(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞や組織に遺伝子を送達する効率を向上させるペプチドの提供。【解決手段】An-B-An部分を含む効率的なトランスフェクション運搬体ポリペプチドであって、部分Bは特定な配列からなるアミノ酸配列に対して70%相同であり、AはArg-Gly-Aspを表し、nは0から2の数字を表し、部分AとBは共有結合しているポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
An-B-An部分を含む効率的なトランスフェクション運搬体ポリペプチドであって、部分Bは配列表の配列番号２に対して70%相同であり、AはArg-Gly-Aspを表し、nは0から2の数字を表し、部分AとBは共有結合しているポリペプチド。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野 
【０００２】
本発明は、細胞や組織に遺伝子を送達する効率を向上させるペプチド、及び細胞や組織に核酸を送達するにあたってペプチドを用いる方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞や組織に核酸を効率よく送達することができるアミノ酸配列、及びペプチドを用いて細胞や組織に核酸を送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．技術の一般的背景と状況
【０００４】
近年、分子生物学及び遺伝子治療の分野における急速な発展にともなって、細胞や組織に効率よく核酸を送達する方法が強く望まれるようになった。遺伝子治療及びアンチセンス治療や生体外での細胞株における実験に用いるために、効果が期待できるような量の核酸を標的細胞や組織に送達する必要がある。同時に、核酸の送達方法においては、ホストに対する免疫反応や細胞毒性が低いものでなければならない。さらに、遺伝子ベースの治療の成功には、送達材料や媒介物が大量生産できることも重要である。現在、遺伝子の送達は、ウイルスを用いる場合とウイルスを用いない場合の二つに大きく分類される。ウイルスを用いる遺伝子送達の場合では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いて、核酸を細胞や組織に導入している。ウイルスを用いる遺伝子送達の場合、細胞の感染性の範囲が限定される、ウイルスに対する免疫反応、ウイルスであるベクターの大量生産が困難であるなどの欠点がある（Yibin Wang et al., DDT. 5(1), 2000（非特許文献１）; Joanne T. Douglas. et al., Science & medicine 44-52 (March/April), 1997（非特許文献２））。
【０００５】
ウイルスを用いない遺伝子送達の場合では、リポソーム、ポリマー、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクションなどの多様な薬剤や方法が使われている（Saghir Akhtar et al., Adv. Drug Deliv. Rev.44:3-21（非特許文献３）; Irina Lebedeva et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:101-119, 2000（非特許文献４）; Ch. Garcia-Chaumont et al., Pharmacol. Ther. 76:151-161, 2000（非特許文献５））。非ウイルス性のベクターは比較的製造が容易なので、前臨床試験や臨床試験に用いるためにベクターを大量生産することが可能である。また、非ウイルス性のベクターに対し惹起される免疫反応が弱いことも知られており、ベクターをホストに複数回投与することができる。このような理由から、非ウイルス性のベクターを用いた遺伝子治療に関心が寄せられるようになってきている（Colin W. Pouton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 46:187-20, 2001（非特許文献６））。
【０００６】
これまでに開発された非ウイルス性のベクターのうち、リポソームが最も多く用いられている遺伝子治療媒介物であり、市販されている。細胞表面が負に帯電しているという性質を有効に利用するために、多くのリポソームは正に帯電させてあり、カチオン性である。核酸やDNAと複合体を形成したカチオン性リポソームは、細胞表面と静電気的に作用した後、細胞質内にエンドサイトーシスによって取り込まれることが知られている。カチオン性リポソームは、生体外では遺伝子の送達を効率的に行うことができるが、生体内での遺伝子送達ではウイルス性のベクターに比べると制限が極めて大きい。さらに、カチオン性リポソームを用いた場合、遺伝子送達の効率は、生体外の系であっても、核酸の大きさ、細胞株などに一般的に依存する。また、核酸の量が多くなると細胞に対する毒性が高まることが知られている（Saghir Akhtar et al., Adv. Drug Deliv.Rev. 44:3-21, 2000（非特許文献７）: Irina Lebedeva et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:101-119, 2000（非特許文献８））。
【０００７】
カチオン性ポリマーが遺伝子を細胞に送達する効率を上げるために使われている。正に帯電するアミノ基の数を操作することで、カチオン性ポリマーは核酸と強く結合することができ、また、細胞に作用することも可能である。したがって、ポリマーの必要量は、カチオン性リポソームと比べると、少なくてすむ。しかしながら、効率的な遺伝子送達運搬体として用いるためには、カチオン性ポリマーの細胞毒性及び水溶液における溶解性を改善する必要がある（Dan Luo et al., Nat. biotech. 18:33-37（非特許文献９）; Saghir Akhtar et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 44:3-21, 2000（非特許文献１０））。最近になって、水によく溶ける、生分解性のポリマーが開発されたが、生体内における安全性についてのデータは得られていない（Sang-Oh Han et al., Bioconjugate Chem. 12:337-345, 2001（非特許文献１１）; Otmane Boussif et al., Proc. Natl. Acd. Sci.92:7297-7301, 1995（非特許文献１２））。
【０００８】
本発明は、核酸送達システムに関する上記のような必要性により開発された。本発明は、細胞による核酸の取り込みを促進するペプチドを含む遺伝子送達システムを提供する。さらに、本発明は、上記のペプチドを用い、核酸を細胞や組織に送達する方法を提供する。
【非特許文献１】Yibin Wang et al., DDT. 5(1), 2000
【非特許文献２】Joanne T. Douglas. et al., Science & medicine 44-52 (March/April), 1997
【非特許文献３】Saghir Akhtar et al., Adv. Drug Deliv. Rev.44:3-21
【非特許文献４】Irina Lebedeva et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:101-119, 2000
【非特許文献５】Ch. Garcia-Chaumont et al., Pharmacol. Ther. 76:151-161, 2000
【非特許文献６】Colin W. Pouton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 46:187-20, 2001
【非特許文献７】Saghir Akhtar et al., Adv. Drug Deliv. Rev.44:3-21, 2000
【非特許文献８】Irina Lebedeva  et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:101-119, 2000
【非特許文献９】Dan Luo et al., Nat. biotech. 18:33-37
【非特許文献１０】Saghir Akhtar et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 44:3-21, 2000
【非特許文献１１】Sang-Oh Han et al., Bioconjugate Chem. 12:337-345, 2001
【非特許文献１２】Otmane Boussif et al., Proc. Natl. Acd. Sci.92:7297-7301, 1995
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
上記の目的を達成するために、本発明は、以下のようなアミノ酸配列のペプチドを提供する：(X)n-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-(X)n(配列表の配列番号１)であって、XがArg-Gly-Asp (RGD)で、nが0から2までの整数のもの。さらに、本発明は、上記ペプチドを用いて核酸を細胞や組織に送達する方法を提供する。
【００１０】
本発明により、効率よくトランスフェクションを行う運搬体ポリペプチドで、An-B-Anからなり、部分Bが配列表の配列番号２と70％相同であり、AがArg-Gly-Aspであり、nが0から2までの整数であり、部分AとBが共有結合しているポリペプチドが得られる。ポリペプチドの部分Bは配列表の配列番号２と80％相同であってもよい。さらに、ポリペプチドの長さは、約8から30アミノ酸、又は、約10から20アミノ酸であることができる。特に、ポリペプチドは、配列表の配列番号１, 2, 3又は4であることができる。
【００１１】
また、本発明により、核酸及び上記のポリペプチドを含む組成物と細胞を接触させることを含む、少なくとも１つの核酸を細胞に挿入する方法が得られる。上記の方法において、組成物は、さらに、核酸送達運搬体を含むことができる。核酸送達運搬体は、カチオン性リポソームであることができる。本発明は場合によっては、細胞に接触させる前に、組成物を混合することができる。また、核酸は10から1000の範囲の塩基を有するオリゴヌクレオチドであることができる。さらに、核酸はプラスミドベクターであることができる。好ましくは、ベクターの長さは約2から50 kbpである。又は、核酸は塩基数が約300から約20,000である一本鎖DNAであることができる。上記の方法において、カチオン性リポソームが、リポフェクタミンTM（lipofectamineTM）、リポフェクチンTM（lipofectinTM）、オリゴフェクチンTM（oligofectinTM）、DMRIE-CTM、リポフェクタミンプラスTM（lipofectamine plusTM）、及び リポフェクタミンTM 2000（lipofectamineTM 2000）、又はDOTAP-DOPEなどであることができる。
