(57)【要約】【課題】複数のポリペプチド種を含むサンプルからのハイスループット、高分解能および感受性タンパク質発現プロファイリングおよび関連局面のための組成物、方法、装置等を提供すること。【解決手段】本発明は、生物学的サンプルに対してプロテオミクスおよび代謝プロファイルを行うための、方法、組成物、装置、およびコンピューターデータ検索システムを提供する。１つの装置は、サンプル容器（５０）、複数の分離キャピラリー（５４、６４、７４）、複数の画分収集デバイス（６０、７０）、検出器（７８）、および分析機（８２）を備える。また本発明は、複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液からポリペプチド種を分離し、そして該ポリペプチド種を同定するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝経路を分析するための方法であって、該方法は、以下：
被験体由来のサンプル中の複数の標的分析物における同位体の存在度を決定して、各標的分析物のフラックスについての値を決定する工程であって、ここで
該複数の標的分析物が、基質および／または１つ以上の標的代謝産物を含み、
該被験体は安定同位体で標識された基質を投与されており、
該基質における同位体の相対的な同位体存在度は既知であり、そして、
該標識された基質は、該被験体により少なくとも部分的に代謝されて、１つ以上の標的代謝産物を形成する、
工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記決定する工程が、前記フラックス値を決定する工程の前に、前記サンプル中の他の生物学的成分から、前記標的分析物を少なくとも部分的に分離する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離する工程が、一連の複数のキャピラリー電気泳動方法を実行する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャピラリー等電点電気泳動からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記キャピラリー電気泳動方法を実行する工程が、複数のキャピラリーゾーン電気泳動方法を実行する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記キャピラリー電気泳動方法を実行する工程が、少なくとも１つの代謝産物のクラスについての別々の画分を生じ、ここで該代謝産物のクラスが、タンパク質、多糖類、炭水化物、核酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂肪、脂肪酸および有機酸からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記分離する工程が、前記複数の電気泳動方法を実行する前に非電気泳動分離技術を実行して、前記生物学的成分の少なくとも一部を沈殿させる工程を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記安定同位体が、１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎ、１８Ｏおよび３４Ｓからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質が、タンパク質、炭水化物、核酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂肪酸、有機酸および脂肪からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質がタンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基質が前記被験体における少なくとも２つの別々の代謝経路についての基質であり、該少なくとも２つの代謝経路を介する該基質の代謝が少なくとも２つの副産物を生じ、そして、前記標的代謝産物が該少なくとも２つの副産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが体液由来であり、該体液が、血液、尿、脳脊髄液、髄液、汗および消化液からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが細胞、組織サンプルまたは糞便物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記決定する工程が、異なる所定の時点での前記被験体由来の複数のサンプルを提供する工程、該サンプルの各々における他の生物学的成分から前記標的分析物を分離する工程、および、該サンプルの各々に含まれる該標的分析物中の前記同位体の存在度を決定する工程を包含することにより、標的分析物の各々における該同位体の存在度についての複数の値が得られ、該標的分析物の各々について決定された該複数の存在度から、標的分析物の各々についての前記フラックス値が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的分析物が、タンパク質、炭水化物、核酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂肪酸、有機酸および脂肪からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的分析物がタンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の標的分析物が、前記基質および少なくとも１つの標的代謝産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の標的分析物が、少なくとも３つの標的代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数の標的分析物が、少なくとも５つの標的代謝産物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記同位体の存在度の決定が、質量分析法、赤外線分光法または核磁気共鳴分光法によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記同位体の存在度の決定が、質量分析法によって実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記安定同位体が１３Ｃであり；前記分離する工程が複数のキャピラリー電気泳動法を実行する工程を包含し、該複数の電気泳動方法が、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動からなる群より選択され；そして、前記同位体の存在度の決定が質量分析法によって実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
代謝経路を分析するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の標的分析物を、被験体由来のサンプル中に含まれる生物学的成分から少なくとも部分的に分離する工程であって、該標的分析物が安定同位体で標識された基質および／または該被験体による該基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝産物を含み、そしてここで該基質中の該同位体の相対的な同位体存在度が既知である、工程；ならびに
（ｂ）該サンプルにおいて複数の該標的分析物中の該同位体の存在度を決定して、標的分析物の各々のフラックスについての値を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記分離する工程が、一連の複数のキャピラリー電気泳動方法を実行する工程を包含し、該キャピラリー電気泳動方法が、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記同位体の存在度の決定が質量分析によって実行される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
疾患と相関する代謝産物についてのスクリーニングのための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）試験被験体およびコントロール被験体由来のサンプルについて、複数の標的分析物における同位体の相対的存在度を決定して、該標的分析物の各々のフラックスについての値を決定する工程であって、該標的分析物が、基質および／または１つ以上の標的代謝産物を含み、該試験被験体および該コントロール被験体が、安定同位体で標識された基質を投与されており、該基質における該同位体の相対的な同位体存在度が既知であり、そして、該試験被験体が該疾患を有しており；そして、該標識された基質が、該試験被験体および該コントロール被験体により少なくとも部分的に代謝されて、１つ以上の標的代謝産物を形成し、そしてここで、該投与および代謝されて標的代謝産物を形成する工程が実行される条件が、該試験被験体および該コントロール被験体について同じである、工程；ならびに
（ｂ）該試験被験体についてのフラックスの値と該コントロール被験体についてのフラックスの値とを比較する工程であって、該試験被験体における標的分析物についてのフラックス値および該コントロール被験体についての対応するフラックス値における差は、このような分析物が該疾患と相関している可能性があることを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記決定する工程が、前記フラックス値を決定する工程の前に、前記サンプル中の他の生物学的成分から前記標的分析物を少なくとも部分的に分離する工程を包含し、該分離する工程は、前記試験被験体および前記コントロール被験体に由来する前記サンプルを用いて、一連の複数のキャピラリー電気泳動方法を別々に実行する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記同位体存在度の決定が、質量分析法によって実行される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患が、癌、自閉症、微生物感染および消化疾患からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
疾患と相関する代謝産物についてのスクリーニングのための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該疾患を有する試験被験体由来のサンプルを分析する工程であって、該サンプルが、該試験被験体に投与された、安定同位体で標識された基質、および／または該試験被験体による該基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝産物を含み、該基質中の該同位体の相対的な同位体存在度が、投与の時点で既知であり、そしてここで該分析する工程が該サンプル中の複数の分析物における該同位体の同位体存在度を決定して、各分析物のフラックスについての値を決定する工程を包含し、ここで該複数の分析物が、該基質および／または１つ以上の該標的代謝産物を含む、工程；ならびに
（ｂ）該分析物についてのフラックス値を、コントロール被験体について得られた同じ分析物についてのフラックス値と比較する工程であって、ここで分析物についてのフラックス値における差は、このような分析物が該疾患と相関していることを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
疾患の存在についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）一連の複数の電気泳動方法を実行して、試験被験体由来のサンプルにおける他の生物学的成分から複数の標的分析物を少なくとも部分的に分離する工程であって、試験被験体が、安定同位体で標識された基質を投与されており、該基質における該同位体の相対的存在度が既知であり；該標的分析物が、該基質および／または１つ以上の該標的代謝産物を含み；そして、該標識された基質が、十分な時間にわたって該試験被験体により少なくとも部分的に代謝されて、該疾患と相関することが既知である１つ以上の標的代謝産物を形成する、工程；
（ｂ）該標的分析物についてのフラックス値を決定する工程であって、該標的分析物の各々についてのフラックス値が、該分析物における該同位体の存在度から決定される、工程；ならびに
（ｃ）決定されたフラックス値を、同じ標的分析物についての対応する参照フラックス値と比較して、該試験被験体の疾患の危険度を評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
（ｉ）前記参照フラックス値が前記疾患の存在および／または該疾患に対して感受性であることを示す場合、参照値と試験値との間の統計的有意差は、前記試験被験体が該疾患を有していないか、そして／または、または該疾患にかかり易くないということを示し；そして
（ｉｉ）前記参照フラックス値が前記疾患の非存在および／または該疾患に対して感受性でないことを示す場合、参照値と試験値との間の統計的有意差は、前記試験被験体が該疾患を有しているか、そして／または、該疾患にかかり易いということを示している、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数の電気泳動方法が、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャピラリー等電点電気泳動からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
疾患の存在についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）試験被験体由来のサンプルを分析する工程であって、該サンプルは、該試験被験体に投与される、安定同位体で標識された基質、および／または該試験被験体による該基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝産物を含み、該基質中の該同位体の相対的な同位体存在度が、投与の時点で既知であり、そしてここで該分析する工程が、該サンプル中の複数の分析物中の該同位体の存在度を決定して、分析物の各々のフラックスについての値を決定する工程を包含し、ここで該複数の分析物が、該基質および／または１つ以上の該標的代謝産物を含む、工程；ならびに
（ｂ）標的分析物の各々について、該決定されたフラックス値を、該分析物についてのフラックス値の範囲と比較する工程であって、ここで該範囲は、該疾患と相関することが既知であり、そして標的分析物について決定されたフラックス値が、該標的分析物についての範囲内にある場合、該試験被験体が該疾患を有するか、または該疾患にかかり易いということを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９９年４月２０日に出願の米国仮出願第６０／１３０，２３８号の優先権を主張する。本発明はまた以下に関連する：１９９８年２月２４日に出願の米国仮出願第６０／０７５，７１５号；２０００年２月２５日に出願した同時係属米国出願番号０９／５１３，４８６（「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｖｉａ  Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００２００ＵＳを有する）；２０００年２月２５日に出願した米国同時係属出願番号０９／５１３，３９５（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００３００ＵＳを有する）；２０００年２月２５日に出願した同時係属米国出願第０９／５１３，９０７（「Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００１００ＵＳを有する）；２０００年４月１９日に出願した同時係属米国出願第 （「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｓ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００４００ＵＳを有する）；および２０００年４月１９日に出願した同時係属ＰＣＴ出願番号 （「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｍｐｌｅ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００５００ＵＳを有する）。これらの全ては、本明細書中でその全体を参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、タンパク質分離およびプロテオミクス、代謝産物のプロファイリング、バイオインフォマティックス、医薬、およびコンピューターデータベースの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ゲノム検索および示差的な遺伝子発現分析の目的は、遺伝子発現と特定の細胞状態（例えば、疾患状態、特定の発生段階、特定の環境刺激への暴露から生じる状態、および治療的処置に関する状態）との間の相関関係を作ることである。このような相関関係は、疾患、細胞発生、および細胞分化の機構における重要な洞察、ならびに新規の治療薬、薬物標的、および疾患マーカーの同定における重要な洞察を提供する可能性を有する。遺伝子発現パターンの相関関係はまた、疾患および生物の代謝における類似の洞察（これは、農作物、トランスジェニック種の開発の速度を増すために、および生物産物の収量または所望の代謝活性を増大させるための生物の代謝操作のために用いられ得る）を提供するために用いられ得る。
【０００４】
多くの機能的ゲノム研究は、特定の条件および状態に対応する細胞応答を提示するようなｍＲＮＡレベルの変化に焦点をあわせる。しかし、最近の研究では、しばしば、ｍＲＮＡレベルにより測定されるような遺伝子発現と、形成される実際に活性な遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質）との間に弱い相関関係が存在することが実証されている。［４］この発見は、驚くべきことではない。なぜならば、多くの因子（翻訳効率、代謝回転、細胞外発現または区画化、および翻訳後の修飾における差異を含む）が、転写制御に関係なくタンパク質レベルに影響するからである。従って、この証拠は、機能的ゲノムが実際のタンパク質レベルを測定すること（すなわち、プロテオミクス法を利用すること）により、核酸ベースの方法を用いるよりもむしろ、最も良く達成されることを示す。しかし、機能的ゲノム分析のためのタンパク質の成功した使用は、細胞または組織サンプルにおいて発現される個々のタンパク質の再現性のある定量および同定を必要とする。
【０００５】
それは、代謝制御が細胞および組織において実行されるタンパク質レベルである。健康な組織と罹患した組織との間のタンパク質発現のレベルの比較、または病原性微生物株と非病原性微生物株との間のタンパク質発現のレベルの比較は、新規の薬物化合物または農作物の発見および開発の速度を増し得る。疾患組織または処置を受けている生物から切除された組織におけるタンパク質発現パターンの分析はまた、疾患状態または処置ストラテジーの有効性の診断学として役立ち得、そして個々の患者についての適切な処置様式および治療選択肢に関する予後情報を提供し得る。
【０００６】
多くのタンパク質は、異なる細胞において様々なレベルで発現される。組織または細胞サンプルから、従来の技術を用いて抽出されたタンパク質は、最初に、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動、あるいはアフィニティー技術により個々のタンパク質に分離されなければならない。その後、個々のタンパク質レベルが、あるサンプル内で、および異なる組織供給源から得られるサンプルにわたり比較され得る。いつでも細胞により発現されるタンパク質の数に起因して、複数の電気泳動技術（例えば、等電点後のポリアクリルアミドゲルを介する電気泳動）が、所定のサンプルに含まれる個々のタンパク質の全てを単離するために、しばしば適用され得る。
【０００７】
いくつかの技術が、以下を含む分離後に存在する各タンパク質の相対量を定量するために用いられている：色素（例えば、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＢｌｕｅおよびＦａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ）を用いる、コロイド物質（例えば、金または銀染色）を用いる、または放射性化合物（例えば、３５Ｓメチオニン、または１４Ｃアミノ酸、あるいは３Ｈ−ロイシン）の添加による細胞合成の間のタンパク質の事前標識による、ポリアクリルアミドゲルで分離されたタンパク質を染色すること。染色技術は、貧弱な定量結果を生じる。なぜならば、様々な量の染色物が、各タンパク質内に取りこまれ、そして染色されたタンパク質は、ゲルまたはエレクトロブロット基材の染色されたバックグラウンドに対して、分離されなければならないからである。放射性標識は、分離の前にタンパク質にのみ適用されるので、これらは、染色技術のバックグラウンドの問題を克服する。しかし、ヒト被験体に放射性化合物を摂取させること、または管理されていない原野の環境（例えば、作物）において放射性物質を取り扱うことは、このアプローチの有効性を制限する。染色技術および放射性標識技術の両方はまた、検出を達成するために異常に長い時間を必要とする。ゲルの染色および脱色は、数時間を必要とする拡散律速プロセスである。放射性標識は、写真フィルムまたはリン光スクリーンに標識したゲルを数時間から数日間（定量的イメージを生じる放射性崩壊プロセスを待つ間）露光させることにより定量されなくてはならない。ゲルにおけるタンパク質の直接的赤外分光光度呼びかけ（ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）もまた、定量的タンパク質発現データを提供するための方法として以前に用いられている。しかし、このアプローチから可能なこの定量的解析は、ゲルの厚さにおける変動、およびゲルの間のタンパク質スポットの差次的な拡散（局所濃度の変化）により、不利に影響される。さらに、赤外におけるタンパク質の比較的低い吸収断面積は、敏感な検出を制限する。タンパク質発現パターンの分析は、多くの適用のために十分な情報を提供しない。
【０００８】
いくつかの方法がまた、タンパク質が分離されるとすぐに、タンパク質を同定するために提唱されている。最も一般的な方法としては以下が挙げられる：記録された分離座標データ（例えば、注釈付２−Ｄゲルイメージデータ）またはコントロールサンプルから得られる分離座標に対して個々のタンパク質の分離座標（例えば、等電点および見かけの分子量）を照会すること、得られたペプチドフラグメントの質量の測定と組み合わせたタンパク質の化学分解消化または酵素分解消化を行うこと、およびこのペプチドの質量フィンガープリントを、予想されるペプチドの質量フィンガープリントと相関させること。予想されるペプチドの質量フィンガープリントは以下に起因する：１組の公知のタンパク質の予想遺伝子配列（Ｊａｍｅｓ，Ｐ．Ｍ．Ｑｕａｎｄｒｏｎｉ，Ｅ．ＣａｒａｆｏｌｉおよびＧ．Ｇｏｎｎｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９５：５８−６４（１９９３）；Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．、Ｓ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、Ｐ．Ｒ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＴ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：３９７−４０８（１９９３）を参照のこと）、ゲノムデータベースから得られる予想配列と比較される部分的タンパク質配列の生成（Ｍａｎｎ，Ｍ．，ＩＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ学会，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９９７年１１月１０〜１１日）でのポスター発表；Ｗｉｌｍ，Ｍ．，Ａ．Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ｔ．Ｈｏｕｔｈａｅｖｅ，Ｓ．Ｂｒｅｉｔ，Ｌ．Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ，Ｔ．ＦｏｔｓｉｓおよびＭ．Ｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３７９：４６６−４６９（１９９６）；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ，Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｃ．ＢｅａｖｉｓおよびＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：９８−９２（１９９３）を参照のこと）、またはこれらの方法の組み合わせ（Ｍａｎｎ，Ｍ．，ＩＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ学会，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９９７年１１月１０〜１１日）でのポスター発表；Ｗｉｌｍ，Ｍ．，Ａ．Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ｔ．Ｈｏｕｔｈａｅｖｅ，Ｓ．Ｂｒｅｉｔ，Ｌ．Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ，Ｔ．ＦｏｔｓｉｓおよびＭ．Ｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３７９：４６６−４６９（１９９６）；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ，Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｃ．ＢｅａｖｉｓおよびＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：９８−９２（１９９３）を参照のこと）。最近の研究は、タンパク質が、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）（これは、ゲノムデータベースから決定される理論的配列を照会することが可能である）と呼ばれる部分配列の決定を介してのみ明白に同定され得ることを示す（Ｃｌａｕｓｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｓ．Ｃ．Ｈａｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．Ｗｅｂｂ，Ｌ．Ｅ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｈ．Ｍ．Ｔｒａｎ，Ｌ．Ｂ．Ｅｐｓｔｅｉｎ，およびＡ．Ｌ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９２：５０７２−５０７６（１９９５）；Ｌｉ，Ｇ．，Ｍ．Ｗａｌｔｈａｎ，Ｎ．Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｕｎｗｏｒｔｈ，Ａ．ＴｒｅｓｔｏｎおよびＪ．Ｎ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：３９１−４０２（１９９７）を参照のこと）。しかし、８〜１８時間が、現��、従来技術により単一のタンパク質サンプルについてＰＳＴを生成させるために必要とされる（この時間の実質的部分は、分離方法による引き続く配列決定に適切な形態でのタンパク質サンプルの回収に充てられる）（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９３：１４４４０−１４４４５（１９９６）；Ｍａｒｋ，Ｊ．，ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ  Ｓｅｍｉｎａｒ  Ｓｅｒｉｅｓでのポスター発表，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｒｖｅｒｙ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ（１９９８年３月）。これは、組織から分離されたタンパク質の全ての同定に、時間と費用のかかる努力を強いる。これは、機能的ゲノムについてのそれらの利点にもかかわらず、プロテオミクス法のより広範な用途を制限し、そして現在利用可能なゲノムデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）に類似した、プロテオミクスデータベースの開発を阻止している。
【０００９】
従って、細胞、組織、および器官のタンパク質発現パターン（「タンパク質フィンガープリント」）を同定および定量するための現在の方法は、十分な分解能、精度、および/または感度に欠ける。本発明は、当該分野で公知の方法において欠けているこれらの特徴を扱う。
【００１０】
（ポリペプチド分離法：キャピラリー電気泳動）
二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動は、現在、細胞または組織サンプルから単離された個々のタンパク質を分離するための、最も広範に適用される方法である［５、６、７］。この証拠は、タンパク質ゲルイメージデータベース（例えば、ＮＩＨにより維持されるＰｒｏｔｅｉｎ−Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）の増加（２０を超える）をみればわかる［８］。これらのデータベースは、種々の組織から調製されるゲルにおけるタンパク質の同定を補助するために、参照２−Ｄゲルのイメージを提供する。
【００１１】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、異なる型の電気泳動であり、そして電場が印加されるキャピラリー内の混合物中の成分を分離することを伴う。電気泳動を行うために用いられるキャピラリーは電解質で満たされ、そしてサンプルは種々の方法（例えば、水圧、電気浸透誘導流（ｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｌｏｗ）、および界面活性剤導電輸送（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ））を用いてキャピラリーの一方の末端に導入される。次いで、キャピラリーの末端は、アノード溶液およびカソード溶液と接触させて配置され、キャピラリーを横切って電圧が印加される。正に荷電したイオンが、カソードの方向に引き寄せられる一方、負に荷電したイオンは、アノードの方向に引き寄せられる。最も高い移動度を有する種は、キャピラリーマトリクスを介して最も速く移動する。しかし、各々の種の溶出の順序は、キャピラリーのいずれの末端から種が溶出するとしても、その見かけの移動度に依存する。見かけの移動度は、電気泳動マトリクスにおける種の電気泳動移動度およびキャピラリーに対する電気泳動マトリクス自身の移動度の合計である。電気泳動マトリクスは、キャピラリーに渡る水圧勾配、または電気浸透誘導流（電気浸透流）により移動し得る。
【００１２】
多数の異なる電気泳動法が存在する。キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）は、分析物のその等電点（すなわち、分析物が正味の電荷を有さないｐＨ）に従うｐＨ勾配においてタンパク質のような分析物を分離することに関する。第２の方法である、キャピラリーゾーン電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＣＺＥ）は、それらの固有の電荷対質量比に基づいて分析物を分画する。キャピラリー電気泳動（ＣＧＥ）は、それらの分子量に従ってタンパク質を分離するように設計される。（一般的な電気泳動、ならびに詳細なＣＩＥＦおよびＣＺＥの総説については、例えば、Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．およびＮｏｌａｎ，Ｊ．Ａ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，第１３章、３２５−３６８頁（１９９４）（一般的電気泳動）；Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」，ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，第４章、３２５−３６８頁（１９９４）；およびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｚｏｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，第１２章、２８７−３２３頁（１９９４）を参照のこと）。これらの全ての参考文献は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【００１３】
２−Ｄゲル電気泳動は、広範に実施されるが、いくつかの制限が、機能的ゲノム検索におけるその有用性を制限する。第１に、２Ｄ−ゲルは、空間的分解能に制限があるので、平均的な細胞において発現される多数のタンパク質（１０００〜１０，０００のタンパク質）を分離することが困難である。非常に大量のタンパク質は、キャピラリー等電点電気泳動における両性担体（ｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）勾配を湾曲させ、サイズ篩電気泳動法（例えば、２−Ｄゲル電気泳動の二次元目およびＣＧＥ）のゲルマトリクスにおける叢生（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）を生じ、従って分離されたタンパク質の空間的パターンを再現不可能にする［２０、２１および２２］。非常に大量のタンパク質はまた、ゲルにおいて沈殿し得、そして分画されるタンパク質の縞をつくる（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）［２０］。架橋密度の変化およびキャストゲルにおける電場強度は、分離されるタンパク質の空間的パターンをさらに湾曲させ得る［２３、２４］。別の問題は、バックグラウンドの高度な染色およびゲル染色の制限されたダイナミックレンジおよび画像化技術に起因して、ゲルにおける非常に大量のタンパク質の近隣の少量のタンパク質を分離することが出来ないことである［２５、２２］。染色に伴う制限はまた、再現可能でかつ定量可能なタンパク質濃度の値を得ることを困難にする。いくつかの最近の実験では、例えば、研究者は、類似の条件下で泳動した３７のゲルにおいて形成されたスポットの、試験スポットのわずか６２％を一致させ得た［２１；２８、２９もまた参照のこと］。さらに、多くのタンパク質は、アクリルアミドゲルトと適合性の緩衝液中に可溶性ではないか、またはその高い分子量に起因して有効にゲルに進入することに失敗する［２６、２７］。
【００１４】
従って、キャピラリー電気泳動の現在用いられる方法は、細胞または組織サンプルの詳細なタンパク質発現フィンガープリントを提供するそれらの有用性に関して、有意な制限を与える。
【００１５】
（タンパク質種同定／タンパク質配列タグ）
タンパク質の電気泳動移動度または等電点に基づくタンパク質の特徴づけと対照的に、組織または細胞サンプルにおいて発現されるタンパク質種を同定するためのアプローチは、サンプルから精製されるタンパク質由来の部分的または完全なペプチド配列情報を得ることである。しかし、いうまでもなく、このアプローチは、明白な配列決定を可能にするように個々のタンパク質を単離するために、大規模でかつしばしば問題のある精製工程を必要とするように、骨の折れるものでありかつ制限された感度のアプローチであり、そして多くの場合、非常に大量ではなく、そして／または夾雑タンパク質種がないように容易に精製可能ではないタンパク質について容易に実現可能ではない。
【００１６】
一次のアミノ酸配列または部分的配列（すなわち、タンパク質配列タグ「ＰＳＴ」）が決定され、その結果、異なる分離座標で見えるタンパク質に関するタンパク質発現パターンの変化に基づいて判断が下され得ることが重要である。タンパク質は、細胞または組織によりタンパク質に及ぼされる翻訳後の修飾の程度に依存して、ある分離座標を超えて見え得る。タンパク質についての分離座標はまた、遺伝子変異に起因して変化し得る。任意の所定の分離座標でのタンパク質の相対的量の変化はまた、遺伝子の発現の調節の変化に起因する。分離されたタンパク質の各々を明白に同定することによってのみ、異なるサンプルにわたるタンパク質発現における任意の変化に基づく判断が導きだされ得る。
【００１７】
いくつかの方法は、以前、分離されるタンパク質の配列またはタンパク質配列タグを決定するために提唱されている。これらとしては、以下が挙げられる：連続回のＮ末端またはＣ末端標識、次いで標識アミノ酸の遊離および測定、一度に１つのアミノ酸のタンパク質のエキソタンパク質分解消化、大きなタンパク質のより小さいペプチドへのエンドタンパク質分解消化、次いでＮ末端標識およびＣ末端標識、そしてアミノ酸決定、ならびに質量分析のフラグメント化パターン認識。連続標識および消化技術（例えば、エドマン分解）は、たとえ自動化されても、時間を消費する。なぜならば、このプロセスは、十分に大きなタンパク質配列タグが蓄積されるまでに、多くのサイクルを繰り返さなくてはならないからである。間違いの伝達（すなわち、各回における不完全な標識か、標識アミノ酸の不完全な遊離か、またはその両方のいずれかに由来する）はまた、これらの技術を用いて決定され得るタンパク質配列の長さを制限する。より完全なタンパク質配列が、連続標識および消化化学の適用の前に、初めに、エンドプロテアーゼを用いてタンパク質をより小さなフラグメントに切断することにより得られ得るが、これもまた、タンパク質フラグメントを再分離または精製する時間と労力のかかる工程（通常、電気泳動分離技術の再適用による）を導入する。本来のタンパク質におけるこれらのペプチドフラグメントの配列順序を決定することはまた、さらなる問題を提示し得る。カルボキシ末端メトキシ標識の臭化シアン消化物は、大きなタンパク質の臭化シアン消化により形成される他のフラグメントからＣ末端ペプチドフラグメントを同定するために用いられている。
【００１８】
（質量分析によるタンパク質配列決定）
質量分析技術は、より伝統的な方法を超えるその速さの利点により、ますます、タンパク質同定に適用されている。エレクトロスプレーおよびマトリクス支援レーザー脱離イオン化（ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＭＡＬＤＩ）は、タンパク質分析に適用される最も一般的な質量分析技術である。なぜならば、大きな低揮発性の分子種を、最も良くイオン化し得るからである。２つの基本的なストラテジーが、分離後のタンパク質のＭＳ同定のために提唱されている：１）質量プロフィールフィンガープリント（「ＭＳフィンガープリント」）および２）ＭＳ／ＭＳ（「ＭＳ／ＭＳ配列決定」）による１つ以上のペプチドドメインの配列決定。ＭＳフィンガープリントは、インタクトなタンパク質のタンパク質分解消化により生成されるいくつかのペプチドの質量を正確に測定し、そしてこのペプチド質量フィンガープリント用いて、公知のタンパク質についてのデータベースを検索することにより達成される。ＭＳ／ＭＳ配列決定は、ＭＳ／ＭＳ装置の四重極（ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ）における、配列特異的フラグメント化イオンの生成により消化されるタンパク質消化に由来するペプチドの、１つ以上のＰＳＴの実測に関する。これらの技術の両方における改良点はまた、サイン検出を達成するために必要な個々のタンパク質の量を低下させる。
【００１９】
１つのアプローチにおいて、タンパク質は、ペプチドを形成するために配列特異的部位で化学分解（例えば、臭化シアン）消化されるか、または酵素分解（例えば、トリプシン）消化される。切断の特異性は、ＭＳにより引き続いて決定され得る再現性のある質量のペプチドを生じる。次いで、個々のタンパク質から検出される質量分析のペプチドパターンは、公知の配列を有する精製タンパク質から生成されるか、または予想される消化パターンに基づく理論的タンパク質配列にから予想される類似のパターンのデータベースと比較される。次いで、未知のタンパク質の正体は、そのペプチド質量フィンガープリントと最も良く一致する公知のタンパク質であると推測される。
【００２０】
歴史的に、エドマン分解のような技術は、タンパク質配列決定に広範に用いられている。しかし、衝突解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）ＭＳ法（ＭＳ／ＭＳ配列決定）は、急速に進化しており、そしてより速く、かつ必要とするタンパク質がエドマン分解技術よりも少ないことがわかっている。ＭＳ配列決定は、ＭＳのイオン化ゾーンにおいてより高い電圧を用いて、タンパク質分解物から単離された単一のペプチドを無作為にフラグメント化することによるか、またはより代表的には、イオントラップ（四重極）における衝突解離を用いるタンデムＭＳによるかのいずれかで、達成される。しかし、タンパク質配列決定に対するＣＩＤ法の適用は、タンパク質が初めに化学分解消化されるか、または酵素分解消化されることを必要とする。
【００２１】
いくつかの技術が、ＭＳ／ＭＳ配列決定のために用いられるペプチドフラグメントを選択するために用いられ得る。これには、以下が挙げられる：四重極ＭＳユニットにおける親ペプチドフラグメントイオンの蓄積、ＥＳ−ＴＯＦ  ＭＳ検出と組み合わせたキャピラリー電気泳動分離、または他の液体クロマトグラフィー分離。ペプチドのアミノ酸配列は、得られたペプチドのＭＳフラグメント化パターンにおいて観察される分子量の差異から、ＭＳにおいて個々のアミノ酸残基と関連する公開された質量を用いて推論され、そして半自動ペプチド配列決定アルゴリズム（ｓｅｍｉ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）へとコードされる。このアプローチにおいて、配列決定されたペプチドは、代表的には、質量分析器の四重極に蓄積される。次いで、ＣＩＤは、天然の衝突気体（代表的には、Ａｒ）を、ペプチドイオンとの高エネルギー衝突をさせるためにこのイオントラップへと注入することにより達成される。これらの衝突のいくつかは、ペプチド骨格の切断、およびより小さなイオン（これは、それらの異なる質量により、比率を変化させ、四重極を離れそして検出される）の生成を生じる。ペプチド切断反応の大多数は、比較的小数の経路で起こり、非常に大量の特定の型の切断イオンを生じる。次いで、ペプチド配列は、検出される非常に大量のペプチドフラグメントの見かけの質量から推論される。
【００２２】
質量分析は、それが、タンパク質のより小さいフラグメントへのエンドタンパク質分解（例えば、トリプシン消化）または化学分解（例えば、臭化シアン）切断の有無で、電気泳動分離技術と有効に組み合わせられ得るという、さらなる利点を有する。しかし、未知のタンパク質のタンパク質配列またはタンパク質配列タグを、直接決定することを以前に記載している、質量分析技術はない。さらに、混合されたタンパク質サンプルから多数のタンパク質を分離するために用いられる電気泳動方法と直接組み合わせることを以前に記載している、ＭＳ配列決定技術はない。
【００２３】
例えば、ＭＳ／ＭＳ実験において陽イオンモードで獲得される単離された１４２５．７Ｄａペプチド（ＨＳＤＡＶＦＴＤＮＹＴＲ）の質量スペクトルにおいて、完全なペプチド１４２５．７Ｄａと次に大きな質量フラグメント（ｙ11、１２８８．７Ｄａ）との間の差異は、１３７Ｄａである。これは、アミド結合で切断されるＮ末端ヒスチジン残基の予想される質量に対応する。このペプチドについて、完全な配列決定は、ペプチド骨格に沿ってほとんどの全ての残基でのペプチド切断に対応する非常に多量のフラグメントイオンの生成の結果として実行できる。ペプチドのいずれかの末端を含む、本質的に完全な組の正に荷電したフラグメントイオンの生成は、Ｎ末端残基およびＣ末端残基（それぞれ、ＨおよびＲ）の両方の塩基性の結果である。塩基性残基が、Ｎ末端またはＣ末端（特に、Ｒ）に配置される場合、ＣＩＤスペクトルにおいて生じるイオンのほとんどは、塩基性残基を含む。なぜならば、正電荷がこの部位に本質的に局在するからである。これは、スペクトルの結果を非常に単純化する。なぜならば、これらの塩基性部位は、限定されたシリーズの特定の娘イオンへのフラグメント化に向けられるからである。塩基性残基を欠くペプチドは、配列決定をより困難にする、より複雑な混合物のフラグメントイオンへとフラグメント化する傾向にある。
【００２４】
この考えを広げて、他のものは、Ｎ末端へ強い正電荷を付着させることが、Ｎ末端での塩基性残基の存在にかかわらず、ＣＩＤ実験において親ペプチドから完全なシリーズのＮ末端フラグメントイオンの生成を検出するためのアプローチに有効であることを実証した。理論的に、全てのフラグメントイオンは、固定荷電基（ｆｉｘｅｄ−ｃｈａｒｇｅｄ  ｇｒｏｕｐ）により方向付けられた電荷リモート（ｃｈａｒｇｅ−ｒｅｍｏｔｅ）フラグメント化により生成される。ペプチドは、現在、いくつかのクラスの固定荷電基（ジメチルアルキルアンモニウム、置換ピリジニウム、４級ホスホニウム、およびスルホニウム誘導体を含む）を用いて修飾されている。最も望ましい標識の特徴は、これらが容易に合成され、ペプチドのイオン化の効果を増大させ、そして（最も重要なことは）不利な標識のフラグメント化を最小にする特定のフラグメントイオンシリーズの形成を指向することである。これらの基準を満たす最も望ましい誘導体は、４級ホスホニウム誘導体を有するジメチルアルキルアンモニウムクラスの誘導体（唯一、それらのより困難な合成により望ましくない）である。置換ピリジニウム誘導体は、アルキルアンモニウム誘導体とは対照的に高エネルギーＣＩＤにより良く適する。
【００２５】
ペプチド分析のいくぶんかの進歩にも関わらず、タンパク質の同定は、プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）の分野における主要なボトルネックであり、その予測されたゲノム配列から単独の精製タンパク質の同定を可能にするのに十分な長さのタンパク質配列タグを産生するために、１８時間までが必要とされる。明白なタンパク質同定がタンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を産生することによって達成され、ＰＳＴは現在、ＭＳ／ＭＳ装置の四重極（ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ）における衝突誘導分離によって優先的に達成される。より大きなペプチドおよびタンパク質のイオン化効率の限定は、ＭＳ技術の内因性の検出感度を制限し、そして低い存在量のタンパク質の同定のためのＭＳの使用を阻害する。飛行時間（ＴＯＦ）検出の質量の正確さの制限はまた、ＭＳ／ＭＳ配列決定の有用性を束縛し得、タンパク質分解手段および化学分解手段によって、配列決定に先だって、より扱いやすいペプチドに、タンパク質が消化されることを要求する。明らかに、迅速かつ費用に効果的なタンパク質配列決定技術は、プロテオミクス研究のスピードを改善し、かつ費用を下げる。最後に、伝統的なタンパク質分離技術において使用される分離薬剤および緩衝液はしばしば、ＭＳ同定方法と両立しない。
【００２６】
（タンパク質サンプルの標識）
健康な組織および罹患した組織より得たタンパク質発現レベルの相関関係は、プロテオミクス研究の基礎である。組織サンプルまたは細胞サンプルより抽出されたタンパク質は、代表的に、ゲル電気泳動によって個々のタンパク質に分離されなければならず（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌ，Ｐ．Ｈ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０：４００７（１９７５）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｄ．Ｆ．，ら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７３：４２４（１９８８）；Ｈｕｈｍｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｒ．，ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：２９Ｒ−５７Ｒ（１９９７）；Ｇａｒｆｉｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２：４２５（１９９０）），ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．，ら，「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第８章，第１８５頁−第２０６頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４）；Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ，」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第４章，第９５頁−第１０９頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，  １９９４）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．，「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１２章，第２８７頁−３２３頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４）；Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．およびＮｏｌａｎ，Ｊ．Ａ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１３章，第３２５頁−第３６８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４）），またはアフィニティー技術（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．，「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，」ＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．，「Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，」ＣＨＩ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９９８年２月１４−１５日））、その後、それらの相対的な発現レベルの定量化および、比較サンプルからのレベルと比較する。最も一般的に使用されるプロテオミ��ス方法は、ゲル内に存在するタンパク質レベルを定量するための染色技術および画像処理技術を使用する２−Ｄゲル電気泳動である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．およびＮ．Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，「Ｔｗｅｎｔｙ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ，」Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１７：４４３（１９９６））。しかし、存在量の低いタンパク質の検出（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｔａｒｇｅｔｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，」ＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）；ＭｃＫｅｅ，Ａ．，「Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ，」ＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）およびタンパク質染色技術および定量化技術の再現性（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｔａｒｇｅｔｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、ＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ，（１９９８年６月１１−１２日）；ＭｃＫｅｅ．Ａ．，「Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ」ＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）；ＩＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された、ＢｉｏＲａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  ａｎｄ  ＰＤＱｕｅｓｔ  ２−Ｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｅｍｉｎａｒ，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）；Ｆｒａｎｚｅｎ，Ｆ．，ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：５８２（１９９７））が、予測を検証した。
【００２７】
ネイティブなヒト組織サンプルから直接にタンパク質発現レベルを分析可能な自動化された、定量的および再現性のシステムの開発が、比較タンパク質発現データを産生し、そしてこれらのデータの質を潜在的に改善するために必要とされる時間と費用に顕著に影響すると期待される。標識された２−Ｄ電気泳動システムの開発は、タンパク質疾患データベースのより迅速な蓄積を可能にし、そしてさらに新しい疾患標的の同定の速度を増す。
【００２８】
２−Ｄゲルのゲルの再現性の問題にも関わらず、プロテオミクス研究の重要性が既に十分に確立されている。Ｓｔｅｉｎｅｒおよびその共同研究者は、ラット肝臓組織における２つの前臨床の薬剤候補の毒性を理解するためのプロテオミクスの使用を報告した（Ｓｔｅｉｎｅｒ，「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ」ＩＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文、Ｃｏｒｏｎａｄｏ、ＣＡ，１９９８年６月１１−１２日、を参照のこと）。最近、Ａｒｎｏｔｔは、タンパク質の発現が、うっ血性心不全にける肥大に関連しそうであるタンパク質の同定を報告したが、任意のこれらのタンパク質が適切な薬剤標的であるのかを決定されるべきままである（Ａｒｎｏｔｔ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」ＩＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ，１９９８年６月１１−１２日、を参照のこと）。Ｗｉｔｚｍａｎｎらは、インビトロ組織切片で観察される１，３，５−トリニトロベンゼンおよび１，３−ジニトロベンゼンの毒物学のよりよい理解のためにウシ精巣のプロテオミクス研究の使用を報告する（Ｗｉｔｚｍａｎｎ，ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：６４２（１９９７）を参照のこと）。Ｆｒａｎｚｅｎらは、悪性ヒト乳癌についてのマーカーを同定するためのプロテオミクス分析の使用を報告する（Ｆｒａｎｚｅｎら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：５８２（１９９７）を参照のこと）。
【００２９】
プロテオミクス研究は、また同定される別のプロセスにおいて、タンパク質が分解することもまた必要とする。ゲノムデータベースから決定された理論的な配列に参照することを可能にするＰＳＴの定量を通じてタンパク質は明白に同定され得るのみであると、Ｃｌａｕｓｅｒらは示唆している（Ｃｌａｕｓｅｒ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９２：５０７２−５０７６（１９９５）を参照のこと）。比較理論的ペプチド質量データ−ベースのサイズが増加するにつれて変性されたＭＳフィンガープリントによる個々のタンパク質の信頼できる同定を見出すことによって、Ｌｉらはこの主張を検証したようである（Ｌｉ，ら，Ｅｌｅｃｒｅｓｉｓ  １８：３９１−４０２（１９９７）を参照のこと）。ゲル内の最も存在量の多いタンパク質についてペプチドマップを得たのみであったことを、Ｌｉらはまた報告した。なぜなら、ＭＳの感度の限界のせいであり、レーザー脱離ＭＡＬＤＩ方法論で補助されたマトリックスが、以前に報告された方法に渡って検出感度を改善することが実証されたにも関わらずである。明らかに、迅速かつ費用に有効なタンパク質配列決定技術は、プロテオミクス研究のスピードを改善し、かつ費用を下げる。
【００３０】
歴史的に、Ｅｄｍａｎ分解のような技術は、タンパク質配列決定に広く使用されていた；Ｓｔａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１０３−１２０（１９７２）；Ｎｉａｌｌ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７：９４２−１０１１（１９７３）；Ｇｒａｙ，：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１２１−１３７（１９７２）；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１３８−１４３（１９７２）；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，１９８４）；Ｎｉｅｄｅｒｗｉｅｓｅｒ，ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：６０−９９（１９７２）；およびＴｈｉｅｄｅ，ら．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３５７：６５−６９（１９９５）を参照のこと。しかし、衝突誘導解離質量分析（ＭＳ）による配列決定方法（ＭＳ／ＭＳ配列決定）は、急速に発展し、そしてより迅速であることを証明し、さらにＥｄｍａｎ技術ほどタンパク質を必要としない。Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９３：１４４４０−１４４４５（１９９６）；Ｗｉｌｍ，ら，Ｎａｔｕｒｅ，３７９：４６６−４６９（１９９６）；Ｍａｒｋ，Ｊ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭＳ／ＭＳ，」ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ  Ｓｅｍｉｎａｒ  Ｓｅｒｉｅｓで提示された論文，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ（１９９８年３月）；およびＢｉｅｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９３：４５５−４７９（１９９０）を参照のこと。
【００３１】
２つの基礎的なストラテジーが、タンパク質混合物から分離した後のタンパク質のＭＳ同定について提唱されている：１）質量プロフィールフィンガープリント（「ＭＳ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ」，Ｊａｍｅｓ，ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９５：５８−６４（１９９３）およびＹａｔｅｓ，ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：３９７−４０８（１９９３）を参照のこと）、および２）ＭＳ／ＭＳによる１以上のペプチドドメインの配列決定（「ＭＳ／ＭＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」，Ｗｉｌｍ，ら，Ｎａｔｕｒｅ，３７９：４６６−４６９（１９９６）；Ｃｈａｉｔ，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：８９−９２（１９９３）；およびＭａｎｎ，Ｍ．，ＩＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９９７年１１月１０−１１日）を参照のこと）。インタクトなタンパク質のタンパク質分解消化によって産生された、いくつかのペプチドの正確に測定された質量、およびペプチド質量フィンガープリントを有する公知のタンパク質についてデータベースの検索によってＭＳフィンガープリントは達成される。ＭＳ／ＭＳ配列決定は、ＭＳ／ＭＳ装置の四重極における配列特異的フラグメンテーションイオンの生成によってタンパク質の１以上のＰＳＴの実際の決定を含む。
【００３２】
プロテオミクスデータへの増加する需要の点から、複合タンパク質サンプルの分離および配列決定のための方法が必要とされる。さらに、複合体サンプルにおけるタンパク質の分離と配列決定をさらに容易にするために、新しいタンパク質標識方法が必要とされる。驚くべきことに、本発明は、タンパク質混合物の標識のための新しい方法を提供する。本明細書中に記載される技術は、タンパク質同定および疾患状態または発生科学に対するタンパク質発現の相関関係のプロセスの速度を増す。
【００３３】
（代謝分析）
生化学研究における１つの目的は、細胞、組織および特定の細胞または組織状態（例えば、疾患状態、特定の発生段階、特定の環境刺激への曝露から生じる状態および治療処置と関連する状態）における特定の分子の存在、非存在、濃度、変換率、または輸送率の間の相関関係を発達することである。このような相関関係は、疾患、細胞発生および分化のメカニズム、ならびに新しい治療的、薬剤標的および／または疾患マーカーの同定における顕著な洞察を提供するための可能性を有する。
【００３４】
ゲノムに基づいた研究は、このような研究で取られるアプローチの１つの型の例である。代表的に機能的ゲノムは、特定の条件または状態への細胞性応答の示す際のｍＲＮＡレベルの変化に集中する。しかし、ｍＲＮＡレベルによって測定される遺伝子発現と生成された活性な遺伝子産物（すなわちｍＲＮＡによってコードされるタンパク質）との間の低い相関関係がしばしば存在することを、最近の研究は実証した。この知見は、特に驚くべきことではない。なぜなら多くの因子（翻訳効率、回転率、細胞外発現または分画化における差、および翻訳後修飾を含む）が、転写調節のタンパク質レベルに独立して影響するからである。
【００３５】
別のアプローチは、プロテオミクスであり、用語が示唆するように、これは、種々の細胞の状態において存在するタンパク質に焦点を合わせる。特にタンパク質活性が、タンパク質をコードするｍＲＮＡの濃度以外の因子をしばしば決めることを示唆することが記載された知見を考慮して、プロテオミクス研究を行う理論的根拠は、部分的に、細胞生物学の特定の局面が、核酸レベルよりもタンパク質レベルの項目表（ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）を考慮することにより、よりよく理解され得るという見地に基づく。
【００３６】
核酸またはタンパク質のいずれかに主に集中するかわりに、本発明は、異なるアプローチをとり、そして細胞性代謝を通じて形成された細胞に存在する代謝を調べる。このようなアプローチは、メトミクス（ｍｅｔｏｍｉｃｓ）と呼ばれる。より具体的には、メトミクスは、代謝フラックスの研究および生物（または細胞の集団あるいは組織）の生理的状態の機能としてのこれらのフラックスの変化の研究に関する。メトミクス研究は、例えば、生物または細胞集団の生理学的状態における変化を生じるか、または変化の結果として起こる特定の代謝パターンを同定することを含み得る。メトミクス研究は、タンパク質およびｍＲＮＡの発現パターンにおける変化に相関し得、また生物または細胞集団の生理学的状態における変化から生じる。
【００３７】
代謝は、細胞の維持および増殖を一緒に支持する異化（エネルギーおよび前駆体産生）および同化（生合成）の酵素学的な経路の複雑なネットワークからなる。この酵素学的反応のネットワークを通じた化合物の流れは、細胞周期（Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，ら，Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，（１９８３））食餌、細胞外栄養素の有用性、および細胞性ストレスへの曝露（例えば、化学的毒素および生化学的毒素または感染因子で異なる。調節における主要な代謝経路および因子は、任意の一般的な生化学の教科書（例えば、Ｖｏｅｔ，Ｄ．およびＶｏｅｔ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８１）；およびＷｈｉｔｅ，Ａ．，ら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第６版．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９７８），これらの各々は、その全体が参考として援用される）を含む）において議論される。
【００３８】
代謝は、異なる条件および刺激に適応可能でなければならないので、細胞は、代謝を調節するために自由に種々のメカニズムを有する。例えば、特定の調節メカニズムは、割合を調節し、この割合で代謝産物は細胞に入る。非常にわずかな物質は、細胞膜を超えて拡散可能であるので、このような調節は代表的に、細胞の活性または受動的輸送メカニズムの１つを経由して生じる。
【００３９】
輸送調節に加えて、多くの異なるメカニズムは、代謝経路の一部である酵素の活性を調節するために機能し得る。例えば、酵素によって産生される産物は、フィードバック阻害を経由して酵素の活性を調節するために作用し得る。酵素はまた、アロステリックな部位（すなわち、酵素の活性部位以外の部位）に結合するリガンドによって調節され得る。アロステリックな調節が急速な時間の応答（新しいタンパク質の誘導および合成について要求されるより短い時間、１０分未満）、ならびにバックグラウンドの要求における変化に対する酵素活性の調節（フィードバック調節）において重要であることが示唆される（Ｃｈｏｃｋ，Ｐ．Ｂ．，ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．，２７：３（１９８５）；Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１７：２２０（１９８２）；Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．およびＣｈｏｃｋ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，１３：５３（１９７８））。アロステリック調節は、細菌がそれらの環境を検出するために使用する主要な方法であり、既に合成されたタンパク質の活性の調節およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびリプレッサータンパク質の調節を介した新しいタンパク質合成を誘発することの両方による（Ｍｏｎｏｄ，Ｊ．，ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６：３０６（１９６３））。アロステリック調節は、多量体タンパク質（いくつかのサブユニットは、一致した様式で働く）に関連し得るか、および／または調節カスケード内に関連し得る：（１）異なる調節リガンドが活性に影響するために、より多くの部位を提供するために（２）応答の割合を拡大するために（３）応答の大きさを拡大するために、および／または（４）応答の感度を拡大するために、関連し得る（Ｃｈｏｃｋ，Ｐ．Ｂ．，ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．，２７：３（１９８５）；Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１７：２２０（１９８２）；Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．およびＣｈｏｃｋ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，１３：５３（１９７８））。
【００４０】
発現の調節は、別の代謝調節メカニズムを成す。小数のタンパク質をコードする一致した遺伝子のセットは、オペロンと呼ばれる同じ転写調節配列下で、しばしば組織化される。しかし、必要な順応できる変化が、多数のタンパク質の誘導を伴う場合、多くのこのようなオペロンはレギュロンに連結され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、後の刺激は、括弧内に示される多くのタンパク質を誘導する：（ａ）熱ショック（１７のタンパク質）、（ｂ）窒素飢餓、（５以上のタンパク質）（ｃ）リン酸塩飢餓（８２以上のタンパク質）、（ｄ）浸透ストレス（１２以上のタンパク質）、および（ｅ）ＳＯＳ応答（１７タンパク質）（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら．（編），第３頁，Ａｍｅｒ  Ｓｏｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ．，（１９８７）；Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．およびＶａｎ  Ｂｏｇｅｌｅｎ，Ｒ．Ａ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（編）．，第１３３４頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７）；Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｂ．およびＮｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（編），第１３１８頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７）；（ＶａｎＢｏｇｅｌｅｎ，Ｒ．Ａ．，ら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１１：１１３１（１９９０））；Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（編），第１３２６頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７））；（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｍ．Ｆ．ら，Ｃｅｌｌ，１４：７５３（１９８５）；およびＷａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｃ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（編），第１３４６頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７）を参照のこと）。従って、レギュロンは、細胞が、時折一致した様式で、特定の刺激に応答するために必要であるが、個々の調節に独立して応答するために、他の時必要である遺伝子を調節することを可能にする（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏ���ｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら．（編），第３頁，Ａｍｅｒ  Ｓｏｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，（１９８７））。
【００４１】
分解は、代謝を調節するための別の調節メカニズムである。ほとんどのタンパク質が、少なくとも安定した増殖の条件下で非常に安定であり、おそらく、細胞がそれらを作るためにとても高い犠牲を払うからである。しかし、幾人かの研究者は、不安定な（６０分以下の半減期を示す）限定されたクラスの細胞性タンパク質（細菌の指数関数的増殖の間に存在する合計のタンパク質の１０〜３０％）を観察した。このクラスのタンパク質は、任意の増殖ダウンシフトおよび指数関数的増殖の間の１０時間以内に迅速に回転するようである（Ｎａｔｈ，Ｋ．およびＫｏｃｈ，Ａ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６：６９５６（１９７１）；Ｓｔ．Ｊｏｈｎ，Ａ．Ｃ．およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４３：１２２３（１９８０））。少なくともこれらの不安定なタンパク質のいくつかは、エネルギーおよび栄養素がダウンシフトの間、タンパク質合成系のタンパク質（例えば、リボソームタンパク質）である（Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｄ．，ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６：４３９（１９８６））；Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，ら，Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，（１９８３）；Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｈ．Ｂ．およびＯｋａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０：４４２（１９７２））。この結論は、タンパク質合成タンパク質のユニットあたりのタンパク質合成の見かけの速度は、低い増殖速度で減少するが、しかし誘導酵素の始めの合成に必要な時間は、すべての増殖速度で一定であるという観察から引き出される（Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，ら，Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，（１９８３））。
【００４２】
異なる細胞状態および代謝の間の相互関係、およびメトミクスの焦点は、ゲノミクス（ｇｅｎｏｍｉｃｓ）とプロテオミクスとで異なるという事実が与えられ、本発明は、細胞内の細胞状態と生体分子のと間の相関関係の新しい洞察を得るためにメトミクス研究を利用する。
【００４３】
（コンピューターデータベースおよびバイオインフォマティクス）
