(57)【要約】【課題】架橋スター形分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を効率よく製造することができる遺伝子導入剤の製造方法を提供する。【解決手段】芳香環を核とし、それから放射状に伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有するスター形分岐型重合体同士をアルコールを含む溶媒中で架橋させる。特に、前記アルコールが、メタノール、エタノール及び２−プロパノールよりなる群から選択される１種以上である遺伝子導入剤の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環を核とし、それから放射状に伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有するスター形分岐型重合体同士が架橋した架橋スター形分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造する方法であって、
アルコールを含む溶媒中でスター形分岐型重合体同士を架橋させることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記溶媒に前記スター形分岐型重合体を溶解及び／又は分散させ、この溶液及び／又は分散液に光を照射して前記スター形分岐型重合体同士を架橋することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記アルコールが低級アルコールよりなることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項４】
請求項３において、前記低級アルコールが、メタノール、エタノール及び２−プロパノールよりなる群から選択される１種以上であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記溶媒が、アルコールのみからなることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記溶媒が、アルコールとアルコール以外の溶媒とからなることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項７】
請求項６において、前記アルコール以外の溶媒が、水、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、キシレン、エーテル、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、塩化メチレンおよび塩化ベンゼンからなる群から選択される少なくとも１種からなることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項８】
請求項６又は７において、前記溶媒のアルコールの濃度が、３０．０〜９９重量％であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記溶媒中のスター形分岐型重合体の濃度が、３〜６０重量％であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記スター形分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であり、
該スター形分岐型重合体の分岐鎖同士を架橋させて架橋スター形分岐型重合体とすることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０において、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１において、前記ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０ないし１２のいずれか１項において、分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が架橋点として寄与していることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１４】
請求項１０ないし１３のいずれか１項において、該分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１５】
請求項１０ないし１３のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、異なるモノマーとのランダム又はブロック共重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
特許文献１の通り、合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香環を核として、カチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐鎖を有するスター形分岐型重合体同士が架橋した架橋スター形分岐型重合体よりなるベクターによると、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１の遺伝子導入剤は、スター形分岐型重合体の分岐鎖の末端にＮ，Ｎ−２置換ジチオカルバミルメチル基を有し、このＮ，Ｎ−２置換ジチオカルバミルメチル基のラジカル開裂により架橋してなるものであるが、スター形分岐型重合体の分岐鎖の末端同士が架橋せずに、分岐鎖の末端と、分岐鎖の末端以外の部分とがネット状に架橋した場合、ゲル状になるため収率が低下する。
【０００５】
本発明は、架橋スター形分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を効率よく製造することができる遺伝子導入剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環を核とし、それから放射状に伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有するスター形分岐型重合体同士が架橋した架橋スター形分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造する方法であって、アルコールを含む溶媒中でスター形分岐型重合体同士を架橋させることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１において、前記溶媒に前記スター形分岐型重合体を溶解及び／又は分散させ、この溶液及び／又は分散液に光を照射して前記スター形分岐型重合体同士を架橋することを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１又は２において、前記アルコールが低級アルコールよりなることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項４の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項３において、前記低級アルコールが、メタノール、エタノール及び２−プロパノールよりなる群から選択される１種以上であることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項５の