(57)【要約】【課題】  環境汚染・生態系破壊・人体への悪影響の懸念がある化学農薬を使用せずに、細菌を用いた生物資材でもって、ナスビのナス半身萎凋病を効果的に抑制するナス半身萎凋病抑制剤及びその抑制方法を提供する。【解決手段】  バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）菌の培養物と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ）ＳＫ５２２（受託番号  微工研条寄第３４５９号）と高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ）ＳＫ５４２（受託番号  微工研条寄第３３８２号）との共生培養物を混合した液状混合培養物に、ナス苗の根を浸漬してこれら菌を接種させた後にナス苗を畑土壌に植生する。【選択図】  図１
2010064958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）を有効菌とするナス半身萎凋病抑制剤。
【請求項２】
バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）を培養した培養物と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）を６０℃以上の高熱性環境下で共生培養した共生培養物とを混合した培養混合物を有効成分とする、ナス半身萎凋病抑制剤。
【請求項３】
バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の培養物と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）の共生培養物とを、粉粒状担体に含有させた複合菌含有物を有効成分とする、ナス半身萎凋病抑制剤。
【請求項４】
請求項３の担体が、粒度調整した炭酸カルシウム、消石灰、硫酸カルシウム、石灰岩粉、ドロマイト岩粉、貝化石粉末、カニ・エビ・シャコ・貝殻等の甲殻・貝殻粉末、ゼオライト、パーライト、バーミキュライト、珪藻土、木炭、くん炭、粉砕ピートモスのいずれか、あるいはこれらの混合物である、請求項３記載のナス半身萎凋病抑制剤。
【請求項５】
バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の液状培養物に、ナス苗の根を浸漬後同ナス苗を土壌に植生する、ナス半身萎凋病抑制方法。
【請求項６】
バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の培養物と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）の共生培養物とを混合した液状培養物にナス苗の根を浸漬した後同ナス苗を畑土壌に植生する、ナス半身萎凋病抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナスビの収穫に大きな影響を与えるナス半身萎凋病の発生を、バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）を有効菌として用いて、又はこの菌と好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）と、高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）
とを６０℃以上の高熱性環境下で培養した共生培養物を混合して利用して、または、これら複数の培養物を炭酸カルシウム等の適当な担体に含有させた複合菌含有物を利用してナス半身萎凋病を抑制する技術に関する。本明細書・特許請求の範囲及び要約書中の細菌名の英文字の下線は、細菌名表記がイタリックであることを示す。
【背景技術】
【０００２】
現在、環境問題が大きな関心事となっている。色々な汚染物質による地球環境汚染が深刻化の度合いを深めているからである。農業分野は特にその危険性が指摘されている。それは農産物の増収を目的に化学肥料、化学農薬を多量に使用してきた過去の歴史の結末に他ならない。特に化学農薬が地球環境汚染、生態系の破壊、人体への悪影響等の元凶となっている事例も少なくなく、そのため、２００３年には農薬法の一部改正が施行されて、いくつかの化学農薬が登録を抹消された。土壌消毒剤として長年使用されてきた臭化メチルがオゾン層破壊物質として使用が禁止されたのはその一例である。このため化学農薬の使用量は年々減少傾向にある
最近の農業は地球環境保全に立脚した農業形態を目指している。有機農業への傾斜が強まっているのはこのためである。堆厩肥の活用や穀物や野菜などの害虫・病原菌に対する生物的防除の取組みなど、有機資材の活用を基本に、化学肥料や化学農薬などの化成品の使用を低減し、バランスの良い資材の施用で、健全で永続的に安定した営農は今や農業分野での基本理念となっている。
【０００３】
このような中で、生物的防除剤への関心が高まっている。特にバチルス・チューリンジェンシス菌を活用した生物農薬の研究開発は世界的な規模で進められおり、実用化されたものも多い。しかし、これは殺虫剤としての活用が主で、細菌やカビなどの植物病原菌に対してはあまり開発が進んでいないのが現状である。
【０００４】
このような現状に鑑み、発明者らはバチルス・チューリンジェンシス菌を他の菌と複合させることにより、作物病害に対して防除的な効果を増強させ、且つ、土壌の化学的・物理的・生物的環境を改善し、地力増強、品質改善などの付随効果も期待される新しい土壌改良剤の発明に至った。
【０００５】
ナス半身萎凋病菌は前作で感染した状態で収穫し、完全な殺菌駆除をせず放置すると、残渣とともに土壌中で生存し続ける感染力の強い菌で、多くの作物に感染する。新しくナスの栽培を始めた時、前作の生存菌がナスの根から侵入し、導管を上昇して感染発病する。気温２０〜２４℃の比較的低温条件で多発することが多く、２８℃以上ではほとんど発病しない。病状は下葉に黒褐色の細長い筋条の病斑を生じ、次第に小葉の葉脈が葉周辺の縁から黄褐色に変わりやがて萎れ始める。症状が進行すると、下葉全体が灰緑色〜淡褐色となり青枯れ状に萎凋し枯れ死する。また、葉柄、果梗、クラウンの導管が褐変し、根は黒褐色に腐敗する。勿論収穫に多大な害をもたらす。
