(57)【要約】【課題】病原性免疫不全ウイルスを制御することを課題とする。【解決手段】ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子を発現するウイルスであって、同ウイルスからの発現によってＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、およびＰｏｌ抗原を産生する組換えＭＶＡウイルス、および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物であって、前記ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子は、ｇｐ１２０、ならびにｇｐ４１の膜貫通および外部ドメインから構成されるが、ｇｐ４１の細胞質ドメインの一部またはすべてを欠失しているＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードするように改変されている、薬学的組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子を発現するウイルスであって、同ウイルスからの発現によってＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、およびＰｏｌ抗原を産生する組換えＭＶＡウイルス、および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物であって、
前記ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子は、ｇｐ１２０、ならびにｇｐ４１の膜貫通および外部ドメインから構成されるが、ｇｐ４１の細胞質ドメインの一部またはすべてを欠失しているＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードするように改変されている、薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＨＩＶ ｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、逆転写酵素およびインテグラーゼを失活するように改変されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＡから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＢから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＣから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＤから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＥから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＦから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＧから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＨから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＪから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、ＭＶＡゲノム内の欠失ＩＩＩの部位に挿入される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、Ｈ５様初期／後期ワクシニアウイルスプロモーターの転写開始調節下にある、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
組換えＭＶＡウイルスは、さらなるＨＩＶ遺伝子またはその改変遺伝子をさらに発現することで、ＨＩＶ抗原を生産する組換えＭＶＡウイルスであって、前記さらなるＨＩＶ遺伝子は、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、およびｎｅｆからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５を含むＭＶＡ／ＨＩＶ４８。
【請求項１６】
配列番号１を有するｐＬＷ−４８。
【請求項１７】
ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子を除いたｐＬＷ−４８（配列番号１）の配列を有するプラスミド移入ベクター。
【請求項１８】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子は、別のクレードから採取された配列を有するｐＬＷ−４８（配列番号１）。
【請求項１９】
配列番号１０を有するｍ７．５プロモーター、配列番号２を有するＰｓｙｎ ＩＩプロモーター、配列番号１１を有するＰｓｙｎ ＩＩＩプロモーター、配列番号１２を有するＰｓｙｎ ＩＶプロモーター、および配列番号１３を有するＰｓｙｎ Ｖプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含むポックスウイルス。
【請求項２０】
霊長目動物においてＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を追加免疫する方法であって、請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の組成物を該霊長目動物に投与することを含み、それにより該霊長目動物における予め初回刺激された抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答が追加免疫される方法。
【請求項２１】
霊長目動物においてＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を誘導する方法であって、請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の組成物を該霊長目動物に投与することを含み、それにより該霊長目動物における抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答が誘導される方法。
【請求項２２】
霊長目動物においてＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を誘導する方法であって、前記抗原をコードする核酸を含む初回刺激用組成物を該霊長目動物に投与し、続いて請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の追加免疫用組成物を該霊長目動物に投与することを含み、それにより抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答が誘導される方法。
【請求項２３】
前記霊長目動物はヒトである、請求項２０ないし２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換えＭＶＡウイルスの投与は無針式注射によるものである、請求項２０ないし２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記初回刺激用組成物は、前記抗原をコードするプラスミドＤＮＡを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子をコードするプラスミド移入ベクターであって、該ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子が、ｇｐ１２０、ならびにｇｐ４１の膜貫通および外部ドメインから構成されるが、ｇｐ４１の細胞質ドメインの一部またはすべてを欠如しているＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードするように改変されているプラスミド移入ベクターを調製し、請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の組成物を生産するために、ＭＶＡウイルスベクターにおいて前記プラスミド移入ベクターを組換えることを含む、請求項１ないし１５のいずれかに記載の組成物を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus: ＨＩＶ）ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子を発現するワクシニアウイルスの複製欠損株である改変ワクシニアアンカラ(modified vaccinia Ankara: ＭＶＡ）を提供する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
細胞性免疫は、免疫不全ウイルス感染の制御において重要な役割を果たす(P.J. Goulder et al., 1999 AIDS 13:S121)。最近では、サイトカイン増強により細胞性免疫を高めるように設計されたＤＮＡワクチンが伝染力の強い免疫不全ウイルスの曝露を首尾よく抑えた(D.H. Barouch et al. 2000 Science 290:486)。細胞性免疫を上昇させるための別の有望なアプローチは、ＤＮＡ初回刺激、続く組換えポックスウイルスブースターである(H.L. Robinson et al. 2000 AIDS Rev 2:105)。この異種初回刺激／追加免疫レジメンは、ＤＮＡまたは組換えポックスウイルスワクチン単独による初回刺激および追加免疫よりも、１０〜１００倍高い頻度のＴ細胞を誘導する。すでに、研究者等は、ポックスウイルスの応答によるＤＮＡ初回刺激応答の追加免疫が非病原性免疫不全ウイルスの制御に関して、ＤＮＡまたはタンパク質による追加免疫より優れていることを示した(H.L. Robinson et al. 1999 Nat Med 5:526)。病原性免疫不全ウイルスを制御する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
［発明の概要］
本明細書では、本発明者等は、ＤＮＡ初回刺激、続く組換え改変ワクシニアアンカラ（ｒＭＶＡ）ブースターがアカゲザル(rhesus macaque)モデルにおいて、高病原性免疫不全ウイルス曝露を制御したことを報告する。ワクチンのＤＮＡおよびｒＭＶＡ構成成分の両方が、複数の免疫不全ウイルスタンパク質を発現した。０週および８週での２回のＤＮＡ接種、ならびに２４週での一回のｒＭＶＡブースターにより、ブースターの７ヵ月後に投与した直腸内の曝露を効果的に制御した。これらの見解は、比較的単純な多タンパク質ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンが後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の流行を制御するのに役立ち得ることを示すと想定される。本発明者等はまた、ｒＭＶＡの接種がＤＮＡ初回刺激なしでも、良好な免疫応答を誘導することを報告する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ｐｏｌ遺伝子配列の独自性に基づいたＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の系統発生的関連。ＳＩＶcpzおよびＳＩＶsmmは、それぞれチンパンジーおよびスーティマンガベイザルから回収した類人霊長目動物レンチウイルスである。
【図２】完全長ｐｏｌ遺伝子配列に基づいた４つの異なるＳＩＶcpz単離物とのＨＩＶ−１群Ｍ、ＮおよびＯの系統発生的関連。横棒は、０．１（１０％ヌクレオチド発散の遺伝距離を示し、アスタリスクは、ｅｎｖ配列に基づいたＮ群のＨＩＶ−１単離物の位置を示す。
【図３】ＨＩＶ−１単離物の向性特性および生物特性。
【図４】ＨＩＶコードタンパク質。ＨＩＶ遺伝子の位置、一次翻訳産物（場合によってはポリタンパク質）の大きさ、およびプロセシングされた成熟ウイルスタンパク質が示されている。
【図５】成熟ＨＩＶ−１ビリオンの模式表示。
【図６】ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ糖タンパク質の線状表示。矢印は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に対するｇｐ１６０切断の部位を示す。ｇｐ１２０では、斜線領域は、可変ドメイン（Ｖ1〜Ｖ5）を表し、白抜きボックスは保存配列（Ｃ1〜Ｃ5）を表す。ｇｐ４１外部ドメインでは、幾つかのドメインを示す：Ｎ末端融合ペプチド、および２つの外部ドメインへリックス（ＮおよびＣ−ヘリックス）。膜貫通ドメインは、黒ボックスで表される。ｇｐ４１細胞質ドメインでは、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｘ−Ｌｅｕ（ＹＸＸＬ）エンドサイトーシスモチーフ（配列番号９）および２つの予測へリックスドメイン（ヘリックス１および２）が示されている。アミノ酸番号を示している。
【図７Ａ】Ｇａｇ特異的Ｔ細胞の時間的頻度。ＤＮＡ初回抗原およびｒＭＶＡブースター免疫感作により上昇されるＧａｇ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答。模式表示は、高用量皮内ＤＮＡ免疫感作動物で作成したＧａｇ−ＣＭ９四量体データを意味する。
【図７Ｂ】Ｇａｇ特異的Ｔ細胞の時間的頻度。曝露前の様々な時間、および曝露の２週後のＡ*０１（白抜き棒）および非Ａ*０１（黒塗り棒）マカクにおけるＧａｇ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ。１０〜１３個のＧａｇペプチド（１２個が重複している２２量体）の３つのプールを分析用に使用した。データ棒上の数字は、各群内のＥＬＩＳＰＯＴに関する相加平均±ＳＤを表す。グラフの最上部の番号は、個々の動物を示している。＊はデータが入手不可能であり、＃は、１×１０6個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）当たりのＥＬＩＳＰＯＴが２０未満である。Ｇａｇ−ＣＭ９−Ｍａｍｕ−Ａ*０１四量体特異的Ｔ細胞に関する時間的データは図１２に見出され得る。
【図８Ａ】ワクチン接種動物および対照動物の曝露後の一時的ウイルス負荷、ＣＤ４計数、および生存。相乗平均ウイルス負荷。曝露後の最初の１２週に関するアッセイは、血漿１ミリリットル当たり１０００個のＲＮＡコピーの検出レベルを有していた。１０００個以下の負荷を有する動物は負荷５００とスコア付けした。１６週および２０週に関して、検出レベルは１ミリリットル当たり３００個のＲＮＡコピーであった。３００個以下のウイルスレベルを有する動物は３００とスコア付けした。
【図８Ｂ】ワクチン接種動物および対照動物の曝露後の一時的ウイルス負荷、ＣＤ４計数、および生存。相乗平均ＣＤ４計数。曝露後の最初の１２週に関するアッセイは、血漿１ミリリットル当たり１０００個のＲＮＡコピーの検出レベルを有していた。１０００個以下の負荷を有する動物は負荷５００とスコア付けした。１６週および２０週に関して、検出レベルは１ミリリットル当たり３００個のＲＮＡコピーであった。３００個以下のウイルスレベルを有する動物は３００とスコア付けした。
【図８Ｃ】ワクチン接種動物および対照動物の曝露後の一時的ウイルス負荷、ＣＤ４計数、および生存。ワクチン接種動物および対照動物の生存曲線。点線は、２４匹のワクチン接種動物すべてを表す。ワクチン群および対照群における個々の動物に関する。曝露後の最初の１２週に関するアッセイは、血漿１ミリリットル当たり１０００個のＲＮＡコピーの検出レベルを有していた。１０００個以下の負荷を有する動物は負荷５００とスコア付けした。１６週および２０週に関して、検出レベルは１ミリリットル当たり３００個のＲＮＡコピーであった。３００個以下のウイルスレベルを有する動物は３００とスコア付けした。
【図８Ｄ】ワクチン接種動物および対照動物の曝露後の一時的ウイルス負荷、ＣＤ４計数、および生存。ウイルス負荷。曝露後の最初の１２週に関するアッセイは、血漿１ミリリットル当たり１０００個のＲＮＡコピーの検出レベルを有していた。１０００個以下の負荷を有する動物は負荷５００とスコア付けした。１６週および２０週に関して、検出レベルは１ミリリットル当たり３００個のＲＮＡコピーであった。３００個以下のウイルスレベルを有する動物は３００とスコア付けした。
【図８Ｅ】ワクチン接種動物および対照動物の曝露後の一時的ウイルス負荷、ＣＤ４計数、および生存。ＣＤ４計数。動物番号の手掛かりは図８Ｅで表す。曝露後の最初の１２週に関するアッセイは、血漿１ミリリットル当たり１０００個のＲＮＡコピーの検出レベルを有していた。１０００個以下の負荷を有する動物は負荷５００とスコア付けした。１６週および２０週に関して、検出レベルは１ミリリットル当たり３００個のＲＮＡコピーであった。３００個以下のウイルスレベルを有する動物は３００とスコア付けした。
【図９Ａ】ワクチン群および対照群における曝露後Ｔ細胞。一時的四量体+細胞（破線）およびウイルス負荷（実線）。
【図９Ｂ】ワクチン群および対照群における曝露後Ｔ細胞。曝露の二週後のＧａｇ−ＣＭ９ペプチドによる刺激に応答したＩＦＮ−γ産生に関する細胞内サイトカインアッセイ。このｅｘ ｖｉｖｏアッセイは、図７Ａに示したピークの曝露後の四量体+細胞の機能状態の評価を可能にする。
【図９Ｃ】ワクチン群および対照群における曝露後Ｔ細胞。曝露後１２週目の増殖アッセイ。一過性のトランスフェクションにより産生されたＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ（白抜き棒）およびＧａｐ−Ｐｏｌ（斜線棒）を刺激用に使用した。偽トランスフェクトした培養物からの上清は対照抗原として作用した。刺激指数は、ウイルス抗原の存在下での培養物の成長を、偽抗原の存在下での培養物の成長で除算したものである。
【図１０Ａ】曝露の１２週後のリンパ節組織形態学。増大胚中心ならびに別個の濃淡ゾーンを有する無数の二次卵胞の存在を特徴とする小胞過形成の徴候を示すワクチン接種マカクからの典型的なリンパ節。
【図１０Ｂ】曝露の１２週後のリンパ節組織形態学。小胞の消耗および副皮質リンパ球の萎縮を示す感染対照動物からの典型的なリンパ節。
【図１０Ｃ】曝露の１２週後のリンパ節組織形態学。非反応性胚中心を示す年齢が対応した未感染マカクからの代表的なリンパ節。
【図１０Ｄ】曝露の１２週後のリンパ節組織形態学。胚中心により占有される総リンパ節領域の割合を測定して、小胞過形成の非特異的指標を与えた。未感染対照に関するデータは、４つの年齢が対応したアカゲザルである。
【図１１Ａ】時間的抗体応答。総Ｇａｇのマイクログラムを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。力価は、ヒトＰＢＭＣで成長させた示したウイルスの５０％中和を付与する血清希釈の逆数である。動物についてのシンボルは図８と同じである。
【図１１Ｂ】時間的抗体応答。総Ｅｎｖ抗体のマイクログラムを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。力価は、ヒトＰＢＭＣで成長させた示したウイルスの５０％中和を付与する血清希釈の逆数である。動物についてのシンボルは図８と同じである。
【図１１Ｃ】時間的抗体応答。ＳＨＩＶ−８９．６（Ｃ）およびＳＨＩＶ−８９．６Ｐ（Ｄ）に関する中和抗体の力価を、ＭＴ−２細胞死滅およびニュートラルレッド染色により測定した(D.C. Montefiori et al. 1988 J Clin Microbiol 26:231)。力価は、ヒトＰＢＭＣで成長させた示したウイルスの５０％中和を付与する血清希釈の逆数である。動物についてのシンボルは図８と同じである。
