(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍、とりわけグリオーマ、特に多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）または退形成性オリゴデンドログリオーマにおける腫瘍形成を調節する遺伝子およびその産物を見出し、腫瘍、とりわけグリオーマ関連疾病の治療または予防に有用な組成物およびその方法の提供。【解決手段】ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物を含む、グリオーマ関連疾病を治療または予防または予防するための医薬組成物、ｓｏｘ１１遺伝子が導入された、あるいはｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進させる因子で処理された細胞。さらに、グリオーマ細胞培養条件下で、ｓｏｘ１１遺伝子を発現している、あるいは発現する能力のあるグリオーマ細胞に候補物質を投与し、次いで前記細胞におけるｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の存在または量を調べる工程を含む、グリオーマ関連疾病の治療または予防候補物質をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物を含む、グリオーマ関連疾病を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項２】
ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる、あるいはｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子。
【請求項３】
ｓｏｘ１１遺伝子が導入された、あるいはｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子で処理された細胞。
【請求項４】
請求項２記載の因子を含む、グリオーマ関連疾病を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項５】
請求項３記載の細胞を含む、グリオーマ関連疾病を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項６】
さらに抗癌剤を含む、請求項１、４または５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
グリオーマ関連疾病にかかっている患者から取り出されたグリオーマ細胞にｓｏｘ１１遺伝子またはその産物、あるいは請求項２記載の因子をコードする遺伝子を導入することを特徴とする、グリオーマ関連疾病治療または予防用細胞の製造方法。
【請求項８】
グリオーマ関連疾病の治療または予防候補物質をスクリーニングする方法であって、グリオーマ細胞培養条件下で、ｓｏｘ１１遺伝子を発現している、あるいは発現する能力のあるグリオーマ細胞に候補物質を投与し、次いで前記細胞におけるｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の存在または量を調べる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍形成、とりわけグリオーマ細胞の腫瘍形成能を抑制するためのｓｏｘ１１遺伝子およびその産物の使用に関する。本発明はまた、ｓｏｘ１１遺伝子およびその産物を含む、腫瘍、とりわけグリオーマ関連疾病を治療または予防のための医薬組成物、ならびに腫瘍、とりわけグリオーマ関連疾病を治療または予防するための細胞の製造方法などにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＳＣ（癌幹細胞ともいう）は、無制限に自己複製しながら、腫瘍のほとんどを形成する制限された増殖能を有する癌細胞を継続的に生成する（非特許文献１−４）。ＣＳＣは、組織特異的な幹細胞の一般的な特徴、ＣＤ１３３などの細胞表面マーカー、サイドポピュレーション（ＳＰ）および／または浮遊細胞塊形成アッセイを用いて、癌および癌細胞株から濃縮できることが示されている。しかしながら、腫瘍および癌細胞株に由来するＣＤ１３３陰性細胞または非ＳＰ細胞が生体内に移植された場合に腫瘍を形成し得るという別の証拠がある（非特許文献５−７）。それゆえ、公知の方法を用いて本物のＣＳＣを特徴付けできるかどうかはいまだ議論の余地がある。一方で、発癌遺伝子の過剰発現は、造血幹／前駆細胞の白血病幹細胞への形質転換を誘導して、少数の白血病幹細胞がインビボに移植されると白血病を形成することがわかっており（非特許文献８および９）、このことは、試験管内ＣＳＣモデルを用いてＣＳＣの特徴付けが可能であることを示唆する。本発明者らは最近、同様の技術を用いて、ｐ５３遺伝子を欠失した神経幹細胞（ＮＳＣ）を癌遺伝子ＨＲａｓＬ６１で形質転換することにより、マウスグリオーマ幹細胞（ｍＧＩＣともいう）株を樹立した（非特許文献１０−１６）。わずか１０個のｍＧＩＣが生体内で移植可能なＧＢＭを形成することから、ｍＧＩＣ株はＣＳＣを多く含むと考えられる。しかし、樹立されたＧＩＣ株を単一細胞培養した結果、細胞間において腫瘍形成能に有無が見られ、この原因は知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Reya, T. et al. Nature 414, 105-111 (2001)
【非特許文献２】Singh, S. K. et al. Oncogene 23, 7267-7273 (2004)
【非特許文献３】Kondo, T. Eur. J. Cancer 42, 1237-1242 (2006).
【非特許文献４】Vescovi, A. L. et al. Nat. Rev. Cancer 6, 425-364 (2006)
【非特許文献５】Mitsutake, N. et al. Endocrinology 148, 1797-1803 (2007)
【非特許文献６】Shmelkov, S. V. et al. J. Clin. Invest. 118, 2111-2120 (2008)
【非特許文献７】Wang, J. et al. Int. J. Cancer 122, 761-768 (2008)
【非特許文献８】Huntly, B. J. & Gilliland, D. G. Nat. Rev. Cancer 5, 311-321 (2005)
【非特許文献９】Krivtsov, A. V. & Armstrong, S. A. Nat. Rev. Cancer 7, 823-833 (2007)
【非特許文献１０】Bizub, D. et al. Oncogene 3, 443-448 (1988)
【非特許文献１１】Rasheed, B. K. et al. Cancer Res. 54, 1324-1330 (1994)
【非特許文献１２】Reilly, K. M. et al. Nature Genet. 26, 109-113 (2000)
【非特許文献１３】Bogler, O. et al. Glia 15, 308-327 (1995).
