(57)【要約】【課題】岩石試料から、ＰＣＲ反応等の遺伝子解析実験に用いることが可能なＤＮＡ試料を直接取得する方法を提供する。【解決手段】粉砕した岩石試料をアルカリ溶液に加え、高温、好ましくは９０〜９５℃で、長時間、好ましくは２時間以上加熱し、その後、クロロホルム又はクロロホルムを含む有機溶剤による抽出、及びアルコールによる沈殿により精製を行うことにより、ＰＣＲ反応を阻害する物質が取りのぞかれたＤＮＡ試料を得ることができる。【選択図】図１
2010136716.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、粉砕した岩石試料をアルカリ溶液に加えて加熱する工程、得られた溶液からクロロホルム又はクロロホルムを含む有機溶媒を用いて抽出する工程、及びアルコールによる沈殿により精製する工程、を含むことを特徴とする岩石試料からのゲノム及び／又はＤＮＡの抽出方法。
【請求項２】
前記岩石試料が、堆積し固結した岩石試料であることを特徴とする請求項１に記載のゲノム及び／又はＤＮＡの抽出方法。
【請求項３】
前記加熱を、９０〜９５℃で、少なくとも２時間行うことを特徴とする請求項１又は２に記載のゲノム及び／又はＤＮＡの抽出方法。
【請求項４】
粉砕した岩石試料からゲノム及び／又はＤＮＡを抽出するためのキットであって、少なくとも、アルカリ溶液、クロロホルム又はクロロホルムを含む有機溶剤、及びアルコールを含むことを特徴とするゲノム及び／又はＤＮＡの抽出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、岩石試料中に存在するゲノム及び／又はＤＮＡの抽出方法並びにそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物生態系の評価方法は、これまで、培養作業に基づく技術が主だった。
しかしながら、近年のＤＮＡ解析を中心とした分子生物学の目覚ましい進展により、土壌や汚泥、湖水、海水などの環境試料から、培養を経ずに直接ゲノム及び／又はＤＮＡ（なお、本件において、「ゲノム及び／又はＤＮＡ」とは、ゲノムＤＮＡ及びその断片ＤＮＡの双方を含むことを意味するものであって、以下、これらをまとめて、単に「ＤＮＡ」ということもある。）を抽出することによって、不特定多数の微生物種からなる環境試料から微生物種を特定することが可能になり、現在様々な環境を対象に盛んに用いられている。
【０００３】
こうした環境試料、なかでも、特に土壌については、ＤＮＡを抽出する方法は種々提案されているが（特許文献１〜５等）、これらの方法では、いずれも界面活性剤を含む緩衝液を用いて、ＤＮＡを抽出している。
例えば、特許文献１では、瞬間凍結した土壌を凍結乾燥した後粉砕し、これから、界面活性剤を含む緩衝液を用いてＤＮＡを抽出するものである。
また、特許文献２、３では、緩衝液に、微生物の細胞壁や細胞膜を破砕するタンパク質分解酵素及び界面活性剤を含有させた液を、抽出液（溶菌液）として用いている。
また、特許文献４、５では、界面活性剤を含有するＤＮＡ抽出液の存在下で環境試料をbeads-beating処理及び／又は加熱処理してＤＮＡを抽出している。
そして、近年では、ISOIL（ニッポンジーン）や、PowerCleanDNA Clean-UP Kit(MoBio)等の、土壌試料からＤＮＡを抽出するためのキットが販売されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−８１０６１号公報
【特許文献２】特開２００４−３３７０２７号公報
【特許文献３】特開２００５−７３６４３号公報
【特許文献４】国際公開第２００５／７３３７７号
