(57)【要約】【課題】本発明は、先行技術の合成インヒビターに付随する欠陥にかんがみて、１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ１７，２０−リアーゼならびに５α−レダクターゼを強力に阻害しえ、すべてのアンドロゲン合成をブロックし、前立腺癌および良性前立腺肥大症の治療において有益である、酵素インヒビターを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、前立腺癌および良性前立腺肥大症の治療において有用なアンドロゲン合成の新規なインヒビターに関する。本発明は、また、それらの新規な化合物を合成する方法、これらの新規な化合物を含有する医薬組成物、および本発明のアンドロゲン合成インヒビターを使用して前立腺癌および良性前立腺肥大症を治療する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
2010024238.tif 000012
（式中、ＸはステロイドのＡ、Ｂ、およびＣ環の残基を表し、Ｒ３、Ｒ４は水素原子を表すか、あるいは一緒になって二重結合を表し、Ｒ１およびＲ２は一緒になってオキシム、またはオキシムアセテートを表す）
の化合物。
【請求項２】
４−エン−３−オン、５−エン−３β−オール、および３，５−ジエン−３−カルボン酸から成る群より選択される基本構造をさらに含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ステロイドが環炭素原子の代わりに環窒素原子を含むアザステロイドである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記アザステロイドがＡ環の中に環窒素を含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記アザステロイドが４−アザステロイドである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記アザステロイドがＢ環の中に環窒素を含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
前記アザステロイドが６−アザステロイドである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が２０β−ヒドロキシ−プレグナ−４、１６−ジエン−３−オン、１６−デヒドロプレグネノロン−２０−オキシム、１６−デヒドロプロゲステロン、１６−デヒドロプロゲステロン−２０−オキシム、およびそれらのアセテートから成る群より選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物が１６−デヒドロプロゲステロン−２０−オキシムまたはそのアセテートである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
１または２以上の請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１１】
哺乳動物における血漿のテストステロンおよびＤＨＴのレベルを減少させるための医薬組成物を製造するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
哺乳動物における良性前立腺肥大症を治療するための医薬組成物を製造するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
前立腺癌を治療する医薬組成物を製造するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌および良性前立腺肥大症の治療において有用なアンドロゲン合成の新規なインヒビターに関する。本発明は、また、これらの新規な化合物を合成する方法、これらの新規な化合物を含有する医薬組成物、および本発明のアンドロゲン合成インヒビターを使用して前立腺癌および良性前立腺肥大症を治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在、前立腺癌は男性において最も支配的な癌としてランクされている。ほぼ160,000の新しい症例が毎年診断されている。これらのうちで、35,000は転移性疾患で死亡するであろう。女性において、乳癌で毎年45,000人の女性が死亡している。本発明者らは、エストロゲンの産生を抑制する選択性アロマターゼ（エストロゲン合成）インヒビターが乳癌のために潜在的に有効な因子であることを以前に提案した。男性において、アロマターゼインヒビターはエストロゲン過剰に関連する症状、例えば、女性化乳房および精子過少症ために有用である(Coen et al.、1991；Hsiang et al．、1987)。アロマターゼインヒビターは、また、前立腺癌および良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）において価値を有することが示唆された（Henderson et al.、1991）。
【０００３】
１９７３年において、本発明者らは、アロマターゼの効力がありかつ選択的なインヒビターである、多数の化合物の最初のものを報告した（Schwarzel et al.、1973）。これらのインヒビターのうちの最も活性なもの、４−ヒドロキシアンドロステン−３，１７−ジオン(4-OHA)(Brodie et al.、1976)は、急速な競合阻害および引き続くin vitroの酵素の不活性化により作用することが発見され、これは長期間持続するか、あるいは不可逆的であるように見えた(Brodie et al.、1981)。これらの性質を有する酵素インヒビターは、酵素の活性部位に結合すると考えられ、非常に特異的であるようであり、酵素の不活性化のためにin vivoで長期間持続する効果を有するべきである(Sjoerdsma、1981)。さらに、本発明者らは、4-OHAが末梢血漿エストロゲンレベルを減少し、他のホルモン治療、例えば、卵巣摘出およびタモキシフェンから悪化した、進行した転移性疾患を有する閉経後の患者において、乳癌の有意な退行を引き起こす。この化合物は経口的活性および非経口的活性の双方を有し、これらの患者において有意な副作用をもたない(Goss et al.、1986；Coombes et al.、1987)。4-OH-A（フォルマスタン）は、１９９５年以来、ほとんどのヨーロッパの国々およびカナダ国を含む、多数の国々において世界的に、乳癌の治療に現在承認されている。それは１０年において乳癌のための最初の新しい治療である。
【０００４】
男性において、エストロゲンは精巣により、そして副腎アンドロゲンの周囲芳香族化により生産される。テストステロンは精巣の主要な産物であり、そして前立腺において、５α−レダクターゼによりいっそう効力のあるアンドロゲン、ジヒドロテストステロン(DHT)に変換に変換される(Bruchovsky et al.、1968)。アンドロゲンは正常前立腺、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）および前立腺癌の成長において主要な重要性を有するが、いくつかの１連の証拠はエストロゲンがまたある役割を有することができることを示唆している（Mawhinney et al.、1976）。
【０００５】
4-OHAは、また、５α−レダクターゼをin vitroにおいて阻害するが、それよりも低い効力でアロマターゼを阻害する(Brodie et al.、1989b)。これらの２つの活性のために、4-OHAが前立腺癌において有効であることができる可能性は進行した疾患を有する男性の小さい群において調査された。主観的応答はこれらの患者の８０％において観察されたが、客観的減退の明瞭な証拠は存在しなかった（Shearer et al.、1991）。エストロゲンのレベルは期待されるように減少したが、ＤＨＴ濃度は患者において未変化であった。後者の発見は、この化合物の弱いアンドロゲン活性に加えて、客観的応答の欠如を決定した。
【０００６】
