(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた効果を有する育毛養毛剤と、この育毛養毛剤の有効成分に適したＮＴ−４発現阻害剤の提供。【解決手段】本発明のＮＴ−４発現阻害剤は、下記式2010241727.tif 000022で示される構造のダフナン（Daphnane）骨格を有する化合物を有効成分として含み、本発明の育毛養毛剤は該化合物を有効成分として含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（２）：
【化１】
2010241727.tif 000017
（式（２）中、１〜１７の数字は炭素原子の位置番号を示す。）
で示される構造のダフナン（Daphnane）骨格を有する化合物を有効成分として含むＮＴ−４発現阻害剤。
【請求項２】
前記ダフナン骨格を有する化合物が、下記一般式（３）：
【化２】
2010241727.tif 000018
（式（３）中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３はそれぞれ独立に水素、水酸基、アシルオキシ基のいずれかであり、Ｍｅはメチル基である。）
で表されるレシニフェロノール（Resiniferonol）であることを特徴とする請求項１に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【請求項３】
前記ダフナン骨格を有する化合物が、下記一般式（４）：
【化３】
2010241727.tif 000019
（式（４）中、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６はそれぞれ独立に水素、水酸基、アシル基、アシルオキシ基のいずれかであり、前記式（２）に示した位置番号９の炭素原子（以下、９位の炭素原子と記す場合もある）に結合しているエーテル基の末端のＲ７は、鎖状炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基、環状炭化水素基、環状不飽和炭化水素基であり、Ｍｅはメチル基である。）
で表されるレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（Resiniferonol 9,13,14-orthoester）であることを特徴とする請求項１に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【請求項４】
前記一般式（４）で表されるレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（Resiniferonol 9,13,14-orthoester）が、レシニフェロノール9,13,14-オルトフェニルアセテート（Resiniferonol 9,13,14-orthophenylacetate）およびチニアトキシン（Tinyatoxin）の少なくとも一つであることを特徴とする請求項３に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【請求項５】
前記ダフナン骨格を有する化合物が、下記一般式（５）：
【化４】
2010241727.tif 000020
（式（５）中、Ｒ８は水素、アシルオキシ基のいずれかであり、Ｒ９は水素、水酸基のいずれかであり、９位の炭素原子に結合しているエーテル基の末端のＲ１０は鎖状炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基、環状炭化水素基、環状不飽和炭化水素基のいずれかであり、Ｍｅはメチル基である。）
で表される6,7-エポキシレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（6,7-Epoxyresiniferonol 9,13,14-orthoester）であることを特徴とする請求項１に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【請求項６】
前記一般式（５）で表される6,7-エポキシレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（6,7-Epoxyresiniferonol 9,13,14-orthoester）が、フラトキシン（Huratoxin）、シンプレキシン（Simplexin）、ユアンフアシン（Yuanhuacine）、エクスコエカリアトキシン（Excoecariatoxin）、ゲンカダフニン（Genkwadaphnin）、ユアンフアジン（Yuanhuadin）、チメレアトキシン（Thymeleatoxin）から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項５に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【請求項７】
前記ダフナン骨格を有する化合物が、下記一般式（６）：
【化５】
2010241727.tif 000021
（式（６）中、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立に水素、水酸基、アシルオキシ基のいずれかであり、Ｒ１２はメチル基以外の有機基であり、Ｒ１６は水素、鎖状炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基のいずれかであり、Ｍｅはメチル基である。）
で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【請求項８】
