(57)【要約】【課題】本発明の目的は、検体の取り違えと、検体間のコンタミネーションによる誤検出を防止することができ、医療現場で求められる高い安全性と信頼性を備えた検出方法が提供することにある。【解決手段】本発明は、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプルを、第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、第１〜第ｎのウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、第１〜第ｎのウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。【選択図】図１
2010011791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第１の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第１のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの検出核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、
互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第１〜第ｎのウェル中の第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプルを、各々第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、
第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、
第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項２】
第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第１の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第１のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域と、第１の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第１のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの検出核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域と、第ｋの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｋのネガティブコントロール固定化領域とを含み、
第１のネガティブコントロール固定化領域が、（ｎ−１）個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定され、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール固定化領域が、（ｎ−１）個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第２〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定された、
核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、
互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第１〜第ｎのウェル中の第1〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプルを、各々第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、
第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、
第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、
第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第７のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項３】
第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域と、第１の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第１のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの検出核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域と、第ｋの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｋのネガティブコントロール固定化領域とを含み、
第１のネガティブコントロール固定化領域が、１つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定され、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール固定化領域が、１つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定された、
核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、
互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第１〜第ｎのウェル中の第1〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプルを、各々第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、
第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、
第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、
第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第７のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項４】
前記第１のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第２〜第ｎのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうちの少なくとも２種が互いに直列に接合しており、かつ、
前記第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された、第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうち少なくとも２種が互いに直列に接合していることを特徴とする、請求項３に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項５】
前記第１のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第２〜第ｎのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうち少なくとも２種が互いに直列に接合しており、そのとき少なくとも１つの配列の端部が他の少なくとも１つの配列の端部と重なり合うように接合しており、かつ、
前記第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうち少なくとも２種が互いに直列に接合しており、そのとき、少なくとも１つの配列の端部が他の少なくとも１つの配列の端部と重なり合うように接合していることを特徴とする、請求項３に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項６】
第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域と、第１の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第１のネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの検出核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域と、第ｋのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｋのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップであって、
第１の核酸サンプル識別用試薬が、第１のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第１のポジティブコントロール判定用試薬と、第２〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第１のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）の核酸サンプル識別用試薬が、第ｋのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第ｋのポジティブコントロール判定用試薬と、第ｋを除く第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第１〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第ｋのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、
第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプルを、第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、
第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、
第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、
第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第７のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項７】
第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第１の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第１のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域と、第１の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｎのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域と、第ｋのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｋのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップであって、
第１の核酸サンプル識別用試薬が、第１のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第１のポジティブコントロール判定用試薬と、第２〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第２〜第ｎのポジティブコントロール用核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第１のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、
第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）の核酸サンプル識別用試薬が、第ｋのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第ｋのポジティブコントロール判定用試薬と、第ｋを除く第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第1〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第ｋのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、
第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、
第１〜第ｎの核酸サンプルを、第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、
第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、
第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、
第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第７のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項８】
前記第１のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第２〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第２〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合された複数の核酸を含み、かつ、
前記第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第ｋを除く第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第1〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合された複数の核酸を含む、ことを特徴とする、請求項７に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項９】
前記第１のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第２〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第２〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合しており、そのとき接合された各核酸の端部が他の核酸の端部と重なり合うように接合された複数の核酸を含み、かつ、
前記第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第ｋを除く第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合しており、そのとき接合された各核酸の端部が他の核酸の端部と重なり合うように接合された複数の核酸を含むことを特徴とする、請求項８に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記第１〜第ｎのウェルが、それぞれ独立した核酸サンプル検出用デバイスであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記第１〜第ｎのウェルが、１つの核酸サンプル検出用デバイス上に設けられていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複数核酸の検出方法において準備された核酸サンプル検出用デバイスと、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複数核酸の検出方法において準備された第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬と、
を含む、複数核酸を検出するためのキット。
【請求項１３】
前記第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬が、第１〜第ｎのポジティブコントロール判定用試薬と、第１〜第ｎのネガティブコントロール判定用試薬とで構成される、複数核酸を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸プローブが固定化された核酸サンプル検出用デバイスを用いて核酸サンプルを検出する方法であり、特に、一度に複数の核酸サンプルを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の分子生物学分野の発展に伴い、多くの疾患遺伝子が同定され、遺伝子診断による疾患の特定が可能となっている。また、遺伝子診断の結果に基づいて各患者に最適な治療を提供するテーラーメイド医療も実現化しつつある。
【０００３】
