(57)【要約】【課題】感染または腫瘍を有する個体を処置する方法を提供すること。【解決手段】感染または腫瘍を有する個体を処置する方法であって、  個体の当該感染部位または腫瘍部位の近辺に有効量の遺伝子改変されたプロフェッショナル抗原提示細胞（ＰＡＰＣ）を注入する工程であって、  ここで、当該ＰＡＰＣは、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するように遺伝子改変されている、工程、を包含する、方法。ＰＡＰＣが樹状細胞である、上記の感染または腫瘍を有する個体を処置する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫学の分野に関する。特に、本発明は、感染または腫瘍と闘うように遺伝子改変された、プロフェッショナル抗原提示細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
腫瘍およびウイルス抗原に対する細胞性免疫応答における初期事象の重要な分析は、樹状細胞を、効果的なＴ細胞応答を誘発する主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）として同定した（Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９１）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１２５５−１２６４）。樹状細胞（ＤＣ）は、適切に活性化されて、可溶性抗原およびアポトーシス体を取り込み、リンパ節の副皮質（ｐａｒａｃｏｒｔｉｃａｌ）Ｔ細胞富化領域に移動し、そして抗原特異的Ｔ細胞の選択およびＤＣサイトカイン、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の放出を誘導する一連の相互作用を開始する。
【０００３】
合成腫瘍関連ペプチドでパルスされたＤＣの投与は、効果的な治療的抗腫瘍ワクチンとして作用し、インビトロおよびマウスにおける養子移入後において効果的な抗腫瘍免疫応答を誘導することが、以前に実証されている（Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１２９７−１３０２；Ｚｉｔｖｏｇｅｌら（１９９６）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８７−９７；ＰｏｒｇａｄｏｒおよびＧｉｌｂｏａ（１９９５），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：２５５−２６０；Ｐｏｒｇａｄｏｒら（１９９６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：２９１８−２９２６）。しかし、Ｔ細胞に規定されるエピトープは、限られた数のヒト腫瘍型についてしか同定されていない。この問題を克服するためにいくつかのアプローチ（酸溶出した大量の腫瘍ペプチド（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら（１９９６））、腫瘍抽出物および腫瘍ＲＮＡ（Ｆｌａｍａｎｄら（１９９４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６０５−６１０；Ａｓｈｌｅｙら（１９９７）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２；Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら（１９９６）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：４６５−４７２）でのＤＣのパルス、またはＤＣとの腫瘍の融合（Ｇｏｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３；５５８−５６１）を含む）が、腫瘍に対するＤＣに基づくワクチン接種ストラテジーのために使用されている。これらのアプローチが、腫瘍関連抗原がそれほどよく特徴付けられていない腫瘍の処置を可能にするとしても、特に、ヒト固形癌由来の臨床サンプルの調製において、なお重大な問題が存在する。
【０００４】
ＩＬ−１２は、ＤＣ、マクロファージ、多形核白血球およびケラチノサイトによって産生されるヘテロダイマーのサイトカインである（ＬａｍｏｎｔおよびＡｄｏｒｉｎｉ（１９９６）、Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｔｏｄａｙ  １７：２１４−２１７）。ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性を増強し、ＩＦＮ−γ産生を含むＴｈ１免疫応答の誘導において鍵となる役割を果たし、そしてＩＦＮ−γ／インターフェロン誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）依存性抗脈管形成効果を有する（ＬａｍｏｎｔおよびＡｄｏｒｉｎｉ（１９９６）、前出；Ｖｏｅｓｔら（１９９５）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７：５８１−５８６；Ｓｇａｄａｒｉら（１９９６）、Ｂｌｏｏｄ  ８７：３８７７−３８８２）。ＤＣは、ＣＤ４０とクラスＩＩ分子の連結後に（おそらく、Ｔ細胞との相互作用後のみ）ＩＬ−１２を産生し得、そしてＤＣと組み合せたＩＬ−１２送達は、インビトロでＣＴＬ応答を増大する（Ｈｅｕｆｌｅｒら（１９９６）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６５９−６６８；Ｋｏｃｈら（１９９６）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：７４１−７４６；Ｂｈａｒｄｗａｊら（１９９６）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：７１５−７２２）。
【０００５】
ＩＬ−１２遺伝子改変腫瘍細胞、ならびにＩＬ−１２タンパク質の全身投与でのワクチン接種モデルにおけるＩＬ−１２の強力な抗腫瘍効果が報告されている（Ｂｒｕｎｄａら（１９９３）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１２２３−１２３０；Ｎａｓｔａｌａら（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１６９７−１７０６；Ｔａｈａｒａら（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４６６−６４７４；Ｍａｒｔｉｎｏｔｔｉら（１９９５）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１３７−１４６）。ＩＬ−１２を形質導入された線維芽細胞の直接注入もまた、効果的な全身性免疫の同時誘導によって、樹立された腫瘍を効果的に排除した（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１３９３−１４０３）。これらの結果に基づいて、ＩＬ−１２遺伝子治療の初期の臨床試験は、フェーズＩ研究の状況で自己由来の線維芽細胞を使用して完了された（Ｔａｈａｒａら（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６：４３９ａ）。部分的応答が、２年までの間持続している黒色腫、乳癌、ならびに頭部および頸部の腫瘍を有する患者において観察された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するよう遺伝子改変されているプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、感染部位または腫瘍部位へ、またはそれらの近辺に直接的に注入し、その抗原でＡＰＣを予め負荷またはパルスすることなく、その感染または腫瘍に関連する抗原に対する特異的な免疫学的応答を誘導し得るという発見に、部分的に依存する。特に、免疫刺激性サイトカイン、好ましくはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の発現を増強するように遺伝子改変されている、樹状細胞、および好ましくは骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）またはＣＤ３４＋由来樹状細胞（ＣＤ３４＋−ＤＣ）を、感染部位または腫瘍部位へ、またはそれらの近辺に直接的に注入し、その注入部位に関連する抗原に対する特異的な免疫応答を誘導し得ることが見出された。
