、Ｒ３及びＲ４は、独立して水素又はＣ１−Ｃ８アルキル（好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル）である］である］を含む。
【０１７７】
６．ジスルフィド結合がもう１つ別の、好ましくはより安定な、架橋成分（例えばアルキレン）で置換されている。例えばＢｈａｔｎａｇａｒ（前出）；Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ  Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．，３５７−９（１９９３）参照。
【０１７８】
７．１個又はそれ以上の個々のアミノ酸残基が修飾されている。様々な誘導体化剤が、下記で詳述するように、選択側鎖又は末端残基と特異的に反応することが知られている。
【０１７９】
リシニル残基及びアミノ末端残基は、リシニル残基の電荷を逆転させる、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応しうる。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬は、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロホウ水素化物；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応を含む。
【０１８０】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンを含む、１個又はいくつかの慣用試薬の組合せとの反応によって修飾しうる。アルギニル残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａの故に、アルカリ性条件下で反応を実施することを必要とする。さらに、これらの試薬はリシンの基ならびにアルギニンε−アミノ基と反応しうる。
【０１８１】
チロシン残基の特異的修飾は広汎に検討されており、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関心が寄せられている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。
【０１８２】
カルボニル側鎖（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾しうる。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換しうる。
【０１８３】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミド化されうる。代替的に、これらの残基は弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
【０１８４】
システイニル残基は、アミノ酸残基又はジスルフィド結合を除去するため又は逆に、架橋を安定化するための他の成分によって置換することができる。例えばＢｈａｔｎａｇａｒ（前出）参照。
【０１８５】
二官能性物質による誘導体化は、ペプチド又はそれらの機能性誘導体を水不溶性支持マトリックス又は他の高分子ビヒクルに架橋するために有用である。一般的に使用される架橋剤は、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）などのジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドを含む。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生じる。代替的に、臭化シアン活性化糖質などの反応性水不溶性マトリックス及び米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号に述べられている反応性基質がタンパク質の固定化のために使用しうる。
【０１８６】
糖質（オリゴ糖）基は、タンパク質内のグリコシル化部位であることが知られている部位に好都合に結合しうる。一般に、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ［式中、Ｘはプロリン以外のあらゆるアミノ酸残基でありうる］の部分であるとき、Ｏ−結合オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合し、Ｎ−結合オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合する。Ｘは、好ましくはプロリン以外の１９の天然に生じるアミノ酸の１つである。Ｎ結合及びＯ結合オリゴ糖の構造及び各々の種類で認められる糖残基は異なる。両方で一般的に認められる糖の１つの種類はＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は通常Ｎ結合及びＯ結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷により、グリコシル化化合物に酸性特性を付与しうる。そのような部位は本発明の化合物のリンカー内に組み込むことができ、好ましくはポリペプチド化合物の組換え生産の間に（例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳類細胞において）細胞によってグリコシル化される。しかし、そのような部位は、この技術分野で既知の合成又は半合成手順によってさらにグリコシル化しうる。
【０１８７】
他の可能な修飾は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐ．７９−８６（１９８３）］を含む。
【０１８８】
本発明の化合物はＤＮＡレベルでも変化させうる。該化合物のいずれかの部分のＤＮＡ配列を、選択する宿主細胞とより適合性のコドンに変更しうる。好ましい宿主細胞である大腸菌については、最適化コドンはこの技術分野において既知である。選択宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングの助けとなる、制限部位を排除する又は沈黙化制限部位を含むようにコドンを置換することができる。ビヒクル、リンカー及びペプチド配列は、前記の配列変化のいずれかを含むように修飾しうる。
【０１８９】
親和性成熟
本発明の１つの実施形態は、「親和性成熟した」ペプチド及びペプチ体を含む。この手順は、ファージディスプレイ又は他の選択テクノロジーを使用して本発明のペプチド及びペプチ体の親和性又は生物活性を高めることを考慮する。コンセンサス配列（関連ペプチドの収集のために生成される）に基づいて、「コア」アミノ酸（コンセンサス配列から決定される）が一定に保持されている又はその発生頻度に偏りがある、指定二次ファージディスプレイライブラリーを作製することができる。代替的に、個々のペプチド配列は、偏りのある指定ファージディスプレイライブラリーを作製するために使用できる。そのようなライブラリーのパニングは、Ａｎｇ−２への高い結合又は高い生物活性を有するペプチド（ペプチ体に変換することができる）を生じることができる。
【０１９０】
非ペプチド類似体／タンパク質ミメティック
さらに、安定な構造又は低い生分解を提供するペプチドの非ペプチド類似体も考慮される。ペプチド模倣性類似体は、選択した阻害性ペプチドに基づいて１個又はそれ以上の残基を非ペプチド成分で置換することによって作製できる。好ましくは、その非ペプチド成分は、ペプチドがその天然の立体配座を保持する、又はＡｎｇ−２を認識し、結合する能力を保持する好ましい、例えば生物活性な立体配座を安定化することを可能にする。１つの局面では、生じる類似体／ミメティックはＡｎｇ−２に対する高い結合親和性を示す。ペプチドから非ペプチドミメティック類似体を作製するための方法の一例が、Ｎａｃｈｍａｎら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．５７：３５９−３７０（１９９５）に述べられている。所望する場合は、本発明のペプチドを、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によって、又は本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル及びＮ−アシル誘導体の生成によって修飾することができる。ペプチ体も、他の成分との共有結合又は非共有結合複合体を形成することによってペプチド誘導体を生成するように修飾することができる。共有結合複合体は、ペプチ体を含むアミノ酸の側鎖上の官能基、若しくはＮ又はＣ末端に化学的成分を結合することによって作製できる。
【０１９１】
特に、該ペプチドは、放射能標識、蛍光標識、酵素（例えば比色定量又は蛍光分析反応を触媒する）、基質、固体マトリックス又は担体（例えばビオチン又はアビジン）を含むが、これらに限定されないレポーター基に複合できることが予想される。本発明は、従って、ペプチ体分子を含み、好ましくは放射能標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス及び担体からなる群より選択されるレポーター基をさらに含む分子を提供する。そのような標識は当業者に周知であり、例えばビオチン標識が特に考慮される。そのような標識の使用は当業者に周知であり、例えば米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９９６，３４５号；及び同第４，２７７，４３７号に述べられている。有用となる他の標識は、放射能標識、蛍光標識及び化学発光標識を含むが、これらに限定されない。そのような標識の使用に関する特許は、例えば米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；及び同第３，９９６，３４５号を含む。本発明のペプチドのいずれも、これらの標識の１個、２個又はそれ以上を含みうる。
【０１９２】
ペプチドを作製する方法
本発明のペプチドは、この技術分野で既知の様々な手法を使用して作製することができる。例えば、そのようなペプチドは、従来の手法に従って溶液中又は支持体上で合成することができる。様々な自動合成器が市販されており、既知のプロトコールに従って使用できる。例えば、各々参照してここに組み込まれる、ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ（前出）；Ｔａｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６）；ＢａｒａｎｙとＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１−２８４；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，３０：７０５−７３９（１９８７）；及び米国特許第５，４２４，３９８号参照。
【０１９３】
固相ペプチド合成法は、０．１−１．０ｍＭアミン／ｇポリマーを含むコポリ（スチレンジビニルベンゼン）を使用する。ペプチド合成のためのこれらの方法は、α−アミノ基のブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）又は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護を用いる。どちらの方法も、ペプチドのＣ末端から出発して各々の段階で１個のアミノ酸を付加する段階的合成を含む（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｉｃｅｎｃｅ，１９９１，Ｕｎｉｔ９参照）。化学合成の完了時に、合成ペプチドを脱保護してｔ−ＢＯＣ又はＦＭＯＣアミノ酸保護基を除去し、低温での酸による処理によって（例えば０℃で約１５分間から約１時間、液体ＨＦ−１０％アニソール）ポリマーから開裂することができる。試薬を蒸発させた後、ペプチドを１％酢酸溶液でポリマーから抽出し、次にそれを凍結乾燥して粗物質を生成する。これを通常、５％酢酸を溶媒として使用するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５でのゲルろ過などの手法によって精製することができる。カラムの適切な分画を凍結乾燥することにより、均質なペプチド又はペプチド誘導体を生成し、次にそれを、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、モル旋光度、溶解度などの標準的手法によって特性付け、固相エドマン分解法によって定量することができる。
【０１９４】
ファージディスプレイライブラリーからペプチドを選択することなどの他の方法も使用可能である。ライブラリーは、ここで述べるようなアミノ酸のセットから作製することができる。ファージディスプレイは、本発明に従った有用なペプチドを特定する上で特に有用でありうる。簡単に述べると、４個から約８０個のアミノ酸残基からインサートを表示するファージライブラリーを作製する（例えばｍｌ  １３，ｆｄ又はλファージを使用して）。それらのインサートは、例えば完全な変性又はバイアスアレイでありうる。次に、所望抗原に結合するファージ担持インサートを選択することができる。所望抗原に結合するファージを再選択する数回のサイクルを通してこの過程を反復することができる。反復ラウンドは、特定配列を担うファージの濃縮を導く。発現されたペプチドの配列を特定するためにＤＮＡ配列分析を実施することができる。所望抗原に結合する配列の最小線状部分を決定することができる。最小線状部分の一部又は全部プラスその上流又は下流の１個又はそれ以上の付加変性残基を含むインサートを含むバイアスライブラリーを使用してこの手順を反復することができる。これらの手法は、Ａｎｇ−２に対してここで既に特定した物質よりも高い結合親和性を有する本発明のペプチドを特定しうる。
【０１９５】
ペプチドを作製する方法に関わりなく、各々のそのようなペプチド及びペプチ体をコードする核酸分子は、標準的な組換えＤＮＡ手法を用いて生成することができる。そのようなＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、核酸コードの縮退を明らかにするためならびに特定宿主細胞におけるコドンの優先性を明らかにするために、それらがコードするアミノ酸配列を変化させることなく適宜に操作することができる。
【０１９６】
組換えＤＮＡ手法は、本発明の完全長ペプチ体及び他の大きなタンパク質様特異的結合物質、又はそれらのフラグメントを生産するための好都合な方法である。ペプチ体又はフラグメントをコードするＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入し、次に今度はそれを抗体又はフラグメントの生産のために宿主細胞に挿入することができる。
【０１９７】
一般に、ペプチド又はペプチ体をコードするＤＮＡ分子は、ここで実施例において述べる手順を用いて入手することができる。プローブ及び典型的なハイブリダイゼーション条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｒｅｓｓ［１９８４］）の中で述べられているようなものである。ハイブリダイゼーション後、プローブしたブロットを、プローブの大きさ、クローンに対するプローブの予想されるホモロジー、スクリーニングするライブラリーの種類、及びスクリーニングするクローンの数などの因子に依存して、適切なストリンジェンシーで洗浄することができる。高ストリンジェンシースクリーニングの例は、５０℃から６５℃の温度で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳである。
【０１９８】
酵母ツーハイブリッドスクリーニング法も、Ａｎｇ−２に結合する本発明のペプチドを特定するために使用しうる。そこで、抗原又はそのフラグメントを使用して、Ａｎｇ−２結合物質、例えば本発明のペプチ体を特定し、選択するために、ファージディスプレイライブラリーを含むペプチドライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１９９】
代替的に、本発明のペプチドを含有し、発現するために様々な発現ベクター／宿主系を使用しうる。これらの系は、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で形質転換した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で形質転換した又は細菌発現ベクター（例えばＴｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は動物細胞系を含むが、これらに限定されない。組換えタンパク質生産において有用である哺乳類細胞は、ベロ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２及び２９３細胞を含むが、これらに限定されない。該ペプチドの組換え発現のための例示的プロトコールを下記で述べる。
【０２００】
「発現ベクター」の語は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からのポリペプチドを発現するためのプラスミド、ファージ、ウイルス又はベクターを意味する。発現ベクターは、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝子エレメント（単数又は複数）、例えばプロモーター又はエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される結合物質をコードする構造又は配列、及び（３）適切な転写開始及び終結配列、の構築物を含む転写ユニットを含みうる。酵母又は真核生物発現系における使用を意図した構造ユニットは、好ましくは、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。代替的に、組換えタンパク質がリーダー又は輸送配列なしで発現される場合、そのタンパク質はアミノ末端メチオニル残基を含みうる。この残基はその後、最終ペプチド産物を提供するために発現された組換えタンパク質から開裂してもよく又は開裂しなくてもよい。
【０２０１】
例えば、該ペプチドは、市販の発現系、例えばＰｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、製造者の指示に従って酵母において組換え発現しうる。この系はまた、分泌を指令するプレ−プロ−α配列に基づくが、インサートの転写は、メタノールによる誘導時にアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって推進される。
【０２０２】
分泌されたペプチドは、例えば細菌及び哺乳類細胞上清からペプチドを精製するために使用される方法によって、酵母増殖培地から精製される。
【０２０３】
代替的に、該ペプチドをコードするｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングしうる。このベクターを製造者の指示（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従って使用して、ｓＦ９無タンパク質培地中でＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に感染させて、組換えタンパク質を生産することができる。この組換えタンパク質を、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて培地から精製して、濃縮することができる。
【０２０４】
代替的に、該ペプチドを昆虫系において発現しうる。タンパク質発現のための昆虫系は当業者に周知である。１つのそのような系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫において外来遺伝子を発現することができる。そのペプチドコード配列を、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。ペプチドの挿入の成功により、ポリヘドリン遺伝子は不活性となり、コートタンパク質のコートを欠く組換えウイルスが生産される。その組換えウイルスを使用して、ペプチドが発現されるＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫に感染させることができる。Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４（１９８３）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：３２２４−７（１９９４）。
【０２０５】
もう１つの例では、該ペプチドをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅して、適切なベクター、例えばｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングすることができる。ｐＧＥＸベクターは、そのベクターによってコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、ベクターのクローニング部位に挿入されるＤＮＡフラグメントによってコードされるタンパク質を含む融合タンパク質を産生するように設計する。ＰＣＲのためのプライマーは、例えば適切な開裂部位を含むように作製することができる。融合成分が、発現を促進するためだけに使用される場合又は対象ペプチドへの結合物として望ましくない場合は、その組換え融合タンパク質を融合タンパク質のＧＳＴ部分から開裂しうる。ｐＧＥＸ−３Ｘ／特異的結合物質ペプチド構築物を大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換し、個々の形質転換体を単離して増殖させる。個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、所望の特異的結合物質をコードする核酸インサートが適切な方向で存在することを確認するために自動シーケンサーを使用して部分的に配列決定することができる。
【０２０６】
本発明の一部のペプチド組成物は、ペプチ体が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの何らかの抗腫瘍ペプチドに複合しているものである。特に好ましい方法では、ＴＮＦ特異的結合物質ペプチドのキメラを、ＴＮＦ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）コード配列にフレーム内融合したペプチドコード配列との組換え融合体として生成する。ペプチド−ＴＮＦ  ｃＤＮＡをｐＥＴ−１１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、ｐＥＴ１１ｂの製造者の指示に従ってＢＬ２１大腸菌におけるＴＮＦ−ペプチドの発現を誘導することができる。可溶性ＴＮＦ−ペプチドを、硫酸アンモニウム製剤、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗでの疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗでのイオン交換クロマトグラフィー及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ−３００  ＨＲでのゲルろ過クロマトグラフィーによって細菌溶解産物から精製することができる。
【０２０７】
細菌中の不溶性封入体として生産しうる融合タンパク質は次のようにして精製できる。宿主細胞を遠心分離によって破壊し；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗って；室温で１５分間、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理することができる。その溶解産物を音波破砕によって清澄化し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞デブリをペレット化することができる。その融合タンパク質含有ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁し、５０％グリセロール上の層にして、６０００×ｇで３０分間遠心分離することができる。そのペレットを、Ｍｇ＋＋及びＣａ＋＋を含まない標準リン酸緩衝塩類溶液に再懸濁することができる。その融合タンパク質を、再懸濁したペレットを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）中で分画することによってさらに精製することができる。ゲルを０．４Ｍ  ＫＣｌに浸してタンパク質を視覚化し、それを切り出して、ＳＤＳを含まないゲル泳動緩衝液中で電気溶出することができる。ＧＳＴ／融合タンパク質が細菌中で可溶性タンパク質として生産される場合は、ＧＳＴ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製することができる。