【特許文献５】特開２００８−５０００６６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kouduka M, Matuoka A, Nishigaki K. Acquisition of genome information from single-celled unculturable organisms (radiolaria) by exploiting genome profiling (GP). BMC Genomics 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、岩石中には地表の植物に匹敵する生物が存在すると考えられている。しかしながら、これまでの報告はいずれも土壌試料についてのものばかりで、第三紀堆積岩とよばれる深い深度から得られるような固結した岩石等から直接ＤＮＡ等を取得したという報告はなく、これまで、岩石、例えば、ボーリングした地下深部コアから直接ＤＮＡを抽出することは困難とされてきた。そのため、岩石中の微生物生態系の評価は、主に岩石中から湧出する水を対象として行われている。
しかしながら、岩石中と岩石中から湧出する水中では、生息する微生物種が異なる可能性がある。
【０００７】
新たなニーズとして、地下空間の利用が検討されており、例えば二酸化炭素の地下での貯留や地層処分、資源開発、バイオ分野（新種微生物、新規遺伝子の発見と利用）等があり、岩石試料からのＤＮＡの直接抽出は、今後ますます望まれている。
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであって、岩石試料から、ＰＣＲ反応等の遺伝子解析実験、或いは塩基配列決定に用いることが可能なＤＮＡ試料を直接取得する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、岩石試料からのＤＮＡ抽出が困難である理由の一つに、多量に含まれるシリカ鉱物へのリン酸基を持つＤＮＡの吸着が挙げられることが判明した。
また、岩石試料中には、腐植物質などの、ＰＣＲ反応（遺伝子増幅反応）を阻害する有機物質が多量に含まれており、岩石試料からのＤＮＡの抽出を困難にしていることも判明した。
【０００９】
ところで、本発明者らは、これまでに、シリカの生体鉱物で包まれた放散虫について、アルカリ抽出法を用いることにより、同様な問題を解決した上での単一細胞からのゲノム抽出と、その後のゲノム解析に成功している(非特許文献１)。
すなわち、アルカリ抽出法自体は生体試料において一般的に知られている方法であって、生物の細胞を壊しＤＮＡを取り出すことを目的としているために加熱は行わないものであるが、本発明者らは、アルカリ溶液中で加熱することにより、単一細胞生物である放散虫の殻を壊すことができることを見いだしたものである。
【００１０】
本発明者らはさらに検討を行った結果、岩石試料に、前記の放散虫で確立したアルカリ抽出法を応用し、さらに高温、好ましくは９０〜９５℃で、長時間、好ましくは２時間以上加熱することにより、岩石中に多量に含まれるシリカ鉱物を溶かし、岩石中に存在する微生物のＤＮＡを取得することに成功した。また、クロロホルムを含む有機溶剤による処理及びアルコールによる沈殿を用いて、抽出物からＰＣＲ反応を阻害する物質を取り除くことにより、岩石試料からのＰＣＲ反応等遺伝子解析実験に用いることが可能なＤＮＡ試料を取得することが可能となることを見いだした。
【００１１】
本発明はこれらの知見に基づいて完成に至ったものであり、以下のとおりのものである。
［１］少なくとも、粉砕した岩石試料をアルカリ溶液に加えて加熱する工程、得られた溶液からクロロホルム又はクロロホルムを含む有機溶媒を用いて抽出する工程、及びアルコールによる沈殿により精製する工程、を含むことを特徴とする岩石試料からのゲノム及び／又はＤＮＡの抽出方法。
［２］前記岩石試料が、堆積し固結した岩石試料であることを特徴とする上記［１］に記載のゲノム及び／又はＤＮＡの抽出方法。
［３］前記加熱を、９０〜９５℃で、少なくとも２時間行うことを特徴とする上記［１］又は［２］のゲノム及び／又はＤＮＡの抽出方法。
