(57)【要約】【課題】グリコサミノグリカンオリゴ糖に関連した、マトリックスメタロプロテアーゼを阻害する新たな手段を提供し、慢性閉塞性肺疾患等の治療の途を提供すること。【解決手段】ヒアルロン酸オリゴ糖、ケラタン硫酸オリゴ糖、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン及びＮ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、並びに、薬学的に許容されるこれらのグリコサミノグリカンオリゴ糖の塩からなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上、を有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤乃至阻害方法、エラスターゼ活性阻害剤、及び、慢性閉塞性肺疾患治療剤等を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸オリゴ糖、ケラタン硫酸オリゴ糖、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン及びＮ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、並びに、薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上、を有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
ヒアルロン酸オリゴ糖、ケラタン硫酸オリゴ糖、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン及びＮ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、並びに、薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上、からなるマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
グリコサミノグリカンオリゴ糖は、下記式ＨＡ４、Ｌ４、Ｌ４Ｌ４でそれぞれ示されるグリコサミノグリカンオリゴ糖及び薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上である、請求項１又は２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
ＨＡ４：GlcA β1-3 GlcNAc β1-4 GlcA β1-3 GlcNAc
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
Ｌ４Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S β1-3 Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【請求項４】
マトリックスメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２及びＭＭＰ−１３からなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項５】
下記式ＨＡ４、Ｌ４、Ｌ４Ｌ４でそれぞれ示されるグリコサミノグリカンオリゴ糖及び薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上により、細胞由来のマトリックスメタロプロテアーゼ活性を抑制する、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害方法。
ＨＡ４：GlcA β1-3 GlcNAc β1-4 GlcA β1-3 GlcNAc
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
Ｌ４Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S β1-3 Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【請求項６】
マトリックスメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２及びＭＭＰ−１３からなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ケラタン硫酸オリゴ糖を有効成分として含有する、エラスターゼ活性抑制剤。
【請求項８】
ケラタン硫酸オリゴ糖からなる、エラスターゼ活性抑制剤。
【請求項９】
ケラタン硫酸オリゴ糖は、下記式Ｌ４で示されるケラタン硫酸オリゴ糖である、請求項７又は８に記載のエラスターゼ活性抑制剤。
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【請求項１０】
下記式Ｌ４で示されるケラタン硫酸オリゴ糖を有効成分として含有する、慢性閉塞性肺疾患の治療剤。
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【請求項１１】
下記式Ｌ４で示されるケラタン硫酸オリゴ糖からなる、慢性閉塞性肺疾患の治療剤。
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【請求項１２】
慢性閉塞性肺疾患は肺気腫である、請求項１０又は１１に記載の治療剤。
【請求項１３】
下記式ＨＡ４、Ｌ４、Ｌ４Ｌ４でそれぞれ示されるＧＡＧオリゴ糖及び薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上、並びに、被験薬剤を、細胞に接触させ、該被験薬剤における前記ＧＡＧオリゴ糖又は塩による該細胞由来のＭＭＰ活性の抑制に対する、促進作用あるいは緩和作用を選別する、薬剤の選別方法。
ＨＡ４：GlcA β1-3 GlcNAc β1-4 GlcA β1-3 GlcNAc
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