【図１１Ｄ】時間的抗体応答。ＳＨＩＶ−８９．６Ｐに関する中和抗体の力価を、ＭＴ−２細胞死滅およびニュートラルレッド染色により測定した(D.C. Montefiori et al. 1988 J Clin Microbiol 26:231)。力価は、ヒトＰＢＭＣで成長させた示したウイルスの５０％中和を付与する血清希釈の逆数である。動物についてのシンボルは図８と同じである。
【図１２】曝露前の様々な時間、および曝露の２週後のＭａｍｕ−Ａ*０１ワクチン接種マカクおよび対照マカクにおけるＧａｇ−ＣＭ９−Ｍａｍｕ−Ａ*０１四量体特異的Ｔ細胞。各プロットの右上角の数字は、総ＣＤ８Ｔ細胞の％としての四量体特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度を表す。ＦＡＣＳデータの各欄上部の番号は個々の動物を示す。
【図１３−１】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８のマップ。
【図１３−２】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−３】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−４】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−５】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−６】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−７】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−８】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−９】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１０】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１１】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１２】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１３】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１４】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１５】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１６】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１７】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１８】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−１９】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２０】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２１】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２２】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２３】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２４】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２５】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２６】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２７】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２８】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−２９】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１３−３０】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１４−１】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１４−２】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１４−３】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１４−４】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１４−５】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８の配列。
【図１４−６】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８、Ｐｓｙ ＩＩプロモーター（これはＡＤＡエンベロープ発現を制御する）、トランケート型ＡＤＡエンベロープの配列。
【図１４−７】トランケート型ＡＤＡエンベロープ、ＰｍＨ５プロモーター（これはＨＸＢ２ ｇａｇ ｐｏｌ発現を制御する）、およびＨＸＢ２ ｇａｇ ｐｏｌ（安全な突然変異、Δインテグラーゼを有する）の配列。
【図１４−８】ＨＸＢ２ ｇａｇ ｐｏｌ（安全な突然変異、Δインテグラーゼを有する）の配列。
【図１４−９】ＨＸＢ２ ｇａｇ ｐｏｌ（安全な突然変異、Δインテグラーゼを有する）の配列。
【図１５】プラスミド移入ベクターｐＬＷ−４８、およびＭＶＡ組換えウイルスＭＶＡ／ＨＩＶ４８の作製。
【図１６】クレードＢ ｇａｇ ｐｏｌ。
【図１７】新規Ｐｓｙｎ ＩＩプロモーターの配列。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
［好適な実施形態の詳細な説明］
組換えＭＶＡウイルス
ポックスビリダエ(Poxviridae)ファミリーのオルソポックスウイルス(Orthopoxvirus)属の成員であるワクシニアウイルスは、ヒト天然痘疾患に対して免疫感作するための生ワクチンとして使用された。ワクシニアウイルスによる世界中に及ぶワクチン接種の成功により、天然痘の原因作用物質である痘瘡ウイルスの根絶に達した(The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication. History of Puclic Health, No.4, Geneva: World Health Organization, 1980)。このＷＨＯ宣言以来、ワクチン接種は、ポックスウイルス感染の高い危険性のある人々（例えば、実験室作業者）を除いて全面的に中断された。
【０００６】
より最近では、ワクシニアウイルスは、組換え遺伝子発現のために、および組換え生ワクチンとしての潜在的用途のために、ウイルスベクターを操作するのにも使用されている(Mackett, M. et al. 1982 PNAS USA 79:7415-7419; Smith, G.L. et al. 1984 Biotech Genet Engin Rev 2:383-407)。これは、ＤＮＡ組換え技法を用いて、ワクシニアウイルスのゲノムに導入される外来抗原をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）を必要とする。遺伝子がウイルスのライフサイクルに必須ではないウイルスＤＮＡ中の部位に組み込まれる場合、新たに産生される組換えワクシニアウイルスが感染性である可能性がある。すなわち、外来細胞を感染させ、したがって組み込まれたＤＮＡ配列を発現することが可能である（欧州特許出願第８３，２８６号、および同第１１０，３８５号）。この方法で調製される組換えワクシニアウイルスは、一方では感染疾患の予防用の生ワクチンとして、他方では真核生物における異種タンパク質の調製に使用することができる。
【０００７】
ベクターの用途としては、高弱毒化ワクシニアウイルス株を用いて健康危機を減少させることである。幾つかのかかるワクシニアウイルス株は、天然痘ワクチン接種による望ましくない副作用を回避するために特に開発された。したがって、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）は、トリ胚線維芽細胞におけるワクシニアウイルス（ＣＶＡ）のアンカラ株を長期にわたり連続的に継代することにより生成された（概説として、Mayr, A. et al. 1975 Infection 3:6-14、スイス特許第５６８，３９２号を参照）。ＭＶＡウイルスは、ＡＴＣＣ第ＶＲ−１５０８号としてAmerican Type Culture Collectionから公的に入手可能である。ＭＶＡは、その高い弱毒性を特徴とし、すなわち良好な免疫原性を保持しながら低減したビルレンスおよび霊長目動物細胞で複製する能力を特徴とする。ＭＶＡウイルスを、親ＣＶＡ株に対するゲノム中の変化を決定するために分析した。総計３１，０００個の塩基対となるゲノムＤＮＡの６つの主な欠失（欠失Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩ）が特定された（Meyer, H. et al. 1991 J Gen Virol 72:1031-1038）。得られたＭＶＡウイルスは、宿主細胞がトリ細胞に厳しく制限されるようになった。
【０００８】
さらに、ＭＶＡは、その高い弱毒性を特徴とする。各種動物モデルで試験すると、ＭＶＡは、免疫抑制された動物においてさえも無毒であることが証明された。より重要なことには、ＭＶＡ株の優れた特性が、広範な臨床試験で実証されている(Mayr A. et al. 1978 Zentralbl Bakteriol [B] 167:375-390; Stickl et al. 1974 Dtsch Med Wschr 99: 2386-2392)。高危険性患者を含む１２０，０００人を超えるヒトでのこれらの研究中、副作用はＭＶＡワクチンの使用に付随しなかった。
【０００９】
ヒト細胞でのＭＶＡ複製は、感染の後期で阻止され、成熟感染ビリオンへの構築を防止することがわかった。それにもかかわらず、ＭＶＡは、非許容性細胞でさえも高レベルでウイルス遺伝子および組換え遺伝子を発現することが可能であり、効率的で格別に安全な遺伝子発現ベクターとして作用すると提唱された(Sutter, G. and Moss, B. 1992 PNAS USA
89:10847-10851)。さらに、新規ワクシニアベクターワクチンを、ＭＶＡゲノム内の欠失ＩＩＩの部位で挿入された外来ＤＮＡ配列を有するＭＶＡに基づいて確立した(Sutter, G. et al. 1994 Vaccine 12: 1032-1040)。
【００１０】
組換えＭＶＡワクシニアウイルスは、以下に記載するように調製することができる。ＭＶＡゲノム内の天然に存在する欠失（例えば、欠失ＩＩＩ）または他の非必須部位に隣接したＭＶＡのＤＮＡ配列が隣接した外来ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物が、ＭＶＡが感染した細胞に導入され、相同組換えを可能にする。いったんＤＮＡ構築物が真核細胞に導入され、外来ＤＮＡがウイルスＤＮＡと組換えられると、好ましくはマーカーを用いて、本質的に既知の様式で、所望の組換えワクシニアウイルスを単離することが可能である。挿入されるべきＤＮＡ構築物は線状であり得るか、または環状であり得る。プラスミドまたはポリメラーゼ連鎖反応産物が好ましい。ＤＮＡ構築物
は、ＭＶＡゲノム内の天然に存在する欠失（例えば、欠失ＩＩＩ）の左側および右側に隣接する配列を含有する。外来ＤＮＡ配列は、天然に存在する欠失に隣接する配列間に挿入される。ＤＮＡ配列または遺伝子の発現のために、遺伝子の転写に必要とされる調節配列がＤＮＡ上に存在する必要がある。かかる調節配列（いわゆるプロモーター）は当業者に既知であり、例えば欧州特許第１９８，３２８号に記載されるようなワクシニア１１ｋＤａ遺伝子のもの、および７．５ｋＤａ遺伝子のもの（欧州特許第１１０，３８５号）が挙げられる。ＤＮＡ構築物は、トランスフェクションにより、例えばリン酸カルシウム沈殿(Graham et al. 1973 Virol 52:456-467; Wigler et al., 1979 Cell 16:777-785)を用いて、エレクトロポレーション(Neumann et al. 1982 EMBO J 1:841-845)により、マイクロインジェクション(Graessmann et al. 1983 Meth Enzymol 101:482-492)により、リポソーム(Straubinger et al. 1983 Meth Enzymol 101:512-527)を用いて、スフェロプラスト(Schaffner 1980 PNAS USA 77:2163-2167)を用いて、または当業者に既知の他の手段を用いて、ＭＶＡ感染細胞に導入することができる。
【００１１】
ＨＩＶおよびその複製
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因学的作用物質は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれるレンチウイルス属の典型的な特徴を示すレトロウイルスであると認識されている。ヒトレンチウイルスの系統発生的関連を図１に示す。ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１よりも、野生型のスーティマンガベイザルから単離したウイルスであるＳＩＶsmmに、より密接に関連している。現在では、ＨＩＶ−２はヒトへのＳＩＶsmmの人獣共通伝染を表すと考えられている。ＳＩＶcpzと称した捕獲チンパンジーからの一連のレンチウイルス単離物は、ＨＩＶ−１に近い遺伝的関係にある。
【００１２】
ＨＩＶ−１単離物の最初期の系統発生的解析を、欧州／北アメリカおよびアフリカからの試料に焦点を当てて行い、ウイルスの別個のクラスターが世界のこれらの２つの地域から同定された。続いて、ＨＩＶ−１の別個の遺伝的亜型またはクレードが定義され、３つの群：Ｍ（主要）、Ｏ（外れ）、およびＮ（非ＭまたはＯ）に類別された（図２）。全世界のウイルス単離物の９５％以上を包含するＨＩＶ−１のＭ群は、完全ウイルスゲノムの配列に基づいて、少なくとも８個の別個のクレード（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＪ）を含有する。ＨＩＶ−１ Ｏ群の成員は、カメルーン、ガボン、および赤道ギニアに居住する個体から回収され、それらのゲノムは、Ｍ群ウイルスと、５０％未満のヌクレオチド配列の同一性を共有する。より最近に発見されたＮ群 ＨＩＶ−１株は、感染カメルーン人において同定されたが、標準的な全ウイルス酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において血清学的に反応することができず、依然として従来のウェスタンブロット解析により容易に検出可能である。
【００１３】
ＨＩＶ−１遺伝的変異に関する最新の知識は、多種多様な地理的起源のＭ群ウイルスの研究によってもたらされる。ここ１０年間に収集したデータは、感染個体内に存在するＨＩＶ−１集団はヌクレオチド配列において６％〜１０％変化し得ることを示している。クレード内のＨＩＶ−１単離物は、ｇａｇにおいて１５％、ｇｐ１２０コード配列において最大３０％のヌクレオチド距離を示し得る。クレード間の遺伝的変異は、解析される遺伝子に応じて、３０％〜４０％の範囲であり得る。
【００１４】
ＨＩＶ−１ Ｍ群亜型はすべてアフリカでに見出すことができる。クレードＡウイルスは、遺伝的に最も多岐にわたり、流行の初期ではアフリカで最も一般的なＨＩＶ−１亜型であった。１９９０年代の中期から後期にかけてのＨＩＶ−１の南アフリカへの急速な蔓延とともに、クレードＣウイルスが優性亜型となり、今では世界中のＨＩＶ−１感染の４８％を占める。最も集中的に研究されたＨＩＶ−１亜型であるクレードＢウイルスは、依然として欧州および北アメリカにおいて最も流行している単離物である。
【００１５】
遺伝子組換えが高比率であることはレトロウイルスの特徴である。遺伝的に多様なウイルス株による同時感染はＨＩＶ−１に関して危険性のある個体において確立される可能性が低いと最初は考えられていた。しかしながら、１９９５年までには、ＨＩＶ−１ Ｍ群の全体的な多様性のかなりの割合がクレード間のウイルス組換え体を包含することが明らかとなってきた。現在では、ＨＩＶ−１組変え体が、アフリカ、南アメリカ、および東南アジアのような地理上の区域で見出され、ここでは複数のＨＩＶ−１亜型が共存し、１０％を上回る循環ＨＩＶ−１株を占め得ることが理解されよう。分子的に、これらの組換えウイルスゲノムは、並置された多様なＨＩＶ−１亜型セグメントを伴うパッチワークモザイクのようであり、それらの世代に寄与する複数のクロスオーバー事象を反映している。多くのＨＩＶ−１組換え体はアフリカに出現し、大部分が本来クレードＡウイルスに由来するセグメントを含有する。タイでは、例えば、優勢循環株の組成は、クレードＡのｇａｇ＋ｐｏｌ遺伝子セグメント、およびクレードＥのｅｎｖ遺伝子から構成される。タイＨＩＶ−１株中のクレードＥのｅｎｖ遺伝子が、中央アフリカ共和国からのウイルス単離物中に存在するクレードＥのｅｎｖに密接に関連しているため、もとの組換え事象はアフリカで起こり、続いて子孫ウイルスがタイに導入されたと考えられる。興味深いことに、完全長ＨＩＶ−１亜型Ｅ単離物（すなわち、亜型Ｅのｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を有する）はこれまで報告されていない。
【００１６】
αおよびβケモカイン受容体がウイルス融合および感受性ＣＤ４+細胞への侵入のための補助受容体として機能するという発見は、ＨＩＶ−１に関する改定類別スキームをもたらした（図３）。今日では、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０およびＣＤ４+補助受容体タンパク質が別個の細胞で発現される単離体は、融合アッセイにおいてケモカイン受容体の有用性に基づいて類別される。図３に示すように、ＣＸＣＲ４受容体を用いたＨＩＶ単離体（ここではＸ４ウイルスと称する）は通常、Ｔ細胞系（ＴＣＬ）向性シンシチウム誘導性（ＳＩ）株であるのに対して、専らＣＣＲ５受容体を利用したもの（Ｒ５ウイルス）は、優勢マクロファージ（Ｍ）向性かつ非シンシチウム誘導性（ＮＳＩ）である。親単離物の大部分を含み、向性表現型の連続体を示し得る二重向性Ｒ５／Ｘ４株は頻繁にＳＩである。
【００１７】
すべての複製コンピテントレトロウイルスの場合のように、すべてが構造タンパク質をコードする３つの一次ＨＩＶ−１翻訳産物は、まずポリタンパク質前駆体として合成され、続いてウイルスまたは細胞プロテアーゼにより成熟粒子関連タンパク質へとプロセシングされる（図４）。５５ｋＤのＧａｇ前駆体Ｐｒ５５Gagは、マトリックス（ＭＡ）、キャプシド（ＣＡ）、ヌクレオキャプシド（ＮＣ）、およびｐ６タンパク質に切断される。１６０ｋＤのＧａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質であるＰｒ１６０Gag-Polの自己触媒は、プロテアーゼ（ＰＲ）、ヘテロ二量体逆転写酵素（ＲＴ）、およびインテグラーゼ（ＩＮ）タンパク質を生じるのに対して、細胞酵素（複数可）によるタンパク質分解性消化は、グリコシル化１６０ｋＤ Ｅｎｖ前駆体ｇｐ１６０を、ｇｐ１２０表面（ＳＵ）およびｇｐ４１膜貫通（ＴＭ）切断産物へと変換する。残りの６つのＨＩＶ−１コードタンパク質（Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、およびＮｅｆ）は、スプライシングされたｍＲＮＡの一次翻訳産物である。
