(57)【要約】【課題】トロウストチトリアレ目、トロウストチトリアレ目から抽出したω-３高度不飽和脂肪酸およびこれらの混合物の群から選択した微生物等を食品に配合することにより、動物用等の食用製品を調製する方法を提供すること。【解決手段】トロウストチトリアレ目、トロウストチトリアレ目から抽出したω-３高度不飽和脂肪酸、およびこれらの混合物からなる群から選択される微生物または抽出したω-３高度不飽和脂肪酸を、食用物質に配合することによつて食用製品を調製する。食用物質の具体例には、動物用食品、人間用食品があり、この食用製品に抗酸化剤を配合することが好適である。なお、前記の群の具体例には、トロウストチトリウム、シゾチトリウム、トロウストチトリウムから抽出されるω−３ＨＵＦＡ等がある。【選択図】図１
2010136730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機性炭素源、同化しうる窒素、海水の塩分濃度よりも低い塩分濃度、および少なくとも約１５℃の温度からなる培養基中で、トロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目の微生物から選択され、ω-３高度不飽和脂肪酸を効率よく生産し得る微生物を培養することを含む、ω-３高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔発明の詳細な説明〕
関連出願との相互関係
この出願は、１９８９年１１月１７日に出願され、「ω-３高度不飽和脂肪酸を高濃度で含む微生物産物のヘテロトロピックな製造方法」との名称の、共に係属中のかつ共通の譲渡人の米国特許出願第０７/４３９,０９３号の一部継続出願である。原出願は、その全体を本明細書中に参照として組み入れるものであり、また、先に明示的に放棄された１９８８年９月７日に出願され、「ω-３高度不飽和脂肪酸を高濃度で含む微生物産物のヘテロトロピックな製造方法」との名称の、米国特許出願第０７/２４１,４１０号の一部継続出願である。
【０００２】
〔発明の属する技術分野〕
本発明の分野は、ヘテロトロピック（従属栄養的）生物及び、食品添加物として人間や動物が消費するのに好適な、あるいは薬学的、工業的製品中で使用するのに好適なω-３高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）を高濃度で含む脂質を製造するために該生物を培養する方法に関する。
【０００３】
本発明の説明において、「ＡＴＣＣ番号」とは、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルの the Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection（ＡＴＣＣ）に寄託された株の受託番号を意味しており、文中、「ＡＴＣＣ番号ＸＸＸＸＸ」は、特に説明されていない限り、ＡＴＣＣに寄託された株のうちの受託番号ＸＸＸＸＸの株を指す。
【背景技術】
【０００４】
〔従来の技術〕
ω-３高度不飽和脂肪酸は、動脈硬化症及び冠状動脈心疾患の予防、炎症状態の軽減、並びに腫瘍細胞の増殖抑制のための重要な食餌療法用化合物として近年認識されてきており、工業的に多大な興味をもたれている。これらの有益な効果は、ω-３高度不飽和脂肪酸がω-６脂肪酸から合成される化合物の競争的阻害を引きおこすこと及び、ω-３高度不飽和脂肪酸それ自体から直接合成される有益化合物の両者によりもたらされる（Simopoulos 他, 1986)。ω-６脂肪酸は植物及び動物中で見出される主な高度不飽和脂肪酸である。近年、ω-３高度不飽和脂肪酸の商業的な食用物として入手源は唯一ある種の魚油からであり、この魚油はこれらの脂肪酸を２０〜３０％まで含み得る。これらの脂肪酸の有益な効果は、週に数回魚を食べるか、あるいは濃縮魚油を毎日摂取することによって得ることができる。このため多量の魚油が毎年、食用補助剤として販売するために加工され、カプセル化されている。
【０００５】
しかしながら、これらの魚油補助剤にはいくつかの重大な問題がある。第一に、これらには天然に魚油中に見いだされる脂溶性ビタミンが高濃度に含まれている。摂取すると、これらのビタミンは、尿中に排泄されるよりもむしろ、人間の脂肪中に蓄積され、代謝される。これらのビタミンを大量に与えると、腎臓障害や失明もたらす点で、安全性に問題があり、いくつかのアメリカの医学会が実際の魚よりもむしろカプセル補助剤を用いることに対して警告を発している。第二に、魚油は飽和脂肪酸及びω-６脂肪酸を８０％まで含有しており、これら両方の脂肪酸は健康上、悪い影響をもたらし得る。そのうえ、魚油は強烈な魚の味と臭いを持っており、そのままでは食用製品の味に悪い影響を与えることなく、食品添加物として加工食品に添加することはできない。さらに、この混合物から純粋なω-３高度不飽和脂肪酸の単離は、高価なプロセスを含んでいるため、これらの脂肪酸の純品は高価格（２００〜１０００ドル／g）となっている（Sigma Chemical Co., 1988； CalBiochem Co., 1987)。
【０００６】
魚油中のω-３高度不飽和脂肪酸の天然源は藻類である。これらの高度不飽和脂肪酸は光合成膜の重要な成分である。ω-３高度不飽和脂肪酸は食物連鎖中に蓄積され、最終的に魚油中に取り込まれる。バクテリヤや酵母はω-３高度不飽和脂肪酸を合成することはできず、二、三のカビが微量のω-３高度不飽和脂肪酸を産生し得ることが知られているのみである（Weete, 1980； Wassef, 1977; Erwin, 1973)。
【０００７】
藻類は、バイオマスを含むω-３高度不飽和脂肪酸を含有する多種の産物を光合成栄養的に生産するため戸外培養池で生育されている。例えば、米国特許第４,３４１,０３８号には藻類から油の光合成的な製造方法が記載されており、また米国特許第４,６１５,８３９号には緑藻類クロレラの数種によって光合成的に製造されるエイコサペンタエン酸（ω-３高度不飽和脂肪酸の一種）の濃縮方法が記載されている。光合成栄養法は、光をエネルギー源として使用して、細胞が光合成プロセスにより二酸化炭素と水から有機化合物を構築するプロセスのことである。太陽光がこのタイプの産生系のドライビングホース（駆動力）であるので、藻類培養池が、経済的に成り立つためには、大表面積（広い土地）を必要とする。規模が大きいため、コストが高くつきまた技術的に問題があるので、これらの系を経済的にカバーすることは不可能である。さらに、たとえ透明なカバーであっても、太陽光のかなりの部分をブロックしやすいという問題もある。したがって、このような生産システムは無菌的ではなく、単一培養として維持するのは難しい。このことは、培養において所望の産物を生産するのに操作したり、ストレスをかけたり（例えば窒素量を制限する）することが必要な場合には、特に重大な問題となる。典型的には、不純物が培養系に容易に侵入するのは、細胞が産物のみを生産し、増殖しない、ストレス下にあるこのこの期間である。そこで、多くの場合、産生されたバイオマスは、脂質を回収するためにコストのかかる抽出プロセスを経ずには、人間が消費するための食品添加物としては望ましいものとはならない。そのうえ、戸外系での藻類の光合成的生産は非常にコストがかかる。これは、栽培系への入力光の減少を避けるために、低密度（１〜２g/ｌ）に培養系を維持しなくてはならないからである。この結果、少量の藻類を回収するのに大量の水を処理する必要があり、また、藻類細胞は大変小さいので、コストのかかる採集プロセスを使用しなくてはならない。
【０００８】
混合栄養法は生産の別法であり、この方法では藻類のある種の株が必要なエネルギー源として光を用いて光合成を行うが、付加的に系中に有機化合物を供給する。混合栄養法によってより高密度化を達成することができ、培養を無菌生産用の密閉反応器中で維持することができる。米国特許第３,４４４,６４７号及び第３,３１６,６７４号に、藻類の混合栄養的生産方法が記載されている。しかしながら、培養基に光を供給する必要があるため、このタイプの生産反応器は建造及び操作が極めて高価であり、しかも培養密度は依然として非常に制限されている。
【０００９】
ω-３高度不飽和脂肪酸生産のための藻類の培養におけるもう一つの問題は、ω-３高度不飽和脂肪酸がある株の全脂肪酸の２０〜４０％を構成するとしても、これらの藻類の全脂肪酸含量は一般に極めて低く、灰分を除いた乾燥重量の５〜１０％程度であることである。細胞の脂肪酸含量を増大させるために、脂質の産生を刺激する窒素量制限期間を設けなくてはならない。しかしながら、これまでに文献に記載されたすべての株のうち、本発明者が評価した６０以上の株において、すべての株が窒素制限下において全脂肪酸中のパーセントとしてω-３高度不飽和脂肪酸の顕著な減少をもたらした（Erwin, 1973； Pohl & Zurheide, 1979)。
【００１０】
経済性及びω-３高度不飽和脂肪酸の食品添加物としての使用の観点からは、これらの脂肪酸をヘトロトロピック培地中で生産することが望ましいであろう。ヘテロトロピー（従属栄養）とは、暗所での持続的かつ連続的な生育及び細胞分裂のための能力のことであり、細胞炭素は唯一有機化合物の代謝で得られる。光をヘテロトロピック培地に供給する必要はないので、密閉反応器中極めて高密度で培養物を生育することができる。ヘテロトロピック生物とは、エネルギー及び細胞炭素を有機基質から得る生物のことであり、暗所で増殖できる。ヘテロトロピック条件とは、光が存在するしないにかかわらず、ヘテロトロピック生物が生長できる条件のことである。しかしながら、藻類のほぼ大部分は、主として光合成栄養的であり、ほんの二、三のヘテロトロピック藻類が知られているにすぎない。米国特許第３,１４２,１３５号及び第３,８８２,６３５号に、クロレラ（Chlorella)、スポンジオコクム（Spongiococcum)、及びプロトセカ（Prototheca）のような藻類からのタンパク質及び色素のヘテロトロピックな生産方法が記載されている。しかしながら、従属栄養的に非常に良好に生長すると記されているこれらの属及び他のもの（例えば、セネデスムス（Scenedosmus)）は、ω-３高度不飽和脂肪酸を産生しない（Erwin, 1973)。多少なりともω-３高度不飽和脂肪酸を産生することが知られている極めて少数のヘテロトロピック藻類（例えば、アポクロロティック珪藻又はアポクロロティック双鞭毛藻類）は、一般に生長が遅く、灰分を除いた乾燥重量の数％という少ない量のω-３高度不飽和脂肪酸を産生する（Harrington と Holfz, 1968； Tornabene 他、1974)。
【００１１】
二、三の高級菌類がω-３高度不飽和脂肪酸を産生することが知られているが、これらは細胞中で全脂肪酸のほんの少ない部分を構成するにすぎない（Erwin, 1973； Wassef, 1977； Weete, 1980)。このように、それらはω-３高度不飽和脂肪酸の工業的生産の良い候補とは考えられない。例えば、ヤマダら（1987）は最近、ω-６脂肪酸、アラキドン酸の生産のために、いくつかの種の細菌、クサレケカビ（Morfierella)（土壌より単離）の培養について報告している。これらの細菌は、低温（５〜２４℃）で生育すると、アラキドン酸と共に、ω-３エイコサペンタエン酸をも少量産生する。しかしながら、得られるエイコサペンタエン酸の含量は、細胞の乾燥重量のわずか２.６％にすぎず、これらの種の中でこの脂肪酸の産生を促進するのに必要な低い温度は、培養系の産生能（及び経済性）の大巾な減少をもたらす。
【００１２】
トロウストチトリアレ目の単細胞類のいくつかも、ω-３高度不飽和脂肪酸を産生することが知られている（Ellenbogen, 1969； Wassef, 1977； Weete, 1980； Findlay 他、1986）が、これらは培養するのが難しいとされている。Sparrow (1960) はトロウストチトリアセ族（トロウストチトリアレ目）の葉状体 (thalli) の微小さと単純な性質が、増殖を極めて困難なものにしていると述べている。この困難さの他の理由が Emerson (1950) によって大まかに挙げられ、Schneider (1976) によってまとめられている： 「 1) これらの菌類はただ１個か数個の細胞の非常に小さな葉状体から成っており、一般に極めて生長が遅く、環境の変化に極めて敏感である； 2) それらは一般に極めて特殊な栄養上及び環境上の必要を有する腐生植物か寄生植物である； 3) 純粋な培地中で、それらは一般に、二、三世代で終わってしまう栄養増殖という、限られた増殖を示す。」（いくつかの先行文献はトロウストチトリドを菌類として分類しているが、最新の共通認識においては、藻類として分類すべきだとされている。以下の記載を参照のこと)。その結果、これらの微生物の数多くの目に対してほとんど注意が向けられていない。これまでになされた研究は、主として分類学的及び生態学的な観点からなされている。例えばトロウストチトリアレのいくつかの構成菌が単純な脂肪酸分布をもっていることが混合栄養的見地から報告されているけれども（Ellenbogen, 1969； Findlay 他、1986)、その全脂肪酸含量あるいは脂質含量の乾燥重量パーセントとしての報告はまったくない。全脂質含量についてのデータが手に入らない限り、任意のタイプの脂肪酸の生産への使用について、ある生物の能力を評価することはできない。例えば、いくつかの海洋性大藻類（海藻類）の脂質中のω-３高度不飽和脂肪酸含量は全脂肪酸の５１％にも達して非常に高いと報告されている（Pohl とZurheide, 1979)。しかしながら、大藻類の脂質含量は一般に少なく、細胞の乾燥重量の１〜２％にすぎない（Ryther, 1983)。したがって、大藻類の脂肪酸中でのω-３高度不飽和脂肪酸の含量は高いと報告されているにもかかわらず、ω-３高度不飽和脂肪酸の生産のための候補となる生物としては、不適格と考えられる。本発明者による熱心な探索にもかかわらず、トロウストチトリアレの簡単なおよその分析（タンパク質、炭水化物、及び脂質の％）報告は見い出されず、その分類学、生理活性あるいは生態学についての実験室的な研究以外の目的でこれらの種を培養する試みは全く報告されていない。さらに、これらの微生物の多くの種は、簡単なポーレンバイティング（pollen baiting）法によって単離されている（例えば、Gaertner, 1968)。ポーレンバイティング法はトロウストチトリアレの構成員に極めて特異的ではあるが、微生物の大規模培養に望ましい任意の特徴について選択するものではない。
