(57)【要約】【課題】  標的物質を高感度に検出することが可能な標的物質検出素子および標的物質検出素子の製造方法を提供する。【解決手段】  標的物質検出素子であって、金属構造体の表面の金または銀からなる部分に設けられたリンカー層と、前記リンカー層に結合した標的物質捕捉体と、を有し、前記リンカー層が架橋構造を有さない鎖状の重合体の非会合体からなり、前記重合体が、側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体もしくは側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体からなることを特徴とする標的物質検出素子。【選択図】  図１
2010151521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質検出素子であって、
金属構造体の表面の金または銀からなる部分に設けられたリンカー層と、
前記リンカー層に結合した標的物質捕捉体と、を有し、
前記リンカー層が架橋構造を有さない鎖状の重合体の非会合体からなり、
前記重合体が、
側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体
もしくは
側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体
からなることを特徴とする標的物質検出素子。
【請求項２】
前記重合体がジアリルアミンとマレイン酸の共重合体からなることを特徴とする請求項１に記載の標的物質検出素子。
【請求項３】
前記ジアリルアミンとマレイン酸の共重合体が下記一般式（１）に記載の重合体であることを特徴とする請求項２に記載の標的物質検出素子。
一般式（１）
【化１】
2010151521.tif 000005
（ｌ：ｍ＝１：０．０００４〜１３であり、ｌとｍは１以上の整数である。また、一般式（１）に示される共重合体の分子量は１０００〜２０００００である。）
【請求項４】
標的物質検出素子の製造方法であって、
金属構造体の表面の金または銀からなる部分にリンカー層を形成する工程と、
前記リンカー層に標的物質捕捉体を結合させる工程と、を有し
前記金属構造体の表面にリンカー層を形成する工程が、
架橋構造を有さない鎖状の重合体であって、側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体もしくは側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体を含み、かつ前記重合体が会合するｐＨより低いｐＨを有する溶液と、前記金属構造体とを接触させる工程であることを特徴とする標的物質検出素子の製造方法。
【請求項５】
前記重合体がジアリルアミンとマレイン酸の共重合体からなることを特徴とする請求項４に記載の標的物質検出素子の製造方法。
【請求項６】
前記ジアリルアミンとマレイン酸の共重合体が下記一般式（１）に記載の重合体であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質検出素子の製造方法。
一般式（１）
【化２】
2010151521.tif 000006
（ｌ：ｍ＝１：０．０００４〜１３であり、ｌとｍは１以上の整数である。また、一般式（１）に示される共重合体の分子量は１０００〜２０００００である。）
【請求項７】
標的物質検出素子であって、
金属の表面に設けられたリンカー層と、
前記リンカー層に結合した標的物質捕捉体と、を有し、
前記リンカー層が鎖状の重合体からなり、
前記重合体が、第１の側鎖が前記金属の表面に結合し、第２の側鎖が前記標的物質捕捉体に結合している繰り返し単位を有する重合体であることを特徴とする標的物質検出素子。
【請求項８】
前記重合体が、
前記第１の側鎖に前記金属の表面に結合するための繰り返し単位Ａと、前記第２の側鎖に前記標的物質捕捉体に結合するための繰り返し単位Ｂと、を有する重合体、
もしくは
前記第１の側鎖に前記金属の表面に結合する部位と、前記第２の側鎖に前記標的物質捕捉体に結合する部位とを有する繰り返し単位Ｃからなる重合体、
である請求項７に記載の標的物質検出素子。
【請求項９】
標的物質検出素子の製造方法であって、
金属の表面にリンカー層を形成する工程と、
前記リンカー層に標的物質捕捉体を結合させる工程と、を有し
前記金属の表面にリンカー層を形成する工程が、
鎖状の重合体であって、前記重合体が、第１の側鎖に前記金属の表面に結合する為の部位と、第２の側鎖に前記標的物質捕捉体に結合する為の部位とを有する重合体を含み、かつ前記重合体が会合するｐＨより低いｐＨを有する溶液と、前記金属とを接触させる工程を含むことを特徴とする標的物質検出素子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の標的物質を検出するための標的物質検出素子および標的物質検出素子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１および２には、検体中の標的物質をリアルタイムかつラベルフリーで検出することができる標的物質検出素子として、プラズモン共鳴を利用したセンサが開示されている。
【０００３】
一方、特許文献３では、センサ基板への抗原の固定を目的として、金属膜の表面に有機リンカー層を形成し、その上にさらに抗原を固定するためのポリマー層を形成した標的物質検出素子が開示されている。
【特許文献１】特登録０３４５２８３７
【特許文献２】特開昭６３−７５５４２
