(57)【要約】【課題】本発明は、酵素を用いた測定方法によって、非侵襲的に軽症耐糖能異常および／またはインスリン初期分泌不良を簡便に検出する方法を提供するものである。【解決手段】被験者への糖負荷前および糖負荷一定時間後に尿中に排泄されるミオイノシトールの量を本試薬にて測定し、前後のミオイノシトールの増加量、または増加率をあらかじめ健常者にて設定した特徴的な値と比較して軽症耐糖能異常および／またはインスリン初期分泌不良を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のミオイノシトールをチオＮＡＤ、ＮＡＤＨ存在下でミオイノシトールデヒドロゲナーゼを用いて酵素的に定量する方法であって、２種類のキナーゼを併用してグルコースを消去する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
２種類のキナーゼがＡＴＰ−ヘキソキナーゼとＡＤＰ消去剤であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＤＰ消去剤がＡＤＰ−ヘキソキナーゼである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ミオイノシトール定量用組成物であって、少なくとも以下の成分を含むことを特徴とする組成物。
１）チオＮＡＤ
２）ＮＡＤＨ
３）ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ
４）２種類のキナーゼ
【請求項５】
２種類のキナーゼがＡＴＰ−ヘキソキナーゼとＡＤＰ消去剤であることを特徴とする請求項４に記載のミオイノシトール定量用組成物。
【請求項６】
ＡＤＰ消去剤がＡＤＰ−ヘキソキナーゼである請求項５に記載のミオイノシトール定量用組成物。
【請求項７】
緩衝液を含み、緩衝液としてＢｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ）、Ｔｒｉｓ（（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）、ＴＥＡ（Ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）を用いることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の定量用組成物。
【請求項８】
チオＮＡＤの濃度が終濃度で０．１ｍＭ以上であることを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載の定量用組成物。
【請求項９】
チオＮＡＤの濃度が終濃度で２〜１０ｍＭであることを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載の定量用組成物。
【請求項１０】
２種類のキナーゼを同時に反応させて、試料中のグルコースを消去することを特徴とするグルコースの消去方法。
【請求項１１】
２種類のキナーゼがＡＴＰ−ヘキソキナーゼとＡＤＰ消去剤であることを特徴とする請求項１０に記載のグルコースの消去方法。
【請求項１２】
ＡＤＰ消去剤がＡＤＰ−ヘキソキナーゼである請求項１１に記載のグルコースの消去方法。
【請求項１３】
少なくとも試料中のグルコースとＡＴＰを反応させグルコース−６−リン酸とＡＤＰに変換する工程と、試料中のグルコースと先の反応で生じたＡＤＰを反応させグルコース−６−リン酸とＡＭＰに変換する工程を併せて持つ試料中のグルコースを消去することを特徴とするグルコースの消去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿などの試料を用いて、軽症耐糖能異常またはインスリン分泌不全を検査する方法に関するものである。また本発明は、これら軽症耐糖能異常、もしくはインスリン分泌不全を経て発症する疾患、例えば糖尿病、動脈硬化、高血圧などの疾患の予知、診断方法、さらにそれら疾患の予防、治療・指導の効果判定方法、もしくは治療するための薬剤評価方法に応用することができる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病治療の最終的な目標は、糖尿病合併症の発症予防ならびに進展抑制である。この目標を達成するためには、できるだけ初期の段階で異常を見つけだし治療することが重要であるということが、臨床試験によって実証されている［非特許文献１：Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２８，１０３（１９９５）など］。
さらに、糖尿病を発症する以前、つまり、糖尿病予備群、さらに現在は糖尿病予備群ではないが近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い軽症耐糖能異常やインスリン分泌不全を見つけだし、治療または運動や食事の指導を行なうことも、さらに進んだ予防的治療法として効果があると考えられる。このことを科学的に実証するための臨床試験が進められている［非特許文献２：Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，２１，１７２０（１９９８）など］。したがって、糖尿病予備群の検出は糖尿病、さらには糖尿病合併症の予防を行う上で重要である。さらに現在は糖尿病予備群ではないが近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い軽症耐糖能異常やインスリン分泌不全を診断することが、より早期に糖尿病の予防を行う観点から最も重要であると考えられている。
【０００３】
糖尿病を診断する方法には、例えば経口糖負荷試験があり、７５ｇ経口グルコース負荷試験を行った場合に、空腹時血糖１１０ｍｇ／ｄｌ未満かつ負荷後２時間血糖１４０ｍｇ／ｄｌ未満である群を正常型と判定する。また空腹時血糖１１０ｍｇ／ｄｌ以上１２６ｍｇ／ｄｌ未満かつ負荷後２時間血糖１４０ｍｇ／ｄｌ未満である群を空腹時血糖異常上昇（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｆａｓｔｉｎｇ ｇｌｙｃｅｍｉａ，ＩＦＧ）、空腹時血糖１２６ｍｇ／ｄｌ未満かつ負荷後２時間血糖１４０ｍｇ／ｄｌ以上２００ｍｇ／ｄｌ未満である群を耐糖能異常（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ＩＧＴ）とし、ＩＦＧ＋ＩＧＴ＝境界型と判定する。空腹時血糖１２６ｍｇ／ｄｌ以上または負荷後２時間血糖２００ｍｇ／ｄｌ以上である群を糖尿病型と判定する。
また日本糖尿病学会の指針には、空腹時血糖値、負荷後２時間血糖値だけを用いた判定では正常型であっても、糖負荷後１時間時の血糖値が１８０ｍｇ／ｄｌ以上である場合は糖尿病型に移行する率が高いので境界型に準じた扱いとするとある。
【０００４】
耐糖能不良もしくは耐糖能不全とは、食事などによって血中に糖が流入した際に、血中の糖を骨格筋、肝臓、脂肪細胞などの末梢組織に充分取り込むことができずに血糖値が上昇する状態をいい、上昇する程度が健常者と比較すると高いが軽度である場合を軽症耐糖能異常という。
【０００５】
インスリンは、膵臓のβ細胞から分泌されるホルモンであり、骨格筋、肝臓、脂肪組織に作用して、血糖を下げる作用を有する。インスリン分泌不全は食事などによって血中に糖が流入した際に、血中の糖を骨格筋、肝臓、脂肪細胞などの末梢組織に充分取り込むために充分なインスリンが分泌されない状態をいう。インスリン分泌不全のうち、血中に糖が流入した直後に末梢組織に取り込むために充分なインスリンが分泌されない状態をインスリン初期分泌不良という。日本糖尿病学会の指針によれば、インスリン初期分泌不良とは、インスリノジェニック・インデックスＩ．Ｉ（血糖値の糖負荷後３０分値と糖負荷前値の差［△ＰＧ（３０−０）］に対する血中インスリン値の糖負荷後３０分値と糖負荷前値の差［△ＩＲＩ（３０−０）］、すなわち、△ＩＲＩ（３０−０）／△ＰＧ（３０−０）が０．４未満の状態をいう。
【０００６】
しかしこれらの診断のための血糖値やインスリンの測定法は、いずれも短時間に複数回の採血が必要な侵襲的な方法であり、被験者に多大な苦痛を与える。従ってこれらの欠点を解消する簡便なより侵襲性の少ない検査方法、好ましくは非侵襲的な検査方法が望まれている。
【０００７】
一方、生体試料中のミオイノシトールを定量することは、糖尿病の診断に有用であると考えられており、以下のような例が報告されている。
（ａ）尿中ミオイノシトール濃度は糖尿病で増加する〔非特許文献３：Ｌａｒｎｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３，３７３−３７８（１９９０）〕。
