(57)【要約】      （修正有）【課題】莢膜多糖の抽出方法と抽出した莢膜多糖を提供する。【解決手段】グラム陰性菌及びグラム陽性菌の細菌細胞に加えてその培養上清から塩基抽出を用いて多量の莢膜多糖（ＣＰＳ）を単離する。この方法は単純で、迅速で、再現性があり、かつ様々な細菌種に適用可能である。また、この方法は、外来性ペプチドグリカンに共有結合しないことによって特徴付けられる新規ＣＰＳも生じる。該莢膜多糖は細菌感染に対するワクチンに利用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性およびグラム陽性細菌の細胞構成要素から莢膜多糖を抽出する方法であって、該細胞構成要素を塩基性条件下で塩基試薬と反応させ、そして該細胞構成要素から莢膜多糖を分離することを含む、前記方法。
【請求項２】
莢膜多糖上に存在し、抽出中に加水分解されるＮ−アセチル基の一部が、その後、該莢膜多糖の免疫原性特性を維持するのに十分な程度に再アシル化される、請求項１の方法。
【請求項３】
請求項１の、グラム陰性およびグラム陽性細菌の細胞構成要素から莢膜多糖を抽出する方法であって、さらに：
（ａ）所望により、クロマトグラフィーにより、他の細胞構成要素から莢膜多糖を分離し；
（ｂ）段階（ａ）由来の莢膜多糖をアシル化剤と反応させ；
（ｃ）段階（ｂ）由来の莢膜多糖をクロマトグラフィーにより精製する
段階を含む、前記方法。
【請求項４】
塩基試薬のｐＨが約９および１４の間である、請求項３の方法。
【請求項５】
塩基試薬のｐＨが約１２である、請求項４の方法。
【請求項６】
細菌が連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）属のいかなる細菌であってもよい、請求項３の方法。
【請求項７】
細菌がＢ群連鎖球菌である、請求項３の方法。
【請求項８】
細菌がＢ群連鎖球菌Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＶ型である、請求項３の方法。
【請求項９】
塩基試薬が有機塩基を含む、請求項３の方法。
【請求項１０】
塩基試薬が無機塩基を含む、請求項３の方法。
【請求項１１】
塩基試薬がＮａＯＨ、ＫＯＨまたはＬｉＯＨを含む、請求項３の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィーにより分離する段階が、疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項３の方法。
【請求項１３】
アシル化剤が無水酢酸、塩化アセチル、酢酸ペンタフルオロフェニル、または４−酢酸ニトロフェニルである、請求項３の方法。
【請求項１４】
クロマトグラフィーにより莢膜多糖を精製する段階が、ゲル浸透クロマトグラフィーである、請求項３の方法。
【請求項１５】
塩基試薬が無機塩基を含み、クロマトグラフィーにより分離する段階が疎水性クロマトグラフィーであり、アシル化試薬が無水酢酸、塩化アセチル、酢酸ペンタフルオロフェニルまたは４−酢酸ニトロフェニルであり、そしてクロマトグラフィーにより莢膜多糖を精製する段階がゲル浸透クロマトグラフィーである、請求項３の方法。
【請求項１６】
塩基試薬がＮａＯＨを含み、クロマトグラフィーにより分離する段階がフェニル・セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を伴い、アシル化試薬が無水酢酸であり、そしてクロマトグラフィーにより莢膜多糖を回収する段階がスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）を伴う、請求項３の方法。
【請求項１７】
塩基を含む試薬を用い、グラム陰性またはグラム陽性細菌細胞構成要素を抽出することを含む方法により産生された、修飾莢膜多糖。
【請求項１８】
このように得た莢膜多糖を、無水酢酸でアシル化し、そしてゲル浸透クロマトグラフィーを用いたクロマトグラフィーにより莢膜多糖を精製する、請求項１７の修飾莢膜多糖。
【請求項１９】
抽出細菌細胞構成要素が、連鎖球菌属から得られる、請求項１８の修飾莢膜多糖。
【請求項２０】
抽出細菌細胞構成要素が、Ｂ群連鎖球菌から得られる、請求項１９の修飾莢膜多糖。
【請求項２１】
請求項２０の修飾莢膜多糖（ＣＰＳ）であって：
Ｉａ型ＣＰＳが：  およそ０．０１０−０．００５の範囲のＫav
およそ３１８−３１１の範囲のＭw（ｋｇ／ｍｏｌ）
およそ１．３５−１．３１の範囲のＭw／Ｍnを有し
Ｉｂ型ＣＰＳが：  およそ０．１９１−０．１５０の範囲のＫav
およそ２１８−１７０の範囲のＭw（ｋｇ／ｍｏｌ）
およそ１．６１−１．２０の範囲のＭw／Ｍnを有し
ＩＩ型ＣＰＳが：  およそ０．１５２−０．１１５の範囲のＫav
およそ２８９−２４６の範囲のＭw（ｋｇ／ｍｏｌ）
およそ１．４６のＭw／Ｍnを有し
ＩＩＩ型ＣＰＳが：およそ０．３４３−０．２６８の範囲のＫav
およそ１０８−１０４の範囲のＭw（ｋｇ／ｍｏｌ）
およそ１．２４−１．２２の範囲のＭw／Ｍnを有し
Ｖ型ＣＰＳが：    およそ０．２５７−０．１５６の範囲のＫav
およそ１７９−９２の範囲のＭw（ｋｇ／ｍｏｌ）
およそ１．２８−１．１５の範囲のＭw／Ｍnを有する
前記修飾莢膜多糖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に援用される、１９９７年１２月２３日に提出された米国仮特許出願第６０／０６８，６０８号から優先権が請求される。
発明の分野
本発明は、グラム陰性およびグラム陽性細菌両方から、莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ＣＰＳ）を抽出し、そして単離するための方法に関する。抽出された多糖は、多糖を単独で含むまたはタンパク質と結合している（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ワクチンを産生するのに有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
発明の背景
連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エリジペロトリックス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）などのグラム陽性菌、ならびにヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）および特定の種類の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのグラム陰性細菌により引き起こされる細菌感染は、世界中に深刻な罹患率（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）を引き起こしている。これは、細菌が示す抗生物質に対する耐性が明らかになりつつあることと合わせ、細菌ワクチン開発の必要性を示唆する。例えば、連鎖球菌属は、グラム陽性細菌の大きくそして多様な属であり、抗原性およびその細胞壁多糖の構造に基づき、いくつかの群に分けられてきている（２６、２７）。これらの群のうち２つは、深刻なヒト感染と関連付けられてきている。Ａ群連鎖球菌は、「連鎖球菌咽頭炎（ｓｔｒｅｐ  ｔｈｒｏａｔ）」、リウマチ熱、連鎖球菌膿痂疹（ｉｍｐｅｔｉｇｏ）、および敗血症を含む、多様な感染性障害を引き起こす。
【０００３】
Ｂ群連鎖球菌は、１９７０年代初期まで、標準的医学教科書ではヒト病原体とされていなかった。その後、Ｂ群連鎖球菌は、発展途上国と共に米国でも周産期の重要な病原体であることが、研究により示されてきている（３７）。生命の最初の２か月の間に全身性Ｂ群連鎖球菌感染を起こすのは、誕生１０００当たりおよそ３であり（１２）、その結果、米国では年間１１，０００の症例がある。これらの感染は、先天性肺炎、敗血症および髄膜炎の症状を引き起こす。これらの幼児のかなりの数が死ぬかまたは永続的な神経学的後遺症を有する。さらに、Ｂ群連鎖球菌感染は、年間５０，０００近くの女性で発生する、妊娠に関連した高い罹患率に関連している可能性がある。Ｂ群連鎖球菌感染の危険性がある他のものは、先天的にまたは化学療法により、あるいは他の手段により、改変された免疫応答を有するものである。
【０００４】
