(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質生産における、特に多量体タンパク質生産における、慣用的な導入遺伝子発現に関連する問題を克服するためのシステムの提供。【解決手段】生化学、分子生物学、薬学及び診断の分野で用いられる、（宿主）細胞内での２又はそれ以上のタンパク質の生産法に関し、（宿主）細胞内で２又はそれ以上のタンパク質の発現を改善するための方法を開発した。該方法は例えば、医薬品調製において又は診断的ツールとして使用されうる組み換え抗体の生産に適している。１つの実施態様は、２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法であって、前記２又はそれ以上のタンパク質をコードするタンパク質発現ユニットを前記細胞に与えることを含む方法において、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つが、少なくとも１つのSTAR配列を含むことを特徴とする。【選択図】図１
2010011859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法であって、前記２又はそれ以上のタンパク質をコードする２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットを前記細胞に与えることを含む方法において、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つが、少なくとも１つの安定化抗リプレッサー（STabilizing Anti-Repressor:STAR）配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
２又はそれ以上のタンパク質の発現が所定の割合であるところの細胞を識別する方法であって、
−前記２又はそれ以上のタンパク質をコードする２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットを有する細胞のコレクションを用意すること、
−前記２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を選択すること、
−前記所定の割合で前記２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を、得られた前記選択物から識別すること
を含む方法において、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つが、少なくとも１つのSTAR配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
２つのタンパク質が発現される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の割合が、１：１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットが、少なくとも２つの異なる選択マーカーをさらにコードし、及び前記方法が、前記細胞での２段階選択マーカースクリーニングをさらに含み、前記細胞が第１の選択マーカーの存在下で第１段階において選択され、そして第２の選択マーカーの存在下で第２段階において選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質発現ユニットの少なくとも１つが、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子を含み、及び前記モノシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質発現ユニットの少なくとも１つが、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位と、選択マーカーとを含むビシストロニックな遺伝子を含み、及び前記ビシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質発現ユニットが、第２の選択マーカーをコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子をさらに含み、及び前記モノシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質発現ユニットの少なくとも１つが、少なくとも２つのSTAR配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも２つのSTAR配列を含む前記タンパク質発現ユニットは、前記タンパク質発現ユニットが少なくとも１つのSTAR配列によっていずれかの側で隣接されるように配置される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのSTAR配列が本質的に同一である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記STAR配列が、表３及び／又は図６に表現され、及び／又はそれらの機能的等価体及び／又は機能的フラグメントである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記STAR配列がSTAR18である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
減少された翻訳効率を有する前記タンパク質翻訳開始部位が、内部リボソーム侵入部位（IRES：Internal Ribosome Entry Site）を含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質発現ユニットの夫々が、別々のDNAキャリアー上に存在する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記DNAキャリアーがベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウィルスベクターが、アデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
目的の前記タンパク質のための前記タンパク質発現ユニットの１つが、イムノグロブリン重鎖をコードする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
目的の前記タンパク質のための前記タンパク質発現ユニットのもう１つが、イムノグロブリン軽鎖をコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数のタンパク質発現ユニットが、前記細胞内に同時に導入される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記機能プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（SV40）プロモーター、ヒトユビキチンCプロモーター又はヒト伸長因子１−アルファ（EF1-α）プロモーターである、請求項６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
−目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位と、選択マーカーとを含むビシストロニックな遺伝子と、ここで前記ビシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、
−少なくとも１つのSTAR配列と
を含むタンパク質発現ユニット。
【請求項２４】
第２の選択マーカーをコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子をさらに含み、前記モノシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、請求項２３に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２５】
少なくとも２つのSTAR配列を含む、請求項２３又は請求項２４に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２６】
少なくとも２つのSTAR配列を含む前記タンパク質発現ユニットは、前記タンパク質発現ユニットが少なくとも１つのSTAR配列によっていずれかの側で隣接されているように配置されている、請求項２５に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２７】
前記STAR配列が本質的に同一である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２８】
前記STAR配列が、表３及び／又は図６に表現され、及び／又はそれらの機能的等価体及び／又は機能的フラグメントである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２９】
前記STAR配列がSTAR18である、請求項２８に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３０】
減少された翻訳効率を有する前記タンパク質翻訳開始部位が、内部リボソーム侵入部位（IRES：Internal Ribosome Entry Site）を含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３１】
前記タンパク質発現ユニットがベクターである、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３２】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項３１に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３３】
前記ウィルスベクターが、アデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターである、請求項３２に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３４】
目的の前記タンパク質が、イムノグロブリン重鎖である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３５】
目的の前記タンパク質が、イムノグロブリン軽鎖である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３６】
STARを含むタンパク質発現ユニットを備えられた細胞。
【請求項３７】
請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのタンパク質発現ユニットを含む細胞。
【請求項３８】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法に従い得られうる細胞。
【請求項３９】
請求項３８に記載の細胞から得られうるタンパク質。
【請求項４０】
多量体タンパク質である請求項３９に記載のタンパク質。
【請求項４１】
抗体である請求項４０に記載の多量体タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、分子生物学、薬学及び診断の分野に関する。より特には、本発明は、宿主細胞内でのタンパク質の生産に関する。そしてさらにより特には、本発明は、（宿主）細胞内での２又はそれ以上のタンパク質の発現を改善するための方法に関する。該方法は例えば、医薬品調製において又は診断的ツールとして使用されうる組み換え抗体の生産に適している。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、生物学及びバイオテクノロジーの広範囲の適用のためのシステムで生産される。これらは、細胞性及び分子性機能、生物薬剤又は診断試薬としてのタンパク質の生産、並びに家畜及び作物の形質又は表現型の修飾の研究を含む。生物薬剤は通常、細胞外の機能を有するタンパク質、例えば免疫療法のための抗体、又は細胞性応答を導き出すためのホルモン若しくはサイトカイニンである。細胞外の機能を有するタンパク質は、分泌経路を介して細胞を出て、そして分泌の間に翻訳後の修飾を受ける。該修正(主にグリコシル化及びジスルフィド結合形成)は、細菌中で生じない。その上、グリコシル化する酵素によってタンパク質に付けられた特定のオリゴ糖は、種(species)及び細胞型特異的である。これらの考察はしばしば、異種のタンパク質生産のための宿主細胞の選択を真核細胞に制限する（カウフマン、2000年）。ヒト治療のタンパク質の発現のために、宿主細胞、例えば細菌、酵母又は植物は不適切かもしれない。例えば、げっ歯動物とヒトとの間のタンパク質グリコシル化での微妙な差でさえ、げっ歯動物細胞で生産されるタンパク質を治療的使用のために許容できなくするのに十分でありうる（シェーリーら、1997年）。不適切な(すなわち、非ヒト）グリコシル化の結果は、免疫原性、減少された機能半減期及び活性の損失を含む。これは、宿主細胞の選択を、ヒト細胞株、又は細胞株、例えばヒト様炭水化物構造を有する糖タンパク質を生成することができるチャイニーズハムスター卵巣(CHO：Chinese Hamster Ovary)細胞にさらに制限する（リュー、1992年）。
【０００３】
バイオテクノロジー的関心の幾つかのタンパク質は、多量体（すなわちそれらは、それらの生物学的に及び／又はバイオテクノロジー的に活性型で、２又はそれ以上の（おそらく異なる）ポリペプチド鎖から成る）として機能的である。例は、抗体（ライト及びモリソンら、1997年）、骨形態形成タンパク質（フルーネフェルト及びブルガーら、2000年）、核ホルモン受容体（アランダ及びパスキュアル、2001年）、ヘテロ二量体の表面受容体（例えば、T細胞受容体（チャン及びマクら、1989年）、インテグリン（ハインズ、1999年）、及び糖タンパク質ホルモンファミリー(絨毛性ゴナドトロピン、絨毛膜の性腺刺激ホルモン、下垂体黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン及び甲状腺刺激ホルモン（トータクラ及びブリゼら、1995年）)を含む。異種のシステムでのそのような多量体タンパク質の生産は、現在の発現システムの多くの制限により技術的に困難である。これらの制限は、(1)高いレベルでモノマーポリペプチドを生産する組み換え細胞/細胞株を単離することの困難性(予測可能性及び収率)と、(2)化学量論的にバランスの取れた比率でのモノマー状ポリペプチドの生産を達成することの困難性（カウフマン、2000年）と、(3)タンパク質の工業的生産サイクルの間の発現のレベルでの減退（安定性）とを含む。これらの問題は、以下により詳細に記載される。
【０００４】
(1)組み換えタンパク質、例えば治療用の化合物として使用される抗体は、大量に生産される必要がある。組み換えタンパク質生産のために使用される宿主細胞は、使用される工業的工程の規模に適合されなければならない。特に、異種のタンパク質のために使用される導入遺伝子（又は目的のタンパク質をコードする遺伝子、該２つの用語は本明細書で交換的に使用される）発現システムは、スケールアップの成長段階及び生産の間に、安定且つ活性な形で宿主細胞によって保持される必要がある。これは、宿主細胞のゲノム内に導入遺伝子を組み込むことによって達成される。しかしながら、慣用的な手段による組み換え細胞株の生成は、組み換え宿主細胞間の導入遺伝子発現の非予測可能性により高価で且つ非効率的な工程である。非予測可能性は、導入遺伝子が遺伝子サイレンシングにより非活性になるであろう高い可能性から生じる(マクバーニら、2002年)。慣用的な技術を使用して、高いレベルで1つのポリペプチドを生産する組み換え宿主細胞の割合は、1〜2%の範囲に及ぶ。高いレベルで2つのポリペプチドを生産する細胞株を構築するために、2つの導入遺伝子が一般に独立して組み入れられる。2つの導入遺伝子が2つの別々のプラスミド上に同時にトランスフェクションされる場合、高いレベルで両方のポリペプチドを生産するであろう細胞の割合は、単一の導入遺伝子のための割合の算術積であろう。それ故に、そのような組み換え細胞株の割合は、2,500個のうち1個〜10,000個のうち1個の範囲に及ぶ。3又はそれ以上のサブユニットを有する多量体タンパク質については、該割合がさらに減少する。これらの高く生産する細胞株は、次に識別され、そして集団の残りから単離されなければならない。これらのまれな、高く発現する細胞株についてスクリーンするために要求される方法は、時間を消費し且つ高価である。
【０００５】
導入遺伝子を有する２つのプラスミドの同時トランスフェクションへの代替は、逐次トランスフェクションである。この場合、高く生産するクローンの割合は、単一の導入遺伝子の割合の合計すなわち2〜4%であろう。しかしながら、逐次トランスフェクションは、高い費用及び貧弱な安定を含む（重大な）欠点を有する。該高い費用は、様々な要因から生じる:特に、各サブユニットの高発現は別々にスクリーニングされなければならない故に、高く発現する細胞株のためのスクリーニングに要求される時間及び資源は2倍になる。2つのポリペプチドを発現する宿主細胞の貧弱な全体的な安定性は、2つの導入遺伝子の各々の固有の不安定性の結果である。
【０００６】
(2)多量体タンパク質の生産は、ポリペプチドモノマーの各々の転写的及び翻訳的発現のバランスの取れたレベルを要求する。該モノマーのバランスの取れていない発現は、細胞培養で使用される高価な資源を浪費する。その上、1つのモノマーのバランスの取れていない発現は、細胞に有害な影響を有することができる。これらの影響は、(a)組み換えタンパク質分泌に要求される細胞性因子(例えば小胞体中のシャペロン、（チェベットら、2001年）)の抑制、及び(b)成長及びタンパク質翻訳の減少された割合をあるいはアポトーシス(プログラムされた細胞死)さえを生じるストレス応答の誘発(パール及びビュールレら、1997年,パティル及びウォルター、2001年)。これらの有害な影響は、生産性及び収率の損失並びにより高い間接費を生じる。
【０００７】
(3)長期の宿主細胞培養の間の導入遺伝子発現のサイレンシングは、普通に観察される現象である。脊椎動物細胞では、それは、導入遺伝子の転写を防ぐ、導入遺伝子座でのヘテロクロマチンの形成によって生じうる。導入遺伝子サイレンシングは確率的である；それは、ゲノム内への導入遺伝子の組み込みの少し後に、又は多くの細胞分割の後にのみ生じることができる。これは、長期の培養後に異種細胞集団を生じ、その中では幾つかの細胞は組み換えタンパク質の高いレベルを発現し続け、一方、他のものがタンパク質の低い或いは検出できないレベルを発現する(マーチン及びホワイトローら、1996年,マクバーニら、2002年)。異種のタンパク質生産のために使用される細胞株は、単一の細胞から得られ、1,000リットル又はそれ以上の培養器中で１ミリリットル当たり1000万個の細胞を超える細胞密度までしばしばスケールアップされ、且つ長期間の間この密度に維持される。これらの大きな細胞集団(1014〜1016個の細胞)は、導入遺伝子サイレンシングによる生産性の重大な減少を傾向しがちである(ミグリアッチオら、2000年,ストラッチェンバーガーら、1999年)。
【０００８】
収率を増加させようとして導入遺伝子コピー数が増幅される場合、組み換え宿主細胞の発現の不安定性が特に厳しい。導入遺伝子増幅は、組み込みの間、選択可能なマーカー遺伝子、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)を導入遺伝子に含めることによって達成される。選択剤(DHFRの場合、薬物  メトトレキサート)の増加された濃度は、染色体中のDHFR遺伝子の数を増幅した細胞を選択する。導入遺伝子及びDHFRは染色体中で共にローカライズされる故に、導入遺伝子コピー数がまた増加する。これは、異種のタンパク質の収率の増加と関連付けられる(カウフマン、1990年)。しかしながら、増幅で生じる導入遺伝子のタンデムリピートは、サイレンシングに非常に感受性である(ガーリックら、1998年,カウフマン、1990年,マクバーニら、2002年)。選択剤が除去される後に、サイレンシングはしばしば導入遺伝子コピー数の減少による(カウフマン、1990年)。しかしながら、選択剤の除去は2つの理由のために、生物薬剤の工業的生産の間でルーチンである。第１に、選択剤の存在下での工業的規模での細胞の培養は、該剤が高価な化合物である故に経済的に実現可能でない。第２に、そしてより重要なことには、製品純度及び安全性についての懸念は、生産サイクルの間に選択を維持することを排除する。タンパク質が医薬での使用を目的とされている場合、組み換えタンパク質を精製すること及び選択剤の全ての痕跡を除去することが必要である。しかしながら、そのようにすることは技術的に困難であり、且つ法外に高価であり、さらにこれが達成されたことを実証することはまた困難で且つ高価である。それ故に、選択剤の連続的な存在を要求する、増幅に基づく形質転換のシステムは、不利である。
【０００９】
代替的に、サイレンシングは、導入遺伝子タンデムリピートの後成的な影響によることがありえ、反復誘導された遺伝子サイレンシング（Repeat Induced Gene Silencing(RIGS)）として知られている現象である(ホワイトローら、2001年)。これらの場合では、導入遺伝子のコピー数が安定であり、及びサイレンシングは、導入遺伝子のクロマチン構造の変化により生じる（マクバーニら、2002年）。細胞培養の間の選択剤の存在は、導入遺伝子転写ユニットのサイレンシングを防ぐことができないかもしれない。なぜならば、導入遺伝子発現が選択可能なマーカーの発現に依存しないからである。従って、慣用の形質転換のシステムでのRIGSを防ぐための手段の欠如は、生産性において高価な損失を生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
タンパク質生産のための及びより特には多量体タンパク質生産のための、慣用的な導入遺伝子発現に関連づけられた問題は、これらの問題を克服するシステムのために従来技術における必要性を明らかに示す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、2又はそれ以上のタンパク質、例えば2又はそれ以上のポリペプチドモノマーを効率的に発現する(宿主)細胞／細胞株を生産し、及び任意的にそれらから機能的多量体タンパク質を生産するための新規な方法に関する。異種の多量体タンパク質の重要な例は、組み換え抗体である。１つの実施態様では、本発明は、2又はそれ以上のタンパク質を生産するために、サイレンシングから導入遺伝子を保護する財産的DNAエレメント（安定化抗リプレッサー(STAR又はSTAR(商標);該用語は、本明細書中で互換的に使用されるだろう)と名付けられた）を利用する。
【００１２】
本発明はまた、転写エレメント及び翻訳エレメント及び選択可能なマーカー遺伝子の新規な配置を開示する。1つの実施態様では、本発明は、異種のタンパク質発現を改善する新規な方法において、抗生物質耐性遺伝子及び減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位(例えば、内部のリボソーム結合性部位、Internal Ribosome Binding Site(IRES))を使用する。STARエレメント及びこれらの他のエレメントの組み合わせは、(1)異種のタンパク質の高い収率を有する組み換え細胞株の高い割合を予測可能に生産し、(2)多量体タンパク質の構成成分である2又はそれ以上のポリペプチドモノマーのバランスの取れた且つ比例した発現を示し、及び(3)安定な生産性特性を有する組み換え細胞株を生成する、2又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るためのシステムを生じる。