【００１８】
Ｇａｇ
他のレトロウイルスと同様にＨＩＶのＧａｇタンパク質は、非感染性ウイルス様粒子の形成に必要かつ十分である。レトロウイルスＧａｇタンパク質は概して、ポリタンパク質前駆体として合成され、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ前駆体は、その見かけの分子質量に基づいてＰｒ５５Gagと呼ばれている。上述したように、Ｐｒ５５Gag用のｍＲＮＡは、細胞質中でのその発現のためにＲｅｖを必要とするスプライシングされていない９．２ｋｂの転写物である（図４）。ｐｏｌ ＯＲＦが存在する場合、ウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）は、細胞からの出芽中、またはその直後にＰｒ５５Gagを切断して、成熟Ｇａｇタンパク質ｐ１７（ＭＡ）、ｐ２４（ＣＡ）、ｐ７（ＮＣ）、およびｐ６を生成する（図４参照）。ビリオ
ンでは、ＭＡは、ウイルスエンベロープの脂質二重層のすぐ内部に局在化され、ＣＡは、粒子の中心にある円錐体形状のコア構造の外側部分を形成し、ＮＣは、ウイルスＲＮＡゲノムとのリボヌクレオタンパク質複合体中のコア中に存在する（図５）。
【００１９】
ＨＩＶ Ｐｒ５５Gag前駆体はその翻訳後にオリゴマー形成し、原形質膜を標的とし、そこでＥＭにより見るのに十分な大きさと密度を有する粒子が集合される。Ｐｒ５５Gagによるウイルス様粒子の形成は自己集合プロセスであり、重要なＧａｇ−Ｇａｇ相互作用がＧａｇ前駆体に沿った複数のドメイン間で行われる。ウイルス様粒子の集合は、ゲノムＲＮＡ（核酸の存在は必須のようであるが）、ｐｏｌコード酵素、またはＥｎｖ糖タンパク質の関与を必要としないが、感染性ビリオンの産生は、ウイルスＲＮＡゲノムのキャプシド形成、ならびにＥｎｖ糖タンパク質およびＧａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質前駆体Ｐｒ１６０Gag-Polの組み込みを必要とする。
【００２０】
Ｐｏｌ
ＨＩＶゲノムの最も高度に保存される領域である、３つの酵素：ＰＲ、ＲＴおよびＩＮをコードするｐｏｌ遺伝子はｇａｇの下流に存在する（図４参照）。ＲＴおよびＩＮは、それぞれ二本鎖ＤＮＡコピーへのウイルスＲＮＡゲノムの逆転写のために、および宿主細胞の染色体へのウイルスＤＮＡの組み込みのために必要とされる。ＰＲは、成熟感染性ビリオンの産生を媒介することによりライフサイクルの後期において重要な役割を果たす。ｐｏｌ遺伝子産物は、Ｐｒ１６０Gag-Polと称される１６０ｋＤのＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質の酵素切断により得られる。この融合タンパク質は、Ｐｒ５５Gagの翻訳中のリボソームフレームシフトにより産生される（図４参照）。他の多くのレトロウイルスによっても利用されるＧａｇ−Ｐｏｌ発現に関するフレームシフトメカニズムは、ｐｏｌ由来タンパク質が低レベルで、Ｇａｇのおよそ５％〜１０％のレベルで発現されることを保証する。Ｐｒ５５Gagと同様に、Ｐｒ１６０Gag-PolのＮ末端はミリスチル化され、原形質膜を標的とする。
【００２１】
プロテアーゼ
トリレトロウイルスを用いて実施した初期のパルス・チェイス研究により、レトロウイルスのＧａｇタンパク質がポリタンパク質前駆体として最初に合成され、切断されて、より小さな産物を生成することが明示された。続く研究により、プロセシング機能は細胞酵素ではなくウイルスにより提供され、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌ前駆体のタンパク質分解性消化がウイルス感染力に必須であることが実証された。レトロウイルスＰＲの配列解析により、レトロウイルスＰＲがペプシンおよびレニンのような細胞の「アスパラギン酸」プロテアーゼに関連することが示された。これらの細胞酵素と同様に、レトロウイルスＰＲは、活性部位にある２つの並置されたＡｓｐ残基を使用して、標的タンパク質中のペプチド結合の加水分解を触媒する水分子を配位させる。偽二量体として機能する（活性部位を生成するために同じ分子内の２つのフォールド（fold）を用いて）細胞のアスパラギン酸プロテアーゼと異なり、レトロウイルスＰＲは真の二量体として機能する。ＨＩＶ−１
ＰＲからのＸ線結晶データは、２つの単量体が、部分的に各単量体のＮおよびＣ末端両方に由来する４本鎖逆平行βシートによりまとまっていることを示す。基質結合部位は、２つの単量体間に形成される間隙内に位置される。それらの細胞相同体と同様に、ＨＩＶ
ＰＲ二量体は、結合部位に突出する可撓性「フラップ」を含有し、間隙内の基質を安定させ、活性部位Ａｓｐ残基は二量体の中心に存在する。興味深いことに、幾つかの限定されたアミノ酸相同性が活性部位残基周辺で観察されるものの、レトロウイルスＰＲの一次配列は非常に多岐にわたり、それらの構造は依然として著しく類似している。
【００２２】
逆転写酵素
定義によると、レトロウイルスは、感染プロセスの初期段階中に、それらの一本鎖ＲＮＡゲノムを二本鎖ＤＮＡに変換する能力を保有する。この反応を触媒する酵素がＲＴであり
、その関連するＲＮアーゼＨ活性を伴う。レトロウイルスのＲＴは、３つの酵素活性を有する：（ａ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡ重合（マイナス鎖ＤＮＡ合成用）、（ｂ）ＲＮアーゼＨ活性（ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中間体に存在するｔＲＮＡプライマーおよびゲノムＲＮＡの縮重用）、および（ｃ）ＤＮＡ指向性ＤＮＡ重合（二重鎖またはプラス鎖ＤＮＡ合成用）。
【００２３】
成熟ＨＩＶ−１ ＲＴホロ酵素は、６６および５１ｋＤのサブユニットのヘテロ二量体である。５１ｋＤのサブユニット（ｐ５１）は、ＰＲによるｐ６６のＣ末端の１５ｋＤのＲＮアーゼＨドメインのタンパク質分解性除去により、６６ｋＤ（ｐ６６）サブユニットから得られる（図４参照）。ＨＩＶ−１ ＲＴの結晶構造は、ｐ６６およびｐ５１サブユニットの配向が実質的に異なる、高度に非対称であるフォールディング（folding）を明らかにする。ｐ６６サブユニットは、パーム（palm）内のポリメラーゼ活性部位、ならびにパーム、フィンガー（fingers）およびサム（thumb）サブドメインにより形成される深い鋳型結合間隙を伴う右手として可視化することができる。ポリメラーゼドメインは、接続サブドメインによりＲＮアーゼＨに連結される。パームに位置する活性部位は、非常に近位の３つの重要なＡｓｐ残基（１１０、１８５、および１８６）、および２つの配位Ｍｇ2+イオンを含有する。これらのＡｓｐ残基の突然変異はＲＴ重合活性を根絶させる。３つの活性部位Ａｓｐ残基の配向は、他のＤＮＡポリメラーゼで観察されるものと類似している（例えば、大腸菌ＤＮＡ ｐｏｌＩのクレノウ断片）。ｐ５１サブユニットは剛質であるようであり、重合間隙を形成せず、このサブユニットのＡｓｐ１１０、１８５、および１８６は分子内に潜在している。およそ１８塩基対のプライマー−鋳型二重鎖は、核酸結合間隙中に存在し、ポリメラーゼ活性部位からＲＮアーゼＨドメインまで伸長している。
【００２４】
ＲＴ−プライマー−鋳型−ｄＮＴＰ構造では、プライマーの３'末端にあるジデオキシヌクレオチドの存在により、新たなｄＮＴＰへの曝露の直前に捕捉される触媒複合体の可視化が可能となる。すでに得られた構造との比較によりモデル、それにより新たなｄＮＴＰへのプライマーの３'−ＯＨの求核曝露前に、鋳型およびｄＮＴＰを捕捉するために包囲されているフィンガーが提案されている。新たなｄＮＴＰが成長中の鎖に付加した後、フィンガーはより開いた立体配置を採択し、それによりピロリン酸塩を放出し、ＲＴが次のｄＮＴＰに結合することが可能である。ＨＩＶ−１ ＲＮアーゼＨの構造もまたＸ線結晶学により決定し、このドメインは大腸菌ＲＮアーゼＨと類似した全体的なフォールディングを示す。
【００２５】
インテグラーゼ
レトロウイルス複製の際立った特徴は、逆転写後の宿主細胞染色体のウイルスゲノムのＤＮＡコピーの挿入である。組み込まれたウイルスＤＮＡ（プロウイルス）はウイルスＲＮＡの合成用の鋳型として作用し、感染細胞の生涯の間、宿主細胞ゲノムの一部として維持される。組み込む能力が欠損したレトロウイルス突然変異体は一般に、生産的感染を確立することができない。
【００２６】
ウイルスＤＮＡの組み込みは、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質のＣ末端部分のＰＲ媒介性切断により生成される３２ｋＤのタンパク質であるインテグラーゼにより触媒される（図４参照）。
【００２７】
レトロウイルスＩＮタンパク質は３つの構造的かつ機能的に別個のドメイン：Ｎ末端ジンクフィンガー含有ドメイン、コアドメイン、および比較的非保存的Ｃ末端ドメインから構成される。その低溶解性のため、全２８８アミノ酸ＨＩＶ−１ ＩＮタンパク質を結晶化することは依然として可能ではない。しかしながら、３つのドメインすべての構造は、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ方法により個々に解明された。鳥類肉腫ウイルスＩＮのコアドメインの結晶構造もまた決定されている。ＮＭＲ分光法により構造が解明されたＮ末端ドメイ
ン（残基１〜５５）は、アミノ酸（Ｈｉｓ−１２、Ｈｉｓ−１６、Ｃｙｓ−４０、およびＣｙｓ−４３）により配位された亜鉛を伴う４つのへリックスから構成される。Ｎ末端ドメインの構造は、いわゆるヘリックス・ターン・へリックスモチーフを含有するヘリックスＤＮＡ結合タンパク質を連想させるが、ＨＩＶ−１構造では、このモチーフが二量体形成に寄与する。最初は、乏しい溶解性がコアドメインの構造を解明するための努力を妨害していた。しかしながら、ＩＮ残基１８５でのＰｈｅからＬｙｓへの変化がｉｎ ｖｉｔｒｏ触媒活性を崩壊することなく溶解性を大いに増大させることが観察されると、結晶学の試みが成功した。ＨＩＶ−１ ＩＮコアドメイン（ＩＮ残基５０〜２１２）の各単量体は、へリックスに隣接した５本鎖βシートから構成され、この構造は、ＲＮアーゼＨおよびバクテリオファージＭｕＡトランスポーゼを含む他のポリヌクレオチジルトランスフェラーゼに対して顕著な類似を保有する。３つの高度に保存される残基は、他のポリヌクレオチジルトランスフェラーゼにおいて類似の位置で見られ、ＨＩＶ−ＩＮでは、これらは、Ａｓｐ−６４、Ａｓｐ−１１６、およびＧｌｕ−１５２、いわゆるＤ，Ｄ−３５−Ｅモチーフである。これらの位置での突然変異は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、ＨＩＶ ＩＮ機能を阻止する。鳥類肉腫ウイルスおよびＨＩＶ−１ ＩＮコアドメインの両方の結晶構造中でこれらの３つのアミノ酸が非常に近位であることは、これらの残基が組み込みプロセスの中心部であるポリヌクレオチジルトランスファー反応の触媒において中心的な役割を果たすこという仮定を支持する。ＮＭＲ分光法により構造が解明されたＣ末端ドメインは、Ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメインを連想させる５本鎖β−バレルフォールディングトポロジーを採択する。最近では、コアドメインおよびＣ末端ドメインの両方を包含するＳＩＶおよびラウス肉腫ウイルスタンパク質断片のＸ線結晶構造が解明されている。
【００２８】
Ｅｎｖ
ＨＩＶ Ｅｎｖ糖タンパク質は、ウイルスのライフサイクルにおいて重要な役割を果たす。ＨＩＶ Ｅｎｖ糖タンパク質は、ＣＤ４受容体および補助受容体と相互作用する決定基を含有し、それらは、ウイルスエンベロープの脂質二重層と宿主細胞原形質膜との間の融合反応を触媒する。さらに、ＨＩＶ Ｅｎｖ糖タンパク質は、診断的視点およびワクチン開発視点の両方から重要である免疫応答を誘発するエピトープを含有する。
【００２９】
ＨＩＶ Ｅｎｖ糖タンパク質は、単独でスプライシングされた４．３ｋｂのＶｐｕ／Ｅｎｖビシストロン性ｍＲＮＡから合成され（図４参照）、粗面小胞体（ＥＲ）に関連したリボソーム上で翻訳が行われる。１６０ｋＤの糖タンパク質前駆体（ｇｐ１６０）は、成熟ＴＭ Ｅｎｖ糖タンパク質ｇｐ４１になるドメイン中の疎水性停止トランスファーシグナルにより細胞膜に固着される完全膜タンパク質である（図６）。ｇｐ１６０は、共翻訳的に（cotranslationally）グリコシル化され、ジスルフィド結合を形成し、ＥＲにおいてオリゴマー形成を受ける。優勢オリゴマー形成は三量体であるように思われるが、二量体および四量体も観察される。ｇｐ１６０はゴルジへ輸送され、ここで他のレトロウイルスエンベロープ前駆体タンパク質と同様に、ｇｐ１６０は細胞酵素により、成熟ＳＵ糖タンパク質ｇｐ１２０およびＴＭ糖タンパク質ｇｐ４１へとタンパク質分解的に切断される（図６参照）。高度に保存されるＬｙｓ／Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇモチーフ後のレトロウイルスＥｎｖ前駆体の切断を招く細胞酵素は、フューリンまたはフューリン様プロテアーゼであるが、他の酵素もまたｇｐ１６０プロセシングを触媒し得る。ｇｐ１６０の切断は、Ｅｎｖ誘導性融合活性およびウイルス感染力に必要とされる。ｇｐ１６０切断に続いて、ｇｐ１２０およびｇｐ４１は、Ｅｎｖ複合体をゴルジから細胞表面へ輸送するのに重要な非共有結合を形成する。ｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用はまさに弱く、ｇｐ１２０の相当量が、Ｅｎｖ発現細胞の表面から除去される。
【００３０】
ＨＩＶ Ｅｎｖ糖タンパク質複合体、特にＳＵ（ｇｐ１２０）ドメインは、非常に多くグリコシル化されており、ｇｐ１６０のおよそ半分の分子質量が、オリゴ糖側鎖から構成さ
れている。ＥｎｖがＥＲにおけるその合成部位から原形質膜へ輸送される間に、側鎖の多くは複雑な糖の付加により修飾される。多くのオリゴ糖側鎖は、宿主免疫認識からｇｐ１２０の多くをわかりにくくする糖の雲（sugar cloud）のように想像することができるものを形成する。図６に示すように、ｇｐ１２０は、分散型保存（Ｃ1〜Ｃ5）ドメインおよび可変（Ｖ1〜Ｖ5）ドメインを含有する。種々の単離体のｇｐ１２０に存在するＣｙｓ残基は高度に保存され、大きなループ中の最初の４つの可変領域を連結するジスルフィド結合を形成する。
【００３１】
ウイルスＥｎｖ糖タンパク質の主な機能は、ウイルスエンベロープの脂質二重層と宿主細胞膜との間の膜融合反応を促進することである。この膜融合事象により、ウイルスコアが宿主細胞質に侵入することが可能となる。ｇｐ１２０およびｇｐ４１の両方における多数の領域が、Ｅｎｖ媒介性膜融合に、直接的または間接的に関与している。オルトミクソウイルスのＨＡ2赤血球凝集素タンパク質、およびパラミクソウイルスのＦタンパク質の研究により、融合ペプチドと称されるこれらのタンパク質のＮ末端にある高疎水性ドメインが膜融合において重要な役割を果たすことが示された。突然変異解析により、類似ドメインがＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ ＴＭ糖タンパク質のＮ末端に位置されることが実証された（図６参照）。ｇｐ４１のこの領域内の非疎水的置換は、シンシチウム形成を大いに減少させるか、またはそれを阻止し、結果として非感染性子孫ビリオンの産生をもたらした。
【００３２】
ｇｐ４１融合ペプチドのＣ末端は、膜融合において中心的な役割を果たす２つの両親媒性へリックスドメインである（図６を参照）。ロイシンジッパー様へプタッド繰り返しモチーフを含有するＮ末端へリックス（Ｎ−へリックスと称される）の突然変異は、感染力および膜融合活性を損ない、これらの配列に由来するペプチドは、培養において強力な抗ウイルス活性を示す。特に２つのへリックスモチーフであるＨＩＶ−１およびＳＩＶ ｇｐ４１の外部ドメインの構造は、近年、構造解析の関心の的である。ＮおよびＣへリックスに由来するペプチドの混合物であるへリックスドメインを含有する融合タンパク質、またはＳＩＶ構造の場合には、残基２７〜１４９の無傷ｇｐ４１外部ドメイン配列のいずれかに関する構造が、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ分光法により決定された。これらの研究により根本的に類似した三量体構造が得られ、ここでは２つのへリックスドメインが逆平行様式で充填され、６つのへリックス束を生成する。Ｎへリックスは束の中でコイルドコイルを形成し、Ｃへリックスは外側上の疎水性溝に充填される。
【００３３】
膜融合を引き起こす工程では、ＣＤ４結合が、補助受容体結合を促進するＥｎｖにおける配座変化を誘導する。３つからなるｇｐ１２０／ＣＤ４／補助受容体複合体の形成後、ｇｐ４１は、融合ペプチドが標的脂質二重層へ挿入することを可能にする仮説上の配座を採択する。ｇｐ４１の６つのへリックス束（これはｇｐ４１のＮへリックスとＣへリックスとの間の逆平行相互作用に関与する）の形成は、ウイルス膜および細胞膜を結び付け、膜融合が行われる。
【００３４】
ＣＤ８+細胞免疫応答を追加免疫するための組換えＭＶＡウイルスの使用
本発明は、抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答の生成、および抗体応答の誘発に関する。より詳細には、本発明は、「初回刺激および追加免疫」免疫感作レジメンに関し、ここでは初回刺激用組成物の投与により誘導される免疫応答が、追加免疫用組成物の投与により追加免疫される。本発明は、組換えＭＶＡ自体を含む各種タイプの初回刺激用組成物のいずれかで初回刺激した後に、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを用いて効果的な追加免疫を達成することができるという本発明者等の実験的実証に基づいている。
【００３５】
多数の病原体に対する免疫応答の主な防御的構成成分は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても既知のＣＤ８+型のＴリンパ球により媒介される。ＣＤ８+細胞の重要な機能は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）の分泌であり、これはＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答の尺度を提供する。免疫応答の第２の構成成分は、病原体のタンパク質に対して誘導される抗体である。
【００３６】
本発明は、以下に記載の実験が示すように、各種初回刺激用組成物のいずれかを用いて抗原に対して初回刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答に対する追加免疫を提供し、また抗体応答を誘発するための効果的な手段であることが見出されたＭＶＡを使用する。
【００３７】
意外にも、以下に記載の実験作業は、本発明の実施形態の使用によりＨＩＶ抗原を発現する組換えＭＶＡウイルスがＤＮＡワクチンにより初回刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を追加免疫し、また抗体応答を誘発することが可能となることを実証した。ＭＶＡは、皮内、筋内、または粘膜免疫感作後にＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。組換えＭＶＡはまた、組換えＭＶＡの１回または複数回の接種により追加免疫される免疫応答を初回刺激することが示されている。
【００３８】