化学療法は通常高度に有効であるが、特に年配の患者において有害である悪い副作用のために、大部分の前立腺癌患者について実際的オプションではない。しかしながら、患者の大部分はホルモン療法に対して最初に応答するが、すべての癌治療で典型的であるように、究極的に再発する。精巣切除またはゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）アゴニストの投与による現在の治療は、精巣によりアンドロゲンの産生を減少させるが、副腎によりアンドロゲン合成を妨害しない。GnRHアゴニストを使用する治療の３カ月後、前立腺中のテストステロンおよびＤＨＴの濃度は治療前のレベルの、それぞれ、２５％および１０％に止まった(Foti et al.、1989)。同様に、再発にある去勢した患者の抗体２０％は前立腺組織においてDHTの有意なレベルを有した(Geller et al.、1984)。これらの発見が示唆するように、副腎は前駆体アンドロゲンを前立腺に与える。これは、副腎アンドロゲンを包含するアンドロゲンの作用をブロックするために、GnRHまたは精巣切除と抗アンドロゲン、例えば、フルタミドとの組合わせた治療を受けている患者の臨床的研究により支持される。このような患者は、GnRHアゴニストまたは精巣切除の単独で治療された患者に比較して、無進行の生存時間を増加した(Crawford et al.、1989；Labrie et al．、1993)。
【０００７】
患者は最初に内分泌療法に対して応答するが、しばしば再発する。内分泌療法で治療された患者の再発性腫瘍の３０％において、高いレベルのアンドロゲンレセプター（ＡＲ）の増幅が見出された（Visakorpi et al.、1995）。また、フルタミドはそれらの突然変異ＡＲと相互作用し、前立腺細胞の成長を刺激する傾向があった。これが示唆するように、ＡＲの増幅は低いアンドロゲン濃度において腫瘍細胞の増殖を促進することができる。したがって、最初の系列の療法として完全なアンドロゲンの遮断は、ＡＲ増幅をまた防止することができるアンドロゲン濃度の最大の抑制を達成することによる、慣用のあるアンドロゲン剥奪よりも、いっそう有効であることがある(Kellens、1993)。現在、異なる因子を使用する順次の治療が最初に療法の利益を延長できるかどうかは不明瞭である。異なるメカニズムにより作用する新しい因子は、再発した患者の一部分において第２の応答を生成することができるであろう。第２系列のホルモン療法に対して応答する患者の百分率は比較的低いことがあるが、実質的な数の患者は、前立腺癌の高い発生率のために、有益であることがある。さらに、現在の療法よりもいっそう効力のある因子を開発するための可能性が存在する。それらのいずれもアンドロゲン作用をブロックするとき完全には有効ではない。
【０００８】
１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼはアンドロゲンの生合成において主要な酵素であり、そして精巣および副腎においてＣ21ステロイド（プログネノロンおよびプロゲステロン）をＣ19アンドロゲン、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、５−アンドロステンジオール（Ａ−ジオール）、テストステロン、およびアンドロステンジオンに精巣および副腎において変換する。１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼのいくつかのインヒビターは記載された(Barrie et al.、1989；McCague et al.、1990；Jarman et al．、1990；Ayub et al．、1987；Nakajin et al.、1988、1989；Angelastro et al．、1989；Potter et al．、1995)。ケトコナゾール、活性イミダゾール殺真菌剤は、進行した前立腺癌の患者の治療においてテストステロン生合成を減少するために現在使用されている唯一のインヒビターである（Trachtenberg et al.、1984；Williams et al．、1986）。しかしながら、ケトコナゾールは非常には効力がない。そのうえ、それは多数の有意な副作用、例えば、いくつかの他のチトクロームＰ450ステロイド発生酵素の阻害、およびコルチゾール産生の減少を有する。前立腺癌ために使用される他の薬剤、アミノグルテチミド（ＡＧ）は同様な欠点を有する。これが示唆するように、この酵素のいっそう効力のある、選択的なインヒビターはこの疾患の治療において有効な薬剤を提供することができるであろう。さらに、このような化合物は乳癌患者の治療において有効であろう。ＡＧはこの目的に使用されたが、悪い副作用に関連した。
【０００９】
前立腺において、５α−レダクターゼは、テストステロンを前立腺の成長を刺激する、いっそう効力のあるアンドロゲン、DHTに変換する酵素である。この酵素は２つの重要なイソ型で存在し、Ｉ型はヒト非生殖器皮膚において発現され、そしてＩＩ型はヒト前立腺の中に存在する（Russell et al.、1994参照）。５α−レダクターゼインヒビター、Ｎ−［１，１−ジメチル−３−オキソ−４−アザ−５α−アンドロスト−１−エン−１７β−カルボキシアミド(フィナステリド；Merck)は、最近BPHの治療のための承認され（Stoner、1990）、Ｉ型イソ型よりもＩＩ型のいっそう効力のあるインヒビターである。しかしながら、多分血清DHTレベルは不完全に減少される（６５〜８０％）ことが見出されたので、フィナステリドは主として最小の疾患を有するＢＰＨ患者において有効である。Ｉ型イソ酵素は多分残留血漿DHTの大部分の源であり、Ｉ型ならびに２回を阻害する化合物は患者においていっそう有効であることがある。より最近において、イヌにおいてフィナステリドよりもいっそう有効に前立腺DHTを減少する、他のアゼステロイドＭＫ−４３４が記載された（Cohen et al.、1995）。in vitroにおいてフィナステリドに類似する活性を有する、この化合物の主要な利点は、そのいっそう好適な薬物速度であるように見える。しかしながら、ヒトにおけるその効能はまだ明らかではない。
【００１０】
これらの化合物はDHTレベルを減少するが、それらはまた血清テストステロンレベルを増加する。テストステロンレベルの保存は、ＢＰＨの患者において有利であることがある。しかしながら、テストステロンレベルを増加する５α−レダクターゼのインヒビターは、前立腺癌の治療において、十分に有効でないことがある。DHTはテストステロンよりも高いアフィニティーでアンドロゲンレセプターに結合するが、DHTレベルが減少するとき、テストステロンはレセプターに結合することができる(Gormley、1991)。上に示したように、治療の間の前立腺ＤＨＴレベルの有意な減少（Cohen et al.、1995）にかかわらず、これらの化合物は去勢ほど有効ではない。より重要なことには、それらは前立腺癌細胞の死の誘発において有効さに劣るように見える。アンドロゲン応答性遺伝子、アポプトシスに関連するTRPM-2は、去勢により有意に増強されるが、フィナステリド治療により増強されない(Rittermaster et al.、1991；Shao et al．、1993）。これは去勢後のより低いアンドロゲンレベルに帰属され(Shao et al.、1993)、これは主としてテストステロン産生の減少の結果である。フィナステリドで長期間治療を受けている患者の最近の研究において、わずかの症例において乳癌に導いた、女性化乳房を発生した、幾人かの患者が見出された（NEJM、Sept．、1996、編集者への手紙）。これは５α−レダクターゼの使用に関する関心を発生させる。なぜなら、この工程の遮断はアンドロゲン基質のエストロゲンへの変換を増加するからである。１７−ヒドロキシラーゼ／リアーゼを阻害することによってテストステロンおよびDHTならびに他のアンドロゲンの産生を減少する化合物はこの問題に関連し、そして前立腺癌の治療においていっそう有効であろう。
【００１１】
