(57)【要約】【課題】イレース光の光量ロスを生じることなく位相変調でき、必要最小限のイレース光パワーで、顕著な超解像機能を誘導できる超解像顕微鏡を提供する。【解決手段】試料63中の物質を安定状態から第１量子状態に励起して発光させる第１照明光および該物質を更に他の量子状態に遷移させて発光を抑制する第２照明光を、一部空間的に重ね合わせて出射する光源部20と、光源部20からの第１照明光および第２照明光を試料63に集光して照射する顕微鏡対物レンズ62を含む照明光学系と、第１照明光および第２照明光の照射により試料63から発光する光応答信号を検出する検出部50と、顕微鏡対物レンズ62を含む光学系の光路中に配置され、第２照明光の一部を空間変調する変調領域3を有し、顕微鏡対物レンズ62により、第１照明光が極大値を持ち、第２照明光が極小値を持つように試料63に集光させるための空間変調光学素子1と、を備える。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を安定状態から第１量子状態に励起して発光させるための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させて前記発光を抑制するための第２照明光を、一部空間的に重ね合わせて前記試料に集光して照射する、顕微鏡対物レンズを含む照明光学系と、
前記第１照明光および前記第２照明光の照射により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
前記照明光学系の前記第１照明光および前記第２照明光が通る光路中に配置され、前記第２照明光の少なくとも一部を空間変調する変調領域を有し、前記顕微鏡対物レンズにより、前記第１照明光を前記試料上に光強度の極大値を持つように集光させ、かつ、前記第２照明光を前記試料上に光強度の極小値を持つように集光させるための空間変調光学素子と、
を備えることを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】
前記照明光学系は、シングルモードファイバを有し、該シングルモードファイバから前記第１照明光および前記第２照明光を、空間的に光軸を一致させて射出させることを特徴とする請求項１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項３】
前記照明光学系は、前記顕微鏡対物レンズの集光点を含む近傍領域において、前記第２照明光を、少なくとも光軸方向に中空部を有する中空パターン状のビーム形状で集光させることを特徴とする請求項１または２に記載の超解像顕微鏡。
【請求項４】
前記空間変調光学素子は、前記変調領域が、前記第１照明光に対しては反射作用または透過型の位相変調作用を有し、前記第２照明光に対しては透過型の位相変調作用を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項５】
前記照明光学系は、前記第１照明光および前記第２照明光を偏向して前記試料を走査する走査光学系を有し、
前記空間変調光学素子は、前記走査光学系における共役瞳面に配置されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項６】
前記走査光学系における共役瞳面は、前記顕微鏡対物レンズの瞳面であることを特徴とする請求項５に記載の超解像顕微鏡。
【請求項７】
前記変調領域は、多層膜を含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項８】
試料中の少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を安定状態から第１量子状態に励起して発光させるための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させて前記発光を抑制するための第２照明光を、一部空間的に重ね合わせて前記試料に集光して照射する、顕微鏡対物レンズを含む照明光学系と、
前記第１照明光および前記第２照明光の照射により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
を有する超解像顕微鏡の前記照明光学系の前記第１照明光および前記第２照明光が通る光路中に配置される空間変調光学素子であって、
前記顕微鏡対物レンズにより、前記第１照明光が前記試料上に光強度の極大値を持つように集光され、かつ、前記第２照明光が前記試料上に光強度の極小値を持つように集光されるように、前記第２照明光の少なくとも一部を空間変調する変調領域を有することを特徴とする空間変調光学素子。
【請求項９】
前記変調領域は、光学基板上に分割して形成された複数領域のうち、一部の領域に形成され、前記第１照明光に対しては反射作用または透過型の位相変調作用を有し、前記第２照明光に対しては透過型の位相変調作用を有することを特徴とする請求項８に記載の空間変調光学素子。
【請求項１０】
前記変調領域は、当該変調領域を透過した前記第２照明光の電場振幅の符号を、他の領域を透過した前記第２照明光の電場振幅の符号と異ならせることを特徴とする請求項９に記載の空間変調光学素子。
【請求項１１】
前記変調領域は、当該変調領域を透過した前記第２照明光の電場振幅の絶対値を、他の領域を透過した前記第２照明光の電場振幅の絶対値と同じにすることを特徴とする請求項１０に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１２】
前記変調領域は、前記第１照明光に対して反射作用を有することを特徴とする請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の空間変調光学素子。
【請求項１３】
前記変調領域は、前記第１照明光に対して透過型の位相変調作用を有し、該変調領域を透過した前記第１照明光の電場振幅の符号を、他の領域を透過した前記第１照明光の電場振幅の符号と同じにすることを特徴とする請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の空間変調光学素子。
【請求項１４】
前記変調領域は、当該変調領域を透過した前記第１照明光の電場振幅の絶対値を、他の領域を透過した前記第１照明光の電場振幅の絶対値と同じにすることを特徴とする請求項１３に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１５】
前記変調領域は、多層膜を含むことを特徴とする請求項８乃至１４のいずれか一項に記載の空間変調光学素子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を複数の波長の光により照明して、高い空間分解能で観察する高性能かつ高機能の新規な超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明して二重共鳴吸収過程を誘導することにより、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観察するものである。この原理について、図７〜図１０を参照して説明する。