(57)【要約】      （修正有）【課題】骨吸収の効果的な抑制が可能で、かつ生体に対する安全性が高く、医薬品、飲食品等の成分として使用するのに好適である骨吸収抑制剤の提供。【解決手段】一般式（１）で表されるベータ酸及び／又は一般式（２）で表される酸化型ベータ酸を有効成分として含有する骨吸収抑制剤。2010260827.tif 000017［式中、Ｒ１及びＲ２は各々、炭素数１〜６のアルキル基を表す。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるベータ酸及び／又は下記一般式（２）で表される酸化型ベータ酸を有効成分として含有する骨吸収抑制剤。
【化１】
2010260827.tif 000015
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜６のアルキル基を表す。］
【化２】
2010260827.tif 000016
［式中、Ｒ２は、炭素数１〜６のアルキル基を表す。］
【請求項２】
前記ベータ酸及び／又は酸化型ベータ酸の全部又は一部がホップに由来する、請求項１に記載の骨吸収抑制剤。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２が各々、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、１−メチルエチル基、エチル基及び３−メチルブチル基から選ばれる、請求項１又は２に記載の骨吸収抑制剤。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２が各々、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基及び１−メチルエチル基から選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨吸収抑制剤。
【請求項５】
骨無機成分分解抑制剤として使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨吸収抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨吸収抑制剤を含有する医薬品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨吸収抑制剤を含有する飲食品。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨吸収抑制剤を含有する飲食品添加物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨吸収抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨代謝においては、破骨細胞が骨吸収を担い、骨芽細胞が骨形成を担っている。正常な骨組織では、骨吸収と骨形成とが絶えずバランスよく繰り返されることで、骨代謝が進み、骨密度が一定に維持されている。このバランスが破綻して骨吸収が骨形成を上回ると、骨密度が低下し、やがて骨粗鬆症が発症する。骨吸収及び骨形成のバランスを是正して骨粗鬆症を治療又は予防するには、骨吸収を抑制するのが有効である。
【０００３】
骨吸収抑制作用を有する化合物としては、例えば、ホップの苦味成分であるアルファ酸及びイソアルファ酸が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−３３０５９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
骨吸収抑制剤はいくつか知られているものの、未だ、多様な需要を満たすのに十分な選択肢が存在するとはいえないのが実情である。
【０００６】
そこで、本発明は、骨吸収の効果的な抑制が可能な新規の骨吸収抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記一般式（１）で表されるベータ酸及び／又は下記一般式（２）で表される酸化型ベータ酸を有効成分として含有する骨吸収抑制剤を提供する。
【０００８】
【化１】
2010260827.tif 000002
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜６のアルキル基を表す。］
【０００９】
【化２】
2010260827.tif 000003
［式中、Ｒ２は、炭素数１〜６のアルキル基を表す。］
【００１０】