【非特許文献１４】Jeuken, J. et al. Acta. Nurophathol. 114, 121-133 (2007)
【非特許文献１５】Cancer Genome Atlas Research Network. Nature 455, 1061-1068 (2008)
【非特許文献１６】Parsons, D. W. et al. Science 321, 1807-1812 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の解決課題は、腫瘍、とりわけグリオーマ、特に多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）または退形成性オリゴデンドログリオーマにおける腫瘍形成を調節する遺伝子およびその産物を見出し、腫瘍、とりわけグリオーマ関連疾病の治療または予防に資することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、転写因子であるＳｏｘ１１をコードする遺伝子をグリオーマ細胞に導入し、過剰発現させたところ、グリオーマ細胞の増殖が効果的に抑制されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は：
（１）ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物を含む、グリオーマ関連疾病を治療または予防するための医薬組成物；
（２）ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる、あるいはｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進させる因子；
（３）ｓｏｘ１１遺伝子が導入された、あるいはｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進させる因子で処理された細胞；
（４）（２）記載の因子を含む、グリオーマ関連疾病を治療または予防するための医薬組成物；
（５）（３）記載の細胞を含む、グリオーマ関連疾病を治療または予防するための医薬組成物；
（６）さらに抗癌剤を含む、（１）、（４）または（５）のいずれかに記載の医薬組成物；
（７）グリオーマ関連疾病にかかっている患者から取り出されたグリオーマ細胞に、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物、あるいは（２）記載の因子をコードする遺伝子を導入することを特徴とする、グリオーマ関連疾病治療または予防用細胞の製造方法；
（８）グリオーマ関連疾病の治療または予防候補物質をスクリーニングする方法であって、グリオーマ細胞培養条件下で、ｓｏｘ１１遺伝子を発現している、あるいは発現する能力のあるグリオーマ細胞に候補物質を投与し、次いで前記細胞におけるｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の存在または量を調べる工程を含む方法
を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、腫瘍、とりわけグリオーマの増殖および腫瘍形成能を効果的に抑制することができるので、腫瘍、とりわけグリオーマ関連疾病を効果的に治療または予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＮＳＣ−Ｌ６１亜株、６Ｂ、８Ｂ、９Ｇおよび１０Ａを注入されたマウスの生存曲線を示す。
【図２】図２は、６Ｂ細胞に由来する腫瘍を有する脳の切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した図を示す。
【図３】図３は、ＮＳＣ−Ｌ６１亜株、６Ｂ、８Ｂ、９Ｇおよび１０Ａの増殖をＭＴＴアッセイにより調べた図を示す。結果は３つの培養物の平均±ＳＤを示す。
【図４】図４は、ＮＳＣ−Ｌ６１亜株、６Ｂ、８Ｂ、９Ｇおよび１０Ａにおける各種神経系列マーカー陽性細胞の割合を示す。３つの培養物の平均±ＳＤとして示す。
【図５】図５は、腫瘍形成能のあるＮＳＣ−Ｌ６１亜株（６Ｂと８Ｂ）と腫瘍形成能のない亜株（９Ｇと１０Ａ）において発現量の増加を示す遺伝子について、上位３０個のプローブセットをクラスター解析により同定した結果を示す。左の３０個の遺伝子名は、腫瘍形成能のあるＮＳＣ−Ｌ６１亜株（６Ｂと８Ｂ）で発現量が増加したものである。右の３０個の遺伝子名は、腫瘍形成能のない亜株（９Ｇと１０Ａ）で発現量が増加したものである。
【図６】図６は、ＮＳＣ−Ｌ６１亜株、６Ｂ、８Ｂ、９Ｇおよび１０ＡにおけるＳｏｘ１１の発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた結果を示す。
【図７】図７は、腫瘍形成能のあるＮＳＣ−Ｌ６１亜株（６Ｂと８Ｂ）と腫瘍形成能のない亜株（９Ｇと１０Ａ）において上方調節される遺伝子の発現解析の結果を示す。全ＲＮＡを腫瘍形成能のある亜株６Ｂと８Ｂ、および腫瘍形成能のない亜株９Ｇと１０Ａから抽出し、どちらかの亜株で上方調節された少なくとも２回上位３０個以内のプローブにランクされた選択遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ｇａｐｄｈの発現は内部コントロールである。
【図８】図８は、ＮＳＣ−Ｌ６１亜株、６Ｂ、８Ｂ、９Ｇおよび１０ＡにおけるＳｏｘ１１の免疫標識を示す。全ての核をヘキスト３３３４２で対比染色した。
【図９】図９は、様々な種類のヒト原発性悪性グリオーマ、ＧＢＭ、ＡＡ、ＡＯＡおよびＡＯ、正常な脳（ＮＢ）およびｈＧＩＣにおけるｓｏｘ１１の発現をＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた結果を示す。
【図１０】図１０は、原発性ヒトＡＯおよびＧＢＭ組織の試料をＳｏｘ１１およびヘマトキシリンにより染色した結果を示す。
【図１１】図１１は、原発性ヒトＧＢＭ組織および再発性腫瘍をＳｏｘ１１およびヘマトキシリンにより染色した結果を示す。
【図１２】図１２は、原発性ＧＢＭと再発性ＧＢＭにおけるＳｏｘ１１およびネスチンに対する免疫反応性を示す。原発性（左図）および再発性ＧＢＭ（右図）をＳｏｘ１１およびネスチンで免疫染色した。全ての核をヘキスト３３３４２で対比染色した。
【図１３】図１３は、コントロールベクターをトランスフェクトした細胞（点線）とｓｏｘ１１を発現する細胞（直線）の両方の増殖をＭＴＴアッセイにより調べた結果を示す。結果は３つの培養物の平均±ＳＤである。
【図１４】図１４は、ＮＳＣ−Ｌ６１およびｈＧＩＣにおけるｓｏｘ１１の過剰発現がネスチンの発現を減少させることを示す。ＮＳＣＬ６１、ｈＧＩＣ１およびｈＧＩＣ２をハイグロマイシンのみをコードするコントロールベクターまたはｓｏｘ１１とハイグロマイシンをコードするｓｏｘ１１発現ベクターのどちらかでトランスフェクトし、１０日間ハイグロマイシンで選別し、次いでネスチンで染色した。ヘキスト染色細胞中におけるマーカー陽性細胞の割合を示す。
【図１５】図１５は、ＮＳＣ−Ｌ６１およびｈＧＩＣにおけるｓｏｘ１１の過剰発現がＭＡＰ２の発現を増加させることを示す。ＮＳＣＬ６１、ｈＧＩＣ１およびｈＧＩＣ２をハイグロマイシンのみをコードするコントロールベクターまたはｓｏｘ１１とハイグロマイシンをコードするｓｏｘ１１発現ベクターのどちらかでトランスフェクトし、１０日間ハイグロマイシンで選別し、次いでＭＡＰ２で染色した。ヘキスト染色細胞中におけるマーカー陽性細胞の割合を示す。
【図１６】図１６は、コントロールベクターをトランスフェクトした細胞とｓｏｘ１１を発現する細胞の両方のコロニー形成能をソフトアガー中で調べた結果を示す。
【図１７】図１７は、コントロールベクターをトランスフェクトした細胞（点線）とｓｏｘ１１を発現する細胞（直線）を注入したマウスの生存曲線を示す。
【図１８】図１８は、ｓｏｘ１１の強制発現がＮＳＣ−Ｌ６１およびｈＧＩＣにおける抗癌剤に対する感受性を増加させることを示す。ＮＳＣＬ６１、ｈＧＩＣおよびｓｏｘ１１発現娘細胞を様々な濃度のエトポシド、テモゾロミドおよびタキソールで２日間培養した。生存細胞の割合はアッセイを用いて算出した。＊は、親細胞と比較したｐ＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、１の態様において、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物を含む、腫瘍、とりわけグリオーマ関連疾病を治療または予防するための医薬組成物を提供する。本発明により治療または予防されうる疾病は、腫瘍細胞がｓｏｘ１１を発現、あるいはｓｏｘ１１を発現する可能性のあるものであればよく、好ましくはグリオーマ関連疾病である。本発明において、「グリオーマ関連疾病」とは、神経膠細胞の性質を有する腫瘍の総称である。本発明におけるグリオーマ関連疾病は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の動物あるいは鳥類のごとく動物、好ましくはヒトにおけるものであり、多形神経膠芽腫（以下、ＧＢＭともいう）、アストロサイトーマ（星細胞腫ともいう）、髄芽腫、脳室上位腫、オリゴデンドログリオーマ（乏突起膠腫ともいう）、脈絡叢乳頭腫、特に、退形成性アストロサイトーマ、退形成性オリゴデンドロアストロサイトーマ、退形成性オリゴデンドログリオーマ、などが例示されるが、これらの疾病に限らない。