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記溶媒が、アルコールのみからなることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項６の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記溶媒が、アルコールとアルコール以外の溶媒とからなることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項７の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項６において、前記アルコール以外の溶媒が、水、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、キシレン、エーテル、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、塩化メチレンおよび塩化ベンゼンからなる群から選択される少なくとも１種からなることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項８の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項６又は７において、前記溶媒のアルコールの濃度が、３０．０〜９９重量％であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項９の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記溶媒中のスター形分岐型重合体の濃度が、３〜６０重量％であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項１０の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記スター形分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であり、該スター形分岐型重合体の分岐鎖同士を架橋させて架橋スター形分岐型重合体とすることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項１１の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１０において、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項１２の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１０又は１１において、前記ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項１３の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１０ないし１２のいずれか１項において、分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が架橋点として寄与していることを特徴とする特徴とするものである。
【００１９】
請求項１４の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１０ないし１３のいずれか１項において、該分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項１５の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１０ないし１３のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、異なるモノマーとのランダム又はブロック共重合体であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環を核とし、それから放射状に伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有するスター形分岐型重合体同士を、アルコールを含む溶媒中で架橋させる。
【００２２】
この遺伝子導入剤の製造方法によれば、前記スター形分岐型重合体の分岐鎖の末端同士を効率よく反応させることができる。
【００２３】
即ち、アルコールを含む溶媒中で架橋反応を行った場合、アルコールと分岐鎖中のカチオン性部分とが水素結合を形成し、分岐鎖中のカチオン性部分がアルコールによって保護され、これにより分岐鎖の末端と分岐鎖中のカチオン性部分との反応が抑制されると推察される。
【００２４】
前記溶媒に前記スター形分岐型重合体を溶解及び／又は分散させ、この溶液及び／又は分散液に光を照射して前記スター形分岐型重合体を架橋した場合（請求項２）、架橋スター形分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を収率よく得ることができる。
【００２５】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、前記アルコールが低級アルコールよりなることが好ましく（請求項３）、特にメタノール、エタノール及び２−プロパノールよりなる群から選択される１種以上であることが好ましい（請求項４）。
【００２６】
上記アルコールを含む溶媒を用いた場合、分岐鎖のカチオン性部分と上記アルコールとが、水素結合を形成しやすい。
【００２７】
また、前記溶媒は、アルコールのみからなるものであってもよく（請求項５）、アルコールとアルコール以外の溶媒とからなるものであってもよい（請求項６）。溶媒がアルコールとアルコール以外の溶媒とからなる場合は、前記アルコール以外の溶媒が、水、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、キシレン、エーテル、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、塩化メチレンおよび塩化ベンゼンからなる群から選択される少なくとも１種からなることが好ましく（請求項７）、前記溶媒のアルコール濃度は、３０．０〜９９重量％が好ましい（請求項８）。
【００２８】
濃度を上記範囲とすることにより、少量のアルコールで分岐鎖のカチオン性部分を水素結合により保護することができる。
【００２９】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法では、前記溶媒中のスター形分岐型重合体の濃度が、３〜６０重量％であることが好ましい。
【００３０】
スター形分岐型重合体の濃度が、上記範囲内であれば分岐鎖の末端同士の反応が速やかに進行する。
【００３１】
架橋スター形分岐型重合体の架橋反応において、スター形分岐型重合体の架橋体が不溶性のゲルを形成する架橋度と、遺伝子導入活性が高い架橋スター形分岐型重合体の架橋度が近接しているため架橋度の制御は困難である。
【００３２】
本発明によれば、前記分岐鎖のカチオン性部分がアルコールとの水素結合により保護されているため、過度に架橋反応が進行しない。即ち、不溶性のゲルが形成されにくく、収率が高くなる。
【００３３】
