(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫応答を誘導する際の使用に適した、コア粒子と１つ又は複数のアンジオテンシンペプチドもしくはアンジオテンシンペプチ部分とを含む複合体の提供。【解決手段】担体、特に、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に結合させることにより、反復骨格において提示される、哺乳動物ペプチドホルモンアンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩおよびアンジオテンシンＩＩのペプチド誘導体の複合体。そのような複合体を生産する方法、およびレニンにより活性化されたアンジオテンシン系に関連する状態の治療と予防のための得られた免疫原複合体の免疫療法上の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの第１付着部位を有する担体、及び
（ｂ）少なくとも１つの第２付着部位を含んでなり、
前記担体がコア粒子を含み、及び
前記第２付着部位が、規則正しい反復アンジオテンシンペプチド部分−担体複合体を形成するように、少なくとも１つの共有結合により前記第１付着部位に結合することができる、
アンジオテンシンペプチド部分−担体複合体。
【請求項２】
前記コア粒子がウイルス又はウイルス様粒子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
（ａ）少なくとも１つの第１付着部位を有する担体、及び
（ｂ）少なくとも１つの第２付着部位を有する少なくとも１つのアンジオテンシンペプチド部分を含んでなり、
前記担体がウイルス又はウイルス様粒子であるコア粒子を含み、
前記第２付着部位が、規則正しい反復アンジオテンシンペプチド部分−担体複合体を形成するように、少なくとも１つの共有結合により前記第１付着部位に結合することができる、
アンジオテンシンペプチド部分−担体複合体。
【請求項４】
前記ウイルス様粒子が、
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、
（ｂ）麻疹ウイルスの組換えタンパク質、
（ｃ）シンドビスウイルスの組換えタンパク質、
（ｄ）ロタウイルスの組換えタンパク質、
（ｅ）口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質、
（ｆ）レトロウイルスの組換えタンパク質、
（ｇ）ノルウォークウイルスの組換えタンパク質、
（ｈ）アルファウイルスの組換えタンパク質、
（ｉ）ヒト乳頭腫ウイルスの組換えタンパク質、
（ｊ）ポリオーマウイルスの組換えタンパク質、
（ｋ）バクテリオファージの組換えタンパク質、
（ｌ）ＲＮＡファージの組換えタンパク質、
（ｍ）Ｑβファージの組換えタンパク質、
（ｎ）ＧＡファージの組換えタンパク質、
（ｏ）ｆｒファージの組換えタンパク質、
（ｐ）ＡＰ２０５ファージの組換えタンパク質、及び
（ｑ）Ｔｙの組換えタンパク質
からなる群から選択される組換えタンパク質又はその断片を含む請求項２又は３に記載の複合体。
【請求項５】
前記ウイルス様粒子がＢ型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項２又は３に記載の複合体。
【請求項６】
Ｂ型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質のアミノ酸配列が配列番号１の配列と８０％同一である請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記コートタンパク質が、少なくとも１つのリシン残基の欠失により、挿入による少なくとも１つのリシン残基の付加により、又は少なくとも１つのリシン残基の置換により修飾された、請求項５に記載の複合体。
【請求項８】
前記ウイルス又はウイルス様粒子がＲＮＡバクテリオファージのタンパク質又はその断片を含む、請求項２又は３に記載の複合体。
【請求項９】
前記ＲＮＡバクテリオファージが、
ａ）バクテリオファージＱβ、
ｂ）バクテリオファージＲ１７、
ｃ）バクテリオファージｆｒ、
ｄ）バクテリオファージＧＡ、
ｅ）バクテリオファージＳＰ、
ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
ｇ）バクテリオファージＭ１１、
ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
ｊ）バクテリオファージｆ２、
ｋ）バクテリオファージＡＰ２０５、及び
ｌ）バクテリオファージＰＰ７
からなる群から選択される請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
前記ウイルス様粒子がバクテリオファージＱβの組換えタンパク質又はその断片を含む、請求項２又は３に記載の複合体。
【請求項１１】
前記ウイルス様粒子がバクテリオファージｆｒ又はバクテリオファージＡＰ２０５の組換えタンパク質又はその断片を含む請求項２又は３に記載の複合体。
【請求項１２】
前記ＲＮＡバクテリオファージの前記組換えタンパク質が突然変異体コートタンパク質を含む、請求項８に記載の複合体。
【請求項１３】
前記突然変異体コートタンパク質が置換による少なくとも１つのリシン残基の除去により、又は置換による少なくとも１つのリシン残基の付加により修飾された、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
前記突然変異体コートタンパク質が少なくとも１つのリシン残基の欠失により、又は挿入による少なくとも１つのリシン残基の付加により修飾された、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１５】
前記組換えタンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有する１つ又は複数のコートタンパク質を含む、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１６】
前記組換えタンパク質が配列番号４又はその突然変異体および配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物を含む、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１７】
前記組換えタンパク質が突然変異体Ｑβコートタンパク質を含む、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１８】
前記突然変異体Ｑβコートタンパク質が、置換による少なくとも１つのリシン残基の除去により、又は置換による少なくとも１つのリシン残基の付加により修飾された、請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
前記突然変異体Ｑβコートタンパク質が、少なくとも１つのリシン残基の欠失により、又は挿入による少なくとも１つのリシン残基の付加により修飾された、請求項１７に記載の複合体。
【請求項２０】
前記突然変異体Ｑβコートタンパク質が、
ａ）配列番号６のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号７のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号８のアミノ酸配列、
ｄ）配列番号９のアミノ酸配列、及び
ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項１７に記載の複合体。
【請求項２１】
前記ウイルス様粒子が、
ａ）配列番号６のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号７のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号８のアミノ酸配列、
ｄ）配列番号９のアミノ酸配列、及び
ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つ又は複数の突然変異体Ｑβコートタンパク質を含む、請求項２又は３に記載の複合体。
【請求項２２】
前記第１付着部位が、
（ａ）アミノ基、
（ｂ）カルボキシル基、
（ｃ）スルフヒドリル基、
（ｄ）ヒドロキシ基、
（ｅ）グアニジニル基、又は
（ｆ）ヒスチジニル基
を含む、請求項１又は３に記載の複合体。
【請求項２３】
前記少なくとも第１付着部位が、リシン残基、アルギニン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、セリン残基、トレオニン残基、ヒスチジン残基及びチロシン残基からなる群から選択される、請求項１又は３に記載の複合体。
【請求項２４】
前記少なくとも第１付着部位がリシン残基である、請求項１又は３に記載の複合体。
【請求項２５】
前記コア粒子が細菌線毛又は線毛様粒子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項２６】
線毛又は線毛様粒子が、
（ａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、
（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、
（ｃ）髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、
（ｄ）淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、
（ｅ）カウロバクタークレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、
（ｆ）シュードモナススツツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、
（ｇ）シュードモナス  アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、
（ｈ）サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、および
（ｉ）コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）
からなる群から選択される生物により生成されるタンパク質又は線毛タンパク質の断片を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２７】
線毛粒子が、
（ａ）１型線毛タンパク質、及び
（ｂ）Ｐ−線毛タンパク質
からなる群から選択されるタンパク質又は線毛タンパク質の断片を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２８】
線毛粒子が組換えタンパク質を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２９】
線毛粒子が組換えおよび非組換えタンパク質を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項３０】
線毛粒子が１型線毛タンパク質又はその断片を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項３１】
線毛粒子が突然変異体線毛タンパク質を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項３２】
前記線毛タンパク質が、置換による少なくとも１つのリシン残基の除去、置換による少なくとも１つのリシン残基の付加、少なくとも１つのリシン残基の欠失、又は挿入による少なくとも１つのリシン残基の付加により修飾された、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３３】
前記線毛粒子が配列番号２のアミノ酸配列を有する線毛タンパク質からなる、請求項３０に記載の複合体。
【請求項３４】
前記アンジオテンシンペプチド部分が、好ましくは、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ及びその断片もしくは誘導体からなる群から選択されるアンジオテンシンペプチドである、請求項１又は３に記載の複合体。
【請求項３５】
前記第２付着部位を含む前記アンジオテンシンペプチド部分が、
ａ）ＣＧＧＤＲＶＹＩＨＰＦ、
ｂ）ＣＧＧＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ、
ｃ）ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬＧＧＣ、
ｄ）ＣＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ、
ｅ）ＣＨＰＦＨＬ、
ｆ）ＣＧＰＦＨＬ、
ｇ）ＣＹＩＨＰＦ、
ｇ）ＣＧＩＨＰＦ、
ｈ）ＣＧＧＨＰＦ、
ｉ）ＣＲＶＹＩＧＧＣ、
ｊ）ＤＲＶＹＧＧＣ、及び
ｋ）ＤＲＶＧＧＣ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１又は３に記載の複合体。
【請求項３６】
請求項１又は３に記載の１つ又は複数の複合体及び薬剤的に許容できる担体又は賦形剤を含んでなる薬剤組成物。
【請求項３７】
免疫学的に有効量の請求項１又は３に記載の複合体及び免疫学的に許容できる担体又は賦形剤を含んでなるワクチン組成物。
【請求項３８】
前記ワクチン組成物がさらに少なくとも１つのアジュバントを含む、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
動物がアンジオテンシンペプチド部分に対する免疫応答を発現するような条件下で、動物に請求項１又は３に記載の複合体を投与することを含んでなる、アンジオテンシンペプチド部分に対して動物を免疫化する方法。
【請求項４０】
前記複合体を前記動物に、鼻腔内投与、経口投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与及び静脈内投与からなる群から選択される投与経路により投与する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記複合体を前記動物に鼻腔内投与する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
動物がアンジオテンシンペプチド部分に対する免疫応答を発現するような条件下で、動物に請求項３７に記載のワクチン組成物を投与することを含んでなる、アンジオテンシンペプチド部分に対して動物を免疫化する方法。
【請求項４３】
前記組成物を前記動物に、鼻腔内投与、経口投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与および静脈内投与からなる群から選択される投与経路により投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物を前記動物に鼻腔内投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
治療上又は予防上有効量の請求項１又は３に記載の１つ又は複数の複合体を、それを必要とする動物に投与することを含んでなる、レニンにより活性化されたアンジオテンシン系に関連した身体的障害を治療又は予防する方法。
【請求項４６】
レニンにより活性化されたアンジオテンシン系に関連した前記身体的障害が、高血圧、卒中、梗塞、うっ血性心不全、腎不全及び網膜出血からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
治療上又は予防上有効量の請求項３６に記載の薬剤組成物を、それを必要とする動物に投与することを含んでなる、レニンにより活性化されたアンジオテンシン系に関連した身体的障害を治療又は予防する方法。
【請求項４８】
治療上又は予防上有効量の請求項３７に記載のワクチン組成物を、それを必要とする動物に投与することを含んでなる、レニンにより活性化されたアンジオテンシン系に関連した身体的障害を治療又は予防する方法。
【請求項４９】
レニンにより活性化されたアンジオテンシン系に関連した前記身体的障害が高血圧、卒中、梗塞、うっ血性心不全、腎不全及び網膜出血からなる群から選択される請求項４７又は４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、公衆衛生、免疫学、分子生物学およびウイルス学の分野に属している。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の動脈血圧は、レニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）として知られている生化学的カスケードにより主として制御されている。それは、動脈血圧の降下後の腎臓の傍糸球体装置の類上皮細胞からのレニンの放出により開始される。レニンは、肝臓により血清中に分泌されるペプチドであるアンジオテンシノーゲン（アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ，配列番号１５）を酵素で切断する。この切断は、デカペプチドであるアンジオテンシンＩ（アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ，配列番号１６）の生成をもたらす。肺の内皮に存在するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、ＡＴＩの２つのＣ末端アミノ酸を数秒以内に切断して、アンジオテンシンＩＩ（アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ，配列番号１７）を生成させる。アンジオテンシンＩは、体内で非常に短い寿命を有し、血管収縮活性をまったく有さないか、わずかな血管収縮活性を有するにすぎないのに対して、アンジオテンシンＩＩは循環系ならびに内分泌系に対して著しい作用を及ぼす。ＲＡＳ活性化アンジオテンシンＩＩの濃度の上昇は、両者とも心血管損傷をもたらす可能性のある動脈圧の増加（高血圧）に寄与する、血管収縮、塩および水の腎貯留を引き起こす。高血圧の可能な臨床症状は、卒中、梗塞、うっ血性心不全、腎不全および網膜出血である。
【０００３】
米国疾病対策センター（Ｕ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ［ＣＤＣ］）によれば、うっ血性心不全が高齢者の主要な慢性疾患であり、米国においてその死者は年間約２６０，０００人にのぼる。１９９５年に、心不全に対してメディケアにより３４億ドルが支払われた。高血圧の治療用の薬剤は利用可能であるが、高血圧の制御は、治療を受けている患者の約半数で得られているにすぎない。これは、一部は、患者の服薬不履行又は使用薬剤の無効に起因している。
【０００４】
現在の高血圧療法としては、小有機分子を用いたＲＡＳ系のインターベンションが挙げられる。主な標的は、レニン、ＡＣＥおよびアンジオテンシンＩＩの受容体である。ＡＣＥ阻害薬としてはリシノプリル（登録商標）、カプトプリル（登録商標）およびエナラプリル（登録商標）などがあるが、これらの薬剤は完全には成功を収めていない。第１にそれらはＡＣＥ活性を完全には阻害しないように思われ、第２にブラジキニンなどの他の生物学的に活性なペプチドがＡＣＥにより生成されることも影響しており、これは望ましくない。これらの薬剤は、乾性咳ならびにめまいおよび起こり得る失神を伴う初回投与降圧効果のような副作用を誘発することがある。アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬としては、ＡＴ１アンジオテンシン受容体に対して特異的に作用するロサルタン（登録商標）、バルサルタン（登録商標）およびイスベサフタン（登録商標）などがある。したがって、それらはアンジオテンシンＩＩの主要な血管収縮効果を阻害し、忍容性はより良好であるが、アンジオテンシンホルモンの他の作用には影響を及ぼさない。しかし、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬ならびにＡＣＥ阻害薬は、不良な患者服薬遵守の少なくとも部分的な説明となる成人生涯の大部分にわたるような、しばしば長期間にわたり規則的に服用する必要がある。したがって、有効かつ忍容性が良好で、患者の高い服薬遵守につながる高血圧の療法が明らかに必要である。
【０００５】
ホルモンの活性に関連する疾患又は障害を治療又は予防するうえでの可能なアプローチは、免疫療法により、すなわち、特異的抗ホルモン又は抗酵素抗体によりホルモンの活性を中和するか、又はそのレベルを低下させるような、ホルモン又はホルモンの発生に関与する酵素に対して患者を免疫化することにより、患者におけるホルモンを中和することである。そのような抗体は、受動免疫化において外来的に投与してもよく、あるいはホルモン又は関連酵素に基づく免疫原を用いて能動免疫化によりｉｎ  ｓｉｔｕで発生させてもよい。
【０００６】
高血圧を調節するためのＲＡＳの成分に対するワクチン接種の実現可能性が動物モデルにおいて示された（総説については、Ｍｉｃｈｅｌ、Ａｍ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．第１１７巻、７５６頁（１９８９）を参照）。レニンに対するワクチン接種は血圧降下には有効であったが、動物は自己免疫腎炎に罹患した（Ｍｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第８１巻、１８９９頁（１９９０）；Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、第１６巻、８０頁（１９９０）。同種ＡＣＥに対する能動免疫化に関するデータは非常に限られている。１つの報告では、ウサギのワクチン接種により５０匹の動物のうちの１匹を除き検出可能な抗ＡＣＥ抗体が生成した（Ｓｏｆｆｅｒ、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．第４２巻、２７３５頁（１９８３））。ＡＣＥに対する免疫血清の受動輸送は、ウサギにおける血圧を下降させることができるが、肺浮腫を伴う免疫アレルギー反応を引き起こす。これは、おそらくＡＣＥが肺において膜結合型として発現するためであると思われる（Ｃａｄｗｅｌｌ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．第６３巻、８２頁（１９７６））。アンジオテンシノーゲンに対する能動免疫化に関する報告は入手可能ではないが、いくつかの試験によりアンジオテンシンＩおよびアンジオテンシンＩＩに対するワクチン接種の実現可能性が探究された。２つの試験でワクチン接種動物における血圧効果が報告され（Ｃｈｒｉｓｔｌｉｅｂ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第４８巻、１５０６頁（１９６９）、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第１２９巻、１１７８頁（２０００））、自己免疫は認められなかった。しかし、アンジオテンシンペプチドを用いたワクチン接種試験の大多数が陰性であり、これは、おそらくアンジオテンシンペプチドに対する誘導された力価が低すぎたか、あるいは誘導された抗体の特異性が最適でなかったためである。アンジオテンシンＩＩのみを標的とするワクチンは、ＲＡＳに対して、アンジオテンシンＩＩならびにアンジオテンシンＩに対して、またおそらく前躯体アンジオテンシノーゲンに対して抗体を誘導するワクチンと同じ作用を有さないということはあり得ることである。
【０００７】
国際特許公開第９８／５８９５２号は、水酸化アルミニウムのようなアジュバントとともに投与した場合にラットにおいてアンジオテンシン特異抗体の誘導をもたらす、破傷風毒素に結合されたアンジオテンシンＩを含む複合体による治療を記述している。アジュバントはしばしば、有毒又は少なくとも刺激性である。現在までのところ、ヒトにおける使用が許容された唯一のアジュバントは、無機塩類（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム）およびウイルソームである。ヒトにおいて最も頻繁に使用されているアジュバントは、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）である。それは安全と考えられるが、体内に長期間残留して貯蔵物を形成する。そのような貯蔵物の形成の結果は依然として十分には理解されておらず、したがって、それらの免疫原性を失うことのない将来のワクチンにＡｌｕｍを避ける試みを行うべきである。
【０００８】
したがって、当技術分野においてアジュバントの非存在下においても高い抗体価の誘導をもたらす複合体を提供する必要性が依然としてある。
【発明の開示】
【０００９】
我々は今回、アジュバントを使用しない場合でさえも有効で、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩのような１つ又は複数のアンジオテンシンペプチドを特異的に標的とするｉｎ  ｖｉｖｏ抗体の開発を可能にする、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩ（本明細書では総称して「アンジオテンシンペプチド」と呼ぶ）に対して特異的な抗体の誘導のための強力な免疫原を開発した。その免疫原は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に結合しているアンジオテンシンペプチド部分からなる。これは、アジュバントを使用しない場合でさえも抗体生成を刺激することができる高度に免疫原性の反復抗原アレイになる。使用するアンジオテンシンペプチド部分のアミノ酸配列によって、高い抗体価が誘導され、さらに、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩのＮ又はＣ末端に対して特異的に誘導することができる。これは、アンジオテンシンペプチドの１つの種のみに、あるいはその組合せに特異的に標的を定めることを可能にする。したがって、本発明の免疫原は、ＲＡＳにより産生されるアンジオテンシンＩＩの高いレベルに関連する状態を抑制するための免疫療法アプローチに用いることができる。
【００１０】
操作又はメカニズムの特定の理論に限定することを意図することなく、複合体および本発明の複合体は、複数のアンジオテンシンペプチド種に結合し、それにより、アンジオテンシンのすべての関連する種を同時に阻害する抗体を誘導することができる。あるいは、誘導された抗体はアンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩのＣ末端に対して特異的である可能性がある。これらの条件下では、誘導された抗体は、それぞれレニン又はＡＣＥによるアンジオテンシノーゲン又はアンジオテンシンＩの活性化を阻害するであろう。それにもかかわらず、エンドペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼのようなＡＣＥやレニンと異なるプロテアーゼは、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩをＮ末端から分解し、それにより抗体に結合した完全なアンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩの蓄積を妨げることができる。
【００１１】
したがって、本発明により、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチドもしくはペプチド部分又はその誘導体を含み、１つ又は複数のコア粒子、好ましくは１つ又は複数のウイルス様粒子（ＶＬＰ）に結合して、規則正しい反復アレイの構造を有する複合体を形成する免疫原が提供される。第１付着部位を含むコア粒子と第２付着部位を含むアンジオテンシンペプチド又はその誘導体とが、前記第１および第２付着部位を介して会合して、そのような規則正しい反復アレイを形成する。第１部位と第２部位との相互作用は、直接であってよく、あるいは少なくとも１つの他の分子、例えば、リンカーを含んでいてよい。
【００１２】
一実施形態において、第１付着部位はコア粒子に天然に存在する。あるいは、第１付着部位は、化学カップリング又は組換え技術により付加されている。好ましい第１付着部位は、アミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基を含む。第１付着部位を含む好ましいアミノ酸は、リシン、アルギニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシンおよびヒスチジンから選択される。リシン残基が特に好ましい。
【００１３】
アンジオテンシンペプチド又はその誘導体上の適切な第２付着部位は、アミン、アミド、カルボキシルおよびスルフヒドリル基である。コア粒子のタンパク質分子の反応性基との共有結合を形成することにより、誘導体化分子へのペプチド／タンパク質の架橋又はタンパク質の結合を可能にするために開発された広範囲の化合物が存在する。
【００１４】