［４］粉砕した岩石試料からゲノム及び／又はＤＮＡを抽出するためのキットであって、少なくとも、アルカリ溶液、クロロホルム又はクロロホルムを含む有機溶剤、及びアルコールを含むことを特徴とするゲノム及び／又はＤＮＡの抽出キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、岩石試料からゲノムＤＮＡ及び／又はＤＮＡが抽出にできるばかりでなく、抽出されたゲノムＤＮＡ及び／又はＤＮＡに含まれるＰＣＲ反応阻害物質を取り除くことができるので、岩石中の微生物に対する遺伝子解析等が可能となる。また、岩石中の微生物生態系を明らかにし、物質循環や環境変動等の総合レベルでの正確な理解に繋がると考えられる。さらに、地下微生物生態系の実態と物質移行を解明することにより、近年注目される、微生物を利用した環境保全、資源エネルギーの利用、環境修復の発展も期待される。また本発明によれば、これまでＤＮＡ抽出の成功例がない第三紀堆積岩とよばれる深い深度から得られるような固結した岩石等からもＮＤＡ試料を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】従来の市販の土壌用ＤＮＡ抽出キットによる抽出と、本発明の方法を用いて行ったＤＮＡ抽出の、ＤＮＡ溶液の濃度比較を示す図。
【図２】ＤＮＡ抽出溶液をテンプレートとして行ったＰＣＲ反応（遺伝子増幅反応）産物の電気泳動による確認結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のゲノム及び／又はＤＮＡの抽出方法は、岩石試料を粉砕後、アルカリ溶液加え、加熱することにより、試料中のシリカ鉱物を溶かすと同時に試料中のＤＮＡを溶出し、さらに、得られた溶液を、クロロホルム又はクロロホルムを含む有機溶媒による処理と、アルコールによる沈殿によって精製し、ＤＮＡ抽出溶液を得るものであり、特に、本発明のＤＮＡ抽出方法は、第三紀堆積岩とよばれる深い深度から得られるような堆積して固結した岩石にも有効な方法である。
【００１５】
本発明において、岩石試料は、粉砕して用いられるが、粉砕方法は特に制限されるものでなく、たとえば、ハンマー等により、直径１ｍｍ以下程度の大きさにまるまで粉砕しておくのが好ましい。
岩石材料としては、深度２００Ｍより深いところから掘削により得られた「固結した岩石試料（ボーリングコアを使用）を用いることが可能であり、具体的は、凝灰岩、泥質岩、泥岩などの堆積岩を用いることができる。
【００１６】
本発明に用いられるアルカリ溶液としては、特に限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの、アルカリ金属の水酸化物溶液が好ましく用いられ、その濃度は、０．１〜１．０規定の濃度のものが用いられる。
【００１７】
本発明においては、岩石中のシリカ鉱物を壊しながらＤＮＡを取得する必要がため、加熱は、前述の非特許文献１に記載されたものよりも、さらに高温で、かつ、長時間行う必要があり、好ましくは、９０〜９５℃で、少なくとも２時間行う。
【００１８】
加熱処理された溶液は、クロロホルム又はクロロホルムを含有する有機溶媒を用いてＤＮＡが抽出され、さらにアルコールによる沈殿処理により精製され、ＰＣＲ反応を阻害する有機物質等が除去される。
本発明に用いるクロロホルムを含む有機溶媒としては、フェノールクロロホルム溶液が用いられる。クロロホルムをそのまま用いても可能である。
なお、比較的、腐植物質など有機物質が岩中の含量が少ない場合は、クロロホルム又はクロロホルムを含む有機溶剤を用いる工程を省いても良い。
【００１９】
本発明におけるアルコールによる沈殿には、好ましくはエタノール又はメタノール等が用いられる。
アルコール沈殿の際、ＤＮＡ溶液中にシリカが多量に含まれている場合、ＤＮＡ溶液のｐＨの変化により溶液がゲル化することがある。その際には、ゲル化した試料を遠心分離し、上澄みを破棄し、沈殿物（ゲル化した部分）にバッファー（Trisバッファー、TEバッファーなど一般的にDNAを保存する際に使うような遺伝子工学実験に用いられる溶媒）を加え、ＤＮＡを溶出ことが可能である。バッファーを加えた後、撹拌もしく沈殿物をすり潰し、遠心分離して得られた上澄みにＤＮＡが含まれている。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明の方法による地下岩石試料からのＤＮＡ抽出能力について、従来用いられてきた土壌試料用のＤＮＡ抽出キットを用いて、比較検討を行った。
なお、本発明は、これらの例により何ら限定されるものではない。
