(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＣＲ又は成長データ内のジャンプ不連続部を除去する。【解決手段】成長プロセスを表すデータセットを受信する段階、非線形回帰プロセスを第１非線形関数に適用して前記第１関数のパラメータを決定することにより、前記データセットにフィットする曲線の第１近似を算出する段階、第２回帰プロセスを第２非線形関数に適用して前記第２関数のパラメータを決定することにより、前記データセットにフィットする曲線の第２近似を算出する段階、前記第１及び第２近似のそれぞれのものの情報係数を決定する段階、前記情報係数に基づいて前記近似の中の１つものを選択する段階、前記選択された近似の前記ステップ型不連続部パラメータの信頼区間を決定する段階、前記信頼区間が値ゼロを含まない場合に、ゼロに設定された対応する前記ステップ型不連続部パラメータを有する前記選択された近似によって前記データセットの一部を置換する段階、を含んで成る。【選択図】図１６
2010015546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長プロセスを表すデータ内のステップ型不連続部を自動的に除去する方法であって、
−成長プロセスを表すデータセットを受信する段階、ここで、前記データセットは、複数のデータポイントを含み、それぞれのデータポイントは、座標値のペアを具備する、
−非線形回帰プロセスを第１非線形関数に適用して前記第１関数のパラメータを決定することにより、前記データセットにフィットする曲線の第１近似を算出する段階、ここで、前記パラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、
−第２回帰プロセスを第２非線形関数に適用して前記第２関数のパラメータを決定することにより、前記データセットにフィットする曲線の第２近似を算出する段階、ここで、前記第２関数の前記パラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、
−前記第１及び第２近似のそれぞれのものの情報係数を決定する段階、
−前記情報係数に基づいて前記近似の中の１つものを選択する段階、
−前記選択された近似の前記ステップ型不連続部パラメータの信頼区間を決定する段階、
−前記信頼区間が値ゼロを含まない場合に、ゼロに設定された対応する前記ステップ型不連続部パラメータを有する前記選択された近似によって前記データセットの一部を置換する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記第１非線形回帰プロセスは、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスであり、且つ、前記第１非線形関数は、ダブルシグモイド関数である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ダブルシグモイド関数は、次の形態を有し、
【数１】
2010015546.tif 000027
式中、ＵｎｉｔＳｔｅｐは、次の形態を有し、
【数２】
2010015546.tif 000028
ここで、第１近似を算出する段階は、前記関数の前記パラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第２非線形関数は、次の形態を有し、
【数３】
2010015546.tif 000029
式中、ＵｎｉｔＳｔｅｐは、次の形態を有し、
【数４】
2010015546.tif 000030
式中、ｘは、サイクル数であり、ｃａｃは、前記不連続部が発生したサイクルであり、ａ、ｂ、及びｈは、前記パラメータであり、且つ、ｈは、前記ステップ型不連続部パラメータである請求項１記載の方法。
【請求項５】
置換された前記データセットの前記部分は、第１データポイントから始まって前記ステップ型不連続部が発生したデータポイントを含むものまでの前記データセットの部分を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記選択段階の後に、
−前記選択された近似のフィットの適合度値を算出し、且つ、前記フィットの適合度値が閾値を上回る場合にのみ、継続する段階、
を更に含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
プロセッサを制御し、成長曲線を表すデータセット内のステップ型不連続部を自動的に除去するコードを含むコンピュータ可読媒体であって、
前記コードは、
−成長プロセスを表すデータセットを受信する段階、ここで、前記データセットは、複数のデータポイントを含み、それぞれのデータポイントは、座標値のペアを具備する、
−非線形回帰プロセスを第１非線形関数に適用して前記第１関数のパラメータを決定することにより、前記データセットにフィットする曲線の第１近似を算出する段階、ここで、前記パラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、
−第２回帰プロセスを第２非線形関数に適用して前記第２関数のパラメータを決定することにより、前記データセットにフィットする曲線の第２近似を算出する段階、ここで、前記第２関数の前記パラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、
−前記第１及び第２近似のそれぞれのものの情報係数を決定する段階、
−前記情報係数に基づいて前記近似の中の１つものを選択する段階、
−前記選択された近似の前記ステップ型不連続部パラメータの信頼区間を決定する段階、
−前記信頼区間が値ゼロを含まない場合に、ゼロに設定された対応する前記ステップ型不連続部パラメータを有する前記選択された近似によって前記データセットの一部を置換する段階、
を実行するための命令を含む、コンピュータ可読媒体。
【請求項８】
前記第１非線形回帰プロセスは、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスであり、且つ、前記第１非線形関数は、ダブルシグモイド関数である請求項７記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項９】
前記ダブルシグモイド関数は、次の形態を有し、
【数５】
2010015546.tif 000031
式中、ＵｎｉｔＳｔｅｐは、次の形態を有し、
【数６】
2010015546.tif 000032
ここで、第１近似を算出する段階は、前記関数の前記パラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含む請求項８記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１０】
前記第２非線形関数は、次の形態を有し、
【数７】
2010015546.tif 000033
式中、ＵｎｉｔＳｔｅｐは、次の形態を有し、
【数８】
2010015546.tif 000034
式中、ｘは、サイクル数であり、ｃａｃは、前記不連続部が発生したサイクルであり、ａ、ｂ、及びｈは、前記パラメータであり、且つ、ｈは、前記ステップ型不連続部パラメータである請求項７記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１１】
置換された前記データセットの前記部分は、第１データポイントから始まって前記ステップ型不連続部が発生したデータポイントを含むものまでの前記データセットの部分を含む請求項７記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項１２】
−キネティックＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成するキネティックＰＣＲ分析モジュールであって、前記データセットは、複数のデータポイントを含み、それぞれのデータポイントは、座標値のペアを具備する、キネティックＰＣＲ分析モジュールと、
−インテリジェンスモジュールと、
を有し、
前記インテリジェンスモジュールは、
−非線形回帰プロセスを第１非線形関数に適用して前記第１関数のパラメータを決定することにより、前記データセットにフィットする曲線の第１近似を算出する段階、ここで、前記パラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、
−第２回帰プロセスを第２非線形関数に適用して前記第２関数のパラメータを決定することにより、前記データセットにフィットする曲線の第２近似を算出する段階、ここで、前記第２関数の前記パラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、
−前記第１及び第２近似のそれぞれのものの情報係数を決定する段階、
−前記情報係数に基づいて前記近似の中の１つものを選択する段階、
−前記選択された近似の前記ステップ型不連続部パラメータの信頼区間を決定する段階、
−前記信頼区間が値ゼロを含まない場合に、ゼロに設定された対応する前記ステップ型不連続部パラメータを有する前記選択された近似によって前記データセットの一部を置換する段階、
