(57)【要約】【課題】迅速にかつ確実に実施できる磁性粒子の分離方法であって、容器移送経路等の装置上の制約を受けることのない方法とそのための装置を提供する。【解決手段】外部に設定された集磁ポジションに磁石を配置し、磁力を作用させて磁性粒子を容器内面に集磁する集磁工程、液体を吸引する第１吸引工程、洗浄液を分注する分注工程、異なる集磁ポジションに磁石を配置し、磁性粒子を前記異なる集磁ポジション近傍に容器内面に沿って移動させる移動工程、及び、分注工程で分注した洗浄液を吸引する第２吸引工程からなる方法により前記課題を解決する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁力透過性容器中の液体に分散した磁性粒子を当該液体と分離する方法であって、容器外部に設定された集磁ポジションに磁石を配置し、当該磁石から磁力を作用させて磁性粒子を容器内面に集磁する集磁工程、容器中の液体を吸引する第１吸引工程、容器中に洗浄液を分注する分注工程、集磁工程における集磁ポジションとは異なる集磁ポジションに磁石を配置し、当該磁石から磁力を作用させると共に、集磁工程における集磁ポジションからの磁力の作用を止めて磁性粒子を集磁工程における集磁ポジション近傍から前記異なる集磁ポジション近傍に容器内面に沿って移動させる移動工程、及び、分注工程で分注した洗浄液を吸引する第２吸引工程からなる、前記方法。
【請求項２】
前記方法は１個の磁石を用いるものであって、前記移動工程は、集磁工程における集磁ポジションに配置した磁石を前記異なる集磁ポジションに移動させることにより実施される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記方法は２個以上の磁石を用いるものであって、前記移動工程は、集磁工程における集磁ポジションに配置した磁石とは異なる磁石を前記異なる集磁ポジションに配置することにより実施される、請求項１の方法。
【請求項４】
磁力透過性容器中の液体に分散した磁性粒子を当該液体と分離するために使用される装置であって、容器を保持する容器保持手段、１個以上の磁石を保持する磁石保持手段、容器保持手段及び／又は磁石保持手段を移動し、前記磁石を容器外部に設定された異なる２箇所以上の集磁ポジションに移動させて各ポジションから容器内部の磁性粒子に前記磁石の磁力を作用させる移動手段、容器中の液体を吸引するための吸引手段、及び、容器中に洗浄液を分注するための分注手段を備える、前記装置。
【請求項５】
前記磁石保持手段は、板状部材及び板状部材に保持された１個以上の磁石を備えるものであり、前記移動手段は、当該板状部材を回転する回転手段である、請求項４の装置。
【請求項６】
前記１個以上の磁石は、磁力の異なる２種類以上の磁石であることを特徴とする、請求項４又は５の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性粒子を液体から分離するための方法と装置に関するものである。本発明の装置及び方法は、表面に抗体のような特定物質に対する親和性を有するものを固定した磁性粒子を用い、当該特定物質を磁性粒子に捕捉した後、磁性粒子を分離する場合に利用されるものである。より具体的には、例えば測定対象物に対して親和性を有する抗体等を固定した磁性粒子を血液由来試料と接触させた後、磁性粒子に捕捉された成分（Ｂｏｕｎｄ成分）を捕捉されなかった成分（Ｆｒｅｅ）から分離するという、免疫測定における、いわゆるＢ／Ｆ分離に利用されるものである。本明細書では、以下、免疫測定におけるＢ／Ｆ分離を具体例として本発明を説明する。
【背景技術】
【０００２】
磁性粒子を固相に用いた免疫測定では、測定に要する時間に占めるＢ／Ｆ分離に要する時間の割合が高い。従って、Ｂ／Ｆ分離をいかに迅速かつ確実に実施できるかどうかが、免疫測定を短時間で実施するためのポイントとなる。従来の免疫測定では、粒子表面に固定された抗体等と反応液中の特定成分との免疫反応の効率と良好な集磁性を確保するために、粒径が１〜５μｍ程度の磁性粒子が多用されている。Ｂ／Ｆ分離は、磁性粒子を磁石で集磁しつつ反応液を吸引分離した後、洗浄液を分注し、磁性粒子を洗浄液に分散し、再び磁石で集磁しつつ分離するという操作を繰り返すのが普通であるが、分離を確実ならしめるためには、洗浄液を分注するごとに磁性粒子を洗浄液中に完全に分散させることが好ましい。
【０００３】
ところが、前記のような粒径範囲の磁性粒子は、一端溶液中に完全に分散させると、磁石で集磁するのに時間がかかってしまう。そこで、確実性を確保しつつ、Ｂ／Ｆ分離を迅速に実施するため、従来から、種々の提案がなされている。例えば、特許文献１や特許文献２では、容器側壁外部から磁力を作用させて容器側壁内部に塊状に集磁した磁性粒子を、完全に分散させず、半分散の状態にて、磁石で容器内面対面まで移動する方法が提案されている。具体的に特許文献１では、容器の移送経路中に複数のＢ／Ｆ分離ポートを設け、その近傍に交互に磁石を配置し、あるポートで容器側壁内部に集磁された磁性粒子は次のポートでは対面に移動するようになっている。この移動の間に磁性粒子の集磁塊中にある被洗浄物は洗浄液中に遊離し、磁性粒子から分離されることになり、Ｂ／Ｆ分離の確実性が向上する。
