(57)【要約】【課題】  新規な代謝活性化物質の効率的なスクリーニング方法およびそのキットに関する。【解決手段】  ｐ３８サブファミリーの遺伝子発現量および／または活性の変化を検出することにより、代謝活性化剤候補物質を選抜することが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ３８サブファミリーの発現量変化を検出する工程を含むことを特徴とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
請求項１記載の代謝活性化物質のスクリーニング方法であって、発現量変化を検出するｐ３８サブファミリーがｐ３８αであることを特長とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１記載の代謝活性化物質のスクリーニング方法であって、発現量変化を検出するｐ３８サブファミリーがｐ３８αおよび／またはβであることを特長とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の代謝活性化物質のスクリーニング方法であって、加えてＳＩＲＴ１及び／またはＰＧＣ-１の発現量変化を検出する工程を含むことを特長とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の代謝活性化物質のスクリーニング方法であって、加えてＳＩＲＴ１、ＰＧＣ-１、ＰＰＡＲα、ＵＣＰ１の内の少なくとも１つ以上の発現量変化を検出する工程を含むことを特長とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１乃至５記載の少なくとも1つ以上の方法を工程に含むことを特長とする代謝活性化物質のスクリーニングキット。
【請求項７】
請求項１乃至５記載の発現量変化の検出に用いた遺伝子の発現量を変化させて作製することを特長とする試験用モデルマウスの作製方法。
【請求項８】
請求項１乃至５記載の発現量変化の検出に用いたタンパク質の発現量を変化させて作製することを特長とする試験用モデルマウスの作製方法。
【請求項９】
請求項７乃至８のいずれか一項に記載の代謝亢進モデルマウスの作製方法であって、発現量を変化させる遺伝子がｐ３８αであることを特長とする試験用モデルマウスの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満及び糖尿病などの疾患の予防薬または治療薬として有用な代謝活性化剤のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、そのスクリーニング方法により選抜された代謝活性化剤に関する。また、スクリーニングに用いたマーカー遺伝子の発現を抑制することによる遺伝的、生理的、生化学的な解析に適した代謝亢進（肥満耐性）モデルマウスの作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年我が国では、食生活の欧米化に伴い、栄養豊富な食事、例えば動物性蛋白質、動物性脂質、あるいはインスタント食品、ファーストフード等の摂取量が著しく増加している。そのためカロリー摂取量が増加し、過食による栄養過多さらに運動不足等の原因により、肥満が著しく増加しており、今後も増加傾向にあると考えられる。また、肥満が原因となり、糖尿病、高血圧症、心血管障害、高脂血症、動脈硬化などの種々の疾患に罹る危険率も高くなり、先進国の国民の健康を脅かす大きな社会問題となっている。肥満は体質的因子、食餌性因子、精神的因子、中枢性因子、代謝性因子、運動不足等が要因となり、結果的に摂取カロリーが消費カロリーを上回り、脂肪が蓄積して起こるといわれている。
【０００３】
現在、肥満の治療法には、一般的にカロリー制限による食事療法、運動療法、薬物療法、及びその組み合わせがある。また、薬物療法では、マジンドール（mazindol）やペンタミン（phentermine）等のアドレナリン作動薬、フェンフルラミン（fenfluramine）やフルオキセチン（fluoxetine）等のセロトニン作動薬といった食欲抑制剤や、トフィソパム（tofisopam）などのストレスによる過食に奏効する自律神経調整剤の他、リパーゼ阻害剤を有効成分とする抗肥満剤（例えば、特許文献１〜４参照）、脂肪細胞分化抑制剤を有効成分とする抗肥満剤（例えば、特許文献５及び６参照）、3,4-seco-lupane型トリテルペノイドサポニン化合物を有効成分とする抗肥満剤（例えば、特許文献７参照）、ザクロ花の乾燥粉末や抽出物を有効成分とする抗肥満剤（例えば、特許文献８参照）、柑橘類のじょうのう膜を原料とした抗肥満剤（特許文献９参照）等数多く提案されている。
