(57)【要約】【課題】ミトコンドリア内膜に存在するＵＣＰ（脱共役タンパク質）の中でも、特にＵＣＰ２の発現を亢進化し得る物質の解明と、ＵＣＰ２亢進化物質を用いて、ＵＣＰ２が関与する各種症状、病態、疾患等（例えば、肥満、炎症等）の治療・予防に役立つ皮膚外用剤、医薬品、飲食品、飼料（ペットフードなど）等を開発する。【解決手段】レスベラトロールからなるＵＣＰ２発現亢進剤。該ＵＣＰ２発現亢進剤を皮膚外用剤、医薬品、飲食品、飼料等に配合する。【選択図】図１
2010024208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロールからなるＵＣＰ２発現亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレスベラトロールからなるＵＣＰ２発現亢進剤に関する。本発明は皮膚外用剤、医薬品、飲食品、飼料等に好適に適用される。
【背景技術】
【０００２】
ＵＣＰ（＝uncoupling protein；脱共役タンパク質）は、細胞のミトコンドリア内膜に存在し、脂肪酸を熱に変換する熱産生（thermogenesis）のための脱共役作用をもつタンパク質である。ミトコンドリアは内外２枚の膜を有し、内膜と外膜の間の膜間部と、内膜に包含されるマトリックスとに分けられる。
【０００３】
脱共役とは、酸化的リン酸化において、電子伝達系で得られたエネルギーをＡＴＰ合成反応に共役するのを阻害することをいい、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーを熱エネルギーに変換する点で重要な生体機能の１つである。酸化的リン酸化反応では、電子伝達系の酸化還元反応によって遊離されるエネルギーを用いて、ＡＤＰと無機リン酸からＡＴＰを合成するが、電子伝達のエネルギーは、いったんミトコンドリア膜内外のプロトンの電気化学ポテンシャル差として保存される。このプロトン濃度勾配がプロトンポンプ（膜ＡＴＰ合成酵素）を駆動してＡＤＰと無機リン酸を縮合させてＡＴＰを合成する。
【０００４】
このように、ミトコンドリアで電子伝達とＡＴＰ合成は内膜でのプロトン濃度勾配によって密に共役している。ＵＣＰはこのプロトン濃度勾配を短絡的に解消する特殊なチャンネルであり、これが活性化されると酸化基質の化学エネルギーはＡＴＰ合成に利用されずに熱へと変換される。恒温動物の体温調節やエネルギー消費、肥満発症に一定の役割をＵＣＰが演じていることは、これまで特にＵＣＰ１、ＵＣＰ２、またはＵＣＰ３の遺伝子を導入したり遺伝子発現を抑制したマウスを用いた実験から明らかになっている。
【０００５】
ＵＣＰ１は主に褐色脂肪組織に、またＵＣＰ２は白色脂肪細胞のみならず骨格筋や腎臓、肝臓などに広く分布し、ＵＣＰ３は骨格筋に比較的限定して強く発現されている。このようなＵＣＰの脂肪燃焼作用を利用した痩身用皮膚外用剤が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
このようなＵＣＰの中でも全身の組織に広く分布するＵＣＰ２は、上述の脂肪燃焼作用のほか、近年、ＮＯ産生を抑制することによる抗炎症効果に関わることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また最近、ＵＣＰ２が脳卒中または外傷に起因する神経系の損傷を抑制する作用を持つこと、およびこれを利用すれば急性脳損傷の長期的な治療成績を改善できる可能性があることなどの報告もされている。
【０００７】
したがって、ＵＣＰ２遺伝子は脂肪燃焼による痩身、抗炎症、外傷による神経系の損傷抑制等に適用され得ると考えられることから、ＵＣＰ２遺伝子を活性化する意義は非常に高いと考えられる。
【０００８】
なお、後述するように本発明はレスベラトロールを利用した技術である。従来、レスベラトロールを利用した技術として、例えばレスベラトロールが細胞中のサーチュインを活性化させることを利用した肥満及びインシュリン耐性障害を治療または防止するための組成物（特許文献２）や、レスベラトロールを有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤（特許文献３）などが報告されているが、これら特許文献２、３には、ＵＣＰ２に関する記載や示唆はない。
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−６３９７７号公報
【特許文献２】特表２００７−５２７４１８号公報
【特許文献３】特開２００６−２７３８３４号公報
【非特許文献１】大野、外３名「ＵＣＰの新しい機能−ＵＣＰ２はＮＯの産生を制御する」、肥満研究、日本肥満学会、２００３年、Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．1、ｐ．８０−８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、ＵＣＰ２の発現を亢進し得る物質が解明できれば、ＵＣＰ２が関与する各種症状、病態、疾患等（例えば、肥満、炎症等）を治療・予防し得る皮膚外用剤、医薬品、飲食品、飼料等の開発に可能性が開かれる。
【００１１】
