(57)【要約】【課題】酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法であって、測定精度および測定感度に優れた方法を提供する。【解決手段】試料中に糖化タンパク質とは別に存在する糖化アミノ酸を除去することを目的として、予め、糖化アミノ酸にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて分解し、その後、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、試料中の糖化タンパク質に、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより、糖化タンパク質量を求める。糖化タンパク質としては、糖化ヘモグロビンが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の糖化タンパク質に、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより糖化タンパク質の量を測定する方法であって、前記試料中に糖化タンパク質とは別に存在する糖化アミノ酸を除去することを目的として、前記酸化還元反応に先立ち、前記糖化アミノ酸にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて分解し、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記酸化還元反応を行う糖化タンパク質の測定方法。
【請求項２】
糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
糖化アミノ酸にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させる前または作用させた後に、糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、この分解物に、前記糖化タンパク質に作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて前記酸化還元反応を行う請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
前記酸化還元反応の測定が、糖化タンパク質にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて発生した過酸化水素と、発色基質であるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムとを酸化還元酵素により反応させ、前記発色基質の発色量を測定することによって、過酸化水素量を決定する過酸化水素量の測定であり、前記発色基質を界面活性剤存在下で反応溶液に添加し、前記反応溶液におけるテトラゾリウム化合物の濃度を０．５〜８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウムの濃度を０．０８〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲および界面活性剤濃度を０．３〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲とし、かつ前記反応溶液のｐＨを７．０〜８．５とする請求項１記載の測定方法。
【請求項５】
糖化アミノ酸に作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用し、糖化タンパク質に作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基およびアミノ酸残基の糖化された側鎖アミノ基に特異的に作用する請求項１記載の測定方法。
【請求項６】
テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、試料に添加する請求項１記載の測定方法。
【請求項７】
テトラゾリウム化合物が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求項１記載の測定方法。
【請求項８】
糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量とからヘモグロビン糖化率を求める測定方法であって、請求項１記載の糖化タンパク質の測定方法により試料中の糖化ヘモグロビン量を測定し、他方、前記試料中のヘモグロビン量を測定し、前記糖化ヘモグロビン量と前記ヘモグロビン量とからヘモグロビン糖化率を求めるヘモグロビン糖化率の測定方法。
【請求項９】
酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定に使用する測定キットであって、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含有する試料の前処理用試薬と、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、酸化還元酵素および発色基質を含有する発色用試薬とを含む糖化タンパク質の測定キット。
【請求項１０】
糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求項９記載の測定キット。
【請求項１１】
前処理用試薬のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用する酵素であり、発色用試薬のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基およびアミノ酸残基側鎖の糖化されたアミノ基に特異的に作用する酵素である請求項９記載の測定キット。
【請求項１２】
さらに、プロテアーゼを含有するプロテアーゼ試薬を含む請求項９記載の測定キット。
【請求項１３】
プロテアーゼが、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、トリプシン、プロティナーゼＫ、ズブチリシンおよびアミノペプチダーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである請求項１２記載の測定キット。
【請求項１４】
プロテアーゼが、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであって、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである請求項１２記載の測定キット。
【請求項１５】
プロテアーゼ試薬が、さらにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含有する請求項１２記載の測定キット。
【請求項１６】
プロテアーゼ試薬におけるテトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）との含有割合（モル比Ａ：Ｂ）が、Ａ：Ｂ＝２０：３〜２０：１２の範囲である請求項１５記載の測定キット。
【請求項１７】
プロテアーゼ試薬において、プロテアーゼがメタロプロテアーゼであって、さらにＣａおよびＮａを含有し、メタロプロテアーゼ濃度が１００〜４０，０００Ｕ／Ｌ、Ｃａ濃度が０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｎａ濃度が５〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１２記載の測定キット。
【請求項１８】
発色基質がＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである請求項９記載の測定キット。
【請求項１９】
前処理用試薬および発色用試薬の少なくとも一方が、さらに界面活性剤を含む請求項９記載の測定キット。
【請求項２０】
プロテアーゼ試薬が、さらに界面活性剤を含む請求項１２記載の測定キット。
【請求項２１】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンフェノールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルおよびポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求項１９または２０載の測定キット。
【請求項２２】
前処理用試薬が、さらにＣＨＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＥＰＰＳ、リン酸、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯおよびホウ酸からなる群から選択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、そのｐＨが、８．０〜１０．０の範囲である請求項９記載の測定キット。
【請求項２３】
発色用試薬が、さらにＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯおよびＥＰＰＳからなる群から選択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、そのｐＨが、６．０〜９．０の範囲である請求項９記載の測定キット。
【請求項２４】
プロテアーゼ試薬が、さらにＴｒｉｓ、ＭＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳおよびリン酸からなる群から選択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、そのｐＨが、５．０〜７．０の範囲である請求項１２記載の測定キット。
【請求項２５】
テトラゾリウム化合物が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求項１５記載の測定キット。
【請求項２６】
前処理用試薬が、さらにウリカーゼおよびビリルビンオキシダーゼの少なくとも一方を含む請求項９記載の測定キット。
【請求項２７】
発色用試薬が、さらにアジ化ナトリウムを含む請求項９記載の測定キット。
【請求項２８】
前処理用試薬において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが糖化されたα−アミノ基に特異的に作用する酵素であり、その濃度が１０〜５０００Ｕ／Ｌの範囲、緩衝剤濃度が５〜２００ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ｐＨが８．０〜１０．０の範囲である請求項２２記載の測定キット。
【請求項２９】
プロテアーゼ試薬が、さらにＣａ、Ｎａおよび緩衝剤を含有し、プロテアーゼがメタロプロテアーゼであって、前記プロテアーゼ試薬におけるメタロプロテアーゼの濃度が、１００〜１０，０００ＫＵ／Ｌの範囲、テトラゾリウム化合物濃度が０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム濃度が０．０８〜４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、Ｃａ濃度が０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、Ｎａ濃度が５〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、緩衝剤濃度が０．１〜５００ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ｐＨが５．０〜７．０の範囲である請求項１５記載の測定キット。
【請求項３０】
発色用試薬において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基および糖化されたアミノ酸残基側鎖に特異的に作用する酵素であり、酸化還元酵素がペルオキシダーゼ、発色基質がＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムであり、前記発色試薬における、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの濃度が１００〜５０，０００Ｕ／Ｌの範囲、ペルオキシダーゼ濃度が０．１〜４００ＫＵ／Ｌの範囲、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム濃度が０．０２〜２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、緩衝剤濃度が１０〜５００ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ｐＨが６〜９の範囲である請求項２３記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明は、酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質の中でも、例えば、血液中の糖化ヘモグロビン（糖化Ｈｂ）は、生体内血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等における重要な指標とされている。
【０００３】
このような糖化Ｈｂは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、ミニカラム法、免疫法、色素法等により、糖化率や糖化量として測定されている。しかし、前記ＨＰＬＣ法の場合は、例えば、糖化Ｈｂを測定するための専用機が必要であり、また、免疫法や色素法では、例えば、測定用のセルの汚れや測定精度等に問題があった。
【０００４】
そこで、糖化Ｈｂ等の糖化タンパク質について、特殊な測定機器が不要であり、操作も簡便である酵素による酸化還元反応を用いた測定方法が、例えば、生化学分析や臨床検査等において適用されている。
【０００５】
前記酸化還元反応を用いた糖化Ｈｂの測定は、例えば、以下に示すようにして行われる。まず、糖化Ｈｂを含む試料をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）で処理し、糖化Ｈｂの糖化部分に作用させて過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化Ｈｂ量に対応する。そして、このＦＡＯＤ処理後の前記試料に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。この時、前記還元剤として、酸化されることにより発色する還元剤を用いれば、その発色の測定により前記過酸化水素量を測定でき、この結果、試料中の糖化Ｈｂ量を知ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このような従来の測定方法は、測定感度が十分ではない。また、測定精度に関しては、例えば、実際に試料中に含まれる糖化Ｈｂに対応する以上の過酸化水素が発生したり、患者によっては一時的に糖化Ｈｂの測定値が急激に増加するという現象が見られることがあるため、さらなる精度の向上が求められている。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、試料中の糖化タンパク質を、酸化還元反応を用いて測定する方法の提供であって、測定感度および測定精度の両方に優れる方法の提供である。また、前記糖化タンパク質の測定に使用する、測定精度、測定感度、取り扱い性に優れる測定キットの提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の糖化タンパク質の測定方法は、試料中の糖化タンパク質にＦＡＯＤを作用させて酸化還元反応を行い、その酸化還元反応を測定することにより糖化タンパク質の量を測定する方法であって、前記試料中に糖化タンパク質とは別に存在する糖化アミノ酸を除去することを目的として、前記酸化還元反応に先立ち、前記糖化アミノ酸にＦＡＯＤを作用させて分解し、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記酸化還元反応を行うことを特徴とする。
【０００９】
なお、前記ＦＡＯＤは、一般名称であり、その基質としては糖化アミノ酸には限られず、例えば、糖化タンパク質や糖化ペプチドにも作用する。以下、本発明において、前記糖化アミノ酸を分解するためのＦＡＯＤを「分解用ＦＡＯＤ」といい、前記糖化タンパク質に作用させる測定のためのＦＡＯＤを「測定用ＦＡＯＤ」という。
【００１０】
