(57)【要約】【課題】タンパク質−ポリマー複合材料の調製方法を提供する。【解決手段】タンパク質−ポリマー複合材料の調製方法は、ポリマー樹脂、界面活性剤、及び非水性有機溶剤の混合物を用意することを含む本発明の実施態様に従って提供される。生理活性タンパク質を含みかつ界面活性剤を実質的に含まない水性溶液がこの混合物と混合される。エマルションが架橋剤と混合されて硬化性組成物が生成される。この硬化性組成物が硬化され、それによってタンパク質−ポリマー複合材料が生成される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー樹脂、界面活性剤、及び非水性有機溶剤の混合物を用意する工程、
生理活性タンパク質を含有する水性溶液であって、界面活性剤を実質的に含まない水性溶液を前記混合物と混合してエマルションを生成する工程、
該エマルションを架橋剤と混合して硬化性組成物を生成する工程、及び
該硬化性組成物を硬化し、それによってタンパク質−ポリマー複合材料を生成する工程
を含む、タンパク質−ポリマー複合材料の調製方法。
【請求項２】
前記ポリマー樹脂がヒドロキシルで官能基化されたアクリル樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋剤がポリイソシアネートである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生理活性タンパク質が酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生理活性タンパク質が、レクチン、抗体、及び受容体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１つ又は複数の添加物を、前記混合物、前記水性溶液、前記エマルション、及び前記硬化性組成物のうち少なくとも１つに添加する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質−ポリマー複合材料中の生理活性タンパク質粒子の平均粒子サイズが１ｎｍと１０μｍを含む１ｎｍ〜１０μｍ（平均直径）の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヒドロキシルで官能基化されたアクリル樹脂、界面活性剤、及び−０．５〜２（−０．５と２を含む）の範囲のｌｏｇ Ｐを有する溶剤の混合物を用意する工程、
生理活性タンパク質を含有する水性溶液であって、界面活性剤を実質的に含まない水性溶液を前記混合物と混合してエマルションを生成する工程、
該エマルションをポリイソシアネート架橋剤と混合して硬化性組成物を生成する工程、及び
重合可能な組成物を硬化し、それによってタンパク質−ポリマー複合材料を生成する工程
を含む、タンパク質−ポリマー複合材料の調製方法。
【請求項９】
前記生理活性タンパク質が酵素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生理活性タンパク質が、レクチン、抗体、及び受容体からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
１つ又は複数の添加物を、前記混合物、前記水性溶液、前記エマルション、及び前記硬化性組成物のうち少なくとも１つに添加する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質−ポリマー複合材料中の生理活性タンパク質粒子の平均粒子サイズが１ｎｍと１０μｍを含む１ｎｍ〜１０μｍ（平均直径）の範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記硬化性組成物を硬化する前に該硬化性組成物を基材に適用する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ポリマー樹脂及び非水性有機溶剤の混合物を用意する工程、
生理活性タンパク質を含有する水性溶液であって、界面活性剤を実質的に含まない水性溶液を前記混合物と混合して第１の成分を生成する工程、
架橋剤を含む第２の成分を用意する工程、
前記第１の成分と前記第２の成分を混合して硬化性組成物を生成する工程、及び
該硬化性組成物を硬化し、それによってタンパク質−ポリマー複合材料を生成する工程
を含む、タンパク質−ポリマー複合材料の調製方法。
【請求項１５】
前記硬化が熱硬化を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記硬化が化学線を用いた硬化を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生理活性タンパク質が酵素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記生理活性タンパク質が、レクチン、抗体、及び受容体からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
１つ又は複数の添加物を、前記混合物、前記水性溶液、前記エマルション、及び前記硬化性組成物のうち少なくとも１つに添加する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質−ポリマー複合材料中の生理活性タンパク質粒子の平均粒子サイズが１ｎｍと１０μｍを含む１ｎｍ〜１０μｍ（平均直径）の範囲である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記硬化性組成物を硬化する前に該硬化性組成物を基材に適用する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