Ｌ４Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S β1-3 Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤に関連し、より具体的には、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−１２活性に対する特性によりスクリーニングされた、ヒアルロン酸オリゴ糖、ケラタン硫酸オリゴ糖等のグリコサミノグリカンの、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びエラスターゼ活性抑制剤としての用途、並びに、慢性閉塞性肺疾患の治療剤に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＭＭＰ：マトリックスメタロプロテアーゼ
ＣＯＰＤ：慢性閉塞性肺疾患
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＤＳ：デルマタン硫酸
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー
ＨＡ４：ヒアルロン酸４糖（GlcA β1-3 GlcNAc β1-4 GlcA β1-3 GlcNAc）
Ｌ４：ケラタン硫酸２糖（Gal6S β1-4 GlcNAc6S）
Ｌ４Ｌ４：ケラタン硫酸４糖（Gal6S β1-4 GlcNAc6S β1-3 Gal6S β1-4 GlcNAc6S）
【０００３】
動物組織を構成する多様な細胞は、種々の細胞外マトリックス（Extracellular Matrix）分子によって接着・固定されている。細胞の増殖・分化・移動・アポトーシスにも深く関与するＭＭＰは、このような細胞外マトリックスタンパク質を主要な基質とする一群の金属要求性プロテアーゼの総称名である。ＭＭＰは現在、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）、好中球コラーゲナーゼ（ＭＭＰ−１８）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）、マクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）、コラーゲナーゼ（ＭＭＰ−１３）等、数十種類の存在が知られている。これらの共通した性質として、活性ドメイン中に亜鉛を有すること、また、生体内に存在するＭＭＰに特異的な天然の阻害物質（Tissue Inhibitor of Metalloproteinase）によって活性を調整されていること等が挙げられる（非特許文献１）。
【０００４】
また、本発明者らの研究により、Fut8ノックアウトマウス（ＣＯＰＤ自然発症モデルマウス）において、ＭＭＰ−９、１２、１３の遺伝子発現レベルが有意に上昇しており、これらが肺胞の破壊に関連していることが報告されている（非特許文献２）。このことから肺胞破壊を阻止するためには、最終段階に働くＭＭＰ活性を抑制することが有効であると考えられる。しかしながらこれまで様々なＭＭＰ阻害薬が開発されてきたが、いずれも重篤な副作用のため治療効果を上げるには至っていない。
【０００５】
ＣＯＰＤは中高年の喫煙者に多く発症し、慢性かつ持続性の閉塞性換気障害を呈する疾患群であり、世界保健機関の統計では死亡原因の第４位にランクインされている。日本においては、日本呼吸器学会ガイドライン（非特許文献３）により、ＣＯＰＤは、肺気腫、慢性気管支炎又は両者の併発により惹起される閉塞性換気障害を特徴とする疾患、と定義されている。このうち肺気腫は、軽症である人を含めると、約３００万人が、肺気腫の患者及び予備軍であると予測されている。
【０００６】
肺気腫の病態は終末細気管支以下の気道と肺胞壁の破壊、及び、非可逆的な気腔の拡張を特徴とし、明らかな線維化や気道系の閉塞を伴わない病態、と病理学的に定義されている。肺気腫の発症の機序については「プロテアーゼ・アンチプロテアーゼ不均衡説」や肺胞壁のアポトーシス（非特許文献４及び５）等が考えられているが、いまだ明らかにされていないことも多い。最も確かな内因性危険因子は、遺伝性疾患であるα１−アンチトリプシン欠損症であるが、日本においては非常にまれである（非特許文献３）。
【０００７】
また、ＧＡＧのＭＭＰに対する作用については、軟骨魚類の軟骨の水抽出物由来の分子量５００ｋＤａ以上のコンドロイチン硫酸Ｃ（コンドロイチン６硫酸）を主成分としたプロテオグリカンが、ＭＭＰを阻害することが報告されている（特許文献１）。多硫酸化されたＧＡＧについては、例えば、多硫酸化ＣＳついて、ＭＭＰ活性への影響が検討されている。しかし、多硫酸化ＣＳは、ＭＭＰ−３は阻害するが、ＭＭＰ−１については活性化することが報告されており、多硫酸化ＣＳがＭＭＰ阻害剤として、好ましい物質ではないことが示されている（非特許文献６）。また、閉塞性換気障害を抑制する薬剤として、肺におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成又は蓄積を阻害することを特徴とする薬剤が知られている（特許文献２）。また、特許文献３や４には、ケラタン硫酸オリゴ糖及びその誘導体の線維化抑制効果として、肺線維症や間質性肺疾患の治療効果が期待できる旨記載されているが、肺気腫は、明らかな線維化を伴わないため、肺気腫のような、肺線維症や間質性肺疾患以外の肺疾患にケラタン硫酸のオリゴ糖が治療効果を有するかを予測することはできない。特許文献５には、分子量５０００〜２００万程度の分子量を有するＧＡＧを有効成分とする成長因子誘導剤の適応疾患の例として、肺気腫や慢性閉塞性肺疾患等が例示されている。
【０００８】
しかしながら、特定の構造を有するＧＡＧが有意にＭＭＰ活性を阻害すること、及び、ＣＯＰＤの治療剤としてＬ４が有用であることは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０８３２５７
【特許文献２】特許４１０１２７６号
【特許文献３】特開平１１−２６９０７６
【特許文献４】特開２０００−２５６３８５
【特許文献５】特開２００２−３３８４
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】宮崎香ら,生化学,68,1791-1807,1996
【非特許文献２】Wang, X  et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 15791-15796,(2005)
【非特許文献３】日本呼吸器学会ＣＯＰＤガイドライン作製委員会：ＣＯＰＤ診断と治療のためのガイドライン１９９９
【非特許文献４】Hoshino Y, Am. J. Physiol. Lung cell Mol. Physiol. 281 (2) p509-516 (2001)
【非特許文献５】Aoshiba K, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153(2) p530-534(2003)