【００１２】
本発明の方法において、ポリペプチド、核酸及びリポソームの比が、約1〜10:1:1〜10 (w/w/w)であることができる。リポソームがDOTAP-DOPE (1:1)であることができる。さらに、ポリペプチド、核酸及びDOTAP:DOPE (1:1)の比が約3〜5:1:3〜6 (w/w/w)であることができる。ある実施例では、リポソームがリポフェクタミンであることができる。さらに、上記の方法において、ポリペプチド、核酸及びリポフェクタミンの比が約3〜5:1:3〜6 (w/w/w)であることができる。
【００１３】
また、本発明により、上記のTatポリペプチドとカチオン性リポソームを含む生体外トランスフェクションシステム、又はトランスフェクション試薬の入った容器及びトランスフェクション試薬の取り扱い説明書を含むキットが得られる。取り扱い説明書は、容器上のラベルや容器とは別の用紙、あるいは他の書き込み基材上に含ませることができる。
【００１４】
これらを含む本発明の内容は、以下の本発明の説明、添付の図面、添えられた請求の範囲を用いて、さらに完全に理解されるだろう。
【００１５】
図面の簡単な説明
以下の本発明の詳細な説明、添付の図面により完全に理解されるであろう。図面は説明のために使われているのであって、本発明が図面によって限定されるわけではない。
【００１６】
図１は、TatCペプチド、DNA及びカチオン性リポソームの三重複合体（３つの物質からなる複合体（triple complex））を用いた時のルシフェラーゼ活性を示す。
＋：TatCペプチド/DNA/カチオン性リポソームの三重複合体による処理
−：DNA/カチオン性リポソームの二重複合体（２つの物質からなる複合体（dual complex））による処理（ネガティブコントロール）
【００１７】
図２は、構成要素であるTatCペプチド、DNA及びカチオン性リポソームを添加する順序を変化させることによるトランスフェクション効率の比較を示す。
【００１８】
図３Ａ〜３Ｂは、TatCペプチド、DNA及びカチオン性リポソームからなる三重複合体を作製する際の混合比とK562細胞におけるルシフェラーゼ活性の関係を示す。
Ａ：TatCペプチド/DNA/DPリポソームからなる三重複合体による処理
Ｂ：TatCペプチド/DNA/LFAリポソームからなる三重複合体による処理
【００１９】
図４Ａ〜４Ｂは、TatCペプチド、DNA及びカチオン性リポソームからなる三重複合体を作製する際の混合比とHeLa細胞におけるルシフェラーゼ活性の関係を示す。
Ａ：TatCペプチド/DNA/DPリポソームからなる三重複合体による処理
Ｂ：TatCペプチド/DNA/LFAリポソームからなる三重複合体による処理
【００２０】
図５Ａ〜５Ｂは、三重複合体を作製する際のpHとトランスフェクション効率の関係を示す。
Ａ：TatCペプチド/DNA/DPリポソームからなる三重複合体による処理
Ｂ：TatCペプチド/DNA/LFAリポソームからなる三重複合体による処理
【００２１】
図６Ａ〜６Ｇは、TatCペプチド/DNA/DPリポソームからなる三重複合体を用いた時の異なるヒト細胞におけるトランスフェクション効率を示す。TatCペプチドとDPリポソームの混合比は示すとおりである。DNA比は1(0.3 ug)と一定である。Ａ：293細胞；  Ｂ：HT-29細胞；  Ｃ：MCF-7細胞；  Ｄ：A549細胞；  Ｅ：NCI-H1299細胞；  Ｆ：WI-38VA13細胞；  及びＧ：Hep3B 細胞
【００２２】
図７Ａ〜７Ｉは、TatC ペプチド/DNA/LFAリポソームからなる三重複合体を用いた時の異なるヒト細胞株におけるトランスフェクション効率を示す。TatCペプチドとDPリポソームの混合比は示すとおりである。DNA比は1(0.3 ug)と一定である。Ａ：293細胞；  Ｂ：HT-29細胞；  Ｃ：MCF-7細胞；  Ｄ：A549細胞；  Ｅ：NCI-H1299細胞；  Ｆ：WI-38VA13細胞；  Ｇ：Hep3B細胞；  Ｈ：HL-60；  及びＩ：HepG2
【００２３】
図８Ａ〜８Ｄは、WRT7/P2細胞において、三重複合体を用いた場合、FITCでラベルしたオリゴヌクレオチドのトランスフェクション効率を示す。トランスフェクションされたWRT7/P2細胞は光学顕微鏡を用いて観察した。
Ａ：トランスフェクションなしのWRT7/P2細胞；
Ｂ：TatCペプチド/FITCでラベルしたオリゴヌクレオチド/LFAリポソームからなる三重複合体による処理；
Ｃ：FITCでラベルしたオリゴヌクレオチド/LFAリポソームからなる二重複合体による処理（TatC ペプチドなし）；
Ｄ：FITCでラベルしたオリゴヌクレオチドのみによる処理。
【００２４】
図９Ａ〜９Ｂは、各種のペプチドに対するルシフェラーゼ活性を示す。
Ａ：HeLa細胞における各種の修飾ペプチドに対するルシフェラーゼ活性；
Ｂ：K562細胞における各種の修飾ペプチドに対するルシフェラーゼ活性。
【００２５】
図１０Ａ〜１０Ｄは、HL-60細胞におけるトランスフェクション効率を示す。GFP遺伝子の発現が各種の修飾ペプチドを用いて認められる。
Ａ：TatCペプチドによる処理；
Ｂ：TatC-RGD-RGDペプチドによる処理；
Ｃ：RGD-TatC-RGDペプチドによる処理；
Ｄ：スクランブルされたTatCペプチドによる処理（ネガティブコントロール）。
【００２６】
図１１Ａ〜１１Ｄは、K562細胞におけるトランスフェクション効率を示す。GFP遺伝子の発現が各種の修飾ペプチドを用いて認められる。
Ａ：TatCペプチドによる処理；
Ｂ：TatC-RGD-RGDペプチドによる処理；
Ｃ：RGD-TatC-RGDペプチドによる処理；
Ｄ：スクランブルされたTatCペプチドによる処理（ネガティブコントロール）。
【００２７】
図１２Ａ〜１２Ｂは、トランスフェクション効率を示す。
Ａ：細胞を３種のプラスミドDNAでコトランスフェクトした際のルシフェラーゼ活性におけるトランスフェクション効率を測定。リン酸カルシウム沈殿法を用いたトランスフェクション方法をトランスフェクションコントロールとして用いた。
Ｂ：HeLaRC32細胞を組み換えAAV及び野生型アデノウイルスによりコトランスフェクトした際のルシフェラーゼ活性。組み換えAAVは３種のプラスミドDNAをHeLaRC32細胞にコトランスフェクトして得る。組み換えAAV含量は、AAV及び野生型アデノウイルスを共感染させた後に、ルシフェラーゼ活性を測定して求める。また、HeLaRC32細胞に対する３種のプラスミドDNAのコトランスフェクトのネガティブコントロールとして、リン酸カルシウム沈殿法を用いた。
【００２８】
図１３Ａ〜１３Ｂは、トランスフェクション効率に対する血清の影響を示すためにルシフェラーゼ活性を示す。
Ａ：HeLa細胞におけるトランスフェクション；
Ｂ：K562細胞におけるトランスフェクション。
【００２９】
図１４Ａ〜１４Ｃは、GFP遺伝子を持つプラスミドDNAを用い、HeLa細胞におけるトランスフェクション効率に対する血清の影響を示すためにルシフェラーゼ活性を示す。
Ａ：血清を含まない培地におけるトランスフェクション；
Ｂ：血清を含む培地（10% FBS）におけるトランスフェクション；
Ｃ：ペプチドなしの培地（DNA-リポソーム複合体、10% FBS）でのトランスフェクション（コントロール）。
【００３０】
図１５Ａ〜１５Ｃは、GFP遺伝子を持つプラスミドDNAを用い、K562細胞におけるトランスフェクション効率に対する血清の影響を示すためにルシフェラーゼ活性を示す。
Ａ：血清を含まない培地におけるトランスフェクション；
Ｂ：血清を含む培地（10% FBS）におけるトランスフェクション；
Ｃ：ペプチドなしの培地（DNA-リポソーム複合体、10% FBS）でのトランスフェクション（コントロール）。
【００３１】
図１６Ａ〜１６Ｆは、TatCペプチド/DNA/リポソームからなる三重複合体を用い、SDラットの腎臓におけるトランスフェクション効率を示す。プラスミドDNAはLacZを持つ。複合体をSDラットの尿管に注入した。４８時間後、腎臓を摘出し凍結切片とした。厚さ10μmの切片をPBSで洗浄し、0.05%グルタルアルデヒドで固定した。スライドを一晩X-gal溶液に浸し、ヘマトキシリンで逆染色した（Ｄ〜Ｅ）（倍率：400倍）。
三重複合体：TatCペプチド/DNA/リポソーム（PDL複合体）
二重複合体：DNA/リポソーム
【００３２】
発明を実施するための最良の形態
【００３３】
本出願において、"a"と"an"は単一及び複数の両方の対象を示すために使用される。
【００３４】
ここで使う「約」又は「実質的に」は、通常、はっきりした数値の限定を避けるために使われる。たとえば、ポリペプチド配列の長さの場合、「約」又は「実質的に」とは、明示されているアミノ酸の数に限定されるわけではないことを意味する。機能活性が保持される限り、アミノ酸配列の数の多少の増減は許容される。成分比を表現する場合、「約」又は「実質的に」とは、期待する機能効果が認められる限り、明示されている数値に限定されるわけではないことを意味する。
【００３５】
ここで使う「と共に」あるいは「と複合体を形成して」投与とは、さらに１つ以上の薬剤を同時に（一斉に）、及び順序は問わず、続けて投与又は混合されることを意味する。
【００３６】
ここでいう「アミノ酸（単数及び複数）」とは、自然界に存在するすべてのL-α-アミノ酸を意味する。この定義はノルロイシン、オルニチン、及びホモシステインを含む。
【００３７】
本出願を通じて、アミノ酸を意味する１文字又は３文字の略語表示が使われており、それらは相互に交換して使うことができ、次の意味を持つ：A又はAla = アラニン; R又はArg = アルギニン; N又はAsn = アスパラギン; D又はAsp = アスパラギン酸; C又はCys = システイン; Q又はGln = グルタミン; E又はGlu = グルタミン酸; G又はGly = グリシン; H又はHis = ヒスチジン; I又はIle = イソロイシン; L又はLeu = ロイシン; K又はLys = リジン; M又はMet = メチオニン; F又はPhe = フェニルアラニン; P又はPro = プロリン; S又はSer = セリン; T又はThr = スレオニン; W又はTrp = トリプトファン; Y又はTyr = チロシン; 及びV又はVal = バリン。
【００３８】
ここでいう「アミノ酸配列のバリアント」とは、参照するポリペプチド（例えばネイティブな配列）とは、多少異なるアミノ酸配列を有する分子を意味する。アミノ酸配列の変化は、ネイティブなアミノ酸配列への置換、挿入、欠失、又は、それらの変化の組み合わせである。