骨吸収を担う破骨細胞は、骨表面に酸（例えば、塩酸）やプロテアーゼ（例えば、カテプシンＫ、ＭＭＰ−９）を分泌して、骨の無機成分（ハイドロキシアパタイト）及びタンパク質成分（例えば、コラーゲン）を分解することを通じて、骨吸収を行う。本発明の骨吸収抑制剤は、破骨細胞による骨の無機成分の分解を抑制し、これを介して骨吸収を効果的に抑制することを可能とする。本発明の骨吸収抑制剤は、特に、骨吸収の亢進に起因する骨密度低下を改善又は予防するのに有用である。
【００１１】
本発明の骨吸収抑制剤において、一般式（１）のベータ酸及び／又は一般式（２）の酸化型ベータ酸の全部又は一部はホップに由来するものであることが好ましい。ホップ中のベータ酸及び酸化型ベータ酸は、ホップを原料とするアルコール飲料の製造過程において製品中まで移行せず、必ずしも有効に利用されていないが、ホップ由来のベータ酸又は酸化型ベータ酸を骨吸収抑制剤の成分として使用することは、ホップ中のベータ酸又は酸化型ベータ酸の有効利用に資する。
【００１２】
一般式（１）のベータ酸としては、ホップ中の含有量が比較的多い点で、例えば、ルプロン、アドルプロン、コルプロン、ポストルプロン及びプレルプロン（それぞれ、Ｒ１が２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、１−メチルエチル基、エチル基及び３−メチルブチル基の化合物）が好適であり、ルプロン、アドルプロン及びコルプロン（それぞれ、Ｒ１が２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基及び１−メチルエチル基の化合物）がより好適である。
【００１３】
また、一般式（２）の酸化型ベータ酸としては、ホップ中の含有量が比較的多い点で、例えば、ルプロン、アドルプロン、コルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンの酸化誘導体（それぞれ、Ｒ２が２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、１−メチルエチル基、エチル基及び３−メチルブチル基の化合物）が好適であり、ルプロン、アドルプロン及びコルプロンの酸化誘導体（それぞれ、Ｒ２が２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基及び１−メチルエチル基の化合物）がより好適である。
【００１４】
本発明の骨吸収抑制剤は、破骨細胞による骨の無機成分（ハイドロキシアパタイト）の分解を抑制することを可能とすることから、骨無機成分分解抑制剤として使用することもできる。
【００１５】
ベータ酸及び酸化型ベータ酸の多くは、古くからビール等の飲食品の原料として使用されてきたホップ中に見出される。そのため、本発明の骨吸収抑制剤は、生体に対する安全性が高く、医薬品、飲食品、飲食品添加物、飼料、飼料添加物等の成分として使用するのに好適である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、骨吸収の効果的な抑制が可能で、かつ生体に対する安全性が高い新規の骨吸収抑制剤が提供される。また、そのような骨吸収抑制剤を含有する医薬品、飲食品、飲食品添加物、飼料、飼料添加物等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ルプロン存在下でのラット破骨細胞の骨吸収活性を示すグラフである。
【図２】アドルプロン存在下でのラット破骨細胞の骨吸収活性を示すグラフである。
【図３】コルプロン存在下でのラット破骨細胞の骨吸収活性を示すグラフである。
【図４】酸化型アドルプロンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図５】酸化型アドルプロンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図６】酸化型アドルプロン存在下でのラット破骨細胞の骨吸収活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１９】
本発明の骨吸収抑制剤は、下記一般式（１）で表されるベータ酸及び／又は下記一般式（２）で表される酸化型ベータ酸を有効成分として含有する。
【００２０】
【化３】
2010260827.tif 000004
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜６のアルキル基を表す。］
【００２１】
【化４】
2010260827.tif 000005
［式中、Ｒ２は、炭素数１〜６のアルキル基を表す。］
