(57)【要約】      （修正有）【課題】乳酸合成能を有する酵母の製造方法，そのような製造方法により得られた酵母，及びそのような酵母を用いた乳酸の製造方法の提供。【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離する工程を含む方法により乳酸耐性を有する酵母を得て，その酵母に，乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより乳酸合成能も有する酵母の製造方法及びそのような方法により得られた酵母，及びその酵母を用いた乳酸の製造方法。【選択図】図１４
2010115112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離することによって得られた酵母に，乳酸合成酵素遺伝子を導入する，乳酸合成能を有する酵母の製造方法。
【請求項２】
前記酵母の変異株は，変異型ＤＮＡポリメラーゼδをコードする遺伝子が導入された株である，請求項１に記載の酵母の製造方法。
【請求項３】
前記酵母の変異株は，Ｐｏｌ３のアミノ酸配列を改変した出芽酵母の変異株である，請求項１に記載の酵母の製造方法。
【請求項４】
所定の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離する工程を繰り返し，
前記所定の乳酸濃度が１％（ｖ／ｖ）以上７％（ｖ／ｖ）以下であり，
前記培養及び単離工程を繰り返すにつれ，乳酸濃度を高くする，
請求項１に記載の酵母の製造方法。
【請求項５】
乳酸合成酵素遺伝子が導入されるとともに，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離する工程を含む，
乳酸合成能を有する酵母の製造方法。
【請求項６】
ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を用い，  少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後に生存細胞を単離する工程を，前記乳酸濃度を１％（ｖ／ｖ）以上７％（ｖ／ｖ）以下の範囲内で高くしつつ繰り返すことにより乳酸耐性を有する酵母を得た後に，乳酸合成酵素遺伝子が導入されることにより得られる  乳酸合成能を有する酵母。
【請求項７】
前記酵母の変異株は，変異型ＤＮＡポリメラーゼδをコードする遺伝子が導入された株である，請求項６に記載の酵母。
【請求項８】
乳酸合成酵素遺伝子が導入されるとともに，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を用い，  少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後に生存細胞を単離する工程を，前記乳酸濃度を１％（ｖ／ｖ）以上７％（ｖ／ｖ）以下の範囲内で高くしつつ繰り返すことにより得られる
乳酸合成能を有する酵母。
【請求項９】
前記酵母の変異株は，変異型ＤＮＡポリメラーゼδをコードする遺伝子が導入された株である，請求項８に記載の酵母。
【請求項１０】
前記酵母が，サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母である請求項６又は８に記載の酵母。
【請求項１１】
前記酵母が，出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項６又は８に記載の酵母。
【請求項１２】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ  ＡＰ−３１９」，「ＮＩＴＥ  ＡＰ−３２０」，又は「ＮＩＴＥ  ＡＰ−３２１」として寄託されている酵母に乳酸合成酵素遺伝子が導入されることにより得られる乳酸合成能を有する酵母。
【請求項１３】
請求項１から請求項５のいずれかに記載の酵母の製造方法により得られた酵母，又は請求項６から請求項１２のいずれかに記載の酵母を糖質存在下で培養し，乳酸を生成させ，培養物から前記乳酸を採取する乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，乳酸耐性や乳酸合成能に優れた酵母の製造方法，そのような酵母，及び，そのような酵母を用いた乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より，乳酸は，例えば，輸液などの医療品原料，食品添加物，化粧品原料として好ましく使用されていた。また，ポリ乳酸は，生物由来材料である乳酸から合成され，生分解性などの優れた性質を有するポリマーとして注目されており，フィルム，樹脂製品，医療材料，その他多くの分野での需要性が高まっている。このように，乳酸の用途は多岐にわたり，需要量も急増しているため，原料である乳酸を安価に製造することが求められている。
【０００３】
乳酸は，主として，ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に代表される乳酸菌を用いて生産されている。これらの乳酸菌は，酸性条件下で生育しないため，乳酸を培養液中に多量に蓄積させるためには，炭酸カルシウム，アンモニア，水酸化ナトリウムなどの中和剤を添加した培養を行わなければならず，中和工程や乳酸の精製工程に多大なコストを要する。また，乳酸菌を用いて乳酸を生産する場合，乳酸のｐＫａ（〜３．８６）以下で発酵を行う必要があるので，培養液中からの乳酸を抽出・精製するために複雑な工程を経なければならない。
【０００４】
一方，酸性条件下で生育可能な酵母株を用いた有機酸の製造方法が，複数提案されている（例えば，下記特許文献１〜３及び非特許文献１〜２参照）。これらの提案によれば，本来乳酸生成能を持たない酵母株に，乳酸生成酵素遺伝子を導入し，乳酸を生産させることにより，中和操作を軽減し，乳酸の製造を低コストに構築することを可能としている。さらに，酵母株による乳酸その他の有機酸の生産能力を，遺伝子組み換え等の技術を用いて向上させることにより，より安価な有機酸の製造方法を構築することができる。
また，培地中に酸が蓄積すると，培地ｐＨの低下に伴って細胞内ｐＨも低下するが，微生物は細胞膜に局在するプロトンエーティーピーエース（Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）を活性化させることにより，細胞外へプロトンを汲み出して，細胞内ｐＨを一定に保とうとする。
【０００５】
しかしながら，酵母細胞においては，酸性条件下で活性化されるべきＨ＋−ＡＴＰａｓｅが，培養液中に乳酸が存在する場合においてはその活性が阻害され，細胞内ｐＨを好適に維持することができず，酵母細胞の生存率が低下することが報告されている（下記非特許文献３参照）。すなわち，乳酸の生産能力をより高く向上させるためには，酵母細胞の乳酸への耐性能力を向上させ，より高濃度の乳酸を生産できるようにすることが，工業上非常に重要な課題である。
【０００６】
現在，乳酸耐性を付与する方法，又は乳酸産生能を維持する方法としては，以下のような方法が用いられている。
第一の方法としては，乳酸耐性の高い新規な乳酸耐性菌株を分離し，得られた乳酸耐性菌を宿主として乳酸を生産させる方法が挙げられる。しかしながら，得られた乳酸耐性菌を宿主として高濃度の乳酸を生産するための遺伝子組み換えを行うためには，取り扱いの容易なベクター系を開発する必要がある。
第二の方法としては，乳酸菌に対して変異誘発剤処理を行うことで突然変異を導入し，乳酸耐性変異体を作製する方法が挙げられるが，大幅な乳酸耐性を付与できるまでには至っていない。
第三の方法としては，異なる性質の乳酸菌を細胞融合することで乳酸耐性変異体を作製する方法（ゲノムシャフリング法）が挙げられる。具体的には，例えば，ｐＨ４．０にて野生株に比べ乳酸を３倍生産する乳酸耐性株を取得した例が報告されている（下記非特許文献４参照）。しかしながら，この方法では，乳酸に対する耐性度の更に高い株を産生するために，長時間を要するという問題がある。
【０００７】
第四の方法としては，乳酸耐性菌から単離された乳酸耐性関連遺伝子を遺伝子組み換えで宿主菌に導入し，乳酸耐性を付与する方法が挙げられる。具体的には，例えば，ワイン酵母Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉから単離された多剤耐性遺伝子ファミリーに属するｏｒｆＣ，ＬｙｓＲファミリーに属する推定転写調節因子ｏｒｆＢ，低分子ヒートショックタンパク質Ｌｏｌ１８の三遺伝子を大腸菌に導入し，酸耐性を付与した例が報告されている（下記非特許文献５参照）。しかしながら，この方法では，乳酸耐性を付与したい宿主微生物に対して適用できるか否かが不明である。また，仮にこの方法を適用できたとしても，乳酸耐性度を更に増強したい場合には，上記乳酸耐性関連遺伝子の発現を増加させる以外に合理的な手段はない。
【０００８】
第五の方法としては，ケモスタットを用いて酸に馴化させる方法が挙げられる。具体的には，例えば，目的の菌を低ｐＨ（ｐＨ５．０）で６０分間，前処理した後，致死ｐＨ（ｐＨ３．０）処理し，耐性化遺伝子の発現を誘導し，乳酸耐性に馴化させる方法が報告されている（下記非特許文献６参照）。しかしながら，この方法では，変異が安定に保持されるか否かが不確定であり，その他にも，生物種によるばらつき，馴化可能な乳酸濃度など不確定な要素が混在するため，簡便な方法ではない。
従って，乳酸耐性に優れる酵母，及びこのような酵母を効率的に得られる製造方法，並びに，酵母を用いた生産性に優れる乳酸の製造方法は，未だ実現されておらず，その速やかな提供が望まれているのが現状である。
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−２０４４６８号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号パンフレット
【特許文献３】特開２００３−２５９８７８号公報
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー），７１，１９６４（２００５）
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー），７１，２７８９（２００５）
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ザ  ジャーナル  オブ  ザ  アメリカン  ソサイエティ  オブ  ブリューイング  ケミスツ），５９，１８７（２００１）