【００３９】
置換の結果生じたバリアントでは、ネイティブな配列から、少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その同じ位置に他のアミノ酸残基が挿入されている。置換は、１分子中のアミノ酸が一つだけ置換されている一置換であってもよいし、あるいは同じ分子中で２以上のアミノ酸が置換されている多置換であってもよい。
【００４０】
配列に存在したアミノ酸残基に代わって入るアミノ酸残基は、アミノ酸残基が属するクラスの他のアミノ酸残基から選択されることできる。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが属する。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが属する。正に帯電している（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが属する。負に帯電している（酸性）アミノ酸のグループには、アスパラギン酸とグルタミン酸が属する。また、本発明には、同一又は類似の生物活性を示すタンパク質、タンパク質の断片、又はタンパク質の誘導体、及び翻訳中又は翻訳後に、たとえば、グリコシル化、タンパク分解性開裂、抗体分子や細胞内に存在する他のリガンドへの結合によって、大幅に修飾された誘導体も含まれる。
【００４１】
挿入の結果生じたバリアントでは、ネイティブなアミノ酸配列のある位置に存在するアミノ酸の直ぐ隣に、１つ以上のアミノ酸が挿入されている。アミノ酸の直ぐ隣に、という表現は、アミノ酸のα-カルボキシル基又はα-アミノ基に結合することを意味する。
【００４２】
欠失の結果生じたバリアントでは、ネイティブなアミノ酸配列から１つ以上のアミノ酸が取り除かれている。通常、欠失の結果生じたバリアントは、分子の特定の領域から１つ又は２つのアミノ酸が取り除かれている。
【００４３】
さらに、本発明のポリペプチドのバリアントは、トランスフェクションの効率を向上させるポリペプチドの配列表の配列番号２において、アミノ酸の数はいくつ含んでいてもよいし、又は置換、及び／若しくは、挿入、及び／若しくは、欠失を含むアミノ酸の変化を含んでもよいが、ただし、ポリペプチドのバリアントにおいて、配列表の配列番号２のポリペプチド配列に少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列であり、かつ変化によってポリペプチドのトランスフェクション効率向上活性が妨げられない場合に限る。
【００４４】
ここでいう「Tat由来ペプチド」、「TatCペプチド」、「Tatポリペプチド」、又は「Tatペプチド」とは、トランスフェクション活性を高めるポリペプチドで、配列表の配列番号２のポリペプチド配列に少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドを意味する。さらに、Tat由来ペプチドにおいては、挿入又は欠失が生じることが可能で、長さが8から30アミノ酸、好ましくは、10から20アミノ酸であることができる。Tat又はTatC由来のポリペプチドは、Tat又はTatCの特定の配列に限定されるわけではないことは理解されるであろう。各種の変異、保存されたアミノ酸の変化、ならびにある種の保存されていないアミノ酸の変化も、ポリペプチドがそれによる付加によってトランスフェクション効率の向上能を保持する限り、許容される。
【００４５】
遺伝子送達システムにTatペプチドを加えることによって、トランスフェクション効率を向上させることができることを発見したのは、本出願人が初めてであり、したがって、トランスフェクション効率向上能を保持しながら、配列に変化を加えることは当業者の範疇であろう。
【００４６】
ここでいう「ストリンジェンシーの高い条件下でハイブリダイズすることができる」とは、ストリンジェンシーの高い条件下で目的のDNAに相補的なDNA鎖をアニーリングすることを意味する。同様に、「ストリンジェンシーの低い条件下でハイブリダイズすることができる」とは、ストリンジェンシーの低い条件下で目的のDNAに相補的なDNA鎖をアニーリングさせることを意味する。アニーリング工程における「ストリンジェンシーの高い条件」とは、たとえば、高温、及び／又は、低塩濃度で、ミスマッチ塩基対間では水素結合を形成しにくい条件をさす。「ストリンジェンシーの低い条件」とは、ストリンジェンシーの高い条件と比較して、低温、及び／又は、高塩濃度である条件をさす。これらの条件下では、二本のDNA鎖がほとんど完全にというわけではなくてもある程度相補的であれば二本のDNA鎖をアニールさせることができ、このような現象は、同一のタンパク質をコードしているが、遺伝子暗号の縮重の結果、配列に違いを生じるようになったDNA鎖間で認められる。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件とは、たとえば、約45℃で6xSSC、続いて50℃で2xSSCで洗浄する条件がこの分野では一般的であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.31-6.3.6にも記載されている。たとえば、洗浄ステップの塩濃度は、50℃で約2xSSCというストリンジェンシーの低い条件から、50℃で約0.2xSSCというストリンジェンシーの高い条件までで選ぶことができる。また、洗浄ステップの温度は、室温、約22℃というストリンジェンシーの低い条件から始めて、約75℃というストリンジェンシーの高い条件に移行させることも可能である。その他、ストリンジェンシーのパラメーターについては、Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring N,Y., (1982), pp. 387-389.; 又はSambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, N.Y. pp. 8.46-8.47 (1989)に記載されている。
【００４７】
ここでいう「運搬体」とは、使用される投与量、濃度では、それらにさらされる細胞や哺乳類に害のない、薬学的に許容できる運搬体、助剤、又は安定剤などをさす。薬学的に許容できる運搬体は、pH緩衝水溶液であることが多い。薬学的に許容できる運搬体の例としては、これに限定されるものではないが、リン酸、クエン酸などの有機酸の緩衝液、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド（10残基程度以下）、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、デキストリンなどの単糖類、二糖類や他の炭水化物、EDTAなどのキレート剤、マニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩を形成する対イオン、及び／又は、TWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（PEG）、PLURONICS（登録商標）などの非イオン性界面活性剤があげられる。
【００４８】
ここでいう「共有結合性誘導」とは、有機タンパク性又は非タンパク性の誘導試薬によるポリペプチドあるいはポリペプチドの断片の修飾、及び翻訳後の修飾などをさす。従来から共有結合性修飾は、標的アミノ酸残基に、選択された側鎖や末端の残基と反応させることができる有機誘導試薬を反応させたり、選択された組み換えホスト細胞で機能する翻訳後修飾機構を用いることによっておこなわれている。発現したポリペプチドに、組み換えホスト細胞が作用した結果、発生する翻訳後修飾もある。グルタミニル残基やアスパラギニル残基は、しばしば翻訳後に脱アミノ化されて、それぞれグルタミル残基、アスパルチル残基に変化する。また、これらの残基は、弱酸性下で脱アミド化される。その他の翻訳後修飾には、プロリン及びリジンの水酸化、セリル残基、チロシン残基、又はスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジンの側鎖のα-アミノ基のメチル化などがある（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）。
【００４９】
ここでいう「有効量」とは、臨床的又は生化学的に有益な又は望ましい効果をもたらすのに十分な量をいう。有効量は一回又は数回にわたって投与することができる。
【００５０】
ここでいう「断片」とは、ポリペプチドの一部で、機能を有し、使用可能な部分をさす。たとえば、本発明では、ポリペプチド断片は、トランスフェクション効率を向上させるという機能を有している。
【００５１】
ここでいう「ホスト細胞」又は「標的細胞」とは、本発明のベクターを受容することができる、又は受容している個々の細胞又は細胞培養をいう。ホスト又は標的細胞には、１つのホスト細胞又は標的細胞から発生した子孫細胞も含み、子孫細胞は、自然的、偶発的又は恣意的に変異及び／又は変化が発生したため、必ずしも、元の親細胞と（形態学的又は全体のDNA相補において）完全に同一である必要はない。
【００５２】
ここでいう治療のための「哺乳類」には、哺乳類として分類されているあらゆる動物、ヒト、家畜、野生動物、スポーツ用動物、ペット動物が含まれ、たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなどである。好ましくは「哺乳類」はヒトである。
【００５３】
ここでいう「精製された」又は「単離された」分子とは、自然界から取り出された生物学的分子で、単離又は分離され、もともと自然界では共存していた他の物質を含まないものをいう。
【００５４】
ここでいう「配列同一性」とは、配列比較を行い、ギャップを導入した後、ネイティブなポリペプチドの配列のアミノ酸残基に一致する候補配列のアミノ酸残基の割合と定義されており、必要なら、最大パーセントの配列同一性を達成させ、いかなる保存的な置換も配列同一性の一部としては考慮されない。配列同一性の値％は、Altschul et al., (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: anew generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res.,25:3389-3402に示されるように、NCBI BLAST2.0ソフトウエアを用いて割り出される。パラメーターは、Penalty for mismatchを-1に設定した以外は、デフォルト値に設定されている。
【００５５】
ここでいう「対象」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトをさす。
【００５６】
