(57)【要約】【課題】特異的に結合する対の物質を利用した凝集法において、低濃度の試料についてもより高感度かつ定量性の高い測定を可能とする。【解決手段】特異的に結合する対の物質のうち一方の物質Ｂにより表面を修飾された修飾担体Ｃと、他方の物質Ａである被検出物質、および修飾担体Ｃと被検出物質Ａとを分散させる分散液Ｄを試料セル１０に供給し、分散液Ｄ中に超音波Ｕを照射して修飾担体Ｃおよび被検出物質Ａによる凝集反応を促進せしめ、被検出物質Ａを測定する凝集反応を利用した測定方法において、超音波に基づいて分散液中に定在波Ｕを形成して、修飾担体Ｃおよび／または被検出物質Ａを定在波Ｕの節の位置に捕捉する。【選択図】図１
2010223756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的に結合する対の物質のうち一方の物質と該一方の物質により表面を修飾された担体とからなる修飾担体、および前記対の物質のうち他方の物質である被検出物質による凝集反応を利用して、被検出物質を測定する測定装置であって、前記修飾担体と前記被検出物質とを分散させる分散液を収容する試料セルと、凝集反応を促進させるために前記分散液中に超音波を照射する超音波照射手段とを備える測定装置において、
前記超音波照射手段により照射される超音波に基づいて前記分散液中に定在波を形成して、前記修飾担体および／または前記被検出物質が前記定在波の節の位置に捕捉されるようにする定在波形成手段を備えることを特徴とする測定装置。
【請求項２】
前記定在波形成手段が、前記試料セルの形状と前記超音波の波長とを整合させることにより、前記定在波を形成するものであることを特徴とする請求項１に記載の測定装置。
【請求項３】
前記定在波形成手段が、前記超音波の波長を調整することにより、前記試料セルの形状と前記超音波の波長とを整合させるものであることを特徴とする請求項２に記載の測定装置。
【請求項４】
前記定在波形成手段が、前記試料セルの形状を調整することにより、前記試料セルの形状と前記超音波の波長とを整合させるものであることを特徴とする請求項２または３に記載の測定装置。
【請求項５】
前記定在波形成手段が、独立した複数の超音波振動子のそれぞれから異なる方向へ照射される前記超音波を重ね合わせることにより、前記定在波を形成するものであることを特徴とする請求項１に記載の測定装置。
【請求項６】
前記定在波形成手段が、２つの前記超音波振動子を対向させて駆動させることにより、前記定在波を形成するものであることを特徴とする請求項５に記載の測定装置。
【請求項７】
特異的に結合する対の物質のうち一方の物質と該一方の物質により表面を修飾された担体とからなる修飾担体、前記対の物質のうち他方の物質である被検出物質、および前記修飾担体と前記被検出物質とを分散させる分散液を試料セルに供給し、前記分散液中に超音波を照射して前記修飾担体および前記被検出物質による凝集反応を促進せしめ前記被検出物質を測定する、凝集反応を利用した測定方法において、
前記超音波に基づいて前記分散液中に定在波を形成して、前記修飾担体および／または前記被検出物質を前記定在波の節の位置に捕捉することを特徴とする測定方法。
【請求項８】
前記試料セルの形状と前記超音波の波長とを整合させることにより、前記定在波を形成することを特徴とする請求項７に記載の測定方法。
【請求項９】
前記超音波の波長を調整することにより、前記試料セルの形状と前記超音波の波長とを整合させることを特徴とする請求項８に記載の測定方法。
【請求項１０】
前記試料セルの形状を調整することにより、前記試料セルの形状と前記超音波の波長とを整合させることを特徴とする請求項８または９に記載の測定方法。
【請求項１１】
独立した複数の超音波振動子のそれぞれから異なる方向へ照射される前記超音波を重ね合わせることにより、前記定在波を形成することを特徴とする請求項７に記載の測定方法。
【請求項１２】
２つの前記超音波振動子を対向させて駆動させることにより、前記定在波を形成することを特徴とする請求項１１に記載の測定方法。
【請求項１３】
前記超音波の波長を変化させることにより、前記節の位置を中心に形成される捕捉空間の大きさを変化させることを特徴とする請求項７から１２いずれかに記載の測定方法。
【請求項１４】
前記定在波を形成した状態で捕捉力が働く方向に沿って前記分散液を流動させて、凝集反応の結果形成される前記修飾担体および前記被検出物質の凝集体の大きさにより該凝集体を分離することを特徴とする請求項７から１３いずれかに記載の測定方法。
【請求項１５】
前記試料セルに測定光を照射し、該測定光の透過光量に基づいて凝集反応を定量的に測定することを特徴とする請求項７から１４いずれかに記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的に結合する対の物質を利用した凝集法に関するものであり、特に反応を促進させるために超音波を利用した凝集法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年臨床検査の分野において、試料中の被検出物質の定量法として、抗原抗体反応等を利用した免疫凝集法が広く行われている。一般的に免疫凝集法とは、担体（例えばラテックス粒子や赤血球等）に、特異的に結合する対の物質の一方（例えば抗体）を修飾し、特異的に結合する対の物質の他方（例えば抗原）と上記修飾された修飾担体とを混合することにより、修飾担体を凝集させる方法である。このような免疫凝集法として、対象とする生体成分の種類によって多種、多様のものがある。具体的には、抗原−抗体反応或いはタンパク質−補因子反応を利用したラジオイムノアッセイ（Radio immunoassay：ＲＩＡ）法、酵素免疫測定法（Enzyme Immunoassay：ＥＩＡ）法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法などが挙げられる。その中でも、ラテックス凝集法や金コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないホモジニアス系での測定が可能なため、測定の自動化や短時間での測定に適している。