図７は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図７に示す基底状態（Ｓ０状態：安定状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図８に示す第１励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図９に示す第２励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１０に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図９の吸収過程や図１０の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図８のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図９のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図９の励起状態から図１０に示す基底状態への蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法は、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能である。すなわち、図７に示す最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有のエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で試料を照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能である。しかし、一般に、いくつかの分子は、吸収帯の波長領域が重複するため、単一波長で試料を照明する場合には、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１１は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１励起状態Ｓ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２励起状態Ｓ２に励起されている様子を示している。なお、図１１は、ある種の分子のＳ２状態からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１１に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１２は、図１１と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１２において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
さらに、波長λ２が蛍光発光帯域と重複するときは、誘導放出過程により分子は、Ｓ１状態から高位の振動準位に強制的に遷移するので、蛍光抑制効果はさらに増強される。言い換えると、波長λ２の光照射により、分子をＳ１状態以外の蛍光収率の低い量子準位に強制的に遷移させれば、蛍光抑制効果が発現することになる。このような分子としては、フォトクロミック性の分子、希土類や金属を含む蛍光体、量子ドット等がある。
【００１６】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１７】
ところが、図１２の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を、空間的に一部重ね合わせて蛍光領域を抑制するので、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を利用した超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１８】
例えば、ローダミン６Ｇ色素を用いた場合、波長５３２ｎｍの光（ポンプ光）を照射すると、ローダミン６Ｇ分子は、Ｓ０状態からＳ１状態へ励起されて波長５６０ｎｍにピークを有する蛍光を発光する。この際、波長５９９ｎｍの光（イレース光）を照射すると、二重共鳴吸収過程が起こって、ローダミン６Ｇ分子は蛍光発光がしにくいＳ２状態に遷移する。すなわち、これらのポンプ光とイレース光とをローダミン６Ｇに同時に照射すると蛍光が抑制されることになる。
【００１９】
図１３は、従来提案されている超解像顕微鏡の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット１１０、スキャンユニット１３０および顕微鏡ユニット１５０からなっている。
【００２０】
光源ユニット１１０は、ポンプ光用光源１１１およびイレース光用光源１１２を有し、ポンプ光用光源１１１から出射されるポンプ光をダイクロイックプリズム１１４に入射させ、イレース光用光源１１２から出射されるイレース光は、位相板１１３により位相変調してからダイクロイックプリズム１１４に入射させて、ダイクロイックプリズム１１４でポンプ光とイレース光とを同軸上に合成して出射させている。
【００２１】
ここで、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察する場合には、ポンプ光用光源１１１は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザを用い、その２倍高調波である波長５３２ｎｍの光をポンプ光として出射するように構成される。また、イレース光用光源１１２は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザとラマンシフタとを用い、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍高調波をラマンシフタで波長５９９ｎｍに変換した光をイレース光として出射するように構成される。
【００２２】
位相板１１３は、光軸の周りをイレース光の位相差が２π周回するように構成されるもので、例えば図１４に示すように、光軸の周りに独立した８領域を有し、イレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なるようにガラス基板をエッチングして形成される。この位相板１１３を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺された中空状のイレース光が生成される。
【００２３】
スキャンユニット１３０は、光源ユニット１１０から同軸で出射されるポンプ光およびイレース光を、ハーフプリズム１３１を通過させた後、２枚のガルバノミラー１３２および１３３により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット１５０に出射させる。また、スキャンユニット１３０は、顕微鏡ユニット１５０から入射する蛍光を、往路と逆の経路を辿ってハーフプリズム１３１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ１３４、ピンホール１３５、ノッチフィルタ１３６および１３７を経て光電子増倍管１３８で受光するようになっている。
【００２４】
図１３は、図面を簡略化するため、ガルバノミラー１３２，１３３を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ１３６および１３７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール１３５は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００２５】