により、前記ＰＣＲデータセットを処理し、前記データセット内のステップ型不連続部を自動的に除去するべく適合されている、キネティックポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システム。
【請求項１３】
前記第１非線形回帰プロセスは、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスであり、且つ、前記第１非線形関数は、ダブルシグモイド関数である請求項１２記載のシステム。
【請求項１４】
前記ダブルシグモイド関数は、次の形態を有し、
【数９】
2010015546.tif 000035
式中、ＵｎｉｔＳｔｅｐは、次の形態を有し、
【数１０】
2010015546.tif 000036
ここで、第１近似を算出する段階は、前記関数の前記パラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含む請求項１３記載のシステム。
【請求項１５】
前記第２非線形関数は、次の形態を有し、
【数１１】
2010015546.tif 000037
式中、ＵｎｉｔＳｔｅｐは、次の形態を有し、
【数１２】
2010015546.tif 000038
式中、ｘは、サイクル数であり、ｃａｃは、前記不連続部が発生したサイクルであり、ａ、ｂ、及びｈは、前記パラメータであり、且つ、ｈは、前記ステップ型不連続部パラメータである請求項１２記載のコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応システムに関し、更に詳しくは、ポリメラーゼ連鎖反応データ内のステップ型不連続部を除去するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は、既定の核酸配列を酵素によって合成又は増幅する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）法である。その反応は、通常、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、これらが両側の鎖にハイブリダイズし、増幅対象の鋳型又は標的ＤＮＡ配列に隣接する。プライマーは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用によって伸長する。鋳型変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長を伴う反復的な一連のサイクルの結果として、特定のＤＮＡ断片が指数的に蓄積される。通常、このプロセスにおいては、増幅プロセスの検出及び定量化を円滑に実行するべく、蛍光ブローブ又はマーカーが使用される。
【０００３】
図１には、代表的なリアルタイムＰＣＲ曲線が示されており、代表的なＰＣＲプロセスにおける蛍光強度値がサイクル数に対してプロットされている。この場合、ＰＣＲプロセスのそれぞれのサイクルにおいて、ＰＣＲ産物の形成がモニタリングされる。増幅は、通常、増幅反応の際の蛍光信号を計測するコンポーネント及び装置を含むサーモサイクラ内において計測される。このようなサーモサイクラの一例が、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２０１１０４６８）である。増幅産物は、例えば、標的核酸にバインドされた際にのみ蛍光信号を放出する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブにより、或いは、特定のケースにおいては、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光染料により、検出される。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲにおいて使用される蛍光染料は、温度感受性を有する。サーマルサイクリングプロファイルは、アニーリング温度を変更する段階を包含可能である。アニーリング温度の変化は、蛍光読取値の大きさの不連続部として出現する。図２は、サイクル６の後にアニーリング温度の変化が見られる具体例を示す。
【０００５】
図２のプロファイルを使用して実施された実験に対応する蛍光データの読取値が図３に示されている。ＨＥＸチャネルにおいて、サイクル５とサイクル６の間に不連続部が存在することがはっきりと分かる。図３は、１０4ＩＵ／ｍｌの濃度を有するＢ１９パルボウイルスサンプルから採取した。温度に対する感受性が低いＦＡＭ染料の場合には、ジャンプ不連続部の大きさが、ＨＥＸ染料よりも小さくなっている。
【０００６】
但し、標的の濃度が増加した場合には、不連続部を蛍光データ内に反映させることができない可能性がある。例えば、２．９×１０11ＩＵ／ｍｌの濃度を有するＢ１９パルボウイルスサンプルを検討すれば、サイクル５の後にアニーリング温度の変化が存在したにも拘わらず、不連続部は、図４ａでは見られない。
【０００７】
いくつかの現在のＰＣＲシステムは、アニーリング温度の変化に起因したステップ型不連続部の除去のための方法を実装している。このようなシステムは、通常、予想されるアニーリング温度の変化及び最大蛍光の変化に対応するサイクル数用の検定固有の入力パラメータを必要としている。このような方法は、いくつかの制限を具備する。第１に、これらは、高滴定濃度サンプルを取り扱うことができない。これは、図４ｂで見ることができ、この場合には、２．９×１０11ＩＵ／ｍｌの濃度のＢ１９パルボサンプルが、このようなシステムによって不正確に取り扱われている。第２に、このような方法が取り扱うことができるのは、不連続部の地点における小さな最大（例えば、５つの）絶対蛍光単位の変化のみである。不連続部における蛍光変化の大きさは、大きく変化することが複数の検定において観察されている。最大変化を通知するための検定固有の入力のセットアップは、最適化が困難である。第３に、このような方法は、ベースラインドリフトが大きい蛍光データを取り扱うことができないであろう。このようなケースにおいては、提供される補正が不十分なものとなろう。第４に、アニーニング温度の変化に対応するサイクル数から１つ以下のサイクルの距離にスパイクが存在する場合には、提供される補正により、報告される結果濃度の変化、即ち、誤った結果が生成されることが判明している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、前述の及びその他の問題を克服する、シグモイドタイプ又は成長曲線と、特に、ＰＣＲ曲線を処理するシステム及び方法を提供することが望ましい。具体的には、これらのシステム及び方法は、確実且つ安定した方式における温度ステップ補正を実装することを要する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＰＣＲプロセスにおいて発生可能な温度シフトについてＰＣＲデータを補正するシステム及び方法を提供する。
【００１０】
本発明の態様は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応データの蛍光のジャンプ不連続（ｊｕｍｐ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｉｔｙ：第１種不連続部）を除去する。不連続部の存在は、不正確な結果計算を生成可能であり、且つ、従って、除去することが推奨される。標的の初期複写数に応じて、高濃度レベルにおいては、蛍光の不連続部が存在しない可能性がある。８パラメータ非線形モデルの信頼域を使用し、データを正確に推定する。本方法は、すべての濃度レベルにおける不連続部の除去のための従来の方法における問題点を克服する。
【００１１】
ある態様においては、データセットをモデル化する非線形関数に非線形回帰プロセスを適用して非線形関数のステップ型不連続部パラメータを含むパラメータを決定することにより、受信したＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する第１近似を決定する。非線形関数の一例は、ダブルシグモイド式である。又、第２の非線形関数に回帰プロセスを適用して第２の関数のステップ型不連続部パラメータを含むパラメータを決定することにより、ＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する第２の近似をも決定する。次いで、第１及び第２近似のそれぞれのものについて決定した情報係数に基づいて、第１又は第２近似の中の１つのものを選択する。ステップ型不連続部パラメータについて算出した信頼区間が値ゼロを含む（例えば、信頼区間が、値０を含む範囲（例えば、−１〜１）にわたって広がっている）場合には、ステップ補正を実行しない。信頼区間が値ゼロを含まない場合には、ステップ補正を実行する。ステップ補正を実行する場合には、ステップ型変化の前のデータ曲線の部分を、選択された近似の適切な部分と置換することにより、シフト補正済みのデータセットを生成する。特定の態様においては、近似が適合度（ｇｏｏｄｎｅｓｓ  ｏｆ  ｆｉｔ)の基準を満足しない場合には、ステップ補正を実行しない。シフト補正済みのデータセットを返し、表示可能であり、さもなければ、更なる処理のために使用可能である。
【００１２】
