(57)【要約】【課題】本発明は、癌の組織型を判別するのに有用なカクテル抗体及びそれを用いた判別方法の提供を目的とする。  さらには判別キットの提供を目的とする。【解決手段】肺癌の組織型を判別するのに用いるカクテル抗体であって、腺癌の細胞質に局在するＮａｐｓｉｎ−Ａ及びその細胞核に局在するＴＴＦ−１に抗原抗体反応を示すＡＤＣカクテル抗体と、扁平上皮癌の細胞質に局在するＣＫ１４及びその細胞核に局在するｐ６３に抗原抗体反応を示すＳＣＣカクテル抗体とを組み合せたことを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌の組織型を判別するのに用いるカクテル抗体であって、
腺癌の細胞質に局在するＮａｐｓｉｎ−Ａ及びその細胞核に局在するＴＴＦ−１に抗原抗体反応を示すＡＤＣカクテル抗体と、扁平上皮癌の細胞質に局在するＣＫ１４及びその細胞核に局在するｐ６３に抗原抗体反応を示すＳＣＣカクテル抗体とを組み合せたことを特徴とする肺癌の組織型判別用カクテル抗体。
【請求項２】
ＡＤＣカクテル抗体及びＳＣＣカクテル抗体と、それらを用いて免疫組織化学を実施するための試薬をセットにしたことを特徴とする肺非小細胞癌の組織型判別用キット。
【請求項３】
さらに、腺癌判別コントロール及び扁平上皮癌判別コントロールを備えたことを特徴とする請求項２記載の肺非小細胞癌の組織型判別用キット。
【請求項４】
請求項１記載のカクテル抗体を用いた肺非小細胞癌の組織型判別方法であって、ＡＤＣカクテル抗体にて陽性を示した腫瘍を腺癌と判別し、次に、ＳＣＣカクテル抗体にて陽性を示した腫瘍を扁平上皮癌と判別することを特徴とする肺非小細胞癌の組織型判別方法。
【請求項５】
さらに、ＡＤＣカクテル抗体及びＳＣＣカクテル抗体共に陰性であった腫瘍に対して、ＣＫ７を対象に免疫組織化学を実施し、陽性を示した腫瘍を腺癌と判別することを特徴とする請求項４記載の肺非小細胞癌の組織型判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫組織化学的に癌の組織型を判別する方法に関し、特に肺非小細胞癌の組織型を判別するのに効果的なカクテル抗体、それらを利用した肺非小細胞癌の組織型判別方法並びに肺非小細胞癌の組織型判別キットに係る。
【背景技術】
【０００２】
世界では毎年１００万人以上が肺癌で死亡していると推計されている。肺癌は、組織分類上、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ：small cell lung carcinoma）と非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ：non-small cell lung carcinoma）に分けられ、非小細胞肺癌は、腺癌（ＡＤＣ：Adenocarcinoma）、扁平上皮癌（ＳＣＣ：Squamous cell carcinoma）及び未分化な非小細胞肺癌である大細胞癌に分けられる。
肺癌の治療に用いられるペメトレキセドやゲフィチニブが特定の病理組織型によって効果が異なる事が再現性をもって確認されている。
その中で、特に扁平上皮癌と腺癌の分別が重要である事が示された。
また、ペメトレキセドでは、扁平上皮癌患者においてプラセボよりも予後が不良である事が示された。
これを受け、国際会議で扁平上皮癌と腺癌の簡便で高感度および特異性の高い分別方法の必要性が議論された。
一方、免疫組織学化学的に肺癌を鑑別するために、鑑別の第１段階に甲状腺、肺で特異的に発現している転写因子のThyroid transcription factor 1（ＴＴＦ−１）、原発性肺腺癌の特異的マーカーであるＮａｐｓｉｎ−Ａおよび癌抑制蛋白のｐ６３を使い、高悪性度神経内分泌腫瘍、腺癌、扁平上皮癌を鑑別し、第２段階で  サイトケラチン１８（ＣＫ１８）を使用し、高悪性度神経内分泌腫瘍として大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ：large cell neuroendocrine carcinoma）と小細胞癌の鑑別を行うことが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
ケラチンは、上皮細胞骨格タンパクで約２０種類のサブタイプが知られている。
