(57)【要約】【課題】糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法、ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ等の提供。【解決手段】ヒトゲノムＤＮＡのＫＣＮＪ１５遺伝子のアリルを検出することで、糖尿病の発症及び／又は進展リスクを判定する、ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ等のＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＣＮＪ１５（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｉｎｗａｒｄｌｙ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｊ，ｍｅｍｂｅｒ  １５）遺伝子のアリルを検出することを特徴とする糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法。
【請求項２】
ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位のアリルがＴアリルである、及び／又はｒｓ７４３２９６（ゲノム上の第一エキソンの第一塩基から数えて１６１８３番目のＧ／Ｃ多型）のアリルがＣアリルであるヒトは糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高いとする請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位の遺伝子型がＣ／Ｔ型またあるいはＴ／Ｔ型である、及び／又はｒｓ７４３２９６（ゲノム上の第一エキソンの第一塩基から数えて１６１８３番目のＧ／Ｃ多型）の遺伝子型がＣ／Ｃ型あるいはＣ／Ｇ型であるヒトは糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高いとする請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項４】
ヒトゲノムＤＮＡを用いる請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の判定方法において、ＫＣＮＪ１５遺伝子多型のアリルを検出するために用いる配列表配列番号１、２、２１又は２２に示されるプライマー。
【請求項６】
糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定に用いるＫＣＮＪ１５遺伝子。
【請求項７】
ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位の塩基又はゲノム上の第一エキソンの第一塩基から数えて１６１８３番目の塩基を含む糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定に用いるＤＮＡ。
【請求項８】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白又は抗体のいずれかであるＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質。
【請求項９】
請求項８に記載の物質であって、ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ。
【請求項１０】
ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する配列表配列番号３７〜４０のいずれかに示されるＲＮＡ。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物。
【請求項１２】
インスリン分泌不全の改善に用いる請求項８に記載の物質、請求項９に記載のＲＮＡまたは請求項１０に記載のＲＮＡを含む組成物。
【請求項１３】
２型糖尿病患者の治療に用いる請求項８に記載の物質、請求項９に記載のＲＮＡまたは請求項１０に記載のＲＮＡを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法に関する。さらに詳しくは、ＫＣＮＪ１５遺伝子のアリルを検出することによる糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法に関する。また、ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質、例えば、ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ、または該ＲＮＡ等を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病は生活習慣病の１つとして知られており、我が国においても罹患率が上昇している。この疾病は遺伝的な要因と、肥満、運動不足、食生活等の環境要因とが加わって発症すると考えられており、２型糖尿病に関連する様々な遺伝子が報告されている。
【０００３】
特に、近年の遺伝子解析技術の向上に伴い、特定の遺伝子において高頻度に検出されるアリルの違いを特定する、一塩基多型（以下、ＳＮＰとする）と２型糖尿病との関連に注目が集まっている。２型糖尿病に関連するこのような遺伝子として、ＴＣＦ７Ｌ２（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ７−ｌｉｋｅ  ２）、ＰＰＡＲＧ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ）、ＣＡＰＮ１０（ｃａｌｐａｉｎ  １０）、ＫＣＮＪ１１（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｉｎｗａｒｄｌｙ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｈａｎｎｅｌ，  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｊ，  ｍｅｍｂｅｒ  １１）、ＳＬＣ３０Ａ８（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３０  ｍｅｍｂｅｒ  ８）、ＨＨＥＸ（ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、ＣＤＫＡＬ１（ＣＤＫ５  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １−ｌｉｋｅ  １）、ＣＤＫＮ２Ａ／Ｂ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ２Ａ／Ｂ）、ＩＧＦ２ＢＰ２（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２  ｍＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２等が報告されている。そして、これらのアリルの違いを特定し、ＳＮＰを調べることにより、２型糖尿病を検査する方法等が開発されている（例えば、特許文献１，２参照）。