ある態様によれば、成長プロセスを表すデータ内のステップ型不連続部を自動的に除去する方法が提供される。本方法は、通常、成長プロセスを表すデータセットを受信する段階であって、データセットは、複数のデータポイントを含み、それぞれのデータポイントは、座標値のペアを具備する、段階と、非線形回帰プロセスを第１非線形関数に適用して第１関数のパラメータを決定することにより、データセットにフィットする曲線の第１近似を算出する段階であって、パラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、段階と、を含む。又、本方法は、通常、第２回帰プロセスを第２非線形関数に適用して第２関数のパラメータを決定する段階により、データセットにフィットする曲線の第２近似を算出する段階であって、第２関数のパラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、段階と、第１及び第２近似のそれぞれのものについて情報係数を決定する段階と、情報係数に基づいて近似の中の１つのものを選択する段階と、をも含む。又、本方法は、通常、選択された近似のステップ型不連続部パラメータの信頼区間を決定する段階と、信頼区間が値ゼロを含まない（例えば、信頼区間が、値０を含まない範囲にわたって広がっている）場合に、ゼロに設定された対応するステップ型不連続部パラメータを有する選択された近似によってデータセットの一部を置換する段階と、をも含む。
【００１３】
別の態様によれば、プロセッサを制御し、成長曲線を表すデータセット内のステップ型不連続部を自動的に除去するコードを含むコンピュータ可読媒体が提供される。コードは、通常、成長プロセスを表すデータセットを受信する段階であって、データセットは、複数のデータポイントを含み、それぞれのデータポイントは、座標値のペアを具備する、段階と、非線形回帰プロセスを第１関数に適用して第１関数のパラメータを決定することにより、データセットにフィットする曲線の第１近似を算出する段階であって、パラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、段階と、を実行するためのコードを含む。又、コードは、通常、第２回帰プロセスを第２非線形関数に適用して第２関数のパラメータを決定することにより、データセットにフィットする曲線の第２近似を算出する段階であって、第２関数のパラメータは、ステップ型不連続部パラメータを含む、段階と、第１及び第２近似のそれぞれのものについて情報係数を決定する段階と、情報係数に基づいて近似の中の１つものを選択する段階と、を実行するコードをも含む。又、コードは、通常、選択された近似のステップ型不連続部パラメータの信頼区間を決定する段階と、信頼区間が値ゼロを含まない場合に、ゼロに設定された対応するステップ型不連続部パラメターを有する選択された近似によってデータセットの一部を置換する段階と、を実行する命令をも含む。
【００１４】
更に別の態様によれば、それぞれのものが座標値のペアを具備する複数のデータポイントを含む、キネティックＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成するキネティックＰＣＲ分析モジュールと、インテリジェンスモジュールと、を通常含むキネティックポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供される。インテリジェンスモジュールは、通常、非線形回帰プロセスを第１非線形関数に適用してステップ型不連続部パラメータを含む第１関数のパラメータを決定することによってデータセットにフィットする曲線の第１近似を算出し、且つ、第２回帰プロセスを第２非線形関数に適用してステップ型不連続部パラメータを含む第２関数のパラメータを決定することによってデータセットにフィットする曲線の第２近似を算出することにより、ＰＣＲデータセットを処理してデータセット内のステップ型不連続部を自動的に除去するべく適合されている。又、インテリジェンスモジュールは、通常、第１及び第２近似のそれぞれのものについて情報係数を決定し、情報係数に基づいて近似の中の１つのものを選択し、選択された近似についてステップ型不連続部パラメータの信頼区間を決定し、且つ、信頼区間が値ゼロを含んでいない場合に、ゼロに設定された対応するステップ型不連続部パラメータを有する選択された近似によってデーセットの一部を置換するべく、適合されている。
【００１５】
図面及び請求項を含む本明細書の残りの部分を参照することにより、本発明のその他の特徴及び利点について理解することができよう。以下、添付の図面との関係において、本発明の更なる特徴及び利点と本発明の様々な態様の構造及び動作について詳述する。添付図面においては、類似の参照符号により、同一又は機能的に類似した要素を示している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＰＣＲプロセスの環境における増幅曲線の一例を示す。
【図２】サイクル６の後にアニーリング温度の変化が見られる具体例を示す。
【図３】１０4ＩＵ／ｍｌの濃度を有するＢ１９パルボウイルスサンプルから採取されたＦＥＭ及びＨＥＸチャネルにおけるＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図４Ａ】標的の濃度が増大した場合に、不連続部が蛍光データ内に反映されない可能性があることを示すＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図４Ｂ】標的の濃度が増大した場合に、不連続部が蛍光データ内に反映されない可能性があることを示すＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図５】ＰＣＲ増幅曲線内の温度シフトを補正するプロセスの一態様を示す。
【図６Ａ】本発明の一態様によるスパイク識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示す。
【図６Ｂ】本発明の一態様によるスパイク識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示す。
【図６Ｃ】本発明の一態様によるスパイク識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示す。
【図６Ｄ】本発明の一態様によるスパイク識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示す。
【図６Ｅ】本発明の一態様によるスパイク識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示す。
【図７】パラメータａ〜ｇを含むダブルシグモイド式の分解を示す。パラメータａ〜ｇは、ダブルシグモイド曲線の形状及び位置を定義する。
【図８】曲線及び変曲点のｘ値である（ｅ）の位置に対するパラメータ（ｄ）の影響を示す。図８の曲線は、いずれも、パラメータｄを除いて、同一のパラメータ値を具備する。
【図９】異なるパラメータセットにおける３つの曲線形状の一例を示す。
【図１０Ａ】ある観点によるダブルシグモイド式のパラメータ（ｅ）及び（ｇ）の値を決定するプロセスを示す。
【図１０Ｂ】ある観点によるダブルシグモイド式のパラメータ（ｅ）及び（ｇ）の値を決定するプロセスを示す。
【図１１Ａ】パラメータの初期セットにおけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示す。
【図１１Ｂ】パラメータの初期セットにおけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示す。
【図１１Ｃ】パラメータの初期セットにおけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示す。
【図１１Ｄ】パラメータの初期セットにおけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示す。
【図１２】ＣＡＰ／ＣＴＭ  ＨＩＶモニタ検定からのＩＱＳ（ＨＥＸチャネル）蛍光データを示す。未加工の蛍光データは、点線で示されており、補正済みのデータは、実線で示されている。
【図１３】Ｂ１９バルボウイルス標的チャネル（ＦＡＭチャネル）検定の（実際の標的の増幅を伴わない）蛍光データを示す。未加工の蛍光データは、点線で示されており、補正済みのデータは、実線で示されている。
【図１４】ＨＢＶ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ（ＦＡＭチャネル）の標的の蛍光データを示す。未加工の蛍光データは、点線で示されており、補正済みのデータは、実線で示されている。この検定は、ジャンプ不連続部を具備しておらず、従って、不連続部の補正は不要である。
【図１５】高濃度（２．９×１０11ＩＵ／ｍｌ）のＢ１９パルボウイルスサンプル（ＦＡＭチャネル）検定の蛍光データを示す。未加工の蛍光データは、点線で示されており、補正済みのデータは、実線で示されている。
【図１６】本発明の方法及びシステムを実装するべく使用可能なソフトウェア及びハードウェアリソースの間の関係を示す概略ブロックダイアグラムの一例である。
【図１７】サーモサイクラ装置とコンピュータシステムの間の関係を示す概略ブロックダイアグラムの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、増幅プロセスにおいて発生可能な温度シフトについてＰＣＲ増幅曲線及びその他の成長曲線を補正するシステム及び方法を提供する。
