(57)【要約】【課題】ラテックス凝集反応において複数項目を同時に検出するための免疫センサチップ、及びそれを用いた免疫センサ装置を提供する。【解決手段】免疫センサチップは、標的物質が含まれる検体と、前記標的物質に特異的に結合する生体親和性分子が担持された粒子とを含む試料が配置される試料収納部と、粒径に基づいて前記粒子を分離する粒子分離手段と、前記試料に電圧を印加して前記粒子を凝集させるための一対の電極とを備える。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質が含まれる検体と、前記標的物質に特異的に結合する生体親和性分子が担持された粒子とを含む試料が配置される試料収納部と、
粒径に基づいて前記粒子を分離する粒子分離手段と、
前記試料に電圧を印加して前記粒子を凝集させるための一対の電極と、を備える免疫センサチップ。
【請求項２】
前記粒子分離手段は階段状の段差である、請求項１に記載の免疫センサチップ。
【請求項３】
前記試料収納部は、試料注入口、空気口、および前記試料注入口から前記空気口に向かって伸びる流路を有し、
前記階段状の段差は、前記注入口から前記空気口の方向に連続的に占有面積を増すように形成されている、請求項２に記載の免疫センサチップ。
【請求項４】
他の一対の電極をさらに有し、
前記一対の電極は前記流路の伸びる方向に対して平行に形成され、前記他の一対の電極は前記流路の伸びる方向に対して垂直方向に形成される、請求項１から３のいずれかに記載の免疫センサチップ。
【請求項５】
前記免疫センサチップと、
前記粒子分離手段によって分離された前記粒子の分布状態を観察する試料観察手段とを有する、請求項１から４のいずれかに記載の免疫センサ装置。
【請求項６】
前記免疫センサチップと、
電圧印加手段を有し、
前記電圧印加手段は、前記他の一対の電極に電圧を印加した後に、前記一対の電極に電圧を印加する、請求項４に記載の免疫センサ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中の標的物質の分析、特に免疫学的反応を用いた分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療などの分野において、生体中の標的物質の存在及びその量を分析することは有益である。中でも、標的物質に特異的に反応する抗体を用いた免疫学的分析法は最もよく用いられる方法の一つである。免疫学的分析法には、反応の検出方法により様々な測定法が存在する。例えば、標識物質を抗体に連結させた試薬を用い抗原抗体反応が生じたかどうかを標識物質により検知する標識免疫測定法が知られている。本方法は、標識物質に酵素、蛍光物質、放射性同位体を用いた方法が知られている。これらはそれぞれ、酵素免疫測定法、蛍光物質標識免疫測定法、放射線免疫測定法と呼ばれている。また、抗体を担持させた粒子状試薬を用い、抗原抗体反応が生じたかどうかを粒子状試薬の凝集状態により検知する、凝集反応に基づく免疫測定法が知られている。この代表的なものとしてラテックス粒子を用いるラテックス凝集法等がある。標識免疫測定法は高精度の分析が可能であるが、用いる試薬が不安定であることや、測定時間が比較的長いという問題がある。一方、凝集反応にもとづく免疫測定法であるラテックス凝集法は、分析精度はあまり高くないものの、測定時間が比較的短いという利点を有している。
【０００３】
ラテックス凝集法は次のように行われる。まず、標的物質に特異的に反応する抗体をラテックス粒子に担持（固定）する。当該ラテックス粒子と試料を反応させ、試料中に含まれる標的物質とラテックス粒子に担持された抗体を反応させる（抗原抗体反応）。当該反応の進行に従いラテックス粒子は凝集するので、その凝集塊を光学的に検出して分析対象物の濃度を測定する。
【０００４】
ラテックス凝集法における測定感度・測定時間は、用いるラテックス粒子の粒子径によって異なり、ラテックス粒子径が大きければ測定感度は高くなるが、測定時間が長くなる。粒子径が小さければ測定感度は低くなるが、測定時間が短くなる。通常、当該方法で用いられるラテックス粒子の粒子径は数百ｎｍであり、測定可能な領域はｎＭ程度である。ラテックス凝集法はいくつかの改良方法が報告されており、特許文献１には、粒径０．５μｍ〜１０μｍのラテックス粒子を用い、試料液に交流電圧を印加して電場をかけることにより、粒子を一直線上に並べる方法が開示されている。この方法によれば、１分で全粒子の９０％を凝集させることが可能であり、比較的大きなラテックス粒子を用いて測定感度を高めつつ、測定時間を短くすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平７−８３９２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ラテックス凝集法及び特許文献１で示したラテックス凝集改良法は、単一の標的物質を検出するために用いられるものの、複数項目を同時に検出することには適していない。仮に検出手段によって分類可能な複数種類のラテックス粒子を同時に用い、ラテックス粒子毎に異なる項目を検出しようとしても、種類の異なるラテックス粒子が同種ラテックス粒子間の凝集反応を邪魔する物理的な障害となるため、凝集効率が落ちてしまう。そのため、通常は検査前に検体を分注し、複数種類のラテックス粒子と各々混合するという煩雑な作業を行い、複数項目を個別に検査する必要があった。
【０００７】
本発明は上記の課題を解決するためのもので、ラテックス凝集反応において複数項目を同時に検出するための免疫センサチップおよびそれを備えた免疫センサ装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の免疫センサチップは、標的物質が含まれる検体と、前記標的物質に特異的に結合する生体親和性分子が担持された粒子とを含む試料が配置される試料収納部と、粒径に基づいて前記粒子を分離する粒子分離手段と、前記試料に電圧を印加して前記粒子を凝集させるための一対の電極とを備える。粒径に基づいて粒子を分離する粒子分離手段を備えるので、粒径ごとに分離させて粒子を凝集させることができる。従って、それらの粒子の凝集状態を観察すれば、一度の測定で複数種類の標的物質の検出が可能となる。
【０００９】
前記粒子分離手段は階段状の段差であることが好ましい。粒径の違いによって、高い精度で粒子を分離することができる。
【００１０】
