(57)【要約】【課題】抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への送達増強剤を提供する。【解決手段】ニトログリセリン、硝酸イソソルビドなどの一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを有効成分として、抗悪性腫瘍剤と併用し、抗悪性腫瘍剤の効果を腫瘍組織への送達性を増強させ、更に詳しくは、特に一酸化窒素ドナーを軟膏などの外用剤として、悪性腫瘍の部位に塗布し投与することによって、腫瘍血管内腔より腫瘍組織内への漏出性を高めることにより抗悪性腫瘍剤等の薬物の局所送達性、即ち、腫瘍組織への薬剤の集積性を増強する【選択図】図１
2010024170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを有効成分として含有する抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項２】
腫瘍組織への薬剤の集積性を増強することによる請求項１に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項３】
一酸化窒素（ＮＯ）ドナーが、ニトログリセリン、グリセリルモノニトレート、グリセリルジニトレート、一硝酸イソソルビドおよび二硝酸イソソルビドから成る群より選択される請求項１〜２項に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項４】
一酸化窒素（ＮＯ）ドナーがニトログリセリンである請求項１〜２項に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項５】
一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを有効成分として含有する薬剤が、外用剤である請求項１〜２に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項６】
外用剤が、軟膏剤、ゲル軟膏、クリーム、液剤、貼付剤、座剤、スプレー、鼻腔内外用剤である請求項５に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項７】
外用剤が、軟膏剤である請求項５に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項８】
外用剤が、スプレーである請求項５に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項９】
悪性腫瘍が、表層性腫瘍である請求項１〜９項に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項１０】
表層性腫瘍が、乳がん、食道がん、胃がん、大腸がん、泌尿器がん、気管支肺がん、気道がん、生殖器がん、皮膚がん、頭頸がん、眼のがん、および腹・胸壁がんから成る群より選択される表層性腫瘍である請求項９項に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項１１】
抗悪性腫瘍剤がアクラルビシンである請求項１〜１０に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項１２】
抗悪性腫瘍剤が高分子薬剤である請求項１〜１１に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項１３】
高分子薬剤が、ＰＥＧ−ＺｎＰＰ、ＰＥＧ化インターフェロン、ミセル化製剤、リポソーム製剤またはその他高分子化抗悪性腫瘍剤である請求項１２に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤。
【請求項１４】
抗悪性腫瘍剤と請求項１〜１３に記載の抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤を含んでなる薬剤キット、薬剤パックまたは患者パック。
【請求項１５】
抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強剤が、軟膏剤である請求項１４に記載の薬剤キット、薬剤パックまたは患者パック。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを有効成分として含有する腫瘍組織への局所送達増強剤に関する。更に詳しくは、本発明は、抗悪性腫瘍剤の局所送達性、即ち、腫瘍組織への薬剤の集積性を増強することにより、抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への局所送達増強をする薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、これまでに生体親和性の高い高分子薬剤、ミセル化製剤、リポゾーム製剤を含む物質や油質が、正常組織と比較して腫瘍組織に高く集積し、かつ長時間にわたり高濃度を維持することを発見した(Enhanced Permeability and Retention effect, EPR効果)（非特許文献１）。