(57)【要約】【課題】本発明の課題は、有機合成における原料として汎用性の高いカルボニル化合物の効率的かつ工業的な製造方法を提供することにある。【解決手段】エノン化合物にニトロレダクターゼを有する微生物、その処理物、酵素、または該酵素を産生する能力を有する形質転換体及びその処理物を作用させて炭素−炭素二重結合を選択的に還元することによってカルボニル化合物を製造する方法を見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）；
【化１】
2010110233.tif 000007
（式中、Ｒ1は水素もしくは、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基を表す。Ｒ2は水素、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基もしくはアラルキル基を表す。）で表されるエノン化合物の二重結合をニトロレダクターゼにより還元することを特徴とする、一般式（２）；
【化２】
2010110233.tif 000008
（式中、Ｒ1、Ｒ2は前記と同じ）で表されるカルボニル化合物の製造方法。
【請求項２】
前記Ｒ1が直鎖または分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、Ｒ2が水素、もしくは前記Ｒ1が水素、Ｒ2が直鎖または分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数６〜１５のアラルキル基である、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
前記エノン化合物がメチルビニルケトン、２−ブチルアクロレインまたはベンジルアクロレインのいずれかである、請求項１または２のいずれかに記載の製造法。
【請求項４】
前記ニトロレダクターゼがエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物由来のものである請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記ニトロレダクターゼが以下の（ａ）又は（ｂ）で表されるポリペプチドである請求項４記載の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトロレダクターゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド、及び／または、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を、共存させることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド、及び／または、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素がグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素である請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエノン化合物の二重結合をニトロレダクターゼにより還元することを特徴とするカルボニル化合物の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌にはニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨ）特異的ニトロレダクターゼとＮＡＤＰＨ及びニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）の両方に作用する２つのＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロ還元酵素が見出されている（非特許文献１）。ＮＡＤＰＨ特異的ニトロレダクターゼはｎｆｓＡ遺伝子にコードされ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロレダクターゼの１つはｎｆｓＢ遺伝子にコードされている（非特許文献２）。
【０００３】
ＮｆｓＢはニトロ化合物やキノンなど幅広い基質に対して還元酵素活性を有していることが知られている（非特許文献３、４）。ニトロ化合物の場合、ＮｆｓＢはニトロ基を還元し、ヒドロキシアミノ基を生成する（非特許文献５）。また、ＮｆｓＢはジヒドロプテリジンレダクターゼとも呼ばれ、ジヒロドプテリジンをテトラヒドロプテリジンに還元することも知られている（非特許文献６）。しかし、メチルビニルケトンのようなエキソメチレン基を有するエノン化合物の二重結合還元酵素活性についてはこれまでに報告はない。
【０００４】
カルボニル化合物は、有機合成における原料として汎用性の高い化合物である。また、カルボニル化合物は医薬品中間体として有用な光学活性アルコール、光学活性アミンの原料としても重要である。これらのカルボニル化合物はエノン化合物の炭素−炭素二重結合を還元することにより製造できる。なお、エノン化合物はアルデヒドとケトンの縮合反応により容易に得られ、例えば、アセトアルデヒドと２−ブタノンの縮合により３−メチル−３−ペンテン−２−オンが調製できる（非特許文献７）。
【非特許文献１】Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７，８１−８６（１９８１）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３３，１０−１６．
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，７３６−７４４（１９９６）
【非特許文献４】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６９，３４４８−３４５５（２００３）
【非特許文献５】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４３，３６２４−３６３１（２０００）
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５５，５８１−５８８（１９８８）
【非特許文献７】Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．， ８１， １１１７−１１１９（１９５９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、有機合成における原料として汎用性の高いカルボニル化合物の効率的かつ工業的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、カルボニル化合物の効率的な製造法を開発すべく検討を重ねた結果、微生物のニトロレダクターゼを用れば、エノン化合物のカルボニル基を還元することなく炭素−炭素二重結合のみを還元することができ、カルボニル化合物を効率良く製造する方法を発見し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。
即ち、本発明は、一般式（１）；
【０００８】
【化３】
2010110233.tif 000002
（式中、Ｒ1は水素、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基を表す。Ｒ2は水素、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基もしくはアラルキル基を表す。）で表されるエノン化合物の二重結合をニトロレダクターゼにより還元することを特徴とする、一般式（２）；
【０００９】
【化４】
2010110233.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ2は前記と同じ）で表されるカルボニル化合物の製造方法である。
【００１０】
本発明の特徴としては前記ニトロレダクターゼが以下の（ａ）又は（ｂ）で表されるポリペプチドである。
（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトロレダクターゼ活性を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のニトロレダクターゼを用いることによって、有機合成における原料として汎用性の高いカルボニル化合物のカルボニル基を還元せず、炭素―炭素二重結合のみを選択的に還元して効率良く、かつ工業的に有利に製造できることが明らかとなった。また、本酵素は大腸菌で組換え発現する場合、宿主由来の酵素であるため、高発現が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を実施形態で詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。
【００１３】
本発明は、ニトロレダクターゼを利用することにより、エノン化合物のカルボニル基を還元することなく、炭素−炭素二重結合のみを還元して、カルボニル化合物を効率的に製造する方法である
本発明において、原料であるエノン化合物は、一般式（１）；
【００１４】
【化５】
2010110233.tif 000004
（式中、Ｒ1は水素、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基を表す。Ｒ2は水素、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基もしくはアラルキル基を表す。）で表される化合物であり、生成物であるカルボニル化合物は一般式（２）；