前記一般式（６）で表される化合物が、グニジマクリン（Gnidimacrin）であることを特徴とする請求項７に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一つに記載のＮＴ−４発現阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする育毛養毛剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダフナン骨格を有する化合物を有効成分として含むＮＴ−４発現阻害剤、および該阻害剤を有する育毛養毛剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−４（本明細書では、ＮＴ−４と略記する場合もある）は、アポトーシス誘導を促進する蛋白質としても知られている。
【０００３】
アポトーシス誘導蛋白質としてのＮＴ−４は、最近の研究により動物の脱毛症に寄与していることが報告されている（非特許文献１）。脱毛症の発症原因、発症機序については多くの研究がなされており、いまだ不明な点が多いが、毛母細胞または／および周辺細胞におけるＮＴ−４の発現によりアポトーシスが促進され、脱毛症が生じることが確認されている。
【０００４】
本願発明者らは、本願に先立って、「アポトーシス誘導促進蛋白質の阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする育毛養毛剤」を提案している（特許文献１）。前記阻害物質としては、椿皮、九節菖蒲、レンゲソウ、アサクー、エクロニアなどの植物抽出物を特定している。この育毛養毛剤は、優れた育毛養毛効果を有し、かつ長期に亘る使用に十分耐え得る安全性を備えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２３２８２８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９９），１３（２）：３９５−４１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記育毛養毛剤の製品としての性能をさらに向上させるために、本発明者らが検討したところ、以下のような改良すべき点があることを知るに到った。
有効成分として用いる植物抽出物は、既知および未知の複数種の有機化合物から構成されていると推定される。それら構成成分の組成比および成分量が、各植物の産地や採集時期などの違いによって、変動することがある。そのため、植物の粗抽出物を有効成分として含有する育毛養毛剤では、その効果が採取時期や原料産地の違いによって、差が生じる場合がある。したがって、上記育毛養毛剤をより実用的なものとするためには、原料植物の種類やそれらの採取時期、産地の違いによって、育毛養毛効果に変動を生じないように改良することが望まれる。また、植物抽出物には、着色性と植物臭とがあり、製剤化する場合、有効成分としての植物抽出物の濃度の増加に伴って着色および植物臭の程度も上昇するため、植物抽出物の配合量を一定量以上に増加させることができず、ＮＴ−４発現阻害効果を高めることができない場合があった。
【０００８】
上記ＮＴ−４発現阻害作用を有する植物抽出物から採取時期や原料産地の違いによって影響を受けない安定した作用を示す化合物もしくは化合物群を特定できれば、それらは上述の神経伝達機構の研究用試薬として使用可能となる。
【０００９】
したがって、本発明の課題は、安定したＮＴ−４発現阻害作用を有し、着色および植物臭の低いＮＴ−４発現阻害剤、および該阻害剤を有する育毛養毛剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本願発明者らが鋭意実験、検討を重ねたところ、以下のような知見を得るに至った。
本発明者らは、上述のように本願発明に先立って、特定の植物の抽出物にＮＴ−４発現阻害作用があることを確認している。上記特定の植物抽出物を構成する化合物については不明な点が多いが、その含有が確認されている化合物も少なくない。そのような多種にわたる化合物を対象に後述する評価方法に基づいてＮＴ−４発現阻害率（％）を測定したところ、アサクー抽出物に含まれることが確認されているフラトキシンに高いＮＴ−４発現阻害作用があることを知るに至った。具体的には、アサクー有機溶媒（７０体積％エタノール）抽出物のＮＴ−４発現阻害率が１２％程度（サンプル濃度１ｐｐｍ）であるのに対して、フラトキシンのＮＴ−４発現阻害率はサンプル濃度１ｐｐｍで８９．６％、サンプル濃度０．１ｐｐｍで８５．６％という高い値を示した。
【００１１】
フラトキシンは化学式（１）で示される化合物である。フラトキシンの高いＮＴ−４発現阻害率は、その化学構造に由来していることが強く推測された。
【００１２】
【化１】
2010241727.tif 000002
フラトキシンの化学構造的特徴は、下記構造で示されるダフナン骨格を有する点にある。
【００１３】
【化２】
2010241727.tif 000003
（式（２）中、１〜１７の数字は炭素原子の位置番号を示す。）
そこで、ダフナン骨格を有する化合物（以下、ダフナン化合物と記す場合もある）として、市販品のあるチニアトキシン（Tinyatoxin）、チメレアトキシン（Tymeleatoxin）、レシニフェロノール9,13,14-オルトフェニルアセテート（Resiniferonol 9,13,14-orthophenylacetate）、エクスコエカリアトキシン（Excoecariatoxin）を入手し、それぞれについてＮＴ−４発現阻害率を測定したところ、フラトキシンと同様の高いＮＴ−４発現阻害率を示すことが確認された。さらに植物抽出物由来のダフナン化合物としてユアンフアシン（Yuanhuacine）、ユアンフアジン（Yuanhuadin）、ゲンカダフニン（Genkwadaphnin）、シンプレキシン（Simplexin）、グニジマクリン（Gnidimacrin）等についてもＮＴ−４発現阻害率を測定したところ、同様に高いＮＴ−４発現阻害率を示すことが確認された。
