(57)【要約】【課題】本発明は、特定のマイクロＲＮＡを頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法、頭頸部腫瘍の判定方法、頭頸部腫瘍の判定キット等を提供することを目的とする。【解決手段】miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡを頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡを頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法。
【請求項２】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を備えたことを特徴とする頭頸部腫瘍の判定方法：
（Ａ）頭頸部の検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：
（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375から選択される１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：
（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の正常組織又は被検体と同種の正常被検体の血液におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：
【請求項５】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項４に記載の頭頸部腫瘍の判定方法。
【請求項６】
抽出したＲＮＡ中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に頭頸部腫瘍であると評価することを特徴とする請求項４又は５に記載の頭頸部腫瘍の判定方法。
【請求項７】
抽出したＲＮＡ中の、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に頭頸部腫瘍であると評価することを特徴とする請求項４又は５に記載の頭頸部腫瘍の判定方法。
【請求項８】
頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載の頭頸部腫瘍の判定方法。
【請求項９】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを頭頸部腫瘍の判定に使用する方法。
【請求項１０】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを、頭頸部腫瘍の判定に使用する方法。
【請求項１１】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいることを特徴とする頭頸部腫瘍の判定キット。
【請求項１４】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えたことを特徴とする頭頸部腫瘍の判定キット。
【請求項１５】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の判定キット。
【請求項１６】
頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の判定キット。
【請求項１７】
以下の工程を含むことを特徴とする頭頸部腫瘍治療薬のスクリーニング方法：
（Ａ）頭頸部腫瘍に罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：
（Ｂ）前記非ヒト動物における頭頸部腫瘍組織中又は血液中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：
（Ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：
【請求項１８】
miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、頭頸部腫瘍におけるマイクロＲＮＡ（microＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）の発現プロファイルとその用途に関する。より詳細には、特定のマイクロＲＮＡを頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法、頭頸部腫瘍の判定方法、頭頸部腫瘍の判定キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭頸部腫瘍は、耳、鼻、咽頭、喉頭、頸部、顔面、あるいは口腔等にできる腫瘍であるが、特に悪性腫瘍は５０歳以上の男性に多く、全悪性腫瘍の６％を占める。罹患率は年齢と共に高率となり、全世界では年間６５万人が罹患し、その内３５万人が原病死している（非特許文献１参照）。中でも、喉頭がんは、頭頸部領域において最も多い疾患であり、がん・統計白書による喉頭がんの年間死亡数の将来予測では、死亡者数が増加するとされている。
【０００３】
頭頸部腫瘍の診断は、内視鏡検査及び各種画像検査（ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ、超音波検査等）を用いた病期診断と生検による組織診断によってなされ、これらをもとに治療が行われる（非特許文献２参照）。しかし、頭頸部腫瘍の診断においては、画像診断では腫瘍の質的診断が不可能であり、良性疾患との鑑別が困難な場面も多々ある。また、確定診断として用いられる生検による組織診断については、基本的なヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色に各種免疫染色を組み合わせて用いたとしても、進行度・進達度の判断に困難な場合がある上、予後の予測まではできないのが現状である。発症・予後の予測に関しては、いくつかの因子が報告されてはいるものの（特許文献１〜３参照）、現在のところ感度と特異性の双方を十分に持つバイオマーカーは存在しない。
【０００４】
一方、頭頸部腫瘍の治療は、主に病期と病理組織学的所見により決定されており、良性腫瘍には、根治可能な一期的摘出術が行われる一方、悪性腫瘍に対しては手術・放射線治療・化学療法が用いられ、進行癌の場合はそれらを組み合わせて行うことが必要とされる。頭頸部腫瘍に対する手術は頭頸部、顔面を整容的に著しく損なう上、発声・嚥下等の身体的機能にも高度の影響を及ぼし、身体的・心理的に侵襲が大きく、それ故、ＱＯＬ（Quality of Life）の大幅な低下を来す。また、これらの治療を組み合わせたとしても、進行癌では５年生存率は３０％程度に留まっており（非特許文献２参照）、治療効果は現在でも決して高いとは言えない。さらに、治療効果と予後には個人差が認められ、これらは腫瘍組織における遺伝子変異とその発現量の異常に起因していると考えられるが（非特許文献３、４参照）、遺伝子レベルでの頭頸部腫瘍の診断は、現在まで行われていない。
【０００５】
前述の通り、高齢化社会を迎えた日本において頭頸部腫瘍の増加が予測されるが、それらの発症予測に関しては、疫学的に喫煙・飲酒・胃酸逆流や音声酷使との関連が示唆されてはいるものの（非特許文献５）、有用なバイオマーカーは現在まで存在しない（特許文献４、５及び非特許文献６参照）。
【０００６】
ところで、マイクロＲＮＡは、細胞内に存在し、タンパクへの翻訳がなされない、長さ２２塩基程度の１本鎖ＲＮＡである（非特許文献７参照）。１９９３年に線虫C.elegansにおいて、その後、２００１年には脊椎動物でも発見され、種を越えて保存されている。現在、ヒトゲノム上には１０００種類近くのマイクロＲＮＡの存在が予測され、これまでに７００種類以上のマイクロＲＮＡがクローニングされている。また、マイクロＲＮＡは、ゲノム上のタンパク翻訳領域の３０％に対し遺伝子制御を行っていると推測されており（非特許文献８参照）、それ故、マイクロＲＮＡの機能破綻は各種の疾患を引き起こす可能性がある。しかしながら、現在までに、その生物学的役割が明らかになったものはごく僅かに過ぎず、今後の解析が待たれている。頭頸部腫瘍に関するマイクロＲＮＡの報告として、腫瘍細胞株を用いたものは散見されるが（非特許文献９、１０参照）、患者臨床検体を用いての報告は現在まで行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−５３２３１４号公報
【特許文献２】米国特許第６８５５３５０号公報
【特許文献３】米国特許第７０４５２９２号公報
【特許文献４】特開２００７−００００５２号公報
【特許文献５】特表２００７−５０２９９０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Argiris A, Karamouzis MV, Raben D, Ferris RL. Head and neck cancer. Lancet. 2008; 371(9625): 1695-1709.
【非特許文献２】Marur S, Forastiere AA.  Head and neck cancer: changing epidemiology, diagnosis, and treatment. Mayo Clin Proc. 2008; 83(4): 489-501.
【非特許文献３】Marsh S. Cancer pharmacogenetics. Methods Mol Biol. 2008; 448: 437-46.
【非特許文献４】Lothaire P, de Azambuja E, DequanterD, Lalami Y, Sotiriou C, Andry G, Castro G Jr, Awada A. Molecular markers of head and neck squamous cell carcinoma: promising signs in need of prospective evaluation. Head Neck. 2006; 28(3): 256-69.
