(57)【要約】【課題】  Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ファミリーの亜鉛フィンガードメインを含み、式５'−(ＡＮＮ)−３'の標的ヌクレオチドに特異的に結合する新規ポリペプチドを提供すること。【解決手段】  ２〜１２個の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ペプチドを含むポリペプチドであって、ペプチドの少なくとも１個が配列番号７〜７０および１０７〜１１２のいずれかの配列を有するヌクレオチド結合領域を含むポリペプチドを提供することにより、上記課題を解決する。【選択図】図１
2010159279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜１２個の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ペプチドを含むポリペプチドであって、ペプチドの少なくとも１個が配列番号７〜７０および１０７〜１１２のいずれかの配列を有するヌクレオチド結合領域を含むポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明の分野は、標的ヌクレオチドに結合する亜鉛フィンガータンパク質である。さらに特定すれば、本発明は、式５'−(ＡＮＮ)−３'の標的ヌクレオチドに特異的に結合する亜鉛フィンガーのαヘリックスドメイン内におけるアミノ酸残基配列に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人工的転写因子の構築は過去何年間にもわたり大いなる興味の対象となっている。遺伝子発現は、調節ドメインに融合されたポリダクチル亜鉛フィンガータンパク質により特異的に調節され得る。
【０００３】
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ファミリーの亜鉛フィンガードメインは、それらのモジュール構造故に人工的転写因子の構築についてこれまでのところ最も有望視されている。各ドメインは、約３０アミノ酸から成り、疎水性相互作用および保存Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２残基による亜鉛イオンのキレート化により安定化されたββα構造に折りたたまれる。現在までのところ、この亜鉛フィンガータンパク質ファミリーの中で最も明白に特性確認されているタンパク質は、マウス転写因子Ｚｉｆ２６８である[Pavletich et al.、（１９９１）Science２５２(５００７)、８０９−８１７、Elrod-Erickson et al.,(１９９６)Structure ４(１０)、１１７１−１１８０]。Ｚｉｆ２６８／ＤＮＡ複合体の分析結果は、ＤＮＡ結合が、主に３ｂｐ ＤＮＡサブサイトのそれぞれ３'、中間および５'ヌクレオチドと１、３および６位におけるαヘリックスのアミノ酸残基の相互作用により達成されることを示唆している。１、２および５位は、ＤＮＡのリン酸バックボーンと直接的または水媒介による接触をもつことが示されている。ロイシンは、通常４位に見出され、ドメインの疎水性コアへパッケージングされる。αヘリックスの２位は、他のヘリックス残基と相互作用することが示されており、さらに、３ｂｐサブサイト外側のヌクレオチドへの接触をもち得る［Pavletich et al.、（１９９１）Science２５２(５００７)、８０９−８１７、Elrod-Erickson et al.,(１９９６)Structure ４(１０)、１１７１−１１８０、Isalan,M.et al.,(１９９７)Proc Natl Acad Sci USA９４(１１)、５６１７−５６２１］。
【０００４】
高い特異性および親和力をもつ５'−ＧＮＮ−３'ＤＮＡサブサイトの各々を認識するモジュール亜鉛フィンガードメインの選択および位置指定突然変異導入によるそれらの洗練はこれまでに立証されている。これらのモジュールドメインは、ヒトまたは他のいずれかのゲノム内において特有なものである拡張された１８ｂｐＤＮＡ配列を認識する亜鉛フィンガータンパク質に組立てられ得る。さらに、これらのタンパク質機能は転写因子として機能し、調節ドメインに融合された場合に遺伝子発現を改変し得、核ホルモン受容体のリガンド結合ドメインへの融合によりホルモン依存的にされることさえあり得る。ＤＮＡ配列に結合する亜鉛フィンガーに基いた転写因子の迅速な構築を可能にするため、モジュール亜鉛フィンガードメインの既存のセットを拡張して６４の可能なＤＮＡトリプレットの各々を認識させることが重要である。この目的は、ファージディスプレイ選択および／または合理的設計により達成され得る。
【０００５】
亜鉛フィンガー／ＤＮＡ相互作用に関する構造データが限られているため、亜鉛タンパク質の合理的設計は多大なる時間の浪費であり、多くの場合可能ではあり得ない。さらに、最も多く天然に存する亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ配列の５'−ＧＮＮ−３'型を認識するドメインにより構成される。５'−ＡＮＮ−３'型の配列に結合する亜鉛フィンガードメインは天然タンパク質からは僅かしか見出されず、例えばＧｆｉ−１のフィンガー５(５'−ＡＡＡ−３')[Zweidler‐McKay et al.,(１９９６)Mol.Cell.Biol.１６(８)、４０２４−４０３４]、ＹＹ１のフィンガー３(５'−ＡＡＴ−３')[Hyde‐DeRuyscher,et al.,(１９９５)Nucleic Acids Res.２３(２１)、４４５７−４４６５]、ＣＦ２IIのフィンガー４および６(５'−[Ａ／Ｇ]ＴＡ−３')[Gogos et al.,(１９９６)PNAS ９３、２１５９−２１６４]およびＴＴＫのフィンガー２(５'−ＡＡＧ−３')[Fairall et al.,(１９９３)Nature(London)３６６(６４５４)、４８３−７]がある。しかしながら、Ｘ線またはＮＭＲ試験によるタンパク質／ＤＮＡ複合体の構造分析では、αヘリックスの６位のアミノ酸残基と５'グアニン以外のヌクレオチドとの相互作用は全く観察されなかった。従って、５'−ＡＮＮ−３',５'−ＣＮＮ−３'または５'−ＴＮＮ−３'型のＤＮＡ標的配列に結合する新規亜鉛フィンガードメインの最も有望視されている同定方法は、ファージディスプレイによる選択である。この方法についての限定的工程は、５'アデニン、シトシンまたはチミンの特定化を可能にするライブラリーの構築である。ファージディスプレイ選択は、このタンパク質の種々のフィンガーがランダム化されているＺｉｆ２６８に基くものであった[Choo et al.,(１９９４)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９１(２３)、１１１６８−７２、Rebar et al.,(１９９４)Science(Washington,D.C.,１８８３−)２６３(５１４７)、６７１−３、Jamieson et al.,(１９９４)Biochemistry ３３、５６８９−５６９５、Wu et al.,(１９９５)PNAS ９２、３４４−３４８、Jamieson et al.,(１９９６)Proc Natl Acad Sci USA ９３、１２８３４−１２８３９、Greisman et al.,(１９９７)Science２７５(５３００)、６５７−６６１]。５'−ＧＮＮ−３'型のＤＮＡ配列を認識する１６ドメインのセットは、Ｃ７のフィンガー２、Ｚｉｆ２６８の誘導体[米国特許番号６１４００８１、この開示を出典明示で援用する、Wu et al.,(１９９５)PNAS ９２、３４４−３４８ Wu,１９９５＃１６４]がランダム化されたライブラリーから以前に報告されている[Segal et al.,(１９９９)Proc Natl Acad Sci USA ９６(６)、２７５８−２７６３]。かかる戦略において、フィンガー３のＡｓｐ２がフィンガー２サブサイトにおける５'グアニンまたはチミンの相補的塩基と接触するため、選択は５'−ＧＮＮ−３'または５'−ＴＮＮ−３'を認識するドメインに限られる[Pavletich et al.、（１９９１）Science２５２(５００７)、８０９−８１７、Elrod-Erickson et al.,(１９９６)Structure ４(１０)、１１７１−１１８０]。場合によっては３ｂｐサブサイト外側のヌクレオチドを認識し得る、亜鉛フィンガードメインの限られたモジュール性については、充分に検討されている[Wolfe et al.,(１９９９)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.３、１８３−２１２、Segal et al.,(２０００)Curr Opin Chem Biol ４(１)、３４−３９、Pabo et al.,(２０００)J.Mol.Biol.３０１、５９７−６２４、Choo et al.,(２０００)Curr.opin.Struct.Biol.１０、４１１−４１６]。標的部位オーバーラップにより課される限界を克服する一法は、２つの隣接フィンガーにおけるアミノ酸残基のランダム化である[Jamieson et al.,(１９９６)Proc Natl Acad Sci USA ９３、１２８３４−１２８３９、Isalan et al.,(１９９８)Biochemistry ３７(３５)、１２０２６−１２０３３]。第二の、ただし時間のかかる方法は、各フィンガーおよびその周囲フィンガーの個々の構造およびＤＮＡ結合方式の説明となる特異的９ｂｐ標的部位についてのフィンガー１〜３の逐次選択法である[Greisman et al.,(１９９７)Science ２７５(５３００)、６５７−６６１、Wolfe et al.,(１９９９)J Mol Biol ２８５(５)、１９１７−１９３４]。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本方法は亜鉛フィンガードメインのモジュール性に基いているため、学術的共同体による亜鉛フィンガータンパク質の迅速な構築を可能にするもので、交差サブサイト相互作用により課される限界に関する懸念が生じる事例は限られた数に過ぎないことを立証している。本開示は、５'−ＡＮＮ−３'型のＤＮＡ配列を特異的に認識する亜鉛フィンガードメインの選択についての新たな戦略を紹介している。これらのドメインの特異的ＤＮＡ結合特性を、１６の全５'−ＡＮＮ−３'トリプレットに対する多重標的ＥＬＩＳＡにより評価した。これらのドメインは、様々な数の５'−ＡＮＮ−３'ドメインを含むポリダクチルタンパク質へ容易に組込まれ得、各々拡張された１８ｂｐ配列を特異的に認識し得る。さらに、これらのドメインは、調節ドメインに融合されたとき遺伝子発現を特異的に改変し得た。これらの結果は、予め特定されたビルディングブロックからポリダクチルタンパク質を構築する可能性を予告している。さらに、本明細書で特性確認されたドメインは、人工的転写因子によりターゲッティングされ得るＤＮＡ配列の数を大きく増加させる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の簡単な要約
本開示は、５'−ＡＮＮ−３'型のＤＮＡ配列を認識する亜鉛フィンガードメインの選択を可能にする新規ファージディスプレイライブラリーの構築を教示している。かかるドメインは単離され、それらが選択される３ｂｐ標的部位についての鋭敏な結合特異性を示した。これらの亜鉛フィンガードメインを、ｐＭ〜低ｎＭ範囲の親和力でそれらの１８ｂｐ標的部位へ特異的に結合する６−フィンガータンパク質へ移植した。調節ドメインに融合されると、５つの５'−ＡＮＮ−３'および１つの５'−ＴＮＮ−３'ドメインを含む一人工的６−フィンガータンパク質は、亜鉛フィンガー結合部位およびＴＡＴＡボックスを含む最小プロモーターの制御下でルシフェラーゼリポーター遺伝子を調節した。さらに、５'−ＡＮＮ−３'および５'−ＧＮＮ−３'ドメインから組立てられた６−フィンガータンパク質は、内在性ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３遺伝子の特異的転写調節をそれぞれ示した。これらの結果は、５'−ＧＮＮ−３'以外の３ｂｐ標的部位に結合するモジュール亜鉛フィンガードメインが選択され得ること、およびそれらが人工的転写因子を作製するための追加モジュールとして適切であり、それによって予め規定された亜鉛フィンガードメインから構築されたＤＮＡ結合タンパク質によりターゲッティングされ得る配列の数が大きく増加することを示す。
【０００８】