すなわち、本発明は、ＵＣＰ２の発現を亢進し得る物質の解明と、ＵＣＰ２亢進化物質を用いて、ＵＣＰ２が関与する各種症状、病態、疾患等（例えば、肥満、炎症等）の治療・予防に役立つ皮膚外用剤、医薬品、飲食品、飼料（ペットフードなど）等の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、レスベラトロールがＵＣＰ２遺伝子の発現亢進効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、レスベラトロールからなるＵＣＰ２発現亢進剤を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明はＵＣＰ２遺伝子の発現活性効果が高いため、それを利用した皮膚外用剤、医薬品、飲食品、飼料（ペットフードなど）等を提供することができ、ＵＣＰ２が関与する種々の症状、病態、疾病等（例えば、肥満、炎症等）の治療・予防に役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について詳述する。
【００１６】
本発明で用いるレスベラトロールは、スチルベン系化合物であり、ｔｒａｎｓ−レスベラトロール、ｃｉｓ−レスベラトロール、およびそれらの配糖体であるｔｒａｎｓ−パイシード、ｃｉｓ−パイシード、さらに該配糖体の脱水二量体であるｅｐｓｉｌｏｎ−ビニフェリン、並びにそれらを２種以上含む混合物などが挙げられる。本発明では、ｔｒａｎｓ−レスベラトロール、ｃｉｓ−レスベラトロール、ｔｒａｎｓ−パイシード、ｃｉｓ−パイシード、およびｅｐｓｉｌｏｎ−ビニフェリンの混合物が好適に用いられる。
【００１７】
レスベラトロールはブドウの葉、新芽、果皮等に存在するポリフェノールの一種で、スチルベン系化合物であり、ｔｒａｎｓ−レスベラトロール、ｃｉｓ−レスベラトロールおよびそれらの混合物の総称である。
【００１８】
従来技術の欄で述べたように、レスベラトロールを利用した技術はこれまでに種々報告されているが（特許文献２〜３等）、レスベラトロールがＵＣＰ２発現亢進効果を奏することは、本発明者らにより初めて見出されたもので、これまで全く知られていなかった。
【００１９】
レスベラトロールは、有機化学的または微生物を用いて合成した高純度品の他、レスベラトロールを含有する天然物から抽出して用いることができ、その場合、抽出物を用いてもよく、またはその抽出物から単離したレスベラトロールを用いてもよい。天然物としては、レスベラトロールを含有するものであればよく、例えば、ブドウ、落花生、およびイタドリやツルドクダミ等のタデ科植物等が挙げられる。
【００２０】
天然物としてはブドウが特に好ましい。ブドウの種類は、特に限定されるものではないが、デラウエア、巨峰、甲州、ピオーネ、マスカット、シュナンブラン、グレナッシュ、マタロ、ミュラーテュルガウ、トレッビアーノ、ベリーＡ、カベルネソービニオン、メルロー、ピノノアール、カベルネフラン、シラー、シャルドネ、ソービニヨンブラン、セミヨン、シラー、ガメイ、リースリング、アリゴテ等が好ましい。ブドウ抽出物とは、ブドウ果実、ブドウ葉またはブドウに由来する物からの抽出物を指す。ブドウに由来する物としては、ブドウジュース、ワイン、ワイン製造時の残渣、ワイン濃縮物等をいう。抽出は、例えば、レスベラトロールはブドウの果皮や新芽、葉に多く含まれているので、それらを必要により乾燥した後、抽出溶媒に一定期間浸漬するか、あるいは加熱還流している抽出溶媒と接触させ、次いで濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを用いるか、あるいはこれらエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また分配法、例えば水／酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いられる。また、ワイン、ワインの濃縮物または濃縮乾固した固形物中にも含まれているので、それらを用いることもできる。また、ワイン製造時に発生するブドウの残渣をそのまま用いるか、それから上記抽出方法と同様にして抽出することもできる。有機溶剤としてはエタノール等のアルコールが好ましく、特にエタノールが好ましい。
なお、レスベラトロールは「VINEATROL 20M」（サンブライト（株）製）等として市販されており、このような市販品を用いることもできる。ただしこれに限定されるものでない。
【００２１】
本発明のＵＣＰ２発現亢進剤は、皮膚外用剤に配合してヒトおよび動物に好適に用いることができる他、各種飲食品、飼料（ペットフード等）に配合して接取させることができる。また医薬製剤としてヒトおよび動物に投与することができる。
【００２２】
本発明のＵＣＰ２発現亢進剤を皮膚外用剤に配合する場合、レスベラトロールの配合量は外用剤全量中、０．０００１〜１０質量％が好ましく、より好ましくは０．０００１〜１質量％、特に好ましくは０．００１〜０．１質量％である。０．０００１質量％未満では本発明の効果が十分に発揮されず、一方、１０質量％を超えて配合しても効果のさらなる増加は実質上望めないし、皮膚外用剤への配合も難しくなる傾向にある。
【００２３】