【０００４】
特許文献３は、磁性粒子を容器底面で集磁するＢ／Ｆ分離方法と、集磁のための磁石を容器底面近傍に移動する手段を備えた装置であり、特許文献４は、容器と磁石との間の相対的な角ポジションを連続的に変化させる移動手段を備えた装置である。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−９１５２１号公報
【特許文献２】特開２００６−１１２８２４号公報
【特許文献３】特許第３２１３７９８号公報
【特許文献４】特許第３９６２７８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１のように、容器の移送経路中に設けたＢ／Ｆ分離ポートの近傍に交互に磁石を配置するためには、容器の周囲にある程度の空間が必要であるため、容器移送の方式が限られるという課題がある。容器の移送を特許文献１が示すような直線的な移送経路（例えばチェーンによる移送経路）を採用する場合は、その空間の確保は比較的容易であるが、ターンテーブル方式を採用する場合は、ターンテーブルをドーナッツ型や空洞型などの特殊形状にすることが必須となり、その結果、装置構造の複雑化、コストアップにつながってしまう。特許文献１及び特許文献２ともに、磁性粒子を容器内面の一方から対面まで洗浄液中を移動させるため、半分散の状態であるとはいえ、対面の磁石によって磁性粒子が集磁されるまでの時間は容器の内容積、すなわち溶液中で磁性粒子を移動させる距離に左右されてしまう。この結果、Ｂ／Ｆ分離を迅速に実施するためには、薄い容器を用いるか、全体的にサイズの小さな容器を用いることが必要となってしまう。
【０００７】
特許文献３は、磁性粒子を集磁する磁石と容器の相対位置のズレが磁性粒子の捕捉量等に影響することから、磁石と容器の相対位置のズレを防止することを目的とするものであって、集磁された磁性粒子を移動させてＢ／Ｆ分離の確実性を向上すること等については特に触れられていない。また磁石の移動についても、容器底面の下部で移動するに止まるものである。特許文献４において、移動手段を用いて容器と磁石との間の相対的な角ポジションを連続的に変化させ、反応容器中で磁性粒子を運動させるのは、あくまでも反応を促進するためであり、Ｂ／Ｆ分離に際しては移動手段を停止する。
【０００８】
以上のような従来技術の課題に鑑みてなされた本発明の目的は、迅速にかつ確実に実施できる磁性粒子の分離方法であって、その実施に際して容器移送経路等の装置上の制約を受けることのない方法とそのための装置を提供することにあり、結果として全工程に要する時間を短縮した免疫測定を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するためになされた本発明は、磁力透過性容器中の液体に分散した磁性粒子を当該液体と分離する方法であって、容器外部に設定された集磁ポジションに磁石を配置し、当該磁石から磁力を作用させて磁性粒子を容器内面に集磁する集磁工程、容器中の液体を吸引する第１吸引工程、容器中に洗浄液を分注する分注工程、集磁工程における集磁ポジションとは異なる集磁ポジションに磁石を配置し、当該磁石から磁力を作用させると共に、集磁工程における集磁ポジションからの磁力の作用を止めて磁性粒子を集磁工程における集磁ポジション近傍から前記異なる集磁ポジション近傍に容器内面に沿って移動させる移動工程、及び、分注工程で分注した洗浄液を吸引する第２吸引工程からなる、Ｂ／Ｆ分離方法である。また前記目的を達成するためになされた本発明は、磁力透過性容器中の液体に分散した磁性粒子を当該液体と分離するために使用される装置であって、容器を保持する容器保持手段、１個以上の磁石を保持する磁石保持手段、容器保持手段及び／又は磁石保持手段を移動し、前記磁石を容器外部に設定された異なる２箇所以上の集磁ポジションに移動させて各ポジションから容器内部の磁性粒子に前記磁石の磁力を作用させる移動手段、容器中の液体を吸引するための吸引手段、及び、容器中に洗浄液を分注するための分注手段を備える、Ｂ／Ｆ分離装置である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、磁力透過性容器中の液体に分散した磁性粒子を当該液体と分離するに当たり、磁石から磁力を作用させて集磁した磁性粒子を容器の内面に沿って僅かに分散させながら移動させるものである。容器の内面に沿って移動させることにより、磁性粒子間隙に存在する反応液（固相である磁性粒子表面に結合されなかった非結合成分が含まれる）は洗浄液中に遊離し、磁性粒子から分離されることになり、Ｂ／Ｆ分離の確実性は向上する。また本発明は、磁性粒子を集磁させた状態で容器の内面に沿って移動させることにより最小限の分散状態を確保しつつ、迅速にＢ／Ｆ分離を実施するものである。