本発明者らは、測定精度の向上を図るべく鋭意研究を行った結果、以下の事を突き止めた。つまり、全血中には、本来、糖化タンパク質の他に遊離の糖化アミノ酸が存在しており、前記ＦＡＯＤは、このような糖化アミノ酸に対しても作用する。このため、前述のようなＦＡＯＤを用いた糖化タンパク質の測定を行った場合、糖化タンパク質とＦＡＯＤとの酸化還元反応だけでなく、糖化アミノ酸とＦＡＯＤとの酸化還元反応も生じてしまい、見かけ上、糖化タンパク質の測定値が増加してしまうのである。さらに、同じ患者の全血試料について、全く同じ条件で前記測定方法により測定を行った場合でも、患者によっては採血時が異なると測定値が著しく変動するという問題に関しては、以下のような事をつきとめた。すなわち、このような問題は、主に、点滴等を受けた患者に見られる現象であり、このように測定値が変動するのは、点滴等の成分として、例えば、グルコース等の糖類や各種アミノ酸が含まれた場合に、これらの外来成分から糖化アミノ酸が生成され、一過的に糖化アミノ酸が増加するためであることを解明したのである。そこで、全血試料中に恒常的な糖化アミノ酸や一過性の外来糖化アミノ酸が存在しても、本発明のように、予め糖化アミノ酸に分解用ＦＡＯＤを作用させて分解すれば、前述のような糖化アミノ酸による測定値の上昇が抑制されることを、本発明者らが初めて見出したのである。これによって、測定精度が向上でき、さらに、点滴を受けたか否かに関わらず、いつでも採血を行うことができるため、患者の負担も低減できる。さらに、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で前記酸化還元反応を行えば、その作用機作は不明であるが、測定感度も向上する。したがって、このように測定精度および測定感度に優れる測定方法によれば、各種糖化タンパク質の指標としての信頼性も増し、臨床医療等の分野において有用な方法となる。
【００１１】
本発明において、前記糖化タンパク質としては、例えば、糖化Ｈｂが好ましい。このような方法によれば、糖化Ｈｂの糖尿病診断の指標としての信頼性が増し、臨床医療等の分野において有用となるからである。
【００１２】
本発明の測定方法としては、例えば、前記糖化アミノ酸と前記糖化タンパク質とに、異なる基質特異性のＦＡＯＤを使用する第１の測定方法と、同じ基質特異性のＦＡＯＤを使用する第２の測定方法とがあげられる。
【００１３】
なお、ＦＡＯＤには、後述するように、例えば、α−アミノ基の糖化部分に作用するもの、リジンやアルギニン等のアミノ酸残基の側鎖アミノ基の糖化部分に作用するもの、および前記両方の糖化部分に作用するもの等があり、その基質特異性はＦＡＯＤの種類により様々である。例えば、糖化タンパク質が糖化Ｈｂの場合、糖化Ｈｂの測定は、前記α−アミノ基の糖化部分、前記側鎖アミノ基の糖化部分または両方の糖化部分のいずれにＦＡＯＤを作用させても、その量を測定することが可能である。
【００１４】
本発明の第１の測定方法としては、前記糖化アミノ酸に作用させる分解用ＦＡＯＤと、糖化タンパク質に作用させる測定用ＦＡＯＤとが、異なる基質特異性を有することが好ましい。これによれば、分解用ＦＡＯＤによって前記糖化アミノ酸が分解され、糖化タンパク質については、前記分解用ＦＡＯＤが作用していない糖化部分に、さらに異なる基質特異性の測定用ＦＡＯＤを作用させることができるため、糖化アミノ酸の影響を受けず、測定精度を向上できるからである。
【００１５】
具体的には、例えば、前記分解用ＦＡＯＤが、糖化α−アミノ基に特異的に作用し、前記測定用ＦＡＯＤが、糖化α−アミノ基および糖化側鎖アミノ基に特異的に作用することが好ましい。前記測定用ＦＡＯＤは、α−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の両方に作用するため、従来の方法であれば、前述のようにα−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸にも作用していた。しかし、本発明においては、前記糖化アミノ酸は、予め、前記糖化α−アミノ基に特異的に作用する分解用ＦＡＯＤによって分解されているため、これに測定用ＦＡＯＤが作用することはなく、見かけ上の測定値の増加が抑制されて精度が向上する。また、前記測定用ＦＡＯＤは、前述のようにα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の両方に作用するが、予め、糖化タンパク質のα−アミノ基糖化部分も分解用ＦＡＯＤによって分解されているため、糖化タンパク質の側鎖アミノ基糖化部分のみに測定用ＦＡＯＤを作用させることができる。このため、特に側鎖アミノ基の糖化量に特徴がある糖化Ｈｂの測定に、有用な方法といえる。
【００１６】
このように異なるＦＡＯＤを用いる場合、前記糖化アミノ酸にＦＡＯＤを作用させる前または作用させた後に、糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、この糖化タンパク質の分解物に、前記糖化タンパク質に作用させる測定用ＦＡＯＤを作用させて前記酸化還元反応を行うことが好ましい。糖化タンパク質をプロテアーゼで分解するのは、ＦＡＯＤは、糖化タンパク質よりも、糖化アミノ酸やより短い糖化ペプチド断片に作用し易いからである。また、プロテアーゼ処理の順序が、糖化アミノ酸の分解処理の前後で制限されないのは、測定用ＦＡＯＤは、前述のように分解用ＦＡＯＤとは異なる糖化部分に作用するため、糖化タンパク質の測定自体には影響を受けないからである。
【００１７】
つぎに、本発明の第２の測定方法としては、糖化アミノ酸に分解用ＦＡＯＤを作用させた後、糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、さらに前記分解用ＦＡＯＤと同じＦＡＯＤを添加して、前記プロテアーゼ分解物に作用させて前記酸化還元反応を行うことが好ましい。すなわち、分解用ＦＡＯＤと測定用ＦＡＯＤとが同じ場合の測定方法である。
【００１８】
具体的には、前記プロテアーゼにより、前記分解用ＦＡＯＤを失活させることが好ましい。ＦＡＯＤは、前述のように測定する糖化タンパク質よりも、糖化アミノ酸やより短い糖化ペプチド断片に対して作用し易いという性質を有している。このため、分解用ＦＡＯＤを添加しても、酵素の反応速度論から、糖化アミノ酸を分解する処理時間においては、糖化タンパク質にはあまり作用しないといえる。しかし、続く糖化タンパク質のプロテアーゼ処理の間も前記分解用ＦＡＯＤ活性が残存していると、前記プロテアーゼ処理と併行して、プロテアーゼによる糖化タンパク質分解物（すなわち糖化アミノ酸や糖化タンパク質のペプチド断片）に残存する前記分解用ＦＡＯＤが作用するおそれがある。そして、その後、さらに測定用ＦＡＯＤを添加しても、すでに前記糖化タンパク質分解物の一部には前記残存する分解用ＦＡＯＤが作用してしまった状態となり、反対に測定精度が低下するおそれがある。したがって、前述のように糖化タンパク質を分解するためのプロテアーゼ処理によって、同時に残存する前記分解用ＦＡＯＤを失活させれば、プロテアーゼ処理による糖化タンパク質分解物は、前記分解用ＦＡＯＤとは未反応のままで維持され、続いて添加する測定用ＦＡＯＤと反応することができる。このため測定精度も向上するのである。
【００１９】
一方、第３の測定方法として、前述のようにプロテアーゼ処理で分解用ＦＡＯＤを失活させなくとも、例えば、前記分解用ＦＡＯＤの添加量と、測定用ＦＡＯＤの添加量とを調整することによっても、高精度な測定を実現できる。この場合、例えば、前記分解用ＦＡＯＤ（Ａ）と測定用ＦＡＯＤ（Ｂ）の添加割合（活性比Ａ：Ｂ）を、Ａ：Ｂ＝１：１０〜１：１０００の範囲に設定することが好ましい。このような添加割合であれば、プロテアーゼ処理を行う際に、前記分解用ＦＡＯＤが残存しても、酵素の反応速度論の点から、糖化タンパク質分解物には作用し難いからである。
【００２０】
本発明の測定方法において、前記プロテアーゼとしては、メタロプロティナーゼ、ブロメライン、パパイン、トリプシン、プロティナーゼＫ、ズブチリシンおよびアミノペプチダーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼ等の少なくとも一つのプロテアーゼが使用できる。
【００２１】
糖化タンパク質が糖化Ｈｂの場合、前記プロテアーゼは、糖化Ｈｂを選択的に分解する、メタロプロティナーゼ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼであることが好ましい。この中でも好ましくはメタロプロティナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼであり、より好ましくはメタロプロティナーゼである。測定対象物が糖化Ｈｂの場合に、このようなプロテアーゼを作用させれば、糖化Ｈｂ以外の糖化タンパク質や糖化ペプチドは分解され難いため、前記他の糖化タンパク質等にはＦＡＯＤも作用し難く、糖化Ｈｂのみの測定が可能になる。
【００２２】
本発明の測定方法において、テトラゾリウム化合物（Ｃ）とアジ化ナトリウム（Ｄ）との添加割合（モル比Ｃ：Ｄ）は、Ｃ：Ｄ＝２０：３〜２０：１２の範囲であることが好ましい。また、前記酸化還元反応溶液におけるテトラゾリウム化合物の終濃度が、０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記反応溶液におけるアジ化ナトリウムの終濃度が０．１３〜１．３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましい。
【００２３】
本発明の測定方法において、より一層感度を向上できることから、テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加することが好ましい。この場合、エージングの処理温度は、２０〜６０℃の範囲であることが好ましく、エージングの処理時間は、６〜１２０時間の範囲であることが好ましい。
【００２４】
本発明において、前記酸化還元反応の測定としては、特に制限されないが、糖化タンパク質にＦＡＯＤを作用させて発生した過酸化水素と、酸化することより発色する基質（発色基質）とを酸化還元酵素により反応させ、前記発色基質の発色量を測定することによって、過酸化水素量を決定する過酸化水素量の測定等があげられる。前記発色基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（以下、「ＤＡ−６４」ともいう）が使用できる。
【００２５】
前記ＤＡ−６４を使用する場合、前記ＤＡ−６４を界面活性剤存在下で反応溶液に添加し、前記反応溶液におけるテトラゾリウム化合物濃度を０．５〜８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム濃度を０．０８〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲および界面活性剤濃度を０．３〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲とし、かつ前記反応溶液のｐＨを７．０〜８．５とすることが好ましい。
【００２６】
本発明は測定感度の向上のため、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で前記酸化還元反応を行うことを特徴の一つとしているが、前述のように、発色基質としてＤＡ−６４を使用すると、このＤＡ−６４と、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムとが共存することによって、ＤＡ−６４が誤発色を起こす場合がある。このように誤発色が生じると、例えば、発色量の測定においてバックグラウンドが高くなり、また、十分量添加したはずのＤＡ−６４が不足するという問題が生じる。しかし、このように界面活性剤の存在下でＤＡ−６４を添加し、かつ各成分濃度を前記濃度範囲に設定し、反応溶液のｐＨを前記範囲に設定すれば、前記バックグラウンドの上昇も抑制でき、より一層高精度な測定が可能になる。
【００２７】
本発明の測定方法において、前記測定試料の種類は、特に制限されず、全血、血漿、血清、血球等の他に、例えば、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用でき、この中でも特に全血試料、血球試料に有用である。例えば、赤血球内の糖化Ｈｂを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血し、この溶血試料を測定試料とすればよい。
【００２８】
測定対象物の糖化タンパク質としては、例えば、前述のような糖化Ｈｂ、糖化アルブミン等があげられるが、好ましくは糖化Ｈｂである。
【００２９】
つぎに、本発明のＨｂ糖化率の測定方法は、糖化Ｈｂ量とＨｂ量とからＨｂ糖化率を求める測定方法であって、前記本発明の糖化タンパク質の測定方法により試料中の糖化Ｈｂ量を測定し、他方、前記試料中のＨｂ量を測定し、前記糖化Ｈｂ量と前記Ｈｂ量とからＨｂ糖化率を求める方法である。本発明によれば、高精度で糖化Ｈｂ量を測定できるため、信頼性の高いＨｂ糖化率を得ることができる。なお、「Ｈｂ量」とは、糖化されているＨｂおよび未糖化のＨｂの両方を含む。
【００３０】
本発明において、前記Ｈｂ量を測定する方法は、特に制限されないが、試料中のＨｂをテトラゾリウム化合物で変性させ、得られた変性Ｈｂに特異的な吸収波長で、前記試料の吸光度を測定し、この吸光度から前記試料中のＨｂ量を算出する方法であることが好ましい。未変性Ｈｂは、例えば、酸素と結合した状態や未結合の状態等、その態様によって様々な吸収波長を有するため、単純に吸光度を測定してもＨｂ量を正確に求めることは困難である。これに対して、テトラゾリウム化合物により変性させた変性Ｈｂは安定であり、吸収極大を示す波長が一定範囲になるため、容易かつ高精度でＨｂ量を求めることができる。このため、前述のような信頼性の高い糖化Ｈｂ量とＨｂ量とから、より一層、信頼性の高いＨｂ糖化率を求めることができる。
【００３１】
また、本発明の糖化タンパク質の測定方法を用いて、ＨｂＡ１ｃを測定することもできる。例えば、このＨｂＡ１ｃの測定方法は、前記本発明の糖化タンパク質の測定方法による糖化Ｈｂ量とＨｂＡ１ｃ量との相関関係から作成された検量線を準備し、前記本発明の糖化タンパク質の測定方法から得られた試料中の糖化Ｈｂ量を前記検量線に代入することにより前記試料中におけるＨｂＡ１ｃ量を求める方法である。
【００３２】
本発明者らは鋭意研究の結果、前記本発明の糖化タンパク質の測定方法により得られる全血中の糖化Ｈｂ量が、同じ試料におけるＨｂＡ１ｃ量と高い相関関係にあることを見出した。ＨｂＡ１ｃは、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端のα−アミノ基が糖化された糖化Ｈｂをいい、糖化Ｈｂの中でも、糖尿病診断等における特に重要な指標とされている。従来の方法によると、ＨｂＡ１ｃの測定は、糖化部分の中でのＨｂＡ１ｃの特徴的構造部分であるβ鎖Ｎ末端のα−アミノ基の糖化部分にＦＡＯＤを特異的に作用させ、その酸化還元反応を測定する必要があった。この場合、例えば、使用するＦＡＯＤが前記α−アミノ基糖化部分に対して基質特異性が高いことや、前記α−アミノ基糖化部分に十分に作用すること等が要求されているため、特別な方法をとらざるを得なかった。しかし、本発明によれば、高精度で測定される糖化Ｈｂ量を基に、ＨｂＡ１ｃ量を決定できるため、正確かつ簡便なＨｂＡ１ｃの測定が可能になる。したがって、ＨｂＡ１ｃの測定を臨床検査等で実用化することができる。
【００３３】
つぎに、本発明の糖化タンパク質の測定キットは、酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定に使用する測定キットであって、ＦＡＯＤを含有する試料の前処理用試薬と、ＦＡＯＤ、酸化還元酵素および発色基質を含有する発色用試薬とを含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明者らは、前述のように測定精度の問題の原因を突き止めた。そして、全血試料中に恒常的な糖化アミノ酸や一過性の外来糖化アミノ酸が存在しても、本発明のように、試料の前処理用試薬にＦＡＯＤを含有させれば、前記酸化還元反応に先立ち、前記前処理試薬を添加することによって、試料中の糖化アミノ酸が分解され、前述のような糖化アミノ酸による測定値の上昇が抑制されることを、本発明者らが初めて見出したのである。このため、本発明の測定キットを使用すれば、迅速かつ簡便に酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定を優れた精度で行うことができ、さらに、点滴を受けた患者の血液試料であっても、同様の条件で測定できる。また、本発明の測定キットを用いた測定は、前述のように測定精度に優れるため、各種糖化タンパク質の指標としての信頼性も増し、臨床医療等の分野において有用な測定キットとなる。
【００３５】
本発明の測定キットは、測定対象物が、例えば、糖化Ｈｂであることが好ましい。このような測定キットによれば、糖化Ｈｂの糖尿病診断の指標としての信頼性が増し、臨床医療等の分野において有用となるからである。
【００３６】
なお、本発明において、前処理試薬に含有させるＦＡＯＤは、前記糖化アミノ酸を分解するものであるため、前述のように、以下、「分解用ＦＡＯＤ」ともいい、発色用試薬に含有させるＦＡＯＤは、糖化タンパク質に作用させるものであることから、以下、「測定用ＦＡＯＤ」ともいう。
【００３７】
本発明の測定キットは、さらに、プロテアーゼを含有するプロテアーゼ試薬を含むことが好ましい。前記ＦＡＯＤは、糖化タンパク質よりも、糖化アミノ酸やより短い糖化ペプチドに作用し易いという性質を有している。したがって、前記プロテアーゼ試薬により、試料中の糖化タンパク質を分解すれば、さらに発色用試薬における測定用ＦＡＯＤが作用し易くなり、測定精度も向上するからである。なお、前記プロテアーゼとしては、前記本発明の糖化タンパク質測定方法と同様のものが使用できる。
【００３８】
本発明の測定キットにおいて、前記プロテアーゼ試薬が、さらにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含有することが好ましい。このようにプロテアーゼ試薬にテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含有させれば、測定感度を向上できると同時に、テトラゾリウム化合物によって、前記試料中に含まれる還元物質等が酸化還元反応に与える影響を除去でき、測定精度をも向上できるからである。