【００１５】
【化６】
2010110233.tif 000005
（式中、Ｒ1、Ｒ2は前記と同様。）で表される化合物である。好ましくは、前記Ｒ1が直鎖または分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、Ｒ2が水素である化合物、もしくは前記Ｒ1が水素、Ｒ2が直鎖または分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、もしくは炭素数６〜１５のアラルキル基である化合物のいずれかである。最も好ましくは、メチルビニルケトン、２−ブチルアクロレインまたはベンジルアクロレインである。
【００１６】
本発明の「ニトロレダクターゼ」は、ニトロ基を還元し、ヒドロキシアミン基を生成する活性（以下、ニトロレダクターゼ活性と略記する）を有し、かつエノン化合物のカルボニル基を還元することなく炭素−炭素二重結合のみを還元する活性を有するポリペプチドである。好ましくはＥＣ番号１．５．１．３４のジヒドロプテリジンレダクターゼに分類される酵素であり、さらに好ましくはエシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の細菌由来のものである。最も好ましくはニトロレダクターゼＮｆｓＢである。ＮｆｓＢは配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、上記ニトロレダクターゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。なお、ニトロレダクターゼ活性の検出方法としては、例えば  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，７３６−７４４（１９９６）に記載の方法がある。
【００１７】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、ニトロレダクターゼ活性を有する限り上記ポリペプチドに包含される。
【００１８】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素ついて、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、前述した他の微生物由来のアミノ基転移酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。
【００１９】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００２０】
また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ, Ａｌａ,  Ｖａｌ，  Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ， Ｍｅｔ，  Ｃｙｓ，  Ｐｒｏ，  Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，  Ｔｈｒ，  Ｇｌｎ，  Ａｓｎ，  Ｔｒｐ，  Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，  Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，  Ｌｙｓ，  Ａｒｇ
【００２１】
置換、挿入、欠失及び／または付加されるアミノ酸の数としては、改変後のポリペプチドがアミノ基転移酵素（Ａ）の活性を有する限り、特に制限されないが、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、配列同一性が８５％以上であることが好ましい。配列同一性９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９９％以上が最も好ましい。配列同一性は、前記の高度保存領域の確認と同様にして、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と改変されたアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除し、さらに１００を乗じた値で表される。
【００２２】
ニトロレダクターゼ活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、ニトロレダクターゼ活性の上記活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
【００２３】
反応に用いるニトロレダクターゼの酵素の純度あるいは形態については、目的とする活性を有していれば特に制限されるものではない。本発明の反応に用いるニトロレダクターゼとして、例えば精製酵素、または粗酵素の形態で用いることができる。また、酵素含有物、微生物培養液、培養物、菌体、培養液、酵素遺伝子が導入されることによって目的とする反応の活性を獲得した組換え微生物（形質転換体）、またはそれらの処理物など、種々の形態で用いることができる。ここで「処理物」とは、例えば、凍結乾燥品、アセトン乾燥品、摩擦物、自己消化物、超音波破砕物またはアルカリ処理物などを言い、目的とする活性が残存する限りは、本発明の反応に用いることができる。また、市販の酵素を用いても良いし、実験者が調製した酵素でも良い。
【００２４】
ニトロレダクターゼの好ましい形態としては、配列表の配列番号１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体、もしくは、配列表の配列番号１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の培養菌体、その処理物をカルボニル化合物の製造に使用することができる。ここで言う形質転換体の処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。
【００２５】
上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内でニトロレダクターゼをコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００２６】
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例２参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレット）などが挙げられる。
【００２７】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００２８】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００２９】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学」（共立出版、１９８７）などに詳細に記述されている。
【００３０】
各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)属、バチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)属、シュードモナス(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)属、セラチア(Ｓｅｒｒａｔｉａ)属、ブレビバクテリウム(Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、コリネバクテリイウム(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、ストレプトコッカス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ)属、及びラクトバチルス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ)属及びストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、クライベロマイセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)属、シゾサッカロマイセス(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、チゴサッカロマイセス(Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、ヤロウイア(Ｙａｒｒｏｗｉａ)属、トリコスポロン(Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ)属、ロドスポリジウム(Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ)属、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)属、及びキャンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ)属、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属、セファロスポリウム(Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ)属、及びトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，３１５,５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００３１】
ニトロレダクターゼコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。
【００３２】
ニトロレダクターゼをコードするＤＮＡを含むベクターの例としては、実施例に示すｐＮＮＲが挙げられる。また、ニトロレダクターゼをコードするＤＮＡを含む形質転換体の例としては、ベクターｐＮＮＲでＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）が挙げられる。
【００３３】
また、ニトロレダクターゼをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を本発明に用いることにより、より効率的にカルボニル化合物を製造することができる。ニトロレダクターゼをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、ニトロレダクターゼをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
【００３４】
補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、ＮＡＤ+もしくはＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、もしくはＮＡＤＰＨに変換する能力を有している酸化還元酵素が好ましい。
【００３５】
このような酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素などが挙げられる。好適には、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素が使用される。
【００３６】
ギ酸脱水素酵素としては、例えば、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロイッケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、ハイホマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、などの微生物、特にチオバシラス・エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から得られる酵素が挙げられる。
【００３７】
グルコース脱水素酵素としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの微生物、特にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から得られる酵素が挙げられる。
【００３８】
得られた形質転換体の培養は、通常これらの微生物が資化できる栄養源を含む培地であれば何でも使用しできる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源；更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源；を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来る。これら培地は用いる微生物の種類によって適宜選択すればよい。
【００３９】
微生物の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０〜４５℃の範囲で、好気的に１０〜９６時間培養するのが好ましい。エノン化合物に微生物を反応させる場合においては、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用することもできるが、培養液の濃縮物も用いることができる。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用することも出来る。
【００４０】
還元反応の際には、基質であるエノン化合物を反応の初期に一括して添加してもよく、反応の進行にあわせて分割して添加してもよい。反応時の温度は通常１０〜６０℃、好ましくは、２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは２．５〜９、好ましくは、５〜９の範囲である。反応液中の酵素源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）である。反応は通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。反応時間は基質濃度、酵素源の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。
【００４１】
還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を０．５〜３０％の割合で加えると優れた結果が得られるので好ましい。一般に生物学的方法による還元反応に必要とされているＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、具体的には、反応液に直接これらを添加する。
【００４２】
また、補酵素再生能有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含まない形質転換体を反応に用いる場合は、反応を促進させるために、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋をそれぞれの還元型へ還元する酵素、及び還元するための基質を共存させて反応を行うと優れた結果が得られるので好ましい。例えば、酵素としてグルコース脱水素酵素、還元するための基質としてグルコースを共存させる。
【００４３】
また更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。更に、基質または還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
【００４４】
還元反応により生成したカルボニル化合物の採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度のカルボニル化合物を容易に得ることが出来る。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。また、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、
Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。
【００４６】
（実施例１）エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１からのメチルビニルケトン二重結合還元酵素の精製
以下の方法に従って、エシェリヒア・コリ（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株（タカラバイオ社製）より、メチルビニルケトンの二重結合を還元してメチルエチルケトンを生成する活性を有するポリペプチドを分離し、電気泳動的に単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。
【００４７】
メチルビニルケトンの二重結合に対する還元活性は以下の方法で測定した。２．８ｍＭのメチルビニルケトン及び３．２ｍＭの補酵素ＮＡＤＨを含む１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に、粗酵素液を添加し、３０℃で５分間反応させた後、反応液をジクロロメタンで抽出し、ガスクロマトグラフィー分析により、メチルエチルケトンの生成量を求めた。ガスクロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
【００４８】
［ガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：ＧＬサイエンス株式会社製  ＩｎｅｒｔＣａｐ５（３０ｍ×０．２５ｍｍ）
検出：ＦＩＤ
キャリアガス：ヘリウム
カラム温度：３５℃
保持時間：メチルビニルケトン２．７１分、メチルエチルケトン２．８２分
本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのメチルビニルケトンをメチルエチルケトンに還元する活性を、１ｕｎｉｔと定義し、下記式より還元活性を算出した。
【００４９】
メチルビニルケトンの二重結合に対する還元活性（Ｕ／ｍｌ）＝メチルエチルケトンのエリア面積÷（メチルビニルケトンのエリア面積＋メチルエチルケトンのエリア面積）×反応に用いたメチルビニルケトン量（μｍｏｌ）÷反応時間（分）÷酵素液量（ｍｌ）
【００５０】
（１）微生物の培養
５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、肉エキス１０ｇ、ペプトン１５ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ６）３Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株の培養液を３０ｍｌ接種し、攪拌回転数４００ｒｐｍ、通気量０．９ＮＬ／ｍｉｎ、３７℃で２４時間培養を行った。
【００５１】
（２）無細胞抽出液の調製