【００１１】
本発明は、容器中の液体に分散した磁性粒子に対し、容器外部から磁石の磁力を作用させるため、容器そのものが磁力透過性であるか、又はその一部が磁力透過性で、容器外部に配置した磁石の磁力が内部に十分に及び、磁性粒子を容器内面に集磁することが可能で、また、磁石の移動に追随して集磁した磁性粒子を移動することが可能であれば、その大きさ、形状、肉厚、材質等に制限はない。従来から使用されている磁力透過性容器としては、ポリプロピレンやポリスチレン等といった熱可塑性樹脂製の容器が例示できる。
【００１２】
磁性粒子については、粒径範囲が０．０１〜１００μｍのものが例示できるが、粒径があまりに小さいとその集磁に長時間を要することとなり、逆にあまりに大きいと溶液中の測定対象物を磁性粒子に捕捉する反応の効率が落ちることとなって好ましくない。一般に入手が容易な磁石によって迅速かつ確実なＢ／Ｆ分離を実施する場合には、０．１〜１０μｍ程度の磁性粒子を対象とすることが好ましい。磁性粒子には、通常、測定対象物質に対して親和性を有する物質を固定するが、そのような物質に対して親和性を有する物質を固定しても良い。例えば、抗体、抗原、レセプター、リガンド、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、酵素、基質又は核酸等を例示することができる。これらの物質の磁性粒子への固定は、化学結合、物理吸着、イオン結合等によって直接的に固定化する方法、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、核酸と核酸又はハプテンと抗ハプテン抗体等の親和性を利用して間接的に固定化する方法を例示することができる。本発明を免疫測定以外の目的、例えば試料から特定の物質を精製又は除去する目的に適用する場合には、磁性粒子には、精製対象（除去対象）物質に対して親和性を有する物質等を固定化すれば良い。
【００１３】
本発明では、まず、免疫反応の反応液や試料と混合されて分散した磁性粒子を集磁する（集磁工程）。このため、集磁工程では、容器の外部に設定された集磁ポジションに磁石を配置し、当該磁石から容器中の磁性粒子に磁力を作用させる。本発明に使用する磁石の種類としては、ネオジウム系やサマリウム系といった希土類磁石、アルニコ磁石、フェライト磁石、ネオジボンド磁石等の永久磁石又は電磁石が例示できる。磁石の形状は特に制限されず、円柱型、角型、リング型又はセグメント型等が例示できるが、実際に本発明を適用する容器の形状等を考慮して、予備的な実験を実施して決定することが好ましい。磁石のサイズや磁力の大きさについても同様である。磁石の集磁ポジションへの配置は、容器に対して磁石を移動させる、磁石に対して容器を移動させる又は容器と磁石の両者を相対的に移動させる、のいずれかにより実施することができるが、後述する本発明の特に好ましい態様を実施する上では、容器に対して磁石を移動させることが特に好ましい。なお、電磁石を使用する場合には、電磁石を予め集磁ポジションに固定しておき、単に電流を流すことで磁性粒子に対して磁力を作用させ集磁することも可能である。本明細書では、容器との相対的な位置を予め固定しておいた電磁石に電流を流して磁石化することも「集磁ポジションに磁石を配置する」に含まれるものとする。
【００１４】
本発明では、磁性粒子を容器の内面、即ち、側面又は底面に集磁するが、特に好ましくは、集磁ポジションを容器側面の外部として、磁石を容器の側面に配置する。このような集磁ポジションを選択することで、より確実かつ迅速な磁性粒子の分離を実現することができるからである。即ち、後に実施する第１吸引工程や第２吸引工程では、磁性粒子から容器中の液体成分を可能な限り分離するために、吸引管を容器底面まで下降して溶液の吸引を実施するが、その際に磁性粒子が溶液とともに容器外部に排出されることを防止できるのである。また後に実施する洗浄液の分注工程においては、分注された洗浄液の流れは容器底面において最大となるが、それよって集磁された磁性粒子が分散され、再度の集磁が必要になるということを防止することもできるのである。
【００１５】
次に、磁性粒子を集磁した状態で、容器中の液体を吸引する（第１吸引工程）。吸引にはＢ／Ｆ分離で多用される吸引手段を使用することができる。吸引手段は、一端が液体トラップボトルを介して真空ポンプに接続された吸引管と、吸引管の他端開口部を下降させ、容器中に侵入させる移動手段で構成することができる。容器中の液体は、可能な限り吸引して磁性粒子から分離することが確実なＢ／Ｆ分離に必要であるため、容器底面まで開口部を下降させることが好ましい。
【００１６】