即ち、腫瘍組織においては、（１）旺盛な血管新生による腫瘍内血管密度の亢進、（２）様々な血管作動因子による血管透過性の亢進、（３）高分子物質の腫瘍血管を介する逆行性の回収の不全、（４）リンパ系回収の機能不全による高分子物などの回収不全などの結果として、血中へ投与した生体親和性のある高分子物質 (上述した薬剤等) や油性超微粒子は、腫瘍組織へ高く集積するようになる。この原理を利用するためには、薬剤を高分子化することにより、血中半減期を大幅に延長することが可能となり、その結果非常に効率よく腫瘍局所に選択的に薬剤が集積する。これに対し、一般の正常組織への集積は極めて低レベルである。これによって副作用の大幅な軽減と同時に、より強い抗悪性腫瘍作用を発揮できるようになることを明らかにしている（非特許文献２）。
【０００３】
一方で、血圧を制御する内因性の物質のひとつである一酸化窒素（ＮＯ）、即ち内皮由来血管弛緩因子(endothelial-derived relaxing factor、降圧物質)（ＥＤＲＦ）は血管平滑筋のグアニル酸シクラーゼを活性化することにより血管を弛緩させることが知られている（非特許文献３）。
【０００４】
本発明者らは、ＮＯとスーパーオキサイド （Ｏ２−） が直ちに反応し、ＮＯを消費することから、血中のＮＯレベルが低下し、正常な血圧維持が困難となり、高血圧を招来することも明らかにしている。
【０００５】
また、これまで固型腫瘍において、ＮＯ合成酵素 （ＮＯＳ） により合成されるＮＯが腫瘍の血管透過性 (漏出性亢進) を誘導していることを見出している（非特許文献４）。また、ＥＰＲ効果は、ＮＯＳの阻害剤であるＬ−Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）およびＮＯのスカベンジャーである２−フェニル−４，４，５，５−テトラメチルイミダゾリン−１−オキシル ３−オキシド（ＰＴＩＯ）の投与により、抑制されることも見出している（非特許文献５、６）。
【０００６】
一方、腫瘍は、血管内皮細胞増殖因子や線維芽細胞増殖因子などの血管新生因子を産出し、腫瘍血管を新生し、同時にこれら因子（ＥＤＲＦ）はＮＯ産生を高め、そして血管透過性を高め、それにより血液を介して栄養や酸素などを獲得するため旺盛な血管造成能を有している（非特許文献７）。
【０００７】
この考え方を進めることによりＮＯ(およびそのドナー) であるＧＴＮを腫瘍の表層より塗布で投与することで、過剰に存在する腫瘍血管を弛緩させ、多くの薬物を腫瘍局所に集積させることができると考えた。
【非特許文献１】Matsumura, Y. and Maeda, H.: Cancer Res. 46: 6387-92, 1989
【非特許文献２】Maeda H. J Controlled Release, 19, 315-324, 1992
【非特許文献３】Moncada S et al. Pharm Rev, 43, 109-142, 1991
【非特許文献４】Doi K et al. Cancer 77, 1598-604, 1996、Br J Cancer, 80,      1945-54, 1999
【非特許文献５】Maeda H et al. Jpn J Cancer Res 85, 331334, 1994、Wu J       et al. Cancer Res 58, 159-65, 1998
【非特許文献６】Iyer AK et al. Drug Discov Today, 11, 812-818, 2006
【非特許文献７】Folkman J, Nat Med 1: 27, 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
悪性腫瘍は、現在ヒトの疾病の中で、処置・治療が最も困難な疾患のひとつであり、薬剤としては様々な抗悪性腫瘍剤が開発されているが、決定的なものはないのが実情である。また、抗悪性腫瘍剤の副作用も常に問題となっている。このような状況下において、有力な抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への送達性を増強することは、悪性腫瘍の処置・治療においてひとつの有効な手段であるのみならず、抗悪性腫瘍剤の量を減らすことにつながり、抗悪性腫瘍剤の有する副作用の軽減になる。従って、優れた抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への送達性の増強剤が求められている。
【０００９】