【０２０８】
その融合タンパク質を消化に供して、本発明のペプチドからＧＳＴを開裂することができる。０．５ｍｌ  ＰＢＳ中のその消化反応物（２０ｍｇから４０ｍｇ融合タンパク質、２０−３０単位のヒトトロンビン（４０００Ｕ／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ））を室温で１６時間から４８時間インキュベートし、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填して反応産物を分画することができる。ゲルを０．４Ｍ  ＫＣｌに浸してタンパク質のバンドを視覚化することができる。該ペプチドの予想分子量に対応するタンパク質バンドの同一性は、自動シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７３Ａ型、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いたアミノ酸配列分析によって確認することができる。代替的に、ペプチドのＨＰＬＣ及び／又は質量分析を実施することによって同一性を確認することができる。
【０２０９】
選択的に、該ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望プロモーター及び、任意に、リーダー配列を含むプラスミドにクローニングすることができる［Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−４３（１９８８）］。この構築物の配列を自動配列決定によって確認することができる。次にそのプラスミドを、細菌のＣａＣｌ２インキュベーション及び熱ショック処理を用いる標準手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）を使用して、大腸菌株ＭＣ１０６１に形質転換することができる。形質転換した細菌をカルベニシリン補足ＬＢ培地で増殖させ、適切な培地中での増殖によって発現タンパク質の生産を誘導することができる。存在する場合は、リーダー配列はペプチドの分泌を生じさせることができ、分泌の間に開裂されうる。
【０２１０】
分泌された組換えタンパク質は、下記の述べる方法によって細菌培地から精製することができる。
【０２１１】
組換えタンパク質の発現のための哺乳類宿主系は当業者に周知である。宿主細胞株は、発現されたタンパク質をプロセシングする、又はタンパク質活性を提供する上で有用である一定の翻訳後修飾を生じさせる個々の能力によって選択できる。タンパク質のそのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化を含むが、これらに限定されない。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等のような種々の宿主細胞は、そのような翻訳後活性について特異的細胞機構及び特徴的機序を有しており、導入される外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを保証するように選択することができる。
【０２１２】
形質転換細胞を長期的な高収率のタンパク質生産のために使用することは好ましく、そのためには安定な発現が望ましい。ひとたびそのような細胞が、所望発現カセットと共に選択マーカーを含むベクターで形質転換されれば、それらの細胞を濃縮培地中で１−２日間増殖させ、その後培地を選択培地に切り換えることができる。選択マーカーは選択に対する耐性を与えるように設計され、その存在は、導入した配列を成功裏に発現する細胞の増殖と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性集塊を、細胞に適切な組織培養手法を使用して増殖させることができる。
【０２１３】
いくつかの選択系が組換えタンパク質生産のために形質転換された細胞を回収するために使用できる。そのような選択系は、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞における、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、メトトレキサートに対する耐性を与えるＤＨＦＲ；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ；アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を与え、且つクロルスルフロンに対する耐性を与えるｎｅｏ；及びヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏについての選択の根拠として使用できる。有用と考えられるさらなる選択可能遺伝子は、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、又は細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤを含む。形質転換体の特定のための視覚的指標を与えるマーカーは、アントシアニン、β−グルクロニダーゼとその基質であるＧＵＳ、及びルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンを含む。
【０２１４】
特異的結合物質の精製及びリフォールディング
一部の場合、本発明のペプチド及び／又はペプチ体のような特異的結合物質は、生物活性であるために、「リフォールディング」されて、適切な三次構造へと酸化され、ジスルフィド結合を生成することを必要とすることがある。リフォールディングはこの技術分野で周知のいくつかの手順を用いて実施されうる。そのような方法は、例えば、可溶化したポリペプチド物質をカオトロピック試薬の存在下で通常７を超えるｐＨに暴露することを含む。カオトロピック試薬の選択は封入体の可溶化のために用いられる選択と同様であるが、カオトロピック試薬は、典型的にはより低い濃度で使用される。例示的なカオトロピック試薬はグアニジンである。ほとんどの場合、リフォールディング／酸化溶液は同時に、システイン架橋の形成のためにジスルフィドシャフリングが起こることを可能にする特定酸化還元電位を生じさせる特定比率で、還元剤プラスその酸化形態を含む。一部の一般的に使用される酸化還元対は、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥを含む。多くの場合、リフォールディングの効率を高めるためにコソルベントを使用しうる。一般的に使用されるコソルベントは、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール及びアルギニンを含む。
【０２１５】
本発明のペプチド及びペプチ体を精製することは望ましいと考えられる。タンパク質精製手法は当業者に周知である。これらの手法は、１つの水準では、タンパク質様及び非タンパク質様画分の粗分別を含む。ペプチド及び／又はペプチ体を他のタンパク質から分離した後、部分的又は完全な精製（又は均一性への精製）を達成するためのクロマトグラフィー及び電気泳動手法を用いて対象ペプチド又はポリペプチドをさらに精製することができる。本発明のペプチ体及びペプチドの作製に特に適する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー又はＨＰＬＣである。
【０２１６】
本発明の一部の局面は、本発明のペプチ体又はペプチドの精製に関し、特定実施形態では、本発明のペプチ体又はペプチドの実施的な精製に関する。ここで使用する「精製ペプチ体又はペプチド」の語は、ペプチ体又はペプチドがその天然で得られる状態に比べてある程度まで精製されている、他の成分から単離可能な組成物を表わすことが意図されている。精製ペプチド又はペプチ体はまた、それ故、それが天然に生じうる環境から分離しているペプチ体又はペプチドを意味する。
【０２１７】
一般に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するための分別に供されており、その組成物が実質的にその発現される生物活性を保持しているペプチド又はペプチ体組成物を意味する。「実質的に精製された」の語を使用する場合、この名称は、ペプチ体又はペプチドが、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又はそれ以上を構成するような、組成物の主要成分を形成するペプチド又はペプチ体組成物を意味する。
【０２１８】
ペプチド又はペプチ体の精製の度合を定量するための様々な方法は、本発明の開示に照らして当業者に既知である。これらは、例えば、活性分画の特異的結合活性を測定すること、又はＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって分画中のペプチド又はペプチ体の量を評価することを含む。ペプチド又はペプチ体分画の純度を評価するための好ましい方法は、その分画の結合活性を算定し、それを初期抽出物の結合活性と比較して、その後、ここでは「−倍数の精製度」として評価する、精製の度合を算定することである。結合活性の量を表わすために使用する実際の単位は、言うまでもなく、精製を追跡するために選択される個々のアッセイ手法、及びそのペプチ体又はペプチドが検出可能な結合活性を示すかどうかに依存する。
【０２１９】
精製における使用に適する様々な手法が当業者に周知である。これらは、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降法）等による沈降反応、又は熱変性とそれに続く遠心分離；アフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイト及びアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；及びそれらやその他の手法の組合せを含む。この技術分野において一般的に知られるように、様々な精製段階を実施する順序は変更しうる、又は一部の段階を省いて、それでもなお実質的に精製された特異的結合物質の作製のために適切な方法をもたらしうると考えられる。
【０２２０】
本発明のペプチド又はペプチ体が常にその最も精製された状態で提供されるという一般的な必要性はない。実際に、実質的に特異性のより低い結合物質は一部の実施形態で有用性を有しうると想定される。部分的精製は、より少ない精製段階を組み合わせて使用することによって、又は同じ一般的精製スキームの異なる形態を利用することによって達成しうる。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ手法よりも高い「−倍数」精製を生じることが認識されている。より低い度合の相対的生成を示す方法は、ペプチド又はペプチ体の全体的回収において、又はペプチド又はペプチ体の結合活性を維持する上で利点を有すると考えられる。
【０２２１】
ペプチド又はポリペプチドの泳動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの種々の条件によって、時として有意に、変化しうることが知られている［Ｃａｐａｌｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７６：４２５（１９７７）］。それ故，異なる電気泳動条件下では、精製又は部分精製特異的結合物質発現産物の見かけ分子量が変化しうることは認識される。
【０２２２】
結合アッセイ
免疫学的結合アッセイは、典型的には、分析物標的抗原に特異的に結合し、しばしばそれを固定する捕獲試薬を利用する。捕獲試薬は分析物に特異的に結合する成分である。本発明の１つの実施形態では、捕獲試薬は、Ａｎｇ−２に特異的に結合するペプチド又はペプチ体又はそのフラグメントである。これらの免疫学的結合アッセイはこの技術分野において周知である［Ａｓａｉ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３７巻，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）］。
【０２２３】
免疫学的結合アッセイは、しばしば捕獲試薬と抗原によって形成される結合複合体の存在をシグナル表示する標識試薬を利用する。標識試薬は結合複合体を含む分子の１つでありうる；すなわち、標識特異的結合物質又は標識抗特異的結合物質抗体でありうる。代替的に、標識試薬は、結合複合体に結合する第三の分子、一般的にはもう１つ別の抗体でありうる。標識試薬は、例えば、標識を担う抗特異的結合物質抗体でありうる。結合複合体に特異的な第二抗体は、標識を有していなくてもよいが、第二抗体がその成員である抗体の種に特異的な第四分子によって結合されねばならない。例えば、第二抗体を、その後酵素標識ストレプトアビジンなどの第四分子によって結合されうる、ビオチンなどの検出可能な成分で修飾することができる。プロテインＡ又はプロテインＧなどの、免疫グロブリン定常領域に特異的に結合することができる他のタンパク質も、標識試薬として使用しうる。これらの結合タンパク質は、連鎖球菌属細菌の細胞壁の通常成分であり、様々な種からの免疫グロブリン定常領域に強い非免疫原性反応を示す。Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２５８９−２５４２（１９８５）；Ｃｈａｕｂｅｒｔ，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．，１０：５８５−５９１（１９９７）。
【０２２４】
アッセイ全体を通じて、試薬の各々の組合せ後に、インキュベーション及び／又は洗浄段階が必要な場合がある。インキュベーション段階は、約５秒間から数時間、好ましくは約５分間から約２４時間まで変化しうる。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ様式、分析物、溶液の容量、濃度等に依存する。通常、アッセイは外界温度で実施するが、一連の温度範囲で実施することができる。
【０２２５】
Ａ．非競合結合測定法：
免疫学的結合測定法は非競合型でありうる。これらのアッセイは、直接測定される捕獲分析物の量を含む。例えば、１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、捕獲試薬（抗体又はペプチ体）を直接固体基質に結合してそれに固定することができる。これらの固定化捕獲試薬は、その後、被験試料中に存在する抗原を捕獲する（抗原に結合する）。そのようにして固定されたタンパク質は、次に、標識を有する第二抗体などの標識試薬に結合する。もう１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、第二抗体は標識を持たないが、その第二抗体が由来する種の抗体に特異的な標識抗体によって結合されうる。第二抗体はまた、ストレプトアビジンなどの第三の標識分子が特異的に結合する、ビオチンなどの検出可能成分で修飾することができる。参照してここに組み込まれる、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈ  １４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（１９８８）参照。
【０２２６】
Ｂ．競合結合測定法：
免疫学的結合測定法は競合型でありうる。試料中に存在する分析物の量を、置き換えられた、又は試料中に存在する分析物によって捕獲試薬（抗体又はペプチ体）から競合排除された、添加分析物の量を測定することによって間接的に測定する。１つの好ましい競合結合測定法では、通常は標識された、既知量の分析物を試料に加え、次に試料を捕獲試薬と接触させる。抗体に結合した標識分析物の量は、試料中に存在する分析物の濃度に逆比例する（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈ  １４，ｐ．５７９−５８３、前出）。
【０２２７】
もう１つの好ましい競合結合測定法では、捕獲試薬を固体基質に固定する。捕獲試薬に結合するタンパク質の量は、タンパク質／抗体複合体中に存在するタンパク質の量を測定することによって、又は代替的に、残存する非複合タンパク質の量を測定することによって決定しうる。タンパク質の量は、標識タンパク質を提供することによって検出しうる。ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（前出）。
【０２２８】
さらにもう１つの好ましい競合結合測定法では、ハプテンの阻害を利用する。ここでは、既知の分析物を固体基質に固定する。既知量の抗体を試料に加え、固定された分析物に試料を接触させる。固定分析物に結合する抗体の量は、試料中に存在する分析物の量に逆比例する。固定抗体の量は、抗体の固定された分画又は溶液中に残存する分画のいずれかを検出することによって検出しうる。検出は、抗体が標識されている場合は直接的でありえ、又は上述したようにその後抗体に特異的に結合する標識成分を添加することによって間接的でありうる。
【０２２９】
Ｃ．競合結合測定法の利用：
競合結合測定法は、当業者が、本発明のペプチ体によって認識されるタンパク質又は酵素複合体が所望タンパク質であって、交差反応分子ではないかどうかを判定すること、又は前記ペプチ体が該抗原に特異的であって、非関連抗原に結合しないかどうかを判定することを可能にする、交差反応性の判定のために使用できる。この種のアッセイでは、抗原を固相支持体に固定することができ、未知のタンパク質混合物をアッセイに加えて、それを固定タンパク質へのペプチ体の結合と競合させる。競合分子は、該抗原に関連のない１又はそれ以上の抗原にも結合する。前記タンパク質混合物の交差反応性を判定するために、固定抗原へのペプチ体の結合と競合する該タンパク質の能力を、固相支持体に固定した同じタンパク質による結合と比較する。
【０２３０】
Ｄ．他の結合アッセイ：
本発明はまた、試料中のＡｎｇ−２の存在を検出する又は定量するためのウエスタンブロット法を提供する。その手法は一般に、試料タンパク質を分子量に基づいてゲル電気泳動によって分離し、そのタンパク質を、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は誘導体化ナイロンフィルターなどの適切な保持体に移す。Ａｎｇ−２に特異的に結合するペプチ体又はそのフラグメントと共に試料をインキュベートし、生じた複合体を検出する。これらのペプチ体は直接標識しうるか、又は代替的に、その後該ペプチ体に特異的に結合する標識抗体を使用して検出しうる。
【０２３１】
診断アッセイ
本発明のペプチド及びペプチ体又はそのフラグメントなどの誘導体結合物質は、Ａｎｇ−２又はサブユニットの発現を特徴とする状態又は疾患の診断のため、又はＡｎｇ−２の誘導物質、そのフラグメント、Ａｎｇ−２活性のアゴニスト又は阻害因子で治療される患者を監視するためのアッセイにおいて有用である。Ａｎｇ−２についての診断アッセイは、ヒト体液、若しくは細胞又は組織の抽出物においてＡｎｇ−２を検出するためにペプチ体と標識を利用する方法を含む。本発明のペプチ体は、修飾を加えて又は修飾なしで使用することができる。好ましい診断アッセイでは、ペプチ体を、例えば標識又はレポーター分子を結合することによって標識する。様々な標識及びレポーター分子が既知であり、その内の一部については既に本明細書に記載されている。特に、本発明はヒト疾患の診断のために有用である。
【０２３２】
それぞれのタンパク質に特異的なペプチ体を使用してＡｎｇ−２タンパク質を測定するための様々なプロトコールがこの技術分野において知られている。その例は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。Ａｎｇ−２上の２つの非干渉エピトープに反応性のモノクローナル抗体を使用する二部位のモノクローナルベースの免疫測定法が好ましいが、競合結合測定法も使用できる。これらのアッセイは、例えばＭａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１（１９８３）に述べられている。
【０２３３】
診断の根拠を提供するために、通常、ヒトＡｎｇ−２発現の正常値又は標準値を確立する。この決定は、正常被験対象、好ましくはヒトからの体液又は細胞抽出物を、この技術分野で周知の複合体形成に適した条件下で、Ａｎｇ−２に対するペプチ体と組み合わせることによって実施できる。標準的な複合体形成の量は、既知量のＡｎｇ−２タンパク質へのペプチ体の結合を対照及び疾患試料の両方と比較することによって数量化できる。その後、正常試料から得た標準値を、潜在的に疾患に罹患している被験対象からの試料から得た値と比較することができる。標準値と被験対照値の間の偏差は、疾患状態におけるＡｎｇ−２の役割を示唆する。
【０２３４】
診断適用のために、一部の実施形態では、本発明のペプチ体又はペプチドを、典型的には検出可能成分で標識する。その検出可能成分は、直接又は間接的に検出可能なシグナルを生じることができるいかなるものでもよい。例えば、検出可能成分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ、などの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリンなどの蛍光又は化学発光化合物、若しくはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素でありうる。Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−１６３（１９９０）。
【０２３５】
疾患
本発明は、ヒト疾患及び標的状態の治療のために有用な、Ａｎｇ−２に結合するペプチド、ペプチ体、若しくはそのフラグメント、変異体又は誘導体などの結合物質を提供する。Ａｎｇ−２の結合活性又は他の細胞活性を調節する物質は、それらの治療効果を増強する又は潜在的副作用を低下させる他の治療物質と組み合わせて使用しうる。
【０２３６】
１つの局面では、本発明は、細胞における有害な又は異常なレベルのＡｎｇ−２活性を特徴とする疾患及び状態を治療するために有用な試薬及び方法を提供する。これらの疾患は、癌、及び過形成、乾癬、接触皮膚炎、免疫学的疾患及び不妊症などの過増殖状態を含む。
【０２３７】
本発明はまた、Ａｎｇ−２活性を阻害する又は低下させる、ペプチ体などの特異的結合物質の有効量を動物に投与することを含む、ヒトを含む動物において癌を治療する方法を提供する。本発明はさらに、生物系における細胞増殖、侵襲及び転移の過程を含む、癌細胞増殖を阻止する方法を対象とする。それらの方法は、癌細胞増殖の阻害因子としての本発明の化合物の使用を含む。好ましくは、前記方法を、哺乳類などの生存動物において癌細胞増殖、侵襲、転移又は腫瘍発生を阻止する又は低下させるために使用する。本発明の方法はまた、アッセイ系における使用、例えば癌細胞増殖及びその特徴を検定するならびに癌細胞増殖に影響を及ぼす化合物を特定するアッセイ系での使用のために容易に適合しうる。
【０２３８】
本発明の方法によって治療できる癌は、好ましくは哺乳類において発生する。哺乳類は、例えばヒト及び他の霊長類、ならびにイヌ及びネコなどのペット又はコンパニオン動物、ラット、マウス及びウサギなどの実験動物、及びウマ、ブタ、ヒツジ及びウシなどの家畜を含む。
【０２３９】
腫瘍又は新生物は、細胞の増殖が制御不能且つ進行性である組織細胞の増殖を含む。そのような増殖の一部は良性であるが、その他は悪性と称され、生物の死亡を導きうる。悪性新生物又は癌は、攻撃的細胞増殖を示すことに加えて、周辺組織を侵襲し、転移しうるという点で良性増殖とは区別される。さらに、悪性新生物は、分化のより大きな喪失（より大きな脱分化）、及び相互及びそれらの周辺組織と比べて機構のより大きな喪失を示すことを特徴とする。この特徴は「退形成」とも称される。
【０２４０】
本発明によって治療しうる新生物はまた、固形腫瘍、すなわち癌腫及び肉腫を含む。癌腫は、周辺組織を浸潤（侵襲）し、転移を生じさせる上皮細胞に由来する悪性新生物を含む。腺癌は、腺組織に由来する、又は認識しうる腺構造を形成する癌腫である。もう１つの広いカテゴリー又は癌は、細胞が胚性結合組織のような原線維又は均質物質中に包埋されている腫瘍である、肉腫を含む。本発明はまた、白血病、リンパ腫、及び典型的には腫瘍塊を示さないが血管又はリンパ細網系に分布する他の癌を含む、骨髄系又はリンパ系の癌の治療を可能にする。