【０００４】
本発明者らはこのアリルの違いより、２型糖尿病に関連する新たな遺伝子として、本発明において示すＫＣＮＪ１５（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｉｎｗａｒｄｌｙ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｈａｎｎｅｌ，  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｊ，  ｍｅｍｂｅｒ  １５）遺伝子を見出した。
ＫＣＮＪ１５遺伝子はＫｉｒ４．２遺伝子とも称され、ヒトの２１番染色体に位置する、腎臓・肝臓・膵臓及びいくつかの成人組織に発現している内向き整流カリウム（Ｋ＋）チャンネル遺伝子として知られている。しかし、２型糖尿病との関連は知られておらず、２型糖尿病との関連の解析及びその結果より、２型糖尿病の関連遺伝子として糖尿病の発症及び／又は進展リスクの指標のひとつと判定等に用いることが期待されている。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００４／０８４７９７号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−１１５８１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法の提供を課題とする。さらに詳しくは、ＫＣＮＪ１５遺伝子のアリルを検出することによる糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法の提供を課題とする。また、ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質、例えば、ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ、または該ＲＮＡ等を含む組成物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、糖尿病患者と健常者との遺伝背景を比較することで、ヒトゲノムＤＮＡのＫＣＮＪ１５遺伝子のアリル頻度の違いを見出し、ＫＣＮＪ１５遺伝子が糖尿病の発症等に関する疾患感受性遺伝子であることを確認した。そして、このＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位又はｒｓ７４３２９６（ゲノム上の第一エキソンの第一塩基から数えて１６１８３番目のＧ／Ｃ多型：以下、ｒｓ７４３２９６とする）のアリル又は遺伝子型を調べることにより、糖尿病の発症及び／又は進展リスクが判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者らは、ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質として、ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡを得て、このＲＮＡ等を含む組成物がインスリン分泌不全の改善等に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１３）の糖尿病発症及び／又は進展リスクの判定方法、ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能抑制する物質等に関する。
（１）ＫＣＮＪ１５（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｉｎｗａｒｄｌｙ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｊ，ｍｅｍｂｅｒ  １５）遺伝子のアリルを検出することを特徴とする糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法。
（２）ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位のアリルがＴアリルである、及び／又はｒｓ７４３２９６（ゲノム上の第一エキソンの第一塩基から数えて１６１８３番目のＧ／Ｃ多型）のアリルがＣアリルであるヒトは糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高いとする上記（１）に記載の判定方法。
（３）ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位の遺伝子型がＣ／Ｔ型またあるいはＴ／Ｔ型である、及び／又はｒｓ７４３２９６（ゲノム上の第一エキソンの第一塩基から数えて１６１８３番目のＧ／Ｃ多型）の遺伝子型がＣ／Ｃ型あるいはＣ／Ｇ型であるヒトは糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高いとする上記（１）又は（２）に記載の判定方法。
（４）ヒトゲノムＤＮＡを用いる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の判定方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の判定方法において、ＫＣＮＪ１５遺伝子多型のアリルを検出するために用いる配列表配列番号１、２、２１又は２２に示されるプライマー。
（６）糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定に用いるＫＣＮＪ１５遺伝子。
（７）ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位の塩基又はゲノム上の第一エキソンの第一塩基から数えて１６１８３番目の塩基を含む糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定に用いるＤＮＡ。