次に、磁性粒子を集磁した状態で、容器中に洗浄液を分注する（分注工程）。洗浄液は、磁性粒子に固定した測定対象物質又は精製対象物質が磁性粒子から遊離しないように選択される以外は特に制限がないが、トリスやリン酸等の適当なバッファーに、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎといった界面活性剤を微量に加えたもの等を例示することができる。分注する洗浄液の量は、容器内部に存在していた液体量を超える量であれば特に制限はなく、分離しようとする磁性粒子の量や容器の容量を勘案して適宜決定すれば良い。
【００１７】
分注にはＢ／Ｆ分離で多用される分注手段を使用することができる。分注手段は、一端が液体ポンプに接続された分注管と、分注管の他端開口部を下降させ、容器中に侵入させる移動手段で構成することができる。洗浄液の分注に際し、磁性粒子を容器側面に集磁しているのであれば、例えば分注管を容器底面近傍まで下降させて洗浄液を分注することができるが、磁性粒子を容器底面に集磁しているのであれば、例えば容器をわずかに傾けたうえで洗浄液を容器側面に分注する等することが好ましい。
【００１８】
以上に説明した、Ｂ／Ｆ分離で多用される吸引手段及び分注手段は、通常は前記吸引管と前記分注管が一体として構成されている。例えばこれらの２本の管が並行に連結され、一体的に昇下降するものや、２本の管が二重管として構成（内管内部が吸引管として、内管外部と外管内部の間が分注管として機能）され、一体的に昇下降するものが例示できる。
【００１９】
次に、集磁工程における集磁ポジションとは異なる集磁ポジションに磁石を配置して、当該磁石から磁力を作用させ、磁性粒子を、集磁工程における集磁ポジション近傍からこの異なる集磁ポジション近傍に容器内面に沿って移動させる（移動工程）。移動工程で使用する磁石の種類、サイズ等については、集磁工程で使用する磁石と同様である。移動もまた、容器に対して磁石を移動させる、磁石に対して容器を移動させる又は容器と磁石の両者を相対的に移動させる、のいずれかにより実施することができる。
【００２０】
磁性粒子を容器内面に沿って移動させるためには、集磁工程で使用した磁石そのものを、磁性粒子が容器内面に沿って移動するように使用する、又は、集磁工程で使用した磁石とは異なる１以上の磁石を、磁性粒子が容器内面に沿って移動するように使用することが必要である。
【００２１】
前者の場合、集磁工程における集磁ポジションから移動工程における集磁ポジションへの磁石の移動は連続的なものとなり、集磁工程で集磁された磁性粒子は、絶えず同一の磁石からの磁力をうけつつ移動することになる。磁石の移動と共に集磁工程における集磁ポジションからの磁力の作用は止まり、当該ポジションに磁性粒子が止まることはない。前者の場合、集磁された磁性粒子が追随するよう磁石を相対的に容器外壁に沿って移動させれば良い。そのため、例えば磁石と容器の相対的な移動速度は、１０〜１０００ｍｍ／秒、好ましくは５０〜５００ｍｍ／秒の範囲であるが、追随性は磁石の強度、容器での磁力の減衰性、磁性粒子の集磁性等が影響することから、事前に予備的な実験を行っておくことが好ましい。一般的には、強い磁石を用いるか、集磁性の高い磁性粒子を用いると磁性粒子の追随性が良好となり、好ましい。しかしながら、追随性のみを考慮して強力に過ぎる磁石を使用したり、集磁性が良好にすぎる磁性粒子を使用したりすると、移動中の磁性粒子の容器内面に沿った分散が起こらず、分離が不十分になる虞が生じてしまう。逆に弱い磁石を使用したり、集磁性が低い磁性粒子を使用したりすると、磁性粒子の容器内面に沿った分散は良好となるが、移動工程における集磁ポジション近傍での集磁に時間を要してしまうという虞が生じてしまうため、事前に予備的な実験を行っておくことが好ましいのである。
【００２２】
後者の場合、すなわち集磁工程で使用した磁石とは異なる１以上の磁石を使用する場合、磁性粒子が容器内面に沿って移動するようにこれら磁石を使用する。例えば、集磁工程における集磁ポジションと移動工程における集磁ポジションとの間に中間的な集磁ポジションを１又は複数設け、当該中間的なポジションに磁石を順次配置することによってあたかも同一の磁石を連続的に移動させているかのようにし、磁性粒子を追随させることが例示できる。また例えば、後の実施例において更に詳細に説明するが、板状部材及び板状部材に保持された１個以上の磁石を準備し、この板状部材を容器近傍で回転させることが例示できる。１個の磁石を保持させれば、板状部材の回転により磁石は、例えば下方向から容器に接近し、上方向に遠ざかるように移動できるため、その過程で板状部材の回転を停止して磁石を集磁する集磁工程を行うことができ、その位置から更に同一又は逆回転させる過程で集磁した磁性粒子を容器内面に沿って移動させれば、移動工程とすることができる。また本明細書では、集磁工程における集磁ポジション、移動工程における集磁ポジション及びその中間的なポジションに電磁石を配置しておき、順次電流を流して磁石化することによって、あたかも同一の磁石を連続的に移動させているかのようにし、磁性粒子を追随させて容器内面に沿って移動させることも、「集磁工程における集磁ポジションとは異なる集磁ポジションに磁石を配置して、当該磁石から磁力を作用させ、磁性粒子を、集磁工程における集磁ポジション近傍からこの異なる集磁ポジション近傍に容器内面に沿って移動させる」に含まれるものとする。