（ｂ）尿中ミオイノシトール量は正常型、境界型において差がない。〔非特許文献４：Ｓｕｓｕｍｕ Ｓｕｚｕｋｉ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ１２（１９９４）１４６５−１４６８〕。
（ｃ）糖負荷後の尿中ミオイノシトールが正常型に比べて境界型（ＩＦＧ、ＩＧＴ）、糖尿病型で増加している（特許文献１：特開２００１−１９０２９９号）。
上記（ａ）、（ｂ）は尿中のミオイノシトールをＧＣ／ＭＳ法によって測定した結果であるが、測定者により結果が異なっているためデータの再現性、信頼性に問題がある。また一方（ｃ）では酵素を用いた高感度なミオイノシトール測定試薬により尿中のミオイノシトールを測定した結果であり、ＧＣ／ＭＳ法と比べより正確で信頼のある結果が得られた。これにより糖尿病予備群の検出が可能となった。
【０００８】
しかしこの（ｃ）のミオイノシトール測定試薬は、（１）測定範囲が狭く、尿中の様々な濃度のミオイノシトールを測定するには試料を希釈しなければならず、よって最小検出感度が充分でなかったこと、（２）尿中の共存物質、特にグルコースの影響回避が充分でないなどの課題が残されており、正常型に含まれている軽症耐糖能異常やインスリン分泌不全の検出は不可能であった。
【０００９】
さらに、７５ｇ経口糖負荷前および糖負荷後２時間時の血糖値だけを用いて正常型と判定された場合には、０〜２時間までの血糖推移の状態は反映されておらず、例えば実は糖負荷直後から血糖推移が高く維持されている近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い群（軽症耐糖能異常やインスリン分泌不全）でも正常型に分類されてしまう。ここで軽症耐糖能異常とは正常型に分類されるが、空腹時、負荷後３０分、１時間、２時間に採血を４回実施する負荷試験を行うと、（１）負荷後３０分、１時間の血糖値が非常に高い（１８０ｍｇ／ｄＬ以上）急峻高血糖や、（２）負荷後２時間時の血糖が１４０ｍｇ／ｄＬ未満ではあるが健常者より高い（例えば１２０ｍｇ／ｄＬ以上）、（３）７５ｇ経口糖負荷直前、糖負荷後３０分、６０分、１２０分の血糖値の総和であるΣＰＧが高い（例えば５３０ｍｇ／ｄＬ以上）などの特徴を有する、軽度に耐糖能が低下したものを指す。そのため上記（ａ）〜（ｃ）の公知の事実からは、ミオイノシトールを調べることにより近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い群、例えば、軽症耐糖能異常の判別が可能であるとは予測できない。
このように、従来技術では、糖負荷直後から血糖推移が高く維持されている近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い軽症耐糖能異常やインスリン分泌不全を検出する方法は見出されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−１９０２９９号
【特許文献２】特公平６−６１２７８号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２８，１０３（１９９５）
【非特許文献２】Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，２１，１７２０（１９９８）
【非特許文献３】Ｌａｒｎｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３，３７３−３７８（１９９０）
【非特許文献４】Ｓｕｓｕｍｕ Ｓｕｚｕｋｉ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ１２（１９９４）１４６５−１４６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、軽症耐糖能異常および／またはインスリン分泌不全を簡便かつ再現性良く判定する検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を達成するために、軽症耐糖能異常および／またはインスリン分泌不全を有効に判定する何らかのマーカーを探すことが有効であると考えた。そこで本発明者らは鋭意検討の結果、従来インスリン抵抗性や糖尿病予備群（境界型や糖尿病型）の検出に有用と考えられていたミオイノシトールが意外にも、軽症耐糖能異常、インスリン分泌不全を有効に判定するマーカーとしても有用であることを見出した。
試料としては、人体から分離された血清または血漿、尿、あるいは、ホモジネイトした生体組織抽出物等が用いられるが、非侵襲で得られる尿が好ましい。
【００１４】
本発明者らは、精度が高く、簡便かつ安価なミオイノシトールの定量方法を提供することを目的としてミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物（特許文献２：特公平６−６１２７８号）の開発を行ってきた。この前処理不要な酵素法によって、初めてミオイノシトールについて信頼できるデータの取得が可能になった。本発明の軽症耐糖能異常および／またはインスリン分泌不全の検査方法は、このようなミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物の開発があって、初めて成功したものである。
【００１５】
さらに、被験者に一定量の糖を投与した後、一定時間の間に被験者から非侵襲的に採取した尿中のミオイノシトール濃度を上記のミオイノシトール測定試薬にて定量したところ、糖尿病予備群（境界型、ＩＦＧ、ＩＧＴ）、糖尿病型のみならず、正常型に分類されてはいるが実は軽症耐糖能異常であるものや、正常型に分類されてはいるが実はインスリンの初期分泌の低下した者においても、あらかじめ健常者にて設定した特徴的な値よりも高いことが明らかとなり、本測定試薬により、正常型と耐糖能異常の進んだ非正常型（境界型、ＩＦＧ、ＩＧＴ、糖尿病）の判別のみならず、正常型に分類されてはいるが実は軽症耐糖能異常である者や、正常型に分類されてはいるが実はインスリンの初期分泌の低下した者を健常者と簡便かつ再現性良く高率に判別できることを見出した。
【００１６】
また試料中のミオイノシトールは微量であり、用いるミオイノシトールデヒドロゲナーゼによってはグルコースにも弱い作用を示すことから、予めグルコースを消去する必要がある場合がある。グルコースを消去する方法としては、ミオイノシトールの極端な化学的安定性を利用する方法や、酵素を触媒としてグルコースを修飾する方法がある。化学的安定性を利用する方法としては、６Ｎ塩酸存在下に加熱し、ミオイノシトール以外の糖類を酸分解し分解生成物中に残存しているミオイノシトールを回収する方法や、水素化ホウ酸ナトリウムの様な還元剤で処理し、ミオイノシトール以外のグルコースなどのカルボニル基またはホルミル基を有する糖類を還元し、ミオイノシトール定量用酵素であるミオイノシトールデヒドロゲナーゼと反応し得ない化合物に修飾する方法などがある。酵素を触媒としてグルコースを修飾する方法としては、試料中のグルコースをグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３，４）にてグルコン酸に変換する方法や、試料中のグルコースをヘキソキナーゼ（ＥＣ２，７，１，１）にてグルコース−６−リン酸に変換する方法などがある。
これらの変換方法において種々の改良が知られている。グルコースオキシダーゼによってグルコースをグルコン酸に変換する方法においては、グルコースオキシダーゼを作用させた後、カタラーゼを作用させ生成する過酸化水素を消去する方法（特開昭６３−１８５３９７号公報）などが知られている。
【００１７】
またヘキソキナーゼによってグルコースをグルコース−６−リン酸に変換する方法においては、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを作用させ、グルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換させることにより、グルコース−６−リン酸が平衡反応によりグルコースに再変換されるのを防ぐ方法（特開平５−７６３９７号）、酸化型補酵素存在下にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させる方法（特開平１−３２０９９８号公報、特開平３−２７２９９号）、アデノシン二リン酸存在下にピルビン酸キナーゼを作用させ、グルコース消去時に減少するアデノシン三リン酸の濃度変化を防止し、アデノシン三リン酸濃度を一定に保つ方法（特開平２−１０４２９８号公報）などが知られている。