（８）ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白又は抗体のいずれかであるＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質。
（９）上記（８）に記載の物質であって、ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ。
（１０）ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する配列表配列番号３７〜４０のいずれかに示されるＲＮＡ。
（１１）上記（９）又は（１０）に記載のＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物。
（１２）インスリン分泌不全の改善に用いる上記（８）に記載の物質、上記（９）に記載のＲＮＡまたは上記（１０）に記載のＲＮＡを含む組成物。
（１３）２型糖尿病患者の治療に用いる上記（８）に記載の物質、上記（９）に記載のＲＮＡまたは上記（１０）に記載のＲＮＡを含む組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により確立された糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法により、糖尿病の発症リスクを早期に判定することができる。これによって、それぞれの患者にあった検査、治療方法の検討や治療薬の選定等を行うことが可能となる。また、本発明によって得られたＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質等を糖尿病の治療等に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の「糖尿病の発症及び／又は進展リスク」とは、糖尿病の患者の遺伝素因による、糖尿病の発症及び／又はこれが進展するする可能性を有する危険性のことをいう。ここで、本発明の糖尿病の進展リスクとは、糖尿病網膜症等の合併症を併発する危険性のことをいう。
【００１０】
本発明の「糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法」とは、判定の対象となるヒトより得たゲノムＤＮＡを用い、ＫＣＮＪ１５遺伝子のアリルを検出することでそのヒトが糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高いか否かを判定することをいう。この判定にあたり、必要に応じて得られたゲノムＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、得られた増幅産物を判定の試料として用いることもできる。
【００１１】
この「糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定」のためには、ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位及び／又はｒｓ７４３２９６のアリル又は遺伝子型を判定の基準とすることが好ましい。
ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位のアリル又は遺伝子型を判定の基準とする場合には、特にＴアリルを有するヒトが糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高いとし、または遺伝子型がＣ／Ｔ型又はＴ／Ｔ型であるヒトが糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高いとする判定方法であることが好ましい。
また、ｒｓ７４３２９６のアリル又は遺伝子型を判定の基準とする場合には、特にＣアリルを有するヒトが糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高いとし、又は遺伝子型がＣ／Ｃ型又はＣ／Ｇ型であるヒトが糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高いとする判定方法であることが好ましい。
【００１２】
本発明の「ヒトゲノムＤＮＡ」は、判定の対象となるヒトから得たゲノムＤＮＡのことをいい、ヒトの血液、血清、白血球、硝子体液などからフェノール・クロロホルム法等の一般的な抽出方法を用いて得ることができ、特に末梢血白血球などから得ることが好ましい。得られたヒトゲノムＤＮＡをＰＣＲなどで増幅し、得られた増幅産物を判定に用いることができる。
糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定において、ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位及び／又はｒｓ７４３２９６のアリル又は遺伝子型を判定の基準とする場合には、この「ヒトゲノムＤＮＡ」が、ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位及び／又はゲノム上の第一エキソンの第一塩基から数えて１６１８３番目の塩基を含むＤＮＡであることが好ましい。
【００１３】
本発明のヒトゲノムＤＮＡの増幅には、ＰＣＲ等の一般的な増幅方法を用いて行うことができる。ＰＣＲを行う場合には、増幅の対象となるＫＣＮＪ１５遺伝子のアミノ酸５６６位及び／又はｒｓ７４３２９６のアリルを含む箇所を増幅できるプライマー、増幅機器、増幅反応条件等を用いることが好ましい。
【００１４】
本発明の「プライマー」としては、ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位及び／又はｒｓ７４３２９６のアリルを検出するためにゲノムＤＮＡの増幅できるプライマーであればいずれのプライマーも用いることができるが、配列の特異度がより高くなるように設計されたプライマーを用いることが好ましい。
例えば、ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位のアリルを検出するためには、本発明者が独自に設計した配列表配列番号２１又は配列番号２２に示されるプライマー等を用いることが好ましい。また、ｒｓ７４３２９６のアリルを検出するためには、配列表配列番号１又は配列番号２に示されるプライマー等を用いることが好ましい。