【００２１】
〈使用した岩石試料〉
本実施例では、岩石試料として、凝灰岩、泥質岩、泥岩などの堆積岩を用いた。
図１に示した、凝灰岩、泥質岩は、共にバイオマーカーの実験により微生物の存在が確認されている領域である。
【００２２】
〈使用した方法（DNA抽出キット）〉
本発明（アルカリ加熱方法）のキット
・１Ｍ  ＮａＯＨ
・ミネラルオイル
・クロロホルム
・１００％エタノール
・３Ｍ酢酸ナトリウム
・７０％エタノール
・ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）
・１．５ｍｌチューブ
市販キット１：ISOIL（ニッポンジーン社製）
・Lysis Solution HE
・Lysis Solution 20S
・Purification Solution
・Precipitation Solution
・Wash Solution
・Ethachinmate
・ＴＥ（ｐＨ８．０）
・ポリロート
市販キット２：UltraCleanTM Soil DNA Isolation kit (Mo BIO社製)
・ソルーションＳ１〜Ｓ５
・ソルーションＩＲＳ
・PowerdBead Tube
・Spin filter
・Collection ２ｍｌ tube
【００２３】
なお、市販キット１、２は、共に土壌試料に対応したDNA抽出キットであるが、ここでの土壌は比較的深度の浅い部分（岩石ではない土）に対応しているものである。すなわち、ISOILは日本製であり、火山灰を含む日本国内の土壌を試料としたDNA抽出に有用な使用となっている。一方、UltraCleanTM Soil DNA Isolation kit は米国製であり、日本国内の土壌からのＤＮＡ抽出も可能であるが、海外でも多く使用されているキットである。
【００２４】
〈ＤＮＡ抽出〉
それぞれ、以下の手順でＤＮＡ抽出を行った。
（本発明）
（１）岩石試料（０．２５ｇ）を１．５ｍｌチューブに入れる。
（２）１Ｍ  ＮａＯＨ（１ｍｌ）を加え、撹拌する。
（３）９４℃で、１２０分インキュベートする。途中、チューブを撹拌する。この際、溶液の蒸発に備え、ミネラルオイル（５μｌ）を加える。
（４）水層を新しい１．５ｍｌチューブに移す。この際、ミネラルオイルが入らないように気をつける。
（５）クロロホルム（１ｍｌ）を加え、激しく撹拌させ、遠心分離（１２，０００×ｇ，１分間）し、上澄みを新しい１．５ｍｌチューブに移す。
（６）１００％エタノール（１ｍｌ）及び０．３mＭ酢酸ナトリウム（５０μｌ）を加え、インキュベートする（−２０℃、３０分）。
（７）遠心分離（１２，０００×ｇ，１分間）し、上澄みを捨てる。
（８）７０％エタノールを（１ｍｌ）加え、遠心分離（１２，０００×ｇ，１分間）し、上澄みを捨て、沈殿物を乾燥させる。
（９）沈殿を、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）（５０μｌ）に溶解する。
【００２５】
（比較例１：市販キット１を用いたDNA抽出）
（１）岩石試料（０．２５ｇ）を２ｍｌチューブに入れる。 
（２）Lysis Solution HE（４７５μｌ）とLysis Solution 20S（２５μｌ）を添加し、転倒混和にて十分に混合した後、６５℃で１時間インキュベートする。
（３）遠心（１２，０００×ｇ、１分間、室温）する。
（４）上清（３００μｌ）を新しいチューブに移し、Purification Solution（２００μｌ）を添加し、十分に混合する。
（５）クロロホルム（３００μｌ）を添加し、１５秒間ボルテックスした後、遠心（１２，０００×ｇ、１５分間、室温）する。 
（６）中間層を入れないように注意しながら水層（４００μｌ）を新しいチューブに移し、Precipitation Solution（４００μｌ）を添加して十分に混合し、遠心（２０，０００×ｇ、１５分間、４℃）する。 
（７）上清を捨て、Wash Solution（５００μｌ）を加えて数回転倒混和し、遠心（２０，０００×ｇ、１０分間、４℃）する。 
（８）上清を捨て、７０％エタノール（５００μｌ）とEthachinmate（２μｌ）を加えてボルテックスした後、遠心（２０，０００×ｇ、５分間、４℃）する。