【００１３】
このように、本発明に至まで、ω-３高度不飽和脂肪酸を実用的なレベルで産生する培養に適したヘテロトロピックな生物は知られておらず、このような生物は自然環境中には極めて希であると考えられていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ヘテロトロピック（従属栄養的）生物及び、食品添加物として人間や動物が消費するのに好適な、あるいは薬学的、工業的製品中で使用するのに好適なω-３高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）を高濃度で含む脂質を効果的に製造するための該生物並びにそれを培養する方法およびそれを用いた食用製品を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
〔１〕  有機性炭素源、同化しうる窒素、海水の塩分濃度よりも低い塩分濃度、および少なくとも約１５℃の温度からなる培養基中で、トロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目の微生物から選択され、ω-３高度不飽和脂肪酸を効率よく生産し得る微生物を培養することを含む、ω-３高度不飽和脂肪酸の製造方法。
〔２〕  さらに、ω-３高度不飽和脂肪酸もしくはトロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目の微生物から選択され、ω-３高度不飽和脂肪酸を効率よく生産し得る微生物の収穫後の加工の間に、ＢＨＴ，ＢＨＡ，ＴＢＨＱ，エトキシキュイン、β-カロテン、ビタミンＥおよびビタミンＣからなる群より選択される化合物を、ω-３高度不飽和脂肪酸もしくはトロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目の微生物から選択され、ω-３高度不飽和脂肪酸を効率よく生産し得る微生物に添加することを含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕  さらに、トロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目の微生物から選択され、ω-３高度不飽和脂肪酸を効率よく生産し得る微生物から脂質を抽出することを含む、〔１〕に記載のω-３高度不飽和脂肪酸の製造方法。
〔４〕  上記の抽出において、
a)  微生物細胞を破砕して破砕細胞を得、
b)  破砕細胞から脂質混合物を溶媒抽出し、
c)  脂質混合物を加水分解し、さらに、
d)  上記脂質混合物中で非高度不飽和脂肪酸を冷却結晶化する
ステップを含む、〔３〕に記載の方法。
〔５〕  ＡＴＣＣ番号２０８８８のシゾチトリウム、ＡＴＣＣ番号２０８８９のシゾチトリウム、ＡＴＣＣ番号２０８９０のトロウストチトリウム、ＡＴＣＣ番号２０８９１のトロウストチトリウム、ＡＴＣＣ番号２０８９２のトロウストチトリウムのいずれかから誘導される、トロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目に属する変異株たる微生物であって、ω-３高度不飽和脂肪酸を産出し得るもので、広範な温度範囲、特に約１５℃〜４８℃の間で生育でき、広範な塩分レベル、特に例えば５〜４０mmho/cmの間の電導率をもたらす塩分レベルのような低い塩分レベルで生育でき、そして、フィラメント状ではない微生物からなる群から選択される単細胞微生物。
〔６〕
a)  (ｉ)  ＡＴＣＣ番号２０８８８のシゾチトリウムから誘導される、トロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目に属する変異株たる微生物であって、ω-３高度不飽和脂肪酸を産出し得るもので、広範な温度範囲、特に約１５℃〜４８℃の間で生育でき、広範な塩分レベル、特に例えば５〜４０mmho/cmの間の電導率をもたらす塩分レベルのような低い塩分レベルで生育でき、そして、フィラメント状ではない微生物；
(ii)  ＡＴＣＣ番号２０８８９のシゾチトリウムから誘導される、トロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目に属する変異株たる微生物であって、ω-３高度不飽和脂肪酸を産出し得るもので、広範な温度範囲、特に約１５℃〜４８℃の間で生育でき、広範な塩分レベル、特に例えば５〜４０mmho/cmの間の電導率をもたらす塩分レベルのような低い塩分レベルで生育でき、そして、フィラメント状ではない微生物；
(iii)  ＡＴＣＣ番号２０８９０のトロウストチトリウムから誘導される、トロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目に属する変異株たる微生物であって、ω-３高度不飽和脂肪酸を産出し得るもので、広範な温度範囲、特に約１５℃〜４８℃の間で生育でき、広範な塩分レベル、特に例えば５〜４０mmho/cmの間の電導率をもたらす塩分レベルのような低い塩分レベルで生育でき、そして、フィラメント状ではない微生物；
(iv)  ＡＴＣＣ番号２０８９１のトロウストチトリウムから誘導される、トロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目に属する変異株たる微生物であって、ω-３高度不飽和脂肪酸を産出し得るもので、広範な温度範囲、特に約１５℃〜４８℃の間で生育でき、広範な塩分レベル、特に例えば５〜４０mmho/cmの間の電導率をもたらす塩分レベルのような低い塩分レベルで生育でき、そして、フィラメント状ではない微生物；
(ｖ)  ＡＴＣＣ番号２０８９２のトロウストチトリウムから誘導される、トロウストチトリウム属およびシゾチトリウム属を除くトロウストチトリアレ目に属する変異株たる微生物であって、ω-３高度不飽和脂肪酸を産出し得るもので、広範な温度範囲、特に約１５℃〜４８℃の間で生育でき、広範な塩分レベル、特に例えば５〜４０mmho/cmの間の電導率をもたらす塩分レベルのような低い塩分レベルで生育でき、そして、フィラメント状ではない微生物；
からなる群から選択される微生物、またはこれらから抽出された脂質と、
b)  食用物質と
を含む、食用製品。
本発明は、その大部分がω-３高度不飽和脂肪酸である脂肪酸を高濃度で有する微生物を含むω-３高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）を高濃度で含有する食用製品に関する。さらに、あるいは、別に、この食用製品は微生物から抽出したω-３ＨＵＦＡを含み得る。特に、その微生物はトロウストチトリアレつまりトロウストチトリウム又はシゾチトリウムである。微生物又は抽出したω-３ＨＵＦＡは添加用の食品材料（食用物質）に加えられる。この食品材料は動物用食品や人間用食品のどちらでもよい。本発明の食用製品は微生物の細胞を破壊することにより、その中に含まれるω-３ＨＵＦＡの生物学的利用性を増大させてもよい。食用製品はまた、押出し加工してもよい。ω-３ＨＵＦＡの劣化を防止するために、食用製品は非酸化性条件下に包装してもよく、あるいはさらに抗酸化剤をふくんでいてもよい。
【００１６】
本発明の他の態様は、動物にトロウストチトリウム又はそれから抽出したω-３ＨＵＦＡを食べさせることを含む動物の飼育方法に関する。本発明の方法で飼育する動物としては、家禽類、牛、豚及び魚、エビ、貝などの海洋生物が挙げられる。ω-３ＨＵＦＡは、これらの動物の肉、卵及び他の製造中に取り込まれる。ω-３ＨＵＦＡは、全細胞微生物製品、抽出ω-３ＨＵＦＡ製品、又はω-３ＨＵＦＡを取り込んだ動物もしくは動物製品の形で消費される。本発明に従って生産されるω-３ＨＵＦＡを人間がより多く摂取すると、心血管疾患、炎症、及び／又は免疫学的疾患、並びに癌の予防もしくは治療に効果的である。
【００１７】
本発明のさらに他の態様は、培養基中で、有機性炭素源と同化しうる窒素源と共にトロウストチトリアレを培養することを含む、ω-３ＨＵＦＡの生産方法である。好ましくは、有機性炭素源と同化しうる窒素源は粉砕穀物からなる。この方法はさらに、トロウストチトリウム、シゾチトリウム又はこれらの混合物からなるトロウストチトリアレを、栄養制限条件下もしくは窒素制限条件下に、効果的な時間のあいだ、好ましくは約６〜２４時間培養し、ついでトロウストチトリアレを微生物中のω-３ＨＵＦＡの濃度を高めるために窒素制限期間のあいだに、収穫することを含む。この方法はさらに、ω-３ＨＵＦＡの劣化を防止するために、収穫後の加工中に、ＢＨＴ，ＢＨＡ，ＴＢＨＱ、エトキシキュイン、β-カロチン、ビタミンＥ、及びビタミンＣからなる群から選択される抗酸化剤を添加することを含む。この方法はさらに、培養中に低温として微生物にストレスをかけること、培養中に培地を高溶存酵素濃度に維持すること、並びに微生物の持続的な生長をもたらすために有効量のリン及び微生物生長因子（酵母エキスあるいはコーン浸漬液）を培地に加えることを含む。本方法はさらに、ＡＴＣＣ番号２０８８８，２０８８９，２０８９０，２０８９１，２０８９２及びこれら由来の変異株と同様な特性を有する単細胞微生物を培養することを含む。これらの方法で生産されたω-３ＨＵＦＡは次いで微生物から抽出された脂質から分別結晶法により単離し得る。この方法は、微生物細胞を破砕し、破砕細胞から脂質混合物を溶媒で抽出し、脂質混合物を加水分解し、不ケン化化合物を除去し、さらに脂質混合物中の非ＨＵＦＡを冷時結晶化することを含む。
【００１８】
本発明の別の態様は、ヘテロトロピックな増殖が可能であり、またω-３ＨＵＦＡを産生し得る水中で生息する単細胞微生物を選択する方法である。この方法は、天然由来の浅い海水の生息地から収集した微生物の小集団から約１μm〜２５μmの間のサイズの微生物を選択し、有機性炭素、同化しうる窒素、同化しうるリン、及び微生物生長因子を含む培養基中、ヘテロトロピック条件下で微生物を培養し、ついで、粗いあるいは織り目様の表面を有する、透明な、白色、オレンジ色もしくは赤色のフィラメント状ではないコロニーを選択することを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】トロウストチトリウム sp.ＵＴ４２-２（ＡＴＣＣ番号２０８９１）を試験株として用いての、種々の培養基補足剤の脂肪酸収量への影響を示す棒グラフである。上記の株は本発明の選択方法に従って単離した。実験方法は実施例２に記載する。縦軸：補足剤なしのＦＦＭ培養基であるコントロールを基準とした脂肪酸収量。横軸： 1）２ｘ「Ｂ」−ビタミンミックス、 2）２ｘ「Ａ」ビタミンミックス、 3）２ｘＰＩ金属類、 4）２８mg／ｌ ＫＨ2ＰＯ4、 5） 2）と 3) と 4）の組合せ処理、及び 6）４８０mg／ｌ ＫＨ2ＰＯ4、の特定的な添加。
【図２】高度不飽和脂肪酸産生量をグラフで示したものであり、□は本発明で新たに単離した株について示し、★は先に単離されていた株について示す。各点はある株を示し、各点の位置は、ω-３高度不飽和脂肪酸の全脂肪酸中の重量％（横軸）及びω-６脂肪酸である脂肪酸全ての重量％（縦軸）により決定される。本発明の株のみが、全脂肪酸の１０.６％（ｗ／ｗ）未満がω-６であり、全脂肪酸の６７％以上がω-３である点にプロットされた。表４からのデータ。
【図３】高度不飽和脂肪酸産生量をグラフで示したものであり、□は本発明で新たに単離した株について示し、★は先に単離されていた株について示す。各点はある株を示し、各点の位置は、ω-３高度不飽和脂肪酸の全脂肪酸中の重量％（横軸）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ Ｃ２０:５ｗ３)（縦軸）である全脂肪酸の重量％より決定される。本発明の株のみが、全脂肪酸の６７％（ｗ／ｗ）以上がω-３であり、全脂肪酸の７.８％（ｗ／ｗ）以上がＣ２０:５ｗ３である点にプロットされる。
【図４】ω-３高度不飽和脂肪酸組成をグラフで示したものであり、□は本発明で新たに単離した株について示し、★は先に単離されていた株について示す。各点は別々の株を示す。横軸上の値はＣ２０:５ｗ３である全ω-３高度不飽和脂肪酸の重量比率であり、縦軸上の値はＣ２２:６ｗ３である全ω-３高度不飽和脂肪 酸の重量比率である。本発明の株だけが、Ｃ２０:５ｗ３の重量比率２８％以上か、あるいはＣ２２:６ω３の重量比率９３．６％以上のいずれかを示す点にプロットされた。
【図５】本発明の新たに単離された種々の株及びこれまでに単離されていた株の、２５℃及び３０℃での増殖を示すグラフである。増殖速度は２５℃でのＵ-３０株の成長速度を基準として規格化して示してある。先に単離されていた株は、そのＡＴＣＣの受託番号で示している。１日あたりの細胞数倍化についての数値データを表５に示す。
【図６】窒素制限によって誘導した後の、細胞での全産生量のグラフである。灰分を除いた乾燥重量、全脂肪酸及びω-３高度不飽和脂肪酸のそれぞれを、図示したように、２８２１１株の対応する値を基準にして規格してプロットした。すべての株はＡＴＣＣの受託番号によって同定している。
【図７】横軸上に示した塩分濃度を含む培養基中で増殖後の、脂肪酸収量のグラフである。示した株は、新たに単離したＳ３１株（ＡＴＣＣ番号２０８８８）（■）とＵ４２-２株（ＡＴＣＣ ２０８９１)（＋)、及びすべてに単離されていた株であるＡＴＣＣ番号２８２１１（＊）とＡＴＣＣ番号２８２０９（□）である。脂肪酸収量は、試験した塩分濃度範囲においてＳ３１株（ＡＴＣＣ番号２０８８８）が示した平均増殖速度に基づいて、適当な値を１.００として規格化した相対収量でプロットしている。