このような知見・状況を背景に、本発明者らは、ニトログリセリンなどの一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを抗悪性腫瘍剤と一緒に適用すると、驚くべきことに、抗悪性腫瘍剤の悪性腫瘍組織への送達が増強されることを見出した。更に詳しくは、本発明は、一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを、抗悪性腫瘍剤と一緒に適用することにより、抗悪性腫瘍剤の局所送達性、すなわち、腫瘍組織への薬剤の集積性を増強することができる。このような、悪性腫瘍剤の腫瘍部位への送達増強効果は、本発明者らがはじめて見出したものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の目的は、一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを有効成分とする抗悪性腫瘍剤の悪性腫瘍組織への局所送達増強剤を提供することにある。
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
本明細書において、「一酸化窒素（ＮＯ）ドナー（供与剤）」とは、生体内で一酸化窒素（ＮＯ）を持続的に放出できる薬剤の総称であり、そのうちニトロ基の離脱が生じ、つづいて生体内の酵素によってＮＯに還元されるものも含む。特に制限はされないが、代表的なものとしては、ニトログリセリン（ＧＴＮ）、グリセリルモノニトレート、グリセリルジニトレート、一硝酸イソソルビド（ＩＳＭＮ）、二硝酸イソソルビド（ＩＳＤＮ）のような硝酸エステル類がある。その他のものとしては、たとえば、ニトロプルシドナトリウム、モルシドミンなどがある。本発明において、最も好ましいものは、ニトログリセリン製剤である。
【００１３】
本発明を実施する際は、一酸化窒素（ＮＯ）ドナーは、通常、軟膏、ゲル軟膏、クリーム、液剤、貼付剤、座剤、スプレー、鼻腔内など外用剤としての形態で適用するが、悪性腫瘍の部位によって適用できる外用剤であれば、いかなる剤形でもよい。好ましい適用形態は、軟膏として患部に塗布するか、あるいはスプレーすることが挙げられる。
【００１４】
軟膏剤として塗布する場合は、通常の方法によって軟膏剤を調製する。軟膏剤・皮膚外用剤は、半固形の製剤であり、有効成分と基剤によって構成されており、基剤の中に有効成分が存在する形であり、有効成分が基剤に溶解しているか、分散している。基剤には、油脂性基剤である疎水性基剤と、乳剤性基剤、水溶性基剤、懸濁性基剤などの親水性基剤がある。疎水性基剤には、ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコ−ン、植物油、ロウ類などがあり、乳剤性基剤には、ポリエチレングリコールのエステル類、ラノリン、親水ワセリンがあり、水溶性基剤には、マグロゴールなどがあり、懸濁性基剤には、セルロースなどを基剤としたゲル、ゼリー、ジェルなどがある。
【００１５】
本発明で用いる一酸化窒素（ＮＯ）ドナーの代表例である、ニトログリセリンの場合は、ワセリン、ラノリンを基剤とした軟膏が容易に入手できる。すなわち、急性心不全、狭心症、心筋梗塞発作の処置・予防薬であるニトログリセリン軟膏、たとえば、バソレーター（三和化学）がある。
【００１６】
更に、上述したごとく本発明で用いる一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを含有する外用剤は、処置・治療する悪性腫瘍の部位によって異なる剤形を用いることができ、上記の軟膏・クリームなどのほかに、噴霧剤（スプレー）、パッチ、座剤、液剤なども用いることができる。これらは、市販の種々のパッチ剤（たとえば、ニトロダーム、ミリス、シドレン、バソレーター、メディトランス、ミニトロなど）を使用することが可能である。
【００１７】
本発明で用いる一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを含有する外用剤が適用できる悪性腫瘍であれば、特に制限はないが、通常適用されるのは、たとえば、乳がん、食道がん、結腸、直腸がんを含む大腸がんなどの消化管のがん、膀胱がんなどの泌尿器のがん、気管支肺がん、気道のがん、子宮がん、膣がんなどの生殖器のがん、皮膚がん、眼、腹・胸壁上のがんなどの表層性腫瘍を挙げることができる。
【００１８】
乳がんの例には、浸潤性腺管がん、浸潤性小葉がん、乳管内がん(ductal carcinoma in situ)、および乳腺小葉非浸潤上皮内がんが含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
気道のがんの例には、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
雄性生殖器官の腫瘍には、前立腺および睾丸がんが含まれるが、これらには限定されない。雌性生殖器官の腫瘍には、子宮内膜、子宮頚部、卵巣、膣、および外陰部がん、および子宮肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