【０００３】
さらに、上記のような特異的に結合する対の物質を利用した免疫凝集法と比濁法を組み合わせることにより、被検出物質の定量的な検出も可能となる。比濁法とは、粒子の凝集によって見かけの粒子径が変化することを利用し、吸光度或いは濁度の変化を光学的に検出する方法である。このような方法は、測定方法が簡単で、ラジオアイソトープ法のような特殊な設備や専用分析装置を必要としないので広く用いられている。
【０００４】
一般的に免疫凝集法は、特異的に結合する対の物質の衝突頻度によって反応速度が律速されている。そこで、特許文献１および２には、反応系に対して超音波を照射することでより反応速度を向上させる方法が開示されている。特に、特許文献２では、振幅変調された超音波を照射し振動状態を乱して、分子運動を整合させないことにより、測定の再現性を向上できると教示している。また、特許文献３には、反応系に対して微小電圧を短時間印加することでより反応速度を向上させる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−５４３１５号公報
【特許文献２】特開平１０−２６７９２７号公報
【特許文献３】特開平９−１０１３０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１および２のような方法では、いくら超音波を照射したとしても反応物質を単に並進運動させるだけであるため、反応物質自体の濃度が低い場合には、反応速度が向上しにくいという問題がある。また、単に進行する超音波でランダムに撹拌する場合には、反応物質を伸張する力および圧縮する力が連続的に働いて反応物質が損傷するという問題もある。一方、特許文献３のような方法では、免疫診断に用いる生体物質（血液、尿）が一般的に電気応答性の高い塩を含むため、反応物質の電気分解や電極への吸着等の問題が生じる恐れがある。
【０００７】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、特異的に結合する対の物質を利用した凝集法において、低濃度の試料についても速い反応速度を実現しかつより定量性の高い測定を可能とする測定装置および測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本出願人は、分散液中に定在波を形成した場合に反応物質（修飾担体および／または被検出物質）に対して定在波の節の位置に向かって捕捉力が働くことに注目し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係る凝集反応を利用した測定装置は、
特異的に結合する対の物質のうち一方の物質とこの一方の物質により表面を修飾された担体とからなる修飾担体、および対の物質のうち他方の物質である被検出物質による凝集反応を利用して、被検出物質を測定する測定装置であって、修飾担体と被検出物質とを分散させる分散液を収容する試料セルと、凝集反応を促進させるために分散液中に超音波を照射する超音波照射手段とを備える測定装置において、
超音波照射手段により照射される超音波に基づいて分散液中に定在波を形成して、修飾担体および／または被検出物質が定在波の節の位置に捕捉されるようにする定在波形成手段を備えることを特徴とするものである。
【００１０】
ここで、「特異的に結合する対の物質」とは、抗原および抗体、もしくはタンパク質および補因子等のように、一方の物質と他方の物質とが特異的に認識し合って結合する関係にある対の物質を意味するものとする。
【００１１】
「凝集反応」とは、凝集原と凝集素との特異的な結合により凝集体（凝集塊）を形成する反応を意味するものとする。例えば、特異的に結合する対の物質を抗原およびこれに対する抗体とした場合には、抗原が凝集原となり、抗体が修飾された修飾担体が凝集素となる。
【００１２】
そして、本発明に係る測定装置において、定在波形成手段は、試料セルの形状と超音波の波長とを整合させることにより、定在波を形成するものであることが好ましい。この場合、定在波形成手段は、超音波の波長を調整することにより、試料セルの形状と超音波の波長とを整合させるものであることが好ましく、或いは試料セルの形状を調整することにより、試料セルの形状と超音波の波長とを整合させるものであることが好ましい。
【００１３】
ここで、「試料セルの形状と超音波の波長とを整合させる」とは、照射した超音波が試料セルの形状に共鳴して定在波を形成するように、試料セルの形状を調整することおよび／または超音波の波長を調整することを意味するものとする。
【００１４】
また、定在波形成手段は、独立した複数の超音波振動子のそれぞれから異なる方向へ照射される超音波を重ね合わせることにより、定在波を形成するものであることが好ましい。この場合、２つの超音波振動子を対向させて駆動させることにより、定在波を形成するものとすることができる。
【００１５】
また、一つの超音波振動子から照射される超音波を対向する反射板に照射して、超音波の反射波との重ね合わせにより、定在波を形成するものであってもよい。反射板は金属や樹脂などの材質が用いられ、媒質と音響インピーダンスが異なっていれば特に限定されない。反射板の形状は超音波の進行方向に対して垂直な平面基板だけでなく、超音波の入射波と交差するように反射波を発生する基板であれば、Ｌ字型やＵ字型などを用いることができ、特に形状に限定はない。
