(57)【要約】      （修正有）【課題】全身性エリテマトーデスの診断とその疾患活動性を評価する。【解決手段】抗体産生細胞を含む被験体からの生物学的試料をdsDNA抗原と反応させ、前記dsDNA抗原と結合する抗dsDNA抗体を検出することにより前記試料中の前記抗dsDNA抗体産生細胞を検出することを特徴とする全身性エリテマトーデスの診断法および疾患活動性の評価方法。dsDNA抗原と、抗体産生細胞を洗浄するための洗浄剤を含む、全身性エリテマトーデスの診断キットおよび評価のためのキット。【選択図】図１
2010071709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の抗dsDNA抗体産生細胞を検出することを特徴とする全身性エリテマトーデスの診断法。
【請求項２】
抗体産生細胞を含む被験体からの生物学的試料をdsDNA抗原と反応させ、前記dsDNA抗原と結合する抗dsDNA抗体を検出することにより前記試料中の前記抗dsDNA抗体産生細胞を検出することを特徴とする請求項１に記載の全身性エリテマトーデスの診断法。
【請求項３】
抗体産生細胞を含む被験者の生物学的試料を培養し、培養中に抗体産生細胞から放出された抗体と前記dsDNA抗原とを反応させることを特徴とする請求項２に記載の全身性エリテマトーデスの診断法。
【請求項４】
被験体の抗dsDNA抗体産生細胞を検出することを特徴とする全身性エリテマトーデスの疾患活動性の評価方法。
【請求項５】
抗体産生細胞を含む被験体からの生物学的試料をdsDNA抗原と反応させ、前記dsDNA抗原と結合する抗dsDNA抗体を検出することにより前記試料中の前記抗dsDNA抗体産生細胞を検出することを特徴とする請求項４に記載の全身性エリテマトーデスの疾患活動性の評価方法。
【請求項６】
抗体産生細胞を含む被験者の生物学的試料を培養し、培養中に抗体産生細胞から放出された抗体とdsDNA抗原とを反応させることを特徴とする請求項５に記載の全身性エリテマトーデスの疾患活動性の評価方法。
【請求項７】
dsDNA抗原と、抗体産生細胞を洗浄するための洗浄剤を含む、全身性エリテマトーデスの診断キット。
【請求項８】
dsDNA抗原と、抗体産生細胞を洗浄するための洗浄剤を含む、全身性エリテマトーデスの疾患活動性の評価のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性エリテマトーデスの診断法、疾患活動性評価方法および診断／評価キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス(SLE)は免疫学的異常により多臓器が障害される全身性自己免疫疾患であり、その約70％で疾患活動性と相関するとされる抗二本鎖DNA（dsDNA）抗体が検出される(非特許文献１)。
【０００３】
抗原に対し高親和性の抗dsDNA抗体は活動期に先行して出現・上昇する。さらに治療によってその値は低下するため、臨床では広く応用され、SLE患者の診療には欠かせない検査と言える。
【０００４】
抗dsDNA抗体は、SLEを発症する数年前から検出され(非特許文献２)、腎症を発症する患者血清中にはαactinin4(ヒト腎のみ存在)と交差反応性を有する抗dsDNA抗体が存在する(非特許文献３)。
【０００５】
現在、抗dsDNA抗体価を検出する測定法としてRIA法（Radioimmunoassay）などの免疫学的測定法や、酵素免疫測定法（Enzyme linked immunosorbent assay：ELISA法）が用いられている。
【０００６】
抗dsDNA抗体価を検出する測定法としてRIA法が存在するが、放射性同位元素を使用するため、特定の施設でしか測定できず汎用性がない。そのため、手技が簡便であるELISA法が臨床で汎用されている。しかしELISA法は疾患活動性が低い症例の約70％が陽性となる(非特許文献４)。このように疾患活動性が低いにもかかわらず、ELISA法が陽転化するため、臨床では疾患活動性の正当な評価がしばしば困難である。
【非特許文献１】Rheumatol. 2007(46) 1052
【非特許文献２】N Eng J Med 2003(349) 1526
【非特許文献３】Arthritis Rheum 2006(37) 359
【非特許文献４】Arthritis Rheum 1983 26:52-62