すなわち、本発明は、２〜１２個の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ペプチドを含み、ペプチドの少なくとも１個が配列番号７〜７１および１０７〜１１２のいずれかの配列を有するヌクレオチド結合領域を含む、単離および精製されたポリペプチドを提供する。好ましい態様において、ポリペプチドは２〜６個の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ペプチドを含む。かかるポリペプチドは、配列５'−(ＡＮＮ)ｎ−３'(式中、各Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴであり、ｎは２〜１２である)を含むヌクレオチドに結合する。好ましくは、ペプチドの各々は、異なる標的ヌクレオチド配列に結合する。この発明のポリペプチドは、１個またはそれ以上の転写調節因子、例えばリプレッサーまたはアクチベーターに機能し得るように結合され得る。
【０００９】
ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび発現ベクターにより形質転換された細胞もまた提供される。
【００１０】
関連した態様において、本発明は、配列(５'−ＡＮＮ)ｎ−３'(式中、ｎは２〜１２の整数である)を含むヌクレオチド配列の発現を調節する方法を提供する。この方法は、ポリペプチドがヌクレオチドの発現調節配列に結合する条件下でこの発明のポリペプチドの有効量にヌクレオチド配列を暴露する工程を包含する。すなわち、配列５'−(ＡＮＮ)ｎ−３'は、ヌクレオチド配列の転写領域、ヌクレオチド配列のプロモーター領域または発現された配列標識内に位置し得る。ポリペプチドは、好ましくは１個またはそれ以上の転写調節因子に機能し得るように結合される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、亜鉛フィンガーファージディスプレイライブラリーの構築を概略的に示す。黒塗りの矢印は、Ｚｉｆ２６８のｘ線結晶学により測定された亜鉛フィンガーヘリックスのアミノ酸残基とそれらの結合部位のヌクレオチドとの相互作用を示し、点線は提案された相互作用を示す。
【図２】図２は、選択されたクローンからのフィンガー‐２認識ヘリックスのアミノ酸配列を示す。各ＤＮＡ標的部位について、第６ラウンドのふるい分け後幾つかの単一クローンを配列決定し、アミノ酸を決定して選択を評価した。フィンガー２のＤＮＡ認識サブサイトは、各セットの左に示され、次いで各出現数が示されている。αヘリックス内のアミノ酸残基の位置は、上部に示されている。四角で囲まれた配列は詳細に試験されたもので、各セットの最善のバインダーを表す。星印を付した配列は、追加分析クローンであった。１フィンガー３におけるＳｅｒ４〜Ｃｙｓ４突然変異を伴うクローン。２修飾ｐＭＡＬ−ｃ２ベクターへ第６ラウンドの選択後のＤＮＡプールからの亜鉛フィンガー配列をサブクローニングした後に決定された配列。＊分析された追加クローン。
【図３−１】図３−１(８パネル：３ａ−３ｈに示されている)は、選択されたドメインのＤＮＡ結合特性を試験するための多重標的特異性検定を示す。各グラフの上部には、分析された３−フィンガータンパク質のフィンガー‐２ドメインのアミノ酸配列(ヘリックス出発点に関して−２〜６位)が示されている。黒塗りの棒線は、異なるフィンガー‐２サブサイト：ＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＧおよびＡＴＴを伴う標的オリゴヌクレオチドへの結合を表す。白い棒線はフィンガー‐２サブサイトの５'位のみが異なる一連のオリゴヌクレオチドへの結合を表し、例えば５'−ＡＡＡ−３'サブサイト(図３ａ)ＡＡＡ、ＣＡＡ、ＧＡＡ、またはＴＡＡに結合するドメインについて５'認識が評価される。各棒線の高さは、２つの独立した実験での平均をとり、黒または白色棒線間で最高のシグナルに正規化した、各標的についてのタンパク質の相対親和力を表す。誤差の縦線は平均からの偏差を表す。分析されたタンパク質は、図２からの四角で囲まれたヘリックス配列に対応する。＊位置指定突然変異導入により生成されたフィンガー‐２ドメインを含むタンパク質。
【図３−２】図３−２(８パネル：３ｉ−３ｐに示されている)は、選択されたドメインのＤＮＡ結合特性を試験するための多重標的特異性検定を示す。各グラフの上部には、分析された３−フィンガータンパク質のフィンガー‐２ドメインのアミノ酸配列(ヘリックス出発点に関して−２〜６位)が示されている。黒塗りの棒線は、異なるフィンガー‐２サブサイト：ＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＧおよびＡＴＴを伴う標的オリゴヌクレオチドへの結合を表す。白い棒線はフィンガー‐２サブサイトの５'位のみが異なる一連のオリゴヌクレオチドへの結合を表し、例えば５'−ＡＡＡ−３'サブサイト(図３−１の３ａ)ＡＡＡ、ＣＡＡ、ＧＡＡ、またはＴＡＡに結合するドメインについて５'認識が評価される。各棒線の高さは、２つの独立した実験での平均をとり、黒または白色棒線間で最高のシグナルに正規化した、各標的についてのタンパク質の相対親和力を表す。誤差の縦線は平均からの偏差を表す。分析されたタンパク質は、図２からの四角で囲まれたヘリックス配列に対応する。＊位置指定突然変異導入により生成されたフィンガー‐２ドメインを含むタンパク質。
【図３−３】図３−３(１０パネル：３ｑ−３ｚに示されている)は、選択されたドメインのＤＮＡ結合特性を試験するための多重標的特異性検定を示す。各グラフの上部には、分析された３−フィンガータンパク質のフィンガー‐２ドメインのアミノ酸配列(ヘリックス出発点に関して−２〜６位)が示されている。黒塗りの棒線は、異なるフィンガー‐２サブサイト：ＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＧおよびＡＴＴを伴う標的オリゴヌクレオチドへの結合を表す。白い棒線はフィンガー‐２サブサイトの５'位のみが異なる一連のオリゴヌクレオチドへの結合を表し、例えば５'−ＡＡＡ−３'サブサイト(図３−１の３ａ)ＡＡＡ、ＣＡＡ、ＧＡＡ、またはＴＡＡに結合するドメインについて５'認識が評価される。各棒線の高さは、２つの独立した実験での平均をとり、黒または白色棒線間で最高のシグナルに正規化した、各標的についてのタンパク質の相対親和力を表す。誤差の縦線は平均からの偏差を表す。分析されたタンパク質は、図２からの四角で囲まれたヘリックス配列に対応する。＊位置指定突然変異導入により生成されたフィンガー‐２ドメインを含むタンパク質。
【図４−１】図４−１は、５'−ＡＮＮ−３'ＤＮＡ配列を認識するドメインを含む６‐フィンガータンパク質の構築およびＥＬＩＳＡ分析を示す。６−フィンガータンパク質ｐＡａｒｔ、ｐＥ２Ｘ、ｐＥ３ＹおよびｐＥ３Ｚは、Ｓｐ１Ｃフレームワークを用いて構築された。α認識ヘリックスの−１〜６位にあるアミノ酸残基は、使用した各フィンガーについて与えられている。
【図４−２】図４−２は、５'−ＡＮＮ−３'ＤＮＡ配列を認識するドメインを含む６‐フィンガータンパク質の構築およびＥＬＩＳＡ分析を示す。タンパク質は、ＭＢＰ融合タンパク質としてエシェリキア・コリ(E.coli)で発現された。結合特異性を、固定化ビオチニル化オリゴヌクレオチド(Ｅ２Ｘ、５'−ＡＣＣ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＧＧＡ−３'(配列番号７２)、Ｅ３Ｙ、５'−ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ−３'(配列番号７３)、Ｅ３Ｚ、５'−ＧＣＣ ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＡＴ−３'(配列番号７４)、Ａａｒｔ、５'−ＡＴＧ−ＴＡＧ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＣＣ−ＡＧＧ−３'(配列番号７５))への粗ライゼートからの結合活性の測定により分析した。検定をデュプリケイトで遂行し、棒線は標準偏差を表す。黒棒線：ｐＥ２Ｘ、縞模様の棒線：ｐＥ３Ｙ、灰色棒線：ｐＥ３Ｙ、白色棒線：ｐＡａｒｔ。
【図５】図５(２パネル：ＡおよびＢに示されている)は、ルシフェラーゼリポーター検定結果を示す。ヒーラ細胞を、ＴＡＴＡ−ボックスおよび亜鉛フィンガー結合部位(Ａ：５×Ａａｒｔ結合部位、Ｂ：６×２Ｃ７結合部位)を伴う最小プロモーターの制御下示された亜鉛フィンガー発現プラスミド(対照としてｐｃＤＮＡ)およびルシフェラーゼ遺伝子を含むリポータープラスミドにより共トランスフェクションした。細胞抽出物におけるルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの４８時間後に測定した。各棒線は、デュプリケイト測定結果の平均値(＋／−標準偏差)を表す。Ｙ軸：１０３で割った光単位。Ｘ軸：トランスフェクションされた亜鉛フィンガータンパク質をコードする構築物、対照、リポーター単独。
【図６】図６(２パネル：ＡおよびＢに示されている)は、レトロウイルス仲介遺伝子ターゲッティングを示す。Ａ４３１細胞を、活性化ドメインＶＰ６４または抑制ドメインＫＲＡＢにそれぞれ融合させたｐＥ２Ｘ(Ａ)またはｐＥ３Ｙ(Ｂ)をコード化するレトロウイルスにより感染させた。３日後、無傷の細胞を、フィコエリスリン標識二次抗体と組合わせたＥｒｂＢ−１特異的ｍＡｂ ＥＧＦＲ−１、ＥｒｂＢ−２特異的ｍＡｂ ＦＳＰ７７、またはＥｒｂＢ−３特異的ｍＡｂ ＳＧＰ１により染色した。点線：対照染色(一次抗体省略)、ダッシュ線：模擬感染細胞の特異染色、点／ダッシュ線：亜鉛フィンガータンパク質ＶＰ６４融合体を発現する細胞、太線：亜鉛フィンガータンパク質‐ＫＲＡＢ融合体を発現する細胞。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な記載
Ｉ  亜鉛フィンガーポリペプチド
本発明は、亜鉛フィンガータンパク質から誘導された２〜１２個のヌクレオチド結合ドメインペプチドを含む単離および精製ポリペプチドを提供する。ヌクレオチド結合ドメインペプチドは、亜鉛フィンガータンパク質のαヘリックス部分から誘導される。好ましい上記ヌクレオチド結合ドメインペプチドは、配列番号７〜７１または１０７〜１１２のいずれかのアミノ酸残基配列を有する。好ましくは、ペプチドは、配列番号４６〜７０のいずれかのアミノ酸残基配列を有する。さらに好ましくは、ペプチドは、配列番号１０、１１、１７、１９、２１、２３〜３０、３２、３４〜３６、４２、４３または４５のいずれかのアミノ酸残基配列を有する。ペプチドの各々は、式５'−ＡＮＮ−３'(式中、Ｎはいずれかのヌクレオチド(すなわち、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ)である)に対応するヌクレオチド標的配列と特異的に結合するように設計され、生成されている。すなわち、この発明のポリペプチドは、ヌクレオチド配列５'−(ＡＮＮ)ｎ−３'(ただし、ｎは２〜１２の整数である)に結合する。好ましくは、ｎは２〜６である。
【００１３】
この発明の化合物は、ＡＮＮヌクレオチド配列に結合し、そのヌクレオチド配列の機能を変調する単離された亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドである。ポリペプチドは、遺伝子の転写を促進または抑制し得、そしてＤＮＡまたはＲＮＡに結合し得る。亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドは、亜鉛フィンガータンパク質の突然変異形態または遺伝子組換え操作により製造されたものであるポリペプチドをいう。ポリペプチドは、例えば、第２タンパク質の亜鉛フィンガードメイン(複数も可)に結合された一タンパク質からの亜鉛フィンガードメイン(複数も可)を含むハイブリッドであり得る。ドメインは野生型であるかまたは突然変異が導入され得る。ポリペプチドは、野生型亜鉛フィンガータンパク質の切頭化形態を包含する。ポリペプチドが製造され得る亜鉛フィンガータンパク質の例には、ＴＦIIIＡおよびｚｉｆ２６８が含まれる。
【００１４】
この発明の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドは、ポリペプチドのαヘリックスドメイン内に特有の七量体（７アミノ酸残基の配列）を含み、この七量体配列が標的ヌクレオチドの結合特異性を決定する。その七量体配列は、αヘリックスドメイン内のどこにでも位置し得るが、残基には当業界では慣用的に番号付けをしており、それによると、七量体は−１位〜６位に伸長しているのが好ましい。この発明のポリペプチドは、亜鉛フィンガータンパク質の一部として機能することが当業界では知られているβ‐シートおよびフレームワーク配列を含み得る。多数の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドを製造し、ＡＮＮトリプレットを含む標的ヌクレオチドに対する結合特異性について試験した。