遺伝子診断の実効性が増加するにつれて、臨床現場で取り扱う検査数も飛躍的に増大し、多量の核酸サンプルを同時に検査する検査アレイおよび検査方法が強く切望され、その一部がすでに実現されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００５−３４５２４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、多量の核酸サンプルを同時に検査する場合、検体の取り違えやコンタミネーションの問題が生じる。遺伝子診断は、発症前診断であることが多く、診断結果に基づいてしばしば予防的治療が行なわれることから、正確な診断結果を得ることが不可欠である。
【０００５】
本発明の目的は、検体の取り違えと、検体間のコンタミネーションによる誤検出を防止することができ、医療現場で求められる高い安全性と信頼性を備えた検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（第１の実施態様）
即ち、本発明は、第１の実施態様として、第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第１の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第１のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの検出核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第１〜第ｎのウェル中の第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプルを、各々第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【０００７】
（第２の実施態様）
また、本発明は、第２の実施態様として、第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第１の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第１のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域と、第１の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第１のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの検出核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域と、第ｋの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｋのネガティブコントロール固定化領域とを含み、第１のネガティブコントロール固定化領域が、（ｎ−１）個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定され、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール固定化領域が、（ｎ−１）個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第２〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定された、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第１〜第ｎのウェル中の第1〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプルを、各々第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第７のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を検出する。
【０００８】
（第３の実施態様）
さらにまた、本発明は、第３の実施態様として、第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域と、第１の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第１のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの検出核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域と、第ｋの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｋのネガティブコントロール固定化領域とを含み、第１のネガティブコントロール固定化領域が、１つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定され、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール固定化領域が、１つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定された、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第１〜第ｎのウェル中の第1〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプルを、各々第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第７のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【０００９】
（第４の実施態様）
さらにまた、本発明は、第４の実施態様として、第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域と、第１の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第１のネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの検出核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域と、第ｋのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｋのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップであって、第１の核酸サンプル識別用試薬が、第１のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第１のポジティブコントロール判定用試薬と、第２〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第１のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）の核酸サンプル識別用試薬が、第ｋのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第ｋのポジティブコントロール判定用試薬と、第ｋを除く第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第１〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第ｋのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプルを、第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第７のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【００１０】
（第５の実施態様）
さらにまた、本発明は、第５の実施態様として、第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第１〜第ｎの核酸サンプルのそれぞれに対応する第１〜第ｎのウェルを備え、第１のウェルが、第１の検出核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域と、第１のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域と、第１の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｎのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第１のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェルが、第ｋの検出核酸プローブが固定化された第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの核酸プローブ固定化領域と、第ｋのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプルを識別するための第ｋのポジティブコントロール固定化領域と、第ｋのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第ｋの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｋのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第１のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップであって、第１の核酸サンプル識別用試薬が、第１のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第１のポジティブコントロール判定用試薬と、第２〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第２〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第２〜第ｎのポジティブコントロール用核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第１のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）の核酸サンプル識別用試薬が、第ｋのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第ｋのポジティブコントロール判定用試薬と、第ｋを除く第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第1〜第ｎのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された第ｋを除く第１〜第ｎのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第ｋのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第２のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する、第３のステップと、第１〜第ｎの核酸サンプルを、第１〜第ｎのウェルに注入する、第４のステップと、第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第５のステップと、第１〜第ｎのネガティブコントロール���定化領域における反応の有無を検出する、第６のステップと、第１〜第ｎの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第７のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の複数核酸の検出方法によって、検体の取り違えと、検体間のコンタミネーションによる誤検出を防止することができ、医療現場で求められる高い安全性と信頼性を備えた検出方法が実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜基本的構成＞
以下、（１）核酸サンプル検出用デバイス、（２）検出の手法、（３）核酸サンプル、および（４）検出の手順について説明する。
【００１３】
（１）核酸サンプル検出用デバイス
本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、例えば、基板と、基板上に複数形成された核酸プローブ固定化領域と、前記核酸プローブ固定化領域を仕切るための枠を備えることを特徴とする。前記枠は、少なくとも１以上のウェルを形成し、各ウェルが１核酸サンプルを検出するための１検査レーンを構成し、検査対象となる核酸プローブが固定化された核酸プローブ固定化領域（以下、検出核酸プローブ固定化領域という）が各ウェル中にそれぞれ形成されている。
【００１４】
前記基板および枠の材料は、特に限定されることなく、当業者に既知の任意の材料を使用することもできる。たとえば、ガラス、石英ガラス、シリコン、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を使用することができる。基板の形状には、特に制限はなく、平面形状、凹凸形状いずれでもよく、さらに多孔質体であってもよい。
【００１５】
前記核酸プローブ固定化領域は、検出核酸プローブ固定化領域と、ポジティブコントロール固定化領域と、ネガティブコントロール固定化領域とで構成される。
【００１６】
「検出核酸プローブ固定化領域」は、検査対象となる標的核酸配列の有無を検出するための領域である。例えば、ある疾患遺伝子の有無を検査する場合、その疾患遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブを固定しておくことにより、核酸サンプル中の疾患遺伝子の有無を判定することができる。検出核酸プローブ固定化領域を複数設け、それぞれに異なる塩基配列を含む核酸プローブを固定しておくことによって、複数の検出項目について同時に検査を行うことができる。なお、「疾患遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブ」とは、疾患遺伝子の少なくとも一部分と相補的な配列を有する核酸プローブを意味する。
【００１７】
「ポジティブコントロール固定化領域」は、核酸サンプルの取り違えの有無を確認するための領域である。従来の核酸サンプル検出用デバイスには、この「ポジティブコントロール固定化領域」が存在しなかったため、複数の核酸サンプルを同時に検出する場合、ある核酸サンプルを別の核酸サンプルと取り違えたとしても、その事実を確認することができなかった。一方、本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、この「ポジティブコントロール固定化領域」によって核酸サンプルの取り違えの有無を確認することができるので、サンプルの取り違えのない、高い安全性と信頼性を備えた核酸サンプル検出用デバイスを提供することができる。
【００１８】
「ネガティブコントロール固定化領域」は、コンタミネーションの有無を確認するための領域である。従来の核酸サンプル検出用デバイスには、この「ネガティブコントロール固定化領域」が存在しなかったため、複数の核酸サンプルを同時に検出する場合、ある核酸サンプル中に他の核酸サンプルが混入（コンタミネーション）したとしても、その事実を確認することができなかった。一方、本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、この「ネガティブコントロール固定化領域」によって他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）の有無を確認することができるので、コンタミネーションのない、高い安全性と信頼性を備えた核酸サンプル検出用デバイスを提供することができる。
【００１９】
前記核酸プローブ固定化領域に固定される核酸プローブの材料は、特に限定されることなく、当業者に既知の任意の材料を使用することができる。たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の核酸類似体、またはこれらのキメラ核酸を使用することができる。使用するプローブの長さは、特に制限はないが、たとえば、8〜200塩基、好ましくは10〜100塩基、さらに好ましくは12〜50塩基である。
【００２０】
前記核酸プローブ固定化領域を作製するために、核酸プローブを固定化する方法は、特に限定されることなく、当業者に既知の任意の方法を使用して固定することができる。たとえば、物理吸着、化学吸着、疎水結合、抱埋、および共有結合などによって固定化することができる。より具体的には、たとえばプローブの末端に導入したアミノ基を介して、カルボジイミドなどの縮合剤を用いて基板上に共有結合することができる。また、基板上にアニオン性の有機物を被覆しておくことで、イオン結合で固定化することもできる。さらに、プローブの末端にビオチンを導入しておくと、ビオチン-アビジン結合で固定化することもできる。また、プローブの末端にチオール基を導入しておき、基板上に被覆したチオール含有物質との間でＳ−Ｓを形成させ、強固に固定化することもできる。これらの場合、あらかじめ基板表面を官能基を有する分子で修飾しておくことによって、固定化を容易にすることができる。なお、プローブと末端の修飾基の間には基板表面とプローブとの立体障害を抑制するためにスペーサーを導入することが望ましい。スペーサー分子は特に限定されないが、たとえばアルカン骨格、アルキン骨格、アルケン骨格、エチレングリコール骨格、さらには核酸鎖であってもよい。また、分子構造は、直鎖であっても、分岐鎖であってもよい。スペーサー部分の長さは特に限定されないが、好ましくは、炭素-炭素結合に換算して10〜500、好ましくは20〜200、さらに好ましくは50〜100である。