【非特許文献５】Hashibe M, Brennan P, Benhamou S, Castellsague X, Chen C, CuradoMP, Dal Maso L, Daudt AW, Fabianova E, Fernandez L, Wunsch-Filho V, FranceschiS, Hayes RB, Herrero R, KoifmanS, La Vecchia C, Lazarus P, Levi F, Mates D, Matos E, Menezes A, Muscat J, Eluf-NetoJ, Olshan AF, Rudnai P, Schwartz SM, Smith E, Sturgis EM, Szeszenia-DabrowskaN, Talamini R, Wei Q, Winn DM, ZaridzeD,ZatonskiW, Zhang ZF, BerthillerJ, BoffettaP. Alcohol drinking in never users of tobacco, cigarette smoking in never drinkers, and the risk of head and neck cancer: pooled analysis in the International Head and Neck Cancer Epidemiology Consortium. J Natl Cancer Inst. 2007 ; 99(10):777-89. Erratum in: J Natl Cancer Inst. 2008; 100(3): 225.
【非特許文献６】Hoogsteen IJ, Marres HA, BussinkJ, van der Kogel AJ, Kaanders JH. Tumor microenvironment in head and neck squamous cell carcinomas: predictive value and clinical relevance of hypoxic markers. Head Neck. 2007; 29(6): 591-604.
【非特許文献７】Barbarotto E, Schmittgen TD, CalinGA. microRNAs and cancer:profile, profile, profile. Int J Cancer. 2008; 122(5):969-977.
【非特許文献８】Zeng Y, Yi R, Cullen BR. miRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms. Proc Nat Acad Sci2003; 100: 9779-9784.
【非特許文献９】Tran N, McLean T, Zhang X, Zhao CJ, Thomson JM, O'Brien C, Rose B.  microRNA expression profiles in head and neck cancer cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 358: 12-17.
【非特許文献１０】Jiang J, Lee EJ, GusevY, Schmittgen TD. Real-time expression profiling of microRNA precursors in human cancer cell lines. Nucleic Acids Res. 2005; 28: 5394-5403.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、特定のマイクロＲＮＡを頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法、頭頸部腫瘍の判定方法、頭頸部腫瘍の判定キット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前述したように、頭頸部腫瘍に関するマイクロＲＮＡの報告として、腫瘍細胞株を用いたものは散見されるが、患者臨床検体を用いての報告は現在まで行われていない。腫瘍細胞株は、臨床検体のように組織を構成せず、また、他の組織からの生体分子の影響を受けない等の理由のため、腫瘍細胞株における遺伝子等の発現プロファイルは、その細胞株に対応する腫瘍細胞の臨床検体における発現プロファイルとは異なることが知られている。したがって、細胞株の発現プロファイルから、臨床検体の発現プロファイルを予測することは基本的に不可能である。このような状況下で、本発明者らは、喉頭腫瘍組織のマイクロＲＮＡと喉頭正常組織のマイクロＲＮＡとを対比し、特定のマイクロＲＮＡが喉頭腫瘍組織において異常発現していることを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは、頭頸部腫瘍の１種である喉頭がんの患者（喉頭がん被検体）のがん摘出手術前及び手術から３０日経過後の血液サンプルを採取し、その血液サンプル中の特定のマイクロＲＮＡの濃度を計測した。その結果、頭頸部腫瘍組織においてコントロールと比較して発現が増加しているマイクロＲＮＡのうち、特定のマイクロＲＮＡは、がん摘出手術前の血中濃度と比較して、かかる手術から３０日経過後の血中濃度が約１２０分の１に低下していることも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡを頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法や、（２）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（３）頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法に関する。
【００１２】
また本発明は、（４）以下の工程を備えたことを特徴とする頭頸部腫瘍の判定方法：（Ａ）頭頸部の検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375から選択される１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の正常組織又は被検体と同種の正常被検体の血液におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：や、（５）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（４）に記載の頭頸部腫瘍の判定方法や、（６）抽出したＲＮＡ中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に頭頸部腫瘍であると評価することを特徴とする上記（４）又は（５）に記載の頭頸部腫瘍の判定方法や、（７）抽出したＲＮＡ中の、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に頭頸部腫瘍であると評価することを特徴とする上記（４）又は（５）に記載の頭頸部腫瘍の判定方法や、（８）頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする上記（４）〜（７）のいずれかに記載の頭頸部腫瘍の判定方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、（９）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを頭頸部腫瘍の判定に使用する方法や、（１０）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを、頭頸部腫瘍の判定に使用する方法や、（１１）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（９）又は（１０）に記載の方法や、（１２）頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法に関する。
【００１４】
さらにまた本発明は、（１３）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいることを特徴とする頭頸部腫瘍の判定キットや、（１４）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えたことを特徴とする頭頸部腫瘍の判定キットや、（１５）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（１３）又は（１４）に記載の判定キットや、（１６）頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の判定キットに関する。
【００１５】