例えば、腫瘍細胞の鑑別にサイトケラチン７（ＣＫ７）とサイトケラチン２０（ＣＫ２０）の染色特性が利用されている。
一方、ＣＫ１８は、もともと腺癌にも扁平上皮癌にも陽性が認められるため、扁平上皮癌のマーカーとしては不適である。
また、ｐ６３は、扁平上皮癌において陽性反応率が１００％ではない。
他方、扁平上皮癌と腺癌の簡便で高感度および特異性の高い分別方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本臨床細胞学会雑誌Vol.47 No.2 Page.146-147 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌の組織型を判別するのに有用なカクテル抗体及びそれを用いた判別方法の提供を目的とする。
さらには判別キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る癌の組織型判別用カクテル抗体は、癌の組織型を判別するのに用いるカクテル抗体であって、各組織型の細胞質に局在する発現因子に抗原抗体反応を示す抗体と、細胞核に局在する発現因子に抗原抗体反応を示す抗体とを組み合せたことを特徴とし、細胞質に局在する腫瘍マーカーに特異的に抗原抗体反応を示す抗体と細胞核に局在する腫瘍マーカーに特異的に抗原抗体反応を示す抗体とを混合することで判別が向上し肺癌の組織型の判別に適した腫瘍マーカーを明らかにした。
【０００７】
具体的に説明すると、肺癌の組織型を判別するのに用いるカクテル抗体であって、腺癌の細胞質に局在するＮａｐｓｉｎ−Ａ及びその細胞核に局在するＴＴＦ−１に抗原抗体反応を示すＡＤＣカクテル抗体と、扁平上皮癌の細胞質に局在するＣＫ１４及びその細胞核に局在するｐ６３に抗原抗体反応を示すＳＣＣカクテル抗体とを組み合せて使用するとよい。
ここで、ＡＤＣカクテル抗体と称したのは、腺癌（ＡＤＣ：Adenocarcinoma）を示すマーカーに有用だからである。
また、ＳＣＣカクテル抗体と称したのは扁平上皮癌（ＳＣＣ：Squamous cell carcinoma）を示すマーカーに有用だからである。
【０００８】
ここで肺非小細胞癌の組織型判別用キットとして、ＡＤＣカクテル抗体及びＳＣＣカクテル抗体と、それらを用いて免疫組織化学を実施するための試薬をセットしてもよく、さらに、腺癌判別コントロール及び扁平上皮癌判別コントロールを備えるようにしてもよい。
【０００９】
本発明に係る癌腫瘍の組織型判別方法は、請求項１記載のカクテル抗体を用いた肺非小細胞癌の組織型判別方法であって、ＡＤＣカクテル抗体にて陽性を示した腫瘍を腺癌と判別し、次に、ＳＣＣカクテル抗体にて陽性を示した腫瘍を扁平上皮癌と判別することを特徴とする。
ここで、さらに、ＡＤＣカクテル抗体及びＳＣＣカクテル抗体共に陰性であった腫瘍に対して、ＣＫ７を対象に免疫組織化学を実施し、陽性を示した腫瘍を腺癌と判別するようにするとよい。
判別の流れを具体的に説明すると、まず、腺癌に対して、ＴＴＦ−１とＮａｐｓｉｎ−Ａのそれぞれに対する抗体カクテル（ＡＤＣカクテル抗体）を使用すると、ＴＴＦ−１の核陽性と細胞質のＮａｐｓｉｎ−Ａに対するびまん性陽性のいずれかを有する腫瘍として腺癌が認識され、扁平上皮癌は全例がこの免疫組織化学（以下免疫染色と称する。）にて否定される。
次に、ｐ６３とサイトケラチン１４に対するカクテル抗体（ＳＣＣカクテル抗体）で、ｐ６３がびまん性に核に免疫染色されて、サイトケラチンが細胞質に免疫染色される腫瘍として扁平上皮癌が認識される。
腺癌はｐ６３とサイトケラチン１４に対するカクテル抗体で免疫染色されない。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明のカクテル抗体に使用される抗体は、ＴＴＦ−１、Ｎａｐｓｉｎ−Ａ、ｐ６３およびサイトケラチン１４のそれぞれに対する抗体であり、それらのＩｇＧ、ＩｇＭなどの種類やマウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの由来は特に限定されない。
それらの中で、モノクローナル抗体が好ましいが、十分な特異性で、ＴＴＦ−１、Ｎａｐｓｉｎ−Ａ、ｐ６３およびサイトケラチン１４を検出可能である限り、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）またはポリクローナル抗体を使用することもできる。