【００２１】
基板上への核酸プローブの固定化の際には、DNAスポッターやDNAアレイヤ−と呼ばれる固定化装置を用いると比較的容易にプローブの固定化を行うことができる。この際、表面を傷つけないために、インクジェット方式や静電方式のスポッターを用いることが望ましい。また、基板表面で直接、核酸鎖の合成を行うこともできる。
【００２２】
また、核酸プローブを固定化して核酸プローブ固定化領域を形成する工程は、基板と枠を密着させる前に行うことが望ましいが、密着後であっても固定化することは可能である。さらに、本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、必ずしも核酸プローブ固定化領域に核酸プローブが固定化された状態で提供される必要はなく、核酸プローブが固定化されていない基板として提供されてもよい。この場合、核酸サンプル検出用デバイスを使用する際に、所望の核酸プローブを上述したように基板上に固定して使用する。
【００２３】
また、枠によって形成されるウェルの形状も特に限定されるものではなく、円形、四角形あるいは多角形であってもよい。また、ウェルの底が無い状態で枠を作製し、核酸プローブ固定化領域を形成した基板を作製した後に密着させて使用することにより、本実施形態の核酸検出基板の作成が容易になるであろう。枠と基板を密着させるには、接着、圧着等、液漏れを防ぐような強固な密着方法が望ましいが、シリコンのパッキンなどを利用して密着することもできる。
【００２４】
また、本実施形態の核酸検出基板は、核酸プローブ固定化領域が形成された基板と枠が、必ずしも一体として提供される必要はなく、両者が分離した状態で提供されてもよい。この場合、核酸検出基板を使用する際に、上記のように基板と枠を密着させて使用する。
【００２５】
本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、複数の核酸サンプルを検出するため、上記枠で形成されるウェルは、複数存在する。個数は特に限定されないが、好ましくは３個以上１００個であり、より好ましくは４個以上５０個以下、さらに好ましくは５個以上２０個以下である。これらのウェルは、同一デバイス中に形成されているが、必ずしも基板は１個とは限らない。１個の基板上に全ウェルが形成されてもよく、複数の基板上に複数のウェルが形成されてもよい。例えば、１つのウェルが形成された１個の基板を複数用意することによって、複数の核酸サンプルを同時に検出してもよい。この場合、１核酸サンプルの検出が１個の基板によって行われる。
【００２６】
（２）検出の手法
本発明には、当業者に既知の全ての検出の手法が含まれ、検出の手法において限定的に解釈されるべきではない。例えば、蛍光色素による蛍光強度による検出や、放射性同位元素を用いた検出、挿入剤分子の電気化学応答を用いた検出、静電容量変化による検出などを用いることができる。特に、代表的な検出手法として、蛍光による検出と電気化学的な検出がある。蛍光による検出は、結果を視覚的に認識することができるので、検出結果の判定ミスを防止することができる。一方、電気化学的な検出は、電流値のみによって検査を行うことができるので、装置の小型化、検査費用の低額化、検査時間の短縮化が可能になる。なお、電気化学的な検出を行う場合、前記各核酸プローブ固定化領域は電極として構成され、電極上に各核酸プローブが固定される。
【００２７】
蛍光による検出の場合、核酸試料を予め蛍光物質で標識しておく。例えば、蛍光物質で標識されたプライマーを使用して標的核酸をＰＣＲ増幅する。核酸プローブとハイブリッド鎖を形成した標的核酸は、洗浄後も核酸プローブ固定化領域内にとどまるため、蛍光発光が得られる。蛍光物質には、公知の任意のものを使用することができ、例えば、FITC、Cy3、Cy5またはローダミンなどが使用される。蛍光物質の発光は、蛍光検出器を用いて検出することができる。得られた蛍光発光量から各核酸プローブに対応する標的核酸の存在の有無を識別することができる。
【００２８】
さらに、蛍光検出方法において、核酸プローブ固定化領域上への核酸や蛍光色素などの非特異的な吸着を抑制するために、核酸プローブ固定化領域の表面を、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘプタノール、メルカプトエチレングリコール、メルカプトオリゴエチレングリコール、メルカプトポリエチレングリコール、炭素鎖が30〜50のアルカンチオールなどのメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質、界面活性剤、アルブミン、核酸などで被覆することが望ましい。
【００２９】
一方、電気化学的な検出の場合は、例えば、電気化学的活性を有する分子を用いる。電気化学的活性を有する分子とは、ハイブリッド鎖に結合し、電位の印加によって電子を放出する分子を意味する。前記分子には、公知の任意のものを使用することができ、例えば、ヘキスト33258（登録商標）（カルビオケム(CALBIOCHEM)より入手可能）、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーターなどが使用される。特に好ましくは、ヘキスト33258が使用される。ヘキスト33258は、化学物質p-(5-(5-(4-メチルピペラジン-1-イル)ベンズイミダゾール-2-イル)ベンズイミダゾール-2-イル)フェノールによって構成された分子である。さらに、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン（ジシクロペンタジエニル鉄）、ビオロゲンなどで修飾してもよい。前記分子の濃度は適宜選択されるが、一般的には1ng/mL〜1000ng/mLの範囲内である。この際、イオン強度0.01〜5、ｐＨ5〜10の範囲内の緩衝液を使用することができる。
【００３０】
前記分子は、前記ハイブリッド鎖を認識し、これにインターカレートする。ここで、電極に電位を印加すると、酸化還元反応が起こり、インターカレートした前記分子から電子が放出されて電流が流れる。この際、電位は定速で掃引するか、パルスで印加するか、あるいは定電位を印加してもよい。電位掃引速度は、10〜1000mV/secの範囲内である。測定の際、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。前記分子に由来する電流が電極に流れ、この電流値を測定することによって各核酸プローブに対応する標的核酸の存在の有無を検出することができる。
【００３１】
さらに、電気化学的検出方法において、核酸プローブ固定化領域（電極）上への核酸や挿入剤などの非特異的な吸着を抑制するために、電極表面を、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘプタノール、メルカプトエチレングリコール、メルカプトオリゴエチレングリコール、メルカプトポリエチレングリコール、炭素鎖が30〜50のアルカンチオールなどのメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質、界面活性剤、アルブミン、核酸などで被覆することが望ましい。
【００３２】
（３）核酸サンプル
本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスによって検出する核酸サンプルは特に限定されることなく、たとえば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、培養細胞、喀痰、食品、土壌、排水、廃水、空気など試料の試料から抽出した、あるいは抽出後に増幅処理を行うことにより得られた核酸サンプルが対象となる。本実施形態の検出方法は、たとえば、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型）、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、ヘルペス群ウイルス、アデノウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ムンプスウイルス、ヒトロタウイルス、エンテロウイルス、日本脳炎ウイルス、天然痘ウイルス、コロナウイルス、SARS、デングウイルス、風疹ウイルス、ＨＴＬＶなどのウイルス感染症、黄色ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコバクターピロリ菌、カンピロバクター、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、炭疽菌、エルシニア、淋菌、リステリア菌、レプトスピラ、レジオネラ菌、スピロヘータ、肺炎マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、マラリア、赤痢アメーバ、病原真菌などの細菌感染症、または寄生虫、真菌の検出等のために使用することができる。
【００３３】
さらに、本実施形態の検出方法は、上記感染症を発症させる微生物の型の判定（ジェノタイピング）に用いることもできる。たとえば、Ｃ型肝炎ウイルスの１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、およびヒトパピローマウイルスの癌化に関連している１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５４、５６、５８、５９、６６、６８、６９、および癌化に関連していない６、１１、３４、４０、４２、４３、４４、７０などである。さらに、薬剤耐性遺伝子を検出することもでき、たとえば、結核菌、エイズウイルス、および呼吸器感染症起因菌の薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、遺伝性疾患、網膜芽細胞腫、ウイルス腫瘍、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、神経腺維腫症、家族性乳ガン、色素性乾皮症、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃ガン、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺ガン、甲状腺腫瘍、乳腺腫瘍、泌尿器腫瘍、男性器腫瘍、女性器腫瘍、皮膚腫瘍、骨・軟部腫瘍、白血病、リンパ腫、および固形腫瘍などの腫瘍性疾患を検査することができる。また、医療以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業などで遺伝子検査が必要なものに全て適応できる。さらに、制限酵素断片多系（ＲＦＬＰ）や１塩基多型（ＳＮＰｓ）、マイクロサテライト配列などの検出もできる。また、未知の塩基配列解析に用いることもできる。
【００３４】
（４）検出の手順
試料に含まれる核酸を検出するためには、まず該試料から核酸成分の抽出を行い、核酸サンプルを得る。抽出方法は特に限定されないが、たとえばフェノール−クロロホルム法などの液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）などの市販の核酸抽出方法を利用することもできる。これらの試料をマイクロタイタープレートなどに分注して、遺伝子検出に供される。遺伝子の抽出の際、疎水性膜を保持したマイクロタイタープレートなどを用いると、より簡便に検出操作に移行することができる。抽出した核酸は、適切な溶液に溶解しておくことが好ましい。
【００３５】
核酸とプローブ固定化領域に固定されたプローブとでハイブリダイゼーション反応を際は、反応溶液として、イオン強度0.01〜5の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡ、および界面活性剤などを添加することができる。さらに、塩濃度調整用試薬や、ポジティブコントロール用試薬などを添加することができる。また、場合によっては前処理として核酸増幅反応を行ってもよい。核酸増幅反応はPCR法、LAMP法、ICAN法など、特に限定されない。次に、抽出した核酸を反応溶液に添加し、90℃以上で熱変性させる。核酸を含む反応溶液とプローブ固定化電極の接触は、変性直後または０℃に急冷後に行うこともできる。反応中は、撹拌または振とうなどの操作によって反応速度を高めることもできる。反応温度は、10℃〜90℃の範囲で、また反応時間は、１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、プローブ固定化領域の洗浄を行う。洗浄には、イオン強度0.01〜5の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。このとき、核酸を含む反応溶液中に、核酸サンプル識別用試薬を予め添加しておく。核酸サンプル識別用試薬には、ポジティブコントロール用核酸プローブ、ネガティブコントロール用核酸プローブに応じた組成が含まれる。
【００３６】
洗浄後、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。検出の手法は特に限定されることなく、上述したとおり、蛍光色素による蛍光強度による検出や、放射性同位元素を用いた検出、挿入剤分子の電気化学応答を用いた検出、静電容量変化による検出などを用いることができる。
【００３７】
本実施形態の検出方法によれば、該基板に形成された反応用ウェル毎に異なる検体に由来する試料を使用して、同時に複数の試料における核酸鎖の存在を検出することができる。
【００３８】
また、上記核酸反応および核酸検出は自動化することができる。自動化することにより、ハンドリングなどに起因する検査毎のバラつきを少なくすることができる。自動検査装置は、抽出反応、増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、洗浄反応などの反応温度を制御する温度制御系を備えることができる。温度制御系はペルティエ素子を利用したもの、電熱ヒーターを利用したものなどが使用できる。また、自動検査装置は各試薬を送液するための送液系を備えることができる。送液系は、ポンプ、配管、流速モニタ、脱気機構、気液検知モニタなどが使用できる。また、自動検査装置は二本鎖核酸、一本鎖核酸を検出するための検出系を備えることができる。検出系は、検出方式により様々だが、蛍光検出方式では、レーザー照射装置、CCDカメラなどが使用できる。電流検出方式では、２電極式もしくは３電極式の電流電圧制御装置が使用できる。また、自動検査装置は、得られた信号を元に自動判定を行う信号処理系を備えることができる。予めコンピュータに内蔵されたデータベースと閾値などを利用し、得られた信号を元にサンプル核酸の配列決定、あるいは目的核酸の有無などを判定することができる。上記自動化装置は一度に複数の核酸サンプル検出用デバイスを処理することができる。また、装置は１台で全工程を行うこともできるし、複数台で工程を分担することもできる。
【００３９】
＜本発明の実施態様＞
以下、図面を用いて本発明の実施態様について説明する。なお、以下に示す実施態様は、本発明の構成を詳細に説明するために例示的に示したものに過ぎない。従って、本発明は、以下の実施態様に記載された説明に基づいて限定解釈されるべきではない。本発明の範囲には、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内にある限り、以下の実施態様の種々の変形、改良形態を含む全ての実施態様が含まれる。
【００４０】
（１）第１の実施態様
図１
図１は、第１の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス１１を示した模式図である。核酸サンプル検出用デバイス１１は、基板１６と、基板上に複数形成された核酸プローブ固定化領域と、前記核酸プローブ固定化領域を仕切るための枠１７を備えることを特徴とする。前記枠１７は、少なくとも１以上のウェル１２を形成し、各ウェルが１核酸サンプルを検出するための１検査レーンを構成し、検査対象となる核酸プローブが固定化された検出核酸プローブ固定化領域１３が各ウェル１２中にそれぞれ形成されている。
【００４１】
第１〜第ｎのウェル１２１−ｎには、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルを注入するための注入ポート１５１−ｎ（以下、第１〜第ｎの注入ポート１５１−ｎともいう）が備え付けられている。第１のウェル１２１は、第１の核酸サンプルを検出するためのウェルであり、第ｋ（ｋは２以上の自然数）のウェル１２ｋは、第ｋの核酸サンプルを検出するためのウェルである。
【００４２】
ここで、第１のウェル１２１は、第１の核酸サンプルを検出するための検出核酸プローブ固定化領域１３１（以下、第１の検出核酸プローブ固定化領域１３１ともいう）と、第１の核酸サンプルを識別するためのポジティブコントロール固定化領域１４１（以下、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１ともいう）とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェル１２ｋは、第ｋの核酸サンプルを検出するための核酸プローブ固定化領域１３ｋ（以下、第ｋの検出核酸プローブ固定化領域１３ｋともいう）、第ｋの核酸サンプルを識別するためのポジティブコントロール固定化領域１４ｋ（以下、第ｋのポジティブコントロール固定化領域１４ｋともいう）とを含む。該構成を備える核酸サンプル検出用デバイス１１は、第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプルを検出することができる。
【００４３】
図１では、例示的に第１〜第４（ｎ＝４）の核酸サンプル（核酸サンプルＳ１〜Ｓ４）を検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス１１を示した。第１〜第４のウェル１２１−４には、それぞれ第１〜第４の核酸サンプルを注入するための第１〜第４の注入ポート１５１−４が備え付けられている。