【００１４】
本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、下記構成を採用したＮＴ−４発現阻害剤および該阻害剤を有する育毛養毛剤を提供する。
【００１５】
[１]   下記式（２）：
【００１６】
【化３】
2010241727.tif 000004
（式（２）中、１〜１７の数字は炭素原子の位置番号を示す。）
で示される構造のダフナン（Daphnane）骨格を有する化合物を有効成分として含むＮＴ−４発現阻害剤。
【００１７】
[２]   前記ダフナン骨格を有する化合物が、下記一般式（３）：
【００１８】
【化４】
2010241727.tif 000005
（式（３）中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３はそれぞれ独立に水素、水酸基、アシルオキシ基のいずれかであり、Ｍｅはメチル基である。）
で表されるレシニフェロノール（Resiniferonol）であることを特徴とする、上記[１]に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【００１９】
[３]   前記ダフナン骨格を有する化合物が、下記一般式（４）：
【００２０】
【化５】
2010241727.tif 000006
（式（４）中、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６はそれぞれ独立に水素、水酸基、アシル基、アシルオキシ基のいずれかであり、前記式（２）に示した位置番号９の炭素原子（以下、９位の炭素原子と記す場合もある）に結合しているエーテル基の末端のＲ７は、鎖状炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基、環状炭化水素基、環状不飽和炭化水素基であり、Ｍｅはメチル基である。）
で表されるレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（Resiniferonol 9,13,14-orthoester）であることを特徴とする、上記[１]に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【００２１】
[４]  前記一般式（４）で表されるレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（Resiniferonol 9,13,14-orthoester）が、レシニフェロノール9,13,14-オルトフェニルアセテート（Resiniferonol 9,13,14-orthophenylacetate）およびチニアトキシン（Tinyatoxin）の少なくとも一つであることを特徴とする、上記[３]に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【００２２】
[５]   前記ダフナン骨格を有する化合物が、下記一般式（５）：
【００２３】
【化６】
2010241727.tif 000007
（式（５）中、Ｒ８は水素、アシルオキシ基のいずれかであり、Ｒ９は水素、水酸基のいずれかであり、９位の炭素原子に結合しているエーテル基の末端のＲ１０は鎖状炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基、環状炭化水素基、環状不飽和炭化水素基のいずれかであり、Ｍｅはメチル基である。）
で表される6,7-エポキシレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（6,7-Epoxyresiniferonol 9,13,14-orthoester）であることを特徴とする、上記[１]に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【００２４】
[６]  前記一般式（５）で表される6,7-エポキシレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（6,7-Epoxyresiniferonol 9,13,14-orthoester）が、フラトキシン（Huratoxin）、シンプレキシン（Simplexin）、ユアンフアシン（Yuanhuacine）、エクスコエカリアトキシン（Excoecariatoxin）、ゲンカダフニン（Genkwadaphnin）、ユアンフアジン（Yuanhuadin）、チメレアトキシン（Thymeleatoxin）から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、上記[５]に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【００２５】
[７]   前記ダフナン骨格を有する化合物が、下記一般式（６）：
【００２６】
【化７】
2010241727.tif 000008
（式（６）中、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立に水素、水酸基、アシルオキシ基のいずれかであり、Ｒ１２はメチル基以外の有機基であり、Ｒ１６は水素、鎖状炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基のいずれかであり、Ｍｅはメチル基である。）