Ｂ群連鎖球菌は、該細菌の莢膜多糖に基づき、さらに、いくつかの異なる型に分類することが可能である。Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩ型は、大部分のＢ群感染による病原性の原因となり、Ｂ型連鎖球菌Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶが、報告されるすべての症例の９０％以上に相当する。これらの多様な型の多糖各々の構造が性質決定されてきている（１９−２２、４４）。他の多くのヒト細菌病原体での発見同様、Ｂ群連鎖球菌の莢膜多糖は、ワクチン中で使用すると、これらの細菌での感染に対し、有効な防御を提供する可能性がある。４、６、２４、２９、３０、４２、４３、４５を参照されたい。
【０００５】
グラム陰性細菌もまた、疾患の重大な原因である。インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型細菌（Ｈｉｂ）に対して向けられる多糖−タンパク質ワクチンが最近開発されそして使用されるまで、Ｈｉｂ細菌感染は、幼児の精神遅滞の多くの症例に責任を負っていた。髄膜炎菌（Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および大腸菌Ｋ１感染は、新生児髄膜炎に責任を負う。グラム陰性細菌株、大腸菌は、大腸菌株で汚染された肉を食べることによる死を含む、深刻な病気に関連付けられてきている。
【０００６】
莢膜多糖ワクチンおよび莢膜多糖結合体ワクチン（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）の大規模産生には、精製莢膜多糖を適切に供給することが必要である。細菌細胞から莢膜多糖を単離する、先行技術の方法（４０、４２）は、酵素ミュータノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）で細胞を処理することに頼る。ミュータノリシンは、細菌細胞壁を切断し、それにより細胞構成要素を遊離させる。本法は、細胞溶解物をさらなる酵素で処理し、タンパク質および核酸を除去し、そして沈澱およびクロマトグラフィーで区別することにより精製することを伴う。精製莢膜多糖を得るには、より効率的でより高い収率の、そしてより単純な手段が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、グラム陰性およびグラム陽性細菌両方の細胞構成要素から、莢膜多糖（ＣＰＳ）を抽出するための方法を提供する。ＣＰＳは、本発明にしたがい、細菌上清または細菌細胞のどちらからでも、ＣＰＳを他の細胞構成要素に連結している塩基不安定性結合の加水分解により、抽出することが可能である。本発明により提供される抽出法の利点は、抽出されるＣＰＳが大部分損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ことである。
【０００８】
本発明の別の態様は、塩基抽出中にＣＰＳのＮ−アセチル基の一部を脱アセチル化し、ＣＰＳの他の細胞構成要素からの分離を容易にすることにより、精製莢膜多糖を得るための方法を提供する。アセチル基の一部を再導入し、Ｎ−アセチル基に関し、天然多糖と同じ反復単位構造を有する精製ＣＰＳを得てもよいし、あるいは、修飾アルキル基でのアシル化を用い、修飾ＣＰＳを得てもよい。
【０００９】
好ましい態様において、ＣＰＳはＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）から抽出される。最も好ましい態様において、ＣＰＳはＧＢＳ  Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩＩＩ型から抽出される。
【００１０】
別の好ましい態様において、ＣＰＳは肺炎連鎖球菌（Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から抽出される。最も好ましい態様において、ＣＰＳは肺炎連鎖球菌ＩＩＩ、ＩＶおよびＸＩＶ型から抽出される。
【００１１】
別の好ましい態様において、ＣＰＳはナイセリア属またはエシャリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細菌から抽出される。最も好ましい態様において、ＣＰＳは髄膜炎菌Ｂ、Ｃ、Ｙ、またはＷ１３５型あるいは大腸菌Ｋ１から抽出される。
【００１２】
細菌上清または細菌細胞のどちらかから、本発明にしたがい、莢膜多糖を精製する方法は、他の方法に対し、以下の利点を有する：（ａ）簡単（最小の段階数）、（ｂ）有効（高収率および純度）、（ｃ）安全（例えば、可燃性有機溶媒使用の減少または排除）、および（ｄ）すべてのグラム陰性およびグラム陽性細菌に一般的に適用可能。
【００１３】
本発明にしたがった方法は、濃縮抽出物および／または単離細菌細胞の、塩基性溶液での処理を含む。ＣＰＳを抽出するのに加え、塩基抽出はまた、Ｎ−アセチル基の脱アセチル化も生じる。脱アセチル化の度合いは反応条件を調整することにより、変化させることが可能である。抽出したＣＰＳをその後、好ましくはクロマトグラフィー分離により、細胞構成要素から分離し、ＣＰＳを得る。アセチル基のいくつかまたは大部分を再導入し、ＣＰＳまたは修飾ＣＰＳを得てもよい。ＣＰＳの最終精製は、ゲル浸透クロマトグラフィーにより達成してもよい。さらなる態様において、本発明は、塩基性抽出条件の結果として、ワクチンまたは結合体ワクチンとして使用するのに適した、新規の、所望により修飾されているＣＰＳを提供する。
【００１４】
哺乳動物において、殺菌性でありそして該動物を感染から防御する抗体の産生を引き出すことが可能な、実質的に純粋なＣＰＳを提供するための方法を提供するのが本発明の態様である。
【００１５】
これらのＣＰＳをワクチン中で、単独でまたはポリペプチドに結合して使用し、ヒトまたは動物を、典型的には該ＣＰＳが単離された細菌株による感染に対し防御することが、本発明の別の態様である。特定の場合では、本発明に用いられる多糖は、他の病原性細菌に交差反応性である抗体の産生を誘導し、それによりこれらの他の細菌による感染に対する防御を生じてもよい。
【００１６】
グラム陰性およびグラム陽性細菌上清あるいはグラム陰性またはグラム陽性細菌細胞のどちらかに含まれる、グラム陰性およびグラム陽性細胞構成要素両方から、莢膜多糖を単離するための方法を提供するのが、本発明の目的である。これらの莢膜多糖をその後、ワクチンとして使用し、またはポリペプチドに結合し、ワクチンとして有用な結合体分子を形成してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｄ2Ｏ中、５０℃で記録された、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ型由来の莢膜多糖のＮＭＲスペクトル（５００  ＭＨｚ）。
【図２】Ｄ2Ｏ中、５０℃で記録された、Ｂ群連鎖球菌Ｉｂ型由来の莢膜多糖のＮＭＲスペクトル（５００  ＭＨｚ）。
【図３】Ｄ2Ｏ中、５０℃で記録された、Ｂ群連鎖球菌ＩＩ型由来の莢膜多糖のＮＭＲスペクトル（５００  ＭＨｚ）。
【図４】Ｄ2Ｏ中、５０℃で記録された、Ｂ群連鎖球菌ＩＩＩ型由来の莢膜多糖のＮＭＲスペクトル（５００  ＭＨｚ）。
【図５】Ｄ2Ｏ中、５０℃で記録された、Ｂ群連鎖球菌Ｖ型由来の莢膜多糖のＮＭＲスペクトル（５００  ＭＨｚ）。
【図６】ＧＢＳＰＩａ−ＨＳＡ被覆プレート上でのウサギ抗ＧＢＳＰＩａ抗血清の阻害。
【図７】ＧＢＳＰＩｂ−ＨＳＡ被覆プレート上でのウサギ抗ＧＢＳＰＩｂ抗血清の阻害。
【図８】ＧＢＳＰＩＩ−ＨＳＡ被覆プレート上でのウサギ抗ＧＢＳＰＩＩ抗血清の阻害。
【図９】ＧＢＳＰＩＩＩ−ＨＳＡ被覆プレート上でのウサギ抗ＧＢＳＰＩＩＩ抗血清の阻害。
【図１０】ＧＢＳＰＶ−ＨＳＡ被覆プレート上でのウサギ抗ＧＢＳＰＶ−ＴＴ抗血清の阻害。
【図１１】ペプチドグリカンと共に群下位莢膜（ｓｕｂｃａｐｓｕｌａｒ）抗原（ポリラムノース）および莢膜多糖（Ｍｉｃｈｏｎら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，  ２７：５３４１−５３５１）を表すＧＢＳ構造集合。ＸおよびＹはそれぞれ、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルムラミン酸残基を表す。白い矢印は：リゾチーム（Ａ）、ミュータノリシン（Ｂ）、リソスタフィン（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）（Ｃ）または塩基による、莢膜多糖およびポリラムノースをペプチドグリカンに連結するホスホジエステル結合の加水分解による、予測される切断部位を示す。