【００１８】
温度シフトの一例は、検定の際の特定のサイクル内におけるアニーリング温度の制御された変化である。通常、この温度シフトは、ベースライン領域によって表されるプロセスの一部に発生する。この温度変化は、シフトが発生したサイクル数に、蛍光信号における後続のシフトを生成する。本明細書においては、温度シフトが発生したサイクルをＣＡＣ（Ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｃｈａｎｇｅ：アニーリングが変化したサイクル）と呼ぶこととする。
【００１９】
ある態様においては、デーセットをモデル化する非線形関数に非線形回帰プロセスを適用して非線形関数のステップ型不連続部パラメータを含むパラメータを決定することにより、ＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する第１近似を決定する。非線形関数の一例は、後程詳述するダブルシグモイド式である。又、回帰プロセスを第２非線形関数に適用して第２関数のステップ型不連続部パラメータを含むパラメータを決定することにより、ＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する第２近似をも決定する。次いで、第１及び第２近似のそれぞれものについて決定した情報係数に基づいて、第１又は第２近似の中の１つのものを選択する。ステップ型不連続部パラメータについて算出した信頼区間が値ゼロを含む（例えば、信頼区間が、値０を含む範囲にわたって広がっている）場合には、ステップ補正を実行しない。信頼区間が値ゼロを含まない場合には、ステップ補正を実行する。ステップ補正を実行する場合には、ステップ型変化の前のデータ曲線の部分を、選択された近似の適切な部分によって置換することにより、シフト補正済みのデータセットを生成する。特定の態様においては、近似が適合度の基準を満足しない場合には、ステップ補正を実行しない。シフト補正済みのデータセットを返し、表示可能であり、さもなければ、更なる処理のために使用可能である。例えば、シフト補正済みのデータセットを使用し、ＰＣＲ検定のＣｔ値を決定可能である。
【００２０】
ＰＣＲプロセスの環境における増幅曲線１０の一例が図１に示されている。図示のように、曲線１０は、ラグフェーズ領域１５と、指数フェーズ領域２５と、を含む。ラグフェーズ領域１５は、一般に、ベースライン又はベースライン領域と呼ばれている。このような曲線１０は、ラグフェーズ領域と指数フェーズ領域をリンクする関心の対象である遷移領域２０を含む。領域２０は、一般に、エルボー又はエルボー領域と呼ばれている。エルボー領域は、通常、基礎をなすプロセスの成長又は増幅レートにおけるベースライン領域の末尾及び遷移部を定義する。領域２０内の特定の遷移点の識別は、基礎をなすプロセスの振る舞いを分析するのに有用であろう。代表的なＰＣＲ曲線においては、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれる遷移点の識別は、ＰＣＲプロセスの効率特性を理解するのに有用である。
【００２１】
類似のシグモイド又は成長曲線を提供可能であるその他のプロセスは、バクテリアプロセス、酵素プロセス、及びバインディングプロセスを含む。例えば、バクテリア成長曲線においては、関心の対象である遷移点は、ラグフェーズ内の時間λと呼ばれている。本発明によって分析可能であるデータ曲線を生成するその他の特定のプロセスは、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、及びＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセスを含む。ＳＤＡ及びＮＡＳＢＡプロセス及びデータ曲線の例については、それぞれ、Ｗａｎｇ，  Ｓｈａ−Ｓｈａ他による「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＢＤ  ＰｒｏｂｅＴｅｃ  ＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００３  ４９（１０）：１５９９）及びＷｅｕｓｔｅｎ，  Ｊｏｓ  Ｊ．Ａ．Ｍ．他による「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ」（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２  ３０（６）：２６）に見出すことができる。従って、本明細書の残りの部分は、ＰＣＲ曲線に対するその適用性の観点において本発明の態様及び観点について説明しているが、本発明は、その他のプロセスに関係したデータ曲線に適用することも可能であることを理解されたい。
【００２２】
図１に示されているように、代表的なＰＣＲ成長曲線のデータは、ＰＣＲサイクル数がｘ軸を定義し、且つ、蓄積されたポリヌクレオチド成長のインジケータがｙ軸を定義する２次元座標系において表現可能である。通常、図１に示されているように、蓄積された成長のインジケータは、蛍光強度値であり、この理由は、蛍光マーカーの使用が、おそらくは、最も広範に使用されている標識方式であるということによる。但し、使用される特定の標識及び／又は検出方式に応じて、その他のインジケータを使用することも可能であることを理解されたい。発生量又は蓄積された信号成長のその他の有用なインジケータの例は、ルミネッセンス強度、ケミルミネッセンス強度、バイオルミネッセンス強度、燐光強度、電荷移動、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘度、光散乱、放射線強度、反射率、透過率、及び吸収率を含む。又、サイクルの定義も、時間、プロセスサイクル、単位動作サイクル、及び再生サイクルを包含可能である。
【００２３】
本発明によれば、キネティックＰＣＲ増幅曲線の温度シフトについて補正するプロセス１００のある観点は、図５を参照して説明可能である。段階１１０において、曲線を表す実験データセットを受信するか、さもなければ、取得する。又、温度シフトが発生したサイクルも識別する。通常、このサイクルの値は、先験的に判明しており、例えば、データを供給する装置又は機器によって記録される。プロットされたＰＣＲデータセットの例が図１、図３、及び図４に示されており、この場合に、ｙ軸及びｘ軸は、それぞれ、ＰＣＲ曲線における蛍光強度及びサイクル数を表している。特定の態様においては、データセットは、連続的であると共に軸に沿って均一に離隔したデータを含むことを要する。
【００２４】
サーモサイクラなどのＰＣＲデータ取得装置内に存在するインテリジェンスモジュール（例えば、命令を実行するプロセッサ）内にプロセス１００を実装するケースにおいては、データセットは、データの収集に伴って、リアルタイムでインテリジェンスモジュールに供給可能であり、或いは、メモリユニット又はバッファ内に保存し、実験が完了した後にインテリジェンスモジュールに供給することも可能である。同様に、データセットは、（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなどの）ネットワーク接続又は取得装置に対する（例えば、ＵＳＢ又はその他の直接的な有線又は無線接続などの）直接接続を介して、デスクトップコンピュータやその他のコンピュータシステムなどの別個のシステムに供給することも可能であり、或いは、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、携帯型ＵＳＢドライブ、又はこれらに類似したものなどの携帯型媒体上において供給することも可能である。特定の態様においては、データセットは、座標値のペア（又は、２次元ベクトル）を具備するデータポイントを含む。ＰＣＲデータの場合には、座標値のペアは、通常、サイクル数と蛍光強度値を表す。段階１１０においてデータセットを受信又は取得した後に、データセットを更に分析し、例えば、検定の際の温度シフトについて補正可能である。
【００２５】
段階１２０において、例えば、サイクル１から最終サイクルまでのデータセットに基づいて、第１近似を演算する。この段階においては、ある態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセス又はその他の回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用し、データセットを表す曲線の近似を見出している。又、後程詳述するように、段階１２０においては、データセットに基づいて、第１近似とは異なる第２近似をも演算する。
【００２６】
ある態様によれば、その内部に内蔵されたステップ関数を有する非線形モデルの信頼域を使用している。ある態様によれば、「ＰＣＲ  Ｅｌｂｏｗ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｉｇｍｏｉｄ」という名称の米国特許出願第１１／５３３，２９１号及び「ＰＣＲ  Ｅｌｂｏｗ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｑｕａｄｒａｔｉｃ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｉｇｍｏｉｄ」という名称の米国特許出願第１１／８６１，１８８号に提示されたダブルシグモイドモデルに基づいて構築することにより、次の式１に規定された関数を第１非線形モデルとして使用している。