【０２４１】
本発明に従った治療を受け入れやすい癌又は腫瘍細胞の種類は、例えば、ＡＣＴＨ産生腫瘍、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、副腎皮質の癌、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、ヘアリーセル白血病、頭部及び頸部癌、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞及び非小細胞）、悪性腹腔内液滲出、悪性胸水、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、卵巣（生殖細胞）癌、膵癌、陰茎癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、皮膚癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、子宮癌、膣癌、外陰部の癌、及びウィルムス腫瘍を含む。
【０２４２】
本発明を、特にある種の実験的に定義されている癌の治療を参照しながらここで説明する。これらの例示的治療では、標準的技術水準のインビトロ及びインビボモデルを使用した。これらの方法は、インビボ治療プログラムにおいて有効であると期待できる物質を特定するために使用できる。しかし、本発明の方法はこれらの腫瘍型の治療に限定されず、あらゆる器官系に由来するあらゆる固形腫瘍に及ぶことは明白である。その侵襲又は転移がＡｎｇ−２の発現又は活性に関連する癌は、特に本発明によって阻止されやすい、またさらには後退へと誘導されやすい。
【０２４３】
本発明はまた、ペプチ体などの本発明の化合物を、従来の何らかの化学療法剤のようなもう１つの別の抗癌化学療法剤と組み合わせて含むことによって実施できる。そのような他の薬剤と特異的結合物質の組合せは化学療法プロトコールを増強しうる。熟達した医師には、数多くの化学療法プロトコールが本発明の方法に組み込むことができるものとして思い浮かぶ。アルキル化剤、代謝拮抗物質、ホルモン及びアンタゴニスト、放射性同位体、ならびに天然産物を含む、あらゆる化学療法剤が使用できる。例えば、本発明の化合物は、ドキソルビシン及び他のアントラサイクリン類似体などの抗生物質、シクロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソール及びその天然及び合成誘導体などのピリミジン類似体等と共に投与することができる。もう１つの例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性及びゴナドトロピン非依存性細胞を含む、乳房の腺癌などの混合腫瘍の場合は、本発明の化合物をロイプロリド又はゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）と共に投与することができる。他の抗腫瘍プロトコールは、ここでは「補助抗腫瘍治療様式」とも称する、もう１つ別の治療様式、例えば手術、放射線等を伴うテトラサイクリン系化合物の使用を含む。そこで、本発明の方法は、副作用を低減し、効果を増強するという恩恵を有するそのような従来のプログラムと共に使用できる。
【０２４４】
本発明は、それ故、固形腫瘍及び白血病を含む極めて多様な癌の治療のために有用な組成物及び方法を提供する。治療しうる癌の種類は、次のものを含むが、これらに限定されない：乳房、前立腺及び結腸の腺癌；すべての形態の肺の気管支原性癌；骨髄腫；黒色腫；肝癌、神経芽細胞腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；癌腫（例えばウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン−ピアース癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞腫、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮癌及び移行上皮癌）；組織球性疾患；白血病；悪性組織球増殖症；ホジキン病；免疫増殖性小細胞肺癌；非ホジキンリンパ腫；プラスマ細胞腫；細網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ。さらに、次の種類の癌も治療しうる：腺腫；胆管腫；コレステリン腫；ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；半陰陽性卵巣腫瘍；肝癌；肝腺腫；膵島細胞腫；乳頭腫；セルトリ細胞腫；卵胞膜細胞腫；平滑筋腫；平滑筋肉腫；筋原細胞腫；筋腫；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；脳室上衣細胞腫；神経節細胞腫；神経膠腫；髄芽細胞腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫；血管腫硬化；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管周囲細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症；及び子宮頸部形成異常。
【０２４５】
本発明のもう１つの局面は、乾癬及び接触皮膚炎を含む皮膚の過剰増殖状態又は他の過増殖性疾患を予防する及び／又は治療するために本発明の物質及び方法を使用することである。乾癬及び接触皮膚炎の患者はこれらの病巣において高いＡｎｇ−２活性を有することが明らかにされた［Ｏｇｏｓｈｉら、Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１０：８１８−２３（１９９８）］。好ましくは、Ａｎｇ−２に特異的な特異的結合物質を、これらの臨床症状を発現するヒトを治療するために他の薬剤と組み合わせて使用する。特異的結合物質は、ここで述べる投与経路及び当業者に周知の他の経路を通して、様々な担体のいずれかを用いて送達することができる。
【０２４６】
本発明の他の局面は、血管新生が関与する様々な網膜症（糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性を含む）、ならびに子宮内膜症、子宮類線維腫などの雌性生殖路の障害／疾患、及び雌性生殖周期中の血管増殖機能不全（子宮内膜微小血管増殖を含む）に関連する他のそのような疾患を治療することを含む。
【０２４７】
本発明のさらにもう１つの局面は、脳動静脈奇形（ＡＶＭ）、胃腸粘膜損傷及び修復、発作から生じる虚血を含む、消化性潰瘍疾患の病歴を有する患者における胃十二指腸粘膜の潰瘍、肝疾患における広い範囲の肺血管障害及び非肝門脈圧亢進を有する患者における根脈圧亢進症を含む、血管増殖異常を治療することに関する。
【０２４８】
本発明のもう１つの局面は、本発明によって提供される組成物及び方法を利用した癌の予防である。そのような試薬は、Ａｎｇ−２に対するペプチ体などの特異的結合物質を含む。
【０２４９】
医薬組成物
ペプチ体などのＡｎｇ−２特異的結合物質の医薬組成物は本発明の範囲内である。抗体を含む医薬組成物は、例えば２００１年１月９日発行の、Ｌａｍらへの米国特許第６，１７１，５８６号に詳述されている。そのような組成物は、抗体、又はここで述べるようなそのフラグメント、変異体、誘導体又は融合物などの特異的結合物質の治療上又は予防上有効な量を、医薬適合性の物質と混合して含有する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、医薬適合性の物質と混合して、Ａｎｇ−２の少なくとも１つの生物活性を部分的に又は完全に変化させるアンタゴニスト特異的結合物質を含む。典型的には、その特異的結合物質は、動物への投与のために十分に精製されている。
【０２５０】
該医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸収又は浸透を変化させる、維持する又は保存するための製剤物質を含みうる。適切な製剤物質は、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）；充填剤（マンニトール又はグリシンなど）、キレート化剤［エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など］；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；増量剤；単糖類；二糖類及び他の糖質（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色料；着香料及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；沈殿防止剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性増強剤（スクロース又はソルビトール）；等張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物など）（好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は製薬補助剤を含むが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。
【０２５１】
最適化医薬組成物は、例えば意図する投与経路、送達形式及び所望用量に依存して、当業者によって決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出参照。そのような組成物は、特異的結合物質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランスの速度に影響を及ぼしうる。
【０２５２】
医薬組成物中の主要ビヒクル又は担体は、水性又は非水性のいずれでもよい。例えば、適切なビヒクル又は担体は、おそらく非経口投与用組成物に共通する他の物質を補足した、注射用蒸留水、生理食塩水又は人工脳脊髄液でありうる。中性緩衝塩類溶液又は血清アルブミンと混合した塩類溶液はさらなる例示的ビヒクルである。他の例示的医薬組成物は、ソルビトール又はその適切な代用物をさらに含みうる、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝液を含む。本発明の１つの実施形態では、結合剤組成物は、凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で、所望の純度を有する選択組成物を任意の製剤物質（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）と混合することにより保存用に調製しうる。さらに、結合物質生成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤しうる。
【０２５３】
医薬組成物は非経口的送達のために選択することができる。選択的に、該組成物は、吸入用、又は経口、耳、眼、直腸又は膣経路などの経腸的送達用に選択しうる。そのような医薬適合性の組成物の調製は当分野の技術範囲内である。
【０２５４】
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、組成物を生理的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、典型的には約５−約８の範囲内のｐＨに維持するために使用される。
【０２５５】
非経口投与を考慮するとき、本発明において使用するための治療組成物は、医薬適合性のビヒクル中に所望の特異的結合物質を含む、発熱物質不含の非経口的に許容される水溶液の形態でありうる。非経口注射用の特に適切なビヒクルは、結合物質が、適切に保存された無菌等張溶液として製剤される無菌蒸留水である。さらにもう１つの製剤は、蓄積注射によって送達されうる生成物の制御された放出又は持続放出を提供する、注射用ミクロスフェア、生体受食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ又はリポソームなどの物質と所望分子の製剤を含む。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環中に保持される期間を延長する効果を有しうる。所望分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬剤送達装置を含む。
【０２５６】
もう１つの局面では、非経口投与に適する医薬組成物は、水溶液中、好ましくはハンクス液、リンガー液又は生理緩衝食塩水などの生理的に適合性の緩衝液中で製剤されうる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランなどの、懸濁液の粘度を上昇させる物質を含みうる。さらに、活性化合物の懸濁液は適切な油性注射懸濁液中で調製しうる。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。非脂質ポリカチオンアミノポリマーも送達のために使用しうる。任意に、懸濁液はまた、化合物の溶解度を上昇させ、高度濃縮溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は作用物質を含みうる。
【０２５７】
もう１つの実施形態では、医薬組成物を吸入用に製剤しうる。例えば、結合物質は吸入用の乾燥粉末として製剤しうる。ポリペプチド又は核酸分子吸入溶液はまた、エーロゾル送達のために推進薬と共に製剤しうる。さらにもう１つの実施形態では、溶液を噴霧化しうる。肺投与はさらにＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に記述されており、この特許願は化学修飾したタンパク質の肺送達を述べている。
【０２５８】
一部の製剤は経口的に投与しうると想定される。本発明の１つの実施形態では、このようにして投与される結合物質分子は、錠剤及びカプセルなどの固形投与形態の調合において慣例的に使用される担体と共に又は担体なしで製剤することができる。例えば、カプセルは、生体利用効率が最大化され、前全身性（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）分解が最小化されるときに胃腸管の一定部位で製剤の活性部分を放出するように設計しうる。結合物質分子の吸収を促進するために付加的な物質を含むことができる。希釈剤、着香剤、低融点ろう、植物油、潤滑剤、沈殿防止剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用しうる。
【０２５９】
経口投与用の医薬組成物はまた、経口投与に適した用量でこの技術分野において周知の医薬適合性の担体を用いて製剤できる。そのような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に製剤することを可能にする。
【０２６０】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と一緒にし、生じた顆粒の混合物を加工して（任意に、摩砕した後）、錠剤又は糖衣丸コアを得ることを通して入手できる。所望に応じて、適切な補助剤を加えることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトールを含む、糖類などの糖質又はタンパク質充填剤；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ又は他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴム及びトラガカントを含むゴム；及びゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質を含む。所望する場合は、架橋ポリビニルピロリドン、寒天及びアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの、崩壊剤又は可溶化剤を加えてもよい。
【０２６１】
糖衣丸コアは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタンを同時に含みうる濃縮糖溶液、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物などの適切な被覆物と共に使用しうる。製品の特定のため又は活性化合物の量、すなわち用量を特徴付けるために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣丸被覆物に加えてもよい。
【０２６２】
経口的に使用できる医薬製剤はまた、ゼラチンで作られるプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンとグリセロール又はソルビトールなどの被覆物で作られる密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース又はデンプンなどの充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意に安定剤と混合した有効成分を含みうる。軟カプセルでは、活性化合物を、安定剤と共に又は安定剤なしで、脂肪油、液体、又は液状ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解しうるか又は懸濁しうる。
【０２６３】
もう１つの医薬組成物は、錠剤の製造に適する非毒性賦形剤と混合して有効量の結合剤を含みうる。錠剤を無菌水又は適切なビヒクルに溶解することにより、溶液を単位用量形態で調製することができる。適切な賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸又は重炭酸ナトリウム、ラクトース又はリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；若しくはデンプン、ゼラチン又はアカシアなどの結合剤；若しくはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクなどの潤滑剤を含むが、これらに限定されない。
【０２６４】
さらなる医薬組成物は、持続又は制御送達製剤中に結合物質分子を含有する製剤を含めて、当業者には明らかである。リポソーム担体、生体受食性マイクロ粒子又は多孔性ビーズ及び蓄積注射などの様々な他の持続又は制御送達手段を製剤するための手法も、当業者に既知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出を述べている、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号参照。持続放出製剤のさらなる例は、成形製品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー［Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３）］、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）［Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）］及び［Ｌａｎｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）］、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、前出）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８号）を含みうる。持続放出性組成物はまた、この技術分野で既知のいくつかの方法のいずれかによって調製できる、リポソームを含む。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ３６，６７６号；ＥＰ８８，０４６号；ＥＰ１４３，９４９号参照。
【０２６５】
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、典型的には無菌でなければならない。これは無菌ろ過膜を通してろ過することによって達成しうる。組成物を凍結乾燥する場合は、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥及び再形成の前又は後に実施しうる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態又は溶液として保存しうる。さらに、非経口組成物は一般に、無菌アクセス口を有する容器、例えば皮下注射針を刺し通すことができる栓のついた静脈内溶液バッグ又はバイアル内に納められる。
【０２６６】
ひとたび医薬組成物が製剤されれば、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体、若しくは脱水又は凍結乾燥粉末として無菌バイアル中で保存しうる。そのような製剤は、即時使用形態又は投与前に再形成を必要とする形態（例えば凍結乾燥）で保存しうる。
【０２６７】
特定実施形態では、本発明は、単回用量投与単位を生成するためのキットを対象とする。そのキットは各々、乾燥タンパク質を含む第一容器及び水性製剤を含む第二容器の両方を含みうる。単一及び多区画予備充填注射器（例えば液体注射器及びｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ）を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。
【０２６８】
治療的に使用される医薬組成物の有効量は、例えば治療背景及び目的に依存する。当業者は、治療のための適切な用量レベルが、それ故、一部には、送達される分子、そのために結合物質分子が使用される適応症、投与経路、及び患者のサイズ（体重、体表面積又は器官の大きさ）及び状態（年齢及び一般的健康状態）に依存して変化することを認識する。従って、臨床医は、至適治療効果を得るために用量を調節し、投与経路を修正しうる。典型的な用量は、上述した因子に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲をとりうる。他の実施形態では、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲をとりうる。
【０２６９】
いかなる化合物についても、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイにおいて若しくはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ又はサルなどの動物モデルにおいて評価することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用しうる。次にそのような情報を使用して、ヒトにおける投与のために有用な用量及び経路を決定することができる。
【０２７０】
正確な用量は、治療を必要とする被験対象に関連する因子に照らして決定される。用量及び投与は、活性化合物の十分なレベルを提供するように又は所望効果を維持するように調整する。考慮しうる因子は、疾患状態の重症度、被験対象の全般的健康状態、被験対象の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の組合せ、反応感受性、及び治療に対する応答を含む。長時間作用性医薬組成物は、個々の製剤の半減期及びクリアランス速度に依存して３日から４日ごと、週に１回又は２週間に１回投与しうる。
【０２７１】
投与頻度は、使用する製剤中の結合物質分子の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、所望効果を達成する用量に達するまで組成物を投与する。該組成物は、それ故、単回用量として、又は所与の期間にわたる多回用量として（同じか又は異なる濃度／用量で）、又は持続注入として投与しうる。適切な用量のさらなる改善は常套的に行われる。適切な用量−反応データの使用を通して適切な用量を確認しうる。
【０２７２】
医薬組成物の投与経路は既知の方法に従う、例えば経口的、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内経路による注射を通して、髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸的、局所、舌下、尿道、膣又は直腸的手段によって、持続放出システムによって又は移植装置によって投与される。所望する場合は、該組成物は、ボーラス注射によって又は注入によって持続的に、又は移植装置によって投与しうる。
