(57)【要約】【解決課題】Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎを含まない無担体１７７Ｌｕを分離・精製して、標識率の高い１７７Ｌｕ−抗体を提供する。【解決手段】１７６Ｙｂ２Ｏ３を原子炉で照射し、照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を得る工程と、照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を塩酸に溶解したＨＣｌ溶液をＨＰＬＣに通して１７７ＬｕとターゲットであるＹｂとを分離する工程と、分離したＬｕフラクションを陽イオン交換カラムに通して１７７Ｌｕを分離する工程と、を含む１７７Ｌｕの分離・精製方法。ＨＰＬＣを用いる分離工程において、あらかじめ陽イオン交換及びキレート交換により精製した溶離液を使用すること、及び陽イオン交換を用いる１７７Ｌｕの分離工程の後にさらに１７７Ｌｕを含む溶液を陰イオン交換カラムに通してＦｅを除去する工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１７６Ｙｂ２Ｏ３を原子炉で照射し、照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を得る工程と、
照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を塩酸に溶解したＨＣｌ溶液をＨＰＬＣに通して１７７ＬｕとターゲットであるＹｂとを分離する工程と、
分離したＬｕフラクションを陽イオン交換カラムに通して１７７Ｌｕを分離する工程と、を含む１７７Ｌｕの分離・精製方法であって、
ＨＰＬＣを用いる分離工程において、あらかじめ陽イオン交換及びキレート交換により精製した溶離液を使用すること、及び
陽イオン交換を用いる１７７Ｌｕの分離工程の後にさらに１７７Ｌｕを含む溶液を陰イオン交換カラムに通してＦｅを除去する工程を含むこと、
を特徴とする１７７Ｌｕの分離・精製方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって分離・精製された１７７Ｌｕ最終溶液を蒸発乾固し、酸溶液に溶解させた後、キレート剤−抗体溶液を添加して反応させ、１７７Ｌｕ−キレート剤−抗体を合成する工程を含む、１７７Ｌｕ−キレート剤−抗体の製造方法。
【請求項３】
前記キレート剤−抗体溶液は、ホウ酸緩衝液中でキレート剤と抗体とを反応させ、次いで酢酸緩衝液を通したゲル濾過カラムで精製することによって得られ、
前記１７７Ｌｕ−キレート剤−抗体は、得られた当該キレート剤−抗体溶液を１７７Ｌｕ酸溶液に加えて反応させることによって得られる
ことを特徴とする請求項１に記載の１７７Ｌｕ−キレート剤−抗体の製造方法。
【請求項４】
前記キレート剤は、ポリアザポリカルボン酸誘導体及びポリアミノポリカルボン酸誘導体から選択される、請求項２又は３に記載の製造方法。
【請求項５】
ポリアザポリカルボン酸誘導体は１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）及び１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ，Ｎ''，Ｎ''−四酢酸（ＴＥＴＡ）から選択され、
ポリアミノポリカルボン酸誘導体は、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−五酢酸（（ＤＴＰＡ）及びエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸（ＥＤＴＡ）から選択される、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記抗体は、ＮｕＢ２、Ｅｒｂ−Ｂ２、ＣＤ２２、ＣＥＡ、ＰＭＳＡ、ＣＡ−ＩＸＧ２５０／ＭＮから選択される、
請求項２〜５のいずれか１項に記載の１７７Ｌｕ−キレート剤−抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体標識が可能な無担体１７７Ｌｕの分離精製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＩ（放射性同位元素）を用いた癌治療は、ＲＩ標識薬剤を体内に投与して癌細胞に特異的に集積させ、当該ＲＩから放射される飛程の短い放射線を病巣の組織や細胞に照射することによって、目的とする病巣の組織や細胞を破壊して疾患を治療する方法であり、正常な身体組織や細胞への放射線の影響を低く抑えることができ、副作用が少ないことから、患者のＱＯＬ（生活の質）の向上が期待できる方法である。しかしながら、ＲＩ標識薬剤の癌集積性の向上及び非ターゲット臓器への集積の低減など、解決すべき課題が多く実用化は未だ限られている。
【０００３】
