(57)【要約】【課題】簡便な方法で過酢酸の濃度を測定するための試薬、及び簡便な過酢酸濃度の測定方法の提供。【解決手段】ヨウ化物イオン、デンプン、及びチオ硫酸イオンを含有し、前記ヨウ化物イオンと前記チオ硫酸イオンとのモル比（ヨウ化物イオン／チオ硫酸イオン）が０．５以上１０以下である過酢酸濃度の測定用試薬、及び該試薬を用いた過酢酸濃度の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酢酸濃度の測定用試薬であって
ヨウ化物イオン、デンプン、及びチオ硫酸イオンを含有し、
前記ヨウ化物イオンと前記チオ硫酸イオンとのモル比（ヨウ化物イオン／チオ硫酸イオン）が０．５以上１０以下である試薬。
【請求項２】
前記ヨウ化物イオンと前記チオ硫酸イオンとのモル比（ヨウ化物イオン／チオ硫酸イオン）が０．７以上２以下である請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
過酢酸を有効成分として含む高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物の該過酢酸の濃度測定に用いられる請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
過酢酸、過酸化水素、及び酢酸の平衡混合物の該過酢酸の濃度測定に用いられる請求項１〜３のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の試薬、及び
過酢酸及び前記試薬を含む溶液の波長４００〜７００ｎｍのいずれかの波長における吸光度と前記過酢酸の濃度との相関関係を示す検量線
を含む過酢酸濃度の測定用キット。
【請求項６】
前記波長が５６０ｎｍである請求項５に記載のキット。
【請求項７】
過酢酸濃度の測定方法であって、以下の工程を含む測定方法：
（１）検体及び請求項１〜４のいずれか一項に記載の試薬を含む溶液の波長４００〜７００ｎｍのいずれかの波長における吸光度を測定する工程；及び
（２）過酢酸及び前記試薬を含む溶液の前記波長における吸光度と前記過酢酸の濃度との相関関係を示す検量線を用いて、工程（１）で測定された吸光度から検体の過酢酸濃度を求める工程。
【請求項８】
前記波長が５６０ｎｍである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検体の過酢酸濃度が１０００ｐｐｍ〜３０００ｐｐｍである請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過酢酸濃度測定用試薬及び該試薬を用いた過酢酸濃度測定方法に関する。より具体的には、本発明は、過酸化水素、酢酸を同時に含み得る該高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物などの溶液における過酢酸の濃度を測定する試薬、及び該試薬を用いた過酢酸濃度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、内視鏡等の医療用機器の洗浄及び殺菌用組成物として、過酢酸を有効成分とする殺菌用組成物が広く用いられるようになってきた。過酢酸を有効成分とする殺菌用組成物としては、市販品として、アセサイド（登録商標）が知られている（非特許文献１）。アセサイドは、過酢酸、過酸化水素、酢酸を含む主剤と緩衝化剤からなり、殺菌用に用いられる際は、これらを精製水に加えて実用のための水溶液を調製する。このような水溶液は殺菌剤として７日程度繰り返し使用可能であるが、水溶液調製後は、温度、紫外線又は不純物混入などにより過酢酸濃度が低下するため、使用前に殺菌力が基準以上であるか否かを確認する必要がある。
【０００３】
過酢酸、過酸化水素、及び酢酸の混合水溶液中の過酢酸の測定方法としては酸化還元滴定を用いる方法等が知られている（特許文献１）。しかし、滴定を用いる定量は簡便ではないため、医療機器の消毒あるいは滅菌を行う現場で行う方法には適していない。
【０００４】