ここでいう「治療（法）」とは、有益なあるいは望ましい臨床結果を得るための方法である。本発明においては、有益なあるいは望ましい臨床結果には、これに限定されるわけではないが、症状の軽減、疾病の程度の軽減、疾病状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾病の進行の遅滞、疾病状態の改善若しくは緩和、及び（部分的な又は全体的な）緩解などであって、検出できる場合も、検出できない場合も含む。また、「治療（法）」は、治療を受けていない場合に予測されるよりも長く生存できることを意味する。「治療（法）」は、疾病治療及び予防手段の両者をさす。治療を必要とする者とは、すでに発症している者及び発症の予防が予測される者を含む。疾病を「緩和する」とは、治療が施されない場合と比較して、疾病状態の程度、及び／又は、望ましくない臨床的症状が軽減され、及び／又は、進行が遅滞する状態をいう。
【００５７】
ここでは、「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「コンストラクト」及び「ポリヌクレオチドオコンストラクト」は、相互に交換可能に使われている。本発明のポリヌクレオチドベクターには、これに限定されるわけではないが、各種のものがあり、RNA、DNA、レトロウイルス被膜に包まれたRNA、アデノウイルス被膜に包まれたDNA、その他のウイルス又はウイルス類似体（単純ヘルペス及びアデノ関連ウイルス (AAV)など）に挿入されたDNA、リポソームに挿入されたDNA、ポリリジンと複合体を形成したDNA、合成ポリカチオン性分子と複合体を形成したDNA、免疫的に分子を「マスク」するため、及び／若しくは、半減期を延長するためにポリエチレングリコール（PEG）などの化合物と複合体を形成したDNA、又は非ウイルス性タンパク質に共役結合したDNAを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドはDNAである。ここでいう「DNA」とは、塩基A、T、C、及びGに限らず、これらの塩基の類似体や修飾体、例えばメチル化ヌクレオチド、無電荷結合やチオエート結合などのヌクレオチド間の修飾、糖類似体、たとえば、ポリアミドなどの骨格構造の修飾及び／又は変化を含む。
【００５８】
Tatペプチド
【００５９】
ペプチドは、アミノ酸が鎖状に結合したもので、通常アミノ酸の数が100程度以下のものをさす。ペプチドの中には、細胞毒性がなく、核酸に可逆的に結合したり、核酸を縮合させたり、細胞や組織に核酸を効率よく送達する能力を有するものがある。
【００６０】
近年、いわゆる塩基性アミノ酸からなるペプチドに細胞内における物質の輸送を担う働きがあることが見つかり、このようなペプチドを用いた薬物送達システムの開発に大きな関心が寄せられている。HIV-1 Tatタンパク質、SV 40 large T抗原、ショウジョウバエ（Drosophila anntennapedia）、硫酸プロタミン、ヒストンH1などからペプチドが得られており、その中で、HIV Tatタンパク質の一部に、タンパク質や遺伝子を細胞に運搬する作用があることが証明されている。HIV-1 Tatタンパク質は86個のアミノ酸残基からなる。N末端の72個の残基はエクソン1によって、その他の残基はエクソン2によってコードされている。運搬作用のあるアミノ酸残基の好ましい領域は、Tatタンパク質の49番目から57番目に位置するアミノ酸配列部分である（Eric Vives et al., J. Biol. Chem. 272(25):16010-16017, 1997）。
【００６１】
本発明では、発明者らは構造的及び機能的に効果のあるTat由来のペプチドを設計した。本発明の実施例の１つでは、塩基性アミノ酸12個からなるペプチドで、DNAの縮合及び核の局在化に重要な働きを持つものを得た。上記塩基性アミノ酸からなるペプチドのN末端、及び／又は、C末端のアミノ酸が異なるペプチドも本発明者らは例示している。これらのペプチドのアミノ酸配列は、以下のように表すことができる：(X)n-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-(X)n(配列表の配列番号１)であって、XがArg-Gly-Asp(RGD)で、ｎが0から2までの整数のもの。Tat由来のペプチドの配列の例を表１に示す。
【００６２】
【表１】
2010159269.tif 000002
【００６３】
また、本発明では、標的核酸、Tatペプチド及び核酸送達運搬体からなる三重複合体の形成によって細胞又は組織に遺伝子を送達することができる。
【００６４】
核酸
【００６５】
標的細胞に挿入される核酸がDNA又はRNAである場合がある。核酸は鎖状又は環状であることができ、また、核酸は、ベクターの形態をとることもできるし、DNAベクターとは関係ない鎖状の形態をとることもできる。核酸はウイルスやプラスミドの一部であってもよい。特に、核酸はアンチセンス分子であることができる。したがって、核酸が治療的価値のある遺伝子をコードすることができる場合もあれば、核酸が標的遺伝子に相補的な配列を有しており、標的遺伝子の発現を阻害することができる場合もある。
【００６６】
本発明では、核酸の大きさや構造が、核酸の送達の効率に影響を及ぼすことはないが、長さ約2から50kbpのプラスミドDNAが好ましい。オリゴヌクレオチドでは、効率的な遺伝子送達には、塩基数が約10から1000の大きさが好ましい。一本鎖DNAでは、細胞内の送達には、塩基数約300から20,000の長さが好ましい。
【００６７】
本発明では、別途、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子を用い、ペプチドによる細胞又は組織への遺伝子導入の度合いを測定した。FITCでラベルしたオリゴヌクレオチドも、この目的で使用した。本発明のペプチドを用いる遺伝子送達システムは、細胞や組織の起源や型には関係なく多くの細胞や組織に対して広範に用いることができるが、ガン細胞や疾病に関連する細胞に対して用いるのが好ましい。
【００６８】
核酸送達運搬体
【００６９】
本発明の核酸送達運搬体として、対象とする細胞に本発明の核酸化合物を送達することができる各種の化合物や方法があげられる。本発明の核酸送達方法又は運搬体として、これに限定されるわけではないが、カチオン性リポソーム、PEG-脂質、PEG、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、デンドリマー、ポリ(D,L-乳酸)、ビロソーム（virosome）、エレクトロポレーション、磁気粒子を用いたトランスフェクション（magnetofection）、裸のDNA、脂質-ポリカチオン-DNA（LPD）、共役葉酸塩-ナノ粒子、インテグリンαvβ3-標的リガンドが結合したカチオン性ナノ粒子（NP）、DNAが結合した（修飾）ウイルス、両親媒性ペプチドの短いもの、遺伝子活性化マトリックス（gene-activated matrix）（GAM）、ポリ(α-(4-アミノブチル)-L-グリコール酸)（PAGA）、イミダゾール含有ポリマー、キトサン、ゼラチン、アテロコラーゲン、ポリ((D),(L)-乳酸-グリコール酸共重合体)（PLGA）、シクロデキストリンベースポリマー、ヒスチジン-リジン（HK）ポリマー、糖類標的（glycotargeted）送達システム、多孔性ポリマー製マイクロビーズなどを含む。
【００７０】
対象に対する核酸の送達の探索にあたっては、遺伝子送達システムは、対象への導入の目的に適した構成要素に加え、核酸、Tatポリペプチド、及びリポソームを含むことができる。ある実施例では、薬学的価値のある核酸化合物又は本発明の組成物を、治療を必要とする局所に投与することが好ましい；これは、限定されるわけではないが、たとえば、手術中における局所注入、手術後の包帯と併用するなどの局所投与、注射、カテーテル、座薬、多孔性、非多孔性、シアラスティック（sialastic）膜などの膜又は繊維などのゼラチン様素材からなるインプラントなどの方法によって実施することができる。また、他の実施例では、化合物又は組成物を、放出制御システム（controlled release system）の下で送達することもできる。他の実施例ではポンプを使うこともできる。別の実施例ではポリマー性の材料を使うこともできる。さらに別の実施例では、放出制御システムを、脳などの治療標的の近くに置くことができ、かくして全身投与量に比べはるかに少ない量で治療を実施することもできる。
【００７１】
ある組成物の投与に対してレシピエント動物が寛容であると思われ、その投与がその動物にとって適切であるならば、その組成物は、「薬理学的又は生理学的に許容できる」といえる。投与量が生理学的に有意な効果を示すならば、そのような薬剤は、「治療的有効量」で投与されたといえる。ある薬剤の投与を受けた患者において、生理学的な変化が明らかに認められる場合、その薬剤には生理学的な価値があるといえる。
【００７２】
本発明の好ましい実施例では、リポソームが用いられている。リポソームは、通常の運搬体と共に用いることができる。リポソームは、アニオン性、中性、及びカチオン性リポソームを含む。これに限定されるわけではないが、カチオン性リポソームには、リポフェクチンTM（lipofectinTM）、オリゴフェクチンTM（oligofectinTM）、DMRIE-CTM、リポフェクタミンTM（lipofectamineTM）、リポフェクタミンプラスTM（lipofectamine plusTM）、及びリポフェクタミンTM2000（lipofectamineTM 2000）などがある。好ましくは、リポフェクタミンが使われる。また、DOTAP:DOPEの約1:1の割合の混合物を使ってもよい。特に、DOTAP:DOPEを約1:1の割合で使った場合、細胞及び組織に優れた遺伝子送達の効果が認められた。さらに、アニオン性リポソーム又は中性リポソームも本発明で使うことができるであろう。
【００７３】
遺伝子送達システム
【００７４】
本発明の特定の実施例では、細胞又は組織に導入される核酸をペプチドとカチオン性リポソームとを混合し複合体を形成した後で、この複合体を標的細胞や組織に混ぜてもよい。三重複合体、例えば、ペプチド、核酸、カチオン性リポソームの三重複合体の形成順序は適宜異なってもよい。当該複合体は血清や抗体を含む又は含まない培地又はリン酸緩衝食塩水のような緩衝液中にて形成させてもよい。この三重複合体のペプチド、核酸、リポソームの比率は1〜10:1:1〜10が好ましい。カチオン性リポソームとしてリポフェクタミン又はDOTAP/DOPEを使用する場合、ペプチド:核酸:リポソームの比率は3〜5:1:3〜6が好ましい。
【００７５】
生体外トランスフェクションシステム
【００７６】
本発明の生体外トランスフェクションシステムは、好ましくはTatペプチド、核酸送達運搬体及び核酸の無菌液からなる。本発明のトランスフェクションシステムは効率がよく毒性が低く、多種類の細胞のトランスフェクションに適している。血清の存在下又は非存在下にてトランスフェクションを行うことができる。核酸の調製液は汚染菌由来の内毒素の含量が最小であることが好ましい。