【特許文献１】特開２００６−２２０９５号公報
【特許文献２】特開２００５−２２５８６３号公報
【特許文献３】特開２００５−８５７２号公報
【特許文献４】特開２００２−１７９５８６号公報
【特許文献５】特開２００５−２２００７４号公報
【特許文献６】特開２００４−７５６４０号公報
【特許文献７】特開２００６−２２０９４号公報
【特許文献８】特開２００４−１６１７２１号公報
【特許文献９】特開２００５−４０１０７号公報
【０００４】
また、肥満の発症とともにミトコンドリア関連遺伝子及びタンパク質が減少することが知られており、肥満とミトコンドリアの量的及び質的変化とが関係していることが示唆されている（非特許文献１参照）。さらにはミトコンドリアの形態変化を指標とした抗肥満剤のスクリーニング方法に関する報告もある（特許文献１０参照）。
【非特許文献１】J.Ckin.Invest.,Vol.114,No.9,1281-1289（2004）
【特許文献１０】特開２００２−３０６０２１号公報
【０００５】
しかし最新の研究によって、その発症や悪化には炎症性の分子群が関与していることが明らかになりつつある。ここでいう炎症性の分子群とは、例えばＴＮＦ-αおよびＣＲＰを含む分子群を挙げることができる。
【０００６】
その中の一つであるＭＡＰキナーゼファミリーの分子群は、酵母からヒトまで高度に保存されたものであり、細胞外部からのサイトカイン、ホルモン、ストレスといった多様なシグナルをＭＡＰＫキナーゼ、ＭＡＰＫＫキナーゼを介したリン酸化カスケードによって細胞核に伝達し、遺伝子発現等を介して細胞周期、細胞分化、免疫応答など恒常性に関わる多様な生命活動を制御すると考えられている。
【０００７】
ＭＡＰキナーゼファミリーはERK1/2、ERK5、JNK、そしてｐ３８の四つのグループに分けられ、それぞれについて複数のアイソフォームが存在する。哺乳類においてｐ３８はα、β、γ、δの4種のアイソフォームを持っており、αがオーソログであるとされている。ｐ３８αは現在までの研究により、免疫細胞系において炎症性サイトカインによって活性化されると同時に、炎症性サイトカイン産生そのものをも正に制御することが明らかになっている。また活性酸素、浸透圧、紫外線などの各種ストレスを細胞に加えた際の細胞応答もｐ３８αによって制御されており、耐性の付与やアポトーシスの誘導、細胞老化などを引き起こすとされている。これらの現象は免疫疾患や炎症性疾患、慢性循環器疾患や発ガンなどの病態にも深く関わっており、ｐ３８αの機能とその制御機構の解明には大きな価値があるといえる。しかしながら、これらの知見は主に培養細胞系で得られたものであり、個体レベルでのｐ３８αの機能や制御に関しては未だ不明な点が多い。
【０００８】
ｐ３８αのメタボリックシンドロームへの関与については、ｐ３８αが脂肪細胞の分化に関わるという報告がある（非特許文献２参照）。しかし、用いる培養細胞系によって分化促進と抑制の相反する結果となっており、未だ議論の分かれる状況である。
【非特許文献２】J BiolChem, Vol. 273, Issue 48, 32111-32120, November 27, 1998
【０００９】
そこで我々は個体レベルにおけるｐ３８αの機能を解析するために、発生工学的手法を用いてｐ３８αのノックアウトマウスを独自に作製し、脂肪過多食を与えた場合の表現型の確認を行ったところ、野生株と比較して体重増加が抑制されることを見出した。このｐ３８αノックアウトマウスは、ヘテロ接合体（＋/−）において骨格筋エネルギー代謝の活性化と肥満の抑制を生じ、特定遺伝子の完全破壊ではなく、発現量や活性の部分的抑制によって効果を発揮する。この結果から、培養細胞あるいはマウスのような検体に物質Ａを投与した後、ｐ３８αの遺伝子発現量および／または活性の変化を検出、遺伝子発現量および活性が低下していれば物質Ａが代謝活性化物質としての機能を有している可能性があることが示唆される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ｐ３８サブファミリーの遺伝子発現量および／または活性の変化を検出することにより、代謝活性化剤候補物質を選抜する新規な方法に関する。