で表される化合物であることを特徴とする、上記[１]に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
[８]  前記一般式（６）で表される化合物が、グニジマクリン（Gnidimacrin）であることを特徴とする、上記[７]に記載のＮＴ−４発現阻害剤。
【００２７】
[９]  上記［１］〜［８］のいずれか一つに記載のＮＴ−４発現阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする育毛養毛剤。
【００２８】
なお、本発明で言う「育毛養毛剤」とは、育毛および養毛を促進する作用を有し、ヘアートニック、ヘアークリームなどの具体的組成物に添加することにより、育毛養毛を促進する効果を付与した育毛養毛用組成物を調製するための薬剤を意味する。本発明の育毛養毛剤を含む育毛養毛用組成物を、哺乳類の主に頭皮に適用することにより、育毛養毛を促進する効果が得られる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明にかかるＮＴ−４発現阻害剤は、高いＮＴ−４発現阻害効果を安定的に有する化合物であるダフナン化合物を有効成分として含み、ＮＴ−４の発現そのものを阻害する作用を発揮する。
【００３０】
また、本発明にかかるＮＴ−４発現阻害剤は、上述のように高いＮＴ−４発現阻害効果を安定的に有する化合物であるダフナン化合物を有効成分として含み、ＮＴ−４の発現そのものを阻害する作用を発揮するので、ＮＴ−４に起因するアポトーシスの誘導を防止することができる。したがって、本発明に係るＮＴ−４発現阻害剤は、ＮＴ−４によるアポトーシスに起因して生体に生じる悪影響の予防、治療及び改善のために有用である。特に、毛包におけるＮＴ−４によるアポトーシスの誘導を防止することにより、哺乳類に対する育毛養毛効果を発揮することができる。その他にアポトーシスが関与していると考えられているアルツハイマー病や脳梗塞の予防および治療薬として、本発明に係るＮＴ−４発現阻害剤は有用であると考えられる。また、本発明にかかるＮＴ−４発現阻害剤が発揮するＮＴ−４発現阻害効果は、使用単位当たり、植物粗抽出物（水性有機溶媒抽出物）の約１００倍にも達するほどに増強される。そのため、所定の育毛養毛効果を得るための使用量を大幅に低減することができる。さらに、有効成分であるダフナン化合物は着色および植物臭が大変少なく、効果に対する使用量が植物抽出物に比べて少量で済むので、植物粗抽出物が有する植物臭および色素を起因とする育毛養毛剤の着臭、着色を容易に防止できるという効果も得られる。
【００３１】
ダフナン化合物は、現在のところ市販品もあるし、植物粗抽出物から分画精製して得る必要のあるものもある。これらのいずれのダフナン化合物も、本発明のＮＴ−４発現阻害剤の有効成分として用いることができる。
【００３２】
上述のように、本発明にかかるＮＴ−４発現阻害剤は、ＮＴ−４によるアポトーシスに起因して生体に生じる悪影響の予防、治療及び改善に有用であり、哺乳類の脱毛症、特に男性型脱毛症を改善すると共に、長期に亘る使用に十分耐え得る安全性を備えているので、使用感の良好な育毛養毛剤の有効成分として産業的価値を有し、医療組成物や毛髪化粧料などの育毛養毛用組成物として利用することができる。さらに、本発明にかかるＮＴ−４発現阻害剤は、育毛養毛剤としての利用の他に、アポトーシスに起因して生体に生じると推測されるアルツハイマー病や脳梗塞の予防および治療薬として有用であると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下に、本発明の実施形態について説明する。
本発明のＮＴ−４発現阻害剤の有効成分として用いるダフナン化合物は、先に示した化学式（２）に示した構造を骨格に有する化合物である。かかるダフナン化合物としては、下記化学式（７）に示すように前記位置番号１１の炭素原子にメチル基が結合したものが多数を占めている。
【００３４】
【化８】
2010241727.tif 000009
（式（７）中、Ｍｅはメチル基を示し、１〜１８の数字は炭素原子の位置番号を示す。）
【００３５】
上記化学式（７）示すような位置番号１１の炭素原子にメチル基が結合したダフナン化合物としては、下記一般式（３）〜（５）に示す化合物が挙げられ、位置番号１１の炭素原子にメチル基以外の有機基が結合したダフナン化合物としては、下記一般式（６）で示した化合物が挙げられる。
これら一般式（３）〜（６）で示される化合物群から選ばれる少なくとも１種を本発明のＮＴ−４発現阻害剤の有効成分として用いることができる。
【００３６】
【化９】
2010241727.tif 000010
（式（３）中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３はそれぞれ独立に水素、水酸基、アシルオキシ基のいずれかであり、Ｍｅはメチル基である。）
この化合物はレシニフェロノール（Resiniferonol）と命名されている。
【００３７】
【化１０】
2010241727.tif 000011
（式（４）中、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６はそれぞれ独立に水素、水酸基、アシル基、アシルオキシ基のいずれかであり、前記式（２）に示した位置番号９の炭素原子に結合しているエーテル基の末端のＲ７は、鎖状炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基、環状炭化水素基、環状不飽和炭化水素基であり、Ｍｅはメチル基である。）