【００７７】
本発明の別の実施例では、トランスフェクション試薬は+4℃にて保存される。保存液のpHは約5から約8の範囲内である。DNAは高品質のものが好ましい。OD260/OD280比率は約1.4から約1.8が好ましい。また、核酸は無菌で内毒素のような汚染物が含まれないものとする。 
【００７８】
細胞密度に関しては、トランスフェクションでは、殆どの種類の細胞の密度（confluency）はトランスフェクション時に約50〜90%が好ましい。トランスフェクション時に細胞がコンフルエント（密集した状態）でなく、又は、静止期でないことが好ましい。さらに、トランスフェクション後の最適インキュベーション期間は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ又は緑色蛍光タンパク質に限定しないが、そのような簡単に検出が可能なタンパク質を発現するリポーター遺伝子を用い決定・観察される。 
【００７９】
トランスフェクトされる核酸としては、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、大きな環状アンチセンス分子、プラスミドやウイルス、又は、その他の核酸が挙げられる。また、遺伝子発現ベクターのトランスフェクション効率は発現させようとしている遺伝子のプロモーターや使用する細胞株の種類によって異なる。例えば、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターは広範囲の細胞株での遺伝子発現率が高いことで最もよく知られている。また、シミアンウイルス（SV40）及びラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターも好ましい。
【００８０】
本発明のトランスフェクションシステムに用いられるTatポリペプチドと核酸送達運搬体の量は、Tatポリペプチドと核酸送達運搬体とに相互作用する核酸の量に依存する。例えば、核酸量は100,000個の細胞あたり約0.01から約50μgの範囲である。 
【００８１】
本発明の１つは、Tatポリペプチド及び細胞の生体外トランスフェクションの際に用いられるカチオン性リポソームのような核酸送達運搬体を含む本発明のトランスフェクション試薬を含んだ容器で構成されるキットに関する。
【００８２】
また、本発明はハイスループット生体外トランスフェクションシステムに関する。特に、本発明のトランスフェクションシステムは96ウェルプレートのようなマルチウェルプレート内の標的細胞に接触し同時に多数のトランスフェクションを行うことができる。
【００８３】
遺伝子治療
【００８４】
本発明によると、既存の遺伝子治療法であればどの方法でも用いることができる。典型的な方法は下記の通りである。 
【００８５】
一般的な遺伝子治療法の検討については次を参照のこと。Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu及びWu, Biotherapy 3:87-95(1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); Morgan及びAnderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215(1993)。公知の組換えDNA技術の方法はAusubel, et al.,(eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); 及びKriegler, Gene Transfer and Expression, ALaboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。 
【００８６】
好ましくは、核酸配列は特定のタンパク質をコードし、ここで核酸配列は適切なホストでポリペプチドを発現する発現ベクターの一部である。さらに、このような核酸配列にはポリペプチドをコードする領域の付近にプロモーターを操作的に結合させ、このようなプロモーターは誘導性または構成的、および所望により組織特異的であったりする。別の実施例で用いた核酸分子の場合、ポリペプチドをコードする配列及び他の望ましい配列が、ゲノム中で所望の位置に相同的な組換えを促進する領域の付近に存在し、そのため、染色体内で抗体をコードする核酸が生じる（Koller及びSmithies, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)）。
【００８７】
核酸を患者に送達する方法は直接又は間接の二つの方法があるが、直接方法では、患者は核酸又は核酸運搬ベクターに直接接触し、間接方法では、細胞は生体外で核酸の導入された後に患者に移植される。この二つの方法は、それぞれ、生体内、生体外遺伝子治療法として知られている。
【００８８】
別の実施例では、核酸配列は生体内に直接投与され、そこでコードする生成物を発現させて生成する。これは当該技術分野での多くの公知の方法で達成することができ、例えば、適当な核酸発現ベクターの一部として構成して投与することで細胞内に送達する、欠陥又は弱毒性レトロウイルスやウイルス性ベクターを用い感染させる、裸のDNAを直接注射する、脂質でのコートや細胞表面受容体やトランスフェクション試薬、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルでの被覆、又は、核に入ることが知られているペプチドに結合させて投与する、又は、受容体仲介エンドサイトーシスができるリガンドに結合させて投与する（Wu及びWu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)を参照のこと）（受容体を特異的に発現するような標的細胞に用いられる）などである。別の実施例では、リガンドが膜融合ウイルスペプチドで構成された核酸-リガンド複合体が形成され、エンドソームを崩すため、核酸のリソソーム分解が回避される。また、もう一つ別の実施例では、核酸は、生体内で特定の受容体を標的とすることにより、細胞に特異的な取込み及び発現を目的とするものである。あるいは、相同組換えにより、核酸を細胞内に導入し、発現のためにホスト細胞DNAに組み込むができる（Koller及びSmithies, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)）。
【００８９】
アンチセンス治療
【００９０】
アンチセンス治療は、標的遺伝子に対するアンチセンス断片を有する鎖状又は共有結合で閉じたアンチセンス核酸分子の特異的な結合を含み、生体外又は生体内で標的RNA配列を不活性化又は切除する。アンチセンス核酸（DNA又はRNA）及びその類似体とは、標的配列のヌクレオチド塩基と水素結合を介して標的ポリヌクレオチド配列又は配列部分を認識することができるヌクレオチド塩基配列の領域を有する様々な化学物質をさす。標的配列は一本鎖若しくは二本鎖RNA又は一本鎖若しくは二本鎖DNAである。 
【００９１】
このようなRNA又はDNA類似体としては、これらに限らないが、2'-O-アルキル糖修飾体、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、3'-チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、及びニトロキシド骨格修飾体、アミド類、及び、塩基部分が修飾された類似体を含む。この他に、分子類似体としては、糖部分が修飾又は別の適切な部分で置換されたポリマーでもよく、結果として、ポリマーはモルホリノ（morpholino）類似体及びペプチド核酸（PNA）類似体を含むがこれらに限定されるものではない。標的RNAのRNaseH-介在破壊、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性、及び、又は、標的特異性を改善する目的のために、このような類似体は、糖又は塩基の結合基及び／又は構造の修飾をはじめ、前述の様々な組み合わせの修飾を含む。
【００９２】
治療組成物
【００９３】
治療化合物の製剤は当該技術分野では一般的に公知であり、参考文献としては、Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USAが便宜に挙げられる。一例としては、一日体重1キロあたり約0.05μgから約20 mgが投与される。用量は最適な治療対応を行えるよう調節してもよい。例えば、用量を一日に数回分けて投与したり、治療面での緊急対応状況に応じて用量を減らしてもよい。有効化合物の投与は、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内若しくは座剤経路、又は移植（例えば、腹腔内経路で徐放分子を用いる、又は、単球や生体外感作樹状突起細胞のような細胞を用いレシピエントに送達する）によることができ、便利である。投与経路に依り、酵素や酸や他の自然の条件などの作用によりペプチドが不活性化されるのを防ぐため、ペプチドを保護するコーティングが必要な場合もある。 
【００９４】
例えば、核酸の場合、アンチセンス分子が低親油性であるため、核酸がペプチド結合を分解することのできる酵素により腸管内で、又は、酸加水分解により胃内で破壊される。アンチセンス分子を腸管外投与以外の経路で投与するために、不活性化を防ぐ物質で被膜して、又はそのような物質とともに投与する。例えば、アンチセンス分子はアジュバントにて投与でき、酵素阻害剤又はリポソームを併用して投与できる。ここで考慮されるアジュバントとしては、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルやn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性表面活性剤がある。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスファイト（DEP）、及びトラジロールがある。リポソームとしては、水/油/水CGFエマルジョンや通常のリポソームが挙げられる。 
【００９５】
有効化合物を非経口又は腹腔内投与してもよい。分散液はグリセロール、液状ポリエチレングリコール、その混合物、及び、油の中でも調製できる。これらの調製液には、通常の保管・使用条件で微生物の成長を防ぐ目的で防腐剤が含まれる。 
【００９６】
