(57)【要約】【課題】生理活性タンパク質の活性を制御する物質を、再現性および定量性よく、検出または定量する。【解決手段】生体試料と、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と、可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプターとを混合する工程と、ＧＭ−ＣＳＦと可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプターとの結合の阻害の度合いに基づいて、生体試料中のＧＭ−ＣＳＦの活性を制御する物質の含有量を測定する工程とを含む、ＧＭ−ＣＳＦの活性を制御する物質の測定方法。【選択図】図１
2010266382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料と、生理活性タンパク質と、可溶性生理活性タンパク質受容体と、を混合する工程と、
前記生理活性タンパク質と前記可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の阻害の度合いに基づいて、前記生体試料中の前記生理活性タンパク質の活性を制御する物質の含有量を測定する工程と、
を含む、生理活性タンパク質の活性と拮抗し制御する物質の測定方法。
【請求項２】
前記生理活性タンパク質の活性を制御する物質の含有量を測定する工程が、
前記生理活性タンパク質の活性を制御する物質が、前記生理活性タンパク質との特異的な結合において、前記可溶性生理活性タンパク質受容体との間で競合することによって、前記生理活性タンパク質と前記可溶性生理活性タンパク質受容体との結合を阻害する度合いを測定する工程を含む、
請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記生理活性タンパク質の活性を制御する物質が、中和抗体である、請求項１または２記載の測定方法。
【請求項４】
前記生理活性タンパク質が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、前記可溶性生理活性タンパク質受容体が、可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプターである、請求項１乃至３いずれかに記載の測定方法。
【請求項５】
前記生理活性タンパク質が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、前記可溶性生理活性タンパク質受容体が、可溶性ＶＥＧＦレセプターである、請求項１乃至３いずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
前記可溶性生理活性タンパク質受容体が、完全体の生理活性タンパク質受容体のうち細胞膜結合ドメインを欠く構造を有する、請求項１乃至５いずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
前記可溶性生理活性タンパク質受容体が、トランスジェニックカイコ由来の組換えタンパク質である、請求項１乃至６いずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
前記生体試料が、血清、血漿、尿、組織液、リンパ液、腹水、臓器抽出液および細胞抽出液からなる群から選ばれる一種以上の試料である、請求項１乃至７いずれかに記載の測定方法。
【請求項９】
生理活性タンパク質と、該生理活性タンパク質に特異的に結合する可溶性生理活性タンパク質受容体と、スクリーニング対象物質と、を含む反応系における、前記生理活性タンパク質と前記可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の阻害の度合いを測定する工程と、
前記阻害の度合いに基づいて、前記スクリーニング対象物質に起因する生理活性タンパク質の活性を制御する能力を評価する工程と、
を含む、生理活性タンパク質の活性を制御する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
固相担体と、前記固相担体に担持されてなる生理活性タンパク質と、前記生理活性タンパク質に特異的に結合する可溶性生理活性タンパク質受容体とを含む、
生体試料中の生理活性タンパク質の活性を制御する物質を検出するためのキット。
【請求項１１】
固相担体に担持されてなる可溶性生理活性タンパク質受容体と、前記可溶性生理活性タンパク質受容体に特異的に結合する生理活性タンパク質とを含む、生体試料中の生理活性タンパク質の活性を制御する物質を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中和抗体など生理活性タンパク質の活性と拮抗し制御する物質の測定方法、生理活性タンパク質とその受容体との結合を制御する物質のスクリーニング方法、および、生理活性タンパク質の受容体への結合を制御する物質を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
中和抗体を含む生理活性タンパク質の活性を制御する物質（以下、「生理活性タンパク質競合物質」と称することもある）は、生体内で過剰産生された生理活性タンパク質の活性を抑制することができるため、医薬品としての有用性が高い。例えば、抗ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体は、ＧＭ−ＣＳＦの過剰な産生が一因となって引き起こされる喘息やアトピー等のアレルギー性疾患のための治療薬として期待されている。また、例えば、血管内皮細胞増殖因子であるＶＥＧＦの活性を阻害する中和抗体等の競合物質は、新生血管を必要とする腫瘍組織の増殖を抑える治療薬として期待されている。
【０００３】
前述した中和抗体を含む生理活性タンパク質競合物質の検出および定量は、生理活性タンパク質と、生理活性タンパク質レセプターを表面に発現している培養細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦの場合はＴＦ−１細胞など）を用いたアッセイ系により行われてきた。このアッセイ系によれば、供試する生体試料が生理活性タンパク質と生理活性タンパク質レセプターの結合を阻害する結果として生ずる細胞の増殖阻害等の度合いを測定することで、中和抗体等の生理活性タンパク質競合物質の検出、定量を行うことが通常である。
【０００４】
特許文献１および非特許文献１には、特発性肺胞蛋白症（以下、「ＩＰＡＰ」と称する）患者の気管支肺胞洗浄液（以下、「ＢＡＬＦ」と称する）による、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、「ＧＭ−ＣＳＦ」と称することもある）とこれに特異的に結合するレセプターとの結合阻害を測定する方法が開示され、前述のＧＭ−ＣＳＦレセプターを表面に発現している培養細胞としては、ＧＭ−ＣＳＦに依存して増殖する腫瘍細胞株であるＴＦ−１細胞が用いられている。かかる文献に開示されているアッセイ系の主要な流れを図５に示す。図５を参照して説明すると、アッセイに供するに先駆けて、凍結保存されたＴＦ−１細胞を活性化するために、解凍後５日間程度前培養を行う。前培養を行ったＴＦ−１細胞を、９６穴プレートにおいて、ＧＭ−ＣＳＦとＩＰＡＰ患者からのＢＡＬＦの存在下で、３日間培養をする。その後、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）試薬を添加し、２時間培養後、生細胞により形成されるホルマザンをイソプロパノール／ＨＣｌに溶解し、波長５９５ｎｍにて吸光度を測定する。この場合、ＩＰＡＰ患者からのＢＡＬＦの添加により、ＴＦ−１細胞の増殖が少なければ、ＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦレセプターの結合阻害活性が高いことになり、ＧＭ−ＣＳＦ阻害物質の検出、定量が可能となると記載されている。
【０００５】