【００２７】
【数１】
2010015546.tif 000003
式１  非線形モデル
【００２８】
式１において、｛ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ｝は、モデル係数であり、ｃａｃは、アニーリング温度が変化したサイクル数である。ｃａｃ値は、既知であり、且つ、システムによって供給される。係数「ｈ」は、ジャンプ不連続部の大きさを表す。（例えば、後程詳述するＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法などの）非線形回帰法を使用し、非線形モデルに対応する係数を導出する。非線形回帰は、通常、アプリケーションに固有である適切な大域的収束のために、初期係数の組を必要とする。回帰プロセス及びパラメータ決定の詳細については、更に詳しく後述する。
【００２９】
ある態様においては、式２に定義されたＵｎｉｔＳｔｅｐ関数を使用する。
【００３０】
【数２】
2010015546.tif 000004
式２  ＵｎｉｔＳｔｅｐ関数
【００３１】
ある態様によれば、第２モデルを式３のように規定している。
【００３２】
【数３】
2010015546.tif 000005
式３  追加の非線形モデル
【００３３】
ある観点においては、第２非線形モデルを使用し、標的を有していない反応井戸から生成された蛍光データを正確に表現している。（例えば、最小二乗ＱＲＤフィットやその他の回帰法などの）非線形回帰法を使用し、第２非線形モデルに対応する係数を導出する。
【００３４】
厳格な数学的観点においては、且つ、前述の態様の式において観察可能であるように、本発明の方法において実装される第２関数は、非線形関数ではなく、線形関数と表記可能であろう。但し、本発明の方法においては、この第２関数を非線形関数として取り扱っているため、本特許出願の文脈においては、これを非線形関数と表記する。
【００３５】
ある態様によれば、段階１３０において、式１に規定されたモデルと式３に規定されたモデルの間において選択を実行する。式１に規定されたモデルと式３に規定されたモデルの間の選択は、特定の観点においては、非パラメトリック情報理論に基づいた方法を使用して実行される。ある態様においては、式４に定義された改良型Ａｋａｉｋｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（ａｉｃ）を非線形回帰モデル（式１及び２）のそれぞれのものについて算出している。この態様においては、最小の係数を有する回帰モデルがベストフィットであると仮定している。ある観点においては、バイアス値を式３によって規定されたモデルから減算している。このバイアスにより、成長を伴わないサンプルを正確に検出可能である。バイアス値は、０（バイアスなし）〜約５０の範囲をとることができる。特定の観点においては、約１０のバイアスを減算している。
【００３６】
【数４】
2010015546.tif 000006
式４  改良型Ａｋａｉｋｅ情報係数
【００３７】
式４において、
【００３８】
【数５】
2010015546.tif 000007
【００３９】
は、予測残差であり、ｎは、蛍光取得サイクルの数であり、且つ、ｍは、モデルの自由度である（例えば、式１の場合には、８であり、式３の場合には、３である）。
【００４０】
ある態様によれば、段階１４０において、（例えば、Ｒ2などの）適合度統計値を算出し、モデル式が実際に蛍光データにマッチングしていることを検証する。この統計値が、予め定義された範囲を外れている場合には、モデルは、収束しておらず、従って、蛍光の不連続部補正を実行しない。例えば、ある観点においては、Ｒ2＜０．８である場合に、収束は実現されない。
【００４１】
Ｒ2値は、未加工の曲線（蛍光データ）及び推定モデルとの関係において演算される。ある観点においては、Ｒ2値を演算するための式は、次のように付与される。
【００４２】
【数６】
2010015546.tif 000008
【００４３】
ここで、ｙは、未加工のデータ曲線を表し、ｆ（ｘ）は、モデル化された曲線を表し、
【数７】
2010015546.tif 000009
は、未加工のデータ曲線の平均値を表し、且つ、ｎは、未加工のデータ曲線の（サイクル数を単位とする）長さを表す。
【００４４】
ある態様によれば、段階１５０において、いずれが選択されたのかに応じて、式１又は式３から、ｈ係数の信頼区間を所与の（例えば、９０％〜９９．９％の間の９５％などの）信頼レベルにおいて算出する。この信頼区間が値ゼロを含む場合には、モデルは、過剰決定パラメータとしての係数ｈを具備する。このようなケースにおいては、データ内の不連続部は識別されず、従って、蛍光の不連続部補正は不要である。ｈ係数の信頼区間演算は、選択されたモデル及びモデルの標準誤差に依存している。特定の態様においては、信頼区間の幅を次のように決定している。
【００４５】
【数８】
2010015546.tif 000010
【００４６】
ここで、１．９６は、９５％の信頼を表し、Ｈ−１は、ｈ係数のヘッセ行列の逆行列を表し、且つ、ｓｔｄＥｒｒｏｒは、選択されたモデルの標準誤差を表す。ヘッセ行列は、次のように演算される。
【００４７】
【数９】
2010015546.tif 000011
【００４８】
ここで、Ｊは、ヤコビ行列であり、ＪＴは、ヤコビ転置行列である。ヤコビは、すべての蛍光サイクルにおけるそれぞれのモデル係数の一次偏微分係数の評価である。標準誤差は、次のように演算される。
【００４９】
【数１０】
2010015546.tif 000012
【００５０】
ここで、ｙは、未加工の曲線を表し、ｆ（ｘ）は、モデル化された曲線を表し、且つ、ｎは、曲線の長さを表す。信頼区間の下限及び上限は、ｈ±ｃｉとして演算され、ここで、ｈの値は、推定モデルによって付与される。
【００５１】
段階１４０及び段階１５０（段階１６５を含む）は、相互交換可能であり、且つ、いずれも任意選択であることを理解されたい。
【００５２】
ある態様によれば、段階１７０において、ステップ又はシフト補正済みのデータセットを生成する。ある観点においては、係数ｈをゼロに等しくなるように設定することによって選択されたモデルから得られた値により、未加工の蛍光強度データ値を置換している。ある観点においては、アニーリング温度の変化の前に発生するサイクルについて置換を実行し、これにより、ジャンプ不連続部を効果的に除去すると共に滑らかな遷移を保証している。ある観点においては、例えば、サイクル１〜サイクルｃａｃ＋１のように、第１サイクルから始まってアニーリング温度の変化が発生したサイクルの後のサイクルを含むものまで、置換を実行している。
【００５３】
段階１７５において、例えば、表示又は更なる処理のために、変更されたシフト補正済みのデータセットを返す。例えば、補正済みの曲線を処理してＣｔ値を決定可能であり、且つ、結果（シフト補正済みのデータ及び／又はＣｔ値）を、例えば、分析を実行したシステムに、或いは、分析を要求した別個のシステムに返すことができる。図５の分析を実行したシステムに結合されたモニタ画面又はプリンタなどの表示装置によってグラフィカルな表示を生成可能であり、或いは、表示装置上においてレンダリングするべく別個のシステムにデータを供給することも可能である。Ｃｔ値は、補正済みのデータセットを使用して様々な方法に従って決定可能である。例えば、ある観点においては、米国特許出願第１１／３１６，３１５号及び第１１／３４９，５５０号の開示内容を使用し、Ｃｔ値を決定可能である。
【００５４】
ある態様においては、式１には、係数の３つの組を導出するための３つの異なる開始条件を提供し、且つ、式３には、係数の単一の組を導出するための開始条件の単一の組を提供している。この態様においては、前述のように、係数の４つの導出された組を使用して式４を処理し、最小のａｉｃ値を有するモデルを決定する。プロセスをモデル化するべく使用される非線形式のそれぞれのものごとに、異なる開始条件を使用可能であることを理解されたい。特定の態様においては、開始条件は、経験的に決定される。
【００５５】
図６の段階５０２〜段階５２４は、データセットの曲線を近似すると共にフィット関数のパラメータを決定するプロセスフローを示す。ある態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）法を使用し、曲線のポイント上におけるデータセットの安定した曲線近似を算出する。ＬＭ法は、非線形回帰プロセスであり、これは、非線形関数とデータセットの間の距離を最小化する反復的な技法である。このプロセスは、とうげ点プロセスとガウス−ニュートンプロセスの組み合わせのように動作し、現在の近似が良好にフィットしない場合には、とうげ点プロセスのように動作するが（相対的に低速であるが、相対的に信頼性の高い収束）、現在の近似が正確になるのに伴って、ガウス−ニュートンプロセスのように動作することになる（相対的に高速であるが、相対的に信頼性の乏しい収束）。
【００５６】
