(57)【要約】      （修正有）【課題】味覚受容体細胞において発現し、苦味および甘味の知覚に関連する、ＴＩＲ３受容体タンパク質の発見、同定および特性決定の提供。【解決手段】ＴＩＲ３ヌクレチオド、宿主細胞発現系、ＴＩＲ３タンパク質、融合タンパク質、ＴＩＲ３導入トランスジェニック動物、およびＴＩＲ３「ノックアウト」動物。さらに、ＴＩＲ３媒介味覚反応のモジュレーターを同定する方法、および苦味または甘味の知覚を阻害または促進するモジュレーターの、食品、飲料および薬剤における調味料としての使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＩＲ３誘導物質を特定する方法であって、
（ｉ）ＴＩＲ３受容体チャンネルタンパク質を発現する単離された細胞を試験化合物と接触させ、ＴＩＲ３の活性化量を測定する段階であって、該ＴＩＲ３受容体タンパク質は『  ＩＤ  Ｎｏ．：１−Ｎｏ．：６のヌクレオチド配列によりコードされるか、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１−Ｎｏ．：６のヌクレオチド配列と厳密条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列によりコードされるものであり、味覚受容体細胞内に存在するとき甘味料によって活性化されて該味覚受容体から神経伝達物質をシナプスに放出して求心性神経を活性化させる段階と、
（ｉｉ）別の実験において、条件を（ｉ）と本質的に同じとして、該ＴＩＲ３受容体タンパク質を発現する単離された細胞を溶剤対照と接触させ、ＴＩＲ３の活性化量を測定する段階と、
（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴＩＲ３の活性化量を（ｉｉ）における活性化量と比較する段階を含み、試験化合物の存在下での活性化ＴＩＲ３の増加量が、試験化合物がＴＩＲ３誘導物質であることを示す方法。
【請求項２】
ＴＩＲ３阻害物質を特定する方法であって、
（ｉ）ＴＩＲ３受容体タンパク質を発現する単離された細胞を甘味料の存在下で試験化合物と接触させ、ＴＩＲ３の活性化量を測定する段階であって、該ＴＩＲ３受容体タンパク質は（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１−Ｎｏ．：６のヌクレオチド配列によりコードされるか、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１−Ｎｏ．：６のヌクレオチド配列と厳密条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列によりコードされるものであり、味覚受容体細胞内に存在するとき甘味料によって活性化されて該味覚受容体から神経伝達物質をシナプスに放出して求心性神経を活性化させる段階と、
（ｉｉ）別の実験において、条件を（ｉ）と本質的に同じとして、該ＴＩＲ３受容体タンパク質を発現する単離された細胞を甘味料と接触させ、ＴＩＲ３の活性化量を測定する段階と、  
（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴＩＲ３の活性化量を（ｉｉ）で測定したＴＩＲ３の活性化量と比較する段階を含み、
試験化合物の存在下でＴＩＲ３の活性化量の低下が、試験化合物がＴＩＲ３阻害物質であることを示す方法。
【請求項３】
ＴＩＲ３の阻害物質である可能性を有する物質をin vivoで特定する方法であって、
（ｉ）ヒトを除く試験動物に（ａ）甘味料を含む組成物または（ｂ）甘味料ならびに試験阻害物質を含むいずれかを摂取する選択権を与える段階と、
（ｉｉ）（ａ）または（ｂ）による組成物の摂取量を比較する段階とを含み、
（ａ）による組成物のより大きな摂取量が、試験化合物がＴＩＲ３を阻害する能力を有する可能性を有することと正の相関関係を有する方法。
【請求項４】
ＴＩＲ３の活性化物質である可能性を有する物質をin vivoで特定する方法であって、
（ｉ）ヒトを除く試験動物に（ａ）対照組成物または（ｂ）試験活性化物質を含む組成物のいずれかを摂取する選択権を与える段階と、
（ｉｉ）（ａ）または（ｂ）による組成物の摂取量を比較する段階とを含み、
（ｂ）による組成物のより大きな摂取量が、試験活性化物質がＴＩＲ３を活性化する能力を有する可能性を有することと正の相関関係を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、味覚受容体細胞において発現し、甘味の知覚に関連する、本明細書においてＴ１Ｒ３と称するＧタンパク質結合受容体の発見、同定および特徴付けに関する。本発明は、Ｔ１Ｒ３ヌクレオチド、宿主細胞発現系、Ｔ１Ｒ３タンパク質、融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、Ｔ１Ｒ３タンパク質に対する抗体、Ｔ１Ｒ３トランス遺伝子を発現するトランスジェニック動物およびＴ１Ｒ３を発現しない「ノックアウト」動物を含む。本発明はさらに、Ｔ１Ｒ３媒介味覚反応のモジュレーターを同定する方法および甘味の知覚を阻害または促進するそのようなモジュレーターの使用に関する。Ｔ１Ｒ３活性のモジュレーターは、食品、飲料および薬剤における調味料として用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
味覚は、ヒトおよび他の生物の生活および栄養状態に重要な役割を果たしている。ヒトの味覚は、４つのよく知られ、広く受け入れられている記述子である甘味、苦味、塩味および酸味（特定の味覚の質または様相に対応する）ならびに２つのより異論の多い質である脂肪およびアミノ酸味に従って分類することができる。甘みのある食べ物を識別する能力は、脊椎動物に高い栄養価を有する必要な炭水化物を捜し出す手段を与えるため、特に重要である。苦味の知覚は、他方で、ヒトが多血症または潜在的に極めて有害な植物アルカロイドならびにエルゴタミン、アトロピンおよびストリキニーネのような他の環境毒素を回避することを可能にするという、防護上の価値があるために重要である。過去数年の間に多くの分子研究で、α−ガストデューシン（α−ｇｕｓｔｄｕｃｉｎ）（１、２）、Ｇγ１３（３）およびＴ２Ｒ／ＴＲＢ受容体（４〜６）のような苦味応答変換カスケードの構成要素が確認された。しかし、甘味変換の構成要素はそのように明確には確認されておらず（７、８）、とらえがたい甘味応答受容体はクローンされておらず、また物理的特徴付けもなされていない。
【０００３】
味覚細胞の生化学的および電気生理学的研究に基づいて、次の２つの甘味変換モデルが提案され、広く受け入れられている（７、８）。第１は、ＧＰＣＲ−Ｇｓ−ｃＡＭＰ経路であり、糖は、Ｇｓに結合する１つまたは複数のＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）に結合し、活性化すると考えられていて、受容体により活性化されたＧαｓは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）を活性化して、ｃＡＭＰを発生させ、ｃＡＭＰは、側底Ｋ＋チャンネルをリン酸化するタンパク質キナーゼＡを活性化して、チャンネルの閉鎖、味覚細胞の脱分極、電位依存性Ｃａ＋＋流入および神経伝達物質の放出をもたらす。第２は、ＧＰＣＲ−Ｇｑ／Ｇβγ−ＩＰ３経路であり、人工甘味料は、おそらく、ＧｑのαサブユニットまたはＧβγサブユニットによりＰＬＣβ２に結合する１つまたは複数のＧＰＣＲｓに結合して、活性化し、活性化されたＧαｑまたは放出されたＧβγは、ＰＬＣβ２を活性化して、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を発生させ、ＩＰ３とＤＡＧは、内部貯蔵からのＣａ＋＋の放出を誘発して、味覚細胞の脱分極と神経伝達物質の放出をもたらす。甘味応答受容体をクローンすることできないことが、この分野の進歩の制約となっていた。
【０００４】
マウスにおける遺伝学的試験で、マウスの甘味感受性および甘味非感受性系統の間の差の主因となっている２つの遺伝子座であるｓａｃ（サッカリン、ショ糖および他の甘味料に対する行動的および電気生理学的応答性を決定する）およびｄｐａ（Ｄ−フェニルアラニンに対する応答性を決定する）が同定された（９〜１２）。ｓａｃは、マウス第４染色体の遠位端にマップされ、ｄｐａはマウス第４染色体の近位部にマップされた（１３〜１６）。オーファン味覚受容体Ｔ１Ｒ１は、第４染色体の遠位部に暫定的にマップされたことから、ｓａｃの候補であると提案された（１７）。しかし、Ｆ２マウスにおけるＴ１Ｒ１と、ｓａｃに近接したマーカーとの組換え頻度の詳細な解析により、Ｔ１Ｒ１は、ｓａｃから離れていることが示されている（Ｌｉら（１６）の遺伝学的データによれば、約５ｃｍ離れており、また、ｓａｃに最も近いマーカーであるＤ１８３４６から百万塩基対以上離れている）。他のオーファン味覚受容体Ｔ１Ｒ２もマウス第４染色体にマップされているが、これは、Ｔ１Ｒ１よりもＤ１８３４６／ｓａｃからさらに離れている。
【非特許文献１】Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第１巻、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２．１０．３頁
【非特許文献２】Ｃｒｅｕｇｈｔｏｎ、１９８３年、「Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａ  ＆  Ｃｏ．、ＮＹ
【特許文献１】米国特許第４，８７３，１９１号
【非特許文献３】Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）による技術
【非特許文献４】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、１９８５年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８２巻、６１４８〜６１５２頁
【非特許文献５】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９年、「Ｃｅｌｌ」、第５６巻、３１３〜３２１頁）
【非特許文献６】Ｌｏ、１９８３年、「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」、第３巻、１８０３〜１８１４頁）
【非特許文献７】Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、「Ｃｅｌｌ」、  １９８９年、第５７巻、７１７〜７２３頁
【非特許文献８】Ｇｏｒｄｏｎ、１９８９年、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．」、第１１５巻、１７１〜２２９頁
【非特許文献９】Ｌａｓｋｏ  Ｍ．ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８９巻、６２３２〜６２３６頁
【非特許文献１０】Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、「Ｎａｔｕｒｅ」、第２５６巻、４９５〜４９７頁
【特許文献２】米国特許第４，３７６，１１０号
【非特許文献１１】Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３年、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ」、第４巻、７２頁
【非特許文献１２】Ｃｏｌｅら、１９８３年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８０巻、２０２６〜２０３０頁）
【非特許文献１３】Ｃｏｌｅら、１９８５年、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁
【非特許文献１４】Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」、第８１巻、６８５１〜６８５５頁
【非特許文献１５】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４年、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３１２巻、６０４〜６０８頁
【非特許文献１６】Ｔａｋｅｄａら、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３１４巻、４５２〜４５４頁）
【特許文献３】米国特許第５，５８５，０８９号
【特許文献４】米国特許第４，９４６，７７８号
【非特許文献１７】Ｂｉｒｄ、１９８８年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第２４２巻、４２３〜４２６頁
【非特許文献１８】Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８５巻、５８７９〜５８８３頁、
【非特許文献１９】Ｗａｒｄら、１９８９年、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３３４巻、５４４〜５４６頁
【非特許文献２０】Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ  Ｉ．ら、１９９４年、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第１７巻、１７２〜１７７頁）