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既存の測定法ではこれらの問題点があるため、正確にSLEを診断し、疾患活動性を評価し得る新規方法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
抗dsDNA抗体は病原性を有していることから、疾患活動性が亢進した活動期では末梢組織などで消費されてしまい、血清中の抗dsDNA抗体価は減少する可能性がある。一方、抗原特異的抗体産生細胞は抗原刺激後、骨髄や脾臓から末梢血へ動員されることが知られている。さらにSLEにおいて自己免疫応答が惹起される活動期に、自己抗体産生細胞が末梢血中へ動員される可能性がある。
【０００９】
以上から、本発明者らはSLE患者の末梢血中に動員される抗dsDNA抗体産生細胞を直接的に検出することで、SLEの診断および疾患活動性の評価に応用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、以下の全身性エリテマトーデスの診断法、活動性評価方法、診断キットおよび評価キットを提供するものである。
項１．  被験体の抗dsDNA抗体産生細胞を検出することを特徴とする全身性エリテマトーデスの診断法。
項２．  抗体産生細胞を含む被験体からの生物学的試料をdsDNA抗原と反応させ、前記dsDNA抗原と結合する抗dsDNA抗体を検出することにより前記試料中の前記抗dsDNA抗体産生細胞を検出することを特徴とする項１に記載の全身性エリテマトーデスの診断法。
項３．  抗体産生細胞を含む被験者の生物学的試料を培養し、培養中に抗体産生細胞から放出された抗体と前記dsDNA抗原とを反応させることを特徴とする項２に記載の全身性エリテマトーデスの診断法。
項４．  被験体の抗dsDNA抗体産生細胞を検出することを特徴とする全身性エリテマトーデスの疾患活動性の評価方法。
項５．  抗体産生細胞を含む被験体からの生物学的試料をdsDNA抗原と反応させ、前記dsDNA抗原と結合する抗dsDNA抗体を検出することにより前記試料中の前記抗dsDNA抗体産生細胞を検出することを特徴とする項４に記載の全身性エリテマトーデスの疾患活動性の評価方法。
項６．  抗体産生細胞を含む被験者の生物学的試料を培養し、培養中に抗体産生細胞から放出された抗体とdsDNA抗原とを反応させることを特徴とする項５に記載の全身性エリテマトーデスの疾患活動性の評価方法。
項７．  抗dsDNA抗体に対する標識抗体と、dsDNA抗原と、抗体産生細胞を洗浄するための洗浄剤を含む、全身性エリテマトーデスの診断キット。
項８．  抗dsDNA抗体に対する標識抗体と、dsDNA抗原と、抗体産生細胞を洗浄するための洗浄剤を含む、全身性エリテマトーデスの疾患活動性の評価のためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば全身性エリテマトーデスを確実に診断することができ、特に全身性エリテマトーデスの疾患活動性を評価することができる。
【００１２】
全身性エリテマトーデスは再燃と寛解を繰り返す疾患であり、疾患活動性が高まったときに速やかに治療する必要がある。
【００１３】
本発明の方法によれば、抗dsDNA抗体産生細胞の陽性患者は100%SLEであり、SLEの診断に有用であるだけでなく、疾患活動性を正確に評価することができ、治療の必要なSLE患者を容易に見分けることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書において、被験体としては、全身性エリテマトーデス(SLE)に罹患する可能性のあるヒトが広く包含され、例えば全身性エリテマトーデス(SLE)の疑いのあるヒト、さらに全身性エリテマトーデスの疾患活動性の評価においてはSLE患者が好ましく例示される。
【００１５】
本明細書において、抗体産生細胞を含む生物学的試料は、抗dsDNA抗体を産生し得る細胞集団を含む生物学的試料が広く包含され、例えばヒトの末梢血から採取された血液のように未処理の血液試料であってもよく、白血球、単核球、リンパ球、あるいはＢリンパ球（Ｂ細胞）、形質細胞などの、抗dsDNA抗体を産生し得る細胞集団がより特定された生物学的試料であってもよい。血液には赤血球と白血球が含まれ、白血球は単核球（単球、リンパ球、形質細胞）と顆粒球(好中級、好酸球、好塩基球)に分けられ、リンパ球はＴリンパ球とＢリンパ球に分けられる。本発明で使用する生物学的試料は、抗dsDNA抗体を産生し得る細胞を含むものであればよく、Ｂリンパ球、形質細胞を含むものであり、単核球が分離操作の容易さと抗dsDNA抗体産生細胞の検出の感度、特異性の観点から生物学的試料として好ましく使用される。白血球、単核球、リンパ球、あるいはＢリンパ球、形質細胞などは、密度勾配遠心分離法により分離してもよく、セルソーターなどの細胞を選別できる任意の方法に従い分離してもよい。