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ネイチャー  バイオテクノロジー），２０，７０７−７１２，２００２
【非特許文献５】Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（レターズ  イン  アプライド  マイクロバイオロジー），３３，１２６−１３０，２００１
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー  アンド  バイオテクノロジー），４，５２５−５３２，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は，乳酸耐性や乳酸合成能に優れた酵母の製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明は，乳酸耐性や乳酸合成能に優れた酵母を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は，酵母を用いた効果的な乳酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は，基本的には，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離することによって得られた酵母に，乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより，乳酸合成することができる酵母を得ることができるという知見に基づくものである。
【００１４】
また，本発明は，基本的には，乳酸合成酵素遺伝子が導入されるとともに，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離することにより，効率的に乳酸合成することができる酵母を得ることができるという知見に基づくものである。
【００１５】
そして，本発明は，そのような酵母を用いれば効果的に乳酸を製造できるという知見に基づくものである。
【００１６】
本発明は，基本的には，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離することによって得られた酵母に，乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより，効率的に乳酸合成することができる酵母を得ることができるという知見に基づくものである。
【００１７】
また，本発明は，基本的には，  乳酸合成酵素遺伝子が導入されるとともに，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離することにより，効率的に乳酸合成することができる酵母を得ることができるという知見に基づくものである。
【００１８】
そして，本発明は，そのような酵母を用いれば効果的に乳酸を合成できるという知見に基づくものである。
【００１９】
本発明の第一の側面は，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離することによって得られた酵母に，乳酸合成酵素遺伝子を導入する，乳酸合成能を有する酵母の製造方法に関する。
【００２０】
本発明の第一の側面の好ましい態様は，前記酵母の変異株は，変異型ＤＮＡポリメラーゼδをコードする遺伝子が導入された株である上記に記載の酵母の製造方法に関する。
【００２１】
本発明の第一の側面の好ましい態様は，前記酵母の変異株は，Ｐｏｌ３のアミノ酸配列を改変した出芽酵母の変異株である，上記いずれかに記載の酵母の製造方法に関する。
【００２２】
本発明の第一の側面の好ましい態様は，所定の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離する工程を繰り返し，前記所定の乳酸濃度が１％（ｖ／ｖ）以上７％（ｖ／ｖ）以下であり，前記培養及び単離工程を繰り返すにつれ，乳酸濃度を高くする，上記いずれかに記載の酵母の製造方法に関する。
【００２３】
本発明の第一の側面の好ましい態様は，乳酸合成酵素遺伝子が導入されるとともに，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離する工程を含む，乳酸合成能を有する酵母の製造方法に関する。
【００２４】
本発明の第二の側面は，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を用い，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後に生存細胞を単離する工程を，前記乳酸濃度を１％（ｖ／ｖ）以上７％（ｖ／ｖ）以下の範囲内で高くしつつ繰り返すことにより乳酸耐性を有する酵母を得た後に，乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより得られる乳酸合成能を有する酵母に関する。
【００２５】
本発明の第二の側面の好ましい態様は，前記酵母の変異株は，変異型ＤＮＡポリメラーゼδをコードする遺伝子が導入された株である，上記に記載の酵母に関する。
【００２６】
本発明の第二の側面の好ましい態様は，乳酸合成酵素遺伝子が導入されるとともに，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を用い，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後に生存細胞を単離する工程を，前記乳酸濃度を１％（ｖ／ｖ）以上７％（ｖ／ｖ）以下の範囲内で高くしつつ繰り返すことにより得られる乳酸合成能を有する酵母に関する。
【００２７】
本発明の第二の側面の好ましい態様は，前記酵母の変異株は，変異型ＤＮＡポリメラーゼδをコードする遺伝子が導入された株である，上記に記載の酵母に関する。
【００２８】
本発明の第二の側面の好ましい態様は，前記酵母が，サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母である上記いずれかに記載の酵母に関する。
【００２９】
本発明の第二の側面の好ましい態様は，前記酵母が，出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である上記いずれかに記載の酵母に関する。
【００３０】
本発明の第二の側面の好ましい態様は，独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ  ＡＰ−３１９」，「ＮＩＴＥ  ＡＰ−３２０」，又は「ＮＩＴＥ  ＡＰ−３２０」として寄託されている酵母に乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより得られる乳酸合成能を有する酵母に関する。
【００３１】
本発明の第三の側面は，上記いずれかに記載の酵母の製造方法により得られた酵母，又は上記いずれかに記載の酵母を糖質存在下で培養し，乳酸を生成させ，培養物から前記乳酸を採取する乳酸の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，高い乳酸濃度下で培養することにより，乳酸耐性に優れた酵母を得ることができ，乳酸合成能を有する遺伝子を導入するか，又は乳酸合成能を有する変異株を用いることにより，乳酸合成することができる酵母の製造方法を提供することができる。
【００３３】
本発明によれば，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，高い乳酸濃度下で培養することにより，乳酸耐性を有する酵母を得ることができ，乳酸耐性を有する酵母に乳酸合成能を有する遺伝子を導入するか，又は乳酸合成能を有する変異株を用いて乳酸耐性を有する酵母を得ることにより，乳酸合成することができる酵母を得ることができる。
【００３４】
本発明によれば，上記のとおり高い乳酸耐性を有するとともに，乳酸合成能を有する酵母を得ることができるので，そのような酵母を用いた効果的な乳酸の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
−乳酸合成能を有する酵母の製造方法−
本発明の第一の側面に係る酵母の製造方法は，基本的には，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離することによって得られた酵母に，乳酸合成酵素遺伝子を導入する，乳酸合成能を有する酵母の製造方法に関する。すなわち，本発明の第一の側面は，基本的には，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離することによって乳酸耐性を有する酵母を得て，その乳酸耐性を有する酵母に対して，乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより乳酸合成能を有する酵母を得るというものである。
【００３６】
「ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株」として，ＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度が調整された酵母の変異株があげられる。「ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株」として，変異型ＤＮＡポリメラーゼδをコードする遺伝子が導入された株があげられ，より具体的には，変異型ＤＮＡポリメラーゼδ発現プラスミドを用いて形質転換された株や，Ｐｏｌ３のアミノ酸配列を改変した出芽酵母の変異株などがあげられる。さらに具体的には，配列番号４で示されるＰＯＬ３遺伝子における９６２番目の塩基がＡからＣに置換され，９６８番目の塩基がＡからＣに置換されたＤＮＡを形質転換することにより得られる出芽酵母の変異株があげられる。このようなＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を，高い乳酸濃度のもとで培養することで，後述する実施例により実証されたとおり，高い乳酸耐性を有する酵母を得ることができる。
【００３７】
「乳酸耐性」を有するとは，少なくとも乳酸に対する耐性を有すること，すなわち，所定の乳酸濃度の環境下において，死滅しないことを意味する。具体的な乳酸耐性の評価方法は，後述するとおりである。なお，「所定の乳酸濃度の環境下」における乳酸として，公知の乳酸を適宜用いることができるが，Ｌ−乳酸を用いることが好ましい。
