(57)【要約】【課題】リガンドに結合された分子の大きさが制御された、好ましくは円錐型の化合物が結合されたサブストレートの提供。【解決手段】分枝された部位の豊富な末端にサブストレートが結合されていて、線状の部位の末端は官能基化されている、分枝された部位及び線状の部位から構成された重合体からなる、均一なスペーサの分子の大きさが制御されたデンドリマー高分子の分子膜を含む、サブストレートの応用を開示する。【選択図】図１
2010151828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子の大きさが制御された円錐型の巨大分子が規則的に分布する分子層を含むサブストレートであって、
前記巨大分子は、分枝された部位及び線状の部位を含むデンドロンを含み、
前記分枝された部位の多数の末端は前記サブストレートに共有結合されていて、前記線状の部位の末端は有機モイアティーに結合することができる官能基を有し、
前記線状の部位は、スペーサドメイン（Ｌ）及び作用基（Ｗ）を含み、
前記Ｌは、ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）（ＣＯ)、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）7Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）6Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨ（ＣＯ）、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｌ）（ＣＯ)、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２、ＮＨ−（ＣＨ２）５、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）（ＣＯ)、及びＮＨ−（ＣＨ２）6Ｃ（Ｏ）からなる群から選択されたものであり、
前記Ｗは、ＮＨ、ＣＨ２、及びＯからなる群から選択されたものであることを特徴とするサブストレート。
【請求項２】
前記巨大分子が規則的な間隔で分布することを特徴とする請求項１に記載のサブストレート。
【請求項３】
前記巨大分子が、前記巨大分子の官能基化された線状の部位の作用基間の間隔が約０．１ｎｍ乃至約１００ｎｍの規則的な間隔になるように分布することを特徴とする請求項２に記載のサブストレート。
【請求項４】
前記巨大分子が約１０ｎｍの規則的な間隔で分布することを特徴とする請求項３に記載のサブストレート。
【請求項５】
前記分枝された部位の末端が、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＨ２、及びＯＢｚｌからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載のサブストレート。
【請求項６】
前記線状の部位の末端に保護基が結合されていることを特徴とする請求項１に記載のサブストレート。
【請求項７】
前記保護基は、アントラセンメチル（Ａ）、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、及びＮｓからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項６に記載のサブストレート。
【請求項８】
前記デンドロンは、下記式で示される重合体であることを特徴とする請求項１に記載のサブストレート。
【化１】
2010151828.tif 000079
但し、上記式において、
Ｌは、ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）（ＣＯ)、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）7Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）6Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨ（ＣＯ）、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｌ）（ＣＯ)、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２、ＮＨ−（ＣＨ２）５、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）（ＣＯ)、及びＮＨ−（ＣＨ２）6Ｃ（Ｏ）からなる群から選択されたものであり、
Ｗは、ＮＨ、ＣＨ２、及びＯからなる群から選択されたものであり、
Ｘは、アントラセンメチル（Ａ）、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、及びＮｓからなる群から選択されたものであり、
Ｒ１〜３、Ｒ１１〜１３、Ｒ２１〜２３、Ｒ３１〜３３、Ｒ１１１〜１１３、Ｒ１２１〜１２３、Ｒ１３１〜１３３、Ｒ２１１〜２１３、Ｒ２２１〜２２３、Ｒ２３１〜２３３、Ｒ３１１〜３１３、Ｒ３２１〜３２３、Ｒ３３１〜３３３は、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）、（ＣＨ２）２−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−Ｃ（Ｏ）、ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）、ＣＨ２ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）、（ＣＨ２）２、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）、及びＣＨ２ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）からなる群から選択されたものであり、
Ｔは、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＨ２、及びＯＢｚｌからなる群から選択されたものである。
【請求項９】
前記線状の部位の末端に標的特異的リガンドが結合されていることを特徴とする請求項１に記載のサブストレート。
【請求項１０】
前記標的特異的リガンドは、化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アプタマー、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、抗体、抗原、バイオミメティックス、ヌクレオチド類似体、及びこれらの混合物からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項９に記載のサブストレート。
【請求項１１】
前記巨大分子の線状の部位に結合されている標的特異的リガンド間の距離は、約０．１乃至約１００ｎｍであることを特徴とする請求項９に記載のサブストレート。
【請求項１２】
前記サブストレートは、半導体、合成有機金属、合成半導体、金属、合金、プラスチック、シリコン、シリケート、ガラス、及びセラミックからなる群から選択されたもので製作されることを特徴とする請求項１に記載のサブストレート。
【請求項１３】
前記サブストレートは、スライド、粒子、ビーズ、マイクロウェル、及び多孔性物質からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１２に記載のサブストレート。
【請求項１４】
前記多孔性物質は、メンブレイン、ゼラチン、及び水和ゲルからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１３に記載のサブストレート。
【請求項１５】
前記ビーズは、制御された気孔を有するビーズであることを特徴とする請求項１３に記載のサブストレート。
【請求項１６】
請求項１に記載のサブストレートの製造方法であって、
（ｉ）サブストレートを巨大分子の末端と反応することができるように官能基化する段階；及び
（ｉｉ）前記巨大分子を前記サブストレートと接触させて、前記巨大分子の末端及び前記サブストレートが結合を形成するようにする段階；を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１７】
前記サブストレートは、半導体、合成有機金属、合成半導体、金属、合金、プラスチック、シリコン、シリケート、ガラス、及びセラミックからなる群から選択されたもので製作されることを特徴とする請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記サブストレートは、スライド、ビーズ、マイクロウェル物質、及び多孔性物質からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記多孔性物質は、水和ゲル、ゼラチン、及びメンブレインからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記ビーズは、制御された気孔を有するビーズであることを特徴とする請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２１】
（ｉ）前記サブストレート上の巨大分子の線状の部位の末端から保護基を除去する段階；及び
（ｉｉ）標的特異的リガンド、または前記標的特異的リガンドに連結された同型の両作用性または異型の両作用性のリンカー分子を前記サブストレート上の巨大分子の線状の部位の末端と接触させて、前記リガンドまたはリンカー分子及び前記末端が結合を形成するようにする段階；を含んで、標的特異的リガンドを線状の部位の末端に固定させることを特徴とする請求項１６に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記サブストレート上の巨大分子が前記標的特異的リガンド及び線状の部位の末端の結合における障害を最少化させることを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記サブストレート上の巨大分子が前記標的特異的リガンドの特異的な標的の検出における障害を最少化させることを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記標的特異的リガンドを規則的な間隔で分布させることを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記サブストレートは低密度の標的特異的リガンドを含むことを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記低密度の標的特異的リガンドの密度は、約０．０１プローブ／ｎｍ２乃至約０．５プローブ／ｎｍ２の範囲であることを特徴とする請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記標的特異的リガンドは、化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アプタマー、ペプチド、ポリペプチド、酵素、炭水化物、ポリサッカライド、抗体、抗原、バイオミメティックス、ヌクレオチド類似体、またはこれらの混合物からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２８】
線状の部位の末端が標的特異的オリゴヌクレオチドに固定されている、請求項１に記載のサブストレートを含むことを特徴とする遺伝子内の変異の検出のための診断システム。
【請求項２９】
前記サブストレートは、癌関連遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２８に記載の診断システム。
【請求項３０】
前記癌関連遺伝子はｐ５３であることを特徴とする請求項２９に記載の診断システム。
【請求項３１】
線状の部位の末端が標的特異的オリゴヌクレオチドに固定されている、請求項１に記載のサブストレートを分析対象遺伝子を含む試料と接触させる段階を含むことを特徴とする遺伝子内の変異の存在有無の検出方法。
【請求項３２】
前記遺伝子は癌関連遺伝子であることを特徴とする請求項３１に記載の検出方法。
【請求項３３】
前記遺伝子はｐ５３であることを特徴とする請求項３２に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度に分枝された巨大分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）に関するものである。本発明は、前記巨大分子が表面に固定された官能基化されたサブストレートに関するものである。また、本発明は、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）の一側面には官能的なサブストレートが結合されていて、他側面には標的特異的リガンドが結合されている、分子の大きさが制御されたデンドリマー（ｓｉｚｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）及びデンドロンに関するものである。また、本発明は、プローブ生体分子が結合されている高度に分枝された高分子が結合された官能基化されたサブストレートを利用した組合わせ化学（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分野、特定蛋白質検出方法、特定核酸混成化、または核酸／ペプチド混成化検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ序列、遺伝的変異、及び遺伝子発現に対する大量分析を可能にするため、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）は、最初の報告[Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６４，５５５−５５６（１９９３）；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，６２３０−６２３４（１９８６）]以来、多大な関心が持たれている。前記の標準化及びヒト遺伝子分析への応用のために、必須の正確度、再生産性、及び点均質性（ｓｐｏｔ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）の側面で改善が必要であると言われている[Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１，７４２−７４３（２００３）]。このような側面は、主に理想的な形状とは異なる表面及び分子の中間層構造（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｌａｙｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の性質に起因する。類似して、大量標的検出システム分野は、固定された生体活性分子及び生体分子を利用した生物学的分析を含む。
【０００３】
本明細書によるナノサイズに調節された表面に製作されたＤＮＡマイクロアレイは、溶液状態のＤＮＡと同一な程度に、単一塩基で間違えて組合わされた対を識別することができる。このような接近は、最小限の立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を有して、各々のプローブＤＮＡ筋（ｐｒｏｂｅ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ）に標的ＤＮＡと相互作用することができる十分な空間が与えられる理想的なＤＮＡマイクロアレイを提供する。顕著に増加した識別効率（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）によって、非常に信頼することができるヒト遺伝子分析を提供することができる。さらに、このような接近は、固定された生体活性分子や生体分子を利用した多様な生物学的分析に応用できるほど一般的である。
【０００４】
親和性精製（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、リガンド結合蛋白質の分離及び同定のための周知の技術である[Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９６８，６１，６３６−６４３]。不溶性サブストレートに共有的に結合されたリガンド及び相補的な標的蛋白質の特異的相互作用は、複雑な混合物から生体分子を分離するのに要求される特異性を供給する。しかし、前記技術の多様な利用は、伝統的なサブストレートの制約的選択及び不安定性のために、制限がある。多くの固体支持体に対する蛋白質の注目すべき非特異的結合は、新たなサブストレートを確立するのにいつでも問題となってきた（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，３０５９−３０６５）。したがって、環境変化による安定性及び正確に定義されて簡便なリガンド結合を示す特異さの観点で、伝統的なサブストレートと比較されるほどの新たなサブストレートを見つけることが要求されてきた。
【０００５】
固体ペプチド合成のために伝統的に使用されてきたＡＭＰＣＰＧ（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）は、多くの好ましい点を有していることが明らかになっている。しかし、ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）の表面は、極性で、コーティングされた時さえも部分的な負の電荷が維持された（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１，４０３−４５７）。蛋白質の注目すべき非特異的結合と関連して、形態は最も重要な役割を果たす。したがって、親和性クロマトグラフィー及び固体ペプチド合成に対する応用は制限されてきた。このような短所が克服される時、前記物質の多様な利用が期待されるはずである。
【０００６】
リガンドの接近性は、結合能力を決定する際に重要な要素となる。スペーサ物質（ｓｐａｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の導入及びリガンドの濃度の増加が、表面にリガンドをよりよく露出させるために使用される伝統的な方法であった（Ｒｕｓｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ １９９２，７，３６７−３７３；Ｓｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０００，３９，４７８−４８７；Ｐｅｎｚｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．１９９８，６０，５１８−５２３；Ｓｐｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９３，９９，７０１２−７０１９）。前記方法は、一定程度の効果はあるが、リガンド間の不適切な間隔及び表面に対する捕獲物質（ｃａｐｔｕｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の無秩序な分布が、未だ解決されていない問題点である（Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１９９０，５１２，２３−３９；Ｍｕｒｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．２０００，７４０，２１１−２１８；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００２，１８，７７２８−７７３９）。最近、このような問題点を改善するための二つの方法が提供されている。一つの方法は、位置固定のための物質として蛋白質のような巨大物質を利用するものである。前記蛋白質はサブストレートに結合されて、前記位置固定のための物質が除去されて洗浄される。このような方式で、サブストレート上に残留した連結物質間の特定距離が確保される。それにもかかわらず、位置固定のための物質の選択及びこれを除去するための経路は、全ての他の状況に対して精巧に最適化されなければならない（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，５４３−５４８）。他の方法としては、正確に整列された自己組立て単一層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を提供して、デンドロンの最頂点に活性化された機能基を使用する円錐型のデンドロン（ｃｏｎｅ−ｓｈａｐｅ ｄｅｎｄｒｏｎ）を使用するものである（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００２，１８，７７２８−７７３９；Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００３，１９，２３５７−２３６５）。
【０００７】
本発明は、デンドロンを使用したＡＭＰＣＰＧの改質、デンドロンの最頂点にＧＳＨの追加的結合、及びＧＳＴ蛋白質の結合による表面物質の特性を提示する。末端に３乃至９つのカルボキシ酸及び最頂点に一つのアミン基を有するデンドロンをマトリクスに導入した。前記カルボキシ酸は固体表面に共有的に結合されている。ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子融合システムに対する理解及び幅広い使用
によって、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）をデンドロンで処理したサブストレートに対するリガンドとして選択した。前記サブストレートのリガンド結合程度をＧＳＴ及び２種類の融合蛋白質リガンド（ＧＳＴ−ＰＸＰ４７、ＧＳＴ−Ｍｕｎｃ−１８）を利用して測定した（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９８８，６７，３１−４０；Ｓｅｂａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．２００３，７８６，３４３−３５５；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．２００３，７８６，１７７−１８５；ＤｅＣａｒｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．２００３，７８６，７−１５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６４，５５５−５５６（１９９３）；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，６２３０−６２３４（１９８６）
【非特許文献２】Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１，７４２−７４３（２００３）
【非特許文献３】Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９６８，６１，６３６−６４３
【非特許文献４】Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，３０５９−３０６５
【非特許文献５】Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１，４０３−４５７
【非特許文献６】Ｒｕｓｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ １９９２，７，３６７−３７３
【非特許文献７】Ｓｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０００，３９，４７８−４８７
【非特許文献８】Ｐｅｎｚｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．１９９８，６０，５１８−５２３
【非特許文献９】Ｓｐｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９３，９９，７０１２−７０１９
【非特許文献１０】Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１９９０，５１２，２３−３９
【非特許文献１１】Ｍｕｒｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．２０００，７４０，２１１−２１８
【非特許文献１２】Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００２，１８，７７２８−７７３９
【非特許文献１３】Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，５４３−５４８
【非特許文献１４】Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００２，１８，７７２８−７７３９
【非特許文献１５】Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００３，１９，２３５７−２３６５
【非特許文献１６】Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９８８，６７，３１−４０
【非特許文献１７】Ｓｅｂａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．２００３，７８６，３４３−３５５
【非特許文献１８】Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．２００３，７８６，１７７−１８５
【非特許文献１９】ＤｅＣａｒｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．２００３，７８６，７−１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、リガンドに結合された分子の大きさが制御された、好ましくは円錐型の化合物が結合されたサブストレートを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、分枝された部位の多数の末端はサブストレートに共有結合されていて、線状の部位の末端は有機モイアティー（ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）に結合することができる官能基を有する分枝された部位及び線状の部位を含むデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）を含む、規則的に分布する分子の大きさが制御された円錐型の巨大分子の分子層を含むサブストレートに関するものである。
また、前記線状の部位は、スペーサドメイン（Ｌ）及び作用基（Ｗ）を含み、前記Ｌは、ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）（ＣＯ)、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）7Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）6Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨ（ＣＯ）、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｌ）（ＣＯ)、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２、ＮＨ−（ＣＨ２）５、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）（ＣＯ)、及びＮＨ−（ＣＨ２）6Ｃ（Ｏ）からなる群から選択されたものであり、前記Ｗは、ＮＨ、ＣＨ２、及びＯからなる群から選択されたものである。  
【００１１】
前記巨大分子は、サブストレート上に規則的な間隔で分布する。
詳しくは、前記巨大分子は、線状の部位の官能基間の間隔が約０．１ｎｍ乃至約１００ｎｍの規則的な間隔になるように分布する。
より詳しくは、前記巨大分子が約１０ｎｍの規則的な間隔で分布する。
【００１２】
前記サブストレートにおいて、分枝された部位の末端は、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＨ２、及びＯＢｚｌからなる群から選択されたものである。
【００１３】
また、保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）が線状の部位の末端に結合されている。前記保護基は、アントラセンメチル（Ａ）、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、及びＮｓからなる群から選択されたものである。
【００１４】
また、前記サブストレートにおいて、前記デンドロンは、下記式で示される重合体である。
【化１】
2010151828.tif 000003
但し、上記式において、
Ｌは、ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）（ＣＯ)、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）7Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）6Ｃ（Ｏ）、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨ（ＣＯ）、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｌ）（ＣＯ)、ＮＨ−（ＣＨ２）6ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２、ＮＨ−（ＣＨ２）５、ＮＨ−（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）（ＣＯ)、及びＮＨ−（ＣＨ２）6Ｃ（Ｏ）からなる群から選択されたものであり、
