(57)【要約】【課題】グルカゴン様ペプチドの提供およびその治療への使用。【解決手段】脊椎動物のGLP-2および少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、置換またはN末端もしくはC末端アミノ酸ブロッキング基を有するアミノ酸が組み込まれているという点で脊椎動物のGLP-2と異なっている腸管栄養性の脊椎動物GLP-2類似体から選択されるGLP-2ペプチド、および製剤学的に許容される担体を含んでなり、ただしGLP-2ペプチドがヒトGLP-2である場合、該担体は0.9％食塩水それ自体でない、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物のGLP-2および少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、置換またはN末端もしくはC末端アミノ酸ブロッキング基を有するアミノ酸が組み込まれているという点で脊椎動物のGLP-2と異なっている腸管栄養性の脊椎動物GLP-2類似体から選択されるGLP-2ペプチド、および製剤学的に許容される担体を含んでなり、ただしGLP-2ペプチドがヒトGLP-2である場合、該担体は0.9％食塩水それ自体でない、医薬組成物。
【請求項２】
脊椎動物のGLP-2および少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、置換またはN末端もしくはC末端アミノ酸ブロッキング基を有するアミノ酸が組み込まれているという点で脊椎動物のGLP-2と異なっている腸管栄養性の脊椎動物GLP-2類似体から選択されるGLP-2ペプチド、および製剤学的に許容される担体を含んでなる、発熱性物質の存在しない医薬組成物。
【請求項３】
脊椎動物のGLP-2および少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、置換またはN末端もしくはC末端アミノ酸ブロッキング基を有するアミノ酸が組み込まれているという点で脊椎動物のGLP-2と異なっている腸管栄養性の脊椎動物GLP-2類似体から選択されるGLP-2ペプチド、および製剤学的に許容される担体を含んでなる、濾過滅菌されている医薬組成物。
【請求項４】
GLP-2ペプチドが次式：
2010159259.tif 000004
(式中、aa1、aa2、aa3、aa4、aa5およびaa6は任意のアミノ酸残基を表し、
XはHis、ArgおよびLysから選択される1または2個のアミノ酸であり、
YはHis、ArgおよぴLysから選択される1または2個のアミノ酸であり・
mは0または1であり、
nはOまたは1であり、
RlはHまたはN末端ブロッキング基であり、そして
R2はOHまたはC末端ブロッキング基である)
で表される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
aa1がMet、Leu、lle、Va1およびCysから選択され、
aa2がA1a、Ser、Thr、Pro、Gly、Asn、Asp、GluおよびGlnから選択され、
aa3がA1a、Ser、Thr、ProおよびGlyから選択され、
aa4がHis、ArgおよびLysから選択され、
aa5がMet、Leu、lle、ValおよびCysから選択され、
aa6がAsn、Asp、Glu、G1n、His、ArgおよびLysから選択される、
請求項4に記載の医薬組成物。
【請求項６】
GLP-2ぺプチドが次のアミノ酸配列:
2010159259.tif 000005
を有する、請求項5に記載の医薬組成物。
【請求項７】
GLP-2ペプチドが脊椎動物のGLP-2である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
GLP-2ペプチドが哺乳動物のGLP-2である、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項９】
GLP-2ペプチドがラットGLP-2である、請求項8に記載の医薬組成物.
【請求項１０】
GLP-2がヒトGLP-2または、ヒトGLP-2に対して、少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、置換またはN末端もしくはC末端ブロッキング基が組み込まれている腸管栄養性のヒトGLP-2類似体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
GLP-2ペプチドがヒトGLP-2である、請求項10に記載の医薬組成物.
【請求項１２】
脊椎動物のGLP-2ペプチドに対して、少なくとも1個のアミノ酸の置換、欠失、付加、またはN末端もしくはC末端ブロッキング基が組み込まれている腸管栄養性の脊椎動物GLP-2ペプチド類似体、および製剤学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
注射または注入により投与するのに適した液体形態にある、請求項1〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
医薬組成物の投与後に該GLP-2ペプチドの遅延放出を引き起こすために製剤化された、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
経口送達用に製剤化された、諸求項1〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
GLP-2が胃腸組織の成長を促進させるのに有効な量で存在する、請求項I〜15のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
GLP-2ペプチドが膵島の成長を促進させるのに有効な量で存在する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
製剤学的に許容されるGLP-2ペプチドの酸付加塩。
【請求項１９】
GLP-2ペプチドが哺乳動物のGLP-2ペプチドである、請求項18に記載の製剤学的に許容されるGLP-2ペプチドの酸付加塩。
【請求項２０】
GLP-2ペプチドがヒトGLP-2である、請求項19に記載の製剤学的に許容されるGLP-2ペプチドの酸付加塩。
【請求項２１】
新規な腸管栄養性ペプチドを同定する方法であって、
a)  少なくとも1個のアミノ酸の置換、欠失、付加、またはブロッキング基をもつアミノ酸を有する、腸管栄養性の脊椎動物GLP-2ペプチドの類似体を取得し、
b)  ラットGLP-2のために利用したとき腸管栄養効果を引き出すことができるレジメを用いて、哺乳動物を上記類似体で治療し、そして
c)  偽治療した対照の哺乳動物と比べて、小腸の重さおよび/または陰窩＋絨毛の高さおよび/または膵島の大きさに及ぼす上記類似体の効果を判定し、その結果として上記重さおよび/または上記高さおよび/または上記大きさの増加を引き出す類似体として上記腸管栄養性ペプチドを同定する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２２】
胃腸組織の成長および/または機能を促進させる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物を製造するためのGLP-2ペプチドの使用。
【請求項２３】
前記医薬組成物が小腸組織の成長および/または機能を促進させるためのものである、請求項22に記載のGLP-2ペプチドの使用。
【請求項２４】
前記医薬組成物が胃腸の症状、障害または疾病を予防または治療するためのものである、請求項22に記載のGLP-2ペプチドの使用。
【請求項２５】
前記医薬組成物が潰瘍、消化障害、吸収不良症候群、短胃腸症候群、盲腸症候群、炎症性腸疾患、セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、限局性腸炎(クローン病)、毒性の薬剤または他の化学療法剤による小腸損傷、および短腸症候群よリ成る群がら選ばれる胃腸の疾病、障害、または症状を治療するためのものである、請求項24に記載のGLP-2ペプチドの使用。
【請求項２６】
前記医薬組成物が短腸症候群を治療するためのものである、請求項25に記載のGLP-2ペプチドの使用。
【請求項２７】
前記医薬組成物が潰瘍、消化障害、吸収不良症候群、短胃腸症候群、盲腸症候群、炎症性腸疾患、セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、限局性腸炎(クローン病)、毒性の薬剤または他の化学療法剤による小腸損傷、および短腸症候群より成る群がら選ばれる胃腸の疾病、障害、または症状を予防するためのものである、請求項24に記載のGLP-2ペプチドの使用。
【請求項２８】
前記医薬組成物が化学療法剤による小腸損傷を予防するためのものである、請求項27に記載のGLP-2ペプチドの使用。
【請求項２９】
膵島の成長を促進する、請求項1〜15および17のいずれか1項に記載の医薬組成物を製造するためのGLP-2ペプチドの使用。
【請求項３０】
糖尿病治療用の、請求項17に記載の医薬組成物を製造するためのGLP-2ペプチドの使用。
【請求項３１】
哺乳動物のGLP-2に対して、少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、置換またはN末端もしくはC末端にブロッキング基が組み込まれており、かつ腸管栄養活性を有するGLP-2ペプチド類似体。
【請求項３２】
ヒトGLP-2類似体である、請求項33に記載のGLP-2ペプチド類似体。
【請求項３３】
胃腸組織のアポトーシスを抑制する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物を製造するためのGLP-2ペプチドの使用。
【請求項３４】
請求項1〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物を含有するバイアルまたはアンプル、および胃腸障害または疾病を治療するためにその内容物を投与するための説明書を含んでなる包装品。
【請求項３５】
請求項18〜20のいずれか1項に記載の製剤学的に許容されるGLP-2の塩および製剤学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃腸組織増殖促進特性を有するグルカゴン関連ペプチド、ならびに、胃腸組織、たとえば腸ならびに膵臓の組織の成長不全あるいは消失によって生じる各種の医学的状態を治療するにあたっての、グルカゴン関連ペプチドの治療への使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン遺伝子を発現させると、１６０残基のプログルカゴン生成物からプロセシングされる組織特異的な各種のペプチド生成物が得られる。こうしたペプチドのプログルカゴン前駆物質内での編成状態を、アングラーフィッシュ、ラット、ハムスター及びウシの膵臓由来のプレプログルカゴンのｃＤＮＡの分子クローニングによって解明した。こうした分析によって、プレプログルカゴンが、グルカゴン及びグリセンチンの配列のみならず、さらに２種のグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２）を含んでいることがわかった。このＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２は、２種のスペーサーペプチドあるいは介在ペプチド（ＩＰ−ＩならびにＩＰ−ＩＩ）によって、グルカゴンから、そして互いに隔てられている。これらのペプチドは、古典的プロホルモン切断部位に特徴的な一対の塩基性アミノ酸によってそれぞれ挟まれており、このことから、プログルカゴンの翻訳後プロセシングの後に、これらのペプチドが放出される可能性が示唆される（Drucker, Pancreas, 1990, 5(4): 484(非特許文献１)）。