前記試料収納部は、試料注入口、空気口、および前記試料注入口から前記空気口に向かって伸びる流路を有し、前記階段状の段差は、前記注入口から前記空気口の方向に連続的に占有面積を増すように形成されていることが好ましい。粒径の違いによって、より高い精度で粒子を分離することができる。
【００１１】
他の一対の電極をさらに有するのが好ましい。一対の電極は前記流路の伸びる方向に対して平行に形成され、他の一対の電極は前記流路の伸びる方向に対して垂直方向に形成されるのが好ましい。粒径の違いによって、より高い精度で粒子を分離することができる。
【００１２】
本発明の免疫センサ装置は、前記免疫センサチップと、前記粒子分離手段によって分離された前記粒子の分布状態を観察する試料観察手段とを有する。試料観察手段によって、粒径ごとに分離された粒子の分布状態（凝集状態）を観察できるので、一度の測定で複数種類の標的物質の検出が可能となる。
【００１３】
本発明の免疫センサ装置は、前記免疫センサチップと、電圧印加手段を有する。前記電圧印加手段は、前記他の一対の電極に電圧を印加した後に、前記一対の電極に電圧を印加してもよい。より高い精度で、粒径の違いによって粒子を分離させた状態で凝集させることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の免疫センサチップは、粒径に基づいて粒子を分離する粒子分離手段を備えるので、粒径ごとに分離させて粒子を凝集させることができる。従って、それらの粒子の凝集状態を観察すれば、一度の測定で複数種類の標的物質の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の第一の態様におけるセンサ装置の模式図
【図２】本発明の第一の態様におけるセンサチップの分解斜視図
【図３】本発明の第一の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図
【図４】（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、本発明に第一の態様のセンサチップにおける交流電圧印加時の粒子挙動を説明するための模式図
【図５】本発明の第二の態様におけるセンサ装置の模式図
【図６】本発明の第二の態様におけるセンサチップの分解斜視図
【図７】本発明の第二の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図
【図８】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、本発明の第二の態様のセンサチップにおける交流電圧印加時の粒子挙動を説明するための模式図
【図９】本発明の第三の態様におけるセンサチップの分解斜視図
【図１０】本発明の第三の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図
【図１１】本発明の第四の態様におけるセンサチップの分解斜視図
【図１２】本発明の第四の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図
【図１３】本発明の第五の態様におけるセンサ装置の模式図
【図１４】本発明の第五の態様におけるセンサチップの分解斜視図
【図１５】本発明の第五の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図
【図１６】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、本発明の第五の態様のセンサチップにおける交流電圧印加時の粒子挙動を説明するための模式図
【図１７】本発明の第六の態様におけるセンサチップの分解斜視図
【図１８】本発明の第六の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下本発明を実施形態を図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
図１は、本発明の第一の態様における免疫センサ装置の模式図である。本発明の免疫センサ装置１１１は、センサチップ１１２と、センサチップ１１２に形成された電極４に連結された交流電圧印加装置１１４、光学検出手段（試料観察手段）１１３からなる。センサチップ１１２の詳細は後述するが、少なくとも１つの流路１３が設けられ、光学検出手段１１３により流路１３（試料収納部）内部の複数個所が観察できるように構成されている。
【００１７】
図２は、本発明の第一の態様におけるセンサチップの分解斜視図である。センサチップ１１２は上カバー１、接着層２、下基盤３からなり、上カバー１と下基盤３との間は、接着層２により中空構造となり流路１３が形成されている。流路１３の一端には注入口１１が形成され、また注入口１１とは異なる他端には空気口１２が形成されている。下基盤３には、少なくとも１対の電極４が設けられ、その一部は流路１３を形成する中空構造に露出している。
【００１８】
図３は、本発明の第一の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図である。上カバーには注入口１１、空気口１２、少なくとも一つの粒子分離手段１４が形成される。粒子分離手段１４は注入口１１と空気口１２の間にある階段状の段差である。
【００１９】
以下に図面を参照し本発明について詳細に説明する。
前記の通り、本発明のセンサ装置に含まれるセンサチップは中空構造、すなわち試料を充填するための空間を有する。センサチップは単に「チップ」とも呼ばれる。チップの形状には制限はないが、直方体であることが好ましい。
【００２０】