生物学的サンプルから関連するおよび／または絶対的な存在比の種々の分子および高分子種を同定および／または定量するために記載された方法は、とりわけ、病的状態、疾患の素因（ｐｒｅｄｏｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、薬剤試験、治療的モニタリング、遺伝子疾患原因連結、免疫および生理学的状態の相関関係の同定と関連付けられる過剰の情報を提供する。これらの方法によって産生される大量の生データは、手動のレビューおよび高スピードのコンピューターを使用してプロセスする前のデータの無い分析に十分に適さないので、生体分子情報を指数付けおよび検索するためのいくつかの方法が提案されている。米国特許第６，０２３，６５９号および同第５，９６６，７１２号は、生体分子配列情報を保管するために関係のデータベースシステムを開示する。このシステムの様式は、配列が目録作成され、そして１以上のタンパク質機能階層に従って検索されることを可能にする。米国特許第５，９５３，７２７号は、フォーマットに情報を含む配列記録を有する関係のデータベースを開示する。このフォーマットは、部分的な長さのＤＮＡ配列の収集が、目録作製され、そして部分的な長さの配列の収集から全長配列を得るために１以上の配列決定プロジェクトとの関連に従って検索されることを可能にする。米国特許第５，７０６，４９８号は、キー配列と標的配列との間の類似度の程度に基づいて遺伝子データベース内の配列データ項目に類似の遺伝子配列を検索するための遺伝子データベース検索システムを開示する。米国特許第５，５３８，８９７号は、クローズネスオブフィット（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）測定を使用する実験的に誘導された質量スペクトルを有する予測質量スペクトルの比較によってコンピューターデータベース内のアミノ酸配列を同定するためにペプチドの質量分析フラグメンテーションパターンを使用する方法を開示した。米国特許第５，９２６，８１８号は、オンライン分析プロセシング（ＯＬＡＰ）として記載される多次元データ分析のための機能性を含む多次元データベースを開示する。ＯＬＡＰは、１より多い強化経路または次元に従って計画された、かつ実際のデータの強化を伴う。米国特許第５，２９５，２６１号は、ハイブリッドデータベース構造を報告する。このデータベース構造において、各データベース記録のフィールドは、２つのクラス、ナビゲーショナルデータおよびインフォメーショナルデータに分けられる。これらのクラスは、階層的なトポロジーマップに保存されたナビゲーショナルフィールドを有する。このトポロジーマップは、ツリー構造としてか、または２以上のこのようなツリー構造の混同として見られ得る。
【００４４】
上記データベース技術は、取り戻せる形態での組み込み、分析および目録作成ために必要な完全な解決、本明細書中で開示され、そして相関関係を提供するための分析方法よって得られる潜在的に有用な情報の富およびこのような情報と医学的条件などとの間の特徴的な連結を提供しない。
【００４５】
（タンパク質発現データベースの適用）
現存するタンパク質発現プロファイリング技術の限定された有用性は、タンパク質発現情報の小さなかつ不完全なデータベースを完全に得たが、この技術は、より高解像度のタンパク質発現データセットの理論的な使用であり、それらは新しい技術または改善された技術の点から利用可能になるとみなされている。
【００４６】
高分解能、高感度のタンパク質発現プロファイリング方法およびデータセットが当該分野で利用可能となった場合、診断、治療、薬剤開発、バイオセンサー開発、および他の関連した領域における顕著な進歩が可能である。例えば、多重疾患マーカーは、疾患条件および段階のよりよい確認のために同定され、そして利用され得る（米国特許第５，６７２，４８０号；同第５，５９９，６７７号；同第５，９３９，５３３号；および同第５，７１０，００７号を参照のこと）。細胞下の毒物学的な情報は、より直接の薬物構造および活性相関について産生され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，」ＩＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）を参照のこと）。細胞下の毒物学的情報はまた、生物学的センサーデバイスにおいて、化学曝露のあり得る毒物学的効果およびあり得るおとり（ｔｏｌｌｅｒａｂｌｅ）曝露閾値を予測するために利用され得る。（米国特許第５，８１１，２３１号を参照のこと）。
【００４７】
本発明は、組成物、方法、装置、および複数のポリペプチド種（例えば、細胞、組織、および細菌、植物および動物の器官）を含むサンプルからのハイスループット、高分解能および感受性タンパク質発現プロファイリングおよび関連局面のためのコンピューターに基づいたデータベースシステム、およびその使用を提供する。
【００４８】
本明細書中に議論される文献の引用は、もっぱら本適用の出願日前のそれらの開示のために提供される。発明前の効力によってこのような開示の日付を早めないために、本発明者らが表題を付けた承認として解釈されるものは本明細書中にはない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００４９】
（発明の要旨）
本発明は、生物学的な高分子（ポリペプチドを含む）を分離するための電気泳動方法および装置、質量分析を使用するポリペプチドの部分的配列または完全配列を決定するための方法、電気泳動方法と質量分析によるポリペプチド配列決定を組み合わせた方法、サンプル（１または複数）からタンパク質発現フィンガープリントデータセットを作製するために、上記を使用する方法、および種々の使用（診断、治療、薬剤発見、薬剤開発、バイオアッセイによる環境モニタリング、毒素定量化、バイオセンサー開発、遺伝子治療、薬理学的モニタリング、違法な薬剤試験、導入遺伝子、代謝工学、および本明細書中に記載されるか、または本明細書に存在する教示によって当業者に明白な関連する使用を含むが、これらに限定されない）のために上記タンパク質発現フィンガープリントデータセットを使用するためのコンピューターに基づいたデータベースクエリ（ｑｕｅｒｙ）および検索システムを提供する。本発明はまた、これらの方法、装置、組成物、およびコンピューター処理されたデータセット紹介および検索システムの各々の使用を提供する。
【００５０】
１つの局面において、本発明は、複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液からあるポリペプチドを分離し、そしてそのポリペプチド種を同定するための方法を提供し、この方法は、この複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液をキャピラリー電気泳動装置で電気泳動して、ポリペプチド種を分離および溶出し、それによりそのタンパク質種を、少なくとも１つの第１の生物物理的パラメーター（これはタンパク質種を識別する）に基づいて分離する工程；および溶出したポリペプチド種の質量分析フラグメンテーションにより、少なくとも１つの分離されたタンパク質種を同定するポリペプチド配列タグ（「ＰＳＴ」）を得る工程を包含する。この方法の変形物において、少なくとも２つのキャピラリー電気泳動法が、１つ以上の溶出されたポリペプチド種の質量分析フラグメンテーションの前に引き続いて使用される。この方法の変形物において、適切な質量分析標識が、質量分析フラグメンテーションの前にポリペプチドに共有結合される。この方法の変形物において、ＰＳＴは、溶出されたポリペプチド種のカルボキシおよび／またはアミノ末端配列のアミノ酸残基の少なくとも２つ、好ましくは、３または４個のアミノ酸残基を含む。この方法の一実施形態において、サンプル溶液中に存在するポリペプチド種の少なくとも７５％が、分離され、そしてＰＳＴ測定により同定される。この方法の一実施形態において、サンプル溶液中に存在する少なくとも５，０００個の固有ポリペプチド種が、分離され、そしてＰＳＴ測定により同定され；好ましくは７，５００以上の固有ポリペプチド種が分離され、そしてこの方法で同定され得る。この方法の一実施形態において、サンプル溶液中のポリペプチド種は、組織、器官または細胞集団のサンプルから得られる天然に存在するポリペプチドである。
【００５１】
１つの局面において、本発明は、細胞集団またはその抽出物を含むタンパク質を含むサンプルから、タンパク質発現プロフィールを得る方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：第１のキャピラリー電気泳動装置で、細胞集団から得られる複数のタンパク質種を含む溶液を電気泳動し、それによりこのタンパク質種を、少なくとも１つの第１の生物物理的パラメーター（これはタンパク質種を識別する）に基づいて分離する工程、この第１の電気泳動装置からの画分を溶出し、そしてこの画分を、別々に第２のキャピラリー電気泳動装置で電気泳動し、それによりこのタンパク質種を、少なくとも１つの第２の生物物理的パラメータ（これはタンパク質種を識別する）に基づいて分離する工程、およびこのタンパク質種を溶出し、そして質量分析フラグメンテーションにより、そのサンプルから複数のタンパク質種のＰＳＴを同定する工程。一実施形態において、サンプルから分離された少なくとも１，０００個のタンパク質が、ＰＳＴ測定により同定され；一実施形態において、サンプルから分離された少なくとも５，０００〜７，５００以上のタンパク質が、ＰＳＴ測定により同定される。変形物において、２つのサンプルが用いられ、第１のサンプルは標準（コントロールまたは正常）細胞集団由来であり、第２のサンプルは試験細胞集団由来であり；試験細胞集団は、例えば、以下であり得るが、これらに限定されない：標準細胞集団とは異なる組織型の細胞、標準細胞と同じ組織型の病理細胞、毒物学的または薬理学的薬剤に暴露されたが、標準細胞と同じ組織型を有する処理細胞、標準細胞と異なる継代レベルもしくは年齢、または複製潜在性を有する細胞、あるいは第１の細胞サンプルと第２の細胞サンプルとの間のタンパク質発現プロフィールの差異を確認しようとしている当業者に明らかな任意の他の変形物。一実施形態において、試験細胞集団は、推定腫瘍性病巣の生検であり、そして標準細胞集団は、同じ組織学的器官の非腫瘍性組織を明らかに取り囲む生検であり、この両方の生検はヒト患者、動物または植物（例えば、根頭癌腫）から得られる。
【００５２】
本発明は、タンパク質の混合物を分離するための様々な電気泳動法および装置を提供する。これらの方法は、複数のキャピラリー電気泳動法を連続して実施する工程を包含し、ここで、最初の方法以外の各方法についてのサンプルは、上記の工程由来のタンパク質のサブセット（例えば、上記の工程により分離したタンパク質を含む画分）のみを含む。電気泳動の間、溶出を制御するための様々な技術を使用することによって、これらの方法は、組織およびネイティブの細胞から得られるような複雑な混合物においてでさえ、タンパク質を分離し得る。様々な標識スキームおよび検出方法を利用して、特定の方法は、分離したタンパク質の各々の量についての定量的情報を提供し得る。このような情報は、特定の条件下で発現されるタンパク質が特徴付けおよび分類されるタンパク質のデーターベースの開発において使用され得る。異なる型の細胞または組織の間で差示的に発現されるタンパク質を同定するための比較研究はまた、本発明の方法と共に行われ得る。これらの方法はまた、診断的研究、構造活性研究、および代謝工学研究において使用され得る。
【００５３】
一般に、これらの方法は、複数の電気泳動法を連続して行う工程を包含する。一連の各方法は、複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動して、複数の分離したタンパク質を得る工程を包含する。電気泳動されるサンプルは、上記の一連の方法（サンプルが全てのタンパク質を含む初期のサンプルであるシリーズの第１の方法を除く）により同時に分離された複数のタンパク質のサブセットのみを含む。最後の電気泳動法により分離したタンパク質は、次いで、様々な技術を使用して検出される。
【００５４】
電気泳動法は典型的に、キャピラリー電気泳動法（例えば、キャピラリー等電点集束電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ））であるが、これらの方法は同様に、他のキャピラリー電気泳動法に受け入れられる。これらの方法の特定の順序は変わり得る。典型的に、これらの方法は、異なる特徴（例えば、サイズ、電荷、等電点）に基づいてタンパク質を分離する電気泳動法の組み合わせを利用する。
【００５５】
特定の方法において、タンパク質は標識され、その結果、分離されたタンパク質は容易に検出され、そしてシグナル対ノイズ比を増加する。また、標識化により、特定の方法が、最終の電気泳動方法から得られる分離されたタンパク質が定量化されるように実施され得る。定量化により、サンプル中、または異なるサンプル中のタンパク質の相対存在比が決定され得る。特定の方法において、タンパク質が標識される時期は、キャピラリーゾーン電気泳動による電気泳動の前になるように選択される。特定の残基を選択的に標識することによって、キャピラリーゾーン電気泳動の間のタンパク質の分解は増加され得る。
【００５６】
分離、定量および再現性は、様々な技術を利用して、電気泳動法の間、タンパク質の溶出を制御することによって高められる。用いられる特定の溶出技術は、部分的に、特定の電気泳動法に依存する。しかし一般に、水力学、塩可動化、ｐＨ可動化、および電気浸透流が、各電気泳動分離の最後に、分離されたタンパク質を制御的に溶出するために利用される。
【００５７】
いくつかの方法は、電気泳動分離後に、さらなる分析を提供する。このタイプの分析は変わり、そして例えば、赤外線分光法、核磁気共鳴分光法、ＵＶ／ＶＩＳ分光法、完全配列決定または部分配列決定を含む。特定の方法において、最終画分中のタンパク質は、分離されたタンパク質のそれぞれについて、少なくとも部分的な配列を決定する（すなわち、タンパク質配列タグを決定する）ために、質量分光法によりさらに分析される。
【００５８】
従って、特定の他の方法は、１つ以上のキャピラリー電気泳動法を実施する工程を包含し、この１つ以上の方法の各々は、（ｉ）キャピラリー内に含まれる電気泳動媒体中の複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動する工程、および複数の画分を取り除き、回収する工程を包含し、各画分は電気泳動工程の間に分離されたタンパク質を含む。一連の工程の各々は、タンパク質の元の混合物を含むサンプルを用いて行われる第１の電気泳動法以外、上記の電気泳動法において回収された画分由来のサンプルを用いて行われる。最後の電気泳動法を行う前に、最初のサンプル中のタンパク質が標識される（すなわち、標識工程が全ての電気泳動分離の前に起こる）か、または最後の電気泳動法の前に回収された画分中に含まれるタンパク質が標識される。最後の電気泳動法が実施され、そしてその最終方法を実施するために使用されたキャピラリー内またはそこから除去した分離されたタンパク質が、検出器で検出される。それ故、この検出器は最終方法で使用されたキャピラリー内の分離されたタンパク質を検出するように適合されるか、またはその分離されたタンパク質がキャピラリーから溶出されると、その分離されたタンパク質を検出するように、キャピラリーとラインで接続される。いくつかの場合において、検出されたタンパク質は定量化され、そして相対存在比を決定し、各分離されたタンパク質のタンパク質配列を確立するために、質量分光法によりさらに分析される。
【００５９】
１つの局面において、本発明は、タンパク質の一部を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）タンパク質をＣ末端またはＮ末端標識部分と接触させて、標識をタンパク質のＣまたはＮ末端に共有結合し、そして標識タンパク質を形成する工程；および
（ｂ）標識タンパク質を、質量分析フラグメンテーション法を使用して分析し、少なくとも２つのＣ末端または２つのＮ末端残基の配列を決定する工程、を包含する。
【００６０】
実施形態の一群において、この方法は、以下：
（ｃ）少なくとも２つのＣ末端または２つのＮ末端残基の配列を使用することによって、タンパク質を同定し、遺伝子配列データのデーターベースから予測タンパク質配列を検索する工程、をさらに包含する。
【００６１】
変形物において、この方法は、以下：
（ｄ）１つ以上の分離座標（すなわち、配列決定の前にタンパク質を分離するために使用される生物学的パラメーターの適切な値）、例えば、見かけの分子量、等電点、または電気泳動易動度を使用することによって、タンパク質をさらに同定する工程、をさらに包含する。
【００６２】
別の変形物において、この方法は、以下：
（ｅ）タンパク質の他の既知の生物学的または測定可能な生物物理的パラメータ（例えば、抽出される細胞または組織型、細胞下の局在化、全または部分アミノ酸組成、化学消化または酵素的消化から得られる任意のペプチドの質量）を使用することによって、タンパク質をさらに同定する工程、をさらに包含する。
【００６３】
変形物において、この方法は、反応性衝突気体の使用による、質量分析計における標識タンパク質の補助断片化をさらに包含する。代表的な反応性気体には、ヒドラジン、臭化シアン、過酸化水素、オゾン、および過酢酸が挙げられ得る。他の類似の反応性気体が当業者に明らかである。
【００６４】
別の変形物において、この方法は、イオン化ゾーンに高エネルギー物質を注入することによる、質量分析計での標識タンパク質の補助フラグメンテーションをさらに包含する。高エネルギー物質には、プラズマまたはコロナ放電において形成される過渡的成分、β放射体または電子ビームによる高エネルギー電子、５６０ｎｍの最小波長のレーザーまたは高強度光源による高エネルギー光子が挙げられ得る。他の高エネルギー物質が当業者に明らかである。
【００６５】
別の局面において、本発明は、タンパク質混合物中のタンパク質の一部を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）タンパク質混合物を、Ｃ末端またはＮ末端標識部分と接触させて、標識を、タンパク質のＣまたはＮ末端に共有結合して、標識タンパク質混合物を形成する工程；
（ｂ）この標識タンパク質混合物中の個々の標識タンパク質を分離する工程；および
（ｃ）質量分光法により、工程（ｂ）由来の標識タンパク質を分析して、少なくとも２つのＣ末端または２つのＮ末端残基の配列を決定する工程、を包含する。
【００６６】
実施形態の一群において、この方法は、以下：
（ｄ）少なくとも２つのＣ末端または２つのＮ末端残基の配列を、標識タンパク質の分離座標および配列のタンパク質末端位置と組み合わせて使用することによって、タンパク質を同定して、遺伝子配列データーのデーターベースから予測タンパク質配列を検索する工程、をさらに包含する。
【００６７】
上記の方法の各々において、イン−ソース（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ）フラグメンテーションによる非タンパク質分解性タンパク質配列決定法の使用は、従来のＭＳ／ＭＳ配列決定アプローチをこえる利点を提供する。１つの特定の利点は、タンパク質消化工程の排除および四極への低揮発性ペプチドイオンの蓄積の必要性の排除に起因する時間の節約である。別の利点は、質量スペクトルの低末端で作用することにより得られる改良された絶対的な質量精度に起因して、より少ない配列あいまい性が生じることである。さらに別の利点は、よりエネルギー性のイオン化条件を使用し、そして１つ以上の荷電基を標識フラグメントに付加することにより、より良いイオン化効率および対応する検出感度が生じることである。「かたい（ｈａｒｄ）」電荷からなる荷電基は、テトラアルキル−またはテトラアリール−アンモニウム、テトラアルキル−またはテトラアリール−ホスホニウム、Ｎ−置換ピリジニウム、あるいはテトラアルキル−またはテトラアリール−ボレート種のような永久的にイオン化された基である。荷電基はさらに、「やわらかい（ｓｏｆｔ）」電荷からなり、これはカルトキシレート、ホスホネート、スルホネート、アルキルアンモニウム、ピリジニウム種のような、プロトンを受容または供与して、イオン化されるイオン化可能基である。この方法は、連続したタンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を提供し、このＰＳＴは、遺伝子配列情報またはｍＲＮＡ配列情報を含むコンピューターデーターベースの問い合わせによる明白なタンパク質の同定のために使用され、ＰＳＴに対応する天然に存在するコード配列を確立するか、またはポリメラーゼ連鎖反応増幅または核酸ハイブリダイゼーション技術によるネイティブの細胞または組織サンプルから対応するｃＤＮＡを単離するのに有用な、Ｎ末端またはＣ末端核酸プローブを生成し得る。
【００６８】
本発明は、電気泳動分離およびその後のタンパク質の配列決定をする際、そのタンパク質の増加した定量のために適切な化学標識の同定および使用方法をさらに提供する。一実施形態において、単一の化学標識は：（ｉ）タンパク質上の１級アミノまたはカルボン酸官能基（Ｎ末端およびＣ末端を含む）と反応し、（ｉｉ）検出感度を上げ、そして（ｉｉｉ）質量分析器によるフラグメンテーションの間に生成するＮまたはＣ末端標識ペプチドフラグメントに固有の質量サインを提供する、基を含む。変形物において、この標識は、同位体的に異なる標識の混合物からなり得、その結果、固有の質量サインは、質量スペクトルにおいて単一の荷電状態の１つ以上の原子により分離される各ペプチドフラグメントにつき、２つ以上のピークからなる。別の変形物において、この固有の質量サイン成分および検出増加成分は、１つおよび同一であり得る。別の実施形態において、化学標識は、部分切断、および／またはタンパク質定量のためのその使用の後、かつタンパク質配列決定のためのその使用の前の付加により、改変され得る。１つの変形物において、標識の付加または切断は、最後のキャピラリー分離工程と質量分析器への注入との間の除去および移送の間、溶液中で行われる。別の変形物において、標識の付加または切断は、質量分析器におけるイオン化の間、気相で行われる。
【００６９】
本発明は、揮発性緩衝液および界面活性剤を最終キャピラリー電気泳動法に導入して、分離および質量分析検出法の直接結合を容易にする方法をさらに提供する。揮発性緩衝液は、質量分析器中のタンパク質またはペプチドのイオン化を妨害する揮発性有機化合物に対してプロトンを容易に受容または供与するアニオンおよびカチオンからなる塩である。例示的な例には、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、または炭酸水素アンモニウム、Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸アンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ピリジウム、およびＮ−モルホリノエタンスルホン酸ピリジウムが挙げられる。揮発性界面活性剤の例示的な例には、ドデシルスルフェート、および少なくとも５個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素の部分的にフッ素化またはペルフルオロ化されたカルボン酸、スルホン酸またはリン酸の、アンモニウム、ピリジニウム、テトラメチルアンモニウム、およびトリメチルアンモニウム塩が挙げられる。多くの他の例が当業者に明らかである。
【００７０】
本発明は、現在のＭＳベースのタンパク質配列決定技術に関連する多くの難点（例えば、イオン化の非効率およびフラグメント質量の不正確さを含む）を克服する。本発明の方法は、好ましくは、タンパク質分解または化学分解消化の必要性を排除するため、本発明の方法は、従来の方法を使用して得られ得る時間から有意に減少したタンパク質配列決定時間を提供する。さらに、配列決定されているタンパク質は、本発明の方法を使用して高度にフラグメンテーションされるため、イオン化効率および得られるフラグメントの揮発性は、親タンパク質のそれより高く、従って、従来の方法をこえて改良された検出感度を導く。
【００７１】
本発明は、タンパク質サンプル中の複数の異なるタンパク質を標識する方法を提供し、この方法は、タンパク質サンプルを、固有のイオン質量サイン成分、定量検出成分および反応性官能基を含む標識試薬と接触させて、標識を複数の異なるタンパク質の少なくとも一部分に共有結合する工程を包含する。好ましくは、このタンパク質サンプルは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも５０個、そしてさらにより好ましくは、少なくとも１００個の異なるタンパク質を含む。本明細書中で使用されるタンパク質サンプルは、好ましくは、生物学的サンプル（例えば、細胞、組織、細菌の体液および器官、植物、動物、ならびにヒト）由来である。
【００７２】
本明細書中で使用される標識試薬は、固有のイオン質量サイン成分、定量検出成分、および反応性官能基を有する。好ましい定量検出成分は、放射性同位体、蛍光残基および発光団から選択される。他の検出増強成分は、質量分析イオン化チャンバにおけるフラグメンテーション条件下で、正電荷または負電荷のイオン種を与える基である。適切な基には、４級アンモニウム、４級ホスホニウム、ならびに４級アリールおよびアルキルボレート基が挙げられる。好ましい反応性官能基は、１級アミンと反応性の官能基、およびカルボン酸と反応性の官能基から選択される。適切なアミン反応性基には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびイソチオシアネートが挙げられる。適切なカルボン酸反応性基には、カルボジイミド化学および無水物化学により結合した１級アミンが挙げられる。好ましい固有イオン質量サイン成分は、２０個の天然のアミノ酸のいずれかの残基質量に一致しないタンパク質フラグメントに質量を与える基である。さらに好ましい固有イオン質量サイン成分は、約１００原子から約７００原子のタンパク質フラグメントに質量を与える基である。さらに他の好ましい固有イオン質量サイン成分は、標識試薬にある比の安定同位体、好ましくは、2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、および37Ｃｌのような安定同位体を組み込む基である。より好ましくは、標識に組み込まれる安定同位体の数は、標識の同位体リッチの形態と標識の同位体が乏しい形態との間の、５〜２０原子の質量単位の差を与えるのに十分である。最も好ましくは、標識の同位体リッチの形態と同位体が乏しい形態の比は、ほぼ等モルである。
【００７３】
本発明は、目的の代謝物を精製および検出する際有用性を有する装置および方法を提供する。この精製および検出方法により、どのように目的の代謝物の様々なパラメーター（例えば、代謝物濃度および／またはフラックス）が、異なる細胞状態または異なる刺激への暴露の関数として変動するかを決定し得る。従って、これらの方法を使用して、特定の細胞状態または刺激に関連する代謝物をスクリーニングし得る。このような情報を使用して、異なる細胞状態および／または特定の刺激に対する応答に特徴的な代謝の「フィンガープリント」または「プロフィール」を開発し得る。この情報をまた使用して、メトミック（ｍｅｔｏｍｉｃｓ）データーベースを開発し得る。一旦、相関が確立されると、本発明の特定の方法を利用して、特定の状態についてスクリーニングし得る。例えば、いくつかの方法は、個体をスクリーニングして、それらの代謝プロフィールと疾患のある個体および／または健康な個体のものとの間の類似性に基づいて、特定の疾患を有するかまたはその危険のある個体を同定する。
【００７４】
より詳細には、本発明は、様々な分離方法を含む。特定の方法は、複数のキャピラリー電気泳動法を連続して実施する工程を包含する。一連の方法の各々は、複数の代謝物、および潜在的に目的の１つ以上の標的分析物を含むサンプルを、複数の分離された代謝物が得られるように電気泳動する工程を包含する。各方法において電気泳動されるサンプルは、サンプルが初期のサンプルであるシリーズの第１の方法を除く、このシリーズの直前に記載した方法により分離される複数の代謝物のサブセットのみを含む。最終の電気泳動法により分離された代謝物を含む画分は、標的分析物の存在を決定するために分析される。このシリーズ内のキャピラリー電気泳動法は、キャピラリー等電点集束電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動からなる群から選択される。
【００７５】
特定の局面において、本発明は代謝経路を分析するための様々な方法を提供する。特定の方法は、安定同位体で標識した基質を被験体に投与する工程を包含し、この基質中の同位体の相対同位体存在比は、基質の投与の前に知られている。次いで、被験体は、１つ以上の標的代謝物を形成するように、この標識基質を少なくとも部分的に代謝するのに十分な時間放置される。次いで、被験体から採取されたサンプル中の複数の標的分析物中の同位体の存在比が決定され、その結果、各標的分析物のフラックスについての値が確認され得る。フラックス値が決定される複数の標的分析物は、基質および／または１つ以上の標的代謝物のいずれかである。標的分析物中の同位体の存在比は、同位体リッチの同位体対より豊富な同位体の比（例えば、12Ｃ／13Ｃ、14Ｎ／15Ｎ、16Ｏ／18Ｏ、および34Ｓ／32Ｓ）を決定し得る分析器を使用して決定される。このような分析器の例には、質量分光器、赤外線分光器および核磁気共鳴分光器が挙げられる。
【００７６】
標的分析物中の同位体の存在比および対応するフラックス値を決定する前に、典型的に、標的分析物は、サンプル中の他の成分から少なくとも部分的に分離される。一般に、これは、複数の電気泳動分離法を連続して行うことによって達成され、その結果、１つの方法の後に得られる画分由来のサンプルは、引き続く電気泳動法に使用される。用いられる実際の電気泳動法は変わり得るが、典型的に、キャピラリー等電収点集束電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動を含む。いくつかの場合において、電気泳動法の分離および溶出条件は、１つ以上のクラスの代謝物（例えば、タンパク質、多糖類、炭水化物、核酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂肪、脂肪酸、および有機酸）について別の画分が得られるように制御される。標的分析物が属するクラスの成分を含む画分を簡単に分析し得るため、これは分析を簡単にする。
【００７７】
本発明はまた、被験体由来のサンプルが以前に得られた代謝経路を分析するための分析方法を提供する。このような例において、特定の方法は、被験体から得られるサンプル中に含まれる他の成分から、複数の標的分析物を少なくとも部分的に分離する工程を包含する。この標的分析物は、安定同位体で標識された基質、および／または被験体による基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝物を含む。各標的分析物のフラックス値は、被験体に投与される前の基質中の同位体存在比の知識から、および標的分析物中の同位体の存在比を決定することによって、決定される。
【００７８】
様々な細胞状態（例えば、特定の疾患）と関連する代謝物を同定するために代謝物をスクリーニングするための方法はまた、本発明に含まれる。特定のスクリーニング方法は、安定同位体で標識した基質を、試験被験体およびコントロール被験体に投与する工程を包含し、基質中の同位体の相対同位体存在比は知られており、そして試験被験体は研究中の疾患を有する。標識基質は、試験被験体およびコントロール被験体により少なくとも部分的に代謝されて、１つ以上の標識代謝物を形成する。投与および静置工程が行われる条件は、それらが試験被験体およびコントロール被験体について同一であるように制御される。サンプルは、試験被験体およびコントロール被験体から得られ、そして標的分析物中の同位体の相対存在比が決定されて、各標的分析物のフラックス値を得る。試験被験体およびコントロール被験体のフラックス値が比較され、試験被験体中の標的分析物のフラックス値、およびコントロール被験体の対応するフラックス値における差は、このような分析物が、研究されている疾患を潜在的に妨害することを示す。
【００７９】
サンプルが以前に入手された場合、特定のスクリーニング方法は、疾患を有する試験被験体由来のサンプルを分析する工程を包含し、このサンプルは、この試験被験体に投与される安定した同位体で標識した基質および／またはこの基質の被験体による代謝から得られる１つ以上の標的代謝産物を含み得る。この基質における同位体の相対的な同位体存在度は、投与の時点で既知であり、そしてこの分析する工程は、このサンプルにおける複数の標的分析物における同位体の同位体存在度を決定し、各々の標的分析物のフラックスについての値を決定する工程を包含する。この試験被験体における標的分析物についてのフラックス値は、コントロール被験体に対するフラックス値と比較され、フラックス値の差は、このような分析物がその疾患と関係があることを示す。
【００８０】
別の局面において、本発明は、疾患の存在についてスクリーニングするための方法を含む。これらの方法の確信は、安定な同位体で標識された基質を試験被験体に投与する工程を包含し、この基質における相対的な同位体の存在度は、既知である。十分な時間は、この標識された基質がこの試験被験体によって少なくとも部分的に代謝されることを可能し、その疾患に関連する公知の１つ以上の標的代謝産物を形成する。複数の電気泳動法は、この試験被験体から得られるサンプルにおける他の生物学的成分由来の複数の標的分析物を少なくとも部分的に分離するために連続して実行され、この標的分析物は、この基質および／または１つ以上のこの標的代謝産物を含む。この標的分析物のフラックス値は、この分析物における同位体の存在度から決定される。
【００８１】
この方法は、サンプルが提供される場合、単純化される。このような例において、特定の方法は、試験被験体由来のサンプルを分析する工程を包含し、このサンプルは、試験被験体に投与される安定な同位体で標識した基質および／またはこの基質のこの試験被験体による代謝から得られる１つ以上の標的代謝産物を含み、この基質における同位体の相対的な同位体存在度は、投与の時点で既知である。この分析する工程自体は、このサンプルにおける複数の分析物における同位体の存在度を決定し、各々の分析物のフラックスの値を決定する工程を包含し、この複数の分析物は、この基質および／または１つ以上の標的代謝産物を含む。各々の標的分析物について、この決定されたフラックス値は、同一の標的分析物の対応する参照フラックス値と比較され、疾患の試験被験体の危険度を評価する。この参照値は、健康状態または疾患状態の代表であり得る。
【００８２】
本発明は、細胞型、組織、または病理学的サンプルの高分解能タンパク質発現フィンガープリントを同定する方法を提供し、この方法は、細胞サンプルのタンパク質含有抽出物を得る工程およびこの抽出物を第１のキャピラリー電気泳動装置を用いて電気泳動する工程、そこからタンパク質含有画分を溶出する工程、第２のキャピラリー電気泳動装置でこのタンパク質含有画分を電気泳動する工程（またはそれを複数、平行して）、およびフラグメント質量分析法配列決定によってタンパク質の種類を同定し、複数のタンパク質の種類のＰＳＴを得る工程、ならびにそれによって得られたＰＳＴの集合を含むデータセット（またはフィンガープリント記録）を集計する工程を包含する。この方法のバリエーションは、タンパク質の種類の定量的検出およびデータセットを集計する工程を包含し、ここで第２のキャピラリー電気泳動から溶出した複数のタンパク質の種類の、相対的な存在度および／または絶対量は、ＰＳＴ同定を用いて相互作表される。代表的な実施形態は、最後のキャピラリー電気泳動の工程の前にタンパク質含有画分におけるタンパク質への質量分析法標識の付着を含む。バリエーションにおいて、２つより多いキャピラリー電気泳動の工程が用いられる；１つ実施形態において、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）は、第１のキャピラリー電気泳動であり、そして第２のキャピラリー電気泳動は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）またはキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）のいずれかである。この方法は、実質的に任意の代謝産物または代謝産物の集合（代謝産物フィンガープリント）が、タンパク質発現フィンガープリントに加えて、または、これの代わりに測定され得るように、改変され得る。このような改変において、このサンプルは、測定されるべき代謝産物の種類を含み、そしてこのサンプルにおける代謝産物の種類を定量するための検出および分離装置；代謝産物フィンガープリントを実行するための適切な装置および方法論が本明細書中に記載される。
【００８３】
タンパク質発現フィンガープリントは、特定の識別子（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（これは、ＰＳＴおよび／または電気泳動移動度データおよび／またはｐＩおよび／またはキャピラリー電気泳動によって確認可能な任意のその他の生物物理学的特性、および／または電気泳動前のこのサンプルの起源によって既知の任意のその他の生物物理学的特性、および／または任意のその他の測定可能な生物物理学的特性）を有する、各々の少なくとも１００個のタンパク質の種類のアレイ含み、必要に応じて、定量データを用いる相互作表を含み、これは、このサンプルにおける各々の種類の相対的存在度および／または絶対的存在度を示す。タンパク質発現フィンガープリント記録は、サンプル供給源を示すデータおよび必要に応じてその他の生物情報学的データ（病理学的状態、年齢、病歴など）に対して相互作表されたタンパク質発現フィンガープリントを含む。同様に、代謝産物フィンガープリントは、少なくとも３つの代謝産物（各々５，０００ダルトン未満の分子量）の種類のアレイを含み、そしてポリペプチドおよびポリヌクレオチド以外であり、各々の代謝産物は、相対的存在度または絶対的存在度、１つ以上のその他の測定される代謝産物との相対比、出現または消失の速度などを示すデータに対して相互作表される特定の識別子を有する。
【００８４】
バリエーションにおいて、本発明は、コンピューターデータベースを産生する方法を提供し、この方法は、コンピューター検索可能形態において各々のタンパク質発現フィンガープリント記録が得られる、タンパク質含有サンプルの供給源を特定するデータを用いて相互作表されるタンパク質発現フィンガープリント記録の集合を、分類するためのコンピューターおよびソフトウェアを含む。バリエーションにおいて、少なくとも１つの供給源は、病理学的障害でない既知の組織サンプル由来である。バリエーションにおいて、少なくとも１つの供給源は、既知の病理学的組織標本であり、例えば、ウイルスなどの感染因子を含む腫瘍性傷害または組織標本であるが、これらに限定されない。バリエーションにおいて、タンパク質発現フィンガープリント記録は、サンプルにおける各々のタンパク質の種類に関する少なくとも以下のパラメータを相互作表する：（１）特定の同定コード（これは、ＰＳＴおよび／または特徴的な電気泳動分離座標を含み得る）；（２）サンプル供給源；必要に応じて（３）このサンプルにおいて存在するタンパク質の種類の絶対量および／または相対量、必要に応じて（４）アミノ末端またはカルボキシ末端の翻訳後修飾の存在または非存在、および／または必要に応じて（５）タンパク質およびＰＳＴを同定するために用いられる元の電気泳動図および／または質量スペクトル。データベースは、複数のタンパク質発現フィンガープリント記録を含み、その各々は、１つのサンプルまたはその部分画分由来のタンパク質発現フィンガープリントを示す。
【００８５】
本発明はまた、コンピューターデータ保存装置におけるこのようなポリペプチドフィンガープリントの集合の保存および検索を提供し、これは、磁気ディスク、光学ディスク、光磁気ディスク、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＧＲＡＭ、ＳＤＲＡＭ、ＲＤＲＡＭ、ＤＤＲ  ＲＡＭ、磁気バブルメモリーデバイス、およびその他のデータ保存デバイスを含み得、これは、ＣＰＵレジスタおよびオンＣＰＵデータ保存アレイを含む。代表的には、このポリペプチドフィンガープリント記録は、磁化可能媒体上で磁気ドメインのアレイにおいてビットパターンとしてか、または荷電状態またはトランジスタゲート状態のアレイとして（例えば、ＤＲＡＭデバイスにおけるセルのアレイとして）保存される（例えば、各々のセルは、トランジスタおよび荷電保存領域で構成され、これは、このトランジスタ上であり得る）。本発明は、このような保存デバイスを提供し、そしてコンピューターシステムは、その上に建てられ、サンプル供給源を用いて相互作表される少なくとも１００個のタンパク質の種類の特定の識別子を含む、タンパク質発現フィンガープリント記録をエンコードするビットパターンを含む。本発明は、関連ポリヌクレオチド配列または関連ポリペプチド配列を同定する方法を提供し、この方法は、コンピューター保存デバイスまたはデータベースに保存してあるか、またはこれから検索されるＰＳＴ配列と少なくとも１つの他の配列との間のコンピューター比較を実行する工程を包含する；このような比較は、配列分析もしくは比較アルゴリズムまたはそのコンピュータープログラム実施形態（例えば、ＦＡＳＴＡ，ＴＦＡＳＴＡ，ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ）を含み得、そして／またはこの比較は、標本のポリヌクレオチドサンプルから決定される配列のプールにおけるＰＳＴ配列の相対量の比較であり得る。本発明はコンピューターシステムを提供し、本発明の方法によって得られる、少なくとも１００個のタンパク質発現フィンガープリント記録を有する、データベースをエンコードするビットパターンを有する保存デバイス、ならびに所定の遺伝子配列またはタンパク質配列に対する配列アラインメントおよび比較のためのプログラムを含む。本発明はまた、磁気ディスク（例えば、ＩＢＭ互換性（ＤＯＳ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９５／９８／２０００、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ、ＯＳ／２））のフロッピー（登録商標）ディスク、またはその他のフォーマット（例えば、Ｌｉｎｕｘ、ＳｕｎＯＳ、Ｓｏｌａｒｉｓ、ＡＩＸ、ＳＣＯ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、ＶＭＳ、ＭＶ、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈなど）のフロッピー（登録商標）ディスクまたはハード（固定化、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ）ディスクドライブを提供し、これは、タンパク質発現フィンガープリント記録をエンコードするビットパターンを含む；しばしば、このディスクは、本発明のタンパク質発現フィンガープリント記録以外の、ポリヌクレオチド配列および／またはポリペプチド配列をエンコードする少なくとも１つの他のビットパターンを含む（代表的には、コンピューター化配列分析、比較、または相対的定量化法において検索および処理に適切なファイルフォーマットにおいて）。本発明はまた、ネットワークを提供し、これは、データリンクを介してリンクされる複数のコンピューターデバイス（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）ケーブル（同軸または１０ＢａｓｅＴ）、電話線、ＩＳＤＮ線、ワイアレスネットワーク、光ファイバー、またはその他の適切なシグナル伝達媒体）を含み、これによって少なくとも１つのネットワークデバイス（例えば、コンピューター、ディスクアレイなど）は、本発明のタンパク質発現フィンガープリント記録をエンコードするビットパターンを含む磁気ドメイン（例えば、磁気ディスク）および／または荷電ドメイン（例えば、ＤＲＡＭセルのアレイ）のパターンを含む。本発明はまた、本発明のタンパク質発現フィンガープリント記録を伝送するための方法を提供し、これは、それを生成するために使用される方法論によって独特に決定され、この方法は、電子通信デバイス（例えば、モデム、ＩＳＤＮターミナルアダプター、ＤＳＬ、ケーブルモデム、ＡＴＭスイッチなど）上での電子シグナルを生成する工程を包含し、これによってこのシグナルは、それぞれ、タンパク質発現フィンガープリント記録を（自然の状態または暗号化されたフォーマットの状態で）エンコードするビットパターンか、本発明の方法によって得られる複数のタンパク質発現フィンガープリント記録を含むデータベースを含む。
【００８６】
本発明は、本発明の方法によって得られるタンパク質発現フィンガープリント記録のＰＳＴ配列のアレイおよびその他のデータ構造を含むデータベースに対してクエリポリペプチド配列またはクエリポリヌクレオチド配列を比較するため、およびクエリ配列に対する配列同一性の程度およびギャップの重要性に基づいてデータベース配列をランク付けするためのコンピューターシステムを提供する。中央プロセッサは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアライメントおよび／または比較のためのコンピュータープログラムをロードおよび実行するために初期設定される。少なくとも４個のアミノ酸または少なくとも１２個のヌクレオチドを含むクエリ配列は、Ｉ／Ｏデバイスを介して中央プロセッサに入力される。コンピュータープログラムの実行は、データファイルから配列データを検索する中央プロセッサを生じる。このデータファイルは、その記録のためのポリペプチド配列データを含む、タンパク質発現フィンガープリント記録またはその一部の二進法記述を含む。この配列データまたは記録およびこのコンピュータープログラムは、２次メモリーに伝送され得る。この２次メモリーは、代表的には、ランダムアクセスメモリー（例えば、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＧＲＡＭ、またはＳＤＲＡＭ）である。配列は、クエリ配列に対する配列同一性の程度に従ってランク付けされ、そして結果は、Ｉ／Ｏデバイスを介して出力される。例であって、そして本発明を限定するのでなく、中央プロセッサは、従来のコンピューターであり得る（例えば、Ｉｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）、ＰｏｗｅｒＰＣ、Ａｌｐｈａ、ＰＡ−８０００、ＳＰＡＲＣ、ＭＩＰＳ  ４４０００、ＭＩＰＳ  １００００、ＶＡＸなど）；プログラムは、市販または公のドメイン分子生物学ソフトウェアパッケージ（例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｄａｒｗｉｎ，ｂｌａｓｔｎ）であり得る；データファイルは、光学ディスクまたは磁気ディスク、データサーバー、メモリーデバイス（例えば、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＧＲＡＭ、ＳＤＲＡＭ、ＥＰＲＯＭ、バブルメモリー、フラッシュメモリーなど）であり得る；Ｉ／Ｏデバイスは、ビデオディスプレイおよびキーボード、モデム、ＩＳＤＮターミナルアダプター、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）ポート、パンチカード読み取り機、磁気ストリップ読み取り機、またはその他の適切なＩ／Ｏデバイスを含むターミナルであり得る。
【００８７】
本発明は、本発明の方法によって得られるタンパク質発現フィンガープリントデータベースに対してクエリポリペプチド配列またはクエリポリヌクレオチド配列あるいは問い合わせたタンパク質発現フィンガープリントを比較するため、ならびに発現されたタンパク質の種類の類似性の程度およびサンプルにおける相対的存在度および／または絶対的存在度に基づいてデータベース配列をランク付けするためのコンピュータープログラムを提供する。最初の工程は、クエリポリヌクレオチド配列またはクエリポリペプチド配列、あるいは本発明の方法によって得られるタンパク質発現フィンガープリント記録のインプットである（Ｉ／Ｏデバイスを介するインプット）。データファイルは、そのクエリに対する比較のためのタンパク質発現フィンガープリント記録の集合を検索するためにアクセスされる；この集合は、本発明の方法によって得られるタンパク質発現フィンガープリント記録を含む。個々にまたは集合的に配列またはタンパク質発現フィンガープリント集合のその他の相互作表される情報は、クエリ配列または問い合わせた発現記録に最適に一致される（例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム、もしくはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム、または当業者によって得られ得るその他の適切なアルゴリズムによって）。一旦、整列または一致されると、配列またはフィンガープリント類似性の割合は、各々の整列された配列または一致された配列において計算され、クエリ配列またはクエリフィンガープリントと比較してタンパク質発現フィンガープリント記録集合において各々の配列またはフィンガープリントについての類似性値を生じる。配列は、クエリ配列またはクエリフィンガープリントに対する配列同一性または加重一致の高い順にランク付けされ、従って記録の集合において最も一致したものに対する配列またはフィンガープリントの相対的なランク付けが作製される。決定がなされる：より大きな配列またはフィンガープリント記録が、このデータファイルに存在する場合、さらなる配列／フィンガープリントまたはそのサブセットが検索され、そしてこのプロセスが繰り返される；さらなる配列／フィンガープリントが、このデータファイルに存在しない場合、ランク付けされた配列／フィンガープリントは、Ｉ／Ｏデバイスを介され、それによってクエリ配列またはフィンガープリントに最適に一致され、そしてこれらと比較される、このデータファイルの配列／フィンガープリント中の配列／フィンガープリントの相対的なランキングが示される。
【００８８】
本発明はまた、上記のコンピューターシステムの使用を提供し、これは、以下を含む：（１）コンピューター、（２）本発明の方法によって得られるタンパク質発現フィンガープリント記録の集合をエンコードする保存されたビットパターン（これはこのコンピューター内に位置され得る）、（３）配列またはフィンガープリントの比較（例えば、クエリ配列またはフィンガープリント情報を含むデータファイル）および（４）アラインメントおよび比較のためのプログラム（代表的には、計算された類似性値に基づく比較の結果の順番を用いて）。１つの実施形態において、ニューラルネットワークパターン一致／認識ソフトウェアは、使用者による経験的データ入力を用いるバックプロパゲーションに基づいてフィンガープリント記録を同定および一致するために学習（ｔｒａｉｎ）される。記載されたコンピューターシステムおよび方法は、タンパク質発現フィンガープリントの集合に対するクエリタンパク質発現フィンガープリントの相対的な関係の同定を可能にする；好ましくは、全てのタンパク質発現フィンガープリント（クエリおよびデータベース）は、本発明の方法によって得られる。
【００８９】
本発明はまた、１つ以上の以下のような情報データに対して相互作表されるツリーベースの階層ナビゲーション領域か、そうでない階層ナビゲーション領域の形態において複数のタンパク質フィンガープリント記録および／または代謝産物フィンガープリント記録を含む、データベースを含むコンピューターシステムを提供する：医療記録、患者の病歴、患者の医学診断試験結果、患者の名前、患者の性別、患者の年齢、患者の遺伝子プロフィール、患者の診断関連群コード、患者の治療、日時、患者の生命徴候、患者の薬物アッセイの結果、患者の血縁関係の医学的情報、およびその他の患者の類似の医学的、生物学的、および生理学的な情報（これらから、タンパク質フィンガープリント記録および／または代謝産物フィンガープリント記録データを生成するために使用されるサンプルが得られる）１つの実施形態において、本発明の方法によって得られるタンパク質発現フィンガープリントおよび／または本発明の方法によって得られる代謝産物発現フィンガープリントを含む、ナビゲーション領域を有するハイブリッドデータ構造を有するデータベースを含むコンピューターシステムが、本明細書中に記載の医学的情報を含む、同一の記録または関連する記録の情報分野にリンクするために使用される；このデータ構造は、米国特許第５，２９５，２６１号（これは、本明細書中で参考として援用される）における概要に準拠し得る。
【００９０】
本発明はまた、所定の疾患または医学的状態、疾患に対する傾向、生理学的状態についての特有症候である、予測または所定のタンパク質発現プロフィール一致を有する、データベース記録を抜き出するために学習されたニューラルネットワークを使用するコンピューターおよびプログラムを含むコンピューターシステムを提供する。例示的な実施形態において、患者由来の血液サンプルまたは細胞サンプルは、本発明の方法に従って分析され、所定のタンパク質発現記録を提供し、この記録は、データベースクエリとして、学習されたニューラルネットワークに入力される。このニューラルネットワークは、タンパク質発現フィンガープリントデータ（ナビゲーション領域）と医学データ（情報領域）との間の相関的なニューラル関係を確立するために複数の所定のデータベース記録において予め学習されており、その結果、このクエリは、患者のタンパク質発現フィンガープリントを有する学習されたニューラルネットワークにおいて最も高い相関関係である医学状態を同定する。この方法は、あるいは、またはさらに、クエリ代謝産物プロフィール記録を、患者の代謝産物プロフィールフィンガープリントを有する学習されたニューラルネットワークにおいて最も高い相関関係である医学状態にリンクされるデータベース代謝産物プロフィールフィンガープリント記録にリンクする、学習されたニューラルネットワークを用いて代謝産物プロフィールフィンガープリント記録のデータベースを問い合わせるために血清、血液、またはその他の細胞サンプルから得られる所定の代謝産物プロフィールフィンガープリント記録を使用し得る。
【００９１】
本発明はまた、患者の血清、血液、またはその他の細胞サンプルから得られ、そして本発明の方法に従って分析されたタンパク質発現フィンガープリントデータセットを含む、１つの領域または複数の領域を有する記録を含むデータベースを使用する、コンピューターおよびプログラムを含むコンピューターシステムを提供し、そしてさらに症状、医学的状態、病歴、またはその他の異なる診断情報に関連する患者から得られたデータ（これらは、インターネットまたはその他のＴＣＰ／ＩＰあるいは関連するネットワークシステムへの回路を介して入力され得る）を含む、１つ以上の領域を有する記録を含むデータベースを使用する、コンピューターおよびプログラムを含むコンピューターシステムを提供する。
【００９２】
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）
複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液からポリペプチド種を分離し、そして該ポリペプチド種を同定するための方法であって、該方法は、該複数のポリペプチド種を含む該サンプル溶液をキャピラリー電気泳動デバイスで電気泳動してポリペプチド種を分離および溶出し、それによりタンパク質種を、タンパク質種を区別する少なくとも１つの第１の生物物理学的パラメーターに基づいて分離する工程；ならびに溶出されたポリペプチド種の質量分析フラグメンテーションにより、少なくとも１つの分離されたタンパク質種を同定するポリペプチド配列タグ（「ＰＳＴ」）を得る工程、を包含する方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、ここで該方法は、第２のキャピラリー電気泳動デバイスにおいて前記キャピラリー電気泳動デバイスから溶出されたポリペプチド種を電気泳動して、ポリペプチド種を分離および溶出し、それにより該タンパク質種を、タンパク質種を区別する少なくとも１つの第２の生物物理学的パラメーターに基づいて分離する工程、ならびに該工程の後、該工程により得られた該ポリペプチド種に対して質量分析フラグメンテーションを行う工程、をさらに包含する方法。
（項目３）
前記キャピラリー電気泳動デバイスが、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）デバイス、キャピラリーゾーン電気泳動デバイス（ＣＺＥ）、またはキャピラリーゲル電気泳動デバイス（ＣＧＥ）である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記キャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＩＥＦデバイスであり、そして前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスがＣＺＥデバイスまたはＣＧＥデバイスのいずれかである、項目２に記載のデバイス。
（項目５）
前記キャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＺＥデバイスであり、そして前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＩＥＦデバイスまたはＣＧＥデバイスのいずれかである、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記キャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＧＥデバイスであり、そして前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスがＣＩＥＦデバイスまたはＣＺＥデバイスのいずれかである、項目２に記載の方法。
（項目７）
項目２に記載の方法であって、ここで該方法は、第３のキャピラリー電気泳動デバイスで前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスから溶出されたポリペプチド種を電気泳動して、ポリペプチド種を分離および溶出し、それにより該タンパク質種を、タンパク質種を区別する少なくとも１つの第３の生物物理学的パラメーターに基づいて分離する工程、ならびに該工程の後、該工程により得られた該ポリペプチド種に対して質量分析フラグメンテーションを行う工程、をさらに包含する方法。
（項目８）
前記キャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＩＥＦデバイスであり、そして前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスがＣＺＥデバイスであり、そして前記第３のキャピラリー電気泳動デバイスがＣＧＥデバイスである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液が、標識されたポリペプチド種を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ポリペプチド種が、キャピラリー電気泳動の後で、かつ質量分析の前に標識される、項目１、２または７に記載の方法。
（項目１１）
前記標識が、検出可能な部分を含む、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
前記標識が、イオン質量サイン成分を含む、項目９または１０に記載の方法。
（項目１３）
前記標識が、イオン質量サイン成分および検出可能な部分を含む、項目９または１０に記載の方法。
（項目１４）
細胞型、組織または病理学的サンプルについての高分解能タンパク質発現フィンガープリントを同定するための方法であって、細胞サンプルのタンパク質含有抽出物を得る工程、および該抽出物を第１のキャピラリー電気泳動装置を用いて電気泳動する工程、該第１のキャピラリー電気泳動装置からタンパク質含有画分を溶出する工程、第２のキャピラリー電気泳動装置で該タンパク質含有画分を電気泳動する工程、または並行して複数の第２のキャピラリー電気泳動装置で該タンパク質含有画分を電気泳動する工程、およびフラグメンテーション質量分析配列決定によりタンパク質の種を同定して、複数のタンパク質種についてのＰＳＴを得る工程、およびそれにより得られたＰＳＴの集合を含む、データセットまたはフィンガープリント記録を集める工程を包含する、方法。
（項目１５）
項目１４に記載の方法であって、タンパク質種の定量的検出工程およびデータセットを集める工程を包含し、ここで前記第２のキャピラリー電気泳動から溶出された複数のタンパク質種の相対的存在量および／または絶対量が、ＰＳＴ同定と相互作表される、方法。
（項目１６）
コンピュータシステムであって、以下：
複数のフィンガープリント記録を含むデータベースであって、該フィンガープリント記録は、サンプル中の各種の相対的存在量および／または絶対的存在量を示す定量的データとともに相互作表される独特の識別子をそれぞれ有する少なくとも５０の分子種のアレイを各々含む、データベース、
ならびに、該データベースにおける該フィンガープリント記録のランク順の類似性を決定する際に使用するための、該データベースに対する１つ以上のクエリの選択を受容し得るユーザインターフェース、を備える、コンピュータシステム。
（項目１７）
項目１に記載の方法により生成された分離座標と相互作表されたＰＳＴを各々有する、少なくとも５０のタンパク質種のアレイを含むフィンガープリント記録を有する、項目１６に記載のコンピュータシステム。
（項目１８）
項目１に記載の方法により得られたＰＳＴを各々有する、少なくとも５０のタンパク質種のアレイを含むフィンガープリント記録を有する、項目１６に記載のコンピュータシステム。
（項目１９）
コンピュータデータベースを生成するかまたはコンピュータデータベースにアクセスするための方法であって、該コンピュータデータベースは、コンピュータで取出し可能な形態でタンパク質発現フィンガープリント記録の集合を格納するためのコンピュータおよびソフトウエアを備え、該タンパク質発現フィンガープリント記録が、タンパク質含有サンプルの供給源を提示したデータと相互作表され、該タンパク質含有サンプルから各々のタンパク質発現フィンガープリント記録が得られた、方法。
（項目２０）
前記供給源の少なくとも１つは、病理学的障害の無いことが既知である組織サンプル由来である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記供給源の少なくとも１つは、既知の病理学的組織標本である、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
タンパク質サンプル中の複数の異なるタンパク質を標識する方法であって、該方法は、該タンパク質サンプルを標識化剤と接触させる工程を包含し、該標識化剤は、独特のイオン質量サイン成分、定量的検出成分、および標識を該複数の異なるタンパク質の少なくとも一部に共有結合で連結するための反応性官能基を含む、方法。
（項目２３）
前記タンパク質サンプルが、少なくとも５つの異なるタンパク質を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記検出増強成分が、ナフチルアミン類、クマリン類、アクリジン類、スチルベン類およびピレン類からなる群から選択される蛍光団である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記検出増強成分が、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネート、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、９−イソチオシアナトアクリジン、アクリジンオレンジ、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド、およびベンゾオキサジアゾールからなる群から選択される蛍光団である、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
最初のサンプル中の複数のタンパク質を分離するための方法であって、該方法は以下：
一連の複数の電気泳動方法を実行する工程であって、各電気泳動方法が、
複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動する工程であって、それにより、複数の分離されたタンパク質が得られる工程を包含し、そして
ここで該電気泳動されたサンプルは、該一連の方法のうちの第１の方法を除いて、該一連の方法における直前の方法からの該複数の分離されたタンパク質のサブセットのみを含み、該第１の方法において該サンプルが該最初のサンプルである、工程；ならびに
最後の電気泳動方法から分離されたタンパク質を検出する工程、を包含する、方法。
（項目２７）
前記複数の電気泳動方法が、キャピラリー電気泳動方法である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記複数のキャピラリー電気泳動方法は、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動からなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記複数のキャピラリー電気泳動方法が、２つの方法であって、第１の電気泳動方法が、キャピラリー等電点電気泳動であり、そして第２の電気泳動方法が、キャピラリーゲル電気泳動である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
複数のキャピラリー電気泳動方法が２つの方法であり、第１の電気泳動方法が、キャピラリーゾーン電気泳動であり、そして第２の電気泳動方法が、キャピラリーゲル電気泳動である、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記複数のキャピラリー電気泳動方法が、３つの方法であり、第１、第２および第３の電気泳動方法が、それぞれキャピラリー等電点電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動である、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
項目２６に記載の方法であって、ここで
前記実行する工程が、前記電気泳動工程を複数回繰り返す工程をさらに包含し、各回において、前記一連の方法における直前の方法からの前記複数の分離されたタンパク質のサブセットのみを含む異なるサンプルを用い、それにより該異なるサンプルの各々について複数の分離されたタンパク質が得られ；そして
前記検出する工程が、前記最後の電気泳動方法からの前記異なるサンプルの各々からの分離されたタンパク質を検出する工程を包含する、方法。
（項目３３）
複数のタンパク質を分離するための方法であって、該方法は、以下：
一連の複数の電気泳動方法を実行する工程であって、ここで最後の方法の前の該方法が、
該電気泳動方法の間に分離されたタンパク質を含む複数の画分を抜き出して集める工程を包含し、そして
ここで各電気泳動方法が、第１の電気泳動方法を除いて、前の電気泳動方法で集められた画分からのサンプルを用いて行われ、該第１の電気泳動方法が、該複数のタンパク質を含むサンプルを用いて行われる、工程；
該最後の電気泳動方法を行う前に、該複数のタンパク質を標識する工程、または集められた画分中に含まれるタンパク質を標識する工程；ならびに
タンパク質に保有される標識を検出することにより、最後の電気泳動方法の間に利用される電気泳動媒体中に含まれるタンパク質を検出する工程であって、該最後の電気泳動方法が、最後から２番目の電気泳動方法において得られる１つ以上の画分からのサンプルを用いて行われる、工程、を包含する方法。
（項目３４）
前記検出工程が、検出器でタンパク質を検出する工程を包含し、該検出器は、前記最後の電気泳動方法の間に利用される前記電気泳動媒体を含有する分離キャビティ−と流体連絡している、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記複数の電気泳動方法のうちの１つが、キャピラリーゾーン電気泳動であり、そして前記標識する工程が、該キャピラリーゾーン電気泳動方法を行う前に行われる、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記複数の電気泳動方法のうちの１つが、キャピラリー等電点電気泳動であり、そして前記標識する工程が、キャピラリー等電点電気泳動方法に続いて実行される、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
複数のタンパク質を分離する方法であって、該方法は、以下：
１つ以上のキャピラリー電気泳動方法を実行する工程であって、該１つ以上の方法の各々が、
キャピラリー内に含まれる電気泳動媒体内に複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動する工程を包含する、工程；
複数の画分を抜き出して集める工程であって、各画分は該電気泳動工程の間に分離されたタンパク質を含有し、そして
ここで各方法が第１の電気泳動方法を除いて、前の電気泳動方法において集められた画分からのサンプルを用いて行われ、該第１の電気泳動方法が、該複数のタンパク質を含有するサンプルを用いて行なわれる、工程；
最後の電気泳動方法を行う前に、該複数のタンパク質を標識する工程、または集められた画分中に含有されるタンパク質を標識する工程；ならびに
最後のキャピラリーを用いて最後のキャピラリー電気泳動方法を行う工程であって、該最後の方法が、該最後のキャピラリー中にあるか、または該最後のキャピラリーから抜き出した、分離されたタンパク質を検出する工程を包含する、工程、を包含する、方法。
（項目３８）
前記１つ以上のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリー等電点電気泳動であり、前記最後のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリーゲル電気泳動である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記１つ以上のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリーゾーン電気泳動であり、そして前記最後のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリーゲル電気泳動である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記１つ以上のキャピラリー電気泳動方法が２つの方法であって、第１の方法が、キャピラリー等電点電気泳動であり、第２の方法がキャピラリーゾーン電気泳動であり、そして最後のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリーゲル電気泳動である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
最初のサンプル中の複数のタンパク質を分離するための方法であって、該方法は、以下：
一連の複数の電気泳動方法を実行する工程であって、各方法が、
電気泳動媒体中で、複数のタンパク質を含有するサンプルを電気泳動し、それにより該複数のタンパク質のサブセットを含有する画分が、物理的に、時間的に、または空間的に単離される工程を包含し、そして
ここで該電気泳動されたサンプルが、該一連の方法のうちの第１の方法を除いて、該一連の方法のうちの直前の方法の間に単離された画分から得られ、該第１の方法において、サンプルは、該最初のサンプルである、工程；ならびに
最後の電気泳動方法から単離されたタンパク質を検出する工程、を包含する、方法。
（項目４２）
複数のタンパク質を分離するための方法であって、該方法は、一連の少なくとも２つのキャピラリー電気泳動分離を実行する工程を包含し、ここで第２のキャピラリー電気泳動分離のためのサンプルが、第１のキャピラリー電気泳動分離の間に得られた画分であり、該画分が、該第１のキャピラリー電気泳動方法の間に電気泳動されたサンプル中に含まれる複数のタンパク質のサブセットのみを含む、方法。
（項目４３）
代謝経路を分析するための方法であって、該方法は、以下：
被験体に安定同位体で標識された基質を投与する工程であって、ここで該基質中の該同位体の相対的同位体存在量が既知である、工程；
該標識された基質が、該被験体により少なくとも部分的に代謝されて、１つ以上の標的代謝産物を形成させる工程；ならびに
該被験体由来のサンプル中の複数の標的分析物における該同位体の存在量を決定して、各標的分析物のフラックスについての値を決定する工程であって、ここで該複数の標的分析物が、該基質および／または１つ以上の該標的代謝産物を含む、工程、を包含する方法。
（項目４４）
前記検出する工程が、前記フラックス値を決定する工程の前に、前記サンプル中の他の生物学的成分から、前記標的分析物を少なくとも部分的に分離する工程を包含する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記分離する工程が、一連の複数のキャピラリー電気泳動方法を実行する工程を包含する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
項目４５に記載の方法であって、ここで前記キャピラリー電気泳動方法を実行する工程が、少なくとも１つの代謝産物のクラスについての別々の画分を生じ、ここで該代謝産物のクラスが、タンパク質、多糖類、炭水化物、核酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂肪、脂肪酸および有機酸からなる群から選択される、方法。
（項目４７）
項目４３に記載の方法であって、ここで前記決定する工程が、前記被験体から異なる所定の時点で複数のサンプルを得る工程、前記標的分析物を、前記サンプルの各々における他の生物学的成分から分離する工程、および各サンプル中に含有される前記標的分析物中の前記同位体の存在量を決定する工程であって、それにより各標的分析物中の該同位体の存在量についての複数の値が得られ、各標的分析物についてのフラックス値が、各標的分析物について決定された複数の存在量の値から決定される、工程を包含する、方法。
（項目４８）
代謝経路を分析するための方法であって、以下：
複数の標的分析物を、被験体から得られるサンプル中に含まれる生物学的成分から少なくとも部分的に分離する工程であって、該標的分析物が安定同位体で標識された基質および／または該被験体による該基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝産物を含み、そしてここで該基質中の該同位体の相対的同位体存在量が既知である、工程；ならびに
該サンプル中の複数の該標的分析物中の該同位体の存在量を決定して、各標的分析物のフラックスについての値を決定する工程、を包含する、方法。
（項目４９）
疾患と相関する代謝産物についてのスクリーニングのための方法であって、該方法は、以下：
該疾患を有する試験被験体由来のサンプルを分析する工程であって、該サンプルが、該試験被験体に投与された、安定同位体で標識された基質、および／または該試験被験体による該基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝産物を含み、該基質中の該同位体の相対的同位体存在量が、投与の時点で既知であり、そしてここで該分析工程が該サンプル中の複数の分析物における該同位体の同位体存在量を決定して、各分析物のフラックスについての値を決定する工程を包含し、ここで該複数の分析物が、該基質および／または１つ以上の該標的代謝産物を含む、工程；ならびに
該分析物についてのフラックス値を、コントロール被験体について得られた同じ分析物についてのフラックス値と比較する工程であって、ここで分析物についてのフラックス値における差は、このような分析物が該疾患と相関しているということを示す、工程、を包含する、方法。
（項目５０）
疾患の存在についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