【非特許文献２１】ＫｏｍｕｒｏおよびＲａｋｉｃ、１９８８年、Ｉｎ：「Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｎ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｌ．Ｗ．Ｈａｙｍｅｓ編、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献２２】Ｍｉｎｇ  Ｄ．ら、１９９８年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、第９５巻、８９３３〜８９３８頁
【非特許文献２３】Ｈｏｏｎ  Ｍ．Ｒ．ら、１９９９年、「Ｃｅｌｌ」、第９６巻、５４１〜５５１頁
【非特許文献２４】Ｎｉｎｏｍｉｙａ  Ｙ．ら、１９９７年、「Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）」、第２７２巻、Ｒ１００２〜Ｒ１００６頁
【非特許文献２５】Ｌａｍ  Ｋ．Ｓ．ら、１９９１年、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３５４巻、８２〜８４頁
【非特許文献２６】Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｒ．ら、１９９１年、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３５４巻、８４〜８６頁
【非特許文献２７】Ｓｏｎｙａｎｇ  Ｚ．ら、１９９３年、「Ｃｅｌｌ」、第７２巻、７６７〜７７８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
味覚の基礎をなす分子的メカニズムを十分に理解するためには、味覚信号変換経路における各分子成分を同定することが重要である。本発明は、味覚変換に関与すると考えられており、甘味感覚に関連する味覚細胞の応答の変化に関与している可能性があるＧタンパク質結合受容体Ｔ１Ｒ３のクローニングに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、味覚信号変換経路に関与する、以後Ｔ１Ｒ３と称する新規のＧタンパク質結合受容体の発見、同定および特徴付けに関する。Ｔ１Ｒ３は、ファミリー３  Ｇタンパク質結合受容体（以後ＧＰＣＲ）と高度な構造的類似性を有する受容体タンパク質である。ノーザンブロット分析により示されているように、Ｔ１Ｒ３転写の発現は厳格に制御されており、最高レベルの遺伝子発現が味覚組織に認められる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成により、Ｔ１Ｒ３は、味覚受容体細胞において選択的に発現するが、周囲の舌上皮、筋肉または結合組織には存在しないことが示されている。さらに、Ｔ１Ｒ３は、茸状、葉状および有郭乳頭の味蕾において高度に発現する。
【０００７】
本発明は、Ｔ１Ｒ３ヌクレオチド、そのようなヌクレオチドを発現する宿主細胞およびそのようなヌクレオチドの発現産物を含む。本発明は、Ｔ１Ｒ３タンパク質、Ｔ１Ｒ３融合タンパク質、Ｔ１Ｒ３受容体タンパク質に対する抗体およびＴ１Ｒ３トランス遺伝子を発現するトランスジェニック動物またはＴ１Ｒ３タンパク質を発現しない組換えノックアウト動物を含む。
【０００８】
さらに、本発明はまた、Ｔ１Ｒ３活性および／または発現を変調する、すなわち、その作用物質または拮抗物質として作用する化合物の同定のための標的としてＴ１Ｒ３遺伝子および／またはＴ１Ｒ３遺伝子産物を用いるスクリーニング方法に関する。甘味料と同様な味覚応答を刺激する化合物は、甘味の知覚を増加することにより、食品、飲料または薬剤中の調味料として作用する添加物として使用することができる。Ｔ１Ｒ３受容体の活性を阻害する化合物は、甘味の感覚を遮断するために用いることができる。
【０００９】
本発明は、味覚受容体細胞において高レベルで発現したＧＰＣＲの発見に一部、基づいている。味覚変換においては、甘味化合物は、ＰＬＣβ２とＩＰ３を用いる二次メッセンジャーカスケードを介して作用すると考えられる。１サブセットの味覚受容体細胞へのα−ガストデューシン、ＰＬＣβ２、Ｇβ３およびＧγ１３ならびにＴ１Ｒ３の同時局在化は、それらが同じ変換経路で機能する可能性があることを示している。
【００１０】
定義
本明細書で使用されているように、Ｔ１Ｒ３の名称のイタリック体での表記は、Ｔ１Ｒ３遺伝子、Ｔ１Ｒ３  ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを示すのに対して、イタリック体で表記されていないＴ１Ｒ３の名称は、そのコードされたタンパク質産物を示す。たとえば、「Ｔ１Ｒ３」はＴ１Ｒ３遺伝子、Ｔ１Ｒ３  ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを意味するのに対して、「Ｔ１Ｒ３」はＴ１Ｒ３遺伝子のタンパク質産物を示すものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】ヒト１ｐ３６．３３とマウスＳａｃ遺伝子座の近くのマウス４ｐｔｅｒ染色体領域との間のシンテニー（ｓｙｎｔｅｎｙ）を示す図である。陰影をつけた円形のものは各遺伝子の予測される開始コドンのおおよその位置を示し、矢印はイントロンとエキソンを含む各遺伝子の全長を示し、矢じりはポリアデニル化シグナルのおおよその位置を示す。小文字で示した遺伝子は、Ｇｅｎｓｃａｎにより予測され、それらの最も近い相同遺伝子に従って命名した。大文字で示した遺伝子（Ｔ１Ｒ３およびＤＶＬ１）は、実験的に同定され、立証された。図に示すマウスマーカーＤ１８３４６は、Ｓａｃ遺伝子座に近接して結合していて、予測されるプソイドウリジンシンターゼ様遺伝子内にある。示す領域は、約４５，０００ｂｐに相当する。下部のスケールマーカーは、キロ塩基（Ｋ）を示す。
【図１Ｂ】ヒトＴ１Ｒ３のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を示す図である。イントロンの末端は、強調小文字で示す。
【図１Ｃ】ヒトＴ１Ｒ３の予測される二次構造を示す図である。Ｔ１Ｒ３は、７つの膜貫通らせんと大きいＮ末端ドメインを有すると予測される。膜貫通セグメントの位置は、ＴＭｐｒｅｄプログラムに従った。二量体化およびリガンド結合ドメインならびにシステインに富むドメインの位置は、ｍＧｌｕＲ１受容体および他のファミリーの３つのＧＰＣＲに基づいている（１９）。
【図２Ａ】マウス組織およびマウス味覚細胞中のＴ１Ｒ３  ｍＲＮＡの分布を示す図である。マウスＴ１Ｒ３  ｃＤＮＡとハイブリッド形成させたノーザンブロットのオートラジオグラム。各レーンは、次のマウス組織から分離された２５μｇの全ＲＮＡを含む。有郭および葉状乳頭に富む舌組織（味覚）、味蕾を欠く舌組織（非味覚）、脳、網膜、嗅上皮（Ｏｌｆ  Ｅｐｉ）、胃、小腸（Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔ）、胸腺、心臓、肺、脾臓、骨格筋（Ｓｋｅ  Ｍｕｓ）、肝臓、腎臓、子宮および精巣。７．２ｋｂの転写が味覚組織においてのみ検出され、わずかにより大きい転写が精巣に検出された。ブロットをＸ線フィルムに３日間曝露させた。同じブロットをはがし、β−アクチンｃＤＮＡで再探査し（下のパネル）、１日曝露させた。ＲＮＡマーカーの大きさ（キロ塩基単位）を右端に示す。
【図２Ｂ】マウスのＳａｃ領域のゲノム配列をマウス発現配列標識（ｅｓｔ）データベースを検索するクエリーとして用いた図である。ｅｓｔデータベースとの一致は、赤色実線で示し、エキソンを示す。特定のｅｓｔ一致におけるギャップは、黒色破線で示し、イントロンを示す。ｅｓｔ一致の密集性は、この領域内の遺伝子のそれぞれの範囲を区別している。Ｔ１Ｒ３の位置にｅｓｔがほぼ存在しないことは、図２ａで認められる発現の高度に限定されたパターンと一致する。
【図３Ａ】味覚受容体細胞におけるＴ１Ｒ３発現を示す図である。Ｔ１Ｒ３およびα−ガストデューシンの３３Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリッド形成したマウス味覚乳頭の凍結切片の顕微鏡写真。アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリッド形成した有郭（ａ）、葉状（ｂ）および茸状（ｃ）乳頭の高輝度像は、Ｔ１Ｒ３の味蕾特異的発現を示す。センスＴ１Ｒ３プローブとハイブリッド形成した有郭（ｅ）、葉状（ｆ）および茸状（ｇ）乳頭の対照高輝度像は、非特異的結合を示さなかった。味蕾におけるＴ１Ｒ３発現のレベルと広い分布は、アンチセンスα−ガストデューシンプローブとハイブリッド形成した有郭乳頭の高輝度像（ｄ）と同等であった。センスα−ガストデューシンプローブとハイブリッド形成した有郭乳頭の高輝度像（ｈ）は、非特異的結合を示さなかった。
【図３Ｂ】味覚組織および味覚細胞におけるＴ１Ｒ３、α−ガストデューシン、Ｇγ１３およびＰＬＣβ２の発現を示す図である。左パネル：マウス味覚組織（Ｔ）および対照非味覚舌組織（Ｎ）のＲＴ−ＰＣＲ産物とのサザンハイブリッド形成。Ｔ１Ｒ３、α−ガストデューシン（Ｇｕｓｔ）、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２およびグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）の３’領域プローブを用いて、ブロットを探査した。Ｔ１Ｒ３、α−ガストデューシン、Ｇγ１３およびＰＬＣβ２は、すべてが味覚組織において発現したが、非味覚組織では発現しなかったことに注意すること。右パネル：個別に増幅した２４味覚受容体細胞のＲＴ−ＰＣＲ産物とのサザンハイブリッド形成。１９細胞はＧＦＰ陽性（＋）で、５細胞はＧＦＰ陰性（−）であった。α−ガストデューシン、Ｇγ１３およびＰＬＣβ２の発現は完全に一致していた。Ｔ１Ｒ３の発現は、α−ガストデューシン、Ｇγ１３およびＰＬＣβ２の発現と部分的に重複していた。Ｇ３ＰＤＨは、産物の増幅の成功を立証するための陽性対照とした。
【図４】ヒト有郭乳頭の味覚受容体細胞におけるＴ１Ｒ３、ＰＬＣβ２およびα−ガストデューシンの同時局在化を示す図である。（ａ、ｃ）ヒト有郭乳頭の縦断切片をヒトＴ１Ｒ３のＣ末端ペプチドに対して誘導したウサギ抗血清ならびにＣｙ３結合抗ウサギ第２抗体で標識した。（ｂ）ヒト乳頭の縦断切片におけるＴ１Ｒ３免疫反応性は、Ｔ１Ｒ３抗体と同族体ペプチドとのプレインキュベーションにより阻害された。（ｄ）Ｔ１Ｒ３（ｈ）およびα−ガストデューシン（ｉ）に対して二重免疫染色したヒト茸状乳頭の切片と隣接した縦断切片。２つの像の重ね合わせを（ｊ）に示す。倍率は、２００倍（ａ〜ｄ）または４００倍（ｅ〜ｊ）であった。
【図５Ａ】ｍＴ１Ｒ３対立遺伝子の差を示す図である。８つのマウス同系繁殖系間のｍＴ１Ｒ３対立遺伝子の差。すべての非味覚系統は、同じ配列を示したので、１つの行にまとめた。下部の行においては、位置番号の直前のアミノ酸は常に非味覚系統からのものであるが、位置番号の直前のアミノ酸は、その位置において非味覚系統と異なっているいずれかの味覚系統からのものである。太字の２種の列は、すべての味覚系統が非味覚系統と異なり、ヌクレオチド配列の差がアミノ酸置換をもたらす位置を表す。コードされるアミノ酸を変化させないヌクレオチドの差は、ｓ、すなわちサイレントと示す。イントロン内のヌクレオチドの差は、ｉ、すなわちイントロンと示す。
【図５Ｂ】（ａ）で分析したマウス同系繁殖系の系統学を示す図である。系統が開発された年を系統名の後ろの括弧内に示す。これらのマウスが樹立された施設を示す。
【図６】マウスＴ１Ｒ３のアミノ酸配列を他の２つのラット味覚受容体（ｒＴ１Ｒ１およびｒＴ１Ｒ２）、マウス細胞外カルシウム感知（ｍＥＣａＳＲ）および代謝調節型グルタメートタイプ１（ｍＧｌｕＲ１）受容体のアミノ酸配列とともに配列させることを示す図である。５種の受容体すべての間で同一である領域は、黒色の地に白色文字で示し、これらの受容体の１つまたは複数がＴ１Ｒ３と同一である領域は、灰色の地に黒色文字で示す。破線の枠は、二量体化に関与すると予測される領域（ｍＧｌｕＲ１のアミノ末端ドメインの溶解構造に基づく）を示し、中塗りの円は、ｍＧｌｕＲ１に基づいて予測されたリガンド結合残基を示し、システイン残基を結ぶ青色の線は、ｍＧｌｕＲ１に基づいて予測された分子間ジスルフィド架橋を示す。上記のアミノ酸配列の配列は、非味覚マウスのすべての系統で認められる多形性を示している。５種の受容体すべてにおいて保存されている予測されるＮ結合グリコシル化部位は、黒色のくねった線で示す。非味覚系統のマウスにおけるＴ１Ｒ３に特異的な予測されるＮ結合グリコシル化部位は、赤色のくねった線で示す。