【特許文献３】特開２０００−１４６９７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１および２に記載のプラズモン共鳴センサの感度を向上するために、センサの表面に、特許文献３に記載のリンカー層およびポリマー層を形成したとしても、リンカー層およびポリマー層の層の厚さが厚いため、標的物質捕捉体とセンサ表面の距離が遠くなり、高感度な検出を行うことができないという問題が発生する。
【０００５】
そこで、本発明は、高感度に検出することが可能な標的物質検出素子およびその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の標的物質検出素子は、金属の表面に設けられたリンカー層と、前記リンカー層に結合した標的物質捕捉体と、を有し、
前記リンカー層が鎖状の重合体からなり、前記重合体が、第１の側鎖が前記金属の表面に結合し、第２の側鎖が前記標的物質捕捉体に結合している繰り返し単位を有する重合体であることを特徴とする。
【０００７】
ここで、前記重合体が、前記第１の側鎖に前記金属の表面に結合するための繰り返し単位Ａと、前記第２の側鎖に前記標的物質捕捉体に結合するための繰り返し単位Ｂと、を有する重合体、
もしくは
前記第１の側鎖に前記金属の表面に結合する部位と、前記第２の側鎖に前記標的物質捕捉体に結合する部位とを有する繰り返し単位Ｃからなる重合体、
であることが好ましい。
【０００８】
本発明の標的物質検出素子の製造方法は、
金属の表面にリンカー層を形成する工程と、
前記リンカー層に標的物質捕捉体を結合させる工程と、を有し
前記金属の表面にリンカー層を形成する工程が、
鎖状の重合体であって、前記重合体が、第１の側鎖に前記金属の表面に結合する為の部位と、第２の側鎖に前記標的物質捕捉体に結合する為の部位とを有する重合体を含み、かつ前記重合体が会合するｐＨより低いｐＨを有する溶液と、前記金属とを接触させる工程を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の一実施形態は、
標的物質検出素子であって、
金属構造体の表面の金または銀からなる部分に設けられたリンカー層と、
前記リンカー層に結合した標的物質捕捉体と、を有し、
前記リンカー層が架橋構造を有さない鎖状の重合体の非会合体からなり、
前記重合体が、
側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体
もしくは
側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体
からなることを特徴とする標的物質検出素子である。
【００１０】
また、別の本発明の一実施形態は、
標的物質検出素子の製造方法であって、
金属構造体の表面の金または銀からなる部分にリンカー層を形成する工程と、
前記リンカー層に標的物質捕捉体を結合させる工程と、を有し
前記金属構造体の表面にリンカー層を形成する工程が、
架橋構造を有さない重合体であって、側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体もしくは側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体を含み、かつ前記重合体が会合するｐＨより低いｐＨの溶液と、前記金属構造体とを接触させる工程であることを特徴とする標的物質検出素子の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、標的物質を高感度に検出することが可能な標的物質検出素子およびその製造方法を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明の第一は、
標的物質検出素子の製造方法であって、
金属構造体の表面の金または銀からなる部分にリンカー層を形成する工程と、
前記リンカー層に標的物質捕捉体を結合させる工程と、を有し
前記金属構造体の表面にリンカー層を形成する工程が、
架橋構造を有さない重合体であって、側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体もしくは側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体を含み、かつ前記重合体が会合するｐＨより低いｐＨの溶液に、前記金属構造体を接触させる工程であることを特徴とする標的物質検出素子の製造方法である。
【００１４】
以下、図２を用いて、本発明の第一の各工程について説明する。
【００１５】
＜金属構造体の表面にリンカー層を形成する工程＞
図２（ｉ）は、金属構造体の表面にリンカー層を形成する工程を示しており、３は金属構造体、５はリンカー層を示している。
【００１６】
金属構造体３は、金または銀からなる部分を表面に有し、プラズモン共鳴現象を発生させることができる金属の構造体であれば良く、形状に制限はない。このような金属構造体の形状としては、例えば、薄膜形状、微粒子形状、リング形状、立方体形状などが挙げられる。
【００１７】
局在表面プラズモン共鳴を利用して検出する場合、金属構造体３は微粒子形状であっても良く、パターン形状であっても良い。
【００１８】
局在表面プラズモン共鳴を利用して検出し、かつ金属構造体３が微粒子である場合、金属構造体３の直径は１０ｎｍ〜５００ｎｍの大きさであることが好ましい。また、金属構造体３がリング形状や立方体形状などの微粒子以外のパターン形状である場合、金属構造体３の大きさは、１０ｎｍ〜１４５０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは５０ｎｍ〜４５０ｎｍである。なお、ここでの金属構造体３の大きさとは、基体の金属構造体３の被形成面と平行な金属構造体の平面での任意の２点間の距離の最大値のこととする。
【００１９】
