(57)【要約】【課題】紫外線障害リスクを評価する方法を提供する。特に、非侵襲的な手段を用いて採取した皮膚角層を用いて、当該被験者の皮膚黒化傾向を知ることができる手法を提供する。  【解決手段】皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量を指標とする皮膚メラニン量を推定する方法、又は、紫外線による皮膚黒化傾向の評価方法。【選択図】図８
2010151481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量を指標とすることを特徴とする紫外線による皮膚黒化傾向の評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて、皮膚黒化に影響を与える成分をスクリーニングする方法。
【請求項３】
請求項２に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて得られた皮膚黒化傾向に応じて化粧料を選択する方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線による皮膚黒化傾向の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線には皮膚に対する発ガン作用、白内障等の眼疾患への影響、免疫機能への影響など多くの健康への影響が懸念されている。皮膚においても紫外線にさらされると、様々な紫外線障害を引き起こす。紫外線は皮膚に炎症を起こしたり、皮膚の不飽和脂質を酸化して脂質ラジカルを発生させ、過酸化脂質を生成する。この様な紫外線による炎症や酸化は組織、細胞、ＤＮＡの障害を引き起こす。皮膚の紫外線曝露による現象としては一般的に、シワ、シミ、皮膚ガン等が挙げられる。
近年、疫学的なデータとして紫外線に対する感受性の違い（肌の色、スキンタイプ等）により皮膚がんのリスクが高まるとの報告もある（非特許文献１，２）。さらに皮膚ガンの一種である悪性黒色腫（メラノーマ）の危険リスク度はｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ１  ｒｅｃｅｐｔｏｅｒの１塩基置換の遺伝子変異によりリスクが数倍高くなることも明らかとなっている（非特許文献３，４）。紫外線に対する感受性はスキンタイプによって大きく異なり、６段階に分類するタイプ別に分けたり、赤み（紅斑）を生じる最小紫外線エネルギー（最小紅斑量：ＭＥＤ)を目安に行われるが、前者は主観的観測、また後者は紫外線を当てなくては測定できないというリスクが伴う。オゾン層破壊などにより以前にも増して紫外線増加が問題になっており、個人に対する紫外線への感受性リスク評価も適切に行われる必要がある。
一方、一般的にシミと言われている色素沈着ができる初期段階においては皮膚表面に顕在化する前に様々な刺激により表皮角化細胞がα−ＭＳＨ、ｂＦＧＦ、ＣＧＲＰ、エンドセリンなどの情報伝達物質を生成し、メラノサイトに伝達する。メラノサイトに伝達された後、細胞内においてメラニン色素が大量に作られる。一方、紫外線によってターンオーバーが異常となり大量に作られたメラニン色素が排出できないため色素性病変へと変化する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系を用いた実験においてもメラノサイトに紫外線を照射した場合、細胞の増殖因子マーカーである、ｐ７３、Ｎｕｐ８８、ｐ２７、Ｉｄ１、ＰＣＮＡが、またアポトーシス関連蛋白質であるｂｃｌ−２の発現が増減するという報告がある（非特許文献５）。これまでに、シミの状況をバイオプシーによる皮膚組織を用いて侵襲的にシミ部と正常部を比較し、シミ部においてＮＴ−３、ＡＤＡＭ９、ＨＢ−ＥＧＦといった蛋白質の発現が顕著に増加しているという報告がある（特許文献１）。さらに、皮膚のシミ形成を予知する検査方法としてバイオプシーによってＭＬＳＴＤ１、ＭＯＧＡＴ１、Ｍｃｐ９、Ｋｒｔ２−６ｂ等のｍＲＮＡ量を測定し、シミ形成のリスクを判断するという報告がある（特許文献２、３、４）。また、非侵襲的な方法としてテープストリッピングもしくは擦過を介して採取した皮膚に由来する角層を試料として、インターロイキン１（ＩＬ−１）とインターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の存在量分析をし、肌質の評価をする方法が特許文献５に開示されている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２０５２４６号公報
【特許文献２】特開２００５−１０６７４５号公報
【特許文献３】特開２００５−１１０５０５号公報
【特許文献４】特開２００７−２８９０６３号公報
【特許文献５】特許第３５９０７０８号公報
【非特許文献１】Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００４；１４０：８１９−８２４