【００２２】
一般式（１）、（２）において、Ｒ１又はＲ２で表される炭素数１〜６のアルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、１−メチルエチル基（イソプロピル基）、１，１−ジメチルエチル基（ｔｅｒｔ−ブチル基）、プロピル基、１−メチルプロピル基（ｓｅｃ−ブチル基）、２−メチルプロピル基（イソブチル基）、２，２−ジメチルプロピル基（ネオペンチル基）、ブチル基、３−メチルブチル基、ペンチル基、ヘキシル基が挙げられる。
【００２３】
一般式（１）のベータ酸としては、ホップ中の含有量が比較的多い点で、Ｒ１が炭素数２〜５のアルキル基であるベータ酸が好適であり、Ｒ１が炭素数３〜４のアルキル基であるベータ酸がより好適である。Ｒ１が炭素数２〜５のアルキル基であるベータ酸としては、例えば、ルプロン、アドルプロン、コルプロン、ポストルプロン及びプレルプロン（それぞれ、Ｒ１が２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、１−メチルエチル基、エチル基及び３−メチルブチル基の化合物）が挙げられる。また、Ｒ１が炭素数３〜４のアルキル基であるベータ酸としては、例えば、ルプロン、アドルプロン及びコルプロン（それぞれ、Ｒ１が２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基及び１−メチルエチル基の化合物）が挙げられる。
【００２４】
また、一般式（２）の酸化型ベータ酸としては、ホップ中の含有量が比較的多い点で、Ｒ２が炭素数２〜５のアルキル基である酸化型ベータ酸が好適であり、Ｒ２が炭素数３〜４のアルキル基である酸化型ベータ酸がより好適である。Ｒ２が炭素数２〜５のアルキル基である酸化型ベータ酸としては、例えば、ルプロン、アドルプロン、コルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンの酸化誘導体（それぞれ、Ｒ２が２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、１−メチルエチル基、エチル基及び３−メチルブチル基の化合物）が挙げられる。また、Ｒ２が炭素数３〜４のアルキル基である酸化型ベータ酸としては、例えば、ルプロン、アドルプロン及びコルプロンの酸化誘導体（それぞれ、Ｒ２が２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基及び１−メチルエチル基の化合物）が挙げられる。
【００２５】
一般式（１）のベータ酸及び一般式（２）の酸化型ベータ酸は、所望の化合物を含有するホップ抽出物を分画・精製することによって得ることができる。ホップ抽出物としては、例えば、市販のホップエキスを使用してもよい。
【００２６】
ホップからの抽出を行う場合、抽出に供するホップ組織としては、毬花（苞を含む）、茎又は葉が好ましく、中でも、毬花、特にβ酸の分泌腺が存在する苞が好ましい。ホップは、乾燥、凍結、加工、粉砕、選別等の処理が施されたものであってもよく、例えば、ホップペレットを使用してもよい。ホップの品種は特に制限されず、既存の品種（例えば、チェコ産ザーツ種、ドイツ産ハラタウ・マグナム種、ドイツ産ハラタウ・トラディション種、ドイツ産ペルレ種）のいずれでもよい。ホップは、１種を単独で、又は複数種を組み合わせて使用することができる。
【００２７】
ホップからの抽出は、有機溶媒又は超臨界流体を用いて、常法に従って行うことができる。有機溶媒としては、例えば、低級アルコール（炭素数１〜４のアルコール、特に、エタノール、メタノール）、アセトン、ｎ−ヘキサンが好適である。また、超臨界流体としては、例えば、二酸化炭素が好適である。得られた抽出物に対しては、公知の方法（例えば、減圧濃縮、凍結乾燥）により濃縮又は乾燥を行ってもよく、更に粉砕等の処理を行ってもよい。
【００２８】
ホップ抽出物からのベータ酸又は酸化型ベータ酸の分画・精製は、公知の方法（例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、フィルター濾過、遠心分離）により行うことができる。
【００２９】
得られた化合物が所望の化合物かどうかは、公知の方法（例えば、質量分析、元素分析、核磁気共鳴分光法、赤外分光法）により確認することができる。
【００３０】
本発明の骨吸収抑制剤において、ベータ酸及び／又は酸化型ベータ酸としてはホップ由来のものが好ましいが、それ以外のもの（例えば、他の植物に由来するもの、人為的に合成したもの）であってもよい。
【００３１】