当該空間の内部には少なくとも１つの流路が形成されている。流路の数を増減することも可能である。空間の形状は制限されないが、例えば直方体であることが好ましい。当該流路には注入口と空気口が形成される必要があるが、その場所は流路内にその一部が露出している電極をはさむように形成されることが望ましい。当該流路への試料の充填は毛細管力を用いて行うことができる。また、ポンプ圧によって行わうことも可能であり、注入口へポンプを接続し、空気口は排気口として用いることで実現できる。ポンプの種類に制限はない。当該流路の内壁を形成する材料は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）やポリカーボネート等のポリマーフィルム、ガラスなどを用いることができる。上記材料は、より良くは表面性質が親水性であればよく、界面活性剤、リン脂質、蛋白質で処理されていてもよい。これらには公知のものが用いられる。また、センサチップの内部空間に存在する粒子像を顕微鏡で観察できる程度に透明性の高いものを用いる。スペーサーは、接着剤、光硬化樹脂、両面粘着テープなどを用いて形成することができ、その材質による制限はない。電極の作製は、スパッタリングや蒸着を用いることができ、電極素材には、金や銀などを用いることができる。本発明のセンサチップの上カバーに形成される粒子分離手段は注入口と空気口の間にある階段状の段差であり、ポリマーの射出成型やガラス切削により作製することができる。この段差と下基盤との間に形成される流路高は、標的物質検出に使用する微粒子群のうち、より大きな粒子群の平均直径よりも小さいことが必要であるが、検出に使用する微粒子の種類により適宜設定することができる。
【００２１】
本発明のセンサチップの分析対象は液体試料であり、より詳しくは液体試料中に存在する標的物質である。液体試料は特に限定されないが、その例には生体から採取した血液等が含まれる。本発明のセンサチップの分析対象である液体試料には、不溶性担体を分析試薬として混合して用いる。不溶性担体（単に「担体粒子」「粒子」ともいう。）には、市販の生化学用ビーズを用いることができるが、好ましくはラテックスである。粒子の直径に関しては、光学検出手段により粒子を観察できる径であればよく、好ましくは１〜１０μｍである。本発明においては少なくとも２種類の異なる粒径の粒子を用いるが、好ましくは直径差が２倍となるように選択することが好ましい。粒子表面には、液体試料中の標的物質に特異的に結合する物質が担持されている。「液体試料中の標的物質に特異的に結合する物質」とは、液体試料中の標的物質（分析対象物）の特定部位を認識して当該部位に結合できる物質をいう。このような物質の例には抗体、抗原、受容体、酵素、核酸、ペプチドなどの生体高分子が含まれる。本発明においては、「液体試料中の特定成分に特異的に結合する物質」は「抗体」であることが好ましい。抗体には公知のものを用いることができる。その例には抗アルブミン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＤＮＴ抗体、抗プロスタグランジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロイドホルモン抗体等が含まれる。抗原の例にはアルブミン、ＨＣＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＡＦＰ、ＤＮＴ、プロスタグランジン、ヒト凝固ファクター、ＣＲＰ、ＨＢｓ、ヒト成長ホルモン、ステロイドホルモン等が含まれる。
【００２２】
「粒子表面に粒子に液体試料中の標的物質に特異的に結合する物質を担持する」とは、粒子表面に化学的あるいは物理的に前記物質を結合させることをいう。例えば、前記物質と粒子を物理的な吸着反応により結合して得る方法や、シランカップリング剤等を用いて化学的に結合して得る方法がある。
【００２３】
本粒子を含む分析試薬は、「液体試料中の標的物質に特異的に結合する物質」の保存性を高めるために他の試薬を含んでいてもよい。このような試薬の例には糖類等が含まれる。また、本粒子を含む分析試薬には、測定に適した条件に調節するための緩衝液成分を含んでいても良い。
【００２４】
次に本発明の実施の形態１による免疫センサチップを用いた、標的物質を検出する方法を述べる。図４（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は免疫センサチップにおける交流電圧印加時の粒子挙動を説明するための模式図である。図４（ａ）は免疫センサチップを上から見た図であり、（ｂ）は（ａ）のＡ部分の拡大図で、（ｃ）は（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。
検体試料を少なくとも２種類の生体親和性分子がそれぞれ担持された、異なる粒径の微粒子（Ａ抗体担持粒子１５、Ｂ抗体担持粒子１６）を含む試料と混合し、試料混合物を調整する。この試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、毛細管力により送液する。試料混合物が流路内を流れる際、より径の大きなＢ抗体担持粒子１６は粒子分離手段部分で流れが妨げられるため、図４(ａ)に示すように粒子分離手段よりも注入口側の流路にとどまる。一方で、Ａ抗体担持粒子１５は粒子分離手段を通過し空気口側まで流れることができる。これにより、注入口側と空気口側でＡ抗体担持粒子１５とＢ抗体担持粒子１６の局在化が起こる。この試料混合物の充填と粒子分離操作後、流路内の電極に交流電圧を印加し、粒子を誘電泳動力により直列させると図４（ｂ）、（ｃ）に示すように、異なる粒径の粒子それぞれが凝集体を形成する。粒子表面には標的物質に対する抗体が担時されており、標的物質が存在すれば標的物質を介して、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用などの相互作用により、交流電圧の印加を停止した後も、凝集体を維持する。一方で、標的物質が存在しなければ凝集体は解消される。この粒子動態を光学検出手段により検出し、検体中の標的物質に関する情報を得る。
【００２５】
以上説明したように、本実施形態によると、粒子分離手段によって粒径の異なるＡ抗体担持粒子１５とＢ抗体担持粒子１６とを分離し、電圧を印加するので、Ａ抗体担持粒子１５の凝集体とＢ抗体担持粒子１６の凝集体とを形成できる。したがって一度の測定で２種類の粒径の粒子の分布を測定できる。すなわち、一度の測定で複数項目の検出が可能となる。
【００２６】
（実施の形態２）
実施の形態２について、詳細を説明する。但し、本発明は実施の形態１で述べた免疫センサ装置とほぼ同一であるため、違いを中心に記載する。
【００２７】
図５は、本発明の第二の態様における免疫センサ装置の模式図である。本発明の免疫センサ装置１１１は、センサチップ１１２と、センサチップ１１２に形成された電極５、電極６、電極７、電極８に連結された交流電圧印加装置１１４、光学検出手段１１３からなる。センサチップ１１２の詳細は後述するが、少なくとも１つの流路１３が設けられ、光学検出手段１１３により流路１３内部の複数個所が観察できるように構成されている。
【００２８】