【０００３】
脾臓のランゲルハンス島でプログルカゴンから放出されたペプチドを分析すると、たとえば、解放された一次膵臓ペプチドが２９マーのグルカゴンであるのに対し、グリセンチン、オキシントモジュリン、ＩＰ−ＩＩ及びグルカゴン様ペプチドは、小腸や大腸中の方に多く見られるということが示唆される。このように、グルカゴン様ペプチドが腸内に見いだされることが実証されたことから、こうした新規に見いだされた腸ペプチドの詳細な構造ならびに推定される機能についての研究がすすむこととなった。そうした研究の大半は、ＧＬＰ−１を対象としており、これは、いくつかの証拠から、ＧＬＰ−１が新規で重要な調節ペプチドであることが示唆されたからである。実際に、ＧＬＰ−１は、膵臓のβ細胞上の受容体との相互作用を介してグルコース依存的に媒介される作用であるインスリンの放出に際して、既知のペプチド刺激では最も有力なものであることがわかった。ＧＬＰ−１及びその誘導体は、糖尿病の治療への使用をめざして開発途上にある。
【０００４】
グリセンチン及びオキシントモジュリンといったいわゆる「腸グルカゴン」の生理学上の役割も研究過程にあり、特に、酸の分泌及び腸細胞の成長の調節に関して研究が進んでいる。オキシントモジュリンは、ペンタガストリンによって刺激される胃酸分泌を用量依存的に阻害しうる。腸の適応の変化及び腸粘膜の成長を媒介するにあたってのグリセンチンの役割も研究されており、グリセンチンの腸管栄養性作用及びその治療への使用が、１９９４年８月３１日に公開されたマツノ（Matsuno）らのEP 612,531(特許文献１)に報告されている。
【０００５】
こうしたＧＬＰ−１や他のグルカゴン関連ペプチドの場合に対し、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−２）の生理学上の役割については、ヒト、ラット、ウシ、ブタ、モルモット、ハムスター及びデグーといった種に由来する各種のＧＬＰ−２相同対が単離され、配列決定されているにもかかわらず、ほとんど知見が得られていない。ＧＬＰ−２が、膵臓抽出物中でなく、主に腸抽出物中に存在することが、合成ＧＬＰ−２に対して産生させたＧＬＰ−２抗血清を使用することにより、さまざまなグループによって測定されている（Mojsovら, J. Biol. Chem., 1986, 261(25): 11880(非特許文献２)；Orskovら, Endocrinology, 1986, 119(4): 1467(非特許文献３)、Diabetologia 1987, 30: 874(非特許文献４)、ならびにFEBS Letters, 1989, 247(2): 193(非特許文献５)；Georgeら, FEBS Letters, 1985, 192(2): 275(非特許文献６)）。その生物学上の役割については、Hooseinら（FEBS Letters, 1984, 178(1): 83(非特許文献７)）が、ＧＬＰ−２が、ラットの肝臓ならびに脳組織との結合についてグルカゴンと競合しているわけではなく、肝臓血漿膜でのアデニレートシクラーゼの産生を刺激しているわけでもないが、なぜか、３０−５０pMの濃度では、ラットの視床下部及び下垂体膜の双方においてアデニレートシクラーゼを刺激可能であることを報告している。ＧＬＰ−２が生理学上有している役割の解明が望まれていることは、明らかといえよう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】EP 612,531
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Drucker, Pancreas, 1990, 5(4): 484
【非特許文献２】Mojsovら, J. Biol. Chem., 1986, 261(25): 11880
【非特許文献３】Orskovら, Endocrinology, 1986, 119(4): 1467
【非特許文献４】Diabetologia 1987, 30: 874
【非特許文献５】FEBS Letters, 1989, 247(2): 193
【非特許文献６】Georgeら, FEBS Letters, 1985, 192(2): 275
【非特許文献７】Hooseinら FEBS Letters, 1984, 178(1): 83
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
今回、ＧＬＰ−２が、栄養性物質として作用して胃腸組織の成長を促進することがわかった。ＧＬＰ−２の効果は、特に、小腸の成長の増大によって示唆されるので、本明細書では、この効果を「腸管栄養」効果と称することとする。驚くべきことに、ＧＬＰ−２の成長促進効果は、膵島の成長にもあらわれ、具体的には、膵島が拡大、増殖する。したがって、本発明の、一般的目的は、ＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２類似体を、治療目的ならびに治療関連目的で開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
より具体的には、本発明の１つの態様では、調剤し、その後患者に投与するのに適した製剤学的に許容される剤型のＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２類似体が提供される。
【００１０】
本発明の別の態様では、ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体、及び製剤学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、胃腸組織の成長及び増殖を必要としている患者の胃腸組織、たとえば、小腸ならびに膵島組織の増殖及び成長を促進させるにあたって、胃腸組織の成長を促進するのに有効な量のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を患者に送達する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様では、新規な腸管栄養性ＧＬＰ−２類似体を同定するうえで有用な方法が提供され、この方法は、
１）  少なくとも１個のアミノ酸の置換、欠失、付加、またはブロッキンング基をもつアミノ酸を有する腸管栄養性ＧＬＰ−２類似体を得、
２）  ラットＧＬＰ−２のために利用したとき腸管栄養効果を引き出すことができるレジメを用いて、哺乳動物を上記類似体で治療し、そして
３）  偽治療した対照の哺乳動物と比べて、小腸の重さ、および／または陰窩＋絨毛の高さおよび／または膵島の大きさに及ぼす上記類自体の効果を判定し、その結果として上記重さおよび／または上記高さおよび／または上記大きさの増加を引き出す類似体として上記腸管栄養性ペプチドを同定する、
工程を含むものである。
【００１３】
本発明の別の態様では、脊椎動物ＧＬＰ−２の腸管栄養性類似体の形態の新規なＧＬＰ−２類似体が提供される。こうしたＧＬＰ−２類似体は、胃腸組織、たとえば、小腸組織ならびに膵島組織の増殖な及び成長を促進する。
【００１４】
本発明の別の態様では、患者を治療して胃腸組織を回復させるための方法であって、（１）上記組織又は上記組織由来の細胞を、組織の成長を促進するのに有効な量のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体とともに培養し、次に、（２）上記組織又は細胞を治療対象患者に移植する工程によって実施される前記方法が提供される。
【００１５】
本発明の関連した態様では、胃腸組織又は上記胃腸組織由来の細胞を成長させる方法であって、上記組織又は細胞を、成長を促進するのに有効な量のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を加えた培養培地中で培養する工程を含んでなる前記方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＧＬＰ−２を用いた場合の用量−応答の結果を示す。ラットＧＬＰ−２を注射した動物での、小腸の重量（ＢＷ−パネルＡ）、ならびに、近位空腸（ＰＪ−パネルＢ）、遠位空腸（ＤＪ−パネルＣ）及び遠位回腸（ＤＩ−パネルＤ）における陰窩＋絨毛の高さにＧＬＰ−２が及ぼす効果の測定値を、それぞれ、ラットＧＬＰ−２の用量に対する関数としてプロットしてある。
【図２】図２は、ＧＬＰ−２の腸管栄養活性に調剤用ビヒクルが及ぼす効果を図示する。小腸の重量（ＢＷ）、ならびに近位空腸（ＰＪ）、遠位空腸（ＤＪ）及び遠位回腸（ＤＩ）における陰窩＋絨毛の高さを、それぞれ、ゼラチン（Ｇ）又は生理食塩水（ＰＢＳ）への溶液としたラットＧＬＰ−２の投与量の関数として測定した。ラットＧＬＰ−２を含まないゼラチン溶液を、対照（Ｃ）として使用した。
【図３】図３は、ＧＬＰ−２の腸管栄養活性に投与経路が及ぼす効果を示す。皮下注射（ＳＣ）、筋内注射（ＩＭ）、腹腔内注射（ＩＰ）によってラットＧＬＰ−２を投与した後、小腸の重量の変化率（％）を測定した。Ｔと表示した棒は、ＧＬＰ−２で治療したラットの試料について、Ｃと表示した棒は、生理食塩水を注射した対照ラットの試料について示したものである。
【図４】図４は、ＧＬＰ−２活性に投与頻度が及ぼす効果を示す。Ｘ軸に示すように、動物の皮下に、ＰＢＳを１２時間おきに、２．５μｇのラットＧＬＰ−２を１２時間おきに（ｑ１２ｈ）、５μｇのラットＧＬＰ−２を毎日（ｑｄ）、あるいは１０μｇのラットＧＬＰ−２を一日おきに（ｑｏｄ）を注射した。各投与プロトコールについて、小腸の重量（ＢＷ）、ならびに近位空腸（ＰＪ）、遠位空腸（ＤＪ）、遠位回腸（ＤＩ）における陰窩＋絨毛の高さを測定した。
【図５】図５は、ＧＬＰ−２投与効果の持続状況を、活性の関数として示す。動物は、５μｇのラットＧＬＰ−２の１０％ゼラチンへの溶液、あるいは１０％ゼラチンのみを、４週間にわたって（パネルＡ）、８週間にわたって（パネルＢ）、あるいは１２週間にわたって（パネルＣ）１日１回注射してから、死亡させた。ＧＬＰ−２を用いた場合の対照に対する治療の効果を、小腸の重量（ＢＷ）、ならびに近位空腸（ＰＪ）、遠位空腸（ＤＪ）、遠位回腸（ＤＩ）における陰窩＋絨毛の高さについて測定した。
【図６】図６は、ＧＬＰ−２の腸管栄養効果の時間的経過を示す。２．５μｇのラットＧＬＰ−２のＰＢＳ溶液を１日２回注射した雌のマウスを、治療開始後各種の日数の経過後に死亡させ、小腸の重量を、ＰＢＳのみを注射した対照動物に対して検定した。
【図７−１】図７は、投与対象動物の週齢ならびに性別の、ＧＬＰ−２の腸管栄養活性への効果を示す。パネルＡからＤでは、４週齢から８週齢までの性別を一致させたＧＬＰ−２処理動物（ＣＤ１マウス）を、小腸の重量（ＢＷ）、ならびに近位空腸（ＰＪ）、遠位空腸（ＤＪ）、遠位回腸（ＤＩ）における陰窩＋絨毛の高さの双方について、ラットＧＬＰ−２での処理後に、それぞれの対照と比較した。
【図７−２】図７は、投与対象動物の週齢ならびに性別の、ＧＬＰ−２の腸管栄養活性への効果を示す。パネルＥからＨでは、１２週齢から１６週齢までの性別を一致させたＧＬＰ−２処理動物（ＣＤ１マウス）を、小腸の重量（ＢＷ）、ならびに近位空腸（ＰＪ）、遠位空腸（ＤＪ）、遠位回腸（ＤＩ）における陰窩＋絨毛の高さの双方について、ラットＧＬＰ−２での処理後に、それぞれの対照と比較した。
【図８】図８は、いくつかの異なったＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２類似体の腸管栄養効果を、対照と比較して示す。パネルＡ、Ｃ、Ｅ及びＧは、小腸の重量（ＢＷ）の変化を示し、パネルＢ、Ｄ及びＦは、近位空腸（ＰＪ）における陰窩＋絨毛の高さの変化を示す。類似体の略称は、Ｎ−アセチル（アミノ末端がアセチル基でブロッキングされたラットＧＬＰ−２ペプチド）、Ａｒｇ+1（アミノ末端にＡｒｇ残基をさらに有しているラットＧＬＰ−２）、Ａｒｇ+34（カルボキシ末端にＡｒｇ残基をさらに有しているラットＧＬＰ−２）、Ｃ−アミド（カルボキシ末端にアミドブロッキング基を有しているラットＧＬＰ−２）、Ａｒｇ+1+2（アミノ末端にＡｒｇ残基２個をさらに有しているもの）である。さらに、デグーのＧＬＰ−２（デグー）の効果についても、マウスでの腸管栄養効果を調べた。