試験被験体由来のサンプルを分析する工程であって、該サンプルは、該試験被験体に投与される、安定同位体で標識された基質、および／または該試験被験体による該基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝産物を含み、該基質中の該同位体の相対的同位体存在量が、投与の時点で既知であり、そしてここで該分析工程が、該サンプル中の複数の分析物中の該同位体の存在量を決定して、各分析物のフラックスについての値を決定する工程を包含し、ここで該複数の分析物が、該基質および／または１つ以上の該標的代謝産物を含む、工程；ならびに
各標的分析物について、該決定されたフラックス値を、該分析物についてのフラックス値の範囲と比較する工程であって、ここで該範囲は、該疾患と相関することが既知であり、そして標的分析物について決定されたフラックス値が、該標的分析物についての範囲内にある場合、該試験被験体が疾患を有するか、または該疾患にかかり易いということを示す、工程、を包含する、方法。
（項目５１）
項目１、１４、２２、２６，３３、３７、４１、４３、４８、４９、または５０に記載の方法を実行するための装置であって、以下：
少なくとも２つのキャピラリー電気泳動デバイスであって、共通プラットホームまたはフレームに固定され、かつ互いに液体連絡し、かつ質量分析計を有し、ここでサンプルは、第１のキャピラリー電気泳動デバイスに流入し、そして分析物の分離は、少なくとも第１の生化学的分離パラメーターに基づいて起こり、そして該分析物は、続いて第２のキャピラリー電気泳動デバイスに流入し、そして分析物の分離は、少なくとも第２の生化学的分離パラメーターに基づいて起こり、該第２の生化学的分離パラメーターが、該第１の生化学的分離パラメーターと異なり、そしてここで該分析物が続いて質量分析計に流入する、少なくとも２つのキャピラリー電気泳動デバイス、を備える装置。
（項目５２）
項目１、１４、１９、２２、２６、３３、３７、４１、４３、４８、４９、また５０に記載の方法、または項目５１の装置、または項目１６に記載のコンピュータシステムもしくはデータベースの使用。
本発明は、開示された方法、組成物、装置、ソフトウェア、およびそれによって得られる情報の使用を提供する。
本発明の性質および利点のさらなる理解は、本明細書および図面の残りの部分の言及によって明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、本発明の特定の方法を用いて利用され得る、代表的な電気泳動システムの１例の概略図である。
【図２】図２Ａは、本発明の特定の電気泳動方法を行うのに利用される、代表的な電気泳動システムの主なエレメントのいくつかの概略図である。図２Ｂは、本発明の特定の方法における電気浸透フローを制御するためにキャピラリーに挿入された多孔性プラグの配向を示す、キャピラリーの断面図である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、本発明の特定の電気泳動法を行うのに利用され得る、マイクロ流体デバイスの特定のエレメントの平面図である。
【図４】図４は、キャピラリーゾーン電気泳動による電気泳動の後に得られる、５つの未標識のタンパク質（ニワトリ卵白コンアルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ、炭酸脱水酵素ＩＩ、ウサギ筋肉ＧＡＰＤＨ、およびウシリボヌクレアーゼＡ）を含むサンプルのための電気泳動図である。吸光度は、２１４ｎｍでモニタされた。このタンパク質が未標識である、この特定の実験の条件下（実施例１を参照のこと）で、これらのタンパク質は分離されなかった。
【図５】図５は、図４に記載したのと同一の電気泳動条件下で、図４において列挙された５つのタンパク質についての電気泳動移動度のプロットである。
【図６】図６は、電気泳動移動度とｐＨ４．０でのタンパク質の予測される質量／電荷比との間の相関を示すプロットである。
【図７】図７は、キャピラリーゾーン電気泳動による電気泳動後に得られる、５つのスルホフェニルイソチオシアネート標識化タンパク質（ニワトリ卵白コンアルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ、炭酸脱水酵素ＩＩ、ウサギ筋肉ＧＡＰＤＨ、およびウシリボヌクレアーゼＡ）を含むサンプルの分離中に得られる電気泳動図である。吸光度は、２１４ｎｍでモニタされた。このタンパク質が標識される、この特定の実験の条件下（実施例２を参照のこと）で、これらの標識化タンパク質は部分的に分離された。
【図８】図８は、タンパク質（ニワトリ卵白コンアルブミン、ウシ血清アルブミン、およびウシ炭酸脱水酵素ＩＩ）を含むサンプルのＣＩＥＦによる分離中に得られる、電気泳動図である。
【図９】図９は、図７に示されるＣＩＥＦによる分離から得られる、画分（画分Ｆ）の電気泳動図である。
【図１０】図１０は、図７において示されるＣＩＥＦによる分離から得られる、画分（画分Ｇ）の電気泳動図である。
【図１１】図１１は、グリコーゲンホスホリラーゼＡタンパク質の低フラグメント化１２Ｖスペクトルを提供する。７００ａｍｕと４０００ａｍｕとの間で観察される多電荷質量ピークのゼロ電荷質量デコンボリューションは、ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｄａｔａ  ＥｘｐｌｏｒｅｒTMソフトフェアを用いて調製された。
【図１２】図１２は、ノズル電位の上昇とともにアセチル化ポリペプチド質量に対応するピークの相対的存在度の上昇を例示する。
【図１３】図１３は、グリコーゲンホスホリラーゼＡの２５０Ｖノズル電位に対応する実質的にフラグメント化した質量スペクトルの例を提供する。
【図１４】図１４は、ＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎペプチドの低フラグメント化１２Ｖスペクトルを提供する。７００ａｍｕと４０００ａｍｕとの間で観察される多電荷質量ピークのゼロ電荷質量デコンボリューションは、ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｄａｔａ  ＥｘｐｌｏｒｅｒTMソフトフェアを用いて調製された。
【図１５】図１５は、ノズル電位の上昇とともにＰＩＴＣ標識化ペプチドの質量に対応するピークの相対的存在度の上昇を例示する。
【図１６】図１６は、ＰＩＴＣ標識化Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの２５０Ｖノズル電位に対応する、実質的にフラグメント化したスペクトルの例を提供する。
【図１７】図１７は、ＩＭＢ標識化ペプチドフラグメントの質量から生成されるα−イオン（図１７）およびβ−イオン（図１８）に対応するピーク数が、約２００Ｖでの最大フラグメント化存在度を用いてノズル電位の上昇とともに相対的存在度において上昇することが明らかに観察されたことを例示する。
【図１８】図１８は、ＩＭＢ標識化ペプチドフラグメントの質量から生成されるα−イオン（図１７）およびβ−イオン（図１８）に対応するピーク数が、約２００Ｖでの最大フラグメント化存在度を用いてノズル電位の上昇とともに相対的存在度において上昇することが明らかに観察されたことを例示する。
【図１９】図１９は、陰イオン様式において得られる、ＳＰＩＴＣ標識化アポミオグロビン由来の質量スペクトルを示す。このノズル電位は、２５〜５０Ｖの増分で１２５Ｖの最小設定から３００Ｖの最大値まで上昇され（１分間の割り当てられた機器平衡時間を有する）、その後各々のノズル電位でスペクトルを集めた。総数３０の３秒のスペクトルは、各々のノズル電位での分析のために蓄積された。
【図２０】図２０は、２５０Ｖのノズル電位以上で生じる、β1イオン、α2イオン、β2イオン、α3イオン、およびβ3イオンの相対的存在度の上昇を示す。
【図２１】図２１は、陽イオン様式において得られる、Ｃ末端（２−アミノエチル）トリメチルアンモニウム標識化Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎペプチドから生成される二重荷電したｙ1〜7イオンの相対的存在度の上昇を示す。このノズル電位は、５０Ｖの増分で最小５０Ｖから最大３００Ｖまで上昇され（１分間の割り当てられた機器平衡時間を有する）、その後各々のノズル電位でスペクトルを集めた。総数６０の３秒のスペクトルは、各々のノズル電位での分析のために蓄積された。
【図２２】図２２は、本発明によって記載される共有結合化学標識の概略図である。
【図２３】図２３は、本発明によって包含される共有結合化学標識の例を描写する。
【図２４】図２４は、本発明の実施形態の進行工程を示す、説明図である。
【図２５】図２５は、予期されるタンパク質の質量分析法のフラグメント化パターンの概略図および本発明を用いて質量分析法のフラグメント化パターンからタンパク質配列を再構築する方法である。
【図２６】図２６は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｐｈｏレギュロンの遺伝子座マップである。ｐｈｏ調節コントロールのオペロンは、ゲノムの外に示される。このフォト遺伝子（４つの遺伝子を含むｃｒｅオペロンの一部）は、ゲノムの内側に示される。
【図２７】図２７は、リン酸不足の前およびその間に、Ｅ．ｃｏｌｉによって示される、アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）と全タンパク質合成速度を示す。リン酸不足の徴候は、３時間の直後に発生する。
【図２８】図２８は、指数関数的増殖（ＥＸＰ）の間、およびＥ．ｃｏｌｉのリン酸不足の間に、差動的に発現される５３タンパク質の時間的な発現を示す。
【図２９】図２９は、ノズル電圧（それぞれ、２７０Ｖ（上方のスペクトル）および１５０Ｖ（下方のスペクトル））の関数として、ＥＳＩ−ＴＯＦ装置のイオン化領域のウシリボヌクレアーゼＡのＭＳ誘導フラグメンテーションの能力の変化を示す。
【図３０−１】図３０は、Ｎ末端配列に適切な「ハード」または「ソフト」な正電荷の標識、ならびに本明細書、米国出願第０９／５１３，３９５号、同０９／５１３，４８６号および同０９／５１３，９０７号に記載される方法によるタンパク質のおよび増強した蛍光検出の例を提供する。
【図３０−２】図３０は、Ｎ末端配列に適切な「ハード」または「ソフト」な正電荷の標識、ならびに本明細書、米国出願第０９／５１３，３９５号、同０９／５１３，４８６号および同０９／５１３，９０７号に記載される方法によるタンパク質のおよび増強した蛍光検出の例を提供する。
【図３１】図３１は、Ｎ末端配列に適切な「ハード」または「ソフト」な正電荷の標識、ならびに本明細書、米国出願第０９／５１３，３９５号、同０９／５１３，４８６号および同０９／５１３，９０７号に記載される方法によるタンパク質のおよび増強した蛍光検出の例を提供する。
【図３２】図３２は、カルボジイミドによるＣ末端標識化に適切な化合物、ならびに本明細書、米国出願第０９／５１３，３９５号、同０９／５１３，４８６号および同０９／５１３，９０７号に記載される方法によって、タンパク質のＣ末端配列および増強した蛍光検出のための無水付着化学物質の例を提供する。
【図３３】図３３は、（Ａ）１３６．８８ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの代謝物比に対応する、質量スペクトルの１３６．８８ａｍｕ位置での数値に対する、１４２．９０ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）１３６．８８ａｍｕでの13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代謝物のフラックスである。
【図３４】図３４は、（Ａ）１５０．８７ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの代謝物比に対応する、質量スペクトルの１５０．８８ａｍｕ位置での数値に対する、１５６．８９ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）１５０．８７ａｍｕでの13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代謝物のフラックスである。
【図３５】図３５は、（Ａ）１５２．８８ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの代謝物比に対応する、質量スペクトルの１５２．８８ａｍｕ位置での数値に対する、１５２．９０ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）１５２．８８ａｍｕでの13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代謝物のフラックスである。
【図３６】図３６は、（Ａ）２８１．７７ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの代謝物比に対応する、質量スペクトルの２８１．７７ａｍｕ位置での数値に対する、２８７．７９ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）２８１．７７ａｍｕでの13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代謝物のフラックスである。
【図３７】図３７は、（Ａ）３２８．７６ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの代謝物比に対応する、質量スペクトルの３２８．７６ａｍｕ位置での数値に対する、３３４．７８ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）３２８．７６ａｍｕでの13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代謝物のフラックスである。
【図３８】図３８は、（Ａ）３３０．７６ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの代謝物比に対応する、質量スペクトルの３３０．７６ａｍｕ位置での数値に対する、３３６．７８ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）３３０．７６ａｍｕでの13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代謝物のフラックスである。
【図３９】図３９は、（Ａ）４９４．８４ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの代謝物比に対応する、質量スペクトルの４９４．８４ａｍｕ位置での数値に対する、５００．８６ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）４９４．８２ａｍｕでの13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代謝物のフラックスである。
【図４０】図４０は、（Ａ）２７８．８０ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に５．０２ａｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの代謝物比に対応する、質量スペクトルの２７８．８０ａｍｕ位置での数値に対する、２８３．８２ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）２７８．８０ａｍｕでの13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代謝物のフラックスである。
【図４１】図４１は、（Ａ）２８０．８０ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に５．０２ａｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの代謝物比に対応する、質量スペクトルの２８０．８ａｍｕ位置での数値に対する、２８５．８２ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）２８８．８０ａｍｕでの13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代謝物のフラックスである。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
（詳細な説明）
（定義）
他に定義されない場合、本明細書中で使用される、全ての技術および科学用語は、本願発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を一般に有する。一般に、本明細書中で使用される命名法および以下に記載される分子生物学、有機化学の実験手段は、当該分野において、周知であり、そして一般に使用されるものである。標準的な技術が、核酸およびペプチド合成に使用される。一般に、酵素反応および精製工程が、工業用指針書に従って実施される。この技術および手順は、当該分野において従来の方法および文書全体に渡って提供される種々の一般的参照（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  ＳＰｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）に従って、一般に実施される。本明細書において使用される命名法および分析化学の実験手順、ならびに以下に記載される有機合成は、当該分野で公知であり、そして使用されるものである。標準技術またはその改良は、化学合成および化学分析のために使用される。
【００９５】
本明細書中で参照される代謝化合物の種々のクラスの議論は、任意の一般的な生化学の教科書（この教科書としては、例えば、Ｖｏｅｔ，Ｄ．およびＶｏｅｔ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８１）；ならびにＷｈｉｔｅ，Ａ．ら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第６版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９７８）（これらの各々は、その全体が参考として援用される）が挙げられる）に見出され得る。
【００９６】
「核酸」は、単鎖または２重鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーである。
【００９７】
「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖または２重鎖のポリマーを言う。
【００９８】
本明細書中で使用されるように、用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、交換可能に使用され、そしてアミノ酸残基のポリマーを言う。一般的な概説のために、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ｉｎ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６７頁（１９８３）（これは、その全体が参考として援用される）。本明細書に使用されるように、２０種の従来のアミノ酸およびその略語は、従来の用法に従う（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（１９９１））。本明細書中で使用されるポリペプチドの表示法では、標準的な用法および慣習に従って、左側の方向は、アミノ末端方向であり、そして右側の方向は、カルボキシ末端方向である。
【００９９】
「炭水化物」は、多価アルコールのアルデヒドまたはケト誘導体を言う。この用語は、単糖類、寡糖類、および多糖類を含む。「寡糖類」および「多糖類」は、単糖類残基の縮合によって形成される。寡糖類は、比較的限定された数の単糖類残基を含み、代表的には、二糖、三糖、四糖および五糖を含む。多糖類は、同じ型（ホモ多糖類）または２以上の型（ヘテロ多糖類）の多くの単糖類の縮合によって形成される高分子量のポリマーである。多糖類の分子量は、百万ダルトンの範囲であり得る。炭化水素の特異的な例としては、グルコース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、スクロース、およびグリコーゲンが挙げられる。用語「単糖」は、代表的に、単糖類を言う。
【０１００】
用語「脂質」は、一般的に、非極性溶媒によって動物または植物の細胞から抽出される物質を言う。この分類に入る物質としては、脂肪酸、脂肪（例えば、モノ、ジおよびトリアシルグリセリド、ホスホグリセリド、スフィンゴリピド、ワックス、テルペンおよびステロイド）が挙げられる。脂質はまた、他のクラスの分子と組み合わされて、リポタンパク質、リポアミノ酸、リポ多糖類およびプロテオリピドが得られる。
【０１０１】
「脂肪酸」は、一般的に、片方がカルボン酸基で終結している長鎖の炭化水素（例えば、６〜２８個の炭素原子）をいうが、炭化水素の鎖は、２、３個の炭素長程度の短さであり得る（例えば、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸）。最も代表的には、炭化水素の鎖は、未分枝の非環式であり、そして偶数の炭素原子を含むが、いくつかの天然に存在する脂肪酸は、奇数の炭素原子を有する。脂肪酸の特定の例としては、カプロン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸が挙げられる。この炭化水素の鎖は、飽和または不飽和のいずれかであり得る。
【０１０２】
「脂肪」は、特定のクラスの脂質であり、そして脂肪酸とグリセロールとのエステルである。脂肪としては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリドおよびトリアシルグリセリドが挙げられる。
【０１０３】
「ヌクレオシド」は、Ｎ−グリコシル結合によってプリンまたはピリミジンに結合された糖の化合物（代表的には、リボースまたはデオキシリボース）である。
【０１０４】
「ヌクレオチド」は、窒素性塩基（代表的には、プリンまたはピリミジン塩基）が、Ｃ（１’）糖残基に連結されるペントース糖のリン酸エステルを言う。最も代表的には、ヌクレオチドは、リン基に結合したヌクレオシドである。
【０１０５】
用語「ステロイド」は、生体の代謝物の一部である、四環系のシクロペンタフェナントレン骨格を含む、大きなクラスの化合物を言う。特定の例は、コレステロールである。
【０１０６】
用語「化合物」または「成分」は、生体または細胞内に見出される分子量に関係い分子を言う。化合物または成分は、基質または代謝物と同じクラスの化合物由来であり得る。
【０１０７】
「有機酸」は、１以上のカルボン酸基を有する任意の有機分子を言う。有機酸は、変化する長さであり得、そして飽和または不飽和であり得る。有機酸の例としては、クエン酸、ピルビン酸、スクシン酸、リンゴ酸、マレイン酸、オキサル酢酸、およびケトグルタル酸が挙げられるが、これらに限定されない。有機酸は、カルボン酸基（例えば、ヒドロキシル、カルボキシルおよびホスフェートが挙げられる）に加えて、他の官能基を含み得る。
【０１０８】
本明細書において、物体に適用する際に使用する場合、用語「天然に存在する」とは、物体が天然に見出され得る事実を言う。例えば、天然の供給源から単離され得、そして実験室で人間によって意図的に改変されいない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。一般に、用語天然に存在するは、種に典型的であるような、非病理学的（所望されない）個体に存在するような物体を言う。
【０１０９】
用語「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、特異的に局在化した化合物のアレイ（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ、ポリヌクレオチドアレイ、および／またはコンビナトリアル小分子アレイ）、生物学的高分子、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリー、バクテリオファージ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディスプレイライブラリー、あるいはバクテリア、植物、真菌、または動物（特に哺乳動物）の細胞または組織のような生物学的物質から作製される抽出物を示すために、本明細書中において使用される。
【０１１０】
本明細書中で使用されるように、「実質的に純粋」は、存在する主な種であり（すなわち、モルを基準として、溶媒の種および金属イオンを除いて、組成物中で他の種よりもより豊富である種）、そして好ましくは、実質的に純粋なフラクションは、その物体の種が、存在する全ての種の中で少なくとも５０％（モルを基準として）を含む、組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての種の約８０％〜９０％を超えて含まれる。より好ましくは、この物体種は、本質的に均一（汚染種は、従来の検出方法によって、組成物中で検出され得ない）に精製される。ここで、この組成物は、本質的に単一の種からなる。
【０１１１】
本明細書中で使用されるように、「正常な血液」または「正常なヒトの血液」は、活性腫瘍性疾患またはリンパ球増殖の他の疾患、あるいは腫瘍性疾患を発生する同定された素因を有さない、健康なヒトの個体からの血液を言う。同様に、「正常な細胞」、「正常な細胞試料」、「正常な組織」、および「正常なリンパ節」は、活性腫瘍性疾患またはリンパ球増殖の他の疾患を有さない、健康なヒトの個体から得られるそれぞれの試料を言う。
【０１１２】
本明細書において使用されるような「特徴的濃度」、「特徴的量」、および「特徴的染色パターン」は、それぞれ、腫瘍性疾患（例えば、癌、肉腫、または白血病）の発生に対して、病理学的（例えば、腫瘍性、老齢化、免疫不全、神経変性、炎症など）状態または素因の存在を示す、試料中のタンパク質またはタンパク質フィンガープリント（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）の濃度、量、または局在化パターンを言う。特徴的量は、予想および／または遡及される統計学的な臨床研究によって確立される、正常な臨床学的な値の範囲を超える細胞または細胞の試料での、タンパク質またはタンパク質発現フィンガープリント特性の量である。一般に、腫瘍性疾患（例えば、癌、肉腫、または白血病）を有する個体は、正常で未疾患の個体に特徴付けられる濃度範囲を超える細胞または組織試料中で、予め決められたタンパク質、または適切なタンパク質発現フィンガープリントの量を示す。代表的には、この特徴的濃度は、平均的な正常値を超える、少なくとも約１つの標準偏差であり、より一般的には、その特徴的濃度は、平均的な正常値またはそれを超える、少なくとも約２つの標準偏差である。しかし、本質的に、全ての臨床診断試験は、偽陽性および偽陰性のいくらかの割合を生じる。診断アッセイの感度および選択性は、診断物および任意の関連する調節要求を満足するために十分でなければならない。一般に、本発明の診断方法は、疾患候補者のような個体を同定するために使用され、資格のある健康専門家によってなされる疾患の鑑別診断におけるさらなるパラメータを提供する。
【０１１３】
用語「統計学的相関」は、例えば、カイ２乗解析、ＡＮＯＶＡまたは多変量解析を含む、任意の統計学的試験によって測定されるような、２つの変数または２つのパラメータ間の統計学的な関連を言う。１つのパラメータ（例えば、代謝物のフラックスの値）と第２パラメータ（例えば、疾患状態）との間の相関は、偶然（Ｐ値）によって生じる結果の可能性が、予め決定されたレベル（例えば、０．０５）よりも低い場合、統計学的に有意であると考えられる。用語「統計学的に有意な差異」は、０．２５未満、好ましくは０．０５未満、そして最も好ましくは０．０１未満の統計学的に信頼あるレベルＰを言う。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、「生理学的状態」は、温度、ｐＨ、イオン強度、粘度、および生化学的なパラメータを言い、これは、生存可能な生物に適合性であり、そして／または代表的には、生存可能に培養された酵母菌または哺乳動物の細胞の細胞内に存在する。例えば、代表的な実験室の培養条件下で増殖した酵母菌の細胞内の状態は、生理学的状態である。インビトロ転写カクテルに対して、適切なインビトロ反応状態は、生物学的状態である。一般に、インビトロの生物学的状態は、５０〜２００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ６．５〜８．５、２０〜４５℃、および０．００１〜１０ｍＭの２価のカチオン（例えば、Ｍｇ++、Ｃａ++）；好ましくは、約１５０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ７．２〜７．６、５ｍＭの２価のカチオンを含み、そして、しばしば、０．０１〜１．０パーセントの非特異的タンパク質（例えば、ＢＳＡ）を含む。非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ，ＮＰ−４０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）は、しばしば、一般的に約０．００１〜２％、代表的に０．０５〜０．２％（ｖ／ｖ）で存在し得る。特定の水性状態は、従来の方法に従って、開業医によって選択され得る。一般的な指針として、以下の緩衝水溶液状態が、適切であり得る：１０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、５〜５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ５〜８（２価のカチオンおよび／または金属キレートおよび／または非極性界面活性剤および／または膜断片および／またはアンチフォーム（ａｎｔｉｆｏｒｍ）剤および／またはシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の最適な添加）。
【０１１５】
本明細書中で使用されるように、用語「マルチマー」は、ダイマーおよびより高次の複合体（トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマーなど）を含む。「ホモマルチマー」は、同じサブユニット種からなる複合体を言う。「ヘテロマルチマー」は、１個以上のサブユニット種からなる複合体を言う。
【０１１６】
用語「アルキル」は、分枝または非分枝の、飽和または不飽和の一価の炭化水素基を言及するために本明細書中に使用され、一般に、約１〜３０個の炭素、好ましくは、４〜２０個の炭素、より好ましくは、６〜１８個の炭素を有する。アルキル基が１〜６個の炭素原子を有する場合、これを「低級アルキル」と呼ぶ。安定なアルキル基は、例えば、１以上のメチレン基、メチン（ｍｅｔｈｉｎｅ）基および／またはメチン（ｍｅｔｈｙｎｅ）基を含む構造を含む。分枝構造は、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、２−エチルプロピルなどに類似した分枝モチーフを有する。本明細書中で使用される場合、この用語は、「置換アルキル」および「環式アルキル」を含有する。
【０１１７】
「置換アルキル」は、低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン（すなわち、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3））、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和および不飽和の環状炭化水素、複素環などのような１以上の置換基を含む、まさに記載されるようなアルキルを言及する。これらの基は、アルキル部分の任意の炭素または置換基に結合され得る。
【０１１８】
用語「アリール」は、芳香族置換基を言及するために本明細書において使用される。これは、一緒になって融合されるか、メチレンまたはエチレン部分のような共通の基に共有結合されるか、または連結される、単一の芳香族環または複数の芳香族環であり得る。この共通の結合基はまた、ベンゾフェノールのようなカルボニルであり得る。この芳香族環としては、とりわけ、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチルおよびベンゾフェノンが挙げられ得る。用語「アリール」は、「アリールアルキル」および「置換アリール」を含む。
【０１１９】
「置換アリール」は、１以上の置換基（例えば、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、フェノキシ、メルカプト、ならびに飽和および不飽和の環状炭化水素（これは、芳香族環に融合されるか、メチレンまたはエチレン部分のような共通の基に共有結合されるか、または連結される））を含む、まさに記載されるようなアリールを言及する。この連結基はまた、シクロヘキシルフェニルケトンのようなカルボニルであり得る。用語「置換アリール」は、「置換アリールアルキル」を含む。
【０１２０】
用語「アリールアルキル」は、「アリール」のサブセットを言及するために、本明細書において使用される。このアリール基は、本明細書中で定義されるようなアルキル基によって別の基に結合される。
【０１２１】
「置換アリールアルキル」は、「置換アリール」のサブセットを定義する。この置換アリール基は、本明細書中で定義されるようなアルキル基によって別の基に結合される。
【０１２２】
用語「アシル」は、ケトン基−Ｃ（Ｏ）Ｒを記載するために使用する。Ｒは、本明細書中で定義されるような、アルキルまたは置換アルキル、アリールまたは置換アリールである。
【０１２３】
用語「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素、およびヨウ素原子を言及するために本明細書中で使用される。
【０１２４】
用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨ基を言及するために本明細書中で使用される。
【０１２５】
用語「アミノ」は、−ＮＲＲ’に使用され、ここで、ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはその置換されたアナログである。「アミノ」は、２級アミンおよび３級アミンを意味する「アルキルアミノ」およびＲＣ（Ｏ）ＮＲ’基を意味する「アシルアミノ」を含む。
【０１２６】
用語「アルコキシ」は、−ＯＲ基を言及するために本明細書で使用される。Ｒは、アルキルまたその置換されたアナログである。適切なアルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどが挙げられる。
【０１２７】
本明細書において使用されるように、用語「アリールオキシ」は、炭素原子によって直接別の基に連結される芳香族基を意味する。この用語は、「置換アリールオキシ」部分を含み、芳香族基は、上記のように「置換アリール」で置換される。例示的なアリールオキシ部分としては、フェノキシ、置換フェノキシ、ベンジルオキシ、フェネチルオキシなどが挙げられる。
【０１２８】
本明細書中で使用されるように、「アリールオキシアルキル」は、本明細書で定義されるように、酸素原子を介してアルキル基に結合される結合される、芳香族基を定義する。用語「アリールオキシアルキル」は、「置換アリールオキシアルキル」部分を含み、ここで、芳香族基は、記載されるように「置換アリール」で置換される。
【０１２９】
本明細書中で使用されるように、用語「メルカプト」は、一般構造−Ｓ−Ｒの部分を定義する。ここで、Ｒは、本明細書中で記載されるように、水素、アルキル、アリール、または複素環である。
【０１３０】
用語「飽和環状炭化水素」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルなどのような基およびこれらの構造の置換されたアナログを意味する。このような環状炭化水素は、単環および多環構造であり得る。
【０１３１】
用語「不飽和環状炭化水素」は、シクロペンタン、シクロヘキサンなど、およびその置換されたアナログのような、少なくとも１つの２重結合を有する、一価の非芳香族基を記載するために使用される。これらの環状炭化水素は、単環または多環構造であり得る。
【０１３２】
本明細書において使用される、用語「ヘテロアリール」は、芳香族環の１以上の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄のようなヘテロ原子によって置換される、芳香族環を言及する。ヘテロアリールは、単一の芳香族環、複数の芳香族環、または１以上の非芳香族環に結合された１以上の芳香族環であり得る構造を言う。多環を有する構造において、この環は、一緒に融合されるか、メチルまたはエチル部分のような共通基に共有結合されるか、または連結され得る。共通の連結基はまた、フェニルピリジルケトンのような、カルボニルであり得る。本明細書中において使用されるように、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、フランなどのような環、またはこれらの環のベンゾ融合アナログが、用語「ヘテロアリール」によって定義される。
【０１３３】
「ヘテロアリールアルキル」は、「ヘテロアリール」のサブセットを定義し、ここで、本明細書において定義されるようにアルキル基は、ヘテロアリール基を別の基に連結する。
【０１３４】
「置換へテロアリール」は、まさに記載されるようなヘテロアリールを言及し、ここで、ヘテロアリール核は、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプトなどのような１以上の官能基で置換される。従って、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、フランなどのような複素環式環の置換アナログ、またはこれらの環のベンゾ融合アナログは、用語「置換へテロアリール」によって定義される。
【０１３５】
「置換へテロアリールアルキル」は、上記のような「置換へテロアリール」のサブセットを言及し、本明細書中に定義されるようなアルキル基は、ヘテロアリールを別の基に連結する。
【０１３６】
用語「複素環」は、１〜１２個の炭素原子および環中に窒素、硫黄または酸素から選択される１〜４のヘテロ原子の、単環または複数の縮合環を有する、一価の飽和または不飽和の非芳香族基を記載するために本明細書中で使用される。このような複素環は、例えば、テトラヒドロフラン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどである。
【０１３７】
本明細書中に使用されるような用語「置換複素環」は、「複素環」のサブセットを記載する。ここで、複素環核は、１以上の官能基（例えば、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプトなど）で置換される。
【０１３８】
用語「複素環式アルキル」は、「複素環」のサブセットを定義する。ここで、本明細書に定義されるアルキル基は、複素環式基を別の基に連結する。
【０１３９】
（Ｉ．概要）
本発明は、ネイティブな細胞および組織サンプルからの複合体混合物におけるタンパク質の有意な分離を含む、タンパク質の分離を達成するための方法および装置を提供する。本発明は、規定された画分を得るための制御された分画技術を利用して一連で行われる複数の（典型的には、異なる）電気泳動方法を含む多次元電気泳動法が、タンパク質の高分離を達成するために使用され得るという認識に一部基づく。バリエーションにおいて、標識化および検出工程が、感受性を高めるため、および分離されたタンパク質についての正確で、再現可能な定量的な情報を得るために含まれ得る。別のバリエーションにおいて、緩衝系は、溶出液を引き続く質量分光学的分析に適合させるために、揮発性の塩、有機溶媒、および短命の（ｅｐｈｅｍｅｒａｌ）界面活性剤の使用によって、最後の分離工程において変更され得る。典型的には、電気泳動方法が、キャピラリー電気泳動方法、特に、キャピラリー等電点（ＣＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）の組み合わせである。
【０１４０】
いくつかの特徴によって、本方法が、制御され、再現性の様式で実施され得る。例えば、一旦、タンパク質が、キャピラリーに含まれる電気泳動媒体において分画するための機会を有すると、溶出条件があつらえられ（ｔａｉｌｏｒ）、その結果、分離されたタンパク質が、画分に含まれるタンパク質が、例えば、特定のｐＨ範囲、電気泳動移動性範囲、または分子量範囲内に入る規定された画分を得るための制御された様式で溶出される。特定の方法において、タンパク質を分離プロセスの選択された段階で標識し、標識されたタンパク質が、検出器を使用して検出される。標識化は、低濃度で存在するタンパク質をより容易に検出することを可能にし、信号対ノイズ比を増加させることによって再現性を増加する。検出器は、タンパク質を、電気泳動キャビティー内において分離されるとき、またはそれらがキャビティーから溶出されたのちに検出するために使用され得る。標識化および検出の組み合わせはまた、分離されたタンパク質の定量化を可能にする。バリエーションにおいて、標識化部分は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に共有結合を与える成分、タンパク質の検出可能性を増加する少なくとも一つの成分、および必要に応じて、質量分光分析器においてタンパク質、またはタンパク質の標識されたペプチドフラグメントに対して独特の質量サインを与える成分からなる。
【０１４１】
さらなる情報が所望される場合、本方法は、電気泳動以外の技術によるさらなる分析を含むために拡張され得る。例えば、特定の方法のバリエーションにおいて、最終電気泳動方法から集められた画分は、さらなる情報（例えば、分子量、および部分配列、化学的または酵素的に誘導されるペプチドの質量、および全アミノ酸組成または部分アミノ酸組成）を得るために質量分光法によって個々に分析される。バリエーションにおいて、最初のサンプルは、硫酸アンモニウム沈澱、細胞分画、またはクロマトグラフィー手段（例えば、逆相、サイズ排除、アフィニティーおよびイオン）によって分画される。さらなるバリエーションにおいて、本方法に対するそれぞれの拡張のもとにある生物学的または生物物理学的なパラメーターは、分離パラメーターとして組み込まれ得、本発明によって分離される任意のタンパク質種を利用し得、そして／またはこのようなタンパク質種のデータベースにおける方法によって分離されたタンパク質種の記載に注釈を付け得る。
【０１４２】
定量的な検出および本方法を自動化する能力は、本方法が、種々のスクリーニング、比較研究および診断研究に受け入れらることを意味する。例えば、本方法は、比較タンパク質発現データを開発するために利用され得る。このような比較研究は、特定の疾患のマーカー、医薬品および／または薬剤候補に対する潜在的な標的を同定するために利用され得る。一旦、例えば、特定の疾患において選択的に発現されるマーカーが同定されると、本発明の方法は、診断用途において利用性を有する。バリエーションにおいて、本方法は、小型化された分離および検出デバイスに組み込まれ得、ここで、複数のキャピラリー電気泳動方法が、診断目的のために１つ以上のタンパク質マーカーを分離、検出、および定量化するために使用される。本発明の方法はまた、異なる細胞、組織または生理学的な状態から得られるタンパク質についての、例えば、等電点、見かけの分子量および相対的な存在比の情報および部分的または完全なタンパク質配列情報を含むタンパク質データベースを開発するために利用され得る。本方法はまた、構造／活性関係についての研究、および特定の遺伝子を遺伝的に改変し、次いで、このような改変が細胞のタンパク質発現に対してどのような効果を有するかを決定する代謝操作調査における有用性を見出す。
【０１４３】
（ＩＩ．分離方法）
（要約）
本発明は、タンパク質の混合物を分離するために種々の電気泳動方法および装置を提供する。本方法は、複数のキャピラリー電気泳動方法を一連で行う工程を包含し、ここで、最初の方法以外のそれぞれの方法に対するサンプルが、先の工程から（例えば、先の方法からの分離されたタンパク質を含む画分から）タンパク質のサブセットのみを含む。電気泳動の間の溶出を制御するための種々の技術を使用することによって、本方法は、組織およびネイティブな細胞から得られるような複合体混合物においてさえタンパク質を分離し得る。種々の標識化スキームおよび検出方法を利用して、特定の方法が、分離されたタンパク質のそれぞれの量についての定量的な情報を提供し得る。このような情報は、特定の条件下で発現されるタンパク質が、特徴付けられ、目録を作られるタンパク質データベースの開発において使用され得る。異なるタイプの細胞または組織の間で示差的に発現されるタンパク質を同定するための比較研究はまた、本発明の方法を用いて行われ得る。本方法はまた、診断、構造活性および代謝操作研究において使用され得る。
【０１４４】
一般的に、本方法は、一連で複数の電気泳動方法を実施する工程を包含する。一連のそれぞれの方法は、複数の分離されたタンパク質を得るために複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動する工程を包含する。電気泳動されるサンプルは、一連の直前の方法由来の複数の分離されたタンパク質のサブセットのみを含む（サンプルが全てのタンパク質を含む最初のサンプルである一連のうちの最初の方法である場合を除く）。次いで、最後の電気泳動方法からの分離されたタンパク質は、種々の技術を使用して検出される。
【０１４５】
電気泳動方法は、典型的に、キャピラリー電気泳動方法、例えば、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）であるが、本方法は、他のキャピラリー電気泳動方法も受け入れられる。本方法の特定の順序は変化し得る。典型的には、本方法は、異なる特徴（例えば、サイズ、電荷、等電点）に基づいてタンパク質を分離する電気泳動方法の組み合わせを利用する。
【０１４６】
特定の方法において、タンパク質は、分離されたタンパク質をより容易に検出するために、タンパク質の電荷を変化させるために、それらの分離を容易にするために、そして／または信号対ノイズ比を増加するために標識化される。標識化はまた、特定の方法が、最後の電気泳動方法から得られた分離されたタンパク質が定量化されるように行われることを可能にする。定量化は、１つのサンプル中のタンパク質の相対的な存在比、または異なるサンプル中のタンパク質の相対的な存在比が決定されることを可能にする。特定の方法において、タンパク質が標識化される時間は、キャピラリーゾーン電気泳動による電気泳動に先立つように選択される。特定の残基を選択的に標識化することによって、キャピラリーゾーン電気泳動の間のタンパク質の分離が増加し得る。
【０１４７】
分離、定量化および再現性は、電気泳動方法の間のタンパク質の溶出を制御するための種々の技術を利用することによって、高められる。使用される特定の溶出技術は、特定の電気泳動方法に一部依存する。しかし、一般的に、水力学、塩移動性、ｐＨ流動性（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）および電気浸透フローは、それぞれの電気泳動分離の最後において分離されたタンパク質を制御可能に溶出するために利用される。
【０１４８】
いくつかの方法は、電気泳動分離の後にさらなる分析を提供する。分析のタイプは変化し得、これには、例えば、赤外分光法、核磁気共鳴分光法、ＵＶ／ＶＩＳ分光法、蛍光分光法、および完全なまたは部分的な配列決定が挙げられる。特定の方法において、最後の画分におけるタンパク質は、さらに分離されたタンパク質のそれぞれの少なくとも部分配列を決定するために（すなわち、タンパク質配列タグを決定するために）質量分光法によって分析される。
【０１４９】
従って、特定の他の方法は、１つ以上のキャピラリー電気泳動方法を実施する工程を包含し、１つ以上の方法のそれぞれが、（ｉ）キャピラリー内に含まれる電気泳動媒体内の複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動する工程、および（ｉｉ）複数の画分を取り除き収集する工程であって、それぞれの画分が、電気泳動工程の間に分離されるタンパク質を含む工程、を包含する。一連のそれぞれの方法は、先行する電気泳動方法において集められた画分からのサンプルを用いて行われる（タンパク質の元の混合物を含むサンプルで行われる最初の電気泳動方法の場合を除く）。タンパク質は、最後の電気泳動方法を行う前に標識化される。最初のサンプルのタンパク質のいずれかが、標識化される（すなわち、標識化が全ての電気泳動に先行する）か、集められた画分に含まれるタンパク質が、最後の電気泳動方法の前に標識化される。最後の電気泳動方法が行われ、そして最後の方法を行うために利用されるキャピラリー内の分離されたタンパク質またはそこから除去された分離されたタンパク質が、検出器で検出される。従って、検出器は、最後の方法で使用されるキャピラリー内の分離されたタンパク質を検出するために適合されるか、または分離されたタンパク質がキャピラリーから溶出するとき、分離されたタンパク質を検出するためにキャピラリーとインラインで接続される。いくつかの場合において、検出されたタンパク質は定量化され、そしてさらにそれらの相対的な存在比を決定するために、そして／またはそれぞれの分離されたタンパク質のタンパク質配列タグを確立するために質量分光法によって分析される。
【０１５０】
本発明は、ネイティブな細胞および組織サンプルから複合体の混合物中のタンパク質の有意な分離を含む、タンパク質の分離を達成するための方法および装置を提供する。本発明は、規定された画分を得るための制御された分画技術を利用して一連で行われる複数の（典型的には、異なる）電気泳動方法を含む多次元電気泳動法が、タンパク質の高分離を達成するために使用され得るという認識に一部基づく。標識化および検出工程は、感受性を増加するため、タンパク質の分離座標を変えるため、そして分離されたタンパク質についての正確で再現可能な定量的な情報を得るために含まれ得る。典型的には、電気泳動方法は、キャピラリー電気泳動方法、特に、キャピラリー等電点（ＣＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）の組み合わせである。
【０１５１】
いくつかの特徴によって、本方法が、制御され、再現性の様式で実施され得る。例えば、一旦、タンパク質が、キャピラリーに含まれる電気泳動媒体において分画するための機会を有すると、溶出条件があつらえられ、その結果、分離されたタンパク質が、画分に含まれるタンパク質が、例えば、特定のｐＨ範囲、電気泳動移動性範囲、または分子量範囲内に入る規定された画分を得るための制御された様式で溶出される。特定の方法において、タンパク質を分離プロセスの選択された段階で標識し、標識されたタンパク質が、検出器を使用して検出される。標識化は、低濃度で存在するタンパク質をより容易に検出することを可能にし、信号対ノイズ比を増加させることによって再現性を増加する。検出器は、タンパク質を、電気泳動キャビティー内で分離するとき、またはそれらがキャビティーから溶出されたのちに検出するために使用され得る。標識化および検出の組み合わせはまた、分離されたタンパク質の定量化を可能にする。標識化および分離の組み合わせは、タンパク質の正味の電荷または溶解性を変化し得、それらの分離座標、例えば、それらの分離順序、されらが集められる画分、および溶出時間の変化を引き起こす。
【０１５２】
さらなる情報が所望される場合、本方法は、電気泳動以外の技術によるさらなる分析を含むために拡張され得る。例えば、特定の方法において、最終電気泳動方法から集められた画分は、さらなる情報（例えば、分子量、および部分配列）を得るために質量分光法によって個々に分析される。
【０１５３】
定量的な検出および本方法を自動化する能力は、本方法が、種々のスクリーニング、比較研究および診断研究に受け入れらることを意味する。例えば、本方法は、比較タンパク質発現データを開発するために利用され得る。このような比較研究は、特定の疾患のマーカー、医薬品および／または薬剤候補に対する潜在的な標的を同定するために利用され得る。一旦、例えば、特定の疾患において選択的に発現されるマーカーが同定されると、本発明の方法は、診断用途において利用性を有する。本発明の方法はまた、異なる細胞、組織または状態のタンパク質についての、例えば、分離座標、等電点、見かけの分子量および相対的な存在比の情報を含むタンパク質データベースを開発するために利用され得る。本方法はまた、構造／活性関係についての研究、および特定の遺伝子を遺伝的に改変し、次いで、このような改変が細胞のタンパク質発現に対してどのような効果を有するかを決定する代謝操作調査における有用性を見出す。
【０１５４】
（一般的な分離方法）
本発明の方法は、タンパク質の混合物を分離するために一連で行われる電気泳動方法の組み合わせを利用する。本方法を、一連で行われると言う。なぜなら、それぞれの方法において電気泳動されるサンプルが、先行する方法において電気泳動されたタンパク質を含む溶液または画分由来であるからである（最初の電気泳動方法で電気泳動されるサンプルを除く）。本明細書中で使用されるように、用語タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは、相互に交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを示す。この用語はまた、一つ以上のアミノ酸が対応する天然のアミノ酸の化学的アナログ（翻訳後プロセス（例えば、グリコシル化およびリン酸化）によって修飾されるアミノ酸を含む）であるアミノ酸ポリマーに適用する。
【０１５５】
一連の電気泳動方法は、典型的には、一連のそれぞれの電気泳動方法について適用されるサンプルのタンパク質が、物理的、時間的または空間的に単離または分離され、複数の画分（それぞれが、適用されたサンプルのタンパク質のサブセットのみを含む）を形成するような方法で行われる。従って、画分は、電気泳動に供されたサンプル中の他のタンパク質から物理的、時間的または空間的に分離された一つのタンパク質またはタンパク質の混合物を示す。分離されたタンパク質は、電気泳動方法の間に他のタンパク質から分離された単一のタンパク質種またはタンパク質の混合物を示し得る。ちょうど述べたように、種々の電気泳動方法におけるサンプルは、このような画分から得られる（サンプルが分離されるべき全てのタンパク質を含む元のサンプルである最初の電気泳動方法を除く）。
【０１５６】
典型的には、一連のこれらの複数の電気泳動方法は、異なる特徴に従ってタンパク質を分離する。例えば、一つの方法は、等電点に基づいてタンパク質を分離し得（例えば、キャピラリー等電点電気泳動）、他の方法は、任意の所与のｐＨにおけるそれらの本来のまたは誘導された（特定のイオン化可能なアミノ酸残基への標識の適用による）電荷対質量比の基づいてタンパク質を分離し得（例えば、キャピラリーゾーン電気泳動）、他の方法は、タンパク質のサイズに従って分離する（例えば、キャピラリーゲル電気泳動）。一連の電気泳動方法によりタンパク質を分離するこのようなアプローチは、本明細書において、「多次元」電気泳動法と呼ばれ、ここで、それぞれの特定の電気泳動方法が、「次元」を構成する。
【０１５７】
種々の電気泳動方法を実施するために使用される装置が当該分野において公知である。しかし、一般的に、図２Ａに示されるように、本発明の特定の方法に利用される典型的なキャピラリー電気泳動システムの基本的な構成は、２つの端部１０，１２を有するキャピラリー８を含む。１つの端部１０は、アノードレザバ１８に含まれるアノード溶液またはアノード液１４と接触し、他の端部１２は、カソードレザバ２０のカソード溶液またはカソード液１６と接触する。一つの電極（アノード２２）が、アノード溶液１４と電気的連絡にあるように配置され、第２の電極２４が、カソード溶液１６と電気的連絡にあるように配置される。キャピラリー８のキャビティー２６は、電気泳動媒体で充填され、ある場合には、ポリマーマトリクスを含み得る。本明細書中で使用される場合、用語アノードは、陽性に荷電した電極を示す。従って、陰性に荷電した種が、電気泳動媒体を通ってアノードに向かって動く。用語カソードは、陰性に荷電した電極をいい、陽性に荷電した種が、この電極に向かって移動する。
【０１５８】
サンプルが、入口２８を介してキャピラリー８に導入され、電場が電源３２によって２つの電極２２、２４の間に印加されるとき、そこでタンパク質成分が分離され、タンパク質が分離キャビティー２６内に含まれる電気泳動媒体内で分離する。タンパク質成分は、電気浸透フロー（下記を参照のこと）のような種々のパラメータ−を制御することによって、そして／またはレザバ溶液の１つまたは両方の組成を変える（例えば、ｐＨまたは塩濃度を調節する）ことによって出口３０を介してキャピラリーから制御可能に溶出され得る。典型的には、入口２８および出口３０は、単に、サンプル、アノード液またはカソード液を含む容器への容易な挿入を可能にするように形成されるキャピラリーの部分である。
【０１５９】
電気泳動が本発明の方法において行われる電気泳動デバイスを参照して使用される場合、用語「キャピラリー」は、便宜のために使用される。この用語は、電気泳動が行われる特定の形状のキャビティまたはデバイスに限定されると解釈されるべきではない。詳細には、キャビティは、円柱状の形状である必要はない。任意の電気泳動方法に関して本明細書中で使用される場合、用語「キャピラリー」は、少なくとも一つのセットの対向する面の間の内部寸法が、約２〜１０００ミクロン、より典型的には、２５〜２５０ミクロンである他の形状を含む。本発明の特定の方法に使用され得る非管状の配置の例は、Ｈｅｌｅ−Ｓｈａｗフローセルである。さらに、キャピラリーは、直線である必要はない；いくつかの場合において、キャピラリーは、例えば、らせん構成に巻かれる。
【０１６０】
本発明の特定の方法に利用されるシステムの例は、図１に示される。この特定の例は、３つの電気泳動方法（最初の方法、中間の方法、および最後の方法）が連結されるシステムを示す。行われる特定の数の電気泳動方法は、変化し得るが、本発明の方法は、少なくとも２つの電気泳動方法を含む。最も典型的には、本方法は、２または３の電気泳動分離方法を利用する。
【０１６１】
図１に示され得るように、複数のタンパク質を含む最初のサンプルが、当該分野で公知の多くの方法のいずれかを利用して、サンプル容器５０から第１のキャピラリー５４の第１の分離キャビティーに、サンプル入口５２を介して導入される。適切な方法の例としては、減圧下でサンプルをサンプル入口５２に引き込む（例えば、サンプル出口で減圧に引くことによる）工程またはサンプル容器５０を加圧することによってサンプルをサンプル入口５２に押し入れる工程を包含する。電気移動（しばしば、動電学注入と呼ばれる）は、別の選択肢である。一旦、最初のサンプルがサンプル入口５２に導入されると、サンプルは、第１のキャピラリー５４内の第１の分離キャビティー内で電気泳動される。第１の分離キャビティーは、最初のサンプル中のタンパク質が少なくとも部分的に分離される所望の電気泳動媒体を含む。分離されたタンパク質を含む電気泳動媒体は、第１のキャビティーから、典型的には、サンプルが導入される端部の反対の分離キャビティーの端部の外に除去されるが、他の除去部位が利用され得る（下記を参照のこと）。除去媒体は、出口５６を通って進行し、複数の画分として分離容器５８に集められる。図１Ｂに示されるように、画分が集められる容器５８は、典型的には、規定された画分（例えば、特定の容積の画分または選択されたｐＨ範囲をカバーする画分）を集めるために１セットの容器５８を自動的に進行させ得る画分収集デバイス（その一部が６０として示される）と関連する。
【０１６２】
次いで、第１の電気泳動方法から集められた画分由来のサンプルは、第２のサンプル入口６２を介して上記のような技術を再び利用して、複数の容器５８の１つから除去される。次いで、画分由来のサンプル中のタンパク質は、さらに、中間電気泳動方法（図１に示される例において、第２の電気泳動方法）を行うことによってさらに分離され得る。サンプルは、入口６２を介して第２のキャピラリー６４に導入され、そしてサンプル内のタンパク質は、さらに、第２のキャピラリー６４の第２の分離キャビティー内に含まれる電気泳動媒体内で分離され、次いで、出口６６を介してキャビティから溶出される。第一の電気泳動分離のように、分離されたかまたは部分的に分離されたタンパク質を含む電気泳動媒体は、容器６８内の分離画分が、典型的に第２の画分収集デバイス（その一部が７０として示される）によって整列し進行するとき集められる。
【０１６３】
第２／中間方法に類似したプロセスは、最後の電気泳動方法（図１に示される第３の電気泳動分離方法）の間に行われる。サンプルは、先行する方法の間に得られる画分を含む容器６８から入り口７２を介して引き込まれ、そして適用されるサンプルに含まれるタンパク質が、なおさらに電気泳動によって分離される第３の電気泳動媒体を含む第３のキャピラリー７４の第３または最後の電気泳動キャビティーに導入される。さらに単離されるタンパク質を含む第３の電気泳動媒体が、実質的に出口７６を通って除去される。
【０１６４】
上記のように、図１に示される３つの電気泳動方法より多くが実施され得る。このような方法は、基本的に、一回以上の第２／中間電気泳動分離に記載された一般的な工程を繰り返す工程を包含する。
【０１６５】
最後の電気泳動分離に続いて、分離されたタンパク質を分析するための種々の異なる選択肢が利用可能である。図１に示されるように、除去された電気泳動媒体は、分離されたタンパク質を検出するために最後のキャピラリー７４の分離キャビティと流体連絡する検出器７８を通って通過し得る。検出器７８または検出器からの信号を受信し得る任意の定量化デバイス（図示しない）は、電気泳動媒体の特定の部分または画分内のタンパク質の量を定量化するために使用され得る。
【０１６６】
あるいは、またはさらには、最終キャピラリー７４または検出器７８から抜け出している電気泳動媒体から画分を取り出し、そして電気泳動以外の同じ技術を用いて分析器８２により分析し得る。このような技術の例としては、種々の分光法（例えば、ＩＲ、ＵＶ／ＶＩＳおよびＮＭＲ）、および種々の質量分析法（例えば、エレクトロスプレーイオン化飛行時間計測式［ＥＳＩ−ＴＯＦ］質量分析）が挙げられる。質量分析データは、例えば、特定の画分内で、タンパク質の一部の配列または全配列を推論する（すなわち、タンパク質配列タグを決定する）ために利用され得る。図１は、サンプルがライン８０（破線で、この工程の至適性質を示す）を介して別の分析器８２（例えば、質量分析計）に排出される状況を示す。
【０１６７】
多数の他の形状が利用され得る。例えば、キャピラリーおよび検出器は、微小流体チップ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈｉｐ）（以下を参照のこと）内で製造され得る。
【０１６８】
分離キャビティ−から分離したタンパク質を排出するために利用される特定の溶出条件は、行われた電気泳動方法の型に依存し、そして本発明において代表的に利用されるそれぞれの電気泳動方法については、以下により詳細に記載されている。しかし、一般に、一旦、タンパク質が分離されれば、分離キャビティ−内の条件は、必要に応じて調節され（または初期条件が選択され）、このキャビティ−からのタンパク質の選択的溶出または制御された溶出を達成する。例えば、溶出は、カソード溶液またはアノード溶液に添加された塩により、もしくはその溶液のｐＨを調節することにより、電気浸透流を調節することにより、流体力学的圧力を加えることにより、または前述の組み合わせにより、達成され得る。
【０１６９】
本発明の方法を用いて、分離したタンパク質は、物理的に（例えば、図１に図示されるような異なる容器への配置）、空間的に（例えば、分離キャビティ−中に含まれる電気泳動媒体を通じた拡散）、および／または時間的に（例えば、異なる時点で、キャピラリーからのサンプル溶出内の異なるタンパク質のそのような溶出制御）、単離され得る。従って、本発明の方法は、溶出緩衝液の組成物の関数および／または時間としてタンパク質の混合物を分離し得、そして、特定の伝統的２次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動システムでそうであるように、タンパク質の空間的分離に限定されない。制御された溶出に代わって、画分が、収集され得、その結果、画分内のタンパク質は、例えば、ある範囲の等電点、電気泳動度、または分子量の内におさまる。タンパク質の制御された溶出は、この方法が再現可能な様式で実行され得ることを意味する。このような再現可能性は、例えば、比較試験を実施するにおいて、そして診断適用において、重要である。
【０１７０】
分離されたタンパク質の溶出または排出の間、一般に、分離したタンパク質を含む電気泳動媒体の一部のみが、代表的に任意の所定の画分中に収集される。これは、特定の２−Ｄ方法と対照的である。この方法では、全ての分離タンパク質を含むゲルを分離キャビティ−から滲出し、そして全てのタンパク質を含む滲出されたゲルを、別の電気泳動分離を実行するために用いる。
【０１７１】
１つの電気泳動方法の結果で得られた、空間的に、物理的に、または時間的に分離されたタンパク質を、次いで、引き続く電気泳動方法の間、この画分内に含まれる、タンパク質のさらなる分離のために、サンプルの供給源として、用いる。図１に示されるように、代表的には、異なる分離画分からのサンプルを、同じキャピラリー上で引き続き電気泳動する。通常は、異なる画分中に含まれるタンパク質の重複がないように、先行しているサンプル中のタンパク質が分離キャビティ−から実質的に排出されるまで、別のサンプルは加えない。同じカラムを通る画分の引き続く溶出は、特定のスラブゲル電気泳動方法において問題であり得る、架橋または電場強度中の差異から得られるバリエーションを有意に減少し得るか、または排除し得る。それ故、引き続く分離がさらに、本発明の方法の再現性を増強し得る。しかし、平行の様式で、他の方法が実行され得る。ここでは、異なる画分からのサンプルが、分離キャピラリー上で電気泳動される。このアプローチは、より迅速であることが意図されるべき分離を可能にする。しかし、複数のキャピラリーの使用により、分離条件の可変性が増大し得、これにより異なるサンプルの間の再現性をある程度まで減じる。
【０１７２】
特定の方法において、分離プロセスの選択された段階で、タンパク質を標識し、次いで検出器を用いて検出する。標識可能タンパク質は、低濃度で存在しても、より容易に検出され、そしてシグナル対ノイズ比を増大することにより再現性を増強する。検出器を用いて、電気泳動キャビティー内で分離される場合に、またはタンパク質がキャビティ−から溶出された後に、タンパク質を検出し得る。標識および検出の組み合わせはまた、定量されるべきタンパク質を分離し得る。標識が行われる方法全般における重要な点は、以下により詳細に議論されるように、一部は実行される特定の電気泳動方法に依存する。しかし、概して、ゲルキャピラリー電気泳動分離が行われる前に、標識は、代表的には行われる。しかし、通常、キャピラリー等電点電気泳動が行われた後、前にではなく、標識は、行われる。標識はまた、タンパク質上の正味の荷電およびその相対的電気泳動度を改変する手段として、ゾーンキャピラリー電気泳動分離が行われる前に用いられ得る。
【０１７３】
上記に注記されるように、本発明において利用されるいくつかのより通常に用いられる電気泳動方法は、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動である。これらの方法の実行に関する特定の論点は以下の節において記載される。
【０１７４】
（キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ））
（一般）
等電点電気泳動は、タンパク質のような両性イオン物質がその等電点（ｐＩ）に基いて分離される電気泳動方法である。ｐＩは、タンパク質のような両性種が、正味の荷電を有さず、従って、電場インヒビターに供されても動かない、ｐＨである。本発明において、タンパク質は、電場内で、両性電解質または他の両性物質を用いて生成されたｐＨ勾配内で分離され得る。アノードは、勾配の高いｐＨ側に配置され、そしてカソードは、勾配の低いｐＨ側に配置される。
【０１７５】
勾配内に導入されるタンパク質は、その等電点によりｐＨ勾配内に集中し、続いてそこに止まる。ＣＩＥＦを実行するための一般的方法は、例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，第４章、９５〜１０９頁（１９９４）；ならびにＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｈ．およびＴ．Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ，「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｐａｒｔ  Ｎｏ．２６６９２３（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，１９９４）；Ｗｅｈｒ，Ｔ．Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ−Ｄｉａｚ，Ｒ．，およびＺｈｕ，Ｍ．，「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９９）（その全体が参考として本明細書に援用されている）により記載されている。
【０１７６】
（システムおよび溶液）
ＣＩＥＦは、主に低電流密度を用いる平衡技術であり、キャピラリーの加熱は、代表的には問題ではない。従って、かなり大きいボア（ｂｏｒｅ）キャピラリーが利用され得る。適切なサイズとしては、２〜６００μｍの内径を有するキャピラリーが挙げられるがこれらに限定されない。しかし、より代表的には、２５〜２５０μｍの内径を有するキャピラリーが利用される。比較的大きいボアキャピラリーの使用は、この方法が比較的高いタンパク質負荷（これは、以下の寸法において検出を容易にする）を用い得ることを意味する。ＣＩＥＦのこの特徴は、このシリーズにおける最初のまたは１つの初期の電気泳動分離に十分適した方法をもたらす。しかし、より小さい直径のキャピラリーは、温度のより注意深い制御を可能にし、そしていくつかの方法において、改善されたシグナル検出を生じる（例えば、蛍光標識されたタンパク質のレーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）検出により）。
【０１７７】
このキャピラリーは、異なる長さを有し得る。選択された長さは、必要な分離の程度のような因子に一部は依存する。代表的には、キャピラリーは、約１０〜１００ｃｍの長さであるが、いくらか短いキャピラリーおよび長いキャピラリーが用いられても良い。キャピラリーが長いほど、代表的に、タンパク質混合物のより良好な分離および改善された分離を生じるが、キャピラリーが長いほど、また、タンパク質壁相互作用、およびより低い電場強度の機会を増大させる。結果的に、キャピラリーの長さの上限が存在するようであり、これを越えると分離が損なわれ得る。より長いキャピラリーは、低量のタンパク質を分離するにおいて特定の用途であり得る。キャピラリーのサイズおよび長さに対するさらなるガイダンスは、例えば、Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．およびＪ．Ａ．Ｎｏｌａｎ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐａｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｄｅｖｅｌｐｏｍｅｎｔ」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１３章、３２５〜３６８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９４）に記載されている。
【０１７８】
一般に、キャピラリーは、融合シリカから構成される。しかし、可塑性キャピラリーおよびＰＹＲＥＸ（登録商標）（すなわち、アモルファスガラス）が、特定の方法において利用され得る。上記のように、キャピラリーは、円形または管状形状を有する必要はない。他の形状（ここで、対向する面の間の内部距離はこの節で示した一般的範囲内である）がまた、用いられ得る。
【０１７９】
種々の異なるカソード溶液およびアノード溶液が用いられ得る。通常の溶液としては、アノード液として水酸化ナトリウム、およびカソード液としてリン酸が挙げられる。同様に、多数の異なる両性電解質がｐＨ勾配を生成するために利用され得る。これには、多くの市販の両性電界質溶液（例えば、ＢｉｏＬｙｔｅ，Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  および  Ｓｅｒｖａｌｙｔｅ）が挙げられる。両性電解質および両性電解質勾配の幅の選択は、ＣＩＥＦ方法により達成される分離に影響し得る。狭い両性電解質勾配により、分離における理論的プレートの数が増加し、そしてこれは狭いｐＩ範囲にわたるより高い分解分離のために利点であり得る。
【０１８０】
本発明の分離において利用されるＣＩＥＦ方法は、ポリマー性マトリックスを含むキャピラリー中で、または溶液なし（すなわち、ゲルも他のポリマーマトリックスもない）のキャピラリー中で実行され得る。ポリマーマトリックスは、代表的に、緩徐な電気浸透流に添加される；しかし、ある場合には、ポリマーマトリックスの封入は、より大きいタンパク質の動きを制限し得る（例えば、Ｐａｔｔｏｎ，２６を参照のこと）。電気浸透流を制御するために、遊離の溶液の使用することは、可能性として他の方法（例えば、キャピラリーコーティング、ゲルプラグ、または誘導された電場）と組み合わせて、このような場合に好ましい。
【０１８１】
（サンプル調製）
代表的には、ＣＩＥＦにより電気泳動されるべきタンパク質サンプルは、サンプルをキャピラリーにロードする前に、変成される。これにより、同じタンパク質がすべて、同じ電荷を有し、従って同一のタンパク質が、潜在的にキャピラリー内のマルチゾーン以外で同じ場所に集中することを確実にする。変性剤（例えば、尿素）非イオン性界面活性剤および両性イオン性界面活性剤（例えば、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０または３−［｛３−コールアミドプロピル｝ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）をまた用いて、タンパク質沈殿を生じ得る、タンパク質壁および／またはタンパク質間相互作用を抑制し得る。電気泳動前にタンパク質を変成することの別の利点は、その結果が、代表的には変性条件下で得られた保存用データと比較して用いられ得ることである。
【０１８２】
代表的な変性緩衝液としては、尿素および非イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤（変性剤として）が挙げられる；還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはメルカプトエタノール）は、代表的に、タンパク質中に存在する任意のジスルフィド結合を還元するために、含まれる。用いられ得る、尿素以外の変性剤としては、チオウレアおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が挙げられるがこれらに限定されない。一般に、塩酸グアニジンは、非常に高いイオン強度がサンプルに影響するので、変性剤として利用されない。例示的な中性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンエーテル（「トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）」、例えば、ノナエチレングリコール  オクチルシクロヘキシルエーテル（「ＴＲＩＴＯＮ」Ｘ−１００）、ポリグリコールエーテル、特に、ポリアルキレンアルキルフェニルエーテル、例えば、ノナエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（「ＮＯＮＩＤＥＴ」Ｐ−４０またはＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（「ＴＷＥＥＮ」−２０）、ポリオキシエチレンエーテル、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｃ12Ｅ23）（「ＢＲＩＪ」−３５）、ポリオキシエチレンエステル、例えば、２１ステアリルエーテル（Ｃ18Ｅ23）（「ＢＲＩＪ」７２１）、Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ［３−グルコナミド−プロピル］コールアミド（「ＢＩＧＣＨＡＰ」）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、グルコシド、例えば、オクチルグルコシド，３−［｛３−コールアミドプロピル｝ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートなどが挙げられる。
