(57)【要約】【課題】フラクトオリゴ糖生産菌であるオーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株を含む培地で培養すると、α−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素が生産される。生産される素酵素中のβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性が高いため、テアンデロースの収率が著しく低下し、テアンデロースの工業的生産に用いることができない。【解決手段】オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株を培養して得られたα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素を加熱処理することで、該粗酵素の中のβ−フラノシダーゼ活性を著しく抑制せしめた後、該加熱処理酵素溶液を、しょ糖とマルトース両方を含む基質と反応させテアンデロースを多く生成せしめる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
しょ糖とマルトースの含有量１０〜７０重量％で、それらの比率が１０：１〜１：１０の溶液の少なくとも一部がα−グルコシルトランスフェラーゼによりテアンデロースに変換されたテアンデロースとフラクトオリゴ糖の比率が１５：１から１５：３０であるテアンデロース含有シロップ。
【請求項２】
オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株をα−１，４結合よりなるグルコースのオリゴ糖または多糖を含む培地で培養することにより得られるα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼとを含む粗酵素を加熱処理し、該粗酵素に含まれるβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性を１０〜７０重量％、好ましくは２０〜６０重量％、さらに好ましくは５０重量％前後である。基質溶液におけるしょ糖とマルトースの比は１０：１〜１：１０抑制させることを特徴とするテアンデロース生成酵素の製造法。
【請求項３】
しょ糖とマルトースを含む基質溶液に請求項２のテアンデロース生成酵素を反応せしめることを特徴とするテアンデロース含有シロップの製造法。
【請求項４】
オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株を培養する培地に含まれるα−１，４結合よりなるグルコースのオリゴ糖または多糖が、マルトテトラオース、あるいはマルトトリオース、あるいはマルトース、あるいは可溶性澱粉を含む培地である請求項１のテアンデロース生成酵素の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株、および同株が高生産するα−グルコシルトランスフェラーゼを用いたテアンデロースの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テアンデロースは、しょ糖のグルコース残基の６位にグルコース基の１位がα−グルコシド結合した三糖類で、少量ながら蜂蜜や甘蔗糖蜜に含まれており、う蝕誘発性を抑える作用、およびビフィズス菌の増殖効果がある有望なオリゴ糖である。
【０００３】
テアンデロースの従来の製造法として、アスペルギルス・アワモリおよびアスペルギルス・フォエニシスの糖転移酵素を用いる方法（特許文献１）、バチルス属のしょ糖転移酵素を用いる方法（特許文献２）、ムコール・ジャパニカスの糖転移酵素を用いる方法（特許文献３）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−１４３８９２
【特許文献２】特開平４−３０７９６
【特許文献３】特開平８−２３９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１、特許文献２、および特許文献３の方法では産業的には生産し得るものの安価に大量生産することはできない。
【０００６】
β−フラクトシルトランスフェラーゼ高生産菌であるオーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株をマルトースあるいはマルトトリオースあるいはマルトテトラオースあるいは可溶性澱粉を含む培地で培養すると、α−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素が生産される。生産される素酵素中のβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性が高いため、テアンデロースの収率が著しく低下し、テアンデロースの工業的生産に用いることができない。
【０００７】
α−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方を含む粗酵素をしょ糖とマルトース両方を含む基質と反応させると、粗酵素中のβ−フラクトシルトランスフェラーゼはしょ糖を基質にしてフラクトオリゴ糖を生成し、α−グルコシルトランスフェラーゼがしょ糖とマルトースを基質にしてテアンデロースを生成することを阻害する。
【０００８】
こうした問題を解決し、安価に大量生産できる製造法の開発が望まれている。本発明は微生物が高生産するα−グルコシダーゼを用いるテアンデロースの製造法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するため鋭意検討するなかで、オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株をマルトースあるいはマルトトリオースあるいはマルトテトラオースあるいは可溶性澱粉を含む培地で培養して得られたα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素を加熱処理することで、該粗酵素の中のβ−フラノシダーゼは著しく活性が低下し、かつα−グルコシダーゼは活性が低下しないことを見い出した。
【００１０】