またさらに本発明は、（１７）以下の工程を含むことを特徴とする頭頸部腫瘍治療薬のスクリーニング方法：（Ａ）頭頸部腫瘍に罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：（Ｂ）前記非ヒト動物における頭頸部腫瘍組織中又は血液中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：や、（１８）miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（１７）に記載のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の頭頸部腫瘍の判定方法や、頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法によると、迅速かつ正確に頭頸部腫瘍を判定することができる。また、本発明の頭頸部腫瘍の判定キットや、頭頸部腫瘍の判定に使用する方法によると、頭頸部腫瘍であるかどうかを迅速かつ正確に判定することができる。さらに、本発明の頭頸部腫瘍治療薬のスクリーニング方法によると、頭頸部腫瘍治療薬を効率的にスクリーニングすることができる。特に、被検体が頭頸部腫瘍に罹患している場合に、被検体の血液中の濃度も変化するマイクロＲＮＡ（例えばmiR-196aなど）の場合は、採取が極めて容易な血液サンプルを利用することができるため、頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法や、頭頸部腫瘍の判定方法等における迅速性や簡便性が特に優れている。なお、本件マイクロＲＮＡ等についてさらに研究が進めば、頭頸部腫瘍の発症・進展・予後予測や治療が可能となることで、現在の頭頸部腫瘍臨床のさまざまな問題点を解決する突破口となることが期待できる。また、マイクロＲＮＡの発現は組織特異的であることが知られており、頭頸部原発不明癌の原発部位の特定にも有用となる可能性がある。さらに治療に際しては、薬剤や放射線治療への抵抗性が診断できれば、患者個人ごとに有効な治療法を選択する個別化治療にまで発展させ得る可能性を含んでいる。正確な診断や予後の予測は、余計な検査や患者の必要以上の通院を減らすことが期待でき、医療経済効果も大きいと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マイクロＲＮＡの発現プロファイル解析のサンプルの概要をまとめた図である。
【図２】サンプル由来のトータルＲＮＡについて行なった、ＵＶを用いた品質検査の結果を示す図である。
【図３】サンプル由来のトータルＲＮＡについて行なった、Bio-Analyzer RNA6000を用いた品質検査の結果を示す図である。
【図４】喉頭がん組織等の喉頭腫瘍組織で発現が増加するマイクロＲＮＡ（miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31）の、各サンプルにおけるそれらのマイクロＲＮＡの相対的発現量を示す図である。
【図５】喉頭がん組織等の喉頭腫瘍組織で発現が低下するマイクロＲＮＡ（miR-133b、miR-145、miR-375）の、各サンプルにおけるそれらのマイクロＲＮＡの相対的発現量を示す図である。
【図６】喉頭の正常組織あるいは腫瘍組織における、miR-34の相対的発現量を示す図である。
【図７】喉頭の正常組織あるいは腫瘍組織における、let-7 familyの相対的発現量を示す図である。
【図８】喉頭の正常組織あるいは腫瘍組織における、miR-17-92 clusterの相対的発現量を示す図である。
【図９】喉頭の正常組織あるいは腫瘍組織における、miR-15及びmiR-16の相対的発現量を示す図である。
【図１０】喉頭がん組織等におけるmiR-455-5pの相対的発現量を示す図である。各患者の左の棒グラフが非癌部の結果を表し、右の棒グラフが喉頭癌の結果を表す。
【図１１】喉頭がん組織等におけるmiR-130b*の相対的発現量を示す図である。各患者の左の棒グラフが非癌部の結果を表し、右の棒グラフが喉頭癌の結果を表す。
【図１２】喉頭がん組織等におけるmiR-196aの相対的発現量を示す図である。各患者の左の棒グラフが非癌部の結果を表し、右の棒グラフが喉頭癌の結果を表す。
【図１３】喉頭がん組織等におけるmiR-133bの相対的発現量を示す図である。各患者の左の棒グラフが非癌部の結果を表し、右の棒グラフが喉頭癌の結果を表す。
【図１４】喉頭がん組織等におけるmiR-375の相対的発現量を示す図である。各患者の左の棒グラフが非癌部の結果を表し、右の棒グラフが喉頭癌の結果を表す。
【図１５】ヒト扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞等におけるmiR-455-5pの相対的発現量を示す図である。
【図１６】ヒト扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞等におけるmiR-130b*の相対的発現量を示す図である。
【図１７】ヒト扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞等におけるmiR-196aの相対的発現量を示す図である。
【図１８】ヒト扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞等におけるmiR-133bの相対的発現量を示す図である。
【図１９】ヒト扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞等におけるmiR-375の相対的発現量を示す図である。
【図２０】良性疾患、前がん病変、がんにおけるmiR-455-5pの相対的発現量の平均値を示す図である。
【図２１】良性疾患、前がん病変、がんにおけるmiR-196aの相対的発現量の平均値を示す図である。
【図２２】良性疾患、前がん病変、がんにおけるmiR-133bの相対的発現量の平均値を示す図である。
【図２３】進行性の喉頭がん患者の喉頭全摘出術前及び手術から３０日経過後の血液中における、miR-196aの相対濃度を示す図である。図中の相対濃度の数値は、喉頭全摘出術から３０日経過後の血液中におけるmiR-196a濃度を１として表した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法としては、miR-455-3p（マイクロＲＮＡ-455-3p）、miR-455-5p（マイクロＲＮＡ-455-5p）、miR-130b（マイクロＲＮＡ-130b）、miR-130b*（マイクロＲＮＡ-130b*）、miR-801（マイクロＲＮＡ-801）、miR-196a（マイクロＲＮＡ-196a）、miR-21（マイクロＲＮＡ-21）、miR-31（マイクロＲＮＡ-31）、miR-133b（マイクロＲＮＡ-133b）、miR-145（マイクロＲＮＡ-145）及びmiR-375（マイクロＲＮＡ-375）からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡ（以下、「本件マイクロＲＮＡ」ともいう。）を、喉頭がん等の頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法である限り特に制限はされず、具体的には、本発明の頭頸部腫瘍の判定方法や、本発明の頭頸部腫瘍の判定に使用する方法や、本発明の頭頸部腫瘍治療薬のスクリーニング方法を例示することができる。
【００１９】
上記の頭頸部腫瘍における腫瘍の種類としては、頭頸部がん（初発又は再発）、頭頸部異形成、頭頸部ポリープ、扁平上皮がんを例示することができ、頭頸部がん（初発又は再発）、頭頸部異形成、扁平上皮がんを好適に例示することができ、頭頸部がん（初発又は再発）、扁平上皮がんをより好適に例示することができ、初発の頭頸部がん、初発の扁平上皮がんをさらに好適に例示することができる。また、本明細書中の頭頸部腫瘍における頭頸部としては、口唇・口腔、鼻・副鼻腔、唾液腺、耳・側頭骨、頭蓋底等の頭部や、咽頭、喉頭、食道、甲状腺等の頸部を挙げることができるが、頸部を好適に例示することができ、中でも喉頭をより好適に例示することができる。頭頸部の腫瘍は、多くの場合、喉頭がん同様その組織型が扁平上皮細胞由来と考えられるため、本件マイクロＲＮＡは、喉頭がん以外の頭頸部腫瘍についても、そのバイオマーカーとして使用することができる。実際、後述の実施例にも記載されているように、本件マイクロＲＮＡは、口腔部のがんである扁平上皮がんのバイオマーカーとして使用することができる。
【００２０】
本件マイクロＲＮＡの由来となる生物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。ヒト由来の本件マイクロＲＮＡであるmiR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375の各ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１〜１１に示される。マイクロＲＮＡの配列は特に哺乳動物間では保存性が高く、上記の本件マイクロＲＮＡはヒト以外の哺乳動物においてもヒトと同様の発現プロファイルを示すと考えられる。なお、例えばマウス由来の本件マイクロＲＮＡであるmmu miR-455-3p、mmu miR-130b*、mmu miR-801、mmu miR-196a及びmmu miR-31の各ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３２〜３６に示される。