【００１６】
さらに、本発明に係る凝集反応を利用した測定方法は、
特異的に結合する対の物質のうち一方の物質とこの一方の物質により表面を修飾された担体とからなる修飾担体、特異的に結合する対の物質のうち他方の物質である被検出物質、および修飾担体と被検出物質とを分散させる分散液を試料セルに供給し、分散液中に超音波を照射して修飾担体および被検出物質による凝集反応を促進せしめ被検出物質を測定する、凝集反応を利用した測定方法において、
超音波に基づいて分散液中に定在波を形成して、修飾担体および／または被検出物質を定在波の節の位置に捕捉することを特徴とするものである。
【００１７】
そして、本発明に係る測定方法において、
試料セルの形状と超音波の波長とを整合させることにより、定在波を形成することが好ましい。この場合、超音波の波長を調整することにより、試料セルの形状と超音波の波長とを整合させることが好ましく、或いは試料セルの形状を調整することにより、試料セルの形状と超音波の波長とを整合させることが好ましい。
【００１８】
また、独立した複数の超音波振動子のそれぞれから異なる方向へ照射される超音波を重ね合わせることにより、定在波を形成することが好ましい。この場合、２つの超音波振動子を対向させて駆動させることにより、定在波を形成することができる。
【００１９】
また、一つの超音波振動子から照射される超音波を対向する反射板に照射して、超音波の反射波との重ね合わせにより、定在波を形成するものであってもよい。反射板は金属や樹脂などの材質が用いられ、媒質と音響インピーダンスが異なっていれば特に限定されない。反射板の形状は超音波の進行方向に対して垂直な平面基板だけでなく、超音波の入射波と交差するように反射波を発生する基板であれば、Ｌ字型やＵ字型などを用いることができ、特に形状に限定はない。
【００２０】
さらに、超音波の波長を変化させることにより、節の位置を中心に形成される捕捉空間の大きさを変化させることが好ましい。
【００２１】
ここで、「捕捉空間」とは、定在波の節の位置を中心として形成される空間であって、定在波中に存在する物質に対して働く捕捉力によって、ある特定の節に上記物質を捕捉することができる範囲を意味するものとする。捕捉力とは、音響放射圧ポテンシャルに基づき、直近の節近傍に物質を集めるように定在波中の物質に働く力である。つまり、捕捉空間とは、捕捉力が発生する基となる音響放射圧ポテンシャルについて、ある極大値に対応する位置から隣の極大値に対応する位置までの範囲ということもできる。
【００２２】
そして、定在波を形成した状態で捕捉力が働く方向に沿って分散液を流動させて、凝集反応の結果形成される修飾担体および被検出物質の凝集体の大きさにより凝集体を分離することが好ましい。つまり、上記のように分散液を流動させて、凝集体のうち所定の体積値よりも小さい体積の凝集体を定在波が形成されている領域から排除することが好ましい。ここで、所定の体積値は、流速（流動の速さ）を調整することにより適宜設定することができる。
【００２３】
ここで、「凝集体」とは、凝集原と凝集素とが凝集することによって形成される塊を意味するものとする。
【００２４】
試料セルに測定光を照射し、測定光の透過光量に基づいて凝集反応を定量的に測定することが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る凝集反応を利用した測定装置および測定方法は、凝集反応を起こさせる試料セル内の分散液中に超音波の定在波を形成して、定在波の節の位置に形成される数ｕｍ〜数百ｕｍの捕捉空間に反応物質（修飾担体および／または被検出物質）を捕捉している。したがって、分散液に対する反応物質の濃度が低い場合でも、反応物質の衝突頻度を上げることができるため、凝集反応の反応速度を効率よく向上させることができる。また、反応物質が節に近づくにつれ捕捉力は減少するため、節近傍に捕捉された反応物質には捕捉力はほとんど働かない。これにより、単に進行する超音波を照射する従来法に比して、反応物質の損傷を低減することができる。この結果、凝集法において、低濃度の試料についても測定の短時間化を実現しかつより定量性の高い測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第１の実施形態に係る測定装置を示す概略断面図
【図２】定在波、音響放射圧ポテンシャルおよび捕捉力の関係を示す概略図
【図３】第２の実施形態に係る測定装置を示す概略断面図
【図４】第３の実施形態に係る測定装置を示す概略断面図
【図５】第４の実施形態に係る測定装置を示す概略断面図
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２８】
「測定装置および測定方法」
＜測定装置の第１の実施形態＞
まず、本実施形態に係る測定装置１の構成について説明する。図１は、本実施形態に係る測定装置１の全体構成を示す概略断面図である。本実施形態は例えば、抗原抗体反応を利用したいわゆるラテックス凝集比濁法によって抗原（被検出物質）を測定する場合について説明する。ここで、各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００２９】
図１に示すように、測定装置１は、試料Ｓ（反応物質を含む分散液Ｄ）を供給する試料セル１０と、試料セル１０の側面１１に取り付けられた超音波振動子１４と、超音波振動子１４によって照射される超音波Ｕの周波数（波長）を制御する駆動装置１５と、試料セル１０の透明な底面１２から測定光Ｌｏを入射する光源１６と、凝集体Ｇを含みうる試料Ｓ中を透過した測定光Ｌｏである透過光Ｌｔを検出する光検出器１８とを備えている。