現在国内で使用されている癌治療用ＲＩは、１３１Ｉ、８９Ｓｒ及び９０Ｙの３種であり、すべてβ線放出ＲＩである。これらβ線の組織中の飛程は、数〜数十ミリメートル程度であり、小〜中サイズの腫瘍の照射に適当な長さである。また、癌治療に有用なβ線を放出するＲＩは、数時間〜数日の範囲の適当な半減期を持つものが多く、さらに、多様な化学的性質を有する。加えて、体外からの画像化に適したガンマ線を放出する場合には、治療レベルの高線量での投与に先立ち、低い線量で生体内分布を確認することができるので、最適な放射性薬剤の投与量の決定に寄与できる。さらに、モニタリングすることにより癌の治療状況を的確に把握することができると共に、各組織の吸収線量の評価を治療と同時に行うことができる。
【０００４】
ＲＩを癌治療に利用するには、その物理的性質（半減期、β線エネルギー）に加え、ＲＩの比放射能（安定同位体に対する放射性同位体の割合）も重要な要素の一つである。すなわち、治療効果を高めるためには、より多くのβ線エネルギーをターゲットの癌組織に照射することが必要であるため、比放射能が高いＲＩが有利である。１７７Ｌｕは、半減期が６．７３日、β線の最大エネルギーが４９８ｋｅＶ、組織中のβ線の飛程が１．８ｍｍと短く、画像化に適した１１３ｋｅＶと２０８ｋｅＶのγ線を放出する。さらに、ルテチウムは、臨床応用が認められたイットリウム（９０Ｙ）と同族元素であり、化学的特性が類似しているため、９０Ｙ標識薬剤の開発で蓄積された知見を有効に活用することができる。
【０００５】
癌治療用の放射性同位元素として有望視されている１７７Ｌｕの製造方法には、原子炉を用いた直接法と間接法の２種類がある。
【０００６】
直接法は、１７６Ｌｕ（ｎ，γ）１７７Ｌｕ反応により１７７Ｌｕを製造する方法であり、ターゲットとしてＬｕを用いる。直接法により製造される１７７Ｌｕには安定同位元素であるＬｕ担体が含まれる。
【０００７】
間接法は、１７６Ｙｂ（ｎ，γ）１７７Ｙｂ（半減期１．９１時間）→１７７Ｌｕ反応により製造する方法であり、ターゲットとしてＹｂを用いる。間接法により製造される１７７Ｌｕには安定同位元素であるＬｕ担体が含まれない。すなわち、無担体１７７Ｌｕを得ることができる。
【０００８】
１７７Ｌｕを癌治療に用いる方法として、癌細胞に発現する抗原に特異的に結合可能な抗体に１７７Ｌｕを標識した１７７Ｌｕ−抗体を作製し、体内に投与して癌治療を行なう方法がある。この治療法の場合、安定同位元素であるＬｕ担体を含んでいると、１７７Ｌｕ−抗体の標識率が低くなるとともに、体内においては、抗原に１７７Ｌｕ−抗体以外に安定Ｌｕ−抗体が結合して、１７７Ｌｕの治療効果を低下させる。そこで、このような癌治療法には間接法で製造した無担体１７７Ｌｕを用いる必要がある。
【０００９】
癌治療に用いる１７７Ｌｕ−抗体は、無担体１７７Ｌｕと、1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,N’,N’’,N’’’-tetraacetic acid（ＤＯＴＡ）を抗体に結合させたＤＯＴＡ−抗体とを反応させることによって得ることができる。
【００１０】
間接法で製造した無担体１７７Ｌｕの製造、分離・精製法は橋本らの"Production of No-carrier-added 177Lu via the 176Lu(n, γ)177Yb→177Lu process", K. Hashimoto, H. Matsuoka, S. Uchida, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol. 255, No. 3 (2003)575-579に報告されている。
【００１１】
橋本らの論文に記載されている分離・精製方法は逆相シリカゲルカラムを用いた方法であり、その手順は以下の通りである。
【００１２】
１７６Ｙｂ２Ｏ３を原子炉で照射し、照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を得る。次いで、照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を塩酸と過酸化水素水で溶解して蒸発乾固の後０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液とする。この溶液をＨＰＬＣ（逆相シリカゲルカラム：Waters Resolve  Ｃ１８  Radial-Pack  ８ｍｍφ×３００ｍｍ）にチャージし、溶離液として０．２５Ｍ  ２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）／０．１Ｍ  １−オクタンスルホン酸ナトリウム（１−ＯＳ）を用い、流速２ｍｌ／ｍｉｎで、１７７ＬｕとターゲットであるＹｂとを分離する。分離したＬｕフラクションを陽イオン交換カラム（Bio Rad社製ＡＧ５０ＷＸ，８ｍｍφ×２０ｍｍ）に通してＬｕを樹脂に吸着させておき、０．１Ｍ  ＨＣｌを流して２−ＨＩＢＡ／１−ＯＳを完全に除去した後、６Ｍ  ＨＣｌで１７７Ｌｕを溶離し、蒸発乾固を行なって標識実験用とする。