下記の参考文献は、ステロイド化合物およびBPHおよび前立腺癌の治療におけるそれらの使用に関する技術水準を代表する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記刊行物、特許および特許出願の開示は、当業者の現在の知識の例示として、各個々の刊行物、特許および特許出願の言語が本明細書において詳しくかつ個々に含められるのと同程度に、その全体において、引用することによって本明細書の一部とされる。
【００１４】
したがって、先行技術の合成インヒビターに付随する前述の欠陥、例えば、それらの相対的無効および付随する副作用にかんがみて、１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼならびに５α−レダクターゼを強力に阻害して、すべてのアンドロゲン合成をブロックし、前立腺癌および良性前立腺肥大症の治療において有益である、酵素インヒビターの新しい型がこの分野においてなお要求されていることは明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明の主要な目的は、前立腺癌および良性前立腺肥大症の患者をいっそう適切に治療する、アンドロゲン生合成の新規なインヒビターを提供することである。
【００１６】
簡単に述べると、本発明は、１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼおよび５α−レダクターゼの双方を阻害することによって、テストステロンおよびDHTを減少する新規な化合物を提供する。これらの化合物は、すべてのアンドロゲン合成(アンドロステンジオン、テストステロン、DHEAおよびそのエストロゲン代謝物、ならびにDHT)を遮断し、こうして前立腺癌のいっそう有効な治療を提供する。多数のこれらの化合物は、１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼおよび５α−レダクターゼの効力のあるインヒビターであり、そして、また、抗アンドロゲン活性を有する。いくつかはケトコナゾールよりも非常にいっそう効力があり、in vivoでフィナステリドとほとんど同程度の有効である。これらの化合物は、二重活性を有するので、前立腺癌の治療における現在の薬剤よりもいっそう有効である。１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼの適度なインヒビターであるが、５α−レダクターゼについていっそう効力のある他の化合物は、BPH患者においてテストステロンおよびエストロゲンのレベルの「正常の」釣合いを維持するとき有効であることがある。これらの化合物は米国特許第5,264,427号（その内容は引用することによって本明細書の一部とされる）の主題である。
【００１７】
本発明の他の目的は、本発明の１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼおよび５α−レダクターゼのインヒビターの１または２以上と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供することである。これらの医薬組成物は、テストステロンおよびDHTのレベルの減少を必要とする症状、例えば、前立腺癌および良性前立腺肥大症の治療において使用することができる。
【００１８】
本発明のなお他の目的は、本発明の１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼおよび５α−レダクターゼのインヒビターの１または２以上を、テストステロンおよび／またはDHTのレベルを所望の量だけ減少するために十分な量で投与することからなる、治療が必要である哺乳動物の患者におけるテストステロンおよびDHTのレベルを減少する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の前述の目的、利点および特徴、および以後において明らかとなるであろう、他の目的、利点および特徴により、本発明の好ましい態様の下記の詳細な説明および請求の範囲を参照することによって、本発明の特質はいっそう明瞭に理解することができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】第１図は、培養におけるアンドロゲン刺激BPH組織中のＤＮＡ合成に対する、本発明のアンドロゲン合成インヒビターの作用を図解する。
【図２】第２図は、ヌードマウスのモデルにおけるヒト前立腺腫瘍の体積に対する、本発明のアンドロゲン合成インヒビターの作用を図解する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の好ましい態様の詳細な説明 本発明は、テストステロンおよびDHTの合成を阻害するとき使用される、従来入手可能な化合物を改良しようとする本発明者らの望みから生じた。本発明者らは、また、BPHおよび前立腺癌のための、安全な、有効な治療を提供することを探求した。本発明の化合物の投与は、哺乳動物におけるテストステロンおよびDHTの合成を有効にブロックすることを本発明者らは発見した。本発明において使用するために好ましい化合物は、下記の一般式を有する化合物を包含する：
【００２２】
【化１】
2010024238.tif 000002
【００２３】
式中、ＸはステロイドのＡ、Ｂ、およびＣ環の残基を表し、Ｒ3、Ｒ4は水素原子を表すか、あるいは一緒になって二重結合を表し、Ｒ1およびＲ2は一緒になってオキシム、またはオキシムアセテートを表す。本発明によるステロイド化合物は、好ましくは４−エン−３−オン、５−エン−３β−オール、および３，５−ジエン−３−カルボン酸から成る群より選択される基本構造をさらに含む。また、本発明によるステロイド化合物は、環炭素原子の代わりに環窒素原子を含むアザステロイドであることができる。好ましくは、このようなアゼステロイドはＡ環の中に環窒素を含む。Ａ環の中に環窒素を含む、本発明によるアザステロイドは好ましくは４−アザステロイドである。Ｂ環の中に環窒素を含む、本発明によるアザステロイドは好ましくは６−アザステロイドである。最も好ましくは、このような化合物は２０β−ヒドロキシ−プレグナ−４，１６−ジエン−３−オン、１６−デヒドロプレグネノロン−２０−オキシム、１６−デヒドロプロゲステロン、１６−デヒドロプロゲステロン−２０−オキシム、およびそれらのアセテートから成る群より選択される。
【００２４】
本発明は、また、下記の一般式の化合物を提供する：
【００２５】
【化２】
2010024238.tif 000003
【００２６】
式中、ＸはステロイトのＡ、Ｂ、およびＣ環の残基を表し、Ｒは５員の複素環式環を表し、そしてＲ3およびＲ4は水素原子を表すか、あるいは一緒になって二重結合を表す。Ｒは好ましくは
【００２７】
【化３】
2010024238.tif 000004
【００２８】
から成る群より選択される。このような本発明によるステロイド化合物は、好ましくは４−エン−３−オン、５−エン−３β−オール、および３，５−ジエン−３−カルボン酸から成る群より選択される基本構造をさらに含む。好ましくは、このようなステロイド化合物は、環炭素原子の代わりに環窒素原子を含むアザステロイドである。好ましくは、このようなアザステロイドはＡ環またはＢ環の中に環窒素を含む。Ａ環の中に環窒素を含む、本発明によるアザステロイドは好ましくは４−アザステロイドである。Ｂ環の中に環窒素を含む、本発明によるアザステロイドは好ましくは６−アザステロイドである。より好ましくは、このような化合物は１７β−（４’−イミダゾリル）−アンドロスト−５−エン−３β−オール、１７β−（４’−イミダゾリル）−アンドロスタ−５，１６−ジエン−３β−オール、１７β−（２’−イミダゾリル）−アンドロスト−５，１６−ジエン−３β−オール、１７β−（３’−ピラゾリル）−アンドロスト−５−エン−３β−オール、１７β−（３’−ピラゾリル）−アンドロスタ−５，１６−ジエン−３β−オール、１７β−（５’−イソキサゾリル）−アンドロスタ−５，１６−ジエン−３β−オール、およびそれらの３−アセテートから成る群より選択される。また、このような化合物は１７β−（４’−イミダゾリル）−アンドロスト−４−エン−３−オン、１７β−（４’−イミダゾリル）−アンドロスタ−４，１６−ジエン−３−オン、１７β−（３’−ピラゾリル）−アンドロスト−４−エン−３−オン、１７β−（３’−ピラゾリル）−アンドロスタ−４，１６−ジエン−３−オン，および１７β−（５’−イソキサゾリル）−アンドロスタ−４，１６−ジエン−３−オンから成る群より選択される。