本発明を皮膚外用剤に適用する場合、上記成分に加えて、さらに必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば酸化防止剤、油分、紫外線防御剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２４】
さらに、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属イオン封鎖剤、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等の防腐剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。
【００２５】
またこの皮膚外用剤は、外皮に適用される化粧料、医薬部外品等、特に好適には化粧料に広く適用することが可能であり、その剤型も、皮膚に適用できるものであればいずれでもよく、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。
【００２６】
使用形態も任意であり、例えば化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料やファンデーション、口紅、アイシャドウ等のメーキャップ化粧料、芳香化粧料、浴用剤等に用いることができる。
【００２７】
また、メーキャップ化粧品であれば、ファンデーション等、トイレタリー製品としてはボディーソープ、石けん等の形態に広く適用可能である。さらに、医薬部外品であれば、各種の軟膏剤等の形態に広く適用が可能である。そして、これらの剤型及び形態に、本発明のＵＣＰ２発現亢進剤の採り得る形態が限定されるものではない。
【００２８】
本発明のＵＣＰ２発現亢進剤を飲食品や飼料等に配合する場合、レスベラトロールの配合量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。特に、保健用飲食品等として利用する場合には、本発明の有効成分を所定の効果が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。
【００２９】
飲食品や飼料の形態としては、例えば、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、または、液体状に任意に成形することができる。これらには、飲食品等に含有することが認められている公知の各種物質、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜含有させることができる。
【００３０】
本発明のＵＣＰ２発現亢進剤を医薬製剤として用いる場合、該製剤は経口的にあるいは非経口的（静脈投与、腹腔内投与、等）に適宜に使用される。剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、または、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。これらの医薬製剤には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。
【００３１】
本発明のＵＣＰ２発現亢進剤を、皮膚外用剤、飲食品、飼料、医薬製剤等として用いる場合、ＵＣＰ２が関与する種々の症状や疾病、病態等の治療、予防、改善等に役立つ。具体的適用例としては、例えば、脂肪燃焼による痩身、抗炎症、外傷による神経系の損傷抑制等に好適に用いられる。またＵＣＰ２が関与する症状や疾病、病態等の治療、予防、改善等の生理機能をコンセプトとして、その旨を表示した皮膚外用剤、機能性飲食品、疾病者用食品、特定保健用食品等に応用することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、配合量はすべて質量％で示す。
【００３３】
以下の実施例においてレスベラトロールは「Resveratrol R007」（東京化成工業（株）製）を用いた。
【００３４】
（実施例１）
１．長期培養法
ヒト皮下由来前駆脂肪細胞（Cambrex社）をブレットキットＰＧＭ−２（Cambrex社）付属の増殖培地ＰＧＭ−２で培養した。細胞は１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ｃｍシャーレへ播種し、コンフルエントまで培養した。培地交換は２〜３日ごとに行った。その後、キット付属の各種添加因子（ヒトインスリン、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、インドメタシン）をＰＧＭ−２に加えた培地を分化培地ＰＤＭとし、ＰＤＭに培地交換し分化誘導を行った。
【００３５】
すなわち、まず分化０日目にＰＤＭに培地交換し、分化誘導を開始した。その後２〜３日ごとにＰＤＭで培地交換を行った。分化７〜８日目にＰＤＭをＰＧＭ−２で２倍希釈した１／２  ＰＤＭに培地交換した。その後、２〜３日ごとに１／２  ＰＤＭで培地交換を行い、分化１４日目にＰＧＭ−２に培地交換し、その後は２〜３日ごとにＰＧＭ−２で培地交換を行った。このような方法で細胞を長期分化・維持した。その後、分化１８日目にレスベラトロール５０μＭを添加し、２１日目に細胞を回収し、以下の操作を行った。なお、レスベラトロールの代わりにその溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を培養液中０．５％（レスベラトロール５０μＭ添加細胞と同濃度）となるように添加したものを対照（コントロール）とした。