また、分岐鎖のカチオン性部分がアルコールとの水素結合により保護されているため、光照射による側鎖の分解が生じにくい。即ち、側鎖の分解による極性基の露出を抑制し、極性基によるタンパクへの悪影響（例えば、補体Ｃ３ａの活性化）を防ぐことができ、さらに、細胞毒性の発現及びポリマー自体のイオン交換容量の低下なども防ぐことができる。
【００３４】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造される遺伝子導入剤は、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性分岐鎖が放射状に伸延する分岐型重合体同士を架橋させた架橋体よりなる合成高分子ベクターである。この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。この遺伝子導入剤は、分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環を核とし、それから放射状に伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有するスター形分岐型重合体同士が架橋した架橋スター形分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造する方法であって、アルコールを含む溶媒中でスター形分岐型重合体同士を架橋させるものである。
【００３６】
このスター形分岐型重合体については後に詳述する。
【００３７】
＜スター形分岐型重合体の架橋＞
本発明では、前記溶媒に前記スター形分岐型重合体を溶解及び／又は分散させ、この溶液及び／又は分散液に光を照射して前記スター形分岐型重合体同士を架橋することが好ましい。
【００３８】
前記溶媒として用いるアルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールのような低級アルコールが好ましく、特にメタノール、エタノール及び２−プロパノールが好ましい。これらのアルコールは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３９】
このようなアルコールを用いた場合、アルコールとスター形分岐型重合体の分岐鎖のカチオン性部分とが水素結合を形成しやすい。
【００４０】
本発明において、前記溶媒は、上記アルコールのみからなってもよいし、アルコールとアルコール以外の溶媒とからなってもよく、アルコール以外の溶媒としては、水、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、キシレン、ジエチルエーテルなどのエーテル、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、塩化メチレンおよび塩化ベンゼンなどを挙げることができる。このアルコール以外の溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４１】
前記溶媒がアルコールとアルコール以外の溶媒とからなる場合、溶媒中のアルコールの割合が極端に小さく、トルエンやクロロホルムなどの無極性溶媒の割合が大きいと分岐鎖のカチオン性部分を水素結合により十分に保護することが難しく、また、水の割合が大きいと、後述するジチオカルバメートのラジカル反応が進行しにくくなる。従って、溶媒中のアルコールの濃度は、３０．０〜９９重量％、特に５０．０〜９９重量％程度が好ましい。
【００４２】
前記溶媒中のスター形分岐型重合体の濃度は、３〜６０重量％、特に６〜３０重量％であることが好ましい。スター形分岐型重合体の濃度が極端に高いと反応が進行しにくくなり、分岐型重合体の濃度が極端に低いと分岐鎖の末端同士の衝突確率が低くなるため好ましくない。
【００４３】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法において、前記スター形分岐型重合体同士を架橋する際の光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４４】
本発明において、架橋スター形分岐型重合体の分子量は、３０，０００〜３００，０００程度特に３５，０００〜１５０，０００程度が好ましい。架橋スター形分岐型重合体の分子量が極端に大きいと、細胞毒性が強く発現されてしまい、代謝、排泄の観点からも好ましくなく、極端に小さいと、ＤＮＡの包蔵能力が低下する。
【００４５】
なお、本明細書中において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００４６】
また架橋スター形分岐型重合体の分子量分布Ｍｗ／Ｍｎは、１．３〜３．０程度特に１．５〜２．５程度が好ましい。
【００４７】
このように架橋反応を行うことにより、スター形分岐型重合体の分岐鎖の末端同士が２〜１０個、特に２〜５個程度架橋して架橋体を構成する。この架橋反応では、分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基のチオ基が開いて分岐鎖の末端同士が架橋するものと推察される。
【００４８】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法によれば、分岐鎖中のカチオン性部分と分岐鎖の末端との反応を抑制することができるため、副生成物である分岐鎖中のカチオン性部分と、分岐鎖の末端とがネット状に架橋したゲル状の架橋体がほとんど生成しない。従って、収率が９０〜１００％程度になる。
【００４９】
本発明においては、アルコールによって分岐鎖中のカチオン性部分であるアミノ基が保護されているため、光照射によるアミノ基の酸化に伴う着色が生じにくく、架橋スター形分岐型重合体の品質が向上する。
【００５０】
＜スター形分岐型重合体＞
スター形分岐型重合体としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体が好適である。このＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基同士が結合することにより、スター形分岐型重合体同士が架橋する。
【００５１】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００５２】
Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００５３】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００５４】
このイニファターに重合させるモノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等、とりわけビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００５５】
イニファターと上記モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００５６】
このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。
【００５７】
イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００５８】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００５９】