【００２１】
また、本件マイクロＲＮＡには、配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡが便宜上含まれる。上記の「１若しくは２個以上」としては、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましく、１〜２個が特に好ましく、１個がさらに好ましい。なお、上記の欠失等されたヌクレオチド配列からなるＲＮＡが、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するかどうかは、例えば後述のマイクロアレイ法や定量ＰＣＲ法により容易に確認することができる。なお、ヒト以外の上記の各生物からの本件マイクロＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている情報に基づいて確認又は特定することができる。また、上記の頭頸部腫瘍被検体とは、頭頸部腫瘍に罹患した被検体を意味する。本明細書における「被検体」としては、対象となるヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。
【００２２】
本発明の頭頸部腫瘍の判定方法としては、（Ａ）頭頸部の検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、本件マイクロＲＮＡ量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の正常組織又は正常被検体の血液におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を備えている限り特に制限されないが、抽出したＲＮＡ中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に喉頭がん等の頭頸部腫瘍であると評価し、及び／又は、抽出したＲＮＡ中の、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に喉頭がん等の頭頸部腫瘍であると評価する方法を好適に例示することができる。なお、上記工程（Ａ）において頭頸部の検体組織を用いた場合は、上記工程（Ｃ）におけるコントロールとして、検体組織と同種の正常組織を用い、上記工程（Ａ）において被検体の血液を用いた場合は、上記工程（Ｃ）におけるコントロールとして、被検体と同種の正常被検体の血液を用いる。また、本明細書におけるマイクロＲＮＡの発現量としては、サンプル間のばらつきを補正するために適切な内部標準遺伝子で補正した相対発現量を用いることがより正確な判定を行なう観点から好ましい。内部標準遺伝子としては特に制限されないが、ＲＮＵ４８、ＲＮＵ６ｂ、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、及び、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）からなる群から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を例示することができ、中でも、後述の実施例４以降のマイクロＲＮＡの発現解析で内部標準遺伝子として用いたＲＮＵ４８及び／又はＲＮＵ６ｂをより好適に例示することができる。
【００２３】
上記（Ａ）工程におけるＲＮＡを抽出する方法としては、頭頸部の検体組織中又は被検体の血液中から、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡを抽出する方法である限り特に制限されず、例えば、mirVana miRNA Isolation Kit（Applied Biosystems社製）を添付のプロトコールにしたがって用いることによって、マイクロＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出する方法を好適に例示することができる。上記の頭頸部の検体組織としては、頭頸部腫瘍の判定の対象となる生物由来の頭頸部の組織である限り特に制限されず、上記生物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。
【００２４】
上記（Ｂ）工程における本件マイクロＲＮＡの発現量を測定する方法としては、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡ中の本件マイクロＲＮＡ量を同定し得る方法である限り特に制限されず、例えば本発明の喉頭がん等の頭頸部腫瘍の判定キット、すなわち、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいる頭頸部腫瘍の判定キットや、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを備えた頭頸部腫瘍の判定キットや、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えた頭頸部腫瘍の判定キットを用いる方法や；本発明の喉頭がん等の頭頸部腫瘍の判定に使用する方法、すなわち、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを頭頸部腫瘍の判定に使用するマイクロアレイ法や、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを頭頸部腫瘍の判定に使用する定量ＰＣＲ法や、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを、頭頸部腫瘍の判定に使用する定量ＰＣＲ法（蛍光プローブ法）；を好適に例示することができる。
【００２５】
上記のマイクロアレイ法としては、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することが可能である限り特に制限されないが、組織から抽出したＲＮＡをラベル（好ましくは蛍光ラベル）で標識し、そのＲＮＡを、同定対象とするマイクロＲＮＡに相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）又はその一部からなるプローブが固定されたマイクロアレイに接触させてハイブリダイゼーションを行った後、マイクロアレイを洗浄して、マイクロアレイ上に残ったマイクロＲＮＡの発現量を測定する方法を例示することができる。
【００２６】
上記の核酸配列のヌクレオチドの種類としては、本発明における所定のマイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されないが、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。また、上記のポリヌクレオチドの一部の長さとしては、本発明における所定のマイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されないが、ハイブリダイゼーションの安定性を確保する観点から、１０〜１００ｍｅｒであることが好ましく、１０〜４０ｍｅｒであることがより好ましい。なお、上記のポリヌクレオチド又はその一部は、当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。
【００２７】
上記のポリヌクレオチド又はその一部を固定するアレイとしては特に制限されないが、ガラス基板やシリコン基板等を好適に例示することができ、ガラス基板をより好適に例示することができる。上記のポリヌクレオチド又はその一部をアレイに固定する方法としては特に制限されず、公知の方法を用いることができる。
【００２８】
また、本発明のマイクロアレイを含んでいる頭頸部腫瘍の判定キットには、前述のマイクロアレイの他に、例えばＲＮＡのラベル化反応に用いる試薬、ハイブリダイゼーション反応に用いる試薬、洗浄に用いる試薬、組織からのＲＮＡ抽出に用いる試薬等の、マイクロアレイ法に用いる試薬などの任意の要素をさらに含んでいてもよい。
【００２９】
そして、マイクロアレイ法としては、Agilent Human miRNAV2 (Agilent Technologies社製)をAgilent Technologies社のmiRNA Microarray protocol Version 1.5に記載の方法に従って用い、DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies社製)でマイクロＲＮＡの発現量を測定する方法をより具体的に例示することができる。上記のポリヌクレオチド又はその一部からなるプローブが固定されたマイクロアレイは、測定対象とする本件マイクロＲＮＡの配列情報に基づいてポリヌクレオチドを合成し、それを市販のアレイに固定するなどして作製することができる。
【００３０】
上記の定量ＰＣＲ法としては、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを用いる方法であり、かつ、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することが可能である限り特に制限されず、アガロース電気泳動法、ＳＹＢＲグリーン法、蛍光プローブ法等の通常の定量ＰＣＲ法を用いることができるが、定量の精度や信頼性の点で、蛍光プローブ法が最も好ましい。