【００１３】
しかし、橋本らの従来方法では、分離精製後の１７７ＬｕにＣａ、Ｆｅ、Ｚｎが大量に含まれており、ＤＯＴＡ−抗体とＣａ、Ｆｅ、Ｚｎが優先的に結合してＣａ−抗体、Ｆｅ−抗体、Ｚｎ−抗体を作り、もはや１７７ＬｕはＤＯＴＡ−抗体と結合できなくなってしまい、１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−抗体の標識ができない、という問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】"Production of No-carrier-added 177Lu via the 176Lu(n, γ)177Yb→177Lu process", K. Hashimoto, H. Matsuoka, S. Uchida, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol. 255, No. 3 (2003)575-579
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎを含まない無担体１７７Ｌｕを分離・精製して、標識率の高い１７７Ｌｕ抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは鋭意研究の結果、１７７Ｌｕと抗体との結合を阻害するＣａ、Ｆｅ、Ｚｎの混入の原因が主に溶離液中に含まれる不純物であることを突き止め、溶離液をあらかじめ精製すること及び分離工程の最後に不純物を除去する工程を加えることで、上記課題を解決できることを知見した。
【００１７】
すなわち、本発明によれば、１７６Ｙｂ２Ｏ３を原子炉で照射し、照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を得る工程と、照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を塩酸に溶解したＨＣｌ溶液をＨＰＬＣに通して１７７ＬｕとターゲットであるＹｂとを分離する工程と、分離したＬｕフラクションを陽イオン交換カラムに通して１７７Ｌｕを分離する工程と、を含む１７７Ｌｕの分離・精製方法であって、ＨＰＬＣを用いる分離工程において、あらかじめ陽イオン交換及びキレート交換により精製した溶離液を使用すること、及び陽イオン交換を用いる１７７Ｌｕの分離工程の後にさらに１７７Ｌｕを含む溶液を陰イオン交換カラムに通してＦｅを除去する工程を含むこと、を特徴とする分離・精製方法が提供される。
【００１８】
ＨＰＬＣとしては、充填剤としてシリカゲルを用いた逆相シリカゲルカラムを用いることができる。
【００１９】
ＨＰＬＣで用いる溶離液としては、従来法と同様に０．２５Ｍ  ２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）／０．１Ｍ  １−オクタンスルホン酸ナトリウム（１−ＯＳ）を用いることができる。ただし、本発明においては、溶離液をＨＰＬＣカラムに通す前に、あらかじめ陽イオン交換及びキレート交換によって精製しておくことが必要である。溶離液の精製に使用することができる陽イオン交換樹脂としてはスルホン酸型イオン交換樹脂が好ましく、具体的にはＡＧ５６０Ｗｘ８（Bio Rad社製）を挙げることができる。キレート樹脂としてはイミノ二酢酸型キレート樹脂が好ましく、具体的にはＣｈｅｌｅｘ−１００（Bio Rad社製）を挙げることができる。
【００２０】
Ｌｕフラクションから１７７Ｌｕを分離する工程において使用することができる陽イオン交換カラムに充填する陽イオン交換樹脂としては、スルホン酸型イオン交換樹脂が好ましく、具体的にはＡＧ５６０Ｗｘ８（Bio Rad社製）を挙げることができる。
【００２１】
分離後の１７７Ｌｕを含む溶液からＦｅを除去する工程において使用することができる陰イオン交換カラムに充填することができる陰イオン交換樹脂としては、トリメチルアンモニウム型、具体的にはＡＧ１ｘ８（Bio Rad社製）、を挙げることができる。また、この樹脂ではＦｅだけでなく、Ｚｎ、Ｇａ、Ｍｏ等、いろいろな元素を除去することができる。
【００２２】
また、本発明によれば、上述の方法で分離・精製された１７７Ｌｕ最終溶液を蒸発乾固し、酢酸溶液とした後、抗体溶液を添加して反応させ、１７７Ｌｕ−抗体を合成する工程を含む、１７７Ｌｕ−抗体の製造方法が提供される。
【００２３】
