(57)【要約】      （修正有）【課題】診断薬などの標識物質に使用可能なレベルの高い発光活性を有するイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の提供、および、そのイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の簡便且つ効率的な製造方法の提供。【解決手段】特定アミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、別の特定アミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、ビオチン結合蛋白質とを、該システインを介して結合させ、イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、ビオチン結合蛋白質とが、該システインを介して結合している、イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
【請求項２】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、ビオチン結合蛋白質とが、該システインを介して結合している、イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
【請求項３】
システインを介しての結合が、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬を介しての結合である、請求項１または２に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
【請求項４】
システインのスルフヒドリル基と反応する官能基がマレイミド基である、請求項３に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
【請求項５】
ビオチン結合蛋白質が、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジンから選ばれた１種以上である、請求項１または２に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
【請求項６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、スルフヒドリル基と反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質とを反応させることを特徴とする、イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
【請求項７】
スルフヒドリル基と反応する官能基がマレイミド基である、請求項６に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
【請求項８】
スルフヒドリル基と反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質が、マレイミド基を有する架橋試薬とビオチン結合蛋白質とを、モル比で２：１〜５０：１の割合で反応させて得られたものである、請求項６に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
【請求項９】
マレイミド基を有する架橋試薬とビオチン結合蛋白質との反応が、１０〜３０℃、０．５〜２時間の反応である、請求項８に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
【請求項１０】
組換えイクオリンと、スルフヒドリル基と反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質との割合が、１：１〜１：１０（モル比）の範囲である、請求項６に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
【請求項１１】
組換えイクオリンと、スルフヒドリル基と反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質との反応が、４〜２０℃、０．５〜２時間の反応である、請求項６に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
【請求項１２】
ビオチン結合蛋白質が、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジンから選ばれた１種以上である、請求項６に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から５の何れか１項に記載の複合体を用いる分析方法。
【請求項１４】
請求項１から５の何れか１項に記載の複合体を含有する分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質とビオチン結合蛋白質との複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウムと特異的に反応し、瞬間発光する蛋白質であり、現在、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシン、およびベルボイン等が知られている。これらの発光蛋白質のカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く、その発光感度もまた、市販の検出装置においての検出感度が１ピコグラム以下と非常に高いものである。そのため、カルシウム結合型発光蛋白質は、このような特徴を活かし、細胞内カルシウムや血液中の微量カルシウムイオンの検出、定量に用いられている（例えば、非特許文献１を参照）。これらの発光蛋白質は、その発光がカルシウムイオンとの特異的結合によるものであるため、通常の化学発光で問題になるバックグランドがほとんどなく、且つ反応自体が瞬間発光で数秒以内に終了するため、短時間にシグナル対ノイズ比の高い結果を得ることができるという利点を有する。