注入用に適切な薬剤形状としては、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び、無菌注入液又は分散液を手早く調合するための無菌粉末がある。いかなる場合も、無菌とし、注射器を簡単に使用できる範囲内で液状とする。製造・保存条件で安定した形状を保ち、細菌や真菌のような微生物の汚染作用に対し防腐処理が施されていることとする。運搬体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、及び、植物油を含む溶媒又は分散媒体が挙げられる。また、例えば、レシチンのようなコーティングを用いたり、分散液の場合は必要な粒子径を維持することにより、及び、界面活性剤を使用することにより適切な流動性が維持できる。微生物の作用は、例えば、クロロブタノール、フェニル、ソルビン酸、テオマルサル（theomersal）などの様々な抗細菌剤や抗真菌剤により防ぐことができる。多くの場合、糖や塩化ナトリウムのような等張剤を含むことが好ましい。モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンのような吸収遅延剤を薬の組成に使用することにより注入可能組成物の吸収を長引かせることが可能である。
【００９７】
必要な量の有効化合物を適切な溶媒に加え、必要に応じて前述のその他成分を加えた後、ろ過滅菌し無菌注入液を調製する。一般的には、分散液は、様々な無菌活性成分を基本的な分散媒体と前述のその他必要な成分とを含む無菌媒介物に混合し調製する。無菌注入液調製用の無菌粉末の場合は、有効成分の粉末や必要な添加成分を先の無菌ろ過液から得る好ましい調製方法としては真空乾燥や凍結乾燥法がある。 
【００９８】
核酸分子が前述のように適切に保護されている場合は、有効化合物を経口投与でき、例えば、不活性希釈液又は消化吸収できる食用運搬体で経口投与でき、また、ハード又はソフトゼラチンカプセルで包みこんだり、圧縮して錠剤としたり、食事の際に食品に直接服用してもよい。経口治療投与用に、有効化合物に賦形剤を加え一体とし、消化可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、 懸濁液、シロップ、オブラートなどの形状で用いられる。このような組成物と調合物では有効化合物の含有量を少なくとも1重量%含む。組成物及び調合物の割合はもちろん多様であり、便宜的に単位重量の約5%から約80%の間とする。このような治療に有用な組成物の有効化合物含有量は、適切な用量が得られるような量とする。本発明による好ましい組成物又は調合物は経口用量単位の形状で約0.1μgから2000 mgの有効化合物を含むものとする。
【００９９】
錠剤、ピル、カプセルなどには次を含んでもよい：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンのような結合剤；リン酸ニカルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、片栗粉、アルギン酸のような分散剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；及び、スクロース、ラクトース又はサッカリンのような甘味料やペパーミント、サリチル酸メチル（oil of wintergreen）、チェリー香料等の香料を添加してもよい。製剤形状がカプセルの場合は、前記のタイプの物質のほかに、液状運搬体を含んでよい。コーティング剤としてその他色々な物質を含んでよく、または、製剤の物理的形状を変えてもよい。例えば、錠剤、ピル、カプセルはセラック、砂糖又はブイヨンでコートしてもよい。シロップ又はエリクシルは有効化合物の他に、甘味剤としてスクロース、防腐剤としてメチルパラベンやプロピルパラベン、着色料及びチェリーやオレンジ香料などの香料を含んでもよい。もちろん、いかなる形状の製剤を調製する際にも、用いられる物質は、薬学的に純粋で、用いられた量では実質的には非毒性でなければならない。また、有効化合物は徐放調合物又は製剤に取り込むこともできる。 
【０１００】
ここに用いられる「薬学的に許容される運搬体及び／又は希釈剤」は溶媒、分散媒体、抗細菌・抗真菌コーティング剤、等張剤、吸収遅延剤などを含むものとする。前記の媒体薬剤を薬学的に有効な物質のために使用することは当該技術分野ではよく知られている。通常の薬剤や媒体が有効成分と不適合である場合を除き、これらを治療組成物に用いることができるであろう。補助的有効成分もこの組成物に取り込むことができる。 
【０１０１】
非経口組成物も、投与の簡便化と用量の均一性のために、製剤化を図ることが特に有益である。ここで用いられる製剤とは、治療を受ける哺乳類を対象にまとまった容量として適切な物理的に別個の単位を示し；１単位は、必要な薬物運搬体と関連して望まれる治療効果を生ずるよう、あらかじめ算定された量の有効物質を有する。本発明の製剤の仕様は（ａ）有効物質に特有な特徴と特定治療効果の達成、及び（ｂ）体の健康を害する病態を示す対象生物に対する疾病治療のため、有効物質を製剤する技術に固有の制限により規定され、直接制限される。
【０１０２】
便利で効果的な投与のために、製剤化された剤形において、主要有効成分は、その効果的な量で、薬学的に適切な運搬体中に混合される。製剤中には、例えば、0.5μgから約2000 mgまでの範囲の量の主要有効化合物が含まれる。有効化合物を比率で示す場合、運搬体に約0.5μg/ml以上含まれることが多い。補助的な有効成分を含む組成物の場合は、通常の用量と当該成分の投与方法を参考に決定される。
【０１０３】
本発明は、ここに記載される特定の実施例に範囲を制限されない。事実、先の説明及び併記される図からこの技術分野に堪能な者には、この記載事項だけではなく、本発明に諸々の変更を加えることは明らかに簡単である。そのような変更は添付の請求の範囲内に入るものであるとされる。次の実施例は本発明を具体的に説明するものであり、制限するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１−細胞培養
【０１０５】
K562（慢性骨髄性白血病細胞株）、HeLa（子宮頚癌）、HeLaRC32（子宮頚癌）、MCF-7（乳癌）、HL-60（急性前骨髄球性白血病細胞株）、HepG2（肝芽細胞腫）、Hep3B（肝細胞癌）、A549（肺細胞癌）、NCI-H1299（肝細胞癌）、WI-38VA13（正常な肺）、AGS（胃腺癌）、HT-29（直腸腺癌）をKCLB（韓国）から、293（ヒト胎児肝細胞）をMicrobix, Inc.（カナダ）から、及び、WRT7/P2（単球／マクロファージ細胞株）をDr. Yagita（日本、順天堂大学）から入手した。本発明で用いられた細胞のリストは表２の通りである。
【０１０６】
【表２】
2010159269.tif 000003
【０１０７】
細胞の培養は、加熱不活性化した10%ウシ胎児血清（FBS）（JBI又はHyClone, USA）、2mM L-グルタミン、ペニシリン（100 ユニット/ml）、及び、ストレプトマイシン（100μg/ml）を補充したRPMI 1640又はEMEM（JBI, 韓国）にて行った。細胞を5% CO2インキュベーターにて37℃で維持した。適切な細胞密度を維持するために通常の細胞培養手順に厳密に従い、培地は細胞処理の前日に取り替えた。密度70%で細胞を継代した。細胞生存率を0.4%トリパンブルーで実験して調べた。 
【０１０８】
実施例２−TatCペプチド、DNA 、及び、カチオン性リポソームの作製
【０１０９】
実施例２．１−ペプチドの作製
【０１１０】
ペプチドをAnygen Inc.（韓国Kwangju市）製ペプチドシンセサイザー上で固相で作製した。ペプチドを分取用HPLCで精製し、分析用HPLC及びMALDI-TOFマス分析器でその特徴を調べた。本発明で使用されるペプチド配列は表１に示される。ペプチドは次の使用時まで-20℃で凍結保存した。
【０１１１】
実施例２．２−レポーター遺伝子を含むプラスミドベクターDNAの作製
【０１１２】
TatCペプチドを用いてトランスフェクション効率をテストするために、ルシフェラーゼ遺伝子、LacZ（β-ガラクトシダーゼ）遺伝子、及び 、GFP（緑色蛍光タンパク質）を発現プラスミドベクターにクローン化した。ルシフェラーゼ遺伝子はpGEM-ルシフェラーゼ（Promega, USA）から切除し、pcDNA3（Invitrogen, USA）のBamH I-Xho I部位にクローン化した。LacZ（β-ガラクトシダーゼ）遺伝子はpHook-2 LacZ（Invitrogen, USA）から切除し、pcDNA3（Invitrogen, USA）のHind III-BamH I-部位へ挿入した。GFP発現については、GFP発現ベクターとしてpEGFP-NIベクター（5kb, Clontech）を使用した。
【０１１３】
実施例２．３−カチオン性リポソームの作製
【０１１４】
カチオン性リポソームの市販品であるリポフェクタミン（LFA）をLife Technologies（USA）から入手し、本発明に直接用いた。当社内にて、カチオン性リポソームの別の組み合わせであるDOTAP-DOPEをDOTAP-DOPE=1:1複合体（DP複合体）にて作製した。DP複合体を作製するために、50mg/mlのDOTAP（N-1(-(2,3-ジオレオイルオキシ) プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムエチル硫酸；Avanti Polar Lipids, Inc. USA）を含むCHCl3溶液と50mg/mlのDOPE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、Avanti Polar Lipids, Inc. USA）を含むCHCl3溶液を1:1の比率で混ぜ 、エバポレーターで複合体を薄膜状に乾燥させた。その後乾燥したDP複合体をボルテックス及び超音波処理して10mlの0.15M食塩水に再懸濁した。最終的に、前述の手順で形成された粗DP複合体は100nmのMini-Extruer（Avanti Polar Lipids, Inc. USA, Alabaster）を通過し、品質が均一なDOTAP-DOPE複合体が得られた。
【０１１５】
実施例３−ペプチド/DNA/カチオン性リポソーム複合体（PDLシステム）の作製と向上したトランスフェクション効率
【０１１６】
実施例３．１−TatCペプチド/DNA/DPリポソーム三重複合体のトランスフェクション効率
【０１１７】