Ｗは、ＮＨ、ＣＨ２、及びＯからなる群から選択されたものであり、
Ｘは、アントラセンメチル（Ａ）、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、及びＮｓからなる群から選択されたものであり、
Ｒ１〜３、Ｒ１１〜１３、Ｒ２１〜２３、Ｒ３１〜３３、Ｒ１１１〜１１３、Ｒ１２１〜１２３、Ｒ１３１〜１３３、Ｒ２１１〜２１３、Ｒ２２１〜２２３、Ｒ２３１〜２３３、Ｒ３１１〜３１３、Ｒ３２１〜３２３、Ｒ３３１〜３３３は、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）、（ＣＨ２）２−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−Ｃ（Ｏ）、ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）、ＣＨ２ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）、（ＣＨ２）２、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）、及びＣＨ２ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）からなる群から選択されたものであり、
Ｔは、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＨ２、及びＯＢｚｌからなる群から選択されたものである。  
【００１５】
本発明のまた他の具体的な例で、前記サブストレートは、標的特異的リガンドを前記線状の部位の末端に結合させることができる。より詳しくは、前記標的特異的リガンドは、化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、抗体、抗原、バイオミメティックス（ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、ヌクレオチド類似体（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇ）、またはこれらの混合物からなる。また、前記巨大分子の線状の部位に結合されている標的特異的リガンド間の距離は、約０．１ｎｍ乃至約１００ｎｍである。
【００１６】
本発明のまた他の具体的な例で、前記サブストレートは、半導体（ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、合成有機金属（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｃ ｍｅｔａｌ）、合成半導体（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、金属（ｍｅｔａｌ）、合金（ａｌｌｏｙ）、プラスチック（ｐｌａｓｔｉｃ）、シリコン（ｓｉｌｉｃｏｎ）、シリケート（ｓｉｌｉｃａｔｅ）、ガラス（ｇｌａｓｓ）、またはセラミック（ｃｅｒａｍｉｃ）である。詳しくは、前記サブストレートは、スライド（ｓｌｉｄｅ）、粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）、ビーズ（ｂｅａｄ）、マイクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ）、または多孔性物質であるが、これに制限されない。前記多孔性物質は、メンブレイン、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、または水和ゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）である。より詳しくは、前記ビーズは、制御された気孔を有するビーズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｂｅａｄ）である。
【００１７】
また、本発明は、分枝された部位及び線状の部位を含む重合体を含む、規則的に分布する分子の大きさが制御された円錐型の巨大分子の分子層の製造方法に関するものであって、前記分枝された部位の多数の末端はサブストレートに共有結合されていて、前記線状の部位の末端は有機モイアティーに結合することができる官能基を有していて、前記方法は、（ｉ）巨大分子の末端と反応することができるようにサブストレートを官能基化する段階；及び（ｉｉ）前記巨大分子をサブストレートと接触させて、前記巨大分子の末端及び前記サブストレート間の結合を形成する段階；を含む。
【００１８】
前記製造方法で、前記サブストレートは、半導体、合成有機金属、合成半導体（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、金属（ｍｅｔａｌ）、合金（ａｌｌｏｙ）、プラスチック（ｐｌａｓｔｉｃ）、シリコン（ｓｉｌｉｃｏｎ）、シリケート（ｓｉｌｉｃａｔｅ）、ガラス（ｇｌａｓｓ）、またはセラミック（ｃｅｒａｍｉｃ）からなるが、これに制限されない。前記サブストレートは、スライド、ビーズ、マイクロウェル、または多孔性物質である。前記多孔性物質は、水和ゲル、ゼラチン、またはメンブレインである。前記ビーズは、制御された気孔を有するビーズである。
【００１９】
また、前記のような製造方法において、標的特異的リガンドを線状の部位の末端に結合させることができ、前記方法は、（ｉ）前記サブストレート上の巨大分子の線状の部位の末端から保護基を除去する段階；及び（ｉｉ）標的特異的リガンドまたは前記リガンドに連結された同型の両作用性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーまたは異型の両作用性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーからなる群から選択されたリンカー分子を前記サブストレート上の巨大分子の線状の部位の末端と接触させて、前記リガンドまたはリンカー分子及び前記末端が結合を形成するようにする段階；を含む。
【００２０】
前記製造方法において、前記サブストレート上の前記巨大分子によって、線状の部位の末端及び標的特異的リガンド間の結合における障害を最少化させることができる。また、前記製造方法において、前記サブストレート上の前記巨大分子によって、標的特異的リガンドの特異的な標的を検出する際の障害を最少化させることができる。また、前記製造方法において、前記標的特異的リガンドは規則的な間隔で分布する。また、前記製造方法において、前記標的特異的リガンドは低い密度で前記サブストレート上に位置する。また、前記製造方法において、標的特異的リガンドは、化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アプタマー、ペプチド、ポリペプチド、酵素、炭水化物、ポリサッカライド、抗体、抗原、バイオミメティックス、ヌクレオチド類似体、またはこれらの混合物である。
【００２１】
本発明のまた他の具体的な例において、本発明は、前記サブストレートを含む遺伝子変異を検出するための診断システムに関し、前記サブストレートは、線状の部位の末端が標的特異的オリゴヌクレオチドに固定されている。このようなオリゴヌクレオチドは癌関連遺伝子である。特に、前記癌関連遺伝子はｐ５３である。
【００２２】
本発明のまた他の具体的な例において、本発明は、前記サブストレートを分析対象遺伝子を含む試料と接触させる段階を含み、前記サブストレートは、線状の部位の末端が標的特異的オリゴヌクレオチドに固定されている、遺伝子の変異の存在有無の検出方法に関するものである。本方法において、前記遺伝子は癌関連遺伝子である。また、前記遺伝子はｐ５３である。
【００２３】
本発明のこのような目的は、下記の発明の詳細な説明、添付した図面、及び添付された請求項によって、より明確に理解される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、リガンドに結合された分子の大きさが制御された、好ましくは円錐型の化合物が結合されたサブストレートを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】分枝型／線状の重合体または分子の大きさが制御された巨大分子を示す構造式Ｉである。
【図２】デンドロンを製造する反応概略図であり、Ｘは保護基である。
【図３ａ】デンドロンを用いた表面改質及び混成化のための概略図である。
【図３ｂ】本発明で使用されたデンドロンの分子構造を示すものである。
【図３ｃ】プローブＤＮＡ序列及び標的ＤＮＡ筋の序列を示すものである。プローブオリゴヌクレオチドは、プローブ１：５´−ＮＨ２−Ｃ６−ＣＡＴ ＴＣＣ ＧＮＧ ＴＧＴ ＣＣＡ−３´（序列番号１）及びプローブ２：５´−ＮＨ２−Ｃ６−（Ｔ）３０−ＣＡＴ ＴＣＣ ＧＮＧ ＴＧＴ ＣＣＡ−３´（序列番号２）を含む。標的ヌクレオチドは、標的１：５´−Ｃｙ３−ＴＧＧ ＡＣＡ ＣＴＣ ＧＧＡ ＡＴＧ−３´（序列番号３）及び標的２：５´−Ｃｙ３−ＣＣＴ ＡＣＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＡＣＴ ＴＧＧ ＡＣＡ ＣＴＣ ＧＧＡ ＡＴＧ−３´（序列番号４）を含む。
【図４】（ａ）は、各々の反応段階後の紫外線スペクトルを示すものである。ＥＧ／ＧＰＤＳ及びデンドロンは、エチレングリコール改質されたサブストレート上にデンドロンを導入させる前及び後に得られるスペクトルを示すものであり、ジブロック（Ｄｅｂｌｏｃｋ）は、脱保護段階後のスペクトルを示すものである。（ｂ）は安定性実験を示すもので、室温で１日間ＤＭＦで攪拌した後に得られるスペクトルを‘洗浄（Ｗａｓｈｉｎｇ）’で表示している。
【図５】デンドロン改質された表面のタッピングモード原子顕微鏡（Ｔａｐｐｉｎｇｍｏｄｅ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＴＭ−ＡＦＭ）イメージを示すものである。‘Ｅ’タイプスキャナーを装着したＮａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＩＩａ ＡＦＭ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した。スキャニングされた広さは、１．０×１．０μｍ２である。
【図６】混成化後の蛍光イメージを示すものである。（ａ）及び（ｂ）はデンドロン改質された表面上での（ａ）プローブ１及び標的１または（ｂ）プローブ１及び標的２の間の混成化後に得られるイメージを示すものである。（ｃ）及び（ｄ）はＡＰＤＥＳ改質された表面上での（ｃ）標的１及びプローブ１または（ｄ）標的１及びプローブ２の間の混成化後に記録されるイメージを示すものである。
【図７】対をなすオリゴヌクレオチド対または内部的に間違えて対をなすオリゴヌクレオチド対の間の強度差を示すものである。上位イメージである（ａ）〜（ｃ）は４×４配列蛍光イメージを示し、下位イメージである（ｄ）〜（ｆ）は１６個のスポットから抽出された一つのスポットを示すイメージである。（ａ）及び（ｂ）はＤＳＣリンカーを有するデンドロン改質されたマイクロアレイに関するものであり、（ｂ）及び（ｅ）はＰＤＩＴＣリンカーを有するＡＰＤＥＳ改質されたマイクロアレイに関するものであり、（ｃ）及び（ｆ）はＤＳＣリンカーを有するＡＰＤＥＳ改質されたマイクロアレイに関するものである。ＤＳＣリンカーを有するデンドロン改質されたマイクロアレイ及びＰＤＩＴＣリンカーを有するＡＰＤＥＳ改質されたマイクロアレイに対する蛍光イメージは、１０％より小さい変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｖａｒｉａｎｃｅ、ＣＶ）及び一つのスポットで均一な蛍光信号を示した。一方、ＤＳＣリンカーを有するＡＰＤＥＳ改質されたマイクロアレイに対する蛍光イメージは、スポットの大きさがはるかに小さく、２０％を越える変動係数（ＣＶ）及び一つのスポットで均一でない蛍光信号を示した。各画素の大きさは、１０×１０μｍ２である。
【図８ａ】[９]−酸デンドロンを使用したｐ５３の単一変異（ｓｉｎｇｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を検出するための標的ＤＮＡ試料及びｐ５３特異的オリゴヌクレオチドプローブの混成化後に得られた蛍光イメージを示すものである。
【図８ｂ】[２７]−酸デンドロンを使用したｐ５３の単一変異（ｓｉｎｇｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を検出するための標的ＤＮＡ試料及びｐ５３特異的オリゴヌクレオチドプローブの混成化後に得られた蛍光イメージを示すものである。
【図９ａ】ｐ５３遺伝子の７つのホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ）に対する同時検出を示すものである。
【図９ｂ】ｐ５３遺伝子の７つのホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ）に対する同時検出を示すものである。
【図１０】ＡＭＰＣＰＧマトリクス上でデンドロンを使用して試料Ｅ１（Ｆｍｏｃ−［３］−酸）及び試料Ｅ３（Ｆｍｏｃ−［９］−酸）を製造し、ＤＭＦに溶解した２０％のピペリジンでＦｍｏｃ基を脱保護させて、グルタチオンを混合することを示す概略図である。
【図１１】三つの形態のビーズを利用する精製されたＧＳＴ及びＧＳＴ溶解物の結合を示すものである。Ｍはマーカ（ｍａｒｋｅｒ）を意味する。比較例として、ＧＳＴ溶解質を直接流した（レーン１）。対照群として、精製されたＧＳＴのマトリクス（Ａ、Ｅ１、及びＥ３）に対する結合を試験した（レーン２、３、及び４）。最後に、細胞溶解物の結合を試験して、マトリクス（Ａ、Ｅ１、及びＥ３）の効率を調査した（レーン５、６、及び７）。
【図１２】保護された第１世代官能基化されたデンドロン（Ｅ１、Ｆｍｏｃ−［３］−酸）及び保護した第２世代官能基化されたデンドロン（Ｅ３、Ｆｍｏｃ−［９］−酸）を示すものである。
【図１３】細胞溶解質から得られたＧＳＴの二つの対照群ビーズ（ＣＬ及びＣＳ）に対する結合をＥ１及びＥ３と比較して記録したものである。Ｍはマーカを意味し、レーン１はＣＬ、レーン２はＣＳ、レーン３はＥ１、レーン４はＥ３を意味する。
【図１４】三つの融合ＧＳＴ蛋白質であるＧＳＴ（２８ ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＰＸｐ４７（４１ ｋＤａ）、及びＧＳＴ−Ｍｕｃｎｃ１８（９８ ｋＤａ）を使用して結合力の変化を測定した結果を示すものである。三つのマトリクスの相対的な結合力をデンシチオメーター（Ｄｅｎｓｉｔｉｏｍｅｔｅｒ）で測定した。全てのマトリクスの結合力は、ＧＳＴに対して１００％である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書において、‘ａ’及び‘ａｎ’は単数及び複数の全てを意味するために使用される。
【００２７】
本明細書において、‘アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）’とは、ワトソン−クリック塩基対の形成または三重筋形成以外のメカニズムによって選択された非オリゴタイド分子、または分子群を特異的に認識することができる単一筋、部分的に単一筋、部分的に二重筋、または二重筋ヌクレオチド序列、有利に複製可能なヌクレオチド序列などを意味する。
【００２８】
本明細書において、‘ニ官能性または二作用性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）’、‘三官能性または三作用性（ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）’、及び‘多官能性または多作用性（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）’が合成重合体または多価ホモ重合体またはヘテロ重合体性ハイブリッド構造を示すために使用される場合、二価、三価、または多価を意味したり、二つ、三つ、または複数の特異的認識要素、定義された序列断片、または結合シートを含むことを意味する。
【００２９】
本明細書において、‘バイオミメティック（ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ）’とは、生物学的分子、分子グループ、または構造を模倣する分子、グループ、多分子構造、または方法を意味する。
【００３０】
本明細書において、‘デンドリチク分子（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）’とは、中心からまたは中心側に分枝された層の連続的添加または世代添加によって形成された規則的なテンドリチク分子を示す分子を意味する。
【００３１】
本明細書において、‘デンドリチク重合体（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）’
とは、中心からまたは中心側に分枝された層の連続的添加または世代添加によって形成された規則的なテンドリチク分子を示す重合体を意味する。デンドリチク重合体とは、中心、少なくともひとつ以上の内部分枝層、及び表面分枝層によって特徴づけられる‘デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ）’を含む[ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，Ｐｅｔａｒ ｅｔ ａｌ．Ｐａｇｅｓ６４１−６４５ Ｉｎ Ｃｈｅｍ．ｉｎ Ｂｒｉｔａｉｎ，（Ａｕｇｕｓｔ １９９４）]。‘デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）’とは、焦点から放射された分子を有するデンドリマーの一種で、中心に連結されて、直接または連結モイアティーを通してデンドリマーを形成することができるものを意味する。多くのデンドリマーは、共通の中心に連結された二つまたはそれ以上のデンドロンを含む。しかし、デンドリマーとは、広くは、一つのデンドロンを含む意味で使用されることができる。
【００３２】
デンドリチク重合体は、対称または非対称的な分枝型デンドリマー、キャスケート分子、及びアーボロル（ａｒｂｏｒｏｌ）などを含むが、これに限定されない。好ましい具体例として、前記分枝された枝は、同一な長さでありうる。例えば、前記分枝は、通常の続けて形成される分枝上に位置した末端のＮＨ２基の水素原子の制限なしに起こることができる。しかし、非対称的なデンドリマーも使用することができる。例えば、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）起源のデンドリマーは非対称的である。つまり、前記デンドリマーの分枝された枝は、その長さが異なる。ある分枝がライシン分子のエプシロン窒素（ｅｐｓｉｌｏｎｎｉｔｒｏｇｅｎ）で起こり、他の分枝が前記分子を以前に形成された分枝に結合させる反応性カルボキシ基に隣接したアルファ窒素（ａｌｐｈａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で起こることができる。
【００３３】
また、規則的な連続的な分枝層の添加によって形成されなかったとしても、高度に分枝された重合体、例えば高度に分枝されたポリオール類（ｐｏｌｙｏｌｓ）は、デンドリマーの分枝された様式に接近するほどの規則性を有する分枝された様式を示す、デンドリチク重合体と同等なものであることができる。
【００３４】
本明細書において、巨大分子またはデンドロン構造を説明するために使用される‘高度に分枝された（ｈｙｐｅｒ ｂｒａｎｃｈｅｄ）’または‘分枝された（ｂｒａｎｃｈｅｄ）’という用語は、共有結合またはイオン結合によってサブストレートに結合することができる複数の末端を有している多数の重合体を意味する。ある具体的な例で、前記分枝されたまたは高度に分枝された構造の巨大分子は、予め製造されて（ｐｒｅ−ｍａｄｅ）、サブストレートに結合されているものである。したがって、本発明の巨大分子から、米国特許第５，６２４，７１１号（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．）に記載されたような重合体交差結合方法は除外される。
【００３５】
本明細書において、‘固定された（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）’という用語は、不溶性化されたものを意味したり、不溶性、部分的に不溶性、コロイド、微粒子、分散、懸濁及び／または脱水された物質、または固体支持体に結合したりこれを含む分子、または固体を含んだりこれに結合したり、操作可能に関連づけられたものを意味する。
【００３６】
本明細書において、‘ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）’とは、混合物、分子、材料、表面、構造的形態、表面特徴、または選択的で制限がない多様な化学的存在、単量体、重合体、構造体、前駆体、産物、変異体、誘導体、物質、形態、模様、特徴の無作為的または非無作為的混合、集合、または分類（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）を意味する。
【００３７】
本明細書において、‘リガンド’とは、相補的な塩基対の結合を含む親和性基材の引力によって他の分子と特異的に結合することができる選択された分子を意味する。前記リガンドは、核酸、多様な合成化合物、水溶体作用物質（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ）、部分的作用物質、混合作用物質、拮抗物質（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、反応誘発分子（ｒｅｓｐｏｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、反応促進分子（ｒｅｓｐｏｎｓｅ−ｓｔｉｍｕｌｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、薬品、ホルモン、フェロモン、神経伝達物質（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）、オータコイド（ａｕｔａｃｏｉｄ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、補欠分子群（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）、補助酵素（ｃｏｅｎｚｙｍｅ）、補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒｓ）、サブストレート、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、ビタミン、毒素（ｔｏｘｉｎｓ）、調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、抗原、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）、炭水化物、分子模写体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｍｉｃ）、構造的分子（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、作動分子（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、選択分子（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、バイオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ジゴクシジェニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、交差反応物質（ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔａｎｔ）、類似体（ａｎａｌｏｇ）、競争体（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）、及びこれら分子の誘導体だけでなく、選択された標的特異的結合を行うことができるライブラリー選択非オリゴヌクレオチド分子、及びこのような物質が２次反応（ｓｅｃｏｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と結合することによって形成されるコンジュゲートを含むが、これらに制限されない。
【００３８】
本明細書において、‘リンカー分子’及び‘リンカー’とは、分枝された／線状の重合体のような分子の大きさが制御された巨大分子の分枝された部分を保護基またはリガンドに結合させる分子を意味する。例えば、リンカーは、リガンドをデンドロンに結合させることができる選択された分子、スペーサ分子などを含むが、これに限定されない。
【００３９】
本明細書において、‘低密度（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ）’とは、プローブの個数が約０．０１乃至約０．５個／ｎｍ２、好ましくは約０．０５乃至約０．２個／ｎｍ２、より好ましくは約０．０７５乃至約０．１５個／ｎｍ２、最も好ましくは約０．1個／ｎｍ２であるものを意味する。
【００４０】
本明細書において、‘分子模写体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｍｉｃｓ）’及び‘ミメティクス（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）’とは、例えば天然、生物学的、または選別された分子のような他の分子または分子グループの構造または機能と同等か類似した構造、または機能を有するように設計、選択、製作、改質、またはエンジニアリングされた天然または合成ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子または分子グループを意味する。分子模写体は、天然、合成、選択された、または生物学的分子に対する代替剤、代案剤、機能向上剤、機能改善剤、構造的類似体、または機能的類似体として作用することができる分子または多分子構造体を含む。
【００４１】
本明細書において、‘ヌクレオチド類似体（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇ）’とは、核酸合成及び加工、好ましくは化学的合成及び加工だけでなく、酵素的合成及び加工で自然に存在する塩基の代わりに使用されることができる分子、特に塩基対を形成することが可能な変型されたヌクレオチド、及びアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、または少数塩基を含まない任意に合成された塩基を意味する。このような用語は、変型されたピューリン及びピリミジン、少数塩基、転換可能なヌクレオシド、ピューリン及びピリミジンの構造的類似体、標識化（ｌａｂｅｌｅｄ）、誘導体化、及び変型されたヌクレオシド及びヌクレオチド、コンジュゲーティッドヌクレオシド及びヌクレオチド、序列改質剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、末端改質剤、スペーサ改質剤、及び骨格が変型されたヌクレオチドを含むが、これに限定されず、またリボス変型ヌクレオチド、ホスホアミデート、ホスホロチオネート、ホスホンアミデート、メチルホスフェノイト、メチルホスフォアミデート、メチルホストアミデート、５´−β−シアノエチルホスホアミデート、メチレンホスホナート、ホスホジオチオエイト、ペプチド、核酸、非光学選択性（ａｃｈｉｒａｌ）及び中性ヌクレオチド連結（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ ｌｉｎｋａｇｅｓ）、及びポリエチレングリコール、芳香性ポリアマイド及び脂肪のような非ヌクレオチド連結を含むが、これに制限されない。
【００４２】
本明細書において、‘重合体またはポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）’または‘分枝された／線状のポリマーまたは重合体’という用語は、分子の一末端で分枝された構造を有し、他の末端には線状の部分を有して、分枝された領域はサブストレートに結合し、線状の領域はリガンド、プローブ、または保護基に結合する分子を意味する。
【００４３】
本明細書において、‘ポリペプチド’、‘ペプチド’、及び‘蛋白質’とは、アミノ酸残基から構成された重合体を意味するもので、互いに混用される。この用語は、自然系に存在するアミノ酸から構成された重合体だけでなく、一つ以上の残基が自然に存在するアミノ酸に相応する任意的に合成された類似体である場合にも適用される。前記用語は、また、ポリペプチドを形成するアミノ酸を連結する典型的なペプチド結合に対する多様な変異体を含むものとして使用される。
【００４４】
本明細書において、‘保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）’とは、分子の反応基（例えばヒドロキシル基またはアミン基）に結合されたグループを意味する。前記保護基とは、一つ以上の化学反応で特定のラジカルの反応を阻止するために選択されたものを意味する。一般に、特定の保護基は、分子に存在する他の反応基の変化なく特定の反応基を回復するために後に除去されるようにするために選択されるものを意味する。保護基の選択は、保護対象の特定のラジカルの機能及びそれが提示される化合物を考慮して行われる。前記保護基の選択に関する技術は、例えばＧｒｅｅｎｅなどのＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ[２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）]などによって周知である。
【００４５】
