(57)【要約】      （修正有）【課題】熱安定性に優れた新たなフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、およびこれを利用した技術を提供する。【解決手段】タンパク質は、アスペルギルス・ニードランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）及び、フェオスフェリア・ノドルム(Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａｎｏｄｏｒｕｍｕ）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有する変異タンパク質であり、上記タンパク質のアミノ酸配列のの複数の特定の位置のアミノ酸の少なくとも何れか１つが置換されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列においてアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンの少なくとも何れか１つが置換されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ末端から５２番目、６５番目、６６番目および２８６番目のアミノ酸以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する相同性が７０％以上であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸の少なくとも何れか１つが、配列番号１に示されるアミノ酸配列における該何れか１つのアミノ酸と対応する位置のアミノ酸と異なるアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ｄ）〜（ｉ）の何れかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質：
（ｄ）配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｅ）配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｆ）配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｇ）配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｈ）配列番号２３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｉ）アミノ酸配列（ｄ）〜（ｈ）においてアミノ末端から５２番目、６５番目、６６番目および２８６番目のアミノ酸以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の（ｊ）〜（ｎ）の何れかに記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド：
（ｊ）配列番号１６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号２２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸の少なくとも何れか１つが、配列番号１に示されるアミノ酸配列における該何れか１つのアミノ酸と対応する位置のアミノ酸と異なるアミノ酸配列からなるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３から５の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養する工程を包含することを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項９】
フルクトシルアミノ酸の測定方法であって、
糖化アミンに請求項１または２に記載のタンパク質を作用させる工程を包含することを特徴とする測定方法。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のタンパク質を備えていることを特徴とする糖化タンパク質測定キット。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のタンパク質を備えていることを特徴とする糖化タンパク質測定センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化タンパク質、特に糖化ヘモグロビンの測定に有用なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびその利用法に関する。より具体的には、熱安定性が向上したフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびその利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者の血糖の測定には、血液タンパク質に含まれる糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）またはグリコアルブミンを血糖コントロールマーカーとして測定する方法が重用されている。糖化タンパク質は、血液中に存在するＤ−グルコースと、血液タンパク質を構成するアミノ酸残基とが反応して生成される。血液タンパク質における主な糖化部位は、リジン残基のε−アミノ基および血液タンパク質のアミノ末端アミノ酸のα−アミノ基である。ＨｂＡ１ｃを測定する場合には、Ｄ−グルコースがヘモグロビンβ鎖のアミノ末端アミノ酸であるバリンのα−アミノ基に結合して生じた糖化タンパク質の量を測定する。
【０００３】
近年、血液中の糖化タンパク質を簡便かつ短時間で測定できる酵素的測定法が開発され、既に商品化されている。酵素的測定法を利用することにより、糖化タンパク質をハイスループットに測定することが可能となり、臨床検査分野で役立てられている。酵素的測定法は、まず、プロテアーゼにより糖化タンパク質を加水分解する。次いで、これにより生じたフルクトシルバリン、フルクトシルリジンおよびフルクトシルバリルヒスチジンなどの糖化アミノ酸を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）により酸化的加水分解する。最後に、オキシダーゼ反応により生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ−色原体反応システムにより比色定量する（特許文献１から１１参照）。
【０００４】
酵素的測定法による糖化タンパク質の測定では、主反応酵素であるＦＡＯＤの基質特異性が重要な要素となる。例えば、ＨｂＡ１ｃの測定では、フルクトシルバリンに対する特異性の高い酵素が望まれている。また、糖化ヘモグロビンのβ鎖に特異的な測定を行うためには、フルクトシルバリルヒスチジンに作用する酵素が望まれている。これは、ヘモグロビンα鎖およびβ鎖のアミノ末端アミノ酸が共にバリンであることから、β鎖に特異的な測定を行うためには、アミノ末端アミノ酸２残基（すなわち、フルクトシルバリルヒスチジン）の認識が必要であるためである（特許文献１２、特許文献１３参照）。
【０００５】
これまでに、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するオキシダーゼ（フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ）は、数種の糸状菌、またはその遺伝子組換え体より抽出および精製されている。また、このフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼをコードする遺伝子も単離されている（特許文献１４、非特許文献１、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１２９５３１号公報（公開日：平成１６年４月３０日）
【特許文献２】特開２００４−１１３０１４号公報（公開日：平成１６年４月１５日）
【特許文献３】国際公開第２００３／０６４６８３号パンフレット（国際公開日：平成１５年８月７日）
【特許文献４】特開２００７−１８１４６６号公報（公開日：平成１９年７月１９日）
【特許文献５】特開２００７−２８９２０２号公報（公開日：平成１９年１１月８日）
【特許文献６】特開２００５−１１０６５７号公報（公開日：平成１７年４月２８日）
【特許文献７】特許第４０４５３２２号公報（発行日：平成２０年２月１３日）
【特許文献８】特許第４０１４０８８号公報（発行日：平成１９年９月２１日）
【特許文献９】特許第４０３９６６４号公報（発行日：平成２０年１月３０日）
【特許文献１０】特許第４０１０４７４号公報（発行日：平成１９年１１月２１日）
【特許文献１１】特許第３９７１７０２号公報（発行日：平成１９年９月５日）
【特許文献１２】国際公開第２００５／０４９８５７号パンフレット（国際公開日：平成１７年６月２日）
【特許文献１３】国際公開第２００５／０４９８５８号パンフレット（国際公開日：平成１７年６月２日）
【特許文献１４】特開２００３−２３５５８５号公報（公開日：平成１５年８月２６日）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hirokawa K., Gomi K., Bakke M., and Kajiyama N., Distribution and properties of novel deglycating enzymes for fructosyl peptide in fungi., Arch. Microbiol., 2003, 180（3）, 227-231.
