(57)【要約】【課題】多色蛍光検出に有用な、スペクトル分解可能な蛍光標識として使用される色素を提供すること。【解決手段】  構造（１）  【化１】2010159420.tif 000035で示されるジベンゾローダミン化合物（この窒素置換形態およびアリール置換形態を含む）を色素として使用すること。当該化合物は、約６３０ｎｍより高い波長を有する励起光源（例えば、ヘリウム−ネオンガスレーザーまたは固体状ダイオードレーザー）を用いる、４色自動DNA配列決定システムに特に適している。で示されるジベンゾローダミン化合物（この窒素置換形態およびアリール置換形態を含む）を色素として使用すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有するジベンゾローダミン化合物であり：
【化１】
2010159420.tif 000033
この窒素置換形態およびアリール置換形態を含む、ジベンゾローダミン化合物。
【請求項２】
エネルギー移動色素であって、以下：
第１の波長において光を吸収し得、そして応答の際に励起エネルギーを放出し得るドナー色素；
該ドナー色素によって放出される励起エネルギーを吸収し得、そして応答の際に第２の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに
該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するリンカーであり、該リンカーは、該ドナー色素と該アクセプター色素との間のエネルギーの効率的な移動を促進するために役立つ；
ここで、少なくとも１つの該ドナー色素および該アクセプター色素が、請求項１に記載のジアゾベンゾローダミン化合物である、エネルギー移動色素。
【請求項３】
式：
ＮＵＣ−Ｄ
を有する、標識ヌクレオシド／シドであり、
ここで、
ＮＵＣは、ヌクレオシド／チドまたはヌクレオシド／チドアナログであり；
Ｄは、請求項１に記載のジベンゾローダミン色素化合物であって、ＮＵＣおよびＤは連結によって連結されており；
ここで、ＮＵＣがプリン塩基を含む場合、該連結が該プリンの８位に結合され、ＮＵＣが７−デアザプリン塩基を含む場合、該連結は該７−デアザプリンの７位に結合され、そしてＮＵＣがピリミジン塩基を含む場合、該連結は該ピリミジンの５位に結合される、標識ヌクレオシド／シド。
【請求項４】
ポリヌクレオチド配列決定方法であり、以下の工程：
第１クラス、第２クラス、第３クラス、および第４クラスのポリヌクレオチドの混合物を形成する工程であって、これによって：
該第１クラスにおける各々のポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシアデノシンを含み、そして第１の色素で標識され；
該第２クラスにおける各々のポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシシチジンを含み、そして第２の色素で標識され；
該第３クラスにおける各々のポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシグアノシンを含み、そして第３の色素で標識され；
該第４クラスにおける各々のポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキチミジンを含み、そして第４の色素で標識され；
ここで、該第１、該第２、該第３または該第４の色素の少なくとも１つが、請求項１に記載のジベンゾローダミン化合物であり；
該色素の他方は、該ジベンゾローダミン色素および互いからスペクトル的に分解可能であり；
該ポリヌクレオチドを電気泳動的に分離し、それによって様似の大きさのポリヌクレオチドのバンドを形成する工程；
該色素に蛍光を引き起こさせ得る照射光を用いて該バンドを照射する工程；ならびに、  該色素の蛍光スペクトルによる該バンドにおける該ポリヌクレオチドのクラスを同定する工程、
を含む、方法。
【請求項５】
フラグメント分析方法であり、以下の工程：
標識されたポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程であり、該フラグメントが、請求項１に記載のジベンゾローダミン化合物で標識される、工程；
該標識されたポリヌクレオチドフラグメントを、サイズ依存性分離プロセスに供する工程；および
該分離プロセスに引き続いて、該標識されたポリヌクレオチドを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
以下の構造を有する、ジベンゾローダミン化合物：
【化２】
2010159420.tif 000034
ここで、該化合物は、その窒素置換形態およびアリール置換形態を含むが、ただし、Ｃ−７は水素に結合している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、蛍光色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、蛍光標識剤として有用な、修飾されたローダミン色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
蛍光標識を使用する、生物学的分析物の非放射性検出は、現代分子生物学において重要な技術である。放射性標識の必要を除去することによって、安全性が高められ、そして薬剤処分に関連する環境影響（ｉｍｐａｃｔ）および費用は、非常に軽減される。そのような非放射性蛍光検出を使用する方法の例として、４色自動ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出、イムノアセッイなどが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
多数の適用において、複数の空間的に重複する分析物の独立的検出（例えば、単管多重ＤＮＡプローブアッセイおよび４色自動ＤＮＡ配列決定）を達成するために、複数のスペクトルで区別可能な蛍光標識を利用することは、有益である。単管多重ＤＮＡプローブアッセイの場合、空間的に区別可能な蛍光標識を利用することによって、反応管の数は減少され得、それによって、実験プロトコルを簡略化し、適用特異的試薬キットの製造を容易にする。４色自動ＤＮＡ配列決定の場合、多色蛍光標識は、単一レーンにおいての複数の塩基の分析を可能にし、それによって、単色法を超えて処理量を増加させ、そして内部レーン電気泳動易動度変化と関連する不確定性を減少させる。
【０００４】
複数のスペクトルで区別可能な蛍光標識のセットを集めることは、問題がある。多色蛍光検出は、特に単励起光源、電気泳動分離、および／または酵素による処理を必要とする適用（例えば、自動ＤＮＡ配列決定）について、色素標識の選択において少なくとも６個の厳密な制約を賦課する。第一に、構造的に類似する色素のセット（その発光スペクトルはスペクトルで分解される）を見つけることは、有機蛍光色素についての典型的な発光バンド半値幅が約４０〜８０ナノメートル（ｎｍ）であるので、困難である。第二に、たとえ重複しない発光スペクトルを有する色素が確認されても、それぞれの蛍光量子効率が低すぎる場合は、そのセットは適切でない。第三に、数個の蛍光色素が同時に使用される場合、色素の吸収バンドは通常広範囲に分離しているので、同時励起は困難である。第四に、色素の、電荷、分子のサイズ、およびコンホメーションは、分析物の電気泳動易動度に悪影響を与えてはならない。第五に、蛍光色素は、分析物（例えば、ＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素など）を生成または製造するために使用される化学物質と適合でなければならない。第六に、色素は、レーザー励起に耐えるに十分な光安定性（ｐｈｏｔｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を有さなければならない。
【０００５】
４色自動ＤＮＡ配列決定適用に適切な、現在入手可能な複数の色素のセットは、セットを作る全色素からの蛍光発光を十分に励起する、ブルーまたはブルー−グリーンレーザー光（例えば、アルゴンイオンレーザー）を必要とする。市販の自動ＤＮＡ配列決定システムにおいてのブルーまたはブルー−グリーンレーザーの使用は、このようなレーザーの高コストおよび寿命制限のために、有益ではない。
【０００６】
（要旨）
本発明は、多色蛍光検出について有用な、スペクトル分解可能な蛍光標識のセットの作製に適切な、ジベンゾローダミン色素化合物のクラスの本発明者らの発見に関する。表題色素化合物は、約６３０ｎｍより高いの波長を有する励起光源（例えば、ヘリウム−ネオンガスレーザーまたは固体状ダイオードレーザー）を用いる、４色自動ＤＮＡ配列決定システムにおける使用について、特によく適している。
【０００７】
第一の局面において、本発明は、以下の構造を有するジベンゾローダミン色素化合物、ならびにその窒素およびアリ−ル置換形態を包含する。
【０００８】
【化１】
2010159420.tif 000002
第二の局面において、本発明は、以下の構造を有するジベンゾローダミン色素化合物の合成について有用な中間体を包含する。
【０００９】
【化２】
2010159420.tif 000003
式Ｉにおいて、Ｒ１は、Ｈまたは
【化３】
2010159420.tif 000004
であり、ここで、Ｙは、Ｈ、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、芳香族、フェニル、多環式芳香族、複素環、水可溶化基（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）、または結合基であり、そしてその置換形態を包含する。Ｒ１がＨである場合、Ｃ−１２結合窒素ならびにＣ−１２およびＣ−１３炭素は、４〜７員を有する第一環構造を形成し、そして／またはＣ−１２結合窒素ならびにＣ−１１およびＣ−１２炭素は、５〜７員を有する第二環構造を形成する。式Ｉの化合物は、さらに、そのアリ−ルおよび窒素置換形態を包含する。
【００１０】
第三の局面において、本発明は、エネルギー移動色素化合物（ドナー色素、アクセプター色素、ならびにドナー色素およびアクセプター色素を結合するリンカーを包含する）を含む。ドナー色素は、第一波長で光を吸収し、そして応答で励起エネルギーを放出し得、そしてアクセプター色素は、ドナー色素によって放出された励起エネルギーを吸収し、そして応答で第二波長で蛍光を発し得る。リンカーは、ドナー色素とアクセプター色素との間のエネルギーの能率的な移動を容易にすることに役立つ。本発明によると、ドナーおよびアクセプター色素の少なくとも１つが、上記の構造のセットを有するジベンゾローダミン色素である。
【００１１】
第四の局面において、本発明は、構造ＮＵＣ−Ｄを有する、標識されたヌクレオシド／チドを包含し、ここで、ＮＵＣは，ヌクレオシド／チドまたはＮＵＣはヌクレオシド／チドアナログであり、そしてＤは上記の構造のセットを有するジベンゾローダミン色素化合物である。本発明によると、ＮＵＣおよびＤは、そこで結合が置換位の１つでＤに連結している結合によって連結される。さらに、ＮＵＣがプリン塩基を含む場合、この結合はこのプリンの８位に連結されており、ＮＵＣが７−デアザプリン塩基を含む場合、この結合はこの７−デアザプリンの７位に連結され、そしてＮＵＣがピリミジン塩基を含む場合、この結合はこのピリミジンの５位に連結される。
【００１２】
第五の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド分析法を含み、そしてこれは、上記の構造のセットを有するジベンゾローダミン色素で標識した標識ポリヌクレオチドフラグメントのセットを形成し、この標識ポリヌクレオチドフラグメントをサイズ依存分離プロセス（ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（例えば、電気泳動）にかけ、そしてこの分離プロセス後の標識ポリヌクレオチドフラグメントを検出する、工程を含む。
【００１３】
上述の本発明の種々の局面は、複数蛍光検出に有用な公知の蛍光色素化合物に対する、一個以上の下記の重要な利点を達成する：（１）表題色素化合物は、約６３０ｎｍ以上の波長を用いる低コストのレッドレーザーによって効率的に励起され得る；（２）表題色素化合物の発光スペクトルは、窒素および／またはアリ−ル置換基のタイプならびに位置における微小な変化によって調整され得、これは、スペクトルで分解可能な蛍光発光スペクトルを有するが、同様の吸収特性を有する色素セットの作製を可能にする；（３）表題色素化合物は、その有利な蛍光特性を妥協せずに、ヌクレオシド／チドまたはポリヌクレオチドに容易に結合し得る；（４）表題色素化合物は、狭い発光バンド幅を有する、すなわち、その発光バンド幅は、約７０ｎｍより小さい、最大発光強度の半分のところでの全幅を有する；（５）表題色素化合物は、高量子収量を維持するが、緩衝水溶液中に高溶解である；（６）表題色素化合物は、比較的光安定である；および（７）表題化合物は、比較的大きな吸光係数（すなわち、約５０，０００より大きい）を有する。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の特色ならびに利点は、以下の説明、図、および添付の特許請求の範囲を参照することで、よりよく理解される。
【００１５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明の好ましい実施態様の参照（添付の図面中に例示される実施例）は、ここで、詳細になされる。本発明は好ましい実施態様と組み合わせて説明されるが、それらが本発明を本実施態様に限定する意図はないということが理解される。それに対して、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような、本発明内に含まれ得る、全ての代替物、改変物、および等価物を包含することを意図する。
【００１６】
一般的に、本発明は、蛍光標識として有用なジベンゾローダミン色素化合物の新規のクラス、このような色素、このような色素を利用する試薬の合成のための方法および中間体、ならびに分析バイオテクノロジーの分野でのこのような色素および試薬を使用する方法を包含する。本発明の化合物は、蛍光核酸分析（例えば、自動ＤＮＡ配列決定およびフラグメント分析、ハイブリダイゼーションアレイにおけるプローブハイブリダイゼーションの検出、核酸増幅産物の検出など）の分野における特定の適用を見出す。
【００１７】
（Ｉ．定義）
他に述べない限り、本明細書中で使用される以下の用語およびフレーズは、以下の意味を有することを意図する：
色素のセットに関する「スペクトル分解」は、色素の蛍光発光バンドが十分に区別できる（すなわち、十分に非重複（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）である）ということ、そこへ各色素が結合される試薬（例えば、ポリヌクレオチド）が、標準的な光検出システム（例えば、バンド通過フィルターおよび光電子増倍管、電荷結合素子および分光器などを用いる）を使用して、各色素によって発生した蛍光シグナルに基づいて区別され得るということ（米国特許第４，２３０，５５８号、同第４，８１１，２１８号、またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、２１〜７６頁、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）に記載のシステムによって例示されるように）を意味する。
【００１８】
「複素環」は、その中で一個以上の環原子が炭素でない（すなわち、へテロ原子である）環式化合物を意味する。例示的な複素環は、ピロール、インドール、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェンおよび他の類似構造が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