【０２７３】
代替的に又は付加的に、該組成物は、膜、海綿又は所望分子が吸収されている又は被包されている別の適切な材料の移植を通して局所的に投与しうる。移植装置を使用する場合は、装置を適切な組織又は器官に移植し、拡散、持続放出型（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）ボーラス又は持続投与によって所望分子を送達しうる。
【０２７４】
一部の場合は、半ビボ的に医薬組成物を使用することが望ましいと考えられる。そのような場合は、患者から切除した細胞、組織又は器官を医薬組成物に暴露し、その後それらの細胞、組織及び／又は器官を患者の体内に移植する。
【０２７５】
別の場合には、ペプチ体などの本発明の結合物質を、ここで述べるような方法を使用して該ポリペプチドを発現し、分泌するように遺伝子操作したある種の細胞を移植することによって送達することができる。そのような細胞は、動物又はヒト細胞でありえ、また自己由来、異種又は組織移植片に関して異種でありうる。任意に、前記細胞は不朽化しうる。免疫学的応答の可能性を低下させるため、周辺組織の浸潤を回避するように細胞を被包しうる。被包材料は、典型的には、タンパク質産物の放出は許容するが、患者の免疫系又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ、生体適合性の半透性ポリマーエンクロージャー又は膜である。
【０２７６】
併用療法
ペプチ体などの本発明の特異的結合物質は、Ａｎｇ−２発現に関連する疾患の治療において他の治療薬と組み合わせて使用することができる。これらの他の治療薬は、例えば放射線治療、化学療法、及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）等のような標的療法を含む。ここで特定して列挙しない付加的な併用療法も本発明の範囲内である。
【０２７７】
化学療法は、例えば、メクロルエタミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）などのニトロソ尿素、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）などのエチレンイミン／メチルメラミン、ブスルファンなどのスルホン酸アルキル、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジンを含むアルキル化剤；メトトレキサート及びトリメトレキサートなどの葉酸類似体、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲンシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン、などのピリミジン類似体、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリンなどのプリン類似体、２’−デオキシコフォルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）を含む代謝拮抗物質；パクリタキセルなどの抗有糸分裂薬、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン及びビンオレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン及びリン酸エストラムスチンを含む天然産物；エトポシド及びテニポシドなどのポドフィロトキシン（ｐｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ）；アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、ミトマイシンＣ及びアクチノマイシンなどの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦなどの生物学的応答変性剤；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体、ミトキサントロンなどのアントラセンジオン、ヒドロキシ尿素などの置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤を含むその多量体ポリペプチド複合体の薬剤；プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドなどのアドレノコルチコイド拮抗物質を含むホルモン及び拮抗物質；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；フルタミド、性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体及びロイプロリドなどの抗アンドロゲン；及びフルタミドなどの非ステロイド系抗アンドロゲンを含む、抗腫瘍性薬剤を使用することができる。
【０２７８】
成長因子との併用療法は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、又はＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子及びエリトロポエチンなどの他の造血因子を含みうる。組成物が含みうるその他の成長因子は、既知のアンギオポエチン、例えばＡｎｇ−１、−２、−４、−Ｙ及び／又はヒトＡｎｇ様ポリペプチド、及び／又は血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である。成長因子は、アンギオゲニン、骨誘導因子−１、骨誘導因子−２、骨誘導因子−３、骨誘導因子−４、骨誘導因子−５、骨誘導因子−６、骨誘導因子−７、骨誘導因子−８、骨誘導因子−９、骨誘導因子−１０、骨誘導因子−１１、骨誘導因子−１２、骨誘導因子−１３、骨誘導因子−１４、骨誘導因子−１５、骨誘導因子受容体ＩＡ、骨誘導因子受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、サイトカイン誘導好中球走化性因子１、サイトカイン誘導好中球走化性因子２、内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮増殖因子、上皮由来好中球活性化因子、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞系由来神経栄養因子受容体−１、グリア細胞系由来神経栄養因子受容体−２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質−１、成長関連タンパク質−２、成長関連タンパク質−３、ヘパリン結合性上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合性タンパク質、角化細胞増殖因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子受容体−１、神経成長因子、神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体−１、血小板由来増殖因子受容体−２、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子−１、トランスフォーミング増殖因子−２、トランスフォーミング増殖因子−１、トランスフォーミング増殖因子−１．２、トランスフォーミング増殖因子−２、トランスフォーミング増殖因子−３、トランスフォーミング増殖因子−５、潜伏性（ｌａｔｅｎｔ）トランスフォーミング増殖因子−１、トランスフォーミング増殖因子−１結合性タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子−１結合性タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子−１結合性タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、血管内皮細胞増殖因子及びキメラタンパク質、及びそれらの生物学的又は免疫学的に活性なフラグメントを含む。
【０２７９】
免疫療法
免疫療法は一般に、免疫エフェクター細胞及び癌細胞を標的して破壊する分子の使用に基づく。免疫エフェクターは、例えば標的細胞の表面上のある種のマーカーを認識する本発明のペプチ体でありうる。前記ペプチ体は、単独で治療のエフェクターとしての役割を果たすか、若しくは実際に細胞の死滅を生じさせる他の細胞を集積しうる。ペプチ体はまた、薬剤又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）に複合することができ、それ故単に標的物質としても役立ちうる。
【０２８０】
本発明によれば、Ａｎｇ−２の突然変異形態は、本発明のペプチ体又はペプチ体複合体の免疫療法による標的となりうる。本発明のペプチ体組成物を、Ａｎｇ−２標的治療と組み合わせた併用療法アプローチにおいて使用しうることが特に想定される。
【０２８１】
受動免疫療法はいくつかの癌に対して特に有効であることが証明されている。例えば、ＷＯ９８／３９０２７号参照。
【０２８２】
下記の実施例は例示のみを意図するものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０２８３】
病的及び正常組織におけるＡｎｇ−２発現
インサイチューハイブリダイゼーションを用いて正常及び病的組織におけるＡｎｇ−２発現を検査した。ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＡＦ００４３２７、ヌクレオチド１２７４−１７２６）及びマウス（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＡＦ００４３２６、ヌクレオチド１１３５−１５８８）Ａｎｇ−２配列のフラグメントを、ヒト又はマウス胎児肺ｃＤＮＡからの逆転写酵素−ＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミドにクローニングして、塩基配列決定によって確認した。３３Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブを、３３Ｐ−ＵＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼを使用して線状化プラスミド鋳型から転写した。ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した組織の塊を５μｍの切片にし、充填したスライドガラス上で収集した。インサイチューハイブリダイゼーションの前に、組織を０．２Ｍ  ＨＣｌで透過性を上げ、次にプロテイナーゼＫで消化して、トリエタノールアミン及び酢酸無水物でアセチル化した。切片を５５℃で一晩放射能標識プローブとハイブリダイズし、その後ＲＮアーゼ消化及び約０．１ＸＳＳＣ中５５℃での高ストリンジェンシー洗浄に供した。スライドガラスをＫｏｄａｋ  ＮＴＢ２乳剤に浸し、４℃で２週間から３週間露光して、現像し、対比染色した。組織の形態とハイブリダイゼーションシグナルを同時評価できるように切片を暗領域と標準照明で検査した。
【０２８４】
その結果は、健常な出生後のヒトでは、Ａｎｇ−２の発現は卵巣、胎盤及び子宮などの血管形成性血管系を含むいくつかの組織に限定されることを示唆した。健常成人の心臓、脳、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓、筋肉、扁桃、胸腺、虫垂、リンパ節、胆嚢、前立腺又は精巣では、Ａｎｇ−２の発現は検出できなかった。５週齢のマウスでは、腎臓は直細血管において著明なＡｎｇ−２発現を示した（しかし成体サル又はヒトではＡｎｇ−２発現は認められなかった）。この発現が胚発生の痕跡であるのかどうかを調べるため、マウスＡｎｇ−２プローブと上述した条件を使用して、１年齢までの年齢範囲にわたるマウスに由来する腎臓に関してこの実験を反復した。Ａｎｇ−２発現は新生児発育の間低下することが認められたが、１年齢のマウスの腎臓においてもまだ明らかであった。
【０２８５】
Ａｎｇ−２発現はまた、結腸癌（５例）、乳癌（１０例）、肺癌（８例）、グリア芽細胞腫（１例）などの原発性ヒト腫瘍、乳癌（２例）、肺癌（２例）及び脳に転移していた卵巣癌（２例）などの転移性ヒト腫瘍、及びＣ６（ラット神経膠腫）、ＨＴ２９（ヒト結腸癌）、Ｃｏｌｏ−２０５（ヒト結腸癌）、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸癌）、Ａ４３１（ヒト類表皮腫）、Ａ６７３（ヒト横紋筋肉腫）、ＨＴ１０８０（ヒト線維肉腫）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌）、Ｂ１６Ｆ１０（マウス黒色腫）、ＭｅｔｈＡ（マウス肉腫）、及びルイスラットの肺癌転移（ｍｅｔｓ）などのげっ歯類腫瘍モデルを含む、試験した実質的にすべての腫瘍型においても検出された。さらに、Ａｎｇ−２発現は、ＶＥＧＦに応答してＭａｔｒｉｇｅｌ栓子へと成長する新生血管において及び未熟児網膜症のマウス低酸素症モデルにおいて検出された。
【実施例２】
【０２８６】
Ａｎｇ−２ペプチ体を評価するための分子アッセイ
Ａｎｇ−２及び関連ファミリー成員へのペプチ体の直接結合及びＡｎｇ−２：Ｔｉｅ−２相互作用へのペプチ体の作用を評価するために、分子アッセイ（アフィニティーＥＬＩＳＡ、中和ＥＬＩＳＡ及びＢＩＡコア）を開発した。これらのインビトロアッセイを下記に述べる。
【０２８７】
アフィニティーＥＬＩＳＡ
候補抗Ａｎｇ−２ペプチ体の初期スクリーニングのために、精製ヒトＡｎｇ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号６２３−ＡＮ；Ａｎｇ−２は２つのトランケートバージョンの混合物として提供される）又はマウスＡｎｇ−２ポリペプチド（上述したように調製した）を使用した。確認結合アッセイのために、完全長ヒトＡｎｇ−２ＤＮＡでトランスフェクトし、約５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養したヒト２９３Ｔ細胞の順化培地からヒトＡｎｇ−２を得た。
【０２８８】
マイクロタイタープレートを使用して、約１００μｌ／穴のＡｎｇ−２を各々のウエルに加え、プレートを約２時間インキュベートした後、約０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でプレートを４回洗った。次にＰＢＳ中約５％ＢＳＡ  約２５０μｌ／穴を使用してウエルを遮断し、プレートを室温で約２時間インキュベートした。インキュベーション後、過剰の遮断溶液を廃棄し、各々の候補抗Ａｎｇ−２ペプチ体約１００μｌを、約４０ナノモルの濃度から出発し、約１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で連続的に４倍に希釈する希釈シリーズでウエルに加えた。その後プレートを室温で一晩インキュベートした。インキュベーション後、約０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでプレートを洗った。洗浄をさらに４回繰り返した後、あらかじめ１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：５０００に希釈しておいた約１００μｌ／穴のヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，カタログ番号３１４１６）を加えた。プレートを室温で約１時間インキュベートした。次に約０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでプレートを５回洗った後、約１００μｌ／穴のＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジンＬｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号Ｔ８６６５）基質を加え、青色を呈するまでプレートを約５分から１５分間インキュベートした。その後分光光度計において約３７０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０２８９】
中和ＥＬＩＳＡ
ヒトＡｎｇ−２ポリペプチドが結合したマイクロタイタープレートを、アフィニティーＥＬＩＳＡについて述べたように調製した。候補抗Ａｎｇ−２ペプチ体を、約１％ＢＳＡ及び約１ｎＭ  Ｔｉｅ−２（Ｔｉｅ−２部分が分子の可溶性細胞外部分だけを含むＴｉｅ−２−Ｆｃ分子として提供される；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３１３−ＴＩ）を含むＰＢＳの溶液中４倍希釈で１０００ｎＭから０．２ｐＭまで滴定した。約１００μｌの抗体／Ｔｉｅ−２溶液を各々のウエルに加えた後、プレートを室温で一晩インキュベートし、その後約０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で５回洗った。洗浄後、約１００μｌ／穴の抗Ｔｉｅ−２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｉｎｃ．，カタログ番号５５７０３９）を加えて約１μｇ／ｍｌの最終濃度にし、プレートを室温で約１時間インキュベートした。次に、約１００μｌ／穴のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，カタログ番号３１４３２）を、約１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１：１０，０００の希釈で加えた。プレートを室温で約１時間インキュベートした後、約０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでプレートを５回洗った。次に約１００μｌ／穴のＴＭＢ基質（上述）を加えて、呈色させた。その後分光光度計において３７０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０２９０】
アフィニティーＢＩＡコア
各々の候補Ａｎｇ−２ペプチ体のアフィニティー分析を、ＰＢＳ及び０．００５％Ｐ２０界面活性剤（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）をランニング緩衝液としてＢＩＡコア（登録商標）２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で実施した。組換えプロテインＧ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）を、Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を製造者の指示するプロトコールに従って使用して、第一級アミン基によって研究グレードのＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）に固定した。
【０２９１】
最初に固定化プロテインＧに対する各々の候補抗Ａｎｇ−２ペプチ体約１００Ｒｕを捕獲して、その後様々な濃度（０ｎＭから１００ｎＭ）のｈｕＡｎｇ−２又はｍＡｎｇ−２を５０μｌ／分の流速で３分間、結合抗体表面に注入することによって結合アッセイを実施した。ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）及びＫＤ（解離平衡定数）を含むペプチ体結合の速度論的パラメータを、ＢＩＡ評価３．１コンピュータプログラム（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。より低い解離平衡定数は、Ａｎｇ−２に対するペプチ体のより大きな親和性を示唆した。
【実施例３】
【０２９２】
Ａｎｇ−２結合ペプチドの特定
１．Ａｎｇ−２被覆磁気ビーズの調製
Ａ．磁気ビーズへのＡｎｇ−２の固定
非特異的溶出のために、ビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号ＢＴ６２３）を、３回の選択すべてについて、製造者からのビーズ原液１００μｌにつきビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質約４μｇの濃度でＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）上に固定した。抗原（Ａｎｇ−２）と受容体（Ｔｉｅ−２）の溶出のために、ビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質２μｇを、２回目の選択に関して、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ５０μｌ上に固定した。３回目の選択に関しては、被覆濃度をビーズ原液５０μｌにつきビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質約１μｇに低下させた。磁石を使用してビーズを試験管の一方の側に引き寄せ、液体をピペットで取り除くことにより、ビーズをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗い、ＰＢＳに再懸濁した。ビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質を上記濃度の洗ったビーズに加え、回転させながら室温で１時間インキュベートし、その後、回転させながら４℃で数時間から一晩インキュベートした。次に、約１％の最終濃度までＢＳＡを加えてＡｎｇ−２被覆ビーズを遮断し、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。生じたＡｎｇ−２被覆ビーズをＰＢＳで５回洗った後、選択手順に供した。
【０２９３】
Ｂ．陰性選択ビーズの作製
陰性選択のためにさらなるビーズを作製した。各々のパニング条件に関して、製造者からのビーズ原液５００μｌを、ビオチニル化Ａｎｇ−２に関するインキュベーション段階を省くことを除いて、上記手順（１Ａ項）に供した。最後の線状段階で、ビーズを５つの１００μｌアリコートに分けた。
【０２９４】
２．Ａｎｇ−２結合ファージの選択
Ａ．全体的戦略
「ＴＮ８−ＩＸ」（５×１０９の独立した形質転換体）、「ＴＮ１２−Ｉ」（１．４×１０９の独立した形質転換体）、及び「Ｌｉｎｅａｒ」（２．３×１０９の独立した形質転換体）（すべてＤｙａｘ  Ｃｏｒｐ．より）と称される３つの糸状ファージライブラリーをＡｎｇ−２結合ファージに関する選択に使用した。各々のライブラリーを非特異的溶出、Ａｎｇ−２溶出、及び受容体溶出（Ｔｉｅ−２）のいずれかに供した。９つの異なるパンング条件をＡｎｇ−２に関して実施した（非特異的溶出法を用いるＴＮ８−ＩＸ、Ａｎｇ−２溶出法を用いるＴＮ８−ＩＸ、Ｔｉｅ−２溶出法を用いるＴＮ８−ＩＸ、非特異的溶出法を用いるＴＮ１２−Ｉ、Ａｎｇ−２溶出法を用いるＴＮ１２−Ｉ、Ｔｉｅ−２溶出法を用いるＴＮ１２−Ｉ、非特異的溶出法を用いるＬｉｎｅａｒ、Ａｎｇ−２溶出法を用いるＬｉｎｅａｒ、及びＴｉｅ−２溶出法を用いるＬｉｎｅａｒ）。３つのライブラリーすべてについて、１回目の選択からのファージは、さらなる回の選択のために非特異的にのみ溶出した。２回目と３回目の選択においてはＡｎｇ−２及びＴｉｅ−２溶出を使用した。Ｌｉｎｅａｒライブラリーについては、第２回目にのみＡｎｇ−２及びＴｉｅ−２溶出に関して選択を実施した。
【０２９５】
Ｂ．陰性選択
各々のパニング条件のために、ＴＮ８−ＩＸ及びＴＮ１２−Ｉライブラリー（ＴＮ８−ＩＸについては約５×１０１１ｐｆｕ、及びＴＮ１２−Ｉについては約１．４×１０１１ｐｆｕ）に関しては約１００のランダムなライブラリー等価物、及びＬｉｎｅａｒライブラリー（約１×１０１１ｐｆｕ）に関しては約１０のランダムなライブラリー等価物をライブラリー原液からアリコートに分けて、ＰＢＳＴ（ＰＢＳと０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で約４００μｌに希釈した。最後の洗浄後、陰性選択（１Ｂ項）のために調製したビーズの最初の１００μｌアリコートから液体を抜き取り、約４００μｌの希釈ライブラリー原液をビーズに加えた。生じた混合物を回転させながら室温で約１０分間インキュベートした。磁石を用いてファージ上清を抜き取り、もう１つの陰性選択段階のための第二の１００μｌアリコートに加えた。このようにして、５つの陰性選択段階を実施した。
【０２９６】
Ｃ．Ａｎｇ−２タンパク質被覆ビーズを用いた選択