【非特許文献２】Hirokawa K., Gomi K., and Kajiyama N., Molecular cloning and expression of novel fructosyl peptide oxidases and their application for the measurement of glycated protein., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 311（1）, 104-111.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼは熱安定性が悪く、診断薬試薬中での長期保存安定性について更なる改良が望まれている。
【０００９】
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、糖化タンパク質、特に糖化ヘモグロビンの測定に有用な、熱安定性に優れたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを新たに創出し、その酵素を利用した糖化タンパク質（糖化ヘモグロビン）の測定方法、および糖化タンパク質（糖化ヘモグロビン）測定用試薬組成物、糖化タンパク質（糖化ヘモグロビン）測定キット、糖化タンパク質（糖化ヘモグロビン）センサーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、フルクトシルアミノ酸の測定に有用なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質で、野生型よりも熱安定性が向上した変異タンパク質を造成することに成功した。さらに本発明者らは、この変異タンパク質をフルクトシルアミノ酸含有検体に作用させ、生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ反応で定量することによって、フルクトシルアミノ酸を測定することが可能であることを確認し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下発明を包含する。
【００１１】
即ち、本発明に係るタンパク質は、上記課題を解決するために、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質であることを特徴としている：（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列においてアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンの少なくとも何れか１つが置換されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ末端から５２番目、６５番目、６６番目および２８６番目のアミノ酸以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する相同性が７０％以上であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸の少なくとも何れか１つが、配列番号１に示されるアミノ酸配列における該何れか１つのアミノ酸と対応する位置のアミノ酸と異なるアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００１２】
また本発明に係るタンパク質は、以下の（ｄ）〜（ｉ）の何れかに記載のタンパク質であることが好ましい：（ｄ）配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｅ）配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｆ）配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｇ）配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｈ）配列番号２３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｉ）アミノ酸配列（ｄ）〜（ｈ）においてアミノ末端から５２番目、６５番目、６６番目および２８６番目のアミノ酸以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１３】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、上記タンパク質をコードすることを特徴としている。
【００１４】
また本発明に係るポリヌクレオチドでは、以下の（ｊ）〜（ｎ）の何れかに記載のポリヌクレオチドであることが好ましい：（ｊ）配列番号１６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ｋ）配列番号１８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ｌ）配列番号２０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ｍ）配列番号２２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ｎ）配列番号２４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１５】
また本発明に係るポリヌクレオチドでは、上記ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸の少なくとも何れか１つが、配列番号１に示されるアミノ酸配列における該何れか１つのアミノ酸と対応する位置のアミノ酸と異なるアミノ酸配列からなるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることが好ましい。
【００１６】
また本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする。
【００１７】
また本発明に係る形質転換体は、上記ベクターを含んでいることを特徴とする。
【００１８】
また本発明に係るフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法は、上記形質転換体を培養する工程を包含することを特徴とする。
【００１９】
また本発明に係るフルクトシルアミノ酸の測定方法は、糖化アミンに上記タンパク質を作用させる工程を包含することを特徴とする。
【００２０】
また本発明に係る糖化タンパク質測定キットは、上記タンパク質を備えていることを特徴とする。
【００２１】
また本発明に係る糖化タンパク質測定センサーは、上記タンパク質を備えていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係るタンパク質は、以上のように、配列番号１に示されるアミノ酸配列およびその類似配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸の少なくとも何れか１つが置換されているアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質である。そのため、優れた熱安定性を有する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質を提供できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】アスペルギルス・ニードランス由来ＦＡＯＤのアミノ酸配列と、フェオスフェリア・ノドラム由来ＦＡＯＤのアミノ酸配列とのアラインメントの一部を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ａ〜Ｂ（ただし、ＡおよびＢが数値または単位付き数値の場合）」と記載されていれば「Ａ以上、Ｂ以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。
【００２５】
＜１．タンパク質＞
本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質である。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列においてアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンの少なくとも何れか１つが置換されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ末端から５２番目、６５番目、６６番目および２８６番目のアミノ酸以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する相同性が７０％以上であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸の少なくとも何れか１つが、配列番号１に示されるアミノ酸配列における該何れか１つのアミノ酸と対応する位置のアミノ酸と異なるアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００２６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、アスペルギルス・ニードランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のゲノムデータベース（http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group/GenomesIndex.html）由来のＦＡＯＤのアミノ酸配列である。
【００２７】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する相同性が７０％以上である配列には、配列番号１に示されるアミノ酸配列とは異なる長さの配列も含まれる。
【００２８】
相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ゼネティックス社）を使用して、２種類の配列のホモロジーサーチにより一致する配列の割合（％）を計算することができる。例えば、フェオスフェリア・ノドラム（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）由来ＦＡＯＤ遺伝子はアスペルギルス・ニードランス由来ＦＡＯＤ遺伝子と相同性が７１％である。
【００２９】
本発明に係るタンパク質においてアミノ酸残基が置換される部位は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有する限りにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンのいずれか１つ以上のアミノ酸であれば特に限定されるものではなく、当該４箇所アミノ酸単独、またはこれらの組み合わせであってもよい。なお、置換されるアミノ酸はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有する限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、５２番目のチロシンはヒスチジンに、６５番目のリジンはプロリンに、６６番目のプロリンはバリンに、２８６番目のフェニルアラニンはトリプトファンまたはチロシンに置換されている場合が挙げられる。
【００３０】