【００４４】
「ポジティブコントロール固定化領域」には、それぞれ異なる識別用の核酸プローブが固定されている。例えば、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１には、第１のポジティブコントロールを構成する核酸プローブＣ１が固定され、第２のポジティブコントロール固定化領域１４２には、第２のポジティブコントロールを構成する核酸プローブＣ２が固定され、第３のポジティブコントロール固定化領域１４３には、第３のポジティブコントロールを構成する核酸プローブＣ３が固定され、第４のポジティブコントロール固定化領域１４４には、第４のポジティブコントロールを構成する核酸プローブＣ４が固定される。
【００４５】
「検出核酸プローブ固定化領域」には、検出対象となる１以上の標的配列に相補的な核酸プローブが、それぞれ独立した領域に固定されている。例えば検出対象となる標的配列が２以上ある場合は、検出核酸プローブ固定化領域は、２以上の独立した固定化領域を備え、各固定化領域には、それぞれ１つの標的配列に相補的な核酸プローブが固定されている。図１では、検出対象となる標的配列が４つある場合を例示しており、各ウェル中の検出用の核酸プローブ固定化領域は、それぞれ４つの独立した固定化領域を備え、各固定化領域には、それぞれ１つの標的配列に相補的な核酸プローブＤ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４が固定されている。なお、ここで「標的配列」とは、例えば検査対象となる疾患遺伝子の少なくとも１部分と相補的な配列を有することを意味する。一般的には、検査対象となる遺伝子の特徴的な配列部位に着目し、この配列部位に相補的な配列を含む核酸プローブを設計し、これを検出核酸プローブ固定化領域に固定することによって検出が行われる。
【００４６】
図２
図２は、図１に示した核酸サンプル検出用デバイス１１を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。
【００４７】
第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第１〜第ｎの核酸サンプルに添加する。第１の核酸サンプル識別用試薬は、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１に相補的な配列を有する、「第１のポジティブコントロール用核酸」を含む。第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）の核酸サンプル識別用試薬は、第ｋのポジティブコントロール固定化領域１４ｋに固定された核酸プローブＣ(ｋ)に相補的な配列を有する、第ｋのポジティブコントロール用核酸を含む。該成分を含む第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬が添加された第１〜第ｎの核酸サンプルを、第１〜第ｎのウェル中に備えられた第１〜第ｎの注入ポート１５１−ｎからそれぞれ注入することによって、第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域１４１−ｎにおけるハイブリダイゼーション反応が生じるため、これを検出することにより、第１〜第ｎの核酸サンプルにおける検体の取り違えがなかったことを確認することができる。
【００４８】
図２では、第１の核酸サンプル識別用試薬（試薬１）が第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）中に添加され（図２ａ）、第２の核酸サンプル識別用試薬（試薬２）が第２の核酸サンプル（サンプルＳ２）中に添加される（図２ｂ）。同様に、第３の核酸サンプル識別用試薬（試薬３）が第３の核酸サンプル（サンプルＳ３）中に添加され、第４の核酸サンプル識別用試薬（試薬４）が第４の核酸サンプル（サンプルＳ４）中に添加される。
【００４９】
第１の核酸サンプル識別用試薬（試薬１）は、第１のポジティブコントロール（ＰＣ）固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１と相補的な配列を有する核酸Ｔ１を含み（図２（ａ））、第２の核酸サンプル識別用試薬（試薬２）は、第２のポジティブコントロール（ＰＣ）固定化領域１４２に固定された核酸プローブＣ２と相補的な配列を有する核酸Ｔ２を含む（図２（ｂ））。同様に、第３の核酸サンプル識別用試薬（試薬３）は、第３のポジティブコントロール固定化領域１４３に固定された核酸プローブＣ３と相補的な配列を有する核酸Ｔ３を含み、第４の核酸サンプル識別用試薬（試薬４）は、第４のポジティブコントロール固定化領域１４４に固定された核酸プローブＣ４と相補的な配列を有する核酸Ｔ４を含む。
【００５０】
第１〜第４の核酸サンプル識別用試薬（試薬１〜４）を添加された第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）は、それぞれ第１〜第４のウェル１４１〜１４４に注入される。各サンプルの注入は、第１〜第４のウェル１４１〜１４４に備え付けられた第１〜第４の注入ポート１５１〜１５４を使用して行われる。例えば、第１の核酸サンプル識別用試薬（試薬１）を添加された第１の核酸サンプルが第１のウェル１２１に注入された場合、試薬１に含まれる核酸Ｔ１が、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１とハイブリダイズする（図２（ａ））。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができる。逆に、第１の核酸サンプルが誤って第２のウェル１２２に注入された場合、試薬１に含まれる核酸Ｔ１は、第２のポジティブコントロール固定化領域１４２に固定された核酸プローブＣ２とハイブリダイズすることができない。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができず、検体の取り違えがあったことを確実かつ容易に確認することができる。
【００５１】
（２）第２の実施態様
図３
図３は、第２の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス３１を示した模式図である。第２の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス３１は、各ウェル中にポジティブコントロール固定化領域１４１−ｎの他に、第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域３２１−ｎを含む。
【００５２】
第１のネガティブコントロール固定化領域３２１は、（ｎ−１）個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブＣ２〜Ｃｎがそれぞれ独立して固定され、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール固定化領域３２ｋは、（ｎ−１）個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第ｋのポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ(ｋ)を除く、第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブＣ１〜Ｃｎがそれぞれ独立して固定されている。
【００５３】
図３では、例示的に第１〜第４（ｎ＝４）の核酸サンプルを検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス３１を示した。第１のネガティブコントロール固定化領域３２１は、３つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第２、第３および第４のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ２、Ｃ３およびＣ４がそれぞれ独立して固定され、第２のネガティブコントロール固定化領域３２２は、３つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第１、第３および第４のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ１、Ｃ３およびＣ４がそれぞれ独立して固定され、第３のネガティブコントロール固定化領域３２３は、３つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第１、第２および第４のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ１、Ｃ２およびＣ４がそれぞれ独立して固定され、第４のネガティブコントロール固定化領域３２４は、３つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第１、第２および第３のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ１、Ｃ２およびＣ３がそれぞれ独立して固定されている。
【００５４】
図４
図４は、図３に示した核酸サンプル検出用デバイス３１を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。第２の実施態様の第１の実施態様との相違は、各ウェル中にネガティブコントロールを配置したことにより、核酸サンプルの取り違えのみならず、核酸サンプル中への他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）の有無を検出することができることにある。
【００５５】
第１の実施態様と同様、第１〜第４の核酸サンプル識別用試薬（試薬１〜４）を添加された第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）を、それぞれ第１〜第４のウェル１２１〜１２４に注入する。各サンプルの注入は、第１〜第４のウェル１２１〜１２４に備え付けられた第１〜第４の注入ポート１５１〜１５４を使用して行われる。例えば、第１の核酸サンプル識別用試薬（試薬１）を添加された第１の核酸サンプルが第１のウェル１２１に注入された場合、試薬１に含まれる核酸Ｔ１が、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１とハイブリダイズする（図４（ａ））。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができる。一方、試薬１に含まれる核酸Ｔ１は、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＣ２、Ｃ３およびＣ４にはいずれもハイブリダイズしない（図４（ｂ））。その結果、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１からは信号が検出されず、他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）が無かったことを確認することができる。
【００５６】
逆に、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１から信号が検出された場合、他の核酸サンプルの混入を検出することができる。例えば、第２の核酸サンプル識別用試薬（試薬２）を添加した第２の核酸サンプル（サンプルＳ２）が、第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）に混入した場合（図４（ｃ））、第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）中には、試薬２に含まれる核酸Ｔ２が混入しているので、核酸Ｔ２が、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＣ２とハイブリダイズする（図４（ｄ））。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号が検出され、他の核酸の混入（コンタミネーション）があったことを検出することができる。第２の実施態様では、各核酸サンプルの取り違えの有無を検出できるとともに、コンタミネーションの有無も検出することができるので、より安全性および信頼性の高い検出方法を提供することができる。
【００５７】
（３）第３の実施態様
図５
図５は、第３の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス５１を示した模式図である。第３の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス５１は、第２の実施形態においては複数設けられていた各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域が、１つの固定化領域で構成されていることを特徴とする。
【００５８】
第１のネガティブコントロール固定化領域は、１つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブＣ２〜Ｃ(ｎ)と同一配列の核酸プローブがともに固定され、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール固定化領域は、１つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第ｋのポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ(ｋ)を除く、第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブと同一配列の核酸プローブがともに固定されている。
【００５９】
図５では、例示的に第１〜第４（ｎ＝４）の核酸サンプルを検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス５１を示した。第１のネガティブコントロール固定化領域３２１は、１つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第２、第３および第４のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブＣ２、Ｃ３およびＣ４がともに固定され、第２のネガティブコントロール固定化領域３２２は、１つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第１、第３および第４のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブＣ１、Ｃ３およびＣ４がともに固定され、第３のネガティブコントロール固定化領域３２３は、１つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第１、第２および第４のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブＣ１、Ｃ２およびＣ４がともに固定され、第４のネガティブコントロール固定化領域３２４は、１つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第１、第２および第３のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブＣ１、Ｃ２およびＣ３がともに固定されている。
【００６０】
図６
図６は、図５に示したネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを示した模式図である。第３の実施態様の第２の実施態様との相違は、ネガティブコントロール固定化領域が１つの領域で構成されていることにある。ネガティブコントロールはポジティブコントロールとは異なり、核酸サンプル数が増加するにつれてネガティブコントロールとして必要な核酸プローブ数が増える。１つの固定化領域に複数の核酸プローブを一緒に固定すれば、核酸サンプル数が増加してもネガティブコントロール固定化領域の数を増加させる必要がなくなり、サンプル数の増減に関わらず、基板上に検査項目のための十分なスペースを恒常的に確保することができる。
【００６１】
複数のネガティブコントロールを１つの領域に配置する場合、その配置の態様には、例えば、ネガティブコントロールを構成する複数種の核酸プローブを並列的に固定化したタイプ（図６（ａ））、複数種の核酸プローブを直列的に接合した核酸鎖を固定化したタイプ（図６（ｂ））、また、複数種の核酸プローブを直列的に接合した核酸鎖であって、各核酸プローブの端部を他の核酸プローブの端部と重なり合うように配置するタイプ（図６（ｃ））などがある。複数種の核酸プローブを並列的に混在させたタイプ（図６（ａ））では、ネガティブコントロール数が増加した場合、２つまたは３つの領域に分割して固定してもよい。例えば、ネガティブコントロールが８種類の核酸プローブで構成される場合、４種類ずつを混合して２つの領域に固定する、あるいはネガティブコントロールが９種類の核酸プローブで構成される場合、３種類ずつを混合して３つの領域に固定する、などである。ネガティブコントロール数がさらに増加した場合は、さらに４つ、５つ、またはそれ以上の領域に分割して固定してもよい。
【００６２】