【図１２】ペプチドグリカンと共に群下位莢膜抗原（ポリラムノース）および莢膜多糖（Ｍｉｃｈｏｎら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，  ２７：５３４１−５３５１）を表すＧＢＳ構造集合。ＸおよびＹはそれぞれ、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルムラミン酸残基を表す。白い矢印は：リゾチーム（Ａ）、ミュータノリシン（Ｂ）、リソスタフィン（Ｃ）または塩基による、莢膜多糖をペプチドグリカンに連結するホスホジエステル結合の加水分解による、およびポリラムノースをペプチドグリカンに連結するホスホジエステル結合の加水分解による、予測される切断部位を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、グラム陰性およびグラム陽性細菌から、ＣＰＳを細胞構成要素に付着させる塩基不安定性結合の塩基加水分解を用いることにより、莢膜多糖を得るための方法を提供する。本発明の方法は、グラム陽性およびグラム陰性細菌両方のＣＰＳを、細菌または細菌断片を含む溶液を塩基と接触させることにより、抽出することを含む。ＣＰＳをその後、多様な方法により塩基から回収してもよい。本発明にしたがい使用するための限定されないグラム陽性細菌の例は、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、腸球菌属、バチルス属、コリネバクテリウム属、リステリア属、エリジペロトリックス属、およびクロストリジウム属である。特に、連鎖球菌の使用がより好ましく、そしてＢ群連鎖球菌Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩ型の使用が最も好ましい。本発明に使用するための限定されないグラム陰性細菌の例には、インフルエンザ菌、髄膜炎菌および大腸菌が含まれる。特に、インフルエンザ菌ｂ型、髄膜炎菌Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５型ならびに大腸菌Ｋ１の使用がより好ましい。
【００１９】
本発明にしたがい、水性または有機溶媒中で塩基不安定性結合を加水分解するのに、多様な条件を用いてもよい。炭水化物のＮ−アセチル結合もまた加水分解されるが、この度合いを、反応条件により調節することが可能である。Ｎ−アセチル結合が切断される度合いが増せば、残りの細胞構成要素に比べ、ＣＰＳがより疎水性になるため、Ｎ−アセチル基の加水分解は、ＣＰＳを他の細胞構成要素から分離するのに都合がよい。この極性の相違を利用し、効果的なクロマトグラフィー分離を達成してもよい。極性の相違に基づいた、混合物の２つまたはそれ以上の構成要素の分離は、当業者に周知である。
【００２０】
例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いると、比較的疎水性の高い化合物は、より親水性である化合物に比べ、カラムにより長く保持される。逆に、親水性相互作用クロマトグラフィーを用いると、親水性化合物は、より疎水性である化合物に比べ、カラムにより長く保持される。両方法を連続して用いると、目的の化合物に比べ、より極性が低い不純物およびより極性が高い不純物を両方除去することが可能になる。
【００２１】
あるいは、ＣＰＳ上に存在する未結合（ｆｒｅｅ）アミノ基またはカルボン酸基を利用し、効果的なクロマトグラフィー分離を容易にしてもよい。電荷の相違に基づいた、混合物の２つまたはそれ以上の構成要素の分離は、当業者に周知である。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いると、ほとんどまたはまったく陽性荷電を持たず、カラムを比較的迅速に通過する化合物よりも、陽性に荷電した基を含む化合物、例えばプロトン付加アミンは、カラムにより長く保持される。逆に、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いると、陰性に荷電した化合物、例えばカルボン酸は、カラムに保持される一方、ほとんどまたはまったく陰性荷電を持たない化合物は、カラムを比較的迅速に通過する。
【００２２】
脱アセチル化ＣＰＳを他の細胞構成要素から分離した後、未結合アミノ基を再アセチル化してもよい。アセチル化試薬および反応条件を変化させることにより、アミノ基が再アセチル化される度合いを調節することが可能になる。アシル化段階で取り込まれた不純物は、再アシル化ＣＰＳに比べ、大きさが小さく、そしてしたがって、ゲル浸透クロマトグラフィーによりＣＰＳから分離することが可能である。
【００２３】
例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーにより、比較的大きなＣＰＳの効率的な分離が可能になる。あるいは、極性または電荷の相違を利用し、残存不純物からＣＰＳを精製してもよい。
Ａ．  莢膜多糖の調製
細菌多糖の細胞構成要素からの単離および精製は、本発明にしたがい、４つの段階：塩基抽出、クロマトグラフィー分離、Ｎ−アシル化、およびクロマトグラフィー精製で達成してもよい。
【００２４】
１．  出発物質
ＣＰＳを抽出するための材料は、ホモジナイズした細菌細胞からの濃縮細菌上清または馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）由来であってもよい。細胞を、遠心分離または微量濾過により分離してもよく、そして上清（ｓｕｐｅｒｎａｔｅ）は典型的には１０−１５倍に濃縮される。好ましくは、細菌上清および馴化培地は、ＣＰＳが約５−２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するよう濃縮される。さらに、沈澱細胞から直接抽出してもよい。
【００２５】
２．塩基抽出
濃縮細菌上清または馴化培地を、多様な塩基と接触させ、ＣＰＳを抽出してもよい。あるいは、単離細菌細胞をさらに、多様な塩基と接触させ、ＣＰＳを抽出してもよい。本発明にしたがい用いてもよい塩基の、限定されない例は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ3、Ｋ2ＣＯ3、ＫＣＮ、Ｅｔ3Ｎ、ＮＨ3、Ｈ2Ｎ2Ｈ2、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ、ＮａＯＥｔ、またはＫＯｔＢｕである。ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨ、ＮａＯＭｅまたはＫＯｔＢｕなどの塩基は、０．５  Ｎ−５．０  Ｎの範囲で用いるのが最も効果的である。ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ3、Ｋ2ＣＯ3およびＫＣＮなどの塩基は、溶解度が許す限り高い濃度で用いてもよい。Ｅｔ3Ｎなどの有機塩基は、加水分解を達成する水またはアルコールなどの剤が存在する限り、中程度の濃度ないし高濃度（５０−１００％）で用いてもよい。ＮＨ3、Ｈ2Ｎ2Ｈ2などの塩基は、１００％を含め、ほとんどいかなる濃度で使用してもよい。水、アルコール（好ましくはＣ1−Ｃ4）、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドまたはこれらの混合物などの溶媒および他の有機溶媒を使用してもよい。水を含む塩基抽出溶液が最も好ましい。
【００２６】
ＣＰＳを細胞構成要素から抽出するのに最も効果的なｐＨ範囲は、約９ないし１４であり、最適ｐＨは１２前後である。抽出は約４℃以上の温度で達成することが可能であるが、好ましくは約４０ないし１００℃の間に温度を増加させ、および／または反応混合物を攪拌することが、収率を増加させると期待される。細胞ペーストおよそ１−２０ｇに対し塩基試薬約１リットルを使用するのが好ましい。あるいは、濃縮上清を１０Ｎ  ＮａＯＨで希釈し、反応混合物中の最終濃度を２Ｎ  ＮａＯＨとする。