本発明の骨吸収抑制剤は、一般式（１）のベータ酸及び一般式（２）の酸化型ベータ酸のうちの１種のみを含有しても、２種以上を含有してもよい。また、骨吸収抑制作用を有する他の化合物（例えば、アルファ酸、イソアルファ酸）を更に含有してもよい。
【００３２】
本発明の骨吸収抑制剤は、固体（例えば、粉末）、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状でもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤等のいずれの剤形をとってもよい。また、放出制御製剤の形態をとることもできる。本発明の骨吸収抑制剤は、一般式（１）のベータ酸及び／又は一般式（２）の酸化型ベータ酸からなるものであってもよい。
【００３３】
上述の各種製剤は、一般式（１）のベータ酸及び／又は一般式（２）の酸化型ベータ酸と、薬学的に許容される添加剤（賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等）と、を混和することによって調製することができる。
【００３４】
例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、上述の界面活性剤の他、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３５】
本発明の骨吸収抑制剤は、医薬、飲食品（飲料、食品）、飲食品添加物、飼料、飼料添加物等の成分として使用することができる。例えば、飲料としては、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、スポーツドリンク、栄養ドリンク等が挙げられる。食品としては、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類等が挙げられる。本発明の骨吸収抑制剤はまた、特定保健用食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。
【００３６】
飲料、食品、飼料等は、当該分野で通常使用される添加物を更に含有してもよい。そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂；グルテン等のタンパク質；大豆、エンドウ等の豆類；グルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース等の二糖類；デキストロース、デンプン等の多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール類；ビタミンＣ等のビタミン類；亜鉛、銅、マグネシウム等のミネラル類；ＣｏＱ１０、α−リポ酸、カルニチン、カプサイシン等の機能性素材、が挙げられる。これらの添加物は、各々を単独で、又は複数種を組み合わせて使用することができる。
【００３７】
本発明の骨吸収抑制剤は、ヒトに摂取されても、非ヒト哺乳動物に摂取されてもよい。摂取量及び摂取方法は、個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。好適な摂取方法としては、例えば、経口摂取が挙げられる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
【００３９】
［実施例１］
（試験サンプルの調製）
ベータ酸（主として、ルプロン、アドルプロン、コルプロン）及びアルファ酸（主として、フムロン、アドフムロン、コフムロン）の混合物（ＨＰＬＣ標準品，ＩＣＥ−２，Ｌａｂｏｒ  Ｖｅｒｉｔａｓ）をＭｅＯＨに溶解して、５ｍｇ／ｍＬのベータ酸／アルファ酸溶液を調製した。そして、この溶液を遠心分離及びフィルター濾過にかけ、更に下記条件でＨＰＬＣを行って、ルプロン溶出画分を得た。得られたルプロン溶出画分を減圧濃縮、凍結乾燥した後、２０％ＤＭＳＯ溶液に溶解して、所定濃度の試験サンプルを得た。
【００４０】
ＨＰＬＣ条件：
・カラム：  ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８（１０ｍｍ×２５０ｍｍ，資生堂）
・移動層：  ６０％ＭｅＣＮ／１０％ＭｅＯＨ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
・流速：  ３ｍＬ／ｍｉｎ
【００４１】
（ピットフォーメーションアッセイ）