【０００７】
従って、１つの局面において、本発明は、感染または腫瘍を有する個体を処置するための方法を提供し、この方法は、個体のその感染部位または腫瘍部位の近辺に、有効量のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）を注入する工程を包含し、ここで、このＡＰＣは、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するように遺伝子改変されている。
【０００８】
好ましい実施態様において、遺伝子改変されたＡＰＣは、プロフェッショナル抗原提示細胞であり、そして最も好ましくはＰＡＰＣは、ＣＤ３４＋由来樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、脾細胞由来樹状細胞、皮膚由来樹状細胞、濾胞樹状細胞および胚中心樹状細胞からなる群から選択される樹状細胞である。特に好ましい実施態様において、樹状細胞は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、Ｆｌｔ−３リガンドおよびキットリガンドからなる群から選択される少なくとも１つの因子の存在下で培養されたＣＤ３４＋由来樹状細胞である。
【０００９】
さらに、好ましい実施態様において、免疫刺激性サイトカインは、以下からなる群から選択される：インターロイキン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンドおよびキットリガンド。
【００１０】
さらに、好ましい実施態様において、ＡＰＣは、免疫刺激性サイトカインをコードするウイルスベクターでの、最も好ましくはレトロウイルスベクターでの形質導入によって遺伝子改変されている。しかし、他の実施態様において、ＡＰＣは、アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクターで、またはリポフェクション、弾道インジェクションもしくは当該分野において公知の他の遺伝子改変手段によって遺伝子改変され得る。
【００１１】
さらに、任意の前述の実施態様において、処置される個体は、以下からなる群から選択される癌に罹患してい得る：黒色腫、肝細胞癌、腺癌、基底細胞癌、口部癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、鼻咽頭癌、喉頭癌、膀胱癌、頭部および頸部癌、腎細胞癌、膵臓癌、肺癌、頸部癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌または他の固形腫瘍。あるいは、個体は、難治性感染に罹患してい得る。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）  感染または腫瘍を有する個体を処置する方法であって、以下：
個体の当該感染部位または腫瘍部位の近辺に有効量の遺伝子改変されたプロフェッショナル抗原提示細胞（ＰＡＰＣ）を注入する工程であって、
ここで、当該ＰＡＰＣは、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するように遺伝子改変されている、工程、
を包含する、方法。
・（項目２）  上記ＰＡＰＣが、樹状細胞である、項目１に記載の方法。
・（項目３）  上記樹状細胞が、ＣＤ３４＋由来樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、脾細胞由来樹状細胞、皮膚由来樹状細胞、小胞樹状細胞、および胚中心樹状細胞からなる群より選択される、項目２に記載の方法。
・（項目４）  上記樹状細胞が、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、Ｆｌｔ−３リガンドおよびキットリガンドからなる群より選択される少なくとも１つの因子の存在下で培養されたＣＤ３４＋由来樹状細胞である、項目３に記載の方法。
・（項目５）  上記サイトカインが、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｉｌ−２、ＩＬ−３，ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＮＦ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンドおよびキットリガンドからなる群より選択される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
・（項目６）  上記樹状細胞が、上記サイトカインをコードするウイルスベクターでの形質導入によって遺伝子改変されている、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
・（項目７）  上記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、項目６に記載の方法。
・（項目８）  上記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、項目６に記載の方法。
・（項目９）  上記樹状細胞が、リポフェクションおよび銃式注入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）からなる群より選択される方法によって遺伝子改変されている、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
・（項目１０）  上記個体が、黒色腫、肝細胞癌、腺癌、基底細胞癌、口腔癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膀胱癌、頭部および頸部の癌、腎細胞癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、前立腺癌、精巣癌および乳癌からなる群より選択される癌を有する、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＩＬ−１２遺伝子改変ＢＭ−ＤＣによるＩＬ−１２産生の時間経過を示す。（Ａ）形質導入の後の４日目に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含むＤＣ培地中の上清を毎日回収し、そしてＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。（Ｂ）ＩＬ−１２遺伝子で形質導入した６日目のＢＭ−ＤＣを収集し、２回洗浄し、そして１０6細胞／ｍｌで再培養し、ＩＬ−１２産生を評価した。白丸は非形質導入細胞を示し、白三角はＤＦＧ−ｈＣＤ８０−ｎｅｏ形質導入細胞を示し、そして黒丸はＤＦＧ−ｍＩＬ−１２形質導入細胞を示す。
【図２】図２は、ＨＢＳＳ（白丸）、１０6Ｚｅｏ形質導入（三角）およびＩＬ−１２形質導入（黒丸）ＢＭ−ＤＣの腫瘍への注射後の、樹立された（Ａ）ＭＣＡ２０５、（Ｂ）Ｂ１６および（Ｃ）Ｄ１２２腫瘍の面積の変化を示す。データを、平均±ＳＥとして示す。
【図３】図３は、遺伝子改変されたＤＣによるＩＬ−１２産生と、ＭＣＡ２０５腫瘍面積に対するこれらのＤＣの腫瘍内注射の効果との間の相関を示す。
【図４】図４は、ＨＢＳＳ（白丸）、１０6Ｚｅｏ形質導入（三角）およびＩＬ−１２形質導入ＢＭ−ＤＣ（四角）またはＩＬ−１２形質導入同系線維芽細胞（黒丸）の注射の、樹立されたＭＣＡ２０５腫瘍の増殖に対する効果を示す。データを、平均±ＳＥとして示す。