【図９】図９は、ラットＧＬＰ−２が小腸の長さに及ぼす腸管栄養効果を示す。ＧＬＰ−２で１０日間処理した後に、小腸の長さの増大を対照動物に対して測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＧＬＰ−２及びＧＬＰ類似体の、治療ならびに関連用途への使用、より詳細には、胃腸組織の増殖及び成長の促進への使用、さらに詳細には、小腸の組織又は膵島の増殖ならびに成長の促進への使用に関する。こうした成長は、小腸の組織に関しては、ＧＬＰ−２によって媒介された小腸の質量及び長さの増大を、未処理の対照と比較測定するのが好都合である。本明細書に提示する結果からもわかるように、ＧＬＰ−２が小腸に及ぼす効果は、陰窩＋絨毛軸の高さの増大としても現れる。本明細書では、こうした活性を、「腸管栄養」の活性と称している。ＧＬＰ−２に対する応答としては、陰窩細胞の増殖および／または小腸上皮のアポプトシスの低減も検出が可能である。こうした細胞効果は、遠位空腸を含む空腸、特に近位空腸で有意に観察され、遠位回腸でも見られる。標準ＧＬＰ−２ペプチドに応答する少なくとも１種の脊椎動物の試験動物が、ある化合物で処理した際に（あるいは、そうした化合物をその動物自体が発現するように遺伝子操作を行った場合に）、小腸の重量増加、陰窩＋絨毛軸の高さの増加、または陰窩細胞の増殖あるいは小腸上皮のアポプトシスの低減を有意に示した場合には、その化合物は「腸管栄養効果」を有すると考えられる。
【００１８】
こうした胃腸の成長を測定するのに適したモデルは、上掲のMatsuno らに記載されており、後述の実施例１でも例示する。ＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２類似体が小腸の陰窩＋絨毛軸の高さに及ぼす細胞効果についての形態計測学的な分析は、後述の実施例２に記載する。
【００１９】
膵島に関しては、こうした成長は、膵島の、未処理の対照と比較した場合における、ＧＬＰ−２によって媒介される拡大および／または増殖によって例証される。試験化合物が膵島細胞の成長（膵島細胞の大きさの増大と数の増大の両方を含む）に及ぼす効果を調べることによって化合物の腸管栄養効果を測定する方法は、後述の実施例１に例示する。
【００２０】
「ＧＬＰ−２ペプチド」という用語は、本明細書では、脊椎動物で天然に生じているＧＬＰ−２と、天然産生型ＧＬＰ−２の類似体とを総称するものであり、このＧＬＰ−２類似体は、腸管栄養効果を生じる物質であるとともに、少なくとも１個のアミノ酸の置換、欠失、付加を生じているか、ブロッキンング基を有するアミノ酸を含んでいることによって、特定の脊椎動物ＧＬＰ−２に対して構造的変異を生じている物質である。
【００２１】
各種の脊髄動物型ＧＬＰ−２としては、ラットＧＬＰ−２、ならびにその相同体、たとえば、オウシＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、デグーＧＬＰ−２、ウシＧＬＰ−２、モルモットＧＬＰ−２、ハムスターＧＬＰ−２、ヒトＧＬＰ−２、ニジマスＧＬＰ−２、ならびにニワトリＧＬＰ−２があり、それらの配列は、多くの執筆者、たとえば、Buhlら(J. Biol. Chem., 1988, 263(18): 8621) 、Nishiと Steiner(Mol. Endocrinol., 1990, 4: 1192-8) 、Irwin と Wong(Mol. Endocrinol., 1995, 9(3): 267-77) によって報告されている。これらの執筆者によって報告された配列も、本明細書に参考として組み込むものである。
【００２２】
脊椎動物ＧＬＰ−２の類似体は、ペプチド化学の標準的な方法を使用して生成させ、腸管栄養活性について検定することができ、生成ならびに検定の双方とも、本明細書の記載にしたがって実施すればよい。本発明の特に好適な類似体は、以下のヒトＧＬＰ−２の配列：
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp を基本とし、配列中の１個以上のアミノ酸残基の別のアミノ酸残基への保存的な置換が、類似体がなおも腸管栄養活性（たとえば、小腸の成長、膵島の成長、および／または陰窩／絨毛の高さ）を保持するようなかたちで生じているものである。
【００２３】
天然生成型ＧＬＰ−２、好ましくはヒトＧＬＰ−２の配列の保存的置換は、以下の５グループのいずれかの内の置換として定義される。 
Ｉ．      Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
ＩＩ．    Asn, Asp, Glu, Gln
ＩＩＩ．  His, Arg, Lys 
ＩＶ．    Met, Leu, Ile, Val (Cys)
Ｖ．      Phe, Tyr, Trp 
【００２４】
本発明は、非保存的置換が生じているのが、異なった種から単離されたＧＬＰ−２同士で変異があることがわかっているアミノ酸位置である場合については、どの脊髄動物ＧＬＰ−２配列であっても、そうしたアミノ酸で非保存的置換が生じている場合も包含するものである。非保存残基の位置は、既知の脊髄動物ＧＬＰ−２配列をすべて整列させてみれば容易にそれとわかる。たとえば、Buhlら, J. Biol. Chem., 1988, 263(18): 8621では、ヒト、ブタ、ラット、ハムスター、モルモット及びウシのＧＬＰ−２の配列が比較され、１３、１６、１９、２７及び２８の位置が非保存的であることが見いだされている（位置の番号は、ヒトＧＬＰ−２配列での類似の位置の番号である）。Nishi と Steiner, Mol. Endocrinol., 1990, 4: 1192-8 は、ＧＬＰ−２コード配列内の別の位置、すなわち上掲のヒト配列中の残基２０も、南米固有種の齧歯類デグーでは変異していることを見いだした。したがって、こうした標準にしたがうと、哺乳動物の種によって変異しているアミノ酸位置であって、非保存残基によって置換されていてもなおも好ましいのは、１３、１６、１９、２０、２７及び２８の位置であることになる。脊髄動物の種によって変異しており、非保存残基によって置換されていてもかまわないさらに別のアミノ酸残基としては、２、５、７、８、９、１０、１２、１７、２１、２２、２３、２４、２６、２９、３０、３１、３２及び３３の位置のアミノ酸残基がある。
【００２５】
また、アミノ酸残基をアラニンで置換しても腸管栄養活性がなんら損なわれることがないという点で、アラニン走査変異誘発によって変異に対するある程度の許容性が示された任意の位置についても、非保存的置換を行うことができる。アラニン走査変異誘発の方法については、CunninghamとWells, Science, 1989, 244: 1081 に記載されており、この文献は、その全体を、本発明に参考として組み込むものである。大半のＧＬＰ−２配列は、約３３個のアミノ酸のみから構成されているので（ヒトＧＬＰ−２の場合、アラニンはすでに４つの位置で生じている）、当業者は、後述の実施例の記載にしたがって、残りの位置のアラニン類似体のそれぞれを、腸管栄養効果について容易に調べることができる。
【００２６】
脊椎動物ＧＬＰ−２の各種既知配列を整列させることによって、こうした各種ＧＬＰ−２間の有意な配列ホモロジー、ならびに種による変異が既知の残基を考慮にいれた一般式を構築した。この式は、置換、付加、欠失又はアミノ酸ブロッキンング基の付加による修飾を行ううえで好適な特定の非保存残基を選ぶ際のガイドとして使用することができる。本発明の一態様で念頭においている脊椎動物ＧＬＰ−２の特定の類似体は、配列番号１として以下に示す一般式に一致する各種のＧＬＰ−２ならびにＧＬＰ−２類似体である。
【００２７】
R1-[Y]m-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-aa1-Leu-Asp-aa2-Leu-Ala-aa3-aa4-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-aa5-aa6-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-[X]n-R2
式中、aaは任意のアミノ酸残基を表し、aa1からaa6は、異なった種から得られたＧＬＰ−２配列同士での変異が公知の残基位置であり、そして
Ｘは、グループＩＩＩから選ばれる１又は２個のアミノ酸、たとえば、Arg、Lys又はArg-Argであり、
Ｙは、グループＩＩＩから選ばれる１又は２個のアミノ酸、たとえば、Arg、Lys又はArg-Argであり、
ｍは、０又は１であり、
ｎは、０又は１であり、
Ｒ１は、Ｈ又はＮ末端ブロッキング基であり、
Ｒ２は、ＯＨ又はＣ末端ブロッキング基である。
【００２８】
本発明の実施態様のいくつかでは、 aa1からaa6は、以下のように、
aa1は、グループＩＶから選ばれ、
aa2は、グループＩ又はＩＩから選ばれ、
aa3は、グループＩから選ばれ、
aa4は、グループＩＩＩから選ばれ、
aa5は、グループＩＶから選ばれ、
aa6は、グループＩＩ又はＩＩＩから選ばれる
ものとして定義される。
【００２９】
本発明の特に好適な実施態様では、aa1からaa6は、異なった種から単離された各種ＧＬＰ−２のその残基の位置で生じていることが公知の一群の残基の群から、以下のようにして、すなわち
aa1は、Ile又はValであり、
aa2は、Asn又はSerであり、
aa3は、Ala又はThrであり、
aa4は、Lys又はArgであり、
aa5は、Ile又はLeuであり、
aa6は、Gln又はHisである
として選ばれるものである。
【００３０】
ヒトおよびラットのＧＬＰ−２は、互いに、１９の位置のアミノ酸残基のみが異なる。ヒトの配列では、この残基はアラニンであり、ラットＧＬＰ−２では、１９の位置はトレオニンである。したがって、本発明で想定している特定のＧＬＰ−２あるいはＧＬＰ−２類似体は、位置１９に変異しうる残基を含んでいる。本発明のこうした実施態様では、ＧＬＰ−２ペプチドは、以下に示す配列番号２と一致する。
【００３１】
R1-[Y]m-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-aa3-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-[X]n-R2
式中、aa3、Ｙ、ｍ、Ｘ、ｎ、Ｒ１およびＲ２は、上記定義のとおりである。
【００３２】
本発明の特定の実施態様では、ＧＬＰ−２ペプチドは、以下のものから選ばれる。
【００３３】
１）下記の配列番号３を有するラットＧＬＰ−２：
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp、
２）Thr19 がAla19 となっているラットＧＬＰ−２の均等配列である下記のヒトＧＬＰ−２：
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp、
３）［Ile13 がVal13 に、Asn16 がHis16 に、Lys20 がArg20 となっている］ラットＧＬＰ−２の均等配列であるデグーＧＬＰ−２、ならびに
４）Ｎ末端ブロッキング基を有するおよび／または、Ｎ末端が、たとえばArg又はArg-Argによって伸長しているおよび／または、Ｃ末端ブロッキング基を有するおよび／または、Ｃ末端が、たとえばArg又はArg-Argによって伸長しているＧＬＰ−２ならびにＧＬＰ−２類似体。
【００３４】