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｃａｕｓｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．１９９７；８    （２）：２４６−２５２
【非特許文献３】Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１７：２９４−３００，２００１
【非特許文献４】Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６６：１７６−１８６，２０００
【非特許文献５】Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２４（１２）：１９２９−１９３４，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、紫外線障害リスクを評価する方法を提供する。特に、非侵襲的な手段を用いて採取した皮膚角層を用いて、当該被験者の皮膚黒化傾向を知るための手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量を指標とすることを特徴とする紫外線による皮膚黒化傾向の評価方法。
（２）（１）に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて、皮膚黒化に影響を与える成分をスクリーニングする方法。
（３）（２）に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて得られた皮膚黒化傾向に応じて化粧料を選択する方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、生体内において発現している蛋白質であるアネキシンII蛋白質量が紫外線被曝によるメラニン量の生成と正の相関関係があることを知見し、皮膚黒化傾向を評価できることを明らかにしたものである。
本発明により、紫外線を実際に照射することなく、紫外線による皮膚黒化傾向を評価することができる。
本発明は、非侵襲的なテープストリッピング手段を用いて採取した皮膚角層を用いて評価することができるので、安全かつ簡便である。
また、本発明の評価法を利用して、紫外線による皮膚黒化傾向の抑制あるいは紫外線被曝後のメラニン生成抑制に有用な成分をスクリーニングすることができる。
本発明により、シミ対策、シミ予防の美容が容易となる。即ち、シミ等色素沈着部位に対する化粧料、医薬部外品、医薬品又は美容用健康食品の選択及びそのために有効な情報を提供することができる。シミ対策等の美容カウンセリングを的確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、皮膚角層中に含まれるアネキシンII蛋白質量を測定することを含む、紫外線障害リスクを評価する方法を提供する。
本願発明は、非侵襲的な手法により採取した皮膚角層中に存在するタンパク質であるアネキシンIIを計測した存在量に基づいて、紫外線曝露によって当該皮膚角層の出所元となった人が黒化するリスクを知ることができるものである。
本発明者は、曝露後のメラニン生成の変化とアネキシンIIの発現量が正の相関があることを知見し、アネキシンIIの発現量を測定することにより、曝露した場合にメラニンが生成するリスク、更に皮膚が黒化する程度を予測できることを明らかにした。
この結果に基づき、皮膚角層中のアネキシンIIの発現量を知ることにより、紫外線曝露の影響を抑制する化粧料の選択などの予防措置を講ずることができる。また、紫外線曝露による影響の予想にあわせて、対策を検討することが可能となる。即ち、本発明により、シミ対策、シミ予防の美容が容易となる。さらには、シミ等色素沈着部位に対する化粧料、医薬部外品、医薬品又は美容用健康食品の選択及びそのために有効な情報を提供することができる。シミ対策等の美容カウンセリングを科学的な根拠をもって的確に行うことができる。
またアネキシンII高発現産生培養皮膚モデルを利用して、このアネキシンIIタンパク質の発現量に影響を与える被検査物質を探索することにより、メラニンの生成を抑制できる薬剤をスクリーニングすることができる。
本願発明は、テープストリッピング等の被侵襲的な方法によって安全に容易に皮膚角層を採取して、その皮膚角層を短時間に、注目するアネキシンIIタンパク質の発現量を特定することができるので、化粧品売り場等で簡単に測定して、その場で化粧料選択資料に利用することができる。このアネキシンIIタンパク質の発現量を測定する機器は、検出した結果と指標とを比較して提示することができる。更に、この結果に基づいて、適した化粧料やメニューを表示することもできる。
【０００８】