【００３０】
試料セル１０は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。試料セル１０は樹脂から形成されたものが好ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより好ましい。また、本実施形態のような場合には、試料セル１０は、測定光Ｌｏを入射する底面のみ透明材料から形成された構成としてもよい。
【００３１】
超音波振動子１４およびその駆動装置１５は、本実施形態において、試料セル１０の形状と超音波Ｕの波長とを整合させ、試料セル１０中に定在波を形成するために、超音波Ｕの周波数（波長）を調整可能となるように構成されている。超音波振動子は、圧電セラミクス、またはフッ化ポリビニルピロリドンのような高分子フィルムのような圧電素子であり、例えばＰＺＴ−Ｐｂ（Ｚｒ・Ｔｉ）Ｏ３ 系 ・ソフト材Ｃ−８２（商品名、株式会社富士セラミックス）を用いることが好ましい。また超音波振動子は、単振動子であってもアレイ振動子であってもよい。共振周波数は、１００ｋＨｚ〜１００ＭＨｚが好ましく、特に３ＭＨｚ程度が好ましい。また、超音波振動子は必ずしも共振周波数で駆動しなくても良く、共振周波数からずれた非共振周波数で駆動してもよい。
【００３２】
一方、駆動装置は、電源、超音波用の発振回路、変調回路および出力回路等を有する個別のユニットとすることもできる。また、駆動装置は、必要に応じて超音波Ｕの波形を自由に加工し得る回路等、付加的な回路を設けることもできる。例えば、駆動装置は、株式会社エヌエフ回路設計ブロック製のＷＦ１９７４（商品名）を用いることができる。駆動電圧の波形は正弦波、方形波、三角波、ランプ波など任意の波形を用いることができる。本実施形態において、超音波振動子１４の駆動装置１５、および超音波振動子１４が取り付けられた側面に対向する側面１１が、定在波形成手段に相当する。
【００３３】
光源１６は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、測定の条件或いは目的に応じて適宜選択することができる。また必要に応じて、光源１６は、測定光Ｌｏを試料セル１０に入射するために、測定光Ｌｏを導光するためのミラーやレンズ等の導光系等を適宜組み合わせることができる。測定光Ｌｏは、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、測定の条件或いは目的に応じて適宜選択することができる。使用する測定光Ｌｏの波長は例えば８００ｎｍ程度の近赤外光である。
【００３４】
光検出器１８は、試料Ｓを透過した測定光Ｌｏである透過光Ｌｔを定量的に測定するものであり、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができる。しかしながら、これに限らず測定の条件或いは目的に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器１８は、測定条件に応じてフィルタや分光器等の分光手段、さらにミラー等の光学系と組み合わせて用いることができる。
【００３５】
そして、図１を用いて本実施形態に係る測定方法について説明する。
測定方法は以下の工程によって行われる。まず、抗原Ａと、この抗原Ａに対する抗体Ｂによって表面を修飾された修飾ラテックス粒子(修飾担体)Ｃと、これらを分散させる分散液Ｄとを試料セル１０に供給する。そして、超音波振動子１４を駆動させて試料セル１０内に超音波Ｕを照射し、照射した超音波と対向する側面１１から反射した超音波との干渉により、試料セル１０内の分散液Ｄ中に定在波を形成する。このとき、試料セル１０の形状と超音波Ｕの波長とが整合するように、超音波の周波数（波長）を駆動装置１５によって調整する。定在波が形成されると、定在波中に存在する物質に対して節の位置へ移動させるような捕捉力が生じる。これにより、抗原Ａおよび／または修飾ラテックス粒子Ｃが節の位置近傍の捕捉空間に捕捉されると共に、抗原抗体反応によって抗原Ａと修飾ラテックス粒子Ｃとが凝集体Ｇを形成する。その後、測定光Ｌｏを試料セル１０の底面１２から入射し、その透過光Ｌｔを光検出器１８によって検出し、測定光Ｌｏと透過光Ｌｔの強度比（或いは、透過光量や吸収光量等）から試料Ｓ中の抗原Ａの濃度を測定する。
【００３６】
上記の測定方法は、以下に示す凝集比濁法、特にラテックス凝集比濁法の原理を用いている。抗原抗体反応により凝集体が形成されると光散乱により濁度が増加する。その結果透過光Ｌｔは減少する。したがって、凝集比濁法は、測定光Ｌｏと透過光Ｌｔの強度比（或いは、透過光量や吸収光量等）から試料Ｓ中の抗原の濃度を測定する方法である。凝集比濁法は通常の分光光度計で短時間に測定可能である。凝集体が形成されて透過光が減少するのを経時的に測定し、その変化を検量線と比較して濃度を測定することにより抗原過剰による反応の低下をチェックすることができる。ラテックス凝集比濁法は、抗原或いは抗体で表面を修飾されたラテックス粒子が抗原抗体反応により凝集を起こし、透過光を測定する方法である。修飾されたラテックス粒子（修飾担体）が分散状態にある場合、粒子系よりはるかに長い波長の光は、修飾担体の存在にあまり影響を受けずに試料を透過する。なお、測定には、近赤外光と白色光を用いる方法がある。近赤外光を使用する場合には、被検出物質の着色や乳濁に影響されない測定が可能となる。ラテックス粒子（担体）の粒径は０．０１〜１０ｕｍが好ましく、０．１〜１ｕｍが特に好ましい。粒径が小さくなると、凝集前の単一粒子と凝集塊のサイズが検出波長に比べて小さいので、両者の区別が付きにくく、測定精度が悪化する。粒径が大きくなると、沈殿や自己凝集しやすくなり、測定することが困難になる。