また、本発明の「アリルの検出」には、ＤＮＡシークエンサーによるシークエンスや、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等の一般的な方法を用いることができる。さらに、ｔａｑｍａｎ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｓｓａｙ（ＡＢＩ社）等の公知の解析方法や、いくつかのＳＮＰを一度に解析可能なＤＮＡアレイを作成し、これを用いた解析方法等を用いる事ができる。
【００１５】
なお、本発明の判定方法の対象は、ヒトであれば可能であるが、糖尿病患者、糖尿病予備軍を対象とすることができる。また、本発明の判定方法は、健常者を対象とする成人検診などに用いることができる。
【００１６】
本発明の「ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質」とは、ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現を阻害する物質や、発現によって得られたＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質であればいずれの物質も含まれる。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白又は抗体などが挙げられる。
このような物質のひとつとして挙げられる、本発明の「ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ」とは、ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡであればいずれのものでもよい。特に配列表配列番号３７〜４０のいずれかに示されるＲＮＡであることが好ましい。
また、ヒトの「ＫＣＮＪ１５遺伝子」には、３個のバリアント（アクセッション番号：ＮＭ＿００２２４３．３、ＮＭ＿１７０７３６．１、ＮＭ＿１７０７３７．１）が報告されていることから、この３個のバリアントの共通部分の一部を含むｄｓＲＮＡ、３個のバリアントに対するＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡまたはＤＮＡ等が好ましい「ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現阻害又はＫＣＮＪ１５タンパク質の機能を抑制する物質」として挙げられる。
本発明の「ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ」又は「該ＲＮＡをコードするＤＮＡ」を含む組成物には、これらのＲＮＡ又はＤＮＡを含むものであればいずれのものも含まれるが、例えば、「ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ」を発現できるＤＮＡをクローニングしたベクター等が挙げられる。本発明のこのような組成物は、特にこれらのＲＮＡ又はＤＮＡを有効成分として含み、インスリン分泌不全の改善や、２型糖尿病患者の治療に用いることができる組成物であることが好ましい。
【００１７】
以下、試験例、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００１８】
［試験例１］
＜２型糖尿病関連遺伝子の特定＞
１．対象
東京女子医科大学の糖尿病センターにおいて、診断を受けてから２年間のうちにインスリン治療が必要とされた、ＧＡＤ抗体（＋）又はＧＡＤ抗体（＋）である一親等の親族を有する２型糖尿病患者１４７名（２型糖尿病患者群）を対象とした。これらの患者は血液サンプリングと医療記録の点検の際のインタビューによって得られ、全て、書面によるインフォームドコンセントを与えられた者であった。また、比較対象として健常者２００名（健常者群）をコントロールとした。
【００１９】
２．２型糖尿病関連遺伝子の検討
１）サンプルの調製
２型糖尿病患者又は健常者のそれぞれの末梢血よりＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。これをＧＥＮｉｏｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いたｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）によって定量し、個々のサンプルに含まれるＤＮＡが２５０ｎｇとなるように調製してプールした。このプールされたＤＮＡが１０ｎｇ／ｍｌとなるように試験時に調製して用いた。
【００２０】
２）アリル頻度の評価
上記１）で調製したゲノムＤＮＡにおいて２１番染色体の３８，０００，０００から４６，９４４，３２３番目の間の領域（２型糖尿病の疾患感受性遺伝子の存在候補領域：参考文献参照）に着目し、この領域に含まれる８６個のＳＮＰを選択した。
それぞれのＳＮＰのアリル頻度をＣＥ−ＳＳＣＰ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析によって調べた。すなわち、表１に示したプライマーを用いて、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡを増幅して、これをキャピラリー電気泳動した。ピーク非からアリル頻度を推定して、２型糖尿病患者群と健常者群の頻度の差を検討することでＣＥ−ＳＳＣＰ解析を行った。
［参考文献］
Ｉｗａｓａｋｉ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ＢＭＩ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２，  ２０９−１３  （２００３）．
【００２１】
【表１】
2010136682.tif 000002
【００２２】
３）タイピング及び変異スクリーニング
上記２）のアリル頻度の評価の結果、５つのＳＮＰについて明らかな違いが見られた。
これらの５つのＳＮＰについて、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ３７３０  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）でダイレクトシークエンスすることによって個々の遺伝子型を特定した。