消化管の腫瘍には、肛門、大腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、すい臓、直腸、小腸、および唾液腺がんが含まれるが、これらには限定されない。
【００２２】
泌尿器管の腫瘍には、膀胱、陰茎、腎臓、腎盤、尿管、尿道およびヒト乳頭状腎臓がんが含まれるが、これらには限定されない。
【００２３】
眼のがんには、眼球内メラノーマおよび網膜芽腫が含まれるが、これらには限定されない。
【００２４】
肝臓がんの例には、肝細胞がん（線維層板変異体をもつかあるいはもたない肝細胞がん）、胆管がん（肝内胆管がん）、および肝細胞がん、胆管がんの混合型が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
皮膚がんには、扁平上皮細胞がん、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚がん(Merkel cell skin cancer)、および非メラノーマ皮膚がんが含まれるが、これらには限定されない。
【００２６】
頭頚がんには、咽頭部、下咽頭、鼻咽頭、口咽頭がん、唇および口腔がん並びに扁平上皮細胞が含まれるが、それらには限定されない。血液がんには、各種白血病のほか、リンパ腫、たとえば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系リンパ腫が含まれるが、これらには限定されない。
【００２７】
これらの疾患は、ヒトでは特徴づけがなされてきているが、他の哺乳類でも同様な病因が存在し、本発明の抗悪性腫瘍剤の局所送達増強剤を投与することによって処置でき、本発明の抗悪性腫瘍剤の局所送達増強剤は、ヒトのみならず哺乳類の適用も包含するものである。
【００２８】
本発明の抗悪性腫瘍剤の悪性腫瘍の組織への局所送達増強剤を使用する場合、悪性腫瘍を処置・治療する抗悪性腫瘍剤は、本発明のメカニズムからして、特に限定はされない。現在使用されている抗悪性腫瘍剤のみならず、開発中の薬剤または将来開発される薬剤をも包含する。本発明を実施する際の抗悪性腫瘍剤は、一つであってよいし、ふたつ以上であってもよい。
【００２９】
本発明を実施する際の抗悪性腫瘍剤は、上述のごとくいかなる薬剤でもよく、特に限定されないが、抗悪性腫瘍作用を有する薬剤の中で、高分子の薬剤の場合に抗悪性腫瘍剤の腫瘍部位への送達増強効果を示す。たとえば、下記の実験例５で用いられているＰＥＧ−ＺｎＰＰのような薬剤の場合に効果を示す。ＰＥＧ−ＺｎＰＰ（ポリエチレングリコール結合亜鉛プロトポルフィン）は、グリベック耐性の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肥満細胞白血病（ＭＣＬ）、乳がん、大腸がんなどに効果が期待される薬剤であり、更に他の抗悪性腫瘍剤との併用により抗悪性腫瘍剤の抗悪性腫瘍効果を増強する作用もある薬剤である。更に、こうした高分子の薬剤には、ＰＥＧ化インターフェロン、ミセル化製剤、リポソーム製剤があるが、その他高分子化抗悪性腫瘍剤であれば、いかなるものでもよい。
【００３０】
高分子薬剤の例としては、たとえば、スマンクス（登録商標）、ドキソルビシン（ドキソル）、カンプトラシンの活性部（ＳＮ３８）を含むＰＥＧ−ｐｏｌｙ（ａｓｐ）ブロックコポリマーミセルであるＮＫ０１２（日本化薬）、カプリタキセル結合型ポリグルタミン酸［Ｘｙｏｐｔａｘ，略号ＰＧ−ＴＸＬ  ＣＯＤＥ  ＣＴ−２１０３］（セル・セラピュティック）などを挙げることができるが、それらには、限定はされない、開発中、あるいは将来世に出る高分子の抗悪性腫瘍剤であってもよい。
【００３１】
現在使用されている抗悪性腫瘍剤の例として、代表的なものを挙げれば、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、メルファラン、ブスルファン、ニムスチンなどのアルキル化剤、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、ゲムシタビン、シタラビン、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、フルオロウラシルメトトレキサートなどの代謝拮抗剤、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセキタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンスルスチン、ビンデシン、ビンブラスチンなどの植物アルカロイド、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ，ミトキサントロンなど抗悪性腫瘍性抗生物質、オキサリブラスチン、カルボプラスチン、シスプラスチン、ネダプラスチンなどのプラチナ製剤、アナストロゾール、エキセメスタン、イチニルエラストラジオール、タモキシフェン、レトロゾールなどのホルモン剤、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、乾燥ＢＣＧ、レンチナンなどの生物学的応答調節剤、イマチニブ、ゲフィチニブ、テミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ポルテゾミブ、リツキシマブなどの分子標的薬、スマンクス、ＰＥＧ化インターフェロンなどの高分子化製剤、ドキシルなどのリポソーム製剤やＮＫ０１２（カンプトラシンの活性部（ＳＮ38）を含むＰＥＧ−ｐｏｌｙ（ａｓｐ）ブロックコポリマーミセル）などのミセル化製剤、ＯＰＡＸＩＯ（カプリタキセル結合型ポリグルタミン酸）などの高分子制がん剤などを挙げることができる。