（９）上清を捨て、風乾した後、沈殿を５０μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）に溶解する。
【００２６】
（比較例２：市販キット２を用いたDNA抽出）
（１）岩石試料（０．２５ｇ）をPowerBeadチューブに入れる。
（２）ソリューションＳ１（６０μｌ）を加え、チューブを緩やかに撹拌する。
（３）ソリューションＩＲＳ（２００μｌ）を加え、１０分間撹拌する。
（４）遠心分離（１０，０００×ｇ，３０秒間）する。
（５）上清をCollection ２ｍｌ Tubeへ移す。
（６）ソリューションＳ２（２５０μｌ）を加え、４℃下に５分間置く。
（７）遠心分離（１０，０００×ｇ，１分間）する。
（８）上清をCollection 2ml Tubeへ移す。
（９）ソリューションＳ３（９００μｌ）を加え、４秒間撹拌する。
（10）上澄みをspinfilterに移し、遠心分離（１０，０００×ｇ，３０秒間）する。この時、spinfilter には７００μｌまでしか入らないので、複数回に分けて行う。
（11）ソリューションＳ４（３００μｌ）を加え、遠心分離（１０，０００×ｇ，３０秒間）する。
（12）溶液を捨て、遠心分離（１０，０００×ｇ，３０秒間）を行うことにより、フィルターを乾かす。
（13）spinfirterを新しいCollection ２ｍｌ Tubeにのせる。
（14）ソリューションＳ５（５０μｌ）をspinfilter のメンブレン部の中央に加え、遠心分離（１０，０００×ｇ，３０秒間）を行うことによりＤＮＡを溶出する。
【００２７】
〈得られたＤＮＡ溶液の濃度（ＯＤ）測定〉
本発明方法、及び市販キット１、２にて抽出したDNA溶液の濃度をNanoDrop ND-1000（分光光度計）を用いて測定し、比較した。その結果を図１に示す。
図１に示すとおり、本発明のアルカリ加熱法によれば、凝灰岩、及び泥質岩より得られたＤＮＡ溶液濃度は、それぞれ２２．４１μｇ／μｌ、及び３６．９８μｇ／μｌであった。これに対して、市販キット１を用いた場合は、それぞれ０．０１μｇ／μｌ、及び１．０３μｇ／μｌであり、また市販キット２を用いた場合は、それぞれ８．０７μｇ／μｌ、及び７．７５μｇ／μｌであった。
【００２８】
また、ＰＣＲ反応用のテンプレートとして用いた検証では、本発明方法によって得たDNA試料をテンプレートとした場合、目的の遺伝子を得ることに成功した。一方、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて得られたＤＮＡ溶液をテンプレートとした場合、目的の遺伝子を増幅させることはできなかった。
この結果から、従来の土壌用DNA抽出キットに比べ、本発明方法ではＰＣＲ反応を行うのに十分な量のＤＮＡ抽出に成功し、その後の反応に用いるのに阻害物質となる腐植物質等を十分に取り除くことに成功していることがいえる。
結果、本発明の方法（アルカリ加熱法）では、従来用いられてきたＤＮＡ抽出キットに比べ、泥岩からのＤＮＡ抽出に対し有用であることが示された。
【００２９】
〈得られた試料（ＤＮＡ溶液）を用いたＰＣＲ反応（遺伝子増幅実験）〉
本発明法によって得られたＤＮＡ溶液がＰＣＲのテンプレートとして用いることができるか、配列決定に用いることができるかを検討した。
実際に、得られたＤＮＡを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析を行った結果について報告する。
【００３０】
１）ＰＣＲ反応による特定遺伝子増幅実験
本発明方法で得られた、ＤＮＡ溶液をテンプレートとして、以下に示す方法で１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとするＰＣＲ反応を行った。
（ＰＣＲ反応溶液組成）
・LA Taq （TAKARA BIO, Tokyo）：１．０Ｕ
・１０×Buffer (LA Taq用) ：２０μｌ
・２．５ｍＭ dNTP：２０μｌ
・テンプレート：１００ｎｇ
・プライマー：０．５ｐｍｏｌ
