(57)【要約】【課題】マトリクス状に配列した凹部内で細胞が選択的に接着・増殖し、且つ増殖の様子を透過観察型顕微鏡によって細胞を観察することができる細胞培養担体を提供すること。【解決手段】基材の主成分が透明材料で形成され、細胞を培養する複数の凹部を有する細胞培養担体であって、複数の凹部の少なくとも内表面にはセラミックス粒子が露出されており、基材側から凹部内が観察可能であり、基材には基材との重量比で０．５％以上１．０％以下のセラミックス粒子を含むことを特徴とする細胞培養担体。【選択図】図２
2010136706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材の主成分が透明材料で形成され、その表面に細胞を培養する複数の凹部を有する細胞培養担体であって、前記複数の凹部の少なくとも内表面にはセラミックス粒子が露出されており、前記基材側から前記凹部内を観察可能であることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記基材には、基材との重量比で０．５％以上１．０％以下の前記セラミックス粒子が含まれていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項３】
前記複数の凹部の各々の開口径が１μｍ以上１０００μｍ以下であり、深さが１μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
前記透明材料が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミドなどの高分子のうち、少なくとも１種類以上の高分子からなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項５】
前記セラミックス粒子が、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、アルミナ、ジルコニア、チタニア、イットリア、シリカのうち少なくとも１種類以上のセラミックスまたはガラスからなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞培養担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透過観察型顕微鏡による観察を可能にし、且つ基材表面にマトリクス状に配列された凹部の内表面に、選択的に細胞が接着・増殖可能な細胞培養担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞培養技術の向上に伴い、細胞が産生するポリアミノ酸や蛋白質類を用いた治療、さらには、細胞自身を患部に用いる先端医療などが行われるようになり、状態の良い多様な細胞が大量に必要とされるようになってきた。このため、様々な種類の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ（生体外）で効率的に培養する方法が検討されている。
しかし、これらの研究の多くは、コラーゲンなどに代表される生体高分子をコーティングした２次元的なシャーレやボトル上で、様々な添加物を培地に添加して培養する方法が主流である。
【０００３】
一方、３次元構造を持たせたバイオマテリアル上で細胞培養を行うと、細胞の生存率や物質生産能が向上する傾向があることが証明されてきており、３次元培養法が注目を集めている。これらの現状から、よりｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）環境に酷似した３次元的バイオマテリアルの開発が重要になってくると考えられる。
【０００４】
このように、細胞を３次元的に培養するための基材として、セラミックス製の多孔体やセラミックス表面に複数の凹部（以下、マイクロポアともいう）を配列させた細胞培養担体が開発されている。
しかしながら、細胞培養担体の素材としてセラミックスを用いると、可視光を透過させることができないため、生きた状態の細胞を、培養しながら観察することができない欠点があった。
また、細胞を生きた状態で観察するためには、合成高分子や生体高分子などを用いれば、透明な培養担体が得られるが、合成高分子は細胞を接着させることができず、細胞培養担体として利用できないという問題がある。
一方、細胞を接着させるために、コラーゲン、ラミニンなどに代表される生体高分子を合成高分子の基材にコーティングすると、細胞を強力に接着させることができるがマイクロポア内外に細胞が接着してしまうので、マイクロポア内に選択的に細胞を接着させて、増殖させることができない。
【０００５】
一方、特許文献１には、細胞培養担体を構成する少なくとも１以上の層に比重調整物質を含めることによって、細胞培養中に細胞培養担体が浮くことがなく、かつ細胞を良好に培養することが可能な細胞培養担体が開示されている。
【特許文献１】特開２００７−１７４９８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載されている技術は、細胞を細胞培養担体表面に接着させることを前提とするものであり、マイクロポア内に保持する点について開示されているものではなかった。
【０００７】
本発明は、上記技術的課題によりなされたものであり、基材表面にマトリクス状に配列した凹部内に細胞を選択的に接着・増殖させ、且つ増殖の様子を透過観察型顕微鏡によって基材側から細胞を観察することができる細胞培養担体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施形態によると、基材の主成分が透明材料で形成され、その表面に細胞を培養する複数の凹部を有する細胞培養担体であって、前記複数の凹部の少なくとも内表面にはセラミックス粒子が露出されており、前記基材側から前記凹部内を観察可能であることを特徴とする細胞培養担体が提供される。
【０００９】
