(57)【要約】      （修正有）【課題】慢性疲労全般を簡潔かつ客観的に評価する方法を提供する。【解決手段】被験者の血液中のα−メラノサイト刺激ホルモン（以下、「α−ＭＳＨ」ということもある）の濃度を指標として、被験者の慢性疲労度を判定する、慢性疲労度の判定方法であって、α−ＭＳＨの濃度が高いと、慢性疲労度が高いと判定する。前記慢性疲労度は、慢性疲労または慢性疲労症候群に基づく過労状態である。また慢性疲労度の判定方法を実施するための慢性疲労度判定キットも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血液中のα−メラノサイト刺激ホルモン（以下、「α−ＭＳＨ」ということもある）の濃度を指標として、被験者の慢性疲労度を判定する、慢性疲労度の判定方法。
【請求項２】
α−ＭＳＨの濃度が高いと、慢性疲労度が高いと判定する、請求項１に記載の慢性疲労度の判定方法。
【請求項３】
前記慢性疲労度は、慢性疲労または慢性疲労症候群に基づく過労状態である、請求項１に記載の慢性疲労度の判定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の慢性疲労度の判定方法を実施するための慢性疲労度判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの疲労度の判定方法に関する。より詳しくは、ヒトの血液中のα−メラノサイト刺激ホルモンの濃度を指標としてヒトの疲労度を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疲労感や倦怠感は、日常的に誰もが経験している感覚であり、『体がだるい』という訴えは、毎年、厚生労働省の「国民生活基礎調査」の有訴者率の上位にランクされている。
【０００３】
１９８５年の健康に関する国民意識調査では、調査時に疲労感を認めた人が６６．４％にのぼる。その７１．７％の人は「１晩の睡眠により疲労感は回復する」と回答しており、疲労・倦怠感は、短期的なものであり、慢性疲労はごくまれなものと思われてきた。しかし、１９９８年に厚生労働省の疲労調査研究班が愛知県豊川保健所管内の１５〜６５歳の男女４０００名に疫学調査を行ったところ、疲労感を自覚している人の割合は約６０％であり、その半数を超える人々（全体の３５．８％）が半年以上続く慢性疲労を認め、５人に１人は作業能力の低下を感じていることも判明した。
【０００４】
“倦怠感”を主訴とする場合、臨床的には（１）器質的疾患（悪性腫瘍、感染症、内分泌・代謝性疾患等）、（２）非器質的疾患（気分障害、身体表現性障害等）、（３）過労（疲れて当然と思われる状況がある）、（４）心配状態（病気を心配しているが、異常のないことを保証すると安心して症状がなくなる）、（５）原因不明の慢性疲労に分けられる。
【０００５】
ここで、“慢性疲労”とは、半年以上の期間続く自覚的な疲労感すべてを意味し、疲労感の程度や疲労感以外の症状の有無、病気に罹患しているか否かなどは関係しない。したがって、日常生活にはまったく支障をきたさない程度のごく軽い疲労感でも、半年以上の期間続いている場合には慢性疲労と呼ばれる。一方、原因不明の慢性疲労の中には、“慢性疲労症候群（ＣＦＳ）”が含まれる。
【０００６】
慢性疲労症候群を客観的に評価することが行われている（例えば、特許文献１参照）。この文献では、被験者の末梢血中のメッセンジャーＲＮＡを用いて、特定のマーカー遺伝子の発現を解析している。しかし、この方法では、慢性疲労全般を評価することができない。
【０００７】
また、「疲労」を簡潔かつ客観的に評価する方法が開発されている（例えば、特許文献２参照）。この文献では、体液中のアシルカルチニンの濃度を測定して、疲労度を評価している。しかし、この文献に記載の方法で評価する疲労度は、急性疲労であることが好ましいとされている。
【０００８】
このように、慢性疲労全般を簡潔かつ客観的に評価する方法は、開発されていない。従って、慢性疲労全般を簡潔かつ客観的に評価する方法の開発が望まれる。
【特許文献１】特開２００７−２２８８７８号公報
【特許文献２】特開２００５−７００２４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、慢性疲労全般を簡潔かつ客観的に評価する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、慢性ストレスモデルラットを用い、長期にストレスを与えたラットでは、下垂体中間葉に存在するメラノトロフが活性化し、α−メラノサイト刺激ホルモン（以下、「α−ＭＳＨ」という）の血液濃度が上昇することを見出している。しかし、実験動物にストレスを負荷することと、ヒトが疲労することとは同義ではない。