また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体などの抗体断片を使用することもできる。
上記抗体は、市販品または免疫学的手法、ファージディスプレイ法など公知方法で作製されたもののいずれであってもよい。
【００１１】
本発明のカクテル抗体を使用して、扁平上皮癌と腺癌の判別を行うには、生体から採取した細胞・組織について標本を作製し、この標本に対し、通常の病理診断で行われる免疫組織化学的手法を用いればよい。
【００１２】
標本は、例えば、生体から採取した細胞・組織を包埋したパラフィンブロックなどから薄切した切片、生体から採取した細胞・組織を包埋したパラフィンブロックなどから作製される細胞・組織マイクロアレイシートなどが挙げられる。
【００１３】
本発明で使用される免疫染色は、標本採取→標本調製→抗原抗体反応→可視化といった免疫組織化学の手法を用いればよい。
ここで、抗原抗体反応・可視化は、酵素抗体法を用いることが好ましい。
酵素抗体法の標準的なプロコールは周知であり、例えば、「酵素抗体法、改訂第３版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画）などを参考にすればよい。
【００１４】
以下、免疫組織化学における免疫染色の方法・手順の一例を示す。
（１）固定・パラフィン包埋
生体（剖検症例の場合は死体）より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド等によって固定する。
その後パラフィン包埋する。
一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。
パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ（例えば３〜５μｍ）に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。
尚、パラフィン包埋標本に代えて凍結標本を用いる場合もある。
（２）脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
（３）前処理（抗原賦活）
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び／又は加圧処理等を行う。
（４）内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
（５）非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液（例えば１％溶液）で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。
尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
（６）一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。
反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
（７）標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。
ペルオキシダーゼを結合させた２次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。
反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
（８）発色反応
トリス緩衝液にＤＡＢ（3,3'-diaminobenzidine）を溶解する。
続いて過酸化水素水を添加する。
このようにして調製した発色用溶液を数分間（例えば５分間）切片に浸透させ、発色させる。
発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、ＤＡＢを除去する。
（９）脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
【００１５】
次に、本発明に係るカクテル抗体を使用する手順例を示す。
（１）パラフィンブロックから薄切した細胞・組織の切片またはアレイシート（以下、検体と称する）を用意する。