「結合基」は、試薬またはエネルギー移動色素対のメンバーと結合する「相補官能基（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）」と反応し得る部分のことを意味し、このような反応は、色素を試薬またはエネルギー移動色素対のメンバーと連結させる「結合」を形成する。好ましい結合基は、イソチオシアナート、塩化スルホニル、４，６−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、または相補官能基がアミンのときはいつでも他の活性化カルボキシレートである。好ましくは、結合基は、マレイミド、ハロアセチル、または相補官能基がスルフヒドリルのときはいつでもヨードアセトアミドである。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。特に好ましい実施態様において、結合基はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、そして相補官能基はアミンであり、ここで、ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート基を含む本発明の色素は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応する。
【００２０】
本明細書で使用されるような「置換（された）」は、一個以上の水素原子が一個以上の非水素原子、官能基または部分と置き換えられる、分子をいう。例えば、非置換窒素は−ＮＨ２であるが、置換窒素は−ＮＨＣＨ３である。例示的な置換基には、ハロ（例えば、フッ素および塩素）、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルフェート、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環芳香族、複素環、水可溶化基、および結合基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
「多環式芳香族」とは、複数の環構造を有する芳香族炭化水素（ビアリ−ルおよび縮合ベンゼノイド炭化水素を含む）を意味する。ビアリ−ルは、２個以上の環が単結合によって共に結合されるベンゼノイド化合物である。このクラスの親（ｐａｒｅｎｔ）系は、ビフェニルである。縮合ベンセノイド化合物は、それぞれの環対が２個の炭素を共有するような様式で、オルト位で共に融合される２個以上のベンゼン環によって特徴づけられる。この基の最も単純なメンバーは、ナフタレン（２環を有する）、ならびにアントラセンおよびフェナントレン（３環を有する）である。
【００２２】
「低級アルキル」とは、１〜８個の炭素原子を含む直鎖および分枝炭化水素部分を示し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなどである。
【００２３】
「低級アルケン」とは、１〜８個の炭素原子を含む炭化水素のことであって、ここで、１個以上の炭素−炭素結合が二重結合である、ということを意味する。
【００２４】
「低級アルキン」とは、１〜８個の炭素原子を含む炭化水素のことであって、ここで、１個以上の炭素が三重結合で結合される、ということを意味する。
【００２５】
「ヌクレオシド」とは、プリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）から成り、１’位で五炭糖に結合する化合物のことである。ヌクレオシド塩基がプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプリンまたはデアザプリンの９位に結合しており、そしてヌクレオシド塩基がピリミジンである場合、糖部分はピリミジンの１位に結合している（例えばＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２））。本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エルテル）のことであり、ここでエステル化の最も典型的な部位は、五炭糖のＣ−５位に結合するヒドロキシ基である。本明細書中で使用される用語「ヌクレオシド／チド」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチド両方を含む化合物の１セットのことである。ヌクレオシド／チドに関する「アナログ」は、修飾された塩基部分、修飾された糖部分および／または修飾されたリン酸エステル部分を有する合成的アナログを含み、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）によって一般的に記載されている。リン酸アナログは、リン（ｐｈｏｓｐｏｒｏｕｓ）原子が＋５酸化状態であり、そして１個以上の酸素原子が非酸素部分で置換されている、リン酸アナログを含む。例示的なアナログは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート、ボロノホスフェート、（対イオンが存在する場合、関連する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）を含む）が、これらに限定されない。例示的な塩基アナログには、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジン、および多の同様のアナログが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な糖アナログには、２’−または３’−修飾体（ここで、２’−または３’−位は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシおよびフェノキシ）、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモである）が挙げられるが、これらに限定されない。用語「標識（された）ヌクレオシド／チド」は、結合を介して、式Ｉの色素化合物に共有結合しているヌクレオシド／チドのことである。
【００２６】
「水可溶化基」とは、水溶液中の本発明の化合物の溶解度を増加させる置換基のことを意味する。例示的な水可溶化基には、第４級アミン、スルフェート、スルホネート、カルボキシレート、ホスフェート、ポリエーテル、ポリヒドロキシル、およびボロネート（ｂｏｒｏｎａｔｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドモノマーのポリマーまたはそのアナログのことを意味し、これは二重および一重らせんデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、そのαアノマー形態などを含む。通常、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合によって結合されており、ここで、本明細書中に使用されるように、用語「ホスホジエステル結合」とは、ホスホジエステル結合（単数または複数）（そのホスフェートアナログを含む）をいい、これは対イオンが存在する場合、このような関連する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）を含む。典型的には、ポリヌクレオチドは、大きさで、少数モノマー単位（たとえば、５〜４０）から数千モノマー単位の範囲である。ポリヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字の配列によって表される場合はいつも、ヌクレオチドは左から右への５’→３’順序であり、そして他に示されなければ、「Ａ」はデオキキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ］はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はデオキシチミジンを表すということが理解される。
【００２８】
「ローダミン色素」は、一般的多環構造
【化４】
2010159420.tif 000005
を含む色素であり、そしてこれは任意のおよび全てのその置換されたバージョンを包含する。
【００２９】
（ＩＩ．１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン中間体）
（Ａ．構造）
第一の局面では、本発明は、ジベンゾローダミン色素の合成における中間体として有用な１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン化合物の新規のクラスを含む。これらの化合物は、直下の式Ｉに示される一般構造（その置換体を包含する）を有する。式Ｉにおいて、Ｒ１はＨまたは
【化５】
2010159420.tif 000006
であり、ここで、Ｙは、Ｈ、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、芳香族、フェニル、多環式芳香族、複素環、水可溶化基、または結合基であり、そしてこれはその置換体を含む。Ｒ1がＨである場合、Ｃ−１２結合窒素ならびにＣ−１２およびＣ−１３炭素は、４〜７員を有する第一環構造を形成し、そして／またはＣ−１２結合窒素ならびにＣ−１１およびＣ−１２炭素は、５〜７員を有する第二環構造を形成する。式Ｉの化合物はさらに、そのアリ−ルおよび窒素置換形態を包含する。（本明細書中で提供される全ての分子構造は、示される正確な電子構造を含むだけでなく、全ての共鳴構造、プロトン化状態およびその関連する対イオンを包含することが意図されるということに注意する。）
【００３０】
【化６】
2010159420.tif 000007
式Ｉの化合物の１つの好ましい実施態様において、Ｙはフェニルまたは置換されたフェニルであり、そしてこのフェニルは以下の構造を有する。
【００３１】
【化７】
2010159420.tif 000008
Ｃ−１４〜Ｃ−１８位のいずれかひとつにおける置換基は、任意の適切な置換基であり得る。好ましくは、この置換基は、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、アルコキシ、フェノキシ、結合基、水可溶化基、およびその置換形態である。特に好ましい実施態様において、Ｃ−１８位での置換基は、カルボン酸およびスルホネートからなる群から選択され、最も好ましくはカルボン酸である。別の特に好ましい実施態様において、Ｃ−１４およびＣ−１７位での置換基は、塩素である。別の好ましい実施態様において、Ｃ−１４〜Ｃ−１７位での置換基は、塩素またはフッ素である。さらに別の特に好ましい実施態様において、Ｃ−１５およびＣ−１６位での置換基の一方は結合基であり、そして他方は水素であり、Ｃ１４およびＣ１７位での置換基は塩素であり、そしてＣ−１８位での置換基は、カルボキシである。
【００３２】
式Ｉの化合物の別の好ましい実施態様において、Ｃ−１２結合窒素ならびにＣ−１２およびＣ−１３炭素は、４〜７員を有する第一環構造を形成し、そして／またはＣ−１２結合窒素ならびにＣ−１１およびＣ−１２炭素は、５〜７員を有する第二環構造を形成する。より好ましくは、第一および／または第二環構造は５員を有し、ここで、好ましくは、この５員環構造は、１個のジェミナル（ｇｅｍ）で二置換された炭素を含む。好ましくは、このジェミナル置換基は、低級アルキル（例えば、メチル）である。別の好ましい実施態様において、この５員環は、結合基で置換される。Ｃ−１２結合窒素ならびにＣ−１２およびＣ−１３炭素が、４〜７員を有する第一環構造を形成し、そして／またはＣ−１２結合窒素ならびにＣ−１１およびＣ−１２炭素が、５〜７員を有する第二環構造を形成する本発明の好ましい実施態様において、Ｒ１はＨまたは
【化８】
2010159420.tif 000009
であり得、そしてここで、Ｙは、Ｈ、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、芳香族、フェニル、多環式芳香族、複素環、水可溶化基、または結合基であり、そしてこれはその置換された形態を含む。
【００３３】
式Ｉの化合物のさらに別の好ましい実施態様において、この化合物は置換窒素を含む。好ましい窒素置換基は、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、フェニル、芳香族、複素環、多環式芳香族、水可溶化基、結合基、およびその置換形態を含む。より好ましくは、この窒素置換基は、低級アルキル、フェニル、またはその置換形態であり、ここで、好ましい置換基は、結合基、スルホネート、または水可溶化基である。例示的な水可溶化基には、カルボキシレート、スルホネート、ホスフェート、第４級アミン、スルフェート、ポリヒドロキシル、および水溶性ポリマーが挙げられる。特に好ましい実施態様において、窒素置換基は、−Ｌ−Ｒであり、ここで、Ｌは任意のリンカーであり得、そしてＲは結合基または水可溶化基である。特に好ましい実施態様において、Ｌは、
【化９】
2010159420.tif 000010
【００３４】
さらに別の好ましい実施態様において、式Ｉの化合物は、１個以上のＣ−８〜Ｃ−１１およびＣ−１３位での１個以上の置換基を包含する。好ましい置換基には、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルフェート、スルホネート、スルホン、スルホンアミド、スルホキシド、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、水可溶化基、複素環、および結合基が挙げられ、これは、その置換形態を含む。特に好ましい実施態様において、この化合物は、Ｃ−９およびＣ−１０炭素を介する、またはＣ−１０およびＣ−１１炭素を介する縮合芳香族環を含み、そしてこれは、その置換形態を含み、ここで、特に好ましい置換基は、スルホネートである。
【００３５】
本発明の数個の代表的１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン化合物は、図１〜３中に、すなわち、化合物４、９、１５、１７、２２、２７および２９で、そして、図１０〜１３中に、すなわち、化合物６２、６３、６８、７３および８０で、示される。
【００３６】
（Ｂ．合成法）
数種の合成方法が、上述の１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン化合物の合成法について利用可能であり、合成される特定の化合物の環構造の性質および窒素置換体に依存して、異なる方法が好ましい。
【００３７】
１−置換−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン化合物（例えば、１−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン４）の合成に適切な第一の好ましい合成法は、図１に示される。この第一方法において、３−メトキシ−１−ヒドロキシナフタレン１は、乾燥トリエチルアミンおよびトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応されて、粗製の３−メトキシナフタレン−１−トリフレート２を形成する。次いで、トリフレート２は、パラジウム触媒のトリフレート／アミンカップリングを使用して、例えば第二級アミン（例えば、ジエチルアミン）と反応され、置換アミノ化合物３を形成する。次いで、化合物３は、三臭化ホウ素脱保護手順を使用して、脱保護され、１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン生成物（例えば、１−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン４）を生成する。この合成の例は、以下の実施例１中で提供される。
【００３８】
ベンゾインドリン化合物（例えば、Ｎ−フェニル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾインドリン９）の合成について適切な第二の好ましい合成方法もまた、図１中に示される。この方法において、３−メトキシナフタレン−１−トリフレート２は、パラジウム触媒トリフレートカップリング反応を使用して、第一級アミン（例えば、アニリン）で誘導され、第２級アミン（例えば、１−アニリノ−３−メトキシナフタレン５）を得る。第二級アミン５は、酸塩化物（例えば、塩化ハロアセチルを使用して、アセチル化され、非置換アミド（例えば、１−アミド−３−メトキシナフタレン６）を得る。第三級アミド６は、Ｌｅｗｉｓ酸触媒Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ環化手順（例えば、ＡｌＣｌ３を使用して）を使用して環化され、化合物７を得る。次いで、化合物７は、還元され（例えば、水素化リチウムアルミニウム（ＬＡＨ）を用いて）、化合物８を得る。引き続く三臭素化ホウ素脱保護手順によるメトキシ基脱保護によって、ベンゾインドリン(例えば、Ｎ−フェニル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾインドリン９）を得る。この合成の例は、以下の実施例２に提供される。