【０００３】
さらに、その発光反応系は、生物発光と呼ばれる酵素発光反応であり、すべて生体内由来の成分で構成されているため、有害な化学発光物質等（例えばラジオアイソトープや発癌性化合物等）を含んでおらず安全性が高い。このため、当該発光蛋白質は、診断薬等における標識として応用されている。
【０００４】
これらの発光蛋白質を標識として用いる場合、発光蛋白質は、通常、被検体に特異的に結合する物質（以下「結合性物質」と言うことがある。）と発光蛋白質とが化学的に結合した複合体の形で使用される。結合性物質としては、酵素、レクチン、糖蛋白質、ペプチド、薬物、レセプター、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインA、プロテインG、ホルモン、核酸、および核酸結合蛋白質などが用いられている。
【０００５】
結合性物質と発光蛋白質との化学的な結合反応には、一般的に架橋試薬が用いられている。架橋試薬の中でも、反応基として、アミノ基と特異的に結合するＮＨＳエステルと、スルフヒドリル基と特異的に結合するマレイミド基とを有する架橋試薬は、それを用いた場合、該結合反応時における非特異的な結合や、発光蛋白質もしくは結合性物質同士の結合が起こり難いことから、一般に好ましく使用されている。
【０００６】
このＮＨＳエステルとマレイミド基とを有する架橋試薬（以下「２官能性架橋試薬」と言うことがある。）を用いて、発光蛋白質と結合性物質とを化学的に結合させる方法には以下の３通りがある。
（１）発光蛋白質のアミノ末端またはリジン残基の一級アミンに、２官能性架橋試薬のＮＨＳエステルを反応させ、結合性物質のスルフヒドリル基と２官能性架橋試薬のマレイミド基を反応させて、発光蛋白質と結合性物質とを結合させる方法（例えば、非特許文献２を参照）。
（２）結合性物質のアミノ末端またはリジン残基の一級アミンに、２官能性架橋試薬のＮＨＳエステルを反応させ、発光蛋白質のスルフヒドリル基と２官能性架橋試薬のマレイミド基を反応させて、発光蛋白質と結合性試薬とを結合させる方法。
（３）Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）などのスルフヒドリル活性化剤を用いてスルフヒドリル基をイクオリンのアミノ基に導入し、次いでこのイクオリンを結合性試薬と結合する方法（例えば、特許文献１〜３を参照）。
【非特許文献１】Blinks, J. R., Wier, W. G., Hess, P., and Prendergast, F.G., Prog. Biophys. Mol. Biol. 40: 1-114
【非特許文献２】Ｔ．Ｅｒｉｋａｋｕ、Ｓ Ｚｅｎｎｏ ａｎｄ Ｓ Ｉｎｏｕｙｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１７４：１３３１−１３３６
【特許文献１】特表平８−５０６８９７
【特許文献２】特開平１０−２５１３００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述の発光蛋白質と結合性物質とを化学的に結合させる方法のうち、（１）の方法でイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体（以下、イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体を「Ａ−ＢＰ複合体」と言うことがある。）を調製した場合、イクオリンの発光活性が著しく低下し、得られるＡ−ＢＰ複合体は、診断薬などの標識物質としては感度が低く実用的とは言い難かった。
【０００８】
（２）の方法でＡ−ＢＰ複合体を調製した場合には、イクオリンとビオチン結合蛋白質との反応性が低く、得られるＡ−ＢＰ複合体も発光活性が低いことから、イクオリンとビオチン結合蛋白質の結合方法としては効率の良い方法であるとは言い難かった。
【０００９】
一方（３）の方法であれば、イクオリンの発光活性を維持したまま、イクオリンとビオチン結合蛋白質とを結合させることも可能である。しかしながら、この方法は操作が煩雑で工程も多く、時間がかかった。さらに、得られたＡ−ＢＰ複合体を診断薬などの標識物質として使用するためには、スルフヒドリル基をイクオリンのアミノ基に導入する際に使用したスルフヒドリル活性化剤のうち余剰の未反応スルフヒドリル活性化剤を完全に除去する必要があり、その際、イクオリンやビオチン結合蛋白質をロスしやすかった。
【００１０】
ことほど左様に、従来技術では診断薬などの標識物質に使用可能な高い発光活性を有するＡ−ＢＰ複合体を、効率よく簡便に製造することは困難であった。即ち、斯様な状況においては、診断薬などの標識物質に好適な高い発光活性を有するＡ−ＢＰ複合体と、このＡ−ＢＰ複合体を効率よく製造する方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、ビオチン結合蛋白質とが、該システインを介して結合しているＡ−ＢＰ複合体が、診断薬などの標識物質に使用可能なレベルの高い発光活性を有すること、さらに前述の組換えイクオリンのいずれかと、スルフヒドリルと反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質とを反応させるＡ−ＢＰ複合体の製造方法であれば、高い発光活性を有するＡ−ＢＰ複合体を簡便且つ効率よく得られることなどを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、以下の構成を有する。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、ビオチン結合蛋白質とが、該システインを介して結合している、イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、ビオチン結合蛋白質とが、該システインを介して結合している、イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
