(57)【要約】【課題】安全性が高く、効果の高い関節軟骨損傷治癒促進剤を提供する。【解決手段】グリセロリン脂質、好ましくは、グリセロリン脂質が、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール及びリゾホスファチジルグリセロールからなる群から選ばれる１又は２以上のものを有効成分として含有することを特徴とする関節軟骨損傷治癒促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロリン脂質を有効成分として含有することを特徴とする関節軟骨損傷治癒促進剤。
【請求項２】
グリセロリン脂質が、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール及びリゾホスファチジルグリセロールからなる群から選ばれる１又は２以上のものである請求項１記載の関節軟骨損傷治癒促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の関節軟骨損傷治癒促進剤を含む飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節軟骨損傷治癒促進剤及びそれを含有する飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨と骨の接合部である関節は、自由な角度に折れ曲がることができ、動物が運動を行う上で重要な役割を果している。
【０００３】
関節の骨と骨とが接する面には粘弾性に富んだ関節軟骨が存在しており、関節を保護すると共に関節面を滑らかにして関節の動きを円滑にしている。
【０００４】
しかしながら、激しい運動や怪我等によって関節軟骨が欠損したり、損傷を受けると、関節軟骨は自然治癒力に乏しいため、悪化して変形性関節症に移行しやすいことが知られている。従来、関節軟骨の再生方法として、ｉ）損傷を受けていないところの軟骨を損傷したところに移植する方法（モザイクプラスティ）、ｉｉ）関節鏡を使って、自分の関節軟骨を取り出し、取り出した関節軟骨の中の軟骨細胞を損傷した軟骨に移植する方法（カーティセル）等が知られている。
【０００５】
近年、上記のような外科的治療だけでなく、軟骨損傷の治癒を促進するために、軟骨組織の構成成分となっているII型コラーゲン（特許文献１、２、非特許文献１）やヒアルロン酸（特許文献３）を経口投与して治療効果を得ようとする試みもなされており、変形性関節症や関節炎の治療に対して有効的であったという報告もある。
【０００６】
他方、グリセロリン脂質は、細胞の膜様構造部位に特異的に存在し、タンパク質と共に生体膜の主要な構成成分として知られている。脳、神経、内臓、血液、卵、種子などの部位に多く含まれ、生命維持のために多くの機能を果たしている。
【０００７】
その他として、近年各種リン脂質の機能性が明らかとなりつつある。例えば、レシチンの主要成分であるホスファチジルコリン（ＰＣ）には、美白効果を得る作用（特許文献４、５）、炎症刺激で誘導されるコラーゲン産生を抑制する作用（非特許文献２）、損傷部皮膚の収縮を抑制して回復を調節する作用（非特許文献３）などが報告され、ホスファチジン酸（ＰＡ）にはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化して毛髪再生を促進する作用（特許文献６）、腫瘍細胞の膜流動性を向上させ多剤耐性を一変させる作用（特許文献７）、またリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）には細胞増殖作用、環状リゾホスファチジン酸（ｃＰＡ）には細胞増殖抑制活性（非特許文献４）が報告されている。他にも、ホスファチジルセリン（ＰＳ）には脳機能改善効果（非特許文献５）や神経突起伸張活性（非特許文献６）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）には神経栄養作用（非特許文献７）が報告されている。
【０００８】
しかしながら、グリセロリン脂質が関節軟骨損傷治癒促進作用を有することは全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−３２７９７９号公報
【特許文献２】特開２００５−２３２０８９号公報
【特許文献３】特開２００７−３１４５３１号公報
【特許文献４】特開２００４−５９４９６号公報
【特許文献５】特開２００５−２７２４４４号公報
【特許文献６】特開２００６−７６９６７号公報
【特許文献７】特開２００６−１４３７４４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】第６１回日本栄養・食糧学会大会、４Ｉ−６ｐ、「コラーゲン・トリペプチドの変形性膝関節症に対する効果」
【非特許文献２】Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１３９（２００２）、２０２−２１０
【非特許文献３】Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．，１７（２００４）、１５−２２