２成分の溶剤型ポリマー樹脂中に分散された生理活性タンパク質を含むタンパク質−ポリマー複合材料であって、該タンパク質−ポリマー複合材料中の生理活性タンパク質粒子の平均粒子サイズが１ｎｍと１０μｍを含む１ｎｍ〜１０μｍ（平均直径）の範囲である、タンパク質−ポリマー複合材料。
【請求項２３】
前記タンパク質−ポリマー複合材料中の生理活性タンパク質粒子の平均粒子サイズが１０μｍ以下（平均直径）である、請求項２２に記載のタンパク質−ポリマー複合材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、生物活性物質を含むコーティング組成物の調製方法に関する。特定の実施態様では、本発明は、薄膜コーティングの形態で使用するためのタンパク質−ポリマー複合材料の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性タンパク質は、種々の用途において潜在的な有用性を有する。しかしながら、生物活性物質を含む材料、特にはタンパク質−ポリマー複合材料の調製方法について継続したニーズがある。
【発明の概要】
【０００３】
重合可能な成分を有する連続相に分散された生理活性タンパク質を含有する微細エマルション溶液の形成を含み、該タンパク質が取り込まれそしてポリマーの網目構造を形成する際に該ポリマーと架橋するようにされる本発明の実施態様による方法が提供される。ポリマー中にタンパク質を閉じ込めるとともにポリマーの網目構造にタンパク質の少なくとも一部を架橋することで、本明細書に記載の方法及び材料を用いて形成されたコーティング中のタンパク質成分の長期にわたる活性が得られる。
【０００４】
タンパク質−ポリマー複合材料の調製方法は、ポリマー樹脂、界面活性剤、及び非水性有機溶剤の混合物を用意することを含む本発明の実施態様に従って提供される。生理活性タンパク質を含みかつ界面活性剤を実質的に含まない水性溶液がこの混合物と混合され、それによってエマルションが生成される。このエマルションは架橋剤と混合されて硬化性組成物が生成され、この硬化性組成物が硬化されてタンパク質−ポリマー複合材料が生成される。
【０００５】
タンパク質−ポリマー複合材料の調製方法は、ヒドロキシルで官能基化されたアクリル樹脂、界面活性剤、及び非水性有機溶剤の混合物を用意することを含む本発明の実施態様に従って提供される。生理活性タンパク質を含みかつ界面活性剤を実質的に含まない水性溶液がこの混合物と混合され、それによってエマルションが生成される。このエマルションはポリイソシアネート架橋剤と混合されて硬化性組成物が生成され、この硬化性組成物が硬化されてタンパク質−ポリマー複合材料が生成される。
【０００６】
タンパク質−ポリマー複合体に含まれる生理活性タンパク質は、タンパク質−ポリマー複合体の所望の特性に従って選択され、含まれる生理活性タンパク質の例としては、特に限定されないが、酵素、レクチン、抗体、及び受容体のうち１つ又は複数のタイプが挙げられる。
【０００７】
任意選択で、１つ又は複数の添加物を、混合物、水性溶液、エマルション、及び／又は硬化性組成物に含めることができる。
【０００８】
本発明の実施態様では、タンパク質−ポリマー複合材料中の生理活性タンパク質粒子の平均粒子サイズは１０μｍ以下（平均直径）であり、例えば、１ｎｍ〜１０μｍ（１ｎｍと１０μｍを含む）の範囲である。
【０００９】
ヒドロキシルで官能基化されたアクリル樹脂、界面活性剤、及び−０．５〜２（−０．５と２を含む）の範囲のｌｏｇ Ｐを有する溶剤の混合物を用意することを含むタンパク質−ポリマー複合材料の調製のための本発明のさらなる実施態様による方法が提供される。生理活性タンパク質を含みかつ界面活性剤を実質的に含まない水性溶液がこの混合物と混合され、それによってエマルションが生成される。このエマルションはポリイソシアネート架橋剤と混合されて硬化性組成物が生成され、この硬化性組成物が硬化されてタンパク質−ポリマー複合材料が生成される。
【００１０】
本発明のさらなる実施態様による２成分の溶剤型タンパク質−ポリマー複合材料の調製方法は、ポリマー樹脂及び非水性有機溶剤の混合物を用意し、そして生理活性タンパク質を含有する水性溶液であって、界面活性剤を実質的に含まない水性溶液をこの混合物と混合して第１の成分を生成することを含む。架橋剤を含む第２の成分がこの第１の成分と混合されて硬化性組成物が生成される。この硬化性組成物が硬化されて本発明のタンパク質−ポリマー複合材料が生成される。
【００１１】
本発明の実施態様によるタンパク質−ポリマー複合材料は、２成分の溶剤型ポリマー樹脂中に分散された生理活性タンパク質を含む。生理活性タンパク質は、タンパク質−ポリマー複合材料中の生理活性タンパク質粒子の平均粒子サイズが１０μｍ以下（平均直径）、例えば、１ｎｍ〜１０μｍ（１ｎｍと１０μｍを含む）の範囲となるように分散される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】本発明の実施態様による方法のフローダイアグラムの図である。
【図１Ｂ】本発明の実施態様による方法のフローダイアグラムの図である。
【図２】生理活性タンパク質及びポリマー又は架橋剤の共有結合による並びにタンパク質の物理的な捕捉による生理活性タンパク質の組み込みの概略図である。
【図３】天然のα−アミラーゼの熱安定性を示すグラフである。
【図４】本発明の実施態様に従って製造された２成分の溶剤型ポリウレタン（２Ｋ ＳＢ ＰＵ）コーティング中に組み込まれたα−アミラーゼの熱安定性を示すグラフである。