【００２７】
３．  クロマトグラフィー分離
塩基抽出試薬中に存在する抽出ＣＰＳを、クロマトグラフィーにより、細胞構成要素から生じた不純物から分離してもよい。クロマトグラフィー分離法の限定されない例は、イオン交換（陽イオン性または陰イオン性）、親水性相互作用、疎水性相互作用またはゲル浸透クロマトグラフィーである。好ましい方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。より好ましいのは、フェニル・セファロース上の疎水性相互作用クロマトグラフィーであり、該クロマトグラフィーは、塩基抽出物から高分子量のＵＶ活性がある（ｕｖ−ａｃｔｉｖｅ）汚染物質のほとんどを除去するであろう。莢膜多糖は、高ｐＨ（ｐＨ  １０ないしｐＨ  ８）高塩（２  Ｎないし１  Ｎ）溶出の始めに溶出するであろうが、より疎水性であるタンパク質および核酸は保持されるであろう。疎水性相互作用クロマトグラフィー法の限定されない例は、アルキルアガロースまたはセファロース樹脂であり、フェニル・セファロースＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；ニュージャージー州ピスカタウェイ）が好ましい樹脂である。カラムは、０．５−５．０  Ｎ  ＮａＨＣＯ3であらかじめ平衡化し、そして０．５−５０  ｍｌ／分の流速で１カラム体積で溶出してもよい。約１カラム体積のＮａＨＣＯ3で溶出した後、水約１ないし１０カラム体積を用い、カラムから溶出してもよい。分画をその後、当業者に知られる手段により、多糖に関しアッセイしてもよい。シアル酸含有多糖を検出するための好ましい方法は、実施例に記載される微量規模オルシノールアッセイである。
【００２８】
４．  Ｎ−アセチル化
塩基性条件下での抽出莢膜多糖の分離は、抽出中、そうでなければ塩基安定性である莢膜多糖の、シアル酸およびアミノ糖残基からＮ−アセチル基を除去することにより促進される。
【００２９】
プールした莢膜多糖含有ＨＩＣ分画は、所望により、多様なアセチル化剤を用い、望ましい度合いに再アセチル化してもよい。アセチル化剤の限定されない例は、無水酢酸、塩化アセチル、酢酸ペンタフルオロフェニル、４−酢酸ニトロフェニルである。Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．  ＧｒｅｅｎｅおよびＰｅｒｅｒ  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，第２版（１９９１）を参照されたい。好ましい方法は、約０．５  Ｍないし約２  Ｍの濃度で、好ましくは約０．７  Ｍないし約１  Ｍの濃度で、無水酢酸と混合し、莢膜多糖の未結合アミノ基を再アセチル化し、こうして天然多糖構造を再生成するものである。
【００３０】
５．  クロマトグラフィー精製
再アセチル化ＣＰＳの精製を、その後達成し、抗原、およびワクチンなどの免疫学的試薬を調製するのに使用するＣＰＳを得てもよい。クロマトグラフィー精製の多様な例が、本発明で使用するのに適している。たとえば、イオン交換（陽イオン性または陰イオン性）、疎水性相互作用、親水性相互作用、またはゲル浸透クロマトグラフィーはすべて、再アセチル化ＣＰＳの反応構成要素からの分離を達成するのに用いてもよい。好ましい方法は、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）（アガロースおよびデキストランを架橋したもの）上のゲル浸透クロマトグラフィーの使用であり、該クロマトグラフィーは、残渣汚染物質を除去し、そして精製ＣＰＳを生じるであろう。特に好ましいのは、１，０００−１００，０００のデキストランに関する分画範囲（ＭＷ）を有するスーパーデックス２００  ＰＧである。ＰＢＳを溶離液として用いた流速は、好ましくは約０．１ないし１０  ｍｌ／分である。
【００３１】
本発明の塩基抽出法により産生される莢膜多糖は新規であり（図１１および１２を参照されたい）、そしてその天然構造上のエピトープを維持する（図５−１０）。したがって、本発明にしたがい調製されたＣＰＳは、天然ＣＰＳおよび該ＣＰＳを発現している細菌に交差反応性である抗体産生を引き出す。本発明の方法によりＣＰＳを得るのは、（ａ）本発明の方法を行うことが比較的容易であり、（ｂ）単離収率が増加し、そして（ｃ）結合収率が増加するため、先行技術の方法より優れている。さらに、細菌ＤＮＡおよびＲＮＡは、塩基抽出段階で分解され、そしてしたがって、本発明にしたがい産生される最終産物には、容易に感知できる量は存在しない。
Ｂ．  抽出ＣＰＳの構造
本発明の方法により抽出された莢膜多糖は、先行技術の方法により抽出されたＣＰＳに比べ、特有の構造を有する。該ＣＰＳは、莢膜多糖をポリラムノースに連結しているホスホジエステル結合の塩基触媒加水分解により、そしてポリラムノースをペプチドグリカンに連結しているホスホジエステル結合の塩基触媒加水分解により、得られる（図１１を参照されたい）。細菌細胞壁構造の代替モデルにしたがい、同じく特有の構造を持つＣＰＳが、莢膜多糖をペプチドグリカンに連結しているホスホジエステル結合の塩基触媒加水分解により、そしてポリラムノースをペプチドグリカンに連結しているホスホジエステル結合の塩基触媒加水分解により、得られる（図１２を参照されたい）。先行技術の方法は、異なる結合を切断する酵素を使用する。例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン／Ｎ−アセチルムラミン酸ポリマーを加水分解するのにリゾチームが用いられてきている。Ｎ−アセチルグルコサミン／Ｎ−アセチルムラミン酸ポリマーおよびペプチド部分の間の連結を加水分解するのにミュータノリシンが用いられてきており、そして細菌細胞壁のペプチド部分を加水分解するのにリソスタフィンが用いられてきている。
【００３２】
本発明の莢膜多糖の、絶対分子量分布は、多分散値（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）（Ｍw／Ｍn）が低いことにより示されるように、狭い（表２を参照されたい）。この均一性は、一定しそして有効なワクチン産物を産生するのに有益である。
Ｃ．  ワクチン
本発明はまた、ワクチン調製にも向けられる。本発明にしたがい、上述の単離ＣＰＳを抗原として用い、ＣＰＳに対し反応性である、そしてしたがって該ＣＰＳが単離された生物に対し反応性である抗体を生成してもよい。
【００３３】
本発明のワクチンは、能動または受動免疫を提供する可能性がある。能動免疫を提供するためのワクチンは、本発明の精製ＣＰＳを含む。好ましくは、本ワクチンは、少なくとも１つの免疫原性ペプチドに結合しているＣＰＳを含む。
【００３４】
６．  抗体
上述のＣＰＳ抽出および単離のための技術は、豊富な量の本発明のＣＰＳを提供する。これは、該ＣＰＳに対し反応性である抗体生成を容易にする。
【００３５】
別の態様において、ＣＰＳに対して向けられる抗体は、当業に周知のいかなる技術により生成してもよい。１つのアプローチにしたがい、単離ＣＰＳ調製あるいはその誘導体または断片を宿主動物に投与することにより、抗体を生成してもよい。宿主動物は、限定されるわけではないが、ラット、マウス、非ヒト霊長類、またはヒトであってもよい。好ましくは、宿主はヒトである。当業に知られるアジュバントの使用により、免疫学的応答を高めてもよい。
【００３６】
ＣＰＳに対して向けられるモノクローナル抗体もまた、当業に周知のいかなる技術により調製してもよい。１つの方法にしたがうと、ハイブリドーマ細胞株の培養を使用する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）。ＣＰＳに対して向けられるモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体、当業に周知のいかなる技術により作成してもよい、キメラモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であってもよい。１つのアプローチにしたがい、ヒト定常部と組み合わせた非ヒト（例えばマウス）抗原結合ドメインを有するキメラモノクローナル抗体を生成してもよい（Ｔａｋｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２）。ヒト化抗体は、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号の方法にしたがい、生成してもよい。