【００２９】
種々の経路による投与に適当な本発明のステロイド化合物の薬学上の塩はこの分野において知られており、そして本明細書において詳細に説明する必要はないであろう。本発明の薬学上許容される塩および本発明によるそれらの誘導体の例は、塩基の塩、例えば、適当な塩基例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム、およびNWnHm塩基および塩（ここでｎおよびｍの各々は０〜４であり、そしてＷは（Ｃ1−Ｃ18）アルキルである）から誘導される塩を包含する。酸基およびアミノ基の薬学上許容される塩は下記のものを包含するが、これらに限定されない：有機カルボン酸、例えば、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、イソチオン酸、ラクトビオン酸（ｌａｃｔｏｂｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）およびコハク酸；有機スルホン酸、例えば、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸；および無機酸、例えば、塩酸、硫酸、リン酸およびスルファミン酸の塩。ヒドロキシを有する化合物の薬学上許容される塩は下記のものを包含するが、これらに限定されない：この化合物のアニオンと適当なカチオン、例えば、Ｎａ+、およびNWnHm（ここでＷは（Ｃ1−Ｃ18）アルキルであり、そしてｎおよびｍは０〜４であり、そしてｎ＋ｍは４である）のアニオンとの組合わせ。
【００３０】
本発明のなお他の部分は、治療を必要とする哺乳動物においてテストステロンおよび／またはDHTのレベルを減少する医薬組成物である。このような医薬組成物は、少なくとも１つの前述のステロイド化合物、それらの混合物、および／またはそれらの薬学上許容される塩と、薬学上許容される担体とを含んでなる。このような組成物は、容認された薬学上の手順、例えば、下記の文献に記載されている手順に従い製造される：Remington's Pharmaceutical Sciences、第７版、Alfonso R.編、Mack Publshing Company、ペンシルベニア州イーストン（１９８５）。
【００３１】
テストステロンおよび／またはDHTの合成を阻害する方法における療法的使用のために、本発明のステロイド化合物またはその塩は、本発明によるステロイド化合物またはその塩と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物の形態で好都合に投与される。適当な担体はこの分野においてよく知られており、そして医薬組成物の所望の形態および投与のモードとともに変化する。
【００３２】
例えば、医薬組成物は希釈剤または賦形剤、例えば、充填剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑剤、およびその他を含むことができる。典型的には、担体は固体、液体、または蒸発性担体、またはそれらの組合わせであることができる。１つの好ましい態様において、組成物は治療用組成物であり、そして担体は薬学上許容される担体である。
【００３３】
本発明の化合物またはその塩を担体と一緒に任意の所望の単位投与形態に配合することができる。典型的な単位投与形態は、錠剤、丸剤、粉剤、溶液、懸濁液、乳濁液、顆粒、カプセル剤、坐剤を包含する。注射可能な溶液および懸濁液は特に好ましい。
【００３４】
各担体は、処方物中の他の成分と適合性でありかつ患者に対して障害性でないという意味において「許容される」ものでなくてはならない。担体は生物学的に許容されかつ不活性でなくてはならない、すなわち、それは細胞が代謝反応を実施できるようにし、こうして本発明の化合物がその阻害活性を行うことができるようにする。
【００３５】
処方物は、経口、経直腸、経鼻、局所（頬および舌下を包含する）、経膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、および経皮）の投与に適当な処方物を包含し、経口、経鼻、経口、および非経口の投与に適当な処方物は好ましい。
【００３６】
例えば、投与に適当な処方物を調製するために、溶液および懸濁液を滅菌されており、好ましくは血液に対して等張である。注射可能な調製物をつくるために、この分野において普通に使用されている担体は、また、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルブテートエステルであることができる。これらの場合において、適切な量の等張調節剤、例えば、塩化ナトリウム、グルコースまたはグリセリンを添加して調製物を等張とすることができる。
【００３７】
水性無菌注射溶液は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、およびその他の非経口処方物に許容される添加剤をさらに含有することができる。
【００３８】
処方物は好都合には単位投与形態で提供され、そして薬学の分野において知られている方法により製造することができる。このような方法は、１または２以上の補助的成分を包含することができる担体と活性成分を組合わせる工程を含む。一般に、処方物は、活性成分を液状担体または微細な担体または双方と均一にかつ緊密に組合わせ、次いで必要に応じて生成物を造形することによって製造される。種々の単位の投与および多投与の容器、例えば、シールしたアンプルおよびバイアルを、この分野においてよく知られているように、使用することができる。
【００３９】
特に前述の成分に加えて、本発明の処方物は、また、この型の医薬処方物のためにこの分野において慣用の他の成分を含むことができる。
【００４０】
本発明の化合物は、担体に対して広い比率で組成物の中に存在することができる。例えば、組成物は０．０１〜９９．９重量％、より好ましくは約０．１〜９９重量％の量で存在することができる。なおより好ましくは、化合物は組成物の約１〜７０重量％の量で存在する。
【００４１】
また、本発明の一部分は、治療を必要とする患者において、有効量の本発明のステロイド化合物、特にその薬学上許容される塩、またはそれらの混合物で患者を治療することによって、BPHまたは前立腺癌を治療するか、あるいは前立腺組織の成長を阻害する方法である。この適用において、「治療」は、本発明の化合物がテストステロンおよび／またはDHTの合成に関係する細胞の機構と接触する手段を包含する。また、この適用において、「患者」は、このような治療を必要とする哺乳動物、特にBPHまたは前立腺癌を患う哺乳動物を包含する。
【００４２】
患者に投与される本発明の組成物において、ステロイド化合物、特にその薬学上許容される塩の投与量はいくつかの因子に依存して変化する。このような因子は下記のものを包含するが、これらに限定されない：患者の年齢、体重、性別、および種、患者の全体的健康、症候の程度、組成物を単独で、あるいは他の成分と組合わせて投与するかどうか、副作用の発生率およびその他。
【００４３】
一般に、BPHの治療における適用に適当な投与量は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／投与、好ましくは約０．０１〜６０ｍｇ／ｋｇ体重／投与、なおより好ましくは約０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重／投与／日である。前立腺癌の治療における適用に適当な投与量は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／投与、好ましくは約０．０１〜６０ｍｇ／ｋｇ体重／投与、なおより好ましくは約０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重／投与／日である。所望の投与量は、１日を通じて適当な間隔で投与される１〜６またはそれより多い細分投与量として投与することができる。化合物は数カ月または数年の期間にわたって反復的に投与するか、あるいは患者にゆっくりかつ終始一貫して注入することができる。より多い投与量およびより少ない投与量を投与することもできる。