より詳細には、代謝活性化剤候補群を筋肉細胞あるいは哺乳類などのモデル細胞・動物などに添加あるいは施与して得た試料のｐ３８サブファミリー遺伝子発現および／または活性の抑制量を検出することにより、代謝活性化物質としての機能を有している可能性のある物質を選抜する新規な方法、および代謝活性化物質のスクリーニングキット、それにより得られた新規代謝活性化剤、スクリーニングに用いたマーカー遺伝子の発現を抑制することによる代謝亢進モデルマウスおよびその作製方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、代謝活性化物質を選抜できることを見出し、本発明に達した。すなわち、本発明はＭＡＰキナーゼ（Mitogen-activated Protein Kinase）であるｐ３８サブファミリーの遺伝子発現量変化を検出することにより、代謝活性化物質を選抜する新規な方法に関する。
（項１）ｐ３８サブファミリーの発現量変化を検出する工程を含むことを特徴とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
（項２）項１記載の代謝活性化物質のスクリーニング方法であって、発現量変化を検出するｐ３８サブファミリーがｐ３８αであることを特長とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
（項３）項１記載の代謝活性化物質のスクリーニング方法であって、発現量変化を検出するｐ３８サブファミリーがｐ３８αおよび／またはβであることを特長とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
（項４）項１乃至３のいずれか一項に記載の代謝活性化物質のスクリーニング方法であって、加えてＳＩＲＴ１及び／またはＰＧＣ-１の発現量変化を検出する工程を含むことを特長とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
（項５）項１乃至４のいずれか一項に記載の代謝活性化物質のスクリーニング方法であって、加えてＳＩＲＴ１、ＰＧＣ-１、ＰＰＡＲα、ＵＣＰ１の内の少なくとも１つ以上の発現量変化を検出する工程を含むことを特長とする代謝活性化物質のスクリーニング方法。
（項６）項１乃至５記載の少なくとも1つ以上の方法を工程に含むことを特長とする代謝活性化物質のスクリーニングキット。
（項７）項１乃至５記載の発現量変化の検出に用いた遺伝子の発現量を変化させて作製することを特長とする試験用モデルマウスの作製方法。
（項８）項１乃至５記載の発現量変化の検出に用いたタンパク質の発現量を変化させて作製することを特長とする試験用モデルマウスの作製方法。
（項９）項７乃至８のいずれか一項に記載の代謝亢進モデルマウスの作製方法であって、発現量を変化させる遺伝子がｐ３８αであることを特長とする試験用モデルマウスの作製方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明において、ｐ３８サブファミリーの発現を抑制する物質が抗肥満剤、糖尿病薬、さらには高脂血症、高血圧、高血糖などのメタボリックシンドロームと呼ばれる疾病の治療薬として有効であることを示している。また、発現量の変化は既存のハイスループットスクリーニング方法を用いて行うことができるため、新規な代謝活性化物質を短時間でスクリーニングすることが可能となる。また本発明の方法により新規な代謝活性化物質の発見が可能となる。さらには、生体材料を試料として本発明のうちの少なくとも一つ以上の方法により発現量の変化を確認することにより、生体試料のドナーの肥満度をチェックすることも可能となると考えられる。またｐ３８αのノックアウトマウスが代謝亢進を呈することが明らかとなったため、遺伝子発現をはじめ、生化学的、生理的諸条件を解析することにより、肥満抑制に関わる新規な遺伝子やメカニズム、創薬ターゲットを探索することができると推測される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書でいう代謝活性化とは、体内のエネルギー代謝が活発に起こることにより、体内に蓄積した脂肪等の貯蔵物質が消費される現象を指し、代謝亢進は代謝活性化と同義である。
【００１４】