最後の陰性選択段階（１Ｂ項）後のファージ上清をＡｎｇ−２被覆ビーズ（１Ａ項）に加えた。この混合物を回転させながら室温で１時間から２時間インキュベートして、ファージを標的タンパク質に結合させた。上清を廃棄した後、ビーズをＰＢＳＴで約１０回洗浄し、次にＰＢＳで２回洗浄した。
【０２９７】
Ｄ．非特異的溶出
最終洗浄後、液体を抜き取り（２Ｃ項）、Ｍｉｎ  Ａ塩溶液（６０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、３３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７．６ｍＭ（ＮＨ４）ＳＯ４、及び１．７ｍＭクエン酸ナトリウム）約１ｍｌをビーズに加えた。このビーズ混合物を注射用の濃縮細菌試料（下記の３Ａ及び３Ｂ項参照）に直接加えた。
【０２９８】
Ｅ．結合ファージの抗原（Ａｎｇ−２）溶出
２回目に関しては、最後の洗浄段階（２Ｃ項）後、各々の条件について１ｐＭ、０．１ｎＭ及び１０ｎＭの組換えＡｎｇ−２タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）１００μｌを連続的に加え、３０分間インキュベートすることにより、結合ファージを磁気ビーズから溶出した。残りのファージは非特異的に溶出した（２Ｄ項）。１０ｎＭから溶出したファージと非特異的溶出ファージを合わせて、３回目の選択に供した（下記の４項参照）。
【０２９９】
３回目に関しては、最後の洗浄段階（２Ｃ項）後、各々の条件について約１ｎＭの組換えＡｎｇ−２タンパク質、及び１０ｎＭの組換えＡｎｇ−２タンパク質を連続的に加え、３０分間インキュベートすることにより、結合ファージを磁気ビーズから溶出した。さらに、回転装置上で約１０分間、１００ｍＭトリエチルアミン溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）１ｍｌでファージを溶出した。ファージ含有トリエチルアミン溶液のｐＨを１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．５ｍｌで中和した。１００ｍＭトリエチルアミン溶液による最後の溶出後、ビーズを細菌に加えることによって残りのファージを溶出した（２Ｄ項）。
【０３００】
Ｆ．結合ファージの受容体（Ｔｉｅ−２）溶出
２回目に関しては、最後の洗浄段階（２Ｃ項）後、各々の条件について１ｐＭ、０．１ｎＭ及び１０ｎＭの組換えＴｉｅ−２タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｅ−２−Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）約１００μｌを連続的に加え、３０分間インキュベートすることにより、結合ファージを磁気ビーズから溶出した。残りのファージは非特異的に溶出した（２Ｄ項）。１０ｎＭから溶出したファージと非特異的溶出ファージを合わせて、３回目の選択に供した（下記の４項参照）。
【０３０１】
３回目に関しては、最後の洗浄段階（２Ｃ項）後、各々の条件について約１ｎＭの組換えＴｉｅ−２タンパク質、及び１０ｎＭの組換えＴｉｅ−２タンパク質を連続的に加え、３０分間インキュベートすることにより、結合ファージを磁気ビーズから溶出した。さらに、回転装置上で１０分間、１００ｍＭトリエチルアミン溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）１ｍｌでファージを溶出した。ファージ含有トリエチルアミン溶液のｐＨを１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．５ｍｌで中和した。１００ｍＭトリエチルアミン溶液による最後の溶出後、ビーズを細菌に加えることによって残りのファージを溶出した（２Ｄ項）。
【０３０２】
３．増幅
Ａ．平板培養細胞の調製
新鮮大腸菌（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）培養を、約１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬＢ培地中約０．５のＯＤ６００まで増殖させた。各々のパニング条件のために、この培養物約２０ｍｌを氷上で冷却し、遠心分離した。その細菌ペレットをＭｉｎ  Ａ塩溶液約１ｍｌに再懸濁した。
【０３０３】
Ｂ．形質導入
上記に述べた（２Ｄ、２Ｅ及び２Ｆ項）各々の異なる溶出法からの各混合物を濃縮細菌試料（３Ａ項）に加え、約３７℃で約１５分間インキュベートした。ＮＺＣＹＭ培地（２×ＮＺＣＹＭ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）約２ｍｌを各混合物に加え、約３７℃で１５分間インキュベートした。生じた４ｍｌ溶液を、約５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む大型ＮＺＣＹＭ寒天平板に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０３０４】
Ｃ．ファージの採集
各々の細菌／ファージ混合物を大型ＮＺＣＹＭ寒天平板（３Ｂ項）で一晩増殖させた後、それらを削り取ってＬＢ培地約３５ｍｌに入れた。寒天平板をさらなるＬＢ培地３５ｍｌでさらに濯いだ。生じたＬＢ培地中の細菌／ファージ混合物を遠心分離して、細菌をペレット化除去した。ファージ上清約５０ｍｌを新鮮試験管に移し、ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、３．５Ｍ酢酸アンモニウム）約１２．５ｍｌを加えて、氷上で２時間インキュベートしてファージを沈殿させた。沈殿したファージを遠心分離し、ファージ再懸濁緩衝液（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）６ｍｌに再懸濁した。このファージ溶液を、遠心分離して残りの細菌を除去し、ＰＥＧ溶液約１．５ｍｌを加えてファージを再び沈殿させることによってさらに精製した。遠心分離段階後、ファージペレットをＰＢＳ約４００μｌに再懸濁した。この溶液を最終的な遠心分離に供して、残存する細菌デブリの溶液を取り除いた。生じたファージ調製物を標準的なプラーク形成アッセイを用いて力価を検定した。
【０３０５】
４．さらなる選択と増幅
２回目では、１回目（３Ｃ項）からの増幅ファージ調製物（約１０１０ｐｆｕ）を、選択及び増幅段階（２及び３項）を実施するための投入ファージとして使用した。Ａｎｇ−２及びＴｉｅ−２溶出のために、１０ｎＭ及び非特異的溶出からのファージを一緒にして、３回目の選択のために増幅した。今度は、２回目からの増幅ファージ調製物（約１０９ｐｆｕ）を３回目の選択及び増幅（２及び３項）を実施するための投入ファージとして使用した。３回目の溶出段階後（２Ｄ、２Ｅ及び２Ｆ）、溶出したファージの小分画をプラーク形勢アッセイ（３Ｃ項）におけるように平板培養した。個々のプラークを採取し、各々のウエルにＴＥ緩衝液１００μｌを含む９６穴マイクロタイタープレートに入れた。これらのマスタープレートを４℃で一晩インキュベートして、ファージをＴＥ緩衝液に溶出させた。
【０３０６】
５．クローン分析
ファージクローンをファージＥＬＩＳＡ及びＤＮＡ塩基配列決定法によって分析した。これら２つのアッセイからの統合結果に基づいて配列を等級付けた。
【０３０７】
Ａ．ファージＥＬＩＳＡ
ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’培養物を、ＯＤ６００が約０．５に達するまで増殖させた。この培養物約３０μｌを９６穴マイクロタイタープレートの各々のウエルに分配した。溶出したファージ（４項）約１０μｌを各々のウエルに加え、室温で約１５分間細菌に感染させた。約１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び約５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地約１００μｌを各ウエルに加えた。次にマイクロタイタープレートを振とうしながら約３７℃で一晩インキュベートした。組換えＡｎｇ−２タンパク質（ＰＢＳ中約１μｇ／ｍｌ）を９６穴Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）に約４℃で一晩結合させた。対照として、純粋なストレプトアビジンを、ＰＢＳ中約２μｇ／ｍｌで別のＭａｘｉｓｏｒｐプレートに被覆した。
【０３０８】
その翌日、タンパク質被覆したＭａｘｉｓｏｒｐプレート中の液体を廃棄し、各々のウエルを約４℃で一晩（選択的に、室温で１時間）、５％乳溶液約３００μｌで遮断した。その後乳溶液を廃棄して、ウエルをＰＢＳＴ溶液で３回洗った。最後の洗浄段階後、ＰＢＳＴ−４％乳約５０μｌを、タンパク質被覆Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートの各々のウエルに加えた。９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルからの一晩培養物約５０μｌを、Ａｎｇ−２被覆プレートならびに対照ストレプトアビジン被覆プレートの対応するウエルに移した。各々の種類のプレート中の１００μｌ混合物を室温で約１時間インキュベートした。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートから液体を廃棄し、ウエルをＰＢＳＴで約３回洗った。ＨＲＰ複合抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を約１：７，５００に希釈し、希釈溶液約１００μｌをＭａｘｉｓｏｒｐプレートの各ウエルに加えて室温で約１時間インキュベートした。再び液体を廃棄し、ウエルをＰＢＳＴで約５回洗った。次にＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）約１００μｌを各ウエルに加え、５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４溶液約５０μｌで反応を停止させた。ＯＤ４５０を分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。
【０３０９】
Ｂ．ファージクローンの塩基配列決定
各々のファージクローンについて、ＰＣＲを用いて塩基配列決定鋳型を作製した。約５００ヌクレオチドフラグメントを増幅するために下記のオリゴヌクレオチド対を使用した：
【０３１０】
【化１】
2010189394.tif 000018
【０３１１】
下記の混合物を各々のクローンについて作製した：
【０３１２】
【表８】
2010189394.tif 000019
【０３１３】
ＰＣＲのために、サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して下記のプログラムを実施した：９４℃を５分間；（９４℃を３０秒間、５５℃を３０秒間、７２℃を４５秒間）×３０サイクル；７２℃を７分間；４℃に冷却。各々の反応からのＰＣＲ産物を、製造者のプロトコールに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。その後、１％アガロースゲル上で染料（１０×ＢＢＸＳアガロースゲル充填染料）約１μｌと共に各ＰＣＲ反応混合物約１０μｌを泳動させて精製ＰＣＲ産物を検定した。残りの産物は、ＡＢＩ３７７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて製造者の勧めるプロトコールに従って塩基配列決定した。
【０３１４】
６．配列の順位及びコンセンサス配列の決定
Ａ．配列の順位と分析
種々のヌクレオチド配列から翻訳されたペプチド配列（５Ｂ項）をＥＬＩＳＡデータに相関付けた。Ａｎｇ−２被覆ウエルにおいて高いＯＤ４５０を示し、ストレプトアビジン被覆ウエルでは低いＯＤ４５０を示すクローンにより高い優先順位を与えた。何度も出現する配列にも高い優先順位を与えた。ペプチド又はペプチ体としてのさらなる分析のためにこれらの判定基準に基づいて候補配列を選択した。
【０３１５】
Ｂ．コンセンサス配列の決定
３つの異なるクラスのコンセンサスモチーフを、次のようにしてＴＮ８−ＩＸライブラリーから作製した：
【０３１６】
【化２】
2010189394.tif 000020
2010189394.tif 000021
【０３１７】
１つのコンセンサスモチーフをＴＮ１２−Ｉライブラリーから作製した：
【０３１８】
【化３】
2010189394.tif 000022
【０３１９】
すべてのコンセンサスモチーフ配列について、各々の位置で最も頻繁に生じるアミノ酸を決定することにより、各々のコンセンサス配列から下線を付した「コアアミノ酸配列」を得た。「Ｘ」は何らかの天然に生じるアミノ酸を表わす。コア配列に隣接する２個のシステインは、ＴＮ８−ＩＸ及びＴＮ１２−Ｉライブラリーにおける固定アミノ酸であった。
【０３２０】
Ａｎｇ−２に結合するものとして特定されたペプチドを下記の表３に示す。
【０３２１】
【表９】
2010189394.tif 000023
【実施例４】
【０３２２】
ペプチ体をコードするＤＮＡの構築
潜在的にＡｎｇ−２：Ｔｉｅ−２結合に対して阻害性であるとして選択された修飾ペプチド（表３参照）を使用して、各々のペプチドの単量体又は各々のペプチドの縦列二量体（単量体ユニットの間にリンカーを有する）のいずれかが、リンカーとそれに続くヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡにフレーム内で融合している融合タンパク質を構築した。各々の修飾ペプチドは、オリゴヌクレオチドの対（「オリゴ」）をアニーリングし、ペプチドに依存して５個のグリシン残基、８個のグリシン残基又は１個のリシン残基のいずれかから成るリンカーと共に該ペプチドをコードするポリヌクレオチド二重鎖を作製することによって構築した；これらの構築物はＮｄｅＩからＸｈｏＩまでのフラグメントとして作製した。これらの二重鎖ポリヌクレオチド分子を、あらかじめＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化しておいた、ヒトＦｃ遺伝子を含むベクター（下記でさらに述べる、ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ  Ｎ末端）に連結した。生じた連結混合物を、標準的な手順を用いて電気穿孔法によって大腸菌株２５９６細胞（下記でさらに述べる、ＧＭ２２１）に形質転換した。クローンを、組換えタンパク質産物を産生し、正しいヌクレオチド配列を備えた遺伝子融合を有する能力に関してスクリーニングした。修飾ペプチドの各々について１個のそのようなクローンを選択した（すなわちＦｃ−ペプチド融合産物）。
【０３２３】
ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ  Ｎ末端ベクターの構築
ｐＡＭＧ２１
発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．９８１１３）は、発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６９５７６）及び米国特許第４，７１０，４７３号に述べられている発現ベクター系から、国際特許公開公報第ＷＯ００／２４７８２号（その中のｐ．１００−１０３にわたる実施例２の部分ならびに図１７Ａ及び１７Ｂ参照）に述べられている手順に従うことによって誘導される。
【０３２４】
Ｆｃ  Ｎ末端ベクター
大腸菌株３７８８、ｐＡＭＧ２１  Ｔｐｏ＿Ｇｌｙ５＿Ｆｃ単量体を鋳型として使用して、Ｆｃ  Ｎ末端ベクターを生成した。この菌株のクローニングに関する情報はＷＯ００／２４７８２号（その中の実施例２及び図１０参照）に見出される。ｐＡＭＧ  Ｔｐｏ  Ｇｌｙ５の中のＴｐｏペプチド配列を除去して、それをＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩ部位を含むポリリンカーで置き換えるように５’ＰＣＲプライマー（下記でさらに述べる）を設計した。菌株３７８８を鋳型として使用し、５’プライマーとして下記の配列番号８のオリゴヌクレオチド及び万能３’プライマーとして下記の配列番号９を使用して、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅでＰＣＲを実施した。生じたＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢｓｒＧＩで消化した。対象ペプチドをそのリンカーと共にコードするプラスミド及びポリヌクレオチドの両方を、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）ゲル精製スピンカラムを用いてゲル精製した。次に標準連結手法を用いてプラスミドとインサートを連結し、生じた連結混合物を大腸菌細胞（菌株２５９６）に形質転換した。１個のクローンを選択し、ＤＮＡ塩基配列決定を実施した。正しいクローンを特定し、これをここで述べる修飾ペプチドのためのベクターソースとして使用した。
【０３２５】
【化４】
2010189394.tif 000024
これらの修飾ペプチドをＦｃへのＮ末端融合（Ｎ末端ペプチ体）として作製することに加えて、それらの一部をＣ末端融合産物（Ｃ末端ペプチ体）としても作製した。Ｃ末端融合を作製するために使用したベクターを下記で説明する。
【０３２６】
Ｆｃ  Ｃ末端ベクターの構築
大腸菌株３７２８、ｐＡＭＧ２１  Ｆｃ＿Ｇｌｙ５＿Ｔｐｏ単量体を鋳型として使用して、修飾ペプチドのためのＦｃ  Ｃ末端ベクターを生成した。この菌株のクローニングに関する情報はＷＯ００／２４７８２号（その中の実施例２及び図７参照）に見出される。Ｔｐｏペプチド配列を除去して、それをＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩ部位を含むポリリンカーで置き換えるように３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０）を設計した。菌株３７２８を鋳型として使用し、万能５’プライマー（配列番号１１）及び上記３’プライマーを使用して、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅでＰＣＲを実施した。生じたＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素ＢｓｒＧＩ及びＢａｍＨＩで消化した。各々の対象ペプチドをそのリンカーと共にコードするプラスミド及びポリヌクレオチドの両方を、Ｑｉａｇｅｎゲル精製スピンカラムを用いてゲル精製した。次に標準連結手法を用いてプラスミドとインサートを連結し、生じた連結混合物を大腸菌（菌株２５９６）細胞に形質転換した。１個のクローンを選択し、ＤＮＡ塩基配列決定を実施した。正しいクローンを特定し、ここで述べる修飾ペプチドのためのベクターのソースとして使用した。
【０３２７】
【化５】
2010189394.tif 000025
【０３２８】
ＧＭ２２１（＃２５９６）。Ｆｃ−ペプチド融合タンパク質を発現するために使用した宿主菌株２５９６は、ｌｕｘプロモーター、及び初期ｅｂｇ領域内に温度感受性λリプレッサーｃＩ８５７ｓ７及び後期ｅｂｇ領域内にｌａｃＩＱリプレッサーを含むように改変された大腸菌Ｋ−１２菌株である。これら２個のリプレッサー遺伝子の存在は、この宿主を様々な発現系と共に使用することを可能にする。この菌株のＡＴＣＣ名称は２０２１７４である。
【実施例５】
【０３２９】
ペプチ体の生産
大腸菌における発現。大腸菌ＧＭ２２１中のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構築物の各々の培養物をＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの参考文献で引用されている、ＴａｒｔｏｆとＨｏｂｂｓ，「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ａｎｄ  ｃｏｓｍｉｄ  ｃｌｏｎｅｓ」，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｆｏｃｕｓ，第９巻，ｐ．１２，１９８７参照）において３７℃で増殖させた。合成自己誘導物質、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで培地に添加して、ｌｕｘＰＲプロモーターからの遺伝子産物発現の誘導を実施した。培養物をさらに６時間３７℃でインキュベートした。次に細菌培養物を封入体の存在に関して顕微鏡で検査し、遠心分離によって収集した。屈曲（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）封入体が誘導した培養物中に認められ、おそらくＦｃ−融合物が大腸菌内の不溶性分画において産生されたと考えられることを示唆した。細胞ペレットを、１０％β−メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に直接再懸濁することによって溶解し、それからＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ほとんどの場合に、適切な分子量の強いクマシー染色バンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に認められた。
【０３３０】
精製。高圧均質化（１４，０００ＰＳＩで２回の通過）を用いて細胞を水中（１／１０）で破壊し、遠心分離（Ｊ−６Ｂ遠心分離機で４０００ＲＰＭ、１時間）によって封入体を収集した。封入体を６Ｍグアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．５に１／１０の比率で１時間可溶化した。Ｆｃに融合した線状ペプチドについては、可溶化混合物を２Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭアルギニン、２ｍＭシステイン、ｐＨ８．５に２５倍希釈した。４℃で２日間酸化を進行させ、ジスルフィド結合化合物（すなわちＦｃ−ペプチドホモ二量体）を形成させた。Ｆｃに融合した環状ペプチドについては、この同じプロトコールを、次の３つの折りたたみ条件を加えて実施した：（１）２Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭアルギニン、４ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミン、ｐＨ８．５；（２）４Ｍ尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭアルギニン、２ｍＭシステイン、ｐＨ８．５；及び（３）４Ｍ尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭアルギニン、４ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミン、ｐＨ８．５。再生されたタンパク質を１．５Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０に対して透析した。この混合物のｐＨを酢酸でｐＨ５に低下させた。沈殿物を遠心分離によって除去し、上清を、各融合産物の等電点に依存して５−６．５のｐＨに調整した。タンパク質をろ過し、各々の構築物について決定されたｐＨで、２０ｍＭ  ＮａＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡させたＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムに４℃で充填した。５０ｍＭ  ＮａＣｌから５００ｍＭ  ＮａＣｌまでの範囲の同じ緩衝液中２０カラム容量の直線勾配を使用してタンパク質を溶出した。そのピークをプールし、ろ過した。
【０３３１】
上記の手順を用いて生成されたペプチ体を下記の表４に示す。
【０３３２】
【表１０】
2010189394.tif 000026
2010189394.tif 000027
表４において、「Ｆｃ」はヒトＦｃ  ＩｇＧ１配列を表わす。２番目の欄はペプチ体のアミノ酸配列を示す。そのＦｃ部分は「Ｆｃ」と分類表示されており、下記の配列番号６０に示されている通りである。分類表示、例えば、「Ｃｏｎ４」又は「Ｃｏｎ−４」を使用する場合、これはＣｏｎ−４ペプチドを表わし、その上の接尾辞「Ｃ」、「（Ｃ）」又は「−Ｃ」；若しくは「Ｎ」、「（Ｎ）」又は「−Ｎ」の使用は、その分子がここで述べるペプチ体であることを示す。ペプチ体名の中の接尾辞「Ｎ」、「（Ｎ）」又は「−Ｎ」は、そのＡｎｇ−２結合ペプチド（単数又は複数）がＦｃドメインのＮ末端側であることを示し、及び接尾辞「Ｃ」、「（Ｃ）」又は「−Ｃ」は、そのＡｎｇ−２結合ペプチド（単数又は複数）がＦｃドメインのＣ末端側であることを示す。さらに、配列番号２５で定義されるような２×Ｃｏｎ４（Ｃ）１Ｋは、ここでは「１Ｋ」の接尾辞を伴わずに称されることもある。