顕微鏡ユニット１５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット１３０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム１５１で反射させて、顕微鏡対物レンズ１５２により少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料１５３上に集光させる。また、観察試料１５３で発光した蛍光は、再び顕微鏡対物レンズ１５２でコリメートしてハーフプリズム１５１で反射させることにより、再び、スキャンユニット１３０に戻すとともに、ハーフプリズム１５１を通過する蛍光の一部は接眼レンズ１５４に導いて、蛍光像として目視観察できるようにしている。
【００２６】
この超解像顕微鏡によると、観察試料１５３の集光点上においてイレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域に存在する蛍光ラベラー分子のみを計測できる。したがって、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列すれば、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する顕微鏡画像を形成することが可能となる。
【００２７】
ところで、図１３に示した超解像顕微鏡において、解像度およびＳ／Ｎの良好な顕微鏡画像を得るためには、ポンプ光の光路とイレース光の光路とを完全に同軸に合わせて、焦点面においてポンプ光のピーク位置をイレース光の中央中空部に完全に一致させる必要がある。
【００２８】
しかしながら、この超解像顕微鏡では、イレース光を位相板１１３で位相変調してからダイクロイックプリズム１１４に入射させて、ダイクロイックプリズム１１４において全く独立した光路から入射するポンプ光と合成するようにしている。このため、ポンプ光と位相変調されたイレース光とが完全に同軸となるように、ポンプ光用光源１１１、イレース光用光源１１２、位相板１１３およびダイクロイックプリズム１１４を光学的に位置調整するのが困難となり、焦点面において、ポンプ光のピーク位置がイレース光の辺緑部にずれて、ポンプ光の集光領域全体が蛍光抑制され、解像度およびＳ／Ｎの劣化を招くことが懸念される。
【００２９】
このような問題を解決するものとして、本発明者は、ポンプ光およびイレース光を、同心円状に２分割した波長選択領域を有する輪帯フィルタに入射させて、ポンプ光は内側の円形の波長選択領域を透過させ、イレース光は外側の輪帯の波長選択領域を透過させることにより、ポンプ光およびイレース光を完全に同軸とし、その後、イレース光については、輪帯位相板により位相変調してから、これらポンプ光およびイレース光を顕微鏡対物レンズに入射させることにより、ポンプ光は試料上に光強度の極大値を持つように集光させ、イレース光は試料上に光強度の極小値を持つように集光させるようにした超解像顕微鏡を提案している（例えば、特許文献３参照）。
【００３０】
この超解像顕微鏡によれば、ポンプ光とイレース光とを合成してから、輪帯フィルタおよび輪帯位相板に入射させるようにしたので、面倒な光学調整を要することなく、ポンプ光およびイレース光を観察試料の全く同じ結像点に集光させることができ、超解像効果を確実に発現することが可能となる。
【００３１】
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献３】特開２００８−５８００３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
しかしながら、本発明者による実験検討によると、先に提案した上記特許文献３に開示の超解像顕微鏡には、改良すべき点があることが判明した。すなわち、この超解像顕微鏡では、イレース光については、輪帯フィルタにより、光束の中央部を意図的にカットしている。このため、カットによる光量ロス分、蛍光抑制で用いるイレース光パワーが弱くなって、超解像機能の発現が弱くなる。その結果、顕著な超解像機能を誘導するには、輪帯フィルタによる光量ロスを補償するように、イレース光光源から出射するイレース光パワーを高くする必要があり、消費電力の増大等を招く場合がある。
【００３３】
また、ポンプ光とイレース光との合成光からイレース光を分離して位相変調するのに、輪帯フィルタと輪帯位相板との２枚の光学素子を要するため、コスト高になるとともに、イレース光のみを確実に位相変調するように位置調整するのに時間を要することが懸念される。
【００３４】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の第１の目的は、イレース光に相当する第２照明光を、光量ロスを生じることなく位相変調でき、必要最小限の第２照明光パワーで、顕著な超解像機能を誘導できる超解像顕微鏡を提供することにある。
【００３５】
さらに、本発明の第２の目的は、簡単かつ安価に構成できて、イレース光に相当する第２照明光のみを確実に空間変調できる超解像顕微鏡に用いる空間変調光学素子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
上記第１の目的を達成する請求項１に係る超解像顕微鏡の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を安定状態から第１量子状態に励起して発光させるための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させて前記発光を抑制するための第２照明光を、一部空間的に重ね合わせて前記試料に集光して照射する、顕微鏡対物レンズを含む照明光学系と、
前記第１照明光および前記第２照明光の照射により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
前記照明光学系の前記第１照明光および前記第２照明光が通る光路中に配置され、前記第２照明光の少なくとも一部を空間変調する変調領域を有し、前記顕微鏡対物レンズにより、前記第１照明光を前記試料上に光強度の極大値を持つように集光させ、かつ、前記第２照明光を前記試料上に光強度の極小値を持つように集光させるための空間変調光学素子と、
を備えることを特徴とするものである。
【００３７】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の超解像顕微鏡において、
前記照明光学系は、シングルモードファイバを有し、該シングルモードファイバから前記第１照明光および前記第２照明光を、空間的に光軸を一致させて射出させることを特徴とするものである。
【００３８】
請求項３に係る発明は、請求項１または２に記載の超解像顕微鏡において、
前記照明光学系は、前記顕微鏡対物レンズの集光点を含む近傍領域において、前記第２照明光を、少なくとも光軸方向に中空部を有する中空パターン状のビーム形状で集光させることを特徴とするものである。
【００３９】
請求項４に係る発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記空間変調光学素子は、前記変調領域が、前記第１照明光に対しては反射作用または透過型の位相変調作用を有し、前記第２照明光に対しては透過型の位相変調作用を有することを特徴とするものである。
【００４０】
請求項５に係る発明は、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記照明光学系は、前記第１照明光および前記第２照明光を偏向して前記試料を走査する走査光学系を有し、
前記空間変調光学素子は、前記走査光学系における共役瞳面に配置されていることを特徴とするものである。
【００４１】
請求項６に係る発明は、請求項５に記載の超解像顕微鏡において、