【００３１】
定量ＰＣＲ法におけるプライマーセットとは、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマー（ポリヌクレオチド）の組合せを意味する。上記プライマーとしては、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得る限り特に制限されないが、本発明における所定のマイクロＲＮＡの配列の５’側の一部の配列からなるプライマー（フォワードプライマー）と、そのマイクロＲＮＡの配列の３’側の一部の配列に相補的な配列からなるプライマー（リバースプライマー）とからなるプライマーセットを例示することができる。ここで、５’側とは、成熟型マイクロＲＮＡの配列において比較した場合に、リバースプライマーに対応する配列よりも、５’側であることを意味し、３’側とは、成熟型マイクロＲＮＡの配列において比較した場合に、フォワードプライマーに対応する配列よりも、３’側であることを意味する。
【００３２】
マイクロＲＮＡの５’側の配列として、好ましくは、そのマイクロＲＮＡの配列の中央の核酸よりも５’側の配列を例示することができ、マイクロＲＮＡの３’側の配列として、好ましくは、そのマイクロＲＮＡの配列の中央の核酸よりも３’側の配列を例示することができる。また、それぞれのプライマーの長さとしては、マイクロＲＮＡを増幅し得る限り特に制限されないが、７〜１０ｍｅｒのポリヌクレオチドであることが好ましい。なお、上記プライマーであるポリヌクレオチドのヌクレオチドの種類としては、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。
【００３３】
上記の蛍光プローブとしては、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含んでいる限り特に制限されず、TaqMan（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものも含む）や、サイクリングプローブ法に用いうる蛍光プローブを好適に例示することができ、特にTaqMan（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものも含む）に用いうる蛍光プローブをより好適に例示することができる。TaqMan（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものを除く）や、サイクリングプローブ法に用いうる蛍光プローブとしては、５’側に蛍光色素を標識し、３’側に消光物質を標識した蛍光プローブを例示することができ、特に好ましいプローブとして、Applied Biosystems社製のPart Number 4378098（miR-455-5p用）、4395225（miR-130b*用）、4373104（miR-196a用）、4373172（miR-133b用）、4373027（miR-375用）等のプローブを例示することができ、ＦＲＥＴ原理を利用した蛍光プローブとしては、５’側と３’側に、それぞれドナー色素とアクセプター色素を標識した蛍光プローブを例示することができる。上記の蛍光色素、消光物質、ドナー色素、アクセプター色素等は、市販のものを適宜使用することができる。
【００３４】
上記の蛍光プローブにおける核酸配列のヌクレオチドの種類としては、本件マイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り、特に制限されないが、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。また、上記のポリヌクレオチドの一部の長さとしては、本発明における所定のマイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り、特に制限されないが、ハイブリダイゼーションの安定性を確保する観点から、１０ｍｅｒ以上であることが好ましく、１５ｍｅｒ以上であることがより好ましく、対象とするマイクロＲＮＡの全長のヌクレオチド数から１〜３ｍｅｒ少ないヌクレオチド数であることがさらに好ましい。
【００３５】
上記プライマーセットや、上記の蛍光プローブは、その配列情報に基づき当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。上記のプライマーセットや蛍光プローブを用いた定量ＰＣＲの具体的な方法としては、TaqMan（登録商標）マイクロＲＮＡ Assays（Applied Biosystems社製）を、添付のプロトコールにしたがって使用する方法を好適に例示することができる。また、プライマーセットと蛍光プローブとを備えた本発明の頭頸部腫瘍の判定キットには、前述のプライマーセットの他に、例えばポリメラーゼ等の定量ＰＣＲ反応に用いる試薬などの任意の要素をさらに含んでいてもよい。
【００３６】
上記（Ｃ）工程のコントロールとしての、検体組織と同種の正常組織（例えば検体組織が喉頭組織である場合は、正常な喉頭組織）におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する方法におけるコントロールとしては、より正確な評価が可能となることから、検体組織と同一個体の組織（正常部位）であることが好ましい。なお、コントロールとしての検体組織と同種の正常組織又は被検体と同種の正常被検体の血液は、検体組織又は被検体の血液を採取する際にかならずしも採取する必要はなく、正常組織中又は正常被検体の血液中の本件マイクロＲＮＡの発現量についてあらかじめ検量線を作成し、それとの比較・評価を行なってもよい。
【００３７】
このように検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡに含まれるマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、その検体組織又はその被検体が頭頸部腫瘍であるかどうかを判定することができる。前記のように、本件マイクロＲＮＡのうち、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31ついては、コントロールと比較してその発現量が増加している場合に頭頸部腫瘍であると判定することができ、miR-133b、miR-145及びmiR-375については、コントロールと比較してその発現量が低下している場合に頭頸部腫瘍であると判定することができる。
【００３８】
本件マイクロＲＮＡの中でも、miR-130b*、miR-196aは、正常組織又は正常被検体の血液における発現がほとんど見られないため、頭頸部腫瘍であるかどうかをより正確に判定することが可能である点で好ましい。また、２種類以上の本件マイクロＲＮＡの発現量を測定してコントロールと比較・評価することにより、喉頭がん等の頭頸部腫瘍であるかどうかをより正確に判定することが可能となる点で好ましい。また、本件マイクロＲＮＡの中でも、被検体が頭頸部腫瘍に罹患している場合に、被検体の血液中の濃度も変化するマイクロＲＮＡ（例えばmiR-196aなど）は、採取が極めて容易な血液サンプルを利用することができるため、頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法や、頭頸部腫瘍の判定方法等における迅速性や簡便性が特に優れている点で、極めて好ましい。また、本件マイクロＲＮＡのうち、miR-455-5pは、高度異形成において、中程度異形成の２倍以上高発現しており、miR-801及びmiR-196aは、高度異形成において、中程度異形成の半分以下の低発現している。
【００３９】
頭頸部腫瘍であると判定する場合の本件マイクロＲＮＡの発現量の増加の程度としては、例えば、コントロールに対する割合として好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは１００％以上の増加であることを挙げることができ、頭頸部腫瘍であると判定する場合の本件マイクロＲＮＡの発現量の低下の程度としては、例えば、コントロールに対する割合として好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７５％以上の低下であることを挙げることができる。
【００４０】