【００１３】
それ故に、本発明は１つの実施態様において、２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法であって、前記２又はそれ以上のタンパク質をコードする２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットを前記細胞に与えることを含む方法において、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つが、少なくとも１つのSTAR配列を含むことを特徴とする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の説明図。  図１Ａは、第1の発現ユニットを示す。それは、STARエレメントによって隣接され、そして（例えば、レポーター遺伝子又は多量体タンパク質の一つのサブユニット（TGS1、「導入遺伝子サブユニット1」）をコードする）導入遺伝子、IRES及び、CMVプロモーターの制御下の選択可能なマーカー（zeo、ゼオシン耐性を与える）を(5'から3'に)含むビシストロニックな遺伝子を含む。SV40プロモーターの制御下のモノシストロニックな選択可能なマーカー(neo、G418耐性を与える)が含まれる。両方の遺伝子は、それらの3'末端(t)でSV40転写ターミネーターを有する。  図１Ｂは、第2の発現ユニットを示す。それは、STARエレメントによって隣接され、そして（例えば、異なるレポーター遺伝子又は多量体タンパク質の他のサブユニット（TGS2）をコードする）導入遺伝子、IRES及び、CMVプロモーターの制御下の選択可能なマーカー（bsd、ブラスチシジン耐性を与える）を(5'から3'に)含むビシストロニックな遺伝子を含む。SV40プロモーターの制御下のモノシストロニックな選択可能なマーカー(neo、G418耐性を与える)が含まれる。両方の遺伝子は、それらの3'末端(t)でSV40転写ターミネーターを有する。
【図２】pSDH-CSPプラスミド。  SEAP（Secreted Alkaline Phosphatase）レポーター遺伝子は、CMVプロモーターの制御下にあり、及びピューロマイシン耐性の選択可能なマーカー(puro)は、SV40プロモーターの制御下である。STARエレメントがその中でクローニングされうるマルチクローニング部位が、これら2つの遺伝子に隣接している。該プラスミドはまた、大腸菌内での増殖のために複製のオリジン(ori)及びアンピシリン耐性遺伝子(ampR)をまた有する。
【図３−Ａ】プラスミドのpSDH-SIB/Z及びpSDH-GIB/Zファミリー。  これらプラスミドは、モノシストロニックなSEAP及びpuro遺伝子を、CMVプロモーターの制御下のビシストロニックな遺伝子及びSV40の制御下のモノシストロニックのネオマイシン耐性の選択可能なマーカー遺伝子（neo）で置換することによって、pSDH-CSPプラスミド(図２)から得られる。  パネルA。内部リボソーム結合部位(IRES)に相対的に、ビストロニックな遺伝子が5'位置でSEAP（Secreted Alkaline Phosphatase）をコードし、及び3'位置でブラスチシジン(bsd)又はゼオシン(zeo)耐性選択可能なマーカーをコードしているpSDH-SIB/Z。
【図３−Ｂ】プラスミドのpSDH-SIB/Z及びpSDH-GIB/Zファミリー。  これらプラスミドは、モノシストロニックなSEAP及びpuro遺伝子を、CMVプロモーターの制御下のビシストロニックな遺伝子及びSV40の制御下のモノシストロニックのネオマイシン耐性の選択可能なマーカー遺伝子（neo）で置換することによって、pSDH-CSPプラスミド(図２)から得られる。  パネルB。内部リボソーム結合部位(IRES) に相対的に、ビストロニックな遺伝子が5'位置で緑色蛍光タンパク質を及び3'位置でブラスチシジン(bsd)又はゼオシン(zeo)耐性選択可能なマーカーをコードしているpSDH-GIB/Z。
【図４】導入遺伝子発現の予測可能性について１段階及び２段階抗生物質選択の結果の比較。  プラスミドpSDH-SIZ又はプラスミドpSDH-SIZ-STAR18を含む組み換えCHO細胞単離体は、G418(パネルA)上で、又は逐次的にG418及びゼオシン(パネルB)上で選択され、そしてSEAP活性について分析された。
【図５】プラスミドのPP(プラグ・アンド・プレイ)ファミリー。  これらプラスミドは、STARエレメントの挿入のためのマルチクローニング部位(multiple cloning sites：MCS)間に(内部リボソーム結合部位(IRES)を含む)ビシストロニックな発現ユニットを含む。MCSI，Sbfl-SalI-XbaI-AscI-SwaI；MCSII，BsiWI- EcoRV-BglII-PacI。  パネルA。ビシストリニックな遺伝子は、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びピューロマイシン耐性マーカー(puro)をコードする。  パネルB。ビシストリニックな遺伝子は、SEAP（Secreted Alkaline Phosphatase）及びゼオシン耐性マーカー(zeo)をコードする。  パネルC。ビシストリニックな遺伝子は、SEAP及びネオシン耐性マーカー(neo)をコードする。  パネルD。ビシストリニックな遺伝子はGFP及びpuroをコードし、近傍のモノシストロニックな遺伝子はneoをコードする。  パネルE。ビシストリニックな遺伝子はSEAP及びzeoをコードし、近傍のモノシストロニックな遺伝子はneoをコードする。  ビシストリニックな遺伝子は、CMVプロモーター(pCMV)の制御下にあり、及びモノシストロニックな遺伝子は、SV40プロモーター(pSV40)の制御下にある。0.37kbのスタッファー(stuffer)フラグメント(St)は、pCMVからMCSIを分離する。ビシストロニックな及びモノシストロニックな遺伝子の両方は、それらの3'末端でSV40ポリアデニレーション部位を有する。
【図６】STAR配列。  STAR1-STAR65を含む配列(配列ID: 1-65)。  STAR66及び試験セットを含む配列(配列ID: 66-84)。  シロイヌナズナSTARA1-A35を含む配列(配列ID: 85-119)。
【図７】STAR活性を試験するために使用されるpSDH-CSPプラスミド。  SEAP（Secreted Alkaline Phosphatase）レポーター遺伝子は、CMVプロモーターの制御下にあり、及びピューロマイシン耐性選択可能なマーカー(puro)は、SV40プロモーターの制御下にある。STARエレメントがその中でクローニングされうるマルチクローニング部位が、これら２つの遺伝子に隣接している。該プラスミドは、大腸菌内の増殖のために複製のオリジン（ori）及びアンピシリン耐性遺伝子（ampR）をまた有する。
【図８】STAR6及びSTAR49は、予測可能性及び導入遺伝子発現の収率を改善する。  pSDH-CSP、pSDH-CSP-STAR6、又はpSDH-CSP-STAR49でトランスフェクションされたCHO細胞によるCMVプロモーターからのSEAPの発現が決定された。STAR含有構築物は、pSDH-CSP構築物のみと比較してより大きい予測可能性及び高い収率を与える。
【図９】STAR6及びSTAR8は、予測可能性及び導入遺伝子発現の収率を改善する。  pSDH-CMV、pSDH-CMV-STAR6、又はpSDH-CMV-STAR8でトランスフェクションされたU-2 OS細胞によるCMVプロモーターからのルシフェラーゼの発現が決定された。STAR含有構築物は、pSDH-CMV構築物のみと比較してより大きい予測可能性及び高い収率を与える。
【図１０】STAR10及びSTAR27の最小必須配列。  STARエレメントの部分は、PCRによって増幅された：STAR10は、フラグメント10Aを与えるためにプライマーE23及びE12で、フラグメント10Bを与えるためにプライマーE13及びE14で、及びフラグメント10Cを与えるためにプライマーE15及びE16で増殖された。STAR27は、フラグメント27Aを与えるためにプライマーE17及びE18で、フラグメント27Bを与えるためにプライマーE19及びE20で、及びフラグメント27Cを与えるためにプライマーE21及びE22で増殖された。これらサブフラグメントは、pSelectベクター内にクローニングされた。U-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1 細胞内にトランスフェクションした後、ゼオシン存在下における培養の成長が観察された。成長速度は、活発な（+++）から悪い（+/-に）と様々であり、一方ある培養は、試験されたDNAフラグメントにおけるSTAR活性の不存在によりゼオシン処理で生存することに失敗した（-）。
【図１１】SV40プロモーターとの関連におけるSTARエレメント機能。  pSDH-SV40及びpSDH-SV40-STAR6は、ヒト骨肉腫内U-2 OS細胞株にトランスフェクションされ、且つルシフェラーゼの発現はピューロマイシン耐性クローンにおいてSTAR6による遺伝子サイレンシングからの保護あり又はなしでアッセイされた。
【図１２】Tet-Offプロモーターとの関連におけるSTARエレメント機能。  pSDH-Tet及びpSDH-Tet-STAR6は、ヒト骨肉腫内U-2 OS細胞株にトランスフェクションされ、且つルシフェラーゼの発現はピューロマイシン耐性クローンにおいてSTAR６による遺伝子サイレンシングからの保護あり又はなしでアッセイされた。
【図１３】STARエレメント配向。  STARエレメントの配向の説明図であって、それらがpSelectベクター内にクローニングされる場合（パネルA）、それらがそれらの自然の配向を保存するためにpSDHベクター内にクローニングされる場合（パネルB）及び、それらが逆の配向においてpSDHベクター内にクローニングされる場合（パネルC）。
【図１４】STAR66機能の方向性。  STAR66エレメントは、自然（STAR66 native）又は反対の配向（STAR66 opposite）のいずれかでpSDH-Tet内にクローニングされ、且つU-2 OS細胞内にトランスフェクションされた。ルシフェラーゼ活性は、ピューロマイシン耐性クローンでアッセイされた。
【図１５】STAR機能のコピー数依存性。  U-2 OSゲノムDNA内に組み込まれた、pSDH-Tet-STAR10内にルシフェラーゼ発現ユニットのサザンブロット法。放射活性ルシフェラーゼDNAプローブは、各クローンのゲノムにおける導入遺伝子DNAの量を検出するために使用され、その後それはフォスファーイメージャー（phosphorimager）で数値化された。
【図１６】STAR機能のコピー数依存性。  各クローンにおけるpSDH-Tet-STAR10発現ユニットのコピー数は、フォスファーイメージャーによって決定され、且つ各クローンによって発現されたルシフェラーゼレポーター酵素の活性と比較される。
【図１７】エンハンサーブロッキング及びエンハンサーアッセイ。  エンハンサーブロッキング及びエンハンサー活性のためのSTARをテストするために使用されるルシフェラーゼ発現ベクターが、概略的に示される。E47エンハンサータンパク質のためのE-Box結合部位は、STARエレメントのためのクローニング部位の上流にある。STARクローニング部位の下流に、ヒトアルカリフォスファターゼ最小プロモーター（mp）の制御下のルシフェラーゼ遺伝子がある。ヒストグラムは、3つの可能性のある実験状況（本文参照）のための予想された結果を示している。パネル  A:  エンハンサー−ブロッキングアッセイ。パネル  B:エンハンサーアッセイ。
【図１８】エンハンサー−ブロッキングアッセイ。  最小プロモーターからのルシフェラーゼ発現は、エンプティベクター（ベクター）におけるE47/E-boxエンハンサーによって活性化される。エンハンサー−ブロッカー（scs,HS4）又はSTARエレメント（STARエレメント1,2,3,6,10,11,18及び27）の挿入は、E47/E-boxエンハンサーによるルシフェラーゼ活性をブロックする。
【図１９】エンハンサーアッセイ。  最小プロモーターからのルシフェラーゼ発現は、エンプティベクター（E47）におけるE47/E-boxエンハンサーによって活性化される。Scs及びHS4エレメント又は種々のSTARエレメント（STARエレメント1,2,3,6,10,11,18及び27）の挿入は、レポーター遺伝子の転写を活性化しない。
【図２０】マウスとヒトとの間のSTAR18配列保存。  497個の塩基対STAR18を含むヒトゲノムの領域が示される（黒いボックス）；該エレメントは、ヒト2番染色体上のHOXD8及びHOXD4ホメオボックス遺伝子の間に生じる。それは、72％配列同一性を共有するマウス2番染色体における領域と並べられる。STAR18のすぐ左のヒト2番染色体の領域は、マウス2番染色体でまた高く保存されている（73％同一性；グレーボックス）；これらの領域を超えると、該同一性は60%以下に落ちる。別々に又は組み合わせてのいずれかでゼオシンでの成長を与えるヒト及びマウス由来のこれらの領域の能力が示される；-  成長しない；+  普通の成長；++  活発な成長、+++  迅速な成長。
【図２１】バイオインフォマティックス分析ワークフローの説明図。詳細には、本文を参照。
【図２２】65個のSTARエレメントのトレーニングセットの分類に対する判別式分析の結果。  ステップワイズ線形判別式分析（Linear Discriminant Analysis；LDA）によってSTARとして正確に分類されるSTARエレメントは、ベン（Venn）ダイアグラム内に示される。LDAの変異体は、6量体のオリゴヌクレオチド（「オリゴ；oligos」）のための及び二分染色体のための頻度分析結果から選択された。該ダイアグラムは、STARを正確に分類する２つのセットの変異体の一致を示す。
【図２３】シロイヌナズナSTAR強度のRT-PCRアッセイ  U-2 OS/Tet-Off/lexA-HP1細胞が、候補シロイヌナズナSTARエレメントでトランスフェクションされかつ低いドキシサイクリン濃度で培養された。総RNAは単離され且つRT-PCRに付された；ゼオシン及びハイグロマイシン耐性mRNAに対応するバンドは、サザンブロット法によって検出され、且つフォスファーイメージャーで数値化された。ハイグロマイシンシグナルに対するゼオシンシグナルの割合は、12の種々のシロイヌナズナSTARエレメント、ショウジョウバエ scs エレメントで隣接された又は隣接エレメントを有しないゼオシン発現ユニットを含む形質転換体（transfectants）のために示される。
【図２４】STARエレメントは、2つの別々のベクターからの2つの遺伝子の効率的な及び同時の発現を可能にする。  夫々GFP及びREDの同時発現をテストするために使用されたppGIZ、ppGIZ-STAR7、ppRIP及びppRIP-STAR7ベクターが示される。発現ユニットは、GFP又はREDタンパク質、IRES及び、CMVプロモーターの制御下の選択可能なマーカー(zeo、ゼオシン耐性遺伝子、又はpuro、ピューロマイシン耐性遺伝子を夫々与える)をコードする遺伝子を(5'から3'に)含む。発現ユニットは、その3'末端(t)でSV40転写ターミネーターを有する。GFP及びRED発現ユニットを有するカセットは、STAR7エレメントによって隣接される(STAR7-保護される)又は隣接されない（対照）のいずれかである。2つの対照構築物又は2つのSTAR7-保護されたベクターは、CHO-K1細胞に同時にトランスフェクションされる。ゼオシン及びピューロマイシンの両方に耐性である安定なコロニーが発育され、そしてGFP及びREDシグナルがXL-MCLベックマンコールター フローサイトメーター(Beckman Coulter flowcytometer）で測定される。GFP及びREDシグナルの両方に２重ポジティブである一つのコロニー中の細胞のパーセントは、両方のタンパク質の同時発現のための尺度として考えられ、そしてこれは図２４中にプロットされる。
【図２５】STARエレメントは、CHO細胞における機能的抗体の発現を向上する。  RING1抗体の軽鎖及び重鎖を含む種々のベクターが、図２５に示される。構築物は、CHO細胞に同時にトランスフェクションされる。ゼオシン及びピューロマイシンの両方に耐性である安定なコロニーが発育される。これらコロニーの細胞培養培地は、抗原としてのRING1タンパク質を用いてELISAにおいて機能的RING1抗体の検出のためにテストされる。該値は、コロニー中の細胞の数によって割算される。STAR無し対照において検出された最高値が、任意的に100%にセットされる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
用語「細胞」／「宿主細胞」及び「細胞株」／「宿主細胞株」は夫々、従来技術で知られている方法によって細胞培養で維持される及び異種のタンパク質を発現する能力を有する、真核細胞及びそれらの均質の集団として典型的に定義される。
【００１６】
用語「発現」は、細胞中での、１つ又はそれ以上の特定のRNA生成物、又は１つ又はそれ以上の特定のタンパク質の生産を云うために典型的に使用される。RNA生成物の場合、それは転写の工程を云う。タンパク質生成物の場合、それは、転写、翻訳及び任意的に翻訳後の修飾の工程を云う。分泌されたタンパク質の場合、それは、転写、翻訳及び任意的に翻訳後の修飾（例えば、グリコシル化、ジスルフィド結合形成など）、及び引き続く分泌の工程を云う。多量体タンパク質の場合、それが、ポリペプチドモノマーからの多量体構造の組み立てを含む。名詞「発現」の対応する動詞は、前記名詞のような類似の意味を有する。
【００１７】
タンパク質は、(i)転写及び翻訳の工程によって得られた製品（しかし前記製品は必ずしも多量体タンパク質の一部（例えば、サブユニット）ではない）、及び／又は(ii)転写、翻訳及び翻訳後の修飾の工程によって得られた製品のいずれかであるとして本明細書中で定義される。用語「多量体」又は「多量体タンパク質」は、2又はそれ以上の、おそらく非同一の、ポリペプチド鎖（「モノマー」）を含むタンパク質として典型的に定義される。多量体タンパク質中の異なるモノマーは、化学量論的に等しい又は等しくない数で存在しうる。いずれの場合でも、モノマーの割合は通常、多量体タンパク質の機能的な構造によって固定される。
【００１８】
用語「タンパク質発現ユニット」は、タンパク質発現を提供することができるユニットとして本明細書中で定義され、機能プロモーター、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム及び機能的ターミネーターをすべて操作可能な配置で典型的に含む。機能プロモーターは、特定の細胞において転写を開始することができるプロモーターである。真核細胞において発現を得るための適切なプロモーターは、CMV-プロモーター、哺乳類のEF1-αプロモーター、哺乳類のユビキチンプロモーター又はSV40プロモーターである。機能的ターミネーターは、転写終結を提供することができるターミネーターである。適切なターミネーターの1つの例は、SV40ターミネーターである。用語「目的のタンパク質(又は導入遺伝子)をコードするオープンリーディングフレーム」は、１又はそれ以上の特定のRNA製品又は１又はそれ以上の特定のタンパク質をコードし且つ宿主細胞のゲノム内に組み込まれることが任意に可能であるDNAのフラグメントとして典型的に定義される。それは、導入遺伝子の１つ又はそれ以上のコード化領域の適切な転写及び翻訳のために要求されるDNAエレメントを含む。目的の前記タンパク質／導入遺伝子をコードする前記DNAは、転写及び翻訳の工程によって得られた製品をコードするDNA（おそらく前記製品は、多量体タンパク質の一部（例えばサブユニット）であるが、そうである必要はない）又は転写、翻訳及び翻訳後の修飾の工程によって得られた製品のいずれかでありうる。
【００１９】
用語「組み換え細胞／宿主細胞」及び「組み換え細胞株／宿主細胞株」は夫々、導入遺伝子が異種のタンパク質を生産する目的のためにその中に導入された宿主細胞及びそれらの異種の集団として典型的に定義される。
【００２０】
STAR（STabilizing Anti-Repressor）配列(又はSTARエレメント；該用語は本明細書中で互換的に使用されるだろう)は、我々が導入遺伝子抑制をブロックするそれらの能力に基づき真核生物のゲノムから単離した天然に生じるDNAエレメントである。好ましくは、STARエレメントはヒトゲノムから回収される。STAR配列は、イン  シス(in cis)で遺伝子の転写に影響を及ぼす、及び／又は安定化及び／又は促進化効果を提供する能力を含む。STARエレメントが導入遺伝子に隣接する場合、ランダムに選択された組み換え細胞株の導入遺伝子発現レベルが、導入遺伝子のプロモーターの潜在的最大の発現に接近するレベルに増加されうることが示された。その上、導入遺伝子の発現レベルは、多くの細胞世代の間安定であり、且つ確率論的なサイレンシングを示さない。それ故に、STAR配列は、慣用的な形質転換のシステムで可能でない導入遺伝子に位置独立的な発現の程度を与える。位置独立性は、導入遺伝子サイレンシングを生じるであろうゲノム位置に組み入れられた導入遺伝子が、STARエレメントの保護を用いて、転写的に活性状態で維持されることを意味する。
【００２１】
遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を検出し及び任意的に選択する方法であって、転写システムに様々なフラグメント含有ベクターを備えることを含み、前記ベクターは、i)遺伝子転写を抑制する特性を有するエレメント、及びii)レポーター遺伝子の転写を指示するプロモーターを含み、前記方法は前記遺伝子転写を調節する特性を有する前記DNA配列を識別するために、前記転写システムにおいて選択ステップを実行することをさらに含む方法を使用して、STAR-配列は（欧州公開特許EP 01202581.3号の実施例１に例えば開示されているように）識別されうる。好ましくは、前記フラグメントは、ｉ）遺伝子転写を抑制する特性を有する前記エレメントと、ｉｉ）前記レポーター遺伝子の転写を指示する前記プロモーターとの間に配置される。RNAポリメラーゼは、どこでRNA合成が開始すべきかを合図するプロモーターと呼ばれる特定の配列に結合後、転写工程を開始する。調節する特性は、所定の細胞型及び／又は所定のプロモーターにおいてイン  シスで前記プロモーターからの転写を助長することができる。同一のDNA配列は、１つの型の細胞において又は１つの型のプロモーターとともに、助長する特性を含むことができる。一方、それは他の細胞において又は他の型のプロモーターとともに、遺伝子転写を調節する他の特性を含むことができるか又は含まない。転写は、特定のプロモーターの転写に対する調節エレメント（又はそれに結合する１又はそれ以上のタンパク質）の直接の影響を通じて影響されうる。しかしながら、転写は、間接的な影響によってもまた影響されうる。例えば調節エレメントが、１つ又はそれ以上の他の調節エレメントの機能に影響を与えるからである。遺伝子転写を調節する特性は、安定な（stable）遺伝子転写特性をもまた含みうる。安定とは、観察された転写レベルが少なくとも30細胞分割の間、有意には変化されないことを意味する。安定な特性は、発現特徴が多くの細胞分割にわたって予測可能であるべきところの状況において有益である。典型的な例は、外来遺伝子でトランスフェクションされた細胞株（cell line）である。他の例は、形質転換動物及び植物並びに遺伝子治療である。導入された発現カセットが細胞分割若しくは植物又は動物世代の数の増加後に夫々に非常にしばしば違うように機能する。好ましくは、安定な特性は、形質転換植物又は動物の後の世代において遺伝子転写を維持する能力を含む。もちろん、発現が誘発可能である場合、前記特性は形質転換植物又は動物の後の世代において発現の誘発性を維持する特性を含む。しばしば、発現レベルは、細胞分割の数の増加に伴い劇的に落ちる。遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を識別するための本明細書記載の方法を用いて、細胞分割の数の増加につれて転写レベルの劇的な落ち込みを少なくとも部分的に防ぐことが可能であるDNA配列を検出し且つ任意的に選択することが可能である。好ましくは、前記遺伝子転写を調節する特性は、安定な遺伝子転写特性を含む。驚くべきことには、前記方法は転写の長期的な安定性を必ずしも測定しないという事実にもかかわらず、前記安定な遺伝子転写特性を有するDNA配列を含むフラグメントは、遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列の識別をするための方法で検出され且つ任意的に選択され得る。好ましくは、前記遺伝子転写を調節する特性は、遺伝子転写を助長する安定な特性を含む。目的の遺伝子を有する発現ベクターへの遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列の組み込みは、細胞のゲノムへの発現ベクターの組み込みに応答して目的の前記遺伝子のより高いレベルの転写を生じること、且つその上、前記より高い遺伝子発現レベルはまた、遺伝子転写を調節する特性を有する前記DNA配列の不存在におけるよりもより安定であるということが観察されている。