【００３７】
ＣＰＳに対して向けられる抗体は、限定されるわけではないが、免疫吸収または免疫アフィニティークロマトグラフィー、あるいは他のクロマトグラフィー法（例えばＨＰＬＣ）を含む、当業に周知のいかなる技術を用い、精製してもよい。抗体はまた、血清、血漿または細胞培地から免疫グロブリン分画として精製してもよい。
【００３８】
本発明の抗体分子は、損なわれていない免疫グロブリン分子、実質的に損なわれていない免疫グロブリン分子、または抗原結合部位を含む、例えばＦａｂ断片などの免疫グロブリン分子の一部であってもよい。
【００３９】
ＣＰＳに対して向けられる抗体の断片は、当業に周知のいかなる技術により生成してもよい（Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８５）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１３巻，Ｂｕｒｄｏｎら（監修），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，アムステルダム）。
【００４０】
７．  結合体分子
本発明のＣＰＳを、単独で、あるいはポリペプチドまたはタンパク質などの別の免疫原性分子に結合して用い、個体において、多様なグラム陰性およびグラム陽性細菌に対する抗体反応を引き出してもよい。ＣＰＳのポリペプチドへの結合は、典型的にはＴ細胞独立性であるＣＰＳに対する免疫応答を、Ｔ細胞依存性の応答に変換する。したがって、ポリペプチドの大きさは、好ましくは、Ｔ細胞独立性からＴ細胞依存性の応答への変換を引き起こすのに十分なものである。第二の免疫原を提供する目的には、より小さいポリペプチドを使用するのが有用である可能性がある。
【００４１】
いかなる結合様式を使用し、ＣＰＳ構成要素をペプチドに結合してもよい。好ましい方法は、米国特許第４，３５６，１７０号に記載されるものである。該特許は、近接（ｖｉｃｉｎａｌ）ジオールの酸化切断を介し、末端アルデヒド基を多糖に導入し、そして還元性アミノ化により該アルデヒド基をペプチドアミノ基にカップリングすることを記載する。
【００４２】
しかし、本発明の結合体ワクチンは、還元性アミノ化を介し産生されるものに限定されないことを理解すべきである。したがって、該ワクチンはまた、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ，  Ｒ．ら（１９８０）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９５２：３６１−４７６および米国特許第４，６４４，０５９号に記載されるような、アジピン酸ジヒドラジドスペーサー、または、例えば、Ｍａｒｂｕｒｇ，  Ｓ．ら（１９８６）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０８：５２８２−５２８７に記載されるようなバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）スペーサー技術をなど、当業者に知られるいかなる連結法を用い、ＣＰＳをペプチドに結合させることにより産生してもよい。
【００４３】
本発明は、ペプチドがＣＰＳ上の１つまたはそれ以上の部位を通じＣＰＳに連結される、結合体分子を産生する能力を提供する。したがって、タンパク質構成要素に関し、本発明にしたがい調製された結合体分子は、単量体、二量体、三量体およびＣＰＳが共に複合タンパク質になるよう架橋している、より高次に架橋された分子であってもよい。
【００４４】
本発明の別の態様において、本発明のＣＰＳに対して向けられる抗体は、宿主個体から別の個体に受動免疫を与えるため（すなわち、グラム陰性またはグラム陽性細菌に対する固体の免疫応答を増大するため、あるいはＡＩＤＳ患者を含む、免疫無防備状態（ｉｍｍｕｎｏ−ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）または免疫枯渇個体に応答を提供するため）、治療または予防適用において薬剤調製として用いてもよい。抗体の受動移植は、当業に知られ、そして、いかなる既知の方法により達成してもよい。１つの方法にしたがい、本発明のＣＰＳまたはその結合体に対して向けられる抗体を、免疫適格（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）宿主（「ドナー」）動物で生成し、該宿主動物から採取し、そしてレシピエント個体に輸注する。例えば、ヒトドナーを用い、本発明のＣＰＳまたはＣＰＳ結合体に対し反応性である抗体を生成してもよい。該抗体をその後、治療または予防に有効な量で、処置が必要なヒトレシピエントに投与し、それにより多糖構成要素により引き出される抗体が結合する細菌に対する耐性を、レシピエントに与えることが可能である（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  Ｍ．およびＣｏｈｅｎ，  Ｓ．  Ｎ．，"Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"，  第７版中，（Ｓｔｉｔｅｓ，  Ｄ．  Ｐ．およびＴｅｒｒ，  Ａ．  Ｔ．監修，  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ  １９９１）第５８章"Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ"を参照されたい）。
【００４５】
８．  薬剤組成物
本発明の薬剤組成物は、ＣＰＳまたは結合体分子を含んでもよく、ＣＰＳおよび薬理学的に許容しうるキャリアー、例えば生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたはそれらに匹敵するものを含む。別の態様において、該薬剤組成物は、例えばペプチドなどの別の免疫原性部分、または本発明のＣＰＳの１つにより引き出される抗体を含む組成物を含む。該組成物はまた、レシピエントの免疫学的応答を亢進するため、アジュバントも含んでもよい。こうしたアジュバントは、アルミニウムに基づく、例えばミョウバン、または長鎖アルキルアジュバント、例えばステアリルチロシンであってもよい（９／１７／９０に提出された、米国特許出願第５８３，３７２号；欧州特許ＥＰ  ０  ５４９  ６１７  Ｂ１；Ｍｏｌｏｎｅｙら、米国特許第４，２５８，０２９号を参照されたい）。また、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、米国特許第５，６８３，６９９号およびＰａｏｌｅｔｔｉら，Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９９７；１７５：１２３７−９も参照されたい。これらの薬剤組成物は、ワクチンとして特に有用である。
【００４６】
受動免疫を引き出すため、薬剤組成物は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体あるいは上述のようなそれらの誘導体または断片を含んでもよい。抗体、断片または誘導体の量は、標準的臨床技術により決定されるように、治療または予防に有効な量である。
【００４７】
本発明の薬剤調製は、有効であることが当業に知られる方法により、個体に導入してもよい。これらのみに限定されないが、皮内、腹腔内、静脈内、皮下、筋内、経口および鼻腔内が、導入経路の中に含まれる。
【００４８】
本発明の組成物は、ワクチンに適していることが当業に知られる、標準的キャリアー、緩衝液または保存剤を含んでもよく、限定されるわけではないが、生理食塩水または他の注射可能液体などの薬学的に許容しうるいかなる適切なキャリアーをも含む。通例ワクチンに用いる添加物、例えばラクトースまたはソルビトールなどの安定化剤およびリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、または硫酸アルミニウムおよびステアリルチロシンなどの免疫応答を亢進するためのアジュバントもまた、存在してもよい。本発明にしたがい産生されるワクチンはまた、複数の感染性病原体に対する免疫応答を引き出す、多価ワクチンの構成要素として用いてもよい。