また、後の実施例で詳細に説明するが、本発明における「集磁工程における集磁ポジションとは異なる集磁ポジションに磁石を配置して、当該磁石から磁力を作用させ、磁性粒子を、集磁工程における集磁ポジション近傍からこの異なる集磁ポジション近傍に容器内面に沿って移動させる」には、集磁工程における集磁ポジション近傍から、磁性粒子を容器内面に沿っていったん異なる場所へ移動させた後、再び集磁工程における集磁ポジションと同一のポジションに磁石を位置させて、当該ポジション近傍に磁性粒子を集磁させることも含まれるものとする。
【００２３】
本発明において２個以上の磁石（電磁石を含む）を使用する場合であっても、各工程における各磁石の種類や強さを統一する必要はない。例えば、集磁工程や移動工程では、第１又は第２吸引工程において容器内の液体や洗浄液を吸引して分離する際に磁性粒子が容器外に排出されるのを防止できる、十分な磁力をもつ磁石を使用する。移動工程で複数の磁石を使用する場合は、最後、即ち最終的に集磁ポジションに配置され、実際に磁性粒子を集磁することとなる磁石として上記のような十分な磁力をもつ磁石を使用する。これらと同様に、分注工程では、洗浄液の分注によって磁性粒子が分散するのを防止できる、十分な磁力をもつ磁石を使用する。これに対して、移動工程で複数の磁石を使用する場合における、上記最後の磁石以外は、磁性粒子の分離効率を上げる目的から、磁性粒子が容器内面に沿って分散しつつ遅れながら磁石を追随するようにすることが好ましく、そのためには上記した磁力と比較して弱い磁力のものが好適である。実際にどのような強度の磁石を使用するかは、事前に予備的な実験を行って決定した強度のものを使用することが例示できる。なお、移動工程において２個以上の磁石を用いる場合には、磁性粒子に対して同時に２個の磁石からの磁力を作用させ、磁力の及ぶ範囲を広くし、磁性粒子の容器内面での分散性を上げることもできる。
【００２４】
容器内面に沿って集磁した磁性粒子を移動させる際には、単に直線的に移動させること以外に、直線上を往復させたり（最初の位置と移動後の位置が同一となる）、ジグザグ状に直線移動させるたり、又は、螺旋状に旋回移動させる等しても良く、磁石の大きさや形状、容器のサイズ・形状等を考慮して決定すれば良い。中でも容器内面に集磁した磁性粒子を、集磁位置を含む直線上で往復させることが、装置構成の簡便性や信頼性等の面で好適である。往復させる方向としては、測定容器に対して水平方向または上下方向が例示できる。このような往復動のため、磁石を容器外壁に沿って移動させても良いし、ターンテーブル、チェーン、ラック等の移送手段によって固定した磁石に対して容器を移動させても良いし、容器と磁石の双方を相対的に移動させても良い。
【００２５】
最後に、移動工程における集磁ポジション近傍に磁性粒子を集磁した状態で、容器中の洗浄液を吸引する（第２吸引工程）。吸引にはＢ／Ｆ分離で多用される吸引手段を使用することができる。
【００２６】
本発明の分離方法は、上記全工程を１回以上行うものであり、分離効率を高めるためには洗浄液の分注と吸引を３回以上行うことが好ましい。ただし、１０回程度実施すると、それ以上洗浄液の分注と吸引を実施しても効率は変化しないため、１０回程度を上限とすることが好ましい。上記全工程を繰り返すに当たり、第２吸引工程を第１吸引工程とみなし、その後は分注工程、移動工程、第２吸引工程の順で本発明の各工程を実施することが例示できる。この場合、移動工程においては、第２吸引工程における集磁ポジション近傍から第１吸引工程における集磁ポジション近傍への磁性粒子の移動と、第１吸引工程における集磁ポジション近傍から第２吸引工程における集磁ポジション近傍への磁性粒子の移動を交互に繰り返すことが例示できる。上記全工程を繰り返すに当たり、第２吸引工程終了後、洗浄液を分注する分注工程をまず実施して、その後、上記説明した集磁工程、第１吸引工程、分注工程、移動工程、第２吸引工程の順に同様の操作を繰り返すことも例示できる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の分離法では、容器及び／又は磁石（磁石保持手段）を移動させて磁性粒子を容器内面に沿って移動させるため、磁性粒子は洗浄液に分散しない。この結果、磁性粒子の分散と集磁を繰り返す従来の方法に比べ、迅速な分離を達成できる。また、自動化のための装置構成についても、本明細書で示したように駆動系を含めて簡便かつ小型化が可能である。
【００２８】
以下本発明を実施例により詳細に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
参考例
１．抗ＴＳＨ抗体固定化磁性粒子の調製