図６は、本発明の第二の態様におけるセンサチップの分解斜視図である。センサチップ１１２は上カバー１、接着層２、下基盤３からなり、上カバー１と下基盤３との間は、接着層２により中空構造となり流路１３が形成されている。流路１３の一端には注入口１１が形成され、また注入口１１とは異なる他端には空気口１２が形成されている。下基盤３には、２対の電極（ａ電極５とｂ電極６、ｃ電極７とｄ電極８）が設けられ、その一部は流路１３を形成する中空構造に露出している。
【００２９】
図７は、本発明の第一の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図である。上カバーには注入口１１、空気口１２、少なくとも一つの粒子分離手段１４が形成される。粒子分離手段１４は注入口１１と空気口１２の間にある階段状の段差である。
本発明による免疫センサ装置、およびセンサチップは実施の形態１と同様に作製することができる。
【００３０】
次に本発明の実施の形態２によるセンサチップを用いた、標的物質を検出する方法を述べる。図８は免疫センサチップにおける交流電圧印加時の粒子挙動を説明するための模式図である。図８（ａ）は免疫センサチップを上から見た図であり、（ｂ）および（ｃ）は（ａ）のＡ部分の拡大図で、（ｄ）は（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。図８（ｂ）はｃ電極７およびｄ電極８に電圧を印加した場合を示すものであり、図８（ｃ）はａ電極５およびｂ電極６に電圧を印加した場合を示すものである。図８（ｄ）は、ｃ電極７およびｄ電極８に電圧を印加した場合を示すものである。
【００３１】
検体試料を少なくとも２種類の生体親和性分子がそれぞれ担持された、異なる粒径の微粒子（Ａ抗体担持粒子１５、Ｂ抗体担持粒子１６）を含む試料と混合し、試料混合物を調整する。次に電極ｃ、電極ｄに交流電圧を印加した状態で、この試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、毛細管力により送液する。試料混合物が流路内を流れる際、図８（ｂ）、（ｄ）に示すように、粒子は流れに対して垂直方向に直列に凝集し、流れに逆った力を受けるため、粒子分離手段よりも空気口側に流れにくくなる。さらに径の大きなＢ抗体担持粒子１６はさらに粒子分離手段部分で流れが妨げられるため、粒子分離手段よりも注入口側の流路にとどまりやすくなる。一方で、Ａ抗体担持粒子１５は粒子分離手段を通過し空気口側まで流れることができる。これにより、注入口側と空気口側でＡ抗体担持粒子１５とＢ抗体担持粒子１６の局在化がよりよく起こる。さらに、試料混合物をセンサチップの注入口に点着する際に、電極ｃ，電極ｄにではなく電極ａと電極ｃあるいは電極ｂと電極ｄに対して交流電圧を印加した場合には、図８（ｃ）に示すように、粒子は斜め方向に直列に凝集し、流れに逆らった力を受ける。そのため電極ｃ，電極ｄに対して交流電圧を印加するのと同様の粒子分離を行うことができると共に、粒子を斜めに並べることでＢ抗体担持粒子１６に衝突することでＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率が減るため、粒子の局在化がよりよく起こる。すなわち、２対の電極を用いることにより、１対の電極を用いる場合よりも高い精度で、粒径ごとに粒子を分離することができる。
【００３２】
この試料混合物の充填、粒子分離操作後、流路内のａ電極とｂ電極、ｃ電極とｄ電極に対して交流電圧を印加し、粒子を誘電泳動力により直列させ、粒子の凝集体を形成する。粒子表面には標的物質に対する抗体が担時されており、標的物質が存在すれば標的物質を介して、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用などの相互作用により、交流電圧の印加を停止した後も、凝集体を維持する。一方で、標的物質が存在しなければ凝集体は解消される。この粒子動態を光学検出手段により検出し、検体中の標的物質に関する情報を得る。
【００３３】
以上説明したように本実施形態によると、２対ある電極のうち１対に対し電圧を印加しながら試料を充填し、流れに逆らった力を粒子に与えることで、粒子分離手段による粒径の異なるＡ抗体担持粒子１５とＢ抗体担持粒子１６の分離をより精度よく行うことができるという効果が得られる。さらに電圧を印加して、Ａ抗体担持粒子１５の凝集体とＢ抗体担持粒子１６の凝集体とを形成することで、一度の測定で２種類の粒径の粒子の分布を測定でき、一度の測定で複数項目の検出をより精度よく行うことが可能となる。
【００３４】
（実施の形態３）
実施の形態３について、詳細を説明する。但し、本発明は実施の形態１で述べた免疫センサ装置とほぼ同一であるため、違いを中心に記載する。
【００３５】
図９は、本発明の第三の態様におけるセンサチップの分解斜視図である。センサチップ１１２は上カバー１、接着層２、下基盤３からなり、上カバー１と下基盤３との間は、接着層２により中空構造となり流路１３が形成されている。流路１３の一端には注入口１１が形成され、また注入口１１とは異なる他端には空気口１２が形成されている。下基盤３には、少なくとも１対の電極４が設けられ、その一部は流路１３を形成する中空構造に露出している。
【００３６】
図１０は、本発明の第三の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図である。上カバーには注入口１１、空気口１２、少なくとも一つの粒子分離手段１４が形成される。粒子分離手段１４は注入口１１と空気口１２の間にある段差である。前記段差は注入口１１から空気口１２の方向に、連続的に占有面積を増すように形成されている。本発明によるセンサチップは図１で示した免疫センサ装置で使用する事ができる。また、本発明による免疫センサ装置、およびセンサチップは実施の形態１と同様に作製することができる。
【００３７】