【００１５】
亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体は、切頭化または伸展により野生型亜鉛フィンガータンパク質から誘導または製造されるか、または位置指定突然変異導入方法により、またはこれらの手順の組み合わせにより野生型誘導ポリペプチドの変異体として誘導または製造され得る。「切頭化（された）」の語は、天然亜鉛フィンガー結合タンパク質で見出される最大限の数より少ない亜鉛フィンガーを含むかまたは非所望配列が欠失した亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合タンパク質についていう。例えば、本来は９個の亜鉛フィンガーを含む、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合タンパク質ＴＦIIIＡを切頭化すると、１個から３個の亜鉛フィンガーしか伴わないポリペプチドとなり得る。伸展は、追加の亜鉛フィンガーモジュールが付加された亜鉛フィンガーポリペプチドをいう。例えば、ＴＦIIIＡは、３個の亜鉛フィンガードメインを加えることにより１２フィンガーに拡張され得る。さらに、切頭化亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドは、複数の野生型ポリペプチドからの亜鉛フィンガーモジュールを含み得るため、「ハイブリッド」亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドとなり得る。
【００１６】
「突然変異導入された」の語は、タンパク質をコード化するＤＮＡのランダムまたは位置指定突然変異導入を達成するための公知方法のいずれかを実施することにより得られた亜鉛フィンガー誘導ヌクレオチド結合ポリペプチドについていう。例えば、ＴＦIIIＡでは、突然変異を導入することにより共通配列の１個またはそれ以上の反復単位が非保存残基と置換され得る。また、切頭化亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合タンパク質にも突然変異が導入され得る。
【００１７】
本発明に従い切頭化、伸展および／または突然変異導入することにより亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の機能が阻害され得る公知亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドの例には、ＴＦIIIＡおよびｚｉｆ２６８がある。他の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合タンパク質は、当業者には周知である。
【００１８】
この発明のポリペプチドは、当業界で公知の様々な標準技術を用いて製造され得る。亜鉛フィンガータンパク質のファージディスプレイライブラリーを作製し、配列特異的タンパク質の濃化に有利な条件下で選択した。若干の配列を認識する亜鉛フィンガードメインは、ファージ選択データおよび構造情報の両方により導かれる位置指定突然変異導入による洗練を必要とした。以前、我々は、Ｃ７、マウス転写因子Ｚｉｆ２６８の変異体に基いたファージディスプレイ選択により単離され、位置指定突然変異導入により洗練された、５'−ＧＮＮ−３'型のＤＮＡ配列の各々を特異的に認識する１６亜鉛フィンガードメインの特性検定について報告した［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３、Dreier et al.,(２０００)J.Mol.Biol.３０３、４８９−５０２］。Ｚｉｆ２６８とその標的ＤＮＡ ５'−ＧＣＧ ＴＧＧ ＧＣＧ−３'(配列番号７６)の分子相互作用は、非常に詳細に特性確認されている。一般に、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２型の亜鉛フィンガードメインの特異的ＤＮＡ認識は、各αヘリックスのアミノ酸残基−１、３および６により伝達されるが、どの場合においても３つの残基全てが必ずしもＤＮＡ塩基と接触しているわけではない。一つの主要な交差サブサイト相互作用が認識ヘリックスの２位から観察された。Ａｓｐ２は、次に続く３ｂｐサブサイトのそれぞれ５'チミンまたはグアニンの相補的アデニンまたはシトシンと直接接触することにより亜鉛フィンガードメインの結合を安定させることが示されている。これらの非モジュール相互作用は、標的部位オーバーラップとして報告されている。さらに、伸展した結合部位を作製するアミノ酸と３ｂｐサブサイト外側のヌクレオチドとの他の相互作用が報告されている［Pavletich et al.、（１９９１）Science２５２(５００７)、８０９−８１７、Elrod-Erickson et al.,(１９９６)Structure ４(１０)、１１７１−１１８０、Isalan et al.,(１９９７)Proc Natl Acad Sci USA ９４(１１)、５６１７−５６２１］。
【００１９】
グアニンまたはチミン以外の５'ヌクレオチドに結合する亜鉛フィンガードメインについての以前に報告されたファージディスプレイライブラリーの選択からは、フィンガー‐３認識ヘリックスＲＳＤ−Ｅ−ＬＫＲの２位にあるアスパラギン酸からの交差サブサイト相互作用故に満足した成果は得られなかった。人工的転写因子構築についての亜鉛フィンガードメインの利用能を拡大するため、５'−ＡＮＮ−３'型のＤＮＡ配列を特異的に認識するドメインを選択した。他のグループは、４つの５'−ＡＮＮ−３'サブサイト、５'−ＡＡＡ−３'、５'−ＡＡＧ−３'、５'−ＡＣＡ３'、および５'−ＡＴＡ−３'を認識するドメインの特性確認に至る逐次選択方法を報告している［Greismanetal.,(１９９７)Science ２７５(５３００)、６５７−６６１、Wolfe et al.,(１９９９)J Mol Biol ２８５(５)、１９１７−１９３４］。本開示は、標的部位オーバーラップを排除することによる上記部位を認識する亜鉛フィンガードメインの異なる選択方法を使用している。まず、サブサイト５'−ＧＣＧ−３'に結合するＣ７(ＲＳＤ−Ｅ−ＲＫＲ)(配列番号３)のフィンガー３を、２位にアスパラギン酸を含まないドメインと交換した(図１)。ヘリックスＴＳＧ−Ｎ−ＬＶＲ(配列番号６)は、以前にフィンガー２位が高い特異性でトリプレット５'−ＧＡＴ−３'に結合することが特性確認されており、有望な候補であると思われた。Ｃ７のフィンガー１および２およびフィンガー‐３位の５'−ＧＡＴ−３'認識ヘリックスを含む、この３−フィンガータンパク質(Ｃ７.ＧＡＴ；図１)を、元のＣ７タンパク質(Ｃ７.ＧＣＧ)と比べた多重標的ＥＬＩＳＡにより異なるフィンガー‐２サブサイトを伴う標的でのＤＮＡ結合特異性について分析した。両タンパク質とも５'−ＴＧＧ−３'サブサイトに結合した（ただし、先に報告されたフィンガー３のＡｓｐ２によるチミンまたはグアニンの５'特定化故にＣ７.ＧＣＧは５'−ＧＧＧ−３'にも結合する）。
【００２０】
フィンガー‐２サブサイトの５'ヌクレオチドの認識を、全１６の５'−ＸＮＮ−３'標的部位(Ｘ＝アデニン、グアニン、シトシンまたはチミン)の混合物を用いて評価した。事実、もとのＣ７.ＧＣＧタンパク質はフィンガー２の５'位におけるグアニンまたはチミンを特定化しており、Ｃ７.ＧＡＴは塩基を特定化しなかったことから、５'チミンに相補的なアデニンへの交差サブサイト相互作用が破壊されたことが示された。同様の効果は、Ａｓｐ２が位置指定突然変異導入によってＡｌａ２により置換されたＺｉｆ２６８の変異体についても以前に報告されている［Isalan et al.,(１９９７)Proc Natl Acad Sci USA ９４(１１)、５６１７−５６２１；Dreier et al.,(２０００)J.Mol.Biol.３０３、４８９−５０２］。ゲル移動度変位分析により測定したＣ７.ＧＡＴの親和力は、Ｃ７.ＧＣＧについての０.５ｎＭと比べて約４００ｎＭと、比較的低いことが見出されており［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］、これは一つにはフィンガー３にＡｓｐ２が欠如しているためであり得る。
【００２１】
３−フィンガータンパク質Ｃ７.ＧＡＴに基き、ライブラリーをファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈで構築した［Barbas et al.,(１９９１)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８、７９７８−７９８２；Rader et al.,(１９９７)Curr.Opin.Biotechnol.８(４)、５０３−５０８］。ランダム化は、ＶＮＳコドンドーピング戦略(Ｖ＝アデニン、シトシンまたはグアニン、Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニンまたはチミン、Ｓ＝シトシンまたはグアニン)を用いることによりフィンガー２のαヘリックスの−１、１、２、３、５および６位を含んでいた。これにより各ランダム化アミノ酸位置について２４の可能性が生じ得、芳香族アミノ酸Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒ並びに停止コドンはこの戦略から排除された。ＬｅｕはＣｙｓ２−Ｈｉｓ２型の亜鉛フィンガードメインの認識ヘリックスの４位から専ら見出されるため、この位置はランダム化されなかった。ＥＲ２５３７細胞(ニューイングランド・バイオラボズ)へのライブラリーの形質転換後、ライブラリーは１.５×１０９の構成員を含んでいた。これは必要なライブラリーサイズを６０倍の割合で越えており、アミノ酸の全組み合わせを含むのに充分であった。
【００２２】
非ビオチニル化競合体ＤＮＡの存在下、１６の５'−ＧＡＴ−ＡＮＮ−ＧＣＧ−３'ビオチニル化ヘアピン標的オリゴヌクレオチドの各々にそれぞれ結合する亜鉛フィンガー‐ディスプレイファージの６ラウンドの選択を遂行した。ビオチニル化標的オリゴヌクレオチドの量を減らし、競合体オリゴヌクレオチド混合物の量を増やすことにより、選択のストリンジェンシーを各ラウンドで増加させた。第６ラウンドでは、標的濃度は通常１８ｎＭであり、５'−ＣＮＮ−３'、５'−ＧＮＮ−３'、および５'−ＴＮＮ−３'競合体混合物は各オリゴヌクレオチドプールについてそれぞれ５倍過剰であり、特異的５'−ＡＮＮ−３'混合物(標的配列を除く)は１０倍過剰であった。ストレプトアビジン‐被覆磁気ビーズへの捕獲により、ビオチニル化標的オリゴヌクレオチドに結合するファージを回収した。
【００２３】
第６ラウンドの選択後にクローンを普通に分析した。選択されたフィンガー‐２ヘリックスのアミノ酸配列を決定したところ、総じて−１および３位で良好な保存性を示し(図２)、これらの位置で以前に観察されたアミノ酸残基と一致していた［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］。３'ヌクレオチドがアデニンである場合−１位はＧｌｎであったが、Ｓｅｒが強く選択された５'−ＡＣＡ−３'(ＳＰＡ−Ｄ−ＬＴＮ)(配列番号７７)結合ドメインは例外であった。３'シトシンを含むトリプレットはＡｓｐ−１(例外は、５'−ＡＧＣ−３'および５'−ＡＴＣ−３'結合ドメインであった)を選択し、３'グアニンはＡｒｇ−１、および５'チミンはＴｈｒ−１およびＨｉｓ−１であった。また、Ｈｉｓ−１による３'チミンの認識は、５'−ＧＡＴ−３'(ＨＩＳ−Ｎ−ＦＣＲ)(配列番号７８)に結合するＴＫＫのフィンガー１で観察された［Fairall et al.,(１９９３)Nature(London)３６６(６４５４)、４８３−７］。中間アデニンの認識の場合、ＡｓｐおよびＴｈｒを認識ヘリックスの３位で選択した。中間シトシンへの結合については、Ａｓｐ３またはＴｈｒ３を選択し、中間グアニンについては、Ｈｉｓ３(例外は、５'−ＡＧＴ−３'の認識であり、これは非通常アミノ酸残基Ｈｉｓ−１故に異なる結合機構を有し得る)および中間チミンについてはＳｅｒ３およびＡｌａ３を選択した。ただし、また、５'−ＡＮＧ−３'サブサイトに結合するドメインは、フィンガー−１サブサイトにおける５'グアニンの相補的シトシンと接触することにより３−フィンガータンパク質の相互作用を安定化させると思われるＡｓｐ２を含むものとする。認識ヘリックスの５位においてはＡｒｇおよびＴｈｒが主に選択されたが、１、２および５位は可変であった。
【００２４】