【図５】図５は、ＨＢＳＳ（白丸）、１０6ＩＬ−１２形質導入ＢＭ−ＤＣ（黒丸）またはＩＬ−１２形質導入同系線維芽細胞（三角）の反復注射の、樹立されたＭＣＡ２０５腫瘍の増殖に対する効果を示す。データを、平均±ＳＥとして示す。
【図６】図６は、（Ａ）ＭＣＡ２０５に対する、ＨＢＳＳ（白丸）、Ｚｅｏ（三角）およびＩＬ−１２（四角）形質導入ＢＭ−ＤＣおよびＩＬ−１２形質導入線維芽細胞（黒丸）で処置されたマウス由来の脾細胞の腫瘍特異的ＣＴＬ活性、ならびに（Ｂ）ＭＣＡ２０５（白丸）、ＹＡＣ−１（三角）および同系線維芽細胞（四角）に対する、ＩＬ−１２形質導入ＢＭ−ＤＣを注射されたマウス由来の脾細胞によるＣＴＬ活性を示す。
【図７】図７は、（Ａ）注射されたＭＣＡ２０５またはＢ１６腫瘍および（Ｂ）注射されていない対側ＭＣＡ２０５またはＢ１６腫瘍の面積に対する、ＨＢＳＳ（白丸）、Ｚｅｏ形質導入（三角）およびＩＬ−１２形質導入（黒丸）ＢＭ−ＤＣの腫瘍内注射の効果を示す。データを、平均±ＳＥとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
（定義）
出願人が発明であると考えた事項をより明瞭かつ簡潔に指摘および記載するために、以下の定義を、書面および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語について提供する。
・本明細書中で使用される用語「抗原提示細胞」またはその略語「ＡＰＣ」は、タンパク質抗原を処理し、それをペプチドに分断し、そしてそれをＭＨＣ分子と組み合わせてその細胞表面上（ここで、それは、適切なＴ細胞レセプターと相互作用し得る）に提示し得る細胞を意味する。本明細書中で使用される用語抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞および非プロフェッショナル抗原提示細胞の両方を含むことが意図される。
【００１４】
本明細書中で使用される用語「プロフェッショナル抗原提示細胞」またはその略語「ＰＡＰＣ」は、高度の効率的な免疫刺激能力を有する抗原提示細胞を意味する。ＰＡＰＣは、適切なクラスのＭＨＣ分子と組み合わせて抗原性ペプチドフラグメントを提示し、そしてまた、共刺激性表面分子を保有する。種々のクラスのＰＡＰＣとしては、ランゲルハンス細胞、相互連結細胞（ＩＤＣ）、濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）、胚中心樹状細胞（ＧＣＤＣ）、Ｂ細胞およびマクロファージが挙げられる。
【００１５】
本発明のＡＰＣに関して本明細書中で使用される「遺伝子改変された」ＡＰＣは、転写および翻訳されて、導入された核酸によってコードされる分子を産生するか、またはＡＰＣのゲノムに組込み、そして免疫刺激性サイトカインをコードする内因性核酸配列の転写および／もしくは翻訳を増強する外因性核酸を、その中またはその先祖または前駆体に導入されたＡＰＣを意味する。用語「遺伝子改変された」は、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどを含むがこれらに限定されない外因性核酸を導入する任意の方法を含むように本明細書中で使用され得る。
【００１６】
本明細書中で使用されるコード配列および調節領域は、それらが、調節領域の影響または制御下にそのコード配列の発現または転写を置くようにそれらが共有結合されている場合に「作動可能に連結されている」といわれる。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されることが所望される場合、２つのＤＮＡ配列は、以下の場合に作動可能に連結されているといわれる：プロモーター機能の導入がコード配列の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が（１）フレームシフト変異の導入を生じないか、（２）調節領域がコード配列の転写を指向する能力を妨害しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合。従って、調節領域は、その調節領域がＤＮＡ配列の転写をもたらし得、その結果得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合に、コード配列に作動可能に連結されている。
【００１７】
本発明の遺伝子改変されたＡＰＣに関して本明細書中で使用される場合、免疫刺激性サイトカインの用語「発現を増強する」は、サイトカインをコードする核酸配列の転写および／または翻訳のレベルを増加することを意味する。
【００１８】
本明細書中で使用される用語「免疫刺激性サイトカイン」は、免疫系細胞間の相互作用を媒介し、特にＡＰＣによって提示された抗原性ペプチドに対する免疫応答における活性化または増加を引き起こす可溶性分子を意味する。特に意図されるものは、以下からなる群から選択される免疫刺激性サイトカインである：インターロイキン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンドおよびキットリガンド。本明細書中で使用される場合、任意のこれらのサイトカインへの言及は、ヒトタンパク質に実質的に類似のヒトにおける活性を有するヒトホモログおよび任意の他の哺乳動物ホモログを含むことが意図される。
【００１９】
（Ｉ．処置方法）
本発明は、一部には、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するように遺伝子改変された抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、感染部位もしくは腫瘍部位またはその付近に直接注射されて、抗原でのＡＰＣの前負荷（ｐｒｅ−ｌｏａｄｉｎｇ）またはパルシングなしに、感染または腫瘍と関連する抗原に対する特異的免疫学的応答を誘導し得るという発見に由来する。特に、免疫刺激性サイトカイン、好ましくはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の発現を増強するように遺伝子改変された、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞（ＤＣ）、そしてより好ましくは骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）またはＣＤ３４＋由来樹状細胞（ＣＤ３４＋−ＤＣ）が、感染部位もしくは腫瘍部位またはその付近に注射されて、注射部位と関連する抗原に対する特異的免疫応答を誘導し得ることが見出された。重要なことに、腫瘍への注射を含む実験において、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、ＩＬ−１２を構成的に発現するように操作されたＤＣ）が、注射部位およびその遠位の両方で腫瘍退化を生じ得、そして局所のリンパ節および脾臓の両方において腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的Ｔｈ１細胞応答を誘導し得ることが見出された。
【００２０】
従って一般に、本発明は、感染または腫瘍を有する被験体（特に、ヒト被験体）の処置方法を提供する。ここで、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するように遺伝子改変されたＡＰＣ（好ましくは、プロフェッショナル抗原提示細胞）は、感染部位もしくは腫瘍部位またはその付近に注射される。従って、この方法は、ＡＰＣのサンプルを得る工程、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するようにＡＰＣを遺伝子改変する工程、および遺伝子改変されたＡＰＣ（好ましくは、プロフェッショナル抗原提示細胞）を感染部位もしくは腫瘍部位またはその付近に注射する工程を包含する。ＡＰＣを遺伝子改変する前またはその後、そしてそれらを注射する前に、それらを、当該分野において周知の細胞培養の標準的技術によってクローン増殖（ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｅｘｐａｎｄ）し得る。ＡＰＣが自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）であるべき場合、細胞を得てそして改変する工程、ならびに必要に応じて細胞をクローン増殖する工程は、好ましくは注射の時間にできるだけ近くに行う。しかし、異種であるが同系のＡＰＣが使用されるべきである場合、細胞は、注射のはるかに前に得られ、そして遺伝子改変され得、そして使用前に無期限に維持され得る。