【図７】Ｍｏｄｅｌｌｅｒプログラムを用いてモデル化したＴ１Ｒ３のアミノ末端の予測される３次元構造で、ｍＧｌｕＲ１（１９）の構造に基づいて予測したものを示す図である。モデルは、Ｔ１Ｒ３のホモ二量体を示す。（ａ）細胞外空隙から膜方向に見おろした二量体の「上」からの像。（ｂ）側面から見たＴ１Ｒ３二量体。この像では、膜貫通領域（示されていない）は二量体の下部に達していると思われる。（ｃ）２つの二量体が離れて広がっていて（２つの矢尻の矢印で示す）、接触面が明らかになっていることを除いて、Ｔ１Ｒ３二量体を（ｂ）と同様に側面から見たものである。３つのグリコシル部分（Ｎ−アセチルガラクトース−Ｎ−アセチルガラクトース−マンノース）の塗りつぶし表示（赤色）を非味覚ｍＧｌｕＲ３の新規の予測されるグリコシル化部位に加えた。この部位におけるさらに３つの糖部分の付加は二量体化と立体的に不適合であることに注意すること。二量体化に関与するｍＧｌｕＲ１の領域に対応するＴ１Ｒ３の領域を塗りつぶしたアミノ酸で示す。予測される二量体化表面を形成している４種のセグメントを図５の破線枠と同じ方法で色分けする。二量体化領域の外側の２つの分子の部分は、骨格の追跡（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｔｒａｃｉｎｇ）により表わされる。マウスの味覚系統と非味覚系統で異なっているＴ１Ｒ３の２つの多形性アミノ酸残基は、アミノ末端に最も近い予測される二量体化境界内（淡青色）にある。Ｔ１Ｒ３の非味覚型に固有のａａ５８における他のＮ−グリコシル化部位を各パネルに直線の矢印により示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｔ１Ｒ３は、受容体媒介味覚信号変換に関与する新規の受容体であり、ファミリー３  Ｇタンパク質結合受容体に属する。本発明は、Ｔ１Ｒ３ヌクレオチド、Ｔ１Ｒ３タンパク質およびペプチドならびにＴ１Ｒ３タンパク質に対する抗体を含む。本発明はまた、Ｔ１Ｒ３受容体を発現もしくは動物の内因性Ｔ１Ｒ３の発現を阻害または「ノックアウト」するように遺伝子工学的に処理した宿主細胞および動物に関する。
本発明はさらに、Ｔ１Ｒ３活性の作用物質および拮抗物質のような変調物質の特定のために計画されたスクリーニング検定を提供する。Ｔ１Ｒ３を自然に発現する宿主細胞もしくは遺伝子工学的に処理した宿主細胞および／または動物の使用は、Ｔ１Ｒ３受容体タンパク質により変換される信号に影響を及ぼす化合物を特定することを可能にするという点で有利である。
【００１３】
本発明の種々の態様を以下の細別の項に詳細に記述する。
Ｔ１Ｒ３遺伝子
ヒトＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ配列および推理されたアミノ酸配列を図１Ｂに示す。本発明のＴ１Ｒ３ヌクレオチド配列は、以下の配列を含む。すなわち、（ａ）図１Ｂに示すＤＮＡ配列、（ｂ）図１Ｂに示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）（ｉ）（ａ）または（ｂ）に示すヌクレオチド配列と厳密条件下でハイブリッド形成し、たとえば、６８℃の０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でのフィルター結合ＤＮＡとのハイブリッド形成（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２．１０．３ページ）、（ｉｉ）機能が同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列、および（ｄ）図１Ｂに示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と、中程度の厳密条件、たとえば、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、前記）のようなより程度の低い厳密条件下でハイブリッド形成し、なおも機能が同等なＴ１Ｒ３遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列。Ｔ１Ｒ３タンパク質の機能的同等物は、ヒト以外の種に存在する天然に産出するＴ１Ｒ３を含む。本発明はまた、配列（ａ）〜（ｄ）の同義性変異型を含む。本発明はまた、たとえば、（Ｔ１Ｒ３遺伝子核酸配列の増幅反応のための、および／またはその増幅反応におけるアンチセンスプライマーとしての）Ｔ１Ｒ３遺伝子調節に有用なＴ１Ｒ３アンチセンス分子をコードする、またはそれとして作用する核酸分子を含む。
【００１４】
上述のＴ１Ｒ３ヌクレオチド配列に加えて、他の種に存在するＴ１Ｒ３遺伝子の同族体は、当技術分野でよく知られている分子生物学的技術により、必要以上の実験によることなく、同定し、容易の分離することができる。たとえば、問題の生物由来のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーは、本明細書でハイブリッド形成または増幅プローブとして記載するヌクレオチドを用いるハイブリッド形成により、スクリーニングすることができる。
【００１５】
本発明はまた、突然変異体Ｔ１Ｒ３ｓ、Ｔ１Ｒ３のペプチド断片、切断型Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ３機能タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。これらは、リガンド結合および二量体化に関与すると考えられているＡＴＤ（アミノ末端ドメイン）、システインに富むドメインおよび／またはＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインまたはこれらのドメインの一部、すなわち、Ｔ１Ｒ３の１または２つのドメインが欠失している切断型Ｔ１Ｒ３、たとえば、ＡＴＤ領域のすべてまたは一部を欠失している機能的Ｔ１Ｒ３を含むが、これらに限定されない、Ｔ１Ｒ３の機能ドメインに対応するポリペプチドまたはペプチドを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドコード融合タンパク質は、全長Ｔ１Ｒ３、切断型Ｔ１Ｒ３、もしくは、マーカーとして用いることができる酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質等の無関係のタンパク質またはペプチドに融合したＴ１Ｒ３のペプチド断片を含むが、これらに限定されない。
【００１６】
Ｔ１Ｒ３の構造のモデルに基づいて、Ｔ１Ｒ３が二量体化して、機能的受容体を形成すると予測される。したがって、これらの特定の切断型または突然変異Ｔ１Ｒ３タンパク質は、天然Ｔ１Ｒ３タンパク質の優性陰性阻害物質として作用する可能性がある。Ｔ１Ｒ３ヌクレオチド配列は、当業者に知られている種々の方法を用いて分離することができる。たとえば、Ｔ１Ｒ３を発現することが知られている組織からのＲＮＡを用いて構成されたｃＤＮＡライブラリーは、標識Ｔ１Ｒ３プローブを用いてスクリーニングすることができる。あるいは、ゲノムライブラリーをスクリーニングして、Ｔ１Ｒ３受容体タンパク質をコードする核酸分子を導き出すことができる。さらに、Ｔ１Ｒ３核酸配列は、本明細書に開示するＴ１Ｒ３ヌクレオチド配列に基づいてデザインされた２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを実施することにより得ることができる。反応の鋳型は、Ｔ１Ｒ３を発現することが知られている細胞系または組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡであってよい。
【００１７】
本発明はまた、前述のＴ１Ｒ３配列および／またはそれらの相補的配列（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター、（ｂ）Ｔ１Ｒ３コード配列の発現を誘導する調節エレメントと機能できるように結合した前述のＴ１Ｒ３配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター、（ｃ）宿主細胞におけるＴ１Ｒ３コード配列の発現を誘導する調節エレメントと機能できるように結合した前述のＴ１Ｒ３配列のいずれかを含む遺伝子工学的に処理した宿主細胞、および（ｄ）前述のＴ１Ｒ３配列のいずれかを含むトランスジェニックマウスまたは他の生物を含む。本明細書で用いるように、調節エレメントは、誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を誘導し、調節する、当業者に知られている他のエレメントを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
Ｔ１Ｒ３タンパク質およびポリペプチド
Ｔ１Ｒ３タンパク質、Ｔ１Ｒ３および／またはＴ１Ｒ３融合タンパク質のポリペプチドおよびペプチド断片、突然変異型、切断型または欠失型は、抗体の発生、Ｔ１Ｒ３媒介味覚変換の調節に関与する他の細胞遺伝子産物の同定ならびに新規の甘味料および味覚変革物質のような味覚を調節するのに用いることができる化合物のスクリーニングを含むが、これらに限定されない、様々な用途のために調製することができる。
【００１９】
図１Ｂに、ヒトＴ１Ｒ３タンパク質の推理されたアミノ酸配列を示す。本発明のＴ１Ｒ３のアミノ酸配列は、図１Ｂに示すアミノ酸配列を含む。さらに、他の種のＴ１Ｒ３ｓは、本発明に含まれる。実際、上の５．１項に記載されているＴ１Ｒ３ヌクレオチド配列によりコードされるＴ１Ｒ３タンパク質は本発明の範囲内にある。
【００２０】
本発明はまた、味覚受容体細胞からシナプスへの伝達物質の放出と求心性神経の活性化をもたらす、味覚受容体細胞におけるＴ１Ｒ３を活性化する甘味料の能力を含むが、これに限定されない多くの基準のいずれかにより判断される、５．１項に記載されているヌクレオチド配列によりコードされるＴ１Ｒ３と機能が同等であるタンパク質を含む。そのような機能が同等なＴ１Ｒ３タンパク質は、上の５．１項に記載されているＴ１Ｒ３ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加または置換を有するが、サイレント変化であり、したがって、機能が同等な遺伝子産物をもたらすタンパク質を含むが、これに限定されない。
【００２１】
Ｔ１Ｒ３の１つまたは複数のドメイン（たとえば、アミノ末端ドメイン、システインに富むドメインおよび／または膜貫通ドメイン）、切断型または欠失型Ｔ１Ｒ３ｓ（アミノ末端ドメイン、システインに富むドメインおよび／または膜貫通ドメインが欠失しているＴ１Ｒ３）に対応するペプチドならびに全長Ｔ１Ｒ３、Ｔ１Ｒ３ペプチドまたは切断型Ｔ１Ｒ３が無関係のタンパク質に融合している融合タンパク質も、本発明の範囲内にあり、本明細書に開示するＴ１Ｒ３ヌクレオチドおよびＴ１Ｒ３アミノ酸配列に基づいてデザインすることができる。そのような融合タンパク質は、マーカー機能を備えた酵素、蛍光タンパク質または発光タンパク質との融合を含む。
【００２２】
Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびペプチドは化学的に合成することができる（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、ＮＹを参照）が、Ｔ１Ｒ３から誘導される大きいポリペプチドおよび全長Ｔ１Ｒ３自体は、Ｔ１Ｒ３遺伝子配列および／またはコード配列を含む核酸を発現するための当技術分野でよく知られている技術を用いて組換えＤＮＡ技術により有利に生産することができる。そのような方法は、５．１項に記載されているＴ１Ｒ３ヌクレオチド配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するのに用いることができる。これらの方法は、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝的組換えを含む。（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、前出およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、前出を参照に記述された技術）
【００２３】
本発明のＴ１Ｒ３ヌクレオチド配列を発現させるために、種々の宿主発現ベクターを用いることができる。Ｔ１Ｒ３ペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体（たとえば、アミノ末端ドメイン、システインに富むドメインおよび／または膜貫通ドメインに対応するペプチド）として発現し、分泌されない場合、ペプチドまたはポリペプチドは、宿主細胞から回収することができる。あるいは、Ｔ１Ｒ３ペプチドまたはポリペプチドが分泌される場合、ペプチドまたはポリペプチドは、培地から回収することができる。しかし、発現システムは、細胞膜に固定されているＴ１Ｒ３または機能的同等物を発現する工学的に処理された宿主細胞も含む。そのような発現システムからのＴ１Ｒ３の精製又は濃縮は、適切な界面活性剤および脂質ミセルならびに当業者によく知られている方法を用いて実現することができる。そのような工学的に処理された宿主細胞自体は、Ｔ１Ｒ３の構造および機能特性を保持するためだけでなく、すなわち薬剤スクリーニング検定において、生物学的活性を評価するためにも重要である場合に、用いることができる。
【００２４】
本発明の目的のために用いることができる発現システムは、Ｔ１Ｒ３ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージで形質転換した細菌のような微生物、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター、Ｔ１Ｒ３ヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母もしくは哺乳類細胞のゲノムまたは哺乳類ウイルス由来のプロモーターを含む組換え発現構成体を有する哺乳類細胞系を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