【００４４】
１日量は、例えば、前述の種々のパラメーターを考慮して調節可能である。典型的には、本発明の組成物は約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で投与することができる。しかしながら、他の量を投与することもできる。
【００４５】
すぐれた血漿濃度を達成するために、活性化合物は、必要に応じて生理食塩水中の、例えば、ほぼ０．１〜１％の溶液の活性成分により投与するか、あるいはボーラスとして経口投与することができる。
【００４６】
活性成分は、療法のために、任意の適当な経路、例えば、局所、経口、経直腸、経鼻、経膣および非経口（腹腔内、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、および経皮を包含する）の経路により投与することができる。理解されるように、好ましい経路は、患者の症状および年齢、障害の特質、および他の治療用成分を包含する、選択された活性成分とともに変化するであろう。経口的経路は好ましい。また、局所的使用は好ましい。しかしながら、また、患者の症状および治療がどれだけの長期間にわたるかに依存して、他の経路を利用することができる。
【００４７】
活性成分を単独で投与することができるが、活性成分は好ましくは医薬処方物として存在する。本発明の処方物は少なくとも１種の、上記において定義した、活性成分と、１または２以上の許容される担体と、必要に応じて他の治療剤とを含んでなる。
【００４８】
前述の方法は、化合物それら自体を投与するか、あるいは化合物を他の活性成分、例えば、他のステロイド化合物および／または治療剤と組合わせて医薬組成物の形態で投与することによって、実施することができる。本発明において使用するために適当な他の治療剤は、意図する目的のために同一または他のメカニズムにより有効な、任意の適合性薬剤であるか、あるいは本発明の薬剤のメカニズムに対して相補的である薬剤である。これらはテストステロンおよび／またはＤＨＴの合成の阻害のために、そして前立腺癌治療において有効な薬剤、抗癌剤を包含する。例は、なかでも、ケトコナゾール、フィナステリド、および４ＭＡである。
【００４９】
組合わせの療法において利用される化合物は、同時に、別々のまたは組合わせた処方物で、あるいは本発明の化合物と異なる時間において、例えば、順次に、組合わせた作用が達成されるように、投与することができる。投与の量および養生法は、実施者により、好ましくは最初に標準的投与量を低下させ、次いで得られた結果を滴定することによって、調節されるであろう。本発明の療法は、実施者が決定する他の療法と組合わせて調節することができる。
【００５０】
本発明を一般的に説明したが、ある特定の実施例を参照することによって、本発明はよりよく理解されるであろう。これらの実施例は例示のみを目的とし、特記しない限り、本発明またはその態様を限定することを意図しない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：睾丸の１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼおよび前立腺の５α−レダクターゼのインヒビターとしての新規な２０−プレグナンおよび他のステロイド誘導体の合成およびin vitroにおける評価
７０を超える２０−置換および他のプレグナン誘導体を合成し、ヒト１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼおよび５α−レダクターゼのインヒビターとして評価した（表１および表２）。
【００５２】
ヒト睾丸ミクロソームを異なる濃度の化合物とインキュベートすることによって、１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼによる放射性標識化プレグネノロンの１７α−ヒドロキシプレグネノロンおよびDHEAへの変換を測定した。逆相ＨＰＬＣを使用して、基質および代謝物を分離し、正確に定量した。１７α−ヒドロキシラーゼおよびＣ17,20−リアーゼの活性を、別々に、計算した。１７α−ヒドロキシラーゼの活性をプレグネノロンの１７α−ヒドロキシプレグネノロンおよびDHEAへの変換から計算し、そしてＣ17,20−リアーゼの活性はプレグネノロンのDHEAへの変換をに基づいた。１７α−ヒドロキシプレグネノロンはＣ17,20−リアーゼによりDHEAに変換した基質であるが、この１７α−ヒドロキシ中間体は変換の間に酵素結合部位から解放されないことが報告された(Nakajin et al.、1981a、b)。また、基質の要件において種の差が存在する。プレグネノロンは、ヒト睾丸の１７α−ヒドロキシラーゼおよびＣ17,20−リアーゼのプロゲステロンよりむしろ、天然の基質である。したがって、この酵素複合体の活性を測定するための基質としてプレグネノロンを使用した。
【００５３】
［７−3Ｈ］テストステロン（１０ｎＭ、６×１０5ｄｐｍ）を含むヒト前立腺ミクロソーム（０．５ｍｌのリン酸塩緩衝液中のほぼ０．６ｍｇのタンパク質）
を、NADPH発生系（１００μｌのリン酸塩緩衝液中のＮＡＤＰ０．６５ｍＭ；グルコース−６−リン酸塩７．１ｍＭ：グルコース−６−リン酸塩デヒドロゲナーゼ２．５１Ｕ）および１０ｎＭおよび１００ｎＭの候捕のインヒビターと、酸素下に３０分間３７℃においてインキュベートすることによって、５α−レダクターゼのアッセイを実施する。インキュベーション後、ステロイド［14Ｃ］標識化(Ｔ．ＡおよびDHT)および真性マーカー（Ｔ．Ａ、DHT、５α−アンドロスタン−３α−ジオールおよび３β−ジオール、３ジオール）を添加する。ステロイドをエーテルで抽出し、ＴＬＣのクロマトグラフィー（クロロホルム：エーテル８０：２０）により分離する。プレートをヨウ素蒸気に暴露した後、DHTおよび３−ジオールをそれらのマーカーから捜し出す。ステロイドをプレートからこすり取り、放射能を測定する。［７3Ｈ］テストステロンのDHTおよび３−ジオールへの変換百分率から、結果を計算する。
【００５４】
表１に示すように、２０−オキシム（Ｉ−１、Ｉ−５）、および２０β−オール（Ｉ−２０、Ｉ−３４）を含有する化合物は１７α−ヒドロキシラーゼおよびＣ17,20−リアーゼの効力のある阻害をを示した。２０β−カルボキシアルデヒド(I-6；Li、et al.、1992)および２０Ｓ−２０，２２−エポキシド（Ｉ−８）は、この酵素複合体の有意な阻害を示す。２２−オキシム（Ｉ−２３）は、また、５α−レダクターゼの効力のある阻害を示し、そして米国特許第５，２６４，４２７号（その内容を引用することによって本明細書の一部とされる）の基準であった。２０−ヒドラゾン（Ｉ−１２）および２０−アミン（Ｉ−９、Ｉ−１０）は劣った阻害を示したが、２０−位置（Ｉ−１４）または２２−位置（Ｉ−１５）におけるＮ，Ｎ−ジメチルヒドラゾンは阻害活性を欠如していた。この結果が暗示するように、これらの置換基と酵素活性部位との間の疎水性相互作用は好適ではない。同様な影響を２０−エン（Ｉ−２８）および２０−イン（Ｉ−２９）において見ることができる。
【００５５】
Ｄ環の変更において、この酵素複合体の阻害に寄与する、最も重要な因子は、２０−オキシム（Ｉ−５）に関連するとき、１６，１７−エンであることを我々は見出した。したがって、２０−オキシム（Ｉ−１）と比較すると、１６−エン−２０−オキシム（Ｉ−５）は３５倍のより高い効力のある阻害を示した。他の化合物、例えば、１６α，１７α−エポキシド（Ｉ−１７）は効力を減少させた。１７，２０−エンの導入は阻害に寄与せず（（Ｉ−２６）と（Ｉ−３２）とを比較したとき）、１７α−ブロモ（Ｉ−１１）は劣った阻害を示し、そして３−アセテートは３−ヒドロキシ化合物（Ｉ−３６）よりも低い活性を有した。