【００２２】
細胞のゲノム内に目的の遺伝子を導入するために且つ目的の前記遺伝子の発現を取得するために設計された実験において、次のことが観察されている。目的の前記遺伝子とともに遺伝子転写を調節する特性を有するDNAがまた導入された場合、前記DNA配列が目的の前記遺伝子とともに導入されないときよりも、目的の前記遺伝子の遺伝子生成物を或る量よりも多く発現したクローンが、より多く検出された。従って、遺伝子転写を調節する特性を有する識別されたDNA配列は、前記細胞のゲノムに目的の前記遺伝子を備えると、目的の遺伝子の遺伝子生成物のあるレベルよりも多く発現する細胞の数を増加するための方法であって、目的の前記遺伝子とともに遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を前記細胞に備えることを含む方法をまた提供する。
【００２３】
遺伝子転写を調節する特性を有するフラグメントを検出することの機会は、フラグメントがそこから得られるところの起源で変わる。典型的には、前記特性を有するフラグメントの存在又は不存在についての先行する知識がない。それらの状況において、多くのフラグメントは、遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を含まない。これらの状況において、前記特性を有するDNA配列のための正式な選択ステップが導入される。これは、前記レポーター遺伝子の生産物の特性に基づき前記配列を含むセレクションベクターによって行われ、これはそれに有利にも不利にも選択されうる。例えば、前記遺伝子生成物は、蛍光若しくは色沈着（例えば、緑色蛍光タンパク質及びその誘導体、ルシフェラーゼ、又はアルカリフォスファターゼ）を誘発し、又は抗生物質耐性を与え、若しくはアポトーシス及び細胞死を誘発しうる。
【００２４】
遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を識別するための方法は、遺伝子転写を助長する特性を含むDNA配列を検出し、且つ任意的に選択する、ために特に適している。目的の遺伝子を含む発現ベクターに組み込まれると、ベクターが遺伝子転写を抑制する特性を有するエレメントを含まなくとも、選択されたDNA配列の少なくとも幾つかは宿主細胞中で目的の前記遺伝子の遺伝子転写を劇的に増加することができる。この遺伝子転写を助長する特性は、外来遺伝子でトランスフェクションされた細胞株において又は形質転換動物及び植物において非常に有用である。
【００２５】
前記転写システムは、細胞フリーのイン  ビトロ（in vitro）転写システムでありうる。自動化された現在の専門的技術では、そのような細胞フリーシステムは、正確且つ迅速でありうる。しかしながら、前記転写システムは宿主細胞を好ましくは含む。宿主細胞を使用することは、フラグメントが細胞内で活性により検出され且つ任意的に選択されることを保証する。
【００２６】
遺伝子転写を抑制する特性を有するエレメントは、使用される転写システムにおいてプロモーターからの転写を抑制する。前記抑制は、検出不可能な発現レベルにまで進む必要はない。重要なことは、抑制の不存在又は存在において発現レベルの相違が、検出可能であり且つ任意的に選択可能であるということである。好ましくは、前記ベクターにおける遺伝子転写抑制は、遺伝子転写を抑制するクロマチンをもたらす。好ましくは、遺伝子転写を抑制するクロマチンの形成を少なくとも部分的に妨げることが可能であるDNA配列が検出され且つ任意的に選択されうる。１つの観点では、遺伝子転写を抑制するクロマチンの形成を少なくとも部分的に妨げることが可能であるDNA配列は、安定な遺伝子転写特性を含む。好ましくは、遺伝子転写抑制に関係するDNA配列が、タンパク質複合体によって認識されるDNA配列であり、及び前記転写システムが前記複合体を含む。好ましくは、前記複合体は、HP1を含むヘテロクロマチン結合性タンパク質（heterochromatin-binding protein）、ポリコーム−グループ（Pc-G）タンパク質、ヒストン脱アセチル化酵素活性又はMeCP２（メチル−CpG−結合性タンパク質）を含む。多くの生物体が、１つ又はそれ以上のこれらのタンパク質を含む。これらのタンパク質はしばしば、他の種においても活性を示す。従って、前記複合体は、２つ又はそれ以上の種からのタンパク質をまた含むことができる。既知のクロマチンに関連付けられたタンパク質複合物の前記されたセットは、多くの塩基対にわたる長い範囲の抑制をももたらすことができる。前記複合体は、細胞分割すると娘細胞に遺伝子の抑制された状態を安定に移すことにまた関係する。この方法で選択された配列は、多くの塩基対にわたる長い範囲の抗抑制をもたらすことができる（ファン  デル  フラッグら、2000年）。
【００２７】
使用されるベクターは、DNAクローニングに適切であり且つ転写システムで使用されうる任意のベクターであり得る。宿主細胞が使用される場合、該ベクターが、エピソーム的に複製するベクターであることが好ましい。このようにして、ベクターの組込みの異なる部位による効果は避けられる。組込みの部位でベクターに隣接する（flanking）DNAエレメントは、プロモーターの転写のレベルに対して影響を与え且つそれによって、遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を含むフラグメントの影響をまねることができる。好ましい実施態様では、前記ベクターが、イプシュタイン−バール（Epstein-Barr）ウィルス（EBV）、OriP、及び核抗原（EBNA-1）からの複製起源を含む。そのようなベクターは、適切な条件下で真核生物の細胞の多くの型において複製することができ且つクロマチン内に組入れる（assemble）ことが可能である。
【００２８】
遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列は、種々の起源例えば植物若しくは脊椎動物又はそれらの誘導体、或いは合成DNA配列すなわち遺伝子エンジニアリングによって構築されたDNA配列から得られることができる。好ましくは、前記DNA配列は表３及び／又は図６に表現された配列、及び／又はそれらの機能的等価体及び／又は機能的フラグメントを含む。
【００２９】
いくつかの方法が、ある共通の特性を共有するDNA配列のファミリーから配列識別子を抽出するために当業者にとって利用可能である。そのような配列識別子は次に、１つ又はそれ以上の識別子を共有する配列を識別するために使用され得る。そのような１つ又はそれ以上の識別子を共有する配列は、同じファミリーの配列のメンバーである可能性が高い、すなわち、ファミリーの共通の特徴を共有する可能性が高いようである。本明細書では、STAR活性を含む非常に多くの配列（いわゆるSTAR配列又はSTARエレメント）が、STAR活性を含む配列に特徴的である配列識別子（パターン）を得るために使用された。これらのパターンは、テスト配列がSTAR活性を含んでいる可能性があるかどうかを決定するために使用されうる。従って、約50〜5000塩基対の核酸配列内のSTAR配列の存在を検出するための方法であって、前記配列における少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度を決定し、そして出現の頻度がSTAR配列を含む少なくとも１つの配列における前記少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度を表わすことを決定することを含む方法が本明細書で提供される。原則的に、配列パターンがSTAR配列を表わすかどうかを決定するための任意の方法が適している。多くの種々の方法が、当業者にとって利用可能である。好ましくは、出現の頻度が、STAR配列を含む少なくとも１つの配列における前記少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度を表わすことを決定する前記ステップが、前記少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度が、前記少なくとも１つのSTAR配列及び少なくとも１つの対照配列の間で有意に異なることを決定することを含む。原則的に、任意の有意な相違が、STAR配列の存在のために識別力がある。しかしながら、特に好ましい実施態様では、前記少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度が、前記少なくとも１つの対照配列と比較して、STAR配列を含む前記少なくとも１つの配列において有意に高い。
【００３０】
上記されたように、STAR配列を含む相当多くの配列が、本明細書で識別されている。パターンが対照配列とSTAR配列を含む配列とを区別する際にいかに有効であるかをテストするためにこれらの配列を使用することが可能である。いわゆる判別式分析（discriminant analysis）を使用して、一つの種（species）におけるSTAR配列の任意のセットに基づき、最適な判別配列（discriminative sequence）パターン又はそれらの組み合わせを決定することが可能である。従って、好ましくは前記パターンの少なくとも１つが、STAR配列を含む前記少なくとも１つの配列と対照配列との間の最適の判別に基づいて選択される。
【００３１】
好ましくは、テスト核酸における配列パターンの出現の頻度は、STAR配列を含むことが知られている配列における出現の頻度と比較される。この場合において出現の頻度が同様である場合、パターンはSTAR配列を含む配列を表わすと考えられる。さらにより好ましくは、他の基準が使用される。STRA配列を含む配列におけるパターンの出現の頻度が、制御配列における前記パターンの出現の頻度と比較される。該2つの頻度を比較することによって、このように分析された各パターンについて、STAR配列を含む配列における前記頻度が対照配列における頻度と有意に異なるかどうかを決定できる。次に、STAR配列を含む少なくとも１つの配列におけるパターンの出現の頻度が対照配列における同じパターンの出現の頻度と有意に異なる場合、配列パターンは、STAR配列を含む配列を表わすと考えられる。STAR配列を含む配列の多くの数を使用することによって、統計的な相違が確立されうるところのパターンの数が増加し、その結果出現の頻度がSTAR配列を含む配列を表わすところのパターンの数を増大する。好ましくは、出現の頻度はSTAR配列を含む少なくとも2配列における、より好ましくはSTAR配列を含む少なくとも5配列における前記少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度を表わす。より好ましくは、STAR配列を含む少なくとも10配列におけるものである。より好ましくは、出現の頻度は、STAR配列を含む少なくとも20配列における少なくとも１つの配列の出現の頻度を表わす。特に好ましい実施態様では、出現の頻度はSTAR配列を含む少なくとも50配列における前記少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度を表わす。
【００３２】
STAR配列を含む配列を表示するところのパターンは使用される対照核酸の型にまた依存する。使用される対照配列の型は好ましくは、STAR配列の存在が検出されるべきであるところの配列に基づき選択される。好ましくは、前記対照配列が、STAR配列を含む前記少なくとも１つの配列と類似のAT/CG含量を有するランダム配列を含む。さらにより好ましくは、対照配列は、前記STAR配列を含む前記配列と同じ種から得られる。例えば、テスト配列が、植物細胞において活性であるSTAR配列の存在を検査される場合、対照配列は好ましくは植物細胞から取得される。同様に、ヒト細胞におけるSTAR活性をテストするために、対照核酸が好ましくは、ヒトゲノムからまた取得される。好ましくは、対照配列は、STAR配列を含む前記少なくとも１つの配列の塩基の50%〜150%を含む。特に好ましい実施態様では、前記対照配列は、STAR配列を含む前記少なくとも１つの配列の塩基の90%〜110%を含む。より好ましくは、95%〜105%である。
【００３３】
パターンは、2よりも多い任意の数の塩基を含むことができる。好ましくは、少なくとも１つの配列パターンは少なくとも5、より好ましくは少なくとも6の塩基を含む。さらにより好ましくは、少なくとも１つの配列パターンは少なくとも8塩基を含む。好ましくは、前記少なくとも１つの配列パターンは、表４及び／又は表５にリストされたパターンを含む。パターンは、塩基の連続したリストから成ってもよい。しかしながら、該パターンは、判別できない又は部分的にのみ判別できる多くの塩基によって１つ又はそれ以上の回数で中断される塩基をもまた含んでもよい。部分的に判別的な塩基は例えば、プリンとして示される。
【００３４】
好ましくは、STAR活性の存在は機能的アッセイを使用して検証される。幾つかの方法は配列がSTAR活性を含むかどうかを決定するために明細書中に示される。STAR活性は、前記配列が次の機能の少なくとも１つを実行することができる場合に確認される：（i）本発明の遺伝子転写を抑制するエレメントを含む配列の効果を少なくとも部分的に阻害する、（ii）クロマチンに関連づけられた抑制を少なくとも部分的にブロックする、（iii）エンハンサーの活性を少なくとも部分的にブロックする、（iv）同一の核酸のみと比較して、転写ユニットをコードする動作可能にリンクされた核酸に、（iv-a）転写のより高い予測可能性、（iv-b）より高い転写、及び／又は（iv-c）長期にわたる転写のより高い安定性を与える。
【００３５】
本明細書において識別されるSTAR活性を含む非常に多くの配列は、種類において同じであり量において必ずしも同じでない活性を含む配列を生成し且つ識別する広い種々の可能性を開く。例えば、本明細書において識別された配列を変更し、且つ変更された配列のSTAR活性を試験することは当業者の到着できる範囲内に十分にある。それ故に、そのような変更された配列はまた本明細書に含まれ、且つ2又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法において、或いは２又はそれ以上のタンパク質の発現が所定の割合である細胞を識別するための方法において使用されうる。変更は、配列における１つ又はそれ以上の塩基の削除、挿入及び変異を含みうる。
【００３６】
STAR活性を含む配列は、400塩基の広がりで識別された。しかしながら、それら400塩基の全てがSTAR活性を保存するために必要とされるのではないことが予測される。400〜5000塩基のフラグメントに或る特性を与える配列の境界を定める方法は、よく知られている。STAR活性を含むフラグメントの最小配列長は、約50塩基であると見積もられる。
【００３７】
表４及び表５は、STAR活性を含む核酸分子において過剰に表わされていると判った6塩基のパターンをリストする。この過剰の表現は、STAR配列の特徴であると考えられる。該表は、65個のSTAR配列のファミリーのために生成された。同様の表が異なるセットのSTAR配列から又はより小さい若しくはより大きいセットのSTAR配列から開始して生成されうる。パターンがSTARエレメントを含まない配列と比較して前記STAR配列において過剰に表わされているならば、パターンはSTAR配列を表わす。これは、ランダム配列でありうる。しかしながら、無関係なバイアスを排除するために、STAR配列を含む配列は好ましくは、ゲノム又はその有意な部分と比較される。好ましくは脊椎動物又は植物のゲノム、より好ましくはヒトゲノムである。ゲノムの有意な部分は例えば、一つの染色体である。好ましくはSTAR配列及び前記対照配列を含む配列は、同一の種の核酸から取得される。
【００３８】
より多くのSTAR配列が、配列パターンの出現の頻度の決定のために使用されると、過剰又は低度に表わされているパターンがSTARをよりよく代表する。核酸によって発現されうる多くの機能性特性がそれに結合するプロテイン性分子によって達成されることを考慮すると、代表パターンはSTAR配列において過剰に表わされることが好ましい。そのように過剰に表わされるパターンは、そのようなタンパク質性分子のための結合性部位の一部分であり得る。好ましくは出現の頻度は、STAR配列を含む少なくとも2配列における、より好ましくはSTAR配列を含む少なくとも5配列における前記少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度を表わす。より好ましくはSTAR配列を含む少なくとも10配列である。より好ましくは出現の頻度は、STAR配列を含む少なくとも20配列における前記少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度を表わす。特に好ましくは、出現の頻度はSTAR配列を含む少なくとも50配列における前記少なくとも１つの配列パターンの出現の頻度を表わす。好ましくは、STAR配列を含む前記配列は、図６に記載されている配列の少なくとも１つを含む。STAR活性は、図６にリストされた配列によって共有される特性である。しかしながら、これは、それらが同一の識別子配列を全て共有しなければならないことを意味しない。異なる識別子が存在することは極めて十分に可能である。識別子は、それを含むフラグメントに共通の特性を与えうるが、しかしながらこれはそうである必要はない。
【００３９】
１又は複数の配列パターンの出現の頻度を決定するためにSTAR活性を含むより多くの配列を使用することによって、そのようなSTAR配列において他よりもよりしばしば存在する又は存在しないパターンを選択することが可能である。このようにして、STAR配列において非常にしばしば過剰に表わされている又は低度に表わされているパターンを見つけることが可能である。しばしば過剰に又は低度に表わされているパターンは、テストセットにおける候補STAR配列を識別する蓋然性がより高い。過剰に又は低度に表わされているパターンのセットを用いる他の方法は、どのパターン又はパターンの組み合わせが配列におけるSTARを識別するために最も適されているかを決定することである。いわゆる判別統計を使用して、我々はSTARエレメントを含む配列を識別する際に最も良く実行するパターンのセットを識別している。好ましくは、STAR配列を検出するための前記配列パターンの少なくとも１つが、配列パターンGGACCC、CCCTGC、AAGCCC、CCCCCA及び／又はAGCACCを含む。好ましくは、STAR配列を決定するための前記配列パターンの少なくとも１つが、配列パターンCCCN{16}AGC、GGCN{9}GAC、CACN{13}AGG及び／又はCTGN{4}GCCを含む。
【００４０】
STAR配列のリストは、それらの中の１つ又はそれ以上のコンセンサス配列を検出するためにまた使用されうる。それ故に、STARエレメントのためのコンセンサス配列がまた本明細書において提供される。このコンセンサス配列は勿論、テスト配列における候補STARエレメントを識別するために使用されうる。
【００４１】
その上、一旦STARエレメントを含む配列が脊椎動物において識別されると、それは脊椎動物に属する他の種におけるSTARエレメントを含む配列を識別するために配列相同性によって使用されうる。好ましくは、哺乳動物のSTAR配列が、他の哺乳動物種におけるSTAR配列をスクリーンするために使用される。同様に一旦、STAR配列が植物種で識別されると、それは他の植物種における同様の機能を有する相同配列をスクリーンするために使用されうる。従って、本発明において記載されるような方法によって取得可能なSTAR配列が提供される。さらにSTAR配列のコレクションが提供される。好ましくは前記STAR配列は、脊椎動物又は植物STAR配列である。より好ましくは、前記STAR配列は、哺乳動物STAR配列又は被子植物（単子葉植物例えば稲、又は双子葉植物例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis））である。より好ましくは、前記STAR配列は、霊長類及び／又はヒトSTAR配列である。
【００４２】
STAR活性を含む配列のリストは、テスト配列がSTARエレメントを含むかどうかを決定するために使用されうる。上記したように、この目的のためのそのようなリストを使用するための多くの種々の方法がある。好ましくは、約50〜5000塩基対の核酸配列がSTAR配列を含むかどうかを決定するための方法であって、該方法が本発明のSTAR配列のコレクションにおける配列パターンの出現の頻度を含む配列パターンの第１のテーブルを生成すること、少なくとも１つの参照（reference）配列における配列パターンの出現の頻度を含む前記パターンの第２のテーブルを生成すること、出現の頻度が前記２つのテーブル間で異なるところの少なくとも１つのパターンを選択すること、前記選択されたパターンの少なくとも１つの出現の頻度を約50〜5000塩基対の核酸配列内において決定すること、及び前記テスト核酸における出現の頻度がSTAR配列の前記コレクションにおける前記選択されたパターンの出現を表わすかどうかを決定することを含む、前記方法が提供される。代替的に、前記決定することは、前記テスト核酸における出現の頻度がSTAR配列の前記コレクションにおける前記選択されたパターンの出現の頻度を表わすかどうかを決定することを含む。好ましくは、前記方法は、前記候補STARが遺伝子転写を調節する特性を有するかどうかを、本明細書において記載される方法を使用して決定することをさらに含む。好ましくは、STARの前記コレクションは、図６に記載されているような配列を含む。
【００４３】
いま、複数の方法が、STAR配列を得るために開示され、我々が本明細書中に記載されるような方法によってSTAR配列を含む単離された及び／又は組換え核酸配列をまた提供することは明らかである。
【００４４】