また、特許文献１および非特許文献１においては、ＩＰＡＰ患者からのＢＡＬＦが、ＴＦ−１細胞上に発現しているＧＭ−ＣＳＦレセプターとの間で競合し、ＧＭ−ＣＳＦの生理活性を中和することで、ＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦレセプター（ＴＦ−１細胞）の結合を阻害することが示されている。さらに、ＩＰＡＰ患者由来のＢＡＬＦから精製された抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体が、上述した結合阻害活性を示すことも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１９８７９９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｎａｋａ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４４２，  ｐｐ．２４６−２５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述したような生理活性タンパク質競合物質の検出および定量に係るアッセイ系においては、ＴＦ−１細胞等の生細胞（生きた培養細胞）を用いるため、結果が不安定である故、再現性および定量性の面で問題があり、信頼性に欠けるものであった。また、細胞培養等に時間が掛かり、迅速に測定することができるアッセイ系が強く望まれていた。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、生体試料から高精度かつ効率的に生理活性タンパク質の活性を制御する物質を測定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明によれば、生体試料と、生理活性タンパク質と、可溶性生理活性タンパク質受容体とを混合する工程と、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の阻害の度合いに基づいて、生体試料中の生理活性タンパク質の活性を制御する物質の含有量を測定する工程とを含む、生理活性タンパク質の活性を制御する物質の測定方法が提供される。かかる方法によれば、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の阻害の度合いに基づいて、生体試料中の生理活性タンパク質の活性を制御する物質の含有量を測定するため、生体試料から高精度かつ効率的に生理活性タンパク質の活性を制御する物質を測定することができる。
【００１１】
また、本発明によれば、生理活性タンパク質と、その生理活性タンパク質に特異的に結合する可溶性生理活性タンパク質受容体と、スクリーニング対象物質とを含む反応系における、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の阻害の度合いを測定する工程と、その阻害の度合いに基づいて、スクリーニング対象物質に起因する生理活性タンパク質の活性を制御する能力を評価する工程とを含む、生理活性タンパク質の活性を制御する物質のスクリーニング方法が提供される。かかる方法によれば、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の阻害の度合いに基づいて、そのスクリーニング対象物質に起因する生理活性タンパク質の活性を制御する活性を評価するため、生体試料から高精度かつ効率的に生理活性タンパク質の活性を制御する物質をスクリーニングすることができる。
【００１２】
さらに、本発明によれば、固相担体と、その固相担体に担持されてなる生理活性タンパク質と、生理活性タンパク質に特異的に結合する可溶性生理活性タンパク質受容体とを含む、または、固相担体に担持されてなる可溶性生理活性タンパク質受容体と、その可溶性生理活性タンパク質受容体に特異的に結合する生理活性タンパク質生理活性タンパク質とを含む、生体試料中の生理活性タンパク質の活性を制御する物質を検出するためのキットが提供される。かかるキットによれば、いわゆる拮抗阻害のメカニズムによって、生体試料から高精度かつ効率的に生理活性タンパク質の活性を制御する物質を検出することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生体試料から高精度かつ効率的に生理活性タンパク質の活性を制御する物質を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施の形態の一例に係るＧＭ−ＣＳＦの活性を制御する物質のアッセイ系の主要な流れを示す図である。
【図２】図２は、様々な濃度の精製抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を、実施の形態に係るアッセイ系に供した時のＧＭ−ＣＳＦと可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプター（ｓＧＭＲ）の結合阻害を示すグラフである。
【図３】図３は、実施の形態に係るＧＭ−ＣＳＦの活性を制御する物質のアッセイ系において、精製抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の中和活性を測定した結果と、ＴＦ−１細胞を用いた従来のアッセイ系に基づいて測定された精製抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の中和活性の相関を示すグラフである。
【図４】図４は、健常者の血清（Ａ〜Ｃ）および特発性肺胞蛋白症患者の血清（Ａ’〜Ｆ’）を実施の形態に係るアッセイ系に供した時のＧＭ−ＣＳＦと可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプター（ｓＧＭＲ）の結合阻害を示すグラフである。
【図５】図５は、従来のＧＭ−ＣＳＦの活性を制御する物質のアッセイ系の主要な流れを示す図である。
【図６】図６は、健常者２０人および非小細胞肺癌患者（Ｌｋ）２０人の血清を、可溶性ＶＥＧＦレセプター１（ｓＶＥＧＦＲ１）および可溶性ＶＥＧＦレセプター２（ｓＶＥＧＦＲ２）を用いた実施の形態に係るアッセイ系に供し、健常者および非小細胞肺癌患者血清に含まれるＶＥＧＦ競合阻害物質を測定した時の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、実施の形態に係る無細胞系による中和能測定法について、ＧＭ−ＣＳＦを固相化したのちｓＧＭＲ、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体の順番で反応させる変形例を説明するための概念図である。
【図８】図８は、実施の形態に係る無細胞系による中和能測定法について、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体を固相化したのちｓＧＭＲ＋ＧＭ−ＣＳＦ  ｃｏｍｐｌｅｘを反応させる変形例について説明するための概念図である。
【図９】図９は、実施の形態に係る無細胞系による中和能測定法について、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体を固相化したのちｓＧＭＲ、ＧＭ−ＣＳＦの順番で反応させる変形例について説明するための概念図である。
【図１０】図１０は、実施の形態に係る無細胞系による中和能測定法について、直接ｓＧＭＲを９６穴プレートに固相化する変形例について説明するための概念図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、可溶性生理活性タンパク質受容体を用いる、拮抗阻害のメカニズムによる生理活性タンパク質競合物質の検出または定量に係るアッセイ系において、培養細胞を用いる必要がない、完全なｉｎ  ｖｉｔｒｏで、極めて高い再現性または定量性が実現されることを初めて見出し、本発明を完成したのである。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。
【００１７】
［実施形態１；生理活性タンパク質の活性を制御する物質の測定方法］
本実施形態に係る生理活性タンパク質の活性を制御する物質の測定方法は、生体試料と、生理活性タンパク質と、その生理活性タンパク質に特異的に結合する可溶性生理活性タンパク質受容体とを混合する工程と、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の阻害の度合いに基づいて、生体試料中の生理活性タンパク質の活性を制御する物質の含有量を測定する工程とを含む、生理活性タンパク質の活性を制御する物質の測定方法である。
【００１８】