本発明の第１付着部位を有するコア粒子としては、規則正しい反復アレイの形成に適したあらゆる粒子が挙げられる。いくつかの実施形態において、そのようなコア粒子としては、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、バクテリオファージ、バクテリオファージウイルス様粒子、線毛などがある。特定の実施形態において、これらは、ＨｂｃＡｇ  ＶＬＰ、バクテリオファージＶＬＰおよびＩ型線毛である。本発明はまた、規則正しい反復構造を形成することが依然として可能であるコア粒子の変異型を提供する。変異型としては、コア粒子の組換えおよび天然型、ならびに突然変異型などがある。特定の実施形態において、コア粒子の突然変異型は、第１付着部位のタイプ又は前記部位の数が親と異なるものを含む。コア粒子上のリシン残基の数の変化が特に好ましい。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明の複合体は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に化学的に結合しているアンジオテンシンペプチド部分を含む。これは、アジュバントを用いない場合でさえも、抗体の生成を刺激することができる高度に免疫原性の反復抗原アレイを生じさせる。用いるアンジオテンシンペプチド部分のアミノ酸配列によって、高い抗体価が誘導され、さらに、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩのＮもしくはＣ末端に対して特異的に誘導することができる。これは、アンジオテンシンペプチドの１つの種又はその組合せのみを特異的に標的にすることを可能にする。本発明による免疫原は、ＲＡＳにより産生されるアンジオテンシンＩＩの高いレベルに関連する状態を抑制するための免疫療法アプローチに用いることができる。
【００１６】
したがって、本発明は、免疫応答を誘導する際の使用に適した、コア粒子と１つ又は複数のアンジオテンシンペプチドもしくはアンジオテンシンペプチ部分とを含む複合体を提供する。本発明はまた、本発明のそのような複合体と、１つ又は複数の賦形剤又は担体、適切には１つ又は複数の薬剤的に許容できる賦形剤又は担体のような１つ又は複数の追加の成分とを含む複合体を提供する。複合体および本発明の複合体としては、追加の薬剤的に許容できる賦形剤又はアジュバントを含む、又は含まないワクチン複合体又は複合体などがある。例えば、本発明は、免疫学的に有効量の１つ又は複数の複合体又は本発明の複合体と薬剤的に許容できる希釈剤、担体又は賦形剤とを含むワクチン複合体も提供する。他の実施形態において、ワクチンはさらに、Ａｌｕｍ又はフロイントアジュバントのような少なくと１つのアジュバントを含む。本発明はまた、動物に免疫学的に有効量の複合体、本発明の複合体又はワクチンを投与し、それにより、複合体又は複合体に対する免疫応答を誘導することを含む、動物、好ましくはヒトのような哺乳動物を免疫化及び／又は治療する方法を提供する。動物は、皮下、筋肉内、鼻腔内、皮内、静脈内、経皮、経粘膜、経口又はリンパ節内への直接的投与経路を含むが、これらに限定されないあらゆる当技術分野で既知の投与経路により複合体又は本発明の複合体により免疫化することが適切である。鼻腔内免疫化は特に適切な経路であり、この種の投与は、実施例で示すようにＩｇＡを含む高い抗体価につながるだけでなく、疼痛のある免疫化処置（例えば、筋肉内）を回避することにより、患者にとってより許容できるものであり、服薬遵守の向上にもつながる。
【００１７】
複合体および本発明の複合体は、抗体の産生を含む免疫応答を誘導する。したがって、他の実施形態において、本発明は、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチドもしくはアンジオテンシンペプチ部分に対する抗体を産生させる方法を提供する。本発明のそのような抗体は、ＲＡＳに関連する身体的障害の治療又は予防に、ならびに例えば、動物の組織又は循環におけるＲＡＳの１つ又は複数の成分の存在に関連する身体的障害を診断する方法におけるアンジオテンシンペプチドもしくはアンジオテンシンペプチド部分の検出に有用である。
【００１８】
関連する実施形態において、本発明は、卒中、梗塞、うっ血性心不全、腎不全、網膜出血などを含むが、これらに限定されない、ＲＡＳに関連する疾患、障害又は状態の予防又は治療に有用である。複合体又は本発明の複合体による免疫化は、免疫分子、特に抗体がアンジオテンシンペプチドもしくはアンジオテンシンペプチド部分に結合するような、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチドもしくはアンジオテンシンペプチド部分に対する免疫応答をもたらす。抗体の受動輸送もＲＡＳに関連する障害の治療および予防に有用である。
【００１９】
我々は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に結合したアンジオテンシンペプチドもしくはアンジオテンシンペプチド部分の複合体が高いアンジオテンシン特異ＩｇＧ抗体を誘導することを発見した。したがって、本発明は、好ましい実施形態において、規則正しい反復ＶＬＰ−アンジオテンシンペプチド／部分複合体に基づくＲＡＳに関連する身体的障害の治療を提供する。この治療は、ワクチン接種動物における高い力価の抗アンジオテンシン抗体を誘導することができる。高い抗体価は、アジュバントの非存在下でさえも誘導され、ＩｇＧだけでなく、ＩｇＡサブタイプも含む。さらに、この治療は、驚くべきことに、炎症のような潜在的に病的な免疫応答の誘導を伴わない。本発明の治療用複合体は、少なくとも１つのアンジオテンシンペプチドもしくはアンジオテンシンペプチド部分とＶＬＰ、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰ、あるいは少なくとも１つのアンジオテンシンペプチドもしくはアンジオテンシンペプチド部分とＨｂｃＡｇもしくは線毛のような別のコア粒子を含む。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、当技術分野で知られていること、本発明の以下の図面および説明ならびに特許請求の範囲に照らし合わせて当業者には明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
定義
以下の記述において、分子生物学、免疫学および医学の分野で用いられている多くの用語を広範に用いる。そのような用語が示す範囲を含む明細書および特許請求の範囲のより明確かつ矛盾のない理解を得るために、以下の非限定的な定義を示す。
【００２２】
能動免疫化：本明細書で用いる「能動免疫化」という用語は、免疫原、ワクチン、抗原又はアンジオテンシンペプチド−担体複合体の投与により惹起された個体、一般的に動物における免疫応答の誘導を指す。これに対して、受動免疫化は、個体への免疫分子又は細胞の移入による個体における免疫の授与を指す。
【００２３】
アルファウイルス：本明細書で用いる「アルファウイルス」という用語は、アルファウイルス属内に含まれているＲＮＡウイルスのいずれかを指す。この属のメンバーの記述は、Ｓｔｒａｕｓｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．第５８巻、４９１〜５６２頁（１９９４）に含まれている。アルファウイルスの例は、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、キャバッソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス、チクングニア（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、イースター（Ｅａｓｔｅｒ）ウマ脳脊髄炎ウイルス、フォートモルガン（Ｆｏｒｔ  ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ゲター（Ｇｅｔａｈ）ウイルス、キジラガー（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス、マヨアロ（Ｍａｙｏａｒｏ）ウイルス、ミドルブルグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇ）ウイルス、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス、ヌドュム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、ピクナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、トナト（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス、トリニチ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）ウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス（ＳＩＮ）、セムリキフォレスト（Ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス（ＳＦＶ）、べネズエラ（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ）ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）およびロス川（Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ）ウイルスなどである。
【００２４】
アミノ酸リンカー：本明細書で用いる「アミノ酸リンカー」は、あるいは本明細書内で「リンカー」とも称するが、第２付着部位を含む抗原又は抗原決定基と結合するか、あるいはより好ましくは、一般的に（しかし、必然的にでない）、１つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として、既に第２付着部位を含んでいる。しかし、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施形態であるとしても、「アミノ酸リンカー」という用語は、そのようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基だけからなることを意味するものはない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、当技術分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸で、すべてＬ又はすべてＤ又はその混合物からなることが好ましい。しかし、スルフヒドリル基又はシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも本発明に含まれる。そのような分子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール又は複素アリール部分を含むことが好ましい。しかし、アミノ酸リンカーのほかに、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール又は複素アリール部分を含み、アミノ酸を欠くリンカーも本発明の範囲内に含まれるものとする。抗原又は抗原決定基、又は場合によって第２付着部位とアミノ酸リンカーとの結合は、好ましくは、少なくとも１つの共有結合によるものであり、より好ましくは少なくとも１つのぺプチド結合によるものである。
【００２５】
アンジオテンシンペプチド部分：本明細書で用いる「アンジオテンシンペプチド部分」という用語は、その部分がｉｎ  ｖｉｖｏでの天然アンジオテンシンの生物学的活性（例えば、アンジオテンシンＩおよびＩＩを含む天然ホルモンの受容体における活性）を有するか、否かにかかわりなく、天然アンジオテンシンペプチドの免疫模擬体（すなわち、アンジオテンシンペプチドに結合する抗体を発生させるようにアンジオテンシンを免疫学的に模擬する）として作用することができるあらゆる部分を指す。したがって、そのような部分は、アンジオテンシンペプチド、好ましくはアンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ（式Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕのデカペプチド，配列番号１６）もしくはアンジオテンシンＩＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅのオクタペプチド，配列番号１７）又はその機能的に同等の変異体を含むことが都合がよい。したがって、「アンジオテンシンペプチド部分」は、本明細書におけるその用語の定義のとおりに「アンジオテンシンペプチド」を含む。そのような機能的に同等な変異体は、単一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失によるアンジオテンシンＩ又はＩＩ配列の修飾を含んでいてよく、また、アミノ酸残基が化学的に修飾されているが、それにもかかわらず、アンジオテンシンの免疫原性活性を保持している配列を含んでいてよい。そのような機能的に（又は免疫学的に）同等な変異体は、天然の生物学的変異体として存在することがあり、あるいは、例えば、化学合成又は修飾、突然変異誘発、例えば、部位特異的又はランダム突然変異誘発等による既知および標準的な技術を用いて調製することができる。この定義の目的のために、この修飾に関する重要な特徴は、アンジオテンシンペプチドが天然アンジオテンシンの免疫模擬体として作用する能力を保持していることである。したがって、例えば、アミノ酸は、例えば、電荷密度、親水性／疎水性、サイズおよび立体配置に関するアンジオテンシンペプチド又はそのエピトープの物理化学的特性を維持し、したがって、免疫学的構造を維持する他のものにより置換されていてよい。「付加」変異体は、ＮもしくはＣ末端融合、ならびに単一又は複数のアミノ酸の配列内挿入を含んでいてよい。欠失は、配列内であってよく、あるいはＮもしくはＣ末端からの切断であってよい。好ましい欠失突然変異体は、Ｎもしくは、好ましくはＣ末端抗体の誘導を可能にするものである。そのような抗体は、活性アンジオテンシンＩＩの発生を妨げることができるが、抗体結合アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩの分解を可能にする。
【００２６】
アンジオテンシンペプチド：本明細書で用いる「アンジオテンシンペプチド」という用語は、すべての、好ましくは天然のアンジオテンシンペプチドおよびそれらの機能的に同等な変異体を含む。したがって、「アンジオテンシンペプチド」は、本明細書で定義した「アンジオテンシンペプチド部分」のサブセットとみなすことができる。実際的問題として、アンジオテンシンペプチド（又はアンジオテンシンペプチド部分）の所与の変異体が好ましくは天然のアンジオテンシンペプチドと「機能的に同等である」かは、アンジオテンシンペプチドの生物学的活性を測定するための様々なアッセイ法により確定することができる。これらのアッセイ法の特定のものは本明細書に記載し、他のものは当業者が容易に精通することができものである。
【００２７】
抗体：本明細書で用いる「抗体」という用語は、エピトープ又は抗原決定基に結合することができる分子を指す。この用語は、単鎖抗体を含む、抗体全体およびその抗原結合断片を含むことを意味する。そのような抗体は、ヒト抗原結合抗体断片を含み、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬ又はＶＨドメインを含む断片を含むが、これらに限定されない。抗体は、鳥類および哺乳類を含むあらゆる動物に起源するものであってよい。好ましくは、抗体は、哺乳動物、例えば、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ等、又は他の適切な動物、例えば、ニワトリに起源するものである。本明細書で用いる「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは、１つ又は複数のヒト免疫グロブリンで形質転換し、例えば、全部が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように内因性免疫グロブリンを発現しない動物から分離された抗体を含む。
【００２８】
抗原：本明細書で用いる「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子により提示された場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により結合されることができる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で用いるＴ細胞エピトープも含む。Ｔ細胞エピトープは、赤血球を除く身体のすべての細胞上に存在するクラスＩ、又は、免疫細胞および特に抗原提示細胞上に存在するクラスＩＩのＭＨＣに関連してＴ細胞受容体により認識される。この認識事象は、Ｔ細胞の活性化と、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン分泌、パーフォリン分泌などの後続のエフェクターメカニズムにつながる。抗原はさらに、免疫系により認識されることができ、かつ／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかし、これは、少なくとも特定の場合に、抗原がＴＨ細胞エピトープを含むか、又は結合していて、アジュバント中に投与することを必要とすることがある。抗原は、１つ又は複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。上に記載した特異的反応は、抗原が、好ましくは、一般的に高度に選択的にその対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原により誘起される他の多数の抗体又はＴＣＲｓと反応しないことを示すことを意味する。抗原は、本明細書で用いる数種の抗原の混合物であってもよい。
【００２９】
抗原決定基：本明細書で用いる「抗原決定基」という用語は、Ｂ又はＴリンパ球により特異的に認識される抗原の部分を指して言う。Ｂリンパ球は抗体産生により外来抗原決定基に対して応答するのに対して、Ｔリンパ球は細胞性免疫のメディエーターである。したがって、抗原決定基又はエピトープは、抗体により、あるいは、ＭＨＣに関連して、Ｔ細胞受容体により認識される抗原の部分である。アレルゲンも脊椎動物において抗原として作用する。
【００３０】
会合：本明細書で用いる「会合」という用語は、第１および第２付着部位に適用するとき、好ましくは少なくとも１つの非ペプチド結合による第１付着部位と第２付着部位との結合を指す。会合の性質は、共有結合、イオン性、疎水性、極性又はその組合せであってよく、好ましくは、会合の性質は共有結合である。
【００３１】
付着部位、第１：本明細書で用いる「第１付着部位」という句は、非天然又は天然由来のもので、抗原又は抗原決定基にある第２付着部位が会合する、コア粒子の要素を指す。第１付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成高分子、二次代謝物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フッ化フェニルメチルスルホニル）、あるいはその組合せ、あるいはその化学的に反応性基であってよい。第１付着部位は、好ましくはウイルス様粒子のようなコア粒子の一般的にかつ好ましくは表面上にある。複数の第１付着部位は、それぞれ一般的に反復立体配置におけるコアおよびウイルス様粒子の表面に存在する。
【００３２】
付着部位、第２：本明細書で用いる「第２付着部位」という句は、それぞれコア粒子およびウイルス様粒子の表面にある第１付着部位が会合する、抗原又は抗原決定基に会合している要素を指す。抗原又は抗原決定基の第２付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成高分子、二次代謝物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フッ化フェニルメチルスルホニル）、あるいはその組合せ、あるいはその化学的に反応性基であってよい。少なくとも１つの第２付着部位が抗原又は抗原決定基に存在する。したがって、「少なくとも１つの第２付着部位を有する抗原又は抗原決定基」は、少なくとも抗原又は抗原決定基および第２付着部位を含む抗原又は抗原構成体を指す。しかし、特に、天然由来でない、すなわち、天然では抗原又は抗原決定基内に存在しない第２付着部位については、これらの抗原又は抗原構成体は「アミノ酸リンカー」を含む。
【００３３】
結合：本明細書で用いる「結合」という用語は、共有結合、例えば、化学的に結合することによる共有結合、あるいは非共有結合、例えば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合等であってよい結合又は付着を指す。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄結合、炭素−リン結合等であってよい。「結合した」という用語は、「カップリング（結合）した」、「融合した」および「付着（結合）した」などの用語よりも広く、これらを含む。
【００３４】
コートタンパク質：本明細書で用いる「コートタンパク質」という用語は、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのキャプシドアセンブリ内に組込むことができるバクテリオファージ又はＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかし、ＲＮＡファージのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子産物を指す場合には、「ＣＰ」という用語を用いる。例えば、ＲＮＡファージＱβのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子産物は「Ｑβ  ＣＰ」と称し、一方、バクテリオファージＱβの「コートタンパク質」は、「Ｑβ  ＣＰ」ならびにＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのキャプシドは、主としてＱβ  ＣＰからなり、Ａ１タンパク質の含量は小さい。同様に、ＶＬＰ  Ｑβコートタンパク質は、主としてＱβ  ＣＰを含み、Ａ１タンパク質の含量は小さい。
【００３５】
コア粒子：本明細書で用いる「コア粒子」という用語は、固有の反復組織を有する強固な構造を指す。コア粒子は、本明細書で用いる合成過程の産物又は生物学的過程の産物であってよい。
【００３６】
有効量：本明細書で用いる「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するために必要又は十分な量を指す。組成物の有効量は、この選択される結果を達成する量であり、そのような量は、当業者により日常業務として決定されるものであろう。例えば、免疫系欠損を治療するための有効量は、抗原への曝露時に抗原特異的免疫応答の発現をもたらす免疫系の活性化を引き起こすのに必要な量であろう。この用語は、「十分な量」と同義でもある。
【００３７】
特定の適用分野における有効量は、治療する疾患又は状態、投与する個々の組成物、対象のサイズ、及び／又は疾患又は状態の重症度のような因子によって変化し得る。当業者は、本発明の特定の組成物の有効量を経験的に決定することができ、不相応な実験を必要としない。
【００３８】
エピトープ：本明細書で用いる「エピトープ」という用語は、個々の抗体又はＴ細胞受容体による認識の基本要素又は最小単位で、したがって、前記抗体又はＴ細胞受容体が結合する特定のドメイン、領域又は分子構造を指す。抗原は多数のエピトープからなっており、一方、ハプテンは一般的に少数のエピトープを有する。
【００３９】
融合：本明細書で用いる「融合」という用語は、１つのポリペプチド鎖における異なる起源のアミノ酸配列の、それらのコーディングヌクレオチドの枠内結合による結合を指す。「融合」という用語は、その末端への融合に加えて、内部融合、すなわち、ポリペプチド鎖内への異なる起源の配列の挿入を明らかに含む。
【００４０】
異種配列：本明細書で用いる「異種配列」という用語は、前記核酸又はタンパク質とともに通常認められず、特定の特性を付与するために、通常、配列に人為的に付加される核酸又はタンパク質の第２の配列を指す。１つの例において、異種アミノ酸は、タンパク質の精製の目的のために組換えキャプシドタンパク質に付加するか、あるいは第１付着部位とすることができる。
【００４１】
免疫応答：本明細書で用いる「免疫応答」という用語は、抗原のような分子又は化合物に対して誘導される個体の免疫系による作用を指す。哺乳動物では、免疫応答は、細胞の活性化ならびにサイトカインおよび抗体のような可溶性分子の産生を含む。したがって、この用語は、体液性免疫及び／又はＢ及び／又はＴリンパ球の活性化又は増殖をもたらす細胞性免疫応答を含む。しかし、場合によっては、免疫応答は、強度が低いことがあり、本発明による少なくとも１つの物質を用いる場合にのみ検出可能になる。「免疫原性」は、免疫系の１つ又は複数の機能が増大し、免疫原性因子に対して誘導されるように、生存生物の免疫系を刺激するために用いる因子を指す。「免疫原性ポリペプチド」は、単独、あるいはアジュバントの存在下又は非存在下で担体に結合されているかどうかにかかわりなく、細胞性及び／又は体液性免疫応答をもたらすポリペプチドである。
【００４２】
免疫偏向：本明細書で用いる免疫偏向という用語は、先在性免疫応答と性質が異なる免疫応答の刺激を指す。例えば、ＩｇＥ抗体がアレルゲンへの曝露時に産生されるようなアレルゲンに対するＴＨ２免疫応答を有する個体は、アレルゲンに対するＴＨ１免疫応答をもたらすために、本発明の実施形態により誘導することができる。そのようなＴＨ１応答は、アレルギー誘導性ＴＨ２応答を阻止し、それによりアレルギー性疾患を軽減する。
【００４３】
免疫療法：本明細書で用いる「免疫療法」という用語は、疾患、障害又は状態の治療のための複合体を指す。より具体的には、この用語は、有用な免疫応答がワクチン接種により発生する、治療の方法を指すために用いられている。
【００４４】
免疫学的に有効量：本明細書で用いる「免疫学的に有効量」という用語は、個体に導入したとき、個体における免疫応答を誘導するに十分な複合体の量を指す。免疫学的に有効であるために必要な複合体の量は、複合体、複合体中の他の成分の存在（例えば、アジュバント）、抗原、免疫化の経路、個体、事前の免疫又は生理的状態などの多くの因子によって異なる。
【００４５】
個体：本明細書で用いる「個体」という用語は、多細胞性生物を指し、植物および動物を含む。好ましい多細胞性生物は、動物であり、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００４６】
分離された：本明細書で用いる「分離された」という用語を分子に関して用いるとき、この用語は分子がその天然環境から除去されたことを意味する。例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチドは生存動物に天然に存在し、「分離されて」いないが、その天然の状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、「分離されて」いる。さらに、ベクターに含まれている組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために分離されているとみなされる。分離ＲＮＡ分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ複製産物を含む。分離核酸分子は、さらに合成により生産された分子を含む。さらに、組換え宿主細胞に含まれているベクター分子も分離されている。したがって、すべての「分離された」分子が「精製されている」必要はない。
【００４７】
免疫療法：本明細書で用いる「免疫療法」という用語は、疾患又は障害の治療のための免疫分子を含む、かつ／又は免疫応答をもたらす複合体である。
【００４８】
個体：本明細書で用いる「個体」という用語は、多細胞性生物を指し、植物および動物を含む。好ましい多細胞性生物は、動物であり、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００４９】
低又は検出されない：本明細書で用いる「低又は検出されない」という句は、遺伝子発現レベルに関して用いるとき、遺伝子が最大限に誘導されるときに認められるよりも著しく低い（例えば、少なくとも５倍低い）又は以下の実施例の項で用いた方法により容易には検出されない発現のレベルを指す。
【００５０】
レクチン：本明細書で用いる特定のモノ又はオリゴサッカリドに対する結合部位を有する、特にマメ科植物の種子からだけでなく、多くの他の植物および動物源からも得られるタンパク質である。例としては、糖タンパク質の研究で分析用および調製用試薬として広く用いられているコンカナバリンＡおよび小麦麦芽凝集素などがある。
【００５１】
ミモトープ：本明細書で用いる「ミモトープ」という用語は、抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を誘導する物質を指す。一般的に、ミモトープという用語は、特定の抗原について用いられる。例えば、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）に対する抗体の産生をもたらすペプチドは、抗体が結合する抗原決定基のミモトープである。ミモトープは、それが免疫応答を誘導する対象である抗原又は抗原決定基との実質的な構造類似性を有していても、有さなくてもよく、あるいは構造特性を共有していても、していなくてもよい。特定の抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を誘導するミモトープを発生させ、同定する方法は、当技術分野で知られており、本明細書の他所に記載されている。