【００３８】
本明細書における「１％（ｖ／ｖ）以上の乳酸濃度」として，１％以上１５％以下があげられ，１％以上１０％以下でもよく，１％以上７％以下でもよい。なお，乳酸濃度が１％の環境下で株を培養する前に，１％以下の濃度において酵母株を培養し，乳酸環境に慣れさせてもよい。なお，本明細書における乳酸濃度は，特に断らない限り，培地の体積に対するＬ−乳酸溶液（和光純薬工業社製，乳酸含量８５．０−９２．０％）の原液当量（体積の比（ｖ／ｖ））を意味する。本発明の好ましい態様は，所定の乳酸濃度下で培養する工程と，生存細胞を単離する工程とを繰り返すものである。このように，所定の乳酸濃度下で培養し，生存細胞を単離する工程を繰り返すことで，乳酸濃度に適応した酵母株を効果的に培養することができる。
【００３９】
本発明においては，所定の乳酸濃度の環境の下で酵母を培養する。乳酸濃度以外の培養条件は公知の培養条件を適宜採用できる。１回の培養時間として，１時間から１週間があげられ，６時間以上２日以下でもよく１日でもよい。培養の際の培地も公知のものを適宜用いることができる。本発明においては，培養した細胞を適宜単離する。生存細胞を単離するためには，公知の単離方法を適宜用いればよい。
【００４０】
本発明の好ましい態様は，所定の乳酸濃度下で培養し，生存細胞を単離する工程を繰り返し，前記培養及び単離工程を繰り返すにつれ，乳酸濃度を高める工程を含む酵母の製造方法である。すなわち，この本発明の好ましい態様は，目的とする乳酸耐性濃度の環境にいきなりするのではなく，徐々に乳酸濃度を高めて培養することで，高い乳酸濃度環境に慣れさせ，最終的には目的とする乳酸耐性を有する酵母を得るというものである。具体的には，培養ごとに，０．１％以上２％以下ずつ，乳酸濃度をあげて培養するものがあげられ，０．５％以上１．５％以下ずつ乳酸濃度をあげて培養するものであってもよい。培養を繰り返すにあたり，適宜，前回の培養における乳酸濃度と同じ環境で酵母株を培養する工程や，前回の培養における乳酸濃度より低い環境において酵母株を培養する工程が含まれていてもよい。目的とする乳酸耐性濃度を有する乳酸濃度下で酵母変異株を培養し，生存細胞を単離することにより，目的とする乳酸耐性を有する酵母を得てもよい。
【００４１】
具体的には，所定の乳酸濃度下で培養した後，生存細胞を単離する工程を繰り返し，前記所定の乳酸濃度が１％以上７％以下であり，前記培養及び単離工程を繰り返すにつれ，乳酸濃度が高くなる，上記いずれかに記載の酵母の製造方法があげられる。
【００４２】
本発明の好ましい態様は，前記のようにして得られた乳酸耐性を有する酵母に，乳酸合成酵素遺伝子を導入する工程を含む，乳酸合成能を有する酵母の製造方法である。遺伝子を導入する方法は，公知の方法を適宜採用すればよい。なお，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御することにより乳酸耐性を有する突然変異を惹起する性質を有する変異株を用いて所定の乳酸濃度で培養することで乳酸耐性を付与した後に，そのまま乳酸合成酵素遺伝子を導入すると，不要な突然変異が引き続き生じる結果として，導入された乳酸合成遺伝子やその他の遺伝子に，有害変異が生じる可能性がある。そこで，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御することにより乳酸耐性を有する突然変異を惹起する性質を付与した酵母の変異株について，所定の乳酸濃度で培養することで乳酸耐性を付与した後に，いったんＤＮＡポリメラーゼの校正機能を元に戻す工程を経た後に，酸合成酵素遺伝子を導入するものが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を元に戻す工程として，染色体上に存在する変異型ＤＮＡポリメラーゼδをコードする遺伝子などの，校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を，相同組み換えにより取り除くものがあげられる。また，プラスミド上に存在する変異型ＤＮＡポリメラーゼδなどの，校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼを，プラスミドを細胞から取り除くことによっても，目的形質の獲得後に，引き続き不要な突然変異が生じるのを止めることができる。
【００４３】
本発明に用いる酵母としては，一般的に酵母とよばれるものであれば特に限定されず，出芽酵母，分裂酵母などを適宜用いることができる。代表的な酵母として，サッカロマイセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ），又はシゾサッカロマイセス科（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）に属するものが挙げられ，これらの中でも，更に，サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属するものが好適に挙げられる。より具体的な酵母として，真核生物のモデル生物として汎用されており，出芽酵母の一種であるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好適に挙げられる。これらの中では，実施例で実証された出芽酵母が好ましいが，本発明は特に出芽酵母に限定されず，酵母全般に広く適用できる。
【００４４】
本発明に用いる酵母としては，乳酸合成能を有する酵母が好ましい。すなわち，本発明の好ましい態様は，乳酸合成酵素遺伝子が導入されるとともに，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御した酵母の変異株を用い，乳酸濃度下で培養する工程と，生存細胞を単離する工程とを適宜繰り返し行うものである。このような変異株を用いることで，乳酸耐性を有する酵母を作出した後に，乳酸合成酵素遺伝子を導入する必要がなくなる。乳酸合成能を有する酵母としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができるが，乳酸合成酵素遺伝子を有する酵母が好ましく，具体的には，例えば，乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより，乳酸合成能を獲得した酵母が特に好ましい。このような乳酸合成酵素としては，例えば，乳酸脱水素酵素が挙げられる。前記乳酸合成能を有する酵母としては，サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母などが好適に用いられ，これらの中でも，サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などがより好適に用いられる。
【００４５】
遺伝子を導入することにより乳酸合成能を持たせる場合，導入する乳酸合成酵素をコードする遺伝子は，酵母において生産され得る乳酸合成酵素をコードするＤＮＡであれば特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができるが，酵素活性が強化された乳酸合成酵素をコードするＤＮＡが好ましい。前記酵素活性が強化された乳酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては，例えば，部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる酵素活性が強い乳酸合成酵素をコードするＤＮＡや，強力なプロモーターの支配下に乳酸合成酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡなどが挙げられる。
【００４６】
前記乳酸合成酵素遺伝子を有する酵母は，乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素，Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入することにより製造することができる。一方，酵母が既に目的とする乳酸合成酵素をコードする遺伝子を有している場合は，必ずしも該遺伝子を導入する必要はない。前記乳酸合成酵素としては，具体的には，例えば，ボス・トウラス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）由来のＬ−乳酸合成酵素遺伝子（Ｌ−ｌｄｈ−ｂ）にコードされるタンパク質からなる酵素が挙げられる。図１３は，前記遺伝子組み換えのため，本発明で用いられるプラスミドｐＬＤＨ−ｂの構築図である。
【００４７】
本発明によれば，例えば，前述のようにＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御して突然変異を導入することで，野生株には見られない，又は野生株では乏しかった優れた乳酸耐性を発揮させることができる。そして，乳酸耐性を有するのみならず，酵母に乳酸合成能を有する遺伝子を導入することで，酵母を用いて乳酸を合成させることができる。
【００４８】
酵母の有用な変異体を作製するためには，変異誘発を行うことが最も一般的である。変異とは，通常，遺伝子をコードする塩基配列の変化をいい，ＤＮＡ配列の変化が含まれる。変異は，それが発生した個体に与える影響により大きく次の三種類に分類される。
（１）中立変異（ｎｅｕｔｒａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：ほとんどの変異が，この中立変異に該当し，中立変異は生物の成育および代謝にほとんど影響がない。
（２）有害変異（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は，中立変異より頻度は少なく，生物の成長または代謝を阻害する。有害変異には生育に必須な遺伝子を破壊するような致死変異（ｌｅｔｈａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）も含まれる。
（３）有益変異（ｂｅｎｅｆｉｔｉａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は，生物の育種に有益な変異を意味するが，その発生頻度は中立変異と比較して極めて低い。また，有益変異の育種効果は，単一の変異だけで現れることは稀であり，複数の有益変異の蓄積が必要である。したがって，有益変異が導入された生物個体を得るためには，より大きな変異集団と，選抜に伴う長い時間が必要となる。