【００３２】
これらの抗悪性腫瘍剤は、悪性腫瘍の種類、部位、患者の重症度、体力、年齢などによって適宜選択して使用されている。たとえば、肺がんには、シスプラチンや、カルボプラチンなどのプラチナ製剤に別の抗悪性腫瘍剤を加えた併用療法が、食道がんには、シスプラチンとオロウラシルの組み合わせなどが、胃がんには、シスプラスチン、イリノテカンが、大腸がんには、フルオロウラシル、イリノテカン、オキサプラチン、テガフール・ウラシルなどが、すい臓がんには、ゲムシタビンなどが、乳がんにはシクロホスファミド、メトレキダート、フルオロウラシル、ドキソルビシンなどからの組み合わせが、子宮頸がんには、シスプラスチンを基本とした組み合わせが、子宮体がんには、シスプラスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミドなどからの組み合わせが使用されている。
【００３３】
上記抗悪性腫瘍剤のいずれでも抗悪性腫瘍剤の腫瘍組織への送達増強効果を示すが、たとえば、抗悪性腫瘍剤として抗悪性腫瘍性抗生物質、分子量８４８．３３であるアクラビシンなどの薬剤の場合である。
【００３４】
アクラルビシンは、悪性腫瘍細胞のＤＮＡに結合して、核酸合成、特にＲＮＡ合成を強く阻害すると言われており、乳がん、胃がん、肺がん、卵巣がんなどの処置・治療に有用な抗悪性腫瘍剤である。
【００３５】
これらの抗悪性腫瘍剤の投与量は、悪性腫瘍の重症度、副作用の出現度、患者の体力、年齢などを考慮するが、通常、体表面積あたりの投与量が決まっている。たとえば、ＣＰＴ−Ｐ療法の場合は、一日あたりイリノテカリン６０ｍｇ／ｍ２（体表面積）、シスプラスチン６０ｍｇ／ｍ２となっており、ＣＡＰ療法においては、シクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２、ドキソルビシン３０〜５０ｍｇ／ｍ２となっており、ＣＰ療法の場合は、シクロホスファミド８００〜９００ｍｇ／ｍ２、シスプラスチン６０〜７５ｍｇ／ｍ２となっている。
【００３６】
本発明の、「一酸化窒素（ＮＯ）ドナー」の投与量には、特に限定はない。悪性腫瘍の重症度、副作用の出現度、患者の体力、年齢などによって適宜変化しうる。ニトログリセリンを用いる場合は、商業上入手しうるニトログリセリン含有軟膏を、悪性腫瘍の発生部位に直接塗布する。この場合、乳がん、皮膚がん、結腸・直腸がん、子宮がん、膀胱がんなど表層性がんでは、こうした軟膏、クリームを直接塗布することにより、目的を達成することができる。食道がん、大腸がんなど直接塗布できない場合は、内視鏡などの器具を用いて直接患部に塗布するか、あるいは、スプレーによってこうした薬剤を投与することができる。ニトログリセリンは、低血圧の可能性のある患者に使用する場合は、その投与量については細心の注意が必要である。本発明の、一酸化窒素（ＮＯ）ドナーの使用する抗がん剤との使用比率は関係なく、一概に言えないが、たとえば、０．０１〜１．０ｍｇ／ｃｍ２腫瘍表面あたりで塗布することである。
【００３７】
ニトログリセリン含有軟膏は、たとえば、バソレーター軟膏であり、これは、黄白色の軟膏であり、添加物として、乳糖水和物、加水ラノリン、白色ワセリンを含有し、１ｇ中に２０ｍｇのニトログリセリンを有効成分として含有している。
【００３８】
こうした軟膏を調製する場合は、通常の軟膏の製造方法で行うことができ、たとえば、ニトログリセリンを２０ｇ、局方白色ワセリン、ラノリンを適量加え、１０００ｇとしてニトログリセリンを有効成分として含有する軟膏を調製することができる。
【００３９】
また、軟膏以外の外用剤、液剤、ローション、ゲル、噴霧剤（スプレー）、パッチ剤、クリームなども、本技術分野で通常行われている方法で、容易に調製することができる。
【００４０】
本発明の外用剤を投与する場合は、様々な適切な抗悪性腫瘍剤と同時に投与してもよいし、抗癌剤の投与の前、あるいは後に時間的間隔を少しずらして投与するいずれの形をとってもよい。
【００４１】