【００２１】
本発明の方法での処置のための被験体は、癌患者および治療不応性感染に罹患した被験体を含む。遺伝子改変されたＡＰＣ（好ましくは、プロフェッショナル抗原提示細胞）が腫瘍部位または感染部位へと直接注入されることが好ましいので、本発明の方法は、少なくとも１つの物理的に十分に規定された腫瘍を有する被験体または少なくとも１つの物理的に十分に規定された感染部位を有する被験体において、広範性の非常に転移した癌を有する被験体または広範性感染を有する被験体においてよりもむしろ最も有用であることが、予期される。一方、以下の実施例に示されるように、腫瘍（または感染）が存在する１つの部位への注射は、全身性免疫応答の発生をもたらし得る。従って、本発明の方法は、広範性の非常に転移した癌または広範性感染を処置する際に、ＡＰＣ（好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞）が注入され得かつ腫瘍関連抗原または感染関連抗原を効果的にロードし得る腫瘍または感染の少なくとも１つの部位が同定され得る場合に、有効であり得る。
【００２２】
現在好ましい実施態様において、本発明の方法が、本発明の遺伝子改変されたＡＰＣ（好ましくは、プロフェッショナル抗原提示細胞）が直接注入され得る固形腫瘍を有する患者を処置するために使用される。適切な固形腫瘍は、黒色腫、肝細胞癌、腺癌、基底細胞癌、口腔癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膀胱癌、頭および首の癌、腎細胞癌、膵臓癌、肺癌、子宮頚癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、前立腺癌、精巣癌、および乳癌を含み得る。これらの癌のうちの多くに関して、ＤＣ浸潤と予後との間の関係が確立されている。
【００２３】
本発明の遺伝子改変されたＡＰＣは、皮下注入、皮内注入、経皮注入、筋肉内注入、腹腔内注入または他の形態の注入のための標準的滅菌技術を使用して、注入され得る。この細胞は、生理学的に受容可能な溶液または生理学的に受容可能な緩衝液中で投与され得、そしてＡＰＣが生存し、抗原をロードし、流入（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節または脾臓へ輸送し、そして抗原を提示して免疫応答を活性化させる能力を促進し得る他の薬剤（特にサイトカイン）と組み合わせて投与され得る。導入される細胞の数は、多数の因子（注入される部位の数、経時的に実施される注入の数、腫瘍または感染病変のサイズ、および腫瘍または感染の性質を含む）に依存する。使用される細胞の数はこのような因子とともに変化するが、１０4〜１０8個、好ましくは１０5〜１０7個の細胞が１回の処置の１つの部位について注入されることが、現在予期される。
【００２４】
ＡＰＣの選択および単離、免疫刺激性サイトカインの選択、およびＡＰＣの遺伝子改変に関連する、詳細および現在好ましい実施態様が、以下に別々に記載される。
【００２５】
（ＩＩ．ＡＰＣの選択および単離）
本発明は、抗原提示細胞ＡＰＣ（好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞、最も好ましくは樹状細胞）を使用し、これらの細胞は、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するように、遺伝子改変されている。
【００２６】
好ましくは、このＡＰＣのもともとの供給源は、処置される被験体であり、このＡＰＣが自己由来であるようにする。同種異系ＡＰＣ（他の個体から入手される）もまた、本発明において使用され得るが、好ましくは、このＡＰＣは組織適合性個体または同系個体に由来して、その被験体の同属の抗原特異的Ｔ細胞レセプターに対する適切なＭＨＣ提示を提供する。さらに、ヒトＭＨＣタンパク質またはヒト化ＭＨＣタンパク質、および必要に応じて同時刺激分子を発現する、遺伝子操作された動物（例えば、マウスまたはブタ）が作製され得、そして被験体の同属の抗原提示Ｔ細胞レセプターに対して適切なＭＨＣ提示をし得るＡＰＣの再生可能な供給源として使用され得る。
【００２７】
好ましいＰＡＰＣは樹状細胞であり、そして特に、動員された末梢血から採取されたＣＤ３４＋由来ＤＣ（ＣＤ３４＋−ＤＣ）、骨髄から採取された骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）である。本発明において有用であり得る他のＤＣは、血液から採取された単球由来ＤＣ、骨髄から採取されたＣＤ３４＋−ＤＣ、脾臓から採取された脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）由来ＤＣ、皮膚由来ＤＣ、小胞樹状細胞（ＦＤＣ）および胚芽中心樹状細胞（ＧＣＤＣ）である。これらの樹状細胞をそれらが生じるかまたは局在する組織から単離する方法は、当該分野において周知である。
【００２８】
例えば、ＢＭ−ＤＣを単離する方法が、Ｉｎａｂａら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２に記載される。あるいは、ＣＤ３４＋前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞が、ヒト臍帯血または成人血から入手され得、そしてサイトカインにより刺激されて、樹状細胞へと分化し得る（例えば、Ｃａｕｘら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５〜７０６；Ｒｏｍａｎｉら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：８３〜９３を参照のこと）。樹状細胞を生成する際のＦｌｔ−３リガンドの有効性が、例えば、Ｓｈｕｒｉｎら（１９９７）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：１７４〜１８４に記載される。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とともに数日（例えば、５日）間培養されたＢＭ−ＤＣまたはＣＤ３４＋−ＤＣが、特に好ましい。ＴＮＦ−αおよびそのキットリガンドはまた、培養して増殖されるＤＣの収量を増大することにおいて有効であることことが示され（例えば、Ｍａｙｏｒｏｄｏｍｏら（１９９７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、１５：９４〜１０３およびこの中に引用される参考文献を参照のこと）、そして本発明のＤＣを得るために使用され得る。このようなＤＣのうちの大多数は、以前の報告（Ｐｉｅｒｒｅら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：７８７〜７９２；Ｉｎａｂａら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４７９〜４８８）に従ってフローサイトメトリーおよびＭＬＲアッセイにより決定される場合に、未成熟な表現型を提示し得る。ＤＣは、その未成熟段階の間でのみ、抗原捕捉能力およびプロセシング能力、ならびに輸送能力を有する（Ｐｉｅｒｒｅら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｔｅ  ３８８：７８７〜７９２；Ｉｎａｂａら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４７９〜４８８；Ｃｅｌｌａら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：７８２〜７８７）。