その結果、図１に示すように、ＳＮＰ（ｒｓ７４３２９６）においてＣアリルを有するヒトが糖尿病の発症及び／又は進展リスクが高く、ＳＮＰ（ｒｓ７４３２９６）が全ての２型糖尿病及びＬｅａｎ２型糖尿病（痩せ型２型糖尿病）に有意な関連があることを確認した。
このＳＮＰ（ｒｓ７４３２９６）を含む連鎖不平衡ブロックはＫＣＮＪ１５遺伝子を含んでおり、この遺伝子の上流及び下流に存在する異なる連鎖不平衡ブロックでは有意な関連が見られなかったことから、ＫＣＮＪ１５遺伝子が２型糖尿病の関連遺伝子であると考えられた。
【００２３】
そこで、ＫＣＮＪ１５遺伝子の全てのエキソンとプロモーター領域について、さらにＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ３７３０  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）を用いてダイレクトシークエンスを行い、高密度のマッピングを行った。このＰＣＲ反応及びシークエンス反応に用いたプライマーの配列を表２に示した。
その結果、プロモーター領域に３つのＳＮＰ及びエキソンに８つのＳＮＰが存在することが確認され、このうち第四エキソンのアミノ酸５６６位に存在するＳＮＰ（ｒｓ３７４６８７６）が、図１に示すように、ｌｅａｎ２型糖尿病に有意な関連があることが確認された（ｐ＝０．００７１，ＯＲ＝３．２５）。独立したサンプル（２型糖尿病患者４１９人、健常者５００人）で再現性を確認したところ、同様に有意であった。
【００２４】
【表２】
2010136682.tif 000003
【００２５】
［試験例２］
＜ＫＣＮＪ１５遺伝子の２型糖尿病との関連＞
１．ｍＲＮＡ発現レベルの検討
ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて健常者１６人の末梢血全血からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。そして、ｃＤＮＡ合成のために、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）  ｐｒｉｍｅｒｓ及びＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて１００ｎｇのＤＮａｓｅで処理した。
定量的リアルタイムＰＣＲ及び解析をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ，  ＵＳＡ）を用いて行った。
９６ウェルプレートに５μｌ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｃＤＮＡ，２５μｌ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｆｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ，ＵＳＡ），２００ｎＭ  ｐｒｉｍｅｒｓ（表３）、ＤＮａｓｅ−ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒで全量を５０μｌに調製した。
ＰＣＲ反応は、５０℃  ２分間、９５℃  １０分間の後、９５℃  １０秒間、５３．５℃  １０秒間、２℃  ３０秒間、及び９５℃  ６０秒間、６０℃  ６０秒間、９５℃  ６０秒間を１サイクルの伸長反応として４０サイクル行った。データをＧｅｎｅＡｍｐ  ＳＤＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅを用いて集め、βアクチンとの比をとってＫＣＮＪ１５のｍＲＮＡの発現比とした。
その結果、ＫＣＮＪ１５遺伝子のアミノ酸５６６位に存在する遺伝子型が異なる健常者において、図２に示したように遺伝子型がＴ／Ｃ型及びＴ／Ｔ型の者は、Ｃ／Ｃ型の者と比べてｍＲＮＡの発現レベルが高いことが確認された。
【００２６】
【表３】
2010136682.tif 000004
【００２７】
２．タンパク発現レベルの検討
ＨＥＫ２９３細胞にＫＣＮＪ１５  ＧＦＰ融合タンパク質発現を強制発現させることで、それぞれのアリルについてのＫＣＮＪ１５遺伝子のタンパク質発現レベルを調べた。
１）形質転換
ＫＣＮＪ１５遺伝子のタンパク質コード領域（ＫＣＮＪ１５遺伝子のアミノ酸５６６位がＣ型のもの：配列表配列番号３５、同位がＴ型のもの：配列番号３６）をｐｃＤＮＡ６．２／Ｃ−ＥｍＧＦＰ−ＤＥＳＴ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にクローニングした。
８５％コンフレントのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡでプレートから剥がした後、２４ウェルプレート上の新鮮な培地（ＤＭＥＭ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １０％  ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ，２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，及びｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に入れた。培養２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）と上記でクローニングしたプラスミドとの複合体（１μｇ／ｗｅｌｌ）を加え、細胞を形質転換した。
２）ウェスタンブロッティング
４８時間後、上記１）で形質転換した細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、プロテアーゼ阻害カクテルを含むＲＡＩＰＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを浸透させた。これを２２口径又は２７口径の注射針に１０及び５回通し懸濁液とした。
メンブレン画分を遠心分離（１０，０００ｇ、３０分）によって集め、浸透バッファーに再懸濁し、１００ｍＭ  ＤＴＴ及び２％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した。流動性を増す為に、サンプルバッファーを加え、室温で２４時間インキュベートした後、５０℃で１５分間、２０℃で３０分間及び５０℃で１５分間加熱した。
