(57)【要約】      （修正有）【課題】チロシナーゼ阻害活性を有し、美白剤として有用な新規テルペノール化合物およびこれを含有する美白剤を提供する。【解決手段】バチルス属に属する微生物の培養抽出物（ヘキサン抽出物）から式（１）で表される新規テルペノール化合物を見出した。更に、これがチロシナーゼ活性阻害を有することを見出した。新規テルペノールは新規なチロキシナーゼ活性阻害剤、更にはこれを含有する美白剤として有用なものである。2010168313.tif 000013【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）または式(２)で表されるテルペノール化合物。
【化１】
2010168313.tif 000009
【化２】
2010168313.tif 000010
【請求項２】
請求項１記載の式（１）及び／又は式（２）で表されるテルペノール化合物を有効成分として含有することを特徴とするチロシナーゼ活性阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載の式（１）及び／又は式（２）で表されるテルペノール化合物を有効成分として含有することを特徴とする美白剤。
【請求項４】
バチルス属に属する微生物を培養する工程と、得られた培養物を有機溶媒抽出に供する工程と、有機溶媒相から下記式（１）または式（２）で表される化合物を単離する工程を含む下記式（１）または式（２）で表されるテルペノール化合物の製造方法。
【化３】
2010168313.tif 000011
【化４】
2010168313.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規テルペノール化合物並びにこれを含有するチロシナーゼ活性阻害剤及び美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロシナーゼは、メラニンの生合成に関与する酵素として知られている。メラニン生成過程において、チロシナーゼはチロシンからＬ−ドーパ（3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン）への水酸化反応、およびＬ−ドーパからドーパキノンへの酸化反応を触媒しており、生体内でチロシンからのメラニン生合成に直接影響を及ぼしている。
このような過程を経て生成されたメラニンは、生体内で紫外線による体細胞の損傷を防ぐ働きしている。その一方で、過剰なメラニン生成が、皮膚の黒化や色素沈着によるシミ・ソバカス、ひいては皮膚の老化を引き起こす原因となることも知れられており、美容上のみならず健康面からも問題視されている。
【０００３】
そのため従来から、過剰なメラニン生成を抑制するために、チロシナーゼ活性をコントロールすることが提案されており、チロシナーゼ活性を阻害する物質の探索が行われている。例えば、ビタミンＣ、アルブチン、コウジ酸等がチロシナーゼ活性を阻害する物質として知られている。しかし、従来のチロシナーゼ活性阻害物質には、安全性や安定性の面で問題のあるものが多いのが現状であり、さらなるチロシナーゼ活性阻害物質の開発が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、チロシナーゼ阻害活性を有し、美白剤として有用な新規化合物並びに該化合物を含有するチロシナーゼ活性阻害剤および美白剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明者等は鋭意検討を行った。その結果、バチルス属に属する微生物の培養抽出液から、新規なテルペノール化合物を見出した。さらに、これらの化合物がチロシナーゼ阻害活性を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
すなわち本発明は、下記式（１）または式（２）で表されるテルペノール化合物およびその製造方法に関する。
また、本発明は下記式（１）または式（２）で表されるテルペノール化合物を含有するチロシナーゼ活性阻害剤に関する。
さらに、本発明は下記式（１）または式（２）で表されるテルペノール化合物を含有する美白剤に関する。
【０００７】
【化１】
2010168313.tif 000002
【０００８】
【化２】
2010168313.tif 000003
【０００９】
なお、本発明において、「美白（作用）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のテルペノール化合物は、チロシナーゼ阻害活性を有し、新規なチロシナーゼ活性阻害剤、さらには美白剤として有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１における、本発明の化合物のチロシナーゼ活性阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の化合物を詳細に説明する。
本発明の化合物は、前記式（１）または式(２)で表されるテルペノール化合物である。
【００１３】