本実施形態に係る測定方法においては、アッセイ系に供試する試料中に、生理活性タンパク質の活性を制御する物質（生理活性タンパク質競合物質）が相当量存在する場合、この生理活性タンパク質競合物質は、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体の結合を阻害するように働く。このような結合阻害活性の具体例としては、生理活性タンパク質競合物質が、可溶性生理活性タンパク質受容体との間で競合して、生理活性タンパク質と特異的に結合（競合結合）し、生理活性タンパク質の効果を中和することで、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合を阻害することが挙げられる。なお、本来的に、生理活性タンパク質は、細胞表面の膜上にあるレセプター（受容体）に結合して働き、レセプターと結合することで、特定の細胞に情報伝達をするという効果を発揮する。
【００１９】
本実施形態に係る測定方法に用いることができる生理活性タンパク質としては、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ケモカイン、ホルモン、神経伝達物質、造血因子、等が挙げられる。これらの生理活性タンパク質のうち、生理活性タンパク質競合物質の医療分野における重要性の観点から、ＧＭ−ＣＳＦやＶＥＧＦは候補となる。ＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞、血管内皮細胞により産生される糖タンパク質であり、顆粒球、マクロファージの前駆細胞に作用し、それらの増殖と分化を促進する生理活性タンパク質である。また、ＧＭ−ＣＳＦは、抗原提示細胞を賦活化することにより生体防御に寄与している反面、アレルギー疾患や自己免疫疾患の局所においては炎症を劇化していると考えられている。かかるＧＭ−ＣＳＦの作用を制御できれば、各種の炎症性疾患が治療できることから、ＧＭ−ＣＳＦに作用する物質の開発が強く望まれていた。また、血管新生因子であるＶＥＧＦの活性を阻害する競合物質は、新生血管を必要とする腫瘍組織の増殖を抑える治療薬として期待されている。
【００２０】
本実施形態に係る測定方法においては、可溶性生理活性タンパク質受容体としては、可溶性の状態で生産されることはもちろんのこと、調製する上で、取り扱いやすく、アッセイ系に供するのに十分な純度および収量を得ることができる、生産性および品質の高いものであることが好ましい。本実施形態に係るアッセイ系において、生理活性タンパク質競合物質の高精度で安定した検出または定量が達成できなくなるためである。
【００２１】
本発明者らは、前述した事項に鑑み、品質の高い可溶性生理活性タンパク質受容体を安定的に取得するための一つの方法として、トランスジェニックカイコを用いた組換えタンパク質生産系を用いたが、同様に品質の高い可溶性生理活性タンパク質受容体を安定的に生産できるのであれば他の発現系を用いても良い。
【００２２】
トランスジェニックカイコ由来の可溶性生理活性タンパク質受容体は、トランスジェニックカイコに組み込んだ可溶性生理活性タンパク質受容体遺伝子（組換えタンパク質遺伝子）を発現させ、当該遺伝子がコードする可溶性生理活性タンパク質受容体をトランスジェニックカイコの後部絹糸腺または中部絹糸腺で産生させ、この産生された可溶性生理活性タンパク質受容体を回収することで得られる。
【００２３】
ここで、「トランスジェニックカイコ」とは、組換えタンパク質構造遺伝子がカイコ染色体に導入されたカイコのことであり、そのカイコ染色体ＤＮＡを常法に従って制限酵素処理したのち、常法に従って標識した生理活性タンパク質遺伝子をプローブとしてサザンブロッティングを行う時、ポジティブなシグナルを与えるカイコのことである。生理活性タンパク質遺伝子が導入される染色体上の遺伝子座位は、カイコの発生、分化、成長を阻害しない部位であれば特に制限はない。
【００２４】
ここで、「組換えタンパク質構造遺伝子」とは、組換えタンパク質をコードする領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｌａｍｅ：  ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、例えば、組換えタンパク質遺伝子のｃＤＮＡが挙げられる。この組換えタンパク質構造遺伝子は、任意のタンパク質をコードするｃＤＮＡ等を用いることができ、ヒトｓＧＭＲ  ｃＤＮＡ等が特に好ましい。
【００２５】
上述のトランスジェニックカイコが合成した組換えタンパク質は、細胞膜結合ドメインを欠いて可溶性の状態であり、生産性および品質が高く、取り扱いやすい。そのため、この組換えタンパク質を生理活性タンパク質レセプターとして用いることによって、細胞の培養状態等により結果が安定しない従来の生理活性タンパク質競合物質の測定方法と比較して、再現性および定量性が高いアッセイ系を構築することができる。また、前述の可溶性生理活性タンパク質受容体としての組換えタンパク質は、カイコが形成する繭等から容易に抽出することができ、生産性やコスト等の面においても有利である。
【００２６】
なお、上述したトランスジェニックカイコから産生された可溶性生理活性タンパク質受容体（組換えタンパク質）が、生理活性タンパク質に特異的に結合することは、後述する実施例にあるとおり、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（生理活性タンパク質の活性を制御する物質）無添加の場合において、ｓＧＭＲがＧＭ−ＣＳＦ（生理活性タンパク質）と結合したという結果が得られたことから明らかである。
【００２７】
本実施形態に係る測定方法に供試する生体試料としては、生体由来の試料であれば特に限定されず、血清、血漿、尿、組織液、リンパ液、腹水、臓器抽出液、細胞抽出液等を例示することができる。
【００２８】
なお、本明細書および本特許請求の範囲において、「生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の阻害の度合い」とは、例えば、生理活性タンパク質競合物質を添加しない場合の生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の度合いに対する、生理活性タンパク質競合物質を添加した場合の生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の度合いの比を阻害率とすること等が挙げられる。
【００２９】
本実施形態に係る測定方法において、生体試料中の生理活性タンパク質の活性を制御する物質を、生理活性タンパク質とこれに特異的に結合する可溶性生理活性タンパク質受容体を用いて測定するには、通常、標識した生理活性タンパク質または可溶性生理活性タンパク質受容体を用い、発色法、蛍光法、発光法などにより標識を検出する。あるいは、生理活性タンパク質または可溶性生理活性タンパク質受容体に結合し、かつ標識された抗体を、生理活性タンパク質または可溶性生理活性タンパク質受容体に結合させ、同様に標識を検出しても良い。図１にその一例を示す。
【００３０】
例えば、以下に示す方法が挙げられる。可溶性生理活性タンパク質受容体を固相担体に固着させ、ビオチン標識した生理活性タンパク質を結合させる。ここに生体試料を添加すると、生体試料中に生理活性タンパク質競合物質が存在する場合、生理活性タンパク質競合物質が可溶性生理活性タンパク質受容体と競合し、可溶性生理活性タンパク質受容体と生理活性タンパク質との結合が解離する。ここに、酵素標識したストレプトアビジンを添加し、さらに発光基質を添加して、可溶性生理活性タンパク質受容体に結合した生理活性タンパク質を検出することにより、生理活性タンパク質競合物質の生理活性タンパク質への結合の度合いを測定する方法である。なお、特許文献１に示すように、ＩＰＡＰ患者からのＢＡＬＦから精製された抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体が、ＧＭ−ＣＳＦとＴＦ−１細胞の結合を阻害する活性を有すること、および、抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体は、ＩＰＡＰ患者の血清中にも存在することが示されている。したがって、血清等の生体試料をアッセイ系に供試した場合であっても、ＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦ受容体との結合阻害は起こり得る。
【００３１】
上記の測定系において、固相担体に固相化するタンパク質は、生理活性タンパク質であっても、可溶性生理活性タンパク質受容体であっても良い。生理活性タンパク質を固層化した場合は、溶液として添加する可溶性生理活性タンパク質受容体を標識しておくか、あるいは、可溶性生理活性タンパク質に結合する標識抗体を用いて、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体の結合の度合いを測定する。反対に、可溶性生理活性タンパク質受容体を固層化した場合は、溶液として添加する生理活性タンパク質を標識しておくか、生理活性タンパク質に結合する標識抗体を用いて、両者の結合の度合いを測定する。