前記走査光学系における共役瞳面は、前記顕微鏡対物レンズの瞳面であることを特徴とするものである。
【００４２】
請求項７に係る発明は、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記変調領域は、多層膜を含むことを特徴とするものである。
【００４３】
さらに、上記第２の目的を達成する請求項８に係る超解像顕微鏡に用いる空間変調光学素子の発明は、
試料中の少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を安定状態から第１量子状態に励起して発光させるための第１照明光、および、前記物質を更に他の量子状態に遷移させて前記発光を抑制するための第２照明光を、一部空間的に重ね合わせて前記試料に集光して照射する、顕微鏡対物レンズを含む照明光学系と、
前記第１照明光および前記第２照明光の照射により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
を有する超解像顕微鏡の前記照明光学系の前記第１照明光および前記第２照明光が通る光路中に配置される空間変調光学素子であって、
前記顕微鏡対物レンズにより、前記第１照明光が前記試料上に光強度の極大値を持つように集光され、かつ、前記第２照明光が前記試料上に光強度の極小値を持つように集光されるように、前記第２照明光の少なくとも一部を空間変調する変調領域を有することを特徴とするものである。
【００４４】
請求項９に係る発明は、請求項８に記載の空間変調光学素子において、
前記変調領域は、光学基板上に分割して形成された複数領域のうち、一部の領域に形成され、前記第１照明光に対しては反射作用または透過型の位相変調作用を有し、前記第２照明光に対しては透過型の位相変調作用を有することを特徴とするものである。
【００４５】
請求項１０に係る発明は、請求項９に記載の空間変調光学素子において、
前記変調領域は、当該変調領域を透過した前記第２照明光の電場振幅の符号を、他の領域を透過した前記第２照明光の電場振幅の符号と異ならせることを特徴とするものである。
【００４６】
請求項１１に係る発明は、請求項１０に記載の超解像顕微鏡において、
前記変調領域は、当該変調領域を透過した前記第２照明光の電場振幅の絶対値を、他の領域を透過した前記第２照明光の電場振幅の絶対値と同じにすることを特徴とするものである。
【００４７】
請求項１２に係る発明は、請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の空間変調光学素子において、
前記変調領域は、前記第１照明光に対して反射作用を有することを特徴とするものである。
【００４８】
請求項１３に係る発明は、請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の空間変調光学素子において、
前記変調領域は、前記第１照明光に対して透過型の位相変調作用を有し、該変調領域を透過した前記第１照明光の電場振幅の符号を、他の領域を透過した前記第１照明光の電場振幅の符号と同じにすることを特徴とするものである。
【００４９】
請求項１４に係る発明は、請求項１３に記載の超解像顕微鏡において、
前記変調領域は、当該変調領域を透過した前記第１照明光の電場振幅の絶対値を、他の領域を透過した前記第１照明光の電場振幅の絶対値と同じにすることを特徴とするものである。
【００５０】
請求項１５に係る発明は、請求項８乃至１４のいずれか一項に記載の空間変調光学素子において、
前記変調領域は、多層膜を含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００５１】
本発明に係る超解像顕微鏡によれば、第１照明光および第２照明光が通る照明光学系の光路中に、第２照明光の少なくとも一部を空間変調する変調領域を有する空間変調光学素子を配置して、第２照明光を変調するので、光量ロスを生じることなく第２照明光を空間変調できる。したがって、必要最小限の第２照明光パワーで、顕著な超解像機能を誘導することができる。
【００５２】
さらに、本発明に係る超解像顕微鏡に用いる空間変調光学素子によれば、１つの光学部材として簡単かつ安価に構成できるとともに、イレース光に相当する第２照明光のみを確実に空間変調することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
（本発明の概要）
先ず、本発明の実施の形態の説明に先立って、本発明の概要について説明する。なお、以下の説明では、第１照明光をポンプ光、第２照明光をイレース光として説明する。本発明の基本的な考え方は、超解像顕微鏡を組み立てる際の最大の難点であるポンプ光とイレース光との位置合わせを機械的な精度で実現し、個別ビームに対する光軸調整作業を省いた点にある。その代わり、照明光学系内には、イレース光を空間変調する変調領域を有する空間変調光学素子を配置する。この空間変調光学素子は、例えば、イレース光のビーム面および集光光学系で規定される瞳面を複数の光学領域に分割し、その一部の光学領域を、ポンプ光に対しては反射作用または透過型の位相変調作用を有し、イレース光に対しては透過型の位相変調作用を有する変調領域とする。すなわち、変調領域を、ポンプ光に対しては反射鏡または分光分散素子として機能させ、イレース光に対しては位相変調素子として機能させることにより、調整の必要がなく、かつイレース光の光量ロスがないシステム構成をもつ超解像顕微鏡を提案することにある。
【００５４】
このため、ポンプ光およびイレース光は、例えば、ピンホールのような微小な射出口を通して同時に放射させる。これらの光は、色収差の無い光学系で同軸にコリメートして顕微鏡光学系に導入して、同一の顕微鏡対物レンズにより試料面に集光させ、必要に応じて、試料と集光したビームとを空間的に相対的に走査して、顕微鏡鏡計測を行う。
【００５５】
この場合、強調すべき点は、ポンプ光およびイレース光を、ピンホールのような微小な射出口から放射させると、これらの光は同じ放射角で放射されるので、色収差の無い光学系でコリメートすれば、多少平行度に関して誤差が生じても、全く同じ光路を空間伝播する。したがって、色収差の無い対物レンズで集光すれば、位置ずれすることなくポンプ光およびイレース光を試料面に集光させることができる。
【００５６】
このとき重要なのは、イレース光のみ空間変調して、焦点面でのビーム形状を中空状に整形し、ポンプ光は空間変調を受けることなく、ガウスビームとして集光させる点にある。このため、本発明では、ポンプ光とイレース光とが同軸にコリメートされた光路中に、波長選択性を有する変調領域を備える空間変調光学素子を配置し、これによりイレース光のみを空間変調してビーム整形を行う。ここで、空間変調光学素子の変調領域は、光学多層膜、回折光子、プリズムのような波長分散性を有する変調素子を用いて構成することができる。
【００５７】
すなわち、同軸・同径に揃ったポンプ光およびイレース光の光路中に、ポンプ光およびイレース光に対して光学的応答が異なる空間変調光学素子を配置し、ポンプ光に対しては通常のドーナッツ状でないガウスビームを集光させ、イレース光に対しては位相変調作用により、ドーナッツ状のスポットを集光させるようにすればよい。
【００５８】
超解像顕微鏡法では、ポンプ光の波長とイレース光の波長とが離れているので、その差、すなわち波長分散性を利用して、同じ光学素子でありながら、それぞれの光に対して光応答が異なる空間変調光学素子を設計することができる。その有力な方法として、光学多層膜が挙げられる。光学多層膜においては、共鳴波長では良質な反射鏡として機能し、共鳴波長から外れた波長では反射率が著しく低下し、単なる透過性の膜として機能する。しかも、多層膜の屈折率は１より大きいので、位相遅れを発生させる位相板としても機能させることができる。