【０１８３】
変性剤および界面活性剤の至適量は、用いられる特定の界面活性剤に依存する。一般に、変成するサンプル緩衝液は、１０Ｍまで（より代表的には、４〜８Ｍ、そして最も代表的には６〜８Ｍ）の尿素を含む。適切な緩衝液（ならびにそこに含まれるための変性剤および非イオン性界面活性剤）の特定の例は、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒら［５］およびＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ［６］により記載されるものを含む。変性は代表的に、キャピラリーへの注入の前に９５℃で１０分間加熱することにより進行される。サンプル緩衝液を変性するにおける調節は、生じる任意の電気浸透流または加熱効果に対処するのに必要である場合になされる（例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，第４章、９５〜１０９頁（１９９４））。
【０１８４】
サンプル内のタンパク質の量は、変化し得、そして上記のように、用いられるキャピラリーのサイズに一部は依存する。一般に、キャピラリーには、総タンパク質の０．１〜５．０ｍｇをロードする。サンプルを、１つ以上の公知のｐＩ標準でスパイクし、この方法の能力を評価する。
【０１８５】
（溶出）
キャピラリーから出た、分離されたタンパク質を含む電気泳動媒体を溶出または排出するために、種々の技術が利用され得るが、これらの方法は３つの一般的な範疇におさまる：流体力学的溶出、電気的溶出、および電気浸透流の制御。
【０１８６】
（流体力学的溶出／圧力溶出）
流体力学的溶出または圧力溶出は、キャピラリーの一端と接続された適切なポンプを介して圧力を加える（または真空を引く）工程を包含する（例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，第４章、９５〜１０９頁（１９９４）を参照のこと）。しかし、流体力学的溶出は、キャピラリー中に形成されるパラボリックフローのプロフィールに起因して、バンドの広がりおよび分解の損失を生じ得る。
【０１８７】
（電気的溶出）
他の主なアプローチである電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）は、種々の技術を包含し、そして一般に、十分に溶出をもたらすための分離キャビティ−において、電気泳動媒体のいくつかのパラメーター（例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度）を変化させるため、カソードおよび／またはアノードで溶液を変更する工程を包含する。
【０１８８】
（塩移動度）
１つの電極溶出アプローチは、アノード液またはカソード液への塩の添加を包含する。この塩は、塩が加えられるリザーバー内の酸性種または塩基性種と同じ電荷の非酸性または非塩基性の対イオンを有しており、それによりこの対イオンはリザーバーからキャピラリーに移動する。電気的中立が、キャピラリー内で維持されなければならないので、対イオンのキャピラリーへの移動は、キャピラリー内の水素または水酸化物の濃度の低下を生じ、従ってｐＨは上昇するか、または低下するかのいずれかである。この型の移動の理論的根拠は、Ｓ．Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｊ．−Ｌ．Ｌｉａｏ，およびＫ．Ｙａｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３８７：１２７（１９８７）により記載されている。例えば、アノード液が水酸緩衝液ナトリウムである場合（すなわち、塩基性種が水酸化物である）、次いで、水酸化物以外の陰性に荷電した対イオンを有する塩が添加される（例えば、塩化ナトリウム）。キャピラリーへの塩素イオンの移動は、キャピラリー内の水酸化物の局所濃度を下げ、それにより、ｐＨを下げる。別の例として、カソード液がリン酸である場合、次いで、水素以外の対イオンを有する塩が加えられる（例えば、リン酸ナトリウム）。この場合、キャピラリー中へのナトリウムイオンの移動は、キャピラリー内の水素の局所濃度を減じ、それによりｐＨを上昇させる。ｐＨが添加された対イオンの存在に起因してキャピラリーの領域内で低下または上昇する場合、溶出が生じる。なぜなら、両性電解物質および集中されたタンパク質は、その等電点に対応する新しく規定されたｐＨ領域に移動するからである。流動のために用いられる塩の型および濃度の両方が、溶出されたタンパク質ピークの分離に影響を有することが示された［Ｒ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｄｉａｚ，Ｍ．Ｚｈｕ，およびＴ．Ｗｅｈｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．７７２：１４５（１９９７）］。特に、塩化ナトリウムに代わって四ホウ酸ナトリウムを、アノード液に添加することにより、分離されたタンパク質のより大きく増大した分解能を得る。
【０１８９】
（ｐＨ移動）
本明細書において、「ｐＨ移動」と呼ばれる別の技術がまた、ＣＩＥＦ中にタンパク質を溶出するために利用され得る。このアプローチにおいては、添加物をカソード溶液またはアノード溶液のいずれかに添加し、溶液のｐＨを変更する。しかし、塩移動と異なり、この添加物は、キャピラリー内で移動する移動性対イオンに寄与しない。ここで、リザーバーの１つまたは両方のｐＨにより再定義されているｐＨ勾配の結果として溶出が生じる；従って、この再定義されたｐＨ勾配におさまらないｐＩ値を有するタンパク質は、カソードリザーバーかまたはアノードリザーバーのいずれか中に溶出される。代表的に、アノード性移動のための技術は、以下のように進行する。カソード液としてリン酸を、そしてアノード液として水酸化ナトリウムを用いて、一旦、タンパク質が３〜１０の代表的なｐＩ範囲に集中されれば、アノード性キャピラリー末端は、溶液を含むリザーバー内に浸漬される。この溶液は、１０よりわずかに小さいｐＨである（例えば、９．８５のｐＨを有する５０ｍＭイミダゾール（ｐＫａ  ７））。次いで、このタンパク質は、キャピラリー中に再集中させられ、これは、キャピラリーを通じた電流の安定化により認識可能であり、ここでｐＩ範囲は３〜９．８５に規定される。９．８５〜１０の等電点を有する任意のタンパク質が、アノード液中に溶出される。このプロセスは、ｐＨを９．８５よりわずかに低くさせる種を含むアノード液で繰り返され得る。段階的様式において、ｐＨはｐＨ７まで低下させられつづけられ得、それにより７〜１０の範囲にわたる画分中の分離されたタンパク質を収集する。この時点で、カソード性移動は、ｐＨを３から７に選択的に増加するために漸増するｐＫａの酸でカソード液を置換することにより進行し得、これにより、酸性範囲（ｐＨ３〜７）中の画分を収集する。画分の数は、所望の分画分離に依存して変化し得る。代表的に、これらの画分は、０．０５〜０．５のｐＨの単位の差異により規定される。
【０１９０】
ｐＨ移動の技術は、キャピラリー内で平坦でない空間的勾配を生じ得る１つ以上の高濃度のタンパク質を含むタンパク質サンプルに関して有用であり得る。ｐＨ移動を用いれば、リザーバーｐＨ値により規定されるｐＩ範囲未満かまたはそれ以上の等電点を有するタンパク質のみが溶出される。従って、この溶出は、キャピラリーｐＨ勾配の形状における差異、またはキャピラリー内部の非平坦な空間的勾配の存在にかかわらず、再現可能である。
【０１９１】
（電気浸透流（ＥＯＦ））
電気浸透流（ＥＯＦ）の大きさを調整することは、前述の電気溶出方法（前記参照）に有意に影響し、そして別の意味である。これにより溶出されたタンパク質は、等電電気泳動分離の結果により選択的に排出され得る。ＥＯＦは、シリカキャピラリーの表面上のシラノール官能性のイオン化により生じさせられる。このようなイオン化は、シリカキャピラリーの表面で電気泳動媒体中に水素（プロトン）の層を生じる。一旦、電場が印加されれば、水素の層は、基本的に、アノードに移動する、液体の正に荷電されたカラムを構成する。これによりキャピラリー内の電気泳動媒体のバルク流が生じる。分析物のみかけの速度は、電気浸透流および分析物の電気泳動移動度の合計に等しい。従って、ＥＯＦを制御することにより、当業者は、タンパク質がキャピラリーを通じて移動する速度を制御または調節し得る。ＣＩＥＦ方法においては、通常、ＥＯＦは、タンパク質がキャピラリーから溶出し始める前に、注入されたサンプル内のタンパク質が集中するのに十分な時間、置かれるように制御されるべきである。
【０１９２】
ＥＯＦを調節するために種々の技術が利用され得る。１つのアプローチは、種々の薬剤でのキャピラリーの壁のコーティングを包含する。例えば、ガラスシリケート表面に沿うＥＯＦは、表面シラノール基のかなりのパーセンテージをマスクする中性シラン試薬でそれらをシラン処理することにより実質的に還元され得る（例えば、ポリアルキルアミド、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンオキシド）。ＥＯＦの大きさは、陽性荷電基または陰性荷電基を含むシラン処理試薬を用いることによりさらに制御され得る。陽性に荷電したコーティングを用いて、表面の陰性荷電を取り消し、正味ゼロの表面荷電を達成し得、これによりＥＯＦはゼロに接近する。より高い陽性荷電密度でのコーティングを用いて、荷電された表面材料についてＥＯＦの方向を逆にし得る。これは、陽性に荷電されたサンプル種の正味の移動速度を遅くするのに有用であり得る。逆に、陰性に荷電されたコーティングを用いて、表面上の陰性荷電の大きさを伝えるかまたは増大して、陰性に荷電した種の正味の移動速度を増大する。代表的な陽性に荷電されたコーティングとしては、例えば、ポリエチレンイミン、４級ポリエチレンイミン、ポリ（Ｎ−エチルアミノアクリルアミド）およびキトサンを有するトリアルコキシシランが挙げられる。代表的な陰性に荷電されたコーティングとしては、例えば、ポリ（メチルグルタメート）および２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネートポリマーのような材料を含む、カルボキシレートおよびスルホネートを有するトリアルコキシシランが挙げられる。荷電されたコーティングはまた、サンプル吸着を効果的に減少し得ること（特に、コーティングと同じ荷電極性を有するサンプルについて）が認識される。
【０１９３】
分離媒体はまた、電気泳動の間のＥＯＦの還元を助けるため、分離キャビティ−の壁を動的にコーティングするための可溶性薬剤を含み得る。このような可溶性コーティング剤としては、例えば、４級アンモニウムコーティングポリマー、メチルセルロース誘導体、セルロースアセテート、ポリエチレンオキシド、キトサン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシド３ブロックコポリマーが挙げられる。代表的には、可溶性コーティング剤は、約０．０５％〜約４％、そしてより代表的には、約１％〜約２％の濃度で含まれる。
【０１９４】
ＥＯＦおよびサンプルの吸着はまた、分離媒体および泳動緩衝液中に適切な試薬を含むことにより、調節され得る。例えば、陰性表面荷電は、培地中に陰イオン性添加物（例えば、金属アミン複合体、アミンおよびポリアミン（例えば、プロピルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、プトレシン、スペルミン、１，３−ジアミノプロパン、モルホリンなど））を含むことによりマスクされ得る。電気泳動のｐＨで等電である、陰性に荷電した基および陽性に荷電した基の両方を含む両イオン性種（例えば、トリアルキルアンモニウムプロピルスルホネート（ここで、アルキルは、メチル、エチル、プロピルおよびより長いアルキル鎖である））がまた、用いられ得る。
【０１９５】
別のアプローチは、ＥＯＦに反対する電流の生成を包含する。代表的には、これは、キャピラリーの外部表面に、金属（例えば、イリジウム酸化スズまたは銅）の薄いフィルムを適用することにより達成される。フィルムに電流を流すことにより、キャピラリー内への比較的小さい誘導電流を生じて、ＥＯＦを逆にする（例えば、Ｓｃａｓｆｏｏｒｔ，Ｒ．Ｂ．Ｍ．，Ｓｃｈａｌａｕｔｍａｎｎ，Ｓ．，Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅ，Ｊ．，およびｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ａ．，「Ｆｉｅｌｄ−Ｅｆｆｅｃｔ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｎｅｔｗａｒｋｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：９４２〜８４５（１９９９）を参照のこと）。
【０１９６】
サンプルが導入される位置の上流位置に多孔性プラグを配置すること（上流とは、キャピラリーを通じるタンパク質の流れの反対方向を言う）をまた利用して、ＥＯＦを制御し得る。プラグの位置を示す例は、図２Ｂに例示されている。ここでは、キャピラリー１００が、一端でカソードリザーバー（示さず）から伸張し、そして他の一端（示さず）でアノードリザーバーから伸張している。タンパク質移動は、矢印１０２の方向である（すなわち、カソードからアノードの方向）。
【０１９７】
理解されるように、多孔性プラグ１０４は、一旦キャピラリー１００に導入されれば、サンプルの後縁（ｔｒａｉｌｉｎｇ  ｅｄｇｅ）１０６の上流になるように配置される。多孔性プラグ１０４は、代表的にはポリマー性物質から形成され、そして電気泳動の間、比較的定常のままである。プラグが形成され得る適切な材料の例としては、ジアクリルアミド架橋を有するポリマー化アクリルアミドおよびアガロースが挙げられる。いかなる特定の理論により束縛されることも意図しないが、多孔性プラグ１０４は、バルク液（プラグ１０４の非存在下ではアノードリザーバーの方へ移動する）の置き換えをブロックすることにより運動量移行障壁として機能するようである。
【０１９８】
多量のタンパク質および／または多数の異なるタンパク質を含有する方法のような幾つかの方法において、ＥＯＦは、電気泳動媒体がＥＯＦのためにキャピラリーから溶出し始める前に、タンパク質が集中し得る非常に低いレベルにまで減少されるべきである。特定の方法において、０．５×１０-6ｃｍ2／Ｖ−ｓ（ｐＨ８．６および２５ｍＭ  ＴＲＩＳ−リン酸）のＥＯＦは、キャピラリーからサンプルが溶出する前にタンパク質の必要な集中のための十分な時間を得ることが、見出された。上に記載される方法は、ＥＯＦをこれらのレベルまで低下させ得る。
【０１９９】
従って、上記アプローチは、異なる基準に従って画分が収集されることを可能にする。例えば、電気溶出技術は、規定されたｐＨ範囲を有する画分を収集するために使用され得る。対照的に、ＥＯＦ溶出および圧力溶出は、溶出の時間に従って、画分を分離するために使用され得る。他の技術はまた、ＣＩＥＦ後の分離されたタンパク質を溶出するために利用され得る（例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」，  ｉｎ  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，第４章、９５−１０９頁（１９９４））。制御された溶出技術は、比較診断方法における重要な因子である再現性を向上するために有用である。このような技術はまた、空間の分離に依存する方法と比較して、高い含量のタンパク質の改良された許容度を提供する。
【０２００】
（キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ））
（概要）
キャピラリーゾーン電気泳動は、ゲルマトリクスを含まない自由溶液中で行なわれる電気泳動方法であり、分子の固有の電荷対質量比に基づく分子（例えば、タンパク質）の分離を生じる。ＣＺＥ法に対する１つの利点は、典型的に水溶性のゲルマトリクスと通常不適合である溶媒系を用いて泳動する能力である。非水性または水混和性の溶媒系は、ゲル電気泳動法によって通常分離されない疎水性の膜結合タンパク質の溶解度を改良するために使用され得る。この方法を実施するための一般的方法は、例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．の「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｚｏｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，第１２章、２８７〜３２３頁（１９９４）；Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．およびＬｕｋａｃｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｊ．Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｃｏｍｍｕｍ．，４：２３０（１９８１）；およびＪｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．およびＬｕｋａｃｓ，Ｋ．Ｄ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５３：１２９８（１９８１）に記載され、これらの各々は全体を通して参考として援用される。
【０２０１】
（システムおよび溶液）
概して、ＣＩＥＦについて上に記載されたキャピラリーはまた、ＣＺＥ法を実施するために適切である。しばしば、このキャピラリーは約５０〜１００ミクロンの内径を有する。ＣＺＥでの分離が電荷対質量比に基づき、そしてタンパク質の電荷が周囲の溶液のｐＨに依存するため、緩衝液組成およびｐＨは、分離に有意に影響を及ぼす。ｐＨの極度（すなわち、２未満および１０より上）において、典型的に、タンパク質の分離を達成することは困難である。なぜなら、全ての残基が完全にプロトン化されるかまたは脱プロトン化されるかのいずれかであり、多くのタンパク質は単位質量あたり同様の数の酸性残基および塩基性残基を有するからである。選択性は、代表的には中間ｐＨで高められる。比較的高い割合の酸性残基を有するタンパク質について、選択性はしばしばｐＨ４．５付近で高められる。高濃度の塩基性残基を有するタンパク質について、選択性はｐＨ１０付近で高められ得る。
【０２０２】
ＣＺＥにおいて、アノードおよびカソードの溶液は、代表的には同じである。使用される緩衝液は、実質的に任意の緩衝液であり得、緩衝液の選択は、電気泳動法が実施されるｐＨ範囲および検出器のノイズに及ぼす影響によって一部制御される。低ｐＨで有用な緩衝液の例として、リン酸およびクエン酸が挙げられ、これらに限定されず；高ｐＨで有用な緩衝液の例として、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ、ボレートおよびＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な緩衝液および緩衝液添加剤に関するさらなるガイダンスは、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｚｏｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，第１２章、２８７〜３２３頁（１９９４）に記載される。
【０２０３】
（溶出）
溶出は、ＣＩＥＦ（すなわち、圧力およびＥＯＦ）について上で記載される同じ方法の幾つかを使用して達成され得る。ＣＩＥＦを用いた場合、ＥＯＦを制御することは、装填されたサンプル内のタンパク質が分離する機会を有する前に、タンパク質を含有する電気泳動媒体がキャピラリーからの溶出を妨げるための特定の方法において重要であり得る。ＥＯＦは、ＣＩＥＦ法におけるＥＯＦを制御するために使用される同じ方法を使用して制御され得る（例えば、キャピラリーの内壁のコーティング、多孔性プラグの使用、およびＥＯＦを相殺するための誘導電場の発生）。電気泳動媒体のｐＨおよびイオン強度を調整しそして慎重に選択することは、使用され得る別の技術である。ＥＯＦは、比較的低いｐＨ（例えば、ｐＨ２−５、より典型的には約３−４）においてＣＺＥを行うことによって、内部キャピラリー表面上のシラノール基のイオン化を生じるため、イオン化されるシラノール基の数は減少される。このような減少は、ＥＯＦを低下させる。完全な分離の前にサンプル溶出を回避するために、特定の分析においてＥＯＦは１×１０-4ｃｍ2／Ｖ−ｓ未満（ｐＨ８．６および２５ｍＭ  ＴＲＩＳ−リン酸緩衝液において）に下げられるべきである。このレベルのＥＯＦは、ちょうど記載した方法を使用して得られ得る。
【０２０４】
検出セクションおよび標識セクションにおいて以下により完全に記載される別のアプローチは、キャピラリーにタンパク質を含むサンプルを注入する前に、サンプル中のタンパク質を標識することである。アミノ基またはカルボキシル基のような特定の官能基と優先的に反応する標識を選択することによって、特定のタンパク質の電荷対質量比は変更され得る。このような変更は、電気泳動中のタンパク質の分離を改良し得、ならびにそれらの検出能を改良し得る。（以下の実施例１および２を参照のこと）。
【０２０５】
（キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＦ））
（概論）
キャピラリーゲル電気泳動は、ゲルマトリクスを通してふるい分けすることによって達成されるタンパク質の分離をいい、サイズによるタンパク質の分離を生じる。１つの形式において、タンパク質はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性され、その結果、質量対電荷比は、タンパク質の固有の質量対電荷比ではなく、むしろこのアニオン性界面活性剤によって決定される［５０，２］。これは、タンパク質の分離度に電荷が寄与することなく、専らサイズをもとに分離され得る。一般的なＳＤＡ  ＰＡＧＥ電気泳動法のキャピラリー電気泳動（ＣＧＥ）への適用は、例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｓ．，「Ｆｒｅｅ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ｃｈｅｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｖ．，９：１２２（１９６７）に記載される。
【０２０６】
（システムおよび溶液）
キャピラリーの型およびそれらのサイズは、概して、ＣＺＥについて上に記載される通りである。種々の異なる緩衝液が使用され得、Ｂｅｃｋｍｅｎによって製造された「ｅＣＡＰ  ＳＤＳ」緩衝液のような市販の緩衝液が挙げられる（また、５１、３０、９および５を参照のこと）。種々の緩衝添加剤は、分離を増大するために利用され得る。このような添加剤として、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、シクロヘキシルジエチルアミン、ジメトキシテトラエチレングリコールおよび他のポリオール（例えば、エチレングリコールおよびポリエチレングリコール）のような少量の有機溶媒が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、［２］および［３］を参照のこと）。このような溶媒の使用は、水溶液中のタンパク質の溶解度を改良し得、熱変性に対するタンパク質の安定性を向上し得、ＣＺＥおよびＣＧＥ［５３］中の電気浸透流を抑制し得［５２］、キャピラリー壁の電気二重層の厚みを変更してタンパク質結合相互作用を阻害し得［４７］、そして電気浸透流を抑制するランニング緩衝液の粘性を増大し得る。使用される溶媒は、キャピラリー内部のポリマーマトリクスと適合するべきである。
【０２０７】
等速電気泳動（ＩＰＥ）は、タンパク質の分離を増大するための特定の方法で使用され得る。ＩＰＥの一般的議論については、例えば、Ｂ．Ｊ．ＷａｎｄｅｒｓおよびＥｖｅｒａｅｒｔｓ，Ｆ．Ｍ．，「Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第５章，１１１〜１２７頁（１９９４）を参照のこと（これは、全体を通して参考として援用される）。一定の場強度下でキャピラリーを移動する荷電した分子の速度は、その相対的移動度に依存し、これは、分子の質量／電荷、温度、およびその分子が通過する媒体の粘性の関数である。しかし、適切な濃度の高移動性イオン上流のサンプルイオンの非存在下で、一旦電場がキャピラリー内部で安定した状態に達すると、全てのイオンは、最終的に最も遅いイオンの速度で移動しなければならない。この状態は、アニオンを先導緩衝液と末端緩衝液との界面においてそれらの相対移動度の順にスタックさせる。
【０２０８】
ＳＤＳ変性状態下で、サンプル中に存在する全てのタンパク質は、ほぼ同一の質量／電荷を有する。末端緩衝液中のより高い質量／電荷アニオンを使用することによって、キャピラリーを通して一定した遅い速度でタンパク質を移動し得る。これは２つの影響を有する。第１に、タンパク質は、キャピラリー内のそれらの有効濃度を増加する先導緩衝液の末端縁で「スタック」する。第２に、タンパク質間の任意の分離は、サイズに基づいている。それ故に、ＩＰＥがサンプル「スタッキング」のために使用されるハイブリッドＩＰＥ−ＣＧＥ法の使用は、幾つかの方法における後のＣＧＥ分離において可能な分離を改良し得る。
【０２０９】
種々の末端緩衝液システムは、ＩＰＥ法と組み合わせて使用され得る。１つのシステムにおいて、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）は、末端電解質として使用される。なぜなら、それは高ｐＨ（＞６）で高い質量／電荷を有するためである。０．０５Ｍのトリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）クエン酸は、ｐＨ＝４．８において先導緩衝液として使用され、ｐＨ＝６．５において中間スタッキング緩衝液として使用される。ＥＡＣＡはｐＨ６．５スタッキング緩衝液中で非常に低い移動度を有するため、サンプルタンパク質は、始めに「スタック」するが、一旦、タンパク質が「スタック」し、ＥＡＣＡが低ｐＨ先導緩衝液に達すると、ＥＡＣＡの移動度は、タンパク質の移動度をまさり、分離が開始する（例えば、［５７］を参照のこと）。このシステムは、ハイブリッド単一カラムＩＰＥ−ＣＰＡＧＥシステムを生成するために使用され得る。
【０２１０】
タンパク質の分離のためのＩＰＥ用の２つの緩衝液システムは、０．０１Ｍ酢酸にサンプルを溶解する工程を包含し、これはまた、末端電解質として使用される。先導緩衝液およびバックグラウンド緩衝液は、ｐＨ４．４の０．０２Ｍトリエチルアミン−酢酸溶液である。末端緩衝液中のサンプルは、先導緩衝液とバックグラウンド緩衝液との間に挟まれる。バックグラウンド緩衝液が末端緩衝液の先導縁を追い越すまでＩＰＥを続け、押し越した時点でＩＰＥが停止し、そして分離が始まる（例えば、［５８］を参照のこと）。
【０２１１】
任意のランニング緩衝液を用いて達成され得る別のＩＰＥアプローチは、より低いイオン強度まで希釈されたランニング緩衝液にサンプルを溶解することである。これによって、サンプルプラグが充填されたキャピラリー中の電気抵抗の増加、およびサンプルマトリクス中に存在するイオンの、ランニング緩衝液境界への対応するより速い移動をもたらす。サンプルマトリクスとランニング緩衝液との間の最適なイオン強度の差は、代表的には約１０倍である（例えば、［４３］を御参照下さい）。
【０２１２】
（溶出）
概して、ＣＺＥについての溶出の議論をＣＧＥに適用する。溶出は、圧力およびＥＯＦを利用して達成され得る。ＣＩＥＦおよびＣＺＥを用いた場合、ＥＯＦを制御することは、適用されたサンプル内のタンパク質が分離の機会を有する前に、タンパク質を含む電気泳動媒体が溶出するのを防ぐための特定の方法において、重要であり得る。ＣＩＥＦおよびＣＺＥについて前述した方法は、所望のレベルでＥＯＦを制御するために使用され得る。完全な分離の前にサンプル溶出を防ぐために、特定の分析において、ＥＯＦは、１×１０−４ｃｍ2／Ｖ−ｓ未満（ｐＨ８．６、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ−リン酸緩衝液）に下げられるべきである。ＥＯＦは、例えば、緩衝液のｐＨの制御、相殺する誘導電場の発生、キャピラリーコーティングおよび多孔性ゲルプラグによって、この範囲に下げられ得る。
【０２１３】
（検出工程との組み合わせ）
幾つかの例において、本発明の方法によって分離されたタンパク質は、質量分析法によってさらなる分析に供される。このような例において、特定の標識は、質量スペクトルの特定の部分へのマスフラグメントの分離を向上するために使用され得る。このような方法における適切な標識は、２０００年２月２５日に出願の、代理人整理番号０２０４４４−０００３００ＵＳを有する、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の同時係属出願番号０９／５１３，３９５により完全に記載される。この出願は、本明細書中において、全体を通して参考として援用される。
【０２１４】
検出されたシグナルの定量は、確立された方法に従って達成され得る。ピーク高さおよびピーク面積は、代表的に、最終的な電気泳動的大きさに分離されたタンパク質の各々の量を定量するために使用される。幾つかの方法において、ピーク高さ、ピーク半値幅、ピーク面積、および各ピークについての溶出時間が記録される。ピーク形状（高さ対幅の比として決定される）は、分離方法の質の尺度として使用され得る。この方法の分離能力は、タンパク質のＭＷを溶出時間で補正することによって決定され得る（例えば、［３０］および［１１］）。各タンパク質の平均ピーク幅で全体の泳動時間を割ることによって、この方法によって分離され得るタンパク質の総数の評価（例えば、少なくとも１つのピーク幅によって分離されたタンパク質は、「分離された」タンパク質と考慮され得る）が得られ得る。ＭＷ評価の再現性は、２つの方法によって決定され得る。１つの方法において、１つの泳動から標準曲線を確立し、そしてその曲線を使用して各々の後の泳動からの溶出時間に基づくＭＷを決定することによって、３つの反復泳動における各タンパク質について決定された見かけのＭＷを比較した（例えば、［２１］を参照のこと）。第２のアプローチにおいて、この方法の全体の誤差は、全ての３つの反復泳動由来のデータを使用して作成した標準曲線の傾きの標準偏差から決定した。
【０２１５】
本発明の特定の方法で使用され得る標識および直接検出アプローチは、従来の２−Ｄゲルで使用される染色画像化方法と比較して、相対タンパク質発現レベルの定量化の改良された再現性を生じ得る。染色技術は頻繁に定量性に乏しい結果を生じる。なぜなら、種々の量の染色が各タンパク質に組み込まれ、その染色されたタンパク質が、ゲルまたはエレクトロブロッティング基板の染色されたバックグラウンドに対して検出されそして分離されなければならないためである。さらに、この方法が電気泳動法の組み合わせを使用するため、得られた２−Ｄゲル画像データと直接比較できる電気泳動図がさらに得られる。これは、他の非電気泳動をベースとする分離（例えば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）と比べて、この方法が２−Ｄゲル情報と比較できることを意味する。
【０２１６】
（例示的システム）
本発明の方法は、種々の異なる電気泳動法に従う。規定された画分が空間的に、物理的に、または時間によって分離される制御された溶出技術、および標識検出方法は、多数の異なる電気泳動技術において使用され得る。上で述べたように、連続して連結した電気泳動法の数は少なくとも２つであるが、複数の追加の電気泳動法を含み得る。幾つかの例において、一連の中の各電気泳動法は異なり；一方で、他の例における特定の電気泳動法は、異なるｐＨまたは分離マトリクス状態で繰り返される。
【０２１７】
この方法の一般的適用性にも関わらず、上のＣＩＥＦで述べたように、ＣＺＥ法およびＣＧＥ法は、本発明の方法に従って利用され得る電気泳動法の型の特定の実施例である。特定の方法において、たった２つの方法が実施される。このような方法の例として、ＣＩＥＦがまず実施され、次いでＣＧＥが実施される方法が挙げられる。標識は、代表的にはＣＩＥＦ後に実施され、ＣＧＥキャピラリーからのタンパク質の溶出の後の検出を伴う。ＣＩＥＦキャピラリーから溶出するタンパク質は、例えば、２１４ｎｍまたは２８０ｎｍにおいてＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を使用して検出され得る。別のシステムにおいて、第１の方法はＣＺＥであり、最終的方法はＣＧＥである。この配置を伴い、標識は代表的に、前述したように分離を高めるためにＣＺＥの前に実施される。検出は、概して、最終的な電気泳動分離が完了するまで実施されない。第３の有用なアプローチは、始めにＣＩＥＦを行う工程、次いでＣＺＥおよびＣＧＥを行う工程を包含する。このようなシステムのための標識は、代表的には、ＣＩＥＦの後でＣＺＥの前に行なわれる。全体の方法におけるこの時点での標識は、ＣＩＥＦパターン（前述を参照のこと）の変更を回避し、ＣＺＥの間のより多くの分離を可能にする。検出は、概して、ＣＧＥの終わり（すなわち、キャピラリー内に分離されたタンパク質を有するか、またはタンパク質がキャピラリーから溶出された後）に行なわれる。これらは、使用され得るシステムの特定の例であり；本発明がこれらの特定のシステムに限定されないことは理解されるべきである。他の配置およびシステムは、本明細書中に記載される技術およびアプローチを使用して発展され得る。
【０２１８】
（サンプル）
本発明の方法は、広範囲のサンプル型を用いて使用され得る。基本的に、任意のタンパク質含有サンプルは、本明細書中に記載される方法を用いて使用され得る。このサンプルは、比較的少数のタンパク質を含み得るか、または大多数のタンパク質（例えば、細胞または組織サンプル内に発現された全てのタンパク質）を含み得る。
【０２１９】
サンプルは、任意の生物から得られ得るか、または合成によって調製したタンパク質の混合物であり得るか、またはそれらの組み合わせであり得る。従って、適切なサンプルは、例えば、微生物（例えば、ウイルス、細菌および真菌）、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコ）、ヒト科（例えば、ヒト、チンパンジーおよびサル）および植物から得られ得る。サンプルの供給源を規定するために使用される用語「被験体」として、例えば、上記供給源の全てが挙げられる。用語「患者」は、ヒトおよび獣医学的被験体の両方をいう。このサンプルは、組織または組織ホモジネートまたは生物の流体および細胞または細胞培養物由来であり得る。従って、例えば、サンプルは、全血、血清、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、頬、皮膚、髄液、組織生検または検死および髪から得られ得る。サンプルはまた、エキソビボ細胞培養物（成長培地、組換え細胞および細胞成分）由来であり得る。潜在的な薬物または薬物標的（下記を参照のこと）を同定するための比較研究において、例えば、１つのサンプルは疾患細胞から得られ得、別のサンプルは非疾患細胞から得られ得る。
【０２２０】
異なる電気泳動技術のためのサンプル調製は、上に記載される。サンプルが細胞片または電気泳動中の分離を妨害する非タンパク質物質を含む場合、このような物質は、種々の公知の分離技術（例えば、ふるい材料を通したサンプルの強制押出し、濾過および遠心分離）のいずれかを使用して除去され得る。イオン強度が特に高いサンプルは、透析および希釈および再濃縮のような確立された技術を使用して脱塩され得る。
【０２２１】
サンプルが塩または他の妨害成分を含む幾つかの例において、緩衝液交換は、ＩＰＥ「スタッキング」を改良し、そして電気泳動法のための溶出時間およびピーク形状の再現性を改良するために、実施され得る。妨害成分を除去するために透析を実施する１つの有用な方法は、スピン透析チューブ（Ｇｉｌｓｏｎ／Ａｍｉｃｏｎ）の透析チャンバに直接に画分を収集することである。次いで、サンプルは、スピン透析され得、そして１０倍希釈のランニング緩衝液に再懸濁し、一連の次の電気泳動分離に利用される。この手順は、以下の利点を有する：（１）ＣＩＥＦの場合において、より大きな容量の緩衝液が、各画分中のタンパク質を希釈することなく、各画分の電気溶出の間に使用され得、（２）同じサンプル容量が、二次元に注入される各画分について使用され得、そして（３）透析されたタンパク質は透析後ほとんど任意の緩衝液の容量に再懸濁され得るため、より少量でより濃縮されたサンプル容量が二次元で使用され得る。
【０２２２】
（変形物）
本発明の方法は、一連の最後の電気泳動法で終了する必要はない。図１に示されるように、分離されたタンパク質は、非電気泳動法によってさらに分析され得る。このような方法の例として、赤外分光法、核磁気共鳴分光法、ＵＶ／ＶＩＳ分光法および完全な配列決定法または部分的な配列決定法が挙げられる。現在の電気泳動をベースとする方法を種々の質量分析法（ＭＳ）に組合せることは、実施され得るさらなる分析の１つの特定の例である。種々の質量分析技術が使用され得、幾つかのＭＳ／ＭＳ法および電子スプレ−飛行時間ＭＳ法が挙げられる（例えば、［６１］、［６２］、［６３］、および［６４］を参照のこと）。このような方法は、タンパク質配列タグ（タンパク質配列タグの議論については、例えば、［６５］および［６６］を参照のこと）のような電気泳動法によって分離されたタンパク質の少なくとも部分的な配列を決定するために使用され得る。本明細書中に記載した電気泳動分離と質量分析との組み合わせに関するさらなる議論は、１９９９年４月２０日出願の表題「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」の米国仮出願第６０／１３０，２３８号に記載され、この出願は利益を請求し、全体を通して参考として援用される。本発明の方法と組み合わせられ得る他の質量分析法は、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の、代理人整理番号０２０４４４−０００３００ＵＳを有する同時係属中の米国出願第０９／５１３，３９５号、および表題「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」の、代理人整理番号０２０４４４−０００２００ＵＳを有する同時係属中の米国出願第０９／５１３，４８６号に記載され、両方とも２０００年２月２５日に出願され、両方とも全体を通して参考として援用される。
【０２２３】
（微小流体システム）
別の変形物において、キャピラリーは、非常に小さなスケールで、サンプルの最小量のみを必要とする本発明の分析を実施するために使用され得る微小流体デバイスの一部を形成するために、基板の一部であるか、基板内に形成され得る。これらの方法において、サンプルの物理的画分は典型的には、収集されない。その代わり、分離されたタンパク質は、空間的にまたは時間によって分離される。微小流体チャネルまたはキャピラリーおよび種々の異なる設計内にサンプルを作製し、移動させるための方法は、例えば、米国特許第５，８５８，１８８号；同第５，９３５，４０１号；同第６，００７，６９０号；同第５，８７６，６７５号；同第６，００１，２３１号；および同第５，９７６，３３６号で議論されており、これらの全てはそれらの全体を通して参考として援用される。
【０２２４】
本発明の方法を用いて使用され得る一般的システム１５０の例は、図３Ａに示される。キャピラリーまたはチャネルは、代表的に、平面の支持体または基板内で形成されるかまたはエッチングされる。分離キャピラリー１５２は、アノード液を含有するアノードリザバ１５４からカソードリザバ１５６まで延びる。このアノードリザバ１５４およびカソードリザバ１５６は、それぞれ、アノード１５８、カソード１６０と電気接続される。サンプル注入チャネル１６２は、分離キャピラリー１５２に対してほぼ垂直に泳動し、一端は、アノードリザバ１５４の僅かに下流の注入部位１６４で交差する。サンプル注入キャピラリー１６２の他端は、サンプルリザバ１６６で終結し、これは、サンプルリザバ電極１６８と電気接続している。検出器１７０は、分離キャピラリー１５２を通過する電気泳動媒体と流体連絡するように位置付けられ、サンプル注入部位１６４の下流に、典型的にカソードリザバ１５６の幾分上流に位置付けられる。この特定の配置において、画分はカソードリザバに引かれる。種々のチャネルを通過する電気泳動媒体の移動は、１つ以上の電極１５８、１６０、１６８を介して、電場を選択的に適用することによって制御される。電場の電極への適用は、種々のキャピラリー内のＥＯＦの規模、従ってそれらを通る流れを制御する。
【０２２５】
別の形状の例を図３Ｂに図示する。このシステム１８０は、図３Ａに示されるシステムに記載される要素を含む。しかし、この構成において、空間的または時間的に分離された画分は、出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃを介した分離キャピラリー１５２に沿った複数の異なる位置で回収され得る。これらのキャピラリーの各々は、それぞれ、緩衝液リザーバ１７６ａ、１７６ｂ、１７６ｃを含み、そしてそれぞれ電極１７４ａ、１７４ｂ、１７４ｃと電気通信する。分離キャピラリー１５２に沿った電気泳動媒体の移動および出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃへのそこからの画分の回収は、分離キャピラリー１５２に沿った電極および出口キャピラリー電極が活性化される制御によって制御され得る。あるいは、または加えて、種々の微流体弁が、出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃに配置されて、流れを制御し得る。代表的には、さらなる検出器が、種々の出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃに配置されて、これらのキャピラリーに回収された画分におけるタンパク質を検出する。
【０２２６】
図３Ｂに図示される形状は、多くのことなる適用に使用され得る。この型のシステムが適切な適用の一つの例は、試験されているサンプルの型が、良好に特徴付けられている状況である。例えば、目的のタンパク質の特定の画分が以前に確立されて、分離キャピラリー１５２の特定の位置で分画される場合、次いで、出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃが、目的のタンパク質画分の選択的除去を可能にするような位置に配置され得る。
【０２２７】
さらに別の形状において、複数の出口キャピラリーは、アノードリザーバ１５６付近の分離キャピラリーの末端（分離された画分の回収および輸送のための各々の出口キャピラリー）から枝分かれする。この形状においてまた、分離キャピラリーからの分画タンパク質の回収は、種々のキャピラリー内部のＥＯＦの調節および／または微流体弁によって制御され得る。
【０２２８】
電気泳動分析を実施するに必要な他の構成要素は、支持体（例えば、上記で議論されたリザーバ、検出器および弁を含む）にエッチングされ得る。
【０２２９】
（基板）
本発明の分析デバイスのキャピラリーネットワークまたはマイクロチャネルネットワークが形成される基板は、広範な種々の材料（珪素、ガラス、融合シリカ、結晶石英、融合石英および種々のプラスチックなどを含む）から作製され得る。デバイスの他の構成要素（例えば、検出器および微流体弁）は、デバイスの特定の使用、経済的懸念、溶媒適合性、光学的透明度、機械的強度および他の構造的懸念に依存して、同じまたは異なる材料から作製され得る。一般的に、基板は、非伝導材料から製造されて、種々のチャネルを介したサンプルの動電学的輸送に適用されるべき比較的高い電場を与える。
【０２３０】
ポリマー性基板（例えば、プラスチック）の場合において、基板材料は、材料が意図される使用に依存して、剛体、半剛体または非剛体、不透明体、半不透明体または透明であり得る。本発明の電場に供する場合に低い表面電荷を有するプラスチック、それ故、特に有益なプラスチックとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンまたはスチレンコポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリビニルクロリド、ポリスルホンなどが挙げられる。
【０２３１】
光学検出器または視覚検出器を含むデバイスは、一般的に、透明な材料から少なくとも部分的に作製されて、検出器による分離チャネル内部の構成要素の検出を容易にする。
【０２３２】
（チャネル構造／形成）
本デバイスの基板に形成されたチャネルまたはキャピラリーの大きさおよび形状は、本質的に任意の形状（半円形、円柱状、矩形および台形を含むが、これらに限定されない）を有し得る。チャネルの深さは変化し得るが、約１０〜１００ミクロンの傾向があり、最も代表的には、約５０ミクロンである。チャネルは、２０〜２００ミクロンの幅の傾向がある。
【０２３３】
基板の表面に形成されたチャネルおよび他の要素の製造は、当該分野で公知の任意の数の微作製（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ）技術によって行われ得る。例えば、石版技術は、例えば、半導体製造業において確立された方法を使用して、ガラス基板または石英基板の作製に利用され得る。写真平板マスキング、プラズマまたはウエットエッチングおよび他の半導体プロセス技術が利用されて、基板表面内または基板表面上の微小規模要素を作製し得る。あるいは、ミクロ機械加工方法（例えば、レーザー穿孔、マイクロミリング（ｍｉｃｒｏｍｉｌｌｉｎｇ）など）が利用され得る。プラスチックにチャネルおよび他の要素を調製するための製造技術もまた確立されている。これらの技術は、例えば、微小規模基板の大きなシートの生産ためのローリングスタンプ、またはポリマーマイクロキャスティング（ｍｉｃｒｏｃａｓｔｉｎｇ）技術を使用した、注入成型技術、スタンプ成型方法を含み、ここで、基板は、マイクロマシン成型の内部で重合化する。
【０２３４】
このような微流体デバイス（例えば、上記のデバイス）を使用するための他の設計および方法に関するさらなる手引きは、例えば、米国特許第５，８５８，１８８号；同第５，９３５，４０１号；同第６，００７，６９０号；同第５，８７６，６７５号；同第６，００１，２３１号；および同第５，９７６，３３６号に見出され得、これらのすべてがその全体において参考として援用される。  （質量分析検出および配列決定）
変形物において、緩衝液システムは、揮発性の緩衝液塩、有機溶媒および短寿命の（ｅｐｈｅｍｅｒａｌ）界面活性剤の使用を通した最後の分離工程において変更されて、引き続く質量分析に適合する溶出剤を作製し得る。緩衝液塩は、イオン種を作製するためのプロトンを受容し得るかまたは拒否し得る、有機種および無機種からなる。揮発性緩衝液塩は、水の蒸発に際して実質的に気相に蒸発する緩衝液塩のサブセットからなり、ここで、実質的に蒸発するとは、代表的には、５０％を超える質量揮発性、より代表的には、８０％を超える質量揮発性および最も代表的には、９０〜１００％の質量揮発性として規定される。例示的な例としては、アンモニウム陽イオン、アルキルアンモニウム陽イオンおよびアリールアンモニウム陽イオン、ピリジウム陽イオン、アルキルホスホニウム陽イオンおよびアリールホスホニウム陽イオン、ならびにアルキルスルホニウム陽イオンおよびアリールスルホニウム陽イオンの群、ならびにアルキルスルホネート陰イオンおよびアリールスルホネート陰イオン、アルキルホスホネート陰イオンおよびアリールホスホネート陰イオン、アルキルボラート陰イオンまたはアリールボラート陰イオン、アルキルカルボキシレート陰イオンまたはアリールカルボキシレート陰イオン、ハロゲン化カルボキシレート陰イオン、炭酸塩陰イオンならびに重炭酸塩陰イオンの群より選択される塩が挙げられる。例示的非代表的な例としては、ナトリウム陰イオンおよびカリウム陰イオン、またはハロゲン化物陰イオンおよび硫酸塩陰イオンの群より選択される、少なくとも１つの成分を有する塩が挙げられる。
【０２３５】
はかない（ｅｐｈｅｍｅｒａｌ）界面活性剤は、気相に実質的に蒸発するか、または水の蒸発に際して実質的に気相に蒸発する種を形成するように分解する、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、中性界面活性剤または双性イオン性界面活性剤からなり、ここで、実質的に蒸発するとは、代表的には、５０％を超える質量揮発性、より代表的には、８０％を超える質量揮発性および最も代表的には、９０〜１００％の質量揮発性として規定される。例示的な陰イオンの例としては、ドデシル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸アルキルアンモニウムまたはドデシル硫酸アリールアンモニウム、ならびにアルキルアンモニウムパーフルオロアルキルカルボキシレートが挙げられる。例示的な陽イオンの例としては、アルキルアンモニウムカルボキシレート種またはアルキルホスホニウムカルボキシレート種が挙げられ、ここで、少なくとも１つのアルキル鎖が、代表的には、５〜３０炭素長であり、そしてより代表的には、６〜１５炭素長であり、そして最も代表的には、１０〜１４炭素長である。
【０２３６】
（非電気泳動技術による予備分離）
この方法はまた、電気泳動分離を開始する前の、非電気泳動技術による初期の分離を含み得る。タンパク質を分離し得る本質的に任意の型の技術が利用され得る。適切な方法としては、硫酸塩勾配、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィおよびアフィニティクロマトグラフィでの分画が挙げられるがこれらに限定されない（重要だと考える他の技術を列挙されたい）。
【０２３７】
（例示的な有用性）
本発明の方法および装置は、分画されたタンパク質の溶出の制御ならびに種々の標識および検出技術の利用によって、多くのタンパク質（例えば、同じ方法における数百または数千のタンパク質）の検出、特徴付けおよび／または同定のために利用され得る。結果的に、この方法は、種々の分析適用（例えば、外部刺激の機能としての特定のタンパク質レベルのモニター、または同定の目的のための複合体組成物における特定のタンパク質の検出）、臨床適用（例えば、正常な細胞および組織ならびに患部細胞および組織の組成物の、検出および／またはモニター、疾患の診断またはモニター、治療有効性および毒性試験についての薬物候補物の試験）ならびに分子生物学および遺伝子研究（例えば、遺伝子産物の分子発現レベルの特徴付けまたはモニター、ならびに特定の遺伝子の付加、変異、欠失または切断の効果の決定）を含むがこれらに限定されない複数の有用性を有する。一般的に、この方法および装置は、プロテオソーム研究における有用性を有する。
【０２３８】
より特に、本発明は、例えば、特定の条件下で発現されるタンパク質が、単離され、計量され、そして同定されるタンパク質データベースの開発に使用され得る。本明細書中に記載される制御された溶出および検出方法を使用して、特定の方法が、分離されたタンパク質の種々の化学的および物理的特徴（ｐＩおよび／または明らかな分子量ならびに／あるいはサンプル中のタンパク質の相対的存在比を含むがこれらに限定されない）の決定および目録作製のために利用され得る。この情報を、収集されたサンプルの供給源および方法に関する種々の情報と、さらに相互参照し得る。このような情報の例としては、属、種、年齢、類、性別、環境曝露条件、被験体の健康、組織型、サンプル収集方法および電気泳動前のサンプル調製方法が挙げられる。
【０２３９】
この方法はまた、潜在的な薬物標的および／または候補物の同定のために利用され得る種々の比較研究における有用性を有する。例えば、この方法は、正常細胞と比較した場合、患部細胞において差次的に発現されるタンパク質を同定するために利用され得る。このように差次的に発現されたタンパク質は、薬物の標的または潜在的療法として役立ち得る。関連した様式において、この方法が毒物学研究において使用されて、特定の毒物に応答して差次的に発現されるタンパク質を同定し得る。このように差次的に発現されたタンパク質は、特定の毒性化合物またはチャレンジのための潜在的標的または潜在的解毒剤として役立ち得る。本発明の検出および標識技術は、このような研究を容易にし得る。なぜなら、これらの技術は、低い存在比のタンパク質でさえも検出し、そして増大された再現性が、異なるサンプル間の発現における実際の差の同定をより容易にするからである。
【０２４０】
本発明の特定の方法を使用したプロテオーム研究は、遺伝子転写物の未成熟末端または生じた遺伝子産物におけるアミノ酸置換を生じる変異を検出し得る。この方法はまた、機能的ゲノムを使用して、容易には検出可能ではないかまたは検出不可能である疾患に関連した翻訳後修飾事象を検出し得る。例えば、プロテオーム方法は、タンパク質の折り畳み、グリコシル化パターン、リン酸化事象および分解速度における差を検出し得る。
【０２４１】
比較研究の結果は、種々の診断適用に移行可能である。例えば、比較研究の間に特定の疾患の特徴として同定された「マーカー」タンパク質または「フィンガープリント」タンパク質が使用されて、マーカーに関連した疾患を有するか否かを決定するために、個体を診断し得る。これらのマーカーはまた、医療用スクリーニング試験に使用され得る。一旦、このようなタンパク質が同定されると、必ずしもすべての画分を試験する必要はない。代わりに、マーカータンパク質を潜在的に含む画分のみを試験する必要がある。この方法の再現性は、このような分析を容易にする。チップまたは支持体（上記参照のこと）上に組み込まれたシステムについて、キャピラリーが、分離キャビティに沿った適切な位置に配置されて、目的のマーカータンパク質を潜在的に含む関連した画分のみを回収し得る。
【０２４２】
診断適用の例として、プロテオーム分析は、免疫診断アッセイのための診断マーカー（例えば、細胞表面抗原または血清タンパク質）の同定に利用され得る。推定診断タンパク質の精製されたサンプルは、プロテオーム分析の間に回収され、そしてタンパク質との特異的結合親和性を有する抗体を産生するために使用され得る。このような抗体は、免疫学的染色を通して、マーカータンパク質と疾患との間の関連を理解するために使用されて、患部細胞にタンパク質を局在化し得るか、またはタンパク質の存在について患者を迅速にスクリーニングし得、これは、疾患とのその統計学的関連を示す。
【０２４３】
本発明の方法は、構造活性研究の実施におけるさらなる有用性を有する。例えば、この方法は、タンパク質発現様式に対して特定の化学薬品またはその薬品の組み合わせが有する効果を決定するために使用され得る。次いで、薬品または組み合わせに対する変更がなされ得、そしてタンパク質発現が、もしあれば、変更がタンパク質発現に対して有する効果を決定するために再評価され得る。このような研究は、例えば、初期の薬物スクリーニング試験の間に同定されたリード化合物の誘導体の作製に有用であり得る。
【０２４４】
（ＩＩＩ．質量分析フラグメンテーション）
本発明の局面は、タンパク質配列決定のための新規の非タンパク質分解性質量分析法の開発に属する。この方法は、独特の質量タグでのインタクトなタンパク質のＮ末端またはＣ末端の標識、質量分析計のイオン化ゾーンにおけるインタクトな標識化タンパク質のフラグメンテーション（供給源内（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ）フラグメンテーション）、および生じた標識化ペプチド系列の質量ラダーからの配列決定によって行われる。標識化ペプチドは、生じた質量スペクトルにおける独特の質量サインによって、未標識のペプチドと区別される。いくつかの実施形態において、このプロセスは、精製された標識化タンパク質について１分未満で果たされ、現行のＭＳ／ＭＳタンパク質配列決定技術よりも５００〜１０００倍迅速な方法をもたらす。
【０２４５】
標識化タンパク質は、ＭＳのイオン化ゾーンにおいて高度にフラグメンテーションされる。これは、親タンパク質に関連して、生じた標識化ペプチドフラグメントイオンの増大したイオン化効率および揮発性を導き、それ故、検出感受性全体を改良する。この配列は、質量スペクトルの低い分子量末端から構築され、生じた標識化ペプチドフラグメントから、より絶対的な質量精度およびより容易な配列決定（ＱおよびＫ残基の分離を含む）を提供する。
【０２４６】
この技術についての適切な標識の選択は、いくつかの基準の考慮を必要とする。第一に、標識は、ＭＳのフラグメンテーション条件に耐えるに十分に強くあるべきである。第二に、標識はまた、タンパク質骨格の内部切断から生成される任意の未標識ペプチドから識別可能である、独特の質量／電荷（ｍ／ｚ）サインを作製するべきである。第三に、標識はまた、安定度の高い荷電を保有して、フラグメンテーションが、非荷電のＮ末端およびＣ末端残基さえも含む高い存在比のイオンを生成することを確実にし得る。天然のＮ末端アセチル化標識を保有するグリコーゲンホスホリラーゼを使用した実施例６は、技術の普遍性を示す。
【０２４７】
一つの局面において、本発明は、タンパク質の一部分を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：
（ａ）Ｃ末端またはＮ末端標識部分とタンパク質を接触させ、タンパク質のＣ末端またはＮ末端へ標識を共有結合させ、そして標識化タンパク質を形成する工程；および
（ｂ）質量分析フラグメンテーション方法を使用して標識化タンパク質を分析し、少なくとも２つのＣ末端残基または少なくとも２つのＮ末端残基の配列を決定する工程を包含する。
【０２４８】
本発明のこの局面において、タンパク質は、本質的に任意の供給源から得られ得る。好ましくは、タンパク質は、干渉成分を含まないように単離され、そして精製される。単離されたタンパク質は、Ｃ末端またはＮ末端標識化部分と接触されて、質量分析フラグメンテーション方法による分析に適した標識化タンパク質を形成するように、タンパク質のＣ末端またはＮ末端へ標識を共有結合し得る。
【０２４９】
（標識化タンパク質）
一つの局面において、本発明は、タンパク質サンプルにおける複数の異なるタンパク質の標識方法を提供し、この方法は、独特のイオン質量サイン成分、定量検出成分および複数の異なるタンパク質の少なくとも一部分に標識を共有結合する反応性官能基を有する標識化因子とタンパク質サンプルを接触させる工程を包含する。
【０２５０】
本発明のこの局面において、タンパク質は、本質的に任意の供給源から得られ得る。好ましくは、タンパク質は、干渉成分を含まないように、少なくとも部分的に単離されるか、または精製される。単離されたタンパク質は、標識化部分、好ましくは、タンパク質の少なくとも一部分のＣ末端またはＮ末端に標識を共有結合する、Ｃ末端またはＮ末端標識化部分と接触されて、さらなる精製および質量分析フラグメンテーション方法による分析に適した、標識化タンパク質の混合物を形成し得る。
【０２５１】
この直接的な検出を容易にするためのタンパク質の化学修飾は、特に、キャピラリー電気泳動において実施されるタンパク質分離について新規ではない。Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．およびＮｏｌａｎ，Ｊ．Ａ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１３章，３２５−３６８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４）；Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ，Ｔ．ら、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｌｕｒｏｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＣＥ−ＬＩＦ−ＩＤ），Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ａ−１７９１Ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ  １９９５）；Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．およびＫ．Ｄ．Ｌｕｋａｃｓ，Ｊ．Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４：２３０（１９８１）；Ｂｏｄｈｅ，Ａ．Ｍ．，ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４：３９−４３（１９８７）；ならびにＧｕｚｍａｎ，Ｎ．Ａ．，ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６０８：１９７−２０４（１９９２）を参照のこと。フルオレサミンは、電気泳動後のゲルおよび電気泳動的転写（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）におけるタンパク質の検出のために使用されている。Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｙｅ，Ｊ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５２：９−１９（１９８５）を参照のこと。しかし、２−Ｄ電気泳動分離技術の後の検出を容易にするための複数のタンパク質の直接的な蛍光標識は、以前に報告されていないようである。
【０２５２】
ＲｏｓｅおよびＪｏｒｇｅｎｓｅｎ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４４７：１１７（１９８８））は、ｏ−フタルジアルデヒドを使用して、キャピラリー後の蛍光検出を増大するために、キャピラリーゾーン電気泳動分離から流出物を誘導体化した。Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔら（「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｌｕｒｏｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＣＥ−ＬＩＦ−ＩＤ），Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ａ−１７９１Ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ  １９９５））は、Ｃｙ５TMシアニン色素で標識された抗原（Ａｎ）（１：１のモル比で）を使用した競合蛍光イムノアッセイ、およびヒト血清由来の免疫反応産物のＣＥ分離後のレーザー誘導性蛍光（ＬＩＦ）検出を示した。Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔらは、競合ＣＥイムノアッセイを用いたアンギオテンシンＩＩ抗原（Ａｎ）についての１０-9Ｍの検出感受性を報告する。ＣＥ−ＬＩＦ系の絶対的な検出感受性は報告されていないが、報告された希釈因子（１０）および銀染色の比較可能な感受性よりもほぼ３オーダーの大きさで良好な約１０6分子（平均４０ｋＤａのタンパク質と仮定）までの推定サンプルローディング（１０〜２０μＬ）から推定され得る。
【０２５３】
化学的誘導体化の使用はまた、多くのタンパク質同定技術の基本である（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１０３−１２０（１９７２）；Ｎｉａｌｌ，Ｈ．Ｄ．，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｄｍａｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ，」：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７：９４２−１０１１（１９７３）；Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１２１−１３７（１９７２）；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｗ．Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１３８−１４３（１９７２）；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，１９８４）；Ｎｉｅｄｅｒｗｉｅｓｅｒ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：６０−９９（１９７２））。ここで、Ｎ末端またはＣ末端アミノ酸は、タンパク質から酵素学的または化学的に切断された後に実施されたクロマトグラフィ分析における検出を容易にする分子で共有結合的に標識される。Ｗｕおよび共同研究者（Ｗｕ，ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３５：１６１−１７４（１９９６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．およびＪ．Ｗｕ，Ｐｏｌｙｍ．Ｐｒｅｐｒ．，３７：３１８（１９９６）），ＤｅｎｓｌｏｗおよびＮｇｕｙｅｎ（Ｄｅｎｓｌｏｗ，Ｎ．Ｄ．およびＨ．Ｐ．Ｎｇｕｙｅｎ，：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＶＩＩ，Ｍａｒｓｈａｋ，Ｄ．Ｒ．，編、２４１−２４８頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６））ならびにＭｉｎｇら（Ｍｉｎｇ，Ｄ．，ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１８：８０８−８１０（１９９５））は、システイン基の数、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）によるタンパク質における位置の同定を容易にするための、システインおよびシステイン基の化学的誘導体化のための方法を報告した。ＭｕｒｐｈｙおよびＦｅｎｓｅｌａｕ（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｃ．Ｍ．およびＣ．Ｆｅｎｓｅｌａｕ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６７：１６４４−１６４５（１９９５））は、内部生成されたすべてのカルボキシル末端ペプチドへ、３２の質量単位を添加するための臭化シアン消化の間に生成された、ホモセリンラクトン残基のメタノリシスの使用を実証した。オリジナルのＣ末端を含むペプチドフラグメントは、メチルエステルに変換され、その質量に１４Ｄａのみ付加し、それ故、ＭＳにおいて識別可能である。Ｒｏｓｅら（Ｒｏｓｅ，Ｋ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５０：２５３−２５９（１９８８））は、タンパク質のトリプシン消化が、Ｈ218Ｏ：Ｈ216Ｏの１：１のモル比で行われる類似のアプローチを実証した。従って、内部生成によって生じたトリプシンフラグメントのカルボキシル末端の半分が、18Ｏで標識され、そして生じた質量スペクトルにおいて、独特の５０：５０の同位体分裂を示す。オリジナルのカルボキシル末端は、未標識のままであり、そして容易に区別される。
【０２５４】
本発明は、非常に精密な分離後検出ならびに引き続く質量分析配列決定および同定のためにタンパク質を同時に調製する、タンパク質またはタンパク質混合物についての標識化手順に属し、これは、好ましくは、非タンパク質分解性であり、そして非化学分解性である。本方法は、独特のイオン質量成分、定量検出成分およびタンパク質（単数または複数）に結合するための反応性の官能基を有する標識で、インタクトなタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端またはタンパク質混合物のＮ末端もしくはＣ末端を標識することによって行われる。次いで、生じた標識化タンパク質混合物は、本明細書中に記載された方法に従って分離され得、そして検出され得る。
【０２５５】
代表的には、これらの分離方法は、複数のキャピラリー電気泳動方法（次元（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ））を実施する工程を包含し、ここで、複数のタンパク質を含むサンプルが、最後の電気泳動分離次元の前の次元において標識され、そして標識化タンパク質検出および定量が、最後の電気泳動次元の終わりに実施される。いくつかの実施形態において、タンパク質検出および定量は、レーザー誘導性蛍光によって達成される。いくつかの実施形態において、このプロセスは、０．０１〜０．００１ｎｇの標識化タンパク質の検出に帰し、現行のゲル染色技術よりも１０〜１００倍高い感受性の検出方法をもたらす。いくつかの実施形態において、このプロセスは、サンプルに含まれるタンパク質の相対的存在比における１〜５％の標準偏差に帰し、現行のゲル染色技術よりも１０倍高いタンパク質存在比の再現可能な測定をもたらす。
【０２５６】
タンパク質同定方法は、代表的には、質量分析計のイオン化ゾーンにおけるインタクトな標識化タンパク質をフラグメンテーションする工程（例えば、供給源内フラグメンテーション）、および生じた標識化ペプチド系列の質量ラダーから配列決定する工程を包含する。標識化ペプチドは、生じた質量スペクトルにおける独特の質量サインによって、未標識ペプチドと区別される。いくつかの実施形態において、このプロセスは、精製された標識化タンパク質について１分未満で達成され、現行のＭＳ／ＭＳタンパク質配列決定技術よりも５００〜１０００倍迅速な方法をもたらす。
【０２５７】
標識化タンパク質は、好ましくは標識の存在によって影響される様式で、ＭＳのイオン化ゾーンにおいて高度にフラグメンテーションされる。好ましい標識は、親タンパク質に関連して、増大したイオン化効率および生じた標識化ペプチドフラグメントイオンの増強した揮発性を導き、従って、検出感受性全体を改良する。タンパク質またはタンパク質配列タグの配列は、好ましくは、質量スペクトルの低い分子量末端から構築され、これまでの方法を超える利点（例えば、生じた標識化ペプチドフラグメントからのより絶対的な質量精度およびより容易な配列決定（Ｑ残基およびＫ残基の分離を含む））を提供する。
【０２５８】
この技術についての適切な標識の選択は、いくつかの判断基準の考慮を必要とする。第１に、標識は、好ましくは、ＭＳの断片化条件を残存するに十分に頑強である。例えば、硫黄含有標識は、一般的に、それらの非硫黄含有類似体よりもさほど頑強ではない。第２に、標識は、好ましくはまた、タンパク質バックボーンの内部分割から生成されるいかなる非標識ペプチドからをも識別可能である、固有の質量／電荷（ｍ／ｚ）サインを作製する。第３に、標識はまた、定量的検出増強成分（例えば、イオン化可能基または永続的にイオン化された基）を保有して、断片化が、非荷電Ｎ末端残基およびＣ末端残基、および／または高感度で光学的に検出され得る発色団基または蛍光団基さえも含む多量のイオンを生じることを保証する。
【０２５９】
水性または水性／有機溶媒環境の混合物中における種々の薬剤でのタンパク質の標識は、当該分野において公知であり、そして本発明を実施する際に有用な広範な種々の標識化試薬および技術が、当業者に容易に利用可能である。例えば、Ｍｅａｎｓら、ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９７１；Ｆｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ；ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＳＰＥＣＴＳ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２；Ｆｅｅｎｅｙら、ＦＯＯＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮＴ  ＴＨＲＯＵＧＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  第１６０巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９７７；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６を参照のこと。
【０２６０】
標識化が実施され得、そしてＰＳＴは、タンパク質のＮ末端末またはＣ末端末のいずれかから決定され得る。真核生物タンパク質の約５９〜９０％が、Ｎ末端アセチル化されており、従って、Ｎ末端標識化に不応性ある。しかし、このようなタンパク質の天然のＮアセチル基は、時折、本発明の目的のための標識として使用され得るが、これは、そのＮ末端の４残基以内において１以上のアミノ酸がイオン化可能である（例えば、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基である）か、またはイオン化可能であるように誘導体化され得る（例えば、チロシン残基、セリン残基、およびシステイン残基）場合においてのみである。従って、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかを標識するためのストラテジーは、任意の所定のタンパク質について非常に高程度の配列決定能力を付与するために提供される。一旦、標識が選択されると、逆重畳アルゴリズムを改変して、任意の改変残基に対応する質量について探索し得る。
【０２６１】
上述のように、以下を考慮することが、標識化剤の選択に適切である：
ｉ）標識の質量は、好ましくは、固有であり、そして好ましくは、低いバックグラウンドを有するスペクトルの領域に、フラグメント質量をシフトさせる；
ｉｉ）標識は、好ましくは、固定された正電荷または負電荷を含み、Ｎ末端またはＣ末端での電荷の断片化を直接的に遠隔する；
ｉｉｉ）標識は、好ましくは、断片化条件下で頑強であり、そして不都合な断片化を受けない；
ｉｖ）標識化化学は、好ましくは、一定範囲の条件（特に、変性条件）下で効率的であり、それにより、再現可能かつ均一に、Ｎ末端またはＣ末端を標識する；
ｖ）標識されたタンパク質は、好ましくは、選り抜きのＭＳ緩衝系において可溶性を維持する；そして
ｖｉ）標識は、好ましくは、タンパク質のイオン化効率を増加させるか、または少なくともタンパク質のイオン化効率を抑制しない；
ｖｉｉ）標識は、２以上の同位体的に異なる種の混合物を含み、各標識フラグメント位置において固有の質量分析パターンを生じ得る。
【０２６２】
標識選択の判断基準の観点から、好ましい標識部分は、検出増強成分、イオン質量サイン成分、およびＣ末端またはＮ末端反応性官能基を有するものである。この反応基は、他の２つの標識成分のいずれかまたは両方に、直接的に結合され得る。
【０２６３】
別の実施形態では、反応性官能基は、検出増強成分およびイオン質量サイン成分の１つまたは両方から、リンカーによって分離され得る。リンカーは、好ましくは、化学的に安定であり、かつ不活性であるように、そして反応基と、タグの他の２つの成分のうちの少なくとも１つとの効率的な分離を可能にするように、設計される。本発明の好ましい実施形態では、リンカーは、炭化水素鎖、最も好ましくは、アリールまたはヘテロアリール環に連結された炭化水素鎖から構成され、そして好ましくは、イオン化可能基とそのイソチオシアネート基との間のさらなる分離を提供する。
【０２６４】
当業者に理解されるように、炭化水素鎖および改変された炭化水素鎖の実質的に無限のアレイが、本発明において利用され得る。フェニル環に結合される好ましい炭化水素鎖は、アルカンのファミリーにおいて見出され得、特に好ましいリンカーは、長さが２炭素原子〜約２０炭素原子の範囲である。本発明の好ましい実施形態では、リンカーはフェネチル基である。