本発明でいう発現量とは、遺伝子、タンパク質などの発現量を指す。遺伝子発現量変化を検出する方法としては、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンハイブリダイゼーション法等が一般的に知られているが、これらに限定されるものではない。タンパク質量の変化を測定する方法としては、紫外吸収法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（クーマシーブルー法）、Ｌｏｗｒｙ法（フェノール試薬法）、ビシンコニン酸法（ＢＣＡ法）などが一般的に知られており、また対象とするタンパク質が酵素である場合、その酵素活性を測定し、その値を発現量とみなすことも可能であるが、これに限定されるものではない。
【００１５】
本発明において使用する試料は、代謝活性化物質が含まれると考えられる物質群を処理する必要がある。施与の方法は食餌、経皮吸収、静脈注射などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
ノックアウトマウスは相同組み換え技術を用いてｐ３８αゲノム中にDNA断片を導入することで、ｐ３８α転写産物の発現を阻害したものである。ホモ接合体は胎生致死となるため、ＰＣＲによるタイピングにより、ヘテロ接合体を実験に用いる。タイピング実施は代表例として以下を示すが、これに限定されるものではない。
【００１７】
組換えＤＮＡ部位を含むタイピングプライマーを用いて実施する。タイピングプライマーの配列は以下の通りである。
ｐ３８ＫＯＦ    5’-ctactggagaagatgctcgttttggac-3’
ｐ３８ＫＯＲ    5’-cttactttgcactgaacacacacatcc-3’
【００１８】
ＰＣＲ反応に用いる酵素は市販のものを利用することが可能である。今回はＥｘＴａｑ（タカラバイオ社）を使用した。ＰＣＲ条件は９８℃＊１０分、６８℃２分を３０−４０サイクル行い、その産物を制限酵素ＥｃｏＲＶを用いて３７℃条件下で切断した後、適当な濃度のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、断片長の確認を行った。ノックアウトマウスのゲノムＤＮＡは野生型マウスと比較して０．２ｋｂ程度短い断片として現れることを確認した。
【００１９】
上記はノックアウトマウスを作製する方法の一例であり、遺伝子のスプライシング、トランスポゾンによる転写物の発現阻害、ＲＮＡｉを用いた転写物の分解による発現阻害など、公知の技術を利用して目的遺伝子発現および／または活性を阻害することが可能である。また、過剰発現させる場合も同様にプロモーター活性促進あるいは遺伝子導入による転写物の過剰発現など、公知の技術を利用して目的遺伝子発現および／または活性を増大させることが可能である。
【００２０】
ｐ３８αノックアウトマウス（＋/−）を代謝亢進モデルとして用いる場合、当該マウスにおける遺伝子発現をはじめ、生化学的、生理的諸条件を解析し、肥満抑制に関わる新規な遺伝子やメカニズム、創薬ターゲットを探索することができる。
【００２１】
Ｃ２Ｃ１２を用いた培養筋細胞は、細胞バンク等で分与されるＣ２Ｃ１２細胞を用い、ＤＭＥＭによる培地に通常の１０〜１５％ＦＣＳでの培養に加え、コンフルエント前に５％ＨＳの条件に置換して７〜８日培養することで筋細胞へと分化させ、実験に用いる。５％ＨＳのＤＭＥＭに０．１％のＤＭＳＯを添加し、対照群として用いる。SB203580などのｐ３８阻害剤を用途に従って１０〜３０ｍＭの濃度で５％ＨＳのＤＭＥＭに添加し、筋分化させたＣ２Ｃ１２細胞に加えて２４時間３７℃５％ＣＯ２条件化でインキュベートする。サンプリングはロシュ社のＴｒｉｐｕｒｅなどのＲＮＡ抽出試薬を用いて迅速に行い、ｃＤＮＡ合成を経てリアルタイムＰＣＲを行う。以上記載した方法は一例であり、これに限定されるものではなく、既存の遺伝子発現量評価方法を使用して検出することも可能である。
【００２２】
化合物スクリーニングにおいても同様に、上記の条件において各種の化合物を培養細胞に添加し、ＳＩＲＴ１、ＰＧＣ-１、ＰＰＡＲα、ＵＣＰ１の遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲ法により検出する。あるいは、これらの遺伝子の発現を制御するプロモーター部位にＧＦＰなどのマーカー遺伝子を接続したプラスミドを作成し、スクリーニング利用してもよいがこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