また、配列番号１に示されるアミノ酸配列と相同性が７０％以上あれば、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮを使用して、これらの残基に該当する部位を決定することができる。例えば、図１のようにアスペルギルス・ニードランス由来ＦＡＯＤ（配列番号１）の２８６番目のフェニルアラニン（図中下向き矢じり）はフェオスフェリア・ノドラム由来ＦＡＯＤ（配列番号２８）の２８２番目のフェニルアラニン（図中上向き矢じり）に相当する。
【００３１】
本発明に係るタンパク質の一実施形態のアミノ酸配列としては、例えば以下の（ｄ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列が挙げられる。なお本発明に係るタンパク質は下記配列に限定されるものではないことは言うまでもない。
（ｄ）配列番号１５に示すアミノ酸配列（Ｆ２８６Ｗ）；
（ｅ）配列番号１７に示すアミノ酸配列（Ｆ２８６Ｙ）；
（ｆ）配列番号１９に示すアミノ酸配列（Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ）；
（ｇ）配列番号２１に示すアミノ酸配列（Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ）；および、
（ｈ）配列番号２３（Ｙ５２Ｈ＋Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ）に示すアミノ酸配列。
【００３２】
配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ末端から２８６番目のフェニルアラニンがトリプトファンに置換されたタンパク質である。また配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ末端から２８６番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されたタンパク質である。また配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ末端から５９番目のセリンおよび６５番目のリジンがともにグリシン、１０９番目のリジンがグルタミン、ならびに２８６番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されたタンパク質である。配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端から５９番目のセリンがグリシン、６５番目のリジンがプロリン、６６番目のプロリンがバリン、１０９番目のリジンがグルタミン、および２８６番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されたタンパク質である。配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端から５２番目のチロシンがヒスチジン、５９番目のセリンがグリシン、６５番目のリジンがプロリン、６６番目のプロリンがバリン、１０９番目のリジンがグルタミン、および２８６番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されたタンパク質である。
【００３３】
本発明に係るタンパク質の別の実施形態のアミノ酸配列として、例えば以下の（ｏ）〜（ｑ）のいずれかのアミノ酸配列もまた挙げられる。
（ｏ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５２番目のチロシンがヒスチジンに置換されたアミノ酸配列（Ｙ５２Ｈ）；
（ｐ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６５番目のリジンがプロリンに置換されたアミノ酸配列（Ｋ６５Ｐ）；
（ｑ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６６番目のプロリンがバリンに置換されたアミノ酸配列（Ｐ６６Ｖ）。
【００３４】
また本発明には、上記で説示した本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をも包含する。１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加される部位は、アミノ末端から５２番目、６５番目、６６番目および２８６番目のアミノ酸以外の部位であって、アミノ酸の欠失、置換および／または付加後のタンパク質がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有していれば、アミノ酸配列中のどの部位であってもよい。ここで「１または数個のアミノ酸」とは、具体的には１０個以内の範囲のアミノ酸数をいう。
【００３５】
本発明におけるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性は、後述する実施例の「活性測定法」の項において説明する方法によって測定される。なお、本発明の説明において「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有する」とは、好ましくは０．１Ｕ/ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ以上を意味し、さらに好ましくは１．０Ｕ/ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ以上を意味する。
【００３６】
本発明に係るタンパク質は、例えば後述するポリヌクレオチドおよびベクターを利用した遺伝子組み換え技術を用いて生産されてもよいし、アミノ酸合成機などを用いて化学合成されてもよい。遺伝子組み換え技術において、好適に用いられる各種組換えタンパク質発現系は、例えば、大腸菌発現系、昆虫細胞発現系、哺乳類細胞発現系、および無細胞発現系を用いてもよく、これらに限定されない。本発明のタンパク質等の製造方法については後述する。
【００３７】
また本発明に係るタンパク質等は、例えば、分子間および／または分子内架橋（例えば、ジスルフィド結合など）が施されたもの、化学修飾（例えば、糖鎖付加、リン酸化またはその他の官能基付加など）されたもの、標識（例えば、ヒスチジンタグなど）が付与されたもの、または融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロムおよびＧＦＰなど）が付与されたものなどが含まれるが、特にこれらに限定されない。さらに、本発明に係るタンパク質等は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性が実質的に維持される限り、数種のタンパク質の断片を組み合わせて構成したキメラタンパク質も含み得る。
【００３８】
本発明に係るタンパク質と、血清タンパク質、有機酸、およびデキストランをはじめとする賦形剤等とからフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ剤を構成してもよい。このフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ剤には、酵素剤の構成成分として公知の成分が含まれていてもよい。
【００３９】
＜２．ポリヌクレオチド＞
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るタンパク質をコードすることを特徴としている。
【００４０】
ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【００４１】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（コドン使用頻度；Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変更してもよい。
【００４２】
本発明に係るポリヌクレオチドを改変する方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、および／または付加することで組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製してよい。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。
【００４３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上述の本発明に係るタンパク質をコードしていればその塩基配列は特に限定されるものではない。よって本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列に応じた塩基配列からなる全てのポリヌクレオチドが本発明に含まれる。
【００４４】
本発明に係るポリヌクレオチドの一実施形態としては、例えば以下の（ｊ）〜（ｎ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｊ）配列番号１６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号２２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００４５】
ここで、配列番号１６に示される塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２８６番目のフェニルアラニンがトリプトファンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質（便宜上「Ｆ２８６Ｗ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。
【００４６】
また配列番号１８に示される塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２８６番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質（便宜上「Ｆ２８６Ｙ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。
【００４７】
また配列番号２０に示される塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５９番目のセリンおよび６５番目のリジンがともにグリシン、１０９番目のリジンがグルタミンならびに２８６番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質（便宜上「Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。
【００４８】
また配列番号２２に示される塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５９番目のセリンがグリシン、６５番目のリジンがプロリン、６６番目のプロリンがバリン、１０９番目のリジンがグルタミンおよび２８６番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質（便宜上「Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。
【００４９】
また配列番号２４に示される塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５２番目のチロシンがヒスチジン、５９番目のセリンがグリシン、６５番目のリジンがプロリン、６６番目のプロリンがバリン、１０９番目のリジンがグルタミンおよび２８６番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質（便宜上「Ｙ５２Ｈ＋Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。