STAR配列は指向的な様式で、すなわち、それを含むフラグメントの１つの側に向って、他の側に向ってよりも多く、その活性を発揮することができる。STAR活性は、STARエレメントの数を複製することによって多量に増幅されうる。後者は、STARエレメントがSTAR活性を含む１つ又はそれ以上のエレメントを含んでもよいことを示唆する。それを含むフラグメント上にSTAR活性を与えることが可能な配列を識別する他の方法は、脊椎動物又は植物配列、STAR活性を含む配列からの選択を含み、そして選択された配列に隣接する配列が他の種において保存されるかどうかを識別することを含む。そのような保存された隣接配列は、機能的配列（functional sequences）である可能性が高い。STARエレメンをを含む配列を識別するそのような方法は、STARエレメントを含む脊椎動物又は植物種からの約50〜5000塩基対の配列を選択すること、及び前記種において前記選択された配列に隣接する配列が少なくとの１つの他の種において保存されるかどうかを識別することを含む。我々は、約50〜5000塩基対の核酸配列内のSTAR配列の存在を検出する方法であって、一つの種（species）の細胞の染色体の一部分におけるSTAR配列を含む配列を識別すること、そして前記配列及び異なる種の染色体の配列との間の有意な相同性を検出することを含む方法をさらに提供する。従って、前記異なる種内のSTAR配列が識別される。好ましくは、前記種は、植物又は脊椎動物種を含み、好ましくは哺乳動物種である。我々は、脊椎動物種又は植物種の約50〜5000塩基対の核酸配列内のSTARエレメントの存在を検出するための方法であって、前記核酸配列の隣接配列が少なくとも１つの他の種に保存されるかどうかを識別することを含む、前記方法をまた提供する。
【００４５】
バイオインフォマティクス的な情報を使用し、STAR配列を含む配列の存在を検出するための本明細書において開示される方法はその性質として反復可能であることに注目することは重要である。STAR配列を含むより多くの配列が、本明細書で記載された方法で識別されると、より多くのパターンが、STAR配列を含む配列と対照配列との間で判別可能であることが見い出される。これらの新規に見つかった判別可能なパターンを使用して、STAR配列を含む多くの配列が識別され、その結果それは判別可能であるパターンのセットを増加し、等々である。この反復性の観点は、本明細書において提供される方法の重要な観点である。
【００４６】
配列に関連する用語「特性」は、前記配列の活性を云う。明細書中で使用される用語  「STAR」、「STAR配列」又は「STARエレメント」は、上記した遺伝子転写を調節する特性の１つ又はそれ以上を含むDNA配列を云う。本明細書中で使用される用語「DNA配列」は、別記しない限りは、塩基の特定の順序のリストを云うのではなく、DNAの物理的な片を云う。DNA配列に関連して転写特性は、前記DNA配列が目的の遺伝子の転写について有する効果を云う。本明細書中で使用される「特性」（quality）は、転写システムにおける核酸又はタンパク質の検出可能な特性又は属性を云う。
【００４７】
本発明は、とりわけ、2又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法、2又はそれ以上のタンパク質の発現が所定の割合である細胞及びタンパク質発現ユニットを識別するための方法を提供する。これらすべての実施態様では、上記された入手可能なSTAR配列が使用されうることは明らかである。例えば、図6、表3、表4、表5又はそれれの組み合わせからのSTAR配列。より好ましくは、前記STAR配列が、脊椎動物のSTAR配列又は植物STAR配列である。さらにより好ましくは、前記脊椎動物のSTAR配列がヒトSTAR配列である。目的の遺伝子が発現される種からのSTAR配列を使用することがさらに好ましい。例えば、2つ又はそれ以上のタンパク質を発現したく、かつタンパク質の1つがヒトタンパク質である場合、一つは好ましくは前記ヒトタンパク質の発現のためのヒトSTAR配列を含む。
【００４８】
上に概説されるように、発現ユニットに隣接するSTARエレメントは、多くの細胞世代に亘りモノマー導入遺伝子の安定した発現の基礎である。我々は、STARエレメントがサイレンシングから個々の導入遺伝子を保護することができることを実証した。本発明では、その能力が、組み換え宿主細胞中に(優先的に)独立して導入された1より多い発現ユニットに展開される。STARエレメントによって隣接されていない発現ユニットは、僅か5〜10培養経過後に有意なサイレンシングを経験することができ、その時間の間STAR保護されたユニットのサイレンシングは無視できる。
【００４９】
２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法であって、前記２又はそれ以上のタンパク質をコードする２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットを前記細胞に与えることを含む方法において、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つが、少なくとも１つのSTAR配列を含むことを特徴とする方法の有利点は、多様である
【００５０】
本発明は2又はそれ以上のタンパク質の生産のためにSTAR配列を使用し、それによって本発明は、(1)目的の異種の多量体タンパク質を効率的に生産する組み換え細胞株の生成において増加された予測可能性、(2)異種の多量体タンパク質の増加された収率、(3)選択剤の不存在下で長期の培養の間でさえ、異種の多量体タンパク質の安定な発現を提供し、及び(4)本発明はまた、導入遺伝子の増幅なしに好ましい導入遺伝子発現特徴を提供する。本発明によって提供される異種のタンパク質の増加された収率は、例えばDHFR/メトトレキサートシステムを使用して、選択的な共増幅なしに、低い導入遺伝子コピー数で得られうる。導入遺伝子コピー数が低く且つ組換え(マクバーニら、2002年)又は反復誘導された遺伝子サイレンシング(ガーリックら、1998年)により減少することに敏感ではない故に、これはより大きな安定性を生じる。第5に、本発明の方法の広い適用可能性は、宿主細胞株の広範囲におけるその有用性を含む。これは例えば、特別の多量体タンパク質が特別の宿主細胞株によって好ましくは発現(例えば、リンパ細胞由来の宿主細胞株からの抗体の発現)される場合、有用であり／望ましい。
【００５１】
それ故に、本発明に従う方法は、(宿主)細胞中の2又はそれ以上のタンパク質の発現の改良を提供する。
【００５２】
他の実施態様では、本発明は、２又はそれ以上のタンパク質の発現が所定の割合であるところの細胞を識別する方法であって、
−前記２又はそれ以上のタンパク質をコードする２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットを有する細胞のコレクションを用意すること、
−前記２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を選択すること、
−前記所定の割合で前記２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を、得られた前記選択物から識別すること
を含む方法において、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つが、少なくとも１つのSTAR配列を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００５３】
前記２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞の選択は例えば、全て当業者によって知られている技術である（それ故に更なる詳細を必要としない）、SDS-PAGE分析、ウェスタンブロット分析又はELISAを実行することによって得られうる。前記所定の割合で前記２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞の識別はまた、これらの技術によって実行されうる。
【００５４】
前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つ中のSTAR配列の存在は再び、２又はそれ以上のタンパク質の所望の予測可能性、収率、安定性、及び化学量論的にバランスの取れた入手可能性を提供する。
【００５５】
特に、多量体タンパク質のポリペプチドが本発明の方法に従い生産される場合、前記多量体タンパク質の形成に関連する割合において、要求されたモノマー/サブユニットを提供することが望ましい。従って、好ましくは前記モノマー/サブユニットは、生物的な関連した、バランスの取れた割合で生産される。例えば、多量体タンパク質が、2つのサブユニットA及び1つのサブユニットBから成る場合、生産されるBのすべてのサブユニットについて2つのサブユニットAを生産することが望ましい。従って、所定の割合は、多量体タンパク質を含む異なるサブユニット/モノマー/ポリペプチドの自然に生じる割合(化学量論)として本明細書中で定義される。
【００５６】
もっと好ましい実施態様では、本発明の方法に従い得られうる細胞は2つのタンパク質を発現する。例えば、治療的に有利な結果をともに提供する2つのタンパク質。さらにより好ましい実施態様では、2つの発現されたタンパク質の所定の割合が1：1である。これは例えば、モノマーが1：1の割合にある多量体タンパク質の生産において有用である。典型的な例は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を含む抗体である。
【００５７】
好ましくは、本発明は、前記２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットが、少なくとも２つの異なる選択マーカーをさらにコードし、及び前記方法が、前記細胞での２段階選択マーカースクリーニングをさらに含み、前記細胞が第１の選択マーカーの存在下で第１段階において選択され、そして第２の選択マーカーの存在下で第２段階において選択されるところの方法を提供する。
【００５８】
本発明のこの実施態様では、２段階抗生物質の選択が使用され、この方法では体制が高いレベルで例えば導入遺伝子１及び２を発現する高い割合の単離物を生じる；選択の第１段階は、１又はそれ以上の発現ユニットを含んでいない細胞を除去し、そして選択の第２段階は、高いレベルでバイシストロニック（以下、ビシストロニックとも記載する）なmRNAの両方を転写しないコロニーを除去する。この方法は、慣用的な方法と比較して、本発明によって達成される、多量体を発現する組み換え細胞株の増加された頻度のための一つの観点である。本明細書で記載されるように、それは、10倍より多いイクスプレッサー株(expressorlines)の頻度の増加を生じる。
【００５９】
他の実施態様では、本発明は、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも１つが、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子を含み、及び前記モノシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にあるところの方法を提供する。
【００６０】
さらに他の実施態様では、本発明は、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも１つが、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位と、選択マーカーとを含むビシストロニックな遺伝子を含み、及び前記ビシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にあるところの本発明に従う方法を提供する。
【００６１】
より好ましい実施態様では、本発明は、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも１つが、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位と、選択マーカーとを含むビシストロニックな遺伝子を含み、及び前記ビシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にあり、該タンパク質発現ユニットが、第２の選択マーカーをコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子をさらに含み、及び前記モノシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にあるところの本発明に従う方法を提供する。
【００６２】
用語「ビシストロニックな遺伝子」は、2つのタンパク質/ポリペプチドをコードするRNA分子を提供することができる遺伝子として典型的に定義される。
【００６３】
用語「モノシストロニックな遺伝子」は、1つのタンパク質/ポリペプチドをコードするRNA分子を提供することができる遺伝子として典型的に定義される。
【００６４】
用語「選択マーカー又は選択可能なマーカー」は、それらの存在が細胞中で直接的に又は間接的に検出されることができる遺伝子及び／又はタンパク質、例えば選択剤を不活性化し且つ該剤の致死的な又は成長阻害効果から宿主細胞を保護する遺伝子及び／又はタンパク質（例えば抗生物質耐性遺伝子及び／又はタンパク質）を云うために典型的に使用される。別の可能性は、選択マーカーが蛍光又は色沈着(例えば、緑色蛍光タンパク質及び誘導体、ルシフェラーゼ、又はアルカリフォスファターゼ)を誘発することである。
【００６５】
用語「選択剤」は、宿主細胞の成長を殺す又は遅らせることができる化合物（例えば抗生物質）として典型的に定義される。
【００６６】
用語「選択」は、特定の遺伝的特性（例えば宿主細胞がそのゲノム内に組み込まれた導入遺伝子を含む）を有する宿主細胞を識別するために選択マーカー／選択可能なマーカー及び選択剤を使用する工程として典型的に定義される。
【００６７】
名詞「クローン」及び「単離物」は、選択によって識別され且つ単離された組み換え宿主細胞株を典型的に云う。
【００６８】
本発明に従う方法によって提供される改良は、3つの統合された観点を有する。(1)既存のシステムで、多量体タンパク質の許容できる量のモノマーを同時に発現する組み換え細胞株は、非常に低い頻度でのみ生成されることができる；本発明は、高収率の組み換え宿主細胞株を生成することの予測可能性を10倍又はそれ以上増加する。(2)既存のシステムは、多量体タンパク質のサブユニットの化学量論的にバランスの取れた且つ比例した量を提供しない；本発明は、サブユニットの発現レベルがバランスの取れた且つ比例的であることを保証する。(3)既存のシステムは、導入遺伝子サイレンシングから、タンパク質サブユニットをコードする導入遺伝子を保護する手段を提供しない。
【００６９】
図1は、本発明のこの一部の実施態様の一つの非制限的な概要図を提供する。図１Ａ及び図１Ｂは、2つの別々のタンパク質発現ユニットを示す。これは、プラスミド中のならびにゲノム内への組み込み後の発現ユニットのDNAエレメントの配置である。発現ユニット1は、図１Ａに示される。それは、導入遺伝子(リポーター遺伝子又は多量体のサブユニット1(TG S1、導入遺伝子サブユニット1))のためのオープンリーディングフレームを含む。これは、減じられたEMCV IRESの、及びゼオシン耐性選択可能なマーカータンパク質(zeo)をコードするオープンリーディングフレームの上流である。このビシストロニックな導入遺伝子はCMVプロモーターから高いレベルで転写される。この隣は、SV40プロモーターからのモノシストロニックなmRNAとして転写された、ネオマイシン耐性選択可能なマーカー(neo；これは、同様に抗生物質G418への耐性を与える)である。これらの２つの遺伝子は、STARエレメントによって隣接される。図１Ｂでは、同様の発現ユニットが記載される。それは、減じられたEMCV IRESの上流の第２の導入遺伝子 (第２のレポーター遺伝子又はヘテロ二量体タンパク質のサブユニット2(TG S2)のためのオープンリーディングフレーム)及びブラスチシジン選択可能なマーカーオープンリーディングフレーム（bsd）から成る。このビシストロニックな導入遺伝子は、CMVプロモーターから、高いレベルで転写される。この隣は、SV40プロモーターからのモノシストロニックなmRNAとして転写された、ネオ選択可能なマーカーである。第２の発現ユニット中の該２つの遺伝子は、同様にSTRAエレメントによって隣接される。
【００７０】
選択マーカーの可能な組み合わせが多数であることは当業者に明らかである。可能な抗生物質の組み合わせの例は、上記されている。特に有利である一つの抗生物質は、ゼオシンである。なぜならば、ゼオシン-耐性タンパク質(ゼオシン-R)は、薬を結合し、そしてそれを無害にすることによって作用するためである。それ故に、高いイクスプレッサーが生き残ることを可能にしながら、ゼオシン-R発現の低いレベルで細胞を殺す薬の量を滴定することは容易である。普通の使用における他の全ての抗生物質耐性タンパク質は酵素であり、従って触媒的に作用する（薬と1:1でない）。それ故に、２段階選択が実行される場合、作用のこの1:1の結合様式で抗生物質耐性タンパク質を使用することは有利である。従って、抗生物質ゼオシンは、好ましい選択マーカーである。便宜のために、ゼオシン抗生物質は、第2のビシストロニック遺伝子中のピューロマイシン-R又はブラスチシジン-Rと、及びモノシストロニックな遺伝子中のネオマイシン-R又はハイグロマイシン-Rと組み合わされた２段階選択方法中にある。
【００７１】
その上、抗生物質選択マーカーを、蛍光の誘発を提供する又は色沈着を提供するところの選択マーカーと組み合わせることがまた可能であることは明らかである。
【００７２】
種々のプロモーターはそれらが使用された細胞中で機能的である限り使用されることが出来ることは当業者にまた明らかである。CMVプロモーターは、最強に利用可能であると考えられ、従って、それは好ましくは、最高可能な生成物収率を得るためにビシストロニックな遺伝子のために好ましくは選択される。適切なプロモーターの他の例は、例えば EF1-アルファのための哺乳類のプロモーター、又はユビキチンである。SV40プロモーターの良好な発現及び安定性は、それをモノシストロニックな遺伝子の発現に十分に適するようにする；十分な選択マーカータンパク質(例えば、本明細書中に引用された例での抗生物質耐性タンパク質ネオマイシン-R)は、前記選択マーカーの高い発現を与えるために作られる。従って、前記SV40プロモーターは、選択マーカーの発現を駆動するプロモーターとして優先的に使用される。
【００７３】
好ましい実施態様では、本発明は、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも1つが、少なくとも２つのSTAR配列を含む方法を提供する。さらにより好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも２つのSTAR配列を含む前記タンパク質発現ユニットは、前記タンパク質発現ユニットが少なくとも１つのSTAR配列によっていずれかの側いずれかの側で隣接されるように配置される方法を提供する。またさらにより好ましい実施態様では、前記少なくとも２つのSTAR配列が本質的に同一である。本質的に同一のSTAR配列は、それらの重要な領域において同一であるが、それらの比較的重要でない領域（転写を安定する又は助長する特性を与える領域）内で変化（STAR配列内の比較的重要でない位置での例えばポイント変異(pointmutation)、欠損又は挿入）しうるSTAR配列として本明細書中で定義される。優先的に、前記本質的に同一のSTAR配列が、転写を安定する又は助長する活性の等しい量を提供する。
【００７４】
少なくとも１つのタンパク質発現ユニットに隣接するSTAR配列の使用は、２又はそれ以上のタンパク質の発現の、及びより特には多量体タンパク質のモノマーの発現のバランスの取れた且つ比例したレベルの観点の一つである。STAR配列は、明確な且つ安定な転写可能性のクロマチン領域を生成する。その結果、各ビシストロニックなmRNAの転写を駆動するプロモーターは、明確で、安定なレベルで機能するだろう。本発明の方法によって生成された組み換え宿主細胞株は容易に識別され、そこではこれらのレベルが、高収率で発現される目的の多量体タンパク質の各モノマーの適切な割合を生じる。
【００７５】
他の実施態様では、タンパク質発現ユニットが、STARエレメントによって隣接されたビシストロニックな遺伝子のみを含む。モノシストロニックな抗生物質耐性遺伝子を省略することの有利点は2倍である。第１に、高く発現する組み換え宿主細胞の選択は、2つの抗生物質のみの使用を要求する。第２に、それは、プロモーター抑制及び転写的妨害(transcriptional interference)の現象によるビシストロニックな及び／又はモノシストロニックな遺伝子の抑制を防ぐ。これらの現象は、2又はそれ以上の転写ユニットが互いの近くに配置される慣用的な形質転換のシステムにおける共通の問題である。下流(3')ユニットの上流(5')ユニットによる抑制は、転写的妨害と命名され、及び上流ユニットの下流ユニットによる抑制は、プロモーター抑制と命名される(ヴィレムレら、2001年)。転写的妨害は、全ての可能な配列(直列の、分岐の及び収束した)ににおける、近傍の導入遺伝子の抑制を生じることができる(エスターハズら、2002年)。これらの現象は、IRES依存性の及び／又はモノシストロニックな抗生物質耐性遺伝子の選択の効率を減少することができ、及び導入遺伝子の収率を減少する。それ故に、STARエレメントによって隣接されたビシストロニックな遺伝子のみを含む本発明の実施態様は、コンポーネントの代替配置を提供する。
【００７６】
好ましい実施態様では、本発明に従う方法はSTAR配列を使用し、そこでは該STAR配列は、表３及び／又は図６に記載され、及び／又はそれらの機能的等価体及び／又は機能的フラグメントである。
【００７７】
我々は、財産的技術を使用して、STAR配列の広範囲なコレクションを単離し、且つ特徴付けた。これらの配列の強度は、広い範囲に及ぶ。これは、STARエレメントによって与えられた組み換え宿主細胞での導入遺伝子発現の改良の変化する程度によって明示される；いくつかのSTARエレメントはサイレンシングからの完全な保護を提供し、一方他は部分的な保護のみを提供する。STARエレメントの強度の範囲はまた、目的の異種のタンパク質を効率的に生産する組み換え細胞株を分離することの予測可能性を改善するそれらの変化する能力において明示される。本発明のために、我々は、効率的に発現する組み換え細胞株の高い数を有するために、強い予測可能性特徴付けを有するSTARエレメントを好ましくは使用した。使用されたSTARエレメントは、組み換えタンパク質生産のレベルを調節して、生成物の要求（例えばポリペプチドモノマーのバランスの取れた且つ比例した発現）と一致するために、中庸から強度までの抗リプレッサー活性を有する。選択されたSTARエレメントはまた、導入遺伝子の発現の安定性に有意な増加を与える。
【００７８】
いくつかのSTARエレメントはまた、プロモーター及び宿主細胞型特異性を表す。これらの特徴は、特定の宿主細胞を要求する異種のタンパク質の生産（例えば、高い収率又は薬学的に有利なグリコシル化パターンを達成するため）又は発現の特定のモード（例えば、誘発性プロモーター(inducible promoter)又は構造的プロモーター（constitutive promoter）の使用；中庸の強度又は高い強度を有するプロモーターなどの使用）を最適化するための新規な遺伝子組み換え系を生成するために利用される。それ故に、異なるSTARエレメントの使用は、これらのタイプの適用に関係する本発明の異なる実施態様を生じる。
【００７９】
表３及び／又は図６中に記載された配列の機能的等価体及び／又は機能的フラグメントは、次のように本明細書中で定義される。表３及び／又は図６中に記載されたような配列の機能的等価体は、表３及び／又は図６中に与えられた情報を用いて導出された配列である。例えば、表３及び／又は図６に示された配列において又は配列から塩基を欠損し、改変（以下、修飾とも記載する）し及び／又は挿入することによって表３及び／又は図６における配列から導出されうる配列であり、ここで前記導出された配列は表３及び／又は図６に記載されている配列の種類と同一の活性（しかし、必ずしも同じ量ではない）を含む。機能的等価体はさらに、表３及び／又は図６に記載されている配列の２又はそれ以上からの部分を含む配列である。機能的等価体はまた、生物体に存在する配列から直接的に又は間接的に導出されない配列である合成DNAでありうる。例えばショウジョウバエscs又はscs’配列を含む配列は、該scs又はscs’配列が人工的に生成されたときであっても合成配列ではない。