【図８】実施例１の方法で単離したトロウストチトリド株（ＡＴＣＣ番号２０８９０）で飼育した、塩水エビ、Ａrtemia salina 中の全脂質のω-３高度不飽和脂肪酸含量の増加を示すグラフである。ＥＰＡ＝Ｃ２０:５ｗ３；ＤＨＡ＝Ｃ２２:６ｗ３。
【図９】実施例１の方法で単離したトロウストチトリド株（ＡＴＣＣ番号２０８８８）で飼育した塩水エビ、Ａrtemia salina 中の全脂質のω-３高度不飽和脂肪酸含量の増加を示すグラフである。ＥＰＡ＝Ｃ２０:５ｗ３；ＤＨＡ＝Ｃ２ ２:６ｗ３。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
この出願全体を通しての定義として、本明細書中、脂肪酸とは脂肪族モノカルボン酸のことであると理解されたい。脂質とは、ホスファチド類、ステロイド類、アルコール類、炭化水素類、ケトン類、及び関連化合物を伴った脂肪酸のグリセリドエステルを包含する油脂類のことであると理解されたい。
【００２１】
一般に使用されている略記システムを本明細書中でも脂肪酸の構造を表現するのに使用している（例えば、Weete, 1980)。このシステムでは、炭化水素鎖中の炭素数を示す数字を伴った文字「Ｃ」を用い、これにコロンと二重結合の数を示す数字が続く。つまり、Ｃ２０:５はエイコサペンタエン酸を表す。脂肪酸はカルボニル炭素から番号づけを始める。二重結合の位置はギリシヤ文字デルタ（Δ）に二重結合の炭素数を付けて表す。すなわち、Ｃ２０:５ω-３Δ5,8,11,14,17というふうに。「ω」表示は不飽和脂肪酸についての略記システムであり、カルボキシ末端炭素から番号づけが使用される。便宜上、特に本明細書中で数字略記命名法を用いる場合に、ｗ３が「オメガ-３」を記号化するために使用される。ω-３高度不飽和脂肪酸は、最後のエチレン性結合が脂肪酸の末端メチル基を含んでそれから三炭素であるポリエチレン性脂肪酸であると理解される。従って、一つのω-３高度不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸の完全な命名は、Ｃ２０:５ｗ３Δ5,8,11,14,17  となる。簡単化のために、二重結合位置（Δ5,8,11,14,17）は省略されうる。そこでエイコサペンタエン酸はＣ２０:５ｗ３と表示され、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２:５ｗ３Δ7,10,13,16,19）はＣ２２:５ｗ３であり、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２:６ｗ３Δ4,7,10,13,16,19）はＣ２２:６ｗ３である。「高度不飽和脂肪酸」なる命名は、４個あるいはそれ以上の二重結合をもつ脂肪酸を意味する。「飽和脂肪酸」は１〜３個の二重結合をもつ脂肪酸を意味する。
【００２２】
ω-３高度不飽和脂肪酸生産のために、経済的に望ましい以下の特性の組合せを有する多くの微生物株を容易に単離するために、本発明者は収集及びスクリーニング法を開発した: 1）ヘテロトロピックな生長（増殖）が可能； 2）ω-３高度不飽和脂肪酸が高含量； 3）単細胞； 3）好ましくは、飽和及びω-６高度不飽和脂肪酸が低含量； 5）好ましくは、色素をもたず、白色もしくは実質的に無色の細胞； 6）好ましくは、耐熱性であること（３０℃以上の温度で生育できること）；並びに 7）好ましくは、広塩性（広範囲の塩分濃度にわたって、特に低塩分濃度で生育できること)。
【００２３】
多数の適したヘテロトロピック株の収集、単離及び選択には、以下の方法が伴い得る。適切な水試料と生物は、一般に、好ましくは、広範囲の温度及び塩分変動をうける浅い塩水生息地から収集できる。これらの生息地としては、海の潮だまり、河口（河潟）及び内陸部の塩水池、泉、プラヤ及び湖が挙げられる。これらの収集地の特定の例として、 1）コロラド州のグレンウッドスプリングスにあるコロラド川に沿った所、あるいはユタ州のスタンズバリイ山脈の西側の端に沿った所のような暖かい塩水泉； 2）ユタ州のゴシェンの近くにあるゴシェンプラヤのようなプラヤ； 3）カリフォルニア州のラ・ジョラのバードロックス地域にあるような海の潮だまり； 4）カリフォルニア州のサンジエゴ郡のチアジュアナ河口のような河口がある。水試料と共に、いくらかの生きた植物分と天然由来の岩屑（分解しつつある植物及び動物分）を含むようにとくに努力する。その後、試料は実験室に戻るまで冷蔵する。水試料を１５〜３０秒間振とうしたのち、フィルターユニットへ、例えば１〜１０mｌをピペットで取るか、一部を注ぐかすればサンプリング時の誤差が最小となる。フィルターユニットは２つのタイプのフィルターを含んでいる。すなわち 1）上部に、減菌したワットマン＃４フィルター（商標、ワットマン社、クリフトン、Ｎ.Ｊ.)；及び 2）ワットマンフィルターの下に、１.０μm孔径のポリカーボネートフィルターである。第一の（上部の）フィルターの目的は、約２５μm以上の大きさのすべての粒子分を除去することであり、一般的には単細胞タイプの物質のみが１.０μmのポリカーボートフィルター上へ透過しうる。第一のフィルターは、他のコロニーの増殖する機会を増大させるより高い温度でのポリカーボネートフィルターの培養において引き続いて増殖するカビのコロニーの数を著しく減少させる。カビの胞子は海辺の塩水及び内陸の塩水中に非常に多数であり、カビのコロニーはスクリーニングで除かないと、寒天プレート上を急速に覆いつくしてしまう。１.０μmサイズのポリカーボネートフィルターは、バクテリヤの多くが通り抜けてろ液に行くようにと選択された。サンドイッチ型のフィルターデザインを使用した目的は、単細胞生物のうち大きさが直径で約１μmから約２５μmの範囲の細胞の少なくとも一部を選択することである（大規模の生産用の発酵システムにおいて、潜在的に容易に増殖しうる生物)。これらの単細胞生物のさらなる増殖は、寒天プレート上でポリカーボネートフィルターを培養することによって促進することができる。フィルター上で増殖する生物間の競争は、単細胞微生物の競争的な強健な株を単離しやすくする。上述の方法によって選択される単細胞の水生微生物は、生育条件及び増殖サイクルの段階に応じてある範囲の細胞の大きさを示す。培養物中の大部分の細胞は、約１μm〜約２５μmの範囲の直径を有している。ただし、培養物中の（葉状体及び胞子嚢）細胞は（株により異なるが）約６０μmまでのより大きな直径をもつことが見出され得る。
【００２４】
ろ過ののち、ポリカーボネートフィルターを塩水培養基を含む寒天プレート上に置く。この培養基は、グルコース、種々のでんぷん、糖蜜、粉砕コーン等の炭水化物のような有機性炭素源、硝酸塩、尿素、アンモニウム塩、アミノ酸のような同化性有機もしくは無機窒素源；酵素エキス、ビタミン及びコーン浸漬液の一種以上に含まれる微生物生育因子；有機もしくは無機の同化性リン源；並びに重炭酸塩のようなpＨ緩衝剤を含有している。微生物生長因子は、菌類や藻類を含む単細胞微生物のヘテロトロピックな生長を促進する未だ特定されていない化合物である。寒天プレートは暗所にて２５〜３５℃（３０℃が好ましい）で培養することができ、２〜４日後に、多数のコロニーがフィルター上に出現する。目的の生物を１プレートあたり１〜５コロニー回収することは珍しくない。酵母のコロニーは色（しばしばピンク色である）またはその形態のいずれかによって区別し得る。酵母コロニーは滑らかであるが、目的の生物はざらざらしたあるいは織り目様の表面を有するコロニーを形成する。目的の生物は個々の細胞をコロニーの境界で微細顕微鏡を通して見ることができるが、酵母細胞は小さいために区別できない。カビ及びより高級な菌類のコロニーは、目的生物はフィラメント状ではないのに、それらはフィラメント状であるので、目的生物と区別し得る。透明なあるいは白色のコロニーをプレートからつまみとり、同様の培養基組成の新しいプレート上に再ストリークし得る。大部分の目的生物は透明あるいは白色であるが、いくつかは、キサントフィル色素の存在により橙色あるいは赤色であり、同様に選択と再ストリークに適している。新しいプレートは同様の条件下（好ましくは３０℃）で培養することができ、２〜４日の培養期間で単一のコロニーをつまみとることができる。その後、単一コロニーをつまみとり、例えば寒天プレート中と同じ有機添加物（寒天をのぞいて）を含む液体培養基５０mｌ中へいれることができる。これらの培養物は３０℃で、空気を吹き込みながら、例えば回転振とうテーブル（１００〜２００rpm）上で２〜４日間培養し得る。培養物が最高密度にまで達したと思われるときに、２０〜４０mｌの培養物を次いで遠心分離あるいは他の適切な方法で収穫し、例えば凍結させて保存することができる。次に、試料をガスクロストグラフィーを含む標準的で周知の方法により分析して、その株の脂肪酸含量を同定することができる。ω-３高度不飽和脂肪酸を含む株をこのようにして同定することができ、これらの株の培養物をさらなるスクリーニング用に維持し得る。
【００２５】
有望な株を、５０mｌの培養基を含む２５０mｌの振とうフラスコにその株を移植することにより、温度許容性についてスクリーニングし得る。次いで、これらの培養物を２日間、振とうテーブル上で、任意の所望の温度範囲、最も実用的には、２７〜４８℃の間で一つの培養物毎に３℃間隔としてインキュベートする。産生量を培養基１mｌあたりの産生された脂肪酸の全量で定量しうる。全脂肪酸は上記のようにガスクロマトグラフィーで定量できる。同様の方法を、塩分許容性についてのスクリーニングに使用し得る。塩分許容性については、大部分の目的に対して、５〜４０mmho／cmの導電率を与える塩分濃度範囲が適当である。種々の炭素源及び窒素源を使用する能力についてのスクリーニングも同様に上で概要を説明した方法を用いて行うことができる。ここで、炭素源及び窒素源の評価は５g／ｌの濃度で行った。評価した炭素源は、グルコース、コンスターチ、粉砕コーン、じゃがいもデンプン、小麦でんぷん及び糖蜜である。評価した窒素源は、硝酸塩、尿素、アンモニウム、アミノ酸、タンパク質加水分解物、コーン浸漬液（コーンスティープ液)、トリプトン、ペプトン、又はカゼインである。他の炭素源及び窒素源も使用することができ、ユーザーが重要とする基準に基づき、この技術分野の当業者が任意に選択しうる。
【００２６】
予想外のことに、トロウストチトリウム（ヤブレツボカビ、Thrausochytrium）属からの種の株が粉砕した、加水分解されていない穀物を直接発酵してω-３ＨＵＦＡを産生することが見出された。この方法は、そのような穀物は一般に安価な炭素源及び窒素源であるので、従来の発酵法に比べて有利である。さらに、この方法を実施しても、ω-３ＨＵＦＡの量のような、藻類の有益な特性を損なうような影響を与えない。
【００２７】
穀物の直接発酵を用いる本方法は、制限なく、トウモロコシ、モロコシ、米、オート麦、ライ麦、及びアワを含む任意の種類の穀物について有用である。しかしながら、少なくとも粗く粉砕した穀物を用いることが好ましく、さらには、小麦粉状のコンシステンシーをもつまでに粉砕した穀物がより好ましい。この方法は、さらに、安価な炭素／窒素源として、その他に、非加水分解コーンシロップ、もしくはスチラーゲ（stillage）のような農産上発酵上の副産物、トウモロコシをアルコールに発酵する際の不要産物を用いることをも包含する。
【００２８】
もう一つの好ましい方法においては、ω-３ＨＵＦＡは、加水分解された上述の穀物及び不要産物の発酵によって、トロウストチトリウムもしくはシゾチトリウムにより産生し得ることが見出された。そのような穀物及び不要産物は酸加水分解又は酵素加水分解のような当業者に公知の任意の方法により加水分解し得る。別の態様は混合加水分解処理である。この方法においては、粉砕穀物を当業者に公知の任意の温和な酸処理方法に従って、温和な酸条件下でまず部分的に加水分解する。続いて、部分的に加水分解した粉砕穀物をさらに、当業者に公知の任意の酵素法に従って、酵素プロセスにより加水分解する。この好ましい方法においては、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、α- もしくはβ-グルコシダーゼのような酵素又はこれらの酵素の混合物が用いられる。得られる加水分解生成物を、次いで、本発明において炭素源及び窒素源として使用する。
【００２９】
上で概要を説明した収集法及びスクリーニング法を用いて、単細胞の菌類及び藻類の株のうち、ω-３高度不飽和脂肪酸含量を灰分を含まない全細胞の乾燥重量（afdw）の３２％まで含有し、かつ、１５〜４８℃の温度範囲で増殖し、極めて低い塩分濃度の培養基中で成長するものを単離し得る。非常に高いω-３株の多くは増殖が大変遅い。上記の方法で単離され、速い増殖と、ω-３高度不飽和脂肪酸を良好に産生し、かつその含量の多い株は、ω-３高度不飽和脂肪酸含量が約１５％afdw程度までである。本発明の方法による株の成長は、満足すべき成長が進行する任意の温度。例えば約１５℃〜４８℃、好ましくは２５〜３６℃で達成し得る。培養基は一般に、もし酸の添加やバッファーによってpＨを調節しないならば、発酵の間によりアルカリ性となる。株は４.０〜１１.０のpＨ範囲で増殖するが、好ましい範囲は約５.５〜８.５である。
【００３０】
増殖を大容量の容器及びタンク中で行う場合には、凍結防止剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もしくはグリセリンを用いて−７０℃で保存した培養物又は傾斜培養物からのアリコートをこのブロス培養物に移植することによって、栄養ブロス培地中に栄養移植物を調製することが好ましい。若い、活発な栄養移植物が確保されたときに、それを無菌的により大きい生産タンク又は発酵槽に移すことができる。栄養移植物が調製される培養基は、その株が良好に増殖する限り、細胞の大規模生産に用いるものと同じであっても、異なっていてもよい。