【００３２】
上述した測定方法において用い得る、各々の要素（例えば、固相担体、標識物質および発色基質等）は、具体的な測定方法の態様に応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されるものではないが、以下に各々の要素における代表的な態様を具体的に例示する。
【００３３】
本実施形態に係る測定方法に用いる得る固相担体としては、例えば、マイクロプレート、ビーズ、チューブ、メンブレン、ゲル、微粒子状固相担体〔例えば、ゼラチン粒子、カオリン粒子、合成ポリマー粒子（ラテックス粒子等）〕などが挙げられ、これらの固相担体の中でも、マイクロプレート、ビーズ、チューブまたは微粒子状固相担体を用いることが好ましい。特に、正確な定量性とその実施に際しての簡便性等を考慮すると、マイクロプレートを固相担体として用いることが好ましい。
【００３４】
マイクロプレートなどの固相担体に、生理活性タンパク質や可溶性生理活性タンパク質受容体を固相化するためには、これらのタンパク質をマイクロプレートに直接吸着させても良いし、はじめに生理活性タンパク質や可溶性生理活性タンパク質受容体に対する抗体をマイクロプレート吸着させ、次にこれらのタンパク質を抗体に結合させることにより、間接的にタンパク質をプレートに固相化してもよい。また、ストレプトアビジンでコートされたプレートに、ビオチンで標識したタンパク質を結合させて固相化する方法や、ニッケルプレートにＨｉｓ?ｔａｇが付加されたタンパク質を結合させる方法を用いることもできる。Ｈｉｓ?ｔａｇが付加されたタンパク質を固相化するには、マイクルプレートにＨｉｓ?ｔａｇを吸着させ、抗体を介してタンパク質を結合する方法もある。
【００３５】
また、生理活性タンパク質および生理活性タンパク質と結合能を有する可溶性生理活性タンパク質受容体を固着させた固相体の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこへ検体中の生理活性タンパク質競合物質や他の分子種が固着すると、正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、検体を固相体と接触させる前にブロッキング物質を添加して、生理活性タンパク質と結合能を有する可溶性生理活性タンパク質受容体が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、ウシ等から採取できる血清アルブミン、カゼイン、ミルクタンパク質等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されている物質を用いることもできる。
【００３６】
本実施形態に係る測定方法に用い得るタンパク質の標識物質としては、例えば、特異的結合対（例えばビオチンとストレプトアビジン等のアビジン類、又はレクチンと糖鎖等）の一方の物質；ＦＩＴＣ，フィコエリトリン，ユーロピウム，フィコシアニン，ローダミン，テキサスレッド，ウンベリフェロン，トリカラー，シアニン，７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）等の蛍光物質；アルカリフォスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ，ペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ等の酵素類；ジニトロフルオロベンゼン，ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、２，４−ジニトロアニリン等のハプテン；１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ等のアイソトープなどを用いることが可能であり、特に限定されるものではないが、上述の特異的結合対の一方の物質を標識物質として選択することが好ましく、特に、ビオチンとアビジン類からなる特異的結合対の一方の物質を選択することが好ましい。
【００３７】
上述のタンパク質の標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位元素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法等（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、１９８７年発行参照）から適宜選択することができる。
【００３８】
また、固相担体に固着させた生理活性タンパク質または可溶性生理活性タンパク質受容体と検体中の特異的に結合する生理活性タンパク質競合物質を結合させた後に、固相担体の表面を洗浄液で洗浄して非特異吸着物を除去することが好ましい。洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等の界面活性剤を添加した緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水およびトリス塩酸緩衝液）等が挙げられる。
【００３９】
標識物質の検出法としては、用いる標識物質により異なるが、例えば、標識物質にビオチンを使用する場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素を添加して、このストレプトアビジン等を介してペルオキシダーゼ等の酵素を標識物質としてビオチンを含む複合体へ結合させ、該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、例えば、標識物質として蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００４０】
なお、上述のペルオキシダーゼをストレプトアビジン等のアビジン類の標識物質として用いる場合には、このペルオキシダーゼにより発色させる基質としては、通常この用途に用いられるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等の発色物質と、ペルオキシダーゼの基質として、過酸化水素水等を使用することが好ましい。
【００４１】
本実施形態に係る測定方法においては、生体試料検体中の生理活性タンパク質競合物質の濃度は、予め既知濃度の精製抗生理活性タンパク質抗体などの競合物質の標準液を用いて競合物質濃度と生理活性タンパク質−可溶性生理活性タンパク質受容体間の結合阻害の度合いとの関係について検量線を作成し、未知濃度の生体試料検体の結合阻害の度合いの結果と前述の検量線とを用いる方法によって、定量することができる。後述するように、実施例において、精製抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の容量に依存して、ＧＭ−ＣＳＦと可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプター（トランスジェニックカイコ由来の組換えタンパク質）との結合阻害率が増加することが認められていることから、かかる関係について検量線を作成すれば、未知濃度の血清をアッセイ系に供試した場合、ＧＭ−ＣＳＦと可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプターの結合阻害率と前述の検量線に基づいて、未知濃度の血清等の検体中の抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の濃度を定量することが可能となる。
【００４２】
本実施形態に係る測定方法によれば、生きた培養細胞を用いる従来の方法とは異なり、生理活性タンパク質の活性を制御する物質（生理活性タンパク質競合物質）のアッセイ系において、極めて高い再現性および定量性を実現することができる。そして、簡便な操作により、短時間で迅速に精度の高い測定を行うことが可能となる。また、医薬品として投与される生理活性タンパク質競合物質（中和抗体を含む）の体内濃度等のモニタリング等に有効に利用することが可能となる点においても有意である。
【００４３】
［実施形態２；生理活性タンパク質の活性を制御する物質のスクリーニング方法］