【００４９】
本発明のワクチンを、免疫原性反応の一部として抗体産生を引き出すのに十分な量で投与する。投与量は、ワクチンを受ける個体の大きさ、体重または年齢に基づき調整してもよい。個体における抗体反応を、抗体力価または殺菌活性に関しアッセイすることによりモニターし、そして必要であれば反応を亢進するため追加免疫してもよい。典型的には、幼児に対する単回用量は用量あたり結合体ワクチン約１０μｇまたは約０．５μｇ−２０μｇ／キログラムである。成人は、結合体ワクチン約０．５μｇ−２０μｇ／キログラムの用量を受ける。ＣＰＳワクチンに関しては、典型的な用量は、用量当たり個々のＣＰＳ各約２５μｇである。すなわち、Ｂ群連鎖球菌に対するワクチンは、９つの血清型各々の各ＣＰＳ型を２５μｇ含む可能性がある。
Ｄ．  診断用キット
別の態様において、本発明のＣＰＳあるいはその誘導体または断片を用い、肺剥離（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｓ）毒素などの毒素を含まないが、なおグラム陰性またはグラム陽性細菌に対して向けられる抗体の存在を示すことが可能である、より安全な診断用キットを産生することが可能である。こうした抗体の存在は、該病原体に以前曝露されたことを示し、そして感染に耐性である可能性がある個体を予測することが可能である。グラム陰性またはグラム陽性細菌に対して向けられる抗体を含む試料と、修飾ＣＰＳあるいは誘導体または断片が混合された際、抗体反応を検出するため、診断用キットは、少なくとも１つの本発明のＣＰＳあるいはその誘導体または断片および適切な試薬を含んでもよい。抗体反応は、当業に記載されるいかなる方法により同定してもよく、限定されるわけではないが、ＥＬＩＳＡアッセイを含む。こうした知識は重要であり、そして該知識により不必要なワクチン接種を避けることが可能である。
【００５０】
あるいは診断用キットは、さらに、固体支持体あるいは磁気ビーズまたはプラスチックマトリックスおよび少なくとも１つの本発明のＣＰＳあるいはその誘導体または断片を含んでもよい。
【００５１】
ある場合では、ＣＰＳあるいは誘導体または断片が標識されていることが好ましい可能性がある。標識剤は当業に周知である。例えば、標識剤には、限定されるわけではないが、放射能、化学発光、生物発光、発光、または簡便な解析のための他の同定「タグ」が含まれる。体液または組織試料（例えば血液、血清、唾液）を収集し、そして精製し、そして診断用キットに適用してもよい。ＣＰＳ、誘導体または断片は精製してもまたは精製しなくてもよく、そして分子カクテルを含んでもよい。
【００５２】
固体マトリックスは当業に知られており、そして入手可能で、そして限定されるわけではないが、試験管、ビーズ、微小粒子、ディップスティック、プレートまたはそれらに匹敵する形状の、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、またはいかなる固体プラスチック成分をも含む。さらに、マトリックスには、限定されるわけではないが、膜、９６ウェルマイクロタイタープレート、試験管およびエッペンドルフチューブが含まれる。一般的に、こうしたマトリックスは、リガンド結合剤が付着することが可能ないかなる表面も、またはそれ自体リガンド付着部位を提供する表面をも含む。
【００５３】
本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および論文は、特に全体として本明細書に援用される。以下の実施例は、本発明を例示するために存在し、いかなる点でも本発明の範囲を限定すると見なしてはならない。当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変化および置換を行ってもよいことが理解されるであろう。
【実施例】
【００５４】
Ａ．細菌株、成長培地、及び培養条件
Ｉｂ型Ｂ群連鎖球菌株Ｈ３６ｂ（ＡＴＣＣ１２４０１）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（Rockville、MD）から入手した。用いた他の株、０９０（Ｉａ型）、１８ＲＳ２１（II型）、Ｍ７８１（III型）、及び１１６９−ＮＴＩ（Ｖ型）は、ハーバード医学校（Harvard Medical School）の D.L. Kasper のご厚意により提供を受けた。髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｂ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５型はＦＤＡ、ＣＢＥＲの Carl Frasch のご厚意により提供を受け、大腸菌（Escherichia coli）ＫｌはＦＤＡ、ＣＢＥＲの Willie Vann のご厚意により提供を受けた。
【００５５】
Ｂ群連鎖球菌株の各々を、透析液（10,000 の公称分子量限界（ＮＭＷＬ）膜）、６％グルコースを補足した３．５％ Columbia ブロス（Difco Laboratories, Inc.、Detroit、MI）のPellicon カセットシステム（Millipore Corp.、Bedford、MA）において個別に成長させた。振盪三角フラスコにおいて３７℃で８時間成長させた種培養物１５０ｍＬを用いて、１４リットルのブロス（上記参照）を充填した Bioflo IV ２０リットル発酵槽（New Brunswick Scientific Co.、Edison、NJ）に接種した。この発酵培養を３７℃に維持し、１０Ｎ  ＮａＯＨを添加することでｐＨ７．１に連続的に調整して、１．５Ｌ／分で通気した。１７時間後に、MiniKros ０．２μｍ孔中空繊維カートリッジ（Microgon, Inc.、Laguna Hills、CA）を通す微量濾過によって細胞を回収した。その培養上清を、さらに処理するまで４℃で無菌的に維持した。分離した細胞を Sorvall GSA ローター（DuPont Clinical & Instruments Div.、Wilmington、DE）において９０００ｒｐｍで５０分間遠心することにより最終細胞ペレットを得た。
Ｂ．莢膜多糖を生成するための一般的な方法
１．抽出及び疎水性相互作用クロマトグラフィー
ペレットを、グラム湿潤重量の細胞ペーストを１容積として用いて４容積の１Ｎ  ＮａＯＨに懸濁させた。この懸濁液を３７℃で一晩インキュベートした。Sorvall GSA ローターにおいて１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心することにより細胞残滓を除去した。濃ＨＣｌ（J.T. Baker、Phillipsburg、NJ）で中和した後、上清を Pellicon 10,000 NMWL 膜を用いて２Ｎ  ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．６）に対してダイアフィルトレート（diafiltered）した。次に、得られたリテンテート（retentate）を、Phenyl Sepharose HP（Pharmacia Biotech；Piscataway、NJ）を充填し、２Ｎ  ＮａＨＣＯ3で予め平衡化した、下記 Pharmacia クロマトグラフィーシステムを用いる Pharmacia XK 26/60 カラムにかけた。このカラムをまず１カラム容積の２Ｎ  ＮａＨＣＯ3を用いて、次に２カラム容積の水を用いて４ｍｌ／分で溶出した。画分を多糖について検定し（下記参照）、莢膜多糖を含むものをプールした。
【００５６】
また、培養上清からも莢膜多糖を精製した。細胞を除去した後、ブロスを１０−１５倍に濃縮し（Pellicon、10,000 NMWL 膜を使用）、１０容積の水に対してダイアフィルトレートした。得られたリテンテートに最終濃度１Ｍとなるまで１０Ｎ  ＮａＯＨを添加した。この溶液を３７℃で一晩インキュベートし、濃ＨＣｌで中和した。細胞抽出について上に記述される通りに処理を継続した。
【００５７】
III型莢膜多糖のバッチの１つについては、細胞及び培養上清を以下のように一緒に抽出した。細胞から分離した培養上清を濃縮してダイアフィルトレートし、得られたリテンテートを上述の通りに処理した。細胞ペレットを４容積の塩基処理リテンテートに懸濁させ、細胞抽出について上に記述される通りにさらに処理した（前記参照）。