Ｒ１及びＲ２によって表される「ブロッキング基」は、生化学的安定性ならびにエキソペプチダーゼによる消化に対する抵抗性を付与する場合に、ペプチド化学の分野で日常的に使用される化学基である。適当なＮ末端保護基としては、たとえば、Ｃ1-5 アルカノイル基、たとえばアセチルがある。Ｎ末端保護基としては、アミノ官能性を欠いたアミノ酸類似体も適当である。適当なＣ末端保護基としては、Ｃ末端カルボキシルの炭素原子でケトンあるいはアミドを形成する基、またはカルボキシルの酸素原子でエステルを形成する基が挙げられる。ケトンならびにエステル形成性の基としては、アルキル基、特に枝分かれ又は非枝分かれのＣ1-5 アルキル基、たとえば、メチル、エチル及びプロピル基があり、一方、アミド形成性の基としては、アミノ官能性の基、たとえば、第一アミン、あるいはアルキルアミノ官能基、たとえば、モノ−Ｃ1-5 アルキルアミノならびにジ−Ｃ1-5 アルキルアミノ基、たとえばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ基などがある。アミノ酸類似体も、本発明の化合物のＣ末端を保護するうえで適当であり、たとえば、脱カルボキシル化アミノ酸類似体、たとえばアグマチンがある。
【００３５】
胃腸組織の成長促進の目的で選んだ特定の形態のＧＬＰ−２は、ペプチド生成物製造で周知の各種の方法によって調製することができる。脊椎動物型ＧＬＰ−２は、タンパク質の単離法を適切なかたちで組み合わせることにより、天然ソースから抽出することによっても、もちろん得ることができる。上掲のBuhlらにも記載されているように、ブタＧＬＰ−２は、回腸の粘膜の酸−エタノール抽出物から単離ならびに精製が行われ、その際には、サイズ選択ならびにＨＰＬＣにもとづいた分画が組み合わされ、さらに、得られた生成物を監視する目的で、合成プログルカゴン１２６−１５９に対して生成した抗体が使用されている。脊椎動物のＧＬＰ−２であるにせよ、その類似体であるにせよ、Ｌ−アミノ酸のみを含むようなかたちのＧＬＰ−２であれば、ＧＬＰ−２を抽出するのでなく、組換えＤＮＡ技術を利用することによって、商業量を生成することができる。こうした場合は、所望のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、微生物、たとえば酵母又は他の細胞性宿主を形質転換し、次に、ＧＬＰ−２の発現に適した条件下でこの微生物を培養する。こうした目的には各種の遺伝子発現システムが適応されており、こうした発現システムでは、通常、選んだ宿主が天然状態で使用している発現制御配列から所望の遺伝子を発現させるようになっている。ＧＬＰ−２は、翻訳後グリコシル化を経ずとも活性を呈するので、細菌宿主、たとえば大腸菌(E.coli)で産生させるのが最も好都合である。そうした方法で産生させる際には、選んだＧＬＰ−２ペプチドをコードするＤＮＡを、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ又はＰＬ遺伝子の発現制御下におくのが有用である。ＧＬＰ−２自体をコードしているＤＮＡを発現させるのでなく、宿主を、ＧＬＰ−２がキャリアタンパク質との融合タンパク質として発現されるようなものとすることもできる。すなわち、この融合タンパク質では、発現生成物の単離を容易とし、発現生成物の安定性を高めるようなキャリアタンパク質に、ＧＬＰ−２が、遊離可能なかたちで連結されている。
【００３６】
選んだＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を生成する際に一般に使用が可能な方法であって、また、非遺伝的にコードされたアミノ酸を含んでいたり、Ｎ及びＣ末端を誘導化した型のＧＬＰ−２ペプチドを生成する際には必然的に使用せざるをえない方法でもある方法が、すでに十分確立されている技術である自動ペプチド合成法である。こうした方法の一般的記載は、たとえば、J.M. StewartとJ.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois、M. BodanszkyとA. Bodanszky, The practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York、ならびにApplied Biosystems 430A Users Manual, 1987, ABI Inc. Foster City, Californiaを参照されたい。これらの方法では、たとえば上掲のOrskovら（１９８９）に記載されているようなＦｍｏｃあるいはｔＢｏｃプロトコールのいずれかを使用して、樹脂にコンジュゲートさせたＣ末端の残基に、適切なかたちで保護を行ったアミノ酸を逐次付加していくことによって、ＧＬＰ−２ペプチドをＣ末端から成長させる。
【００３７】
Ｎおよび／またはＣ末端のブロッキング基を取り込む際には、固相ペプチド合成法で従来から使用されているプロトコールを適用することもできる。Ｃ末端のブロッキング基を取り込む際には、たとえば、所望のＣ末端ブロッキング基を有するＧＬＰ−２ペプチドが樹脂からの切断時に得られるよう化学的に修飾した樹脂製支持体を固相として使用することによって、所望のペプチドの合成を行うのが代表的である。Ｃ末端が一次アミノブロッキング基を有するようなペプチドを生成するにあたっては、たとえば、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を使用することによって合成を行い、ペプチド合成の終了時にフッ化水素酸で処理すると、所望のＣ末端アミド化ペプチドが遊離されるようにする。同様に、Ｃ末端へのＮ−メチルアミンブロッキング基の導入は、ＨＦで処理するとＮ−メチルアミド化されたＣ末端を有するペプチドを遊離するＮ−メチルアミノエチル誘導化ＤＶＢ樹脂を使用することによって行う。エステル化によるＣ末端の保護も、通常の方法を使用することによって行うことができる。この方法では、側鎖が保護されたペプチドが樹脂から遊離され、その後所望のアルコールとの反応が生じてエステル官能基が形成されるようにした樹脂／ブロッキング基の組み合わせを使用する。この目的では、ＦＭＯＣ保護基を、メトキシアルコキシベンジルアルコール又は同等のリンカーで誘導化したＤＶＢ樹脂と組み合わせたものを使用することができ、この場合、支持体からの切断は、ＴＦＡのジクロロメタン溶液を使用して行う。次に、所望のアルコールを加えることによって、適切に活性化されたカルボキシル官能基の、たとえばＤＣＣを用いたエステル化を進め、その後脱保護化し、エステル化されたＧＬＰ−２ペプチドを単離する。
【００３８】
Ｎ末端ブロッキング基の取り込みは、合成したＧＬＰ−２ペプチドが樹脂に結合している間に、たとえば、適当な無水物及びニトリルで処理することによって行うことができる。アセチルブロッキング基をＮ末端に取り込む際には、たとえば、樹脂に結合したペプチドを、２０％無水酢酸のアセトニトリル溶液で処理することができ、次に、Ｎ末端がブロッキングされたＧＬＰ−２ペプチドを樹脂から切断し、脱保護化し、その後単離する。
【００３９】
所望のＧＬＰ−２ペプチドを合成し、樹脂から切り出し完全に脱保護した後、選択したアミノ酸配列をもつ単一のオリゴペプチドの回収を確実にするためにペプチドを精製する。精製はいかなる標準法を用いてもよく、アルキル化シリカカラム、例えばＣ4−、Ｃ8−又はＣ18−シリカカラム上の逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含む。このようなカラム分画は、ＴＦＡやＴＥＡなどの少量の（例えば０．１％）対になる薬剤(pairing agent) を通常含む水性緩衝液中で、アセトニトリルなどの有機溶媒濃度を例えば１０−９０％で増加していく直線状グラジエントで流すことによって一般に実施できる。あるいは、荷電性を利用してイオン交換ＨＰＬＣを用いてペプチドを分離できる。カラム画分を回収し、場合によっては所望の又は必要な純度のペプチドを含む画分を集める。本発明の一態様では、次に分解性の酸（例えばＴＦＡ）を薬学的に許容しうる酸、例えば酢酸、塩酸、リン酸、マレイン酸、酒石酒、コハク酸などで置換する公知の方法でＧＬＰ−２ペプチドを処理し、ペプチドの薬学的に許容しうる酸付加塩を製造する。
【００４０】
患者に投与するには、本発明の一面においては、ＧＬＰ−２ペプチド又はその塩は薬学的に許容しうる形態、例えば０．２２μフィルターなどで滅菌濾過し、実質的に発熱物質不含な調製物として提供される。好ましくは、調製すべきＧＬＰ−２ペプチドはＨＰＬＣ上で単一又は区別されたピークとして移動し、その分析において均一で真正のアミノ酸組成および配列を示し、あるいは医薬品の品質を管理する種々の国家機関により定められた基準に合致するものである。
【００４１】
治療用途には、選択されたＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を、薬学的に許容でき、かつ選択された投与経路によりペプチドを送達するのに適した担体とともに製剤化する。適当な薬学的に許容しうる担体は、希釈剤、賦形剤などのペプチド医薬に慣用的に用いられる担体である。医薬製剤の一般的なガイダンスについては、"Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th Ed. Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1985を参照されたい。本発明の一態様では、化合物は、例えば全身非経口栄養治療を受けている患者に液体栄養補充物として使用する場合には灌流により投与するように、あるいは例えば皮下、筋肉内又は静脈内などの注射により投与するように製剤化され、従って滅菌かつ発熱物質不含形態の水溶液で用いられ、場合によりやや酸性又は生理的ｐＨなどの生理的に耐え得るｐＨに緩衝化される。従って、化合物は蒸留水又はより好ましくは食塩水、リン酸緩衝化食塩水又は５％デキストロース溶液などのビヒクル中の形で投与される。所望する場合には、酢酸などの溶解度増強剤を含めることによりＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体の水溶性を増強できる。
【００４２】
水性担体又はビヒクルには、注射部位又はその付近にＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を貯蔵して所望の作用部位で徐放する作用をする一定量のゼラチンを注射可能な形で補充することができる。貯蔵（デポ）効果を達成するために有効なゼラチン濃度は１０−２０％の範囲にあることが予想される。あるいはヒアルロン酸などのゲル化剤をデポ剤として用いることもできる。
【００４３】
本発明のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体は、ＧＬＰ−２を長時間持続して投与するための徐放性移植装置として製剤化することもできる。このような持続性徐放製剤には、生物適合性ポリマー、例えばポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの複合材料が含まれる。医薬送達ビヒクル中の分解可能なポリマーの構造、選択及び使用についてはいくつかの出版物に総説があり、A. Domb et al., Polymers for Advanced Technologies 3:279-292, 1992を含む。医薬製剤中のポリマーの選択及び使用についてのさらなるガイダンスは、M. Chasin and R. Langer (編集), "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", Vol. 45, "Drugs and the Pharmaceutical Science", M. Dekker, New York, 1990に見られる。ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体の持続性放出にはリポソームも使用できる。興味のある医薬のリポソーム製剤をいかに使用し製造するかについての詳細はとりわけ、米国特許第4,944,948号；米国特許第5,008,050号；米国特許第4,921,706号；米国特許第4,927,637号；米国特許第4,452,747号；米国特許第4,016,100号；米国特許第4,311,712号；米国特許第4,370,349号；米国特許第4,372,949号；米国特許第4,529,561号；米国特許第5,009,956号；米国特許第4,725,442号；米国特許第4,737,323号；米国特許第4,920,016号に見られる。持続性放出製剤は、例えば糖尿病において膵臓の成長を促進するために膵臓付近にＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体の高い局所濃度を提供することが好ましいような場合には特に関心がもたれる。