また、表面プラズモン共鳴を利用して検出する場合、金属構造体３は薄膜形状であることが好ましく、金属構造体３の厚さは１０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。金属構造体３の厚さをこれらの範囲内とすることで、目的とする検出感度を達成できる表面プラズモン共鳴を効果的に生じさせることができる。
【００２０】
金属構造体３は、金または銀を含む部分を表面に有しプラズモン共鳴を発生させることができれば、全体が金または銀からなっていても良く、金または銀からなる部分とそれ以外の材料からなる部分とを有していても良い。金属構造体３が、金または銀を含む部分とそれ以外の材料からなる部分を有している場合、それ以外の材料からなる部分は、金および銀以外のプラズモン共鳴現象を生じさせる金属、例えば、銅、アルミニウムもしくはそれらの合金などで形成することが可能である。
【００２１】
なお、金属構造体３は、図３（Ｉ）に示すように、金属構造体３がそれ自体で存在していても良いし、図１（II）に示すように、金属構造体３が基体４の表面に形成されていても良い。金属構造体３がそれ自体で存在する場合は、金属構造体３が標的物質検出素子の支持体として機能する。
【００２２】
金属構造体３が基体４の表面に形成される場合、基体４の材料としては、ガラス基体、石英基体、ポリカーボネートやポリスチレンなどの樹脂基体、ＩＴＯ基体などを用いることができる。しかしながら、プラズモン共鳴現象を利用してシグナルを検出する場合、即ち光吸収を透過光として検出する場合、光吸収によって検出可能な程度の透過性を有していれば、いかなる材料も用いることが可能である。なお、基体４は、一つの層で構成されていても良く、複数の層で構成されていても良い。基体４が複数の層で構成されている場合は、最表面の層をクロムもしくはチタンなどからなる層とすることが好ましい。最表面の層をクロムもしくはチタンなどからなる層とすることで、基体４と金属構造体３との密着性が向上する。
【００２３】
また、基板４の表面に金属構造体３が複数形成される場合は、図４に示すように、１ｍｍ〜１０ｍｍ角の領域に金属構造体３を規則的に設けて、アレイ状とすることが好ましい。アレイ状とする場合、金属構造体３同士の間隔は、好ましくは５０ｎｍ〜２μｍ、より好ましくは１５０ｎｍ〜１μｍの範囲とする。間隔が狭すぎると、各金属構造体が有するプラズモン同士が相互作用し、空間的な電場の分布・強度に影響を及ぼして、センサ感度が低下してしまう場合がある。また、間隔が広すぎると、金属構造体の密度が低いことにより信号強度が弱くなり、特殊な光学系が必要となる場合がある。なお、一例として、基体の表面にアレイ状に形成されたリング形状の金属構造体のＳＥＭ画像を図１２に示す。
【００２４】
基体４の表面に複数の金属構造体３を形成する場合は、例えば、図５のような方法で形成することが可能である。
【００２５】
具体的には、以下のような方法である。
【００２６】
基体４（図５（Ａ））の表面に金属膜２０をスパッタ法あるいは蒸着法などを用いて成膜する（図５（Ｂ））。そして、前記金属膜２０の表面に電子線レジスト膜２１をスピンコートなどの方法により成膜する（図５（Ｃ））。前記電子線レジスト膜２１のうち金属構造体を形成する部分にのみ電子線描画装置で露光し、現像してレジストパターン２２を得る（図５（Ｄ））。その後、不要な金属膜をエッチングし（図５（Ｅ））、レジストパターン２２を除去して、アレイ状に配置した金属構造体３を得る（図５（Ｆ））。ここで、レジストを露光する装置としては電子線描画装置の他、集束イオンビーム加工装置、Ｘ線露光装置、ＥＵＶ露光装置、エキシマレーザー露光装置などを使用することもできる。
【００２７】
また、図６に示すように、モールド法により作製した微細な凹凸の基体４（図６（１））を用いて金属構造体３を作製することも可能である。この場合、基体４の凹凸を有する表面に、スパッタ法あるいは蒸着法などの方法により金属膜２０を成膜する（図６（２））。次に、基体の凹部のみに金属膜２０が残るよう研磨することで、基体の表面に形成された金属構造体３を得る（図６（３））。
【００２８】
また、金属膜２０が基体４の凹凸よりも薄い場合、図６の（２）の状態を経ることなく（３）の状態となり、金属構造体を得ることができる。この場合、金属構造体３の高さよりも基体４の凸部の高さの方が高くても良い。また、金属構造体３が基体４の凹凸部壁面に形成されていてもよい。なお、研磨する代わりに金属膜２０をドライエッチングによるエッチバックを利用して除去することも可能である。
【００２９】
次に、金属構造体３の表面にリンカー層５を形成する方法について説明する。
【００３０】
金属構造体３の表面にリンカー層５を形成する方法は、架橋構造を有さない重合体であって、側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体もしくは側鎖に官能基としてのアミノ基および官能基としてのカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体を含み、前記重合体が会合するｐＨより低いｐＨの溶液に、前記金属構造体を接触させることにより行うことができる。
【００３１】