【００５０】
本発明の一実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチドは化学的に合成された塩基で置換されてもよい。また、本発明に係るポリヌクレオチドが置換される部位は特に限定されず、置換後の塩基配列から発現するタンパク質が好適な性質を有していればよい。
【００５１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもいてもよい。付加される塩基配列としては、限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグおよびＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴおよびＭＢＰなど）またはシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列および分泌配列など）をコードする塩基配列、およびプロモーター配列（例えば、酵母由来プロモーター配列、ファージ由来プロモーター配列および大腸菌由来プロモーター配列など）などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は、翻訳されるタンパク質の所望の機能が維持される限り特に限定されるものではないが、翻訳されるタンパク質のＮ末端またはＣ末端に相当する部位であることが好ましい。
【００５２】
また本発明に係るポリヌクレオチドには、上述の本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１６、１８、２０、２２または２４に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、またはこれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５２番目のチロシン、６５番目のリジン、６６番目のプロリンおよび２８６番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸の少なくとも何れか１つが配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較して置換されているアミノ酸配列からなるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。これらの配列からなるポリヌクレオチドもまた、通常行われるポリヌクレオチド改変方法により取得することができる。
【００５３】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ値から１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体例としては、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。
【００５４】
本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列は、Science, 1981, 214, 1205. に記載されたジデオキシ法により決定され得る。
【００５５】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものである。本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、その他の構成は特に限定されるものではない。本発明に係るベクターを構成するベースとなるベクターとしては、宿主細胞において好適なベクターが適宜選択され得る。本発明に係るベクターとしてプラスミドベクターを用いる場合、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）およびｐＵＣ１８などが使用できる。この場合、ベクターが導入される宿主微生物または宿主細胞としては、例えば、酵母、大腸菌（エシェリヒア・コリーＷ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α）、昆虫細胞および哺乳類細胞などが利用可能である。
【００５６】
上述の宿主微生物または宿主細胞に本発明に係るベクターを導入する方法としては特に限定されるものではないが、例えば宿主微生物としてエシェリヒア属に属する微生物にベクターを導入する場合は、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡを導入する方法、およびエレクトロポレーション法を用いる方法が適用され得る。その他、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いて遺伝子導入が行われても良い。
【００５７】
本発明に係るベクターを構築するには、本発明に係るポリヌクレオチドを分離および精製した後、制限酵素などを用いて切断した該ポリヌクレオチドの断片と、ベースとなるベクターを制限酵素で切断して得た直鎖ポリヌクレオチドを結合閉鎖させて構築することができる。結合閉鎖する際にはＤＮＡリガーゼなどがベクターおよび該ポリヌクレオチドの性質に応じて使用され得る。本発明のベクターを複製可能な宿主に導入した後、ベクターのマーカーおよび酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、本発明のポリヌクレオチドを含有する形質転換体を得ることができる。よって、本発明に係るベクターには薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。
【００５８】
なお本発明は、上述の本発明に係るベクターで形質転換された形質転換体、すなわち本発明に係るベクターを含んでいる形質転換体を包含する。本発明に係るベクターによって形質転換される宿主細胞は、特に限定されないが、酵母、大腸菌、昆虫細胞、および哺乳類細胞などが挙げられる。
【００５９】
＜３．タンパク質の製造方法＞
本発明に係るタンパク質の製造方法は、上述の本発明に係る形質転換体を培養する工程（「培養工程」という）を含むことを特徴としている。本発明に係るタンパク質の製造方法には、培養工程の他、形質転換体を用いたタンパク質生産において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば、培養工程後に形質転換体が生産したタンパク質を回収する回収工程およびこのタンパク質を精製する精製工程が挙げられる。
【００６０】
（３−１）培養工程
培養工程では、本発明に係る形質転換体が栄養培地で培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００６１】
培養工程で用いられる栄養培地の栄養源としては、培養に通常用いられるものが広く使用されてよい。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜およびピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物および大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。これらに加えて、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄およびマンガン亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、ならびに特定のビタミンなどが必要に応じて培地に添加されてよい。
【００６２】
本発明に係る形質転換体の培養温度は、形質転換体が本発明に係るタンパク質を生産可能な範囲内であれば適宜変更し得るが、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主として利用する場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は、本発明に係るタンパク質が最高収量に達する適当な時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは形質転換体が好適に発育し、且つ本発明に係るタンパク質を生産可能な範囲内で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００６３】
（３−２）回収工程
形質転換体がタンパク質を細胞外に分泌する場合、その培養物には本発明のタンパク質が含まれている。よって培養物を本発明に係るタンパク質としてそのまま利用することが可能である。このとき、例えばろ過および遠心分離などにより、培養液と形質転換体とを分離してもよい。
【００６４】
また本発明に係るタンパク質が形質転換体内に存在する場合、形質転換体を培養して得られた培養物からろ過および遠心分離などの手段を用いて形質転換体を採取し、採取した形質転換体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法により破壊した後、目的のタンパク質を回収すればよい。また、必要に応じて、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）および界面活性剤（例えば、トリトン−Ｘ１００など）を添加して本発明に係るタンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取してもよい。
【００６５】
（３−３）精製工程
精製工程は、回収工程によって得られたタンパク質を精製する工程である。精製工程の具体的な方法は特に限定されるものではないが、例えば、本発明に係るタンパク質を含む溶液を、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理（例えば、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウムなどを用いる）、または親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノールおよびアセトンなど）による分別沈殿法に供すればよい。これらの操作によって、目的である本発明に係るタンパク質を沈殿させ、精製することができる。
【００６６】
また、精製工程では、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを用いて精製を行ってもよい。
【００６７】
これらの手法を用いて得られた目的のタンパク質を含む精製酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００６８】
上記の精製酵素は、例えば凍結乾燥、真空乾燥およびスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。また、精製酵素を使用する際は、その用途によって適宜緩衝液に溶解した状態で使用することができる。緩衝液としては、例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液などが目的のタンパク質の性質、および／または実験条件もしくは環境に応じて好適に選択されてよい。さらに、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンなど）、および血清アルブミンなどを精製酵素に添加することにより安定化することができる。
【００６９】
＜４．糖化タンパク質の測定方法＞