【００２９】
（ＩＩＩ．サイトカインの選択）
本発明のＡＰＣは、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するように遺伝子改変される。好ましくは、そのサイトカインは、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンドまたはキットリガンドのうちの１つである。これらのサイトカインのアミノ酸配列は、当該分野で周知である（１９８９）。従って、インターロイキン−４のアミノ酸配列は、例えば、Ａｒａｉら（１９８９）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２（１）２７４〜２８２に見出され得；インターロイキン−６のアミノ酸配列は、例えば、Ｙａｓｕｋａｗａら（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６（１０）：２９３９〜２９４５に見出され得；インターロイキン−１２のｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットのアミノ酸配列は、例えば、Ｗｏｌｆら（１９９１）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６（９）：３０７４〜３０８１に見出され得；種々のＩＦＮ−αサブタイプのアミノ酸配列は、例えば、Ｇｒｅｎら（１９８４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．４（４）：６０９〜６１７、およびＷｅｉｓｍａｎｎら（１９８２）Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｓｙｍｐ．１２：１〜２２に見出され得；ＴＮＦのアミノ酸配列は、例えば、Ｐｅｎｎｉｃａら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２４〜７２９に見出され得；Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列は、例えば、Ｈｉｒａｎｏら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：７３〜７６に見出され得；ならびにＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列は、例えば、Ｃａｎｔｒｅｌｌら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２（１８）：６２５０〜６２５４に見出され得る。ＡＰＣを遺伝子改変してこれらのサイトカインのうちの１つの発現を増強するために、当業者は、そのサイトカインをコードする天然に存在する核酸配列（例えば、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列）を含むベクターを使用することを選択し得るか、または遺伝子コードの縮重を利用して、機能的サイトカインをなおコードする天然に存在しない配列を含むベクターを設計および作製し得る。ヘテロ二量体免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）の場合、本発明のＡＰＣは、このサイトカイン分子の両方のサブユニットを発現するように遺伝子改変されなければならない。
【００３０】
本発明のＡＰＣはまた、これらのサイトカインの改変体を発現するように遺伝子改変され得る。例えば、プロ形態および成熟形態の両方を有するサイトカイン（例えば、シグナルペプチドの切断により活性フラグメントを生成する前後、または限定的タンパク質分解により活性フラグメントを生成する前後）について、本発明のＡＰＣは、プロ形態または成熟形態のいずれかを発現するように遺伝子改変され得る。他の改変体（例えば、サイトカインの活性フラグメントと異種配列（例えば、異種シグナルペプチド）との間の融合タンパク質）もまた使用され得る。種改変体もまた、それらがヒト被験体において活性を保持する程度まで、使用され得る。従って、例えば、ヒトＡＰＣは、ヒトサイトカインのマウス改変体、ウシ改変体、ウマ改変体、ヒツジ改変体、ネコ改変体、イヌ改変体、非ヒト霊長類改変体または他の哺乳動物改変体を発現するように、これらの種改変体がそのヒトホモログと実質的に類似した活性を保持する場合には、遺伝子改変され得る。
【００３１】
（ＩＶ．ＡＰＣの遺伝子改変）
本発明のＡＰＣは、所望のサイトカインをコードする核酸を導入するために、当該分野で公知の任意の標準的技術により、遺伝子改変され得る。例えば、レトロウイルス形質導入によるヒト樹状細胞の遺伝子改変の方法は、Ｒｅｅｖｅｓ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５６７２〜５６７７、およびＳｐｅｃｈｔら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１２１３〜１２２１に記載される。同様に、ＩＬ−４遺伝子のレトロウイルス媒介性移入による骨髄細胞の遺伝子改変は、Ｃｈａｍｂｅｒｓら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９（９）：２８９９〜２９０５に記載される。さらに、ヒトＣＤ３４+前駆細胞のレトロウイルス形質導入、続くサイトカイン刺激による樹状細胞への分化および成熟（遠心分離を用いるかまたは用いない）は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３７６３〜３７７０、およびＲｅｅｖｅｓら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５６７２〜５６７７に記載される。レトロウイルスプロデューサー細胞との同時培養の代わりの、レトロウイルス上清の使用（Ｓｐｅｃｈｔら（１９９７））は、他のストラテジーを超える以下を含むいくつかの利点を有する：（１）その細胞に対する直接の毒性が存在しない；（２）安定な遺伝子発現が得られる；（３）アデノウイルスベクターを用いる方法と異なり、最小のウイルス特異的ＣＴＬ応答が存在する（例えば、Ｓｍｉｔｈら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６７３３〜６７４０を参照のこと）；ならびに（４）レトロウイルス上清の使用に伴う、より広範な臨床経験が存在する。
【００３２】
本発明のＡＰＣの遺伝子改変は、一過性であってもよいし、または安定であってもよい。すなわち、ＡＰＣに導入されるサイトカインコード核酸配列は、このＡＰＣ細胞のゲノムＤＮＡから離れて存在し得、そして一時的にのみ発現され得るか、またはこのＡＰＣ細胞のゲノムに組込まれ得、そしてこの細胞の生存を通じて発現され続け得る。例えば、アデノウイルスベクターを使用するＩＬ−６の一過性発現は、Ｒｉｃｈａｒｄｓら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６２：２８２〜２９２に記載される。一過性発現された配列について、免疫刺激性サイトカインの発現が少なくとも１日、好ましくは数日続き、ＡＰＣが、感染部位または腫瘍部位で抗原を載せるため、領域的リンパ節へ移動するため、そして抗原の提示により同属のＴ細胞を活性化するために、十分な時間を可能にすることが、好ましい。
【００３３】
好ましくは、免疫刺激性サイトカインの発現を増強するために用いられる遺伝子構築物は、遺伝子組換えされたＡＰＣによるサイトカインの構成的発現を可能にする、サイトカインをコードする配列に作動可能に連結されている構成的プロモーターを含む。しかし、あるいは、誘導のための条件が、被験体のさらなる処置（例えば、インデューサーの投与）とともに、またはその処置なしに、生理学的条件に適合され得る場合、誘導性のプロモーターが用いられ得る。
【００３４】