加熱処理によりβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性が著しく低下した処理粗酵素溶液を、しょ糖とマルトース両方を含む基質と反応させるとフラクトオリゴ糖の生成が抑えられ、加熱処理をしていないα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素溶液をしょ糖とマルトース両方を含む基質と反応させた場合よりもテアンデロースが多く生成された。
【００１１】
本発明の基質溶液は、しょ糖とマルトースの両方を含むものをいい、しょ糖とマルトースを合せた糖質濃度は完全に糖質が溶解する濃度であれば問題なく、１０〜７０重量％、好ましくは２０〜６０重量％、さらに好ましくは５０重量％前後である。基質溶液におけるしょ糖とマルトースの比は１０：１〜１：１０の範囲が可能である。基質溶液のｐＨは３〜７が可能で、４．５〜５．０が好ましい。反応温度は、２０〜７０℃であれば可能で、５０〜６５℃が好ましい。
【００１２】
本発明のα−グルコシルトランスフェラーゼとは、マルトースのグルコシド結合が切れて生じるグルコース残基を、しょ糖のグルコース残基の６位の炭素に結合させ、α−グルコシド結合で結合した三糖テアンデロースを生成する作用を有する菌体または菌体抽出物を意味する。菌体とは、培養したオーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株を含む培養液、および培養液からオーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株の菌体を常法により一旦分離した菌体の両方を意味する。菌体抽出物とは、菌体を常法により破壊して得られた上述のグルコシル基転移活性を有する部分精製酵素、さらに必要に応じて公知の方法で精製された上述のグルコシル基転移活性を有する酵素を意味する。
【００１３】
本α−グルコシルトランスフェラーゼは、オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株を培養することによって得る事ができる。該菌株は独立行政法人産業技術総合研究所?特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番１号?中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ?Ｐ−４２５７として寄託されている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株の生産するα−グルコシルトランスフェラーゼをしょ糖とマルトースを含む基質溶液に作用させることにより、う蝕誘発性を抑える作用、およびビフィズス菌の増殖効果のあるテアンデロースを工業的に安価に生産できる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において使用できる培地としては、次の掲げるものがある。例えば、炭素源としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、可溶性澱粉などを、窒素源としては、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機物、およびペプトン、コーンスチープリカー、コーングルテンミールなどの有機物を用いることができる。その他、微量の無機金属類、ビタミン類、成長促成因子を、例えばチアミン、ビオチンを含む粉末酵母などを添加してもよい。これらの培地成分は該菌株の成育を阻害しない濃度であればよく、炭素源は通常０．５〜１５．０重量％用いるのが適当である。窒素源は通常０．１〜２．５重量％用いるのが適当である。培地は通常ｐＨ５．５〜７．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．０に調整し、滅菌して使用する。培養温度の範囲は該菌株が生育し得る温度であればよく、通常２０〜３０℃が適当である。該菌株を液体培養する場合は、振とう培養または通気攪拌培養するのが好ましい。培養時間は種々の培養条件によって異なるが、振とう培養または通気攪拌培養の場合は、２〜５日間、このましくは２〜３日間が適当である。
【００１６】
オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株が産生するα−グルコシルトランスフェラーゼは、菌体そのもの、または菌体処理物としてもテアンデロースの製造に使用することができる。
【００１７】
菌体そのものとしては、培養されたオーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株を集菌し蒸留水で洗浄後再び集菌した菌体を使用することができる。菌体処理物としては、細胞壁分解酵素処理して得られる菌体溶解産物を使用することができる。
【００１８】
オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株において生産されるα−グルコシルトランスフェラーゼの分離は、細胞壁分解酵素で細胞壁を破壊することにより実施できる。その後、適宜ろ過または遠心分離することにより、粗酵素溶液を得ることができる。この粗酵素溶液は必要に応じて限外ろ過による濃縮または硫安塩析法、溶媒沈殿法、透析法などの公知の方法を適用して精製してもよい。
【００１９】
また、当該粗酵素溶液および粗酵素は、イオン交換クロマトグラフィーによる吸着および溶出、分子量の差によるゲル濾過法など一般的酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製することもできる。
【００２０】
本発明のα−グルコシルトランスフェラーゼの活性は、例えば、マルトースを基質とした酵素活性測定によって調べることができる。つまり、マルトースを含有する溶液に、試料を添加し、単位時間当たりに遊離したＤ−グルコースを量をグルコース定量キット（グルコーステスト和光純薬工業株式会社）により調べることによって決定することができる。本明細中においてα−グルコシルトランスフェラーゼ活性１単位（Ｕ）とは、１分間に１マイクロモルのＤ−グルコースを生成する酵素量と定義した。
【００２１】
本発明を以下に実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）培養
オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株を１００ｍｌのマルトースＨ培地（マルトース２５ｇ、粉末酵母７．５ｇ、硝酸ナトリウム１．０ｇ、リン酸水素二カリウム１．０ｇを蒸留水に溶解してｐＨ７．０に調整し１Ｌとする）を含む３００ｍｌ三角フラスコの中で２９℃で２日間振盪培養した。同培養液１００ｍｌを２０Ｌの前記マルトースＨ培地を入れたジャーファーメンターに移植して、２９℃で２日間培養した。培養終了後、ろ過により集菌し、蒸留水で洗浄後再び集菌し、湿菌体重量および乾燥菌体重量を計測した。
【００２３】
（実施例２）α−グルコシダーゼの抽出
０．０７５ＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）１００ｍｌにオーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株乾燥菌体５ｇ、およびキタラーゼ（２０００Ｕ／ｇ和光純薬）２０ｍｇを加えて４０℃で１５０分間処理した。処理溶液を遠心分離した。その上精約１００ｍｌを氷冷しながら硫酸アンモニウム５６．１ｇを徐々に加えた。遠心分離を行ない沈殿を得た。この沈殿物を０．０７５ＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍｌに懸濁し、０．０７５ＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて透析した。
【００２４】
次に、この粗酵素溶液５０ｍｌの体積が１０ｍｌに減るまで分画分子量１００００の限外ろ過膜で限外ろ過を行なった。１０ｍｌの粗酵素溶液に４０ｍｌの０．０２５Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を加えて同様に限外ろ過を行なった。この作業を３回繰り返し０．０７５ＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）を２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に変換し、粗酵素溶液１０ｍｌを得た。これを以下に述べる精製操作に供した。
【００２５】
（実施例３）酵素の精製
実施例２で得られた粗酵素溶液１０ｍｌを、ＳＰセファロースファストフローカラム（陰イオン交換カラムＧＥヘルスケア社）で、２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いて分画した。α−グルコシダーゼ活性のある画分溶液１７５ｍｌの体積が１０ｍｌになるまで分画分子量１００００の限外ろ過膜で限外ろ過を行なった。
【００２６】
（実施例４）テアンデロースの製造
シュクロース１５ｇ、マルトース１０ｇを含む０．０７５ＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍｌにオーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株乾燥菌体１ｇを加えて、６５℃で３０分反応させた。反応液を１００℃で１０分間加熱処理したのち、遠心分離によって上精を得た。得られた反応液上精を下記分析条件で高速液体クロマトグラフィー装置を使って分析した結果、３．４３ｇのテアンデロースの生成が認められた（図１）。
【００２７】
（分析条件）ＨＰＬＣカラム：東ソー株式会社製?ａｍｉｄｏ−８０（４．６×２５０ｍｍ）
溶離液：アセトニトリル：水＝７０：３０、流速?：１．０ｍｌ／ｍｉｎカラムオーブン温度?：８０℃、検出器：示差屈折計
【００２８】
（実施例５）フラクトオリゴ糖の生成抑制
４０ｍｌの０．０７５ＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）に３ｇのオーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株乾燥菌体を懸濁した。懸濁液を２ｍｌずつマイクロチューブに分注して、各温度（４５,５５,６０,６５,７０,７５℃）で１０分間インキュベートした。その後、すぐに氷冷した。
【００２９】
各温度で処理した菌体懸濁液０．５ｍｌを、しょ糖１．５ｇおよびマルトース１ｇを含む０．０７５ＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）４．５ｍｌに加えて６５℃で３０分間反応させた。反応液を１００℃で１０分間加熱処理したのち、遠心分離によって上精を得た。得られた反応液上精を高速液体クロマトグラフィー装置を使って分析した（表１）。熱処理により、フラクトオリゴ糖であるケストースの生成が抑えられたことを確認した。
【００３０】
【表１】
2010159225.tif 000002
【００３１】
（表１）は温度処理しない場合のテアンデロース生成量を１００とした時の、各条件でのテ
アンデロースとケストースの生成量を相対値で示す。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、抗う蝕性、ビフィズス因子を持つ甘味料として知られるテアンデロースを安価に効率よく製造するための新規な方法に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】高速液体クロマトグラフィーによるテアンデロースの分析結果を示す図である。
【図１】
2010159225.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月8日(2009.1.8)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
オーレオバシジウムｓｐ．ＡＴＣＣ２０５２４株をα−１，４結合よりなるグルコースのオリゴ糖または多糖を含む培地で培養することにより得られるα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼとを含む粗酵素を加熱処理し、該粗酵素に含まれるβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性を抑制させることを特徴とするテアンデロース生成酵素の製造法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】（分析条件）ＨＰＬＣカラム：東ソー株式会社製ａｍｉｄｏ−８０（４．６×２５０ｍｍ）溶離液：アセトニトリル：水＝７０：３０、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎカラムオーブン温度：８０℃、検出器：示差屈折計