検査基板の小型化が進む現在、各検査スポットも微小化の傾向にある。また、同時にサンプル数の一層の増加も予想される。サンプル数の増加は、ネガティブコントロール数の増加を意味するが、将来的に実現が予想されるような極微小領域上に数多くのネガティブコントロールを並列的に混在させた場合（図６（ａ））、１つ１つのネガティブコントロールの固定量が少なくなり、結果として十分なシグナルを検出することができなくなるおそれがある。しかしながら、複数種の核酸プローブを直列的に接合し、空間的展開をすることによって（図６（ｂ））、１つ１つのネガティブコントロールの固定量を維持することができる。これによって将来的に実現が予想されるような極微小領域であっても数多くのネガティブコントロールを１つの領域に固定することができる。また、直列に接合するに際し、各核酸プローブの端部を他の核酸プローブの端部と重なり合うように配置することによって、直列接合に伴う核酸プローブの長さの増大を抑制することができ（図６（ｃ））、特にサンプル数が増加した場合に有効である。
【００６３】
図７
図７は、図５に示した核酸サンプル検出用デバイス５１を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。第３の実施態様の第２の実施態様との相違は、ネガティブコントロール固定化領域が１つの領域で構成されていることにある。ネガティブコントロール固定化領域を１つにすることによってネガティブコントロールに必要な基板上のスペースを著しく節約することができ、その効果は、サンプル数が増えれば増えるほど顕著になる。
【００６４】
第２の実施態様と同様、第１〜第４の核酸サンプル識別用試薬（試薬１〜４）を添加された第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）を、それぞれ第１〜第４のウェル１２１〜１２４に注入する。各サンプルの注入は、第１〜第４のウェル１２１〜１２４に備え付けられた第１〜第４の注入ポート１５１〜１５４を使用して行われる。例えば、第１の核酸サンプル識別用試薬（試薬１）を添加された第１の核酸サンプルが第１のウェル１２１に注入された場合、試薬１に含まれる核酸Ｔ１が、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１とハイブリダイズする（図７ａ）。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができる。一方、試薬１に含まれる核酸Ｔ１は、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＣ２、Ｃ３およびＣ４にはいずれもハイブリダイズしない（図７ｂ）。その結果、第１のネガティブコントロール固定化量領域３２１からは信号が検出されず、他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）が無かったことを確認することができる。図７では、ネガティブコントロールを構成する複数種の核酸プローブを混在して固定したタイプのネガティブコントロール固定化領域を示したが、複数種の核酸プローブを直列に接合して固定するタイプ（図６ｂ）、複数種の核酸プローブを端部を重ねながら直列に接合して固定するタイプ（図６ｃ）、いずれのタイプのネガティブコントロール固定化領域であってもよい。
【００６５】
逆に、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１から信号が検出された場合、他の核酸サンプルの混入を検出することができる。例えば、第２の核酸サンプル識別用試薬（試薬２）を添加した第２の核酸サンプル（サンプルＳ２）が、第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）に混入した場合（図７ｃ）、第１の核酸サンプル中には、試薬２に含まれる核酸Ｔ２が混入しているので、核酸Ｔ２が、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＣ２とハイブリダイズする（図７ｄ）。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号が検出され、他の核酸の混入（コンタミネーション）があったことを検出することができる。
【００６６】
第３の実施態様では、第２の実施態様と同様、各核酸サンプルの取り違えの有無を検出できるとともに、コンタミネーションの有無も検出することができるので、より安全性および信頼性の高い検出方法を提供することができる。さらに、第３の実施態様は、ネガティブコントロール固定化領域に固定される核酸プローブを１つの領域にまとめて固定しているので、核酸サンプル数が増えてもネガティブコントロール固定化領域の数を増加させる必要がない。このため、検出基板の大部分の領域を検査項目のために割り当てることができ、検査項目数の多い核酸サンプルの検出であっても小型の検出基板において一度に大量に検査することができる。
【００６７】
（４）第４の実施態様
図８
図８は、第４の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス８１を示した模式図である。第４の実施態様の特徴は、ポジティブコントロール用の試薬（「ポジティブコントロール判定用試薬」）と共に、ネガティブコントロール用の新たな試薬を調製し、この「ネガティブコントロール判定用試薬」を混合して他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）の有無を検出する点にある。
【００６８】
装置の基本的構成は、第１〜第３の実施態様と同様である。すなわち、核酸サンプル検出用デバイス８１は、第１〜第ｎの核酸サンプルを注入するための注入ポート１５１−ｎがそれぞれ備え付けられた、第１〜第ｎのウェル１２１−ｎを備える。
【００６９】
ここで、第１のウェル１２１は、第１の核酸サンプルを検出するための第１の検出核酸プローブ固定化領域１３１と、第１の核酸サンプルを識別するための第１のポジティブコントロール固定化領域１４１と、第１の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第１のネガティブコントロール固定化領域３２１とを含み、かつ、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のウェル１２ｋは、第ｋの核酸サンプルを検出するための第ｋの検出核酸プローブ固定化領域１３ｋと、第ｋの核酸サンプルを識別するためのポジティブコントロール固定化領域１４ｋと、第ｋの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第ｋのネガティブコントロール固定化領域３２ｋとを含む。
【００７０】
第１の核酸サンプルには、第１のポジティブコントロール判定用試薬と、第１のネガティブコントロール判定用試薬とが添加される。第１のポジティブコントロール判定用試薬は、第１〜第３の実施形態において説明した第１の核酸サンプル識別用試薬と同様であり、「第１のポジティブコントロール用核酸」、つまり、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１と相補的な配列を有する核酸Ｔ１を含む。一方、第１のネガティブコントロール判定用試薬は、第２〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域３２２−ｎに固定された核酸プローブＨ２〜Ｈ(ｎ)とそれぞれ相補的な配列を有する核酸Ｕ２〜Ｕ(ｎ)を含む。
【００７１】
同様に、第ｋの核酸サンプルには、第ｋのポジティブコントロール判定用試薬と、第ｋのネガティブコントロール判定用試薬とが添加される。第ｋのポジティブコントロール判定用試薬は、第ｋのポジティブコントロール固定化領域１４ｋに固定された核酸プローブＣ(ｋ)と相補的な配列を有する核酸Ｔ(ｋ)を含む。一方、第ｋのネガティブコントロール判定用試薬は、第ｋ（ｋは２〜ｎの自然数）のネガティブコントロール固定化領域３２ｋに固定された核酸プローブＨ(ｋ)と相補的な配列を有する核酸Ｕ(ｋ)を除く、第１〜第ｎのポジティブコントロール固定化領域３２１−ｎに固定された核酸プローブＨ１〜Ｈ(ｎ)とそれぞれ相補的な配列を有する核酸Ｕ１〜Ｕ(ｎ)を含む。
【００７２】
上述した第１〜第ｎのポジティブコントロール判定用試薬と、第１〜第ｎのネガティブコントロール判定用試薬を使用することによって、各ネガティブコントロール固定化領域に固定する核酸プローブを１種類に限定することができる。なお、ポジティブコントロール判定用試薬およびネガティブコントロール判定用試薬は、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬」としてもよい。また、「核酸サンプル識別用試薬」には、任意の添加剤、例えば塩濃度調整用バッファなどが含まれていてもよい。
【００７３】
図８では、例示的に第１〜第４（ｎ＝４）の核酸サンプル（核酸サンプルＳ１〜Ｓ４）を検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス８１を示した。第１〜第４のウェル１２１−４には、それぞれ第１〜第４の核酸サンプルを注入するための注入ポート１５１−４が備え付けられている。
【００７４】
「ポジティブコントロール固定化領域」には、それぞれ異なる識別用の核酸プローブＣ１〜Ｃ４が固定されている。例えば、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１には、第１のポジティブコントロールを構成する核酸プローブＣ１が固定され、第２のポジティブコントロール固定化領域１４２には、第２のポジティブコントロールを構成する核酸プローブＣ２が固定され、第３のポジティブコントロール固定化領域１４３には、第３のポジティブコントロールを構成する核酸プローブＣ３が固定され、第４のポジティブコントロール固定化領域１４４には、第４のポジティブコントロールを構成する核酸プローブＣ４が固定される。
【００７５】
「ネガティブコントロール固定化領域」には、「ポジティブコントロール固定化領域」に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４とは異なる識別用の核酸プローブＨ１〜Ｈ４が固定されている。例えば、第１のネガティブコントロール固定化領域１４１には、第１のネガティブコントロールを構成する核酸プローブＨ１が固定され、第２のネガティブコントロール固定化領域１４２には、第２のネガティブコントロールを構成する核酸プローブＨ２が固定され、第３のネガティブコントロール固定化領域１４３には、第３のネガティブコントロールを構成する核酸プローブＨ３が固定され、第４のネガティブコントロール固定化領域１４４には、第４のポジティブコントロールを構成する核酸プローブＨ４が固定される。
【００７６】
第１〜第４のポジティブコントロール判定用試薬（試薬１Ａ〜４Ａ）は第１〜第３の実施形態において説明した第１〜第４の核酸サンプル識別用試薬と同様である。
【００７７】
次に、第１〜第４のネガティブコントロール判定用試薬（試薬１Ｂ〜４Ｂ）について説明する。
【００７８】
先ず、第１のネガティブコントロール判定用試薬（試薬１Ｂ）は、第１の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬１Ｂは、第２のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２２に固定された核酸プローブＨ２と相補的な配列を有する「核酸Ｕ２」、第３のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２３に固定された核酸プローブＨ３と相補的な配列を有する「核酸Ｕ３」、第４のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２４に固定された核酸プローブＨ４と相補的な配列を有する「核酸Ｕ４」、以上３つの核酸Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４を含む試薬である。
【００７９】
第１のネガティブコントロール判定用試薬（試薬１Ｂ）は、第１のポジティブコントロール判定用試薬（試薬１Ａ）とともに第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）中に添加される。なお、試薬１Ａおよび試薬１Ｂは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬１Ｅ」としてもよい。
【００８０】
次に、第２のネガティブコントロール判定用試薬（試薬２Ｂ）は、第１の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬２Ｂは、第１のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１と相補的な配列を有する「核酸Ｕ１」、第３のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２３に固定された核酸プローブＨ３と相補的な配列を有する「核酸Ｕ３」、第４のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２４に固定された核酸プローブＨ４と相補的な配列を有する「核酸Ｕ４」、以上３つの核酸Ｕ１、Ｕ３、Ｕ４を含む試薬である。
【００８１】
第２のネガティブコントロール判定用試薬（試薬２Ｂ）は、第２のポジティブコントロール判定用試薬（試薬２Ａ）とともに第２の核酸サンプル（サンプルＳ２）中に添加される。なお、試薬２Ａおよび試薬２Ｂは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬２Ｅ」としてもよい。
【００８２】
続いて、第３のネガティブコントロール判定用試薬（試薬３Ｂ）は、第１の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬３Ｂは、第１のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１と相補的な配列を有する「核酸Ｕ１」、第２のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２２に固定された核酸プローブＨ２と相補的な配列を有する「核酸Ｕ２」、第４のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２４に固定された核酸プローブＨ４と相補的な配列を有する「核酸Ｕ４」、以上３つの核酸Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４を含む試薬である。
【００８３】
第３のネガティブコントロール判定用試薬（試薬３Ｂ）は、第３のポジティブコントロール判定用試薬（試薬３Ａ）とともに第３の核酸サンプル（サンプルＳ３）中に添加される。なお、試薬３Ａおよび試薬３Ｂは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬３Ｅ」としてもよい。
【００８４】
最後に、第４のネガティブコントロール判定用試薬（試薬４Ｂ）は、第１の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬４Ｂは、第１のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１と相補的な配列を有する「核酸Ｕ１」、第２のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２２に固定された核酸プローブＨ２と相補的な配列を有する「核酸Ｕ２」、第３のネガティブコントロール（ＮＣ）固定化領域３２３に固定された核酸プローブＨ３と相補的な配列を有する「核酸Ｕ３」、以上３つの核酸Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３を含む試薬である。
【００８５】
第４のネガティブコントロール判定用試薬（試薬４Ｂ）は、第４のポジティブコントロール判定用試薬（試薬４Ａ）とともに第４の核酸サンプル（サンプルＳ４）中に添加される。なお、試薬４Ａおよび試薬４Ｂは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬４Ｅ」としてもよい。
【００８６】
図９
図９は、図８に示した核酸サンプル検出用デバイス８１を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。
【００８７】
試薬１Ａおよび１Ｂを添加された第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）を、注入ポート１５１を介してウェル１２１に注入する。このとき、試薬１Ａに含まれる核酸Ｔ１は、ポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される（図９ａ）。一方、試薬１Ｂに含まれる核酸Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４は、いずれもネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない（図９ｂ）。
【００８８】
同様に、試薬２Ａおよび２Ｂを添加された第１の核酸サンプル（サンプルＳ２）を、注入ポート１５２を介してウェル１２２に注入する。このとき、試薬２Ａに含まれる核酸Ｔ２は、ポジティブコントロール固定化領域１４２に固定された核酸プローブＣ２にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される（図９ｃ）。一方、試薬２Ｂに含まれる核酸Ｕ１、Ｕ３、Ｕ４は、いずれもネガティブコントロール固定化領域３２２に固定された核酸プローブＨ２とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない（図９ｄ）。以下、第３の核酸サンプル（サンプルＳ３）、第４の核酸サンプル（サンプルＳ４）についても同様の反応機構が成立する。
【００８９】