５ｍＬのマイクロチューブに市販のカルボキシル化磁性微粒子（マイクロモッド社製、商品名  Ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ、直径４．０μｍ）を１０ｍｇ取り、１ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にて３回洗浄し、１０％Ｎ―エチル―Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を含む１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を１ｍＬ添加し、室温で１時間振盪攪拌した。集磁後、上清を除去し、１ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にて１回洗浄し、５分間の超音波処理後、１ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を１００μＬ添加し、２時間室温にて振盪攪拌した。
【００２９】
０．１％アジ化ナトリウムを含む１ｍＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて３回洗浄後、０．１％ＢＳＡと０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にてブロッキングし、同緩衝液中に保存した。
２．ＴＳＨのｚｅｒｏアッセイ
上記で製造した抗ＴＳＨ抗体固定化磁性粒子の０．４％分散液  １０μＬ、ＴＳＨのｚｅｒｏ濃度試料１０μＬ及び界面活性剤入り精製水４０μＬを円筒型測定容器（ポリプロピレン製、５００μＬ）に取り、３７℃にて５分間、２ステップサンドイッチ法の第１反応を行った。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％アジ化ナトリウムを含む、ｐＨ８．０）を洗浄液として、後述する洗浄法１にて第１洗浄を行った。さらに２．８μｇ／ｍＬのアルカリ性ホスファターゼ標識抗ＴＳＨ抗体を５０μＬ添加し、３７℃で３分間、第２反応を行った。第１洗浄と同じ洗浄液を用い、洗浄法１にて第２洗浄を行い、最後に０．４ｍＭのアルカリ性ホスファターゼ用化学発光基質溶液（東ソー、特開２００５−７７１４２）１００μＬを添加して３７℃、５分間反応させ、エンドポイント測光した。
３．Ｂ／Ｆ分離法１（図１）
分離法１として、特許文献２の分離法を実施した。ネオジウム磁石（８φ×８ｍｍ）（３）をそれぞれ容器外側に１個ずつ対向配置し、洗浄液を入れた容器（１）に交互に接近させて磁性粒子（２）を半分散状態で容器内面対面まで移動させる操作を３回繰り返した後、２０秒間磁性粒子を集磁し、洗浄液を吸引吐出することを、第１分離では３回（洗浄液量は各３５０μＬ）、第２分離では３〜１１回（洗浄液量は、1回目２５０μＬ、２回目３００μＬ、３回目以降３５０μＬ）行った。
【００３０】
測定された化学発光（カウント／秒、ｃｐｓ）と洗浄回数の関係を表１に示す。表１から分離法１では、８回の第２分離操作で概ね良好な分離効率が得られ、１０回の分離操作で最低カウント値（２１９カウント／秒（ｃｐｓ））を示すことがわかった。また、上記操作後の容器中の磁性粒子の量を分光光度計で濁度測定（６００ｎｍ）により求めた結果、洗浄操作前の９８％であった。
【００３１】
【表１】
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実施例１
参考例と同じ抗体固定化磁性微粒子を用いたＴＳＨアッセイにおいて、Ｂ／Ｆ分離を以下の分離法２（図２）にて行った。即ち、分離法１と同一の磁石（３）をプレートに固定し、このプレートを容器１の側面の外部に、パルスモータによって水平方向に往復動できるように配置した。洗浄液を入れた状態で、磁石を、その中心を基準に、プラスマイナス１．１ｍｍ、プラスマイナス５．６ｍｍ又はプラスマイナス８．９ｍｍの距離を１１１ｍｍ／秒の速度で３回往復動させた後、直ちに洗浄液を吸引することを第１分離で３回（洗浄液量は各３５０μＬ）、第２分離で８回（洗浄液量は、1回目２５０μＬ、２回目３００μＬ、３回目以降３５０μＬ）行った。
【００３２】
測定された化学発光（カウント／秒、ｃｐｓ）と磁石移動距離の関係を表２に示す。表２から分離法２では、磁石をその中心を基準にしてプラスマイナス８．９ｍｍ往復させる条件においてカウント値が２３２ｃｐｓ、磁性粒子回収率で９９％と、分離法１と遜色のない分離効率を得た。
【００３３】
【表２】
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実施例２