アネキシンIIは、分子質量３８，４７３Ｄａの細胞内蛋白質で、カルシウムで制御される膜結合蛋白質であり、この蛋白質に二つのカルシウムイオンが結合する。２組あるアネキシンリピートのうち、一つはカルシウムが結合し、一つはリン脂質が結合する。この蛋白質は細胞膜にあるリン脂質に結合しているアクチンや細胞骨格系の蛋白質と架橋したり、ｔ−ＰＡ (ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ)を介してプラスミノーゲンを活性化したりする。遺伝子塩基配列情報（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ２ ,Ｇｅｎｅ  ９５：２４３−２５１（１９９０）,  ＢＣ０１５８３４）。アミノ酸配列情報（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ２, Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６６：５１６９−５１７６（１９９１），  Ｐ０７３５５)。
【０００９】
皮膚角層から角層蛋白質を採取する方法
（１）テープストリッピング法による角層の採取
テープストリッピング法とは皮膚に粘着テープを貼り付けて、粘着テープを剥がすことにより、粘着面に粘着した角層を採取する方法である。
市販の粘着テープを用いて、例えばヒト頬部に粘着テープを押し付けることにより、角層を粘着テープに粘着させて採取することができる。市販の粘着テープとしてはアサヒバイオメッド社製角質チェッカー、モリテックス社製角層シール、ＰＲＯＭＯＴＯＯＬ社製角質チェッカー（ディスクタイプＷ、ディスクタイプＧ、ＰＲＯタイプ）、Ｉｎｔｅｇｒａｌ社製Ｃｏｒｎｅｏｆｉｘ、３Ｍ社製透明テープ、３Ｍ社製透明両面テープ等が挙げられる。
【００１０】
（２）抽出バッファー
粘着テープに粘着した角層から角層蛋白質を抽出するために抽出バッファーを用いる。抽出バッファーとして例えば以下の組成を挙げることができる。組成：ＰＢＳ（−）、０．１％ＳＤＳ。
粘着テープで採取されてくる皮膚の角質層は角化細胞が分化したもので、細胞骨格系の蛋白質を多く含む。そのため角層蛋白質の抽出効率を上げるには、この抽出バッファーに適当な界面活性剤を含有させることが好ましい。界面活性剤としてはＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム、CH3(CH2)11OSO3Na）を使用することが好ましい。
【００１１】
（３）角層蛋白質の抽出
角層を採取した粘着テープを円筒容器に入れて、高速回転するホモジナイゼーション用のペッスル（以下、「ペッスル」と呼ぶ）を用いて粘着面を擦ることにより迅速に角層蛋白質の抽出が可能である。粘着テープは粘着面を円筒容器内側に向けて、粘着面の反対面を円筒容器の内側に沿わせるようにして、円筒容器に入れる。粘着テープを粘着面の反対面を円筒容器の内側に沿わせて入れることにより、ペッスルにより容易に粘着面を擦ることができる。この他の方法として、角層を採取した粘着テープを抽出バッファーに浸してスクレーパーで擦って角層蛋白質を抽出しても良く、振盪法や超音波法を用いても良い。
【００１２】
（４）角層蛋白質抽出液の回収
角層蛋白質抽出液を約１分間静置し、泡を沈静化し、その後、円筒容器から角層蛋白質抽出液を吸引して回収することが好ましい。
【００１３】
（５）角層蛋白質中のアネキシンII蛋白質量の分析
得られた角層蛋白質抽出液中のアネキシンII蛋白質量は、免疫ブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、抗体チップ法、ＦＲＥＴ法により定量分析することができる。
【００１４】
紫外線による皮膚黒化傾向の評価
本発明により、皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量と、１ＭＥＤ（最小紅斑量）の紫外線照射後の皮膚明度が負の相関関係を有することが明らかとなった。また、皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量と、１ＭＥＤ（最小紅斑量）の紫外線照射後のメラニン量（メグザメーターで測定したＮ値）が正の相関を有することが明らかとなった。
従って、皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量が平均値よりも高い場合には、皮膚の紫外線による皮膚黒化傾向が強いと評価できる。具体的には、皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量が平均値よりも高い人は、紫外線曝露によってメラニン産生が亢進され易く、シミ等の紫外線障害が生じ易いと評価できる。
【００１５】
紫外線による皮膚黒化の抑制剤のスクリーニング
マウス等の皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量を減少させる成分を探索することにより、紫外線による皮膚黒化の抑制剤をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００１６】
１．被験者
２０代と３０代の男性１０名を被験者とした。各被験者の年齢、スキンタイプ、最小紅斑量、紫外線照射前のＬ＊値、Ｎ値を表１に示す。また、スキンタイプのIIは「簡単にサンバーン（Ｓｕｎｂｕｒｎ）を起こし、僅かにサンタン（Ｓｕｎｔａｎ）を起こす」タイプ、IIＩは「普通にサンバーンを起こし、普通にサンタンを起こす（薄茶色の日焼け）」タイプ、ＩＶは「僅かにサンバーンを起こし、常にサンタンを起こす（茶色の日焼け）」タイプである。