最も興味深い観察結果は、３ｂｐサブサイトの５'ヌクレオチドへの結合を決定するαヘリックスの６位におけるアミノ酸残基の選択であった。５'グアニンの認識とは対照的に、直接塩基接触がヘリックスの６位にあるＡｒｇまたはＬｙｓにより達成される場合、５'位にある他のヌクレオチドについてのタンパク質／ＤＮＡ複合体における直接相互作用は全く観察されなかった［Elrod-Erickson et al.,(１９９６)Structure ４(１０)、１１７１−１１８０；Pavletich et al.、（１９９３）Science(Washington,D.C.,１８８３−)２６１(５１２９)、１７０１−７；Kim et al.,(１９９６)Nat Struct Biol ３(１１)、９４０−９４５；Fairall et al.,(１９９３)Nature(London)３６６(６４５４)、４８３−７；Houbaviy et al.,(１９９６)Proc Natl Acad Sci USA ９３(２４)、１３５７７−８２；Wuttke et al.,(１９９７)J Mol Biol ２７３(１)、１８３−２０６；Nolte et al.,(１９９８)Proc Natl Acad Sci USA ９５(６)、２９３８−２９４３］。５'−ＧＮＮ−３'型のフィンガー‐２サブサイトに対するドメインの選択により、５'グアニンと直接接触するＡｒｇ６のみを含むドメインが生成した［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］。しかしながら、５'−ＧＮＮ−３'亜鉛フィンガードメインについての結果とは異なり、５'−ＡＮＮ−３'型のフィンガー‐２サブサイトに対するファージディスプレイライブラリーの選択により、様々なアミノ酸残基：Ａｌａ６、Ａｒｇ６、Ａｓｎ６、Ａｓｐ６、Ｇｌｎ６、Ｇｌｕ６、Ｔｈｒ６またはＶａｌ６を含むドメインが同定された（図２）。さらに、５'−ＴＡＧ−３'を認識する一ドメインが、アミノ酸配列ＲＥＤ−Ｎ−ＬＨＴ(図３ｚ)(配列番号７１)を伴うこのライブラリーから選択された。Ｔｈｒ６はまた、Ｚｉｆ２６８／ＤＮＡ複合体では直接接触が全く観察されなかった５'−ＴＧＧ−３'に結合するＺｉｆ２６８(ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ)(配列番号７９)のフィンガー２に存在する。
【００２５】
Ｃ７.ＧＡＴのフィンガー‐２変異体を、マルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)との融合体として細菌発現ベクターへサブクローニングし、１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導によりタンパク質を発現させた(タンパク質(ｐ)は、それらが選択されたフィンガー‐２サブサイトの名称を与える)。５'−ＧＡＴ ＡＮＮ ＧＣＧ−３'型の１６フィンガー‐２サブサイトの各々に対する固相酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)によりタンパク質を試験して、それらのＤＮＡ結合特異性を調べた(図３、黒色棒線)。さらに、特異的標的オリゴヌクレオチドおよび中間トリプレットの５'ヌクレオチドのみが異なる３つのサブサイトへ亜鉛フィンガータンパク質を暴露することにより、５'−ヌクレオチド認識を分析した。例えば、ｐＡＡＡを、５'−ＡＡＡ−３'、５'−ＣＡＡ−３'、５'−ＧＡＡ−３'、および５'−ＴＡＡ−３'サブサイトについて試験した(図３、白色棒線)。試験した３−フィンガータンパク質の多くは、それらが選択されたフィンガー‐２サブサイトについての鋭敏なＤＮＡ結合特異性を示した。図２において四角で囲んだ、各セットの中で最も特異的なバインダーであると考えられているドメインの結合特性は、図３の上方パネルに表されており、試験した追加ドメイン(図２で星印が付されている)は図３の下方パネルに要約されている。例外は、そのＤＮＡ結合が弱すぎてＥＬＩＳＡにより検出され得ないｐＡＧＣおよびｐＡＴＣであった。３'シトシンおよび中間グアニンを特定化する予測通りのアミノ酸Ａｓｐ−１およびＨｉｓ３、および５'アデニンについてはいずれの場合にも選択されなかったＴｈｒ６を含むｐＡＧＣ(ＤＡＳ−Ｈ−ＬＨＴ)(配列番号８０)について最も有望なヘリックスを、検出可能なＤＮＡ結合を伴わずに分析した。
【００２６】
より大型のセットを分析するため、第６ラウンドの選択後、ｐＡＧＣについてのコーディング配列のプールを、プラスミドｐＭａｌへサブクローニングし、ＤＮＡ結合特異性について１８の個々のクローンを試験したところ、どれもＥＬＩＳＡにおいて測定可能なＤＮＡ結合性を示さなかった。ｐＡＴＣの場合、ＤＮＡ結合が全く検出され得ないＬｅｕ４〜Ｃｙｓ４突然変異を含む２つのヘリックス（ＲＲＳ−Ｓ−ＣＲＫおよびＲＲＳ−Ａ−ＣＲＲ）(配列番号８０、８１)が選択された。ファージディスプレイによりフィンガー‐２サブサイトと結合するタンパク質は全く生成されなかったため、合理的な設計を適用することによりこれらの５'−ＡＧＣ−３'または５'−ＡＴＣ−３'に結合するドメインを見出した。５'−ＧＧＣ−３'(ＥＲＳ−Ｋ−ＬＡＲ(配列番号８２)、ＤＰＧ−Ｈ−ＬＶＲ(配列番号８３))および５'−ＧＴＣ−３'(ＤＰＧ−Ａ−ＬＶＲ)(配列番号８４)に特異的に結合することが以前に立証された認識ヘリックスに基いてフィンガー‐２突然変異体を構築した［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］。ｐＡＧＣについては、単に５および６位を５'アデニン認識モチーフＲＡまたはＲＶ(図３ａ、３ｂおよび３ｉ)へ交換することにより、２つのタンパク質を構築した(ＥＲＳ−Ｋ−ＬＲＡ(配列番号８５)、ＤＰＧ−Ｈ−ＬＲＶ(配列番号８６))。これらのタンパク質のＤＮＡ結合は検出レベル未満であった。ｐＡＴＣの場合には、ＲＶモチーフ(図３ｂ)を含む２つのフィンガー‐２突然変異体(図３ｂ)を構築した(ＤＰＧ−Ａ−ＬＲＶ(配列番号８７)、ＤＰＧ−Ｓ−ＬＲＶ(配列番号８８))。３位がＡＬａまたはＳｅｒであるかどうかとは関係無く両タンパク質とも非常に低い親和力でＤＮＡと結合した。
【００２７】
ＥＬＩＳＡによる１６のフィンガー‐２サブサイトについての３−フィンガータンパク質の分析結果は、フィンガー‐２ドメインの中には、それらを選択させなかった標的に最もよく結合するものもあることを示した。第１に、５'−ＡＧＡ−３'について主に選択されたヘリックスはＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＮ(配列番号６３)であり、これは、事実、５'−ＡＧＧ−３'と結合した(図３ｒ)。これは、−１位にあるＡｒｇにより説明され得る。さらに、このタンパク質は、主に選択されたヘリックスｐＡＧＧ(ＲＳＤ−Ｈ−ＬＡＥ(配列番号５５)；図３ｊ)と比べて５'アデニンの明白な相違を示した。第２に、５'−ＡＡＧ−３'(ＲＳＤ−Ｎ−ＬＫＮ(配列番号６１)；図３ｐ)に特異的に結合するヘリックスは、５'−ＡＡＣ−３'(図２)に対して実際に選択され、そして５'−ＡＡＧ−３'セットで選択されていた、ｐＡＡＧ(ＲＳＤ−Ｔ−ＬＳＮ(配列番号４８)；図３ｃ)よりもフィンガー‐２サブサイト５'−ＡＡＧ−３'に特異的に結合した。さらに、５'−ＡＮＧ−３'型の標的部位へ指向したタンパク質は、ｐＡＧＧ(図３ｊおよび３ｒ)を除き、５'−ＡＮＧ−３'型の４つの全標的部位と交差反応性を示した。またｐＡＡＧ(ＲＳＤ−Ｎ−ＬＫＮ(配列番号６１)；図３ｐ)は弱い交差反応性しかもたないため、中間プリンの認識は、中間ピリミジンの場合よりも限定的であると思われる。
【００２８】
比較すると、タンパク質ｐＡＣＧ(ＲＴＤ−Ｔ−ＬＲＤ(配列番号５２)；図３ｇ)およびｐＡＴＧ(ＲＲＤ−Ａ−ＬＮＶ(配列番号５８)；図３ｍ)は、全５'−ＡＮＧ−３'サブサイトとの交差反応性を示す。中間ピリミジンの認識は、５'−ＧＮＧ−３'配列に結合するドメインについての以前の試験では困難であると報告されている［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３；Dreier et al.,(２０００)J.Mol.Biol.３０３、４８９−５０２］。中間ヌクレオチドの認識を改善するため、３位に異なるアミノ酸残基を含むフィンガー‐２突然変異体を位置指定突然変異導入により生成した。ｐＡＡＧ(ＲＳＤ−Ｔ−ＬＳＮ(配列番号４８)；図３ｃ)の結合は、Ｔｈｒ３〜Ａｓｎ３突然変異後中間アデニンについてはより特異的であった(図３ｏ)。５'−ＡＴＧ−３'(ＳＲＤ−Ａ−ＬＮＶ(配列番号５８)；図３ｍ)への結合は、Ａｌａ３〜Ｇｌｎ３の単一アミノ酸交換により改善され(図３ｗ)、ｐＡＣＧ(ＲＳＤ−Ｔ−ＬＲＤ(配列番号５２)；図３ｇ)についてのＴｈｒ３〜Ａｓｐ３またはＧｌｎ３突然変異により、ＤＮＡ結合は破壊された。さらに、認識ヘリックスｐＡＧＴ(ＨＲＴ−Ｔ−ＬＬＮ(配列番号５６)；図３ｋ)は、Ｌｅｕ５〜Ｔｈｒ５置換により低減化される(図３ｓ)中間ヌクレオチドについての交差反応性を示した。驚くべきことに、中間ヌクレオチドについての識別が改善されることに伴い、５'アデニンの認識についての特異性がある程度失われることが多かった(図３ｏ〜３ｐ、３ｍ〜３ｗ、３ｋ〜３ｓ比較)。
【００２９】
３−フィンガータンパク質Ｃ７に基いた前記フィンガー‐２ライブラリー［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］からの５'アデニンまたはシトシンを含むサブサイトに結合する亜鉛フィンガードメインの選択は、フィンガー‐２サブサイトの５'位の相補的ヌクレオチドへ交差サブサイト接触させるフィンガー３の２位にあるアスパラギン酸による制限故に(図１)亜鉛フィンガードメインの選択について適切ではなかった。我々は、Ａｓｐ２を欠くドメインとフィンガー３を交換することによりこの接触を排除した。Ｃ７.ＧＡＴのフィンガー２をランダム化し、ファージディスプレイライブラリーを構築した。たいていの場合、５'−ＡＮＮ−３'型のフィンガー‐２サブサイトに結合する新規３−フィンガータンパク質が選択された。サブサイト５'−ＡＧＣ−３'および５'−ＡＴＣ−３'について、堅固なバインダーは同定されなかった。Ｃ７に基くファージディスプレイライブラリーから以前に選択されたサブサイト５'−ＧＧＣ−３'および５'−ＧＴＣ−３'に結合するドメインは、それらの標的部位への優れたＤＮＡ結合特異性および４０ｎＭの親和力を示したため［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］、これは予想外であった。一つの単純な説明は、芳香族アミノ酸残基を含まないＶＮＳコドンの使用による限定的ランダム化戦略である。５'−ＧＮＮ−３'サブサイトに結合するドメインについては、ランダム化戦略に含まれるとしても芳香族アミノ酸残基は選択されないため、これらはライブラリーには含まれなかった［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］。しかしながら、芳香族残基を含む亜鉛フィンガードメイン、例えばＣＦII２(ＶＫＤ−Ｙ−ＬＴＫ(配列番号８９);[Gogos et al.,(１９９６)PNAS ９３、２１５９−２１６４])のフィンガー２、ＴＦIIIＡ(ＫＮＷ−Ｋ−ＬＱＡ(配列番号９０);[Wuttke et al.,(１９９７)J Mol Biol ２７３(１)、１８３−２０６])のフィンガー１、ＴＴＫ(ＨＩＳ−Ｎ−ＦＣＲ(配列番号７８)[Fairall et al.,(１９９３)Nature(London)３６６(６４５４)、４８３−７])のフィンガー１およびＧＬＩ(ＡＱＹ−Ｍ−ＬＶＶ(配列番号９１);[Pavletich et al.、（１９９３）Science(Washington,D.C.,１８８３−)２６１(５１２９)、１７０１−７])のフィンガー２がこれまでに報告されている。芳香族アミノ酸残基は、サブサイト５'−ＡＧＣ−３'および５'−ＡＴＣ−３'の認識にとって重要であり得る。
【００３０】