本実施形態に係る生理活性タンパク質の活性を制御する物質のスクリーニング方法は、生理活性タンパク質と、生理活性タンパク質に特異的に結合する可溶性生理活性タンパク質受容体と、スクリーニング対象物質とを含む反応系における、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体との結合の阻害の度合いを測定する工程と、阻害の度合いに基づいて、スクリーニング対象物質に起因する生理活性タンパク質の活性を制御する能力を評価する工程とを含む、生理活性タンパク質の活性を制御する物質のスクリーニング方法である。かかるスクリーニング方法は、基本的には、上述の実施形態１に係る測定方法に基づいて、生理活性タンパク質の活性を制御する物質をスクリーニングする方法である。すなわち、生理活性タンパク質競合物質は、生理活性タンパク質に特異的に結合（競合結合）し、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体の結合を阻害するように働き、生理活性タンパク質の効果を中和することで、生理活性タンパク質と可溶性生理活性タンパク質受容体の結合を阻害する。この結合阻害の度合いに基づいて、生理活性タンパク質競合物質に起因する生理活性タンパク質の活性を制御する活性を評価できるという知見に基づいたスクリーニング方法である。
【００４４】
ここで、候補物質としては、任意の物質を用いることができる。候補物質の種類は特に限定されず、例えば、上述の実施形態１で説明した生体試料等のように未同定の物質を含むような構成であってもよいし、既知の組成物を所定の組成比で含むような構成であってもよい。また、候補物質としては、タンパク質、核酸、脂質、多糖類、有機化合物および無機化合物のいずれでもよい。
【００４５】
本実施形態に係るスクリーニング方法によれば、候補物質を、簡便な操作により、短時間で迅速かつ正確にスクリーニングすることができる。そのため、医薬品開発におけるスクリーニング方法に利用することが可能であり、産業上の有用性および優位性に富むものである。
【００４６】
［実施形態３；生理活性タンパク質の活性を制御する物質を検出するためのキット］
本実施形態に係る生理活性タンパク質の活性を制御する物質を検出するためのキットは、少なくとも、固相担体と、固相担体に担持されてなる生理活性タンパク質または可溶性生理活性タンパク質受容体と、溶液として反応系に添加する可溶性生理活性タンパク質受容体（生理活性タンパク質が固相化されている場合）、または生理活性タンパク質（可溶性生理活性タンパク質受容体が固相化されている場合）を含む、生体試料中の生理活性タンパク質の活性を制御する物質を検出するためのキットである。かかる検出キットは、生きた培養細胞を必要としないので、簡便な操作により、短時間で、生理活性タンパク質競合物質の安定した検出を実現することができる。
【００４７】
本実施形態に係るキットは、少なくとも、固相担体に担持されてなる生理活性タンパク質または可溶性生理活性タンパク質受容体と、反応系に添加する可溶性生理活性タンパク質受容体（生理活性タンパク質が固相化されている場合）、または生理活性タンパク質（可溶性生理活性タンパク質受容体が固相化されている場合）を含む限りにおいて特に限定されない。固相担体、生理活性タンパク質および生理活性タンパク質に特異的に結合する可溶性生理活性タンパク質受容体については、実施形態１で説明したものを用いることができる。さらに、本実施形態にかかるキットには、検量線作成のための標準となる既知濃度の精製抗生理活性タンパク質抗体などの競合物質（例えば、精製抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体など）、標識試薬、あるいは、標識物質の検出試薬等を構成成分として加えることができる。また、これらの構成成分の他に、ブロッキング物質、洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。
【００４８】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に実施形態１に係る測定方法に従って使用することができるキットとして保存しておくことができる。
【００４９】
本実施形態に係る生理活性タンパク質の活性を制御する物質を検出するためのキットによれば、簡便な操作により、短時間で迅速に、生理活性タンパク質競合物質を高感度かつ正確に検出することができ、そして、これにより得られる情報に基づき、生理活性タンパク競合物質のスクリーニング等を有効に行うことが可能になる。
【００５０】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００５１】
例えば、図１に示した上記実施の形態の一例では、無細胞系による中和能測定法について、ｓＧＭＲを固相化したのち、ＧＭ−ＣＳＦを反応させる構成としたが、特にこのような構成に限定する趣旨ではなく、以下のような変形例１〜４に示すような構成を採用してもよい。このようにしても、上記実施の形態と同様に無細胞系による生理活性タンパク質競合物質の測定が可能である。
【００５２】
＜変形例１＞
この変形例では、基本的には上記の実施形態の場合と同様であるが、図７に示すように、ＧＭ−ＣＳＦ固相化したのちｓＧＭＲ、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体の順番で反応させる点で、上記の実施形態の場合とは異なる。具体的には、この変形例では、以下のプロトコルからなる無細胞系による生理活性タンパク質競合物質の測定を行う。
【００５３】
ビオチン化組み替えＧＭ−ＣＳＦを９６穴アビジンコートｐｌａｔｅに固相化
↓Ｏ／Ｎ  ４℃
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ
↓１ｈ  ＲＴ
↓２ｘ  ＷＡＳＨ
可溶化ＧＭ−ＣＳＦ受容体と反応させる。
↓３ｈ
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
可溶化ＧＭ−ＣＳＦのＨｉｓ?ｔａｇに対するアルカリフォスファターゼあるいはペルオキシダーゼラベル抗体を入れ、反応させる。
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
↓２ｘ  ＷＡＳＨ
アルカリフォスファターゼあるいはペルオキシダーゼの発光基質と反応させ、蛍光を測定
【００５４】
＜変形例２＞
この変形例では、基本的には上記の実施形態の場合と同様であるが、図８に示すように、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体を固相化したのちｓＧＭＲ＋ＧＭ−ＣＳＦ  ｃｏｍｐｌｅｘを反応させる点で、上記の実施形態の場合とは異なる。具体的には、この変形例では、以下のプロトコルからなる無細胞系による生理活性タンパク質競合物質の測定を行う。
【００５５】
Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ?ｔａｇ抗体を９６穴  ｐｌａｔｅに固相化
↓Ｏ／Ｎ  ４℃
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  スタビルコート  １００ｕｌ／ｗｅｌｌ
↓１ｈ  ＲＴ
↓２ｘ  ＷＡＳＨ
事前にｓＧＭＲ＋ＧＭ−ＣＳＦ  ｃｏｍｐｌｅｘを作成しておき、５０ｕｌ反応させる。
↓３ｈ
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
ＧＭ−ＣＳＦに標識されているｂｉｏｔｉｎをｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰ（１００００倍希釈）と反応
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
↓２ｘ  ＷＡＳＨ
アルカリフォスファターゼの発光基質と反応させて、６０分後蛍光を測定
【００５６】
＜変形例３＞
この変形例では、基本的には上記の実施形態の場合と同様であるが、図９に示すように、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体を固相化したのちｓＧＭＲ、ＧＭ−ＣＳＦの順番で反応させる点で、上記の実施形態の場合とは異なる。具体的には、この変形例では、以下のプロトコルからなる無細胞系による生理活性タンパク質競合物質の測定を行う。
【００５７】
Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｔａｇ  抗体を９６穴ｐｌａｔｅに固相化
↓Ｏ／Ｎ  ４℃
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  スタビルコート  １００ｕｌ／ｗｅｌｌ