Ｂ６／Ｊ由来の１２週齢の野生型マウスおよびｐ３８αノックアウトマウス（＋／−）（以下ｐ３８αノックアウトマウスと記載）にラード脂質を20％含んだ高脂肪餌を与え、２〜３週間ごとに体重を測定した。野生型マウスとノックアウトマウスは同腹仔を使用した。ｐ３８αノックアウトマウスであることはゲノミックサザンブロッティング法を用いて確認した。１００ｇ当たりの飼料の脂肪分以外の組成は以下のようなものを用いる。
【００２５】
（原料名）              （重量／１００ｇ当たり）
コーンスターチ                  ４４ｇ
カゼイン                        １４ｇ
αコーンスターチ                ５ｇ
スクロース                      ５ｇ
ダイズ油                        ２ｇ
セルロースパウダー              ５ｇ
ＡＩＮ９３ミネラルＭｉｘ        ３．５ｇ
ＡＩＮ９３ビタミンＭｉｘ        １ｇ
Ｌ−シスチン                    ０．１８ｇ
重酒石酸コリン                  ０．２５ｇ
第３ブチリルヒドロキノン        ０．８ｍｇ
【００２６】
結果を図１に示す。高脂肪食施与後３、６、９週間後において野生型マウスとｐ３８αノックアウトマウス間に有意な体重差が生じ、ｐ３８αノックアウトマウスにおいて肥満の抑制すなわち代謝亢進が観察された。
【００２７】
（実施例２）
１２週齢雄の野生型マウスおよびｐ３８αノックアウトマウスを各４匹より、肝臓、脂肪組織、骨格筋をサンプリングした後、各々をホモジナイザーによって粉砕、ＲＮＡ抽出を行い（ロシュ社Ｔｒｉｐｕｒｅ），リアルタイムＰＣＲにより遺伝子発現量を調べた。対象とした遺伝子はＳＩＲＴ１、ＰＧＣ−１、ＰＰＡＲａｌｐｈａ、ＰＰＡＲｇａｍｍａ、ＰＰＡＲｄｅｌｔａ、ＡＭＰＫａ２、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３である。それぞれの検出に用いたプライマー配列（Ｆ；フォワード用、Ｒ；リバース用）を以下に示す。
【００２８】
β-アクチン（内部標準）−Ｆ     5’-gatcattgctcctcctgagc-3’
β-アクチン（内部標準）−Ｒ     5'-acatctgctggaaggtggac-3’
ＳＩＲＴ１−Ｆ                  5’-gtctcctgtgggattcctga-3’
ＳＩＲＴ１−Ｒ                  5’-caaacatggcttgagggtct-3’
ＰＧＣ−１−Ｆ                  5'-gtcaacagcaaaagccacaa-3’
ＰＧＣ−１−Ｒ                  5’-gtgtgaggagggtcatcgtt-3’
ＰＰＡＲａｌｆａ−Ｆ            5’-acttgaacgaccaagtcacctt-3’
ＰＰＡＲａｌｆａ−Ｒ            5’-taaggaactcgcgtgtgataaa-3’
ＰＰＡＲｄｅｌｔａ−Ｆ          5’-agaattccatctgcaggtcaac-3’
ＰＰＡＲｄｅｌｔａ−Ｒ          5’-tcactctccgtcttctttagcc-3’
ＰＰＡＲｇａｍｍａ−Ｆ          5’-gatggaagaccactcgcatt-3’
ＰＰＡＲｇａｍｍａ−Ｒ          5’-aaccattgggtcagctcttg-3’
ＡＭＰＫａ２−Ｆ                5’-catattcctccaggcttgaaac-3’
ＡＭＰＫａ２−Ｒ                5’-ctagagacttgggcttcgttgt-3’
ＵＣＰ−１Ｆ                    5’-gggacctacaatgcttacagagtt-3’
ＵＣＰ−１Ｒ                    5’-catgaggtcatatgttaccagctc-3’
ＵＣＰ−２Ｆ                    5’-aaagatactctcctgaaagccaac-3’
ＵＣＰ−２Ｒ                    5’-gttcatgtatctcgtcttgaccac-3’
ＵＣＰ−３Ｆ                    5’-ggaaatacagagggactatggatg-3’
ＵＣＰ−３Ｒ                    5’-cttctccttgatgatgtcgtaggt-3’
【００２９】