【０３３３】
各々のペプチ体のＦｃ部分のアミノ酸配列は次の通りである（アミノ末端からカルボキシ末端へ）：
【０３３４】
【化６】
2010189394.tif 000028
【０３３５】
それぞれ表４の中のペプチ体配列番号１２−３２に対応するペプチ体をコードするＤＮＡ配列（配列番号３３−５３）を下記に示す：
【０３３６】
【化７】
2010189394.tif 000029
【０３３７】
【化８】
2010189394.tif 000030
【０３３８】
【化９】
2010189394.tif 000031
【０３３９】
【化１０】
2010189394.tif 000032
【０３４０】
【化１１】
2010189394.tif 000033
【０３４１】
【化１２】
2010189394.tif 000034
【０３４２】
【化１３】
2010189394.tif 000035
【０３４３】
【化１４】
2010189394.tif 000036
【０３４４】
【化１５】
2010189394.tif 000037
【０３４５】
【化１６】
2010189394.tif 000038
【０３４６】
【化１７】
2010189394.tif 000039
【０３４７】
【化１８】
2010189394.tif 000040
【０３４８】
【化１９】
2010189394.tif 000041
【０３４９】
【化２０】
2010189394.tif 000042
【０３５０】
【化２１】
2010189394.tif 000043
【０３５１】
【化２２】
2010189394.tif 000044
【０３５２】
【化２３】
2010189394.tif 000045
【０３５３】
【化２４】
2010189394.tif 000046
【０３５４】
【化２５】
2010189394.tif 000047
【０３５５】
【化２６】
2010189394.tif 000048
【０３５６】
【化２７】
2010189394.tif 000049
【実施例６】
【０３５７】
ペプチ体アッセイ
中和ＥＬＩＳＡを使用して１４個のペプチ体を試験し、アフィニティーＥＬＩＳＡを使用して３個のペプチ体を試験した。その結果を表５に示す。
【０３５８】
【表１１】
2010189394.tif 000050
【０３５９】
陰性対照ペプチ体４８８３のアミノ酸配列は次の通りである（Ｆｃ部分には下線を付しており、リンカーは「ＧＧＧＧＧ」であり、ペプチド部分は太字で示している）：
【０３６０】
【化２８】
2010189394.tif 000051
ここでの「阻害なし」の語の使用は、化合物が阻害特性を持たないことを表わすわけではないことは認識される。むしろ、ここで使用する「阻害なし」は、ここで述べる条件下で中和ＥＬＩＳ検定法を用いて試験したとき、これらの化合物をスクリーニングする最高濃度であった１０００ｎＭよりも高いＩＣ５０値を示した化合物を意味する。「阻害なし」を示すと分類表示された分子に関しては、有意の阻害特性は認められなかったが、それらの分子が、実際に、異なるアッセイ条件下又は異なるアッセイにおいては阻害特性を示しうることは認識される。好ましい実施形態では、本発明が、ここで述べるアッセイを用いて阻害特性を有するペプチ体に関することは認識される。
【０３６１】
２個のペプチ体はアフィニティーＢＩＡコアアッセイ（実施例２で述べたような）を用いて試験した。その結果を下記の表６に示す。
【０３６２】
【表１２】
2010189394.tif 000052
【実施例７】
【０３６３】
全身投与したＡｎｇ−２ペプチ体に関する治療効果試験
腫瘍攻撃誘発後７２時間目から１日１回スケジュールで、Ａ４３１腫瘍を有するマウスにＡｎｇ−２ペプチ体、ＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃを皮下投与した。使用したペプチ体の容量は１０００、２００、４０及び８μｇ／マウス／日であった。合計２０回の投与をすべての動物に実施した。腫瘍容積と体重を週に３回記録した。試験終了時に、動物を犠牲剖検し、ＥＬＩＳＡによってペプチ体レベルを測定するために血清を採集した。腫瘍及び正常組織のパネルをすべての群から収集した。
【０３６４】
その結果を図１に示す。図からわかるように、Ａｎｇ−２ペプチ体処置群とビヒクル対照の間で腫瘍増殖に有意差が認められた。Ａｎｇ−２ペプチ体の４つの用量すべてがビヒクル対照と比較して腫瘍増殖を阻止した（反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ＜０．０００１ｖｓビヒクル対照）。これに対し、対照群における腫瘍ははるかに速い速度で増殖し続けた。このペプチ体による処置は、上記用量で処置した動物の最終体重、器官重量又は血液学的パラメータに有意の作用を及ぼさなかった。
【実施例８】
【０３６５】
１．Ａｎｇ−２二次ペプチドライブラリーの構築
Ａ．エレクトロコンピテント大腸菌細胞
Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ（登録商標）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’電気穿孔コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＃２００１５８）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）より購入した。
【０３６６】
Ｂ．ｐＣＥＳ１ベクターの改変
ｐＣＥＳ１ベクター（Ｔａｒｇｅｔ  Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｃ．）１μｇを鋳型として、Ｅｘｔｅｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ混合物容量は、１×ＰＣＲ緩衝液、２個のプライマー：５’−ＣＡＡＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号２４４）及び５’−ＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＡＧＣＡ−３’（配列番号２４５）の各々２００ｎＭ、ｄＮＴＰ  ２００ｎＭ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ３単位（Ｕ）を含む１００μｌであった。ＴＲＩＯ−Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）ＰＣＲシステムを次のように実施した：９４℃を５分間；９４℃を３０秒間、５０℃を３０秒間、７２℃を４５秒間の３０サイクル；及び７２℃を１０分間；４℃に冷却。
【０３６７】
次にＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で泳動させ、製造者のプロトコールに従ってＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。２回目のＰＣＲ反応を、上述したのと同じＰＣＲ条件下で、ＰＣＲ産物５μｌ及び２個のプライマー：５’−ＣＡＡＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号２４６）及び５’−ＡＡＣＡＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴ−３’（配列番号２４７）の各々２００ｎＭを用いて実施した。
【０３６８】
次に、ＰＣＲ産物ともとのｐＣＥＳ１ベクターを、１×ＮＥＢ２緩衝液、ＡｐａＬＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）６０Ｕ、ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）６０Ｕを含む１００μｌの反応物中、３７℃で１時間、別々に消化した。消化したＤＮＡを、その後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを用いて精製し、１×連結緩衝液及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）４０Ｕを含む４０μｌの反応物中、室温で一晩連結した。
【０３６９】
上記ベクターを大腸菌にトランスフェクトし、３７℃で一晩インキュベートした。単離した１個のコロニーを選択し、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを用いてプラスミドを精製した。ＤＮＡ塩基配列決定によって正しいインサートを確認した。
【０３７０】
Ｃ．ベクターＤＮＡの作製
改変ｐＣＥＳ１ベクターＤＮＡ（上記１Ｂ項より）１μｇを、２５００Ｖ、２５μＦ及び２００オームに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてエレクトロコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（上記１Ａ項より）４０μｌに形質転換した。形質転換した細菌試料を、直ちにＳＯＣ（２％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）９６０μｌを含む試験管に移し、培養物を振とうしながら３７℃で１時間増殖させた。
【０３７１】
次に細胞を２×ＹＴＡＧＴ（２×ＹＴと１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び２％グルコース）寒天平板上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。１個のコロニーを塩基配列決定によって確認し、それを使用して、振とうしながら３７℃で一晩、２×ＹＴＡＧＴ培地２ｌに接種した。プラスミドベクターＤＮＡを、製造者のプロトコールに従ってＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔで精製した。
【０３７２】
Ｄ．ベクターＤＮＡの消化
合計約２０００μｇのベクターＤＮＡ（上記１Ｃ項より）を、１×ＮＥＢ２緩衝液、ＡｐａＬＩ  ３００Ｕ及びＸｈｏＩ  ３００Ｕを含む５０００μｌ反応物中、３７℃で一晩消化した。制限消化反応物を３７℃で一晩インキュベートし、あらかじめ作製された０．８％アガロースゲル（Ｅｍｂｉ  Ｔｅｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）において分析した。次に線状化したベクターＤＮＡをゲルから切り出し、製造者の指示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）で抽出した。
【０３７３】
Ｅ．ライブラリーオリゴヌクレオチドの作製
６個のライブラリーオリゴヌクレオチド（固定１個、ドープ５個）を、上述した結果から誘導される配列に基づいて設計した。１個の固定ライブラリーオリゴヌクレオチドは：
５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＳ  ＡＲＴＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＡＳＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡ−３’（ライブラリー番号２０）（配列番号２４８）
であり、２個の７０％ドープしたライブラリーオリゴヌクレオチドは次の通りであった：
５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫａａＫｃｇＫｃｃＫＮＮＫｇａＫｇａＫａｔＫｔｔＫｇｇＫｇｇＫＮＮＫａｃＫｔａＫｃａＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡ−３’（ライブラリー番号２７）（配列番号２４９）
５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＮＮＫａａＫｔｔＫａａＫｃｃＫｃｔＫｇａＫｇａＫｃｔＫｇａＫｇａＫａｃＫｃｔＫｔａＫｇａＫｃａＫｔｔＫａｃＫｔｔＫｃａＫｃａＫＮＮＫＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡ−３’（ライブラリー番号９９）（配列番号２５０）
小文字は、示されている塩基７０％と他の３つのヌクレオチド各々１０％の混合物を表わす。他の３つの９１％ドープしたライブラリーオリゴヌクレオチドは次の通りであった：
５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫｃａＫｇａＫｇａＫＴＧＣｇａＫｔｇＫｇａＫｃｃＫｔｇＫａｃＫＴＧＣｇａＫｃａＫａｔＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣ  Ａ−３’（ライブラリー番号９４）（配列番号２５１）
５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＮＮＫｔｔＫｇａＫｔａＫＮＮＫｇａＫｇｇＫｇｔＫｇａＫｇａＫｃｃＫｔｔＫａｃＫｔｔＫｇｇＫＮＮＫｇａＫａａＫｃａＫＮＮＫＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡ−３’（ライブラリー番号２５）（配列番号２５２）
５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＮＮＫａａＫｔｔＫａａＫｃｃＫｃｔＫｇａＫｇａＫｃｔＫｇａＫｇａＫａｃＫｃｔＫｔａＫｇａＫｃａＫｔｔＫａｃＫｔｔＫｃａＫｃａＫＮＮＫＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡ−３’（ライブラリー番号２６）（配列番号２５３）
上記のオリゴに関して、当業者は、「Ｎ」は、４個のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）の各々がオリゴ合成において等しく提示されることを表わし、及び「Ｋ」は、ヌクレオチドＧ及びＴがオリゴ合成において等しく提示されることを表わすことを認識する。小文字は、指示されている塩基９１％と他の３つのヌクレオチド各々３％の混合物を表わす。これらのオリゴヌクレオチドの各々をＰＣＲにおける鋳型として使用した。
【０３７４】
Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）をＰＣＲ反応のために使用した。各々のライブラリーオリゴを、ライブラリーオリゴヌクレオチド１ｎＭ、１×ＰＣＲ緩衝液、プライマー：
５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号２５４）
５’−ＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧ−３’（配列番号２５５）
各々３００ｎＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及びＥｘｐａｎｄポリメラーゼ３５０Ｕを含む９６穴の５０μｌ  ＰＣＲ反応物中で増幅した。サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して下記のプログラムを実施した：９４℃を５分間；（９４℃を３０秒間、５２．５℃を６０秒間、７２℃を３０秒間）×２５サイクル；７２℃を１０分間；４℃に冷却。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．カタログ番号２８１０４）を製造者のプロトコールに従って使用して遊離ヌクレオチドを除去した。
【０３７５】
Ｆ．ライブラリーオリゴヌクレオチドの消化
各々のライブラリーについて、ＰＣＲ産物（１Ｅ項）を、１×ＮＥＢ２緩衝液、ＡｐａＬＩ  ７５０Ｕ及びＸｈｏＩ  ７５０Ｕを含む１２００μｌ反応物中、３７℃で一晩消化した。消化したＤＮＡをあらかじめ作製した３％アガロースゲル（Ｅｍｂｉ  Ｔｅｃ）上で分離した。各反応物からの対象とするＤＮＡバンドをゲルから切り出し、ＣＯＳＴＡＲ  Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心分離管フィルター、０．２２μｍ酢酸セルロース（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，カタログ番号８１６０）で抽出した。
【０３７６】
Ｇ．ライブラリーオリゴヌクレオチドとベクターの連結
４５０μｌの連結反応物は、１：５のモル比の線状化ベクター（１Ｄ項）と各々の消化ライブラリーＰＣＲ産物（１Ｆ項）、１×ＮＥＢ連結緩衝液、及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ２０，０００Ｕを１６℃で一晩含んだ。連結した産物を６５℃で２０分間インキュベートしてＴ４  ＤＮＡリガーゼを不活性化し、ＮｏｔＩ  １００Ｕと共に３７℃で２時間さらにインキュベートしてベクターの自己連結を最小化した。次に、連結産物を標準フェノール／クロロホルム抽出（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｎｉａｔｉｓら、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）によって精製し、Ｈ２Ｏ  １２０μｌに再懸濁した。
【０３７７】
Ｈ．電気穿孔形質転換
各々のライブラリーについて、１２の電気穿孔反応を実施した。各々の形質転換のための、連結したベクターＤＮＡ（１Ｇ項）１０μｌとＸＬ１−ＢＬＵＥ  ＭＲＦ’細胞（１Ａ項）３００μｌを０．２ｃｍキュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中で混合した。生じた混合物を、２５００Ｖ、２５μＦ及び２００オームに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩによってパルスした。１２の電気穿孔反応からの形質転換細菌を合わせて、ＳＯＣ  ２６ｍｌを含むフラスコに移し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を２×ＹＴＡＧ  ４５０ｍｌに加え、振とうしながら３７℃で５時間増殖させた。細胞を４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを１５％グリセロール／２×ＹＴ  １２ｍｌに再懸濁し、−８０℃で保存した。これがライブラリーの一次原液であった。力価は、５．０×１０９（ライブラリー番号２０）、３．３×１０１０（ライブラリー番号９４）、４．７×１０９（ライブラリー番号２５）、５．０×１０９（ライブラリー番号２６）、３．０×１０９（ライブラリー番号２７）、及び４．２×１０９（ライブラリー番号９９）の独立した形質転換体のライブラリーサイズを示した。
【０３７８】
２．ライブラリーの増幅
Ａ．ライブラリーの二次原液の作製
一次ライブラリー細胞原液（上記１Ｈ項より）から、各々のライブラリーサイズの１０倍過剰をカバーするのに十分な細胞を使用して、出発ＯＤ６００が０．１であるように２×ＹＴＡＧＴ（２×ＹＴと１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び２％グルコース）培地に接種した。培養物を、ＯＤ６００＝０．５になるまで振とうしながら３７℃で数時間増殖させた。各ライブラリーから１／１０アリコートを取り、別々のフラスコ内でさらに２時間、３７℃で増殖させた。次にこれらのサブ培養物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−１４回転装置を用いて４℃で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離し、細菌ペレットを１５％グリセロール／２×ＹＴ  ７．０ｍｌ（各ライブラリーについて）に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０３７９】
Ｂ．ファージの誘導
Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージアリコート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をＯＤ６００＝０．５の残りの細菌培養物（上記２Ａ項より）に加えて、３×１０９ｐｆｕ／ｍｌの最終濃度にした。ヘルパーファージを、３７℃で振とうせずに３０分間及び緩やかに振とうしながら３０分間細菌に感染させた。感染細胞を４℃で１５分間、５０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、同じ容量（上記２Ａ項より）の２×ＹＴＡＫ培地（２ＹＴと１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び４０μｇ／ｍｌカナマイシン）に再懸濁した。振とうしながら３０℃で一晩、ファージミドを生成させた。
【０３８０】
Ｃ．ファージの採集
上記２Ｂ項からの細菌培養物を４℃で１５分間、５０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を新しいビンに移し、０．２容量の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加えて、氷上で１時間インキュベートしてファージミドを沈殿させた。沈殿したファージミドを４℃で３０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、低温ＰＢＳ  １００ｍｌに慎重に再懸濁した。ファージミド溶液を、４℃で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離して残りの細胞を除去し、０．２容量の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加えてファージミドを沈殿させることによってさらに精製した。そのファージミドを４℃で３０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、ファージミドペレットを低温ＰＢＳ  １８ｍｌに再懸濁した。６０％グリセロール溶液６ｍｌをファージミド溶液に加えて−８０℃で保存した。ファージミドの力価を標準手順（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｍａｎｉａｔｉｓら、第３版）によって測定した。
【０３８１】
３．Ａｎｇ−２結合ファージの選択
Ａ．磁気ビーズへのＡｎｇ−２の固定
ビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質（上記３Ａ項より）を、製造者からのビーズ原液１００μｌにつきＡｎｇ−２タンパク質約２０００ｎｇの濃度でＤｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＤＹＮＡＬ，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）上に固定した。磁石を使用してビーズを試験管の一方の側に引き寄せ、液体をピペットで取り除いた後、ビーズをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗い、ＰＢＳに再懸濁した。ビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質を上記濃度の洗ったビーズに加え、回転させながら室温で１時間インキュベートした。次に、２％の最終濃度までＢＳＡを加えてＡｎｇ−２被覆ビーズを遮断し、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。生じたＡｎｇ−２被覆ビーズをＰＢＳＴ（ＰＢＳと０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗った後、選択手順に供した。
【０３８２】
Ｂ．Ａｎｇ−２被覆ビーズを用いた選択