【００５９】
（第１実施の形態）
図１および図２は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡に用する空間変調光学素子を説明するための図で、図１（ａ）および（ｂ）は、空間変調光学素子の概略構成を示す断面図および平面図、図２は、その光学的特性を示す図である。この空間変調光学素子１は、ガラス基板２を、ポンプ光およびイレース光の円形瞳面内で、同心円状に複数の領域に分割し、その円形瞳面の中央部分に相当する領域を変調領域３として、該変調領域３に多層膜４をコートしたものである。ここでは、多層膜４は、ポンプ光に対して反射作用を有する光学反射膜として機能する。
【００６０】
図１に示すように、多層膜４は、ポンプ光に対して屈折率が異なる第１物質５（屈折率ｎａ(λ)）と第２物質６（屈折率ｎｂ(λ)）とを、ガラス基板１上にバッファ層７を介して交互に蒸着により積層して構成する。これら第１物質５および第２物質６は、それぞれの膜厚をｄａおよびｄｂとすると、ポンプ光に対して光学反射膜として機能させる場合は、ポンプ光の波長をλ１とすると、例えば、光路長がλ１／４であればよいので、下記（１）式を満たせばよい。
【００６１】
［数１］
ｄａｎａ(λ１)＝λ１／４，ｄｂｎｂ(λ１)＝λ１／４          （１）  
【００６２】
この条件で設計された多層膜４は、ポンプ光とは波長が異なるイレース光については干渉条件から外れるので、イレース光は反射させずに通過させる。その際、イレース光は位相遅れを受ける。すなわち、多層膜４は、イレース光に対しては位相変調作用を有し、位相板として機能する。したがって、この場合、多層膜４を通過したイレース光と、通過しないイレース光とを比較すると、同じ瞳面で下記（２）式で示される位相差δが発生する。なお、（２）式において、λ２は、イレース光の波長を示し、ｍは第１物質５と第２物質６とを対とする総対数を示す。
【００６３】
［数２］
δ＝ｍ｛ｄａｎａ(λ２)＋ｄｂｎｂ(λ２)｝−ｍ（ｄａ＋ｄｂ）      （２）
【００６４】
ここで、位相差δが、下記の（３）式を満たす場合は、多層膜４を通過したイレース光の波面と、それ以外の領域を通過したイレース光の波面とを比較すると、図２に示すように、電場振幅において完全に同じ振幅で符号が反転する。なお、（３）式において、Ｌは、整数を示す。
【００６５】
［数３］
δ＝（２Ｌ＋１）λ２／２          （３）  
【００６６】
したがって、瞳面内において、多層膜４を通過しないイレース光と、通過したイレース光との光量が同じであれば、瞳面内を通過したイレース光を集光すると、焦点において完全に電場強度が相殺される。すなわち、焦点面において、干渉により光強度が存在しない、すなわち光強度の極小値を有するドーナッツ形状の集光ビームが得られる。これは、例えば、特許第3993553号公報に開示されている輪体型の位相板と同等の機能をもつ。すなわち、イレース光を、図１に示す空間変調光学素子１を通過させることにより、超解像顕微鏡用の集光イレース光スポットを形成することができる。
【００６７】
一方、ポンプ光は、多層膜４を有する変調領域３では反射されるために、通過できない。結果的に、空間変調光学素子１を通過できるのは、位相変調を受けない多層膜４以外の領域を通過したポンプ光のみである。この場合は、例えば、Y.Iketaki,et.al.Opt.Lett.,19(1994)1804-1806.に開示されているように、光強度の極大値を有する通常の集光ビームが得られる。
【００６８】
したがって、図１および図２に示した空間変調光学素子１に、同じ瞳径のポンプ光とイレース光とを同軸に入射させて、その透過光を顕微鏡対物レンズにより集光させれば、イレース光は、顕微鏡対物レンズの集光点を含む近傍領域において、少なくとも光軸方向に中空部を有する中空パターン状（ドーナッツ形状）のビーム形状、より具体的には、カプセル状（３次元的なダークホール形状）または管状（マカロニ状）に集光させることができ、ポンプ光は通常の集光ビームの形状で集光させることができる。しかも、ポンプ光およびイレース光は、同じ空間点に集光するので、超解像顕微鏡における最大の課題であるイレース光とポンプ光との光学調整を省くことができる。なお、空間変調光学素子１にポンプ光およびイレース光を入射させるには、ポンプ光およびイレース光を同じシングルモードファイバから取り出し、これを色収差の無いレンズでコリメートして入射させるように、照明光学系を構成するのが好ましい。
【００６９】
このように照明光学系を構成すれば、以下のような効果が期待できる。
（１）ポンプ光およびイレース光を、シングルモードファイバから取り出すので、これらを完全球面波とすることができる。したがって、色収差の無いレンズでコリメートすれば、波面収差の無い完全な平面波を得ることができるので、空間変調光学素子１において位相変調をより確実に行うことが可能となる。
（２）ポンプ光およびイレース光を、シングルモードファイバから取り出して、色収差のないレンズでコリメートすることにより、空間変調光学素子１が多少傾いて配置されたり、空間変調光学素子１のガラス基板２の平行度が悪かったりした場合でも、色収差のない顕微鏡対物レンズで集光すれば、試料上に同じ空間ポイントで結像させることができ、ビームずれを解消できる。
（３）シングルモードファイバの射出口は、機械的に固定されるので、ポンプ光およびイレース光の集光点の位置が空間的に変動しない、極めて機械的に安定な照明光学系を構築することができる。
【００７０】
ところで、上述したように、空間変調光学素子１の多層膜４を通過したイレース光と、それ以外の領域を通過したイレース光とが、電場振幅において完全に同じ振幅で符号が反転している場合、焦点面においてドーナッツ形状の集光ビームを得るには、多層膜４を通過しないイレース光と通過したイレース光との光量が等しいことが必要条件である。具体的には、瞳面に入射するイレース光の強度が均一であるならば、多層膜４の面積をＳＡ、全瞳面の面積をＳ０とすると、下記の（４）式を満たす必要がある。
【００７１】
［数４］
ＳＡ＝Ｓ０／２          （４）  
【００７２】
特に、図１（ｂ）に示すように、瞳の形状が半径Ｒの円形で、変調領域３も半径ρの円形である場合は、（４）式から、Ｒ／ρは、２１／２となる。しかしながら、これは限定された最適条件である。つまり、瞳および変調領域３の形状やサイズが調整できる場合は、「変調領域３を通過したイレース光とそれ以外の領域を通過したイレース光とは、電場振幅において完全に同じ振幅で符号が反転している」と言う条件は、絶対的なものではなく、「変調領域３を通過したイレース光とそれ以外の領域を通過したイレース光とは、符号が反転している」と言う極めて広い最適条件が提示できる。
【００７３】
ここで、イレース光の電場の最大振幅をＥｅとし、多層膜４による位相遅れ角をδｅとする。この場合、多層膜４を通過したイレース光とそれ以外の領域を通過したイレース光との振幅を同じ瞳面で調べると、多層膜４を通過したイレース光の振幅強度Ｅinは、下記の（５）式で表される。なお、下式において、ωｅはイレース光の周波数、上部に右矢を付して示すｋｅおよびｒｅは、それぞれ波数ベクトルおよび位置ベクトルである。
【００７４】
【数５】
2010015026.tif 000003
【００７５】
一方、変調領域３外を通過したイレース光の振幅強度Ｅoutは、下記の（６）式で表される。
【００７６】
【数６】
