(57)【要約】【課題】安価、低侵襲性、かつ全自動化への応用可能であることを特徴とするインフルエンザ罹患リスクの予測方法を提供すること。【解決手段】被験者から採取した検体中の総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率を測定することを含む、インフルエンザ罹患リスクの予測方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した検体中の総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率を測定することを含む、インフルエンザ罹患リスクの予測方法。
【請求項２】
総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が第一の基準値以下の場合にインフルエンザ罹患リスクが高いと予測し、総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が第二の基準値以上の場合にインフルエンザ罹患リスクが低いと予測する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が2.0％以下の所定の基準値以下の場合にインフルエンザ罹患リスクが高いと予測し、総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が4.0％以上の所定の基準値以上の場合にインフルエンザ罹患リスクが低いと予測する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
検体が頭頚部粘膜より採取した体液検体である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
固相担体に固定したインフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープに、被験者から採取した検体を接触させることによって、該検体中の抗インフルエンザＩｇＡを測定する、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
（ａ）インフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープを固相担体に固定化し、（ｂ）該固相担体に、抗インフエルエンザ抗体を含有している疑いのある検体を接触させ、（ｃ）未反応の該検体を除去し、（ｄ）生成したインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原エピトープと抗インフルエンザ抗体とからなる抗原抗体複合体に、検体中の抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体を接触させ、（ｅ）未反応の該標識抗体を除去し、（ｆ）結合した該標識抗体上の標識物質の量を測定することによって検体中の抗インフエルエンザ抗体の存在又は量を測定することを含む、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
標識抗体が、標識した抗ヒトＩｇＡ抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標識抗体が、酵素標識抗体または蛍光標識抗体である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
蛍光標識抗体が、シアニン色素またはローダミン6G試薬で標識した抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
シアニン色素がＣｙｅ３またはＣｙｅ５である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れかに記載の方法によりインフルエンザ罹患リスクを予測し、インフルエンザ罹患リスクが高いと予測された場合にはインフルエンザワクチンの投与の必要性が高い、あるいは感染の危険性を極力さけるべきであると判断し、インフルエンザ罹患リスクが低いと予測された場合にはインフルエンザワクチンの投与の必要性が低いと判断する、インフルエンザワクチンの投与の要否や感染患者との接触の危険度の決定方法。
【請求項１２】
(i)インフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープを固相担体に固定化した固定化抗原、及び(ii)抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体を含む、請求項１から１１の何れかに記載の方法を行うための抗インフルエンザ抗体測定キット。
【請求項１３】
固相担体が、プラスチック材料、繊維材料、又は無機材料からなる担体である、請求項１２に記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
【請求項１４】
固相担体が、ポリスチレンビーズ、ポリスチレンマイクロタイタープレート、スライドガラス、又はポリエステルフイルムである、請求項１２又は１３に記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
【請求項１５】
固相担体表面にアミド結合を介してインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原エピトープが固定化されている、請求項１２から１４の何れかに記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
【請求項１６】
抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体が、標識した抗ヒトＩｇＡ抗体である、請求項１２から１５の何れかに記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
【請求項１７】
抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体が、蛍光標識抗インフエルエンザ抗体である、請求項１２から１６の何れかに記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個人毎のインフルエンザへの罹患リスクを、インフルエンザウイルスが最初に感染する気道粘膜、特に鼻腔粘膜防御機能を、その代表的な生体防御物質の分泌型IgA(sIgA）量から判定することを特徴とする、インフルエンザ罹患リスクの新規な予測方法に関する。本発明は、鼻腔洗浄液や気管支洗浄液を採取して、現状では避けがたい個人毎の洗浄程度の違いによるデータのばらつきを補正することで、気道粘膜の防御能を測定し、客観的にインフルエンザの感染リスクを診断する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高病原性鳥インフルエンザは撲滅不可能な程度にまで世界に広がり、新型インフルエンザの脅威が高まっている今日、その対策を急がなくてははらない。現行のインフルエンザワクチンは皮下（筋肉）注射のため、血液中に抗原特異的（インフルエンザの型が変わると効果の無い）IgG抗体を誘導する。しかし、インフルエンザウイルスが感染して増殖する部位は、抗体が誘導される血液とは別の、気道、鼻腔の粘膜上皮のため、現状のワクチンで作られた抗体は作用できない（木戸博  他、インフルエンザ経鼻ワクチンー肺サーファクタントと粘膜免疫―小児科48(12), 1837-1844, 2007; 田村慎一  インフルエンザワクチン開発の現状、日本臨床61(11), 1993-2000, 2003; Shedlock D, Shen H, Requirement of CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science 300, 337-339, 2003）。重症化して肺炎になった時に初めて血液の抗体は有効に働くが、その間に感染は周囲に広がってしまう。従来、抗インフルエンザ抗体は血液中の抗体価でのみ判断していたため、肺炎（重症化）の予防効果は判定できても、感染リスクを判定することは困難であった。
【０００３】
【非特許文献１】木戸博  他、インフルエンザ経鼻ワクチンー肺サーファクタントと粘膜免疫―小児科48(12), 1837-1844, 2007
【非特許文献２】田村慎一  インフルエンザワクチン開発の現状、日本臨床61(11), 1993-2000, 2003
【非特許文献３】Shedlock D, Shen H, Requirement of CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science 300, 337-339, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、安価、低侵襲性、かつ全自動化への応用可能であることを特徴とするインフルエンザ罹患リスクの予測方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、個人毎のインルエンザ罹患（感染）リスクを。ウイルスが最初に感染する鼻腔粘膜洗浄液や気道洗浄液の抗インフルエンザIgA抗体量から的確に判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。なお、ウイルスの感染する気道、鼻腔の粘膜からは、交叉免疫性の高い（インフルエンザの型が変わっても効果のある）IgA抗体が分泌されており、感染防御と自然治癒の主要な因子として働いている。
【０００６】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  被験者から採取した検体中の総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率を測定することを含む、インフルエンザ罹患リスクの予測方法。
（２）  総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が第一の基準値以下の場合にインフルエンザ罹患リスクが高いと予測し、総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が第二の基準値以上の場合にインフルエンザ罹患リスクが低いと予測する、（１）に記載の方法。
（３）  総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が2.0％以下の所定の基準値以下の場合にインフルエンザ罹患リスクが高いと予測し、総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が4.0％以上の所定の基準値以上の場合にインフルエンザ罹患リスクが低いと予測する、（１）又は（２）に記載の方法。
【０００７】
（４）  検体が頭頚部粘膜より採取した体液が検体である、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（５）  固相担体に固定したインフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープに、被験者から採取した検体を接触させることによって、該検体中の抗インフルエンザＩｇＡを測定する、（１）から（４）の何れかに記載の方法。
【０００８】
（６）  （ａ）インフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープを固相担体に固定化し、（ｂ）該固相担体に、抗インフエルエンザ抗体を含有している疑いのある検体を接触させ、（ｃ）未反応の該検体を除去し、（ｄ）生成したインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原エピトープと抗インフルエンザ抗体とからなる抗原抗体複合体に、検体中の抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体を接触させ、（ｅ）未反応の該標識抗体を除去し、（ｆ）結合した該標識抗体上の標識物質の量を測定することによって検体中の抗インフエルエンザ抗体の存在又は量を測定することを含む、（１）から（５）の何れかに記載の方法。
【０００９】
（７）  標識抗体が、標識した抗ヒトＩｇＡ抗体である、（６）に記載の方法。
（８）  標識抗体が、酵素標識抗体または蛍光標識抗体である、（６）又は（７）に記載の方法。