ラット破骨細胞前駆細胞（プライマリーセル社）５×１０６ｃｅｌｌｓを、ラット破骨細胞培養キット（セルガレージ社）に含まれる分化誘導用培地（１０％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＲＡＮＫＬ  ＆  Ｍ−ＣＳＦを含有するα−ＭＥＭ）５ｍＬに懸濁し、これを、ハイドロキシアパタイトで被膜された２４ウェルＯＡＡＳプレート（オスコテック社）に１００μＬ／ｗｅｌｌ（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）播種した。細胞がプレートに完全に接着するまで培養した（３７℃，５％ＣＯ２）後、各ウェルに試験サンプルを加えて、更に１２日間培養した（３７℃，５％ＣＯ２）。培養後、各ウェルの表面の様子をデジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−Ｆ，キーエンス社）で観察し、吸収面積及び吸収痕跡数を計測した。コントロールとして２０％ＤＭＳＯ溶液を使用した。
【００４２】
結果を表１、２及び図１に示す。図１は、ルプロン存在下でのラット破骨細胞の骨吸収活性を示すグラフである。図１において、「吸収面積」のグラフは、コントロールに対する相対吸収面積（％）で表される骨吸収活性を示し、「吸収痕跡数」のグラフは、コントロールに対する相対吸収痕跡数（％）で表される骨吸収活性を示す。表１、２及び図１において、ルプロン濃度（μＭ）は培地中の濃度を示す。
【００４３】
【表１】
2010260827.tif 000006
【００４４】
【表２】
2010260827.tif 000007
【００４５】
表１、２及び図１から明らかなように、骨無機成分（ハイドロキシアパタイト）の分解は、ルプロン存在下で顕著に抑制された。
【００４６】
［実施例２］
（試験サンプルの調製）
実施例１と同様にしてベータ酸／アルファ酸溶液を調製した。そして、この溶液を遠心分離及びフィルター濾過にかけ、更に実施例１と同様の条件でＨＰＬＣを行って、アドルプロン溶出画分を得た。得られたアドルプロン溶出画分を減圧濃縮、凍結乾燥した後、２０％ＤＭＳＯ溶液に溶解して、所定濃度の試験サンプルを得た。
【００４７】
（ピットフォーメーションアッセイ）
得られた試験サンプルについて、実施例１と同様にしてピットフォーメーションアッセイを行った。
【００４８】
結果を表３、４及び図２に示す。図２は、アドルプロン存在下でのラット破骨細胞の骨吸収活性を示すグラフである。図２において、「吸収面積」のグラフは、コントロールに対する相対吸収面積（％）で表される骨吸収活性を示し、「吸収痕跡数」のグラフは、コントロールに対する相対吸収痕跡数（％）で表される骨吸収活性を示す。表３、４及び図２において、アドルプロン濃度（μＭ）は培地中の濃度を示す。
【００４９】
【表３】
2010260827.tif 000008
【００５０】
【表４】
2010260827.tif 000009
【００５１】
表３、４及び図２から明らかなように、骨無機成分（ハイドロキシアパタイト）の分解は、アドルプロン存在下で顕著に抑制された。
【００５２】
［実施例３］
（試験サンプルの調製）
実施例１と同様にしてベータ酸／アルファ酸溶液を調製した。そして、この溶液を遠心分離及びフィルター濾過にかけ、更に実施例１と同様の条件でＨＰＬＣを行って、コルプロン溶出画分を得た。得られたコルプロン溶出画分を減圧濃縮、凍結乾燥した後、２０％ＤＭＳＯ溶液に溶解して、所定濃度の試験サンプルを得た。
【００５３】
（ピットフォーメーションアッセイ）
得られた試験サンプルについて、実施例１と同様にしてピットフォーメーションアッセイを行った。
【００５４】
結果を表５、６及び図３に示す。図３は、コルプロン存在下でのラット破骨細胞の骨吸収活性を示すグラフである。図３において、「吸収面積」のグラフは、コントロールに対する相対吸収面積（％）で表される骨吸収活性を示し、「吸収痕跡数」のグラフは、コントロールに対する相対吸収痕跡数（％）で表される骨吸収活性を示す。表５、６及び図３において、コルプロン濃度（μＭ）は培地中の濃度を示す。
【００５５】
【表５】
2010260827.tif 000010
【００５６】
【表６】
2010260827.tif 000011
【００５７】
表５、６及び図３から明らかなように、骨無機成分（ハイドロキシアパタイト）の分解は、コルプロン存在下で顕著に抑制された。
【００５８】
［実施例４］
（酸化型アドルプロンの単離）
使用済みホップペレット（ハラタウ・トラディション種、２００６年産、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ）５００ｇを７０〜８０％エタノールに浸漬し、得られた抽出液を減圧濃縮した。濃縮液から油状物質を分離した後、残液を７０％ＭｅＯＨ／ｎ−ヘキサンで分配し、得られたｎ−ヘキサン層を先の油状物質と合わせた。そして、これを更に９０％ＭｅＯＨ／ｎ−ヘキサンで分配し、ｎ−ヘキサン層を回収した。