参考例と同一の抗体固定化磁性微粒子を用いたＴＳＨアッセイにおいて、Ｂ／Ｆ分離を以下の分離法３（図３）にて行った。即ち、分離法１と同一の磁石（３）２個をプレートに固定し、このプレートを容器１の側面の外部に、パルスモータによって水平方向に往復動できるように配置した。洗浄液を入れた状態で、磁石を、２個の磁石間の中心を基準にプラスマイナス１．７ｍｍ又はプラスマイナス５．６ｍｍの距離を、１１１ｍｍ／秒の速度で磁石を３回往復動させた後、直ちに洗浄液を吸引するセットことを第１分離で３回（洗浄液量は各３５０μＬ）、第２分離で８回（洗浄液量は、1回目２５０μＬ、２回目３００μＬ、３回目以降３５０μＬ）行った。
【００３４】
測定された化学発光（カウント／秒、ｃｐｓ）と磁石移動距離の関係を表３に示す。表３から分離法３では、２個の磁石間の中心を基準にしてプラスマイナス１．７ｍｍまたはプラスマイナス５．６ｍｍ往復させる条件において、カウント値がそれぞれ２２２ｃｐｓまたは２２６ｃｐｓ、磁性粒子回収率でともに９９％と、分離法１と遜色のない分離効率を得た。
【００３５】
【表３】
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実施例３
参考例１と同一の抗体固定化磁性微粒子を用いたＴＳＨアッセイにおいて、Ｂ／Ｆ分離を以下の分離法４（図４）にて行った。即ち、ネオジウム磁石（５φ×１０ｍｍ）（３）をプレートに固定し、このプレートを容器（１）の外部に、パルスモータを用いて容器側面に沿って上下方向に往復動できるように配置した。洗浄液を入れた状態で、磁石を、その中心を基準にプラスマイナス８．８ｍｍ、移動速度を１７５、２５０、３７５ｍｍ／秒、上端および下端での待ち時間をそれぞれ０．５秒および１．０秒として５回往復移動させた後、直ちに洗浄液を吸引することを第１分離で３回（洗浄液量は各３５０μＬ）、第２分離で５回（洗浄液量は、1回目２５０μＬ、２回目３００μＬ、３回目以降３５０μＬ）行った。
【００３６】
測定された化学発光（カウント／秒、ｃｐｓ）と磁石移動距離の関係を表４に示す。表４から分離法４では、磁石移動速度が２５０ｍｍ／秒以上で良好な分離効率が得られ、３７５ｍｍ／秒の条件において２３０ｃｐｓ、磁性粒子回収率で９９％と、分離法１と遜色のない分離効率を得た。
【００３７】
【表４】
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実施例４
実施例３における分離法４において、工程に要する時間等を、参考例における分離法１と比較した。ここで、分離法１と分離法２の各工程の時間は、Ｂ／Ｆ分離終了後の磁性粒子回収率が９８％以上となるように設定した。２ステップサンドイッチ法の第１反応後の洗浄回数はともに３回、第２反応後の洗浄回数は実施例４記載の方法においては５回（全洗浄回数８回）、分離法１においては２５０ｃｐｓ以下の洗浄終了後検出シグナルを示す８回（全洗浄回数１１回）として比較した。ただし、分離法１における1回のノズル動作、洗浄液吸排動作、磁石移動に要する時間は測定間で変動するため、実施例３記載の自動化Ｂ／Ｆ分離法において要した時間を用いた。その結果、実施例３記載のＢ／Ｆ分離法によると、全Ｂ／Ｆ分離工程に要する時間は１６１秒となり、分離法１（３４７秒）の２分の１以下となり、実施例３の結果と合わせると、少ない洗浄液置換回数で迅速に良好な洗浄効率が得られることが実証された。
【００３８】
実施例３記載の方法が分離法１に比べて特に時間短縮が可能な工程は、磁石往復移動における両端での待機工程、および磁性粒子の移動が終了してからノズルによる洗浄液吸引までの待機工程であることがわかる。分離法１のように磁性粒子を容器対面まで洗浄液中を移動させる場合、対面の磁石に大部分の磁性粒子が移動するのを待ってから磁石を移動させないと洗浄効率が低下するため待機時間を十分に取る必要がある。さらに磁石の移動終了後、ノズルによる洗浄液吸引までの時間を上記待機時間以上に十分に設定しないと、集磁が遅くなり、洗浄液中に僅かに存在する磁性粒子がノズルに吸引されてしまう可能性がある。1回の吸引量が無視できるほどに僅かでも、全１１回の洗浄工程を繰り返すため、磁性粒子の残存率は無視できないものと考えられる。
【００３９】
【表５】
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実施例５
図５は、実施例３における分離法４（図４）を自動的に実施するための装置の一例であって、１個の磁石（３）を用いる例を示す図である。磁力透過性容器（１）は、当該容器を垂直に保持する容器保持手段（９）に保持される。磁石保持手段（４）は、ネオジウム磁石（３）（５φ×１０ｍｍ）１個を固定したプレートである。本例の装置では、容器を保持する容器保持手段を固定しておき、磁石保持手段を移動手段（４ａ）によって容器に対して相対的に移動するよう構成してある。具体的には、移動手段であるパルスモータ（４ａ）を駆動することにより、磁石保持手段（４）に保持された磁石（３）を、容器（１）の外部に設定された異なる２個以上の集磁ポジションに移動させる。図５は、磁石（３）を容器外部に設定された集磁ポジションのうちの最上端のものに配置したときの様子を示している。この他、本例の装置では、磁石（３）は容器側面に沿って昇下降するが、その量はパルスモータによって管理することが可能であるから、昇下降動の過程における任意の地点を集磁ポジションとすることが可能である。