約１０００倍ライブラリー当量ファージミド（上記２Ｃ項より）を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ  １ｍｌで１時間遮断した。遮断したファージミド試料を、ブランクビーズ（３Ａ項と同じビーズであるがＡｎｇ−２タンパク質で被覆していない）に加えることによって３つの陰性選択段階に供し、この混合物を回転させながら室温で１５分間インキュベートした。磁石を使用してファージミドを含む上清を抜き取り、ブランクビーズ（上記３Ａ項で述べたと同じビーズであるがＡｎｇ−２タンパク質で被覆していない）を含む第二の試験管に移して、この混合物を回転させながら室温で１５分間インキュベートした。
【０３８３】
この手順を反復した。磁石を使用してファージミドを含む上清を抜き取り、Ａｎｇ−２タンパク質被覆ビーズ（上記３Ａ項より）を含む新しい試験管に移して、その混合物を回転させながら室温で１時間インキュベートした。上清を廃棄した後、ファージミド結合ビーズを、２％乳−ＰＢＳで１０回；２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０回；ＰＢＳＴで１０回及びＰＢＳで２回洗った。次にファージミドを、回転装置上で１０分間、１００ｍＭトリエチルアミン溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１ｍｌ中に溶出させた。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．５ｍｌを加えてファージミド含有溶液のｐＨを中和した。生じたファージミドを使用して、新鮮増殖ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細菌（約０．５のＯＤ６００）１０ｍｌに、３７℃で振とうせずに３０分間及び緩やかに振とうしながら３０分間感染させた。その後、すべての感染ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細胞を１５×１５ｃｍの２×ＹＴＡＧ平板に塗布し、３０℃で一晩インキュベートした。
【０３８４】
Ｃ．ファージの誘導と採集
２×ＹＴＡＧＴ培地の１０ｍｌアリコートを平板（３Ｂ項より）に加えてＸＬ１−ＢＬＵＥ  ＭＲＦ’細胞を再懸濁した。すべてのＸＬ１−ＢＬＵＥ  ＭＲＦ’細胞を試験管に収集し、これらの細胞の２５０μｌアリコートを２×ＹＴＡＧＴ  ２５ｍｌに加えて、ＯＤ６００＝０．５になるまで３７℃で増殖させた。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを加えて３×１０９ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度にして、３７℃で振とうせずに３０分間及び緩やかに振とうしながら３０分間インキュベートした。細胞を４℃で１０分間、５０００ｒｐｍで遠心分離し、２×ＹＴＡＫ  ２５ｍｌに再懸濁した。振とうしながら３０℃で一晩細菌を増殖させた。誘導したファージミドを採集し、２Ｃ項におけるように精製した。
【０３８５】
Ｄ．２回目の選択
２回目の選択は、次の点を除いて３Ｂ−３Ｃ項で概説したように実施した。３Ｃ項から生じた約１００倍ライブラリー当量ファージミドを投入ファージミドとして使用した。Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎへのビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質（３Ａ項）被覆の量を２０ｎｇに低下した。次に、ファージミド結合ビーズを２％乳−ＰＢＳで１０回；２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０回；ＰＢＳＴで１０回洗い、最終洗浄はＰＢＳＴ中室温で６０分間のインキュベーションを含んだ。そのビーズをＰＢＳで２回洗った。溶出条件は１回目（３Ｂ項）と同じであった。
【０３８６】
Ｅ．３回目の選択
３回目の選択は、次の点を除いて３Ｂ−３Ｃ項で概説したように実施した。３Ｄ項から生じた約１０倍ライブラリー当量のファージミドを投入ファージミドとして使用した。約２ｎｇのビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質（３Ａ項）を使用してＤｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを被覆した。ファージミド結合ビーズを２％乳−ＰＢＳで１０回；２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０回；ＰＢＳＴで１０回洗い、最終洗浄はＰＢＳＴ中室温で６０分間のインキュベーションを含んだ。そのビーズをＰＢＳで２回洗った。溶出条件は１回目（３Ｂ項）と同じであった。
【０３８７】
Ｆ．４回目の選択
４回目の選択は、次の点を除いて３Ｂ−３Ｃ項で概説したように実施した。３Ｅ項から生じたライブラリー当量ファージミドを投入ファージミドとして使用した。Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎへのビオチニル化Ａｎｇ−２タンパク質（３Ａ項）被覆の量を、ライブラリー２５、２６及び２７については０．４ｎｇに低下した。ライブラリー２０及び９４については、被覆量は３回目の２ｎｇのままに維持した。ライブラリー９９は、４回目の選択段階では実施しなかった。溶出条件は１回目（３Ｂ項）と同じであった。
【０３８８】
４．クローン分析
Ａ．マスター平板の調製
２回目の選択からの単一コロニーを採取し、各ウエルにつき１２０μｌの２×ＹＴＡＧＴを含む９６穴平板に接種した。９６穴平板を３０℃の振とう機で一晩インキュベートした。６０％グリセロール  ４０μｌを各々のウエルに加えて−８０℃で保存した。
【０３８９】
Ｂ．ファージミドＥＬＩＳＡ
マスター平板（上記４Ａ項）からの細胞の約２μｌアリコートを、２×ＹＴＡＧＴ  １００μｌ／穴を含む新鮮Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６穴平板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，カタログ番号９７９４）に接種し、この新しい平板の細胞を、およそＯＤ６００＝０．５になるまで３７℃で増殖させた。
【０３９０】
Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（１．５×１０１３ｃｆｕ／ｍｌ）を含む２×ＹＴＡＧＴ  ４０μｌを各々のウエルに加え、９６穴平板を３７℃で振とうせずに３０分間及び緩やかに振とうしながらさらに３０分間インキュベートした。平板を４℃で１０分間、２０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣＳ−６Ｒ卓上用遠心分離機）。ウエルから上清を除去し、各々の細胞ペレットを、２×ＹＴＡＫ  １５０μｌｌ／穴を用いて再懸濁した。ファージミド発現のために平板を３０℃で一晩インキュベートした。
【０３９１】
ヒトＡｎｇ−２タンパク質を、１×ＰＢＳ中４℃で一晩、１μｇ／ｍｌで９６穴Ｍａｘｉｓｏｒｐ平板（ＮＵＮＣ）上に被覆した。対照として、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を別のＭａｘｉｓｏｒｐ平板に被覆した。その翌日、細胞培養を４℃で１０分間、２０００ｒｐｍで遠心分離した。各々のウエルからの上清１０μｌを、ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を含む新しい９６穴平板に移して、上清を１：１０に希釈した。生じた混合物を振とうしながら室温で１時間インキュベートしてファージミドを遮断した。一方、Ａｎｇ−２タンパク質被覆平板は、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液／穴  ４００μｌで、振とうしながら室温で１時間遮断した。ＢＳＡ溶液を廃棄し、各ウエルをＰＢＳ溶液で３回洗った。最後の洗浄段階後、遮断したファージミド溶液１００μｌを、Ａｎｇ−２タンパク質被覆平板ならびに対照平板の各々のウエルに加え、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。液体を廃棄し、各ウエルをＰＢＳＴ溶液で３回洗った。１５，０００希釈のＨＲＰ複合抗Ｍ１３ｍＡｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）１００μｌを、Ａｎｇ−２タンパク質被覆及び対照平板の各々のウエルに加え、これらの平板を振とうしながら室温で１時間インキュベートした。再び液体を廃棄し、各ウエルをＰＢＳＴ溶液で３回洗った。ＬｕｍｉＧＬＯ化学発光基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）１００μｌをウエルに加え、各々のウエルをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＤＬＲｅａｒｌｙ機器（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で読み取った。
【０３９２】
Ｃ．ファージクローンの塩基配列決定
マスター平板（４Ａ項）の各々のウエルからの細菌１μｌを鋳型として使用してＰＣＲ反応を実施した。各ＰＣＲ混合物の容量は、１×ＰＣＲ緩衝液、２個のプライマー：
５’−ＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣ−３’（配列番号２５６）及び
５’−ＧＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＧ−３’（配列番号２５７）
の各々３００ｎＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２及びｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む５０μｌであった。ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して次のプログラムを実施した：９４℃を５分間；（９４℃を４５秒間、５５℃を４５秒間、７２℃を９０秒間）×４０サイクル；７２℃を１０分間；４℃に冷却。ＰＣＲ産物を、製造者の指示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  ９６  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）で精製した。すべての精製ＰＣＲ産物を、製造者の指示に従ってＡＢＩ３７７０  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、プライマー  ５’−ＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧ−３’（配列番号２５８）で塩基配列決定した。
【０３９３】
５．配列の順位
ヌクレオチド配列から翻訳されたペプチド配列（上記４Ｃ項）をＥＬＩＳＡデータに相関付けた。Ａｎｇ−２被覆ウエルにおいて高いＯＤ読取り値を示し、ＢＳＡ被覆ウエルでは低いＯＤ読取り値を示すクローンをより重要とみなした。何度も出現する配列も重要とみなした。ライブラリー２０からの２４ペプチド配列、ライブラリー９４からの２６ペプチド配列、ライブラリー２５からの７ペプチド配列、ライブラリー２６からの１８ペプチド配列、ライブラリー２７からの６ペプチド配列、及びライブラリー９９からの４ペプチド配列を、さらなる分析とペプチ体生成のために選択した。さらに、ライブラリー２０及び９４からの１１コンセンサス配列、ライブラリー２６及び９９からの３コンセンサス配列、及びライブラリー２５からの２コンセンサス配列を推論し、ペプチ体を生成するために使用した。表７中のペプチ体は、本文中実施例１０で述べた中和ＥＬＩＳＡプロトコールを用いて評価した。その結果を下記の表７に示す。
【０３９４】
【表１３】
2010189394.tif 000053
2010189394.tif 000054
2010189394.tif 000055
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【実施例９】
【０３９５】
Ａｎｇ−２ペプチ体の６つの試料を、ｈｕＡｎｇ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＢＮＯ１２１０３Ａ）へのそれらの結合活性に関してＢＩＡコアで試験した。プロテインＧを標準アミンカップリングプロトコール（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）に従ってＣＭ５チップに固定し、次にペプチ体を捕獲のためにプロテインＧ表面上に注入した（ＲＬ〜１００Ｒｕ）。ｈＡｎｇ−２と捕獲したペプチ体の間の結合を調べるために、０．３ｎＭ−４０ｎＭのｈｕＡｎｇ−２を捕獲ペプチ体表面に注入し、結合センサーグラムをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて解析した。表８はこの実験の結果をまとめたものである。
【０３９６】
【表１４】
2010189394.tif 000062
【実施例１０】
【０３９７】
中和ＥＬＩＳＡ
ヒト、マウス、イヌ及びラットＡｎｇ−２、及びヒト及びマウスＡｎｇ−１順化培地を次のようにＤＭＥＭ／５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中で希釈した：ｈＡｎｇ−２―１：６４希釈；ｍＡｎｇ−２―１：６４希釈；ラットＡｎｇ−２―希釈せず；サルＡｎｇ−２―１：３２希釈；ｈＡｎｇ−１―１：４希釈；及びｍＡｎｇ−１―１：４希釈。
【０３９８】
これらの順化培地の各々を希釈する度合は、最大達成可能結合（すなわちプラトー）の５０％で１ｎＭ  ｈＴｉｅ−２−Ｆｃに結合する能力（Ｔｉｅ−２部分が分子の可溶性細胞外部分だけを含むＴｉｅ−２−Ｆｃ分子として提供される；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３１３−ＴＩ）によって決定した。マイクロタイタープレートを希釈順化培地１００μｌで被覆した。Ａｎｇ−２中和ＥＬＩＳＡのために、候補抗Ａｎｇ−２ペプチ体を、約１％ＢＳＡ及び約１ｎＭ  Ｔｉｅ−２（Ｔｉｅ−２部分が分子の可溶性細胞外部分だけを含むＴｉｅ−２−Ｆｃ分子として提供される；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３１３−ＴＩ）を含むＰＢＳの溶液中４倍希釈で６２．５ｎＭから０．０１５ｐＭまで滴定した。Ａｎｇ−１中和ＥＬＩＳＡのために、候補抗Ａｎｇ−２ペプチ体を、約１％ＢＳＡ及び約１ｎＭ  Ｔｉｅ−２（Ｔｉｅ−２部分が分子の可溶性細胞外部分だけを含むＴｉｅ−２−Ｆｃ分子として提供される；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３１３−ＴＩ）を含むＰＢＳの溶液中４倍希釈で１０００ｎＭから０．２ｐＭまで滴定した。
【０３９９】
約１００μｌのペプチ体／Ｔｉｅ−２溶液を各々のウエルに加えた後、プレートを室温で一晩インキュベートし、その後約０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で５回洗った。洗浄後、約１００μｌ／穴の抗Ｔｉｅ−２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｉｎｃ．，カタログ番号５５７０３９）を加えて約１μｇ／ｍｌの最終濃度にし、プレートを室温で約１時間インキュベートした。次に、約１００μｌ／穴のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，カタログ番号３１４３２）を、約１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１：１０，０００の希釈で加えた。
【０４００】
プレートを室温で約１時間インキュベートした後、約０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでプレートを５回洗った。次に約１００μｌ／穴のＴＭＢ基質（ＳＩＧＭＡ，カタログ番号Ｔ８６６５）を加えて、青色を発現させた。その後分光光度計において３７０ｎｍで吸光度を読み取った。その結果を下記の表９に示す。
【０４０１】
【表１５】
2010189394.tif 000063
【実施例１１】
【０４０２】
ＰＫ試験
試験計画
体重２０ｇから３０ｇの雄性ＣＤ−１マウスを各々のペプチ体処置群（２×Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及びＬ１−２１−Ｎ）に無作為に分けた。動物に、単回ＩＶボーラス（ｎ＝３８／群）又は５０μｇペプチ体の単回ＳＣ投与（ｎ＝３４／群）を実施した。注射は、ＩＶ及びＳＣ投与に関してそれぞれ尾静脈を通して及び肩の皮膚下に行った。
【０４０３】
血液採取及び分析方法
各々の抗Ａｎｇ−２ペプチ体濃度測定のために、投与前、及びＳＣ及びＩＶ群については投与後１、２、４、８、１６、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、２１６、２６４、３１２及び３３６時間目に血液試料を採集した。ＩＶ群についてはさらなる試料を投与の５分後及び３０分後に採集した。各時点で２匹の動物から採血し、採血後動物を犠牲剖検した。血液（約０．５０ｍＬ）は、心臓穿刺からポリプロピレンｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）血清分離管に収集した。試料を、約２０分間若しくは血餅形成が起こるまで氷上に保持した。血清を２℃から８℃で約１０分間の遠心分離によって血液試料から分離し、検定時まで約−７０℃で保存した。試料を、定量下限（ＬＬＯＱ）１００ｎｇ／ｍｌの検定済み時間分解蛍光（ＴＲＦ）アッセイを用いて測定した。ＮＵＮＣフルオロＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートを組換えマウスＡｎｇ−２タンパク質で被覆した。次に非特異的結合を低下させるためにプレートをタンパク質溶液で遮断した。標準、品質管理及び未知試料を１０％マウス血清アッセイ緩衝液中で調製し、マイクロタイタープレートのウエルにピペットで分配した。ペプチ体を固定Ａｎｇ−２に特異的に結合させた。非結合物質を洗い流した後（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）モノクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）をウエルに加えた。非結合ビオチニル化モノクローナル抗体を除去するための洗浄段階後、ユーロピウム標識ストレプトアビジンをウエルに加えた。非結合ストレプトアビジンユーロピウムを洗浄除去した後、酸性溶液を各々のウエルにピペットで加えて、結合ユーロピウムをストレプトアビジンから遊離させた。蛍光シグナルを生じさせ、Ｗａｌｌａｃ蛍光光度リーダーで読み取った。マウス血清中の抗Ａｎｇ−２ペプチ体の分析についての検定範囲は０．０７８μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬであった。
【０４０４】
薬物動態分析
各々の群についての統合平均濃度−時間データを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（バージョン３．３、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて非コンパートメント解析に供した。試料は名目時間の１０％以内に採集したので、ＰＫ解析には名目試料採取時間を使用した。ＰＫ解析前にＬＬＯＱ未満のすべての濃度値をゼロに設定した。次のＰＫパラメータを評価した：
・最終半減期（ｔ１／２）は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｅｌであった［式中、ｋｅｌは最終対数線形減衰期の線形回帰によって評価した一次最終速度定数である］。
・血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ（０−ｌａｓｔ））を、０時から最後まで、すなわち最後の定量可能濃度（Ｃｌａｓｔ）の時点まで線形／対数台形法を用いて評価した。
・０から無限大までの曲線下面積（ＡＵＣ（０−∞））を、対応する（ＡＵＣ（０−ｌａｓｔ））と推定Ｃｌａｓｔ／ｋｅｌ値の合計として評価した：
【０４０５】
【数１】
2010189394.tif 000064
【０４０６】
ＳＣ投与後の絶対生体利用効率（Ｆ）を：
【０４０７】
【数２】
2010189394.tif 000065
として算定した。
【０４０８】
その結果を図２に示す。
【実施例１２】
【０４０９】
試験０日目に、雌性ヌードマウスに１×１０７Ａ４３１細胞を皮下注射した。３日目に、Ａｎｇ−２ペプチ体２×Ｃｏｎ４−Ｃを２００μｇ／マウス／日の用量で皮下投与した。図に示すような規則的間隔で腫瘍容積と体重を記録した。Ａｎｇ−２ペプチ体処置群対ビヒクル対照及び対照ペプチ体の間で腫瘍増殖に有意差が認められた（Ｓｃｈｅｆｆｅのポストホック検定と反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ＜０．０００１ｖｓ各々の対照）。このペプチ体による処置は体重に有意の影響を及ぼさなかった。その結果を図３に示す。
【実施例１３】
【０４１０】
Ａ４３１インビトロ増殖曲線
Ａ４３１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したＤＭＥＭ  ２００μｌ中、２０００細胞／ウエルで９６穴組織培養平板に接種した。接種の１６時間後に培地を吸引した。その後次のものをウエルに戻し加え、３組作製した：１００μｌ／ウエルのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１ｍｇ／ｍｌの陰性対照ペプチ体４８８３又はペプチ体ＴＮ８−Ｃｏｎ４。同じ設定を５平板に関して反復した。１つの平板からの培地を処置後２４、４８、７２、９６及び１２０時間目に吸引した。１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を平板あたり１００μｌ加え、平板を４℃で保存した。最後の平板が少なくとも４時間１０％ＴＣＡ中にあったときすべての平板を収集した。１０％ＴＣＡを振とうして、ウエルを水道水で５回洗浄した。次に細胞を、室温で１０分間、１％酢酸（Ｓｉｇｍａ  Ａ−６２８３）中０．４％スルホローダミンＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ−９０１２）１００μｌで染色し、１％酢酸で５回洗った。その後平板を空気乾燥した。前記染料を、回転振とう機上で２時間、２０ｍＭ非緩衝Ｔｒｉｓ（ｐＨ＞１０）３００μｌで可溶化した。光学密度（ＯＤ）をマイクロタイタープレートリーダーにおいて５４０ｎｍで読み取った。その結果を図４に示す。
【実施例１４】
【０４１１】
試験０日目に、雌性ヌードマウスに２×１０６Ｃｏｌｏ−２０５細胞プラスＭａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下注射した。３日目に、Ａｎｇ−２ペプチ体Ｌ１−７−Ｎ、Ｌ１−２１−Ｎ、Ｃｏｎ４−Ｃ及び２×Ｃｏｎ４−Ｃを１４μｇ／マウスの用量で週に２回皮下投与した。抗Ａｎｇ−２抗体Ａｂ５３６、４７μｇ／マウスを陽性対照として週に３回投与した。規則的間隔で腫瘍容積と体重を記録した。
【０４１２】
Ａｎｇ−２ペプチ体処置群対ビヒクル対照及び対照ペプチ体の各々１つの間で腫瘍増殖に有意差が認められた（Ｓｃｈｅｆｆｅのポストホック検定と反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ＜０．０００１ｖｓ各々の対照）。これらのペプチ体による処置は体重に有意の影響を及ぼさなかった（結果は示していない）。それらの結果を図５に示す。
【実施例１５】
【０４１３】
試験０日目に、雌性ヌードマウスに２×１０６Ｃｏｌｏ−２０５細胞プラスＭａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下注射した。３日目に、Ａｎｇ−２ペプチ体２×Ｃｏｎ４−Ｃを１４、２．８及び０．５６μｇ／マウスの用量で週に２回皮下投与した。図に示すような規則的間隔で腫瘍容積と体重を記録した。２つのより高い用量のＡｎｇ−２ペプチ体処置群対ビヒクル対照及び対照ペプチ体の間で腫瘍増殖に有意差が認められた（Ｓｃｈｅｆｆｅのポストホック検定と反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、中間用量についてはｐ＝０．００３及び高用量についてはｐ＜０．０００１）。これらのペプチ体による処置は体重に有意の影響を及ぼさなかった。破線は、１匹のマウスの原因不明の死亡により、群の総数が１０匹から９匹のマウスに減少したことを表わす。それらの結果を図６に示す。