【００３１】
本発明者は、上記の方法で単離され、スクリーニングされたトロウストチトリアレ目の単細胞株（ω-３脂肪酸を含有する）は、エマーソン（1950）とSchneide（1976）によって予見されたように、数世代後には栄養増殖を停止するという制限された増殖を一般に示すことを見出した。しかしながら、本発明者は、比較的高濃度の（例えば、ＫＨ2ＰＯ4>０.２g／ｌ）に維持するか及び／又は酵母エキスもしくはコーン浸漬液（０.２g／ｌ以上）のような栄養補助物（菌類成長因子の源）を加えることよって、連続的なこれらの単細胞菌類の培養増殖が維持できることを見出した。液体培地中で２〜３世代を越えて増殖を維持する能力を、本明細書中で持続増殖と表現する。群として、トロウストチトリド属の株は、シゾチトリウム属の株よりも、リン酸塩の添加に対してより好ましい形で応答するようであり、後者はリン酸塩の必要がより少ないと思われる。菌類成長因子を供給する栄養補助剤に関して、コーン浸漬液を、酵母エキスの代りとすることができ、ある種の株においては、培地中で株の高密度化を達成するのにより優れた効果を有する。コーン浸漬液及び酵母エキスは、細胞が成長するのに必要な一種以上の成長因子を含んでいる。成長因子は、現在のところ解明されていないが、それは酵母エキスおよびコーン浸漬液の成分であり、これらのよく知られた栄養補助物のどちらかで十分である。５０％に近い炭素変換効率（培養基に添加した１００gの有機性炭素当たりの生成した細胞乾燥重量のg数）が、この方法を用いて容易に達成できる。
【００３２】
成長の指数増殖期に細胞を収穫することによって、高タンパク質で、高ω-３高度不飽和脂肪酸の微生物産物を得ることができる。有意により高い脂質とω-３高度不飽和脂肪酸の産物を望む場合には、栄養制限下で、好ましくは窒素制限下で適切な期間、好ましくは６〜２４時間、培養を行い得る。培養物を窒素を含まない培養基に移すか、あるいは、好ましくは指数増殖期の後期に窒素が不足するように、生育培養基の最初の窒素含量を調節しうる。誘導期間を短く、通常は６〜２４時間とする限り、窒素の制限は、ω-３高度不飽和脂肪酸を高レベルで維持しながら全脂質の産生を促進する。培養のこの段階、つまり培養物分布がその最高細胞密度に到達した段階は、定常期として知られている。誘導期間の長さは、使用した株に応じて、温度を上げるか下げることによって調整できる。さらに、細胞を高い炭素／窒素比の培養基中で、連続的な形で培養でき、高脂質含量（及び高ω-３含量）の細胞バイオマスを連続的に生産することが可能となる。上記したスクリーニング法により単離したヘテロトロピック微生物の単細胞株は、三種のω-３高度不飽和脂肪酸、すなわちＣ２０:５ｗ３、Ｃ２２:５ｗ３及びＣ２２:６ｗ３を高濃度で含有し、Ｃ２０:４ｗ６を極めて低い濃度で含む傾向にある。これらの脂肪酸の比率は、培養条件と使用した株によって変動しうる。Ｃ２０:５ｗ３とＣ２２:６ｗ３の比率は約１:１〜１:３０の範囲をとりうる。Ｃ２２:５ｗ３とＣ２２:６ｗ３の比率は１:１２から、ほんの痕跡量のＣ２２:５ｗ３までになりうる。Ｃ２２:５ｗ３を含まない株では、Ｃ２０:５ｗ３とＣ２２:６ｗ３の比率は約１:１から１:１０をとり得る。付加的な高度不飽和脂肪酸、Ｃ２２:５ｗ６が先行技術の株のすべてを含むいくつかの株により産生される（Ｃ２２:６ｗ３脂肪酸と１:４の比率まで)。しかしながら、Ｃ２２:５ｗ６脂肪酸は、Ｃ２０:４ｗ６脂肪酸に逆変換されるため、食事療法用の脂肪酸としては望ましくないものと考えられている。本発明で説明したスクリーニング方法は、しかしながら、ω-６高度不飽和脂肪酸（Ｃ２０:４ｗ６もしくはＣ２２:５ｗ６）を全く（又は１％未満しか）含まないいくつかの株の単離を容易にする。
【００３３】
本方法で生産されるもののような、微生物産物中のＨＵＦＡは、酸化条件に曝されると、より望ましくない不飽和脂肪酸または飽和脂肪酸に変換され得る。しかしながら、ω-３ＨＵＦＡの飽和は、β-カロテン、ビタミンＥおよびビタミンＣのような合成抗酸化剤または天然由来の抗酸化剤を微生物産物に加えることによって減少または防止することができる。
【００３４】
ＢＨＴ，ＢＨＡ，ＴＢＨＱまたはエトキシキュインのような合成抗酸化剤またはトコフェロールのような天然の抗酸化剤を、収穫後細胞を加工している間に産物に加えることによって、食品または食餌製品に添加することができる。このように添加される抗酸化剤の量は、例えば、製品処方、包装法、および所望の棚寿命のようなその後の用途から要求される程度によって決められる。
【００３５】
天然由来の抗酸化剤の濃度は、指数関数的増殖の間よりもむしろ定常段階で発酵物を収穫すること、低温で発酵にストレスをかけること、および／または培養基の溶存酸素濃度を高く維持することによって調整できる。さらに、天然由来の抗酸化剤の濃度は、温度、塩分濃度、および栄養分濃度のような培養条件を変化させることによって調節することができる。そのうえ、Ｌ-トリプトファンもしくはＬ-フェニルアラニンのようなビタミンＥの生合成前駆体を、摂取とそれに引き続くビタミンＥへの変換のために発酵培養基に添加できる。あるいは、抗酸化剤と共同して酸化を防止する化合物（例えば、アスコルビン酸、クエン酸、リン酸）を収穫の前に細胞によって取り込まれるために発酵物に加えることができる。さらに、痕跡量の金属、とくに二種以上の価数状態で存在し、適した酸化還元電位を持つもの（例えば、銅、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル）の濃度は、加工細胞中でＨＵＦＡの自動酸化を生じさせるその可能性を最も小さくするように、最高の増殖のために必要な最小限に維持すべきである。
【００３６】
収穫した細胞のバイオマスから抽出し得る他の産物としては、タンパク質、炭水化物、ステロイド、カロテノイド、キサントフィル、および酵素（例えば、プロテアーゼ）が挙げられる。ω-６脂肪酸を高レベルで産生する株も単離されている。そのような株は、ω-６脂肪酸を生産するのに有用であり、この脂肪酸はプロスタグランジンや他のエイコサノイドの化学的な合成に有用な原料である。全脂肪酸の２５％以上をω-６脂肪酸として産生する株が本明細書に記載の方法によって単離されている。
【００３７】
収穫したバイオマスは、（例えば、噴霧乾燥、トンネル乾燥、真空乾燥、もしくは類似の方法）で乾燥し、その肉あるいは産物が人間によって消費される任意の動物用の餌または食品補助物として使用できる。同様に、抽出したω-３高度不飽和脂肪酸は餌または食品補助物として使用できる。あるいは、収穫され、洗浄したバイオマスを直接（乾燥せずに）餌の補助物として使用できる。その棚寿命を延ばすために、湿ったバイオマスを酸性化（約pＨ＝３.５〜４.５）し、および／または殺菌しあるいは瞬間的加熱して酵素を不活化し、その後、真空下または非酸化性雰囲気（例えば、窒素または二酸化炭素）下で缶詰、瓶詰あるいは包装できる。「動物」という用語は動物界に属する任意の生物を意味し、それから鳥肉、シーフード、牛肉、豚肉、羊肉が得られる任意のものを制限なく包含する。シーフードは、限定されないが、魚、海老、及び貝から得られる。「産物」という用語は、そのような動物から得られる肉以外の任意の産物を包含し、これらに制限されないが、卵や他の産物を含む。これらの動物に与えると、収穫したバイオマス中のω-３ＨＵＦＡまたは抽出したω-３ＨＵＦＡは、これらの動物の肉、卵、あるいはその他の産物に取り込まれ、それらのω-３ＨＵＦＡ含量が増大する。
【００３８】
異なった動物では、所望のω-３ＨＵＦＡ含量を達成するのに様々な要件があることに注意すべきである。例えば、反芻動物では、動物がω-３ＨＵＦＡを消化吸収する前に反芻胃の菌叢によって分解もしくは飽和されることからこの不飽和脂肪酸を保護するために、ω-３ＨＵＦＡ用にある種のカプセル化手法が必要となる。ω-３ＨＵＦＡは、反芻胃中で消化できない（又は消化が遅い）タンパク質（例えばゼアイン）あるいは他の物質でオイルもしくは細胞をコーティングすることによって「保護」できる。これにより、脂肪酸は反芻動物の第一胃を損傷を受けることなく通過しうる。細胞もしくは油をコーティングする前に、タンパク質や他の「保護」物質を溶媒に溶解する。細胞は、保護剤でコーティングする前に、ペレット化しうる。高い食餌変換率（例えば、４:１〜６:１）を有する動物は、低い食餌変換率（２:１〜３:１）の動物と同等のω-３ＨＵＦＡの取り込みを達成するのにより高い濃度のω-３ＨＵＦＡを必要とするであろう。餌投与法は、収穫したバイオマスもしくは抽出したω-３ＨＵＦＡを所望の結果をうるために与えなくてはならない動物の生活期間を考慮して、さらに最適化しうる。
【００３９】
大部分の餌の投与において、収穫した細胞の油脂含量は約２５〜５０％afdwであり、他の成分はタンパク質及び炭水化物である。タンパク質は、評価した数種の株がすべて必須アミノ酸を持っているので、細胞の栄養物として有意に有益であり得、栄養的にバランスのとれたタンパク質と考えられる。
【００４０】
好ましい方法では、ω-３ＨＵＦＡを含有する新たに収穫され洗浄された細胞（ベルトろ過、回転ドラムろ過、遠心分離などで収穫）は、収穫した細胞ペーストの水含量を水分４０％以下に減らすために、任意の乾燥粉砕穀物と混合することができる。例えば、トウモロコシを用いることができ、このような混合によって、細胞ペースト／トウモロコシ混合物を、通常の押出し方法を使用して、直接押出すことが可能となる。押出し温度と圧力は、押出し生成物における細胞破砕の程度（すべて完全細胞から１００％破砕された細胞まで）を変えるために調節することができる。この方法での細胞の押出しは、穀物中の抗酸化剤のいくつかが脂肪酸を酸化から保護し、押出されたマトリックスもまた酸素が脂肪酸に容易に到達することからの保護に役立つので、ω-３ＨＵＦＡ含量を大きく減少させることはないと考えられる。合成のもしくは天然の抗酸化剤もまた、押出し前に細胞ペースト／穀物混合物に加えることができる。細胞ペースト／穀物混合物の直接押出しによって、乾燥時間とコストを大きく削減することができ、また、細胞破砕の程度によって、ω-３ＨＵＦＡの生物学的利用度を調節できるようになる。望ましい細胞破砕の程度は、酸化の許容レベル（細胞破砕が進めば、酸化もおそらく増大する）及び押出し物質を消費する動物による生物学的利用度の要求される程度を含めた様々な因子に依存する。
【００４１】
上述の方法によって単離される単細胞菌株はすぐに凝集し、沈澱する。このプロセスは、培地のpＨを７.０以下に調整することによって促進しうる。この方法によって、簡単に１〜２分以内に細胞濃度を６倍にすることができる。従って、この方法は、収穫前に細胞を予備濃縮するため、あるいは窒素制限の前に極めて高密度にまで細胞を濃縮するために使用しうる。（脂質産生を高めるための）窒素制限は、従って、さらに小さい反応器中で行いうるし、あるいはいくつかの反応器からの細胞を一つの反応器に集約しうる。
【００４２】
培養基から微生物細胞を回収するにあたって、多くの方法を使用しうる。好ましい回収プロセスでは、その方法で生産される細胞は、ろ過もしくは遠心分離のような従来法での分離によって培養基から回収される。その後、細胞を洗浄し；凍結、凍結乾燥、もしくは噴霧乾燥し；次いで加工食品または食餌製品に添加する前に（酸素が存在しないようにするために）二酸化炭素もしくは窒素のような非酸化性気体雰囲気下で貯蔵しうる。
【００４３】
ω-３高度不飽和脂肪酸を含有する細胞脂質はまた、任意の適切な手段、例えば超臨界液体抽出あるいは、クロロホルム、ヘキサン、塩化メチレン、メタノール等の溶媒で抽出し、ついで抽出物を減圧下で蒸発して濃縮脂質材料を得ることによって、微生物細胞から抽出することもできる。この調製物中のω-３高度不飽和脂肪酸はさらに、脂質を加水分解し、ついで、尿素付加もしくは分別蒸留（Ｓchlenk, 1954)、カラムクロマトグラフィー（Ｋates, 1986）のような伝統的な方法を用いて 、あるいは超臨界液体分別法（Ｈunter, 1987）によって高度不飽和分を濃縮し得る。また、細胞を破砕もしくは溶解し、脂質を植物油もしくは他の食用油で抽出することもできる（Ｂorowitzka とＢorowitzka, 1988)。抽出油は、植物油の精製に日常的に使用されている周知のプロセスで精製できる（例えば、化学的精製または物質的精製)。これらの精製プロセスにより、食用油として使用もしくは販売する前に、抽出油から不純物が除去される。精製プロセスは、抽出油のガム質除去、漂白、ろ過、脱臭及び磨きという一連のプロセスから成る。精製後、油は直接食餌もしくは食品添加物として使用して、ω-３ＨＵＦＡに富む製品を製造することができる。あるいは、油を下記のようにさらに加工、精製し、ついで上述の用途や、薬学的用途に使用し得る。
【００４４】
好ましいプロセス方法では、高純度ω-３ＨＵＦＡまたは高純度ＨＵＦＡの混合物を抽出油から容易に濃縮できる。収穫した細胞（新鮮なもしくは乾燥したもの）は、超音波処理法、液体せん断破砕法（例えば、マントン-ゴーリンホモジナイザーのフレンチプレス)、ビーズ磨砕、高圧下でのプレス法、凍結-解凍法、凍結プレス法、あるいは細胞壁の酵素的消化法のような周知の技術によって、破砕もしくは易浸透性にすることができる。破砕された細胞からの脂質は、ヘキサン、クロロホルム、エーテルまたはメタノールのような溶媒もしくは溶媒混合物を用いて抽出される。溶媒を除去し（例えば、溶媒を回収し再使用し得る真空ロータリーエバポレータによって)、ついで、塩基加水分解、酸加水分解もしくは酵素加水分解を含む、トリグリセリト類を遊離脂肪酸もしくは脂肪酸のエステルに変換する任意の周知の方法を用いて脂質を加水分解する。ω-３ＨＵＦＡの分解を最少限とするために、加水分解はできる限り低温（例えば、室温から６０℃）で、しかも窒素下で行わねばならない。加水分解が完了したのち、不ケン化物はエーテル、ヘキサンもしくはクロロホルムのような溶媒で抽出して除去する。その後、残りの溶液をＨＣｌのような酸の添加によって酸性化し、遊離脂肪酸をヘキサン、エーテルもしくはクロロホルムのような溶媒中へ抽出する。遊離脂肪酸を含む溶媒溶液を、その後、非ＨＵＦＡが結晶化するのに充分低く、ＨＵＦＡが結晶化する程は低すぎない温度に冷却する。典型的には、溶液を約−６０〜約−７４℃の範囲に冷却する。結晶化した脂肪酸（飽和脂肪酸、並びにモノ-、ジ-及びトリ-エン型脂肪酸）は、次いで、（溶液を冷却状態に保ちながら）ろ過、遠心分離あるいは沈積によって除去し得る。ＨＵＦＡはろ液中（あるいは上清中）に溶解して残っている。ろ液（あるいは上清）中の溶媒を除去すると、ω-３ＨＵＦＡまたは炭素鎖長が２０以上のＨＵＦＡのいずれかの純度が９０％以上の脂肪酸混合物が得られる。精製ω-３高度不飽和脂肪酸は、その後、食品添加物として、人間の栄養補助物に、あるいは薬学的用途に使用することができる。これらの用途のためには、精製脂肪酸をカプセル化したり、直接用いたりすることができる。その安定性を改善するために、抗酸化剤を脂肪酸に添加することができる。