ここで、第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）に第２の核酸サンプル（サンプルＳ２）が混入（コンタミネーション）した場合について説明する（図９ｅ）。サンプルＳ２がサンプルＳ１に混入した場合、サンプルＳ２に添加された試薬２Ｂ内に含まれる核酸Ｕ１が、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１とハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される（図９ｆ）。ネガティブコントロール固定化領域３２１から信号が検出されたことによって、他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）があったことを確認することができる。
【００９０】
第４の実施態様では、ネガティブコントロール判定用試薬を新たに調製し、第１〜第ｎのネガティブコントロール固定化領域に固定される核酸プローブ数をそれぞれ１種類に限定したことに特徴がある。第４の実施態様では、核酸サンプル数が増加しても各ネガティブコントロール固定化領域に固定される核酸プローブ数はつねに１種類である。従って、核酸サンプル数の増減に伴うネガティブコントロール固定化領域の設計上の変更が不要であり、簡易かつ迅速に大量の核酸プローブ検出用デバイスを提供することができる。
【００９１】
（５）第５の実施態様
図１０
図１０は、第５の実施態様における複数核酸の検出方法を示した模式図である。第５の実施態様の第４の実施態様との相違は、使用する「ネガティブコントロール判定用試薬」にある。第５の実施態様で使用するネガティブコントロール判定用試薬は、ネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＨ１〜Ｈ(ｎ)と、ポジティブコントロール判定用試薬に含まれる核酸Ｔ１〜Ｔ(ｎ)とを直列に接合させるリンカー配列を有する核酸Ｖ１〜Ｖ(ｎ)を含む。該リンカー配列を有する核酸Ｖ１〜Ｖ(ｎ)（以下、単にリンカー配列Ｖ１〜Ｖ(ｎ)ともいう）を使用することによって、ネガティブコントロールで形成されるハイブリダイズ鎖の長さが長くなるので、より高感度な検出が可能になる。
【００９２】
第５の実施態様では、第４の実施態様と同様、図８に示した核酸サンプル検出用デバイス８１を使用することができる。以下、第５の実施態様について、核酸サンプル検出用デバイス８１を使用した、第１〜第４の核酸サンプルの検出方法を例にとって説明する。
【００９３】
先ず、第１〜第４のネガティブコントロール判定用試薬（試薬１Ｂ〜４Ｂ）について説明する。
【００９４】
第１のネガティブコントロール判定用試薬（試薬１Ｂ）は、第１の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬１Ｂは、核酸Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４を含む試薬である。核酸Ｖ２は、その一端において、第２のネガティブコントロール固定化領域３２２に固定された核酸プローブＨ２と相補的な配列を有し、かつその他端において、第２のポジティブコントロール固定化領域１４２に固定された核酸プローブＣ２にハイブリダイズする「核酸Ｔ２」と相補的な配列を有する。核酸Ｖ３は、その一端において、第３のネガティブコントロール固定化領域３２３に固定された核酸プローブＨ３と相補的な配列を有し、かつその他端において、第３のポジティブコントロール固定化領域１４３に固定された核酸プローブＣ３にハイブリダイズする「核酸Ｔ３」と相補的な配列を有する。核酸Ｖ４は、その一端において、第４のネガティブコントロール固定化領域３２４に固定された核酸プローブＨ４と相補的な配列を有し、かつその他端において、第４のポジティブコントロール固定化領域１４４に固定された核酸プローブＣ４にハイブリダイズする「核酸Ｔ４」と相補的な配列を有する。
【００９５】
第１のネガティブコントロール判定用試薬（試薬１Ｂ）は、第１のポジティブコントロール判定用試薬（試薬１Ａ）とともに第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）中に添加される。なお、試薬１Ａおよび試薬１Ｂは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬１Ｅ」としてもよい。
【００９６】
次に、第２のネガティブコントロール判定用試薬（試薬２Ｂ）は、第２の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬２Ｂは、核酸Ｖ１、Ｖ３、Ｖ４を含む試薬である。核酸Ｖ１は、その一端において、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１と相補的な配列を有し、かつその他端において、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１にハイブリダイズする「核酸Ｔ１」と相補的な配列を有する。核酸Ｖ３は、その一端において、第３のネガティブコントロール固定化領域３２３に固定された核酸プローブＨ３と相補的な配列を有し、かつその他端において、第３のポジティブコントロール固定化領域１４３に固定された核酸プローブＣ３にハイブリダイズする「核酸Ｔ３」と相補的な配列を有する。核酸Ｖ４は、その一端において、第４のネガティブコントロール固定化領域３２４に固定された核酸プローブＨ４と相補的な配列を有し、かつその他端において、第４のポジティブコントロール固定化領域１４４に固定された核酸プローブＣ４にハイブリダイズする「核酸Ｔ４」と相補的は配列を有する。
【００９７】
第２のネガティブコントロール判定用試薬（試薬２Ｂ）は、第２のポジティブコントロール判定用試薬（試薬２Ａ）とともに第２の核酸サンプル（サンプルＳ２）中に添加される。なお、試薬２Ａおよび試薬２Ｂは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬２Ｅ」としてもよい。
【００９８】
続いて、第３のネガティブコントロール判定用試薬（試薬３Ｂ）は、第３の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬３Ｂは、核酸Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４を含む試薬である。核酸Ｖ１は、その一端において、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１と相補的な配列を有し、かつその他端において、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１にハイブリダイズする「核酸Ｔ１」と相補的な配列を有する。核酸Ｖ２は、その一端において、第２のネガティブコントロール固定化領域３２２に固定された核酸プローブＨ２と相補的な配列を有し、かつその他端において、第２のポジティブコントロール固定化領域１４２に固定された核酸プローブＣ２にハイブリダイズする「核酸Ｔ２」と相補的な配列を有する。核酸Ｖ４は、その一端において、第４のネガティブコントロール固定化領域３２４に固定された核酸プローブＨ４と相補的な配列を有し、かつその他端において、第４のポジティブコントロール固定化領域１４４に固定された核酸プローブＣ４にハイブリダイズする「核酸Ｔ４」と相補的は配列を有する。
【００９９】
第３のネガティブコントロール判定用試薬（試薬３Ｂ）は、第３のポジティブコントロール判定用試薬（試薬３Ａ）とともに第３の核酸サンプル（サンプルＳ３）中に添加される。なお、試薬３Ａおよび試薬３Ｂは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬３Ｅ」としてもよい。
【０１００】
最後に、第４のネガティブコントロール判定用試薬（試薬４Ｂ）は、第４の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬４Ｂは、核酸Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３を含む試薬である。核酸Ｖ１は、その一端において、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１と相補的な配列を有し、かつその他端において、第１のポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１にハイブリダイズする「核酸Ｔ１」と相補的な配列を有する。核酸Ｖ２は、その一端において、第２のネガティブコントロール固定化領域３２２に固定された核酸プローブＨ２と相補的な配列を有し、かつその他端において、第２のポジティブコントロール固定化領域１４２に固定された核酸プローブＣ２にハイブリダイズする「核酸Ｔ２」と相補的な配列を有する。核酸Ｖ３は、その一端において、第３のネガティブコントロール固定化領域３２３に固定された核酸プローブＨ３と相補的な配列を有し、かつその他端において、第３のポジティブコントロール固定化領域１４３に固定された核酸プローブＣ３にハイブリダイズする「核酸Ｔ３」と相補的は配列を有する。
【０１０１】
第４のネガティブコントロール判定用試薬（試薬４Ｂ）は、第４のポジティブコントロール判定用試薬（試薬４Ａ）とともに第４の核酸サンプル（サンプルＳ４）中に添加される。なお、試薬４Ａおよび試薬４Ｂは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬４Ｅ」としてもよい。
【０１０２】
次に、第５の実施態様における検出機構について説明する。
【０１０３】
試薬１Ａおよび１Ｂを添加された第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）を、注入ポート１５１を介してウェル１２１に注入する。このとき、試薬１Ａに含まれる核酸Ｔ１は、ポジティブコントロール固定化領域１４１に固定された核酸プローブＣ１にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される（図１０ａ）。一方、試薬１Ｂに含まれる核酸Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４は、いずれもネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない（図１０ｂ）。
【０１０４】
同様に、試薬２Ａおよび２Ｂを添加された第１の核酸サンプル（サンプルＳ２）を、注入ポート１５２を介してウェル１２２に注入する。このとき、試薬２Ａに含まれる核酸Ｔ２は、ポジティブコントロール固定化領域１４２に固定された核酸プローブＣ２にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される（図１０ｃ）。一方、試薬２Ｂに含まれる核酸Ｖ１、Ｖ３、Ｖ４は、いずれもネガティブコントロール固定化領域３２２に固定された核酸プローブＨ２とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない（図１０ｄ）。以下、第３の核酸サンプル（サンプルＳ３）、第４の核酸サンプル（サンプルＳ４）についても同様の反応機構が成立する。
【０１０５】
ここで、第１の核酸サンプル（サンプルＳ１）に第２の核酸サンプル（サンプルＳ２）が混入（コンタミネーション）した場合について説明する（図１０ｅ）。サンプルＳ２がサンプルＳ１に混入した場合、サンプルＳ２に添加された試薬２Ｂ中に含まれる核酸Ｖ１が、その一端において、第１のネガティブコントロール固定化領域３２１に固定された核酸プローブＨ１とハイブリダイズする。このとき、核酸Ｖ１の他端の一本鎖部分に、試薬１Ａ中に含まれる核酸Ｔ１がハイブリダイズし、全体として長い二本鎖領域が形成される（図１０ｆ）。二本鎖領域を特異的に認識するような検出方法を採用した場合、例えば、電気化学的検出方法においては、長い二本鎖領域により多くの挿入剤が結合できるので、検出される電気量も多くなり、結果としてより高感度な検出が実現される。したがって、他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）の有無をより正確かつ確実に検出することができる。
【０１０６】
図１１
図１０に示したネガティブコントロール判定用試薬のうち、第１のネガティブコントロール判定用試薬（試薬１Ｂ）を構成する核酸の態様を模式的に示した図である。
【０１０７】
試薬１Ｂには、試薬１Ｂに含まれる核酸Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４を、それぞれ独立した核酸として調製するタイプ（図１１ａ）、互いに直列に接合して１つの核酸として調製するタイプ（図１１ａ）、および各核酸プローブの端部が他の核酸プローブの端部と重なり合うように互いに直列に接合することによって、配列の全長を短く設計したタイプ（図１１ｃ）がある。なお、当然ながら、第２〜第ｎのネガティブコントロール判定用試薬（試薬２Ｂ〜(ｎ)Ｂ）についても同様のタイプがある。
【０１０８】
核酸サンプル数の増加に伴いネガティブコントロール判定用試薬に含まれる核酸の種類も増加する。各核酸試薬を直列に接合することにより（図１１ｂ）、独立した核酸の種類を減らすことができ、迅速かつ容易にネガティブコントロール判定用試薬を提供することができる。また、各核酸を直列に接合した場合、その端部を重ね合わせることにより（図１１ｃ）、各核酸の全長を短く設計することができ、特に、核酸サンプル数が増加した場合に有効である。
【０１０９】
（６）核酸サンプル検出用キット
上述した第１〜第５の実施態様において使用される核酸サンプル検出用キットを提供することができる。該核酸サンプル検出用キットには、第１〜第５の実施態様において使用される核酸サンプル検出用デバイスと、第１〜第ｎ（ｎは２以上の自然数）の核酸サンプル識別用試薬とが含まれる。核酸サンプル検出用デバイスの検出核酸プローブ固定化領域には、検査対象となる特定の疾患遺伝子に相補的な配列を有する核酸プローブが固定されており、複数の核酸サンプルをキットに含まれる核酸サンプル識別用試薬で処理後、核酸サンプル検出用デバイスに注入することによって、同時かつ迅速な検査結果を得ることができる。
【０１１０】
キットに含まれる核酸サンプル検出用デバイスは、１核酸サンプルを検出するための各検査レーンが１つの基板に一体に形成されていてもよいし、あるいは各検査レーンが独立した基体に形成されていてもよい。さらに、例えば、８つの核酸サンプルを検出するために４つの検査レーンを含む基板が２つ用意されていたり、９つの核酸サンプルを検出するために３つの検査レーンを含む基板が３つ用意されているものであってもよい。
【０１１１】
また、第１〜第ｎの核酸サンプル識別用試薬が、それぞれ独立した第１〜第ｎのポジティブコントロール判定用試薬と、第１〜第ｎのネガティブコントロール判定用試薬とで構成されてもよいし、任意の添加剤、例えば塩濃度調整用バッファなどが試薬として存在していてもよい。
【実施例】
【０１１２】
実施例１（第１の実施態様）
１．使用機器、使用材料等
（１）核酸検出用デバイス
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図１に示したとおりである。すなわち、１つのポジティブコントロール固定化領域と、１以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。本実施例では、図１に示したとおり、検出項目数を４とし、核酸プローブＤ１〜Ｄ４がそれぞれ独立して固定された、４つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。
【０１１３】
また、本実施例では、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。すなわち、各ウェルに形成された複数の核酸プローブ固定化領域は、いずれも金電極を備え、各固定化領域で形成された２本鎖核酸に由来した電気的信号を検出することができる。電気的信号は、２本鎖核酸に特異的に結合する挿入剤によって得ることができる。本実施例では、挿入剤として「ヘキスト33258」を使用した。
【０１１４】
（２）核酸プローブ
ポジティブコントロール固定化領域１４１−４に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４の配列は、以下のとおりである。  
C1: TTCAGTTATGTGGATGAT
C2: TCAGTTATGTCGATGATG
C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
検出核酸プローブ固定化領域１３１−４に固定された核酸プローブＤ１〜Ｄ４の配列は、以下のとおりである。  
D1: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
【０１１５】
（３）判定用試薬
ポジティブコントロール判定試薬（試薬１〜４）に含まれる核酸Ｔ１〜Ｔ４の配列は、以下のとおりである。  
試薬１（核酸T1（C1と相補的な配列）を含有）
試薬２（核酸T2（C2と相補的な配列）を含有）
試薬３（核酸T3（C3と相補的な配列）を含有）
試薬４（核酸T4（C4と相補的な配列）を含有）。
【０１１６】
（４）核酸サンプル
検出対象となる第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）の配列は、以下の配列を含む。  
サンプルS1:（検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む）
サンプルS2:（検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む）
サンプルS3：（検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む）
サンプルS4：（検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む）
２．実験手順
