(57)【要約】      （修正有）【課題】隣接した脊椎骨を固定する、あるいは骨成長を局在化する方法、装置および組成物の提供。【解決手段】隣接した脊椎骨間の椎間板の隙間に椎間板埋込物を受け入れるため、椎間板の隙間を前処理する。担体中に骨誘導因子を含む骨誘導性組成物からなる埋込物を椎間板の隙間に挿入する。担体は、骨誘導因子の流出に対して実質的に不浸透性であり、担体が吸収または生分解されるにつれて、放出される。担体としては、硬化性の、吸収性の担体が挙げられ、例えば、約２日を超過して少なくとも約５０％の骨誘導因子を保持するリン酸カルシウムセメントがある。好ましい骨誘導因子は、成長因子であり、骨形成タンパク質およびＬＩＭミネラリゼーションタンパク質。当該方法は、後方進入法により、腰椎脊椎骨で有利に実施され、椎骨間固定装置およびそれらの前処理のための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨誘導性組成物を受け入れるため、椎間板の隙間の処理部位、または、１以上の脊椎骨の近傍の処理部位を前処理すること；および、
分解性の担体に結合させた骨誘導性組成物を、前記処理部位に配置すること、
を含み、前記担体は、前記骨誘導性組成物の流出に対して実質的に不浸透性であり、それにより、骨形成が、前記処理部位に配置された担体の体積に実質的に限定される、脊椎処理方法。
【請求項２】
前記骨誘導性組成物が、成長因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成長因子が、骨形成タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記骨形成タンパク質が、組換えヒトタンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、それらのヘテロ二量体、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えタンパク質が、ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−７、それらのヘテロ二量体、および、それらの組み合わせから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記骨誘導性組成物が、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、成長分化因子、軟骨誘導性の形成タンパク質、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子および線維芽細胞増殖因子からなる群より選択される骨誘導因子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記分解性の担体が、リン酸カルシウム含有担体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分解性の担体が、セメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記セメントが、リン酸カルシウムセメントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
隣接した脊椎骨間の椎骨間の隙間に椎間板埋込物を受け入れるため、椎間板の隙間を前処理すること（前記埋込物は骨誘導性組成物を保持するように形成され、前記前処理は、拡散性の骨誘導因子に接触しやすい血腫部位または瘢痕組織部位を露出させる後方進入法または側方椎間孔進入法によりなされる）；および、
前記骨誘導性組成物の流出に対して実質的に不浸透性な分解性の担体と結合させた骨誘導性組成物を提供すること（前記骨誘導性組成物は、担体が分解するにつれて担体から放出され、それにより、前記血腫部位または瘢痕組織部位における骨形成を実質的に防ぐ）、
を含む、後方固定法または側方椎間孔固定法による患者の隣接した脊椎骨の固定方法。
【請求項１２】
前記埋込物が、前記骨誘導性組成物を保持するためのチャンバーを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記骨誘導性組成物が、成長因子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記成長因子が、骨形成タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨形成タンパク質が、組換えヒトタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、それらのヘテロ二量体、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換えタンパク質が、ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−７、それらのヘテロ二量体、および、それらの組み合わせから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記骨誘導性組成物が、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、成長分化因子、軟骨誘導性の形成タンパク質、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子および線維芽細胞増殖因子からなる群より選択される骨誘導因子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記分解性の担体が、リン酸カルシウム含有担体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記担体が、リン酸カルシウムセメントを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記椎間板の隙間に埋込物を挿入することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記埋込物が、前記骨誘導性組成物を受け入れるためのチャンバーを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記埋込物が、生分解性または吸収性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