更に、本発明による抗悪性腫瘍剤と一酸化窒素（ＮＯ）ドナーとの組み合わせは、必要に応じて、本発明による軟膏などの外用剤を、抗悪性腫瘍剤と薬剤パック、キット、患者パックの形で提供されてもよい。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、ニトログリセリンなどの一酸化窒素（ＮＯ）ドナーを抗悪性腫瘍剤と併用することにより、各種抗悪性腫瘍薬剤特にミセル、リポソーム、高分子薬結合型、たん白結合型の抗がん剤の腫瘍局所への送達を増強させ、その腫瘍組織内への集積性増強をもたらす。こういった効果により、悪性腫瘍の処置・治療に極めて有益であり、かつ各種抗悪性腫瘍剤の投与量を軽減することができ、抗悪性腫瘍剤特有の副作用を著しく軽減することができる。従って、本発明の価値は高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
更に、特に、本発明は、抗悪性腫瘍効果のある高分子薬剤と併用することにより、より高い効果を有する。抗悪性腫瘍剤の局所への送達効果を増強することを見出したことは、ＧＴＮなどの一酸化窒素ドナーの表層性腫瘍に対するドラックデリバリーを高め、悪性腫瘍の治療効果を高めることは、極めて価値が高い。
【００４４】
上記効果を証明するために、本発明者らが行った動物実験での結果を以下に示す。
【実施例】
【００４５】
以下に、本発明の実施例および実験例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
実施例１：ＧＴＮのザルコーマ１８０(Sarcoma180）腫瘍への塗布群と非塗布群のエバンスブルー−アルブミンの腫瘍組織内集積性の差
６週齢の雄性ｄｄＹマウスの背部皮下に、２×１０６個のマウス肉腫Ｓａｒｃｏｍａ１８０（Ｓ−１８０）腫瘍細胞を移植し、固型腫瘍を作成した。約２週間後に８〜１５ｍｍの腫瘍径になったマウスを選択し、腫瘍部を剃毛して２％ＧＴＮ軟膏（バソレーター軟膏（登録商標）、三和化学、名古屋）を５０ｍｇ（ＧＴＮとして塗布投与量１．０ｍｇ）ずつ腫瘍径と同じ径の穴をあけた湾曲したプラスチックにより腫瘍部のみに塗布した後、直ちに１０ｍｇ／ｋｇとなるようにエバンスブルー（ＥＢ）の生理食塩水溶液０．１ｍｌを尾静脈内に注射した。ＥＢを投与後、３０分、１、４、６および２４時間後にマウスを麻酔下で屠殺し、腫瘍部を切除し、その重量を測定した後ＥＢの抽出を行った。ＥＢの蓄積量は、試験管内で約４ｍｌのホルムアミドを加え、６０℃で４８時間溶出抽出した後、６２０ｎｍの吸光度により定量した。また、ＧＴＮの塗布投与量と腫瘍組織集積量の濃度相関を検討するため、２％ＧＴＮ軟膏をＧＴＮ塗布投与量が０．１、０．０１および０．００１ｍｇとなるように白色ワセリンで希釈したＧＴＮ軟膏を作製した。これらの軟膏を５０ｍｇずつ上述のように腫瘍部のみに塗布した後、１０ｍｇ／ｋｇＥＢで投与し、４時間後に屠殺し、ＥＢの抽出を行い、比較を行った。血管透過性の増大効果は腫瘍組織におけるＥＢ−アルブミン複合体の組織内蓄積量をＧＴＮの塗布群と非塗布群とを比較することで評価した。図１は、ＧＴＮのエバンスブルーのＳ−１８０腫瘍組織における集積性増大効果を示す。図１に示すとおり、ＧＴＮ塗布群は、非塗布群と比較して３０分から６時間にわたり、薬剤ＥＢは約２．８倍の腫瘍組織集積性が増大した（ｐ＜０．０５）。その中で、ＥＢを投与して４時間後に最も腫瘍組織内に蓄積していた。このため、今後の検討は、ＥＢを投与して４時間目の腫瘍内組織集積量の比較を行った。
上記の結果を踏まえ、ＧＴＮ塗布投与量とＥＢの腫瘍組織内集積量の濃度相関関係の検討を、ＥＢを投与後、４時間目で行った。図２は、ＧＴＮ濃度依存的な腫瘍組織集積性増大効果を示す。図２において、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１（非塗布群（コントロール群）に対するＧＴＮ塗布群）を示す。図２から明らかなごとく、ＧＴＮの濃度依存的にＥＢの腫瘍組織集積性の増大を示した。ＧＴＮ塗布投与量が１．０μｇでも約１．６倍と有意に腫瘍組織集積性の増大を示していた（ｐ＜０．０５）。
【００４７】
実施例２：ＧＴＮのＭｅｔｈ−Ａ腫瘍への塗布群と非塗布群のエバンスブルー−アルブミンの腫瘍組織内集積性の差
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に、２×１０６個のマウス線維肉腫Ｍｅｔｈ−Ａ腫瘍細胞を移植し、固型腫瘍を作成した。移植後約１０日目に５〜１３ｍｍの腫瘍径になったマウスを選択し、２％ＧＴＮ軟膏を５０ｍｇ（ＧＴＮ塗布投与量局所当り１．０ｍｇ）および実施例１に準じて作製した白色ワセリンを用いて希釈したＧＴＮ軟膏を５０ｍｇ（ＧＴＮ塗布投与量局所当り０．００１ｍｇ）ずつ腫瘍部のみに、実施例１に準じて塗布した後、ＥＢを１０ｍｇ／ｋｇとなるように生理食塩水溶液０．１ｍｌを尾静脈内に注射した。４時間後に屠殺し、評価は実施例１と同様にして行った。図３は、ＧＴＮのエバンスブルーのＭｅｔｈ−Ａ腫瘍組織における集積性増大効果を示す。＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１（非塗布群（コントロール群）に対するＧＴＮ塗布群）を示す。図３から明らかなごとく、ＧＴＮ塗布投与量１．０および０．００１ｍｇのＧＴＮ軟膏塗布群は、非塗布群と比較して約２．０倍の腫瘍組織集積性の増大が認められた（ｐ＜０．０５）。