【００８０】
STARエレメントの機能的配列は、従来技術で知られている様々な方法によって描写され得る。１つの実施態様では、欠損及び／又は置換は、STAR配列においてなされる。そのようにして修飾されるDNAは例えば、単一の修飾された核酸を使用することによって又は前記修飾された核酸を含むテスト核酸のコレクションを生成することによって活性を試験される。STAR配列内の機能的配列の説明は、遺伝子転写を調節する特性及び／又は遺伝子転写を抑制する特性を有するエレメントのためのコンセンサス配列の説明を可能にする。
【００８１】
表３及び／又は図６に記載されているようなSTAR配列の機能的フラグメントは例えば、前記配列若しくはそれらの任意の組み合わせの5’末端或いは3’末端からの又は内部からの欠損によって得られることができ、前記導出された配列は、種類において同一の活性（しかし、必ずしも量において同一ではない）を含む。
【００８２】
より好ましい実施態様では、表３及び／又は図６に記載された前記STAR配列が、STAR18、及び／又はその機能的等価体及び／又は機能的フラグメントである。
【００８３】
本発明に従う方法のさらに他の好ましい特性は、目的のタンパク質のオープンリーディングフレームと選択マーカーオープンリーディングフレームとの間への、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位の例としての（弱い）内部リボソーム結合性部位(IRES)の導入である。例えばSTAR配列との組み合わせにおいて、本発明のこの成分は、２又はそれ以上のタンパク質の発現のための形質転換における注目される改善を含む。
【００８４】
内部リボソーム結合性部位(IRES)エレメントは、ウィルスの及び哺乳類の遺伝子から知られ（マーチンツ−サラス、1999年）、及び小さな合成のオリゴヌクレオチドのスクリーンでまた識別された（ヴェンカテサン及びダスグプタ、2001年）。脳心筋炎ウィルスからのIRESは、詳細に分析された(ミズグチら、2000年)。IRESは、真核生物のリボソームが結合することができるところの転写されたRNA中の構造を生じそして翻訳を開始するDNA中にコードされたエレメントである。IRESは、２又はそれ以上のタンパク質が単一のRNA分子から生産されることを可能にする（第1のタンパク質は、その5'末端のキャップ構造でRNAを結合するリボソームによって翻訳される（マーチンツ−サラス、1999年）。IRESエレメントからのタンパク質の翻訳は、キャップ依存性翻訳よりも効率的でない：IRES依存性オープンリーディングフレーム（ORF）からのタンパク質の量は、第１のORFからの量の20%より下から50%までの範囲に及ぶ。これは、IRESエレメントを１つメッセンジャーRNA(mRNA)から多量体タンパク質のすべてのサブユニットを生産するために望ましくなくする。なぜならば、ビシストロニックな又はマルチシストロニックなmRNAから、２又はそれ以上のタンパク質モノマーの、バランスの取れた且つ比例した発現を達成することは可能でないからである。しかしながら、IRES依存性翻訳の減少された効率性は、本発明によって開発される有利点を提供する。その上、IRESエレメントの変異は、それらの活性を減じることができ、及びIRES依存性ORFからの発現を、第１のORFの10%より下に低くする(ロペッツ  デ  クイント及びマルチネス−サラス、1998年、リースら、1996年)。本発明によって開発された有利点は、次の通りである：IRES依存性ORFが選択可能なマーカータンパク質をコードする場合、翻訳のその低い相対的なレベルが、組み換え縮主細胞が選択されるべきために生じなければならないということを意味する。それ故に、選択された組み換え組み換え宿主細胞単離体は、必然的に導入遺伝子mRNAの高い量を発現するだろう。組み換えタンパク質が、キャップ依存性のORFから翻訳される故に、それは豊富に生産されることができて、高い製品収率を結果する。
【００８５】
IRESへの変更は、IRESの機能の本質を変更すること無しに行われることが出来（従って、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位を提供する）、修飾されたIRESを生じることは当業者に明らかである。それ故に、(5’キャップ翻訳と比較して)翻訳の小さなパーセントを提供することがなお可能である修飾されたIRESの使用はまた、本発明に含まれる。
【００８６】
さらに他の実施態様では、本発明は、2又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法、又は２又はそれ以上のタンパク質の発現が所定の割合である細胞を識別するための方法てあって、前記タンパク質発現ユニットの夫々は、別々のDNAキャリアー上に存在する方法を提供する。本発明は、各タンパク質及び／又は多量体タンパク質のモノマーについて別々の転写ユニットを優先的に使用する。各転写ユニットでは、モノマーORFは、効率的なキャップ依存翻訳によって生産される。本発明のこの特徴は、バランスの取れた及び多量体タンパク質の化学量論に比例するレベルで、各モノマーの高収率を有する組み換え宿主細胞が単離されることに寄与する。そのような組み換え宿主細胞が単離される増加された予測可能性は、そのような単離物のためのスクリーニングの効率の10倍又はそれ以上の改善を生じる。好ましい実施態様では、前記DNAキャリアーは、ベクター(又はプラスミド；該用語は本明細書では互換的に使用される)である。他の実施態様では前記ベクターがウィルスベクターであり、及びより好ましい実施態様では、前記ウィルスベクターがアデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターである。他のウィルスベクターがまた本発明に従う方法で使用されることが出来ることは当業者に明らかである。
【００８７】
慣用的な発現システムは、組み換えプラスミド又は組み換えウィルスのゲノムの形でのDNA分子である。プラスミド又はウィルスのゲノムは(哺乳類の宿主)細胞内に導入され、そして従来技術で知られている方法によってそれらのゲノム内に組み込まれる。本発明はまた、その改善された導入遺伝子発現システムを運ぶためにDNA分子のこれらのタイプを使用する。本発明の好ましい実施態様は、発現システムを運ぶためのプラスミドDNAの使用である。プラスミドは多くのコンポーネントを含む：従来技術で知られている慣用的なコンポーネントは、複製のオリジン及び細菌細胞中でのプラスミドの増殖のための選択可能なマーカー；組み込まれた導入遺伝子発現システムを運ぶ宿主細胞を識別し且つ単離するための真核細胞中で機能する選択可能なマーカー；その高いレベルの転写が、真核細胞中で機能的であるプロモーターによってもたらされる目的のタンパク質(例えば、ヒトサイトメガロウィルス主要先発型初期(major immediate early)プロモーター／エンハンサー、pCMV (ボシャルトら、1985年))；及び目的の導入遺伝子及び選択可能なマーカーのためのウィルスの転写ターミネーター（例えばSV40ポリアデニレーション部位(カウフマン及びシャープ、1982年)）である。
【００８８】
使用されたベクターは、DNAをクローニングするために適しており且つ転写システム中で使用されることができるところの任意のベクターでありうる。宿主細胞が使用される場合、ベクターがエピソーム的に複製するベクターであることが好まれる。このように、ベクターの組み込みの異なる部位による影響は、避けられる。組み込みの部位でベクターに隣接するDNAエレメントは、プロモーターの転写のレベルに効果を持つことができ、それによって、遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を含む破片の影響をまねる。好ましい実施態様では、前記ベクターはイプシュタイン−バール（Epstein-Barr）ウィルス（EBV）、OriP、及び核抗原（EBNA-1）からの複製起源を含む。そのようなベクターは、多くのタイプの真核細胞中で複製することができ及び適切な条件下でクロマチン内に組み入れられる。
【００８９】
好ましい実施態様では、本発明は、２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法或いは２又はそれ以上のタンパク質の発現が所定の割合であるところの細胞を得るための方法であって、２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットを用意することを含み、ここで目的の１つ又はそれ以上の前記タンパク質のための前記タンパク質発現ユニットの一つがイムノグロブリン重鎖をコードし及び／又は目的の１つ又はそれ以上の前記タンパク質のための前記タンパク質発現ユニットのもう１つがイムノグロブリン軽鎖をコードするところの方法を提供する。この実施態様に従い、多量体タンパク質(抗体)が得られる。１つのタンパク質発現ユニットからイムノグロブリン重鎖を発現し、他のタンパク質発現ユニットからイムノグロブリン軽鎖を発現し、第３のタンパク質発現ユニットが分泌コンポーネント又は接続チェーンをコードするところの細胞を提供することが可能であることは、当業者によって明らかである。この方法で例えば、sIgA及び五量体IgMの生産が提供される。
【００９０】
好ましくは、使用された宿主細胞は、生成された多量体を分泌する。このように、該生成物は、前記宿主細胞を囲む培地から容易に単離される。
【００９１】
より好ましくは、本発明は、機能的多量体の生産を生じる。生成された多量体の機能性は、標準手順で決定される。例えば、生成されたマルチサブユニット酵素は、対応する酵素的アッセイで試験され、又は抗原への結合（例えばELISAで）が、生成された抗体の機能性を試験するために使用される。
【００９２】
従って、多量体を発現する最終的な適切な宿主細胞の選択は、多量体の所望のサブユニト全てを発現する細胞の選択、引き続き前記多量体の機能的分析を含む、複数の工程に関与する。
【００９３】
多量体タンパク質に関して、該サブユニットの高い発現レベルは、前記サブユニットの機能的多量体タンパク質の形成と同様に望まれる。驚いたことに、多量体タンパク質のサブユニットの生産のためのSTAR配列の使用は、STAR配列無しの対照ベクターと比較して、サブユニットを発現する細胞の高い量を生じる。その上、対照と比較された場合、機能的多量体タンパク質の量は比較的、より高い。
【００９４】
サブユニットの生産、及びこれらサブユニットからの機能的多量体タンパク質の形成は、特に抗体の生産のために重要である。重鎖及び軽鎖発現カセットがSTAR配列によって隣接される場合、これは、STAR配列無しの対照ベクターと比較して、機能的抗体のより高い生産を生じる。従って、STAR配列の存在は、機能的抗体発現の予測可能性のより高い程度を生じる。好ましくは、各発現ユニットは、前記発現ユニットが少なくとも１つのSTAR配列によっていずれかの側で隣接されるように配置されるところの少なくとも２つのSTAR配列を含む。
【００９５】
さらに他の実施態様では、前記複数のタンパク質発現ユニットが前記細胞内に同時に導入される本発明に従う方法が提供される。
【００９６】
好ましくは、機能プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルス（CMV）プロモーター、シミアンウイルス（SV40）プロモーター、ヒトユビキチンCプロモーター又はヒト伸長因子１−アルファ（EF1-α）プロモーターである。
【００９７】
実施例の部で本明細書に記載されているように、STAR配列は、導入遺伝子発現ユニットにコピー数依存性を与えることができ、導入遺伝子発現を、タンデムアレイの他の導入遺伝子コピーから独立させ且つ組み込みの部位で遺伝子サイレンシング影響から独立させる。従って、本発明はまた、２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法或いは２又はそれ以上のタンパク質の発現が所定の割合であるところの細胞を識別するための方法であって、目的のタンパク質をコードするタンパク質発現ユニットの複数のコピーが前記細胞のゲノム内に組み込まれる（すなわち、その細胞内で、目的の遺伝子の増幅が存在する）ところの方法を提供する。
【００９８】
本発明のこの部分に従えば、複数のタンパク質発現ユニットは、従来技術で知られている方法によって、前記(宿主)細胞又は細胞のコレクション内に同時に導入される。組み換え宿主細胞は、従来技術で知られている方法を使用して、適切な抗生物質例えばG418で処理することによって選択される。個々の抗生物質耐性コロニーの形成後、他の抗生物質又は複数の抗生物質の組み合わせ（例えばゼオシンとブラスチシジンの組み合わせ）が適用され、そして抗生物質耐性コロニーが識別されそして単離される。これらは、導入遺伝子の発現のレベルを試験される。
【００９９】
他の実施態様では、本発明は、
−目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位と、選択マーカーとを含むビシストロニックな遺伝子と、ここで前記ビシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、
−少なくとも１つのSTAR配列と
を含むタンパク質発現ユニットを提供する。
【０１００】
より好ましい実施態様では、前記タンパク質発現ユニットは、第２の選択マーカーをコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子をさらに含み、前記モノシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある。
【０１０１】
さらにより好ましい実施態様では、前記タンパク質発現ユニットは、少なくとも２つのSTAR配列を含み、それらは、前記タンパク質発現ユニットが少なくとも１つのSTAR配列によっていずれかの側で隣接されているように配置されている。そのようなタンパク質発現ユニットの例は本特許出願の実施例の部内に提供されている(例えば、図１及び図５)。
【０１０２】
他の実施態様では、本発明に従うタンパク質発現ユニットは複数のSTAR配列を含み、前記複数のSTAR配列は本質的に同一である。
【０１０３】
他の実施態様では、本発明は、
−目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位と、選択マーカーとを含むビシストロニックな遺伝子と、ここで前記ビシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、
−少なくとも１つのSTAR配列と、及びモノシストロニックな遺伝子カセットを任意的に備えられ、ここで前記STAR配列は表３及び／又は図６に表現され、及び／又はそれらの機能的等価体及び／又は機能的フラグメントであり、及びさらにより好ましくは、前記STAR配列がSTAR18である、
を含むタンパク質発現ユニットを提供する。
【０１０４】
他の実施態様では、減少された翻訳効率を有する前記タンパク質翻訳開始部位が、内部リボソーム侵入部位（IRES：Internal Ribosome Entry Site）を含むところの本発明に従うタンパク質発現ユニットが提供される。より好ましくは、修飾された（例えばより弱い）IRESが使用される。
【０１０５】
さらに他の実施態様では、前記タンパク質発現ユニットがベクターであるところの本発明に従うタンパク質発現ユニットが提供される。好ましい実施態様では、前記DNAキャリアーがベクター（又はプラスミド；概用語は、本明細書中で互換的に使用される）である。他の実施態様では、前記ベクターがウィルスベクターであり、及びより好ましい実施態様では、前記ウィルスベクターが、アデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターである。他のウィルスベクターがまた、本発明に従う方法中で使用されうることは当業者にとって明らかである。
【０１０６】
好ましい実施態様では、目的の前記タンパク質がイムノグロブリン重鎖であるところの本発明に従うタンパク質発現ユニットが提供される。さらに他の好ましい実施態様では、目的の前記タンパク質がイムノグロブリン軽鎖であるところの本発明に従うタンパク質発現ユニットが提供される。これらの2つのタンパク質発現ユニットが同じ(宿主)細胞内に存在する場合、多量体タンパク質及びより特には抗体が組み入れられる。
【０１０７】
本発明は、STARを含むタンパク質発現ユニットを備えられた細胞を含む。
【０１０８】
本発明はまた、本発明に従う少なくとも1つのタンパク質発現ユニットを含む(宿主)細胞を含む。次に、そのような(宿主)細胞は例えば、大規模生産工程のために使用される。
【０１０９】
本発明はまた、本明細書中に記載されるような方法の何れかに従い得られうる細胞を含む。その上、本発明は、前記細胞から(例えば、タンパク質精製の工程を経て)得られうるタンパク質を含む。好ましくは、前記タンパク質は多量体タンパク質であり、及びさらにより好ましくは、前記多量体タンパク質が抗体である。そのような抗体は、薬学的及び／又は診断的適用において使用されることができる。
【０１１０】
前記議論及び次の実施例は、実例となる目的のために与えられ、及びそれらは、本明細書に請求されているような発明の範囲を制限することを意図されない。それらは、本発明の好ましい実施例のうちのいくつかを単に提供する。当業者の一人に生じうる修正及び変化は、本発明の意図された範囲内である。様々な他の実施態様は本発明に適用され：他の選択可能なマーカー遺伝子；他のIRESエレメント又はIRES活性を減少することの手段；プロモーター、エンハンサー、イントロン、ターミネーター及びポリアデニレーション部位を含む転写に影響する他のエレメント；モノシストロニックな及びビシストロニックな遺伝子の順序及び／又は配向；他の抗リプレッサーエレメント又はそれらの部分、誘導体及び／又は類似体；発明のDNA分子を真核宿主細胞内に運ぶための他のベクターシステム；及び他の形質転換システムへの発明の方法の適用を含む。
【０１１１】
実施例
【実施例１】
【０１１２】
STARエレメント及び２段階選択は、導入遺伝子発現の予測可能性を改善する
本発明の一つの目的は、２段階抗生物質選択手順を使用することによって異種タンパク質の生産のための導入遺伝子発現を改善することである。該２段階手順は、導入遺伝子を発現する組み換え宿主細胞株を見つけることの予測可能性を高いレベルまで増加し、従って、異種のタンパク質の収率を増加する。
【０１１３】
材料及び方法
プラスミド構築
プラスミドのpSDH-SIB/Z及びpSDH-GIB/Zファミリーは、次のようにして構築された:ゼオシン選択可能なマーカーは、プライマーE99及びE100(全てのPCRプライマー及び変異原生のオリゴヌクレオチド配列は、表１に記載される)を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応増幅(PCR)によってプラスミドpEM7/zeo(Invitrogen V500-20)から回収され、そしてpIRES(Clontech6028-1)のマルチクローニング部位(MCS)BのXbaI及びNotI内に指向的にクローニングされて、pIRES-zeoを作成した。ブラスチシジン選択可能なマーカーは、プライマーE84及びE85を使用してPCRによってプラスミドpCMV/bsd(Invitrogen V510-20)から回収され、そしてXbaI及びNotI内に指向的にクローニングされて、pIRES-bsdを作成した。SEAP(secreted alkaline phosphatase：分泌されたアルカリフォスファターゼ)レポーター遺伝子は、プライマーF11及びE87を使用してPCRによってプラスミドpSEAP2-basic(Clontech 6049-1)から回収され、そしてpIRES-zeo及びpIRES-bsdのMCS-A内に指向的にクローニングされて、プラスミドpIRES-SEAP-zeo及びpIRES-SEAP-bsdを生成した。GFPレポーター遺伝子は、NheI及びEcoRIでの制限消化によってプラスミドphr-GFP-1(Stratagene 240059)から回収され、そしてpIRES-zeo及びpIRES-bsdのMCS-A内に指向的にライゲーションされて、プラスミドpIRES-GFP-zeo及びpIRES-GFP-bsdを生成した。リンカーが、オリゴヌクレオチドF34及びF35を使用してAgeI部位を導入するために、これらのプラスミドの夫々のメチル化されていないClaI部位（ネオマイシン耐性マーカーの下流）で挿入された。
【０１１４】
pSDH-Tetベクターは、プライマーC67及びC68を使用しプラスミドpREP4-HSF-Luc(ファン  デル  フラッグら、2000年)からのルシフェラーゼオープンリーディングフレームのPCR、及びSacII/BamHIフラグメントをSacII/BamHI-消化されたpUHD10-3(ゴッセン及びビュヤード、1992年)内に挿入することによって構築された。ルシフェラーゼ発現ユニットはプライマーC65及びC66で再増幅され、そしてそれをマルチクローニング部位(MCSI及びMCSII)にそれを隣接するためにpUHDlO-3内に再挿入された。次に、AscI部位は、EcoRIでの消化、そして（アニールされたオリゴヌクレオチドD93及びD94を含む）リンカーの挿入によってMCSI内に導入された。CMVプロモーターは、ベクター pSDH-CMVを生成するために、プライマーD90及びD91を用いてプラスミドpCMV-Bsdから増幅され、そしてSalI/SacII消化及びライゲーションによりpSDH-Tet内のTet-Offプロモーターを置換するために使用された。このベクター中のルシフェラーゼオープンリーディングフレームは、次のようにしてSEAPによって置換された：ベクター pSDH-CMVは、SacII及びBamHIで消化され、そして平滑（blunt）にされた；SEAPオープンリーディングフレームは、ベクター pSDH-CSを生成するために、EcoRI/SAlI消化によってpSEAP−ベーシック（Clontech 6037-1）から単離され、平滑にされ、且つpSDH-CMV内にライゲーションされた。SV40プロモーターの制御下のピューロマイシン耐性遺伝子は、プライマーC81及びC82を使用し、PCRによってプラスミドpBabe-Puro（モルゲンスターン及びランド、1990年）から単離された。これは、pGL3-puroを生成するために、NcoI/XbaIで消化されたベクターpGL3-コントロール（BamHI部位が除去された）（Promega E1741）内にライゲーションされた。pGL3-puroは、SV-40-ピューロ耐性遺伝子を単離するためにBglII/SalIで消化されて、それは平滑にされ且つ、NheI消化された平滑末端（blunt-ended）pSDH-CS内にライゲーションされた。生じたベクターpSDH-CSPは、図２に示される。STAR18は、適切な制限酵素でSTARエレメント及びpSDH-CSPベクターを消化し、引き続きライゲーションによる２段階で、MCSI及びMCSII内に挿入された。STARエレメントの配向は、制限マッピングによって決定された。挿入物の同一性及び配向は、DNA配列解析によって検証された。配列決定は、製造者の指示書に従って、ベックマン（Beckman）CEQ2000自動化DNAシーケンサーを使用しジデオキシ方法（サンガーら、1977年）によって実行された。簡単にいうと、DNAは、QIAprep Spin Miniprep及びPlasmid Midi Kits（夫々QIAGEN 27106及び12145）を使用し大腸菌から精製された。サイクル配列決定が、染料ターミネーター（CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit、Beckman 608000）の存在下でカスタムオリゴヌクレオチドC85、E25及びE42（表１）を使用して、実行された。