トランスフェクション効率をテストするために、TatCペプチドは、50μl OPTI-MEM培地でpcDNA3-ルシフェラーゼベクターDNAと先に複合体を形成させ、室温で5分間インキュベートした。DPリポソームを50μlのOPTI-MEM培地で作製し、先に形成されたTatCペプチドとpcDNA3-ルシフェラーゼベクターDNAの複合体に加えた。TatCペプチド/DNA/DPリポソーム三重複合体の各成分の比率をそれぞれ3:1:5に調節した。TatCペプチド/DNA/DPリポソーム三重複合体を室温で10分インキュベートし、細胞へトランスフェクトするために用いた。5時間のインキュベーション後、20%ウシ胎児血清（FBS）を含むOPTI-MEM培地を300μlづつ各トランスフェクションウェルに入れた。更に16時間インキュベーションした後に、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega, USA）でルシフェラーゼ活性におけるトランスフェクション効率を測定した。pcDNA3-ルシフェラーゼベクターDNAのルシフェラーゼ活性を調べるために、次の手順を用いた。細胞をPBS緩衝液（Mg2+ 、Ca2+なし）で洗浄し、100μl/ウェルの1xCCLR液（細胞培養溶解試薬、25mM トリス-リン酸 [pH 7.8]、2mM DTT、2mM 1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸、 10% グリセロール、 1% Triton X-100）に溶解した。細胞溶解物を12,000xgで1分間遠心分離し、50μlの上清液を細胞ペレットを撹乱しないように慎重に収集した。次に、細胞溶解物を20μlのルシフェラーゼアッセイ試薬と混合した。ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（Berthold検出装置、Sirius、ドイツ）を用いテストした。ネガティブコントロールとして、DPリポソームのみを用いた。図１に示す結果から、TatCペプチド/DNA/DPリポソーム三重複合体では、DPリポソームのみで処理したものと比べ、ルシフェラーゼ活性が著しく向上していることが分かる。故に、このTatCペプチド/DNA/DPリポソーム三重複合体はDNA送達の効果的な運搬体として使用することができる。
【０１１８】
実施例３．２−TatCペプチド/DNA/LFAリポソーム複合体のトランスフェクション効率
【０１１９】
実施例３．１に記載されるのと同様に、TatCペプチド/DNA（pcDNA3-ルシフェラーゼベクター）/LFAリポソーム複合体を作製した。トランスフェクションは製造会社が薦めるプロトコール（Life Technologies, USA）に従って行い、ルシフェラーゼ活性をテストした。図１はTatCペプチド/DNA/LFAリポソーム複合体の方がLFAリポソームのみの場合よりトランスフェクション活性が高いことを示している。故に、このTatCペプチド/DNA/LFAリポソームの三重複合体は効率的な送達システムであることが示された。
【０１２０】
実施例４−TatCペプチド/DNA/カチオン性リポソーム三重複合体の混合順序別トランスフェクション効率
【０１２１】
トランスフェクション効率が向上するか否かを判断するために、TatCペプチド/DNA/カチオン性リポソーム三重複合体をその成分の混合順序を変えて形成させた。TatCペプチド、DNA、カチオン性リポソームの三重複合体の混合順序は次の通りである。 
【０１２２】
Ａ：(ペプチド + リポソーム) + DNA 
【０１２３】
Ｂ：(DNA + ペプチド) + リポソーム
【０１２４】
Ｃ：(DNA + リポソーム) + ペプチド 
【０１２５】
Ｄ：DNA + リポソーム
【０１２６】
括弧内は最初に形成させた組み合わせを示す。トランスフェクション効率を調べるためにルシフェラーゼアッセイを行った。図２に示すように、TatCペプチドとDNAを最初に混合した後にカチオン性リポソーム（LFA）を加えた場合が、トランスフェクション効率は一番高かった。このように、(DNA + ペプチド) + リポソームの混合順序が最適トランスフェクション効率を得る上で重要とみられる。
【０１２７】
実施例５−TatCペプチド/DNA/リポソームの混合比率と相対する三重複合体のトランスフェクション効率
【０１２８】
三重複合体のトランスフェクション効率をテストするために、様々な比率で、TatCペプチド及びリポソーム（DP又はLFA）をプラスミドDNAと混合した。次に、三重複合体をK562及びHeLa細胞へトランスフェクトした。このプラスミドDNAは、ルシフェラーゼ遺伝子を持つpcDNA3-lucベクターである。詳細には、DNA:TatCペプチド:リポソームの比率を約1: 2〜5:2〜6 (w/w/w)とし、三重複合体でK562細胞にトランスフェクトした。また、HeLa細胞には約1:3〜4:3〜5 (w/w/w) の比率が用いられた。遺伝子送達に関する本発明のペプチドの効果を比較するために、TatCペプチドなしの比較例としてリポソームのみを用いた。次に、実施例３．１に述べるように、ルシフェラーゼ活性を測定した。 
【０１２９】
K562細胞での三重複合体のすべての組み合わせでは、比較例より著しく高いルシフェラーゼ活性を示した（図３）。 特に、より高い重量比率で複合リポソーム量を増やすほど高活性が得られた。DPリポソームはペプチドと3:3又は4〜6:4の比率で複合体形成されるとき高いトランスフェクション効率を示し（図３Ａ）、LFAリポソームは5〜6:3〜5の比率で高いトランスフェクション効率を示した（図３Ｂ）。同様の結果がHeLa細胞でも得られた（図４）。HeLa細胞では、DPリポソームはペプチドと4:4の比率で複合体が形成されるとき、ルシフェラーゼ活性が向上し（図４Ａ）、LFAは5:3〜4の比率で高い送達効率を示した（図４Ｂ）。
【０１３０】
実施例６−pHの、ペプチド/DNA/リポソーム三重複合体のトランスフェクション効率に及ぼす効果
【０１３１】
pHの三重複合体のトランスフェクション効率に及ぼす効果をテストするために、pHが5.0から8.0の範囲内の異なったpHの緩衝液を、PBS（リン酸緩衝食塩水）及びOPTI-MEM培地（Life Technologies、USA）の両方を用いて調製した。緩衝液には血清や抗生物質は含まれない。pHが5.0から6.0の緩衝液はPBSで調製し、pHが6.5から8.0の緩衝液はOPTI-MEM(-)で調製した。次に、異なるpHの培地・緩衝液の中で形成されたペプチド/DNA/リポソームの三重複合体をHeLa細胞に加えた。トランスフェクション24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。使用したカチオン性リポソームはDPリポソームあるいはLFAのいずれかを使用した。三重複合体は、ペプチド:pcDNA-luc.ベクターDNA:DPリポソームを、比率を約3:1:3 (w/w/w)として形成された。LFAを用いた場合は、ペプチド:DNA:LFAの比率は約3:1:5 (w/w/w)に調節された。
【０１３２】
ルシフェラーゼ活性はテストを行った殆どのpHで検出された（図５）。特に、pHが6.0から7.5の範囲では、トランスフェクション効率が高いことがわかった。この結果から、これらの複合体は、ペプチド、DNA又はリポソームから誘発される特定電荷間の静電気相互作用により形成されるので、酸性又はアルカリ性が強い条件が三重複合体の形成に影響を及ぼしていることが分かる。
【０１３３】
実施例７−異なる細胞株におけるペプチド/DNA/リポソーム三重複合体のトランスフェクション効率
【０１３４】
９つの異なる細胞株（293、HT-29、HL-60、MCF-7、A549、NCI-H1299、WI-38VA13、HepG2 、及び、Hep3B細胞）にて三重複合体の３つの成分の比率を変えて、トランスフェクション効率を検討した。まず、本発明のTatCペプチドとDNA（pcDNA3-luc.ベクター）の比率を変えて、様々な比率で三重複合体を形成した。実施例３．１に記載されている手順と同様に、ルシフェラーゼ活性につきトランスフェクトされた細胞をアッセイした。TatCペプチド/DNA/DPの三重複合体は、DPリポソームのみの場合より著しく高いルシフェラーゼ活性を示した。類似の結果がTatCペプチド/DNA/LFAの三重複合体で得られた（図６及び図７）。これらの結果は、標的DNAを広範な種類の細胞に送達するために本発明のペプチドが使用可能であることを示すものである。
【０１３５】
実施例８−FITC-標識のオリゴヌクレオチドに関する細胞内取込み効率
【０１３６】
次に、両端がFITCで標識されたオリゴヌクレオチドについて、三重複合体による核酸のトランスフェクション効率をテストした。オリゴヌクレオチドをTatCペプチドとLFAリポソームで複合形成し、ラット単球細胞株WRT7/P2にトランスフェクトした。その後、FITC-蛍光についてトランスフェクトされた細胞をアッセイした。TatCペプチド/DNA/LFA三重複合体によるオリゴヌクレオチドの細胞内取込み量は、LFAリポソームのみでの送達より遥かに多いことが観察された（図８）。これらの結果から、本発明の三重複合体を用いた送達方法は、AS-オリゴ類、おとり分子、リボザイムなどのオリゴヌクレオチドの細胞内送達のための効果的な手段である。従って、本発明のTatCペプチド送達システムは、送達されるDNAのタイプにかかわらず、効果的な細胞送達のために効率的に活用できる。 
【０１３７】
実施例９−修飾TatCペプチドの送達効率
【０１３８】
実施例９．１−修飾TatCペプチドの作製とその細胞内取込み
【０１３９】
実施例２．１に示すTatCペプチドは、N-、C-の両末端がRGDアミノ酸配列で修飾されている。この種の修飾は、この技術分野の専門家にとっては一般的なことである。この修飾ペプチド分子は「RGD-TatC-RGD」ペプチドという名称で、配列表の配列番号３に示されている。また、TatCペプチドのC-末端に２つのRGD配列を連続的に加えることにより、もう一つの別のタイプのペプチド分子を合成した。その名称は「TatC-RGD-RGD」とし、配列表の配列番号４とした。次に、この２種類の修飾ペプチドでペプチド/DNA/リポソームの三重複合体を形成した。この三重複合体を形成するためにルシフェラーゼ遺伝子を含むpcDNA3ベクターとDPリポソームを用いた。K562細胞とHeLa細胞を、ベクターDNA、ペプチド、DPリポソームの比率がそれぞれ約1:4:4 (w/w/w)の複合体でトランスフェクトした。実施例３．１に記載されているように、各々のトランスフェクトされた細胞についてルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１４０】
HeLa細胞にて、本発明のTatCペプチド、RGD-TatC-RGDペプチド、及び、TatC-RGD-RGD ペプチドは、次の２つの比較例、すなわち、修飾されてないTatペプチド（SEQ ID NO:6）や修飾されたスクランブルペプチド（Sc-Tatペプチド、SEQ ID NO:5に示す）と比べ、著しく高いルシフェラーゼ活性を示した（図９Ａ）。これらの修飾ペプチドは、K562細胞への送達でも同様な向上パターンを示した（図９Ｂ）。
【０１４１】
特に、修飾Tatペプチドと比べると、NLS（核局在化シグナル）モチーフ（SEQ ID NO:6）を含むTatペプチドとNLSモチーフがランダムに撹乱されたSc-Tatペプチド（SEQ ID NO:5）では両方とも同じ様に低かった。これらの結果は、NLS自体だけでなく、本発明の修飾Tatペプチドによっても、より向上した送達が達成できたことを示すものである。