リンカー層５は、側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂを有する重合体もしくは側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体であるため、重合体中に含まれるアミノ基およびカルボキシル基の割合が高い。したがって、リンカー層が有する多数のアミノ基が、金属構造体の表面に存在する金または銀を含む部分に結合するため、リンカー層が金属構造体に強固に固定される。なお、アミノ基は、アンモニア、もしくは第一級あるいは第二級アミンから水素を除去した基となることで、金および銀と結合することが一般的に知られている（特登録３４５２８３７、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｓｃｉ．ｊｐ／ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ＿ｐａｓｔ／２００３／ＢＫ２００３／Ａｂｓ／３／３Ｃｐ０７．ｐｄｆ）。また、リンカー層が有する多数のカルボキシル基により、多数の標的物質捕捉体をリンカー層に結合させることが可能となる。さらに、重合体は架橋構造を有さないため、厚さの薄いリンカー層を形成することが可能である。ここで、架橋構造とは線状（鎖状）重合体の側鎖同士が共有結合により結合していることである。
【００３２】
側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体としては、例えば、ジアリルアミン、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルプロピオンアミド、Ｎ−ビニルブチルアミド、Ｎ−ビニルバレルアミド、Ｎ−イソプロペニルホルムアミド、Ｎ−イソプロペニルアセトアミド、Ｎ−イソプロペニルプロピオンアミド、Ｎ−イソプロペニルブチルアミド、Ｎ−イソプロペニルバレルアミド、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどのアミノ基を含む構造と（繰り返し単位Ａに相当）とマレイン酸、コハク酸、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、ケイ皮酸、イタコン酸、フマル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸などのカルボン酸を含む構造体（繰り返し単位Ｂに相当）とを組み合わせた共重合体が挙げられる。それらの中でもジアリルアミンとマレイン酸の共重合体であることが好ましく、更には、一般式（１）に示される重合体であることが好ましい。
一般式（１）
【００３３】
【化１】
2010151521.tif 000003
【００３４】
（ｌ：ｍ＝０．０００４〜１３であり、ｌとｍは１以上の整数である。また、一般式（１）に示される共重合体の分子量は１０００〜２０００００である。）
【００３５】
また、側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体の例としては、ジアリルアミン、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルプロピオンアミド、Ｎ−ビニルブチルアミド、Ｎ−ビニルバレルアミド、Ｎ−イソプロペニルホルムアミド、Ｎ−イソプロペニルアセトアミド、Ｎ−イソプロペニルプロピオンアミド、Ｎ−イソプロペニルブチルアミド、Ｎ−イソプロペニルバレルアミド、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどのアミノ基を含む構造にカルボキシル基を導入した誘導体、マレイン酸、コハク酸、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、ケイ皮酸、イタコン酸、フマル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸などのカルボン酸を含む構造体にアミノ基を導入した誘導体、または上記アミノ基を含む構造とカルボキシル基を含む構造を結合させた誘導体などが挙げられる。
【００３６】
これらの重合体を含み、かつ重合体が会合するｐＨより低いｐＨの溶液と、金属構造体とを接触させることで、重合体が有するアミノ基へのプロトネーションが起こり、分子全体として電荷を有する重合体の割合が高くなる。すなわち、静電斥力により会合しにくくなる重合体の割合が高くなる。これにより、重合体が積層せずに金属構造体の表面に固定される。
【００３７】
一方、溶液のｐＨを重合体が会合するｐＨとした場合、分子全体として電荷を有さない重合体の割合が高くなり、重合体同士が会合して金属構造体の表面に積層されて固定されると考えられる。また、会合によりリンカー層の固定量にばらつきが生じると考えられる。
【００３８】
また、溶液のｐＨを重合体が会合するｐＨより高いｐＨとした場合、分子全体として電荷を有する重合体の割合は高く、重合体同士は会合しにくいものの、重合体が有するアミノ基へのプロトネーションが起こりにくいため、重合体の金もしくは銀からなる部分との結合が悪くなり、重合体を固定しにくくなると考えられる。
【００３９】
なお、架橋構造を有する重合体の架橋構造を還元などにより切断した後に上記溶液を作製することも可能である。また、重合体が架橋構造を有していないものの、重合体が有する疎水性基同士の相互作用などが起きる場合には、重合体を含む溶液に分散剤を含ませることが好ましい。
【００４０】
プラズモン共鳴を用いたセンサでは、標的物質が標的物質検出素子に結合したことによる金属構造体表面近傍の誘電率の変化に応答してシグナルが生じ、誘電率の変化が生じる場所が金属構造体の表面に近いほど大きなシグナルが生じる。したがって、重合体が含まれる溶液のｐＨを重合体が会合するｐＨより低いｐＨとすることで、重合体を積層させずに金属構造体の表面に固定することが可能となり、標的物質捕捉体を金属構造体の表面のより近くに固定することが可能となる。これにより高感度な標的物質検出素子が得られることになる。
【００４１】
なお、本発明において重合体が会合するｐＨとは、０．２５％の当該重合体溶液のｐＨを２〜９に変化させた際に得られる、６６０ｎｍにおける吸光度の最も高いｐＨと最も低いｐＨの吸光度との差が０．５以上であるスペクトルにおける、最も高い吸光度の１／１００より高い吸光度を有するｐＨと定義する。