プラスミドＤＮＡで免疫感作され、ＭＶＡで追加免疫された非ヒト霊長目動物は、生ウイルスによる粘膜内曝露に対して効果的に防御された。好適には、本発明者等は、初回刺激および追加免疫の両方のために皮内、筋内または粘膜内免疫感作に使用されるワクチン接種レジメンを使用することができ、例えばヒトにおいて、ＣＤ８+Ｔ細胞を誘導し、また抗体応答を誘発するのに適切な一般的な免疫感作レジメンとなることを見出した。
【００３９】
様々な態様および実施形態の本発明は、抗原をコードする核酸の先の投与により初回刺激される抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を追加免疫し、また抗体応答を誘発するために、ＨＩＶ抗原をコードするＭＶＡベクターを使用する。
【００４０】
本発明の一般的な態様は、ＨＩＶ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を追加免疫し、また抗体応答を誘発するためのＭＶＡベクターの使用を提供する。
【００４１】
本発明の一態様は、個体においてＨＩＶ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を追加免疫し、また抗体応答を誘発する方法であって、核酸からの発現による個体における抗原の産生のための調節配列に作動可能に連結された抗原をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを個体に供給することを含み、それにより個体において予め初回刺激された抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答は追加免疫される方法を提供する。
【００４２】
ＨＩＶ抗原に対する免疫応答は、プラスミドＤＮＡを用いた免疫感作により、または感染性作用物質を用いた感染により初回刺激されてもよい。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、個体においてＨＩＶ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を誘導し、また抗体応答を誘発する方法であって、抗原をコードする核酸を含む初回刺激用組成物を個体に投与し、続いて核酸からの発現による個体における抗原の産生のための調節配列に作動可能に連結された抗原をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む追加免疫用組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４４】
さらなる態様は、ＨＩＶ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を追加免疫し、また抗体応答を誘発するために哺乳動物に投与するための薬剤の製造における、開示するようなＭＶＡベクターの使用を提供する。かかる薬剤は概して、抗原をコードする核酸を含む初回刺激用組成物の先の投与後に投与するためのものである。
【００４５】
初回刺激用組成物は、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣ(Tartaglia et al. 1992 Virology 118:217-232)のような複製欠損株のようなワクシニアウイルスベクター、鶏痘またはカナリア痘（例えば、ＡＬＶＡＣとして知られる株）(Paoletti et al. 1994 Dev Biol Stand 82:65-69)のようなアビポックス(avipox)ベクター、あるいはアデノウイルスベクターまたは水疱性口内炎ウイルスベクターまたはアルファウイルスベクターのような任意のウイルスベクターを含んでもよい。
【００４６】
初回刺激用組成物は、抗原をコードするＤＮＡを含んでもよく、かかるＤＮＡは好ましくは哺乳動物細胞において複製することが不可能な環状プラスミドの形態である。任意の選択マーカーは、臨床的に使用される抗生物質に対して耐性であるべきではなく、したがって例えばカナマイシン耐性はアンピシリン耐性よりも好ましい。抗原発現は、哺乳動物細胞において活性なプロモーター、例えばサイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ ＩＥ）プロモーターにより駆動されるべきである。
【００４７】
本発明の様々な態様の特定の実施形態では、初回刺激用組成物の投与に続いて、追加免疫用組成物、または第１および第２の追加免疫用組成物で追加免疫され、第１および第２の追加免疫用組成物は、互いに同じであるか、または異なる。さらなる追加免疫用組成物は、本発明を逸脱することなく使用され得る。一実施形態では、三重免疫感作レジメンは、ＤＮＡ、続いて第１の追加免疫用組成物としてアデノウイルス、続いて第２の追加免疫用組成物としてＭＶＡ、続いて任意にさらなる（第３の）追加免疫用組成物、あるいは同じかもしくは異なるベクターのいずれかまたは両方の続く追加免疫投与を使用する。別の選択は、ＤＮＡ、続いてＭＶＡ、続いてアデノウイルス、続いて任意に同じかもしくは異なるベクターのいずれかまたは両方の続く追加免疫投与である。
【００４８】
それぞれ初回刺激用組成物および追加免疫用組成物においてコードされるべき抗原（しかしながら多くの追加免疫用組成物が使用される）は同一である必要はないが、少なくとも１つのＣＤ８+Ｔ細胞エピトープを共有すべきである。抗原は安全な抗原またはその断片に対応し得る。ペプチドエピトープまたは人工の一連エピトープを使用して、抗原における不必要なタンパク質配列をより効率的に切除し、ベクター（単数または複数）において配列をコードしてもよい。１つまたは複数のさらなるエピトープ、例えばＴヘルパー細胞により認識されるエピトープ、特に異なるＨＬＡ型の個体において認識されるエピトープが含まれてもよい。
【００４９】
組換えＭＶＡウイルスによりコードされるべき本発明のＨＩＶ抗原としては、少なくとも１つのＣＤ８+Ｔ細胞エピトープとしてＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、またはＮｅｆアミノ酸配列のアミノ酸配列により誘発される免疫原性活性を有するポリペプチドが挙げられる。このアミノ酸配列は、既知のＨＩＶ ＥｎｖまたはＰｏｌの少なくとも１０〜９００個のアミノ酸断片および／またはコンセンサス配列、あるいは既知のＨＩＶ Ｇａｇの１０〜４５０個のアミノ酸配列断片および／またはコンセンサス配列、あるいは既知のＨＩＶ Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、もしくはＮｅｆの少なくとも１０〜１００個のアミノ酸断片および／またはコンセンサス配列に実質的に相当する。
【００５０】
完全長Ｅｎｖ前駆体配列が本発明で使用するために提供されるものの、Ｅｎｖは部分配列を任意に欠失される。例えば、ｇｐ１２０表面およびｇｐ４１膜貫通切断産物の領域を欠失させることができる。
【００５１】
完全長Ｇａｇ前駆体配列が本発明で使用するために提供されるものの、Ｇａｇは部分配列を任意に欠失される。例えば、マトリックスタンパク質（ｐ１７）の領域、キャプシドタンパク質（ｐ２４）の領域、ヌクレオキャプシドタンパク質（ｐ７）の領域、およびｐ６（Ｇａｇポリタンパク質のＣ末端ペプチド）の領域を欠失させることができる。
【００５２】
完全長Ｐｏｌ前駆体配列が本発明で使用するために提供されるものの、Ｐｏｌは部分配列を任意に欠失される。例えば、プロテアーゼタンパク質（ｐ１０）の領域、逆転写酵素タンパク質（ｐ６６／ｐ５１）の領域、およびインテグラーゼタンパク質（ｐ３２）の領域を欠失させることができる。
【００５３】
かかるＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌは、既知のＥｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌタンパク質アミノ酸配列に少なくとも全体の５０％の同一性（例えば、５０〜９９％同一性）、または任意のその範囲もしくは値を有することができ、同時にＨＩＶの少なくとも１つの株に対して免疫原性応答を誘発する。
【００５４】
同一性率は、例えばthe University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム（バージョン６．０）を用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。ＧＡＰプログラムは、Smith and Waterman (Adv Appl Math 1981 2:482)により改訂されるように、Needleman and Wunsch (J Mol Biol 1970 48:443)のアラインメント方法を利用する。簡潔に述べると、ＧＡＰプログラムは、同一である整列させた表象（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）数を、２つの配列の短い方における表象の総数で除算したものとして同一性を定義する。ＧＡＰプログラムに関する好ましいデフォルトパラメータとしては、（１）ユニタリー比較行列（同一性に関して１、および非同一性に関して０の値を含む）およびSchwartz and Dayhoff (eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. 1979, pp. 353-358)に記載されるようなGribskov and Burgess (Nucl Acids Res 1986 14:6745)の加重比較行列、（２）各ギャップに関して３．０のペナルティ、および各ギャップ中の各表象に関してさらに０．１０のペナルティ、および（３）エンドギャップに関してはペナルティなしが挙げられる。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明のＥｎｖは、少なくとも１つのＨＩＶエンベロープタンパク質の変異形態である。好ましくは、Ｅｎｖは、ｇｐ１２０、ならびにｇｐ４１の膜貫通ドメインおよび外部ドメインから構成されるが、ｇｐ４１の細胞質ドメインの一部または全てを欠如する。
【００５６】
既知のＨＩＶ配列は、ＧＥＮＢＡＮＫのような市販用かつ規格化されたＨＩＶ配列データベースから、あるいはMyers et al. eds., Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Vol. I and II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, N. Mex. (1993)、またはhttp://hiv-web.lanl.gov/のような刊行編集物として容易に入手可能である。
【００５７】
本発明の組換えＭＶＡウイルスにおいて使用するための核酸によりコードされるさらなるＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌを得るためのＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌの置換あるいは挿入は、少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば、１〜２５個のアミノ酸）の置換または挿入を包含し得る。あるいは、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、１〜２５個のアミノ酸）を、ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌ配列から欠失させることができる。好ましくは、かかる置換、挿入、または欠失は、安全性特徴、発現レベル、免疫原性、および高複製率のＭＶＡとの適合性に基づいて特定される。
【００５８】
本発明のＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌにおけるアミノ酸配列変化は、例えばＤＮＡ中の突然変異により調製することができる。かかるＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌは、例えばアミノ酸配列内の異なるアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの欠失、挿入または置換を包含する。明らかに、ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌをコードする核酸でなされる突然変異は、リーディングフレームの外の配列に位置させてはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を産生することができる相補ドメインを創出しない。
【００５９】
本発明のＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌコード核酸はまた、本明細書中に提示した教示および手引きに基づいて、ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、もしくはＰｏｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ中のヌクレオチドの増幅あるいは部位特異的突然変異誘発、その後、コードＤＮＡを合成または逆転写して、ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、もしくはＰｏｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを産生することにより調製することができる。
【００６０】
本発明のＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌを発現する組換えＭＶＡウイルスは、本明細書中に提示した教示および手引きに基づいて、必要以上の実験なしで、当業者がルーチンで獲得することができる置換ヌクレオチドとして、ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌコード配列の限定された組を包含する。タンパク質化学および構造の詳細な説明に関しては、Schulz, G.E. et al., 1978 Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, N.Y.、およびCreighton, T.E., 1983 Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CAを参照されたい。コドン選択性のようなヌクレオチド配列置換の提示に関しては、Ausubel et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, N.Y. 1994 at §§ A.1.1-A.1.24、およびSambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. at Appnedices C and Dを参照されたい。
【００６１】
したがって、当業者は、本明細書中に提示した教示および手引きを考慮すれば、置換、欠失または挿入変異体を含む代替的ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌを得るために、ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ ＤＮＡまたはＲＮＡの他の位置で他のアミノ酸残基を置換する方法を理解されよう。
【００６２】
ＭＶＡベクター内では、コード抗原の発現のための調節配列は、天然、改変または合成ポックスウイルスのプロモーターを包含する。「プロモーター」とは、下流に（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖上における３'方向に）作動可能に連結されるＤＮＡの、転写が開始され得るヌクレオチド配列を意味する。「作動可能に連結される」とは、プロモーターから開始されるべき転写にとって適切に位置され、かつ方向付けられる、同じ核酸分子の一部として結合されることを意味する。プロモーターに作動可能に連結されるＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下にある」。ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含む他の調節配列は、当業者の知識と実践にしたがって適切な場合に包含されてもよい。例えば、Moss, B. (2001). Poxviridae: the viruses and their replication. In Fields Virology, D.M. Knipe, and P.M. Howley, eds. (Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins), pp. 2849-2883を参照されたい。例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質解析に関する多くの既知の技法およびプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, 1998 Ausubel et al. eds., John Wiley & Sonsに詳述されている。
【００６３】
本発明の態様および実施形態で使用するためのプロモーターは、ポックスウイルス発現系と適合しなくてはならず、天然、改変および合成配列が挙げられる。
【００６４】
初回刺激および追加免疫用組成物のいずれかまたは両方は、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはそれらのコード核酸のようなアジュバントを含んでもよい。
【００６５】
追加免疫用組成物の投与は概して、初回刺激用組成物の投与の約１〜６ヶ月後、好ましくは約１〜３ヵ月後である。
【００６６】
好ましくは、初回刺激用組成物、追加免疫用組成物、または初回刺激および追加免疫用組成物の両方の投与は、皮内、筋内、または粘膜免疫感作である。
【００６７】
ＭＶＡワクチンの投与は、ウイルス懸濁液を注射するための針を用いることで達成され得る。代替法は、冷蔵保管を必要としない個々の調製用量の製造を提供するワクチンを含有するウイルス懸濁液（例えばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）無針式インジェクターを用いて）または再懸濁凍結乾燥粉末を投与するための無針式注射デバイスの使用である。これは、アフリカの農村地方で必要とされるワクチンに非常に好適である。
【００６８】
ＭＶＡは、ヒト免疫感作において優れた安全成績を有するウイルスである。組換えウイルスの生成は簡単に達成することができ、それらは大量に再現性よく製造することができる。したがって、組換えＭＶＡウイルスの皮内、筋内または粘膜投与は、ＣＤ８+Ｔ細胞応答により制御することができるＡＩＤＳに対するヒトの予防用または治療用ワクチンに非常に適している。
【００６９】
個体は、抗原の送達、および抗原へのＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答の生成が有益であるか、または治療上有益な効果を有するようにＡＩＤＳを有し得る。
【００７０】
多くの場合、投与は、感染または症状の発症前にＨＩＶまたはＡＩＤＳに対する免疫応答を生成するという予防目的を有する。
【００７１】
本発明により投与されるべき構成成分は、薬学的組成物中に配合され得る。これらの組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、キャリア、緩衝液、安定剤、または当業者に既知の他の物質を含んでもよい。かかる材料は無毒であるべきであり、有効成分の効力を妨害すべきではない。キャリアまたは他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば静脈内、皮膚または皮下、鼻、筋内、腹腔内経路に依存し得る。