2010015026.tif 000004
【００７７】
ここで、上記（５）式と（６）式とを比較すると、δｅだけ位相がずれている。したがって、ＥinおよびＥoutは、Ｅｅから−Ｅｅの間で任意の値をとるので、δｅの値によって、符号が異なる値をとることになる。特に、上記（３）式の場合は、振幅の絶対値も同じになる特別な場合である。
【００７８】
以上のことから、ＥinおよびＥoutは、符号が異なれば、上記（４）式の条件に限らず、下記の（７）式で示されるより広い条件となる。
【００７９】
［数７］
（Ｓ０−ＳＡ）Ｅout＋ＳＡＥin＝０            （７）  
【００８０】
すなわち、（７）式の条件で、Ｓ０とＳＡとの比率や位相差δを調整することで、イレース光の焦点における電場を相殺し、ゼロとすることができる。
【００８１】
したがって、ＥinとＥout との符号が異なれば、必ずしも（３）式の条件を満たさずとも、Ｓ０とＳＡとの比率の調整で（７）式の条件を実現することができる。具体的には、多層膜４の面積ＳＡの調整で可能であるが、瞳径全体の面積Ｓ０をアイリスにより調整して対応することも可能であり、従来法と比較しても、ゆるい調整で超解像顕微鏡法の照明条件を実現することが可能となる。
【００８２】
以上、イレース光に対する空間変調光学素子１の条件について説明したが、ポンプ光に対しても、更に広い適用条件を提示することができる。
【００８３】
（第２実施の形態）
図３は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡に用する空間変調光学素子の光学的特性を示す図である。この空間変調光学素子１は、図１に示した構成において、多層膜４を、ポンプ光に対して透過型の位相板として機能させるようにしたものである。
【００８４】
図３において、ポンプ光の電場の最大振幅をＥｐとし、多層膜４による位相遅れ角をδｐとする。この場合、多層膜４を通過したポンプ光とそれ以外の領域を通過したポンプ光との振幅を同じ瞳面で調べると、多層膜４を通過したポンプ光の振幅強度Ｅinは、下記の（８）式で表される。なお、下式において、ωｐはポンプ光の周波数、上部に右矢を付して示すｋｐおよびｒｐは、それぞれ波数ベクトルおよび位置ベクトルである。
【００８５】
【数８】
2010015026.tif 000005
【００８６】
一方、変調領域３外を通過したポンプ光の振幅強度Ｅoutは、下記の（９）式で表される。
【００８７】
【数９】
2010015026.tif 000006
【００８８】
上記（８）式と（９）式とを比較すると、イレース光の場合と同様に、δｐだけ位相がずれている。したがって、ＥinおよびＥoutは、Ｅｐから−Ｅｐの間で任意の値をとるので、ポンプ光の場合は、δｐの値を調整して、同じ符号の値をとるように設定する。
【００８９】
この場合、図３に示すように、多層膜４を通過したポンプ光と、それ以外の領域を通過したポンプ光とは、同じ極性を持つので、集光した際に、イレース光とは異なり電場は相殺されずに加算される。結果として、この場合は、焦点で強度を有するガウス型の集光スポットが得られる。すなわち、多層膜４を設計する際、δｐとδｅとを調整して、ポンプ光では同極性とし、イレース光では異なる極性とすればよい。具体的には、ポンプ光とイレース光とは、波長が異なるので、多層膜４における屈折率も異なる。したがって、屈折率差を利用して、層数や厚みを最適化する。例えば、吸収端近傍の異常分散が強いような波長領域において、ポンプ光とイレース光との屈折率差が十分大きい透明な物質を用いることで、多層膜にせずとも１層で上記と同じ効果をもつ、最も単純な空間変調光学素子を構成可能である。
【００９０】
（第３実施の形態）
図４は、本発明の第３実施の形態に係る超解像顕微鏡に用する空間変調光学素子を説明するための図で、図４（ａ）は、空間変調光学素子の概略構成を示す平面図、図４（ｂ）は、その光学特性を説明するための図である。この空間変調光学素子１は、ガラス基板２上の入射光束の全領域を変調領域３とし、この変調領域３を光軸の周りに複数領域、ここでは８領域に分割して、その８領域にイレース光波長λ２に対して、λ２／８ずつ位相が異なるように、多層膜４を形成したものである。ここで、多層膜４は、図４（ｂ）に、ポンプ光およびイレース光の位相分布を模式的に示すように、ポンプ光に対しては、図３の場合と同様に、同相で透過させ、イレースに対しては、位相分布が２πで周回するラゲール・ガウシアンビームとなるように全体を位相変調するように構成する。
【００９１】
図４に示した空間変調光学素子１を用いて、この空間変調光学素子１を透過したポンプ光およびイレース光を顕微鏡対物レンズにより試料上に集光すれば、第２実施の形態の場合と同様に、ポンプ光に対しても光量ロスを生じることなく、集光面上で、ポンプ光については光軸上に光強度が最大値を有するスポットを形成でき、イレース光については光軸上に光強度が極小値を有する中空状のスポットを形成することができる。
【００９２】
以上、第１実施の形態〜第３実施の形態に示した空間変調光学素子１によれば、１つの光学部材として簡単かつ安価にできるとともに、ポンプ光とイレース光との合成光からイレース光のみを確実に位相変調することができる。
【００９３】
以下、上記実施の形態で説明した空間変調光学素子を用いる本発明に係る超解像顕微鏡の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００９４】
（第４実施の形態）
図５は、本発明の第４実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット２０、スキャンユニット４０および顕微鏡ユニット６０を有しており、スキャンユニット４０および顕微鏡ユニット６０は、瞳投影レンズ系７０を介して光学的に結合されている。
【００９５】
光源ユニット２０は、ポンプ光用光源２１、イレース光用光源２２、ダイクロイックプリズムや偏光プリズムからなるビームコンバイナ２３、ファイバ集光レンズ２４、シングルモードファイバ２５およびファイバコリメータレンズ２６を有している。ポンプ光用光源２１から出射されるポンプ光およびイレース光用光源２２から出射されるイレース光は、ビームコンバイナ２３でほぼ同軸に合成した後、ファイバ集光レンズ２４を経て同一のシングルモードファイバ２５にほぼ同軸に入射させ、これによりシングルモードファイバ２５の射出口から放射立体角を揃えて完全球面波として出射させる。シングルモードファイバ２５から出射されるポンプ光およびイレース光は、色収差のないファイバコリメータレンズ２６で平面波に変換して、スキャンユニット４０に導入する。
【００９６】
本実施の形態では、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察するため、ポンプ光用光源２１は、例えば連続波を出射するＨｅ−Ｎｅレーザを用い、その波長５４３ｎｍの発振線をポンプ光とする。また、イレース光用光源２２は、例えば連続波を出射するＨｅ−Ｎｅレーザを用い、その波長６３３ｎｍの発振線をイレース光とする。したがって、後述の空間変調光学素子を含む光学系は、これらの波長に対して最適化したものとする。
【００９７】
スキャンユニット４０は、光源ユニット２０から出射されるポンプ光およびイレース光を、偏光ビームスプリッタ４１を通過させた後、走査光学系である２枚のガルバノミラー４４および４５により２次元方向に揺動走査して、瞳投影レンズ系７０を介して顕微鏡ユニット６０に入射させる。なお、図５では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー４４，４５を同一平面内で揺動可能に示している。