（９）  蛍光標識抗体が、シアニン色素またはローダミン6G試薬で標識した抗体である、（８）に記載の方法。
（１０）  シアニン色素がＣｙｅ３またはＣｙｅ５である、（９）に記載の方法。
【００１０】
（１１）  （１）から（１０）の何れかに記載の方法によりインフルエンザ罹患リスクを予測し、インフルエンザ罹患リスクが高いと予測された場合にはインフルエンザワクチンの投与の必要性が高い、あるいは感染の危険性を極力さけるべきであると判断し、インフルエンザ罹患リスクが低いと予測された場合にはインフルエンザワクチンの投与の必要性が低いと判断する、インフルエンザワクチンの投与の要否や感染患者との接触の危険度の決定方法。
（１２）  (i)インフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープを固相担体に固定化した固定化抗原、及び(ii)抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体を含む、（１）から（１１）の何れかに記載の方法を行うための抗インフルエンザ抗体測定キット。
【００１１】
（１３）  固相担体が、プラスチック材料、繊維材料、又は無機材料からなる担体である、（１２）に記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
（１４）  固相担体が、ポリスチレンビーズ、ポリスチレンマイクロタイタープレート、スライドガラス、又はポリエステルフイルムである、（１２）又は（１３）に記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
【００１２】
（１５）  固相担体表面にアミド結合を介してインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原エピトープが固定化されている、（１２）から（１４）の何れかに記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
（１６）  抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体が、標識した抗ヒトＩｇＡ抗体である、（１２）から（１５）の何れかに記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
（１７）  抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体が、蛍光標識抗インフエルエンザ抗体である、（１２）から（１６）の何れかに記載の抗インフルエンザ特異抗体測定キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、蛍光抗体測定法などの測定法によって、鼻腔粘膜洗浄液や気道分泌液中の抗インフルエンザIgA抗体価を測定することによってインフルエンザ感染リスクを予測する方法である。本発明によるインフルエンザ罹患リスクの予測方法は、例えば、96穴プラスチックプレートで測定したり、これをハイスループットアレイに応用することにより、安価で、低侵襲性で、かつ全自動化への応用可能な方法である。本発明によるインフルエンザ感染リスク診断は、限られた量のワクチンを感染リスクの高い人に優先的に投与することを可能とし、社会全体のインフルエンザ感染に対する安全性を高めることができるだけでなく、ワクチン接種後の感染リスクの低下の程度を客観的に評価する技術をも提供する。鼻腔や気道の抗インフルエンザIgA抗体量から感染リスクを前もって診断することにより、国民に「安全と安心」を提供するとともに、高い医療経済効果を提供することになる。また、予め感染リスクの診断を行うことにより、予防的措置、感染時の迅速な対応が可能になる。
【００１４】
即ち、本発明によるインフルエンザ罹患リスクの予測方法は、以下の点において産業上有用である。
（１）「インフルエンザ感染リスク診断」データを基に、感染リスクの高いヒトを選択することが可能となり、限られた量の新型インフルエンザワクチンやインフルエンザワクチンの有効利用が可能となり、社会、経済に多大な貢献をする。また、ワクチン接種者の感染リスクの低下の程度を客観的に評価できるため、ワクチン作成の改良、個人の感染に対する意識の向上と予防的措置、感染時の迅速な対応を可能になる。
（２）ELISAをマイクロアレイで実施することで、多数の患者検体を迅速に診断することが可能となり、安価で迅速に感染リスクを判定することで、国民に「安全と安心」を提供すると共に「高い医療経済効果」を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明についてさらに具体的に説明する。
本発明は、インフルエンザウイルスがヒトに最初に感染する気道の粘膜局所の抗インフルエンザ抗体、特に分泌型抗インフルエンザIgA(sIgA）抗体量が、個人の感染リスクを決めている重要な因子であることを発見したことに基づくものである。検体として容易に採取可能な鼻腔粘膜洗浄液の場合、個人によって乾いた鼻腔、湿った鼻腔があるように、検体の質の違いによるデータのばらつきを考慮して、本発明においては、感染リスクを正確に判定する方法として、検体中の総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率（即ち、全sIgA(Total sIgA)を分母に、インフルエンザウイルスに対する特異的抗体sIgA量を分子に置いた値）を指標として評価することによって、感染リスクの判断が可能になった。なお、現在世界中で感染している代表的な株には、Influenza A H3N2株、Influenza A H1N1株、Influenza B株の３株が、さらには新型インフルエンザの発症が危惧されているInfluenza H5N1株を代表例とするH5株、H7株等があり、これらのウイルス株に対する特異的sIgA抗体量の測定となる。
【００１６】