なお、Ｌ＊値は分光測色計（ＣＭ−５００、コニカミノルタ社製）で測定したＬ＊ａ＊ｂ＊表色系の明度であり、Ｌ＊値が大きいと明るく（黒化していない）、Ｌ＊値が小さいと暗い（黒化している）と評価できる。また、Ｎ値はメラニン量の指標であり、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ製ｍｅｘａｍｅｔｅｒＭＸ１６を用いて測定した。Ｎ値が大きいほど、黒化しており、Ｎ値が小さいとメラニン量が少なく色白であると評価できる。
【００１７】
【表１】
2010151481.tif 000003
【００１８】
２．皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量の測定
２．１  テープストリッピングによる角層の採取
粘着テープとしてアサヒバイオメッド社製角質チェッカー（２．５ｃｍ×２．５ｃｍ）を用いた。被験者の背部に角質チェッカーを貼り、指先で軽く擦り付けて皮膚角層を角質チェッカーの粘着面に粘着させ、合計５枚のテープストリッピングを背部から採取した。  また、テープストリッピングからの採取箇所は紫外線照射部位から採取した。
【００１９】
２．２  皮膚角層蛋白質の抽出
抽出バッファー：ＰＢＳ（−）、  ０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ。
抽出バッファー量：２００μＬ。
抽出容器：直径１１ｍｍの円筒容器。
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社  ｃｏｄｅ１３７５３Ｅ）にペッスルとしてＨａｎｄｙ  ｐｅｓｔｌｅ (ＴＯＹＯＢＯ社、ｃｏｄｅ  ＨＭＸ−３０１)を接続し、ペッスルを９０００ｒｐｍで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は９０秒とした。
皮膚角層蛋白質抽出液を約１分間静置し、泡を沈静化し、その後、円筒容器から皮膚角層蛋白質抽出液を吸引して回収した。
【００２０】
３．皮膚角層蛋白質量の測定
皮膚角層蛋白質抽出液に含まれる全蛋白質量をＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社)を用いて測定した。
【００２１】
４．皮膚角層蛋白質中のアネキシンII蛋白質量測定
皮膚角層蛋白質量１μg分を用いて免疫ブロッティングによるアネキシンIIの発現量を測定した。各被験者の皮膚角層蛋白質１μg分を用いて５−１５％グラジエントゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写し、５％スキムミルクでブロッキングを行った。１次抗体（アネキシンIIポリクローナル抗体：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１０００倍希釈、２次抗体（ＨＲＰ-ラビットａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ：ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００００倍希釈で反応させた後、ＥＣＬｐｌｕｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製)にて検出を行った。得られたバンドの強度は画像解析ソフトＮＩＨ−Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ製）にて数値化を行った。この数値をアネキシンII蛋白質量とした。
【００２２】
５．紫外線照射
被験者の背部の直径約８ｍｍの円内に１ＭＥＤの紫外線を照射した。紫外線照射装置はｓｏｌａｒ  ｌｉｇｈｔ  ｃｏｍｐａｎｙ製  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｏｌａｒ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ６０１を用いた。紫外線強度はｓｏｌａｒ  ｌｉｇｈｔ  ｃｏｍｐａｎｙ製  Ｅｒｙｔｈｅｍａ  ＵＶ  ＆  ＵＶＡＩｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３Ｄ−６００  ｖ２．０を用いて設定した。
【００２３】
６．皮膚明度の測定
分光側色計（ＣＭ−５００、コニカミノルタ社製）を用いて紫外線照射部位および非照射部位のＬ＊値を測定した。紫外線照射前、照射後２、４、７、１０、１４日目の紫外線照射部位および非照射部位のＬ*値を測定し、同日内で照射部位と非照射部位のL*の差を測定日のＬ*変化量として解析に用いた。
【００２４】
７．皮膚メラニン量の測定
Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ製ｍｅｘａｍｅｔｅｒＭＸ１６を用いて、メラニン量の指標となるＮ値を測定した。Ｎ値は波長５６８〜６６０ｎｍの光の反射率である。