【００３９】
Ｎ−置換−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン化合物（例えば、Ｎ−メチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン１５）の合成について適切な第三の好ましい合成法は、図２中に示される。この方法において、化合物１０は、ピリジン中のピペリジン触媒を利用して、マレイン酸と共に濃縮することによって、メトキシ−ナフトアルデヒド（ｎａｐｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）から合成される。次いで、化合物１０は、水素によって還元され、ＬＡＨ還元が続き、そしてトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応し、トリフレート１１を得る。トリフレート１１は、ＮａＮ３と反応されて、化合物１２を得る。
化合物１２は、Ｌｅｗｉｓ酸（例えば、ＡｌＣｌ３）と共に複合体化され、そして還流され、環化ベンゾキノリン誘導体１３を得る。次に、窒素置換体が添加され、例えば、窒素は、従来のアルキル化手順を利用してアルキル化され、例えば、ベンゾキノリン誘導体１３はｎ−ブチルリチウムおよびアルキル化剤（例えば、化合物１４またはプロパンスルトン（ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｔｏｎｅ）を与えるＭｅＩ）と共に反応され、化合物１６を得る。次いで、このメトキシ基は、三臭化ホウ素手順によって除去され、Ｎ−アルキルベンゾキノリン誘導体（例えば、化合物１５または１７）を得る。この合成の例は、以下の実施例３中で提供される。
【００４０】
Ｎ−置換−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシ−ベンゾキノリン化合物（例えば、Ｎ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン２２）の合成について適切な第四の好ましい合成方法は、図３中に示される。この方法において、Ａ．ＲｏｓｏｗｓｋｙおよびＥ．Ｊ．Ｍｏｄｅｓｔ（Ｊ．Ｏ．Ｃ．３０ １８３２ １９６５、およびその中の参考文献）の手順に続いて、１−アミノ−３−メトキシナフタレン１８は、ヨウ素によって触媒化されたアセトンと共に反応され、次いで飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３でクエンチされ、ベンゾキノリン化合物１９を得る。次いで、一般的なアルキル化手順に従って、化合物１９はアルキル化剤（例えば、ＭｅＩ）でアルキル化され、化合物２０を得る。このアルキル化化合物２０は、Ｐｄ／Ｃによって触媒化されたＨ２と共に反応され、Ｎ−メチル−メトキシキノリン中間体２１を得、一般的な三臭化ホウ素手順による引き続くメトキシ基脱保護により、Ｎ−置換−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシ−ベンゾキノリン化合物（例えば、Ｎ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン２２）を得る。この合成の例は、以下の実施例４中に提供される。
【００４１】
Ｎ−置換−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾインドリン化合物（例えば、Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾインドリン２７）の合成について適切な第五の好ましい一般的な合成方法もまた、図３中に示される。この方法において、１−アミノ−３−メトキシナフタレン１８は、酸塩化物（例えば、２−ブロモ−２−メチルプロピオニルクロリド）でアセチル化され、化合物２３を得る。化合物２３は、ＡｌＣｌ３との反応によって環化され、化合物２４を得る。次いで、化合物２４はＬＡＨで還元され、３，３−ジメチル−４−メトキシベンゾインドリン２５を得る。次いで、化合物２５はアルキル化剤（例えば、ヨウ化メチル）でアルキル化され、Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４−メトキシベンゾインドリン（例えば、化合物２６）を得る。三臭化ホウ素と共に用いることによる引き続くメトキシ基脱保護により、化合物２７を得る。この合成の例は、以下の実施例５中で提供される。
【００４２】
（ＩＩＩ．ジベンゾローダミン色素化合物）
（Ａ．構造）
第二の局面において、本発明は、直下の式ＩＩに示される一般構造を有する、分子標識として有用な、ジベンゾローダミン色素化合物の新規のクラス、ならびにそのアリ−ルおよび窒素置換形態を包含する。
【００４３】
【化１０】
2010159420.tif 000011
式ＩＩの化合物の好ましい１つの実施態様において、この化合物は、Ｃ−１２結合窒素ならびにＣ−１２およびＣ−１３炭素が一緒になる場合に、４〜７員を有する第一環構造を形成する第一架橋基、および／またはＣ−２結合窒素ならびにＣ−１およびＣ−２炭素が一緒になる場合に４〜７員を有する第二環構造を形成する第二架橋基を含む。より好ましくは、第一および第二環構造の１つまたは両方が、５員を有する。さらにより好ましい実施態様において、５員環構造は、１つのジェミナルで二置換された炭素を含み、ここで、ジェミナル置換基は低級アルキル（例えば、メチル）である。代替の好ましい実施態様において、５員環は、結合基で置換される。別の好ましい実施態様において、５員環は、以下に示すように、一個以上の窒素置換基を含む。
【００４４】
別の好ましい実施態様において、式ＩＩの化合物は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、複素環芳香族、複素環、およびその置換形態からなる群から選択される、Ｃ−７置換基を含む。さらに好ましい実施態様において、Ｃ−７置換基は、以下の構造を有するフェニルまたは置換されたフェニルであり、
【化１１】
2010159420.tif 000012
ここで、Ｃ−１４〜Ｃ−１８位のアリ−ル置換基は、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、アルコキシ、フェノキシ、結合基、およびその置換形態からなる群から、別々に選択され得る。好ましくは、Ｃ−１８でのフェニル置換基は、カルボン酸およびスルホネートからなる群から選択され、そして最も好ましくはカルボン酸である。別の好ましい実施態様において、Ｃ−１４およびＣ−１７位の置換基は塩素である。さらに別の好ましい実施態様において、Ｃ−１４〜Ｃ−１７位の置換基は全て塩素または全てフッ素である。特に好ましい実施態様において、Ｃ−１５およびＣ−１６位の置換基の一方は、結合基であり、他方は水素であり、Ｃ−１４およびＣ−１７位の置換基は塩素であり、そしてＣ−１８位の置換基はカルボキシである。
【００４５】
さらなる好ましい実施態様において、式ＩＩの化合物は、Ｃ−７位で水素ラジカルを含む、すなわち、Ｃ−７位は置換されない。
【００４６】
本発明のさらに別の好ましい実施態様において、式ＩＩの化合物は一個以上の窒素置換基を含む。好ましくは、このような置換基は、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、フェニル、芳香族、複素環、多環式芳香族、水可溶化基、結合基、およびその置換形態からなる群から選択される。より好ましくは、この窒素置換基は、低級アルキル、フェニル、多環式芳香族、およびその置換形態からなる群から選択され、ここで、例示的置換基は、結合基および水可溶化基を含む。
【００４７】
本発明の第二の局面の別の好ましい実施態様において、式ＩＩの化合物は、Ｃ−１２結合窒素ならびにＣ−１１およびＣ−１２炭素が一緒になる場合に、５〜７員を有する第三環構造を形成する第三架橋基、および／またはＣ−２結合窒素ならびにＣ−２およびＣ−３炭素が一緒になる場合に、５〜７員を有する第四環構造を形成する第四架橋基を含む。好ましくは、第三および第四環構造の１つまたは両方が、６員を有する。さらに好ましくは、この６員環構造が１つのジェミナルで二置換された炭素を含み、ここでは、このジェミナルは低級アルキル（例えば、メチル）である。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施態様において、式ＩＩの化合物は、一個以上の炭素Ｃ−１、Ｃ−３〜Ｃ−６、Ｃ−８〜Ｃ１１、およびＣ−１３でのアリ−ル置換基を含む。例示的アリ−ル置換基は、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルフェート、スルホネート、スルホン、スルホンアミド、スルホキシド、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、水可溶化基、複素環、および結合基を含み、これはその置換形態を含む。特に好ましい実施態様において、少なくとも一個の置換基はスルホネートである。別の特に好ましい実施態様において、式ＩＩの化合物は、Ｃ−３およびＣ−４炭素、Ｃ−４およびＣ−５炭素、Ｃ−９およびＣ−１０炭素、またはＣ−１０およびＣ−１１炭素を介して結合する縮合芳香族環を含み、これはその置換形態を含む。最も好ましくは、この縮合芳香族環が、Ｃ−３およびＣ−４炭素ならびにＣ−１０およびＣ−１１炭素を介して、またはＣ−９およびＣ−１０炭素ならびにＣ−４およびＣ−５炭素を介して結合し、これはその置換形態を含む。
【００４９】
本発明の第二の局面に従った数個の例示的色素化合物は、図７および図１０〜１３中（すなわち、化合物４１〜４７ならびに６７、７２、７６および８１）に示される。
【００５０】
（Ｂ．合成法）
一般に、本発明のジベンゾローダミン色素は以下のように合成される。図４を参照のこと。無水物誘導体３０（例えば、無水フタル酸）を、１−アミノ−３−メトキシ中間体３１および３２、ならびにＬｅｗｉｓ酸（例えば、ＺｎＣｌ２）
と混合する。ここで化合物３０のＲ−置換基は同一または異なり得るが、同一であることが好ましい。典型的には、Ｒ−置換基は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、フェニル、複素環、およびこれらの置換体を含むが、これらに限定されない。混合物を融解が観察されるまで短時間加熱する。溶媒（例えば、１，２−ジクロロベンゼン）を反応混合物に添加し、そして不均一な混合物を約１３０℃〜約１８０℃まで加熱する。粗反応混合物を冷却し、そして順相フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、色素化合物３３を得る。無水物が一部が置換された無水フタル酸（例えば、化合物３４）である場合、２種の異性体が形成される。図５を参照のこと。異性体３５および３６はＰＴＬＣにより分離する。純粋な異性体色素は、順相および逆相ＴＬＣ上の単一スポットによって、ならびにそれらのＵＶ／可視吸収スペクトルならびにそれらの長波長の蛍光励起スペクトルおよび発光スペクトルによって同定される。
【００５１】
非対称の色素化合物を合成するための代替の手順を図６に示す。このプロセスにおいて、無水物誘導体（例えば、無水フタル酸３４）を乾燥ニトロベンゼンと混合し、加熱する。混合物を室温まで冷却し、そして無水ＡｌＣｌ３を撹拌しながら添加する。続いて１−アミノ−３−メトキシ中間体３１を撹拌しながら添加し、そして反応系を加熱する。反応系を冷却しＥｔＯＡｃ中に懸濁する。有機層を飽和ＮＨ４Ｃｌ、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして溶媒を減圧下で除去する。得られたケトン中間体３７／３８を精製し、そしてフラッシュクロマトグラフィーまたは再結晶によって個々の異性体３７および３８に分離する（Ｃ−１４およびＣ−１７の置換基が同じであり、かつＣ−１５およびＣ−１６の置換基が同じである場合を除く）。純粋な異性体のケトン中間体３７または３８のメトキシ基を、一般的な三臭化ホウ素による脱保護の手順に従って脱離する。従って、化合物３８はアミノ−ヒドロキシナフタレンケトン中間体３９を与える。次いで、アミノ−ヒドロキシナフタレンケトン中間体３９を１−アミノ−３−メトキシ中間体３２と反応させる。反応系を冷却し、純粋な異性体であり非対称の置換生成物４０を得、これはＰＴＬＣによってさらに精製され得る。
【００５２】
本発明のジベンゾロータミン色素を合成するため、特にＣ−７位が無置換の色素（すなわち、ピロニン色素）を合成するために適切な他の方法において、色素は、Ｏ−保護Ｎ−置換３−ヒドロキシベンゾインドリン化合物から生成するヒドロキシベンゾインドリン中間体から合成され、続いて酸素保護基を脱保護し（例えば、脱メチル試薬（すなわち、塩化アルミニウム）によるメチル基の脱保護）、そして順相クロマトグラフィー精製によって単離される。この合成法に従って、色素分子の半分に相当するヒドロキシベンゾインドリン中間体を、はじめにホルミル化試薬（例えば、メチルホルムアニリド／ＰＯＣｌ３）と反応させ、次いでホルミル化したヒドロキシベンゾインドリン中間体を、色素分子の別の半分に相当する異なる（または同じ）ヒドロベンゾインドリン中間体と直接反応させる。酸性脱水条件下（すなわち、ＰＯＣｌ３）で反応を続け、そして加熱（すなわち１２０〜１６０℃）し、カルボン酸エステルに誘導体化した粗ベンゾピロニン色素を得る。いくらかの場合、メトキシベンゾインドリン中間体は、メチル基の脱保護より先にホルミル化され、次いでホルミル化したメトキシインドリン誘導体のメチル基は脱保護され、２当量のヒドロキシインドリンと反応し、ピロニン色素を与える前にホルミル化したヒドロキシベンゾインドリン中間体を与える。純粋な色素は水性の後処理および順相クロマトグラフの後に単離される。次いで中間体色素のカルボン酸エステルを酸（すなわち、ＨＢｒ）で加水分解し、水性の後処理をして、そして順相クロマトグラフィーの後に遊離酸色素誘導体を得る。続いてＮ−フェニル置換色素はスルホン化試薬（例えば、ＣｌＳＯ３Ｈ）によってスルホン化され得、水性の後処理および順相クロマトグラフィーの後、最終的に好ましい色素誘導体を与える。
【００５３】
（Ｖ．ジベンゾローダミン色素を結合するエネルギー移動色素）
他の局面において、本発明は式Ｉのジベンゾローダミン色素化合物と結合したエネルギー移動色素化合物を包含する。一般に本発明のエネルギー移動色素は、第一波長の光を吸収し、応答して励起エネルギーを放出するドナー色素、ドナー色素によって放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長を蛍光発光することが可能なアクセプター色素、およびドナー色素とアクセプター色素を結合するリンカーを包含し、リンカーはドナー色素とアクセプター色素との間の効率の良いエネルギー移動を促進するのに有効である。このようなエネルギー移動色素の構造、合成および使用についての一貫した議論は、Ｌｅｅらによる米国特許第５，８００，９９６号およびＭａｔｈｉｅｓらによる米国特許第５，６５４，４１９号に記載される。
【００５４】
好ましい実施態様において、リンカーは、そのリンカーにある程度の構造的な堅さを与える官能基（アルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合または縮合環構造を有する５員環および６員環など）を含む。
【００５５】
エネルギー移動蛍光色素において、本発明に従うドナー色素とアクセプター色素を結合するための好ましいリンカーの一つは、一般構造
【化１２】
2010159420.tif 000013
を有し、ここでＲ２１はドナー色素と結合する低級アルキルであり、Ｚ１はＮＨ、硫黄または酸素のいずれかであり、Ｒ２２はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合またはカルボニル炭素と結合した縮合環構造を有する５員または６員環を含む置換基であり、Ｒ２８はリンカーをアクセプター色素に結合する官能基を含む。
【００５６】
このリンカーの１実施態様において、リンカーは以下に記載の一般構造を有し、
【化１３】
2010159420.tif 000014