１７７Ｌｕに抗体を結合させるためには、まずキレート剤を抗体に結合させ、次いで、キレート剤−抗体を１７７Ｌｕに結合させる。このとき使用することができるキレート剤としては、ポリアザポリカルボン酸誘導体及びポリアミノポリカルボン酸誘導体を好ましく用いることができる。ポリアザポリカルボン酸誘導体としては、特に１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,N’,N’’,N’’’-tetraacetic acid（ＤＯＴＡ））、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＴＥＴＡ）を挙げることができ、ポリアミノポリカルボン酸誘導体としては、特にジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸（Diethylenetriamine-N,N,N',N",N"-pentaacetic acid（ＤＴＰＡ））、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸（ＥＤＴＡ）を挙げることができる。
【００２４】
キレート剤と結合させる抗体としては、悪性リンパ腫に多く発現するＣＤ２０抗原を認識するＮｕＢ２、乳癌、肺癌の治療を目的とする抗Ｅｒｂ−Ｂ２抗体（trastuzumab）、悪性リンパ腫の治療を目的とする抗ＣＤ２２抗体（epratuzumab）、転移性大腸癌の治療を目的とする抗ＣＥＡ抗体（cT84.66）、前立腺癌の治療を目的とする抗ＰＭＳＡ抗体（J591）、転移性腎細胞癌の治療を目的とする抗ＣＡ−ＩＸＧ２５０／ＭＮ抗体（cG250）などを挙げることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、無担体１７７Ｌｕの精製純度を向上させることができるので、１７７Ｌｕ−キレート剤−抗体の標識率を大幅に向上させることができる。１７７Ｌｕは半減期が６．７３日と癌治療に適しており、また最大エネルギー４９８ｋｅＶのβ線を放出するため、癌治療に有望な核種である。本発明で分離・精製した１７７Ｌｕを用いて、癌細胞に発現する抗原に特異的に結合する１７７Ｌｕ−抗体を用いた癌治療の研究の進展が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明による１７７Ｌｕの分離精製フローである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、実施例を参照しながら本発明を具体的に説明する。
【００２８】
図１に本発明の１７７Ｌｕの分離精製フローを示す。１７７Ｌｕを得るためにターゲットである１７６Ｙｂ２Ｏ３を原子炉で照射して、照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を得る（３）。照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を塩酸に溶解したＨＣｌ溶液をＨＰＬＣ逆相シリカゲルカラムに通して１７７ＬｕとターゲットであるＹｂとを分離する（４）。このとき、２−ＨＩＢＡを陽イオン交換カラムに通して不純物を除去し（１）、１−ＯＳをキレート交換カラムに通して不純物を除去し（２）、両者を当量混合して溶離液を調製し、ＨＰＬＣカラムに導入する。分離したＬｕフラクションを陽イオン交換カラムに通して１７７Ｌｕを吸着させ、ＨＰＬＣの溶離液を除去して、１７７Ｌｕを分離する（５）。分離した１７７Ｌｕを含む溶液を陰イオン交換カラムに通して、Ｆｅを除去する（６）。精製された１７７Ｌｕを含む溶液を得る（７）。
【実施例】
【００２９】
（１）溶離液の調製
陽イオン交換樹脂ＡＧ５０Ｗｘ８（Bio Rad製）を１５ｍｍφ×１１３ｍｍのカラムに詰めて陽イオン交換カラムを調製した。この陽イオン交換カラムに、０．５Ｍ  ２−ＨＩＢＡ（２−ヒドロキシイソ酪酸）溶液を流し、２−ＨＩＢＡの精製を行なった。
【００３０】
キレート樹脂Ｃｈｅｌｅｘ−１００を１５ｍｍφ×１１３ｍｍのカラムに詰めてキレート交換カラムを調製した。このキレート交換カラムに、０．２Ｍ  １−ＯＳ（１−オクタンスルホン酸ナトリウム）溶液を流し、１−ＯＳの精製を行なった。
【００３１】
０．５Ｍ  ２−ＨＩＢＡ溶液と０．２Ｍ  １−ＯＳ溶液を当量混合して０．２５Ｍ  ２−ＨＩＢＡ／０．１Ｍ  １−ＯＳ溶液を調製した。
（２）無担体１７７Ｌｕの製造
１７６Ｙｂ２Ｏ３を原子炉（日本原子力研究開発機構のＪＲＲ３ＨＲ−２孔（１×１０１４ｎ．ｃｍ-２．ｓ-１．））を用いて６時間照射した。
【００３２】
照射済み１７６Ｙｂ２Ｏ３を６Ｍ塩酸３ｍＬと３０％過酸化水素水２ｍＬで溶解し、蒸発乾固させて０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液としてＨＰＬＣ（カラム：Waters Resolve  Ｃ１８  Radial-Pack  ８ｍｍφ×３００ｍｍ）に仕込んだ。あらかじめ精製した溶離液（０．２５Ｍ  ２−ＨＩＢＡ／０．１Ｍ  １−ＯＳ溶液）をＨＰＬＣカラムに通して、ターゲットであるＹｂから１７７Ｌｕを分離した。