一般に、ＬＭ回帰法は、様々な入力を必要とすると共に出力を供給するアルゴリズムを含む。ある観点においては、入力は、処理対象のデータセットと、データをフィッティングするのに使用される関数と、関数のパラメータ又は変数の初期推定値と、を含む。出力は、関数とデータセットの間の距離を極小化する関数のパラメータの組を含む。
【００５７】
ある態様によれば、フィット関数は、次の形態のダブルシグモイドである。
【００５８】
【数１１】
2010015546.tif 000013
【００５９】
この式のフィット関数としての選択は、一般的なＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線がとり得る様々な曲線形状にフィットするその柔軟性及びその能力に基づくものである。当業者は、前述のフィット関数の変形又はその他のフィット関数を必要に応じて使用可能であることを理解するであろう。例えば、ある態様においては、式１が使用される。
【００６０】
ダブルシグモイド式（５）は、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇという７つのパラメータを具備し、式１は、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈという８つのパラメータを具備する。この式は、定数、スロープ、及びダブルシグモイドの合計に分解可能である。ダブルシグモイド自体は、２つのシグモイドの乗算である。図７は、ダブルシグモイド式（５）の分解を示す。パラメータｄ、ｅ、ｆ、及びｇは、２つのシグモイドの形状を決定する。最終的な曲線に対するこれらの影響を示すべく、次の単一のシグモイドを検討してみよう。
【００６１】
【数１２】
2010015546.tif 000014
【００６２】
ここで、パラメータｄは、曲線の「鋭さ」を決定し、且つ、パラメータｅは、変曲点のｘ値を決定する。図８は、曲線に対するパラメータｄの、そして、変曲点のｘ値の位置に対するパラメータｅの影響を示す。次の表１は、ダブルシグモイド曲線に対するパラメータの影響を示している。
【００６３】
【表１】
2010015546.tif 000015
【００６４】
ある観点においては、曲線が非現実的な形状をとることを防止するべく、ダブルシグモイド式の「鋭さ」パラメータｄ及びｆを制限する必要がある。従って、ある観点においては、ｄ＜−１又はｄ＞１．１、或いは、ｆ＜−１又はｆ＞１．１におけるすべての反復を不成功と見なしている。その他の態様においては、パラメータｄ及びｆに対する異なる制限を使用可能である。
【００６５】
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、反復的なアルゴリズムであるため、通常、フィットのための関数パラメータの初期推定値が必要である。初期推定値が良好であるほど、近似が良好になり、且つ、アルゴリズムが局所的な最小値に向かって収束する確率が低下する。ダブルシグモイド関数の複雑性及びＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線の様々な形状に起因し、アルゴリズムがしばしば局所的な最小値に向かって収束することを防止するには、すべてのパラメータ用の１つの初期推定値では、十分ではない可能性がある。従って、ある観点においては、初期パラメータの複数(例えば、３つ以上）の組を入力し、且つ、最良の結果を保持している。ある観点においては、パラメータの大部分を、使用されるパラメータの複数の組にわたって一定に保持しており、パラメータｃ、ｄ、及ｆのみが複数のパラメータセットのそれぞれのものについて異なるものであってよい。図９は、異なるパラメータセットにおける３つの曲線形状の例を示す。これらのパラメータの３つの組の選択肢は、ＰＣＲデータを表す曲線の３つの可能な異なる形状を示す。パラメータの３つを上回る数の組を処理し、且つ、最良の結果を保持可能であることを理解されたい。
【００６６】
図６に示されているように、段階５１０において、ＬＭ法の初期入力パラメータを識別する。これらのパラメータは、オペレータによって入力可能であり、或いは、算出することも可能である。ある観点によれば、後述するように、段階５０２、５０４、及び５０６に従ってパラメータを決定又は設定している。
【００６７】
初期パラメータ（ａ）の算出：パラメータ（ａ）は、ベースラインの高さであり、この値は、初期パラメータのすべての組について同一である。ある観点においては、段階５０４において、データセットから、例えば、蛍光値などの３番目に小さいｙ軸値をパラメータ（ａ）に割り当てている。これにより、安定した計算が実現する。当然のことながら、その他の態様においては、必要に応じて、最低のｙ軸値や２番目に小さい値などの任意のその他の蛍光値をパラメータ（ａ）に割当可能である。
【００６８】
初期パラメータ（ｂ）の計算：パラメータ（ｂ）は、ベースライン及びプラトーのスロープである。この値は、初期パラメータのすべての組について同一である。ある観点においては、段階５０２において、０．０１という固定値を（ｂ）に割り当てており、これは、理想的には、スロープが存在するべきではないという理由による。その他の態様においては、例えば、０〜約０．５の範囲の値などの異なる値をパラメータ（ｂ）に割り当て可能である。ある観点においては、値（ｂ）は、ＣＡＣ＋１からベースラインの末尾までのベースラインのスロープを表す。
【００６９】
初期パラメータ（ｃ）の計算：パラメータ（ｃ）は、プラトーの高さからベースラインの高さを減算したものを意味しており、これは、ＡＦＩ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ）と表記される。ある観点においては、パラメータの第１の組については、ｃ＝ＡＦＩ＋２であり、最後の２つのパラメータについては、ｃ＝ＡＦＩである。これが図９に示されており、この場合には、最後の２つのパラメータの組については、ｃ＝ＡＦＩであり、パラメータの最初の組については、ｃ＝ＡＦＩ＋２である。この変化は、パラメータの第１の組によってモデル化された曲線の形状に起因するものであり、これは、プラトーを具備していない。
【００７０】
パラメータ（ｄ）及び（ｆ）の計算：パラメータ（ｄ）及び（ｆ）は、２つのシグモイドの鋭さを定義している。これらのパラメータにおける曲線に基づいて近似を付与する方法は存在しないことから、ある観点においては、段階５０２において、３つの代表的な固定値を使用している。その他の固定された又は固定されていない値をパラメータ（ｄ）及び／又は（ｆ）に使用することも可能であることを理解されたい。これらのペアは、遭遇するＰＣＲ曲線の最も共通的な形状をモデル化する。次の表２は、図９に示されたパラメータの異なる組における（ｄ）及び（ｇ）の値を示す。
【００７１】
【表２】
2010015546.tif 000016
【００７２】
パラメータ（ｅ）及び（ｇ）の計算：段階５０６において、パラメータ（ｅ）及び（ｇ）を決定する。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、２つのシグモイドの変曲点を定義している。ある観点においては、これらは、いずれも、すべての初期パラメータセットにわたって、同一の値をとる。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、同一又は異なる値を具備可能である。近似を見出すべく、ある観点においては、例えば、蛍光などの強度の平均を上回る第１ポイントのｘ値を使用している（これは、スパイクではない）。この態様に従って（ｅ）及び（ｇ）の値を決定するプロセスが図１０に示されており、且つ、以下、これについて説明する。この態様に従ってパラメータ（ｅ）及び（ｇ）及びその他のパラメータの値を決定するプロセスの更に詳細な説明は、米国特許出願第１１／３１６，３１５号に見出すことができる。
【００７３】
図１０を参照すれば、まず、（例えば、蛍光強度などの）曲線の平均を決定する。次に、平均を上回る第１データポイントを識別する。次いで、ａ．そのポイントが、曲線の、例えば、最初の５サイクル内などのような開始点の近傍に位置していないかどうか、ｂ．そのポイントが、曲線の、例えば、最後の５つのサイクル内などのような末尾の近傍に位置していないかどうか、並びに、ｃ．そのポイントの周り（例えば、その周りの２ポイントの半径内）の微分係数が、符号の変化を示していないかどうかを決定する。これらが変化を示している場合には、そのポイントは、スパイクである可能性が高く、且つ、従って、拒絶することを要する。
【００７４】
別の態様においては、係数（ｅ）及び（ｇ）の決定において、ｃａｃサイクルの後のサイクルの蛍光値のみを検討している。従って、近似を見出すべく、ｃａｃから最後のサイクルまでのサイクルの、例えば、蛍光などの強度の平均を上回る（スパイクではない）第１ポイントのｘ値を使用する。まず、（サイクルｃａｃから最後のサイクルまでの）曲線の平均を決定し、且つ、平均を上回る第１ポイントを決定する。このようなポイントが見出されない場合には、ある観点においては、未加工の曲線の長さの２／３を検討する。
【００７５】
次の表３は、ある観点による図９において使用される初期パラメータ値の例を示す。
【００７６】
【表３】
2010015546.tif 000017
【００７７】
図６を再度参照すれば、段階５１０において、すべてのパラメータが設定されたら、入力されたデータセット、関数、及びパラメータを使用し、ＬＭプロセス５２０を実行する。従来、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、非線形最小二乗問題を解決するべく使用されている。従来のＬＭ法は、曲線近似とデータセットの間の誤差の二乗の合計として定義された距離尺度を算出している。しかしながら、二乗の合計を極小化する場合には、異常値の距離がスパイクではないデータポイントの距離を上回っていることから、異常値に対して大きな重みが付与されることになり、この結果、しばしば、不適切な曲線、又は望ましくない曲線が得られる。従って、本発明のある観点によれば、絶対誤差の合計を極小化することにより、近似とデータセットの間の距離を演算しており、この理由は、この場合には、大きな重みが異常値に対して付与されないためである。この態様においては、近似とデータの間の距離は、次式によって付与される。
【００７８】
【数１３】
2010015546.tif 000018
【００７９】
上述のように、ある態様においては、段階５２２及び５２４に示されているように、初期パラメータの複数（例えば、３つ）の組のそれぞれのものを入力して処理した後に、最良の結果を保持しており、この場合に、最良の結果とは、式（７）における最も小さい又は最小の距離を提供するパラメータセットである。ある観点においては、パラメータの大部分をパラメータの複数の組にわたって一定に保持しており、パラメータのそれぞれの組について異なることができるのは、ｃ、ｄ、及びｆのみである。任意の数の初期パラメータセットを使用可能であることを理解されたい。
【００８０】
図１１は、本発明によるパラメータの組におけるＬＭプロセス５２０のプロセスフローを示す。前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、とうげ点プロセスのように、又はガウス−ニュートンプロセスのように動作可能である。この動作は、減衰係数λに依存している。λが大きいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、とうげ点プロセスのように動作する。一方、λが小さいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、ガウス−ニュートンプロセスのように動作することになる。ある観点においては、λは、０．００１から始まっている。λは、約０．０００００１〜約１．０などの任意のその他の値から始まることも可能であることを理解されたい。
【００８１】
前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、反復的な技法である。ある観点によれば、図１１に示されているように、それぞれの反復において、次の段階を次実行している。
【００８２】
１．先行する近似のヘッセ行列（Ｈ）を算出する。
【００８３】
２．先行する近似の転置ヤコビ行列（ＪT）を算出する。
【００８４】
３．先行する近似の距離ベクトル（ｄ）を算出する。
【００８５】
４．現在の減衰係数λにより、次のように、ヘッセ行列の対角項を増大させる。
【００８６】
【数１４】
2010015546.tif 000019
【００８７】
５．増大した式を次のように解く。
【００８８】
【数１５】
2010015546.tif 000020
【００８９】
６．増大した式の解ｘを関数のパラメータに追加する。
【００９０】
７．新しい近似及び曲線の間の距離を算出する。
【００９１】
８．このパラメータの新しい組に伴う距離が以前のパラメータの組に伴う距離を下回っている場合には、・その反復は成功であると見なされ、・新しいパラメータの組を保持又は保存し、且つ、・例えば、係数１０だけ、減衰係数λを低減する。
【００９２】
新しいパラメータの組に伴う距離が以前のパラメータの組に伴う距離を上回っている場合には、・その反復は失敗であると見なされ、・新しいパラメータの組を破棄し、且つ、・例えば、係数１０だけ、減衰係数λを増大させる。
【００９３】
ある観点においては、図１１のＬＭプロセスは、次の基準の中の１つのものが実現される時点まで反復される。
【００９４】
１．既定の回数Ｎだけ既に反復されている。この第１基準は、アルゴリズムが無制限に反復されることを防止する。例えば、図１０に示されたある観点においては、既定の反復値Ｎは、１００である。アルゴリズムが収束可能である場合には、１００回の反復は、アルゴリズムが収束するのに十分であるはずである。一般に、Ｎは、１０未満から１００以上の範囲をとることができる。
【００９５】
２．２つの成功した反復の間の距離の差が、例えば、０．０００１などの閾値を下回っている。差が非常に小さくなった際には、所望の精度が実現されており、解は、それ以上大幅に良好にはなることはないことから、反復を継続するのは無意味である。
【００９６】
３．減衰係数λが既定の値を超過し、例えば、１０20を上回っている。λが非常に大きくなった際には、アルゴリズムは、現在の解よりも良好に収束することはなく、従って、反復を継続するのは無意味である。一般に、規定値は、１０20を大幅に下回る又は上回るものであってよい。
【００９７】
別の態様によれば、使用するＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、次の式１０に規定された式と等価である。初期条件ｚ0及び（例えば、既定により、１０-3に設定される）精度レベルｔｏｌを有するベクトル関数
【００９８】
【数１６】
2010015546.tif 000021
【００９９】
が付与された場合に、式１０は、真である。関数Ｊ（ｚ）は、関数ｆ（ｚ）のヤコビ行列として定義される。変数ｍａｘｉｔｅｒは、反復の最大数である（例えば、既定により、１００に設定される）。変数λは、回帰における減衰係数である。
【０１００】
【数１７】
2010015546.tif 000022
式１０  Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｔｄｔ非線形回帰
【０１０１】
式１０における逆行列は、ＱＲ分解によって取得される。ある観点においては、ＱＲ分解は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｅ．（編集）の「ＬＡＰＡＣＫ  Ｕｓｅｒｓ’  Ｇｕｉｄｅ」（第３版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ：  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、１９９９年）のＤＧＥＬＳ法に類似している。逆行列を決定不能である場合には、λに２（又は、その他の値）を乗算して回帰を継続する。
【０１０２】
本発明の方法、システム、及びコンピュータ可読媒体の特定の態様においては、第１及び第２近似のそれぞれのものの情報係数を決定する段階は、第１及び第２近似のそれぞれのもののＡＩＣ（Ａｋａｉｋｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）値を算出する段階を包含可能である。
【０１０３】
特定の態様においては、本発明による方法、システム、及びコンピュータ可読媒体は、第２非線形関数について算出されたＡＩＣ値からバイアス値を減算する段階を更に包含可能である。
【０１０４】
本発明の方法、システム、及びコンピュータ可読媒体の特定の態様においては、情報係数に基づいて近似の中の１つものを選択する段階は、最低のＡＩＣ値を具備する近似を選択する段階を含む。
【０１０５】
本発明の方法及びコンピュータ可読媒体の特定の態様においては、データセットは、キネティックポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの成長曲線を表すことが可能であり、この場合に、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積及びサイクル数を表すことができる。
【０１０６】
本発明の方法及びコンピュータ可読媒体の特定の態様においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネッセンス強度値、ケミルミネッセンス強度値、燐光強度値、電荷移動値、バイオルミネッセンス強度値、又は吸収率値の中の１つのものによって表すことができる。
【０１０７】
本発明の方法及びコンピュータ可読媒体の特定の態様においては、データセットは、キネティックポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセス、バクテリアプロセス、酵素プロセス、又はバインディングプロセスの成長曲線を表すことが可能である。
【０１０８】
本発明による特定の態様においては、置換されるデータセットの部分は、第１データポイントから始まってステップ型不連続部が発生するデータポイントを含むものまでのデータセットの部分を包含可能である。
【０１０９】
又、インテリジェンスモジュールは、選択の後に、選択された近似の適合度の値を算出し、且つ、適合度の値が閾値を上回る場合にのみ、継続するべく更に適合可能である。
【０１１０】
本発明によるシステムの特定の態様においては、インテリジェンスモジュールは、第２非線形関数について算出されたＡＩＣ値からバイアス値を減算するべく更に適合可能である。