適切な発現システムは、Ｔ１Ｒ３タンパク質の正しい修飾、処理および細胞下局在化が起こることを保証するために、選択することができる。この目的のために、Ｔ１Ｒ３タンパク質を適切に修飾し、処理する能力を有する真核生物宿主細胞が好ましい。スクリーニング目的のための細胞系の開発で望まれるような組換えＴ１Ｒ３タンパク質の長期の高収量生産のために、安定な発現が好ましい。複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、適切な発現制御エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子、すなわち、ｔｋ、ｈｇｐｒｔ、ｄｈｆｒ、ｎｅｏおよびｈｙｇｒｏ遺伝子等により制御されるＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入の後に、工学的に処理された細胞を富化培地で、次いで、選択培地に切り替えて、１〜２日間増殖させることができる。そのような工学的に処理された細胞系は、Ｔ１Ｒ３遺伝子産物の内因性活性を変調する化合物のスクリーニングと評価に特に有用であると思われる。
【００２６】
トランスジェニック動物
Ｔ１Ｒ３遺伝子産物は、トランスジェニック動物においても発現させることができる。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、ならびにヒト以外の霊長類、たとえば、ヒヒ、サルおよびチンパンジーを含むが、これらに限定されない、あらゆる種の動物を用いて、Ｔ１Ｒ３トランスジェニック動物を発生させることができる。
【００２７】
当技術分野で知られている技術を用いてＴ１Ｒ３トランス遺伝子を動物に導入し、トランスジェニック動物の創始ラインを生産することができる。そのような技術は、前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ  Ｐ．Ｃ．およびＷａｇｎｅｒ  Ｔ．Ｅ．、１９８９年、米国特許第４，８７３，１９１号）、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８２巻、６１４８〜６１５２頁）、胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９年、Ｃｅｌｌ、第５６巻、３１３〜３２１頁）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第３巻、１８０３〜１８１４頁）および精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、１９８９年、Ｃｅｌｌ、第５７巻、７１７〜７２３頁）等を含むが、これらに限定されない。そのような技術の総説については、その全部が参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｏｒｄｏｎ、１９８９年、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．第１１５巻、１７１〜２２９頁を参照のこと。
【００２８】
本発明は、そのすべての細胞においてＴ１Ｒ３トランス遺伝子を有するトランスジェニック動物ならびにその細胞の一部においてであるが、すべてにおいてではない、トランス遺伝子を有する動物、すなわち、モザイク動物を提供する。トランス遺伝子は、たとえば、Ｌａｓｋｏら（Ｌａｓｋｏ  Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、６２３２〜６２３６頁）に従って、特定の細胞型に選択的に導入し、活性化することもできる。そのような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、問題の特定の細胞型に依存し、当業者に明らかであろう。Ｔ１Ｒ３トランス遺伝子を内因性Ｔ１Ｒ３遺伝子の染色体部位に組み込むことが望まれる場合、遺伝子ターゲッティングが好ましい。概要を述べると、そのような技術を用いる場合、内因性Ｔ１Ｒ３遺伝子と相同のいくつかのヌクレオチド配列を含むベクターは、染色体配列との相同的組換えにより、内因性Ｔ１Ｒ３遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれて、その機能を阻害する目的のためにデザインされている。
【００２９】
トランスジェニック動物を発生させたならば、組換えＴ１Ｒ３遺伝子を標準的技術を用いて分析することができる。最初のスクリーニングは、トランス遺伝子の組込みが起こっていたかどうかを試験する目的での動物組織を分析するためのサザンブロット分析またはＰＣＲ法により遂行することができる。トランスジェニック動物の組織におけるトランス遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルは、動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成分析およびＲＴ−ＰＣＲを含むが、これらに限定されない技術を用いて評価することもできる。Ｔ１Ｒ３遺伝子発現組織のサンプルを、Ｔ１Ｒ３トランス遺伝子産物に対して特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に評価することもできる。
【００３０】
Ｔ１Ｒ３タンパク質に対する抗体
Ｔ１Ｒ３の１つまたは複数のエピトープ、またはＴ１Ｒ３の保存変異型のエピトープ、またはＴ１Ｒ３のペプチド断片を特異的に認識する抗体も、本発明に含まれている。そのような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｎＡｂｓ）、人化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体および上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の抗体は、たとえば、Ｔ１Ｒ３遺伝子産物の発現および／または活性に対する試験化合物の影響の評価のための下の５．５項に記載のような化合物スクリーニングスキームとともに用いることができる。
【００３２】
抗体の産生のために、様々な宿主動物をＴ１Ｒ３タンパク質またはＴ１Ｒ３ペプチドの注射により免疫化することができる。そのような宿主動物は、ウサギ、マウスおよびラット等を含むが、これらに限定されない。免疫応答を増大させるために、宿主動物種に応じて、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロンポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油性乳濁液、カサガイ（ｋｅｙ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノールならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）  およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含む様々なヒトアジュバントを用いることができる。
【００３３】
抗体分子の異種集団からなるポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から得ることができる。モノクローナル抗体は、連続細胞系培養により抗体分子の生産をもたらす技術により得ることができる。これらは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５〜４９７頁、および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、第４巻、７２頁、Ｃｏｌｅら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８０巻、２０２６〜２０３０頁）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、１９８５年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）を含むが、これらに限定されない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスのものであってよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。高力価のｍＡｂをｉｎ  ｖｉｖｏで生産できることから、現在、これが好ましい生産方法となっている。
【００３４】
さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子とをスプライシングすることにより「キメラ抗体」を生産するために開発された技術を用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８１巻、６８５１〜６８５５頁、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ、第３１２巻、６０４〜６０８頁、Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、第３１４巻、４５２〜４５４頁）。あるいは、人化抗体（米国特許第５，５８５，０８９号）または単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻、４２３〜４２６頁、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻、５８７９〜５８８３頁、およびＷａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、５４４〜５４６頁）の生産のために開発された技術を用いて、Ｔ１Ｒ３の１つまたは複数のエピトープを特異的に認識する抗体を生産することができる。
【００３５】
味覚の調節における有用な薬物および他の化合物のスクリーニング検定
本発明は、Ｔ１Ｒ３活性またはＴ１Ｒ３遺伝子発現を変調し、したがって、甘味の知覚の変調に有用である可能性のある化合物または組成物を特定するためにデザインされたスクリーニング検定に関する。
【００３６】
本発明によれば、細胞を用いる試験系を用いて、Ｔ１Ｒ３の活性を変調し、それにより、甘味の知覚を変調する化合物をスクリーニングすることができる。この目的のために、Ｔ１Ｒ３を内因的に発現する細胞を用いて化合物をスクリーニングすることができる。あるいは、Ｔ１Ｒ３を発現するように遺伝子工学的に処理した、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞等の細胞系をスクリーニングの目的のために用いることができる。機能的Ｔ１Ｒ３を発現するように遺伝子工学的に処理された宿主細胞は、味覚受容体細胞のような、甘味料による活性化に応答するものであることが好ましい。さらに、Ｔ１Ｒ３を発現するように工学的に処理された卵母細胞またはリポソームを、Ｔ１Ｒ３活性のモジュレーターを特定するために開発された試験に用いることができる。
【００３７】
本発明は、（ｉ）Ｔ１Ｒ３受容体を発現する細胞を試験化合物と接触させ、Ｔ１Ｒ３の活性化量を測定する段階と、（ｉｉ）別の実験において、条件を（ｉ）と本質的に同じとして、Ｔ１Ｒ３受容体タンパク質を発現する細胞を溶剤対照と接触させ、Ｔ１Ｒ３の活性化量を測定する段階と、（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴ１Ｒ３の活性化量を（ｉｉ）におけるＴ１Ｒ３の活性化量と比較する段階とを含み、試験化合物の存在下での活性化Ｔ１Ｒ３のレベルの増加が試験化合物がＴ１Ｒ３活性化物質であることを示す、甘味の知覚を誘発する化合物（甘味活性化物質）を特定する方法を提供する。
【００３８】
本発明はまた、（ｉ）Ｔ１Ｒ３受容体タンパク質を発現する細胞を甘味料の存在下で試験化合物と接触させ、Ｔ１Ｒ３の活性化量を測定する段階と、（ｉｉ）別の実験において、条件を（ｉ）と本質的に同じとして、Ｔ１Ｒ３受容体タンパク質を発現する細胞を甘味料と接触させ、Ｔ１Ｒ３の活性化量を測定する段階と、（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴ１Ｒ３の活性化量を（ｉｉ）におけるＴ１Ｒ３の活性化量と比較する段階とを含み、試験化合物の存在下でのＴ１Ｒ３の活性化量の低下が試験化合物がＴ１Ｒ３阻害物質であることを示す、甘味の知覚を阻害する化合物（甘味阻害物質）を特定する方法を提供する。
【００３９】
本明細書で定義される「甘味料」は、対象において甘味の知覚を誘発する化合物または分子複合体である。特に、甘味料は、以下の１つまたは複数のことをもたらす、Ｔ１Ｒ３タンパク質の活性化をもたらすものである。すなわち、（ｉ）細胞内へのＣａ＋２の流入、（ｉｉ）内部貯蔵からのＣａ＋２の放出、（ｉｉｉ）Ｇｓおよび／またはガストデューシンのような結合Ｇタンパク質の活性化、（ｉｖ）アデニリルシクラーゼおよび／またはホスホリパーゼＣのような２次メッセンジャー調節酵素の活性化。甘味料の例は、サッカリンまたはショ糖または他の甘味料を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
そのような細胞系を使用するに際して、Ｔ１Ｒ３受容体を発現する細胞を試験化合物または溶剤対照（たとえば、プラセボ）に曝露させる。曝露後、細胞を検定して、Ｔ１Ｒ３のシグナル変換経路の構成要素の発現および／または活性を測定することができ、あるいは、シグナル変換経路それ自体も検定することができる。
【００４１】