【００３７】
ポリスチレンラテックス粒子への抗体修飾方法および修飾ラテックス粒子の分散方法は、例えば以下に示すものである。
ｓｔｅｐ１：まず、ｐＨ９．６の０．０１３４Ｍ  ＥＤＴＡ・０．２４Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅバッファを用いて、ラテックス粒子（φ６４０−７５０ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、商品名Ｋ１−０７０、Ｅｓｔａｐｏｒ社）を希釈し、固形分濃度３ｗｔ％のラテックス粒子溶液を５００ｕＬ作製する。
ｓｔｅｐ２：上記のラテックス溶液にＥＤＴＡバッファおよび、抗ＣＲＰモノクローナル抗体（商品名Ａｎｔｉ−ｈ  ＣＲＰ６４０７ＳＰＴＮ−５、ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて抗体終濃度１．０ｍｇ／ｍＬの溶液とし、攪拌する。
ｓｔｅｐ３：次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（商品名０１−６２−００１１、和光純薬工業株式会社）水溶液を１／１００量加え室温で攪拌する。これによりラテックス粒子への抗体の修飾がなされる。
ｓｔｅｐ４：さらに、２ｍｏｌ／Ｌ ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を５／１００量添加し撹拌した後、遠心分離にて、修飾ラテックス粒子を沈降させる。
ｓｔｅｐ５：最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーおよびソニケーターにより修飾ラテックス粒子を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００ｕＬ加え、修飾ラテックス粒子を再分散させて３ｗｔ％分散液とする。
【００３８】
ここで、このポリスチレンラテックス粒子と特異的に結合し、凝集塊を形成する他方の物質として、ＣＲＰ抗原（Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｈｕｍａｎ，  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ｒＣＲＰ）、商品名３０９−５１１９１、和光純薬工業株式会社）などを用いることができる。
【００３９】
また、ポリスチレン粒子等のラテックス粒子に限らず、担体として金属微粒子等を用いることもできる。特に、金コロイド粒子の大きさは通常５ｎｍ〜１００ｎｍであり、これは一般的なラテックス粒子よりも小さいため、より微量物質の測定に利用可能である（特許文献１および２）。
【００４０】
試料セル１０（試料セルの収容部の形状）と超音波Ｕとが共鳴していない場合、つまり例えば図１において試料セル１０の幅Ｗと超音波Ｕの波長λとが整合していない場合には、定在波が形成されないため、これらを整合させる必要がある。そこで、本実施形態では、定在波を形成する際に超音波の波長を調整することにより、試料セルの形状と超音波の波長とを整合させている。定在波が形成されると、定在波中に存在する物質に対して節の位置へ移動させるような捕捉力が生じる。この捕捉力は、図２に示すように直近の節の方向に働く力であり、その大きさＦは、下記式（１）に示すように物質Ｍの体積Ｖおよび音波周波数ｆ等に比例する。
【００４１】
式（１）：
【数１】
2010223756.tif 000003
ここで、Ｆは捕捉力の大きさ、ｚは図２中の定在波端部からの距離、ρ０は媒質の密度、ｃ０は媒質における音速、Ｖは物質Ｍの体積、Ｐ０は音圧、ｆは音波周波数、λは音波の波長を表す。或いは、捕捉力の大きさは、図２に示す音響放射圧ポテンシャルの勾配に比例するともいえる。したがって、定在波の腹の位置に近い物質Ｍほど捕捉力は大きくなり、節の位置ではほとんど働かない。ここで、音響放射圧ポテンシャルとは、定在波音響場中の力学的なポテンシャルを意味する。
【００４２】
また、物質Ｍが捕捉力により捕捉される捕捉空間Ｙの大きさは、超音波の波長の半分程度である。ここで、「捕捉空間」とは、定在波の節の位置を中心として形成される空間であって、定在波中に存在する物質に対して働く捕捉力によって、ある特定の節に上記物質を捕捉することができる範囲を意味するものとする。捕捉力とは、音響放射圧ポテンシャルに基づき、直近の節近傍に物質を集めるように定在波中の物質に働く力である。つまり、捕捉空間とは、捕捉力が発生する基となる音響放射圧ポテンシャルについて、ある極大値に対応する位置から隣の極大値に対応する位置までの範囲（図２中のＹ）ということもできる。例えば、超音波の周波数が１ＭＨｚの場合には、蒸留水における音速を用いて、波長λが１．５ｍｍと得られる。したがって、このときの捕捉空間Ｙの大きさは７５０ｕｍとなる。これは、周波数を掃引することで、捕捉空間Ｙの大きさを連続的に変化させることができることを意味する。
【００４３】
捕捉空間Ｙに捕捉された抗原および修飾ラテックス粒子は、捕捉された結果衝突頻度が上昇し効率よく短時間で抗原抗体反応を起こしながら凝集体Ｇを形成する。凝集体Ｇは、図１に示すように、抗体Ｂが表面に修飾された修飾ラテックス粒子Ｃが、抗体Ｂに対する抗原Ａを介して形成される塊状の集合物である。修飾ラテックス粒子Ｃ単体は、近赤外光の波長よりも小さいため、近赤外光を散乱しない。しかし、上記のような凝集体Ｇを形成することにより全体として大きな集合物となり近赤外光を散乱するようになる。したがって、測定光Ｌｏと透過光Ｌｔとの間にこの散乱による影響の分だけ差異が生じ、その差異を測定することにより抗原濃度を測定している。