【００３８】
前記一般式（４）で表されるダフナン化合物は、レシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（Resiniferonol 9,13,14-orthoester）と命名されており、具体例としては、例えば、レシニフェロノール9,13,14-オルトフェニルアセテート（Resiniferonol 9,13,14-orthophenylacetate）およびチニアトキシン（Tinyatoxin）を挙げることができる。これらの一つをＮＴ−４発現阻害剤の有効成分として用いてもよいし、これら二つを同時に用いてもよい。
【００３９】
【化１１】
2010241727.tif 000012
（式（５）中、Ｒ８は水素、アシルオキシ基のいずれかであり、Ｒ９は水素、水酸基のいずれかであり、９位の炭素原子に結合しているエーテル基の末端のＲ１０は鎖状炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基、環状炭化水素基、環状不飽和炭化水素基のいずれかであり、Ｍｅはメチル基である。）
この化合物は、6,7-エポキシレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（6,7-Epoxyresiniferonol 9,13,14-orthoester）と命名されている。
【００４０】
前記一般式（５）で表される6,7-エポキシレシニフェロノール9,13,14-オルトエステル（6,7-Epoxyresiniferonol 9,13,14-orthoester）の具体例としては、例えば、フラトキシン（Huratoxin）、シンプレキシン（Simplexin）、ユアンフアシン（Yuanhuacine）、エクスコエカリアトキシン（Excoecariatoxin）、ゲンカダフニン（Genkwadaphnin）、ユアンフアジン（Yuanhuadin）、チメレアトキシン（Thymeleatoxin）が挙げられる。これらの一つをＮＴ−４発現阻害剤の有効成分として用いてもよいし、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４１】
【化１２】
2010241727.tif 000013
（式（６）中、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立に水素、水酸基、アシルオキシ基のいずれかであり、Ｒ１２はメチル基以外の有機基であり、Ｒ１６は水素、鎖状炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基のいずれかであり、Ｍｅはメチル基である。）
この化合物の具体例としてグニジマクリン（Gnidimacrin）が挙げられる。
【００４２】
（育毛養毛剤）
本発明にかかる育毛養毛剤は、上記ダフナン化合物を有効成分として含むＮＴ−４発現阻害剤を有効成分として有することを特徴とする。
上記有効成分であるダフナン化合物を植物粗抽出物を液体クロマトグラフィーを用いて分画精製することにより得る場合では、最終溶離溶媒が、エタノール、水／エタノール（含水エタノール）等の非毒性の溶媒である場合、溶出物を育毛養毛剤の有効成分としてそのまま用いても良く、あるいは上記抽出溶媒をさらに希釈液として用いて希釈してもよい。なお、ダフナン化合物の最終溶離溶媒として上記以外の溶媒を用いた場合は、溶媒を留去後、乾燥分を非毒性の溶媒で希釈して用いることが望ましい。
【００４３】
本発明の育毛養毛剤を、ヘアートニック、ヘアクリームなどの具体的組成物に添加することにより、その具体的組成物に養毛育毛効果を付与した育毛養毛組成物を得ることができる。
【００４４】
本発明の育毛養毛剤を具体的組成物に添加する場合、各組成物中における育毛養毛剤の配合量は、その製品形態、使用頻度により異なり一概に規定することはできないが、通常製剤全体に対してダフナン化合物換算で１０−７〜１．０質量％（以下、％と略称する）、より好ましくは０．０００１〜１．０％である。１０−７％より少ないと十分な効果が期待できず、また１．０％を超えると効果が頭打ちになったり、製剤の安定性および使用感の面で不具合が発生したりする可能性があるためである。
【００４５】
本発明の育毛養毛組成物は、さらに炭素鎖長が１１、１３、１５、および１７の奇数鎖脂肪酸からなる群より選ばれる少なくとも１種の脂肪酸を含むことが好ましい。前記脂肪酸を含むことにより、相乗的な育毛養毛効果を得ることができるためである。これら脂肪酸の濃度としては０．０００５〜５０％、特に０．２５〜２５％が好ましい。０．０００５％より少ないと十分な効果が期待できず、また５０％を超えると効果が頭打ちになったり、製剤の安定性の面で不具合が発生したりする可能性があるためである。
【００４６】
本発明の育毛養毛用組成物は、更に、既存の育毛養毛成分を含有してもよい。既存の養育毛成分としては、ＰＤＧ（ペンタデカン酸グリセリド）、特開平０９−１５７１３６号公報記載のコレウスエキス、特開平１０−４５５３９号公報記載のゲンチアナエキス、マツカサエキス、ローヤルゼリーエキス、クマザサエキスなどの化学物質及びエキス類を挙げることができる。中でも、育毛養毛効果の点から、ＰＤＧ、コレウスエキスが好ましい。
【００４７】