その結果を図２から図４に示す。データは内部標準としてβ-アクチンを使用し、β-アクチンの発現量を基準とした場合の相対値を示した。１０〜１６週齢の野生型マウスおよびｐ３８αノックアウトマウス（＋/−）を頚椎脱臼により安楽死させ、肝臓、脂肪組織、骨格筋をサンプリングした後、ホモジナイザーによって粉砕し、ロシュ社Ｔｒｉｐｕｒｅなどの試薬を用いてＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成してリアルタイムＰＣＲによって遺伝子発現を検出する。１２週齢雄の野生型マウスおよびｐ３８αノックアウトマウス（＋/−）を各４匹よりサンプリングし、以下のプライマーを用いて実験を行った。β-アクチンを基準とした発現量の相対値を測定した結果を図２から図４に示す。各遺伝子において、野生型の平均値を１としてｐ３８αノックアウトマウス（＋/−）の値を示す。骨格筋において、ＳＩＲＴ１およびＰＧＣ-１の発現量がｐ３８αノックアウトマウス（＋/−）で有意に増大していることが明らかになった。
【００３０】
（実施例３）
Ｃ２Ｃ１２細胞を１０〜１５％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ培地で培養し、飽和状態になる前に５％ＨＳのＤＭＥＭ培地に置換して７〜８日培養することで筋細胞へと分化させ、実験に用いた。５％ＨＳのＤＭＥＭに０．１％のＤＭＳＯを添加し、対照群として用いた。ＳＢ２０３５８０等のｐ３８阻害剤を用途に従って１０〜３０ｍＭの濃度で５％ＨＳのＤＭＥＭに添加し、筋分化させたＣ２Ｃ１２細胞に加えて２４時間３７℃５％ＣＯ２条件化で培養した。サンプリングはロシュ社のＴｒｉｐｕｒｅなどのＲＮＡ抽出試薬を用いて迅速に行い、ｃＤＮＡ合成を経てリアルタイムＰＣＲを行った。
【００３１】
上記条件において得られた実験結果を図５および図６に示す。ＳＢ２０３５８０の添加によって、Ｃ２Ｃ１２から分化した培養筋細胞において、マウス組織と同じくＳＩＲＴ１とＰＣＧ-１の発現量が有意に増加した。また、別のＭＡＰＫサブファミリーであるＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６ではこの増加は生じなかった。
【００３２】
さらに、Ｃ２Ｃ１２から分化した培養筋細胞においてヘテロノックアウトのマウス組織では有意な増加が観察されなかった他の代謝制御遺伝子についても検討した。その結果を図７に示す。ノックアウトマウス組織での結果とは異なりＰＰＡＲαとＵＣＰ１について有意な増加がみられた。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】１２週齢の雄マウス野生型７匹、ｐ３８αノックアウトマウス（＋/−）７匹に２０％ラード高脂肪餌を摂取させた場合の体重変化を示した図である。
【図２】１２週齢雄の野生型マウス４匹、ｐ３８αノックアウトマウス（＋/−）４匹を頚椎脱臼により安楽死させ、骨格筋からRNAを抽出し、リアルタイムPCRによる代謝系遺伝子群の発現量比較の結果を示した図である。
【図３】１２週齢雄の野生型マウス４匹、ｐ３８αノックアウトマウス（＋/−）４匹を頚椎脱臼により安楽死させ、脂肪組織からRNAを抽出し、リアルタイムPCRによる代謝系遺伝子群の発現量比較の結果を示した図である。
【図４】１２週齢雄の野生型マウス４匹、ｐ３８αノックアウトマウス（＋/−）４匹を頚椎脱臼により安楽死させ、肝臓よりRNAを抽出し、リアルタイムPCRによる代謝系遺伝子群の発現量比較の結果を示した図である。
【図５】５％ＨＳを含むＤＭＥＭ培地で７日間培養し、筋分化させたＣ２Ｃ１２細胞に対してＳＢ２０３５８０を２０ｍＭおよびＵ０１２６を１０ｍMの最終濃度で添加し、２４時間後に回収してＲＮＡを抽出、リアルタイムPCRを用いてＳＩＲＴ１の発現量を検討した結果を示した図である。
【図６】５％ＨＳを含むＤＭＥＭ培地で７日間培養し、筋分化させたＣ２Ｃ１２細胞に対してＳＢ２０３５８０を２０ｍＭおよびＵ０１２６を１０ｍMの最終濃度で添加し、２４時間後に回収してＲＮＡを抽出、リアルタイムＰＣＲを用いてＰＧＣ−１の発現量を検討した結果を示した図である。
【図７】Ｃ２Ｃ１２から分化した培養筋細胞における代謝制御遺伝子発現量を検討した結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月13日(2009.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010115125000001.app