【００１１】
また、本発明者らは、自らを被験者として、急性疲労の状態における血液中のα−ＭＳＨの濃度を確認したところ、α−ＭＳＨの上昇は認められなかった。一方、慢性疲労状態にある被験者においては、血液中のα−ＭＳＨの濃度が上昇することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１２】
本発明の慢性疲労度の判定方法は、被験者の血液中のα−ＭＳＨの濃度を指標として、被験者の慢性疲労度を判定するものである。
【００１３】
上記判定方法において、α−ＭＳＨの濃度が高いと、慢性疲労度が高いと判定する。
【００１４】
上記判定方法において、上記慢性疲労度は、慢性疲労または慢性疲労症候群に基づく過労状態である。
【００１５】
本発明は、上記の慢性疲労度の判定方法を実施するための慢性疲労度判定キットである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の慢性疲労度の判定方法は、被験者の血液中のα−ＭＳＨの濃度を指標として、被験者の慢性疲労度を判定する。被験者の血液中の成分であるため、被験者の負担も少ない。また、血液中のα−ＭＳＨの濃度を測定することで、慢性疲労度を簡便かつ正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、血漿中α−ＭＳＨ濃度とＣＦＳ罹病期間との相関を表すグラフである。
【図２】図２は、慢性疲労症候群罹病期間と血漿α−ＭＳＨ濃度の関係を示すグラフである。
【図３】図３は、通常の睡眠をとった状態と、短期疲労状態における血液中のα−ＭＳＨ、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）、コルチゾール、ＡＣＴＨの濃度を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明の慢性疲労度の判定方法は、被験者の血液中のα−ＭＳＨの濃度を指標として、被験者の慢性疲労度を判定するものである。
【００１９】
（慢性疲労度）
本明細書で、「慢性疲労度」とは、上記した“慢性疲労症候群（ＣＦＳ）”を含む原因不明の慢性疲労を意味する。また、本発明の慢性疲労度の判定方法で検出できる慢性疲労度としては、疲労感を自覚して５年以内の疲労度に適用できる。なお、“慢性疲労”とは、上記したように、半年以上の期間続く自覚的な疲労感を意味するが、半年未満であっても半年近傍の期間続く自覚的な疲労感も含めるものとする。
【００２０】
（α−メラノサイト刺激ホルモン）
α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）は、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）のＮ末端部分の１３個のアミノ酸からなるペプチドであり、そのＮ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化されている。
【００２１】
α−ＭＳＨは、例えば動物がストレスを受けた際に、視床下部−脳下垂体−副腎皮質が介在して生産されるホルモンである。ストレスを受けた場合に、最初に視床下部において副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）が放出される。これが刺激となり、脳下垂体においてプロピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）が生産される。ＰＯＭＣ遺伝子は、主として下垂体前葉のＡＣＴＨ産生細胞で発現している。ＣＲＦによってＰＯＭＣの発現が誘導さ
れると、プロセシングを受けて、α−ＭＳＨが産生される。
【００２２】
通常、ストレスを受けた動物の血液中では、α−ＭＳＨの濃度が上昇する。また、急性疲労のヒトの血液中では、α−ＭＳＨの濃度は上昇しない。一方、原因不明の慢性疲労の場合は、α−ＭＳＨの血中濃度が、上昇する。なお、本明細書中で、「いわゆる慢性疲労ではないヒト」とは、半年以上の期間続く自覚的な疲労感を感じていないヒトまたは慢性疲労症候群が発生していない健康なヒトのことをいう。
【００２３】
血液中のα−ＭＳＨの測定は、公知の方法で行えばよい。例えば、放射免疫測定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）法、エライザ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）法などである。
【００２４】
（慢性疲労度判定キット）