【００１６】
ヒト血液中に存在し、全身性エリテマトーデスの血液中のマーカーである抗dsDNA抗体は、二本鎖ＤＮＡを認識する抗体であり、この抗体はDNAの配列に対する特異性は低く、例えばλファージDNAを含む任意の二本鎖ＤＮＡを認識することができる。
【００１７】
本発明で抗dsDNA抗体を結合させるために使用する二本鎖ＤＮＡ(dsDNA抗原)は、任意の二本鎖ＤＮＡ抗原を使用することができ、例えばλファージのdsDNAを好ましく例示できる。このλファージdsDNAは、水溶液を96穴マイクロタイタープレートのウェルなどに適用し、固相化することができる。dsDNA抗原の固相化される対象は、抗体産生細胞を培養できるものであればマイクロタイタープレートのウェルには限定されない。
【００１８】
dsDNA抗原に結合した抗dsDNA抗体の検出は、抗dsDNA抗体に対する標識された抗ヒトIgG抗体を使用して行うことができる。抗ヒトIgG抗体の標識としては、蛍光標識（フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラサイトグリーン、ルシファー・イエロー、カスケード・ブルー、テキサス・レッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、ＬＣレッド７０５、オレゴン・グリーンなど）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ （ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼ 、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、ルシフェラーゼなど）が挙げられる。好ましくは酵素標識であり、より好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼが挙げられる。なお、標識抗体の他に、表面プラズモン共鳴などにより、固相化したdsDNAと抗体の抗原抗体複合体を検出してもよい。
【００１９】
抗体産生細胞の洗浄剤としては、ノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤などの任意の界面活性剤、好ましくはTween（Tween 20、Tween 80など）、Triton X-100、MEGA-8、N-ラウロイルサルコシン-ナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、SDS、塩化セチルピリジニウム、CTAB、CHAPS、CHAPSO、スルホベタインSB10、スルホベタインSB16などが挙げられる。洗浄剤はPBSなどの緩衝液中で用いるのが好ましい。洗浄剤の濃度は、抗体産生細胞が除去され、かつ、抗dsDNA抗体が除去されない濃度であれば特に制限はなく、例えば0．001〜5%程度、好ましくは0.01〜1%程度である。
【００２０】
全身性エリテマトーデスは、例えばアメリカリウマチ協会のSLE分類基準(Mark C. Hochberg: Up dating the American College of Rheumatology Revised Criteria for the classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum, 40: 1725. 1997)に従い診断することができ、以下の11項目のうち、4項目が該当した場合に全身性エリテマトーデスと診断することができる。
１．頬部紅斑：頬骨隆起部上の紅斑 
２．円板状紅斑 
３．光線過敏症：患者病歴または医師の観察による 
４．口腔内潰瘍：医師の観察によるもので通常無痛性 
５．関節炎：二つ以上の末梢関節の非びらん性関節炎 
６．漿膜炎
ａ）胸膜炎：疼痛、摩擦音、胸水