【００４４】
ヒトを含む哺乳動物における小腸の成長又は膵島細胞の増殖と増加を刺激する用途には、本発明は一面において、組織成長促進量のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を単回投与量又は複数回投与量で含む滅菌充填したバイアル又はアンプルの形でのパッケージを提供し、このパッケージにはこのような成長促進への内容物の使用を説明するラベルを入れる。本発明の一態様では、パッケージにはＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体と所望の担体をすぐ投与できる製剤として含む。あるいは、本発明の別の態様では、パッケージはリン酸緩衝化食塩水などの適当な担体中に用時調製するのに適した凍結乾燥剤形としてＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を提供する。
【００４５】
一態様では、パッケージは水性ビヒクル中に溶解した有効で腸管栄養的量のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を含有する注射溶液を含む滅菌充填したバイアル又はアンプルである。
【００４６】
注射可能な製剤に代わるものとして、ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体はその他の経路で投与するために調製できる。標準的製剤技術により錠剤、カプセルなどの経口投与剤形を調製できる。
【００４７】
本発明によると、ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体は胃腸組織の成長によって恩恵を受ける患者の治療のために投与される。一面においては、患者となりうるのは小腸組織の成長によって恩恵を受ける患者である。本明細書で示す結果で実証されるように小腸組織に及ぼすＧＬＰ−２ペプチドの効果は劇的であり、潰瘍及び炎症性障害；吸収不良症候群を含む先天性又は後天性の消化吸収障害；特に長期の非経口栄養摂取を受けている患者、あるいは手術の結果として腸の制限を受けたり、短胃腸症候群及び盲管症候群に苦しむ患者において腸粘膜機能の消失によって引き起こされる疾患及び状態を含む、小腸管粘膜の異常を特徴とする疾患及び症状に苦しむ患者には明らかに恩恵を与えるであろう。腸管粘膜機能の低下と関連するこれらの患者の症状を軽減又は除去するために、ＧＬＰ−２ペプチドによる治療処置を行う。例えば、炎症性の腸症状をもつ患者に、腸の不快とこの症状によって引き起こされる下痢を改善するために十分な量のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を投与する。さらに、吸収不良障害の患者に、栄養吸収を増強し、これによって患者の栄養状態を改良するために、ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を投与する。
【００４８】
一般に、小腸重量の増加とその結果としての小腸粘膜機能の増加によって恩恵を受けそうな患者が、ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体による治療の候補者である。ＧＬＰ−２で治療できる特定の症状には、小麦由来のα−グリアジンとの毒性反応によって引き起こされ、激しい腸絨毛の消失を特徴とするセリアックスプルー；感染によって引き起こされ、絨毛の部分的偏平化を特徴とする熱帯性スプルー；普遍的な種々の免疫不全患者又は低ガンマグロブリン血症によく見られ、絨毛の高さが有意に減少することを特徴とする低ガンマグロブリン血症性スプルーを含む種々の形態のスプルーを含む。ＧＬＰ−２治療の治療有効性は、絨毛の形態を試験する腸生検によって、栄養吸収の生化学的評価によって、患者体重の増加によって、あるいはこれらの状態と関連する症状の改善によってモニターすることができる。ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体で治療できるその他の症状、あるいはＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体が予防的に有用な症状には、放射線腸炎、感染性又は感染後腸炎、限局性腸炎（クローン病）、毒性又はその他の化学療法剤による小腸の損傷、及び短腸症候群の患者を含む。
【００４９】
別の面では、ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体による治療の患者となりうるのは、膵島細胞の成長により、そして特に膵島細胞の拡大又は増殖又は再生により恩恵を受ける患者である。このような患者には、膵島細胞の欠失又は減少、あるいは膵島機能の低下を特徴とする疾患又は状態に苦しむ患者を含む。特定の患者候補者は、１型及び２型の糖尿病に苦しむ患者、並びに膵臓の浸潤、炎症又は破壊による糖尿病の二次形態をもつ患者である。これらの患者に、少なくとも部分的膵臓機能を回復し、内在性インシュリン濃度を増加し、そして症状を改善するために十分な量のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を投与する。
【００５０】
患者の治療に最も適した治療量及び治療法は勿論治療すべき疾患又は状態により、また患者の体重やその他のパラメーターにより変わりうる。以下に示す結果は、約２．５ｍｇ／ｋｇ（又はそれ以下、下記参照）と均等なＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体の投与量を１日２回、１０日投与すると、小腸重量と、特に近位空腸の陰窩（crypt）／絨毛の高さとを顕著に増加させることを示している。これよりもはるかに少ない投与量、例えばμｇ／ｋｇ範囲で、かつより短いか長い治療期間又は治療頻度でも、治療的に有用な結果、すなわち特に小腸重量の統計的に有意な増加をもたらすであろう。ヒトに最も適した投与量と投与法は本明細書に示す結果から導かれ、また適切に設計した臨床試験で確認できる。
【００５１】
有効投与量及び治療プロトコルは慣用的手段で決定することができ、最初は実験動物で低投与量から始め、次に投与量を増加しながら効果をモニターし、投与量処方を体系的に変更する。特定の被験者にとっての最適投与量を決定する際には臨床医は多くの要因を考慮に入れる。その中で主なものは、血漿中を普通循環するＧＬＰ−２の量であり、これは静止状態では１５１pmol/mLのオーダーであり、健康な成人が栄養摂取を行った後には２２５pmol/mLに上昇する。Orskow, C. および Helst, J.J., 1987, Scand. J. Clin. Lav. Invest. 47:165参照。付加的要因には、患者の体重、患者の年齢、患者の一般的状態、治療すべき特定の疾患、疾患の重症度、患者が用いているその他の医薬、ＧＬＰ−２ペプチドのin vivo活性などを含む。試験投与量は動物実験や臨床文献の結果を考慮した後に選択する。投与量を計算する際にはin vitroのＧＬＰ−２結合競合アッセイから得られる結合定数やＫｉなどの情報を用いることも当業者には理解できるであろう。
【００５２】
ＧＬＰ−２ペプチドの典型的なヒト投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは５０μｇ／ｋｇ／日から約５ｍｇ／ｋｇ／日であり、より好ましくは約１００μｇ／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００５３】
本発明の別の面では、ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体で予めin vitro又はin vivoでインキュベーション又は処置されてコンディショニングされているか、あるいはこれを生産するように予め遺伝子操作されている移植細胞を用いる同定されたばかりの患者候補者の治療を本発明は提供する。ex vivoでの細胞のコンディショニングは、移植すべき細胞又は組織を成長促進的量のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を補充した培地中、あるいはこれらの細胞の培養に適した培養中で単に生育させることによって達成できる。適当なコンディショニング期間の後、細胞を患者に直接移植するか、あるいは確立された細胞カプセル化技術を用いてカプセル化した後に移植する。
【００５４】
本発明のさらに別の面では、小腸組織の成長を促進するか、あるいは膵島細胞の大きさ又は数を増加するために、ＧＬＰ−２ペプチドで動物をin vivo処置することを包含する。小腸及び／又は膵島細胞が拡大した後、これらの組織を異種間移植法に用いる。移植する器官又は組織のサイズがこのような方法の成功を妨げることがあるので、非ヒト動物由来の組織をヒトに異種間移植する前にこのようなＧＬＰ−２ペプチド処置を行うことは有利である。例えば、ブタ小腸組織をこの器官を必要とするヒトに異種間移植する前に、小腸のサイズを増加するためにブタのドナー動物をＧＬＰ−２ペプチドで処置することができる。
【００５５】
あるいは、移植すべき細胞を、グルカゴン遺伝子又はより直接的にはＧＬＰ−２のみをコードするＤＮＡを発現又は過剰発現するように予め遺伝子操作された細胞からin vitroで樹立することができる。遺伝的にコードされたアミノ酸を含むＧＬＰ−２形のみがこの方法で生産できるという制限の下で、このようなＤＮＡ配列は選択したＧＬＰ−２のアミノ酸配列から容易に決定することができる。ヒト細胞に遺伝情報を導入するのに適した種々のウイルスベクターを用いることができ、宿主細胞中で機能的な発現制御下に、ＧＬＰ−２をコードするＤＮＡを導入する。遺伝的に変更した後、遺伝子操作した細胞を当業界で確立した方法を用いて移植できる。
【実施例１】
【００５６】
小腸の成長に及ぼすグリセンチン（glicentin）の効果を研究するために設計した最初の実験では、１群６匹のマウス（８週、Charles River Laboratoriesから入手のＣＤ１雌）からなる２群を以下のように処置した。各マウスに１２時間ごとに４１．５μｇを１０日間注射した。注射は１６％ゼラチンの最終容量で皮下に行い、１２時間ごとに０．５ｃｃを皮下注射した。グリセンチン（ラット）は水１０ｍｌに容易に溶解した。対照マウスには１２時間ごとに１６％ゼラチン溶液０．５ｃｃのみを与え、ペプチドは与えなかった。マウスは殺す１２時間前までは飼料及び水に自由にアクセスできる状態で標準的ラット飼料を与え、それ以後は飼料を与えず、水のみを与えた。小腸全体を切り出して、胃（近位末端）と垂／盲腸／大腸（遠位末端）を除去して、小腸の重量を測定した。残る小腸を食塩水で洗浄して糞便を除去し、重量を測定した。結果を以下に示す。
【００５７】
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【００５８】