本発明の慢性疲労度判定キットは、ヒトにおける疲労度を評価するキットである。すなわち、上記した本発明の疲労度の判定方法を実施するためのキットであればよい。具体的には、被験者の血液を採取するための手段と、採取後の血液中のα−ＭＳＨの濃度を測定する手段を有するキットであればよい。採取後の血液中のα−ＭＳＨの濃度を測定する手段としては、公知の測定方法を実施する手段である。例えば、上記したα−ＭＳＨの濃度の測定方法に用いる、試薬、器具、装置、触媒などをいう。
【００２５】
（慢性疲労度の判定方法および慢性疲労度判定キットの利用方法）
本発明の慢性疲労度の判定方法および慢性疲労度判定キットの利用方法は、慢性疲労を自覚して、５年以内のヒトに対して有効である。また、血液中のα−ＭＳＨの濃度を測定するだけで、従来存在しなかった慢性疲労症候群を含む慢性疲労を評価することができる。このため、長期間に渡り継続する過労の蓄積を検出するマーカーとして利用できる。
【００２６】
また、本発明の慢性疲労度の判定方法および慢性疲労度判定キットの利用方法を用いると、長期間に渡り継続する過労の蓄積を検出できる。このため、過労による様々な障害や事故を予防することができる。また、血液中のα−ＭＳＨの濃度を測定することにより、被験者が慢性疲労から回復できる物質等をスクリーニングすることができる。
【００２７】
なお、本発明の慢性疲労度の判定方法および疲労度判定キットは、血液中のα−ＭＳＨの濃度を測定するだけで、被験者が慢性疲労の状態にあるかどうかを判断することができる。また、この血液中のα−ＭＳＨの濃度の測定も簡便に行える。このため、被験者、実施者のいずれにおいても、負担の少ない方法および定キットを提供することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【００２９】
（被験者）
大阪市立大学疲労クリニカルセンターにて、慢性疲労症候群と診断され、罹患期間１２０ヶ月以内で、本診断法開発のための研究に参加することについて文章により説明し同意を得た者（５７名）とした。対照群には、各患者に対して、性別比、年齢分布を揃えた健常者（３０名）を用いた。本研究は、大阪市立大学医学部付属病院倫理委員会の承認を得ている。
【００３０】
（α−ＭＳＨの測定）
上記慢性疲労症候群の患者および健常者の血漿を用いて、血漿中のα−ＭＳＨの濃度を以下のように測定した。
【００３１】
上記慢性疲労症候群の患者および健常者から、ＥＤＴＡ-２ＮＡａ入り採血管により採血を行った。採血は、午前中、朝食抜きで、医師または看護師が安静下に肘静脈より行った。
【００３２】
上記採取した血液を、３０００ｒｐｍ（１７００×ｇ）、１０分間、４℃で遠心分離し、上清（血漿）を得た。この血漿を分注し、−８０℃にて保存したものをサンプルとした。
【００３３】
α−ＭＳＨの濃度の測定は、ＲＩＡを用いて行った。具体的には、ＥＵＲＩＡ−α−ＭＳＨ（ＥＵＲＯ−ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ製）を用いて、以下のようにしてα−ＭＳＨの濃度を測定した。
【００３４】
まず、下記表１に示すスタンダード、およびサンプル血漿を準備した。
【表１】
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希釈液はｋｉｔに添付のものを使用
希釈液（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄ）；０．０５Ｍ  ｐＨ７．４リン酸緩衝液、０．２５％ヒト血清アルブミン、０．２５％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％アジ化ナトリウム、５００  ＫＩＵ／ｍＬ  Ｔｒａｓｙｌｏｌ混合液。
Ｓｔａｎｄａｒｄは添付の合成ペプチド（ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ）を使用
【００３５】
標準液、およびサンプル血漿、それぞれ１００μＬをＲＩＡチューブに各２本ずつ入れた。ＮＳＢを除く、ＴＢおよび、ｓｔａｎｄａｒｄ、サンプル血漿の各チューブに抗α−ＭＳＨ抗体希釈液を２００μＬずつ加えボルテックスにより混和した。抗α−ＭＳＨ抗体希釈液（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ）として、ウサギ抗α−ＭＳＨ血清（抗体濃度は不明）、０．０５Ｍ  ｐＨ７．４  リン酸緩衝液、０．２５％ヒト血清アルブミン、０．２５％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％アジ化ナトリウム、５００  ＫＩＵ／ｍＬ  Ｔｒａｓｙｌｏｌ混合液を用いた。