【非特許文献６】Andrew Nethery et al., Biochem. Pharmacol., 44, p1549-1553(1992)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記の状況を鑑み、ＧＡＧに関連した、ＭＭＰを阻害する新たな手段を提供し、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の治療の途を提供することを課題とする発明である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の構造を有するＧＡＧが、有意にＭＭＰを阻害する活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、ＨＡオリゴ糖、ケラタン硫酸オリゴ糖、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン及びＮ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、並びに、薬学的に許容されるそれらの塩、からなる群から選択される少なくとも１種、を有効成分として含有するＭＭＰ阻害剤（以下、「本発明ＭＭＰ阻害剤」という）を提供する発明である。なお、上記したＧＡＧオリゴ糖と特定の構造を有するヘパロサン、さらにそれらの薬学的に許容される塩を、以下、「ＧＡＧオリゴ糖等」とも総称する。
【００１４】
本発明ＭＭＰ阻害剤は、下記式ＨＡ４、Ｌ４及びＬ４Ｌ４で示されるＧＡＧオリゴ糖からなる群から選ばれる１種又は２種以上、を有効成分として含有することがより好ましい。
ＨＡ４：GlcA β1-3 GlcNAc β1-4 GlcA β1-3 GlcNAc
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
Ｌ４Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S β1-3 Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００１５】
本発明ＭＭＰ阻害剤は、特に、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２及びＭＭＰ−１３を阻害する用途として用いることが好ましく、中でもＭＭＰ−９を阻害する用途として用いることが好適である。
【００１６】
また本発明は、下記式ＨＡ４、Ｌ４、Ｌ４Ｌ４でそれぞれ示されるＧＡＧオリゴ糖及び薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上により、細胞由来のＭＭＰ活性を抑制する、ＭＭＰの阻害方法（以下、「本発明阻害方法」という）を提供する発明である。
ＨＡ４：GlcA β1-3 GlcNAc β1-4 GlcA β1-3 GlcNAc
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
Ｌ４Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S β1-3 Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００１７】
本発明阻害方法は、特に、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２及びＭＭＰ−１３を阻害するために用いることが好ましく、中でも、ＭＭＰ−９を阻害するために用いることが好適である。
【００１８】
また本発明は、ケラタン硫酸オリゴ糖を少なくとも含むエラスターゼ活性抑制剤（以下、「本発明エラスターゼ抑制剤」という）を提供する発明である。
【００１９】
本発明エラスターゼ抑制剤の有効成分であるケラタン硫酸オリゴ糖は、下記式Ｌ４で示されるケラタン硫酸オリゴ糖であることが好ましい。
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００２０】
また本発明は、下記式Ｌ４で示されるケラタン硫酸オリゴ糖からなる慢性閉塞性肺疾患の治療剤（以下、「本発明肺疾患治療剤」という）を提供する発明である。
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００２１】
また、上記慢性閉塞性肺疾患は、肺気腫である場合に用いることがさらに好ましい。
【００２２】
なお、本発明において「剤」とは、「調剤物」又は「有効成分そのもの」を意味することとする。「調剤物」は、「組成物」と同意義であるが、医薬品分野における慣用表現として「剤」を用いることとする。また、「調剤物」であるか、「有効成分そのもの」であるかは、剤の定義によって明確に区別をすることができる。すなわち、「〜を有効成分として含有する剤」は「調剤物」を意味するものであり、「〜からなる剤」は「有効成分そのもの」を意味するものである。例えば、本発明ＭＭＰ阻害剤は、「ＨＡオリゴ糖、ケラタン硫酸オリゴ糖、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン及びＮ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、並びに、薬学的に許容されるそれらの塩、からなる群から選択される少なくとも１種、を有効成分として含有するＭＭＰ阻害用組成物」とも表現される。これは、本発明エラスターゼ抑制剤と本発明肺疾患治療剤においても同様であり、それぞれの有効成分を含有する「エラスターゼ活性抑制用組成物」と「慢性閉塞性肺疾患治療用組成物」と同意義である。また、上記の各有効成分からなる剤は、それぞれの有効成分自体の用途を示している。
【００２３】
加えて、本発明は、下記式ＨＡ４、Ｌ４、Ｌ４Ｌ４でそれぞれ示されるＧＡＧオリゴ糖及び薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上、並びに、被験薬剤を、細胞に接触させ、該被験薬剤における前記ＧＡＧオリゴ糖又は塩による該細胞由来のＭＭＰ活性の抑制に対する、促進作用あるいは緩和作用を選別する、薬剤の選別方法（以下、「本発明選別方法」という）を提供する発明である。
ＨＡ４：GlcA β1-3 GlcNAc β1-4 GlcA β1-3 GlcNAc
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