【００４９】
変異を生じさせるため，例えば，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が破壊されるような変異を，ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子）に導入することにより，校正機能が野生型より低下した，ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチドおよびポリペプチドを産生することができる。
校正機能とは，細胞が受けたＤＮＡ損傷または誤りを検知し，補修する生体機能をいう。具体的な補修として，脱プリン，脱ピリミジンがある場合はそのまま塩基が挿入されること，あるいはＡ−Ｐエンドヌクレアーゼ（ａｐｕｒｉｎｉｃ−ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で一本鎖切断が入れられた後，５’→３’エンドヌクレアーゼで除去されることがあげられる。なお，除去部分はＤＮＡポリメラーゼにより合成補充され，切断部分はＤＮＡリガーゼにより連結される。このような反応を除去修復という。
そのような校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼとしては，例えば真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδ（デルタ），ＤＮＡポリメラーゼε（イプシロン）などがあげられる。これらの中でも，ＤＮＡポリメラーゼδがより好適に挙げられ，その校正機能の調節は，校正機能に関連するアミノ酸配列を改変することによって達成できる。
【００５０】
本発明により得られる乳酸耐性を有する酵母は，少なくとも１％以上の乳酸濃度に対する乳酸耐性を有し，好ましくは，少なくとも３％，より好ましくは少なくとも４％以上，更に好ましくは，少なくとも５％以上，より更に好ましくは，少なくとも７％以上，特に好ましくは，少なくとも１０％以上の乳酸濃度に対する耐性を有する酵母である。なお，乳酸の生産などに好適な乳酸耐性を付与し，かつ乳酸耐性を有する酵母の作製の工程数やコストなどとの均衡を図る観点から，４％〜７％の乳酸濃度に対する耐性を有する酵母が，最も好ましい。
【００５１】
本発明において，乳酸耐性を，例えば以下のようにして決定する。すなわち，乳酸耐性度を評価したい酵母株を，乳酸を含まない培地で一晩培養する。次に，各種濃度の乳酸を含む培地を調製し，各培地に，前記一晩培養した該培養液を，１％添加し，一晩培養する。一晩培養後，例えば，吸光度法，寒天プレート法，トリパンブルー染色による生存率測定などにより菌濃度を測定する。中性付近の培地を用いた場合と同等の増殖性が認められた乳酸濃度の数値を，その濃度の乳酸耐性を持つと評価する。
【００５２】
本明細書において「エラープローン頻度」とは，エラープローンの性質のレベルをいう。エラープローン頻度は，たとえば，遺伝子配列における変異の絶対数（変異の数そのもの）または相対数（全長における変異の数の比率）で表現できる。あるいは，ある生物または酵素について言及するとき，エラープローン頻度は，ある生物の生殖または分裂１回あたりの遺伝子配列における変異の絶対数または相対数で表現してもよい。特に言及しない場合，エラープローン頻度は，遺伝子配列における複製過程１回あたりの誤差の数で表される。エラープローン頻度は，逆の尺度として本明細書において「精度」ということがある。エラープローン頻度が均一であるとは，複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に言及するとき，互いのエラープローン頻度が実質的に等しいことをいう。他方，エラープローン頻度が不均一であるとは，有意な差異が複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に存在する場合をいう。
【００５３】
本明細書において「エラープローン頻度の調節」とは，エラープローン頻度を変化させることをいう。そのようなエラープローン頻度の調節には，エラープローン頻度の上昇および低減が含まれるが，好ましくはエラープローン頻度を上昇するものである。エラープローン頻度を調節するための手法として，たとえば，校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼの改変，複製中に重合反応または伸長反応を阻害または抑制するような因子の挿入，これらの反応を促進するような因子の阻害，抑制，単数または複数の塩基の欠損，ＤＮＡ修復酵素の欠損，異常塩基の除去修復因子機能を有する酵素の改変，ミスマッチ塩基対修復因子の改変，複製自体の精度の低減などがあげられるがそれらに限定されない。エラープローン頻度の調節は，ＤＮＡの二本鎖の両方に対して行われてもよいし，片方のみに対して行われてもよい。好ましくは，ＤＮＡの二本鎖のうち片方のみに対して行われるものは，有害な変異誘発が低減されるため好ましい。
【００５４】
本明細書において「エラープローン」とは，遺伝子（ＤＮＡなど）の複製における誤り易い（すなわち，複製誤りの）性質をいう。エラープローンは，主に，校正機能を有する酵素（たとえば，ＤＮＡポリメラーゼなど）の校正機能の精度によって影響を受ける。本明細書において「複製誤り」とは，遺伝子（ＤＮＡなど）の複製の過程で生じるヌクレオチド取り込みの誤りをいう。複製誤りは，通常，生体では，その頻度は１０8〜１０12回に１回程度で極めて低い。複製誤りの頻度が低い理由としては，ヌクレオチドの取り込みが鋳型ＤＮＡの取り込まれるヌクレオチドとが相補的な塩基対を形成することによって複製が起こること，ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素の校正機能すなわち３’→５’エキソヌクレアーゼが，鋳型に相補性を示さないヌクレオチドが誤って取り込まれたときそれを察知し直ちに切り出す機能が存在することなどがあげられる。したがって，本発明において複製におけるエラープローン頻度の調節は，特異的塩基対形成の障害，校正機能の障害などによって行うことができる。
【００５５】
本明細書において「エラーフリー」とは，遺伝子（ＤＮＡなど）の複製において誤りがほとんどない，好ましくは実質的に全くない性質をいう。エラーフリーは，主に，校正機能を有する酵素の校正機能の精度によって影響を受ける。本明細書においてエラープローンとエラーフリーとは，絶対的に（すなわち，エラープローン頻度のレベルなどで決定する）分類することができ，あるいは相対的（２種以上の遺伝子の複製を担う因子（たとえば，ＤＮＡポリメラーゼなど）におけるエラープローン頻度について多いほうをエラープローンとし，少ないほうをエラーフリーとする）に分類することができる。
【００５６】
なお，本明細書において“ＤＮＡポリメラーゼ”または“Ｐｏｌ”とは，４種類のデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸からピロリン酸を遊離してＤＮＡを重合する働きを有する酵素をいう。ＤＮＡポリメラーゼ反応には，鋳型となるＤＮＡ，プライマー分子，Ｍｇ２＋などが必要とされる。プライマーの３’−ＯＨ末端に鋳型に相補的なヌクレオチドを順次付加し分子鎖を伸長する。
【００５７】
本発明において，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御するためには，公知の方法に従って，ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に何らかの変異を導入すればよい。遺伝子変異の導入方法は，たとえば，酵母のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列は公知であるから，それらの塩基配列を，例えば１個〜１００個，好ましくは１個〜１０個，より好ましくは１個〜３個他の塩基で置換し，形質転換すればよい。例えば，ＤＮＡ複製時にラギング鎖の複製に関与するとされるポリメラーゼ３（Ｐｏｌ３）の校正機能を消失させた変異タンパク質を目的の酵母細胞内で発現させることで，ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御できる。すなわち，校正機能を消失させた変異型Ｐｏｌ３を目的の酵母細胞内で発現させるための方法として，人為的に変異型ｐｏｌ３遺伝子を得て，対象となる酵母に形質転換することにより，変異遺伝子を発現させ，機能させるものがあげられる。すなわち，校正機能を消失させた変異型Ｐｏｌ３の作成方法として，予めクローニングした野生型のＰＯＬ３遺伝子を鋳型にして，その校正機能活性部位のアミノ酸配列を一部人工的に置換し，校正機能を制御すればよい。また，ｐｏｌ３変異株と同様の形質を持ち，既に天然の変異体として同定されている株より，当該遺伝子をクローニングして用いる方法を用いてもよい。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子には，ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子のみならず，ＤＮＡポリメラーゼのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含してもよい。
【００５８】
本明細書において校正機能が「野生型のものよりも低い」とは，ある校正機能を有する酵素などについて言及するとき，その酵素の野生型よりも校正機能が低いこと（すなわち，その酵素での校正処理の後に残留する変異の数が野生型による校正処理の後に残留する変異の数よりも多いこと）をいう。そのような野生型との比較は，相対的または絶対的な表示によって行うことができる。そのような比較はまた，エラープローン頻度などによって行うことができる。
【００５９】
本明細書において「変異」とは，遺伝子について言及するとき，その遺伝子の配列の変化を生じることまたはその変化によって生じた遺伝子の（核酸またはアミノ酸）配列の状態をいう。本明細書では，たとえば，変異は，校正機能について生じる遺伝子配列の変化について用いられる。本明細書では，特に言及しない場合は，変異は，改変と同義で用いられる。
【００６０】
本発明の第二の側面に係る乳酸合成能を有する酵母は，上記酵母の製造方法により製造された，少なくとも１％以上の乳酸濃度に対する乳酸耐性を有するとともに，乳酸合成能を有する酵母である。乳酸合成能を有する酵母については，上記酵母の製造方法で述べた通りの方法により得ることができる。  本発明の乳酸耐性を有する酵母は，後述の本発明の乳酸の製造方法に，好適に用いることができ，特に乳酸合成能を有する酵母を用いることで高濃度の乳酸を効率的に生産することができる。