試験分子がＴ１Ｒ３の活性を変調する能力は、標準的生化学的および生理学的技術を用いて測定することができる。Ｔ１Ｒ３および／または他のタンパク質の触媒活性の活性化または抑制、リン酸化または脱リン酸化、２次メッセンジャーの産生の活性化または変調、細胞イオンレベルの変化、シグナル伝達分子の会合、解離または転移、もしくは特定の遺伝子の転写または翻訳のような反応をモニターすることができる。本発明の非限定的実施形態において、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化をｉｎｄｏ、ｆｕｒａ等の指示色素の蛍光によりモニターすることができる。さらに、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３およびＤＡＧレベルも検定することができる。他の実施形態において、Ｔ１Ｒ３シグナル変換を変調する化合物を特定するために、アデニリルシクラーゼ、グアニリルシクラーゼ、プロテインキナーゼＡおよび神経伝達物質のＣａ２＋感受性放出を測定することができる。さらに、Ｔ１Ｒ３チャンネルタンパク質の変調に起因する膜電位の変化は、電位固定法またはパッチレコード法を用いて測定することができる。本発明の他の実施形態において、微小生理機能測定機を用いて細胞活性をモニターすることができる。
【００４２】
たとえば、試験化合物への曝露後に、Ｃａ２＋の細胞内濃度の増加とアデニリルシクラーゼ、プロテインキナーゼＡまたはｃＡＭＰのようなカルシウム依存性下流メッセンジャーの活性化について検定することができる。溶剤対照で処理した細胞で認められるレベルと比較して、Ｃａ２＋の細胞内濃度を増加し、プロテインキナーゼＡを活性化し、あるいはｃＡＭＰ濃度を増加させる試験化合物の能力は、試験化合物が作用物質（すなわち、Ｔ１Ｒ３活性化物質である）として作用し、宿主細胞が発現するＴ１Ｒ３によって媒介されるシグナル変換を誘導することを示している。溶剤対照で認められるレベルと比較して、甘味料誘発性カルシウム流入を阻害し、プロテインキナーゼＡを阻害し、あるいはｃＡＭＰ濃度を低下させる試験化合物の能力は、試験化合物が拮抗物質（すなわち、Ｔ１Ｒ３阻害物質である）として作用し、Ｔ１Ｒ３により媒介されるシグナル変換を阻害することを示している。
【００４３】
本発明の特定の実施形態において、ｃＡＭＰのレベルは、種々のリポーター遺伝子のいずれかに連結されたｃＡＭＰ応答性エレメントを含む構成体を用いて測定することができる。そのようなリポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、増殖ホルモンまたは胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を含むが、これらに限定されない。そのような構成体をＴ１Ｒ３を発現する細胞に導入して、Ｔ１Ｒ３活性のモジュレーターを特定するために計画されたスクリーニング検定に有用な組換え型細胞を得ることができる。
【００４４】
細胞を試験化合物に曝露させた後に、リポーター遺伝子の発現のレベルを定量して、試験化合物がＴ１Ｒ３活性を調節する能力を測定することができる。アルカリホスファターゼ検定は、この酵素が細胞から分泌されるので、本発明の実施上、特に有用である。したがって、組織培養上清を、分泌されたアルカリホスファターゼについて検定することができる。さらに、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ  Ｉ．ら（１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１７巻、１７２〜１７７頁）に記載されているように、アルカリホスファターゼ活性を熱量測定、生物発光または化学発光定量法により測定することができる。その検定法は、薬剤の単純で、感度が高く、容易に自動化可能な検出システムとなる。
【００４５】
さらに、細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定するために、シンチレーション近接定量法（ＳＰＡ）を用いることができる（ＳＰＡキットがＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓにより供給されている）。この定量法では、１２５Ｉ標識ｃＡＭＰ、抗ｃＡＭＰ抗体および第２抗体を被覆したシンチラント組込みミクロスフェアを用いる。標識ｃＡＭＰ抗体複合体を介してミクロスフェアに極めて近接した状態になったとき、１２５Ｉがシンチラントを励起して、光を放射させる。細胞から抽出された非標識ｃＡＭＰは、抗体への結合を１２５Ｉ標識ｃＡＭＰと競合し、それにより、シンチレーションを減弱させる。定量は、高処理量スクリーニングを可能にするために９６ウエルプレートを用いて実施し、読み出しには、ＷａｌｌｅｃまたはＰａｃｋａｒｄにより製造されたような９６ウエルを用いるシンチレーション計数機器を用いることができる。
【００４６】
本発明の他の実施形態において、細胞内Ｃａ２＋の濃度をＫｏｍｕｒｏおよびＲａｋｉｃ、１９８８年、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｎ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｌ．Ｗ．Ｈａｙｍｅｓ編、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されているような方法を用いてＦｌｕｏ−３およびＦｕｒａ−ＲｅｄのようなＣａ２＋指示色素を用いてモニターすることができる。
【００４７】
上記の方法のいずれかにより特定された、Ｔ１Ｒ３の活性を活性化する試験活性化物質は、甘味の知覚を誘発させるそれらの能力を確認するためにさらなる試験に供することができる。上記の方法のいずれかにより特定された、甘味料によるＴ１Ｒ３の活性化を阻害する阻害物質は、それらの阻害活性確認するためにさらなる試験に供することができる。試験化合物がＴ１Ｒ３受容体の活性を変調する能力は、行動的、生理学的方法またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ法により評価することができる。
【００４８】
たとえば、試験動物に推定上のＴ１Ｒ３活性化物質を含む組成物と化合物を添加していない同じ組成物を摂取する選択権を与える、行動試験を実施することができる。たとえば、摂取量がより多いことから証明される試験化合物を含む組成物に対する好みは、Ｔ１Ｒ３活性の活性化と正の相関があるであろう。さらに、甘味料の存在下でのＴ１Ｒ３の推定上の阻害物質を含む食物に対する動物の好みの欠如は、甘味阻害物質の特定と正の相関があるであろう。
【００４９】
細胞を用いる検定に加えて、細胞を用いない検定システムを用いて、Ｔ１Ｒ３と相互作用する、たとえば、結合する化合物を特定することができる。そのような化合物は、Ｔ１Ｒ３活性の拮抗物質または作用物質として作用する可能性があるので、甘味知覚を調節するのに用いることができる可能性がある。
【００５０】
この目的のために、可溶性Ｔ１Ｒ３を組換えにより発現させて、細胞を用いない検定に用いて、Ｔ１Ｒ３に結合する化合物を特定することができる。以下の５．２項で述べるように調製したＴ１Ｒ３の１つまたは複数のドメインを含む組換えにより発現するＴ１Ｒ３ポリペプチドまたは融合タンパク質を細胞を用いないスクリーニング検定に用いることができる。たとえば、Ｔ１Ｒ３のリガンド結合および二量体化に関与すると考えられているアミノ末端ドメイン、システインに富むドメインおよび／または膜貫通ドメインに対応するペプチド、もしくはＴ１Ｒ３の１つまたは複数のドメインを含む融合タンパク質を、細胞を用いない検定システムを用いて、Ｔ１Ｒ３の一部に結合する化合物を特定することができる。そのような化合物は、Ｔ１Ｒ３のシグナル変換経路を変調するのに有用であると思われる。細胞を用いない検定において、組換えにより発現するＴ１Ｒ３を、当業者によく知られている手段（Ａｕｓｕｂｅｌら、前記を参照）により、試験管、ミクロタイターウエルまたはカラムのような基体に付着させることができる。次いで、試験化合物をＴ１Ｒ３に結合する能力について検定する。
【００５１】
Ｔ１Ｒ３タンパク質は、他の分子から完全または部分的に分離されたものであってよく、あるいは、粗または半精製抽出物の一部として存在していてもよい。非限定的な例において、Ｔ１Ｒ３タンパク質は、味覚受容体細胞膜の標本に存在する。本発明の特定の実施形態において、そのような味覚受容体細胞膜は、参照により本明細書に組み込まれているＭｉｎｇ  Ｄ．ら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻、８９３３〜８９３８頁に記載のように調製することができる。具体的には、ウシ有郭乳頭（「味覚組織」、味覚受容体細胞を含む）を用手切開し、液体窒素で凍結し、使用前に−８０℃で保存する。収集した組織を、１０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１０容量％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μｇ／μｌペプスタチンＡ、１０μｇ／μｌロイペプチン、１０μｇ／μｌアプロチニンおよび１０μＭ  ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホイルフルオリド塩酸塩を含む緩衝液中でＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（各２５，０００ＲＰＭで２０秒間の３サイクル）を用いてホモジナイズする。１，５００×ｇで１０分間遠心分離して粒子状物質を除去した後、４５，０００×ｇで６０分間遠心分離して、味覚膜を収集する。次いで、ペレット状の膜を２回洗浄し、プロテアーゼインヒビタを欠くホモジナーゼーション緩衝液に再懸濁し、２５ゲージ針に２０回通してさらにホモジナイズする。次いで、分割量をフラッシュ凍結するか、使用時まで氷上で保存する。他の非限定的な例として、味覚受容体を組換えクローンから得ることができる（Ｈｏｏｎ  Ｍ．Ｒ．ら、１９９９年、Ｃｅｌｌ、第９６巻、５４１〜５５１頁を参照）。
【００５２】
検定法はまた、Ｔ１Ｒ３発現を転写または翻訳レベルで調節する化合物をスクリーニングするようにデザインすることができる。１実施形態において、リポーター分子をコードするＤＮＡをＴ１Ｒ３遺伝子の調節エレメントに連結させて、適切な無処理の細胞、細胞抽出物または溶解産物に用いて、Ｔ１Ｒ３遺伝子発現を変調する化合物を特定することができる。適切な細胞または細胞抽出物は、通常、Ｔ１Ｒ３遺伝子を発現する細胞型から調製し、それにより、細胞抽出物がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写に必要な転写因子を含むようにする。スクリーニングを用いて、リポーター構成体の発現を変調する化合物を特定することができる。そのようなスクリーニングにおいては、リポーター遺伝子の発現のレベルを試験化合物の存在下で測定し、試験化合物の非存在下での発現のレベルと比較する。
【００５３】
Ｔ１Ｒ３翻訳を調節する化合物を特定するために、Ｔ１Ｒ３転写物を含む細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞溶解産物を、Ｔ１Ｒ３  ｍＲＮＡの翻訳の変調について試験してもよい。Ｔ１Ｒ３翻訳の阻害物質について検定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳抽出物中のＴ１Ｒ３  ｍＲＮＡの翻訳を変調する試験化合物の能力を検定する。
【００５４】
さらに、Ｔ１Ｒ３活性を調節する化合物を動物モデルを用いて特定することができる。行動的、生理学的または生化学的方法を用いて、Ｔ１Ｒ３の活性化が起こったかどうかを検討することができる。行動的および生理学的方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。行動測定の例として、試験活性化物質の存在下または非存在下での動物が組成物を自発的に摂取する傾向を測定することができる。もし試験活性化物質が動物におけるＴ１Ｒ３活性を誘導するならば、動物は、より多くの組成物を摂取することを促進すると思われる甘味を経験すると予想される。もし動物に甘味料のみ（Ｔ１Ｒ３を活性化する）を含む組成物または試験阻害物質と甘味料とを含む組成物を摂取するかどうかの選択権を与えるならば、動物は甘味料のみを含む組成物を摂取することを好むと予想される。したがって、動物が示す相対的好みは、Ｔ１Ｒ３受容体の活性化と逆相関する。
【００５５】
生理学的方法としては、味覚細胞を含む組織にｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能できるように接合された神経を用いて実施することができる神経応答試験がある。Ｔ１Ｒ３活性化をもたらす甘味料への曝露は味覚受容体細胞における活動電位を生じさせ、それが末梢神経を経て伝播されるので、甘味料に対する神経応答の測定は、とりわけ、Ｔ１Ｒ３活性化の間接的な測定である。舌咽神経を用いて実施された神経応答試験の例が、Ｎｉｎｏｍｉｙａ  Ｙ．ら、１９９７年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）、第２７２巻、Ｒ１００２〜Ｒ１００６頁に記載されている。
【００５６】