【００３６】
上記各チューブに蓋をして、２０〜２４時間、４℃にて静置した。次に、各チューブに、ダブル抗体ＰＥＧ液を５００μＬずつ加え、ボルテックスで混和した。使用したダブル抗体ＰＥＧ液は、ヤギ抗ウサギ血清を含む（濃度不明）、０．０５Ｍ  ｐＨ７．４  リン酸緩衝液、０．２５％ヒト血清アルブミン、０．２５％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％アジ化ナトリウム、５．０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００  混合液である。
【００３７】
上記チューブを室温にて３０−６０分間静置した。次に、３０００ｒｐｍ（１７００×ｇ）、４℃、１５分間遠心分離を行い、上清を吸引して排除した。
【００３８】
沈殿物をガンマカウンター（アロカ社ＡＵＴＯ  ＷＥＬＬ  ＧＡＭＭＡ  ＳＹＳＴＥＭ）を用いて、放射活性を測定した。ＮＳＢ、ＴＢ、及びｓｔａｎｄａｒｄより検量線を作成し、解析ソフトＡＬＯＫＡ  ＲＩＡ  ＳＹＳＴＥＭを用いてサンプルの濃度を算出した。結果を以下に示す。
【００３９】
血漿中α−ＭＳＨ濃度の平均値は、ＣＦＳ群では１８．２±７．４ｐｇ／ｍＬ、コントロール群では１４．５±５．７ｐｇ／ｍＬを示し、ＣＦＳ群のほうが高値を示した（ｔ検定：ｐ＝０．０２）。
【００４０】
図１は、血漿中α−ＭＳＨ濃度とＣＦＳ罹病期間との相関を表すグラフである。図１において、横軸はＣＦＳ罹病期間（月）を、縦軸は血漿中のα−ＭＳＨ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。図１から、血漿中のα−ＭＳＨ濃度は、罹患期間の経過と共に、低下していくが、罹患期間が６０ヶ月（５年）までは、血漿中のα−ＭＳＨ濃度が高いことがわかる。
【００４１】
次に、罹患期間を５年以内と５年から１０年未満の２群にわけて検討した。結果を図２に示す。図２は、慢性疲労症候群罹病期間と血漿α−ＭＳＨ濃度の関係を示すグラフである。図２において、横軸はＣＦＳ罹病期間（年）を、縦軸は血漿中のα−ＭＳＨ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。図２から、ＣＦＳ罹病期間が５年以内の群（ｎ＝２７）では２０．７±６．９ｐｇ／ｍＬを示し、健常人の値（１４．５±５．７ｐｇ／ｍＬ）よりも有意に高かった（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｐ≦０．０１，Ａｎｏｖａ  Ｐ＝０．００３）。しかし、ＣＦＳ罹病期間が５年以上の群（１４．４±６．１ｐｇ／ｍＬ）と対照群（図中、「ｈｅａｌｔｈ」）との間には統計的な有意差が認められなかった。
【００４２】
（短期疲労における血液中のα−ＭＳＨなどの挙動）
本発明者らは、自らを被験者として、通常の睡眠をとった状態と、２４時間睡眠なしの状態（短期疲労の状態）における、血液中のα−ＭＳＨ、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）、コルチゾール、ＡＣＴＨの濃度を測定した。成長ホルモン、コルチゾール、ＡＣＴＨの濃度の測定は、α−ＭＳＨと同様に、市販の測定キットを用いて行った。結果を図３に示す。図３は、通常の睡眠をとった状態と、短期疲労状態における血液中のα−ＭＳＨ、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）、コルチゾール、ＡＣＴＨの濃度を測定した結果を示すグラフである。図３において、横軸は通常の睡眠をとった状態と、短期疲労状態を、縦軸はα−ＭＳＨ（図３（Ａ）中、「ｐｇ／ｍＬ」）、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）（図３（Ｂ）中、「ｎｇ／ｍＬ」）、コルチゾール（図３（Ｃ）中、「μｇ／ｍＬ」）、ＡＣＴＨ（図３（Ｄ）中、「ｐｇ／ｍＬ」）のそれぞれの濃度を示す。図３から、短期疲労の場合には、α−ＭＳＨの濃度は変化しないことがわかる。一方、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）の濃度は大きく低下している。このことから、短期疲労の場合には、血中のα−ＭＳＨの濃度に影響を与えないことがわかった。
【００４３】
以上の結果から、本発明の評価方法は、発症して５年以内の慢性疲労のマーカーとして用いることができることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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