溶解物を１０−２０％ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル電気泳動を行った。その後蛋白質をゲルからｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に写し、２０００倍希釈したラビットポリクローナル抗ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体及び１０００倍希釈したラビットポリクローナルＥ−カドヘリン抗体を加え１時間室温で反応させた。その後、さらに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）でラベルされた特異的な二次抗体をアプライした。バックグランドレベルを下げる為の抗体希釈バッファー中にＧｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（Ｔｏｙｏｂｏ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を用いた。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてラベルしたｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌをＣＣＤ  ｃａｍｅｒａ  ｓｙｓｔｅｍを用いて検出した。
その結果、図３に示したように、ＫＣＮＪ１５遺伝子のアミノ酸５６６位のアリルがＴアリルのものの方がＣアリルのものを形質転換した場合よりもタンパク質の発現レベルが高いことが確認された。
【００２８】
３．インスリン依存性及び感受性の検討
１）対象及びサンプルの調製
東京女子医科大学の糖尿病センターにおいて、糖尿病発症後１０年以内で、ＨＯＭＡ−Ｂ≦１０である２型糖尿病患者又はインスリン注射加療が開始されている２型糖尿病患者１８６名をインスリン依存性に進展している患者として対象とした。これらの患者それぞれの末梢血より試験例１と同様にＤＮＡを調製して用いた。
【００２９】
２）タイピング及び変異スクリーニング
この調製したＤＮＡを用い、試験例１と同様にＳＮＰ（ｒｓ３７４６８７６）についてＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ３７３０  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）でダイレクトシークエンスすることによって個々の遺伝子型を特定した。
【００３０】
その結果、図４に示すように、インスリン依存性に進展している患者は、ＫＣＮＪ１５遺伝子のアミノ酸５６６位の遺伝子型がＴ／Ｃ型又はＴ／Ｔ型の者が多く、Ｃ／Ｃ型は少なかった。
【実施例１】
【００３１】
＜糖尿病の発症及び／又は進展リスクの判定方法＞
１．ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位
ヒトの末梢血よりゲノムＤＮＡを抽出し、配列表配列番号２１及び配列番号２２に示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物を、直接塩基配列決定法を用いて両方向のシークエンスを行い、遺伝子型を決定した。得られた遺伝子型より、ＫＣＮＪ１５遺伝子多型の遺伝子型がＴ／Ｔ型又はＣ／Ｔ型である患者は糖尿病の発症リスク及び／又は進展リスクを有すると判定した。
２．ｒｓ７４３２９６
上記１．と同様に、配列表配列番号１及び配列番号２に示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物を、直接塩基配列決定法を用いて両方向のシークエンスを行い、遺伝子型を決定した。得られた遺伝子型より、ｒｓ７４３２９６の遺伝子型がＣ／Ｃ型又はＣ／Ｇ型である患者は糖尿病の発症リスク及び／又は進展リスクを有すると判定した。
この判定方法によって、糖尿病の発症リスク及び／又は進展リスクを有すると判定された患者に対し、適した治療方法の検討を行った。
【実施例２】
【００３２】
＜ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡの製造＞
委託会社に依頼して、表４に示すＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡの製造を行った。
【００３３】
【表４】
2010136682.tif 000005
【００３４】
［試験例３］
１．ＩＮＳ−１培養細胞におけるインスリン分泌量への影響の検討
ＫＣＮＪ１５遺伝子に対するＲＮＡｉをラット培養インスリン産生腫瘍細胞であるＩＮＳ−１  ｃｅｌｌｓ（ｋｉｎｄｌｙ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  Ｄｒ  Ｉｔａｒｕ  Ｋｏｊｉｍａ，Ｇｕｎｍａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）に導入して、ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現を抑制することでＫＣＮＪ１５遺伝子の役割を調べた。
【００３５】
１）試料
ａ）ＩＮＳ−１  ｃｅｌｌｓ
Ｄ−ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）基礎培地にＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）１５％付加した培地を用い、３７度  ５％ＣＯ２でＩＮＳ−１培養細胞を培養した。
ｂ）ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ
上記実施例２．で調製したＲＮＡ（ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ＫＣＮＪ１５）を用いた。
ｃ）コントロール
Ｍｅｄ  ＧＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
【００３６】
２）ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現ノックダウン
ＩＮＳ−１細胞にコントロール又はＫＣＮＪ１５に対するｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて導入した後、７２時間インキュベートし、ＫＣＮＪ１５遺伝子の発現をノックダウンした。