【００７２】
上述のように、投与は好ましくは、皮内、筋内、または粘膜である。
【００７３】
生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）が含まれてもよい。
【００７４】
静脈内、皮膚、皮下、筋内、または粘膜注射、あるいは罹患部位での注射のために、有効成分は、発熱物質を含まず、かつ適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口投与的に許容可能な水溶液の形態である。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液のような等張性媒質を用いて、適切な溶液を十分に調製することが可能である。防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤、および／または他の添加剤は必要に応じて含まれてもよい。
【００７５】
徐放性配合物を使用してもよい。
【００７６】
ＭＶＡ粒子の産生、および組成物へのかかる粒子の任意の配合に続いて、粒子は、個体、特にヒトまたは他の霊長目動物に投与され得る。投与は、別の動物、例えばマウス、ラット、またはハムスター、モルモットのようなげっ歯類、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、イヌ、またはネコに対するものであってもよい。
【００７７】
投与は好ましくは、「予防上有効な量」または「治療上有効な量」（場合に応じて、予防は治療とみなされる場合がある）であり、これは個体に有益性を示すのに十分である。投
与する実際の量、および投与の速度および時間的経過は、治療されるものの性質および重篤性に応じる。治療の処方、例えば投与量等の決定は、一般開業医および他の医師、または獣医学的状況では獣医の責任の範囲内であり、通常治療されるべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に既知の他の要素を考慮する。上述の技法およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, 1980, Osol, A. (ed.)に見出すことができる。
【００７８】
１つの好ましいレジメンでは、ＤＮＡは２５０μｇ〜２．５ｍｇ／注射の用量で投与され、続いてＭＶＡが１０6〜１０9個の感染ウイルス粒子／注射の用量で投与される。
【００７９】
組成物は、単独で、あるいは他の治療薬と併用して、治療されるべき状態に応じて同時にまたは順次投与され得る。
【００８０】
非ヒト動物への送達は治療目的のためのものである必要はないが、例えば所定の抗原に対する免疫応答のメカニズム（例えばＨＩＶまたはＡＩＤＳに対する防御）の研究における実験的状況において使用するためのものであり得る。
【００８１】
本発明のさらなる態様および実施形態は、説明および非限定の手段として含まれる上記開示および以下の実験的例示を鑑みて、ならびに添付の図面を参照して、当業者に明らかであろう。
【実施例１】
【００８２】
多タンパク質ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンによる粘膜曝露の制御およびＡＩＤＳの予防
ここでは、本発明者等は、高病原性粘膜曝露に対して防御する能力に関して、ＤＮＡ初回刺激およびポックスウイルス追加免疫を試験した。サルおよびヒト免疫不全ウイルスの８９．６キメラ（ＳＨＩＶ−８９．６）を免疫原の構築に、その高病原性誘導体であるＳＨＩＶ−８９．６Ｐを曝露用に使用した(G.B. Karlsson et al. 1997 J Virol 71:4218)。ＳＨＩＶ−８９．６およびＳＨＩＶ−８９．６Ｐは、交差中和抗体を産生せず(D.C...Montefiori et al. 1988 J Virol 72:3427)、本発明者等はワクチンにより上昇したＴ細胞および非中和抗体の、免疫不全ウイルス曝露を制御する能力を検討することが可能であった。改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を組換えポックスウイルスの構築に使用した。ＭＶＡは、ＤＮＡで初回刺激したＣＤ８Ｔ細胞を追加免疫する際に非常に有効であり、ヒトおよびサル細胞において効率的に複製しないという安全性を享受する(H.L. Robinson et al. 2000 AIDS Reviews 2:105)。
【００８３】
広範な免疫応答を保証するために、ワクチンのＤＮＡおよび組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）構成成分は、複数の免疫不全ウイルスタンパク質を発現した。ＤＮＡ初回刺激（ＤＮＡ／８９．６）は、単一転写物から、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、およびＶｐｒ、ならびにヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）Ｅｎｖ、Ｔａｔ、およびＲｅｖを発現した(R.J. Gorelick et al. 1999 Virology 253:259; M.M. Sauter et al. 1996 J Cell Biol 132:795)。
【００８４】
分子的にクローニングしたＳＨＩＶ−８９．６配列を、ＣｌａＩおよびＲｓｒＩＩ部位を用いてベクターｐＧＡ２にクローニングした。このクローニングにより、長い末端反復配列（ＬＴＲ）およびｎｅｆの両方を欠失させた。ＳＨＩＶ−８９．６配列はまた、ヌクレオキャプシド中の第２のジンクフィンガーの最初の４つのアミノ酸をコードする１２塩基対領域に関して内部で突然変異された。この突然変異により、ＳＨＩＶウイルスは非感染性となる(R.J. Gorelick et al. 1999 Virology 253:259)。ｇｐ４１中の突然変異は、７１０位のチロシンをシステインに変換し、ＤＮＡ発現細胞の原形質膜上のＥｎｖのより良好な発現を達成した(M.M. Sauter et al. 1996 J Cell Biol 132:795)。ｐＧＡ２は、イントロンＡなしのＣＭＶ最初期プロモーター、およびウス成長ホルモンポリアデニル化配列を使用して、ワクチン挿入物を発現させる。ワクチンＤＮＡは、Althea(San Diego, CA)により産生された。２９３Ｔの短期のトランスフェクションでは、ＤＮＡ／８９．６は１×１０6個の細胞当たりＧａｇ約３００ｎｇ、およびＥｎｖ８５ｎｇを産生した。
【００８５】
ｒＭＶＡブースター（ＭＶＡ／８９．６）は、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターの制御下で、ＳＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＨＩＶ−１ Ｅｎｖを発現した。
【００８６】
ＭＶＡ二重組換えウイルスは、ＨＩＶ ８９．６ ＥｎｖおよびＳＩＶ ２３９ Ｇａｇ−Ｐｏｌの両方を発現し、それぞれＭＶＡの欠失ＩＩおよび欠失ＩＩＩに挿入された。８９．６ Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ４１のＣＯＯＨ末端の１１５個のアミノ酸がトランケートされた。改変Ｈ５プロモーターは、両方の外来遺伝子の発現を制御した。
【００８７】
ワクチン接種は、０週および８週目にＤＮＡで初回刺激し、２４週目にｒＭＶＡで追加免疫することにより達成された（図７Ａ）。
【００８８】
皮内および筋内ＤＮＡワクチン接種は、無針式ジェットインジェクター（Bioject, Portland, OR）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で送達されて、ＤＮＡの２．５ｍｇ用量として各外側大腿に５回の皮内１００μｌ注射、またはプラスミドの２５０μｇ用量として右外側大腿に１回の皮内注射を送達した。ＤＮＡの筋内送達は、２．５ｍｇ用量として各外側大腿に１回のＰＢＳ中ＤＮＡの０．５ｍｌ注射、および２５０μｇ用量として右外側大腿に１回の１００μｌ注射により行われた。１×１０8ｐｆｕのＭＶＡ／８９．６を、ニードルを用いて皮内および筋内に投与した。１回の１００μｌ用量は、皮内用量として各外側大腿に送達され、１回の５００μｌ用量は、筋内用量として各外側大腿に送達された。対照の動物は、Ｂｉｏｊｅｃｔデバイスを用いたワクチン挿入なしで２．５ｍｇのｐＧＡ２ベクターを与えられ、各外側大腿に５回の皮内１００μｌ用量を送達した。対照ＭＶＡブースター免疫感作は、ＭＶＡ／８９．６に関して記載するように、皮内および筋内送達される挿入物なしで、２×１０8ｐｆｕのＭＶＡから構成された。
【００８９】
それぞれ６匹のアカゲザルの４つの群を、無針式ジェット注射デバイス(Bioject, Portland, OR)を用いて、皮内（ｉ．ｄ．）または筋内（ｉ．ｍ．）経路により、２．５ｍｇ（高用量）または２５０μｇ（低用量）のＤＮＡのいずれかで初回刺激した(T.M. Allen et al. 2000 J Immunol 164:4968)。
【００９０】
Yerkes breeding colonyから入手した若い成体アカゲザルを、Emory University Insititutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコルを用いて、the Animal Welfare Act and the NIH 「Guide for the Care and USE of Laboratory Animals」により樹立されたガイドラインの下で管理した。マカクは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析によりＭａｍｕ−Ａ*０１対立遺伝子と類別された(M.A. Egan et al. 2000 J Virol 74:7485; I. Ourmanov et al. 2000 J Virol 74:2740)。少なくとも１つのＭａｍｕ−Ａ*０１対立遺伝子を含有する２匹以上の動物を各群に割り当てた。動物番号は以下の通りである：１，ＲＢｒ−５*、２，ＲＩｍ−５*、３，ＲＯｆ−５*、４，ＲＺｅ−５、５，ＲＯｍ−５、６，ＲＤｍ−５、７，ＲＡｊ−５*、８，ＲＪｉ−５*、９，ＲＡｌ−５*、１０，ＲＤｅ−５*、１１，ＲＡｉ−５、１２，ＲＰｒ−５、１３，ＲＫｗ−４*、１４，ＲＷｚ−５*、１５，ＲＧｏ−５、１６，ＲＬｐ−４、１７，ＲＷｄ−６、１８，ＲＡｔ−５、１９，ＲＰｂ−５*、２０，ＲＩｉ−５*、２１，ＲＩｑ−５、２２，ＲＳｐ−４、２３，ＲＳｎ−５、２４，ＲＧｄ−６、２５，ＲＭｂ−５*、２６，ＲＧｙ−５*、２７，ＲＵｓ−４、および２８，ＲＰｍ−５。Ａ*０１対立遺伝子を有する動物はアスタリスクで示している。
【００９１】
ＤＮＡの遺伝子銃による送達は、これらが１９９６年〜９８年の試行において非防御的免疫応答を初回刺激したため採用しなかった(H.L. Robinson et al. 1999 Nat Med 5:526)。ＭＶＡ／８９．６ブースター免疫感作（２×１０8プラーク形成ユニット、ｐｆｕ）を、皮内および筋内の両方で針を用いて注射した。対照群は、２匹の偽免疫感作動物および２匹の未処置動物を含んでいた。ｒＭＶＡブースターの７ヵ月後に曝露を与えて、長期免疫性の生成に関して試験した。ほとんどのＨＩＶ−１感染が粘膜表面を通って伝染するため、直腸内曝露を施した。
【００９２】
ＤＮＡ初回刺激、続くｒＭＶＡ追加免疫により、高頻度のウイルス特異的Ｔ細胞が生成し、これはｒＭＶＡブースターの１週後にピークを示した（図７）。Ｇａｇ−ＣＭ９エピトープを認識するＴ細胞の頻度は、Ｍａｍｕ−Ａ*０１四量体の平均により評価され、Ｇａｇ全体にわたってエピトープを認識するＴ細胞の頻度は、重複ペプチドのプールおよび酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイにより評価された(C.A. Power et al. 1999 J Immunol Methods 227:99)。
【００９３】
四量体分析に関して、約１×１０6個の末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させたＣＤ３（ＦＮ−１８、Biosource International, Camarillo, CA)、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）に結合させたＣＤ８（ＳＫ１、Becton Dickinson, San Jose, CA)、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合させたＧａｇ−ＣＭ９（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭ）−Ｍａｍｕ−Ａ*０１四量体（配列番号６）に対する抗体で、１００μｌ容量で、８〜１０℃にて３０分間表面染色した。細胞を、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する冷ＰＢＳで二度洗浄し、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドで固定化し、２４時間以内にＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ(Becton Dickinson, San Jose, CA)で分析した。細胞を最初に前方散乱および側方散乱を用いてリンパ球集団で、つづいてＣＤ３細胞でゲート操作した(gated)。続いてＣＤ３細胞を、ＣＤ８および四量体結合細胞に関して分析した。約１５０，０００個のリンパ球が各試料に関して得られた。ＦｌｏＪｏソフトウェア(Tree Star, San Carlos, CA)を用いてデータを解析した。
【００９４】
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴを行うため、マルチスクリーン９６ウェル濾過プレート(Millipore Inc. Bedford, MA)を、ヒトＩＦＮ−γに対する抗体(Clone B27, Pharmingen San Diego, CA)を用いて、炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌの濃度で、８〜１０℃にて一晩コーティングした。プレートをＲＰＭＩ培地で二度洗浄した後、完全培地（１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ）を用いて３７℃で１時間ブロックした。プレートを単なるＲＰＭＩ培地でさらに５回洗浄し、細胞を１００μｌ完全培地中で、ウェル１つ当たり２×１０4個〜５×１０5個の範囲の細胞数で、二連で接種した。完全培地の容量１００μｌ中に各ペプチドの最終濃度が２μｇ／ｍｌとなるように、ペプチドプールを各ウェルに添加した。細胞を３７℃で約３６時間、５％ＣＯ2下で培養した。プレートを洗浄緩衝液（０．０５％ツイーン−２０を有するＰＢＳ）で６回洗浄し、続いて２％ＦＢＳを含有する洗浄緩衝液中に希釈した１ミリリットル当たり１μｇのビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ抗体(clone 7-86-1; Diapharma Group, West Chester, Oh)を添加し、インキュベーションした。プレートを３７℃で２時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で６回洗浄した。アビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を各ウェルに添加して、３７℃で３０〜６０分間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、基質として安定なＤＡＢ(Research Genetics, Huntsville, Al)を用いてスポットを発色させた。立体解剖顕微鏡を用いてスポットを計数した。オボアルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号７）を各分析において対照として包含した。オボアルブミンペプチドに関するバックグラウンドのスポットは概して、５×１０5個のＰＢＭＣに関して５未満であった。１×１０6個のＰＢＭＣに関して標準化した場合のこのバックグラウンドは１０未満であった。バックグラウンドの２倍のＥＬＩＳＰＯＴ計数のみ（２０以上）を有意であるとみなした。ＥＬＩＳＰＯＴの頻度は、異なる希釈の細胞が支持細胞の非存在下でのスポット形成の異なる効率を有するために近似的である(C.A. Power et al. 1999 J Immunol Methods 227:99)。所定の時点ですべての動物に対して同じ希釈の細胞を使用したが、記憶応答および急性応答を検出する際には異なる希釈を使用した。
【００９５】
Ｇａｇ−ＣＭ９四量体分析は、Ｍａｍｕ−Ａ*０１組織適合性型を発現したマカクに制限される一方で、ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、特定の組織適合型に依存しなかった。予想通り、ＤＮＡ免疫感作は、ｒＭＶＡブースターの１週以内に高頻度に増大する低レベルの記憶細胞を上昇させた（図７および図１２）。Ｍａｍｕ−Ａ*０１マカクでは、Ｇａｇ−ＣＭ９エピトープに特異的なＣＤ８細胞は、総ＣＤ８Ｔ細胞の１９％程度と高い頻度に増大した（図１２）。特定細胞のこのピークは、ＤＮＡ／ＭＶＡ記憶プールへの１０〜１００倍の縮小を受けた（図７Ａおよび６）。Ｇａｇペプチドの３つのプールに関するＥＬＩＳＰＯＴは、ＤＮＡ／ＭＶＡ記憶応答へ５〜２０倍に縮小する前に、主な増大（１×１０6個のＰＢＭＣに関して最大４０００個のスポット頻度）を受けた（図７Ｂ）。ＥＬＩＳＰＯＴの頻度は、Ａ*０１組織適合性型ありおよびなしでのマカクで同じであった（Ｐ＞０．２）。
【００９６】
単純な線形回帰を用いて、ブースター後と曝露後のＥＬＩＳＰＯＴ応答との間、記憶と曝露後のＥＬＩＳＰＯＴ応答との間、および対数的に形質転換したウイルス負荷とＥＬＩＳＰＯＴ頻度との間の相関関係を推定した。ワクチン群および対照群とＡ*０１マカクおよび非Ａ*０１マカクとの間の比較は、対数的に形質転換したウイルス負荷およびＥＬＩＳＰＯＴ応答を用いて、２試料ｔ検定を用いて実施された。分散の二元解析を用いて、ピークＤＮＡ／ＭＶＡ ＥＬＩＳＰＯＴ、記憶ＤＮＡ／ＭＶＡ ＥＬＩＳＰＯＴ、および対数的に形質転換されたＧａｇ抗体データに対する、用量および投与経路の影響を検査した。
【００９７】
ワクチン応答のピーク相および記憶相の両方で、ワクチン群におけるＥＬＩＳＰＯＴの高さに関する順位序列は、２．５ｍｇ皮内＞２．５ｍｇ筋内＞２５０μｇ皮内＞２５０μｇ筋内であった（図７Ｂ）。ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴは、ＣＤ４およびＣＤ８細胞の両方を含んでいた。Ｇａｇ−ＣＭ９特異的ＣＤ８細胞は、ペプチドによる再刺激後に良好な溶菌活性を有していた。
【００９８】
ワクチンで上昇させたＴ細胞が記憶にある場合に、高病原性ＳＨＩＶ−８９．６Ｐ曝露を、ｒＭＶＡブースターの７ヵ月後に直腸内に施した（図７）。
【００９９】
曝露ストック（１ミリリットル当たり、５．７×１０9個のウイルスＲＮＡコピー）は、元のＳＨＩＶ−８９．６Ｐストックの、アカゲザルにおける１回の静脈内接種、続く１回の直腸内接種により産生された(G.B. Karlsson et al. 1997 J Virol 71:4218)。リンパ系細胞をピークウイルス血症で直腸内感染した動物から回集し、ＣＤ８を除去し、ストック産生のために分裂促進因子刺激した。直腸内曝露前に、絶食させた動物を麻酔して（ケタミン、１０ｍｇ／ｋｇ）、骨盤領域をわずかに上昇させて、腹部を下にして載せた。供給チューブ（８Ｆｒ（２．７ｍｍ）×１６インチ（４１ｃｍ）、Scherwood Medical, St.