【非特許文献４】蛋白質  核酸  酵素、Ｖｏｌ．４４、Ｎｏ．８（１９９９）、１１１８−１１２５
【非特許文献５】ＦＯＯＤ  Ｓｔｙｌｅ  ２１、Ｖｏｌ．６、Ｎｏ．１１（２００２）、１０８−１１６
【非特許文献６】日本農芸化学会  ２００４年大会、３Ａ１９ｐ２３、「卵黄由来ホスファチジルセリンが神経突起伸張に与える影響」
【非特許文献７】Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４７（２００６）、１４３４−１４４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、これらの経口摂取可能な関節軟骨損傷治癒促進剤のうち、コラーゲンはアレルギーなどでタンパク質に過剰反応する人は注意が必要であり、ヒアルロン酸は経口摂取での安全性については信頼できる充分なデータがないなど安全性に関する問題点があった。
【００１２】
本発明の目的は、安全性の高い関節軟骨損傷治癒促進剤及びそれらを含有する飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、グリセロリン脂質に関節軟骨損傷治癒促進作用があることを見出し、本発明に到達した。
【００１４】
すなわち、本発明は、グリセロリン脂質を有効成分として含有することを特徴とする関節軟骨損傷治癒促進剤を要旨とするものであり、好ましくは、グリセロリン脂質が、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール及びリゾホスファチジルグリセロールからなる群から選ばれる１又は２以上のものである関節軟骨損傷治癒促進剤である。
【００１５】
また、別の本発明は、前記した関節軟骨損傷治癒促進剤を含む飲食品を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、食経験が充分にあるグリセロリン脂質を有効成分として含有させることにより経口摂取でより安全性の高く、効果の高い関節軟骨損傷治癒促進剤を提供でき、またそのような関節軟骨損傷治癒促進剤を大量にかつ容易に製造し得る。また、本発明の飲食品は、グリセロリン脂質を有効成分とする関節換骨損傷治癒促進剤を配合しているので安全性が高く、日常的に摂取可能であり、これを喫食することにより関節軟骨損傷の予防効果及び治癒促進の生理機能を付与した飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の関節軟骨損傷治癒促進は、必須成分としてグリセロリン脂質を単独又は２つ以上組み合わせたものを有効成分とする。グリセロリン脂質として、エステル型（モノアシル型、ジアシル型）、エーテル型（アルキル型、アルキルアシル型、アルケニルアシル型、ジアルキル型）、ホスホノ型（Ｃ−Ｐ化合物）の存在が知られている。
【００１９】
本発明に用いられるグリセロリン脂質は、エステル型グリセロリン脂質が望ましく、より具体的にはホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール及びリゾホスファチジルグリセロールなどが挙げられる。これらの中でも、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸の効果が高いため好ましい。
【００２０】
本発明に用いられるエステル型グリセロリン脂質を構成する脂肪酸は、少なくとも一つ以上が不飽和脂肪酸であることが好ましく、その不飽和脂肪酸の不飽和度が１以上で炭素数が４以上であることがより望ましい。より具体的にはブテン酸（Ｃ４：１、例えばクロトン酸、イソクロトン酸など）、ペンテン酸（Ｃ５：１）、ヘキセン酸（Ｃ６：１）、ヘプテン酸（Ｃ７：１）、オクテン酸（Ｃ８：１）、ノネン酸（Ｃ９：１）、デセン酸（Ｃ１０：１）、ウンデセン酸（Ｃ１１：１）、ドデセン酸（Ｃ１２：１、例えばラウロレイン酸など）、トリデセン酸（Ｃ１３：１）、テトラデセン酸（Ｃ１４：１、例えばミリストレイン酸、ミリステライジン酸など）、ペンタデセン酸（Ｃ１５：１）、ヘキサデセン酸（Ｃ１６：１、例えばパルミトレイン酸、パルミテライジン酸など）、ヘプタデセン酸（Ｃ１７：１）、オクタデセン酸（Ｃ１８：１、例えばペトロセリン酸、ペトロセライジン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸など）、ノナデセン酸（Ｃ１９：１）、エイコセン酸（Ｃ２０：１、例えばガドレイン酸、ゴンドレン酸など）、ドコセン酸（Ｃ２２：１、例えばエルカ酸、ブラッシジン酸、セトレイン酸など）、テトラコセン酸（Ｃ２４：１、例えばネルボン酸など）、ヘキサコセン酸（Ｃ２６：１）、オクタコセン酸（Ｃ２８：１）、トリアコンテン酸（Ｃ３０：１）、ペンタジエン酸（Ｃ５：２）、ヘキサジエン酸（Ｃ６：２、例えばソルビン酸など）、ペプタジエン酸（Ｃ７：２）、オクタジエン酸（Ｃ８：２）、ノナジエン酸（Ｃ９：２）、デカジエン酸（Ｃ１０：２）、ウンデカジエン酸（Ｃ１１：２）、ドデカジエン酸（Ｃ１２：２）、トリデカジエン酸（Ｃ１３：２）、テトラデカジエン酸（Ｃ１４：２）、ペンタデカジエン酸（Ｃ１５：２）、ヘキサデカジエン酸（Ｃ１６：２）、ヘプタデカジエン酸（Ｃ１７：２）、オクタデカジエン酸（Ｃ１８：２、例えばリノール酸、リノエライジン酸など）、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２）、ドコサジエン酸（Ｃ２２：２）、テトラコサジエン酸（Ｃ２４：２）、ヘキサコサジエン酸（Ｃ２６：２）、オクタコサジエン酸（Ｃ２８：２）、トリアコンタジエン酸（Ｃ３０：２）、ヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３）、オクタデカトリエン酸（Ｃ１８：３、例えばα−リノレン酸、γ−リノレン酸、など）、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３、例えばジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸など）、ドコサトリエン酸（Ｃ２２：３）、テトラコサトリエン酸（Ｃ２４：３）、ヘキサコサトリエン酸（Ｃ２６：３）、オクタコサトリエン酸（Ｃ２８：３）、トリアコンタトリエン酸（Ｃ３０：３）、オクタデカテトラエン酸（Ｃ１８：４、例えばステアリドン酸など）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４、例えばアラキドン酸など）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４、例えばアドレン酸など）、テトラコサテトラエン酸（Ｃ２４：４）、ヘキサコサテトラエン酸（Ｃ２６：４）、オクタコサテトラエン酸（Ｃ２８：４）、トリアコンタテトラエン酸（Ｃ３０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５、例えばクルパドノン酸など）、テトラコサペンタエン酸（Ｃ２４：５）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）、テトラコサヘキサエン酸（Ｃ２４：６、例えばニシン酸など）、などが挙げられる。
【００２１】
上記に示した直鎖不飽和脂肪酸以外にもルメン酸（Ｃ１８：２）、カレンジン酸（Ｃ１８：３）、ジャカリン酸（Ｃ１８：３）、エレオステアリン酸（Ｃ１８：３）、カタルピン酸（Ｃ１８：３）、プニカ酸（Ｃ１８：３）、ルメレン酸（Ｃ１８：３）のような共役脂肪酸、リシノレイン酸（Ｃ１８：１）やリシネライジン酸（Ｃ１８：１）、ジモルフェコリン酸（Ｃ１８：２）のような水酸化不飽和脂肪酸、ベモリン酸（Ｃ１８：１）のようなエポキシ脂肪酸、ウロフラン酸のようなフラノイド脂肪酸、ミコリン酸のような高分子量の分岐鎖不飽和脂肪酸、その他メトキシ不飽和脂肪酸や環状不飽和脂肪酸などであってもよく、不飽和度が１以上で炭素数が４以上であれば構造や種類は特に限定されない。
【００２２】
本発明に用いられるグリセロリン脂質は、グリセロリン脂質を含有する素材から水や有機溶剤で抽出することにより得ることができる。例えば、大豆、菜種などの植物素材由来、卵黄などの動物素材由来、菌類や細菌類由来のグリセロリン脂質を抽出することができる。ここで用いられる有機溶剤としては、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサンなどの炭化水素、エタノール、アセトニトリル、酢酸エステル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、グリコール、石油エーテル、ＴＨＦ、アセトン、塩化メチレン、クロロホルムなどが挙げられる。抽出にはこれら溶剤を単独で又は２種類以上を混合して用いることができるが、特にエタノール、アセトン、ヘプタン、石油エーテルが好ましい。
【００２３】
抽出に用いる溶剤の量に特に制限はないが、グリセロリン脂質を含有する素材の重量に対して２〜１０倍量を用いることが好ましい。２倍量以下では操作性が、１０倍量以上では作業効率が悪い。
【００２４】
また、抽出は１種又は複数種の溶剤を用いて、複数回行うこともできる。複数回行う場合は、グリセロリン脂質を含有する素材からの抽出でもよいし、グリセロリン脂質を含有する素材から得られた抽出画分をさらに抽出してもよい。また、それらを組み合わせて行うことができる。
【００２５】
抽出操作の際の温度は、特に制限はないが１０〜６０℃が好ましい。１０℃以下では抽出効率が悪く、６０℃以上ではグリセロリン脂質以外の不純物も抽出されやすくなり、純度が低下してしまう。抽出時間にも特に制限はないが、１時間〜２日間程度が好ましい。１時間以下では抽出量が少なく、２日間以上では作業効率が低い。また、抽出は静置のまま行うこともできるが、撹拌又は振盪などすることによって抽出効率を高めることができる。
【００２６】
また、本発明に用いられるグリセロリン脂質は、上記のようにして得られたグリセロリン脂質をさらに精製や化学処理やホスホリパーゼなど酵素処理等をしたグリセロリン脂質、化学合成品や酵素合成品を用いることも可能である。
【００２７】