埋め込み後の約２日後に、約５０重量％未満の骨誘導性組成物が担体から放出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
埋め込み後の約７日後に、約５０重量％未満の骨誘導性組成物が担体から放出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
処理が必要であり、かつ、望ましい処理部位の近傍部位における骨の過剰成長に関する素因または既存の状態を有する患者を識別すること；
望ましい処理部位を前処理すること；
骨誘導性組成物の流出に対して実質的に不浸透性の分解性の担体と結合させた骨誘導性組成物を埋め込むこと、
を含み、それにより、骨形成は実質的に処理部位に限定される、脊椎の欠陥の処理方法。
【請求項２７】
前記分解性の担体が、リン酸カルシウム含有担体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
前記分解性の担体が、リン酸カルシウムセメントである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記骨誘導性組成物が、成長因子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記成長因子が、骨形成タンパク質である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記骨形成タンパク質が、組換えヒトタンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、それらのヘテロ二量体、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記組換えヒトタンパク質が、ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−７、それらのヘテロ二量体、および、それらの組み合わせから選択される、請求項３  １に記載の方法。
【請求項３４】
前記成長因子が、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子および線維芽細胞増殖因子からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
埋め込み後の約２日後に、約５０重量％未満の骨誘導性組成物が担体から放出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
埋め込み後の約７日後に、約５０重量％未満の骨誘導性組成物が担体から放出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記骨誘導性組成物および担体が、スペーサー中に提供される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本発明は、２０００年１０月２４日付で出願された米国仮出願第６０／４２４，７９４号の利益を主張し、その全体を参照することによって本明細書に含まれる。
【発明の背景】
【０００２】
本発明は、一般的に、脊椎を安定化する方法および装置に関する。より特定には、本発明は、隣接した脊椎骨を固定し、脊椎骨成長を局在化する方法および装置を提供する。
多数の人々が背痛に冒されており、中年期の労働人口に共通の障害の原因である。背痛のよくある原因は、椎間板の断裂または変性である。
【０００３】
椎間板は、隣接した脊椎骨の端板（endplate）間に位置し、脊椎を安定させ、脊椎骨間の力を分配し、椎体を保護する。椎間板は、髄核と、線維輪（annulus fibrosus）と呼ばれる外側の線維輪（fibrous ring）で取り巻かれ、包まれたゼラチン状成分とを含む。健康な損傷を受けていない脊椎において、線維輪は、髄核が椎間板の隙間から外側にはみ出ることを防ぐ。
【０００４】
椎間板（spinal discs）は、外傷、病気、または老化によって、ずれたり、損傷したりすることがある。線維輪が破壊されると、髄核が脊柱管にはみ出してしまい、これは、一般的に椎間板ヘルニア（herniated discまたはruptured disc）と呼ばれる状態である。突出した髄核が脊髄神経を圧迫し、それにより神経損傷、痛み、しびれ、筋衰弱および麻痺に陥ることがある。また椎間板は、通常の老化の過程または病気により劣化することもある。椎間板の脱水や硬化によって、椎間板の隙間の高さが減少し、脊椎の不安定、可動性の減少および痛みが生じる。
【０００５】
多くの例において、このような状態の症状を軽減するには、椎間板切除、または、椎間板全部または部分を外科的除去し、続いて、隣接した脊椎骨を固定するしかない。損傷した椎間板または不健康な椎間板の除去により、椎間板の隙間がつぶれる。椎間板の隙間がつぶれると、脊椎の不安定性、異常な関節力学、関節炎の早期発達、または神経損傷が引き起こされるのに加えて、激しい痛みがもたらされ得る。椎間板切除や関節固定によって得られる痛みを軽減するには、椎間板の隙間を保持し、最終的に冒された可動部分（motion segment）を固定することが必要である。
【０００６】
切除された椎間板の隙間を安定化する一つの解決方法は、それらの各端板の間の脊椎骨を固定することである。典型的には、骨誘導性の物質を処理部位に埋め込み、脊椎固定を促進する。椎間板切除および固定方法を成功させるには、隣接した骨を成長させ、患者の生活に係る脊椎への圧縮荷重に耐えることができる固体状の集合体を形成することが必要である。
【０００７】