（３）システインを介しての結合が、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬を介しての結合である、前記第１項または第２項に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
（４）システインのスルフヒドリル基と反応する官能基がマレイミド基である、前記第３項に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
（５）ビオチン結合蛋白質が、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジンから選ばれた１種以上である、前記第１項または第２項に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体。
（６）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、スルフヒドリル基と反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質とを反応させることを特徴とする、イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
（７）スルフヒドリル基と反応する官能基がマレイミド基である、前記第６項に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
（８）スルフヒドリルと反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質が、マレイミド基を有する架橋試薬とビオチン結合蛋白質とを、モル比で２：１〜５０：１の割合で反応させて得られたものである、前記第６項に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
（９）マレイミド基を有する架橋試薬とビオチン結合蛋白質との反応が、１０〜３０℃、０．５〜２時間の反応である、前記第８項に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
（１０）組換えイクオリンと、スルフヒドリルと反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質との割合が、１：１〜１：１０（モル比）の範囲である、前記第６項に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
（１１）組換えイクオリンと、スルフヒドリルと反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質との反応が、４〜２０℃、０．５〜２時間の反応である、前記第６項に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
（１２）ビオチン結合蛋白質が、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジンから選ばれた１種以上である、前記第６項に記載のイクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法。
（１３）前記第１項から第５項の何れか１項に記載の複合体を用いる分析方法。
（１４）前記第１項から第５項の何れか１項に記載の複合体を含有する分析用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＡ−ＢＰ複合体は、診断薬などの標識物質に使用可能なレベルの高い発光活性を有し、抗原の検出や測定などの検出シグナルとして有効である。本発明のＡ−ＢＰ複合体の製造方法であれば、高い発光活性を有するＡ−ＢＰ複合体を簡便且つ効率よく製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的にかつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
１．イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体
本発明に使用する組換えイクオリンの１つは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする。配列番号１のアミノ末端から４番目までのアミノ酸は、アミノ末端から順に、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒである。アミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたとは、ＶａｌとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれかにシステイン残基が挿入されていることを意味する。
【００１６】
システイン残基が挿入される位置は、上記のＶａｌとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれであっても構わないが、ＬｅｕとＴｈｒの間であることが好ましい。ＬｅｕとＴｈｒの間にシステイン残基が挿入されたアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００１７】
本発明に使用する組換えイクオリンのもう１つは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする。配列番号２のアミノ末端から６番目までのアミノ酸は、アミノ末端から順に、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒである。アミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたとは、ＡｌａとＡｓｎの間、ＡｓｎとＳｅｒの間、ＳｅｒとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれかにシステイン残基が挿入されていることを意味する。