ｂ）心膜炎：心電図、摩擦音、心膜液 
７．腎障害
ａ）0.5g/日以上または３+以上の持続性蛋白尿
ｂ）細胞性円柱：赤血球、顆粒、尿細管性円柱 
８．神経障害
ａ）けいれん
ｂ）精神障害 
９．血液学的異常
ａ）溶血性貧血
ｂ）白血球減少症：4,000/mm3未満が2回以上
ｃ) リンパ球減少症：1,500/mm3未満が2回以上
ｄ) 血小板減少症：100,000/mm3未満 
１０．免疫学的異常
ａ) 抗DNA抗体：native DNAに対する抗体の異常高値
ｂ) 抗Sm抗体の存在
ｃ) 抗リン脂質抗体：抗カルジオリピン抗体、ループスアンチコアグラント陽性、梅毒血清反応偽陽性 
１１．抗核抗体の検出
これらの１１項目の各症状において、生物学的試料における抗dsDNA抗体産生細胞の値が高いほど症状が重篤になる傾向にあり、本発明によれば治療の必要な全身性エリテマトーデスの患者を特定することができる。全身性エリテマトーデス(SLE)は、上記のように多彩な症状を有しかつ診断が難しく、SLEの非専門医が診察する機会が多い。本発明の方法およびキットを用いて、SLEの非専門医にも早期の治療の必要な患者が容易に判別されれば、症状が重篤になる前に治療を行うことができる。
【００２１】
SLEの評価項目としては、上記の11項目の診断基準の他にSLEDAI(SLE Disease Activity Index)が用いられる。本発明の方法は、SLEDAIとも有意に相関し、SLEの診断法として優れていることが明らかにされた。
【００２２】
本発明において、抗dsDNA抗体産生細胞の検出は、例えばDNA抗原を固相化し末梢血抗dsDNA抗体産生細胞を検出・定量するELISPOT（Enzyme Linked Immunospot Assay）法により好ましく実施される。以下、本発明を図1に示されるELISPOT法に基づき説明するが、本発明はELISPOT法以外の方法により実施してもよい。
（１）抗原の固相化と抗体産生細胞のウェルへの導入
まず、dsDNA抗原を固相化する。固相化は、抗体産生細胞が培養可能な容器に行うことができる。このような容器としてはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられるが、抗体産生細胞が培養可能である限りウェルに限定されることはない。
【００２３】
この固相化したウェルに単核球などの抗dsDNA抗体産生細胞を含み得る生物学的試料（以下単核球を例にとり説明する）を加える。単核球は、被験体の血液中に存在する抗dsDNA抗体が好適に除かれている。これは、本発明では、血液中に存在する抗dsDNA抗体量を求めるのではなく、抗dsDNA抗体産生細胞の量に基づいて診断等を行うためである。
【００２４】
１ウエルあたりの単核球数は、特に限定されないが、例えば１×１０４個から１×１０６個程度が例示される。単核球数は、培養により検出に必要な抗体量が得られればよく、単核球数が少ない場合には、より長時間培養することになる。
（２）培養
単核球の培養は、例えば３７℃前後の温度、５％CO2などの培養条件で１〜24時間好ましくは２〜８時間程度培養を行う。培養液としては、例えば１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地などのヒト細胞の培養に通常用いられる培地が広く用いられる。
（３）細胞の洗浄除去
培養後、単核球などの抗体産生細胞は、0.05%TweenのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）溶液などの洗浄液により洗浄除去される。洗浄は、超音波の存在下に行ってもよく、培地を洗浄液にしてインキュベートすることにより行ってもよい。また、単核球などの抗体産生細胞の洗浄除去は、1回のみでもよく、2回以上繰り返し行ってもよい。抗体産生細胞が残存していると、次の工程で検出される抗体量が増えることになるので、細胞の洗浄除去は完全に行うのがよい。単核球などの抗体産生細胞の洗浄除去の工程において、培養液中に含まれる非結合型の抗体は同時に除去される。
（４）抗dsDNA抗体の検出
ウェルに固相化された抗dsDNA抗体は、ヒト被験体由来のIgG抗体であるので、標識された抗ヒトIgG抗体を用いて検出することができる。抗ヒトIgG抗体は、市販品を用いることができる。
【００２５】