【０００６】
従来、植物及び果実における真菌感染または細菌感染による病害を抑制する方法として、抗菌活性を有するバチルス・チューリンジェンシス株ＡＱ５２（ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ２１６１９）の菌の培養物を用いる方法が特表２００１−５２４８０６号公報で知られている。
【０００７】
このバチルス・チューリンジェンシス株は、他の細菌株との組み合わせによってトマト植物の焼き枯れ病の抑制、ビートアワヨトウ幼虫の生育阻害を示す。しかしながらナス半身萎凋病に有効とまでは知られていない。また、このナス半身萎凋病を効果的に抑制する細菌は知られていなかった。
【特許文献１】特表２００１−５２４８０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は従来の問題を解消し、ナス半身萎凋病を有効に抑制しうる細菌を用いたナス半身萎凋病抑制剤及び抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決した本発明の構成は、
１）  バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）を有効菌とするナス半身萎凋病抑制剤
２）  バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）を培養した培養物と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）を６０℃以上の高熱性環境下で共生培養した共生培養物とを混合した培養混合物を有効成分とする、ナス半身萎凋病抑制剤
３）  バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の培養物と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）の共生培養物とを、粉粒状担体に含有させた複合菌含有物を有効成分とする、ナス半身萎凋病抑制剤
４）  前記３）の担体が、粒度調整した炭酸カルシウム、消石灰、硫酸カルシウム、石灰岩粉、ドロマイト岩粉、貝化石粉末、カニ・エビ・シャコ・貝殻等の甲殻・貝殻粉末、ゼオライト、パーライト、バーミキュライト、珪藻土、木炭、くん炭、粉砕ピートモスのいずれか、あるいはこれらの混合物である、前記３）記載のナス半身萎凋病抑制剤
５）  バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の液状培養物に、ナス苗の根を浸漬後同ナス苗を土壌に植生する、ナス半身萎凋病抑制方法
６）  バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の培養物と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）の共生培養物とを混合した液状培養物にナス苗の根を浸漬した後同ナス苗を畑土壌に植生する、ナス半身萎凋病抑制方法
にある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）を有効菌として利用することで、及びこの菌と好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）を複合菌として利用することでナス半身萎凋病を効果的に抑制することができた。また、その使用方法として別個に培養した上記３菌株の培養混合物、あるいは上記３菌株を別個に培養した培養物を粒度調整した炭酸カルシウム等の適当な担体に含有させて土壌又は栽培土に散布、又は漉き込むことによってナス半身萎凋病が発生し難い畑、土壌にできる。また、バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株の単独菌の培養物に、又は上記３菌株を別個に培養して混合した培養混合物にナス苗の根を浸した後、再度、畑や土壌に戻すことによってもナス半身萎凋病を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の培養物と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）
の共生培養物を混合して、複合菌混合培養物として畑や土壌に散布するか、または前記３菌を別個に培養した培養物を炭酸カルシウム等の適当な担体に含有せしめて複合菌含有物として畑や土壌に散布することが最も望ましい。散布の時期としてナスを播種する１〜２週間前に直接畑や土壌に散布することが最も好ましい。
【実施例１】
【００１２】
以下、本発明の実施例１について詳しく説明する。
図１は、実施例１に用いたバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の細菌の寒天培地培養３日後の形状を示す説明図である。
図２は、実施例１で使用した抗菌活性試験用角型シャーレ寒天培地を示す説明図である。
図３は、実施例１のナス苗の菌液への接触要領を示す説明図である。
【００１３】
図中、Ｐは４号ポット、Ｙは直径３０ｃｍ×深さ８ｃｍの円形状プラスチック容器、Ｎは根の先端を切ったナス苗、Ｓは４号ポットＰ内の培養土、Ｂはプラスチック容器Ｙ内の菌液、Ｋは抗菌活性試験用の長さ１４４ｍｍ×幅１０４ｍｍ×高さ１６ｍｍの角型シャーレ内の寒天培地、Ａは同培地に設けた内径８ｍｍで深さ５ｍｍの孔である。
【００１４】
（バチルス・チューリンジェンシスＮ−０２９株）
本発明に使用するバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の性状について説明する。
【００１５】
生態学的性状
＊グラム染色    陽性
＊通性好気性
＊運動性        陽性
＊桿菌（単連鎖あり）
＊胞子形成（楕円形、芽胞位置  偏在）
＊胞子の横に不定形（いびつな球形、ダルマ型、ハート型のＰａｒａｓｐｏｒａｌ  ｃｒｙｓｔａｌを作る（図１参照）
【００１６】
【表１】
2010064958.tif 000003
【００１７】
生化学的性状テストの結果は下記の表２のとおりである。
【００１８】
【表２】
2010064958.tif 000004
【００１９】