【０２６５】
（ＩＶ．標識成分および結合化学）
（タンパク質混合物）
適切なタンパク質サンプルは、本質的に任意の生物学的サンプル（例えば、細胞）または患者由来の組織サンプルから獲得され得る。好ましい実施形態では、サンプルは、流体（例えば、血液、脳脊髄液など）中のヒト細胞または他の組織（例えば、腫瘍の生検または検死サンプル由来の細胞のような）から得られる。サンプルは、代表的に、ヒト患者から採取されるが、サンプルはまた、概して真核生物（植物、脊椎動物、および無脊椎動物を含む）由来の細胞、そして特に哺乳動物（イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、およびブタ）、そしてとりわけ、霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、マカク、およびヒヒ）、およびげっ歯類（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）における細胞から調製され得る。細菌培養物もまた、タンパク質サンプルの供給源として使用され得る。
【０２６６】
タンパク質サンプルを調製した細胞サンプルまたは組織サンプルは、代表的に、例えば、癌または別の疾患を有すると疑われる患者から採取される。細胞サンプルおよび組織サンプルを単離する方法は、当業者に周知であり、そしてこれには、吸引、組織切片化、針生検などが含まれるが、これらに限定されない。しばしば、サンプルは、「臨床的サンプル」であり、これは、当業者に公知の任意の標準的技術の使用に由来するサンプルである。例えば、宿主細胞を溶解して、フレンチプレス、均質化、および／または超音波処理によって、細胞質の成分を放出し得る。次いで、ホモジネートは遠心分離され得る。
【０２６７】
ポリペプチドが、ペリプラズムにおいて形成された封入体を有するタンパク質サンプルについて、この封入体は、しばしば、細胞内膜および／または細胞外膜に結合し、従って、主に遠心分離後のペレット物質において見出される。次いで、このペレット物質をカオトロピック剤（例えば、グアニジンまたは尿素）で処理して、封入体を放出、分解、そして可溶化し得る。膜貫通タンパク質および脂肪親和性タンパク質は、カオトロピック剤、界面活性剤および有機溶媒の使用を通して、遠心分離後にペレット物質から可溶化され得る。次いで、これらの可溶性形態のポリペプチドは、免疫沈降、酸沈降（例えば、５〜１０％のトリクロロ酢酸）、硫安沈殿、溶媒沈殿、または他の当業者に公知の方法によって、単離され得る。タンパク質単離の他の方法が、例えば、Ｍａｒｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８２：２６４−２７５（１９９０）に記載される。
【０２６８】
封入体が宿主細胞のペリプラズムにおいて有意な程度には形成されない、タンパク質およびポリペプチド混合物について、ポリペプチドは主に、細胞ホモジネートの遠心分離後の上清において見出され、そしてポリペプチドは、種々の型のクロマトグラフィー（免疫親和性、分子ふるい、および／またはイオン交換）、および／または高速液体クロマトグラフィーのような方法を使用して、この上清から単離され得る。いくつかの場合には、完全な精製のために、１つより多くのこれらの方法を使用することが好適であり得る。
【０２６９】
上記のようなタンパク質またはポリペプチド混合物の単離後に、タンパク質サンプルは、代表的に、適切な緩衝溶液で希釈されるか、またはいくつかの場合においては、濃縮され得る。任意の多くの標準的な緩衝溶液（種々の緩衝液（例えば、生理学的ｐＨでのホスフェート、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなど）の１つを使用する）が、使用され得る。上述の供給源由来のタンパク質サンプルは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、または少なくとも１００、もしくはそれより多いタンパク質を含み得る。
【０２７０】
（標識化剤）
種々の標識化剤が、本発明において有用である。適切な標識化剤の選択は、以下から選択される、いくつかの判断基準の考慮を必要とする：
ｉ）標識の質量は、好ましくは、固有であり、そして好ましくは、低いバックグラウンドを有する質量スペクトルの領域に、フラグメント質量をシフトさせる；
ｉｉ）標識は、好ましくは、固定された正電荷または負電荷を含み、Ｎ末端またはＣ末端での電荷の断片化を直接的に遠隔する；
ｉｉｉ）標識は、好ましくは、断片化条件下で頑強であり、そして不都合な断片化を受けない；
ｉｖ）標識化化学は、好ましくは、一定範囲の条件（特に、変性条件）下で効率的であり、それにより、再現可能かつ均一に、Ｎ末端またはＣ末端を標識する；
ｖ）標識されたタンパク質は、好ましくは、選り抜きのＣＥおよびＭＳ緩衝系において可溶性を維持する；そして
ｖｉ）標識は、好ましくは、タンパク質のイオン化効率を増加させるか、または少なくともタンパク質のイオン化効率を抑制しない；
ｖｉｉ）標識は、２以上の同位体的に異なる種の混合物を含み、各標識フラグメント位置において固有の質量分析パターンを生じ得る。
【０２７１】
標識選択の判断基準の観点から、好ましい標識部分は、検出増強成分、イオン質量サイン成分、およびＣ末端またはＮ末端反応性官能基を有するものである。この反応基は、他の２つの標識成分のいずれかまたは両方に、直接的に結合され得る。
【０２７２】
別の実施形態では、反応性官能基は、検出増強成分およびイオン質量サイン成分の１つまたは両方から、リンカーによって分離される。リンカーは、好ましくは、化学的に安定であり、かつ不活性であるように、そして反応基と、タグの他の２つの成分のうちの少なくとも１つとの効率的な分離を可能にするように、設計される。本発明の好ましい実施形態では、リンカーは、炭化水素鎖もしくはポリエチレンオキシド鎖、または最も好ましくは、アリールまたはヘテロアリール環に連結された炭化水素鎖またはポリエチレンオキシド鎖から構成され、そして好ましくは、イオン化可能基と反応性官能基との間のさらなる分離を提供する。
【０２７３】
当業者に理解されるように、種々の炭化水素鎖および改変された炭化水素鎖が、本発明において利用され得る。フェニル環に結合される好ましい炭化水素鎖は、アルキレン基である。特に好ましいリンカーは、長さが２炭素原子〜約２０炭素原子の範囲である。本発明の好ましい実施形態では、リンカーはフェネチル基である。
【０２７４】
本発明は、より一般的に、以下を含む化学的標識部分を具現化する：
（ｉ）検出増強成分、
（ｉｉ）質量分析法において固有のイオン質量サインを示し、そして標識化部分に結合されたペプチドフラグメントにこのサインを付与する、成分、および
（ｉｉｉ）特定の位置のタンパク質（最も好ましくは、タンパク質のＭ末端アミンまたはＣ末端カルボキシル末端）に共有結合により化学薬剤を結合させる、成分。
【０２７５】
この方法のバリエーションにおいて、標識化部分は、（ｉｖ）少なくとも１つの電気泳動分離工程の前に、複数のタンパク質を含む混合物中のすべてのタンパク質に結合される。
【０２７６】
この方法のバリエーションにおいて、標識化部分は、（ｖ）タンパク質において内在する（またはネイティブな）電荷を変更し、電気泳動モードにおいてその分離座標を変更する。
【０２７７】
この方法のバリエーションにおいて、標識部分の質量および／または電荷は、（ｖｉ）最後の電気泳動工程における検出および定量化の後であって、かつタンパク質の部分的配列決定のための質量分析法における使用の前に、１以上の成分の付加または切断を通して変更される。
【０２７８】
１つの実施形態では、標識化部分は、電気泳動の間、標識化タンパク質の分離の後に混合サンプル中に存在する大部分のタンパク質の相対量または絶対量を定量するために使用される。蛍光、ＵＶ、または可視的色素、および放射性検出増強成分が、その内在的に高い検出制限が理由で、この実施形態において典型的である。蛍光構成成分は、これらの電気泳動単位の蛍光検出器の容易な利用可能性が理由で、キャピラリー電気泳動分離について最も典型的である。放射性構成要素は、電気泳動ゲルについてのリン光体スクリーンおよび写真フィルム検出技術の容易な利用可能性が理由で、他のモードの電気泳動分離について最も典型的である。ＭＳ検出についての最も典型的な検出増強成分は、荷電成分または容易にイオン化可能な成分である。この実施形態のバリエーションにおいて、１より多い検出増強成分が、標識化部分において使用され得る。
【０２７９】
別の実施形態では、標識化部分は、質量分析法においてタンパク質またはそのタンパク質に由来するフラグメント化ペプチドに対して、固有の質量サインを付与し、その結果、その固有な質量サインを使用して、標識から伸長されている部分的タンパク質配列を決定し得る。この方法のバリエーションにおいて、標識は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に結合されて、Ｎ末端またはＣ末端のタンパク質配列の決定を可能にする。この方法のバリエーションにおいて、標識の固有の質量サインは、検出増強成分およびタンパク質との反応後の反応成分の質量の合計の関数として作成される。この方法のバリエーションにおいて、固有の質量サインは、化学的部分の１以上の同位体を富化した改変体の混合物の使用によって付与される。この方法のバリエーションにおいて、固有の質量サインは、化学基の置換によって互いに異なる実質的に同一の化学的部分の混合物によって付与される。別の実施形態では、同じ成分が、定量的検出のため、および固有のイオン質量サインを提示するための両方のために使用され得る。このような構成成分の例は、ナフタレン（ｎａｐｔｈａｌｅｎｉｃ）構成要素（例えば、ダンシルクロリド中）（これは、質量分析法において蛍光性であり、かつイオン化される）であるが、ナフタレン構成要素に限定されない。
【０２８０】
（イオン質量サイン成分）
イオン質量サイン成分は、好ましくは、質量分析において固有のイオン質量サインを付与する標識化部分の部分である。標識のすべての構成要素原子の質量の合計は、好ましくは、すべての可能なアミノ酸のフラグメントとは固有に異なる。結果として、標識化アミノ酸およびペプチドは、生じた質量スペクトルにおけるそのイオン／質量パターンによって、非標識アミノ酸およびペプチドから容易に識別可能である。好ましい実施形態では、イオン質量サイン成分は、質量分析法フラグメント化の間に生成されるタンパク質フラグメントに質量を付与し、これは、任意の２０個の天然のアミノ酸についての残基、もしくはａ−イオン質量およびｂ−イオン質量（Ｎ末端配列決定について）、またはｙ−イオン質量（Ｃ末端配列決定について）とは、一致しない。
【０２８１】
当業者によって理解されるように、偽性の質量スペクトルのピークは、標識されていないアミノ酸およびペプチドのフラグメント化からのみならず、サンプルおよび／またはマトリックス中の不純物からをも生じ得る。標識のイオン質量サインの異常をさらに増加させるために、そしてこの「ノイズ」に対して、所望される標識フラグメントのピークを同定するために、標識の質量を最適化することによって、よりスペクトルのノイズの少ない領域に標識フラグメントをシフトさせることが好適であり得る。例えば、標識質量が、１００  ａｍｕより高くそして７００  ａｍｕより低いイオンを生成することが好ましい。これは、低分子量標識の分子量を増加させることによって、または高分子量標識において電荷の数を増加させることによって実施され得る。
【０２８２】
標識化部分に対してより固有の質量サインを提供するための代替的方法は、標識中に安定な同位体を組み込ませることである（例えば、Ｇｙｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９９４−９９９（１９９９）を参照のこと）。例えば、標識化部分に８つの重水素原子を組み込ませること、および変性および非変性標識の５０：５０混合物でタンパク質を標識することによって、結果として生じた標識を含むわずかに荷電したフラグメントは、等しい強度の二重線（１つは、非変性標識を有する種に対応する質量において、そして他方は、８  ａｍｕの種を有する変性標識を有する種に対応する質量において）として、容易に同定される。好ましい実施形態では、質量の差異は、単一電荷状態において、約１〜約２０  ａｍｕである。最も好ましい実施形態では、質量の差異は、単一電荷状態において、約４〜約１０  ａｍｕである。
【０２８３】
標識化部分により固有の質量サインを提供するための別の方法は、標識にアルキルおよび／またはアリール置換基混合物を組み込み、その結果、フラグメントピークの対応するセットが、質量分析において容易に認識可能であることである。例えば、タンパク質は、トリメチルアンモニウム基を含む標識と、そのトリメチルアンモニウム基の場所にジメチルエチルアンモニウム基を含む同じ標識との混合物で標識され得る。この標識部分は、配列中の各アミノ酸についての２つのフラグメントイオンピークを生じ、これは、互いに対して１４  ａｍｕ程度異なる。多くのこのような組み合わせが誘導され得ることが、当業者に明らかである。
【０２８４】
（検出増強成分）
本明細書中で使用される場合、検出増強成分は、質量分析、他の分光学的方法（例えば、ＵＶ／Ｖｉｓ、ＥＳＲ、ＮＭＲなど）またはシンチレーション計数によるタンパク質フラグメントの検出および定量を容易にする標識化部分の部分をいう。従って、１つの群の実施形態において、検出増強成分は、質量分析法イオン化チャンバーにおけるイオン化条件下において、荷電性（正または負）のイオン種を提供し得、その結果、タンパク質のイオン化効率が改善される。多くの検出増強成分について、存在するイオン化種の量は、タンパク質を可溶化するために使用される媒体に依存する。好ましい検出増強成分（すなわち、正電荷または負電荷を生じ得る種）は、以下の２つのカテゴリーに分類され得る：１）「硬い（ｈａｒｄ）」電荷を保有する成分、および２）「軟らかい（ｓｏｆｔ）」電荷を保有する成分。
【０２８５】
「硬い」電荷を保有する成分は、媒体のｐＨに関わらず、すべての条件下において、イオン化される原子の配置である。「硬い」の正に荷電した検出増強成分としては、テトラアルキルアンモニウム基またはテトラアリールアンモニウム基、テトラアルキルホスホニウム基またはテトラアリールホスホニウム基、およびＮ−アルキル化またはＮ−アシル化されたヘテロシクリルおよびヘテロアリール（例えば、ピリジニウム）基が挙げられるが、これらに限定されない。「硬い」の負に荷電した検出成分としては、テトラアルキルボラート基またはテトラアシルボラート基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８６】
「軟らかい」電荷を保有する成分は、それぞれ特定のｐＨ（すなわち、塩基および酸）においてイオン化される原子の配置である。本発明の状況において、「軟らかい」の正電荷としては、８より高い、好ましくは１０より高い、そして最も好ましくは１２より高いｐＫａを有するそれらの塩基である。本発明の状況において、「軟らかい」の負電荷としては、４．５未満、そして好ましくは２未満、そして最も好ましくは１未満のｐＫａを有するそれらの酸である。極度なｐＫａでは、「軟らかい」電荷は、「硬い」電荷としての分類に近づく。「軟らかい」の負に荷電した検出増強成分としては、１°、２°、および３°アルキルまたはアリールアンモニウム基、置換および非置換ヘテロシクリルおよびヘテロアリール（例えば、ピリジニウム）基、アルキルまたはアリールＳｃｈｉｆｆ塩基またはイミン基およびグアニジノ基が挙げられるが、これらに限定されない。「軟らかい」の負に荷電した検出増強成分としては、アルキルカルボキシレート基またはアリールカルボキシレート基、アルキルスルホネート基またはアリールスルホネート基、およびアルキルホスホネート基またはアルキルホスフェート基、あるいはアリールホスホネート基またはアリールホスフェート基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８７】
「硬い」および「軟らかい」荷電基の両方について、当業者に理解されるように、これらの基は、対立電荷の対イオンが付随する。例えば、種々の実施形態において、正に荷電した基の対イオンとしては、低級アルキル有機酸（例えば、アセテート）、ハロゲン化有機酸（例えば、トリフルオロ酢酸）、およびオルガノスルホネート（例えば、Ｎ−モルホリノエタンスルホネート）のオキシアニオンが挙げられる。負に荷電した基の対イオンとしては、例えば、アンモニウムカチオン、アルキルアンモニウムカチオンもしくはアリールアンモニウムカチオン、およびアルキルスルホニウムカチオンまたはアリールスルホニウムカチオンが挙げられる。
【０２８８】
標識の検出増強成分はまた、複数荷電であり得るか、または複数荷電になり得る。例えば、複数の負電荷を有する標識は、１以上のわずかに荷電した種（例えば、カルボキシレート）を組み込み得るか、またはこれは、１以上の複数荷電した種（例えば、ホスフェート）を組み込み得る。本発明のこの実施形態の代表的な実施形態において、複数のカルボキシレートを保有する種（例えば、ポリアミノカルボキシレートキレート剤（例えば、ＥＤＴＰ、ＤＴＰＡ）のような）を、タンパク質に結合させる。タンパク質および他の種にポリアミノカルボキシレートを結合させる方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｍｅａｒｅｓら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｈｅｌａｔｅ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ、ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＳＰＥＣＴＳ；Ｆｅｅｎｅｙら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２、第３７０〜３８７頁；Ｋａｓｉｎａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ９：１０８〜１１７（１９９８）；Ｓｏｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ８：２４９−２５５（１９９７）を参照のこと。
【０２８９】
類似の様式において、複数の正電荷を有する標識が購入され得るか、または当業者に利用可能な方法を使用して調製され得る。例えば、２つの正電荷を保有する標識化部分は、ジアミン（例えば、エチレンジアミン）から、迅速かつ容易に調製され得る。代表的な合成経路において、ジアミンは、当該分野において公知の方法を使用して一保護（ｍｏｎｏｐｒｏｔｅｃｔ）され、そして保護されていないアミン部分が、引き続いて１以上の正電荷を保有する種（例えば、（２−ブロモエチル）トリメチルアンモニウムブロミド）（Ａｌｄｒｉｃｈ））でジアルキル化される。当該分野において認知されている方法を使用した脱保護は、少なくとも２つの正電荷を保有する反応性標識化種を提供する。複数荷電した標識化種に対する多くのこのような単純な合成経路が、当業者に明らかである。別の実施形態では、質量分析法検出増強成分は、揮発性の非水性溶媒においてタンパク質の溶解度を増加させる成分からなり得る。
【０２９０】
荷電した標識が好ましいものの、中性であるが「軟らかい」電荷を保有するタンパク質残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸）に密接に近い成分を、検出増強成分として使用し得る。この場合、標識は、イオン化された基もイオン化可能な基も保有せず、そして検出の増強は、イオン化可能な残基を中和し、そして揮発性有機溶媒の量を増加させることによって引き起こされるタンパク質の揮発度の増加によって提供される。このような成分が固有のイオン質量を保有する場合、これはまた、近位のタンパク質残基が電荷を保有する場合にタンパク質配列タグを生成するために供され得る。本発明の状況において、密接に近いとは、タンパク質の標識された末端から約４残基以内、そしてより好ましくは、タンパク質の標識された末端の約２残基以内として規定される。例としては、フェニルイソチオシアネートおよびＮ−アセチル基が挙げられる。
【０２９１】
別の実施形態のグループでは、検出増強成分は、例えば、分光法（例えば、ＵＶ／Ｖｉｓ、蛍光、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）など）、またはシンチレーション計数（放射性同位体の検出）などによって検出され得る検出可能部分である。タンパク質が、ＵＶ／Ｖｉｓによって検出される場合、タンパク質に発色団標識（例えば、フェニル、ナフチルなど）を結合させることが、一般に所望される。同様に、蛍光分光法による検出について、発蛍光団は、好ましくは、タンパク質に結合される。ＥＳＲについて、検出可能部分は、遊離ラジカル（例えば、窒素酸化物基を含む部分）であり得る。タンパク質がＮＭＲ法によって検出される場合、検出可能部分は、ＮＭＲアクセス可能な核（例えば、フッ素、13Ｃなど）を富化され得る。
【０２９２】
現在好ましい実施形態において、検出可能な部分は、蛍光団である。多くの反応性蛍光標識は、例えば、ＳＩＧＭＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに当業者に公知の他の多数の市販の供給源から市販されている。さらに、当業者は、特定の適用のために適切な蛍光団を選択する方法を認識し、そして市販で容易には入手可能ではない場合には、必要な蛍光団をデノボで合成し得るか、または市販の蛍光化合物を合成により改変して、所望の蛍光標識に到達する。
【０２９３】
特定の検出可能なタグのために適切な蛍光団を選択するための、文献において利用可能な多数の実用的なガイダンスが、以下の参考文献により例示されるように、存在する：Ｐｅｓｃｅら編、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７０）；など。文献はまた、蛍光分子および色素分子、ならびにこれらの関連する光学特性の、徹底的な列挙を提供する参考文献を含む（例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＯＦ  ＡＲＯＭＡＴＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ、第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、ＣＯＬＯＵＲ  ＡＮＤ  ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ編、ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２）Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９４９）；などを参照のこと）。さらに、分子に付加され得る容易に利用可能な反応性基を介する共有結合のために、このような分子を誘導体化するための広範なガイダンスが、文献に存在する。
【０２９４】
蛍光団を他の分子に結合体化させるために利用可能な化学の多様性および有用性は、蛍光団で誘導体化された核酸の調製についての文献の広範な本文により、例示される。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（前出）；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３５１，７６０号を参照のこと。従って、適切な蛍光団を選択すること、およびタンパク質またはポリペプチドに蛍光団を結合体化させることは、十分に当業者の能力内である。
【０２９５】
タンパク質に直接付着される蛍光団に加えて、蛍光団はまた、間接的な手段により付着され得る。例示的な実施形態において、リガンド分子（例えば、ビオチン）が、好ましくは、タンパク質に共有結合される。次いで、このリガンドは、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合し、これが、固有に検出可能であるか、または上記の蛍光団のようなシグナル系に共有結合するかの、いずれかである。結合する界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）で変性されたタンパク質（例えば、多次元キャピラリー電気泳動分離のＣＧＥ段階において分離されたもの）についての改変において、検出は、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅTM色素およびＳｙｐｒｏTM色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）のような界面活性剤結合蛍光団を介してタンパク質に非共有結合される、検出増強成分を用いて、容易にされ得る。これらの化合物は、いくつかの望ましい性質を有し、以下が挙げられる：１）結合における、従ってタンパク質定量における、優れた再現性、２）タンパク質型に依存しない、結合の一般性、ならびに３）色素が界面活性剤により被覆されたタンパク質に結合した場合のみの、蛍光挙動。本発明において、独自の質量表示成分が、共有結合を介して、Ｎ末端またはＣ末端において、タンパク質に別々に結合され得る。
【０２９６】
適切な蛍光化合物（または蛍光団）としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。本発明の方法とともに使用する、現在好ましい蛍光団は、フルオレセインおよびローダミン色素である。これらの化合物の多くの適切な形態が、これらのフェニル部分に置換基を有して広範に市販されており、この置換基を、タンパク質に蛍光団を付着させるための結合官能基として使用し得る。好ましい蛍光化合物の別の群は、アミノ基をα位またはβ位に有する、ナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物のうちで、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが挙げられる。他の適切な蛍光団としては、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、アクリジン（例えば、９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ）；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが挙げられる。
【０２９７】
有用な蛍光検出可能部分は、これらを当該分野において公知の任意の様式（例えば、光または電気化学的エネルギーによるものが挙げられる）で励起することにより、蛍光するようにされ得る（例えば、Ｋｕｌｍａｌａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３８６：１（１９９９）を参照のこと）。蛍光標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、蛍光標識は、蛍光団を適切な波長の光で励起させ、そして生じる蛍光を検出することにより、検出され得る。蛍光は、写真フィルムによって、電気検出器（例えば、電荷結合要素（ＣＣＤ）または光電子増倍など）の使用により、視覚的に検出され得る。
【０２９８】
任意の分離技術とＭＳ配列決定法との間の処理工程が少ないほど、そのタンパク質はより迅速に同定され得、そしてプロテオーム研究の費用がより低くなる。代表的な電気泳動緩衝液（例えば、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７３：４２４（１９８８）、およびＯ’Ｆａｒｒｅｌ、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５０：４００７（１９７５））は、質量分析計中でのタンパク質のイオン化を抑制する成分（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液およびドデシル硫酸ナトリウム）を含む。これらの成分は、ＭＳにおけるイオン化を抑制しない、他のより揮発性の成分（例えば、モルホリノアルキルスルホネート緩衝液および一時的な界面活性剤）と置換され得る。別の実施形態において、サンプルは、重炭酸アンモニウム緩衝液または酢酸アンモニウム緩衝液で希釈されて、質量分析計のための揮発性プロトン表面を提供する。Ｗｉｌｍ，Ｍ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６８：１−８（１９９６）。別の実施形態において、緩衝液交換は、サンプルが分離プロセスの出口からＭＳの入口へと移送されるにつれて、クロマトグラフィー透析または接線流れ透析により、実施される。
【０２９９】
（反応性基）
標識部分の第三の成分は、Ｎ末端アミノ酸基、Ｃ末端アミノ酸基、またはＮ末端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸の別の成分と反応性である、官能基である。
【０３００】
反応性官能基は、標識薬剤またはタグの任意の位置に位置し得る。例えば、反応性基は、アリール核上、またはアリール核に付着した鎖（例えば、アルキル鎖）上に、位置し得る。反応性基が、アリール核に係留されたアルキル鎖、または置換アルキル鎖に付着される場合には、この反応性基は、好ましくは、アルキル鎖の末端位置に位置する。本発明の実施において有用な反応性基および反応のクラスは、一般に、生結合体化学の分野において周知のものである。現在好ましい反応のクラスは、比較的マイルドな条件下で、水性溶媒または混合された水性／有機溶媒の媒体中で、進行するものである。
【０３０１】
タンパク質中の一級アミノ基（Ｎ末端を含む）を標的とする、特に好ましい化学としては、例えば以下が挙げられる：アリールフルオリド（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３９：５０７（１９４５）；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ＮＹ、１９８４）；Ｎｉｅｄｅｒｗｉｅｓｅｒ，Ａ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：６０−９９（１９７２）；およびＨｉｒｓ，Ｃ．Ｈ．Ｗ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１１１：２０９−２２２（１９６５）を参照のこと）、スルホニルクロリド（Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：１２１−１３７（１９７２））、シアネート（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：１０３−１２０（１９７２））、イソチオシアネート（Ｎｉａｌｌ，Ｈ．Ｄ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７：９４２−１０１１（１９７３））、イミドエステル（Ｇａｌｅｌｌａ，Ｇ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０：７１−８０（１９８２））、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｌｏｍａｎｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０４：２４３−２６１（１９７６））、Ｏ−アシルイソウレア（Ｌｏｍａｎｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０４：２４３−２６１（１９７６））、クロロカーボネートおよびカルボニルアジド（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６）、アルデヒド（Ｎｏｖｏｔｎｙら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６３：４０８（１９９１）およびＮｏｖｏｔｎｙら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４９９：５７９（１９９０））ならびにアルキルハライドおよび活性化アルケン（Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｌ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、２０：４１９−４２５（１９９１））。
【０３０２】
タンパク質のカルボキシル基と反応する化学成分の好ましい例は、以下である：ベンジルハライド（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：３４１−３４７（１９８６）；およびＨｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：４６８（１９７２））、カルボジイミド（Ｙａｍａｄａ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０：４８３６−４８４２））（特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して安定化される場合（Ｇｒａｂａｒｅｋ，Ｚ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１３１−１３５（１９９０）を参照のこと））、ならびに無水物（Ｗｅｒｎｅｒら、「Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｎｉｎｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙでのポスター紹介を参照のこと）。カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのアプローチは、Ｃ末端のアミノ酸残基とともにカルボキシル含有アミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）を標識すると、予測される。しかし、無水物のアプローチを独自に使用して、タンパク質のカルボキシル残基とＣ末端カルボキシル基との間を区別し得る。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２に記載される。
【０３０３】
反応性官能基は、これらがタグを構築するために必要な反応に関与しないか、またはこの反応を妨害しないように、選択され得る。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在により反応に関与することから保護され得る。当業者は、特定の官能基を保護して反応条件の選択した設定を妨害しないようにする方法を、理解する。有用な保護基の例としては、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照のこと。
【０３０４】
種々の官能基は、適切な付着のための条件を参照して、以下に記載される。当業者は、確立された化学プロトコルに従って、記載される基の各々がさらに改変されて、独自のイオン質量表示成分および定量検出成分を組み込むことを、理解する。
【０３０５】
わずかにアルカリ性（ｐＨ８〜９）の溶液中では、サンガー試薬（１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）は、一級アミンにより求核攻撃を受けて、安定な二級アリールアミンを形成する（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６））。サンガー試薬はまた、リジン残基のε−アミノ基、ならびにヒスチジン残基およびチロシン残基と、ｐＨ１０および４０℃で反応する（十分に規定されたラグ相の後でさえも）（Ｈｉｒｓ，Ｃ．Ｈ．Ｗ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１１１：２０９−２２２（１９６５））。還元的アミノ化（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６））をまた使用して、アルデヒドおよびケトンを使用して、アミンの置換の程度を増加させ得る（Ｎｏｖｏｔｎｙら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６３：４０８（１９９１）；Ｎｏｖｏｔｎｙら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４９９：５７９（１９９０））が、水溶液中では効率が減少する。
【０３０６】
ダンシルクロリドは、アルカリ性ｐＨで、タンパク質中のアミンにより同様の求核攻撃を受け、芳香族スルホンアミドを生成する（Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：１２１−１３７（１９７２））。しかし、スルホニルクロリドはまた、ｐＨに依存して、二級アミンと反応し得る（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６）。芳香族成分は、反応生成物の蛍光検出を可能にする。ダンシルクロリドはまた、リジンのε−アミノ基と反応する（Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：１２１−１３７（１９７２））。
【０３０７】
シアン酸カリウムもまた、アルカリ性ｐＨにおいて、タンパク質のアミノ基を標識するために使用され得る。Ｓｔａｒｋら（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：１０３−１２０（１９７２））を参照のこと。同様に、フェニルイソチオシアネート（Ｎｉａｌｌ，Ｈ．Ｄ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７：９４２−１０１１（１９７３））を使用して、アルカリ性ｐＨにおいて、タンパク質のアミノ基を標識した。シアネートはＮ末端アミドを形成し、そしてイソチオシアネートはチアミドを形成する。イソチオシアネートはまた、タンパク質への蛍光標識の付着のために、通常使用される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ、１９９６））。
【０３０８】
イミドエステルは、タンパク質の架橋（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）；Ｈａｒｔｍａｎ，Ｆ．Ｃ．およびＦ．Ｗｏｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６：２４３９−２４４８（１９６７））のため、およびタンパク質への蛍光団または他の部分の結合体化のために、広く使用される（Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、１９９６））。アルカリ性ｐＨ（８〜９）における、タンパク質上の一級アミンによる、イミドエステルの求核攻撃は、アミジン結合の形成をもたらす（Ｂｒｏｗｎｅ，Ｄ．Ｔ．およびＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、６７：１２６−１３２（１９７５））。Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルもまた、アミド結合を介する、タンパク質架橋およびタンパク質への標識の付着のために、通常使用される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ、１９９６））。ＮＨＳエステルは、リジンの一級ε−アミノ基（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｐ．およびＩ．Ｐａｒｉｋｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１：２２９１−２２９９（１９７２））、およびタンパク質のＮ末端のα−アミノ基（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５））に対して優れた特異性で反応し、他のアミン含有残基をインタクトなままにする。イミジルエステルの加水分解の速度は、ｐＨにより制御される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５））。
【０３０９】
ベンジルクロロカーボネート、ベンジルクロロホルメート、およびｔ−ブトキシカルボニルアジドは、ポリペプチド合成反応において、反応性アミン基をブロックするために、通常使用される（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：３４１−３４７（１９８６））。いずれも、アルカリ性条件下室温で、非常に効率的な誘導体化薬剤である。いずれの試薬も、類似の酸不安定なアミドエステルを生じる。
【０３１０】
リジンのε−アミノ基は、上記例の全てのうちで、優先的に標識される。なぜなら、隣接するカルボニル基に近いことは、α−アミノＮ末端基の求核性を減少させるからである（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６））。アルギニンおよびヒスチジンにおいて追加される、アミンの共鳴安定化は、これらの残基の反応性をＮ末端のα−アミノ基より低くし、そしてこれらの残基は、正しい反応条件下で有意に標識されるとは、予測されない。
【０３１１】
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：３４１−３４７（１９８６））は、カルボン酸イオンによるベンジルクロリドの求核置換（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｒ．およびＤ．Ｅ．Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｊｒ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：４６８（１９７２））を、自分の古典的な固相ペプチド合成法において、利用した。このベンジルハライド反応は、ベンジルエステルを形成する。
【０３１２】
カルボジイミドは、カルボキシル基と反応して、Ｏ−アシルイソウレア中間体を形成し、これは、水溶液中では非常に不安定であるが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの添加により安定化されて、酸安定な中間体の形成をもたらし得、これは、アルカリ条件下で一級アミンと反応されて、アミドを生成し得る（Ｇｒａｂａｒｅｋ，Ｚ．およびＪ．Ｇｅｒｇｅｌｙ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１３１−１３５（１９９０））。カルボキシル末端（グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基）は全て、酸性ｐＨ（４．５〜５）において、タンパク質のカルボジイミドを標的化する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５））。カルボジイミド化学は、過剰の一級アミンがタンパク質溶液に添加されて架橋反応を阻害する場合にタンパク質のＣ末端を標識するため、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド中間体を介するアミン含有蛍光分子の使用を包含する２段階プロセスにおいて、有用であり得る。
【０３１３】
塩基（例えば、２，６−ルチジン）の存在下で、無水酢酸［Ｄｕｐｏｎｔら、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｂｉｏ．ｃｏｍ］は、自由な溶液中でかまたは固体支持体（例えば、ポリビニリデンフルオリド）に固定されてかのいずれかで、タンパク質のカルボキシ基と反応して、混合した無水物を形成する。得られるＣ末端α−アミノ無水物は、環化して、オキサゾロン中間体を形成し得る。グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基から形成される混合無水物は、環化しない。Ｃ末端オキサゾロンは、塩基性条件下での引き続く求核付加に対して抵抗性であるが、他の無水物は、そうではない。従って、カルボキシ残基は、Ｃ末端の前に、選択的に保護され得る。次いで、酸（例えば、ＴＦＡ）の添加によりｐＨを低下させ、引き続いて、適切な検出増強成分および独自の質量表示成分を担持する一級アミンまたは他の求核剤を添加することにより、Ｃ末端が標識され得る。しかし、このアプローチは、Ｃ末端残基がプロリンである場合には、役に立たない。
【０３１４】
表１は、本発明の標識において有用な多数の標識部分の非限定的列挙を提供する。
【０３１５】
【表１】
2010249831.tif 000002
当業者は、標識技術が、多数の標識部分について容易に利用可能であることを理解する。Ｎ末端標識基（ダンシルクロリド）およびＣ末端標識基（カルボジイミド）の例を、これらの使用のより完全な説明を参照して、本発明の例示として提供する。これら２つの標識部分に焦点を当てることは、本発明の例示の明瞭化のためであり、本発明の範囲を限定しない。
【０３１６】
ダンシルクロリドは、アルカリ性ｐＨにおいて、タンパク質中のアミンによる求核攻撃を受け、芳香族スルホンアミドを生成する。しかし、スルホニルクロリドはまた、ｐＨに依存して、二級アミンとも反応し得る。この芳香族構築物は、反応生成物の分光学的（例えば、蛍光）検出を可能にする。ダンシルクロリドはまた、リジンのε−アミノ基と反応する。α−アミンとε−アミンとの間のｐＫの差を利用して、これらの基のうちの１つを他のものより優先的に改変し得る。
【０３１７】
カルボジイミドは、カルボキシル基と反応して、Ｏ−アシルイソウレア中間体を形成し、これは、水溶液中で非常に不安定であるが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの添加により安定化されて、酸に対して安定な中間体の形成をもたらし得、これは、一級アミンと反応されて、アミドを生成し得る。カルボキシル末端（グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基）は全て、酸性ｐＨ（４．５〜５）において、タンパク質のカルボジイミドを標的化する。カルボジイミド化学は、タンパク質のＣ末端を標識するために、有用である。カルボジイミド化学を利用する場合には、過剰のアミンがタンパク質溶液に添加されて、架橋反応を阻害することが、一般に好ましい。別の例示的な実施形態において、タンパク質アミンは、２工程プロセスで標識される；アミン含有蛍光分子が、タンパク質のＮ−ヒドロキシスクシンイミド中間体またはタンパク質に付着されたスペーサーアームを介して、タンパク質に係留される。
【０３１８】
（合成）
一旦、反応性基、リンカー、およびイオン化可能基が選択されると、最終化合物が、標準的な有機化学反応を利用して、当業者により合成される。本発明において使用するために好ましい化合物は、ＰＥＴＭＡ−ＰＩＴＣ、または類似の薬剤である。この化合物は、カップリングにおいて、フェニルイソチオシアネートの優れた特徴を維持する。さらに、この化合物は、分析方法における標識として、良好に作用する。なぜなら、フェニル環の電子構造が、エチルリンカーにより四級アンモニウム基から十分に分離され、従って四級アンモニウム基により妨害されずにイソチオシアネートが反応することを可能にするからである。ＰＥＴＭＡ−ＰＩＴＣ、Ｃ５  ＰＥＴＭＡ−ＰＩＴＣおよびＰＩＴＣ−３１１の調製は、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら、米国特許第５，５３４，４４０号（１９９６年７月９日発行）に記載される。
【０３１９】
上記標識薬剤の基準を満足する、他の適切な市販の標識としては、スルホフェニルイソチオシアネート、Ｎ−アミノプロピルピリジン（カルボジイミド化学を介してＣ末端に付着される）、および図１〜３に示す種が挙げられる。図１および２は、ＮＨＳ−エステル、イソチオシアネートおよびスルホニルクロリドの反応性基を保有する、カチオン性およびアニオン性の蛍光Ｎ末端標識の例を示す。例は、「かたい」および「やわらかい」正電荷（例えば、「かたい」電荷は、ジアルキルアンモニウム（ｉｍｍｏｎｉｕｍ）により表され、そして「やわらかい」電荷は、アニリニウムにより表される）（図３０）ならびに「やわらかい」負電荷（すなわち、スルホネートおよびカルボキシレート）（図３１）の両方を含む。図３２は、カルボジイミドまたは無水物のアプローチによるＣ末端標識のために使用され得る、一級アミノ基を保有する、カチオン性およびアニオン性の両方の蛍光標識の例を示す。図１〜３の標識の全ては、２００以上のＭＷを有する；従って、アミノ酸の一価に荷電したフラグメントの最小質量は、約２２９であり、これは、グリシンのａ−イオン（２９）と標識の重量（２００）との質量の和である。アミノ酸の最大フラグメント（すなわち、トリプトファンのｙ−イオン）は、約２０５の質量を有するので、示される全ての標識は、より高い質量の、従って天然に存在するアミノ酸の質量とは独自に異なる質量の、最初の目的のフラグメントを生成する。好ましい実施形態において、より高い分子量を有して示される標識（例えば、ＭＷ＞５００のフルオレセイン誘導体）は、フラグメント質量を少なくとも５００以上までシフトさせ、これは、擬似汚染およびマトリックスのピークに占有される傾向のある、ＭＳにおける低ｍ／ｚ範囲を回避する。
【０３２０】
（標識手順）
適切な標識部分を選択して、この標識をタンパク質に付着させるための条件は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端が均一に標識されること、ならびに標識されたタンパク質が適切なＣＥ緩衝系およびＭＳ緩衝系に可溶なままであることを、確実にするべきである。代表的に、標識は、変性条件下（例えば、界面活性剤または８Ｍ尿素）で実施される。界面活性剤および尿素の両方は、ＭＳイオン化を抑制する。この方法の改変において、標識されたタンパク質の迅速な清掃および適切なＭＳ緩衝液への移動を提供する技術もまた、使用されるべきである。この方法の別の改変において、これらの改変剤は、標識後に実施される電気泳動分離工程の間に、標識されたタンパク質から本来分離される。
【０３２１】
記載したように、電気泳動緩衝液中に存在するいくらかの塩（例えば、ＴＲＩＳおよびＳＤＳ）ならびに尿素は、標識タンパク質のイオン化を抑制し得、そして配列分析を潜在的に混乱させる小さな質量／電荷のイオンを生成し得る。従って、スピン透析手順を使用して、ＭＳ分析の前に、緩衝液系を迅速に交換し得る。あるいは、脱塩カラム（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅにより販売されるＺｉｐＴｉｐTMチップ）を、サンプルの清掃および緩衝液交換のために、使用し得る。脱塩されたサンプルを、ＷｉｌｍおよびＭａｎｎにより記載されたように、最小量のメタノールを添加した０．１Ｍ重炭酸アンモニウム中、またはＭａｒｋにより記載されたように、最小量のアセトニトリルを添加した０．０１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（０．１％ギ酸を含む）に再懸濁させ得る（「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭＳ／ＭＳ」、ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ  Ｓｅｍｉｎａｒ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ（１９９８年３月）に示される論文を参照のこと）。
【０３２２】
化合物のカップリング速度は、この化合物がポリペプチドの配列決定に適切であることを保障するように試験され得る。一般に、カップリング速度が速いほど、化合物はより好ましい。５０℃〜７０℃にて２〜１０分の間のカップリング速度が、特に好ましい。同様に、速い反応速度もまた好ましい。なぜなら、延長した時間にわたって反応混合物に曝すことにより、ペプチド結合を加水分解し得るか、またはポリペプチド残基との役に立たないかつ再現性のない副反応を生じるからである（これは、質量分析デコンボルーション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を複雑にし得る）。
【０３２３】
別の好ましい実施形態において、タンパク質混合物のうちの１以上の成分が、標識がポリペプチドに結合される前に、固体支持体に可逆的に結合される。種々の材料（例えば、多数の樹脂、膜または紙を含む）が、固体支持体として使用され得る。これらの支持体は、切断可能な官能基を取り込むようにさらに誘導体化され得る。この目的のために使用され得る、多数の切断可能基としては、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、グリコール（−ＣＨ［ＯＨ］−ＣＨ［ＯＨ］−）、アゾ（−Ｎ＝Ｎ−）、スルホン（−Ｓ［＝Ｏ］−）、およびエステル（−ＣＯＯ−）の連結が挙げられる（Ｔａｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９１：５８０（１９８３）を参照のこと）。特に好ましい支持体としては、Ｓｅｑｕｅｌｏｎ  ＴＭ（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ）のような膜が挙げられる。これらの支持体の構築のための代表的な材料としては、とりわけ、ポリスチレン、多孔性ガラス、ポリビニリジンフルオリドおよびポリアクリルアミドが挙げられる。特に、ポリスチレン支持体としては、とりわけ、（１）（２−アミノエチル）アミノメチルポリスチレン（Ｌａｕｒｓｅｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８８：５３４４（１９９６）を参照のこと）；（２）アリールアミノ基を有する、番号（１）と類似するポリスチレン（Ｌａｕｒｓｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：８９（１９７１）を参照のこと）；（３）アミノポリスチレン（Ｌａｕｒｓｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１：６７（１９７２）を参照のこと）；および（４）トリエチレンテトラミンポリスチレン（Ｈｏｒｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６：２８５（１９７３）を参照のこと）が挙げられる。多孔性ガラス支持体としては、（１）３−アミノプロピルガラス（Ｗａｃｈｔｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５：９７（１９７３）を参照のこと）；および（２）Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルガラス（Ｂｒｉｄｇｅｎ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０：１５９（１９７５）を参照のこと）が挙げられる。これらの誘導体化された多孔性ガラス支持体のｐ−フェニレンジイソチオシアネートとの反応は、活性化されたイソチオシアネートガラスを生じる（Ｗａｃｈｔｅｒら（前出）を参照のこと）。ポリアクリルアミドベースの支持体（架橋されたβ−アラニルヘキサメチレンジアミンポリジメチルアクリルアミド（Ａｔｈｅｒｔｏｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．６４：１７３（１９７６）を参照のこと）およびＮ−アミノエチルポリアクリルアミド（Ｃａｖａｄｏｒｅら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．６６：１５５（１９７６）を参照のこと）を含む）もまた、有用である。
【０３２４】
当業者は、上記の固体支持体にポリペプチドをカップリングさせる適切な化学を容易に利用する（一般には、ＭａｃｈｌｅｉｄｔおよびＷａｃｈｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：［２９］Ｎｅｗ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ２６３〜２７７（１９７４）を参照のこと）。好ましい支持体およびカップリング方法としては、ＥＤＣカップリングを用いるアミノフェニルガラス繊維紙（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８７：５６〜６５（１９９０）を参照のこと）；ＤＩＴＣガラス繊維（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６８６０〜６８６７（１９８８）および膜ポリビニリジンフルオリド（ＰＶＤＦ）（Ｉｍｍｕｂｉｌｏｎ  Ｐ  ＴＭ，Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ）、およびＳｅｑｕｅＮｅｔ  ＴＭ化学（Ｐａｐｐｉｎら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｉｌｌａｆｒａｎｃａ  Ｊ．（編）１９１〜２０２頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０）を参照のこと）の使用が挙げられる。
【０３２５】
本発明の実施において、固体支持体へのポリペプチドの結合は、ポリペプチドと固体支持体との間の共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用のいずれかによって生じ得る。固体支持体へのポリペプチドの非共有結合については、この固体支持体は、ポリペプチドが非共有結合的相互作用によって固体支持体に結合するように選択される。例えば、ガラス繊維固体支持体は、ポリペプチドを非共有結合する固体支持体表面を提供するために、ポリブレン（ポリマー性４級アンモニウム塩）（Ｔａｒｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４：６２２（１９７８）を参照のこと）でコーティングされ得る。他の適切な吸着性固体相は、市販されている。例えば、溶液中のポリペプチドは、合成ポリマー（例えば、ポリビニリジンジフルオリド（ＰＶＤＦ，Ｉｍｍｕｏｂｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）またはカチオン性表面ででコーティングされたＰＶＤＦ（Ｉｍｍｕｂｉｌｏｎ  ＣＤ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ））上に固定され得る。これらの支持体は、ポリブレンを用いて、または用いずに使用され得る。あるいは、ポリペプチドサンプルは、電気ブロッティング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）と呼ばれるプロセスによってポリアクリルアミドから直接的にポリペプチドを抽出することによって、配列決定のために調製され得る。電気ブロッティングプロセスは、溶液中に存在し得る他のペプチドからのペプチドの単離を排除する。適切な電気ブロッティング膜としては、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎおよびＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＣＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）が挙げられる。
【０３２６】
より最近、化学反応が非共有結合性疎水性相互作用によって固体支持体上に固定されたポリペプチド上で実行されることを可能にする自動化方法が、開発されている。このアプローチにおいて、水性緩衝液中のサンプル（これは、塩および変性剤を含み得る）は、固体支持体を含むカラムに圧力により充填される。次いで、結合したポリペプチドは、妨害成分を取り除くために圧力によりリンスされ、標識に直ちに使用できる結合したポリペプチドを残す（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｂｒｏｃｈｕｒｅ  ２３−５０９１−５１６８Ｅ（１９９２年１１月）およびＨｏｒｎ，米国特許第５，９１８，２７３号（１９９９年６月２９日）を参照のこと）。
【０３２７】
結合したポリペプチドは、ポリペプチドの末端アミノ酸と標識部分との間でカップリングが生じるに十分な条件および時間で反応される。支持体の物理特性は、特定の標識部分に対して反応条件を最適にするように選択され得る。例えば、ＰＥＴＭＡ−ＰＩＴＣの強力な極性の性質は、ポリペプチドの共有結合に影響する。好ましくは、ポリペプチドのアミノ基とのカップリングは、例えば、有機塩基（例えば、トリメチルアミンまたはＮ−エチルモルフィン）の存在下で、塩基性条件下で生じる。好ましい実施形態において、この標識は、５％  Ｎ−エチルモルフィンのメタノール：水（７５：２５ｖ／ｖ）の存在下で、結合したペプチドと反応させられる。結合様式のために、過剰の試薬、カップリング塩基および反応副生成物は、標識されたポリペプチドを取り出して、そして質量分析によって配列決定する前に、非常に極性の洗浄溶媒によって除去される。種々の試薬（例えば、メタノール、水、メタノールと水との混合液、またはアセトンを含む）が、洗浄溶媒として適切である。
【０３２８】
より極性が低い試薬（例えば、ＰＩＴＣ−３１１）は、好ましくは、疎水性非共有結合性相互作用によって固体支持体に結合したポリペプチドと反応され得る。この場合において、より極性の低い洗浄液（例えば、ヘプタン、酢酸エチルおよびクロロホルム）が、好ましい。洗浄サイクルの後に、標識されたポリペプチドは、５０％〜８０％の水性メタノールまたはアセトンを含む溶媒での溶出によって固体支持体から分離される。
【０３２９】
標識反応が、完全に、溶液相で行われる場合、反応混合液は、好ましくは、精製サイクル（例えば、透析、ゲル透過クロマトグラフィーなど）に供される。
【０３３０】
タンパク質を標識するためのなお他の条件は、例えば、Ｍｅａｎｓら，ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９７１；Ｆｅｅｎｅｙら，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＳＰＥＣＴＳ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，１９８巻，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２；Ｆｅｅｎｅｙら，Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮＴ  ＴＨＲＯＵＧＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６０巻，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９７７；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６に見出され得る。
【０３３１】
標識が、行われ得、そしてＰＳＴが、タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかから決定され得る。約５９〜９０％の真核生物タンパク質は、Ｎ末端がアシル化されており（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，１９８４を参照のこと）、それによってＮ末端標識に抵抗性である。しかし、このようなタンパク質の天然Ｎアセチル基は、時折、本発明の目的のための標識として使用され得るが、Ｎ末端の４残基以内の１以上のアミノ酸のみが、イオン性であるか（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、もしくはグルタミン酸残基である）、またはイオン性に誘導体化され得る（例えば、チロシン、セリン、およびシステイン残基）。従って、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかを標識するストラテジーが、任意の所定のタンパク質に対して最大の程度の配列決定能力を与えるように提供される。
【０３３２】
（標識されたタンパク質の配列決定）
別の局面において、本発明は、タンパク質混合物中の一部のタンパク質を配列決定するための方法を提供する。この方法は、以下を含む：（ａ）タンパク質混合物と、Ｃ末端もしくはＮ末端標識部分とを接触させ、このタンパク質のＣ末端もしくはＮ末端に標識を共有結合させて、そして標識されたタンパク質混合物を形成する工程；（ｂ）タンパク質混合物中の個々の標識されたタンパク質を分離する工程；および（ｃ）質量分析方法によって工程（ｂ）からの標識されたタンパク質を分析して、少なくとも２個のＣ末端残基もしくは２個のＮ末端残基の配列を決定する工程。
【０３３３】
実施形態の１つの群において、この方法は、さらに以下を含む：（ｄ）遺伝子配列データのデータベースから推定タンパク質配列を検索するために、標識タンパク質の分離座標およびこの配列のタンパク質末端位置と組み合わせて、少なくとも２個のＣ末端残基もしくは２個のＮ末端残基の配列を使用することによってタンパク質を同定する工程。
【０３３４】
（分離）
好ましい実施形態において、タグ化手順は、タンパク質の混合物において行われる。タグ化手順の後に、タンパク質の混合物は、分離プロセスに供される。この手順は、好ましくは、タンパク質混合物の個々の画分への分離を可能にする。各画分は、好ましくは、実質的に、タンパク質混合物のうちの唯一の標識されたタンパク質に富む。
【０３３５】
本発明の方法は、ポリペプチドの配列を決定するために利用される。本発明の好ましい実施形態において、このポリペプチドは、「実質的に純粋」である。これは、このポリペプチドが約８０％均質、および好ましくは約９９％以上均質であることを意味する。当業者に周知の多くの方法が、そのアミノ酸配列を決定する前に、ポリペプチドを精製するために利用され得る。代表的な例としては、ＨＰＬＣ、逆相液体高速クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、または任意の多数のペプチド精製方法が挙げられる（一般には、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳとの表題の一連の巻を参照のこと）。キャピラリー電気泳動、および特に、多次元キャピラリー電気泳動（例えば、同一人に譲渡された同時継続米国特許出願第０９／５１３，４８６号（表題「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」（代理人書類番号０２０４４４−０００２００ＵＳおよび２０００年２月２５日出願））に記載されるもの）の使用が、さらにより好ましい。
【０３３６】
実質的に純粋なポリペプチドは、本明細書中に記載される方法に好ましくは利用されるが、ポリペプチド混合物の配列を決定することもまた可能である。簡潔には、１つの実施形態において、混合物中のペプチドのうちの１つペプチドの観察された質量に等しい算定された質量を有する、全てのハイポセティカル配列を決定するために、アルゴリズムが利用される。Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：１０８３〜１０９１（１９９２）を参照のこと。次いで、このようなアルゴリズムを利用するペプチドのタンデム型質量スペクトルにおいて、これらの配列の各々がこのフラグメントイオンを十分に説明する方法に従う利益を、これらの配列に与え、この混合物内のポリペプチドの配列が、容易に決定され得る。上記のように、本明細書中の方法は、健常な組織サンプルまたは病んだ組織サンプル由来のタンパク質を同定するために特に有用である。実施形態の１つの群において、この方法は、健常組織サンプル由来のタンパク質の混合物および病んだ組織サンプル由来のタンパク質の混合物の両方に適用される。従って、本発明のこの局面に使用されるタンパク質混合物は、本質的に任意の供給源から入手され得る。組織サンプルからタンパク質を単離する方法は、周知である。
【０３３７】
本発明において、誘導体化された末端アミノ酸を有するポリペプチドは、質量分析器によって配列決定される。種々の質量分析器が、本発明において使用され得る。代表的な例としては、三重極質量分析器（磁気セクター（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｃｔｏｒ）機器）（磁気タンデム型質量分析器，ＪＥＯＬ，Ｐｅａｂｏｄｙ，Ｍａｓｓ）；イオンスプレー質量分析器（Ｂｒｕｉｎｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２６４２〜２６４７（１９８７）；電気スプレー質量分析器（Ｆｅｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：６４〜７１（１９８９）；レーザー脱離飛行時間型（ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）質量分析器（Ｋａｒａｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９〜２３０１（１９８８））、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器（Ｅｘｔｒｅｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｍａｓｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、電気スプレー質量分析器（ＭａｒｉｎｅｒTMモデル、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、誘導体化された末端ポリペプチドをフラグメント化するために利用され、そして５０ｐｐｍよりも良好な質量精度を備える飛行時間型検出器が、標識されたフラグメントの質量から配列を決定するために使用される。
【０３３８】
当業者は、本発明の方法を使用して得られた配列情報が、タンパク質の可能性のあるアイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）数をなおさらに減少させる分析下でタンパク質の他の特徴と組み合わされ得ることを理解する。従って、好ましい実施形態において、本発明の方法は、タンパク質配列タグからの情報を、１以上の他のタンパク質特徴と組み合わせて、タンパク質を同定する。配列データを補充するに有用なデータとしては、アミノ酸組成、特定の残基（例えば、システイン）の数および同一性、切断情報、タンパク質分解による（例えば、トリプシンによる）ペプチド質量およびまたは化学分解によるペプチド質量、細胞内位置、ならびに分離座標（例えば、保持時間、ｐＩ、２−Ｄ電気泳動座標など）が挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質を同定するために本発明のＰＳＴからの情報と組み合わされ得る、特定のタンパク質またはタンパク質のクラスに特徴的な他の形態は、当業者に明らかである。特定のタンパク質に特徴的なデータの主体が、より包括的になるにつれ、分析下のタンパク質が、より短いタンパク質配列タグを使用して同定され得る。
【０３３９】
従って、さらなる好ましい実施形態において、タンパク質の１以上の特徴に関する情報は、約４個のアミノ酸の長さ、より好ましくは約３個のアミノ酸の長さ、より好ましくはなお約２個のアミノ酸の長さのＰＳＴからの情報と組み合わされ、このタンパク質を同定するために使用される。本発明の材料、方法およびデバイスは、以下の実施例によってさらに例示される。これらの実施例は、本願発明を例示するために提供されるが、制限するために提供されない。
【０３４０】
従って、さらに好ましい実施形態において、タンパク質の１以上の特徴に関する情報は、約４個のアミノ酸の長さ、より好ましくは約３個のアミノ酸の長さ、より好ましくはなお約２個のアミノ酸の長さのＰＳＴからの情報と組み合わされ、このタンパク質を同定するために使用される。
【０３４１】
（Ｖ．代謝物プロファイリング（メトミクス（ｍｅｔｏｍｉｃｓ））
（総論）
本発明は、代謝分析を行うための方法および装置（目的の代謝物を精製するための方法、特定の疾患と相関する代謝物を同定するスクリーニング方法、および疾患を有する個体または疾患に対する感受性を有する個体を同定するための診断スクリーニング方法を含む）を提供する。
【０３４２】
本発明の特定の方法は、連続して実行される複数の電気泳動方法を使用して種々の代謝物を分離するための電気泳動方法を提供する。このような分離方法は、種々の代謝分析を行うために利用され得る。例えば、本発明の特定の分析方法は、安定な同位体で標識された基質を被験体に投与する工程を包含する。投与前のこの基質の同位体の組成および富化は、公知である。基質が利用されることを可能にする時間を待った後に、サンプルは、被験体から抜き取られ、そして複数の標的検体、基質を含む標的検体および／またはこの基質から形成された１以上の標的代謝物の同位体組成を決定するために使用される。代表的には、サンプルは、異なる時点で被験体から得られ、そして同位体の量が、各サンプル中の標的検体について決定される。この様式において、この基質の同位体組成は、各標的被験体についての流動値が決定されることを可能にする時間の関数として測定され得る。種々の方法が、標的検体中の同位体の相対同位体量を決定するために利用され得る。この方法としては、核磁気共鳴分析、赤外線分析および質量分析が挙げられる。
【０３４３】
特定の代謝物の濃度に焦点を合わせる特定の他の方法とは異なり、本発明の特定の方法は、単一の濃度値ではなく流動を決定するために設計される。これは、この方法を単純化する。なぜなら、流動値は、絶対濃度値を決定することではなく、標的検体中の同位体標識の相対量から決定され得るからである。さらに、流動の決定は、簡単な濃度決定から観察され得ない特定の生物学的プロセスに対する洞察を提供する。例えば、濃度値は一定であるようであるが、流動は、実際には変化してい得る。任意の代謝物の濃度は、その代謝物の形成、変換、および輸送に関与する全ての反応の速度によって決定される。従って、代謝物の形成および除去（変換または輸送）の両方に関与する任意の２つの特定の反応（流動）における増加は、この代謝物の同じみかけの濃度を生じ得る。流動は、多数の異なる刺激に応答して変化され得、それによって特定の細胞状態の感度のよい指標として作用し得る。例えば、流動は、生理学的状態のような因子に、毒素および環境的な侵襲に対して曝されることに、ならびに感染、癌、炎症および代謝における遺伝子ベースの欠損のような種々の疾患状態に応答して変化され得る。従って、流動は、多様な細胞状態または他の方法によって必ずしも検出可能ではない状態を検出するために使用される。
【０３４４】
本発明のいくつかの方法において、被験体から得られるサンプルは、検体中の同位体の同位体量を決定する前に精製される。この精製手順は、目的の標的検体由来の細胞中の他の成分を少なくとも部分的に除去するために使用される。代表的には、これは、連続して行われる複数の電気泳動方法（すなわち、多次元）により、サンプル中の成分を分離することによって達成される。
【０３４５】
特定の方法は、本発明の電気泳動分離局面と、本発明の特定の質量分析技術とを組み合わせる。このような処理は、比較的限定された数の標的検体を含むサンプルが質量分析器に直接的に注入されて、目的の種々の標的検体における同位体量を決定するように、比較的複雑なサンプルが、複雑性において十分に低減されることを可能にする。このようなシステムは、代謝サンプルのハイスループット分析を可能にするために自動化され得る。
【０３４６】