本発明に係るタンパク質は、フルクトシルアミノ酸の測定方法に用いることが可能である。また本発明に係るタンパク質を利用したフルクトシルアミノ酸の測定方法は、糖化ヘモグロビンなどの糖化タンパク質の測定に適用され得る。なお、本発明に係るタンパク質として、Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ、Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ、およびＹ５２Ｈ＋Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙなどフルクトシルバリルヒスチジンと反応し得るタンパク質を使用する場合には、フルクトシルバリルヒスチジンの測定方法に好適に利用し得、糖化ヘモグロビンのβ鎖に特異的な測定に好適に適用され得る。以下に本発明に係るタンパク質を用いた糖化タンパク質の測定方法（以下「本発明の測定方法」という）を説明する。
【００７０】
本発明の測定方法は、少なくとも糖化アミンに本発明に係るタンパク質を作用させることを特徴としている。以下に本発明の測定方法の一実施形態を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７１】
本発明に係る測定方法の一実施形態は、
（１）試料とプロテアーゼとを反応させて、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程（便宜上「第１工程」という）、
（２）上記（１）の工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明に係るタンパク質を作用させる工程（便宜上「第２工程」という）、および、
（３）上記（２）の工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程（便宜上「第３工程」という）、を含む糖化タンパク質を測定するための方法である。
【００７２】
この実施形態における一具体例としては、酵素法が挙げられる。酵素法においては、試料中の糖化タンパク質をアミノ酸、またはペプチドのレベルまで酵素（例えば、プロテアーゼ）を用いて断片化する（第１工程）。次に、生じた糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに、ＦＡＯＤを加え、酸化還元反応により過酸化水素を発生させる（第２工程）。この試料にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および酸化により発色する還元剤を添加し、ＰＯＤを触媒として過酸化水素と還元剤との間で酸化還元反応を生じさせる（第３工程）。酸化還元反応により還元剤を発色させ、この発色強度を測定することにより過酸化水素量を測定できる（第３工程）。
【００７３】
（４−１）第１工程
第１工程は、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程である。
【００７４】
本明細書において「糖化タンパク質」とは、タンパク質を構成するアミノ酸残基の一部または全部に糖が結合した（糖化した）タンパク質を意味する。糖化タンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質のアミノ末端のα−アミノ基が糖化されたもの（例えばＨｂＡ１ｃ）等が挙げられる。なお上記例示したＨｂＡ１ｃは、糖尿病の診断など臨床診断の指標として利用されている。
【００７５】
第１工程において使用するプロテアーゼとしては、試料中に含まれる糖化タンパク質を糖化アミノ酸または糖化ペプチドに分解し得るものであれば特に限定されるものではない。例えば臨床検査において使用されているプロテアーゼが好ましく利用され得る。
【００７６】
また本測定方法に使用される「試料」は、糖化タンパク質の有無や濃度を検出すべき対象物であれば特に限定されるものではなく、例えば、全血、血漿、血清および血球等の他に、尿および髄液等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）、ならびにジュース等の飲料水、醤油およびソース等の食品類等の試料が挙げられる。本発明の方法は、糖尿病の診断に応用することができるため、上記の中でも特に全血試料および血球試料について測定を行う場合に有用である。特に限定されるものではないが、赤血球内の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血したりして、この溶血試料を測定用の試料とすればよい。
【００７７】
試料とプロテアーゼとを反応させる際の具体的な条件は、所望の糖化アミンが調製され得る条件であれば特に限定されるものではなく、試料の濃度および種類、ならびにプロテアーゼの濃度および種類に応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。
【００７８】
本発明の測定方法に好適に使用できるプロテアーゼの濃度は、例えば０．１Ｕ〜１ＭＵ／ｍｌであり、より好ましくは１Ｕ〜５００ＫＵ／ｍｌであり、最も好ましくは５Ｕ〜１００ＫＵ／ｍｌである。プロテアーゼの濃度は、限定されるものではなく、反応条件、試料の種類および状態、実験者の手技ならびに使用する試薬の種類などに応じて、実験者または使用者に好適に決定され得る。
【００７９】
また本発明に係るタンパク質が作用する「糖化アミン」は、試料中に含まれる糖化タンパク質に由来の糖化アミノ酸および糖化ペプチドなどが挙げられる。糖化ペプチドの長さは特に限定されるものではないが、本発明のタンパク質が作用し得る長さ、例えばアミノ酸残基数が２〜６の範囲のものが挙げられる。
【００８０】
（４−２）第２工程
第２工程は、第１工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明に係るタンパク質を作用させる工程である。
【００８１】
本発明に係るタンパク質が有し得るＦＡＯＤ活性は特に限定されるものではないが、ＦＡＯＤ活性が高いほど高感度で糖化アミンを検出することができ、ＦＡＯＤタンパク質の使用量を少なくすることができるために好ましい。なお本発明の測定方法に好適に使用できるＦＡＯＤタンパク質の濃度は、例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌであり、好ましくは０．５〜２００Ｕ／ｍｌであり、最も好ましくは１．０〜１００Ｕ／ｍｌである。ただし上記のＦＡＯＤの濃度は、特に限定されるものではなく、反応条件、試料の種類および状態、実験者の手技ならびに使用する試薬の種類などに応じて、適宜、決定され得る。
【００８２】
なお、本発明に係るタンパク質が糖化アミンに作用すると、酸化的加水分解反応により酸素が消費され、過酸化水素が発生する。
【００８３】
（４−３）第３工程
第３工程は、第２工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程である。第３工程は過酸化水素の量または酸素の量を測定し得る方法であれば、その具体的方法は特に限定されるものではない。したがって、公知の方法が適宜適用され得る。
【００８４】
酵素法を利用している場合には、第２工程によって得られた試料にＰＯＤ、および酸化により発色する還元剤を添加し、還元剤の発色強度を測定することにより過酸化水素量を測定する。
【００８５】
この場合に好適なＰＯＤは、西洋ワサビ、微生物などに由来するものである。また、ＰＯＤの好適な使用濃度は、０．０１〜１００単位／ｍＬである。
【００８６】
第３工程において好適な過酸化水素の測定方法としては、ＰＯＤの存在下でのカップラー（４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）および３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）など）に対してフェノール系、アニリン系またはトルイジン系の色原体を酸化縮合反応させることにより色素を生成するトリンダー試薬類、およびＰＯＤの存在下で直接酸化呈色するロイコ色素が使用され得る。これらの方法は、当業者に公知であり、一般に容易に使用され得る。
【００８７】
トリンダー試薬としては、限定されないが、例えば、フェノールおよびその誘導体を用いることができる。
【００８８】
第３工程において好適に使用可能なカップラーとしては、４−アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）およびスルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）などが挙げられる。
【００８９】
第３工程において好適に使用できるロイコ色素としては、特に限定されないが、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体およびジフェニルアミン誘導体などが使用できる。
【００９０】
第３工程における過酸化水素量の測定において、ＰＯＤ等を用いた発色方法以外に、各種センサー系を用いた測定法が当業者に一般的に知られている（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと）。具体的には、各種センサー系に用いる電極としては、酸素電極、カーボン電極、金電極および白金電極などが挙げられる。本発明において、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）および参照電極（例えば、Ａｇ／Ｃｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持しながら、作用電極に一定の電圧を加え、さらに試料を添加して、酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。
【００９１】
また、カーボン電極、金電極および白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエーターを用いる系がある。例えば、作用電極として酵素およびフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、およびフェナジンメトサルフェートなどの電子メディエーターを吸着、または共有結合法により高分子マトリクスに固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。続いて、作用電極に一定の電圧を加え、試料を添加して酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。
【００９２】
第３工程で消費された酸素量を測定することで糖化アミン量を測定することもできる（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと）。具体的には、酸素電極を用い、電極表面に酸素を固定化して、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。ここに試料を加えて、電流の減少値を測定する。
【００９３】
カーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、メディエーターを含む電流の増加量を測定する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体およびフェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。
【００９４】
本発明の測定法において、各工程を実施する系に本発明のタンパク質の安定性を増すために不活性タンパク質を添加してもよい。不活性タンパク質は、血清アルブミン類、グロブリン類および繊維性タンパク質類を含む。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンであり、ｗｔ／ｖｏｌにおける好ましい濃度は、０．０５〜１％である。好ましい不活性タンパク質は、酵素分解を起こすプロテアーゼ不純物を含まないものである。