前記既存の育毛養毛成分として例示した化学物質及びエキス類は、市販品あるいは公知の方法によって得られたものを使用することができる。特に、前記エキス類は植物成分の抽出により得ることができる。この場合、抽出に用いる溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類などが挙げられ、これらは一種を単独で又は２種以上の混合物として用いることができる。抽出方法は、通常の植物エキスの抽出法などの方法に準じて行えばよく、必要により公知の方法で脱臭、脱色等の処理を施してから用いてもよい。また、市販の抽出物も用いることができる。
【００４８】
また、本発明の育毛養毛剤には、使用目的に応じて、上記有効成分であるＮＴ−４発現阻害剤以外の任意の成分を配合することができる。そのような成分としては、例えば、精製水、エタノール、非イオン性界面活性剤，糖質系界面活性剤およびその他の界面活性剤セルロース類、油脂類、エステル油、高分子樹脂、色剤、香料、紫外線吸収剤やビタミン類、ホルモン類、血管拡張剤、アミノ酸類、抗炎症剤、皮膚機能亢進剤、角質溶解剤等の薬効成分などを挙げることができる。
【００４９】
前記セルロース類としては、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース等が挙げられる。
【００５０】
前記界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油モノまたはイソステアレート、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル（モノミリスチン酸デカグリセリン、モノミリスチン酸ペンタグリセリン）等が挙げられる。
【００５１】
前記油脂類としては、例えば、多価アルコール脂肪酸エステル（トリ−２エチルヘキサン酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン酸等）、サフラワー油、月見草油、ホホバ油等が挙げられる。
【００５２】
前記エステル油としては、例えば、不飽和脂肪酸アルキルエステル（オレイン酸エチル、リノール酸イソプロピル等）、ミリスチン酸メチル、ミリスチン酸イソプロピル等が挙げられる。
【００５３】
前記アミノ酸類としては、例えば、メチオニン、セリン、グリシン、シスチン等が挙げられる。
【００５４】
前記角質溶解剤としては、例えば、サリチル酸、レゾルシン等が挙げられる。
【００５５】
前記高分子樹脂としては、例えば、両性、カチオン性、アニオン性及びノニオン性ポリマー等が挙げられる。
【００５６】
前記紫外線吸収剤としては、例えば、メトキシケイ皮酸オクチル（ネオヘリオパンＡＶ）、オキシベンゾン、ウロカニン酸等が挙げられる。
【００５７】
本発明の育毛養毛剤に、その他蛋白質を配合する場合は、任意の量で配合できる。
【００５８】
本発明の育毛養毛剤の適用分野（具体的組成物）としては、各種の外用製剤類（動物用に使用する製剤も含む）全般が挙げられる。具体的には、カプセル状、粉末状、顆粒状、固形状、液状、ゲル状、軟膏状、或いは気泡性の（１）医薬品類、（２）医薬部外品類、（３）局所又は全身用の皮膚化粧品類、（４）頭皮・頭髪に適用する薬用及び／又は化粧用の製剤類（例えば、シャンプー剤、リンス剤、トリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料など）が挙げられる。
【００５９】
本発明の育毛養毛剤を有効成分として含む育毛養毛組成物としては、上述のように育毛養毛用毛髪化粧料及び育毛養毛用医薬品が挙げられるが、これら前記育毛養毛用毛髪化粧料及び育毛養毛用医薬品には、本発明の効果を損なわない範囲において、既知の薬効成分を必要に応じて適宜配合することができる。既知の薬効成分としては、例えば、抗菌剤、抗炎症剤、保湿剤等を配合することができる。
【００６０】
本発明の育毛養毛剤を有効成分として含む育毛養毛用毛髪化粧料及び育毛養毛用医薬品は、常法に従って均一溶液、ローション、ジェルなどの形態で外用により使用することができる。また、本発明の養育毛用毛髪化粧料は、エアゾールの形態をとることができ、その場合には、前記成分以外に、ｎ−プロピルアルコールまたはイソプロピルアルコールなどの低級アルコール：ブタン、プロパン、イソブタン、液化石油ガス、ジメチルエーテル等の可燃性ガス：窒素ガス、酸素ガス、炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等の圧縮ガスを含有することができる。 
【実施例】
【００６１】
以下、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００６２】
以下に示す実施例及び比較例においては、各例で得られたサンプルのＮＴ−４発現阻害率を測定しているが、それらは以下の方法により測定したものである。
【００６３】
（ＮＴ−４阻害率の測定方法）
まず、ＮＴ−４上流配列約２０００ｂｐ（配列番号１）を、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ (Ｐｒｏｍｅｇａ社製)にサブクローニングを行う。得られたプラスミドを、内部標準としてのｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とともに、ＨｅＬａ細胞に導入する。これを所定の培地中で１日培養後、その培地を、測定用の各サンプルの各１ｐｐｍと１０−７Ｍ ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＴ）とを含む培地に交換する。
【００６４】
コントロール群としてはＤＨＴを含まない培地を用いる。また、ＤＨＴ添加群を基準対照群として用いる。このＤＨＴ添加群としては、各サンプルを含まない代わりに０．１体積％エタノールと１０−７Ｍ  ＤＨＴとを含む培地を用いる。
【００６５】