本発明に使用するバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の特性は下記の表３のとおりである。
【００２０】
【表３】
2010064958.tif 000005
【００２１】
本発明に使用するバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の寄託の情報
寄託所：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
受託番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７
分類学上の位置：バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）
識別のための表示：Ｎ−０２９
【００２２】
（クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２菌株）
本発明に使用する好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）の性状について説明する。
【００２３】
菌学的性質
旺盛なる繊維素分解力と弱又は微弱なるリグニン可溶化能を有する（随伴菌なしで単独では生育ができない）。
【００２４】
生態学的性状
＊グラム染色    陰性
＊嫌気性
＊直桿状（わずかに湾曲するものあり）。単独、ときどき２連。
＊運動性  見られない
＊胞子    末端に楕円、または円形の胞子を形成
【００２５】
生理生化学的性質は次のとおりである。
酵素作用等
本菌は繊維素分解酵素を持ち、その酵素で繊維素の巨大分子の末端から分解していく。その性質を下記の表４に繊維素の基質を主体として示す。
【００２６】
【表４】
2010064958.tif 000006
【００２７】
生産物試験
また、本菌は繊維素や他の物質を旺盛に分解して様々な産生物質を作る。下記の表５にそれらを示す。
【００２８】
【表５】
2010064958.tif 000007
【００２９】
本菌の生育条件を下記の表６に示す。
【００３０】
【表６】
2010064958.tif 000008
【００３１】
本菌の特性は下記の表７のとおりである。
【００３２】
【表７】
2010064958.tif 000009
【００３３】
本発明に使用する好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）に関する寄託の情報
寄託所：微工研条寄（現：特許生物寄託センター）
受託番号：第３４５９号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３４５９）
分類学上の位置：好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ）
識別のための表示：ＳＫ−５２２
【００３４】
（サーマス・アクアティクスＳＫ５４２菌株）
本発明に使用する高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）の性状について説明する。
【００３５】
菌学的性質
強いタンパク質分解力を持ち、黄色色素（カロチノイド系色素）を産生する。また、好熱性繊維素分解菌との共生培養によって、好熱性繊維素分解菌のリグニン可溶化能を顕著に増強する。
【００３６】
生態学的性状
＊グラム染色  陰性
＊絶対好気性
＊長桿状、０．４〜０．６×３．０〜５．０μ（培養が古くなると糸状、長さ２０〜１３０μ）
＊鞭毛なし
＊運動性    見られない
＊内生胞子  なし
＊増殖      活発。ジェネレーションタイム２０〜５０分。
【００３７】
生理生化学的性質は次のとおりである。
【００３８】
本菌の様々な物質（酵素）に対する作用状況を下記の表８に示す。
酵素作用等
【００３９】
【表８】
2010064958.tif 000010
【００４０】
生産物試験
本菌の生産物試験の結果を下記の表９に示す。
【００４１】
【表９】
2010064958.tif 000011
【００４２】
生育条件
本菌の生育条件を下記の表１０に示す。
【００４３】
【表１０】
2010064958.tif 000012
【００４４】
本菌の特性は下記の表１１のとおりである。
【００４５】
【表１１】
2010064958.tif 000013
【００４６】
本発明に使用する高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）に関する寄託の情報
寄託所：微工研条寄（現：特許生物寄託センター）
受託番号：第３３８２号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３８２）
分類学上の位置：高熱性タンパク質分解菌サーマスアクアティックス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）
識別のための表示：ＳＫ−５４２
【００４７】
菌の分離と培養
バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）のスクリーニング方法
試験に供する多くのバチルス・チューリンジェンシス菌を収集するため、日本各地で２１５個の土壌サンプルを採取した。その土壌サンプルから定法に従って６３株のバチルス・チューリンジェンシス菌を分離した。それらのバチルス・チューリンジェンシス菌を使って、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）との抗菌活性試験を実施したところ、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）に抗菌活性を示すバチルス・チューリンジェンシス菌が７菌株見出された。その中で東京都荒川区荒川自然公園で採取した土壌から分離したバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）が最も強い抗菌活性を示したことからこの菌だけをスクリーニングしたものである。
以下、バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）のスクリーニング方法について説明する。