【００９５】
フルクトシルアミノ酸濃度の測定は、試料の特定体積および試薬の特定体積を用いて行われる。吸光度測定は、試料ブランクを測定するために、混合後、かつフルクトシルアミノ酸による有意な吸光度変化が起こる前にできるだけ速やかに行われる。０．５〜５秒後の第１の吸光度測定が適当である。第２の吸光度測定は、吸光度が定常的になった後、典型的には１ｍｇ／ｄＬのフルクトシルアミノ酸濃度において３７℃にて３〜５分間である。典型的には、該試薬は既知のフルクトシルアミノ酸濃度を有する水性または血清溶液にて標準化される。
【００９６】
＜５．糖化タンパク質測定キットおよび糖化タンパク質測定センサー＞
（５−１）糖化タンパク質測定キット
本発明に係る糖化タンパク質測定キット（以下「本発明のキット」という）は、少なくとも本発明に係るタンパク質を備えていることを特徴としている。本発明のキットに備えられている本発明に係るタンパク質の形態は特に限定されるものではないが、例えば、水溶液、懸濁液または凍結乾燥粉末などの形態が採用され得る。凍結乾燥粉末は常法に従って作製され得る。
【００９７】
上述の添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えば、本発明に係るタンパク質を含む緩衝液に添加剤を配合する方法、添加剤を含む緩衝液に本発明に係るタンパク質を配合する方法、または本発明に係るタンパク質および安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００９８】
本発明のキットは、少なくとも本発明に係るタンパク質、ペルオキシダーゼ、および色原体を備える試薬組成物により構成されていてもよい。
【００９９】
本発明の測定方法においてフルクトシルアミノ酸の酸化に由来する過酸化水素の検出には、ペルオキシダーゼ反応を利用する。よって試薬組成物には、ペルオキシダーゼおよび色原体（過酸化水素発色試薬）が好ましく用いられる。ペルオキシダーゼおよび色原体（過酸化水素発色試薬）は何ら制限されるものではない。
【０１００】
本発明に用いられる色原体（過酸化水素発色試薬）は、溶液において安定であり、且つビリルビン干渉が低いものであることが好ましい。本発明に好適に用いることができる色原体（過酸化水素発色試薬）としては、例えば４−アミノアンチピリンもしくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）およびフェノールもしくはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体の組み合わせからなる試薬が挙げられる。また、本発明において用いられる色原体（過酸化水素発色試薬）は、ベンジジン類、ロイコ色素類、４−アミノアンチピリン、フェノール類、ナフトール類およびアニリン誘導体類であってもよい。
【０１０１】
また本発明において好適に用いられるペルオキシダーゼは、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。このペルオキシダーゼは、高純度かつ低価格のものが商業的に入手可能である。酵素濃度は、迅速かつ完全な反応のために充分高くなければならず、好ましくは、１，０００〜５０，０００Ｕ／Ｌである。
【０１０２】
また試薬組成物には、上記構成の他、緩衝剤（例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液およびＧＯＯＤ緩衝液など）が含まれていてもよい。さらに試薬組成物には、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬（例えば、ＥＤＴＡおよびＯ−ジアニシジンなど）、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、各種界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００およびＮＰ−４０など）、ならびに各種抗菌剤および防腐剤（例えば、ストレプトマイシンおよびアジ化ナトリウムなど）などが含まれていてもよい。これらの試薬は、単一試薬でも２種類以上の試薬を組み合わせてなるものであってもよい。
【０１０３】
緩衝剤としては特に限定されないが、６〜８．５のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有する任意の緩衝剤を使用することができる。このｐＨ範囲の緩衝剤としては、リン酸塩、トリス、ビス−トリスプロパン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−モルフォリノエタンスルホン酸１水和物（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（piperazine-1,4-bis（2-ethanesulfonic acid））（ＰＩＰＥＳ）、２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸（2-[4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）（ＨＥＰＥＳ）、および３−[Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）などが挙げられる。特に、好ましい緩衝剤はＭＥＳおよびＰＩＰＥＳである。また特に、好ましい濃度範囲は２０〜２００ｍＭであり、好ましいｐＨ範囲はｐＨ６〜７である。
【０１０４】
本発明のキットには、例えば、ＦＡＯＤ、緩衝液、プロテアーゼ、ＰＯＤ、発色試薬、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、抗菌剤、防腐剤、ウェルプレート、蛍光スキャナー、自動分析機、および本発明に係る測定方法を紙媒体に記載した取り扱い説明書などが含まれていてもよい。
【０１０５】
本発明のキットは、本発明に係るフルクトシルアミノ酸の測定方法、および糖化タンパク質の測定に利用し得るものであり、とりわけ、糖化ヘモグロビンの測定に好適に利用し得る。
【０１０６】
（５−２）糖化タンパク質測定センサー
本発明に係る糖化タンパク質測定センサー（以下「本発明のセンサー」）は、糖化タンパク質を検出するために用いられるセンサーであり、少なくとも本発明に係るタンパク質を備えている。本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる。とりわけ、糖化ヘモグロビンの測定に好適に利用し得る。よって、本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法および本発明のキットの項における緩衝剤等の説明を援用することができる。
【０１０７】
本発明のセンサーの一実施形態は、本発明に係るタンパク質を支持体に固定して用いることができる。支持体としては、本発明に係るタンパク質を固定化できるものであれば、特に限定されるものではなく、形状や材質はタンパク質の性質に応じて好適なものを使用してよい。支持体の形状は、タンパク質が固定化できる十分な面積を有するものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、基板、ビーズおよび膜などが挙げられる。支持体の材料としては、例えば、無機系材料、天然高分子および合成高分子などが挙げられる。
【０１０８】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【０１０９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。表１は、以下の実施例において使用した活性測定試薬の組成を示している。なお、実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク社より購入したものを用いた。
【０１１０】
【表１】
2010115189.tif 000002
【０１１１】
＜活性測定＞
実施例におけるＦＡＯＤの活性測定条件を以下に示す。
【０１１２】
（活性測定法）
各基質に対する酵素活性は、酵素反応により生成される過酸化水素を追随するペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加を測定した。まず、活性測定試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温後、この活性測定試薬に、予め酵素希釈液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５））で希釈した酵素溶液０．１ｍｌを加え、反応を開始する。３７℃で５分間反応させ、５００ｎｍの吸光度変化を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍｌを加え、上記と同様に操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づき酵素活性を算出した。なお、上記条件で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【０１１３】
（計算式）
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛（（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）−（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ））×３．１ｍｌ×希釈倍率｝／（１３×１．０ｃｍ×０．１ｍｌ）
３．１ｍｌ：全液量
１３：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１ｍｌ：酵素サンプル液量
＜参考例１：アスペルギルス・ニードランス由来ＦＡＯＤ遺伝子のクローニング＞
アスペルギルス・ニードランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＦＡＯＤ遺伝子のクローニングを行うために、アスペルギルス・ニードランスのゲノムデータベース（http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group/GenomesIndex.html）を検索した。このゲノムデータベースの中から、ＦＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードすることが予測される遺伝子を抽出した。検索結果から得られた種々の遺伝子のうち、フルクトシルバリンに実質的に作用するＦＡＯＤタンパク質をコードする遺伝子として、ＤＤＢＪアクセッション番号ＡＡＣＤ０１０００１３９のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＦＧＳＣ  Ａ４  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ＩＩ  ＡＮｃｏｎｔｉｇ１．１３（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=29570992）の３２５８６８−３２７４８６に対応する遺伝子を特定した。
【０１１４】