第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬（試薬１〜４）を添加した。次に、サンプルＳ１〜Ｓ４を、それぞれ注入ポートを介して第１〜第４のウェルに注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第１〜第４の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第１〜第４の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図１２に示した。
【０１１７】
次に、サンプルの入れ違えを模擬するため、S1とS2を故意に入れ替えて同様の検出を行った。電流値の測定結果を示したグラフを図１３に示した。
【０１１８】
３．実験結果
図１２は、サンプルＳ１〜Ｓ４のそれぞれについて検出された電流値を棒グラフで表わしたものである。Ｓ１〜Ｓ４は、第１〜第４の各核酸サンプルＳ１〜Ｓ４を意味する。ポジティブコントロール用プローブ（ＰＣＰ）は、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４における電流値を示す。検出用プローブ（ＤＰ）は、検出核酸プローブ固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された４つの核酸プローブＤ１〜Ｄ４における電流値を示す。
【０１１９】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、核酸が２本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出される。逆に、２本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。なお、わずかながら電流値が検出される理由は、洗浄作業において完全に除去できなかった非特異的な吸着核酸によるものと考えられる。
【０１２０】
図１２をみると、４つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ（ＰＣＰ）から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルＳ１では、61nA、核酸サンプルＳ２では、72nA、核酸サンプルＳ３では、62nA、核酸サンプルＳ４では、69nAの電流値が検出された。
【０１２１】
そして、検出核酸プローブ固定化領域Ｄ１〜Ｄ４から得られた電流値から各核酸サンプルに含まれる核酸の配列を特定することができた。すなわち、核酸サンプルＳ１では、核酸プローブＤ１において82nAが検出され、核酸サンプルＳ１には核酸プローブＤ１に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルＳ２では、核酸プローブＤ２において62nAが検出され、核酸サンプルＳ２には核酸プローブＤ２に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルＳ３では、核酸プローブＤ３において73nAが検出され、核酸サンプルＳ３には核酸プローブＤ３に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらにまた、核酸サンプルＳ４では、核酸プローブＤ４において66nAが検出され、核酸サンプルＳ4には核酸プローブＤ４に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【０１２２】
次に図１３をみると、第１のウェルと第２のウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ（ＰＣＰ）から閾値以上の電流値が得られておらず、核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルＳ１では、19nA、核酸サンプルＳ２では、17nA、核酸サンプルＳ３では、70nA、核酸サンプルＳ４では、72nAの電流値が検出された。
【０１２３】
その他、核酸サンプルＳ３、Ｓ４については、サンプルの入れ違えが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルＳ３では、核酸プローブＤ３において66nAが検出され、核酸サンプルＳ３には核酸プローブＤ３に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルＳ４では、核酸プローブＤ４において73nAが検出され、核酸サンプルＳ４には核酸プローブＤ４に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【０１２４】
実施例２（第２の実施態様）
１．使用機器、使用材料等
（１）核酸検出用デバイス
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図３に示したとおりである。すなわち、１つのポジティブコントロール固定化領域と、３つのネガティブコントロール固定化領域と、１以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。本実施例では、図３に示したとおり、検出項目数を４とし、核酸プローブＤ１〜Ｄ４がそれぞれ独立して固定された、４つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例１と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【０１２５】
（２）核酸プローブ、判定用試薬
いずれも、実施例１に示したとおりである。なお、実施例２では、ネガティブコントロール固定化領域３２１−４を使用する。ネガティブコントロール固定化領域３２１−４に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４は、ポジティブコントロール固定化領域１４１−４に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４と同一である。
【０１２６】
（３）核酸サンプル
検出対象となる第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）の配列は、以下の配列を含む。  
サンプルS1:（検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む）
サンプルS2:（検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む）
サンプルS3：（検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む）
サンプルS4：（検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む）。
【０１２７】
２．実験手順
第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬（試薬１〜４）を添加した。次に、サンプルＳ１〜Ｓ４を、それぞれ注入ポートを介して第１〜第４のウェルに注入したが、サンプルの混入を模擬するため、第１のウェルにはＳ１とＳ２を故意に混合したサンプル（Ｓ１＋Ｓ２）を注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第１〜第４の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第１〜第４の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第１〜第４の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例１と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図１４に示した。
【０１２８】
３．実験結果
図１３は、サンプルＳ１〜Ｓ４のそれぞれについて検出された電流値を棒グラフで表わしたものである。Ｓ１〜Ｓ４は、第１〜第４の各核酸サンプルＳ１〜Ｓ４を意味する。ポジティブコントロール用プローブ（ＰＣＰ）は、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４における電流値を示す。ネガティブコントロール用プローブ（ＮＣＰ）は、ネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４における電流値を示す。検出用プローブ（ＤＰ）は、検出核酸プローブ固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された４つの核酸プローブＤ１〜Ｄ４における電流値を示す。
【０１２９】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例１と同様、核酸が２本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、２本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【０１３０】
図１４をみると、４つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ（ＰＣＰ）から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルＳ１では、71nA、核酸サンプルＳ２では、66nA、核酸サンプルＳ３では、70nA、核酸サンプルＳ４では、73nAの電流値が検出された。
【０１３１】
また、第１のウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ（ＮＣＰ）から閾値以上の電流値が得られており、他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）があったことを正しく確認することができた。
【０１３２】
その他、核酸サンプルＳ２、Ｓ３、Ｓ４については、サンプルの入れ違えが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルＳ２では、核酸プローブＤ２において72nAが検出され、核酸サンプルＳ２には核酸プローブＤ２に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルＳ３では、核酸プローブＤ３において69nAが検出され、核酸サンプルＳ３には核酸プローブＤ３に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルＳ４では、核酸プローブＤ４において72nAが検出され、核酸サンプルＳ４には核酸プローブＤ４に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【０１３３】
実施例３（第３の実施態様）
１．使用機器、使用材料等 
（１）核酸検出用デバイス
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図５に示したとおりである。すなわち、１つのポジティブコントロール固定化領域と、１つのネガティブコントロール固定化領域と、１以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。１つのネガティブコントロール固定化領域には、３種類の異なる核酸プローブが混在して固定されている。本実施例では、図５に示したとおり、検出項目数を４とし、核酸プローブＤ１〜Ｄ４がそれぞれ独立して固定された、４つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例１および２と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【０１３４】
（２）核酸プローブ、判定用試薬
いずれも、実施例１に示したとおりである。なお、実施例３では、ネガティブコントロール固定化領域３２１−４を使用する。ネガティブコントロール固定化領域３２１−４に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４は、ポジティブコントロール固定化領域１４１−４に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４と同一である。
【０１３５】
（３）核酸サンプル
検出対象となる第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）の配列は、以下の配列を含む。  
サンプルS1:（検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む）
サンプルS2:（検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む）
サンプルS3：（検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む）
サンプルS4：（検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む）。
【０１３６】
２．実験手順
第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬（試薬１〜４）を添加した。次に、サンプルＳ１〜Ｓ４を、それぞれ注入ポートを介して第１〜第４のウェルに注入したが、サンプルの入れ違えを模擬するため、S３とS４を故意に入れ替えて注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第１〜第４の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第１〜第４の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第１〜第４の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例１と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図１５に示した。
【０１３７】
３．実験結果
図１５に示す各記号は、図１４と同じである。なお、本実施例では、１つのポジティブコントロール固定化領域に３種類の核酸プローブが混在して固定されている。
【０１３８】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例１および２と同様、核酸が２本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、２本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【０１３９】
図１５をみると、第３のウェルと第４のウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ（ＰＣＰ）から閾値以上の電流値が得られておらず、核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルＳ１では、62nA、核酸サンプルＳ２では、68nA、核酸サンプルＳ３では、22nA、核酸サンプルＳ４では、25nAの電流値が検出された。
【０１４０】
また、第３のウェルと第４のウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ（ＮＣＰ）から閾値以上の電流値が得られており、この結果からも核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。
【０１４１】
その他、核酸サンプルＳ１、Ｓ２については、コンタミネーションが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルＳ１では、核酸プローブＤ１において65nAが検出され、核酸サンプルＳ１には核酸プローブＤ１に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルＳ２では、核酸プローブＤ２において72nAが検出され、核酸サンプルＳ２には核酸プローブＤ２に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【０１４２】
実施例４（第４の実施態様）
１．使用機器、使用材料等
（１）核酸検出用デバイス
本実施例では、実施例１〜３で使用したポジティブコントロール用判定試薬１Ａ〜４Ａの他に、ネガティブコントロール用判定試薬１Ｂ〜４Ｂを使用して、検体の取り違えやコンタミネーションの有無を検出する。
【０１４３】
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図８に示したとおりである。すなわち、１つのポジティブコントロール固定化領域と、１つのネガティブコントロール固定化領域と、１以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。１つのネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４とは異なる、核酸プローブＨ１〜Ｈ４が固定されている。核酸プローブＨ１〜Ｈ４は、ネガティブコントロールコントロール用の試薬１Ｂ〜４Ｂによって検出する。本実施例では、図８に示したとおり、検出項目数を４とし、核酸プローブＤ１〜Ｄ４がそれぞれ独立して固定された、４つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例１〜３と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【０１４４】
（２）核酸プローブ
ポジティブコントロール固定化領域１４１−４に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４の配列は、以下のとおりである（実施例１と同じ）。  