次に本発明の実施の形態３によるセンサチップを用いた、標的物質を検出する方法を述べる。検体試料を少なくとも２種類の生体親和性分子がそれぞれ担持された、異なる粒径の微粒子（Ａ抗体担持粒子１５、Ｂ抗体担持粒子１６）を含む試料と混合し、試料混合物を調整する。この試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、毛細管力により送液する。試料混合物が流路内を流れる際、より径の大きなＢ抗体担持粒子１６は粒子分離手段の段差部分で流れが妨げられるが、段差が連続的に占有面積を増すように形成されているために段差に当った粒子は流路の端側に流れる。これにより、粒子分離手段近傍において、Ｂ抗体担持粒子１６に衝突してＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率が減るため、粒子の局在化がよりよく起こる。この試料混合物の充填、粒子分離操作後、流路内電極に交流電圧を印加、粒子を誘電泳動力により直列させ、粒子の凝集体を形成する。粒子表面には標的物質に対する抗体が担時されており、標的物質が存在すれば標的物質を介して、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用などの相互作用により、交流電圧の印加を停止した後も、凝集体を維持する。一方で、標的物質が存在しなければ凝集体は解消される。この粒子動態を光学検出手段により検出し、検体中の標的物質に関する情報を得る。
【００３８】
以上説明したように本実施形態によると、粒子分離手段の段差を連続的に占有面積を増すように形成することで、段差に当った径の大きなＢ抗体担持粒子１６を流路の端側に流す。これにより、Ｂ抗体担持粒子１６に衝突してＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率が減るため、粒子の局在化がより精度よく行うことができるという効果が得られる。
【００３９】
（実施の形態４）
実施の形態４について、詳細を説明する。但し、本発明は実施の形態２で述べた免疫センサ装置とほぼ同一であるため、違いを中心に記載する。
【００４０】
図１１は、本発明の第四の態様におけるセンサチップの分解斜視図である。センサチップ１１２は上カバー１、接着層２、下基盤３からなり、上カバー１と下基盤３との間は、接着層２により中空構造となり流路１３が形成されている。流路１３の一端には注入口１１が形成され、また注入口１１とは異なる他端には空気口１２が形成されている。下基盤３には、２対の電極（ａ電極５とｂ電極６、ｃ電極７とｄ電極８）が設けられ、その一部は流路１３を形成する中空構造に露出している。
【００４１】
図１２は、本発明の第四の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図である。上カバーには注入口１１、空気口１２、少なくとも一つの粒子分離手段１４が形成される。粒子分離手段１４は注入口１１と空気口１２の間にある段差である。前記段差は注入口１１から空気口１２の方向に、連続的に占有面積を増すように形成されている。本発明によるセンサチップは図５で示した免疫センサ装置で使用する事ができる。また、本発明による免疫センサ装置、およびセンサチップは実施の形態１と同様に作製することができる。
【００４２】
次に本発明の実施の形態４によるセンサチップを用いた、標的物質を検出する方法を述べる。検体試料を少なくとも２種類の生体親和性分子がそれぞれ担持された、異なる粒径の微粒子（Ａ抗体担持粒子１５、Ｂ抗体担持粒子１６）を含む試料と混合し、試料混合物を調整する。次に電極ｃ，電極ｄに交流電圧を印加した状態で、この試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、毛細管力により送液する。粒子は実施の形態２と同様に、図８の本発明によるセンサチップ断面図における粒子挙動の模式図で示したように、流れに対して垂直方向に直列に凝集し、流れに逆った力を受けるため、粒子分離手段よりも空気口側に流れにくくなる。そのため、注入口側と空気口側でＡ抗体担持粒子１５とＢ抗体担持粒子１６の局在化がよりよく起こる。さらに、より径の大きなＢ抗体担持粒子１６は粒子分離手段の段差部分で流れが妨げられるが、段差が連続的に占有面積を増すように形成されているために段差に当った粒子は流路の端側に流れる。これにより、粒子分離手段近傍において、Ｂ抗体担持粒子１６に衝突してＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率が減るため、粒子の局在化がよりよく起こる。
【００４３】
試料混合物をセンサチップの注入口に点着する際に、電極ｃ，電極ｄにではなく電極ａと電極ｃあるいは電極ｂと電極ｄに対して交流電圧を印加した場合の効果については、実施の形態２で述べたとおりであるが、段差の形状によって、Ｂ抗体担持粒子１６に衝突してＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率が減るという効果が追加された分、さらに粒子の局在化をよりよく起こすことができる。
【００４４】
この試料混合物の充填、粒子分離操作後、流路内のａ電極とｂ電極、ｃ電極とｄ電極に対して交流電圧を印加し、粒子を誘電泳動力により直列させ、粒子の凝集体を形成する。粒子表面には標的物質に対する抗体が担時されており、標的物質が存在すれば標的物質を介して、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用などの相互作用により、交流電圧の印加を停止した後も、凝集体を維持する。一方で、標的物質が存在しなければ凝集体は解消される。この粒子動態を光学検出手段により検出し、検体中の標的物質に関する情報を得る。
【００４５】
以上説明したように本実施形態によると、２対ある電極のうち１対に対し電圧を印加しながら試料を充填し、流れに逆らった力を粒子に与える。さらに粒子分離手段の段差を連続的に占有面積を増すように形成することで、段差に当った径の大きなＢ抗体担持粒子１６を流路の端側に流す。これによりＢ抗体担持粒子１６に衝突してＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率が減る。これらの相乗効果により、粒子の局在化がより精度よく行うことができるという効果が得られる。
【００４６】
（実施の形態５）
実施の形態５について、詳細を説明する。但し、本発明は実施の形態２で述べた免疫センサ装置とほぼ同一であるため、違いを中心に記載する。
【００４７】