簡便な方法として、上記の確認はヨウ素−デンプン反応による呈色を利用した専用試験紙で前記水溶液が有効濃度の過酢酸を含むか否かを判定することにより行われている。すなわち、不十分な呈色を示すようになった場合に、上記水溶液における過酢酸が有効濃度未満であると判断される。しかしながら、この呈色の判定は、試験紙を前記水溶液に浸漬後１０秒程度の時間において行わなければならず、時間が経過すると有効濃度未満の溶液であっても十分な呈色を示してしまうため、判定作業に制約があるとともに、誤判定をする可能性が高いという問題があった。そのため、この問題の解決方法として、複数の判定用具を用いる方法も開示されている。（特許文献２）しかし、簡便な方法はいずれも有効濃度の有無しか判定することしかできず、直接的な濃度測定はできなかった。
【０００５】
【非特許文献１】アセサイド６％消毒液カタログ、サラヤ株式会社（平成１３年１０月）
【特許文献１】特開平6-130051号公報
【特許文献２】特開2008-14685号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は簡便な方法で過酢酸の濃度を測定するための試薬、及び簡便な過酢酸濃度の測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行い、ヨウ素でんぶん反応による呈色反応が過酢酸濃度を定量的に示すことを見出し、さらに定量性を示す条件を研究して、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は下記を提供するものである。
［１］過酢酸濃度の測定用試薬であって
ヨウ化物イオン、デンプン、及びチオ硫酸イオンを含有し、
前記ヨウ化物イオンと前記チオ硫酸イオンとのモル比（ヨウ化物イオン／チオ硫酸イオン）が０．５以上１０以下である試薬。
［２］前記ヨウ化物イオンと前記チオ硫酸イオンとのモル比（ヨウ化物イオン／チオ硫酸イオン）が０．７以上２以下である［１］に記載の試薬。
【０００９】
［３］過酢酸を有効成分として含む高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物の該過酢酸の濃度測定に用いられる［１］又は［２］に記載の試薬。
［４］過酢酸、過酸化水素、及び酢酸の平衡混合物の該過酢酸の濃度測定に用いられる［１］〜［３］のいずれか一項に記載の試薬。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の試薬、及び
過酢酸及び前記試薬を含む溶液の波長４００〜７００ｎｍのいずれかの波長における吸光度と前記過酢酸の濃度との相関関係を示す検量線
を含む過酢酸濃度の測定用キット。
［６］前記波長が５６０ｎｍである［５］に記載のキット。
【００１０】
［７］過酢酸濃度の測定方法であって、以下の工程を含む測定方法：
（１）検体及び［１］〜［４］のいずれか一項に記載の試薬を含む溶液の波長４００〜７００ｎｍのいずれかの波長における吸光度を測定する工程；及び
（２）過酢酸及び前記試薬を含む溶液の前記波長における吸光度と前記過酢酸の濃度との相関関係を示す検量線を用いて、工程（１）で測定された吸光度から検体の過酢酸濃度を求める工程。
［８］前記波長が５６０ｎｍである［７］に記載の方法。
［９］前記検体の過酢酸濃度が１０００ｐｐｍ〜３０００ｐｐｍである［７］又は［８］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、過酢酸の濃度、特に過酢酸、過酸化水素、及び酢酸の混合水溶液中の過酢酸の濃度を簡便に測定することができる試薬が提供される。この試薬を用いた測定方法により、高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物における該過酢酸濃度を簡便にかつ正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
【００１３】
ヨウ素−デンプン反応は、デンプンおよびヨウ素が複合体を形成し青紫色を呈する反応をいうが、ヨウ化物イオンおよびデンプンの存在下では、過酢酸の酸化作用により、ヨウ化物イオンがヨウ素になり、上記の呈色を示す。この呈色の発色濃度に対する過酢酸濃度の関係を明らかにした検量線を得ることができれば、過酢酸濃度を簡便に測定することができる。
【００１４】