【００６１】
−乳酸の製造方法−  本発明の第三の側面は，上記の酵母の製造方法により得られた酵母を糖質存在下で培養し，乳酸を生成させ，培養物から前記乳酸を採取する，乳酸の製造方法に関する。  前記乳酸を生成させるために，乳酸合成能を有する酵母を用いることが好ましい。この乳酸合成能を有する酵母としては，乳酸合成酵素遺伝子を有する酵母が好ましく，乳酸合成酵素遺伝子を導入された酵母がより好ましい。これら乳酸合成能を有する酵母や乳酸合成酵素遺伝子の導入方法などの詳細は，上記の酵母の製造方法で述べた通りである。
【００６２】
本発明の乳酸の製造方法で用いる酵母の培養は，以下に記載した通常の方法に従って行うことができる。
本発明の乳酸の製造方法で用いる酵母を培養する培地としては，該酵母が資化し得る炭素源，窒素源，及び無機塩類等を含有し，該酵母の培養を効率的に行うことができる培地であれば，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができ，天然培地及び合成培地のいずれを用いても良い。
前記炭素源としては，該酵母株が資化し得るものであれば，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができるが，グルコース，フルクトース，シュークロース，これらを含有する糖蜜，デンプン，及びデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。
前記窒素源としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができるが，アンモニア，塩化アンモニウム，硫酸アンモニウム，酢酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩，ペプトン，肉エキス，酵母エキス，コーンスティーブリカー，カゼイン加水分解物，大豆粕，大豆粕加水分解物，及び各種醗酵菌体消化物，などを用いることができる。
前記無機塩としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができるが，リン酸マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化ナトリウム，リン酸第一カリウム，リン酸第二カリウム，硫酸第一鉄，硫酸マンガン，硫酸銅および炭酸カルシウム，などを用いることができる。
【００６３】
前記炭素源は，培養開始時に一括して添加してもよいし，培養中分割して，又は連続的に添加することもでき，５０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌの濃度で用いるのが好ましい。
本発明における前記培養は，振とう培養もしくは撹拌培養などで行うのが好ましく，好気的条件下，微好気条件下又は嫌気的条件下で行うことができる。培養温度としては，２５〜３５℃が好ましく，培養時間としては，通常２４時間〜５日間が好ましい。また，必要に応じてｐＨの調整を行ってもよく，その調製は，アルカリ溶液，アンモニアおよび炭酸カルシウムなどを用いて行うこともできる。
【００６４】
前記培養液中の乳酸濃度は，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法で定量することができ，例えば，培養液を遠心分離して培養液上清を調製し，該培養液上清を分析サンプルとして有機酸分析用陰イオン交換カラムを用い，電気伝導度を測定することにより，培養液中の，例えば，乳酸や酢酸等の有機酸濃度を定量することができる。
【００６５】
前記培養液中で生成された乳酸の採取方法としては，培養終了後，培養物から菌体などの沈殿物を除去し，イオン交換処理法，濃縮法および塩析法などを併用することにより，培養物から目的とする乳酸を単離し，精製することができる。例えば，特開２００１−２０４４６４号公報，特開平９−１３５６９８号公報などに開示されているような電気透析法や，蒸留法により精製することが可能であるが，これらに限定されるものではない。また，必要に応じて，当該粗抽出画分及びその精製物に対してエステル化等を行うことにより，各種の乳酸誘導体を得ることができる。
乳酸耐性を有する酵母を用いた，本発明の乳酸の製造方法で得られた乳酸は，ポリマー原料などの工業用途，食品添加物，化粧品材料，医薬品原料などに好適に用いられる。
【００６６】
寄託株の説明  後述する実施例で用いられるＢＹＤ５（変異型ｐｏｌ３遺伝子発現株）は，平成１７年８月１９日から独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に，受領番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３１として寄託されている。  後述する実施例で用いられるＡＭＹ５２−３Ｄ（野生型ｐｏｌ３遺伝子発現株）は，平成１７年８月１９日から独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに，受領番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９として寄託されている。
後述する実施例で得られたＢＹＤ５−ＬＡ７（乳酸耐性株）は，平成１７年７月２９日から独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに，受領番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２２として寄託されている。
【００６７】
後述する実施例で得られたＴＢＳＣＲ８（乳酸耐性株）は，平成１９年２月２２日から独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ  ＡＰ−３１９」として寄託されている。
後述する実施例で得られたＨＲＳＣ２０７（乳酸耐性株）は，平成１９年２月２２日から独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ  ＡＰ−３２０」として寄託されている。
後述する実施例で得られたＨＲＳＣ２０８（乳酸耐性株）は，平成１９年２月２２日から独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ  ＡＰ−３２１」として寄託されている。  
【００６８】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが，本発明はこれらに限定されるものではない。すなわち，本発明は，本明細書において開示された事項及び下記実施例において実証された事項から，当業者にとって自明な範囲で適宜修正を加えたものをも含む。なお，下記実施例において用いられる試薬類は，明細書注に特に記載したものを除き，Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ），和光純薬工業（大阪，日本）などで市販されているものを用いた。
【実施例１】
【００６９】
参考例１  乳酸添加による培地ｐＨの変化と細胞増殖への影響の検討
−酵母株−  酵母株として，変異型ｐｏｌ３遺伝子発現株（ＢＹＤ５，以下，ｐｏｌ３変異株と称する）と，野生型ｐｏｌ３遺伝子発現株（ＡＭＹ５２−３Ｄ，以下，野生株と称する）を用いた。前記ＢＹＤ５の遺伝子型は，（ｐｏｌ３−０１／ｐｏｌ３−０１，ＭＡＴａ／ＭＡＴα，ｌｙｓ１−１／ｌｙｓ１−１）であり，前記ＡＭＹ５２−３Ｄの遺伝子型は，（ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２，ｌｅｕ２−１，ｌｙｓ１−１，ａｄｅ２−１，ｈｉｓ１−７，ｈｏｍ３−１０，ｔｒｐ１−２８９，ｃａｎＲ）である。
【００７０】
−培地及び試薬−  液体培地として，ＹＰＤ  ｍｅｄｉｕｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用い，寒天培地として，ＹＰＤ  ａｇａｒ  ｍｅｄｉｕｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。これらは，いずれもＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。前記液体培地及び寒天培地を，オートクレーブにより，１２０℃で１５分間，滅菌した。  乳酸として，Ｌ−乳酸（和光純薬工業社製）を用いた。
【００７１】
−実験方法−  （１）乳酸添加による培地ｐＨの測定実験  前記液体培地に乳酸を添加し，乳酸濃度が１％刻みで，１％〜２０％となるよう調製し，乳酸を添加していない液体培地と，それぞれの乳酸濃度の液体培地のｐＨを測定した。
【００７２】
（２）乳酸の細胞増殖への影響実験  （Ａ）前記寒天培地に展開したｐｏｌ３変異株及び野生株のコロニーを，白金耳で掻き取り，液体培地を４ｍＬ入れた試験管（直径１８ｍｍ）に各々植菌した。各試験管を，３０℃，１８０ｒｐｍで一晩（１６時間以上）振とう培養した。  （Ｂ）各々の培養液の一部を採取し，血球計算盤を用いて細胞密度を測定し，両株の細胞密度が等しくなるように，各培養液を液体培地で希釈した。  （Ｃ）培養開始時の細胞密度が，２．０×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように，各培養液をマイクロチューブに採取し，５，０００ｘｇで３分間遠心して，細胞を回収した。  （Ｄ）前記と同様に調製した乳酸濃度１％，３％，５％，６％，７％，８％，９％，１０％，１１％，１３％，１５％，１７％，１９％，２０％の液体培地各４ｍＬに，前記（Ｃ）で回収した細胞を再懸濁し，３０℃，１８０ｒｐｍで１８時間振とう培養した。なお，この培養においても直径１８ｍｍの試験管を使用した。  （Ｅ）培養後，血球計算盤を用いて各培養液の細胞密度を測定し，乳酸添加により細胞増殖に与える影響を比較した。
【００７３】
−実験結果−  （１）乳酸添加による培地ｐＨの検討  乳酸を液体培地に添加した際のｐＨの変化を，下記表１及び図２に示す。また，その際の培地の変化を，図１に示す。  下記表１の結果より，乳酸を添加することにより，ＹＰＤ液体培地のｐＨが著しく低下することが明らかとなった。  また，図１に示されるように，乳酸を添加することにより，培地成分の一部が析出し，培地が濁ることも明らかとなった。