【００３９】
また、前記プロテアーゼ試薬において、プロテアーゼとしてメタロプロテアーゼを使用する場合は、さらにＣａおよびＮａを含有し、メタロプロテアーゼ濃度が１００〜４０，０００ＫＵ／Ｌ、Ｃａ濃度が０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｎａ濃度が５〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。このように、前記濃度範囲になるように、メタロプロテアーゼ、ＣａおよびＮａを共存させれば、メタロプロテアーゼの安定性が向上し、例えば、低温だけでなく常温条件下においてもメタロプロテアーゼの失活を防止して安定に保存することができる。なお、ＣａおよびＮａは、使用時に、それぞれＣａ2+およびＮａ+にイオン化すればよい。
【００４０】
なお、前記プロテアーゼ試薬における各物質の濃度は、前記濃度範囲には限定されず、例えば、その割合が、前記濃度範囲と同様の含有割合であることが好ましい。これは、反応溶液に対する前記プロテアーゼ試薬の添加割合（希釈率）によって、反応に必要な前記各物質の添加量は調整可能だからである。なお、他の物質や他の試薬についても同様である。
【００４１】
本発明の測定キットとしては、前記前処理用試薬に含有させる分解用ＦＡＯＤと、前記発色用試薬に含有させる測定用ＦＡＯＤとに、例えば、異なる基質特異性のＦＡＯＤを使用する第１の測定キットと、同じＦＡＯＤを使用する第２および第３の測定キットとがあげられる。
【００４２】
本発明において、第１の測定キットとしては、前述のように、前処理用試薬に含有させる分解用ＦＡＯＤと、発色用試薬に含有させる測定用ＦＡＯＤとに、異なる基質特異性のＦＡＯＤを使用することが好ましい。このような測定キットを用いれば、前記糖化アミノ酸は分解用ＦＡＯＤによって分解され、糖化タンパク質については、前記分解用ＦＡＯＤが作用していない異なる糖化部分に、前記測定用ＦＡＯＤを作用させることができるため、糖化アミノ酸の影響を受けず、測定精度を向上できるからである。
【００４３】
具体的には、例えば、前記分解用ＦＡＯＤが、糖化α−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤであり、前記測定用ＦＡＯＤが、糖化α−アミノ基および糖化側鎖アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤであることが好ましい。前記測定用ＦＡＯＤは、α−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の両方に作用するため、従来の方法であれば、前述のようにα−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸にも作用していた。しかし、本発明の測定キットを使用すれば、前処理用試薬での処理によって、前記糖化アミノ酸は、予め、前記糖化α−アミノ基に特異的に作用する分解用ＦＡＯＤに分解されているため、これに測定用ＦＡＯＤが作用することはなく、見かけ上の測定値の増加が抑制されて精度が向上する。また、測定用ＦＡＯＤは、前述のようにα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の両方に作用するが、予め、糖化タンパク質のα−アミノ基糖化部分も分解用ＦＡＯＤによって分解されているため、本発明における前記発色用試薬で処理すれば、糖化タンパク質の側鎖アミノ基糖化部分のみに測定用ＦＡＯＤを作用させることができる。このため、特に側鎖アミノ基の糖化量に特徴がある糖化Ｈｂの測定に、有用な測定キットであるといえる。なお、このような測定キットは、前記本発明の第１の糖化タンパク質の測定方法に利用できる。
【００４４】
つぎに、前記第２の測定キットは、前処理用試薬の前記分解用ＦＡＯＤおよび発色用試薬の前記測定用ＦＡＯＤとして、同じＦＡＯＤを使用し、糖化タンパク質を分解し、かつ、前記分解用ＦＡＯＤを消化失活させるプロテアーゼを含有するプロテアーゼ試薬を含むことが好ましい。
【００４５】
この第２の測定キットの使用方法は、例えば、まず、前処理用試薬を試料に添加して糖化アミノ酸に分解用ＦＡＯＤを作用させた後、プロテアーゼ試薬を添加して糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、あわせて残存する分解用ＦＡＯＤもプロテアーゼにより消化分解する。そして、さらに前記発色用試薬を添加して測定用ＦＡＯＤを前記プロテアーゼ分解物に作用させ、前記酸化還元反応を行えばよい。
【００４６】
ＦＡＯＤは、前述のように測定する糖化タンパク質よりも、糖化アミノ酸やより短い糖化タンパク質のペプチド断片に対して作用し易いという性質を有している。このため、分解用ＦＡＯＤを含有する前処理用試薬を添加しても、酵素の反応速度論から、糖化アミノ酸を分解する処理時間においては、前記ＦＡＯＤは糖化タンパク質にはあまり作用しないといえる。しかし、続くプロテアーゼ試薬による処理の間も前記分解用ＦＡＯＤの活性が残存していると、プロテアーゼ処理と併行して、プロテアーゼによる糖化タンパク質分解物（すなわち糖化アミノ酸や糖化タンパク質のペプチド断片）に前記分解用ＦＡＯＤが作用してしまい、後に測定用ＦＡＯＤを含む発色用試薬を添加しても、すでに前記糖化タンパク質の分解物の一部には分解用ＦＡＯＤが作用してしまった状態となり、反対に測定精度が低下するおそれがある。したがって、前記第２の測定キットのように、糖化タンパク質を分解し、かつ分解用ＦＡＯＤを消化失活させるプロテアーゼ試薬を含めば、糖化タンパク質の分解物は、前記分解用ＦＡＯＤとは未反応のままで維持され、続いて添加する発色用試薬中の測定用ＦＡＯＤと反応することができる。このため測定精度も向上するのである。なお、このような測定キットは、前記本発明の第２の糖化タンパク質の測定方法に利用できる。
【００４７】
一方、第３の測定キットは、分解用ＦＡＯＤと測定用ＦＡＯＤとに同じＦＡＯＤを用いて場合であっても、前述の第２の測定キットのように、プロテアーゼ試薬で残存する分解用ＦＡＯＤを失活させなくとも、例えば、前処理用試薬の前記分解用ＦＡＯＤ濃度と、発色用試薬の前記測定用ＦＡＯＤ濃度とを調整することによって、高精度な測定を実現できる。この場合、例えば、最終的な発色反応溶液における前記分解用ＦＡＯＤ（Ａ）と測定用ＦＡＯＤ（Ｂ）の添加割合（活性比Ａ：Ｂ）が、Ａ：Ｂ＝１：１０〜１：１０００の範囲になるように、前処理用試薬と発色用試薬のＦＡＯＤ濃度を設定することが好ましい。このような添加割合であれば、プロテアーゼ試薬で処理する際に、前記分解用ＦＡＯＤが残存しても、酵素の反応速度論の点から糖化タンパク質には作用し難いからである。なお、このような測定キットは、前記本発明の第３の糖化タンパク質の測定方法に利用できる。
【００４８】
本発明の測定キットにおいて、前記発色基質は、例えば、酸化により発色する基質や還元により発色する基質等が使用できるが、好ましくは、酸化により発色する基質であり、具体的には、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムであることが好ましい。
【００４９】
このように、発色基質としてＤＡ−６４を使用する場合に、前記プロテアーゼ試薬がテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含有すると、これらの３つの成分が反応系において混合することにより、ＤＡ−６４が誤発色を起こす場合がある。このように誤発色が生じると、例えば、発色量の測定においてバックグラウンドが高くなり、また、十分量添加したＤＡ−６４が不足するという問題が生じる。しかし、前述のように、各試薬が前記濃度範囲で各成分を含有すれば、反応系におけるＤＡ−６４の誤発色も防止される。このため、前記バックグラウンドの上昇も抑制でき、より一層高精度な測定が可能になる。
【００５０】
本発明の測定キットにおいて、前記前処理用試薬、プロテアーゼ試薬、発色用試薬が、さらに界面活性剤を含んでもよい。
【００５１】
また、前記各種試薬が、ＣＨＥＳ，ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ホウ酸、トリエタノールアミン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＰＯＰＳＯ、ＡＤＡ，ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓからなる群から選択された少なくとも一つの緩衝剤を含有することが好ましい。前記各種試薬はそれぞれ酵素を含有するため、緩衝剤を添加することにより、例えば、至適ｐＨにおいて前記酵素を作用できるからである。
【００５２】
具体的には、前記前処理用試薬が、さらにＣＨＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＥＰＰＳ、リン酸、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ホウ酸からなる群から選択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、そのｐＨが、８．０〜１０．０の範囲であることが好ましい。
【００５３】
また、前記プロテアーゼ試薬が、さらにＴｒｉｓ、ＭＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、リン酸からなる群から選択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、そのｐＨが、５．０〜７．０の範囲であることが好ましい。
【００５４】
また、前記発色用試薬が、さらにＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳからなる群から選択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、そのｐＨが、６．０〜９．０の範囲であることが好ましい。
【００５５】
前記発色用試薬は、例えば、ＤＡ−６４等の発色基質の誤発色を防止できることから、さらにアジ化ナトリウムを含むことが好ましい。
【００５６】
前記前処理用試薬は、さらにウリカーゼおよびビリルビンオキシダーゼの少なくとも一方を含むことが好ましい。このようにウリカーゼを含有すれば、例えば、測定試料に含まれる尿酸を分解でき、また、ビリルビンオキシダーゼを含有すれば、ビリルビンを分解できる。この尿酸やビリルビンは還元力を有するため、このように分解すれば、さらに還元物質による影響が除去でき、測定精度を向上できるからである。
【００５７】
本発明の測定キットにおける各試薬の具体的な組成としては、例えば、以下の組成があげられる。
【００５８】
前記前処理用試薬は、例えば、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが糖化されたα−アミノ基に特異的に作用する酵素であり、その濃度が１０〜５０００Ｕ／Ｌの範囲、緩衝剤濃度が５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ｐＨが８．０〜１０．０の範囲であることが好ましい。
【００５９】
前記プロテアーゼ試薬は、例えば、メタロプロテアーゼの濃度が、１００〜１０，０００ＫＵ／Ｌの範囲、テトラゾリウム化合物濃度が０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム濃度が０．０８〜４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、Ｃａ濃度が０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、Ｎａ濃度が５〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、緩衝剤濃度が０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ｐＨが５．０〜７．０の範囲であることが好ましい。
【００６０】
前記発色用試薬は、例えば、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基および糖化されたアミノ酸残基側鎖に特異的に作用する酵素であり、その濃度が１００〜５０，０００Ｕ／Ｌの範囲、ペルオキシダーゼ濃度が０．１〜４００ＫＵ／Ｌの範囲、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム濃度が０．０２〜２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、緩衝剤濃度が１０〜５００ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ｐＨが６〜９の範囲であることが好ましい。
【００６１】
本発明の測定キットは、前記本発明の糖化タンパク質の測定方法と同様の試料に適用できる。また、その測定対象物も同様であり、好ましくは糖化Ｈｂである。
【００６２】
なお、本発明の測定キットにおける各種試薬は、各成分を水性溶媒に溶解した液系の試薬でもよいし、使用前に水性溶媒に溶解して使用するドライ系の試薬であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、本発明の測定方法の一実施例において、酵素法によるＨｂＡ１ｃ量と、ＨＰＬＣ法によるＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本発明の測定方法および測定キットにおいて使用するＦＡＯＤは、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましく、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−α」という）、アミノ酸残基の側鎖アミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−Ｓ」という）、α−アミノ基が糖化された糖化アミンおよび前記側鎖アミノ基が糖化された糖化アミンのいずれにも特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）等があげられる。なお、「糖化アミン」とは、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸等をいう。
【００６５】
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2  ＋  Ｈ2Ｏ  ＋  Ｏ2
→Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  ＮＨ2−Ｒ2  ＋  Ｈ2Ｏ2    …（１）
【００６６】
前記式（１）において、Ｒ1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］n−ＣＨ2ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
【００６７】
前記式（１）において、Ｒ2は、特に制限されないが、糖化アミンが糖化アミノ酸または糖化ペプチド（糖化タンパク質を含む）の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基（アミノ酸側鎖のアミノ基）が糖化されている場合とで異なる。
【００６８】
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−αおよびＦＡＯＤ−αＳである。
【００６９】
−ＣＨＲ3−ＣＯ−Ｒ4              …（２）
【００７０】
前記式（２）において、Ｒ3はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
【００７１】
−（ＮＨ−ＣＲ3Ｈ−ＣＯ）n−ＯＨ                  …（３）
【００７２】
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（４）で示すことができる。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−ＳおよびＦＡＯＤ−αＳである。
【００７３】
−Ｒ5−ＣＨ（ＮＨ−  Ｒ6）−ＣＯ−Ｒ7    …（４）
【００７４】
前記式（４）において、Ｒ5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5は
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ5は、
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）−
である。
【００７５】
また、前記式（４）において、Ｒ6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
【００７６】
−（ＣＯ−ＣＲ3Ｈ−ＮＨ）n−Ｈ        …（５）
【００７７】
また、前記式（４）において、Ｒ7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