加えて、椎間板の隙間に埋め込むための数種の金属スペーサーが開発されており、固定を促進するために用いることができる。Medtronic Sofamor Danek社（Memphis, TN）は、いくつかの中空の脊椎ケージ（spinal cage）を市場に出しており、さらに、多種多様な他のこのようなケージが当業界で知られている。例えば、Michelson等およびZdeblick等の米国特許第５，０１５，２４７号および第５，９８４，９６７号は、それぞれ、ねじ式脊椎ケージ（threaded spinal cage）を開示する。当該ケージは中空であり、骨誘導性の物質、例えば自己移植片、同種異系移植片、および／または、移植片から分離した物質で充填することができる。ケージ中に定められた開口部は、中空の内部に通じており、脊椎骨の端版間の組織成長のための経路を提供する。
【０００８】
前方進入法や後方進入法を含む当業界周知の医学的方法によって、前記のような埋込物がインビボで設置される。ある例において、骨誘導因子などの骨誘導性の物質が、埋込物から望ましくない位置に拡散したり、またあるいは、移動したりして、それにより、その場所で骨形成が起こってしまうことがあり得る。例えば、骨誘導性の物質がケージまたは他の埋込物から拡散し、隣接する血腫または組織、例えば線維性瘢痕組織の内部に骨を形成することがある。これは、後方経路腰椎椎体間固定術（posterior lumber interbody fusion: ＰＬＩＦ）または径椎間孔腰椎椎体間固定法（transforaminal lumbar interbody fusion: ＴＬＩＦ）に伴う血腫形成の危険を増すこととなり、なぜならこれらの術中に放出された血液が脊椎管または椎間孔の隙間に溜まるためである。また、先の手術により溜まった血液からの瘢痕組織形成は、ＰＬＩＦまたはＴＬＩＦの再手術においていっそう好ましくない。それゆえに、隣接した脊椎骨を固定させる方法、および、不必要な位置または望ましくない位置における骨組織形成を減少させるのを助ける骨誘導性組成物が必要である。
【０００９】
上述した問題を考慮すると、整形外科による創傷や欠陥を処理するための改良方法、脊椎固定の強化に関する骨形成性の組成物および装置などの関連分野における進歩に関して、継続的な必要性がある。本発明は、このような進歩に相当し、多種多様な利益と長所を提供する。
【発明の概要】
【００１０】
骨誘導性組成物と徐放性担体とを混合することによって、脊椎固定術中における望ましくない位置での骨形成を効果的に減少させ得ることがわかった。例えば、徐放性担体は、添加された骨誘導性組成物が、処理部位に隣接した組織、例えば、固定が望まれる部位から離れた、または隣接した血腫部位、瘢痕組織または他の線維組織に移動することを防ぐことができる。従って、本発明の一つの観点は、椎体間固定術において、隣接した脊椎骨を固定する方法、またあるいは、骨成長を局在化する方法を提供する。当該方法は、すでに局所的な血腫または瘢痕組織を示す処理部位、または、それに関する臨床的素因を示す処理部位に、特に有利である。椎間板の隙間を前処理する間、血腫部位または瘢痕組織部位を露出させることができ、または、拡散性の骨誘導因子によって誘導される骨組織成長に関する素因について評価することができる。一実施形態において、骨誘導性組成物と担体との複合体は、望ましい処理部位において骨成長を促進し、限定するように配合させることができる。他の実施形態において、骨誘導性組成物が保持されるように、埋込物を有利に配合し、構成することができる。それゆえに、骨誘導性組成物は、埋込物により提供および運搬され、埋込物からの骨誘導性組成物の望ましくない移動を最小化する。
【００１１】
他の形態において、本発明は、隣接した脊椎骨を固定する低侵襲の方法を提供する。当該方法は、骨誘導性組成物を受け入れるための椎間板の隙間を前処理することを含み、骨誘導性組成物は、荷重負荷（load-bearing）脊椎埋込物を利用することなく、前処理された椎間板の隙間に挿入される。このような方法は、脊椎のインスツルメンテーション、例えばロッド、プレート等を含む前方または後方インスツルメンテーションと連結させて使用することもできる。
【００１２】
本発明で用いられる組成物は、担体と、有効量の骨誘導性の物質または骨誘導因子とを含む。骨誘導性の物質は、担体中に取り込ませるか、または同伴させることができる。担体は、好ましくは、骨誘導因子の流出に対して実質的に不浸透性である。一実施形態において、担体が分解するか、または吸収されるにつれて、骨形成物質が担体から放出される。一実施形態において、骨形成は、実質的に、担体や骨形成物質が占める最初の容積または隙間に限定される。骨形成物質の血腫部位または瘢痕組織部位への移動は、顕著に減少するか、またはなくなる。本発明の他の実施形態において、担体は、吸収性セメントであり、骨形成性物質は、骨誘導因子または骨形成タンパク質である。
【００１３】
他の形態において、本発明は、後方経路腰椎椎体間固定術または径椎間孔腰椎椎体間固定術（transforaminal lumbar interbody fusion）の実行方法を提供し、ここで処理に選択された椎間板は腰椎椎間板である。
【００１４】
また、上述の脊椎埋込物と骨誘導性組成物とを含む椎骨間固定装置、同様に、固定装置を前処理する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、標準Etexリン酸カルシウムセメント担体中のｒｈＢＭＰ−２を用いた後側方横突起固定術(posterolateral transverse process fusion)で処理したアカゲザルの脊椎骨の、３軸スライスの連続ＣＴスキャン画像である。当該ＣＴスキャンは、埋め込み後２、４および６ヶ月に撮影された。
【図２】図２は、改変Etexリン酸カルシウムセメント担体中のｒｈＢＭＰ−２を用いた後側方横突起固定術で処理したアカゲザルの脊椎骨の、３軸スライスの連続ＣＴスキャン画像である。当該ＣＴスキャンは、埋め込み後２、４および６ヶ月に撮影された。
【図３】図３は、図１の場合と同様に処理されたサルの脊椎全体のＸ線連続スキャン画像である。
【図４】図４は、図２の場合と同様に処理したサルの脊椎全体のＸ線連続スキャン画像である。