【００４８】
バチルス・チューリンジェンシス菌の分離
サンプル土壌１ｇを容量５０ｍｌの遠心チューブに入れ、９ｍｌの滅菌水を加えてボルテックミキサーで１分間攪拌後1分間静置して、その上澄水５ｍｌを容量１５ｍｌの遠心チューブに分取し、６５℃のインキュベーターに３０分間静置して殺菌した。この液から１ｍｌを容量１５ｍｌの遠心チューブに分取し、滅菌水でこの液の１０３倍希釈溶液、１０４倍希釈溶液、１０５倍希釈溶液を作製し、その希釈溶液をそれぞれ２００μlずつ分取し、バチルス・チューリンジェンシス寒天培地（細菌用魚肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、寒天２０ｇを蒸留水に溶解し、全体を１リットルとしてオートクレーブ滅菌して作製）に塗抹し、インキュベーターで２８℃で３日間培養した。培養後、出現したコロニーを滅菌した竹串で一部取り、位相差顕微鏡下で１０００倍に拡大してクリスタルの有無を観察した。およそ視界内に８割以上のクリスタルが形成されている菌がバチルス・チューリンジェンシス菌であることから、６３菌株についてこれを確認した。
【００４９】
バチルス・チューリンジェンシス菌ストック菌液の作製
これら６３菌株のコロニーから、それぞれ滅菌した竹串でバチルス・チューリンジェンシス菌を寒天培地に画線培養し、単コロニーを分離した。その単コロニーから1白金耳を１ｍｌ滅菌水に懸濁し、うち２００μlをバチルス・チューリンジェンシス寒天培地に植菌し７日間培養した。
このようにして培地表面に生成した菌体をスパーテルで掻き取り、その菌体重量を測定、その重量の３倍の滅菌水に懸濁した菌液を作製、これをバチルス・チューリンジェンシス菌ストック菌液とし、合計６３菌株のストック菌液を作製した。
【００５０】
病原菌の培養
ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）をポテトデキストロースブロス培養液（DIFCO社製PDB培地２４ｇを蒸留水に溶解して全体を１リットルにしてオートクレーブ滅菌して作製）に１白金耳植菌し、１５０ｒｐｍ、２４℃で１４日間振盪培養した。このようにして得られた菌液を、滅菌した２重ガーゼで濾過して短菌糸菌液を作製、それをもとに、短菌糸菌液１０１倍、１０２倍、１０３倍希釈溶液を作製した。この菌液各２００μｌを滅菌コンラージでポテトデキストロースブロス寒天培地（DIFCO社製PDA培地３９ｇを蒸留水に溶解して全体を１リットルにしてオートクレーブ滅菌して作製）に塗抹し、２４℃にて３日間静置培養した後、菌数を測定した。その結果、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）の短菌糸菌液中の菌数は約４×１０３／ｍｌであった。菌数が所定量だったため、この短菌糸菌液の原液をそのまま試験に供した。
【００５１】
抗菌活性試験用混合培地
抗菌活性試験で使用した混合培地の組成、及び作成法を下記の表１２に示す。この培地はバチルス・チューリンジェンシス菌とナス半身萎凋病病原菌が丁度拮抗する培地組成である。角型シャーレ（長さ１４４ｍｍ×幅１０４ｍｍ×深さ１６ｍｍ）に下記の表１２に示す混合培地を４０ｍｌ注入して固化せしめた寒天培地に金属製のペニシリンカップ（外径８ｍｍ×長さ１０ｍｍ）で径８ｍｍ×深さ５ｍｍの孔Ａを２８個穿った抗菌活性試験用寒天培地Ｋを作製し、抗菌活性試験に供した（図２参照）。
【００５２】
抗菌活性の判定方法
抗菌活性試験方法は、図２に示す孔Ａにバチルス・チューリンジェンシス菌液とナス半身萎凋病病原菌菌液を所定量混合して充填し、所定温度、所定時間培養して、どちらの菌がより強く増殖しているかで当該バチルス・チューリンジェンシス菌の抗菌活性の強弱を判定するものである。バチルス・チューリンジェンシス菌が強い抗菌活性があると、バチルス・チューリンジェンシス菌特有の茶褐色のコロニーが大きく現れ、逆にナス半身萎凋病病原菌の増殖が強い（逆に言えば、バチルス・チューリンジェンシス菌の抗菌活性がない）場合にはナス半身萎凋病病原菌特有の白色の菌糸が大きく増殖して現れる。それによってバチルス・チューリンジェンシス菌のナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）に対する抗菌活性の強弱が判定でき、最終的に最強のバチルス・チューリンジェンシス菌をスクリーニングすることができる。これらは全て目視による観察によって判定した。
【００５３】
【表１２】
2010064958.tif 000014
【００５４】
抗菌活性試験
２１５個のサンプル土壌から分離した６３菌株のバチルス・チューリンジェンシス菌のストック菌液を使って、それぞれの１００倍希釈溶液を作製し、その２５μｌと、短菌糸濃度を１００個／２５μlに調整したナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）菌液２５μlを混合し、図２に示す抗菌活性試験用寒天培地Ｋの孔Ａへ充填し、２４℃にて３日間培養した。培養後の孔中で、どの菌がより強く増殖しているかを目視観察した。全部で６３菌株のバチルス・チューリンジェンシス菌株を試験した結果、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）に対して７菌株のバチルス・チューリンジェンシス菌が抗菌活性を有していることが分かった。その中でバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）が半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）を強く抑制して増殖し、その褐色のコロニーを極めて大きく拡大していたことから最大の抗菌活性を有すると判定し、バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）をナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）に対して最も大きな抑制効果がある有効菌としてスクリーニングした。
【００５５】
ナス半身萎凋病ポット試験