【００７８】
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ          …（６）
【００７９】
前記糖化α−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤ−αとしては、例えば、市販の商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−Ｅ）（キッコーマン社製）、ペニシリウム属由来のＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６号公報）等があげられる。前記糖化されたアミノ酸側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ−Ｓとしては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会  平成１２年度  「Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀  他」）等があげられる。また、前記糖化α−アミノ基および糖化アミノ酸側鎖基の両方に作用するＦＡＯＤ−αＳとしては、例えば、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９）等があげられる。
【００８０】
本発明におけるテトラゾリウム化合物としては、例えば、テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する構造であることが好ましく、より好ましくは、３箇所に環構造置換基を有する構造である。
【００８１】
前記テトラゾリウム化合物が、前述のように、前記テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位および３位に有することが好ましい。また、テトラゾリウム化合物が３箇所に環構造置換基を有する場合は、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位、３位および５位に有することが好ましい。
【００８２】
また、テトラゾリウム化合物は、少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。前記ベンゼン環以外の環構造置換基としては、例えば、環骨格にＳまたはＯを含み、かつ共鳴構造である置換基があげられ、例えば、チエニル基、チアゾイル基等である。
【００８３】
また、前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の少なくとも３箇所に環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。
【００８４】
また、少なくとも１つの環構造置換基が官能基を有することが好ましく、前記官能基の数が多いことがより好ましい。
【００８５】
前記官能基としては、電子吸引性の官能基が好ましく、例えば、ハロゲン基、エーテル基、エステル基、カルボキシ基、アシル基、ニトロソ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基等があげられる。この他にも、例えば、ヒドロペルオキシ基、オキシ基、エポキシ基、エピジオキシ基、オキソ基等の酸素を含む特性基や、メルカプト基、アルキルチオ基、メチルチオメチル基、チオキソ基、スルフィノ基、ベンゼンスルホニル基、フェニルスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、ｐ−トリルスルホニル基、トシル基、スルファモイル基、イソチオシアネート基等の硫黄を含む特性基等があげられる。これらの電子吸引性官能基の中でも、好ましくは、ニトロ基、スルホ基、ハロゲン基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基である。また、前記電子吸引性の官能基の他に、例えば、フェニル基（Ｃ6Ｈ5−）、スチリル基（Ｃ6Ｈ5ＣＨ＝ＣＨ−）等の不飽和炭化水素基等もあげられる。なお、前記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。
【００８６】
前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を有することが好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇所（ｏｒｔｈｏ−、ｍｅｔａ−、ｐｒａ−）に前記官能基を有してもよい。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を有しても、異なる官能基を有してもよい。
【００８７】
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前記テトラゾール環の２位、３位および５位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（以下、「ＷＳＴ−３」ともいう）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジル）−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム塩および２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム塩等があげられる。
【００８８】
また、前記テトラゾリウム化合物は、前述のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム塩、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル  カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，２’−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩および３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等があげられる。
【００８９】
また、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリウム化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム塩等があげられる。
【００９０】
前述のテトラゾリウム化合物の中でも、前述のように、環構造置換基を３つ有する化合物が好ましく、より好ましくは、環構造がベンゼン環である置換基を３つ有し、かつ電子吸引性官能基を多く有するものであり、特に好ましくは、ＷＳＴ−３である。なお、このようなテトラゾリウム化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態等であってもよい。また、このテトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００９１】
つぎに、本発明の糖化タンパク質の測定方法について、血球中の糖化Ｈｂを測定する例を、下記実施形態Ａ−１〜Ａ−５において説明する。
【００９２】
（実施形態Ａ−１）
この実施形態は、前記糖化アミノ酸の分解にＦＡＯＤ−αを、糖化Ｈｂの測定にＦＡＯＤ−αＳをそれぞれ使用し、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で酸化還元反応を行った例である。
【００９３】
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００９４】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリエチレンソルビタンアルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０１〜５重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよい。
【００９５】
つぎに、前記溶血試料に対し、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加する。
【００９６】
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、処理溶液中の血球濃度が、０．２〜２体積％の場合、濃度０．００５〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。具体的に、前記テトラゾリウム化合物がＷＳＴ−３の場合は、濃度０．００４〜１６ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。なお、前記テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することにより、無添加の場合に比べて、その感度が、約１．２〜３倍の範囲で向上する。
【００９７】
また、前記テトラゾリウム化合物（Ｃ）とアジ化ナトリウム（Ｄ）の添加割合（モル比Ｃ：Ｄ）は、例えば、Ｃ：Ｄ＝２０：３〜２０：１２の範囲であり、好ましくは２０：５〜２０：１１の範囲、より好ましくは２０：６〜２０：１０の範囲である。
【００９８】
前記テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムは、そのまま前記溶血試料に添加してもよい。しかし、操作の簡便性等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液およびアジ化ナトリウム溶液として、または、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの両方を含有する溶液（テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液）として使用することが好ましい。
【００９９】
前記各種溶液におけるテトラゾリウム化合物またはアジ化ナトリウムの濃度は、前記溶血試料に添加する場合の希釈倍率等に応じて適宜決定できるが、テトラゾリウム化合物の濃度は、例えば、０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは、０．６〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．７〜２．７ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。アジ化ナトリウムの濃度は、例えば、０．１〜４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは、０．１５〜１．８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、より好ましくは０．２〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、前記混合液の場合、テトラゾリウム化合物（Ｃ）とアジ化ナトリウム（Ｄ）との配合割合（モル比Ｃ：Ｄ）は、Ｃ：Ｄ＝２０：３〜２０：１２の範囲であり、好ましくは２０：５〜２０：１１の範囲、より好ましくは２０：６〜２０：１０の範囲である。
【０１００】
前記溶液の溶媒としては、例えば、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ，ＭＯＰＳＯ，ＤＩＰＳＯ，ＴＥＳ，ＰＯＰＳＯ，ＨＥＰＥＳ，リン酸等の緩衝液が使用でき、好ましくは、ＭＯＰＳ、ＭＥＳである。前記溶媒のｐＨは、例えば、５．０〜７．０の範囲であり、好ましくは、５．５〜６．５の範囲である。また、前記緩衝液の濃度は、例えば、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、より好ましくは１〜３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記溶血試料に添加した場合の処理溶液における最終濃度は、例えば、０．７〜９ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、０．８〜４．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、より好ましくは０．８〜２．７ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０１０１】
また、より一層の感度向上が可能であることから、調製した前記テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液を、前記溶血試料に添加する前に、一定時間放置することによってエージングすることが好ましい。このエージング処理によって、感度が、エージングしない場合よりも、例えば、約１．２〜３倍に向上する。
【０１０２】
前記エージングにおいて、例えば、処理温度は、４０〜６０℃の範囲が好ましく、より好ましくは５０〜６０℃の範囲である。処理時間は、例えば、６〜７２時間の範囲であり、好ましくは１５〜２０時間の範囲である。
【０１０３】
前記溶血試料に対して、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを直接または前記溶液として添加した後、通常、処理温度４０〜６０℃の範囲で、６〜７２時間インキュベートし、前記試料の前処理を行う。このように試料をテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムで前処理することによって、前述のように感度の向上が達成できると同時に、テトラゾリウム化合物によって、前記試料中に含まれる還元物質等が酸化還元反応に与える影響を除去でき、測定精度をも向上できるからである。このようにテトラゾリウム化合物は、測定精度の向上にも寄与するが、本発明の目的の一つである測定感度の向上には、テトラゾリウム化合物だけでなくアジ化ナトリウムの共存が必要であり、それによって本発明に特有の効果が奏される。
【０１０４】
続いて、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した前処理済み溶血試料について、プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用するＦＡＯＤを測定対象物に作用し易くするためである。また、前述のようにテトラゾリウム化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行うため、糖化Ｈｂの分解を迅速に行うこともできる。
【０１０５】
前記プロテアーゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロティナーゼ等が使用でき、具体的には、トリプシン、プロテナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ等が使用でき、好ましくは、前記糖化Ｈｂを選択的に分解する、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロティナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼ等が好ましい。前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来プロテアーゼとしては、商品名プロテアーゼＮ（例えば、フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタロプロティナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロティナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）（例えば、東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロティナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロティナーゼである。このように、選択的に分解するプロテアーゼを使用すれば、糖化Ｈｂ分解物を選択的に調製できる。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、糖化Ｈｂの濃度等により適宜決定される。
【０１０６】
前記緩衝液としては、例えば、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が使用できる。そのｐＨは、例えば、６〜１３の範囲であり、好ましくは８〜１２の範囲、より好ましくは９〜１１の範囲である。また、プロテアーゼ処理溶液における前記緩衝液の最終濃度は、例えば、１．０〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０１０７】
具体的には、例えば、前記プロテアーゼとしてメタロプロティナーゼを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のメタロプロティナーゼ濃度０．１〜４０ＭＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。
【０１０８】