本明細書において、‘保護化されたアミン（ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ａｍｉｎｅ）とは、アミノ保護基と反応したアミンを意味する。アミノ保護基は、線状の末端の機能基がアミノ基である場合に、分枝された末端が固体支持体に結合される間にアミド反応が起こるのを防止する。前記アミノ保護基は、前記分子で他の反応基の変化なくアミノ基を維持して、次の段階で除去されるようにする。例えば、前記エクソサイクリックアミン（ｅｘｏｃｙｃｌｉｃ ａｍｉｎｅ）は、ジメチルアミノメチレンアミノ反応を行うために、ジメチルホルムアミドジエチルアセタールと反応することができる。アミノ保護基は、一般に、カバーメイト（ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ベンジルラジカル（ｂｅｎｚｙｌ ｒａｄｉｃａｌ）、イミデート（ｉｍｉｄａｔｅ）、及び関連分野の当業者に周知の他のものを含む。好ましいアミノ保護基としては、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）やジメチルアミノメチレンアミノが含まれるが、これに限定されない。
【００４６】
本明細書において、‘規則的な間隔（ｒｅｇｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｖａｌ）’という用語は、前記分子の大きさが制御されたデンドリマー（ｓｉｚｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ）の巨大分子の末端間の空間が規則的であることを意味し、これらの間の距離が実際的な立替障害（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）なく、標的特異的リガンド及び標的間の相互作用が起こるための空間である約１ｎｍ乃至約１００ｎｍであることを意味する。したがって、サブストレート上の巨大分子層は、特異的な分子相互作用が起こるように、密度が高すぎてはならない。
【００４７】
本明細書において、‘固体支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）’とは、固定化されたサブストレートからなる構造を意味する。前記固定化されたサブストレートとは、不溶性物質、固体、表面、サブストレート、層、コーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）、織物または不織布、マトリクス、結晶、メンブレイン、不溶性重合体、プラスチック、ガラス、生物学的または生物両立性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）、生物腐食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）、または生分解が可能な重合体、またはサブストレート、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）またはナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を含むが、これに限定されない。固体支持体は、例えば、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）、二重層（ｂｉｌａｙｅｒｓ）、商業的メンブレイン（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、樹脂（ｒｅｓｉｎｓ）、マトリクス、繊維、分離媒質（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）、クロマトグラフィー支持体（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｕｐｐｏｒｔ）、重合体、プラスチック、ガラス、雲母、金、ビーズ、マイクロスピア、ナノスピア、シリコン、ガリウム非化物、有機及び無機金属、半導体、絶縁剤、マイクロ構造及びナノ構造を含むが、これに限定されない。マイクロ構造及びナノ構造は、超小型でナノメートル規模であり、超分子の大きさのプローブ、チップ（ｔｉｐ）、バー（ｂａｒ）、楔、キャップ、棒（ｒｏｄ）、スリーブ（ｓｌｅｅｖｅ）、線（ｗｉｒｅ）、フィラメント、及びチューブを含むが、これに限定されない。
【００４８】
本明細書において、‘スペーサ分子’とは、二つのヌクレオチド間またはヌクレオチド及び非ヌクレオチドが結合することができるように選択されたり考案された、一つまたはそれ以上のヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子、機能基、スペーサアーム（ａｒｍ）を意味し、好ましくは、ヌクレオチド間またはヌクレオチド及び非ヌクレオチド間の距離を変化または調整することができるものを意味する。
【００４９】
本明細書において、‘特異的結合’とは、リガンド及びその特異的結合パートナー間、または定義された序列断片及び選択された分子または選択された核酸序列間に、測定可能で再現性がある程度の引力を意味する。引力の程度は最大である必要はない。弱い、中間、または強い引力が多様に適用されることができる。このような相互作用で起こる特異的結合は、本技術分野の専門家に周知である。定義された合成序列断片に関して、それは合成アプタマー、合成ヘテロ重合体に、ヌクレオチドリガンド、ヌクレオチド受容体、形状認識要素、及び特異的に結合可能な表面である。前記‘特異的結合’は、構造的形状及び表面特徴を特異的に認識するものを含む。特異的結合は、化学的同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（つまり、一つ以上の同一な化学的グループ）または特異的結合パートナーを有する分子的認識能（つまり、分子的結合特異性）を共有する第３の分子（つまり、競争者）によって競争的に阻害される二つの分子間（つまり、特異的結合パートナー）の特異的で飽和可能で（ｓａｔｕｒａｂｌｅ）非共有的な相互作用を明確に意味する。前記競争者は、例えば交差反応物（ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔａｎｔ）、抗体またはその抗原類似体、リガンドまたはその受容体、またはアプタマーまたはその標的である。例えば、抗原抗体間の特異的結合は、交差反応する抗体または抗原により競争的に阻害される。前記‘特異的結合’とは、特異的結合及び構造的形状認識を全て含む特異的認識の部分集合であって、略称または近接した意味で便宜上使用することができる。
【００５０】
本明細書において、‘サブストレート’とは、物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、構造、表面または材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）に使用される場合に、非生物学的、合成的、生きていない（ｎｏｎｌｉｖｉｎｇ）、平べったい球形の、または平らな表面を含む組成物であって、表面、構造、または材料を含む多様な分子種を超越する複数の認識シート、特異的結合、混成化または触媒的認識シート、または多数の多様な認識シートを含む。前記サブストレートは、例えば半導体、合成（有機）金属、合成半導体、絶縁剤、ドーパント（ｄｏｐａｎｔ）；金属、合金、元素、化合物、ミネラル；合成、切断、エッチング、リソグラフィ、印刷、機械化されたり微細に製作されたスライド、装置、構造及び表面；産業的重合体、プラスチック、メンブレイン、シリコン、シリケート、ガラス、金属及びセラミック；木、紙、カードボード、綿、毛、服、織物または不織布、材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）、ファブリク；分枝された／線状の重合体を利用して、プローブ分子の固定化によって改質されないナノ構造またはマイクロ構造を含むが、これに限定されない。
【００５１】
本明細書において、‘標的プローブ結合（ｔａｒｇｅｔ−ｐｒｏｂｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）’とは、少なくとも一つの選択された分子が特異的方式で他の一つに結合された、二つ以上の分子を意味するものである。一般に、最初に選択された分子は、２番目に選択された分子と間接的に、つまり、例えばスペーサアーム（ａｒｍ）、スペーサグループ、分子、ブリッジ、運搬体、または特異的認識パートナーの介入によって、または直接的に、例えば、スペーサアーム、グループ、分子、ブリッジ、運搬体、または特異的認識パートナーの介入なく結合することができる。他の非共有的結合は、ヌクレオチド及び非ヌクレオチド分子の結合を意味し、例えばイオン結合、疏水性相互作用、リガンドヌクレオチド結合、キレーティング剤／金属イオン対形成、または特異的結合対、例えばアビジン／バイオチン、ストラップタビジン／バイオチン、アンチ−フルオレセイン／フルオレセイン、アンチ−２，４−ジニトロフェノール（ａｎｔｉ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）／ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、アンチ−パーオキシダイズ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）／パーオキシダイズ、抗ジゴキシジェニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）／ジゴキシジェニン、またはより一般な収容体／リガンド間の結合を含む。例えば、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ホスラディシュパーオキシダイズ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、β−カラクトシダーゼ、ウレアーゼ（ｕｒｅａｓｅ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、ロダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、または、例えば標識の目的で使用された蛍光マイクロスピアなどのリポーター分子が選択した分子または選択された核酸序列にアビジン／ビオチン（ａｖｉｄｉｎ／ｂｉｏｔｉｎ）、ストレプタビジン／ビオチン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ／ｂｉｏｔｉｎ）、アンチフルオセイン／フルオセイン、アンチ−ペルオキシダイズ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）／ペルオキシダイズ、アンチ−２，４−ジニトロフェノール（ａｎｔｉ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）／ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、アンチジゴキシジェニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）／ジゴキシジェニン、または受容体／リガンド間の結合によって（つまり、直接的及び共有結合によって）選択された分子または選択された核酸序列に特異的結合対を通して結合することもできる。
【００５２】
［巨大分子重合体の製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）］
図１は本発明の重合体の構造式Ｉを説明するための図である。多様なＲ、Ｔ、Ｗ、Ｌ、及びＸ基の変異体が図１に示されている。前記本発明の巨大分子の重合体は、分枝されたり、高度に分枝されたり、または対称か非対称の重合体を含む。前記重合体の分枝された末端は、好ましくは多数の末端を通してサブストレートに結合することができる。前記重合体の線状の末端は、保護基または標的特異的リガンドに結合することができる官能基を有することができる。前記サブストレート上の多数の重合体間のプローブ間の距離は、約０．１ｎｍ乃至約１００ｎｍであり、好ましくは約１ｎｍ乃至約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ乃至約７０ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ乃至約６０ｎｍ、最も好ましくは約２ｎｍ乃至約５０ｎｍである。
【００５３】
＜Ｒ作用基＞
図１に記載された構造式Ｉによれば、前記重合体は、一般に分枝された部位を含み、多数の末端が官能基化されてサブストレートに結合する。前記分枝された部位内で、分枝の第１世代作用基Ｒｘ（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）は、官能基Ｗによって分枝の第２世代作用基Ｒｘｘ（Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３）と連結されている。前記分枝の第２世代作用基は、官能基Ｗによって分枝の第３世代作用基Ｒｘｘｘ（Ｒ１１１、Ｒ１１２、Ｒ１１３、Ｒ１２１、Ｒ１２２、Ｒ１２３、Ｒ１３１、Ｒ１３２、Ｒ１３３、Ｒ２１１、Ｒ２１２、Ｒ２１３、Ｒ２２１、Ｒ２２２、Ｒ２２３、Ｒ２３１、Ｒ２３２、Ｒ２３３、Ｒ３１１、Ｒ３１２、Ｒ３１３、Ｒ３２１、Ｒ３２２、Ｒ３２３、Ｒ３３１、Ｒ３３２、Ｒ３３３）と連結されている。そして、追加的な第４世代作用基が同一な方式で分枝の第３世代作用基に連結されている。末端のＲ基は、サブストレートに結合することができるように官能基化されている。
【００５４】
全ての世代のＲ基は同一であるか相異したものである。通常、Ｒ基は、反復単位、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、アミノアルキルなどのような線状または分枝型有機モイアティであるが、これに限定されない。しかし、全てのＲ基が同一な反復単位であったり、Ｒ基の全ての原子の位置（ｖａｌｅｎｃｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）が反復単位である必要はない。例えば、第１世代の分枝Ｒｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３において、前記分枝水準での全てのＲ基は同一な反復単位でありうる。または、Ｒ１は反復単位であり、Ｒ２及びＲ３はＨまたは他の全ての化学作用基（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）でありうる。または、Ｒ２は反復単位であり、Ｒ１及びＲ３はＨまたは他の全ての化学作用基でありうる。これと類似して、第２世代及び第３世代の分枝の場合には、Ｒ基は反復単位、Ｈ、または他の全ての化学作用基でありうる。
【００５５】
したがって、このような方式で多様な形状の重合体を製作することができる。例えば、Ｒ１、Ｒ１１、Ｒ１１１、Ｒ１１２、及びＲ１１３が同一な反復単位であり、他の全てのＲ基がＨ´または他の多くの中性小分子または原子である場合には、Ｒ１１１、Ｒ１１２、及びＲ１１３に対する三つの官能基の末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）を有する分枝を有する非常に長くて薄い重合体が形成される。多様な任意の他の化学的配列が可能である。したがって、サブストレートに結合可能な官能基を有する約３乃至約８１個の末端を得ることができる。好ましい末端の個数は、約３個乃至約７５個、約３個乃至約７０個、約３個乃至約６５個、約３個乃至約６０個、約３個乃至約５５個、約３個乃至約５０個、約３個乃至約４５個、約３個乃至約４０個、約３個乃至約３５個、約３個乃至約３０個、約３個乃至約２７個、約３個乃至約２５個、約３個乃至約２１個、約３個乃至約１８個、約３個乃至約１５個、約３個乃至約１２個、約３個乃至約９個、または約３個乃至約６個である。
【００５６】
＜Ｔ末端基＞
末端基Ｔは、添加反応または置換反応が起こるようにするのに十分な反応性がある作用基である。このような作用基の例として、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシル、アルケニル、アリル、ビニル、イミド、ハルロ、ウレア、オクシラニル、アジリジニル、オキサゾールリニール、イミダゾールリニール、スルホネート、ホスホネート、イソシアネート、イソチオシアネート、シラニル、及びハロゲニルなどを含むが、これに限定されない。
【００５７】
＜Ｗ作用基＞
図１の構造式Ｉにおいて、Ｗは重合体を他のもの（または他の全ての２価有機モイアティ）に連結させることができる全ての作用基であり、エーテル、エステル、アミド、ケトン、ウレア、ウレタン、イミド、カルボネート、カルボン酸無水物、カルボジイミド、イミン、アゾ基、アミジン、チオカルボニル、有機スルフィド、ジスルフィド、ポリスルフィド、有機スルホキシド、サルファイト、有機スルホン、スルホンアミド、スルホン酸塩、有機スルフェート、アミン、有機ホスホロス基、アルキレン、アルキレンオキシド、アルキレンアミンなどを含むが、これに限定されない。
【００５８】
＜Ｌスペーサまたはリンカー＞
図１において、重合体の線状の部分は、任意に作用基が散在したリンカー部位を含むスペーサドメインを含む。リンカー部位は、多様な重合体から構成される。リンカーの長さは、多様な因子によって決定され、このような因子には、サブストレートに結合する分枝された作用基の数、サブストレートとの結合の長さ、使用されたＲ基の形態、特に使用された反復単位の形態、重合体の線状の部位の末端に結合する標的特異的リガンドまたは保護基の形態などがある。したがって、前記リンカーは、特定の類型の重合体または特定の長さに制限されないことが分かる。しかし、一般的な基準として、リンカーの長さは約０．５ｎｍ乃至約２０ｎｍであり、好ましくは約０．５ｎｍ乃至約１０ｎｍ、最も好ましくは約０．５ｎｍ乃至約５ｎｍである。
【００５９】
リンカーの化学的構造体は、置換されたり置換されていないアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、アミノアルキル、ポリアルケニルグリコールなどのような、しかしこれに制限されない、線状または分枝型有機モイアティを含むことができるが、これに制限されない。前記リンカーは、前記のような作用基を追加的に含むことができ、前記のようにいずれかの特定構造に制限されない。
【００６０】
端部で官能基化されたリンカーは、保護基を含む。したがって、一側面において、本発明は、保護基付きの線状の端部を含む多数の分枝／線状の重合体付きのサブストレートに関するものである。このようなサブストレートは、化学的に反応して、標的特異的リガンドによって代替される保護基を除去することができる。したがって、本発明のシステムの機能的用途において、一端の標的特異的リガンドに連結された分枝型／線状の重合体と結合されたサブストレートが提供される。
【００６１】
＜Ｘ保護基＞
保護基の選択は、好ましい酸反応性または塩基反応性のような多数の因子によって異なる。したがって、本発明は、作用基が他の化学作用基と反応するのを防止する機能を提供し、所望の特定化された条件下で除去されるものである限り、いかなる特定の保護基にも限定されない。前記保護基は、容易に除去されるのが好ましい。本発明で使用されるこのような保護基の例として、下記のものを挙げることができるが、これに限定されない。
【００６２】
アミノ酸保護基：メチル、ホルミル、エチル、アセチル、ｔ−ブチル、アニシル、ベンジル、トリフルオロアセチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイル、４−メチルベンジル、チオアニジル、チオクレシル、ベンジルオキシメチル、４−ニトロフェニル、ベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンゾイル、２−ニトロフェニルソルフェニル、４−トルエンスルホニル、ペンタフルオロフェニル、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４，５−トリクロロフェニル、２−ブロモベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル、フタルロイル、３−ニトロフタオイルである、４，５−ジクロロフタロイル、テトラブロモフォタロイル、テトラクロロフタロイル。
【００６３】
アルコール保護基：ｐ−アニシルオキシメチル（ｐ−ＡＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｔ−ブトキシメチル、２−クロロテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、グアイアコルメチル（Ｇｕａｉａｃｏｌｍｅｔｈｙｌ、ＧＵＭ）、（１Ｒ）−メントキシメチル（ｍｅｎｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ、ＭＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、メトキシメチル（ＭＯＭ）、ｏ−ニトロベンジルオキシメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）。
【００６４】
ＤＮＡ、ＲＮＡ保護試薬：２´−ＯＭｅ−Ａｃ−Ｃ−ＣＥホスホラミダイト、２´−ＯＭｅ−Ａｃ−ＲＮＡ  ＣＰＧ、２´−ＯＭｅ−Ｉ−ＣＥホスホラミダイト、２´−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−Ｃ−ＣＥホスホラミダイト、Ａｃ−Ｃ−ＣＥホスホラミダイト、Ａｃ−Ｃ−ＲＮＡ  ５００、ｄｍｆ−ｄＧ−ＣＥホスホラミダイト、ｄｍｆ−ｄＧ−ＣＰＧ  ５００、２−アミノ−ｄＡ−ＣＥホスホラミダイト（Ｍ．Ｐ．Ｒｅｄｄｙ，Ｎ．Ｂ．Ｈａｎｎａ，ａｎｄ  Ｆ．Ｆａｒｏｏｑｕｉ，ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９４，３５，４３１１−４３１４；Ｂ．Ｐ．Ｍｏｎｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８，１４５１４−１４５２２）。
【００６５】
有機合成における一般的な保護試薬：（ジメチル−ｔ−ブチルシリルオキシ）メチルクロライド（ＳＯＭＣｌ）、エトキシエチルクロライド（ＥＥＣｌ）、−クロロエーテル類、ｏ−ニトロベンジルオキシメチルクロライド、ｂ，ｂ，ｂ−トリクロロエトキシメチルクロライド（ＴＣＥＭＣｌ）、（−）−メンチル（Ｍｅｎｔｈｙｌ）エステル、（Ｐ）−ベンジルエステル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−フェニル−２−プロピルエーテル、１，１，３，３−テトラメチル−１，３，２−チシラザン、１，２，４−ジチアゾールリジン−３，５−ジオン、１，２−ジブロマイド、１，２−ジクロライド、１，２−ジオールモノ−４−メトキシベンジルエーテル、１，２−ジオールモノ−ｔ−ブチルエーテル、１，２−ジオールモノアセテートエステル、１，２−ジオールモノアリルエーテル、１，２−ジオールモノベンゾエートエステル、１，２−ジオールモノベンジルエーテル、１，２−ジオールモノトシレート、１，３−ベンゾジチオラン、１，３−ベンゾジチオラン−２−イルエーテル、１，３−ジオールモノ−４−メトキシベンジルエーテル、１，３−ジオールモノベンゾエートエステル、１，３−ジオールモノベンジルエーテル、１，３−ジオキサン、１−（２−（トリメトキシシリル）エトキシ）エチルエーテル、１−アダマンチルエステル、１−ベンゾイル−１−プロペン−２−イルアミン、１−エトキシエチルエーテル、１−メトキシエチリデンアセタール、１−メチル−１−メトキシエチルエーテル、１−フェニル−３，５−ジ−ｔ−ブチルシクロヘキサジエン−４−オンイルアミン、１−フェニルエチルエステル、２，２，２−トリクロロエトキシメチルエーテル、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルエステル、２，２，２−トリクロロエチルホスフェート、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド、２，２−ジメチル−４−ペンテノエートエステル、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド、２，４−ＤＮＰハイドラゾン、２，５−ジクロロフェニルホスフェート、２，５−ジメチルピロール、２−（２−メトキシエトキシ）エチルエステル、２−（４−ニトロフェニル）エチルエーテル、２−（４−ニトロフェニル）エチルホスフェート、２−（４−トルエンスルホニル）エチルエステル、２−（ジブロモメチル）ベンゾエートエステル、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルエステル、２−（トリメチルシリル）エチルエーテル、２−ベンゼンスルホニルエチルチオエーテル、２−ブロモエチルエステル、２−クロロエチルエステル、２−クロロフェニルホスフェート、２−シアノエチルホスフェート、２−メトキシエチルエステル、２−ニトロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロベンゼンスルホンアミド、２−オキサゾリン、２−フェニルエチルエステル、２−ピリジルジスルファイド、２−テトラヒドロピラニルアミン、４−クロロベンゾエートエステル、４−クロロブチルエステル、４−メトキシベンズアミド、４−メトキシベンゾエートエステル、４−メトキシベンジルアミン、４−メトキシベンジルエステル、４−メトキシベンジルオキシメチルエーテル、４−ニトロベンズアミド、４−ニトロベンゾエートエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−ニトロベンジルエーテル、４−ニトロベンジルホスフェート、４−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルハイドラゾン、４−トルエンスルホンアミド、４−トルエンスルホン酸塩、９−フルオレニルメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルエステル、アリルカーボネート、アリルエステル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホン酸塩、ベンジルカーボネート、ベンジルエステル、ＢＯＭエーテル、ＤＭＴｒエーテル、ＭＥＭエーテル、メタンスルホンアミド、メタンスルホン酸塩、エチルカーボネート、ＭＭＴｒエーテル、ＭＯＭカーボネート、ＭＯＭエステル、ＭＯＭエーテル、ＭＴＨＰエーテル、ＭＴＭエステル、ＭＴＭエーテル、Ｎ−４−メトキシベンジルアミド、Ｎ−４−トリルアミド、Ｎ−ベンゼンスルホニルアミド、Ｎ−ベンジルイミン、ｎ−ブチルエステル、ｎ−ブチルエーテル、Ｏ−４−メトキシベンジルカバーメイト、Ｏ−９−フルオレニルメチルカバーメイト、フェニルチオエーテル、フェニルチオールエステルピペリジンアミド、ＰＭＢエーテル、ＳＥＭエステル、ＳＥＭエーテル、スクシネートエステル、ｔ−ブチルカーボネート、ｔ−ブチルエステル、ｔ−ブチルエーテル、ｔ−ブチルホスフェート、ｔ−ブチルチオエーテル、ｔ−ブチルチオールエステル、ＴＢＤＭＳエステル、ＴＢＤＭＳエーテル、ＴＢＤＰＳエーテル、ＴＥＳエーテル、ＴＨＦエーテル、ＴＨＰエーテル、ＴＩＰＤＳジエーテル、ＴＩＰＳエーテル、ＴＭＳエステル、ＴＭＳエーテル、ＴＭＳチオエーテル、トシルハイドラゾン、ＴＰＳエーテル、トリフルオロアセトアミド。
【００６６】
商業的に入手可能な保護基の目録は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）カタログから見つけることができ、その内容は、保護基の基材と関連があるため、全体が参考として本明細書に含まれる。
【００６７】
一般に、本発明の一側面において、本発明に使用された保護基は、連続する一つ以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸の成長中であるペプチド鎖への添加に使用されるものなどである。普通は、第１アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基は、適切な保護基によって保護されたものである。
【００６８】
特に好ましい方法において、前記アミノ作用基は、酸敏感または塩基敏感作用基によって保護されたものである。このような保護基は、連結形成条件に適し、成長中である分枝型／線状の重合体の破壊なく、容易に除去される特性がなければならない。このような適切な保護基には、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、非ペニルイソプロピル−オキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボニルオキシカルボニル、（α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニルなどがあるが、これに限定されない。
【００６９】
特に好ましい保護基の例は、また、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼンスルホニル、アダマンチルオキシカルボニル、ベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジル、イソプロフィル、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、シクロヘキシル、シクロフェニル及びアセチル（Ａｃ）、１−ブチル、ベンジル及びテトラヒドロピラニル、ベンジル、ｐ−トルエンスルホニル、及び２，４−ジニトロフェニルなどを含む。
【００７０】
追加的な方法において、線状／分枝型の重合体の分枝の末端を適切な固体支持体に結合させる。前記合成に使用可能な適切な固体支持体は、使用される培地で不溶性であるだけでなく、順次的な縮合−脱保護反応の条件及び試薬に不活性である物質である。
【００７１】