具体的には、インフルエンザの流行期以前に、鼻汁中の抗Influenza A H3N2株、Influenza A H1N1株、Influenza B株のそれぞれに対するsIgA量を測定して、インフルエンザの感染リスクを診断する。本発明は、インフルエンザに感染したヒトが、未だ気道粘膜の抗体誘導が起こっていない48時間以内に鼻腔粘膜洗浄液中の抗体価を測定すると、インフルエンザに感染しなかったヒトの抗体価に比べて有意な差のあることを見いだして、これを基盤としている。この場合、インフルエンザ感染者と非感染者の血液中の抗インフルエンザIgG抗体価の違いに比べて、鼻腔粘膜洗浄液中のsIgA抗体価の違いがより鮮明で、リスク診断が可能である。鼻腔粘膜洗浄液中の感染リスク値は、インフルエンザの株の違いによってそれぞれの値を示す。
【００１７】
典型的な例として、Influenza A/Hiroshima/52/2005(H3N2)株の場合は、抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価 [Specific sIgA(U/mL)/Total sIgA(μg/mL) × 100]が 2.0以下では、感染確率は92.5% 以上を、2.1-3.9では、感染確率は35.0 %を、4.0以上では、感染確率は3.2%以下を示した。
【００１８】
Influenza A/New caledonia/20/99(H1N1)株の場合は、抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価 [Specific sIgA(U/mL)/Total sIgA(μg/mL) × 100]が2.0以下では、感染確率は89.7% 以上を、2.1-3.9では、感染確率は54.9%を、4.0以上では、感染確率は13.1%以下を示した。
【００１９】
Influenza B/Malaysia/2506/2004 株の場合は、抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価 [Specific sIgA(U/mL)/Total sIgA(μg/mL) × 100]が 2.0 以下では、感染確率は93.7% を、4.0以上では、感染確率は12.5%以下を示した。
【００２０】
上記の通り、本発明によるインフルエンザ罹患リスクの予測方法は、被験者から採取した検体中の総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率（即ち、抗インフルエンザＩｇＡの量／総ＩｇＡの量）を測定することを特徴とする方法であり、具体的には、総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が第一の基準値以下の場合にインフルエンザ罹患リスクが高いと予測し、総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が第二の基準値以上の場合にインフルエンザ罹患リスクが低いと予測することができる。
【００２１】
基準値は、対象となるインフルエンザの種類などに応じて適宜選択することができるが、例えば、総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が２％以下の所定の基準値（例えば、１．３３％、１．１５％、又は２．０％など）以下の場合にインフルエンザ罹患リスクが高いと予測し、総ＩｇＡに対する抗インフルエンザＩｇＡの比率が４％以上の所定の基準値（例えば、４．７４％、７．２２％、又は１０．６５％など）以上の場合にインフルエンザ罹患リスクが低いと予測することができる。
【００２２】
本発明で用いる検体の種類は特に限定されないが、好ましくは、頭頚部粘膜より採取した体液を検体に用いることができ、さらに好ましくは気道粘膜、特に好ましくは鼻腔粘膜より採取した検体を用いることができる。
【００２３】
本発明では、固相担体に固定したインフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープに、被験者から採取した検体を接触させることによって、該検体中の抗インフルエンザＩｇＡを測定することができる。
【００２４】
固相担体の種類は、インフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープを固定化して抗原抗体反応を行うことができるものであれば特に限定されないが、好ましくは、プラスチック材料、繊維材料、又は無機材料からなる担体を用いることができる。担体の形態としては、ビーズ、微粒子、膜、又はプレートなどを挙げることができる。さらに具体的には、固相担体としては、ポリスチレンビーズ、ポリスチレンマイクロタイタープレート、スライドガラス、又はポリエステルフイルムを用いることができる。
【００２５】
本発明で用いるインフルエンザ抗原の種類は特に限定されず、任意のインフルエンザ抗原を用いることができる。Influenza Aには、H1〜H15、N1〜N9の各種の組み合わせに「よる亜型があり、その他Influenza B、Influenza Cが対象となる。近年の流行亜型では、Influenza A H3N2株、Influenza A H1N1株、Influenza B株がある。また高病原性鳥インフルエンザでは、Influenza A  H5, H7の各種亜型を挙げることができる。また、インフルエンザ抗原のみならず、その一部であるインフルエンザ抗原エピトープを用いることもできる。インフルエンザ抗原エピトープとしては、糖鎖修飾されたインフルエンザ膜抗原のアミノ酸配列に由来するアミノ酸残基４〜３０個、好ましくは４〜２０個程度のペプチドを意味する。
【００２６】
糖鎖修飾されたインフルエンザ膜抗原又はそのエピトープは、糖鎖修飾可能な昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを用いた遺伝子組換え技術を用いることによって調製することができる。糖鎖修飾の無いウイルス抗原タンパクについては、所望の抗原をコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば、細菌、酵母または哺乳動物細胞）に導入することによって、ＤＮＡを宿主細胞中で発現させて所望の抗原を産生させることができる。あるいは、インフルエンザ抗原又はそのエピトープは、化学合成によって製造することもできる。抗原の化学合成のためには、当業者に公知の通常の固相ペプチド合成法を用いることができる。あるいは、インフルエンザ抗原は、ウイルス自体から入手することもできる。例えば、所望のインフルエンザ抗原又はそのエピトープを、例えば、遠心分離またはサイズ排除クロマトグラフィーなどを用いて分離及び回収することができる。