【００１８】
システイン残基が挿入される位置は、上記のＡｌａとＡｓｎの間、ＡｓｎとＳｅｒの間、ＳｅｒとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれであっても構わないが、ＬｅｕとＴｈｒの間であることが好ましい。ＬｅｕとＴｈｒの間にシステイン残基が挿入されたアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００１９】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、天然型アポイクオリンのアミノ酸配列であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、遺伝子組換え法により生産されたアポイクオリン（以下「変異型アポイクオリン」ということがある。）のアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列へのシステインの導入は、公知の方法で行うことができ、具体的には、特開２００４−０００１４３に記載の方法を挙げることができる。
なお、天然型アポイクオリンと変異型アポイクオリンは、市販品を入手することも可能である。また、天然型アポイクオリンであれば、天然の発光クラゲから抽出、精製して入手することも可能である。変異型アポイクオリンは、発光クラゲからアポイクオリンのｃＤＮＡをクローニングし、そのｃＤＮＡを用い、かつ大腸菌を宿主とし、宿主の菌体内及び菌体外でのアポイクオリンを生産させ、抽出、精製するなどの方法により製造することも可能である。
【００２０】
本発明は、前述の組換えイクオリンのいずれかとビオチン結合蛋白質とが、導入されたシステインを介して結合しているＡ−ＢＰ複合体である。該システインを介した結合であれば、組換えイクオリンとビオチン結合蛋白質との結合様式は特に限定されるものではないが、本発明においては、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬が、該システインと結合し、この架橋試薬がさらにビオチン結合蛋白質と結合している形態であることが好ましい。即ち、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬を介して、組換えイクオリンとビオチン結合蛋白質とが結合していることが好ましい。
【００２１】
本発明に使用されるビオチン結合蛋白質は、ビオチンと特異的に結合する蛋白質であれば特に限定されるものではない。例えば卵白等から抽出されるグリコプロテインであるアビジンやＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉから単離されたストレプトアビジン、更にアビジンを脱グリコシル化したニュートラアビジンなどが挙げられる。これらはそれぞれ市販されており、容易に入手することができる。
【００２２】
システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬は、特に限定されるものではないが、具体的には、Ｎ-（４‐[ｐ-アジドサリシルアミド]ブチル）-３´-２´ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、１，４−ジ-（３´-[２´ピリジルジチオ]プロピオンアミド）ブタン、１，６−ヘキサン-ビス-ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）、スクシンイミジル３-（ブロモアセタミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ-スクシンイミジル３-（２-ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ-（α‐マレイミドアセトキシ）-スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ＭＢＳのスルホン化誘導体（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ＳＭＰＢのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−（Ｎ−マレイミド−ｎ−ヘキサノエート）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート、ビス−（マレイミド）メチルエステル、およびビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）などを挙げることができる。本発明においては、その中でもスルフヒドリル基と反応する官能基としてマレイミド基を有する架橋試薬が好ましい。
【００２３】
２．抗原測定方法
本発明のＡ−ＢＰ複合体は、高い発光強度を維持したままビオチン結合蛋白質と結合していることから、ビオチン−ビオチン結合蛋白質複合体を利用して、例えばイムノアッセイにおける抗原の検出や測定に好適に用いることができる。本発明の抗原の測定方法は、通常の方法によって行うことができる。具体的には、抗原と反応したビオチン標識抗体に本発明のＡ−ＢＰ複合体を結合させ、カルシウムイオンによって発光させることにより抗原を検出することができる。
【００２４】
３．抗原測定キット
本発明の抗原測定キットは、本発明のＡ−ＢＰを構成成分とするものであれば、それ以外の構成成分は特に限定されるものではない。本発明のキットには、さらにセレンテラジンもしくはその誘導体を含んでいてもよい。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。
【００２５】
４．イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体の製造方法