また、例えば、前記プロテアーゼとしてプロティナーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜３００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
【０１０９】
つぎに、前記プロテアーゼ処理した溶血試料を、前記式（１）の反応、具体的には下記式（７）の反応を触媒するＦＡＯＤ−α（分解用ＦＡＯＤ）で処理する。
【０１１０】
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯＯＨ  ＋  Ｈ2Ｏ  ＋  Ｏ2 
→  Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  ＮＨ2−ＣＨＲ3−ＣＯＯＨ  ＋  Ｈ2Ｏ2    …（７）
【０１１１】
前記式（７）において、Ｒ1は前述と同様の糖残基を示し、Ｒ3は前述と同様にアミノ酸側鎖を示す。
【０１１２】
この処理によって、前記溶血試料に含まれるα−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸、および前記糖化Ｈｂ分解物のうちα−アミノ基の糖化部分が分解される。
【０１１３】
なお、前記ＦＡＯＤ−α処理によっては、糖化アミノ酸の中でも側鎖アミノ基が糖化されたものは分解されずに残存する。しかし、この側鎖が糖化されたアミノ酸の糖化アミノ酸全体に対する割合、および糖化Ｈｂにおける糖化された側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基に対する割合から考えても、残存する糖化アミノ酸の影響は小さく、測定精度は十分に向上するといえる。
【０１１４】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ−α濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．５〜２０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【０１１５】
つぎに、前記ＦＡＯＤ−α処理した前記溶血試料を、さらにＦＡＯＤ−αＳで処理する。このＦＡＯＤ−αＳは、前述のように、糖化されたα−アミノ基および糖化された側鎖アミノ基の両方に作用する。しかし、糖化Ｈｂ分解物は、予め、分解用ＦＡＯＤ−αによって処理されているため、糖化側鎖アミノ基のみに測定用ＦＡＯＤ−αＳを作用させることができる。
【０１１６】
このＦＡＯＤ−αＳ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【０１１７】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ−αＳ濃度１０〜３０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．１〜５体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【０１１８】
つぎに、前記ＦＡＯＤ−αＳ処理で生成した過酸化水素を、酸化酵素および発色基質を用いて、さらに酸化還元反応によって測定する。
【０１１９】
前記発色基質としては、例えば、ＤＡ−６４、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、前述のように、ＤＡ−６４である。
【０１２０】
前記酸化酵素としては、例えば、ＰＯＤが好ましい。
【０１２１】
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ＩＵ／Ｌ、発色基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
【０１２２】
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、例えば、予め準備した過酸化水素量と糖化Ｈｂ量との相関関係を表わす検量線と、測定した過酸化水素量とを用いて、試料中の糖化Ｈｂ量を求めることができる。
【０１２３】
なお、はじめに添加した分解用ＦＡＯＤ−αによって生成した過酸化水素は、血液試料（溶血試料）中にはじめから存在するカタラーゼによって消失するため、ＦＡＯＤ−αＳにより生成した測定対象物由来の過酸化水素の測定には影響を及ぼすことはない。また、別途カタラーゼを添加して消去させてもよい。このように前記カタラーゼにより過酸化水素を消去する場合、後に行う測定用ＦＡＯＤ−αＳ処理で生成する過酸化水素までもが消去されることを防ぐために、ＦＡＯＤ−αＳの添加と共に、過剰量のＰＯＤおよび発色性基質を添加することが好ましい。この場合、ＰＯＤは、前記カタラーゼの添加量（Ｕ）に対し、例えば、５〜１００倍の活性（Ｕ）量を添加することが好ましい。
【０１２４】
また、分解用ＦＡＯＤで溶血試料を処理する際に、例えば、さらにウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等を添加して同様に処理してもよい。このようにウリカーゼで処理すれば、さらに前記試料中に含まれる尿酸を分解でき、また、ビリルビンオキシダーゼで処理すれば、ビリルビンを分解できる。この尿酸やビリルビンは還元力を有するため、このように処理することによって、さらに還元物質による影響が除去でき、測定精度を向上できる。
【０１２５】
前記ウリカーゼまたはビリルビンオキシダーゼの添加割合は、反応液中の血球濃度が０．２〜２体積％の場合、例えば、前記反応液中のウリカーゼ濃度０．１〜５０００Ｕ／Ｌ、ビリルビンオキシダーゼ濃度０．１〜５０００Ｕ／Ｌであり、好ましくは、ウリカーゼ濃度１〜２０００Ｕ／Ｌ、ビリルビンオキシダーゼ濃度０．５〜１０００Ｕ／Ｌであり、より好ましくはウリカーゼ濃度５〜１０００Ｕ／Ｌ、ビリルビンオキシダーゼ濃度２〜１０００Ｕ／Ｌである。また、その処理条件としては、例えば、前記分解用ＦＡＯＤと同様に行うことができる。
【０１２６】
この測定において、前記プロテアーゼ処理は、前述のように前記分解用ＦＡＯＤ−α処理の前には限られず、例えば、前記ＦＡＯＤ−α処理の後に行ってもよい。前記プロテアーゼ処理は、前述のように、ＦＡＯＤを作用し易くするために行うが、前記ＦＡＯＤ−α処理は糖化アミノ酸の分解を目的として行うため、ＦＡＯＤ−α処理前にプロテアーゼによって糖化Ｈｂが分解されていなくても、本発明の効果は十分に得ることができるからである。
【０１２７】
また、本発明の測定方法は、本実施形態の操作順序には限定されず、例えば、同時に行ってもよい工程もある。例えば、溶血処理と、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウム処理と、分解用ＦＡＯＤ処理とを同時に行ってもよく、また、プロテアーゼ処理と、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウム処理とを同時に行うこともできる。なお、これらの組み合わせには制限されない。
【０１２８】
なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【０１２９】
（実施形態Ａ−２）
この実施形態は、糖化アミノ酸の分解と糖化Ｈｂの測定に、同じＦＡＯＤを用いた例である。ＦＡＯＤとしては、特に制限されず、例えば、ＦＡＯＤ−α、ＦＡＯＤ−Ｓ、ＦＡＯＤ−αＳのいずれを用いてもよい。なお、特に示さない限りは、前記実施形態Ａ−１と同様にして測定を行う。
【０１３０】
テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した前処理済み溶血試料に分解用ＦＡＯＤを添加する。
【０１３１】
具体的な処理条件としては、例えば、反応液中の分解用ＦＡＯＤ濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．５〜２０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前述と同様の緩衝液が使用できる。
【０１３２】
つぎに、分解用ＦＡＯＤ処理した試料に対しプロテアーゼ処理を行う。このプロテアーゼ処理の第１の目的は、前述と同様に、血球由来の糖化Ｈｂを分解し、後の工程でさらに添加する測定用ＦＡＯＤを作用し易くするためである。そして、第２の目的は、前記分解用ＦＡＯＤを消化して失活させるためである。
【０１３３】
ＦＡＯＤは、糖化タンパク質よりも糖化アミノ酸に作用し易いため、前記分解用ＦＡＯＤ処理では、糖化アミノ酸が分解される。しかし、この分解用ＦＡＯＤが残っている状態で、前記糖化Ｈｂをプロテアーゼ処理すると、残存する分解用ＦＡＯＤと糖化Ｈｂ分解物の糖化部分とが反応してしまい、正確な測定ができないという問題がある。したがって、この残存する分解用ＦＡＯＤをプロテアーゼで失活させ、前記糖化Ｈｂ分解物との反応を防止する。このために、はじめに添加した分解用ＦＡＯＤを速やかに失活させ、かつ、糖化Ｈｂを分解できるだけのプロテアーゼを添加する必要がある。
【０１３４】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されず前述と同様のものが使用できる。また、その処理条件は、例えば、使用するプロテアーゼの種類、糖化Ｈｂの濃度、分解用ＦＡＯＤの種類やその量等に応じて適宜決定される。
【０１３５】
プロテアーゼ処理の反応溶液におけるプロテアーゼの添加量は、分解用ＦＡＯＤ１００Ｕ／Ｌに対して、例えば、１〜１０００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１０〜３００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１００〜１００，０００ＫＵ／Ｌの範囲である。
【０１３６】
具体的に、プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、前記試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１０００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜５体積％、反応液中のＦＡＯＤ濃度１０〜１０００Ｕ／Ｌ、反応温度２０〜５０℃、反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【０１３７】
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた糖化Ｈｂ分解物に、分解用ＦＡＯＤと同じＦＡＯＤを、再度測定用ＦＡＯＤとして添加して処理する。この測定用ＦＡＯＤは、前記プロテアーゼによって失活するおそれがあるため、十分量添加する必要がある。
【０１３８】
この測定用ＦＡＯＤ処理も、前述と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【０１３９】
測定用ＦＡＯＤ処理の反応溶液における測定用ＦＡＯＤの添加量は、プロテアーゼ１０，０００ＫＵ／Ｌに対して、例えば、１０〜１０００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは１００〜２００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、より好ましくは５００〜５０，０００Ｕ／Ｌの範囲である。
【０１４０】
具体的な処理条件としては、例えば、反応液中の測定用ＦＡＯＤ濃度５００〜２０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜４０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【０１４１】
（実施形態Ａ−３）
この実施形態は、糖化アミノ酸の分解と糖化Ｈｂの測定に、同じＦＡＯＤを用いた例である。特に示さない限りは、前記実施形態Ａ−１と同様にして測定を行う。
【０１４２】
但し、この実施形態は、前記実施形態Ａ−２とは異なり、分解用ＦＡＯＤを、プロテアーゼによって必ずしも失活させる必要がない実施形態である。酵素には基質特異性があるため、プロテアーゼとＦＡＯＤとの組み合わせによっては、ＦＡＯＤをプロテアーゼで失活させ難い場合がある。このような場合に本実施形態の方法が有効になる。なお、はじめに添加した分解用ＦＡＯＤが、プロテアーゼにより生成した糖化Ｈｂ分解物と反応すると、測定精度を向上できないため、以下に示すように、ＦＡＯＤの添加割合を調整することが重要となる。
【０１４３】
テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した前処理済み溶血試料に、分解用ＦＡＯＤを添加する。
【０１４４】
分解用ＦＡＯＤは、プロテアーゼで失活させ難い場合、その活性が残存しても、プロテアーゼ処理の間に、生成した糖化Ｈｂ分解物に作用しない範囲で添加する必要がある。また、ＦＡＯＤは糖化アミノ酸に作用しやすく、糖化タンパク質に作用し難いという性質を利用するため、糖化アミノ酸のみに作用する程度の添加量であり、かつ反応時間とすることが好ましい。
【０１４５】
ＦＡＯＤ処理の条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜２０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前述と同様の緩衝液が使用できる。
【０１４６】
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理した試料に対しプロテアーゼ処理を行う。この実施形態は、前述のように、プロテアーゼが前記ＦＡＯＤに作用し難い場合の例であるため、特にプロテアーゼの添加量は特に制限されない。
【０１４７】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されず、前述と同様のものが使用できる。その処理条件は、前述と同様に、使用するプロテアーゼの種類、糖化Ｈｂの濃度、使用するプロテアーゼのＦＡＯＤに対する基質特異性等により適宜決定される。
【０１４８】
このような実施形態に該当するＦＡＯＤとプロテアーゼの組み合わせとしては、例えば、商品名ＦＯＤ（旭化成社製）と商品名トヨチーム（東洋紡社製）、前記ギベレラ属由来ＦＡＯＤと商品名プロテナーゼＫ（ロシュ社製）のプロテアーゼ等があげられる。
【０１４９】
プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、前記試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜６０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜５体積％、反応液中のＦＡＯＤ濃度１〜１００Ｕ／Ｌ、反応温度２０〜５０℃、反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【０１５０】
続いて、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物に、再度同じＦＡＯＤを測定用ＦＡＯＤとして添加する。
【０１５１】
この測定用ＦＡＯＤ処理も、前述と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【０１５２】
このように、本実施形態においては、分解用ＦＡＯＤ（Ａ）と測定用ＦＡＯＤ（Ｂ）の添加割合（活性比Ａ：Ｂ）を、例えば、前述のようにＡ：Ｂ＝１：５０，０００〜１：１０の範囲、好ましくは１：５０００〜１：２５の範囲、より好ましくは１：５００〜１：５０の範囲にする。このように設定すれば、前記実施形態Ａ−２と異なり前記分解用ＦＡＯＤは反応液中に残存するが、この残存したＦＡＯＤの反応速度は非常に遅いため、プロテアーゼ処理工程において、測定に影響を与える程度に、生成した糖化Ｈｂ分解物に残存ＦＡＯＤが作用することはない。
【０１５３】
処理条件としては、例えば、反応液中の測定用ＦＡＯＤ濃度５００〜２０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜４０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【０１５４】
（実施形態Ａ−４）
この実施形態は、発色基質としてＤＡ−６４を用いて、前記測定用ＦＡＯＤ処理によって生成した過酸化水素を測定する例である。なお、特に示さない限りは、前記実施形態Ａ−１と同様に行う。
【０１５５】
発色基質としてＤＡ−６４を使用する場合は、ＤＡ−６４の誤発色を防止するために、ＤＡ−６４、テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよび界面活性剤のそれぞれの前記酸化還元反応溶液における終濃度を以下の範囲に設定する。各成分の終濃度は、通常、ＤＡ−６４  １〜１０，０００μｍｏｌ／Ｌ、界面活性剤０．０１〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ、テトラゾリウム化合物０．０５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは、ＤＡ−６４  ２〜１０００μｍｏｌ／Ｌ、界面活性剤０．０５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、テトラゾリウム化合物０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム０．０２〜２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくはＤＡ−６４  ３〜３００μｍｏｌ／Ｌ、界面活性剤０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、テトラゾリウム化合物０．５〜８ｍｍｏｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム０．０８〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記界面活性剤としては、特に制限されず、例えば、前述や後述のものが使用できる。