【実施例１６】
【０４１４】
抗Ａｎｇ−２ペプチ体対Ｃｏｌｏ−２０５異種移植片腫瘍
試験０日目に、雌性ヌードマウスに２×１０６Ｃｏｌｏ−２０５細胞プラスＭａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下注射した。３日目に、Ａｎｇ−２ペプチ体２×Ｃｏｎ４−Ｃ又は対照ペプチ体を３５０μｇ／日の用量で週に２回皮下投与した。対照ペプチ体（表５に示すような）で処置した群からの腫瘍を１４日目（サイズ対合対照）又は１８日目（時間対合対照）に採取した。２×Ｃｏｎ４（Ｃ）からの腫瘍は１８日目に採取した。図に示すような規則的間隔で腫瘍容積と体重を記録した。時間対合対照群と２×Ｃｏｎ４−Ｃ処置群の間で腫瘍増殖に有意差が認められた（Ｓｃｈｅｆｆｅのポストホック検定と反復測定ＡＮＯＶＡにより、ｐ＝０．０１５４）。これらのペプチ体による処置は体重に有意の影響を及ぼさなかった。
【０４１５】
画像解析用に調製した腫瘍を冠状面で二等分し、半分をＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に急速凍結（ｓｎａｐ  ｆｒｏｚｅｎ）した。凍結切片を、ＤＡＢを色素原として、抗マウスＣＤ３１（カタログ番号５５３３７０、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を２μｇ／ｍｌで使用して免疫組織化学的に染色した。腫瘍切片を２０Ｘの対物レンズ倍率でデジタル写真撮影した。処置群当り１０の腫瘍に関して、各腫瘍について４つの「コンパスポイント」領域をとらえた。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）画像解析システムを使用して、画像内のＣＤ３１染色血管について閾値を定めた。ＣＤ３１陽性染色の面積を、各々の領域内の総腫瘍組織の比として表わした。その結果を図７に示す。
【実施例１７】
【０４１６】
試験０日目に、雌性ヌードマウスに２×１０６Ｃｏｌｏ−２０５細胞プラスＭａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下注射した。試験３、１０又は１５日目のいずれかに、３５０μｇ／マウス、皮下、週に２回のＡｎｇ−２ペプチ体２×Ｃｏｎ４−Ｃによる処置、又は同等の対照ペプチ体による処置を開始した。規則的間隔で腫瘍容積と体重を記録した。すべてのＡｎｇ−２ペプチ体処置群対ビヒクル対照の間で腫瘍増殖に有意差が認められた（Ｓｃｈｅｆｆｅのポストホック検定と反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、１５日目群についてはｐ＝０．０８９及び３日目及び１０日目群についてはｐ＜０．０００１）。これらのペプチ体による処置は体重に有意の影響を及ぼさなかった。それらの結果を図８に示す（体重は示していない）。
【実施例１８】
【０４１７】
Ａ４３１及びＣｏｌｏ−２０５異種移植片モデルの両方において、週に３回腹腔内投与した４７μｇ／雌性ヌードマウスの抗体Ａｂ５３６、又は種々の長期試験（≧１０週間の投与）における多回投与スケジュールで皮下投与したペプチ体２×Ｃｏｎ４（Ｃ）を使用して、完全応答（ＣＲ）率の要約を得た。ここで用いるＣＲは、処置後測定可能な腫瘍が残存しなかったという結果を意味する。それらの結果を図９に示す。
【実施例１９】
【０４１８】
ａ）Ｃｏｌｏ−２０５腫瘍モデルにおけるペプチ体とタキソテールの併用
試験０日目に、雌性ヌードマウスに２×１０６Ｃｏｌｏ−２０５細胞プラスＭａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下注射した。試験１４日目に、ａ）３５０μｇ／マウス、皮下、週に２回のＡｎｇ−２ペプチ体２×Ｃｏｎ４−Ｃ、ｂ）２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、週に３回のタキソテール、又はｃ）両方の併用による処置を開始した。規則的間隔で腫瘍容積と体重を記録した。すべての処置群対ビヒクル対照の間で腫瘍増殖に有意差が認められた（Ｓｃｈｅｆｆｅのポストホック検定と反復測定ＡＮＯＶＡを使用してｐ＜０．０００１）。さらに、併用治療群は単独療法のどちらの群とも有意の差があった（ｐ＜０．０００１ｖｓ２×Ｃｏｎ４−Ｃ及びｐ＝０．０１２２ｖｓタキソテール）。破線は、１匹のマウスの原因不明の死亡により、群の総数が１０匹から９匹のマウスに減少したことを表わす。これらのペプチ体による処置は体重に有意の影響を及ぼさなかった。それらの結果を図１０ａに示す。
【０４１９】
ｂ）Ｃｏｌｏ−２０５腫瘍モデルにおけるペプチ体と５−ＦＵの併用
試験０日目に、雌性ヌードマウスに２×１０６Ｃｏｌｏ−２０５細胞プラスＭａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下注射した。試験１４日目に、ａ）３５０μｇ／マウス、皮下、週に２回のＡｎｇ−２ペプチ体２×Ｃｏｎ４−Ｃ、ｂ）５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内１日１回を５日間の５−ＦＵ、又はｃ）両方の併用による処置を開始した。図に示すような規則的間隔で腫瘍容積と体重を記録した。
【０４２０】
すべての処置群対ビヒクル対照の間で腫瘍増殖に有意差が認められた（Ｓｃｈｅｆｆｅのポストホック検定と反復測定ＡＮＯＶＡを使用してｐ＜０．０００１）。さらに、併用治療群は単独療法のどちらの群とも有意の差があった（ｐ＝０．０３７５ｖｓ２×Ｃｏｎ４−Ｃ及びｐ＝０．０４５３ｖｓ５−ＦＵ）。５−ＦＵ処置群（試験２０日目で１８％）ならびに併用療法群（試験２０日目で１６％）において一過性の体重減少が認められたが、その後体重は完全に回復した。それらの結果を図１０ｂに示す。
【実施例２０】
【０４２１】
アジュバント関節炎モデル
雄性ルイスラット（１２０ｇから１３０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、１２時間の明暗周期で環境制御室（温度２３±２℃、相対湿度５０±２０％）内のフィルターキャップケージに２匹ずつ収容した。動物には市販のげっ歯類飼料（Ｆｏｍｕｌａｔｉｏｎ  ８６４０；Ｔｅｋ  Ｌａｂ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を与え、フィルター精製した水道水を自由に摂取させた。食餌のカルシウム及びリン含量はそれぞれ１．２％と１．０％であった。
【０４２２】
パラフィン油０．０５ｍＬ（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ）に懸濁した熱死滅ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）の単回０．５ｍｇ注射を尾の基部に経皮的に実施して、アジュバント関節炎を誘発した。関節炎の臨床的発症は、後足の腫脹と歩行困難によって示されたように９日目であった。２×Ｃｏｎ４（Ｃ）処置群（免疫後１日目から処置した）を除いて、免疫後９日目（関節炎の発症前）から、毎日の皮下注射として処置を開始し、１８日目まで継続した。
【０４２３】
アジュバント関節炎の臨床的モニタリング
Ｆｅｉｇｅら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５７：１４５７−１４７０（２０００）が述べた方法に従って水プレチスモグラフィーを使用する後足容積の間欠的測定によって炎症の進行を臨床的に評価した。式：
［１−｛（処置ＡｄＡ）−正常｝／（未処置ＡｄＡ−正常）］］×１００
に従って台形規則を用いて、曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて足の炎症の抑制を算定した。
【０４２４】
さらに、この関節炎モデルでは体重減少が関節炎症の進行と並行することが示されているので、補足的エンドポイントとして９日間の治療プログラム中毎日、総体重を測定した。１８日目にＣＯ２下で動物を犠牲死亡させた。
【０４２５】
骨無機質密度（ＢＭＤ）の損失を剖検で検査した（免疫後１８日目）。後足を柔皮線（足根関節（踵関節）のすぐ近く）で切除し、７０％エタノールに浸して、その後ファンビームＸ線デンシトメータ（ＱＤＲ−４５００Ａ型；Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して水平方向に走査した。Ｆｅｉｇｅら、前出参照。走査後、分析する部位を描写するために踵足を中心とする長方形の箱（２９×２５ｍｍ）を位置づけ、特許アルゴリズム（Ｈｏｌｏｇｉｃソフトウエア）で骨面積、骨無機質含量及び骨無機質密度を算定した。
【０４２６】
すべての結果を平均±標準誤差で表わした。群間の有意差を表わすのに０．０５のｐ値を使用した。臨床データ（連続変数）に関して、市販の統計ソフトウエア（Ｓｔａｔｓｏｆｔ  ｖ３．０；Ｓｔａｔｓｏｆｔ，Ｔｕｌｓａ，ＯＫ）を使用してクラスカル−ウォリスＡＮＯＶＡ及びマン−ホイットニーＵ検定を実施した。
【０４２７】
結果をそれぞれ図１１ａ、１１ｂ及び１１ｃに示す。
【実施例２１】
【０４２８】
角膜血管新生モデル
ラットにおけるＶＥＧＦ誘導血管新生へのＣＯＮ４（Ｃ）の作用
Ａｎｇ−２ペプチ体ＣＯＮ４（Ｃ）をラットにおける血管新生の角膜モデルで評価した。ＶＥＧＦ（又はＢＳＡ対照）に浸したナイロンディスクを角膜支質に移植することによって血管新生を誘導した（ｎ＝８／群）。ペプチ体ＴＮ８ＣＯＮ４−Ｃを１．０又は０．１ｍｇ／ラット／日の用量の皮下注射によって７日間投与した。他の２つの群の動物は、同じ用量の陰性対照ペプチ体４８８３で処置した。すべての群を、１．０又は０．１ｍｇの維持用量の３倍である３．０又は０．３ｍｇの単回負荷用量で前処置した（図参照）。７日間の処置後、２つの血管エンドポイントをラット角膜の各々のデジタル画像から判定した：ディスクと角膜縁の間の中間点を横切る血管の数、及び血管面積。ＴＮ８ＣＯＮ４−Ｃによる処置はＶＥＧＦ誘導の血管新生を用量依存的に有意に阻止したが（ｐ＜０．０４）、対照ペプチ体による処置はどちらのエンドポイントにも有意の作用を及ぼさなかった。処置動物の体重に基づく明らかな毒性の証拠は存在しなかった。結果を図１２に示す。
【実施例２２】
【０４２９】
エピトープマッピング
完全長（アミノ酸１−４９５）、Ｎ末端（アミノ酸１−２５４）及びＣ末端（アミノ酸２５５−４９５）ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）タンパク質を、Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するＣＭＶ−推進哺乳類発現ベクターにクローニングした。生じた３つの構築物プラスベクター対照を２９３Ｔ細胞に一過性発現させた。次に順化培地をトランスフェクト細胞から収集し、培地中のＡｎｇ−２の発現レベルを抗６ｘＨｉｓ  ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット法によって評価した。
【０４３０】
抗Ａｎｇ−２抗体及びペプチ体の結合エピトープを、次のプロトコールに従ったＥＬＩＳＡにより、ヒトｈＡｎｇ−２の３つのバージョンに結合する能力によって判定した：高結合９６穴アッセイ平板をウエル当り１００μｌの順化培地で被覆し、３７℃で１時間インキュベートした。順化培地を吸引し、平板を、ウエル当り２００μｌのＰＢＳ中５％ＢＳＡにより室温で１時間遮断した。その後遮断溶液を吸引した。ウエル当り１００μｌの抗体、ペプチ体又はＴｉｅ２−ＦｃをＰＢＳ中１％ＢＳＡに１μｇ／ｍｌで加え、室温で１時間インキュベートした。ウエルをＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２００μｌで４回洗った。ウエル当り１００μｌのＨＲＰ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ又はヤギ抗マウスＩｇＧを加え、室温で４５分間インキュベートした。その後ウエルをＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２００μｌで４回洗った。ウエル当り１００μｌのＴＭＢ基質を加えた。Ｏ．Ｄ．を３７０ｎｍで読み取った。
【０４３１】
結果をそれぞれ図１３ａ、１３ｂ及び１３ｃに示す。
【実施例２３】
【０４３２】
ＢｉａＣｏｒｅアッセイに固有のある種の感受性限界の故に、結合親和性をＳｅｐｉｄｙｎｅ  ＫｉｎＥｘＡアッセイによっても評価した。
【０４３３】
ｈｕＡｎｇ−２への２×ＣＯＮ４−Ｃ（Ｐｂ５７１４）の結合をＫｉｎＥｘＡ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）で試験した。Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ  ６ｘビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）をｈｕＡｎｇ−２で前被覆し、ＢＳＡで遮断した。１０ｐＭ及び３０ｐＭの２×ＣＯＮ４−Ｃ試料を様々な濃度のｈｕＡｎｇ−２（０．３ｐＭ−３ｎＭ）と共に室温で８時間インキュベートした後、ｈｕＡｎｇ−２被覆ビーズを通過させた。ビーズ結合ペプチ体の量を蛍光（Ｃｙ５）標識ヤギ抗ヒト−Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）によって定量した。結合シグナルは、平衡での遊離ペプチ体の濃度に比例する。
【０４３４】
解離平衡定数（ＫＤ）を、二重曲線一部位均一結合モデル（ＫｉｎＥｘ（商標）ソフトウエア）を用いた競合曲線の非線形回帰から得た。次にＫＤを、ｈｕＡｎｇ−２との２×ＣＯＮ４−Ｃ結合に関して約２ｐＭと決定した。
【０４３５】
図１４に示すように、ＫｉｎＥｘＡアッセイを使用して、ペプチ体２×Ｃｏｎ４はｈＡｎｇ−２に対して〜２ｐＭの親和性を有することが示された。
【実施例２４】
【０４３６】
ペグ化ペプチド
Ｌｉ−１７ペプチドを、標準カップリングプロトコール及び、Ｎ末端からＣ末端へ番号付けて、残基１４（ｍｅｔ）からＮ末端残基１（Ｃｙｓ）までの二重カップリングを用いて４３１  ＡＢＩシンセサイザーで合成した。
【０４３７】
「ｍＰＥＧ５Ｋ−（Ｌ１−７ペプチド）」と称される、Ｌ１−７ペプチドとメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−マレイミド；分子量：５ＤＫａの複合物
緩衝液１（２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）４００μｌ中のＬ１−７ペプチド０．８ｍｇの溶液を、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−マレイミド（分子量：５ＫＤａ；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）１３．５ｍｇ；緩衝液１中５０．０ｍｇ／ｍＬの溶液０．２７ｍｌで処理した。反応混合物を４℃で一晩インキュベートし、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸塩、ｐＨ７．２）１．６ｍＬで希釈して、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（３５００ＭＷＣＯ，Ｐｉｅｒｃｅ）において同じ緩衝液に対して透析した。透析した反応混合物を１．０ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）でイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。生成物ピークを、４０カラム容量で１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ）までの勾配によって２つの１．０ｍＬ分画中に溶出した。併合生成物分画を、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  １Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で０．２３ｍｇタンパク質／ｍＬを含む２５０μｌに濃縮した。
【０４３８】
「ＰＥＯ４（Ｌ１−７ペプチド）２」と称される、Ｌ１−７ペプチドと１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコールの複合物
緩衝液１（２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）５００μＬ中のＬ１−７ペプチド１．０ｍｇの溶液を、１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール（Ｐｉｅｒｃｅ）０．０３７５ｍｇ（緩衝液１中０．１ｍｇ／ｍＬの溶液０．３７５ｍＬ）で処理した。反応混合物を４℃で３．３３時間インキュベートし、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（３５００ＭＷＣＯ，Ｐｉｅｒｃｅ）において緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸塩、ｐＨ７．２）に対して透析した。透析した反応混合物を１．０ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）でイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。二量体生成物ピークを、４０カラム容量で１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ）までの勾配によって３つの１．０ｍＬ分画中に溶出した。併合生成物分画を、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  １Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で０．１２ｍｇタンパク質／ｍＬを含む５５０μＬに濃縮した。
【０４３９】
「ＰＥＧ３．４Ｋ（Ｌ１−７ペプチド）２」と称される、Ｌ１−７ペプチドとポリ（エチレングリコール）−ビス−マレイミド；分子量：３．４ＤＫａの複合物
緩衝液１（２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）１．５ｍＬ中のＬ１−７ペプチド３．０ｍｇの溶液を、ポリ（エチレングリコール）−ビス−マレイミド（分子量＝３．４ＫＤａ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）１．１２５ｍｇ；緩衝液１中２．０ｍｇ／ｍＬの溶液０．５６３ｍＬで処理した。反応混合物を４℃で一晩インキュベートし、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（３５００ＭＷＣＯ，Ｐｉｅｒｃｅ）において緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸塩、ｐＨ７．２）に対して透析した。透析した反応混合物を５．０ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）でイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。生成物ピークを、４０カラム容量で１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ）までの勾配によって３つの３．０ｍＬ分画中に溶出した。併合生成物分画を、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  １Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で０．２４ｍｇタンパク質／ｍＬを含む８５０μｌに濃縮した。
【０４４０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果は次の通りであった：
【０４４１】
【表１６】
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ＰＥＧ３．４Ｋ（Ｌ１−７ペプチド）及びＰＥＯ４（Ｌ１−７ペプチド）についての下付き文字「２」は、ポリマー鎖に付き２個のペプチドが存在し、ポリマーの各々の末端に１個が位置することを示すことは認識される。
【０４４２】
ＩＣ５０測定
Ｌ１−７遊離及びペグ化ペプチドについてのｈＡｎｇ−２：ｈＴｉｅ２−Ｆｃ相互作用の阻害に関するＩＣ５０を実施例２で述べたような中和ＥＬＩＳＡによって測定した。中和ＥＬＩＳＡのために、ヒトＡｎｇ−２ポリペプチドが結合したマイクロタイタープレートを、アフィニティーＥＬＩＳＡに関して実施例２で述べたように調製した。候補抗Ａｎｇ−２  Ｌ１−７ペグ化及び遊離ペプチドペプチ体を、約１％ＢＳＡ及び約１ｎＭ  Ｔｉｅ−２（Ｔｉｅ−２部分が分子の可溶性細胞外部分だけを含むＴｉｅ−２−Ｆｃ分子として提供される；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３１３−ＴＩ）を含むＰＢＳの溶液中４倍希釈で１０００ｎＭから０．２ｐＭまで滴定した。約１００μｌの抗体／Ｔｉｅ−２溶液を各々のウエルに加えた後、プレートを室温で一晩インキュベートし、その後約０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で５回洗った。洗浄後、約１００μｌ／穴の抗Ｔｉｅ−２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｉｎｃ．，カタログ番号５５７０３９）を加えて約１μｇ／ｍｌの最終濃度にし、プレートを室温で約１時間インキュベートした。次に、約１００μｌ／穴のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，カタログ番号３１４３２）を、約１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１：１０，０００の希釈で加えた。プレートを室温で約１時間インキュベートした後、約０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでプレートを５回洗った。次に約１００μｌ／穴のＴＭＢ基質（上述）を加えて、呈色させた。その後分光光度計において３７０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０４４３】
Ｌ１−７ペプチド（Ｃ−ＧＧＧＧＧ−ＡＱ−ＴＮＦＭＰＭＤＤＬＥＱＲＬＹＥＱＦＩＬＱＱＧ−ＬＥ）（配列番号３５９）は、ＰＥＧへのカップリングのためのＮ末端システイン及び５Ｇｌｙリンカーを含んだ。ＡＱ及びＬＥ隣接配列が、もとのファージクローン及びペプチ体の両方に存在した。ｈＡｎｇ−２：Ｔｉｅ２阻害のＩＣ５０の結果は次の通りであった：
【０４４４】
【表１７】
2010189394.tif 000067
【図７】
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【図１０Ｂ】
2010189394.tif 000075
【図１２】
2010189394.tif 000076
【図１】
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【図２】
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【図３】
2010189394.tif 000079
【図４】
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【図５】
2010189394.tif 000081
【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2010189394.tif 000085
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１３Ａ】
2010189394.tif 000089
【図１３Ｂ】
2010189394.tif 000090
【図１３Ｃ】
2010189394.tif 000091
【図１４】
2010189394.tif 000092
【配列表】
2010189394000001.app
【外国語明細書】
2010189394000001.pdf