Ｌ４Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S β1-3 Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００２４】
本発明選別方法により、上記の本発明の剤のエラスターゼ抑制作用を促進して、本発明の剤と組み合わせて処方することにより、肺気腫等の慢性閉塞性肺疾患に対していっそうの治療効果を上げることが可能な有効成分を選別することが可能となる。逆に、本発明の剤のエラスターゼ抑制作用を緩和して、例えば、本発明の剤による副作用が顕在化した際の緩和剤の有効成分を選別することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、ＧＡＧオリゴ糖等を有効成分とするＭＭＰ阻害剤、それを用いたＭＭＰ阻害方法、エラスターゼ活性抑制剤及び慢性閉塞性肺疾患治療薬が提供される。ＭＭＰ阻害剤はその他さまざまな疾患に応用できることが期待されることから極めて有用である。さらに、本発明により、上記の剤の作用を促進又は緩和することが可能な有効成分を選別することが可能な選別方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】各種ＧＡＧオリゴ糖群に応じたＭＭＰ活性への影響を示す図である。
【図２】ＨＡオリゴ糖の結合糖鎖数を変化させてＭＭＰ−９抑制の度合いを検討した結果を示した図面である。
【図３】ケラタン硫酸オリゴ糖のＭＭＰ活性阻害効果の濃度依存性を示す図である。
【図４Ａ】GM6001によるＭＭＰ−９に対する阻害定数を示す図である。
【図４Ｂ】ケラタン硫酸オリゴ糖L4によるＭＭＰ−９に対する阻害定数を示す図である。
【図４Ｃ】ケラタン硫酸オリゴ糖L4L4によるＭＭＰ−９に対する阻害定数を示す図である。
【図５Ａ】Ｌ４による総細胞数の集積抑制効果を検討した図面である。
【図５Ｂ】Ｌ４による好中球数の集積抑制効果を検討した図面である。
【図５Ｃ】Ｌ４による好中球数比率への影響を検討した図面である。
【図６Ａ】Ｌ４による、エラスターゼ誘導肺気腫の抑制効果を検討した図面である。
【図６Ｂ】Ｌ４による、エラスターゼ誘導肺気腫の抑制効果を、ホルマリン固定顕微鏡像で示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
＜１＞本発明ＭＭＰ阻害剤
本発明ＭＭＰ阻害剤は、ＨＡオリゴ糖、ケラタン硫酸オリゴ糖、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン及びＮ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、並びに、薬学的に許容されるそれらの塩、からなる群から選択される少なくとも１種、を有効成分として含有するＭＭＰ阻害剤である。
【００２８】
［Ａ］有効成分
本発明ＭＭＰ阻害剤で用いられる、ＧＡＧオリゴ糖は、単一の種からなっていても、混合物であってもよい。
【００２９】
また、それぞれのＧＡＧオリゴ糖等は、例えば、ＷＯ９６／１６９７３やＷＯ０２／０４４７１に記載の方法により適宜調整される。その原料として使用されるＧＡＧは、サメ等の軟骨魚類のプロテオグリカンや鶏冠等から取得できる。また、市販されているものを用いることもできる。具体的なＧＡＧオリゴ糖等の製造方法は、実施例の欄にて具体的に開示した。
【００３０】
（１）ＨＡオリゴ糖
例えば、公知の手段により入手したＨＡを、ヒアルロン酸分解酵素によってオリゴ糖に分解し、該オリゴ糖を、常法、例えば、エタノール沈殿による濃縮、ゲルろ過及び陰イオン交換クロマトグラフィーによる分解精製法等を用いて精製することにより、本発明に用いるＨＡオリゴ糖を製造することができる。ＨＡオリゴ糖は、下記のＨＡ４であることが好適である。
【００３１】
ＨＡ４：GlcA β1-3 GlcNAc β1-4 GlcA β1-3 GlcNAc
（式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００３２】
（２）ケラタン硫酸オリゴ糖
ケラタン硫酸オリゴ糖の調製法としては、ケラタン硫酸又は高硫酸化ケラタン硫酸の緩衝溶液にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素、例えばバチルス属細菌由来のケラタナーゼ(II）、又は、バチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株由来のケラタン硫酸分解酵素を作用させて分解した後、得られた分解物を分画することにより得ることができる。得られたオリゴ糖の画分は、例えば、エタノール沈殿による濃縮、ゲルろ過及び陰イオン交換クロマトグラフィーによる分解精製法等を用いて、目的のケラタン硫酸オリゴ糖を分離精製することが出来る。ケラタン硫酸は、下記のＬ４又はＬ４Ｌ４であることが好適である。
【００３３】
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
Ｌ４Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S β1-3 Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００３４】
（３）６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン
６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンは、公知の手段により入手したＮ−アセチルヘパロサンを蒸留水に溶解した後、触媒の存在下、６−Ｏ−硫酸化を行い、例えば、エタノール沈殿による濃縮、ゲルろ過及び陰イオン交換クロマトグラフィーによる分解精製法等を用いて、分離精製することができる。
【００３５】
（４）Ｎ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン
Ｎ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサンは、例えば、公知の手段により入手したポリサッカライドを、ヒドラジン分解しＮ−脱アセチル化を行い、得られた生成物をＮ−硫酸化し、さらに触媒の存在下、６−Ｏ−硫酸化を行い、例えば、エタノール沈殿による濃縮、ゲルろ過及び陰イオン交換クロマトグラフィーによる分解精製法等を用いて、分離精製することができる。
【００３６】
（５）薬学的に許容される塩