【０１５６】
この酸化還元反応溶液のｐＨは、６．０〜１０．０の範囲が好ましく、より好ましくは６．５〜９．０の範囲、特に好ましくは７．０〜８．５の範囲である。
【０１５７】
前記界面活性剤の添加は、例えば、ＤＡ−６４を添加する前または同時に行ってもよいし、溶血試料を調製するために界面活性剤を添加する場合であれば、酸化還元反応の際に界面活性剤が前記濃度範囲になるように、予め添加しておいてもよい。
【０１５８】
前記ＤＡ−６４は、酸化還元反応により発色するため、この反応液について、例えば、検出波長６００〜７８０ｎｍの範囲における吸光度（発色程度）を分光光度計で測定すれば、過酸化水素の量を測定できる。
【０１５９】
（実施形態Ａ−５）
つぎに、本発明のＨｂ糖化率の測定方法について、全血を試料とした場合の例をあげて説明する。
【０１６０】
まず、前記実施形態Ａ−１と同様にして、全血を溶血し、溶血試料中の糖化Ｈｂ量を測定し、一方、前記溶血試料におけるＨｂ量を測定する。
【０１６１】
Ｈｂ量は、例えば、以下に示すようにして測定できる。まず、前記溶血試料に、前述のようなテトラゾリウム化合物を添加し、Ｈｂを変性させる。その添加割合は、例えば、前記溶血試料中の血球濃度が、０．２〜２体積％の場合、濃度０．００５〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。具体的に、前記テトラゾリウム化合物がＷＳＴ−３の場合、濃度０．００４〜１６ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０１６２】
前記テトラゾリウム化合物は、そのまま使用してもよいが、操作の簡便性や処理効率等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液として使用することが好ましい。前記溶液の濃度は、テトラゾリウム化合物の種類（例えば、分子量等）等により適宜決定でき、例えば、０．０１〜１２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、より好ましくは０．２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記溶媒としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が使用でき、前記緩衝液としては、例えば、前述の緩衝液等が使用できる。なお、前記テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【０１６３】
前記テトラゾリウム化合物による処理条件は、特に制限されないが、例えば、温度４〜５０℃の範囲、処理時間２０秒〜６０分の範囲であり、好ましくは、温度１５〜４０℃の範囲、処理時間２０秒〜２０分の範囲であり、より好ましくは、温度２５〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜６分の範囲である。
【０１６４】
また、このテトラゾリウム化合物処理は、界面活性剤存在下において行うことが好ましい。これによって、さらにＨｂの変性を促進できるからである。このため、操作の簡便性等から前記試料の溶血時に予めテトラゾリウム化合物を添加しておいてもよい。
【０１６５】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンフェノールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等が使用できる。このポリオキシエチレンエーテル等が好ましい。このポリオキシエチレンエーテル［ＣLＨM−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）NＨ］は、ポリオキシエチレン鎖と炭化水素鎖とがエーテル結合しており、前記炭化水素鎖としては、例えば、アルキル基、アルキルフェニル基等があげられる。前記ポリオキシエチレン鎖の重量平均重合度（Ｎ）は８〜２３の範囲であり、他方の炭化水素鎖の炭素数（Ｌ）は８〜１８の範囲であることが好ましく、より好ましくは前記重量平均重合度（Ｎ）が８〜１５の範囲であり、炭化水素鎖の炭素数（Ｌ）が８〜１６の範囲であり、特に好ましくは前記重量平均重合度（Ｎ）が８〜１０の範囲であり、炭化水素鎖の炭素数（Ｌ）が８〜１４の範囲である。また、前記炭化水素鎖は、例えば、直鎖でもよく、分岐鎖を有していてもよい。前記ポリオキシエチレンエーテルの具体例としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコール（１０）ラウリルエーテル、ポリエチレングリコール（９）ラウリルエーテル等があげられる。
【０１６６】
より具体的には、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルである市販のＴｒｉｔｏｎ系界面活性剤等、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである市販のＴｗｅｅｎ系界面活性剤等、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである市販のＢｒｉｊ系界面活性剤等が使用できる。この他に、例えば、ポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル、商品名Ｎｉｋｋｏｌ  ＢＬ−９ＥＸ（ポリオキシエチレンの重量平均重合度Ｎが９：和光純薬工業社製）等のようなポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル、商品名Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰＸ（ポリオキシエチレンの重量平均重合度Ｎが約１０．５：ナカライテスク社製）および商品名Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−４０（ポリオキシエチレンの重量平均重合度Ｎが２０：ナカライテスク社製）等のようなポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等も使用できる。なお、これらの界面活性剤は、溶血用の界面活性剤としても使用することができる。
【０１６７】
界面活性剤の添加量は、特に制限されないが、例えば、前記溶血試料中の血球濃度が、０．２〜１体積％の場合、濃度０．０５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．３〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。具体的に、前記界面活性剤が商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の場合、濃度０．２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、商品名Ｂｒｉｊ３５の場合、濃度０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０１６８】
また、前記界面活性剤は、前記テトラゾリウム化合物０．５〜５ｍｍｏｌに対して、例えば、０．１〜７０ｍｍｏｌの範囲になるように添加してもよく、好ましくは０．３〜５０ｍｍｏｌの範囲、より好ましくは０．４〜２０ｍｍｏｌの範囲である。具体的に、前記界面活性剤が商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の場合、テトラゾリウム化合物１ｍｍｏｌに対して、０．２〜１５ｍｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．５〜１０ｍｍｏｌの範囲、特に好ましくは０．７〜５ｍｍｏｌの範囲である。また、また、商品名Ｂｒｉｊ３５の場合、テトラゾリウム化合物１ｍｍｏｌに対して、０．１〜１０ｍｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２〜８ｍｍｏｌの範囲、特に好ましくは０．３〜４ｍｍｏｌの範囲である。なお、界面活性剤は、試料の溶血時に、予めＨｂ変性を促進できる十分量を添加しておいてもよい。
【０１６９】
つぎに、前記変性Ｈｂの吸光度測定を行う。測定波長は、前述のように、５２０〜６７０ｎｍの範囲が好ましく、より好ましくは５５０〜６６０ｎｍの範囲である。また、前記波長を主波長として二波長測定を行う場合、副波長は、７３０〜９００ｎｍの範囲が好ましく、より好ましくは８００〜９００ｎｍの範囲であり、特に好ましくは８００〜８５０ｎｍの範囲である。
【０１７０】
そして、測定した変性Ｈｂの吸光度と、予め作成した検量線からＨｂ量を求め、前述の測定した糖化Ｈｂ量とＨｂ量とから、Ｈｂ糖化率を算出できる。
【０１７１】
前記検量線は、例えば、既知量のＨｂを含む標準試料を、前述のＨｂ測定方法および公知の測定方法によって測定し、これらの測定値から作成する。前記公知の測定方法としては、測定精度に優れる方法であれば特に制限されないが、例えば、国際標準であるＨｉＣＮ法が好ましい。
【０１７２】
なお、Ｈｂ量を求めるための変性Ｈｂの吸光度測定は、例えば、糖化Ｈｂ測定のために調製した溶血試料の一部を分取して、これをＨｂ測定用試料として行ってもよい。しかし、操作を簡便かつ迅速に行えることから、糖化Ｈｂの測定工程において行うことが好ましい。具体的には、例えば、前記実施形態Ａ−１に示す前記糖化Ｈｂの測定において、前記溶血試料にテトラゾリウム化合物を添加した後、前記溶血試料にテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した後、プロテアーゼ処理を行った後、または測定用ＦＡＯＤ処理を行った後等に、変性Ｈｂの吸光度を測定できる。
【０１７３】
（実施形態Ａ−６）
つぎに、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法について、全血を試料とした場合の例をあげて説明する。
【０１７４】
まず、全血試料について、前記実施形態Ａ−１と同様にして糖化Ｈｂ量の測定を行う。他方、糖化ＨｂのうちＨｂＡ１ｃ量が既知である糖化Ｈｂ標準液を準備し、これについて、前述と同様にして糖化Ｈｂ量の測定を行い、この標準液の測定値（糖化Ｈｂ量）とＨｂＡ１ｃ量との関係を示す検量線を作成する。前述のように、前記糖化Ｈｂの測定値とＨｂＡ１ｃ量とは相関関係にあるため、この検量線に、前記全血試料における糖化Ｈｂの測定値を代入すれば、前記全血試料中のＨｂＡ１ｃ量を求めることができる。
【０１７５】
なお、検量線の作成において、前記糖化Ｈｂ量の測定値としては、最終的に求めた糖化Ｈｂ量だけでなく、前記糖化Ｈｂ量の測定においてＰＯＤ処理よって得られた反応液の吸光度の値でもよいし、前記吸光度から求めた過酸化水素量を使用してもよい。
【０１７６】
つぎに、本発明の測定キットについて、測定対象物が糖化Ｈｂである例をあげて説明する。
【０１７７】
（実施形態Ｂ−１）
この実施形態は、前処理用試薬の分解用ＦＡＯＤにＦＡＯＤ−αを、発色用試薬の測定用ＦＡＯＤにＦＡＯＤ−αＳをそれぞれ使用した前記第１の測定キットの一例である。
【０１７８】
この測定キットは、分解用ＦＡＯＤを含有する前処理用試薬、プロテアーゼを含有するプロテアーゼ試薬、および測定用ＦＡＯＤ、酸化還元酵素および発色基質を含有する発色用試薬から構成される。
【０１７９】
これらの前処理用試薬、プロテアーゼ試薬、発色用試薬は、それぞれ含有させる成分を水性溶媒に溶解することによって調製できる。
【０１８０】
（前処理用試薬）
前処理用試薬は、最終的な発色反応溶液において、例えば、１０〜２００倍に希釈され、好ましくは２０〜１００倍に希釈される。したがって、前処理用試薬に含まれるＦＡＯＤ等の濃度は、例えば、この希釈倍率等に応じて適宜決定できる。また、測定試料中の測定対象物または分解する糖化アミノ酸の量に応じて、前処理用試薬の試料への添加量を変化することによって、反応系におけるＦＡＯＤ等の量を調整してもよい。
【０１８１】
具体的には、前処理用試薬における分解用ＦＡＯＤ濃度は、例えば、１０〜５０００Ｕ／Ｌの範囲である。
【０１８２】
前記水性溶剤としては、特に制限されないが、例えば、水、前述のような各種緩衝剤を含む緩衝液等があげられる。前記緩衝剤の中でも、好ましくはＣＨＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＥＰＰＳ、リン酸、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ホウ酸であり、より好ましくはＣＨＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、リン酸である。前記緩衝液の濃度は、例えば、５〜２００ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは２０〜１５０ｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、前記緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ８〜１０の範囲であり、好ましくは８．５〜１０．０の範囲である。
【０１８３】
また、この前処理用試薬は、分離用ＦＡＯＤの他に、さらに以下の成分を含有してもよい。
【０１８４】
界面活性剤を含有する場合、例えば、前述のような各種界面活性剤が使用できるが、好ましくはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルである。また、界面活性剤濃度は、例えば、０．０３〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０１８５】
ウリカーゼを含有する場合、その濃度は、例えば、１〜２０００Ｕ／Ｌの範囲であり、また、ビリルビンオキシダーゼを含有する場合、その濃度は、例えば、１〜２０００Ｕ／Ｌの範囲である。なお、これら両者を含有してもよい。
【０１８６】
（プロテアーゼ試薬）
つぎに、プロテアーゼ試薬は、最終的な発色反応溶液において、例えば、１．１〜３倍に希釈される。したがって、前述の前処理用試薬と同様に、各成分の濃度は、この希釈倍率等に応じて適宜決定でき、また、試料中の糖化Ｈｂ量等に応じて、試料への添加量を変化することにより、反応系におけるプロテアーゼ量を調整してもよい。
【０１８７】
プロテアーゼとしては、例えば、前述のものが使用できる。プロテアーゼ試薬におけるプロテアーゼ濃度は、プロテアーゼがメタロプロテアーゼの場合、例えば、０．５〜１００ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜４０ＭＵ／Ｌの範囲である。
【０１８８】
前記水性溶剤としては、特に制限されないが、例えば、水、前述のような各種緩衝剤を含む緩衝液等があげられる。前記緩衝剤の中でも、好ましくはＭＥＳ、ＭＯＰＳであり、より好ましくはＭＥＳである。前記緩衝液の濃度は、例えば、１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、前記緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ５．０〜７．０の範囲であり、好ましくは５．５〜６．５の範囲である。
【０１８９】
また、このプロテアーゼ試薬は、前記プロテアーゼの他に、さらに以下の成分を含有してもよい。
【０１９０】
他の成分としては、例えば、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムがあげられる。この場合、前記プロテアーゼ試薬は、例えば、テトラゾリウム化合物濃度が０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム濃度が０．０５〜４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくはテトラゾリウム化合物濃度が０．６〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム濃度が０．１５〜１．８ｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、テトラゾリウム化合物（Ｃ）とアジ化ナトリウム（Ｄ）との添加割合は、（モル比Ｃ：Ｄ）は、Ｃ：Ｄ＝２０：３〜２０：１２の範囲であることが好ましく、より好ましくはＣ：Ｄ＝２０：５〜２０：１１の範囲であり、特に好ましくはＣ：Ｄ＝２０：６〜２０：１０の範囲である。
【０１９１】