【００４５】
この方法の利点は、冷時結晶化の前に飽和脂肪酸とモノ不飽和脂肪酸を除去するために、尿素錯体法あるいは、超臨界二酸化炭素抽出や高速液体クロマトグラフィーのような他の高価な抽出法を行わずにすむことである。この利点は、魚油のような２０にものぼる脂肪酸を含む複雑な油（飽和、モノ-、ジ-、トリ- 及びポリエン型脂肪酸が連続的にふくまれており、そのままでは一連の重なり合う結晶化温度を示す）よりもむしろ、トロウストチトリドが産生するような単純な脂肪酸組成からなる油（３〜４種の飽和もしくはモノ不飽和脂肪酸と３〜４種のＨＵＦＡで、脂肪酸の２つのグループはその結晶化温度がはっきりと分かれている）を原料として精製を行うことによりもたらされる。
【００４６】
好ましい方法においては、ω-３ＨＵＦＡに富んだ油はトロウストチトリウム属の株を培養して生産できる。任意のいくつかの周知の方法によって、細胞から油を抽出した後、主としてタンパク質と炭水化物から成る残りの抽出（脂質を除いた）バイオマスは殺菌して発酵槽に戻すことができる。その中で、トロウストチトリウムの株は栄養源（炭素と窒素源）として直接リサイクルできる。細胞のバイオマスを予備加水分解または予備消化することは必要ではない。最初に酸及び／または酵素処理により消化しておけば、トロウストチトリウム属の抽出バイオマスは同様の方法でリサイクルできる。
【００４７】
上で詳しく述べたように、全細胞バイオマスを、人間の摂取あるいは動物の餌のために、ω-３高度不飽和脂肪酸含量及び加工食品の栄養価を高めるために、食品添加物として直接用いることができる。動物の餌として用いた場合には、ω-３ＨＵＦＡは動物の肉あるいは他の産物中に取り込まれる。これらの脂肪酸を含む複合脂質はまた、溶媒で全細胞生成物から抽出でき、薬学的もしくは栄養の目的のために及び工業的用途に、より高濃度の形（例えば、カプセル化した形）で用いることができる。本発明の他の態様では、種々の病気の処置のために、上述のソースからのω-３ＨＵＦＡを人間に投与することを包含する。
【００４８】
本明細書中で、「処置」とは薬物を治療及び予防のために与えることの両方を意味する。ω-３ＨＵＦＡの食餌療法上の価値は文献上広く認識されており、本発明にしたがって生産されたω-３ＨＵＦＡの人間による摂取は、脳血管疾患、炎症及び／または免疫疾患並びに癌の処置に有効である。
【００４９】
本発明を実施例によりさらにくわしく説明する。上記の選択基準に適合する種はこれまで先行技術において記載されていない。これらの選択基準を用いることによって、本発明者は、スクリーニングした約１０００のサンプルから２５以上の潜在的に期待のもてる株を単離した。Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection（ＡＴＣＣ）の約２０,５００株の中で、１０株が本発明者が単離した株と同じ分類学上のグループに属することがあとになって同定された。そのＣollection中で、まだ生きているそれらの株を入手し、かつ使用して上述の方法で単離し培養した株と比較した。この比較の結果を下記の実施例５及び６に示す。
【００５０】
本願の原出願を出願してから、最近の進展によりトロウストチトリドの分類の改訂があった。最新の分類理論学者はそれらを藻類と一緒にしている。しかしながら、依然として残されている分類学上の不確かさのために、それらの株をトロウストチトリドとして考えることが本発明の目的において最良であろう（目；トロウストチトリアレ（Thraustochytriales)，族；トロウストチトリアセ（Thraustochytriaceae), 属；トロウストチトリウム（Thraustochytrium）またはシゾチトリウム（Schizochytrium))。最新の分類学上の変更を以下に概括する。
【００５１】
本明細書中に開示し、クレームした単細胞微生物のすべての株はトロウストチトリド目のメンバーである。トロウストチトリド（ヤブレツボカビ類）は数奇な分類上の歴史をもつ海の有核生物である。トロウストチトリドの分類学上の位置についての問題は、最近、Ｍoss（1986)、とＢahnweb とＪackle（1986)、及びとＣhamberlain とＭoss（1988）によって概括されている。便宜上、トロウストチトリドは最初、分類学者によって、藻菌類（藻類様菌類）の中の他の無色のべん毛菌類と共に位置づけられた。しかしながら、藻菌類の名は、結局は分類学上の地位から脱落し、トロウストチトリドは卵藻類の中にとどまった（二べん毛べん毛菌類)。卵藻類はヘテロコント藻類に関係づけられると最初仮定され、ついにはＢarr（1983）によりまとめられた広汎な超微細構造また生化学的な研究からこの仮定が支持された。卵藻類は事実、Ｌeedal（1974）と他の藻類学者によって、ヘテロコント藻類の一部であるとして受け入れられた。しかしながら、それらのヘテロトロピックな性質に起因して便宜的に、卵藻類とトロウストチトリドは、藻類学者（藻類を研究する学者）よりも、菌類学者（菌類を研究する学者）によって多く研究されてきた。
【００５２】
他の分類学的な観点から、革新的な生物学者の間で、有核生物がどのようにして発生したかについて、考え方での二つの一般的な学派が生まれた。一つの理論では、一連の内部共生を通して膜結合性オルガネラの外因性の起源を提案している（Margulis（1970)；例えば、ミトコンドリアはバクテリヤの内部共生に由来し、クロロプラストは卵藻類に、また、フラケラはスピロヘータに由来)。他の理論は、オートジーンプロセスを経て、原核生物の先祖の非膜結合性システムから膜結合性オルガネラが徐々に発生したことを示唆している（Cavalier-Smith 1975)。この両者の革新的生物学者のグループは、しかしながら、卵藻類とトロウストチトリドを菌類から除き、それらを褐色植物界の褐色藻類に（Calvalier-Smith 1981)、あるいはプロトクチスタ（Protoctista）界のすべての藻類の中に（Margulis とSagan 1985）位置づけている。
【００５３】
電子顕微鏡の発達に伴い、トロウストチトリドの２つの属、トロウストチリウムとシゾチトリウムの遊走子の超構造についての研究（Ｐerkins 1976；Kazama 1980；Barr 1981）は、トロウストチトリアセ（ヤブレツボカビ）は卵藻類とかなり離れた関係にあることの良い証拠を提供している。さらに、５ＳリボソームＲＮＡ配列の対応分析（多変量統計の形）を示すより最近の遺伝子データは、トロウストチトリアレは明らかに、有性生物中で特異なグループであって、菌類とは完全に分離され、紅藻類及び褐藻類並びに卵藻類の仲間と最も密接な関係にあることを示している（Mannella 他、1987)。しかしながら最近、大部分の分類学者は卵藻類からトロウストチトリドを除くことに同意している（Bartnicki-Garcia, 1988)。
【００５４】
まとめると、Ｃavalier-Ｓmith (1981, 1983) の分類システムを使用すれば、トロウストチトリドは４つの植物界の１つである、褐色植物界の中の褐色（chro-mophyta）藻類に分類される。これにより、それらは、Ｅufungi 界にすべてが位置する菌類とは完全に異なった界に位置づけられる。従って、トロウストチトリド類の分類学的な位置は以下のようにまとめられる。
界:  褐色植物（クロモフィタ）
門:  ヘテロコンタ
目:  トロウストチトリアレ
族:  トロウストチトリアセ（ヤブレツボカビ）
属:  トロウストチトリウムまたはシゾチトリウム
より上位の分類である界及び門の中での分類学的な位置づけは不明確であるにもかかわらず、トロウストチトリドは、そのメンバーを依然として、トロウストチトリアレ目の中に分類可能な区別しうる特徴的なグループとして存在している。
【００５５】
ω-３高度不飽和脂肪酸は、人間及び動物の双方にとって、栄養として重要な脂肪酸である。現在、市販されている唯一のこれらの脂肪酸源は魚油からのものである。しかしながら、魚油を食品もしくは餌の添加物あるいは補助物として用いる場合には、いくつかの重大な問題が存在する。第一の、そして最も重大なものとして、魚油は強烈な魚臭及び魚味を有し、そのままでは食用製品にマイナスの影響を与えることなく加工食品に添加物として加えることはできない。このことは、動物の食品または餌の添加物としてのその多くの用途においても同様である。例えば、本発明者や他の人々による実験で、魚油を多く含む餌を数日以上与えると、産卵めんどりはその餌を直ちに嫌いになることが明らかとなっている。魚油は非常に不安定であり、すぐに腐敗臭がするようになり、これにより餌のおいしさ及び栄養価が減少してしまう。
【００５６】
第二に、魚油は一般に２０〜３０％のω-３ＨＵＦＡしか含んでいない。海の幼魚及び海老の餌中に望ましいω-３ＨＵＦＡ含量はその乾燥重量の５〜１０％程度でありうる。５〜１０％のω-３ＨＵＦＡを含む好適な合成食料を構成するためには、１５〜３０％が魚油の食料を必要とする。このような合成食料は、これらの幼い生物にとって、おいしさ、消化性、あるいは安定性のいずれかの点で最適のものではない（Ｓargent 他、1989)。人間の栄養という観点では、魚油中の他の７０〜８０％の脂肪酸は飽和脂肪酸及びω-６脂肪酸であり、人間にとって健康に悪影響を及ぼしうる。魚油から純粋なω-３脂肪酸を単離するプロセスを含むとコストがかかり、得られる純粋な形の脂肪酸は極めて高価（２００〜１０００ドル／g）なものとなり、食品や餌の添加物として使用するにはあまりにも高価すぎる（Sigma Chemical, Co., 1988; CalBiochem Co., 1988)。
【００５７】
第三に、農産物産業で現在使用されている大部分の餌は穀物をベースとする餌であり、そのままではω-３ＨＵＦＡ含量は比較的低い。最近の海産物の調査において、水産養殖場で製造された魚及び海老は、一般に、野性の捕獲された魚や海老のω-３ＨＵＦＡ含量の１／３〜１／２しか有していないことが明らかとなっている（Pigott, 1989)。水産養殖生物は、多くが、そのマイルドさ、魚臭がしないことのゆえに賞賛されているが、その食品の魚油含量を増加させることは、魚の味のする製品としてしまう点で、有効なことではない。
【００５８】
上述した問題の結果として、ω-３ＨＵＦＡの別の（魚由来でない）源を開発することが重要な課題として存在する。
【００５９】
本発明の微生物産物は、食品あるいは餌の補助物として使用でき、従来の源に比べて優れた利点を有するω-３高度不飽和脂肪酸のより良い源を提供する。この微生物産物を添加した食料で養われた家禽は、ω-３高度不飽和脂肪酸を体組織や卵に取り込む。この卵は、全く魚臭がしないし、魚の味もしない。また、黄身の色にも変化は全くない。家禽は、魚油添加食餌のときのようには、その添加食餌を食べることを止めない。本発明の微生物産物を添加した餌は、通常の棚寿命をもち、数日間室温で放置しても腐敗臭を発しない。本発明にしたがって、飼育された家禽の卵及び肉は、ω-６脂肪酸含量は低く、魚臭は全くしないままで、ω-３高度不飽和脂肪酸源として、人間の栄養物に有用である。
【００６０】
本発明の微生物産物は、また、水産養殖で生産された魚、海老、及び他の産物に対するω-３高度不飽和脂肪酸源としても価値がある。産物は餌に補助物として直接添加することができ、あるいは水産養殖産物によって消費するための塩水海老、又は他の生きた餌生物に食べさせることもできる。このような補助物を用いることによって、養殖によってもたらされる食味上の利点を保持し、一方ω-６脂肪酸含量が減少した付加的な健康上の利点を伴った野性の魚のような高いω-３高度不飽和脂肪酸含量を有する改良された製品を、魚や海老養殖業者が市場に出すことが可能となる。
【実施例】
【００６１】
〔実施例１〕
収集とスクリーニング
浅い、内陸部の塩水池から１５０mｌの水試料を収集し、滅菌したポリエチレン瓶に保存した。水試料とともに、いくらかの生きた植物材料と天然由来の破片（分解しつつある植物および動物分）が含まれるように特に努力した。実験室に戻るまで、試料を氷上においた。実験室で、水試料を１５〜３０秒振とうし、以下の２つのタイプのフィルターを有するフィルターユニットに、１〜１０mｌの試料をピペットでとり注入した。２つのフィルターは、 1）上部に、孔経約２５μmで、直径４７mmの滅菌したワットマン＃４フィルター及び 2）ワットマンフィルターの下に、孔経約１.０μmで直径４７mmのポリカーボネートフィルターである。フィルターの公称孔径をこのように少し変えることによって、ポリカーボネートフィルター上に集められた細胞の大きさが約１.０μm〜約２５μmの範囲となる。
【００６２】