これらの結果は、グリセンチンの腸栄養効果はわずかなものであることを示していたので、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２を含むその他のプログルカゴン遺伝子由来の生産物の効果を調べるために同じプロトコルを用いて第２の実験を行った。この目的のために、配列番号３のラットＧＬＰ−２及びヒトＧＬＰ−１（７−３６アミド）を、ｔＢｏｃを用いる固相法を応用して合成した。ラットＧＬＰ−２の分析の結果、分析ＨＰＬＣ（１．０ｍｇ／ｍｌで２０μＬ試料；５μＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラム；１．５ｍｌ／分で２０分かけて０．１％ＴＦＡ／２０−６０％ＣＨ3ＣＮ）で９５％純度を示した。
【００５９】
注射用ＧＬＰ−２調製物は以下のようにして調製した：１６％の重量比となるようにゼラチンを温水に溶解し、この溶液５０ｍＬをオートクレーブにかけ、室温まで冷却した。５ｍｇのＧＬＰ−２と１０ｍＬよりもやや少ない容量の水を混合し、これにペプチドを完全に溶解するのに十分な容量（１０−２０μＬ）の１Ｎ酢酸を加えることにより、ペプチド溶液を別途調製した。等量の１Ｎ  ＮａＯＨ（１０−２０μＬ）を加えてｐＨを約７．０に調整し、次に蒸留水を加えて溶液量を１０ｍＬに調整した。注射用調製物を調製するには、ペプチド溶液１０ｍＬと１６％ゼラチン溶液５０ｍＬを混合して組み合わせ、注射用アリコートを０．５ｍＬインスリン注射器に取った。同じ方法を用いてＧＬＰ−１を調製したが、これは比較的水によく溶解するため、酸／塩基の調整は必要でない点で異なる。
【００６０】
マウスに、ペプチド（６２．５μｇ／１回）含有又は不含の１６％ゼラチン溶液０．５ｍＬを注射した。１群４匹のマウス（８週、Charles River Laboratoriesから入手のＣＤ１雌）からなる４群に、１日２回、１０日間注射した。結果を以下に示す。
【００６１】
2010159259.tif 000003
【００６２】
これらの結果は、約２．５ｍｇ／ｋｇ（６４０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）の投与量で、ＧＬＰ−２はペプチドを注射しなかった対照群並びに別のグルカゴン関連ペプチドであるＧＬＰ−１を注射した群のいずれと比較しても、１日２回、１０日間の処置の後に、小腸重量が統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０５）ことを示す。グリセンチンで示した結果と比較しても、ＧＬＰ−２が主要な腸組織成長因子を構成することが明らかである。
【００６３】
上記マウスへのＧＬＰ−２ペプチド投与の効果を、４匹のＧＬＰ−２処置マウスと４匹の対照マウスの胃腸管を切片にし、パラフィン固定切片と標準的組織病理学的方法を用いて調べた。膵島領域を形態測定分析によって測定した。定量にはヘマトキシリン及びエオシン染色した切片を用いた。各切片の全膵臓領域及び全膵島領域を測定した。得られたデータによると、対照群では全膵臓領域のうち平均で０．３１％が膵島領域であった。一方、ＧＬＰ−２処置群の膵島領域は全膵臓領域の０．７６％を構成し、ＧＬＰ−２処置群では膵島領域の増加が２倍以上であることを示す。膵島の大きさに加えて、膵島細胞の数の増加も観察された。
【実施例２】
【００６４】
小腸成長に及ぼすＧＬＰ−２ペプチドの効果をさらに検討し、特に投与量、時間、投与経路及び頻度、製剤形、並びに許容者の性別及び年齢の関数としての組織応答性を評価した。これらの効果を小腸重量の増加との関係のみでなく、陰窩及び絨毛の高さの増加との関係において測定した。
【００６５】
これらの目的のために、ラットＧＬＰ−２を実施例３に記載の方法で調製した。ラットＧＬＰ−２をリン酸緩衝化塩溶液又はゼラチン含有デポ製剤として調製した。リン酸緩衝化塩溶液を調製するには、ＧＬＰ−２ペプチドを以下のようにして調製した：８０ｇのＮａＣｌ（BDH ACS 783）、２ｇのＫＣｌ（BDH ACS 645）、１１．５ｇのＮａ2ＨＰＯ4（Anachemia AC-8460）、及び２ｇのＫＨ2ＰＯ4（Malinckrodt AR7100）を用いて１０ＸストックＰＢＳ溶液をまず調製し、これを滅菌蒸留水で全量１リットルにした。ストック溶液を滅菌蒸留水で１０：１希釈し、必要ならば１０Ｎ  ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）数μＬでｐＨ７．３−７．４に調製して最終使用溶液を得た。次に使用溶液を３０分オートクレーブにかけた。最終使用ＰＢＳ溶液中の濃度は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、４．３ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び１．４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4であった。
【００６６】
ＰＢＳ調製化ＧＬＰ−２ペプチドを作るには、所望のペプチド濃度をもつ調製物に必要な粉末ペプチドを使用ＰＢＳ溶液に加えた。例えば、１３０ｍｇ／ＬのペプチドのＰＢＳ溶液を作るには、４．２ｍｇのＧＬＰ−２をＰＢＳ４０ｍｌに溶解して１３０μｇ／ｍｌのＧＬＰ−２濃度を得る。マウスに２．５ｍｇ／ｋｇの投与量を与えるためには、この溶液約０．５ｍｌを１日２回注射する。
【００６７】
ゼラチンベースの調製物を作るには、ゼラチン１２ｇ（Sigma,ブタ皮膚由来のG-8150ロット番号54H07241 Type A [9000-70-8]-300 Bloom）を蒸留水１００ｍｌに溶解することによってまずゼラチン溶液を調製した。ゼラチン溶液をオートクレーブにかけ、３７℃に暖め、上述のリン酸緩衝化塩溶液に予め溶解しておいたＧＬＰ−２ペプチドを加えて、特定の所望ペプチド濃度を得た。次に、ＰＢＳ調製化ＧＬＰ−２を上述のゼラチン溶液と混合することによって、ゼラチンベースのＧＬＰ−２調製物を所望のＧＬＰ−２濃度で得た。例えば、１３０ｍｇ／Ｌ濃度でＧＬＰ−２のゼラチンベースＰＢＳ溶液を作るには、４．２ｍｇのＧＬＰ−２で調製したＰＢＳ溶液１０ｍｌを上述の２０％使用ゼラチン溶液３０ｍｌで希釈した。溶液をゆっくりピペットで混合して、１５％ゼラチンを含むＰＢＳ中の１３０ｍｇ／Ｌ  ＧＬＰ−２の最終溶液を得た。
【００６８】
実施例１と同様に、許容者はCharles River Laboratories(Ontario, Canada)から入手したＣＤ１マウスであった。特記しない限り、ＣＤ１マウスは注射時に同年齢、すなわち６週齢の雌（１群当たり３−４匹）であった。各実験を始める前に、少なくとも２４時間、動物を実験室設備に環境順応させた。動物は耳に穴をあけて識別した。実験中、マウスの飼料や活動は制限しなかった。明暗サイクルは午後６時と午前６時の１２時間であった。多くの注射は１２％ゼラチン又はＰＢＳをビヒクルとして用いた。対照は年齢及び性別が同じ動物（３−４匹）であり、ＰＢＳ又はゼラチン調製物を注射した。各ペプチドは０．５ｃｃのビヒクルに溶解して特定濃度に調製した。ペプチドを皮下注射し、実験室設備でマウスを毎日モニターした。注射の１４日後に動物を殺し、殺す２０−２４時間前は飼料を与えなかった。
【００６９】
マウスをＣＯ2で麻酔し、心臓穿孔により瀉血した。血液をＴＥＤ（Trasysol; EDTA (5000 KIU/ml: 1.2mg/ml; Diprotin-A)７５μＬ中に回収し、血液を１４ｋｘｇで５分遠心し、血漿を分析前は−７０℃で貯蔵した。腹腔から、幽門から盲腸までの小腸を摘出し、洗浄し重量を測り、測定した。比較の目的で、各動物から同じ解剖学的部位由来の切片を得た。近位空腸、遠位空腸、及び遠位回腸を表す組織形態学測定のために、各１．５−２．０ｃｍの長さの断片を幽門から８±２ｃｍ、１８±２ｃｍ、３２±２ｃｍで得た。各小腸断片を組織ブロック中の抗腸間隙（antimesentric）境界で縦方向に開き、１０％ホルマリン（ｖ／ｖ）上に一晩置き、次に７０％ＥｔＯＨに移した。
【００７０】
顕微鏡及び形態測定的分析のために、そして特に陰窩／絨毛の高さに及ぼすＧＬＰ−２の効果を評価するために、５μｍ厚さの切片を切り出し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。コンピュータモニターと接続したビデオカメラ付きの顕微鏡（Leitz, Wetzar, Germany）を用いて腸の顕微測定を行った。顕微鏡は４ｘ，１０ｘ，２５ｘの倍率に調節し、全ての評価に同じ顕微鏡を用いた。陰窩＋絨毛高さは、近位空腸、遠位空腸、及び遠位回腸の各スライド由来の陰窩の根元から絨毛の先端までの、少なくとも２０の縦方向の絨毛を試験することによって測定し、μｍ＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．（標準偏差）で表した。
【００７１】
種々の分析結果を図１−７及び９に示し、これらの図を参照して下記にまとめた。
【００７２】
用量応答性：  図１は、小腸重量として（ＢＷ−パネルＡ）、及び近位空腸（ＰＪ−パネルＢ）、遠位空腸（ＤＪ−パネルＣ）、及び遠位回腸（ＤＩ−パネルＤ）における陰窩＋絨毛高さとして測定したラットＧＬＰ−２に対する応答を、皮下投与した１２％ゼラチン調製物（すなわちＰＢＳ中のＧＬＰ−２）中のラットＧＬＰ−２用量の関数として示す。ラットＧＬＰ−２ペプチドは皮下投与した。結果は、１２％ゼラチンのみをビヒクルとして注射した対照の変化％として表した。星印は対照と比較した統計的有意差を表す（＊＝ｐ＜０．００５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。図１に示す結果から、ＧＬＰ−２ペプチドの注射が１．０から５．０μｇの用量で小腸重量に統計的に有意な増加をもたらすことが理解できよう。陰窩／絨毛高さに及ぼす所望の効果は０．２５μｇという低用量でも認められる。
【００７３】
調製物の効果：  図２は、２．５μｇのＧＬＰ−２用量で１日２回皮下投与したときの、ゼラチンベースの調製物（Ｇ）又はＰＢＳ調製物（ＰＢＳ）を用いて得られた結果を示す。パネルＡはグラムで表した小腸重量の効果の差を示し、パネルＢは近位空腸（ＰＪ）、遠位空腸（ＤＪ）、及び遠位回腸（ＤＩ）で観察されるμｍで表した陰窩／絨毛高さの効果の差を示す。どちらの調製物も統計的に有意な増加を引き出したことが理解できよう。多分注射部位からＧＬＰ−２をより持続して放出できるために、ゼラチンベースの調製物はＰＢＳ調製物よりもやや大きな応答を引き出した。
【００７４】
投与経路の効果：  図３は、ラットＧＬＰ−２を１日２回２．５μｇの用量で、リン酸緩衝塩溶液ビヒクル中で皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）又は腹腔内（ＩＰ）注射したときの、小腸重量（ＢＷ）の増加率を示す。ＰＢＳビヒクルのみを皮下投与した対照群と比較して、選択した投与経路にかかわらず、ＧＬＰ−２ペプチドに対する有意な応答を引き出したことが理解できよう。皮下注射が最大応答を与えた。
【００７５】
投与頻度の効果：  図４は、ＧＬＰ−２投与頻度の関数として、小腸重量及び陰窩／絨毛高さを評価した結果を示す。ＧＬＰ−２を表示の用量で、１２時間ごと（ｑ１２ｈ）、１日１回（ｑｄ）又は１日おき（ｑｏｄ）に皮下投与した。図示した結果から、ＰＢＳのみを注射した対照群と比較して、全ての投与頻度で小腸重量の変化率に有意な増加を引き出したことが理解できよう。小腸重量及び陰窩／絨毛高さにとって、最大の増加は最も頻度の高い投与スケジュール、すなわち１２時間ごとの投与によって引き出された。
【００７６】
長期間投与の効果：  １０％ゼラチン調製物中のラットＧＬＰ−２を、５μｇの１回量で１日１回、４週間（パネルＡ）、８週間（パネルＢ）又は１２週間（パネルＣ）連続して皮下投与した。図５は、１０％ゼラチンのみを注射した対照群（Ｃ）と比較した、処置群（Ｔ）における小腸重量（ＢＷ）並びに陰窩＋絨毛の高さ（ＰＪ，ＤＪ及びＤＩ）に及ぼすＧＬＰ−２媒介の効果を示す。小腸重量の結果は、ＧＬＰ−２媒介の小腸重量増加が試験した投与期間にわたって誘導され持続したことを示しており、また近位空腸の陰窩／絨毛高さについても同様であった。全ての動物は殺した時点で完全な剖検を行ったが、いずれの動物においても組織学的な異常は認められなかった。