↓１ｈ  ＲＴ
↓２ｘ  ＷＡＳＨ
ｓＧＭＲを加え、ａｎｔｉ−Ｈｉｓ?ｔａｇ抗体と反応させる。
↓３ｈ  ＲＴ
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
Ｂｉｏｔｉｎ／ｕｎｌａｂｅｌｅｄ  ＧＭ−ＣＳＦとｂｉｏｔｉｎ化  ＧＭ−ＣＳＦを反応させる。
↓３ｈ
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
ＧＭ−ＣＳＦに標識されているｂｉｏｔｉｎをｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰ（１００００倍希釈）と反応
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
↓２ｘ  ＷＡＳＨ
アルカリフォスファターゼの発光基質と反応させ、６０分後蛍光を測定
【００５８】
＜変形例４＞
この変形例では、基本的には上記の実施形態の場合と同様であるが、図１０に示すように、直接ｓＧＭＲを９６穴ニッケルプレートに固相化する点で、上記の実施形態の場合とは異なる。具体的には、この変形例では、以下のプロトコルからなる無細胞系による生理活性タンパク質競合物質の測定を行う。
【００５９】
ｓＧＭＲを固相化
↓Ｏ／Ｎ  ４℃
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  スタビルコート  １００ｕｌ／ｗｅｌｌ
↓１ｈ  ＲＴ
↓２ｘ  ＷＡＳＨ
Ｂｉｏｔｉｎ／ｕｎｌａｂｅｌｅｄ  ＧＭ−ＣＳＦ  ５０ｕｌ反応させる。
↓３ｈ
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
ＧＭ−ＣＳＦに標識されているｂｉｏｔｉｎをｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰ（１００００倍希釈）と反応
↓５ｘ  ＷＡＳＨ
↓２ｘ  ＷＡＳＨ
アルカリフォスファターゼの発光基質と反応させ、６０分後蛍光を測定
【００６０】
このような変形例１〜４のいずれの構成を採用した場合にも、ＧＭ−ＣＳＦと可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプターの結合阻害率と前述の検量線に基づいて、未知濃度の血清等の検体中の抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の濃度を定量することが可能となる。そのため、この変形例に係る測定方法においても、上述の実施形態の場合と同様に、生きた培養細胞を用いる従来の方法とは異なり、生理活性タンパク質の活性を制御する物質（生理活性タンパク質競合物質）のアッセイ系において、極めて高い再現性および定量性を実現することができる。そして、簡便な操作により、短時間で迅速に精度の高い測定を行うことが可能となる。また、医薬品として投与される生理活性タンパク質競合物質（中和抗体を含む）の体内濃度等のモニタリング等に有効に利用することが可能となる点においても有意である。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
［実験例１］  トランスジェニックカイコによる可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプター（ｓＧＭＲ）の生産
＜ベクターの構築＞
ヒトｓＧＭＲ  ｃＤＮＡ（塩基番号１−９９９：  ＧｅｎＢａｎｋデータベース登録番号１４３８）を、５’末端にＮｒｕ  ＩサイトおよびＢｍＮＰＶポリへドリンｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ配列を付加したプライマーＦ１（５’−ＣＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡ−３’）、および、プライマーＲ２（５’−ＧＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＣＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＡ  ＡＣＡＧＣＣＧＣＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＴ−３’）を用い、ＰＣＲ法によりヒト胎盤由来ｃＤＮＡから単離した。得られたＰＣＲ産物を鋳型として、プライマーＦ１、および５’末端にＮｒｕ  ＩサイトおよびＨｉｓ−Ｔａｇをコードする配列を付加したプライマーＲ３（５’−ＴＣＧＣＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＡＣＧＧＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＣＴＧＴＧＧＡＡ−３’）を用いて、ヒトｓＧＭＲ  ｃＤＮＡの３’末端側にＨｉｓ−Ｔａｇをコードする配列等を付加した。得られたｃＤＮＡ断片は、５’末端側より、Ｎｒｕ  Ｉサイト、ＢｍＮＰＶポリへドリンｍＲＮＡ５’−ＵＴＲ配列、ｓＧＭＲ  ｃＤＮＡ、Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列、およびＮｒｕ  Ｉサイトより構成される。このｃＤＮＡ断片をｐ−ＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）に挿入した後、制限酵素Ｎｒｕ  Ｉで消化することにより再びｃＤＮＡ断片を切り出し、ｐＭＳＧ１．１−Ｒ（Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０５，  ５９５−６０３  （２００８））に含まれるＤｓＲｅｄ  ｃＤＮＡをＭＧＦＰ  ｃＤＮＡ（プロメガ社製）に置き換えたベクター（ｐＭＳＧ１．１−ＭＧ）のＮｒｕ  Ｉサイトに組み込み、トランスジェニックカイコ作製用ベクター（ｓＧＭＲ／ｐＭＳＧ１．１−ＭＧ）を構築した。
【００６３】
＜トランスジェニックカイコの作出＞
ｓＧＭＲ／ｐＭＳＧ１．１−ＭＧと、ヘルパープラスミドであるｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  ８１−８４  （２０００））をプラスミド量が１：１になるようにそれぞれ混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、それぞれの濃度が２００μｇ／ｍｌなるように、インジェクションバッファー（０．５ｍＭリン酸バッファー  ｐＨ  ７．０，  ５ｍＭ  ＫＣｌ）に溶解した。これらのＤＮＡ溶液を、産卵後２から８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）１，８６６個に、一つの卵あたり１５〜２０ｎｌの液量で微量注入した。ベクターＤＮＡを微量注入した卵を２５℃でインキュベートしたところ３３５個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼育を続け、得られた生殖可能な成虫を交配し６９グループのＦ１卵塊を得た。産卵日から５〜６日目のＦ１卵塊を蛍光実体顕微鏡で観察することにより、眼や神経系から緑色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵をスクリーニングした。その結果、トランスジェニックカイコの卵を含む卵塊を３グループ得ることができた。卵塊に含まれるトランスジェニックカイコ卵から孵化したカイコを飼育し、トランスジェニックカイコｓＧＭＲを作出した。
【００６４】
なお、組換えｓＧＭＲの発現量を増加させるため、トランスジェニックカイコｓＧＭＲを、バキュロウイルス（ＢｍＮＰＶ）由来の転写調節因子であるｉｅ１遺伝子を中部絹糸腺で発現するカイコ（ＩＭ７１）と交配し、次の世代のカイコから、ｓＧＭＲ  ｃＤＮＡおよびｉｅ１遺伝子を有するトランスジェニックカイコを選別した。得られたトランスジェニックカイコを飼育し、組換えｓＧＭＲを含む繭を作らせた。
【００６５】
＜組換えタンパク質の回収＞