分枝型／線状の重合体の線状の末端からのＦｍｏｃのような保護基の除去は、二次アミン、好ましくはピペリジンで処理して行うことができる。前記保護された部分を約３倍過量のモル数で導入させることができ、ＤＭＦ内でカップリングを行うのが好ましいこともある。カップリング剤は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルウロニウムヘクサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）及び１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）であるが、これに制限されない。
【００７２】
ポリマーは、連続操作または単一操作で脱保護させることができる。ポリペプチドの除去及び脱保護は、サブストレート結合ポリペプチドを切断試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）で処理することによって、単一操作で行うことができ、前記切断試薬には、例えばチアニゾル（ｔｈｉａｎｉｓｏｌｅ）、水、エタンジチオール、及びトリフルオロ酢酸などを使用することができる。
【００７３】
下記の表１は、多様な類型の例示的化合物を列挙したものである。しかし、Ｘ、Ｌ、Ｗ、Ｒ、及びＴの変異も本発明に含まれると理解される。
【表１−１】
2010151828.tif 000004
【表１−２】
2010151828.tif 000005
【００７４】
［標的特異的（Ｔａｒｇｅｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）リガンドまたはプローブ］
標的特異的リガンドは、プローブともいわれ、前記分枝型／線状の重合体の線状の末端に結合するようになる部分であって、化学物質、生化学物質、生活性化合物などの多様な化合物を含む。これと関連して、前記リガンドは、核酸、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）である。前記オリゴヌクレオチドは、天然核酸またはその類似体である。したがって、前記リガンドは、天然アミノ酸または合成アミノ酸からなるポリペプチドである。前記リガンドは、核酸、アミノ酸、炭水化物、または分枝型／線状のポリマーの線状の部分に結合することができる他の全ての化学物質の組合わせである。特に、前記リガンドは、トリアジン骨格などに基づく化学物質であり、これは組合わせ的化学ライブラリー、特にトリアジン標識されたライブラリーの成分として使用されることができる。
【００７５】
［サブストレート（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）］
サブストレートは、前記分枝型／線状の重合体が共有結合またはイオン結合によって結合することができる全ての固体表面を意味するものである。前記サブストレートは、前記分枝型／線状の重合体の分枝された末端間に結合が起こるように官能基化されたものである。前記サブストレートの表面は、本発明が属する技術分野における当業者の必要に応じて、多様な表面を有することができる。マイクロアレイまたはバイオチップフォーマットが要求される場合には、通常、酸化されたシリコンウエハー、融合シリカ、またはガラスをサブストレートとして使用することができる。前記サブストレートは、ガラススライドであるのが好ましい。サブストレートの他の例として、ニトロセルロースまたはナイロンのようなメンブレンフィルターを挙げることができるが、これに限定されない。前記サブストレートは、親水性または極性でありえ、コーティング前または後に負の電荷または正の電荷を帯びるものである。
【００７６】
［マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）］
ＤＮＡマイクロアレイの性能を向上させるために、プローブ設計、スポッティング間の反応条件、混成化及び洗浄条件、非特異的結合の抑制、生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）及び表面間の距離、及び固定化された生体分子間の空間などの因子が考慮されなければならない。これら因子の大部分は、マイクロアレイの表面の性質に関連するものであるため、マイクロアレイの研究において、表面最適化が主な目的になっている。Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ及びＣｈａｎｇは、固定化されたオリゴペプチドのアルファ螺旋形成が空間制御された（ｓｐａｃｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）金の表面で促進されることを示した[Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，７３−７６（１９９３）]。
【００７７】
本発明では、円錐型デンドロンによって溶解値（１：０．０１）に近い単塩基多形成（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）識別効率を有し、ＤＮＡ非特異的結合は減少した、ＤＮＡマイクロアレイが提供される。
【００７８】
図２はデンドロンの合成を示す概略図である。多様な出発物質、中間体化合物、及びデンドロン化合物が示されており、図面における‘Ｘ’はアントラセンメチル（Ａ）、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｎｓなどのような全ての保護基である。図３ａはデンドロンでガラス表面を改質すること（図３ｂ）及び蛍光物質（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）で標識された標的ヌクレオチドを適切なオリゴヌクレオチドプローブと選択的に混成化させながら、単塩基が間違えて組合わされた対をデンドロン改質された表面で効果的に識別することができることを示す。
【００７９】
分枝の末端に表面反応性作用基を有する第２世代分枝デンドロンを使用することができ、これは自己組立て可能であり、これらの間に適切な空間を提供する。現在までの研究は、ガラスサブストレート上の陽イオン及びデンドロンの末端の陰イオンであるカルボキシレート間の多重イオン結合（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｏｎｉｃ  ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）によって良好な動きの（ｗｅｌｌ−ｂｅｈａｖｅｄ）単一層を成功的に生成して、リガンド間の間隔を２４Å以上に確保することができることを示した[Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９，２３５７−２３６５（２００３）]。脱保護を容易にし、脱保護した端部のアミンの反応性を増進させるために、本発明者らは、前記構造を図３ｂに示したように変型させた。また、本発明者は、デンドロンのカルボン酸基及び表面のヒドロキシ基間の共有結合の形成がイオン結合の程度に効果的であり、また末端の安定性を増進させることを観察した。さらに、オリゴエーテル間層（ｏｌｉｇｏｅｔｈｅｒａｌ  ｉｎｔｅｒｌａｙｅｒ）が非特異的オリゴヌクレオチド結合を抑制するのに効果的であった。
【００８０】
既に報告された方法を利用してヒドロキシ化された表面を製作した[Ｍａｓｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，核酸ｓ  Ｒｅｓ．２０，１６７９−１６８４（１９９２）]。酸化されたシリコンウエハー、融合シリカ、及びガラススライドを含むサブストレートを（３−グリシドオキシプロピル）メチルジエトキシラン（ＧＰＤＥＳ）及びエチレングリコール（ＥＧ）で改質した。４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で、１−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）または１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用してデンドロンのカルボン酸基及びサブストレートのヒドロキシ基間を結合反応させることによって、デンドロンをサブストレートに導入した[Ｂｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０，２３９４−２３９５（１９８５）；Ｄｈａｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７，１９６２−１９６５（１９８２）]。デンドロン導入後の厚さの増加値は１１±２Åであり、これはイオン結合で観察された既存の値に匹敵する値である[Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９，２３５７−２３６５（２００３）]。固定化後、デンドロンのアントラセンモイアティで発生する吸収ピークは２５７ｎｍと観察された。分子層は安定し、ジメチルホルムアミドで１日攪拌した時にも厚さ及び吸着特性に変化を示さない（図４）。タッピングモード原子顕微鏡（ｔａｐｐｉｎｇ  ｍｏｄｅ  ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＭ−ＡＦＭ）によって得られた局所イメージも、得られた層が凝集または孔なく非常になめらかで均質であることを示した（図５）。
【００８１】
ＤＮＡマイクロアレイを準備するために、固定化されたデンドロンを活性化して脱保護過程を通じて一次アミン基を生成した。１．０Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で脱保護化後[Ｋｏｒｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２，３９９−４００（１９７７）]に、２５７ｎｍでの吸収ピークが、表面特性の他のいかなる有害な変化もなく無くなった（図４ａ）。このような観察結果は、保護基が層に化学的損傷なく成功的に除去され、前記保護基の除去によって厚さが若干減少するということを示した。
【００８２】
既に確立された方法［Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７，１９７０−１９７７（１９９９）］によって、ジ（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（ＤＳＣ）を使用して改質した後、Ｍｉｃｒｏｓｙｓ ５１００ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してクラス１０，０００クリーンルームに適切にアミン結合された（ａｍｉｎｅ−ｔｅｔｈｅｒｅｄ）オリゴヌクレオチド（２０μＭ）の５０ｍＭのソジウム非カーボネートバッファー（１０％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ｐＨ８．５）溶液をスポッティングすることによって、プローブオリゴヌクレオチドを活性化したガラススライド表面に固定化させた。通常、反応性アミン基表面を有するサブストレートに、チオール結合された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）オリゴヌクレオチド及びスクシンイミジル４−マレイミドブチレート（ＳＭＢ）、またはスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＳＭＣＣ）のような異型の両作用性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーを使用する[Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ １８，１７６４−１７６９（２００２）；Ｆｒｕｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ１６，２１９２−２１９７（２０００）]。これとは対照的に、デンドロン改質された表面によってアミン作用基間の所定の距離が確保されるので、ＤＳＣのような同型の両作用性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーを使用しても何ら問題がない。結果的に、アミン結合された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）オリゴヌクレオチドをスポッティングに使用することができる。費用効率性は別問題として、チオール結合された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）オリゴヌクレオチドが特定条件下で有用であるが、容易に酸化されるチオール結合されたオリゴヌクレオチドの使用を回避することができる。
【００８３】
前記ＤＮＡマイクロアレイを製作して、相補的対（Ａ：Ｔ）及び３組の内部単塩基が間違えて組合わされた対（Ｔ：Ｔ、Ｇ：Ｔ、Ｃ：Ｔ）の間の識別効率を評価することができる。プローブオリゴヌクレオチドを４／４フォーマットに並べてスポッティングした後、前記マイクロアレイを恒湿器（湿度８０％）で１２時間インキュベーティングして、アミン結合された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）ＤＮＡに十分な反応時間を提供した。その後、スライドを３７℃で３時間バッファー溶液（２ｘ ＳＳＰＥバッファー（ｐＨ７．４）、７．０
ｍＭのソジウムドデシルスルフェートを含む）で攪拌して、沸騰した水で５分間攪拌して、非特異的に結合されたオリゴヌクレオチドを除去した。最後に、次の段階のために、ＤＮＡ機能化されたマイクロアレイを窒素気流下で乾燥させた。適切な比較のために、他の種類のプローブを一つのプレート上にフローティングした。
【００８４】
混成化させるために、１５塩基オリゴヌクレオチド（標的１）または４５塩基オリゴヌクレオチド（標的２）を使用した（図３ｃ）。Ｃｙ３蛍光染料で標識された標的オリゴヌクレオチド（１．０ｎＭ）を含む前記洗浄バッファー溶液で５０℃で１時間ＧｅｎｅＴＡＣＴＭＨｙｂＳｔａｔｉｏｎ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用し
て混成化を行った。過剰の標的オリゴヌクレオチドを除去するために、前記マイクロアレイを３７℃でバッファー溶液で４回洗浄して、窒素で乾燥した。各々のスポット上の蛍光信号は、ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）を使用して測定し、Ｉｍａｇｅｎｅ４．０（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して分析した。
【００８５】
１５塩基標的オリゴヌクレオチドの場合、得られたイメージは、正しく組合わされた対と内部が間違えて組合わされた対との間の強度に顕著な差があることを示した（図６Ａ）。標準化された蛍光信号比率（または完全に組合わされた対に対する単塩基の内部の間違えて組合わされた対の強度の比率、つまりＭＭ／ＰＭ）は、０．００５、０．００８、及び０．００６（Ｔ：Ｔ、Ｇ：Ｔ、及びＣ：Ｔの内部の間違えた組合わせ）（図６Ａ及び表２）であった。観察された選択度は、既存の通常の方法より顕著に向上し、一般的な表面上でのマイクロアレイと比較する時、非常に大きい選択度の増加（２０乃至８２倍）が記録された（表２）。すでに、本発明者は、また、混合された自己組立て単一層（つまり、混合ＳＡＭ）を含む多様なアミン表面上に製作されたマイクロアレイの選択度の比率が１：０．１９乃至０．５７であることを観察した[Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ １８，１７６４−１７６９（２００２）]。また、他の研究者らによって、表面を改質させてより優れた検出方法を開発して、ＤＮＡマイクロアレイの性能を改善させることが報告されたが、蛍光検出方法に関連する限り、これらのうちのいかなるものも、このような改善された比率を示すことはできなかった[Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，１２５３１−１２５４０（２００３）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，１２５３１−１２５４０（２００３）；Ｂｅｎｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０、ｅ１０（２００２）；Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５０，２０３−２１１（１９９７）；Ｔａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９，１７５７−１７６０（２０００）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０，ｅ６１（２００２）]。例えば、３成分混成化／検出システム（捕獲者／標的／プローブ）において、成功的な識別比率である１：０．０７が報告された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，１２５３１−１２５４０（２００３）]。選択度を増加させることができるペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を使用する場合にも、金薄膜及び金ナノ粒子上での選択度は各々１：０．１４及び１：０．０７であった[Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，１２５３１−１２５４０（２００３）]。
【表２】
2010151828.tif 000006
【００８６】
より実際的なシステムを実現するために、４５塩基の標的オリゴヌクレオチドを使用した。Ｔ：Ｔ、Ｇ：Ｔ、及びＣ：Ｔの内部に間違えて組合わされた塩基対に対するＭＭ／ＰＭの比率が０．００６、０．００９、及び０．００９であった（図６Ｂ及び表２）。このような結果は、標的オリゴヌクレオチドの長さが長い場合に、明確な選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を現わすことを示す。前記ＤＮＡマイクロアレイの効率は、デンドロン改質表面の特殊性、つまり固定されたＤＮＡ−鎖間のｍｅｓｏｓｐａｃｉｎｇによるものであると思われる。
【００８７】
比較のために、（３−アミノプロピル）ジエトキシメチルシラン（ＡＰＤＥＳ）に変型させたサブストレート上にＤＮＡマイクロアレイを製作した（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ１８，１７６４−１７６９（２００２））。これは、ＤＮＡまたは蛋白質マイクロアレイ用に使用される一般的なサブストレートである。１，４−フェニレンジイソチオシアネート（ＰＤＩＴＣ）リンカーを使用することを除いては、デンドロン改質ＤＮＡマイクロアレイの場合と同様に、前記選択性を試験した。アミン処理されたオリゴヌクレオチドは、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１２１−２１２５（１９９４）に記載された方法通りに使用した。Ｔ：Ｔ、Ｇ：Ｔ、及びＣ：Ｔの場合、測定されたＭＭ／ＰＭの比率は０．４１、０．３８、及び０．２６であった（図６Ｃ及び表２）。ＡＰＤＥＳ改質サブストレート上にＤＳＣリンカーを使用した結果、高い変異係数（ＣＶ）値（＞２０％）が示され、これは、スポット当たりの変異程度及び各スポット内で不均一な蛍光強度を示すものである。反面、ＤＳＣリンカーがあるデンドロン改質表面のように、ＰＤＩＴＣリンカーはより良い変異係数値（ＣＶ）（＜１５％）及び単一スポット内に均一な蛍光強度を示した（図７）。
【００８８】
追加的な比較のために、オリゴマーの５´末端に追加的な（Ｔ）３０スペーサを有するプローブ２ オリゴヌクレオチドをＳＮＰ区別実験に使用した。この場合、追加スペーサを有する前記プローブをＡＰＤＥＳ改質表面上に固定化させた。Ｔ：Ｔ、Ｇ：Ｔ、及びＣ：Ｔの場合に対する測定されたＭＭ／ＰＭの比率は、０．１７、０．１８、及び０．１２であった（図６Ｄ及び表２）。Ｃ６スペーサを有するプローブＤＮＡに比べて、前記選択性が非常に向上したが、依然としてデンドロン改質ＤＮＡマイクロアレイより低かった。
【００８９】
表面混成化に多様な問題点を有し、正確なマイクロアレイスクリ−ニングを行う際の調節及び予測を難しくする。二重筋形成に対するＧｉｂｂｓ自由エネルギー及び二重筋の熔解温度（Ｔｍ、ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に加えて、洗浄段階で、非特異的結合、立替効果、静電気的効果、及び条件変化などを考慮しなければならない。内部的に間違えて組合わされた塩基対（１５−ｍｅｒのうち、Ｔ：Ｔ、Ｇ：Ｔ、及びＣ：Ｔは内部的に間違えて組合わされた欠陥）及び完全に組合わされた塩基対の間のＧｉｂｂｓ自由エネルギーの差は、５０℃で２．６７、１．７５、及び３．０５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーは、ＨＹＴＨＥＲＴＭソフトウェアで計算した（ｈｔｔｐ：／／ｏｚｏｎｅ２．ｃｈｅｍ．ｗａｙｎｅ．ｅｄｕ）。したがって、理論的な蛍光比率（ＭＭ／ＰＭ）は、各々０．０１６、０．０６５、及び０．００９であった。また、分子信号を利用した溶液上の研究結果によれば、ＳＮＰ区別比率は、１：０．０１と低かった（Ｔａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９，１７５７−１７６０（２０００））。これらデータは、本発明のデンドロン改質ＤＮＡマイクロアレイが熱力学的限界に到達したり、これを超越する理想的なものであることを説明している。特に、Ｇ：Ｔの場合、マイクロアレイ方式での区別効率性は、溶液上で計算した数値より優れている。前記選択度の増加の主な因子は調査されなかったが、洗浄段階で厳格な条件が重要な役割を果たすものと期待される。
【００９０】
［ｐ５３ＳＮＰ探知］
生物界で、ｐ５３腫よう抑制遺伝子は、細胞調節、遺伝子転写、ゲノム安定性、ＤＮＡ修復、及び細胞死滅に重要な役割を果たす（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４２：８５８−８６８，Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９６，８８：１４４２−１４５５、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，１９９６，４７：２８５−３０１）。ｐ５３が本来の機能を喪失すると腫ようが誘導され、ｐ５３の変異は直腸癌及び肺癌のようなヒトの癌で最もありふれた遺伝的変異である（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ，１９９４，５４：４８５５−４８７８）。
【００９１】
[９]−酸デンドロン改質サブストレート上のＤＮＡマイクロアレイを利用して、癌細胞株からｐ５３腫よう抑制遺伝子の単一変異を探知しようとする。１７５コドンを含む標的ＤＮＡサンプル（２００−４００塩基）をゲノムＤＮＡ鋳型にレンドンプライマー法で製造し、１８個の塩基から構成されたプローブオリゴヌクレオチドが固定されたデンドロン改質表面に混成化させた。Ａ：Ｃ、Ｔ：Ｃ、及びＣ：Ｃの内部の間違えた組合わせに対するＭＭ／ＰＭの比率は、０．０２８、０．０３１、及び０．００７であった（図８ａ）。このような結果は、実際の標的ＤＮＡに対しても明確な選択性があることを示している。
【００９２】
[２７]−酸デンドロン改質サブストレート上のＤＮＡマイクロアレイを前記[９]−酸デンドロンと同様な方法で製造し、ｐ５３腫よう抑制遺伝子のうちの１７５コドンの単一塩基の変異の探知に適用した。Ａ：Ｃ、Ｔ：Ｃ、及びＣ：Ｃの内部の間違えて組合わされた塩基に対するＭＭ／ＰＭの比率は、０．０６６、０．０１、及び０．００５であった（図８ｂ）。このような結果は、[２７]−酸デンドロン改質サブストレート上のＤＮＡマイクロアレイもまた、実際の標的ＤＮＡの単一塩基変異に対して明確な選択性があることを示している。
【００９３】
＜デンドロン改質表面を利用したｐ５３遺伝子の７ホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）変異の探知＞
デンドロン改質サブストレートを使用して癌細胞株にあるｐ５３腫よう抑制遺伝子の単一塩基変異を探知した。７つのホットスポットコドン（１７５、２１５、２１６、２３９、２４８、２７３、及び２８２）を含む標的ＤＮＡサンプル（２００−４００塩基対）をレンドンプライマ−法で腫よう細胞から抽出したＤＮＡから増幅し、固定された７つのホットスポットに相応するキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチド１５〜２５ｍｅｒ）と混成化した（図９ａ及び９ｂ）。その結果、非常に優れたＳＮＰ区別効率を得た。
【００９４】
本発明者は、プローブＤＮＡ間の空間調節（ｍｅｓｏｓｐａｃｉｎｇ）を通じて最高の再現性を有するＤＮＡマイクロアレイを成功的に製作することができ、ＳＮＰ区別効率性は溶液での数値よりはるかに向上することができた。測定された区別効率性は、本発明による方法を遺伝子診断で高い信頼性で利用可能にした。本発明の方法が固定化生分子を利用する多様な生物学的分析に適用することができると予想される。
【００９５】
［調節された気孔を有するガラスビーズ］
親和性クロマトグラフィーで幅広く利用されるクロマトグラフィー担体は、デキストリン及びアガロースのような天然ポリマーである。セファロース６Ｂ、４Ｂ、及び２Ｂは非常に低い非特異的結合率を有する架橋されたアガロースから構成されたクロマトグラフィー用物質である。前記物質が幅広く使用されるにもかかわらず、一般的なビーズ形態のアガロースゲルはいくつかの短所がある。例えば、前記物質の柔らかい性質によって流速（流出速度）が低く、著しく収縮して非可逆的であるため、凍結したり乾燥することができず、いくつかの有機溶媒に弱い（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５、３０５９−３０６５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００２，４１，３４１４−３４２１）。これと比較して、調節された気孔を有するガラス（ＣＰＧ）は、担体として多様な特別な特性を示す：１）機械的安定性、２）固定された３次元構造、つまり環境変化にも膨張したり収縮しない、３）ｐＨ１乃至ｐＨ１４の条件で化学的安定性、４）広い範囲の親核性及び親電子性試薬に対する安定性、５）熱安定性、６）優れた流性（または溶出性）、７）容器表面に対する低い吸着性。追加的に、変型段階以降に洗浄を通して試薬及び副産物を迅速に除去することができる。このような全ての特性により、ゲル透過クロマトグラフィー、固体合成、親和性分離、その他の多様な分野で潜在的な有用性を提供する。
【００９６】
気孔の大きさ：ホスト表面に対するゲスト接近性を利用して、吸着された物質に対するＣＰＧの効果的な気孔性を測定した。最初の接近法として、ゲストに対するＣＰＧ接近性は、ゲストの大きさに比べてホストの相対的な大きさに相関性がある幾何学的因子に依存的である。ゲストが内部表面、吸着、及び相互作用を誘導する気孔より大きい分子の大きさは、調査対象気孔物質の内部表面積よりはるかに小さい外部表面を有する場合にだけ可能である（Ｐｏｓｃｈａｌｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４１５−１３４２６；Ｏｔｔａｖｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．Ｂ．２００３，１０７，２０４６−２０５３）。このような事実を考慮してみれば、ＣＰＧ上のゲストの吸着力及び吸着程度は、下記の因子に依存的であると考えられる：ＣＰＧの気孔の大きさ、ホスト全体の表面積、及びホストの接近可能な表面の化学的組成。本発明において、三つ種類のＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ（２８ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＰＸＰ４７（４１ｋＤａ）、及びＧＳＴ−Ｍｕｎｃ１８断片（９８ｋＤａ））を使用した。分子次元のＧＳＴ−Ｍｕｎｃ１は、融合ＧＳＴ １００ｋＤａ、ＧＳＴ−ＤＲＥＦと類似していなければならない（１４０×４０×９３Å）（Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，３９３０−３９３７；Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ２００１，２１８、１−９）。気孔及び表面積間の均衡に達するために、各具体的蛋白質に合うように担体の気孔性を最適化しなければならない。約５０ｎｍの気孔を有するＣＰＧは、蛋白質に一般に存在する分子サブユニットの複合体を含むものは周知の事実であるため、５０ｎｍのＣＰＧを使用して本研究を行った。同時に、前記蛋白質を使用する限り、より大きい大きさの気孔（３００ｎｍ）を有するＣＰＧは、５０ｎｍ ＣＰＧの効率性を確認した。（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７３，５４，４７−５３；Ｈａｌｌｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９７３，８５，１２９−１３１）。
【００９７】