【図５】異なるタイプのポリウレタン（ＰＵ）コーティング中に組み込まれたα−アミラーゼの室温での長期安定性を説明するグラフである。
【図６】上面から約２μｍの深さにおけるα−アミラーゼを含有する２Ｋ ＳＢ ＰＵの共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
タンパク質−ポリマー複合材料の調製方法が本発明の実施態様に従って提供される。本発明によるタンパク質−ポリマー複合材料は、コーティング、例えば、バイオセンサー、防汚表面、及び生体触媒装置のためのコーティングを含む多くの用途において有用である。
【００１４】
生理活性タンパク質の水性溶液と非水性有機溶剤型ポリマーを用いて生物活性のある有機溶剤型タンパク質−ポリマー複合材料を生成することを含むタンパク質−ポリマー複合材料の調製方法が本発明の実施態様に従って提供される。これらの本発明の方法はまた、本明細書において「直接分散」法とも称される。
【００１５】
本発明の実施態様に従って提供される方法は、図１Ａ及び１Ｂに示されるフローダイアグラムにおいて一般的に図示される。図１Ａに示されるように、生理活性タンパク質の水性溶液１０と、ポリマー樹脂と有機溶剤の混合物２０が混合されて硬化性のタンパク質−ポリマー組成物４０が生成される。任意選択で、架橋剤３０が、用いられるポリマー樹脂及び選択される硬化法に応じて、硬化性のタンパク質−ポリマー組成物４０中に存在している。組成物の硬化を実施して硬化されたタンパク質−ポリマー複合材料５０が生成される。
【００１６】
図１Ｂに示される好ましい実施態様では、生理活性タンパク質の水性溶液６０と、ポリマー樹脂、界面活性剤及び非水性有機溶剤の混合物７０が混合されてエマルション７５が生成される。架橋剤８０が、用いられるポリマー樹脂及び選択される硬化法に応じて、このエマルション７５に添加され、硬化性のタンパク質−ポリマー組成物９０が生成される。この硬化性のタンパク質−ポリマー組成物９０が硬化されてタンパク質−ポリマー複合材料１００が生成される。
【００１７】
本発明の実施態様によるタンパク質−ポリマー複合材料の調製方法は、硬化の前に溶剤型樹脂中に生理活性タンパク質を分散させることを特徴とし、これは、複合材料では、生理活性タンパク質及びタンパク質−ポリマー複合材料の官能性を損なう生理活性タンパク質の大きな凝集体が形成するのと対照的である。本発明の実施態様では、生理活性タンパク質は、生理活性タンパク質が他の生理活性タンパク質と結合しないか及び／又は結合したタンパク質の比較的小さな粒子を形成するように、タンパク質−ポリマー複合材料中に分散される。したがって、これらの実施態様では、タンパク質−ポリマー複合材料中の生理活性タンパク質粒子の平均粒子サイズは１０μｍ以下（平均直径）、例えば、１ｎｍ〜１０μｍ（１ｎｍと１０μｍを含む）の範囲である。
【００１８】
本発明の実施態様による硬化性のタンパク質−ポリマー組成物は、２成分の溶剤型（２Ｋ ＳＢ）組成物であり、この２成分は使用の直前に混合され、例えば、硬化性のタンパク質−ポリマー組成物を基材に適用して生物活性コーティング、例えば、生物活性のあるクリアコートが形成される。一般的に言えば、第１の成分は架橋性ポリマー樹脂を含有し、第２の成分が架橋剤を含有する。したがって、例えば、図１Ｂを参照すると、エマルション７５は架橋性樹脂を含有する第１の成分であり、架橋剤８０が第２の成分であり、それらが互いに混合されて硬化性のタンパク質−ポリマー組成物が生成される。
【００１９】
本発明の方法及び組成物において含まれるポリマー樹脂は、コーティング組成物、例えば、クリアコート組成物において有用な任意の膜形成ポリマーであることができる。このようなポリマーの例としては、アミノプラスト、メラミン、ホルムアルデヒド、カルバメート、ポリウレタン、ポリアクリレート、エポキシ、ポリカーボネート、アルキド、ビニル、ポリアミド、ポリオレフィン、フェノール樹脂、ポリエステル、ポリシロキサン、及びそれらの又は他のポリマーの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２０】
特定の実施態様では、硬化性組成物に含まれるポリマー樹脂は架橋性である。例えば、架橋性ポリマーは、架橋性ポリマーに特有の官能基を有する。このような官能基の例としては、アセトアセテート、酸、アミン、カルボキシル、エポキシ、ヒドロキシル、イソシアネート、シラン、及びビニルが挙げられる。
【００２１】
架橋剤は硬化性組成物中に任意選択で含まれる。選択される特定の架橋剤は、用いられる特定のポリマー樹脂に依存している。架橋剤の限定的でない例としては、イソシアネート官能基、エポキシ官能基、アルデヒド官能基、及び酸性官能基などの官能基を有する化合物が挙げられる。
【００２２】
タンパク質−ポリウレタン複合材料を形成するための方法の特定の実施態様では、本発明の方法及び組成物において含まれるポリマー樹脂はヒドロキシル官能性アクリルポリマーであり、架橋剤はポリイソシアネートである。
【００２３】