しかしながらヘキソキナーゼを用いてグルコースを消去する場合には、酵素反応によってＡＤＰが反応液中に大量に生成するため、酵素反応に及ぼす影響は無視できないものとなる。そのため生成したＡＤＰを反応に影響を及ぼさないものに変換することが好ましい。
【００１８】
そこで本発明者らは、酵素反応によって反応液中に生成するＡＤＰを反応に影響を及ぼさないものに変換する方法としてＡＤＰ消去剤を用いる方法が有効であると考えた。
ＡＤＰ消去剤としてはＡＤＰを反応に影響を及ぼさないものに変換できればいかなるものでも構わないが、酵素が好ましく、ＡＤＰをＡＭＰに変換する反応を触媒するキナーゼがより好ましい。キナーゼはホスホキナーゼ、ホスホトランスフェラーゼとも呼ばれ、ＡＤＰをＡＭＰに変換する反応を触媒するキナーゼとしては、ピロフォスフェート−グリセロールトランスフェラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、アセテートキナーゼ、ＡＤＰ−ヘキソキナーゼなどが知られている。
【００１９】
本発明者らは鋭意検討の結果、本発明のＡＤＰ消去剤として用いるキナーゼとしては、６−ホスホフルクトキナーゼやＡＤＰ−ヘキソキナーゼが好ましいことを見いだした。
ＡＤＰ消去剤として６−ホスホフルクトキナーゼを用いた場合には、試料中のグルコース消去反応において、ＡＴＰ存在下にＡＴＰ−ヘキソキナーゼの作用でグルコースをグルコース−６−リン酸に変換する際に生成するＡＤＰを、６−ホスホフルクトキナーゼを同時に作用させることで、あらかじめ添加してあるフルクトース−６−リン酸をフルクトース−１、６−２リン酸に変換するとともにＡＤＰをＡＭＰに変換することができる。
ＡＤＰ消去剤としてＡＤＰ−ヘキソキナーゼを用いた場合には、試料中のグルコース消去反応において、ＡＴＰ存在下にＡＴＰ−ヘキソキナーゼの作用でグルコースをグルコース−６−リン酸に変換する際に生成するＡＤＰをＡＭＰに変換することができる。また反応の際、塩類を共存させるのが好ましく、塩類としては塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カリウム、硫酸カリウム等のカリウム塩等が挙げられる。これらの塩は１〜１００ｍＭ程度用いるのが好ましいが、特に限定はされない。
これら酵素により修飾されて生じた化合物は、いずれもミオイノシトール定量用酵素であるミオイノシトールデヒドロゲナーゼが作用しない化合物である。本発明者らは、このような方法によって、予めグルコースを消去することが、より好ましいことを見出した。
【００２０】
さらに、本発明者らは、糖消去反応に関して、ＡＴＰ−ヘキソキナーゼおよびＡＤＰ−ヘキソキナーゼの２種類のキナーゼを同時に用いた場合に試料中の糖の影響が小さくなり、より正確にミオイノシトールを測定できることを見出した。またチオＮＡＤ濃度を終濃度で０．１ｍＭ以上、好ましくは２〜１０ｍＭにすることによりミオイノシトールの測定範囲を既法の１０倍程度まで広げられることを見出し、より高感度な測定系を完成することができた。
【００２１】
特徴的な値とは、正常型からさらに選別した健常者の尿中ミオイノシトールの平均値、標準偏差やＲＯＣ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線をもとに設定した値であり、試料が尿である場合は糖負荷前および糖負荷一定時間後に尿中に排泄されるミオイノシトールの量の増加量として０〜２０μｇ／ｍｇ・クレアチニン、もしくは５〜１５μｇ／ｍｇ・クレアチニン、好ましくは８〜１２μｇ／ｍｇ・クレアチニンである。また今後大規模試験を行って、臨床的に確定した健常者を判断したときにはこの特徴的な値は変わることもあり得る。また特徴的な値については、例えば人種、性別、年齢など母集団の選択によって変わることもあり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】参考例１に基づくチオＮＡＤ量の検討結果を示す。
【図２】参考例２に基づくミオイノシトール試薬の安定性試験の結果を示す。
【図３】参考例３に基づくＡＤＰ−ヘキソキナーゼの影響を示す。
【図４】参考例４に基づくミオイノシトール定量曲線を示す。
【図５】実施例１に基づくミオイノシトールとΣＰＧの関連図である。
【図６】実施例２に基づくイノシトールとインスリノジェニック・インデックスの関連図である。
【図７】実施例３に基づく各群とΣＰＧの関連図である。
【図８】実施例４に基づく各群とインスリノジェニック・インデックスの関連図である。
【図９】実施例５に基づく各群とミオイノシトールとの関連図である。
【図１０】実施例６に基づく各群とミオイノシトールとの関連図である。
【図１１】実施例７に基づく糖負荷試験における尿中ミオイノシトールと食事における尿中ミオイノシトールの相関図である。
【図１２】実施例８に基づく各群の糖負荷試験における△ミオイノシトールと食事における△ミオイノシトールの関連図である。
【図１３】実施例９に基づく尿糖陰性者での食事における尿中ミオイノシトールと軽症耐糖能異常との関連図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明およびその好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明における軽症耐糖能異常、インスリン分泌不全の検出は、被験者への糖負荷前および糖負荷一定時間後に尿中に排泄されるミオイノシトールの量を本試薬にて測定し、前後のミオイノシトールの増加量、または増加率をあらかじめ健常者にて設定した特徴的な値と比較して行う。
【００２４】
増加量は糖負荷一定時間後のミオイノシトール量と糖負荷前のミオイノシトール量の差として算出され、増加率は糖負荷一定時間後のミオイノシトール量と糖負荷前のミオイノシトール量の比として算出される。
【００２５】
ミオイノシトールの濃度は、実測値または飲水などによる尿の希釈の影響を補正するための適当な標準となる指標に対する相対値が使用されても構わない。指標としてはそれぞれの尿におけるクレアチニン値が好ましい。測定の対象は糖尿病などの生活習慣病の疑いがあるものだけではなく、全てのものが対象となりうる。
【００２６】
糖負荷の量および糖負荷の方法は、いかなる量、いかなる方法でも構わないが、通常の糖負荷試験に用いられている７５ｇグルコースの水溶液を経口投与する方法または食事が好ましい。
【００２７】
尿を採取する時間は、糖負荷前および糖負荷直後から６時間後までのいずれの時期であっても構わず、３０分から３時間までが好ましい。蓄尿期間は３０分から３時間までの間で適宜選択される。
【００２８】
試料として尿を用いる場合には非侵襲の方法であるので、サンプル採取の方法、時間、場所を選ばずに済む。例えば自宅、職場、学校などにおいて自分で簡単にサンプルを作ることができ、採取した尿を直接、または濾紙などにしみ込ませて輸送することも可能であるため、医療機関などで拘束される必要もない。尿を濾紙などにしみ込ませた場合には、送付されたサンプルを適当な方法で抽出し、本発明を用いて簡便、短時間に測定し、結果を被験者に直ちに返すことができる画期的な方法を提供できる。
特に糖負荷を行わず普段通りに生活しながら随時尿中のミオイノシトールをモニタリングし、例えば１日のなかの最高ミオイノシトール量、または最高ミオイノシトール量と最低ミオイノシトール量の差で耐糖能異常の程度、インスリン分泌不全の程度を把握することも可能である。また随時尿中のミオイノシトールをモニタリングすることで、食事内容の見直しや、運動量の調整を行い普段通りに生活しながら糖尿病の予防や進行防止をサポートすることも可能である。
【００２９】
尿中ミオイノシトールをモニタリングする方法としては、ミオイノシトールが検出できればいかなる方法でも構わないが、例えばミオイノシトールに作用する酵素を試験紙に固定する試験紙法や、ミオイノシトールに作用する酵素を電極に固定化してセンサーとし電気化学的に検出する方法が挙げられる。
【００３０】
試験紙法では、例えばオキシダーゼにより生じた過酸化水素にペルオキシダーゼを作用させ活性酸素を発生せしめ、これが色原体を酸化し呈色される度合いを観察すればよい。色原体としてはヨウ化カリウム、テトラメチルベンチジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，３'，５，５'−テトラメチルベンチジンナトリウム、４−アミノアンチピリン、０−トリジンなどが挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００３１】
またセンサーで検出する場合、例えばオキシダーゼを用いる場合には生じた過酸化水素を直接電極にて測定するか、もしくはフェロセン誘導体やキノン誘導体などの電子伝達体を介在させ、得られる酸化還元電流あるいはその電気量を測定すれば良く、デヒドロゲナーゼを用いる場合にも同様に、還元型補酵素を直接電極測定するか、電子伝達体を介在させ、得られる酸化還元電流あるいはその電気量を測定すれば良い。例えば「バイオセンサおよびそれを用いた基質の定量法（特願平９−２６３４９２）」などの例が挙げられる。