グルタチオンＣＰＧの変型（サンプルＥ１、Ｅ３、Ａ、ＣＳ、及びＣＬ）：親和性マトリクスで最も重要な関心事は、非特異的結合（またはＮＳＢ）の程度である。これは、親和性分離及び固体合成で非常に独特な問題である。一般に、非特異的結合を抑制するための最も重要な因子は、マトリクスで水素結合供与グループをなくして親水性を高めるものである（Ｓｉｇａｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，３４６４−３４７３；Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ２０００，１６，６９２７−６９３６；Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，８３０３−８３０４；Ｈｏｌｍｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ２００１，１７，２８４１−２８５０；Ｏｓｔｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ２００１，１７，６３３６−６３４３；Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ２００１，１７，１２２５−１２３３；Ｏｓｔｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ２００１，１７，５６０５−５６２０）。たとえ、アミノアルキル基に変型させた場合でも、ＣＰＧ表面は極性であり、部分的に負の電荷を有している（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１，４０３−４５７）。スペーサとしてジエポキシドを使用することによって、マトリクスの親水性及び非特異的結合を最少化することができると報告された（Ｓｕｅｎｅｔａｌ．，Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０００，３９，４７８−４８７；Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．１９７４，９０，８７−９８；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０００，１８，８７７−８８１）。したがって、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（またはＢＵＤＧＥ）に表面を変型して、サンプルＥ１及びＥ３を製造した。ＢＵＤＧＥ使用の重要な特性は、加水分解に対して非常に安定的なエーテル結合を生成し、長いスペーサアーム（ａｒｍ）による向上した柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を有し、ある程度非特異的結合を抑制するということである。前記最後の長所は、ポリエチレングリコールと類似した構造的モチーフで説明される。ジエポキシド（Ｄｉｅｐｏｘｉｄｅ）を使用して分子及び親核性基（例：アミン及びチオール）を有する表面と連結することができる。開環過程で、β−ヒドロキシグループだけでなく、安定した炭素ヘテロ原子間の結合を形成する。デンドロン変型段階前及び後でリンカーを使用することによって、変型されたＧＳＨの柔軟性を保障することができる。変型段階を要約して図１０に概括的に表わした。マトリクス表面にデンドロンを結合させるために、ＥＤＣ及びＮＨＳと呼ばれる一般的な試薬を使用した。デンドロンでサブストレートを変型させた後に、無水酢酸に導入して残っているアミン基を全てキャッピングした。最後に、前記マトリクスを２０％のピペリジンで３０分間処理して、デンドロンのＦｍｏｃグループの追加的な変型を解除（ｄｅｂｌｏｃｋ）した。ＢＵＤＧＥでもう一度延長反応を行った後に、チオール及びエポキシド間の結合を利用して、ＧＳＨを固定した。
対照群として、サンプルＡを製造した。デンドロンがないことを除いては、Ｅ１及びＥ３と実質的に同様な方法で、ＢＵＤＧＥ、１，３−ジアミノプロパン、及びＢＵＤＧＥ提供表面物質に連続的に変型させた。エポキシド及びチオール間の開環反応を使用して、ＧＳＨを固定した。ＧＭＢＳと呼ばれるヘテロバイオ官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーを使用して、また他の対照ビーズ（サンプルＣＬ及びＣＳ）を製造し、ＧＳＨ及びＡＭＣＰＧまたはＬＣＡＡ−ＣＰＧと結合させた。ＡＭＰＣＰＧは、表面にＣ３炭化水素から構成された短いアーム（ａｒｍ）を有し、ＬＣＡＡ−ＣＰＧは、Ｃ１５脂肪族鎖から構成された長いアームを有している。ＧＭＢＳでアミドを形成した後に、ビーズをＧＳＨで処理した。マレイミドグループにチオール基を添加することによって、炭素及び硫黄原子間に共有結合が形成された。前記二段階処理で共有結合を形成すれば、ＧＳＨが結合された、調節された気孔を有するガラスビーズ、つまりＣＳ及びＣＬが得られた。
【００９８】
リガンド密度の測定：固定化されたグルタチオンの量を直接測定することは難しいため、脱保護化段階で放出されるジベンゾフルベンの量を測定して、リガンドの密度を決定する間接的な方法を使用した。デンドロンの頂点に結合された９−フルオロメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基は、酸に安定的であるか、多様な塩基によって簡単に切断される。本実施例では、ＤＭＦのうちの２０％のピペリジンを使用してＦｍｏｃグループを脱保護化した。ピペリジンは、ジベンゾフルベン及び付加物を生成し、前記付加物を３０１ｎｍで吸光する（Фｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．２００３，１０７，３４９６−３４９９）。反面、２０％のピペリジンによる脱保護化段階で得られた溶液の吸光度が３０１ｎｍと現れる時、これは意図した通り脱保護が起きていることを意味する。
このような方法で得られたリガンドの密度は、Ｅ１に対して８．３μ ｍｏｌ／ｇであ
り、Ｅ３に対して５．６μ ｍｏｌ／ｇであった。前記密度は、Ｆｍｏｃ（３）酸で変型した場合に１１．１倍ほど減少し、前記数値はより大きいデンドロンを使用すると１．５倍ほど追加的に減少する。したがって、本発明の具体的な例で、より小さなデンドロンはより大きなデンドロンより高い密度を得るのにより効果的である。
【００９９】
ＧＳＴ結合の分析：精製されたＧＳＴ及び細胞溶解物を使用して、サンプルＡ、Ｅ１、及びＥ３の結合特性を分析した（図１１でレーン２、３、及び４）。レーン１は、成功的に溶解物を製造したことを示す。三つのマトリクスが精製されたＧＳＴに効果的に結合することが明白である。細胞溶解物をビーズに導入した場合に（レーン５、６、及び７）、Ａ及びＥ１またはＥ３サンプル間に相当な差が観察された。サンプルＡの場合、ＢＵＤＧＥリンカーを導入したにもかかわらず、深刻な非特異的結合が観察された。さらに、マトリクスにデンドロンを導入した場合に、非特異的蛋白質結合が効果的に抑制された。１世代デンドロン及び２世代デンドロンのうちの一つの自己組立てによって固体担体に対する非特異的結合が効果的に抑制されたことは、注目に値する。デンドロン及びＧＳＨ間の延長されたスペーサは、結合されたトリペプチドの活性を維持した。
図１２で、本発明の一例において、エーテル及びアミドグループが構造の主要骨格を形成し、デンドロンの固定によって再びアミド結合が生成される。また、デンドロンの広い範囲も成功した重要な因子である。
Ｅ１のリガンドの密度はＥ３より１．４８倍高い。言い換えれば、Ｅ１は１４８％のリガンド濃度を記録した（表３）。２種類のビーズの結合効率性を試験するために、各サンプルごとに同じ数のＧＳＨを有するようにサンプル質量を調節した。密度測定器によれば、２種類の場合のリガンドの利用度は非常に近接した（２９％、３１％）。Ｅ３のより広い空間化は、ＧＳＴの結合効率性を向上させることができず、これは、恐らく実験対象蛋白質がＥ１及びＥ３の空間化より大きかったためであろう。
【表３】
2010151828.tif 000007
【０１００】
対照実験：ＧＳＨ密度はＣＳに対して１４．５μ ｍｏｌ／ｇ、ＣＬに対して１１．９μ ｍｏｌ／ｇであった。ＧＳＴの特異的結合の観点でビーズの効率性を比較するために、ＣＳ（５．７ｍｇ）及びＣＬ（７．０ｍｇ）のビーズで捕獲された蛋白質をＥ１（１０．０ｍｇ）及びＥ３（１４．８ｍｇ）のビーズからのサンプルと共に分析した。おおよそ、ＧＳＨも同一な数に利用度を調節した。ＣＳ及びＣＬのビーズは低い結合能を現わすだけでなく、好ましくない選択度を現わすことがクロマトグラフィーに明確に示されている（図１３）。このような結果は、固定化ＧＳＴに対するＧＳＴの接近性の向上だけでなく、非特異的結合の効果的な抑制を保障するために、デンドロンの重要性を強調的に示すものである。
【０１０１】
分子量依存性：デンドロン変型により固定化されたリガンド間に空間が調節された表面を提供するため、多様な分子量を有する蛋白質に対する結合能が複合する。特に、２世代デンドロンを使用する場合、２４Å以上の空間を保障することができることが知られている（Ｃａｒｄｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，４０２３−４０２４）。具体的な実験として、ＧＳＴ蛋白質（２８ ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＰＸｐ４７（４１ ｋＤａ）、及び野生溶解物から得られたＧＳＴ−ｍｕｎｃ−１８断片（９８ ｋＤａ）を製造した。図１４に示したように、ビーズの結合能（Ｅ１、Ｅ３、及びセファロース４Ｂ）は、蛋白質の分子量が増加するほど急激に減少する。前記減少程度は三つの場合で全て同一である。興味深いのは、三つの異なる場合において、減少の程度が同一だということである。Ｅ１に対する結合能をＧＳＴに対して１００％に合わせた場合に、ＧＳＴ−ｍｕｎｃ１８に対してＧＳＴ−ＰＸｐ４７は相対的結合能が９２％及び２２％であった。Ｅ３ビーズに対してＧＳＴは８５％であり、ＧＳＴ−ｍｕｎｃ１８は２３％だった。これは、蛋白質の分子量に対する依存性を、グルタチオンセファロース４Ｂでも観測したことを示す。グルタチオンセファロース４Ｂ対してＧＳＴ−ＰＸｐ４７の結合能は１０４％であり、ＧＳＴ−ｍｕｎｃ１８は１７％であった。唯一の差異点は、市販されるマトリクスに対して、ＧＳＴ及びＧＳＴ−ＰＸｐ４７は一定の結合能を示すことである。前記差異点は、セファロース４Ｂの不均一な間隔を反映するものでありうる。これら物質から、ＧＳＨ間に多様な間隔が存在し、その結果、マトリクスは融合ＧＳＴに天然ＧＳＴ程度に結合することができる。はるかに大きい蛋白質、ＧＳＴ−ｍｕｎｃ１８に対して、間隔はより小さくするべきである。このような点から、デンドロンで処理したビーズの結合能が一定に減少することは、表面上のＧＳＨの一定の間隔を裏付ける。
要約すれば、デンドロン改質マトリクスは、市販されるマトリクス（例：セファロース４Ｂ）程度の高い敏感度を示し、市販製品とほぼ同一な程度の分子量依存性を示す。ＡＭＰＣＰＧマトリクスにデンドロンを導入することによって、非特異的結合を効果的に減少させるだけでなく、ＧＳＨの結合力を維持する。蛋白質分子量の増加に比例して、結合力が一定に減少することを観察し、このような現象は、固定化されたＧＳＨ間の規則的な間隔と一致すると考えられる。間隔の調節が容易であるだけでなく、機械的安定性、多様な化学的環境との広い両立性、及び予想される多様な応用が容易であるなど、多様な利点がある。
【０１０２】
本発明の保護範囲は、本明細書に記載された具体的な例に限定されず、本明細書に記載された具体的な例以外にも、多様な変更が本発明の詳細な説明及び添付した図面によって本技術分野の専門家には明白であろう。そのような変更も、また、本発明の請求範囲の保護範囲内に属する。以下の実施例は、本発明を例示するためのもので、制約的な意図ではない。
【実施例】
【０１０３】
下記の実施例で、化合物の番号体系（Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）は、化合物１、化合物２、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖなどのように命名された。しかし、化合物の番号体系は、引用される特定の実施例で限定されて一貫して使用される意図である。例えば、実施例２で再び引用された化合物１は、必ずしも実施例３での化合物１と同一である必要はない。
【０１０４】
［実施例１：大きさが調節された巨大分子（Ｓｉｚｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｍａｃｒ
ｏｎｏｌｅｃｕｌｅ）を使用したマイクロアレイ製造方法］
実施例１で、図２に示したように、名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎｓ）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶは、図２に示した多様な化合物及び中間体化合物を指すものである。
【０１０５】
＜実施例１．１：材料＞
シランカップリング剤である（３−グリシトキシプロピル）メチルジエトキシラン（ＧＰＤＥＳ）及び（３−アミノプロピル）ジエトキシメチルシラン（ＡＰＤＥＳ）は、ゲレスト社（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．）から購入し、他の化合物は、シグマ−アルドリッチ社から試薬級で購入した。シリル化（ｓｉｌｙｌａｔｉｏｎ）用反応溶媒は、アルドリッチ社から購入した無水物である（Ｓｕｒｅ／Ｓｅａｌ ｂｏｔｔｌｅｓ）。サブストレートに対する全ての洗浄溶媒は、マリンクロッド試薬製造会社（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からＨＰＬＣ級で購入した。ＵＶ級ヒュームドシリカプレート（３０ｍｍ×１０ｍｍ×１．５ｍｍ）は、ＣＶＩレーザー有限会社（ＣＶＩ Ｌａｓｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から購入した。研磨された１級Ｓｉウエハー（１００）（ｄｏｐａｎｔ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ；ｒｅｓｉｓｔｉｖｉｔｙ、１．５−２．１Ω．ｃｍ）は、ＭＥＭＣ電子材料会社（ＭＥＭＣ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ）から購入した。ガラススライド（２．５×７．５ｃｍ）は、コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、全てメタバイオン（Ｍｅｔａｂｉｏｎ）から購入した。超純水（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）（１８ＭΩ．ｃｍ）は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から得た。
【０１０６】
＜実施例１．２：装置＞
フィルムの厚さは、エリプソメータ（ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｅｒ）分光器（Ｊ．Ａ．Ｗｏｏｌｌａｍ Ｃｏ．Ｍｏｄｅｌ Ｍ−４４）で測定した。ＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、ヒューレットパッカード社の分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ｄｉｏｄｅａｒｒａｙ ８４５３ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定した。タッピングモードＡＦＭ実験（Ｔａｐｐｉｎｇ ｍｏｄｅ ＡＦＭ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）は、‘Ｅ’類型スキャナーを有するナノスコープＩＩＩａ ＡＦＭ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）装備を使用して行った。
【０１０７】
＜実施例１．３：サブストレートの清浄化＞
シリコンウエハー、ヒュームドシリカ、ガラススライドのようなサブストレートはピラニア溶液（Ｐｉｒａｎｈａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、濃度Ｈ２ＳＯ４：３０％ Ｈ２Ｏ２＝７：３（ｖ／ｖ））に浸して、前記溶液及びサブストレートを含む反応容器を１時間超音波処理した（注意事項：ピラニア溶液は爆発性の有機物質を酸化させることがある。したがって、酸化性物質の接触は避ける）。超音波処理した後、過量の脱イオン水を使用してプレートを洗浄してすすいだ。洗浄されたサブストレートは、次の段階のために３０−４０ｍＴｏｒｒの真空チャンバで乾燥した。
【０１０８】
＜実施例１．４：ヒドロキシル化サブストレートの製造＞
前記洗浄されたサブストレートは、１．０ｍｌの３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン（ＧＰＤＥＳ）が溶解した１６０ｍｌのトルエン溶液に１０時間浸漬した。自己組立て（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）反応を行った後、サブストレートをトルエンで簡単に洗浄してから、オーブンに入れて１１０℃で３０分間加熱した。プレートは、トルエン、トルエン−メタノール（１：１（ｖ／ｖ））、及びメタノールで順次に各洗浄段階で３分間超音波処理した。前記洗浄されたプレートは、真空チャンバ（３０−４０ｍＴｏｒｒ）で乾燥した。ＧＰＤＥＳ改質されたサブストレートは、９５％の硫酸を２−３滴添加した純粋なエチレングリコール（ＥＧ）溶液に８０乃至１００℃で８時間浸漬した。冷却した後、前記サブストレートは、エタノール及びメタノールで順次に各々３分間超音波処理した。洗浄されたサブストレートは真空チャンバ（３０−４０ｍＴｏｒｒ）で乾燥した。
【０１０９】
＜実施例１．５：デンドロン改質サブストレートの製造＞
前記水酸化されたサブストレートは、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．８２ｍＭ）存在下でデンドロン（１．２ｍＭ）及びカップリング剤である１−[−３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）または１，３−ジサイクルロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１１ｍＭ）を溶解したメチレンクロライド溶液に浸した。室温で３日後、前記プレートをメタノール、水、及びメタノールで順次に各々３分間超音波処理した。次の段階のために、前記洗浄されたプレートは真空チャンバ（３０−４０ｍＴｏｒｒ）で乾燥した。
【０１１０】
＜実施例１．６：ＮＨＳ改質サブストレートの製造＞
前記デンドロン改質サブストレートは、１．０Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が含まれているメチレンクロライド溶液に浸した。３時間後、２０％（ｖ／ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）が含まれているメチレンクロライド溶液に１０分間の浸漬した。前記プレートは、メチレンクロライド及びメタノールで各々３分間超音波処理した。その後、真空チャンバで乾燥して、非保護されたサブストレートをジ（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（ＤＳＣ）（２５ｍＭ）及びＤＩＰＥＡ（１．０ｍＭ）が含まれているアセトニトリル溶液で反応させた。窒素雰囲気下で４時間反応させた後、前記プレートをジメチルホルムアミド溶液で３０分間定置して、メタノールで簡単に洗浄した。洗浄されたプレートは、次の段階のために、真空チャンバ（３０−４０ｍＴｏｒｒ）で乾燥した。
【０１１１】
＜実施例１．７：ＮＨＳ改質サブストレート上にオリゴヌクレオチドを配列＞
５０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝溶液（ｐＨ８．５）に溶解されたプローブオリゴヌクレオチドは、ＮＨＳ改質サブストレート上に４フォーマットによって４つに並べてスポットした。アミン化されたＤＮＡ（ｔｈｅ ａｍｉｎｅ−ｔｅｔｈｅｒｅｄ ＤＮＡ）に十分な反応時間を保障するために、マイクロアレイは、湿度チャンバ（８０％湿度）で１２時間反応させた。スライドは、混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）緩衝溶液（７．０ｍＭのソジウムドデシルスルフェートを含む２×ＳＳＰＥ緩衝溶液（ｐＨ７．４））で３７℃で１時間攪拌した後、５分間沸騰した水に攪拌して、非特異的に結合されたオリゴヌクレオチドを除去した。最終的に、ＤＮＡ官能基化（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）マイクロアレイは、次の段階のために、窒素雰囲気下で乾燥した。完全な比較のために、多様な種類のプローブを前記単一プレートにスポットした。
【０１１２】
＜実施例１．８：混成化＞
混成化は、ＧｅｎｅＴＡＣＴＭ ＨｙｂＳｔａｔｉｏｎ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を利用して、Ｃｙ３蛍光染料を使用した標的オリゴヌクレオチド（１．０ｎＭ）標識化を含む混成化緩衝溶液で５０℃で１時間行った。マイクロアレイは、混成化緩衝溶液を使用してすすいで標的オリゴヌクレオチドを除去した後、窒素を使用して乾燥させた。各スポット上の蛍光信号はＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）を利用して測定し、Ｉｍａｇｅｎｅ４．０（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で結果を分析した。
【０１１３】
＜実施例１．９：デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）の合成＞
≪実施例１．９．１：９−アントリルメチルＮ−（３−カルボキシルプロピル）カバーメイト（Ｉ）（化合物Ｉ）の製造≫
４−アミノブチリクサン（０．５０ｇ、４．８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑｕｉｖ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）（１．０ｍｌ、７．３ｍｍｏｌ、１．５ｅｑｕｉｖ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解して、５０℃で攪拌した。前記溶液に９−アントリルメチルｐ−ニトロフェニルカーボネート（１．８１ｇ、４．８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑｕｉｖ）を攪拌しながら徐々に添加した。５０℃で２時間攪拌した後、溶液を蒸発させて乾燥させて、０．５０Ｎの水酸化ナトリウム溶液（ＮａＯＨ）で塩基化させた。水溶液は、酢酸エチル（ＥＡ）で洗浄して、氷槽で攪拌した後、希薄な塩酸（ＨＣＩ）で酸性化させた。生成物はＥＡで抽出し、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させてろ過してから、溶媒を蒸発させた。最終の黄色粉末の総量は１．０６ｇであり、収率は６５％であった。
1H NMR(CDCl3)
δ 11.00-9.00(br, CH2COOH, 1 H), 8.41 (s, C14H9CH2, 1 H), 8.31 (d, C14H9CH2, 2H), 7.97 (d, C14H9CH2, 2H), 7.51 (t, C14H9CH2, 2H), 7.46(t, C14H9CH2, 2H), 6.08(s, C14H9CH2O, 2H), 5.01 (t, OCONHCH2,1 H), 3.23(q, NHCH2CH2, 2H), 2.34(t, CH2CH2COOH, 2H), 1.77(m, CH2CH2CH2, 2H). 
13C NMR(CDCl3) 
δ 178.5(CH2COOH), 157.9(OCONH), 132.1 (C14H9CH2), 131.7(C14H9CH2), 129.7(C14H9CH2), 129.7(C14H9CH2), 127.3(C14H9CH2), 126.8(C14H9CH2), 125.8( C14H9CH2), 124.6( C14H9CH2), 60.2(C14H9CH2), 41.0(NHCH2CH2), 31.7(CH2CH2COOH),25.6(CH2CH2CH2).
【０１１４】
≪実施例１．９．２：９−アントリルメチルＮ−{[（トリス{[２−（メトキシカルボニル）エトキシ]メチル}メチル）アミノ]カルボニル}プロピルカーボネート（ＩＩ）（化合物ＩＩ）の製造≫
９−アントリルメチルＮ−（３−カルボキシルプロピル）カバーメイト（０．６５ｇ、１．９３ｍｍｏｌ、１．５ｅｑｕｉｖ）、１−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカーボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）（０．３７ｇ、１．９３ｍｍｏｌ、１．５ｅｑｕｉｖ）、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート（ＨＯＢＴ）（０．２６１ｇ、１．９３ｍｍｏｌ、１．５ｅｑｕｉｖ）をアセトニトリルに溶解して、室温で攪拌した。アセトニトリルに溶解されたトリス{[（メトキシカルボニル）エトキシ]メチル}アミノメタン（０．４９ｇ、１．２９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑｕｉｖ）を攪拌しながら前記溶液に添加した。室温で１２時間攪拌した後、アセトニトリルを蒸発させた。粗生成物（ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）はＥＡに溶解して、１．０ＮのＨＣｌ及び飽和ソジウムバイカーボネート溶液で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４で乾燥させてろ過した後、溶媒を蒸発させ、粗生成物をシリカゲルが充填されたコラムにローディングして、コラムクロマトグラフィー（展開溶媒：エチルアセテート：ヘキサン＝５：１（ｖ／ｖ））で精製して、粘性の黄色液体を得た。黄色液体の総量は０．６７ｇであった（収率７４％）。
1H NMR(CDCl3) 
δ 8.43(s, C14H9CH2, 1 H), 8.36(d, C14H9CH2, 2H), 7.99 (d, C14H9CH2, 2H), 7.53(t, C14H9CH2, 2H), 7.47(t, C14H9CH2, 2H), 6.15(s, CONHC, 1H), 6.08(s, C14H9CH2O,2H), 5.44(t, OCONHCH2,1 H), 3.63-3.55(m, CH2OCH2CH2COOCH3, 21 H), 3.27(q, NHCH2CH2, 2H), 2.46(t, CH2CH2COOCH3, 6H), 2.46(t, CH2CH2CONH, 2H), 1.81 (m, CH2CH2CH2, 2H). 
13C NMR(CDCl3) 
δ173.2(CH2CONH), 172.7(CH2COOCH3), 157.4(OCONH), 132.9(C14H9CH2), 
131.5(C14H9CH2), 129.5(C14H9CH2), 129.4(C14H9CH2}, 127.5(C14H9CH2), 127.0(C14H9CH2), 125.6(C14H9CH2), 124.7(C14H9CH2), 69.6(NHCCH2O), 67.2(C14H9CH2), 60.1 (OCH2CH2), 59.4(NHCCH2), 52.1(OCH3), 40.8(NHCH2CH2), 35.1 (OCH2CH2), 34.7(CH2CH2CONH), 26.3(CH2CH2CH2).
Anal. Calcd for C36H46N2O12.0.5 H2O: C 61.18, H 6.65, N 4.03; Found: C61.09, H 6.69, N 3.96. 
【０１１５】
≪実施例１．９．３：９−アントロメチルＮ−[（{トリス[（２−カルボキシエトキシ）メチル]メチル}アミノ）カルボニル]プロピルカバーメイト（ＩＩＩ）（化合物ＩＩＩ）の製造≫
９−アントリルメチルＮ−{[（トリス{[２−（メトキシカルボニル）エトキシ]メチル}メチル）アミノ]カルボニル}プロピルカーボネート（０．６７ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）をアセトン（３０ｍｌ）及び０．２０ ＮＮａＯＨ（３０ｍｌ、６ｍｍｏｌ）に溶解した。
室温で１日攪拌した後に、アセトンを蒸発させた。得られた水溶液はＥＡを使用して洗浄して、氷槽で攪拌しながら希薄な塩酸で酸性化させた。生成物はＥＡを使用して抽出し、有機溶液は無水ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過した後、溶媒を蒸発させた。生成物は−２０℃でアセトン及びエーテルで固体化して、黄色粉末を得た。得られた薄い黄色粉末の最終量は０．５４ｇであった（収率８８％）。
1H NMR(CDCl3) 
δ 11.00-9.00(br, CH2COOH, 3H}, 8.61(s, C14H9CH2, 1H}, 8.47(d, C14H9CH2, 2H), 8.11 (d, C14H9CH2, 2H), 7.60(t, C14H9CH2, 2H}, 7.52(t, C14H9CH2, 2H), 6.63(s, CONHC, 1 H), 6.36(t, OCONHCH2, 1 H), 6.12(s, C14H9CH2O, 2H). 3.40-363(m, CH2OCH2CH2COOH, 12H), 3.20(q, NHCH2CH2, 2H), 2.52(t, CH2CH2COOH, 6H), 2.17(t, CH2CH2CONH,2H), 1.75(m, CH2CH2CH2, 2H). 
13C NMR(CDCl3) 
δ 172.2(CH2COOH), 172.0(CH2CONH), 156.7(OCONH), 131.2(C14H9CH2), 130.7(C14H9CH2), 128.6(C14H9CH2), 128.4(C14H9CH2), 127.3(C14H9CH2), 126.2(C14H9CH2), 124.8(C14H9CH2), 124.0(C14H9CH2), 68.6(NHCCH2O), 66.5(C14H9CH2), 59.5(OCH2CH2), 58.0(NHCCH2), 40.0(NHCH2CH2), 34.0(OCH2CH2), 33.5(CH2CH2CONH), 25.8(CH2CH2CH2).
Anal. Calcd for C33H40N2O12.1.5 H2O: C 57.97, H 6.34, N 4.10; Found: C 57.89,H 6.21, N 4.09. 