【００４２】
次に、図２（ii）に示すように、形成したリンカー層５に標的物質捕捉体１を結合させる。
【００４３】
形成したリンカー層５を構成する重合体が有するカルボキシル基に標的物質を捕捉する標的物質捕捉体１を結合させる。リンカー層のカルボキシル基と標的物質捕捉体を結合させる方法としては、リンカー層のカルボキシル基と標的物質捕捉体のアミノ基を脱水縮合反応で結合させる方法などを用いることが可能である。標的物質捕捉体にアミノ基が存在しない場合は、スペーサなどを介してアミノ基を導入して誘導体化することにより、リンカー層に結合させることができる。脱水縮合反応はリンカー層に標的物質捕捉体と１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅなどのカップリング試薬を含んだ水溶液を滴下することなどによって行える。
【００４４】
このような標的物質捕捉体１と標的物質２の組み合わせとしては、抗原−抗体、酵素−基質、ＤＮＡ−ＤＮＡなどが挙げられる。
【００４５】
なお、金属構造体の表面には、リンカー層５の他に非特異的吸着防止層を形成しても良い。このような非特異的吸着防止層を形成することで金属構造体表面への夾雑物の非特異的吸着を軽減することができる。このような非特異的吸着防止層を構成する材料としては、スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、リン脂質、ポリエチレングリコール及びそれらの誘導体などを用いることが好ましい。なお、非特異的吸着防止層を形成する場合は、標的物質捕捉体をリンカー層に結合させた後に形成することが望ましい。
【００４６】
このような方法などにより、本発明の標的物質検出素子である、
金属構造体の表面の金または銀からなる部分に設けられたリンカー層と、
前記リンカー層に結合した標的物質捕捉体と、を有し、
前記リンカー層が架橋構造を有さない鎖状の重合体の非会合体からなり、
前記重合体が、
側鎖にアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体
もしくは
側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｃからなる重合体
からなることを特徴とする標的物質検出素子を得ることができる。なお、側鎖にアミノ基およびカルボキシル基を有する繰り返し単位Ａは、同じ側鎖にアミノ基とカルボキシル基を有する繰り返し単位であっても良いし、複数の側鎖を有し、前記複数の側鎖のうちの異なる側鎖に各々アミノ基とカルボキシル基が存在する繰り返し単位であっても良い。
【００４７】
また、図１は、本発明の標的物質検出素子の一例を示しており、本発明の一実施形態による標的物質２の検出素子は、金属（金属構造体３）の表面に設けられたリンカー層５と、リンカー層に結合した標的物質捕捉体１と、を有する。そして、リンカー層が鎖状の重合体からなり、重合体が、第１の側鎖が金属の表面に結合し、第２の側鎖が標的物質捕捉体に結合している繰り返し単位を有する重合体である。
【００４８】
ここで、重合体は、第１の側鎖に金属の表面に結合するための繰り返し単位Ａと、第２の側鎖に標的物質捕捉体に結合するための繰り返し単位Ｂと、を有する重合体であり得る。
【００４９】
もしくは、第１の側鎖に金属の表面に結合する部位と、第２の側鎖に標的物質捕捉体に結合する部位とを有する繰り返し単位Ｃからなる重合体、でありうる。
【００５０】
また上記の標的物質検出素子の製造方法は、金属の表面にリンカー層を形成する工程と、前記リンカー層に標的物質捕捉体を結合させる工程と、を有する。
【００５１】
そして、金属の表面にリンカー層を形成する工程が、鎖状の重合体であって、前記重合体が、第１の側鎖に金属の表面に結合する為の部位と、第２の側鎖に標的物質捕捉体に結合する為の部位とを有する重合体を含み、かつ前記重合体が会合するｐＨより低いｐＨを有する溶液と、前記金属とを接触させる工程を含む。
【００５２】
また、本発明において重合体の非会合体とは、会合していない重合体からなるものを示すものとする。
【００５３】
本発明によって得られる標的物質検出素子（図７における１０）は、反応ウェル６、流路７、インレット８、アウトレット９を有する基板１１と張り合わせて標的物質検出基板とすることができる。なお、標的物質検出素子１０と基板１１を張り合わせる場合は、基板１１の反応ウェル６や流路７が形成されている面と、標的物質検出素子１０のうち基体４の金属構造体が形成されている面とを貼りあわせて図７のような形状の標的物質検出基板として使用することができる。なお、図７において、１２は光源、１４は光検出装置、１９はコリメートレンズである。ここで、反応ウェル６とは、標的物質検出素子と検体を接触させるための領域（反応機構）を形成するもののことである。
【００５４】
また、基体４が基板１１の機能を有する場合は、基体４が反応ウェル、流路、インレットおよびアウトレットを有することが好ましいが、流路、インレット、アウトレットは基材と接触するセルなどによって形成されるものであっても良い。
【００５５】
反応ウェル７や流路１０を表面に有する基板１１は、基体４と同様、プラズモン共鳴現象を利用してシグナルを検出する場合、即ち光吸収を透過光として検出する場合、光吸収によって検出可能な程度の透過性を有する材料であることが好ましい。具体的には、いわゆるμＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）型の装置で用いられているポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなるプレートによって、作製することが好ましい。