【００５９】
得られたｎ−ヘキサン層に対して、
シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ＳｉＯ２，６３〜２００μｍ，３５ｍｍ×２００ｍｍ，Ｍｅｒｃｋ；ジクロロメタン／ＭｅＯＨ（９９：１）  １Ｌ］、
ゲル濾過クロマトグラフィー［Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（２９ｍｍ×４０ｍｍ），ファルマシア；ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＨ／ＡｃＯＨ（３：１：０．２）］、及び
フラッシュクロマトグラフィー［ＹＭＣ−Ｇｅｌ  ＯＤＳ−Ａ  ＡＡ１２Ｓ５０（４５０ｍｍ×３８０ｍｍ），ＹＭＣ；７０％ＭｅＣＮ／５０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４  ３００ｍＬで洗浄後、９０％ＭｅＣＮ／５０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４  ３００ｍＬで溶出］
を順に行って、酸化型アドルプロン溶出画分を得た。
【００６０】
上記溶出画分をポリテトラフルオロエチレン膜で濾過し、濾液に対して更に下記条件でＨＰＬＣを行って、酸化型アドルプロン粗精製画分を得た。なお、酸化型アドルプロン粗精製画分は、溶出時間１９．５〜２３．０分の画分であった。
【００６１】
ＨＰＬＣ条件：
・カラム：  ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧ（１０ｍｍ×２５０ｍｍ，資生堂）
・移動層：  ＭｅＣＮ／３００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４（ＭｅＣＮは、まず９０％ＭｅＣＮに５分間維持し、次いで２０分かけて１００％ＭｅＣＮに変化させ、最後に１００％ＭｅＣＮに２０分間維持した。）
・流速：  ３ｍＬ／ｍｉｎ
【００６２】
上記粗精製画分に対して更に下記条件でＨＰＬＣを行って、酸化型アドルプロン精製画分を得た。なお、酸化型アドルプロン精製画分は、溶出時間１９．０〜２０．０分の画分であった。
【００６３】
ＨＰＬＣ条件：
・カラム：  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ＰＥ（１０ｍｍ×２５０ｍｍ，ナカライテスク）
・移動層：  ７０％ＭｅＣＮ／５％ＡｃＯＨ
・流速：  ３ｍＬ／ｍｉｎ
【００６４】
（単離化合物の分析）
上記精製画分を減圧濃縮、凍結乾燥し、得られた油状物について、高分解能質量分析及びＮＭＲ解析による構造決定を行った。
【００６５】
質量分析：
質量分析は、ＦＡＢ法（ＭＳｔａｔｉｏｎ  ７００，ＪＥＯＬ）により行った。結果は下記の通りである。
ｍ／ｚ：４３１．２７９８（[Ｍ＋Ｈ]＋）
【００６６】
１Ｈ−ＮＭＲ：
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定は、５００ＭＨｚの装置（ＪＥＯＬ  ＥＣＡ−５００）を用いて行った。溶媒として重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を使用し、ピークの帰属は、残留クロロホルム（ＣＨＣｌ３）の共鳴周波数を７．２７ｐｐｍとして行った。結果（スペクトル図）は図４に示す通りであり、主なピークは下記の通りである。
【００６７】
・成分Ａ：δ（ｐｐｍ）  ５．０７（ｍ），４．９０（ｍ），４．６３（ｍ），３．３４（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．８３（ｄｄ，Ｊ＝９．２，１３．８Ｈｚ），２．７６（ｄｄ，Ｊ＝６．１，１３．８Ｈｚ），２．６５（ｍ），２．６２（ｍ），２．４４（ｍ），２．０２（ｍ），１．８１（ｍ），１．６３４（ｓ），１．６３（ｓ），１．６２６（ｓ），１．４９（ｓ），１．４７（ｍ），１．４４（ｓ），１．３７（ｓ），１．０８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），０．９９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）．