【００５６】
２０−アザの特徴をインヒビタ−Ｉ−１６の中にバイオイソステアー（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）変更として導入すると、効力の増加が期待された。しかしながら、２０−アザ化合物（Ｉ−４０）はＩ−１６よりもほぼ４倍低い阻害を示した。
【００５７】
イミダゾール部分はいくつかのシトクロムＰ−４５０酵素、特にアロマターのインヒビターの中に導入された(Schieweck、et al.、1993)。イミダゾール部分はリガンドとして作用して、シトクロムＰ−４５０酵素のヘム補欠基の鉄原子に結合し、配位複合体を形成することができる。１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼによる１７α−ヒドロキシル化およびＣ17,20−側鎖の切り放しの詳細なメカニズムは、我々のインヒビターの研究に基づいて、現在不明瞭であり、酵素のヘム基は基質のＣ１７およびＣ２０位の密接しているに違いないように見える。したがって、これらの位置におけるイミダゾール基の導入はこの基をヘムに近接させて配置するであろう。この根本原理を使用して、我々は１７β−または２０−位置にイミダゾール基を有する１系列のプレグナン誘導体を設計し、合成した。
この変更は効力のあるインヒビターを製造する、最も有効な方法であることが見出された。１７β−（４’イミダゾリル環）を含有する化合物Ｉ−４７は、１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼの効力のある阻害を示した（ＩＣ50１１／７ｎＭ）。これが示唆するように、この位置におけるイミダゾリル窒素の孤立電子対は、酵素の活性部位におけるヘムコファクターの鉄原子に配位することができる。１６，１７α−エポキシド（Ｉ−５１、ＩＣ50４３１／９８ｎＭ）または１７α−ヒドロキシ基（Ｉ−４４、ＩＣ50１，２００／１０００ｎＭ）の導入は、この阻害を劇的に減少させた。しかしながら、１６，１７二重結合（Ｉ−４９、ＩＣ50４／４ｎＭ）の導入は、阻害を２倍増加させた。Potter、et al.、（1995）は、また、１７−（３’−ピリジル）置換基が１６，１７−二重結合と一緒に効力のある活性を示すことを見出した。
【００５８】
イミダゾール環に関すると、２’位置におけるメチル基の導入（Ｉ−４、ＩＣ50４００ｎＭ）はこの活性を減少させるが、大きい２’−フェニル基はほとんど完全な活性の喪失を引き起こすことを我々は見出した。ステロイドがイミダゾールの２’−位置に結合した、１７β−（２’−イミダゾリル）Ｌ−１）は、１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼの劣った阻害を示した。２０β−［４’−イミダゾリル］−（Ｉ−４５）は、また、活性を示さなかった。これらの結果が示唆するように、イミダゾール環とステロイドＤ環との間の並列は重要である。１７β−［２’−メチル−４’オキサゾリル］（Ｌ−５）、Ｎ’原子がＯ原子で置換されている、Ｌ−４のバイオイソステアー類似体は低い阻害を引き起こした。３−アセトキシ誘導体（Ｌ−１２）はＩ−４９よりも低い効力を有し、これは３−位置における制限された嵩許容度を反映するであろう。しかしながら、Ｌ−１２は合理的な活性（ＩＣ50７５／２５ｎＭ）をなお保持し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩ−４９のプロドラッグとして有用であろう。
【００５９】
前述の誘導体は５−エン−３β−オール構造をベースとし、天然の基質のプレグネノロンに類似する。しかしながら、５α−レダクターゼの基質は４−エン−３−オン、すなわち、テストステロンである。期待されるように、Ｉ−４７およびＩ−４９は５α−レダクターゼを阻害しなかった。他方において、Ｉ−４１およびＬ−６は、それぞれ、Ｉ−４７およびＩ−４９の４−エン−３−オン誘導体であり、５α−レダクターゼに対する活性を示した（ＩＣ50＝１２２ｎＭおよび５２２ｎＭ）が、１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼに対する強い効力（それぞれ、ＩＣ50５９／５ｎＭおよび１６／２）をなお保持した。したがって、アンドロゲン合成に対する完全な阻害を達成するために、Ｉ−４１およびＬ−６は有望な候捕であるように見える。
【００６０】
５−エン−３−オール、４−エン−３−オン、５，１６−ジエン−３−オールおよび４，１６−ジエン−３−オンプレグナン系列における２０−ヒドロキシエピマーの阻害活性を研究した。５−プレグネン−３−オール系列において、２０β−オール（Ｉ−２０）は２０α−オールエピマー（Ｉ−１９、ＩＣ50７２０／５１０ｎＭ）よりも１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼのより強い阻害（ＩＣ50ｍ１８０／１９０ｎｍｏｌ）を示したが、期待されるように、５α−レダクターゼに対する活性を示さなかった。５−エン−３−オールから４−エン−３−オンへの変換は１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼの阻害を減少させたが、５α−レダクターゼの阻害を大きく増強させた。したがって、２０α−オール（Ｉ−３３）は効力のある５α−レダクターゼインヒビター（ＩＣ50１３ｎＭ）であり、そしてその２０β−オール−エピマー（Ｉ−３４、ＩＣ50９０ｎＭ）よりも強い。上に示したように、１６，１７−二重結合の導入は１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼの阻害を増加した。したがって、Ｌ−８（２０α−ヒドロキシ−５，１６−プレグナジエン−２０−オン）はＩ−２０よりも強い（ＩＣ50＝１００ｎＭ）が、２０β−オール（Ｉ−９）は低い活性であった。Ｌ−１０、２０β−ヒドロキシ−４，１６−プレグナジエン−３−オールはフィナステリド（ＩＣ50＝１４ｎＭ）に匹敵する効力のある５α−レダクターゼインヒビター（ＩＣ50＝２０ｎＭ）であるが、そのエピマ−２０α−オール（Ｌ−１１）は活性を示さなかった。Ｌ−１０の２０β−オールはｉｎ ｖｉｖｏにおいて２０−オンに代謝するので、１６−デヒドロプロゲステロン（Ｌ−１３）をまた試験し、１７α−ヒドロキシラーゼ（ＩＣ50＝７３／２４ｎＭ）および５α−レダクターゼ（ＩＣ50＝２２ｎＭ）の双方の効力のあるインヒビターであることが見出された。また、プロゲステロンは効力のある５α−レダクターゼインヒビターであることが知られているが、その身体における急速な代謝および経口活性の欠如は治療剤としてのその価値を減ずる（Ｐｅｔｒｏｗ、ｅｔ ａｌ．、１９８３）。しかしながら、Ｌ−１０およびＬ−１３の双方は１６，１７−二重結合を有するので、それらの１７β−アセチル側鎖はｉｎ ｖｉｖｏにおいて分解することが困難であろう。
【００６１】
示すように、２０−オキシム基の導入は一般に１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼの阻害を増強する。プレグネノロン−２０−オキシム（Ｉ−５）は、いっそう効力のある１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼのインヒビターである（ＩＣ50＝１６ｎＭ／１６ｎＭ）である。Ｉ−５、Ｌ−２の４−エン−３−オン誘導体は１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼに対して２倍強い活性（ＩＣ50＝６／５ｎＭ）を示すばかりでなく、かつまた５α−レダクターゼに対して効力のある活性を示した（ＩＣ50＝５２．５ｎＭ）。３−オキシム基（Ｉ−４２、Ｉ−４３）の導入は、１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼおよび５α−レダクターゼに対する活性を減少させた。
【００６２】