また例えばトイレ便器などに直接、あるいは併設したデバイス内に上記センサーを組み込むことで、日常の尿中ミオイノシトールのモニタリングをより簡便にすることもできる。さらにデバイスに測定結果を記憶する機能、情報端末などへの接続機能を持たせることにより、例え被験者が遠隔地に住むような場合でも、電子媒体を用いて医師や医療機関との連携のもとに生活データを管理・指導し、耐糖能異常の程度、インスリン分泌不全の程度を把握し、食事内容の見直しや、運動量の調整、生活習慣の改善、治療を行うことも可能である。
【００３２】
また試料中のミオイノシトールと併せて試料中のグルコースを定量し、軽症耐糖能異常および／またはインスリン分泌不全を検出する場合、ミオイノシトールの定量は本発明で述べた方法が好ましいが、グルコースの定量は公知のいかなる方法を用いても構わない。
【００３３】
また測定した結果に医師の診断を添付すればより精密な管理ができる。さらに従来のマーカーでは判別し得ない糖尿病を発症する以前、つまり、糖尿病予備群、さらに現在は糖尿病予備群ではないが近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い軽症耐糖能異常やインスリン分泌不全を見つけだすことで糖尿病に移行するリスクがわかるので、例えば生命保険等の審査項目として使用することもできる。
【００３４】
試料中のミオイノシトールを定量するには、ミオイノシトール定量用組成物に試料１〜５００μＬを加え、３７℃の温度にて反応させ、反応開始後の一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３分と８分後の５分間において変化した補酵素の量を直接または間接的に測定すれば良い。この場合既知濃度のミオイノシトールを用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば試料中のミオイノシトール量を求めることができる。
【００３５】
定量用組成物（試薬）は、少なくともミオイノシトールに作用する酵素を含むことが必要であるが、さらに、補酵素を含むものが好ましい。
また本試薬にはポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ＯＰ−１０）などの界面活性剤を適宜添加しても構わない。
また本試薬は液状品、凍結乾燥品、凍結品の形で用いられる。
【００３６】
試料中のミオイノシトールを定量するには酵素を用いミオイノシトールを定量できる方法であればいずれの方法を用いても良い。本発明に使用しうるミオイノシトールを定量できる酵素としては、少なくともミオイノシトールに作用する酵素であればいかなる酵素を用いても良いが、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼが好ましく、フラボバクテリウム・エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）６７１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２３、以下Ｆ．ｓｐ．６７１と略す）由来のミオイノシトールデヒドロゲナーゼが最も好ましい。また用いるミオイノシトールデヒドロゲナーゼは試薬中に含まれるチオＮＡＤやＮＡＤＨなどの補酵素に悪影響を与える、例えばＮＡＤＨオキシダーゼのような補酵素分解活性を持つ物質などのコンタミネーションをできる限り軽減、もしくはなくしたものが好ましい。
なお、Ｆ．ｓｐ．６７１株は日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２３（寄託日平成１２年１０月１２日）として国際寄託されている。
【００３７】
検出方法としてはミオイノシトールが検出できればいかなる方法でも構わないが、例えばチオＮＡＤを用いた黄色発色、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）を用いた青色発色、あるいはＩＮＴ（２−（４−ｌｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いた赤色発色に代表される可視光発色試薬を用いる方法、発光法や蛍光法を用いる方法、電気的変化を捉える方法、およびこれらを増幅する方法を組み合わせる方法が挙げられる。
また上記の方法を利用できるコンパクトなデバイスを用いることで時間や場所の制限を受けずに非侵襲的に尿中ミオイノシトールを測定することも可能である。
【００３８】
ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの活性測定法は以下のとおりである。
（１）活性測定法
＜反応液組成＞
１００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．５）
２０ｍＭ ミオイノシトール（シグマ社製）
２ｍＭ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）（オリエンタル酵母社製）
５Ｕ／ｍｌジアフォラーゼ（旭化成社製）
０．０２５％ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ；和光純薬社製）
１．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００（和光純薬社製）
上記反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３７℃で５分間インキュベート後に、Ｂ倍に希釈した酵素液２０μｌを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に５分間の反応後に０．１ＮＨＣｌ ２ｍｌを添加して攪拌し反応を停止する。５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、Ａ１を求め、また上記反応液よりミオイノシトールを除いた反応液を用いて同様の測定を行いその吸光度Ａ０を求める。酵素活性は下記の式より算出する。
2010094135.tif 000002
式中の数値は、次の意味である。
１８．３ ； ＮＴＢの分子吸光係数
５ ； 反応時間
３．０２； 総反応液量
０．０２； 酵素液量
Ｂ ； 酵素液の希釈倍率
Ｆ．ｓｐ．６７１株由来のミオイノシトールデヒドロゲナーゼの性状は以下の通りである。
【００３９】
（２）酵素作用
少なくともミオイノシトールおよび補酵素の存在下、イノソース及び還元型補酵素を生成する。上記の補酵素に関しては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下ＮＡＤ類と略する）、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）、ピリジンアルデヒドアデニンジヌクレオチド（アルデヒドＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）が挙げられる。各補酵素を用いた場合の相対活性比（ＮＡＤを補酵素として用いた場合を１００％とする）は表１に示すとおりである。また相対活性は下記の方法に基づき補酵素を変えて測定を行った。
相対活性測定法
＜反応液組成＞
緩衝液 １００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）
基質 ２０ｍＭ ミオイノシトール（シグマ社製）
補酵素 ２ｍＭ
（ＮＡＤ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤＰ；以上オリエンタル酵母社製）。
上記の反応液１ｍｌを石英セルにとり、３７℃に温度コントロールされている分光光度計にセットする。５分以上インキュベートし、約１．０Ｕ／ｍｌの酵素溶液を２０μｌを添加、攪拌する。それぞれの還元型補酵素に特有な波長の１分間当たりの吸光度変化より初速度を求める。各補酵素で求めた初速度を、ＮＡＤを補酵素として用いた場合の初速度（１００％）と対比して、相対活性とした。
【表１】
2010094135.tif 000003
【００４０】
（３）基質特異性
前記の相対活性測定法に従い、反応液中の基質に変えて同一濃度のＤ−カイロイノシトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、マンニトール、エピイノシトール、サイロイノシトールを測定した。ミオイノシトールに対する反応初速度を１００とした場合の各基質における酵素活性を表２に示す。Ｆ．ｓｐ．６７１株由来の酵素はミオイノシトールに特異性が高いデヒドロゲナーゼであることが明らかである。