【００９８】
顕微鏡ユニット６０は、スキャンユニット４０から瞳投影レンズ系７０を介して入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム６１で反射させて、集光手段である顕微鏡対物レンズ６２によりローダミン６Ｇ色素で染色された観察試料６３上に集光させる。また、観察試料６３で発光した蛍光は、顕微鏡対物レンズ６２でコリメートしてハーフプリズム６１で反射させることにより、瞳投影レンズ系７０を経てスキャンユニット４０に戻すと同時に、ハーフプリズム６１を通過する蛍光の一部は、蛍光像として目視観察できるように接眼レンズ６４に導く。なお、顕微鏡対物レンズ６２は、その鏡筒も含めて示している。
【００９９】
また、スキャンユニット４０は、顕微鏡ユニット６０から瞳投影レンズ系７０を経て入射する蛍光を、往路とは逆の経路を辿って偏光ビームスプリッタ４１で所要の偏光成分を分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ４６、ピンホール４７を、ノッチフィルタ４８および４９を経て検出部である光電子増倍管５０で受光する。
【０１００】
なお、ピンホール４７は、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものであり、ノッチフィルタ４８および４９は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。
【０１０１】
図５に示す超解像顕微鏡は、顕微鏡対物レンズ６２の瞳面を、瞳投影レンズ系７０によりスキャンユニット４０内のガルバノミラー４４，４５の近傍に投影して共役瞳面を形成し、これにより瞳面を軸にしてガルバノミラー４４，４５による照明光の空間走査が行われる。
【０１０２】
本実施の形態では、顕微鏡ユニット６０内の瞳面またはその近傍に、図１に示した構成の空間変調光学素子１と、ビーム径を制限するアイリス（可変絞り）６５とを設置し、空間変調光学素子１によりイレース光ビームのみを中空状に空間変調し、この空間変調されたイレース光と、空間変調を受けないポンプ光とを、アイリス６５を経て色収差の無い顕微鏡対物レンズ６２により、ローダミン６Ｇで染色された試料６３上に集光させる。これにより、イレース光については、光軸方向に中空部を有する中空パターン状（ドーナッツ形状）のビーム形状として、回折限界以下のサイズとなった蛍光スポットを、ガルバノミラー４４，４５により空間走査する。
【０１０３】
ここで、空間変調光学素子１は、波長５４３ｎｍのポンプ光と、波長６３３ｎｍのイレース光とに対して最適化した同心円状の２領域からなり、図１（ｂ）に示したように、中央部の領域を変調領域３として、該変調領域３に多層膜４を形成して構成する。この多層膜４を有する変調領域３は、ポンプ光に対しては、反射鏡として機能し、イレース光に対しては、位相をλ／２だけ遅延させる位相変調素子として機能する。すなわち、上記（１）式〜（３）式を満たすものとする。
【０１０４】
具体的には、多層膜４は、ガラス基板２上に、バッファ層７として波長５３２ｎｍでの屈折率が１．５２のＳｉＯ２を厚さ５３２．７ｎｍコートし、このバッファ層７上に、波長５３２ｎｍでの屈折率が２．１６のＴａＯ５と、波長５３２ｎｍでの屈折率が１．５２のＳｉＯ２とを、ＴａＯ５については厚さ６２．８ｎｍ、ＳｉＯ２については厚さ８９．９ｎｍで、交互に１１層まで蒸着により積層して構成する。
【０１０５】
この構成の多層膜４は、ポンプ光に対しては、５％程度の透過漏れ光が発生するが、ほぼ反射鏡として機能する。また、イレース光に対しては位相板として機能し、多層膜４を通過すると、多層膜４を通過しないイレース光との間で、相対的に位相をほぼπだけ遅延させる。なお、本実施の形態では、空間変調光学素子１を、同心円状の２領域とし、その中央領域を、多層膜４を有する変調領域３として構成したが、位相型のフレネルゾーンプレートのように、さらに多くの輪体状の領域を形成して、多層膜４を有する変調領域３を２領域以上形成することもできる。
【０１０６】
また、空間変調光学素子１を通過したポンプ光およびイレース光は、集光面でイレース光を完全な中空ビームとするために、アイリス６５でビーム径を調整する。すなわち、瞳面における強度分布が均一であれば、瞳の形状が半径Ｒの円形で、変調領域３も半径ρの円形であれば、上述したように、上記（４）式を満たすには、Ｒ／ρは、２１／２となる。しかし、一般のレーザ走査型顕微鏡は、ビームの強度分布が均一でなく、ガウス状の分布をもつ。したがって、完全な中空ビームを形成するためには、上記（７）式に準じて、Ｒ／ρを調整する必要がある。そのため、瞳面の直後に設けたアイリス６５でビーム外径を調整して、Ｒ／ρの最適化を図る。さらに、アイリス６５は、変調領域３を透過するイレース光の位相遅れ誤差も調整可能である。
【０１０７】
このように、本実施の形態では、イレース光とポンプ光とを、同軸に合成した後、空間変調光学素子１に入射させて、イレース光については、空間変調光学素子１の多層膜４を有する変調領域３を通過したイレース光と、変調領域３を通過しないイレース光との間で、相対的に位相をほぼπだけ遅延させ、これによりイレース光の中空ビームを形成するようにしている。したがって、空間変調光学素子１において、イレース光の光量ロスが生じないので、イレース光用光源２２から出射するイレース光の光パワーを必要最小限として、顕著な超解像機能を誘導することができる。
【０１０８】
また、空間変調光学素子１およびアイリス６５は、顕微鏡ユニット６０内の瞳面またはその近傍に配置し、その共役瞳面またはその近傍にガルバノミラー４４，４５を配置して、ポンプ光およびイレース光を空間走査するので、走査による波面収差の発生を抑えることができる。したがって、超解像顕微鏡性能を左右するイレース光の集光形状を乱すことなく、広い視野で高い結像性能を保つことができるとともに、観察試料６３上ではポンプ光およびイレース光を常に同軸上で集光でき、良好な状態で超解像機能を発現できる。
【０１０９】
さらに、光源ユニット２０においては、ポンプ光用光源２１から出射されるポンプ光およびイレース光用光源２２から出射されるイレース光を、ビームコンバイナ２３で合成した後は、いずれの光もデリバリすることなく、同一光学系、すなわちファイバ集光レンズ２４およびシングルモードファイバ２５を経て出射させている。しかも、シングルモードファイバ２５から出射される完全球面波のポンプ光およびイレース光を、ファイバコリメータレンズ２６により同じ条件でコリメートしている。したがって、面倒な光学調整を要することなく、ポンプ光およびイレース光を、波面収差を与えることなく、同じダイバージェンス（ビーム広がり）で顕微鏡対物レンズ６２により観察試料６３の全く同じ結像点に集光させることができる。
【０１１０】
（第５実施の形態）
図６は、本発明の第５実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、図５に示した超解像顕微鏡において、光源ユニット２０を、１台のレーザ光源２７を用い、このレーザ光源２７から出射されるレーザ光を、ファイバ集光レンズ２４、シングルモードファイバ２５およびファイバコリメータレンズ２６を経てスキャンユニット４０に導入するようにしたものである。
【０１１１】
ここで、レーザ光源２７は、例えば、マルチラインで発振するＨｅ−Ｎｅレーザを用い、波長５４３ｎｍの発振線をポンプ光として用い、波長６３３ｎｍの発振線をイレース光として用いる。その他の構成および動作は、第４実施の形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。