ここでＲ２１およびＲ２２は上記に詳述され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ独立してＮＨ、硫黄または酸素のいずれかであり、Ｒ２９は低級アルキルであり、そして末端カルボニル基はアクセプター色素の環構造と結合している。Ｚ２が窒素である改変体の場合、Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２９Ｚ２サブユニットはアミノ酸サブユニットを形成する。リンカーの内のＲ２２として使用され得る５員環または６員環の特別な例として、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、トリアジン、ピラジンおよびオキサジンが挙げられるが、これらに限定されない。縮合環構造の例として、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドールおよびナフタレンが挙げられるがこれらに限定されない。このリンカーの好ましい実施態様は、以下で示したようにＲ２１およびＲ２９がメチレンであり、Ｚ１およびＺ２がＮＨであり、Ｒ２２がベンゼンである。
【００５７】
【化１４】
2010159420.tif 000015
本発明のエネルギー移動色素の局面の他の好ましい実施態様において、リンカーは、エネルギー移動色素のジベンゾローダミン色素成分のＣ−１またはＣ−１３位で結合し、あるいはＣ−７置換基がフェニル基または置換フェニル基である場合はＣ−１５位またはＣ−１６位の一方と結合する。特に好ましい実施態様において、エネルギー移動対の構成要素の両方が、ジベンゾローダミン色素であり、そして第１構成要素はＣ−１位で結合し、第２構成要素はＣ−１５位またはＣ−１６位の一方で結合する。
【００５８】
本発明のエネルギー移動色素の局面のさらに他の好ましい他の実施態様において、色素対の第１構成要素はジベンゾローダミン色素であり、色素対の第２構成要素はシアニン、フタロシアニン、スクアレン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）、ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセインまたは第１構成要素と異なる置換基を有するジベンゾローダミン色素である。
【００５９】
（ＶＩ．ジベンゾローダミン色素を結合する試薬）
別の局面において、本発明は式Ｉのジベンゾローダミン色素化合物で標識された試薬を含む。本発明の試薬は、実質的に本発明の色素が結合し得るものであり得る。好ましくは、色素は試薬と共有結合する。試薬は、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機ポリマーおよび無機ポリマー、およびそれらの組み合わせおよびそれらの集合体（染色体、核、生細胞（細菌または他の微生物）、脊椎動物の細胞、組織など）を含み得るが、これらに限定されない。
【００６０】
（Ａ．ヌクレオシド／チド試薬）
好ましい種類の標識された試薬は、本発明のジベンゾローダミン色素を組み込むヌクレオシド／チドを含む。このヌクレオシド／チド試薬は酵素的合成によって生成したポリヌクレオチドを標識する状況において特に有用である（例えばＰＣＲ増幅、Ｓａｎｇｅｒ型ポリヌクレオチドの塩基配列決定、およびニックトランスレーション反応の状況において使用されるヌクレオチド三リン酸）。
【００６１】
一般に、標識されたヌクレオシド／チド試薬の構造は ＮＵＣ−Ｄ 式ＩＩＩであり、ここでＮＵＣはヌクレオシド／チドまたはヌクレオシド／チドアナログであり、かつＤは式ＩＩのジベンゾローダミン色素化合物である。
【００６２】
ヌクレオシド／チドと色素を結合している結合は、置換位置Ｃ−１〜Ｃ−１８のいずれか１つまたは窒素と結合しているＣ−２もしくは窒素と結合しているＣ−１２で結合し得る。好ましくは、色素はＣ−７位にフェニル基または置換フェニル基を含み、Ｃ−１５またはＣ−１６の置換位置のいずれか１つでヌクレオシド／チドと結合し、他の位置は水素原子と結合する。
【００６３】
ＮＵＣがプリン塩基を含む場合、ＮＵＣとＤとの間の結合はプリンのＮ８位と結合し、ＮＵＣが７−ジアザプリン塩基を含む場合、この結合は７−ジアザプリンのＮ７位と結合し、ＮＵＣがピリミジン塩基を含む場合、この結合はピリミジンのＮ５位と結合する。
【００６４】
ヌクレオシドの標識は、公知の結合、結合基を用いるヌクレオシド／チドの多くの公知の標識技術の１つを使用して達成され得、補足的な機能性を付随し得る。一般に、色素とヌクレオチドを結合する結合は、（ｉ）オリゴヌクレオチドを標的とするハイブリダイゼーションを妨害せず、（ｉｉ）適切な酵素（例えばポリメラーゼ、リガーゼなど）と適合し、（ｉｉｉ）色素の蛍光特性に悪影響を与えないべきである。本発明と関連して使用するのに適切な典型的な塩基標識手順を以下に示す。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：６４５５−６４６７（１９８７）（Ｇｉｂｓｏｎら）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４５１３−４５３５（１９８７）（Ｇｅｂｅｙｅｈｕら）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８５６−４８７６（１９８７）（Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら）、Ｎｅｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，５（３）：２３３−２４１（１９８６）（Ｎｅｌｓｏｎら）、ＪＡＣＳ，１１１：３７４−３７４（１９８６）（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら）、および米国特許第４，８５５，２２５号、同第５，２３１，１９１号、同第５，４４９，７６７号。
【００６５】
好ましくは結合はアセチレンアミド結合またはアルケンアミド結合、色素の活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をヌクレオシド／チドのアルキニルアミノ−またはアルケニルアミノ−誘導体化塩基と反応させることによって形成された色素とヌクレオシド／チド塩基との間の結合である。より好ましくは、得られた結合は構造
【化１５】
2010159420.tif 000016
を有する３−（カルボキシ）アミノ−１−プロピン−１−イルである。
【００６６】
代替の好ましい結合は、構造
【化１６】
2010159420.tif 000017
【化１７】
2010159420.tif 000018
（ここでｎは１〜５の範囲である）
【化１８】
2010159420.tif 000019
（ここでｎは１〜５の範囲である）
【化１９】
2010159420.tif 000020
および
【化２０】
2010159420.tif 000021
から成る群から選択され、Ｒ１は、−Ｈ、低級アルキルおよび保護基から成る群から選択され；およびＲ３は−Ｈおよび低級アルキルから成る群から選択される。１９９７年４月１０日出願の米国特許出願第０８／８３３，８５４号（Ｋｈａｎら）を参照のこと。
【００６７】
アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、Ｈｏｂｂｓらによって、ヨーロッパ特許出願第８７３０５８４４．０号およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４：３４２０（１９８９）（Ｈｏｂｂｓら）で教えられる。アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオチド（Ｈｏｂｂｓらによって教示されるように（上記で引用）通常は５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）は、適切なハロジデオキシヌクレオシドおよびＣｕ（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を除去するためにアルゴンを流し、乾燥ＤＭＦを添加し、次いでアルキニルアミン、トリエチル−アミンおよびＰｄ（０）を添加することによって生成する。この反応混合物を数時間、すなわち薄層クロマトグラフが、ハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、撹拌する。保護されていないアルキニルアミンを使用した場合、アルキニルアミノ−ヌクレオシドは、反応混合物を濃縮し、カップリング反応において生成したハロゲン化水素を中和するための水酸化アンモニウムを含む溶出溶液を用いるシリカゲルクロマトグラフによって単離され得る。保護されたアルキニルアミンを使用した場合、メタノール／塩化メチレンがこの反応混合物に添加され得、次いで強塩基陰イオン交換樹脂の炭酸水素塩種が添加され得る。次いでスラリーは約４５分間撹拌され得、濾過され、そして樹脂は追加のメタノール／塩化メチレンで洗浄される。合わせた濾液は濃縮され、メタノール−塩化メチレンの勾配を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフによって精製され得る。トリホスフェートは標準的な技術によって得られる。
【００６８】
本発明の特に好ましいヌクレオシド／チドは以下の式ＩＶに示され、
【化２１】
2010159420.tif 000022
ここでＢはヌクレオシド／チド塩基（例えばウラシル、シトシン、デアザアデニンまたはデアザグアノシン）であり；Ｗ１およびＷ２は別々にＯＨまたはポリメラーゼ媒介テンプレート指向型重合を遮へいし得る基（例えばＨ、フッ素など）であり；Ｗ３はＯＨ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートまたはホスフェートアナログであり；Ｄは式Ｉの色素化合物である。特に好ましい１実施態様において、本発明のヌクレオチドは以下の式ＩＶ．１に示される構造を有するジデオキシヌクレオチド三リン酸であり、カウンターイオンがある場合それと会合している。
【００６９】
【化２２】
2010159420.tif 000023
式ＩＶ．１で示されるような標識されたジデオキシヌクレオチドは、蛍光検出を利用するＳａｎｇｅｒ型ＤＮＡ塩基配列決定の方法において、鎖の末端処理剤としての特定の使用が見出される。
【００７０】
第２の特に好ましい実施態様において、本発明のヌクレオチドは以下の式ＩＶ．２で示される構造を有するデオキシヌクレオチド三リン酸である。
【００７１】
【化２３】
2010159420.tif 000024
式ＩＶ．２に示されたような標識されたデオキシヌクレオチドは、ポリメラーゼ伸長生成物を標識（例えばポリメラーゼ連鎖反応またはニックトランスレーションにおいて）するための試薬としての特定の使用が見出される。
【００７２】
（Ｂ．ポリヌクレオチド試薬）
本発明のさらに別の好ましい試薬の種類は、本発明のジベンゾローダミン色素で標識されたポリヌクレオチドを含む。このような標識されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ塩基配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチド連結プローブなどを含む多くの重要な状況において有用である。
【００７３】
好ましい１実施態様において、本発明の標識されたポリヌクレオチドは、エネルギー移動がドナー色素とアクセプター色素との間で起こるように配置された多様な色素を包含する。このような多様な色素のエネルギー移動ポリヌクレオチドは分光学的に調整可能な塩基配列決定プライマーとして（例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４３４７−４３５１（１９９５）（Ｊｕら））、およハイブリダイゼーションプローブとして（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：３７６１−３７６６（１９９３）（Ｌｅｅら））の適用が見出される
標識されたポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを使用する酵素的合成（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２４，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８１））、または例えばホスホラミダイト法、ホスファイトトリエステル法、など化学的合成（Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））のいずれかによって合成され得る。標識は、上記に記載されたように、標識されたヌクレオチド三リン酸モノマーを使用する酵素的合成に導入され得るか、または上記に記載されたように標識された無核ヌクレオチドまたはヌクレオチドホスホラミダイトを使用する化学的合成に導入され得るか、または合成の後に導入され得る。
【００７４】
一般に、標識されたポリヌクレオチドが酵素的合成を使用して合成される場合、以下の手順が使用され得る。テンプレートＤＮＡを変性し、そしてオリゴヌクレオチドプライマーをテンプレートＤＮＡに添加する。デオキシヌクレオチド三リン酸を、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含む混合物に添加し、最後に、デオキシヌクレオチドの分画を本発明の色素化合物で上記に記載したように標識する。次いで、ポリメラーゼ酵素を、ポリメラーゼ酵素が活性である条件下で添加する。標識したポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ媒介鎖合成中に標識されたデオキシヌクレオチドを組み込むことによって生成する。代替の酵素的合成法において、プラス鎖に補足的な一方の標的プライマーおよびマイナス鎖に補足的な他方の標的プライマーである２種のプライマーが、１種のプライマーの代わりに使用され、このポリメラーゼは熱安定性のポリメラーゼであり、そして反応温度は変性温度と伸長温度との間を循環し、ＰＣＲ（例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））によって標識された相補体を目的の配列に飛躍的に合成する。
【００７５】
標識されたポリヌクレオチドはホスホラミダイト法を使用して化学的に合成され得る。ホスホラミダイト法によってポリヌクレオチドを形成するために使用される化学薬品の詳細な説明は、米国特許第４，４５８，０６６、および同４，４１５，７３２（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら）；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４：１−１７（１９８２）（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら）；Ｕｓｅｒｓ Ｍａｎｕａｌ Ｍｏｄｅｌ ３９２ ａｎｄ ３９４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ，６−１〜６−２２頁，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｒｔ Ｎｏ．９０１２３７（１９９１）によって提供される。
【００７６】
ポリヌクレオチドを合成するためのホスホラミダイト法は、その効果的かつ迅速な結合のため、および出発物質の安定性のため、好ましい方法である。この合成は固体担体に結合したポリヌクレオチド鎖の成長によって達成され、液相中の過剰な試薬は濾過により容易に除去され得、これにより合成サイクルの中で精製工程の必要が排除される。
【００７７】
以下に、ホスホラミダイト法を用いるポリヌクレオチドの典型的な合成サイクルを簡単に示す。第１に、５’−ヒドロキシル保護基を除去するために保護されたヌクレオチドモノマーを包含する固体担体を、酸（例えば、トリクロロ酢酸）で処理し、次に続く結合反応のためにヒドロキシル基を遊離する。保護されたホスホラミダイトヌクレオシドモノマーおよび反応させるための弱酸（例えば、テトラゾ−ル）を同時に添加することによって活性化した中間体が生成する。弱酸はホスホラミダイトの窒素をプロトン化し、反応性の中間体を形成する。ヌクレオチドの付加は３０秒以内で完了する。次に、キャッピングの工程が実施され、ヌクレオシドが付加しなかったポリヌクレオチド鎖は終端する。キャッピングは、好ましくは、無水酢酸および１−メチルイミダゾールによって行われる。次いで、ヌクレオチド間の結合を、好ましい酸化剤としてヨウ素および酸素ドナーとして水を使用する酸化によって、ホスファイトからより安定なホスホトリエステルに変換する。酸化した後、ヒドロキシの保護基は、プロトン性酸（例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）によって脱保護され、そしてこのサイクルは鎖の伸長が完了するまで繰り返される。合成後、ポリヌクレオチド鎖は、塩基（例えば、水酸化アンモニウムまたはｔ−ブチルアミン）を使用して担体から分割される。分割反応はまた、全てのホスフェートの保護基（例えば、シアノエチル）を除去する。最後に、ポリヌクレオチドの溶液を塩基中で高温（例えば、５５℃）で処理して、色素中の塩基およびヒドロキシルの保護基の環外アミンについた保護基を除去する。