上記および以下の実施例に記載の遺伝子組換えＡＰＣのレトロウイルス方法に加えて、他の多くの、適切なベクターを生成する方法、これらのベクターで細胞を遺伝子組換えする方法、そして形質転換体を同定する方法が当該分野で周知であり、本明細書においては簡略に概説されるのみである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。人工的なプロモーターエレメントの調節下でヌクレオチド配列の誘導性発現（例えば、ＬａｃＳｗｉｔｃｈ発現ベクター、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）または構成的発現（例えば、ｐｃＤＮＡ３ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を可能にする広範な種々のベクターが開発されており、そして市販されている。このようなプロモーターエレメントは、しばしば、ＣＭＶウイルス遺伝子またはＳＶ４０ウイルス遺伝子から誘導されるが、他の強力なプロモーターエレメント（真核生物細胞において活性である）がまた、転写を誘導するために使用され得る。代表的には、これらのベクターはまた、人工的ポリアデニル化配列および３’ＵＴＲを含む。これは、外因性のウイルス遺伝子配列からか、または他の真核生物遺伝子から誘導され得る。さらに、いくつかの構築物において、目的のサイトカイン配列の発現を増強するために、人工的な非コードのイントロンおよびエキソンが、ベクターに含まれ得る。これらの発現系は、一般に商業的供給業者から市販されており、そしてｐｃＤＮＡ３およびｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなベクターにより代表される。数多くの市販の発現ベクターおよびカスタム設計された発現ベクターが商業的供給業者から入手可能であり、多少の所望の細胞型における、任意の所望の転写物の発現を、構成的にか、または外来性刺激（例えば、テトラサイクリンの投与停止またはＩＰＴＧへの曝露）への曝露後のいずれかで可能にする。
【００３５】
ベクターは、当該分野で周知の種々の方法によりＡＰＣに導入され得る。この方法には以下が挙げられるがこれらに限定されない：リン酸カルシウムトランスフェクション、リン酸ストロンチウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクチン（例えば、Ｄｏｓｐｅｒ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌトランスフェクション試薬、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、マイクロインジェクション、「遺伝子銃」を用いるマイクロビーズ上での衝撃（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）インジェクション、またはウイルスベクター（組換えウイルスでの感染による）。
【実施例】
【００３６】
（実施例）
（レトロウイルスベクター）レトロウイルスＤＦＧ−ｍＩＬ−１２、ＴＦＧ−ｍＩＬ−１２およびＤＦＧ−ｈＣＤ８０−ｎｅｏの構築物は、以前の研究において記載されている（Ｔａｈａｒａら（１９９５）；Ｚｉｔｖｏｇｅｌら（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１３３５〜１３４１）。ＭＦＧ−ＥＧＦＰおよびＭＦＧ−Ｚｅｏを、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得られるそれぞれのフラグメントをサブクローニングすることにより生成した（Ｃｏｒｍａｃｋら（１９９６）、Ｇｅｎｅ  １７３：３３〜３８）。レトロウイルスの上清を、これらのプロウイルス構築物をＢＯＳＣ２３またはＢＩＮＧパッケージング細胞株（Ｔａｈａｒａら、１９９５）にトランスフェクトすることにより生成した。ＤＦＧ−ｈＣＤ８０−ｎｅｏレトロウイルスを生成するＣＲＥおよびＣＲＩＰ細胞を、それぞれ、ＢＩＮＧまたはＢＯＳＣ２３産生レトロウイルスを用いてのこれらのパッケージング細胞の感染、さらにＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）での選択により作製した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞への形質導入後、Ｇ４１８−生存コロニーから、レトロウイルス上清の力価を算出した。
【００３７】
（腫瘍細胞株およびマウス系統）種々の移植可能なマウス腫瘍細胞株を、マウスに注入し、腫瘍を惹起する。次いで、これを本発明の遺伝子組換えＡＰＣで処置した。ＭＣＡ２０５メチルコラントレン誘導の線維肉腫は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のご好意により提供頂いた。Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞株は、Ｅ．Ｇｏｒｅｌｉｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のご好意により提供頂いた。３ＬＬ腫瘍細胞の高転移性改変体Ｄ１２２は、Ｌ．Ａｉｓｅｎｂａｃｈ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）のご好意により提供いただいた。ＹＡＣ−１は、Ｗ．Ｃｈａｍｂｅｒｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）により贈呈された。これらの細胞株を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび５×１０-5Ｍ  ２−ＭＥ（これら全ては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹからである）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（以降は、完全培地（ＣＭ）とよぶ）中で維持した。
【００３８】
雌性の６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスをＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入し、そして全ての実験に８〜１０週齢で用いた。
【００３９】
（ＡＰＣの培養および遺伝子組換え）以前に記載の方法（Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら（１９９５）；Ｚｉｔｖｏｇｅｌら（１９９６）；Ｉｎａｂａら（１９９２）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２）を用いて、ＢＭ−ＤＣ培養物を得た。手短には、屠殺したマウスの大腿および脛骨からマウス骨髄細胞を回収した。混入する赤血球を０．８３Ｍ  ＮＨ4Ｃｌ緩衝液で溶解し、そしてリンパ球を、抗体のカクテル（ＲＡ３−３Ａ１／６．１、抗−Ｂ２２０；２．４３，抗Ｌｙｔ２；ＧＫ１．５，抗Ｌ３Ｔ４；これら全てはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤからである）およびウサギ補体（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で、０日目に枯渇させた。これらの細胞を、ＣＭ中で一晩培養して粘着したマクロファージを除き、次いで非粘着性の細胞を、ｒｍＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびｒｍＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）を含有する新鮮ＣＭ（ＤＣ培地）に、１日目に入れた。６日目に細胞をほぼ回収した。形態学、表現型、および強力な、リンパ球混合反応刺激活性によりＢＭ−ＤＣを規定した。フローサイトメトリーによる表現型分析により、培養細胞の大部分（６０〜９５％）において、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ならびにＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの高い発現が示された。