【００１０】
本発明のｓｏｘ１１遺伝子は、ＳＲＹ型のＨＭＧボックスを有する転写因子Ｓｏｘ１１タンパク質をコードする遺伝子である。それゆえ、前記Ｓｏｘ１１タンパク質は、細胞の核内において、特定のＤＮＡ配列に結合して下流因子の遺伝子の発現や転写を調節することを特徴とする。本明細書において、「ｓｏｘｌｌ遺伝子」は、Ｓｏｘ１１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドをいい、好ましくは、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；配列番号：１に示すアミノ酸配列において、１または数個、例えば、１〜９個、好ましくは、１〜５個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；配列番号：１に示すアミノ酸配列と５０％以上の相同性、好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上の相同性、より好ましくは８５％以上、９０％以上の相同性、さらに好ましくは９３％、９５％、９７％、あるいは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；あるいは上記アミノ酸配列のフラグメントを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。ここで、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、同一のアミノ酸を示す異なるヌクレオチド配列、いわゆる縮重コドンを含むものである。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。すなわち、本明細書においては、上述のごときｓｏｘ１１遺伝子の変異体もまた、ｓｏｘ１１遺伝子に包含されるものとする。さらに、本発明のｓｏｘｌｌ遺伝子は、ｓｏｘｌｌ遺伝子と同等の性質を有するものであって、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２）を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。本明細書における同等の性質とは、ｓｏｘ１１遺伝子として同等の生物学的、化学的、および物理学的特性を有することをいう。加えて、本発明において、ｓｏｘｌｌ遺伝子は、ヒト由来のものであるが、例えば、マウス、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるｓｏｘ１１遺伝子は、本明細書におけるｓｏｘ１１遺伝子に包含されうる。特に、本発明におけるマウスＳｏｘ１１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。この場合においても、ヒトｓｏｘ１１遺伝子と同様に、上述のごとく変異を有する変異体もマウスｓｏｘ１１遺伝子に包含されるものとする。
【００１１】
本発明において、前記ハイブリダイズさせる条件は、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressの記載に従って、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイズの条件は、低ストリンジェントな条件であってもよいが、好ましくは高ストリンジェントな条件である。低ストリンジェントな条件とは、上記文献に従ってハイブリダイズさせた後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの条件である。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳの条件などを含む。ただし、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様の条件を実現することができる。
【００１２】
本発明のｓｏｘ１１遺伝子の産物は、上述のごときｓｏｘ１１遺伝子のポリヌクレオチドから転写・合成されたものであればいかなるものをも含み、例えば、転写されたＲＮＡを含んでもよく、さらに該ＲＮＡから合成されたポリペプチドもしくはそのフラグメントを含んでもよい。例えば、本発明のｓｏｘ１１遺伝子の産物は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよく、あるいは配列番号：１に示すアミノ酸配列において、１または数個、例えば、１〜９個、好ましくは、１〜５個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；配列番号：１に示すアミノ酸配列と５０％以上の相同性、好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上の相同性、より好ましくは８５％以上、９０％以上の相同性、さらに好ましくは９３％、９５％、９７％、あるいは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列；ならびに上記アミノ酸配列のフラグメントを有するポリペプチドであってもよい。
【００１３】
本発明は、別の態様において、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子を提供する。ここで、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させるとは、インビボまたはインビトロにおいて、内在的または外因的に、ｓｏｘｌｌ遺伝子を発現させるか、導入することによりｓｏｘ１１遺伝子の発現量を通常より高めることをいう。それゆえ、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子は、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させるものであればいかなるものであってもよく、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、それらのフラグメントなどであってもよい。ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子がポリヌクレオチド、ポリペプチド、それらのフラグメントである場合に、安定性や利便性などのためのヌクレオチド配列や修飾物質がＮ末端やＣ末端などに結合されていてもよい。また、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子がポリヌクレオチドである場合には、上記ポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントが公知のベクター、特に発現ベクターに組み込まれているものであってもよい。かかる因子により、インビトロもしくはインビボにおいてｓｏｘ１１遺伝子の発現量を外因的に上昇させることが可能である。
【００１４】
ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子はまた、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる上流因子であってもよい。かかる上流因子は、ｓｏｘ１１遺伝子のエンハンサーやプロモーターのごとき調節因子に結合することによりｓｏｘ１１遺伝子の発現を上昇させることができるものが好ましい。それゆえ、本発明の因子には、例えば、ｓｏｘｌｌ遺伝子の発現を調節することが公知であるＮｅｕｒｏＤおよびＭａｔｈ３などが含まれるが、これらだけに限定されない（Bergsland, M., et al Genes Dev. 20:3475-3486）。また、Ｓｏｘ１１タンパク質は、転写因子であることから、様々な分泌因子やさらなる転写因子などをコードする遺伝子のエンハンサーやプロモーターのごとき制御・調節領域に結合し、それらの発現を調節すると考えられる。例えば、ｄｎｆａ５の発現を上方調節、逆にｆｇｆ５およびｐｌａｇｌ１の発現を下方調節する（Allerstorfer, S. et al., Oncogene. 27:4180-4190、Kim, M.S. et al., J.Hum/Genet. 51:652-64）。したがって、本発明のｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子には、Ｆｇｆ５、ｄｎｆａ５およびｐｌａｇｌ１のごとき下流因子も含まれてもよいが、これらだけに限定されない。さらに、本発明のｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子は、ＮｅｕｒｏＤ、Ｍａｔｈ３、Ｆｇｆ５、ｄｎｆａ５、ｐｌａｇｌ１のごときｓｏｘ１１遺伝子の上流および下流因子の作用を促進する因子も含まれてよい。かかる因子により、インビトロもしくはインビボにおいてｓｏｘ１１遺伝子の発現量を内在的に上昇させることができる。加えて、本発明のｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子は、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させるような化学物質、薬剤、サイトカイン、およびそれらの類似物質であってもよいが、これらだけに限定されない。また、本発明のｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子は天然物質、合成物質のいずれであってもよい。本発明のｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子はリポソームなどに包含されていてもよい。