【００７８】
任意のホスホラミダイトヌクレオシドモノマーは、上記に記載したように色素で標識されたホスホラミダイトであり得る。ヌクレオチドの５’−末端位が標識されている場合、本発明の標識された無核ヌクレオチドホスホラミダイトは最後の縮合工程に使用され得る。オリゴヌクレオチドの内部の位置が標識されている場合、本発明の標識されたヌクレオチドホスホラミダイトは任意の縮合工程に使用され得る。
【００７９】
合成した後に、ポリヌクレオチドは、５’−末端位を含む多くの位置で標識され得る（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）およびＯｒｇｅｌら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１（１８）：６５１３（１９８３）；米国特許第５，１１８，８００号；ホスホジエステルバックボーン、例えばｉｂｉｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ９；または３’−末端、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（２３）：６２５３−６２５９，および米国特許第５，４０１，８３７号および同５，１４１，８１３号）。オリゴヌクレオチドの標識を全体的に再検討するためには、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ ｉｎ Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｓｔｅｉｎｅｒ編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８３）を参照のこと。
【００８０】
図１４および１５に示されるように、１つの好ましいポスト合成の化学的な標識方法で、オリゴヌクレオチドを以下のように標識する。カルボキシ結合基を包含する色素を、１当量の適切な１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび３当量の適切なＮ−ヒドロキシスクシンイミドと室温で３時間、乾燥酢酸エステル中で反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換する。反応混合物を５％ＨＣｌで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして固体になるまで濃縮し、これをＤＭＳＯに再懸濁する。次いで、０．２５Ｍビカルボネート／カルボネートのｐＨ９．４の緩衝液中の、アミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドにＤＭＳＯ色素のストックを過剰（１０〜２０倍）に添加し、６時間反応させる（例えば、米国特許第４，７５７，１４１号）。この色素で標識されたオリゴヌクレオチドを、緩衝液（例えば、０．１ｍｏｌｌａｒのトリエチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ））で溶出するサイズ排除カラムクロマトグラフィーを介する通過によって、未反応の色素と分離する。粗製の標識されたオリゴヌクレオチドを含むフラクションをさらに溶出勾配を用いる逆相ＨＰＬＣによって精製する。
【００８１】
（ＶＩＩ．ジベンゾローダミン色素を利用する方法）
本発明の色素および試薬は、蛍光の検出を利用する方法、特に多重の空間的に重なった分析物を同時に検出することが必要とされる任意の方法に有用である。本発明の色素および試薬は、特に電気泳動のような生化学的分離手順を受けたポリヌクレオチド、または空間的に位置付け可能なハイブリダイゼーションアレイ内の位置間に分散されたポリヌクレオチドの種類を同定するのに十分適している。
【００８２】
本明細書中で「フラグメント分析」法または「遺伝分析」法と呼ばれる方法の好ましい範疇において、標識されたポリヌクレオチドフラグメントは、標識されたプライマーまたはヌクレオチドを使用するテンプレート指向型（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）酵素的合成によって生成され（例えばライゲーションまたはポリメラーゼ指向型プライマー伸長）、そのフラグメントはサイズ依存選別分離のプロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に供され、そして分離されたフラグメントは分離後に、例えば、レーザーによって誘導される蛍光によって検出される。特に好ましい実施態様において、多種のポリヌクレオチドが同時に分離され、そして異なる種類はスペクトル的に分解可能な標識によって識別される。
【００８３】
増幅断片長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ）として知られている１つのこのようなフラグメント分析方法は、増幅断片長多型、すなわちＰＣＲによって増幅される制限断片長多型に基づく。これらの種々のサイズの増幅されたフラグメントは、科（ｆａｍｉｌｉｅｓ）を通して変異遺伝子を追跡するための連結したマーカーとしてはたらく。増幅されたフラグメントが染色体上の変異遺伝子に近づくにつれて、連鎖相関は高くなる。多くの遺伝子障害についての遺伝子が同定されていないため、これらの連鎖マーカーは、疾患危険性または父性の評価を助けるようにはたらく。ＡｍｐＦＬＰ技術において、ポリヌクレオチドは、標識されたポリヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用することによって、またはＰＣＲ中の標識されたヌクレオチド三リン酸を利用して標識される。
【００８４】
ニックトランスレーションとして公知の別のこのようなフラグメントの分析方法において、反応は、二重鎖のＤＮＡ分子中の標識されていないヌクレオシド三リン酸を標識されたヌクレオシド三リン酸に置き換えるために使用される。遊離３’−ヒドロキシル基は、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡａｓｅＩ）の処理によってできた「ニック」によって、標識されていないＤＮＡ内に形成される。次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩは、ニックの３’−ヒドロキシル末端への標識されたヌクレオチドの付加を触媒する。同時に、この酵素の５’〜３’− エキソヌクレアーゼ活性によりヌクレオチドユニットがニックの５’−ホスホリル末端から脱離する。遊離の３’−ＯＨ基を有する新しいヌクレオチドは、元々の切除されたヌクレオチドの位置に組み込まれ、そしてニックは１つのヌクレオチドユニットだけ３’の方向に沿って移動する。この３’移動は、現存の標識されていないヌクレオチドの除去を伴う、新たな標識されたヌクレオチドのＤＮＡへの連続的な付加をもたらす。次いで、ニックトランスレーションされたポリヌクレオチドは、分離プロセス（例えば、電気泳動）を使用して分析される。
【００８５】
他の例示的なフラグメント分析法は、可変数の縦列反復配列、すなわちＶＮＴＲに基づく。ＶＮＴＲは、特定の配列の隣接した複数のコピーを含み、反復ユニットの数は可変性である二重鎖のＤＮＡの領域である。ＶＮＴＲ座の例には、ｐＹＮＺ２２，ｐＭＣＴ１１８およびＡｐｏＢがある。ＶＮＴＲ法のサブセットは、それらのマイクロサテライト反復、または短い縦列反復（ＳＴＲｓ）（すなわち、短い（２〜４塩基）反復配列によって特徴付けられるＤＮＡの縦列反復）の検出に基づく方法である。ヒトにもっとも多く点在している反復ＤＮＡの１つは、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド反復のファミリーである（（ＣＡ）nジヌクレオチド反復ファミリーともよばれる）。ヒトゲノムには５０，０００〜１００，０００個程多くの（ＣＡ）ｎ反復領域があると考えられており、代表的には１ブロックにつき１５〜３０個の反復を有する。これらの反復領域の多くは、長さが多型性であり、従って、有用な遺伝子マーカーとして働き得る。好ましくは、ＶＮＴＲ法またはＳＴＲ法において、標識は、色素で標識されたＰＣＲプライマーを使用してポリヌクレオチドフラグメントに導入される。
【００８６】
特に好ましいフラグメントの分析方法において、本発明に従って同定されたクラスは、末端ヌクレオチドに関して定義され、そうして４つの可能な末端塩基とスペクトル的に分解可能な色素のセットのメンバーとの間で対応が確立される。このようなセットは、市販の分光硬度計を用いて発光および吸収のバンド幅を測定することによって、本発明の色素から容易に構成される。より好ましくは、このクラスは、ＤＮＡ配列決定の化学的方法または鎖終結法の状況において生じ、もっとも好ましくは、このクラスは鎖終結法、すなわちジデオキシＤＮＡ配列決定またはＳａｎｇｅｒ型配列決定の状況において生じる。
【００８７】
Ｓａｎｇｅｒ型配列決定は、配列が決定されるべき１本鎖または２本鎖のＤＮＡテンプレートを使用するインビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖合成を包含する。合成は、オリゴヌクレオチドプレイマーがテンプレートにアニーリングする場所に基づく決められた部位で開始される。合成反応は、連続したＤＮＡの延長を支持しないヌクレオチドアナログを組み込むことによって終結される。例示的な鎖終結ヌクレオチドアナログは、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド ５’−トリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）を包含し、これは３’〜５’ＤＮＡ鎖の伸長に必要な３’−ＯＨ基を欠失する。ｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート）の適切な割合および４個のｄｄＮＴＰの１個が使用される場合、酵素で触媒される重合化は、ｄｄＮＴＰが組み込まれているそれぞれの部位にある鎖の母集団のフラクション内で終結される。標識されたプライマーまたは標識されたｄｄＮＴＰがそれぞれの反応に使用される場合、配列情報は、高分解能電気泳動によって分離された後の蛍光によって検出され得る。鎖終結法において、本発明の色素は、配列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに結合され得る。色素は、例えば、Ｆｕｎｇら、米国特許第４，７５７，１４１号に示される教示に従って、プライマーの５’−末端で、プライマーの塩基上で；または、例えば、上記のＨｏｂｂｓらによって開示されるアルキニルアミノ結合基を介してジデオキシヌクレオチドの塩基上で相補的な機能性と連結し得る。
【００８８】
上記のそれぞれのフラグメント分析方法において、標識されたポリヌクレオチドは、好ましくは電気泳動手順によって分離される（例えば、上記で引用されたＧｏｕｌｄおよびＭａｔｔｈｅｗｓ；ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ，編，Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ， １９８１；Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｒｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９８４；または米国特許第５，３７４，５２７号、同第５，６２４，８００号および／または同第５，５５２，０２８号）。好ましくは、電気泳動基質のタイプは、約２〜２０重量パーセントの間の濃度（重量：容量）を有する架橋されたまたは架橋されていないポリアクリルアミドである。より好ましくは、ポリアクリルアミドの濃度は約４〜８パーセントである。好ましくは、特にＤＮＡ塩基配列決定の状況において、電気泳動基質は変性物質（例えば、尿素、ホルムアミドなど）を包含する。このような基質を作製するための詳述な手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ９８％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ｏｒ ７Ｍ Ｕｒｅａ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：２９９−３０５（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｃｈａｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｄｏｕｂｌｅ− ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４：３７８７−３７９４（１９７５）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１７９−１８５（１９８２）；およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM３７７ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ａ，Ｊａｎｕａｒｙ １９９５，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（ｐ／ｎ ９０３４３３，Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって提供される。特定の分離において利用される、最適な電気泳動条件（例えば、ポリマーの濃度、ｐＨ、温度、変性物質の濃度）は、多くの要因に依存し、これらには、分離される核酸のサイズの範囲、それらの塩基組成、これらの核酸が１本鎖であるかまたは２本鎖であるか、および電気泳動によって情報が求められるクラスの性質が含まれる。従って、本発明の出願は、特に分離のための最適条件に対して標準的な予備試験をすることを必要とし得る。
【００８９】
電気泳動分離に続いて、色素−ポリヌクレオチド結合体が、色素で標識されたポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することによって検出される。そのような検出を実行するために、標識されたポリヌクレオチドは標準的な手段（例えば、高輝度水銀灯、レーザーなど）によって照射される。好ましくは照射手段は、約６００ｎｍを超える波長の照射ビームを有するレーザーである。より好ましくは、色素−ポリヌクレオチドは、Ｈｅ−Ｎｅガスレーザーまたは固体状態のダイオードレーザーによって発生したレーザー光によって照射される。次いでこの蛍光は光感知検出器（例えば、光電子増倍管、帯電した結合デバイスなど）によって検出される。例示的な電気泳動の検出システムは、他（例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号および同第４，８１１，２１８号）に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、本発明の１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン中間体の合成のための、例示的な合成経路を表す。
【図２】図２は、本発明の１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン中間体の合成のための、例示的な合成経路を表す。
【図３】図３は、本発明の１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン中間体の合成のための、例示的な合成経路を表す。
【図４】図４は、本発明のジベンゾローダミン色素化合物の合成のための、一般化した合成経路を表す。
【図５】図５は、本発明のジベンゾローダミン色素化合物の合成のための、例示的な合成経路を表す。
【図６】図６は、本発明のジベンゾローダミン色素化合物の合成のための、例示的な合成経路を表す。
【図７】図７は、本発明の数個の例示的ジベンゾローダミン色素化合物の構造を表す。