次に、上記各培地を２４時間培養した後、各サンプル群、ＤＨＴ添加群およびコントロール群に対して、デュアル−ルシフェラーゼ  レポーター  アッセイ  システム（Dual-Luciferase Reporter Assay System：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼアッセイ（Luciferase assay）を行う。このルシフェラーゼアッセイは、１０％チャコール処理済ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's Medium、フェノールレッド不含）培地で行う。
【００６６】
上記ルシフェラーゼアッセイにより各サンプルのルシフェラーゼ相対活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）が算出される。このルシフェラーゼ相対活性は、ＮＴ−４上流配列とpGL3-basicのサブクローニングにより得られたベクターにより発現するホタルルシフェラーゼの活性値を、内部標準として導入したpRL-SV40により発現するウミシイタケルシフェラーゼの活性値で除することにより求められる。このルシフェラーゼ相対活性（ＮＴ−４発現率）から下記の式を用いてＮＴ−４発現阻害率（％）を算出する。
NT-4発現阻害率(%)＝[１−(RLASamp−RLACont)/(RLADHT−RLACont)]×１００
・・・・・・（１）
式（１）中、RLACont:コントロール群のNT-4発現率
RLADHT:DHT添加群のNT-4発現率
RLASamp:各サンプル添加群のNT-4発現率
【００６７】
（ユアンフアシン（Yuanhuacine）およびユアンフアジン（Yuanhuadin）の調製）
文献情報（Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13(3), p645-655, 2005）に従って、以下のようにしてユアンフアシン（Yuanhuacine）およびユアンフアジン（Yuanhuadin）を調製した。
【００６８】
芫花（ゲンカ、Daphne genkwaの花蕾）を破砕し、２０倍量のエタノール（濃度９５％以上）を加え一昼夜撹拌後、減圧乾固して固形の抽出物を得た。次に、得られたゲンカのエタノール抽出物をクロロホルム／水で液液分画し、クロロホルム層を採取した。
【００６９】
得られたクロロホルム層を、シリカゲルカラムを用いて極性分画した。溶離溶媒としては石油エーテルにアセトンを徐々に混合し、溶離してくるＦｒ−ａ１からＦｒ−ａ５までの画分を採取した。
【００７０】
分画物Ｆｒ−ａ１（１番目の画分）について、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。溶離液として石油エーテル／アセトン（６／１）を用い、紫外線吸収（２６０ｎｍ）でモニターしながら、ユアンフアシン（Yuanhuacine）およびユアンフアジン（Yuanhuadin）を分取した。
【００７１】
（ゲンカダフニン（Genkwadaphnin）の調製）
文献情報（Journal of Ethnopharmacology, 111, p496-503, 2007）に従って、以下のようにしてゲンカダフニン（Genkwadaphnin）を調製した。
芫花（ゲンカ、Daphne genkwaの花蕾）を破砕し、１０倍量のメタノール（濃度９５％以上）を加え一昼夜撹拌後、減圧乾固して固形の抽出物を得た。次に、得られたメタノール抽出物を水に懸濁し、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチルを順に添加して抽出した。
【００７２】
クロロホルム分画物を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。溶離液としては、クロロホルムとメタノールの混合比を徐々に変化させ、溶離してくるＦｒ−ｂ１からＦｒ−ｂ１０までの画分を採取した。
【００７３】
３番目の画分（Ｆｒ−ｂ３）を逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（「Ｃ１８カラム」島津製作所社製）に供し、移動相としてメタノール／水（７／３）を用いた。溶出してくる画分を順にＦｒ−ｂ３−１からＦｒ−ｂ３−１０まで（１０画分）採取した。
【００７４】
次に、３番目の画分（Ｆｒ−ｂ３−３）をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、ヘキサン/酢酸エチル（１５／１）にて溶離してくる画分を順に１４画分採取した。
【００７５】
１１番目の画分（Ｆｒ−ｂ３−３−１１）を逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（「Ｃ１８カラム」島津製作所社製）に供し、メタノール/水（３／１）にて溶出するゲンカダフニンを分取した。
【００７６】
（フラトキシン（Huratoxin）、シンプレキシン（Simplexin）およびグニジマクリン（Gnidimacrin）の調製）
文献情報（東邦医学会雑誌, 38(6), p896-909, 1992）に従って、以下のように精製した。
瑞香狼毒（Stellera chamaejasme）の根部を破砕し、５倍量のメタノール（濃度９５％以上）を加え８時間加熱抽出後、減圧乾固して固形の抽出物を得た。
【００７７】
得られたエタノール抽出物に石油エーテルを加えて５時間抽出し、減圧乾固して固形の石油エーテル抽出物を得た。次に、得られた石油エーテル抽出物を、ヘキサン/酢酸エチル（４／１→２／１→１／１→１／４）を移動相としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、紫外線吸収（２６０ｎｍ）でモニターしながら、溶離してくる画分を順に４画分Ｆｒ−ｃ１からＦｒ−ｃ４を採取した。