【００１５】
本発明の因子はまた、ｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進する因子であってもよい。ここで、ｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進するとは、ｓｏｘ１１遺伝子からの産物の転写因子としての機能を高めることをいう。それゆえ、ｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進する因子は、上述のごときｓｏｘｌｌ遺伝子の発現量を上昇させる因子を含むが、ｓｏｘ１１遺伝子の産物の転写因子としての機能を高めるものであればいかなる因子であってもよい。ｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進する因子は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、それらのフラグメントなどであってもよい。例えば、本発明のｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進する因子は、配列番号：１および配列番号：３に示すＳｏｘｌｌタンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含むものであってもよい。本発明のｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進する因子は、かかるポリペプチドまたはそのフラグメントに、安定性や利便性などのためのアミノ酸配列を有するペプチドや修飾物質などがＮ末端やＣ末端に結合されていてもよい。さらに、本発明のｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進する因子はリポソームなどの中に包含されていてもよい。
【００１６】
本発明は、さらなる別の態様において、ｓｏｘ１１遺伝子が導入された、あるいはｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子で処理された細胞を提供する。かかる本発明の細胞は、腫瘍形成、とりわけグリオーマにおける腫瘍形成能を抑制することができることを特徴とする。細胞へのｓｏｘ１１遺伝子の導入は公知の手段・方法にて行うことができ、例えば、ベクターによる方法、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、塩酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション法などの一般的な方法を用いることができる。ｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子での細胞の処理もまた公知の手段・方法にて行うことができ、例えば、かかる因子を含む培地にて細胞を培養してもよく、あるいは該因子をマイクロインジェクションにて細胞に導入してもよい。当業者は、細胞の種類、因子の種類などに応じてこれらの方法を適宜選択して用いることができる。ｓｏｘ１１を導入される細胞、あるいは上記因子で処理される細胞はいかなる細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、哺乳動物、好ましくはヒトのグリオーマ細胞であり、より好ましくは、ＧＢＭもしくは退形成性オリゴデンドログリオーマ細胞である。
【００１７】
本発明は、別の態様において、腫瘍、とりわけグリオーマ関連疾病を治療または予防するための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、有効成分としてｓｏｘ１１遺伝子またはその産物、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子、ｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進させる因子、ｓｏｘ１１遺伝子が導入された細胞、あるいはｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子で処理された細胞を含む。加えて、本発明の医薬組成物は、前記有効成分以外に、担体や賦形剤などの成分を含有してもよい。本発明の医薬組成物はいかなる投与経路にても投与することができる。非経口投与には注射（例えば筋肉注射、皮内、腫瘍内、静脈内、又は皮下、又は直接注射）、輸液、経皮投与等を用いることができ、局所投与であっても全身投与であってもよい。あるいは本発明の医薬組成物を経口投与してもよい。経口投与剤形は公知であり、錠剤、顆粒、液剤等がある。本発明に使用することができる担体や賦形剤は、投与形態および剤形に応じて当業者が適宜選択することができる。非経口投与用処方には、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を担体または賦形剤として用いてもよく、必要に応じて殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を添加して調製してもよい。経口投与用処方には、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等を担体または賦形剤として用いてもよく、必要に応じて結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。これらの剤形は、溶解、撹拌、混合、粉砕、打錠、乾燥などの公知の手法を用いて製造することができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物はまた、上記有効成分と一緒に公知の抗癌剤を含んでもよい。本発明の医薬組成物に使用されうる抗癌剤としては、エトポシド、テモゾロミド、タキソール、シスプラチンなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。また、本発明の医薬組成物と従来の抗癌療法、例えば放射線治療や化学療法などを併用してもよい。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、ｓｏｘ１１遺伝子を発現する、あるいはｓｏｘ１１遺伝子を発現する可能性のある細胞から生じる腫瘍であればいかなる腫瘍にも適用することができ、好ましくはグリオーマ関連疾病に適用される。例えば、ＧＢＭ、アストロサイトーマ、髄芽腫、脳室上位腫、オリゴデンドログリオーマ、脈絡叢乳頭腫、退形成性アストロサイトーマ、退形成性オリゴデンドロアストロサイトーマおよび退形成性オリゴデンドログリオーマなどのグリオーマに適用することができるが、これらの腫瘍に限定されない。
【００２０】
本発明の医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、併用される抗癌剤または抗癌療法、ならびに動物種、患者の年齢、体重、症状によって適宜決定されうる。有効量の投与量は種々の条件によって変動するが、例えば、公知の抗癌剤の用量を参照などして、医師により決定されうる。
【００２１】
本発明は、さらなる別の態様において、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子、ｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子、ｓｏｘ１１遺伝子が導入された細胞、あるいはｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子で処理された細胞を患者に投与することを特徴とする、グリオーマ関連疾病の治療または予防方法を提供する。本発明の方法により治療または予防されるグリオーマは、上述のとおりである。
【００２２】