基質としては、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、マンニトール、Ｄ−カイロイノシトール（以上、和光純薬社製）、ミオイノシトール、エピイノシトール、サイロイノシトール（以上、シグマ社製）を用いた。
【表２】
2010094135.tif 000004
【００４１】
（４）至適ｐＨ
前記の相対活性測定法を用い、反応液中の１００ｍＭのｐＨ１０．０グリシン緩衝液にかえて１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）及び１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）の各緩衝液を用いて測定した。測定の結果、至適ｐＨは、１１．０付近（基質；ミオイノシトール）であることが分かった。
【００４２】
（５）分子量
ＴＳＫゲルＧ３００ＳＷ（０．７５φ×６００ｍｍ）、溶離液；５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）＋０．２ＭＮａ２ＳＯ４＋０．０５％ＮａＮ３、分子量マーカーはオリエンタル酵母社製（日本）を使用した。クロマトグラフィー装置は島津社製装置（日本）を使用し、ＵＶ２８０ｎｍ及びフラクションの活性測定にて検出した。活性測定はミオイノシトールを基質として用いた。４００００±１００００であることが分かった。
【００４３】
（６）熱安定性
４０℃、１５分の処理でほぼ１００％の残存活性を有する。
酵素液、約５Ｕ／ｍｌに１５分間の加熱処理を行った。残存活性は前記の酵素活性測定法にて測定した。活性測定はミオイノシトールを基質として用いた。
【００４４】
（７）Ｋｍ値
前記の相対活性測定法を用い、ミオイノシトールの濃度及び、ＮＡＤ及びチオＮＡＤの濃度を変化させそれぞれのＫｍ値を測定した。なお、前記活性測定法を用いて基質濃度を変化させＫｍ値を算出した。
基質に対するＫｍ値
ミオイノシトール：１．７±０．２ｍＭ
補酵素に対するＫｍ値
ＮＡＤ：０．０４±０．０１ｍＭ
チオＮＡＤ：４．５±１ｍＭ
【００４５】
またミオイノシトールを定量するにあたり、さらに高感度が必要な場合には酵素サイクリング法を用いることができる。下式にその１例を示す。
2010094135.tif 000005
式中、Ａ１はＮＡＤ（Ｐ）類、またはチオＮＡＤ（Ｐ）類を示し、Ａ２はＡ１の還元型を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤ（Ｐ）類の場合には還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を、Ａ１がＮＡＤ（Ｐ）類の場合には還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す。なお、ここで、ＮＡＤ（Ｐ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のことを表す。
【００４６】
酵素サイクリングを用いたミオイノシトール定量反応の液組成については、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの各種補酵素間のＫｍ値等を考慮して補酵素を２種類またはそれ以上適宜選択し、その後正反応／逆反応の至適ｐＨの間でｐＨ条件を酵素的サイクリングが効率よく進行するように設定すればよい。Ａ１、Ｂ１の量は試料中のミオイノシトール量に比較して過剰量であり、またミオイノシトールデヒドロゲナーゼのＡ１、Ｂ１に対するＫｍ値に比較しても過剰量であることが必要である。
【００４７】
例えばＦ．ｓｐ．６７１由来のミオイノシトールデヒドロゲナーゼについてみれば、Ｋｍ値はＮＡＤ、チオＮＡＤについてそれぞれ０．０４ｍＭ、４．５ｍＭであり、サイクリング反応を行う場合にはチオＮＡＤ、ＮＡＤＨを補酵素として選択し、サイクリング反応を行うと良い。Ａ１およびＢ１の濃度は０．０２ｍＭ〜２Ｍ、特に０．０５〜１００ｍＭが好ましく、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの量は１〜１０００Ｕ／ｍＬ、特に１〜１００Ｕ／ｍＬが好ましいが、その量は被検体の種類や量および測定したい試料中のミオイノシトール量などにより適宜選択することができ、これ以外の量を用いることもできる。
試料中に存在する糖を消去する酵素としてヘキソキナーゼを用いる場合、グルコースからグルコース−６−リン酸への反応を触媒すればいかなるヘキソキナーゼを用いても良いが、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．由来のヘキソキナーゼが挙げられる。好ましいヘキソキナーゼとしては熱安定性に優れたヘキソキナーゼが良い。 熱安定性に優れたヘキソキナーゼは「安定なヘキソキナーゼおよびその製造法（特開２０００−０７８９８２）」に記載の方法により取得することができる。
【００４８】
さらに本発明者らはグルコース−６−リン酸と同時に生成されるＡＤＰにより、本酵素サイクリング法は若干の反応阻害を受けるため、次式のようにＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼをヘキソキナーゼと同時に作用させることでミオイノシトールデヒドロゲナーゼの反応に影響を及ぼさずに、グルコース消去能を大幅に向上させることに成功した。
Ｇｌｃ＋ＡＴＰ＋Ｍｇ２＋ → Ｇ−６−Ｐ＋ＡＤＰ
Ｇｌｃ＋ＡＤＰ＋Ｍｇ２＋ → Ｇ−６−Ｐ＋ＡＭＰ
ＡＴＰ：アデノシン５'−三リン酸、ＡＤＰ：アデノシン５'−二リン酸、ＡＭＰ：アデノシン５'−一リン酸
【００４９】
ヘキソキナーゼの活性測定法は以下の通りである。
＜反応液組成＞
５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．５）（シグマ社製）
２０ｍＭ グルコース（和光純薬社製）
４ｍＭ ＡＴＰ（オリエンタル酵母社製）
５Ｕ／ｍＬ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡社製）
１ｍＭ ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）
１０ｍＭ 塩化マグネシウム（和光純薬社製）
酵素溶解希釈用液 ５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．５）
上記反応液１ｍＬを光路長１ｃｍのセルに入れ、３７℃で５分間インキュベート後に、Ｂ倍に希釈した酵素液２０μＬを添加して攪拌し、反応を開始する。反応開始後、３４０ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光度変化Ａ１を求める。盲検は酵素液の代わりに酵素溶解希釈用液５０μＬを加え同様の反応を行い１分間当たりの吸光度変化Ａ０を求める。酵素活性は下記の式より算出する。
2010094135.tif 000006
式中の数値は、次の意味である。
６．２２ ；ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおけるミリモル分子吸光係数
１．０２ ；反応総液量（ｍＬ）
０．０２ ；反応に供した酵素試料液量（ｍＬ）
Ｂ ；酵素液の希釈倍率
【００５０】
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの活性測定法は以下のとおりである。
＜反応液組成＞
５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース溶液（和光純薬工業社製）
２ｍＭ ＡＤＰ溶液（ｐＨ７．０）（オリエンタル酵母社製）
５Ｕ／ｍＬ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（旭化成社製）
１ｍＭ ＮＡＤＰ溶液（オリエンタル酵母社製）
２ｍＭ 塩化マグネシウム溶液（和光純薬工業社製）
酵素溶解希釈用液１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）
上記反応液３ｍＬを小試験管に入れ、３７℃で５分間インキュベート後に、Ｂ倍に希釈した酵素液５０μＬを添加して攪拌し、反応を開始する。反応開始後、３４０ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光度変化Ａ１を求める。盲検は酵素液の代わりに酵素溶解希釈用液５０μＬを加え同様の反応を行い１分間当たりの吸光度変化Ａ０を求める。酵素活性は下記の式より算出する。