次に、上記ＦＡＯＤ遺伝子のｃＤＮＡクローニングを行った。アスペルギルス・ニードランスＡ８９株を、ＧＰＹ液体培地（２％グルコース、０．５％カザミノ酸、１％ペプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％塩化カリウムおよび０．００１％硫酸鉄、ｐＨ６．０）で、３０℃、２日間培養した。液体培養したアスペルギルス・ニードランスＡ８９株からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を利用して全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの調製方法は、ＩＳＯＧＥＮの添付プロトコールに従った。調製した全ＲＮＡからＭａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ−ｍＲＮＡ−（東洋紡績社）を用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ０．１μｇを用いて、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社）によるＲＴ−ＰＣＲを行った。１段階目の逆転写反応では、配列番号３に示したオリゴデオキシリボヌクレオチドＰ１プライマー（5'-CTACATCTTTGCCTCATTCCTCCACCCCGG-3'）を用いた。２段階目のＰＣＲでは、Ｐ１プライマーと、配列番号４に示したオリゴデオキシリボヌクレオチドＰ２プライマー（5'-ATGACGCCCCGAGCCAACACCAAAATCATT-3'）とをプライマーとして用いた。得られたｃＤＮＡについて、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社）により末端の平滑化を行った。平滑化したｃＤＮＡを公知のプラスミドｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位へサブクローニングした。ｃＤＮＡ部分についてシーケンス解析を行った結果、配列番号２に示した塩基配列が得られた。配列番号２に示した塩基配列のｃＤＮＡコーディング領域は、１番目の塩基から１３１４番目の塩基であり、開始コドンは１番目の塩基から３番目の塩基、終止コドンＴＡＧは１３１５番目の塩基から１３１７番目の塩基に相当する。配列番号２の塩基配列から明らかとなったアミノ酸配列は配列番号１に示した。
【０１１５】
＜参考例２：アスペルギルス・ニードランス由来ＦＡＯＤ遺伝子の大腸菌での大量発現、精製、および酵素アッセイ＞
配列番号２に示した塩基配列を有するＦＡＯＤ遺伝子を含むプラスミドの大腸菌における大量発現を試みた。ＦＡＯＤ遺伝子の終止コドンを除いた全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２に示した塩基配列の１から１３１４番目の塩基まで）をＰＣＲで増幅した。その際、アミノ酸配列のＮ末端側に相当する位置に、配列番号５に示すプライマーＰ３（5'-GGAATTCCATATGACGCCCCGAGCCAACACCAAAATCATTGTC-3'）（この塩基配列における「CATATG」はＮｄｅＩ認識部位）を用いてＮｄｅＩ切断部位を挿入し、Ｃ末端側に相当する位置に、配列番号６に示すプライマーＰ４（5'-CCGCTCGAGCATCTTTGCCTCATTCCTCCACCCCGGCAT-3'）（この塩基配列における「CTCGAG」はＸｈｏＩ認識部位）を用いてＸｈｏＩ切断部位を導入した。本ＤＮＡ断片をｐＥＴ−２３ｂベクター（ノバジェン社）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へＴ７プロモーターと正方向になるようにサブクローニングした。作製したプラスミドは、ＦＡＯＤ発現用プラスミドとしてｐＩＥ２０１と命名した。
【０１１６】
次いで、プラスミドｐＩＥ２０１を用いて大腸菌ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ストラタジーン社）を形質転換した。その後、アンピシリン耐性を示す形質転換体ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ２０１）を選抜した。
【０１１７】
上記形質転換体の培養用の培地として、２００ｍｌのＴＢ培地を２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行ったものを用いた。この培地を放冷後、別途無菌濾過したアンピシリンを終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにこの培地に添加した。この培地に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ２０１）の培養液を２ｍｌ接種した。続いて、３０℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、細胞を超音波破砕した。次に、この超音波破砕した懸濁液を遠心分離して、上清液を粗酵素液として得た。フルクトシルバリン含有測定試薬を用いて測定した粗酵素液のＦＡＯＤ活性は、約４．０Ｕ／ｍｌであった。一方、フルクトシルバリルヒスチジン含有測定試薬を用いて測定したところ、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性は検出されなかった。
【０１１８】
得られた粗酵素液についてポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、次いで、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて透析を行った。透析後のサンプルを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｈｉｓ−ｔａｇ−（東洋紡績製）を用いて、規定のプロトコールに従って精製した。次に、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）カラムクロマトグラフィーによりさらに分離および精製した後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて透析を行い、精製酵素標品（ＩＥ２０１）を得た。本方法により得られたＩＥ２０１標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。
【０１１９】
＜参考例３：フェオスフェリア・ノドラム由来ＦＡＯＤ遺伝子のクローニング＞
フェオスフェリア・ノドラム由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼのｃＤＮＡクローニングを行うために、フェオスフェリア・ノドラムのゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?organism=fungi&database=321614）を検索した。
【０１２０】
ゲノムデータベースから、ＦＡＤ依存オキシドレダクターゼ（ＦＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードすることが予測される遺伝子を抽出した。検索結果から得られた種々の遺伝子のうち、フルクトシルバリンに実質的に作用する酵素をコードする可能性を有するという観点からさらに絞り込みを行った結果、GenBank no. AAGI01000177239512 bp Phaeosphaeria nodorum SN15 cont1.177, whole genome shotgunSequence(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?tool=portal&db=nuccore&term=&query%5Fkey=11&dopt=gb&dispmax=20&page=1&qty=1&WebEnv=0x3fThZQ1ubv2E4QUtcTFzS2yHOV3ljOuR6kUwGyNOVEiqCGdFac8yYAlfzZG%2DvpBxXqNrPNESW3skk%402644558678701720%5F0135SID&WebEnvRq=1)の７５，１４３ｂｐから７６，６２５ｂｐの配列に相当する遺伝子をクローニング候補遺伝子とした。
【０１２１】
次に、このクローニング候補遺伝子のｃＤＮＡについて、スプライシング部位（エキソン-イントロン）の予測ツール(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)の使用、および既知の他の生物種のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子との比較により、タンパク質をコードする部分に対応するｃＤＮＡ全配列を推定した。この情報をもとに、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成、すなわち全ＲＮＡの調製からｍＲＮＡの抽出を経て逆転写を行うことで、推定した全配列を有するｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて末端の平滑化を行い、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位へサブクローニングした。ｃＤＮＡ部分についてシーケンス解析を行った結果、配列番号２９に示した塩基配列が得られた。配列番号２９に示した塩基配列におけるｃＤＮＡのコーディング領域は１番目の塩基から１３１４番目の塩基であり、開始コドンは１番目の塩基から３番目の塩基、終止コドンＴＡＧは１３１２番目の塩基から１３１４番目の塩基に相当する。配列番号２９に示した塩基配列から明らかとなったアミノ酸配列は、配列番号２８に示した。
【０１２２】
＜参考例４：フェオスフェリア・ノドラム由来ＦＡＯＤ遺伝子の大腸菌での大量発現、精製、および酵素アッセイ＞
配列番号２９に示した塩基配列を有するフェオスフェリア・ノドラム由来ＦＡＯＤ遺伝子を含むプラスミドの大腸菌における大量発現を試みた。フェオスフェリア・ノドラム由来ＦＡＯＤ遺伝子の終止コドンを除いた全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２９に示した塩基配列の１番目から１３１１番目の塩基まで）をＰＣＲで増幅した。その際、配列番号３０に示すプライマーＰ５（5’-GGAATTCCATATGGCGCCCTCCAGAGCAAACACCAGTGTCATT-3’）（この塩基配列における「CATATG」はＮｄｅＩ認識部位）を用いて、アミノ酸配列のＮ末端側にＮｄｅＩ切断部位を挿入した。また、配列番号３１に示すプライマーＰ６（5’-CCGCTCGAGCAAGTTCGCCCTCGGCTTATCATGATTCCAACC-3’）（この塩基配列における「CTCGAG」はＸｈｏＩ認識部位）を用いて、アミノ酸配列のＣ末端側にＸｈｏＩ切断部位を導入した。本ＤＮＡ断片をｐＥＴ−２３ｂベクター（ノバジェン社）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へＴ７プロモーターと正方向になるようにサブクローニングした。作製したプラスミドは、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ発現用プラスミドとしてｐＩＥ３５３と命名した。
【０１２３】
発現プラスミドｐＩＥ３５３を用いて大腸菌ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ストラタジーン社）を形質転換した。参考例２と同様に、形質転換体を培養し、得られた粗酵素液の精製を行うことにより、精製酵素標品（ＩＥ３５３）を得た。フルクトシルバリルヒスチジン含有測定試薬を用いて測定した粗酵素液のＦＡＯＤ活性は、約４．０Ｕ／ｍｌであった。
【０１２４】