ポリイソシアネート、好ましくはジイソシアネートは、本発明の実施態様によるヒドロキシル官能性アクリルポリマーと反応する架橋剤である。脂肪族のポリイソシアネートは、クリアコート用途、例えば、自動車用クリアコート用途のためのタンパク質−ポリマー複合材料の製造方法において用いられる好ましいポリイソシアネートである。脂肪族のポリイソシアネートの限定的でない例としては、１，４−ブチレンジイソシアネート、１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、１，２−ジイソシアネートプロパン、１，３−ジイソシアネートプロパン、エチレンジイソシアネート、リシンジイソシアネート、１，４−メチレンビス（シクロヘキシルイソシアネート）、ジフェニルメタン、４，４’−ジイソシアネート、ジフェニルメタン４，４’−ジイソシアネートのイソシアヌレート、メチレンビス−４，４’−イソシアネートシクロヘキサン、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネートのイソシアヌレート、イソホロンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートのイソシアヌレート、ｐ−フェニレンジイソシアネート、トルエンジイソシアネート、トルエンジイソシアネートのイソシアヌレート、トリフェニルメタン４，４’，４”−トリイソシアネート、テトラメチルキシレンジイソシアネート、及びメタ−キシレンジイソシアネートが挙げられる。
【００２４】
本明細書で用いられる「生理活性タンパク質」という語は、特に別の物質、例えば、リガンド、ドラッグ、基材、抗原又はハプテンと相互作用する活性を有するタンパク質を言うものである。生理活性タンパク質としては、特に限定されないが、抗体、レクチン、リガンド受容体、及び酵素が挙げられる。特に別の物質と相互作用する活性を有するタンパク質に関する分析としては、周知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、受容体結合アッセイ、及び酵素活性アッセイが挙げられる。
【００２５】
特定のタンパク質−ポリマー複合材料に含めるために選択される生理活性タンパク質は、意図される材料の用途に依存しており、当業者であれば、１つ又は複数の適切な生理活性タンパク質を選択できるであろう。
【００２６】
１つ又は複数のタイプの酵素を含むタンパク質−ポリマー複合材料は、本発明の実施態様に従って提供される。本明細書で用いられる「酵素」という語は、生化学反応を触媒する活性を有するタンパク質を一般に言うものである。酵素は、酵素番号（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ） ｎｕｍｂｅｒｓ）ＥＣ１オキシドレダクターゼ；ＥＣ２トランスフェラーゼ；ＥＣ３ヒドロラーゼ；ＥＣ４リアーゼ；ＥＣ５イソメラーゼ；又はＥＣ６リガーゼとして規格化された命名法に従って一般に記載される。これらのカテゴリーのいずれかにおける酵素を、本発明の実施態様によるタンパク質−ポリマー複合材料に含めることができる。
【００２７】
特定の実施態様では、含められる酵素は、ヒドロラーゼ、例えば、グルコシダーゼ、ペプチダーゼ、又はリパーゼである。特定のグルコシダーゼの限定的でない例としては、アミラーゼ、キチナーゼ、及びリゾチームが挙げられる。特定のペプチダーゼの限定的でない例としては、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、スブチリシン、パパイン、エラスターゼ、及びプラスミノーゲンが挙げられる。リパーゼの限定的でない例としては、膵リパーゼ及びリポタンパク質リパーゼが挙げられる。
【００２８】
生理活性タンパク質は、天然源、例えば、生理活性タンパク質を生成するか又は周知の化学的及び／又は組み換え手法を用いて合成できる有機体又は細胞から分離された商業的供給源から得ることができる。
【００２９】
生理活性タンパク質は、複合材料組成物の合計質量の０．１〜５０ｗｔ％の量で本発明の実施態様による複合材料中に含まれる。
【００３０】
硬化手法は、従来の硬化性ポリマー組成物のために典型的に用いられるものである。
【００３１】
本発明の方法の実施態様によって生成されるタンパク質−ポリマー複合材料は、任意選択で熱硬化性のタンパク質−ポリマー複合材料である。
【００３２】
例えば、熱硬化は特定の実施態様において用いられる。熱重合開始剤は、任意選択で、本発明の実施態様による硬化性組成物中に含められる。熱重合開始剤としては、遊離基開始剤、例えば、有機過酸化物及びアゾ化合物が挙げられる。有機過酸化物の熱開始剤の例としては、過酸化ベンゾイル、過酸化ジクミル、及び過酸化ラウリルが挙げられる。例示的なアゾ化合物の熱開始剤は２，２’−アゾビスイソブチロニトリルである。
【００３３】
従来の硬化温度及び硬化時間を本発明の実施態様による方法において用いることができる。例えば、特定の温度又は特定の硬化条件下での硬化時間は、架橋剤の官能基が硬化前に存在する合計量の５％未満まで低減するという基準によって決定される。架橋剤の官能基は、ＦＴ−ＩＲ又は他の好適な方法によって定量的に特徴付けることができる。例えば、本発明のポリウレタンのタンパク質−ポリマー複合体のための特定の温度又は特定の硬化条件下での硬化時間は、架橋剤の官能基ＮＣＯが硬化前に存在する合計量の５％未満まで低減するという基準によって決定することができる。ＮＣＯ基はＦＴ−ＩＲによって定量的に特徴付けることができる。特定の樹脂のための硬化の程度を評価するための追加の方法は当技術分野でよく知られている。
【００３４】
硬化は、特定の実施態様において溶剤の蒸発を包含することができる。
【００３５】
任意選択で、硬化性組成物は、化学線、例えば、紫外線、電子ビーム、マイクロ波、可視線、赤外線又はガンマ線にさらすことによって硬化される。
【００３６】
本発明の方法のさらなる実施態様は、タンパク質−ポリマー複合材料、及び／又は有機溶剤とポリマー樹脂の混合物、水性生理活性タンパク質溶液、エマルション及び／又は硬化性組成物の特性を改質するための１つ又は複数の添加物の添加を含む。このような添加物の例としては、ＵＶ吸収剤、可塑剤、湿潤剤、防腐剤、界面活性剤、滑剤、顔料、充填剤、及びたわみ抵抗性を向上させるための添加物が挙げられる。