【００２７】
インフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原エピトープは、固相担体表面に共有結合（例えば、アミド結合）又は非共有結合（例えば、水素結合またはファンデルワールス力）を介して固定化することができる。アミド結合を介して固相担体表面にインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原エピトープを固定化するためには、
【００２８】
本発明の好ましい態様においては、（ａ）インフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープを固相担体に固定化し、（ｂ）該固相担体に、抗インフエルエンザ抗体を含有している疑いのある検体を接触させ、（ｃ）未反応の該検体を除去し、（ｄ）生成したインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原エピトープと抗インフルエンザ抗体とからなる抗原抗体複合体に、検体中の抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体を接触させ、（ｅ）未反応の該標識抗体を除去し、（ｆ）結合した該標識抗体上の標識物質の量を測定することによって検体中の抗インフエルエンザ抗体の存在又は量を測定することができる。
【００２９】
本発明においては、インフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープを固定化した固相担体に、抗インフエルエンザ抗体を含有している疑いのある検体を接触させて、抗原抗体反応を行うことができる。その後、上記の抗原抗体反応で生成したインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原エピトープと抗インフルエンザ抗体とからなる抗原抗体複合体に、検体中の抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体を接触させて、抗原抗体反応を行う。上記の２つの抗原抗体反応は、抗原と抗体の複合体を形成するような条件下で行うことができ、具体的には、抗体が、そのエピトープに結合するのに十分な時間、温度、及びｐＨの条件下で行うことができる。このような条件の一例としては、ｐＨ約７〜約８．５の溶液を用いて、約２０℃〜約４２℃、好ましくは約２０℃〜約３８℃（例えば、室温）において、約１分間〜約２４時間、好ましくは約１０分間〜約１０時間の反応時間を挙げることができる。
【００３０】
標識抗体としては、酵素又は蛍光物質で標識した抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることができる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどを用いることができ、蛍光物質としては、シアニン色素（Ｃｙｅ３またはＣｙｅ５など）またはローダミン6G試薬などを用いることができる。
【００３１】
本発明においては、上記した方法によりインフルエンザ罹患リスクを予測し、インフルエンザ罹患リスクが高いと予測された場合にはインフルエンザワクチンの投与の必要性が高い、あるいは感染の危険性を極力さけるべきであると判断し、インフルエンザ罹患リスクが低いと予測された場合にはインフルエンザワクチンの投与の必要性が低いと判断する、インフルエンザワクチンの投与の要否や感染患者との接触の危険度を決定することができる。
【００３２】
本発明によれば、(i)インフルエンザ抗原又はインフルエンザ抗原エピトープを固相担体に固定化した固定化抗原、及び(ii)抗インフエルエンザ抗体に対する標識抗体を組み合わせることによって、インフルエンザ罹患リスクを予測するための抗インフルエンザ抗体測定キットが提供される。本キットにはさらに、適当な緩衝液、希釈液などを含めることもできる。本キットは、例えば、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、蛍光標識又は化学発光標識を使用する免疫アッセイ、またはRIA法などを実施するためのキットである。
【００３３】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
（実験方法）
（１）インフルエンザワクチン抗原
蛍光抗体測定法に用いる抗原としてのInfluenza  A/Hiroshima/52/2005  (H3N2)株、Influenza A/New caledonia/20/99(H1N1)株、Influenza B/Malaysia/2506  /2004  株は、2005/2006年と2006/2007年に製造されたワクチン（皮下注射用のスプリットワクチンとして３種混合）株で、原料となったそれぞれの株は阪大微生物病研究会から供与いただいた。本発明に用いるインフルエンザワクチンは、上記のエーテルスプリット法のインフルエンザワクチン以外にも、βプロピオラクトン不活化ワクチンや、全粒子ホルマリン不活化ワクチンも同様に使用できる。また、代表例として挙げた上記の株以外でも、全てのインフルエンザ株を対象とすることができる。なお、抗原とは、ワクチン用に高度精製された純度が約90%以上のウイルス抗原を例とする。なお、本発明の応用例として、感染症で問題となる細菌由来抗原や、トキソイド等のアレルゲン、タンパク質、糖タンパク質、高分子の糖質や核酸等でも同様に抗原として用いることとができる。抗原質量の値には、実測値を用いるか、あるいは抗原の純度、比活性、分子量、抗原抗体反応等からの計算値を用いることができる。
【００３５】
（２）鼻腔洗浄液の調製