【００７７】
経時評価：  図６は、ＰＢＳのみ（対照）又はＰＢＳ中の２．５μｇラットＧＬＰ−２で１日２回、図示する日数の間連続して、皮下投与処置したＣＤ１マウスにおいて測定した小腸重量の変化率を示す。結果から、投与４日目以後に有意な結果が得られ、またこの効果は投与を続けている間持続することが明らかである。別の研究では、ＧＬＰ−２投与で獲得した小腸重量の増加が処置の１０日後に後戻りすることも明らかである。しかしながら、絨毛増生に及ぼすＧＬＰ−２の効果は完全には後戻りせず、特により加齢した（２４カ月齢）マウスでは後戻りせず、これはより加齢した許容者では腸組織の交替速度がより遅いことを示唆する。従って、ＧＬＰ−２治療の間は許容者を維持投薬レジメに保つことが適切である。
【００７８】
許容者の性別及び年齢評価：  図７は、小腸重量及び組織学の両方についての各対照と比較した、４−１６週齢の２．５μｇのＧＬＰ−２で１日２回処置した同性のＣＤ１マウスを用いて得られた結果を示す。図示した結果から、小腸に及ぼすＧＬＰ−２の効果は許容者の性別とは関係なく引き出されることが理解されよう。関連の実験では、ＧＬＰ−２で処置した６カ月から２年齢の雌Ｃ５７ＢＬＫマウス（Charler River, U.S）で評価したところ、ＧＬＰ−２は６カ月から２年齢マウスで小腸成長を促進するのに有効であることが見いだされた。
【００７９】
小腸長さに及ぼすＧＬＰ−２の効果の評価：  図９は、小腸長さに及ぼすＧＬＰ−２投与の効果を示す。ＣＤ１マウスをＰＢＳ（対照）又はＰＢＳ中のラットＧＬＰ−２（２．５μｇ、１日２回）で１０日間処置した後、マウスを殺して胃から回盲部バルブまでの小腸長さをセンチメーターで測定した。
【００８０】
ＧＬＰ−２に応答して観察される絨毛伸長は、細胞増殖に及ぼすＧＬＰ−２の効果に由来するのか、あるいは老衰阻害に及ぼすＧＬＰ−２の効果に由来するのかも知れない。これらの２つの可能性を試験するために、刺激した組織又は対照組織由来の小腸のパラフィン切片を試験して、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を検出して増殖を測定し、またアポトーシス分析のためのＴＵＮＥＬ法を用いてアポトーシス細胞を検出した。ＧＬＰ−２処置したマウスの近位空腸における増殖速度は対照マウスと比較して増加（１２４％）した（対照では４６．０±１．２％；処置マウスでは５７±５．５％）。対照マウスでは、増殖は小腸の陰窩部分に限定され；絨毛はＰＣＮＡ−陽性細胞を含んでいなかった。ＧＬＰ−２処置群では、絨毛、及び陰窩−絨毛軸の結合部で増殖細胞が観察された。ＧＬＰ−２処置マウスの近位空腸におけるアポトーシス速度は、対照マウスよりも低かった。対照マウスにおけるアポトーシス細胞は主に絨毛の先端又は末端で観察され；腸の陰窩部分では全く観察されなかった。ＧＬＰ−２処置マウスでは、アポトーシス細胞の分布は同様であったが、その数は少なかった。
【実施例３】
【００８１】
マウス許容者においてラットＧＬＰ−２で観察された結果に基づき、ラットＧＬＰ−２の種々の脊椎動物相同体及び類似体も腸管栄養効果を媒介することが推測できる。この目的のために、種々のＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２類似体を合成し、下記のようにして評価した。
【００８２】
クロロメチル（Merrifield）樹脂（Ｃ末端遊離酸ペプチド用）６ｇを、１ｇ当たり０．５ミリ当量（ｍｅｑ）の置換で用いて、３００ｍＬ容器中、３ｍｍｏｌｅスケールの手動法で、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を行った。アミノ酸はアミノ末端をｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）基で保護した。アミノ酸の側鎖は、ベンジル（Ｂｚ、セリン及びスレオニン用）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ、ヒスチジン用）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−ＢｒＺ、チロシン用）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−ＣｌＺ、リシン用）、シクロヘキシル（ｃＨｅｘ、アスパラギン酸及びグルタミン酸用）、及びトシル（Ｔｓ、アルギニン用）側鎖保護基、並びにクロロメチル（Merrifield）樹脂で保護した。最初のアミノ酸を、フッ化カリウム（ＫＦ）の存在下に、保護アミノ酸のエステル化によってクロロメチル樹脂に結合した。Ｃ末端アミドペプチドは、３ｍｍｏｌｅスケールの４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂６ｇ上で、０．５ミリ当量／ｇの置換を行って、合成した。最初のアミノ酸をペプチド伸長のための文献記載の方法によりＭＢＨＡ樹脂と結合した。
【００８３】
アミノ基の脱保護はＣＨ2Ｃｌ2中の５０％トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）を用いて行い、次いでＣＨ2Ｃｌ2中の１０％トリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）による２回の洗浄により中和した。ＣＨ2Ｃｌ2／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＣＣ／ＨＯＢｔ）を用いてペプチド伸長を行った。各伸長工程の後に、伸びて行くペプチド鎖をジクロロメタン（ＣＨ2Ｃｌ2）中の２０％無水酢酸（Ａｃ2Ｏ）でキャッピングした。各伸長、キャッピングおよび脱保護の後にペプチド−樹脂をイソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）とメタノール（ＭｅＯＨ）により洗浄した。洗浄は１回繰り返した。ＣＨ2Ｃｌ2中の２０％Ａｃ2Ｏで末端アミノ基をアセチル化して、Ｎ末端アセチルペプチドを調製した。樹脂結合生成物を、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）及びｐ−クレソールをスカベンジャーとして含むフッ化水素（ＨＦ）を用いて、高低法（low-high procedure）によりルーチンに切断した。
【００８４】
粗ペプチドを分離用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、Vyda
c
C18、１５−２０μｍ幅孔、２インチｘ１２インチ、逆相シリカカラムで、アセトニトリル修飾した水中の０．１％ＴＦＡのグラジエント溶出を用いて精製した。溶出は２２０ナノメーター（ｎｍ）でモニターした。回収した各分画を、分析用ＨＰＬＣにより、Vydac C18、５μｍ、４．６ｘ２５４ミリメーター（ｍｍ）、逆相シリカカラムで、アセトニトリル修飾した水中の０．１％ＴＦＡのグラジエント溶出を用いて、２１５ｎｍでモニターしながら純度を分析した。９５％以上の純度を示す分画を集めて凍結乾燥した。必要な場合にはアセトニトリルを添加して溶解を助けることにより、凍結乾燥した粉末を水中に溶解し、ＴＦＡ塩からペプチドの酢酸塩を調製した。溶液をプロトン化Bio-Rex 70カチオン交換樹脂を通した。樹脂を５ベッド容量の水で洗浄し、樹脂結合ペプチドを水中の５０％酢酸で溶出した。溶出物を水で希釈し凍結乾燥した。
【００８５】
最終の凍結乾燥粉末を、Vydac C18、５μｍカラム、４．６ｘ２５４ｍｍの逆相シリカカラムを用いて、分析用逆相ＨＰＬＣ法により純度を分析した。使用した２つの溶媒系は、アセトニトリル修飾した、リン酸トリエチルアミンでｐＨ２．２５に調整した水のグラジエントと、アセトニトリル修飾した水中の０．１％ＴＦＡのグラジエントであった。カラム溶出物を２１５ｎｍでモニターした。各生成物の同定はアミノ酸分析及び電子スプレーマススペクトルによって確認した。
【００８６】
この方法によって、以下のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体を酢酸塩として合成した：
ａ）配列番号３のラットＧＬＰ−２；
ｂ）Ｎ−アセチルラットＧＬＰ−２、これはラットＧＬＰ−２のアミノ末端がアセチル基でブロックされている；
ｃ）［Ａｒｇ+1］ラットＧＬＰ−２、これはアミノ末端にＡｒｇ残基が１個付加することによって修飾されたラットＧＬＰ−２である；
ｄ）Ｃ−アミドラットＧＬＰ−２、これはカルボキシル末端にアミド基が付加したラットＧＬＰ−２である（１ｍｇの溶解は１％酢酸（１１０μＬ）中で達成でき、５Ｎ  ＮａＯＨを４５０μＬで中和する）；
ｅ）［Ａｒｇ+1,+2］ラットＧＬＰ−２、これはアミノ末端にＡｒｇ残基が２個付加することによって修飾されたラットＧＬＰ−２である；
ｆ）［Ａｒｇ+34］ヒトＧＬＰ−２、これは残基３３の後にＡｒｇ残基が付加されたヒトＧＬＰ−２である；及び
ｇ）ｄｅｇｕ  ＧＬＰ−２。 
これらのペプチドは特記しない限り、室温で水によく溶解する。
【００８７】
これらのＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２類似体の腸管栄養効果を実施例２で記載した方法で評価した。特定すると、ペプチドを０．５ｍｌ注射当たり、２．５μｇ用量でＰＢＳ中に調製し、１２時間ごとに１０日間又は１４日間、雌ＣＤ１マウスに皮下投与した。小腸重量及び陰窩／絨毛高さを偽処置したマウス（ＰＢＳのみ）と比較した。
【００８８】
これらの実験結果を図８に示す。アミノ末端に化学基を付加することによりＧＬＰ−２から修飾されたペプチド、特に［Ｎ−アセチル］−ＧＬＰ−２、又は［Ａｒｇ+1］−ＧＬＰ−２などのようなＮ末端に付加アミノ酸を含むペプチドは、１４日間のマウス実験において、（食塩水処置の対照と比較して）小腸成長の促進及び陰窩＋絨毛高さの増加における有効性で示されるように、ＧＬＰ−２誘導体において、in vivoで小腸成長因子特性を示した（図８、パネルＡ−Ｆ）。さらに、有効な小腸成長因子様性質をもつＧＬＰ−２関連分子は、種々の種由来の関連ＧＬＰ−２様分子の配列から得られる情報を用いて調製できる。例えば、ｄｅｇｕ  ＧＬＰ−２配列もマウスの１０日間実験で小腸成長因子様活性を示し、ラットＧＬＰ−２で得られたのとほぼ同じ小腸重量の増加を示した（いずれのペプチドも１日２回２．５μｇで皮下投与した）。このデータは、ここに例示するようなＧＬＰ−２ペプチド構造の修飾が、天然ＧＬＰ−２様の性質をin vivoで示す分子を生じることを示している。これとは対照的に、分子のカルボキシル末端領域にアミノブロッキング基を付加して修飾すると、得られるペプチド、［Ｃ−アミド］−ＧＬＰ−２はin vivoで有意なＧＬＰ−２の生物活性を示さなかった（図８、Ｃ−Ｄ）。
【００８９】
均等物
上述の明細書は当業者が本発明を実施するのに十分である。実際、分子生物学、医学又は関連分野の当業者にとって自明な、本発明を実施するための上述の手段を様々に修飾したものは、以下の請求の範囲内に入ることを意図するものである。
【図１】
2010159259.tif 000006
【図２】
2010159259.tif 000007
【図３】
2010159259.tif 000008
【図４】
2010159259.tif 000009
【図５】
2010159259.tif 000010
【図６】
2010159259.tif 000011
【図７−１】
2010159259.tif 000012
【図７−２】
2010159259.tif 000013
【図８】
2010159259.tif 000014