【０１１６】
≪実施例１．９．４：９−アントリルメチルＮ−[（{トリス[（２−{[（トリス{[２−（メトキシカルボニル）エトキシ]メチル}（メチル）アミノ）カルボニル]エトキシ}メチル）メチル]アミノ}カルボニル）プロピルカバーメイト（ＩＶ）（化合物ＩＶ）の製造 ≫
９−アントリルメチルＮ−[（{トリス[（２−カルボキシエトキシ）メチル]メチル}アミノ）カルボニル]プロピルカバーメイト（０．５４ｇ、０．８２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑｕｉｖ）、ＥＤＣ（０．５５ｇ、２．８７ｍｍｏｌ、３．５ｅｑｕｉｖ）、及びＨＯＢＴ（０．３９ｇ、２．８９ｍｍｏｌ、３．５ｅｑｕｉｖ）をアセトニトリルに溶解して、室温で攪拌した。その後、アセトニトリルに溶解したトリス{[（メトキシカルボニル）エトキシ]メチル}アミノメタン（０．９６ｇ、２．５３ｍｍｏｌ、３．１ｅｑｕｉｖ）を攪拌しながら前記溶液に添加した。室温で３６時間攪拌した後、アセトニトリルを蒸発させた。前記粗生成物をＥＡに溶解して、１．０ＮのＨＣＬで洗浄して、重炭酸ナトリウム溶液で飽和させた。無水ＭｇＳＯ４で乾燥、ろ過、及び蒸発させた後に、前記粗生成物をシリカゲルが充填されたコラムにローディングした。コラムを利用して精製（展開溶媒：酢酸エチル：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ））した結果、粘性の黄色液体が得られた。前記黄色液体の総重量は１．２６ｇであった（８８％収率）。
1H NMR(CDCl3) 
δ 8.47(s, C14H9CH2, 1 H), 8.39(d, C14H9CH2, 2H), 8.02 (d, C14H9CH2, 2H), 7.53(t, C14H9CH2, 2H), 7.47(t, C14H9CH2, 2H), 6.60(s, CH2CH2CH2CONHC, 1 H), 6.13(s, OCH2CH2CONHC, 3H), 6.11 (s, C14H9CH2O, 2H), 5.79(t, OCONHCH2,1 H), 3.65-3.60(m, CH2OCH2CH2CONH, CH2OCH2CH2COOCH3, 75H), 3.29(q, NHCH2CH2, 2H), 2.50(t, CH2CH2COOCH3, 18H), 2.36(t, OCH2CH2CONH, 6H), 2.27(t, CH2CH2CH2CONH, 2H), 1.85(m, CH2CH2CH2, 2H). 
13C NMR(CDCl3) 
δ 173.3(OCH2CH2CONH), 172.5(CH2CH2CH2CONH), 171.6(CH2COOCH3), 157.2(OCONH), 131.8(C14H9CH2), 131.5(C14H9CH2), 129.4(C14H9CH2), 129.3(C14H9CH2), 127 .6(C14H9CH2), 127.0(C14H9CH2), 125.6(C14H9CH2), 124.7(C14H9CH2), 69.5(NHCCH2OCH2CH2COOCH3), 67.9(NHCCH2OCH2CH2CONH), 67.2(C14H9CH2), 60.3(OCH2CH2CONH), 60.2(OCH2CH2COOCH3), 59.2(NHCCH2OCH2CH2COOCH3, NHCCH2OCH2CH2CONH), 52.1(OCH3), 41.0(NHCH2CH2), 37.6(OCH2CH2CONH), 35.1(OCH2CH2COOCH3), 34.7(CH2CH2CH2CONH), 26.3(CH2CH2CH2). 
Anal. Calcd for C81H121N5O36.H2O: C 55.31, H 7.05, N 3.98; Found: C 55.05, H 7.08, N 4.04. 
MALDI- TOF-MS: 1763.2 (MNa+), 1779.2 (MK+). 
【０１１７】
≪実施例１．９．５：９−アントリルメチルＮ−（{[トリス（{２−[（{トリス[（２−カルボキシエトキシ）メチル]メチル}アミノ）カルボニル]エトキシ}メチル）メチル]アミノ}カルボニル）プロピルカバーメイト（Ｖ）（化合物Ｖ）の製造≫
９−アントリルメチルＮ−[（{トリス[（２−{[（トリス{[２−（ｍエトキシカルボニル）エトキシ]メチル}メチル）アミノ]カルボニル}エトキシ）メチル]メチル}アミノ）カルボニル]プロピルカバーメイト（０．６０ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）をアセトン（３０ｍｌ）及び０．２０ＮのＮａＯＨ（３０ｍｌ）に溶解した。室温で１日攪拌した後、アセトンを蒸発させた。得られた水溶液はＥＡを使用して洗浄して、氷槽で攪拌しながら希薄な塩酸で酸性化させた。生成物はＥＡを使用して抽出し、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過した後、溶媒を蒸発させた。得られた黄色粉末の最終量は０．３７ｇであった（収率６８％）。
1H NMR(DMSO) 
δ 13.00-11.00(br, CH2COOH, 9H), 8.66(s, C14H9CH2, 1 H), 8.42(d, C14H9CH2, 2H), 8.13 (d, C14H9CH2, 2H), 7.62(t, C14H9CH2, 2H), 7.54(t, C14H9CH2, 2H), 7.12(t, OCONHCH2, 1H), 7.10(s, OCH2CH2CONHC, 3H), 7.06(s, CH2CH2CH2CONHC, 1 H), 6.06(s, C14H9CH2O, 2H), 3.57-3.55(m, CH2OCH2CH2CONH, CH2OCH2CH2COOH,48H), 3.02(q, NHCH2CH2, 2H), 2.42(t, CH2CH2COOH, 18H), 2.32(t, OCH2CH2CONH, 6H), 2.11(t, CH2CH2CH2CONH, 2H), 1.60(m, CH2CH2CH2, 2H).   13C NMR(DMSO) 
δ 172.8(CH2COOH), 172.2(CH2CH2CH2CONH), 170.5(OCH2CH2CONH), 156.5(OCONH), 131.0(C14H9CH2), 130.6(C14H9CH2), 129.0(C14H9CH2), 128.7(C14H9CH2), 127.6(C14H9CH2), 126.7(C14H9CH2), 125.4(C14H9CH2), 124.3(C14H9CH2), 68.3(NHCCH2OCH2CH2COOH), 67.4(NHCCH2OCH2CH2CONH), 66.8(C14H9CH2), 59.8(OCH2CH2COOH), 59.6(OCH2CH2CONH), 57.9(NHCCH2OCH2CH2CONH), 55.9(NHCCH2OCH2CH2COOH), 36.4(NHCH2CH2), 34.6(OCH2CH2COOH), 30.8(OCH2CH2CONH), 29.7(CH2CH2CH2CONH), 25.9(CH2CH2CH2).
【０１１８】
[実施例２：代替出発物質であるデンドロン巨大分子の製造方法（Ｆｍｏｃ−Ｓｐａｃｅｒ−[９]−酸）]
実施例２で、多様な名称の化合物は、化合物１、２などと命名した。まず、スペーサである６−アジドヘクシルアミン（１）は、１，６−ジブロモヘキサンから下記に示す文献の方法（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗ．；Ｊｕｎ，Ｓ．Ｉ．；Ｋｉｍ，Ｋ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２００１，４２，２７０９）によって合成した。
【化２】
2010151828.tif 000008
【０１１９】
前記スペーサは、下記に示すように、非対称ウレア形成（ｕｎｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｕｒｅａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及び製作されたＮ３−スペーサ−[３]エステル（３）を通じて反復単位を添付した。前記反復単位は、ｔｅｒｔ−ブチルアクリレートを使用したトリスの縮合で合成した（ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ Ｃａｒｄｏｎａ，Ｃ．Ｍ．；Ｇａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｅ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，１４１）。
【化３】
2010151828.tif 000009
【０１２０】
前記トリエステルは、ペプチドカップリング条件下で加水分解及びトリエステル（２）に組合わせることを通じて、Ｎ３−スペーサ−[３]酸（４）に形質転換させた。アジドのアミン基への還元反応、及びＦｍｏｃ基を有するアミンの保護反応後に、ノナエステル（ｎｏｎａ ｅｓｔｅｒ）の加水分解はＦｍｏｃ−ｓｐａｃｅｒ−[９]酸（５）を提供した。Ｆｍｏｃ−ｓｐａｃｅｒ−[９]酸（５）の構造を下記に示す。
【化４】
2010151828.tif 000010
【０１２１】
＜Ｎ−（６−アジドヘキシル）−Ｎ−トリス{[２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ]メチル}−メチルウレア（３）＞
トリホスジン（Ｔｒｉｐｈｏｓｇｅｎｅ）（１．３ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解した。無水ＣＨ２Ｃｌ２（３５ｍＬ）に溶解された６−アジドヘキシルアミン（１）（１．６ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２．４ｍＬ、１３．８ｍｍｏｌ）の混合物をシリンジポンプを利用して７時間以上の周期で前記撹拌されたトリホスジン溶液に滴下して添加した。２時間さらに攪拌した後、無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解された前記化合物（２）（６．４ｇ、１３ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２．７ｍＬ、１５．２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物は窒素雰囲気下で室温で４時間攪拌して、０．５ＭのＨＣｌ及び塩を使用して洗浄した。有機層は無水ＭｇＳＯ４で乾燥した後、溶媒は蒸発させて除去した。コラムクロマトグラフィーを使用した精製（ｓｉｌｉｃａ，１：１ ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ）で、無色オイルを得た（３．０ｇ、４０％）。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ1.45 (s, (CH3)3C, 27H); 1.36-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2,8H); 2.46 (t, CH2CH2O, J = 6.4 Hz, 6H), 3.13 (m, CONHCH2, 2H), 3.26 (t, N3CH2, J = 6.9 Hz, 2H), 3.64-3.76 (m, CCH2O and CH2CH2O, 12H); 5.00 (t, CH2NHCO, J=6.7 Hz, 1H), 5.29 (s, CONHC, 1H). 
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 26.52, 26.54, 28.81, 30.26 (CH2CH2CH2CH2); 28.14((CH3)3C); 36.20 (CH2CH2O); 39.86 (CONHCH2); 51.40 (N3CH2); 58.81 (CCH2O); 67.16 (CH2CH2O); 69.23 (CCH2O); 80.58 ((CH3)3C); 157.96 (NHCONH); 171.26 (COOt-Bu). 
FAB-MS: 674.26 (M+).
【０１２２】
＜Ｎ−（６−アジドヘキシル）−Ｎ−トリス{[２−カルボキシエトキシ]メチル}メチルウレア（４）＞
Ｎ３−スペーサ−[３]エステル（３）（０．３６ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を２４時間６．６ｍＬの９６％ホルム酸で攪拌した。ホルム酸は、５０℃で減圧によって除去して、定量的な（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）収率で無色オイルを製造した。
1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz): δ 1.34-1.60 (m, CH2CH2CH2CH2, 8H); 2.53 (t, CH2CH2O, J = 6.4 Hz, 6H), 3.07 (t, CONHCH2, J = 6.9 Hz, 2H), 3.32 (t, N3CH2, J = 6.9 Hz, 2H), 3.67-3.73 (m, CCH2O and CH2CH2O, 12H). 
13C NMR (CD3COCD3, 75 MHz): δ 27.21, 29.54, 31.02 (CH2CH2CH2CH2); 35.42 (CH2CH2O); 40.27 (CONHCH2); 52.00 (N3CH2); 59.74 (CCH2O); 67.85 (CH2CH2O); 70.96 (CCH2O); 158.96 (NHCONH); 173.42 (COOH). 
FAB-MS: 506.19 (MH+).
【０１２３】
＜Ｎ−（６−アジドヘキシル）−Ｎ´−トリス[（２−{[（トリス{[２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ]−メチル}メチル）アミノ]カルボニル}エトキシ）メチル]メチルウレア（４．１）＞
ＨＯＢｔ（０．２０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．３０ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣ（０．３３ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル５．０ｍＬに溶解した前記化合物（４）（０．２５ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）に添加した。その後、乾燥アセトニトリル２．５ｍＬに溶解したアミン（２）（１．１４ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を４８時間Ｎ２下で攪拌した。溶媒を減圧で除去した後、残余物をＭＣに溶解して、０．５ＭのＨＣｌ及び塩で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を真空で除去して、コラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２：１ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘａｎｅ）で精製して、無色オイルを得た（０．６７ｇ、７０％）。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ1.45 (s, (CH3)3C, 81H); 1.36-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2,8H); 2.40-2.47 (m, CH2CH2O gen. 1 & 2, 24H), 3.13 (m, CONHCH2, 2H), 3.26 (t, N3CH2, 6.9 Hz, 2H), 3.62-3.69 (m, CCH2O gen. 1 & 2, CH2CH2O gen. 1 & 2, 48H); 5.36(t, CH2NHCO, J=6.7 Hz, 1H), 5.68 (br, CONHC, 1H), 6.28 (br, amide NH, 3H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 26.59, 26.69, 28.91, 30.54 (CH2CH2CH2CH2); 28.22 ((CH3)3C); 36.20 (CH2CH2O gen. 2); 37.43 (CH2CH2O gen. 1); 39.81 (CONHCH2); 51.47(N3CH2); 58.93 (CCH2O gen. 1); 59.89 (CCH2O gen. 2); 67.15 (CH2CH2O gen. 2); 67.68 (CH2CH2O gen. 1); 69.23 (CCH2O gen. 2); 70.12 (CCH2O gen. 1); 80.57 ((CH3)3C); 158.25 (NHCONH); 171.01 (COOt-Bu) 171.41 (CONH amides). 
MALDI-MS: 1989.8 (MNa+), 2005.8 (MK+).
【０１２４】
＜Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ´−トリス[（２−{[（トリス{[２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ]−メチル}メチル）アミノ]カルボニル}エトキシ）メチル]メチルウレア（４．２）＞
エタノール（２０．０ｍＬ）に溶解されたノナ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４．１）（０．３７ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を１０％Ｐｄ／Ｃ（３７．０ｍｇ）と共にＨ２下で室温で１２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、混合物を０．２ｍｍのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターでろ過した。ろ過紙をＣＨ２Ｃｌ２ですすいだ後、混合された溶媒を真空で除去して、無色オイルを得た。
【０１２５】
＜Ｎ−{６−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノヘキシル}−Ｎ´−トリス[（２−{[（トリス{[２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ]メチル}メチル）アミノ]カルボニル}エトキシ）メチル]メチルウレア（４．３）＞
アミン（４．２）（０．３３ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（３３ｍＬ、０．１９ｍｍｏｌ）を５．０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解して、窒素雰囲気下で３０分間攪拌した。２．０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した９−フルオレニルメチルクロロホメイト（４８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去して、０．５ＭのＨＣｌ及び塩で洗浄した（０．１８ｇ、６４％）。残余物をコラムクロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ、ＥｔＯＡｃ）で精製して、無色オイルを得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.45(s, (CH3)3C, 81H); 1.23-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2,8H); 2.37-2.47 (m, CH2CH2O gen. 1 & 2, 24H); 3.10-3.22 (m, CONHCH2, 4H); 3.62- 3.70 (m, CCH2O gen. 1 & 2, CH2CH2O gen. 1 & 2, 48H); 4.22 (t, CH(fluorenyl)-CH2,J=7.1 Hz, 1H); 4.36 (d, fluorenyl-CH2, J=7.1 Hz, 2H); 5.27-5.35 (m, CH2NHCO, 2H); 5.67 (br, CONHC, 1H); 6.25 (br, amide, 3H); 7.28 -7.77 (fluorenyl, 8H). 
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 26.85, 27.02, 30.27, 30.88 (CH2CH2CH2CH2); 28.49 ((CH3)3C); 36.48 (CH2CH2O gen. 2); 37.73 (CH2CH2O gen. 1); 40.03, 41.34 (CONHCH2); 47.68 (CH(fluorenyl)-CH2); 59.22 (CCH2O gen. 1); 60.16 (CCH2O gen. 2); 66.87 (fluorenyl-CH2); 67.43 (CH2CH2O gen. 2); 67.98 (CH2CH2O gen. 1); 69.52 (CCH2O gen. 2); 70.42 (CCH2O gen.1); 80.84 ((CH3)3C); 120.28, 125.52, 127.38, 127.98, 141.65, 144.48 (fluorenyl); 156.88 (OCONH); 158.52 (NHCONH); 171.27 (COOt-Bu) 171.65(amide CONH). 
MALDI-MS : 2186.8 (MNa+), 2002.8 (MK+).
【０１２６】
＜Ｎ−{６−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノヘキシル}−Ｎ´−トリス[（２−{[（トリス{[２−カルボキシエトキシ]メチル}メチル）アミノ]カルボニル}エトキシ）メチル]−メチルウレア（５）＞
保護基を有するノナ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４．３）（０．１２ｇ、７２ｍｍｏｌ）を１８時間１０ｍＬの９６％ホルム酸で攪拌した。ホルム酸は、５０℃で減圧して除去して、定量的な（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）収率で無色オイルを製造した。
1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz): δ 1.23-1.51 (m, CH2CH2CH2CH2, 8H); 2.44-2.58 (m, CH2CH2O gen. 1 & 2, 24H); 3.15-3.18 (m, CONHCH2, 4H); 3.61-3.75 (m, CCH2O gen. 1& 2, CH2CH2O gen. 1 & 2, 48H); 4.23 (t, CH(fluorenyl)-CH2, J=7.0 Hz, 1H); 4.35 (d, fluorenyl-CH2, J=7.0 Hz, 2H); 5.85, 6.09 (br, CH2NHCO, 2H); 6.57 (br, CONHC,1H); 6.88 (br, amide NH, 3H); 7.31-7.88 (fluorenyl, 8H). 
13C NMR (CD3COCD3, 75 MHz): δ 27.21, 27.33, 30.69, 30.98 (CH2CH2CH2CH2); 35.31 (CH2CH2O gen. 2); 37.83 (CH2CH2O gen. 1); 40.56, 41.54 (CONHCH2); 48.10 (CH(fluorenyl)-CH2); 59.93 (CCH2O gen. 1); 61.10 (CCH2O gen. 2); 66.86 (fluorenyl-CH2); 67.81 (CH2CH2O gen. 2); 68.37 (CH2CH2O gen. 1); 69.80 (CCH2O gen. 2); 70.83 (CCH2O gen.1); 120.84, 126.13, 127.98, 128.56, 142.10, 145.16 (fluorenyl); 157.50 (OCONH); 159.82 (NHCONH); 173.20 (amide CONH); 173.93 (COOH).