【０１４２】
実施例９．２−三重複合体（TatC/DNA/リポソーム）で介在されるGFP遺伝子発現の分析
【０１４３】
TatCを含む修飾Tatペプチドや前記のその他の誘導体と複合体を形成したリポソームを用い、生体外遺伝子送達の効率を確認した。まず、前記（実施例３．１）のように、ペプチド/DNA/DPリポソーム三重複合体を形成した後、これをHL-60及びK562細胞へトランスフェクトした。トランスフェクタントをPBS緩衝液で二回洗浄後、蛍光顕微鏡（Leica, ドイツ）下でGFP発現を観察した。その結果、図１０に示すように、HL-60細胞においては、Sc-Tatペプチドと比べ、本発明のペプチドを含む三重複合体ではGFP発現が５〜７倍高いことが分かった。同様に、比較例のペプチドと比べTatペプチドを用いた場合、GFP発現が高いことが示唆された。これらの結果は、実施例９．１に示すように、K562細胞のルシフェラーゼアッセイで得られた結果とよく一致している（図１１）。
【０１４４】
実施例１０− ペプチド介在コトランスフェクションによるウイルス生成効率
【０１４５】
本発明のペプチド送達方法を用いコトランスフェクション効率を分析するために、ペプチド/DNA/リポソーム三重複合体を作製した。その際、３種類の異なるプラスミド（ACP-ルシフェラーゼ、pXX2及びpXX6）を組換えアデノ関連ウイルス（rAAV）の生成に用いた。rAAV生成に必要な３種類のプラスミドを表３に示す。
【０１４６】
【表３】
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【０１４７】
実施例１０．１−コトランスフェクション後のルシフェラーゼ活性の測定
【０１４８】
293細胞を、トランスフェクション24時間前に、6-ウェルプレートの各ウェルに7X105個づつ播種し、5% CO2の湿式インキュベーターにて37℃で更にインキュベートした。その後、TatCペプチド（実施例２．１）とプラスミドの混合物（ACP-Luc:pXX2:pXX6=1:1:3 (w/w)） との複合体を、3:1、4:1、及び、5:1の比率で形成し、室温で5分間インキュベートした。プラスミドとTatCの複合体に５倍のDPリポソーム(w/w)を加え、更に10分間、室温でインキュベートした。血清を含まないOPTI-MEM培地で洗浄後、この三重複合体を293細胞に加えた。293細胞をCO2インキュベーターにて6時間、三重複合体とともにインキュベートした後、20% FBSを含む1 mlのEMEMと共に各ウェルに入れた。更に、細胞を24時間インキュベートした。トランスフェクション効率を比較するコントロール方法として、リン酸カルシウムを使用するトランスフェクション方法を用いた。
【０１４９】
その結果、図１２Ａに示すように、本発明のペプチド/DNA/リポソームの複合体を使用した場合、ルシフェラーゼ活性は、リン酸カルシウム法よりも高かった。
【０１５０】
実施例１０．２−rAAV生成の定量による遺伝子送達効率の検査
【０１５１】
図１２Ａに示すように、プラスミドのうちpACP-Lucのみで細胞をトランスフェクトする場合もルシフェラーゼが発現する。しかし、rAAV粒子を生成するためには３種類のプラスミドのコトランスフェクションが必要である。また、３種類のプラスミドの核への移行が３種類のプラスミドでの遺伝子発現に必須である。結果として、トランスフェクタントのルシフェラーゼ活性を検査することによりrAAV生成を間接的に測定できる。
【０１５２】
まず、実施例１０．１で述べられているように、トランスフェクションを293細胞にて72時間行った。次に、細胞を凍結・解凍のサイクルを繰り返すことにより収集・溶解した。その後、HeLaRC32細胞を収集細胞の上清液及び野生型アデノウイルスで50 MOIにて共感染した。24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。同時にコントロール細胞上清液をリン酸カルシウム法で作製した。これらの上清液は野生型アデノウイルスと共にHeLaRC32細胞を感染するために用いられた。その結果、図１２Ｂに示すように、約4:1:5の比率のペプチド/DNA/リポソーム三重複合体でトランスフェクションを行った場合、ルシフェラーゼ活性はリン酸カルシウム法より高かった。このことから、本発明のペプチド遺伝子送達方法によるトランスフェクション効率が高いため、３種類のプラスミドはすべて細胞に効率的に移動し、その結果、rAAV生成が効率的に行われることが分かった。故に、本発明は、複数のDNAを同時に細胞に送達する効果的な方法を提供するものである。
【０１５３】
実施例１１−血清を含む又は含まない、ペプチドを用いたトランスフェクション効率の検査
【０１５４】
血清を含む又は含まない場合のトランスフェクション効率を調べるために、10% FBSを含む培地と含まない培地にてHeLa及びK562細胞へ本発明のTatC/DNA(pcDNA3-luc)/DPリポソーム三重複合体をトランスフェクトした。DNAとリポソームの複合体をネガティブコントロールとして用いた。その結果、図１３に示すように、TatC/DNA/リポソーム複合体で得られるルシフェラーゼ活性は、血清を含まない培地と比べ、血清を含む培地の場合の方が高かった。更に、β-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を用いた図１４及び１５に示される結果と図１３の結果は一致している。これらの結果から、本発明のペプチド介在DNA送達は生体外、生体内ともに有用であることが明らかである。
【０１５５】
実施例１２−生体内TatCペプチド含有三重複合体の送達効率の検査
【０１５６】
生体内ペプチド/DNA/リポソーム三重複合体のトランスフェクション効率を調べるために、次の実験を行った。雄Sprague-Dawley（SD）ラット（日本、静岡県浜松市）をSLCから提供受けして、各群6匹づつに分け、標準的飼料と水を自由に摂取させ飼育した。体重200〜250 gの雄SDラットを実験に用いた。ペントバルビタール腹腔内注射（5 mg/100 g体重）の麻酔後、腹部中央を切開し左腎臓を露出した。ラット左腎臓近位の尿管結紮後、24ゲージのカテーテル注射器を用い三重複合体（TatC:DNA:DP=4:1:4）の逆行性注入を行った。三重複合体注入24時間後腎臓を回収し、液体窒素下でTissue-TekTM OCT化合物（Miles, イリノイ州エルカート）へ埋め込んだ。4%パラホルムアルデヒドで灌流固定の腎臓の組織部分を、10 μmの厚さに凍結切片化し、Poly-PrepTMスライド（Sigma, ミズーリー州セントルイス）上にのせた。各腎臓を切開後、腎臓の断片を15分灌流し、0.05%グルタルアルデヒド含有PBSで固定し、X-gal液（1.5 mMフェリシアン化カリウム、1.5 mMフェロシアン化カリウム、及び 1% X-gal）中で37℃で4 時間インキュベートした。4μmの組織断片はヘマトキシリンで対比染色し、400倍の倍率で顕微鏡で観察した。 
【０１５７】
図１６に示すように、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現は、TatC/DNA/リポソームからなる複合体投与群のみにて認められ、DNA/リポソ−ム又はDNAのみの投与群では見られなかった。故に、TatC/DNA/リポソーム三重複合体は生体外及び生体内の両方の遺伝子送達に大変有益である。
【０１５８】
発明の有用性
【０１５９】
前述のとおり、本発明の発明者は、構造的且つ機能的に効果がある核局在化機能を持つ12個の塩基性アミノ酸からなる配列を含むTat-由来ペプチドを作製した。発明者は、前記のN-末端及び／又はC-末端を前記塩基性アミノ酸配列で修飾したアミノ酸修飾体であるペプチドを設計した。本発明のペプチドはカチオン性リポソームを用いるDNA送達の限界を克服する上で有用である。このTatCペプチドを用いる三重複合体は、産業上の応用で基本的な点である大量生産が簡単に可能である。更に、TatCペプチドは、生体外、生体内両方での複数プラスミドの細胞へのコトランスフェクションを高トランスフェクション効率で行う際に用いることができる。従って、本発明は遺伝子治療のための送達手段として使用することができる。
【０１６０】
本文に引用された参考文献はすべてその全体が参照されたとみなされる。
【０１６１】
本技術分野における当業者は単なる通常の実験法だけを用い、ここに記載の発明の実施例の均等物を多数認め、確認できるであろう。そのような均等物は請求の範囲に含まれていると意図されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】TatCペプチド、DNA及びカチオン性リポソームの三重複合体を用いた時のルシフェラーゼ活性を示す。
【図２】構成要素であるTatCペプチド、DNA及びカチオン性リポソームを添加する順序を変化させることによるトランスフェクション効率の比較を示す。
【図３】TatCペプチド、DNA及びカチオン性リポソームからなる三重複合体を作製する際の混合比とK562細胞におけるルシフェラーゼ活性の関係を示す。
【図４】TatCペプチド、DNA及びカチオン性リポソームからなる三重複合体を作製する際の混合比とHeLa細胞におけるルシフェラーゼ活性の関係を示す。
【図５】三重複合体を作製する際のpHとトランスフェクション効率の関係を示す。
【図６】TatCペプチド/DNA/DPリポソームからなる三重複合体を用いた時の異なるヒト細胞におけるトランスフェクション効率を示す。
【図７】TatC ペプチド/DNA/LFAリポソームからなる三重複合体を用いた時の異なるヒト細胞株におけるトランスフェクション効率を示す。
【図８】WRT7/P2細胞において、三重複合体を用いた場合、FITCでラベルしたオリゴヌクレオチドのトランスフェクション効率を示す。
【図９】各種のペプチドに対するルシフェラーゼ活性を示す。
【図１０】HL-60細胞におけるトランスフェクション効率を示す。
【図１１】K562細胞におけるトランスフェクション効率を示す。
【図１２】トランスフェクション効率を示す。
【図１３】トランスフェクション効率に対する血清の影響を示すためにルシフェラーゼ活性を示す。
【図１４】GFP遺伝子を持つプラスミドDNAを用い、HeLa細胞におけるトランスフェクション効率に対する血清の影響を示すためにルシフェラーゼ活性を示す。
【図１５】GFP遺伝子を持つプラスミドDNAを用い、K562細胞におけるトランスフェクション効率に対する血清の影響を示すためにルシフェラーゼ活性を示す。
【図１６】TatCペプチド/DNA/リポソームからなる三重複合体を用い、SDラットの腎臓におけるトランスフェクション効率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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