【００５８】
２．再Ｎ−アセチル化
多糖を前に記述される抽出条件に晒すと多糖からＮ−アセチル基が放出されるため、無水酢酸（Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、WI）をプールした画分に最終濃度０．８Ｍになるまで滴下により添加することによって多糖を再Ｎ−アセチル化した。この反応混合物を室温で１時間攪拌し、１０Ｎ  ＮａＯＨを添加することでｐＨ９に維持した。次に、反応のｐＨを１３に上昇させ、反応をさらに３０分間継続した。再Ｎ−アセチル化莢膜多糖を含むその溶液を Minitan カセットシステム（10,000 NMWL 膜、Millipore）を用いて水に対してダイアフィルトレートし、リテンテートを凍結乾燥した。その凍結乾燥体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、Superdex 200 PG でのゲル浸透クロマトグラフィーによって精製した（下記参照）。莢膜多糖を含む画分をプールし、水に対してダイアフィルトレートし（前記参照）、リテンテートを凍結乾燥して精製ＣＰＳを得た。
【００５９】
３．ゲル浸透クロマトグラフィー
分析用ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）は、Pharmacia UV-1 紫外線検出器（２８０ｎｍフィルター装備）、Waters 社（Milford、MA） R401 示差屈折計、及び Pharmacia Superose 6 HR 10/30 （高度に架橋したビーズ化アガロース）カラムを備える Pharmacia FPLC システムで行った。カラムはＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて０．５ｍｌ／分で溶出した。デキストラン（分子量約２×１０6；Sigma Chem Co.、St. Louis、MO）を空隙容積（Ｖo）を決定するのに用い、ナトリウムアジドを総床容積（Ｖt）を決定するのに用いた。相対溶出容積はＫav＝（Ｖe−Ｖo）／（Ｖt−Ｖo）で表し、ここでＶeはＲＩプロフィールからの溶出容積である。分離用ＧＰＣは、上記検出器、P-50 ポンプ、FRAC-100 画分コレクター、GP-250 Plus コントローラー、及び Superdex 200 PG を充填した XK 26/100 カラム（Pharmacia）を含む Pharmacia システムで行った。カラムはＰＢＳを用いて１ｍｌ／分で溶出した。
Ｃ．多糖の分析
１．モル質量の決定
多糖の絶対モル質量を、インライン多角度レーザー光散乱光度計及び示差屈折計による検出を備える分析用ＧＰＣ（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ／ＲＩ）によって決定した。この方法は、Jasco PU-980 HPLC ポンプ（Easton、ＭＤ）、Rheodyne モデル７１２５注入弁（Cotati、ＣＡ）、及びＰＢＳで平衡化した Superose 6 HR 10/30 カラムからなる液体クロマトグラフィーシステムを用いて、０．５ｍｌ／ｍｌの流速で行った。移動相は超高純度水（Stephens Scientific、Riverdale、NJ）中に調製し、Millipore GV 型０．２２ｍｍ膜を備える２５ｍｍ径インラインフィルター（Millipore）を通して濾過した。多糖試料（１−２ｍｇ）を移動相中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、注入する前に得られた溶液を微量遠心機において１４，０００ｒｐｍで２ないし３分間遠心して粒体を除去した。カラム流出液を、Hewlett-Packard モデル 1047A 示差屈折計に連結させたインライン miniDAWN 固定三角度レーザー光散乱光度計（Wyatt Technology Corp.、Santa Barbara、CA）で直接分析した。屈折計のアナログ信号出力は補助入力チャンネルを介して miniDAWN に連結した。光散乱データを得、Wyatt's ASTRette 及び EASI ソフトウェアで処理した。ピーク面積を Wyatt ソフトウェアにより、ピークの全範囲にわたる２００−３００の台形状区画、すなわち"スライス"の面積の合計として算出した。このようにして得られた面積から、所定のピークにおいて溶出した多糖の重量平均及び数平均モル質量（それぞれＭw及びＭn）を算出した。比屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）は、オンライン HP 1047A 屈折計を用いて、全ての多糖について０．１４０ｍｌ／ｇであると決定された。この値は他の多糖について従来得られている値（７、８、３８）に匹敵した。
【００６０】
２．ＮＭＲ分光法
Ｄ2Ｏ（Aldrich）中の多糖試料（４−５ｍｇ／ｍｌ）の一次元1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、Bruker Instruments AMX 500 分光計（Billerica、MA）を用いて５００ＭＨｚで記録した。スペクトルデータは５０℃で得、化学シフトはＤ2Ｏ中の外部２，２，３，３−テトラジューテリオ−３−（トリメチルシリル）プロピオネート（Aldrich）を参照した。
【００６１】
３．化学分析
分離用カラム流出液及び精製多糖中の多糖含量を、シアル酸についての  Reuter 及び Schauer （３５）のマイクロスケール・オルシノール検定を修正することによって決定した。簡単に述べると、１−１．５μｇのＮｅｕＡｃ標準又は３００μｇ／ｍｌまでの精製莢膜多糖を含む試料又は対照１００μｌを１．５ｍｌ微量遠心管中のオルシノール試薬（３５）１００μｌに添加した。試料を十分混合し、沸騰水浴中で１５分間加熱した。試料を氷水中で５分間冷却した後、５００μｌのイソアミルアルコール（Fluka Chemical Co.、Ronkonkoma、NY）を各々の試料に添加した。その試料を完全に混合し、微量遠心機において３０００ｒｐｍで２−３分間遠心した。この手順を繰り返し、アルコールへの発色団の完全な抽出を確実なものとした。各試料のアルコール相から２００μｌを９６ウェル平底低結合性ポリスチレンマイクロタイタープレート（Coming Costar Corp.、Cambridge、MA）に移し、Molecular Devices Emax マイクロプレート・リーダー（Menlo Park、CA）において５６０ｎｍで読み取った。最終多糖調製品の純度はシアル酸含量から以下の式量を用いて導き出した；末端ＮｅｕＡｃ残基について３１４．３ｇ／モル；Ｉａ、Ｉｂ、又はIII型ＣＰＳの反復単位について１００４ｇ／モル；II又はＶ型ＣＰＳの反復単位について１３２８ｇ／モル。
【００６２】
タンパク質含量はＰＢＳ中にｍｌ当たり１−２ｍｇの莢膜多糖を含む試料について Bradford 法（９）により Pierce （Rockford、IL) Coomassie Plus 試薬及び標準としてのウマＩｇＧを用いて決定した。核酸含量は２６０ｎｍでの直接ＵＶ光度測定によって決定した。これらの検定のための光度測定は Shimadzu モデル UV160U 分光光度計（Shimadzu Scientific Inst., Columbia, MD）を用いて行った。
Ｄ．収量
様々なＢ群連鎖球菌血清型から得られた莢膜多糖の収量を表１に示す。全ての血清型について、細胞ペレットから精製された多糖は培養上清から精製されたものを上回り、その範囲はII型についての４倍高い収量からＩｂ型についての６０倍までであった。比較のため、細胞からの収量の他に上清からの収量を培養のリットル当たりの多糖のミリグラム（ｍｇ／Ｌ）として表１に示す。したがって、１４リットルの発酵を考えたとき、細胞からの総収量はＩａ型についての１．１ｇからII型についての０．６ｇまでの範囲をとり、これに対して上清からの総収量はII型についての１５０ｍｇからＩｂ型についての１４ｍｇまでの範囲をとっていた。III型の発酵からの細胞及び上清を一緒に処理したとき、その収量、合計６３ｍｇ／Ｌ、すなわち０．９ｇは細胞ペレット単独から得られるものに類似していた。研究したＢ群連鎖球菌株の間での細胞に由来する莢膜多糖の分離収量対上清に由来するものの比における変動は、血清型の間での、本発明の成長条件下で莢膜多糖を放出する異なる傾向を示唆するものである。この手順によって精製した細胞関連莢膜多糖の量は、Hunoistein ら（３９）によって報告されるように、（莢膜多糖のマーカーとして用いられる）細胞結合シアル酸のレベルから推定し得る、Ｉａ、III、IV、Ｖ、及びVI型のＢ群連鎖球菌株のバッチ発酵から入手可能であることが見出されている量にほぼ等しい。より強力な抽出条件（例えば、より強い塩基、より高い温度、又は抽出混合物の攪拌）により細胞結合莢膜多糖の収量が改善されることが期待される。