【００３６】
２．細胞からのＲＮＡ抽出
上記の方法で刺激を与えた脂肪細胞の回収法は、細胞にIsogen（（株）ニッポンジーン）を添加し、ピペッティングすることで細胞を破壊しＲＮＡを抽出した。所定の方法でＲＮＡを調製し、１μｇのtotalＲＮＡをＤＮａｓｅＩ処理し、オリゴｄＴをプライマーとしてSuper Script II（Invitrogen社）で逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。
【００３７】
３．定量ＲＴ−ＰＣＲ
Platinum(R) SYBR(R) Green qPCR SuperMix-UDG（Invitrogen Cat no.11733-046）を用い、上記に従って調製したｃＤＮＡ  ２．５μＬ、ｆｏｒｗａｒｄ側およびｒｅｖｅｒｓｅ側プライマー（下記参照）各０．３μＭ（終濃度）、ROX Reference dye  ０．５μｌ、×2 SuperMix-UDG Mix  １２．５μｌに水を加えて全量２５μｌとした反応液を調製し、ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems）により定量ＰＣＲを行った。反応は５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および（９５℃で１５秒間→６０℃で１分間）×４０サイクルを終了した後、９５℃から６０℃の融解曲線解析を行った。定量化のためのスタンダードには、各プライマーにより得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルから切り出し精製し調整したものを使用した。切り出し精製の後、１０2〜１０8ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎとなるように希釈し、これらをスタンダードとして各ｃＤＮＡ検体のＵＣＰ２遺伝子、シクロフィリンＡ遺伝子（ｈＣＹＣ）のコピー数を求め、また各ｃＤＮＡ検体ごとのシクロフィリンＡコピー数で補正した値を同一条件検体の平均±ＳＤで表した。結果を図１に示す。
【００３８】
図１に示すグラフから明らかなように、コントロール（ＤＭＳＯ）を添加した細胞よりも、レスベラトロール５０μＭを添加した細胞で有意にＵＣＰ２遺伝子の発現が亢進していた（Ｎ＝３）。
【００３９】
すなわちレスベラトロールが、ＵＣＰ２遺伝子に起因する種々の症状・病態・疾患、例えば、肥満、炎症等の種々の病態に対し、優れた予防・治療効果を有することが裏付けられた。
【００４０】
以下にさらに処方例を示す。
【００４１】
（配合処方例１：  クリーム）
（配  合  成  分）                              （質量％）
ＵＣＰ２発現亢進剤（レスベラトロール）              ０．０２
セチルアルコール                                    ５．０
ステアリン酸                                        ３．０
ワセリン                                            ５．０
スクワラン                                        １０．０
グリセロールトリ２−エチルヘキサン酸エステル        ７．０
ジプロピレングリコール                              ５．０
グリセリン                                          ５．０
プロピレングリコールモノステアリン酸エステル        ３．０
ＰＯＥ（２０）セチルアルコールエーテル              ３．０
トリエタノールアミン                                １．０
防腐剤                                              適量
酸化防止剤                                          適量
香料                                                適量
精製水                                              残部
（製造方法）
精製水に保湿剤、アルカリを加え７０℃に調整。また、油分を加熱溶解し、界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、薬剤を加え、７０℃に調製する。これを水相に添加し予備入荷を行った後、ホモミキサーで乳化粒子調整を行い、脱気、ろ過、冷却を行う。
【００４２】
（配合処方例２：  エッセンス）