上述の検定法は、Ｔ１Ｒ３活性を変調する化合物を特定することができる。たとえば、Ｔ１Ｒ３活性に影響を及ぼす化合物は、Ｔ１Ｒ３に結合し、シグナル変換を活性化（作動物質）または活性化を阻害（拮抗物質）する化合物を含むが、これらに限定されない。Ｔ１Ｒ３遺伝子活性に影響を及ぼす化合物（Ｔ１Ｒ３遺伝子発現に影響を及ぼすことによる、全長または切断型のＴ１Ｒ３の発現を変調することができるように転写に影響を及ぼす、またはスプライシング事象を妨害する分子、たとえば、タンパク質または小有機分子を含む）も本発明のスクリーニングを用いて特定することができる。しかし、記載した検定法も、Ｔ１Ｒ３シグナル変換を変調する化合物を特定することができる（たとえば、その受容体への味覚物質（ｔａｓｔａｎｔ）の結合により活性化されたシグナルの変換に関与するＧタンパク質の活性の阻害物質または促進物質のような、下流のシグナル伝達事象に影響を及ぼす化合物）ことに留意すべきである。Ｔ１Ｒ３の下流のシグナル伝達事象に影響を及ぼし、それにより、味覚に対するＴ１Ｒ３の影響を変調するそのような化合物の特定と使用は、本発明の範囲内にある。
【００５７】
本発明によりスクリーニングすることができる化合物は、Ｔ１Ｒ３に結合し、天然味覚物質リガンドにより誘発された活性を模擬（すなわち、作用物質）、または、天然リガンドにより誘発された活性を阻害（すなわち、拮抗物質）する小有機または無機分子、ペプチド、抗体およびその断片、ならびに他の有機化合物を含むが、これらに限定されない。そのような化合物は、たとえば、発酵ブロス、チーズ、植物および菌類に存在するような天然に存在する化合物であってよい。
【００５８】
化合物は、たとえば、ランダムペプチドライブラリーのメンバー（たとえば、Ｌａｍ  Ｋ．Ｓ．ら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、第３５４巻、８２〜８４頁、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｒ．ら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、第３５４巻、８４〜８６頁を参照）を含むが、これらに限定されない可溶性ペプチドのようなペプチド、ならびにＤおよび／またはＬ立体配置アミノ酸からなるコンビナトリーケミストリーにより得られる分子ライブラリー、リンペプチド（ランダムまたは部分的に縮重し、誘導されたリンペプチドのメンバーを含むが、これらに限定されない）（たとえば、Ｓｏｎｙａｎｇ  Ｚ．ら、１９９３年、Ｃｅｌｌ、第７２巻、７６７〜７７８頁を参照）、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、人化、抗イディオタイプ、キメラまたは単鎖抗体ならびにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリー断片ならびにそのエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されない）および小有機または無機分子を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明によりスクリーニングすることができる他の化合物は、Ｔ１Ｒ３遺伝子またはＴ１Ｒ３シグナル変換経路に関与する他のいくつかの遺伝子の発現に影響を及ぼす（たとえば、遺伝子発現に関与する調節領域または転写因子と相互作用することにより）小有機分子、もしくはＴ１Ｒ３の活性またはたとえば、Ｔ１Ｒ３結合Ｇタンパク質のようなＴ１Ｒ３シグナル変換経路に関与する他のいくつかの細胞内因子の活性に影響を及ぼすような化合物を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
Ｔ１Ｒ３のモジュレーターを含む組成物およびそれらの使用
本発明は、上の５．５項に示すようにＴ１Ｒ３の活性化を測定することにより特定されるＴ１Ｒ３活性化物質のような、有効な量のＴ１Ｒ３活性化物質を対象に投与することを含む、対象の味覚組織を甘味料と接触させることによる甘味を誘発する方法を提供する。本発明はまた、有効な量のＴ１Ｒ３阻害物質を組成物に混入することを含む、組成物の甘味を阻害する方法を提供する。Ｔ１Ｒ３阻害物質の「有効な量」とは、甘味の知覚を主観的に低下させる、かつ／または、上述の検定法のうちの１つにより測定されるＴ１Ｒ３の活性化の検出可能な低下を伴う量である。
【００６１】
本発明はさらに、上の５．５項に示すように特定される甘味活性化物質のようなＴ１Ｒ３活性を活性化する化合物を含む組成物を投与することを含む、対象による甘味の知覚をもたらす方法を提供する。組成物は、対象により甘いと認識される味覚をもたらすのに有効な量の活性化物質を含んでいてよい。
【００６２】
したがって、本発明は、甘味活性化物質および甘味阻害物質を含む組成物を提供する。そのような組成物は、食品、飲料、薬剤、歯科用品、化粧品ならびに封筒および切手に使用される水和糊を含むが、これらに限定されない、対象の味覚組織と接触する可能性のある物質を含む。
【００６３】
本発明の一連の実施形態において、Ｔ１Ｒ３活性化物質は、食品または飲料甘味料として使用される。そのような例においては、本発明のＴ１Ｒ３活性化物質を食品または飲料に混入し、それにより、食品の炭水化物含量を増加させることなく、食品または飲料の甘味を増大させる。
【００６４】
本発明の他の実施形態において、甘味活性化物質は、共存する苦味物質に伴う苦味の知覚をうち消すために使用される。これらの実施形態において、本発明の組成物は苦味物質および甘味活性化物質を含み、甘味活性化物質が苦味の知覚を阻害する濃度で存在する。たとえば、組成物中の苦味物質の濃度および組成物中の甘味活性化物質の濃度を上の５．５項に開示するように検定に供する。
【００６５】
本発明は、甘味の知覚を増大させることにより、もしくは、苦味物質の忌避的効果を減弱または除去することにより、食品の味を改善するのに用いることができる。苦味物質が食品保存料である場合、本発明のＴ１Ｒ３活性化物質は、食品へのそれの混入を可能または促進し、それにより、食品の安全性を改善する。栄養補助食品として投与する食品については、本発明のＴ１Ｒ３活性化物質の混入により、摂取が促進され、それにより、対象への栄養またはカロリーの供給の点で、これらの組成物の有効性が増大する。
【００６６】
本発明のＴ１Ｒ３活性化物質は、医療用および／または歯科用組成物に混入することができる。造影剤や局所口腔麻酔薬のような、診断処置に用いられるある種の組成物は、不快な味を有している。本発明のＴ１Ｒ３活性化物質は、組成物の味を改善することにより、そのような処置を受ける対象の快適さを改善するのに用いることができる。さらに、本発明のＴ１Ｒ３活性化物質は、錠剤および液剤を含む薬剤組成物に混入して、それらの味を改善し、患者の遵守（特に、患者が小児またはヒト以外の動物である場合）を改善するために用いることができる。
【００６７】
本発明のＴ１Ｒ３活性化物質は、味の特徴を改善するために化粧品に含めてもよい。たとえば、限定の意図はないが、本発明のＴ１Ｒ３活性化物質は、美顔用化粧クリームおよび口紅に混入することができる。さらに、本発明のＴ１Ｒ３活性化物質は、在来の食品、飲料、薬剤または化粧品ではなく、味覚膜と接触する可能性がある組成物に混入することができる。例は、石けん、シャンプー、義歯接着剤、切手の表面および封筒用の糊および病害虫防除に用いられる有毒組成物（たとえば、ラットまたはゴキブリ毒物）を含むが、これらに限定されない。
【実施例】
【００６８】
Ｔ１Ｒ３遺伝子のクローニングおよび特徴付け
以下に示すデータは、新規の味覚受容体Ｔ１Ｒ３のＳａｃとしての同定を記述している。この同定は、以下の所見に基づいている。Ｔ１Ｒ３は、Ｓａｃに最も緊密に結合したＤ１８３４６マーカーに中心を置くヒトゲノムＤＮＡの百万ｂｐ領域に存在する唯一のＧＰＣＲである。Ｔ１Ｒ３の発現は狭く限定されており、味覚受容体細胞のサブセットにおいて高度に発現する。味覚受容体細胞におけるＴ１Ｒ３の発現は、甘味変換経路の既知および提唱されている要素（すなわち、α−ガストデューシンおよびＧγ１３）と大部分、重複している。Ｔ１Ｒ３は、プロテアーゼに対して感受性の高い、大きい細胞外ドメイン（甘味受容体の既知の性質）を有するファミリー３  ＧＰＣＲである。非常に明らかなことに、マウスのすべての味覚系統を非味覚系統と区別するＴ１Ｒ３の多形性が特定された。非味覚系統のＴ１Ｒ３は、その二量体化を妨げると予想されるＴ１Ｒ３の構造のモデリングに基づくＮ末端グリコシル化部位を含むと予測される。したがって、Ｔ１Ｒ３は、ｓａｃと同定されるだけでなく、Ｔ１Ｒ３のモデルとこの多形性変化に基づいて、甘味応答性（すなわち、甘味をリガンドとする）味覚受容体でもある。
【００６９】
遺伝子の同定
Ｄ１８３４６マーカーを含むマウス遺伝子（プソイドウリジンシンターゼ様）を同定するために、Ｄ１８３４６配列を、マウス発現配列標識（ｅｓｔ）データベースのＢｌａｓｔＮスクリーニングにおける検索配列として用いた。得られた各オーバーラップ配列の整合を反復的に用いて、ほぼ全長の遺伝子が決定されるまで、配列を延長した。得られたコンティグを翻訳し、予測された読み枠を、高処理能力ゲノム配列（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＨＴＧＳ）データベースのＴＢｌａｓｔＮ検索における検索配列として用いた。この検索により、ヒト相同分子種を含むヒトＢＡＣクローンＡＬ１３９２８７が位置決めされた。Ｇｅｎｓｃａｎを用いて、このクローンにおける遺伝子およびエキソンを予測した。ＮＲまたはｅｓｔデータベースのＢｌａｓｔＮまたはＴＢｌａｓｔＮ検索を用いて、このクローンおよび他のクローンにおける既知または未知遺伝子をさらに定義した。得られた予測される各遺伝子を、ＨＴＧＳのＴＢｌａｓｔＮまたはＢｌａｓｔＮ検索に用いて、重複ＢＡＣまたはＰＡＣクローンを発見した。重複配列の各々をＨＴＧＳのＢｌａｓｔＮ検索に用いて、この領域の非定序コンティグの構築を継続した。この検索から得られた予測遺伝子およびエキソンを用いて、Ｄ１８３４６マーカーを含むプソイドウリジンシンターゼ様遺伝子に中心を置くゲノム配列の百万塩基にわたり部分的に配列させた。２つのヒトクローンがＴ１Ｒ３、前述のＡＬ１３９２８７およびＡＣ０２６２８３を含むことが認められた。ヒトＴ１Ｒ３遺伝子は、最初にＧｅｎｓｃａｎにより予測され、その後、ヒト茸状味蕾ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよび／またはヒト味覚ライブラリーのスクリーニングにより確認された。上記の操作および検索に加えて、我々はアルゴリム（ゲノム配列における膜貫通スパンを認識するように設計された）を用いて、ヒト第１染色体のｐアーム上の１ｐｔｅｒから１ｐ３３までのヒトゲノムクローンのすべてを検索した（Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ第１染色体マッピングプロジェクト、ＦＣおよびＨＷ、未公表）。このスクリーニングにより、Ｔ１Ｒ３ならびにＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２が予測された。ヒトＴ１Ｒ１は、２０，０００ｂｐのＤ１８３４６マーカーおよびプソイドウリジンシンターゼ様遺伝子の範囲内にあり、この百万塩基領域における予測された唯一のＧＰＣＲである。
【００７０】
次いで、予測されたヒト遺伝子をＣｅｌｅｒａマウス断片ゲノムデータベースのＴＢｌａｓｔＮスクリーニングに用いた。一致した各断片を用いて、ギャップを埋め、反復ＢｌａｓｔＮ検索においてマウスＴ１Ｒ３相同分子種をさらに延長した。以下のマウス断片を用いて、マウスＴ１Ｒ３ゲノム配列を構築し、精密にした。ＧＡ＿４９５８８９８７、ＧＡ＿７２２８３７８５、ＧＡ＿４９９０４６１３、ＧＡ＿５０３７６６３６、ＧＡ＿７４４３２４１３、ＧＡ＿７０９１４１９６、ＧＡ＿６２１９７５２０、ＧＡ＿７７２９１４９７、ＧＡ＿７４０５９０３８、ＧＡ＿６６５５６４７０、ＧＡ＿７００３０８８８、ＧＡ＿５０４８８１１６、ＧＡ＿５０６８９７３０、ＧＡ＿７２９３６９２５、ＧＡ＿７２１５４４９０、ＧＡ＿６９８０８７０２。Ｇｅｎｓｃａｎを用いて、得られたゲノムコンティグからマウス遺伝子を予測した。予測されたマウスＴ１Ｒ３遺伝子は、マウス味蕾ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより確認された。Ｄ１８３４６に中心を置くヒトゲノム領域の他の遺伝子を用いて、Ｃｅｌｅｒａマウス断片データベースを検索した。これらの検索による配列を用いて、この領域のマウスゲノムコンティグを構築し、マウスゲノムにおけるＤ１８３４６とＴ１Ｒ３との連鎖ならびにこの領域におけるヒトおよびマウス遺伝子のマイクロシンテニーを確認した。Ｔ１Ｒ３の５’末端と糖脂質転換酵素様遺伝子の３’末端との間のゲノム配列の１つのギャップをＰＣＲにより架橋し、配列分析により確認した。
【００７１】
ノーザンハイブリッド形成
いくつかのマウス組織からＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて総ＲＮＡｓを分離し、レーン当たり２５μｇの各ＲＮＡを６．７％のホルムアルデヒドを含む１．５％アガロースゲル上での電気泳動にかけた。サンプルをナイロン膜に移し、ＵＶ照射により固定した。ブロットを、７％ＳＤＳおよび４０μｇ／ｍｌヘリング精子ＤＮＡを含む０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で５時間撹拌しながら前ハイブリッド形成した。３２Ｐ−放射性標識マウスＴ１Ｒ３プローブを用いた２０時間にわたるハイブリッド形成を同じ溶液中で行った。膜を５％ＳＤＳを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で６５℃で４０分間にわたり２回洗浄し、１％ＳＤＳを含む同じ緩衝液（ｐＨ７．２）で６５℃で４０分間にわたり２回、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで３０分間にわたり１回洗浄した。ブロットを二重増感板を用いてＸ線フィルムに８０℃で３日間曝露させた。３２Ｐ−標識マウスＴ１Ｒ３プローブは、（α−３２Ｐ）−ｄＣＴＰの存在下でエキソ（−）クレノウポリメラーゼを用いた５’末端コード配列に対応するマウスＴ１Ｒ３の１．３４ｋｂ  ｃＤＮＡのランダム９量体プライミングにより、発生させた。