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、０．９％塩化ナトリウム水溶液を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０型超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。
【００５２】
（３）プロタミン処理
無細胞抽出液の１０分の１量の１０％（ｗ／ｖ）硫酸プロタミン溶液を無細胞抽出液加えて４℃で２時間攪拌後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。
【００５３】
（４）ポリペプチドの精製
プロタミン処理後の無細胞抽出液を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．２Ｍまで）により活性画分を溶出させた。この活性画分を集めて、次に１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で予め平衡化したＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（７０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．２Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集めて、さらに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒＱ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ（東ソー株式会社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．２Ｍまで）により活性画分を溶出させた。
【００５４】
（５）ポリペプチドの同定
活性画分を集めて、ＵｌｔｒａｆｒｅｅＭＣ（ミリポア株式会社社製）により酵素液を濃縮した。濃縮した酵素液についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写し、クマシーブリリアントブルー染色によって可視化された約２６ｋＤａ目的タンパクのバンドを切り出し、アミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。決定したＮ末端アミノ酸配列「ＭＤＩＩＳＶＡＬＫ」について、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するブラストサーチを用いた相同性検索を行った。その結果、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のニトロレダクターゼＮｆｓＢのＮ末端アミノ酸配列と１００％一致した。
【００５５】
（実施例２）ニトロレダクターゼＮｆｓＢ高発現組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）の作製
ニトロレダクターゼＮｆｓＢを高発現する組換え菌を作製した。プライマー１（配列表の配列番号３）：５'−ＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧ−３'、プライマー２（配列表の配列番号４）：５'−ＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＣＧＧＴＴ−３'を用い、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
【００５６】
上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＮＲを構築した。この組換えベクターｐＮＮＲを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を得た。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を実施例１に示した方法で培養し、得られた培養液のメチルビニルケトンの二重結合還元活性を実施例２に示した方法で測定した。結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2010110233.tif 000006
【００５８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）はＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）よりもメチルビニルケトンの二重結合還元活性が高かった、すなわちニトロレダクターゼＮｆｓＢはメチルビニルケトンの二重結合還元活性が高く、メチルビニルケトンをメチルエチルケトンへ変換することを確認した。
【００５９】
（実施例３）組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を用いたメチルエチルケトンの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ１．０％、ｐＨ７．０）５００ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養液１００ｍｌを超音波ホモジナイザーにより菌体破砕し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）５００Ｕ、グルコース２．８ｇ、ＮＡＤ+１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。これにメチルビニルケトン１ｇを加え、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌を続けた。２４時間の反応ののち、実施例１に示したガスクロマトグラフィー条件で分析することによりメチルエチルケトンへの変換率を求めた。その結果、メチルエチルケトンへの変換率は１００％であった。
【００６０】
メチルビニルケトンのカルボニル基を還元した３−ブテン−２−オールを生成することなく、効率的にメチルエチルケトンが得られた。
【００６１】
（実施例４）組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を用いた２−メチル−１−ヘキサナールの製造
実施例３に示した方法で得られたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）の培養液３０ｍｌ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１９５ｍｌ、５５％グルコース水溶液２５ｍｌ、ＮＡＤＰ２５ｍｇを加えた。その後、基質２−ブチルアクロレイン１ｇをヘキサン１００ｍｌに溶解させ、２５分間かけて反応系中に滴下した。５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌を続けた。２４時間後、反応液を分液し、減圧下にてヘキサンを留去し、０．７ｇの２−メチル−１−ヘキサナールを取得した。なお、２−メチル−１−ヘキサナールの生成量は下記ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）条件で分析することにより決定した。
【００６２】
[ＧＣ分析条件]
キャピラリーカラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β  φ０．２５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×６０ｍ（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ  ３００ｋPa、検出器：ＦＩＤ、カラム温度：４５℃、検出時間：（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナール  ４９．９分、（Ｓ）−２−メチル−１−ヘキサナール  ５１．５分、２−ブチルアクロレイン  ４４．６分。
【００６３】
（実施例５）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を用いた２−メチル−３−フェニルプロパナールの製造
実施例３に示した方法で得られたＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）の培養液９００μｌ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、基質２−ベンジルアクロレインを１０ｍｇ加え、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法により分析することで、反応変換率を求めた。その結果、２−メチル−３−フェニルプロパナールへの変換率は１００％であった。
【００６４】
[ＧＣ分析条件]
キャピラリーカラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β  φ０．２５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×６０ｍ（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ  ３００ｋPa、検出器：ＦＩＤ、カラム温度：８０℃、検出時間：（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナール  １１３．９分、（Ｓ）−２−メチル−３−フェニルプロパナール  １１６．９分、２‐ベンジルアクロレイン  ９６．２分
【配列表】
2010110233000001.app