本発明はもう１つの態様において、グリオーマ関連疾病の治療または予防のための医薬の製造のための、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子、ｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子、ｓｏｘ１１遺伝子が導入された細胞、あるいはｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子で処理された細胞の使用を提供する。さらなる態様において、本発明は、グリオーマ関連疾病を治療または予防するために使用される、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子、ｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子、ｓｏｘ１１遺伝子が導入された細胞、あるいはｓｏｘ１１の産物の作用を促進させる因子で処理された細胞を提供する。
【００２３】
本発明は、さらに別の態様において、グリオーマ関連疾病にかかっている患者から取り出されたグリオーマ細胞に、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物、ｓｏｘ１１遺伝子の発現量を上昇させる因子、ｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進させる因子、ｓｏｘ１１遺伝子が導入された細胞、あるいはｓｏｘ１１遺伝子の産物の作用を促進させる因子を導入することを特徴とする、グリオーマ関連疾病治療または予防用細胞の製造方法を提供する。本発明の方法を適用される患者は、好ましくはヒトであり、より好ましくは、グリオーマに関連する疾病にかかっているヒトである。本発明において、患者から細胞を取り出す方法は、皮膚切開、外科的手術などの方法があり、当業者が適宜選択することができる。細胞にｓｏｘ１１遺伝子またはその産物あるいは上記因子を導入する方法は公知であり、特に限定されないが、ベクターによる方法、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、塩酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション法などの方法、あるいはこれらの因子との共培養などがある。この製造方法により得られた細胞では、Ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の作用・活性がもとの細胞よりも上昇している。かかる好ましい細胞の例は、ｓｏｘ１１遺伝子を過剰発現するものである。また、本発明の細胞の製造方法において、自己のグリオーマ細胞を用いることは、この製造方法により得られたグリオーマ関連疾病医療用の組み換え細胞製剤を投与する際に、適合性の面から有利である。
【００２４】
本発明は、別の態様において、グリオーマにおいて細胞増殖が抑制または促進された細胞を判別する方法を提供する。かかる方法は、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の存在または量を調べる工程を含むことを特徴とする。本発明において、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の存在または量を調べるために、当業者間で一般的な手法を用いてもよい。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、ノ−ザンブロット法、ドットブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などのポリヌクレオチドの検出法を含んでよい。また、例えば、免疫染色法、蛍光抗体法、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、ＥＬＩＳＡ法、ツーハイブリッドシステムなどの免疫学的なタンパク質の検出方法を行ってもよいが、これら以外の方法であってもよい。前記判別方法は、上記手法により正常部位または正常な時期と比較して、ｓｏｘｌｌ遺伝子またはその産物が高いレベルまたは低いレベルで検出される細胞を、それぞれ増殖が抑制または促進されたと判別することができる。
【００２５】
本発明は、さらなる別の態様において、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の存在または量を調べるための手段を必須構成要素とする、グリオーマにおいて細胞増殖が抑制または促進された細胞を判別するキットを提供する。本発明のキットは、上記の方法を含むものとし、例えば、上記方法に用いる反応容器、細胞の取得手段等を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、迅速かつ適切にグリオーマ細胞の腫瘍形成能の大小または有無を判別することができる。
【００２６】
本発明の判別方法またはキットは、グリオーマを除去または治療した後、すなわち予後において、グリオーマの腫瘍形成能を判別するためにも使用することができる。
【００２７】
本発明は、別の態様において、グリオーマ関連疾病の治療または予防に対する効果を有する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の存在または量をマーカーとすることを特徴とする。本発明のスクリーニング方法は、例えば、培養条件下で、ｓｏｘ１１遺伝子を発現している、あるいは発現する能力のあるグリオーマ細胞に候補物質を投与し、次いでこれらの細胞におけるｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の存在または量を調べ、ｓｏｘ１１遺伝子の発現を促進する候補物質を選択することであってもよい。それゆえ、この方法で選択された物質は、グリオーマの治療または予防に効果を有し、医薬組成物として用いることができる。ｓｏｘ１１遺伝子またはその産物の存在または量を調べる方法は、上述のごとき手法であってもよい。
【００２８】
次に、下記の実施例に用いた主な材料および方法を示すが、本発明を限定するものではない。
【００２９】
動物および試薬類
動物を、理化学研究所発生・再生科学総合研究センター（ＣＤＢ）の変異マウス開発チームおよび日本チャールズ・リバー株式会社から入手した。全てのマウス実験は、理研ＣＤＢ動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。化学薬品および成長因子は、特に記載される場合を除き、ＳｉｇｍａおよびＰｅｐｒｏｔｅｃｈからそれぞれ購入した。
【００３０】
ベクターの構築
全長マウスおよびヒトｓｏｘ１１を、マウスＮＳＣ  ｃＤＮＡおよびヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）から、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（FINNZYME, Espoo, Finland）を用いて製造業者の使用説明書に従って増幅し、ｐＤｒｉｖｅベクター（ＱＩＡＧＥＮ）にクローニングした。ヌクレオチド配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットバージョン３．１（Applied Biosystems）およびＡＢＩシークエンサーモデル３１３０ｘｌ（Applied Biosystems）を用いて確認した。ヒトおよびマウスｓｏｘ１１  ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇベクター（Invitrogen）に挿入し、各々ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇ−ｈｓｏｘ１１およびｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇ−ｍｓｏｘ１１を得た。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した：全長ヒトｓｏｘ１１については、５’プライマーを５’−ＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号：５）とし、３’プライマーを５’−ＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号：６）とした。全長マウスｓｏｘ１１については、５’プライマーを５’−ＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＧＣ−３’（配列番号：７）とし、３’プライマーを５’−ＴＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＧＴＣ−３’（配列番号：８）とした。
【００３１】
ヌードマウスの脳への頭蓋内細胞移植
マウスおよびヒトＧＩＣの詳細な性質の決定は他で報告する。Ｓｏｘ１１を発現するＧＩＣ細胞およびそれらの親細胞を５μｌの培地中で懸濁し、前もって１０％のペントバルビタールで麻酔をかけておいた５〜８週齢の雌のヌードマウスの脳中に注入した。注入部位の定位座標をラムダから２ｍｍ前方、矢状縫合から２ｍｍ側方、５ｍｍの深部とした。