生理食塩水の入った噴霧型点鼻容器(Sun Chemical Co., Ltd., 大阪)を垂直方向から約30度傾けて片鼻ずつ10回噴霧する。速やかに、直径1.7 mm のシリコンカテーテル（MD-33105, Akita-Sumitomo Bake Co., Ltd., Akita）を鼻に挿入し、片鼻ずつ1分間吸引機（EP-1500, Bluecross Co., Ltd., 埼玉）で吸引する。カテーテル内の鼻洗浄液を回収するために、生理食塩水1mlを吸引して、プラスチック試験管に集める。検体は速やかに氷冷して、１分間超音波処理後、4℃下に500xg で10分間遠心をおこない上清を分離し、−30℃で保存した。この方法では、生理食塩水は両側で0.46 ± 0.15 mL (mean ± SD)が噴霧され、0.44 ± 0.37 mL (mean ± SD)が回収され、回収率は96%であった。
【００３６】
（３）全インフルエンザsIgAの定量
個人個人で鼻の乾き具合が異なるため、噴霧された生理食塩水に含まれる鼻汁の量は異なり、そのため鼻腔洗浄液中に含まれる抗インフルエンザsIgAの量はばらつく。そこで鼻腔洗浄液中に含まれる全sIgA量を測定して、この中に含まれる抗インフルエンザsIgA量の割合を算出して、感染リスクとの関係を検討した。なお分泌型IgA (sIgA)とは、血清型IgAの二量体構造にさらにS成分が結合したもので、sIgAとIgAは共にIgAのELISAキットで定量可能である。
【００３７】
全sIgA量の定量は、IgAのELISAキット（Human IgA ELISA Quantitation Kit、BETHYL Laboratory Inc, Montgomery, TX, USA）を使用し、マニュアルに従って測定した。キットに含まれるGoat anti-Human IgA-affinity purifiedをcoating buffer(0.05 M sodium carbonate pH9.6)で100倍希釈して、ELISA用の96穴Nuncイムノプレート（Nalgen Nunc International, NW）の各ウェルに100μL加え、室温で1時間インキュベーションする。それぞれのウェルにTTBS 洗浄液(50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Tween20, pH8.0)を300 μL加え、アスピレーションによって取り除く。この操作を3回繰り返した後、ウェルにblocking buffer  (50 mM Tris,0.14 M NaCl,1% BSA, pH8.0)を200μL加え、室温で30分インキュベーションする。それぞれのウェルにTTBS洗浄液を300 μL加え、アスピレーションによって取り除く。これを3回繰り返した後、鼻腔洗浄液をsample buffer (50 mM Tris,0.14 M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween20, pH8.0)で希釈する。WHOからのIgA, IgG, IgM を含有する既知濃度の標準標品も同様にsample bufferで希釈する。Blankとしてのcontrol sample (後述)、既知濃度のIgA 標準標品、検体を、ウェルに100μL加え、室温で1時間反応させる。次いで、それぞれのウェルにTTBS洗浄液を300μL加え、アスピレーションによって取り除く。これを5回繰り返した後、２次抗体としてキットに添付のGoat anti-Human IgA-HRP conjugateを説明書に従ってsample bufferで希釈し、ウェルに100μL加え、室温で1時間インキュベーションする。反応後、ウェルにTTBS洗浄液を300μL加え、アスピレーションによって取り除く。これを5回繰り返す。次いでTMB Microwell Peroxidase Substrate System (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Md) を用いて発色反応を行う。最後に、反応停止液(2 M H2SO4)を100μL加え、プレートリーダーでOD 450 nmを測定する。IgA の標準検量線より、各検体のsIgAの値 (μg/mL) を求めた。プレート間差、日間差は、プールされた鼻腔洗浄液を500倍希釈した値を用いて補正した。また全ての値は、Negative control鼻腔洗浄液との差として表記した。
【００３８】
（４）抗インフルエンザsIgA抗体の定量
96穴Nuncイムノプレートの各ウェルに100μLのワクチン溶液 [Phosphate-buffered saline (PBS)に溶解したタンパク量にして1μgのワクチン、100 mgのウシ血清アルブミン（BSA）（SIGMA）]を加え、4℃で一晩固相化反応を行った。その後300μLのTTBS洗浄液で3回すすぎワクチン液を除去した。次いで、各ウェルに0.15 M NaCl, 1% BSAを含む50 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 8.0) 200μLを加え、室温で1時間ブロッキング反応を行った。各ウェルを洗浄液で3回すすいだのち、sample buffer (50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) にて検体を適量に希釈した。WHOのIgA標準標品も同様にsample bufferで希釈した。Blankとしてのcontrol sample (後述)、IgA 標準検体をウェルに100 μL加え、室温で２時間反応させた。次いで、それぞれのウェルをTTBS洗浄液300μLで洗浄し、アスピレーションによって取り除く。これを5回繰り返した後、２次抗体としてキットに添付のGoat anti-Human IgA-HRP conjugateを説明書に従ってsample bufferで希釈し、ウェルに100μL加え、室温で1時間インキュベーションした。反応後、ウェルにTTBS 洗浄液を300μL加え、アスピレーションによって取り除く。これを5回繰り返す。次いでTMB Microwell Peroxidase Substrate System (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. MD) を用いて発色反応を行う。最後に、反応停止液 (2 M H2SO4)を100μL加え、プレートリーダーでOD 450 nmを測定する。理論上では、定量のためのスタンダードとしては、ヒトの鼻腔洗浄液からaffinity 精製したそれぞれのワクチン抗原に対する抗インフルエンザsIgAを用いる事が最適であるが、検体採取に制限と限界があるため、これに替わって便宜上、全IgAの測定時に使用した検量線を用いて相対的濃度(Unit)として測定した。そのため、得られた値は、Unit/mLで表記した。プレート間差、日間差を補正するため、プール鼻腔洗浄液を500倍希釈した検体の値を用いた。また全ての値は、Negative control鼻腔洗浄液との差として表記した。