【０１２７】
［実施例３：追加デンドロン化合物］
特定保護基を以下に示すが、前記化合物は限定されないことを周知しなければならない。また、多様な鎖及びスペーサが正確な分子構造を示して描写される限り、サブストレート表面上に調節された密度、好ましくは低密度の配列のための改質は容認された化学的改質方法（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）により可能であった。化合物のショートハンド技術（ｓｈｏｒｔ−ｈａｎｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）に対する参考として、以下に示す化合物の左側の大部分は保護基を示し；括弧（ｂｒａｃｋｅｔｓ）の数字は鎖の末端（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｔｅｒｍｉｎｉ）の数を示し；右側の大部分は化学的な本体（ｅｎｔｉｔｙ）の鎖の末端上の化学的作用（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を示す。
実施例において、‘Ａ−[２７]−酸’とは、アントリルメチル保護基；２７末端、及び末端が酸性基のものを示す。
【化５】
2010151828.tif 000011
【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【０１２８】
［実施例３．１：製造方法］
１．Ａ−[３]−ＯＥｔ（化合物３）
【化３４】
2010151828.tif 000040
化合物１は、ＮａＣ（ＣＯ２Ｅｔ）３（化合物２）と共に８０℃で反応させた。
【０１２９】
２．Ａ−[３]−ＯＭｅ（化合物５）
【化３５】
2010151828.tif 000041
Ａ−[３]−ＯＥｔ（化合物３）は、エーテルに溶解したＬｉＡｌＨ４またはＬｉＢＨ４と共に反応させ、ｔ−ＢｕＯＫ／ｔ−ＢＵＯＨの存在下でクロロ酢酸と反応させて、ＭｅＯＨでエステル化した。
【０１３０】
３．Ａ−[３]−ＯＴｓ（化合物７）
【化３６】
2010151828.tif 000042
化合物７にトシル化されたトリオール化合物６は、エーテルでのＡ−[３]−ＯＭｅ（化合物５）及びＬｉＡｌＨ４の反応で得る。
【０１３１】
４．Ａ−[９]−ＯＥｔ（化合物８）
【化３７】
2010151828.tif 000043
目的化合物であるノナエステル（化合物８）は、Ａ−[３]−ＯＴｓ（化合物７）をＣ６Ｈ６−ＤＭＦに溶解されたＮａＣ（ＣＯ２Ｅｔ）３で処理して製造する。
【０１３２】
５．Ａ−[２７]−ＯＨ（化合物９）
【化３８】
2010151828.tif 000044
Ａ−[９]−ＯＥｔ（化合物８）は、７０℃でＤＭＳＯに溶解されたトリス（ヒドロシメチル）アミノメタン及びＫ２ＣＯ３で処理した。
【０１３３】
［実施例３．２］
１．Ｂｏｃ−[２]−ＯＭｅ（化合物３）
【化３９】
2010151828.tif 000045
５０℃以下の温度でメタノール溶媒下で化合物１及びメチルアクリレート(化合物２)を反応させた。５５℃以下の高真空下で過量の試薬及び溶媒を除去した。
【０１３４】
２．Ｂｏｃ−[４]−ＮＨ２（化合物５）
【化４０】
2010151828.tif 000046
５０℃以下の温度でメタノール溶媒下でＢｏｃ−[２]−ＯＭｅ（化合物３）及び非常に過量のエチレンジアミン（ＥＤＡ）(化合物４)を反応させた。５５℃以下の高真空下で過量の試薬及び溶媒を除去した。
【０１３５】
３．Ｂｏｃ−[８]−ＯＭｅ（化合物６）
【化４１】
2010151828.tif 000047
５０℃以下の温度でメタノール溶媒下でＢｏｃ−[４]−ＮＨ２（化合物５）及びメチルアクリレート(化合物２)を反応させた。５５℃以下の高真空下で過量の試薬及び溶媒を除去した。
【０１３６】
［実施例３．３］
１．Ｂｏｃ−[２]−ＯＨ（化合物３）
【化４２】
2010151828.tif 000048
化合物１、１−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート（ＨＯＢＴ）をアセトニトリルに溶解して、室温で攪拌した。アセトニトリルに溶解されたＬ−グルタミン酸−ジエチルエチルエステル（Ｈ２ＮＣＨ（ＣＯ２Ｅｔ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ）を攪拌しながら前記溶液に添加した。室温で１２時間攪拌した後、アセトニトリルを蒸発させた。粗生成物をＥＡに溶解して、１．０ＮのＨＣｌ及び飽和ソジウムバイカーボネート溶液で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４で乾燥した後、ろ過して溶媒を蒸発させて、シリカゲルが充填されたコラムに粗生成物を入れた。コラムクロマトグラフィー（展開溶媒：エチルアセテート：ヘキサン）で精製して、粘性の黄色液体を得た。
化合物２をＮａＯＨで加水分解した。１日室温で攪拌した後、有機溶液を蒸発させた。水溶液はＥＡで洗浄して、氷槽で攪拌した後、ＨＣｌで酸性化させた。ＥＡを使用して生成物を抽出した後に、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過して、溶媒を蒸発させた。
【０１３７】
２．Ｂｏｃ−[４]−ＯＨ（化合物３）
【化４３】
2010151828.tif 000049
化合物３、１−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート（ＨＯＢＴ）をアセトニトリルに溶解して、室温で攪拌した。前記溶液にアセトニトリルに溶解したＬ−グルタミン酸−ジエチルエステル（Ｈ２ＮＣＨ（ＣＯ２Ｅｔ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ）を攪拌しながら添加した。室温で１２時間攪拌した後、アセトニトリルを蒸発させた。粗生成物をＥＡに溶解して、１．０ＮのＨＣｌ及び飽和ソジウムバイカーボネート溶液で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４で乾燥した後、ろ過して溶媒を蒸発させて、シリカゲルが充填されたコラムに粗生成物を入れた。コラムクロマトグラフィー（展開溶媒：エチルアセテート：ヘキサン）で精製して、粘性の黄色液体を得た。
化合物４をＮａＯＨで加水分解した。１日室温で攪拌した後、有機溶液を蒸発させた。水溶液はＥＡで洗浄して、氷槽で攪拌した後、ＨＣｌで酸性化させた。ＥＡを使用して生成物を抽出した後に、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過して、溶媒を蒸発させた。
【０１３８】
３．Ｂｏｃ−[８]−ＯＨ（化合物３）
【化４４】
2010151828.tif 000050
化合物５、１−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート（ＨＯＢＴ）をアセトニトリルに溶解して、室温で攪拌した。前記溶液にアセトニトリルに溶解したＬ−グルタミン酸−ジエチルエステル（Ｈ２ＮＣＨ（ＣＯ２Ｅｔ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ）を攪拌しながら添加した。室温で１２時間攪拌した後、アセトニトリルを蒸発させた。粗生成物はＥＡに溶解して、１．０ＮのＨＣｌ及び飽和ソジウムバイカーボネート溶液で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４で乾燥した後、ろ過して溶媒を蒸発させて、シリカゲルが充填されたコラムに粗生成物を入れた。コラムクロマトグラフィー（展開溶媒：エチルアセテート：ヘキサン）で精製して、粘性の黄色液体を得た。
化合物６をＮａＯＨで加水分解した。１日室温で攪拌した後、有機溶液を蒸発させた。水溶液はＥＡで洗浄して、氷槽で攪拌した後、ＨＣｌで酸性化させた。ＥＡを使用して生成物を抽出した後に、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過して、溶媒を蒸発させた。
【０１３９】
［実施例３．４］
１．Ｂｏｃ−[２]−ＣＮ（化合物３）
【化４５】
2010151828.tif 000051
室温で化合物１をアセトニトリルに溶解した。結晶状酢酸（Ｇｌａｃｉａｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を添加し、溶液を２４時間環流下で加熱した。過量のアセトニトリルを真空下で蒸留して除去して、残余物をクロロホルムで抽出した後、濃いアンモニア溶液を添加した。有機状を分離した後、水で洗浄して、ソジウムスルフェートで乾燥した。
【０１４０】
２．Ｂｏｃ−[２]−ＮＨ２（化合物４）
【化４６】
2010151828.tif 000052
Ｂｏｃ−[２]−ＣＮ（化合物３）をメタノールに溶解して、コバルト（ＩＩ）クロライドヘキサハイドレートを添加した。ソジウムボロハイドライドを分割して添加した。結果混合物を２時間室温で攪拌した後、濃い塩酸で慎重に酸性化させた。溶媒を真空下で除去して濃縮した。有機状を分離した後、水で洗浄して、ソジウムスルフェートで乾燥した。
【０１４１】
３．Ｂｏｃ−[４]−ＣＮ（化合物５）
【化４７】
2010151828.tif 000053
室温でＢｏｃ−[２]−ＮＨ２（化合物４）をアセトニトリルに溶解した。結晶状酢酸（Ｇｌａｃｉａｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を添加し、溶液を２４時間環流下で加熱した。過量のアセトニトリルを真空下で蒸留して除去して、残余物をクロロホルムで抽出した後、濃いアンモニア溶液を添加した。有機状を分離した後、水で洗浄して、ソジウムスルフェートで乾燥した。
【０１４２】
４．Ｂｏｃ−[４]−ＮＨ２（化合物６）
【化４８】
2010151828.tif 000054
Ｂｏｃ−[４]−ＣＮ（化合物５）をメタノールに溶解して、コバルト（ＩＩ）クロライドヘキサハイドレートを添加した。ソジウムボロハイドライドを分割して添加した。結果混合物を２時間室温で攪拌した後、濃い塩酸で慎重に酸性化させた。溶媒を真空下で除去して濃縮した。有機状を分離した後、水で洗浄して、ソジウムスルフェートで乾燥した。
【０１４３】
５．Ｂｏｃ−[８]−ＣＮ（化合物７）
【化４９】
2010151828.tif 000055
室温でＢｏｃ−[４]−ＮＨ２(化合物６)をアセトニトリルに溶解した。結晶状酢酸（Ｇｌａｃｉａｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を添加し、溶液を２４時間環流下で加熱した。過量のアセトニトリルを真空下で蒸留して除去して、残余物をクロロホルムで抽出した後、濃いアンモニア溶液を添加した。有機状を分離した後、水で洗浄して、ソジウムスルフェートで乾燥した。
【０１４４】
６．Ｂｏｃ−[８]−ＮＨ２（化合物８）
【化５０】
2010151828.tif 000056
Ｂｏｃ−[８]−ＣＮ（化合物７）をメタノールに溶解して、コバルト（ＩＩ）クロライドヘキサハイドレートを添加した。ソジウムボロハイドライドを分割して添加した。結果混合物を２時間室温で攪拌した後、濃い塩酸で慎重に酸性化させた。溶媒を真空下で除去して濃縮した。有機状を分離した後、水で洗浄して、ソジウムスルフェートで乾燥した。
【０１４５】
７．Ｂｏｃ−[１６]−ＣＮ（化合物９）
【化５１】
2010151828.tif 000057
室温でＢｏｃ−[８]−ＮＨ２（化合物８）をアセトニトリルに溶解した。結晶状酢酸（Ｇｌａｃｉａｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を添加し、溶液を２４時間環流下で加熱した。過量のアセトニトリルを真空下で蒸留して除去して、残余物をクロロホルムで抽出した後、濃いアンモニア溶液を添加した。有機状を分離した後、水で洗浄して、ソジウムスルフェートで乾燥した。
【０１４６】
８．Ｂｏｃ−[１６]−ＮＨ２（化合物１０）
【化５２】
2010151828.tif 000058
Ｂｏｃ−[１６]−ＣＮ（化合物９）をメタノールに溶解して、コバルト（ＩＩ）クロライドヘキサハイドレートを添加した。ソジウムボロハイドライドを分割して添加した。結果混合物を２時間室温で攪拌した後、濃い塩酸で慎重に酸性化させた。溶媒を真空下で除去して濃縮した。有機状を分離した後、水で洗浄して、ソジウムスルフェートで乾燥した。
【０１４７】
［実施例３．５］
１．Ａ−[３]−アルケン（化合物３）
【化５３】
2010151828.tif 000059
Ａ−[１]−ＳｉＣｌ３（化合物１）をジエチルエーテルに溶解された過量の１０％アリルマグネシウムブロマイドを利用して４時間環流させた後、０℃で冷却して、１０％のＮＨ４Ｃｌ水溶液で加水分解した。前記有機層を水で洗浄して、ＭｇＳＯ４を利用して乾燥して濃縮した。
【０１４８】
２．Ａ−[３]−ＳｉＣｌ３（化合物４）
【化５４】
2010151828.tif 000060
Ａ−[３]−アルケン（化合物３）、ＨＳｉＣｌ３、及び通常の白金基材のハイドロシリル化触媒、例えばプロパン−２−オールに溶解されたＨ２ＰｔＣｌ６（Ｓｐｅｉｅｒの触媒）、または白金ジビニルシロキサン錯化合物（Ｋａｒｓｔｅｄｔの触媒）の混合物を２４時間常温で攪拌した。反応が終了した時、過量のＨＳｉＣｌ３を真空で除去した。
【０１４９】
３．Ａ−[９]−アルケン（化合物５）
【化５５】
2010151828.tif 000061
Ａ−[３]−ＳｉＣｌ３（化合物４）をジエチルエーテルに溶解した過量の１０％アリルマグネシウムブロマイドを利用して４時間還流させた後、０℃で冷却した。その後、１０％ ＮＨ４Ｃｌ水溶液で加水分解した。前記有機層を水で洗浄して、ＭｇＳＯ４を利用して乾燥して濃縮した。
【０１５０】
４．Ａ−[９]−ＳｉＣｌ３（化合物６）
【化５６】
2010151828.tif 000062
Ａ−[９]−アルケン（化合物５）、ＨＳｉＣｌ３、及び通常の白金基材ハイドロシリル化触媒、例えばプロパン−２−オールに溶解されたＨ２ＰｔＣｌ６（Ｓｐｅｉｅｒの触媒）または白金ジビニルシロキサン錯化合物（Ｋａｒｓｔｅｄｔの触媒）の混合物を２４時間常温で攪拌した。反応が終了した時、過量のＨＳｉＣｌ３を真空ポンプを利用して除去した。
【０１５１】
［実施例３．６］
１．[１]−酸−[３]−トリオール（化合物３）
【化５７】
2010151828.tif 000063
（ａ）段階では、前記トリオール１をシアノエチル化して、前記ニトリル化合物２を製造した。アクリロニトリル、ｎＢｕ３ＳｎＨ、及びアゾビシソブチロニトリルを前記化合物１が含まれているＰｈＣＨ３に１１０℃で添加した。（ｂ）段階では、前記ニトリル化合物２をＫＯＨ、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ、Ｈ２Ｏ２、及び△のような反応条件で加水分解して、化合物３及びカルボキシ酸を製造した。
【０１５２】
２．Ａ−[３]−トリオール（化合物５）
【化５８】
2010151828.tif 000064
（ｃ）段階では、[１]−酸−[３]−トリオールを１−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート（ＨＯＢＴ）を利用して、アミドカップリング反応を通して化合物４と結合した。
【０１５３】
３．Ａ−[３]−トリブロマイド（化合物６）
【化５９】
2010151828.tif 000065
（ｄ）段階では、１００℃でＨＢｒ／Ｈ２ＳＯ４を臭素化し、トリブロマイドを合成するために前記アルコールを使用した。
【０１５４】
４．[１]−ＣＮ−[３]−ＯＢｚｌ（化合物８）
【化６０】
2010151828.tif 000066
（ｅ）段階では、トリオール（１）をＭｅ２ＳＯ及びＫＯＨを使用してトリエーテルを製造するためにベンジルクロライドで処理した。（ｆ）段階では、トリエステル（化合物８）をシアノエチル化して、ニトリル化合物（化合物９）を製造した。アクリロニトリル、ｎＢｕ３ＳｎＨ、及びアゾビスイソブチロニトリルを化合物８を含むＰｈＣＨ３に１１０℃で添加した。
【０１５５】
５．[１]−ＯＨ−[３]−ＯＢｚｌ（化合物１１）
【化６１】
2010151828.tif 000067
（ｇ）段階では、ニトリル化合物９(化合物９)をＫＯＨ、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ、Ｈ２Ｏ２、Δのような環境でカルボキシ酸を用いて加水分解し、化合物１０を製造した。（ｈ）段階では、化合物１０とカルボキシ酸をアルコールに転換させるために１．０Ｍの濃度を超えるＢＨ３ＴＨＦ溶液と共に反応させた。
【０１５６】
６．[１]−アルキン−[３]−ＯＢｚｌ（化合物１３）
【化６２】
2010151828.tif 000068
（ｉ）段階では、過量のＳＯＣｌ２及びピリジン触媒下でアルコールを塩化物（ＣＨ２Ｃｌ２）にした。（ｊ）段階では、塩化物をジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）下でリチウムアセチライドエチレンジアミン錯化合物（ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｉｄｅ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）と４０℃で反応させた。
【０１５７】
７．Ａ−[３]−アルキン−[９]−ＯＢｚｌ（化合物１４）
【化６３】
2010151828.tif 000069
（ｋ）段階では、４当量のアルキン末端を形成するブロックを有する化合物１３、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）、及びテトラメチルエチレンアミン（ＴＭＥＤ）で０℃乃至４０℃で１．５時間反応させて、前記Ａ−[３]−ＯＢｚ（化合物６）をアルキル化させた。
【０１５８】
［実施例３．７］
１．Ａ−[９]−ＯＨ（化合物１５）
【化６４】
2010151828.tif 000070
Ａ−[３]−アルキン−[９]−ＯＢｚｌ（化合物１４）は、Ａ−[９]−ＯＨ（化合物１５）を製造するために、ＥｔＯＨ及びＴＨＦ１０％溶液下でＰｄ−Ｃ／Ｈで６０℃で４日反応させて、還元させて脱保護化した。
【０１５９】
２．Ａ−[２７]−ＣＯＯＨ（化合物１７）
【化６５】
2010151828.tif 000071
前記アルコールは、塩化物（ＣＨ２Ｃｌ２）下でＳＯＢｒ２を利用して４０℃で１２時間ゆっくり非ブロマイド（ｎｏｎａｂｒｏｍｉｄｅ）に転換させた。前記過程後に、４９％のＡ−[９]−アルキン−[２７]−ＯＢｚｌ（化合物１６）を製造するために、１２価の[１]−アルキン−[３]−ＯＢｚｌ（化合物１３）で前記非ブロマイド化合物をアルキル化させた。Ａ−[９]−アルキン−[２７]−ＯＢｚｌ（化合物１６）は、１０％のＰｄ−Ｃ／Ｈが含まれているＥｔＯＨ及びＴＨＦ溶液下でＰｄ−Ｃ／Ｈと６０℃で４時間反応させる一段階を通して還元させて脱保護化させて、８９％のＡ−[２７]−ＯＨを製造した。Ａ−[２７]−ＯＨをＮＨ４ＯＨまたは（ＣＨ３）４ＮＯＨ下でＲｕＯ４で酸化させて、８５％のＡ−[２７]−ＣＯＯＨ（化合物１７）を製造した。
【０１６０】
［実施例３．８］
１）[Ｇ１]−（ＯＭｅ）２（化合物３）
【化６６】
2010151828.tif 000072
化合物１（１．０５ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．）、３，５−ジメトキシベンジルブロマイド（１．００ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．  化合物２）、炭酸カリウム（１．１ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．）、及び１８−ｃ−６（０．２ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．）の混合物を脱水されたアセトン下で４８時間、窒素下で環流されるまで加熱した。前記混合物を冷却した後、乾燥されるまで蒸留して、残留物は塩化物（ＣＨ２Ｃｌ２）及び水の間で分割した。前記水溶液層は、塩化物（ＣＨ２Ｃｌ２）（３×）で抽出し、連結された有機膜層を乾燥した後、乾燥されるまで蒸発させた。化合物３を得るために、前記粗結果物に対してＥｔＯＡｃ−ＣＨ２Ｃｌ２を溶出液（ｅｌｕｅｎｔ）としてフラッシュクロマトグラフィー（ｆｌａｓｈ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用して精製した。
【０１６１】
２）[Ｇ１]−（ＯＨ）２（化合物４）
【化６７】
2010151828.tif 000073
化合物３のメチルエーテル基をＥｔＯＡｃ溶液下でＢＢｒ３によって１時間脱離させた。これによる粗結果物に対してＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃを溶出液（ｅｌｕｅｎｔ）としてフラッシュクロマトグラフィー（ｆｌａｓｈｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用して精製して、化合物４を得た。
【０１６２】
３）[Ｇ２]−（ＯＭｅ）４（化合物５）
【化６８】
2010151828.tif 000074
[Ｇ１]−（ＯＨ）２（１．００ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．  化合物４）、３，５−ジメトキシベンジルブロマイド（２．００ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．  化合物２）、炭酸カリウム（２．１ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．）及び１８−ｃ−６（０．２ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．）の混合物を脱水されたアセトン下で４８時間、窒素下で還流されるまで加熱した。前記混合物を冷却した後、乾燥されるまで蒸留して、残留物は塩化物（ＣＨ２Ｃｌ２）及び水の間で分割した。前記水溶液層は、塩化物（ＣＨ２Ｃｌ２）（３×）で抽出し、連結された有機膜層を乾燥した後、乾燥されるまで蒸発させた。化合物５を得るために、前記粗結果物に対してＥｔＯＡｃ−ＣＨ２Ｃｌ２を溶出液（ｅｌｕｅｎｔ）としてフラッシュクロマトグラフィー（ｆｌａｓｈ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用して精製した。
【０１６３】
４）[Ｇ２]−（ＯＨ）４（化合物６）
【化６９】
2010151828.tif 000075
化合物５のメチルエーテル基をＥｔＯＡｃ溶液下でＢＢｒ３によって１時間脱離させた。前記粗結果物に対してＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃを溶出液としてフラッシュクロマトグラフィーを利用して精製して、化合物４を得た。
【０１６４】
５）[Ｇ３]−（ＯＭｅ）８（化合物７）
【化７０】
2010151828.tif 000076
[Ｇ２]−（ＯＨ）４（１．００ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．  化合物６）、３，５−ジメトキシベンゾブロマイド（４．００ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．  化合物２）、炭酸カリウム（４．１ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．）及び１８−ｃ−６（０．２ｍｏｌ ｅｑｕｉｖ．）の混合物を脱水されたアセトン下で４８時間、窒素下で還流されるまで加熱した。前記混合物を冷却した後、乾燥されるまで蒸留して、残留物は塩化物（ＣＨ２Ｃｌ２）及び水の間で分割した。前記水溶液層は、塩化物（ＣＨ２Ｃｌ２）（３×）で抽出し、連結された有機膜層を乾燥した後、乾燥されるまで蒸発させた。化合物７を得るために、前記粗結果物に対してＥｔＯＡｃ−ＣＨ２Ｃｌ２を溶出液（ｅｌｕｅｎｔ）としてフラッシュクロマトグラフィー（ｆｌａｓｈ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用して精製した。
【０１６５】
６）[Ｇ３]−（ＯＨ）８（化合物８）
【化７１】
2010151828.tif 000077
化合物７のメチルエーテル基をＥｔＯＡｃ溶液中でＢＢｒ３によって１時間脱離させた。化合物８を得るために、粗結果物に対してＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃを溶出液（ｅｌｕｅｎｔ）としてフラッシュクロマトグラフィー（ｆｌａｓｈ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を実施した。
【０１６６】
［実施例４：サブストレート上にデンドロンの組立て］
ＡＰＤＥＳの代わりに、ガラス酸化物（ｏｘｉｄｅ ｇｌａｓｓ）上にＴＭＡＣ（Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）を自己組立てした。前記ＴＭＡＣ上のデンドリマー層のアミン残基をキャッピングする必要はなかった。
【０１６７】
＜ＴＭＡＣによるアミノシリル化＞
清潔なサブストレート（スライドガラス）をＴＭＡＣ（２ｍＬ）及びアセトン（１００ｍＬ）の混合溶液に５時間浸した。自己組立て後に、前記サブストレートをフラスコから取り出して、アセトンで洗浄した。前記サブストレートをオーブンに入れて１１０℃で４０分間加熱した。アセトンに浸漬した後に、前記サブストレートを３分間超音波処理した。洗浄されたサブストレートをテフロン（登録商標）容器に入れ、Ｏ−フックに連結された大きなスクリューキャップを有するガラス容器に置いて、前記ガラス容器を真空処理して、前記ＴＭＡＣが自己組立てされたサブストレートを乾燥した。
ＴＭＡＣの化学式構造を以下に示す。
【化７２】
2010151828.tif 000078
【０１６８】
無水酢酸でアミン残基をキャッピングすることを除いては、Ｆｍｏｃ−スペーサ−[９]酸をＣＢｚ−[９]酸と同一な条件で自己組立てした。
【０１６９】
＜Ｆｍｏｃ−スペーサ−[９]酸（化合物５）の自己組立て＞
一定量のＦｍｏｃ−スペーサ−[９]酸（化合物５）を混合溶媒（ＤＭＦ：脱イオン水＝１：１（ｖ／ｖ））に溶解して、２０ｍＬの溶液を製造した。テフロン（登録商標）容器に前記溶液を入れて、前記で製造したアミノシリル化されたスライドガラス片を溶液に浸した。フラスコを常温に置いて、自己組立てするようにして、１日後に各サブストレート片を溶液から取り出した。片を取り出した直後に前記プレートを脱イオン水で洗浄した。各々のサブストレートを脱イオン水、脱イオン水−メタノール混合溶媒（１：１（ｖ／ｖ））、及びメタノールで順次に３分間超音波処理した。超音波処理した後に、テフロン（登録商標）容器に前記サブストレートを浸して、再びＯ−フックが連結された大きなスクリューギキップを有するガラス容器に入れて、前記ガラス容器を真空にして（３０−４０ｍＴｏｒｒ）サブストレートを乾燥した。
【０１７０】
＜Ｆｍｏｃ−スペーサ−[９]酸（化合物５）のＦｍｏｃ脱保護化＞
ＤＭＦ中に５％のピペリジンを含むテフロン（登録商標）容器を容易した。前記自己組立てされたサブストレートを前記テフロン（登録商標）容器に浸して２０分間攪拌した。各々のサブストレートをアセトン及びメタノールで順次に３分間超音波処理して、真空チャンバで（３０−４０ｍＴｏｒｒ）乾燥した。
【０１７１】