Louis, Mo)を１５〜２０ｃｍの長さで直腸に挿入した。供給チューブの挿入後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０ ２ｍｌに２０回の直腸内感染用量を含有するシリンジをチューブに取り付けて、接種材料を直腸にゆっくりと注入した。接種材料の送達後、供給チューブから、ＦＢＳなしのＲＰＭＩ ３．０ｍｌを流し、続いてゆっくりと引き抜いた。曝露後１０分間、骨盤領域をわずかに上昇させて、動物を留置した。
【０１００】
曝露により、ワクチン接種動物および対照動物すべてを感染させた（図８）。しかしながら、曝露の２週間後までには、血漿ウイルスＲＮＡの力価は、対照動物（相乗平均４×１
０8）よりもワクチン群（相乗平均１×１０7〜５×１０7）の方が少なくとも１０倍低かった（図８Ａ）(S. Staprans et al. in: Viral Genome Methods K. Adolph, ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1996 pp.167-184; R. Hofmann-Lehmann et al. 2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16:1247)。
【０１０１】
ＳＨＩＶコピー数を決定するため、ＡＣＤ抗凝固血漿１５０μｌから得たウイルスＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡキット(Qiagen)で直接抽出し、ＡＶＥ緩衝液６０μｌ中に溶出させて、ＳＨＩＶ ＲＮＡ定量を行うまで−８０℃で凍結させた。精製した血漿ＲＮＡ５μｌを、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ 各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、２．５μＭ ランダム六量体、２０ユニットのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅＲＴ、および８ユニットのリボヌクレアーゼ阻害剤を含有する最終２０μｌ容量中で逆転写させた。反応物を２５℃で１０分間インキュベーションし、続いて４２℃で２０分間インキュベーションし、９９℃で５分間逆転写酵素を失活させた。反応混合物を、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．４ｍＭ 各ｄＮＴＰ、０．２μＭ 正方向プライマー、０．２μＭ 逆方向プライマー、０．１μＭ プローブ、および５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（試薬はすべて、PerkinElmer Applied Biosystems, Foster City, CAから入手）を含有する最終容量５０μｌに調節した。ＳＩＶ ｇａｇ遺伝子の保存部分内のプライマー配列は、先に記載したものと同じである(S. Staprans et al. in: Viral Genome Methods K. Adolph, ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1996 pp. 167-184)。PerkinElmer Applied Biosystems製の７７００配列検出システムをＰＣＲプロフィールで使用した：９５℃で１０分、続いて９３℃で３０秒および５９．５℃で１分を４０サイクル。ＰＣＲ産物蓄積を、７７００配列検出器を用いて、また内部保存ｇａｇ遺伝子配列：６ＦＡＭ−ＣＴＧＴＣＴＧＣＧＴＣＡＴＴＴＧＧＴＧＣ−Ｔａｍｒａ（配列番号８）（ここで、ＦＡＭおよびＴａｍｒａはレポーターおよびクエンチャー色素を意味する）に対するプローブを用いてモニタリングした。ＳＨＩＶ ＲＮＡコピー数は、ＳＩＶ ｂＤＮＡ方法(Bayer Dignostics, Emeryville, CA)により定量したビリオン由来ＳＩＶｍａｃ２３９ ＲＮＡから構成される外部標準曲線との比較により決定した。検体はすべて、二連で抽出および増幅させて、平均の結果を報告した。０．１５ｍｌの血漿を入力すると、アッセイは、血漿１ミリリットル当たり１０3個のＲＮＡコピーの感受性、および１０3〜１０8個のＲＮＡコピーの線形ダイナミックレンジ（Ｒ2＝０．９９５）を有する。変動のアッセイ内係数は、１ミリリットル当たり１０4個を超えるＳＨＩＶ ＲＮＡコピーを含有する試料に関して２０％未満、１ミリリットル当たり１０3〜１０4個のＳＨＩＶ ＲＮＡコピーを含有する試料に関して２５％未満であった。１６週目および２０週目にワクチン接種動物中の低ＳＨＩＶ ＲＮＡコピー数をより正確に定量するために、本発明者等は、以下の修正を行って、ＳＨＩＶ ＲＮＡアッセイの感受性を増加させた：（ｉ）ウイルスＲＮＡ抽出前に１０℃で１５０分間、２３，０００ｇで遠心分離することにより、１ｍｌ以下の血漿からのビリオンを濃縮した、および（ｉｉ）一段階逆転写酵素ＰＣＲ方法を使用した(R. Hofmann-Lehmann et al. 2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16:1247)。これらの変更により、１ミリリットル当たり３００個のＳＨＩＶ ＲＮＡコピーの信頼性の高い定量限界が提供され、使用する第１の方法により得��れる値に非常に相関したＳＨＩＶ ＲＮＡ値が得られた（ｒ＝０．９１、Ｐ＜０．０００１）。
【０１０２】
曝露の８週後までには、高用量ＤＮＡ初回刺激群および低用量皮内ＤＮＡ初回刺激群の両方が、１ミリリットル当たり約１０００個のウイルスＲＮＡコピー数にまでそれらの相乗平均負荷を減少させた。この時点で、低用量筋内ＤＮＡ初回刺激群は、６×１０3個のウイルスＲＮＡコピーの相乗平均を有し、非ワクチン接種対象は２×１０6個の相乗平均を有していた。曝露の２０週後までには、低用量筋内群さえもそのウイルスＲＮＡの相乗平均コピーを１０００にまで減少させた。２４匹のワクチン接種動物の中では、低用量筋内群のたった１つの動物、動物番号２２が、１ミリリットル当たり約１×１０4個のコピー
を超えるウイルス負荷を断続した（図８Ｄ）。
【０１０３】
曝露の５週後までには、非ワクチン接種対照はすべて、ＣＤ４細胞を著しく消耗した（図８Ｂ）。ワクチン接種動物はすべて、それらのＣＤ４細胞を維持したが、但し、低用量筋内群の動物２２（上記参照）は、ゆっくりとしたＣＤ４減退を受けた（図８Ｅ）。曝露の２３週後までには、４匹の対象動物のうち３匹がＡＩＤＳにより死亡した（図８Ｃ）。これらの動物は、多様な度合いの下痢を伴う腸炎、クリプトスポリジウム症、大腸菌性膀胱炎(colicystitis)、腸カンピロバクター感染、巨脾腫症、リンパ節症、およびＳＩＶ関連巨細胞性肺炎を有していた。対照的に、２４匹のワクチン接種動物すべては健康を維持した。
【０１０４】
ウイルス曝露の封じ込めは、抗ウイルスＴ細胞の破裂に関連する（図７および図９Ａ）。曝露の１週後に、末梢血中の四量体+細胞の頻度は減少し、感染部位への特定Ｔ細胞の動員を潜在的に反映した（図９Ａ）。しかしながら、曝露の２週後までに、末梢血中の四量体+細胞は、ｒＭＶＡブースター後と同じ程度と高いか、それよりも高い頻度に増大した（図７および図９Ａ）。四量体+細胞の大部分が、６時間ペプチド刺激に応答してＩＦＮ−γを産生し（図９Ｂ）(S.L. Waldrop et al. 1997 J Clin Invest 99:1739)、ときにはウイルス感染で観察された「気絶」ＩＦＮ−γ陰性表現型を有さなかった(F.Lechner et al. 2000 J Exp Med 191:1499)。
【０１０５】
細胞内サイトカインアッセイを行うため、約１×１０6個のＰＢＭＣを、１ミリリットル当たり０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ならびに抗ヒトＣＤ２８抗体１μｇおよび抗ヒトＣＤ４９ｄ抗体(Pharmingen, San Diego, CA)１μｇを含有するＲＰＭＩ１００μｌ容量中に、１ミリリットル当たりＧａｇ−ＣＭ９ペプチド（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭ）（配列番号６）１００μｇを有する５ｍｌポリプロピレンチューブ内にて、３７℃で１時間刺激した。続いて、１０％ＦＢＳおよびモネンシン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ９００μｌを添加して、３７℃でさらに５時間、５％ＣＯ2下で５°の角度で細胞を培養した。細胞を、ＰｅｒＣＰに結合させた抗ＣＤ８抗体(Clone SK1, Becton Dickinson)で、８〜１０℃で３０分間、表面染色し、２％ＦＢＳを含有する冷ＰＢＳで二度洗浄し、固定化して、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液(Pharmingen)で透過処理した。細胞を、それぞれＦＩＴＣおよびフィコエリトリンに結合させた抗ヒトＣＤ３抗体(clone FN-18; Biosource International, Camarillo, CA)および抗ＩＦＮ−γ抗体(Clone B27; Pharmingen)とともに、Ｐｅｒｍ洗浄溶液(Pharmingen)中で４℃にて３０分間インキュベーションした。細胞をＰｅｒｍ洗浄で二度、単なるＰＢＳで一度洗浄し、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒド中に再懸濁させた。約１５０，０００個のリンパ球がＦＡＣＳカリバで獲得され、ＦｌｏＪｏソフトウェアで解析した。
【０１０６】
Ｔ細胞の曝露後の破裂は、ウイルス負荷の減退に付随して縮小した。曝露の１２週後までには、ウイルス特異的Ｔ細胞は、それらのピーク高さの約１０分の１で存在していた（図７Ａおよび図９Ａ）。ワクチン接種動物における強力な二次応答に対比して、未処置動物は穏やかな一次応答をとった（mounted）（図７Ｂおよび図９Ａ）。四量体+細胞は、総ＣＤ８細胞の１％未満でピークを示し（図９Ａ）、ＩＦＮ−γ−産生ＥＬＩＳＰＯＴは、ワクチン群における１０００〜６０００のかなり高い頻度に対して、約３００の平均頻度で存在していた（図７Ｂ）（Ｐ＜０．０５）。
【０１０７】
ワクチン群と同様に、対照群の四量体+細胞は、ペプチド刺激後にＩＦＮ−γを産生した（図９Ｂ）。曝露の１２週後までには、４匹の対照のうち３匹が検出不可能なレベルのＩＦＮ−γ−産生ＥＬＩＳＰＯＴを有さなかった。高ウイルス負荷の存在下での抗ウイルスＴ細胞のこの迅速な損失は、ＣＤ４ヘルプの欠如を反映し得る。
【０１０８】
Ｔ細胞増殖応答は、ウイルス特異的ＣＤ４細胞が曝露を生き残り、抗ウイルス免疫応答を支持するのに利用可能であることを実証した（図９Ｃ）。
【０１０９】
約２０万個のＰＢＭＣを、示した抗原を用いて、ＲＰＭＩ２００μｌで、３７℃にで５％ＣＯ2下で、５日間、３連で刺激した。ＳＨＩＶ−８９．６ ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＳＨＩＶ−８９．６ Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖのいずれかを発現するＤＮＡでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの上清を抗原として直接使用した（最終濃度は１ミリリットル当たりｐ２７ Ｇａｇおよそ０．５μｇ）。偽ＤＮＡ（ベクターのみ）でトランスフェクトした細胞からの上清は陰性対照として作用した。６日目に、細胞を、１ウェル当たり１μＣｉのトリチウムチミジンで、１６〜２０時間パルス標識した。自動細胞収集装置(TOMTEC, Harvester 96, Model 1010, Hamden, CT)で細胞を収集し、Ｗａｌｌａｃ １４５０ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡシンチレーションカウンター(Gaitherburg, MD)で計数した。刺激指数は、８９．６抗原で刺激したＰＢＭＣ中に組み込まれたトリチウムチミジンの計数を、偽抗原で刺激した同じＰＢＭＣにより組み込まれたトリチウムチミジンの計数で除算したものである。
【０１１０】
曝露の１２週後には、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ、またはＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質に関する平均刺激指数は、ワクチン群で３５〜１４の範囲であったが、対照群では検出不可能であった。増殖アッセイと一貫して、細胞内サイトカインアッセイは、ワクチン接種動物ではウイルス特異的ＣＤ４細胞の存在を示したが、対照動物では示さなかった。増殖応答の等級に関するワクチン群の全体の順位序列は、２．５ｍｇ皮内＞２．５ｍｇ筋内＞２５０μｇ皮内＞２５０μｇ筋内であった。
【０１１１】
曝露の１２週後に、ワクチン接種動物から得られたリンパ節は形態学的に無傷であり、感染に応答していたが、感染対照から得られたリンパ節は機能的に破壊されていた（図１０）。ワクチン接種動物から得られた節は、増大した胚中心および別個の濃淡ゾーンを伴って、多数の反応性二次ろ胞を含有していた（図１０Ａ）。対照的に、非ワクチン接種対照動物からのリンパ節は、小胞および副皮質の消耗を示す（図１０Ｂ）一方で、非ワクチン接種かつ非曝露動物からのリンパ節は、正常数の最低限の反応性胚中心を示した（図１０Ｃ）。胚中心は、感染対照では総リンパ節領域の０．０５％未満、未感染対照ではリンパ節領域の２％、およびワクチン接種群ではリンパ節領域の最大１８％を占有した（図１０Ｄ）。高用量ＤＮＡ初回刺激動物よりも低用量におけるより強力な免疫応答性は、低用量群中のより広範な胚中心により示唆された（図１０Ｄ）。曝露の１２週後に、ウイルスＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成により、２４匹のワクチン接種マカクのうち３匹からのリンパ節中で稀なウイルス発現細胞が明らかとなったが、ウイルス発現細胞は感染対照動物それぞれからのリンパ節では容易に検出された。ＣＤ４Ｔ細胞において著しい消耗を受けた対照では、感染リンパ節細胞の細胞形態は、マクロファージ表現型と一貫していた。
【０１１２】
初回刺激／追加免疫戦略は、低レベルの抗Ｇａｇ抗体、および検出不可能なレベルの抗Ｅｎｖ抗体を上昇させた（図１１）。曝露後、抗Ｅｎｖおよび抗Ｇａｇ抗体両方が既往性応答を受けて、総Ｇａｇ抗体が１ｍｇ／ｍｌに近い高さに到達し、総Ｅｎｖ抗体は最大１００μｇ／ｍｌの高さに到達した。
【０１１３】
抗Ｇａｇ総抗体に関する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、細菌で産生されたＳＩＶ ｇａｇ ｐ２７を使用して、ウェルをコーティングした（炭酸水素塩緩衝液中に１ミリリットル当たり２μｇ）。Ｅｎｖ抗体に対する抗体に関するＥＬＩＳＡは、一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において産生される８９．６Ｅｎｖを使用し、抗Ｅｎｖヤギ抗体（カタログ番号６２０５、International Enzymes, Fairbrook CA）で捕捉した。ＧａｇおよびＥｎｖ ＥＬＩＳＡに関する標準曲線は、ＧａｇまたはＥｎｖに特異的
な既知の量の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を用いて、ＳＨＩＶ−８９．６感染マカクからの血清により作成した。結合抗体は、抗マカクＩｇＧペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体（カタログ番号ＹＮＧＭＯＩＧＧＦＣＰ、Accurate Chemical, Westbury, NY)、およびＴＭＢ基質（カタログ番号Ｔ３４０５、Sigma, St. Louis, MO)を用いて検出した。血清は、二連のウェルで３倍希釈でアッセイした。試験血清の希釈は乳清緩衝液（１×ＰＢＳ中の４％乳清および０．１％ツイーン２０）中で実施した。ブロッキング緩衝液は、乳清緩衝液＋０．５％脱脂粉乳から構成されていた。反応は２Ｍ Ｈ2ＳＯ4で停止させ、光学濃度を４５０ｎｍで読み取った。標準曲線を適合させて、ＳＯＦＴｍａｘ２．３ソフトウェア(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、血清１ｍｌ当たりの抗体μｇとして、試料濃度を内挿した。
【０１１４】
曝露の２週後までには、ＳＨＩＶ−８９．６曝露ではない８９．６免疫原に対する中和抗体は、高用量ＤＮＡ初回刺激群において存在した（皮内での相乗平均力価は３５２、筋内群では３０３）（図１１Ｃ）(D.C. Montefiori et al. 1988 J Clin Microbiol 26:231)。曝露の５週後までには、抗８９．６Ｐ中和抗体が生成し（高用量皮内での相乗平均力価は２００、高用量筋内群では１２６）（図１１Ｄ）、抗８９．６中和抗体は減退し始めた。曝露の１６〜２０週後までには、抗Ｇａｇおよび抗Ｅｎｖ抗体は、ほとんどの動物で降下した。
【０１１５】
本発明者等の結果により、多タンパク質ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンが、高毒性粘膜免疫不全ウイルス曝露を制御することが可能な記憶免疫応答を上昇させることができることが実証される。ウイルス制御の本発明者等のレベルは、ＤＮＡワクチンのみ(M.A. Egan et al. 2000 J Virol 74:7485)、またはｒＭＶＡワクチンのみ(I. Ourmanov et al. 2000 J Virol 74:2740)を用いて達成されたものよりも好適であり、インターロイキン−２をアジュバントとして用いたＤＮＡ免疫感作により得られたレベル(D.H. Barouch et al. 2000 Science 290:486)に匹敵した。これらの過去の研究はすべて、３回以上のワクチン接種を使用しており、いずれも粘膜曝露を使用せず、ほどんどがピークのエフェクター応答で曝露し、ワクチン接種後の長い期間は「長期」有効性に関して試験することが可能でなかった。