【００３９】
（５）バックグラウンド測定のための control sampleの調整
被験者57名の鼻腔洗浄液をプールして、プール鼻腔洗浄液として、プレート間差、日間差の補正に使用した。一方、Negative control鼻腔洗浄液を調整するため、抗原として用いたInfluenza  A/Hiroshima/52/2005  (H3N2)株、Influenza A/New caledonia/20/99(H1N1)株、Influenza B/Malaysia/2506/2004  株の混合ワクチンを固相化した直径3 cmのシャーレに鼻腔洗浄液を加え、4℃でオーバーナイト反応させて抗体を吸収させた。この操作を鼻腔洗浄液中に抗体が検出されなくなるまで繰り返して、Negative control鼻腔洗浄液とした。
【００４０】
（６）カルボキシル化Diamond like carbon 蛋白アレイを用いた抗インフルエンザsIgA抗体の定量
カルボキシル化Diamond like carbonアレイを蛋白チップとして応用する方法は、これまでに報告がある（特開２００６−２６７０５８号公報：ダイヤモンドチップへの蛋白質/ペプチドの固定化方法、特開２００６−２６７０６３号公報：アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット、及びPCT/JP2008/000242: アレルギー疾患の判定方法）。この方法に準じて行うが、以下の方法でインフルエンザワクチンをカルボキシル化Diamond like carbonアレイに固定化した。
【００４１】
具体的には、蛋白質量として1mg/mlに調整した各種インフルエンザワクチン株と、内部標準としてWHO human IgG, A, M (67/086)200 U/mL(NIBSC)、sample 溶解液（10 mg/ml BSA/0.05% Tween20/0.3% KCl/ PBS）のそれぞれを、30%  Dimethyl Sulfoxide(DMSO)/PBS溶液で200倍希釈し、OmniGridR Accent (Genomic Solutions-NIPPUN Techno Cluster)でアレイにスポットした。次いで遮光下に37℃で3時間乾燥を行い、NanoBio Bloker(Nano Bio Tech)とBSA溶液(10 mg/ml BSA, 0.1 M Glycine ,0.1% PEG /PBS)の1対3の混合液をブロッキング溶液として、1スポット当たり10μLを加え、遮光下に4℃でオーバーナイト放置してブロッキングした。その後、チップをMilliQ水で軽く洗浄後、TTBSで5分間洗浄を1回行った。再びMilliQで軽く洗浄後、150 x gで2分間遠心して水切りを行った。その後、Sample 溶解液で希釈した鼻腔洗浄液を1スポット当たり5μL加え、遮光下に37℃で1時間反応させた。反応後、MilliQで軽く洗浄して検体を除去後、TTBSで5分洗浄を2回行った。MilliQで軽く洗浄後、150 x gで2分間遠心して水切りを行った。二次抗体として、鼻腔洗浄液の検体は蛍光色素Cy3でラベルしたanti-Human IgAを1スポットに5 μL加えた。これを遮光下に37℃で1時間反応を行い、その後MilliQ水で軽く洗浄して、TTBSで5分間 2回の洗浄を行った。再びMilliQ水で軽く洗浄後、150 x gで2分間遠心して水切りを行った。最後に、532 nm (FUJIFILM FLA-8000)で蛍光強度を測定した。
【００４２】
（結果）
（１）インフルエンザ感染者と非感染者間で見られた感染前及び感染直後の鼻腔洗浄液中のInfluenza A/Hiroshima/52/2005(H3N2)と反応するsIgA抗体価の違いと、これを用いた感染リスク診断
2005年/2006年、及び2006年/2007年の日本におけるインフルエンザシーズン中でインフルエンザに感染したボランティアー患者で、発熱後48時間以内に来院して鼻腔洗浄液を採取できた41名（インフルエンザの迅速診断キット、Espline Influenza A&B-N, Fujirebio, Tokyoによるウイルス抗原の検出で確定診断）と、各インフルエンザシーズンの１１月に鼻腔洗浄液を採取できたボランティアーで、インフルエンザ感染のなかった70名の、鼻腔洗浄液の抗Influenza A/Hiroshima/52/2005(H3N2)  sIgA抗体価を、図１に示す。図１は、抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価 [Rate of anti-influenza virus sIgA: Specific sIgA(U/mL)/Total sIgA(μg/mL) × 100]で表した結果である。インフルエンザ感染者の抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価の平均値は1.04 ± 1.10 (mean ± SD)であるのに対して、非感染者では 9.98 ± 8.39で、両群間では、統計学的に有意差（p<0.01: Mann-Whitney U-test）を示した。さらに抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価 [Specific sIgA(U/mL)/Total sIgA(μg/mL) × 100] が2.0以下では、感染確率は92.5% 以上を、2.1-3.9では、感染確率は35.0 %を、4.0以上では、感染確率は3.2%以下を示した。
【００４３】
（２）インフルエンザ感染者と非感染者間で見られた感染前及び感染直後の鼻腔洗浄液中のInfluenza A/New Caledonia/20/99(H1N1)と反応するsIgA抗体価の違いと、これを用いた感染リスク診断