酵素処理の例としては、天然レシチンを酵素と反応させる例を挙げることができる。天然レシチンとしては、例えば、大豆、菜種、魚などの水産物、卵黄などに由来するレシチンが挙げられる。酵素としては、好ましくは、リパーゼ、ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＡ１、およびホスホリパーゼＡ２からなる群より選択される少なくとも１種が用いられる。酵素反応条件は、用いる酵素に応じて、当業者により適宜決定され得る。
【００２８】
以上のようにして抽出などにより得られたグリセロリン脂質は、そのままで本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤の有効成分として使用してもよく、また本発明の効果を損なわない限りで濃縮、脱色、脱塩、分配、粉末化等の処理を施したものを使用してもよい。例えば、減圧濃縮して溶媒を溜去して固形分含量を高めたものとしてもよく、活性炭処理により着色成分を除去したものでもよく、水層と有機溶媒層との液／液分配により水溶性成分を除去したものでもよい。また、順相系や逆相系の各種クロマトグラフィー等で精製してもよい。さらに、それら抽出物あるいは処理品にデキストリンや乳糖等の賦形剤を添加して粉末化したものでもよい。
【００２９】
本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤は、上記のグリセロリン脂質を関節軟骨損傷治癒促進剤中に、好ましくは１〜１００質量％、より好ましくは１０〜１００質量％の割合で含有される。
【００３０】
また、本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤には、上記グリセロリン脂質に加えて、Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸、コラーゲン若しくはその加水分解物などの関節軟骨損傷治癒促進作用が報告されている成分を一緒に含有することもできる。
【００３１】
本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤は、経口摂取可能な形態、例えば粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセルなどの剤型にすることができ、また飲料などの食品に配合することもできる。飲食品に配合した場合は、日常的に摂取しやすくなり、そのため関節軟骨疾患の予防および治療が可能となる。
【００３２】
本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤の摂取量は、特に制限はないが、通常、グリセロリン脂質の量が０．０１〜１０ｇ／日となるような量である。もちろん、摂取する者の年齢、体重、症状、投与期間、治療経過等に応じて変化させることもできる。１日あたりの量を数回に分けて摂取することもできる。また、他の関節軟骨損傷治癒に有効な素材と組み合わせて摂取することもできる。
【００３３】
本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤は、軟骨組織を構成する軟骨細胞の基となる前駆軟骨細胞の増殖を促進する。さらに、この前駆軟骨細胞の軟骨細胞への分化を促進してコラーゲンやグリコサミノグリカンを蓄積させる作用も有することから、軟骨組織の再生に有効なものである。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
卵黄レシチンＰＬ−３０Ｓ（キユーピー株式会社製）２００ｇにヘプタンとアセトンとの混液（３：１（容量比））を加えて溶解し、全量を２Ｌとした（卵黄レシチン溶液とする）。次いで、２０，０００ＵのホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）を含む酵素溶液（ｐＨ＝８．０）７４０ｍＬを調製した。この酵素溶液を卵黄レシチン溶液に添加して、撹拌しながら３０℃で２０時間酵素反応させた。次いで、分液後、ホスファチジン酸（ＰＡという場合がある）を含む有機溶媒層を、エバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）した。濃縮後、濃縮物の５倍容量のアセトンを加え、不溶物として得られるＰＡを減圧乾燥してＰＡ晶析物５４ｇを得た。なお、純度は９５％であった。このＰＡ晶析物を本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤として試験に供した。
【００３６】
実施例２〜５