本発明のＡ−ＢＰ複合体の製造方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、スルフヒドリル基と反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質とを反応させることを特徴とするものである。
【００２６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、および配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンは、先の「１．イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体」において述べたものを用いればよい。
【００２７】
スルフヒドリル基と反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質（以下「スルフヒドリル反応性ビオチン結合蛋白質」と言うことがある。）は、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する物質とビオチン結合蛋白質とが化学反応により結合することにより、スルフヒドリル基と反応する官能基を具備するに至ったビオチン結合蛋白質である。本発明においてスルフヒドリル反応性ビオチン結合蛋白質は、特に限定されるものではないが、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬とビオチン結合蛋白質とが化学的に結合したものを挙げることができる。なお、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬とビオチン結合蛋白質とは、先の「１．イクオリンとビオチン結合蛋白質との複合体」において述べたものを用いればよい。
【００２８】
スルフヒドリル反応性ビオチン結合蛋白質の製造方法は、特に限定されるものではないが、具体例として、マレイミド基を有する架橋試薬を用いた場合について説明する。マレイミド基を有する架橋試薬とビオチン結合蛋白質とを反応させる際の割合は、モル比で１：１〜１００：１、好ましくは２：１〜５０：１、より好ましくは３：１〜３０：１の割合で反応させることが好ましい。この比率で反応させることにより、架橋試薬の非特異的な結合も少なく、マレイミド基を有する架橋試薬がビオチン結合蛋白質に効率よく結合するため好ましい。また、その際の反応温度と時間は、好ましくは４〜３０℃、０．５〜１８時間、特に好ましくは１０〜３０℃、０．５〜２時間である。この温度でこの時間反応することにより、短時間で効率よく、架橋試薬とビオチン結合蛋白質を結合させることができる。
また、あらかじめスルフヒドリル反応性を付与したビオチン化結合蛋白質が市販されており、それらを使用することもできる。
【００２９】
組換えイクオリンとスルフヒドリル反応性ビオチン結合蛋白質との反応条件は、特に限定されるものではないが、反応の際の組換えイクオリンとスルフヒドリル反応性ビオチン結合蛋白質との割合は、モル比で１：１〜１０：１の範囲であることが好ましい。この比率で反応させることにより、スルフヒドリル反応性ビオチン結合蛋白質と組換えイクオリンが効率よく結合する。また、その際の反応温度と時間は、好ましくは４〜３０℃、０．５〜１８時間、特に好ましくは４〜２０℃、０．５〜２時間である。この温度でこの時間反応することにより短時間で効率よく、スルフヒドリル反応性ビオチン結合蛋白質と組換えイクオリンを結合させることができる。
【００３０】
以下、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例において「％」は、特に断りが無い限り「重量％」を意味する。
【実施例】
【００３１】
実験例１：システイン導入アポイクオリンの製造
（１）システイン導入アポイクオリン発現ベクターの構築
先ず、ＰＣＲ法により、天然型アポイクオリンのＮ−末端のValがAla-Asn-Serで置換された変異型アポイクオリンの発現ベクターpiP-HE（Inouye et al., J. Biochem., 105(1989): 473-477  参照）から、アポイクオリン遺伝子のＮ−末端近傍にある制限酵素部位EcoRIが欠失したpiP-HEΔEを構築した。
次いで、piP-HEΔEを用いて、変異型アポイクオリンのＮ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステイン残基をＰＣＲ法で導入することにより、システイン挿入イクオリン遺伝子発現ベクターpiP-HE-Cys4を構築した。その具体的な構築プロセスの概略を図１に示す。
【００３２】
１）piP-HEΔEプラスミドの調製
０.１μgのpiP-HEプラスミドをテンプレートとし、ＰＣＲプライマーとしてOmpA1-XbaI（5'TGG-AAC-TCT-AGA-TAA-CGA-GGG-CAA-AAA 3', SEQ ID NO：3）およびOmpA1-HindIII（5'TCC-AAG-CTT-GGA-GTT-CGC-GGC-CTG 3', SEQ ID NO：4）を、各１μｇ用いた。
DNA Thermal Cycler（Perkin-Elmer社製）およびAmpli Taq DNAポリメラーゼを含むGeneAmp ＰＣＲ試薬キット（宝酒造社製）を用いて制限酵素XbaＩとHindIIIサイトとOmpAシグナル配列を含み、EcoRＩサイトを欠失したフラグメントをＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離、制限酵素XbaIとHindIIIで消化を行い、制限酵素部位EcoRIを欠失したXbaI-HindIIIフラグメントを取得した。一方、piP-HEプラスミドを制限酵素XbaIとHindIIIで消化し、アポイクオリン遺伝子を含むベクター部分をＤＮＡ精製キット（キアゲン社製）で単離した。これを増幅したXbaI-HindIIIフラグメントと連結し、このようにして得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、EcoRI部位を欠失したpiP-HEΔEプラスミドを単離した。遺伝子配列の確認は、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit（Applied Biosytems 社製）およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定した。EcoRI部位のみが欠失し、アミノ酸配列はもとの変異型と同一であった。
【００３３】
２）piP-HE-Cys4プラスミドの調製
０.１μgのpiP-HEΔEプラスミドをテンプレートとし、プライマーとしてCys4-AQ (5'GGC-AAG-CTT-TGT-ACT-AGT-GAC-TTC-GAC-AAC-CCA-AGA-TGG 3', SEQ ID NO：5)および630EcoRI-AQ (5'GCC-GAA-TTC-ATC-AGT-GTT-TTA-TTC-AAA 3', SEQ ID NO：6) を各１μg用いて、GeneAmp PCR 試薬キット（宝酒造社製）により制限酵素EcoRＩおよびHindIIIサイトを含む変異型アポイクオリンのＮ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステイン残基を有するフラグメントをＰＣＲ増幅した後、精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離し、次いで制限酵素HindIIIとEcoRIで消化して、変異型アポイクオリンのＮ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステイン残基を有するHindIII-EcoRIフラグメントを取得した。一方、piP-HEΔEプラスミドを制限酵素HindIIIとEcoRIで消化した後、プロモーターおよびOmpAシグナルペプチドを含むベクター側を単離した。次いで、これをHindIII-EcoRIフラグメントと連結し、このようにして得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、Ｎ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステインが導入された変異型アポイクオリン発現するpiP-HE-Cys4プラスミドを単離した。塩基配列を、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit (Applied Biosytems 社製)およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定し、このシステイン導入アポイクオリン（以下「Ｃｙｓ４−アポイクオリン」と言うことがある。）遺伝子を確認した。このＣｙｓ４−アポイクオリンのアミノ酸配列は配列番号４で示したものである。
【００３４】
（２）システイン導入アポイクオリン生産株の分離
宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を使用し、実施例１で作製した組換えプラスミドpiP-HE-Cys4を発現ベクターとし、常法により形質転換を実施した。形質転換体２０株をＬＢ（水１Ｌ中、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ，ｐＨ７.２）寒天培地にて３０℃で一晩培養した後、５mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌し、さらに３７℃で１６時間培養した。次いで、最も高い発光活性を有する菌株、即ち最も高いＣｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を選択し、高発光活性を有する菌株を大量培養用の種株とした。
【００３５】
（３）システイン導入アポイクオリン産生菌株の培養
Ｃｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を３０℃で一晩培養後、５０mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌した。さらに３０℃で８時間培養した後、新鮮ＬＢ液体培地２Ｌに移し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。菌体と培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）により分離した。菌体、培養液は両者とも発現したアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、Ｃｙｓ４−アポイクオリン精製の出発材料とした。
【００３６】
（４）菌体からのシステイン導入イクオリンの再生および精製
集菌した菌体は、還元剤のジチオスレイトール（和光純薬社製）２００mgを含む４００mLの緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）に懸濁した。菌体を氷冷下で２分間超音波破砕処理して破砕した後、２０分間遠心分離（１２０００×ｇ）して上澄み液を集めた。少量のメタノールに溶解した化学合成セレンテラジンを、Ｃｙｓ４−アポイクオリンの１.２倍のモル濃度になるように、上記の上澄み液に添加し、４℃で５時間以上放置した。得られた上澄み液を直ちに、カラム緩衝液（２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２cm×１０cm）に吸着させ、２８０nmでの溶出液の吸光度が０.０５以下になるまで０.１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液でカラムを洗浄した。次いで、カラムに吸着した未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンと再生Ｃｙｓ４−イクオリンの両者を含む画分を０.１Ｍ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出した。