【００５２】
突然変異タンパク質：本明細書で用いる「突然変異タンパク質」という用語は、所与の対照標準（例えば、天然、野生型等）ポリペプチドと１つ又は複数のアミノ酸が異なっているタンパク質又はポリペプチドを指す。
【００５３】
天然由来：本明細書で用いる「天然由来」という用語は、その全体又は一部が合成でなく、天然に存在又は生成されることを意味する。好ましくは、本明細書で用いる「天然由来」という用語は、全体が合成でなく、天然に存在又は生成されることを意味する。
【００５４】
非天然：本明細書で用いるこの用語は、一般的に天然由来でないことを意味し、より具体的には、この用語は人為的なものであることを意味する。
【００５５】
非天然分子骨格：本明細書で用いる「非天然分子骨格」という句は、第１付着部位の強固な反復アレイを設ける役割を果たす人為的に調製された生成物を指す。必然的でないが、理想的には、これらの第１付着部位は、幾何学的秩序を有する。非天然分子骨格は、有機又は非有機であってよく、一部又は全体が化学的に、あるいは生物学的過程により合成されてよい。非天然分子骨格は、（ａ）天然又は非天然由来のコア粒子、および（ｂ）少なくとも１つの第１付着部位からなる。非天然由来：本明細書で用いる「非天然由来」という用語は、一般的に合成によるもの、又は天然由来でないことを意味し、より具体的には、この用語は人為的なものであることを意味する。
【００５６】
規則正しい反復抗原又は抗原決定基アレイ：本明細書で用いる「規則正しい反復抗原又は抗原決定基アレイ」という用語は、それぞれコア粒子およびウイルス様粒子に関して抗原又は抗原決定基の一般的にかつ好ましくは均一な空間的配置を特徴とする、抗原又は抗原決定基の反復パターンを一般的に指す。本発明の一実施形態において、反復パターンは幾何学的パターンであってよい。適切な規則正しい反復抗原又は抗原決定基アレイの一般的かつ好ましい例は、好ましくは、０．５〜３０ｎｍ、好ましくは５〜１５ｎｍの間隔を有する厳密に反復性準結晶性秩序を有するものである。
【００５７】
受動免疫化：本明細書で用いる「受動免疫化」という用語は、外因的に産生させた免疫分子（例えば、抗体）又は細胞（例えば、Ｔ細胞）の動物へのあらゆる経路による投与を指す。受動免疫化は、免疫応答をもたらすために個体への免疫原、ワクチン、抗原又はハプテン−担体複合体の導入により得られる「能動」免疫化と異なる。
【００５８】
線毛：本明細書で用いる「線毛（ｐｉｌｉ）」（単数形は「ｐｉｌｕｓ」）という用語は、規則正しい反復パターンに組織化されているタンパク質モノマー（例えば、ピリンモノマー）からなる細菌細胞の細胞外構造を指す。さらに、線毛は宿主細胞表面への細菌細胞の付着、細胞内遺伝子交換および細胞−細胞認識のような過程に関与する。線毛の例としては、１型線毛、Ｐ線毛、Ｆ１Ｃ線毛、Ｓ線毛および９８７Ｐ線毛などがある。線毛のさらなる例は、本明細書の他所に記載されている。
【００５９】
線毛様構造：本明細書で用いる「線毛様構造」という句は、線毛と同様な特性を有し、タンパク質モノマーからなる構造を指す。「線毛様構造」の一例は、天然線毛と本質的に同じである、規則正しい反復アレイを形成しない修飾ピリンタンパク質を発現する細菌細胞により形成される構造である。
【００６０】
ポリペプチド：本明細書で用いる「ポリペプチド」という用語は、互いにペプチド結合により結合されているアミノ酸残基、一般的に天然アミノ酸残基からなる高分子を指す。ポリペプチドは、必ずしもサイズが限定されておらず、タンパク質とペプチドとを含む。ペプチドは、約５個〜約５０個の一般的なサイズのアミノ酸、又はこの一般的な範囲内のいずれかの数のアミノ酸からなるポリペプチドである。しかし、ペプチドは、より長い、例えば、最高１２０〜１５０個のアミノ酸からなるものであってもよい。
【００６１】
タンパク質：タンパク質という用語は、一般的に約５個又はそれ以上、１０個又はそれ以上、２０個又はそれ以上、２５個又はそれ以上、５０個又はそれ以上、７５個又はそれ以上、１００個又はそれ以上、２００個又はそれ以上、５００個又はそれ以上、１０００個又はそれ以上、２０００個又はそれ以上のサイズのアミノ酸からなるポリペプチドを指す。タンパク質は一般的に、しばしば明確な３次元構造を有さず、多数の異なる立体配座をとることができ、折りたたまれていないと称されるペプチドおよびポリペプチドと異なり、必ずしも必要はないが、しばしば折りたたまれていると称される明確な３次元構造を有する。しかし、ペプチドは明確３次元構造も有することがある。
【００６２】
精製された：本明細書で用いる「精製された」という用語を分子に関して用いる場合、精製される分子の濃度が、その自然環境、又はそれが産生され、発見され、もしくは合成された環境においてそれと会合していた分子と比較して増加したことを意味する。自然に会合した分子としては、タンパク質、核酸、脂質および糖などであるが、一般的に、精製される分子の精製の完全性を維持又は促進するために加えられる水、緩衝液および試薬は含まれない。例えば、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーの実施中にｍＲＮＡが水性溶媒で希釈されたとしても、自然に会合した核酸および他の生物学的分子がカラムに結合せず、対象ｍＲＮＡ分子から分離されるならば、ｍＲＮＡ分子はこのクロマトグラフィーにより精製される。この定義によれば、物質は、その汚染物質と比較して考えたとき、５％又はそれ以上、１０％又はそれ以上、２０％又はそれ以上、３０％又はそれ以上、４０％又はそれ以上、５０％又はそれ以上、６０％又はそれ以上、７０％又はそれ以上、８０％又はそれ以上、９０％又はそれ以上、９５％又はそれ以上、９８％又はそれ以上、９９％又はそれ以上又は１００％純粋である。
【００６３】
受容体：本明細書で用いる「受容体」という用語は、リガンドと呼ばれる他の分子と相互作用することができるタンパク質もしくは糖タンパク質又はその断片を指す。リガンドは生化学的又は化学的化合物のどのクラスに属してもよい。受容体は、必ずしも膜結合タンパク質である必要はない。例えば、マルトース結合タンパク質やレチノール結合タンパク質のような可溶性タンパク質も受容体である。
【００６４】
残基：本明細書で用いる「残基」という用語は、ポリペプチド主鎖又は側鎖における特定のアミノ酸を意味する。
【００６５】
組換え宿主細胞：本明細書で用いる「組換え宿主細胞」という用語は、本発明の１つ又は複数の核酸分子が導入された宿主細胞を指す。宿主細胞は、例えば、哺乳動物、昆虫、植物、鳥類、酵母などの真核生物、ならびに例えば、大腸菌および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核生物を含む。
【００６６】
組換えウイルス：本明細書で用いる「組換えウイルス」という句は、人為的に遺伝的に修飾されているウイルスを指す。この句は、当技術分野で知られているウイルスを対象として含む。より具体的には、この句は、人為的に遺伝的に修飾されているアルファウイルスを指し、また、より具体的には、この句は、人為的に遺伝的に修飾されているシンビスウイルスを指す。
【００６７】
ＲＮＡファージ：本明細書で用いる「ＲＮＡファージ」という用語は、ＲＮＡウイルス感染細菌、より具体的には、１本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルス感染細菌を指す。
【００６８】
ベクター：本明細書で用いる「ベクター」という用語は、宿主細胞に遺伝物質を伝達するために用いる因子（例えば、プラスミド又はウイルス）を指す。ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡからなっていてよい。
【００６９】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で用いる「ウイルス様粒子」という用語は、ウイルス粒子に類似した構造を指す。さらに、本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムのすべて又は一部、特に、ウイルスゲノムの複製および感染性成分を欠いているので、非複製性および非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含んでいてよい。本発明によるウイルス様粒子の一般的および好ましい実施形態は、対応するウイルス、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのウイルスキャプシドのようなウイルスキャプシドである。本明細書において同義で用いている「ウイルスキャプシド」又は「キャプシド」という用語は、ウイルスタンパク質サブユニットからなる巨大分子アセンブリを指す。一般的かつ好ましくは、ウイルスタンパク質サブユニットは、固有の反復組織を含む構造を有するウイルスキャプシドおよびキャプシドにそれぞれ集合し、前記構造は、一般的に球状又は管状である。例えば、ＲＮＡファージ又はＨＢｃＡｇ’ｓのキャプシドは、正十二面体対称性の球形の形態を有する。本明細書で用いている「キャプシド様構造」という用語は、上で定義した意味でキャプシド形態に集合するウイルスタンパク質サブユニットからなるが、十分な程度の秩序と反復性を維持しながら、一般的な対称性集合から偏っている巨大分子集合を指す。
【００７０】
バクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で用いる「バクテリオファージのウイルス様粒子」という用語は、バクテリオファージの構造に類似し、非複製性かつ非感染性で、バクテリオファージの複製装置をエンコードする少なくとも１つの遺伝子又は複数の遺伝子を欠き、また、一般的に宿主細胞へのウイルスの付着又は侵入を担っているタンパク質又は複数のタンパク質をエンコードする遺伝子又は複数の遺伝子も欠いているウイルス様粒子を指す。しかし、この定義には、前述の遺伝子又は複数の遺伝子がまだ存在しているが、不活性で、したがって、バクテリオファージの非非複製性かつ非感染性ウイルス様粒子となっている、バクテリオファージのウイルス様粒子も含めるべきである。
【００７１】
ＲＮＡコートタンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡコートタンパク質の１８０サブユニットの自己集合により形成され、場合によって宿主ＲＮＡを含むキャプシド構造を「ＲＮＡコートタンパク質のＶＬＰ」と称する。特定の例は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰである。この特定のケースにおいて、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰは、Ｑβ  ＣＰサブユニットのみの集合によるもの（例えば、抑制により、より長いＡ１タンパク質の発現を排除するＴＡＡ終止コドンを含むＱβ  ＣＰ遺伝子の発現により発生する、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ、Ｔ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３９巻、９〜１５頁（１９９６）を参照）又はキャプシド集合にさらにＡ１タンパク質サブユニットを含むものであってよい。
【００７２】
ウイルス粒子：本明細書で用いる「ウイルス粒子」という用語は、ウイルスの形態学的型を指す。一部のウイルス型ではウイルス粒子はタンパク質キャプシドにより囲まれたゲノムを含み、他の型のものは別の構造（例えば、包膜、尾部等）を有する。
【００７３】
１つ（ｏｎｅ、ａ又はａｎ）：語「１つ」（「ｏｎｅ」、「ａ」又は「ａｎ」）をこの開示で用いる場合、特に断らない限り、「少なくとも１つ」又は「１つ又は複数」を意味する。
【００７４】
数値に適用する場合、本明細書で用いる「約」という語は記載する値の±１０％の値を意味する（例えば、「約５０℃」は４５℃から５５℃までの範囲（両端の値を含む）を含み、同様に、「約１００ｍＭ」は９０ｍＭから１１０ｍＭまでの濃度の範囲（両端の値を含む）を含む）。
【００７５】
概要
我々は今回、アジュバントを使用しない場合でさえも有効で、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩを特異的に標的とすることができる、アンジオテンシンペプチドに対して特異的な抗体の誘導のための強力な免疫原を開発した。この免疫原は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）又は細菌線毛又は線毛様粒子のような他の粒子に結合しているアンジオテンシンペプチド部分からなる。これは、アジュバントを使用しない場合でさえも抗体生成を刺激することができる高度に免疫原性の反復抗原アレイになる。使用するアンジオテンシンペプチド部分のアミノ酸配列によって、高い抗体価が誘導され、さらに、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩのＮ又はＣ末端に対して特異的に誘導することができる。これは、アンジオテンシンペプチドの１つの種のみに、あるいはその組合せに特異的に標的を定めることを可能にする。したがって、本発明の免疫原は、ＲＡＳにより産生されるアンジオテンシンペプチド部分、特に、アンジオテンシンＩＩおよびその誘導体の高いレベルに関連する状態を抑制するための免疫療法アプローチに用いることができる。
【００７６】
本発明の複合体の形成、すなわち、コア粒子（例えば、ＶＬＰ）への１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分の結合は、付着、連結、融合又は共有結合および非共有結合などの他の結合により達成される。一実施形態において、ＶＬＰが第１付着部位を含み、有機分子が第２付着部位を含む。有機分子間の会合は、第１付着部位を第２付着部位に直接、又は第３分子を介して連結することによって起こる。付着部位は、天然に存在することがあり、あるいは導入することもできる。
【００７７】
アンジオテンシンペプチド部分とコア粒子との複合体による、あるいは本発明により提供されるような複合体を含む複合体による動物の免疫化は、示されるアンジオテンシンペプチド部分に対する強い免疫応答を誘導する。したがって、複合体および本発明の複合体は、様々なアンジオテンシンペプチド部分又はその誘導体に対する免疫応答の刺激に、ひいては動物における使用に有用である。本発明はまた、免疫学的に有効量の１つ又は複数の複合体又は本発明の複合体と薬剤的に許容できる希釈剤、担体又は賦形剤とを含むワクチンに関する。複合体又は本発明の複合体は、動物に１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分又はその誘導体に対するワクチン接種を行うために用いることができる。ワクチン接種は、予防もしくは治療目的又は両方のためであってよい。関連する態様において、そのような複合体に対して産生させた抗体のような免疫分子又は複合体は、疾患、状態又は障害の治療、予防又は診断に用いることができる。そのような抗体、複合体および本発明の複合体は、成分キットとしても有用である。
【００７８】
したがって、一態様において、本発明は、規則正しい反復アンジオテンシンペプチド部分−担体複合体としての１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分と担体との複合体、ならびにそのような複合体を調製する方法を提供する。本発明はまた、本発明のそのような少なくとも１つの複合体と、少なくとも１つの他の成分、適切には、少なくとも１つの賦形剤又は担体、および特に少なくとも１つの薬剤的に許容できる賦形剤又は担体とを含む複合体を提供する。複合体および本発明の複合体は、アンジオテンシンペプチド部分に対する免疫応答を誘導するのに有用である。そのような免疫応答は、治療、予防および診断目的に有用な抗体を生成させるために用いることができる。
【００７９】
本発明の複合体は、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分の高度に規則正しい反復アレイを含む。本発明のこの態様による複合体アレイは、（ａ）第１付着部位を含むコア粒子と（ｂ）第２付着部位を含むアンジオテンシンペプチド部分とを含み、要素（ａ）と（ｂ）とが第１および第２付着部位を介して会合して、前記アンジオテンシンペプチド部分の規則正しい反復アレイを形成する。
【００８０】
複合体および本発明の複合体に用いることが適切なコア粒子は、天然又は非天然のものであってよい。複合体および本発明の複合体に用いる天然コア粒子としては、ウイルス粒子、ウイルス様粒子および線毛などがある。これらの天然コア粒子のタンパク質は、天然又は組換えタンパク質であってよい。コア粒子上の第１付着部位は、天然に存在していてよく、あるいは化学的又は組換え手段により導入してもよい。複合体および本発明の複合体に用いるアンジオテンシンペプチド部分は、ＲＡＳの様々な成分（すなわち、様々なアンジオテンシンペプチド部分又はその誘導体）に対する免疫応答の誘導に適するものであって、アンジオテンシンペプチド部分、好ましくは、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ（式Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕのデカペプチド，配列番号１６）もしくはアンジオテンシンＩＩ（式Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅのオクタペプチド，配列番号１７）又は本明細書の他所に記載するアンジオテンシンペプチド部分を含むその機能的に同等な変異体の配列又はその断片を含む、あるいは、それからなるものを含むが、これに限定されない。アンジオテンシンペプチド部分における第２付着部位は、天然に存在していてよく、あるいは導入してもよい。第１および第２付着部位間の相互作用は、直接であってよく、あるいは少なくとも１つの他の分子、例えば、リンカーを含んでいてよい。さらに、第１付着部位と第２付着部位との会合のために、本発明により架橋分子を用いることができる。架橋分子は、一般的にリンカーに加えて用いる。
【００８１】
複合体および本発明の複合体は、驚くべきことに、様々なアンジオテンシンペプチド部分に対する免疫応答、特に抗体の誘導に有効である。したがって、それらは、高血圧、卒中、梗塞、うっ血性心不全、腎不全又は網膜出血を含むが、これらに限定されないＲＡＳに関連する疾患、障害又は状態に対する治療又は予防のための動物の免疫化に適する複合体に有用である。複合体および本発明の複合体による免疫化により産生される抗体も治療および予防の目的のために有用である。
【００８２】
他の実施形態において、本発明は、複合体および本発明の複合体を用いる疾患の治療および予防の方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、診断およびスクリーニングに適するキットを提供する。
【００８３】
規則正しい反復アレイの複合体
本発明は、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分の規則正しい反復アレイを含む複合体、および複合体の複合体を提供する。さらに、本発明は、好都合なことに、開業医が様々な目的のために、好ましくは１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分又はその誘導体に対する免疫応答の誘導のために規則正しい反復アレイを構築することを可能にする。
【００８４】
本発明の複合体は本質的に、２つの要素、すなわち、（１）非天然分子骨格及び、（２）少なくとも１つの結合により前記第１付着部位に会合することができる少なくとも１つの第２付着部位を有するアンジオテンシンペプチド部分とを含む、あるいはそれらからなる。
【００８５】
非天然分子骨格は、（ａ）（１）非天然由来のコア粒子および（２）天然由来のコア粒子からなる群から選択されるコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの共有結合により前記コア粒子に結合されている少なくとも１つの第１付着部位とを含む、あるいはそれらからなる。複合体、本発明の複合体および方法に用いるコア粒子としては、無機分子、ウイルス粒子、ウイルス様粒子および細菌線毛などがある。複合体、本発明の複合体および方法に用いるアンジオテンシンペプチド部分は、（ａ）アンジオテンシンペプチド部分内の天然に存在しない付着部位および（ｂ）アンジオテンシンペプチド部分内の天然に存在する付着部位からなる群から選択される少なくとも１つの第２付着部位を有する。
【００８６】
本発明は、少なくとも１つの結合による第２付着部位と第１付着部位との会合による規則正しい反復アレイを提供する。したがって、アンジオテンシンペプチド部分と非天然分子骨格とが第１および第２付着部位のこの会合により結び付けられて、規則正しい反復抗原アレイを形成する。開業医は、非天然分子骨格、又は特定の実施形態において、コア粒子に結合するすべての部分の配置が均一であるようなアンジオテンシン部分および第２付着部位を具体的に設計することができる。例えば、単一の第２付着部位をアンジオテンシンペプチド部分に置き、それにより、非天然分子骨格に付着するすべてのアンジオテンシンペプチド部分が均一に位置する完全な設計を確保することができる。本発明のそのような一態様において、特に、本発明によりコア粒子との配向した規則正しい会合を確保するために、１つ又は複数の別のアミノ酸（天然に存在しない第２付着部位をもたらす）をアンジオテンシンペプチド部分配列のＣ又はＮ末端に付加する。したがって、本発明は、あらゆるアンジオテンシンペプチド部分を定められた順序で、反復パターンを形成するように非天然分子骨格に置く都合のよい手段を提供する。
【００８７】
当業者には明らかなように、本発明の特定の実施形態は、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核および真核細胞における組換えタンパク質の発現などの組換え核酸技術の使用を必要とする。そのような方法論は、当業者によく知られており、公表されている実験法マニュアル（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  研究所出版、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７））に適宜見出すことができる。組織培養細胞系に関する研究のための基本的実験技術（Ｃｅｌｉｓ  Ｊ．編、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９９８））および抗体に基づく技術（Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ．「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールド  スプリング  ハーバー研究所、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク（１９８８）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ｍ．Ｐ．「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）、Ｓｃｏｐｅｓ  Ｒ．Ｋ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４））も文献に十分に記載されている［これらのすべてを参照により本明細書に組込まれる］。
【００８８】
さらに、本発明の実施に必要な、例えば、有機分子をアミノ酸に結合させる技術や適切な第２付着部位を含むアンジオテンシンペプチド部分の誘導体を調製する手段は、当業者によく知られている。そのような方法論は、化学教科書および刊行物に見出すことができ、それらの例を以下に含まれており、参照により組込まれる。米国特許第５，８７６，７２７号、国際公開第９９／６１０５４号、Ｉｓｏｍｕｒａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第６６巻、４１１５〜４１２１頁（２００１）、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ、第５７巻、１００６〜１０１０頁（１９７４）、Ｌａｎｇｏｎｅ  Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ  Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第８４巻、６２８〜６４０頁（１９８２）、Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ（１９９１）。
【００８９】
コア粒子および非天然分子骨格
一実施形態において、本発明は、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分の規則正しい反復アレイを形成する方法を提供する。本発明により、これは、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分が結合するコア粒子の第１および第２付着部位を介しての会合により起こる。
【００９０】
したがって、特定の複合体および本発明の複合体における１つの要素は、コア粒子および第１付着部位を含む、あるいはそれらからなる非天然分子骨格である。より具体的には、非天然分子骨格は、（ａ）天然又は非天然由来のコア粒子および（ｂ）少なくとも１つの共有結合によりコア粒子に結合している少なくとも１つの第１付着部位を含む、あるいはそれらからなる。
【００９１】
コア粒子  本発明の一実施形態において、コア粒子は、合成高分子、脂質ミセル又は金属である。そのようなコア粒子は、当技術分野で知られており、本発明の新規の非天然分子骨格を構築するための基盤を提供する。例として、合成高分子又は金属コア粒子が、全部が参照により本明細書に組込まれる米国特許第５，７７０，３８０号および米国特許第５，３３４，３９４号に開示されている。適切な金属は、クロム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレン、ニッケル、金、銀、白金を含むが、これらに限定されない。適切なセラミック金属は、二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ルテニウムおよび酸化スズを含むが、これらに限定されない。この実施形態のコア粒子は、ポリスチレン、ナイロンおよびニトロセルロースを含む炭素および適切な高分子を含むが、これらに限定されない有機材料から調製することができる。ナノ結晶性粒子については、酸化スズ、二酸化チタン又は炭素（ダイヤモンド）から調製した粒子が有用である。本発明用の脂質ミセルは、当技術分野で知られているいずれかの手段、例えば、全部が参照により本明細書に組込まれるＢａｉｓｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌａｒ（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．第４巻、３５５〜３６１頁（１９７５））又はＣｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ、第３８巻、１９７〜２１４頁（１９８１））又はＬｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．第４２６巻、３１４〜３１８頁（１９９８））又はＴｏｐｃｈｉｅｖａ  ａｎｄ  Ｋａｒｅｚｉｎ（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．第２１３巻、２９〜３５頁（１９９９））又はＭｏｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ、第３０８号、４５７〜４６０頁（１９８４））により調製される。
【００９２】
本発明の一実施形態において、コア粒子は、天然又は非天然であってよい、生物学的過程により生成される。例えば、ウイルスおよび細菌線毛又は線毛様構造は、規則正しい反復構造に組織化されるタンパク質から形成される。したがって、本発明は、ウイルス、ウイルス様粒子、細菌線毛、ファージ、ウイルスキャプシド粒子又はその断片を含むが、これらに限定されない有用なコア粒子を含む複合体、複合体および方法を含む。そのような特定の実施形態において、タンパク質は組換えであってよい。
【００９３】