【図５】図５は、EtexセメントからのｒｈＢＭＰ−２放出の動力学を説明したグラフである。
【図６】図６は、Etexセメント中のｒｈＢＭＰ−２の保持特徴を説明したグラフである。
【実施形態の説明】
【００１６】
本発明の原理の理解を促進するために、ここでは実施形態に対して参考文献が示されており、特定の用語は同一物を説明するものとして用いられる。なお、それにより本発明の範囲を限定することは意図されておらず、本発明に関連する当業者が通常想到し得るような本発明の変更やさらなる改変、および、本明細書で説明したような本発明の原理のさらなる用途が予想される、と考えられる。
【００１７】
本発明は、隣接した脊椎骨を処理する方法および装置に関する。本発明の好ましい形態において、後方経路腰椎椎体間固定法または径椎間孔椎体間固定法（transforaminal interbody fusion）、例えば後方経路腰椎椎体間固定術（ＰＬＩＦ）または径椎間孔腰椎椎体間固定術（ＴＬＩＦ）によって、隣接した脊椎骨を固定する方法が提供される。また、椎間板固定法において、予め選択された位置に骨形成を局在化する方法も提供される。また、本発明の特定の形態において、本明細書で説明された方法は、後外側または前外側において実行することができる。後方経路腰椎椎体間固定法または径椎間孔椎体間固定法で椎間板の隙間を前処理する際、望ましくない骨組織成長を起こしやすい組織、または、望ましくない骨組織成長の素因がある組織を露出させることができる。望ましい骨組織の成長は、上記物質または上記物質の活性部分を実質的に担体から流出させない担体に、選択された骨誘導性の物質を混合する、分散させる、またあるいは、同伴させる(entraining)ことによって促進される。一つの形態において、骨誘導性の物質は、担体の外にゆっくり拡散する。他の形態において、担体は、骨誘導性の物質の実質的な部分を放出しないが、むしろ、担体が分解および／または生体吸収されるにつれて、同伴された(entrained)骨誘導性の物質が徐々に処理部位に露出される。
【００１８】
骨成長に対する素因を有する組織とは、先の手術より前に存在し得る瘢痕組織、または、それらの形成が原因で起こる他の付随する病気や創傷が挙げられる。瘢痕組織は、骨形成が望まれる部位から離れた部位、典型的には隣接した部位に生じるか、または存在する。例えば、瘢痕組織は、線維芽細胞が先の手術による血餅または血腫へ浸潤（invasion）するために形成された可能性がある。
【００１９】
その上、本明細書で説明する本発明の外科手術の最中もしくは先の外科的方法の結果として、または、病気および／または外傷の結果として、血腫が形成され得る。血腫は、望ましい骨形成部位から離れた、または望ましい骨形成部位に隣接して形成されるか、またあるいは、存在し得る。例えば、外科的方法の間に損傷または挫傷した組織は血液や他の液体を滲出させ、この組織は外科的縫合後にも血液／液体を滲出させ続けることがある。この血液／液体は貯蔵され、組織の腔や嚢中（例えば脊椎管や椎間孔の隙間の中）に集まる。
【００２０】
骨誘導性組成物は、血腫または瘢痕組織の骨組織への石灰沈着を誘発させる可能性があるため、場合によっては血腫または瘢痕組織への骨誘導性組成物の拡散を最小化することが望ましい。
【００２１】
本発明の一つの観点において、隣接した脊椎骨を固定する方法、あるいは、骨成長を局在化する方法が提供される。本発明の一つの形態において、脊椎骨は、ＰＬＩＦまたはＴＬＩＦ法によって固定される。初めに患者を、外科的方法のために前処理する。例えば、患者を、手術台上に、典型的には患者の骨盤を床と平行にした腹臥位で適切に配置させる。次に、外科的方法論および道具を利用して、固定しようとする脊椎骨（例えば選択された腰椎椎間板）のレベルの進入路を確保する。次に、椎間板埋込物またはスペーサーを受け入れるために、椎間板の隙間および隣接した脊椎骨を前処理する。有利な骨誘導性組成物を保持するように、スペーサーを前処理または形成する。本発明の特定の形態において、スペーサーを用いず、骨誘導性組成物を椎間板の隙間に注入またあるいは配置するので、多くの場合に脊椎埋込物の設置のために必要な切開外科手術を行わなくてよい。
【００２２】
本発明は、低侵襲外科手術法と併せることができる。椎間板の隙間は、当業者既知の低侵襲の方法で前処理することができ、典型的には、患者にわずかな切開（例えば約３０ｍｍ以下）を施し、患者に経皮的にカニューレを挿入し、それによって必要な道具を外科手術部位に到達させ、外科手術部位で操作することができる。骨誘導性組成物は、椎間板の隙間に注入することができる。
【００２３】
その上、望ましい場合、または医学的に賢明と思われる場合は、ロッドやプレートなどの脊椎のインスツルメンテーションを、有利に本発明の特定の形態で利用することができ、固定過程における術後に望ましい椎間板の隙間の高さを維持または保持し、椎間板の隙間がつぶれることを防ぐ。
【００２４】
骨誘導性組成物は、製薬上許容できる徐放性担体と結合させる。骨誘導因子を徐放させる好ましい担体が選択される。「徐放性」とは、本明細書において、担体からの骨誘導因子の放出を実質的に減少させ、それにより担体または埋込物から離れた組織、典型的には担体または埋込物に隣接した組織への骨誘導因子の移動または拡散を実質的に減少させる速度での、骨誘導因子の放出を意味するものと定義される。離れた部位とは、瘢痕組織または他の線維組織、血腫、または他の血液細胞もしくは組織の集積を含み、これらは骨組織成長する傾向を示す。従って、本明細書で定義される「徐放性」はまた、望ましくない位置での骨組織形成を実質的に減少させる速度での骨誘導性組成物の放出を意味する。また、徐放性とは、担体からの骨誘導性組成物の放出に関する半減期が、典型的に、約２日を超過、好ましくは少なくとも約４日を超過、より好ましくは少なくとも約７日を超過、さらにより好ましくは少なくとも約１４日を超過する放出速度を含む。骨誘導性組成物に関して、半減期とは、組成物の質量の５０％が担体から放出されるのに係る時間を意味する。一実施形態において、骨誘導性組成物は、約８〜約１２週の範囲で担体からの放出を終える。
【００２５】