近年、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガードメインの認識ヘリックスは、最適な結合を達成するためにＤＮＡに対し異なる配向を採り得ることが明白になってきた［Pabo et al.,(２０００)J.Mol.Biol.３０１、５９７−６２４］。しかしながら、この領域におけるヘリックスの配向は、亜鉛イオン、Ｈｉｓ７およびリン酸バックボーンを巻き込む頻繁に観察される相互作用により部分的に制限され得る。さらに、タンパク質／ＤＮＡ複合体における相互作用の結合特性を比較したところ、６位のＣ−α原子は通常ＤＮＡサブサイトにおける５'ヌクレオチドの最も近い重原子から８.８±０.８オングストローム離れており、これはＡｒｇ６またはＬｙｓ６による５'グアニンの認識にのみ有利であるという結論に達した［Pabo et al.,(２０００)J.Mol.Biol.３０１、５９７−６２４］。現在までのところ、他の６位残基とグアニン以外の塩基との相互作用は、タンパク質／ＤＮＡ複合体からは全く観察されていない。例えば、ＹＹ１(ＱＳＴ−Ｎ−ＬＫＳ)(配列番号９２)のフィンガー４は、５'−ＣＡＡ−３'を認識するが、Ｓｅｒ６および５'シトシン間において接触は全く観察されなかった［Houbaviy et al.,(１９９６)Proc Natl Acad Sci USA ９３(２４)、１３５７７−８２］。さらに、５'−ＡＴＴ−３'を認識する、ＹＹ１（ＬＤＦ−Ｎ−ＬＲＴ）(配列番号９３)のフィンガー３、および５'−Ｔ／ＧＧＧ−３'を特定化する、Ｚｉｆ２６８（ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ）(配列番号７９)のフィンガー２におけるＴｈｒ６の場合、５'ヌクレオチドとの接触は全く観察されなかった[Houbaviy et al.,(１９９６)Proc Natl Acad Sci USA ９３(２４)、１３５７７−８２；Elrod-Erickson et al.,(１９９６)Structure ４(１０)、１１７１−１１８０]。最後に、サブサイト５'−ＡＡＧ−３'に結合するトラムトラック(ＲＫＤ−Ｎ−ＭＴＡ)(配列番号９４)のフィンガー２のＡｌａ６は、５'アデニンとは接触しない［Fairall et al.,(１９９３)Nature(London)３６６(６４５４)、４８３−７］。
【００３１】
異なる状況で５'グアニンと有効に結合することが立証されている［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］、アミノ酸残基Ａｌａ６、Ｖａｌ６、Ａｓｎ６およびＡｒｇ６までが、５'−ＡＮＮ−３'型（図２）のＤＮＡサブサイトについてのＣ７.ＧＡＴライブラリーから主に選択された。さらに、６位は、フィンガー‐２標的部位によりＴｈｒ、ＧｌｕおよびＡｓｐとして選択された。これは、近接フィンガーの位置がランダム化された他のグループによる初期の試験と一致する［Jamieson et al.,(１９９６)Proc Natl Acad Sci USA ９３、１２８３４−１２８３９；Isalan et al.,(１９９８)Biochemistry ３７(３５)、１２０２６−１２０３３］。ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングの結果、５'アデニンの認識について、アミノ酸残基Ａｌａではなく、同Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＧｌｕおよびＬｅｕ、並びにＧｌｙ、ＳｅｒおよびＡｒｇが選択された。さらに、逐次ファージディスプレイ選択戦略を用いることにより、５'−ＡＮＮ−３'サブサイトに結合する幾つかのドメインを同定し、標的部位選択により特異性を評価した。ヘリックスの６位におけるＡｒｇ、ＡｌａおよびＴｈｒは、主に５'アデニンを認識することが立証された［Wolfe et al.,(１９９９)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.３、１８３−２１２］。
【００３２】
さらに、サブサイト５'−ＡＡＡ−３'に結合するＧｆｉ−１(ＱＳＳ−Ｎ−ＬＩＴ)(配列番号９５)のフィンガー５についての標的部位選択により示されている通り［Zweidler‐McKay et al.,(１９９６)Mol.Cell.Biol.１６(８)、４０２４−４０３４］Ｔｈｒ６は５'アデニンを特定化する。これらの例は、本結果を含め、６位アミノ酸残基および５'アデニン間には、それらが頻繁に選択されることから、ある関係が存在すると考えられることを示している。これは、グアニン以外の５'ヌクレオチドと＿‐ヘリックスの６位の相互作用を決して示さなかった、結晶学試験から得られたデータと一致しない。一つの単純な説明としては、短いアミノ酸残基、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｓｎは、５'−ＡＮＮ−３'サブサイトを認識するドメインの結合方式における立体障害ではないことがあり得る。これは、５'−Ｇ／ＡＴＡ−３'サブサイトに結合するヘリックス(ＱＲＳ−Ａ−ＬＴＶ)(配列番号９６)についての６位における位置指定突然変異導入により集められた結果により立証されている［Gogos et al.,(１９９６)PNAS ９３、２１５９−２１６４］。本明細書記載のドメインについても見出される、Ｖａｌ６をＡｌａ６と置換しても、結合特異性または親和力には全く影響が無かった。
【００３３】
コンピューターモデリングを用いることにより、５'アデニンと頻繁に選択されるＡｌａ６、Ａｓｎ６およびＡｒｇ６の可能な相互作用を調べた。５'アデニンと５'−ＡＡＡ−３'(ＱＲＡ−Ｎ−ＬＲＡ；図３ａ)(配列番号４６)に結合するヘリックスにおけるＡｌａ６からの相互作用の分析は、Ｚｉｆ２６８変異体からのフィンガー１(ＱＳＧ−Ｓ−ＬＴＲ)(配列番号９７)のタンパク質／ＤＮＡ複合体の座標に基いていた。ＱＲＡ−Ｎ−ＬＲＡ(配列番号９８)のＧｌｎ−１およびＡｓｎ３が規定の方法でそれらの各アデニン塩基と水素結合する場合、これらの相互作用により、Ａｌａ６のメチル基および５'アデニン間の約８オングストロームおよびＡｌａ６のメチル基およびアデニンと塩基対合したチミン間の１１オングストロームを越える距離が当然固定されることから、直接的接触はＶａｌ６およびＴｈｒ６については提案され得ないことも示唆されている。
【００３４】
興味深いことに、α‐ヘリックスの６位にある短いアミノ酸による５'特異性の予測される欠如は、結合データにより部分的に立証されているに過ぎない。ヘリックス、例えばＲＲＤ−Ａ−ＬＮＶ(配列番号５８)(図３ｍ)およびＣ７.ＧＡＴのフィンガー‐２ヘリックスＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ(配列番号５)は、事実、本質的には５'特異性を示さなかった。しかしながら、ヘリックスＤＳＧ−Ｎ−ＬＲＶ(配列番号４７)(図３ｂ)は、５'アデニンについて卓越した特異性を示し、ＴＳＨ−Ｇ−ＬＴＴ(配列番号７０)(図３ｙ)は５'アデニンまたはグアニンについて特異的であった。短い６位残基を伴う他のヘリックスは、様々な程度の５'特異性を示しており、唯一明らかに一貫しているのは５'チミンが通常は排除されていることであった(図３)。６位残基が特異性に直接寄与し得るとは考えられないため、観察された結合パターンは別の供給源から誘導されるはずである。可能性としては、局在する配列特異的ＤＮＡ構造および近隣ドメインからの重複する相互作用が含まれる。しかしながら、フィンガー３の２位の残基(近隣部位と接触するのを観察されることが多い)は、親タンパク質Ｃ７.ＧＡＴにおけるグリシンであるため、および５'チミンは上述の２つのヘリックスにより排除されなかったため、後者の可能性は不都合である。
【００３５】
アスパラギンはまた６位で選択されることが多かった。ヘリックスＨＲＴ−Ｔ−ＬＴＮ(配列番号５６)(図３ｋ)およびＲＳＤ−Ｔ−ＬＳＮ(配列番号４８)(図３ｃ)は、５'アデニンについて卓越した特異性を示した。しかしながら、Ａｓｎ６はまた、アデニンおよびグアニンの両方についての特異性を付与すると思われ(図３ｎ、３ｐおよび３ｒ)、両ヌクレオチドに共通したＮ７との相互作用が示唆された。Ｚｉｆ２６８／ＤＮＡ結晶構造(ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ(配列番号７９);[Elrod-Erickson et al.,(１９９６)Structure ４(１０)、１１７１−１１８０])において、５'−ＴＧＧ−３'に結合する、フィンガー２の座標に基いた、５'−ＡＧＧ−３'(ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＮ(配列番号９０);図３ｒ)に結合するヘリックスのコンピューターモデリングは、Ａｓｎ６のＮ−δが５'アデニンのＮ７から約４.５オングストロームであることを示唆していた。規定のドッキング配向の範囲内で考えられる＿‐ヘリックスの適度の再配向により［Pabo et al.,(２０００)J.Mol.Biol.３０１、５９７−６２４］、アルギニンではなくグルタメートが−１位に現れるときに観察される再配向と同様に、水素結合間隔内にＮ−δが妥当と思われる状態で導かれ得る。しかしながら、Ａｓｎ６がこの５'−ＡＮＮ−３'認識セットで選択され、さらに長いＧｌｎ６が選択されなかった理由を推測するのは興味深いことである。Ｇｌｎ６は、さらに可変性であり、ファージディスプレイ中に選択された他の相互作用を安定化させ得た可能性がある。別法として、Ａｓｎ６の短い方の側鎖は、ヘリックスの再配向を伴わずに５'ヌクレオチドと接触し得る規則正しい水分子を適応させ得る。
【００３６】
考えるべき最後の残基はＡｒｇ６である。我々の以前の試験では、高い特異性で５'グアニンを認識するものとして異議なく選択されていたため［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］、Ａｒｇ６が５'−ＡＮＮ−３'標的で非常に頻繁に選択されることは幾分驚くべきことであった。しかしながら、最近の試験では、場合によっては５'グアニンの認識に加えて（図３ｔおよびｕ）、Ａｒｇ６は主として５'アデニンを特定化した（図３ｅ、ｆ、ｈおよびｖ）。５'−ＧＣＡ−３'に結合するＺｉｆ２６８変異体のフィンガー１ ＱＳＧ−Ｓ−ＬＴＲ(配列番号９８)の座標に基いた[Elrod-Erickson et al.,(１９９８)Structure ６(４)、４５１−４６４]、５'−ＡＣＡ−３'(ＳＰＡ−Ｄ−ＬＴＲ(配列番号５０);図３ｅ)に結合するヘリックスのコンピューターモデリングは、Ａｒｇ６が、５'アデニンと塩基対合したチミンのＯ４との交差鎖水素結合を可能にする立体配座を容易に採り得ることを示唆していた。事実、Ａｒｇ６は、チミンのＯ４および中間シトシンと塩基対合したグアニンのＯ６の両方と良好な結合構造で結合し得る。かかる相互作用は、標的配列が５'−ＡＣＮ−３'であるときＡｒｇ６がほぼ異議なく選択されたという事実と一致する。アルギニンが多重相互作用を促進するという予想は避けられない。ＴＦIIIＡにおける幾つかのリシンは、立体配座的に可変性であることがＮＭＲにより観察されており[Foster et al.,(１９９７)Nat.Struct.Biol.４(８)、６０５−６０８]、Ｇｌｎ−１は可変性を示唆する方法で行動する［Dreier et al.,(２０００)J.Mol.Biol. ３０３、４８９−５０２］。アルギニンは、リシンまたはグルタミンよりも回転可能な結合および高い水素結合ポテンシャルを有し、Ａｒｇ６が５'グアニンの認識に限定されないという予測は興味を引くものである。
【００３７】
−１および３位のアミノ酸残基は、２つの例外があるにせよそれらの５'−ＧＮＮ−３'対応物質と類似した形で一般的に選択された。Ｈｉｓ−１はｐＡＧＴおよびｐＡＴＴについて選択され、３'チミンを認識し(図３ｋ、３ｎおよび３ｙ)、Ｓｅｒ−１はｐＡＣＡについて選択され、３'アデニンを認識した(図３ｅおよび３ｔ)。Ｇｌｎ−１は５'ＧＮＮ−３'型のサブサイトにおける３'アデニンを特定化するのに使用されることが多く、３'アデニン認識の新たな構成要素は、３'アデニンと水素結合を形成し得る５'−ＡＣＡ−３'サブサイトを認識するドメイン(図２)について選択されるＳｅｒ−１を含むことがこの試験から示唆された。コンピューターモデリングは、ヘリックスＳＰＡ−Ｄ−ＬＴＲ(配列番号５０)(図３ｅ)で共に選択されたＡｌａ２が、潜在的に３'アデニンと塩基対合したチミンのメチル基とのファンデルワールス接触をもち得ることを立証している。Ａｌａ２が含まれ得るということの最善の証拠は、ヘリックスＳＰＡ−Ｄ−ＬＴＲ(配列番号５０)(図３ｅ)が３'アデニンに強い特異性を示し、ＳＨＳ−Ｄ−ＬＶＲ(配列番号６５)(図３ｔ)は示さないことである。Ｇｌｎ−１は３'アデニン認識に充分であることが多い。しかしながら、我々の以前の試験から得たデータは、Ｇｌｎ−１の側鎖が、例えば３'チミンの認識を可能にする多重立体配座を採り得ることを示唆していた[Nardelli et al.,(１９９２)Nucleic Acids Res. ２０(１６)、４１３７−４４；Elrod-Erickson et al.,(１９９８)Structure ６(４)、４５１−４６４；Dreier et al.,(２０００)J.Mol.Biol. ３０３、４８９−５０２]。Ｓｅｒ−１と組合わせたＡｌａ２は、３'アデニンを特定化する代替的手段であり得る。
【００３８】