特定の実施形態において、非天然分子骨格のコア粒子は、ウイルス、細菌線毛、細菌ピリンから形成される構造、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ウイルスキャプシド粒子又はその組換え型を含む。規則正しい反復コート及び／又はコアタンパク質構造を有する当技術分野で知られているウイルスは、非天然分子骨格として、本発明の方法、複合体および複合体における使用のために選択することができる。適切なウイルスの例は、シンドビスおよび他のアルファウイルス、ラブドウイルス（例えば、小水疱性口内炎ウイルス）、ピコナウイルス（例えば、ヒト鼻ウイルス、アイチ（Ａｉｃｈｉ）ウイルス）、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、Ｔｈｏｇｏｔｏウイルス、Ｂａｔｋｅｎウイルス、家禽ペストウイルス）、ポリオーマウイルス（例えば、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、鳥類ポリオーマウイルスＢＦＤＶ）、パルボウイルス、ロタウイルス、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージｆ２、バクテリオファージＰＰ７、バクテリオファージＡＰ２０５、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス、フロックハウスウイルス（Ｆｌｏｃｋ  Ｈｏｕｓｅ  Ｖｉｒｕｓ）およびヒト乳頭腫ウイルスを含むが、これらに限定されない（例えば、Ｂａｃｈｍａｎ  Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ  Ｒ．Ｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第１７巻、５５３〜５５８頁（１９９６）の表１を参照）。本発明のより特定的な具体例としての実施形態において、コア粒子は、ロタウイルスの組換えタンパク質、ノーウォークウイルスの組換えタンパク質、アルファウイルスの組換えタンパク質、細菌線毛又は線毛様構造を形成する組換えタンパク質、口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質、レトロウイルスの組換えタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質（例えば、ＨＢｃＡｇ）、タバコモザイクウイルスの組換えタンパク質、フロックハウスウイルスの組換えタンパク質およびヒト乳頭腫ウイルスの組換えタンパク質を含む、あるいはそれらからなっていてよい。
【００９４】
複合体、本発明の複合体および方法に用いるコア粒子は、さらに、そのようなタンパク質の１つ又は複数の断片、ならびに互いに会合して、規則正しい反復抗原又は抗原決定基アレイを形成する能力を保持しているそのようなタンパク質の変異体を含むか、あるいはそれらからなっていてよい。例えば、同一所有権者の同時係属米国特許出願第１０／０５０９０２号（２００２年１月１８日に出願、その開示のその全部が参照により本明細書に組込まれる）に説明されているように、コア粒子は、アミノ酸配列の同一性および類似性ならびに配列の長さが野生型粒子と著しく異なっているヒトＨＢｃＡｇの変異型から形成することができる。例えば、ハクガンおよびアヒルを感染させるＢ型肝炎ウイルスのＨＢｃＡｇのアミノ酸配列は、タンパク質のアライメントが困難である、ウイルス感染哺乳動物のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列と十分に異なっている。しかし、両ウイルスは、規則正しい反復抗原アレイの形成に適するコア構造を形成する能力を保持している。同様に、ＨＢｃＡｇは、Ｎ末端リーダー配列の除去、さらなる欠失、置換又は配列への付加の後に、ウイルスに特有の多量体を形成する能力を保持していることがある。タンパク質がそのような構造を形成するかどうかを検討するために用いることができる方法は、ゲルろ過、アガロースゲル電気泳動、ショ糖密度勾配遠心分離および電子顕微鏡を含む（例えば、Ｋｏｓｃｈｅｌ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７３巻、２１５３〜２１６０頁（１９９９））。
【００９５】
第１結合部位  天然又は非天然を問わず、複合体、本発明の複合体および方法に用いるコア粒子は一般的に、少なくとも１つの共有結合により、天然又は非天然コア粒子に結合する第１付着部位を含む成分を有する。第１付着部位を含む要素は、規則正しい反復配列を形成するための核生成部位を提供するコア粒子に規則的に結合する。必然的でないが、理想的には、この要素は幾何学的順序でコア粒子と結合する。第１付着部位は、第２付着部位に結合するのに適する表面曝露アミノ酸残基のようなコア粒子の天然部分であってよい。例えば、リシンおよびシステインは、アミノ酸の反応性基を介して非ペプチド結合を形成することができる。あるいは、第１付着部位を含む要素を、化学結合により、あるいは組換え分子の設計により、コア粒子に導入することができる。第１付着部位は、少なくとも１つの共有結合によるコア粒子への結合を含む要素であるか、あるいはその要素上に見出されるものであってよい。
【００９６】
第１付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸（すなわち、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの残基）、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成高分子、二次代謝物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フッ化フェニルメチルスルホニル）、又はその組合せ、又はその化学的反応性の基を含む第１付着部位を含むか、あるいはそれらからなっていてよい。より特定の実施形態において、第１付着部位は、抗原、抗体又は抗体断片、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、受容体、受容体リガンド、リガンド、リガンド結合タンパク質、相互作用性ロイシンジッパーポリペプチド、アミノ基、アミノ基に対して反応性の化学基、カルボキシル基、カルボキシル基に対して反応性の化学基、スルフヒドリル基、スルフヒドリル基に対して反応性の化学基又はその組合せを含む。
【００９７】
一実施形態において、本発明は、ウイルスの遺伝子工学を用いて、規則正しい反復ウイルス包膜タンパク質と、異種タンパク質、ペプチド、抗原決定基又は適切な反応性アミノ酸残基を含む第１結合部位を含む要素との融合体を生成させる。当業者に知られている他の遺伝子操作を、非天然分子骨格の構築に含めることができる。例えば、遺伝子突然変異により組換えウイルスの複製能力を制限することが望ましい。第１付着部位タンパク質を含むタンパク質への融合のために選択するウイルスタンパク質は、組織化された反復構造を有するべきである。そのような組織化された反復構造は、ウイルスの表面上の０．５〜３０ｎｍ、好ましくは、５〜１５ｎｍの間隔を有する準結晶組織などである。この種の融合タンパク質の生成は、ウイルスの表面上の複数の規則正しい反復性の第１付着部位を生じさせるであろう。したがって、それから生じた第１付着部位の規則正しい反復組織は、天然ウイルスタンパク質の正常組織を反映する。
【００９８】
当業者より理解されるであろうように、第１付着部位は、非天然分子骨格に適切な抗原又は抗原決定基を特異的に結合させる機能を果たす可能性がある適切なタンパク質、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド（アミノ酸）、天然又は合成ポリマー又はその組合せであるか、又はその一部であってよい。一実施形態において、この付着部位は、当技術分野で知られているものから選択されるようなタンパク質又はペプチドである。例えば、第１付着部位は、リガンド、受容体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ＨＡ又はＴ７標識、Ｍｙｃ、Ｍａｘのようなエピトープ、免疫グロブリンドメインおよび第１付着部位として有用であると思われる当技術分野で知られている他のアミノ酸配列であってよい。
【００９９】
本発明の他の実施形態において第１付着部位が、キャプシドタンパク質へのフレーム内融合の構築に用いる第１付着部位を運ぶ要素（例えば、タンパク質又はポリペプチド）の生成に伴い二次的に生成される可能性があることがさらに当業者より理解されるであろう。例えば、タンパク質は、特異的にグリコシル化されることが知られているアミノ酸配列を有する包膜タンパク質への融合に用いることができ、結果として付加される糖部分が次に、抗原の第２付着部位として機能するレクチンへの結合によりウイルス骨格の第１付着部位として機能する。あるいは、配列をｉｎ  ｖｉｖｏでビオチン化すると、ビオチン部分は本発明の第１付着部位として機能することができ、あるいは、その配列の別のアミノ酸残基をｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学的修飾すると、修飾部分が第１付着部位として機能する。
【０１００】
本発明の特定の実施形態において、第１付着部位は、Ｂ型肝炎キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）にフレーム内で融合するＪＵＮ−ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインである。しかし、他のキャプシドタンパク質を、第１付着部位を本発明の非天然分子骨格に置くための融合タンパク質構成体に用いることができることは、当業者には明らかであろう。例えば、本発明の他の実施形態において、第１付着部位は、ＨＢｃＡｇにフレーム内で融合されたリシン又はシステイン残基として選択される。他のウイルスキャプシド又はウイルス様粒子を、第１付着部位を本発明の非天然分子骨格に置くための融合タンパク質構成体に用いることができることもすべての当業者には明らかであろう。
【０１０１】
ウイルス粒子  本発明の一実施形態において、非天然分子骨格は、組換えアルファウイルスであり、より具体的には、組換えシンドビスウイルスである。アルファウイルスファミリーのいくつかのメンバー、すなわち、シンドビス（Ｘｉｏｎｇ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４３巻、１１８８〜１１９１頁（１９８９）、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１１巻、１８〜２２頁（１９９３））、セムリキフォレスト（Ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス（ＳＦＶ）（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  Ｐ．＆  Ｇａｒｏｆｆ  Ｈ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第９巻、１３５６〜１３６１頁（１９９１））およびその他（Ｄａｖｉｓ  Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１７１巻、１８９〜２０４頁（１９８９））は、種々のタンパク質のウイルスに基づく発現ベクターとしての（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ  Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第８巻、５７８〜５８２頁（１９９７）、Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  Ｐ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第５巻、４９５〜５００頁（１９９４））およびワクチン開発の候補としての使用について著しい注目を集めている。異種タンパク質の発現およびワクチン開発のためのアルファウイルスの使用は、開示されている（米国特許第５，７６６，６０２号、第５，７９２，４６２号、第５，７３９，０２６号、第５，７８９，２４５号および第５，８１４，４８２号、全部についてすべての開示を参照により組込む）。本発明のこの態様によるアルファウイルス骨格の構築は、参照により本明細書に組み込まれる前記の論文に記載されているような組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られている手段によって行うことができる。１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分の付着のためのウイルスに基づくコア粒子を生成させるために、種々の組換え宿主細胞を用いることができる。
【０１０２】
パッケージドＲＮＡも宿主細胞を感染させるために用いることができる。これらのパッケージドＲＮＡは、それらを培地に添加することにより宿主細胞に導入することができる。例えば、非感染性アルファウイルス粒子の調製は、「Ｓｉｎｄｂｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、カタログ番号Ｋ７５０−１）を含む多くの情報源に記載されている。
【０１０３】
哺乳動物細胞をウイルスに基づくコア粒子の生産のための組換え宿主細胞として用いる場合、これらの細胞は一般的に組織培養において成長させる。培養により細胞を成長させる方法は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｃｅｌｉｓ  Ｊ．編、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９９８）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  研究所出版、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク（１９８９）、Ａｕｓｂｅｌ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｒ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８３）を参照）。
【０１０４】
したがって、本発明は、ウイルス、ウイルス様粒子、ファージ、ウイルスキャプシド粒子又はその組換え型を含むか、あるいはそれからなるウイルスに基づくコア粒子を含む。当業者はそのようなコア粒子を生成させ、それに第１付着部位を付着させる知識を有する。特に、ＨＢｃＡｇから集合又は自己集合させたＢ型肝炎ウイルス様粒子の生産、ならびにコア粒子としての麻疹ウイルスキャプシド粒子は、参照により本明細書に明確に組込まれる国際公開第００／３２２２７号の実施例１７〜２２に開示されている。そのような実施形態において、ＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメイン又はＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインを本発明の非天然分子骨格の第１付着部位として用いることができる。当業者は、それぞれ第１および第２付着部位としての、反応性リシン残基を有するフレーム内融合ペプチドを運ぶＢ型肝炎コア粒子および遺伝学的に融合したシステイン残基を運ぶアンジオテンシンペプチド部分を構築する方法を知っているであろう。
【０１０５】
他の実施形態において、本発明の複合体に用いるコア粒子は、ウイルス様粒子を形成することができ、規則正しいアレイであり、遊離システイン残基を除去、又はその数を減少させるために修飾された、Ｂ型肝炎キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）、ＨＢｃＡｇの断片、あるいは、他のタンパク質又はペプチドから構成されている。Ｚｈｏｕら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６６巻、５３９３〜５３９８頁（１９９２））は、天然で常在するシステイン残基を除去するために修飾されたＨＢｃＡｇは会合して、多量体構造を形成する能力を保持していることを示した。したがって、本発明の複合体への使用に適したコア粒子としては、１つ又は複数の天然で常在するシステイン残基を欠失させた、又は他のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）で置換した修飾ＨＢｃＡｇｓ又はその断片を含むものなどである。本発明の一実施形態において、配列番号１又はその下位部分に示されているアミノ酸配列を含む修飾ＨＢｃＡｇを用いて、非天然分子骨格を調製する。特に、本発明の実施に際しての使用に適した修飾ＨＢｃＡｇとしては、配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するタンパク質の位置４８、６１、１０７および１８５に対応する位置の１つ又は複数のシステイン残基を欠失させた、又は他のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）で置換したタンパク質などがある。当業者が認識しているように、配列番号１に示されているものと異なるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ変異体における同様な位置にあるシステイン残基も欠失させ、又は他のアミノ酸残基で置換することができる。次いで、その修飾ＨＢｃＡｇ変異体を用いて、本発明のワクチン複合体を調製することができる。
【０１０６】
特定の状況下（例えば、異種二官能性架橋物質を用いて、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分を非天然分子骨格に結合させる場合）では、ＨＢｃＡｇにおける遊離システイン残基の存在が、コア粒子への有毒化合物の共有結合と、単量体の架橋による未定義種の生成をもたらすと考えられている。さらに、多くの例において、これらの有毒化合物が、本発明の複合体について実施された定量法により検出できない可能性がある。非天然分子骨格への有毒化合物の共有結合が、有毒化合物が種々のシステイン残基に結合している多様な種の集団の生成をもたらすか、あるいは場合によってはＨＢｃＡｇのシステイン残基が存在しないことがあるため、これが言える。言い換えれば、ＨＢｃＡｇの各遊離システイン残基は、有毒化合物に共有結合しない。さらに、多くの場合に、個々のＨＢｃＡｇｓのシステイン残基のいずれも有毒化合物に結合しない。したがって、有毒化合物は分子の混合集団中に存在すると思われるので、これらの有毒化合物の存在を検出することは困難である。しかし、有毒化合物を含むＨＢｃＡｇ種の個体への投与は、潜在的に重篤な副作用をもたらし得る。
【０１０７】
遊離システイン残基が多くの化学副反応に関与し得ることは当技術分野でよく知られている。これらの副反応は、ジスルフィド交換、例えば、注射された、又は他の物質との併用療法で生成した化学物質又は代謝物との反応、あるいは直接酸化およびＵＶ光線への曝露時のヌクレオチドとの反応などである。特に、ＨＢｃＡｇが核酸と結合する強い傾向を有することを考慮すると、有毒な付加体が生成する可能性がある。広い範囲の分子量を有する生成物の分布が発生すると思われるので、遊離システインおよび異種二官能性架橋物質を含むＨＢｃＡｇを用いて調製したキャプシドを用いて抗原−キャプシド複合体中のそのような有毒生成物を検出することは困難であろう。有毒な付加体がそのように複数の種にわたって分布し、個別にはそれぞれが低濃度で存在するが、一緒になったときに毒性レベルに達する可能性がある。
【０１０８】
上記のことを考慮すると、天然で常在するシステイン残基を除去するために修飾されたワクチン複合体中のＨＢｃＡｇｓの使用の１つの利点は、アンジオテンシンペプチド部分が非天然分子骨格に結合している場合に有毒種が結合することができる部位が、その数が減少するか、あるいはまったくなくなることである。さらに、高濃度の架橋物質を用いて高度に修飾された粒子を生成させることができ、ＨＢｃＡｇ単量体の複数の未定義架橋種（すなわち、架橋単量体ＨＢｃＡｇｓの多様な混合物）が発生するという欠点がなくなる。
【０１０９】
本発明の実施において使用するのが適切である多くの天然に存在するＨＢｃＡｇ変異体が特定された。Ｙｕａｎら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７３巻、１０１２２〜１０１２８頁（１９９９））は、例えば、配列番号１における位置９７に対応する位置のイソロイシンがロイシン残基又はフェニルアラニン残基で置換されている変異体を記述している。多くのＨＢｃＡｇ変異体ならびに数種のＢ型肝炎コア抗原前駆変異体のアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋ報告ＡＡＦ１２１２４０、ＡＦ１２１２３９、Ｘ８５２９７、Ｘ０２４９６、Ｘ８５３０５、Ｘ８５３０３、ＡＦ１５１７３５、Ｘ８５２５９、Ｘ８５２８６、Ｘ８５２６０、Ｘ８５３１７、Ｘ８５２９８、ＡＦ０４３５９３、Ｍ２０７０６、Ｘ８５２９５、Ｘ８０９２５、Ｘ８５２８４、Ｘ８５２７５、Ｘ７２７０２、Ｘ８５２９１、Ｘ６５２５８、Ｘ８５３０２、Ｍ３２１３８、Ｘ８５２９３、Ｘ８５３１５、Ｕ９５５５１、Ｘ８５２５６、Ｘ８５３１６、Ｘ８５２９６、ＡＢ０３３５５９、Ｘ５９７９５、Ｘ８５２９、Ｘ８５３０７、Ｘ６５２５７、Ｘ８５３１１、Ｘ８５３０１、Ｘ８５３１４、Ｘ８５２８７、Ｘ８５２７２、Ｘ８５３１９、ＡＢ０１０２８９、Ｘ８５２８５、ＡＢ０１０２８９、ＡＦ１２１２４２、Ｍ９０５２０、Ｐ０３１５３、ＡＦ１１０９９９およびＭ９５５８９に開示されている（この開示のそれぞれが参照により本明細書に組込まれる）。これらのＨＢｃＡｇ変異体は、配列番号１における位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２および１８３に存在するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む多くの位置におけるアミノ酸配列が異なっている。
【０１１０】
本発明の組成物における使用に適し、本明細書の開示に従ってさらに修飾することができるさらなるＨＢｃＡｇ変異体は、全部が参照により本明細書に組込まれる国際公開第００／１９８３３３号、第００／１７７１５８号および第００／２１４４７８号に記載されている。
【０１１１】
本発明における使用に適するＨＢｃＡｇｓは、会合して、規則正しい反復抗原アレイを形成することができる限り、あらゆる生物から得ることができる。一般的に処理されたＨＢｃＡｇｓ（すなわち、リーダー配列を欠くもの）は、本発明のワクチン複合体に使用される。本発明は、ワクチン複合体、ならびに非天然分子骨格の調製のために上述の変異型ＨＢｃＡｇｓを用いる、これらの複合体を用いる方法を含む。さらに本発明の範囲内に含まれるのは、会合して、ニ量体又は多量体構造を形成することができる別のＨＢｃＡｇ変異体である。したがって、本発明はさらに、配列番号１および適切な場合、Ｎ末端リーダー配列を除去するめに処理されたこれらのタンパク質の型を含む、上の配列に示されているアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％又は約９９％同じであるアミノ酸配列を含む、あるいは、それからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含むワクチン複合体を含む。
【０１１２】
ポリペプチドのアミノ酸配列が上に示したアミノ酸配列の１つと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％又は約９９％同じであるアミノ酸配列を有するか、あるいはその下位部分であるかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムのような既知のコンピュータプログラムを用いて適宜確定することができる。特定の配列が本発明による対照アミノ酸配列と、例えば、約９５％同じであるかを確定するためにＢｅｓｔｆｉｔ又は他の配列アライメントプログラムを用いる場合、同一性の割合が対照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、対照配列におけるアミノ酸残基の総数の最高５％の相同性のギャップが許容されるようにパラメーターを設定する。そのようにして、配列番号１のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列と他のＨＢｃＡｇとの比較を行うことができる。配列番号１における特定の位置に対応する位置にあるＨＢｃＡｇ変異体のアミノ酸残基に関して比較的類似しているタンパク質を比較するとき、配列番号１に示されているアミノ酸配列におけるその位置に存在するアミノ酸残基を基準にする。これらのＨＢｃＡｇ変異体間の相同性は、哺乳類に感染するＢ型肝炎ウイルスの間では大部分、十分に高いので、当業者は配列番号１に示されているアミノ酸配列と特定のＨＢｃＡｇ変異体のそれとを検討し、「対応する」アミノ酸を同定する困難はほとんどない。例えば、配列番号１とウッドチャックに感染するウイルス由来のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列との比較において、３つのアミノ酸残基挿入物が配列番号１のアミノ酸残基１５５と１５６との間の配列に存在することが容易にわかる。
【０１１３】
しかし、アライメントが困難である場合、当業者は、配列における特定のアミノ酸又はモチフの重要性を認識するであろう。例えば、ヒトウイルスのＨＢｃＡｇのアミノ酸配列は、そのようなアライメントが困難なほどにアヒルウイルスのアミノ酸配列と異なっており、当業者は、本発明のワクチン複合体にそれらを含める前に保存システイン残基を他のアミノ酸で置換するか、欠失させることを認識するであろう。
【０１１４】
一実施形態において、配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するタンパク質の位置４８と１０７におけるシステイン残基が欠失しているか、あるいは他のアミノ酸残基で置換されているが、位置６１におけるシステインは本来の位置に残っている。さらに、この修飾されたポリペプチドを用いて本発明のワクチン複合体を調製する。
【０１１５】
本発明に用いることができる好ましいＢ型肝炎ウイルス様粒子の調製は、例えば、国際公開第００／３２２２７号およびこれによる特に実施例１７〜１９および２１〜２４ならびに国際公開第０１／８５２０８号およびこれによる特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１および４１、ならびに、２００２年１月１８日に本譲受人により出願された係属米国出願第１０／０５０９０２号に開示されている。後者の出願において、これは特に実施例２３、２４、３１および５１に記載されている。３つの文書すべては参照により本明細書に明確に組込まれる。
【０１１６】
２００２年１月１８日に本譲受人により出願された米国出願第１０／０５０９０２号の実施例３１に記載されているように、溶媒が接触可能な位置４８および１０７のシステイン残基は、例えば、部位特異的突然変異により除去することができる。そのような一実施例において、２００２年１月１８日に出願された同時係属米国出願第１０／０５０９０２号（その全部が参照により本明細書に組込まれる）に記載されているように構築されたＣｙｓ−４８−Ｓｅｒ、Ｃｙｓ−１０７−Ｓｅｒ  ＨＢｃＡｇ二重突然変異体が大腸菌中で発現させることができることが見出された。
【０１１７】
上記のように、遊離システイン残基の除去により、有毒成分がＨＢｃＡｇに結合することができる部位の数が減少し、また、同じ又は隣接ＨＢｃＡｇ分子のリシンおよびシステイン残基の架橋が起こる部位も除去される。２量体形成に関与し、他のＨＢｃＡｇの位置６１のシステインとのジスルフィド架橋を形成する位置６１のシステインは、通常、本発明のＨＢｃＡｇ２量体および多量体の安定化のためにそのままである。（１）遊離システイン残基を含むＨＢｃＡｇｓ、ならびに（２）遊離システイン残基をヨードアセトアニドにより非反応性としたＨＢｃＡｇｓを用いた架橋実験により、ＨＢｃＡｇの遊離システイン残基は、異種２官能性架橋物質誘導体化リシン側鎖と遊離システイン残基との反応によるＨＢｃＡｇｓ間の架橋に役割を担っていることが示されている。ＨＢｃＡｇサブユニットの架橋は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分解することができないサイズ未定義の高分子量種の生成をもたらすことも見出された。
【０１１８】
アンジオテンシンペプチド部分をリシン残基を介して非天然分子骨格に連結するとき、配列番号１の位置７および９６に対応する位置にある天然に常在するリシン残基の１つ又は両方ならびにＨＢｃＡｇ変異体に存在する他のリシン残基を置換又は除去することが有利であると言える。これらのリシン残基の除去により、規則正しいアレイを破壊する可能性のあるアンジオテンシンペプチド部分の結合部位の除去がもたらされ、最終ワクチン複合体の品質と均一性が改善されるはずである。
【０１１９】
多くの場合に、配列番号１の位置７および９６に対応する位置にある天然に常在するリシン残基の両方を除去する場合、他のリシンがアンジオテンシンペプチド部分の付着部位としてＨＢｃＡｇに導入されるであろう。そのようなリシン残基を挿入する方法は、例えば、２００２年１月１８日に出願された同時係属米国特許出願第１０／０５０９０２号およびそれによる特に、米国特許出願第１０／０５０９０２号の実施例２３（その全部が参照により本明細書に組込まれる）に記載されている。例えば、配列番号１の位置７および９６に対応する位置にある天然に常在するリシン残基の両方を変化させ、アンジオテンシンペプチド部分を非天然分子骨格に異種２官能性架橋物質を用いて連結しようとする場合に、リシン残基をＨＢｃＡｇに導入することがしばしば有利であろう。
【０１２０】