要約すると、７０を超える化合物を合成し、酵素阻害について評価した。最も効力のあるインヒビターを表３に要約する。Ｉ−４７、Ｉ−４９およびＬ−６は１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼおよび５α−レダクターゼの効力のあるインヒビターである。Ｌ−１２はＩ−４９よりも弱いインヒビターであるが、それはｉｎ ｖｉｖｏにおいてＩ−４９のプロドラッグとして作用することができる。我々の候補のいくつかはまた１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼの非常に効力のあるインヒビターであると我々は考える。１７β−（シクロプロピルアミノ）アンドロスト−５−エン−３−オールは９０ｎＭのＫｉを有すると報告された。ラット１７α−ヒドロキシラーゼに対して効力のある活性を有する１７β−ウレイド−置換ステロイドは記載された(Goldman、et al.、1976)。最近、Potter、et al.（1995）は、４ｎＭ／２．９ｎＭのＩＣ50を有する、最も効力のあるインヒビター、１７−（３’−ピリジル）アンドロスタ−５，１６−ジエン−３−オール（CB7598）を報告した。しかしながら、これは天然の基質［3Ｈ］−プレグネノロンの代わりに［3Ｈ］−プロゲステロンに対して試験された。彼らのアッセイにおけるケトコナゾールのＩＣ50は６５ｎＭ／２６ｎＭであったので、ＣＢ７５９８はＬ−２およびＩ−４９に対して同様な活性を有した。前述の、我々の候補の大部分は、ケトコナゾールよりも１０〜５０倍いっそう活性であった。しかしながら、Ｌ−２、Ｌ−６、およびＬ−１３は、また、５α−レダクターゼの効力のあるインヒビターを示しが、ＣＢ７５９８はこの酵素に対する活性を示さなかった（Potter、et al.、1995）。ここに提供したインヒビターはより大きい可能性を有するように見える。
【００６３】
実施例２：副腎ステロイドの阻害
これらの研究はモルモットの副腎を使用して実施された。ラットと対照的に、モルモットはヒトと同様にコルチゾルを合成する。多数のいっそう効力のある睾丸の１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼのインヒビターを使用して、インキュベーションを実施して、それらがまたコルチゾルの産生に要求される副腎の１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼに影響を与えるかどうかを決定した。多数のプレグン−４−エン−３−オン誘導体は副腎の酵素を阻害するように思われたが、大部分のプレグン−５−エン−３β−オール化合物、例えば、Ｉ−４７およびＩ−４９は非常にわずかの作用を有した。Ｉ−５およびＩ−７は、コルチゾル合成に要求される副腎１７α−ヒドロキシラーゼに対して比較的わずかの（４％）作用を有するか、あるいは作用をもたないが、Ｃ17,20−リアーゼに対して適度に強い作用を有し、副腎のアンドロゲン合成の減少を引き起こした（それぞれ、７７％および６３％）ので、それらは重要性を有した。
【００６４】
実施例３：アンドロゲンレセプターに対するインヒビターの作用
Ｉ−１６、Ｉ−２３、およびＩ−４７を今日までを使用して、インヒビターがアンドロゲンレセプターと相互作用するかどうかを決定する研究を実施した。アンドロゲンレセプター仲介遺伝子転写に対するＤＨＴの刺激作用を中和する、これらの化合物の能力を決定した。さらに、化合物の中和特性をまた研究した。ヒトアンドロゲンレセプター（ＡＲ）またはＬＮＣａＰ細胞において発現される突然変異ＡＲをコードする遺伝子で、ＣＶ１細胞を一時的にトランスフェクトした。また、マウス乳房腫瘍ウイルスのプロモーターのアンドロゲン応答因子の制御下に、ルシフェラーゼリポーターのベクターをトランスフェクトした。ＡＲを活性化する処理はルシフェラーゼ活性を増加させた。これは細胞を溶解し、ＡＴＰおよびルシフェリンを添加し、そして発生した発光をルミノメーターで測定することによって定量した。DHT(１ｎＭ)は、野生型ＡＲでトランスフェクトした細胞において、ルシフェラーゼ活性を１０５〜１１７倍刺激した。Ｉ−１６、Ｉ−２３、およびＩ−４７のすべては、野生型レセプターの投与量依存性中和を示した。ＬＮＣａＰ細胞の突然変異レセプターでトランスフェクトした細胞において、Ｉ−４７は再びアンタゴニストとして挙動したが、Ｉ−１６およびＩ−２３はアゴニストとして作用した。
【００６５】
実施例４：in vitroにおいて前立腺のアンドロゲン依存性増殖に対するインヒビターの作用 ヒト前立腺癌細胞（LNCaP）
薬剤のビヒクルのみ（対照）、０．１ｎＭのテストステロン、または０．１ｎＭのテストステロンおよび０．３、１、２．５、または５μＭのインヒビターで、９日間処理したウェルにおける細胞の数を比較することによって、ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞系統の増殖に対するテストステロンの刺激作用を逆転する、種々のインヒビターの能力を試験した。テストステロンは、薬剤ビヒクルのみで処理した対照培養物に比較して、ＬＮＣａＰ細胞の増殖を２倍刺激した。Ｉ−４７、Ｉ−４９、Ｌ−１０および参照化合物のフィナステリドおよび４−ＭＡは、テストステロンの刺激作用の投与量依存性逆転を示した。Ｉ−２３、Ｉ−３３、Ｉ−３４およびヒドロキシフルタミド（０．３〜１μＭ）は細胞の増殖を刺激した。この作用は、多分、ＬＮＣａＰ細胞のアンドロゲンレセプターの突然変異に帰属され、この突然変異はプロゲスチンに対するアンドロゲンレセプターの応答を増加させる。最も有効な化合物はＩ−４７、４ＭＡおよびフィナステリドであり、これらのすべては０．１ｎＭのテストステロンの刺激作用を１μＭまたはそれより低い濃度において５０％だけ減少させ、そして５μＭにおいてテストステロンの作用をほとんど完全に逆転させた。また、細胞を０．０３ｎＭのDHTとインキュベートし、これはLNCaP細胞の増殖を２．８倍だけ刺激した。Ｉ−４７、Ｉ−４９、４−ＭＡおよびフィナステリドのすべては、DHTの刺激作用の投与量依存性を逆転し、Ｉ−４７およびＩ−４９は５μＭにおいてほとんど完全な逆転を示した。Ｌ−１０の阻害作用は、試験した濃度範囲にわたって投与量依存性ではなかった。インヒビタ−Ｉ−２３およびＩ−３４は、DHTにより生成されたレベルより上の増殖の刺激を生成した。
【００６６】
組織培養における前立腺組織
我々は、最近、ヒト前立腺組織に対する化合物の増殖阻害特性を評価する組織培養法を開発した。患者からのヒトBPHまたは前立腺癌組織の外科的生検を小片に切断し、そして２４ウェルのプレート中で５％の木炭ストリップした胎仔ウシ血清およびテストステロンまたはDHT基質を含有し、インヒビターを含むか、あるいは含まない、１ｍｌのイーグル培地（フェノールレッドを含まない）中でゼラチンスポンジ上で３７℃において７日間インキュベートした。次いで２μｌのＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］−チミジンを含有する新鮮な培地／処理において、組織の試料を３日間インキュベートした。次いで組織を消化し、ＤＮＡを抽出した。各試料について、［3Ｈ］−チミジンの吸収をＤＮＡ含量に対して正規化した。テストステロン（１μＭ）およびＤＨＴ（１０ｎＭ）は、未処理試料に比較して、刺激ＤＮＡ合成を、それぞれ、ほぼ２倍および３倍に刺激した。Ｉ−３３、Ｉ−３４、Ｉ−４７、４ＭＡおよびフルタミド（１μＭ）はテストステロンの刺激作用のほとんど完全な逆転を生成した（第１図）が、Ｉ−４９は部分的に有効であり、そしてＩ−４１およびＩ−４３は作用を示さなかった（データは示されていない）。Ｉ−３３および４−ＭＡも０．３μＭにおいて高度に有効であったが、Ｉ−３４は部分的に有効であり、これらの化合物による５α−レダクターゼの阻害が増殖を阻害するために十分であることを示唆する。ＤＨＴの刺激作用は１μＭのＩ−４７によりほとんど完全に逆転された。この発見は抗アントロゲンとして作用する化合物と一致する。化合物のいずれも、添加したアンドロゲンの非存在においてＤＮＡ合成に対して独立の作用を生成しなかった。
【００６７】
結論