【００３７】
再生Ｃｙｓ４−イクオリンと未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンとの分離は、ブチルセファロース４ファーストフローゲルクロマトグラフィーによって、次のように実施した。
Ｑ−セファロースカラムから溶出したオレンジ色の溶出液に、最終濃度が２Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加した。添加後、不溶性画分を遠心分離により除去した。次いで、２Ｍ  硫酸アンモニウムを含む上述のカラム緩衝液で平衡化したブチルセファロース４ファーストフロー（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８cm）にその上澄み液を加え、硫酸アンモニウムの２Ｍ〜１Ｍの直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有する、即ち再生Ｃｙｓ４−イクオリンを含むオレンジ色画分を収集した。一方、未再生のＣｙｓ４−アポイクオリンはカラム緩衝液でのみ溶出された。
【００３８】
精製画分の純度検定は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施した。その結果、精製画分について分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターで測定した結果、９８％以上であった。精製蛋白質濃度をウシ血清アルブミンを標品としてBradford法（バイオラッド社製）により決定したところ、２Ｌの培養菌体からの高純度Ｃｙｓ４−イクオリン収量は４４.６mgであった。
【００３９】
（５）培養液からのシステイン導入イクオリンの再生および精製
培養液から純度９８％以上のアポイクオリンを取得し、実験例１（４）に従ってイクオリンに再生し、精製した。精製されたイクオリンを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、実験例１（４）で得られたものと同じであった。培養液２Ｌから高純度Ｃｙｓ４−イクオリン１０.４mgが得られた。
【００４０】
実験例２：Ａ−ＢＰ複合体の製造−１（システイン導入イクオリンとストレプトアビジンとの複合体）
（１）スルフヒドリル反応性ストレプトアビジンの製造（ストレプトアビジンとマレイミド基を有する架橋試薬との結合）
６０μｇ（１ｎｍｏｌ）のストレプトアビジン(和光純薬製)を１４９μｌの０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、以降「緩衝液Ａ」と記載）に溶解したものに、緩衝液Ａにて１０ｍＭに調製したスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ、ＰＩＥＲＣＥ社）を１μｌ（スルホ−ＳＭＣＣ １０ｎｍｏｌ、混合条件：ストレプトアビジン／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１０）加え、４℃にて２時間反応させた。反応後、１０ｍＭグリシンを、１０μｌ（１００ｎｍｏｌ）加え２５℃にて１０分以上静置して、反応を停止した。未反応のスルホ−ＳＭＣＣをアミコンウルトラ−４スピンカラム（ミリポア社製、分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心して（日立製作所製、ＣＲ２０Ｂ２）除去し、ストレプトアビジンとマレイミド基を有する架橋試薬との結合体（以下「マレイミド化ＳＡ」と言うことがある。）を得た。
【００４１】
（２）システイン導入イクオリンとスルフヒドリル反応性ストレプトアビジン（マレイミド化ＳＡ）との反応
実験例１で製造した３．５ｍｇ／ｍｌのシステイン導入イクオリン８．８μｌ（８００ｐｍｏｌ）を７０μｌの緩衝液Ａに加え、更に実験例２（１）で製造したマレイミド化ＳＡ  ２５μｌ（８０ｐｍｏｌ）を加え、４℃にて２時間反応させた。反応後、１０ｍＭシステイン水溶液を２μｌ（２０ｎｍｏｌ）加え、システイン導入イクオリンとマレイミド化ＳＡとの複合体（以下「ＡＱ−Ｓ−ＳＡ」と言うことがある。）を得た。
ＡＱ−Ｓ−ＳＡに発光活性の低下はほとんど起こらず、９６％の発光活性を保持していた。
【００４２】
（３）ＡＱ−Ｓ−ＳＡによるα−フェトプロテインの生物発光イムノアッセイ
製造したＡＱ-Ｓ-ＳＡが、抗原の検出や測定などの検出シグナルとして有効であることを確認するため、ＡＱ-Ｓ-ＳＡを用いた免疫測定法で、血清中の肝癌マーカーである、α−フェトプロテイン（以下「ＡＦＰ」と言うことがある。）の検量線を作成した。
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
抗−ＡＦＰ抗体（クローンＮｏ．６Ｄ２、サブクラスＩｇＧ２ａ−κ、日本医学臨床検査研究所、以下「６Ｄ２」と言うことがある。）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて５μｇ／ｍｌに調製し、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェル分注し、室温にて一晩静置してコートした。
【００４３】
２）ポストコーティング
静置後、炭酸緩衝液を除去し、１％牛血清アルブミン（フラクションＶ、生化学工業）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、同仁化学研究所）、０．０５％アジ化ナトリウム（和光純薬工業）を含む１５０ｍＭ ＮａＣｌ（和光純薬工業）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（和光純薬工業）（以降ＴＢＳと記載）（以降ポストコーティング溶液と記載）を２００μｌ／ウェル分注、４℃にて一晩静置した。
【００４４】
３）ＡＦＰとビオチン標識抗−ＡＦＰ抗体の反応