2005年/2006年、及び2006年/2007年の日本におけるインフルエンザシーズン中でインフルエンザに感染したボランティアー患者で、発熱後48時間以内に来院して鼻腔洗浄液を採取できた41名（インフルエンザの迅速診断キット、Espline Influenza A&B-N, Fujirebio, Tokyoによるウイルス抗原の検出で確定診断）と、各インフルエンザシーズンの１１月に鼻腔洗浄液を採取できたボランティアーで、インフルエンザ感染のなかった66名の、鼻腔洗浄液の抗Influenza A/New Caledonia/20/99(H1N1)sIgA抗体価を、図２に示す。図２は、抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価 [Rate of anti-influenza virus sIgA: Specific sIgA(U/mL)/Total sIgA(μg/mL) × 100]で表した結果である。インフルエンザ感染者の抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価の平均値は1.56 ± 1.71 (mean ± SD)であるのに対して、非感染者では 7.96 ± 5.93で、両群間では、統計学的に有意差（p<0.01: Mann-Whitney U-test）を示した。さらに抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価 [Specific sIgA(U/mL)/Total sIgA(μg/mL) × 100]が 2.0以下では、感染確率は89.7% 以上を、2.1-3.9では、感染確率は54.9%を、4.0以上では、感染確率は13.1%以下を示した。
【００４４】
（３）インフルエンザ感染者と非感染者間で見られた感染前及び感染直後の鼻腔洗浄液中のInfluenza B/Malaysia/2506/2004と反応するsIgA抗体価の違いと、これを用いた感染リスク診断
2005年/2006年、及び2006年/2007年の日本におけるインフルエンザシーズン中でインフルエンザに感染したボランティアー患者で、発熱後48時間以内に来院して鼻腔洗浄液を採取できた41名（インフルエンザの迅速診断キット、Espline Influenza A&B-N, Fujirebio, Tokyoによるウイルス抗原の検出で確定診断）と、各インフルエンザシーズンの１１月に鼻腔洗浄液を採取できたボランティアーで、インフルエンザ感染のなかった70名の、鼻腔洗浄液の抗Influenza B/Malaysia/2506/2004 sIgA抗体価を、図３に示す。図３は、抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価 [Rate of anti-influenza virus sIgA: Specific sIgA(U/mL)/Total sIgA(μg/mL) × 100]で表した結果である。インフルエンザ感染者の抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価の平均値は1.65 ± 2.72 (mean ± SD)であるのに対して、非感染者では10.94 ± 6.75で、両群間では、統計学的に有意差（p<0.01: Mann-Whitney U-test）を示した。さらに抗原特異的抗インフルエンザsIgA抗体価 [Specific sIgA(U/mL)/Total sIgA(μg/mL) × 100]が 2.0 以下では、感染確率は93.7% を、4.0以上では、感染確率は12.5%以下を示した。
【００４５】
（４）カルボキシル化Diamond like carbon 蛋白アレイを用いた抗インフルエンザsIgA抗体の定量
実験方法に記載した方法により、2005年/2006年、及び2006年/2007年の日本におけるインフルエンザシーズン中でインフルエンザに感染したボランティアー患者で、発熱後48時間以内に来院して鼻腔洗浄液を採取できた41名（インフルエンザの迅速診断キット、Espline Influenza A&B-N, Fujirebio, Tokyoによるウイルス抗原の検出で確定診断）と、各インフルエンザシーズンの１１月に鼻腔洗浄液を採取できたボランティアーで、インフルエンザ感染のなかった66名の、鼻腔洗浄液を検体とした。カルボキシル化Diamond like carbon 蛋白アレイでは、抗Influenza A/Hiroshima/52  /2005(H3N2)、抗Influenza A/New Caledonia/20/99(H1N1)、抗Influenza  B/Malaysia/  2506/2004 のsIgA抗体価を同時に測定する。抗原に結合したそれぞれの抗体の濃度をBinding Unit として、上記に記載した96穴Nuncイムノプレート法の結果と相関させて、リスク診断を行う。１患者の鼻腔洗浄液例を代表例として図４に示す。アレイを用いることによってインフルエンザ特異的sIgAの定量が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、インフルエンザ感染者と非感染者間で見られた感染前及び感染直後の鼻腔洗浄液中のInfluenza A/Hiroshima/52/2005(H3N2)と反応するsIgA抗体価の違いと、これを用いた感染リスク診断を示す。
【図２】図２は、インフルエンザ感染者と非感染者間で見られた感染前及び感染直後の鼻腔洗浄液中のInfluenza A/New Caledonia/20/99(H1N1)と反応するsIgA抗体価の違いと、これを用いた感染リスク診断を示す。
【図３】図３は、インフルエンザ感染者と非感染者間で見られた感染前及び感染直後の鼻腔洗浄液中のInfluenza B/Malaysia/2506/2004と反応するsIgA抗体価の違いと、これを用いた感染リスク診断を示す。
【図４】図４は、カルボキシル化Diamond like carbon 蛋白アレイを用いた抗インフルエンザsIgA抗体の定量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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