紫外線照射前、照射後２、４、７、１０、１４日目の紫外線照射部位および非照射部位のＮ値を測定し、同日内で照射部位と非照射部位のＮ値の差を測定日のＮ値変化量として解析に用いた。
【００２５】
８．皮膚明度の測定結果
紫外線照射後のＬ＊値の変化量を図１に示す。
Ｌ＊値の変化量（紫外線照射後のＬ＊値−紫外線照射前のＬ＊値）は紫外線照射２日目に負の値が最大になり、その後、１４日目にほぼ回復した。紫外線照射２日目のＬ＊値が最も低く、皮膚が黒化していることを反映している。
０日目のＬ＊値とアネキシンIIの角層中の発現量の相関関係、並びに、２日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目のＬ＊値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を調べた。回帰直線のグラフを図２〜７に、相関係数を表２に示す。
自然対数変換したアネキシンII蛋白質量と２、１０、１４日目のＬ＊値の変化量は「かなりの負の相関」を示し、４、７日目のＬ＊値の変化量は「強い負の相関」を示した。
以上のことから、皮膚角層中のアネキシンＩＩ蛋白質量が多いほど、紫外線曝露によるＬ＊値の低下（皮膚黒化）傾向が強いことが分かる。皮膚角層中のアネキシンＩＩ蛋白質量は紫外線曝露による皮膚黒化傾向の指標となることが判明した。
【００２６】
【表２】
2010151481.tif 000004
【００２７】
一般的に、相関係数は以下のように評価されている。
０〜０．２  ：  ほとんど相関無し、
０．２〜０．４  ：  やや相関あり、
０．４〜０．７  ：  かなりの正の相関あり、
０．７〜１      ：  強い正の相関  
０〜-０．２ ：  ほとんど相関無し、
-０．４〜-０．２ ：  やや相関あり、
-０．７〜−０．４：  かなりの負の相関あり、
−１〜−０．７：  強い負の相関   
【００２８】
９．皮膚メラニン量の測定結果
紫外線照射後のＮ値の変化量を図８に示す。
Ｎ値の変化量（紫外線照射後のＮ値−紫外線照射前のＮ値）は紫外線照射４日目以降１４日目まで、紫外線照射前（０日目）と比べて高い値を示した。紫外線照射４日目以降１４日目まで皮膚メラニン量が多く、皮膚の黒化を反映している。
０日目のＮ値とアネキシンIIの角層中の発現量の相関関係、並びに、０日目のＮ値を基準とした、２日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目のＮ値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を調べた。回帰直線のグラフを図９〜１４に、相関係数を表３に示す。
４日目以降、自然対数変換したアネキシンII蛋白質量とＮ値の変化量は強い正の相関を示した。
従って、アネキシンII蛋白質量の増加は紫外線曝露によるメラニン量の増加を意味する。すなわち、アネキシンIIが増加すると紫外線曝露によるメラニンの増加並びに皮膚の黒化が増大することが判明した。つまり、アネキシンII蛋白質量は紫外線曝露による皮膚の黒化傾向を反映し、さらにはメラニンの増加の指標となりうることが明らかである。
【００２９】
【表３】
2010151481.tif 000005
以上、アネキシンＩＩ蛋白質量とＬ＊値の変化、並びにアネキシンＩＩ蛋白質量とＮ値の変化の関係から、皮膚角層中のアネキシンＩＩ蛋白質量は、紫外線曝露による皮膚の黒化度の指標となることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】紫外線照射後のＬ＊値の変化量示すグラフ。縦軸はＬ＊値の変化量示す。
【図２】紫外線照射直前（０日目）のＬ＊値とアネキシンIIの角層中の発現量の相関関係を示すグラフ
【図３】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後２日目のＬ＊値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図４】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後４日目のＬ＊値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図５】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後７日目のＬ＊値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図６】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後１０日目のＬ＊値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図７】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後１４日目のＬ＊値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図８】紫外線照射後のＮ値の経時変化量を示すグラフ。縦軸はＮ値の変化量を示す。