抗菌活性試験によりナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）に対して最も抗菌活性が大きく表れたバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）について、単独で使用した場合と他の菌と複合して使用した場合とでナス半身萎凋病の抑制効果にどのような差異があるかを、実際の土（培養土）でナスを栽培してのポット試験で比較検討した。
【００５６】
ポット試験用菌液の作製
ポット試験に先立って、試験に必要なそれぞれの菌液を作製した。
【００５７】
ＢＴ菌菌液
バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）をバチルス・チューリンジェンシス菌培養液( 魚肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇを蒸留水に溶解して１０００ｃｃとし、オートクレーブ滅菌したもの)８ｍｌに植菌し、２８℃で、１２０rpm、１８時間、振盪培養で前培養（少量培養）した。その後、この培養液を８００ｍｌにスケールアップして２４時間、１２０rpm、２８℃で振盪培養してＢＴ菌菌液とした。
【００５８】
ＳＫ菌菌液
好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）を共生Ｅ培地（リン酸水素二カリウム５ｇ、尿素２ｇ、硫安２ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、セルロース１５ｇ、炭酸カルシウム２ｇを蒸留水に溶解して１リットルとしてオートクレーブ滅菌して作製）で７日間培養した培養液をＳＫ菌菌液とした。
【００５９】
病原菌菌液
ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）を前記のポテトデキストロースブロス液体培地（ＰＤＢ培地）６００ｍｌに植菌し、１５０ｒｐｍ、１４日振盪培養した。この液を二重ガーゼで２回濾過し、濾液を遠心機で３０００rpm、５分、４℃で遠心し、集菌後、２回滅菌水で遠心洗浄した。その後、ペレットの湿重を測定し、５．００ｇであったため、１０倍量の滅菌水５０ｍｌに懸濁し、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）原液とした。菌原液の菌数を前記のポテトデキストロースブロス寒天培地（ＰＤＡ培地）で測定した結果、菌数２×１０７ｓｐｏ/ｍｌであったので、滅菌水で希釈して１×１０６ｓｐｏ／ｍｌに調整した液を作製、この病原菌菌液をポット試験用ナスへの病原菌の接種源とした。ｓｐｏは胞子数の単位である。
これらの菌液はポット試験前に全てを作製、準備して試験に供した。
【００６０】
ポット試験
前記で作製した菌液を使用してポット試験を実施した。ポット試験の手順を日程に従って説明する。
【００６１】
ポット試験用ナス苗の育苗(平成２０年４月８日〜６月１８日)
タキイ種まき培土（
野菜・草花全般）をオートクレーブで滅菌し、３×３×５ｃｍ１２８マスの苗箱に敷き詰め、４月８日に播種、５月１９日に清新産業株式会社製のＪＡくみあい園芸培養土をオートクレーブで滅菌した滅菌培養土を充填した４号ポットＰに移植し、本葉５〜６葉期になるまで育苗したものを使用した。
【００６２】
バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）、及びナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）の接種(平成２０年６月１８、１９日)
【００６３】
ナス苗根部の先端切断
ナス苗を４号ポットＰより取り出し、水道水で根を洗浄し、根の先端を約５分の１、アルコールで滅菌したハサミで切断した。
【００６４】
ナス苗根部のＢＴ菌菌液への接触
ＢＴ菌菌液２００ｃｃをプラスチック製の円形のプラスチック容器Ｙ（直径３０ｃｍ×深さ８ｃｍ）に入れ、根の先端を切ったナス苗Ｎの根全体を円形のプラスチック容器ＹのＢＴ菌菌液に１０分間浸した後、再び４号ポットＰに戻して、滅菌した新しい培養土をポット上端まで充填し、十分散水した（図３参照）。
翌日、再びナス苗Ｎを４号ポットＰより取り出し、前日の手順に従ってナス苗根部を別のプラスチック製の円形のプラスチック容器Ｙ（直径３０ｃｍ×深さ８ｃｍ）に入れた、ナス半身萎凋病病原菌菌液２００ｃｃに１０分間浸し、再度４号ポットＰに戻し、新しい培養土Ｓをポット上端まで充填し、十分散水した。試験の概要を図３に示す。
【００６５】
ナス苗根部のＳＫ菌菌液への接触
ＳＫ菌菌液２００ｃｃを図３の円形のプラスチック容器Ｙに入れ、根の先端を切ったナス苗Ｎの根全体を円形のプラスチック容器Ｙの菌液に１０分間浸した後、再び４号ポットＰに戻して、滅菌した新しい培養土Ｓをポット上端まで充填し、十分散水した。
翌日、再びナス苗Ｎを４号ポットＰより取り出し、前日の手順に従ってナス苗根部を図３の円形のプラスチック容器Ｙに入れた、ナス半身萎凋病病原菌菌液２００ｃｃに１０分間浸し、再度４号ポットＰに戻し、滅菌した新しい培養土Ｓをポット上端まで充填し、十分散水した。
【００６６】
ＢＴＳＫ混合菌液の作製、及びナス苗根部のＢＴＳＫ混合菌液への接触
図３の円形のプラスチック容器ＹにＢＴ菌菌液１００ｃｃと、ＳＫ菌菌液１００ｃｃを入れてよく混合し、ＢＴＳＫ菌液を作製した。この混合菌液２００ｃｃに先端を切ったナス苗Ｎの根全体を１０分間浸した後、再び４号ポットＰに戻して、滅菌した新しい培養土Ｓをポット上端まで充填し、十分散水した。
翌日、再びナス苗Ｎを４号ポットＰより取り出し、前日の手順に従ってナス苗根部を図３の円形のプラスチック容器Ｙに入れた、ナス半身萎凋病病原菌菌液２００ｃｃに１０分間浸し、再度４号ポットＰに戻し、滅菌した新しい培養土Ｓをポット上端まで充填し、十分散水した。
【００６７】
ナス苗根部の化学農薬希釈液への接触
病害の発生に対して効果の比較のためにタケダ園芸製の化学農薬ベンレート水和剤（粉末）の１０００倍液を使用した。調整したナス半身萎凋病病原菌菌液を図３の円形のプラスチック容器Ｙに２００ｃｃ入れ、この菌液に根の先端を切ったナス苗Ｎの根全体を１０分間浸した後、再び４号ポットＰに戻して、滅菌した新しい培養土Ｓをポット上端まで充填し、十分散水した。