【００３７】
上記のとおり、好ましい実施態様では、本発明の方法は、エマルションを生成するよう混合されるポリマー樹脂、界面活性剤及び非水性有機溶剤の混合物を含む。「界面活性剤」という語は、それが溶解される液体の表面張力を低下させるか、又は２つの液体の間若しくは液体と固体の間の界面張力を低下させる表面活性剤を言うものである。
【００３８】
用いられる界面活性剤は、両性のシリコーン系フルオロ界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤、例えば、Ｋ．Ｒ．Ｌａｎｇｅ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈａｎｓｅｒ Ｇａｒｄｎｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９９；及びＲ．Ｍ．Ｈｉｌｌ，Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９９において記載されるものを含む種々の界面活性剤のいずれかであることができる。アニオン性界面活性剤の例としては、スルホン酸アルキル、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキル及びアルキルアリール二硫酸塩、スルホン化脂肪酸、ヒドロキシアルカノールの硫酸塩、スルホコハク酸エステル、ポリエトキシ化アルカノール及びアルキルフェノールの硫酸塩及びスルホン酸塩が挙げられる。カチオン性界面活性剤の例としては、第四級の界面活性剤及びアミンオキシドが挙げられる。非イオン性界面活性剤の例としては、アルコキシレート、アルカノールアミド、ソルビトール又はマンニトールの脂肪酸エステル、及びアルキルグルカミドが挙げられる。シリコーン系界面活性剤の例としては、シロキサンポリオキシアルキレンコポリマーが挙げられる。
【００３９】
本発明の方法の好ましい実施態様では、界面活性剤は意図的に水性生理活性タンパク質溶液に添加されず、水性生理活性タンパク質溶液は界面活性剤を実質的に含まない。「実質的に含まない」という語は、水性生理活性タンパク質溶液中に界面活性剤が完全に存在しないか又はほとんど完全に存在しないことを言うものである。
【００４０】
本発明の実施態様による方法で用いられる成分は、程度の差は幾分ある場合があるが、本明細書で記載される量において用いられる。
【００４１】
ポリマー樹脂又はポリマー樹脂の混合物は、１つ又は複数のポリマー樹脂、溶剤及び界面活性剤の混合物の約１０〜９０ｗｔ％の範囲の量で存在する。本発明の実施態様では、ポリマー樹脂又はポリマー樹脂の混合物は、混合物の約２０〜６０ｗｔ％の範囲の量で存在する。１つ又は複数のポリマー樹脂の希釈剤として用いられる溶剤は、混合物の約１〜５０ｗｔ％の範囲の量で典型的に存在する。本発明の実施態様では、１つ又は複数のポリマー樹脂の希釈剤として用いられる溶剤は、混合物の約２〜３０ｗｔ％の範囲の量で存在する。界面活性剤は、混合物の約０．１〜５ｗｔ％の範囲の量で典型的に存在する。本発明の実施態様では、１つ又は複数のポリマー樹脂の希釈剤として用いられる溶剤は、混合物の約０．２〜４ｗｔ％の範囲の量で存在する。
【００４２】
ポリマー樹脂又はポリマー樹脂の混合物は、硬化性組成物の約１０〜９０ｗｔ％の範囲の量で存在する。本発明の実施態様では、ポリマー樹脂又はポリマー樹脂の混合物は、硬化性組成物の約２０〜６０ｗｔ％の範囲の量で存在する。１つ又は複数のポリマー樹脂の希釈剤として用いられる溶剤は、硬化性組成物の約１〜５０ｗｔ％の範囲の量で典型的に存在する。本発明の実施態様では、１つ又は複数のポリマー樹脂の希釈剤として用いられる溶剤は、硬化性組成物の約２〜３０ｗｔ％の範囲の量で存在する。１つ又は複数の架橋剤は、用いられる樹脂及び硬化法に応じて、硬化性組成物の約１〜３０ｗｔ％の範囲の量で硬化性組成物中に存在する。
【００４３】
界面活性剤が１つ又は複数のポリマー樹脂及び溶剤の混合物に添加される。
【００４４】
特定の実施態様では、−０．５〜２（−０．５と２を含む）の範囲のｌｏｇ Ｐを有する非水性有機溶剤が本発明よる方法において使用される。本発明の実施態様では、−０．５〜２（−０．５と２を含む）の範囲のｌｏｇ Ｐを有する非水性有機溶剤は、ポリマー樹脂のための希釈剤、例えば、ポリマー樹脂の粘度を調整するための希釈剤として用いられる。
【００４５】
「ｌｏｇ Ｐ」という語は、物質の分配係数を言うものである。物質のｌｏｇ Ｐは、［ｎ−オクタノール中の物質の溶解度］／［水中の物質の溶解度］の比の常用対数である。多くの有機溶剤に関するｌｏｇ Ｐ値は、例えば、Ｌｅｏ Ａ、Ｈａｎｓｃｈ Ｃ及びＥｌｋｉｎｓ Ｄ（１９７１）の「Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ」，Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ７１（６）：５２６−６１６において記載されているとおり公知である。ｌｏｇ Ｐ値はまた、例えば、Ｓａｎｇｓｔｅｒ，Ｊａｍｅｓ（１９９７）のＯｃｔａｎｏｌ−Ｗａｔｅｒ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２ ｏｆ Ｗｉｌｅｙ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄにおいて記載されているように算出することができる。
【００４６】