ワットマンフィルターは取り出して捨てた。ポリカーボネートフィルターをペトリ皿中の個体Ｆ-１培養基上においた。この培養基は、１リットル当り以下のものを含んでいた:海水（人口海水を使用できる）６００mｌ，蒸留水４００mｌ，寒天１０g，グルコース１g，タンパク質加水分解物１g，酵母エキス０.２g，０.１ＭＫＨ2ＰＯ4 ２mｌ，ビタミン溶液（Ａ-vits)，（１００mｌ／ｌのチアミン、０.５mg／ｌのビオチン、及び０.５mg／ｌのシアノコバラミンを含む）１mｌ，微量金属混合物５mｌ（ＰＩＩ金属、１リットル当り、Ｎa2ＥＤＴＡ ６.０g、ＦeＣｌ3・６Ｈ2Ｏ ０.２９g、Ｈ3ＢＯ3 ６.８４g、ＭnＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０.８６g、ＺnＣｌ2 ０.０６g、ＣoＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０.２９g、（ＮiＳＯ4・Ｈ2Ｏ ０.０５２g、ＣuＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.００２g、と Ｎa2ＭoＯ4・２Ｈ2Ｏ ０.００５g、並びに５００mgづつのストレプトマイシン硫酸塩及びペニシリンＧ。寒天プレートは暗所、３０℃でインキュペートした。２〜４日後、無数のコロニーがフィルター上に出現した。単細胞菌類（酵母を除く）のコロニーをプレートから取り出して、同様組成の新しい培養基プレート上に再ストリークした。無色または白色の細胞からなるすべてのコロニーを取り出すように特に注意を払った。新しいプレートを３０℃でインキュベートし、２〜４日のインキュベート期間の後に、単一コロニーを取り出した。単一コロニーを取りだし、次いで寒天プレート中と同じ有機分増強物を含む５０mｌの液体培養基にいれた。この培養基を回転振とうテーブル（１００〜２００rpm）上、３０℃で２〜４日間インキュベートした。培養物が最大密度に到達したと思われたときに、２０〜４０mｌの培養物を収穫し、遠心にかけ、そして凍結した。その後、試料を標準的なよく知られたガスクロマトグラフィー法（例えば、Ｌepage とＲey、1984）によって分析し、その株の脂肪酸含量を同定した。これにより、ω-３高度不飽和脂肪酸を含む株を同定し、これの株の培養物をさらにスクリーニングにかけた。
【００６３】
上記した収集法及びスクリーニング法を用いて、１５０を越える単細胞菌類の株が単離された。これらの株は、灰分を除いた全細胞乾燥重量の３２％までのω-３高度不飽和脂肪酸含量を有し、１５〜４８℃の範囲の温度で増殖する。１％未満の（全脂肪酸に対する％として）望ましくないＣ２０:４ｗ６及びＣ２２:５ｗ６高度不飽和脂肪酸を含む株も単離することができる。これらの菌類の株は、上記した方法を用いて、同じ場所から繰り返し単離できる。二、三の新たに単離された株は、大変よく似た脂肪酸プロフィールを有する。幾つかのものは同じ株の二重の単離物である可能性も現在のところ否定できない。塩分許容性あるいは種々の炭素源及び窒素源の使用能力のような他の望ましい特徴についてさらにスクリーニングすることも、同様の方法を用いてその後行うことができる。
【００６４】
〔実施例２〕
非制限的細胞増殖の維持:リン
実施例１の方法で単離した株、トロウストチリウム sp.Ｕ４２-２（ＡＴＣＣ番号２０８９１）の細胞を固体Ｆ-培養基から取りだし、５０mｌの修飾ＦＦＭ培養基（Ｆuller 他，1964）に接種した。この培養基は、海水 １０００mｌ；グルコース １.０g；ゼラチン加水分解物 １.０g；肝臓エキス ０.０１g；酵母エキス ０.１g；ＰＩＩ金属類 ５mｌ；１mｌのＢ-ビタミン類溶液（Goldstein 他、1969）；および１mｌの抗生物質溶液（２５g／ｌのストレプトマイシン硫酸塩とペニシリンＧ）を含む。１.０mｌのビタミンミックス（pＨ７.２）は、チアミン塩酸塩 ２００μg；ビオチン ０.５μg；シアノコバラミン ０.０５μg；ニコチン酸 １００μg；パントテン酸カルシウム １００μg；リボフラビン ５.０μg；ピリドキシン塩酸塩 ４０.０μg；ピリドキサミン二塩酸塩 ２０.０μg；ｐ-アミノ安息香酸 １０μg；クロリン塩酸塩 ５００μg；イノシトール １.０mg；チミン ０.８mg；オロチン酸 ０.２６mg；フォリニン酸 ０.２μg、及び葉酸 ２.５μg含む。この培養基 ５０mｌの入った２５０mｌの三角フラスコを２７℃のオービタル振とう器（２００rpm）上に２〜４日間置いた。この時点で培養物はその最高密度に達した。この培養物の１mｌを、１リットル当り以下の処理剤の１つを余分に添加した修飾ＦＦＭ培養基の入った新しいフラスコに移した： 1）１mｌのＢ-ビタミンミックス； 2）１mｌのＡ-ビタミン溶液； 3）５mｌのＰＩＩ金属類； 4）２mｌの０.１ＭＫＨ2ＰＯ2（〜２８mg）； 5）２、３、及び４の処理剤の組み合わせ；並びに 6）４８０mgのＫＨ2ＰＯ4。培養物の１mｌを、また、余分の添加剤を含まない修飾ＦＦＭ培養基のフラスコに接種し、実験におけるコントロールとした。培養物を回転振とう器（２００rpm）上、２７℃で４８時間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離によって収穫し、脂肪酸をガスクロマタグラフィーで定量した。その結果を図１及び表１に示す。図１においては、収量をコントロールとの比としてプロットしてあり、従ってコントロールの相対的収量は１.０である。１〜６の処理は次の通り： 1）２×Ｂビタミン類の濃度； 2）２×Ａビタミン類の濃度； 3）２×微量金属類の濃度； 4）２×（Ｂビタミン類＋リン酸塩＋微量金属類）の濃度； 5）２×リン塩酸の濃度；及び6）５０mｌ当り２４mgのリン酸塩（１リットル当り０.４８g)。１リットル当り０.４８gのＫＨ2Ｏ4を添加する処理のみが、増殖の促進をもたらし、また有意に
増大した脂肪酸収量をもたらした。
【００６５】
【表１】
2010136730.tif 000003
【００６６】
〔実施例３〕
非制限的生長の維持:ＰＯ4及び酵母エキス
シゾチトリウムアグレガタム（Schizuchytrium aggregatum)（ＡＴＣＣ番号２８２０９）の細胞を固体Ｆ-１培養基から取り出して、５０mｌのＦＦＭ培養基に接種した。培養物を２７℃の回転振とう器（２００rpm）上に置いた。３〜４日後、この培養物の１mｌをそれぞれ以下の処理剤 ５０mｌに移した： 1）ＦＦＭ培養基（コントロ-ルとして）；及び 2）ＫＨ2ＰＯ4 ２５０mg／ｌ及び酵母エキス２５０mg／ｌを添加したＦＦＭ培養基。これらの培養物を２７℃の回転振とう器（２００rpm）上に４８時間置いた。細胞を収穫し、細胞の収量を定量した。処理１において、灰分を除いた乾燥重量基準で、細胞の最終濃度は６１６mg／ｌであった。処理２では、細胞の最終濃度は１６７５mg／ｌであり、培養基中のＰＯ4  及び酵母エキスの濃度の増大が促進効果を与えることを示している。
【００６７】
〔実施例４〕
非制限的生長の維持:酵母エキスをコーン浸漬液に代替
シゾチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）の細胞を固体Ｆ-１培養基から取りだし、５０mｌのＭ-５培養基にいれた。この培養基は、（１リットル当りに)、ＮaＣｌ ２５g；ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５g；ＫＣｌ １g；ＣaＣｌ2 ２００mg；グルコ-ス ５g；グルタメ-ト ５g；ＫＨ2ＰＯ4 １g；ＰＩＩ金属類 ５mｌ；Ａ-ビタミン溶液 １mｌ；及び抗生物質溶液１mｌからなっている。溶液のpＨを７.０に調整し、溶液をフィルタ-滅菌した。コーン浸漬液（４g／４０mｌ；pＨ７.０）及び酵母エキス（１g／４０mｌ；pＨ７.０）の滅菌溶液を調製した。Ｍ-５培養基フラスコ１セットに、次の量の酵母エキス溶液を加えた: 1）２mｌ； 2）１.５mｌ； 3）１mｌ； 4）０.５mｌ；及び 5）０.２５mｌ。Ｍ-５培養基フラスコの他の１セットには、以下の量の酵母エキス及びコーン浸漬液を加えた: 1）２mｌの酵母エキス； 2）１.５mｌの酵母エキスと０.５mｌのコーン浸漬液； 3）１.０mｌの酵母エキスと１.０mｌのコーン浸漬液； 4）０.５mｌの酵母エキスと１.５mｌのコーン浸漬液；及び 5）２mｌのコーン浸漬液。Ｆ-１培養基中の培養物１mｌを用いて各々のフラスコに接種した。それらを２７℃の回転振とう器上に４８時間置いた。細胞を遠心分離器によって収穫し、細胞の収量を（灰分を除いた乾燥重量として）定量した。結果を表２に示す。この結果は、培養器の０.８g／ｌまで酵母エキスを添加すると細胞収量が増加することを示している。しかしながら、コーン浸漬液の添加はさらに効果的であり、酵母エキスの添加処理での収量の２倍という結果が得られた。コーン浸漬液は酵母エキスに比べてより安価であるので、このことは、細胞の経済的な生産にとって極めて好都合である。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
〔実施例５〕
ＡＴＣＣ株（従来から知られていた株）に比べて、実施例１の方法で単離された株の高度不飽和脂肪酸含量が多いこと。
実施例１に記載された方法に従って選択された、１５１の新たに単離された株のバッテリーを指数増殖期の後期にサンプリングし、気液クロマトグラフィーにより、高度不飽和脂肪酸含量を定量的に分析した。すべての株は、細胞が最高の収量を与える、Ｍ１培養基あるいは液体ＦＦＭ培養基のいずれかの中で増殖させた。さらに、五つの先に単離されていたトロウストチリウムまたはシゾチトリウム種を、Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection から得、この機関から生きた状態で得られるすべての株の代表とした。Ｔ.オウレウム（ＡＴＣＣ番号２８２１０)、Ｔ.オウレウム（ＡＴＣＣ番号３４３０４)、Ｔ.ロゼウム（ＡＴＣＣ番号２８２１０)、Ｔ.ストライチューム（ＡＴＣＣ番号３４４７３）と Ｓ.アグレガチューム（ＡＴＣＣ番号２８２０９)。これらの株はすべて従来の培養基中で成長を示し、一般にＭ５培養基及びＦＦＭ培養基を含む本発明の培養基中でより向上した増殖を示す（実施例２)。既知の株のそれぞれの脂肪酸産生は、本発明の培養基中で株のより向上した成長に基づいて、上述のように、測定した。
【００７０】
脂肪酸のピ-クは構造既知の純粋化合物を用いて同定した。全脂肪酸の重量％としての定量は、クロマトグラフのピークの積分によって行った。同定した化合物は、パルミチン酸（Ｃ１６:０)、Ｃ２０:４ｗ６とＣ２２:１（使用したシステムではピークが分離しなかった)、Ｃ２０:５ｗ３、Ｃ２２:５ｗ６、Ｃ２２:５ｗ３及びＣ２２:６ｗ３であった。通常低分子量脂肪酸である残余は、「他の脂肪酸」のカテゴリーの中に一括して含ませた。全ω-３脂肪酸は、２０:５ｗ３、２２:５ｗ３及び２２:６ｗ３の総和として計算した。全ω-６脂肪酸は、２０:４／２２:１ピークと２２:５ｗ６ピ-クの総和として計算した。
【００７１】
結果を表３〜４に示し、また図２〜４に示した。表３から、多くの数の株が本発明の方法で単離することができ、また多くの数の株が幾つかの重要な基準において従来公知の株よりも優れている。例えば、１０２の株が全脂肪酸の少なくとも７.８重量％のＣ２０:５ｗ３を産生し、この脂肪酸の％は従来公知のどの株よりも高い。株２３Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９２）及び１２Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９０）がそのような株の例である。本発明の３０の株が、従来公知のどの株よりも多い、全脂肪酸の少なくとも６８重量％をω-３脂肪酸として産生した。株２３Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９２）がそのような株の一例である。本発明の７６の株が人間の食品成分として望ましくないと考えられるω-６脂肪酸として、全脂肪酸の１０重量％未満を産生し、この量は従来公知のどの株よりも少ない。株２３Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９２）及び１２Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９０）がそのような株の例である。さらに、従来公知のどの株よりも多い、全脂肪酸の２５重量％以上をω-６脂肪酸として産生する本発明の株が３５ある。このような株は食品用途には役立たないが、ω-６脂肪酸を原料とするエイコサノイドの化学合成用に餌として有用である。
【００７２】
さらに、デ-タから、本発明の多くの株が全ω-３脂肪酸のうち高比率をＣ２２:６ｗ３として産生することを示している。表４では、表２で示した４８の株を、従来公知の株と比較して、Ｃ２０:５ｗ３、Ｃ２２:５ｗ３及びＣ２２:６ｗ３の それぞれを全ω-３含量の重量％で示している。１５の株が、従来公知のどの株 よりも多い、全ω-３脂肪酸の少なくとも９４％をＣ２２:６ｗ３として有していた。株Ｓ８（ＡＴＣＣ番号２０８８９）がそのような株の一例であった。１８の株が、従来公知のどの株よりも多い、全ω-３脂肪酸の少なくとも２８重量％を Ｃ２０:５ｗ３として有していた。株１２Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９０）がそのような株の一例であった。
【００７３】
図２は、６７％より多いω-３脂肪酸（全脂肪酸の％として）及び、１０.６％未満のω-６脂肪酸（全脂肪酸の％として）を有する、実施例１の方法で単離した一連の株を示している。すべての従来公知の株は、６７％未満のω-３脂肪酸（全脂肪酸の％として）及び１０.６％より多いω-６（全脂肪酸の％として）を有していた。
【００７４】
図３は、６７％より多いω-３脂肪酸（全脂肪酸の％として）及び７.５％より多いＣ２０:５ｗ３（全脂肪酸の％として）を有する、実施例１の方法で単離した一連の株を示している。すべての従来公知の株は、６７％未満のω-３脂肪酸（全脂肪酸の％として）及び７.８％未満のＣ２０:５ｗ３（全脂肪酸の％として）を有していた。