他の形態において、本発明の担体は生分解性であり、それらの完全な状態を維持するような半減期を示す。担体の半減期とは、担体の質量の半分が分解または吸収する時間である。一実施形態において、担体は、埋め込み後、典型的には約２日を超過、好ましくは少なくとも約４日を超過、より好ましくは少なくとも約１０日を超過、さらにより好ましくは少なくとも約１４日を超過する半減期を有する。さらに、他の実施形態において、担体の選択または配合は、埋め込み後少なくとも８週までは、担体が完全には分解しないか、または、担体の質量または体積が０に近づかず、より好ましくは、埋め込み後約１６週の前には、選択された担体が完全には分解しないか、または、担体の質量／体積が０に減少しないようになされる。
【００２６】
担体は、高温で流動性を有するか、または注射可能であるように選択および／または配合することができ、当該担体はより低温で硬化する。高温とは、組織のダメージを引き起こすような高いレベルであるべきではなく、従って、高温とは、典型的に、約６０℃未満、より好ましくは約５０℃未満、さらにより好ましくは約４５℃未満であるように選択される。低温とは、担体がその選択された構造を体温で十分に維持できるような高さであるべきであり、感染症や他の生理現象による発熱に起因する正常な体温レベルより高い温度を考慮に入れることができる。低温レベルは、少なくとも約３７℃、より好ましくは少なくとも約４０℃であるように選択することができる。
【００２７】
その他の実施形態において、ポリマーベースの担体が選択される。ポリマーベースの担体としては、スポンジ様基材でみられるような孔を有するポリマー基材が好ましい。ポリマー材料は、米国特許出願第０９／６９６，３８９号、第０９／６９６，１４６号または第０９／６９６，７１５号（全て２０００年１０月２５日付で出願された）で説明されたような形状記憶ポリマー材料が可能である。ポリマー材料は、骨誘導性組成物を徐放するように改変できる。例えば、ポリマー鎖間の架橋を増やすことや、ポリマーと、コラーゲン、ゼラチンもしくはカルボキシメチルセルロースまたはグリカンと結合させることは、骨誘導性組成物をポリマー基材中へ取り込ませることに役立つ。
【００２８】
本発明において、多種多様な担体を用いることができる。適切な担体としては、ポリマー類、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸との交互共重合体、ポリエチレングリコールが挙げられる。これらポリマーで、骨誘導性の物質を浸潤させるための気孔を有するスポンジのような基材を形成することができる。必要に応じて、これらポリマーは、適切な放出特徴を達成するために、１以上のカルボキシメチルセルロースヒアルロン酸、グリカン類（例えばグリコサミノグリカン）、ゼラチン、および／またはコラーゲンと結合させることができる。これらポリマーからの放出速度は、例えば、ポリマー鎖長および／または架橋の誘導および／または増加のような化学修飾により、セミ相互侵入高分子網目（ＳＩＰＮ）または相互侵入高分子網目（ＩＰＮ）、星型高分子のポリマー複合体およびポリマーブレンドまたはポリマーアロイ、ならびにそれらの組み合わせを形成することによって、さらに影響を与えることができる。さらに、カルボキシメチルセルロースヒアルロン酸、グリカン類（例えばグリコサミノグリカン）、ゼラチン、および／またはコラーゲンは、これら組成物の濃度を増加させることによって適切な放出特徴を示すように改変することができる。
【００２９】
本発明に用いるのに適切な他の担体としては、吸収性セメント、例えば、リン酸カルシウム、リン酸三カルシウムおよびヒドロキシアパタイトベースのセメントが挙げられる。吸収性セメントとは、実質的に本明細書で説明された徐放性特性を有する非晶質材料であり得る。一つの形態において、担体は、選択された骨誘導性組成物により高い親和性を有するように配合される。次に、これら担体を、選択された骨形成性の組成物と結合および／または調合することができる。
【００３０】
一つの形態において、担体は、リン酸カルシウムセメントとして提供される。このようなリン酸カルシウムセメントは、好ましくは、合成リン酸カルシウム材料であり、例えば、劣った結晶性または低結晶性のリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイトのような、低結晶性または劣った結晶性のアパタイトが挙げられ、これらはEtex社から購入でき、例えば、米国特許第号５，７８３，２１７；５，６７６，９７６；５，６８３，４６１；および５，６５０，１７６、ならびにＰＣＴ国際公報ＷＯ９８／１６２６８、ＷＯ９６／３９２０２およびＷＯ９８／１６２０９（全てLee等による）で説明されたようなものである。「劣った結晶性または低結晶性」という用語を使用する際は、小さいサイズまたは長くない範囲のサイズの非晶質材料、および／または、ナノメーターまたはオングストロームサイズの結晶性領域を示すナノ結晶性の材料を含むことを意味する。担体のカルシウム：ホスフェートの割合は、典型的に、約０．３〜約０．７、より好ましくは約０．４〜約０．６の範囲である。
【００３１】
他の形態において、担体は、実質的に密閉気孔構造を示すように改変することができる。実質的に密閉気孔の基材に担体を改変する前に、骨誘導性の物質と、担体材料または前駆物質とを、結合または混合させることが好ましい。骨誘導性の物質は、基材中の内部胞に捉えられる。使用の際、担体材料はゆっくりと侵食され、担体材料が侵食させるにつれ、骨誘導性の物質が添加された内部胞が露出する。露出した胞は、そこに含まれる骨誘導性の物質を放出する。担体の生分解速度を望ましいように変更し、骨誘導性の物質の放出速度を変更することができる。
【００３２】
本明細書で説明された担体を利用して、骨形成を有利に担体の体積に限定する。従って、形成された骨は、埋め込み時の担体の原型のように構成または形成することができる。担体が吸収されるにつれて骨誘導因子を実質的に放出するように、担体は、骨誘導因子を担体中に閉じ込めるか、またあるいは取り込むことができる。別の言い方をすれば、担体は、有利に骨誘導因子の流出に対して実質的に不浸透性とすることができる。さらに好ましくは、実質的に上述の不必要な骨形成領域への骨誘導因子の移動またあるいは拡散が起こらないように担体を選択するか、または、このような領域へ移動し得る骨誘導因子の量を実質的に骨組織を発生を誘導するのに不十分な量にする。