表１は、組み込まれた生理活性タンパク質の活性の保持及びポリアクリレートポリオール樹脂の適合性とｌｏｇ Ｐ値の相関を示している。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
この関係は、溶剤型タンパク質−ポリマー複合材料中に組み込まれた生理活性タンパク質が広い範囲の溶剤において類似の初期比活性度を有することを示している。しかしながら、安定性の観点で、−０．５〜２（−０．５と２を含む）の範囲のｌｏｇ Ｐ値を有する溶剤が本明細書に記載の方法において使用され、１０３℃での半減期によって示される最適な酵素安定性で以って溶剤型コーティング中への酵素の組み込みを可能にする。３．５以上のｌｏｇ Ｐを有する溶剤、例えば、ヘキサン及びイソオクタンは、本発明の２成分溶剤型（２Ｋ ＳＢ）のポリマー−タンパク質複合体を製造する方法の実施態様において用いられるポリアクリレートポリオール樹脂と適合していない。
【００４９】
本発明による方法の好ましい実施態様は−０．５〜２（−０．５と２を含む）の範囲のｌｏｇ Ｐを有する非水性有機溶剤の使用を含むが、これよりも低いか又は高いｌｏｇ Ｐを有する溶剤もまた、それらが樹脂及び生理活性タンパク質と適合している場合には使用することができる。
【００５０】
−０．５〜２（−０．５と２を含む）の範囲のｌｏｇ Ｐ値を有する溶剤の限定的でない例としては、メチルエチルケトン（０．２９）、酢酸エチル（０．７）、メチルイソブチルケトン（１．３１）、酢酸ブチル（１．７）及び表２に記載の他の溶剤が挙げられる。
【００５１】
−０．５〜２（−０．５と２を含む）の範囲のｌｏｇ Ｐを有する非水性有機溶剤は、ポリマー樹脂と適合しかつ本発明の方法において使用されるべき選択された架橋剤と実質的に反応しない任意のこのような溶剤であることができる。ポリアクリレートポリオールポリマー樹脂及びポリイソシアネート架橋剤と適合しない非水性有機溶剤の例は、脂肪族炭化水素並びにヒドロキシル基及び／又はアミノ基を有する非水性有機溶剤である。したがって、好ましい実施態様では、脂肪族炭化水素の非水性有機溶剤並びにヒドロキシル基及び／又はアミノ基を有する非水性有機溶剤は、本発明の方法において使用されるポリマー樹脂と適合しないとして除外される。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
タンパク質−ポリマー複合材料が、硬化性組成物が高温、例えば、複合体中に含まれるポリマー成分の硬化と適合する３７℃を超える温度にさらされた場合に、生理活性タンパク質の活性を保持するということは本発明の驚くべき知見である。一般に、生理活性タンパク質を３７℃を超える温度にさらすことは、例えば、タンパク質の変性のために生物活性の損失の要因になると考えられている。理論によって束縛されることを意図するものではないが、硬化性組成物を３７℃を超える温度にさらすことは、生理活性タンパク質及びポリマー又は架橋剤の共有結合を増加及び／又は促進させると考えられる。酵素は、そのプロセスを妨げる方法が提供されない場合には、高温で変性する傾向があることが知られている。しかしながら、本明細書の実施例で記載される８０℃などの高温における３０分間の硬化プロセスは、組み込まれた酵素の活性に関して大きな影響を及ぼさず、このことは、高温でより速く形成されるポリマーマトリクスが多点連鎖及び閉じ込めを介して組み込まれた酵素の安定化に寄与することを示している。高温での不利な溶剤のより速い蒸発速度もまた、酵素の活性の保持に寄与する場合がある。
【００５４】
したがって、特定の実施態様では、硬化性組成物は、硬化された組成物からの生理活性タンパク質の浸出を低下させるのに十分な時間にわたり３７℃を超える温度にさらされる。浸出は、周知の方法、例えば、本明細書の実施例において記載される方法によって測定される。
【００５５】
図２は、生理活性タンパク質及びポリマー又は架橋剤の共有結合による並びにタンパク質の物理的な捕捉による生理活性タンパク質の組み込みの概略図である。
【００５６】
タンパク質−ポリマー複合材料は、２成分の溶剤型ポリマー樹脂中に分散された生理活性タンパク質を含む本発明の実施態様に従って提供される。タンパク質−ポリマー複合材料の実施態様では、タンパク質−ポリマー複合材料中の生理活性タンパク質粒子の平均粒子サイズは１０μｍ以下（平均直径）であり、例えば、１ｎｍ〜１０μｍ（１ｎｍと１０μｍを含む）の範囲である。
【００５７】
特定の実施態様では、本発明に従って製造されるタンパク質−ポリマー複合材料はタンパク質−ポリウレタン複合材料である。
【００５８】
本明細書に記載の方法によって形成される硬化性組成物は、本発明の実施態様によるタンパク質−ポリマー複合材料の生物活性コーティングを形成するために基材に適用される。
【００５９】
典型的には、コーティングは、乾燥した場合に約１〜５００μｍの範囲の厚さを有するコーティングを製造するよう適用されるが、所望の用途に応じてより厚い又はより薄いコーティングを使用することができる。
【００６０】
硬化性組成物の適用は、例示としてスプレーコーティング、ディップコーティング、フローコーティング、ローラーコーティング、及びブラシコーティングを含む種々の方法のいずれかによって達成される。
【００６１】
基材は、コーティングが有利に適用される種々の基材のうちのいずれかである。例えば、基材はシート材料である。さらなる例では、基材は自動車部品、例えば、車体パネルである。
【００６２】
本発明による使用のための基材としては、特に限定されないが、金属基材、シリカ基材、プラスチック基材、及びガラス基材が挙げられる。