【０１１６】
ＤＮＡ用量は、細胞性応答および体液性応答の両方に対して統計学的に有意な影響を与える（Ｐ＜０．０５）のに対して、ＤＮＡ投与経路は体液性応答にのみ影響を及ぼした。皮内ＤＮＡ送達は、Ｇａｇに対する抗体の生成に関して筋内接種よりも約１０倍効果的であった（Ｐ＝０．０２）。経路もＤＮＡ用量も、防御に関しては有意な影響を有さなかった。曝露の２０週後に、高用量ＤＮＡ初回刺激動物は、低用量ＤＮＡ初回刺激動物（９×１０2、および１×１０3）よりもわずかに低いウイルスＲＮＡの相乗平均レベルを有した（７×１０2、および５×１０2）。
【０１１７】
ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンは感染を制御し、ウイルス負荷を、血液１ミリリットル当たりおよそ１０００個またはそれ以下のウイルスＲＮＡのコピーに迅速に減少させた。感染の予防というよりは封じ込めにより、慢性感染を樹立する機会を与える(H.L. Robinson et al. 1999 Nat Med 5:526)。ウイルス負荷を迅速に減少させることにより、多タンパク質ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンは、長期の非進行に関する見込みを展開させ、ＨＩＶ伝染を制限するであろう(J.W. Mellors et al. 1996 Science 272:1167, T.C. Quinn et al. 2000 N Engl J Med 342:921)。
【実施例２】
【０１１８】
改変ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、およびＰｏｌ遺伝子を発現するＭＶＡ
この開示はＨＩＶ株ＡＤＡ ｅｎｖおよびＨＸＢ２ ｇａｇ ｐｏｌを発現するＭＶＡ／ＨＩＶクレードＢ組換えウイルス（ＭＶＡ／ＨＩＶ ＡＤＡ ｅｎｖ＋ＨＸＢ２ ｇａｇ ｐｏｌ）である改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）組換えウイルスの構築について記載する。
敷衍のために、ＭＶＡ／ＨＩＶ４８という研究室名称を使用し、それは構築物が由来するプラスミドを表す。
【０１１９】
ＨＩＶ ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、クレードＢ感染性ＨＸＢ２ウイルスに由来していた。ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、ほとんどのインテグラーゼコード配列が除去され、アミノ酸１８５、２６６および４７８がそれぞれ逆転写酵素を失活させるために、鎖転移活性を阻害するために、およびＲＮアーゼＨ活性を阻害するために突然変異されるようにトランケートされた。クレードＢ ＣＣＲ５向性エンベロープ遺伝子は、一次ＡＤＡ単離物に由来しており、未熟転写終結を防止するために、ＴＴＴＴＴＮＴ配列はコード容量を変化させることなく突然変異され、表面発現、免疫原性およびＭＶＡベクターの安定性を改善する目的で細胞質テールがトランケートされた。ＨＩＶ遺伝子は、同様の高レベルの発現を提供するように、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子が改変Ｈ５初期／後期ワクシニアウイルスプロモーターにより調節され、ｅｎｖ遺伝子が新たに設計した初期／後期ＰｓｙｎＩＩプロモーターにより調節されるようにプラスミド移入ベクターに挿入された。自己欠失性ＧＵＳレポーター遺伝子は、組換えウイルスの検出および単離を可能にするために包含された。ＨＩＶ遺伝子は、欠失３部位への相同組換えを可能にするためにＭＶＡ配列が隣接し、その結果組換えＭＶＡは休止細胞において安定性および高発現に関してＴＫ陽性を保持した。組換えＭＶＡを単離し、大量のｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖを発現し、ｇａｇを処理することがわかった。ＨＩＶ様粒子の産生は、遠心分離および電子顕微鏡により実証された。ＨＩＶ様粒子中のｅｎｖの存在は、免疫電子顕微鏡により実証された。
【０１２０】
【表１】
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【０１２１】
プラスミド移入ベクター
相同組換えによりＭＶＡ組換えウイルスを作製するために使用されるプラスミド移入ベクターであるｐＬＷ−４８（図１５）を以下のように構築した：
【０１２２】
１．市販のプラスミドであるｐＧｅｍ−４Ｚ(Promega)から、それぞれ９２６個の塩基対および５２０個の塩基対を含有するフランク１およびフランク２と称した欠失ＩＩＩの片側上のフランキング領域を、ワクシニアウイルスのＭＶＡ株からＰＣＲにより増幅した。これらのフランク内には、クローニングされた遺伝子の発現を増加するために、すでに公開された研究により示されているように２つの塩基を変化させることにより本来公開された配列から改変されたプロモーターであるｍＨ５が付加された。
【０１２３】
２．クレードＢ ｇａｇ ｐｏｌ（図１６）を、インテグラーゼが除去されるようにトランケートし、ｍＨ５プロモーターにより制御されるようにプラスミドにクローニングした。この遺伝子が、ｇａｇの完全ＨＸＢ２配列を含有していた。ｐｏｌ遺伝子は、ＲＴの活性部位内のアミノ酸１８５中に逆転写酵素の安全な突然変異を有し、アミノ酸２６６中の突然変異は鎖転移活性を阻害し、アミノ酸４７８での突然変異はＲＮアーゼ活性を阻害する。さらに、インテグラーゼ遺伝子をＥｃｏＲＩ部位の先で欠失させた。
【０１２４】
３．ＭＶＡフランク１の最後の２８０塩基対に相当する２８０塩基対の直接反復をフランク１の後に付加した。
【０１２５】
４．ｐ１１プロモーターおよびＧＵＳレポーター遺伝子を、フランク１の２つの直接反復の間に付加して、その結果このスクリーニングマーカーは、組換えウイルスを獲得するために初期に使用することができるが、最終組変えウイルスでは欠失除去される(Scheiflinger, F. et al. 1998 Arch Virol 143:467-474; Carroll, M.W.、およびB. Moss 1995 BioTechniques 19:352-355)。
【０１２６】
５．新規プロモーターであるＰｓｙｎＩＩを、ＡＤＡ ｅｎｖの発現増加が可能となるように設計した。この新規の初期／後期プロモータの配列を図１７で示す。
【０１２７】
６．サイレント５ＴＮＴ突然変異を伴うＡＤＡエンベロープのトランケート型をＰＣＲにより獲得し、ＰｓｙｎＩＩプロモーターの制御下でプラスミドに挿入した。エンベロープをｇｐ４１遺伝子の細胞質テールでトランケートし、細胞質テールの１１５個のアミノ酸を欠失させた。このトランケートは、感染細胞の表面上のエンベロープタンパク質の量を増加させ、マウスにおけるエンベロープタンパク質の免疫原性および組織培養中の組換えウイルスの安定性を高めることがわかった。
【０１２８】
組換えＭＶＡ構築
１．ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１５０８から得られ得るＭＶＡウイルスを、B and E Eggs, Stevens, PAにより分配された９週齢のＳＰＦ Ｐｒｅｍｉｕｍ ＳＰＡＦＡＳトリ受精卵から作製されたトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）における末端希釈により３回プラーク精製した。
【０１２９】
２．二次ＣＥＦ細胞を、ＭＯＩ ０．０５のＭＶＡで感染させて、上述のプラスミドｐＬＷ−４８ ２μｇでトランスフェクトした。３７℃で２日間のインキュベーション後、ウイルスを回収し、３回凍結および解凍し、ＣＥＦプレート上に蒔いた。
【０１３０】
３．４日目に、Ｘ−ｇｌｕｃ基質の添加後に青色に染色した感染巣は、プラスミドと感染性ウイルスとの間に組換えが起こったことを示し、それらを採取して、ＣＥＦプレート上に接種した。再び、青色に染色した巣を採取した。
【０１３１】
４．これらのＧＵＳ含有巣を三連で蒔いて、ＧＵＳ染色（本発明者等はＧＵＳがここで欠失することを望む）およびＡＤＡエンベロープ発現に関して分析した。ＧＵＳ染色巣および非染色巣、ならびに主としてエンベロープ染色巣のおおよそ等しい数の混合集団を有する試料の３番目の複製プレートから個々の巣を採取した。
【０１３２】
５．これらの巣を三連でふたたび蒔いて、同様の方法で分析した。５回の継代の後、エンベロープタンパク質を発現するが、二重反復のためにＧＵＳ遺伝子を欠失したウイルスが得られた。免疫染色により、このウイルスはまたｇａｇ ｐｏｌタンパク質を発現した。
【０１３３】
ＭＶＡ組換えウイルスであるＭＶＡ／ＨＩＶ４８の特性化
１．ＭＶＡ／ＨＩＶ４８感染細胞溶解産物の一部を、エンベロープおよびｇａｇ ｐｏｌタンパク質の両方の発現に関して、モノクローナル抗体を用いた放射性免疫沈降および免疫染色により分析した。これらの試験の両方で、これらのタンパク質はそれぞれ検出された。
【０１３４】
２．組換えウイルスは、２０％ショ糖クッション上で35Ｓ標識粒子をペレット化することにより、感染細胞の上清中のｇａｇ粒子を産生することがわかった。
【０１３５】
３．ｇａｇ粒子はまた、薄切片中の電子顕微鏡において、細胞の外側および細胞からの発芽にて、ならびに細胞の液胞内で可視化された。これらのｇａｇ粒子は、それらの表面上にエンベロープタンパク質を有していた。
【０１３６】
別記しない限り、本明細書中のＤＮＡ分子をシーケンシングすることにより決定されるヌクレオチド配列はすべて自動ＤＮＡシーケンサーを用いて決定され、本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列はすべて、上述のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳により予測された。したがって、この自動アプローチにより決定される任意のＤＮＡ配列に関する技術分野で既知であるように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列は幾つかの誤りを含有し得る。自動により決定されるヌクレオチド配列は典型的に、シーケンシングされるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％同一、より典型的には少なくとも９５％〜少なくとも９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野で既知の手動ＤＮＡシーケンシング方法を含む他のアプローチにより、より正確に決定することができる。同様に当該技術分野で既知であるように、実際の配列と比較した決定ヌクレオチド配列中の単一挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳にフレームシフトを引き起こし、その結果決定ヌクレオチド配列によりコードされる予測アミノ酸配列は、かかる挿入または欠失の時点から始まって、シーケンシングしたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列と完全に異なる。
【０１３７】
まとめ
要約すると、本発明者等は、高発現のＡＤＡトランケート型エンベロープおよびＨＸＢ２
ｇａｇ ｐｏｌを有する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ／ＨＩＶ４８を作製した。ＭＶＡ組換えウイルスは、最終ウイルス中で欠失される一過的に発現されるＧＵＳマーカーを用いて作製される。高発現のＡＤＡエンベロープは、新規ハイブリッド初期／後期プロモーターであるＰｓｙｎＩＩにより可能である。さらに、本発明者等はエンベロープのトランケートが感染細胞の表面上のタンパク質の量を高め、したがって免疫原性を高めること、また組換え体の安定性も高められるを示したことからエンベロープはトランケートされた。ＭＶＡ組換え体は、ショ糖を用いて粒子をペレット化すること、およびＰＡＧＥで分析することにより示されたｇａｇ粒子を作製する。表面上にエンベロープタンパク質を有するｇａｇ粒子はまた、電子顕微鏡で可視化された。
【実施例３】
【０１３８】
ＭＶＡまたは他のポックスウイルスにおける遺伝子発現のために設計されたさらなる改変または合成プロモーター
さらなる改変または合成プロモーターを、ＭＶＡまたは他のポックスウイルスにおける遺伝子発現のために設計した。プロモーターは、感染後の初期および後期での発現を可能にし、複数のプロモーターが同じＭＶＡベクター中で使用される場合に同一配列間での相同組換えの可能性を減少させるように改変させた。プロモーターは、タンパク質コード配列の上流に配置される。
【０１３９】
ｍ７．５プロモーター（配列番号１０）：
ＣＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＣＧＧＴ
【０１４０】
ＰｓｙｎＩＩプロモーター（配列番号２）：
ＴＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＧＧＡＣＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡ
【０１４１】
ＰｓｙｎＩＩＩプロモーター（配列番号１１）：
ＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＧＧＡＣＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡ
【０１４２】
ＰｓｙｎＩＶプロモーター（配列番号１２）：
ＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＧＧＡＣＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡ
【０１４３】
ＰｓｙｎＶプロモーター（配列番号１３）：
ＡＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＣＧＣＴＴＴＣＧＡＧＴＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴ
【実施例４】
【０１４４】
表Ａ〜Ｆ
表Ａ：ＭＶＡ／４８免疫感作−モルモット
モルモット群を、筋内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）経路のいずれかにより、１×１０8の感染ユニットのＭＶＡ／４８で、０日目および３０日目に免疫感作した。対照として、別の群を、同用量の非組換えＭＶＡでＩＭ免疫感作した。各免疫感作前ならびに後に採取した血清を、ＨＩＶ−１−ＭＮに対する中和活性に関して分析した。力価は、ＭＴ−２細胞の５０％がウイルス誘導性死滅から防御された血清希釈の逆数である。ＭＶＡ／４８で第２の免疫感作（４９日目）した後の動物すべてにおいて、有意な中和活性が観察された。
【０１４５】
表Ｂ：ＭＶＡ／４８によるマウスの免疫感作後のＨＩＶ−１ ｇａｇ特異的Ｔ細胞の頻度
ＢａｌｂＣマウス群を、３つの経路：腹腔内（ＩＰ）、皮内（ＩＤ）、または筋内（ＩＭ）のうちの１つにより、１×１０7の感染ユニットのＭＶＡ／４８で、０日目および２１日目に免疫感作した。対照群は、非組換えＭＶＡで免疫感作した。最後の免疫感作の５週後に、脾細胞を調製し、ＨＩＶ−１ ｐ２４からの免疫優性ペプチドで７日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。続いて、細胞を、ペプチドパルス標識Ｐ８１５細胞と、または可溶性ペプチドと混合した。γインターフェロン産生細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで計数した。「＞５００」とした値は、スポットをあまりに多く含有しすぎて計数することができないウェルに与えられた。他のウイルスでＩＰ免疫感作したマウスにおいて、強力なＴ細胞応答が報告されている。この実験では、ＭＶＡ／４８によるマウスのＩＰ免疫感作が、非常に強力なＨＩＶ−１ｇａｇ特異的Ｔ細胞応答を誘発した。
【０１４６】
表Ｃ：ＤＮＡ初回刺激およびＭＶＡ／４８追加免疫−動物１匹当たりの総ＥＬＩＳＰＯＴ１０匹のアカゲザルを、ＡｄａエンベロープおよびＨＸＢ２ ｇａｇｐｏｌを含むＨＩＶ−１抗原を発現するＤＮＡワクチンで初回刺激した（０週および８週）。２４週目に、１×１０8の感染ユニットのＭＶＡ／４８で、動物を筋内追加免疫した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、以下のようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイでγインターフェロンの産生に関して分析した：ＰＢＭＣを、ワクチン中の個々のＨＩＶ−１抗原に相当する重複ペプチドのプールの存在下で３０〜３６時間インキュベーションした。各動物からのγインターフェロン産生細胞の総数を表中に示す。ＤＮＡワクチン接種に対するＴ細胞応答は制限された（２〜２０週）。しかしながら、ＭＶＡ／４８により追加免疫は、すべての動物において非常に強力なＨＩＶ−１特異的Ｔ細胞応答をもたらした（２５週）。
【０１４７】
表Ｄ：ＭＶＡ／ＳＨＩＶ ＫＢ９によりマカクの免疫感作後の抗体応答