【００７５】
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００７６】
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【００７７】
〔実施例６〕
ＡＴＣＣ株（従来公知の株）に比べて、実施例１の方法で単離した株が向上された成長速度を示すこと。
シゾチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８)、シゾチリウム sp.Ｓ８（ＡＴＣＣ番号２０８８９)、トロウストチリウム sp.Ｓ４２、トロウストチリウム sp.Ｕ４２-２、トロウストチトリウム sp.Ｓ４２とＵ３０（すべて実施例１の方法で単離）及びトロウストチトリウム、オウレウム（ＡＴＣＣ番号２８２１１）及びシゾチトリウム、アグレガタム（ＡＴＣＣ番号２８２０９)(従来公知の株）を固体Ｆ-１培養基からとり、Ｍ-５培養基５０mｌに入れた。この培養基は（１リットル当りで)、酵母エキス １g；ＮaＣｌ ２５g；ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ５g；ＫＣｌ １g；ＣａＣｌ2 ２００mg；グルコース ５g；グルタミン ５g；ＫＨ2ＰＯ4 １g；ＰＩＩ金属類 ５mｌ；Ａ-ビタミン溶液 １mｌ；抗生物質 １mｌからなっていた。溶液のpＨを７.０に調節し、溶液をろ過して滅菌した。オービタル振とう器（２００rpm，２７℃）上で３日間増殖した後、各々の培養物１〜２mｌを他のフラスコのＭ-５培養基に移し、２日間振とう器上に置いた。次いで培養物（１〜２mｌ）をＭ-５培養基の入った他のフラスコの移し、振とう器上に１日置いた。この方法により、すべての培養物が増殖の指数期にあることを確実なものとした。これらの後期培養物を、次いで、各々の株についてＭ-５培養基のはいった２つの２５０mｌフラスコに接種するのに用いた。その後、これらのフラスコを２５℃と３０℃で振とう器上に置き、それらの光学密度の変化をベックマンＤＢ-Ｇ分光光度計（６６０nm，１cm光路長）でモニターした。光学密度の読取りは、０，６，１０，１４，１７.２５，２０.２５及び２２.７５の各時間に行った。次いで、指数増殖速度（倍化／日）を、Ｓorokin（1973）の方法によって、光学密度のデータから算出した。結果を表５に示し、また（２５℃での株Ｕ３０の増殖に対して正規化して）図５に示す。データから、実施例１の方法で単離した株は、従来公知のＡＴＣＣ株に比べて、持続的な増殖に必須の最適リン酸濃度においてすら、２５℃及び３０℃の両方で、はるかに大きい増殖速度を有していることが明かである。冷たい南極海の水から単離したトロウストチトリアレ目の株は、３０℃では増殖しないことが判る。
【００７８】
【表１１】
2010136730.tif 000013
【００７９】
〔実施例７〕
ＡＴＣＣ株（従来技術の株）に比べて、実施例１の方法で単離した株がより良好な産生特性（増殖及び脂質誘起）を示すこと。
シゾチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８)、シゾチトリウム sp.Ｓ８（ＡＴＣＣ番号２０８８９）（両方とも実施例１の方法で単離)、及びトロウストチトリウム  オウレウム（ＡＴＣＣ番号２８２１１)、シゾチトリウム  アグレガタム（ＡＴＣＣ番号２８２０９）（従来技術の株）の細胞を固体Ｆ-１培養基から取り、５０mｌのＭ-５培養基（実施例５参照）に入れた。容器のpＨを７.０に調整し、溶液をろ過滅菌した。オ-ビタル振とう器（２００rpm，２７℃）上で３日間増殖させた後、各々の培養物の１〜２mｌをＭ-５培養基の入った他のフラスコの移し、２日間振とう器上に置いた。次いで、これらの培養物それぞれの灰分を除いた乾燥重量を素早く測定し、３.２９mgの各培養物を５０mｌのＭ-５培養基を含む２つの２５０mｌ三角フラスコにピペットで入れた。これらのフラスコを回転振とう器（２００rpm，２７℃）上に置いた。２４時間後、各培 養物の２０mｌづつを遠心分離し、上清を捨て、グルタメート（窒素源）を含まない５０mｌのＭ-５培養基を含む２５０mｌの三角フラスコに細胞を移した。フラスコを振とう器上に再び置き、さらに１２時間経た後、サンプリングして、灰分を除いた乾燥重量を測定し、またＬepage とＲoy（1984）の方法により脂肪酸含量を定量した。結果を（従来公知の株、ＡＴＣＣ番号２８２１１の収量を基に正規化して）図６に示す。この結果から、実施例１の方法で単離した株は、従来技術のＡＴＣＣ株よりも、指数増殖と窒素制限（脂質誘起のため）の組み合せの下、同じ時間の間に、灰分を除いた乾燥重量で２〜３倍多く産生することが認められる。さらに、本発明の株では、全脂肪酸及びω-３脂肪酸の収量が向上し、株Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）では、従来技術のＡＴＣＣ株に比べてω-３脂肪酸を３〜４倍多く産生した。
【００８０】
〔実施例８〕
実施例１の方法で単離した株による向上した塩分許容性と脂肪酸産生
シゾチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）とトロウストチトリウム sp.Ｕ４２-２（ＡＴＣＣ番号２０８９１)（両方とも実施例１の方法で単離し、スクリーニングした)、及びＳ.アグレガタム（ＡＴＣＣ番号２８２０９）とＴ.オウレウム（ＡＴＣＣ番号２８２１０)（Ａmerican type Ｃulture Ｃollectionより入手）の４種のトロウストチトリウムの株を固体Ｆ-１培養基から取り、回転振とう器（２００rpm）上、２７℃で３〜４日間インキュベートした。ある範囲の異なった塩分濃度の培養基を、Ｍ培養基塩類（ＮaＣｌ，２５g／ｌ；ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，５g／ｌ；ＫＣｌ，１g／ｌ；ＣaＣｌ2，２００mg／ｌ）を以下のように希釈して調整した。 1）１００％（ｗ/ｖ Ｍ培養基塩類； 2）８０％（ｖ/ｖ）Ｍ培養基塩類、２０％（ｖ/ｖ）蒸留水； 3）６０％（ｖ/ｖ）Ｍ培養基塩類、４０％（ｖ/ｖ）蒸留水； 4）４０％（ｖ/ｖ）Ｍ培養基塩類、６０％（ｖ/ｖ）蒸留水； 5）２０％（ｖ/ｖ）Ｍ培養基塩類、８０％（ｖ/ｖ）蒸留水； 6）１５％（ｖ/ｖ）Ｍ培養基塩類、８５％（ｖ/ｖ）蒸留水； 7）１０％（ｖ/ｖ）Ｍ培養基塩類、９０％（ｖ/ｖ）蒸留水； 8）７％（ｖ/ｖ）Ｍ培養基塩類、９３％（ｖ/ｖ）蒸留水； 9）３％（ｖ/ｖ）Ｍ培養基塩類、９７％（ｖ/ｖ）蒸留水； 10）１.５％（ｖ/ｖ）Ｍ培養基塩類、９８.５％（ｖ/ｖ）蒸留水)。以下の栄養物を処理物に加えた（１リットル当り）:グルコース ５g；グルタメート５g；酵母エキス １g；（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２００mg；ＮaＨＣＯ3 ２００mg；ＫＨ2ＰＯ4 １g／ｌ；ＰＩＩ金属類 ５mｌ；Ａ-ビタミン溶液 １mｌ；及び抗生物質溶液 ２mｌ。これらの処理物のそれぞれ５０mｌにＦ-１培養基中で増殖している細胞１mｌを接種した。これらの培養物をオ-ビタル振とう器（２００rpm）上に置き、２７℃で４８時間維持した。細胞を遠心分離器によって収穫し、脂肪酸をガスクロマトグラフィーで定量した。結果を図７に示す。実施例１の方法で単離したトロウストチトリウム sp.Ｕ４２-２（ＡＴＣＣ番号２０８９１）は、Ｔ.オウレウム（ＡＴＣＣ番号２８２１０）の産生した脂肪酸のほぼ２倍、またＳ.アグレガタム（ＡＴＣＣ番号２８２０９）の産生した脂肪細胞酸量の８倍以上を産生することができる。さらに、Ｕ４２-２は、試験した塩分範囲の上限において、より広い塩分許容量を有すると思われる。やはり実施例１の方法で単離したシゾチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）は、従来公知のＡＴＣＣ株に比べて、より多い脂肪酸収量（従来公知のＡＴＣＣ株の収量の２.５〜１０倍）及び極めて広い範囲の塩分濃度許容性を示した。そのうえ、シゾチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）は極めて低い塩分濃度で最も良く成長する。この性質は、塩水の金属製反応器への腐食作用及び、塩水の廃棄に伴う問題の両方の理由で、工場的生産を考えた場合に重要な経済的な利点をもたらす。
【００８１】
〔実施例９〕
培養／低塩分濃度
２５０mｌの三角フラスコ中のＭ／１０-５培養基の５０mｌを、寒天傾斜培養物から取ったシゾチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）のコロニーで接種した。このＭ／１０-５培養基は、脱イオン水 １０００mｌ，ＮaＣｌ ２.５g，ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.５g，ＫＣｌ ０.１g，ＣaＣｌ2 ０.０２g，ＫＨ2ＰＯ4 １.０g，酵母エキス １.０g，グルコ-ス ５.０g，グルタミン酸 ５.０g，ＮaＨＣＯ3 ０.２g，ＰＩＩ微量金属類 ５mｌ，ビタミンミックス ２mｌ，及び抗生物質ミックス ２mｌを含有している。培養物は３０℃で回転振とう器（２００rpm)上でインキュベートした。２日後、培養物は、中程度の密度であり、活発に増殖していた。この活発に増殖している培養物の２０mｌを、グルコ-スとグルタメートの濃度を４０g／リットル（Ｍ／１０-４０培養基）とした以外は同じ培養基１７００mｌを含む２リットルの発酵槽に接種するのに使用した。発酵槽は３０℃に保ち、１vol／vol／minでエアレーションし、３００rpmで撹拌した。４８時間後、発酵槽中の細胞濃度は２１.７g／ｌとなった。細胞を遠心分離して収穫し、冷凍し、窒素下に保存した。
【００８２】
全脂肪酸含量及びω-３脂肪酸含量はガスクロマトグラフィーにより測定した。最終生成物の全脂肪酸含量は、灰分を除いた乾燥重量で２９.０％であった。微生物産物のω-３高度不飽和脂肪酸含量（Ｃ２０:５ｗ３，Ｃ２２:５ｗ３及びＣ ２２:６ｗ３）は灰分を除いた乾燥重量の１５.６％であった。試料の灰分含量は７.０％であった。
【００８３】
〔実施例１０〕
実施例５に記した種々の株の増殖及び脂肪酸産生のガスクロマトグラフィーでの分析によって、脂肪酸分布の違いが明かとなった。本発明の株は、従来入手可能な株よりも、より少ない種類の脂肪酸を合成した。分離すべき不純物が少ないので、脂肪酸分散が小さなことは好都合である。食品補助物としての目的のためにも、望ましくない脂肪酸を摂取する可能性が減るので、脂肪酸の種類が少ないことは好都合である。表６は、ＡＴＣＣ記号で表示した従来公知の株及び種々の本発明の株について、全脂肪酸の１重量％を越える濃度で存在する高度不飽和脂肪酸の種類の数を示している。
【００８４】
【表１２】
2010136730.tif 000014
【００８５】
〔実施例１１〕
回  収
２５０mｌの三角フラスコ中のＭ５培養基５０mｌを、寒天傾斜培地から取ったシゾチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＴＣ番号２０８８８）の１つのコロニーで接種した。Ｍ／５培養基は、脱イオン水 １０００mｌ，ＮaＣｌ ２５.０g，ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５.０g，ＫＣｌ １.０g，ＣaＣｌ2 ０.２g，ＫＨ2ＰＯ4 １.０g，酵母エキス １.０g，グルコース ５.０g，グルタミン酸 ５.０g，ＮaＨＣＯ3 ０.２g，ＰＩＩ微量金属類 ５mｌ，ビタミンミックス ２mｌ，及び抗生物質ミックス ２mｌを含有する。培養物は３０℃で回転振とう器（２００rpm）上でインキュベートした。２日後、培養物は、中程度の密度となり、活発に増殖していた。この活発に増殖している培養物の２０mｌを、グルコ-スとグルタメートの濃度を４０g／リットル（Ｍ／２０培養基）に増加させたことを除いて同じ培養基１０００mｌを含む１リットルの発酵槽に接種するのに使用した。発酵槽は３０℃でpＨ７.４に保ち、１vol／minでエアレーションし、また４００rpmで撹拌した。４８時間後、発酵槽中の細胞濃度は１８.５g／ｌであった。発酵槽のエアレーション及び撹拌を止めた。２〜４分以内に、細胞は凝集し、発酵槽の底の２５０mｌに沈澱する。この細胞の濃縮したゾーンは７２g／ｌの細胞濃度を有していた。この細胞ゾーンを、発酵槽からサイフォンで取りだし、そして（1）窒素制限期間のあいだ他の反応器に移すか（例えば、幾つかの発酵槽の高度に濃縮された産生物を一緒にして)、あるいは（2）遠心分離またはろ過によって直接収穫することができる。このように細胞を予め濃縮することにより、６０〜８０％も少ない水を細胞の回収のために処理することになる。
【００８６】
〔実施例１２〕
種々の炭素源及び窒素源の利用
２５０mｌの三角フラスコ中のＭ５培養基５０mｌを寒天傾斜培養物から取ったシゾチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）またはトロウストチトリウム sp.Ｕ４２-２（ＡＴＣＣ番号２０８９１）の１つのコロニーで接種した。Ｍ５培養基は２mｌのビタミンミックスと２mｌの抗生物質ミックスを除いて実施例４に記載したものと同じである。培養物を回転振とう器上（２００rpm)、３０℃でインキュベートした。２日後、培養物は中程度の密度となり、活発に増殖していた。この培養物を、グルコースの代りに（５g／ｌで）次の１つのもの：デキストリン、ソルビトール、フルクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、コーンスターチ、小麦デンプン、じゃがいもデンプン、粉砕コ-ン；あるいはグルタメートの代りに（５g／ｌで）次の１つのもの：ゲリゼート、ペプトン、トリプトン、カゼイン、コーン浸漬液、尿素、ナイトレート、アンモニウム、ホエーまたはコーングルテンミール、と置き換えたＭ５培養基の入ったフラスコに接種するのに用いた。培養物を回転振とう器（２００rpm，２７℃）上で４８時間インキュベートした。種々の有機基質上での増殖を示す、相対的な培養物濃度を表７〜８に示す。