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００６０】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００６１】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００６２】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得る。
【００６３】
このスター形分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、2,000〜500,000、特に2,000〜150,000、とりわけ2,000〜100,000程度が好ましい。
【００６４】
本発明では、この分岐鎖は、上記ホモポリマーであってもよく、さらに異なる重合体とのブロック共重合体又はランダム共重合体であってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。なお、先にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマーよりなる分岐鎖を有した分岐型重合体を形成し、その後、各分岐鎖の先端側にカチオン性ポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００６５】
このＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。なお、これにより遺伝子導入剤が上記温度応答性を具備するようになる。
【００６６】
カチオン性ポリマーブロックにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドあるいはＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成したスター形分岐型重合体を好ましくはアルコール例えばメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型ポリマーの濃度は0.01〜10重量％程度が好適であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は0.3〜30重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長250〜400ｎｍ、照射時間1〜150分、照射強度100〜10,000μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００６７】
このスター形分岐型重合体の分子量は3,000〜600,000、特に3,000〜150,000であることが好ましい。
【００６８】
上記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【００６９】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【００７０】
＜核酸含有複合体＞
本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００７１】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００７２】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００７３】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００７４】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００７５】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００７６】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００７７】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００７８】
このような核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００７９】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００８０】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００８１】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００８２】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００８３】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００８４】
［４分岐型遺伝子導入剤の合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００８５】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００８６】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｉｎ  ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００８７】
【化１】
2010024192.tif 000003
【００８８】
ii)光重合によるスター形４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００８９】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を２５分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させてスター形４分岐型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率３２％）。分子量はポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより、４１，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３）と測定された。
【００９０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｉｎ  Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００９１】
【化２】
2010024192.tif 000004
【００９２】
iii)スター形４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの溶解性
上記ii)で合成したスター形４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマー０．２ｇと３．０ｇのメタノールとを混合し、この混合液を１０００ｍＬのジエチルエーテルへ滴下してカチオン性ホモポリマーの溶解性の評価を行った（実施例１）。
【００９３】