また、本発明の頭頸部腫瘍の判定方法は、上記（Ａ）〜（Ｃ）工程に加えて、さらに（Ｄ）抽出したＲＮＡ中のlet-7 family、miR-17-92 cluster、miR-15、及びmiR-16からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定し、コントロールとしての、検体組織と同種の正常組織又は被検体と同種の正常被検体の血液における前記マイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を含むことができる。上記let-7 familyとしては、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7iを好適に例示することができ、上記miR-17-92 clusterとしては、miR-17、miR-18a、miR-18b、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-20b、miR-92a、miR-92bを好適に例示することができ、上記miR-15としては、miR-15a、miR-15bを好適に例示することができる。ヒト由来の上記各マイクロＲＮＡ（let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-17、miR-18a、miR-18b、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-20b、miR-92a、miR-92b、miR-15a、miR-15b、miR-16）としては、それぞれ配列番号１２〜３１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡを特に好適に例示することができる。
【００４１】
この（Ｄ）工程における各マイクロＲＮＡ（let-7 family、miR-17-92 cluster、miR-15、及びmiR-16）は、頭頸部腫瘍以外の腫瘍において異常発現が認められるため、（Ｂ）工程の同定・評価の結果、検体組織又は被検体が頭頸部腫瘍であると判定された場合に、さらに（Ｄ）工程におけるマイクロＲＮＡの異常発現が認められるときは、頭頸部腫瘍以外の腫瘍巣が存在すると判定することができる。なお、マイクロＲＮＡlet-7 familyは肺腫瘍組織で、miR-15及びmiR-16は慢性リンパ性白血病あるいは膵臓腫瘍組織で発現が減少することが知られており、miR-17-92 clusterはＢ細胞リンパ腫あるいは肺腫瘍組織で発現が増加することが知られている。
【００４２】
本発明の頭頸部腫瘍治療薬のスクリーニング方法としては、（ａ）頭頸部腫瘍に罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：（ｂ）前記非ヒト動物における頭頸部腫瘍組織中又は血液中の、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：（ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を含んでいる限り特に制限されず、上記非ヒト動物の種類としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物を好適に例示することができ、中でもマウス、ラットをより好適に例示することができる。また、頭頸部腫瘍に罹患した非ヒト動物としては、頭頸部腫瘍を自然に罹患した非ヒト動物であってもよいし、発がん物質で頭頸部腫瘍を誘導した非ヒト動物であってもよい。
【００４３】
上記（ｂ）工程における本件マイクロＲＮＡの発現量を測定する方法としては、前述の本件マイクロＲＮＡの発現量を測定する方法を用いればよく、また、上記（ｃ）工程において比較・評価する方法としては、本件マイクロＲＮＡのうち、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31については、コントロールと比較して低下している場合に、その被検物質が頭頸部腫瘍治療薬である可能性が高いと判定することができ、miR-133b、miR-145及びmiR-375については、コントロールと比較して増加している場合に、その被検物質が頭頸部腫瘍治療薬である可能性が高いと判定することができる。マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡに結合するなどして、その遺伝子の発現を抑制するなどの性質が報告されているため、頭頸部腫瘍組織又は血液中における上記マイクロＲＮＡの異常発現を正常化方向にシフトさせるような被検物質は、頭頸部腫瘍治療薬として用いうる可能性が高いと考えられる。
【００４４】
なお、（ｃ）工程に代えて、（ｄ）コントロールとしての、腫瘍組織と同種の正常組織又は被検体と同種の正常被検体の血液におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程を採用することができる。（ｄ）工程において比較・評価する方法としては、本件マイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して有意差がない場合に、その被検物質が頭頸部腫瘍治療薬である可能性が高いと判定することができる。
【００４５】
本件マイクロＲＮＡの中でも、miR-130b*、miR-196aは、正常組織又は正常被検体の血液における発現がほとんど見られないため、頭頸部腫瘍治療薬である可能性をより正確に判定することが可能である点で好ましい。また、上述のマイクロＲＮＡを２種類以上、頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして併用すると、頭頸部腫瘍治療薬である可能性をより正確に判定することが可能となる点で好ましい。また、本件マイクロＲＮＡの中でも、被検体が頭頸部腫瘍に罹患している場合に、被検体の血液中の濃度も変化するマイクロＲＮＡ（例えばmiR-196aなど）は、採取が極めて容易な血液サンプルを利用することができるため、頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法や、頭頸部腫瘍の判定方法等における迅速性や簡便性が特に優れている点で、極めて好ましい。
【００４６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
［サンプル組織の採取１］
慶應義塾大学医学部ならびに佐野厚生総合病院の倫理委員会の承認のもと、慶應義塾大学病院又は佐野厚生総合病院の耳鼻咽喉科外来を受診した患者を選定し、サンプル提供の依頼対象者とした。その上で、その対象者からインフォームド・コンセントを得た後、６人の各対象者から、８種類のサンプル組織（図１の“sample ID 1-8”）を採取した。なお、sample ID 1と6は、同一患者であり、sample ID 2と7は、同一患者である。これら８種類のサンプル組織における組織の種類（図１の“tissues”の項目）としては、喉頭（larynx）、声帯（vocal cord）の２種類であり、組織の状態（図１の“cancer”の項目）としては、正常（normal）、ポリープ（polyp）、中程度異形成（moderate dysplasia）、高度異形成（severe dysplasia）、がん（cancer）の５種類であり、また、がんの種類としては、cancer 1-2は初発（incipient）のがん、cancer 3は再発がん（recurrence；rec）の２種類であった。
【００４８】
採取したこれらの組織のそれぞれの一部を、RNAlater（登録商標）（Applied Biosystems社製）が分注されたチューブに入れて冷凍保存し、組織内のＲＮＡを安定化した。なお、各サンプルの組織の状態（がん、異形成、ポリープ、正常等）は、採取した組織の他の一部について病理学検査を実施し、確定診断を行った。
【実施例２】
【００４９】
［サンプル組織からのＲＮＡの抽出及びその質的評価１］
後述のマイクロアレイに用いるため、実施例１で冷凍保存した各組織からＲＮＡを抽出した。具体的には、mirVana miRNAIsolation Kit（Applied Biosystems社製）を添付のプロトコールにしたがって用いて、前述の各組織から、マイクロＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出した。
【００５０】
次に、後述のマイクロアレイで十分な精度が得られることを確認するために、抽出したＲＮＡの質的評価を行った。具体的には、得られたＲＮＡの濃度を蒸留水にて約３０ｎｇ／μＬに調整し、分光光度計にてＯＤ２６０／２８０（ＯＤ２６０の計測値をＯＤ２８０の計測値で割った数値）等を計測及び算出した。その結果を図２に示す。図２に示されているように、ＯＤ２６０／２８０はいずれも約１．７〜２．０の範囲内に入っており、タンパク質やフェノールの混入の少ない、質の良いＲＮＡであることが分かった。また、抽出したトータルＲＮＡのＲＩＮ（RNA Integrity Number）を、Bio-Analyzer RNA6000（Agilent Technologies社製）にて計測し、ＲＮＡの分解の程度を調べた。その結果を図３に示す。図３に示されているように、各サンプルのＲＩＮは十分に高いレベルを保持しており、質の良いＲＮＡであることが分かった。
【実施例３】
【００５１】
［各組織におけるマイクロＲＮＡの発現解析１］
Agilent Human miRNA V2 (Agilent Technologies社製)を用いて、ヒトのマイクロＲＮＡ７２３種につき網羅的解析を行った。前述のAgilent Human miRNA V2のマイクロアレイは、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375用のプローブとして、それぞれ配列番号１〜１１に示されるヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ配列を有している。解析の方法は、Agilent Technologies社のmiRNA Microarray protocol Version 1.5に記載の方法にしたがった。具体的には、以下のような方法で解析を行った。なお、試薬の量は１サンプル用の分量で記載する。