翌日、ポットより再びナス苗Ｎを掘り起こして取り出し、図３の円形のプラスチック容器Ｙにベンレート水和剤の１０００倍液を２００ｃｃ入れ、このベンレート希釈液に根の先端を切ったナス苗Ｎの根全体を１０分間浸した後、再び４号ポットＰに戻して、滅菌した新しい培養土Ｓをポット上端まで充填し、十分散水した。
【００６８】
これらの試験の概要を下記の表１３に示す。
【００６９】
【表１３】
2010064958.tif 000015
【００７０】
表中○はそれぞれの菌の使用、×は不使用を表す。各試験区の内容はブランク区、バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）菌区（ＢＴ菌区）、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）共生菌区（ＳＫ菌区）、バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）の混合菌区（ＢＴＳＫ菌区）、化学農薬ベンレート水和剤（粉末）の１０００倍液施用区（化学農薬区）、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）区（病原菌区）の６試験区で、各試験区について1区画５ポット（１ポットにナス苗１株栽培）ずつを試験した。各試験区のナス苗はブランク区を除いて防除のための菌液に接触させた後、前述で調整したナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）菌液に浸したが、化学農薬区のみは通常の化学農薬施用の慣例に従って、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）菌液に浸した翌日に化学農薬ベンレートの１０００倍液に接触させて試験した。
【００７１】
１．判定(平成２０年７月１０日)
接種より、２１日後の7月１０日にそれぞれのナス苗の葉を１枚ずつ病徴調査を実施、それぞれの葉の黄変・褐変、枯死程度により、下記の表１４に示すような判定基準に従って０〜４の発病指数で病徴を判定し、各株ずつそれを集計して下記の計算式に従って発病度、及び防除価を算出した。
【００７２】
【表１４】
2010064958.tif 000016
なお、病徴指数については整数の間に少数で示される病徴指数も採用した。
【００７３】
発病度＝Σ(発病指数別株数×指数)／(４×調査株数)×１００
防除価＝１００−（当該菌区発病度／病原菌区発病度）×１００
下記の表１５に試験結果を示す。
【００７４】
【表１５】
2010064958.tif 000017
【００７５】
試験結果
ブランク区（試験番号０）はこの試験区で栽培した５ポットのナス苗の根部が菌との接触の全くない試験区で、発病は全く見られなかった。試験土壌が健全な土壌であったことが分かる。
一方、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）菌液のみにナス苗を接触させた病原菌区（試験番号５）は６５．２の発病度を示した。当該病原菌がナス苗に対して強い感染力を持っていたことがわかる。
これに対してナス半身萎凋病を抑制する効果を目的にＢＴ菌液、ＳＫ菌液、ＢＴＳＫ菌液にナス苗を接触させて、しかる後にナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）に接触させた各試験区は使用した材料によって発病の抑制効果にバラツキがあった。この試験方法はナス苗がナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）に感染する前に有効菌を施用して、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）の感染発病を防止する効果を見るために実施した試験方法である。
その結果、ＢＴ菌区（試験番号１）は、抗菌活性試験でナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）に対して強い抗菌活性を持つことが明らかになったバチルス・チューリンジェンシス菌だけの試験区で、ポット試験でも４７．１の防除価が得られた。
また、ＳＫ菌区（試験番号２）は好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）を共生培養して得られた共生複合菌の培養液を使用した試験区で、３０．７の防除価が得られた。ＳＫ共生菌は植物の生育を促し、強い体質の植物を成長させるのに大きな効果を持つ共生菌で、植物を強壮にすることにより耐病性を付与する働きを持つ。その結果、バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）を使用したＢＴ菌区には及ばないものの、３０．７の防除価を示した。
【００７６】
しかし、これらの有効菌を個別に使用した試験結果（試験番号１、２）は、確かに病原菌区に比較して発病率は抑えられたものの、ベンレート水和剤の１０００倍液を施用した化学農薬区（試験番号４）の防除価８０．７に比べると防除価は半分以下でそれほど大きな効果には至っていない。これに比較してバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）菌と好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）共生菌を混合して使用した試験区（試験番号３、ＢＴＳＫ菌区）は防除価が６８．７で、化学農薬区（ベンレート１０００倍液施用）には及ばないものの、ＢＴ菌区（防除価４７．１）、ＳＫ菌区（防除価３０．７）よりも高い防除価を示した。バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）と、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）共生菌との複合的な相乗効果によりかなり発病度が低下することが明らかとなった。
【００７７】
ここでバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）が、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）、及び高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティクスＳＫ５４２（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２、微工研条寄第３３８２号）共生菌との混合により、ナス半身萎凋病病原菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＮＢＲＣ９７６５）に対して強い抗菌活性を持つ結果となった、これらの複合菌の相乗効果について述べる。
【００７８】
ＳＫ共生菌の相乗効果
嫌気性の好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ
ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）と、絶対好気性の高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティックス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３８２）との共生培養の特殊効果について説明する。
好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）と高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティックス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３８２）の高温環境下での共生培養物は、嫌気性の好熱性繊維素分解菌ＳＫ５２２菌株単独ではほとんど不可能な天然の難分解性有機物の分解発酵を顕著に増強する。以下、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ
ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）をＳＫ５２２、絶対好気性の高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティックス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３８２）をＳＫ５４２と略記する。
【００７９】
まず、ＳＫ５４２菌株の増殖はＳＫ５２２菌株の欠如するタンパク分解活性を補充する。しかも、イナワラ、ムギワラ、モミガラ、牧草等の堆・厩肥をはじめ廃木材、都市下水汚泥等の難分解性有機物の分解発酵は、すべて固体発酵の状態で、かなり通気のよい環境下に置かれている。そして、初期の段階におけるＳＫ５４２菌株の増殖は発酵過程にある有機物を高温嫌気的環境へと変移せしめ、これによって通常の自然環境ではなかなか単独での増殖が困難なＳＫ５２２菌株の自然界での生育が可能となる。
【００８０】
リグニンの可溶化
ここで、特に注目されることは、ＳＫ５４２菌株によってＳＫ５２２菌株のリグニン可溶化能が顕著に増強されることである。難分解性有機物は、実際には繊維素がリグニン、その他の有機成分と強く結合した状態で存在する。こうした天然のリグノセルロースは繊維素分解力の旺盛なるＳＫ５２２菌株であっても、その単独施用ではほとんど分解が不可能である。リグニンの化学構造は、未だ完全に明らかにされていないが、ベンゼン環に炭素数３つの側鎖を持つフェニルプロパンが基本単位になって、この単位体がパーオキシダーゼによって触媒されるラジカル反応によりランダムに三次元的に重合した高分子化合物である。微生物の分解に対する抵抗がきわめて強く、きわめて分解が困難であることはよく知られている。ところが、本願発明で使用するＳＫ５２２菌株は弱または微弱ではあるが、リグニンを可溶化する。そして、このリグニン可溶化能が、ＳＫ５４２菌株と共生培養することによって、たとえば、イナワラリグニンの５０％以上が１０日前後の短日時において可溶化されることが分かっている。その作用効果は５０〜８０℃以上という高温期段階で発揮され、分解発酵へその腐植化が急速に進行する。
【００８１】
黄色色素の産生
ＳＫ５４２菌株をはじめ、サーマス属（ｇｅｎｕｓ  Ｔｈｅｒｍｕｓ）の産生する黄色色素はカロチノイド系不溶性色素である。菌体中のこの黄色色素が他の微生物等による分解を受け、水溶性の低分子量体のものとなり、植物体に吸収され、必要部位に移行し、丁度都合のよい前駆物質となる。すなわち、このような黄色色素が、ほかの溶菌した細胞内容物や分泌物、それに発酵生産物等とともに根茎葉部位の増大繁茂を促すだけでなく、花芽の形成、着花、果実の肥大等の生殖生長の代謝系に深く関与しており、果実の味、色沢、貯蔵性等品質向上に大きな役割をもつ。
【００８２】
微生物生態系の混合複合化
また、この黄色色素を含むＳＫ５４２菌株の菌体を施用すると、それを基質として繁殖する一般の従属栄養微生物、土壌有効菌等の増殖を促す。さらに重要なことは、堆肥の製造現場、あるいは自然界の植物体の腐植化の過程では、ＳＫ５２２菌株のような好熱性微生物が、すぐに増殖活性化するわけではない。当初は、一般の常温性従属栄養微生物が増殖し、これらの作用による発酵熱が蓄積されて品温の上昇に役立つものであり、単一菌株の好熱性繊維素分解菌や少数の微生物のみが、天然の難分解性有機資材の腐植化に関与するわけではない。微生物フローラの混合複合化、多様化が必要で、様々なタイプの有効菌が多く、さらに「エサ（基質）」も適度にあるという複合的内容が望ましい。こうして、難分解性有機物の高温分解は、ＳＫ５２２菌株を中心とする細菌フローラがまず形成され、その腐植化過程が単純な構成成分の変化だけでなく、きわめて複雑な微生物フローラの相互作用やその変遷等が深い関わりをもって最も効率よく進行するのである。
【００８３】
このように、好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）と、高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティックス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３８２）の高温環境下での共生培養により増殖した共生菌は植物繊維素の軟らかいセルロース部位は勿論、難分解性のリグニンをも高効率で分解するために土壌に残留せる繊維素の分解効率を高め、腐植を増大せしめ、土壌地力を増強するのに大きな役割を果たす。