【００６３】
【表１】
2010011862.tif 000002
【００６４】
結果
Ａ．精製多糖の分析
研究したＢ群連鎖球菌血清型の各々について、両源からの多糖調製品の一次元1Ｈ  ＮＭＲ分光法により、それぞれの型の多糖について従来公開されているスペクトルデータ（４１、４４）とのそれらの同一性が確認された。さらに、これらの調製品全てのＮＭＲスペクトルデータは非常に低いレベルの汚染を示した。５つのＢ群連鎖球菌多糖の代表的なＮＭＲスペクトルを図１−５に示す。２６０ｎｍでの直接ＵＶ光度測定による検出で核酸レベルは１質量％を超えることがなく、これに対して Bradford 法（９）による検定でタンパク質はいかなる多糖調製品においてもこの検定の検出下限（１μｇ／ｍｌ）より上で検出することができなかった。修正マイクロスケール・オルシノール検定（３５）によって推定されるシアル酸含量から算出される多糖の純度は、全て約１００％であった。したがって、上述の手順によって得られる全ての多糖調製品について、スペクトル及び光度測定データはタンパク質又は核酸による汚染が最小に留まる非常に純粋な莢膜多糖と一致する。
Ｂ．多糖の分子サイズ
ＲＩ検出ＧＰＣプロフィールのピーク最大から得た、Superose 6 での精製多糖の（ＫAVとしての）相対溶出容積を表２に示す。
【００６５】
別々の分析で、多糖の絶対モル質量分布をＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ／ＲＩによって決定した。この方法は、流速及び保持容積のようなクロマトグラフィーのパラメータとは無関係に、かつその水力学的特性が関心のある分析物から大きく変動する可能性のある二次標準を必要とすることなく、巨大分子のモル質量を直接推定することを可能にする。ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ／ＲＩを特徴付けの方法として利用することは薬学的に関心のある多糖について十分に確立されている（７、８、１０、１７、２５）。モル質量分布は、通常、重量平均モル質量（Ｍw）及び多分散（Ｍw／ＭN）として提示され、後者は分散の幅を示すものである。多分散が単一に近づくに従ってモル質量分布が均一に近づく。
【００６６】
精製Ｂ群連鎖球菌多糖のモル質量データを表２に示す。各々の血清型で、両源からの多糖調製品のモル質量分布は類似していた。これらの調製品の重量平均モル質量は、Ｖ型由来の細胞関連莢膜多糖についての９２ｋｇ／モルから、培養上清から精製したＩａ型の莢膜多糖についての３１８ｋｇ／モルの範囲であった。それらの低い多分散性（ＭW／ＭN≦１．６）によって示されるように、全ての調製品の分布は狭かった。これらの値は、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）及びｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の幾つかの血清型の莢膜多糖を同様に分析することによって得られるものに匹敵した（７、１７）。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
ＮＭＲスペクトルデータと併せて考えると、これらのモル質量分布は、各々の血清型について、上清又は細胞ペレットから（加えて、III型については両源を合わせたものから）精製された多糖の間での相違が些細なものであることを示す。各々の血清型の調製品に対するＮＭＲスペクトルによってそれらが化学的に同一であることが示されるため、これらの調製品の免疫化学的挙動も同一であるものと予想される。したがって、抽出のために培養上清を細胞と組み合わせるかどうかの判断は、上清から期待される、収量に対する寄与（表１）にのみ基づく。したがって、II型の抽出物を合わせて用いることが好ましいものであり得る。
【００６９】
免疫化学的分析
Ａ．競合阻害ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（NUNC Polysorp）を、ＰＢＳ（５０ｎＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）で希釈したＧＢＳＰIa−ＨＳＡ、ＧＢＳＰIb−ＨＳＡ、ＧＢＳＰII−ＨＳＡ、ＧＢＳＰIII−ＨＳＡ、又はＧＢＳＰV−ＨＳＡ（各々のウェルに対して１００μＬ中１００ｎｇの多糖）のいずれかを用いて３７℃で１時間受動的にコートした。これらのプレートをＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ＝７．４）で洗浄した後、１５０μＬ／ウェルのＰＢＳ＋０．１％ウシ血清アルブミンでブロックした。後コートの後、プレートを再度洗浄して用いるまで４℃で保存した。
【００７０】
ＧＢＳＰIa、ＧＢＳＰIb、ＧＢＳＰII及びＧＢＳＰIIIに対するウサギ抗全細胞Ｂ群連鎖球菌抗血清（Dennis Kasper）を、それぞれ、ＧＢＳＰIa−ＨＳＡ、ＧＢＳＰIb−ＨＳＡ、ＧＢＳＰII−ＨＳＡ、及びＧＢＳＰIII−ＨＳＡでコートしたプレート上で別々に滴定した。同様に、ウサギ抗ＧＢＳＰV−ＴＴ抗血清をＧＢＳＰV−ＨＳＡでコートしたプレート上で滴定した。最大信号の約５０％に相当する希釈を阻害研究に適するものとして選択した。
【００７１】
この抗血清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで希釈した。希釈した抗血清を含むバッファで阻害剤を連続的に５倍に希釈した。次に、これらの試料１００μＬをコートしたマイクロタイタープレートのウェルに二組ずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、製造者の指示に従ってＰＢＳ-Tｗｅｅｎで希釈したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン−セイヨウワサビ結合体（Kirkegaard & Perry）１００μＬを各ウェルに添加した。それらのプレートを室温でインキュベートした後、再度洗浄した。１００μＬのＴＭＢマイクロウェル基質（カタログ番号５０−７６−０４、Kirkegaard & Perry）を各ウェルに添加した。５分後に１００μＬの一成分停止溶液（カタログ番号５０−８５−０４、Kirkegaard & Perry）を添加することにより反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。阻害を、いかなる阻害剤も存在しない状態において希釈抗血清で達成される最大信号のパーセンテージとして決定した。
Ｂ．結果
特異的ＧＢＳ抗血清Ｉａ、Ｉｂ、II、III、Ｖの各々の、それらの相同莢膜ＰＳ抗原での結合阻害曲線をそれぞれ図５−１０に表す。これらの曲線によって立証されるように、培養上清から抽出されたものであろうとブロスから抽出されたものであろうと、各々のＰＳ抗原は同様の阻害特性を有し、これらはそれらの抗原的な等価性を示す。したがって、これらの莢膜多糖の生成に用いられる手順はそれらの抗原性に影響を与えない。
【００７２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010011862.tif 000010
【図８】
2010011862.tif 000011
【図９】
2010011862.tif 000012
【図１０】
2010011862.tif 000013
【図１１】
2010011862.tif 000014
【図１２】
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