【００５２】
まず、実施例２で得られたトータルＲＮＡを約２５ｎｇ／μＬになるように、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、その希釈液のＲＮＡ濃度を測定した。次に、１０×ＣＩＰ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）０．７μＬと、１６Ｕ／μＬのＣＩＰ（ＧＥヘルスケア社製）０．７μＬを混合して得られたＣＩＰマスターミックス１．４μＬを調製した。前述のＲＮＡ希釈液から、トータルＲＮＡ量が１００ｎｇとなる量を１．５ｍＬチューブに分取し、前述のＣＩＰマスターミックス１．４μＬを添加し、さらにＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水で７μＬにメスアップした。この後、３７℃で３０分間インキュベーションして、トータルＲＮＡの脱リン酸化反応を行った。
【００５３】
脱リン酸化反応したサンプル溶液にＤＭＳＯ（Sigma社製）を５μＬ添加して混合し、１００℃で約５分間インキュベートしてトータルＲＮＡの熱変性を行った。その後、直ちに氷水にて２分間冷却した。
【００５４】
次に、ライゲーションを行なった。具体的には、２μＬの10×T4 RNA Ligase Buffer（ＧＥヘルスケア社製）、２μＬの０．１％ＢＳＡ（ＧＥヘルスケア社製）、１５Ｕ／μＬに調整した１μＬのT4 RNA Ligase（ＧＥヘルスケア社製）、３μＬのCyanine 3-Cytidine（Agilent Technologies社製）を別の１．５ｍＬチューブ中で混合し、ライゲーションマスターミックスを調製した。このライゲーションマスターミックス８μＬを、熱変性を行なった後冷却した前述のサンプルに添加し、１６℃にて２分間インキュベーションした。
【００５５】
次いで、サンプルの精製を行った。具体的には、MicroBioSpin6（BioRad社製）を添付のプロトコールにしたがって利用して、前述のサンプルから、Cyanine 3-Cytidineで蛍光標識したサンプルＲＮＡを精製した。
【００５６】
Agilent Human miRNA V2 (Agilent Technologies社製)オリゴＤＮＡマイクロアレイを用いて前述のサンプルＲＮＡのマイクロＲＮＡプロファイル解析を行った。Agilent Technologies社のプロトコールに従って、５５℃で２０時間以上ＲＮＡサンプルのハイブリダイゼーション反応を行なった。次いで、ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイを、Agilent Technologies社のプロトコールにしたがって、洗浄バッファー１で室温５分間、洗浄バッファー２で３７℃５分間洗浄した。マイクロアレイを洗浄バッファー２から引き上げて、DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies社製)を用いてスキャニングを行なった。
【００５７】
７２３種類のマイクロＲＮＡのうち、正常な喉頭組織（normal 1, 2）と、喉頭腫瘍組織（sample ID 4-8）（特に喉頭がん組織：cancer 1-3）とを比較して、発現量（シグナル強度）に大きな差が見られる複数のマイクロＲＮＡを見出した。各サンプルにおけるそれらのマイクロＲＮＡのシグナル強度を図４及び５に示す。図４には、喉頭がん組織等の喉頭腫瘍組織で発現が増加するマイクロＲＮＡ（miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31）を示し、図５は、喉頭がん組織等の喉頭腫瘍組織で発現が低下するマイクロＲＮＡ（miR-133b、miR-145、miR-375）を示す。これらのマイクロＲＮＡは、喉頭がん組織等の喉頭腫瘍組織において、正常組織とは異なる発現（異常発現）していることから、これらのマイクロＲＮＡは、喉頭がん組織等の喉頭腫瘍組織のマーカーとして用いることができる。
【００５８】
なお、がん化の抑制に関与すると考えられているmiR-34についての発現を、各サンプルについて確認したが、喉頭腫瘍においては特に異常発現は見られなかった（図６）。また、他のがんにおいて異常発現することが知られるlet-7 family（let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i）、miR-17-92 cluster（miR-17、miR-18a、miR-18b、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-20b、miR-92a、miR-92b）、miR-15（miR-15a、miR-15b）及びmiR-16についての発現を各サンプルにて確認したが、喉頭腫瘍においては特に異常発現は見られなかった（図７、図８、図９）。
【実施例４】
【００５９】
［サンプル組織の採取２］
慶應義塾大学医学部ならびに佐野厚生総合病院の倫理委員会の承認のもと、慶應義塾大学病院あるいは佐野厚生総合病院の耳鼻咽喉科外来を受診した患者を選定し、サンプル提供の依頼対象者とした。その上で、その対象者からインフォームド・コンセントを得た後、６人の各対象者（患者１〜６）から、喉頭がん組織（喉頭癌）と、その隣接部であって病理学的に非がん部と認められた組織（非癌部）とをそれぞれ採取し、１２種類のサンプル組織を入手した。
【００６０】
採取したこれらの組織のそれぞれの一部を、RNAlater（登録商標）（Applied Biosystems社製）が分注されたチューブに入れて冷凍保存し、組織内のＲＮＡを安定化した。なお、各サンプルの組織の状態（がん、正常等）は、採取した組織の他の一部について病理学検査を実施し、確定診断を行った。
【実施例５】
【００６１】
［サンプル組織からのＲＮＡの抽出及びその質的評価２］
後述のリアルタイムＰＣＲに用いるため、実施例４で冷凍保存した各組織からＲＮＡを抽出した。具体的には、mirVana miRNAIsolation Kit（Applied Biosystems社製）を添付のプロトコールにしたがって用いて、前述の各組織から、マイクロＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出した。
【００６２】
次に、後述のリアルタイムＰＣＲで十分な精度が得られることを確認するために、抽出したＲＮＡの質的評価を行った。抽出したＲＮＡのＯＤ２６０／２８０やＲＩＮ（RNA Integrity Number）の値から、それらのＲＮＡが十分に質の良いＲＮＡであることを確認した。
【実施例６】
【００６３】
［各組織におけるマイクロＲＮＡの発現解析２］
前述の実施例５で抽出した各ＲＮＡ及びTaqMan（登録商標）MicroRNA Assays（AppliedBiosystems社製）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法により、miR-455-5p、miR-196a、miR-130b*、miR-133b、miR-375の発現量の定量を行なった。定量の方法は、添付のプロトコールに記載の方法にしたがった。患者１〜２、４、６由来のサンプルについてmiR-455-5pを定量した結果を図１０に、患者１、４〜６由来のサンプルについてmiR-130b*を定量した結果を図１１に、患者１〜６由来のサンプルについてmiR-196aを定量した結果を図１２に、患者１〜５由来のサンプルについてmiR-133bを定量した結果を図１３に、患者１〜２、４、６由来のサンプルについてmiR-375を定量した結果を図１４にそれぞれ示す。図１０〜１２に示されるように、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196aについてはそれぞれ、非癌部における発現と比較して喉頭がん組織における発現の増加が確認でき、図１３〜１４に示されるように、miR-133b、miR-375についてはそれぞれ、非癌部における発現と比較して喉頭がん組織における発現の低下が確認できた。
【実施例７】
【００６４】
［ヒト扁平上皮がん細胞からのＲＮＡの抽出及びその質的評価］
本発明におけるマイクロＲＮＡが、喉頭がん以外の頭頸部腫瘍のバイオマーカーとしても用い得ることを実証するために、ヒト扁平上皮がん細胞株（ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＳＡＳ、ＣＡ９２２）の各細胞からトータルＲＮＡを抽出した。具体的には、mirVana miRNA Isolation Kit（Applied Biosystems社製）を添付のプロトコールにしたがって用いて、前述の各細胞から、マイクロＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出した。