【００３２】
脳の固定および組織病理
解剖したマウス脳を、４％パラホルムアルデヒド中に４℃で一晩固定した。固定後、ＰＢＳ中に１２〜１８％のスクロースを用いて脳を凍結保護し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ化合物（Miles, Elkhart,IN）中に包埋した。大脳皮質から冠状切片（１０μｍ厚）を調製し、一般的な技術を用いてヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００３３】
細胞培養
マウスＮＳＣ−Ｌ６１およびヒトＧＩＣを、以前に記載したとおり、試薬、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ）中で培養した（Kondo, T. & Raff, M. Genes Dev. 18, 2963-2972 (2004)）。免疫染色では、腫瘍細胞塊を、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ，１５μｇ／ｍｌ）およびフィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした８ウェルチャンバースライド（Nunc）上で培養した。
【００３４】
トランスフェクション
ＮＳＣ−Ｌ６１およびｈＧＩＣのトランスフェクションを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて製造業者の使用説明書に従って行った（AMAXA）。簡単に説明すると、２×１０６個の細胞を、１０μｇのベクターを含むマウスＮＳＣ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（１００μｌ）に懸濁し、次いでＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を最適培地で培養した。
【００３５】
免疫染色
免疫染色を、以前に記載したとおりに行った（Kondo, T. & Raff, M. Science 289, 1754-1757 (2000)）。以下の抗体を用いて抗原を検出した：ラット抗ネスチン（１：１０００；BD Pharmingen、１：２００；ヒト細胞にはChemicon）、マウス抗ＭＡＰ２（ａ＋ｂ）（１：２００；Abcam）、ラット抗ＧＦＰ（１：１０００；Nacalai Tesque, Japan）およびウサギ抗ヒトＳｏｘ１１（１：５０；SIGMA）。これらの抗体を、ヤギ抗ラットＩｇＧ−Ａ４８８（１：４００；Molecular Probes）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３（１：４００；Jackson ImmunoResearch）、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａ４８８（１：４００；Molecular probes）を用いて検出した。核を可視化するために、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で細胞を対比染色した。
【００３６】
増殖アッセイ
２０００個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルで１００μｌの培地中において培養した。細胞増殖を調べるために、ＭＴＴアッセイを以下のとおり行った。１０マイクロリットルのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ、Nacalai Tesque, Japan）を、インビトロで０、２または３、および４日目に各ウェルに添加した。これらの細胞を４時間インキュベートし、培地を１００μｌのＤＭＳＯに交換し、細胞を解離させ、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad）で５７０ｎｍにおける吸収スペクトルを用いて細胞増殖を定量化した。抗癌薬、エトポシド、テモゾロミドおよびタキソールの効果を調べるために、５０００個の細胞を、９６ウェルプレートにおいて様々な濃度の薬物を含む１００μｌの培地中において培養した。２日後、ＭＴＴアッセイを上述のごとく行った。
【００３７】
ソフトアガーアッセイ
本発明者らは、細胞が足場非依存的に増殖できるかどうかを調べるために、ソフトアガーアッセイを行った。Ｓｏｘ１１を発現するＮＳＣ−Ｌ６１、Ｓｏｘ１１を発現するｈＧＩＣおよびそれらの親細胞を、最適培地中で作製した０．３％トップアガーに懸濁し、同じ培地で作製した０．６％ボトムアガーの上に層状にした。トップアガーが重合した後、培地を添加し、細胞を３日毎に培地交換しながら２０日間培養した。
【００３８】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲを以前に記載したとおりに行った（Kondo, T. & Raff, M. EMBO J. 19, 1998-2007 (2000)）。サイクルパラメータを、９４℃で２０秒、５８℃で３０秒、７２℃で４５秒の３５サイクルとした。ｇａｐｄｈについては、９４℃で１５秒、５３℃で３０秒および７２℃で９０秒の２２サイクルとした。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した。Ｔ−ボックス２０（ｔｂｘ２０）については、５’プライマーを５’−ＴＡＧＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＴＣＣ−３’（配列番号：９）とし、３’プライマーを５’−ＣＣＴＣＴＣＡＡＴＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＴ−３’（配列番号：１０）とした。アネキシンＡ８（ａｎｘａ８）については、５’プライマーを５’−ＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＡＧＧＡＡＣＣＡ−３’（配列番号：１１）とし、３’プライマーを５’−ＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号：１２）とした。カテプシンＨ（ｃｔｓｈ）については、５’プライマーを５’−ＧＧＡＡＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＣ−３’（配列番号：１３）とし、３’プライマーを５’−ＡＴＧＴＡＣＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴ−３’（配列番号：１４）とした。ＡＬＸホメオボックス１（ａｌｘ１）については、５’プライマーを５’−ＴＴＧＧＴＴＴＣＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＧＧＣＣ−３’（配列番号：１５）とし、３’プライマーを５’−ＧＣＧＡＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴ−３’（配列番号：１６）とした。ｓｏｘ１１については、５’プライマーを５’−ＧＡＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＴ−３’（配列番号：１７）とし、３’プライマーを５’−ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧＡＡＣＡＴ−３’（配列番号：１８）とした。熱ショック２２ｋＤａタンパク質８（ｈｓｐｂ８）については、５’プライマーを５’−ＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＣＣ−３’（配列番号：１９）とし、３’プライマーを５’−ＧＴＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣ−３’（配列番号：１０）とした。ニューロンＰＡＳドメインタンパク質３（ｎｐａｓ３）については、５’プライマーを５’−ＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＡＣＡＧＧＣＣＧＧ−３’（配列番号：１１）とし、３’プライマーを５’−ＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号：１２）とした。溶質輸送体ファミリー２メンバー３（ｓｌｃ２ａ３）については、５’プライマーを５’−ＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号：１３）とし、３’プライマーを５’−ＡＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＧＧ−３’（配列番号：１４）とした。微小管結合タンパク質２（ｍａｐ２）については、５’プライマーを５’−ＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＧＣＣＴＡ−３’（配列番号：１５）とし、３’−プライマーを５’−ＡＧＣＣＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：１６）とした。ＣＡＰアデニル酸シクラーゼ結合タンパク質（ｃａｐ２）については、５’プライマーを５’−ＣＧＣＴＣＡＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＣＣＣＡ−３’（配列番号：１７）とし、３’プライマーを５’−ＧＴＴＧＡＴＣＡＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣ−３’（配列番号：１８）とした。ｇａｐｄｈのプライマーは以前に記載し��とおりにした（Kondo, T. Setoguchi, T. & Taga, T. Natl. Acad. Sci. USA 101, 781-786 (2004)）。