【００７２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成
３３Ｐ−標識ＲＮＡプローブＴ１Ｒ３（２．６ｋｂ）およびα−ガストデューシン（１ｋｂ）をマウス舌組織の凍結切片（１０μｍ）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成に用いた。ハイブリッド形成および洗浄は、（２）に記載の通りであった。スライド標本をＫｏｄａｋ  ＮＴＢ−２核飛跡乳剤で被覆し、４℃で３週間曝露させた後、現像し、固定した。
【００７３】
遺伝子発現プロファイル作成
単一味覚受容体細胞ＲＴ−ＰＣＲ産物（５μｌ）を１．６％アガロースゲル上でサイズ別に分別し、ナイロン膜に移した。分離細胞の発現パターンを、マウスＴ１Ｒ３、α−ガストデューシン、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２およびＧ３ＰＤＨの３’末端ｃＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリッド形成により測定した。ブロットは、８０℃で５時間曝露させた。単一有郭乳頭および非味覚上皮の同様の大きさの断片からの総ＲＮＡｓも分離し、逆転写し、増幅し、個々の細胞の場合と同様に分析した。
【００７４】
免疫細胞化学
ヘモシアニン結合Ｔ１Ｒ３ペプチド（Ｔ１Ｒ３−Ａ、ａａ  ８２９−８４３）に対するポリクローナル抗血清をウサギにおいて産生させた。ＰＬＣ  β２抗体は、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。ヒト舌組織の１０μｍの厚さの凍結切片（あらかじめ４％パラホルムアルデヒドで固定し、２０％ショ糖で凍結保護した）をＰＢＳ中３％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％ヤギ血清および０．１％アジ化ナトリウムで室温で１時間ブロックし、次いで、α−ガストデューシンに対する精製抗体またはＴ１Ｒ３に対する抗血清とともに４℃で８時間インキュベートした（１：８００）。第２抗体は、Ｔ１Ｒ３に対するＣｙ３結合ヤギ抗ウサギＩｇおよびＰＬＣ  β２に対するフルオレセイン結合ヤギ抗ウサギＩｇであった。ＰＬＣ  β２およびＴ１Ｒ３免疫反応性を、抗血清のそれぞれ対応する１０μＭおよび２０μＭの合成ペプチドとのプレインキュベーションによりブロックした。免疫前血清は、免疫反応性を示さなかった。いくつかの切片を（４６）に記載の通りにＴ１Ｒ３およびＰＬＣ  β２で二重免疫染色した。その概要を述べると、切片をＴ１Ｒ３抗血清、抗ウサギＩｇ−Ｃｙ３結合物、正常抗ウサギＩｇ、ＰＬＣβ２抗体とともに順次、そして最後に抗ウサギＩｇ−ＦＩＴＣ結合物とともに、各段階の間に間欠的な洗浄の段階を設けて、インキュベートした。ＰＬＣβ２抗体を除く上記のすべてのものとともにインキュベートした対照切片は、緑色チャンネルにおいて蛍光を示さなかった。
【００７５】
ｍＴ１Ｒ３における配列多形性の同定
Ｃｅｌｅｒａマウス断片データベースから得られたマウスＴ１Ｒ３の配列に基づいて、読み取り枠を含む領域をコードするＤＮＡを増幅するようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。味覚乳頭から分離した総ＲＮＡまたは１味覚（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）および１非味覚（１２９／Ｓｖｅｖ）マウス系統から分離した各尾部ゲノムＤＮＡをそれぞれＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲを用いてマウスＴ１Ｒ３  ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを増幅するための鋳型として用いた。ＰＣＲ産物をＡＢＩ  ３１０自動シークエンサで完全に配列決定した。得られた配列に基づいて、４組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、２系統のマウス間で多形性が認められたＴ１Ｒ３領域を増幅した。マウスの系統ＤＢＡ／２、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＳＷＲおよびＦＶＢ／ＮのゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。アンプリコンを精製し、直接配列決定した。これらの系統のマウスの系統樹は、Ｈｏｇａｎら（４７）およびＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ）に基づくものであった。
【００７６】
Ｔ１Ｒ３の構造のモデリング
マウスＴ１Ｒ３およびマウスＧｌｕＲ１のアミノ末端ドメイン（ＡＴＤｓ）をＣｌｕｓｔａ１Ｗプログラム（４８）を用いて一列に並べた。配列を手作業で編集し、構造および機能に関する考察に基づいて、最適の配列を発生させた。ｍＧｌｕＲ１  ＡＴＤ結晶構造の原子座標（１９）をタンパク質データベースから得て、配列とともにモデリングの空間的制約の源として用いた。マウスＴ１Ｒ３の構造モデルは、ＭＯＤＥＬＬＥＲ（４９）プログラムを用いて発生させた。図７のオリジナルの画像をＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩおよびＷｅｂｌａｂ  Ｖｉｅｗｅｒプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．）を用いて作製し、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐに導入し、そこで開いた像を作製し、ラベルを加えた。
【００７７】
結果
マウスおよびヒトＳａｃ領域のマッピング
マウスＳａｃ遺伝子は、ショ糖、サッカリン、アセスルファム（ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ）、ズルチン、グリシンおよび他の甘味料に対する系統内優先反応の主要な決定因子である（９〜１２）が、Ｓａｃ遺伝子産物の分子的性質は不明である。味覚系統のマウスと非味覚系統マウスとで甘味料および甘味アミノ酸に対する味覚神経の異なる電気生理学的応答を示し、このことがＳａｃが末梢における甘味経路に対してその作用を及ぼすことの証拠となっている（１４、１８）。これらの差異の最も有力な説明は、甘味シグナル伝達経路の受容体、Ｇタンパク質サブユニット、エフェクター酵素または他のメンバーのような甘味応答性味覚変換エレメントをコードする遺伝子における対立遺伝子の差異である。甘味応答性受容体を修飾したＳａｃ遺伝子産物（１２）は、それ自体味覚受容体（１７）またはＧタンパク質サブユニット（１４）であったと推測された。Ｓａｃ遺伝子の性質の確認の第１段階として、我々はこの領域におけるヒトゲノムの近接マップを作製した。
【００７８】
４ｐｔｅｒのｓａｃ遺伝子座に最も近接して位置するマウスマーカーＤ１８３４６（１６）を初めとして、ｅｓｔデータベースから新規のマウス遺伝子が同定された。すなわち、Ｄ１８３４６は、プソイドウリジンシンターゼと相同性を有する新規のマウス遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に認められる。この研究を開始した時点では、ヒトゲノムの配列はほぼ完全であった（わずかに部分的に構成されたが）のに対して、マウスの配列はかなり不完全であり、したがって、完成したヒトゲノム配列とヒト染色体１ｐｔｅｒ（１ｐ３６．３３）（マウス４ｐｔｅｒとシンテニック）に位置することが知られている細菌人工染色体（ＢＡＣ）およびＰ１人工染色体（ＰＡＣ）クローンの未完成配列を、Ｄ１８３４６マーカーを含む新規のプソイドウリジンシンターゼ様遺伝子の相同分子種についてスクリーニングした。ＴｂｌａｓｔＮプログラムを用いて高処理能力ヒトゲノム配列（ＨＴＧＳ）データベース（ＮＣＢＩ）を検索して、プソイドウリジンシンターゼ様遺伝子のヒト相同分子種を含むＰＡＣクローンを同定した。これと重複ＰＡＣおよびＢＡＣクローンの配列の部分を含むヒトＨＴＧＳの反復Ｂｌａｓｔ検索により、我々はヒトゲノムＤＮＡ配列の約百万ｂｐに及ぶ６重複ＢＡＣまたはＰＡＣクローンの近接マップ（「コンティグ」）を作製することができた。
【００７９】
Ｇｅｎｓｃａｎ遺伝子予測プログラムを用いて、我々はこのコンティグ内の予測されたエキソンおよび遺伝子を同定した。「プソイドウリジンシンターゼ様」、「切断およびポリアデニル化様」および「糖脂質転移様」を含む２３種の遺伝子がこの領域において予測された（図１Ａ）。この領域内のいくつかの遺伝子は、他者により以前に同定および／または実験的に立証された（たとえば、ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ  １、ｄｖｌ１）。Ｃｅｌｅｒａマウスゲノムデータベースを検索し、この領域内の遺伝子のマウス相同分子種を同定し、マウスコンティグの全容を明らかにした（図１Ａ）。
【００８０】
Ｓａｃ領域内の新規の受容体Ｔ１Ｒ３の同定
Ｓａｃ領域における百万ｂｐのゲノムＤＮＡ配列のスクリーニングにおいて、予測された１つのＧＰＣＲ遺伝子のみが認められた。Ｔ１Ｒ３と称するこの遺伝子（味覚受容体については、メンバー３ファミリー）は、それがコードする予測されたタンパク質が味覚細胞内で発現する２つのオーファンＧＰＣＲｓである（１７）、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２と非常に類似しており、以下に示すように、味覚細胞内で特に発現することから、特に興味深いものであった。ヒトＴ１Ｒ３（ｈＴ１Ｒ３）は、Ｄ１８３４６マーカーを含むマウス遺伝子のヒト相同分子種であるプソイドウリジンシンターゼ様遺伝子から約２０ｂｐの位置にある（図１Ａ）。もしＴ１Ｒ３がＳａｃならば、それがＤ１８３４６に近接していることが、Ｆ２交雑および共通遺伝子マウスにおける以前に観察された、このマーカーとＳａｃ遺伝子座との間の交差型の確率が非常に低いこと（１６）と一致している。
【００８１】
ｈＴ１Ｒ３遺伝子のコード部分のイントロン／エキソン構造は、Ｇｅｎｓｃａｎにより４ｋｂにわたり、７エキソンを含むと予測された（図１Ｂ）。予測されたｈＴ１Ｒ３タンパク質の推測されるアミノ酸配列を確認し、さらに正確にするために、ヒト味覚ｃＤＮＡライブラリーから得られた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅ｈＴ１Ｒ３ｃＤＮＡｓからの複数の独立した生成物をクローンし、配列を決定した。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡｓのヌクレオチド配列、膜スパンニング領域の疎水性プロファイルおよびＴＭｐｒｅｄ予測（図１Ｃ）に基づいて、ｈＴ１Ｒ３は、７つの膜貫通らせんを含む８４３アミノ酸のタンパク質と大きい５５８アミノ酸長の細胞外ドメインをコードすると予測される。
【００８２】
対応するマウスＴ１Ｒ３（ｍＴ１Ｒ３）ゲノム配列をＣｅｌｅｒａマウスゲノム断片データベースから構成した。種々のマウス系統の味蕾ｍＲＮＡ由来の、いくつかの逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ発生マウスＴ１Ｒ３  ｃＤＮＡｓもクローンし、配列を決定した。Ｃ５７ＢＬ／６のマウスＴ１Ｒ３遺伝子のコード部分は、４ｋｂにわたり、６エキソンを含む。コードされるタンパク質は８５８アミノ酸長である。味覚系統と非味覚系統との多形性の差異とそれらの機能上の意義は、以下に述べる（図５および６ならびに関連する本文を参照）。
【００８３】
Ｔ１Ｒ３は、すべてが大きい細胞外ドメインを含む、ＧＰＣＲｓのファミリー３サブタイプのメンバーである。他のファミリー３サブタイプＧＰＣＲｓとしては、メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）、細胞外カルシウム感知受容体（ＥＣａＳＲ）、鋤鼻器において発現する候補フェロモン受容体（Ｖ２Ｒ）ならびにリガンド特異性が不明の２つの味覚受容体であるＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２などがある。Ｔ１Ｒ３は、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２と最も密接に関連しており、これらのオーファン味覚受容体のそれぞれと約３０％のアミノ酸配列の同一性を共有している（Ｔ１Ｒ１とＴ１Ｒ２は互いに約４０％同一である）。アミノ酸レベルでは、ｈＴ１Ｒ３は、ｍＧｌｕＲと約２０％同一で、ＥＣａＳＲと約２３％同一である。ファミリー３  ＧＰＣＲｓの大きいアミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）は、リガンド結合および二量体化と密接に関連づけられた（１９）。他のファミリー３  ＧＰＣＲｓと同様に、ｍＴ１Ｒ３は、アミノ末端シグナル配列、５７３アミノ酸の広範なＡＴＤ、複数の予測されるアスパラギン関連グリコシル化部位（そのうちの１つは高度に保存されている）およびいくつかの保存システイン残基を有する。これらのシステインの９つは、ＡＴＤを膜貫通ドメインを含む受容体の部分に連結している領域内にある。マウスの味覚および非味覚系統間の表現型の差異に対するｍＴ１Ｒ３のＡＴＤの関連性の有無については、以下に詳細に示す（図５および６ならびに関連する本文を参照）。