【００７４】
【表１】
2010115112.tif 000003
【００７５】
（２）乳酸添加による細胞増殖に与える影響の検討  前記野生株及びｐｏｌ３変異株を，前記で調製した乳酸を各乳酸濃度で含有した培地で１８時間培養した際の細胞密度を測定した結果を，下記表２及び図２に示す。  下記表２の結果より，野生株及びｐｏｌ３変異株の細胞密度は，乳酸添加によって低下したことがわかった。特に，乳酸濃度が５％を超えると，ほとんどが増殖できないことが明らかとなった。  また，乳酸添加による培地のｐＨ及び両株の細胞増殖に相関が認められることから，培地のｐＨ低下により両株の細胞増殖が阻害されていることが示された。
【００７６】
【表２】
2010115112.tif 000004
【００７７】
参考例２  乳酸耐性を有する酵母の製造方法を用いた酵母の製造  参考例２では，本発明の乳酸耐性を有する酵母の製造方法を用いて，ｐｏｌ３変異株に乳酸耐性を付与した。その手順等を以下に示す。
【００７８】
−酵母株−  参考例１と同様のｐｏｌ３変異株（ＢＹＤ５）を使用した。−培地など−  参考例１と同様の液体培地及び乳酸を用いた。
【００７９】
−実験方法−  （１）ｐｏｌ３変異株のコロニーを掻き取り，液体培地４ｍＬを入れた試験管（直径１８ｍｍ）に植菌し，３０℃，１８０ｒｐｍで一晩培養した。
（２）培養液を１５ｍＬ容の遠沈管に採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して，全ての細胞を回収した。
（３）液体培地1００ｍＬを入れた３００ｍＬ容三角フラスコに，上記で回収した全ての細胞を再懸濁し，３０℃，１８０ｒｐｍで一晩培養した。
（４）上記で培養した培養液を５０ｍＬ容遠沈管（コーニング社製）にとり，１，０００ｘｇで５分間遠心して，全ての細胞を回収した。
（５）乳酸濃度３％となるよう調製した液体培地（以下，３％乳酸培地などと称する）１５０ｍＬを入れた３００ｍＬ容三角フラスコに，上記で回収した全ての細胞を懸濁し，３０℃，１８０ｒｐｍで―晩培養した。
（６）上記で培養した３％乳酸培養液の一部を採取し，該培養液と等量の０．１％トリパンブルー溶液（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）と混合して細胞を染色した。青色に染色された細胞は死滅細胞であり，染色されない細胞は生存細胞であるため，これを目印として生存細胞の割合を観察した。
（７）生存細胞の存在を確認した後，３％乳酸培養液の１／３量（５０ｍＬ）を５０ｍＬ容遠沈管に採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して，細胞を回収した。
【００８０】
（８）４％の乳酸培地１５０ｍＬを入れた３００ｍＬ容三角フラスコに，回収した細胞を懸濁し，３０℃，１８０ｒｐｍで一晩培養した。
（９）上記で培養した４％乳酸培養液の一部を採取し，前記と同様のトリパンブルー染色により細胞を観察した。生存細胞を確認した後，１／３量（５０ｍＬ）の培養液を５０ｍＬ容遠沈管に採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して細胞を回収した。
【００８１】
（１０）５％乳酸培地１５０ｍＬを入れた３００ｍＬ容三角フラスコに，回収した細胞を懸濁し，３０℃，１８０ｒｐｍで一晩培養した。
（１１）上記で培養した５％乳酸培養液の―部を採取し，前記と同様のトリパンブルー染色により生存細胞の確認を行った。
（１２）生存細胞の存在を確認した後，５％乳酸培養液１／１０量（ｌ５ｍＬ）を採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して，細胞を回収した。また，５％乳酸培地７０ｍＬを入れた２００ｍＬ容振とうフラスコ（ＩＷＡＫＩ社製）に，回収した細胞を懸濁した後，細胞密度を測定した。測定後，これらの培養液を，３０℃，１８０ｒｐｍで振とう培養した。
（１３）２４時間ごとに前記培養液の細胞密度を測定し，培養開始直後の細胞密度に対して，約５〜１０倍になるまで培養を行った。
（１４）上記の５％乳酸培地で増殖が確認された培養液から，１／１０量（７ｍＬ）を採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して，細胞を回収した。これらの細胞を再び５％乳酸培地に懸濁し，３０℃，１８０ｒｐｍで振とう培養した。
【００８２】
（１５）前記（１１）〜（１４）の操作を繰り返すことで，継代培養を行った。なお，継代培養の基準として，（ｉ）トリパンブルー染色により，生存細胞を確認すること，（ii）培養開始直後の細胞密度に対して，約５〜１０倍増殖していること，以上の２点を設定した。
【００８３】
−実験結果−  上述のように，液体培地の乳酸濃度を徐々に高くし，最終的に乳酸濃度５％の乳酸培地で継代培養を行った際の細胞密度を，下記表３及び図４に示す。
【００８４】
下記表３及び図４の結果から，下記事実が認められた。
（１）ｐｏｌ３変異株を３％乳酸培地で培養した結果，細胞密度が増大し，また，生存細胞も多く認められた。
（２）３％乳酸培地による培養で増殖したｐｏｌ３変異株を，４％乳酸培地へ移植した結果，細胞密度の増大及び生存細胞が認められた。
（３）４％乳酸培地による培養で増殖したｐｏｌ３変異株を，５％乳酸培地へ移植した結果，培養開始から４日目に細胞密度の増大が認められた。
（４）トリパンブルー染色の結果，５％乳酸培地による培養において，多くの生存細胞が認められた（図３）。
（５）５％乳酸培地による培養で増殖したｐｏｌ３変異株を，再び５％乳酸培地へ移植し，同培地で継代培養を繰り返した。この結果，継代回数が増すごとに細胞増殖の速度が高まる傾向が認められた（表３，図４）。
【００８５】
以上の結果より，上記のような酵母の製造方法を用いることで，ｐｏｌ３変異株に濃度５％の乳酸に対する耐性を付与することができることが示された。
【００８６】
【表３】
2010115112.tif 000005
【００８７】
参考例３  ５％乳酸耐性株の培養特性
参考例２において，濃度５％の乳酸に対して耐性を獲得したｐｏｌ３変異株（以下，５％乳酸耐性株と称する）の培養特性を検討した。実験の方法を以下に示す。
【００８８】
−酵母株−  参考例１と同様の野生株及び，参考例２で得られた５％乳酸耐性株を使用した。
【００８９】
−実験方法−
参考例２で得られた５％乳酸耐性株は，５％乳酸培地７０ｍＬを入れた２００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコで継代培養を行った。この培養は，３０℃，２００ｒｐｍで行行われ，全培養液に対して１／１０程度の細胞が継代された。
【００９０】
（１）野生株のコロニーを掻き取り，液体培地４ｍＬを入れた試験管（直径１８ｍｍ）に植菌し，３０℃，１８０ｒｐｍで一晩培養した。
（２）野生株の培養液を５，０００ｘｇで，３分間遠心して細胞を回収し，液体培地７０ｍＬを入れた２００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに懸濁した。これを３０℃，２００ｒｐｍで回転振とう培養した。
【００９１】
（３）５％乳酸培地で継代している５％乳酸耐性株，及び上記で培養した野生株を５０ｍＬ容遠沈管に採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して細胞を回収した。
（４）上記で回収した細胞を数ｍＬの乳酸無添加の液体培地に再懸濁した後，血球計算盤で細胞密度を測定した。
（５）測定した細胞密度をもとに，野生株及び５％乳酸耐性株の細胞密度が等しくなるように，各々を乳酸無添加の液体培地で希釈した。
【００９２】
（６）最終細胞密度が約２．０×ｌ０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製された前記細胞希釈液を，５ｍＬ容の遠沈管に採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して，細胞を回収した。次に，乳酸濃度が５％，６％及び７％の乳酸培地７０ｍＬを入れた２００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに，回収した細胞を懸濁し，３０℃，２００ｒｐｍで回転振とう培養した。なお，野生株については，５％乳酸培地のみで培養を行った。また，これらの乳酸培地は０．４５μｍの滅菌フィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で濾過して使用した。
（７）懸濁直後を０日目とし，２４時間ごとに３日間の細胞密度を測定した。なお，血球計算盤による測定は，１測定につき３回行い，平均値及び標準偏差を算出した。
【００９３】
−実験結果−
上述のように，野生株及び５％乳酸耐性株を，各濃度の乳酸培地で培養した際の細胞密度の変化を，下記表４及び図５，図６に示す。
【００９４】
下記表４及び図５，図６の結果から，下記事実が認められた。
（１）５％乳酸培養の結果，５％乳酸耐性株は野生株に比べて顕著な増殖が認められ，また，野生株はほとんど増殖していないことが判った（図５）。
（２）５％乳酸耐性株は，濃度が５％及び６％の乳酸を含む培養条件において速やかに増殖し，培養３日目では約１０倍に増殖したことが判った（表４，図６）。
（３）５％乳酸耐性株を７％乳酸培地で３日間培養したが，顕著な増殖は認められなかった（表４，図６）。
【００９５】
以上の結果より，ｐｏｌ３変異株を乳酸に馴化させることによって取得した５％乳酸耐性株は，５％及び６％乳酸に対して優れた耐性を獲得していることが判明した。
【００９６】
【表４】
2010115112.tif 000006
【００９７】
参考例４  ７％乳酸耐性株の作製
参考例２及び参考例３で示した５％乳酸耐性株に，本発明の乳酸耐性を有する酵母の製造方法を用いて，濃度７％の乳酸への耐性を付与する実験を行った。
【００９８】
−実験方法−
参考例２及び参考例３で得られた５％乳酸耐性株（ｐｏｌ３変異株）は，５％乳酸培地７０ｍＬを入れた２００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコを用いて，３０℃，２００ｒｐｍで継代培養を行った。新しい培地への継代は，２〜３日ごとに行い，全培養液に対して１／１０量の細胞を回収し，移植した。
【００９９】