【０１１２】
本実施の形態によれば、１台のＨｅ−Ｎｅレーザから、ポンプ光とイレース光とを同時に取り出すことができるので、第４実施の形態におけるよりも構成を簡略化できるとともに、第４実施の形態では必要となる、ポンプ光とイレース光との光軸を調整してシングルモードファイバ２５に導入する作業を省くことができ、調整もより簡単にできる。
【０１１３】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記第４実施の形態および第５実施の形態に示した超解像顕微鏡では、図１に示した構成の空間変調光学素子１を用いたが、図３または図４に示した構成の空間変調光学素子１を用いることもできる。また、上記第４実施の形態および第５実施の形態に示した超解像顕微鏡では、ガルバノミラー４４，４５によりポンプ光およびイレース光を偏向して観察試料６３を２次元走査するようにしたが、顕微鏡対物レンズ６２および／または観察試料６３を載置する試料ステージを移動させて、ポンプ光およびイレース光により観察試料６３を２次元走査したり、１つのガルバノミラーによるポンプ光およびイレース光の１次元移動（主走査）と、その１次元移動と直交する方向への顕微鏡対物レンズ６２あるいは試料ステージの１次元移動（副走査）との組み合わせて、観察試料６３を２次元走査したり、することもできる。
【０１１４】
また、図５に示す構成において、シングルモードファイバ２５として偏波面保存ファイバを用いて、蛍光抑制効果を効果的に誘導することもできる。すなわち、一般に、蛍光抑制効果は、ポンプ光とイレース光との偏光方向が一致したときに強く発現することが知られている（例えば、N.Bokor et.al,Opt.Commun.272,263(2007)）。したがって、偏波面保存ファイバを用い、かつ、ポンプ光とイレース光との偏光方向を最初から固定してスキャンユニット４０に導入すれば、各蛍光色素に対して、弱いイレース光高度で効果的に蛍光抑制効果を誘導することができる。
【０１１５】
さらに、本発明は、特に商用レーザ走査型顕微鏡を改良して、超解像顕微鏡を簡単に構成することができる。すなわち、商用レーザ走査型顕微鏡においては、多波長のレーザ光を１本のシングルモードファイバから取り出して、ガルバノミラーにより空間走査するタイプのものがある。このような商用レーザ走査型顕微鏡の場合は、イレース光およびポンプ光の波長に対応するレーザ光源を用意して、シングルモードファイバから出射したイレース光およびポンプ光をコリメートした後、上述した空間変調光学素子１を通過させるようにすれば、商用レーザ走査型顕微鏡に容易に超解像機能を付加することができる。
【０１１６】
また、第４実施の形態では、ポンプ光とイレース光とを、ビームコンバイナ２３およびシングルモードファイバ２５を用いて同軸に合成するようにしたが、２入力１出力の光合成ファイバを用いて同軸に合成することもできる。さらに、このようなシングルモードファイバ２５や光合成ファイバを用いることなく、通常のダイクロックミラー等によりポンプ光およびイレース光を同軸に合成した後、空間変調光学素子１に入射させるようにすることもできる。この場合は、ポンプ光およびイレース光は、ダイバージェンスと角度ずれの影響が全く同じに受けるので、光学調整の際の利便性が向上する。
【０１１７】
さらに、空間変調光学素子１は、顕微鏡対物レンズの鏡枠に内蔵させることもできる。このようにすれば、市販のレーザ走査型顕微鏡システムの構成を変化させることなく、顕微鏡対物レンズの交換のみで超解像機能を付加することができるので、顕微鏡の利便性を向上することができる。
【０１１８】
この場合、特に、空間変調光学素子を顕微鏡対物レンズの瞳面に配置すれば、ガルバノミラーでイレース光を空間走査しても、波面収差が少ないので超解像顕微鏡機能を左右するイレース光の集光形状を乱すことなく、広い視野で高い結像性能を保つことができる。
【０１１９】
さらに、空間変調光学素子１は、例えば、反射ミラーやプリズムに、多層膜や回折格子等を有する変調領域を形成して構成することもできる。一例として、図１に示した空間変調光学素子１と同様の光学特性を有する空間変調光学素子を構成する場合は、反射ミラーやプリズム等の反射面に透過型の多層膜をコーティングして変調領域を形成し、該変調領域に入射して、多層膜を透過して反射面で反射され、さらに多層膜を透過して変調領域から出射されるイレース光の位相が、変調領域に入射することなく、反射面で反射されて出射されるイレース光の位相に対して反転するように構成すればよい。
【０１２０】
また、本発明に係る超解像顕微鏡は、蛍光相関分光法により試料を観察する場合にも有効に適用することができる。この場合は、図５および図６において、走査光学系であるガルバノミラー４４，４５は不要となる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡に用いる空間変調光学素子の概略構成を示す断面図および平面図である。
【図２】図１に示す空間変調光学素子の光学的特性を示す図である。
【図３】本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡に用いる空間変調光学素子の光学特性を示す図である。
【図４】本発明の第３実施の形態に係る超解像顕微鏡に用いる空間変調光学素子の概略構成を示す断面図および光学的特性を示す図である。
【図５】本発明の第４実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。
【図６】本発明の第５実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。
【図７】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図８】図７に示す分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図９】図７に示す分子の第２励起状態を示す概念図である。
【図１０】図７に示す分子が第２励起状態から基底状態に戻る状態を概念的に示す図である。
【図１１】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１２】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１３】従来の超解像顕微鏡の要部構成図である。
【図１４】図１３に示す位相板の構成を示す拡大平面図である。
【符号の説明】
【０１２２】
１  空間変調光学素子
２  ガラス基板
３  変調領域
４  多層膜
５  第１物質
６  第２物質
７  バッファ層
２０  光源ユニット
２１  ポンプ光用光源
２２  イレース光用光源
２３  ビームコンバイナ
２４  ファイバ集光レンズ
２５  シングルモードファイバ
２６  ファイバコリメータレンズ
４０  スキャンユニット
４１  偏光ビームスプリッタ
４４，４５  ガルバノミラー
４６  投影レンズ
４７  ピンホール
４８，４９  ノッチフィルタ
５０  光電子増倍管
６０  顕微鏡ユニット
６１  ハーフプリズム
６２  顕微鏡対物レンズ
６３  観察試料
６４  接眼レンズ
６５  アイリス（可変絞り）
７０  瞳投影レンズ系
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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