【０１１５】
STARエレメントを含むpSDH-CSPプラスミドは、次のように修飾された：SEAP-IRES-zeo/bsdカセットを受け取るために、AgeI部位はオリゴヌクレオチドF32及びF33を使用し、BglII部位でリンカーの挿入で導入された；GFP-IRES-zeo/bsdカセットを受け取るために、AgeI部位はオリゴヌクレオチドF44及びF45を使用し、Bsu36I部位でリンカーの挿入で導入された。SEAP-IRES-zeo/bsdカセットは、Bsu36I/AgeIフラグメントを、pIRES-SEAP-zeo/bsdプラスミドからの対応するフラグメントで置換することによって、pSDH-CSP-STAR18プラスミド内に挿入された。GFP-IRES-zeo/bsdカセットは、BglII/AgeIフラグメントを、pIRES-GFP-zeo/bsdプラスミドからの対応するフラグメントでの置換によって、pSDH-CSP-STARプラスミド内に挿入された。生じたプラスミドファミリー、pSDH-SIB/Z及びpSDH-GIB/Zは、図３に示される。
【０１１６】
全てのクローニング工程は、従来技術で知られている方法（サムブルックら、1989年）に従い、使用される試薬の製造者によって提供される指示書に従い実行された。
【０１１７】
CHO細胞のトランスフェクション及び培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1（ATCC CCL-61）が、HAMS-F12培地＋2mMグルタミン、100U/mlペニシリン及び100マイクログラム/ml ストレプトマイシンを含む10%ウシ胎仔血清（Fetal Calf Serum）内で、37℃/5%CO2下で培養された。細胞は、製造者によって記載されたようにSuperFect（QIAGEN）を使用し、pSDH−SIZプラスミドでトランスフェクションされた。簡単に言えば、細胞は、培養容器に接種され且つ70〜90％コンフルエンスにまで一晩成長された。SuperFect試薬は、6マイクロリットル/マイクログラムの割合（例えば10cmペトリ皿に、20マイクログラムDNA及び120マイクロリットルSuperFect）でプラスミドDNAと一緒にされ、そして細胞に添加された。一晩のインキュベーション後、トランスフェクション混合物は、新鮮な培地で置き換えられ、及びトランスフェクションされた細胞はさらにインキュベートされた。一晩の培養後、細胞は新鮮な培養容器に接種され、そして500マイクログラム/ml ネオマイシンが添加された。ネオマイシン選択は3〜4日以内に完了した。次に、ゼオシン(100μg/ml)を含む新鮮な培地が添加され、そしてさらに培養された。4〜5日後、個々のクローンが単離され、そしてさらに培養された。レポーター遺伝子の発現は、トランスフェクション後、ほぼ3週間でSEAP活性を測定することによって評価された。
【０１１８】
SEAP（Secreted Alkaline Phosphatase）アッセイ
該クローンの培養培地中のSEAP活性（ベルゲルら、1988年；ヘンソルンら、1988年；カイン、1997年；ヤングら、1997年）は、製造者（Clontech Great EscAPe kit #K2041）によって記載されるように決定された。簡単に言えば、培地の分取物は、65℃で熱不活性化され、その後アッセイバッファー及びCSPD化学発光法基質と一緒にされ、そして室温で10分間インキュベートされた。その後、基質変換の速度は、照度計（luminometer）（Turner 20/20TD）において決定された。細胞密度は、Coulter ACT10細胞カウンターにおいてトリプシン化された細胞を算えることによって決定された。
【０１１９】
結果
ネオマイシン耐性遺伝子を発現させることができる初期形質転換体の増加された割合におそらくよって、pSDH-SIZ-STAR18発現ベクターのトランスフェクションは、エンプティpSDH-SIZベクターのトランスフェクションよりも、約10倍多いコロニーを一貫して生じた。典型的な実験の結果が表２に示され、その中でエンプティベクターのトランスフェクションは、〜100  G418-耐性コロニーを生じ、及びSTAR18ベクターのトランスフェクションは、〜1000コロニーを生じた。
【０１２０】
SEAPレポーター導入遺伝子の発現は、エンプティpSDH-SIZベクター(従って、STAR配列無し)とSTAR18ベクター(図４)との間で比較された。G418-耐性単離物の集団は、２つのセットに分けられた。第1のセットはG418のみで培養された(１段階選択)。このセッについて、サイレンシングから、導入遺伝子を保護するためのSTAR18の含有は、レポータータンパク質のより高い収率を生じた：分析された20個のクローン間の発現の最大のレベルは、STARエレメントのないクローンの最大の発現レベルより2〜3倍高かった。STAR18の含有はまた、増加された予測可能性をもたらした：STAR18クローンの25%より多くが、STAR無しクローン中で観察された最大の発現レベルよりも多い又は等しい発現レベルを有した。STAR18クローンのこの集団では、70%が、背景レベルより上の発現を有し、一方STAR無しクローンの50%のみが、背景レベルより上の発現を有した。
【０１２１】
STAR18の性能は、２段階選択において使用された場合よりもさらによかった。G418-耐性単離物の第２のセットが、ゼオシンで処理された。２段階選択体制で生き残ったクローンは、SEAPレポーター導入遺伝子の発現のために分析された。この場合また、STAR18エレメントは、STAR無しクローンと比べてほぼ3倍収率を増加した。予測可能性はまた、STAR18の含有によって増加された：集団の〜80%が、最も高く発現するSTAR無しクローンよりも多い発現レベルを有した。
【０１２２】
１段階選択が２段階選択と比較される場合、後者は、収率及び予測可能性の両方の点で優れていることが理解されることができる。実際、２段階選択では、クローンは発現の背景レベルで現われない。これは、ビシストロニックなSEAP-ゼオシン遺伝子の転写の高いレベルを有するという要求をゼオシン選択を生き残るクローンに課すゆえである。表２に示されているように、第２の抗生物質選択工程による低く生産するクローンの減少は、高く生産するクローンを見つけることの予測可能性を増加する；STAR18が発現ユニット内に含まれる場合、この増加された予測可能性は3倍から30倍改善される。要約すると、STARエレメントが２段階抗生物質選択と組み合わせて使用される場合、高収率の導入遺伝子を有するクローンを見つけることの予測可能性は劇的に改善される。２又はそれ以上の導入遺伝子へのこの増加された予測可能性の適用は、多量体タンパク質の高い収率を有するクローンを見つける可能性を同時に有意に増加するだろう。
【実施例２】
【０１２３】
２つのタンパク質の同時発現は、２段階選択及びSTARエレメントによって改善される。
本発明の第２の目的は、異種の多量体タンパク質例えば抗体の発現を改善することである。この実施例は、STARエレメント及び２段階抗生物質選択の組合せが、高い収率で2つの異種のポリペプチドのバランスの取れた且つ比例した量を発現する組み換え宿主細胞株を確立することの予測可能性を改善することを実証する。本発明のこの方法は、多量体タンパク質例えば抗体に実際上適用可能である。それは、2つのレポータータンパク質、SEAP(secreted alkaline phosphatase)及び緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用して、本実施例で実証される。
【０１２４】
材料及び方法
プラスミド
実施例１で記載されたプラスミドのpSDH-SIB/Z及びpSDH-GIB/Zファミリーが使用される。STARエレメントx及びyのクローニング、宿主細胞のトランスフェクション及び培養、並びにSEAPアッセイが、実施例１に記載される。GFPのためのアッセイは、製造者の指示書に従い行われる。
【０１２５】
結果
結果は、クローンの増加された数を示し、２つのレポータータンパク質が両方とも発現される。その上、発現は、そのようなクローンの多くの中でバランスを取られた。
【実施例３】
【０１２６】
複数のポリペプチドの同時発現のための一般目的ベクター
実施例１において試験され且つ検証された発現システムは、宿主細胞中の他のポリペプチド又は複数のポリペプチド(例えば、組み換え抗体の重鎖及び軽鎖)と好ましくは共発現される任意のポリペプチドへのその適用を容易にするために修飾された。それは、該発現ユニットの容易且つ迅速な構築のために設計される。この改善されたシステムは、本実施例中に記載される。
【０１２７】
材料及び方法
プラスミド
プラスミドPP1〜PP5の構築が以下に記載され、及びそれらのマップが図５に示される。プラスミドpd2EGFP(Clontech 6010-1)は、pd2EGFP-リンクを生成するために、BsiWI部位でリンカーの挿入によって修飾された。該リンカー(オリゴヌクレオチドF25及びF26をアニーリングすることによって作成された)は、PacI、BglII及びEcoRV制限エンドヌクレアーゼのための部位を導入する。これは、STARエレメントの挿入のためのマルチクローニング部位MCSIIを生成する。次に、プライマーF23及びF24が、pd2EGFPから0.37kbの領域を増幅するために使用され、それはpIRES-stufを生成するために、pIRES(Clontech 6028-1)のBglII部位内に挿入された。これは、MCSIで、AscI及びSwaI制限エンドヌクレアーゼのための部位を導入し、且つSTARエレメントと、近傍のプロモーターとの間で潜在的な干渉を避けるために「スタッファー(stuffer)フラグメント」として働く。pIRES-stufは、スタッファーフラグメント、CMVプロモーター、（マルチクローニング部位MCS A及び MCS Bによって隣接された）IRESエレメント、及びSV40ポリアデニレーションシグナルから成るDNAフラグメントを自由にするためにBglII及びFspIで消化された。このフラグメントは、pd2IRES-リンクを生成するために、BamHI及びStuIで消化することによって生成されたpd2EGFP-リンクのベクターバックボーンでライゲーションされた。
【０１２８】
ゼオシン−、ネオマイシン−又はピューロマイシン−耐性遺伝子のオープンリーディングフレームは、次のようにしてpd2IRES-リンク中のMCS BのBamHI/NotI部位内に挿入された：ゼオシン−耐性ORFは、pd2IRES-リンク-zeoを生成するために、PCRによってプラスミドpEM7/zeoからプライマーF18及びE100で増幅され、BamHI及びNotIで消化され、そしてBamHI/NotI-消化されたpd2IRES-リンクでライゲーションされた。ネオマイシン-耐性ORFは、pd2IRES-リンク-neoを生成するために、PCRによってpIRESからプライマーF19及びF20で増幅され、BamHI及びNotIで消化され、そしてBamHI/NotI-消化されたpd2IRES-リンクでライゲーションされた。ピューロマイシン-耐性ORFは、pd2IRES-リンク-puroを生成するために、PCRによってプラスミドpBabe-Puro(モルゲンステルン及びランド、1990年)からプライマーF21及びF22で増幅され、BamHI及びNotIで消化され、そしてBamHI/NotI-消化されたpd2IRES-リンクでライゲーションされた。
【０１２９】
GFPレポーターORFは、プラスミドPP1(図５Ａ)を生成するために、プライマーF16及びF17でのphr-GFP-1の増幅、そしてpd2IRES-リンク-puro プラスミドのMCS A中のEcoRI部位へのEcoRI-消化されたGFPカセットの挿入によって、pd2IRES-リンク-puro内に導入された。正確な配向は、制限マッピングによって検証された。SEAPレポーターORFは、プライマーF14及びF15でのpSEAP2-basicのPCR増幅、そして（プラスミドPP2(図５Ｂ)を生成するために）プラスミドpd2IRES-リンク-zeo及び（プラスミドPP3(図５Ｃ)を生成するために）pd2IRES-リンク-neoのMCS A中のEcoRI部位へのEcoRI-消化されたSEAPカセットの挿入によって、pd2IRES-リンク-zeo及びpd2IRES-リンク-neo内に導入された。正確な配向は、制限マッピングによって検証された。
【０１３０】
プラズミッドPP1、PP2及びPP3は、レポータータンパク質の発現のためのビシストロニックな遺伝子及び抗生物質耐性マーカーを含む。別々の抗生物質で２段階抗生物質選択を行なうために、モノシストロニックな耐性マーカーが、次のようにして導入された：pIRES-stufはClaIで消化され、クレノウ酵素で平滑にされ、そしてBglIIでさらに消化された。これは、スタッファーフラグメント、CMVプロモーター、（マルチクローニング部位MCS A及び MCS Bによって隣接された）IRESエレメント、SV40ポリアデニレーションシグナル及びSV40プロモーターの制御下のネオマイシン耐性マーカーから成るDNAフラグメントを自由にした。このフラグメントは、pd2IRES-リンク-neoを生成するために、BamHI及びStuIでの消化によって生成されたpd2EGFP-リンクのベクターバックボーンでライゲーションされた。次に、上記されたように、PP4(図５Ｄ)を生成するためにGFP及びpuroカセットが導入され、並びにPP5(図５Ｅ)を生産するために、SEAP及びzeoカセットが導入された。
【実施例４】
【０１３１】
予測可能性及び収率が発現システムにおけるSTARエレメントの適用によって改善される。
STARエレメントは、導入遺伝子発現ユニットに対する転写抑制機能の効果をブロックするために機能する。これらの抑制影響は、ヘテロクロマチン（「位置影響」、（ボイヴィン及びデュラ、1998年））に又は導入遺伝子の近傍のコピー（「反復導入された遺伝子サイレンシング（repeat-induced gene silencing）」、（ガーリックら、1998年））によりうる。タンパク質生成のためのSTARエレメントの２つの利点は、高発現性プライマリー組み換え宿主細胞を見い出すことの増加した予測可能性、及び生成サイクルの間の増加した収率である。これら利益は本実施例において示される。
【０１３２】
材料及び方法
pSDHベクター及びSTAR含有誘導体の構築：pSDH-Tetベクターは、プライマーC67及びC68を使用しプラスミドpREP4-HSF-Luc（ファン  デル  フラッグら、2000年）からのルシフェラーゼオープンリーディングフレームのポリメラーゼ連鎖反応増幅（PCR）（PCRプライマー及び突然変異オリゴヌクレオチドのすべてが表１にリストされている）、及びSacII/BamHIフラグメントをSacII/BamHI-消化されたpUHD10-3へ挿入すること（ゴッセン及びビュヤード、1992年）によって構築された。ルシフェラーゼ発現ユニットはプライマーC65及びC66で再増幅され且つそれを２つのマルチクローニング部位（MCSI及びMSCII）に隣接するためにpUHD10-3内に再挿入された。次に、AscI部位は、EcoRIでの消化及び（アニールされたオリゴヌクレオチドD93及びD94を含む）リンカーの挿入によってMCSI内に導入された。CMVプロモーターは、ベクター pSDH-CMVを生成するために、プライマーD90及びD91を用いてプラスミドpCMV-Bsd（Invitrogen K510-01）から増幅され及びSalI/SacII消化且つライゲーションによりpSDH-Tet内のTet-Offプロモーターを置換するために使用された。このベクターにおけるルシフェラーゼオープンリーディングフレームは、次のようにしてSEAP（Secreted Alkaline Phosphatase）によって置換された：ベクター pSDH-CMVは、SacII及びBamHIで消化されそして平滑（blunt）にされた：SEAPオープンリーディングフレームは、ベクター pSDH-CSを生成するために、EcoRI/SAlI消化によってpSEAP−ベーシック（Clontech 6037-1）から分離され、平滑にされ且つpSDH-CMV内にライゲーションされた。SV40プロモーターの制御下のピューロマイシン耐性遺伝子は、プライマーC81及びC82を使用し、PCRによってプラスミドpBabe-Puro（モルゲンスターン及びランド、1990年）から単離された。これは、pGL3-puroを生成するために、NcoI/XbaIで消化されたベクターpGL3-コントロール（BamHI部位が除去された）（Promega E1741）内にライゲーションされた。pGL3-puroは、SV-40-ピューロ耐性遺伝子を分離するためにBgｌII/SalIで消化されて、それは平滑にされ且つ、NheI消化された、平滑末端（blunt-ended）pSDH-CS内にライゲーションされた。生じたベクターpSDH-CSPは、図７に示される。全てのクローニングステップは、従来技術で知られている方法（サムブルックら、1989年）に従い、試薬の製造者によって提供される指示書に従い実行された。
【０１３３】
STARエレメントは、適切な制限酵素でSTARエレメント及びpSDH-CSPベクターを消化し、引き続きライゲーションすることによる２段階で、MCSI及びMCSII内に挿入された。組み換えられたpSDHベクターにおけるSTARエレメンントの配位は、制限マッピングによって決定された。挿入物の識別及び配位は、DNA配列解析によって検証された。配列決定は、製造者の指示書に従って、ベックマン（Beckman）CEQ2000自動化DNAシーケンサーを使用しジデオキシ方法（サンガーら、1977年）によって実行された。簡単にいうと、DNAは、QIAprep Spin Miniprep及びプラスミド ミディ（Midi）キット（夫々QIAGEN 27106及び12145）を使用し大腸菌から精製された。サイクル配列決定が、染料ターミネーター（CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit、Beckman 608000）の存在下でカスタムオリゴヌクレオチドC85、E25及びE42（表１）を使用して、実行された。
【０１３４】
pSDHプラスミドを有するCHO細胞のトランスフェクション及び培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1（ATCCCCL-61）が、HAMS-F12培地＋2mMグルタミン、100 U/mlペニシリン及び100マイクログラム/ml ストレプトマイシンを含む10%ウシ胎仔血清（Fetal Calf Serum）内で、37℃/5%CO2下で培養された。細胞は、製造者によって記載されたようにSuperFect（QIAGEN）を使用し、pSDH−CSPベクター及び、MCSI及びMSCIIにおいてSTAR6又はSTAR49を含むその誘導体でトランスフェクションされた。簡単に言えば、細胞は、培養容器に接種され、そして70〜90％コンフルエンスにまで一晩成長された。SuperFect試薬は、6マイクロリットル/マイクログラムの割合（例えば10cmペトリ皿に、20マイクログラムDNA及び120マイクロリットルSuperFect）で（PvuIでの消化によって本実施例において線形化された）プラスミドDNAと一緒にされ、且つ細胞に添加された。一晩のインキュベーション後、トランスフェクション混合物は、新鮮な培地で置き換えられ、及びトランスフェクションされた細胞はさらにインキュベートされた。一晩の培養後、5マイクログラム/ml ピューロマイシンが添加された。ピューロマイシン選択は2週間内に完了し、その後個々のピューロマイシン耐性CHO/pSDH-CSPクローンがランダムに分離されそしてさらに培養された。
【０１３５】
SEAP（Secreted Alkaline Phosphatase）アッセイ
CHO/pSDH-CSPクローンの培養培地におけるSEAP活性（ベルゲルら、1988年；ヘンソルンら、1988年；カイン、1997年；ヤングら、1997年）は、製造者（Clontech Great EscAPe kit #K2041）によって記載されるように決定された。簡単に言えば、培地の分取は、65℃で熱不活性化され、その後アッセイバッファー及びCSPD化学発光法基質と一緒にされ、そして室温で10分間インキュベートされた。その後、基質変換の速度は、照度計（luminometer）（Turner 20/20TD）において決定された。細胞密度は、Coulter ACT10細胞カウンターにおいてトリプシン化された細胞を算えることによって決定された。
【０１３６】
pSDHプラスミドを有するU-2 OS細胞のトランスフェクション及び培養
ヒト骨肉腫U-2 OS細胞株（ATCC #HTB-96）がダルベッコMEM培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）+グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン（上述）を含む10%ウシ胎仔血清内で、37℃/5%CO2下で培養された。細胞は、SuperFect（上述）を使用し、（プラスミドpBabe-Puroとともに）pSDH-CMVベクター及び、MCSI及びMSCIIにおいてSTAR6又はSTAR8を含むその誘導体で同時トランスフェクションされた。ピューロマイシン選択は2週間内に完了し、その後個々のピューロマイシン耐性U-2 OS/pSDH-CMVクローンがランダムに分離されそしてさらに培養された。
【０１３７】
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼ活性（ヒメス及びシャノン、2000年）が、照度計（Turner 20/20TD）を使用し、アッセイキット製造者の指示書（Roche 1669893）に従い、再懸濁された細胞においてアッセイされた。合計細胞タンパク質濃度は、製造者の指示書（Sigma B-9643）に従いビシンコニン酸（bicinchonic acid）方法によって決定され、且つルシフェラーゼデータを正規化するために使用された。
【０１３８】
結果
pSDH-CSPベクター又はSTAR6若しくはSTAR49を含むpSDH-CSPプラスミド（表６）を含む組み換えCHO細胞クローンは、3週間培養された。その後、培養上清におけるSEAP活性が決定され、且つ細胞数に基づき表わされる（図8）。見られうるように、発現ユニットにおいてSTARエレメントを有するクローンは分離され、それはSTARエレメントを含まない発現ユニットのクローンよりも2〜3倍高いSEAP活性を発現する。その上、STARのないクローンの最大の活性の又はそれより上のSEAP活性を発現するSTAR含有クローンの数は、かなり高い：STARクローン集団の25%〜40%がpSDH-CSPクローンの最高SEAP発現を超える。
【０１３９】
pSDH-CMVベクター又は、STAR6若しくはSTAR8（表６）を含むpSDH-CMVプラスミドを含む組み換えU-2 OS細胞クローンは、3週間培養された。その後、宿主細胞内のルシフェラーゼ活性が決定され且つ総細胞タンパク質に正規化された相対ルシフェラーゼ単位（図９）として表現される。発現ユニットに隣接するSTARエレメントを有する組み換えU-2 OSクローンは、STARのないクローンよりもより高い収率を有した：STAR8クローンから観察された最高の発現は、STARのないクローンからの発現よりも2〜3倍高かった。STAR6クローンは、STARのないクローンよりも5倍高い最大の発現レベルを有した。STARエレメントは同様により高い予測可能性を与えた：両方のSTARエレメントについて、クローンの15〜20％が、最高の発現レベルを有するSTARのないクローンと類似の又はそれよりも大きいレベルでルシフェラーゼ発現を示した。