（１）５％乳酸耐性株の継代培養から全培養液の１／５量を採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して，細胞を回収した。乳酸濃度が７％の７％乳酸培地７０ｍＬを入れた２００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに回収した細胞を懸濁し，３０℃，２００ｒｐｍで一晩培養した（継代１回目）。
（２）上記培養後の全培養液の１／５量を採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して，細胞を回収した。新鮮な７％乳酸培地７０ｍＬに，回収した細胞を懸濁し，３０℃，２００ｒｐｍで５日間培養した（継代２回目）。
（３）上記培養後の全培養液の１／１０量を採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して，細胞を回収した。新鮮な７％乳酸培地７０ｍＬに，回収した細胞を懸濁し，３０℃，２００ｒｐｍで５日間培養した（継代３回目）。
（４）上記培養後の全培養液の１／１０量を採取し，１，０００ｘｇで５分間遠心して，細胞を回収した。新鮮な７％乳酸培地７０ｍＬに，回収した細胞を懸濁し，３０℃，２００ｒｐｍで４日間培養した（継代４回目）。
（５）上記４回目の継代培養株，及び液体培地で―晩前培養した野生株の一部を，７％乳酸培地に移植し，３０℃，２００ｒｐｍで一晩回転振とう培養した。これらの細胞についてトリパンブルー染色を行い，生存細胞を顕微鏡観察することによって，７％の乳酸濃度への耐性を確認した。
【０１００】
−実験結果−
上述のように，５％乳酸耐性株を７％乳酸培地で継代培養した際の細胞密度の変化を，下記表５及び図７に示す。
【０１０１】
下記表５及び図７の結果から，下記事実が認められた。
（１）継代培養２回目において５日間培養したところ，継代直後に比べて約６.７倍の増殖が認められた（表５，図７）。
（２）継代培養３回目において５日間培養したところ，継代直後に比べて約６６．９倍の増殖が認められた（表５，図７）。
（３）継代培養４回目において４日間培養したところ，継代直後に比べて約３１０倍の増殖が認められた（表５，図７）。
（４）トリパンブルー染色の結果，野生株はほぼ全ての細胞が死滅したにも関わらず，乳酸耐性株では，多くの生存細胞が観察された（図８）。
【０１０２】
【表５】
2010115112.tif 000007
【０１０３】
実施例で得られた乳酸耐性株を，ＢＹＤ５−ＬＡ７（濃度７％の乳酸を含むＹＰＤ培地中で増殖可能）と命名した。
【０１０４】
参考例５  乳酸耐性を有する酵母の製造方法を用いた酵母の製造−酵母株−
参考例５では，野生株としてサッカロマイセス  セレビシエ  （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＹＰＨ４９９株を用いた。なお，ＹＰＨ４９９株は，公知の野生株であり，たとえばＮＩＴＥが運営する分譲機関において，カタログ番号ＮＢＲＣ１０５０５として紹介されている。
−培地−  液体培地として、ＹＰＤＡ  Ｂｒｏｔｈ（ＹＰＤ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製），２０ｍｇ／Ｌ  Ａｄｅｎｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ（和光純薬工業社製））を用いた。固体培地として、ＹＰＤＡ  Ｂｒｏｔｈ（ＹＰＤ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製），２０ｍｇ／Ｌ  Ａｄｅｎｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ（和光純薬工業社製），２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ （Ｂｅｃｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製））を用いた。乳酸として，Ｌ−乳酸（和光純薬工業社製）を用いた  また、５−ＦＯＡ固体培地として、（２０ｇ／Ｌ  Ｄ-Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業社製），６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ/ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ （Ｂｅｃｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製），０．７９ｇ／Ｌ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（ＦＯＲＭＥＤＩＵＭ社製，４０ｍｇ／Ｌ  Ａｄｅｎｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ（和光純薬工業社製），１ｇ／Ｌ  ５-Ｆｕｌｏｒｏｏｒｏｔｉｃ Ａｃｉｄ（和光純薬工業社製），２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ （Ｂｅｃｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製））を用いた。
【０１０５】
−実験方法−
（１）サッカロマイセス  セレビシエ  （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＹＰＨ４９９株を変異型ＤＮＡポリメラーゼδ発現プラスミドＹＥｐｌａｃ１９５  ｐｏｌ３−０１で形質転換した。図９に，上記の変異型ＤＮＡポリメラーゼδ発現プラスミドの構築図を示す。変異型ＤＮＡポリメラーゼδ発現プラスミドＹＥｐｌａｃ１９５  ｐｏｌ３−０１は，酵母細胞中に遺伝情報を導入するためのベクタープラスミドであるＹＥｐｌａｃ１９５のマルチクローニングサイトに，変異型ＤＮＡポリメラーゼδ遺伝子を組み込んで構築されたプラスミドである。変異型ＤＮＡポリメラーゼδ遺伝子を組み込むことができる同様なプラスミドとして，酵母細胞内で染色体と独立して複製する高コピープラスミドであるＹＥｐシリーズやＹＲｐシリーズ，酵母細胞内で染色体と独立して複製する低コピープラスミドであるＹＣｐシリーズ，及び酵母細胞内で染色体に組み込まれるプラスミドであるＹＩｐシリーズがあげられる。
（２）形質転換株のコロニーを掻き取り，液体培地４ｍＬを入れた試験管に植菌し，３０℃，１８０ｒｐｍで一晩振とう培養した。
（３）培養液の一部を濃度３．５％の乳酸を含有した固形培地に蒔き、３０℃で５日間培養し、生えてきたコロニー数個を釣菌した。
（４）濃度３．５％の乳酸を含有した固体培地に、（３）で釣菌したコロニーを植え継ぎ、３０℃で１晩培養し、生えてきたコロニーを釣菌した。
（５）液体培地に、（４）で釣菌したコロニーを植え継ぎ、３０℃で６時間培養し、培養液から遠心分離により再度全ての細胞を回収した。
（６）濃度４．０％の乳酸を含有した液体培地に、（５）で回収した細胞を植え継ぎ、３０℃で１晩培養した。
（７）培養液の一部を濃度４．０％の乳酸を含有した固体培地に蒔き、３０℃で４日間培養し、生えてきたコロニーを釣菌した。
（８）液体培地に、（７）で釣菌したコロニーを植え継ぎ、３０℃で８時間培養し、培養液から遠心分離により再度全ての細胞を回収した。
（９）濃度５％の乳酸を含有した液体培地に、（８）で回収した細胞を植え継ぎ、３０℃で３晩培養した。
（１０）５％培養液中の細胞からＹＥｐｌａｃ１９５  ｐｏｌ３−０１を脱落させ、５％培養液を５−ＦＯＡ固体培地に蒔き、３０℃で３晩培養し、生えてきたコロニーについてプラスミドを保持していないことをＰＣＲによって確認した。
（１１）（１０）で、ＹＥｐｌａｃ１９５  ｐｏｌ３−０１の脱落が確認された株について、濃度４．５％の乳酸を含有した液体培地で３０℃で２晩培養し、培養開始直後の細胞密度に対して約５〜１０倍になるまで培養を行なうことにより，４．５％の乳酸濃度に対する耐性を獲得した酵母株を単離した。
【０１０６】
参考例５で得られた乳酸耐性株を，ＨＲＳＣ２０７，ＨＲＳＣ２０８，ＨＲＳＣ２１０，及びＨＲＳＣ２１４とそれぞれ命名した。
【０１０７】
参考例６  乳酸耐性を有する酵母の製造方法を用いた酵母の製造−酵母株−
参考例５と同様の株を用いた。
−培地−
参考例５と同様の培地を用いた。
【０１０８】
−実験方法−
（１）サッカロマイセス  セレビシエ  （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＹＰＨ４９９株を変異型ＤＮＡポリメラーゼδ発現プラスミドＹＥｐｌａｃ１９５  ｐｏｌ３−０１で形質転換した。
（２）形質転換株のコロニーを掻き取り，液体培地４ｍＬを入れた試験管に植菌し，３０℃，１８０ｒｐｍで一晩振とう培養した。
（３）培養液の一部を濃度５．０％の乳酸を含有した固形培地に蒔き、３０℃で２日間培養し、生えてきたコロニー数個を釣菌した。
（４）濃度５．５％の乳酸を含有した培養液に（３）で釣菌したコロニーを植菌し、３０℃で１晩培養した。
（５）培養液から遠心分離により再度全ての細胞を回収した。  
（６）５．５％培養液中の細胞からＹＥｐｌａｃ１９５  ｐｏｌ３−０１を脱落させるため、５．５％培養液を５−ＦＯＡ固体培地に蒔き、３０℃で３晩培養し、生えてきたコロニーについてプラスミドを保持していないことをＰＣＲによって確認した。
（７）（６）で、ＹＥｐｌａｃ１９５  ｐｏｌ３−０１の脱落が確認された株について、濃度４．５％の乳酸を含有した液体培地で３０℃で２晩培養し、培養開始直後の細胞密度に対して約５〜１０倍になるまで培養を行なうことにより，４．５％の乳酸濃度に対する耐性を獲得した酵母株を単離した。
【０１０９】
参考例６で得られた乳酸耐性株を，ＴＢＳＣＲ５，ＴＢＳＣＲ８と命名した。
【０１１０】
参考例７  ４．５％乳酸耐性株の培養特性１
参考例５，６において，濃度４．５％の乳酸に対して耐性を獲得した変異株（以下４．５％乳酸耐性株と称する）の培養特性を検討した。実験の方法を以下に示す。
【０１１１】
−酵母株−  参考例５と同様の野生株（ＹＰＨ４９９株）及び，参考例５，６で得られた４．５％乳酸耐性株（ＨＲＳＣ２０７，ＨＲＳＣ２０８，ＨＲＳＣ２１０，ＨＲＳＣ２１４，ＴＢＳＣＲ５及びＴＢＳＣＲ８）を使用した。−培地−  液体培地として、ＹＰＤＡ  Ｂｒｏｔｈ（ＹＰＤ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製），２０ｍｇ／Ｌ  Ａｄｅｎｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ（和光純薬工業社製））を用いた。