グリセロリン脂質として以下の市販品を購入し、それぞれ本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤（実施例２〜５）とし、試験に供した。すなわち、１、２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  （ＤＯＰＡ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）（実施例２）、１、２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  （ＤＯＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）（実施例３）、１−Ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  （ＬＰＡ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）（実施例４）、１−Ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  （ＬＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）（実施例５）である。
【００３７】
試験例１（軟骨細胞の増殖促進作用）
マウスteratocarcinoma細胞由来の前駆軟骨細胞（ＡＴＤＣ５：理研バイオリソースセンター）を９６ウェルプレートに３×１０3  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％炭酸ガス存在下、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（１：１）培地（ＷＡＫＯ）で培養した。２４時間後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む同培地（ＦＢＳを含まない）に交換した後、実施例１〜５の関節軟骨損傷治癒促進剤を終濃度が１０μg/mlとなるようにそれぞれ添加して培養を継続した。７２時間後、Ｃell Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同人化学製）を添加し、３７℃で２時間反応させた際の４５０ｎｍの吸光度を測定することによって細胞数を比較した。結果を表１に示した。なお、無添加群の測定値を１００として相対値で評価した。
【００３８】
【表１】
2010189315.tif 000002
表１から明らかなように、卵黄由来のＰＡ及びグリセロリン脂質（ＤＯＰＡ，ＤＯＰＣ，ＬＰＡ，ＬＰＣ）は前駆軟骨細胞の増殖を促進することが示され、軟骨損傷の治癒に対して有効であることが明らかとなった。
【００３９】
試験例２（コラーゲン産生促進作用）
上記したＡＴＤＣ５細胞を２４ウェルプレートに５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％炭酸ガス存在下、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（１：１）培地（ＷＡＫＯ）で培養した。２４時間後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む同培地（ＦＢＳを含まない）に交換した後、実施例１〜５の関節軟骨損傷治癒促進剤を終濃度が１０μg/mlとなるようにそれぞれ添加して培養を３日間継続した。コラーゲン産生量は、−２０℃に冷却した７０％エタノールで細胞を固定した後、Ｓｉｒｃｏｌ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社）を用いて測定した。結果を表２に示した。なお、無添加群の測定値を１００として相対値で評価した。
【００４０】
【表２】
2010189315.tif 000003
表２から明らかなように、卵黄由来のＰＡ及びグリセロリン脂質（ＤＯＰＡ，ＤＯＰＣ，ＬＰＡ，ＬＰＣ）はコラーゲン産生を促進した。これは前駆軟骨細胞の軟骨細胞への分化が促進されたことを示しており、本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤は軟骨損傷の治癒に対して有効であることが明らかとなった。
【００４１】
試験例３（グリコサミノグリカンの蓄積促進作用）
上記したＡＴＤＣ５細胞を２４ウェルプレートに５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％炭酸ガス存在下、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（１：１）培地（ＷＡＫＯ）で培養した。細胞がコンフルエントに達した段階で、培地にＩＴＳ（終濃度１％）とともに終濃度が１０μg/mlとなるように実施例１〜５の関節軟骨損傷治癒促進剤をそれぞれ添加し、培養をさらに２週間継続した。グリコサミノグリカンは細胞を−２０℃の９５％メタノールで細胞を固定後、１％アルシアンブルー染色液（ｐＨ２．５）で一晩細胞を染色した後、６Ｍグアニジン塩酸溶液を用いて２時間遮光下で色素を溶出し、溶出液の６３０ｎｍの吸光度を測定することによってグリコサミノグリカン蓄積量を比較した。無添加群の測定値を１００として相対値で評価した。得られた結果を表３に示した。
【００４２】
【表３】
2010189315.tif 000004
表３から明らかなように、卵黄由来のＰＡ及びグリセロリン脂質（ＤＯＰＡ，ＤＯＰＣ，ＬＰＡ，ＬＰＣ）はグリコサミノグリカン蓄積が促進した。これは前駆軟骨細胞の軟骨細胞への分化が促進されたことを示しており、本発明の関節軟骨損傷治癒促進剤は軟骨損傷の治癒に対して有効であることが明らかとなった。