【００４４】
以上のように、本実施形態に係る測定装置および測定方法では、凝集反応を起こさせる試料セル内の分散液中に超音波の定在波を形成して、定在波の節の位置に形成される数ｕｍ〜数百ｕｍの捕捉空間に反応物質（修飾担体および被検出物質）を捕捉している。したがって、分散液に対する反応物質の濃度が低い場合でも、反応物質の衝突頻度を上げることができるため、凝集反応の反応速度を効率よく向上させることができる。また、反応物質が節に近づくにつれ捕捉力は減少するため、節近傍に捕捉された反応物質には捕捉力はほとんど働かない。これにより、単に進行する超音波を照射する従来法に比して、反応物質の損傷を低減することができる。この結果、凝集法において、低濃度の試料についても測定の短時間化を実現しかつより定量性の高い測定が可能となる。
【００４５】
さらに、前述したように捕捉空間の大きさは超音波の周波数に依存することを述べた。したがって、反応初期では捕捉空間を広げ、徐々に周波数を高くしていき捕捉空間を徐々に狭くしてさらに濃縮することも可能である。凝集体Ｇの捕捉についても周波数を調整することにより、測定の条件および目的に応じて、捕捉する凝集体Ｇの大きさを任意に選択することも可能である。
【００４６】
＜第１の実施形態の設計変更＞
ここで、上記の説明では、特異的に結合する対の物質として抗原およびこの抗原に対する抗体を用いて説明したが、これに限られるものではない。すなわち、特異的に結合する対の物質であれば、タンパク質および補因子等を用いてもよい。また、上記の説明では、担体としてラテックス粒子や金属微粒子等の無機粒子について説明したが、これに限られるものではない。すなわち、担体を赤血球とした血球凝集法等にも本発明は適用可能である。
【００４７】
＜測定装置の第２の実施形態＞
まず、本実施形態に係る測定装置２の構成について説明する。図３は、測定装置２を示す概略断面図である。測定装置２は、第1の実施形態に係る測定装置１と同様の構成であるが、試料セルの形状と超音波の波長を整合させることができるように、試料セルの幅（収容部の長さ）が可変となるように構成されている点で測定装置１と異なる。したがって、測定装置１と同様の構成要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。また、本実施形態においても、例えば抗原抗体反応を利用したいわゆるラテックス凝集比濁法によって抗原（被検出物質）を測定する場合について説明する。
【００４８】
図３に示すように、測定装置２は、試料Ｓ（反応物質を含む分散液Ｄ）を供給する、一方の側面２１ｂが可動式の試料セル２０と、試料セル２０の他方の側面２１ａに取り付けられた超音波振動子１４と、超音波振動子１４によって照射される超音波Ｕの周波数（波長）を制御する駆動装置１５と、試料セル２０の透明な底面２２から測定光Ｌｏを入射する光源１６と、凝集体Ｇを含みうる試料Ｓ中を透過した測定光Ｌｏである透過光Ｌｔを検出する光検出器１８とを備えている。
【００４９】
試料セル２０は、第１の実施形態の試料セル１０と同様に例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。試料セル２０は、試料セルの形状と超音波の波長を整合させることができるように、試料セルの幅（収容部の長さ）が可変となるように構成されている点で試料セル１０と異なる。例えば、図３に示す試料セル２０は、側面２１ｂを動かすことにより進行する超音波の進行方向（Ｘ方向）の試料セル２０の幅Ｗを調整可能となるように構成されている。しかし、試料セルの形状を可変とするような構成は、これに限られるものではない。
【００５０】
本実施形態では上記のような構成とすることで、駆動装置１５により超音波Ｕの波長を調整することおよび／または可動式の側面２１ｂにより試料セル１０の形状を調整することで、試料セル２０の形状と超音波Ｕの波長を整合させることができる。したがって、超音波振動子１４の駆動装置１５、およびこの超音波振動子１４が取り付けられた側面に対向し可動式の側面２１ｂが、定在波形成手段に相当する。
【００５１】
そして、図３を用いて本実施形態に係る測定方法について説明する。
測定方法は以下の工程によって行われる。まず、抗原Ａと、この抗原Ａに対する抗体Ｂによって表面を修飾された修飾ラテックス粒子(修飾担体)Ｃと、これらを分散させる分散液Ｄとを試料セル２０に供給する。そして、超音波振動子１４を駆動させて試料セル２０内に超音波Ｕを照射し、照射した超音波と対向する側面２１ｂから反射した超音波との干渉により、試料セル２０内の分散液Ｄ中に定在波を形成する。このとき、試料セル２０の形状と超音波Ｕの波長とが整合するように、超音波の周波数（波長）および／または試料セル２０の幅Ｗ（形状）を調整する。定在波が形成されると、定在波中に存在する物質に対して節の位置へ移動させるような捕捉力が生じる。これにより、抗原Ａおよび／または修飾ラテックス粒子Ｃが節の位置近傍の捕捉空間に捕捉されると共に、抗原抗体反応によって抗原Ａと修飾ラテックス粒子Ｃとが凝集体Ｇを形成する。その後、測定光Ｌｏを試料セル２０の底面２２から入射し、その透過光Ｌｔを光検出器１８によって検出し、測定光Ｌｏと透過光Ｌｔの強度比（或いは、透過光量や吸収光量等）から試料Ｓ中の抗原Ａの濃度を測定する。
【００５２】