【００４０】
レトロウイルスの形質導入については、２４時間ＤＣ培地中で培養した１×１０6のＢＭ細胞を、１４ｍｌの丸底チューブにアリコートし、そして８μｇ／ｍｌポリブレン、１０００Ｕ／ｍｌ  ｒｍＧＭ−ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌ  ｒｍＩＬ−４とともに１ｍｌのレトロウイルス上清中に懸濁した。これらの細胞を２５００×ｇ、３０〜３２℃で２時間遠心分離した（Ｋｏｔａｎｉら（１９９４），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１９〜２８；Ｂａｈｎｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５４：１３１〜１４３）。遠心分離後、細胞をＤＣ培地中で培養した。形質導入プロセスを３日目および４日目に繰り返した。エコトロピックなプロデューサー細胞、ＢＯＳＣ２３およびＣＲＥ由来
のレトロウイルス上清は、匹敵する力価での両栄養性ウイルスと比べた場合、より効率的にマウスＢＭ−ＤＣに形質導入する。ＢＯＳＣ２３細胞由来のレトロウイルス上清が最高力価（２〜８×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）のウイルスを産生したために、それを用いた。マウスＢＭ−ＤＣの形質導入効率を試験するために、本発明者らは、形質導入マーカーとして挿入されたヒトＣＤ８０（Ｂ７・１）遺伝子またはＥＧＦＰ遺伝子を有するレトロウイルスベクターを生成し、そしてフローサイトメトリーにより形質導入の効率を決定した。高い形質導入効率（２２〜７５％）でレトロウイルスにより改変されたＤＣは、培養中で、最後の形質導入（４日目）の少なくとも１２日後に導入遺伝子を発現し得る。形質導入効率は、用いたレトロウイルス上清の力価と十分に相関していた。２色の免疫蛍光染色により、マーカー（ｈＣＤ８０）−陽性細胞の有意な数がまた、高いレベルのｍＣＤ８０ならびにＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩおよびＤＥＣ−２０５を発現したことが示された。
【００４１】
ＥＧＦＰレトロウイルスベクターでの形質導入は、マウスＢＭ−ＤＣが、高い効率でレトロウイルスにより形質導入され得ることを示した。さらに、ＢＭ−ＤＣをまた、両方のＩＬ−１２遺伝子（ＤＦＧ−ｍＩＬ−１２）を発現するように改変したレトロウイルスベクターで形質導入した。４日目の形質導入手順の完了後、培養培地中のｍＩＬ−１２  ｐ７０のヘテロ二量体の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。図１Ａに示すように、ヘテロ二量体ＩＬ−１２（ｐ７０）の蓄積は、ＤＦＧ−ｍＩＬ−１２形質導入したＢＭ−ＤＣの培養中では観察されたが、形質導入されていない細胞またはマーカー遺伝子を形質導入された細胞の培養中では観察されなかった。６日目、ＤＣを回収し、２回洗浄し、そして新しいプレートに移した。このとき、ＩＬ−１２で形質導入したＤＣは、約８０ｎｇ／１０6細胞／４８時間のヘテロ二量体性ＩＬ−１２を産生した（図１Ｂ）。ＩＬ−１２で形質導入したＤＣからのＩＬ−１２産生の範囲は、８〜８０ｎｇ／１０6細胞／４８時間であり、そしてそれぞれの実験で用いたレトロウイルス上清の力価と関連していた。遺伝子組換えされたＤＣにより産生されたＩＬ−１２タンパク質が、生物学的に活性であり、そしてＣｏｎＡ処理脾細胞からのＩＦＮ−γ産生を刺激し得ることを確認した。ＤＣ表現型に対するＩＬ−１２形質導入の効果を試験するため、フローサイトメトリーを用いて、種々の細胞表面分子を試験した。ＩＬ−１２で形質導入したＤＣは、それがＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の増加したレベルを発現したこと以外は、非形質導入ＤＣまたはＺｅｏ形質導入ＤＣと違いはなかった。
【００４２】
（線維芽細胞の培養および遺伝子組換え）本発明の遺伝子組換えＡＰＣの治療的有効性と比較するため、同様に改変した線維芽細胞を調製した。手短には、同系の線維芽細胞の初代培養物をＢ６マウスの肺から得た。肺の小片をはさみで細かく切断し、そしてコラゲナーゼＩＶ、ヒアルロニダーゼＶおよびデオキシリボヌクレアーゼＩＶの３つの酵素溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で、室温で３時間撹拌した。ＨＢＳＳでの２回のリンス後、細胞上清をＣＭ中で培養し、線維芽細胞の初代培養物を得た。ＩＬ−１２で形質導入した線維芽細胞を、ＣＲＩＰ−ＴＦＧ−ｍＩＬ−１２−ｎｅｏの上清での感染により、続いてＧ４１８での選択により生成した。
【００４３】
（遺伝子組換えしたＡＰＣの腫瘍内注入）癌患者の動物モデルを生成するため、マウス（１群あたり４〜５匹の動物）に、０日目に、１×１０5細胞のＭＣＡ２０５、Ｂ１６およびＤ１２２腫瘍株を、右脇腹に皮下注射した。７日目に、腫瘍サイズが１０〜２０ｍｍ2になった時点で、１０6の非形質導入ＢＭ−ＤＣまたは形質導入ＢＭ−ＤＣを腫瘍内に注入した。ＩＬ−１２で形質導入した同系の線維芽細胞を、以前に記載（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら（１９９５））のように、照射（５０００ラド）後、腫瘍内注入のために用いた。マウスが樹立された腫瘍を拒絶した場合、それらのマウスの反対側の脇腹に、より多数の腫瘍細胞（２×１０5）を再チャレンジし、腫瘍に対する防御的全身免疫の誘導を評価した。
【００４４】
（樹立腫瘍の抑制および／または拒絶）  免疫刺激サイトカインの発現を増強するように遺伝子改変されたＡＰＣを用いて腫瘍内注射の抗腫瘍効果を試験するために、１０6非形質導入またはＩＬ−１２形質導入ＢＭ−ＤＣを、７日目の樹立腫瘍（ＭＣＡ２０５、Ｂ１６、およびＤ１２２）（腫瘍直径；３〜５ｍｍ）に注射した。図２に示すようにＩＬ−１２形質導入ＤＣは、これらの樹立腫瘍の増殖を有意に抑制し、ＭＣＡ２０５を注射した５匹のマウスのうち２匹において最終的な拒絶を生じた。非形質導入ＤＣもＺｅｏ形質導入ＤＣもいかなる抗腫瘍効果も有さなかった。これらの実験において、遺伝子改変されたＤＣのＩＬ−１２産生は、２９ｎｇ／１０6細胞／４８時間であった。全体において、ＩＬ−１２形質導入ＤＣでの単独処理は、１４匹のマウスのうち５匹（３６％）では樹立したＭＣＡ２０５腫瘍の拒絶を生じた。これらの無腫瘍マウスは、ＭＣＡ２０５の２倍での次の再チャレンジを拒絶した。このことは、拒絶された腫瘍の免疫記憶の獲得を示唆する。図３に示すように、ＩＬ−１２形質導入ＤＣの抗腫瘍効果は、ピアソン線形回帰を用いると、２８日目のＩＬ−１２産生と相関した（Ｒ＝−０．８０、ｐ＜０．０５）。別の実験では、マウスを、まず１×１０5のＭＣＡ２０５細胞で感染用量（ｉ．ｄ．）で注射し、そして次に、７日目にＨＢＳＳ（白丸）、１０6のＺｅｏ形質導入（三角）、ＩＬ−１２形質導入ＢＭ−ＤＣ（四角）、またはＩＬ−１２形質導入同系線維芽細胞（黒丸）を樹立腫瘍に注射した。図４に示すように、ＩＬ−１２形質導入ＤＣの抗腫瘍効果もまた、ＩＬ−１２形質導入線維芽細胞の効果と比較した。以前に報告されたように（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら（１９９５））、Ｉｌ−１２形質導入線維芽細胞は、ＭＣＡ２０５の増殖を抑制し、一方、それらの単回注射は、腫瘍のいかなる拒絶も示さなかった。しかし、ＩＬ−１２形質導入ＤＣは、ＩＬ−１２形質導入線維芽細胞と比較した場合、より効率的に腫瘍増殖を抑制した。この線維芽細胞は、類似であるが、しかし僅かに高いレベルでＩＬ−１２を発現した（遺伝子改変ＤＣおよび線維芽細胞のＩＬ−１２産生は、それぞれ１３ｎｇ／１０6細胞／４８時間および２２ｎｇ／１０6細胞／４８時間であった）。ＩＬ−１２形質導入ＤＣの腫瘍内注射の毎週の連続した処理もまた試験した。簡潔にいえば、マウスを、まず１×１０5のＭＣＡ２０５細胞で感染用量（ｉ．ｄ．）で注射した。７日目および１４日目に、ＨＢＳＳ（白丸）、１０6のＩＬ−１２形質導入ＢＭ−ＤＣ（黒丸）、またはＩＬ−１２形質導入同系線維芽細胞（三角）を樹立腫瘍に注射した。図５に示すように、ＩＬ−１２形質導入ＤＣの繰り返し注射は、単回注射と比較した場合に、より重要でありそして長期の腫瘍抑制（６０日を超える）を生じた。