【０１１２】
−実験方法−
（１）野生株及び４．５％乳酸耐性株をそれぞれ液体培地４ｍＬを入れた試験管に植菌し，３０℃，１８０ｒｐｍで一晩培養した。培養液から遠心分離により細胞を回収し，滅菌水で３回洗浄した後、２時間放置し、希釈して濁度（ＯＤ６６０）を測定した。
（２）濃度４．５％の乳酸を含有した液体培地３ｍＬに、それぞれＯＤ６６０＝１．０に希釈した菌体培養液を０．０５ｍLずつ植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍで３６時間培養後、それぞれのＯＤ６６０値を測定した。
【０１１３】
−実験結果−
上記実験の結果，図１０，１１に示すように，４．５％乳酸耐性株は，野生株に比べて顕著な増殖を示した。なお、ＴＢＳＣＲ５株は乳酸耐性能は低いが、高い凝集性を示した。
以上の結果より，変異型ＤＮＡポリメラーゼδ発現株を乳酸に馴化させることにより取得した４．５％乳酸耐性株は，４．５％の乳酸存在下において顕著な耐性を示し，細胞増殖を行うことが示された。
【０１１４】
参考例８  ４．５％乳酸耐性株の培養特性２
参考例５，６において４．５％の乳酸濃度に対して耐性を獲得した変異株（以下４．５％乳酸耐性株）の培養特性を検討した。
（１）野生株及び４．５％乳酸耐性株を，ＹＰＤＡ培地（１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製），２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社製），２０ｇ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，４０ｍｇ／Ｌ  Ａｄｅｎｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製））を，それぞれ１０ｍＬずつ入れた各試験管に植菌し，３０℃，１２０ｒｐｍで一晩培養した。
（２）該培養液０．１ｍＬを濃度４％の乳酸を含むＹＰＤＡ液体培地１０ｍＬに添加し，３０℃，１２０ｒｐｍで振とう培養した。
（３）培養開始１４時間，２２時間，３８時間，４５時間，及び７０時間後に培養液のＯＤ６００を測定した。その結果，図１２に示すように，参考例５，６で取得した４．５％乳酸耐性株は，野生株に比較して，４％濃度の乳酸存在下で顕著に増殖することが示された。
【０１１５】
参考例９  乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素，Ｌ−ｌｄｈ）遺伝子のクローニング
ウシ（ボス・トウラス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ））の骨格筋由来ｃＤＮＡライブラリー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）より、付属のプロトコールに従いファージミドを調製した。得られたファージミドを鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＰＣＲにより乳酸合成酵素遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（宝酒造社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素Ｈｉｎｃ  ＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）に、ライゲーションした。ライゲーションは、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、ウシ由来乳酸合成酵素（Ｌ−ｌｄｈ−ｂ）遺伝子（配列番号３）をクローニングした。クローニングしたＬ−ｌｄｈ−ｂ遺伝子をＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３‘−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター制御下に連結し、Ｌ−ｌｄｈ−ｂ発現プラスミドｐＬＤＨ−ｂを構築した。
【０１１６】
４．５％乳酸耐性株による乳酸生産試験
参考例５において作製し、参考例７，８において乳酸存在下で親株であるＹＰＨ４９９株よりも良好な生育が確認された４．５％乳酸耐性株の中で、ＨＲＳＣ２０７株，ＨＲＳＣ２０８株，ＴＢＳＣＲ８株と，親株であるＹＰＨ４９９株とを，ｐＬＤＨ−ｂを用いて形質転換した。図１３に，ｐＬＤＨ−ｂの構築図を示す。形質転換はＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は，付属のプロトコールに従った。
宿主とするＨＲＳＣ２０７株，ＨＲＳＣ２０８株，ＴＢＳＣＲ８株，およびＹＰＨ４９９株はウラシル合成能を欠損した株であり，ｐＬＤＨ−ｂ上にあるＵＲＡ３遺伝子の働きにより，ウラシル非添加培地上で形質転換体を選抜することができる。作製したＨＲＳＣ２０７／ｐＬＤＨ−ｂ株，ＨＲＳＣ２０８／ｐＬＤＨ−ｂ株，ＴＢＳＣＲ８／ｐＬＤＨ−ｂ株，ＹＰＨ４９９／ｐＬＤＨ−ｂ株を用いて，次のように，乳酸発酵試験を行った。
（１）５ｍＬのＳＣ２−Ｕｒａ培地（１００ｇ／Ｌ  グルコース，６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製），３．８４ｇ／Ｌ  Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｕｒａｃｉｌ（Ｓｉｇｍａ社製））を用いて，３０℃の温度で２４時間振とう培養した。
（２）該培養液０．５ｍＬをＳＣ２−Ｕｒａ培地５０ｍＬを入れた２００ｍＬ容三角フラスコに接種した後，３０℃の温度で６５時間振とう培養し，計時的に１ｍＬサンプリングした。培養中にグルコースが枯渇しないように，培養開始４０時間後、５０時間後のサンプリング後にそれぞれ２０％グルコース溶液を１０ｍＬ，５０％グルコース溶液を５ｍＬ添加し，６５時間振とう培養した。
（３）サンプリングした該培養液から遠心分離により菌体を除去し，上清のグルコース濃度と乳酸濃度を測定した。グルコース濃度はテストワコーＧＬＵ−ＩＩ（和光純薬工業社製）を用いて測定し，乳酸濃度は以下の条件でＨＰＬＣを用いて測定した。
・カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（島津製作所社製）
・移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸，２０ｍＭ  ビストリス，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・カラムオーブン温度：４５℃
【０１１７】
実験の結果，図１４に示すように，ＹＰＨ４９９／ｐＬＤＨ−ｂ株と比較して、ＨＲＳＣ２０７／ｐＬＤＨ−ｂ株およびＨＲＳＣ２０８／ｐＬＤＨ−ｂ株は５％，ＴＢＳＣＲ８／ｐＬＤＨ−ｂ株は１２％，それぞれ乳酸の生産性が向上していることが示され、乳酸耐性能力向上株を作出することにより，より高い乳酸の生産株を構築できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は，乳酸添加による培地の変化を示した写真である（写真左：乳酸無添加のＹＰＤ液体培地，写真右：濃度３％の乳酸を加えたＹＰＤ液体培地）。
【図２】図２は，乳酸添加による野生株及びｐｏｌ３変異株の細胞増殖を比較したグラフである。
【図３】図３は，培養２日目における５％乳酸耐性株をトリパンブルー染色して観察した写真である。写真上で黒く示された細胞はトリパンブルーにより青色に染色された死滅細胞で，染色されていない白色の細胞が生存細胞である。
【図４】図４は，５％乳酸培養におけるｐｏｌ３変異株の細胞増殖の変化を示すグラフである。
【図５】図５は，５％乳酸培養における野生株及び５％乳酸耐性株の細胞増殖を比較したグラフである。
【図６】図６は，野生株及び５％乳酸耐性株の乳酸添加による細胞増殖への影響を示したグラフである。
【図７】図７は，５％乳酸耐性株を７％乳酸培地で継代培養した際の細胞密度の変化を示したグラフである。
【図８】図８は，７％乳酸培地で培養した１日目の野生株及び乳酸耐性株をトリパンブルー染色した写真である。写真上で黒く示された細胞はトリパンブルーにより青色に染色された死滅細胞で，染色されていない白色の細胞が生存細胞である。
【図９】図９は，本発明で用いられるプラスミドＹＥｐｌａｃ１９５  ｐｏｌ３−０１の構築図である。
【図１０】図１０は，参考例７における４．５％乳酸耐性株（ＨＲＳＣ２０７，ＨＲＳＣ２０８，ＨＲＳＣ２１０，ＨＲＳＣ２１４）の，４．５％の乳酸濃度下での増殖比較を示すグラフである。
【図１１】図１１は，参考例７における４．５％乳酸耐性株（ＴＢＳＣＲ５，ＴＢＳＣＲ８）の，４．５％乳酸濃度下での増殖比較を示すグラフである。
【図１２】図１２は，参考例８における４．５％乳酸耐性株の４％乳酸濃度下での増殖比較を示すグラフである。
【図１３】図１３は，本発明で用いられるプラスミドｐＬＤＨ−ｂの構築図である。
【図１４】図１４は，実施例１における４．５％乳酸耐性株と野生株を用いた乳酸生産を比較したグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１１９】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
【図１】
2010115112.tif 000008
【図２】
2010115112.tif 000009
【図３】
2010115112.tif 000010
【図４】
2010115112.tif 000011
【図５】
2010115112.tif 000012
【図６】
2010115112.tif 000013
【図７】
2010115112.tif 000014
【図８】
2010115112.tif 000015
【図９】
2010115112.tif 000016
【図１０】
2010115112.tif 000017
【図１１】
2010115112.tif 000018
【図１２】
2010115112.tif 000019
【図１３】
2010115112.tif 000020
【図１４】
2010115112.tif 000021
【配列表】
2010115112000001.app