＜実施例１：アスペルギルス・ニードランス由来ＦＡＯＤ遺伝子の機能改変によるフルクトシルバリンオキシダーゼ活性およびフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質の造成、精製、および酵素アッセイ＞
発現プラスミドｐＩＥ２０１および合成オリゴヌクレオチド（配列番号７および８）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を使用して、規定のプロトコールに従って変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８６番目のフェニルアラニンがトリプトファンに置換されたＦＡＯＤ変異体（配列番号１５）をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｆ２８６Ｗ）を取得した。
【０１２５】
同様に、配列番号９および１０に示した合成オリゴヌクレオチドを用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８６番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されたＦＡＯＤ変異体（配列番号１７）をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｆ２８６Ｙ）を取得した。
【０１２６】
また、配列番号１３および１４に示した合成オリゴヌクレオチドを用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の５２番目のチロシンがヒスチジンに置換されたＦＡＯＤ変異体をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｙ５２Ｈ）を取得した。
【０１２７】
また、配列番号２５および２６に示した合成オリゴヌクレオチドを用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の６５番目のリジンがプロリンに置換されたＦＡＯＤ変異体をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｋ６５Ｐ）を取得した。
【０１２８】
また、配列番号２７および１２に示した合成オリゴヌクレオチドを用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の６６番目のプロリンがバリンに置換されたＦＡＯＤ変異体をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｐ６６Ｖ）を取得した。
【０１２９】
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５９番目のセリンおよび６５番目のリジンがグリシン、１０９番目のリジンがグルタミンに置換されたＦＡＯＤ変異体をコードする組換えプラスミドｐＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑおよび合成オリゴヌクレオチド（配列番号９および１０）を用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の５９番目のセリンがグリシン、６５番目のリジンがグリシン、１０９番目のリジンがグルタミンおよび２８６番目のフェニルアラニンがチロシンにそれぞれ置換したＦＡＯＤ４重変異体（配列番号１９）をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ）を取得した。
【０１３０】
また、組換えプラスミドｐＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙおよび合成オリゴヌクレオチド（配列番号１１および１２）を用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の５９番目のセリンがグリシン、６５番目のリジンがプロリン、６６番目のプロリンがバリン、１０９番目のリジンがグルタミンおよび２８６番目のフェニルアラニンがチロシンにそれぞれ置換したＦＡＯＤ５重変異体（配列番号２１）をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ）を取得した。
【０１３１】
また、組換えプラスミドｐＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙおよび合成オリゴヌクレオチド（配列番号１３および１４）を用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の５２番目のチロシンがヒスチジン、５９番目のセリンがグリシン、６５番目のリジンがプロリン、６６番目のプロリンがバリン、１０９番目のリジンがグルタミンおよび２８６番目のフェニルアラニンがチロシンにそれぞれ置換したＦＡＯＤ６重変異体（配列番号２３）をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｙ５２Ｈ＋Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ）を取得した。
【０１３２】
取得した各プラスミドを用いてＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す形質転換体をそれぞれ選抜した。
【０１３３】
参考例２と同様に、各形質転換体を培養し、得られた粗酵素液の精製を行うことにより、それぞれの精製酵素標品（ＩＥ２０１−Ｙ５２Ｈ、ＩＥ２０１−Ｋ６５Ｐ、ＩＥ２０１−Ｐ６６Ｖ、ＩＥ２０１−Ｆ２８６Ｗ、ＩＥ２０１−Ｆ２８６Ｙ、ＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ、ＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ、ＩＥ２０１−Ｙ５２Ｈ＋Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ）を得た。本方法により得られた各標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。
【０１３４】
＜実施例２：各ＦＡＯＤタンパク質の特性評価＞
野生型ＦＡＯＤ（ＩＥ２０１）、およびＦＡＯＤ変異体（ＩＥ２０１−Ｙ５２Ｈ、ＩＥ２０１−Ｋ６５Ｐ、ＩＥ２０１−Ｐ６６Ｖ、ＩＥ２０１−Ｆ２８６Ｗ、ＩＥ２０１−Ｆ２８６Ｙ、ＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ、ＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ、ＩＥ２０１−Ｙ５２Ｈ＋Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｐ＋Ｐ６６Ｖ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙ）の精製酵素標品の酵素活性を、フルクトシルバリルヒスチジン（Ｆ−ＶＨ）およびフルクトシルバリン（Ｆ−Ｖ）をそれぞれ単独に含有する活性測定試薬を用いて測定し、熱安定性評価を実施した。その結果を表２に示す。
【０１３５】
熱安定性評価はそれぞれの精製酵素標品０．１ｍｇ／ｍｌ−５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）の溶液を調製し、５０℃、６０分間加熱処理を実施し、以下計算式により熱安定性（％）を算出した。
熱安定性（％）＝[（５０℃,６０分間加熱処理後活性値）／（加熱処理なし活性値）]×１００
【０１３６】
【表２】
2010115189.tif 000003
【０１３７】
表２の結果から明らかなように、Ｙ５２Ｈ、Ｋ６５Ｐ、Ｐ６６Ｖ、Ｆ２８６ＷおよびＦ２８６Ｙは野生型ＦＡＯＤタンパク質と比較して熱安定性が向上している。また、Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ＋Ｆ２８６Ｙは野生型ＦＡＯＤタンパク質と比較して熱安定性が向上しており、かつフルクトシルバリルヒスチジンにも反応し得る。さらにＫ６５Ｐ、Ｐ６６ＶおよびＹ５２Ｈを導入しても熱安定性が向上した。
【０１３８】
＜実施例３：フェオスフェリア・ノドラム由来ＦＡＯＤ遺伝子の機能改変によるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質の造成、精製、および酵素アッセイ＞
発現プラスミドｐＩＥ３５３および合成オリゴヌクレオチド（配列番号３２および３３）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を使用して、規定のプロトコールに従って変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号２８に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換されたＦＡＯＤ変異体をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を取得した。
【０１３９】
取得したプラスミドを用いてＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す形質転換体を選抜した。
【０１４０】
参考例２と同様に、形質転換体を培養し、得られた粗酵素液の精製を行うことにより、精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を得た。
【０１４１】
次に、実施例２と同様の方法で、野生型ＦＡＯＤ（ＩＥ３５３）、およびＦＡＯＤ変異体（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）の精製酵素標品の酵素活性を、フルクトシルバリルヒスチジン（Ｆ−ＶＨ）を単独に含有する活性測定試薬を用いて測定し、熱安定性評価を実施した。その結果を表３に示す。
【０１４２】
熱安定性評価はそれぞれの精製酵素標品０．１ｍｇ／ｍｌ−５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）の溶液を調製し、５０℃、１０分間加熱処理を実施し、以下計算式により熱安定性（％）を算出した。
熱安定性（％）＝[（５０℃,１０分間加熱処理後活性値）／（加熱処理なし活性値）]×
１００
【０１４３】
【表３】
2010115189.tif 000004
【０１４４】
表３の結果から明らかなように、ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙは野生型ＦＡＯＤタンパク質（ＩＥ３５３）と比較して熱安定性が向上している。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明によれば、フルクトシルアミノ酸の測定に有用な耐熱性の高いフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供できるので、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを利用したフルクトシルアミノ酸の測定方法およびフルクトシルアミノ酸測定用試薬組成物等を提供できる。したがって、本発明は、予防医学に基づく臨床検査分野、診断医療分野、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図１】
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【配列表】
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