薬学的に許容される塩とは、上記（１）〜（３）のＧＡＧオリゴ糖の塩、すなわち、ＨＡオリゴ糖の該塩、ケラタン硫酸オリゴ糖の該塩、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの該塩、及び、Ｎ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサンの該塩である。
【００３７】
ここで、薬学的に許容される塩とは、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、ジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基塩等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
［Ｂ］選択的成分
本発明ＭＭＰ阻害剤は、ＭＭＰ阻害効果を損なわない範囲で、上記のＧＡＧオリゴ糖（１）〜（５）以外の成分を、必要に応じて配合することが可能である。例えば、保湿剤、細胞賦活剤、抗炎症剤、抗酸化剤、美白剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤、活性酸素抑制剤、抗ヒスタミン剤、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、その他着色剤、崩壊剤等を適宜配合することができる。
【００３９】
［Ｃ］投与方法と剤形
本発明ＭＭＰ阻害剤は、注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入等により投与することが可能であり、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。本発明ＭＭＰ阻害剤が投与される組織又は細胞は、特に限定されるものではないが、肺または気管支への直接投与は、好適な投与形態の一つである。
【００４０】
本発明ＭＭＰ阻害剤の剤形は、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。
【００４１】
本発明ＭＭＰ阻害剤を医薬として用いる場合、そのエンドトキシン濃度は、溶液状態の剤とした場合において０．３EU/mL以下であることが好ましい。エンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシン測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なお、ＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試験通則（ＪＩＳ Ｋ８００８）、又は米国薬局方等に従って測定・算出できる。
【００４２】
本発明ＭＭＰ阻害剤の投与量は、投与の目的（予防、悪化防止、症状の改善、又は治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年齢、体重、投与部位、投与方法等によって個別に設定されるものであり、特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、ＧＡＧオリゴ糖（１）〜（５）の量として、１ng／投与部位〜３０mg／投与部位程度、を投与することが可能である。
【００４３】
本発明ＭＭＰ阻害剤は医薬としての用途としても用いることができる他、実験試薬の用途としても用いることができる。すなわち、本発明ＭＭＰ阻害剤を医薬としての承認を得るための治験の他、本発明ＭＭＰ阻害剤が有効な生体臓器や疾患を検証するために、様々な種類の生体細胞に対して本発明ＭＭＰ阻害剤を共存させて、そのＭＭＰ阻害作用の有無や強弱を検証することや、特定の患者に対して、本発明ＭＭＰ阻害剤の有効性が確認されている臓器（例えば、肺等）に対する生検を行い、ＭＭＰ阻害効果の有無強弱の確認を行い、本発明ＭＭＰ阻害剤の使用の是非、投薬量、投薬時期等の判断指標を得ることも可能である。また、ＭＭＰの阻害の生体に対する微視的又は巨視的な影響をさらに基礎的に検討するために、in vivo又はin vitroにおける本発明ＭＭＰ阻害剤の作用を検証することも可能である。
【００４４】
また、本発明ＭＭＰ阻害剤は、特に、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２及びＭＭＰ−１３を阻害する用途として用いることが好ましく、中でもＭＭＰ−９を阻害する用途として用いることが好ましい。
【００４５】
＜２＞本発明阻害方法
本発明阻害方法は、下記式ＨＡ４、Ｌ４、Ｌ４Ｌ４でそれぞれ示されるＧＡＧオリゴ糖及び薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上により、細胞由来のＭＭＰ活性を抑制する、ＭＭＰの阻害方法である。
【００４６】
ＨＡ４：GlcA β1-3 GlcNAcβ1-4 GlcA β1-3 GlcNAc
Ｌ４；Gal6S β1-4 GlcNAc6S
Ｌ４Ｌ４；Gal6S β1-4 GlcNAc6S β1-3 Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００４７】
本発明阻害方法で用いられる、上記のＧＡＧオリゴ糖とそれらの塩を「共存」させる細胞の出所となる生物種、また、その種類は特に限定されない。生物種は、ヒトをはじめ、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物を例示することが可能であるが、これらに限定されるものではない。細胞の種類は、ＭＭＰの活性を阻害することを試みることに意義がある細胞であれば、特に限定されるものではなく、分離又は非分離の各種の正常細胞の他、腫瘍細胞を用いることができる。また、該細胞は、分離された細胞であることが好適である。
【００４８】
本発明阻害方法における、細胞由来のＭＭＰ活性を阻害する手段は、特に限定されないが、典型的には、ＭＭＰ活性を阻害する対象の細胞に、ＧＡＧオリゴ糖を接触させることにより行われる。この接触の態様は、例えば、細胞とＧＡＧオリゴ糖の培養初期からの共存培養、増殖期の培養細胞に対するＧＡＧオリゴ糖の添加、定常期の培養細胞に対するＧＡＧオリゴ糖の添加、等が挙げられる。また、ＭＭＰの活性を長期にわたり抑制したい場合には、ＧＡＧオリゴ糖の濃度が常に高い状態に保たれるよう、細胞の培養系に対し、随時ＧＡＧオリゴ糖を添加することも出来る。また、細胞とＧＡＧオリゴ糖の接触に際しての条件も特に限定されず、ＭＭＰの阻害が望まれるような細胞にとって好ましい温度やｐＨを適宜選択して接触させることができる。例えば、温度は、２５〜４５℃程度の範囲が通常であり、３０〜４０℃であることが好ましく、３５〜３８℃であることがより好ましい。また、ｐＨは、６〜８程度の範囲が通常であり、７．０〜７．６であることが好適である。