（２）検体に対し、ＴＴＦ−１とＮａｐｓｉｎ−Ａのそれぞれに対するカクテル抗体を使用して免疫染色を行う。
（３）免疫染色された検体を観察し、ＴＴＦ−１について、細胞の核が陽性および／または細胞質のＮａｐｓｉｎ−Ａについて、びまん性陽性と判断した腫瘍を腺癌とする。
（４）検体に対し、ｐ６３とサイトケラチン１４のそれぞれに対するカクテル抗体を使用して免疫染色を行う。
（５）免疫染色された検体を観察し、ｐ６３について、びまん性に核が染まり、サイトケラチン１４について、細胞質に免疫染色される腫瘍を扁平上皮癌とする。
【００１６】
さらに、本発明の分別方法において、第三段階として、腺癌の補助的なマーカーであるサイトケラチン７（ＣＫ７）に対する抗体を使用することもできる。
【００１７】
本発明方法を利用したキットは、以下のカクテル抗体を含むキットである
（ａ）ＴＴＦ−１とＮａｐｓｉｎ−Ａのそれぞれに対するＡＤＣカクテル抗体。
（ｂ）ｐ６３とサイトケラチン１４のそれぞれに対するＳＣＣカクテル抗体。
ＡＤＣカクテル、ＳＣＣカクテルは、例えば、凍結乾燥されたもの、それらを含む溶液であってもよいが、利便性の点で溶液状態のものが好ましい。
また、上記キットは、例えば、抗原賦活化液、洗浄液、ブロッキング液、緩衝液、染色液、標識二次抗体、反応基質、コントロールスライドなどを含むものであってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
ｐ６３は扁平上皮癌との陽性反応率が１００％ではなく、そのｐ６３と相補的にする陽性を示すＣＫ１４を加えたカクテル化したマーカーを使用することによってはじめて１００％近い確度で非扁平上皮性ＮＳＣＬＣを扁平上皮性ＮＳＣＬＣから鑑別差別化することができる。
また、本発明方法により病理診断における免疫染色手技ならびに判定の簡便化を図ることができる
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】腫瘍マーカー候補について、扁平上皮癌と腺癌の病理組織標本の免疫染色象を示す。
【図２】カクテル抗体を利用した感度と染色法ならびに染色結果の評価法を示す図である。
【図３】肺扁平上皮癌と腺癌の判別スクリーニングのアルゴリズムを示す図である。
【図４】肺非小細胞癌組織アレイによるＡＤＣカクテルの検証結果す図である。
【図５】肺非小細胞癌組織アレイによるＳＣＣカクテルの検証結果す図である。
【図６】第二段階のＳＣＣカクテルの検証結果を示す図である。
【図７】ＡＤＣカクテルで陰性で、かつＳＣＣカクテルで陰性である症例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００２０】
１．肺非小細胞癌の扁平上皮癌、腺癌特異的な免疫組織化学的なマーカーの選択
（１）表１のマーカー候補について、扁平上皮癌（５例）と腺癌（７例）で検討した結果、サイトケラチン７（ＣＫ７）、サイトケラチン１４（ＣＫ  １４）、Ｎａｐｓｉｎ−Ａ、ＴＴＦ−１、ｐ６３を、カクテル抗体を構成するマーカーの候補として選択した（図１）。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
各抗体の特異性ならびに相補的な反応性を生かすために細胞質に局在するマーカーと細胞核に局在するマーカーの組み合わせを検討した。
その結果、図１に示すように腺癌に陽性を示し、また扁平上皮癌に陰性を示す腺癌マーカーの組み合わせ（ＡＤＣカクテル）は細胞質局在のＮａｐｓｉｎ−Ａと細胞核局在のＴＴＦ−１であり、逆に腺癌に陰性を示し、扁平上皮癌に陽性を示す扁平上皮癌の組み合わせ（ＳＣＣカクテル）は細胞質局在のＣＫ１４と細胞核局在のｐ６３の組み合せであった。
【００２３】
２．扁平上皮癌と腺癌用の抗体カクテル
各カクテル抗体候補の特異性ならびに反応性を最大限に生かすために、抗原賦活処理法の検討と煩雑な処理法の一本化と各抗体濃度ならびに混合比の検討と最適化を実施した。
最終的にカクテル抗体を利用した感度と反応性で一番優れた免疫染色法ならびに染色結果の評価法を決定した（図２）。
（１）各種カクテル抗体を利用した免疫染色の検証ならびに妥当性の確認
過去に富山大附属病院病理部で診断された扁平上皮癌１５例、腺癌１５例を選択して肺非小細胞癌組織アレイを作成し（表２）、この組織アレイを利用してカクテル抗体免疫染色法を検証した。