図１３は、本発明の第五の態様におけるセンサ装置の模式図である。本発明の免疫センサ装置１１１は、センサチップ１１２と、センサチップ１１２に形成された電極５、電極６、電極７、電極８に連結された交流電圧印加装置１１４、光学検出手段１１３からなる。センサチップ１１２の詳細は後述するが、少なくとも１つの流路１３が設けられ、光学検出手段１１３により流路１３内部の複数個所が観察できるように構成されている。図１４は、本発明の第五の態様におけるセンサチップの分解斜視図である。センサチップ１１２は上カバー１、接着層２、下基盤３からなり、上カバー１と下基盤３との間は、接着層２により中空構造となり流路１３が形成されている。流路１３の一端には注入口１１が形成され、また注入口１１とは異なる他端には空気口１２が形成されている。下基盤３には、２対の電極（ａ電極５とｂ電極６、ｃ電極７とｄ電極８）が設けられ、その一部は流路１３を形成する中空構造に露出している。
【００４８】
図１５は、本発明の第五の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図である。上カバーには注入口１１、空気口１２、少なくとも一つの粒子分離手段１４が形成される。粒子分離手段１４は注入口１１と空気口１２の間にある階段状の段差である。
本発明による免疫センサ装置、およびセンサチップは実施の形態１と同様に作製することができる。
【００４９】
次に本発明の実施の形態５によるセンサチップを用いた、標的物質を検出する方法を述べる。図１６は免疫センサチップにおける交流電圧印加時の粒子挙動を説明するための模式図である。図１６（ａ）は免疫センサチップを上から見た図であり、（ｂ）および（ｃ）は（ａ）のＡ部分の拡大図で、（ｄ）は（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。図１６（ｂ）はｃ電極７およびｄ電極８に電圧を印加した場合を示すものであり、図１６（ｃ）はａ電極５およびｂ電極６に電圧を印加した場合を示すものである。図１６（ｄ）は、ｃ電極７およびｄ電極８に電圧を印加した場合を示すものである。検体試料を少なくとも２種類の生体親和性分子がそれぞれ担持された、異なる粒径の微粒子（Ａ抗体担持粒子１５、Ｂ抗体担持粒子１６）を含む試料と混合し、試料混合物を調整する。次に電極ｃ，電極ｄに交流電圧を印加した状態で、この試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、毛細管力により送液する。試料混合物が流路内を流れる際、図１６（ｂ）、（ｄ）に示すように、粒子は流れに対して平行方向に直列に凝集し、流れに逆った力を受けるため、粒子分離手段よりも空気口側に流れにくくなる。さらに径の大きなＢ抗体担持粒子１６はさらに粒子分離手段部分で流れが妨げられるため、粒子分離手段よりも注入口側の流路にとどまりやすくなる。一方で、Ａ抗体担持粒子１５は粒子分離手段を通過し空気口側まで流れることができる。これにより、注入口側と空気口側でＡ抗体担持粒子１５とＢ抗体担持粒子１６の局在化がよりよく起こる。このとき、粒子は流れに対して平行方向に並ぶため、Ｂ抗体担持粒子１６に衝突することでＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率が減るため、粒子の局在化がよりよく起こる。
【００５０】
この試料混合物の充填、粒子分離操作後、ｃ電極とｄ電極への交流電圧の印加を停止し、図１６（ｃ）に示すように流路内のａ電極とｂ電極に交流電圧を印加する。これにより、粒子を誘電泳動力により直列させ、粒子の凝集体を形成する。粒子表面には標的物質に対する抗体が担時されており、標的物質が存在すれば標的物質を介して、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用などの相互作用により、交流電圧の印加を停止した後も、凝集体を維持する。一方で、標的物質が存在しなければ凝集体は解消される。この粒子動態を光学検出手段により検出し、検体中の標的物質に関する情報を得る。
【００５１】
以上説明したように本実施形態によると、２対ある電極のうち１対に対し電圧を印加しながら試料を充填し、流れに逆らった力を粒子に与えることで、粒子分離手段による粒径の異なるＡ抗体担持粒子１５とＢ抗体担持粒子１６の分離をより精度よく行うことができる。さらに粒子は流れに対して平行方向に並ぶため、Ｂ抗体担持粒子１６に衝突することでＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率が減ることから、粒子の局在化をより精度よく行うことができるという効果が得られる。
【００５２】
（実施の形態６）
実施の形態６について、詳細を説明する。但し、本発明は実施の形態２で述べた免疫センサ装置とほぼ同一であるため、違いを中心に記載する。
【００５３】
図１７は、本発明の第六の態様におけるセンサチップの分解斜視図である。センサチップ１１２は上カバー１、接着層２、下基盤３からなり、上カバー１と下基盤３との間は、接着層２により中空構造となり流路１３が形成されている。流路１３の一端には注入口１１が形成され、また注入口１１とは異なる他端には空気口１２が形成されている。下基盤３には、２対の電極（ａ電極５とｂ電極６、ｃ電極７とｄ電極８）が設けられ、その一部は流路１３を形成する中空構造に露出している。
【００５４】
図１８は、本発明の第六の態様におけるセンサチップの上カバーの反転図である。上カバーには注入口１１、空気口１２、少なくとも一つの粒子分離手段１４が形成される。粒子分離手段１４は注入口１１と空気口１２の間にある階段状の段差である。前記段差は注入口１１から空気口１２の方向に、連続的に占有面積を増すように形成されている。
本発明による免疫センサ装置、およびセンサチップは実施の形態１と同様に作製することができる。
【００５５】
次に本発明の実施の形態６によるセンサチップを用いた、標的物質を検出する方法を述べる。検体試料を少なくとも２種類の生体親和性分子がそれぞれ担持された、異なる粒径の微粒子（Ａ抗体担持粒子１５、Ｂ抗体担持粒子１６）を含む試料と混合し、試料混合物を調整する。次にｃ電極，ｄ電極に交流電圧を印加した状態で、この試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、毛細管力により送液する。粒子は実施の形態５と同様に、図１６（ｂ）で示したように流れに対して平行方向に直列に凝集し、流れに逆った力を受けるため、粒子分離手段よりも空気口側に流れにくくなる。さらに径の大きなＢ抗体担持粒子１６はさらに粒子分離手段部分で流れが妨げられるため、粒子分離手段よりも注入口側の流路にとどまりやすくなる。一方で、Ａ抗体担持粒子１５は粒子分離手段を通過し空気口側まで流れることができる。これにより、注入口側と空気口側でＡ抗体担持粒子１５とＢ抗体担持粒子１６の局在化がよりよく起こる。このとき、粒子は流れに対して平行方向に並ぶため、Ｂ抗体担持粒子１６に衝突することでＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率が減るため、粒子の局在化がよりよく起こる。