ＨＢｃＡｇのＣ末端は、このタンパク質の核局在化を誘導することが示された（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６５巻、５７５〜５８２頁（１９９１））。さらに、このタンパク質のこの領域は、ＨＢｃＡｇに核酸に結合する能力も与えると考えられている。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本発明のワクチン複合体は、核酸結合活性を有するＨＢｃＡｇｓを含む（例えば、天然で常在するＨＢｃＡｇ核酸結合ドメインを含む）。１つ又は複数の核酸結合ドメインを含むＨＢｃＡｇｓは、高いＴ細胞刺激活性を示すワクチン複合体を調製するのに有用である。したがって、本発明のワクチン複合体は、核酸結合活性を有するＨＢｃＡｇｓを含む複合体を含む。ＨＢｃＡｇｓが核酸に結合している、ワクチン複合体ならびにワクチン接種プロトコールにおけるそのような複合体の使用がさらに含まれる。これらのＨＢｃＡｇｓは、個体への投与前に核酸に結合されていてよく、あるいは投与後に結合してもよい。
【０１２２】
本発明の実施における使用に適するさらなるＨＢｃＡｇｓは、ＮおよびＣ末端切形突然変異体、ならびにアミノ酸配列が前記切形突然変異体と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％又は約９９％同じであるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる突然変異体を含む。
【０１２３】
上記のように、本発明の特定の実施形態において、リシン残基を、非天然分子骨格を形成するポリペプチドに第１付着部位として導入する。好ましい実施形態において、本発明のワクチン複合体を、位置７９および８０に対応するアミノ酸がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３１）のアミノ酸配列を有するペプチドで置換されており、位置４８および１０７のシステイン残基が欠失しているか、又は他のアミノ酸残基で置換され、位置６１のシステインは本来の位置に残っているように修飾されている配列番号１のアミノ酸１〜１４４又はアミノ酸１〜１４９又はアミノ酸１〜１８５を含む、あるいはそれからなるＨＢｃＡｇを用いて調製する。
【０１２４】
本発明はさらに、配列番号１における対応する位置に存在しないシステイン残基が除去された、配列番号１に示されている以外のアミノ酸配列を含む、あるいはそれからなるＨＢｃＡｇの断片含むワクチン複合体を含む。
【０１２５】
本発明のワクチン複合体は、種々のＨＢｃＡｇの混合物を含んでいてよい。したがって、これらのワクチン複合体は、アミノ酸配列が異なっているＨＢｃＡｇｓから構成されていてよい。例えば、「野生型」ＨＢｃＡｇおよび１つ又は複数のアミノ酸残基が変化した（例えば、欠失、挿入又は置換された）修飾ＨＢｃＡｇを含むワクチン複合体を調製することができる。
【０１２６】
本発明はさらに、非天然分子骨格を、他のタンパク質に融合されたＨＢｃＡｇを用いて調製するワクチン複合体を含む。上記のように、そのような融合タンパク質の１つの例は、ＨＢｃＡｇ／ＦＯＳ融合体である。本発明のワクチン複合体における使用に適するＨＢｃＡｇ融合タンパク質の他の例としては、ＨＢｃＡｇ２量体および多量体の生成及び／又は安定化を促進するアミノ酸が付加された融合タンパク質などがある。この追加のアミノ酸配列は、ＨＢｃＡｇのＣ末端に融合されていてよい。そのような融合タンパク質の一例は、ＨＢｃＡｇ２量体および多量体を調製し、安定化するために用いることができる非共有結合相互作用によりホモ２量体を形成するサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＣＮ４らせん領域とＨＢｃＡｇとの融合である。
【０１２７】
他の一実施形態において、本発明は、ＨＢｃＡｇ又はその断片を含み、Ｃ末端に融合されたＧＣＮ４ポリペプチド（配列番号５，ＰＡＡＬＫＲＡＲＮＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫ）を含むＨＢｃＡｇ融合タンパク質を用いて調製したワクチン複合体を提供する。このＧＣＮ４ポリペプチドは、ＨｂｃＡｇのＮ末端に融合されていてもよい。
【０１２８】
ＨＢｃＡｇ／ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメイン融合タンパク質も本発明のワクチン複合体を調製するのに用いることができよう。ＳＨ３ドメインは、タンパク質結合パートナーにおけるプロリンに富む特定の配列と相互作用をする能力を付与する多くのタンパク質に認められる比較的小さいドメインである（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ、第１１巻、２２９〜２３８頁（１９９９）を参照）。ＨＢｃＡｇ／ＳＨ３融合タンパク質は、いくつかの方法で用いることができよう。第１に、ＳＨ３ドメインは、アンジオテンシンペプチド部分の第２付着部位と相互作用する第１付着部位を形成することができよう。同様に、プロリンに富むアミノ酸配列は、ＨＢｃＡｇに付加させ、アンジオテンシンペプチド部分のＳＨ３ドメイン第２付着部位に対する第１付着部位として用いることができよう。第２に、ＳＨ３ドメインは、ＨＢｃＡｇに導入されたプロリンに富む領域と会合することができよう。したがって、ＳＨ３ドメインおよびプロリンに富むＳＨ３相互作用部位は、同じ又は異なるＨＢｃＡｇｓに挿入し、本発明の２量体および多量体を形成し、安定化するために用いることができよう。
【０１２９】
前記の例によって明らかなように、当業者は、コア粒子および第１付着部位を含む分子骨格をＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ由来突然変異体からどのようにして形成させるかを知っているであろう。当技術分野で知られている技術と常用の実験の適用により、当業者は他のウイルスを同様に用いて分子骨格を構築する方法を理解するであろう。
【０１３０】
本明細書の他所に示すように、ウイルスキャプシドは、（１）１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分の提示、および（２）本発明のワクチン複合体の調製に用いることができる。特に、本発明の実施に有用なものは、本明細書で「コートタンパク質」とも称する、発現時にキャプシド又はキャプシド様粒子を形成するウイルスキャプシドタンパク質である。したがって、これらのキャプシドタンパク質は、コア粒子および非天然分子骨格を形成することができる。一般的に、これらのキャプシドおよびキャプシド様構造は、抗原決定基の提示および本発明のワクチン複合体の調製に用いることができる規則正しい反復アレイを形成する。
【０１３１】
１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５等）のアンジオテンシンペプチド部分をいずれかの数の手段により、ウイルスキャプシド又はキャプシド様構造を形成する１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５等）のタンパク質（例えば、バクテリオファージコートタンパク質）ならびに他のタンパク質に付着させることができる。例えば、アンジオテンシンペプチド部分を第１および第２付着部位を用いてコア粒子に付着させることができる。さらに、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５等）の異種二官能性架橋物質を用いて、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分をウイルスキャプシド又はキャプシド様構造を形成する１つ又は複数のタンパク質に付着させることができる。
【０１３２】
ウイルスキャプシドタンパク質又はその断片を用いて、例えば、本発明のコア粒子およびワクチン複合体を調製することができる。例えば、Ｑβコートタンパク質は、組換えにより大腸菌において発現させることができる。さらに、そのような発現により、これらのタンパク質は、ウイルス様粒子であるキャプシドを自発的に形成する。さらに、これらのキャプシドは、アンジオテンシンペプチド部分の提示とワクチン複合体の調製に用いることができる規則正しい反復アレイを形成する。
【０１３３】
好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組換えタンパク質又はその断片を含む、それらから本質的になる、あるいはそれらからなっている。好ましくは、ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ、ｂ）バクテリオファージＲ１７、ｃ）バクテリオファージｆｒ、ｄ）バクテリオファージＧＡ、ｅ）バクテリオファージＳＰ、ｆ）バクテリオファージＭＳ２、ｇ）バクテリオファージＭ１１、ｈ）バクテリオファージＭＸ１、ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、ｋ）バクテリオファージｆ２、ｌ）バクテリオファージＰＰ７およびｍ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択する。
【０１３４】
本発明の他の好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβ、又はＲＮＡバクテリオファージｆｒ、又はＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５の組換えタンパク質又はその断片を含む、あるいはそれらから本質的になる、あるいはそれらからなっている。
【０１３５】
本発明の複合体を調製するために用いることができるバクテリオファージコートタンパク質の特定の例は、バクテリオファージＱβ（Ｑβ  ＣＰについては配列番号３、ＰＩＲデータベース受託番号ＶＣＢＰＱβ、およびＱβ  Ａ１タンパク質については配列番号４、受託番号ＡＡＡ１６６６３）、バクテリオファージＲ１７（ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（ＳＰ  ＣＰについてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３０３７４、およびＳＰ  Ａ１タンパク質については受託番号）、バクテリオファージＭＳ２（ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７、バクテリオファージＡＰ２０５（配列番号１２）のようなＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質などである。当業者が認識しているように、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するあらゆるタンパク質を本発明のワクチン複合体の調製に用いることができる。さらに、バクテリオファージＱβのＡ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ１６６６３（配列番号４）又はそのＣ末端から約１００、約１５０又は約１８０アミノ酸を欠失しているＣ末端切形は、Ｑβコートタンパク質のキャプシドアセンブリに組込むことができる。Ａ１タンパク質は、第２付着部位を含むアンジオテンシンペプチド部分の付着のための、第１付着部位を含む要素に融合することもできる。一般的に、キャプシドアセンブリ中のＱβ  ＣＰに対するＡ１タンパク質の割合は、キャプシド形成を保証するために制限する。
【０１３６】
Ｑβコートタンパク質も大腸菌中で発現させたとき、キャプシドに自己集合することが見出された（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  ＴＭ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、第１３７巻、１３３〜１３７頁（１９９３））。得られたキャプシド又はウイルス様粒子は、直径２５ｎｍでＴ＝３の準対称を有する正十二面体ファージ様キャプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造が解明された。キャプシドは、ジスルフィド架橋により共有結合五量体および六量体に連結されている１８０コピーのコートタンパク質を含む（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４巻、５４３〜５５５４頁（１９９６））。他のＲＮＡファージコートタンパク質も細菌宿主中の発現により自己集合することが示された（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、第２３巻、２４５〜２５４頁（１９８３）、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ  ＴＭ．ｅｔ  ａｌ．、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ、第２８７巻、４５２〜４５５頁（１９８６）、Ａｄｈｉｎ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１７０巻、２３８〜２４２頁（１９８９）、Ｎｉ  ＣＺ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．第５巻、２４８５〜２４９３頁（１９９６）、Ｐｒｉａｎｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２４９巻、２８３〜２９７頁（１９９５））。Ｑβファージキャプシドは、コートタンパク質に加えて、いわゆる読み過しタンパク質Ａ１と成熟タンパク質Ａ２を含む。Ａ１は、ＵＧＡ停止コドンにおける抑制により生成し、３２９ａａの長さを有する。本発明に用いるファージＱβ組換えコートタンパク質のキャプシドは、Ａ２溶解タンパク質が欠けており、宿主からのＲＮＡを含む。ＲＮＡファージのコートタンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ウイルスの生活環における翻訳レプレッサーとして作用する複製遺伝子のリボソーム結合部位のステムループと相互作用する。相互作用の配列および構造的要素は知られている（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ  ＧＷ．＆  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ  ＯＣ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２８巻、７１〜７６頁（１９８９）、Ｌｉｍ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻、３１８３９〜３１８４５頁（１９９６））。ステムループおよびＲＮＡは一般にウイルス集合に関与することが知られている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４巻、５４３〜５５５４頁（１９９６））。
【０１３７】
Ｓｔｏｌｌ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５２巻、９９０〜９９３頁（１９７７）に記載されているように、我々がＮ末端エドマン配列決定により認めたように、大腸菌中での発現によりＱβコートタンパク質のＮ末端メチオニンが通常除去される。Ｎ末端が除去されていないＱβコートタンパク質からなるＶＬＰ、あるいは、Ｎ末端メチオニンが切断された、又は存在するＱβコートタンパク質の混合物を含むＶＬＰも本発明の範囲内である。
【０１３８】
１．本発明のさらなる好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えタンパク質又はその断片を含む、あるいはそれらから本質的になる、あるいはそれらからなっている。
【０１３９】
２．ＡＰ２０５ゲノムは、関連ファージに存在しない成熟タンパク質、コートタンパク質、レプリカーゼおよび２つの読み取り枠、ならびに成熟遺伝子の翻訳に役割を果たす溶解遺伝子および読み取り枠からなる（Ｋｌｏｖｉｎｓ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第８３巻、１５２３〜３３頁（２００２））。ＡＰ２０５コートタンパク質は、ｐＱｂ１０の誘導体であり（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、第１３７巻、１３３〜３７頁（１９９３））、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含むプラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号１１）から発現させることができる。あるいは、ＡＰ２０５コートタンパク質は、ベクターに存在するリボソーム結合部位の下流のｐＱｂ１８５にクローンすることができる。両アプローチにより、発明の名称が「分子抗原アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙ）」で、本譲受人が２００２年７月１７日に出願し、その全部が参照により組込まれ、その特許出願の実施例２に特に記載されている、同時係属米国仮特許出願第６０／３９６１２６号に記載のようなタンパク質の発現およびキャプシドの形成がもたらされる。ベクターｐＱｂ１０およびｐＱｂ１８５は、ｐＧＥＭベクター由来のベクターであり、これらのベクターにおけるクローン化タンパク質の発現は、ｔｒｐプロモーターにより制御されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、第１３７巻、１３３〜３７頁（１９９３））。プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号１１）は、ＸｂａＩ部位の下流にあり、ＡＰ２０５コートタンパク質のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流にある以下の配列における推定上のＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む。すなわち、ｔｃｔａｇａＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣａｔｇ（配列番号３３）。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位の下流にあり、開始コドンの上流にあるシャインダルガルノ配列を含む（ｔｃｔａｇａＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧ  ＴＣＡＧＧＣＣａｔｇ、下線部がシャインダルガルノ配列である，配列番号１８）。
【０１４０】
３．本発明のさらなる好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質又はその断片を含む、あるいはそれらから本質的になる、あるいはそれらからなっている。
【０１４１】
４．したがって、本発明のこの好ましい実施形態は、キャプシドを形成するＡＰ２０５コートタンパク質を含む。そのようなタンパク質は、組換えにより発現させるか、又は天然源から調製する。電子顕微鏡法（ＥＭ）および免疫拡散により明らかなように、細菌において産生されるＡＰ２０５コートタンパク質はキャプシドを自発的に形成する。ＥＭで観察したとき、ＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号１２）により形成されるキャプシドの構造特性とＡＰ２０５  ＲＮＡファージのコートタンパク質により形成されるものとほぼ区別できない。ＡＰ２０５  ＶＬＰは、高度に免疫原性で、抗原及び／又は抗原決定基に結合させて、有する抗原及び／又は抗原決定基の反復性の配向を示すワクチン構成体を生成することができる。結合した抗原及び／又は抗原決定基が抗体分子との相互作用に利用でき、免疫原性であることを示す、そのように提示された抗原に対して高い力価がもたらされる。
【０１４２】
５．本発明のさらなる好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換え突然変異コートタンパク質又はその断片を含む、あるいはそれらから本質的になる、あるいはそれらからなっている。
【０１４３】
６．アミノ酸５におけるプロリンのトレオニンへの置換を有するＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号１３）を含む、ＡＰ２０５  ＶＬＰの集合能力のある突然変異型も、本発明の実施に用いることができ、本発明のさらなる好ましい実施形態につながる。これらのＶＬＰ、天然源由来のＡＰ２０５  ＶＬＰ又はＡＰ２０５ウイルス粒子は、抗原に結合させて、本発明による抗原の規則正しい反復アレイを生成させることができる。
【０１４４】
７．ＡＰ２０５  Ｐ５−Ｔ突然変異コートタンパク質は、ｐＱｂ１８５から直接誘導され、Ｑβコートタンパク質遺伝子の代わりにＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子を含むｐＡＰ２８１−３２（配列番号１４）から発現させることができる。ＡＰ２０５コートタンパク質の発現のために、ＡＰ２０５コートタンパク質の発現のためのベクターを大腸菌にトランスフェクトする。
【０１４５】
８．ＶＬＰへの自己集合をもたらす、それぞれコートタンパク質および突然変異コートタンパク質を発現させる方法は、発明の名称が「分子抗原アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙ）」で、本譲受人が２００２年７月１７日に出願し、その全部が参照により組込まれる、同時係属米国仮特許出願第６０／３９６１２６号に記載されている。適切な大腸菌株は、大腸菌Ｋ８０２、ＪＭ１０９、ＲＲ１を含むが、これらに限定されない。適切なベクターおよび株ならびにその組合せは、コートタンパク質および突然変異コートタンパク質の発現をそれぞれ試験することにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにキャプシド形成および集合により、場合によって最初にゲルろ過によりキャプシドを精製し、次にそれらを免疫拡散検定（オクタロニー試験）又は電子顕微鏡法（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、第１３７巻、１３３〜３７頁（１９９３））により特定することができる。
【０１４６】
９．ベクターｐＡＰ２８３−５８およびｐＡＰ２８１−３２から発現させたＡＰ２０５コートタンパク質は、大腸菌の細胞質中での処理のため、最初のメチオニンアミノ酸を欠いていることがある。ＡＰ２０５  ＶＬＰの切断、非切断型又はその混合物は、本発明のさらなる実施形態である。
【０１４７】
１０．本発明のさらなる好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質又はその断片の混合物、ならびにＲＮＡファージＡＰ２０５の組換え突然変異コートタンパク質又はその断片を含む、あるいはそれらから本質的になる、あるいはそれらからなっている。
【０１４８】
１１．本発明のさらなる好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質又は組換え突然変異コートタンパク質を含む、あるいはそれらから本質的になる、あるいはそれらからなっている。
【０１４９】
１２．ＶＬＰおよびキャプシドにそれぞれ集合することができる組換えＡＰ２０５コートタンパク質断片も本発明の実施に有用である。これらの断片は、それぞれコートタンパク質および突然変異コートタンパク質の内部又は末端における欠失により生成させることができる。コートタンパク質および突然変異コートタンパク質配列への挿入又はコートタンパク質および突然変異コートタンパク質配列への抗原配列の融合、およびＶＬＰへの集合との適合性は、本発明のさらなる実施形態であり、それぞれキメラＡＰ２０５コートタンパク質および粒子につながる。コートタンパク質配列への挿入、欠失および融合の結果ならびにそれがＶＬＰへの集合と適合しているかどうかは、電子顕微鏡法により確認することができる。
【０１５０】
１３．上記のＡＰ２０５コートタンパク質、コートタンパク質断片およびキメラコートタンパク質により形成された粒子は、発明の名称が「分子抗原アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙ）」で、本譲受人が２００２年７月１６日に出願し、その全部が参照により組込まれる、同時係属米国仮特許出願に記載されているように、沈殿による分画段階と、例えば、セファロースＣＬ−４Ｂ、セファロースＣＬ−２Ｂ、セファロースＣＬ−６Ｂカラムおよびその組合せを用いたゲルろ過による精製段階との組合せにより純粋な形で分離することができる。ウイルス様粒子を分離する他の方法が当技術分野で知られており、バクテリオファージＡＰ２０５のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を分離するために用いることができる。例えば、酵母レトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰを分離するための超遠心分離の使用は、全部が参照により組込まれる米国特許第４，９１８，１６６号に記載されている。
【０１５１】
本発明によれば、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分をＲＮＡファージコートタンパク質のキャプシドのサブユニットに付着させることができる。ＲＮＡファージのコートタンパク質のキャプシド、および特にＱβキャプシドのサブユニット当たり数個のアンジオテンシンペプチド部分を結合する能力は、高密度のアンジオテンシンペプチド部分アレイの生成を可能にするものである。例えば、その主要免疫優性領域（ＭＩＲ、国際公開第００／３２２２７号）におけるリシン残基で修飾したＨＢｃＡｇのような、他のウイルスキャプシドを化学的架橋によるアンジオテンシンペプチド部分の共有結合付着のために用いることができる。ＨＢｃＡｇのスパイク（ＭＩＲに対応する）間の距離は、５０Åであり（Ｗｙｎｎｅ  ＳＡ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、第３巻、７７１〜７８０頁（１９９９））、したがって、５０Åより短い距離を有するアンジオテンシンペプチド部分アレイは生成させることはできない。
【０１５２】
Ｑβコートタンパク質のキャプシドは、それらの表面上に、キャプシドの内側に向き、ＲＮＡと相互作用する３つのリシン残基と、キャプシドの外側に露出した他の４つのリシン残基を有するという定まったトポロジーを有する定まった数のリシン残基を示す。これらの定まった特性は、アンジオテンシンペプチド部分の粒子の外側への付着に有利であり、リシン残基がＲＮＡと相互作用する内部への付着に有利でない。他のＲＮＡファージコートタンパク質のキャプシドもそれらの表面上の定まった数のリシン残基とこれらのリシン残基の定まったトポロジーを有する。ＲＮＡファージ由来のキャプシドの他の利点は、手頃な費用で大量な物質の生産を可能にする細菌におけるそれらの高い発現収率である。
【０１５３】
Ｑβコートタンパク質のキャプシド他の特徴は、その安定性である。Ｑβサブユニットは互いにジスルフィド架橋を介して結合していて、サブユニットが共有結合により連結している。Ｑβキャプシドタンパク質は、有機溶媒および変性剤に対しても異常な耐性を示す。驚くべきことに、我々は、約３０％という高いＤＭＳＯおよびアセトニトリル濃度、ならびに約１Ｍと高いグアニジニウム濃度をキャプシドの安定性又はアンジオテンシンペプチド部分アレイを形成する能力に影響を及ぼさずに用いることができたことを見出した。したがって、これらの有機溶媒を特定のアンジオテンシンペプチド部分のような疎水性分子を結合させるために用いることができる。Ｑβコートタンパク質のキャプシドの高い安定性は、特に哺乳動物およびヒトの免疫化およびワクチン接種のためのその使用に関して重要な特徴である。キャプシドが有機溶媒に対して耐性を有することより、水性緩衝液中で可溶性でないアンジオテンシンペプチド部分又はその誘導体の結合が可能となる。
【０１５４】
ＲＮＡファージＭＳ−２のコートタンパク質のＮ末端βヘアピンへのシステイン残基の挿入は、全部が参照により組込まれる米国特許第５，６９８，４２４号に記載されている。しかし、我々は、キャプシドにおける露出遊離システイン残基の存在が、ジスルフィド架橋形成によるキャプシドのオリゴマー化をもたらす可能性があることを認めた。上記の米国特許において検討された他の結合は、アンジオテンシンペプチド部分とＱβ粒子との間のジスルフィド架橋の形成がある。そのような結合は、スルフヒドリル部分を含む分子に対して不安定である。
【０１５５】
Ｑβ上のシステインにより形成された最初のジスルフィド架橋と遊離スルフヒドリル残基を含む抗原との反応により、アンジオテンシンペプチド部分以外のスルフヒドリル含有種が放出される。これらの新たに形成されたスルフヒドリル含有種は、再び、粒子上に存在する他のジスルフィド架橋と反応することができ、それにより平衡を確立する。粒子上の形成されたジスルフィド架橋との反応時に、アンジオテンシンペプチド部分は、粒子からのシステイン残基と、あるいは、粒子上の最初のジスルフィド架橋を形成していた遊離基分子のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成する。さらに、１側のＱβ粒子上のシステインと、また、他側のアンジオテンシンペプチド部分上のリシン残基と、反応する異種二官能性架橋剤を用いた、記載した他の結合方法は、粒子上のアンジオテンシンペプチド部分のランダム配向をもたらし得る。