回収した繭１ｇをホモジナイザーにより粉砕して１００ｍｌのＰＢＳに浸漬し、４℃で１６時間撹拌することにより組換えｓＧＭＲを抽出した。次に、抽出液からＮｉカラムを用いてｓＧＭＲを精製した。抽出液をＮｉカラム（ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  ５ｍｌ；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした後、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ  ７．８，  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）でカラムをよく洗浄し、バッファーＡとバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ  ６．３，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を用いて、１０〜２５０ｍＭのイミダゾールのグラジエント溶出を行った。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、６０分間で１０ｍＭ〜２５０ｍＭまでイミダゾール濃度を上昇させた。得られたフラクションに含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、ｓＧＭＲはイミダゾール１７５〜１９０ｍＭのフラクションに溶出され、これらのフラクションには夾雑物が含まれていないことが確認された。そこで、ｓＧＭＲを含むフラクションを回収し、ＰＢＳに対して透析した。精製した組換えｓＧＭＲの収量は１．１ｍｇであり、純度は９５％以上であった。
【００６６】
［実験例２］  ＧＭ−ＣＳＦと組換えタンパク質ｓＧＭＲを用いた競合アッセイ系による、特発性肺胞蛋白症患者由来抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体のＧＭ−ＣＳＦ−ＧＭ−ＣＳＦレセプター間の結合阻害活性の測定
トランスジェニックカイコの繭から精製したｓＧＭＲとビオチン化したＧＭ−ＣＳＦ（ｌｅｕｋｉｎｅ  ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｎ；  Ｉｍｍｕｎｅｘ社製）をブロキング試薬のスタビルコート（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社製）で希釈した後、それぞれの濃度が０．５μｇ／ｍｌおよび７．５μｇ／ｍｌになるようにサンプルチューブ内で混合し、氷上で１時間静置した。このサンプルチューブに、特発性肺胞蛋白症患者の血清からＧＭ−ＣＳＦアフィニティーカラムで精製した抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体（精製抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体）を、終濃度が２５ｎｇ／ｍｌ〜２５００ｎｇ／ｍｌになるように添加し（ｓＧＭＲ、ＧＭ−ＣＳＦの終濃度は、それぞれ０．１μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌになる）、さらに氷上で１時間静置した。
【００６７】
なお、抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の精製については、以下の手順で行った。まず、患者血漿６００ｍｌに５０％硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を沈殿させた。次いで、沈殿物をＰＢＳに縣濁し、透析によって脱塩した。続いて、ＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇ  ｃｏｌｕｍｎ  に通すことによって、抗体のみ回収した。そして、ＧＭ−ＣＳＦ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎに通すことによって、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体のみを回収した。最後に、透析することで、ｂｕｆｆｅｒをＰＢＳに置換した。
【００６８】
ストレプトアビジンプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μｌのスタビルコートを加えて１時間以上室温で静置した後、ウェルを０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した。次に、上記の組換えｓＧＭＲ、ビオチン化ＧＭ−ＣＳＦおよび精製ＧＭ−ＣＳＦ抗体の混合液５０μｌをウェルに添加し、室温で３時間静置した。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後に、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０および１％  ＢＳＡを含むＰＢＳで８，０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗Ｈｉｓ抗体５０μｌを加えて、室温で１時間静置した。その後、再び０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）５０μｌを加えて発色させた。最後に、０．５Ｍ硫酸５０μｌを添加して反応を停止し、プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６９】
［実験例３］  ＴＦ−１細胞を用いたアッセイ系で測定した結果との相関性の検証
次に、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の中和活性に関して、本実施形態に係るアッセイ系で測定した結果と、ＴＦ−１細胞を用いたアッセイ系（非特許文献１；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４４２，  ２４６−２５０  （１９９９）参照）で測定した結果との相関について検討した。
【００７０】
ＧＭ−ＣＳＦ依存性の腫瘍細胞株であるＴＦ−１は、ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＣＳ／１０ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養した。使用する前に細胞はＰＢＳで４回洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦを除いた。
【００７１】
ＴＦ−１の増殖測定はＭＴＴアッセイにより行った。ＴＦ−１（２×１０４／ｗｅｌｌ）を９６穴プレートで０．５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと特発性肺胞蛋白症患者の血清由来の精製抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体（９．７７ｎｇ／ｍｌから２５００ｎｇ／ｍｌまでの９点の濃度）の存在下で３日間培養し、位相差顕微鏡下で観察後、ＭＴＴ（３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２−イル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；シグマ社）５μｇ／ｍｌを添加し、２時間培養後、生細胞により形成されたホルマザンを１００μｌのイソプロパノール／ＨＣｌに溶解し、ＯＤ５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７２】
［実験例４］  特発性肺胞蛋白症患者血清自体が結合阻害活性を示すか否かについての検討
本実施形態に係るアッセイ系に、精製抗体ではなく、特発性肺胞蛋白症患者の血清を直接添加し、患者血清中に含まれる抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の中和活性が正確に測定できるか否かについて検討を行った。
【００７３】
健常者（ｎ＝３）および特発性肺胞蛋白症患者（ｎ＝６）の血清を３０００倍に希釈してアッセイ系に添加し、反応後、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７４】
本実験例においては、上述したとおり、精製抗体の代わりに血清を用いたこと以外は、基本的には、実験例２と同様の手順で行った。
【００７５】
［結果と考察］
図２に、本実施形態に係るアッセイ系において、精製抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体を添加しなかった場合の吸光度を１００％とし、これに対する２５ｎｇ／ｍｌから２５００ｎｇ／ｍｌまでの７点（２５，５０，１００，２５０，５００，１０００，２５００ｎｇ／ｍｌ）の濃度の精製抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体を添加した場合の吸光度を相対吸光度（％ｂｉｎｄｉｎｇ）とした結果を示す。