【００６５】
次に、後述のリアルタイムＰＣＲで十分な精度が得られることを確認するために、抽出したＲＮＡの質的評価を行った。抽出したＲＮＡのＯＤ２６０／２８０やＲＩＮ（RNA Integrity Number）の値から、それらのＲＮＡが十分に質の良いＲＮＡであることを確認した。
【実施例８】
【００６６】
［ヒト扁平上皮がん細胞におけるマイクロＲＮＡの発現解析］
前述の実施例７で抽出した各ＲＮＡ及びTaqMan（登録商標）MicroRNA Assays（Applied Biosystems社製）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法により、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196a、miR-133b、miR-375の発現量の定量を行なった。定量の方法は、添付のプロトコールに記載の方法にしたがった。リアルタイムＰＣＲに用いたTaqMan probeとしては、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196a、miR-133b、miR-375につき、それぞれPart Number 4378098、4395225、4373104、4373172、4373027のプローブ（Applied Biosystems社製）を用いた。コントロールとして、上記実施例５で抽出した正常組織（normal）のトータルＲＮＡ中のマイクロＲＮＡも同様に定量した。ヒト扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞由来のサンプル及び正常組織細胞由来のサンプルについて、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196a、miR-133b、miR-375の発現量の定量を行なった結果をそれぞれ図１５〜１９に示す。図１５〜１７に示されるように、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196aについてはそれぞれ、非癌部（normal）における発現と比較してヒト扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞における発現の増加が確認でき、図１８〜１９に示されるように、miR-133b、miR-375についてはそれぞれ、非癌部（normal）における発現と比較してヒト扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞における発現の低下が確認できた。
【実施例９】
【００６７】
［各組織におけるマイクロＲＮＡの発現解析３］
前述の実施例４〜６におけるマイクロＲＮＡの発現解析の方法と同様の方法にしたがって、喉頭における良性疾患（benign）（サンプル数１６）、前がん病変（dysplasia) （サンプル数１０）、がん（cancer）（サンプル数１６）の各組織において、miR-455-5p、miR-196a、miR-133bの発現解析を行なった。各サンプルの結果を各組織ごとに平均した結果を、各マイクロＲＮＡごとにそれぞれ図２０（miR-455-5p）、図２１（miR-196a）、２２（miR-133b）に示す。図２０及び２１に示されるように、miR-455-5p、miR-196aではそれぞれ、良性疾患、前がん病変、がんとなるにつれ、発現量が次第に増加する傾向が見られ、図２２に示されるように、miR-133bでは、良性疾患、前がん病変、がんとなるにつれ、発現量が次第に低下する傾向が見られた。また、同様の発現解析の結果、miR-130b*についてはmiR-455-5p、miR-196aと同様の傾向が見られ、miR-375についてはmiR-133bと同様の傾向が見られた。このように、これらのマイクロＲＮＡ（特にmiR-455-5p、miR-196a、miR-133b）は、がんの悪性度に伴って発現量が変化していく傾向が見られたため、頭頸部腫瘍の判定に特に好適に用いることができることが判明した。
【実施例１０】
【００６８】
［喉頭がん患者のがん摘出前後における、血中のマイクロＲＮＡ濃度の測定］
頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用し得る本件マイクロＲＮＡのうち、頭頸部組織サンプルを利用するのではなく、被検体の血液サンプルを利用することによって、頭頸部腫瘍か否かを判定し得るものがあるかどうかを調べるために、以下の測定実験を行なった。
【００６９】
慶應義塾大学医学部の倫理委員会の承認のもと、慶應義塾大学病院を受診した患者を選定し、血液サンプル提供の依頼対象者とした。その上で、その対象者からインフォームド・コンセントを得た後、その患者（被検体）から血液サンプルを採取した。この患者は、進行性の喉頭がん（Ｔ４Ｎ２ｃＭ０）を罹患した６１歳男性であり、頸部リンパ節転移に対して、喉頭全摘出術を行なった。この患者からの血液サンプルの採取は、上記の喉頭全摘出術の直前、及び、上記の喉頭全摘出術から３０日経過後に行なった。
【００７０】
採取した血液サンプルからのＲＮＡの抽出は、mirVana PARIS (Ambion社製)を、添付のプロトコールにしたがって用いて行なった。具体的には、以下の方法により行なった。まず、血液サンプルから得た血清を懸濁し、３００μＬを新しいチューブに分注した後、３００μＬの2xDenaturing solutionを添加して氷上に５分静置した。次いで、６００μＬのAcid-Phenol: Chloroformを添加してボルテックスしてから、室温で５分間、１００００ｇにて遠心し、分離した水相（６５０μＬ）を回収した。回収した溶液に、室温の１００％エタノールを８１２．５μＬ添加し、得られた溶液のうち、まず７００μＬを分取してFilter Cartridge上に分注し、室温で３０秒間、１００００ｇにて遠心して、溶液をFilter Cartridgeの反対側に通過させた。通過させた溶液は廃棄した。先ほど７００μＬ分取した残りの溶液から再度７００μＬを分取して、前述のFilter Cartridge上に分注し、室温で３０秒間、１００００ｇにて遠心して、溶液をFilter Cartridgeの反対側に通過させた。通過させた溶液は廃棄した。Filter Cartridge上に、７００μＬのWash Solution 1を添加し、室温で１５秒間、１００００ｇにて遠心して、Wash Solution 1をFilter Cartridgeの反対側に通過させた。通過させた溶液は廃棄した。次いで、Filter Cartridge上に、５００μＬのWash Solution 2/3を添加し、室温で１５秒間、１００００ｇにて遠心して、Wash Solution 2/3をFilter Cartridgeの反対側に通過させた。通過させた溶液は廃棄した。Filter Cartridge上に、再度５００μＬのWash Solution 2/3を添加し、室温で１５秒間、１００００ｇにて遠心して、Wash Solution 2/3をFilter Cartridgeの反対側に通過させた。通過させた溶液は廃棄した。その後、１分間、１００００ｇにて遠心してから、カラムを新しいチューブに代えた。Filter Cartridge上に、９５℃の脱イオン蒸留水を５０μＬ添加してFilter Cartridgeに吸着したＲＮＡを溶出させた後、室温で３０秒間、１００００ｇにて遠心させてＲＮＡ抽出溶液を得た。得られたＲＮＡ抽出溶液は、−８０℃以下で保存した。
【００７１】
上記のＲＮＡ抽出方法にて、喉頭全摘出術前後の各血液サンプルからＲＮＡ抽出溶液を得た。これらの両ＲＮＡ抽出溶液中のマイクロＲＮＡ濃度を、miR-196a及びmiR-455-5pについて測定した。マイクロＲＮＡ濃度の測定は、TaqMan（登録商標）MicroRNA Assays（Applied Biosystems社製）を用いたリアルタイムＰＣＲ法にて、測定対象であるマイクロＲＮＡ濃度が所定の濃度を超えるまでに要したＰＣＲ反応のサイクル数を計測することによって行なった。その結果、miR-455-5pについては、喉頭全摘出術前の血液サンプル中の濃度と、喉頭全摘出術から３０日経過後の血液サンプル中の濃度とほとんど変化がなかったが、miR-196aについては、図２３に示すように、喉頭全摘出術前の血液サンプル中の濃度（pre-Op）と比較して、喉頭全摘出術から３０日経過後の血液サンプル中の濃度（30 day post-Op）が約１２０分の１に低下していることが分かった。この結果から、本件マイクロＲＮＡの中には、頭頸部腫瘍組織中だけでなく、血液サンプル中の濃度も変化するものがあり、それらのマイクロＲＮＡについては、血液サンプル中の濃度変化を指標とすることによって、頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用し得ることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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