なお、不活性ガスを充填済みの防湿・遮光性の袋にマイクロタイタープレートあるいはμＴＡＳチップをパッケージングし、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などを含有する検体希釈試薬や反応後の洗浄専用試薬、反応前の基準スペクトル測定用専用試薬などを同梱し、標的物質検出キットとして提供することもできる。
【００５６】
次に、本発明によって得られる標的物質検出素子を用いた標的物質の検出方法の一例について図８を用いて説明する。
【００５７】
図８において、６は反応ウェル、７は流路、８はインレット、９はアウトレット、１０は標的物質検出素子、１３は光源ユニット、１４は光検出装置、１５は送液ポンプ、１６は廃液リザーバ、１７は中央演算装置、１８は表示ユニットを示している。
【００５８】
送液ポンプ１５を用いて、インレット８、流路７を介して標的物質を含む検体（溶液）を反応ウェル６に満たし、検体と標的物質検出素子１０とを接触させて一定時間インキュベーションを行う。標的物質検出素子１０が有する金属構造体表面に設けた標的物質捕捉体に標的物質が特異的に結合すると、金属構造体表面でのプラズモン共鳴状態が変化する。
【００５９】
このような状態で、標的物質検出素子１０に、光学ユニット１３から発生する光を照射し、標的物質検出素子１０から出射した出射光を信号として光検出装置１４により取得することで、プラズモン共鳴状態の変化を検出シグナルとして検出することができる。なお、光検出装置１４によって測定する標的物質検出素子１０からの出射光は、反射光であっても透過光であっても良い。
【００６０】
そして、光検出装置１４で測定した結果を中央演算装置１７にて、あらかじめ既知濃度の標的物質含有溶液を用いて作成した検量用データと比較、演算し、標的物質の濃度を特定し、濃度などの測定結果を表示ユニット１８に表示する。
【００６１】
反応用ウェル６や流路７は、９６ウェルや３８４ウェルマイクロタイタープレートに代表される開放型のポリスチレン製のウェル、または、いわゆるμＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）型の装置で用いられているポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）基体によって、作製することができる。また、送液ポンプ１５としては、マイクロピストンポンプやシリンジポンプなどを用いる。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００６３】
（実施例１および比較例１、比較例２）
はじめに、側鎖に官能基としてのアミノ基を有する繰り返し単位Ａと側鎖に官能基としてのカルボキシル基を有する繰り返し単位Ｂとからなる重合体としてＰＡＳ―４１０を用い、重合体が会合するｐＨを測定した。
【００６４】
０．２５％濃度でＰＡＳ−４１０をリン酸緩衝液に分散させた溶液の吸光度を測定した。得られた吸光度のスペクトルを図１７の（ａ）に示す。また、ＰＡＳ―４１０の構造を下記一般式（２）に示す。
一般式（２）
【００６５】
【化２】
2010151521.tif 000004
【００６６】
（ｊ：ｋ＝１：１であり、ｊ、ｋ＝４４〜９０）
【００６７】
図１７（ａ）より、ｐＨ３．６において重合体を含む溶液の吸光度は最大値の２．０１８、ｐＨ２．０において吸光度は最小値の−０．００１となっており、最大値と最小値の差が０．５以上あり、ｐＨ３．２〜４．６で吸光度が０．０２０より大きいことがわかる。
【００６８】
したがって、重合体はｐＨ３．２から会合が起こり始め、ｐＨ４．６まで会合している。すなわち、重合体が会合するｐＨは、ｐＨ３．２〜４．６であることがわかった。
【００６９】
次に、標的物質検出素子を作製した。図９に用いた標的物質検出素子の構造を示す。図９において、１は標的物質捕捉体、３は金属構造体、５はリンカー層、６は反応ウェル、１２は光源、１４は光検出装置である。なお、反応ウェル６が標的物質検出素子の基体の機能を果たしている。また、光源１２としてタングステンランプ、光検出装置１４として分光光度計を用いた。
【００７０】
粒径１００ｎｍの金属構造体３である金コロイドを含む溶液（ブリティッシュ・バイオセル社製）に反応ウェル６であるアミノ化マイクロタイタープレート（コーニング社製）を１２時間浸漬させて、アミノ化マイクロタイタープレートの底面に金コロイドを分散させて固定した。固定させた金コロイドの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を図１０に示す。なお、金コロイドの吸収スペクトルは、５３０ｎｍ近傍にピーク波長を有していることを確認した。
【００７１】
次に、上記作製した金コロイドの表面にリンカー層５を形成した。
【００７２】
金コロイドの表面に濃度が０．２５％、ｐＨ２〜９に調製したＰＡＳ−４１０（日東紡績株式会社製）を含む溶液をスポッタで滴下し、金属構造体の表面にリンカー層を形成した。洗浄後、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（シグマアルドリッチ社製）水溶液と標的物質捕捉体である（＋）‐Ｂｉｏｔｉｎ‐（ＰＥＯ）４‐Ａｍｉｎｅ（モレキュラー・バイオサイエンス社製）水溶液の混合液をウェルに入れ、３７℃、１時間反応させた。終了後、さらに０．１％ウシ血清アルブミンリン酸緩衝液に２時間浸し、標的物質検出素子を作製した。
【００７３】
次に、以下の操作を行った。
（１）作製した標的物質検出素子に検体である１００μｇ／ｍｌのウサギ抗Ｂｉｏｔｉｎ抗体のリン酸緩衝液をピペットにより導入し、３７℃、２時間反応させた後、ウサギ抗Ｂｉｏｔｉｎ抗体を（＋）‐Ｂｉｏｔｉｎ‐（ＰＥＯ）４‐Ａｍｉｎｅと結合させた。