【００６３】
基材は、任意選択で、コーティング、例えば、プライマー、プライマーサーフェーサー、プライマーシーラー、ベースコート、接着促進層；又はそれらの若しくは他の表面処理コーティングの任意の組み合わせを含む。
【００６４】
本発明の実施態様によるタンパク質−ポリマー複合材料の生物活性コーティングは、基材に対する優れた接着、環境障害に対する保護、腐食に対する保護を提供し、生理活性タンパク質の生物活性特性をさらに提供する。したがって、本発明の実施態様によるタンパク質−ポリマー複合材料の生物活性コーティングは、多数の用途、例えば、酵素のための基材、又は受容体、抗体若しくはレクチンのためのリガンドである検体の検出において有用な基材上に酵素活性を提供する。特定の実施態様では、生物活性コーティングは、汚れ生成材料の１つ又は複数の成分の酵素消化によって汚れに対する抵抗性を提供する。
【００６５】
本発明の実施態様が以下の実施例において説明される。これらの実施例は例示を目的として与えられるものであり、本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。
【実施例】
【００６６】
［実施例１−溶剤型（ＳＢ）ポリウレタン（ＰＵ）コーティングを製造するための酵素溶液の直接的な分散］
典型的な調製において、まず、酵素を最大２００ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＩ水中に溶解した。幾つかの酵素、例えば、多量の不純物を含むα−アミラーゼ（Ａｍａｎｏ Ｅｎｚｙｍｅ社からのＫＬＥＩＳＴＡＳＥ ＳＤ８０）に関して、コーティングの調製のための使用前に濾過又は遠心分離が不溶性の固形物を除去するのに必要であった。ヒドロキシルで官能基化されたアクリル樹脂（Ｂａｙｅｒ社からのＤｅｓｍｏｐｈｅｎ Ａ ８７０ ＢＡ２．１ｇ）を選択された溶剤で２：１の質量比において希釈し、次いで、２０ｍｌのガラス製小びんにおいてシリコーン界面活性剤のポリエーテル改質ポリジメチルシロキサン（ｎ−ブタノール中ＢＹＫ ３３３溶液（１７ｗｔ％）０．１ｍｌ）及び酵素溶液（０．６ｍｌ）とともに１分間混合し、続いてＤｅｓｍｏｄｕｒ Ｎ ３６００（Ｂａｙｅｒ社）のヘキサメチレンジイソシアネート０．８ｇを添加し、さらに１分間混合した。混合した組成物を予備洗浄したアルミニウムの試験パネル上にドローダウン塗布器を用いて適用することによりコーティングを形成し、それをまず８０℃で３０分間、次いで室温で１週間硬化した。
【００６７】
［実施例２−天然の及び組み込まれた酵素に関する活性アッセイ］
α−アミラーゼの活性は、でんぷんの酵素触媒分解から放出された糖（主としてマルトース）の検出に基づいて比色分析により測定した。まず、６．７ｍＭの塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ、ｐＨ６．９のリン酸ナトリウム緩衝液中にジャガイモでんぷんを溶解することにより基質溶液を調製した。典型的なアッセイでは、α−アミラーゼ溶液の１０μｌアリコートを１ｍｌの基質溶液とともに室温で３分間温置した。続いて、３，５−ジニトロサリチル酸溶液１ｍｌを添加した。反応は、沸騰水中に反応小びんを１５分間温置し、続いて氷浴において冷却することにより停止した。還元糖の相当量を５４０ｎｍでの吸光度変化によって決定した。α−アミラーゼの活性の一単位は、２５℃、ｐＨ６．９、３分においてでんぷんから放出された還元糖（マルトースに対して先に測定された基準曲線から算出される）１．０ｍｇとして規定した。
【００６８】
タンパク質−ポリマー複合材料のコーティングにおけるα−アミラーゼの活性を、実施例１で調製したα−アミラーゼでコーティングした１つの試料パネル（１．２×１．９ｃｍ2）を酵素溶液の代わりに使用したこと以外は同様にして決定した。すべての活性試験の前に、コーティングは、物理的に吸収された酵素を除去するために少なくとも５回にわたりＤＩ水で十分にリンスした。リンス溶液を回収し、リンス溶液中のタンパク質の含有量をコーティング中のタンパク質充填量を算出するためのブラッドフォード試薬により決定し、α−アミラーゼ含有ＳＢ ＰＵコーティングの場合に約５０μｇタンパク質／ｃｍ2であった。
【００６９】
サーモリシンのタンパク質分解活性は以下のようにして決定した。リン酸ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．５）中０．６５％（ｗ／ｖ）のカゼイン溶液を試験用基質として使用した。天然サーモリシンに関して、酵素溶液２００μｌを３７℃で１０分間にわたり基質溶液１ｍｌとともに温置した。反応は、１１０ｍＭのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液１ｍｌを添加して停止し、ＴＣＡ可溶性成分中のチロシン相当量をフォーリンチオカルト試薬を用いて６６０ｎｍで決定した。活性の一単位は、３７℃で１分当たり１．０μｍｏｌのチロシンに相当する吸光度を得るためのカゼインを加水分解する酵素の量として規定する。コーティング中のサーモリシンの活性を、実施例１で調製したサーモリシンでコーティングした１つの試料プレート（１．２ｃｍ×１．９ｃｍ）を天然酵素溶液の代わりに使用したこと以外は同様にして決定した。すべての活性試験の前に、コーティングは、物理的に吸収された酵素を除去するために少なくとも５回にわたりＤＩ水で十分にリンスした。
【００７０】
［実施例３−アミラーゼ含有ＳＢ ＰＵコーティングの表面活性に関する溶剤タイプの効果］