種々の標的検体について決定された流動値は、種々の異なる適用に使用され得る。例えば、種々の被験体についての、または種々の生理条件（例えば、病んでいるか、または正常な）についての流動値が、データベースへの入力として直接的に使用され得る。流動値はまた、種々のスクリーニング適用に用いられ得る。例えば、試験被験体からの流動値は、疾患に対する潜在的マーカー（すなわち、この疾患と相関するようである代謝物）を同定するために、病んだ被験体について対応する流動値と比較され得る。流動値の群は、異なる細胞状態についての「フィンガープリント」を開発するために使用され得る。一旦、疾患状態と１以上の代謝物との間の相関性がなされると、試験被験体についての流動値は、異なる疾患を有する個体についての流動値と比較され得る。試験被験体と病んでいる被験体との間に統計学的に有意な差異がないことは、試験被験体が疾患を有するか、または疾患に対する感受性があることを示す。代謝流動における変化は、代謝分岐点にて単一の基質から生成される代替的な検体の相対量における変化として、および単一の基質の連続的な変換から生じる検体が生成される速度として表される。
【０３４７】
（方法）
（Ａ．概論）
組織、細胞集団または生物を供給することによって、同位体に富む基質および細胞中の非同位体代謝物に対する同位体代謝物の経時的な比率を追跡して、細胞性代謝の量的状況を生成し得る。相対的な代謝流動は、異なる同位体の相対量を検出し得る種々の異なる検出器（例えば、質量分析）を使用して、任意の所定の時間で、正常な検体に対する同位体に富む検体の量の比率を決定することによって確認され得る。各々の代謝分岐点にて、分岐点の各々の側における非同位体生成物に対する同位体生成物の相対的な比率は、代謝経路の各々の分岐に転じた代謝物の流動の指標を提供する。パルス（ｐｕｌｓｅ）標識した培養物における直線的な代謝経路に沿う同定可能な代謝物における同位体の比率の変化速度の追跡は、この経路の各段階を介しての代謝物の流動の評価を提供する。代謝物は、ゆっくりとした反応速度段階の前に同位体に富むようになり、そしてこれらの段階の直後では同位体を欠乏したままである。一旦、毒性チャレンジまたは感染によって誘導されるような細胞性代謝における特定の変化が、本明細書中に記載される技術を使用して同定されると、これらの代謝変化の特定の診断マーカーとして使用され得る、同位体に富む化合物を合成し得る。ここでは，基質は、特定の疾患状態に応答して代謝されるのみであるか、または代謝され得ない（例えば、米国特許第４，８３０，０１０号；同第５，５４２，４１９号；６，０１０，８４６号および同第５，９２４，９９５号を参照のこと）。
【０３４８】
（Ｂ．被験体への標識された基質の投与）
（１．被験体の型）
本明細書中で使用される場合「被験体」とは、一般的には、代謝分析を行うためにサンプルが採取された、任意の生きている生物をいう。被験体としては、微生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、カビおよび真菌）、動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコ）、ヒト上科（例えば、ヒト、チーパンジー、およびサル）ならびに植物が挙げられるがこれらに限定されない。この用語は、トランスジェニック種およびクローン化種を含む。この用語はまた、調査の下に代謝プロセスを行うために培養され得る細胞培養物または組織培養物を含む。用語「患者」とは、ヒトおよび獣医学的被験体の両方をいう。
【０３４９】
被験体が細胞集団または細胞培養物である場合には、当該分野で公知の標準的細胞培養系のいずれかが、使用され得る。適切な細胞型の例としては、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２およびＢａＦ３細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、ならびに昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）が挙げられるがこれらに限定されない。細胞培養に関するさらなる指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（第２版）（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に提供される。
【０３５０】
（２．基質の型）
本明細書中で使用される場合、用語「基質」は、化学種が被験体に投与される状況において使用されるときには、目的の被験体によって代謝され得る任意の種をいう。例示的な基質としては、タンパク質、糖質、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、脂肪、脂肪酸およびステロイドが挙げられるがこれらに限定されない。「代謝物」とは、被験体に投与された基質の酵素による変換（この変換は、被験体の代謝プロセスの一部として生じる）から誘導された生成物をいう。「標的代謝物」は、分析における研究下の代謝物（例えば、流動値が決定されるべきである代謝物）である。
【０３５１】
安定な同位体で標識された基質とは、対応する天然に存在する基質に見出される同位体とは有意に異なる安定な同位体の分布を有する基質をいう。用語、安定な同位体とは、放射性ではない元素の同位体をいう。本発明の方法に代表的に使用される同位体としては、13Ｃ、2Ｈ、15Ｎ、18Ｏおよび34Ｓが挙げられる。従って、基質が13Ｃで標識される場合、この基質としては、炭素同位体の混合物（ここで13Ｃ同位体は、その天然の量よりも大きな検出可能なレベルの量で基質中に取り込まれている）が挙げられる。質量分析による13Ｃの検出については、このレベルは、この基質に存在する全てのＣ原子のうち、２〜１００％、および好ましくは１０〜１００％である（すなわち、この基質中の原子は、示される富化パーセントを集合的に有する）。15Ｎで標識された基質については、検出可能なレベルは、０．７５〜１００％の15Ｎ、およびより好ましくは４〜１００％の15Ｎである。18Ｏで標識された基質については、検出可能なレベルは、０．４〜１００％の18Ｏ、および好ましくは２〜１００％の18Ｏである。34Ｓで標識された化合物については、検出可能なレベルは、８．４〜１００％の34Ｓ、および好ましくは４２〜１００％の34Ｓである。いくつかの場合には、この所望される量のレベルは、同位体に富む基質と富んでいない基質とを混合することによって得られる。
【０３５２】
（２．基質の量）
添加される基質の量は、いくつかの因子に依存して変更する。しかし、一般に、基質は、安全および有効量で添加される。本明細書中で使用される場合、用語「安全および有効量」は、基質の量が十分であり、その結果同位体存在量または少なくとも、同位体存在量の比が、えり抜きの検出器を用いて決定され得るが、基質は、過度の有害な副作用を引き起こすほどには高くない。従って、投与される量は、適切なリスク対利益比で釣り合うべきである。例えば、基質が13Ｃを用いて標識される場合、次いで基質は、十分な量で患者に投与され、その結果、標的分析物における13Ｃ／12Ｃの比が、決定され得る。しかし、投与される基質の量は、望まない副作用（例えば、毒性、刺激またはアレルギー反応）を引き起こす量より少ない。この安全および有効量は、得られるサンプル（例えば、気体または液体および／または獲得部位）の性質および量、試験被験体の重量、および基質における同位体の相対濃度のような因子に依存する。
【０３５３】
（３．投与の様式）
代表的に、既知の量の標識化基質および非標識化基質の両方の混合物が、被験体に投与される。この混合物は、５〜９５％の間の標識化基質の相対存在量を含み得る。より好ましくは、混合物は、２５〜７５％の間の標識化基質を含む。最も好ましくは、この混合物は、約等モルの比の標識化基質および非標識化基質を含む。
【０３５４】
特定の方法において、基質は、パルスとして被験体に投与される。パルス添加またはパルス標識は、同位体的な標識化基質の調節された添加をいい、ここで、同位体の相対的同位体存在量は公知である。長いパルスは、パルスの時間から開始する、特定の生体分子の正味の合成比を見積もるのに使用され得る。この場合、以前の生物体量は標識を含まず、しかし、新しい生物体量は、基質における標識の同位体存在量に比例して、同位体を蓄積し始める。パルスの持続時間が、目的の基質および標的分析物の代謝回転に比較して長い場合、正味の合成比が、測定される。短いパルス（代謝回転率より有意に短い）は、分解および再循環の原因とはならず、一方向の合成比の見積もりを提供する。
【０３５５】
基質が被験体に投与される様式は変更し得るが、基質が、適切な時間枠内で代謝され得るような方法で投与されるべきである。基質は、実質的な純形態または、組成物の一部として投与され得る。薬学的に受容可能な成分が、投与される基質の代謝を妨げない限り、組成物としては、この薬学的に受容可能な成分を含み得、この成分としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：希釈剤、乳化剤、結合剤、潤滑剤、着色料、風味および甘味料。このような任意の成分の援用における案内は、例えば、以下に記載される：Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら、編）１９７６；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５）；およびＬａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）（これらの各々が、その全体において、参考として援用される）。
【０３５６】
ある場合、基質は、固体形態（例えば、固体錠剤、カプセル、粉末、丸剤顆粒）で、または液体溶液（例えば、乳剤、懸濁液）の一部として経口的に投与される。錠剤の形態に形成された場合、基質に対するキャリアとして、以下が使用され得る：賦形剤（例えば、ラクトース、スクロース、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、およびリン酸カリウム）；結合材（例えば、水、エタノール、プロパノール、単純シロップ剤、グルコース溶液、デンプン溶液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびポリビニルピロリドン）；崩壊薬（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、置換の程度が低いヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天粉末、ラミナラン（ｌａｍｉｎａｒａｎ）粉末、重炭酸ナトリウム、および炭酸カルシウム）；界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、およびステアリン酸モノグリセリド）；改変阻害剤（例えば、スクロース、ステアリン、カカオバター、および硬化油）；吸着促進剤（例えば、第四アンモニウム塩基、およびラウリル硫酸ナトリウム；湿潤剤（例えば、グリセリンおよびデンプン）；吸着剤（例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイト、およびコロイドケイ酸）；および潤滑剤（例えば、精製タルク、ステアラート、ホウ砂およびポリエチレングリコール）。さらに、錠剤が、通常の錠剤コーティングに供された錠剤（例えば、シュガーコートされた錠剤、ゼラチンコードされた錠剤、腸溶性錠剤、フィルムコートされた錠剤、または二重錠剤および多層錠剤）に、必要に応じて形成され得る。
【０３５７】
ピルの形態に形成する場合、基質のキャリアとして、以下が使用され得る：賦形剤（例えば、グルコース、ラクトース、デンプン、カカオバター、硬化植物油、カオリン、およびタルク）；結合剤（例えば、アラビアゴム、トラガカント粉末、ゼラチン、およびエタノール）；および崩壊薬（例えば、ラミナランおよび寒天）。
【０３５８】
基質単独、または他の適切な成分と組み合わせて、エアゾル処方物にもまた作製され（すなわち、それらは「噴霧」され得る）、吸入を介して投与され得る。エアゾル処方物は、加圧された受容可能な噴霧体（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素）中に置き換えられ得る。
【０３５９】
直腸投与に適切な処方物としては、例えば、坐剤ベースと共に詰められた活性成分からなる、坐剤が挙げられる。適切な坐剤ベースは、天然または合成トリグリセリド、アルカン、ポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル、ゼラチン、および半合成グリセリドが挙げられる。さらに、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびアルカンを含むベースと基質の組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することもまた可能である。
【０３６０】
非経口投与（例えば、関節内（連結部（ｊｏｉｎｔ）中の）経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、および皮下経路によるような）に適切な基質の処方物としては、水性溶液および非水性溶液、等張性滅菌注射溶液（これは、抗酸化薬、緩衝液、静菌薬、および意図された受容者の血液と等張な処方物を与える溶質を含み得る）、ならびに水性懸濁液および非水性懸濁液（懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定薬、および保存薬を含み得る）が挙げられる。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入、、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内により、投与され得る。組成物が、滅菌状態で、実質的に等張として、そして、米国医薬品局の優良製造規則（ＧＭＰ）の規定に全て従って処方される。
【０３６１】
基質が細胞集合に投与される場合、細胞は、代表的には、等張で、富化された基質を含む混合物中に懸濁される。混合物は、代表的には水性溶液であり、そして他の栄養素もまた含み得る。細胞の数に依存して、細胞が、例えば、標準培地フラスコ中またはマイクロタイタープレートのウェル内に懸濁され得る。
【０３６２】
（Ｂ．サンプルコレクション）
（１．サンプルソースおよび型）
上記のように、本発明の方法は、本質的に、任意の生きている生物体における代謝を分析するために使用され得る。サンプルは、組織または組織ホモジネート、生物体または細胞または細胞培養物の液体に由来し得る。一般に、サンプルは、生物体の体液から得られ得る。このような液体としては、以下にが挙げられるが、これらに限定されない：全血、血漿、血清、精液、唾液、尿、汗、髄液、唾液、消化液、汗、脳脊髄液、および涙液。ある場合、サンプルは、糞便物質（ｆｅｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、頬、皮膚、組織生検、または検死および髪から得れられる。サンプルはまた、エキソビボ細胞培養物（増殖培地、組換え細胞および細胞成分を含む）に由来し得る。潜在的薬物または薬物標的（以下を参照のこと）を同定するための比較研究において、あるサンプルは、病気の被験体または細胞から得られ得、そして別のサンプルは、例えば、病気でない被験体または病気でない細胞から得られ得る。
【０３６３】
（２．収集選択）
ある方法は、被験体から血液のサンプルを回収する工程を包含する。全血が使用される場合、サンプルは代表的には、当業者に公知の任意の方法（例えば、サンプルの凍結／解凍を含む）により、溶解される。尿は、清潔な容器中に被験体の尿を採取することにより採取され得る。ある場合、サンプルは、固体の呼吸から得られる（例えば、標的代謝産物が二酸化炭素である場合）。種々の異なるデバイスおよび方法が、呼吸サンプルを採取するために開発された。例えば、被験体の呼吸が、被験体に伸び得る収集バッグ（例えば、バルーン）を膨らまさせることにより捕捉され得る。次いで、サンプルが、後の貯蔵および／または輸送のために、市販の貯蔵容器に移され得る（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより製造されたＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ）。他の呼吸収集デバイスは、米国特許第５，９２４，９９５号および同第５，１４０，９９３号に記載される（これらは、その全体が参考として援用される）。組織サンプルが、生検により得られ得る。
【０３６４】
細胞培養または組織培養の場合、細胞は、遠心分離または濾過により収集され、次いで、標準的なプロトコルに従って（例えば、音波破砕、ブレンディング、加圧、凍結融解および変性）、溶解される。あるいは、細胞が収集され得、そして三塩化酢酸の添加（５〜１０％重量／容積の最終濃度まで）、または他の膜溶解溶媒（例えば、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、アセトン、およびエタノール）の類似の使用により溶解され得る。このような膜溶解溶媒が使用され、膜分子成分を沈殿させ得、そして後の電気泳動分離技術に対する前駆体としての小分子代謝産物を選択的に可溶化し得る。
【０３６５】
（Ｃ．標的分析物分離）
（１．予備精製）
サンプルの複雑性（すなわち、サンプル内の成分の数および異なる型）に依存して、標的分析物（すなわち、基質および／または標的代謝産物）が、サンプル内の他の成分から、最初少なくとも部分的に精製される。サンプルが、細胞の破片または分離を妨げ得る他の物質を含む場合、このような物質は、種々の公知の分離技術（例えば、サンプルを、強制的にふるい材料に通す、濾過、遠心分離（例えば、密度勾配遠心分離）、および種々のクロマトグラフィー方法（例えば、ゲル濾過、イオン交換または親和性クロマトグラフィー））のいずれかを使用して除去され得る。
【０３６６】
多くの高分子（例えば、タンパク質および核酸）は、細胞を溶解し、そして冷トリクロロ酢酸（例えば、氷上に３０分間、５〜１０％ＴＣＡ重量／容積）を用いて溶解された細胞を処理することにより高分子を定量的に沈殿することによって、小分子（例えば、ヌクレオチド、アセチルＣｏＡ、単糖類および二糖類、アミノ酸）から分離され得るが、細胞中の小分子のほとんどが、可溶性のままである。さらなる分離方法が、例えば、ＨａｎｓｏｎおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（Ｈａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｒｈａｒｄｔら（編）、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂａｉｏｌ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．頁３２８（１９８１））により、議論される。
【０３６７】
（２．多次元電気泳動）
一旦、このような最初の精製工程が完了されると（必要な場合）、標的分析物が、連続して実施される複数の電気泳動方法を実施することにより、代表的にさらに精製される。最適な実施について、イオン強度が特に高いサンプルが、電気泳動方法を実施する前に、確立された技術（例えば、透析、希釈および再集権化（ｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））を用いて、脱塩化され得る。この方法は、連続して実施されると言われる。なぜなら、各方法において電気泳動されるサンプルは、最初の電気泳動方法において電気泳動されるサンプルは例外として、先行する方法において電気泳動された成分を含む溶液または画分にお由来するからである。異なる電気泳動方法の各々が、「次元」とみなされる。従って、この連続は、「多次元」分離を構成する。
【０３６８】
一連の電気泳動方法が、この一連の各電気泳動方法のために注入されたサンプルの成分が単離されるかまたは物理的に、時間的にもしくは空間的に分解されるような方法において代表的に実施され、複数の画分を形成し、この画分の各々は、サンプル中に含まれる成分の１つのサブセットのみを含む。従って、画分は、電気泳動に供されるサンプルの他の成分から、物理的に、時間的にまたは空間的に分解される成分または成分の混合物を含む溶液をいう。それゆえに、分解された成分は、電気泳動方法の間に、他の成分から分離された、単一の成分または成分の混合物をいい得る。少し注釈をつける場合、種々の電気泳動方法におけるサンプルは、最初の電気泳動方法（これにおけるサンプルは、分離されるべき全ての成分を含む本来のサンプルである）は例外として、このような画分から得られる。
【０３６９】
代表的には、一連のこれらの複数の電気泳動方法は、異なる特性に従って成分を分離する。例えば、ある方法は、等張点に基づいて成分を分離し得（例えば、キャピラリー等電点電気泳動）、他の方法は、任意の所定のｐＨで、それらの内因性または誘導性（特定のイオン化群に対する標識の適用を通じ）の荷電対質量比に基づいて成分を分離し得るが（例えば、キャピラリーゾーン電気泳動）、一方、他の方法は、
成分のサイズに従って分離する（例えば、キャピラリーゲル電気泳動）。
【０３７０】
種々の電気泳動方法を実施するために使用される装置は、当該分野で公知である。しかし、一般に、そして図２Ａにおいて示されるように、本発明の特定の方法において利用される代表的なキャピラリー電気泳動系の基本的な構成は、２つの末端１０、１２を有するキャピラリー８を含む。一方の末端１０は、アノードリザーバー１８に含まれるアノード溶液すなわちアノード液（ａｎｏｌｙｔｅ）１４と接触し、そしてもう一方の末端１２は、カソードリザーバー２０においてカソード溶液すなわちカソード液（ｃａｔｈｏｌｙｔｅ）１６と接触する。１つの電極（アノード）２２は、アノード溶液１４と電気的連絡をとるように位置され、そして第二の電極２４は、カソード溶液１６と電気的連絡をとるように位置される。キャピラリー８のキャビティー２６は、電気泳動媒体で満たされ、これはある場合、ポリマーマトリックスを含み得る。本明細書中で使用される場合、用語アノードは、正に荷電した電極をいう。従って、負に荷電した種は、アノードに向かって、電気泳動媒体を介して移動する。用語カソードは、負に荷電した電極をいい；正に荷電した種は、この電極に向かって移動する。アノード液は、アノードが浸された溶液であり、そしてカソード液は、カソードが浸された溶液である。
【０３７１】
サンプルは、入口２８を介してキャピラリー８中に導入され、そしてそこで成分が、電源３２によって２つの電極２２、２４との間に電界が印加されると分解され、そしてこの成分が、分離キャビティー２６内に含まれる電気泳動媒体内で分離する。成分は、電気浸透流のような種々のパラメーターを制御することにより（以下を参照のこと）、および／またはリザーバー溶液の１つまたは両方の成分を変化させる（例えば、ｐＨまたは塩濃度を調整する）ことにより、出口３０を介してキャピラリーから制御可能に溶出され得る。代表的には、入口２８および出口３０は、サンプル、アノード液またはカソード液を含む容器中に、容易に挿入が可能なように形成されたキャピラリーの単純な部分である。
【０３７２】
電気泳動が本発明の方法において実施される電気泳動デバイスに関連して使用される場合の用語「キャピラリー」は、利便性のために使用される。この用語は、電気泳動が実施されるキャビティーまたはデバイスの特定の形を制限するために解釈されるべきでない。特に、キャビティーは、形が円筒形である必要はない。任意の電気泳動方法に関して、本明細書中で使用されるような、用語「キャピラリー」は、少なくとも一組の対向面との間の内部寸法が、およそ２〜１０００ミクロンであり、より代表的には、２５〜２５０ミクロンである他の形を含む。本発明の特定の方法において使用され得る非環状配置の例は、Ｈｅｌｅ−Ｓｈａｗフローセル（ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ）である（例えば、米国特許第５，１３３，８４４号；およびＧｕｐｔａ，Ｎ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．２２２：１０７−１１６（２０００）を参照のこと）。さらに、キャピラリーは、線状である必要はなく；ある場合、キャピラリーは、例えば、らせん状の構成で巻かれる。
【０３７３】
本発明の特定の方法を用いて利用される系の例は、図１に例示される。この特定の例は、３つの電気泳動方法（最初、中間および最終方法）が関連する系を示す。本発明の方法は、一般に、少なくとも２つの電気泳動方法を含むが、実施される電気泳動方法の特定の数は変更し得る。最も代表的には、この方法は、２つまたは３つの電気泳動分離方法を利用する。
【０３７４】
図１に示され得るように、複数の成分を含む最初のサンプルは、サンプル容器５０から当該分野で公知の多数の方法のいずれかを利用して、サンプル入口５２を介して、第一のキャピラリー５４の第一の分離キャビティー中に導入される。適切な方法の例としては、真空下でサンプル入口５２中にサンプルを引く工程（例えば、サンプル出口において、真空を引くことにより）または、サンプル容器５０に加圧することによりサンプル入口５２にサンプルを押す工程が挙げられる。動電学的注入としばしばいわれる電気移動法は、別の選択である。一旦、最初のサンプルがサンプル入口５２に導入されると、次いでサンプルは、第一のキャピラリー５４内の第一の分離キャビティー内に電気泳動される。第一の分離キャビティーは、最初のサンプル中の成分が少なくとも部分的に分解さえる所望の電気泳動媒体を含む。他の回収部位が利用され得る（以下を参照のこと）が、分解成分を含む電気泳動媒体は、第一のキャビティーから回収される（代表的には、サンプルが導入される末端に対向する分離キャビティーの末端から外へ）。回収された媒体は、出口５６を通って移動し、そして複数の画分として、分離容器５８に回収される。図１Ｂで示されるように、画分が回収される容器５８は、代表的に、規定された画分（例えば、特定の容量の画分または選択されたｐＨ範囲を含むこと）を回収するための一組の容器５８を自動的に進行させることが可能な画分回収デバイス（６０で示される部分）と関連される。
【０３７５】
次いで、第一の電気泳動方法から回収された画分由来のサンプルが、第２のサンプル入口を介して、前出の記載されたような技術を再度利用して、複数の容器５８の１つから回収される。次いで、画分からのサンプルの成分は、中間電気泳動方法を実施することによりさらに分解され得る（図１において示される例における、第２の電気泳動方法）。サンプルが、入口６２を介して、第２のキャピラリー６４中に導入され、そしてサンプル内の成分は、さらに第２のキャピラリー６４の第２の分離キャビティーに内に含まれる電気泳動媒体内で分離し、次いで、出口６６を介してキャビティーから溶出する。第一の電気泳動分離と同様に、分解または部分的に分解された成分を含む電気泳動媒体が、代表的に、第２の画分回収デバイス（７０で示される部分）により整列され、そして前進された容器６８内に、分離画分として収集される。
【０３７６】
第２／中間方法と類似のプロセスが、最終電気泳動方法（図１において示される第３の電気泳動分離方法）の間、実施される。サンプルが、先行の方法の間に得られる画分を含む容器６８から入口７２を介して引かれ、そして適用されたサンプルに含まれる成分が、電気泳動によりさらに分離される第３の電気泳動媒体を含む第３のキャピラリー７４の第３または最終電気泳動キャビティーに導入される。さらに単離されたタンパク質を含む、第３の電気泳動媒体が、引き続き出口７６を通して回収される。
【０３７７】
上記のように、図１において示される３つより多い電気泳動方法が、実施され得る。このような方法は、本質的に、第２／中間電気泳動分離について、上記の一般的工程を１回以上繰り返すことを含む。
【０３７８】
最終的電気泳動分離後、分解された成分を分析するための種々の異なる選択が、利用可能である。図１に示されるように、回収される電気泳動媒体は、最後のキャピラリー７４の分離キャビティーと液体連絡して、任意の検出器７８を通過して、分解された成分（例えば、標識化タンパク質）を検出し得る。検出器７８または検出器（示されていない）からのシグナルを受けることが可能な、任意の、量を定めるデバイスが、電気泳動媒体の特定の部分または画分内の成分の量を定量化するために使用され得る。検出器はまた、同様に、他のカラムの後の分離の進行をモニターするために使用され得る。
【０３７９】
画分が、最終キャピラリー７４または検出器７８を終えた電気泳動媒体から採取され、そして分析器８２により分析され、画分内の成分の分子量を決定する。特に、分析器が、標的分析物における富化された同位体の存在量を決定するために使用され得る。下記のように、種々の分析器および技術が、この決定をするために利用され得る。例えば、分析器８２は、質量分析計または赤外分光計であり得る。質量分析データは、例えば、画分内の種々の成分の質量を決定するために利用され得る。標識化分析物および非標識分析物の比は、質量分析において標識化標的分析物または非標識化標的分析物についての相対シグナル強度から決定され得る。
【０３８０】
分離キャビティーから分解された成分を回収するのに利用される特定の溶出条件は、実施される電気泳動方法の型に依存し、そして本発明において代表的に利用される電気泳動方法の各々について、以下でより十分に記載される。しかし、一般に、一旦成分が分離キャビティー内に分解されると、キャビティー内の条件が、キャビティーからの成分の選択的または制御された溶出を達成するのに必要なように（または選択された最初の条件のように）調整される。例えば、溶出は、塩をアノード溶液またはカソード溶液に添加するか、またはそれらの溶液のｐＨを調整することにより、電気浸透流を調節することにより、流体力学上の圧力または前述の組み合わせを適用することにより達成され得る。
【０３８１】
本発明の方法を用いて、分解された成分が、物理的に（例えば、図１に例示されるような異なる容器中へ配置）、空間的に（例えば、分離キャビティーに含まれる電気泳動媒体全体に広がる）および／または時間的に（例えば、溶出を制御して、サンプル内の非常に異なる成分が、異なる時間において、キャピラリーから溶出する）単離され得る。従って、本発明の方法は、溶出緩衝液および／または溶出時間の構成の関数として、成分の混合物を分離し得る。この方法は、成分の空間的な分離に制限されず、特定の伝統的なゲル電気泳動系（例えば、タンパク質分離のための２−Ｄゲル電気泳動系または核酸分離のためのパルス化電界（ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ）および連続（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ゲル系）、または２次元薄層クロマトグラフィー（２−Ｄ  ＴＬＣ）方法（小分子代謝産物分離のため）である。代わりに、制御された溶出により、画分が制御され、画分内の成分が、例えば、等電点および電気泳動の代謝産物の範囲内におちる。成分の制御された溶出は、方法が、再現可能な様式において実施され得ることを意味する。このような再現性は、例えば、比較研究および診断上の適用において重要である。
【０３８２】
分離成分の溶出または回収の間、一般に、分離された成分を含む電気泳動媒体の一部分のみが、代表的に、任意の所定の画分において収集される。これは、全ての分離された成分（例えば、タンパク質）を含むゲルが、分離キャビティーから押し出され、そして全ての成分を含む押し出されたゲルが、別の電気泳動分離を実施するために使用される特定の二次元方法と対照をなす。これはまた、全ての代謝産物が、１つの溶媒系を用いた系列におけるマトリックスについての、その代謝産物の相対親和性により分離され、そして第一の溶媒系の流れの方向に垂直に適用される第二の溶媒系により変更された親和性に基づいて表される。
【０３８３】
次いで、１つの電気泳動方法の結論で得られた、空間的、物理的、または時間的に分離された成分は、引き続く電気泳動方法の間の画分中に含まれる成分のさらなる分離のためのサンプルの供給源として使用される。図１に例示されるように、異なる分離された代表的なサンプルは、同じキャピラリー上で連続して電気泳動される。通常、先行するサンプル中の成分が十分に分離キャビティーから引き出されるまで、別のサンプルは適用されない。その結果、異なる画分中に含まれる成分の重複は存在しない。同じカラムを通しての画分の連続的な溶出は、特定のスラブゲル電気泳動方法において問題を生じ得る架橋または電場の違いから生じる変化を有意に減少および除去し得る。従って、連続的分離は、本発明の方法の再現性をさらに増強し得る。しかし、他の方法は、並行様式で実行され得、ここでは、異なる画分からのサンプルは、分離キャピラリー上で電気泳動される。このアプローチは、分離がより迅速に完了することを可能にする。しかし、複数のキャピラリーの使用は、分離条件の可変性を増大させ得、それによって、異なるサンプル間のある程度の再現性を減少させる。
【０３８４】
特定の方法において、類似の成分を含むプールが得られるような電気泳動方法が実行される。例えば、最初のまたは最初の数回の電気泳動方法の後に、主として関連する成分（例えば、主にタンパク質、ポリサッカリド、核酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴサッカリド、リン酸化モノ−またはオリゴサッカリド、脂肪、脂肪酸、または有機酸）を含む少なくとも１つのプールが得られるように、電気泳動条件は制御され得る。関連する成分のプールは、細胞中の成分の異なるクラスの区別可能な特徴でキャピラリー分離することによって得られ得る。例えば、いくつかの成分のクラスは、主として、一価で荷電している（例えば、リン酸化モノ−またはオリゴサッカリド）が、他は主として双生イオン性である（例えば、アミノ酸、タンパク質、ヌクレオチド、およびいくつかの脂肪）。ＣＩＥＦは、異なる双生イオン成分を分離するために使用され得、そしてまた、双生イオン種を非双生イオンから分離するために使用され得る。大きな成分（例えば、タンパク質）は、ＣＧＥを用いて、より小さな成分（例えば、アミノ酸、モノ−およびジサッカリド、ならびにヌクレオシド）から分離され得る。ｐＨおよび緩衝液条件の慎重な選択を通して、種々の成分上の電荷を制御し得、そしてＣＺＥによって、異なる電荷対分子量を有する成分の分離をもたらし得る。例えば、特定の成分と選択的に複合体形成する特定の緩衝液が、選択された成分に所望の電荷を導入するために利用され得る。このような緩衝液の例は、ホウ酸緩衝液であり、これは、使用されて炭水化物に複合体形成し得、それによって、サンプル中に存在する炭水化物に負電荷を付与する。電気泳動方法に関するさらなる詳細は以下に示される。
【０３８５】
電気泳動条件を制御して、最初に、複合体混合物を成分のクラスのプールに分離することによって、分析を顕著に単純化させ得る。例えば、目的の代謝産物が炭水化物であった場合、炭水化物のプールが得られるように条件を適切に制御すること（例えば、ホウ酸緩衝液を使用すること）によって、化合物の他のクラスを含む画分を無視し得る。従って、引き続く電気泳動による分離は、目的のプールからのサンプルを用いて単純に行われ得る。あるいは、類似の化合物のプールが十分に小さい場合、プールの個々の成分は、電気泳動による分離後に、質量スペクトル分析手段によって完全に分離され得る。同様に、一旦特定の代謝産物に対する条件が確立したならば、種々の電気泳動方法から得られたすべての画分を分析する必要はない。この方法の再現性によって、目的の標的分析物を含むことが以前に確立された画分に隣接して得られたいくつかの画分からのみ、サンプルをとることが可能になる。それにも関わらず、特定の方法が自動化され得るので、最初のスクリーニング試験の間でさえ、例えば、すべての最終画分を迅速に分析し得る、目的の分子量フラグメントについてのシグナルを同定するために質量スペクトルをスキャンすることさえ、コンピュータープログラムの使用を通して自動化されて、分析をスピードアップし得る。
【０３８６】
（Ｄ．定義）
一旦標的分析物がサンプル中の他の分子から少なくとも部分精製されたならば、代謝されていない基質および／または標的分析物中の同位体の相対量が決定される。代表的には、これは、より豊富な同位体に対する、富化された同位体の比（例えば、12Ｃ／l3Ｃ、l4Ｎ／Ｉ５Ｎ、16Ｏ／18Ｏ、および34Ｓ／32Ｓ）を決定する工程を包含するが、他の量の測定もまた決定され得る。
【０３８７】
富化された安定な同位体の濃度の測定は、種々のオプションに従ってなされ得る。１つのアプローチは、質量スペクトル分析によって同位体レベルの相対的な量を決定することである。標的分析物は、基質の分子量対電荷比に従って、質量スペクトルにおいて別個のシグナルを生成する。存在する異なる同位体型についてのこの相対的なシグナル強度は、サンプル中の分析物の絶対的な濃度に関わらず、各標的分析物の異なる同位体型の相対的な量を計算することを可能にする。
【０３８８】
質量スペクトル分析によって種々の生物学的分子を分析するための方法が確立された。質量スペクトル分析は、比較的低分子（例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、モノ−およびジサッカリド）ならびに比較的高分子の分子量を決定するための公知の方法に従って使用され得る。例えば、質量スペクトル分析は、タンパク質の同定にますます適用されている。エレクトロスプレーおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、タンパク質分析のために適用される最も一般的に使用される質量スペクトル技術である。なぜなら、これらは、大きな、低揮発性分子種をイオン化するのが最も可能であるからである。
【０３８９】
ＤＮＡの場合において、ＤＮＡは、加水分解の標準的な方法を用いて、デオキシリボヌクレオチドに加水分解され得る。例えば、ＤＮＡは、酵素的に（例えば、ヌクレアーゼまたはホスファターゼを用いて、または非酵素的に、酸、塩基、または他の化学的加水分解の方法を用いて）分解され得る。あるいは、インタクトなＤＮＡポリマーが分析され得る。次いで、デオキシリボヌクレオチドが、標準的な技術（例えば、トリメチルシリル、メチル、アセチル、および関連する誘導体または直接プローブ挿入）を用いて質量スペクトル分析のために調製され得る。
【０３９０】
以下の主要なクラスの代謝産物のために、以下の供給源は、このような分子の質量スペクトル分析のさらなる手引きを提供し、その全体が参考として援用される：（１）脂質（例えば、Ｆｅｎｓｅｌａｕ、Ｃ．「Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、５４１：１−７（１９９４）を参照のこと）；（２）揮発性代謝産物（例えば、Ｌａｕｒｉｔｓｅｎ，Ｆ．Ｒ．およびＬｌｏｙｄ，Ｄ．「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｏｌａｔｉｌｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｌ  Ｓｅｒ．，５４１：９１−１０６  （１９９４）を参照のこと）；（３）炭水化物（例えば、Ｆｏｘ，Ａ．およびＢｌａｃｋ，Ｇ．Ｅ．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．５４１：１０７−１３１（１９９４）を参照のこと）；（４）核酸（例えば、Ｅｄｍｏｎｄｓ，Ｃ．Ｇ．ら、「Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．，５４１：１４７−１５８（１９９４）を参照のこと）；ならびに（５）タンパク質（例えば、Ｖｏｒｍ，Ｏ．ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖｅｒｙ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｍａｄｅ  ｂｙ  Ｆａｓｔ  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：３２８１−３２８７（１９９４）；ならびにＶｏｒｍ，Ｏ．およびＭａｎｎ，Ｍ．「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍａｓｓ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：９５５−９５８（１９９４）を参照のこと）。質量スペクトル分析に関するさらなる詳細は、以下に示される。
【０３９１】
標識された二酸化炭素（［13Ｃ］ＣＯ2）もまた、質量スペクトル分析を用いて検出され得る。このようなアプローチは、例えば、Ｅｗｉｎｇ，Ｇ．Ｗ．、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、第４版（１９７５）；およびＫｌｅｉｎ，Ｐ．ら「Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２１：１５５−１６６（１９８４）（これらの両方は、その全体が参考として援用される）によって記載される。
【０３９２】
質量スペクトルによる検出に対する代替としては、赤外（ＩＲ）スペクトル分析または核磁気共鳴スペクトル分析（ＮＭＲ）を用いて同位体標識を検出することである。種々の標的分析物（例えば、二酸化炭素を含む）がこのアプローチを用いて検出され得る。同位体分析を行うためのＩＲ法およびＮＭＲ法は、例えば、米国特許第５，３１７，１５６号；Ｋｌｅｉｎ，  Ｐ．ら、Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ４：９−１９（１９８５）；Ｋｌｅｉｎ，  Ｐ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  １１：３４７−３５２（１９８２）；および日本国特許公開番号６１−４２２１９および５−１４２１４６（これらのすべては、その全体が参考として援用される）において議論される。
【０３９３】
特定の方法において、電気泳動方法によって部分的にまたは完全に精製された標的分析物は、引き続いて標的分析物の同位体組成物を分析するための適切な検出器に直接輸送される。いくつかの方法において、サンプルは、最終的な電気泳動による分離の間に収集された個々の画分から引き出され、そして質量スペクトル分析装置に直接注入されて、相対量を決定する。
【０３９４】
（Ｅ．フラックスの決定）
一般的に、任意の所定の経路における各反応工程を通しての代謝産物のフラックスは、正方向の反応および逆方向の反応の相対的な速度に依存する。本明細書中で使用される場合、フラックスとは、時間およびサンプルサイズの関数として標的分析物の濃度の変化の速度をいう。任意の単一の代謝転換を通しての代謝フラックスは、以下の式に従って、時間（ｔ）に対する同位体標識された分析物の相対的な量（ＲＡｔ）の変化から決定され得る：
【０３９５】
【数１】
2010249831.tif 000003
ここでＲＡｓｓは、長時間での標識された代謝産物の相対的な量である。相対的な量（ＲＡ）は、標的分析物中の同位体標識の量の比から決定された、同位体標識された基質および／または標的代謝産物（すなわち、標的分析物）の相対的な濃度である。いくつかの実施形態において、同位体の量に関する定常状態は、被験体に投与された最初の基質中の既知の比に等しいとみなされ得、その結果、単一のサンプルのみが代謝フラックスを決定するために必要とされる。別の実施形態において、同位体の量に関する定常状態は、異なる時間の点において取られたサンプルから取られた２以上の相対量の測定についての上記の式の同時の解から予測され得る。別の実施形態において、同位体の量に関する定常状態は、長時間で取られたサンプルから直接測定され得る。
【０３９６】
上記の式の代替的な型が使用されて、同位体標識した分析物または同位体標識した基質の相対量の減少後の基質の枯渇から分析物のフラックスを決定し得ることは、当業者には明らかである。この代替的な型は以下であり：
【０３９７】
【数２】
2010249831.tif 000004
ここで、ＲＡｏは、相対量を変化させる基質の投与の前の同位体標識した分析物の最初の相対量である。１つの実施形態において、ＲＡｏは、新規な基質の投与の前に直接測定される。別の実施形態において、ＲＡｏは、変化の前に投与された基質中の相対的な同位体量と同じであることが仮定される。
【０３９８】
ｎに分枝した代謝経路のネットワーク中の代謝分枝（ｉ）に、基質の相対的な代謝フラックスが、任意の時点（ｔ）（好ましくは、長時間（すなわち、定常状態で））で代謝経路の各分枝（ｊ）の下流の分析物中に見られる、同位体標識した分析物の相対量の比から決定され、これは、以下の式に従う：
【０３９９】
【数３】
2010249831.tif 000005
フラックスを決定するために、代表的には、異なるあらかじめ決定された時点で１以上のサンプルが被験体から引き出される。次いで、サンプルは、処理され、必要に応じて精製され、次いで、上記のように分析して、サンプリング時点（ｔ）で標的分析物中の同位体標識の相対濃度についての１以上の値を決定する。次いで、これらの値は、上記に示した式中で使用されて、複数の標的分析物の各々についてフラックス速度を決定し得る。いくつかの例において、フラックスを決定するために使用される標的分析物は、すべての有機化合物である（すなわち、分析物は、例えば、二酸化炭素を含まない）。
【０４００】
より正確なフラックスの決定および見積もられたフラックスの標準誤差もまた、統計学的曲線の適合または当該分野で一般的に公知であるパラメーター適合法［例えば、Ｚａｒ，Ｊ．Ｈ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ，１９７４）］、および異なる時点で取られた複数のサンプルから得られた同位体比データを用いて作製され得ることは、当業者に明らかである。
【０４０１】
経路を通した代謝フラックスは、経路中で工程を決定する速度に依存する。これらの工程は、経路における引き続く工程よりも遅いため、速度を決定する工程の産物は、それが反応物と平衡し得る前に除去される。フラックスおよびその決定のための方法についてのさらなる手引きは、例えば、Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ，Ｅ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．４３：１８３−２０５（１９７８）；Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ，Ｅ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．４１：６１−１１０（１９７６）；ならびにＮｅｗｓｈｏｌｍｅ，Ｅ．Ａ．およびＳａｒｔ．，Ｃ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第１章および第３章、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ（１９７３）によって提供される。
【０４０２】
（Ｖ．標識された代謝基質の合成）
同位体標識された生物学的化合物の合成は、種々の異なる型の化合物（例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、ならびに解糖およびタンパク質の代謝経路中間体）について十分に確立されている。核酸を同位体標識するための方法は、例えば、米国特許第６，０１０，８４６号において議論されており；炭水化物の標識化は、米国特許第４，６５６，１３３号において議論されており；そして解糖中間体を標識するための方法は、米国特許第５，４３９，８０３号において議論されている。これらの文献のすべては、その全体が参考として援用される。
【０４０３】
いくつかの例において、同位体標識された生物学的化合物は、１以上の安定な同位体が富化された食餌を生きた生物に与えること、同位体で富化された食餌の天然の代謝産物から得られる、所望の同位体が富化された化合物を収集し、そしてそれを精製することによって得られる。あるいは、同位体が富化された物質は、同位体が富化された前駆体から化学的に合成され得る。メトミックス（ｍｅｔｏｍｉｃｓ）研究のための多くの適切な物質（例えば、［13−Ｃ］脂肪酸、［2Ｈ，13Ｃ，および15Ｎ］アミノ酸、［13Ｃおよび2Ｈ］ペプチド、および［13Ｃおよび15Ｎ］ヌクレオチド）は、商業的な供給源（例えば、Ｉｓｏｔｅｃ（Ｍｉａｍｉｓｂｕｒｇ，ＯＨ），ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ），およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手可能である。
【０４０４】
（ＶＩ．代謝産物プロファイリングのためのキャピラリー電気泳動方法）
（Ａ．代謝産物についてのキャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ））
（１．一般論）
等電点電気泳動は、双性イオン物質（例えば、タンパク質、ヌクレオチド、アミノ酸、およびいくつかの脂肪）がその等電点（ｐＩ）に基づいて分離される電気泳動方法である。ｐＩは、双性イオン種（例えば、タンパク質）が正味の電荷を有さず、従って、電場に供された場合に動かない。本発明において、双性イオン種は、両性電解質を使用して生成されたｐＨ勾配中で分離され得るか、または他の両性電解質性物質は、電場中で分離され得る。カソードは、勾配の高ｐＨ側に配置され、そしてアノードは、勾配の低ｐＨ側に配置される。
【０４０５】
双性イオン種は、その等電点に従って、ｐＨ勾配中の勾配の中心に導入され、ついでそこにとどまる。次いで、中心に集められた成分は、以下に記載されるように選択的に溶出され得る。ＣＩＥＦを実行するための一般的方法は、例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．第４章、９５−１０９頁（１９９４）；ならびにＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｈ．およびＴ．Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｐａｒｔ  Ｎｏ．２６６９２３  （Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，１９９４）；Ｗｅｈｒ，Ｔ．，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ−Ｄｉａｚ，Ｒ．、およびＺｈｕ，  Ｍ．「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９９）によって記載されており、これらは、本明細書中において、その全体が参考として援用される。
【０４０６】
（２．システムおよび溶液）
ＣＩＥＦは、主として、低い電流密度を用いる平衡技術であり、キャピラリーの加熱は問題ではない。従って、完全に大きなボアキャピラリーが利用され得る。適切なサイズには、２〜６００μｍの内径を有するキャピラリーが含まれるがこれに限定されないが、より代表的には、２５〜２５０μｍの内径を有するキャピラリーが使用され得る。比較的大きなボアキャピラリーの使用が、この方法が比較的高いサンプル負荷量を使用し得、このことが引き続く次元における検出を容易にする。このＣＩＥＦの特徴は、一連の電気泳動による分離の最初または初期の１つについて十分に適切な方法にする。しかし、より小さな直径のキャピラリーは、温度をより伸長に制御し得、そして、いくつかの方法において、改善されたシグナル検出を生じる（例えば、蛍光標識したタンパク質のレーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）検出）。
【０４０７】
キャピラリーは、種々の長さを有し得る。選択される長さは、因子（例えば、必要とされる分離の程度）に部分的に依存する。代表的には、キャピラリーは、約１０〜１００ｃｍ長であるが、いくぶん短いキャピラリーおよびいくぶん長いキャピラリーが使用され得る。より長いキャピラリーは、代表的には、より良好な分離および改善された複合体混合体の分離を生じるが、より長いキャピラリーはまた、サンプル中の種とキャピラリー壁の種との間の相互作用のためのより多くの機会、およびより低い電場の強さを与える。結果として、分解能が失われ得るキャピラリーの長さの上限が存在する傾向にある。より長いキャピラリーは、少ない量の化合物の解像における特定の使用用であり得る。キャピラリーのサイズおよび長さについてのさらなる手引きは、例えば、Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．およびＪ．Ａ．Ｎｏｌａｎ「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１３章、３２５−３６８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  １９９４）に記載される。
【０４０８】
一般的に、キャピラリーは、融合シリカから作られるが、プラスチックキャピラリーおよびＰＹＲＥＸ（登録商標）（すなわち、アモルファスガラス）が特定の方法において使用され得る。上述のように、キャピラリーは、円形または管状の形状を有する必要はない。他の形状（ここで、対向する面間の内部寸法は、この節に記載される一般的範囲にある）もまた使用され得る。
【０４０９】
種々のアノード溶液およびカソード溶液が使用され得る。一般的な溶液には、カソード液として水酸化ナトリウムおよびアノード液としてリン酸が含まれる。同様に、多数の異なる両性電解質が使用されて、ｐＨ勾配を生成し得る。これには、多数の市販の両性電解質（例えば、ＢｉｏＬｙｔｅ、ＰｈａｒｍａｌｙｔｅおよびＳｅｒｖａｌｙｔｅ）が含まれる。両性電解質の選択および両性電解質勾配の幅は、ＣＩＥＦ法によって達成された分解能にインパクトを与え得る。狭い両性電解質勾配は、理論的なプレートの数を増大し、そして狭いｐＩの幅にわたる高分解能の分離についての利点を有し得る。
【０４１０】
本明細書の分離において使用されるＣＩＥＦ法は、ポリマー性マトリックスを含むか、または遊離の溶液を含むキャピラリー中で行われ得る（すなわち、ゲルまたはタンパク質のポリマー性マトリックスがない）。ポリマーマトリックスは、代表的には、電気浸透流を示すように添加される；しかし、いくつかの例において、ポリマー性マトリックスを含むことは、より大きなタンパク質の移動を制限し得る（Ｐａｔｔｏｎ，Ｗ．Ｆ．「Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」、ＩＢＣ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（Ｊｕｎｅ  １１−１２，１９９８）において提示された論文）。遊離の溶液の使用は、電気浸透流を制御するために、おそらく他の方法（例えば、キャピラリーコーティング、ゲルプラグ、または誘導された電場）と組み合わせる場合において好ましい。
【０４１１】
（３．代謝産物プロファイリングのためのサンプル調製）
いくつかの例において、ＣＩＥＦによって電気泳動されるサンプルは、特定の高分子（特にタンパク質）を変性させるために、変性剤に供せられる。このことは、同じ成分がすべて同じ電荷を有し、従って、同一の成分が、キャピラリー中の複数のゾーンに潜在的にあるのではなく、むしろ同じ位置に集中することを確証する。変性剤（例えば、尿素）、非イオン性界面活性剤、および双性イオン性界面活性剤（例えば、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０または３−［｛３−コルアミドプロピル｝ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）もまた、タンパク質沈殿を生じ得る、タンパク質と壁面の相互作用およびタンパク質とタンパク質の相互作用を抑制するために使用され得る。電気泳動の前にサンプル中の他を変性させることの利点は、結果が、代表的に変性条件下で得られた記録されているデータと比較して使用され得ることである。
【０４１２】
代表的な変性緩衝液には、変性剤として、尿素および非イオン性界面活性剤または双性イオン性界面活性剤が含まれ；還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはメルカプトエタノール）は、代表的には、タンパク質に存在するジスルフィド結合を還元するために含まれる。尿素の他にさらに使用され得る変性剤には、チオ尿素およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が含まれるがこれらに限定されない。一般的に、塩酸グアニジンは、変性剤としては使用されない。なぜなら、これは、非常に高いイオン強度をサンプルに与えるからである。典型的な中性のデタージェントには、ポリオキシエチレンエーテル（「トリトン」）（例えば、ノナエチレングリコールオクタシクロヘキシルエーテル（「ＴＲＩＴＯＮ」Ｘ−１００））、ポリグリコールエーテル、特に、ポリアルキレンアルキルフェニルエーテル（例えば、ノナエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（「ＮＯＮＩＤＥＴ」Ｐ−４０またはＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０））、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（「ＴＷＥＥＮ」−２０））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｃ12Ｅ23）（「ＢＲＩＪ」−３５））、ポリオキシエチレンエステル（例えば、２１ステアリルエステル（Ｃ18Ｅ23）（「ＢＲＩＪ」７２１））、Ｎ，Ｎ−ビス［３−グルコンアミド−プロピル］コルアミド（「ＢＩＧＣＨＡＰ」）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、グルコシド（例えば、オクチルグルコシド）、３−［｛３−コルアミドプロピル｝ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートなどが含まれる。
【０４１３】
変性剤およびデタージェントの最適量は、使用される特定のデタージェントに依存する。一般的に、変性サンプル緩衝液は、１０Ｍまでの尿素（より代表的には、４〜８Ｍ、そして最も好ましくは、６〜８Ｍ）を含む。適切な緩衝液の特定の例（ならびにそこに含まれる変性剤および非イオン性界面活性剤）は、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３：４２４（１９８８））およびＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７（１９７５））によって記載されたものを含む。変性は、代表的には、キャピラリーへの注入前に９５℃で１０分間の加熱によって進行する。サンプル緩衝液を変性させる際の調整は、電気浸透流および生じる加熱の効果をしとめるために必要に応じてなされる（例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、第４章、９５ー１０９頁を参照のこと）。
【０４１４】
注入されるサンプルの量は、使用されるキャピラリーのサイズに一部依存して上記のように変化し得る。一般的に、キャピラリーは、サンプルの０．１〜５．０ｍｇでロードされる。サンプルは、１以上のｐＩスタンダードでスパイクされ、この方法の性能を評価し得る。
【０４１５】
（４．溶出）
種々の技術を使用して、分離された化合物を含む電気泳動媒体を、溶出するか、またはキャピラリーから引き出すが、これらの方法は、３つの一般的なカテゴリーに分かれる：水力学的な溶出。電気溶出、および電気浸透流の制御である。
【０４１６】
（ａ．水力学的／圧力溶出）
水力学的／圧力溶出は、キャピラリーの一端に接続した適切なポンプを介して、圧力を適用する（または、真空に吸引する）工程を含む（例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．第４章、９５−１０９頁（１９９４）を参照のこと）。しかし、水力学的溶出は、キャピラリー中に形成される放物線的な流れのプロフィールに起因して、バンドを広くし得、そして分解能の損失を引き起こし得る。
【０４１７】
（ｂ．電気溶出）
電気溶出（他の主要なアプローチ）は、種々の技術を包含し、そして一般に、溶出を行うために、十分に、分離キャビティ中の電気泳動媒体のいくつかのパラメーター（例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度）を変更するためにアノードおよび／またはカソードで溶液を変化させる工程を含む。
【０４１８】
（塩流動）
１つの電気溶出アプローチは、塩のカソード液（ｃａｔｈｏｌｙｔｅ）またはアノード液（ａｎｏｌｙｔｅ）への添加を含み、この塩は、リザバ内の酸性種または塩基性種と同じ電荷の非酸性対イオンまたは非塩基対イオンを有する。この塩はリザバに添加され、その結果、対イオンはリザバからキャピラリーに移動する。電気的中性がキャピラリー内で維持されなくてはならないので、対イオンのキャピラリーへの移動は、キャピラリー内でのプロトンまたは水酸化物の濃度の減少を生じ、従って、ｐＨが上昇するか、または低下するかのいずれかである。このタイプに流動についての理論的基礎は、Ｓ．Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｊ．−Ｌ．Ｌｉａｏ，およびＫ．Ｙａｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３８７：１２７（１９８７）によって記載される。例えば、カソード液が、水酸化ナトリウムである（すなわち、塩基性種が水酸化物である）場合、水酸化物以外の負に荷電した対イオンを有する塩が添加される（例えば、塩化ナトリウム）。塩化物イオンのキャピラリーへの移動は、キャピラリー内での水酸化物の局所濃度を減少させ、それによって、ｐＨを減少させる。別の例として、アノード液がリン酸である場合、プロトン以外の対イオンを有する塩が添加される（例えば、リン酸ナトリウム）。この例において、ナトリウムイオンのキャピラリーへの移動は、キャピラリー内のプロトンの局所濃度を減少させ、それによってｐＨを増加させる。添加された対イオンの存在に起因するキャピラリーの領域内で、ｐＨが増加または減少するにつれて溶出が起こる。なぜなら、両性電解質および濃縮された（ｆｏｃｕｓｅｄ）成分が、それらの等電点に対応する新たに規定されたｐＨ領域に移動するからである。流動のために使用される塩のタイプおよび濃度の両方が溶出した化合物ピークの分解能に対して影響することが示されている（例えば、Ｒ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｄｉａｚ，Ｍ．Ｚｈｕ，およびＴ．Ｗｅｈｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，７７２：１４５（１９９７）を参照のこと）。例えば、塩化ナトリウムの代わりに四ホウ酸ナトリウムのカソード液への添加は、分離されるタンパク質の非常に増加した分解能を生じる。
【０４１９】
（ｉｉ．ｐＨ流動）
本明細書中で、「ｐＨ流動」として参照される別の技術のまた、ＣＩＥＦの間に化合物を溶出するために利用され得る。このアプローチにおいて、添加物が、溶液のｐＨを変更するために、アノード溶液またはカソード溶液のいずれかに添加される。しかし、塩流動とは異なり、添加物はキャピラリーに移動する可動対イオンに寄与しない。ここで、溶出が、リザバの１つまたは両方のｐＨによって再規定されるｐＨ勾配の結果として起こる；従って、この再規定されたｐＨ勾配の外側にあるｐＩを有する成分は、アノードリザバまたはカソードリザバのいずれかに溶出される。代表的に、カソード流動についての技術は以下のように進行する。一旦、成分が濃縮されると（例えば、アノード液としてリン酸およびカソード液として水酸化ナトリウムを使用する３〜１０のｐＩ範囲において）、カソードキャピラリー端部は、１０より少し低いｐＨを有する溶液（例えば、９．８５のｐＨを有する５０ｍＭイミダゾール（ｐＫａ  ７））を含むリザバに浸される。次いで、これらの成分は、キャピラリー中に再濃縮され、キャピラリーを通る電流の安定化によって認識可能となり、ここで、ｐＩ範囲は、３〜９．８５によって規定される。９．８５〜１０の等電点を有する任意の化合物は、カソード液に溶出される。このプロセスは、ｐＨを９．８５より少し低くさせる種を含むカソード液で繰り返され得る。段階的な様式で、ｐＨは、ｐＨ７に減少されつづけ得、それによって、７〜１０の範囲を補う画分に分離した成分を回収する。この点において、アノード流動は、ｐＨを３から７に選択的に増加させるために、アノード液を増加したｐＫａの酸と置きかえることによって進行し得、それによって、酸性範囲（ｐＨ３〜７）の画分を回収する。画分の数は、所望の分別分解能に依存して変化し得る。代表的に、これらの画分は、０．０５〜０．５ｐＨ単位の差によって規定される。
【０４２０】
ｐＨ流動の技術は、キャピラリーの内部の不均一な空間勾配を引き起こし得る、高濃度の１以上の成分（例えば、タンパク質）を含むサンプルに対して有用であり得る。ｐＨ流動を使用して、リザバｐＨによって規定されるｐＩ範囲より下か、または上である等電点を有する成分のみが溶出される。従って、この溶出は、キャピラリーのｐＨ勾配の形状における差異またはキャピラリー内部の不均一な空間勾配の存在に関わらず、再現性がある。
【０４２１】
（ｃ．電気浸透流（ＥＯＦ））
電気浸透流（ＥＯＦ）の大きさを調節することは、先の電気溶出法（前出を参考のこと）に有意に影響し、そして分離された成分が等電濃縮分離の結果の際に選択的に引かれ得る別の方法である。ＥＯＦは、シリカキャピラリーの表面上のシラノ−ル官能基のイオン化によって発生する。このようなイオン化は、シリカキャピラリーの表面での電気泳動媒体中のプロトンの層を生じる。一旦、電場が印加されると、プロトンの層は、本質的に、カソードに向かって移動する流体の正に荷電したカラムを構成し、それによってキャピラリー内に電気泳動媒体のバルクフロー（ｂｕｌｋ  ｆｌｏｗ）を引き起こす。成分の見かけの速度は、電気浸透流とそれらの電気泳動移動度との合計に等しい。従って、ＥＯＦを制御することによって、成分がキャピラリーを通って動く速度を制御または調節し得る。ＣＩＥＦ法において、一般にＥＯＦは、タンパク質が、キャピラリーから溶出し始める前に、濃縮するのに十分な時間、注入されたサンプル内にあるようにさせるように制御されなくてはならない。
【０４２２】
種々の技術が、ＥＯＦを制御するために利用され得る。１つのアプローチは、キャピラリーの壁を種々の薬剤でコーティングする工程を含む。例えば、シリケートガラス表面に沿ったＥＯＦは、表面シラノール基（例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンオキシド）の相当な割合をマスクする中性のシラン試薬を用いて、それらをシラン処理することによって実質的に減少され得る。ＥＯＦの大きさは、正または負に荷電した基を含むシラン処理試薬を使用してさらに制御され得る。正に荷電したコーティングを使用して、ゼロの正味の表面電荷を与えるために、表面の負の電荷を無効にし得、その結果、ＥＯＦはゼロに近づく。より高い正電荷密度を有するコーティングを使用して、荷電した表面物質に対してＥＯＦの方向を逆にし得る。このことは、正に荷電したサンプル種の正味の移動速度を遅くするために有用であり得る。逆に、負に荷電したコーティングを使用して、表面の負の電荷の量に付与するかまたは増加させ得、その結果、負に荷電した種の正味の移動速度を増加させる。代表的な正に荷電したコーティングには、例えば、ポリエチレンイミン、四級化ポリエチレンイミン、ポリ（Ｎ−エチルアミノアクリルアミド）およびキトサンを有するトリアルコキシシランが挙げれらる。代表的な負に荷電したコーティングには、例えば、カルボキシレートおよびスルホネート（ポリ（メチルグルタメート）および２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネートポリマーのような物質を含む）を有するトリアルコキシシランが挙げられる。荷電したコーティングはまた、特にコーティングと同じ電荷極性を有するサンプルに対して、サンプル吸着を効果的に減少させ得る。
【０４２３】
分離媒体はまた、電気泳動の間にＥＯＦを減少させることを助けるために、分離キャビティの壁を動力学的にコーティングするための可溶性薬剤を含み得る。このような可溶性コーティング剤には、例えば、以下が挙げられる：四級化アンモニウム含有ポリマー、メチルセルロース誘導体、酢酸セルロース、ポリエチレンオキシド、キトサン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドトリブロックコポリマー。代表的に、可溶性コーティング剤は、約０．０５％〜約４％、より代表的には約１％〜約２％の濃度で含まれる。
【０４２４】
ＥＯＦおよびサンプル吸着はまた、分離媒体およびランニング緩衝液に適切な試薬を含むことによって調節され得る。例えば、負の表面電荷は、媒体中にカチオン性添加物（例えば、金属アミン錯体、アミン、およびポリアミン（例えば、プロピルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、プトレシン、スペルミン、１，３−ジアミノプロパン、モルホリンなど））を含ませることによってマスクされ得る。電気泳動のｐＨで等電である負および正に荷電した基の両方を含む両性イオン種（例えば、トリアルキルアンモニウムプロピルスルホネート（ここで、アルキルは、メチル、エチル、プロピル、およびより長いアルキル鎖である））もまた、使用され得る。
【０４２５】
別のアプローチは、ＥＯＦと反対方向の電流の発生を含む。代表的に、これは、キャピラリーの外部表面に金属（例えば、イリジウムスズ酸化物または銅）の薄層を適用することによって達成される。電流のフィルムへの適用は、キャピラリー内に比較的小さな誘導電流を発生させ、ＥＯＦを逆にする（例えば、Ｓｃｈａｓｆｏｏｒｔ，Ｒ．Ｂ．Ｍ．，Ｓｃｈｌａｕｔｍａｎｎ，Ｓ．，Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅ，Ｊ．，およびｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ａ．，「Ｆｉｅｌｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：９４２−９４５（１９９９）を参照のこと）。
【０４２６】
サンプルが導入される場所よりも上流（上流とは、キャピラリーを通る成分の流れとは反対の方向をいう）の位置に多孔性プラグを配置することはまた、ＥＯＦを制御するために利用され得る。プラグの位置を示す例が、図２Ｂに示され、ここで、キャピラリー１００が、一方の端部において、アノードリザバ（示さず）から延び、他方の端部においてカソードリザバから延びる（示さず）。成分移動は矢印１０２の方向である（すなわち、アノードからカソードの方向）。
【０４２７】
理解されるように、多孔性プラグ１０４は、一旦キャピラリー１００」に導入されると、サンプルの後縁１０６の上流であるように位置決めされる。多孔性プラグ１０４は、代表的に、ポリマー材料から形成され、電気泳動の実施の間比較的定常のままである。プラグが形成され得る適切な材料の例には、ジアクリルアミド架橋剤およびアガロースと重合されたアクリルアミドが挙げられる。任意の特定の理論によって縛られることは意図されないが、多孔性プラグ１０４は、プラグ１０４が存在しない場合に、カソードリザバに向かって移動するバルク流体の置換をブロックすることによって運動量移動バリアとして機能する。
【０４２８】
いくつかの方法（例えば、大量の特定の成分（例えば、タンパク質）および／または大量の異なる成分を含む方法）において、ＥＯＦは、非常に低いレベルに減少されて、電気泳動媒体が、ＥＯＦのためにキャピラリーから溶出し始める前に、成分が濃縮する機会を可能にしなければならない。特定の方法において、＝０．５×１０-6ｃｍ2／Ｖ−ｓのＥＯＦ（ｐＨ８．６において、そして２５ｍＭＴＲＩＳ−ホスフェート）は、サンプルがキャピラリーから溶出する前に、タンパク質の必要な濃縮のための十分な時間を可能にすることが見出されている。上記の方法は、ＥＯＦをこれらのレベルに減少させ得る。
【０４２９】
従って、先のアプローチは、異なる基準に従って、画分が回収されることを可能にする。例えば、電気溶出技術を使用して、規定されたｐＨ範囲を有する画分を回収し得る。対照的に、ＥＯＦ溶出および圧力溶出を使用して、溶出時間に従って、画分を分離し得る。他の技術もまた、ＣＩＥＦ後分離されたタンパク質を溶出するために利用され得る（例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ，「ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，第４章，９５−１０９頁（１９９４）を参照のこと）。制御された溶出技術は、再現性を高めるために有用であり、比較法および診断方法における重要なファクターである。このような技術はまた、空間的分離に依存する方法と比較して、大量成分（例えば、タンパク質）の改善された許容範囲を提供する。
【０４３０】
（Ｂ．代謝物プロファイリングのためのキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ））
（１．一般論）
キャピラリーゾーン電気泳動は、ゲルマトリックスのない自由溶液中で行われる電気泳動法であり、そしてそれらの固有の質量／電荷比に基づいて荷電成分（例えば、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸、脂肪、砂糖ホスフェート、核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシド）の分離を生じる。ＣＺＥ方法に対する１つの利点は、典型的な水溶性ゲルマトリックスと通常適合しない溶媒系で行う能力である。非水または水混和性溶媒系を使用して、水性電気泳動方法によって通常分離されない疎水性でかつ膜結合成分の溶解度を改善し得る。この方法を実施するための一般的な方法が、例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｚｏｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，第１２章，２８７−３２３頁（１９９４）；Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．およびＬｕｋａｃｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｊ．Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４：２３０（１９８１）；ならびにＪｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．およびＬｕｋａｃｓ，Ｋ．Ｄ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５３：１２９８（１９８１）（それらの各々は、その全体が参考として援用される）によって記載される。
【０４３１】
（２．システムおよび溶液）
一般に、ＣＩＥＦのための上記のキャピラリーはまた、ＣＺＥ方法を行うために適切である。しばしば、キャピラリーは、約５０〜１００ミクロンの内径を有する。緩衝液組成物およびｐＨは、分離に有意に影響し得る。なぜなら、ＣＺＥにおける分離は、質量／電荷比に基づき、そして成分の電荷は、周囲溶液のｐＨに依存するからである。極端なｐＨ（すなわち、２より低く、そして１０より高い）において、多くの成分の分解能を達成することは、典型的に困難である。なぜなら、成分上のほとんどの荷電基は、完全にプロトン化されているか、または脱プロトン化されているかのいずれかであり、そして多くの成分が、単位質量当たり同じような数の酸性残基および塩基性残基を有するからである。選択性は、代表的に、中間のｐＨにおいて高められる。比較的高いパーセントの酸性基を有する成分について、選択性は、しばしば、ｐＨ４．５付近で高められ得る。高濃度のアミン残基を有する成分について、選択性は、ｐＨ１０付近で高められ得る。
【０４３２】
ＣＺＥにおいて、アノードおよびカソードにおける溶液は、典型的に同じである。利用される緩衝液は、本質的に任意の緩衝液であり得、緩衝液の選択は、部分的に、電気泳動方法が実行されるｐＨ範囲および検出機ノイズに対するその影響によって制御される。低ｐＨにおける有用な緩衝液の例には、ホスフェートおよびシトレートが挙げられるが、これらに限定されない；高ｐＨにおいて有用な緩衝液には、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ、ボラート、およびＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）が挙げられる。適切な緩衝液および緩衝液添加物に関するさらなる手引きは、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｚｏｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，第１２章，２８７−３２３頁（１９９４）によって記載される。