アカゲザル群を、幾つかの経路：扁桃腺、皮内（ＩＤ）、または筋内（ＩＭ）のうちの１つにより、０週および４週目に、２×１０8の感染ユニットのＭＶＡ／ＳＨＩＶ−ＫＢ９で免疫感作した。別の群を同じ経路を用いて非組換えＭＶＡで免疫感作した。第２の免疫感作の２週後からの血清試料を、ＥＬＩＳＡによりＫＢ９エンベロープタンパク質に対する結合に関して、およびＳＨＩＶ−８９．６ＰおよびＳＨＩＶ−８９．６の中和に関して
分析した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、可溶性ＫＢ９エンベロープタンパク質が、ｇｐ１２０のＣ末端に対する抗体を用いて９６ウェルプレート中に捕捉された。血清の段階希釈を分析して、終点の力価を決定するのに使用した。ＳＨＩＶ−８９．６ＰおよびＳＨＩＶ−８９．６の中和は、ＭＴ−２細胞アッセイで測定された。力価は、細胞の５０％がウイルス誘導性死滅から防御された血清希釈の逆数である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイでは、ＳＨＩＶ−８９．６ＰおよびＳＨＩＶ−８９．６は異種であり、すなわちウイルスの１つで感染させた動物からの血清は他のウイルスを中和しない。したがって、ＭＶＡ／ＳＨＩＶ−ＫＢ９による２回の免疫感作は、すべての動物において良好なＥＬＩＳＡ結合抗体を、また幾つかの動物においては同種ウイルス（ＳＨＩＶ−８９．６Ｐ）に対する中和抗体を誘発した。さらに、異種中和抗体は動物のサブセットにおいて観察された。
【０１４８】
表Ｅ：ＭＶＡ／ＳＨＩＶ−ＫＢ９によるマカクの免疫感作後のｇａｇ ＣＭ−９特異的ＣＤ３／ＣＤ８Ｔ細胞の頻度
ＭａｍｕＡ*０１陽性アカゲザル群を、幾つかの経路：扁桃腺、皮内（ＩＤ）、または筋内（ＩＭ）のうちの１つにより、０週および４週目に、２×１０8の感染ユニットのＭＶＡ／ＳＨＩＶ−ＫＢ９で免疫感作した。別の群を同じ経路を用いて非組換えＭＶＡで免疫感作した。ＳＩＶ ｇａｇ特異的ペプチドＣＭ９を含有する四量体複合体を結合するＣＤ３+／ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度を、各免疫感作後に様々な時間でフローサイトメトリーにより決定した。時間間隔は以下の通りであった：１ａ、１ｂおよび１ｄは、それぞれ最初の免疫感作の１週後、２週後、および４週後であった。２ａ、２ｂ、２ｃ、および２ｄは、それぞれ第２の免疫感作の１週後、２週後、３週後、および１２週後であった。バックグラウンドを超える値は、太字で示してある。強力なＳＩＶ ｇａｇ特異的応答が、免疫感作した動物すべてにおいて、ＭＶＡ／ＳＨＩＶ−ＫＢ９による単回免疫感作後に観察された。追加免疫は、第２の免疫感作後にほとんどの動物で観察された。さらに、測定可能な四量体結合が、第２の免疫感作の１２週後でも依然として見られた。
【０１４９】
表Ｆ：ＭＶＡ／ＳＨＩＶ ＫＢ９によるマカクの免疫感作後の特異的Ｔ細胞の頻度
マカク群を上述のようにＭＶＡ／ＳＨＩＶ−ＫＢ９で免疫感作した。ＭＶＡ／ＳＨＩＶ−ＫＢ９は、キメラウイルスであるＳＨＩＶ−８９．６Ｐから５つの遺伝子：エンベロープ、ｇａｇ、ポリメラーゼ、ｔａｔ、およびｎｅｆを発現する。したがって、５つの抗原それぞれに特異的なＴ細胞の頻度を、各個々のタンパク質に相当するペプチドプールを用いて分析した。新鮮なＰＢＭＣをペプチドプールで３０〜３６時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。γインターフェロン産生細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイで計数した。各抗原に特異的な細胞の総数を、「総スポット数」として与える。さらに、応答動物の数、および１群当たりのスポットの平均数を示す。ＰＢＭＣは、最初の免疫感作の１週後（１ａ）および第２の免疫感作の１週後（２ａ）に分析した。７匹の動物を有する別の群を非組換えＭＶＡで免疫感作した。これらの動物では、バックグラウンドレベルを超えるスポットは検出されなかった。したがって、ＭＶＡ／ＳＨＩＶ−ＫＢ９による単回免疫感作は、すべての動物において強力なＳＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を誘発した。ｇａｇおよびエンベロープ応答は最強であり、ほとんどの動物がｇａｇに対して応答し、すべての動物がエンベロープに応答した。Ｅｌｉｓｐｏｔ応答はまた、低レベルではあろうと、ＭＶＡ／ＳＨＩＶ−ＫＢ９による第２の免疫感作後に観察された。両時点で、応答の順位序列は、扁桃腺＞ＩＤ＞ＩＭであった。本発明者等は、ｎｅｆに対する良好な免疫応答、およびｔａｔに対する幾らかの免疫応答を示す。
【表Ａ】
2010115208.tif 000003
【０１５０】
【表Ｂ】
2010115208.tif 000004
【０１５１】
【表Ｃ】
2010115208.tif 000005
【０１５２】
【表Ｄ】
2010115208.tif 000006
【０１５３】
【表Ｅ】
2010115208.tif 000007
【０１５４】
【表Ｆ】
2010115208.tif 000008
【０１５５】
本発明は、明瞭性および理解の目的でやや詳細に記載してきたが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態および詳細において様々な変更がなされ得ることを当業者は理解されよう。上記に参照した特許、特許出願、および刊行物はすべて、参照により本明細書に援用される。
【図１】
2010115208.tif 000009
【図２】
2010115208.tif 000010
【図３】
2010115208.tif 000011
【図４】
2010115208.tif 000012
【図５】
2010115208.tif 000013
【図６】
2010115208.tif 000014
【図７Ａ】
2010115208.tif 000015
【図７Ｂ】
2010115208.tif 000016
【図８Ａ】
2010115208.tif 000017
【図８Ｂ】
2010115208.tif 000018
【図８Ｃ】
2010115208.tif 000019
【図８Ｄ】
2010115208.tif 000020
【図８Ｅ】
2010115208.tif 000021
【図９Ａ】
2010115208.tif 000022
【図９Ｂ】
2010115208.tif 000023
【図９Ｃ】
2010115208.tif 000024
【図１０Ａ】
2010115208.tif 000025
【図１０Ｂ】
2010115208.tif 000026
【図１０Ｃ】
2010115208.tif 000027
【図１０Ｄ】
2010115208.tif 000028
【図１１Ａ】
2010115208.tif 000029
【図１１Ｂ】
2010115208.tif 000030
【図１１Ｃ】
2010115208.tif 000031
【図１１Ｄ】
2010115208.tif 000032
【図１２】
2010115208.tif 000033
【図１３−１】
2010115208.tif 000034
【図１３−２】
2010115208.tif 000035
【図１３−３】
2010115208.tif 000036
【図１３−４】
2010115208.tif 000037
【図１３−５】
2010115208.tif 000038
【図１３−６】
2010115208.tif 000039
【図１３−７】
2010115208.tif 000040
【図１３−８】
2010115208.tif 000041
【図１３−９】
2010115208.tif 000042
【図１３−１０】
2010115208.tif 000043
【図１３−１１】
2010115208.tif 000044
【図１３−１２】
2010115208.tif 000045
【図１３−１３】
2010115208.tif 000046
【図１３−１４】
2010115208.tif 000047
【図１３−１５】
2010115208.tif 000048
【図１３−１６】
2010115208.tif 000049
【図１３−１７】
2010115208.tif 000050
【図１３−１８】
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【図１３−１９】
2010115208.tif 000052
【図１３−２０】
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【図１３−２１】
2010115208.tif 000054
【図１３−２２】
2010115208.tif 000055
【図１３−２３】
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【図１３−２４】
2010115208.tif 000057
【図１３−２５】
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【図１３−２６】
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【図１３−２７】
2010115208.tif 000060
【図１３−２８】
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【図１３−２９】
2010115208.tif 000062
【図１３−３０】
2010115208.tif 000063
【図１４−１】
2010115208.tif 000064
【図１４−２】
2010115208.tif 000065
【図１４−３】
2010115208.tif 000066
【図１４−４】
2010115208.tif 000067
【図１４−５】
2010115208.tif 000068
【図１４−６】
2010115208.tif 000069
【図１４−７】
2010115208.tif 000070
【図１４−８】
2010115208.tif 000071
【図１４−９】
2010115208.tif 000072
【図１５】
2010115208.tif 000073
【図１６】
2010115208.tif 000074
【図１７】
2010115208.tif 000075
【配列表】
2010115208000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月1日(2010.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子を発現するウイルスであって、同ウイルスからの発現によってＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、およびＰｏｌ抗原を産生する組換えＭＶＡウイルス、および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物であって、
前記ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子は、ｇｐ１２０、ならびにｇｐ４１の膜貫通および外部ドメインから構成されるが、ｇｐ４１の細胞質ドメインの一部またはすべてを欠失しているＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードするように改変されている、薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＨＩＶ ｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、逆転写酵素およびインテグラーゼを失活するように改変されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＡから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＢから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＣから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＤから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＥから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＦから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＧから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＨから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、クレードＪから採取される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、ＭＶＡゲノム内の欠失ＩＩＩの部位に挿入される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、もしくはｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子は、Ｈ５様初期／後期ワクシニアウイルスプロモーターの転写開始調節下にある、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
組換えＭＶＡウイルスは、さらなるＨＩＶ遺伝子またはその改変遺伝子をさらに発現することで、ＨＩＶ抗原を生産する組換えＭＶＡウイルスであって、前記さらなるＨＩＶ遺伝子は、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、およびｎｅｆからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
配列番号１０を有するｍ７．５プロモーター、配列番号２を有するＰｓｙｎ ＩＩプロモーター、配列番号１１を有するＰｓｙｎ ＩＩＩプロモーター、配列番号１２を有するＰｓｙｎ ＩＶプロモーター、および配列番号１３を有するＰｓｙｎ Ｖプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含むポックスウイルス。
【請求項１６】
霊長目動物においてＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を追加免疫する方法であって、請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の組成物を該霊長目動物に投与することを含み、それにより該霊長目動物における予め初回刺激された抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答が追加免疫される方法。
【請求項１７】
霊長目動物においてＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を誘導する方法であって、請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の組成物を該霊長目動物に投与することを含み、それにより該霊長目動物における抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答が誘導される方法。
【請求項１８】
霊長目動物においてＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌ抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を誘導する方法であって、前記抗原をコードする核酸を含む初回刺激用組成物を該霊長目動物に投与し、続いて請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の追加免疫用組成物を該霊長目動物に投与することを含み、それにより抗原に対するＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答が誘導される方法。
【請求項１９】
前記霊長目動物はヒトである、請求項１６ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換えＭＶＡウイルスの投与は無針式注射によるものである、請求項１６ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記初回刺激用組成物は、前記抗原をコードするプラスミドＤＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＩＶ ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子、またはそれらの改変遺伝子をコードするプラスミド移入ベクターであって、該ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子が、ｇｐ１２０、ならびにｇｐ４１の膜貫通および外部ドメインから構成されるが、ｇｐ４１の細胞質ドメインの一部またはすべてを欠如しているＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードするように改変されているプラスミド移入ベクターを調製し、請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の組成物を生産するために、ＭＶＡウイルスベクターにおいて前記プラスミド移入ベクターを組換えることを含む、請求項１ないし１４のいずれかに記載の組成物を作製する方法。