また、プロテアーゼとしてメタロプロテアーゼを使用する場合は、さらにＣａ化合物およびＮａ化合物を含有してもよい。前記Ｃａ化合物およびＮａ化合物としては、前記水性溶媒中で、Ｃａ2+およびＮａ+にイオン化するものであれば特に制限されず、前記Ｃａ化合物としては、例えば、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）、ＣａＳＯ4、（ＣＨ3ＣＯＯ）2Ｃａ等が使用でき、好ましくはＣａＣｌ2、ＣａＳＯ4である。また、前記Ｎａ化合物としては、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ＣＨ3ＣＯＯＮａ、Ｎａ2ＳＯ4、ＮａＮＯ3等が使用でき、好ましくはＮａＣｌ、Ｎａ2ＳＯ4である。これらのＣａ化合物およびＮａ化合物は、それぞれ一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【０１９２】
メタロプロテアーゼの濃度は、前述のように、０．５〜１００ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜４０ＭＵ／Ｌの範囲である。
【０１９３】
一方、前記Ｃａ化合物の濃度は、解離したＣａ2+濃度が０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲となるように、０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎａ化合物の濃度は、解離したＮａ+濃度が５〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲となるように、５〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０１９４】
（発色用試薬）
つぎに発色用試薬は、最終的な発色反応溶液において、例えば、２〜２０倍に希釈され、好ましくは３〜１０倍、より好ましくは４〜８倍に希釈される。この場合も前述と同様に、各成分の濃度は、この希釈倍率等に応じて適宜決定でき、また、試料中の糖化Ｈｂや発生する過酸化水素の量に応じて、添加量を変化することにより、反応系における各成分の量を調整してもよい。
【０１９５】
発色用試薬における測定用ＦＡＯＤの濃度は、例えば、１〜２００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜１００ＫＵ／Ｌの範囲である。
【０１９６】
酸化還元酵素の濃度は、例えば、１〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１０〜２００ＫＵ／Ｌの範囲である。前記酸化還元酵素としては、前述のようにＰＯＤがあげられる。
【０１９７】
前記発色基質の濃度は、例えば、０．００１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．００５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．０２〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記発色基質としては、前述のようなものがあげられる。
【０１９８】
前記水性溶剤としては、特に制限されないが、例えば、水、前述のような各種緩衝剤を含む緩衝液等があげられる。前記緩衝剤の中でも、好ましくはＴｒｉｓ、リン酸である。前記緩衝液の濃度は、例えば、２０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、前記緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜９の範囲であり、好ましくは６．５〜８の範囲である。
【０１９９】
（使用方法）
つぎに、このような測定キットを使用して、血球中の糖化Ｈｂを測定する方法を説明する。
【０２００】
まず、前記実施形態Ａ−１と同様にして、全血から溶血試料を調製し、この溶血試料に前記前処理用試薬を添加して、分解用ＦＡＯＤを試料中の糖化アミノ酸に作用させてこれを分解する。
【０２０１】
この分解用ＦＡＯＤ−αＳの作用によって、前記溶血試料に含まれるα−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸、および前記糖化Ｈｂ分解物のうちα−アミノ基の糖化部分が分解される。なお、前記ＦＡＯＤ−α処理によっては、糖化アミノ酸の中でも側鎖アミノ基が糖化されたものは分解されずに残存する。しかし、この側鎖が糖化されたアミノ酸の糖化アミノ酸全体に対する割合および糖化Ｈｂにおける糖化された側鎖アミノ基に対する割合から考えても、残存する糖化アミノ酸の影響は小さく、測定精度は十分に向上するといえる。
【０２０２】
前記前処理用試薬の添加量は、血球濃度が３０〜６０体積％の溶血試料３０μＬに対して、例えば、３００〜３０００μＬの範囲であり、好ましくは６００〜２４００μＬの範囲である。前記前処理用試薬を添加した前処理反応液は、血球濃度１体積％に対して、前記分解用ＦＡＯＤ濃度が１０〜５０００Ｕｍｏｌ／Ｌの範囲となることが好ましい。また、前記処理溶液のｐＨは、８〜１０の範囲が好ましく、より好ましくは８．５〜１０の範囲である。
【０２０３】
この前処理は、前記前処理用試薬を添加してからインキュベートすることが好ましく、その条件は、例えば、１０〜３７℃、０．１〜２０分間であり、好ましくは１５〜３７℃、０．１〜５分間である。
【０２０４】
なお、この前処理用試薬が界面活性剤を含有する場合、例えば、前述のような溶血処理を別途行って溶血試料を調製する必要はない。つまり、前処理用試薬を全血または血球試料に添加することによって、界面活性剤による溶血処理と、分解用ＦＡＯＤによる糖化アミノ酸の分解処理の両方を行うことができるのである。
【０２０５】
この場合、前記前処理用試薬を添加した前処理反応液は、血球濃度１体積％に対して、前記界面活性剤濃度が０．０５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲となることが好ましく、より好ましくは０．２〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、特に好ましくは０．３〜１０ｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０２０６】
また、前記前処理用試薬が、前述のようにウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼを含有する場合、前記処理用試薬は、血球濃度１体積％に対して、前記ウリカーゼ濃度が０．４〜４０００Ｕ／Ｌの範囲、ビリルビンオキシダーゼ濃度が０．４〜４０００Ｕ／Ｌの範囲となることが好ましく、より好ましくはウリカーゼ濃度が３〜１５００Ｕ／Ｌの範囲、ビリルビンオキシダーゼ濃度が１〜７００Ｕ／Ｌの範囲であり、特に好ましくはウリカーゼ濃度が５〜１０００Ｕ／Ｌの範囲、ビリルビンオキシダーゼ濃度が２〜７００Ｕ／Ｌの範囲である。
【０２０７】
次に、前記前処理反応液に、プロテアーゼ試薬を添加し、試料中の糖化Ｈｂに分解用ＦＡＯＤを作用させて分解する。
【０２０８】
プロテアーゼ試薬の添加量は、例えば、血球濃度が１体積％の前記前処理反応液１０μＬに対して、例えば、５０〜３００μＬの範囲であり、好ましくは６０〜１８０μＬの範囲である。前記プロテアーゼ試薬を添加したプロテアーゼ反応液は、血球濃度０．１体積％に対して、前記プロテアーゼ濃度が１００〜５０，０００ＫＵ／Ｌの範囲となることが好ましく、より好ましくは３００〜３０，０００ＫＵ／Ｌの範囲である。また、前記プロテアーゼ反応液のｐＨは、６〜９の範囲が好ましく、より好ましくは７〜８．５の範囲である。
【０２０９】
このプロテアーゼ処理は、前記プロテアーゼ試薬を添加してからインキュベートすることが好ましく、その条件は、例えば、２５〜３７℃、３〜３０分間であり、好ましくは２５〜３７℃、３〜１０分間であり、より好ましくは３０〜３７℃、３〜５分間である。
【０２１０】
また、このプロテアーゼ試薬が前述のようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む場合、前記プロテアーゼ反応液は、前記プロテアーゼ濃度が１００〜１０，０００ＫＵ／Ｌの範囲であるのに対して、例えば、テトラゾリウム化合物０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム０．０８〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくはテトラゾリウム化合物０．６〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム０．１５〜１．８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。具体的に、テトラゾリウム化合物がＷＳＴ−３の場合、プロテアーゼ反応液における濃度が０．２〜６ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．６〜４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．７〜２．７ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することにより、無添加の場合に比べて、その感度が、約１．２〜３倍の範囲で向上する。
【０２１１】
また、このプロテアーゼ試薬が、前述のようにメタロプロテアーゼを含有し、さらにＣａ化合物およびＮａ化合物を含む場合、前記プロテアーゼ反応液は、前記メタロプロテアーゼ濃度が１００〜１０，０００ＫＵ／Ｌの範囲であるのに対して、例えば、Ｃａ化合物０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、Ｎａ化合物５〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくはＣａ化合物０．２〜１０ｍｏｌ／Ｌの範囲、Ｎａ化合物１０〜５００ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくはＣａ化合物０．２〜５ｍｏｌ／Ｌの範囲、Ｎａ化合物３０〜５００ｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０２１２】
次に、前記プロテアーゼ反応液に前記発色用試薬を添加し、測定用ＦＡＯＤを糖化Ｈｂ分解物に作用させて、前記式（１）の反応により過酸化水素を生成させ、これと発色基質とを酸化還元酵素により反応させ、前記発色基質を酸化により発色させる。
【０２１３】
測定用のＦＡＯＤ−αＳは、前述のように、糖化されたα−アミノ基および糖化された側鎖アミノ基の両方に作用する。しかし、予め、前処理用試薬中の分解用ＦＡＯＤ−αによって処理されているため、糖化された側鎖アミノ基のみに測定用ＦＡＯＤ−αＳを作用させることができる。
【０２１４】
発色用試薬の添加量は、例えば、前記プロテアーゼ反応液１００μＬに対して、例えば、５〜１００μＬの範囲であり、好ましくは８〜５０μＬの範囲であり、より好ましくは１０〜３０μＬの範囲である。前記発色用試薬を添加した発色反応溶液は、測定用ＦＡＯＤ濃度が０．５〜２００ＫＵ／Ｌの範囲、酸化還元酵素濃度が１〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲、発色基質の濃度が０．００１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましく、より好ましくは測定用ＦＡＯＤ濃度が１〜１００ＫＵ／Ｌの範囲、酸化還元酵素濃度が５〜２００ＫＵ／Ｌの範囲、発色基質の濃度が０．００５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは測定用ＦＡＯＤ濃度が２〜１００ＫＵ／Ｌの範囲、酸化還元酵素濃度が５〜２００ＫＵ／Ｌの範囲、発色基質の濃度が０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、前記発色反応溶液のｐＨは、６〜９の範囲が好ましく、より好ましくは６．５〜８の範囲である。
【０２１５】
この発色反応は、前記発色用試薬を添加してから一定時間インキュベートすることが好ましく、その条件は、例えば、１５〜３７℃、１〜３０分間であり、好ましくは２５〜３７℃、３〜１０分間であり、より好ましくは３０〜３７℃、３〜５分間である。
【０２１６】
つぎに、発色基質の発色を測定する。これは、例えば、発色反応溶液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定すればよく、この吸光度から、過酸化水素の量を決定する。そして、例えば、予め準備した過酸化水素量と糖化Ｈｂ量との相関関係を表わす検量線と、測定した過酸化水素量とを用いて、試料中の糖化Ｈｂ量を求めることができる。
【０２１７】
なお、前記本発明の糖化タンパク質はじめに添加した分解用ＦＡＯＤ−αによって生成した過酸化水素は、血液試料（溶血試料）中にはじめから存在するカタラーゼによって消失するため、ＦＡＯＤ−αＳにより生成した測定対象物由来の過酸化水素の測定には影響を及ぼすことはない。しかし、十分に前記過酸化水素を消去するために、前処理用試薬に、さらにカタラーゼを含有させてもよい。このように前記カタラーゼにより過酸化水素を消去する場合、後に添加する発色用試薬中の測定用ＦＡＯＤ−αＳ処理によって生成する過酸化水素までもが前記カタラーゼにより消去されることを防ぐために、発色用試薬中のＰＯＤおよび発色基質を過剰量含有させることが好ましい。
【０２１８】
この場合、前処理用試薬におけるカタラーゼの濃度は、例えば、５〜３００Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは１０〜１００Ｕ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１０〜７０Ｕ／Ｌの範囲である。また、前記前処理反応液におけるカタラーゼ濃度は、例えば、１．５〜５０Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは１．５〜３０Ｕ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１．５〜１５Ｕ／Ｌの範囲であり、前記発色反応溶液におけるカタラーゼ濃度は、例えば、１〜５０Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜３０Ｕ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１〜１０Ｕ／Ｌの範囲である。
【０２１９】
また、発色用試薬におけるＰＯＤ濃度は、例えば、５〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１０〜２００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくは２０〜２００ＫＵ／Ｌの範囲であり、発色反応溶液におけるＰＯＤの濃度は、例えば、３〜３００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜２００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１０〜１００ＫＵ／Ｌの範囲である。
【０２２０】
また発色反応溶液におけるカタラーゼ（Ｅ）とＰＯＤ（Ｆ）の割合（活性比Ｅ：Ｆ）は、例えば、Ｅ：Ｆ＝１：２〜１：４０の範囲であり、好ましくは１：３〜１：２０の範囲であり、より好ましくは１：４〜１：１０の範囲である。
【０２２１】
また、発色用試薬における発色基質濃度は、例えば、０．０１〜２００ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０２〜２０ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．０４〜５ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、発色反応溶液における発色基質の濃度は、例えば、０．００１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．００５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０２２２】
この測定キットを用いた測定において、各試薬の添加は、前記順序には限定されず、また、同時に添加してよい試薬もある。具体的には、試料に、例えば、前処理用試薬を添加した後、プロテアーゼ試薬と発色用試薬とを同時に添加してもよいし、前処理用試薬とプロテアーゼ試薬とを同時に添加した後に、発色用試薬を添加してもよい。また、試料に、例えば、プロテアーゼ試薬を添加した後、前処理用試薬を添加し、それから発色用試薬を添加してもよい。
【０２２３】
なお、本発明の測定キットを用いれば、ＨｂＡ１ｃ量を迅速かつ簡便に、精度よく測定することもできる。これは本発明の測定キットを用いて測定した糖化Ｈｂ量は、ＨｂＡ１ｃと高い相関関係にあるからである。具体的には、本発明の測定キットにより測定した糖化Ｈｂ量とＨｂＡ１ｃ量との相関関係から検量線を作成し、前記測定キットにより試料中の糖化Ｈｂ量を測定して、この測定値を前記検量線に代入すればＨｂＡ１ｃ量を求めることができる。
【０２２４】
（実施形態Ｂ−２）