【図９】紫外線照射直前（０日目）のＮ値とアネキシンIIの角層中の発現量の相関関係を示すグラフ
【図１０】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後２日目のＮ値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図１１】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後４日目のＮ値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図１２】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後７日目のＮ値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図１３】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後１０日目のＮ値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図１４】０日目のＮ値を基準とした紫外線照射後１４日目のＮ値の変化量と自然対数変換したアネキシンII蛋白質量の相関関係を示すグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月5日(2009.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量に応じて皮膚の紫外線による皮膚黒化傾向が強いと評価することを特徴とする紫外線による皮膚黒化傾向の評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて、皮膚黒化に影響を与える成分をスクリーニングする方法。
【請求項３】
請求項２に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて得られた皮膚黒化傾向に応じて化粧料を選択する方法。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量に応じて皮膚の紫外線による皮膚黒化傾向が強いと評価することを特徴とする紫外線による皮膚黒化傾向の評価方法。
（２）（１）に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて、皮膚黒化に影響を与える成分をスクリーニングする方法。
（３）（２）に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて得られた皮膚黒化傾向に応じて化粧料を選択する方法。
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月5日(2010.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量と、紫外線照射後、日数が経過したときのメラニン量とが正の相関を示すことを利用し、皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量を測定して皮膚の紫外線による皮膚黒化傾向を評価することを特徴とする紫外線による皮膚黒化傾向の評価方法。
【請求項２】
皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量と、紫外線照射後、日数が経過したときのメラニン量とが正の相関を示すことを利用し、皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量に影響を与える成分を判別して皮膚黒化を抑制する成分をスクリーニングする方法。
【請求項３】
請求項１に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて得られた皮膚黒化傾向に応じて化粧料を選択する方法。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量と、紫外線照射後、日数が経過したときのメラニン量とが正の相関を示すことを利用し、皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量を測定して皮膚の紫外線による皮膚黒化傾向を評価することを特徴とする紫外線による皮膚黒化傾向の評価方法。
（２）皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量と、紫外線照射後、日数が経過したときのメラニン量とが正の相関を示すことを利用し、皮膚角層中のアネキシンII蛋白質量に影響を与える成分を判別して皮膚黒化を抑制する成分をスクリーニングする方法。
（３）（１）に記載された皮膚黒化傾向の評価方法を用いて得られた皮膚黒化傾向に応じて化粧料を選択する方法。