本発明のキットは、単核球などの抗体産生細胞の洗浄液、抗ヒトIgG抗体（二次抗体）の洗浄液、緩衝液、抗体産生細胞の培養液（培地）、適当な反応希釈液、反応停止液、抗体産生細胞の培養のための培養容器（例えば96穴マイクロタイタープレートなどのプレート）、dsDNA抗原、使用説明書などが含まれていてもよい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
【００２７】
以下の実施例では、SLE患者、関節リウマチ（RA）患者、原発性シェーグレン症候群（Sjogren）患者、強皮症（SSｃ）患者、成人健常ドナー（NHC）を対象として、ELISPOT法を用いて末梢血単核球中の抗dsDNA抗体産生細胞を検出・定量を行った。抗dsDNA抗体産生細胞は疾患活動性の高いSLE患者のみで検出された。また、ELISA法では疑陽性を示した症例も識別可能であった。
【００２８】
このELISPOT法は従来の検査法よりも、より正確なSLE患者の疾患活動性の評価が可能となる点で優れていた。
実施例１
SLE患者130例、RA患者32例、Sjogren患者6例、SSc患者2例、NHC  18例から得られた静脈血を密度勾配遠心分離法によって末梢血単核球（PBMC）を単離した。
【００２９】
抗原としてS1 nuclease処理後のλファージDNAを固相化した96穴プレートに上記単核球を各ウェルに2.5×105個ずつ加え、4時間培養した。アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG抗体を反応させ、5-brome 4-chloro 3-indolyl phosphate(BCIP)を加え、末梢血抗dsDNA抗体産生細胞数を測定した（図1）。Cut  off値2.0/2.5×105PBMCにて、SLE患者130例中29例が陽性となり、疾患対象群、健常人では陽性例は認めなかった（図2）。またSLE患者をELISPOT法陽性例と陰性例に分け臨床特徴を比較した結果、疾患活動性を示すSLEDAI値が高い症例が陽性例に多く存在した（表１）。
【００３０】
さらに疑陽性を示すELISA法との比較のため、ELISA法陽性・陰性例に分けELISPOT法の結果を検討した。ELISA法陽性例の中でもSLEDAI値の高い症例がELISPOT法陽性であり、ELISA法よりも疾患活動性の高い症例を選択的に検出できることが判明した（表２）。
【００３１】
これを確認するために、SLE患者をSLEDAI値5以上、5以下の症例に分け、ELISA法の抗体価とELISPOT法の陽性数を用いてグラフに展開した。その結果ELISA法で高力価陽性例の中でもELISPOT法はより疾患活動性の高い症例を検出することができた（図3）。
【００３２】
【表１】
2010071709.tif 000003
ELISPOT陽性例では抗dsDNA抗体価が高く、尿蛋白陽性例が多く認められ、また、SLEの疾患活動性を表すSLEDAI・SLAMがより高い患者が含まれた。
【００３３】
【表２】
2010071709.tif 000004
抗dsDNA抗体陽性例の中でもELISPOT法は、よりSLEDAI値が高い患者を検出することが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ELISPOT法の概要。末梢血単核球をS1 Nuclease処理後のλファージDNAを固相化したメンブレンに2.5×105個ずつ加え、４時間培養した。その後アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG抗体で反応させ、5-brome 4-chloro 3-indolyl phosphate(BCIP)を加え、抗dsDNA抗体産生細胞数を測定した。
【図２】SLE患者・疾患対象群・健常ドナーを対象としたELISPOT法の結果の比較。SLE患者130例、RA患者32例、Sjogren患者6例、SSｃ患者2例、NHC 18例を対象とした結果、末梢血抗dsDNA抗体産生細胞はSLE患者のみで検出された。
【図３】SLE患者における末梢血抗dsDNA抗体産生細胞数と抗dsDNA抗体価との関連。抗dsDNA抗体高力価陽性例の中で、より疾患活動性の高い症例で末梢血抗dsDNA抗体産生細胞が検出された。
【図２】
2010071709.tif 000005
【図３】
2010071709.tif 000006
【図１】
2010071709.tif 000007