2010094135.tif 000007
式中の数値は、次の意味である。
６．２２ ；ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおけるミリモル分子吸光係数
３．０５ ；反応総液量（ｍＬ）
０．０５ ；反応に供した酵素試料液量（ｍＬ）
Ｂ ；酵素液の希釈倍率
【００５１】
ヘキソキナーゼの量は１〜１０００ｕ／ｍＬ、特に１〜１００ｕ／ｍＬが好ましく、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの量は１〜１０００ｕ／ｍＬ、特に１〜１００ｕ／ｍＬが好ましいが、その量は被検体の種類や量などにより適宜選択することができ、これ以外の量を用いることもできる。
また幅広い濃度範囲の尿中ミオイノシトールを再現性良く測定するためには効率良く酵素サイクリング反応を行わせる必要がある。本発明者らは、酵素サイクリング反応に用いる２種類の補酵素であるチオＮＡＤ、ＮＡＤＨの濃度、比率を鋭意検討した結果、チオＮＡＤ濃度は終濃度で０．０１ｍＭ以上に、特に２〜１０ｍＭに、ＮＡＤＨ／チオＮＡＤ比は０．０１〜０．５、特に０．０１〜０．１にすることが好ましいことが分かった。しかし、その量は被検体の種類や量などにより適宜選択することができ、これ以外の量を用いることもできる。
［実施例］
【００５２】
本発明の実施例および参考例を詳細に述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
【００５３】
参考例１（チオＮＡＤ量の検討）
１）試薬
＜Ｒ−１＞
５ｍＭ ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｐＨ６．０）
０〜４０ｍＭ チオＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）
＜Ｒ−２；ミオイノシトール定量試薬＞
２００ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ９．０）
０．３ｍＭ ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母社製）
２５ｕ／ｍＬ ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（旭化成社製）
２）方法
測定装置は自動分析装置７１７０Ｓ（日立化成）を用いた。あらかじめ調製した０〜３０００μＭミオイノシトール溶液３μＬにＲ−１試薬１８０μＬを添加し３７℃４．８分間の反応後、Ｒ−２試薬１８０μＬを加え反応を開始した。反応開始後５．４分と７．８分の４０５ｎｍにおける吸光度を読みとりその差をとり、１分間当たりの吸光度増加速度（△ｍＡＢＳ／ｍｉｎ）を求め、標準液に対する感度を調べた。
３）結果
結果を図１に示す。図１に示すように終濃度０．１〜１０ｍＭのいずれのチオＮＡＤ濃度においてもミオイノシトール０〜３０００μＭで検量線の直線性が認められた。またミオイノシトールの検出感度を上げるためには終濃度２〜１０ｍＭのチオＮＡＤ濃度が好ましいことが分かった。
【００５４】
参考例２（ミオイノシトール定量試薬のバッファー種の検討）
１）試薬
＜Ｒ−１＞
５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）
５ｍＭ チオＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）
＜Ｒ−２；ミオイノシトール定量試薬＞
１００ｍＭ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．８）
０．５ｍＭ ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母社製）
１０ｕ／ｍＬ ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（旭化成社製）
２）方法
Ｒ−２；ミオイノシトール定量試薬のＢｕｆｆｅｒの種類として、Ｔｒｉｓ（（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｉ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ）、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＥＡ（Ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＣＨＥＳ（２−（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＭＰＳＯ（３−（（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を選択し、上記の組成で各Ｒ−２試薬を調製した。測定装置は自動分析装置７１７０Ｓ（日立化成）を用いた。あらかじめ調製した標準液１００μＭミオイノシトール溶液１５μＬにＲ−１試薬１８０μＬを添加し３７℃４．８分間の反応後、Ｒ−２試薬６０μＬを加え反応を開始した。反応開始後５．４分と７．８分の４０５ｎｍにおける吸光度を読みとりその差をとり、１分間当たりの吸光度増加速度（△ｍＡＢＳ／ｍｉｎ）を求め、標準液に対する感度を調べた。加速試験としてＲ−２試薬のみを３０℃のインキュベーター中にて２０日間保存し、７、１２、２０日目に同様の試験を行い、各Ｒ−２試薬の安定性を調べた。
３）結果
結果を図２に示す。標準液に対する感度が安定であった緩衝液はＴｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＥＡであり、最も感度が安定であった緩衝液はＢｉｃｉｎｅであった。
【００５５】
参考例３（ＡＤＰ−ヘキソキナーゼの検討）
１）試薬
＜Ｒ−１＞
５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）
５ｍＭ ＭｇＣｌ２（和光純薬工業社製）
８ｍＭ ＡＴＰ（オリエンタル酵母社製）
１０ｍＭ チオＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）
１０ｕ／ｍＬ ＡＴＰ−ヘキソキナーゼ（旭化成社製）
０〜４ｕ／ｍＬ ＡＤＰ−ヘキソキナーゼ（旭化成社製）
＜Ｒ−２；ミオイノシトール定量試薬＞
２００ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ９．０）
０．３ｍＭ ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母社製）
２５ｕ／ｍＬ ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（旭化成社製）
２）方法
測定装置は自動分析装置７１７０Ｓ（日立化成）を用いた。２０００μＭミオイノシトール溶液１００μＬと０〜１０ｇ／ｄＬグルコース溶液１ｍＬを混和したものを試料とした。各試料３μＬにＲ−１試薬１８０μＬを添加し３７℃４．８分間の反応後、Ｒ−２試薬１８０μＬを加え反応を開始した。反応開始後５．４分と７．８分の４０５ｎｍにおける吸光度を読みとりその差をとり、１分間当たりの吸光度増加速度（△ｍＡＢＳ／ｍｉｎ）を求め、各試料に対する感度を調べた。
３）結果
結果を図３に示す。図３から分かるように、ＡＴＰ−ヘキソキナーゼ単独ではグルコース濃度が１０ｇ／ｄＬのように高くなると、感度に影響が現れるのに対して、ＡＤＰ−ヘキソキナーゼを併用するときにはグルコース濃度が高くなっても影響がない。このことは、ＡＴＰ−ヘキソキナーゼとＡＤＰ−ヘキソキナーゼを同時に反応させることで、試料中の糖が消去され、より正確にミオイノシトールを測定できることを示している。
【００５６】
参考例４（酵素を用いた高感度なミオイノシトールの定量）
１）試薬
ミオイノシトール測定試薬
＜Ｒ−１；グルコース消去試薬＞
５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）
０．０５％ ＮａＮ３（和光純薬工業社製）
０．０５％ ＯＰ−１０（日本ケミカルズ社製）
５ｍＭ ＭｇＣｌ２（和光純薬工業社製）
８ｍＭ ＡＴＰ（オリエンタル酵母社製）
１０ｍＭ チオＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）
１０ｕ／ｍＬ ＡＴＰ−ヘキソキナーゼ（旭化成社製）
４ｕ／ｍＬ ＡＤＰ−ヘキソキナーゼ（旭化成社製）
＜Ｒ−２；ミオイノシトール定量試薬＞
２００ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ９．０）