化合物Ｉ−４７、Ｉ−４９、Ｌ−２、Ｌ−６およびＬ−１３は、ヒト１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼについて、ケトコナゾールよりも１０〜５０倍より高い効力を有することを、今日までの結果は示す。さらに、Ｌ−２はまたヒト５α−レダクターゼの効力のあるインヒビターであり、そしてフィナステリドよりもわずかに低い効力を有する（４〜６倍）が、Ｌ−１０およびＬ−１３はフィナステリドとほとんど等しい効力を有する。今日までのデータは、Ｌ−２およびＬ−１３は、双方酵素の効力のあるインヒビターであるので、最良の化合物である。前立腺組織の組織培養におけるＤＮＡ合成のテストステロン刺激を阻害する、Ｉ−３３および４ＭＡの能力は、５α−レダクターゼに対するそれらの阻害作用に少なくとも部分的に帰属される。しかしながら、化合物Ｉ−４７は５α−レダクターゼに対して活性をもたず、しかも、前立腺組織の組織培養およびＬＮＣａＰ細胞系統の細胞培養の双方において、テストステロンばかりでなく、かつまたＤＨＴの増殖刺激作用を阻害することができた。これが示唆するように、Ｉ−４７はアンドロゲンレセプターのアンタゴニストならびに１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼの効力のあるインヒビターとして作用する。ＬＮＣａＰ細胞の突然変異アンドロゲンレセプターに対してアゴニスト活性を有することが見出されたヒドロキシフルタミド（Veldscholte et al.、1992）と異なり、Ｉ−４７は突然変異レセプターのアゴニストではない。したがって、Ｉ−４７は前立腺癌の治療のために現在使用されている抗アンドロゲン、ヒドロキシフルタミドを越えた利点を有する。なぜなら、ＬＮＣａＰ突然変異は前立腺組織のバイオプシーのアンドロゲンレセプターの中にしばしば見出されたからである（Gaddipati et al.、1994）。
【００６８】
Ｉ−４７の二重アンドロゲン発生的１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼインヒビターの作用は、前立腺癌の治療における、その潜在的実用性を増加させる。
【００６９】
実施例５：正常ラットにおけるｉｎ ｖｉｖｏ研究
４−プレグネン−３−オン−２０β−カルボキシアルデヒド（I-16）(Li et al.、1992)およびその２０−カルボキシアルドキシム（I-23）(Li et al.、1995)を使用して、正常ラットにおける研究を実施した。双方の化合物はラット１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼならびに５α−レダクターゼを阻害し、そしてラットにおける血清、睾丸および前立腺組織中のテストステロンおよびDHTのレベルの減少において有効であった。３−オキソ−４−プレグネン−２０β−カルボキシアルデヒドオキシム（Ｉ−２３）は、基質としてプロゲステロンを使用して１７α−ヒドロキシラーゼの中程度の阻害(Ki74nM/Km29nM)を示し、そして基質として１７α−ヒドロキシプロゲステロンを使用してＣ17,20−リアーゼ活性の効力のある阻害(Ki18nM/Km76nM)を示した。基質としてプロゲステロンを使用する、この酵素のそれ以上の研究において、阻害が主として１７α−ヒドロキシル化段階において起こることが示された。また、Ｉ−２３はヒト前立腺ミクロソームにおいて５α−レダクターゼの効力のある、競合阻害を示した（Kil.4nM/Km14nM）。成体の雄のラットに毎日１〜２３（５０ｍｇ／ｋｇ／日）を２１日間皮下注射したとき、血清および睾丸のテストステロン濃度は、ビヒクル処置した対照に比較して、それぞれ、６５％および５９％だけ有意に減少した。さらに、ラット前立腺組織中のテストステロンおよびＤＨＴの双方の濃度は、対照組織に比較して、６０％および４４％だけ有意に減少した。血清ＬＨ濃度は、対照グループに比較して、Ｉ−２３処置したグループにおいて未変化であった。これが示すように、この化合物で処置した動物におけるアンドロゲン濃度の減少は、ＬＨ分泌を減少させる下垂体のフィードバックメカニズムに対する、その影響のためではない。これらの発見が示唆するように、Ｉ−２３はin vitroおよびin vitroの双方において１７α−ヒドロキシラーゼ／Ｃ17,20−リアーゼおよび５α−レダクターゼの阻害を通して、アンドロゲン合成の減少において有効である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９５５）。
【００７０】
実施例６：ヒト前立腺癌異種移植モデルにおける研究
MatrigelにおけるＭＣＦ−７乳癌細胞の接種がヌードマウスにおいて乳房腫瘍の形成を増加することを、我々は報告した（Yue et al.、1994）。したがって、同一手順を利用して、雄のヌードマウスにおけるヒト前立腺癌細胞(LNCaP)から腫瘍を発生させた。４〜６週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雄の無胸腺マウスに、Matrigel中に懸濁させたLNCaP細胞を皮下接種した。４部位／マウスに、０．１ｍｌのMatrigel中の１．８×１０6細胞を注射した。腫瘍が１００ｍｍ3の体積に到達したとき、処置を開始した。処置の開始前および処置の間に１回／週で、腫瘍を測定した。腫瘍の体積を式４／３πｒ12ｒ2（ｒ1＜ｒ2）により計算した。処置の終わりにおいて、マウスを殺し、個々の腫瘍を秤量した。腫瘍の発生の潜伏時間は３０〜４０日であり、そして全体の腫瘍発生率は８２％であった。
【００７１】
それ以上の実験において、細胞接種後４５日に、２匹のマウスをＩ−１６（１ｍｇ／マウス／日、皮下）で処置した。２匹のマウスに対照としてベヒクル与えた。３週の処置後、対照マウスの総腫瘍体積はそれらの初期の体積の２８１％に増加したが、Ｉ−１６処置したマウスにおいて、総腫瘍体積は１７３．６％であった。平均腫瘍重量はＩ−１６処置マウスにおいて１９８．７８±７２ｍｇであり、これに対して対照群において３８６．３±１４７．２であった。他の実験において、Ｉ−４７およびＩ−４９は腫瘍の増殖の抑制において有効であった。対照マウスの総腫瘍体積は初期の体積の８８４．０％に増加した。５週において、４匹のマウス／群の腫瘍増殖速度はＩ−４７およびＩ−４９を使用する処置により減少した（それぞれ、それらの初期の体積の５２５．８％および３１５．３％（第２図））。平均腫瘍重量は対照マウスにおいて１３１０、５±１１２５．９ｍｇであり、Ｉ−４７処置群において６０７．０±１４２．４ｍｇおよびＩ−４９処置群において２５５．９±７６．９ｍｇ（対照に比較してｐ＜０．０５）であった。
【００７２】
種々の特定の材料、手順および実施例により、本発明を記載し、例示したが、理解されるように、本発明はその目的のために選択された特定の材料、材料の組合わせ、および手順に制限されない。このような詳細の多数の変化が当業者により可能であり、理解されるであろう。
【００７３】
【表１Ａ】
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【００７４】
【表１Ｂ】
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【００７５】
【表１Ｃ】
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【００７６】
【表１Ｄ】
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【００７７】
【表２Ａ】
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【００７８】
【表２Ｂ】
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【００７９】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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