【０１５６】
我々はさらに、ＱβおよびＦｒコートタンパク質のキャプシドと異なり、米国特許第５６９８４２４号に記載されている組換えＭＳ−２は、本質的に核酸を含まないが、ＲＮＡは上記の２つのキャプシドの内部に詰め込まれていることを認めた。
【０１５７】
我々はここに、新規かつ発明による複合体と、複合体中に可変の密度のアンジオテンシンエピトープを含むアンジオテンシンペプチド部分の頑健なアレイの形成を可能にする複合体を記述する。我々は、アンジオテンシンペプチド部分をＶＬＰに付着させることにより、非常に高いエピトープ密度を達成できることを示す。さらに、アンジオテンシンペプチド部分の密度と間隔は、適切な第１付着部位を有する残基の数と種類を変化させることにより、修正することができる。例えば、２００２年１月１８日に出願された同時係属米国特許出願第１０／０５０９０２号は、野生型Ｑβコートタンパク質で認められるよりも高い密度のアレイを得るのに適した別のリシン残基を有するＱβ突然変異コートタンパク質を開示している。さらに、前記出願はまた、適切な間隔を有するいくつかの抗原の同時の提示に適した複合体と、補助的分子の追加が溶解度を増加させ、あるいは適切かつ所望の仕方でキャプシドを修飾する複合体を開示している。ウイルス様粒子であるキャプシドを形成する他のＱβコートタンパク質突然変異体が、同時係属米国特許出願第１０／０５０９０２号に開示されており、本発明の組成物を生成するのに適している。特に、アンジオテンシンペプチド部分およびＱβ−アンジオテンシンペプチド抗原アレイの溶解度が、Ｑβウイルス様粒子に付着させることができるアンジオテンシンペプチド部分の数に制限を課している場合、リシンが、リシン残基と同じ反応性を有さないアルギニンで置換された突然変異体を用いることができる。これらの組成物を調製する場合、高濃度のアンジオテンシンペプチド部分、又は第２付着部位を含むように修飾したアンジオテンシンペプチド部分を用いて、ｗｔＱβウイルス様粒子を用いた場合のように、より多数の付着アンジオテンシンペプチド部分を有する潜在的に不溶性粒子を発生させることなく、突然変異Ｑβウイルス様粒子上のリシン残基における完全な反応を達成することができる。
【０１５８】
数種のＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定された（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４巻、５４３〜５５４頁（１９９６））。そのような情報を用いて、当業者は容易に、表面露出残基を特定し、１つ又は複数の反応性アミノ酸残基を挿入することができるように、バクテリオファージコートタンパク質を修飾することができよう。したがって、当業者は本発明の実施において用いることができる修飾型のバクテリオファージコートタンパク質を容易に発生させ、同定することができよう。したがって、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体（例えば、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質）も本発明のワクチン複合体を調製するために用いることができる。
【０１５９】
上で論じた変異タンパク質の配列はそれらの野生型と異なっているが、これらの変異タンパク質は一般的にキャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を保持している。したがって、本発明はさらに、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体を含むワクチン複合体、ならびにそのようなワクチン複合体を調製する方法、そのようなワクチン複合体を調製するために用いる個々のタンパク質サブユニットを含む。したがって、規則正しい反復アレイを形成し（例えば、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体）、会合して、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を保持している野生型タンパク質の変異型が本発明の範囲内に含まれる。通常、Ｃ又はＮ末端切形変異体は、ウイルス様粒子を形成する能力を保持している。その結果、欠失、付加又は置換を含む変異型、キメラ型および天然に存在する変異体は、本発明の適切な構成成分である。
【０１６０】
細菌線毛およびピリンタンパク質．  他の実施形態において、細菌ピリン、細菌ピリンの下位部分、又は細菌ピリンもしくはその下位部分を含む融合タンパク質を用いて、本発明のワクチン複合体を調製する。ピリンタンパク質の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、カウロバクタークレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、シュードモナススツツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス  アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）により生成されるピリンなどがある。本発明に関する使用に適したピリンタンパク質のアミノ酸配列は、すべての開示が参照により組込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ報告ＡＪ０００６３６、ＡＪ１３２３６４、ＡＦ２２９６４６、ＡＦ０５１８１４、ＡＦ０５１８１５およびＸ００９８１に記載されているものを含む。
【０１６１】
細菌ピリンタンパク質は一般的に、細菌ペリプラズムへのタンパク質の輸出の前にＮ末端リーダー配列を除去するために処理する。さらに、当業者が認識しているように、本発明のワクチン複合体を調製するために用いる細菌ピリンタンパク質は、一般的に天然に存在するリーダー配列を有していない。
【０１６２】
本発明における使用に適したピリンタンパク質の１つの特定の例は、大腸菌のＰピリンである（ＧｅｎＢａｎｋ報告ＡＦ２３７４８２）。本発明における使用に適した１型大腸菌ピリンの例は、ＧｅｎＢａｎｋ報告Ｐ０４１２８に記載され、ＧｅｎＢａｎｋ報告Ｍ２７６０３に示されているヌクレオチド配列を有する核酸によりエンコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を有するピリンである。これらのＧｅｎＢａｎｋ報告のすべての開示は参照により本明細書に組込まれる。再び、上述のタンパク質の成熟型は、一般的に本発明のワクチン複合体を調製するために使用されよう。
【０１６３】
本発明の実施における使用に適した細菌ピリン又はピリン下位部分は、一般的に会合して、非天然分子骨格を形成することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで線毛および線毛様構造を調製する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｂｕｌｌｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９３巻、１２８９０〜１２８９５頁（１９９６）に、大腸菌Ｐ線毛サブユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構成が記載されている。さらに、Ｅｓｈｄａｔら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１４８巻、３０８〜３１４頁（１９８１））は、大腸菌の１型線毛を解離させるのに適した方法と線毛の再構成を記載している。概要を示すと、これらの方法は次のとおりである。線毛を飽和塩酸グアニジン中で３７℃でインキュベートして解離させる。次いで、ピリンタンパク質をクロマトグラフィーにより精製し、その後、５ｍＭ塩酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）に対して透析して、ピリン２量体を形成させる。Ｅｓｈｄａｔらは、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）に対して透析することにより、ピリン２量体が再集合して、線毛を形成することも見出した。
【０１６４】
さらに、例えば、従来の遺伝子工学とタンパク質修飾法を用いて、アンジオテンシンペプチド部分が第２付着部位を介して結合する第１付着部位を含むようにピリンタンパク質を修飾することができる。あるいは、アンジオテンシンペプチド部分は、これらのタンパク質に天然で常在するアミノ酸残基に第２付着部位を介して直接結合することができる。これらの修飾ピリンタンパク質は、本発明の免疫化複合体に用いることができる。
【０１６５】
本発明の複合体を調製するために用いる細菌ピリンタンパク質は、ＨＢｃＡｇについて本明細書で記載したの同様に修飾することができる。例えば、システインおよびリシン残基を欠失させるか、又は他のアミノ酸残基で置換し、第１付着部位をこれらのタンパク質に付加することができる。さらに、ピリンタンパク質は、修飾された形態で発現させるか、あるいは、発現後に化学的に修飾することもできる。同様に、完全なピリンを細菌から収集し、次いで、化学的に修飾することができる。
【０１６６】
他の実施形態において、線毛又は線毛様構造を細菌（例えば、大腸菌）から収集して、本発明のワクチン複合体を形成するために用いる。ワクチン複合体の調製に適した線毛の一例は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するピリン単量体から形成される大腸菌の１型線毛である。
【０１６７】
細菌線毛を収集する多くの方法が当技術分野で知られている。例えば、ＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．第７４巻、６２３〜６３２頁（１９９８））は、大腸菌からＰ線毛を収集するための線毛精製法を記載している。この方法によれば、線毛をＰ線毛プラスミドを含む高線毛大腸菌から採取し、可溶化とＭｇＣｌ２（１．０Ｍ）沈殿のサイクルにより精製する。２００２年１月１８日に出願された同時係属米国出願第１０／０５０９０２号は、天然で線毛を生産する、又は線毛生産を担っているｆｉｍオペロンをエンコードするベクターが導入された細菌からのＩ型線毛の収集と精製を開示している。
【０１６８】
収集されたならば、線毛および線毛様構造は、様々な方法で修飾することができる。例えば、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分を第２付着部位を介して付着させることができる、第１付着部位を線毛に付加することができる。言い換えれば、細菌線毛および線毛様構造を収集し、修飾して、非天然分子骨格を形成させることができる。
【０１６９】
線毛および線毛様構造はまた、非天然第１付着部位が存在しない場合に、アンジオテンシンペプチド部分の付着によっても修飾することができる。例えば、抗原又は抗原決定基を天然に存在するシステイン残基又はリシン残基に結合させることができよう。そのような例において、天然に存在するアミノ酸の高い秩序と反復性が、線毛および線毛様構造へのアンジオテンシンペプチド部分の結合のガイドとなるであろう。例えば、線毛および線毛様構造を、アンジオテンシンペプチド部分の第２付着部位に異種二官能性架橋物質を用いて結合させることができるであろう。
【０１７０】
生物により天然で合成される構造（例えば、線毛）を用いて本発明のワクチン複合体を調製する場合、所望の特性を有する構造を生産するようにこれらの生物を遺伝子工学的に処理することがしばしば有利である。例えば、大腸菌の１型線毛を用いる場合、これらの線毛を収集する大腸菌を、特定の特性を有する構造を生産するように変異させることができる。ピリンタンパク質の可能な修飾の例は、１つ又は複数のリシン残基の挿入、１つ又は複数の天然に常在するリシン残基の欠失又は置換、および１つ又は複数の天然に常在するシステイン残基（配列番号２における位置４４および８４におけるシステイン残基）の欠失又は置換などである。
【０１７１】
さらに、リシン残基以外の第１付着部位（例えば、ＦＯＳ又はＪＵＮドメイン）を含む発現産物をもたらす付加的修飾をピリン遺伝子に対して行うことができる。もちろん、適切な第１付着部位は一般的に、ピリンタンパク質が本発明のワクチン複合体における使用に適する線毛および線毛様構造を形成することを妨げないものに限定される。組換えピリンタンパク質が線毛を形成する能力は、電子顕微鏡法を含む多くの方法により測定することができる。
【０１７２】
細菌細胞に天然で常在するピリン遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで修飾することができ（例えば、相同的組換えにより）、あるいは、特定の特性を有するピリン遺伝子をこれらの細胞に挿入することができる。例えば、ピリン遺伝子を複製性クローニングベクター又は細菌染色体に挿入するベクターの成分として細菌細胞に導入することができよう。挿入されたピリン遺伝子は、発現調節制御配列（例えば、ｌａｃオペレーター）に連結させることもできる。
【０１７３】
ほとんどの場合に、本発明のワクチン複合体に用いる線毛および線毛様構造は、単一の種類のピリンサブユニットから構成されるであろう。しかし、本発明の複合体には、異種ピリンサブユニットから形成される線毛および線毛様構造を含むワクチンも含まれる。同じサブユニットからなる線毛および線毛様構が一般的に使用されるであろう。その理由は、それらは高度に規則正しい反復抗原アレイを示す構造を形成すると予想されるためである。
【０１７４】
第２付着部位  高いエピトープ密度を有するＲＮＡファージコートタンパク質のキャプシドの複合体を含む、規則正しい反復アレイを有する分子骨格の調製が本発明により提供される。当業者により理解されるように、アンジオテンシンペプチド部分の性質、その部分における第２付着部位の性質と位置は、本発明の複合体を構築するために利用可能な手段、および免疫応答を誘導することに関するそれらの複合体の有効性に影響を及ぼす可能性がある重要な因子である。
【０１７５】
第２付着部位を設計するための必要条件は、それを融合し、挿入又は遺伝子工学的に処理する、又は結合する位置を選択することである。当業者は、第２付着部位の位置の選択の指針となるものをどのようにして見出すのか、そしてこのような決定に関連する多くの因子を考慮することを知っているであろう。アンジオテンシンペプチド部分の化学及び／又は結晶構造は、結合に適する分子上のドメインの利用可能性に関する情報を提供する可能性がある。反応性ドメインの溶媒への接触可能性は、第１結合部位への化学的結合の速度論における制限因子となることがある。スルフヒドリル残基のような、結合に適する基が利用可能でなければならない。一般的に、アンジオテンシンパプチド部分による免疫化が、基質又は受容体のようなその天然リガンドを有する自己抗原でもあるアンジオテンシンパプチド部分の相互作用を阻害することを目的とする場合、第２付着部位は、天然リガンドとの相互作用の部位に対する抗体の生成を可能にするように付加させる。したがって、第２付着部位の位置は、第２付着部位又はそれを含むアミノ酸リンカーによる立体障害を避けるように選択する。さらなる実施形態において、抗原のその天然リガンドとの相互作用部位と異なる部位において誘導された抗体反応が望ましい。そのような実施形態において、第２付着部位は、それが抗原のその天然リガンドとの相互作用部位に対する抗体の生成を妨げるように選択することができる。考慮すべき他の因子は、アンジオテンシンパプチド部分の性質、ｐＩのようなその生化学的特性、電荷分布、さらなる修飾などである。一般的に、可変リンカーが好ましい。
【０１７６】
第２付着部位の位置の選択における他の基準は、アンジオテンシンパプチド部分のオリゴマー化の程度、オリゴマー化の部位、補因子の存在、ならびにアンジオテンシンパプチド部分の修飾が機能部分と、又は部分を認識し、好ましくはアンジオテンシンパプチド部分の機能を阻害する抗体の生成と適合する部分の構造における部位および配列を明らかにする実験的証拠の入手可能性などである。特定の実施形態において、特に、本発明によりウイルス様粒子へのアンジオテンシンパプチド部分の配向した規則正しい結合を確保するために、１つ又は複数の別のアミノ酸（天然に存在しない第２付着部位につながる）をアンジオテンシンパプチド部分配列のＣ又はＮ末端に付加する。
【０１７７】
ポリペプチド抗原をＶＬＰおよび特に、ＲＮＡファージコートタンパク質のキャプシドに付着させる特に好ましい方法は、ＲＮＡファージコートタンパク質のキャプシドの表面のリシン残基を抗原上のシステイン残基に認められるようなスルフヒドリル基とを結合させることである。同様に、アンジオテンシンペプチド部分上の遊離スルフヒドリル基も有効な付着部位である。第２付着部位として酸化スルフヒドリル基を機能させるために還元しなければならない場合、還元は、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ又はβ−メルカプトエタノールを用いて実現できる。
【０１７８】
本発明によれば、ＲＮＡファージコートタンパク質のキャプシド上のエピトープ密度は、架橋物質の選択および他の反応条件により調節することができる。例えば、架橋物質Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳおよびＳＭＰＨは、高いエピトープ密度を達成することを可能にする。誘導体化は高濃度の反応体による正の影響を受けるので、反応条件の操作を用いてＲＮＡファージキャプシドタンパク質および特に、Ｑβキャプシドタンパク質に結合する抗原の数を調節することができる。さらに、コア粒子上の第１付着部位の数は、アンジオテンシンペプチド部分アレイの密度に影響を及ぼす他の因子である。本発明の一実施形態において、我々はより高密度のアレイを得るのに適した付加的リシン残基を有するＱβ突然変異体コートタンパク質を提供する。
【０１７９】
最も好ましい実施形態において、アンジオテンシンペプチド部分は、それぞれコア粒子上の第１付着部位およびＶＬＰｓ又はＶＬＰサブユニットと会合することができる単一第２付着部位又は単一反応性付着部位を含む。これは、少なくとも１つ、しかし一般的には複数、好ましくは１０、２０、４０、８０、１２０個の抗原のそれぞれコア粒子およびＶＬＰへのそれぞれ明確かつ均一な結合および会合を保証する。したがって、抗原上の単一第２付着部位又は単一反応性付着部位の供給は、それぞれ非常に高度に規則正しい反復アレイにつながる単一かつ均一なタイプの結合および会合を保証する。例えば、結合および会合がそれぞれリシン（第１付着部位としての）およびシステイン（第２付着部位としての）相互作用による影響を受ける場合、本発明のこの好ましい実施形態により、抗原当たり１つのシステイン残基が、このシステイン残基が抗原上に天然で存在するか、あるいは天然で存在しないかにかかわりなく、それぞれＶＬＰおよびコア粒子の第１付着部位とそれぞれ結合および会合することができることが保証される。
【０１８０】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、共有結合は非ペプチド結合である。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、抗原上の第２付着部位の工学的処理は、本発明の開示による第２付着部位として適したアミノ酸を含むアミノ酸リンカーの融合を必要とする。したがって、本発明の好ましい実施形態において、アミノ酸リンカーを少なくとも１つの共有結合により抗原又は抗原決定基に結合させる。好ましくは、アミノ酸リンカーは、第２付着部位を含む、あるいはそれからなっている。さらなる好ましい実施形態において、アミノ酸リンカーは、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む。他の好ましい実施形態において、アミノ酸リンカーはシステインである。アミノ酸リンカーの選択のいくつかの基準ならびに本発明によるアミノ酸リンカーのさらなる好ましい実施形態は、既に上で述べた。
【０１８２】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基、すなわち、ＰｒＰタンパク質、ＰｒＰペプチド又はＰｒＰドメインをそれぞれコア粒子およびウイルス様粒子に融合させる。上で略述したように、ＶＬＰは、一般的に、ＶＬＰに集合する少なくとも１つのサブユニットからなる。したがって、再び本発明のさらなる好ましい実施形態において、抗原又は抗原決定基、好ましくは、少なくとも１つのアンジオテンシンペプチド部分を、ウイルス様粒子又はＶＬＰに組込むことができるタンパク質の少なくとも１つのサブユニットに融合して、キメラＶＬＰサブユニット−アンジオテンシンペプチド部分融合体を生成させる。
【０１８３】
アンジオテンシンペプチド部分の融合は、ＶＬＰサブユニット配列への挿入により、又はＶＬＰサブユニットもしくはＶＬＰに組込むことができるタンパク質のＮ又はＣ末端への融合により行うことができる。以後、ＶＬＰサブユニットへのペプチドの融合タンパク質に言及する場合、サブユニット配列のいずれかの末端への融合又はサブユニット配列内のペプチドの内部挿入が含まれる。
【０１８４】
融合は、さらに切形突然変異体と称されているサブユニット配列の一部が欠失したＶＬＰサブユニットの変異体へのアンジオテンシンペプチド部分配列の挿入によっても行うことができる。切形突然変異体は、ＮもしくはＣ末端、又はＶＬＰサブユニットの配列の一部の内部の欠失を有していてよい。例えば、例えばアミノ酸残基７９〜８１の欠失を有する特定のＶＬＰ  ＨＢｃＡｇは、内部欠失を有する切形突然変異体である。切形突然変異体ＶＬＰサブユニットのＮもしくはＣ末端へのアンジオテンシンペプチド部分の融合も本発明の実施形態につながる。同様に、ＶＬＰサブユニットの配列へのエピトープの融合は、置換によっても行うことができ、例えば、特定のＶＬＰ  ＨＢｃＡｇの場合には、アミノ酸残基７９〜８１が外来エピトープで置換されている。したがって、本明細書で以後に記載するとき、融合は、ＶＬＰサブユニットへのアンジオテンシンペプチド部分配列の挿入により、ＶＬＰサブユニットの配列の一部のアンジオテンシンペプチド部分配列による置換により、あるいは、欠失、置換又は挿入により行うことができる。
【０１８５】
キメラアンジオテンシンペプチド部分−ＶＬＰサブユニットは、一般的にＶＬＰに自己集合することができる。それらのサブユニットに融合されているＶＬＰ提示エピトープも、本明細書ではキメラＶＬＰと称する。示したように、ウイルス様粒子は、少なくとも１つのＶＬＰサブユニットを含むか、あるいはそれにより構成されている。本発明のさらなる実施形態において、ウイルス様粒子は、キメラＶＬＰサブユニットと非キメラＶＬＰサブユニット、すなわちそれに融合した抗原を有さないＶＬＰサブユニットとの混合物（いわゆるモザイク粒子につながる）を含むか、あるいはそれにより構成されている。これは、ＶＬＰの形成およびそれへの集合を確保するために有利であると思われる。それらの実施形態において、キメラＶＬＰサブユニットの割合は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％又はより高い値であってよい。
【０１８６】
フランキングアミノ酸残基は、ＶＬＰのサブユニットの配列のいずれかの末端に融合させるためにペプチド又はエピトープの配列のいずれかの末端、あるいはＶＬＰのサブユニットの配列へのそのようなペプチド配列の内部挿入のために加えることができる。グリシンおよびセリン残基は、融合するアンジオテンシンペプチド部分に加えるフランキング配列に用いられる特に好ましいアミノ酸である。グリシン残基は、ＶＬＰのサブユニットの配列への外来配列の融合の潜在的不安定化効果を低減させるような付加的柔軟性を与える。
【０１８７】
本発明の特定の実施形態において、ＶＬＰはＢ型肝炎コア抗原ＶＬＰである。ＨＢｃＡｇのＮ末端への融合タンパク質（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．第５巻、１１５７〜１１６３頁（１９９９）又はいわゆる主要免疫優性領域（ＭＩＲ）への挿入が記載され（Ｐｕｍｐｅｎｓ  Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ  Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４４巻、９８〜１１４頁（２００１））、国際公開第０１／９８３３３号）、これらは本発明の好ましい実施形態である。ＭＩＲの欠失を有するＨＢｃＡｇの天然に存在する変異体も記載され（Ｐｕｍｐｅｎｓ  Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ  Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４４巻、９８〜１１４頁（２００１）、これは参照により全部が特に組込まれる）、Ｎ又はＣ末端への融合ならびにｗｔ  ＨＢｃＡｇと比較した欠失に対応するＭＩＲの位置への挿入は本発明のさらなる実施形態である。Ｃ末端への融合も記載された（Ｐｕｍｐｅｎｓ  Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ  Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４４巻、９８〜１１４頁（２００１））。当業者は古典的分子生物学技術を用いて融合タンパク質を構築する方法に関する手引きを容易に見出すであろう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  研究所出版、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク（１９８９）、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、第７７巻、５１頁（１９８９））。ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質をエンコードし、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質の発現に有用なベクターおよびプラスミドが記載され（Ｐｕｍｐｅｎｓ  Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ  Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４４巻、９８〜１１４頁（２００１）、Ｎｅｙｒｉｎｃｋ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．第５巻、１１５７〜１１６３頁（１９９９））、これらは、本発明の実施において用いることができる。我々はまた、実施例（実施例６）により、キメラ自己集合ＨＢｃＡｇをもたらす、ＨＢｃＡｇのＭＩＲへのエピトープの挿入を述べる。自己集合の効率およびＨＢｃＡｇのＭＩＲに挿入するエピトープの提示の最適化における重要な因子は、挿入部位の選択ならびに挿入時にＭＩＲ内のＨＢｃＡｇ配列から除去するアミノ酸の数（Ｐｕｍｐｅｎｓ  Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ  Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４４巻、９８〜１１４頁（２００１）、欧州特許第４２１６３５号、米国特許第６２３１８６４号）、すなわち、言い換えれば、ＨＢｃＡｇを形成するアミノ酸が新しいエピトープで置換される数である。例えば、ＨＢｃＡｇアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５又は８０〜８１の外来エピトープによる置換が記載された（Ｐｕｍｐｅｎｓ  Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ  Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４４巻、９８〜１１４頁（２００１）、欧州特許第４２１６３５号、米国特許第６２３１８６４号）。ＨＢｃＡｇは、長いアルギニン尾部を含み（Ｐｕｍｐｅｎｓ  Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ  Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４４巻、９８〜１１４頁（２００１））、これは、キャプシド集合に���要なものでなく、核酸に結合することができる（Ｐｕｍｐｅｎｓ  Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ  Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４４巻、９８〜１１４頁（２００１））。このアルギニン尾部を含む、又は欠くＨＢｃＡｇは、本発明の両実施形態である。
【０１８８】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主要コートタンパク質は、細菌、特に大腸菌における発現時にＶＬＰに自発的に集合する。本発明の組成物を調製するのに用いることができるバクテリオファージコートタンパク質の特定の例としては、バクテリオファージＱβのようなＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質（Ｑβ  ＣＰについては配列番号３、ＰＩＲデータベース受託番号ＶＣＢＰＱβ、およびＱβ  Ａ１タンパク質については配列番号４、受託番号ＡＡＡ１６６６３）およびバクテリオファージｆｒ（配列番号３２、ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ）などがある。