【０４３３】
いくつかの例において、多重ＣＺＥ分離が、異なるｐＨ緩衝液を用いて実施されて、成分の分別に影響し得る。例えば、ｐＨ３の緩衝液を使用して、中性成分（例えば、オリゴ糖、多糖類、単純砂糖、および脂肪酸）から、および正味負に荷電した成分（例えば、リン糖酸およびヌクレオチド）から、正味正に荷電したアミン官能性成分（例えば、アミノ酸、およびヌクレオシド）を分離し得る。この最初のＣＺＥディメンションから回収された画分は、続いて、別のｐＨにおける第二のＣＺＥディメンションにおいて、さらに分離され得る。例えば、アミノ酸は、ｐＨ７で実施された第二のＣＺＥディメンションによってヌクレオシドから分離され得、そして脂肪酸は、５．５のｐＨにおいてアミノ酸から分離され得る。リン糖酸は、ｐＨ１１での続くＣＺＥ分離によって、カルボン酸からさらに分離され得る。
【０４３４】
（３．溶出）
溶出は、ＣＩＥＦについての上記の同じ方法のいくつか（すなわち、圧力およおびＥＯＦ）を利用して、達成され得る。ＣＩＥＦと同様に、ＥＯＦを制御することは、充填されたサンプル内の成分が分離される機会を有する前に、成分を含む電気泳動媒体がキャピラリーから溶出することを防ぐために、特定の方法において重要である。ＥＯＦは、ＣＩＥＦ方法においてＥＯＦを制御するために利用される同じ方法（例えば、キャピラリーの内壁をコーティングすること、多孔性プラグを使用すること、およびＥＯＦを相殺する誘導場を発生させること）を用いて、制御され得る。電気泳動媒体のｐＨおよびイオン強度を調節し、そして注意深く選択することは、使用され得る別の技術である。ＥＯＦは、比較的低いｐＨ（例えば、ｐＨ２〜５、より代表的には、約ｐＨ３〜４）でＣＺＥを実施することによって、内部キャピラリー表面のシラノール基のイオン化から生じるので、イオン化されるシラノール基の数は減少される。このような減少は、ＥＯＦを減少させる。完全な分離の前にサンプル溶出を防止するために、特定の分析において、ＥＯＦは、＜１×１０-4ｃｍ2／Ｖ−ｓ（ｐＨ８．６および２５ｍＭ  ＴＲＩＳ−ホスフェート緩衝液における）に減少されるべきである。このレベルのＥＯＦは、こおで記載された方法を使用して得られ得る。
【０４３５】
１以上の検体の共有結合性改変はまた、成分溶出を制御するための手段として戦略的に使用され得る。この技術は、サンプルを次のチャピラリーに注入する前に、化学的部分をサンプル中の特定の成分またはＣＥ工程から回収された画分に添加する工程を含む。特定の官能基（例えば、アミノまたはカルボキシル基）と優先的に反応する改変剤を選択することによって、特定の成分の質量／電荷比を変更し得る。このようの変更は、電気泳動の間の成分の分解能を改善し、そしてそれらの検出性を改善する。
【０４３６】
（Ｄ．代謝物プロファイリングのためのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ））
（１．一般論）
キャピラリーゲル電気泳動は、ゲルマトリックスを介する篩分けによって達成されるタンパク質、核酸、または他の高分子の分離をさし、サイズに従う分離を生じる。１つの形式において、タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性され、その結果、質量／電荷比が、タンパク質の固有の質量／電荷比よりもむしろこのカチオン性界面活性剤によって決定される（Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，ＮＹ，（１９８０））。このことは、タンパク質は、電荷が分離の程度に要因として入ることなく、サイズを基準にして単に分離され得ることを意味する。一般的なＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動方法のキャピラリー電気泳動（ＣＧＥ）への適用は、例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｓ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｖ．，９：１２２（１９６７）によって記述される。
【０４３７】
（２．システムおよび溶液）
キャピラリーおよびそれらのサイズのタイプは、一般的に、ＣＺＥについて上記されたようなものである。種々の異なる緩衝液が使用され得、Ｂａｃｍａｎによって製造された「ｅＣＡＰ  ＳＤＳ」のような市販の緩衝液を含む（Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｓ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｖ．，９：１２２（１９６７）；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，「ｅＣＡＰ  ＳＤＳ  ２００：Ｆａｓｔ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，」ＢＲ２５１１Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，（１９９３）；Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｍ．およびＣｈａｖｋｏ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６５：３３（１９８７）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｄ．Ｆ．，ら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７３：４２４（１９８８））。種々の緩衝液添加物は、分解能を増加させるために利用され得る。このような添加物には、以下のような少量の有機溶媒が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、シクロヘキシルジエチルアミン、ジメトキシテトラエチレングリコールおよび他のポリオール（例えば、エチレングリコールよおびポリエチレングリコール）（例えば、Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．およびＮｏｌａｎ，Ｊ．Ａ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１３章，３２５−３６８頁，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，（１９９４）；Ｗａｎｄｅｒｓ，Ｂ．Ｊ．およびＥｖｅｒａｅｒｔｓ，Ｆ．Ｍ．，「Ｉｓｏｔｇａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第５章，１１１−１２７頁，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，（１９９４）を参照のこと）。このような溶媒の使用は、特定の化合物（例えば、水溶液中の脂質親和性成分）の溶解度を改善し得、そして熱変性に対するそれらの安定性を高め得（Ｍａｒｔｉｎｅｋ，Ｋ．，ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５１：１５２−１５５（１９７５））、ＣＺＥおよびＣＧＥにおける電気浸透流を抑制し（Ａｌｔｒｉａ，Ｋ．Ｄ．およびＳｉｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｆ．，Ａｎａｌ．Ｐｒｏｃ．，２３：４５３（１９８６））、キャピラリー壁における電気二重層の厚さを変更して、タンパク質結合相互作用を阻害し得（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．，「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１２章，２８７−３２３頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，（１９９４））、そして電気浸透流を抑制するランニング緩衝液の粘度を増加させ得る。利用される溶媒は、キャピラリー内のポリマーマトリックスと適合するべきである。
【０４３８】
等速回転電気泳動（ＩＰＥ）を特定の方法で使用して、荷電成分の分解能を高め得る。ＩＰＥの一般的な議論について、例えば、Ｂ．Ｊ．ＷａｎｄｅｒｓおよびＥｖｅｒａｅｒｔｓ，Ｆ．Ｍ．，「Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，」ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第５章，１１１−１２７頁（１９９４）（これは、その全体が参考として援用される）を参照のこと。一定の電場強度下で、キャピラリーを通過する荷電分子の速度は、その相対移動度に依存し、この移動度は、分子の質量／電荷比、温度、そして分子が通過する媒体の粘度の関である。しかし、サンプルイオンの上流の高度に移動可能なイオンの適切な濃度が存在しない場合、一旦電場がキャピラリーの内部で定常状態に達すると、全てのイオンは、最終的に最も遅いイオンの速度で移動しなければならない。この条件は、リーディング（ｌｅａｄｉｎｇ）緩衝液およびターミネ−ティング（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）緩衝液の界面におけるそれらの相対的な移動度の順番でで、カチオンを積み重ねさせる。
【０４３９】
ＳＤＳ変性条件下で、サンプルに存在する全ての成分は、ほぼ同一の質量／電荷を有する。ターミナル緩衝液により高い質量／電荷のアニオンを使用することによって、成分を一定の遅い速度でキャピラリーを通過させ得る。このことは、２つの効果を有する。第１に、成分は、キャピラリー内部のそれらの有効濃度を増加させるリーディング緩衝液の末端縁で、「積み重なる」。第２に、成分間の任意の分離は、それらのサイズに基づく。従って、ＩＰＥがサンプルの「積み重なり」のために使用されるハイブリッドＩＰＥ−ＣＧＥ方法の使用は、いくつかの方法における続くＣＧＥ分離において可能な分解能を改善し得る。
【０４４０】
種々のターミナル緩衝液系は、ＩＰＥ方法と関連して利用され得る。１つの系において、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）は、ターミナル電解質として使用される。なぜなら、それは、高ｐＨ（＞６）において高い質量／電荷を有するからである。トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）シトレート（０．０５Ｍ）は、ｐＨ＝４．８でリーディング緩衝液として、およびｐＨ＝６．５で中程度のスタッキング緩衝液として使用される。サンプル成分（例えば、タンパク質）は、最初に「積み重なる」。なぜなら、ＥＡＣＡは、ｐＨ６．５のスタッキング緩衝液において非常に低い移動度を有するためである。しかし、一旦タンパク質が「積み重なり」、そしてＥＡＣＡがより低いｐＨのリーディング緩衝液に達すると、ＥＡＣＡの移動度は、サンプル中の成分の移動度を超え、そして分離が開始する（例えば、Ｓｃｈｗｅｒ，Ｃ．およびＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６２３：３４５（１９９２）を参照のこと）。この系は、ハイブリッド単一カラムＩＰＥ−ＣＰＡＧＥ系を作製するために使用され得る。
【０４４１】
タンパク質の分離のためのＩＰＥについての２緩衝液系は、サンプルを０．０１Ｍ  酢酸に溶解する工程を含み、この酢酸はまた、ターミナル電解質として使用される。リーディング緩衝液およびバックグラウンド緩衝液は、ｐＨ４．４の０．０２Ｍトリエチルアミン−酢酸溶液であった。ターミナル緩衝液中のサンプルは、リーディング緩衝液とバックグラウンド緩衝液との間に挟まれる。ＩＰＥは、バックグラウンド緩衝液が、ターミナル緩衝液の先行縁に追いつくまで続く。その場所で、ＩＰＥは停止し、そして分離が始まる（例えば、Ｆｏｒｅｔ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６０８：３（１９９２）を参照のこと）。
【０４４２】
任意のランニング緩衝液を用いて達成され得る別のＩＰＥアプローチは、サンプルをランニング緩衝液に溶解し、より低いイオン強度に希釈することである。これは、サンプルプラグが充填されるキャピラリーにおける電気抵抗の増加を引き起こし、そして対応して、サンプルマトリックスに存在するイオンをランニング緩衝液の境界へより迅速に移動させる。サンプルマトリックスとランニング緩衝液との間の最適なイオン強度の差は、典型的に約１０倍である（例えば、Ｓｈｉｈａｂｉ，Ｚ．Ｋ．およびＧａｒｃｉａ，Ｌ．Ｌ．，「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓａｍｐｌｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｎ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，」：ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｐｉｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第２０章，５３７−５４８頁，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，（１９９４）を参照のこと）。
【０４４３】
（３．溶出）
一般に、ＣＺＥについての溶出の議論を、ＣＧＥに適用する。溶出は、圧力およびＥＯＦを利用して達成され得る。ＣＩＥＦおよびＣＺＥと同様に、ＥＯＦを制御することは、適用されたサンプル内の成分が分離の機会を有する前に、成分を含む電気泳動媒体が溶出することを防ぐために、特定の方法において重要であり得る。ＣＩＥＦおよびＣＺＥについての上記の方法を使用して、所望のレベルでＥＯＦを制御し得る。特定の分析において、完全な溶出の前にサンプルが溶出することを防ぐために、ＥＯＦは、＜１×１０-4ｃｍ2／Ｖ−ｓ（ｐＨ８．６および２５ｍＭ  ＴＲＩＳ−ホスフェート緩衝液における）に減少されるべきである。ＥＯＦは、例えば、緩衝液のｐＨを制御することによって、相殺する誘導電場、キャピラリーコーティングおよび多孔性プラグの生成によって、この範囲に減少され得る。
【０４４４】
（Ｅ．分離に続く検出）
図１に示されるように、最後の電気泳動分離の間に抜き出された電気泳動溶液は、標識された分析物および標識されていない分析物の相対的存在量の決定のために、分析機８２に向けられ得る。この構成は、検出の性質に関するかなりの柔軟性を提供し、そしてこの方法を標準的な吸収および蛍光の技術に限定しない。しかし、この分析機は、図１に示されるように溶出される成分を検出するように位置付けされる必要はない。他の構成では、分析機は、キャピラリー管自体の分離キャビティー内の分割された成分をスキャンし得るように適合される。このような構成の例は、分割された成分中の13Ｃ存在量を検出するための近赤外分析機の使用を含む。代謝フラックスは、目的の分析物の同位体比の相対的存在量から決定されるのみであるので、標識された分析物および標識されていない分析物の相対的存在量を分析し得る任意の検出器が、この方法で使用され得る。検出器の定量的感度および精度は、比較的重要でない。なぜならば、各分析物は、標識された形態および標識されていない形態の両方で同時に存在するからである。この検出器は、同位体の相対的存在量を、ただ正確に定量し得るべきである。
【０４４５】
いくつかの例において、検出器は、流れをモニターするため、および／または画分が収集されるべき時を決定するために、最後のキャピラリーカラムの末端（および／または他のカラムの間）に配置され得る。
【０４４６】
（Ｆ．例示的なシステム；代謝プロファイリング）
本発明の方法は、種々の異なる電気泳動方法に従う。制御された溶出技術（この技術により、規定された画分は、空間的、物理的、または時間により分離される）、ならびに標識化方法および検出方法は、多数の異なる電気泳動技術において利用され得る。上記のように、一連の連結された電気泳動方法の数は、代表的には少なくとも２であるが、複数のさらなる電気泳動方法も含み得る。いくつかの例では、この一連の方法における各電気泳動方法は、異なるが；特定の電気泳動方法が異なるｐＨまたは分離マトリックス条件で繰り返される例もある。
【０４４７】
この方法の一般的な適用性にもかかわらず、上記のようなＣＩＥＦ、ＣＺＥおよびＣＧＥ方法は、本発明の方法に従って利用され得る電気泳動方法の型の特定の例である。特定の方法において、２つの方法のみが実行される。このような方法の例としては、ＣＩＥＦが最初に、次いでＣＧＥが実行される方法が挙げられる。実行される場合、標識化は、代表的にはＣＧＥキャピラリーからの成分の溶出後の検出を伴って、ＣＩＥＦの後に実行される。別のシステムでは、第１の方法は、ＣＧＥであり、そして最後の方法が、ＣＺＥである。同位体検出は、一般的には最後の電気泳動分離が完了するまで実行されない。しかし、上記で示したように、ＵＶ／ＶｉｓまたはＬＩＦ検出は、任意または全ての分離規模（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）を通して使用されて、分離の進行をモニターし得、特に画分が収集されるべきときを決定し得る。第３の有用なアプローチは、複数のＣＺＥ規模の実行を含む。これらは利用され得るシステムの特定の例であり；本発明は、これらの特定のシステムに限定されないことが理解されるべきである。他の構成およびシステムは、本明細書中に記載される技術およびアプローチを使用して開発され得る。
【０４４８】
（ＶＩＩ．代謝プロファイルのための質量分析法）
荷電された分析物またはイオン化された分析物は、種々の質量分析方法により検出され得る。特定の方法としては、飛行時間（ＴＯＦ）イオン検出と組合せた、電子スプレー（ＥＳＩ）イオン化法およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法が挙げられる。ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩは、低エネルギーイオン化法であり、一般的に大部分の分析物の低いフラグメンテーションを生じ、標的分析物の最も広範な可能なアレイのイオン化に適切であるため、好ましい。ＴＯＦ検出は、質量を決定する際のこの技術の精度が、多価荷電種についてさえ、単一原子質量単位レベルまで同位体の分析を一般的に可能にするので、有用である。しかし、他の質量分析イオン化および検出技術は、分析物がフラグメンテーションに対して特に丈夫（ｒｏｂｕｓｔ）である場合、標識された分析物と標識されていない分析物との間の同位体差が、十分に大きい場合、および／または電荷状態の数が十分に低い場合には、標識された分析物および標識されていない分析物の分析を達成するために、有用に使用され得る。
【０４４９】
（ＶＩＩＩ．代謝プロファイルのための微小流体システム）
（Ａ．構成の例）
以下に記載される電気泳動システムのバリエーションにおいて、キャピラリーは、微小流体デバイスの一部であるか、または基板内に形成されて微小流体デバイスの一部を形成し、この微小流体システムを使用して、非常に小さいスケールで、かつ最小量のサンプルのみが必要な場合に、本発明の分析を行い得る。これらの方法において、サンプルの物理的画分は典型的には収集されない。代わりに、分割された成分が、空間的または時間により分離される。微小流体チャネルまたはキャピラリーおよび種々の異なる設計内でサンプルを製造または移動させるための方法が考察されており、これらとしては，例えば、米国特許第５，８５８，１８８号；同第５，９３５，４０１号；同第６，００７，６９０号；５，８７６，６７５号；６，００１，２３１号；および同第５，９７６，３３６号（これらの全てはそれらの全体が参考として援用される）が挙げられる。
【０４５０】
本発明の方法と共に使用され得る一般的なシステム１５０の例は、図３Ａに示される。キャピラリーまたはチャネルは、代表的には平坦な支持体または基板に形成されるかエッチングされる。分離キャピラリー１５２は、アノード液を含むアノードリザーバー１５４からカソードリザーバー１５６へ延びる。アノードリザーバー１５４およびカソードリザーバー１５６は、それぞれアノードおよびカソード１５８、１６０と電気接触している。サンプル注入チャネル１６２は、分離キャピラリー１５２へほぼ垂直に延び、そして一方の端がアノードリザーバー１５４のわずかに下流の注入部位１６４で交差する。サンプル注入キャピラリー１６２の他方の端は、サンプルリザーバー１６６で終結し、このサンプルリザーバー１６６は、サンプルリザーバー電極１６８と電気接触している。検出器１７０は、分離キャピラリー１５２を通過する電気泳動媒体と流体連絡するように位置付けられ、そしてサンプル注入部位１６４の下流で、かつ代表的にはカソードリザーバー１５６のいくらか上流に位置付けられる。この特定の構成において、画分はカソードリザーバー１５６へ抜き出される。種々のチャネルを通る電気泳動媒体の移動は、１つ以上の電極１５８、１６０、１６８を介する電界の選択的な印加により制御される。電極への電界の印加は、種々のキャピラリー内のＥＯＦの大きさを制御し、それにより種々のキャピラリーを通る流れを制御する。
【０４５１】
別の構成の例は図３Ｂに例示される。このシステム１８０は、図３Ａに示されるシステムにおいて記載される要素を含む。しかし、この構成において、空間的または時間的に分割された画分は、分離キャピラリー１５２に沿った複数の異なる場所で、出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃを介して抜き出され得る。これらのキャピラリーの各々は、それぞれ緩衝液リザーバー１７６ａ、１７６ｂ、１７６ｃを含み、そしてそれぞれ電極１７４ａ、１７４ｂ、１７４ｃと電気連絡している。電気泳動媒体の分離キャピラリー１５２に沿った移動および画分の分離キャピラリーから出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃへの抜き出しは、分離キャピラリー１５２に沿ったどの電極を起動させるか、およびどの出口キャピラリー電極を起動させるかを制御することにより、制御され得る。あるいは、またはさらに、種々の微小流体弁が、流れを制御するために出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃに位置付けられ得る。代表的には、さらなる検出器が、種々の出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃににおいて、これらのキャピラリー内に引き込まれた画分中の成分を検出するために位置付けられる。
【０４５２】
図３Ｂに示された構成は、多くの異なる適用において使用され得る。この型のシステムが適切である適用の一例は、試験されるサンプルの型が、十分に特徴付けられている状況である。例えば、目的の成分の特定の画分が、以前に分離キャピラリー１５２の特定の場所で分別されることが確立されている場合、出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃは、目的の成分の選択的除去を可能にする場所に位置付けられ得る。
【０４５３】
なお別の構成において、複数の出口キャピラリーは、カソードリザーバー１５６に近い分離キャピラリー１５２の末端から分岐し、抜き出しおよび輸送用の各出口キャピラリーは、画分を分離する。この構成においてまた、分別された成分の分離キャピラリーからの抜き出しは、種々のキャピラリー内のＥＯＦを調整することにより、および／または微小流体弁により、制御され得る。
【０４５４】
電気泳動分析を行うために必要な他の構成要素は、支持体にエッチングされ得、これらの構成要素としては、例えば、上記で考察されたリザーバー、検出器および弁が挙げられる。
【０４５５】
（２．基板）
本発明の分析デバイスのキャピラリーまたは微小チャネルネットワークが上に形成される基板は、広範な種々の材料（ケイ素、ガラス、溶融シリカ、結晶石英、溶融石英および種々のプラスチックなどを含む）から製造され得る。このデバイスの他の構成要素（例えば、検出器および微小流体弁）は、このデバイスの特定の用途、経済的な事柄、溶媒の適合性、光学的清澄性、機械的強度および他の構造的な事柄に依存して、同じ材料または異なる材料から製造され得る。一般的に、基板は、種々のチャネルを通るサンプルの動電学的輸送するために印加される比較的高い電界を可能にするために、非電導性材料から製造される。
【０４５６】
プラスチックのようなポリマー物質の場合、基板材料は、材料が意図される用途に依存して、剛体、半剛体、または非剛体で有り得、不透明、半透明または透明であり得る。本発明の電界に供された場合に低い表面電荷を有し、従って特に有用であるプラスチックとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンまたはスチレンコポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリスルホンなどが挙げられる。
【０４５７】
光学的または視覚的検出器を含むデバイスは、検出器による分離チャネル内の成分の検出を容易にするために、一般的に、少なくとも部分的に透明な材料から製造される。
【０４５８】
（２．チャネル構造／形成）
本発明のデバイスの基板に形成されるチャネルまたはキャピラリーのサイズおよび形状は、本質的に任意の形状を有し得、これらとしては、半円形、円筒形、長方形および台形が挙げられるが、これらに限定されない。チャネルの深さは変化し得るが、約１０〜１００ミクロンになる傾向があり、そして最も代表的には、約５０ミクロンである。チャネルは２０〜２００ミクロンの幅になる傾向がある。
【０４５９】
基板表面に形成されるチャネルおよび他の要素の製造は、当該分野で公知の任意の数の製造技術により実行され得る。例えば、リソグラフィー技術は、例えば、半導体製造産業において確立された方法を使用して、ガラスまたは石英の基板の製造において使用され得る。フォトリソグラフィーマスキング、プラズマエッチングまたは湿性（ｗｅｔ）エッチング、および他の半導体処理技術は、基板表面に、かつ基板表面上にミクロスケールの要素を生成するために利用され得る。あるいは、微細加工方法（例えば、レーザードリル法、ミクロミリング法など）が、利用され得る。プラスチックにチャネルおよび他の要素を調製するための製造技術はまた、確立されている。これらの技術としては、射出成形技術、スタンプ成形方法（例えば、ミクロスケール基板の大きなシートを生成するためにローリングスタンプを使用する）、ポリマーミクロ鋳造技術（ここで基板は微細加工された鋳型内で重合される）が挙げられる。
【０４６０】
上記に記載されるこのような微小流体デバイスを使用するための他の設計および方法に関するさらなる手引きは、例えば米国特許第５，８５８，１８８号；同第５，９３５，４０１号；同第６，００７，６９０号；同第５，８７６，６７５号；同第６，００１，２３１号；および同第５，９７６，３３６号（これらの全てはそれらの全体が参考として援用される）に見出され得る。
【０４６１】
（ＩＸ．例示的な有用性）
本発明の方法および装置は、種々の異なる型の代謝化合物を分離および検出するために使用され得る。このような代謝化合物としては、タンパク質、核酸、多糖類、脂質、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、単糖類および二糖類が挙げられるが、これらに限定されない。結果として、これらの方法および装置は、種々の代謝適用において使用され得る。例えば、これらの方法は、種々の代謝産物のフラックスを決定するために使用され得る。この能力は、生化学において、特に代謝産物のフラックスが、異なる細胞状態の関数として、または種々の外部刺激に応答してどのように変化するかを決定する際に、代謝の研究において使用され得る。これらの方法は、種々の代謝産物のフラックス速度が、健康状態と疾患状態との間でどのように変化し得るかを決定することにより、臨床的研究において価値がある。
【０４６２】
より詳細には、本発明は、メトミクス（ｍｅｔｏｍｉｃ）データベースを開発するために使用され得る。このようなデータベースとしては、例えば、被験体の特定の状態または生理学的状態について検出された種々の代謝産物のレジスターが挙げられ得る。このデータベースは、被験体および／または代謝産物に関するさらなる情報と相互参照され得る。例えば、被験体に関して、データベースは、属、種、年齢、種族、性別、環境の曝露条件、健康状態、サンプル収集方法論およびサンプルの型に関する情報を含み得る。フラックス値は、データベース中に格納される各々の代謝産物について含まれ得、そして代謝産物濃度値、代謝フラックスの原因である酵素または輸送タンパク質濃度値、または代謝フラックスの原因であるタンパク質に対応する遺伝子発現値とともに、他所参照され得る。
【０４６３】
複数の分析物のフラックスが、全体の細胞代謝の分離可能な成分を表すと決定される場合、被験体の代謝フィンガープリントが得られ得る。全体の代謝の分離可能な成分に由来する分析物は、一連の酵素的変換段階により十分に分離される化合物として、機能的に規定される。任意の単一の基質により導入される同位体富化は、分析物中の同位体の天然存在比より上には検出され得ず、その結果、第２の基質が、フラックスを測定するために導入されなければならない。一般的に、この機能的基準は、標的分析物が５つ以上の変換段階で加えられた基質から除去される場合に満たされる。例えば、標識されたグルコースの基質としての投与は、糖分解経路におけるいくつかのリン糖質のフラックスの決定に適切である。しかし、このような投与は、一般的には、これらの標的分析物から基質を分離する多数の変換段階のために、アミノ酸、脂肪酸、およびタンパク質中の13Ｃの相対的存在量を上昇させるには十分ではない。このような例において、同位体で標識されたアミノ酸の投与は、アミノ酸およびタンパク質のフラックスを決定するために使用され得；同位体で標識された脂肪酸またはアセテートの投与は、脂肪酸の代謝フラックスを決定するために使用され得る。
【０４６４】
特定の方法において、複数の代謝で分離可能な基質は、被験体に同時に投与され得、そして複数の代謝で分離可能な標的分析物は、所定の時間後に被験体から得られた単一のサンプルから検出され得る。このような方法のバリエーションにおいて、代謝で分離可能な基質の各々は、異なる安定同位体で標識され得る。例えば、［18Ｏ］−グルコース、［15Ｎ］−フェニルアラニン、および［13Ｃ］−アセテートは、糖分解代謝経路、アミノ酸代謝経路、および脂肪酸代謝経路における標的分析物フラックスを決定するために、被験体に同時に投与され得る。
【０４６５】
本発明は、種々のスクリーニング適用において利用され得る。例えば、本発明の装置および方法は、特定の細胞状態（例えば、特定の疾患）と相関する代謝産物を同定するために使用され得る。例えば、これらの方法は、濃度またはフラックスが、健康な個体または細胞と疾患個体または細胞との間で変化する代謝産物を同定するために利用され得る。従って、このような代謝産物の濃度およびフラックスの制御の原因である酵素は、例えば薬物治療のための潜在的な標的として同定される。同様の様式で、特定の方法は、毒物学の研究を行うために使用されて、どの代謝産物が毒物攻撃により影響されるか、従ってどの酵素が代謝産物の形成を制御するかを同定し得る。
【０４６６】
代謝産物と特定の細胞状態を相関させるスクリーニング方法は、以下に述べる一般的な分析方法と類似である。例えば、安定同位体で標識された基質は、疾患を有する試験被験体に投与され、そして少なくとも部分的にその試験被験体によって代謝される。次いで、一般的に、目的の標的分析物を部分的または全体的に、サンプル中の他の成分から、上記に記載したような種々の分離技術を利用する評価の下で分離する。標的分析物中の同位体の相対的存在量は、試験被験体中の標的分析物の各々についてのフラックス値を決定するために、異なる同位体を検出し得る方法を使用して決定される。次いで、これらの決定された値は、非疾患状態におけるフラックス値についての参照として役立つコントロールについての対応するフラックス値と比較される。
【０４６７】
コントロールは、同様の条件下で決定されたコントロール被験体（すなわち疾患を有さない被験体）についての値（例えば、平均値（ａｖｅｒａｇｅ  ｏｒ  ｍｅａｎ  ｖａｌｕｅ））であり得る。あるいは、コントロールは、以前に非疾患状態を代表することが確立された値の範囲であり得る。試験フラックス値とコントロールフラックス値との間の差（例えば、統計学的に有意な差）は、特定の代謝産物が、疾患と相関するということを示す。このように、代謝産物は、疾患についての「マーカー」または潜在的なマーカーである。コントロール被験体についてのフラックス値は、以前に同様の条件下で試験被験体に対して得られたデータであり得るか、またはフラックス値は、同一の条件下で試験被検体と同時に処置を受けるコントロール被験体について決定され得る。
【０４６８】
当然のことながら、類似のスクリーニング方法は、特定の代謝産物と疾患状態以外の細胞状態との間の相関を生じさせるために実行され得る。例えば、方法は、特定の発症段階、特定の環境刺激に曝露されて生じた状態、および特定の治療的処置に関連する状態と相関する代謝産物を同定するために実行され得る。
【０４６９】
疾患被験体とコントロール被験体との間のフラックス値において統計学的に有意な差を有するとみなされた複数の代謝産物（すなわち、マーカー）は、「代謝フラックスフィンガープリント」または単に疾患についての「フィンガープリント」を開発するために使用され得る。このようなフィンガープリントは、続いて疾患を診断するために使用され得る（以下を参照のこと）。代表的には、このようなフィンガープリントは、疾患に相関することが見出された少なくとも２、３、４、または５種の代謝産物を含む。他の例において、フィンガープリントは、少なくとも６、７、８、９、または１０種のこのような代謝産物を含み、そしてなお他の例においては、１０、１５、または２０種以上のこのような代謝産物を含む。
【０４７０】
比較研究からの結果は、種々の診断的適用に移行可能である。例えば、「マーカー」または「フィンガープリント」は、被験体が特定の疾患を有するか、または疾患にかかりやすいか否かを決定するために、被験体をスクリーニングするか、診断するために使用され得る。同位体で標識された基質が、疾患を有するか、または疾患にかかり易いと疑われる被験体（あるいは、疾患を有するか、または疾患にかかり易いか否かを決定することの探求に単に興味のある個体）に投与されることを除いて、この方法は、上記に記載される方法と一致する。次いで、試験分析物についてのフラックス値（すなわち、試験被験体についての「代謝プロファイル」は、個々の試験分析物についての参照フラックス値（マーカー）またはマーカーの集合（フィンガープリント）と比較される。
【０４７１】
決定された値と比較される参照値は、健康状態または疾患状態のいずれかを表し得る。さらに、参照値は、健康状態または疾患状態のいずれかと相関する特定の値か、または値の範囲であり得る。例えば、この参照は、コントロール被験体または疾患を有するかもしくは有さない被験体についての値（例えば、平均値（ａｖｅｒａｇｅ  ｏｒ  ｍｅａｎ  ｖａｌｕｅ））であり得、参照値は、試験被験体が試験された条件と同様の条件下で決定される。あるいは、参照は、疾患を有するかまたは有さないかのいずれかであるコントロール被験体の集合から得た値の範囲であり得る。
【０４７２】
参照が正常または健康な状態である場合、試験被験体と参照との間のフラックス値の差（例えば統計的に有意な差）は、試験被験体が、疾患を有するか、または疾患を獲得する危険性があるということを示す。あるいは、差が無いことは、試験被験体が疾患を有さないか、および／または疾患を獲得する危険が無いことを示す。しかし、参照が疾患状態を表す場合、試験値と参照値との間の差（例えば、統計学的に有意な差）は、試験被験体が疾患を有さないか、および／または疾患を獲得する危険のないことを示す。逆に、示唆の無いことにより、試験被験体が疾患を有するか、疾患を獲得し易いということのいずれかが示される。
【０４７３】
診断的スクリーニングは、単に疾患状態を検出することに限定されない。スクリーニングはまた、例えば特定の発症状態または毒性状態のような細胞状態の他の型を検出するために使用され得る。
【０４７４】
このようなスクリーニング試験を実行する場合、代表的には分析は単純化され得る。例えば、一旦疾患についてのマーカーが同定されると、目的のマーカーを含む画分が既知であるような分離条件を確立し得る。従って、スクリーニング試験の間、特定の画分中の成分のみが評価される必要がある。本発明の分離および検出の局面の再現性は、このような分析を容易にする。
【０４７５】
このようなスクリーニング方法は、種々の異なる疾患について行われ得る。本発明の方法で評価され得る疾患としては、種種の型の癌、自閉症、微生物感染およびウイルス感染、および種々の消化疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７６】
本発明の方法は、構造活性研究を行う際にさらなる有用性を有する。例えば、これらの方法は、特定の化学的薬剤または薬剤の組み合わせが一般的に代謝に対して有する効果、より詳細には、目的の特定の代謝産物のフラックスに対する効果を決定するために使用され得る。このような試験は、代謝を妨害する薬剤を同定し得、もたらされた特定の代謝を正確に指し示す。他の適用において、一旦薬剤が最初に試験されると、薬剤または薬剤の組合せが、改変され得、そして存在するならば改変が代謝にもたらす効果を決定するために分析が繰り返される。このような研究は、例えば、最初の薬物スクリーニング試験の間に同定されたリード化合物の誘導体を作製する際に有用であり得る。
【０４７７】
代謝工学研究はまた、本発明の方法を使用して行なわれ得る。このような研究において、代謝に関与する遺伝子は、特定の所望の変異を含むように遺伝的に処理され得るか、または遺伝子のプロモーターは、この遺伝子の相対的な発現レベルを増加させるかまたは減少させるように遺伝子的に処理され得る。本明細書中に記載される方法を使用して、存在するならば、何が試験被験体の代謝に対して遺伝的に処理された変化をもたらすのかを決定し得る。
【０４７８】
（タンパク質発現フィンガープリントおよび／または代謝プロファイルフィンガープリントデータを含むバイオインフォマティクスデータベース）
（概観）
本発明は、サンプル中に存在する分子種に対する情報を与える有効な分析方法、それらの独特な識別子特性（例えば、アミノ酸配列タグ（ＰＳＴ）；分離座標など）を提供し、そしてさらに複数の前述の分子種の定量的測定を提供し得る。この有効な分析ツールは、サンプル中の複数の分子種の相対的または絶対的な存在量を、さらなるデータと相関させる可能性を提供し、例えば、サンプルが由来する患者の医療情報が得られ、または新規な薬物および毒物を同定しようとする研究において、本発明が使用される場合に、生物学的情報および生化学的情報が得られる。
【０４７９】
ある局面において、本発明は、細胞集団またはタンパク質を含むサンプル（その抽出物を含む）からのタンパク質発現プロファイリング方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：細胞集団から得られた複数のタンパク質種を含む溶液を第１のキャピラリー電気泳動装置において電気泳動し、それによってタンパク質種を区別する少なくとも１つの第１の生物物理学的パラメーターに基づいてこのタンパク質種を分離する工程、この第１の電気泳動装置からの画分を溶出し、そしてこの画分を第２のキャピラリー電気泳動装置において別々に電気泳動し、それによってタンパク質種を区別する少なくとも１つの第２の生物物理学的パラメーターに基づいてこのタンパク質種を分離する工程、およびこのタンパク質種を溶出し、そして質量分析フラグメンテーションによりサンプルからの複数のタンパク質種のＰＳＴを同定する工程。ある実施形態において、サンプルから分離された少なくとも１，０００のタンパク質がＰＳＴ決定により同定される；ある実施形態において、サンプルから分離された少なくとも５，０００〜７，５００以上のタンパク質がＰＳＴ決定により同定される。バリエーションでは、２つのサンプル、すなわち、標準的（コントロールまたは正常）細胞集団由来の第１のサンプルおよび試験細胞集団由来の第２のサンプルが使用され；試験細胞集団は、例えば、標準的な細胞集団とは異なる組織学的型の細胞、標準的な細胞と同じ組織学的型の病的細胞、毒物学的または薬理学的薬剤に曝されているが、標準的な細胞と同じ組織学的型である処理された細胞、標準的な細胞とは異なる継代レベルまたは年齢または複製能力の細胞、あるいは第１の細胞サンプルと第２の細胞サンプルとの間のタンパク質発現プロフィール差を確かめるために調査している当業者に明らかな任意の他の改変体であり得るが、これらに限定されない。あるいは、複数の非タンパク質代謝産物は、タンパク質発現フィンガープリントを確認するとともに、または別々にのいずれかで本発明の方法に従ってプロフィールが得られ得る。
【０４８０】
ある局面において、本発明は、細胞集団、または代謝産物を含むその抽出物を含むサンプルから代謝産物のプロファイリング方法を提供する。この方法は、以下を包含する：細胞集団または非細胞サンプルからから得た複数の代謝産物種を含む溶液を第１の装置において分離し、それによって少なくとも１つの第１の生物物理学的パラメーターに基づいて、この代謝産物種を分離する工程、ならびに質量分析フラグメンテーションによりこのサンプル由来の複数の代謝産物種の第１の装置における分離に基づいて、独特の質量サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）および／または分離座標を同定する工程。ある実施形態において、サンプルから分離された少なくとも５つの代謝産物が、質量サインおよび／または分離座標決定により同定される；ある実施形態において、サンプルから分離された少なくとも７〜５００以上の代謝産物が質量分析決定により同定される。バリエーションにおいて、２つのサンプル、すなわち、標準的な（コントロールまたは正常）細胞集団由来の第１のサンプルおよび試験細胞集団由来の第２のサンプルが使用され；試験細胞集団は、例えば、標準的な細胞集団とは異なる組織学的型の細胞、標準的な細胞と同じ組織学的型の病的細胞、毒物学的または薬理学的薬剤に曝されているが、標準的な細胞と同じ組織学的型である処理された細胞、標準的な細胞とは異なる継代レベルまたは年齢または複製能力の細胞、あるいは第１の細胞サンプルと第２の細胞サンプルとの間の代謝産物発現プロフィール差を確かめるために調査している当業者に明らかな任意の他の改変体であり得るが、これらに限定されない。複数の非タンパク質代謝産物は、タンパク質発現フィンガープリントを確認するとともに、または別々にのいずれかで本発明の方法に従ってプロフィールが得られ得る。
【０４８１】
（データベースシステムおよび計算されたデータ分析および検索（ｒｅｔｒｅｉｖａｌ）システム）
本発明は、一般に、生物学的情報を格納し、そして検索するための関連するデータベースに関する。より詳細には、本発明は、クライアント−サーバー環境での検索を可能にする関連フォーマット（ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔ）における生物学的分子（例えば、タンパク質）の独特の識別子データ（例えば、配列）、独特に識別可能な生物学的巨大分子（例えば、コードされたｍＲＮＡ種を含む）の相対量または絶対量に関する量的情報、ならびに必要に応じて多くの他の型のデータ（例えば、医学的記録情報、差次的診断（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）および／または予測情報）を提供するためのシステムおよび情報に関する。情報科学（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）は、情報管理に対するコンピューターの研究および適用ならびに統計技術である。ゲノムプロジェクトにおいて、生物情報科学は、データベースを迅速に検索するため、核酸配列情報を分析するため、およびＤＮＡ配列データからタンパク質配列、構造および機能を推定するための方法の開発を含む。プロテオミクスプロジェクトにおいて、これは、タンパク質発現プロフィールを提供するために、独特の識別子情報と構造情報との相関を含み得、そして他のデータ（例えば、医学的データなど）と相互に表にした場合、細胞または生物における特定のタンパク質およびそれらのコードされている遺伝子の機能に見識を提供し得る。
【０４８２】
本発明は、配列データの供給源および解釈を詳述する生物学的注釈とともに、生体分子独特の識別子情報を格納および分析するための関連データベースシステムを提供する。本発明は、薬物開発および他の研究および開発目的のための強力なデータベースツール、ならびにヒト疾患を診断および処置するための深くかつ強力なツールを提供する。
【０４８３】
本発明はまた、１つ以上の生物型、細胞型、医学的サンプルについてのタンパク質発現フィンガープリントライブラリーを含むデータベースを含むコンピューターシステムを提供し、これらのライブラリーは、独特に識別された種についての量的情報および／または量的情報（例えば、ある条件下での分離座標の変更）に対して相互リンクされた複数の独特のタンパク質識別子フィールドを有する記録を有する。このシステムはまた、１つ以上のタンパク質タグ（ＰＳＴ）配列とゲノムライブラリーにおけるコードポリヌクレオチド配列からの推定アミノ酸配列との間の相同性適合を決定し、そしてこの決定の結果を表示する際に使用するための１つ以上のプローブ配列の選択を受け入れ得るユーザーインターフェースを含む。
【０４８４】
生物、細胞または病的状態の１つ以上の型についてのタンパク質発現フィンガープリントライブラリーを含むデータベースに関連して、具現化されたコンピューター読みとり可能なプログラムコードを有するコンピューター使用可能な媒体を含むコンピュータープログラム製品もまた提供される。このライブラリーは、複数のタンパク質発現フィンガープリント記録を有し、この記録は、ナビゲーション用フィールドとして働き、そしてデータ相関および他の関連を識別するために使用され得る情報フィールドにリンクしている。コンピュータープログラム製品が、コンピューターシステム内で、比較のために２つ以上のタンパク質発現フィンガープリント記録の選択を受け入れ、翻訳後修飾および／または各フィンガープリント記録において独特に同定され、そして比較される記録のセットに共通するか、または独特なタンパク質種の相対量もしくは絶対量の変化を決定し、ならびに決定の結果を表示するためのインターフェースを提供するためのコンピューター読みとり可能なプログラムコードを含む。
【０４８５】
１つ以上の型の生物、組織、細胞型または病的状態についてのタンパク質発現フィンガープリント記録ライブラリーを含むデータベースに関連して、具現化されたコンピューター読みとり可能なプログラムコードを有するコンピューター使用可能な媒体を含むコンピュータープログラム製品がさらに提供される。このコンピュータープログラム製品は、コンピューターシステム内でデータベースに対する問い合わせを入力し、そして問い合わせ結果の出力を得るためのインターフェースを提供するためのコンピューター読みとり可能なプログラムコードを含む。
【０４８６】
（データベース構造）
本発明の方法により得られたタンパク質発現フィンガープリントに関して、初めに記載するが、関連データベースシステム構造は、代謝産物プロフィールフィンガープリント記録を含むデータベースを含むように、またはこのようなデータベースと別々に存在するように容易に改変され得る。
【０４８７】
タンパク質発現フィンガープリント記録は、ナビゲーション用フィールドおよび情報フィールドを含み、好ましくは、複数の情報フィールドを含み、そして好ましくは複数のナビゲーション用フィールドを含み、各々は、記録が１つ以上の情報フィールドにリンクしている。例えば（限定ではない）、ナビゲーション用フィールドは、独特のアミノ酸配列タグ（ＰＳＴ）、分離座標、または両方の組合わせを含み得、この組合わせは、種々の様式で表示され得る。このうちの１つは、当業者の裁量で選択され得る任意の多くの他の代替物の中で、分離座標のバイナリビットストリング表示に対して独特なＰＳＴサイン配列を追加している、連結されたバイナリビットストリングである。サンプル中で検出される各タンパク質種については、少なくとも１つの独特な識別子属性は、ナビゲーション用フィールドを含む。例えば（限定ではない）、情報フィールドは、それぞれのナビゲーション用フィールド要素（すなわち、独特に識別されたタンパク質種）に関連する任意の種々の他の情報を含み得る。このような情報としては、サンプルが得られた患者についての情報、サンプルについての情報、サンプル中に存在する独特に識別されたタンパク質種の相対量または絶対量（種々のアイソフォーム、翻訳後修飾の比を含む）についての情報などが挙げられる。代表的なタンパク質発現フィンガープリント記録は、サンプルからのデータを表示し、そして２５〜１００以上の独特に識別されたナビゲーション用フィールドを含み得、各々は、１つ以上の情報フィールド（しばしば、サンプル中の特定のタンパク質種の相対量を含む）に対して相互に表にされる。タンパク質発現フィンガープリント記録のライブラリーにおいて、このライブラリーのメンバーは、複数の共通ナビゲーション用フィールド（例えば、独特のタンパク質＃１００および独特のタンパク質＃１０１）を共有する。その結果、共通のフィールドにまたがってライブラリーのメンバーを比較し、そして／またはメンバーの間で、共通のナビゲーション用フィールドの存在を識別しかつ重みづけ（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）するためのソフトウェアが実行され、そしてライブラリーのメンバー間の統計学的に有意な関係の計算および相関尺度が実行され得る（ユーザーがデータベースに入力した問い合わせを介するか、またはデータフィールド間、もしくはデータフィールドの組合わせおよび部分組合わせ（ｓｕｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）間の内因的な関係を識別し、かつ重みづけするために訓練されたニューラルネットワークプログラムを介して自動的にかのいずれか）。ナビゲーション用フィールドとしてタンパク質種各々の独特の識別子を使用することはしばしば好ましい。その結果、タンパク質発現フィンガープリント記録における全ての独特の識別子の組合わせは、各独特のタンパク質識別子ナビゲーションフィールドにリンクした情報フィールド間の相関を検索するために、そして類似のスコアに基づいたセットにおける記録をランク順にするために、記録間で比較されるナビゲーション用フィールドのセットを含み得る。このスコアは、ユーザーがプログラムしたいと望む、すなわち、ユーザーが望めば、標準的なセットのデータを用いてニューラルネットワークを訓練したいと望む任意の適切な比較アルゴリズムを用いて（例えば、同じまたは類似の表現型を有する所定のコントロールおよび所定の改変体からのタンパク質発現フィンガープリント記録を用いてバックプロパゲーションまたは他の訓練ストラテジーにより）計算して、ユーザーが望む予測精度を提供する出力を提供するそれらのフィールド比較重みづけを反映する。
【０４８８】
例示的な実施形態において、コンピューターシステムにおけるタンパク質発現フィンガープリント記録データベースは、サンプルにおける整数または浮動小数点値（絶対量または相対量を表示する）を含む情報フィールドに関連してリンクしているバイナリストリングとして表示された（関連してリンクしたＰＳＴ識別子により表示された）独特のＰＳＴを含むナビゲーション用フィールドを含む。各タンパク質発現フィンガープリント記録は、各独特のＰＳＴについての量または分離座標情報に関連している複数の情報フィールドを含み得、そしてさらにタンパク質発現フィンガープリント記録自体、サンプル、患者、状態もしくは処置に関するデータに関連しているさらなる情報フィールドにリンクされ得る。
【０４８９】
他のデータベース構造および問い合わせ方法論が本明細書を読んだ当業者に明らかである。
【０４９０】
上記の説明は、例示であって限定ではないと意図されることが理解されるべきである。上記の説明を読むと、当業者には多くの実施形態が明らかである。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲により含まれる等価物の全範囲に沿って、このような特許請求の範囲を参照して決定されることが意図されるべきである。全論文および参考文献（特許出願および刊行物を含む）の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０４９１】
以下の実施例は、例示のために提供され、本願発明を制限するためには提供されない。
【実施例】
【０４９２】
（実験的実施例）
（実施例１：非標識タンパク質のｃＺＥ分離）
５つのタンパク質の各々（表２を参照のこと）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得、そして水性変性サンプル緩衝液（２５ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンホスフェート（ｐＨ４．０）、０．５％重量％のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ＃Ｉ３０２１から得た）および１重量％のトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）ヒドロクロリド（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃２０４９０ＺＺから得た）を含有する）中に５ｍｇ／ｍｌで懸濁した。タンパク質サンプルを９５℃で１５分間加熱することによりこのサンプル緩衝液中で変性させた。５つの変性タンパク質サンプルの各々を、ｃＺＥサンプル緩衝液に希釈して、２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンホスフェート緩衝液（ｐＨ４．０）、８Ｍ尿素、および５つのタンパク質の各々について最終濃度が０．２ｍｇ／ｍｌからなる最終溶液を作製した。各変性タンパク質のコントロールサンプルもまた調製した（同じサンプル緩衝液で０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で別々に）。
【０４９３】
【表２】
2010249831.tif 000006
混合したタンパク質サンプルおよび各々のコントロールサンプルを、６０ｃｍ×７０μｍの石英硝子キャピラリー（ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）においてｃＺＥで泳動させた。８００μｍの検出ウィンドウをキャピラリーのカソード端から５０ｃｍに配置した。１６０ｎｌのサンプル容量をカソード端に圧入（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｊｅｃｔ）し、そして２５ｍＭ  ＴＲＩＳ−リン酸および８Ｍ  尿素泳動溶液（ｐＨ４．０）中５００Ｖ／ｃｍで分離を行った。タンパク質検出を２１４ｎｍのＵＶ吸収により行った。
【０４９４】
個々の非標識タンパク質は、これらの条件下では分離しなかった（図４を参照のこと）。各タンパク質の電気泳動易動度を、個々のタンパク質コントロールの反復泳動から決定し（図５）、そしてｐＨ４．０でのタンパク質の電荷比に対して推定質量を相関させた（図６）。非標識タンパク質の各々についての質量対電荷の比は、その全体が参考として援用されるＣａｎｔｅｒ，Ｃ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）により記載される様式で、Ｇｅｎｂａｎｋを通じて得た公開されたタンパク質配列から決定した。
【０４９５】
（実施例２：標識タンパク質のｃＺＥ分離）
実施例１に記載の５つのタンパク質の各々を、等しい質量のドデシル硫酸ナトリウムをＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０の代わりに使用したことを用いて、実施例１に記載の同じ変性緩衝液中に、１０ｍｇ／ｍｌで懸濁した。変性タンパク質サンプルを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｔ＃８５，７８２−３）から得た４−スルホフェニルイソチオシアネート（ＳＰＩＴＣ）で標識し、供給時に使用した。１０μｌのトリエチルアミン、１０μｌの２Ｍ酢酸および２０μｌの１０重量％ＳＰＩＴＣ水溶液を１００μｌの各変性タンパク質サンプルに添加することにより標識を行った。反応混合物を、５０℃で２４時間加熱した。
【０４９６】
５０μｌ量のＳＰＩＴＣ標識タンパク質標準物質の各々をともに混合し、そして分離緩衝液のｐＨを３．０に調節したことを除いて、実施例１に記載のようにｃＺＥで分離した。個々のＳＰＩＴＣ標識タンパク質を分離した（図７）。従って、本実施例（非標識タンパク質があまり分離しなかった実施例１の結果を考慮して行った）は、ｃＺＥ分離の前に行った場合に標識が有し得るポジティブな効果を実証する。電気的溶出により、示された時間の分離緩衝液を有する別のバイアルに画分を集めた。ＳＰＩＴＣ標識タンパク質の正体を、画分のその後のｃＧＥ分析により決定した。
【０４９７】
（実施例３：画分収集によるＣＩＥＦ  １次元分離）
ウシ血清アルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、およびコナルブミンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（表２）から与えたように使用した。各タンパク質を実施例１に記載のように変性させた。各変性タンパク質サンプルの１０μｌのアリコートを２００μｌのｃＩＥＦ集束緩衝液に添加した。ｃＩＥＦ集束緩衝液は、１容量％のｐＨ３〜１０  両性電解質（Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ＃１００４３）および１重量％の３−［（３−コルアミドプロピル（ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））ジメチルアンモニオ（ｄｉｍｅｔｈｌａｍｍｏｎｉｏ）］−１−プロパンスルホネートを含有する０．４重量％のヒドロキシメチルセルロース溶液（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｅＣＡＰ  ｃＩＥＦゲル緩衝液、Ｃａｔ＃４７７４９７）からなっていた。
【０４９８】
ポリ（エチレングリコール）でコーティングした６０ｃｍ長、１００μｍ内径の石英硝子キャピラリー（Ｓｕｐｅｌｃｏｗａｘ  １０，Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｃａｔ＃２５０２５−Ｕ）に、集束緩衝液中のタンパク質サンプルを充填した。キャピラリー内容物は、５００Ｖ／ｃｍおよび２５℃で７．５分の間、１０ｍＭ  リン酸と２０ｍＭ  ＮａＯＨリザーバとの間に集束した。次いで、０．５ｐｓｉの圧力勾配をアノード液リザーバとカソード液リザーバとの間に付与して、電気浸透流の方向に、集束したタンパク質の溶出を促進した。
【０４９９】
タンパク質ピークは、低ｐＨ端から５０ｃｍに配置したキャピラリーの光学ウィンドウを通して、２１４ｎｍの紫外線吸収をモニターすることにより検出した。キャピラリーを通る電流もまたモニターした（図８）。画分（Ｂ〜Ｇ）を、示された時間につき、別々のリザーババイアルに含まれる５０μｌの２０ｍＭ  ＮａＯＨへ収集した（図８）。ＦおよびＧ画分のみがタンパク質を含んでいることが分かった（実施例４を参照のこと）。画分Ｇは、カルボニックアンヒドラーゼを含み、そしてコナルブミンもウシ血清アルブミンも含まないことが分かった。コナルブミンおよびウシ血清アルブミンは画分Ｆで観察されたピークに同時に溶出することが分かった。この実験により、１つの次元でのタンパク質混合物の部分的分離が示される。さらなる分離を第２の次元で達成した（実施例４を参照のこと）。
【０５００】
（実施例４：ＣＩＥＦ画分のＣＧＥ第２次元分離）
実施例３に記載のＣＩＥＦ分離の間に収集したＣＩＥＦ画分（Ｂ〜Ｇ）の各々を、最終容量５μｌまでＳａｖａｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ＳＣ２１０Ａ  Ｓｐｉｎ−Ｖａｐでエバポレートして、画分中に存在する任意のタンパク質を濃縮した。１０μｌ量のＳＤＳサンプル緩衝液を各タンパク質濃縮物に添加した。ＳＤＳサンプル緩衝液は、１００μｌのｅＣＡＰ  ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｔ＃２４１５２５）、１０μｌのｅＣＡＰ  オレンジＧ  参照マーカー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｔ＃２４１５２４）および９０μｌの無水グリセロールからなっていた。
【０５０１】
次いで、各サンプルを直鎖状ポリ（アクリルアミド）でコーティングした石英硝子キャピラリー（６０ｃｍ長および１００μｍ内径）を用いてｃＧＥモードで泳動した。ｅＣＡＰ  ＳＤＳ１４−２００ゲル緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃａｔ＃４７７４１６）を分離のためにおよび両方のリザーバにおいて用いた。分離を２０℃および５００Ｖ／ｃｍで５０分間行った。タンパク質の紫外線検出をキャピラリーのサンプル注入端から５０ｃｍに配置した光学ウィンドウを通して２１４ｎｍで行った。ｅＣＡＰ  ＭＷ標準物質（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃａｔ＃４７７４１８）を製造業者による記載のように用いて、別の泳動で分子量較正を行った。０．５ｐｓｉで１００秒のサンプル注入を用いて各サンプルをキャピラリーにロードした。
【０５０２】
得られた電気泳動図は、画分Ｆ（図９）およびＧ（図１０）を除いて任意のｃＩＥＦ画分においてタンパク質が検出できないことを示した。画分Ｆ（図９）において見られた２つのタンパク質の分子量は、ウシ血清アルブミンおよびコナルブミンの分子量（表２）に対応していた。画分Ｇ（図１０）において見られたタンパク質の分子量は、カルボニックアンヒドラーゼの分子量（表１）に対応していた。コナルブミンからウシ血清アルブミンを完全に分離するために第２のｃＧＥ次元が必要であることが観察された。コナルブミンは１回のｃＩＥＦモードでは、分離されなかった（実施例３）。
【０５０３】
（実施例５：健常組織と癌組織とを区別するためのプロテオミクス分析における方法の使用）
本実施例は、健常組織と癌組織を区別するために本発明を使用することを示す。本発明は、健常組織および癌組織および転移組織のタンパク質発現パターンを直接分析して、遺伝子発現のパターン、ならびに癌（例えば、前立腺、胸部、結腸および皮膚）の発生、段階分けおよび転移の種々の局面に対するこのような関連を解釈するために使用され得る。
【０５０４】
本発明の方法は、疾患の機構の機能的ゲノム分析を行うために必要な時間を顕著に減少させ得、そして新たな治療標的、診断マーカー、および薬物産物（すなわち、特定の細胞タンパク質が、それ自体治療薬剤として働き得る場合）の同定を導き得る。プロテオミクス分析を用いることにより、調査されなければならない遺伝子の数を１０分の１に（標的組織におけるタンパク質を形成するために実際に発現されている５０，０００〜１５０，０００のヒト遺伝子を２，０００〜１０，０００の遺伝子に）減少する。健常組織および疾患組織のタンパク質発現パターンの定量的比較を通じて、疾患の進行において役割を果たし得る候補遺伝子の数を、約１００分の１にさらに減少する。最終的にタンパク質配列タグ（ＰＴＳ；すなわち、部分的アミノ酸配列）の引き続く生成を通じて、差次的発現を示すタンパク質の各々を、それらが完全な配列決定のためにゲノムに戻ることが可能な様式で、独特に同定し得る（例えば、変異検出）。
【０５０５】
最初に、組織サンプルを疾患に罹った被験体およびコントロール被験体（例えば、研究される特定の癌組織を有することが分かっていない個体）から得る。各個体由来の組織サンプルを公知の方法に従ってホモジナイズする。サンプルに依存して、得られるホモジネートを濾過するか、または遠心分離して、細胞細片を除去する。尿素（６〜８Ｍ）、界面活性剤（例えば、１重量％のドデシル硫酸ナトリウム）および１重量％のジチオスレイトールを含むようにサンプルを調節することにより、サンプルを変性したホモジネートおよびホモジネート中のタンパク質から得る。サンプルを９５℃で１５分間加熱して、変性を早める。
【０５０６】
次いで、サンプル（５μｌ）をカラム（７５ミクロン内径、６０ｃｍ長）上でＣＩＥＦにより電気泳動する。アノード液は最初１０ｍＭリン酸であり、カソード液は最初２０ｍＭ  水酸化ナトリウムである。５００Ｖ／ｃｍで分離を行う。分離したタンパク質の画分をカソード溶液の塩化ナトリウム濃度を９６増分単位で１０ｍＭから１００ｍＭに増加させることにより溶出する。９６ウェルプレートのウェルに含まれる２００μｌのカソード溶液中の各塩濃度に、キャピラリーの高ｐＨ端を連続的に挿入することにより、画分を収集する。キャピラリー端を次の画分に移動させる前に、分離電流を再平衡化させる。
【０５０７】
標識の前に、画分をロータリーエバポレーターを使用して濃縮する。収集した画分中のタンパク質を、スルホフェニルイソチオシアネートについて実施例２に記載するように、タンパク質とフルオレセインイソチオシアネートとを反応させることにより標識する。
【０５０８】
標識タンパク質を含む画分を、ＣＺＥにより別々に電気泳動した。標識タンパク質を、ＣＺＥサンプル緩衝液中に希釈し、２５ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８Ｍ  尿素および約１ｍｇ／ｍｌの最終濃度のタンパク質を含む最終溶液を形成する。混合タンパク質サンプルおよび各々のコントロールサンプルを６０ｃｍ×７５μｍの融合シリカキャピラリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）中でＣＺＥモードで泳動する。１つの８００μｍウィンドをそのキャピラリーのカソード末端から５０ｃｍに配置する。１６０ｎｌのサンプル容量を、カソード末端に加圧注入する。そして、分離を、２５ｍＭ  ＴＲＩＳリン酸および８Ｍ  尿素の泳動緩衝液（ｐＨ４．０）中で５００Ｖ／ｃｍにて行った。タンパク質を、キャピラリー中の残留ＥＯＦにより溶出する。キャピラリーが１つのウェルから次のウェルへ進行的に進められる場合、再度、画分を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルにおける溶出時間に基づいて収集する。各々のウェルは、２００μｌのｃＺＥ分離緩衝液を含む。このプロセスを、ＣＩＥＦの間に収集した他の画分からのサンプルを用いて繰り返す。
【０５０９】
ＣＺＥ画分からのサンプルをＣＧＥによりさらに分離する。ＣＺＥからの画分を、ロータリーエバポレーターにより別々に濃縮し、約５μｌの最終液体容積にする。タンパク質サンプルを冷却（４℃）遠心分離により結晶尿素から単離する。１０マイクロリットルのＳＤＳサンプル緩衝液を、タンパク質濃縮物の各バイアルに添加する。ＳＤＳサンプル緩衝液は、１００μｌのｅＣＡＰ  ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｂｅｃｋｍｏｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，カタログ番号２４１５２５）、１０μｌのｅＣＡＰ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，カタログ番号２４１５２４）および９０μｌの無水グリセロールからなる。
【０５１０】
各サンプルを、１００μｍの内部直径を有する６０ｃｍ長の直線ポリ（アクリルアミド）コートした融合シリカキャピラリーを使用してｃＧＥモードで泳動する。市販のｅＣＡＰ  ＳＤＳ  １４−２００Ｇｅｌ緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  カタログ番号４７７４１６）を分離に使用し、そして両方のリザーバーでインキュベートする。分離を５０分間２０℃かつ５００Ｖ／ｃｍで行った。分子量の較正を、製造業者により記載されるように、ｅＣＡＰ  ＭＷ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  カタログ番号４７７４１８）を使用して分離泳動において行う。一回の０．５ｐｓｉでの１００秒のサンプル注入を使用して、キャピラリーへ各サンプルをロードする。溶解タンパク質を、４６６ｎｍのレーザー誘導蛍光検出機を用いてフルオレセイン蛍光により検出する。
【０５１１】
（実施例６）
本実施例は、グリコーゲンホスホリラーゼの配列を決定するための逆転質量梯子型配列決定（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍａｓｓ  ｌａｄｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ）の使用を例示する。
【０５１２】
グリコーゲンホスホリラーゼＡ（ＥＣ  ２．４．１．１）は、アミノ末端においてアセチル化されるタンパク質の群のメンバーである（Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：５２３−５２７（１９８５）を参照のこと）。このアセチル基は、グリコーゲンホスホリラーゼの場合、天然の生化学的手段を解してＮ末端へ付加され得る。Ｎ末端アセチル化はまた、Ｎ−ヒドロキシスクシミジルアセテートまたはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシミジルアセテート（これらは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから市販される）を使用して、公開されたプロトコールを介して達成され得る（Ｌｏｎａｍｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０４：２４３−２６１（１９７６）を参照のこと）。このアセチル基は、逆転質量梯子型配列決定について、単一の質量サインを提供する。
【０５１３】
アセチル化グリコーゲンホスホリラーゼＡを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入した（カタログ番号Ｐ１２６１）。このタンパク質を０．７２ｍｇ／ｍＬで、４ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）中に溶解した。このサンプル（５００μｌ）を、５０，０００ＭＷのカットオフ膜を用いたＭｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）スピン透析チューブを使用する透析により、残留不揮発性イオンならびに低分子量タンパク質およびペプチド不純物から精製した。このサンプルを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ製品の指示に従って、４ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液に対して１０倍に希釈した。この保留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を４６０μＬの酢酸緩衝液中に回収し、約０．８ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得た。
【０５１４】
回収した保留物を、市販のＭｉｃｒｏｓｐｒａｙイオン源を備えるエレクトロスプレー−飛行時間質量分析器−ＭａｒｉｎｅｒTM（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）中でインソースフラグメント化に供した。公開された機器のプロトコールに従って、質量分析器の設定を最適化し、そして機器をグリコーゲンホスホリラーゼサンプルを注入する直前に較正した。サンプルを、０．４μＬ／分の速度で、マイクロスプレー源へ連続して供給した。ノズル電位を、各ノズル電位においてスペクトルを収集する前に割り当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）、５分の機器平衡化時間で２５Ｖの増加にて、１２Ｖの最小設定値から３５０Ｖの最大値へ増加した。合計３０の３秒間スペクトルを各ノズル電位における分析のために蓄積した。
【０５１５】
親のグリコーゲンホスホリラーゼＡタンパク質の同一性および純度を、販売業者により供給されたＢｉｏＳｐｅｃ  Ｄａｔａ  ＥｘｐｌｏｒｅｒTMソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．０）を使用して、７００と４０００ａｍｕとの間で観測された多重電荷質量ピークのゼロ電荷質量デコンボレーションを行うことにより、最小フラグメント化された１２Ｖスペクトル（図１）において決定した。グリコーゲンホスホリラーゼのＮ末端配列を、得られた質量スペクトルを調査することにより決定し、各ノズル電位において可能なアセチル化ペプチドの相対存在比を決定した。アセチル化ペプチド質量に対応するピークを、ノズル電位の増加に伴い、相対存在比が増加することを明らかに観察した（図１２）。図１２は、配列における各ペプチド質量について、ａ−イオンおよびｂ−イオンの両方の累積相対存在比を示す。２５０Ｖの２５０Ｖノズル電位に対応する実質的にフラグメント化した質量スペクトルの例を、図１３に示す。２００Ｖを超えるノズル電位における増加した存在比を示すこれらの質量フラグメントは、グリコーゲンホスホリラーゼについての公開されたアミノ末端配列（アセチル−ＳＲＰＬＳＤ）に対応すした（Ｐｅｒｓｓｏｎら、同書を参照のこと）。
【０５１６】
アミノ末端のセリンまたはアセテート標識のいずれかにおけるイオン化可能な残基の欠失は、配列中の第１のアミノ酸の直接決定を妨げた。しかし、このアミノ酸の同定は、第２のペプチドフラグメント（アセチル−ＳＲに対応する）の累積質量から容易に推論され、これは、第１の検出可能なＲ−残基からの正に荷電したイオンを生成する。ペプチド質量梯子型の配列は、全ての試験したノズル電位における６番目のアミノ酸残基を超えて曖昧になった。
【０５１７】
（実施例７）
本実施例は、フェニルイソチオシアネートを用いて標識したブラジキニンの配列を決定するための逆転質量梯子型配列決定の使用を例示する。
【０５１８】
Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（９個のアミノ酸ペプチド）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し（カタログ番号Ｂ３２５９）、そして供給されたまま使用した。Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（５ミリモル）を、１０μＬのトリエチルアミン（純粋）、１０μＬの２Ｍ  酢酸、５μＬの配列決定グレードのフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）（Ｐｉｅｒｃｅから購入（カタログ番号２６４２２））および２ｍＬの５０％水性メタノールからなる１００μＬのカップリング緩衝液に可溶化した。カップリング混合物を５５℃にて１０分間インキュベートした。この反応混合物を室温に冷却し、そして１５０μＬの２：１（ｖ／ｖ）ヘプタン／酢酸エチル溶液で２回抽出した。抽出サンプルを凍結乾燥し、そして１容量％の酢酸を含む５０％水性アセトニトリル溶液中の２μＭ  ＰＩＴＣ−ブラジキニンに再懸濁した。
【０５１９】