なお、表２において左半分（列０．０００〜６．０００）は扁平上皮癌、右半分（列９．０００〜１５．０００）は腺癌である。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
（２）扁平上皮癌と腺癌を判別スクリーニングするためのアルゴリズム（図３）。
アルゴリズムでは、第一段階としてＡＤＣカクテルを使用した免疫染色を実施し、陽性の症例を非扁平上皮癌すなわち腺癌と判別し、陰性の症例は第二段階としてＳＣＣカクテルを使用した免疫染色を実施した。この第２段階で陽性の症例を扁平上皮癌と判別する。さらに、ＡＤＣカクテルならびにＳＣＣカクテルで陰性を示す症例は腺癌の補助的なマーカーであるＣＫ７を使用した第三段階の染色を実施した。この段階で陽性の症例は腺癌と判別され、陰性の症例はその他の稀な組織型癌と判別した。また、判定は腫瘍細胞の１０％以上に細胞質あるいは核に陽性染色が認められるものを陽性とした。
【００２６】
３．肺非小細胞癌組織アレイによるカクテル抗体の検証結果
（１）第一段階でのＡＤＣカクテルとの反応では２９症例（１症例は腫瘍細胞が十分量採取できていないかったため検討から省いた。）中の右半分の腺癌症例１５例のうち１３症例が陽性と判定された（図４）。
図４において、右半分の腺癌症例のうち１３例が陽性を示した。
この結果より、全陰性例（１６例、図５）をＳＣＣカクテルで検討した。
図５において、左半分の扁平上皮癌１４例と右半分の腺癌２例は陰性である
【００２７】
（２）第二段階のＳＣＣカクテルとの反応で、ＡＤＣカクテルでの反応性が陰性であった１６例中１４例が陽性であった（図６）。
ＡＤＣカクテルでの結果が陰性で、かつＳＣＣカクテルでの検討も陰性である症例は２例であった（図７）。
上記２例のうち、１例はＨＥ染色での形態学的な再判定で明らかな腺癌であり、また、腺癌判定の補助マーカーであるＣＫ７も陽性であった。
【００２８】
４．組織アレイによる検証の考察
ＡＤＣカクテル抗体とＳＣＣ抗体との反応の結果を考察すると、１５症例の腺癌のうち１例（ＩＤ：97-3353）はＡＤＣカクテル抗体が陰性でＳＣＣカクテル抗体が陽性であった。
また、１４症例の扁平上皮癌のうち１例（ＩＤ：01-3517-15）ではＡＤＣカクテル抗体とＳＣＣ抗体ともに陰性であった。  
確認のために、他のマーカーとの反応性ならびにＨＥ染色による再判定を実施した結果、症例９７−３３５３は過去に腺癌と診断されているが、扁平上皮癌の中の特殊なbasaloid typeと判定されるものであった。
一方、症例０１−３５１７−１５はサイトケラチンマーカーのＰａｎ−ＣＫ、ＣＫ８／１８が陽性であり、腺系上皮由来を示し、ＨＥ染色標本での形態学的な再検討では腫瘍細胞の大きさ等より大細胞癌と判定された。
この２例をそれぞれ扁平上皮癌と、その他癌（大細胞癌）に再分類すると、検討症例は腺癌が１４例、扁平上皮癌１４例、その他（大細胞癌）１例、合計２９例となった。
最終的なＡＤＣカクテル抗体の１４症例の腺癌に対する特異性ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙは１００％となり、感度ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙは９２．９％であった。
また、ＳＣＣカクテル抗体の１４症例に対する特異性ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙと感度ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙはそれぞれ１００％であった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のＡＤＣカクテル抗体とＳＣＣカクテル抗体を利用した免疫組織化学的な方法は、肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）の組織型（扁平上皮癌、腺癌）の判別法として特異性ならびに感度に優れ、日常の病理診断において有用性が高いものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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