【００４０】
容器中の液体の吸引手段（５）と容器への洗浄液の分注手段（６）は、不図示の真空ポンプ、液体ポンプと接続された管によって構成され、一体としてプレート（７）に固定されている。プレート（７）は、ガイドレール（８）とパルスモーター（８ａ）から構成される吸引・分注手段用の移動手段により、容器（１）に対して昇下降動するように構成されている。吸引工程では、吸引手段（５）の先端を容器（１）の底面近傍まで下降し、洗浄液分注工程では分注手段（６）の先端を容器の上部まで下降する。本例では、磁性粒子（２）の集磁ポジションが容器（１）の内部側面となることから、底部から液体を吸引しまた容器上部から洗浄液を底面に向けて分注しても磁性粒子を分散させることはない。
実施例６
図６は、本発明の分離法を自動的に実施するための装置の一例であって、磁性粒子の移動用の低磁力ネオジウム磁石（５φ×３ｍｍ、３，８１０ガウス）（３ａ）４個と、磁性粒子の集磁用の高磁力ネオジウム磁石（８φ×８ｍｍ、５，０５０ガウス）（３ｂ）１個とを、磁石保持手段（円板状部材）の外側円弧上に等間隔に保持させた例を示す図である。図６の例では、磁石保持手段を回転する回転手段としてパルスモータ（４ｂ）及び不図示の駆動系を備え、磁石保持手段を回転させてそこに保持された磁石を容器（１）に接近させ、容器外部の集磁ポジションに位置させる。
【００４１】
集磁工程では、集磁用磁石４ｂを集磁ポジションに位置させ、その近傍で容器中の磁性粒子を集磁する。この状態で、吸引手段（５）を容器に挿入して容器中の液体を吸引し、次いで分注手段（６）から洗浄液を分注する。洗浄液が分注された状態で、磁石保持手段を、例えば図に記載した矢印の方向に回転させることにより、集磁した磁性粒子を容器内面に沿って移動させることができる。磁性粒子は、集磁工程における集磁ポジション近傍から、容器中の液体に分散することなく、容器内面に沿って上下方向に昇下動し、必要に応じて図中の移動工程１から７を繰り返した後、最終的に集磁工程における集磁ポジションと同一のポジションに配置された集磁用磁石３ａの作用により、当該ポジション近傍に集磁する（図６における集磁工程８）。
実施例７
図７は、磁石保持板を用いる本発明の装置の他の一例を示すものである。容器のほぼ中央部にまで到達する円盤状の磁石保持板には磁石が保持されており、その回転により、集磁した磁性粒子を容器内面に沿って上下方向に昇下動させる。
実施例８
図８は、電磁石を用いる本発明の装置の一例を示すものである。容器の横に３個の電磁石（３ａ、３ｂ及び３ｃ）を保持する磁石保持手段を設け、３ｂの位置を集磁工程及び移動工程における集磁ポジションとすることが例示できる。即ち、まず３ｂの電磁石に電流を流して磁性粒子をその近傍で集磁し、容器中の液体の吸引、洗浄液の分注を行った後、３ａ又は３ｃの電磁石に電気を流すことで、磁性粒子を分散させることなく容器内面にそって３ａ（３ｃ）から３ｂを通過して３ｃ（３ａ）に移動し、そして３ｂの電磁石に電気を流してその近傍で再び集磁することが例示できる。なお、実施例６の構成のように、集磁用の電磁石３ｂを、他の電磁石３ａ及び３ｃと比較して強力なものとしても良い。また磁性粒子を移動させるにあたり、３ｂと３ｃの電磁石の両方に電気を流すなど、２つの電磁石を同時に使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、参考例の分離法１による分離を説明するための図である。
【図２】図２は、実施例１の分離法２による分離を説明するための図である。
【図３】図３は、実施例２の分離法３による分離を説明するための図である。
【図４】図４は、実施例３の分離法４による分離を説明するための図である。
【図５】図５は、実施例５で説明した本発明の装置の構成例の一つを示す図である。
【図６】図６は、実施例６で説明した本発明の装置の構成例の一つを示す図である。
【図７】図７は、実施例７で説明した本発明の装置の構成例の一つを示す図である。
【図８】図８は、実施例８で説明した本発明の装置の構成例の一つを示す図である。
【符号の説明】
【００４３】
１    容器
２    磁性粒子
３    磁石
４    磁石を上下動させる機構
４    パルスモータ
５    吸引手段（管）
６    分注手段（管）
【図１】
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【図２】
2010151738.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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