・成分Ｂ：δ（ｐｐｍ）  ５．０７（ｍ），４．９０（ｍ），４．６３（ｍ），３．３０（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．８３（ｄｄ，Ｊ＝９．２，１３．８Ｈｚ），２．７６（ｄｄ，Ｊ＝６．１，１３．８Ｈｚ），２．６５（ｍ），２．６２（ｍ），２．４４（ｍ），２．０２（ｍ），１．６８（ｍ），１．６３４（ｓ），１．６３（ｓ），１．６２６（ｓ），１．５０（ｓ），１．４５（ｓ），１．４２（ｍ），１．３６（ｓ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），０．８６（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．
【００６８】
１３Ｃ−ＮＭＲ：
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定は、５００ＭＨｚの装置（ＪＥＯＬ  ＥＣＡ−５００）を用いて行った。溶媒として重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を使用し、ピークの帰属は、残留クロロホルム（ＣＨＣｌ３）の共鳴周波数を７７．０ｐｐｍとして行った。結果（スペクトル図）は図５に示す通りであり、主なピークは下記の通りである。
【００６９】
・成分Ａ：δ（ｐｐｍ）  ２０６．２，  ２０４．９，  １９８．８，  １９２．８，  １３８．９，  １３６．６，  １３６．５，  １１９．０３，  １１６．６，  １１５．２５，  １１１．７，  ８５．２，  ６１．８，  ４１．７，  ４０．９，  ３７．１，  ３４．０，  ２７．９，  ２５．９，  ２５．９，  ２５．８，  １８．１，  １８．１，  １７．７，  １５．４，  １１．６．
・成分Ｂ：δ（ｐｐｍ）  ２０６．３，  ２０４．９，  １９８．７，  １９２．９，  １３８．７，  １３６．６，  １３６．５，  １１８．９９，  １１６．６，  １１５．４５，  １１１．７，  ８５．１，  ６１．９，  ４２．０，  ４１．６５，  ３７．１，  ３３．９，  ２５．９，  ２５．９，  ２５．９，  ２５．８，  １８．１，  １８．１，  １８．０，  １７．７，  １２．１．
【００７０】
以上の分析結果及びイソアルファ酸の文献報告値（ファイトケミカル・アナリシス，２００７年，１８巻，３７１〜３７７ページ）により、単離化合物が下記式（３）の酸化型アドルプロンであることが確認された。なお、分析した油状物は、環上４級不斉炭素に関する２種のジアステレオマー（成分Ａ、Ｂ）の混合物であり、両者の混合比（Ａ：Ｂ）は約５：４であった。
【００７１】
【化５】
2010260827.tif 000012
【００７２】
（試験サンプルの調製）
酸化型アドルプロン精製画分を減圧濃縮、凍結乾燥した後、２０％ＤＭＳＯ溶液に溶解して、所定濃度の試験サンプルを得た。
【００７３】
（ピットフォーメーションアッセイ）
得られた試験サンプルについて、実施例１と同様にしてピットフォーメーションアッセイを行った。
【００７４】
結果を表７、８及び図６に示す。図６は、酸化型アドルプロン存在下でのラット破骨細胞の骨吸収活性を示すグラフである。図６において、「吸収面積」のグラフは、コントロールに対する相対吸収面積（％）で表される骨吸収活性を示し、「吸収痕跡数」のグラフは、コントロールに対する相対吸収痕跡数（％）で表される骨吸収活性を示す。表７、８及び図６において、酸化型アドルプロン濃度（μＭ）は培地中の濃度を示す。
【００７５】
【表７】
2010260827.tif 000013
【００７６】
【表８】
2010260827.tif 000014
【００７７】
表７、８及び図６から明らかなように、骨無機成分（ハイドロキシアパタイト）の分解は、酸化型アドルプロン存在下で顕著に抑制された。
【００７８】
以上の実施例により、本発明の骨吸収抑制剤は、破骨細胞による骨無機成分（ハイドロキシアパタイト）の分解を抑制し、これを介して骨吸収を効果的に抑制することが可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の骨吸収抑制剤は、骨粗鬆症の改善及び予防に利用可能である。
【図１】
2010260827.tif 000018
【図２】
2010260827.tif 000019
【図３】
2010260827.tif 000020
【図４】
2010260827.tif 000021
【図５】
2010260827.tif 000022
【図６】
2010260827.tif 000023