５'−ＧＮＮ−３'試験では観察されない別の相互作用は、Ｈｉｓ−１および２位の残基による３'チミンの協同的認識である。トラムトラック／ＤＮＡ複合体の結晶構造のフィンガー１では、ヘリックスＨＩＳ−Ｎ−ＦＣＲ(配列番号９９)は、サブサイト５'−ＧＡＴ−３'に結合する［Fairall et al.,(１９９３)Nature(London)３６６(６４５４)、４８３−７］。Ｈｉｓ−１環は、３'チミン塩基の面と垂直であり、メチル基から約４オングストロームである。Ｓｅｒ２はさらに３'チミンのＯ４と水素結合をなす。類似した一連の接触は、ヘリックスＨＫＮ−Ａ−ＬＱＮ(配列番号１００)(図３ｎ)による５'−ＡＴＴ−３'の認識についてのコンピューターモデリングにより予見され得る。このヘリックスにおけるＡｓｎ２は、３'チミンとだけでなく、チミンと塩基対合したアデニンとも水素結合する可能性を有する。Ｈｉｓ−１はまた、Ｔｈｒ２と組合わせて５'−ＡＧＴ−３'(ＨＲＴ−Ｔ−ＬＬＮ(配列番号９８);図３ｋ)と結合するヘリックスについても見出された。ＴｈｒはＳｅｒと構造的に類似しており、類似した認識機構に関与し得る。
【００３９】
結論として、５'−ＡＮＮ−３' ＤＮＡサブサイトと結合するこの試験で報告された亜鉛フィンガードメインの特性確認の結果は、普遍的認識コードは存在しないという全般的見解と一致しており、そのため追加ドメインの合理的設計が困難となっている。しかしながら、ファージディスプレイ選択が適用され得、予め特定された亜鉛フィンガードメインは人工的転写因子を構築するためのモジュールとしての役割を果たし得る。ここで特性確認されたドメインは、５'−(ＧＮＮ)６−３'以外のＤＮＡ配列のターゲッティングを可能にする。Ｇ／Ｃ濃厚配列は細胞タンパク質についての結合部位を含むことが多く、５'(ＧＮＮ)６−３'配列は必ずしも全プロモーターからは見出され得ないため、これは既存ドメインへの重要な補足である。
【００４０】
II．ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび形質転換細胞
本発明は、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を包含する。本発明の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列は、天然、切頭化および拡張されたポリペプチドを含め、幾つかの方法により入手され得る。例えば、ＤＮＡは、当業界で公知のハイブリダイゼーション手順を用いて単離され得る。これらには、(１)共有ヌクレオチド配列を検出するためのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーとプローブのハイブリダイゼーション、(２)共有的構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、および(３)ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)による合成があるが、限定されるわけではない。本発明のＲＮＡ配列は、当業界で公知の方法により入手され得る（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel,et al．編(１９８９)参照）。
【００４１】
本発明の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドをコード化する特異的ＤＮＡの開発は、(１)ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、(２)ＤＮＡ配列の化学的製造による、興味の対象であるポリペプチドに必要なコドンの提供、および(３)真核生物ドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のインビトロ合成により達成され得る。後者の場合、結局はｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が形成され、これは一般にｃＤＮＡと称される。組換え技法で使用するための特異的ＤＮＡ配列を開発するこれら３方法のうち、ゲノムＤＮＡの単離が最も稀である。イントロンの存在故に哺乳類ポリペプチドの微生物発現の達成が望まれる場合、これは特に当てはまる。
【００４２】
亜鉛フィンガー誘導ＤＮＡ結合ポリペプチドを得るには、所望のポリペプチド生成物のアミノ酸残基の全配列が既知である場合、ＤＮＡ配列の合成は、選抜きの方法であることが多い。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が既知ではないとき、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であり、選抜きの方法はｃＤＮＡ配列の形成である。興味の対象であるｃＤＮＡ配列を単離する標準的手順には、高レベルの遺伝子発現を呈するドナー細胞で豊富にあるｍＲＮＡの逆転写から誘導されるプラスミド担持ｃＤＮＡライブラリーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組合わせて使用するとき、稀な発現産物でもクローンであり得る。ポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が既知である場合、標的ｃＤＮＡに存在すると推定される配列を複製する標識一本または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の製造は、一本鎖形態へ変性されたｃＤＮＡのクローン化コピーで実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション手順で使用され得る(Jay et al.,Nucleic Acid Research １１：２３２５、１９８３)。
【００４３】
この発明のポリペプチドは、１個またはそれ以上の機能的ペプチドに機能し得るように結合され得る。上記機能的ペプチドは当業界では公知であり、転写調節因子、例えばリプレッサーまたは活性化ドメインまたは他の機能を有するペプチドであり得る。具体例としての好ましい上記機能的ペプチドは、ヌクレアーゼ、メチラーゼ、核局在化ドメイン、および制限酵素、例えばエンド‐またはエクトヌクレアーゼである（例えば、ChandrasegaranおよびSmith、Biol.Chem.,３８０：８４１−８４８(１９９９)参照）。
【００４４】
具体例としての抑制(リプレッション)ドメインペプチドは、ｅｔｓ２リプレッサー因子(ＥＲＦ)のアミノ酸４７３〜５３０により特定された、ＥＲＦリプレッサードメイン(ＥＲＤ)(Sgouras,D.N.,Athanasiou,M.A.,Beal,G.J.,Jr.,Fisher,R.J.,Blair,D.G.および Mavrothalassitis,G.J.(１９９５)EMBO J.１４、４７８１−４７９３)である。このドメインは、ｅｔｓファミリーの転写因子の活性に対するＥＲＦの拮抗作用を伝達する。合成リプレッサーは、亜鉛フィンガータンパク質のＮ−またはＣ−末端へのこのドメインの融合により構築される。第２リプレッサータンパク質は、クルッペル関連ボックス(ＫＲＡＢ)ドメインを用いて製造される(Margolin,J.F.,Friedman,J.R.,Meyer,W.,K.-H.,Vissing,H.,Thiesen,H.-J.および Rauscher III,F.J.(１９９４)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１、４５０９−４５１３)。このリプレッサードメインは、一般に亜鉛フィンガータンパク質のＮ−末端で見出され、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１(Friedman,J.R.，Fredericks,W.J.,Jensen,D.E.,Speicher,D.W.,Huang,X.-P.,Neilson,E.G. & Rauscher III,F.J.(１９９６)Genes & Dev.１０、２０６７−２０７８)との相互作用により、距離‐および配向‐非依存的方法でＴＡＴＡ依存的転写に対しその抑制活性を発揮すると思われる(Pengue,G. & Lania,L.(１９９６)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９３、１０１５−１０２０)。我々は、亜鉛フィンガータンパク質ＫＯＸ１(Margolin,J.F.,Friedman,J.R.,Meyer,W.,K.-H.,Vissing,H.,Thiesen,H.-J.および Rauscher III,F.J.(１９９４)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１、４５０９−４５１３)のアミノ酸１および９７間に見出されるＫＲＡＢドメインを使用した。この場合、亜鉛フィンガーポリペプチドとのＮ−末端融合を構築する。最後に、抑制についてのヒストン脱アセチル化の有用性を調査するため、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン(ＳＩＤ)のアミノ酸１〜３６を、亜鉛フィンガータンパク質のＮ−末端に融合させる(Ayer,D.E.,Laherty,C.D.,Lawrence,Q.A.,Armstrong,A.P. & Eisenman,R.N.(１９９６)Mol.Cell.Biol.１６、５７７２−５７８１)。この小ドメインは、転写因子ＭａｄのＮ−末端で見出され、ｍＳＩＮ３との相互作用によるその転写抑制の伝達に関与し、これは次に共リプレッサーＮ−ＣｏＲおよびヒストンデアセチラーゼｍＲＰＤ１と相互作用する（Heinzel,T.,Lavinsky,R.M.,Mullen,T.-M.,Ssderstrsm,M.,Laherty,C.D.,Torchia,J.,Yang,W.-M.,Brard,G.,Ngo,S.D. & al.,e.(１９９７)Nature ３８７、４３−４６）。遺伝子特異的活性化を調べるため、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質(Sadowski,I.,Ma,J.,Triezenberg,S. & Ptashne,M.(１９８８)Nature ３３５、５６３−５６４)のアミノ酸４１３〜４８９、またはＶＰ６４と称される、ＶＰ１６の最小活性化ドメイン(Seipel,K.,Georgiev,O. & Schaffner,W.(１９９２)EMBO J.１１、４９６１−４９６８)の人工的四量体反復配列に亜鉛フィンガーポリペプチドを融合することにより、転写アクチベーターを生成する。
【００４５】
III．医薬組成物
別の態様において、本発明は、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドの治療有効量または亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の治療有効量を医薬上許容される担体と組合わせて含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
本明細書で使用されている「医薬上許容される」、「生理学的に許容される」の語およびそれらの文法的変形は、それらを組成物、担体、希釈剤および試薬についていう場合、互換的に使用され、組成物の投与を禁じる程度である望ましくない生理学的作用、例えば悪心、めまい、胃の不調などを生じること無くそれらの物質がヒトに投与できることを表す。
【００４７】
有効成分を溶解または分散した状態で含む薬理学的組成物の製造は当業界では充分に理解されている。典型的には、上記組成物は、滅菌注射可能物質として液体溶液または懸濁液として製造されるが、しかしながら、使用前に液体中で溶液または懸濁液とするのに適切な水性または非水性固体形態も製造され得る。調製物はまた乳化され得る。
【００４８】
有効成分は、医薬上許容され、有効成分と適合し得る賦形剤と本明細書記載の治療方法での使用に適切な量で混合され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどおよびそれらの組み合わせである。さらに、所望ならば、組成物は、有効成分の有効性を高めるごく少量の補助物質、例えば湿潤または乳化剤、並びにｐＨ緩衝剤などを含み得る。
【００４９】
本発明の治療用医薬組成物は、その中にある成分の医薬上許容される塩類を含み得る。医薬上許容される塩類は、無機酸、例えば塩酸またはリン酸、または有機酸、例えば酢酸、酒石酸、マンデル酸などにより形成される酸付加塩類(ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される)を包含する。遊離カルボキシル基により形成される塩類はまた、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄水酸化物、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。