（２）ウェル中の検体を排出し、リン酸緩衝液をピペットにより導入し、反応ウェル内部を洗浄した。
（３）最後にリン酸緩衝液をウェルに導入して、標的物質検出素子の吸収スペクトルを測定した。
【００７４】
標的物質検出素子の吸収スペクトルは、図９に示すように、光源１２から発生させた光を標的物質検出素子に照射し、標的物質検出素子からの透過光を光検出装置１４を用いて検出した。得られた吸収スペクトルのシフト量を縦軸に、標的物質検出素子作製時のＰＡＳ−４１０を含む溶液のｐＨを横軸にしたグラフを図１７の（ｂ）に示す。
【００７５】
なお、ＰＡＳ−４１０の溶液がｐＨ３．２未満である場合が実施例１であり、ｐＨが３．２〜４．６である場合が比較例１であり、ｐＨが４．６より大きい場合が比較例２である。
【００７６】
実施例１においては、図１７の（ａ）に示すように吸光度が０．０２０以下であり、図１７の（ｂ）に示すように、標的物質検出素子のピークシフト量が大きいことがわかる。これは、重合体が有するアミノ基へのプロトネーションが起こり、重合体同士が静電斥力により反発し、重合体が積層せずに金属構造体の表面に固定されることによるものと考えられる。
【００７７】
比較例２においては、図１７の（ａ）に示すように、吸光度が０．０２０以下であり、会合はしていないと考えられるが、図１７の（ｂ）に示すように、標的物質検出素子のピークシフト量が小さい。これは、前述したように、重合体が有するアミノ基へのプロトネーションが起こりにくくなることにより、重合体が金属構造体の表面の金もしくは銀からなる部分に固定されにくくなることによるものであると考えられる。また、重合体が固定されにくいことより、複数回の洗浄を行った場合に、重合体が剥がれることでピークシフト量がより小さくなるものと考えられる。
【００７８】
さらに、比較例１においては、図１７の（ａ）に示すように、吸光度が０．０２０より大きく、重合体が会合していることがわかる。その中でも、ｐＨが３．２〜３．６においては、ｐＨが上がるに連れて吸光度が上がっている。また、ｐＨが上がるに連れて、標的物質検出素子のピークシフト量が下がっている。したがって、重合体を含む溶液のｐＨが３．２〜３．６においては、ｐＨが上がるに連れて、会合している重合体の割合が増え、金属構造体の表面に重合体が積層されていき、ｐＨ３．６が極大値であり会合のピークに達していると考えられる。また、ｐＨが３．６〜４．６においては図１７（ａ）に示すようにｐＨが上がるに連れて標的物質検出素子のピークシフトが多少上がっている。これは、ｐＨ３．６〜４．６においては、プロトネーションされていないアミノ基が増えることよりもｐＨが上がるに連れて会合している重合体の割合が低くなることの影響をより強く受けているからと考えられる。
【００７９】
（実施例２）
リンカー層を形成する際に、ｐＨ２〜９までの溶液とする代わりにｐＨ２の溶液を用いたこと、および標的物質捕捉体をリンカー層に結合させた後に１％ウシ血清アルブミンリン酸緩衝液に２時間浸すことに加えて、０．０２５％スキムミルク緩衝液に２時間浸した以外は実施例１と同様の方法で標的物質検出素子を作製した。
【００８０】
得られた吸収スペクトルについて反応前と反応後を比較すると、図１１に示すように、特異的な抗原抗体反応によって標的物質が標的物質検出素子表面に結合することで、吸収スペクトルが長波長側へシフトした。また、吸収スペクトルのピーク強度、あるいはピーク波長のシフト量と検体中の抗Ｂｉｏｔｉｎ抗体濃度の相関は、あらかじめ既知の抗Ｂｉｏｔｉｎ抗体コントロール溶液により求められるため、上記操作によって濃度未知の検体の抗Ｂｉｏｔｉｎ抗体濃度を求めることも可能である。
【００８１】
（比較例３、比較例４）
比較例３、比較例４では、実施例１とは異なるリンカー層を用いた場合の標的物質検出素子のスペクトルシフト量を示す。
【００８２】
リンカー層として、比較例３では架橋構造を有する重合体であるウシ血清アルブミンを用いたこと、比較例４ではアミノ基を有する繰り返し単位Ａを有さないカルボキシメチルデキストランを用いたこと、比較例３および比較例４でリンカー層を形成する際にｐＨ７．６の溶液を用いたこと以外は実施例２と同様の方法により標的物質検出素子を作製した。
【００８３】
比較例３、比較例４で作製した標的物質検出素子のウェルに、検体である１ｍｇ／ｍｌのウサギ抗Ｂｉｏｔｉｎ抗体リン酸緩衝液を導入し、３７℃、２時間反応させた後、標的物質検出素子の吸収スペクトルのシフト量を得た。
【００８４】
実施例２、比較例３、比較例４の吸収スペクトルのシフト量を図１３に示す。実施例２の標的物質検出素子を用いた際の吸収スペクトルのシフト量は、比較例３に対しては、３．２倍、比較例４に対しては１．６倍であった。
【００８５】
（実施例３）
本実施例においては、検体が実施例１および２のような精製されたものだけでなく、クルードなヒト血清であっても本発明によって得られる標的物質検出素子によって検出可能であることを示す。
【００８６】
本実施例では、実施例２の標的物質検出素子において、標的物質捕捉体としてアミノ化血液型Ａ抗原（デキストラ・ラボラトリ社製）を用いた以外は実施例２と同様な方法で標的物質検出素子を作製した。
【００８７】
また、本実施例で用いた検体１と検体２はいずれもＯ型の異なる人から採血・分離したヒト血清であり、ヒト血清中に抗血液Ａ型抗体、抗血液Ｂ型抗体の両方を含むものであった。
【００８８】
次に、以下の測定操作を行った。
（１）０．２５％ＰＡＳ−４１０、０．０１％ＢＳＡ、０．０１％スキムミルクを含むリン酸緩衝液を検体希釈専用試薬とし、検体と検体希釈専用試薬を体積比率１：２の比率で混合、攪拌し、検体を希釈した。
（２）作製した標的物質検出素子のウェルに上記の方法で希釈した検体をピペットにより導入し、抗血液Ａ型抗体を標的物質検出素子が有する血液型Ａ抗原に捕捉させた。