また、前述しているように高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティックス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３８２）の産生するカロチノイド系の黄色色素は他の微生物等による分解を受け、ほかの溶菌した細胞内容物や分泌物、それに発酵生産物等とともに植物の自立強壮体質への向上に大きな役割をもつ。即ち、病気に罹患することが少ない植物体を育成する力を持っているのである。
【００８４】
バチルス・チューリンジェンシス菌の他の菌との相乗効果
このように好熱性繊維素分解菌クロストリジュウム・サーモセルムＳＫ５２２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５２２、微工研条寄第３４５９号）と、高熱性タンパク質分解菌サーマス・アクアティックス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｂｉｏｖａｒ  ＳＫ５４２  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３８２）の高温環境下での共生培養により増殖した共生菌による植物体そのものの基礎体力の増強と相まって、バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）菌によるナス半身萎凋病の抑制効果は一層増強される。
【００８５】
ここで、生物的防除がいかに環境保全的な特性を持ちながら農業の健全化に寄与しているか、その特性が何に由来するものであるか、そのために生物的防除はどのような要件を満たさなければならないかを述べる。
【００８６】
化学農薬は即効性があり、病害菌に対して劇的な効果があり、安価で使い易いという、農業従事者にとって極めて大きな利点を有する。しかし、その利点が逆に弊害をも生み出す欠点にもなっている。そして、それは地球環境破壊、生態系の破壊という人類の生存にとって致命的な欠点である。化学農薬は害虫や病原菌の壊滅を劇的にするために毒性の強い人工的な薬剤を含んでいる場合が多く、その特殊性の故にオゾン層を破壊して地球環境の危険性を増幅したり、また、一般の生物にもその毒性が強く作用する場合が多く、生態系の破壊という危険な因子を内包している。そのことは即、我々人類の生命の存亡にかかわる重大な因子となる場合がしばしばである。
また、化学農薬を使い続けることによって、有害生物、有害病害菌とともにミミズなどの有効生物、有効微生物までも絶滅しかねない弊害を持ち、圃場そのものの疲弊につながる危険性が大きい。最近のあいつぐ化学農薬の規制はこのような化学農薬の危険な実態が根底にある。我々はこのような実態に深く思いを廻らし、今こそ恒久的に地球環境保全、生態系の破壊防止のために安全な農業資材の使用という命題に全力を傾注しなければならない。
【００８７】
このような実態を背景として化学農薬の使用は年々減少しており、それに代替する資材として、生物的防除剤への関心が高まっている。その理由として生物的防除剤は有害生物のみに作用し、生態系を破壊しない、地球環境保全的な特性を持つからである。その作用も化学農薬のように即効性があるわけでなく、また効果も緩慢で、遅効性である。しかし、この柔らかな効果がかえって地球環境保全的な利点を持つ。しかも、それを長く使い続けることによって圃場には有効菌が増殖し、その有効菌の働きで圃場は次第に地力を増強し、有害生物、有害菌の少ない、病気の出ない健全な土壌となる。もし、生物的防除剤に化学農薬並みの激烈な効果が認められたら、それは他の生物や人間への悪影響の懸念を払拭しきれないため化学農薬並みに徹底的な影響調査が必要とされている。化学農薬はその効果が激烈なものがＡランク（ほとんどの病害菌が死滅するが動物や人間にも害がある場合がある）、効果が柔らかいものがＢランク（効果は若干弱いが、動物や人間に対する害が少ない）とされており、生物的防除剤はＣランクくらいが最も適切（効果は化学農薬よりは弱いが、動物や人間には全く無害である）とされている。
【００８８】
本発明が化学農薬の防除価より若干小さいのは生物的防除剤の宿命であり、むしろ、他の生物的防除剤の非力な効果に比べたら、化学農薬に迫るくらいの防除結果が得られており、極めて有効な生物的防除剤と言えるであろう。
生物的防除効果としてはこれくらいの効果が最適であることは言うまでもない。
【００８９】
その意味で本発明は「化学農薬ほどの劇的な効果はないが、その効果はＣランクくらいで、長く使い続けることにより効果を持続させ、動物や人間に無害で生態系を破壊しない最も妥当な生物的防除剤的効能を持った、土壌改良剤としては新しいタイプの発明と言える。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のナス半身萎凋病抑制剤は、今回はナス半身萎凋病だけにその効果を確認したが、まだ試験を実施していない他の多くの作物病害を抑制する可能性を秘めている。最終的には、他のＢＴ菌や抗菌性微生物を添加することにより、リスクの大きい化学農薬の代替剤として環境保全的特性を持った万能薬的な作物病害抑制剤としての展開が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】実施例１に用いたバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｎ−０２９株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６４７）の細菌の寒天培地培養３日後の形状を示す説明図である。
【図２】実施例１で使用した抗菌活性試験用角型シャーレ寒天培地を示す説明図である。
【図３】実施例１のナス苗の菌液への接触要領を示す説明図である。
【符号の説明】
【００９２】
Ａ  孔
Ｂ  菌液
Ｋ  寒天培地
Ｎ  ナス苗
Ｐ  ４号ポット
Ｓ  培養土
Ｙ  プラスチック容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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