【０１４０】
これらの結果は、強いCMVプロモーターとともに使用される場合、STARエレメントは異種のタンパク質（ルシフェラーゼ及びSEAP）の収率を増加することを示す。本実施例において導入された3つの全てのSTARエレメントは、高められた収率を提供する。STARエレメントによって与えられた増加した予測可能性は、STARなしのクローンによって示された最高の収率と等しいか又はそれよりも大きい収率を有するクローンの大きい割合によって明らかにされた。
【実施例５】
【０１４１】
STARエレメントは導入遺伝子発現の安定性を改善する
組み換えられた宿主細胞の培養の間、抗生物質の選択を維持することは通常のプラクティスである。これは、導入遺伝子の転写的サイレンシング又は組み換えのような工程によってゲノムからの導入遺伝子の損失を防ぐことを目的とされる。しかしながら、それは異種のタンパク質の生産にとって多くの理由のために望ましいものではない。第1に、使用される抗生物質はとても高価であり、生産物の単位コストに重大な寄与をする。第2に、生物薬剤的な使用の点から、タンパク質は、明らかに純粋でなければならず、生成物に抗生物質の痕跡があってはならない。異種のタンパク質生産のためのSTARエレメントの一つの利点は、抗生物質選択の不存在下であっても、それらは、長期の培養の間、導入遺伝子に対して安定な発現を与えるということである：この特性は、本実施例で示される。
【０１４２】
材料及び方法
U-2 OS細胞株は、プラスミドpSDH-Tet-STAR6でトランスフェクションされ、且つ実施例４に記載されているように培養された。個々のピューロマイシン耐性クローンが分離され、かつドキシサイクリンの存在なしにさらに培養された。週間隔で、1:20の希釈率で細胞は新しい培地容器に移された。ルシフェラーゼ活性は、実施例１１に記載されているように定期的な間隔で測定された。15週間後、培養物は２つの複製に分けられた：一つの複製はピューロマイシンを受け続け、一方他の複製は実験の残りにおいて抗生物質を受けなかった（25週間合計）。
【０１４３】
結果
表７は、抗生物質あり又はなしで、長期にわたる成長の間、STAR6に隣接された発現ユニットによるルシフェラーゼ発現についてのデータを表わす。見られうるように、レポーター導入遺伝子、ルシフェラーゼの発現は、実験の持続の間、U-2 OS宿主細胞において安定に保持される。該培養物が２つの処理（抗生物質をプラスと抗生物質なし）に分けられた後、ルシフェラーゼの発現は、抗生物質選択の不存在下で基本的に安定であった。これは、長期に渡る培養の間、サイレンシング又は損失から導入遺伝子を防ぐためのSTARエレメントの能力を示す。それは、この特性は抗生物質選択から独立であることをまた示す。それ故に、異種のタンパク質の生産は、抗生物質の又は難しい下流の処理の費用を生じることなしに可能である。
【実施例６】
【０１４４】
STARエレメントの最小必須配列
STARエレメントは本明細書に記載された遺伝子スクリーンから分離される。該スクリーンは、ほぼ0.5〜２キロ塩基（上述）にサイズ分画されたヒトゲノムDNAで構築されたライブラリーを使用する。該STARエレメントは、500から2361塩基対の範囲である（表６）。分離されている多くのSTARエレメントにとって、STAR活性は当初分離されたクローンよりも小さいDNAフラグメントによって与えられるようである。STAR活性にとって必須であるこれらの最小のフラグメントサイズを決定することは、2つの理由で有用である。第１に、より小さい機能的STARエレメントは、コンパクトな発現ベクターの設計に有利であり、なぜならばより小さいベクターが、より高い効力で宿主細胞をトランスフェクションするからである。第２に、最小必須のSTAR配列を決定することは、助長された機能性のそれらの配列の変性を許容する。２つのSTAR配列は、それらの最小必須配列を決定するために詳細マッピングされる。
【０１４５】
材料及び方法
STAR10（1167塩基対）及びSTAR27（1520塩基対）が、詳細マッピングされた。それらはPCRによって増幅され、ほぼ等しい長さ（図１０説明）のサブフラグメントを与えた。初期のテストのために、これらは、BamHI部位でpSelectベクター内にクローニングされ、且つU-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1細胞内にトランスフェクションされた。宿主株の構築は、記載されている（ファン  デル  フラッグら、2000年）。手短に言えば、それらはU-2 OSヒト骨肉腫細胞株（American Type Culture Collection HTB-96）に基づく。U-2 OSは、Tet-リプレッサーDNA結合性ドメイン及びVP16転写促進ドメインから成るタンパク質キメラをコードするpTet-Offプラスミド（Clontech K1620-A）で安定にトランスフェクションされる。該細胞株は次に、LexA DNA結合性ドメイン、及びHP1又はHPC2（DNAにつながれた場合に遺伝子発現を抑制する２つのショウジョウバエ  ポリコーム−グループタンパク質）のいずれかのコード領域を含む融合タンパク質遺伝子で引き続き安定的にトランスフェクションされる。LexA-リプレッサー遺伝子は、Tet-Off転写的調整システムの制御下にある（ゴッセン及びビュヤード、1992年）。ハイグロマイシン耐性について選択の後、LexA-HP1がドキシサイクリン濃度を低くすることによって導出された。その後、トランスフェクションされた細胞は、LexA−HP1結合による抑制からSV40−Zeo発現ユニットを保護するためのSTARフラグメントの能力をテストするために、ゼオシンとともにインキュベーションされた。
【０１４６】
結果：
この実験では、STAR10及びSTAR27は、予想されたように遺伝子サイレンシングに対して良い保護を与える（図１０）。これは、ゼオシンの存在下における強力な成長によって表わされる。
【０１４７】
3個のSTAR10サブフラグメントのうち、10A（〜400塩基対）は、トランスフェクションされた細胞に対してゼオシンの存在下における活発な成長を与え、これは完全長STARエレメントのそれを超える。他の2個のサブフラグメントを含むpSelect構築物でトランスフェクションされた細胞は、ゼオシンの存在下で成長しない。これらの結果は、STAR10の抗リプレッサー活性に責任のあるDNA配列を包含するとして、〜400塩基対10Aフラグメントを識別する。
【０１４８】
STAR27は、本実験においてトランスフェクションされた細胞に対して、ゼオシン中での中庸の成長を与える。このSTARのサブフラグメントの一つ、27B（〜500塩基対）は、ゼオシン含有培地において宿主細胞の弱い成長を許容する。これは、このSTARの抗リプレッサー活性がサブフラグメント27B上に部分的に局地化されるが、完全な活性は同様に27A及び/又は27C（夫々〜500塩基対）からの配列を要求することを示す。
【実施例７】
【０１４９】
培養された哺乳動物細胞の多様な株におけるSTARエレメント機能
（異種の）タンパク質発現のための宿主細胞株の選択は、タンパク質の質、収率及び単位コストのために重要なパラメータである。考慮例えばポスト翻訳変性、分泌経路能力及び細胞株不死は、特定の生物薬剤的な生成システムのために適切な細胞株を指示する。この理由のために、収率、予測可能性及び安定性の観点においてSTARエレメントによって与えられる利点は、多様の細胞株において取得可能であるべきである。これは、それが元々クローニングされているところのヒトU-2 OS細胞株、及びバイオテクノロジーにおいて広く適用されているCHO細胞株におけるSTAR6の機能を比較することによって試験された。
【０１５０】
材料及び方法
実施例４の実験が参照される。
【０１５１】
結果
CHO細胞内のSEAPレポーター遺伝子の発現は、図8に表わされている；U-2 OS細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現は、図９に示される。これらの2つの実験の結果の比較によって、STAR6エレメントは、両方の細胞株において機能することは明らかである：レポーター遺伝子発現はそれらの両方においてより予測可能であり、及び該レポーター遺伝子がSTAR６による位置効果から保護される場合、各細胞株のクローンはより高い収率を示した。これらの２つの細胞株は、異なる種（ヒト及びハムスター）並びに異なる組織型（骨及び卵巣）から得られ、このSTARエレメントが異種のタンパク質発現を改善する際にその中で利用されうるところの宿主細胞の広い範囲を反映する。
【実施例８】
【０１５２】
種々の転写プロモーターとの関係におけるSTARエレメント機能
導入遺伝子転写は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを外来のプロモーターの制御下に置くことによって達成される。プロモーターの選択は、（異種の）タンパク質の性質及び生成システムによって影響される。ほとんどの場合、強い構造的プロモーター（constitutive promoter）は、それらが提供できる高い収率の故に好まれる。幾つかのウィルスプロモーターは、これらの特性を有する；CMV-IEG（cytomegalovirus immediate early gene）のプロモーター／エンハンサー（「CMVプロモーター」）は、通常の生物化学的な使用において最強のプロモーターであると一般にみなされている（ボシャルトら、1985年；ドールら、1996年；フェッキング及びホフステッテル、1986年）。シミアンウィルスSV40プロモーターもまた、中庸に強力であり（ボシャルトら、1985年；フェッキング及びホフステッテル、1986年）、且つ哺乳動物細胞ベクターにおける異所性の発現のためにしばしば使用される。Tet-Offプロモーターは導出可能である：該プロモーターは、tTAプラスミド（Clontech K1620-A）を発現する細胞株においてテトラサイクリン又は関連する抗生物質（ドキシサイクリンが通常使用される）の存在下で抑制され、抗生物質の除去は転写的誘発を生じる（ドイシュレら、1995年；ゴッセン及びビュヤード、1992年；イズミ及びギルバート、1999年；ウマナら、1999年）。
【０１５３】
材料及び方法：
pSDH-Tet及びpSDH-CMVベクターの構築が、実施例４に記載されている。pSDH-SV40は、とりわけ、pSelect-SV40-Zeoから得られる。STARエレメントのための選択ベクター、pSelect-SV40-zeoは次のようにして構築される：pREP4ベクター（Invitrogen V004-50）が、プラスミドバックボーンとして使用される。それは、霊長類の細胞株における高いコピーのエピソーマル複製のために、複製のイプシュタイン（Epstein）バール（Barr）oriPオリジン及びEBNA-1核性抗原を提供し、；哺乳動物細胞における選択のために、チミジンキナーゼプロモーター及びポリアデニレーション部位を有するハイグロマイシン（hygromycin）耐性遺伝子を提供し；及びアンピシリン耐性遺伝子及び大腸菌における維持のための複製のcolE1オリジンを提供する。ベクターは、XbaI及びNheI制限部位の間に４つの連続したLexAオペレーター部位を含む（ブンケル及びキングストン、1994年）。LexAオペレーターとNheI部位の間に、次の制限部位から成るポリリンカーが埋め込まれる；HindIII-AscI-BamHI-AscI-HindIII。NheI部位とSalI部位の間に、SV40プロモーター及びポリアデニル化部位を有するゼオシン耐性遺伝子があり、それはpSV40/Zeo（Invitrogen V502-20）から導出される；これは、STARスクリーンのための選択可能なマーカーである。
【０１５４】
pSDH-SV40は、プラスミド pSelect-SV40-ZeoからのSV-40プロモーター（プライマー D41及びD42）のPCR増幅、引き続くSacII及びSalIでPCR生成物の消化によって構築された。pSDH-CMVベクターは、CMVプロモーターを除去するためにSacII及びSalIで消化され、且つベクター及びSV40フラグメントはpSDH-SV40を生成するためにともにライゲーションされた。STAR6は実施例４で記載されたようにMCSI及びMCSII内にクローニングされた。プラスミド pSDH-Tet、pSDH-Tet-STAR6、pSDH-Tet-STAR7、pSDH-SV40及びpSDH-SV40-STAR6は、製造者によって記載されたようにSuperFectを使用し、U-2 OS内にpBabe-Puroで同時にトランスフェクションされた。細胞培養、ピューロマイシン選択及びルシフェラーゼアッセイは、実施例４に記載されているように実施された。
【０１５５】
結果：
図９、１１及び１２は、下記の3つの異なるプロモーターからのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を比較する：2つの強く且つ構造的なウィルスプロモーター（CMV及びSV40）、及び導出可能なTet-Offプロモーター。全ての3つのプロモーターは、U-2 OS細胞においてSTAR6エレメントとの関連においてテストされた。結果は、全ての3つのプロモーターからの収率及び予測可能性は、STAR6によって増加されることを示す。実施例４及び７に記載されているように、STAR6はCMVプロモーターの関連において有益である（図９）。同様の改善が、SV-40プロモーターとの関連において見られる（図１１）：最高発現するSTAR6クローンからの収率は、最良のpSDH-SV40クローンよりも２〜３倍良く、且つ6個のSTARクローン（集団の20%）は最良のSTARのないクローンよりも高い収率を有する。導出すする（低いドキシサイクリン）濃度下でTet-Offプロモーターの関連において、STAR6は導入遺伝子発現の収率及び予測可能性をまた改善する（図１２）：最高発現するSTAR6クローンは、最良のpSDH-Tetクローンよりも20倍高い収率を有し、及び9個のSTAR6クローン（集団の35％）は、最良のSTARのないクローンよりも高い収率を有する。このSTARエレメントはその導入遺伝子を保護する特性において多様的であり、なぜならばそれは、転写の様々なバイオテクノロジー的に有益な転写プロモーターとの関連において機能するからであると結論される。
【実施例９】
【０１５６】
STARエレメント機能は方向性でありうる
短い核酸配列が対称（例えば回文）でありうるのに対して、より長い自然に生じる配列は典型的には非対称である。結果として、核酸配列の情報内容は方向性であり、且つ配列自体はそれらの5’及び3’末端に関して記載されうる。核酸配列情報の方向性は、組み換えDNA分子が当業者に知られている標準クローニング技術（サムブルックら、1989年）を使用して組み立てられるところの準備に影響を与える。STARエレメントは、長く、非対称的なDNA配列であり、且つそれらがpSelectベクターにおいて元々クローニングされた配向に基づく方向性を有する。上記された実施例では、pSDHベクターにおける2つのSTARエレメントを使用し、この方向的に保持された。この配向は、ゼオシン耐性遺伝子に相対的に、自然の又は5’-3’ 配向として記載される（図１３参照）。この実施例では、STAR機能のための方向性の重要性が、pSDH-Tetベクターにおいてテストされる。pSDHベクターにおけるレポーター遺伝子は目的のSTARエレメントのコピーによって両方の側で隣接される故に、各STARコピーの配向が考慮されなければならない。この実施例は、自然の配向を逆の配向と比較する（図１３）。
【０１５７】
材料及び方法：
STAR66エレメントは、実施例４に記載されているようにpSDH-Tet内にクローニングされた。U-2 OS細胞は、プラスミド pSDH-Tet-STAR66- native及びpSDH-Tet-STAR66- oppositeで同時トランスフェクションされ、実施例記載のように培養された。夫々のクローンは分離され、そして培養された；ルシフェラーゼ発現のレベルは、記載されたように（上述）決定された。
【０１５８】
結果：
自然の配向及び逆の配向におけるSTAR66活性の比較の結果が、図１４に示される。STAR66が逆の配向にある場合、一つのクローンのみの収率がかなり高い（60ルシフェラーゼ単位）。その一方、STAR66が自然の配向にある場合の最高発現クローンの収率はかなり高く（100ルシフェラーゼ単位）、且つ予測可能性は同様にはるかに高い：自然配向の集団の7個（30%）のクローンが、逆配向の集団からの最高発現クローンのレベルより上のルシフェラーゼを発現し、且つ自然配向の集団の15個（60％）のクローンが、10相対的ルシフェラーゼ単位よりも上のルシフェラーゼを発現する。それ故に、STAR66機能は方向性であることが示される。
【実施例１０】
【０１５９】
STARエレメントとの関連における導入遺伝子の発現はコピー数依存性である
異質タンパク質発現のための導入遺伝子発現ユニットは、細胞分割の間の安定な保存を保証するために宿主細胞のゲノム内に一般的に組み込まれる。組み込みは、ゲノム内に挿入された発現ユニットの一つ又は複数のコピーを生じうる：複数のコピーはタンデムアレイとして存在するか又は存在しない。STARエレメントによって保護された導入遺伝子のために示された増加した収率（上述）は、STARエレメントは導入遺伝子発現ユニットがゲノム内の組み込みの部位に関連付けられた転写への影響に独立的に機能することを許容する（位置効果からの独立性（ボイヴィン及びデュラ、1998年））ことを示す。それは、STARエレメントは各発現ユニットが、それらがタンデムアレイとして組み込まれた場合に、発現ユニットの近傍するコピーに独立的に機能することを許容することをさらに示唆する（反復導出された遺伝子サイレンシングからの独立性（independence from repeat-induced gene silencing）（ガーリックら、1998年））。コピー数依存性は、下記の実施例で記載されるように導入遺伝子発現レベル及びコピー数の間の関係から決定される。
【０１６０】
材料及び方法：
U-2 OS細胞は、pSDH-Tet-STAR10で同時トランスフェクションされ、そして記載されたように（上述）ピューロマイシン選択下で培養された。8個の個々のクローンが分離され、そしてさらに培養された。その後、細胞は収穫され、そして一つの部分は、記載したように（上述）ルシフェラーゼ活性を試験された。残った細胞は溶解され、そしてゲノムDNAはDNeasy Tissue Kit（QIAGEN 69504）を使用し製造者によって記載されたように精製された。DNAサンプルは、UV分光測定法によって数値化された。3マイクログラムの各ゲノムDNAサンプルが、製造者によって記載されたように（New England Bioabs）一晩PvuII及びXhoIで消化され、そしてアガロースゲル電気泳動法によって分離された。DNAフラグメントは、記載されたように（サムブルックら、1989年）ナイロン膜に移され、そして（BamHI/SacII-消化されたpSDH-Tetから分離された）ルシフェラーゼ遺伝子に対する放射活性的にラベル化されたプローブとハイブリダイズされた。ブロット（blot）は、記載されたように（サムブルックら、1989年）洗われ、そしてフォスファーイメージャースクリーン（Personal F/X,BioRad）にさらされた。生じたオートラジオグラム（図１５）はルシフェラーゼDNAバンドの相対強度を決定するために、デンシトメトリーによって解析され、それは導入遺伝子コピー数を表わす。
【０１６１】
結果：
pSDH-Tet-STAR10クローン集団からのコロニーにおけるルシフェラーゼの酵素活性及びコピー数（DNAバンド強度）が、図１６に示される。導入遺伝子コピー数は、これらのpSDH-Tet-STAR10クローンにおけるルシフェラーゼ発現のレベルに高く相関されている（r=0.86）。このことは、STAR10が導入遺伝子発現ユニットに対してコピー数増加依存性を与え、導入遺伝子発現をタンデムアレイにおける他の導入遺伝子コピーに独立に及び組み込みの部位における遺伝子サイレンシング影響に独立にする。
【実施例１１】
【０１６２】
STARエレメントはエンハンサーブロッカーとして機能し、しかしエンハンサーとして機能しない
遺伝子プロモーターは、転写を開始するためのそれらの能力に対してポジティブな及びネガティブな影響の両方に付される。ポジティブな影響を働かせるエレメントの重要な分類は、エンハンサーである。エンハンサーは、それらが遠くに配置された場合（多くのキロ塩基対）にでさえ、プロモーターに影響を特徴的に与えることができる。ヘテロクロマチン形成（例えばポリコーム  グループタンパク質）によって作用するネガティブな影響は上記に記載されており、且つそれらはSTAR活性のターゲットである。エンハンサー機能のための及びヘテロクロマチン形成のための生化学的な基礎は、基本的に類似しており、なぜならばそれらはいずれも、DNAに対するタンパク質の結合に関係するからである。それ故に、STARエレメントがネガティブ影響ならびにポジティブ影響をブロックすることができるか、換言すれば組み込みの部位の近傍におけるゲノム的エンハンサーからの導入遺伝子を保護することができるかどうかを決定することが重要である。エンハンサー活性からの導入遺伝子を保護する能力は、バイオテクノロジーの用途において導入遺伝子の安定な且つ予測可能な能力を保証する。この実施例は、エンハンサーブロッキングアッセイにおけるSTARエレメントの能力を検査する。
【０１６３】
それらの機能に対して重要であるところのSTAR活性の他の特徴は、それらが導入遺伝子に対して与える増加した収率である（実施例４）。ヘテロクロマチン形成タンパク質が候補STARエレメントの近傍に結合される場合、複数のSTARがゼオシン発現の高いレベルを維持するそれらの能力に基づき分離される。複数のSTARはゼオシン発現ユニット内へのヘテロクロマチンの拡散をブロックすることが予測される故に、高い発現が生じると予測される。しかしながら、第２のシナリオは、ゼオシン耐性クローンにおけるDNAフラグメントがエンハンサーを含むことである。エンハンサーは、ポリコーム−グループタンパク質例えばSTARスクリーンの方法において使用されるそれらの抑制効果を克服する能力を有することが示されている（チンク及びパロ、1995年）。この現象によって分離されたエンハンサーは、偽のポジティブとみなされ、なぜならばエンハンサーはSTARのために本明細書中に請求された特性を有しないからである。STARエレメントがエンハンサーでないことを示すために、それらはエンハンサーアッセイにおいて試験された。
【０１６４】
エンハンサーブロッキングアッセイ及びエンハンサーアッセイは、方法論的に及び概念的に類似である。これらアッセイは、図１７において図式的に示される。エンハンサーをブロックするSTARエレメントの能力は、E47/E-boxエンハンサーシステムを使用し実行される。E47タンパク質は、それがプロモーターの近傍に配置されたE-box DNA配列に結合されている場合、該プロモーターによる転写を活性化することができる（クォングら、2002年）。E47は、B及びTリンパ球分化の制御に通常関係する（クォングら、2002年）が、しかしそれは異所的に発現した場合、多様な細胞型において機能することが可能である（ピーターソンら、2002年）。E-boxは回文的DNA配列、CANNTGである（クノフラーら、2002年）。エンハンサーブロッキングアッセイにおいて、E-boxは、発現ベクターにおいて（最小プロモーターを含む）ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に配置される。STARエレメントのためのクローニング部位は、E-boxと該プロモーターとの間に配置される。E47タンパク質は、第2のプラスミド上にコードされる。アッセイは、E47プラスミド及びルシフェラーゼ発現ベクターの両方を細胞内にトランスフェクションすることによって実行される：E47タンパク質は、発現され且つE-boxに結合され、及びE47/E-box複合体はエンハンサーとして作用することができる。ルシフェラーゼ発現ベクターがSTARエレメントを含まない場合、E47/E-box複合体はルシフェラーゼ発現を助長する（図１７Ａ、状況１）。STARエレメントがE-boxとプロモーターとの間に挿入された場合、エンハンサーをブロックするそれらの能力が、ルシフェラーゼ活性の低減した発現によって示される（図１７Ａ、状況２）；STARがエンハンサーをブロックできない場合、ルシフェラーゼ発現は活性化される（図１７Ａ、状況３）。