【００３３】
多種多様な骨誘導因子が骨形成性の組成物に用いることができ、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質（mineralization protein）（ＬＭＰ）（例えばＬＭＰ−１）、成長分化因子（ＧＤＦ）、軟骨誘導性の形成タンパク質（cartilage-derived morphogenic protein）（ＣＤＭＰ）、および、他の成長因子、例えば上皮成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子およびトランスフォーミング成長因子（例えばＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−α）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。多種多様な骨形成タンパク質が考慮され、例えば、ＢＭＰ−２〜ＢＭＰ−１８と指定される骨形成タンパク質、それらのヘテロ二量体、および、それらの組み合わせが挙げられる。タンパク質は、組換えタンパク質、例えば組換えヒトタンパク質であり得る。適切な組換えヒト骨形成タンパク質（ｒｈＢＭＰ）としては、ｒｈＢＭＰ−２およびｒｈＢＭＰ−７が挙げられる。
【００３４】
ＢＭＰは、Genetics Institute社（Cambridge, Massachusetts）から入手可能であり、Wozney等の米国特許第５，１８７，０７６号；Wozney等の第５，３６６，８７５号；Wang等の第４，８７７，８６４号；Wang等の第５，１０８，９２２号；Wang等の第５，１１６，７３８号；Wang等の第５，０１３，６４９号；Wozney等の第５，１０６，７４８号；およびWozney等のＰＣＴ特許ＷＯ９３／００４３２号；Celeste等のＷＯ９４／２６８９３号；およびCeleste等のＷＯ９４／２６８９２号で説明されるように当業者によって調製することもできる。全ての骨形成タンパク質は、上記のように入手するか、または、骨から分離するかのいずれかが考慮される。骨形成タンパク質を骨から分離する方法は、例えば、Uristの米国特許第４，２９４，７５３号、およびUrist et al., 81 PNAS 371, 1984で説明される。
【００３５】
骨誘導性組成物は、骨誘導因子、または、製薬上許容できる担体中で骨誘導因子がインビボで生産されるようにそれぞれの骨誘導因子をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ヌクレオチド配列は、実施可能なようにプロモーター配列に連結させることができ、ベクター（例えばプラスミドベクター）に挿入することができる。核酸配列が、他の核酸配列と特定な機能的関連を持たせて設置した場合、他の核酸配列に「実施可能なように連結（operably linked）」される。
【００３６】
他の実施形態において、細胞を、骨誘導因子をコードしたヌクレオチド配列で形質転換することができ、従って、骨誘導性組成物は製薬上許容できる担体中に形質転換細胞を含み得る。他の形態において、骨誘導性組成物は、ウイルス、例えば、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質の細胞内生産を起こすことができるアデノウイルスを含む。
【００３７】
吸収性セメント担体を利用する際、担体中に、細胞を維持する成分をさらに含ませる。細胞を維持する成分とは、細胞が骨誘導因子を生産できるように細胞に養分を供給する成分である。また、細胞を維持する成分は、担体が吸収される速度、または、骨誘導因子が放出される速度を実質的に変更またあるいは改変しないように選択される。このような細胞を維持する成分としては、コラーゲン、および、生体外での細胞培養に利用される様々な細胞培地、例えば注入可能な培地（infusible media）、例えば約５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加した一般的な食塩水、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、または、ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０、または、無血清培地配合品（例えばX VIVO製品）が挙げられ、また、上記成分はこれらの組み合わせを含む。
【００３８】
本発明のさらなる他の形態において、ヌクレオチド配列は、運搬のために担体と直接結合させることができる。
担体に含まれる骨誘導因子の量、および、処理部位に適用される量は、典型的に、新しい骨の形成に有効な量、および、隣接した脊椎骨の結果的な固定に有効な量である。この量は、骨誘導因子の特徴、骨誘導因子の骨誘導性の潜在力、および、担体の特徴などの様々な要素に依存するが、典型的に、約０．５ｍｇＢＭＰ／ｍｌ担体〜約４ｍｇＢＭＰ／ｍｌ担体である（重量の割合で、ＢＭＰ：乾燥担体＝約１：２０００〜約１：２５０に対応する）。当該組成物は、約１ｍｇＢＭＰ／ｍｌ担体〜約３ｍｇＢＭＰ／ｍｌ担体で構成されるが（重量の割合で、ＢＭＰ：乾燥担体＝約１：１０００〜約１：３３３に対応する）、典型的に、少なくとも約２ｍｇＢＭＰ／ｍｌ担体で構成される（重量の割合で、ＢＭＰ：乾燥担体＝少なくとも約１：５００に対応する）。また、固定部位に適用される骨誘導性組成物の量は変更することができるが、典型的に、約２ｍｇＢＭＰ〜約４０ｍｇＢＭＰ、好ましくは約４ｍｇＢＭＰ〜約２０ｍｇＢＭＰ、典型的に、少なくとも約１２ｍｇＢＭＰを運搬するのに十分な量である。
【００３９】