前記基材には、基材との重量比で０．５％以上１．０％以下の前記セラミックス粒子が含まれていることが好ましい。
【００１０】
前記複数の凹部の各々の開口径が１μｍ以上１０００μｍ以下であり、深さが１μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。
【００１１】
透明材料が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミドなどの高分子のうち、少なくとも１種類以上の高分子からなることが好ましい。
【００１２】
セラミックス粒子が、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、アルミナ、ジルコニア、チタニア、イットリア、シリカのうち少なくとも１種類以上のセラミックスまたはガラスからなることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、基材表面にマトリクス状に配列した凹部内に細胞を選択的に接着・増殖させ、且つ増殖の様子を透過観察型顕微鏡によって基材側から細胞を観察することができる細胞培養担体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を、図面を参照しつつ、説明する。なお、実施形態において、同一構成要素には同一符号を付け、実施形態の間において重複する説明は省略する。
【００１５】
図１は、本発明の第１の実施形態に係る細胞培養担体１の構成を示す平面図である。図２は、図１に示す細胞培養担体１のＡ−Ａ線矢視断面を示す図である。
【００１６】
図１に示すように、本発明の第１の実施形態に係る細胞培養担体１は主成分が透明材料で形成された基材２から構成される。この基材２にはマトリクス状に配列された複数の凹部（マイクロウェル部）３が形成されている。この複数の凹部（マイクロウェル部）３内で細胞を培養する。
【００１７】
図２に示すように、本発明の第１の実施形態に係る細胞培養担体１においては、複数の凹部（マイクロウェル部）３の各底面７の内表面にはセラミックス粒子４が露出している。一方で、細胞培養担体１の表面のうち複数の凹部３外の領域６の表面にはセラミックス粒子が露出していない。
【００１８】
このように、細胞培養担体１の凹部３の底面７の内表面のみにセラミックス粒子４が露出しているために、凹部３内に細胞を保持することができる。
【００１９】
本発明の第１の実施形態に係る細胞培養担体１は基材２の主成分が透明材料からなる。基材（透明材料）２の凹部３で選択的に細胞を接着・増殖し、かつ、細胞を観察するため基材２には、基材２との重量比で０．５％以上１．０％以下のセラミックス粒子４を含んでいることが好ましい。ここで、基材２に、セラミックス粒子４が０．５％未満である場合には、凹部３内で細胞を保持することができない。また、一方で、基材２に、セラミックス粒子４が１．０％を超えると、細胞培養担体１の裏面から増殖した細胞を透過観察型顕微鏡等で観察することができない。
【００２０】
本発明の第１の実施形態に係る細胞培養担体１を構成する基材２の主成分が透明材料として、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミドなどの合成高分子やアガロースに代表される糖類のうち、少なくとも１種類以上の高分子からなることが好ましい。これらの透明材料については、細胞毒性を示さない限り、どのようなものを用いても作製可能であるが、特に生体内に移植する目的がある場合、生分解性を示す、ポリ乳酸、グリコール酸などを用いることが好ましい。
【００２１】
本発明の第１の実施形態に係る基材２中に含有するセラミックス粒子４として、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、アルミナ、ジルコニア、チタニア、イットリア、シリカのうち少なくとも１種類以上のセラミックスまたはガラスからなることが好ましい。これらのセラミックスまたはガラスは生体安定性と細胞接着性とが確認されているため、好適に用いることができる。
【００２２】
本発明の第１の実施形態に係る凹部３の各々の開口径は１μｍ以上１０００μｍ以下であり、深さが１μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。通常、細胞のサイズは１０μｍ以上２０μｍ以下であることから、凹部３で細胞が選択的に保持・増殖することを考慮すると、前記開口径・深さともに５０μｍ以上１０００μｍ以下であることがさらに好ましい。
【００２３】
本発明の第１の実施形態に係る細胞培養担体１の凹部３は、マトリクス状に規則的に配列していることが好ましい。さらに、凹部３間の距離が１０μｍ以上５０μｍ以下であることがより好ましい。こうすることで、細胞を撒種した際、細胞培養担体１の凹部３に、細胞をより効率的に接着させ、且つ十分に細胞に栄養分・酸素を供給することができる。ここで、マトリクス状とは、行方向及び列方向に配列されていることを意味し、特に、行方向と列方向とが、直交していることが好ましい。このような形状の細胞培養担体１を３次元構造の細胞培養担体１として用いることにより、凹部３内で細胞を確実に保持させて、凹部３内で安定して細胞を培養することができる。
【００２４】
また、本発明の第１の実施形態に係る細胞の培養方法は、上記のような本発明の実施形態に係る細胞培養担体１を用いて、未分化細胞を細胞培養担体１の凹部３の少なくとも１ヶ所に撒種して培養し、細胞塊を得ることを特徴とするものである。上記のような特定の形状を有する細胞培養担体１を用いることにより、効率的に細胞の３次元細胞塊を形成させることができ、且つ細胞塊を細胞培養担体１から容易に透過観察型顕微鏡で観察することができる。
【００２５】