【００４８】
実施例３：ＧＴＮのＣｏｌｏｎ３８腫瘍への塗布群と非塗布群のエバンスブルー−アルブミンの腫瘍組織内集積性の差
６週齢の雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウスの背部皮下に、約５０ｍｇのマウス結腸がんＣｏｌｏｎ３８（Ｃ３８）腫瘍片を、トローカー針を用いて移植し、固型腫瘍を作成した。移植後約１２日目に６〜１５ｍｍの腫瘍径になったマウスを選択し、実施例１に準じてＧＴＮを塗布し、ＥＢを１０ｍｇ／ｋｇ尾静脈より投与して、評価は実施例１に準じて行った。図４は、ＧＴＮのエバンスブルーのＣｏｌｏｎ ３８腫瘍組織における集積性増大効果を示す。図４において、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１（非塗布群（コントロール群）に対するＧＴＮ塗布群）を示す。図４から明らかなごとく、Ｓ−１８０およびＭｅｔｈ−Ａと同様にＧＴＮ塗布群は、非塗布群と比較して約１．６倍の腫瘍組織集積性の増大が認められた（ｐ＜０．０５）。
【００４９】
実施例４：ＧＴＮの化学発がん剤７，１２−ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）投与により生じたラット乳がんに対し、塗布群と非塗布群の高分子薬剤エバンスブルー−アルブミンの腫瘍組織内集積性の差
７週齢雌性ＳＤラットにＤＭＢＡをコーン油に１０ｍｇ／ｍｌとしたものをゾンデにより強制経口投与を行い、約１５週間で固型腫瘍を発生させた。６〜１５ｍｍの腫瘍径を持ったラットを選択し、２％ＧＴＮ軟膏を１００ｍｇ（ＧＴＮ塗布投与量局所当り２．０ｍｇ）および実施例１に準じて作製した白色ワセリンを用いて希釈したＧＴＮ軟膏を１００ｍｇ（ＧＴＮ塗布投与量局所当り０．２および０．０２ｍｇ）ずつ腫瘍部のみに実施例１に準じて塗布した後、ＥＢを１０ｍｇ／ｋｇとなるように生理食塩水溶液０．５ｍｌを尾静脈内に注射した。評価は実施例１に準じて行った。図５は、ＧＴＮのエバンスブルーのＤＭＢＡ誘発ラット乳がん腫瘍組織における集積性増大効果を示す。＊は、Ｐ＜０．０５＊＊は、Ｐ＜０．０１（非塗布群（コントロール群）に対するＧＴＮ塗布群）を示す。図５から明らかなごとく、Ｓ−１８０などの移植した腫瘍と同様に、ＧＴＮ塗布投与量０．０２、０．２および２．０ｍｇのＧＴＮ軟膏塗布群は、非塗布群と比較して、約１．９、２．５および２．４倍の腫瘍組織集積性の増大が認められた（ｐ＜０．０５）。
【００５０】
実施例５：ＧＴＮと高分子薬剤のＳ−１８０腫瘍への併用効果
６週齢の雄性ｄｄＹマウスの背部皮下に、２×１０６個のＳ−１８０腫瘍細胞を移植し、７日間飼育後、５〜７ｍｍの固型腫瘍が形成されたマウスを選び出し、実験に用いた。実験に用いた高分子薬はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合亜鉛型プロトポルフィリンＩＸ（ＰＥＧ−ＺｎＰＰ）で、見かけ上分子量は１３万付近であり、グリベックに耐性の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞と肥満細胞白血病（ＭＣＬ）に強力な細胞増殖抑制作用を示す(Sahoo SK et al. Bioconj Chem 13, 1031-1038, 2002、 Fang J et al. Cancer Res 63, 3567-3574, 2003)。試験群として、（ａ）コントロール群（無治療）、（ｂ）ＧＴＮコントロール群（ＧＴＮ塗布のみ）、（ｃ）１ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−ＺｎＰＰ群（ＰＥＧ−ＺｎＰＰ投与）、（ｄ）５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−ＺｎＰＰ群（ＰＥＧ−ＺｎＰＰ投与）、（ｅ）１ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−ＺｎＰＰとＧＴＮ併用、および（ｆ）５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−ＺｎＰＰとＧＴＮ併用群の６群を設けた。２％ＧＴＮ軟膏５０ｍｇ（ＧＴＮ濃度局所当り１ｍｇ）を実施例１に準じて腫瘍部のみに塗布した後、高分子薬剤であるＰＥＧ−ＺｎＰＰを尾静脈より３日間連日で投与した。腫瘍の大きさは、ノギスを用いて測定し、常法により腫瘍サイズが測定された。すなわち、腫瘍容積（Ｖ）は長径（Ｌ）×対巾（Ｗ）とすると、Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２である。上述のごとく、対照群として、無治療群および非ＧＴＮ塗布群による治療群を設けた。