【００７８】
４番目の画分（Ｆｒ−ｃ４）を、メタノール／水（１０／１）を移動相として、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（「Ｃ１８カラム」和光純薬社製）に供した。紫外線吸収（２２８ｎｍ）にてモニターしながら、溶離するフラトキシン、グニジマクリンとシンプレキシンを分取した。
【００７９】
（その他のダフナン化合物（市販品））
チニアトキシン（Tinyatoxin）、チメレアトキシン（Tymeleatoxin）、レシニフェロノール9,13,14-オルトフェニルアセテート（Resiniferonol 9,13,14-orthophenylacetate）、エクスコエカリアトキシン（Excoecariatoxin）は、それぞれ市販品があるので、下記それぞれの製造会社から入手した。
【００８０】
チニアトキシン（Tinyatoxin）：MP Biomedicals社製、商品名「Tinyatoxin」
チメレアトキシン（Tymeleatoxin）：SIGMA社製、商品名「Tymeleatoxin」
レシニフェロノール9,13,14-オルトフェニルアセテート（Resiniferonol 9,13,14-orthophenylacetate）：MP Biomedicals社製、商品名「Resiniferonol 9,13,14-orthophenylacetate」
エクスコエカリアトキシン（Excoecariatoxin）：Herbstandard社製、商品名「Excoecariatoxin」
【００８１】
上述のようにして準備した１０種類のダフナン化合物を先に述べたＮＴ−４発現阻害率測定法により測定した。その結果を下記（表１）に示す。
【００８２】
【表１】
2010241727.tif 000014
【００８３】
上記（表１）から明らかなように、ダフナン化合物のＮＴ−４発現阻害率（サンプル濃度：１ｐｐｍ）は４３．６〜９７．９％という非常に高い値を示している。
【００８４】
（ダフナン化合物を有効成分とするＮＴ−４発現阻害剤を有効成分として有する育毛養毛剤の育毛養毛効果の評価）
（育毛養毛効果の評価方法）
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）を用い、小川らの方法（フレグランスジャーナル，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．５，ｐ２０−２９，１９８９．参照）を参考にして実験を行った。マウスの背部体毛を約２〜４ｃｍの大きさに電気バリカン及び電気シェーバーにて除毛し、毛髪成長期を誘導した。除毛後、ＤＨＴ３０ｍｇを皮下に投与した。翌日より１日１回１００μＬずつ週５回、３０日間サンプル塗布を行い、除毛部分に対し毛再生が始まった部分の面積比の変化を求め、下記１０段階評価にて、毛再生の早さの比較を行った。
【００８５】
サンプルとしては、前記１０種類のダフナン化合物のエタノール溶液を用いた。サンプル量はダフナン化合物換算で０．０１質量％とした。また、比較例としてアサクーの７０体積％エタノール抽出物を用い、コントロール群には、溶媒であるエタノールの５０％水溶液を用いた。各群ともに１群６匹として実験に供した。除毛、皮下投与後から、下記発毛スコアが５点に至るまでに要した日数を（表２）に示す。
【００８６】
（育毛養毛効果の評価基準）
除毛された部分の全体面積に対する毛再生が始まった部分の面積の割合（％）に下記点数を付して、点数（発毛スコア）の大きさによって、育毛養毛効果を評価した。
（点数）：（毛再生面積率（％））
０点：０〜４％
１点：５〜１４％
２点：１５〜２４％
３点：２５〜３４％
４点：３５〜４４％
５点：４５〜５４％
６点：５５〜６４％
７点：６５〜７４％
８点：７５〜８４％
９点：８５〜９４％
１０点：９５〜１００％
【００８７】
【表２】
2010241727.tif 000015
【００８８】
（表２）に見るように、ダフナン化合物を含む育毛養毛剤の育毛養毛効果がコントロール群に比べて格段に優れていることが分かる。また、ダフナン化合物の着色度および植物臭は極めて低い値であるので、その配合量の上限は効果の点を考慮して自由に設定することが可能である。
【００８９】
上記育毛養毛効果の確認に供した育毛養毛剤としては、ダフナン化合物を溶剤に溶解させた単純な構成の溶液を用いた。以下に、かかる育毛養毛剤を実際の育毛養毛組成物に適用した処方例を示す。
【００９０】
【表３】
2010241727.tif 000016
【産業上の利用可能性】
【００９１】
以上のように、本発明にかかるＮＴ−４発現阻害剤は、高いＮＴ−４発現阻害効果を安定的に有する化合物であるダフナン化合物を有効成分として含み、ＮＴ−４の発現そのものを阻害する作用を発揮する。
また、本発明にかかるＮＴ−４発現阻害剤は、ＮＴ−４に起因するアポトーシスの誘導を防止することができるので、ＮＴ−４によるアポトーシスに起因して生体に生じる悪影響の予防、治療及び改善のために有用である。特に、毛包におけるＮＴ−４によるアポトーシスの誘導を防止することにより、哺乳類に対する育毛養毛効果を発揮することができる。
また、本発明にかかる育毛養毛剤は、前記本発明にかかるＮＴ−４発現阻害剤を有効成分として有しているので、哺乳類の脱毛症、特に男性型脱毛症を改善すると共に、長期に亘る使用に十分耐え得る安全性を備え、使用感の良好な育毛養毛剤である。
【配列表】
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