本発明の前記式（１）または(２)で表されるテルペノール化合物の製造方法に特に制限はなく、例えば、バチルス属に属する微生物の培養抽出物から単離することができる。
【００１４】
本発明に使用できるバチルス属に属する微生物としては、枯草菌６−１０株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８３５）が好ましい。枯草菌６−１０株は、本発明者が単離し、２００６年３月８日付で、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に寄託された微生物である。
【００１５】
バチルス属に属する微生物の培養抽出物の調製方法のとしては、例えば、バチルス属に属する微生物を培養し、培養液を有機溶媒抽出することが挙げられる。
培養に使用する培地としては、バチルス属に属する微生物を培養できるものであれば特に制限はなく、例えば、K培地(後述の表１に示す組成から成る培地)、SCD寒天培地「ダイゴ」(日本製薬(株)製)やMRS培地（Oxoid製）等の市販培地が挙げられる。培養温度は、例えば、１５〜４５℃、好ましくは３０〜３７℃とする。培養方法は、静置培養又は振盪培養のいずれであってもよい。培養時間は、例えば６時間〜６日間、好ましくは１２時間〜４日間とする。
【００１６】
本発明においては、上記で得られた培養液をそのまま用いて、下記に記載の溶媒抽出を行っても良い。また、得られた培養液の上清を分離して、培養上清を下記の溶媒抽出に供しても良い。培養液から上清を分離する方法としては、例えば、上記培養後、培養液を２０００〜１００００ｒｐｍ（好ましくは４０００〜９０００ｒｐｍ）で５〜６０分間（好ましくは１０〜３０分間）遠心分離する方法が挙げられる。
【００１７】
次いで、得られた培養液（または培養上清）を有機溶媒抽出に供する。ここで使用する有機溶媒としては、例えば、ヘキサンやオクタン、トルエン等の炭化水素、エタノール、プロパノール等のアルコール系溶媒、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、アセトン、酢酸エチル及びこれら有機溶媒の混合物が挙げられる。特に、水層との分離の観点から疎水性溶媒が好ましく、酢酸エチル、ヘキサン及びこれらの混合物がより好ましい。培養液に対する有機溶媒の割合は、例えば、容量比で１０：１〜１：１０（培養液：有機溶媒）、好ましくは２：１〜１：４とする。分離し、得られた有機溶媒相自体を、前記式（１）または式（２）で表される化合物を単離するために用いることができる。あるいは、必要に応じて、得られた有機溶媒相を、希釈、濃縮、乾固等に供してもよい。例えば、濃縮及び乾固に供した後、エタノール等の有機溶媒に溶解したものを培養抽出物とすることができる。さらに、この有機溶媒抽出工程は、同じか又は異なる種類の有機溶媒を用いて繰り返してもよい。
【００１８】
特に、有機溶媒抽出で酢酸エチルを用いた場合には、さらにメタノール／ヘキサンを用いて、再度有機溶媒抽出を行うことが好ましい。ここで使用するメタノールの濃度は、例えば１０〜９０％、好ましくは２０〜７０％である。一方、ヘキサンの濃度は例えば１〜８９％、好ましくは２３〜７８％である。この場合には、分離したヘキサン相を培養抽出物として用いる。あるいは、上述と同様に、分離したヘキサン相を希釈、濃縮、乾固等に供してもよい。
【００１９】
得られた有機溶媒相（例えば、ヘキサン相）から溶媒を留去し、クロマトグラフィーなどの分画法に付すことにより本発明の化合物を得ることができる。例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを利用して有機溶媒相（ヘキサン相）に含まれる化合物を極性の順に分画し、場合によっては、さらに、ＵＶ吸収などをモニターしながら高速液体クロマトグラフィーを用いて分画精製して、本発明の化合物を単離することができる。
【００２０】
また、本発明のテルペノール化合物は酵素変換法を用いて製造することもできる。酵素変換の方法として、例えば、下記に示す方法が挙げられる。
微生物の代謝物として公知のβ-クルクメンあるいはα-クルクメン（例えば、文献：CHEMISTRY＆BIODIVERSITY、３，６２２（２００６）参照）にテルペン環化酵素（例えば、文献：薬学雑誌、１２８（８）、１１０９（２００８）参照）を作用させる事によって各々、前記式（１）および式（２）で示される本発明のテルペノール化合物を製造することができる。
【００２１】
【化３】
2010168313.tif 000004
【００２２】
本発明の化合物は、チロシナーゼ活性阻害効果を有しており、チロシナーゼ活性阻害剤、美白剤に好ましく用いることができる。
本発明のチロシナーゼ活性阻害剤および美白剤は、それぞれ前記式（１）及び／又は式（２）で表される本発明のテルペノール化合物を有効成分として含有する。
【００２３】
本発明のチロシナーゼ活性阻害剤および美白剤における本発明の化合物の配合量は、効果を得られる範囲であれば特に限定されないが、それぞれ概ね０．０００００１〜５重量％の範囲とすることが好ましく、０．００００１〜１重量％であることがより好ましい。
【００２４】