【００３９】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ処理
５μｇの全ＲＮＡを、Ｏｎｅ−Ｃｙｃｌｅ標的標識手順（Affymetrix, Santa Clara, CA）を用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）によりビオチンで標識した。次いで、ｃＲＮＡを断片化し、製造業者の使用説明書に従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐマウスゲノム４３０  ２．０アレイ（Affymetrix）とハイブリダイズさせた。マイクロアレイ画像データをＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ３０００（Affymetrix）を用いて処理し、ＣＥＬデータを作成した。次に、このＣＥＬデータを、複数のデータベースを同時に標準化し、処理する能力を搭載するｄＣｈｉｐソフトウェアによる解析にかけた。データをプログラムのデフォルト設定に従って各グループ内で標準化した。統計的検定を、２および３サンプル比較に対して各々、ｅＢａｙｅｓ法およびＡＮＯＶＡにより試した（Smyth, G.K. Stat. Appl. Genet. Mol. Biol. 3; article3 (2004)）。ｑ値は、「偽陽性率（ＦＤＲ）」と呼ばれる量の拡張であり、これを調べて、有意性のゲノムワイド検定に対する有意性を評価した。ＦＤＲ＜０．１である。
【００４０】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４ソフトウェアを用い、カプラン・マイヤー法によって、有意性について生存データを分析した（ｐ値はｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いて算出した）。
【００４１】
ヒト脳腫瘍
１１種のＧＢＭ、５種の退形成性アストロサイトーマ、５種の退形成性オリゴデンドログリオーマ、３種の退形成性オリゴアストロサイトーマおよび２種のＧＳＣ、ＧＳＣ１およびＧＳＣ２を、理化学研究所発生・再生科学総合研究センターおよび熊本大学医学研究科の研究ガイドラインに従って使用した。ＧＳＣの詳細な性質の決定は他で報告する（Ｔａｋｅｚａｋｉら、未公開データ）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ精製キット（GE Healthcare）を用いてグリオーマ細胞塊から調製し、ｃＤＮＡを転写第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて合成した。パラフィン包埋した腫瘍を６μｍの厚さで切片にした。Ｓｏｘ１１染色については、抗原を、製造業者の使用説明書に従ってＨｉｓｔｏＶＴ  Ｏｎｅ（Nacalai Tesque, Japan）により賦活化した。内在性ペルオキシダーゼ活性を、２％Ｈ２Ｏ２を室温で１５分間アプライすることにより不活化させた。次いで、切片をＴＰＢＳ中の５％スキムミルクと室温で３０分間前処理し、抗Ｓｏｘ１１抗体（１：５０）で室温において２時間免疫染色し、ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Vector laboratory）およびジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて可視化した。
【００４２】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００４３】
ＣＳＣは、無制限に自己複製しながら、腫瘍のほとんどを形成する制限された増殖能を有する癌細胞を継続的に生成する（Reya, T. et al. Nature 414, 105-111 (2001)、Singh, S. K. et al. Oncogene 23, 7267-7273 (2004)、Kondo, T. Eur. J. Cancer 42, 1237-1242 (2006)、およびVescovi, A. L. et al. Nat. Rev. Cancer 6, 425-364 (2006)）。ＣＳＣは、組織特異的な幹細胞の一般的な特徴、ＣＤ１３３などの細胞表面マーカー、サイドポピュレーション（ＳＰ）および／または浮遊球形成アッセイを用いて、癌および癌細胞株から濃縮できることが示されている。しかしながら、腫瘍および癌細胞株に由来するＣＤ１３３陰性細胞または非ＳＰ細胞のいずれかがインビボに移植された場合においても腫瘍を形成し得るという別の証拠がある（Mitsutake, N. et al. Endocrinology 148, 1797-1803 (2007)、Shmelkov, S. V. et al. J. Clin. Invest. 118, 2111-2120 (2008)、およびWang, J. et al. Int. J. Cancer 122, 761-768 (2008)）。それゆえ、公知の方法を用いて本物のＣＳＣを特徴付けできるかどうかはいまだ議論の余地がある。一方で、発癌遺伝子の過剰発現は、造血幹／前駆細胞の白血病幹細胞への形質転換を誘導して、少数の白血病幹細胞がインビボに移植されると白血病を形成することがわかっており（Huntly, B. J. & Gilliland, D. G. Nat. Rev. Cancer 5, 311-321 (2005)およびKrivtsov, A. V. & Armstrong, S. A. Nat. Rev. Cancer 7, 823-833 (2007)）、このことは、試験管内ＣＳＣモデルを用いてＣＳＣの特徴付けが可能であることを示唆する。本発明者らは最近、同様の技術を用いて、ｐ５３遺伝子を欠失した神経幹細胞（ＮＳＣ）を癌遺伝子ＨＲａｓＬ６１で形質転換することにより、マウスＧＩＣ株、ＮＳＣ−Ｌ６１を樹立した（Bizub, D. et al. Oncogene 3, 443-448 (1988)、Rasheed, B. K. et al. Cancer Res. 54, 1324-1330 (1994)、Reilly, K. M. et al. Nature Genet. 26, 109-113 (2000)、Bogler, O. et al. Glia 15, 308-327 (1995)、Jeuken, J. et al. Acta. Nurophathol. 114, 121-133 (2007)、Cancer Genome Atlas Research Network. Nature 455, 1061-1068 (2008)、およびParsons, D. W. et al. Science 321, 1807-1812 (2008)）。わずか１０個のＮＳＣ−Ｌ６１細胞をインビボに移植した場合であっても、それらは自己複製し、２ヶ月以内に移植可能なＧＢＭを形成した。このことは、ＮＳＣ−Ｌ６１がＣＳＣを多く含むことを示唆している。ＮＳＣ−Ｌ６１がＧＩＣおよび非ＧＩＣの両方からなることから、ＧＩＣの遺伝子発現プロファイルを非ＧＩＣのものと比較することにより、真のＣＳＣを特徴付けし、悪性グリオーマに対する新規な治療または予防の標的を同定することが可能である。本発明者らは、この可能性を検証するために、限界希釈アッセイを行い、２４種のＮＳＣ−Ｌ６１亜株を樹立した。
【００４４】