ＰＩＴＣ標識したＢｒａｄｙｋｉｎｉｎを、標準の市販の含気性エレクトロスプレーイオン源を備えるエレクトロスプレー−飛行時間質量分析器−ＭａｒｉｎｅｒTM（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）中でインソースフラグメント化に供した。公開された機器のプロトコールに従って、質量分析器の設定を最適化し、そして機器をＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎサンプルを注入する直前に較正した。サンプルを、５μＬ／分の速度で、エレクトロスプレー源へ連続して供給した。ノズル電位を、各ノズル電位においてスペクトルを収集する前に割り当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）１分の機器平衡化時間で２５Ｖの増加で、１２Ｖの最小設定値から３５０Ｖの最大値へ増加した。合計３０の３秒間スペクトルを各ノズル電位における分析のために蓄積した。
【０５２０】
親のＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎペプチドの同一性および純度を、推定反応生成物についての算出された質量に基づいて最小にフラグメント化している１２Ｖスペクトル（図１４）において決定した。残留非標識Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの濃度を、５％未満であるように標準添加により決定した。ＢｒａｄｙｋｉｎｉｎのＮ末端配列を、得られた質量スペクトルを調査することにより決定し、各ノズル電位において可能なＰＩＴＣ標識ペプチドフラグメントの相対存在比を決定した。ＰＩＣＴ標識ペプチド質量に対応するピークを、ノズル電位が増加するにつれて相対存在比が増加することを明らかに観察した（図５）。図５は、配列における各ペプチド質量について、ａ−イオンおよびｂ−イオンの和の累積相対存在比を示す。２５０Ｖのノズル電位に対応する実質的にフラグメント化した質量スペクトルの例を、図１６に示す。２００Ｖを超えるノズル電位における増加した存在比を示すこれらの質量フラグメントは、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎについて公開されたアミノ末端配列に対応する（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９を参照のこと）。
【０５２１】
いくつかのＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎフラグメントが、サンプルマトリックスにより生成される他のイオンのピークと重複することが見られる。ｂ1−イオン（ＰＩＴＣ−Ｒ）は、（標識Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの非存在下で）サンプルマトリックスから生成されているように同定されたイオンの第１の単一の同位体（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）ピークと重複した。このマトリックスイオンの非存在は、ノズル電位と共に不変のままであることが見出された。同様に、ａ2−イオンピーク（ＰＩＴＣ−ＲＰ）は、マトリックスにより生成される別のイオンの第２の同位体ピークと重複することが見出された。この場合、マトリックスイオンは、ノズル電位が増加するにつれて消失することが見出された。第１〜第３の同位体種の推定相対存在比およびａ−およびｂ−イオンの両方の位置の調査を使用して、以前に記載されるように（Ｈｉｅｓら、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃ．３：３２６−３３６（１９９２）を参照のこと）質量スペクトルにおけるそれらの重複を決定し、そしてデコンボレーションをした。
【０５２２】
（実施例８）
本実施例は、イミノビオチンで標識したブラジキニンの配列を決定するための逆質量梯子型配列決定の使用を例示する。
【０５２３】
Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し（カタログ番号Ｂ３２５９）そして供給されたまま使用した。イミノビオチンのＮ−ヒドロキシスクシミジル（ＮＨＳ）エステルを、Ｐｉｅｒｃｅから購入し（カタログ番号２１１１７ＺＺ）、そして供給されたまま使用した。Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（５ナノモル）を１００μＭの１Ｍ酢酸ピリジニウム緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶解した。ＮＨＳ−イミノビオチンをＤＭＳＯに溶解し、反応混合物に添加した７μｌのこのＤＭＳＯ溶液で、６．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。この反応混合物を、４℃にて２時間インキュベートした。このサンプルを、凍結乾燥し、そして１容量％の酢酸を含む５０％の水性アセトニトリル溶液中で２μＭの最終のイミノビオチン（ＩＭＢ）標識Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの濃度にした。
【０５２４】
イミノビオチン（ＩＭＢ）標識したＢｒａｄｙｋｉｎｉｎを、標準の市販の含気性エレクトロスプレーイオン源を備えるエレクトロスプレー−飛行時間質量分析器−ＭａｒｉｎｅｒTM（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）中でインソースフラグメント化に供した。公開された機器のプロトコールに従って、質量分析器の設定を最適化し、そして機器をＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎを注入する直前に較正した。サンプルを、５μＬ／分の速度で、マイクロスプレー源へ連続して供給した。ノズル電位を、各ノズル電位においてスペクトルを収集する前に割り当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）１分の機器平衡化時間で２５Ｖの増加にて、７５Ｖの最小設定値から４００Ｖの最大値へ増加した。合計３０の３秒間スペクトルを各ノズル電位における分析のために蓄積した。
【０５２５】
親のＩＭＢ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎペプチドの同一性および純度を、推定反応生成物についての算出された質量に基づいて最小にフラグメント化している７５Ｖスペクトルにおいて決定した。残留非標識Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの濃度を、５％未満であるように標準添加により決定した。ＢｒａｄｙｋｉｎｉｎのＮ末端配列を、得られた質量スペクトルを調査することにより決定し、各ノズル電位において可能なＩＭＢ標識ペプチドフラグメントの相対存在比を決定した。ＩＭＢ標識したフラグメントの質量から生じたａ−イオン（図１７）およびｂ−イオン（図１８）に対応するピークカウントを、約２００Ｖにおいて記載される最大フラグメント化存在比を有するノズル電位が増加するにつれて相対存在比が増加することを明らかに観察した。２００Ｖを超えるフラグメントイオンの存在比における減少は、全てのイミノビオチン種の検出またはイオン化効率における全体的な減退に起因し、そして観察される全カウントにおける減退と並行する（図１７および図１８）。２００Ｖのノズル電位における増加した存在比を示すこれらのフラグメントは、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎについて公開されたアミノ末端配列に対応する。
【０５２６】
（実施例９）
本実施例は、４−スルホフェニルイソチオシアネート標識したアポミオグロビンを使用する逆質量梯子型配列決定の適用を例示する。
【０５２７】
配列決定グレードのアポミオグロビンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し（カタログ番号Ａ８６７３）、そして提供された用に使用した。アポミグロビン（１０ナノモル）を、以下からなる１００μＬの反応緩衝液中に溶解した：１０μｌのトリエチルアミン、１０μＬの２Ｍ酢酸、２ｍＬの８Ｍ尿素および１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬの水性４−スルホフェニルイソチオシアネート（ＳＰＩＴＣ）溶液。ＳＰＩＴＣを、Ｆｌｕｋａから購入し（カタログ番号８６１８０）そして供給されたまま使用した。反応混合物を、５５℃にて１時間インキュベートした。尿素および過剰試薬を、脱イオン水を用いる６回の洗浄に対するスピン透析により、反応混合物から除去した。スピン透析を、梱包の指示に従って、モデルＹＭ１０  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号４２４０７）チューブ中で行った。透析したサンプルを凍結乾燥し、そして０．１容量％のトリエチルアミンを含む、５００μＬの５０％の水性アセトニトリル中に再溶解した。
【０５２８】
ＳＰＩＣＴ標識したアポミオグロビンサンプルを、標準の市販の含気性エレクトロスプレーイオン源を備えるエレクトロスプレー−飛行時間質量分析器−ＭａｒｉｎｅｒTM（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）中でインソースフラグメント化に供した。質量分析機を陰イオンモードで操作した。公開された機器のプロトコールに従って、質量分析器の設定を最適化し、そして機器をサンプルを注入する直前に較正した。サンプルを、３μＬ／分の速度で、マイクロスプレー源へ連続して供給した。ノズル電位を、各ノズル電位においてスペクトルを収集する前に割り当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）１分の機器平衡化時間で２５〜３０Ｖの増加にて、１２５Ｖの最小設定値から３００Ｖの最大値へ増加した。合計３０の３秒間スペクトルを各ノズル電位における分析のために蓄積した。
【０５２９】
顕著な数のＳＰＩＣＴ標識が、より高いノズル電位においてタンパク質およびフラグメントイオンから脱離されることが見出された（図１９）。これは、配列決定についてのこの標識の感受性を阻害する。しかし、アポミオグロビンタンパク質の初めの３つのアミノ酸残基（Ｇｅｎｅｂａｎｋからの配列）のフラグメント質量に対応するピークは、より高いノズル電位において存在比における増加を見出した。標識ａ1−イオンフラグメントは、２００Ｖ以上のノズル電位において現れる。ｂ1，ａ2，ｂ2，ａ3およびｂ3イオンは、全て、２５０Ｖを超えるノズル電位のみにおける相対存在比におおいて増加するようである（図２０）。
【０５３０】
（実施例１０）
本実施例は、１−メチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）を介して、（２−アミノエチル）トリメチル塩化アンモニウム塩酸（２−ＡＥＴＡ）でのカルボキシ末端（Ｃ末端）において標識されたブラジキニンの配列を決定するための逆質量梯子型配列決定の使用を例示する。
【０５３１】
Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（カタログ番号Ｂ３２５９）、２−ＡＥＴＡ（カタログ番号２８４５５６）および２−［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（カタログ番号Ｍ５２８７）を、Ｓｉｇｎａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、そして供給されたまま使用した。ＥＤＣをＰｉｅｒｃｅ（カタログ番号２２９８０）から購入し、そして供給されたままに使用した。Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（０．６７μｌ）を０．２５ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中に溶解した。この溶液を８．０μｍｏｌの２−ＡＥＴＡに添加し、そしてこの溶液を、固体が溶解するまで混合した。次いで、この溶液を３７．５μｍｏｌのＥＤＣに添加し、そしてＥＤＣが溶解するまで完全に混合した。このサンプルを周囲温度で一晩インキュベートした。
【０５３２】
１容量％の酢酸を含む５０％の水性アセトニトリル溶液中に反応混合物を希釈することにより、質量分析のためのサンプルを調製し、その結果、２−ＡＥＴＡ−標識ブラジキニンの最終濃度は、１０μＭであった。この２−ＡＥＴＥ−標識ブラジキニンを、標準の市販の含気性エレクトロスプレーイオン源を備えるエレクトロスプレー−飛行時間質量分析器−ＭａｒｉｎｅｒTM（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）中でインソースフラグメント化に供した。製造業者の指示プロトコールに従って、質量分析器の設定を最適化し、そして機器を２−ＡＥＴＡ標識ブラジキニンサンプルを注入する直前に較正した。サンプルを、５μＬ／分の速度で、マイクロスプレー源へ連続して供給した。ノズル電位を、各ノズル電位においてスペクトルを収集する前に割り当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）１分の機器平衡化時間で５０Ｖの増加にて、５０Ｖの最小設定値から３００Ｖの最大値へ増加した。５０〜２０００の電荷単位に対する範囲のデータを、各スペクトルにおいて得、そして全部で６０の３秒スペクトルを各ノズル電位において分析のために蓄積した。
【０５３３】
親の２−ＡＥＴＡ標識ブラジキニンの同一性を、推定反応生成物についての算出された質量に基づいて最小にフラグメント化している５０Ｖスペクトルにおいて決定した。ブラジキニンのＣ末端配列を、得られた質量スペクトルを調査することにより決定し、各ノズル電位における可能な２−ＡＥＴＡ−標識ペプチドフラグメントの相対存在比を決定した。２−ＡＥＴＡ標識ペプチドフラグメント質量から生じた全体の可能な一連のｙ2+イオン（図２１）に対応するピークカウントは、１５０〜２００Ｖの範囲における最大フラグメント化存在比を有するノズル電子の増加に伴なって、相対存在比における増加を明らかに観察した。固定正電荷を保有するこの標識を用いて、１電荷のｙイオンを観察しなかった。なぜなら、ブラジキニンのＣ末端の残基は、アルギニンだからである。１５０〜２００Ｖのノズル電位の範囲における増加した存在比を示すこれらのフラグメントは、ブラジキニンについて公開されたＣ末端配列に対応する。
【０５３４】
（実施例１１）
本実施例は、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を一致させるために遺伝子データベースを検索することによるタンパク質グリコーゲンホスホリラーゼの同定のための逆質量梯子型配列決定の有用性および検索がタンパク質配列中のＰＳＴの位置に基づくことを制限することを例示する。
【０５３５】
実施例１から、グリコーゲンホスホリラーゼＡの還元Ｎ末端アミノ酸配列（すなわち、ＳＲＰＬＳＤ）を使用して、公開されたＥｘＰＡＳｙ  ＴａｇＩｄｅｎｔツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｔａｇｉｄｅｎｔ／ｈｔｍｌを参照のこと）を使用してＳＷＩＳ−ＰＲＯＴおよびＴｒＥＭＢＥＬタンパク質配列データベースを検索した。このツールは、１〜６の連続するアミノ酸ＰＳＴに対して一致する配列を含む任意の配列について、このデータベース内に含まれる既知のタンパク質配列を検索し得る。検索は、タンパク質中のＰＳＴの位置（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端）、ならびに電気泳動の座標による等電点および／または見かけの分子量の使用により制限される。
【０５３６】
この検索は、当時のデータベース内に含まれた４９０種類のウサギタンパク質配列に限定された。一致したタンパク質の数（「ヒット」）は、ＰＳＴの長さが増加するにつれて減少することが見出された（表２）。所定のＰＳＴの長さにおけるヒットの数は、Ｎ末端の一致のさらなる検索を制限することによりさらに減少され得た（表２）。任意の所定のＰＳＴの長さにおけるヒットの数はまた、キャピラリーゲル電気泳動分離から決定される、タンパク質の見かけのＭＷ（１００＋／−２０ｋＤａ）を含むことにより減少される（表２）。
【０５３７】
【表３】
2010249831.tif 000007
（実施例１２）
本実施例は、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を一致させるために遺伝子データベースを検索することによるヒトペプチドＢｒａｄｙｋｉｎｉｎの同定のための逆質量梯子型配列決定の有用性および検索がタンパク質配列中のＰＳＴの位置に基づくことを制限することを例示する。
【０５３８】
実施例２および３から決定されたブラジキニンの還元Ｎ末端アミノ酸配列（すなわち、ＲＰＰＧＦＳ）を使用して、実施例６に記載されるようなＳＷＩＳ−ＰＲＯＴおよびＴｒＥＭＢＥＬタンパク質配列データベースを検索した。
【０５３９】
この検索は、当時のデータベース内に含まれた７１７１種類のヒトタンパク質配列に限定された。一致したタンパク質の数（「ヒット」）は、ＰＳＴの長さが増加するにつれて減少することが見出された（表３）。所定のＰＳＴの長さにおけるヒットの数は、Ｎ末端の一致のさらなる検索を制限することによりさらに減少され得た（表３）。任意の所定のＰＳＴの長さにおけるヒットの数はまた、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおける親ペプチドのゼロ電荷質量から決定される、タンパク質の見かけのＭＷ（１０００＋／−２０ｋＤａ）を含むことにより減少される（表３）。
【０５４０】
【表４】
2010249831.tif 000008
（実施例１３）
本実施例は、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を一致させるために遺伝子データベースを検索することによるウマアポミオグロビンタンパク質の同定のための逆質量梯子型配列決定の有用性および検索がタンパク質配列中のＰＳＴの位置に基づくことを制限することを例示する。
【０５４１】
実施例４から決定されたアポミオグロビンの還元Ｎ末端アミノ酸配列（すなわち、ＧＬＳ）を使用して、実施例６に記載されるようなＳＷＩＳ−ＰＲＯＴおよびＴｒＥＭＢＥＬタンパク質配列データベースを検索した。
【０５４２】
この検索は、当時のデータベース内に含まれた２４１種類のウマタンパク質配列に限定された。一致したタンパク質の数（「ヒット」）は、ＰＳＴの長さが増加するにつれて減少することが見出された（表４）。所定のＰＳＴの長さにおけるヒットの数は、Ｎ末端の一致のさらなる検索を制限することによりさらに減少され得た（表４）。任意の所定のＰＳＴの長さにおけるヒットの数はまた、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおける親ペプチドのゼロ荷電質量から決定される、タンパク質の見かけのＭＷ（７＋／−３．４ｋＤａ）およびキャピラリー等電点決定により決定されるタンパク質の等電点（ｐＩ＝７＋／−０．５）を含むことにより減少される（表４）。
【０５４３】
【表５】
2010249831.tif 000009
（実施例１４）
質量分析配列分析についての最大蛍光検出可能性および適切性の両方に適切な標識化学物質は、代替的標識化学物質で既知の濃度および配列の精製タンパク質を標識すること、およびＣＥ分析および質量分析の両方においてそれらを試験することによって、決定する。少なくとも３つの異なる、タンパク質または合成調製ペプチドを、この作業における評価のために選択する。２つのタンパク質が、使用するＮ末端標識化学物質またはＣ末端標識化学物質への交差反応性を示し、そして１つは示さない。理論的に適切な構成を有する３０個までの代替的標識が、市販されている。各タンパク質のサンプルを調製し、そしてそれらのＣＥ検出可能性およびエレクトロスプレー質量分析サインについて分析する。最適化した５個までの第２回の代替的標識化学物質を合成し、そして市販の標識から得られる結果に基づいて分析する。次いで、最適の標識を、残りの作業における使用のために選択する。
【０５４４】
（実施例１５）
（２次元ＣＥ法）
ＣＩＥＦ技術、ＣＺＥ技術、およびＣＰＡＧＥ技術が以前に開発されそして記載されているが、２次元ＣＥ法を作製するためにこれらの技術を結合することに対する言及は以前になされていない。本実施例は、個別のタンパク質の複合混合物を再現可能にかつ定量的に分離するために、ＣＰＡＧＥまたはＣＺＥとＣＩＥＦを組み合わせ得ることを示す。既知の濃度および配列の精製タンパク質の混合物を、実施例１２のように調製する。これらのタンパク質混合物を、実施例１２からの標識で標識し、そしてまず、ＣＩＥＦ法を流し画分収集する。その後、収集したＣＩＥＦ画分をＧＰＡＧＥ法またはＣＺＥ法を流し、さらにそのタンパク質を分離する。混合物中の個別のタンパク質の濃度が互いに対して１０００倍まで変動する、少なくとも２５連の実験を実行して、２次元ＣＥ法のバリエーションの係数を確立する。最後に、少なくとも５連の実験を、異なるタンパク質ローディングで実行して、溶出時間および見かけの等電点に対するカラムローディングの効果を決定する。
【０５４５】
（実施例１６）
タンパク質の質量分析分画パターンおよび効率は、そのタンパク質がイオン化工程の間に存在する緩衝溶液により有意に影響され得る。代表的なＣＥ緩衝液は、ＭＳによるタンパク質配列決定に通常使用されるのと同じ緩衝液ではない。ＣＥの第２次元から溶出する個別のタンパク質の画分を収集し、そして使用する溶出緩衝液について質量分析法を最適にするために使用する。エレクトロスプレーおよびＭＡＬＤＩ  ＭＳ技術の両方を比較する。そのサンプルを、検出感度、分画効率、および識別し得るタンパク質配列の最大長について、評価する。最良のＭＳ法および条件を、さらなるすべての作業について選択しそして使用する。
【０５４６】
（実施例１７）
（ＣＥ＋ＭＳ法の使用）
本実施例において、上記実施例１３および１４からのＣＥ法およびＭＳ法を、代表的プロテオミクス系に組み合わせる。この系は、市販の構成成分から構築し得る。例えば、ストレス遺伝子分析（下記を参照のこと）についてのこの系の適切性は、公知のストレス遺伝子応答のプロテオミクス分析（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｈｏ応答）を実施することにより示す。この系の性能を確認するために、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、適切なＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのストックから調製し、そしてホスフェート飢餓に供する。細胞性タンパク質を対数増殖期培養サンプルから抽出し、そしてこの系を使用してホスフェート飢餓させたサンプルと比較する。この系から得た結果を、文献に記載される結果（例えば、Ｌ．Ｖ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ」Ｔｈｅｓｉｓ博士、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９７）を参照のこと）と比較する。２次元ＣＥ法から得たタンパク質発現パターンを画像に変換し、この画像を古典的２次元ゲル電気泳動の結果と直接比較する。ｐｈｏ遺伝子すべてに関する遺伝子配列が公開されているので、この分析から決定したタンパク質配列タグの正確性をその公知の配列と比較することができる。
【０５４７】
（実施例１８）
（健常組織と癌性組織との間を識別するためのプロテオミクスの使用）
本実施例は、健常組織と癌性組織との間を識別するための本発明の使用を示す。詳細には、本発明を使用して、健常前立腺組織および癌性前立腺組織、ならびに転移組織のタンパク質発現パターンを直接分析して、前立腺癌における種々の局面の発症、段階および転移に関連する、遺伝子発現および翻訳のパターンを解明し得る。このようなプロテオミクス調査は、疾患の機構のゲノム分析および機能的ゲノム分析を非常に促進し、そして新規な治療標的、診断マーカー、および薬物産物（すなわち、特定の細胞性タンパク質がそれ自体が治療剤として作用し得る）の同定を迅速にもたらす。プロテオーム分析を使用することによって、調査されなければならない遺伝子の数は、（５０，０００〜３５１００，０００個のヒト遺伝子から標的組織中で実際に発現される２，０００〜５，０００個へと）１０分の１に減少する。健常組織と疾患組織とのタンパク質発現パターンの定量的比較を通じて、疾患の進行において役割を果たし得る候補遺伝子の数を、さらに約１００分の１に減少させる。最後に、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）の生成を通じて、これらのタンパク質を、完全配列決定（例えば、変異検出）のためにそれらをゲノムに戻して追跡することを可能にする様式で、独自に同定し得る。
【０５４８】
この方法はまた、疾患における機構的役割のより徹底的な分子生物学的調査（例えば、モデル生物におけるノックイン研究およびノックアウト研究）のためのｃＤＮＡ捕捉を可能にする。事実上すべての細胞代謝および細胞シグナル伝達が生じるのは、タンパク質レベルにおいてである。遺伝子転写物の未成熟の終結または生じた遺伝子産物におけるアミノ酸置換のいずれかを生じる遺伝子変異を検出するために、プロテオミクスを使用する。これらは、生じるタンパク質における分子量変化または等電点変化として現れる。遺伝子産物における直接の変化が観察されるので、矛盾する遺伝的バリエーション（例えば、多型）は無視する。このようにして、プロテオーム分析は、癌性細胞を生じる遺伝子変異を迅速に同定し得る。個別のタンパク質の発現レベルの変化は、遺伝子発現における変化により引き起こされ得る。これらの変化は、機能的ゲノム法により追跡し得るが、翻訳効率および分解における変化によってもまた引き起こされ得、これらの翻訳効率および分解における変化は、プロテオーム分析を使用してのみ同定し得る。特定のタンパク質のレベルはまた、癌の原因であり得る。例えば、Ｇタンパク質（膜レセプター）のおける変動（細胞外シグナル（例えば、ホルモンレベル）を細胞性応答に翻訳することを担う）は、その細胞がその対応するシグナルの変化を増殖するための喚起として解釈する場合に、癌をもたらし得る。代謝タンパク質における変化は、増殖および癌をもたらす細胞性代謝での増加を引き起こし得る。プロテオミクスを通じて、レベルの変化の理由に関わらず、健常細胞と腫瘍細胞との間のタンパク質レベルと直接比較する。癌の可能な別の原因は、翻訳後タンパク質修飾の失敗であり、これは、制御されない細胞増殖をもたらす、重要なシグナル伝達系の損失を引き起こし得る。また、これは、翻訳後にのみ生じ、そしてゲノム分析または機能的ゲノム分析によっては検出し得ない。天然のディフェンシンタンパク質（これは、腫瘍増殖と闘う）もまた、翻訳後修飾の失敗または分解速度の増加により非機能的になり得る。プロテオーム分析は、疾患に対する薬物または遺伝子治療剤として使用し得る天然のディフェンシンの不在を明らかにするのを補助する。これらの様式で、プロテオーム分析は、疾患のゲノム分析および機能的ゲノム分析に対する補助であり、そしてその疾患の経路の原因および薬物開発の標的の両方の同定を促進する。
【０５４９】
プロテオーム分析はまた、免疫診断アッセイのための診断マーカー（例えば、細胞表面抗原または血清タンパク質）の同定を可能にする。推定診断タンパク質の精製サンプルを、プロテオーム分析の間に回収し、それにより抗体を惹起することが可能になる。これらの抗体を使用して、その診断タンパク質とその疾患との間の関連を、細胞におけるそのタンパク質の位置決めのための免疫組織化学的染色を介してさらに研究するか、またはそのタンパク質の存在について患者集団を迅速にスクリーニングして、その疾患に対するその統計学的関連を示す。プロテオーム分析はまた、改良されたスクリーニング試験を提供する。
【０５５０】
米国において、前立腺癌の発症率は、６５歳よりも若い男性すべての間で１００，０００人あたり２３人であり、そして６５歳を超える男性の間で１００，０００人あたり８８４人である。高齢に加えて、この癌についての他の危険因子としては、家族性関連性の疑い、高飽和脂肪の摂取（ω−３脂肪酸が危険を減少させると考えられる）、性病の病歴、複数の性交相手、精管切除、および窒素肥料への曝露（農家／農場作業者）およびフェロクロムが挙げられる。すべての癌と同様に、これらの危険因子は、複数の原因因子が関与し得ることを示唆する。例えば、家族性関連性は、遺伝的偏向（ｐｒｅｄｉｌｅｃｔｉｏｎ）（おそらくは遺伝子変異に関連する）を示唆する。食事因子に対する関連性は、代謝経路または化学的に誘導された遺伝子損傷を示唆する。性病および複数の性交相手に対する関連性は、病原菌（ｉｎｆｅｃｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）（例えば、ウイルス性の原因）または感染により損なわれた天然の腫瘍防御の損失を示唆する。これらの推定疾患機構すべてに、プロテオーム分析を介して取り組み得る。初期の前立腺癌は、通常は無症候性であり、そして慣用的スクリーニングによってのみ検出し得る。最もしばしば使用するスクリーニング様式は、直腸指診である。しかし、最近の前立腺スクリーニング研究の結果は、直腸指診が、触知可能な硬変を有する悪性腫瘍の患者のほぼ３分の２に適当な感度を欠くことを示している。前立腺癌特異抗原（ＰＳＡ）レベルスクリーニングは、初期前立腺癌の感度の良い指標であるが、不十分な特異性しか有さないと見なされる。なぜなら、レベルの上昇が、良性前立腺肥大（ＢＨＰ）、前立腺炎、または前立腺に対する物理的損傷を有する患者において存在するからである。最近開発された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）マーカーアッセイは、ＰＳＡスクリーニングに対する有望な補助であるようである。それにも関わらず、スクリーニングの道具としてのＰＳＡの広範な使用は、なお議論の余地がある。なぜなら、部分的には、前立腺癌の早期の検出が、見込みのある十分に制御された研究において、死亡率および罹患率に関して患者の結果の改善をもたらすと証明されていないからである。より決定的なスクリーニング試験がひどく必要とされる。
【０５５１】
前立腺癌は、一般的に、４つの臨床段階により特徴付けられ、わずかな臨床的管理選択肢しかない。初期段階（段階Ａ）は、処置せずに増殖についてモニターし得るか、放射線治療で処置し得るか、または除去し得る（前立腺全摘出術）。段階Ｂの前立腺癌（確定的だが限局的な癌）は、放射線治療か、または診断の最初の８ヶ月内の除去により自動的に処置する。段階Ｃの前立腺癌（拡大中だがなお器官に限局的）は、除去および放射線の組み合わせ治療によってか、またはホルモン療法と組み合わせた待期的放射線治療によって、直ちに処理する。段階Ｄの前立腺癌（転移した）は、最も根治的な治療（前立腺の経尿道的切除、組み合わせ放射線治療、待期的放射線治療およびホルモン療法を含む）を必要とする。骨のスキャンもまた、段階Ｄで実行する。首尾良い臨床結果は、その疾患の各段階で実質的に減少する。初期の検出における改良は別として、治療の選択を案内することによってかまたはその癌の進行を適切に段階分けする腫瘍遺伝子学者の能力を改善することによって、臨床管理の改善を可能にする診断法もまた、臨床結果を改善し得る。多数の抗癌薬物が前立腺癌についての臨床試験において存在するが、今日の唯一の頼りとなるものは、その腫瘍組織を除去または殺傷することである。前立腺癌およびその転移の機構を同定することは、より良好な薬物療法の開発を促進するはずである。
【０５５２】
従って、健常前立腺組織および癌性前立腺組織ならびに前立腺癌転移のプロテオーム分析を実行する。プロテオームデータベースを、この分析に基づいて構築し、そして前立腺タンパク質すべての発現レベルを、その等電点、分子量によって定量する。相対的発現レベルを、ネイティブの組織サンプルから直接決定する。タンパク質発現レベルの定量分析のために同位体標識したサンプルは、必要としない。従って、正常な生検サンプルまたは剖検サンプルを、実施する分析すべてのために使用し得る。タンパク質配列タグを、健常前立腺組織と癌性前立腺組織との間で発現パターンの変化を示すタンパク質すべてについて決定する。モデルタンパク質を使用して、代替的タンパク質配列決定技術の相対的効率を評価する。健常組織サンプルの２次元キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して、前立腺組織サンプルの２次元ＣＥのための条件を開発する。この開発において健常組織サンプルを使用することによって、本発明者らは、基準プロテオミクスデータベースを同時に作製する。複製実験を、別個の人々から採取した前立腺組織サンプルを用いて実施して、タンパク質発現における天然の変動を評価する。少なくとも２連の実験を、各組織サンプルを用いて実施し、タンパク質発現レベルにおける実験上の変動を評価する。段階Ｄの前立腺癌は、健常組織からのタンパク質発現において最も大きい変動を示す。従って、上記で開発した２次元ＣＥ条件を、５つまでの切除した段階Ｄの前立腺腫瘍サンプルに適用する。最良の結果が、健常組織サンプルと同様の年齢および人種の背景の個体から採取したサンプルを用いて予測される。上記で開発した２次元ＣＥパターンにて出現するかまたは消失するかのいずれかである、各タンパク質についてのＰＳＴを、健常組織の２次元電気泳動パターンの比較の際に開発する。本発明者らは、１０個のタンパク質のみが、完全にその２つの発現パターンのうちの１つに存在しないとみなし、このことは、遺伝子５の配列、発現、または翻訳後修飾における変化を示す。これらのタンパク質は、前立腺癌の発症または転移に最も関連がありそうであると考えられる。ＰＳＴの決定は、正常組織について決定された天然の変動の有意に（すなわち、３標準偏差）外側にある発現レベルを示すタンパク質へと拡張される。本発明者らは、いくつかのタンパク質が、有意な発現レベル変化を示すと見なす。これらのタンパク質は、前立腺癌にその次に最も関連がありそうである。前立腺癌のプロテオームデータベースを、上記から生じた情報を用いて開発する。このデータベースは、同定した各タンパク質について（決定した場合）、等電点、分子量、相対発現レベルおよびタンパク質配列タグを含む。
【０５５３】
上記の実験はまた、前立腺癌の基礎をなす共通の機構に基づく、基礎のデータセットを提供する。このデータを使用して、家族性癌を追跡し得、癌標的および他の組織における転移と関連するプロテオームの変動を調査し得、そして思春期と関連する発達タンパク質に関連し得る腫瘍容疑標的の機能を調査し得る。さらに、他の身体組織における転移の付着と関連するタンパク質を発見し得、そして前立腺癌またはその種々の段階の血漿タンパク質マーカーを同定し得る。さらに、臨床前試験または臨床試験からの種々の薬物療法のプロテオーム効果を、その薬物の作用機構および効力を決定するのを補助するためにスクリーニングし得る。
【０５５４】
（実施例１９）
（ストレス遺伝子発現の分析のためのプロテオミクスの使用）
プロテオミクスを用いて、ストレス遺伝子発現を使用して、組織に基づくバイオセンサーにおいて応答を引き起こすことが既知である化学物質または生物学的物質を識別し得る。組織に基づく検出系の優れた感度は、生物学的検出にて固有の生化学的増幅カスケードに起因する。このレセプターに基づく生化学的増幅アプローチ（（細菌からヒトまでの）すべての生物学的検出にて固有である）は、従来の化学的検出系の２つの主要な限界：閾値感度および兆し（ｔｈｒｅａｔ）の識別をよけて通る能力を保持する。既知の兆しは、その兆し因子への曝露に際して組織により生成された生化学的サインを既知の生化学的サインのライブラリーに一致させることによって、同定し得る。生化学的増幅系の１つの種類は、ストレス遺伝子系である。フィンガープリント生成においてストレス遺伝子のサインを使用する利点は、新規かつ未知の兆しをその組織に対して有する毒性効果の型に基づいて同定し得ることである。
【０５５５】
本実施例は、ストレス遺伝子発現を（その遺伝子配列レベルまで）迅速に同定しそして定量するための、新規なプロテオミクス法を示す。ストレス遺伝子のフィンガープリントを、組織に基づくバイオセンサーを誘発することが公知である化学物質および生物学的物質について同定する。ストレス遺伝子のフィンガープリントのライブラリーをどの化学物質および生物学的物質についても作製し得、そしてそのライブラリーを、一旦組織に基づくセンサーが誘発された領域にて、迅速に兆しを識別するために使用する。そのプロテオミクス技術は、任意の組織または細胞型に普遍的に適用可能である。
【０５５６】
（実施例２０）
（プロテオミクスデータベースプロフィールを作製する目的のための疾患組織サンプルおよび健常組織サンプルのＭＤＥ分析よびＩＭＬＳ分析のための蛍光タグでのタンパク質の標識）
タンパク質濃度がより感度のよい検出様式を必要とするに十分低い場合において、所望の感度を達成するための蛍光団の使用は、十分に記載されている。さらに、標識反応を実施する場合において、保護ストラテジーを実施して、所望の基のみ標識するのを確実にすることは、一般的である。水性溶媒環境または水性／有機性混合溶媒環境中における種々の因子でのタンパク質の標識もまた、当該分野で公知であり、そして本発明の実施にて有用な広範な標識試薬および技術が、当業者に容易に利用可能である。例えば、Ｍｅａｎｓら、ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９７１；Ｆｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＳＰＥＣＴＳ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２；Ｆｅｅｎｙら、ＦＯＯＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮＴ  ＴＨＲＯＵＧＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、第１６０巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９７；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６を参照のこと。
【０５５７】
以下の実施例は、蛍光原性ＰＳＴを本発明の代表的実施形態において選択しそして利用する方法を示す。さらに、この実施例は、保護基化学を戦略的に使用して（ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｗｉｌｅｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９））を参照のこと）タンパク質またはペプチドの選択的末端標識を確実にすることを示す。最後に、この実施例は、放射性同位体タグおよびモディファイヤーを用心深く使用して、その物質がＩＭＬＳ条件下で断片化および分析された場合に、特有の質量フラグメントを生成することを示す（同時係属中の米国特許出願第０９／５１３，３９５「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（２０００年２月２５日出願）を参照のこと）。
【０５５８】
この実施例において、健常標本および疾患標本由来の組織サンプルを、タンパク質粗抽出のための代表的手段に供する。そのタンパク質を単離した後、予備分離を、電気泳動（好ましくはｃＩＥＦ）を使用して実施する。さらなる分離が必要ならば実施する。次いで、タンパク質画分を、本発明の所望の特徴すべて（すなわち、特有の質量サイン、定量検出成分、および反応性官能基）すべてを含む蛍光タグ材料での標識に供する。Ｑｕａｎｔｕｍ  ＤｙｅTM（市販の化合物（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＯＨ））は、特有の蛍光特性を示し、そして本発明の主な特徴を組み込む、ユーロピウム（ＩＩＩ）の大環状キレートである（Ｌｅｉｆら、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４６４、Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｓ．ＫａｍｐａｌａおよびＰ．Ｗ．Ｔｏｄｄ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、４１〜５８頁（１９９１）；Ｖａｌｌａｒｉｎｏら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｒ．ＬａｋｏｗｉｃｚおよびＲ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、ならびにＡ．Ｋａｔｚｉｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｓｅｒｉｅｓ編、ＳＰＩＥ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  Ｓｅｒｉｅｓ  １８８５、３７６〜３８５頁（１９９３）；ならびにＬｅｉｆら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ、編Ｒ．Ｆ．Ｂｏｎｎｅｒ、Ｇ．Ｅ．Ｃｏｈｎ、Ｔ．Ｍ．ＬａｕｅおよびＡ．Ｖ．Ｐｒｉｅｚｚｈｅｖ．、ＳＰＩＥ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｓｅｒｉｅ  ２１３６、２５５〜２６２頁（１９９４）を参照のこと）（図１を参照のこと）。適切なエネルギーの光（３６０ｎｍ）により切除し、そして増強剤の存在下における場合、Ｅｕ（ＩＩＩ）キレートは、強力な狭いバンドの発光スペクトルを（代表的には、ピークの高さの２分の１にて約１０ｎｍ）大きなストークスシフトとともに示す。この錯体は、強力に発光し、約６２０ｎｍの発光である。特徴的に長い蛍光時間（３００マイクロ秒を超える、Ｐｅｒｉａｓａｍｙら、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍａｒｃｈ、３３〜３５頁（１９９５）およびＳｅｖｅｕｓら、Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｓ．Ａｎｄ  Ｔｅｃｈ．２８、１４９〜１５４頁（１９９４）を参照のこと）により、サンプルの短いパルス励起、続いてタイムディレイシグナル検出を実施することが可能になり、結果として、比較的短い蛍光寿命を有する成分からのパックグラウンド干渉を０にする。偶然にも、その標識は、他の多くの標識がそうであるのと同様に、蛍光クエンチングに悩まされず、従って、スタンダードについての応答曲線は、高濃度で直線状のままである。Ｓｅｖｅｕｓら（同書）は、これらの化合物が、水溶性の増加およびそのキレート金属の遊離に対する相対的不活性に起因して、生物学的適用に最適であることを示している。これは、より安全な反応条件の使用を可能にし、そしてこの標識における硬い（ｈａｒｄ）正電荷というさらなる特徴を提供する。Ｑｕａｎｔｕｍ  ＤｙｅTM上のフェニルイソチオシアナート結合は、アミンへの結合に最適であり、そしてこのキレートの中心の正の３つ（＋３）の硬い電荷は、そのタグの大きな質量９２７．７ａｍｕを快適なｍ／ｅ値３０９．２３３３にする。
【０５５９】
この実施例において、Ｑｕａｎｔｕｍ  ＤｙｅTMタグを、代表的には単離されたタンパク質混合物上に結合し得る（Ｊ．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｃｈｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅ  Ｗｅｉｔｚｍａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．とＪ．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒとの間の私信）；Ｄ．Ｂｌａｋｅｓｌｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３：３０５（１９７６）；およびＨ．Ｐ．Ｒｏｔｈｂａｒｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９：１０１（１９７８）を参照のこと）。試験タンパク質サンプルとコントロールタンパク質サンプルとを、ｐＨ９〜９．５の０．０５Ｍホウ酸塩（または炭酸塩または他の適切な緩衝液）にて、濃度０．５〜３ｍｇ／ｍＬまで分離する。０．４Ｍ塩化ナトリウムを添加して、イオン強度を調整する。適切な体積（５ｍＬ）を透析バッグ中に配置する。約３ｍｇのＱｕａｎｔｕｍ  ＤｙｅTMを１００ｍＬホウ酸塩（炭酸塩）緩衝液（ｐＨ９．３）に溶解する。そのタンパク質溶液を色素溶液に対して適切な時間（１時間＋）室温で透析して、タグをそのタンパク質に結合させる。次いで、結合したタンパク質を、分離に適切な緩衝液に対して透析し、そしてｃＧＥまたはｃＺＥ様式（例えば、ＭＥＳまたは酢酸ピリジニウム）にて多次元キャピラリー電気泳動により分析する。
【０５６０】
タグ化タンパク質をキャピラリーにロードし、そして電気泳動し、検出し、そして分画する。このタンパク質を蛍光および紫外検出によりモニターする。なぜなら、Ｑｕａｎｔｕｍ  ＤｙｅTMは、蛍光団であることに加えて、発色団でもあるからである。これら画分の各々を、蛍光およびＵＶにより定量する。次いでその画分を細分し、そしてＮａｎｏＯｒａｎｇｅTM色素およびＳｙｐｒｏTM色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈａｒｖｅｙ  Ｍ．Ｄ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｅｐ；１９（１２）：２１６９〜７４（１９９８）を参照のこと）により総タンパク質について分析する。各サンプルについて分析したタンパク質の総質量を知ると、完全標識に必要な蛍光タグの理論量を評価し得る。これは、分画したタンパク質の全体消化と組み合わせて決定して、全体のアミノ酸含量を決定し得る。各タンパク質画分において実際に見出されるタグの量を、ＡＡ分析、ならびにＳｙｐｒｏTMアッセイおよびＮａｎｏＯｒａｎｇｅTMアッセイにより見出される総質量に基づいて予測した理論量と比較する。この様式で、全体標識効率を、サンプル対サンプルの原理に基づいて決定する。
【０５６１】
代表的なＮａｎｏＯｒａｎｇｅTMアッセイまたはＳｙｐｒｏTMアッセイにおいて、ｎｇ／ｍＬレベルまでの検出が可能である。この試薬は、水溶液中で非蛍光性であるが、界面活性剤の存在下でタンパク質と相互作用する際に、タンパク質に強く結合する。
【０５６２】
他の標識が必要とされる場合において、選択肢は多い。蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）に対する他の連結化学物質としては、塩化スルホニル、ＮＨＳエステル、アルキルハライド、および活性化アルケンが挙げられる。他の連結化学物質を選択することによって、他の蛍光発生種（例えば、タグ）の使用が可能であり、そして多くのアミノ酸残基を含むフラグメントでの優れたＩＭＬＳデータを生成するために必要とされる選択肢を有する機会が増大される。各々の選択肢（本実施例で使用されるＯｕａｎｔｕｍ  ＤｙｅTMタグおよびより多くの標識を含む）は、本発明の主要な特徴（すなわち、連結官能性、荷電化学種（＋または−）、強い（ｈａｒｄ）または弱い（ｓｏｆｔ）電荷、および固有の質量サイン）を取り込むことが可能である。
【０５６３】
Ｃ末端上でタンパク質を標識するために、いくつかの保護手段が通常必要であり、そして望ましい（Ａｔａｓｓｉら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５；Ｂｏｙｄ，Ｖ．Ｌ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ、１０９−１１８頁；ならびにＤｕｐｏｎｔら、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅを参照のこと）。慣用的なＡＡアッセイから収集されるデータに基づいて、適切な保護化学物質が選択される。いくつかの型のＣ末端標識または配列決定の実施を試みる場合に、ｃｙｓ、ｌｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｐおよびｇｌｕ側鎖残基がチャレンジを課され得、そしてこれらの基の改変がしばしば必要であるが、達成することは比較的容易であることが実証されている（例えば、Ａｔａｓｓｉら、同書、およびＧｕｇａら、「Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｄｅ−Ｃｈａｉｎｓ：Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｃｙｓ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ．」、ｔｈｅ  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９９３）のポスター発表を参照のこと）。
【０５６４】
これらの保護化学物質は、ＰＥ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｏｃｉｓｅ  ４９４Ｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにおいて、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって使用される保護化学物質に類似するが（Ｗｅｒｎｅｒら、「Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｎｉｎｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙでのポスター発表；およびＢｒｕｎｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０７：２８５（１９９２）を参照のこと）、本実施例においては、同位体標識した試薬を、それらに対応する非同位体対応物とのほぼ５０／５０の混合物で提供し、ここでは、慎重に標識を行う。本実施例の継続において、ｃｙｓ残基は、アクリルアミドでのアルキル化によって改変されて、安定な誘導体を生じる。Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＴｈｒもまた、同位体および非同位体のフェニルイソチオシアネートの混合物で改変して、非常に安定な誘導体を生じる。フェニル尿素誘導体がリジンで形成され、そしてカルバメートが、ＳｅｒおよびＴｈｒで形成され、そしてアシルカルバメートがＴｙｒ残基で形成される。同位体標識されたＰＩＴＣを使用して、ＩＭＬＳスペクトルにおける固有の質量フラグメント対を生じる。どの程度使用するかを選択することが、ＰＶＤＦ膜へ接着する場合の最終的な疎水性に役立つ。これらの変換は、ＰＶＤＦ膜上で容易に行われる。ＳｅｒおよびＴｈｒのヒドロキシル基は、無水酢酸を使用してキャップされる。Ｃ末端と共にＡｓｐ残基およびＧｌｕ残基はまた、無水酢酸中で反応される。このＣ末端は、オキサゾロン環を形成し、これは、アスパラギン酸およびグルタミン酸側鎖残基のいずれか一方については形成されず、代わりに混合酸無水物を形成する。これは、このキャップ化プロセスの間に同位体標識された無水酢酸をＴｈｒおよびＳｅｒ残基に選択的に組み込むことを可能にし、ＩＭＬＳ分析の間にそれらの残基の同定をより容易にする。次いで、この環化Ｃ末端を、ＮＨＳエステルで促進される機構を介して、所望のアミン改変剤と反応させる。完了すると、全ての潜在的に相互作用する残基の側鎖が、選択的に改変され、そしてＣ末端は、アミンに化学改変された。この接合部において、本実施例のＯｕａｎｔｕｍ  ＤｙｅTMが、上記で議論された手順によって容易に結合されるか、または所望の場合に、他の所望の蛍光タグが利用され得る。
【０５６５】
側鎖改変およびこのタンパク質サンプルのアミン改変Ｃ末端への蛍光タグの結合の後、このサンプルを、ＭＥＳ緩衝液（または、多くの他の可能な界面活性剤／界面化性物質のうちの１つ）中に溶解させて、そしてｃＧＥ様式またはｃＺＥ様式で電気泳動し、蛍光およびＵＶによって検出し、そしてタンパク質のレベルを定量して、最後に分画する。ＳｙｐｒｏTMアッセイおよびＮａｎｏＯｒａｎｇｅTMアッセイは、タグ化の前後のいずれかで、行うサンプル量に依存して、タンパク質サンプルに対して行う。蛍光発光せず、単に発色団である標識を選択する場合、このタンパク質配列タグの一部として蛍光特性を有することによって付与される利点を必要とすることなく、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅTMアッセイおよびＳｙｐｒｏTMアッセイが、これらのタンパク質のＣＥでの容易な分析を可能にするためになお使用され得ることに留意する。消費されるＱｕａｎｔｕｍＤｙｅTM標識の実際量を、推定される理論的な量と比較して、明確な標識効率を得る。
【０５６６】
次いで、分画したタグ化タンパク質を、同じ緩衝液（本実施例のＭＥＳ）中でのＩＭＬＳ分析に適切な容量にして、そしてＩＭＬＳフラグメント化条件下でＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計において分析する。本発明者らが開発したＩＭＬＳデータ分析アルゴリズムを使用するデータ整理およびデータ分析下で、スペクトルデータを収集する。次いで、タンパク質配列およびＩＤの同定および割当てを、ＣＥ分析を受けたタンパク質画分の各々について収集された定量データおよび移動データに対して相関させる。この情報は、全タンパク質アッセイ（ＳｙｐｒｏTMなど）の情報と結び付け、各アッセイから得られた情報集団と共に、完全なタンパク質発現データベースが構築するのを可能にする。このデータベース集団は、本実施例の最終目標である、疾患組織におけるタンパク質発現プロフィールとコントロール（すなわち、健常）組織との間での競合分析を可能にする。
【０５６７】
前述のプロセスは、疾患被験体およびコントロール被験体由来の複数のサンプルで繰り返され、そして同じ被験体由来のサンプルで繰り返し実行される。次いで、これらの結果を試験して、疾患被験体とコントロール被験体との間で相対的な存在比が変化するタンパク質を同定する。このようなタンパク質は、特定の疾患および／または薬物標的についての潜在的なマーカー、あるいは潜在的な薬物である。
【０５６８】
（実施例２１）
（自閉症における代謝の役割）
本発明の方法を利用して、種々の疾患が代謝性の根源を有するか否かを確認し得、およびその代謝性の根源を特定さえし得る。特定の例として、本発明の方法および装置を使用して、自閉症（または、重篤な自閉的症状）が食餌性の因子から生じるか否かを確認し、食餌が自閉症に影響を及ぼし得る機構を決定し、そしてこのような食餌性の影響の診断を容易にするための単純な13Ｃ代謝アッセイを確立し得る。
【０５６９】
外因性ペプチドの上昇が、多数の自閉症の幼児の血液、尿および脳骨髄液に見い出された（Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，４２：１−１１（１９９０）；Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，７：７１−８５（１９９４）；Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，４：３０８−３１９（１９９１）；Ｇｉｌｌｂｅｒｇ，Ｃ．「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｏｐｉｏｉｄｓ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅ」、Ｗｉｎｇ，Ｌ．編、Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｕｔｉｓｍ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１−３７頁、Ｇａｓｋｅｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８８）；Ｓｈａｔｔｏｃｋ，Ｐ．Ａ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，３：３２８−３４５（１９９０））。セリアック病からの前例、ならびに穀物および日常の食事制限において有意な患者の改善を実証する多くの臨床事象研究は、自閉症に対する食餌性の効果に関する３つの仮説を導いた（例えば、Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，Ｓ．およびＹｏｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２９６：１０７−１１１（１９９２）；Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，Ｓ．およびＹｏｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１６：１７−１９（１９９３）；Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，４２：１−１１（１９９０）；Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，７：７１−８５（１９９４）；Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，４：３０８−３１９（１９９１）；Ｓｈａｔｔｏｃｋ，Ｐ．，Ａ．，ら、Ｂｒａｉｎ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，３：３２８−３４５（１９９０）；Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｓ．，「Ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ：Ｗｈｙ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａ  ｇｌｕｔｅｎ  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎ  ｆｒｅｅ  ｄｉｅｔ？」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  ａｎｄ  ＰＤＤ，１９６−２２６頁（Ｓｈａｗ、１９９８）；Ｓｅｒｏｕｓｉ，Ｋ．，「Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏａｄ．Ａ  ｃｈｉｌｄ’ｓ  ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ａｕｔｉｓｍ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  ａｎｄ  ＰＤＤ，２６５−２８９頁（Ｓｈａｗ、１９９８）を参照のこと）。
【０５７０】
Ｌｅｗｉｓによって提案された第１の理論は、軽度の段階のセリアック病が、全てではないが、自閉症幼児に多く存在し得、これが、腸のペプチド吸収不全（ｍａｌａｓｏｒｐｔｉｏｎ）および関連する神経学的症状を導くということである（Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｓ．，「Ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ：Ｗｈｙ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａ  ｇｌｕｔｅｎ  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎ  ｆｒｅｅ  ｄｉｅｔ？」：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  ａｎｄ  ＰＤＤ，１９６−２２６頁（Ｓｈａｗ、１９９８））。Ｓｈａｗは、第２の理論、すなわち、観察された外因性ペプチドが、腸の酵母感染の結果であり、この感染は、穀物および乳汁の炭水化物成分によって刺激されるということを提唱した（Ｓｈａｗ，Ｗ．ら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  Ｋｒｅｂｓ  ｃｙｃｌｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｂｒｏｔｈｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｔｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４１：１０９４−１１０４（１９９５）；およびＳｈａｗ，Ｗ．，「Ｏｒｇａｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ，ｂｙｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ａｕｔｉｓｍ」：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  ａｎｄ  ＰＤＤ，３１−６５頁（Ｓｈａｗ、１９９８））。腸内酵母は、二次代謝物として外因性ペプチドを直接的に産生し得るか、またはこれらのペプチドは、酵母が産生する高レベルの還元糖によって生じる架橋によって、間接的に血液中に形成され得る。自閉症幼児の食餌中のセクレチンおよびペプチダーゼの補給の効力に関する臨床データに基づいて、Ｓｈａｗは、第３の可能性のある機構を提唱し、これは、消化酵素が、自閉症患者において適切に機能していないかもしれないということを示唆する（Ｓｈａｗ、Ｗ．，「Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｓｙｓｔｅｍ」：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  ａｎｄ  ＰＤＤ，１２４−１３８（Ｓｈａｗ，１９９８））。
【０５７１】
本発明の方法をどのように使用して、これらの理論間を区別し得るかは、腸を介するペプチド吸収の２画分の薬物動態学モデルから観察され得る（Ｎｏｔａｒｉ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，第２版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ（１９７５））。腸壁を介する外因性ペプチドのフラックス（ｇp）は、以下：
【０５７２】
【数４】
2010249831.tif 000010
によって表され、ここで、ｋtは、この腸壁についての質量輸送係数であり、ＫｉおよびＫbは、腸壁におけるペプチドの溶解についての平衡定数であり、
【０５７３】
【数５】
2010249831.tif 000011
は、それぞれ、腸および血液におけるペプチド濃度である。
【０５７４】
腸壁を介するペプチドのフラックスは、腸におけるペプチドのペプチダーゼ消化の速度（ｒp）と競合し、このｒpを、本発明者らは、以下：
【０５７５】
【数６】
2010249831.tif 000012
によって表し、ここで、ｋは、速度定数であり、Ｅpは、腸におけるペプチダーゼ濃度であり、そしてＫmは、ミカエリス定数である。
【０５７６】
代表的には、以下：
【０５７７】
【数７】
2010249831.tif 000013
であるので、血液中のペプチド濃度は、時間（ｔ）の関数として、以下：
【０５７８】
【数８】
2010249831.tif 000014
によって示され、ここで、Ｖiは、腸に含まれる容量であり、Ｖbは、体内の分配容量であり、そして
【０５７９】
【数９】
2010249831.tif 000015
は、腸におけるペプチドボーラスの初濃度である。ここで、
【０５８０】
【数１０】
2010249831.tif 000016
の場合、式３は、以下：
【０５８１】
【数１１】
2010249831.tif 000017
によって近似され得る。式４から、腸壁を横切るペプチドの量は、腸におけるペプチド消化の速度（ｋＥＶｉ）に対する透過速度（ｋtＳ）の比によって決定されることが、容易に明らかである。
【０５８２】
血液中のペプチドの蓄積速度も等しく重要であり、これは、腸におけるペプチダーゼ活性（ｋＥ）に主に依存することが予測される（式４）。従って、血液中のペプチド蓄積のタイムコースの測定を使用して、吸収不全をもたらす基礎となる機構を同定し得、そして最も適切な治療過程に対する有意な洞察を提供し得る。より詳細には、これは、自閉症幼児の血液中および尿中の外因性ペプチドの出現についての以下の２つの可能な理由、すなわち：（１）腸壁は、セリアック病ににある場合に損なわれ、ペプチド透過性（ｋt）の増加を生じるか、または（２）自閉症幼児は、ペプチダーゼ欠損症（例えば、低いペプチダーゼ酵素レベル（すなわち、正常なペプチダーゼ活性よりも低い））を罹患し得る、の間を区別するための基礎を提供する。
【０５８３】
コムギから生じる外因性ペプチドの供給源（すなわち、不適切な消化および吸収不全または微生物刺激）を同定するために、自閉症幼児（およびコントロール群）に、13Ｃ富化コムギ粉および正常なコムギ粉の混合物を食餌させる。外因性ペプチドを、自閉症群およびコントロール群の血漿および尿から同定する。質量分析技術を使用して、同定された任意の外因性ペプチドの安定同位体の比を確認する。摂取されたコムギ粉混合物の相対的な存在比に対して等しい相対的な存在比を有する、２つの優位な同位体ピークを示すペプチドは、コムギタンパク質自体からのみ直接的に誘導され得る。摂取されたコムギ粉混合物の相対的な存在比とは異なる相対的な存在比にある、複数の同位体ピークを示すペプチドは、コムギタンパク質の完全な消化後（すなわち、構成する13Ｃアミノ酸および12Ｃアミノ酸は、混合する機会を有した後）にしか形成され得ない。追跡実験において、患者に、プロテアーゼで消化したコムギ混合物を食餌させる。これらの患者は、コムギタンパク質に由来するいかなる外因性ペプチドを示すはずがないが、体内の微生物合成または疾患関連性の合成に由来するペプチドをなお示すはずである。
【０５８４】
関連する方法を使用して、任意の外因性ペプチドが、血液脳関門を通過する（神経学的障害を生じる可能性を有する）か否かを同定し、そしてそれらの最終的な供給源を同定する。不完全な消化および食品タンパク質の吸収不全に直接的に由来するペプチドは、本明細書中に記載される方法に従って、コムギ粉混合物の摂取後の自閉症幼児から採取した脳脊髄液において、直接的に検出され得る。13Ｃ富化アミノ酸を供給し、同時に１以上のアミノ酸の静脈内補給を提供することによって、コムギタンパク質に直接的に由来しない外因性ペプチドの可能性のある供給源を、同定し得る。腸中の微生物起源のこれらのペプチドは、高い比の13Ｃ−アミノ酸を含有する。低い安定同位体含量（特に、静脈内投与されたアミノ酸の）は、血液中またはヒト組織中で合成されたペプチドを示す。ペプチダーゼまたはセクレチン補充の効力は、この技術を用いて同様に調べられ得る。
【０５８５】
腸から発生する外因性ペプチドが脳脊髄液中に現れることを立証すること、およびこれらのペプチドの最終的な供給源を同定することが、自閉症の適切な臨床処置において使用され得る。例えば、この安定同位体技術は、臨床医のための迅速な早期診断ツールの開発において使用され得、食餌または酵母感染の影響が不可逆的になる前のより早期の臨床介入を可能にする。
【０５８６】
（実施例２２）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける［13Ｃ］6−グルコースおよび［12Ｃ］6−グルコースの代謝の検出）
本実施例において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの培養物を、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら［Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，Ｐ．Ｌ．ＢｌｏｃｈおよびＤ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１１９：７３６（１９７４）］に記載されるように、［12Ｃ］−グルコースモルホリノプロパンスルホン酸緩衝化最小培地中、３７℃で、ＡＵ600＝０．７の細胞密度まで対数的に増殖させた。この細胞密度の時点で、０．８４ｍｌの［13Ｃ］6−グルコースの５００ｍＭ溶液を、８４ｍｌのこの培養物に添加し、ほぼ等モル比の［13Ｃ］6−グルコースおよび［12Ｃ］6−グルコースを生じた。約８ｍｌのアリコートを、培養物から定期的に収集し、そして２ｍｌの氷冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中でクエンチし、最終濃度１０重量％ＴＣＡにした。このクエンチしたサンプルを、４，０００ｒｐｍ、１０℃で、４０分間遠心分離した。このＴＣＡ上清のアリコート（１ｍｌ）を、２ｍｌの微量遠心管に配置し、Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｐ中で濃縮し、乾燥させた。このサンプルを、ＨＰＬＣグレードの水に再懸濁し、各時点のサンプルについての再懸濁した濃縮物を合わせて０．７ｍｌの総量にした。
【０５８７】
この再懸濁したＴＣＡ可溶性画分を、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＭａｒｉｎｅｒTMマイクロエレクトロスプレー飛行時間型質量分析計で、陰イオン様式における質量分析に供した。この質量分析計は、製造者の説明書に従って、分析直前に較正した。サンプルを、１６０Ｖのノズル電位および１７０℃のノズル温度で、このエレクトロスプレーイオン化システムに０．３μｌ／分で連続的に供給した。質量スペクトルを、約１５分間蓄積した。
【０５８８】
質量スペクトルデータを、各位置より正確に６．０２０１３ａｍｕより高い位置で測定されたカウントを、各質量位置におけるピークカウントで除算することにより分析し、全ての６炭素種についての13Ｃ／12Ｃ同位体比スペクトルを得た。各時点で採取したサンプルについて得られた13Ｃ／12Ｃ比スペクトルを、一緒にプロットし、そして定時サンプルにわたって一貫して変化したピークについて、手動で調査した。この分析において、０時間のスペクトルが、１より有意に小さいピークを示し、そして基質添加後（すなわち、13［Ｃ］−グルコースの代謝後）から十分に長い時点のスペクトルは、１に近い平衡値に漸近的に到達することが予測される。比スペクトルの手動調査は、７つのこのような可能性のある６炭素代謝物を示した（図３３−４１）。
【０５８９】
平衡基質比は、ほぼ等モルであることが予測されるので、実際のＭＳスペクトル（全カウントに対して測定された）を、この比分析から得られた対応する12Ｃおよび13Ｃの位置の各々で分析した。７つの推定される６炭素代謝物のうちの３つは、この第２レベルの分析によって排除された。なぜなら、推定される12Ｃおよび13Ｃのピークは、同じ大きさで見い出されなかったからである（図３３、３７および３９）。
【０５９０】
最後に、代謝フラックスを、以下の式：
【０５９１】
【数１２】
2010249831.tif 000018
に当てはめることによって決定した。ここで、ＲＡssは、無視される。１５０．８７ａｍｕ（図３４）および１５２．８８ａｍｕ（図３５）の代謝物のみが、０とは有意に異なる代謝フラックス値を有することが見い出され、そして長時間の時点で13Ｃおよび12Ｃの両方の位置でほぼ等モルのピークを示した。これらの質量位置は、６つのグルコース炭素から直接的に得られる実際の代謝物にもっとも対応するようであり、従って、これが、これらの増殖条件でのＥ．ｃｏｌｉによるグルコース代謝の代謝性Ｃ6フィンガープリントに対応する。１５０．８７ａｍｕおよび１５２．８８ａｍｕの代謝物の代謝フラックスは、それぞれ、１×１０-2ｓ-1ＡＵ600-1および９×１０-3ｓ-1ＡＵ600-1に近似することが見い出された。
【０５９２】
類似の分析を、５炭素代謝物に対して行い、これは、２つの５炭素代謝物がまた、［13Ｃ］−グルコース代謝に由来し得ることを示唆した（図４０および４１）。しかし、長時間の時点でのみ、２７８．８１ａｍｕ代謝物が、13Ｃ含量における任意の有意な増加を示し（図４０）、これは、このピークが、実験による人為的産物であり得ることを示唆する。２８０．８０ａｍｕ代謝物は、焼く４×１０-3ｓ-1ＡＵ600-1の実際のフラックスを示すようであり、これは、６炭素代謝物について観察されたフラックスの約半分である。これらの代謝物の化学的実体は、未知である。
【０５９３】
類似の分析を、４、３および２炭素代謝物レベルで行い、質量スペクトルデータに見い出される［13Ｃ］−グルコースから生じる明らかな13Ｃ−代謝物は存在しなかった。
【０５９４】
本明細書中で記載される実施例および実施形態は、例示的目的のみのものであり、それらを考慮する種々の改変または変更は、当業者に示唆され、そして本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、各々個々の刊行物、特許または特許出願が、参考として特定かつ個々に援用されるように特定かつ個々に示されるような程度で、全ての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【０５９５】
【表６】
2010249831.tif 000019
【０５９６】
【表７】
2010249831.tif 000020
【０５９７】
【表８】
2010249831.tif 000021
【０５９８】
【表９】
2010249831.tif 000022
【０５９９】
【表１０】
2010249831.tif 000023
【０６００】
【表１１】
2010249831.tif 000024
【図１】
2010249831.tif 000025
【図２】
2010249831.tif 000026
【図３】
2010249831.tif 000027
【図４】
2010249831.tif 000028
【図５】
2010249831.tif 000029
【図６】
2010249831.tif 000030
【図７】
2010249831.tif 000031
【図８】
2010249831.tif 000032
【図９】
2010249831.tif 000033
【図１０】
2010249831.tif 000034
【図１１】
2010249831.tif 000035
【図１２】
2010249831.tif 000036
【図１３】
2010249831.tif 000037
【図１４】
2010249831.tif 000038
【図１５】
2010249831.tif 000039
【図１６】
2010249831.tif 000040
【図１７】
2010249831.tif 000041
【図１８】
2010249831.tif 000042
【図１９】
2010249831.tif 000043
【図２０】
2010249831.tif 000044
【図２１】
2010249831.tif 000045
【図２２】
2010249831.tif 000046
【図２３】
2010249831.tif 000047
【図２４】
2010249831.tif 000048
【図２５】
2010249831.tif 000049
【図２６】
2010249831.tif 000050
【図２７】
2010249831.tif 000051
【図２８】
2010249831.tif 000052
【図２９】
2010249831.tif 000053
【図３０−１】
2010249831.tif 000054
【図３０−２】
2010249831.tif 000055
【図３１】
2010249831.tif 000056
【図３２】
2010249831.tif 000057
【図３３】
2010249831.tif 000058
【図３４】
2010249831.tif 000059
【図３５】
2010249831.tif 000060
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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