・Ｈ２Ｏ：全体で２０μｌ
（プログラム）
(１)９４℃  ２分
(２)９４℃  ３０秒
(３)５０℃  １分
(４)７２℃  １分
(５)７２℃  ５分
（１）の後、（２）〜（４）を３５サイクル行い、最後に(５)を行った。
【００３１】
２）１）で得られたＰＣＲ産物の電気泳動による確認
電気泳動用ゲル組成：1xTAE、１％  アガロース
バッファー組成：1xTAE (40 mM Tris-acetate/ 1 mM EDTA)
電気泳動条件：１００Ｖ、３０ｍｉｎ、室温
電気泳動マーカー：１００ｂｐ  ＤＮＡ Ladder
泳動サンプル：ＰＣＲ産物５μｌ＋色素１μｌ
【００３２】
上記の条件で、電気泳動を行った結果を図２に示す。
図中、レーン１は、DNA抽出  negative control、レーン２は、凝灰岩の試料、レーン３は、泥質岩の試料、のそれぞれのＰＣＲ産物であり、Ｍは、マーカー（１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ladder）である。
該図から、レーン１には何もないが、レーン２、３にはバンドが確認できる。これは、試料から遺伝子増幅がされたことを示している。また、マーカーとの対応関係から得られた遺伝子の長さは４５０ｂｐであり、目的の遺伝子の長さであることを確認した。これらの結果は、遺伝子を試料から、目的遺伝子の増幅反応に成功したことを示している。
【００３３】
〈遺伝子解析結果〉
得られたＰＣＲ産物に対し、ライゲーションと形質転換（クローニング処理）を行った後、遺伝子の配列決定を行った。得られた配列を元に、微生物の群集構造解析を行った。
解析の結果、微生物の16S rRNA遺伝子の配列であることが確認され、先行研究により用いた岩石試料中に棲息すると予想された微生物が見つかった。特に、メタン酸化細菌（Methylobacterium sp.）、好熱性細菌（Geobacillus stearothermophilus、Thermus thermophilus）、脱窒細菌（Pseudomonas sp.）等が多く検出された。
【００３４】
また、好熱菌Ａ（Thermus thermophilus）と好熱菌Ｂ（Geobacillus stearothermophilus）とされた遺伝子配列のＧＣ含量を調べたところ、好熱菌Ａは６６．３％、好熱菌Ｂは６１．３％と他の解析した配列中のＧＣ含量より有為に高かった。ＧＣ含量は微生物の生育温度と正の相関線があることが証明されており(Kimura et al. 2006)、相関式から推定した結果、好熱菌Ａは約６５℃、好熱菌Ｂは約６０℃で生育する微生物と同レベルだった。岩石試料を得た現在の掘削現場の地下温度は約２５℃であり、得られた好熱菌の遺伝子は化石由来であることが予想された。これは、過去に岩石中の温度が約６０〜６５℃となり、そこに好熱性細菌が棲息していたことを示唆している。
また、岩石中の鉱物（シリカ鉱物）から過去の温度を知ることができるが（地質温度計）、今回得られた遺伝子配列から算出した過去の温度はそれに矛盾しない結果だった。
本発明では、岩石中に優先している微生物種を特定して調べ、岩石中の微生物生態系を明らかにし、化石由来の遺伝子を解析することにより、過去の環境についても推測することができた。
【００３５】
以上のとおり、従来の方法では岩石試料からＤＮＡを得ることができなかったが、本発明の方法では、その後の実験に用いるのに十分な量のＤＮＡを得ることに成功した。
さらに得られたＤＮＡ試料に対し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の解析を行った結果、現在、存在すると予想された微生物のほか、化石由来と考えられるＤＮＡ情報を取得することに成功した。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の方法は、岩石中の微生物生態系の実態と物質移行の解明に有用であり、微生物を利用した環境保全、資源エネルギーの利用、環境修復の発展が期待される。
【図１】
2010136716.tif 000003
【図２】
2010136716.tif 000004