【００３３】
分離した１７７Ｌｕフラクションを陽イオン交換カラム（Bio Rad製  ＡＧ５０ＷＸ８、８ｍｍφ×２０ｍｍ）に通してＬｕを樹脂に吸着させておき、０．１Ｍ  ＨＣｌを流して２−ＨＩＢＡ／１−ＯＳを完全に除去した。次いで、陽イオン交換カラムに６Ｍ  ＨＣｌを流して１７７Ｌｕを溶離した。
【００３４】
最後に、溶離した１７７Ｌｕを含む溶出液を陰イオン交換カラム（Bio Rad製の陰イオン交換樹脂ＡＧ１ｘ８を８ｍｍφ×２０ｍｍのカラムに詰めた）に通して、１７７Ｌｕ最終溶液を得た。
（３）１７７Ｌｕ最終溶液中の不純物含有量
比較のため、対照１（ＨＰＬＣ溶離液の精製を行わず、ＨＰＬＣ溶出液の陰イオン交換による精製も行わなかった。従来方法と同じ）及び対照２（ＨＰＬＣ溶離液の精製は行ったが、ＨＰＬＣ溶出液の陰イオン交換による精製は行わなかった）を調製した。
（４）抗体標識
１７７Ｌｕ最終溶液を蒸発乾固し、０．１Ｍ酢酸３５μｌを加えて溶解させた。これに３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝６）を７μｌ及び５ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡ−ＮｕＢ２抗体溶液を２６μｌ加えて、４０℃で１．５時間反応させて、１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＮｕＢ２を合成した。なお、ＤＯＴＡ−ＮｕＢ２抗体溶液の調製は以下のように行った。
【００３５】
５００μＬのホウ酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ＝８）中のＮｕＢ２に、５μＬ  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジルエステル）（1,4,7,10-tetraazacyclodocecane-N,N’,N’’,N’’’-tetracetic acid mono (N-hydroxysuccinimidyl ester)）（ｍＤＯＴＡ）を加え、１５時間室温で反応させた後、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝６）を通したゲルろ過カラムで精製した。
【００３６】
次に、合成された１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＮｕＢ２を含む溶液に１００ｍＭのＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）を添加して、未反応の１７７Ｌｕを１７７Ｌｕ−ＥＤＴＡとした。
【００３７】
標識率は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）で求めた。具体的には、合成した１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＮｕＢ２を含む溶液をＴＬＣペーパー（Gelman Science Inc.のＩＴＬＣ  ＳＧ）にスポットして生理食塩水で展開し１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＮｕＢ２と１７７Ｌｕ−ＥＤＴＡを分離して、それぞれの放射能を測定した。Ｇｅ検出器で１７７Ｌｕの２０８ｋｅＶのγ線を測定することにより放射能量を求めた。なお、本実験は抗体標識のため、２０ＭＢｑ程度の放射能を使用しているが、動物の治療には１００〜２００ＭＢｑが必要となる。
【００３８】
標識率は下記式で求めた。
【００３９】
標識率（％）＝177Lu -DOTA-NuB2の放射能量／標識に使用した177Luの放射能量×100
なお、「標識に使用した177Luの放射能量」は１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＮｕＢ２と１７７Ｌｕ−ＥＤＴＡに別れ、生成した１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＮｕＢ２の割合が標識率となる。
【００４０】
本発明による実施例並びに対照１及び対照２について、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎの残留量測定結果及び標識率を表１に示す。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
表１より、本発明の分離・精製方法を行った実施例では従来法と比較してＣａ、Ｆｅ、Ｚｎの残留量が大幅に減少し、標識率が大幅に向上したことがわかる。
【図１】
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