０．０５％ ＮａＮ３（和光純薬工業社製）
４０ｍＭ ＫＨＣＯ３（和光純薬工業社製）
０．３ｍＭ ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母社製）
２５ｕ／ｍＬ ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（旭化成社製）
２）方法
測定装置は自動分析装置７１７０Ｓ（日立化成）を用いた。あらかじめ調製したミオイノシトール溶液３μＬにグルコース消去試薬１８０μＬを添加し３７℃４．８分間のグルコース消去反応後、ミオイノシトール定量試薬１８０μＬを加え反応を開始した。反応開始後５．４分と７．８分の４０５ｎｍにおける吸光度を読みとりその差をとり、１分間当たりの吸光度増加速度（△ｍＡＢＳ／ｍｉｎ）を求めた。
３）結果
結果を図４に示す。図４に示すように本測定試薬によりミオイノシトールを簡便に定量することができた。ミオイノシトールの測定範囲は０〜２０００μＭであり、０ｍＭミオイノシトールの多重測定により得られた△ｍＡＢＳ／ｍｉｎの平均＋２×標準偏差と重ならない最低濃度を最小検出感度とすると、最小検出感度は１０μＭであった。
【００５７】
実施例１（尿中ミオイノシトール測定による軽症耐糖能異常の判定）
１）対象
被験者１１２名に通常の７５ｇ経口糖負荷試験を施行し、糖負荷直前、糖負荷後３０分、６０分、１２０分、１８０分に採血し、血糖、インスリンを測定した。また同時に糖負荷直前、糖負荷後６０分、１２０分、１８０分に採尿しミオイノシトール、尿糖、クレアチニンを測定した。
２）試薬と測定法
血糖：電極法（京都第一化学：ＧＡ−１１６０）
インスリン：ＲＩＡ２抗体法
ミオイノシトール測定試薬：実施例４に同じ。
尿糖：電極法（京都第一化学：ＧＡ−１１６０）
クレアチニン：クレアチニン−ＨＡテストワコー（和光純薬工業社製）
３）方法
耐糖能の指標として、７５ｇ経口糖負荷直前、糖負荷後３０分、６０分、１２０分の血糖値の総和であるΣＰＧを用いた。７５ｇ経口糖負荷直前、糖負荷後６０分、１２０分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチニン濃度を測定し、尿中クレアチニン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール／クレアチニン）を求めた。また、糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、△ミオイノシトール量：［（６０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２］＋［（１２０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２］を用いた。
ΣＰＧと△ミオイノシトール量の関係を調べた。
４）結果
結果を表３および図５に示す。図５に示したように、ΣＰＧと△ミオイノシトール量は非常に良く相関した。ΣＰＧが高いことは、糖負荷後の血糖推移が高く維持されていることを示し、すなわち耐糖能異常があることを意味する。また例えば△ミオイノシトールの特徴的な値を１０μｇ／ｍｇ Ｃｒｅ（クレアチニン）とすればΣＰＧが５３０ｍｇ／ｄＬ程度の軽症耐糖能異常から効率よく検出することができる。
【表３−１】
2010094135.tif 000008
【表３−２】
2010094135.tif 000009
【表３−３】
2010094135.tif 000010
【００５８】
実施例２（尿中ミオイノシトール測定によるインスリン初期分泌不良の判定）
１）対象
実施例１に同じ。
２）試薬と測定法
実施例１に同じ。
３）方法
７５ｇ経口糖負荷直前、糖負荷後６０分、１２０分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチニン濃度を測定し、尿中クレアチニン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール／クレアチニン）を求めた。
また、糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、△ミオイノシトール量：［（６０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２］＋［（１２０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２］を用いた。
インスリノジェニック・インデックス（Ｉ．Ｉ．）と△ミオイノシトール量の関係を調べた。
４）結果
結果を図６に示す。図６に示したように、インスリノジェニック・インデックスと△ミオイノシトール量には関連が認められ、△ミオイノシトール量が１５μｇ／ｍｇ Ｃｒｅ以上であればかなり高率にインスリノジェニック・インデックスは０．４未満であった。日本糖尿病学会の指針によれば、インスリノジェニック・インデックス＜０．４であればインスリン初期分泌不良と判断できる。図６から明らかなように、△ミオイノシトールの特徴的な値を１５μｇ／ｍｇ Ｃｒｅとすればインスリノジェニック・インデックスが０．４未満、つまりインスリン初期分泌不良であるものを効率よく検出することができる。
【００５９】
実施例３（尿中ミオイノシトール測定と尿糖測定による軽症耐糖能異常の判定）
１）対象
実施例１に同じ。
２）試薬と測定法
実施例１に同じ。
３）方法
７５ｇ経口糖負荷直前、糖負荷後６０分、１２０分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチニン濃度を測定し、尿中クレアチニン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール／クレアチニン）を求めた。また同時に尿糖濃度を求めた。糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、△ミオイノシトール量：［（６０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２］＋［（１２０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２）］を用いた。
４）結果
△ミオイノシトール量が１０μｇ／ｍｇ Ｃｒｅ以上である場合をプラス（＋）、そうでない場合をマイナス（−）とした。同様に尿糖に関しては糖負荷２時間後の尿糖が５０ｍｇ／ｄＬ以上である場合を＋、そうでない場合を−とした。ΣＰＧは実施例５で算出したものを用いた。
検討した１１２名中、△ミオイノシトール−尿糖−群は５２名、△ミオイノシトール＋尿糖−群は１２名、△ミオイノシトール＋尿糖＋群は４８名であった。△ミオイノシトール−尿糖＋群に該当するものは無かった。△ミオイノシトール−尿糖−群、△ミオイノシトール＋尿糖−群、△ミオイノシトール＋尿糖＋群それぞれのΣＰＧを比較した。
結果を図７に示す。図７に示すように△ミオイノシトール−尿糖−群におけるΣＰＧの平均値、および標準偏差はそれぞれ４５３ｍｇ／ｄＬ、７６．６ｍｇ／ｄＬであった。△ミオイノシトール＋尿糖−群におけるΣＰＧの平均値、および標準偏差はそれぞれ５５６ｍｇ／ｄＬ、８１．１ｍｇ／ｄＬであった。△ミオイノシトール＋尿糖＋群におけるΣＰＧの平均値、および標準偏差はそれぞれ７９１ｍｇ／ｄＬ、１６４．８ｍｇ／ｄＬであった。また△ミオイノシトール−尿糖−群のΣＰＧと比べ、△ミオイノシトール＋尿糖−群のΣＰＧは有意に高く、△ミオイノシトール＋尿糖＋群のΣＰＧは更に有意に高かった。
このことから尿中ミオイノシトール、尿糖を併せて測定することにより非侵襲的に耐糖能異常の程度を判定することができた。
【００６０】
実施例４（尿中ミオイノシトール測定と尿糖測定によるインスリン初期分泌不良の判定）
１）対象
実施例１に同じ。
２）試薬と測定法
実施例１に同じ。
３）方法
実施例３に同じ。
４）結果
△ミオイノシトール量が１０μｇ／ｍｇ Ｃｒｅ以上である場合をプラス（＋）、そうでない場合をマイナス（−）とした。同様に尿糖に関しては糖負荷２時間後の尿糖が５０ｍｇ／ｄＬ以上である場合を＋、そうでない場合を−とした。インスリノジェニック・インデックスは実施例２で算出したものを用いた。
△ミオイノシトール−尿糖−群、△ミオイノシトール＋尿糖−群、△ミオイノシトール＋尿糖＋群それぞれのインスリノジェニック・インデックス（△ＩＲＩ３０−０／△ＰＧ３０−０）を比較した。