以上のように、本実施形態に係る測定装置および測定方法においても、凝集反応を起こさせる試料セル内の分散液中に超音波の定在波を形成して、定在波の節の位置に形成される数ｕｍ〜数百ｕｍの捕捉空間に反応物質（修飾担体および被検出物質）を捕捉している。この結果、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００５３】
また、超音波振動子の周波数掃引には限界があるため、試料セル２０をこのように構成することにより、より容易に試料セルの形状と超音波の波長を整合させることができる。さらに、試料セルの幅（収容部の長さ）を調整することにより、測定の条件や目的に応じて超音波の周波数を変えずに節の数を変えることができる。ここで、当然ながら定在波形成手段は可動式の側面２１ｂのみでも本発明における課題を解決しうる。
【００５４】
＜測定装置の第３の実施形態＞
まず、本実施形態に係る測定装置３の構成について説明する。図４は、測定装置３を示す概略断面図である。測定装置３は、第１の実施形態に係る測定装置１と同様の構成であるが、２つの超音波振動子を対向させて駆動させることにより、定在波を形成する点で測定装置１と異なる。したがって、測定装置１と同様の構成要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。また、本実施形態においても、例えば抗原抗体反応を利用したいわゆるラテックス凝集比濁法によって抗原（被検出物質）を測定する場合について説明する。
【００５５】
図４に示すように、測定装置３は、試料Ｓ（反応物質を含む分散液Ｄ）を供給する試料セル１０と、試料セル１０の対抗する側面１１にそれぞれ取り付けられた超音波振動子３４ａおよび３４ｂと、超音波振動子３４ａおよび３４ｂによって照射される超音波Ｕの周波数（波長）を制御する駆動装置（図示省略）と、試料セル１０の透明な底面１２から測定光Ｌｏを入射する光源１６と、凝集体Ｇを含みうる試料Ｓ中を透過した測定光Ｌｏである透過光Ｌｔを検出する光検出器１８とを備えている。
【００５６】
超音波振動子３４ａおよび３４ｂは、第１の実施形態と同様に、圧電セラミクス、またはフッ化ポリビニルピロリドンのような高分子フィルムのような圧電素子であり、単振動子であってもアレイ振動子であってもよい。一方、駆動装置についても、図示を省略しているが、第１の実施形態と同様である。本実施形態では、照射した超音波と反射した超音波とを利用するのではなく、複数の独立した超音波振動子を用いてそれらからの超音波を異なる方向から重ね合わせることにより定在波を形成している点で第１の実施形態の定在波形成手段と異なる。超音波振動子３４ａおよび３４ｂのそれぞれから照射される超音波の位相は、略同一であることが好ましい。本実施形態において、超音波振動子３４ａおよび３４ｂが、定在波形成手段に相当する。
【００５７】
そして、図４を用いて本実施形態に係る測定方法について説明する。
測定方法は以下の工程によって行われる。まず、抗原Ａと、この抗原Ａに対する抗体Ｂによって表面を修飾された修飾ラテックス粒子(修飾担体)Ｃと、これらを分散させる分散液Ｄとを試料セル１０に供給する。そして、超音波振動子３４ａおよび３４ｂを駆動させて試料セル１０内にそれぞれから超音波Ｕを照射し、超音波振動子３４ａから照射された超音波と超音波振動子３４ｂから照射された超音波との干渉により、試料セル１０内の分散液Ｄ中に定在波を形成する。ここで、上記両超音波の位相が略同一であれば試料セルの形状によらず、両超音波が重なり合う領域で定在波は形成される。定在波が形成されると、定在波中に存在する物質に対して節の位置へ移動させるような捕捉力が生じる。これにより、抗原Ａおよび／または修飾ラテックス粒子Ｃが節の位置近傍の捕捉空間に捕捉されると共に、抗原抗体反応によって抗原Ａと修飾ラテックス粒子Ｃとが凝集体Ｇを形成する。その後、測定光Ｌｏを試料セル１０の底面１２から入射し、その透過光Ｌｔを光検出器１８によって検出し、測定光Ｌｏと透過光Ｌｔの強度比（或いは、透過光量や吸収光量等）から試料Ｓ中の抗原Ａの濃度を測定する。
【００５８】
以上のように、本実施形態に係る測定装置および測定方法においても、凝集反応を起こさせる試料セル内の分散液中に超音波の定在波を形成して、定在波の節の位置に形成される数ｕｍ〜数百ｕｍの捕捉空間に反応物質（修飾担体および被検出物質）を捕捉している。この結果、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００５９】
また、本実施形態では、独立した複数の超音波振動子のそれぞれから異なる方向へ照射される超音波を重ね合わせることにより、試料セル内に定在波を形成している。したがって、独立した超音波振動子が複数あるため、それぞれの信号の位相を制御することにより、定在波を任意の形状に制御することが可能となり、かつ定在波の腹と節の位置を任意の位置に制御することが可能となる。
【００６０】
＜第３の実施形態の設計変更＞
ここで、上記の説明では、図４に示すように一対の超音波振動子３４ａおよび３４ｂを用いた場合について説明したが、これに限られるものではない。すなわち、例えば図４において、さらに紙面垂直方向に２つの超音波振動子を対向させて配置することもできる。また、例えば試料セル（特に試料セルの収容部）が上面から見て正三角形の形状を有するような場合には、３つの超音波振動子をそれぞれの辺に対応する側面に配置し、それぞれの超音波振動子から正三角形の重心に向けて超音波を照射するような態様も可能である。
【００６１】
＜測定装置の第４の実施形態＞