細胞のＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出し、ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ，Ｌｅｗｅｓ，Ｅａｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，Ｕ．Ｋ．）で処理して一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ノックダウンの効果を、各々の細胞におけるＫＣＮＪ１５遺伝子のｍＲＮＡレベルを質量的なｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによって調べることで行った。
ＩＮＳ−１細胞は２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅで培養し、Ｋｒｅｂｓ-Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ｛Ａｒｄｅｎ，  ２００７  ＃２６｝で洗浄した。その後、ｇｌｕｃｏｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｋｒｅｂｓ-Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ内で、３７℃で３０分間プレインキュベートした後、グルコースを含む（５ｍＭ又は２５ｍＭ）培地で１時間インキュベートし、インスリン分泌量を検出した。培養液中のインスリン濃度はＥＬＩＳＡ（Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって測定した。
その結果、図５に示したように、ＫＣＮＪ１５遺伝子のノックダウンによって、２５ｍＭグルコース存在下でのインスリン分泌量が顕著に増加した。一方５ｍＭグルコース存在下ではインスリン分泌量は変化しなかった。
【００３７】
２．糖尿病モデルマウスにおけるインスリン分泌不全の改善
１）試料
ａ）マウス
６週齢における随時血漿グルコース濃度が３００〜４００ｍｇ／ｄｌのアキタ糖尿病マウス（Ａｋｉｔａ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ）の雌（８週齢）及び比較としてＣ５７／Ｂ６マウスを用いた（いずれもａｐａｎ  ＳＬＣ  Ｉｎｃ）。
ｂ）ＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ
上記実施例２．で調製したＲＮＡ（ＭＳＳ２０５６９０）を用いた。
ｃ）コントロール
ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ
ｓｅｎｓｅ（配列番号４１）：
５’−ＣＣＵＡＣＡＵＧＡＣＧＡＣＧＡＵＧＵＡＣＣＧＵＧＡ−３’
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（配列番号４２）：
５’−ＵＣＡＣＧＧＵＡＣＡＵＣＧＵＣＧＵＣＡＵＧＵＡＧＧ−３’．
【００３８】
２）マウスにおけるＫＣＮＪ１５遺伝子の発現ノックダウン
上記１）ののアキタ糖尿病マウス及び比較としてＣ５７／Ｂ６マウスを用いた。これらのマウスを、ＫＣＮＪ１５−ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉを投与するもの及びコントロールとしてｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉを投与するもの、それぞれ２つのグループにランダムにわけた。合成ＲＮＡｉ４００μｇを０．８ｍｌのＰＢＳに溶解し、尾の静脈に注入した。
その後４日後及び２週間後に、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行い、ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｔｅｒｕｍｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてＤ−ｇｌｕｃｏｓｅ（２ｇ／５ｍｌ／ｋｇ）を経口インジェクションする前及びインジェクション１５分後の血中グルコース濃度及び血漿中のインスリン濃度を測定した。
その結果、図６に示したように、アキタ糖尿病マウスにおいては、Ｂ５７／Ｂ６マウスと比べて、ＫＣＮＪ１５−ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉを投与したマウスにおけるＯＧＴＴ後１５分の血中グルコース濃度が有意に下がることが確認された。
また、図７に示したように、アキタ糖尿病マウスにおいては、ＫＣＮＪ１５−ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉを投与したマウスにおける血中インスリン濃度が有意に上昇することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の判定方法を利用することにより、糖尿病の発症及び／又は進展リスクを早期に判定することができる。これによって、それぞれの患者にあった検査や治療の検討等の真に必要な検査や治療のみを行うことで可能となり、診察時間の短縮や医療費の節約にもつながる。
また、本発明のＫＣＮＪ１５遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ等を糖尿病の治療などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＫＣＮＪ１５遺伝子の第四エキソンのアミノ酸５６６位又はｒｓ７４３２９６に存在するＳＮＰを示した図である（試験例２）。
【図２】遺伝子型の違いによるｍＲＮＡ発現レベルを示した図である（試験例２）。
【図３】アリルの違いによるタンパク質の発現レベルを示した図である（試験例２）。
【図４】インスリン依存性及び感受性を示した図である（試験例２）。
【図５】ＫＣＮＪ１５遺伝子のノックダウンによるインスリン分泌量への影響を示した図である（試験例２）。
【図６】ＫＣＮＪ１５遺伝子のノックダウンによる糖尿病マウスにおける血中グルコース濃度の低下を示した図である（試験例２）。
【図７】ＫＣＮＪ１５遺伝子のノックダウンによる糖尿病マウスにおける血中インスリン濃度の上昇を示した図である（試験例２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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