【００５０】
生理学的に許容される担体は当業界では公知である。液体担体の例としては、有効成分および水以外の物質を含まないか、または緩衝液、例えば生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理食塩水またはその両方、例えばリン酸緩衝食塩水を含む滅菌水溶液がある。さらになお、水性担体は、複数の緩衝塩、並びに塩類、例えば塩化ナトリウムおよびカリウム、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含み得る。液体組成物はまた、水に加えておよび水を除いて液相を含み得る。上記の追加的液相の例には、グリセリン、植物油、例えば綿実油、有機エステル類、例えばエチルオレエート、および水‐油エマルジョンがある。
【００５１】
IV.用途
一態様において、本発明方法は、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の発現を変調(阻害または抑制)する方法であって、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合モチーフを、モチーフに結合する亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドの有効量と接触させる工程を含む方法を包含する。ヌクレオチド配列がプロモーターである場合、この方法では、亜鉛フィンガー‐ＤＮＡ結合モチーフを含むプロモーターの転写活性化(トランスアクチベーション)を阻害する。「阻害する」の語は、例えば、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合モチーフを含む、プロモーターへ機能し得るように結合された構造遺伝子の転写活性化レベルの抑制をいう。さらに、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体は、構造遺伝子内またはＲＮＡ配列内のモチーフと結合し得る。
【００５２】
「有効量」の語は、以前に活性化されたプロモーターの非活性化をもたらす量または亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターの不活化をまねく量、または構造遺伝子の転写またはＲＮＡの翻訳を遮断する量を包含する。必要とされる亜鉛フィンガー誘導ヌクレオチド結合ポリペプチドの量は、既存のタンパク質／プロモーター複合体における天然亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合タンパク質を置換するのに必要な量、または天然亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合タンパク質と競合してプロモーター自体との複合体を形成するのに必要な量である。同様に、構造遺伝子またはＲＮＡを遮断するのに必要とされる量は、それぞれ、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、遺伝子での読み過ごしからそれを遮断する量または翻訳を阻害する量である。好ましくは、この方法は細胞内で遂行される。プロモーターまたは構造遺伝子を機能的に不活化することにより、転写または翻訳が抑制される。亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合タンパク質モチーフを含む細胞ヌクレオチド配列と結合するかまたは「接触する」ための阻害タンパク質の有効量の送達は、本明細書記載の機構の一つ、例えばレトロウイルスベクターまたはリポソーム、または当業界で公知の他の方法により達成され得る。
【００５３】
「変調する」の語は、機能の抑制、促進または誘導をいう。例えば、本発明の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドは、プロモーター内のモチーフへ結合することによりプロモーター配列を変調し、それによってプロモーターヌクレオチド配列に機能し得るように結合された遺伝子の転写を促進または抑制し得る。別法として、変調は遺伝子の転写の阻害を包含し得、その場合、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドが構造遺伝子に結合し、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を読み過ごしするのを遮断することにより、遺伝子の転写が阻害される。構造遺伝子は、正常な細胞性遺伝子または例えば癌遺伝子であり得る。別法として、変調は、転写物の翻訳の阻害を含み得る。
【００５４】
遺伝子のプロモーター領域は、典型的には構造遺伝子に対し５'に存する調節エレメントを包含する。遺伝子を活性化すべき場合、転写因子として知られているタンパク質は、遺伝子のプロモーター領域に結合する。この組合わせは、酵素にＤＮＡからＲＮＡへと第２遺伝子セグメントを転写させ得ることによる「オンスイッチ」と似ている。たいていの場合、生成したＲＮＡ分子は、特異的タンパク質合成用の鋳型としての役割を果たし、ＲＮＡ自体が最終生成物となる場合もある。
【００５５】
プロモーター領域は、正常な細胞性プロモーターまたは例えばオンコ‐プロモーターであり得る。オンコ‐プロモーターは、一般的にウイルス由来のプロモーターである。例えば、レトロウイルスの長末端反復(ＬＴＲ)は、本発明の亜鉛フィンガー結合ポリペプチド変異型についての標的であり得るプロモーター領域である。例えばヒトＴ細胞向性ウイルス(ＨＴＬＶ)１および２、またはヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)１または２といった病原体を含む、レトロウイルス群のメンバーからのプロモーターは、本発明の亜鉛フィンガー結合ポリペプチドにより転写変調についてターゲッティングされ得るウイルスプロモーター領域の例である。
【００５６】
５'−ＡＮＮ−３'ＤＮＡ配列に特異的に結合する本明細書記載のドメインが上記人工的転写因子の構築に適切であるか否かを調べるため、様々な数の５'−ＡＮＮ−３'ドメインを含む４種のの６−フィンガータンパク質を組立てた。６−フィンガータンパク質の各々について、Ｓｐ１Ｃフレームワークを用いるＰＣＲオーバーラップ拡張により２種の３フィンガーコーディング領域を生成した[Beerli et al.,(１９９８)Proc Natl Acad Sci USA ９５(２５)、１４６２８−１４６３３]。次いで、これらの３−フィンガータンパク質を融合することにより、制限部位を介して６−フィンガータンパク質を作製し(図４ａ)、ＤＮＡ結合特異性および親和力を分析するため細菌性発現ベクターｐＭａｌへクローン化した。第一に、完全に５'−ＧＮＮ−３'トリプレットを含まない、不定の１８ｂｐ標的部位５'−ＡＴＧ−ＴＡＧ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＣＣ−ＡＧＧ−３'を認識するよう設計された、６−フィンガータンパク質ｐＡａｒｔを構築した。第二に、５'−ＧＮＮ−３'および５'−ＡＮＮ−３'ドメインの両方を含む３種の６−フィンガータンパク質を構築した。以前我々が、内在性遺伝子の調節は、５'−(ＧＮＮ)６−３' ＤＮＡ配列に結合している、６−フィンガータンパク質ｐＥ２ＣまたはｐＥ３によりそれぞれ特異的に達成されることを示したｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３遺伝子の充分に特性確認されたモデル[Beerli et al.,(２０００)Proc Natl Acad Sci USA ９７(４)、１４９５−１５００；Beerli et al.,(２０００)J.Biol.Chem.２７５(４２)、３２６１７−３２６２７]を試験用に選択した。
【００５７】
ｅｒｂＢ−２遺伝子の５'非翻訳領域(ＵＴＲ)の−１６８〜−１５１位にある標的部位５'−ＡＣＣ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＧＧＡ−３'(配列番号１０１)に結合する６−フィンガータンパク質ｐＥ２Ｘを構築した(図４ａ)。さらに、ｅｒｂＢ−３遺伝子の５'ＵＴＲで結合している２種のタンパク質を生成した。タンパク質ｐＥ３Ｙは、５'ＵＴＲの−９４〜−１１１位にある標的部位５'−ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ−３'(配列番号１０２)に結合し、−７９〜−６１位にあるｐＥ３Ｚは５'−ＧＣＣ ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＡＴ−３'(配列番号１０３)を認識する(図４ａ)。次いで、４種の６−フィンガータンパク質についてのコーディング配列を、細菌性発現ベクターｐＭａｌにクローン化した。亜鉛フィンガー‐ＭＢＰ融合タンパク質を含む粗抽出物を、ＥＬＩＳＡにおけるＤＮＡ結合について試験した(図４ｂ)。４種のタンパク質は全て、それらの標的ＤＮＡへの鋭敏な結合特異性を示し、試験した他の標的部位との交差反応性は伴わなかった。精製タンパク質によるゲル移動度変位検定法で親和力を測定した。タンパク質Ａａｒｔは、７.５ｐＭの親和力でそのＤＮＡ標的部位と結合し、ｐＥ２Ｘは１５ｎＭの親和力で、ｐＥ３Ｙは同８ｎＭおよびｐＥ３Ｚは同２ｎＭで結合しており、これは、我々がこれまでに分析されたほとんどの６−フィンガータンパク質について観察した親和力の範囲に含まれる。
【００５８】
特異的遺伝子調節についての潜在性を評価するため、Ａａｒｔについてのタンパク質コーディング配列を、ベクターｐｃＤＮＡへクローン化し、ＶＰ６４活性化ドメイン、すなわち単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６［Seipel et al.,(１９９２)EMBO J.１１(１３)、４９６１−４９６８；Beerli et al.,(１９９８)Proc Natl Acad Sci USA ９５(２５)、１４６２８−１４６３３］から誘導された最小活性化ドメインの四量体反復に融合した。ヒーラ細胞を、亜鉛フィンガータンパク質についてのみまたはＶＰ６４ドメインとの融合体としてコーディングするエフェクター構築物、およびルシフェラーゼリポータープラスミドにより亜鉛フィンガー結合部位およびＴＡＴＡボックスを含む最小プロモーターの制御下一時的に共トランスフェクションした。Ａａｒｔ結合部位は５コピーに存在し、対照として使用されるプロモーターは６個の２Ｃ７結合部位を含んでいた。ルシフェラーゼの発現を、活性化ドメイン不含有の対照と比べてｐＡａｒｔ−ＶＰ６４融合タンパク質により２０００倍アップレギュレーションした(図５ａ)。６×２Ｃ７結合部位を含むリポーターの調節は全く観察されなかったため、活性化は特異的であった(図５ｂ)。特異性についての追加対照として、６−フィンガータンパク質ｐ２Ｃ７［Wu et al.,(１９９５)PNAS ９２、３４４−３４８］についても試験したところ、プロモーターが６×２Ｃ７結合部位を含むとき(図５ｂ)のみルシフェラーゼ発現を活性化したが、プロモーターが５×Ａａｒｔ結合を含むとき(図５ａ)にはしなかった。ＶＰ６４に融合されたｐＡａｒｔの各半部位の３−フィンガータンパク質は、ルシフェラーゼ発現を活性化し得ず、これは以前の結果と一致している［Beerli et al.,(２０００)Proc Natl Acad Sci USA ９７(４)、１４９５−１５００；Beerli et al.,(２０００)J.Biol.Chem.２７５(４２)、３２６１７−３２６２７］。
【００５９】
６−フィンガータンパク質ｐＥ２Ｘ、ｐＥ３ＹおよびｐＥ３Ｚが内在性ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３遺伝子をそれぞれ転写調節し得ることを調べるため、コーディング配列をレトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰへサブクローニングし、Ｋｏｘ−１のＶＰ６４活性化またはＫＲＡＢ抑制ドメインへ融合した［Margolin et al.,(１９９４)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１、４５０９−４５１３; Beerli et al.,(１９９８)Proc Natl Acad Sci USA ９５(２５)、１４６２８−１４６３３］。レトロウイルスを用いて、ヒト癌セルラインＡ４３１を感染させた。感染の３日後、細胞をフローサイトメトリーにかけて、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の発現レベルを分析した(図６)。ＧＦＰ発現の測定により、感染効率を測定した。全細胞プールは、ｐＥ２Ｘ−ＶＰ６４以外、８０％を越える割合で感染していた。ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の発現レベルを測定するため、細胞を特異抗体またはＥｒｂＢ−１に特異的な対照抗体で染色した。融合タンパク質ｐＥ２Ｘ−ＶＰ６４は、ＥｒｂＢ−２発現をアップレギュレーションし得たが、細胞の５０％に過ぎず、このことは低い感染効率に起因すると思われる。ｐＥ３Ｙは、ＶＰ６４またはＫＲＡＢにそれぞれ融合されたとき、特異的なアップ‐およびダウン‐レギュレーションを示したことから、以前に報告したｐＥ３と同様に有効であった。ｐＥ３Ｚは３種の生成されたタンパク質のうち最高の親和力を有しているが、ｐＥ３Ｚ融合タンパク質はｅｒｂＢ−３の遺伝子発現を改変しなかった。５'−ＡＮＮ−３' ＤＮＡ配列を特異的に認識する本明細書記載の亜鉛フィンガードメインは、現時点で構築され得る６−フィンガータンパク質および亜鉛フィンガーに基く転写因子によりターゲッティングされ得るＤＮＡ配列の数に大きく寄与する。