【図９】
2010159259.tif 000015
【配列表】
2010159259000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月22日(2010.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたはラットのＧＬＰ−２、および１個または２個のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換、またはＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸ブロッキング基を有するアミノ酸が組み込まれているという点でヒトまたはラットのＧＬＰ−２と異なっている腸管栄養性のヒトまたはラットＧＬＰ−２類似体から選択されるＧＬＰ−２ペプチドと、製剤学的に許容される担体とを含んでなる、胃腸疾患の治療または予防用の医薬組成物であって、ＧＬＰ−２ペプチドが次式：
2010159259.tif 000016
（式中、aa1、aa2、aa3、aa4、aa5およびaa6は任意のアミノ酸残基を表し、
X はHis、ArgおよびLysから選択される１または２個のアミノ酸であり、
Y はHis、ArgおよびLysから選択される１または２個のアミノ酸であり、
m は０または１であり、
n は０または１であり、
R1はＨまたはＮ末端ブロッキング基であり、そして
R2はＯＨまたはＣ末端ブロッキング基である）
で表される、前記胃腸疾患の治療または予防用の医薬組成物。
【請求項２】
発熱性物質を含まない、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
濾過滅菌されている、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項４】
aa1 がMet、Leu、Ile、ValおよびCysから選択され、
aa2 がAla、Ser、Thr、Pro、Gly、Asn、Asp、GluおよびGlnから選択され、
aa3 がAlaおよびThrから選択され、
aa4 がHis、ArgおよびLysから選択され、
aa5 がMet、Leu、Ile、ValおよびCysから選択され、
aa6 がAsn、Asp、Glu、Gln、His、ArgおよびLysから選択される、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＧＬＰ−２ペプチドがラットＧＬＰ−２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＧＬＰ−２ペプチドがヒトＧＬＰ−２、またはヒトＧＬＰ−２に１個または２個のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換、またはＮ末端もしくはＣ末端ブロッキング基が組み込まれている腸管栄養性のヒトＧＬＰ−２類似体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＧＬＰ−２ペプチドがヒトＧＬＰ−２である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
Xが１個のArgである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＧＬＰ−２ペプチドがヒトまたはラットのＧＬＰ−２ペプチドに１個または２個のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換、またはＮ末端もしくはＣ末端ブロッキング基が組み込まれている腸管栄養性のヒトまたはラットのＧＬＰ−２ペプチド類似体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
注射または注入により投与するための液体形態にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
医薬組成物の投与後に該ＧＬＰ−２ペプチドの遅延放出を引き起こすように製剤化された、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
経口送達用に製剤化された、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＧＬＰ−２が胃腸組織の成長を促進させるのに有効な量で存在する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＧＬＰ−２ペプチドが膵島の成長を促進させるのに有効な量で存在する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトの治療に使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＧＬＰ−２ペプチドが１００μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日の投与量でヒトに投与される請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
１個または２個のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換、またはＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸ブロッキング基を有するアミノ酸が組み込まれているという点でヒトまたはラットのＧＬＰ−２と異なっている腸管栄養性のヒトまたはラットＧＬＰ−２の類似体から選択されるＧＬＰ−２ペプチドの製剤学的に許容される酸付加塩であって、ＧＬＰ−２ペプチドが次式：
2010159259.tif 000017
（式中、aa1、aa2、aa3、aa4、aa5およびaa6は任意のアミノ酸残基を表し、
X はHis、ArgおよびLysから選択される１または２個のアミノ酸であり、
Y はHis、ArgおよびLysから選択される１または２個のアミノ酸であり、
m は０または１であり、
n は０または１であり、
R1はＨまたはＮ末端ブロッキング基であり、そして
R2はＯＨまたはＣ末端ブロッキング基である）
で表される、前記ＧＬＰ−２ペプチドの製剤学的に許容される酸付加塩。
【請求項１８】
ＧＬＰ−２ペプチドがヒトＧＬＰ−２類似体である、請求項１７に記載の製剤学的に許容される酸付加塩。
【請求項１９】
新規な腸管栄養性ペプチドを同定する方法であって、
ａ）１個または２個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはブロッキング基をもつアミノ酸を有する、腸管栄養性のヒトまたはラットＧＬＰ−２ペプチドの類似体を取得し、
ｂ）ラットＧＬＰ−２のために利用したとき腸管栄養効果を引き出すことができるレジメを用いて、非ヒト哺乳動物を上記類似体で治療し、そして
ｃ）偽治療した対照の非ヒト哺乳動物と比べて、小腸の重さおよび／または陰窩＋絨毛の高さおよび／または膵島の大きさに及ぼす上記類似体の効果を判定し、その結果として上記重さおよび／または上記高さおよび／または上記大きさの増加を引き出す類似体を上記腸管栄養性ペプチドとして同定する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２０】
胃腸組織の成長および/または機能を促進させるための請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物の製造におけるＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項２１】
前記医薬組成物が小腸組織の成長および/または機能を促進させるためのものである、請求項２０に記載のＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項２２】
前記医薬組成物が胃腸の症状、障害または疾病を予防または治療するためのものである、請求項２０に記載のＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項２３】
前記医薬組成物が潰瘍、消化障害、吸収不良症候群、短胃腸症候群、盲腸症候群、炎症性腸疾患、セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、限局性腸炎（クローン病）、毒性の薬剤または他の化学療法剤による小腸損傷、および短腸症候群よりなる群から選ばれる胃腸の疾病、障害、または症状を治療するためのものである、請求項２２に記載のＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項２４】
前記医薬組成物が短腸症候群を治療するためのものである、請求項２３に記載のＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項２５】
前記医薬組成物が潰瘍、消化障害、吸収不良症候群、短胃腸症候群、盲腸症候群、炎症性腸疾患、セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、限局性腸炎（クローン病）、毒性の薬剤または他の化学療法剤による小腸損傷、および短腸症候群よりなる群から選ばれる胃腸の疾病、障害、または症状を予防するためのものである、請求項２２に記載のＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項２６】
前記医薬組成物が化学療法剤による小腸損傷を予防するためのものである、請求項２５に記載のＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項２７】
膵島の成長を促進させるための請求項１〜１２および１４のいずれか１項に記載の医薬組成物の製造におけるＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項２８】
糖尿病治療用の請求項１４に記載の医薬組成物の製造におけるＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項２９】
ヒトまたはラットのＧＬＰ−２に１個または２個のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換、またはＮ末端もしくはＣ末端ブロッキング基が組み込まれており、かつ腸管栄養活性を有するＧＬＰ−２ペプチド類似体であって、ＧＬＰ−２ペプチドが次式：
2010159259.tif 000018
（式中、aa1、aa2、aa3、aa4、aa5およびaa6は任意のアミノ酸残基を表し、
X はHis、ArgおよびLysから選択される１または２個のアミノ酸であり、
Y はHis、ArgおよびLysから選択される１または２個のアミノ酸であり、
m は０または１であり、
n は０または１であり、
R1はＨまたはＮ末端ブロッキング基であり、そして
R2はＯＨまたはＣ末端ブロッキング基である）
で表される、前記ＧＬＰ−２ペプチド類似体。
【請求項３０】
ヒトＧＬＰ−２の類似体である、請求項２９に記載のＧＬＰ−２ペプチド類似体。
【請求項３１】
胃腸組織のアポトーシスを抑制するための請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物の製造におけるＧＬＰ−２ペプチドの使用。
【請求項３２】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物を含有するバイアルまたはアンプル、および胃腸障害または疾病を治療するためにその内容物を投与するための説明書を含んでなる包装品。
【請求項３３】
請求項１７または１８に記載の製剤学的に許容されるＧＬＰ−２ペプチドの塩および製剤学的に許容される担体を含んでなる、胃腸疾患の治療または予防用の医薬組成物。