本発明の試薬は、ヨウ素−デンプン反応を利用した測定方法に用いることができる試薬であって、ヨウ化物イオン、デンプン、及び還元剤としてのチオ硫酸イオンを含む。ヨウ化物イオンとチオ硫酸イオンとのモル比（ヨウ化物イオン／チオ硫酸イオン）は、０．５以上１０以下であればよく、０．７以上２以下であることが好ましく、０．８以上１．５以下であることがより好ましい。
【００１５】
試薬は溶液として提供されればよい。該溶液の溶媒としては、例えば水を用いることができる。
ヨウ化物イオンの供給源としては、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化アンモニウム、ヨウ化カルシウムなどのヨウ化物塩を用いることができる。この中でヨウ化カリウムを用いることが好ましい。
【００１６】
ヨウ化カリウムは、試薬又は製造用として市販されているものであればよく、例えば「よう化カリウム」（和光純薬工業164-03977）等を用いることができる。測定液を調製するための溶液における濃度は０．１〜１０質量％の範囲であればよい。
ヨウ化物イオンの濃度は１×10-3M〜１×10-8Mであることが好ましく、さらに好ましくは１×10-4M〜１×10-7Mである。
【００１７】
デンプンとしてはトウモロコシやバレイショ等の由来のものでよく、可溶化し易いものが好ましい。例えば「でんぷん溶性」（和光純薬工業197-03987）が用いられ、測定液を調製するための溶液におけるデンプンの濃度は０．５〜１０質量％の範囲であればよい。ヨウ化カリウムおよび前記デンプンの質量比（ヨウ化カリウム／デンプン）は０．４５〜０．１５であることが好ましい。
【００１８】
チオ硫酸イオンの供給源としては、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム、又はチオ硫酸アンモニウムなどのチオ硫酸塩を用いることができるが、チオ硫酸アンモニウムあるいはチオ硫酸ナトリウムを用いることが好ましい。チオ硫酸イオンの濃度は１×10-3M〜１×10-8Mであることが好ましく、さらに好ましくは１×10-4M〜１×10-7Mである。
【００１９】
試薬におけるチオ硫酸イオン濃度は、ヨウ化カリウムとの濃度比が上述の範囲となるように調製される。
試薬にはさらに、酸化分解防止の目的で亜硫酸ナトリウム、イオン濃度調節などのために塩化カリウム、環境中の微生物による変質を避けるための防菌剤などを添加してもよい。
【００２０】
本発明の試薬を、検体と混合し、発色を測定することによって、該検体の過酢酸濃度を測定することが可能である。典型的には、濃度既知の過酢酸含有溶液を本発明の試薬と混合し、過酢酸の濃度を変えて作製した２以上のこのような混合溶液の吸光度の測定結果から検量線を作成して、その検量線を基に、検体の過酢酸濃度を検体の吸光度から求めることができる。
【００２１】
吸光度は４００〜７００ｎｍのいずれかの波長で測定されることが好ましく、４５０〜６００ｎｍのいずれかの波長で測定されることがより好ましく、５００〜５８０ｎｍのいずれかの波長で測定されることがさらに好ましく、波長５６０ｎｍで測定されることがさらに好ましい。
【００２２】
吸光度の測定は市販の分光光度計を用いて行うことができる。測定溶液を入れるセルの光路長は特に限定されないが、５ｍｍであればよい。
吸光度の測定は、本発明の試薬と過酢酸を含有する溶液が混合された後、好ましくは１０秒〜５分、より好ましくは２０秒後〜１２０秒において行えばよい。
【００２３】
過酢酸を含有する溶液である検体としては、例えば、過酢酸を有効成分として含む高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物が挙げられる。
【００２４】
過酢酸の高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物が例えば内視鏡洗浄消毒に使われる場合の有効濃度は過酢酸処方の種類により若干異なるが、通常２６ｍＭ以上であり、約２０００ppmに相当する。本発明の試薬は、検体の過酢酸濃度として、好ましくは１０００〜３０００ｐｐｍ、より好ましくは１５００〜２５００ｐｐｍの測定が可能であり、上記の標準的な高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物における過酢酸濃度を網羅する。上記検量線はこのような濃度範囲の２つ以上、好ましくは３つ以上の測定点を用いて作成されることが好ましい。