【００５６】
さらに、より径の大きなＢ抗体担持粒子１６は粒子分離手段の段差部分で流れが妨げられるが、段差が連続的に占有面積を増すように形成されているために段差に当った粒子は流路の端側に流れる。これにより、粒子分離手段近傍において、Ｂ抗体担持粒子１６に衝突してＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率がさらに減るため、粒子の局在化をよりよく起こすことができる。
【００５７】
この試料混合物の充填、粒子分離操作後、ｃ電極、ｄ電極への交流電圧の印加を停止し、流路内のａ電極、ｂ電極に交流電圧を印加する。これにより、粒子を誘電泳動力により直列させ、粒子の凝集体を形成する。粒子表面には標的物質に対する抗体が担時されており、標的物質が存在すれば標的物質を介して、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用などの相互作用により、交流電圧の印加を停止した後も、凝集体を維持する。一方で、標的物質が存在しなければ凝集体は解消される。この粒子動態を光学検出手段により検出し、検体中の標的物質に関する情報を得る。
【００５８】
以上説明したように本実施形態によると、２対ある電極のうち１対に対し電圧を印加しながら試料を充填し、流れに逆らった力を粒子に与えることで、粒子分離手段による粒径の異なるＡ抗体担持粒子１５とＢ抗体担持粒子１６の分離をより精度よく行う。このとき、粒子は流れに対して平行方向に並んでおり、さらに粒子分離手段の段差を連続的に占有面積を増すように形成しているため段差に当った径の大きなＢ抗体担持粒子１６は流路の端側に流れる。これら２つの要因がＢ抗体担持粒子１６に衝突してＡ抗体担持粒子１５の流れが妨げられる確率を減らすため、粒子の局在化がより精度よく行うことができるという効果が得られる。
【実施例】
【００５９】
（実施例１）
幅６００μｍ、深さ２０μｍの流路、深さ５μｍの段差部分を作製したガラス基板と、スパッタリングにより電極を作製したガラス基盤とをＵＶ硬化樹脂で接着し、実施の形態１なるセンサチップを作製した。このセンサチップの電極と交流電圧印加装置とを接続し、流路部分を顕微鏡で観察した。
【００６０】
Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製の直径３μｍのラテックス粒子に抗ヒトＣＲＰ抗体を、直径８μｍのラテックス粒子に抗ヒトＡＦＰ抗体を担持し、粒子を調整した。この粒子０．４〜０．５％（ｗ／ｗ）、５％トレハロースを含む０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）を検体試料と混合し、試料混合物とした。試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、粒子挙動を顕微鏡にて観察した結果、粒子分離手段である段差部分において８μｍ粒子がとどまり、３μｍ粒子は段差部分を越えて空気口側まで到達し、粒径の違いによる粒子分離が見られた。また、その後、２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの交流電圧を印加すると粒子凝集が起こり、免疫反応による標的物質の検出ができた。
【００６１】
（実施例２）
幅６００μｍ、深さ２０μｍの流路、深さ５μｍの段差部分を作製したガラス基板と、スパッタリングにより電極を作製したガラス基盤とをＵＶ硬化樹脂で接着し、実施の形態２なるセンサチップを作製した。このセンサチップの電極と交流電圧印加装置とを接続し、流路部分を顕微鏡で観察した。
【００６２】
Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製の直径３μｍのラテックス粒子に抗ヒトＣＲＰ抗体を、直径８μｍのラテックス粒子に抗ヒトＡＦＰ抗体を担持し、粒子を調整した。この粒子０．４〜０．５％（ｗ／ｗ）、５％トレハロースを含む０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）を検体試料と混合し、試料混合物とした。試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、粒子挙動を顕微鏡にて観察した。粒子点着時に電極ｃ，電極ｄに２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの交流電圧を印加することで、粒子分離手段である段差部分においてよりよく粒子分離ができる様子が見られた。また、その後、ａ電極、ｂ電極にも２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの交流電圧を印加すると流路のほぼ全域で粒子凝集が起こり、免疫反応による標的物質の検出ができた。
【００６３】
（実施例３）
幅６００μｍ、深さ２０μｍの流路、深さ５μｍの段差部分を作製したガラス基板と、スパッタリングにより電極を作製したガラス基盤とをＵＶ硬化樹脂で接着し、実施の形態３なるセンサチップを作製した。このセンサチップの電極と交流電圧印加装置とを接続し、流路部分を顕微鏡で観察した。Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製の直径３μｍのラテックス粒子に抗ヒトＣＲＰ抗体を、直径８μｍのラテックス粒子に抗ヒトＡＦＰ抗体を担持し、粒子を調整した。この粒子０．４〜０．５％（ｗ／ｗ）、５％トレハロースを含む０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）を検体試料と混合し、試料混合物とした。試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、粒子挙動を顕微鏡にて観察した結果、粒子分離手段である段差部分において８μｍ粒子がとどまり、３μｍ粒子は段差部分を越えて空気口側まで到達し、粒径の違いによる粒子分離が見られた。その際、段差部分に到達した８μｍ粒子が流路壁側に流れる様子が確認でき、３μｍ粒子の流れを阻害しにくい様子が見られた。その後、２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの交流電圧を印加すると粒子凝集が起こり、免疫反応による標的物質の検出ができた。