【００４５】
（全身性腫瘍特異的免疫応答）  上述のように、ＩＬ−１２形質導入ＤＣの局所抗腫瘍効果は、ＩＬ−１２形質導入線維芽細胞で観察されたよりも著しかった。ＩＬ−１２形質導入ＤＣの腫瘍内注射が腫瘍に特異的な有意な全身免疫応答を誘導し得るか否かを決定するために、接種腫瘍の同側鼡径部における皮下リンパ節（排出リンパ節）ならびに脾臓を、腫瘍を保有するマウスから、ＤＣの注射の７日後（腫瘍接種１４日後）に採取した。これらのリンパ細胞を、照射腫瘍細胞（ＭＣＡ２０５）とインビトロで同時培養し、そして培養上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生を試験した。興味深いことに、非形質導入ＤＣおよびＺｅｏ形質導入ＤＣでの注射は、ＩＬ−１２形質導入線維芽細胞と比較した場合、排出リンパ節および脾臓から採取したリンパ細胞による腫瘍特異的ＩＦＮ−γ産生を増強した。さらに、ＩＬ−１２形質導入ＤＣの腫瘍内注射は、これらのリンパ細胞による腫瘍再刺激に応答してＩＦＮ−γ産生のより大きな増強を生じた。興味深いことに、ＤＣ注射はまた、より少ない程度でＩＬ−４産生を増強した。ＩＦＮ−γ産生は、ＭＣＡ２０５刺激後に特異的に放出されるが、Ｂ１６またはＭＣＡ２０７腫瘍では放出されなかった。これらの結果は、ＩＬ−１２で形質導入した腫瘍内注射したＤＣは、排出リンパ節に行き交い、インサイチュでリンパ球を効率的に刺激してＩＦＮ−γを産生することを示唆する。この仮説を確認するために、ＩＬ−１２形質導入ＤＣを、蛍光染料（ＰＫＨ−２６）で染色し、そして腫瘍内注射し、そして排出リンパ節を注射の２４時間後に試験した。有意数のＤＣが、注射２４時間後に排出リンパ節中で検出された。
【００４６】
さらに、処置マウス由来の脾臓細胞のＣＴＬ活性もまた評価した。脾臓細胞を採取し、そしてＢＭ−ＤＣの腫瘍内注射の７日後に群当たり２匹のマウスからプールした。これらの細胞（２×１０6）を、２５ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２の存在下で２×１０5照射（５０００ラド）ＭＣＡ２０５を用いてインビトロで再刺激した。再刺激細胞を、標準の51Ｃｒ放出アッセイにおいて５日後に試験した。ＨＢＳＳ、Ｚｅｏ形質導入ＢＭ−ＤＣおよびＩＬ−１２形質導入ＢＭ−ＤＣ、およびＩＬ−１２形質導入線維芽細胞で処置された群由来の脾臓細胞によるＣＴＬ活性を、ＭＣＡ２０５に対して試験した（図６Ａ）。Ｚｅｏ形質導入ＤＣは、ＣＴＬ活性の誘導において、ＩＬ−１２線維芽細胞よりも有効であった。ＩＬ−１２形質導入ＤＣは、任意の他のストラテジーを用いて観察された活性よりも有意に高いＣＴＬ活性を誘導した。ＩＬ−１２形質導入ＢＭ−ＤＣを注射したマウス由来の脾臓細胞によるＣＴＬ活性を、ＭＣＡ２０５、ＹＡＣ−１および同系線維芽細胞に対して試験した（図６Ｂ）。この活性は、ＭＣＡ２０５腫瘍に対して特異的であるようであり、そして抗ＣＤ８抗体で４０〜５０％ブロックされ得、そして抗Ｈ−２Ｋb抗体で２４〜３５％ブロックされ得た。
【００４７】
全身免疫の誘導をさらに確認するために、対側性の未処置の腫瘍の増殖を試験した。マウスを、まず１×１０5のＭＣＡ２０５腫瘍細胞およびＢ１６腫瘍細胞で感染用量（ｉ．ｄ．）でその両脇腹を注射し、そしてＩＬ−１２形質導入ＤＣを、７日目に右脇腹の腫瘍中に注射した。このとき、腫瘍面積は、１３〜２０ｍｍ2に達した。両脇腹の腫瘍増殖をモニタリングした。図７は、ＩＬ−１２形質導入ＤＣの腫瘍内注射は、注射腫瘍の増殖（図７Ａ）だけでなく、対側性の注射されていない腫瘍の増殖（図７Ｂ）もまた有意に抑制した。これらの実験において、ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２形質導入ＤＣの注射の２日後に、マウス血清中で検出されなかった。
【００４８】
（フローサイトメトリー）  ＢＭ−ＤＣの表現型分析のために、ＰＥまたはＦＩＴＣに結合体化された、マウス細胞表面分子（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤＥ８６、Ｇｒ−１、Ｈ−２Ｋb、Ｉ−Ａb、および適当なアイソタイプコントロール（これらは全てＰｈａＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡより））に対するモノクローナル抗体を使用した。ＤＥＣ−２０５は、ＮＬＤＣ−１４５抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｓ．、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）での染色によって検出された。形質導入マーカーｈＣＤ８０を、ＦＩＴＣ結合体化抗ｈＣＤＥ８０抗体（ＰｈａＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した。この抗体は、マウスＣＤ８０と交差反応しない。
【００４９】
（インビトロサイトカイン放出アッセイ）  リンパ細胞を、７日前にＢＭ−ＤＣの腫瘍内注射を受容した２匹のマウスの各々から採取した排出（鼡径）リンパ節および脾臓から入手した。これらの細胞（２×１０6）を、以前に記載（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら（１９９６）のように３６時間、２５ＩＵ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）の存在下で２×１０5照射（５０００ラド）ＭＣＡ２０５を有する２４ウェルプレート中で同時培養した。上清を採集し、そしてＩＦＮ−γおよびｍＩＬ−４発現（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）についてＥＬＩＳＡにおいて評価した。各アッセイについての感度の下限は、それぞれ１８ｐｇ／ｍｌおよび３６ｐｇ／ｍｌであった。
【００５０】
（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ）  脾臓を採取し、そして、ＢＭ−ＤＣの腫瘍内注射の７日後に１群当たり２匹のマウスからプールした。これらの細胞（２×１０6）を、２５ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２の存在下で、インビトロで２×１０5照射（５０００ラド）ＭＣＡ２０５で再刺激した。５日後、再刺激細胞を、標準的な４時間のＭＣＡ２０５、ＹＡＣ−１、および同系線維芽細胞に対する51Ｃｒ放出アッセイのためにエフェクターとして使用した。簡潔には、１０6の各標的細胞を１００μＣｉのＮａ251ＣｒＯ4で１時間標識した。２回洗浄した後、これらのエフェクターおよび標的細胞を、９６ウェル丸底プレート中で適当なＥ／Ｔ比でプレートした。上清（１００μｌ）を４時間インキュベーション後に採集し、そして放射能をγカウンターで計数した。比溶解の百分率を、下式のように算定した：％比溶解＝１００×（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）。
【００５１】
（統計学的分析）  統計学的分析を独立両側スチューデントｔ検定を用いて実施した。ピアソン線形回帰を当てはめて、相関を調べた。差異は、ｐ値が０．０５未満である場合、有意であるとみなした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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