ポストコーティング溶液を捨て、よく洗浄した後、１０％ブロックエース（大日本製薬）、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢＳ（以下「希釈液」と言うことがある。）で１１０μｇ／ｍｌ ＡＦＰ（Ｄａｋｏ）を希釈、１０ｐｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌまでの希釈系列を作製し、５０μｌ／ウェル分注した。そこへあらかじめビオチン標識した抗−ＡＦＰ抗体(日本医学臨床検査研究所製、クローンＮｏ．１Ｄ５、サブクラスＩｇＧ１−κ、以下「ビオチン-１Ｄ５」と言うことがある。)を希釈液で７４．９ｎｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェル分注後、３０℃にて１時間静置した。
【００４５】
４）ＡＱ-Ｓ-ＳＡの反応
１時間反応後、ＡＦＰとビオチン−１Ｄ５の反応液を捨て、よく洗浄した後、希釈液で１ｐｍｏｌ／ｍｌに希釈したＡＱ-Ｓ-ＳＡを１００μｌ／ウェル分注し、３０℃にて３０分静置した。
【００４６】
５）イクオリンによる発光の測定
３０分静置後、反応液を捨て、よく洗浄した後、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）にて、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル注入して発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）を算出した。
【００４７】
ＡＱ−Ｓ−ＳＡを用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによる検量線を図２に示した。その結果、ＡＦＰの検出限界は３×１０−２ｎｇ／ｍｌ、ダイナミックレンジは３×１０−２〜１０２ｎｇ／ｍｌを示した。バックグランドが低く抑えられており、高感度なイムノアッセイに優れていることが示された。
【００４８】
実験例３：Ａ−ＢＰ複合体の製造２（システイン導入イクオリンとスルフヒドリル反応性ストレプトアビジン（マレイミド活性化ストレプトアビジン）との複合体）
７７．４μｌの緩衝液Ａに３７．８ｎｍｏｌ／ｍｌマレイミド活性化ストレプトアビジン（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製）を３５０μｌ（１３．２ｎｍｏｌ）と実験例１で製造した４．０ｍｇ／ｍｌのシステイン導入イクオリンを７２．６μｌ（１３．２ｎｍｏｌ）を加え、４℃にて２時間反応させた。反応後、１０ｍＭシステインを５μｌ（５０ｎｍｏｌ）加えた。得られたイクオリン−ストレプトアビジン複合体をＡＱ−Ｓ−ＳＡ−２とした。
ＡＱ−Ｓ−ＳＡ−２に発光活性の低下はほとんど起こらず、９０％の発光活性を保持していた。
【００４９】
実験例４：Ａ−ＢＰ複合体を用いた生物発光イムノアッセイによるＡＦＰの定量
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
実験例２に記載の方法の準じて６Ｄ２のコーティングを行った。
２）ポストコーティング
実験例２に記載の方法の準じてポストコーティングを行った。
【００５０】
３）ＡＦＰとビオチン−１Ｄ５の反応
実験例２に記載の方法の準じてＡＦＰとビオチン−１Ｄ５を反応させた。
４）ＡＱ-Ｓ-ＳＡ−２の反応
実験例２に記載の方法の準じてＡＱ−Ｓ−ＳＡ−２を反応させた。
５)イクオリンによる発光の測定
実験例３に記載の方法の準じてイクオリンの発光を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）を算出した。
【００５１】
ＡＱ−Ｓ−ＳＡ−２を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによる検量線を図３に示した。その結果、ＡＦＰの検出限界は１０−２ｎｇ／ｍｌ、ダイナミックレンジは１０−２〜１０２ｎｇ／ｍｌを示した。バックグランドが低く抑えられており、高感度なイムノアッセイに優れていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリン、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えイクオリンのいずれかと、ビオチン結合蛋白質とが、該システインを介して結合している本発明のＡ−ＢＰ複合体は、高い発光活性を有することから、診断薬などの標識物質に好ましく使用することができる。また、前述の組換えイクオリンのいずれかと、スルフヒドリルと反応する官能基を有するビオチン結合蛋白質とを反応させる本発明のＡ−ＢＰ複合体の製造方法であれば、従来のイクオリンにスルフヒドリル基を導入する工程がなくとも、Ａ−ＢＰ複合体が作製でき、工程や時間を軽減できるだけではなく、イクオリンやビオチン結合蛋白質のロスも軽減できる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】システイン挿入イクオリン発現ベクターの構築プロセスを示す概略図。
【図２】ＡＱ−Ｓ−ＳＡを用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによる検量線。
【図３】ＡＱ−Ｓ−ＳＡ−２を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによる検量線。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
［配列番号：１］天然型アポイクオリンのアミノ酸配列。
［配列番号：２］変異型アポイクオリンのアミノ酸配列。
［配列番号：３］システインが導入された天然型アポイクオリンのアミノ酸配列。
［配列番号：４］システインが導入された変異型アポイクオリンのアミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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