本発明のチロシナーゼ活性阻害剤および美白剤には、本発明の化合物以外に、本発明の効果を損なわない範囲で任意の成分を配合してもよい。例えば、酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を加えることができる。
【００２５】
本発明のチロシナーゼ活性阻害剤および美白剤は、皮膚外用組成物および化粧料組成物に用いることができる。これら皮膚外用組成物および化粧料組成物の形態としては、軟膏、ローション、クリーム、乳液、美容液、化粧水、マッサージ剤、パック、ファンデーション等が挙げられる。また、本発明のチロシナーゼ活性阻害剤および美白剤以外に、通常の皮膚外用組成物および化粧料組成物に用いられる成分、例えば保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート類、ｐＨ調整剤、乳化安定剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を任意に組み合わせて配合することができる。
【００２６】
本発明のチロシナーゼ活性阻害剤または美白剤を皮膚外用組成物または化粧料組成物として用いる場合、それらの使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１cm2当たり０．０５ｇ〜０．５ｇ、液状製剤の場合、同じく０．０１ｇ〜０．１ｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
製造例
（１）枯草菌６−１０株からの培養抽出物（ヘキサン抽出物）の調製
枯草菌６−１０株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８３５）を下記組成のＫ培地５００ｍｌを入れた２本の２Ｌ容フラスコに接種し、３０℃で２日間振とう培養を行った。その後、培養液に酢酸エチルを１．５リットル添加し、５時間攪拌して分相した。得られた酢酸エチル相を濃縮乾固した後、９０％メタノール／ヘキサン（１０ｍｌ／１０ｍｌ）で分画した。得られたヘキサン相を乾固し、これをヘキサン抽出物とした（収量：培地１リットルあたり１０ｍｇ）。
【００２９】
【表１】
2010168313.tif 000005
【００３０】
（２）化合物の単離
上記（１）で得られたヘキサン抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーと順相ＨＰＬＣを用いて精製した。まず、１．５ｇのヘキサン抽出物をフラッシュカラム（山善社製：２Ｌ；２６×１５０ｍｍ；４０μｍ，４５ｇ）を用いて、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン／酢酸エチル：１００／０〜０／１００）を溶出溶媒として分画し、画分（１００ｍｇ）を得た。この画分をさらに順相ＨＰＬＣカラム（関東科学Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  Ｓｉ６０；２５０−２０；５μｍ）に供し、得られた画分（５．７ｍｇ）から化合物Ｃ１（１．２ｍｇ）およびＣ２（３．５ｍｇ）を単離した。各々の化合物Ｃ１およびＣ２のＮＭＲ解析データを下記に示す。
【００３１】
【表２】
2010168313.tif 000006
【００３２】
【表３】
2010168313.tif 000007
【００３３】
実施例１  チロシナーゼ活性阻害効果の測定
上述の製造例で得られた化合物Ｃ１またはＣ２を、それぞれヘキサンに溶解して０．５質量％溶液を調製し、これをさらにエタノールで１０倍に希釈して、濃度０．０５質量％の化合物Ｃ１、Ｃ２サンプル溶液を調製した。このサンプル溶液１０μＬと０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）８５μＬ、５０００Ｕ／ｍＬのチロシナーゼ（マッシュルーム由来：シグマ社製）５μＬを混合し、３７℃で１０分間保持した。チロシナーゼの基質としてＬ−ドーパ（０．１５質量％）を５０μＬ添加し、３７℃で５分間保持した後、マイクロプレートリーダーにて４９０ｎｍの吸光度を測定した。
測定した吸光度をもとに、サンプル溶液のチロシナーゼ活性阻害効果を評価した。チロシナーゼ活性は、サンプル溶液の代わりに上記リン酸緩衝液を等量加えた系の吸光度を基準として、その相対値で算出した。結果を表４および図１に示す。
なおポジティブコントロールとして、サンプル溶液の代わりに、チロシナーゼ活性阻害効果が従来から知られているビタミンＣ（０．０５質量％）を等量用いた系を使用した。
【００３４】
【表４】
2010168313.tif 000008
【００３５】
表４及び図１の結果から明らかなように、単離化合物Ｃ１及びＣ２はともにチロシナーゼ活性が低下しており、チロシナーゼ活性阻害効果を有することがわかった。
前述のように、チロシナーゼはメラニン生合成に関与する酵素である。したがって、表４の結果から、本発明の前記単離化合物Ｃ１及びＣ２は、チロシナーゼ活性を抑制することでメラニン産生を抑制し、その結果、美白作用を有することがわかる。
【図１】
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