【００４９】
また、細胞と上記ＧＡＧオリゴ糖とを接触させる時の、該ＧＡＧオリゴ糖の濃度についても特に限定はされないが、０．５mM〜２０mM程度の範囲が通常であり、１mM〜５mMであることが好適である。
【００５０】
また後述する実施例から、添加するＧＡＧオリゴ糖の濃度依存的にＭＭＰの活性を抑制することができる。
【００５１】
本発明阻害方法で用いられるＧＡＧオリゴ糖とそれらの塩については、「本発明ＭＭＰ阻害剤」と同様であり、本発明阻害方法の目的や構成も、「本発明ＭＭＰ阻害剤」にて開示した「細胞」を用いる系において開示している。
【００５２】
本発明阻害方法は、例えば、ＧＡＧオリゴ糖を有効成分とする本発明ＭＭＰ阻害剤、本発明エラスターゼ阻害剤、又は、本発明肺疾患阻害剤、を投与する対象となる患者（ヒト又はヒト以外の哺乳動物）において、これらの剤が有効か否かを判定するために行うことができる。すなわち、例えば、生検等により分離された対象患者の細胞、又は、特定の細胞モデルとして確立された細胞株に対して、ＧＡＧオリゴ糖を接触させることにより、該ＧＡＧオリゴ糖が、該細胞のエラスターゼ活性を、有効性を伴って抑制することができるか否かを判断することができる。該細胞のエラスターゼ活性が有効性をもって抑制されれば、上記の剤は、被験細胞の提供者又は被験細胞株をモデルとした者において、ＣＯＰＤに対して有効であると判断される。
【００５３】
＜３＞本発明エラスターゼ抑制剤
本発明エラスターゼ抑制剤は、ケラタンオリゴ糖を有効成分として含有する、エラスターゼ活性抑制剤である。
【００５４】
該ケラタンオリゴ糖は、特に、下記式で示されるケラタン硫酸オリゴ糖であることが好ましい。
【００５５】
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００５６】
本発明エラスターゼ抑制剤の、必須成分、選択的成分、及び、投与方法と剤形は、「本発明ＭＭＰ阻害剤」と同様である。
【００５７】
エラスターゼは、炎症反応における免疫細胞の遊走に関与している可能性があるので、本発明エラスターゼ抑制剤は炎症抑制剤としても有用である。
【００５８】
＜４＞本発明肺疾患治療剤
本発明肺疾患治療剤は、下記式で示されるケラタンオリゴ糖を有効成分として含有する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）治療剤である。
【００５９】
Ｌ４：Gal6S β1-4 GlcNAc6S
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、６Sは６位に硫酸基が保持されていることを、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。）
【００６０】
本発明肺疾患治療剤における「治療」には、ＣＯＰＤの発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、これらの治療については、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。さらに、本発明肺疾患治療剤の治療対象は、肺気腫であることが好適である。
【００６１】
本発明肺疾患治療剤の好ましい投与経路としては、本発明ＭＭＰ阻害剤として例示されているものが好ましいが、中でも静脈注射であることが好ましい。また、本発明肺疾患治療剤の必須成分、選択的成分、及び、投与方法と剤形は、上記のように、静脈注射が特に好適であることを除けば、「本発明ＭＭＰ阻害剤」と同様である。
【００６２】
＜本発明選別方法＞
本発明選別方法は、被験成分を細胞の培養系に添加することを除けば、上記の本発明阻害方法と実質的には同一の要領で行うことができる。被験成分の添加は、適切な添加濃度を選択して、細胞の培養前、細胞の培養開始時、又は、細胞の培養後、さらには、これらの添加時を適宜組み合わせて行うことが可能である。なお、用いる細胞は、特定の細胞モデルとして確立された細胞株を用いることが、被験薬剤の効果の普遍性をより的確に確認することが可能であり好適である。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６４】
（試料の調製）
（１）Ｌ４、Ｌ４Ｌ４の調製
各ケラタン硫酸オリゴ糖は、ウシ角膜由来のケラタン硫酸Ｉ（生化学工業社製）又はサメ軟骨由来のケラタン硫酸II（生化学工業社製）の１mg／２００μl水溶液に、０．１Ｍの酢酸緩衝液で希釈したケラタナーゼIIを１mU／μl加え、ｐＨ５．０、３７℃で二時間反応後、分画分子量１００００の遠心フィルター（ミリポア社製）にかけて、高分子量成分を取り除き、得られた抽出液をＧＰＣで分離することにより、得られる。生成物の構造は、特開２００６−２９２６８３号公報に記載の方法で、質量分析計（4000Q Trap、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて確認した。
【００６５】
（２）ＨＡ４の調製
ＨＡ４の調製は、(Tawada、A、et al.、Glycobiology 12、421-426(2002))及び（Blundell、C.D.、et al. Analytical Biochemistry 353、236-247(2006))の方法に従い調製を行った。具体的には、まず、鶏冠由来のＨＡを羊精巣由来ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）によってオリゴ糖に分解し、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製及びＧＰＣによる精製を経てＨＡ４を調製した。生成物の構造がＨＡ４であることは、上記と同様に質量分析計を用いて確認した。
【００６６】
（３）６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの調製
６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの調製は、特開２００５−２９０３８３号公報に記載の方法に従い調製を行った。具体的には、まず、大腸菌Ｋ５株から得られたＮ−アセチルヘパロサンを蒸留水に溶解した後、カラムにて分画し、ｎ−トリブチルアミン（ＴＢＡ）を添加し、Ｎ−アセチルヘパロサンＴＢＡ塩を得た。得られたＮ−アセチルヘパロサンＴＢＡ塩に対しジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加し、５０℃で４時間攪拌した。さらにピリジン−サルフォトリオキサイド複合体（Ｐｙ−ＳＯ３）を添加した後、５０℃にて攪拌条件下２時間の反応を進行させた。その後氷冷により、反応を終結させ、蒸留水を添加後、流水透析した。得られた液を生成し、凍結乾燥した後、酢酸ナトリウムに溶解し、カラムにて分画し、脱塩・凍結乾燥により調製を行い６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンを得た。