酵素溶液の添加前にアセトン（−０．２３）、メチルエチルケトン（０．２９）、酢酸エチル（０．７）、メチルイソブチルケトン（１．３１）、酢酸ブチル（１．７）、トルエン（２．７）、ヘキサン（３．５）又はイソオクタン（４．５）を含む様々なｌｏｇ Ｐ値を有する溶剤を使用して樹脂を希釈したこと以外は、α−アミラーゼ含有ＳＢ ＰＵコーティングを実施例１において記載したのと同じ手順に従って調製した。得られたコーティングの表面活性及び安定性の観点での性能を評価して表１にまとめた。初期の表面活性に関してはあまり影響が見られなかったが、溶剤のタイプは酵素の安定性に影響を及ぼしている。例えば、−０．２３〜１．７の範囲のｌｏｇ Ｐ値では、組み込まれたα−アミラーゼの１０３℃における半減期は一貫して向上した。しかしながら、希釈溶剤としてトルエン（ｌｏｇ Ｐ＝２．５）を用いた場合には、それは大きく低下した。
【００７１】
［様々な温度での天然の及び組み込まれたα−アミラーゼの熱安定性（比較研究）］
実施例１と同様にして調製したα−アミラーゼに基づく生物活性コーティングの熱安定性を、室温（２３℃）から１２０℃の極めて高い温度までの特定の温度において決定した。重力オーブン（ｇｒａｖｉｔｙ ｏｖｅｎ）におけるエージングの特定期間の後、酵素を含まない試料と酵素含有コーティングの活性を実施例２と同様にして評価した。４０、８３、１００及び１２０℃の様々な高温における天然の及び組み込まれたα−アミラーゼの熱安定性をそれぞれ図３及び４に示す。天然酵素と比較すると、ＳＢ ＰＵコーティング中に組み込まれた酵素の耐熱性は非常に向上していた。組み込まれたα−アミラーゼの推定の半減期は、８３、１００及び１２０℃で約４６０、２００、３１時間であったのに対し、束縛を受けない非結合の天然同等物の半減期は、それぞれ約５０、１９、１時間であった。図４に示される４０℃などの比較的低い温度で温置する間は、組み込まれた酵素に関する活性の大きな損失は観測されず、推定の半減期は６６０日もの長さである。
【００７２】
ＳＢコーティング中の酵素は、水性（ＷＢ）コーティングと比較して酵素分子に対してより優れた保護を与えた。α−アミラーゼ含有コーティングを含む２Ｋ ＷＢ ＰＵコーティングを以下のようにして調製した。まず、Ｂａｙｈｙｄｒｏｌ ＸＰ ７０９３（Ｂａｙｅｒ社）のポリエステル樹脂１．５ｇを等体積の酵素溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）及び界面活性剤ＢＹＫ ３３３（１−ブタノール中１７％ｗ／ｖ）０．３６ｍｌと混合してＡ部分を形成し、それをＢ部分の硬化剤−水分散性ジイソシアネート（Ｂａｙｅｒ社からのＢａｙｈｙｄｒｏｌ ３０２、０．６ｇ）に添加した。１分間混合した後、コーティングを調製し、ＳＢコーティングに関して実施例１で記載したのと同じ手順に従って硬化した。図５に示すように、ＳＢ ＰＵコーティング中に組み込まれた酵素が３月後に８５％を超える相対活性を保持していたのに対し、水性（ＷＢ）ＰＵコーティング中の酵素は一定の活性低下を示し、半減期が約５０日であった。
【００７３】
［実施例５−ＳＢ−ＰＵコーティング中の酵素分布］
実施例１に記載されるよう調製したＳＢ ＰＵコーティング中のα−アミラーゼの分布は、蛍光染料標識及び共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）を用いて特性評価した。酵素含有コーティングは、５μＭのＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（マレイミド）中で暗い所において４℃で１６時間染色され、次いでｐＨ７のリン酸塩緩衝剤により室温で２時間リンスされた。顕微鏡上に試料を載せた場合にＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄの退色防止剤を使用した。対照標準として、酵素なしのコーティングを調製し、同じ手順に従って実験した。画像は６３倍の水浸対物レンズを用いて撮影した。励起及び最大放出波長は、それぞれ４８８ｎｍ及び５２４ｎｍであった。図６に示すように、酵素分子は、１μｍ未満から数μｍの範囲のサイズを有する小粒子の形態でコーティング中に分散されていた。
【００７４】
本明細書において言及したすべての特許文献又は刊行物は、それぞれの個々の刊行物がその参照により含められることを具体的にかつ個々に示したのと同程度にその参照により本明細書に含められるものとする。
【００７５】
本明細書に記載の組成物及び方法は、現在の好ましい実施態様の代表的なもの、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者であればそれらの変更及び他の用途を思い付くであろう。このような変更及び他の用途は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなくなしうるものである。
【図１Ａ】
2010260865.tif 000005
【図１Ｂ】
2010260865.tif 000006
【図３】
2010260865.tif 000007
【図４】
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【図５】
2010260865.tif 000009
【図２】
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【図６】
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【外国語明細書】
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