全ての単一クローンは増殖し、癌遺伝子ＨＲａｓＬ６１を発現していたが（非ＧＩＣ亜株、９Ｇおよび１０Ａをネガティブコントロールとして用いた）、これらの亜株の腫瘍形成能を調べるために、本発明者らが各クローン細胞をそれぞれ１０００個ずつヌードマウスの脳（ｎ＝３）に注入した結果、わずか２種の亜株、６Ｂおよび８ＢのみがＧＢＭを形成することを見出した（図１および２参照）。本発明者らは、腫瘍形成能のある亜株が腫瘍形成能のない亜株に比べゆっくり増殖することをＭＴＴアッセイ法により確認した（図３参照）。本発明者らはまた、両亜株を、ＮＳＣマーカーであるネスチンとＳｏｘ２、グリアマーカーであるＡ２Ｂ５とグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ならびにニューロンマーカーである微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）について免疫標識した。図４に示されるように、ＧＩＣ亜株、６Ｂと８Ｂは、主にＮＳＣマーカーおよびグリアマーカーを発現していたが、ＭＡＰ２を発現していなかった。対照的に、非ＧＩＣ亜株、９Ｇおよび１０Ａは、ＭＡＰ２を発現する一方で、ＮＳＣマーカーおよびグリアマーカーの両方の発現を喪失した。これらのデータから、ＧＩＣ亜株はＮＳＣおよびグリア細胞の特徴を保持するが、非ＧＩＣ亜株は神経細胞に運命付けられていることが示唆された。
【００４５】
本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイ分析により、ＧＩＣと非ＧＩＣ亜株の間で生じる遺伝子発現の変化の特徴付けを行った。ＧＩＣ亜株では５４７個の遺伝子が上方調節される一方で、非ＧＩＣ亜株では４０２個の遺伝子が上方調節されることを見出した（図５参照）。次いで、ＧＩＣおよび非ＧＩＣ亜株で上方調節された遺伝子に対する上位３０個のプローブセットにより少なくとも２回ランク付けされたいくつかの遺伝子の発現パターンを確認した（図７参照）。候補遺伝子の中で、以下の理由により非ＧＩＣ亜株においてその発現量が増加したＳｏｘ１１転写因子に着目した（図６および８参照）。Ｓｏｘ１１は、神経特異的な塩基性へリックス−ループ−へリックス（ｂＨＬＨ）タンパク質、Ｍａｔｈ３およびニューロゲニン２（Ｎｇｎ２）の下流因子であり、運命付けられたニューロン前駆細胞で発現されているが、ＮＳＣでは発現されない（Uwanogho, D. et al. Mech. Dev. 49, 23-36 (1995)、Hargrave, M. et al. Dev. Dyn. 210, 79-86 (1997)、およびBergsland, M. et al. Genes Dev. 20, 3475-3486 (2006)）。第２に、ｓｏｘ１１の過剰発現は、増殖している神経前駆細胞に神経マーカー、ＭＡＰ２およびβ−ＩＩＩチューブリンの発現を誘導する（Bergsland, M. et al. Genes Dev. 20, 3475-3486 (2006)）。このことは、非ＧＩＣ亜株がｍａｐ２のｍＲＮＡを発現し（図７参照）、ＭＡＰ２について標識される（図４参照）という本明細書中のデータと一致する。最後に、ドミナントネガティブ型Ｓｏｘ１１の過剰発現は神経分化を妨げる（Bergsland, M. et al. Genes Dev. 20, 3475-3486 (2006)）。これらのことから、Ｓｏｘ１１はＧＩＣを神経へ分化誘導する事により、腫瘍形成能を抑制していると示唆された。
【００４６】
複数の証拠から、悪性腫瘍は少数のＣＳＣと、分化マーカーを発現する多数の非ＣＳＣからなることが示唆されている。本発明者らは、ヒト悪性グリオーマであるＧＢＭ、退形成性アストロサイトーマ（ＡＡ）、退形成性オリゴデンドロサイトーマ（ＡＯＡ）および退形成性オリゴデンドログリオーマ（ＡＯ）がｓｏｘ１１のｍＲＮＡを発現し（図９参照）、原発性のＡＯおよびＧＢＭ組織の切片がＳｏｘ１１（図１０）とＭＡＰ２（データ図示せず）について免疫標識されることを確認した。次いで、ヒトＧＩＣにおけるＳｏｘ１１発現を調べるために、以前に示したとおり、原発性のＡＯとＧＢＭ組織にそれぞれ由来する２種のヒトＧＩＣ株、ｈＧＩＣ１およびｈＧＩＣ２を樹立した（Singh, S. K. et al. Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003)およびYuan, X. et al. Oncogene 23, 9392-400 (2004).）。これらの細胞株は、細胞増殖因子を含む無血清培地中で浮遊細胞塊として増殖でき、わずか１０個の細胞がインビボで移植されると、悪性グリオーマを形成できる。さらに、限界希釈アッセイにより樹立されたｈＧＩＣ亜株（１０個のクローン中１０個）は全て、インビボで腫瘍形成能を保持した。これらのデータは、本発明者らのｈＧＩＣ株がＣＳＣを多く含むことを示唆する（Ｔａｋｅｚａｋｉら、未公開データ）。本発明者らは、これらのｈＧＩＣ株がｓｏｘ１１発現を喪失していることを見出した（図９参照）。さらに、移植されたｈＧＩＣは、Ｓｏｘ１１について陰性であったが、少数の細胞はＳｏｘ１１についてしばしば標識されていた（データ示さず）。すなわち、これらのデータは、真のＧＩＣがＳｏｘ１１について陰性であることを示す。
【００４７】
再発性腫瘍は、原発性腫瘍より抗癌剤に対して耐性であることが多いことから、再発性腫瘍が原発性腫瘍より多くのＣＳＣを含んでいることが示唆される。本発明者らは、原発性ＧＢＭにおけるＳｏｘ１１発現を再発性ＧＢＭのＳｏｘ１１発現と比較し（ｎ＝５）、再発性ＧＢＭにおいてＳｏｘ１１発現が著しく低下することを見出した（図１１参照）。また、再発性ＧＢＭはネスチンについて陽性であるが、ＭＡＰ２免疫反応性を喪失していることも見出した（図１２参照）。従って、マウス異種移植モデルで知見したように、再発性ＧＢＭがＧＩＣからなるものである可能性が高いといえる。
【００４８】
ｍＧＩＣ亜株およびｈＧＩＣの両方がＳｏｘ１１の発現を喪失しているという知見から、ｓｏｘ１１の過剰発現がグリオーマ形成を抑制できるかどうかを調べた。本発明者らは、ｓｏｘ１１の過剰発現がＮＳＣ−Ｌ６１およびｈＧＩＣの細胞増殖を妨げることを知見した。そこで、ｓｏｘ１１を発現する細胞の増殖を定量化するために、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを行った。図１３に示されるように、ｓｏｘ１１を発現する細胞はその親細胞よりもゆっくりと増殖した。また、ｓｏｘ１１の過剰発現がネスチンの発現を阻害し（図１４参照）、ＭＡＰ２の発現量を増加させること（図１５参照）も見出した。これらのことは、Ｓｏｘ１１が神経分化に関連することと一致した（Uwanogho, D. et al. Mech. Dev. 49, 23-36 (1995)、Hargrave, M. et al. Dev. Dyn. 210, 79-86 (1997)、およびBergsland, M. et al. Genes Dev. 20, 3475-3486 (2006)）。次に、ｓｏｘ１１を発現するＮＳＣ−Ｌ６１およびｈＧＩＣの腫瘍形成能を調べるために、まず、ソフトアガー中でコロニー形成アッセイを行った。図１６に示されるように、ｓｏｘ−１１を発現する細胞はコロニー形成能を失っていた。次いで、１００個のｓｏｘ−１１を発現するＮＳＣ−Ｌ６１とｈＧＩＣをヌードマウスの脳に移植した。ＮＳＣ−Ｌ６１とｈＧＩＣを移植された全てのマウス（各実験ｎ＝５）がＧＢＭを形成し、４５日までに死亡する一方、ｓｏｘ１１を発現する細胞（各々ＮＳＣ−Ｌ６１、ｈＧＩＣ１およびｈＧＩＣ２）を注入されたほとんどのマウス（４／５、４／５および５／５）は６０日より長期にわたって生存した。これらのデータから、ｓｏｘ１１の過剰発現は、神経分化を誘導することにより、ＮＳＣ−Ｌ６１およびｈＧＩＣの腫瘍形成を阻止できることが示された。
【００４９】
ＣＳＣは抗癌剤に耐性であるが、一方で、非ＣＳＣ、すなわち運命付けされた／分化した癌細胞は、これらの薬剤に感受性を示す証拠が多くなってきた（Eramo, A. et al. Cell Death Differ. 13, 1238-1241 (2006)およびLiu, G. et al. Mol. Cancer 5, 67 (2006)）。そこで、上述のとおり、ｓｏｘ１１の過剰発現がＮＳＣ−Ｌ６１とｈＧＩＣの非腫瘍形成性神経細胞への分化を誘導したことから、ｓｏｘ１１発現がその薬剤感受性を増加させるかどうかを試験した。Ｓｏｘ１１を発現する細胞およびその親細胞を、様々な濃度の従来の化学療法薬、エトポシド、テモゾロミドおよびタキソールとともに２日間培養し、それらの生存をＭＴＴアッセイにより調べた。ｓｏｘ１１を発現するＮＳＣ−Ｌ６１およびｈＧＩＣがその親細胞よりもエトポシドとタキソールの両方に感受性である一方、ｓｏｘ１１の過剰発現はテモゾロミドに対して感受性を増加させないことを見出した（図１８参照）。従って、これらの結果は、Ｓｏｘ１１誘導の神経分化がＮＳＣ−Ｌ６１とｈＧＩＣを抗癌剤に感受性にすることを示すものであった。以上の実験よりｓｏｘ１１誘導と従来の抗癌剤との組み合わせは悪性グリオーマを効果的に排除しうることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、腫瘍形成、とりわけグリオーマにおける腫瘍形成能を抑制する因子、および該因子を用いた腫瘍の医薬組成物などを提供する。そのため、腫瘍の治療または予防のための医薬品の分野ならびにその関連分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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