【００２５】
検体は、希釈して吸光度の測定に用いられていてもよい。希釈は透過光で吸光度を測定するために、水を用いて検体を２倍から１００００倍に希釈することが好ましい。特に好ましくは１０倍から１０００倍希釈である。ヨウ化物イオン、チオ硫酸イオン、でんぷんは固体で添加されてもよいし、あらかじめ水溶液にしてから添加してもよい。検体からの吸光度を測定するためのサンプル調製方法は、あらかじめヨウ化物イオンとチオ硫酸イオンとでんぷんを溶かした水溶液、検体、及び水を混合する方法であることが好ましい。
【００２６】
また、高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物は、過酢酸のほかに、酢酸及び／又は過酸化水素を含んでいてもよい。さらに、高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物は、上記の成分のほかに１又は２以上の添加剤を含んでいてもよい。添加剤の例としては、腐食防止剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、金属封鎖剤、安定化剤、界面活性剤、及び再付着防止剤等が挙げられる。高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物として用いられる過酢酸は過酢酸と過酸化水素と酢酸を含有する平衡過酢酸組成物として存在することが好ましい。
【００２７】
なお、本明細書において用いられる「高水準消毒あるいは滅菌」という用語には、「洗浄」、「消毒」、「抗菌」、及び「滅菌」などの意味が含まれる。高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物の用途は特に限定されず、液体又は固体の高水準消毒あるいは滅菌のほか、汚染された気相の高水準消毒あるいは滅菌に用いることができる。内視鏡等の医療機器の場合、通常機器を浸漬させることによって両者を接触させて高水準消毒あるいは滅菌が行われる。高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物は繰り返し使用が可能であるが、複数回の使用や時間の経過によって、過酢酸濃度は低下していく。使用前に本発明の測定方法を用いて高水準消毒あるいは滅菌に有効な濃度であるか否かを確認することにより、高水準消毒あるいは滅菌用水性組成物を効率よく使用することが可能となる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（例１）
（ヨウ化カリウムでんぷん溶液１の調製）
水                                      ８０ｍＬ
溶性デンプン                            ３.０ｇ
チオ硫酸アンモニウム溶液（75％）        １.９８ｇ
ヨウ化カリウム                          ０．８５ｇ
デンプンを２００ｍＬビーカーに入れ、水を徐々に加え約３０分膨潤後、約７０℃の温水にビーカーを浸し攪拌溶解した。溶解したデンプン液に、チオ硫酸アンモニウム溶液（75％）とヨウ化カリウムを添加して溶解、その後３０℃以下に冷まし、水を加えて１００ｍＬにした。
【００２９】
（ヨウ化カリウムでんぷん溶液２の調製）
チオ硫酸アンモニウム溶液（75％）を0.66ｇとした以外はヨウ化カリウムでんぷん溶液１と同様に調製した。
（ヨウ化カリウムでんぷん溶液３の調製）
チオ硫酸アンモニウム溶液（75％）を抜いた以外はヨウ化カリウムでんぷん溶液１と同様に調製した。
【００３０】
（過酢酸溶液の調製）
アセサイド（登録商標）のI剤２０ｍＬとII剤２０ｍＬと水３６０ｍＬを加え、攪拌し、アセサイド実用液を調整した。
（過酢酸濃度測定方法）
上記で調製したアセサイド実用液の過酢酸濃度の定量を酸化還元滴定で行った。サンプルをマイクロピペッターで１ｍＬ採取し、メスフラスコを用いて純水で２０ｍＬに希釈した。
２００ｍＬのコニカルビーカーに２０倍に希釈したサンプルをマイクロピペッターで１ｍＬ採取し、１０％硫酸２０ｍＬを加えた。
【００３１】