本発明の第１の実施形態に係る細胞培養担体１において培養する細胞は、接着系細胞である。具体的には、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞に代表される未分化細胞や、肝臓や腎臓由来の正常組織細胞などが挙げられる。なお、ここでいう未分化細胞とは、自分自身と同じ細胞に増殖する能力と、分化誘導因子の付与により決まった組織細胞に増殖する能力と、分化誘導因子の付与により決まった組織細胞に分化する能力とを有している、未分化の状態にある細胞であり、一旦、他の組織細胞に分化すると、未分化な状態に戻ることはできない細胞のことをいう。
【００２６】
本発明は、以上のとおり構成することによって、培養した細胞を非常に簡単に裏面側から観察することができる。さらに、細胞培養担体１の凹部３外の領域６には、セラミックス粒子４が含まれていないため、細胞が浮いた状態となり、前記領域６上に細胞が接地された場合でも、容易に凹部３内に細胞を入れることができる。
【００２７】
次に、図３を用いて、本発明の第２の実施形態を示す。これは凹部３の底面７の内表面のみならず側面８の内表面にセラミックス粒子４を露出させた例である。
【００２８】
本発明の第２の実施形態においても、その上面からみた構成は図１と同様である。また、基材２の材料、セラミックス粒子４の材料、基材２中の含有率、凹部３の形状、表面の深さ等も本発明の第１の実施形態において説明したものと同様である。
【００２９】
本発明の第２の実施形態の細胞培養担体１は凹部３の底面７と側面８との各内表面にセラミックス粒子４を露出しているために、凹部３内に効果的に細胞を保持することができ、かつ、培養した細胞を側面及び裏面側から観察することができる。さらに、細胞培養担体１の凹部３外の領域６には、セラミックス粒子４が形成されていないため、細胞が浮いた状態となり、容易に凹部３内に細胞を入れることができる。
【００３０】
以下、本発明の各実施形態におけるセラミックス粒子の含有量を決定するにあたってなした実験結果を示す。
【００３１】
アガロース１００ｍｇと純水４９００ｍｇとを混合し、ここに、５０％ハイドロキシアパタイトスラリーを０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇと振って添加し、各々超音波処理を５分間行った。超音波処理後、混合液を１００℃で５分間加熱した後、鋳型に流し込み、室温で３０分静置した。３０分静置後、鋳型より離型した細胞培養担体を透過観察型顕微鏡により観察した。
【００３２】
５０％ハイドロキシアパタイトスラリーを５０ｍｇ添加した時の、細胞培養担体１の透過観察型顕微鏡写真（１００倍）を図４に示す。上記４条件いずれも透過性を有することが確認された。
【００３３】
さらに、２４ウェルプレート中に、作製したそれぞれの細胞培養担体１を浸漬させ、あらかじめ培養したＥＳ細胞を５．０×１０５個、撤種し、ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｃｒａｍ  Ｒｅｐｌａｃｃｍｅｎｔ）、ピルビン酸、非必須アミノ酸、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）を含んだＤＭＥＭにおいて、５％ＣＯ２インキュベーターを用い、３７℃で３日間、培養した。
【００３４】
培養後の細胞培養担体１を透過観察型顕微鏡で観察したところ、５０％ハイドロキシアパタイトスラリーを０ｍｇ、２５ｍｇ添加した時の細胞培養担体上には、ほとんどの細胞が接着せず、細胞の培養が確認できなかった。一方、５０％ハイドロキシアパタイトスラリーを５０ｍｇ、１００ｍｇ添加した細胞培養担体１上の凹部には細胞が接着・増殖する様子を確認できた。
【００３５】
アガロース１００ｍｇと純水４９００ｍｇとを混合し、さらに、５０％ハイドロキシアパタイトスラリーを５００ｍｇ添加し、超音波処理を５分間行った。超音波処理後、混合液を１００℃で５分間加熱した後、鋳型に流し込み、室温で３０分静置した。３０分静置後、鋳型より離型した。
【００３６】
さらに、２４ウェルプレート中に、作製した細胞培養担体１を浸漬させ、あらかじめ培養したＥＳ細胞を５．０×１０５個、撤種し、ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｃｒａｍ  Ｒｅｐｌａｃｃｍｅｎｔ）、ピルビン酸、非必須アミノ酸、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）を含んだＤＭＥＭにおいて、５％ＣＯ２インキュベーターを用い、３７℃で３日間、培養した。
【００３７】
培養後の細胞培養担体１を透過観察型顕微鏡で観察したが、可視光が透過せず、細胞が接着・増殖したことを確認できなかった。
【００３８】
上記各実験から、５０％ハイドロキシアパタイトスラリーを５０ｍｇ、１００ｍｇ添加した細胞培養担体１が細胞の付着及び透過性の観点から最適であることが判明した。これは、基材との重量比で０．５％以上１．０％以下の量のセラミックス粒子４を含ませることに相当する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る細胞培養担体の構成を示す平面図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る細胞培養担体の断面図である。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る細胞培養担体の断面図である。
【図４】本実施例における５０％ハイドロキシアパタイトスラリーを５０ｍｇ添加した時の、細胞培養担体の透過観察型顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００４０】
１…細胞培養担体、２…基材、３…凹部（マイクロウェル部）、４…セラミックス粒子、５…凹部間の領域、７…底面、８…側面
【図１】
2010136706.tif 000003
【図２】
2010136706.tif 000004
【図３】
2010136706.tif 000005
【図４】
2010136706.tif 000006