（３）ウェル内の検体液を排出し、リン酸緩衝液をピペットにより導入し、反応ウェル内部を洗浄した。
【００８９】
反応前後の金コロイドの吸収スペクトルのシフト量を図１４、図１５に示す。検体１においては、検体希釈専用試薬を用いない場合に対して、非特異吸着によるノイズが０．４倍、特異的な結合反応による信号量が１．０倍となり、検体２においては、非特異吸着によるノイズが０．５倍、特異的な結合反応による信号量が１．５倍となった。
【００９０】
したがって、クルードなヒト血清も測定が可能であり、かつ検体を上記検体希釈溶液で希釈する場合は、リン酸緩衝液で希釈する場合よりも更に好ましく、非特異吸着によるノイズを同等もしくは減少させ、特異的な結合反応による信号量を同等もしくは増加させることができることがわかった。
【００９１】
（実施例４）
本実施例においては、本発明によって得られる標的物質検出素子により定量分析が可能であることを示す。
【００９２】
本実施例は、実施例２で用いた検出装置において、実施例２と同様の操作によりアミノ化血液型Ａ抗原（ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ  ＳＹＮＴＨＳＩＳ社製）を標的物質捕捉体として固定し、さらに０．０１％ウシ血清アルブミンリン酸緩衝液に２時間浸し、次に０．０２５％スキムミルク緩衝液に２時間浸して、標的物質検出素子を得た。また、同様の操作によりアミノ化血液型Ｂ抗原（ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ  ＳＹＮＴＨＳＩＳ社製）を固定し、抗血液Ｂ型抗体の検出素子を得た。
【００９３】
検体１（実施例３と同様の検体）をリン酸緩衝液により２倍、８倍に希釈した検体を調製し、抗血液Ａ型抗体検出用素子および抗血液Ｂ型抗体検出用素子と、実施例２と同じ組成の検体希釈専用試薬を用い、実施例２と同様の測定操作により検体中に含まれる抗血液Ａ型抗体および抗血液Ｂ抗体を各々測定した。
【００９４】
結果を図１６に示す。なお、（ｉ）が抗血液Ａ型抗体を測定したデータであり、（ii）が抗血液Ｂ型抗体を測定したデータである。
【００９５】
これらの結果から、希釈倍率に応じたシグナル変化が起こり、検体中に含まれる抗血液Ａ型抗体と抗血液Ｂ型抗体を定量的に検出可能であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明の標的物質検出素子の一例を示す模式図である。
【図２】金属構造体とリンカー層および標的物質検出素子の一例を表す模式図である。
【図３】金属構造体の一例の状態を示す模式図である。
【図４】基体表面に形成されたアレイ状の金属構造体の一例を示す模式図である。
【図５】基体表面に金属構造体を形成する方法の一例を示す模式図である。
【図６】基体表面に金属構造体を形成する方法の一例を示す模式図である。
【図７】標的物質検出装置の一例を示す模式図である。
【図８】標的物質検出装置の一例を示す模式図である。
【図９】実施例１の標的物質検出装置を示す模式図である。
【図１０】実施例１において基体表面に形成した金属構造体のＳＥＭ画像である。
【図１１】実施例２における検体接触前後の標的物質検出素子の光特性の変化を示す図である。
【図１２】基体表面にアレイ状に形成された金属構造体のＳＥＭ画像である。
【図１３】実施例２、比較例３、比較例４の標的物質検出素子のシグナルを示す図である。
【図１４】実施例３においてリン酸緩衝液と検体希釈専用試薬を用いた際の非特異的吸着によるノイズを示すデータである。
【図１５】実施例３においてリン酸緩衝液と検体希釈専用試薬を用いた際のシグナルを示すデータである。
【図１６】実施例４において（ｉ）検体１に含まれる抗血液Ａ型抗体を測定したデータ（ii）検体１に含まれる抗血液型Ｂ型抗体量を測定したデータである。
【図１７】（ａ）０．２５％ＰＡＳ−４１０の６６０ｎｍにおける吸光度とｐＨの関係を示すデータ、（ｂ）ｐＨ２．０〜９．０の０．２５％ＰＡＳ−４１０を含む溶液を用いてリンカー層を形成したときの標的物質検出素子のシグナルを示すデータである。
【符号の説明】
【００９７】
１  標的物質捕捉体
２  標的物質
３  金属構造体
４  基体
５  リンカー層
６  反応ウェル
７  流路
８  インレット
９  アウトレット
１０  標的物質検出素子
１１  基板
１２  光源
１３  光源ユニット
１４  光検出装置
１５  送液ポンプ
１６  廃液リザーバ
１７  中央演算装置
１８  表示ユニット
１９  コリメートレンズ
２０  金属膜
２１  電子線レジスト膜
２２  レジストパターン
【図１】
2010151521.tif 000007
【図２】
2010151521.tif 000008
【図３】
2010151521.tif 000009
【図４】
2010151521.tif 000010
【図５】
2010151521.tif 000011
【図６】
2010151521.tif 000012
【図７】
2010151521.tif 000013
【図８】
2010151521.tif 000014
【図９】
2010151521.tif 000015
【図１０】
2010151521.tif 000016
【図１１】
2010151521.tif 000017
【図１２】
2010151521.tif 000018
【図１３】
2010151521.tif 000019
【図１４】
2010151521.tif 000020
【図１５】
2010151521.tif 000021
【図１６】
2010151521.tif 000022
【図１７】
2010151521.tif 000023