【０１８９】
より好ましい実施形態において、少なくとも１つのアンジオテンシンペプチド部分がＱβコートタンパク質に融合されている。エピトープがＱβの切形のＡ１タンパク質のＣ末端に融合又はＡ１タンパク質内に挿入された融合タンパク質構成体が記載された（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｉｇｙ、第３９巻、９〜１５頁（１９９６））。Ａ１タンパク質は、ＵＧＡ停止コドンにおいて抑制されることによって生成し、３２９ａａ、又は、Ｎ末端メチオニンの切断を考慮に入れた場合、３２８ａａの長さを有する。アラニン（Ｑβ  ＣＰ遺伝子によりエンコードされる第２アミノ酸）の前のＮ末端メチオニンの切断は通常、大腸菌において起こり、Ｑβコートタンパク質ＣＰのＮ末端について当てはまる。Ａ１遺伝子の一部であるＵＧＡアンバーコドンの３’は、１９５アミノ酸の長さを有するＣＰエクステンションをエンコードする。ＣＰエクステンションの位置７２と７３との間への少なくとも１つのアンジオテンシンペプチド部分の挿入は、本発明のさらなる実施形態につながる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｉｇｙ、第３９巻、９〜１５頁（１９９６））。Ｃ末端において切断されたＱβ  Ａ１タンパク質のＣ末端におけるアンジオテンシンペプチド部分の融合は、本発明のさらなる好ましい実施形態につながる。例えば、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｉｇｙ、第３９巻、９〜１５頁（１９９６））は、エピトープが、位置１９において切断されたＱβ  ＣＰエクステンションのＣ末端に融合されているＱβ  Ａ１タンパク質融合を記載している。
【０１９０】
Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｉｇｙ、第３９巻、９〜１５頁（１９９６））によって記載されたように、融合エピトープを提示する粒子の集合には一般的に、モザイク粒子を形成するための、Ａ１タンパク質−アンジオテンシンペプチド部分融合体とｗｔ  ＣＰとの存在を必要とする。しかし、ウイルス様粒子、およびそれに融合された少なくとも１つのアンジオテンシンペプチド部分を有するＶＬＰサブユニットからもっぱら構成されている、それによる特に、ＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰを含む実施形態も本発明の範囲内にある。
【０１９１】
モザイク粒子の生産は、多くの方法により行うことができる。Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｉｇｙ、第３９巻、９〜１５頁（１９９６））は、両方とも本発明の実施において用いることができる２つの方法を記載している。第１のアプローチでは、ＶＬＰ上の融合エピトープの効率のよい提示は、ＵＧＡコドンのＴｒｐ（ｐＩＳＭ３００１）プラスミドへの翻訳をもたらすクローン化ＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをエンコードするプラスミドを有する大腸菌株におけるＣＰとＣＰエクステンションとの間にＵＧＡ停止コドンを有するＱβ  Ａ１タンパク質融合をエンコードするプラスミドの発現によって媒介される（Ｓｍｉｌｅｙ  Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、第１３４巻、３３〜４０頁（１９９３））。他のアプローチでは、ＣＰ遺伝子停止コドンをＵＡＡに修飾し、Ａ１タンパク質−アンジオテンシンペプチド部分融合体を発現する第２のプラスミドを同時形質転換する。第２のプラスミドは、異なる抗生物質耐性をエンコードし、複製起点は第１のプラスミドと両立する（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｉｇｙ、第３９巻、９〜１５頁（１９９６））。第３のアプローチでは、ＣＰおよびＡ１タンパク質−アンジオテンシンペプチド部分融合体は、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｉｇｙ、第３９巻、９〜１５頁（１９９６）の図１に記述されているように、Ｔｒｐプロモーターのようなプロモーターに実働できるように連結されて、２シストロン的にエンコードされる。
【０１９２】
さらなる実施形態において、アンジオテンシンペプチド部分をアミノ酸２と３との間（切断ＣＰの番号付け、すなわち、Ｎ末端メチオニンが切断されている場合）に挿入し、それによりアンジオテンシンペプチド部分−ｆｒ  ＣＰ融合タンパク質を生成させる。ＶＬＰに自己集合し、本発明の実施に有用であるｆｒ  ＣＰ融合タンパク質の構築と発現のためのベクターおよび発現系が記載された（Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．第６巻、８８３〜８９１頁（１９９３））。特定の実施形態において、アンジオテンシンペプチド部分を、ｆｒ  ＣＰの残基３および４が欠失した、ｆｒ  ＣＰの欠失変異体のアミノ酸２の後に挿入する（Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．第６巻、８８３〜８９１頁（１９９３））。
【０１９３】
ＲＮＡファージＭＳ−２のコートタンパク質のＮ末端突出βヘアピンにおけるエピトープの融合と、ＲＮＡファージＭＳ−２の自己集合ＶＬＰ上の融合エピトープのそのごの提示も記載されており（国際公開第９２／１３１０８１号）、ＭＳ−２  ＲＮＡファージのコートタンパク質への挿入又は置換によるアンジオテンシンペプチド部分の融合も本発明の範囲に入る。
【０１９４】
本発明の他の実施例において、アンジオテンシンペプチド部分を乳頭腫ウイルスのキャプシドタンパク質に融合させる。より特定的実施形態において、アンジオテンシンペプチド部分をウシ１型乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）の主要キャプシドタンパク質Ｌ１に融合させる。バキュロウイルス／昆虫細胞系におけるＢＰＶ−１融合タンパク質の構築および発現のためのベクターと発現系が記載された（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９６巻、２３７３〜２３７８頁（１９９９）、国際公開第００／２３９５５号）。ＢＰＶ−１  Ｌ１のアミノ酸１３０〜１３６のアンジオテンシンペプチド部分による置換により、本発明の好ましい実施形態であるＢＰＶ−１  Ｌ１−アンジオテンシンペプチド部分融合タンパク質が得られる。バキュロウイルスにおけるクローニングとバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞における発現が記載され、本発明の実施において用いることができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９６巻、２３７３〜２３７８頁（１９９９）、国際公開第００／２３９５５号）。融合アンジオテンシンペプチド部分を提示する集合粒子の精製は、例えば、ゲルろ過又はショ糖密度勾配遠心分離のような多くの方法により実施することができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９６巻、２３７３〜２３７８頁（１９９９）、国際公開第００／２３９５５号）。
【０１９５】
本発明のさらなる実施形態において、アンジオテンシンペプチド部分を、Ｔｙ  ＶＬＰに組込むことができるＴｙタンパク質に融合させる。より特定的実施形態において、アンジオテンシンペプチド部分をＴＹＡ遺伝子によりエンコードされるｐ１又はキャプシドタンパク質に融合させる（Ｒｏｔｈ  Ｊ．Ｆ．、Ｙｅａｓｔ、第１６巻、７８５〜７９５頁（２０００））。酵母レトロトランスポゾンＴｙ１、２、３および４はサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から分離され、一方、レトロトランスポゾンＴｆ１はシゾサッカロミセスポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｏｍｂａｅ）から分離された（Ｂｏｅｋｅ  Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ  Ｓ．Ｂ．、「Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ」、ｉｎ  Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｕｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：  Ｇｅｎｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ．、１９３頁、コールド  スプリング  ハーバー  研究所出版（１９９１））。レトロトランスポゾンＴｙ１および２は植物および動物要素のコピアクラスに属しているが、Ｔｙ３は、植物および動物レトロウイルスに関連するレトロトランスポゾンのジプシーファミリーに属している。Ｔｙ１レトロトランスポゾンにおいては、Ｇａｇ又はキャプシドタンパク質とも称されるｐ１タンパク質は、４４０アミノ酸の長さを有する。ｐ１は、位置４０８におけるＶＬＰの突然変異時に切断されて、ＶＬＰの必須成分であるｐ２タンパク質となる。
【０１９６】
ｐ１との融合タンパク質および酵母における前記融合タンパク質の発現のためのベクターが記載された（Ａｄａｍｓ  Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３２９巻、６８〜７０頁（１９８７））。したがって、例えば、アンジオテンシンペプチド部分をコードする配列をｐＭＡ５６２０プラスミドのＢａｍＨ１部位に挿入することによって、アンジオテンシンペプチド部分をｐ１に融合させることができる（Ａｄａｍｓ  Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３２９巻、６８〜７０頁（１９８７））。外来エピトープをコードする配列をｐＭＡ５６２０ベクターにクローニングすることにより、外来エピトープのＮ末端にＣ末端が融合したＴｙ１−１５のｐ１のアミノ酸１〜３８１を含む融合タンパク質の発現がもたらされる。同様に、アンジオテンシンペプチド部分のＮ末端融合、又はｐ１配列への内部挿入、又はｐ１配列の一部の置換も、本発明の範囲内に入るものである。特に、Ｔｙタンパク質ｐ１のアミノ酸３０〜３１、６７〜６８、１１３〜１１４および１３２〜１３３の間のＴｙ配列へのアンジオテンシンペプチド部分の挿入（欧州特許第０６７７１１１号）は、本発明の好ましい実施形態につながる。
【０１９７】
アンジオテンシンペプチド部分の融合に適するさらなるＶＬＰは、例えば、レトロウイルス様粒子（国際公開第９６３０５２３号）、ＨＩＶ２  Ｇａｇ（Ｋａｎｇ  Ｙ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第３８０巻、３５３〜３６４頁（１９９９））、Ｃｏｗｐｅａモザイクウイルス（Ｔａｙｌｏｒ  Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第３８０巻、３８７〜３９２頁（１９９９））、パルボウイルスＶＰ２  ＶＬＰ（Ｒｕｅｄａ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２６３巻、８９〜９９頁（１９９９））、ＨＢｓＡｇ（米国特許第４７２２８４０号、欧州特許第００２０４１６Ｂ１号）である。
【０１９８】
本発明の実施に適するキメラＶＬＰの例もＩｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３９巻、１頁（１９９６）に記載されている。本発明における使用が考えられるＶＬＰのさらなる例は、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ  ＧＡＧ、タバコモザイクウイルスである。ＳＶ−４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルスおよびノーウォークウイルスのウイルス様粒子も調製されており、これらのＶＬＰのキメラＶＬＰも本発明の範囲内にある。
【０１９９】
架橋．アンジオテンシンペプチド部分をコア粒子に結合させる方法は、当業者の実際的知識の範囲内に十分含まれており、当業者向けの多数の参考文献が存在する（例えば、すべてが参照により本明細書に組込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  研究所出版、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）、Ｃｅｌｉｓ  Ｊ．編、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９９８））、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ．「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールド  スプリング  ハーバー研究所、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク（１９８８））。
【０２００】
コア粒子とアンジオテンシンペプチド部分との間の会合を実現する種々の方法が本明細書に記載されており、また、２００２年１月１８日に出願された同時係属米国出願第１０／０５０９０２号（その全部が参照により本明細書に組込まれる）にさらに記載されている。これらの方法では、ＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインをそれぞれ本発明の第１および第２付着部位に用いることが含まれる。
【０２０１】
本発明の好ましい実施形態は、アンジオテンシンペプチド部分に非天然分子骨格を化学的架橋により結合させることを含む。誘導体化分子、例えば、アンジオテンシンペプチド部分へのタンパク質／ペプチドの架橋又はタンパク質の結合を促進するために開発された広範囲の化合物が存在する。これらは、当業者に知られている、カルボン酸由来活性エステル（活性化化合物）、混合アルデヒド、ハロゲン化アシル、アシルアジド、ハロゲン化アルキル、Ｎ−マレイミド、イミノエステル、イソシアナートおよびイソチオシアナートを含むが、これらに限定されない。これらは、タンパク質分子の反応性基と共有結合を形成することができる。活性化される基によって、反応性基は、反応したとき、アミド、アミン、チオエーテル、アミジン尿素又はチオ尿素結合の形成をもたらすタンパク質上のリシン残基のアミノ基、又は担体タンパク質もしくは修飾担体タンパク質分子におけるチオール基である。当業者は、例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（Ｗｏｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ボカラトン、フロリダ（１９９１））のような一般参考教科書においてさらなる適切な活性化基を特定することができる。ほとんどの試薬は、リシン側鎖基と選択的に反応する。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、異種二官能性架橋物質を用いて、アンジオテンシンペプチド部分を化学的架橋によりコア粒子に付着させる。いくつかの異種二官能性架橋物質が当技術分野で知られている。一実施形態において、異種二官能性架橋物質は、コア粒子のリシン残基の側鎖アミノ基と反応することができる官能基、ならびに、還元により反応に利用可能な、あるいはアンジオテンシンペプチド部分上で工学的に処理された、又は場合によって還元により反応に利用可能な、存在するシステイン残基もしくはスルフヒドリル基と反応することができる官能基を含む。手順の第１段階は、誘導体化と呼ばれる、コア粒子と架橋物質との反応である。この反応の生成物は、活性化担体とも呼ばれている、活性化コア粒子である。第２段階では、ゲルろ過や透析のような通常の方法を用いて、未反応架橋物質を除去する。第３段階では、抗原（例えば、アンジオテンシンペプチド部分）を活性化コア粒子と反応させる。この段階は、結合段階と呼ばれる。未反応抗原は、場合によって、第４段階で除去してもよい。
【０２０３】
別の実施形態において、第１付着部位との架橋に適する活性部分を有するアンジオテンシンペプチド部分を誘導体化し、活性化アンジオテンシンペプチド部分を生成させる。そのような誘導体化は、分離アンジオテンシンペプチド部分で、又は化学合成により起こり得る。次いで、結合が起こるように、活性化アンジオテンシンペプチド部分をコア粒子と反応させる。
【０２０４】
数種の二官能性架橋物質が当技術分野で知られている。これらは、架橋物質ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡおよび例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ロックフォード、イリノイ、アメリカ合衆国）から入手可能で、アミノ酸に対して反応性の１つの官能基とＳＨ残基に対して反応性の１つの官能基を有する他の架橋物質である。上記の架橋物質はすべて、チオエーテル結合の形成をもたらす。本発明の実施に適する他のクラスの架橋物質は、結合時にアンジオテンシンペプチド部分とコア粒子との間へのジスルフィド結合の導入を特徴とする。このクラスに属する架橋物質は、例えば、ＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）などである。架橋物質によるコア粒子の誘導体化の程度は、有機化学の分野における反応理論からよく知られているように、反応パートナーのそれぞれの濃度、１つの試薬の他の試薬に対する過剰の程度、ｐＨ、温度およびイオン強度のような様々な実験条件による影響を受ける可能性がある。結合の程度、すなわち、担体当たりのアンジオテンシンペプチド部分の量は、上記の実験条件を変化させることにより、ワクチンの要件に適合させることができる。アンジオテンシンペプチド部分の溶解性が各サブユニットに結合させることができる抗原の量に制限を課すことがあり、得られるワクチンが不溶性である場合、サブユニット当たりの抗原の量を減少させることが有利である。
【０２０５】
１つの特定の実施形態において、化学物質は、（１）アミノ基と反応性のスクシンイミド基および（２）ＳＨ基と反応性のマレイミド基を含む、異種二官能性架橋物質であるε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである（Ｔａｎｉｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｙｎ．第４巻、８１２頁（１９８１）、Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．第４５巻、１９５頁（１９８１））。第１付着部位の異種タンパク質又はポリペプチドは、異種二官能性架橋物質のスクシンイミド部分に対する反応性部分として機能する１つ又は複数のリシン残基を含むように工学的に処理することができる。異種タンパク質のリシン残基に化学的に結合させたならば、異種二官能性架橋物質のマレイミド基は、抗原又は抗原決定基上のシステイン残基のＳＨ基との反応に利用可能となる。このような例における抗原又は抗原決定基は、非天然分子骨格の第１付着部位に結合した架橋物質上の遊離マレイミド基と反応することができるように、第２付着部位としてのスルフヒドリル残基の工学的処理を必要とする。したがって、そのような例においては、異種二官能性架橋物質は、非天然分子骨格の第１付着部位に結合し、その骨格をアンジオテンシンペプチド部分の第２付着部位に連結する。
【０２０６】
アンジオテンシンペプチド部分をコア粒子に結合させる他の方法としては、アンジオテンシンペプチド部分をカルボジイミド結合を用いてコア粒子に架橋させる方法がある。これらは、カルボジイミドＥＤＣ（塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド）およびＮＨＳを含む。１つの方法において、ＥＤＣを、遊離カルボン酸、アミノ又はアミド部分を含むアンジオテンシンペプチド部分と混合し、次いで、タンパク質担体に加える。他の方法において、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、イリノイ、アメリカ合衆国）のような同種二官能性架橋物質又はコア粒子のアミノ基又はカルボキシル基に対して反応性の官能基を有する他の既知の同種二官能性架橋物質を用いて、アンジオテンシンペプチド部分をコア粒子に結合させる。
【０２０７】
ハプテンをそれぞれコア粒子およびウイルス様粒子に付着させるのに適する別の架橋法および架橋物質、ならびに、カップリング反応の実施および化学架橋物質の使用および化学的架橋法に関する手引きは、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．Ｔ．、ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、サン  ディエゴ、カリフォルニア、アメリカ合衆国に見出すことができる。
【０２０８】
アンジオテンシンペプチド部分にコア粒子に結合させるさらなる方法としては、コア粒子をビオチン化し、部分をストレプトアビジンに融合させる方法、又は部分とコア粒子とをビオチン化する方法などである。この場合、遊離結合部位が次の段階で加えるコア粒子の結合に利用可能であるように部分とストレプトアビジンとの比率を調節することにより、アンジオテンシンペプチド部分を最初にストレプトアビジン又はアビジンに結合させることができる。あるいは、すべての成分を「１ポット」反応において混合してもよい。可溶型の受容体およびリガンドが利用可能で、コア粒子又はアンジオテンシンペプチド部分に架橋させることができる他のリガンド−受容体対をコア粒子にアンジオテンシンペプチド部分を結合させるための結合剤として用いることができる。
【０２０９】
アンジオテンシンペプチド部分
したがって、一態様において、本発明は、そのような部分に対する免疫化に適するアンジオテンシンペプチド部分の規則正しい反復アレイを提供する。好ましいアンジオテンシンペプチド部分は、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩもしくはアンジオテンシンＩＩの配列又はその断片を含む、あるいはそれからなるものである。上記のように、特に、コア粒子に対するアンジオテンシンペプチド部分の配向した規則正しい会合を確保するために、１つ又は複数の別のアミノ酸をアンジオテンシンペプチド部分配列のＣ又はＮ末端に適切に付加することができる。
【０２１０】
複合体および本発明の複合体に用いる好ましいアンジオテンシンペプチド部分は、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩもしくはアンジオテンシンＩＩの全長配列を含む、あるいはそれからなるものである。好ましくは、アンジオテンシンペプチド部分は、ＣＧＧＤＲＶＹＩＨＰＦ（配列番号１９，本明細書では「Ａｎｇｉｏ１」と称する、アンジオテンシンペプチド部分に追加されたアミノ酸をイタリック体で示す）のようなアンジオテンシンＩＩの全長配列、又はＣＧＧＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ（配列番号２０，「Ａｎｇｉｏ２」）、ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬＧＧＣ（配列番号２１，「Ａｎｇｉｏ３」）およびＣＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ（配列番号２２，「Ａｎｇｉｏ４」）のようなアンジオテンシンＩの全長配列を含む、あるいはそれからなる。さらなる好ましい実施形態は、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩもしくはアンジオテンシンＩＩの配列の断片のみを含む、あるいはそれからなるアンジオテンシンペプチド部分である。そのような特定の実施形態は、アンジオテンシンペプチドのＣ末端の少なくとも３つのアミノ酸を含む、あるいはそれらからなるアンジオテンシンペプチド部分を含み、また、それについて別の実施形態において、Ｎ末端の少なくとも４つのアミノ酸が欠失したもの。他の関連実施形態は、ＣＨＰＦＨＬ（配列番号２３，「Ａｎｇｉｏ５」）およびＣＧＰＦＨＬ（配列番号２４，「Ａｎｇｉｏ６」）のようなアンジオテンシンＩから誘導されたもの、又はＣＹＩＨＰＦ（配列番号２５，「Ａｎｇｉｏ７」）、ＣＧＩＨＰＦ（配列番号２６，「Ａｎｇｉｏ８」）およびＣＧＧＨＰＦ（配列番号２７，「Ａｎｇｉｏ９」）のようなアンジオテンシンＩＩから誘導されたものである。
【０２１１】
本発明のさらなる実施形態は、アンジオテンシンペプチドのＮ末端の少なくとも３つのアミノ酸を含む、あるいはそれからなるアンジオテンシンペプチド部分を使用するものであり、それについてさらなる好ましい実施形態においてＣ末端の少なくとも４つ、好ましくは５つが欠失したものである。他の関連実施形態は、ＤＲＶＹＩＧＧＣ（配列番号２８，「Ａｎｇｉｏ１３」）、ＤＲＶＹＧＧＣ（配列番号２９，「Ａｎｇｉｏ１４」）およびＤＲＶＧＧＣ（配列番号３０，「Ａｎｇｉｏ１５」）である。しかし、アンジオテンシンペプチド部分の前述の例は非限定的な例であり、Ｃ又はＮ末端における結合のために付加されたアミノ酸の数と性質は変わり得ることは、当業者により理解されるであろう。
【０２１２】
本発明において、免疫化アンジオテンシンペプチド部分が特定のアンジオテンシンペプチド部分の完全な分子全体を含むことは必要でない。問題のアンジオテンシンペプチド部分に対する適切な免疫応答は、アンジオテンシンペプチド部分の断片、又はその誘導体、突然変異体もしくは突然変異タンパク質を用いて発生させることができる。
【０２１３】
本発明は、コア粒子に対するアンジオテンシンペプチド部分の結合の種々の部位および手段を具体化するものであり、その非限定的例は、本明細書の他所に記載する。好ましい結合の部位および手段はまた、以前の経験、理論に基づき、また通常の実験により当業者が決定することができる。
【０２１４】
複合体、ワクチンおよび使用方法
本発明は、したがって、ＲＡＳの１つ又は複数の成分、特に、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分に関連する疾患又は障害を予防かつ／又は減弱させるために用いることができる複合体を提供する。本発明はさらに、個体、特に哺乳動物のような動物、および特にヒトにおける疾患又は障害を予防かつ／又は減弱させるためのワクチン接種方法を提供する。好ましい実施形態において、複合体および本発明の複合体は、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分に結合する抗体を含む免疫分子の産生をもたらす免疫応答を刺激する。本発明はさらに、個体におけるＲＡＳに関連する疾患又は障害を予防かつ／又は減弱させるためのワクチン接種方法を提供する。
【０２１５】
免疫応答の性質又は種類は、この開示の制限因子ではない。治療的又は予防的免疫応答の望ましい結果は、当技術分野においてよく知られている原理によれば、疾患によって異なることがある。以下の機構的説明により本発明を限定することを意図するものではないが、本発明による複合体は、複数のアンジオテンシンペプチド種に結合し、それにより、アンジオテンシンのすべての関連する種を同時に阻害する抗体を誘導すると思われる。あるいは、誘導される抗体は、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩもしくはアンジオテンシンＩＩのＣ末端に特異的に結合すると思われる。これらの条件下では、誘導される抗体は、それぞれレニン又はＡＣＥによるアンジオテンシノーゲン又はアンジオテンシンＩの活性化を阻害する。それにもかかわらず、エンドペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼのようなＡＣＥやレニンと異なるプロテアーゼは、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩをＮ末端から分解し、それにより抗体に結合した完全なアンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩの蓄積を妨げることができる。
【０２１６】
さらに、疾患に応じて、また当技術分野においてよく知られている原理により、種々のタイプの免疫応答を刺激することが望ましい。例えば、ある種の免疫応答が他の免疫応答より特定の抗原に対して適切であることはよく知られている。ある種の免疫応答は、実際に不適切で、病原性炎症のような病的状態をもたらすことがある。
【０２１７】
免疫応答の性質は、抗原の性質、体内への導入経路、用量、投与法、抗原の反復性、宿主背景および免疫系のシグナリング因子による影響を受けることがある。そのような知識は、当技術分野でよく知られている。それとして、免疫応答は、当技術分野の理論と通常の実験を適用して、適応させることができる。
【０２１８】