【００８７】
【表１３】
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【００８８】
【表１４】
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【００８９】
〔実施例１３〕
エビのω-３ＨＵＦＡ含量を増大させるためのトロウストチトリドベースの餌補助物の給餌
トロウストチトリウム sp.１２Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９０）の細胞性バイオマスを、２５℃でＭ-５培養基（実施例６参照）中、振とうフラスコ中で生産した。トロウストチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）の細胞性バイオマスは２７℃でＭ-５／１０培養基（実施例９参照）中、振とうフラスコの中で生産した。各々の株の細胞を遠心分離により収穫した。ペレットを一回蒸留水で洗浄し、ついで再遠心して５０％固形分ペーストを製造した。得られたペーストを海水に再懸濁し、その後、餌補助物としておとなの塩水エビ飼育物に与えた。この塩水エビは、それまでは農産廃棄物製品で飼育したものであり、その結果そのω-３ＨＵＦＡ含量は極めて低く、全脂肪酸のほんの１.３〜２.３％であった（自然界で捕らえた塩水エビは、平均して全脂肪酸の６〜８％のω-３ＨＵＦＡを有している)。この塩水エビ（２〜３／mｌ）を海水で満たした１リットルのビーカー中に入れ、エアレーションと飼育物を混合するためにエアーストーンを用いた。餌補助物を加えたのち、塩水エビのサンプルを周期的に収穫し、洗浄し、そしてその脂肪酸含量をガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を図８〜図９に示す。トロウストチトリドベースの餌補助物を仕上げ餌として与えると、塩水エビのω-３含量を、株１２Ｂを与えたときは５時間以内に、また株Ｓ３１を与えたときは１１時間以内に野性の塩水エビの含量と同じにまで増加することができる。塩水エビのω-３ＨＵＦＡ含量は、これらの餌補助物を２４時間までに与えると、野性のものの含量をはるかに越えさせることができる。さらに、これらの餌補助物は、自然界で捕らえた塩水エビ中では通常微量レベルにすぎないと報告されているＤＨＡ含量を著しく増大させる。
【００９０】
〔実施例１４〕
ω-３ＨＵＦＡに富んだ卵を産卵めんどりに産ませるためのトロウストチトリドベースの餌補助物の給餌
トロウストチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）の細胞性バイオマスを２７℃でＭ-５／１０培養基（実施例９参照）中、１０リットルの発酵槽中で生産した。トロウストチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）の細胞を遠心分離で収穫し、一旦蒸留水で洗浄し、再遠心分離して５０％固形分ペーストを製造した。その後、この細胞ペーストを次の２つの方法の一つで処理した：1）冷凍すること；または 2）粉砕コーンと混合して７０％固形分ペーストを製造し、次いで９０〜１２０℃で押出し、風乾する。得られた乾燥生成物を次に粉砕し、ω-３ＨＵＦＡ含量を分析し、さらに産卵するめんどりに１日当り４００mgのω-３ＨＵＦＡとなるレベルで飼料に混合した（４００mgのω-３ＨＵＦＡ／１００gの飼料）。産まれた卵を約４５日にわたってサンプリングレ、ガスクロマトグラフィーでω-３ＨＵＦＡについて分析した。２００〜４２５mg ω-３ＨＵＦＡ／卵の鶏卵がω-３補助物ＤＥ養わられためんどりによって産卵された（５０００mg脂肪酸卵に正規化した濃度)。調理すると、これらの卵は全く魚臭を呈さなかった。コントロールのめんどりは約２０mg ω-３ＨＵＦＡ／卵を含む卵を産卵した。コントロール群とω-３補助物を与えためんどりとによって産卵された卵の数に有意な差はなかった。餌補助物とコントロール食品とで得られた卵の黄味の色にも変りは全くなかった。
【００９１】
〔実施例１５〕
高純度品の製造（>９０％純度のω-３ＨＵＦＡあるいは>９０％純度のＨＵＦＡ脂肪酸混合物）
トロウストチトリウム sp.Ｓ３１（ＡＴＣＣ番号２０８８８）の細胞性バイオマスは１０リットルの発酵槽中、２７℃でＭ-５／１０培養基（実施例９参照）中で生産した。この株の細胞を遠心分離によって収穫した。約５gの細胞ペーストを、０.５mmガラスビーズで１／２を満たしたビーズビータービーズミルの３５０mｌのステンレススチール粉砕チャンバーに入れた。その容積の残りを試薬グレードのＭeＯＨで満たし、細胞を２回、３分間均質化した。ビーズミル操作のあいだ、ステンレススチールチャンバーを付属の氷浴で冷却状態に保った。
【００９２】
破砕した細胞の溶液をフラスコに注ぎ、その中へクロロホルムと２Ｍ ＮaＣｌ水溶液を加えて最終溶液がおよそ１:１:０.９（クロロホルム：ＭeＯＨ：水）となるようにした。その後、溶液を分液ロートに注ぎ、数回振り混ぜて脂質がクロロホルム層に移動するのを促進した。数分間で溶液が分離した後、クロロホルム層をフラスコに集め、新たなクロロホルムを分液ロートに加えて抽出を繰り返した。その後、このクロロホルム層を分液ロートから抜き出して２つのクロロホルム層を一緒にした。次いで、クロロホルムを、４０℃で操作される回転真空蒸発装置を用いて除去（及び回収）した。残った脂質の一部（３００mg）を取り出し、１５０mgテフロン（登録商標）張りのネジ蓋つき瓶中で、５０mｌのメタノール性ＮaＯＨ（０.３Ｎ ＮaＯＨ １０mｌをメタノールで１００mｌに希釈したもの）で、６０℃にて６時間加水分解した。その後、非加水分解性物質（ステロイド類、炭化水素類など）を、分液ロートで、５０mｌづつの石油エーテルで２回層分離し、エーテル層をその都度捨てることにより除去した。次いで、残った溶液を３mｌの６ＮＨＣｌを加えて酸性とし、遊離脂肪酸を５０mｌの石油エーテルで２回抽出した。遊離脂肪酸を含むエーテル溶液の５mｌを３つの１３mm×１００mm試験管に入れ、窒素気流下に溶液に吹き入れてエーテルを除去した。その後、２mｌのエーテル、ヘキサンまたはアセトンを１つの管に加え、蓋をしてドライアイス-エタノール溶液中（−７２〜−７４℃）に置き、非ＨＵＦＡ脂肪酸を結晶化させた。結晶化が完結した考えられるときに、培養管を、細かい紛末状のドライアイスで満たした５０mｌのポリカーボネートの遠心管中に入れた。次いで、これらの管を−１０℃に冷却した遠心装置に置き、１０,０００rpmに３〜５分間遠心した。その後、上清をパスツールピペットで各々の管からすばやく抜き取り、きれいな培養管に入れた。溶媒を窒素を吹き付けて上清から除去した。次いで、脂肪酸を、窒素下にテフロン（登録商標）張りのネジ蓋をした管の中で、メタノール性Ｈ2ＳＯ4（９６mｌのＭeＯＨ中、４mｌのＨ2ＳＯ4）中１００℃で１時間メチル化した。脂肪酸メチルエステルを次いでガスクロマトグラフィー（ＨＰ５８９０ガスクロマトグラフ、スペルコＳＰ２３３０カラム；カラム温度＝２００℃；検出器及び注入部温度＝２５０℃；キャリヤーガス＝窒素）で定量した。得られた脂肪酸混合物の組成は、（エーテル）９３.１％ ＨＵＦＡ − ２３.４％ Ｃ２２:５ｎ-６ ＋ ６９.７％ ２２:６ｎ-３；（ヘキサン）９１.５％ ＨＵＦＡ − ６６.８％ ２２:６ｎ-３ ＋ ２２.１％ ２２:５ｎ-６ ＋ ２.６％ ２０:５ｎ-３；（アセトン）９０.０％ ＨＵＦＡ − ６５.６％ ２２:６ｎ-３ ＋ ２１.８ｎ-６ ＋ ２.６％ ２０:５ｎ-３。
【００９３】
>９０％のω-３ＨＵＦＡを含む脂肪酸混合物を、１２Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９０）のようなトロウストチトリドの株の収穫したバイオマスについて上記の方法を行うことによって得ることができる。
【００９４】
一般的な備考
本発明の方法に従って単離した以下の新規株を本明細書中で開示し、クレームした生物の例として、the Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection（ＡＴＣＣ)、メリーランド州ロックビルに寄託した。
株                       ＡＴＣＣ番号       寄託日
シゾチトリウム   Ｓ３１             ２０８８８      ８／８／８８
シゾチトリウム  Ｓ８                ２０８８９      ８／８／８８
シゾチトリウム  １２Ｂ              ２０８９０      ８／８／８８
トロウストチトリウム  Ｕ４２-２     ２０８９１      ８／８／８８
シゾチトリウム  ２３Ｂ              ２０８９２      ８／８／８８
【００９５】
本発明は、特定の微生物株について開示されているが、本明細書中に開示した教示に従って得られるまたは用いうるすべての方法及び株を包含するものであり、当業者に熟知のそのような置換、変形、最適化はすべて本発明に包含される。
【００９６】
文  献  Ainsworth, G.C. (1973)  "Introduction and keys to the higher taxa."In:  The Fungi. An Advanced Treatise. Vol. 4B, G.C. Ainsworth  et al. (eds.), Academic Press, New York, pp. 107. Bahnweg, G. & Jackle, I. (1986)  "A new approach to taxonomy of the Thraustochytriales and Lybrinthulales."  In:  The Biology of  Marine Fungi, S.T. Moss (ed.), Cambridge University Press, London, pp. 131-140. Barr, J.S. (1981)  "The phylogenetic and taxonomic implications of flagellar rootlet morphology among zoosporic fungi."  BioSystems 14: 359-370. Barr, J.S. (1983)  "The zoosporic grouping of plant pathogens." In: Zoosporic Plant Pathogens:  a modern perspective, S.T. Buczacki (ed.), Academic Press, pp. 43-83. Bartnicki-Garcia, S. (1988)  "THe cell wall: a crucial structure in fungal evolution."  In:  Evolutionary Biologyof the Fungi, A.D.M. Rayner et al. (eds.), Cambrindge University Press, pp. 389-403. CalBiochem Co. (1987).  Biochemical/Immunochemical Catalog.  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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年4月26日(2010.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、食用製品。
ａ．全ω―３脂肪酸の少なくとも９４重量％をＣ２２：６ｎ−３（ＤＨＡ）として有する脂質を有する、トロウストチトリアレ目の微生物、またはそれから抽出された脂質：
ここで、前記微生物が発酵培養基中、窒素制限下でω−３脂肪酸を産生することができる、及び、
ｂ．食用物質。
【請求項２】
前記脂質中のω―３脂肪酸の少なくとも６４．５％がＤＨＡである、請求項1の食用製品。
【請求項３】
前記脂質中のω―３脂肪酸の少なくとも８６％がＤＨＡである、請求項1の食用製品。
【請求項４】
前記脂質の全脂肪酸の少なくとも４９％がω―３脂肪酸である、請求項１〜3のいずれか一項記載の食用製品。
【請求項５】
前記脂質の全脂肪酸の少なくとも６８％がω―３脂肪酸である、請求項１〜3のいずれか一項記載の食用製品。
【請求項６】
前記脂質の全脂肪酸の２０％以下がω―６脂肪酸である、請求項１〜5のいずれか一項記載の食用製品。
【請求項７】
前記脂質が、全ω−３脂肪酸の少なくとも９５重量％をＣ２２：６ｎ−３（ＤＨＡ）として有する、請求項１〜5のいずれか一項記載の食用製品。
【請求項８】
前記脂質が、全ω−３脂肪酸の少なくとも９６．５重量％をＣ２２：６ｎ−３（ＤＨＡ）として有する、請求項１〜5のいずれか一項記載の食用製品。
【請求項９】
前記脂質が、全ω−３脂肪酸の少なくとも９７．５重量％をＣ２２：６ｎ−３（ＤＨＡ）として有する、請求項１〜5のいずれか一項記載の食用製品。
【請求項１０】
前記脂質が、全ω−３脂肪酸の少なくとも９８．３重量％をＣ２２：６ｎ−３（ＤＨＡ）として有する、請求項１〜5のいずれか一項記載の食用製品。
【請求項１１】
前記脂質中のＥＰＡ：ＤＨＡ比が、１：１〜１：３０である、請求項１〜5のいずれか一項記載の食用製品。
【請求項１２】
前記脂質中のＤＰＡ：ＤＨＡ比が、少なくとも１：１２である、請求項１〜5のいずれか一項記載の食用製品。
【請求項１３】
前記微生物が、トロウストチトリウム属またはシゾチトリウム属の微生物またはそれらの混合物である、請求項１〜5のいずれか一項記載の食用製品。