この実施形態は、前処理用試薬の分解用ＦＡＯＤと、発色用試薬の測定用ＦＡＯＤとに、同じＦＡＯＤを用いた第２の測定キットの一例である。ＦＡＯＤとしては、特に制限されず、例えば、ＦＡＯＤ−α、ＦＡＯＤ−Ｓ、ＦＡＯＤ−αＳのいずれを用いてもよい。なお、本実施形態の測定キットは、特に示さない限り前記実施形態Ｂ−１と同様の構成であり、また、同様にして糖化Ｈｂの測定に使用できる。
【０２２５】
ＦＡＯＤは、前述のように糖化タンパク質よりも糖化アミノ酸に作用し易いため、前記分解用ＦＡＯＤによって、糖化アミノ酸が分解される。しかし、前記実施形態Ｂ−１と異なり、分解用ＦＡＯＤと測定用ＦＡＯＤとに、同じＦＡＯＤを使用すると、以下のような問題が生じる。つまり、前処理反応液に、分解用ＦＡＯＤが残存している状態でプロテアーゼ試薬を加え、前記糖化Ｈｂを分解すると、残存するＦＡＯＤと糖化Ｈｂ分解物の糖化部分とが反応してしまい、正確な測定ができないという問題が起こるのである。したがって、同じＦＡＯＤ使用する場合は、プロテアーゼ試薬のプロテアーゼによって、糖化Ｈｂを分解し、かつ、前記前処理反応液に残存する分解用ＦＡＯＤを失活させて、前記糖化Ｈｂ分解物との反応を防止する必要がある。このために、前処理用試薬の分解用ＦＡＯＤを速やかに失活させ、かつ、糖化Ｈｂを分解できるだけのプロテアーゼをプロテアーゼ試薬に含有させる必要がある。
【０２２６】
前記プロテアーゼの種類や含有量は、特に制限されないが、例えば、使用するＦＡＯＤの種類や量、プロテアーゼのＦＡＯＤに対する基質特異性、糖化Ｈｂ量等や、反応溶液への添加による希釈割合によって、適宜決定することが好ましい。このようなＦＡＯＤとプロテアーゼの組み合わせとしては、例えば、商品名ＦＯＤ（旭化成社製）と商品名トヨチーム（東洋紡社製）、前記ギベレラ属由来ＦＡＯＤと商品名プロテナーゼＫ（ロシュ社製）のプロテアーゼ等があげられる。
【０２２７】
具体的には、プロテアーゼ反応液におけるプロテアーゼ濃度が、前記分解用ＦＡＯＤ１００Ｕ／Ｌに対して、例えば、１〜１０００，０００ＫＵ／Ｌの範囲になるように前記プロテアーゼ試薬を添加することが好ましく、より好ましくはプロテアーゼ濃度１０〜３００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、特に好ましくは１００〜１００，０００ＫＵ／Ｌの範囲である。具体的に、プロテアーゼとしてトリプシンを使用する場合は、例えば、前記プロテアーゼ反応液中のトリプシン濃度１０００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、血球濃度０．２〜５体積％、分解用ＦＡＯＤ濃度１０〜１００Ｕ／Ｌとなるように、前記プロテアーゼ試薬を添加することが好ましい。また、反応条件としては、例えば、温度２０〜５０℃、時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９である。
【０２２８】
また、本実施形態においては、発色用試薬中の測定用ＦＡＯＤまでもが、前記プロテアーゼによって失活するおそれがあるため、前記測定用ＦＡＯＤを十分量添加する必要がある。
【０２２９】
具体的には、測定用ＦＡＯＤ処理の反応溶液における測定用ＦＡＯＤ濃度が、プロテアーゼ１０，０００ＫＵ／Ｌに対して、例えば、１０〜１０００，０００Ｕ／Ｌの範囲になるように、前記発色用試薬を添加することが好ましく、より好ましくは測定用ＦＡＯＤ濃度１００〜２００，０００Ｕ／Ｌの範囲、特に好ましくは測定用ＦＡＯＤ濃度５００〜５０，０００Ｕ／Ｌの範囲となるように前記発色用試薬を添加することが好ましい。
【０２３０】
具体的な処理条件としては、例えば、反応液中の測定用ＦＡＯＤ濃度５００〜２０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％となるように、前記発色用試薬を添加することが好ましい。また、反応条件としては、例えば、温度１５〜４０℃、時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【０２３１】
（実施形態Ｂ−３）
この実施形態は、前処理用試薬の分解用ＦＡＯＤと、発色用試薬の測定用ＦＡＯＤにＦＡＯＤ−αＳとに、同じＦＡＯＤを用いた第３の測定キットの一例である。但し、この実施形態は、前記実施形態Ｂ−２とは異なり、前処理用試薬の分解用ＦＡＯＤを、プロテアーゼによって必ずしも失活させる必要がない。酵素には基質特異性があるため、プロテアーゼとＦＡＯＤとの組み合わせによっては、ＦＡＯＤをプロテアーゼで失活させ難い場合がある。このような場合に本実施形態の測定キットが有効になる。なお、前処理用試薬中の分解用ＦＡＯＤが糖化Ｈｂ分解物と反応すると、測定精度を向上できないため、以下に示すように、前処理用試薬と発色用試薬とにおけるＦＡＯＤの添加割合を調整することが重要となる。
【０２３２】
前記ＦＡＯＤとしては、特に制限されず、例えば、ＦＡＯＤ−α、ＦＡＯＤ−Ｓ、ＦＡＯＤ−αＳのいずれを用いてもよい。また、本実施形態の測定キットは、特に示さない限り前記実施形態Ｂ−１と同様の構成であり、また、同様にして糖化Ｈｂの測定に使用できる。
【０２３３】
このような実施形態に該当するＦＡＯＤとプロテアーゼの組み合わせとしては、例えば、商品名ＦＯＤ（旭化成社製）およびギベレラ属由来ＦＡＯＤ（アークレイ社製、特開平−１５４６７２号公報）と、商品名トリプシン（シグマ社製）および商品名プロティナーゼＫ（和光純薬工業社製）等があげられる。
【０２３４】
前記分解用ＦＡＯＤは、その活性が残存しても、プロテアーゼ処理の間に糖化Ｈｂ分解物に作用しない範囲で添加する必要があり、かつ、糖化アミノ酸に作用しやすく、糖化タンパク質に作用し難いという性質を利用するため、糖化アミノ酸のみに作用する程度の添加量であることが望ましい。
【０２３５】
具体的には、前処理用試薬における分解用ＦＡＯＤ濃度は、例えば、１０〜２０，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは２０〜１０，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１００〜５０００Ｕ／Ｌの範囲である。発色用試薬における測定用ＦＡＯＤ濃度は０．５〜２００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜１００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくは２〜１００ＫＵ／Ｌの範囲である。
【０２３６】
そして、前記前処理試薬は、前処理反応液において、例えば、分解用ＦＡＯＤ濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、血球濃度０．２〜２０体積％となるように添加することが好ましい。
【０２３７】
この測定キットを使用する場合、分解用ＦＡＯＤを含有する前処理用試薬による処理は、ＦＡＯＤが糖化アミノ酸に作用しやすく糖化タンパク質に作用し難いという性質を利用するため、例えば、糖化アミノ酸のみに作用する程度の反応時間であることが好ましい。具体的には、反応温度２０〜３７℃、反応時間１分〜６０分であることが好ましく、より好ましくは反応温度２５〜３７℃、反応時間２分〜３０時間であり、特に好ましくは反応温度３０〜３７℃、反応時間３分〜１０時間である。
【０２３８】
本実施形態においては、発色反応溶液における分解用ＦＡＯＤ（Ｇ）と測定用ＦＡＯＤ（Ｈ）との割合（活性比Ｇ：Ｈ）が、例えば、Ｇ：Ｈ＝１：３〜１：１００の範囲となるように、前記前処理用試薬および発色用試薬を添加することが好ましく、より好ましくはＧ：Ｈが１：５〜１：５０の範囲であり、特に好ましくはＧ：Ｈが１：１０〜１：４０の範囲である。このように設定すれば、前記実施形態２と異なり前記分解用ＦＡＯＤはプロテアーゼ反応溶液中に残存するが、この残存したＦＡＯＤの反応速度は非常に遅いため、プロテアーゼ処理工程において、測定に影響を与える程度に、生成した糖化Ｈｂ分解物に残存ＦＡＯＤが作用することはないからである。
【０２３９】
（実施形態Ｂ−４）
この実施形態は、発色用試薬の発色基質としてＤＡ−６４を用いた例である。なお、本実施形態の測定キットは、特に示さない限りは、前記実施形態Ｂ−１と同様の構成であり、また、同様にして糖化Ｈｂの測定に使用できる。
【０２４０】
プロテアーゼ試薬が、前述のように測定感度の向上のためにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含有し、発色用試薬が発色基質としてＤＡ−６４を含有する場合、発色反応溶液中で、前記テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよびＤＡ−６４が共存することによって、前述のようなＤＡ−６４の誤発色が生じてしまう。したがって、この誤発色を防止するためには、以下の組成とすることが好ましい。
【０２４１】
前処理用試薬、プロテアーゼ試薬および発色用試薬のうち少なくともいずれかが、界面活性剤を含有することが好ましい。前記界面活性剤としては、例えば、前述のような界面活性剤が使用できる。
【０２４２】
前処理用試薬に含有させる場合、その濃度は、０．０３〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。プロテアーゼ試薬に含有させる場合、その濃度は、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。発色用試薬に含有させる場合、その濃度は、０．０６〜３０ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１〜２０ｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０２４３】
そして、発色反応溶液における各成分が以下の濃度範囲となるように、測定キットの各試薬を添加すればよい。前記発色反応溶液において、例えば、ＤＡ−６４  ０．００１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、界面活性剤０．００２〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、テトラゾリウム化合物０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム０．０８〜４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲でありことが好ましく、より好ましくは、ＤＡ−６４  ０．００５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、界面活性剤０．００５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、テトラゾリウム化合物０．６〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム０．１５〜１．８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、特に好ましくはＤＡ−６４  ０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、界面活性剤０．０２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、テトラゾリウム化合物０．７〜２．７ｍｍｏｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム０．２〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０２４４】
また、この発色反応溶液のｐＨは、６．０〜９．０の範囲が好ましく、より好ましくは６．５〜８．５の範囲、特に好ましくは７．０〜８．０の範囲である。
【０２４５】
前記ＤＡ−６４は、酸化還元反応により発色するため、この反応液について、例えば、検出波長６５０〜７５０ｎｍの範囲における吸光度（発色程度）を分光光度計で測定すれば、過酸化水素の量を測定できる。
【実施例】
【０２４６】
（実施例１）
患者から全血試料を採取し（患者数１６３名）、赤血球を自然沈降させて回収した。そして、この沈降した赤血球画分１０μＬに、下記前処理用試薬６００μＬを添加して溶血試料を調整した（ｎ＝１６３）。なお、この試料は、赤血球を自然沈降させた画分を使用するため、血漿も含有している。
【０２４７】
（前処理用試薬：ｐＨ９．４）
ＣＨＡＰＳ                                      ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤（商品名ＮＩＫＫＯＬ−ＢＬ９ＥＸ、ニッコーケミカル社製）  ９ｇ／Ｌ
ＦＡＯＤ（商品名ＦＡＯＸ、キッコーマン社製）                １ＫＵ／Ｌ
【０２４８】
次に、得られた溶血試料２０μＬと下記プロテアーゼ試薬７６μＬを混合して、３７℃で５分間インキュベートした。続いて、さらに下記発色試薬１９μＬを添加して３７℃で３分間インキュベートし、この際の波長７５１ｎｍおよび波長５７１ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定には、自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８、日本電子社製）を使用した。
【０２４９】
（プロテアーゼ試薬：ｐＨ５．５）
テトラゾリウム化合物（商品名ＷＳＴ−３、同仁化学社製）  ２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＮ3                                            ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ                                        １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＣａＣｌ2                                      ２ｍｍｏｌ／Ｌ
中性プロテアーゼ（アークレイ社製）                ４ＭＵ／Ｌ
ＭＥＳ                                      １ｍｍｏｌ／Ｌ
【０２５０】
（発色試薬：ｐＨ７．０）
商品名ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）            ８０μｍｏｌ／Ｌ
ＦＡＯＤ（アークレイ株式会社社製）        ３６ＫＵ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ                                  ３８０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＮ3                                    ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【０２５１】
そして、予め作成したＨｂ濃度（ｇ／Ｌ）またはＨｂＡ１ｃ濃度（ｇ／Ｌ）と、吸光度との関係を示す各検量線に、測定したそれぞれの吸光度を代入してＨｂＡ１ｃ濃度およびＨｂ濃度を求め、下記式からＨｂＡ１ｃ％を算出した。なお、Ｈｂ濃度は波長７５１ｎｍの吸光度から、ＨｂＡ１ｃ濃度は波長５７１ｎｍの吸光度から求めることができる。
【０２５２】
ＨｂＡ１ｃ（％）＝（ＨｂＡ１ｃ濃度／Ｈｂ濃度）×１００
【０２５３】
なお、前記検量線は、以下に示す方法により作成した。まず、Ｈｂ濃度が既知である種々濃度の標準液について、ＨｂＡｌｃ測定装置（商品名ＨＡ−８１６０：アークレイ社製）を用いたＨＰＬＣ法によりＨｂＡ１ｃ濃度とＨｂ濃度とを測定した。一方、前記各標準液について、前記実施例と同様の測定方法により、Ｈｂ濃度およびＨｂＡ１ｃ濃度に相当する吸光度の測定を行った。そして、前記自動測定器による測定値と前記吸光度から一次回帰式を作成し、これを検量線とした。
【０２５４】
また、対照例としては、前記実施例１において調製した溶血試料（ｎ＝１６３）を試料とし、前記ＨＰＬＣ法によって測定した値を使用した。
【０２５５】
以上の結果を図１に示す。同図は、酵素法により測定した実施例１のＨｂＡ１ｃ（％）と、ＨＰＬＣ法による対照例のＨｂＡ１ｃ（％）との関係を示すグラフである。同図において、実施例の相関式は、「ｙ＝１．０３１ｘ−０．０９」、相関係数は「０．９８１」であった。
【０２５６】
このように、本発明の実施例によれば、対照例の値と非常に近い値が得られ、その相関係数（０．９８１）も非常に高いことから、優れた精度で糖化Ｈｂを測定できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２５７】
以上のように、本発明の糖化タンパク質の測定方法および測定キットは、共存する糖化アミノ酸の影響を排除するため、測定精度に優れる。このため、本発明を、例えば、赤血球中の糖化Ｈｂ、ＨｂＡ１ｃの測定に適用すれば、従来よりも信頼性の高い測定値が得られるため、糖化ＨｂやＨｂＡ１ｃの糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。
【図１】
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