さらに、本発明は、アンジオテンシンペプチド部分に対するワクチン接種の過程における種々のコア粒子の使用を具体化する。例えば、線毛のようなコア粒子に対する強い免疫応答を発現する個体は、同じアンジオテンシンペプチド部分と異なるコア粒子を含む複合体で免疫化することができる。
【０２１９】
理論により束縛されることは望まないが、本発明の最新の複合体は、１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分に対する免疫応答を発生する薬剤複合体の成分として、また特にワクチンとして、特有の新規かつ驚くべき利点を備えている。ＢＳＡ、カサガイヘモシアニン、破傷風毒素、細菌外膜タンパク質、コレラ毒素およびシュードモナス  アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡなどの当技術分野で知られている他の担体は、個体、および特にヒトにおける使用は不適切である。前述の担体は、アレルギー反応を誘発したり、病原性免疫応答を刺激することがある（例えば、コレラ毒素、ＫＬＨ、ＢＳＡ）。前述の担体は、現在、ヒトにおける使用が不適切と考えられている、完全フロイントアジュバントのようなアジュバントの存在を必要とする。多くの担体が現在のワクチンの成分であってよい（例えば、破傷風毒素、コレラ毒素、エキソトキシンＡ）。それとして、個体はこれらの担体に対する高レベルの前在性免疫を有している可能性があり、そのため、抗原−担体複合体による免疫化により、新規の抗原に対するよりも担体に対する比較的大きい免疫応答を誘導するであろう。これらに理由のため、個別に、あるいは全体として、複合体および本発明の複合体は、上述の担体タンパク質よりも有用な改善を示す。
【０２２０】
本発明の実施形態の使用に際して、コア粒子に結合した１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分は抗原提示細胞により取り込まれ、それにより、Ｔ細胞を刺激して、免疫応答を誘導することを助けることができる。Ｔヘルパー細胞応答は、タイプ１（ＴＨ１）およびタイプ２（ＴＨ２）Ｔヘルパー細胞応答に分けることができる（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第１８巻、２６３〜２６６頁（１９９７））。ＴＨ１細胞は、Ｂ細胞がＩｇＧ１−３を産生すること誘発するγインターフェロンおよび他のサイトカインを分泌する。これに対して、ＴＨ２細胞により産生される重要なサイトカインは、Ｂ細胞がＩｇＧ４およびＩｇＥを産生することを誘導するＩＬ−４である。多くの実験系では、ＴＨ１細胞はＴＨ２細胞の誘導を抑え、ＴＨ２細胞はＴＨ１細胞の誘導を抑えるため、ＴＨ１およびＴＨ２応答の発現は互いに相反する。したがって、強いＴＨ１応答を誘発する抗原は、同時にＴＨ２応答の発生とひいてはＩｇＥ抗体の産生を抑制する。興味深いことに、実際上すべてのウイルスが宿主細胞におけるＴＨ１応答を誘導し、ＩｇＥ抗体の産生を誘発しない（Ｃｏｕｔｅｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１６５巻、６４〜６９頁（１９８７））。ＩｇＥイソタイプの抗体は、アレルギー反応における重要な構成要素である。マスト細胞がそれらの表面上のＩｇＥ抗体に結合し、マスト細胞表面に結合したＩｇＥ分子に対する特異的抗原の結合時にヒスタミンおよびアレルギー反応の他のメディエーターを放出する。ＴＨ１応答に特有なイソタイプパターンは、生ウイルスに限定されず、不活性化又は組換えウイルス粒子についても認められた（Ｌｏ−Ｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２８巻、１４０１〜１４０７頁（１９９８））。したがって、本発明の方法（例えば、アルファウイルス技術）を用いることにより、ウイルス粒子を様々なアンジオテンシンペプチド部分でデコレートし、免疫化に用いることができる。得られるアレイの「ウイルス構造」により、ＴＨ１応答が誘発され、「防御」ＩｇＧ１−３抗体が産生され、アレルギー反応を誘発するＩｇＥ抗体の産生は妨げられる。したがって、本発明は、好ましい免疫応答、特にＴＨ１タイプ応答を誘導することができる複合体を具体化する。さらに、本発明は、問題の抗原に対する別のワクチンにより誘導されるアレルギー反応に拮抗する本発明の複合体の使用を具体化する。
【０２２１】
本発明のさらなる有利な特徴は、アンジオテンシンペプチド部分を、Ｔ細胞補助の存在下および非存在下での効率的免疫応答を誘導できる規則正しい反復アレイとして粒子上に提示することができることである。本発明のこの特徴は、特に有利である。
【０２２２】
分離タンパク質と異なり、ウイルスは、Ｔ細胞補助の存在下および非存在下、かつあらゆるアジュバントの非存在下で、速やかで、効率のよい免疫応答を誘導する（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５巻、２３５〜２７０頁（１９９７））。ウイルスは、しばしば数種のタンパク質からなるが、それらの分離成分よりはるかに強い免疫応答を誘発することができる。Ｂ細胞応答については、ウイルスの免疫原性に関する１つの重要な因子は表面エピトープの反復性と秩序であることは知られている。多くのウイルスは、Ｂ細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンに効率よく架橋するエピトープの規則正しいアレイを示す準結晶性表面を示す（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第１７巻、５５３〜５５８頁（１９９６））。Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンのこの架橋は、細胞周期の進行とＩｇＭ抗体の産生を直接誘導する強い活性化シグナルである。さらに、そのような誘発Ｂ細胞はＴヘルパー細胞を活性化することができ、これがひいてはＢ細胞におけるＩｇＭ抗体産生からＩｇＧ抗体産生への切り替えと長命Ｂ細胞メモリーの発生（ワクチン接種の目標）を誘発する（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５巻、２３５〜２７０頁（１９９７））。本発明は、コア粒子にアンジオテンシンペプチド部分を結合させることにより、免疫化に用いるアンジオテンシンペプチド部分の反復性の程度を増加させて、ワクチン接種の効率を向上させる１つの方法を提供する。前記のように、本発明は、形成体の数及び／又は配列を変化させるために修飾したコア粒子を含む複合体を提供する。
【０２２３】
当業者により理解されるように、本発明の複合体を個体に投与するとき、それらは、塩類、緩衝液、アジュバント又は複合体の有効性を改善するために望ましい他の物質を含む複合体としてであってよい。薬剤複合体を調製する際の使用に適した物質の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ  Ａ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９０））などの多数の情報源に示されている。
【０２２４】
本発明の複合体は、それらの投与に対して被投与者が耐えることができる場合、「薬理学的に許容できる」と言われる。さらに、本発明の複合体は「治療上有効量」（すなわち、所望の生理学的効果をもたらす量）で投与する。
【０２２５】
免疫応答を誘導するために、本発明の複合体は、動物、適切にはヒトのような哺乳動物に当技術分野で知られている様々な方法で投与することができるが、通常、注射、注入、吸入、経口投与又は他の適切な物理的方法で投与する。あるいは、複合体は、筋肉内、静脈内、経粘膜、経皮又は皮下投与することができる。投与のための複合体の成分は、滅菌水性（例えば、生理食塩水）又は非水性溶液および懸濁液などである。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。担体又は閉塞包帯は、皮膚透過性を増加させ、抗原吸収を促進するために用いることができる。
【０２２６】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の複合体による免疫化により産生された免疫分子を含む。免疫分子としては、抗体およびＴ細胞受容体などがある。そのような免疫分子は、ワクチンを接種する個体における１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分を標的とするための結合に有用である。免疫分子は、複合体又は本発明の複合体に対して免疫化されていない個体に伝達し、それにより免疫を「受動的」に伝達するときにも有用である。一実施形態において、免疫分子は抗体である。１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分の結合に適するモノクローナル抗体を個体に伝達して、治療又は予防を実現することができる。
【０２２７】
本発明はまた、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）における１つ又は複数のアンジオテンシンペプチド部分の検出用のキットにおける複合体又は本発明の複合体による免疫化により産生される抗体の使用を含む。関連実施形態において、アンジオテンシンペプチド部分の規則正しい反復アレイは、結合アッセイにおけるそのような部分に対する抗体の検出に有用であり得る。本発明の他の実施形態は、本発明の複合体の生産の方法ならびに高血圧、卒中、梗塞、うっ血性心不全、腎不全又は網膜出血のような特にＲＡＳに関連する１つ又は複数の身体的障害を治療するためのそのような複合体を用いる内科的治療の方法を含む。
【０２２８】
本明細書に記載する方法および適用に対する他の適切な修正および適応は、容易に明らかであり、本発明の範囲又はその実施形態から逸脱することなく行うことができることは、当業者により理解されるであろう。本発明を詳細に説明したが、例示のみの目的のために含めるのであって、本発明を限定することを意図するものではない以下の実施例を参照することによって、本発明がより明確に理解されよう。
【実施例１】
【０２２９】
アンジオテンシンＩおよびアンジオテンシンＩＩから誘導されたペプチドのＱβへの結合および得られた複合体によるマウスの免疫化 
Ａ．複合体の生産 
以下のアンジオテンシンペプチド部分を化学的に合成した。ＣＧＧＤＲＶＹＩＨＰＦ（配列番号１９，「Ａｎｇｉｏ１」）、ＣＧＧＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ（配列番号２０，「Ａｎｇｉｏ２」）、ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬＧＧＣ（配列番号２１，「Ａｎｇｉｏ３」）、ＣＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ（配列番号２２，「Ａｎｇｉｏ４」）、ＣＨＰＦＨＬ（配列番号２３，「Ａｎｇｉｏ５」）、ＣＧＰＦＨＬ（配列番号２４，「Ａｎｇｉｏ６」）、ＣＹＩＨＰＦ（配列番号２５，「Ａｎｇｉｏ７」）、ＣＧＩＨＰＦ（配列番号２６，「Ａｎｇｉｏ８」）、ＣＧＧＨＰＦ（配列番号２７，「Ａｎｇｉｏ９」）、ＤＲＶＹＩＧＧＣ（配列番号２８，「Ａｎｇｉｏ１３」）、ＤＲＶＹＧＧＣ（配列番号２９，「Ａｎｇｉｏ１４」）およびＤＲＶＧＧＣ（配列番号３０，「Ａｎｇｉｏ１５」）。以下に記載するように、それらをＱβに対する化学的結合に用いた。
【０２３０】
ペプチドＡｎｇｉｏ１〜Ａｎｇｉｏ４について：２０ｍＭヘペス中２ｍｇ／ｍｌＱβキャプシドタンパク質の５ｍｌの溶液。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４をＨ２Ｏ中１３ｍｇ／ｍｌ  Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）の５０７μｌの溶液とロッキング振とう機上で２５℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を２Ｌの２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して４℃で２時間にわたり２回透析した。次いで、６６５μｌの透析済み反応混合物を２．８μｌのそれぞれの対応する１００ｍＭペプチド保存溶液（ＤＭＳＯ中）とロッキング振とう機上で２５℃で２時間反応させた。その後、反応混合物を２Ｌの２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して４℃で２時間にわたり２回透析した。
【０２３１】
ペプチドＡｎｇｉｏ５〜９およびＡｎｇｉｏ１３〜１５について：２０ｍＭヘペス中２ｍｇ／ｍｌＱβキャプシドタンパク質の３ｍｌの溶液。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．２をＤＭＳＯ中１００ｍＭ  ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオノアミドヘキサノアート、Ｐｉｅｒｃｅ）の８６μｌの溶液とロッキング振とう機上で２５℃で５０分間反応させた。その後、反応溶液を２Ｌの２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間にわたり２回透析した。５１４μｌの透析済み反応混合物を３．６μｌのそれぞれの対応する１００ｍＭペプチド保存溶液（ＤＭＳＯ中）とロッキング振とう機上で２５℃で４時間反応させた。その後、反応混合物を２Ｌの２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間にわたり２回透析した。
【０２３２】
Ｂ．免疫化
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにＱβキャプシドタンパク質に結合させた９種のアンジオテンシンペプチド誘導体のうちの１つを用いてアジュバントを加えずにワクチン接種した。各試料の５０μｇ（Ｑβ−Ａｎｇｉｏ１〜４ワクチン）又は２０μｇ（Ｑβ−Ａｎｇｉｏ５〜９ワクチン）の総タンパク質をＰＢＳで２００μｌに希釈し、０日目と１４日目に皮下注射した（腹側２箇所に１００μｌ）。２１日目にマウスの後眼窩洞から採血し、血清をアンジオテンシン特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析した。
【０２３３】
アンジオテンシンペプチドのヒトおよびマウス配列は互いにまったく同じに対応することに注意すべきである。したがって、本発明による抗原決定基としてのアンジオテンシンペプチド部分をそれぞれ含むワクチン又は複合体によるヒト又はマウスの免疫化は、自己抗原に対するワクチン接種である。
【実施例２】
【０２３４】
Ｑβに結合させたアンジオテンシンＩおよびアンジオテンシンＩＩから誘導されたペプチドによるワクチン接種マウスからの血清のＥＬＩＳＡ分析
実施例１で記載したように調製したＡｎｇｉｏ１〜Ａｎｇｉｏ９およびＡｎｇｉｏ１３〜１５ペプチド誘導体を化学架橋物質ｓｕｌｆｏ−ＳＰＤＰを用いて個別にウシＲＮＡｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ）に結合させた。ＥＬＩＳＡプレートを結合ＲＮＡｓｅ調製物でコーティング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨ２ＣＯ３、ｐＨ９．６）中１０μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一夜コーティングした。あるいは、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩ（ＳＩＧＭＡ）を同じコーティング緩衝液で２００μｇ／ｍｌに希釈した。プレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％トゥイーン２０中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を用いて３７℃で２時間ブロックし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％トゥイーン２０で洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液中連続希釈マウス血清とともに室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％トゥイーン２０で洗浄し、次いで、１μｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％トゥイーン２０で洗浄し、基質溶液を加えた（０．０６６Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０３５Ｍクエン酸（ｐＨ５．０）＋０．４ｍｇ  ＯＰＤ（１，２−フェニレンジアミン二塩酸塩）＋０．０１％Ｈ２Ｏ２）。１０分後に５％Ｈ２ＳＯ４で呈色反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０２３５】
対照として、同じマウスの免疫前血清も試験した。Ｑβ又は他の担体に架橋させた非関連ペプチドで免疫化したマウスの血清を用いた対照ＥＬＩＳＡ実験では、検出された抗体は各ペプチドに対して特異的であることが示された。ＥＬＩＳＡ力価は、ＥＬＩＳＡにおける最大シグナルの半値（最大光学濃度の５０％）を示す血清希釈度の逆数として計算した。
【０２３６】
結果：
図１にＱβキャプシドタンパク質に結合させたＡｎｇｉｏ１〜４ペプチドで免疫化したマウスの血清中のＡｎｇｉｏ２ペプチドおよびアンジオテンシンＩに対して特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。図で用いたＱβ−Ａｎｇｉｏ１、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ１、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ３およびＱβ−Ａｎｇｉｏ４は、マウスに注射したワクチンを表し、マウスからの血清はアンジオテンシンペプチドの上の定義に従って誘導される。雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに０日目と１４日目にＰＢＳ中ワクチン５０μｇを皮下にワクチン接種した。Ｑβ−Ａｎｇｉｏ１、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ２、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ３およびＱβ−Ａｎｇｉｏ４を用いてワクチン接種したマウスの血清中のＩｇＧ抗体をＲＮＡｓｅ  Ａに結合させたＡｎｇｉｏ２ペプチドに対して、およびアンジオテンシンＩに対して２１日目に測定した。対照として、免疫前血清も分析した。示した血清希釈物に関する結果を４５０ｎｍでの光学濃度として示す。３匹の各マウスの平均値（標準偏差を含む）をＡｎｇｉｏ２について示す。２匹の各マウスの平均値をアンジオテンシンＩについて示す。Ａｎｇｉｏ２、Ａｎｇｉｏ３又はＡｎｇｉｏ４ペプチドで免疫化したマウスは、Ａｎｇｉｏ２、Ａｎｇｉｏ３およびＡｎｇｉｏ４ペプチドならびにアンジオテンシンＩの密接な類似性で相互に関連するＡｎｇｉｏ１をワクチン接種したマウスよりも高い力価を示したが、すべてのワクチン接種マウスはＡｎｇｉｏ２ならびにアンジオテンシンＩに対する特異ＩｇＧ抗体を産生した。
【０２３７】
図２にＱβキャプシドタンパク質に結合させたＡｎｇｉｏ１〜４ペプチドで免疫化したマウスの血清中のＡｎｇｉｏ１ペプチドおよびアンジオテンシンＩＩに対して特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。図で用いたＱβ−Ａｎｇｉｏ１、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ２、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ３およびＱβ−Ａｎｇｉｏ４は、マウスに注射したワクチンを表し、マウスからの血清はアンジオテンシンペプチドの上の定義に従って誘導される。雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに０日目と１４日目にＰＢＳ中ワクチン５０μｇを皮下にワクチン接種した。Ｑβ−Ａｎｇｉｏ１、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ２、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ３およびＱβ−Ａｎｇｉｏ４をワクチン接種したマウスの血清中のＩｇＧ抗体をＲＮＡｓｅ  Ａに結合させたＡｎｇｉｏ１ペプチドに対して、およびアンジオテンシンＩＩに対して２１日目に測定した。対照として、免疫前血清も分析した。示した血清希釈物に関する結果を４５０ｎｍでの光学濃度として示す。３匹の各マウスの平均値（標準偏差を含む）をＡｎｇｉｏ１について示す。２匹の各マウスの平均値をアンジオテンシンＩＩについて示す。Ａｎｇｉｏ１ペプチドで免疫化したマウスは最高力価を示し、Ａｎｇｉｏ１およびアンジオテンシンＩＩの密接な類似性で相互に関連するが、すべてのワクチン接種マウスはＡｎｇｉｏ１ならびにアンジオテンシンＩＩに対する特異ＩｇＧ抗体を産生した。
【０２３８】
図３にＱβキャプシドタンパク質に結合させたＡｎｇｉｏ５〜９ペプチドで免疫化したマウスの血清中のＡｎｇｉｏ２ペプチドおよびアンジオテンシンＩに対して特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。図で用いたＱβ−Ａｎｇｉｏ５、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ６、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ７、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ８およびＱβ−Ａｎｇｉｏ９は、マウスに注射したワクチンを表し、マウスからの血清はアンジオテンシンペプチドの上の定義に従って誘導される。雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに０日目と１４日目にＰＢＳ中ワクチン２０μｇを皮下にワクチン接種した。Ｑβ−Ａｎｇｉｏ４、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ５、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ６、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ７、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ８およびＱβ−Ａｎｇｉｏ９をワクチン接種したマウスの血清中のＩｇＧ抗体をＲＮＡｓｅ  Ａに結合させたＡｎｇｉｏ２ペプチドに対して、およびアンジオテンシンＩに対して２１日目に測定した。示した血清希釈物に関する結果を４５０ｎｍでの光学濃度として示す。２匹の各マウスの平均値を示す。Ｑβ−Ａｎｇｉｏ８およびＱβ−Ａｎｇｉｏ９をワクチン接種した２匹のマウスは、Ａｎｇｉｏ２ならびにアンジオテンシンＩに対する非常に低い、又は特異的力価を示さなかった。このことは、これらの２つのタイプのワクチンがアンジオテンシンＩＩのＣ末端に対して主として特異的であるが、アンジオテンシンＩに対してはそうでない抗体を誘導することを示している（図４も参照）。
【０２３９】
図４にＱβキャプシドタンパク質に結合させたＡｎｇｉｏ５〜９ペプチドで免疫化したマウスの血清中のＡｎｇｉｏ１ペプチドおよびアンジオテンシンＩＩに対して特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。図で用いたＱβ−Ａｎｇｉｏ５、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ６、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ７、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ８およびＱβ−Ａｎｇｉｏ９は、マウスに注射したワクチンを表し、マウスからの血清はアンジオテンシンペプチドの上の定義に従って誘導される。雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに０日目と１４日目にＰＢＳ中ワクチン２０μｇを皮下にワクチン接種した。Ｑβ−Ａｎｇｉｏ４、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ５、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ６、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ７、Ｑβ−Ａｎｇｉｏ８およびＱβ−Ａｎｇｉｏ９を用いてワクチン接種したマウスの血清中のＩｇＧ抗体をＲＮＡｓｅ  Ａに結合させたＡｎｇｉｏ１ペプチドに対して、およびアンジオテンシンＩＩに対して２１日目に測定した。示した血清希釈物に関する結果を４５０ｎｍでの光学濃度として示す。２匹の各マウスの平均値を示す。Ｑβ−Ａｎｇｉｏ５およびＱβ−Ａｎｇｉｏ６でワクチン接種した２匹のマウスは、Ａｎｇｉｏ１ならびにアンジオテンシンＩＩに対する非常に低い、又は特異的力価を示さなかった。このことは、これらの２つのタイプのワクチンがアンジオテンシンＩのＣ末端に対して主として特異的であるが、アンジオテンシンＩＩに対してはそうでない抗体を誘導することを示している（図３も参照）。
【０２４０】
以下の表にＱβに結合させたＡｎｇｉｏペプチド１〜９をワクチン接種したマウスの血清のＥＬＩＳＡ分析を要約する。２１日目の平均ＥＬＩＳＡ力価は、実施例２に記載したように計算した。
【０２４１】
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【０２４２】
Ａｎｇｉｏ５および６に関する結果から、アンジオテンシンＩを選択的に認識するペプチドを誘導することができることがわかる。さらに、Ａｎｇｉｏ７〜９に関する結果から、アンジオテンシンＩＩを選択的に認識するが、アンジオテンシンＩについてはそうでない抗体を誘導することができることがわかる。アンジオテンシンＩおよびＩＩは、Ｃ末端における２アミノ酸だけが異なっているが、残りの８アミノ酸は同じであるので、これらの結果は、Ａｎｇｉｏ５又はＡｎｇｉｏ６により誘導されたすべての抗体がアンジオテンシンＩのＣ末端を選択的に認識し、Ａｎｇｉｏ７〜９、および特にＡｎｇｉｏ８〜９により誘導されたすべての抗体がアンジオテンシンＩＩのＣ末端を選択的に認識することを示すものである。したがって、共通の８アミノ酸は認識されず、また、特に共通のＮ末端は認識されない。このことから、Ｎ末端は、結合するとき抗体内に埋もれず、したがって、プロテアーゼと接触することができることがわかる。
【０２４３】
理解を明確にする目的で図表と実施例により本発明を詳細に記述したので、広く同等の条件の範囲内で本発明を、発明の範囲又はその特定の実施形態に影響を及ぼすことなく処方および他のパラメーターを修正又は変更することにより同じことを実施することができ、そして、そのような修正又は変更は、添付した特許請求の範囲内に含まれることを意図するものであることは当業者には明らかであろう。
【０２４４】
本明細書に記載したすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する技術分野の熟達者の技術の水準を示すものであり、個々の刊行物、特許および特許出願を具体的かつ個別に参照により組込まれたことを示されたと同程度に、参照により本明細書に組込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】Ｑβキャプシドタンパク質に結合したＡｎｇｉｏ１、Ａｎｇｉｏ２、Ａｎｇｉｏ３又はＡｎｇｉｏ４ペプチドで免疫化したマウスの血清中のＡｎｇｉｏ１ペプチドおよびアンジオテンシンＩＩに対して特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析。
【図２】Ｑβキャプシドタンパク質に結合したＡｎｇｉｏ１、Ａｎｇｉｏ２、Ａｎｇｉｏ３又はＡｎｇｉｏ４ペプチドで免疫化したマウスの血清中のＡｎｇｉｏ２ペプチドおよびアンジオテンシンＩに対して特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析。
【図３】Ｑβキャプシドタンパク質に結合したＡｎｇｉｏ５、Ａｎｇｉｏ６、Ａｎｇｉｏ７、Ａｎｇｉｏ８又はＡｎｇｉｏ９ペプチドで免疫化したマウスの血清中のＡｎｇｉｏ１ペプチドおよびアンジオテンシンＩＩに対して特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析。
【図４】Ｑβキャプシドタンパク質に結合したＡｎｇｉｏ５、Ａｎｇｉｏ６、Ａｎｇｉｏ７、Ａｎｇｉｏ８又はＡｎｇｉｏ９ペプチドで免疫化したマウスの血清中のＡｎｇｉｏ２ペプチドおよびアンジオテンシンＩに対して特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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