図６は、ＧＴＮの高分子薬剤ＰＥＧ−ＺｎＰＰとのＳ−１８０腫瘍に対する併用効果を示し、上記に説明した６群の場合の、腫瘍接種後の腫瘍容積を示す。図６において、×は、（ａ）コントロール群（無治療）、○は、（ｂ）ＧＴＮコントロール群（ＧＴＮ塗布のみ）、■は、（ｃ）１ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−ＺｎＰＰ群（ＰＥＧ−ＺｎＰＰ投与）、△（黒で塗りつぶした三角）は、（ｄ）５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−ＺｎＰＰ群（ＰＥＧ−ＺｎＰＰ投与）、□は、（ｅ）１ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−ＺｎＰＰとＧＴＮ併用、△は、（ｆ）５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−ＺｎＰＰとＧＴＮ併用群をそれぞれ示す。↓は、ＰＥＧ−ＺｎＰＰ投与、▽（黒く塗りつぶした逆三角）はＧＴＮ塗布を示す。データは平均±ＳＥ（エラーバー）で表した。＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１（コントロール群に対するＰＥＧ−ＺｎＰＰあるいはＰＥＧ−ＺｎＰＰとＧＴＮ併用投与群）を示す。図６から、ＰＥＧ−ＺｎＰＰの単独投与で有意な抗腫瘍活性を発揮するが、ＧＴＮと併用投与することにより、更により強い抗腫瘍活性が発揮されていることが明らかである。
【００５１】
実施例６：ＧＴＮと塩酸アクラルビシンのＣ３８腫瘍への併用効果
６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部皮下に、トローカー針を用い５０ｍｇのＣ３８腫瘍片を移植し、７日間飼育後、５〜７ｍｍの固型腫瘍が形成されたマウスを選び出し、実験に用いた。試験群として、（ａ）コントロール群（無治療）、（ｂ）ＧＴＮコントロール群（ＧＴＮ塗布のみ）、（ｃ）５ｍｇ／ｋｇ塩酸アクラルビシン群（メルシャン（株）製の塩酸アクラルビシン投与）および（ｄ）５ｍｇ／ｋｇ塩酸アクラルビシンとＧＴＮ併用群の４群を設けた。上記のごとく、対照として、無治療群および非ＧＴＮ塗布群による治療群を設けた。２％ＧＴＮ軟膏５０ｍｇ（ＧＴＮ塗布投与量局所当り１ｍｇ）を腫瘍部のみに塗布した後、生理食塩水に溶かした塩酸アクラルビシンを尾静脈より３日間連続で投与した。ノギスを用いて腫瘍の大きさを測定し、常法により腫瘍サイズを測定した。すなわち、腫瘍容積（Ｖ）は長径（Ｌ）×対巾（Ｗ）とすると、Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２である。図７は、ＧＴＮの低分子薬剤塩酸アクラルビシンとのＣ３８腫瘍に対する併用効果を示す。図７において、×は、（ａ）コントロール群（無治療）、○は、（ｂ）ＧＴＮコントロール群（ＧＴＮ塗布のみ）、■は、５ｍｇ／ｋｇ塩酸アクラルビシン治療群、□は、（ｄ）５ｍｇ／ｋｇ塩酸アクラルビシンとＧＴＮ併用治療群を示す。↓は塩酸アクラルビシン投与、▽（黒く塗りつぶした逆三角）はＧＴＮ塗布を示す。データは平均±ＳＥ（エラーバー）で表した。＊＊は、Ｐ＜０．０１（コントロール群に対するＧＴＮと塩酸アクラルビシンの併用投与群）を示す。図７から、ＧＴＮと塩酸アクラルビシンの併用治療群は、塩酸アクラルビシン単独および無治療群と比較して有意な腫瘍増殖抑制を示すことが明らかである。
【００５２】
上記の動物実験においては、抗悪性腫瘍剤との併用、特に高分子薬剤との併用によって腫瘍局所への送達を増強することが証明されている。従って、一酸化窒素ドナー、特にＧＴＮを表層性腫瘍に対するドラックデリバリーを高め、治療に益することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＧＴＮのエバンスブルーのＳ−１８０腫瘍組織における集積性増大効果を示す図である。
【図２】ＧＴＮ濃度依存的な腫瘍組織集積性増大効果を示す図である。
【図３】ＧＴＮのエバンスブルーのＭｅｔｈ−Ａ腫瘍組織における集積性増大効果を示す図である。
【図４】ＧＴＮのエバンスブルーのＣｏｌｏｎ ３８腫瘍組織における集積性増大効果を示す図である。
【図５】ＧＴＮのエバンスブルーのＤＭＢＡ誘発ラット乳がん腫瘍組織における集積性増大効果を示す図である。
【図６】ＧＴＮの高分子薬剤ＰＥＧ−ＺｎＰＰとのＳ−１８０腫瘍に対する併用効果を示す図である。
【図７】ＧＴＮの低分子薬剤塩酸アクラルビシンとのＣ３８腫瘍に対する併用効果を示す図である。
【図１】
2010024170.tif 000003
【図２】
2010024170.tif 000004
【図３】
2010024170.tif 000005
【図４】
2010024170.tif 000006
【図５】
2010024170.tif 000007
【図６】
2010024170.tif 000008
【図７】
2010024170.tif 000009