【００８４】
味覚組織および味蕾におけるＴ１Ｒ３  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現
味覚および非味覚組織におけるマウスＴ１Ｒ３の一般的分布を検討するために、マウスｍＲＮＡｓのパネルを用いてノーザンブロット分析を行った。７．２ｋｂ  ｍＲＮＡとハイブリッド形成したマウスＴ１Ｒ３プローブは、味覚組織に存在するが、味蕾を欠いている対照舌組織（非味覚）および検査した他のいくつかの組織においては発現しない（図２Ａ）。いくぶん大きい（約７．８ｋｂ）ｍＲＮＡ種が精巣で中程度のレベルで、脳で非常に低いレベルで発現した。より小さい（約６．７ｋｂ）ｍＲＮＡ種が胸腺で非常に低いレベルで発現した。７．２ｋｂの味覚発現転写物は分離ｃＤＮＡｓまたはＧｅｎｓｃａｎ予測エキソンよりも長く、付加的な非翻訳配列が転写物に存在している可能性があることが示唆される。
【００８５】
種々の組織におけるＴ１Ｒ３の発現のパターンの他の尺度として、Ｔ１Ｒ３およびＳａｃ領域における他の予測される遺伝子との強い一致について、発現配列標識（ｅｓｔ）データベースを検討した（図２Ｂ）。ｄｖｌ１、糖脂質変換酵素様、切断およびポリアデニル化様ならびにプソイドウリジンシンターゼ様遺伝子はそれぞれ、数種の組織のｅｓｔｓと多数の高度に有意な一致を示したが、Ｔ１Ｒ３は結腸のｅｓｔと単一の強い一致を示したにすぎなかった。ノーザンブロット分析と一致したこの結果は、Ｔ１Ｒ３の発現は高度に限定されており、ｅｓｔデータベースにおけるそのような過小表示のパターンは、Ｔ１Ｒ３が味覚受容体であることと一致していることを示唆している。
【００８６】
味覚組織におけるＴ１Ｒ３発現の細胞パターンを検討するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を実施したところ、Ｔ１Ｒ３は味覚受容体細胞において選択的に発現したが、周囲の舌上皮、筋肉または結合組織には存在しなかった（図３Ａ）。感覚プローブ対照は、舌組織との非特異的ハイブリッド形成を示さなかった（図３Ａ）。Ｔ１Ｒ３のＲＮＡハイブリッド形成シグナルは、α−ガストデューシンのそれよりも強かった（図３Ａ）。このことから、Ｔ１Ｒ３  ｍＲＮＡが味覚受容体細胞において極めて高度に発現することが示唆される。これは、明らかにα−ガストデューシンよりも低いレベルで発現するＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２  ｍＲＮＡに関する結果（１７）と対照的である。さらに、Ｔ１Ｒ３は茸状、葉状および有郭乳頭の味蕾において高度に発現するのに対して、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２  ｍＲＮＡはそれぞれ局所的に異なる発現パターンを示す（Ｔ１Ｒ１は茸状乳頭およびｇｅｓｃｈｍａｃｋｓｓｔｒｅｉｆｅｎ（「味覚線（‘ｔａｓｔｅ  ｓｔｒｉｐｅ’」）の味覚細胞において選択的に発現し、葉状乳頭の味覚細胞においてより少ない程度に発現するが、有郭乳頭の味覚細胞においてはほとんど発現せず、Ｔ１Ｒ２は一般的に有郭および葉状乳頭の味覚細胞において発現するが、葉状乳頭またはｇｅｓｃｈｍａｃｋｓｓｔｒｅｉｆｅｎの味覚細胞においてはほとんど発現しない）（１７）。
【００８７】
Ｔ１Ｒ３  ｍＲＮＡが味覚受容体細胞の特定のサブセットにおいて発現するかどうかを検討するために、発現プロファイル作成を用いた（３）。最初に、Ｔ１Ｒ３、α−ガストデューシン、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２およびＧ３ＰＤＨ  ｃＤＮＡｓのマウスクローンの３’領域のプローブを単一有郭乳頭のＲＴ−ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡｓとハイブリッド形成させ、非味覚舌上皮の同様な大きさの断片を用いた場合と比較した。この方法により、マウスＴ１Ｒ３は、α−ガストデューシン、Ｇγ１３およびＰＬＣβ２と同様に、味蕾を含む組織において発現するが、非味覚舌上皮では発現しないと判断された（図３Ｂ左）。個々の味覚細胞におけるこれらの遺伝子の発現のパターンを次にプロファイルした。すなわち、単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ生成物を上で用いたのと同じ組のプローブとハイブリッド形成させた。以前に検討したように（３）、１９種のα−ガストデューシン陽性細胞のすべてがＧβ３およびＧγ１３を発現し、これらの１９種の細胞のすべてがＰＬＣβ２も発現した（図３Ｂ右）。これらの１９種の細胞のうちの１２種（６３％）がＴ１Ｒ３も発現した。α−ガストデューシン／Ｇβ３／Ｇγ１３／ＰＬＣβ２陰性であった５種の細胞のうちの１種のみがＴ１Ｒ３を発現した。このことから、Ｔ１Ｒ３およびα−ガストデューシン／Ｇβ３／Ｇγ１３／ＰＬＣβ２の発現は、完全には一致しないが、大いに重複していると結論された。これは、α−ガストデューシン陽性細胞の約１５％がＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２陽性であった葉状乳頭の味覚受容体細胞に関する以前のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成結果（１７）と対照的である。
【００８８】
抗ｈＴ１Ｒ３抗体を用いた免疫細胞化学試験により、ヒト有郭（図４ＡＣ）および茸状（図４ＥＨ）乳頭における味覚受容体細胞の１／５がｈＴ１Ｒ３陽性であったことが示された。ｈＴ１Ｒ３免疫反応性がｈＴ１Ｒ３抗体の同族体ペプチドとのプレインキュベーションにより阻害された（図４Ｂ）。ｈＴ１Ｒ３陽性味覚細胞の縦断切片は、いわゆる明細胞に特有な細長い双極の形態を示し（多くがα−ガストデューシン陽性）、免疫反応性は味孔またはその近傍で最も顕著であった（図４ＡＣＥＨ）。ｈＴ１Ｒ３およびＰＬＣβ２に対する抗体で隣接切片を標識することにより、ｈＴ１Ｒ３よりもＰＬＣβ２に対して陽性の細胞が多いことがわかった（図４ＣＤ）。ｈＴ１Ｒ３およびＰＬＣβ２（図４ＥＦＧ）またはｈＴ１Ｒ３およびα−ガストデューシン（図４ＨＩＪ）に対する２重標識により、すべてではないが、多くの細胞が２重に陽性（より多くの細胞がｈＴ１Ｒ３に対してよりもＰＬＣβ２またはα−ガストデューシンに対して陽性であった）であることが示され、発現プロファイル作成の結果と一致していた。要約すると、Ｔ１Ｒ３  ｍＲＮＡおよびタンパク質は、味覚受容体について予想されるように、α−ガストデューシン／ＰＬＣβ２陽性味覚受容体細胞のサブセットにおいて選択的に発現する。
【００８９】
Ｔ１Ｒ３の１つの多形性の差異がＳａｃｂ非味覚表現型の説明となり得る
Ｓａｃｂ遺伝子座を有するＣ５７ＢＬ／６マウスおよび他のいわゆる味覚系統のマウスは、ＤＢＡ／２マウス（ｓａｃｄ）および他の非味覚系統と比較して、ヒトが甘いと特徴づけるいくつかの化合物（たとえば、ショ糖、サッカリン、アセスルファム、ズルチンおよびグリシン）に対して強い好みと大きい鼓索神経応答を示す（１０〜１２、１４、１５、１８）。味覚および非味覚系統のマウスのＴ１Ｒ３の推測されたアミノ酸配列を検討して、これらの表現型の差異の説明となり得る変化を探索した（図５Ａを参照）。検討した４つの非味覚系統のすべて（ＤＢＡ／２、１２９／Ｓｖｅｖ、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪ）が、それらの最新の共通祖先が１９００年代初期またはそれ以前にさかのぼる（図５Ｂを参照）にもかかわらず、同じヌクレオチド配列を有していた。４つの味覚系統のすべて（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＳＷＲ、ＦＶＢ／ＮおよびＳＴ／ｂｊ）が非味覚系統との４つのヌクレオチドの差異を共有していた。すなわち、ｎｔ１３５Ａ→Ｇ、ｎｔ１６３Ａ→Ｇ、ｎｔ１７９Ｔ→Ｃおよびｎｔ６５２Ｔ→Ｃ（味覚系統のｎｔを最初に示す）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは、他のすべての系統と異なっていた多くの位置も有していた（図５Ａを参照）が、これらの差異の多くはタンパク質コード領域における「サイレント」な交互のコドン変化か、顕著な影響を及ぼす可能性がないようなイントロン内の置換であった。２つのコード変化（特定の残基における単一文字のアミノ酸の変化として記述、味覚系統ａａを最初に示す）は、Ｔ５５ＡおよびＩ６０Ｔであった。Ｉ６０Ｔ変化は、Ｔ１Ｒ３のＡＴＤに新規のＮ−結合グリコシル化部位を導入すると予測されるので、特に興味をそそる差異である（以下を参照）。
【００９０】
味覚系統と非味覚系統とのＴ１Ｒ３タンパク質におけるこれらの２つのアミノ酸の差異の機能面の関連性を考察するために、Ｔ１Ｒ３のＡＴＤをＧＰＣＲｓのタイプ３サブセットの他のメンバーのＡＴＤと配列させ（図６）、関連ｍＧｌｕＲ１受容体の最近解明されたＡＴＤの構造（１９）に基づいてＴ１Ｒ３のＡＴＤをモデル化した（図７）。Ｔ１Ｒ３のＡＴＤは、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、ＣａＳＲおよびｍＧｌｕＲ１のＡＴＤとそれぞれ、２８、３０、２４および２０％の同一性を示す（図６）。ＡＴＤにおける約５７０残基のうちの５５残基が５つの受容体すべてにおいて同一であった。これらの保存残基には、予測されたＮ−結合グリコシル化部位がＴ１Ｒ３のＮ８５に含まれている。ｍＧｌｕＲ１との相同性に基づいて、二量体化に関与すると予測された領域は、ａａ  ５５〜６０、１０７〜１１８、１５２〜１６０および１７８〜１８１である（図６の破線枠内に示す）。Ｉ６０Ｔ味覚系統の非味覚系統への置換は、５つの受容体すべてに存在する保存Ｎ−結合グリコシル化部位から２７アミノ酸上流の新規のＮ−結合グリコシル化部位を導入すると予測される。Ｎ５８における新規のＮ−結合グリコシル化部位は、Ｎ８５における保存部位の正常なグリコシル化を妨害し、リガンド結合ドメインの構造を変化させ、受容体の二量体化の可能性を妨害するか、あるいは、Ｔ１Ｒ３機能に対して他のなんらかの影響を及ぼす可能性がある。
【００９１】
ｍＴ１Ｒ３の非味覚変異体のＮ５８におけるグリコシル化がタンパク質の機能を変化させると予想されるかどうかを検討するために、我々はｍＧｌｕＲ１のＡＴＤに基づいてそのＡＴＤをモデル化した（図７）。Ｔ１Ｒ３における二量体化の可能性のある領域は、ｍＧｌｕＲ１のそれと非常に類似しており、これらの領域におけるアミノ酸は、Ｔ１Ｒ３において二量体化が実際に起こる可能性があることを示唆するぴったりと合った接触表面を形成している。Ｔ１Ｒ３のＡＴＤの３次元構造のモデルから、我々は、Ｎ５８における新規のＮ−結合グリコシル化部位がＴ１Ｒ３の二量体化する能力に対して著しい影響を及ぼす可能性があることがわかる（図７Ｃ）。Ｎ５８におけるたとえ短い炭水化物基の付加（図７Ｃのモデルに三糖類部分が付加された）でさえも二量体の安定性に必要な少なくとも１つの接触表面を破壊すると思われる。したがって、もしＴ１Ｒ３が、ｍＧｌｕＲ１と同様に、二量体の形態（ホモ二量体またはヘテロ二量体）をとるならば、Ｎ５８における予測されるＮ−結合グリコシル基が、Ｔ１Ｒ３が自己ホモ二量体またはＴ１Ｒ３と同時発現する他のＧＰＣＲｓとの同じ二量体化界面を用いたヘテロ二量体を形成することを妨げると予想される。もし非味覚系統Ｔ１Ｒ３のＮ５８における新規の予測されるＮ−結合グリコシル化部位が利用されないならば、予測される二量体化の表面におけるＴ５５ＡおよびＩ６０Ｔ置換それ自体が二量体を形成するＴ１Ｒ３の能力に影響を及ぼす可能性がある。
【００９２】
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【００９３】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態により範囲を限定されないものである。実際、本明細書に記載されている形態に加えて、前記の説明と添付図面とから、本発明の様々な修正形態が当業者に明らかになるであろう。そのような修正形態は、添付の特許請求の範囲内に入るものとする。様々な参考文献が本明細書に引用されているが、その開示は、それらの全部が参照により組み込まれている。
【図１Ａ】
2010115201.tif 000002
【図１Ｃ】
2010115201.tif 000003
【図１Ｂ】
2010115201.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2010115201.tif 000006
【図３Ａ】
2010115201.tif 000007
【図３Ｂ】
2010115201.tif 000008
【図４】
2010115201.tif 000009
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図７】
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【図６】
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