【００６７】
（４）Ｎ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサンの調製
Ｎ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサンの調製は、特表２０００−５１７３２８号公報に記載の方法に従い行った。具体的には、まず、大腸菌Ｋ５株から得られたポリサッカライドをヒドラジン分解しＮ−脱アセチル化を行い、得られた生成物を無水／トリメチルアミンアダクト（ＴＭＡ／ＳＯ３）でＮ−硫酸化した。その後、蒸留水に溶解しカラムにアプライし、ＴＢＡを添加した。過剰のＴＢＡをジエチルエーテルで除去した後、無水ジメチルホルムアミドに溶解し、無水ジメチルホルムアミドに溶解したＰｙ−ＳＯ３を加え、０℃で１時間反応させることによりＮ，６−Ｏ−硫酸化ヘパロサンを得た。
【００６８】
（５）各種コンドロイチン硫酸
各種コンドロイチン硫酸は生化学工業バイオビジネス株式会社より購入した。低分子化されたコンドロイチン硫酸については、各種コンドロイチン分解酵素を用いて低分子化し入手した。コンドロイチン硫酸Ｃについては、原料のコンドロイチン硫酸Ｃ（重量平均分子量：３０ｋＤａ、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩（サメ軟骨））を出発原料とし、１ｇをＰＢＳ（ｐＨ５．３）５０mlに溶解した。この溶液に、ヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社製：type V）１０万Ｕを添加して３７℃で酵素反応させた。経時的に反応液の一部を採取し、GPC-HPLCで分析し、低分子化の程度を調べた。目的の分子量に達したところで反応液を煮沸して酵素反応を停止させた。目的の分子量に達しない場合には、同様の反応を目的の分子量になるまで繰り返した。こうして得た目的の分子量画分は、反応終了液に活性炭を添加して５０℃で１時間反応させ、その後、反応液をろ過し、次いで酢酸ナトリウムで洗浄後、エタノールを添加して沈殿物を得、得られた沈殿物をエタノールで洗浄後、乾燥することで精製した。以上の方法によって各種低分子化したコンドロイチン硫酸を白色粉末として得た。
【００６９】
［実施例１］  活性測定系の樹立
マクロファージ細胞の無血清培養上清と特異的基質を用いた、ＭＭＰ活性測定系を樹立した。マクロファージ細胞は生体内において主要なＭＭＰ産生細胞であることが知られている。培養上清を濃縮し、総タンパク量が１４−１８ mg/mlのものをＭＭＰ酵素液として用いた。培養上清には、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−１３をそれぞれ約０．０１％、０．０００６％程度含んでいた。今回は治療薬の開発を念頭に、総ＭＭＰ活性に対する抑制効果をスクリーニングの目標としたため、汎用型のＭＭＰ基質［DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2（Cha=β-cyclohexylalanyl、Abz=2-aminobenzoyl (anthraniloyl) (Ex. 365 nm / Em. 450 nm)）］を採用することとした。基質はＭＭＰ-１、３、７、８、９、１１、１２、１３、１４による分解を受け、ＭＭＰ-９に対するkcat/Km＝１．３ｘ１０４と報告されている。ＭＭＰ-９精製酵素を用いて検討したところ、本基質を用いた測定感度は０．０１５ng以上であった。
【００７０】
［実施例２］ＧＡＧオリゴ糖によるＭＭＰ活性の変化
まず、上記で調製した各種ＧＡＧ糖鎖（終濃度1mg/ml）それぞれ１０μlと、ポジティブコントロールとして市販のＭＭＰ阻害剤であるＧＭ６００１（コスモ・バイオ株式会社より購入：終濃度 ２５μＭ）に、ヒト由来のリコンビナントＭＭＰ−９(4ng/ml)１０μl、精製水２０μｌ及びバッファー（最終濃度50mM Tris-HCL、pH7.6、1.5mM ＮａＣｌ、0.5 mM ＣａＣｌ２、1μM ＺｎＣｌ２、０．０1％ (v/v) Brij-35）５０μlを混合し、３７℃で１時間インキュベーションした。なお、ネガティブコントロールは、それぞれの系にて配合するべきＧＡＧ糖鎖を無配合としたものを用いた。
【００７１】
その後、蛍光標識したＭＭＰ基質１０μlを添加した後、９６−wellプレートにて、分解速度を２分間隔で１２０分まで蛍光強度を測定し、分解物濃度を求めた。基質は、上記のDNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2（Cha=β-cyclohexylalanyl、Abz=2-aminobenzoyl (anthraniloyl) (Ex. 365 nm / Em. 450 nm)）を、終濃度４μＭとして用いた。
【００７２】
ＭＭＰ阻害活性は、阻害剤なしの活性を１００％とし、比活性値（％）として計算した。各種ＧＡＧオリゴ糖群に応じたＭＭＰ活性への影響を検討した。これらの結果から低分子量のＨＡオリゴ糖、ケラタン硫酸オリゴ糖、硫酸化ヘパロサン及び６−Ｏ−硫酸化−Ｎ−アセチルヘパロサンで、有意にＭＭＰ活性の抑制効果が認められた(図１)。図１において、縦軸は比活性値であり、横軸の各棒が各々のＧＡＧオリゴ糖におけるこれらの活性を示している。この図１に示された結果と共に、ＨＡオリゴ糖の結合糖鎖数を変化させてＭＭＰ−９の抑制度合いを検討した結果を示したものが図２である。図２において、「Medium」がネガティブコントロールであり、「GM6001」がポジティブコントロールである。また、「４」は「ＨＡ４」、「６」は「ＨＡ６」、「８」は「ＨＡ８」、「１０」は「ＨＡ１０」、「１２」は「ＨＡ１２」を示している。また、「５ｋＤａ」、「２５ｋＤａ」及び「２００ｋＤａ」は、それぞれ、当該分子量のヒアルロン酸であることを示している。この図２の結果より、ヒアルロン酸オリゴ糖の中でも、ＨＡ４又はＨＡ６においてＭＭＰ阻害活性が認められ、ＨＡ４が最も好適であることが明らかになった。
【００７３】