【００７６】
ＧＭ−ＣＳＦ（生理活性タンパク質）の活性を制御する精製抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体（生理活性タンパク質競合物質）の濃度に依存して、ｓＧＭＲ（生理活性タンパク質レセプター）とＧＭ−ＣＳＦの結合が阻害されることが確認でき、本実施形態に係るアッセイ系により、抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体のＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦレセプター間の結合阻害活性（生理活性タンパク質の効果を中和する活性）が定量的に測定できることが示された。
【００７７】
図３に、９．７７ｎｇ／ｍｌから２５００ｎｇ／ｍｌまでの９点の濃度の抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体を添加した場合のＧＭ−ＣＳＦとｓＧＭＲの結合阻害活性について、ＴＦ−１細胞を用いた従来のアッセイ系による結果（％ｇｒｏｗｔｈ）を横軸に、本実施形態に係るアッセイ系で測定した結果（％ｂｉｎｄｉｎｇ）を縦軸にそれぞれプロットして得られた、両アッセイ系間の相関性を示す。
【００７８】
相関係数は０．９４４４となり、これら２つのアッセイ系で測定して得られた結果の間に高い相関性が認められた。
【００７９】
この結果より、本実施形態に係るアッセイ系を用いて、特発性肺胞蛋白症患者由来の抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の中和活性が正確に測定できることが証明された。
【００８０】
また、本実施形態に係るアッセイ系において、精製ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体ではなく、特発性肺胞蛋白症患者の血清を生体試料として直接供試し、患者の血清中に含まれる抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体のＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦレセプター（ｓＧＭＲ）の間の結合を阻害する活性（中和活性）が正確に測定できるか否かについて検討を行った。図４に、血清を添加しなかった場合の吸光度を１００％とし、これに対する血清を添加したときの吸光度の相対値を％ｂｉｎｄｉｎｇとした結果を示す。
【００８１】
特発性肺胞蛋白症患者の血清（Ａ’からＦ’）を添加した場合、健常者血清（ＡからＣ）の場合と比較して、ｓＧＭＲとＧＭ−ＣＳＦの結合が阻害され、吸光度（％ｂｉｎｄｉｎｇ）は減少した（図４参照）。ｔ検定の結果、健常者血清と患者血清の平均値には優位な差が認められた（ｐ＜０．００５％）。
【００８２】
かかる結果より、本実施形態に係るアッセイ系により、特発性肺胞蛋白症患者の血清中の抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の中和活性を、抗体を精製することなく直接的に測定できることが確認できた。そして、既知の濃度の抗生理活性タンパク質自己抗体による結合阻害の結果から検量線を作成し、この検量線と血清を供試した場合の結合阻害の結果に基づいて、血清中の生理活性タンパク質競合物質の測定をすることが可能であることが示唆された。
【００８３】
［実施例５］ＶＥＧＦと可溶性ＶＥＧＦレセプターを用いた競合アッセイ系による血清中の  ＶＥＧＦ阻害物質の検出
イモビライザーアミノプレート（コスモバイオ社製）のウェルに、１μｇ／ｍｌの可溶性ＶＥＧＦレセプター１（ｓＶＥＧＦＲ１；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）または可溶性ＶＥＧＦレセプター１（ｓＶＥＧＦＲ２；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え、４℃で一晩インキュベートしてウェルにレセプターをコートした。
【００８４】
ブロッキングバッファー（０．２％  Ｉ−ＢＬＯＣＫ，０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＰＢＳ）にてビオチン化ＶＥＧＦを１０ｎｇ／ｍｌに希釈した。次に、血清２０μｌと希釈したビオチン化ＶＥＧＦ  ４８０μｌを混合し、４℃にて一晩インキュベートした。血清を加えないビオチン化ＶＥＧＦ溶液をポジコンとして、また、血清とブロッキングバッファーのみを混合した溶液をネガコンとして用意した。
【００８５】
ｓＶＥＧＦＲをコートしたプレートを洗浄した後、ブロッキングバッファーを加えて、室温で１時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除き、血清とビオチン化ＶＥＧＦの混合液、ポジコン溶液、またはネガコン溶液を加えて室温で１時間反応させた。洗浄後、アルカリフォシファターゼ標識したストレプトアビジンを加えて３０分間室温でインキュベートし、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ロシュ社製）を基質として用いて、シグナルを発光強度として検出した。測定結果を以下の式に当てはめ、阻害率（％  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ）を求めた。
【００８６】
阻害率＝（ポジコン値―サンプル値）／（ポジコン値―ネガコン値）×１００（％）
【００８７】
健常者２０人および非小細胞肺癌患者（Ｌｋ）２０人の血清について、ｓＶＥＧＦＲ１およびｓＶＥＧＦＲ２を用いた場合の上記の測定結果を図６に記した。多くの健常者の血清中には、ＶＥＧＦとＶＥＧＦレセプター（ｓＶＥＧＦＲ１およびｓＶＥＧＦＲ２の両方）との結合を阻害する物質が含まれており、比較的高い阻害率を示すことがわかった。一方、非小細胞肺癌患者の血清を用いた場合、ＶＥＧＦとｓＶＥＧＦＲ１との結合阻害率は有意に減少していた（ｐ＜０．０５）。ｓＶＥＧＦＲ２との結合については、健常者と肺癌患者間に有意差は認められなかった。癌細胞はＶＥＧＦを発現し血管新生を促すことが知られているが、健常者血清にＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ１の結合を阻害する物質が存在し、癌患者血清においては、この阻害物質が減少していると考えられ大変興味深い。
【００８８】
以上の結果より、実施の形態の測定方法によれば、生きた培養細胞を用いる従来の方法とは異なり、生理活性タンパク質の活性を制御する物質（生理活性タンパク質競合物質）のアッセイ系において、極めて高い再現性および定量性を実現することができる。そして、簡便な操作により、短時間で迅速に精度の高い測定を行うことが可能となる。また、医薬品として投与される生理活性タンパク質競合物質（中和抗体を含む）の体内濃度等のモニタリング等に有効に利用することが可能となる点においても、産業上の優位性および有用性に富むものである。
【００８９】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることはいわゆる当業者に理解されるところである。
【００９０】
例えば、前述の実施例では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を生理活性タンパク質として用いているが、他のインターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ケモカイン、細胞増殖因子、細胞傷害因子や造血因子等の生理活性タンパク質を用いることもできる。実施例の結果に基づき、血清から直接的に生理活性タンパク質−生理活性タンパク質レセプター結合阻害活性を測定することが可能であることが実証されたことを本発明者らは確認していることから、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦに限らず、他の生理活性タンパク質であっても利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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