【図８】図８は、化合物１８の合成を表す。
【図９】図９は、化合物５７〜６１の合成を表す。
【図１０】図１０は、化合物６７の合成を表す。
【図１１】図１１は、化合物７２の合成を表す。
【図１２】図１２は、化合物７６の合成を表す。
【図１３】図１３は、化合物８１の合成を表す。
【図１４】図１４は、化合物８２〜８４の合成を表す。
【図１５】図１５は、化合物８５の合成を表す。
【実施例】
【００９１】
（ＶＩＩＩ．実施例）
本発明は、以下の実施例の考察によってさらに明らかにされ、この実施例は本発明が純粋に模範的でありそして請求の範囲を限定することを意図しない。
【００９２】
（材料および方法）
全ての薬品は、他の記述がなければＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。マルチウスイエローはＦｌｕｋａから購入した。アセトンはＣａＳＯ４で乾燥し、蒸留した。ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）およびニトロベンゼンはＣａＨ２で乾燥し、蒸留した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）はＬＡＨで乾燥し、必要に応じて蒸留した。トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）はナトリウムで乾燥し、蒸留した。ＤＭＳＯ（９９．９％）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９９．５％）は、乾燥し、活性化モレキュラーシーブにかけて保存した。ＶＷＲのシリカゲル（２２０〜４００メッシュ）は、順相フラッシュクロマトグラフィーに使用した。逆相クロマトグラフィーをＡｌｄｒｉｃｈのオクタデシル基のついたシリカゲル上で実施した。分離用の薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）をＥＭＳｃｉｅｎｃｅ（ＶＷＲ）の１および２ｍｍの既製のシリカゲルプレート上で実施した。ＴＬＣをＥＭｓｃｉｅｎｃｅ（ＶＷＲ）のアルミニウムバックシリカゲル６０のプレート上で実施した。発色させたスポットは長波長および短波長ＵＶ照射によって可視化した。
【００９３】
吸収分光法をＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄモデル８４５１ＡのＵＶ／Ｖｉｓダイオードアレイ分光測定計で実施した。蛍光測定をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５０Ｂ発光分光測定計で行った。ＮＭＲスペクトルをＶａｒｉａｎ３００ＭＨｚ ＮＭＲのＣＤ３Ｃｌの７．２６ｐｐｍまたはＣＤ３ＯＤの３．３１ｐｐｍの溶媒ピークを参照して決定した。オリゴマー標識色素フラグメントのＨＰＬＣによる精製を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ２００ポンプで、逆相Ｃ−１８カラムを利用して、ＵＶおよび蛍光発光検出を使用して実施した。蛍光検出を赤を感知するＰＭＴを備えたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＣ ２４０蛍光検出器によって実施し、そしてＵＶ検出をＭｏｄｅｌ ＬＣ ２９５ ＵＶ／Ｖｉｓ検出器によって実施した。ポンプおよび検出器はすべて、２チャンネル型のＰｒｅｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ １０２２コンピューターランに連結した。緩衝液を以下の濃縮されたストックから作成した：１０×ＴＢＥ（０．８９Ｍトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．８９Ｍホウ酸、０．０２Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）および０．１Ｍ ＴＥＡＡ（トリエチルアミンアセテート）。
【００９４】
全ての反応をオーブン乾燥した丸底フラスコの中で、アルゴン下、ゴムのセプタムをかぶせて行った。無水溶媒をオーブン乾燥したシリンジでアルゴン雰囲気下で扱った。本明細書中で使用される用語「水性後処理（ａｑｕｅｏｕｓ ｗｏｒｋｕｐ）」は以下の工程を含む精製方法を意味する：（ｉ）飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液、５％ＨＣｌ水溶液または飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液に反応混合物を添加する工程、（ｉｉ）この溶液を有機溶媒（例えば、ＥｔＯＡｃまたはＣＨ２Ｃｌ２）で三回抽出する工程、（ｉｉｉ）合わせた有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄する工程、および（ｉｖ）その溶媒をＮａ２ＳＯ４で乾燥する工程、（ｖ）その乾燥剤を濾過する工程、および（ｖｉ）その溶媒を減圧下で除去する工程。３−メトキシ−１−ヒドロキシナフタレン１を１，３−ジヒドロキシナフタレンからＫ．Ｈ．ＢｅｌｌおよびＬ．Ｆ．ＭｃＣａｆｆｅｒｙ（Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．４６：７３１（１９９３））の方法によって合成した。１−アミノ−３−メトキシナフタレン１８を、Ｇ．Ｔ．ＭｏｒｇａｎおよびＥ．Ｄ．Ｅｖａｎｓ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：１１２６（１９１９））または以下の実施例１０で記載されたような手順に従って合成した。
【００９５】
（実施例１）
１−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン（ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｔｈａｌｅｎｅ）４の合成（図１）
３−メトキシ−１−ヒドロキシナフタレン１（１ｇｍ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中で懸濁させた。乾燥トリエチルアミン（１．２当量）を添加し、そして反応系を−５℃まで冷却した。ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中で懸濁させた無水トリフルオロメタンスルホン酸（１．１当量）を勢いよく攪拌しながら２時間に渡って滴下した。この反応系を室温まで昇温させ、そして５％のＨＣｌおよびＣＨ２Ｃｌ２を使用して水性の後処理をした。得られた粗３−メトキシナフタレン−１−トリフラート２をＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１０）の移動相を用いる順相フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００９６】
精製された３−メトキシナフタレン−１−トリフラート２を以下のようなＷｏｌｆｅのパラジウムが触媒するトリフラート／アミンカップリングの手順（Ｊ．Ｐ．Ｗｏｌｆｅ ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｕｃｈｗａｌｄ，ＪＯＣ，６１：１１３３（１９９６））を使用して、１−ジエチルアミノ−３−メトキシナフタレン３へ変換した。３−メトキシナフタレン−１−トリフラート２（１グラム）を（Ｓ）−（−）−２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル（ｂｉｎａｐｔｈｙｌ）（ＢＩＮＡＰ）（０．０１５当量）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（Ｐｄ２（ｄｂａ）３）（０．００５当量）、および乾燥ジエチルアミン（３当量）と共に、乾燥トルエン（１００ｍＬ）中で懸濁させた。この反応系をアルゴンでパージし、そして固体のナトリウムｔ−ブトキシド（３．３当量）を攪拌しながら添加した。次いで、反応系を加熱して、そして油浴中８０℃で１６時間攪拌した。反応系を室温にし、そして５％のＨＣｌおよびＣＨ２Ｃｌ２を使用して水性の後処理をし、粗１−ジエチルアミノ−３−メトキシナフタレン３を得た。これを、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：４９）を用いる順相フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００９７】
【数１】
2010159420.tif 000025
次に、１−ジエチルアミノ−３−メトキシ−ナフタレン３のメチル基を以下の三臭化ホウ素脱保護により除去した。１−アミノ−３−メトキシナフタレン（１００ｍｇ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中で懸濁させ、そしてこの混合物をドライアイス／アセトン浴中で−７０℃に冷却した。三臭化ホウ素（１０当量）を滴下し、そして反応系を３０分間攪拌し、次いで、冷蔵庫（０℃）に一晩置いた。反応を−７０℃でＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を注意深く添加することで、停止させた。固体のＮａＨＣＯ３（３０当量）を添加し、そして反応系を室温に暖めて、次いで暫時加熱して還流した。この混合物を冷却し、そして濾過し、この濾液をＡｃＯＨで酸性化し、そして溶媒を真空中で除去して、粗１−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン４を得た。これを、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：４）を用いる順相フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００９８】
（実施例２）
Ｎ−フェニル−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン９の合成（図１）
３−メトキシナフタレン−１−トリフラート２を、実施例１における上記のパラジウムが触媒するトリフラート／アミンカップリング反応に従い、アニリンを用いて誘導体化し、１−アニリノ−３−メトキシナフタレン５を得た。
【００９９】
１−アニリノ−３−メトキシナフタレン５を以下のアミノ基のアセチル化手順によりアセチル化した。１−アミノ−３−メトキシナフタレン５（５００ｍｇ）および乾燥Ｅｔ３Ｎ（１．２当量）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中で懸濁させ、そして氷／ＮａＣｌ浴を用いて−５℃に冷却した。２−ブロモ−２−メチルプロピオニルクロリド（１．１当量）を滴下し、そして反応系を−５℃で１時間攪拌し、そして室温でさらに１時間攪拌した。この反応系を室温にし、そして５％のＨＣｌおよびＥｔＯＡｃを使用する水性の後処理をして、粗中間体１−（ブロモアルキル）アミド−３−メトキシ−ナフタレン６を得た。これを、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：９）を用いる順相フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【０１００】
１−（ブロモアルキル）アミド−３−メトキシ−ナフタレン６を以下のように、ＡｌＣｌ３が触媒するフリーデル−クラフツ環化の手順を使用して環化した。
ニトロベンゼン中のＡｌＣｌ３（１〜３当量）を１−（ブロモアルキル）アミド−３−ヒドロキシ−ナフタレン６へ添加した。この反応系を１３０℃に加熱し、１時間反応させた。ＮＨ４ＣｌおよびＥｔＯＡｃを使用する水性の後処理によって粗Ｎ−フェニル−ベンゾインドリノン中間体７を得た。これを、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：４）を用いる順相フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。次いで、Ｎ−フェニル−ベンゾインドリン中間体７のアミドカルボニル基をＬＡＨを用いて還元すると、化合物８を得た。
【０１０１】
【数２】
2010159420.tif 000026
化合物８のメトキシ基の脱保護を実施例１に記載の三臭化ホウ素脱保護の手順を使用して成し遂げ、Ｎ−フェニル−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン９を得た。
【０１０２】
（実施例３）
Ｎ−メチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン１５の合成（図２）
化合物１０をピリジン中のピペリジン触媒作用を用いるマロン酸およびメトキシ−ナフトアルデヒドの縮合により合成した。化合物１０を１０％Ｐｄ／炭素上の水素で、そして続いてＬＡＨ還元で還元し、上で化合物２の合成について概略されたように、無水トリフルオロメタンスルホン酸と反応させて、トリフラート１１を得た。次いで、トリフラート１１をＤＭＦ中でＮａＮ３（３当量）と１００℃で６時間反応させた。次いで、この反応系を室温にし、そして純水およびＥｔＯＡｃを使用する水性の後処理をして、純粋な化合物１２を得た。化合物１２を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中で懸濁させ、固体のＡｌＣｌ３（３〜５当量）と複合し、そして２時間還流して化合物１３を得た。
【０１０３】
化合物１３は、以下のような一般のアミノ基のアルキル化の手順に従い、ＭｅＩでアルキル化した。３−メトキシベンゾキノリン誘導体１３（１００ｍｇ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）中で懸濁させ、そして−５℃（氷／ＮａＣｌ）に冷却した。１．１当量のｎ−ブチルリチウム（１Ｍ）を滴下し、そして反応系を１時間攪拌した。ＭｅＩアルキル化試剤（３当量）をゆっくりと添加し、そして反応系を室温で２時間攪拌させた。ＮＨ４ＣｌおよびＥｔＯＡｃを使用する水性の後処理によって粗製のアルキル化された３−メトキシベンゾキノリン中間体１４を得た。次いで、中間体１４を、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：１９）を用いる順相フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【０１０４】
【数３】
2010159420.tif 000027
実施例１における上記の一般の三臭化ホウ素の手順による続くメトキシ基の脱保護によってＮ−メチル−ヒドロキシベンゾキノリン誘導体１５を得た。
【０１０５】
（実施例４）
３−（５−ヒドロキシベンゾキノリン−１−イル）プロパンスルホン酸１７の合成（図２）
化合物１３を実施例３でＮ−メチル−ヒドロキシベンゾキノリン誘導体１５の合成について概説された上記の手順に従い合成した。次いで、化合物１３を実施例３における一般のアミノ基のアルキル化の上記の手順に従いアルキル化した。この時、アルキル化試剤としてＭｅＩよりはむしろ１，３−プロパンスルトンを使用して、５−メトキシベンゾキノンリン−Ｎ−プロパンスルホン酸中間体１６を得た。
【０１０６】
【数４】
2010159420.tif 000028
実施例１における上記の一般の三臭化ホウ素の手順による続く化合物１６のメトキシ基の脱保護によって３−（５−ヒドロキシベンゾキノリン−１−イル）プロパンスルホン酸１７を得た。
【０１０７】
（実施例５）
Ｎ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン２２の合成（図３）
Ａ．ＲｏｓｏｗｓｋｙおよびＥ．Ｊ．Ｍｏｄｅｓｔの手順（Ｊ．Ｏ．Ｃ．，３０：１８３２（１９６５））に従って、１−アミノ−３−メトキシナフタレン１８（１ｇｍ）を乾燥アセトン（５０ｍＬ）中で溶解させ、そしてヨウ素（０．０１当量）をこの溶液に添加した。この反応系を加熱し、そして１６時間攪拌し、冷却し、次いで飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を用いて停止させた。次いで、この反応混合物を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびＥｔＯＡｃを使用する水性の後処理をして、粗メトキシベンゾキノリン１９を得た。このメトキシベンゾキノリン１９をＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：９の移動相を使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。次いで化合物１９を実施例３における上記の一般のアミノ基のアルキル化の手順に従いＭｅＩでアルキル化して、化合物２０を得た。化合物２０をＰａｒｒ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｏｒ中、７０ｐｓｉでＨ２および１０％のＰｄ／炭素触媒作用を用いて還元して、Ｎ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−メトキシベンゾキノリン中間体２１を得た。