さらに、ＭＭＰ阻害活性が優れていたコンドロイチン硫酸Ｃオリゴ糖（ＣＳ−Ｃ）の濃度依存性と糖重合度との関係を、ＭＭＰ−９精製酵素を用いて検討したところ、Ｌ４ 及びＬ４Ｌ４で特に抑制効果が高く、濃度依存的にＭＭＰ活性を阻害することが分かった（図３）。図３（１）は、Ｌ４における濃度依存的なＭＭＰ阻害活性を、図３（２）は、L4L4における濃度依存的なＭＭＰ阻害活性を示している。図３の縦軸は比活性値（％）であり、横軸は各ＧＡＧオリゴ糖の添加濃度である。Ｌ４Ｌ４について、ＭＭＰ−９に対する阻害定数Ｋｉを測定したところ、それぞれＬ４に対しては０．８mM、Ｌ４Ｌ４に対しては０．６mMであった。陽性コントロールとして用いた市販ＭＭＰ阻害薬GM6001を同様の方法で測定したところ、そのＫｉは約４μMであった（図４Ａ〜Ｃ）。図４Ａは、市販ＭＭＰ阻害薬GM6001についてのＫｉを求めた図面であり、図４ＢはＬ４の、図４ＣはＬ４Ｌ４の、Ｋｉ値の算出の基となったデータ解析図である。それぞれ、縦軸は勾配であり、横軸はＧＡＧオリゴ糖の添加量である。
【００７４】
［実施例３］エラスターゼ惹起モデル
９〜１１週齢のC57BL/6マウス（オス：日本クレア株式会社より購入した）に、Ｌ４を２５０μg/bodyとなるように、５mg/ml水溶液を静注した。コントロールとして、生理食塩水を５０μｌ投与した群を用いた。３０分後ブタ膵臓由来エラスターゼ３Ｕを気管内にスプレー投与した。エラスターゼ投与後２４時間後に解剖し、肺に対して生理食塩液で３回、気管支肺胞洗浄を行い、気管支肺洗浄液（BALF）を得た。評価項目は気管支肺洗浄液中の総細胞数及び好中球量により評価した。その結果を図５Ａ〜Ｃに示した。図５Ａは、総細胞数に対するＬ４投与の影響を検討した図面であり、図５Ｂは、好中球数に対するＬ４投与の影響を検討した図面である。図５Ａ、Ｂにおいて、縦軸は細胞数であり、縦軸への棒グラフは、試験系を示している。また、図５Ｃは、算出した総細胞数における好中球の比率（％：縦軸）を示した図面である。これらの図に示すとおり、エラスターゼを投与する前にＬ４を投与した群では、有意に好中球の集積を抑制することがわかった。
【００７５】
今回の実験においてＭＭＰ−９等の活性阻害効果が認められ、エラスターゼ誘発性肺気腫モデルマウスにおいてＭＭＰ産生細胞である好中球の遊走能亢進が抑えられたことから、Ｌ４をＣＯＰＤ治療薬として用いることができると考えられる。
【００７６】
［実施例４］  エラスターゼ誘導肺気腫モデル
９〜１１週齢のC57BL/6マウス（オス：日本クレア株式会社より購入した）に、Ｌ４を２５０μg/bodyとなるように、５mg/ml水溶液を静注した。コントロールとして、生理食塩水を５０μｌ投与した群を用いた（１回目のＬ４投与）。この１回目のＬ４投与の３０分後に、ブタ膵臓由来エラスターゼ５Ｕを気管内にスプレー投与した。このエラスターゼ投与の２４時間後に、１回目と同一内容のＬ４投与を、コントロール群における５０μｌの生理食塩水投与と共に行った（２回目のＬ４投与）。この２回目のＬ４投与の２４時間後に、Ｌ４を１２５μg/bodyとなるように、５mg/ml水溶液を静注し、コントロール群においては、５０μｌの生理食塩水を投与した（３回目のＬ４投与）。この３回目のＬ４投与から２１日後に、実験に供したマウスの犠死を行い、常法に従って、肺のホルマリン固定を行い、肺の平均肺胞壁間距離（Ｌｍ）を測定した。なお、Ｌ４投与群（Ｌ４）のマウスのｎ数は９であり、生理食塩水投与群（ＰＳ）のマウスのｎ数は９であり、未処理群（Untreat）のｎ数は２、として本試験は行われた。
【００７７】
この肺気腫モデル試験の結果を、図６（Ａ，Ｂ）に示す。図６Ａにおける棒グラフの縦軸は、肺の平均肺胞壁間距離（Ｌｍ）を示し、各々の棒の間に跨る数字は、確率上の危険率を示すｐ値である。ここに示された結果により、Ｌ４は、エラスターゼ誘導性肺気腫を有意に抑制することが明らかになった。図６Ｂは、各々の試験群のマウスの肺のホルマリン固定像が開示されているが、Ｌ４群の肺組織は、ＰＳ群に比べると稠密になっており、図６Ａに示した数値上の結果を裏付けるものである。
【図１】
2010260846.tif 000002
【図２】
2010260846.tif 000003
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2010260846.tif 000009
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2010260846.tif 000011
【図６Ｂ】
2010260846.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月6日(2010.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
［実施例１］  活性測定系の樹立
マクロファージ細胞の無血清培養上清と特異的基質を用いた、ＭＭＰ活性測定系を樹立した。マクロファージ細胞は生体内において主要なＭＭＰ産生細胞であることが知られている。培養上清を濃縮し、総タンパク量が１４−１８ mg/mlのものをＭＭＰ酵素液として用いた。培養上清には、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−１３をそれぞれ約０．０１％、０．０００６％程度含んでいた。今回は治療薬の開発を念頭に、総ＭＭＰ活性に対する抑制効果をスクリーニングの目標としたため、汎用型のＭＭＰ基質［DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2（Cha=β-cyclohexylalanyl、Abz=2-aminobenzoyl (anthraniloyl) (Ex. 365 nm / Em. 450 nm)）］（配列番号１）を採用することとした。基質はＭＭＰ-１、３、７、８、９、１１、１２、１３、１４による分解を受け、ＭＭＰ-９に対するkcat/Km＝１．３ｘ１０４と報告されている。ＭＭＰ-９精製酵素を用いて検討したところ、本基質を用いた測定感度は０．０１５ng以上であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
その後、蛍光標識したＭＭＰ基質１０μlを添加した後、９６−wellプレートにて、分
解速度を２分間隔で１２０分まで蛍光強度を測定し、分解物濃度を求めた。基質は、上記のDNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2（Cha=β-cyclohexylalanyl、Abz=2-aminobenzoyl (anthraniloyl) (Ex. 365 nm / Em. 450 nm)）（配列番号１）を、終濃度４μＭとして用いた。