（配  合  成  分）                              （質量％）
ＵＣＰ２発現亢進剤（レスベラトロール）              ０．０１
ジプロピレングリコール                              ５．０
ポリエチレングリコール４００                      １０．０
エタノール                                          ０．３
カルボキシビニルポリマー                            ０．２
キサンタンガム                                      ０．５
水酸化カリウム                                      １．０
ＰＯＥソルビタンモノステアリン酸エステル            ０．５
オレイルアルコール                                  ０．５
香料                                                適量
防腐剤                                              適量
精製水                                              残部
（製造方法）
精製水に水溶性高分子を溶解し、保湿剤を順次溶解する。エタノールに界面活性剤、エモリエント剤、薬剤、香料、防腐剤を順次溶解し、前述の水相に添加し、マイクロエマルション化する。最後に一部の精製水に水酸化カリウムを溶解し、これを添加し、撹拌、脱気、ろ過する。
【００４３】
（配合処方例３：  エモリエントローション）
（配  合  成  分）                              （質量％）
ＵＣＰ２発現亢進剤（レスベラトロール）              ０．００１
セチルアルコール                                    １．０
ミツロウ                                            ０．５
ワセリン                                            ２．０
スクワラン                                          ６．０
ジメチルポリシロキサン                              ２．０
エタノール                                          ５．０
グリセリン                                          ４．０
１，３−ブチレングリコール                          ４．０
ＰＯＥ（１０）モノオレイン酸エステル                １．０
グリセロールモノステアリン酸エステル                １．０
防腐剤                                              適量
香料                                                適量
精製水                                              残部
（製造方法）
精製水に保湿剤を加え７０℃に加熱調整。油分に界面活性剤、防腐剤を加え７０℃に加熱調整する。これを先の水相に加え予備乳化を行う。ここにエタノールを加え攪拌。ホモミキサーで乳化粒子を均一にした後、脱気、ろ過、冷却を行う。
【００４４】
（配合処方例４：顆粒  １，２００ｍｇ／日  中）
（配  合  成  分）                              （質量％）
ＵＣＰ２発現亢進剤（レスベラトロール）            ３３．４
ビタミンＣ                                          ８．３
大豆イソフラボン                                  ２０．８
還元乳糖                                          ２５．０
大豆オリゴ糖                                        ３．０
エリスリトール                                      ３．０
デキストリン                                        ２．５
香料                                                ２．０
クエン酸                                            ２．０
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例におけるコントロール群（ＤＭＳＯ添加）とレスベラトロール添加群でのＵＣＰ２発現亢進結果を示すグラフである。
【図１】
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