これにフェロイン指示薬を１〜２滴添加し、１／１０Ｎ硫酸セリウム標準液で滴定し、赤色から淡青色になったところを終点（Ａｍｌ）とした。
次に、別の２００ｍＬのコニカルビーカーに消毒液をマイクロピペッターで１ｍＬ採取し、１０％硫酸２０ｍＬ、１０％ヨウ化カリウム溶液１０ｍＬ、５％モリブデン酸アンモニウム溶液１〜２滴を加え、これに１／１０Ｎチオ硫酸ナトリウム標準液で淡黄色になるまで滴定し、１％デンプン溶液を約１ｍＬ加えて暗青色が消えたところを終点（ＢｍＬ）とした。過酢酸の濃度は以下式により求めた。
「過酢酸(w/v%)＝（ Ｂ×ｆ2 − Ａ×ｆ1 ）×0.05  ×  76  ×  100/1000」
ここで、ｆ1は１／１０Ｎ硫酸セリウム標準液のファクター、ｆ2は１／１０Ｎチオ硫酸ナトリウム標準液のファクターを表す。
上記の方法で過酢酸溶液の過酢酸濃度を算出した結果、3220ppmであった。
【００３２】
（過酢酸濃度測定の予備試験）
上記で調整したアセサイド実用液の添加量を変化させてヨウ化カリウムでんぷん溶液での発色テストを行った。添加方法としてはヨウ化カリウムでんぷん溶液１４０μＬに水１０ｍＬ添加した液にアセサイド実用液（添加量は表１記載）を添加し、発色挙動を目視で観察した。結果を表１に示す。発色挙動は表に示す基準で評価した。
【００３３】
【表１】
2010060437.tif 000002
【００３４】
（結果）
表１に示したように、ヨウ化カリウムでんぷん溶液２を用いることで、表１中の黒枠部分のように、過酢酸濃度が５０％、２５％になった場合を判別できることが確認できた（溶液２で過酢酸溶液添加量100μＬに対して、50μＬ添加の場合は過酢酸濃度が50％、25μＬ添加の場合は過酢酸濃度が25％相当に対応する）。
ヨウ化カリウムでんぷん溶液１または３では過酢酸濃度が５０％、２５％になった場合を判別できない（溶液１では過酢酸溶液添加量175μＬに対して、125μＬ添加(過酢酸濃度として約70%相当)までしか判別できない。溶液３ではいずれの過酢酸濃度でも発色してしまい、過酢酸濃度測定に利用できない。）結果であり、ヨウ化物イオン/チオ硫酸イオンモル比に好ましい範囲があることを確認できた。
【００３５】
（例２）
（模擬疲労過酢酸溶液）
実施例1で用いた過酢酸溶液が自然経時で過酢酸が過酸化水素と酢酸に分解した模擬疲労過酢酸溶液を調整した。
水                      ３６０ｍＬ
アセサイドII剤          ２０ｍＬ
過酸化水素（３０％）    ７．１ｇ
酢酸                    ７．９ｇ
水を加えて４００ｍＬとした。
この液の過酢酸と過酸化水素濃度を酸化還元滴定で求めると、それぞれ、０ｐｐｍと６３５０ｐｐｍであった。
【００３６】
実施例１の過酢酸溶液と上記の模擬疲労過酢酸を種々の比率で混合することで種々の過酢酸濃度液を調整した。過酢酸と過酸化水素濃度は表２の結果であった。
【００３７】
【表２】
2010060437.tif 000003
【００３８】
表２で調整した過酢酸濃度液（(1)から(7)のそれぞれ）１００μＬと実施例１で用いたヨウ化カリウムでんぷん溶液２の１５０μＬと水１０ｍＬとを加え、撹拌した液を測定液とした。
この測定液の分光吸収を島津製作所製U−3310分光光度計で測定した。セル長は５ｍｍで行った。測定結果を図１に示す。
さらに図１の結果を元に作成した、５６０ｎｍの吸光度と過酢酸濃度の関係を示すグラフを図２に示す。
【００３９】
図２の結果から、検体の過酢酸濃度１０００ｐｐｍから３０００ｐｐｍにおいて、吸光度と良好な相関関係が得られることがわかる。この相関関係を検量線に使い、本発明によって得られた発色濃度を測定することで簡便な過酢酸濃度測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の試薬を異なる過酢酸濃度を有する液と混合した溶液の吸収スペクトルを示す図である。
【図２】本発明の試薬を異なる過酢酸濃度を有する検体と混合した溶液（過酢酸含有検体１００μＬ、ヨウ化カリウムデンプン液１５０μＬ、及び水１０ｍＬからなる溶液）における、５６０ｎｍの吸光度（セル光路長５ｍｍ）と該過酢酸濃度の関係を示すグラフである。
【図１】
2010060437.tif 000004
【図２】
2010060437.tif 000005