実施例１では、ジエチルエーテルが若干白濁するだけでポリマー成分の沈殿は確認されなかった。これは、スター形４分岐型重合体とメタノールとの頑強な水素結合により、スター形４分岐型重合体を溶媒和しているメタノール分子がジエチルエーテル相に拡散しないため、スター形４分岐型重合体が二次粒子を形成せずに安定して溶解及び／又は分散しているためだと考えられる。
【００９４】
ii)で合成したスター形４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマー０．２ｇと３．０ｇのエタノールとを混合した混合液（実施例２）、及び上記カチオン性ホモポリマー０．２ｇと３．０ｇの２−プロパノールとを混合した混合液（実施例３）についても実施例１と同様の評価を行ったが、いずれも沈殿は確認されなかった。
【００９５】
比較例として、ii)で合成したスター形４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマー０．２ｇと５０ｇのクロロホルムとを混合した混合液（比較例１）、及び上記カチオン性ホモポリマー０．２ｇと５０ｇのトルエンとを混合した混合液（比較例２）について実施例と同様に評価した。
【００９６】
比較例１，２では、ジエチルエーテル中で速やかに粘着質の塊状のポリマーが沈殿した。これは、クロロホルムやトルエンが、スター形４分岐型重合体との溶媒和が弱いため、速やかにジエチルエーテル相へ拡散するためだと考えられる。
【００９７】
iv)スター形４分岐型重合体（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ）の光架橋
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンの光架橋を行った。
【００９８】
即ち、上記ii）で合成した分子量４１，０００の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー０．２ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ、３．０ｇのメタノール、エタノール、２−プロパノール（実施例１〜３）及びトルエン（比較例２）に溶解し、回転子で緩やかに攪拌しながらii)と同じ光照射装置で光照射重合を行った。光照射は落射式で２ｍｍ厚の軟質ガラス板を介して行い、照射強度は１．０ｍＷ／ｃｍ２、光照射時間は１８０分で行った。照射終了後、実施例１〜３で得られたペーストはほとんど無色透明で異物を認めなかった。一方、トルエンを溶媒とした比較例２の場合は、１８０分照射でポリマーのほぼ全量が不溶性のゲルとなった。ゲルは黄褐色を呈し、強いアミン臭がした。
【００９９】
実施例１〜３で得られた光照射体に対して、トルエンを３０ｍＬ混合してからエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。比較例２で得られた光照射体は、５０ｍＬのトルエンで希釈し、濾過により不溶性ゲルを除去し、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。
【０１００】
実施例１〜３の光架橋体の分子量は、ポリエチレングリコール換算によるＧＰＣによりメタノール、エタノール及び２−プロパノールでそれぞれ、４８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）、５０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）、５３，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）と測定され、分子量の増大が確認された。分散はブロードになることなく、ピーク形状も光架橋前と同様に正規分布となった。この架橋体は、水、アルコール、トルエン、クロロホルムなど光架橋前のポリマーの良溶媒に対して良好な溶解性を示した。また、光架橋体の収率はほぼ１００％であり、不溶性の成分は形成されていなかった。
【０１０１】
これに対して、比較例２の光架橋体の分子量は、６８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．７）となり、分子量が増大し、ピーク形状も高分子量側に大きな肩を有するブロードなものとなった。
【０１０２】
目的とする架橋スター形分岐型重合体の収率は約５％であり、残りはスター形分岐型重合体よりなる不溶性のゲルとなった。これはポリマーの側鎖に分岐鎖のω末端が結合し、複雑に架橋点が点在するネットワーク構造体となっていると推測される。
【０１０３】
［遺伝子導入実験］
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【０１０４】
上記iv）にて合成したカチオン性ポリマーの光架橋体を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【０１０５】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は、陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。３時間の培養の後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し，ＰＢＳで洗浄した後に完全培地を加えてさらに４８時間培養を行った。
【０１０６】
［遺伝子導入活性の評価］
トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。
【０１０７】
＜比較例３＞
ベクターとして、上記の合成プロセスiii）で合成したスター形４分岐型重合体を架橋せずにそのまま用いたこと以外は、実施例と同様に遺伝子導入実験を行った。結果を図１に示す。
【０１０８】
［考察］
上記iii）で検証したように、側鎖保護の効果は、炭素数に依存せずに発現しているが、この遺伝子導入活性試験では、アルコールの炭素数の増加に伴い遺伝子導入活性が向上している。これは、分岐鎖のω末端でラジカル解裂するＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート基が疎水性の官能基であるため、アルコールの炭素数が多く、親油性が高い溶媒の方が外れやすく、反応性やラジカルの寿命が架橋に有利な状態になると考えられる。これにより、分岐鎖の末端同士が架橋した光照射体の濃度が高くなると考えられる。
【０１０９】
比較例２の光架橋体は、スター形分岐型重合体である比較例３よりも遺伝子導入活性が低下している。この要因は、比較例２の光架橋体が、あらゆる溶媒に対して溶解性が低く、生理食塩水にもほとんど溶解しないためであると考えられる。即ち、遺伝子導入剤の調製方法がポリマーを約１ｍｇ／ｍＬ濃度の生理食塩水溶液として０．２μｍフィルターで濾過を行ってからＤＮＡ溶液と混合する方法であるため、ＤＮＡとの混合比が最適混合比である１：２０まで到達し得ないためであると考えられる。
【０１１０】
なお、比較例２において、照射時間を１２０分間とした場合の収率は約４５％であり、遺伝子導入活性は比較例３よりも向上していた。このことから、分岐鎖を保護しない場合、光架橋の架橋度の制御は困難であり、かつ歩留まりも悪いことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】実施例及び比較例の結果を示すグラフである。
【図１】
2010024192.tif 000005