結果を図８に示す。図８に示すように△ミオイノシトール−尿糖−群における△ＩＲＩ３０−０／△ＰＧ３０−０の平均値、および標準偏差はそれぞれ１．３２、０．７９であった。△ミオイノシトール＋尿糖−群における△ＩＲＩ３０−０／△ＰＧ３０−０の平均値、および標準偏差はそれぞれ０．４５、０．４２であった。△ミオイノシトール＋尿糖＋群における△ＩＲＩ３０−０／△ＰＧ３０−０の平均値、および標準偏差はそれぞれ０．１６、０．１９であった。また△ミオイノシトール−尿糖−群の△ＩＲＩ３０−０／△ＰＧ３０−０と比べ、△ミオイノシトール＋尿糖−群の△ＩＲＩ３０−０／△ＰＧ３０−０は有意に低く、△ミオイノシトール＋尿糖＋群の△ＩＲＩ３０−０／△ＰＧ３０−０は更に有意に低かった。
このことから尿中ミオイノシトール、尿糖を併せて測定することにより非侵襲的にインスリン初期分泌不良の程度を判定することができた。
【００６１】
実施例５（尿中ミオイノシトール測定による軽症耐糖能異常の判定）
１）対象
実施例１のうち、空腹時血糖１１０ｍｇ／ｄｌ未満かつ負荷後２時間血糖１４０ｍｇ／ｄｌ未満である正常型に分類された５９名。
２）試薬と測定法
実施例１に同じ。
３）方法
正常型と判定された中で、負荷後１時間血糖１８０ｍｇ／ｄＬ以上、または負荷後２時間血糖１２０ｍｇ／ｄＬ以上のものをやや耐糖能の低下した症例（軽症耐糖能異常）としてＢ群、それ以外のものをＡ群とした。正常型と判定された５９名中、Ａ群は４５名、Ｂ群は１４名であった。７５ｇ経口糖負荷直前、糖負荷後６０分、１２０分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチニン濃度を測定し、Ａ群、Ｂ群の尿中クレアチニン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール／クレアチニン）を求めた。
また、糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、△ミオイノシトール量：［（６０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２］＋［（１２０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２］を用いた。
４）結果
結果を図９に示す。図９に示したように、Ａ群の△ミオイノシトール平均値は３．９μｇ／ｍｇ Ｃｒｅ、Ｂ群の△ミオイノシトール平均値は２５．８μｇ／ｍｇ Ｃｒｅであり、Ａ群に比べやや耐糖能の低下したＢ群（軽症耐糖能異常）では△ミオイノシトールが高い結果であった。
【００６２】
実施例６（尿中ミオイノシトール測定によるインスリン分泌不全の判定）
１）対象
実施例１に同じ。
２）試薬と測定法
実施例１に同じ。
３）方法
正常型と判定された中で、インスリノジェニック・インデックスが０．４未満のものをＢ群、それ以外のものをＡ群とした。正常型と判定された５９名中、Ａ群は３７名、Ｂ群は２２名であった。７５ｇ経口糖負荷直前、糖負荷後６０分、１２０分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチニン濃度を測定し、Ａ群、Ｂ群の尿中クレアチニン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール／クレアチニン）を求めた。
また、糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、△ミオイノシトール量：［（６０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２］＋［（１２０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）／２］を用いた。
４）結果
結果を図１０に示す。図１０に示したように、Ａ群の△ミオイノシトール平均値は４．４μｇ／ｍｇ Ｃｒｅ、Ｂ群の△ミオイノシトール平均値は１６．９μｇ／ｍｇ Ｃｒｅであり、Ａ群に比べインスリン初期分泌の低下したＢ群では△ミオイノシトールが高い結果であった。
【００６３】
実施例７（糖負荷試験における尿中ミオイノシトールと食事における尿中ミオイノシトールの関係）
１）対象
実施例１のうち、食事負荷試験に同意した５２名。正常型（Ｃ群）２２名、境界型（Ｂ群）１４名、糖尿病型（Ｄ群）１６名であった。食事前および食後１２０分後に採血し、血糖、インスリンを測定した。また食事前および食後１２０分後に採尿し、ミオイノシトール、尿糖、クレアチニンを測定した。
２）試薬と測定法
実施例１に同じ。
３）方法
空腹時に採血、採尿を行い食事を摂取した。食事内容はレトルトの調理済食品（ニチレイ製ウェルネス・メニューおよび佐藤食品工業製包装米飯）で、糖質９１．６ｇ、タンパク質３１．０ｇ、脂質１３．９ｇ、ナトリウム１．１ｇを含み、エネルギーは６２２ｋｃａｌである。食事後１２０分に採血、採尿を行った。各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチニン濃度を測定し、尿中クレアチニン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール／クレアチニン）を求めた。
また、食事前後のミオイノシトール量の指標としては、△ミオイノシトール量：［（１２０分ミオイノシトール量−負荷前ミオイノシトール量）］を用いた。
４）結果
糖負荷試験における△ミオイノシトール（Ｘ軸）と食事における△ミオイノシトール（Ｙ軸）の関係を図１１に示す。図１１に示したように、糖負荷試験における△ミオイノシトールと食事における△ミオイノシトールは非常に良く相関し（Ｙ＝１．０４４Ｘ−２．０，ｒ＝０．８３，Ｐ＜０．０００１）、ほぼ同じ値を示した。これにより糖負荷試験を実施しなくとも、食事前後の尿中ミオイノシトールを測定することで、軽症耐糖能異常またはインスリン分泌不全を検出できることが明らかとなった。
【００６４】
実施例８（糖負荷試験における尿中ミオイノシトールと食事における尿中ミオイノシトールの関係）
１）対象
実施例７に同じ。
２）試薬と測定法
実施例１に同じ。
３）方法
実施例７に同じ。
４）結果
各群での糖負荷試験における△ミオイノシトールと、食事における△ミオイノシトールの関係を図１２に示す。図１２に示したように、各群での糖負荷試験における△ミオイノシトールと食事における△ミオイノシトールは非常に良く一致していた。これにより糖負荷試験を実施しなくとも、食事前後の尿中ミオイノシトールを測定することで、軽症耐糖能異常またはインスリン分泌不全を検出できることが明らかとなった。
【００６５】
実施例９（尿糖陰性者での食事における尿中ミオイノシトールと軽症耐糖能異常との関係）
１）対象
実施例７のうち、食後２時間後尿糖が陰性（５０ｍｇ／ｄＬ未満）である３２名。
２）試薬と測定法
実施例１に同じ。
３）方法
実施例７に同じ。ただし、食事における△ミオイノシトールが７μｇ／ｍｇ Ｃｒｅ以上のものを（＋）群、それ以外を（−）群とした。
４）結果
結果を図１３に示す。図１３に示したように、食後２時間後尿糖陰性者でも△ミオイノシトール（＋）群は△ミオイノシトール（−）群と比べ、糖負荷試験でのΣＰＧが高値を示す例が多かった。
このことから食後２時間後尿糖陰性者でも、食事前後における尿中ミオイノシトールを測定することにより非侵襲的に耐糖能異常の程度を判定することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上のとおり、本発明によれば、軽症耐糖能異常および／またはインスリン初期分泌不良を非侵襲的に、簡便かつ再現性良く判定する検査方法を提供することができる。
【受託番号】
【００６７】
FERM  BP-7323
〔寄託された生物材料への言及〕
イ．当該生物材料を寄託した寄託機関の名称およびあて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１中央第６
ロ．イの機関に寄託した日付
平成12年10月12日（原寄託日）
ハ．イの機関が寄託について付した寄託番号
FERM  BP-7323
【図１】
2010094135.tif 000011
【図２】
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【図３】
2010094135.tif 000013
【図４】
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【図５】
2010094135.tif 000015
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2010094135.tif 000021
【図９】
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【図１０】
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