加えて、多種多様な異なる埋込物またはスペーサーを本発明に用いることができる。埋込物またはスペーサーは、本明細書で説明された骨誘導性組成物を保持するように構成することができる。埋込物は、骨誘導性組成物を封入、設置、またあるいは保持することができるチャンバー、流路、孔または他の隙間を含み得る。埋込物またはスペーサーは、吸収性／生分解性、または、非吸収性（nonresorbable）／生分解性のいずれかであり得る。さらに、埋込物は、ケージのような椎骨間固定装置であってもよく、当該ケージはチャンバーをその中に有し、必要に応じて骨誘導性組成物の保持をさらに補助するエンドキャップを有する。適切な埋込物の例は、米国特許第４，９６１，７４０号；第５，０１５，２４７号；第５，４２３，８１７号、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０８１９３号およびＰＣＴ／ＵＳ０１／０８０７３号、ならびに公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９９／２９２７１号において見出すことができる。
【００４０】
また、上述の脊椎埋込物および骨誘導性組成物を含む椎骨間固定装置も提供され、椎骨間固定術、特にＰＬＩＦまたはＴＬＩＦ法の間に、本明細書で説明されたような望ましい領域に骨を局在化させるのに有利に用いることができる。
【００４１】
本明細書で説明された脊椎埋込物を利用した方法において、埋込物を椎間板の隙間に挿入する前に、骨誘導性組成物を、好ましくは、本明細書で説明された脊椎埋込物中に配置もしくはその上に配置するか、または、脊椎埋込物に連結させる。骨誘導性組成物は、椎間板の隙間に埋込物を挿入する前に、埋込物中の１以上のチャンバー中に配置することができる。さらに、埋込物を椎間板の隙間に設置する間、またはそのように設置した後、骨誘導性組成物を埋込物上またはその中に保持またあるいは配置することができることも理解される。埋込物を椎間板の隙間に配置した後、当該組成物を埋込物の上またはその中に配置する際、担体をフロアブル形態で利用することが好ましく、当該フロアブル形態は、ほぼ体温で硬化することが好ましいが、埋込物の上またはその中に担体を配置する前に、担体が、インビボで、薬理学的な温度、ｐＨで、かつ、骨組織や結合組織の近傍で見出されるような選択された体液中で最終的に硬化形態または硬化状態でありさえすれば、担体は、フロアブルの形態または非フロアブルの形態、硬化可能な形態または硬化形態などの多種多様な形態も可能であることが理解される。
【００４２】
ここで参考文献は、上述の組成物、方法および装置を説明する特定の実施例に対して示される。実施例は好ましい実施形態を説明するために提供されたものであり、それにより本発明の範囲を限定することは意図しない、ということが理解される。
【実施例】
【００４３】
実施例１：アカゲザルの単一レベル（single−level）後外側固定
この実施例は、アカゲザルで実施された、本明細書で説明された骨代用組成物を用いた後外側固定により、骨代用組成物が占める体積に限定された新しい骨形成が起こったことを示す。
【００４４】
動物および実験計画
２匹のアカゲザルからなる群を２つ用いて、後側方横突起固定術（posterolateral transverse process fusion）を行った。その群の１つは、標準のα−骨代用材料（標準のα−ＢＳＭ：登録商標）、市販のリン酸カルシウムセメント（Etex社（Cambridge, MA）から購入）からなる担体中にｒｈＢＭＰ−２を受け入れた。この標準材料は、４０％の微孔質を含む。もう一方の群は、改変α−ＢＳＭ：登録商標（Etex社から購入した骨代用材料であり、４０％を超過する多孔度を有する）の担体中にｒｈＢＭＰ−２を受け入れた。この第二の群において、脊椎の左側を、８０％の多孔度を有するα−ＢＳＭ：登録商標の担体に含まれるｒｈＢＭＰ−２で処理し（上記多孔度は、液含量を増やすことによって増加した）、脊椎の右側を、標準のα−ＢＳＭ：登録商標にコラーゲン線維を添加してから、約８０％の多孔度を有するα−ＢＳＭ：登録商標で処理した。固定の程度を、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）およびＸ線分析で観察した。
【００４５】
ＢＭＰ／担体の前処理
Genetics Institute（Cambridge MA）から得た緩衝液（ｐＨ４．５）に、ｒｈＢＭＰ−２を添加した。そのｒｈＢＭＰ−２溶液を針とシリンジで与えられたバイアルから取り出し、α−ＢＳＭ：登録商標の乾燥粉末を含むプラスチック製の混合用「バルブ」に注入した。次に、パテ状混合物が得られるまで、手動でプラスチック製バルブを約２〜３分間練ることによってその粉末を混合した。バルブの先端を切り取り、そのパテ物質を、それぞれの脊椎の後外側固定部位に適用またあるいは投与した。ｒｈＢＭＰ−２濃度は、２．１ｍｇＢＭＰ／ｍｌ担体であった。約１５ｎｇのＢＭＰと約７ｍｌのパテ状物質とを含む複合物を、脊椎のそれぞれの側に用いた。
【００４６】
結果
全ての試験動物において固定が達成され、さらに、新しい骨形成が、横突起を横切って埋め込まれた骨代用材料の形に限定されたことがわかった。図１は、埋め込み後２、４および６ヶ月における、処理された横突起部位の３つの異なるレベルで撮影された連続ＣＴスキャン画像であり、第一のセットは、標準Etex担体中のｒｈＢＭＰ−２で処理されたサルに関する。同様に、図２は、埋め込み後２、４および６ヶ月における、処理された横突起部位の３つの異なるレベルで撮影された連続ＣＴスキャン画像であり、第二のセットは、改変Etex担体中のｒｈＢＭＰ−２で処理されたサルに関する。図１および２を解析したところ、固定した集合体の形およびサイズが、長期間そのままであることが観察され、これは、担体がその基材中にＢＭＰを保持することを示す。担体が表面から内部へ吸収されるため、担体は新しい骨で置換され、それにより正確に制御された骨形成を実現される。
【００４７】
図３および４は、サルの脊柱における埋め込み後１、２、４．５および６ヶ月に撮影されたＸ線スキャン画像であり、それぞれ図１および２のＣＴスキャンに対応する。図３および４で見られるように、α−ＢＳＭ：登録商標は、長期間吸収され、横突起を横切って新しい骨で置換される。
【００４８】