【００６４】
（実施例４）
幅６００μｍ、深さ２０μｍの流路、深さ５μｍの段差部分を作製したガラス基板と、スパッタリングにより電極を作製したガラス基盤とをＵＶ硬化樹脂で接着し、実施の形態４なるセンサチップを作製した。このセンサチップの電極と交流電圧印加装置とを接続し、流路部分を顕微鏡で観察した。Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製の直径３μｍのラテックス粒子に抗ヒトＣＲＰ抗体を、直径８μｍのラテックス粒子に抗ヒトＡＦＰ抗体を担持し、粒子を調整した。この粒子０．４〜０．５％（ｗ／ｗ）、５％トレハロースを含む０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）を検体試料と混合し、試料混合物とした。試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、粒子挙動を顕微鏡にて観察した結果、粒子分離手段である段差部分において８μｍ粒子がとどまり、３μｍ粒子は段差部分を越えて空気口側まで到達し、粒径の違いによる粒子分離を見られた。粒子点着時に電極ｃ，電極ｄに２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの電圧を印加することで、粒子分離手段である段差部分においてよりよく粒子分離し、さらに段差部分に到達した８μｍ粒子が流路壁側に流れることで、３μｍ粒子の流れを阻害しにくい様子が見られた。その後、ａ電極、ｂ電極にも２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの交流電圧を印加すると流路のほぼ全域で粒子凝集が起こり、免疫反応による標的物質の検出ができた。
【００６５】
（実施例５）
幅６００μｍ、深さ２０μｍの流路、深さ５μｍの段差部分を作製したガラス基板と、スパッタリングにより電極を作製したガラス基盤とをＵＶ硬化樹脂で接着し、実施の形態５なるセンサチップを作製した。このセンサチップの電極と交流電圧印加装置とを接続し、流路部分を顕微鏡で観察した。Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製の直径３μｍのラテックス粒子に抗ヒトＣＲＰ抗体を、直径８μｍのラテックス粒子に抗ヒトＡＦＰ抗体を担持し、粒子を調整した。この粒子０．４〜０．５％（ｗ／ｗ）、５％トレハロースを含む０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）を検体試料と混合し、試料混合物とした。試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、粒子挙動を顕微鏡にて観察した。粒子点着時に電極ｃ，電極ｄに２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの交流電圧を印加することで、粒子分離手段である段差部分においてよりよく粒子分離ができる様子が見られた。また、その後、ｃ電極とｄ電極への交流電圧の印加を停止し、ａ電極とｂ電極に２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの交流電圧を印加すると粒子凝集が起こり、免疫反応による標的物質の検出ができた。
【００６６】
（実施例６）
幅６００μｍ、深さ２０μｍの流路、深さ５μｍの段差部分を作製したガラス基板と、スパッタリングにより電極を作製したガラス基盤とをＵＶ硬化樹脂で接着し、実施の形態６なるセンサチップを作製した。このセンサチップの電極と交流電圧印加装置とを接続し、流路部分を顕微鏡で観察した。Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製の直径３μｍのラテックス粒子に抗ヒトＣＲＰ抗体を、直径８μｍのラテックス粒子に抗ヒトＡＦＰ抗体を担持し、粒子を調整した。この粒子０．４〜０．５％（ｗ／ｗ）、５％トレハロースを含む０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）を検体試料と混合し、試料混合物とした。試料混合物をセンサチップの注入口に点着し、粒子挙動を顕微鏡にて観察した結果、粒子分離手段である段差部分において８μｍ粒子がとどまり、３μｍ粒子は段差部分を越えて空気口側まで到達し、粒径の違いによる粒子分離を見られた。粒子点着時に電極ｃ，電極ｄに２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの電圧を印加することで、粒子分離手段である段差部分においてよりよく粒子分離し、さらに段差部分に到達した８μｍ粒子が流路壁側に流れることで、３μｍ粒子の流れを阻害しにくい様子が見られた。その後、ｃ電極とｄ電極への交流電圧の印加を停止し、ａ電極とｂ電極に２０Ｖ（ｐ／ｐ）、１００ｋＨｚの交流電圧を印加すると粒子凝集が起こり、免疫反応による標的物質の検出ができた。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、ラテックス凝集反応において複数項目を同時に検出する方法において、少なくとも２種類の生体親和性分子がそれぞれ担持された、異なる粒径の微粒子を用いることで、同一チップ内での複数項目同時検出を可能とするものであり、液体試料中の特定物質の分析、特に免疫学的反応を用いた分析装置等に有用である。
【符号の説明】
【００６８】
１  上カバー
２  接着層
３  下基盤
４  電極
５  ａ電極
６  ｂ電極
７  ｃ電極
８  ｄ電極
１１  注入口
１２  空気口
１３  流路
１４  粒子分離手段
１５  Ａ抗体担持粒子
１６  Ｂ抗体担持粒子
１１１  免疫センサ装置
１１２  センサチップ
１１３  光学検出手段
１１４  交流電圧印加装置
【図１】
2010266218.tif 000003
【図２】
2010266218.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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