［実施例５：デンドロン（９−酸及び２７−酸）］改質表面上のｐ５３マイクロアレイ］
非常に高い頻度で無意味な（ｍｉｓｓｅｎｓｅ）変異ホットスポットを有することが分かっている７つのコドン、つまり１７５、２１５、２１６、２３９、２４８、２７３、及び２８２を選択して、実験に利用した。７つのコドンのうち、コドン１７５、２４８、２７３、及び２８２は国際Ｐ５３変異データベース（ＩＡＲＣ、ｈｔｔｐ／／：ｗｗｗ−ｐ５３．ｉａｒｃ．ｆｒ／ｐ５３ＤａｔａＢａｓｅ．ｈｔｍ）から得て、残りの三つのコドン、つまり２１５、２１６、及び２３９は韓国ｐ５３変異ホットスポットデータベースから得た。前記６つのコドンに対するキャプチャープローブ序列（デンドロン改質表面に固定化されたＤＮＡ）をソフトウェアで製作し、これらの長さは１５−２３ｍｅｒと多様にして、Ｔｍは約５５℃に合わせた。
【０１７２】
＜実施例５．１：デンドロン改質表面を使用したｐ５３遺伝子の７つのホットスポット変異の探知＞
デンドロン改質サブストレートを使用して、癌細胞株のｐ５３遺伝子の単一変異を探知した。７つのホットスポットコドン（１７５、２１５、２１６、２３９、２４８、２７３、及び２８２）を含む標的ＤＮＡサンプル（１００−２００ｍｅｒ）を、ランダムプライミング法を使用して癌細胞から抽出されたＤＮＡを増幅して製造し（実施例５．８参照）、固定化された７つのホットスポットコドンに相応するキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチドｏｆ１５−２５ｍｅｒ）と混成化させた。各々の混成化されたスポットの蛍光強度を共焦点レーザースキャナで測定し、ＳＮＰ区別能を計算した。この実施例によれば、デンドロン改質表面を有するＤＮＡマイクロアレイの品質は、実際に標的サンプルに存在する単一変異を探知することができることを示している。
【０１７３】
＜実施例５．２：混成化効率及びＳＮＰ区別に及ぼすＴ３０を有するプローブオリゴヌクレオチドの長さの影響＞
ＳＮＰ区別のためのキャプチャープローブの長さの影響をＴ３０を有する多様な長さのキャプチャープローブを使用して試験した。Ｔ３０を含んでコドン１７５及び２３９に相応するキャプチャーオリゴヌクレオチドを５´末端及びデンドロン改質表面の末端の１次アミノ基に連結することによって固定させた後に、ｐ５３標的ＤＮＡを混成化させて、蛍光強度を測定した。この実施例は、キャプチャープローブの長さに対するＳＮＰ区別能及び信号強度の依存性を示した。
【０１７４】
＜実施例５．３：キャプチャープローブ濃度ｖｓ強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）；及びキャプチャープローブｖｓＳＮＰ区別＞
キャプチャープローブの濃度に対する信号強度及びＳＮＰ区別能の依存性を調査した。デンドロン改質表面上のキャプチャープローブを多様な濃度にして標的ＤＮＡと混成化して、蛍光強度及びＳＮＰ区別能を測定した。ｐ５３に対するキャプチャープローブの最適濃度を決定した。
【０１７５】
＜実施例５．４：プローブ濃度ｖｓ強度；及び標的プローブ濃度ｖｓＳＮＰ区別＞
標的プローブの濃度に対する信号強度及びＳＮＰ区別能の依存性を調査した。標的ＤＮＡを多様な濃度にして混成化して、蛍光強度及びＳＮＰ区別能を測定した。この実施例により、デンドロン改質表面を有するＤＮＡマイクロアレイの多様な範囲を提供した。
【０１７６】
＜実施例５．５：混合標的サンプルにある変異の探知＞
正常な序列に比べて変異した標的序列が小さい部分に存在する、点突然変異を有する標的サンプル（５または１０％）を探知することができる。二種類の標的ＤＮＡを含む標的サンプルを異なるモル濃度で製造して混成化して、変異した標的ＤＮＡだけでなく、正常な序列の混合物において特定コドンで単一点突然変異を探知するようにした。この実施例は、初期段階の癌を診断するのに大変重要な臨床的意義がある。
【０１７７】
＜実施例５．６：１０個の未知の直腸癌細胞株の変異探知＞
癌細胞株の未知の変異を探知するために考案したシステムである。
【０１７８】
≪実施例５．６．１：細胞培養及びゲノムＤＮＡ抽出≫
直腸癌細胞株ＳＮＵ−Ｃ１、ＳＮＵ−Ｃ５、ＣＯＬＯ ２０１、ＣＯＬＯ ２０５、ＤＬＤ−１、ＬＳ ５１３、ＨＣＴ−１５、ＬＳ １７４Ｔ、ＨＣＴ １１６、及びＳＷ ４８０をＫＣＬＢ（韓国細胞株バンク、韓国、ソウル）から購入した。１０％ウテア血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍｌのストラプトマイシン、及び１００Ｕのペニシリン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０に細胞を接種して、５％のＣＯ２、３７℃で培養した。直腸癌細胞（２×１０６細胞）をＩｎｖｉｓｏｒｂ（登録商標）ｓｐｉｎ ｃｅｌｌ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｅｋ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用者マニュアルに従って得て、ゲノムＤＮＡ分析に使用した。これらゲノムＤＮＡからｐ５３標的ＤＮＡを製造し（実施例５．８．２参照）、ＤＮＡマイクロアレイ実験を前記方法と同様な方法で行った。
【０１７９】
＜実施例５．７：混成化効率及びＳＮＰ区別に対する標的プローブの長さの影響＞
ランダムプライマ−法、ＰＣＲ、Ｄｎａｓｅ分解などの多様な方法で多様な長さを有する標的ＤＮＡを製造し、混成化効率及びＳＮＰ区別に対する標的プローブの長さの影響を調査した。
【０１８０】
＜実施例５．８：実験方法＞
≪実施例５．８．１：ゲノムＤＮＡサンプル≫
ＳＮＵ細胞株（ＳＮＵ−６１、２１６、４７５、５６３、６０１、６６８、７６１、及び１０４０）のゲノムＤＮＡをソウル大学医学部の朴ジェガプ氏から得た。前記ＳＮＵ細胞株は、韓国の患者から採取したヒト腫よう細胞株である。これら細胞株の特性は以前に記述したものと同一であり、多様な研究で使用された（Ｂａｅ ＩＳ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐａｒｋ ＪＧ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｋａｎｇ ＭＳ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｙｕａｎ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７，３７８−８７）。
【０１８１】
≪実施例５．８．２：サブクローニング及び序列分析≫
各細胞株に対して、ｐ５３遺伝子、特にエクソン５及びエクソン８間に存在するｐ５３遺伝子を２対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した：エクソン５Ｆｗｄ Ｉ、５´−ＣＴＧ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＣＣ Ｔ−３´（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；エクソン５Ｆｗｄ ＩＩ、５´−ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＣＣ ＣＴＣＡＡＣ ＡＡ−３´（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；エクソン８Ｒｅｖ Ｉ、５´−ＴＧＣ ＡＣＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＡＣ−３´（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；エクソン８Ｒｅｖ ＩＩ、５´−ＣＴＣ ＧＣＴ ＴＡＧ ＴＧＣ ＴＣＣ ＣＧＧ Ｇ−３´（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（Ｋａｎｇ ＭＳ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。下記条件により、Ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｙｂａｉｄ，ＵＫ）全体の反応体積が２０μｌになるように、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（補充Ｔａｑポリメラーゼ）のうち、２５０μ Ｍ ｄＮＴＰミックス、２．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１０ｐｍｏｌｅの最初のプライマー対（イントロは４及び８に相応するエクソン５Ｆｗｄ Ｉ及びエクソン８Ｒｅｖ Ｉ）、２５０μ Ｍ ｄＮＴＰミックス、２．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）にして、各ゲノムＤＮＡを増幅した：ポリメラーゼ初期活性化、９５℃で１分；２０周期、９５℃で３０秒；５８℃で３０秒；７２℃で９０秒；７２℃で５分最終延長した。最初のＰＣＲ産物を希釈して２番目のＰＣＲのための鋳型として使用した。ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅産物を２０倍に希釈して、ＰＣＲプライマ−を１０ｐｍｏｌの２番目のプライマー対（エクソン５及び８に相応するエクソン５Ｆｗｄ ＩＩ及びエクソン８Ｒｅｖ ＩＩ）を使用したことを除いては、前記段階と同一な条件下で２番目のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。増幅周期は２５周期に増加させた。最終のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ産物をゲル抽出法で精製した。ゲノムＤＮＡから得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクトル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結して、ＤＨ５ａ細胞に形質転換させた。サブクローニングされたプラスミドをＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で分離して、序列分析に使用した。ｐＵＣ／Ｍ１３正方向及び逆方向序列分析を次のプライマー対を使用して行った：Ｍ１３ ＦＷＤ ５´−ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＴＴＧ−３´（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）及びＭ１３ ＲＥＶ ５´−ＴＧＡ ＧＣＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＣＡ ＣＡＧ−３´（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。
【０１８２】
≪実施例５．８．３：標的プローブの製造≫
ＳＮＰシートを含むＤＮＡ標的プローブをランダムプライマ−法及び標識化方法で５０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、５０ＵのＫｌｅｎｏｗ酵素（ＮＥＢ）、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（Ｋｌｅｎｏｗ酵素補充）、６μｇのランダムオクタマ（Ｂｉｏｎｉｃｓ社合成）、低濃度ｄＴ ｄＮＴＰミックス（１００μＭ ｄＡ、Ｇ、ＣＴＰ／５０μＭ ｄＴＴＰ）、及び５０Ｃｙａｎｉｎｅ３−ｄＵＴＰ（ＮＥＮ）を含むＭｕｌｔｉｂｌｏｃｋ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｙｂａｉｄ，ＵＫ）で体積全体を２０μｌにして、３７℃、２時間行った。ＱＩＡＧＥＮＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して併合されないヌクレオチドを分離した。ＵＶ／Ｖｉｓスペクトロフォトメーターを使用して定量及び定性分析（特異的活性、結合された蛍光染料当たりのヌクレオタイスの数）を行った後に、分析された産物を混成化に利用した。
【０１８３】
≪実施例５．８．４：細胞培養及びゲノムＤＮＡ抽出≫
直腸癌細胞株ＳＮＵ−Ｃ１、ＳＮＵ−Ｃ５、ＣＯＬＯ ２０１、ＣＯＬＯ ２０５、ＤＬＤ−１、ＬＳ ５１３、ＨＣＴ−１５、ＬＳ １７４Ｔ、ＨＣＴ １１６、及びＳＷ４８０をＫＣＬＢから購入した。ウテア血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍｌのストラプトマイシン、及び１００Ｕのペニシリン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０に細胞を接種して、５％のＣＯ２、３７℃で反応させた。Ｉｎｖｉｓｏｒｂ（ｔｒａｄｅｍａｒｋ）ｓｐｉｎ ｃｅｌｌ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｅｋ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して使用者マニュアルによる方法で前記直腸癌細胞株（２×１０６細胞）を収穫して、ゲノムＤＮＡ抽出に使用した。
【０１８４】
［実施例６：デンドロン上に固定された蛋白質プローブ］
＜実施例６．１：デンドリマー改質スライドガラス上にＮＨＳバイオチン固定化＞
１ｍＬの重炭酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ及びＤＭＳＯ（４０％ｖ／ｖ）中にスクシンイミジルＤ−バイオチン（１．０ｍｇ）を含むスポッティング溶液を製造した。デンドリマー改質スライドガラス上にＮＨＳバイオチンをＭｉｃｒｏｓｙｓ５１００マイクロアレイヤー（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を使用してクラス１０，０００の清浄ルームで固定化した。固定化、及び湿潤チャンバー（７５％の湿度）で１時間反応させた後に、バイオチンマイクロアレイをＤＭＦ（５０℃）ＴＨＦ及びＭＢＳＴ（５０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．０）で順次に２時間洗浄した。前記スライドを蒸溜水ですすいで、乾燥させて、直ちに使用したり数日間常温で保存してから使用した。
【０１８５】
＜実施例６．２：蛋白質／リガンド相互作用の探知＞
この実施例は、Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ，Ｐ．Ｊ．；Ｄｅｐｅｗ，Ｋ．Ｍ．；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，７８４９によって行った。Ｃｙ３標識ストラプタビチン溶液を添加する前に、３％ウテア血清補充ＭＢＳＴで１時間遮断した。若干すすいだ後に、Ｃｙ３標識ストラプタビチン溶液に３０分間、室温で前記スライドを露出させた。前記溶液は、適切な蛋白質のストック溶液を１％ＢＳＡ補充ＭＢＳＴで希釈して、１ｍｇ／ｍＬにして製造した。前記反応後に、ＭＢＳＴで１回スライドを洗浄して、１２分間、ＭＢＳＴを４回交換しながら弱く攪拌した。スライドを乾燥して共焦点スキャナＳｃａｎ Ａｒｒａｙ（登録商標）Ｌｉｔｅ（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）を使用してスキャニングした。マイクロアレイ定量分析ソフトウェアＩｍａＧｅｎｅ（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．）を使用してイメージ及び蛍光強度分析を行った。
【０１８６】
［実施例７：孔が調節された巨大分子を含む、調節された気孔を有するガラスビーズ］
アミノプロピル基が結合された、気孔が調節されたガラスビーズ（ＡＭＰＣＰＧ；８０−１２０メッシュ；平均気孔直径、５０ｎｍまたは３００ｎｍ）及び長い鎖状アミノアルキルグループで改質された気孔が調節されたガラスビーズ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ；８０−１２０ｍｅｓｈ；ｍｅａｎ ｐｏｒｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ、５０ｎｍ）をＣＰＧ，Ｉｎｃから購入した。１，４−ブタンジオールジグリジルエーテル、１，３−ジアミノプロパン、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−（３−メチルアミノプロピル）−Ｎ´−エチルカルボイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−（９−フルオロメトキシカルボニルオキシ）クロライド（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、ピペリジン、４−マレイミドブチル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。他の化合物は、分析試薬級で購入し、追加精製なく使用した。Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｅ−ｐｕｒｅ ３−Ｍｏｄｕｌｅ ｓｙｓｔｅｍで蒸溜水を処理して、脱イオン水（１８ＭΩ．ｃｍ）を製造した。ＵＶ−ｖｉｓスペクトルはＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ｄｉｏｄｅ−ａｒｒａｙ８４５３スペクトロフォトメーターで記録した。
【０１８７】
＜実施例７．１：デンドロン改質ＣＰＧ（サンプルＥ１及びＥ３）上にグルタチオン固定化＞
（ｉ）Ｆｍｏｃ−［３］−酸で改質：ＡＭＰＣＰＧ（乾燥重量０．７０ｇ）をガラスフィルターにアセトンを使用して洗浄した。真空乾燥した後に、１，４−ブタンジルジグリシジルエーテル（１．０ｍＬ）及び炭酸塩緩衝液（２．０ｍＬ、ｐＨ＝１１）の混合液をＡＭＰＣＰＧ（表面能：９１．８μ ｍｏｌ／ｇ、表面積：４７．９ｍ２／ｇ）に添加した。常温で２４時間よく揺らして混ぜた後に、得られたビーズをろ過して脱イオン水及びアセトンで順次に洗浄した。前記サンプルが含まれているバイアル（ｖｉａｌ）を１，３−ジアミノプロパン（１．０ｍＬ）及び炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝１１）の混合液を添加して２４時間常温で混ぜた。徹底的に洗浄した後に、２−モルカプトエタノール（１．０ｍＬ）及び水溶性重炭酸ナトリウム溶液（２．０ｍＬ、ｐＨ＝８．５）の混合液で表面に残っているエポキシ基の反応を遮断させた。Ｆｍｏｃ−［３］−酸（１４ｍｇ、２１．３μ ｍｏｌ）が溶解されたジメチルホルムアミド（３０％ＤＭＦ（ｖ／ｖ））、Ｎ−（３−メチルアミノプロピル）−Ｎ´−エチルカルボイミド（１５ｍｇ、７７μ ｍｏｌ）、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（９．０ｍｇ、７７μ ｍｏｌ）をビーズを含むバイアルに添加した。室温で１１時間揺らして混ぜた後に、脱イオン水及びアセトンで順次に徹底的に洗浄した。
（ｉｉ）遮断段階：無水メチレンクロライド（２．０ｍＬ）中に無水酢酸（１．０ｍＬ）を使用して常温で一晩残留するアミン基を遮断した。
（ｉｉｉ）脱保護化段階：メチレンクロライド及びアセトンで順次にビーズを洗浄して、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中の２０％のピペリジンをビーズを含むバイアルに添加して、３０分間バイアルを揺らして混ぜた。
（ｉｖ）リガンド固定化段階：１，４−ブタンジルジグリシジルエーテル（１．０ｍＬ）及び炭酸塩緩衝液（２．０ｍＬ、ｐＨ＝１１）の混合液をバイアールに添加し、常温で２４時間混ぜた。脱イオン水及びアセトンで順次に洗浄した後に、重炭酸ナトリウム溶液（３．０ｍＬ、ｐＨ８．５）及び還元グルタチオン（ＧＳＨ、５．４ｍｇ、１７．６μ ｍｏｌ）をビーズを含むバイアルに添加して、常温で２４時間揺らして混ぜた。ビーズの洗浄後に、２−モルカプトエタノール（１．０ｍＬ）及び水溶性重炭酸ナトリウム溶液（２．０ｍＬ、ｐＨ＝８．５）の混合液をビーズを含むバイアルに添加した。最後に、ビーズを分離して洗浄して、真空で乾燥して窒素雰囲気下で４℃で保管した。Ｆｍｏｃ−［３］−酸の代わりにＦｍｏｃ−［９］−酸を使用することを除いては同一な段階を、サンプルＥ３を製造するために行った。
【０１８８】
＜実施例７．２：対照実験のための異なるＧＳＨ結合マトリクスの製造（サンプルＣＳ、ＣＬ、及びＡ）：＞
（ｉ）サンプルＣＳ及びＣＬ：ＧＳＨをＧＭＢＳリンカーを使用してＡＭＰＣＰＧ及びＬＣＡＡ−ＣＰＧに直接固定させた。ビーズ（０．１０ｇ）をガラスフィルターを使用してアセトンで洗浄した。真空で乾燥した後に、ＤＭＦ及び４−マレイミドブチル酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ、３．０ｍｇ、１１μ ｍｏｌ）が溶解された重炭酸ナトリウム緩衝液（１．０ｍＬ、３：７（ｖ／ｖ）、ｐＨ＝８．５）の混合液をビーズを含むバイアルに添加した。常温で４時間揺らして混ぜた後に、得られたビーズをろ過、及び脱イオン水、アセトン洗浄で分離した。最後に、無水メチレンクロライド（２．０ｍＬ）中の無水酢酸（１．０ｍＬ）でマトリクスに残っているアミン基を反応させた。洗浄後に、ＰＢＳ緩衝液（１．０ｍＬ）中のＧＳＨ（３．４ｍｇ、１１μ ｍｏｌ）をビーズを含むバイアルに添加して、常温で１２時間揺らして混ぜた。２−モルカプトエタノール（１．０ｍＬ）に残っているマレイミド基を遮断し、ビーズを分離して、洗浄、真空乾燥を行った。
（ｉｉ）サンプルＡ：Ｅ１及びＥ３と同一な改質方法で、１，４−ブタンジルジグリシジルエーテル及び１，３−ジアミノプロパンでＡＭＰＣＰＧを改質した。２−モルカプトエタノールでキャッピングした後に、１，４−ブタンジルジグリシジルエーテルでエポキシ基を製造した。最後に、クリタチオンを固定させて、２−モルカプトエタノールでビーズ上に残っているエポキシ基の環を開環した。
【０１８９】
＜実施例７．３：改質ビーズ上のアミン密度測定＞
Ｅ１またはＥ３の改質途中のビーズ、または対照実験用ビーズ（１０ｍｇ）をｅチューブに入れた。同時に、９−フルオロメチルクロロホルメート（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ、１．７５ｍｇ）及びＮａ２ＣＯ３（１．４５ｍｇ）を別途のガラスバイアルに入れて、１，４−ジオキサン及び水の混合溶媒（２：１（ｖ／ｖ））を２．５ｍＬ添加して、試薬を溶解した。前記溶液中の１／５を取って、ビーズを含むｅチューブに添加した。前記チューブをバイアルに入れて、バイアルを常温で１２時間揺らして混ぜた。ガラスフィルターを利用してビーズを分離して、前記多孔性物質を脱イオン水及びアセトンで順次に洗浄した。真空で乾燥した後に、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）中の２０％のピペリジンをビーズを含むｅチューブに入れて、３０分間ピペリジンと反応するようにした。残っている溶液をチューブから慎重に新たなｅチューブに移動させて、ビーズをＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中の２０％のピペリジンで二回洗浄した。前記溶液全体を前のｅチューブに添加した。溶液を再びメタノールと混合して、最終吸光度を調節した。ＵＶ／Ｖｉｓスペクトロメーターを使用して３１０ｎｍで吸光度を測定し、関連溶媒を背景誤差の訂正をするために使用した。信頼性向上のために、測定は５種類の異なるサンプルに対して行った。
測定のために、一連のＤＭＦ中の２０％のピペリジン、及びＮ−Ｆｍｏｃ−エタノールアミン（または９−フルオロメチルＮ−（２−ヒドロキシエチル）カバーメイト）（３０μＭ−７０μ Ｍ）を製造した。３０分間反応させた後に、ジベンゾフルベンを含む溶液を使用して吸光度を測定し、吸光係数を計算した。
【０１９０】
＜実施例７．４：ＧＳＴ融合蛋白質溶解物の製造＞
ＧＳＴ−融合蛋白質を公知の文献で説明された通りに製造した（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．；Ｌｅｅ，Ｓ．；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．；Ｌｅｅ，Ｔ．Ｇ．；Ｈｉｒａｔａ，Ｍ．；Ｓｕｈ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｙｕ，Ｓ．Ｈ．；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，４１，３４１４−３４２１で、その全体を本明細書の参考文献として併合する）。大規模培養のためには、再組合わせｐＧＥＸプラスミドを含む単一コロニーを２００ｍｌ ２Ｘ ＹＴＡ培地で培養した。対数増殖期まで培養した後に、ＩＰＴＧで６時間遺伝子発現を誘導した。次に、遠心分離で細胞を集めて、１Ｘ ＰＢＳで洗浄した。その後、０．５０ｍＭ ＰＭＳＦを含む１０ｍＬ低浸透圧性緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．４）でＥ．ｃｏｌｉを超音波溶解した。前記不溶性物質を除去して蛋白質を得た。
【０１９１】
＜実施例７．５：結合分析＞
（ｉ）鎖の長さの効果：前記製造されたビーズＣＬ（５．７２ｍｇ）、ＣＳ（６．９７ｍｇ）、Ｅ１（１０．０ｍｇ）、及びＥ３（１４．８ｍｇ）を０．８ｍＬの反応緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ＴＸ−１００、０．１０ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４、０．５０ｍＭ ＰＭＳＦ）中のＧＳＴ溶解物を含む混合溶液と別個に１時間、４℃で反応させて、１０ベッド体積の反応緩衝液で３回洗浄して、１００μＬ ＳＤＳサンプル緩衝液を添加した。前記チューブを５分間９５℃に置いた後に、２０μＬのサンプルを採取して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用し、得られたゲルをＣＢＢＧ−２５０染色溶液で染めた。
（ｉｉ）デンドロン処理マトリクスの選択度：１０ｍｇのサンプルＡ、Ｅ１、及びＥ３以外に、１００μｇの精製ＧＳＴまたはＧＳＴ融合蛋白質溶解物を実験に使用した。その他の段階は前記段階と同一である。
【０１９２】
＜実施例７．６：グルタチオンセファロース−４Ｂ、Ｅ１、及びＥ３からＧＳＴ融合蛋白質溶出＞
グルタチオンセファロース−４Ｂ、Ｅ１、及びＥ３を前記結合分析項目に記載された方法通りに行った。ビーズに結合された蛋白質の量をＩｍａｇｅ ｇａｕｇｅ Ｖ３．１２（ＦＵＪＩ ＰＨＯＴＯ ＦＩＬＭ ＣＯ．，ＬＴＤ．）で定量した。ｐ４７ｐｈｏｘのＰＸドメイン及びＭｕｎｃ−１８断片溶解物に対しても同一な段階を行った（図１３）。
【０１９３】
本明細で言及された全ての文献は、その全体が本明細書に併合される。本技術分野で通常の技術を有する者は、単に通常の実験でも本発明の具体的な例と同等な多数の発明を認識して到達することができるであろう。このような等価発明は、請求の範囲の保護範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【配列表】
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