実施例２：α−ＢＳＭおよびＡＣＳからのｒｈＢＭＰ−２の放出の薬物動力学的研究
α−ＢＳＭおよびＡＣＳからのｒＨＢＭＰ−２の放出の動力学を、ウサギ尺骨の骨切り術で評価した。ウサギ尺骨の骨切り術において、ｌ２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２／α−ＢＳＭまたは１２５ＩｒｈＢＭＰ−２／ＡＣＳの製品を外科的に埋め込んだ。手術後できる限りすぐに、埋込部位の放射活性を評価した。加えて、その後、定期的に（すなわち術後１、２、３、４、７、１４および２１日目に）評価した。
【００４９】
ｒｈＢＭＰ−２を、ヨードゲン法（iodogen technique）を用いて１２５Ｉで放射標識した。以下は典型的な手順である。８０μｇ／ｍＬのヨードゲン試薬溶液（Pierce, Rockford, Illinois）をクロロホルム中に調製した。この溶液のアリコート（５０μＬ）をマイクロエッペンドルフチューブに入れ、穏やかな窒素流下で乾燥するまで蒸発させた。このチューブに、３０μｇのｒｈＢＭＰ−２を加え、体積が５０μＬになるまで十分な量のＭＦＲ００８４２緩衝液を加えて、１〜２ｍＣｉの担体を含まない１２５Ｉ（Dupont NEN Research Product, Boston MA）を加えた。この溶液を、穏やかにかき混ぜながら室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、その溶液を、１カラム体積のＭＦＲ００８４２緩衝液で予め平衡化したＮＡＰ−５カラム（セファデックスＧ−２５、Pharmacia, Uppsala, Sweden）に加えた。反応混合物を加えた際、カラムは約１００μＬのＭＦＲ００８４２を含む。ヨウ化タンパク質を、ＭＦＲ００８４２緩衝液でカラムから溶出させ、５００μＬの分画を回収した。５μＬの各分画を２９５μＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１０ｍｇ／ｍＬ）と２００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）とを含むポリスチレンチューブに添加することによって、各分画中の総１２５Ｉ含有量を測定した。各チューブを、ガンマ線測定器で総活性に関して計数した。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿可能な放射活性を以下のように測定した：５００μＬの２０％ＴＣＡを各チューブに加え、約７００×ｇで１０分間遠心分離した。５００μＬの上清を計数し、可溶性の放射活性を以下の方程式で決定した。
【００５０】
【数１】
2010214123.tif 000002
【００５１】
５％未満の可溶性であった分画を貯蔵し、４℃で保存した。各ヨウ素化は、４００μＬの緩衝液中に、約３．３×１０９のＣＰＭ（計数毎分）で３０μｇのｒｈＢＭＰ−２を生産した。
【００５２】
α−ＢＳＭ試験埋込物を、実施例１で上述したように前処理した。α−ＢＳＭの臨床用製剤のＬ：Ｓの割合は、０．８５を示し、湿潤した製剤のＬ：Ｓの割合は、１．０を示した。
【００５３】
ＡＣＳは、吸収性コラーゲン源（Helistat:登録商標、Integra Life Sciences Holdings社（Plainsboro, N.J.）から購入できる）であり、緩衝液（ＭＦＲ００９２６）中の１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２のサンプルをコラーゲン源片にピペットで注入することによって前処理した。試験埋込物を約５分間放置して、放置後できる限りすぐに被検ウサギに埋め込んだ。
【００５４】
その部位の放射活性を、ガンマシンチグラフィー（Siemans Orbitor Gamma Camera）を用いて評価した。ガンマカメラ画像を数量化するために、ファントムを現像しなければならない。ファントムは、既知量の１２５Ｉ標識ｒｈＢＭＰ−２を含むバイアルをウサギ死体中の埋め込み部位に埋め込むことによって観察される活性の減衰に基づいて設定された。１２５Ｉの崩壊を長期間にわたり調べるために、ファントムを各時間ポイントで評価した。外科的縫合した後（埋め込み後５〜１０分）、上記部位におけるゼロ時間（Ｔ０）の放射活性を評価した。その後、動物を麻酔し、必要に応じて評価した。
【００５５】
図５は、上述したように前処理および測定したα−ＢＳＭ中のｒｈＢＭＰ−２の保持特性を説明したグラフである。グラフから、ＡＣＳコラーゲンスポンジ担体に比べかなり遅い速度で骨形成性の組成物がＢＳＭ担体から放出されることが観察できる。
【００５６】
図６は、上述したように前処理されたα−ＢＳＭからのｒｈＢＭＰ−２の放出速度論を説明したグラフである。この結果より、α−ＢＳＭ中におけるｒｈＢＭＰ−２の保持率が、吸収性コラーゲン源、Helistat（登録商標）中の同ｒｈＢＭＰ−２の保持に比べてかなり高かったことが示される。
【００５７】
本発明の実施形態は、図面および上記した説明中に詳細に説明および記載されているが、これらは説明のためであり、特徴を限定することはなく、本発明の本質の範囲内の全ての変更および改変が保護されることが望ましいと理解されるべきである。加えて、本明細書で引用された全ての参考文献は、その全体を参照することによって本明細書に含まれる。
【図５】
2010214123.tif 000003
【図６】
2010214123.tif 000004
【図１】
2010214123.tif 000005
【図２】
2010214123.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月7日(2010.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨成長を誘導するのに有効な量の骨誘導性組成物、と
該骨誘導性組成物が中に混入された徐放性、生分解性担体であってインビボで骨誘導性組成物の流出に対して実質的に不浸透性であるように選択される徐放性、生分解性担体と
を含む組成物。
【外国語明細書】
2010214123000001.pdf