【０１０８】
【数５】
2010159420.tif 000029
実施例１における上記の一般の三臭化ホウ素の手順によって、続く化合物２１のメトキシ基の脱保護によってＮ−メチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン２２を得た。
【０１０９】
（実施例６）
Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン２７の合成（図３）
１−アミノ−３−メトキシナフタレン１８を実施例２における上記の一般のアミノ基のアセチル化手順に従い、２−ブロモ−２−メチルプロピオニルクロリドでアセチル化して化合物２３を得た。化合物２３を実施例２における上記のようなフリーデルクラフツ環化の手順で環化し、化合物２４を得た。次に化合物２４をＴＨＦ中でＬＡＨ（３当量）を用いて還元し、４−メトキシベンゾインドリン２５を得た。アルキル化試剤としてヨウ化メチルを使用する実施例３における上記の一般のアミノ基のアルキル化の手順を使用して、化合物２５をアルキル化し、Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４−メトキシベンゾインドリン中間体２６を得た。
【０１１０】
【数６】
2010159420.tif 000030
実施例１において上記の一般の三臭化ホウ素の手順によって、続く化合物２６のメトキシ基の脱保護によりＮ−メチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン２７を得た。
【０１１１】
（実施例７）
Ｎ−エチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾインドリン２９の合成（図３）
４−メトキシベンゾインドリン２５を上記の実施例６のように合成した。化合物２５をアルキル化試剤としてヨウ化エチルを用いる実施例３において記載された一般のアミノ基のアルキル化の手順によってアルキル化し、Ｎ−エチル−３，３−ジメチル−４−メトキシベンゾインドリン中間体２８を得た。
【０１１２】
【数７】
2010159420.tif 000031
実施例１に記載された一般の三臭化ホウ素の手順により、続いて化合物２８のメトキシ基を脱保護し、Ｎ−エチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾインドリン２９を得た。
【０１１３】
（実施例８）
選択されたジベンゾローダミン色素化合物の合成
一般の手順Ａ（図５）。固体の無水フタル酸誘導体３４をアミノヒドロキシ中間体３１（１．４当量）およびＺｎＣｌ２（２．８当量）と混合した。オーブンで乾燥された反応容器にラバーセプタムを取り付けて、そしてアルゴンでパージした。この固体の混合物を暫時１３０℃で融解が観測されるまで（例えば、約１５分後）加熱した。１，２−ジクロロベンゼン（約１０当量）をこの反応混合物へシリンジにより添加し、そしてこの不均一な混合物を１３０℃〜１７０℃に４時間加熱した。この粗反応混合物を冷却し、最小限の量のＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（１：１９）に懸濁させて、直接に、順相フラッシュクロマトグラフィーカラム上に充填し、そして粗色素をＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（１：１９）の移動相で溶出した。必要に応じて、この色素をＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（１：９）で展開するＰＴＬＣによって、異なる異性体３５および３６を分離および精製した。異性体的に純粋な色素（これはＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（１：９）で溶出するシリカのＴＬＣ上で単一の点として移動した）をそのＵＶ／可視吸収スペクトルおよびその長波長蛍光励起および放射スペクトルにより同定した。
【０１１４】
一般の手順Ｂ（図６）。図６に概説した一般の手順において、固体の無水フタル酸誘導体３４（１００ｍｇ）をラバーセプタムが取り付けられた丸底フラスコに入れ、そして乾燥アルゴンでパージした。乾燥ニトロベンゼン（２ｍＬ）を添加し、そしてこの無水物を溶解させるために加熱した。この混合物を室温まで冷却し、そして無水ＡｌＣｌ３（３〜６当量）をこの固体を溶解させるために攪拌しながら添加した。続いて、１当量の１−アミノ−３−メトキシナフタレン中間体３１を攪拌しながら添加し、そしてこの反応系を１３０℃に１時間加熱した。次いで、反応系を冷却し、そしてＥｔＯＡｃ中で懸濁させた。この有機層を飽和ＮＨ４Ｃｌおよびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして溶媒を真空中で除去した。必要に応じて、得られたケトン中間体３７／３８を、移動相として（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２、１：１９）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーを使用し、または再結晶によって異なる異性体３７および３８を分離および精製した。異性体的に純粋な中間体３７または３８のメトキシ基を実施例１に記載された一般の三臭化ホウ素脱保護の手順に従い除去して、アミノ−ヒドロキシナフタレンケトン３９を得た。次いで、アミノ−ヒドロキシナフタレンケトン３９（１００ｍｇ）を１３０℃で、乾燥１，２−ジクロロベンゼン（２ｍＬ）中の１−アミノ−３−ナフタレン中間体３２（１当量）と２時間反応させた。この反応系を冷却して、異性体的に純粋および不斉的に置換された生成物４０（これは、上記の一般の手順Ａのように精製された）を得た。
【０１１５】
ジベンゾローダミン色素４１の合成（図７）。無水フタル酸誘導体として無水ジクロロトリメリト酸（すなわち、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基がＣｌであり、そしてＣ−１５での置換基がＣＯ２Ｈである化合物３４）ならびにアミノヒドロキシ中間体３１としては１−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン４を使用して、一般の手順Ａに従った。
【０１１６】
ジベンゾローダミン色素４２の合成（図７）。無水フタル酸誘導体として無水ジクロロトリメリト酸（すなわち、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基がＣｌであり、Ｃ−１５での置換基がＣＯ２Ｈである化合物３４）ならびにアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−メチル−５−ヒドロキシ−ベンゾキノリン１５を使用して、一般の手順Ａに従った。
【０１１７】
ジベンゾローダミン色素４３の合成（図７）。無水フタル酸誘導体として無水ジクロロトリメリト酸（すなわち、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基がＣｌであり、Ｃ−１５での置換基がＣＯ２Ｈである化合物３４）ならびにアミノヒドロキシ中間体３１として５−ヒドロキシ−ベンゾキノリン１７を使用して、一般の手順Ａに従った。
【０１１８】
ジベンゾローダミン色素４４の合成（図７）。無水フタル酸誘導体として無水ジクロロトリメリト酸（すなわち、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基がＣｌであり、Ｃ−１５での置換基がＣＯ２Ｈである化合物３４）ならびにアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシ−ベンゾキノリン２２を使用して、一般の手順Ａに従った。
【０１１９】
ジベンゾローダミン色素４５の合成（図７）。無水フタル酸誘導体として無水ジクロロトリメリト酸（すなわち、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基がＣｌであり、Ｃ−１５での置換基がＣＯ２Ｈである化合物３４）ならびにアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−メチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾインドリン２７を使用して、一般の手順Ａに従った。
【０１２０】
ジベンゾローダミン色素４６の合成（図７）。無水フタル酸誘導体として無水テトラフルオロフタル酸（すなわち、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基がＦである化合物３４）およびアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−エチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾインドリン２９を使用して、一般の手順Ａに従った。
【０１２１】
ジベンゾローダミン色素４７の合成（図７）。無水フタル酸誘導体として無水ジクロロトリメリト酸（すなわち、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基がＣｌであり、Ｃ−１５での置換基がＣＯ２Ｈである化合物３４）ならびにアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−フェニル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾインドリン９を使用して、一般の手順Ａに従った。
【０１２２】
（実施例９）
選択されたジベンゾローダミン色素化合物のスペクトル特性
以下の表は種々の代表的な本発明のジベンゾローダミン色素化合物の重要なスペクトル特性を表す。遊離した色素（色素のλmax,absで０．０５の吸収を有する）に対する全スペクトルを１×ＴＢＥ緩衝液および８Ｍの尿素中、室温で記録した。色素の濃度は約１０−６Ｍであった。
【０１２３】
【表１】
2010159420.tif 000032
（実施例１０）
３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン２５の合成（図８および９）
以下のパラジウムが触媒するトリフラート／イミンカップリングおよびＢｕｃｈｗａｌｄの加水分解の手順（Ｂｕｃｈｗａｌｄ，Ｓ．Ｌ．らＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，３８／３６，６３６７−６３７０）を使用して化合物２を１−アミノ−３−メトキシナフタレン１８へ変換した（図８）。
【０１２４】
３−メトキシ−ナフタレン−１−トリフラート２（２５ｇ）をトリス（ジベンジリデンアセトン）−ジパラジウム（Ｐｄ２（ｄｂａ）３）（０．０１３当量）、ラセミ体の２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル（±ＢＩＮＡＰ）（０．０４当量）、炭酸カリウム（１．３当量）、炭酸セシウム（１．３当量）、およびベンゾフェノンイミン（１．５当量）と混合した。あるいは、カリウムまたはナトリウムｔ−ブトキシド（２．６当量）をこの反応の置換塩基として使用し得る。この反応混合物を乾燥トルエン（７５ｍＬ）および乾燥テトラヒドロフラン（７５ｍＬ）中で懸濁させ、そして油浴中１２０℃で２４時間攪拌した。７５ｍＬのヘキサン／酢酸エチル（９：１）の混合物をこの反応混合物に添加し、そしてこの混合物をヘキサン／酢酸エチル（３：２）を用いてシリカゲルを通して溶出した。この溶出液を回収し、次いで減圧下で濃縮した。濃縮した油状物にヘキサン／酢酸エチル（９：１）を添加して、１−ベンゾフェノンイミノ−３−メトキシナフタレン４９を黄色の結晶として晶出させた（２０．０ｇ、７２．６％）。この母液を濃縮し、そしてヘキサン／酢酸エチル（９：１）を添加して、黄色の結晶として４９の第２の収穫を晶出させた（３．０ｇ、１０．９％）。（全収率：８３．５％）。
【０１２５】
化合物４９を酸性条件下で加水分解して以下のように１８を得た。化合物４９（２７ｇｍ）を１，４−ジオキサン（１５０ｍＬ）および５％の硫酸（Ｈ２ＳＯ４、１００ｍＬ）中で懸濁させた。次いで反応系を油浴中、５０℃で１時間加熱および攪拌した。この反応混合物を室温に冷却し、そして１５０ｍＬのヘキサン／酢酸エチル（３：２）で洗浄した。次いで、この溶液を氷冷した水性ＮａＯＨでｐＨ１０〜ｐＨ１１に塩基性化し、そして酢酸エチルで３回抽出した。この合わせた有機の抽出液を硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させて、そして減圧下でエバポレートすると、淡褐色の油状物（これは放置したときに結晶となる）として１８を得た（１３．９ｇ、１００％）。
【０１２６】
化合物２５（３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン）を実施例６に記載の手順に従い１８から合成した。
【０１２７】
（実施例１１）
Ｎ−置換メトキシベンゾインドリン中間体５７〜６１の合成（図９）
化合物２５を共通の中間体として用い、Ｎ−置換された誘導体５７〜６１をアルキル化的置換（ａｌｋｙｌａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）またはパラジウムが触媒する二級アミン基へのカップリングにより合成した（図９）。
【０１２８】
Ｎ−（６−ヘキサン酸）−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン５７の合成。化合物２５（２．３ｇ）を市販のメチル−６−インドヘキサン酸５２（３当量）およびジイソプロピルエチルアミン（３当量）での処理で、アルキル化した。この混合物を乾燥トルエン（２３ｍＬ）中で懸濁させ、そして油浴中１３０℃で攪拌しながら１８時間加熱した。この溶媒を減圧下で除去し、粗Ｎ−（６−ヘキサン酸）−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン５７を得た。粗５７をジクロロメタン中に溶解させ、そしてヘキサン／酢酸エチル（９９：１）で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーにより精製した（収量２．２５ｇ、７４％）。
【０１２９】
Ｎ−（ビフェニル）−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン５８の合成。化合物２５（２．３ｇ）を、以下のような確立された手順（Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．，１９９７，６２，６０６６〜６０６８）に従うパラジウムが触媒するカップリングによりＮ−アリール化した：化合物２５（２ｇ）を４−ブロモ−ビフェニル７（１．４当量）、ナトリウムｔ−ブトキシド（１．３当量）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（Ｐｄ２（ｄｂａ）３）（０．０１３当量）、ラセミ体の２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル（±ＢＩＮＡＰ）（０．０４当量）と混合した。この反応混合物を乾燥トルエン（１００ｍＬ）中で懸濁させ、十分攪拌し、そして油浴中１３０℃で一晩（１６時間）加熱した。この反応混合物を水性塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）でクエンチし、そして酢酸エチルで抽出（３×）した。この有機の抽出液を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。ヘキサン（等容量）を粗反応混合物に添加し、そしてそれをヘキサン／酢酸エチル（１：１）を用いてシリカゲルを通して溶出した。この溶媒を減圧下でエバポレートし、そしてその残渣をヘキサン／酢酸エチル（９８：２）で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーで精製し、Ｎ−（ビフェニル）−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン５８を白色の粉末として得た（収率８５％）。