【実施例】
【００６０】
実施例１：亜鉛フィンガーライブラリーの構築およびファージディスプレイによる選択
亜鉛フィンガーライブラリーの構築は、先に記載したＣ７タンパク質に基くものであった([Wu et al.,(１９９５)PNAS ９２、３４４−３４８];図１)。５'−ＧＣＧ−３'サブサイトを認識するフィンガー３を、フィンガー３をコーディングするプライマー（５'−ＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＴＣ−３'）(配列番号１０４)およびｐＭａｌ特異的プライマー(５'−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣ−３')(配列番号１０５)を用いるオーバーラップＰＣＲ戦略を用いて５'−ＧＡＴ−３'サブサイト［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］に結合するドメインにより置換した。ＰＣＲオーバーラップ拡張による亜鉛フィンガーライブラリーのランダム化は、本質的には報告された通りであった［Wu et al.,(１９９５)PNAS ９２、３４４−３４８; Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３］。ライブラリーをファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ［Rader et al.,(１９９７)Curr.Opin.Biotechnol.８(４)、５０３−５０８］へライゲーションした。以前に報告された要領[Barbas et al.,(１９９１)Methods:Companion Methods Enzymol.２(２)、１１９−１２４;Barbas et al.,(１９９１)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８、７９７８−７９８２; Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３]でファージの増殖および沈澱を行った。体積５００μｌの亜鉛緩衝液Ａ（ＺＢＡ：１０ｍＭのトリス、ｐＨ７.５／９０ｍＭのＫＣｌ／１ｍＭのＭｇＣｌ２／９０μＭのＺｎＣｌ２）／０.２％ＢＳＡ／５ｍＭのＤＴＴ／１％ブロット(バイオラッド)／１００μｌ沈澱ファージ(１０１３コロニー形成単位)含有二本鎖せん断ニシン精液ＤＮＡ２０μｇ中で結合反応を行わせた。ファージを、４℃で１時間非ビオチニル化競合体オリゴヌクレオチドに結合させた後、ビオチニル化標的オリゴヌクレオチドを加えた。結合は４℃で一晩続いた。１時間５０μｌのストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(ダイナル；ＺＢＡ中５％のブロットにより遮断)とのインキュベーション後、ビーズを５００μｌのＺＢＡ／２％トウィーン２０／５ｍＭのＤＴＴで１０回、およびトウィーン不含有の緩衝液で１回洗浄した。結合ファージの溶離は、室温で３０分間ＴＢＳ(トリス緩衝食塩水)中２５μｌトリプシン(１０μｇ／ｍｌ)でのインキュベーションにより行った。ヘアピン競合体オリゴヌクレオチドは、配列５'−ＧＧＣＣＧＣＮ'Ｎ'Ｎ'ＡＴＣ ＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＧＡＴＮＮＮＧＣＧＧＣＣ−３'(配列番号１０６)(ただし、ＮＮＮはフィンガー‐２サブサイトオリゴヌクレオチドを表し、Ｎ'Ｎ'Ｎ'はその相補塩基を表す)(標的オリゴヌクレオチドはビオチニル化されていた)を有していた。標的オリゴヌクレオチドを、通常、最初の３ラウンドの選択では７２ｎＭで、次いで第６および最終ラウンドでは３６ｎＭおよび１８ｎＭに減らして加えた。競合体として５'−ＴＧＧ−３'フィンガー‐２サブサイトオリゴヌクレオチドを用いることにより、親クローンと競合させた。標的部位を除く、１５のフィンガー‐２,５'−ＡＮＮ−３'サブサイトの当モル混合物、および５'−ＣＮＮ−３'、５'−ＧＮＮ−３'、および５'−ＴＮＮ−３'型の各フィンガー‐２サブサイトの競合体混合物を、各連続的選択ラウンドで量を増加させながら加えた。通常、特異的５'−ＡＮＮ−３'競合体混合物を第１ラウンドでは加えなかった。
【００６１】
多重標的特異性検定法およびゲル移動度変位分析−亜鉛フィンガーコーディング配列を、ｐＣｏｍｂ３Ｈから修飾細菌性発現ベクターｐＭａｌ−ｃ２(ニューイングランド・バイオラブズ)へサブクローニングした。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ(ストラタジーン)へ形質転換後、１ｎＭのイソプロピルβ‐Ｄ−チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)を加えた後、亜鉛フィンガー‐マルトース‐結合タンパク質(ＭＢＰ)融合体を発現させた。これらの細菌培養物の凍結／解凍抽出物を、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート(ピアス)へ１：２希釈率で適用し、それぞれ１６の５'−ＧＡＴ ＡＮＮ−ＧＣＧ−３'標的部位の各々に対するＤＮＡ結合特異性について試験した。本質的には報告された要領［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３；Dreier et al.,(２０００)J.Mol.Biol.３０３、４８９−５０２］でＥＬＩＳＡ(固相酵素結合免疫測定法)を行った。マウス抗ＭＢＰ(マルトース結合タンパク質)抗体(シグマ、１：１０００)とインキュベーション後、アルカリ性ホスファターゼ(シグマ、１：１０００)とカップリングしたヤギ抗マウス抗体を適用した。検出後、アルカリ性ホスファターゼ基質(シグマ)を加え、ＯＤ４０５をＳＯＦＴＭＡＸ２.３５(モレキュラー・ディバイシーズ)で測定した。
【００６２】
本質的には報告された要領で精製タンパク質(タンパク質融合および精製システム、ニューイングランド・バイオラブズ)によりゲル変位分析を行った。
【００６３】
実施例２：フィンガー２の位置指定突然変異導入
報告された要領［Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３; Dreier et al.,(２０００)J.Mol.Biol.３０３、４８９−５０２］でフィンガー‐２突然変異体をＰＣＲにより構築した。ＰＣＲ鋳型として、５'−ＴＧＧ−３'フィンガー２および５'−ＧＡＴ−３'フィンガー３を含むライブラリークローンを使用した。突然変異フィンガー２および５'−ＧＡＴ−３'フィンガー３を含むＰＣＲ産物を、Ｃ７のフィンガー１との枠におけるＮｓｉＩおよびＳｐｅＩ制限部位を介して修飾ｐＭａｌ−ｃ２ベクター（ニューイングランド・バイオラブズ）へサブクローニングした。
【００６４】
ポリダクチル亜鉛フィンガータンパク質の構築−報告された要領[Beerli et al.,(１９９８)Proc Natl Acad Sci USA ９５(２５)、１４６２８−１４６３３]で、ＳＰ１Ｃフレームワークを用いるフィンガー‐２縫取り法により、３‐フィンガータンパク質を構築した。この工程で生成されたタンパク質は、５'−ＧＮＮ−３' ＤＮＡ配列を認識するヘリックス[Segal et al.,（１９９９）Proc Natl Acad Sci USA９６(６)、２７５８−２７６３]、並びに本明細書記載の５'−ＡＮＮ−３'および５'−ＴＡＧ−３'ヘリックスを含んでいた。適合し得るＸｍａＩおよびＢｓｒＦＩ制限部位を介して、６種のフィンガータンパク質を組立てた。ＤＮＡ結合特性の分析を、ＩＰＴＧ誘導凍結／解凍細菌抽出物から遂行した。これらのタンパク質の遺伝子発現調節能力を分析するため、先に報告された要領(［Beerli et al.,(１９９８)Proc Natl Acad Sci USA ９５(２５)、１４６２８−１４６３３；Beerli et al.,(２０００)Proc Natl Acad Sci USA ９７(４)、１４９５−１５００；Beerli et al.,(２０００)J.Biol.Chem.２７５(４２)、３２６１７−３２６２７];ＶＰ６４:単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６最小活性化ドメインの四量体反復）でそれらをＫｏｘ−１の活性化ドメインＶＰ６４または抑制ドメインＫＲＡＢに融合し、ｐｃＤＮＡ３またはレトロウイルスｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（[Liu et al.,(１９９７) Proc Natl Acad Sci USA ９４、１０６６９−１０６７４]；ＩＲＥＳ、内部リボソーム‐エントリー部位；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）へサブクローニングした。
【００６５】
実施例３：一般的方法
トランスフェクションおよびルシフェラーゼ検定法
ヒーラ細胞を、培養飽和密度の４０〜６０％で使用した。細胞を、２４ウェルプレートにおいて１６０ｎｇのリポータープラスミド(ｐＧＬ３−プロモーター構築物)および４０ｎｇのエフェクタープラスミド（ｐｃＤＮＡ３における亜鉛フィンガー‐エフェクタードメイン融合体）によりトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に細胞抽出物を調製し、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ ＬＢ９６Ｐルミノメーター（ＥＧ ＆ バーソルド、ガイザーズバーグ、メリーランド）においてルシフェラーゼ検定試薬（プロメガ）により測定した。
【００６６】
レトロウイルス遺伝子ターゲッティングおよびフローサイトメトリー分析
報告された要領［Beerli et al.,(２０００)Proc Natl Acad Sci USA ９７(４)、１４９５−１５００；Beerli et al.,(２０００)J.Biol.Chem.２７５(４２)、３２６１７−３２６２７］でこれらの検定法を遂行した。一次抗体として、ＥｒｂＢ−１特異的ｍＡｂ ＥＧＦＲ（サンタクルス）、ＥｒｂＢ−２特異的ｍＡｂ ＦＳＰ７７（Nancy E.Hynesから寄贈；Harwewrth et al.,１９９２）およびＥｒｂＢ−３特異的ｍＡｂ ＳＧＰ１（オンコジーン・リサーチ・プロダクツ）を使用した。蛍光標識ロバＦ(ａｂ')２抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用した(ジャクソン・イムノ‐リサーチ)。
【００６７】
コンピューターモデリング
インサイトII（モレキュラー・シミュレーションズ、インコーポレイテッド）を用いてコンピューターモデルを作成した。モデルは、Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ（ＰＤＢ受託１ＡＡＹ）およびＱＧＳＲ−ＧＣＡＣ(配列番号１０７)(１Ａ１Ｈ)の共結晶構造の座標に基いていた。これらの構造は、エネルギー最小限化されておらず、提示されてはいても可能な相互作用を示唆しているに過ぎない。重原子間の距離が３(＋／−０.３)オングストロームであり、重原子および水素により形成される角度が１２００またはそれより大きいとき、水素結合は信頼できそうであるとみなされた。信頼できそうであるファンデルワールス相互作用は、４(＋／−０.３)オングストロームのメチル基炭素原子間の距離を必要とした。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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