C1: TTCAGTTATGTGGATGAT
C2: TCAGTTATGTCGATGATG
C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
ネガティブコントロール固定化領域３２１−４に固定された核酸プローブＨ１〜Ｈ４の配列は、以下のとおりである。  
H1: TCCGGGCGCAGAAAC
H2: GTGCTGCAGGTGCG
H3: CGTGATGACACCAAG
H4: ATGCTTTCCGTGGCA
検出核酸プローブ固定化領域１３１−４に固定された核酸プローブＤ１〜Ｄ４の配列は、以下のとおりである（実施例１と同じ）。  
D1: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
【０１４５】
（３）判定用試薬
ポジティブコントロール判定試薬（試薬１Ａ〜４Ａ）に含まれる核酸Ｔ１〜Ｔ４の配列は、以下のとおりである。  
試薬１Ａ（核酸T1（C1と相補的な配列）を含有）
試薬２Ａ（核酸T2（C2と相補的な配列）を含有）
試薬３Ａ（核酸T3（C3と相補的な配列）を含有）
試薬４Ａ（核酸T4（C4と相補的な配列）を含有）
ネガティブコントロール判定試薬（試薬１Ｂ〜４Ｂ）に含まれる核酸Ｖ１〜Ｖ４の配列は、以下のとおりである。  
試薬１Ｂ（核酸U1（H1と相補的な配列）を含有）
試薬２Ｂ（核酸U2（H2と相補的な配列）を含有）
試薬３Ｂ（核酸U3（H3と相補的な配列）を含有）
試薬４Ｂ（核酸U4（H4と相補的な配列）を含有）。
【０１４６】
（４）核酸サンプル
検出対象となる第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）の配列は、以下の配列を含む。
【０１４７】
サンプルS1:（検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む）
サンプルS2:（検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む）
サンプルS3：（検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む）
サンプルS4：（検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む）
２．実験手順
第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬（試薬１Ａ〜４Ａ）およびネガティブコントロール判定試薬（試薬１Ｂ〜４Ｂ）を添加した。次に、サンプルＳ１〜Ｓ４を、それぞれ注入ポートを介して第１〜第４のウェルに注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第１〜第４の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第１〜第４の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第１〜第４の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例１と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図１６に示した。
【０１４８】
次に、サンプルの入れ違えを模擬するため、S1とS2を故意に入れ替えて同様の検出を行った。電流値の測定結果を示したグラフを図１７に示した。
【０１４９】
３．実験結果
図１６に示す各記号は、図１４および１５と同じである。なお、本実施例のネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４とは異なる、核酸プローブＨ１〜Ｈ４が固定されている。
【０１５０】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例１〜３と同様、核酸が２本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、２本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【０１５１】
図１６をみると、４つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ（ＰＣＰ）から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルＳ１では、60nA、核酸サンプルＳ２では、72nA、核酸サンプルＳ３では、68nA、核酸サンプルＳ４では、71nAの電流値が検出された。
【０１５２】
また、４つの全てのウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ（ＮＣＰ）から閾値40nA以上の電流値が得られなかったことから、他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）も無かったことを確認することができた。
【０１５３】
そして、検出核酸プローブ固定化領域Ｄ１〜Ｄ４から得られた電流値から各核酸サンプルに含まれる核酸の配列を特定することができた。すなわち、核酸サンプルＳ１では、核酸プローブＤ１において56nAが検出され、核酸サンプルＳ１には核酸プローブＤ１に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルＳ２では、核酸プローブＤ２において67nAが検出され、核酸サンプルＳ２には核酸プローブＤ２に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルＳ３では、核酸プローブＤ３において56nAが検出され、核酸サンプルＳ３には核酸プローブＤ３に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらにまた、核酸サンプルＳ４では、核酸プローブＤ４において72nAが検出され、核酸サンプルＳ４には核酸プローブＤ４に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【０１５４】
次に図１７をみると、第１のウェルと第２のウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ（ＰＣＰ）から閾値以上の電流値が得られておらず、核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルＳ１では、18nA、核酸サンプルＳ２では、16nA、核酸サンプルＳ３では、78nA、核酸サンプルＳ４では、81nAの電流値が検出された。
【０１５５】
その他、核酸サンプルＳ３、Ｓ４については、サンプルの入れ違えが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルＳ３では、核酸プローブＤ３において62nAが検出され、核酸サンプルＳ３には核酸プローブＤ３に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルＳ４では、核酸プローブＤ４において71nAが検出され、核酸サンプルＳ４には核酸プローブＤ４に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【０１５６】
実施例５（第５の実施態様）
１．使用機器、使用材料等
（１）核酸検出用デバイス
本実施例では、実施例１〜４で使用したポジティブコントロール用判定試薬１Ａ〜４Ａの他に、ネガティブコントロール用判定試薬１Ｂ〜４Ｂを使用して、検体の取り違えやコンタミネーションの有無を検出する。
【０１５７】
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図８に示したとおりである。すなわち、１つのポジティブコントロール固定化領域と、１つのネガティブコントロール固定化領域と、１以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。１つのネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４とは異なる、核酸プローブＨ１〜Ｈ４が固定されている。核酸プローブＨ１〜Ｈ４は、ネガティブコントロールコントロール用の試薬１Ｂ〜４Ｂによって検出する。本実施例では、図８に示したとおり、検出項目数を４とし、核酸プローブＤ１〜Ｄ４がそれぞれ独立して固定された、４つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例１〜４と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【０１５８】
（２）核酸プローブ
ポジティブコントロール固定化領域１４１−４に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４の配列は、以下のとおりである（実施例１と同じ）。  
C1: TTCAGTTATGTGGATGAT
C2: TCAGTTATGTCGATGATG
C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
ネガティブコントロール固定化領域３２１−４に固定された核酸プローブＨ１〜Ｈ４の配列は、以下のとおりである。  
H1: TCCGGGCGCAGAAAC
H2: GTGCTGCAGGTGCG
H3: CGTGATGACACCAAG
H4: ATGCTTTCCGTGGCA
検出核酸プローブ固定化領域１３１−４に固定された核酸プローブＤ１〜Ｄ４の配列は、以下のとおりである（実施例１と同じ）。  
D1: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
【０１５９】
（３）判定用試薬
ポジティブコントロール判定試薬（試薬１Ａ〜４Ａ）に含まれる核酸Ｔ１〜Ｔ４の配列は、以下のとおりである。  
試薬１Ａ（核酸T1（C1と相補的な配列）を含有）
試薬２Ａ（核酸T2（C2と相補的な配列）を含有）
試薬３Ａ（核酸T3（C3と相補的な配列）を含有）
試薬４Ａ（核酸T4（C4と相補的な配列）を含有）
ネガティブコントロール判定試薬（試薬１Ｂ〜４Ｂ）に含まれる核酸Ｖ１〜Ｖ４の配列は、以下のとおりである。  
試薬１Ｂ（核酸V1（H1と相補的な配列＋T1と相補的な配列）を含有）
試薬２Ｂ（核酸V2（H2と相補的な配列＋T2と相補的な配列）を含有）
試薬３Ｂ（核酸V3（H3と相補的な配列＋T3と相補的な配列）を含有）
試薬４Ｂ（核酸V4（H4と相補的な配列＋T4と相補的な配列）を含有）。
【０１６０】
（４）核酸サンプル
検出対象となる第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）の配列は、以下の配列を含む。
【０１６１】
サンプルS1:（検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む）
サンプルS2:（検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む）
サンプルS3：（検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む）
サンプルS4：（検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む）
２．実験手順
第１〜第４の核酸サンプル（サンプルＳ１〜Ｓ４）に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬（試薬１Ａ〜４Ａ）およびネガティブコントロール判定試薬（試薬１Ｂ〜４Ｂ）を添加した。次に、サンプルＳ１〜Ｓ４を、それぞれ注入ポートを介して第１〜第４のウェルに注入したが、サンプルの混入を模擬するため、第３のウェルにはＳ３とＳ４を故意に混合したサンプル（Ｓ３＋Ｓ４）を注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第１〜第４の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第１〜第４の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第１〜第４の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例１と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図１８に示した。
【０１６２】
３．実験結果
図１８に示す各記号は、図１７と同じである。なお、本実施例のネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブＣ１〜Ｃ４とは異なる、核酸プローブＨ１〜Ｈ４が固定されている。
【０１６３】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例１〜４と同様、核酸が２本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、２本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【０１６４】
図１８をみると、４つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ（ＰＣＰ）から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルＳ１では、66nA、核酸サンプルＳ２では、65nA、核酸サンプルＳ３では、77nA、核酸サンプルＳ４では、81nAの電流値が検出された。
【０１６５】
また、第３のウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ（ＮＣＰ）から閾値以上の電流値が得られており、他の核酸サンプルの混入（コンタミネーション）があったことを正しく確認することができたことがわかった。
【０１６６】
その他、核酸サンプルＳ１、Ｓ２、Ｓ４については、サンプルの混入が無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルＳ１では、核酸プローブＤ１において63nAが検出され、核酸サンプルＳ１には核酸プローブＤ１に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルＳ２では、核酸プローブＤ２において72nAが検出され、核酸サンプルＳ２には核酸プローブＤ２に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルＳ４では、核酸プローブＤ４において62nAが検出され、核酸サンプルＳ４には核酸プローブＤ４に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】第１の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス１１を示した模式図
【図２】図１に示した核酸サンプル検出用デバイス１１を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図３】第２の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス３１を示した模式図
【図４】図３に示した核酸サンプル検出用デバイス３１を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図５】第３の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス５１を示した模式図
【図６】図５に示したネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを示した模式図
【図７】図５に示した核酸サンプル検出用デバイス５１を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図８】第４の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス８１を示した模式図
【図９】図８に示した核酸サンプル検出用デバイス８１を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図１０】第５の実施態様における複数核酸の検出方法を示した模式図
【図１１】図１０に示したネガティブコントロール判定用試薬に含まれる複数種の核酸を模式的に示した図
【図１２】第１の実施態様においてサンプルＳ１〜Ｓ４から検出された電流値を表わした第１の棒グラフ
【図１３】第１の実施態様においてサンプルＳ１〜Ｓ４から検出された電流値を表わした第２の棒グラフ
【図１４】第２の実施態様においてサンプルＳ１〜Ｓ４から検出された電流値を表わした棒グラフ
【図１５】第３の実施態様においてサンプルＳ１〜Ｓ４から検出された電流値を表わした棒グラフ
【図１６】第４の実施態様においてサンプルＳ１〜Ｓ４から検出された電流値を表わした第１の棒グラフ
【図１７】第４の実施態様においてサンプルＳ１〜Ｓ４から検出された電流値を表わした第２の棒グラフ
【図１８】第５の実施態様においてサンプルＳ１〜Ｓ４から検出された電流値を表わした棒グラフ
【符号の説明】
【０１６８】
１１、３１、５１、８１・・・核酸サンプル検出用デバイス、１２・・・ウェル、１３・・・検出核酸プローブ固定化領域、１４・・・ポジティブコントロール固定化領域、１５・・・注入ポート、１６・・・基板、１７・・・枠、３２・・・ネガティブコントロール固定化領域。
【図１】
2010011791.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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