まず、本実施形態に係る測定装置４の構成について説明する。図５は、測定装置４を示す概略断面図である。測定装置４は、第１の実施形態に係る測定装置１と同様の構成であるが、試料セル４０が流路を有している点で測定装置１と異なる。したがって、測定装置１と同様の構成要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。また、本実施形態においても、例えば抗原抗体反応を利用したいわゆるラテックス凝集比濁法によって抗原（被検出物質）を測定する場合について説明する。
【００６２】
図５に示すように、測定装置４は、試料Ｓ（反応物質を含む分散液Ｄ）が供給される流路を有する試料セル４０と、試料セル４０の側面４１に取り付けられた超音波振動子１４と、超音波振動子１４によって照射される超音波Ｕの周波数（波長）を制御する駆動装置１５と、試料セル４０の透明な底面４２から測定光Ｌｏを入射する光源１６と、凝集体Ｇを含みうる試料Ｓ中を透過した測定光Ｌｏである透過光Ｌｔを検出する光検出器１８とを備えている。
【００６３】
試料セル４０は、第１の実施形態の試料セル１０と同様に例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。そして、試料セル４０は、試料を流動させることができるように流路を有しており、本実施形態においては図５の矢印Ｔから分散液Ｄが注入され、反対の穴から出て行くように構成されている。本実施形態において、超音波振動子１４の駆動装置１５、および超音波振動子１４が取り付けられた側面に対向する側面４１が、定在波形成手段に相当する。
【００６４】
そして、図５を用いて本実施形態に係る測定方法について説明する。
測定方法は以下の工程によって行われる。まず、抗原Ａと、この抗原Ａに対する抗体Ｂによって表面を修飾された修飾ラテックス粒子(修飾担体)Ｃと、これらを分散させる分散液Ｄとを試料セル４０に供給する。そして、超音波振動子１４を駆動させて試料セル４０内に超音波Ｕを照射し、照射された超音波と側面に反射された超音波との干渉により、試料セル４０内の分散液Ｄ中に定在波を形成する。このとき、試料セル４０の形状と超音波Ｕの波長とが整合するように、超音波の周波数（波長）を駆動装置１５によって調整する。定在波が形成されると、定在波中に存在する物質に対して節の位置へ移動させるような捕捉力が生じる。これにより、抗原Ａおよび／または修飾ラテックス粒子Ｃが節の位置近傍の捕捉空間に捕捉されると共に、抗原抗体反応によって抗原Ａと修飾ラテックス粒子Ｃとが凝集体Ｇを形成する。そして、ある程度凝集反応が進行してから、定在波を形成したままの状態で流路に分散液Ｄを図５中のＴ方向へ流動させる。その後、測定光Ｌｏを試料セル１０の底面１２から入射し、その透過光Ｌｔを光検出器１８によって検出し、測定光Ｌｏと透過光Ｌｔの強度比（或いは、透過光量や吸収光量等）から試料Ｓ中の抗原Ａの濃度を測定する。
【００６５】
本実施形態では、ある程度凝集反応が進行してから、定在波を形成したままの状態で流路に分散液Ｄを流動させている。これにより、小さい凝集体Ｇ２を分離して凝集反応を測定することができる。これは前述したように、定在波による捕捉力の大きさは、その捕捉力が働く物質の体積に依存するためである。より具体的には、上記式（１）からわかるように捕捉力の大きさは、その捕捉力が働く物質の体積に比例する。これは、体積の大きな凝集体Ｇ１（大きい凝集体）に対しては強い捕捉力が働き、体積の小さな凝集体Ｇ２（小さい凝集体）に対しては弱い捕捉力が働くことを意味する。つまり、小さい凝集体Ｇ２は、分散液Ｄの流動と共に流されるように調整することができる。したがって、上記のように分散液を流動させて、凝集体のうち所定の体積値よりも小さい体積の凝集体を定在波が形成されている領域から排除することが可能となる。ここで、所定の体積値は、流速（流動の速さ）を調整することにより適宜設定することができる。
【００６６】
以上のように、本実施形態に係る測定装置および測定方法においても、凝集反応を起こさせる試料セル内の分散液中に超音波の定在波を形成して、定在波の節の位置に形成される数ｕｍ〜数百ｕｍの捕捉空間に反応物質（修飾担体および被検出物質）を捕捉している。この結果、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００６７】
また従来法では、凝集体の大きさに分散があることによって定量性に問題があったが、本実施形態はこの問題を解決することができる。つまり、例えば凝集反応後に一定流速を流して、捕捉力の弱い小さい凝集体Ｇ２を流し大きい凝集体Ｇ１のみを捕捉空間に保持することができるため、より定量性の高い測定を行うことが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上の説明では、特異的に結合する対の物質が生体物質であるとして、本発明に係る装置および方法を用いて免疫測定を行う場合を例にした。しかしながら、本発明の装置および方法の利用分野は、免疫測定の分野に限られるものではなく、例えば凝集反応を利用して排水中に含まれる金属（或いは金属イオン等）を測定する等の分野においても適用可能である。
【符号の説明】
【００６９】
１、２、３、４        測定装置
１０   試料セル
１４   超音波振動子
１５   駆動装置
１６   光源
１８   光検出器
Ａ     抗原
Ｂ     抗体
Ｃ     修飾担体（担体）
Ｄ     分散液
Ｇ     凝集体
Ｇ１   大きい凝集体
Ｇ２   小さい凝集体
Ｌｏ   測定光
Ｌｔ   透過光
Ｓ     試料
Ｕ     超音波（定在波）
Ｗ     幅
Ｙ     捕捉空間
【図１】
2010223756.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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