【０１１１】
本発明によるシステムの特定の態様においては、情報係数に基づいて近似の中の１つのものを選択する段階は、最低のＡＩＣ値を具備する近似を選択する段階を包含可能である。
【０１１２】
本発明によるシステムの特定の態様においては、キネティックＰＣＲ分析モジュールは、キネティックサーモサイクラ装置内に存在可能であり、この場合に、インテリジェンスモジュールは、分析モジュールに通信可能に結合されたプロセッサを包含可能である。
【０１１３】
本発明によるシステムの特定の態様においては、インテリジェンスモジュールは、ネットワーク接続又は直接接続の中の１つのものによって分析モジュールに結合されたコンピュータシステム内に存在するプロセッサを包含可能である。
【０１１４】
本発明によるシステムの特定の態様においては、置換されるデータセットの部分は、ステップ型不連続部が発生したデータポイントの後のデータポイントを包含可能である。
【０１１５】
本発明によるコンピュータ可読媒体の特定の態様においては、置換されるデータセットの部分は、ステップ型不連続部が発生したデータポイントの後のデータポイントを包含可能である。
【０１１６】
本発明による方法の特定の態様においては、置換されるデータセットの部分は、ステップ型不連続部が発生したデータポイントの後のデータポイントを包含可能である。
【０１１７】
特定の態様においては、本発明による方法は、限定を伴うことなしに、キーボード、マウス、及びこれらに類似したものなどのデータセットを入力するための入力装置と、モニタなどの曲線の領域内の関心の対象である特定のポイントを表すための表示装置と、ＣＰＵなどの方法のそれぞれの段階を実行するのに必要な処理装置と、モデムなどのネットワークインターフェイスと、データセットを保存するためのデータストレージ装置と、プロセッサ上において稼働するコンピュータコードと、これらに類似したものと、を含む従来のパーソナルコンピュータシステムを使用することによって実装可能である。更には、方法は、本発明によるＰＣＲ装置内において実装することも可能である。
【０１１８】
本発明によるシステムの一例が図１６〜図１７に示されている。図１６は、本発明の方法及びシステムを実装するべく使用可能なソフトウェア及びハードウェアリソースの間の関係を説明する概略ブロックダイアグラムを示す。図１７に示されたシステムは、サーモサイクラ装置内に配置可能なキネティックＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの一部であるインテリジェンスモジュールと、を有する。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接接続を介して、分析モジュールからインテリジェンスモジュールに、或いは、この反対方向に、転送される。データセットは、例えば、図５、図６、図１０、及び図１１に示されたフローチャートに従って処理可能である。これらのフローチャートは、例えば、図１６に示されたフローチャートに従って、コンピュータシステムのハードウェア上に保存されたソフトウェアによって便利に実装可能である。図１６を参照すれば、コンピュータシステム（２００）は、例えば、ＰＣＲ反応において得られた蛍光データを受信する受信手段（２１０）と、本発明の方法に従って前述のデータを処理する計算手段（２２０）と、計算手段によって得られた結果に従って前述のデータの一部を置換する適用手段（２３０）と、コンピュータ画面上に結果を表示する表示手段（２４９）と、を有することができる。図１７は、サーモサイクラ装置とコンピュータシステムの間のやり取りを示す。本システムは、サーモサイクラ装置内に配置可能であるキネティックＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの一部であるインテリジェンスモジュールと、を有する。データセット（ＰＣＲデータセット）は、分析モジュールからインテリジェンスモジュールに、或いは、この反対方向に、ネットワーク接続又は直接接続を介して転送される。データセットは、プロセッサ上において稼働すると共にインテリジェンスモジュールのストレージ装置内に保存されたコンピュータコードにより、図１６に従って処理され、且つ、処理の後に、分析モジュールのストレージ装置に返送可能であり、ここで、変更済みのデータを表示装置上に表示可能である。
【０１１９】
前述のように、本発明のシステム及び方法は、ポリメラーゼ連鎖反応データ内のステップ型不連続部を除去するために有用である。例えば、蛍光データを使用してポリメラーゼ連鎖反応をモニタリングする際には、本発明のシステム及び方法は、相対的に正確なデータを提供する。このようなデータは、反応をモニタリングするのに有用であるのみならず、ＰＣＲにおいて増幅された標的核酸の定量化又は得られたデータに応じたＰＣＲの反応条件の適合などの技術的な効果をも提供する。
【０１２０】
以下の例及び図は、本発明の理解を支援するべく提供されるものであり、本発明の真の範囲は、添付の請求項に記述されているとおりである。本発明の精神を逸脱することなしに、記述された手順における変更を実施可能であることを理解されたい。
【０１２１】
（例）
（ケース１）
これは、ＣＡＰ／ＣＴＭ  ＨＩＶモニタ検定からのＩＱＳ（ＨＥＸチャネル）蛍光データである。検定設計は、サイクル１５の後にジャンプ不連続部を具備する。図１２は、未加工の蛍光データ（点線）と、補正済みのデータ（実線）と、を示す。次の表４は、推定された係数と、対応する信頼区間と、を示す。ケース１のＲ2は、０．９９を上回っている。
【０１２２】
【表４】
2010015546.tif 000023
【０１２３】
（ケース２）
これは、実際の標的の増幅を伴わないＢ１９パルボウイルス標的チャネル（ＦＡＭチャネル）である。検定設計は、サイクル５の後にジャンプ不連続部を具備する。図１３は、未加工の蛍光データ（点線）と、補正済みのデータ（実線）と、を示す。次の表５は、推定されたモデル係数と、それらの対応する信頼区間と、を示す。ケース２のＲ2は、０．９４である。
【０１２４】
【表５】
2010015546.tif 000024
【０１２５】
（ケース３）
これは、ＨＢＶ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ（ＦＡＭチャネル）の標的である。この検定は、ジャンプ不連続部を具備しない。このケースにおける係数ｈの信頼区間は、ゼロを含むことになる。従って、不連続部の補正は不要である。図１４は、未加工のデータ（点線）と、補正済みのデータ（実線）と、を示す。次の表６は、推定されたモデル係数と、それらの対応する信頼区間と、を示す。ケース３のＲ2は、０．９９を上回っている。
【０１２６】
【表６】
2010015546.tif 000025
【０１２７】
（ケース４）
これは、高濃度（２．９×１０11ＩＵ／ｍｌ）のＢ１９パルボウイルスサンプル（ＦＡＭチャネル）である。検定設計は、サイクル５の後にジャンプ不連続部を具備するが、大きな複写数に起因し、不連続部は観察されない。前述の方法は、このケースを上手に取り扱うことができる。図１５は、未加工のデータ（点線）と、補正済みのデータ（実線）と、を示す。このケースにおける係数ｈの信頼区間はゼロを含む。次の表７は、推定されたモデル係数と、それらの対応する信頼区間と、を示す。ケース４のＲ2は、０．９９を上回る。
【０１２８】
【表７】
2010015546.tif 000026
【０１２９】
以上、例示目的で、且つ、特定の態様の観点で本発明について説明したが、本発明は、開示された態様に限定されないことを理解されたい。
【図１】
2010015546.tif 000039
【図２】
2010015546.tif 000040
【図３】
2010015546.tif 000041
【図４Ａ】
2010015546.tif 000042
【図４Ｂ】
2010015546.tif 000043
【図５】
2010015546.tif 000044
【図６Ａ】
2010015546.tif 000045
【図６Ｂ】
2010015546.tif 000046
【図６Ｃ】
2010015546.tif 000047
【図６Ｄ】
2010015546.tif 000048
【図６Ｅ】
2010015546.tif 000049
【図７】
2010015546.tif 000050
【図８】
2010015546.tif 000051
【図９】
2010015546.tif 000052
【図１０Ａ】
2010015546.tif 000053
【図１０Ｂ】
2010015546.tif 000054
【図１１Ａ】
2010015546.tif 000055
【図１１Ｂ】
2010015546.tif 000056
【図１１Ｃ】
2010015546.tif 000057
【図１１Ｄ】
2010015546.tif 000058
【図１２】
2010015546.tif 000059
【図１３】
2010015546.tif 000060
【図１４】
2010015546.tif 000061
【図１５】
2010015546.tif 000062
【図１６】
2010015546.tif 000063
【図１７】
2010015546.tif 000064
【外国語明細書】
2010015546000001.pdf