【０１３０】
Ｎ−（カルボキシビフェニル）−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン５９の合成。化合物５４を市販のブロモ−ビフェニル−メチルケトンからハロホルム反応により合成し、ブロモ−ビフェニル酸を得、続いて確立された手順を用いてエステル化した。化合物２５を５４と、以下のような確立された手順（ＢｕｃｈｗａｌｄらＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，３８／３６，６３５９〜６３６２）に従ってＮ−アリール化した：化合物２５（０．４ｇ）を化合物５４（１．４当量）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（Ｐｄ２（ｄｂａ）３）（０．０１３当量）、ラセミ体の２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル（±ＢＩＮＡＰ）（０．０４当量）および炭酸セシウム（３当量）と混合した。この反応混合物を乾燥トルエン（１００ｍＬ）および乾燥テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中で懸濁させ、次いで油浴中１３０℃で加熱し、１８時間攪拌した。この反応系を冷却し、そしてヘキサン（３０ｍＬ）をこの粗混合物に添加した。この粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（３：２）を用いてシリカゲルを通して溶出した。この溶媒を減圧下で除去し、そしてＮ−（カルボキシビフェニル）−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン５９をヘキサン／酢酸エチル：（９５：５）で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーで精製した（明るい黄色の固体、収量０．２５ｇ、３２％）。
【０１３１】
Ｎ−フェニル−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン６０の合成。化合物２５を、化合物２５からの化合物５８の合成について上記のように、ヨードベンゼンまたはブロモベンゼンでＮ−アリール化した。純粋なＮ−フェニル−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン８をヘキサン／酢酸エチル：（９８：２）を用いる順相フラッシュクロマトグラフィーで単離した。
【０１３２】
Ｎ−カルボキシフェニル−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン６１の合成。化合物２５を、化合物５９の合成について上記のように、メチルヨードベンゾエートまたはメチルブロモベンゾエートでＮ−アリール化した。純粋なＮ−カルボキシフェニル−３，３−ジメチル−ヒドロキシ−ベンゾインドリン６１をヘキサン／酢酸エチル：（９５：５）を用いる順相フラッシュクロマトグラフィーで単離した。
【０１３３】
（実施例１２）
ジベンゾローダミン色素６７、７２、７６および８１の合成（図１０〜１３）
Ｊｏｄａ ４−色素６７の合成（図１０）。ヒドロキシインドリン６２を以下の手順に従い、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）を使用し、化合物５８の脱メチル化によって得た：化合物５８（２ｇ）および塩化アルミニウム（６ｇ）をアルゴンの強気流下で完全に混合し、そしてこの反応混合物を１０分間アルゴンでパージした。この固体の混合物をアルゴン下で、オイルバス中９０℃〜１２０℃に２０分に渡り加熱した。この反応混合物を冷却し、そしてこの固体をジクロロメタン中で懸濁させて、そして氷および希Ｈ２ＳＯ４の溶液へ移した。この水層を５回抽出し、合わせた有機の抽出液を飽和塩化ナトリウムで洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後、この溶媒を減圧下でエバポレートし、そして純粋な６２（０．１３ｇ）をジクロロメタン／メタノール：（９９：１）で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーで単離した。ヒドロキシインドリン６３を、化合物５８の化合物６２への変換の手順と同一の手順を用いて化合物５９から得た。
【０１３４】
次に、乾燥ジクロロメタン中のＮ−メチルホルムアニリドとオキシ塩化リンの１：１錯体（１当量）を、小さいナス型フラスコ中の６２（１当量）（５ｍｌフラスコ中１００ｍｇ）に添加した。この反応混合物をアルゴン気流下、油浴中８０℃で加熱し、最終的にジクロロメタンが蒸発して暗赤色の油状物が残った。ニトロベンゼン（３００μｌ）を添加し、続いてＰＯＣｌ３（２当量）添加した。
上記の溶液にニトロベンゼン（５００μｌ）中で懸濁した６３（１当量）を添加した。この反応混合物を８０℃〜１５５℃に２５分にわたり加熱し、次いで１５５℃で１５分間保った。この反応系を冷却し、そしてジクロロメタンと共に５％のＨＣｌへ移した。その水層をブラインで飽和化し、そしてジクロロメタンで抽出（×３）した。合わせた有機の抽出液を分離し、そして減圧下でエバポレートして粗色素誘導体６４を得た。粗製の６４を酢酸（３ｍｌ）および５％のＨＣｌ（３ｍｌ）中で懸濁させ、６０℃で１時間加熱した。次いで反応混合物を氷を入れた飽和塩化ナトリウム水溶液に注ぎ、ジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機層のエバポレート後、次いで純粋なモノ−カルボキシル化された不斉の色素誘導体６５を他の２個の対称的な色素生成物（ビス−ビフェニルおよびビス−カルボキシビフェニル色素）からジクロロメタン／メタノ−ル（９：１）で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーで精製した。
【０１３５】
最終的に、この精製された色素誘導体６５を以下のようにスルホン化してＪｏｄａ−４色素６７を得た。色素誘導体６５（３０ｍｇ）および無水硫酸ナトリウム（３当量）をアルゴン下０℃で乾燥ジクロロメタン（５０ｍＬ）中に懸濁させた。上記の溶液に５当量のクロロスルホン酸（ＣｌＳＯ３Ｈ）を添加し、そしてこの反応混合物を室温で１８時間攪拌した。この反応混合物を飽和水性塩化ナトリウム／５％塩酸で停止し、そして水層を３回ジクロロメタンで抽出した。その有機抽出液を減圧下でエバポレートして粗Ｊｏｄａ−４色素６６を得た。粗色素６６をジオキサンおよび５％のＨＣｌ（２：１）の溶液中で懸濁させ、そして室温で２０時間攪拌した。次いでこの溶液を減圧下で濃縮し、飽和水性塩化ナトリウム中で懸濁させ、そしてジクロロメタンで３回抽出した。この溶媒をエバポレートして粗Ｊｏｄａ４色素６７を得た。純粋なＪｏｄａ４色素６７をメタノール／ジクロロメタン（１：４）で展開する順相分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）またはメタノール／ジクロロメタン（１：９）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【０１３６】
Ｊｏｄａ−３色素７２の合成（図１１）。いずれも化合物５８の化合物６２への変換について上記の塩化アルミニウム脱保護の手順を使用することで、化合物６１を脱メチル化して化合物６８を得、そして化合物８を脱メチル化して化合物９を得た。化合物６８をメチルホルムアニリド／ＰＯＣｌ３錯体と反応させ、連続して化合物９と反応させて、化合物６２および６３からの色素誘導体６４の合成で記載したような色素誘導体７０を得た。上記の６４からの色素誘導体６５の生成に関する手順に従い、粗色素誘導体７０を酸で加水分解して色素誘導体７１を得た。この純粋な不斉の色素誘導体７１を２つの対称的なビス−フェニルおよびビス−カルボキシフェニル色素生成物からＰＴＬＣで精製した。次いで、色素誘導体６５からのＪｏｄａ−４色素６７の生成について上記のように、この精製された色素７１をスルホン化および加水分解して粗Ｊｏｄａ−３色素７２を得た。純粋なＪｏｄａ−３色素７２を、メタノール／ジクロロメタン（１：４）で展開する順相分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）またはメタノール／ジクロロメタン（１：９）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【０１３７】
Ｊｏｄａ−２色素７６の合成（図１２）。三臭化ホウ素脱保護により化合物５７を脱メチル化して化合物７３を得、そして化合物８を脱メチル化して９を得た（化合物５８の化合物６２への変換について上記の塩化アルミニウム脱保護手順を用いる）。化合物５７をメチルホルムアニリド／ＰＯＣｌ３錯体と標準の条件下で反応させ、そして続けて化合物９と標準の条件下で反応させて、上記の実施例７に記載されているような色素誘導体７４を得た。粗色素誘導体７４を標準の酸加水分解で加水分解して色素誘導体７５を得た。この純粋な不斉の色素誘導体７５を２つの対称的なビスフェニルおよびビス−ヘキサン酸色素生成物からＰＴＬＣで精製した。次いで、６５から６７の形成について記載された標準の手順により、精製された色素７５をスルホン化して、粗Ｊｏｄａ−３色素７６を得た。純粋なＪｏｄａ−２色素７６を、メタノール／ジクロロメタン（１：４）で展開する順相分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）またはメタノール／ジクロロメタン（１：９）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【０１３８】
Ｊｏｄａ−１色素８１の合成（図１３）。化合物５７（０．３１３ｇ）を、メタノール中、室温で３時間にわたり１ＭのＫＯＨ（７当量）との処理でけん化した。この溶液を乾固するまで濃縮し、そしてその油状物を酢酸エチルおよび５％の塩酸溶液で十分に抽出した。この有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして無色油状物まで濃縮した。純粋な７７を５％のメタノール／ジクロロメタン／０．１％の酢酸で溶出する順相クロマトグラフィーにより単離した（収量０．２４３ｇ；８４％）。
【０１３９】
次に、化合物７７（０．３６０ｇｍ）を乾燥ジクロロメタン（２ｍｌ）ならびにジクロロメチルメチルエーテル（２．６当量）および四塩化スズ（４当量）の溶液に溶解させた。この溶液を１．５時間還流した。この混合物を酢酸エチルおよび３Ｍの塩酸溶液で抽出した。この有機層を水およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、油状物まで濃縮し、そして精製をしないで使用した。薄層クロマトグラフィーに基づいて、この時点において、化合物７７および７８の約等モルの混合物が存在した。この油状物を乾燥ジクロロメタン（８ｍｌ）中に溶解させてそして−７８℃に冷却した。混合物の脱メチル化を確立された三臭化ホウ素の手段により実行して化合物７９および８０の混合物を得た。この得られた粗油状物を乾燥ジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解させ、そしてオキシ塩化リン（２当量）を添加した。次いでニトロベンゼン（５ｍｌ）を添加した。この混合物を４５分間に渡って８０℃〜１５０℃に加熱し、そして即座に熱から除去した。後処理および単離を、化合物６７の合成に関する実施例１２に記載されたように行なって粗Ｊｏｄａ１色素８１を得た。純粋な色素８１を化合物６７の合成に関する実施例１２に記載されているようにＰＴＬＣにより単離して３２ｍｇを得た。
【０１４０】
（実施例１３）
化合物６７、７２、７６、および８１の色素カルボキシＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の合成ならびにこれらの誘導体のヌクレオチドおよびポリヌクレオチドへのカップリング（図１４および１５）
カルボン酸の色素６７、７２、７６および８１のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体を２つの方法の内一つの方法で成し遂げた。Ｊｏｄａ４色素ＮＨＳ８２、Ｊｏｄａ３色素ＮＨＳ８３、およびＪｏｄａ２色素ＮＨＳ８４の合成に関して、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ））−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ）テトラフルオロボレート試薬を用いる方法（方法Ａ）が好ましいが、Ｊｏｄａ１色素８５に関してはジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いる方法（方法Ｂ）が好ましい。
【０１４１】
方法Ａ：この色素を乾燥ＤＭＦ中で（５ｍｇ色素：３００μｌＤＭＦ）ジイソプロピル−エチルアミン（６当量）と懸濁させた。この色素の溶液にＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１５当量）を添加し、そして反応系を室温で１５分間攪拌した。この反応系をジクロロメタンと共に５％のＨＣｌ（２０ｍｌ）に移した。この水層を飽和されたＮａＣｌを添加することで塩を多くし、ジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機層を乾固するまで濃縮し、そして粗色素−ＮＨＳをＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１：９）で溶出する順相のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【０１４２】
方法Ｂ：この色素およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２０当量）を乾燥ジクロロメタン（５ｍｇ：５００μｌ ＣＨ２Ｃｌ２）中で懸濁させた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（９当量）を添加し、そして反応系を室温で１時間攪拌した。この反応を停止させ、そして純粋な色素−ＮＨＳを方法Ａのように単離した。
【０１４３】
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドへのＮＨＳ誘導体の結合を以下のように行なった。アミノ基で置換されたオリゴマーまたはターミネーターをホルムアミド（５×１０−４Ｍ）中で懸濁し、そしてジイソプロピルエチルアミン（１５当量）を添加した。ＤＭＳＯ（５ｍｇ／６０μｌ）中で懸濁させた過剰の色素−ＮＨＳ（５〜１０当量）を室温で攪拌しながら添加した。この反応系を室温で４時間攪拌した。この反応混合物に３ＭのＮａＯＡｃを添加して０．５ＭのＮａＯＡｃを得た。反応容量の４倍のＥｔＯＨを添加し、そしてこの混合物を冷却した。沈殿した、色素で標識されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを遠心分離によって単離し、そして３０％のＡｃＣＮ／０．１×ＴＥＡＡ緩衝液で溶出する逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０１４４】
本明細書で示される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各それぞれの刊行物、特許または特許出願が、ここで参考として援用されることが特に、および個々として示されたと同程度に、参考として援用される。
【０１４５】
少数の実施態様のみが上記で詳細に記載されているが、化学当業者は多くの改変がこれらの実施態様においてそれらの教示から逸脱することなく可能であることを明らかに理解する。このような改変の全ては、上記の請求項の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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