【０１６５】
エンハンサーとして作用するSTARエレメントの能力は、同一のルシフェラーゼ発現ベクターを利用する。E47の不存在において、E-boxそれ自身は転写に影響を与えない。代わりに、STARエレメントによるエンハンサー行動は、ルシフェラーゼ転写の活性化を結果する。アッセイは、E47プラスミドなしにルシフェラーゼ発現ベクターをトランスフェクションすることによって実行される。発現ベクターがSTARエレメントを含まない場合、ルシフェラーゼ発現は低い（図１７Ｂ、状況１）。STARエレメントがエンハンサー特性を有しない場合において、STARエレメントがベクター内に存在するときルシフェラーゼ発現は低い（図１７Ｂ、状況２）。STARエレメントがエンハンサー特性を有する場合、ルシフェラーゼ発現はSTAR含有ベクターにおいて活性化される（図１７Ｂ、状況３）。
【０１６６】
材料及び方法：
ルシフェラーゼ発現ベクターは、ｐGL3-E-boxルシフェラーゼ（W.Romanowのギフト）を生成するために、E-boxを及び、プラスミド mu-E5+E2x6-cat(x)（ルエジンスキーら、1991年）からのヒトアルカリ性フォスファターゼ最小プロモーターを、プラスミドｐGL3-basic（Promega E1751）においてルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入することによって構築される。E47発現プラスミドは、pHBApr-1-neoプラスミドにおいてベータ−アクチンプロモーターの制御下でE47オープンリーディングフレームを含む；E47は構造的にこのプラスミド（W.Romanowのギフト）から発現される。
【０１６７】
STARエレメント1、2、3、6、10、11、18及び27は、ルシフェラーゼ発現ベクター内にクローニングされている。ショウジョウバエscsエレメントおよびニワトリベータ−グロビンHS4-6x  コア（「HS4」）エレメントを含むクローンは、ポジティブ対照（それらは、エンハンサーをブロックし且つ固有のエンハンサー特性を有しないとして知られている（チュングら、1993年；ケルム及びシェドル、1992年））として含まれ、及びエンプティルシフェラーゼ発現ベクターは、ネガティブ対照として含まれている。全てのアッセイは、U-2 OS細胞株を使用し実行された。エンハンサー−ブロッキングアッセイにおいて、E47プラスミドは、ルシフェラーゼ発現ベクター（エンプティベクター、又はSTAR若しくはポジティブ対照エレメントを含む）で同時トランスフェクションされた。エンハンサーアッセイにおいて、E47プラスミドは、エンハンサー活性のためのポジティブ対照としてSTARのないルシフェラーゼ発現ベクターで同時トランスフェクションされた；全ての他のサンプルは同時トランスフェクションの間にモック（mock）プラスミドを受けた。この一時的にトランスフェクションされた細胞は、プラスミドトランスフェクションの48時間後に、ルシフェラーゼ活性をアッセイされた（上述）。E-boxを含まない又はSTAR/コントロールエレメントを含むプラスミドから発現したルシフェラーゼ活性は差し引かれ、及びルシフェラーゼ活性は、記載されたように（上述）タンパク質含量に対して正規化された。
【０１６８】
結果：
図１８は、エンハンサー−ブロッキングアッセイの結果を示す。STARエレメント（又は既知のエンハンサー−ブロッキングエレメント scs及びHS4）の不存在下で、E-47/E-boxエンハンサー複合体は、ルシフェラーゼ（「ベクター」）の発現を活性化する。；発現のこの助長されたレベルは、100に正規化された。エンハンサー活性は、テストされた全てのSTARエレメントによってブロックされる。エンハンサー活性は、予想されたように（ベルら、2001年；ゲラシモワ及びコルセス、2001年）、HS4及びscsエレメントによってまたブロックされる。これらの結果は、転写的サイレンシングの拡散をブロックするそれらの能力（ネガティブ影響）に加えて、STARエレメントはエンハンサーの活性をブロックすることができる（ポジティブ影響）ことを示す。
【０１６９】
図１９は、エンハンサーアッセイの結果を示す。E47/E-box複合体による増強によるルシフェラーゼ発現のレベルは、100にセットされた（「E47」）。比較によると、STARエレメントのいずれも、ルシフェラーゼ発現の有意な活性化をもたらさない。予想されるように、scs及びHS4エレメントはレポーター遺伝子の活性をまた生じない。それ故に、少なくともテストされたSTARエレメントはエンハンサー特性を保有しないと結論付けられる。
【実施例１２】
【０１７０】
STARエレメントはマウスとヒトの間で保存される
ヒトゲノムデータベース（htt://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）に対するSTAR DNA配列のBLAT分析は、これらの配列の幾つかがヒトゲノムの他の領域と高い配列保存を有することを明らかにした。これらの複製された領域は、候補STARエレメントである；それらがSTAR活性を示さない場合、それらはクローニングされたSTARのパラログ(paralogs)と考えられる（2個の遺伝子又は遺伝子的エレメントは、それらが複製イベントから得られる場合、パラロガス（paralogous）であると言われる（リー、1997年））。
【０１７１】
マウスゲノム（http://www.ensembl.org/Mus_musculus/blastview）に対するヒトSTARのBLAST分析は、マウスとヒトとの間に高い配列保存の領域をまた表わす。この配列保存は、65個のヒトSTARエレメントのうちの15個のフラグメントに見られている。保存は64%〜89%の範囲であり、141個の塩基ないし909塩基対の長さにわたる（表８）。配列保存のこれらの程度は、注目すべきであり、これらのDNA配列がマウスゲノム内で同様にSTAR活性を与えうることを示唆する。表８のマウス及びヒトゲノムからの配列の幾つかは、オルトログ（ortholog）として厳密に定義される（2個の遺伝子又は遺伝子的エレメントは、それらが種形成イベント（リー、1997年）から得られる場合、オルトロガス（orthologous）であると言われる。）。例えば、STAR6は、ヒト及びマウスゲノムの両方においてSLC8A1及びHAAO遺伝子の間にある。他の場合、クローニングされたヒトSTARは、ヒトゲノム内にパラログを有し、そのオルトログはマウスゲノム内で識別されている。例えば、STAR3aは、ヒト15番染色体の15q11.2領域のフラグメントである。この領域は、ヒト5番染色体上の5q33.3でのDNAフラグメントと96.9%同一性があり（パラロガス）、それはIL12B  インターロイキン遺伝子に近い。これらのヒトDNAは、マウス11番染色体上の11B2領域のフラグメントとほぼ80%同一性を共有する。該11B2フラグメントは、（マウス）IL12Bインターロイキン遺伝子にも近い。それ故にSTAR3a及びマウス11B2フラグメントは、パラログとして厳密に定義されうる。マウス及びヒトゲノムにおける高い配列保存の領域の間でSTAR活性が共有されるという仮説を試験するために、マウスにおける保存された配列を有するヒトSTARの一つ、STAR18がより詳細に解析された。オリジナルのSTAR18クローンで検出されたマウスゲノムにおける配列保存は、約500塩基対のためにヒト2番染色体上で左側に伸びる（図２０；左及び右は、2番染色体のアームの標準記述に関連する）。この実施例では、我々は、配列保存の領域が、オリジナルのクローンよりも長さにおいてより伸張する「ヒト」における「自然に生じる（naturally occurring）」STARエレメントを定義するかどうかを試験する。我々は、このSTARエレメントのSTAR機能がマウス及びヒトの間に保存されるかどうかをまた試験する。
【０１７２】
材料及び方法：
STAR18の周りのマウス/ヒト配列保存の領域は、PCR増幅によってヒトBACクローンRP11-387A1から3つのフラグメントとして回収された：完全な領域（プライマーE93及びE94）、左方向の半分（プライマーE93及びE92）、及び右方向の半分（プライマーE57及びE94）。相同なマウス領域からの対応するフラグメントが、同一の様式でBACクローン RP23-400H17から回収された（夫々、プライマーE95及びE98、E95及びE96、並びにE97及びE98）。全てのフラグメントは、pSelectベクター内にクローニングされ、且つU-2OS/Tet-Off/LexA-HP1細胞株（上述）内にトランスフェクションされた。トランスフェクション後に、ハイグロマイシン選択は。トランスフェクションされた細胞を選択するために実行された。LexA-HP1タンパク質は、ドキシサイクリン濃度を低くすることによって導出され、且つ抗生物質ゼオシンに耐える（STAR活性の尺度）ためのトランスフェクションされた細胞の能力が、細胞成長を監視することによって評価された。
【０１７３】
結果：
オリジナルSTAR18クローンは、ゼオシン耐性遺伝子のサイレンシングを防止するその能力に基づき、pSelectベクター内にライゲーションされた、Sau3AI消化されたヒトDNAから分離された。マウスゲノムを有するヒトSTAR18クローン（497塩基対）の配列は、オルトロガスヒト及びマウスSTAR18領域の間に高い配列類似性（72%）を示した。それは、クローニングされた領域の左端を定義するSau3AI部位の直接左側に488塩基対伸張する領域において高い類似性（73%）をまた明らかにした。これらの領域の外で、ヒトとマウスDNAの間の配列類似性は、60%以下に落ちる。
【０１７４】
図２０に示されているように、ヒト及びマウスSTAR18エレメントの両方が、lexA-HP1リプレッサータンパク質を発現する宿主細胞にゼオシンに対する生存を与える。オリジナルの497個塩基対STAR18クローン及びそのマウスオルトログはいずれも、成長する能力を与える（図２０、ａ及びｄ）。両方のゲノムからの高い類似性の近接する488個塩基対領域はまた、成長する能力を与え、及び事実それらの成長表現型はオリジナルのSTAR18クローンのそれよりもより強健である（図２０、ｂ及びｅ）。配列類似性の全領域が試験された場合、マウスとヒトの両方からのこれらのDNAは成長を与え、及び成長表現型は、2つのサブ−フラグメントよりもより強健である（図２０、ｃ及びｆ）。これらの結果は、ヒトSTAR18のSTAR活性はマウスからのそのオルトログ内に保存されることを示している。これらオルトロガス領域間の高い配列保存は特に注目に値し、なぜならばそれらはタンパク質をコードする配列ではないためであり、それらは変異を通じるそれらの進化的多様性を防いでいるある調節機能を有するという結論を導く。
【０１７５】
この分析は、オリジナルのスクリーニング・プログラムによって識別されたクローニングされたSTARエレメントが、ある場合において部分的なSTARエレメントを表すかも知れず、且つそれらがその中に埋め込まれるところのゲノムDNAの分析はより強力なSTAR活性を有する配列を識別することができるということを示す。
【実施例１３】
【０１７６】
STARエレメントは特徴的なDNA配列モチーフを含む
STARエレメントは、導入遺伝子発現の観点においてそれらの抗抑制表現型に基づき分離される。この抗抑制表現タイプは、STARエレメントに関連付けられるクロマチン形成を調節する基礎的な生化学的プロセスを反映する。これらのプロセスは、典型的に配列特異的であり且つタンパク質結合又はDNA構造から生じる。これは、STARエレメントがDNA配列類似性を共有することを示唆する。STARエレメント間の配列類似性の識別は、機能的スクリーン及びテストによってすでに識別されているエレメントの特徴である配列モチーフを提供する。該配列モチーフは、その機能が本特許の請求項に一致するところの新しいSTARエレメントを認識し且つ請求するためにまた有益である。該機能は、真核宿主細胞内で発現される導入遺伝子の改善された収率及び安定性を含む。
【０１７７】
STARエレメントを特徴付ける配列モチーフを識別する他の利点は、：（１）ゲノムデータベースにおける新しいSTARエレメントの予測及び識別のための探索モチーフの提供、（２）エレメントの修飾のための理論的根拠の提供及び（３）STAR活性の機能的分析のための情報の提供を含む。バイオインフォマティックスを使用し、STARエレメント間の配列類似性が識別された；該結果は、本実施例で表わされる。
【０１７８】
バイオインフォマティックス及び統計的背景。
調節DNAエレメントは、配列特異的DNA結合性タンパク質との相互作用を介して典型的に機能する。DNAエレメント例えばその調節特性が識別されているがその相互作用タンパク質が知られていないところのSTARエレメントのバイオインフォマティックス分析は、配列モチーフの識別のための統計学的アプローチを要求する。これは、参照配列（例えば完全なヒトゲノム）と比較して、調節DNAエレメント（例えばSTARエレメント）のセットにおいて過剰に現れている短いDNA配列パターンを検出する方法によって達成されうる。該方法は、各調節エレメントにおけるパターンの観察された、及び予想された事象の数を決定する。予想された事象の数は、参照配列における各パターンの観察された事象の数から計算される。
【０１７９】
DNA配列パターンは、所定の長さ例えば6塩基対のオリゴヌクレオチドでありうる。最も簡単な分析において、4つのヌクレオチド（A、C、G及びT）から成る6塩基対オリゴヌクレオチド（六量体）にとって、46＝4096の区別されるオリゴヌクレオチド（AAAAAA〜TTTTTTまでの全ての組み合わせ）がある。調節配列及び参照配列が完全にランダムであり且つA、C、G及びTヌクレオチドの等しい割合を有した場合、各六量体の予想された頻度は、1/4096（〜0.00024）である。しかしながら、参照配列における各六量体の実際の頻度は、G：C塩基対などの含量におけるかたよりの故にこれよりも典型的には異なる。それ故に、参照配列における各オリゴヌクレオチドの頻度は、パターンのための「頻度テーブル」を生成するために、数えることによって経験的に決定される。
【０１８０】
その後、参照配列の該パターン頻度テーブルは、調節エレメントセットにおける各パターンの事象の予想された頻度を計算するために使用される。予想された頻度は、パターンの事象の観察された頻度と比較される。セットにおける「過剰に表わされている（over-represented）」パターンが識別される；例えば、六量体ACGTGAが、20キロ塩基対の配列において5回生じることを予想されるが、15回生じることを観察されるなら、それは3倍過剰に表わされている。エレメントがゲノム全体と同一の六量体組成を有していた場合、その六量体配列パターンの該15事象の10回が調節エレメント内に予想されない。いったん過剰に表わされているパターンが識別されたなら、統計テストはそれらの過剰表現が有意であるか又は偶然によるものかどうかを決定するために適用される。このテストのために、有意性インデックス、「sig」が各パターンのために計算される。有意性インデックスは、各パターンの事象の蓋然性から導出され、それは2項分布によって見積もられる。蓋然性は可能なパターン（六量体について4096）の数を考慮する。最も高いsig値は、最も過剰に表わされているオリゴヌクレオチドに対応する（ファン  ヘルデンら、1998年）。実務において、sig＞＝0であるオリゴヌクレオチドは、過剰に表わされていると考えられる。sig＞＝0であるパターンは、調節エレメント配列のセットにおいて一回の機会（＝100）により過剰に表れることがありうる。しかしながら、sig＞＝１でパターンが、10（＝101）配列セットにいて一回、sig＞＝２で100（＝102）配列セットにおいて一回などと過剰に表わされることが予想される。
【０１８１】
調節エレメントセットにおいて有意に過剰に表わされているパターンは、分類のためのモデル及び調節エレメント配列予測を展開するために使用される。これは、判別式分析（Discriminant Analysis）、いわゆる当業者に知られた統計的分類（ヒュベルティ、1994年）の「管理された（supervised）」方法を使用する。判別式分析において、既知の又は分類された項目（例えば、STARエレメント）のセットは、特定の変異体（例えば配列パターン例えば六量体）に基づきそれらの項目を認識するためのモデルを「トレーニングする（train）」ために使用される。次に、トレーニングされたモデルは、他の項目が既知の項目のセットに属するように分類されるべきである（例えば、DNA配列がSTARエレメントである）かどうかを予測するために使用される。この実施例では、トレーニングセットにおける既知の項目が、STARエレメント（ポジティブなトレーニングセット）である。それらは、STARエレメントと同じ長さを有するゲノム（ネガティブなトレーニングセット）からランダムに選択される配列と対照される。判別式分析は、ポジティブを区別する変異体のセットに基づきネガティブからポジティブを区別するための基準を確立する；この実施例では、変異体は、有意に過剰に表わされているパターン（例えば、六量体）である。
【０１８２】
過剰に表わされているパターンの数がトレーニングセットのサイズと比較して高い場合に、該モデルは過剰なトレーニングによりバイアスをかけられうる。過剰トレーニングは、変異体のフォワードステップワイズ選択を適用することによって回避される（ヒュベルティ、1994年）。ステップワイズ判別式分析の目標は、ポジティブとネガティブとの間で最大の区別を提供する変異体の最小数を選択することである。該モデルは、ポジティブな及びネガティブなトレーニングセットにおける項目を適切に分類するそれらの能力について変異体を一つずつ評価することによりトレーニングされる。これは、モデルへの新しい変異体の追加がモデルの予言的な力を有意に増加することのないまで（すなわち、分類エラー割合が最小化されるまで）行われる。次に、この最適化されたモデルは、「新しい」項目がポジティブか又はネガティブかを予測するための試験をするために使用される（ヒュベルティ、1994年）。
【０１８３】
複雑な項目例えばDNA配列にとって、ポジティブトレーニングセットのあるエレメントがネガティブ（偽のネガティブ）として分類され、及びネガティブトレーニングセットのあるメンバーはポジティブ（偽のポジティブ）として分類されるであろうことは、分類統計において固有である。トレーニングされたモデルが、新しい項目をテストするために適用される場合、同じタイプの誤分類が生じることが予想される。明細書中に記載したバイオインフォマティックス方法において、第１のステップ、パターン頻度分析は、配列パターンの大きなセット（例えば、合計4096六量体）を、有意に過剰に表わされたパターンの最小セット（例えば100六量体）にまで減少する；第２のステップ、ステップワイズ判別式分析は、過剰に表わされたパターンのセットを、最大の判別力を有するそれらのパターンのサブセット（例えば、5〜10六量体）にまで減少する。それ故に、このアプローチは、調節DNAエレメント例えばSTARエレメントを識別するための、簡単且つ強力な基準を提供する。
【０１８４】
DNA結合性タンパク質は、それらが占領する結合部位のタイプに基づき区別されうる。あるものは隣接している配列を認識する；このタイプのタンパク質にとって、長さ6塩基対（六量体）のオリゴヌクレオチドであるパターンは、バイオインフォマティクス分析にとって実りのあるものである（ファン  ヘルデンら、1998年）。他のタンパク質は、二分染色体を配列決定するために結合する：接触は、固定された幅の非保存領域によって分離された高く保存されたトリヌクレオチドの対の間に作成される（ファン  ヘルデンら、2000年）。二分染色体結合性タンパク質によって結合されているかも知れないSTARエレメントにおける配列を識別するために、頻度分析がこのタイプのパターンのために行われ、ここで二つのトリヌクレオチド間のスペースは0〜20で変化される（すなわち、XXXN{0-20}XXX、ここでXはトリヌクレオチドを構成する特定のヌクレオチド、及びNは長さにおいて0〜20塩基対のランダムヌクレオチドである）。二分染色体頻度分析の結果は、上記したように線形判別式分析のためにまた使用される。
【０１８５】
材料及び方法
本明細書及び欧州公開特許EP 01202581.3号に記載されている遺伝子的スクリーンを使用し、66個のSTARエレメントがヒトゲノムDNAから最初に分離され、且つ詳細に（表６）特徴付けられた。該スクリーンは、胎座（Clontech 6550-1）から精製された又はバクテリアの/P１染色体（BAC/PAC）人工染色体内に運ばれている、ヒトゲノムDNAのSau3AI消化によって構築された遺伝子ライブラリー上で実行された。BAC/PACクローンは、1番染色体の領域（クローン RP1154H19及びRP3328E19）からの、相同異質遺伝子（クローン RP1167F23、RP1170019及びRP11387A1）のHOXクラスターからの又はヒト22番染色体（Research Genetics 96010-22）からのゲノムDNAを含む。該DNAはサイズフラクションされ、そして0.5〜2kbサイズフラクションは、標準技術（サムブルックら、1989年）によって、BamHI-消化されたpSelectベクター内にライゲーションされた。低いドキシサイクリン濃度でゼオシンに対する耐性を与えたヒトゲノムDNAを含むpSelectプラスミドが分離され且つ大腸菌内で増殖された。表６のSTARエレメントを生じたスクリーンは、ヒトゲノムのほぼ1〜2％をアッセイした。
【０１８６】
これら66個のプラスミド内のヒトゲノムDNAは挿入物は、Beckman CEQ2000 automated DNA sequencerを使用し製造者の指示書を用いて、ジデオキシ法（サンガーら、1977年）によってシーケンスされた。簡単に言えば、DNAは、QIAprep Spin Miniprep及びプラスミド Midi Kits（夫々、QIAGEN 27106及び12145）を使用し、大腸菌から精製された。サイクルシーケンシング（cycle sequencing）が、染料ターミネーター（CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Beckmann 608000）の存在において、pSelectベクター（プライマー  D89及びD95、表５）に対応するカスタムオリゴヌクレオチドを使用して実行された。組み立てられたSTARDNA配列は、BLAT（Basic Local Alignment Tool（ケント、2002年））；http://gonome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway；表６）を使用し、ヒトゲノム（データベースは。2001年8月に作成された）内に配置された。全体として、一緒にされたSTAR配列は、平均長1.3キロ塩基対とともに、85.6キロ塩基対を含む。
【０１８７】
ヒトゲノムDNA内のSTARエレメントを区別する配列モチーフは、2段階の工程を使用してバイオインフォマティックス分析によって、次のように（図式的な図の図２１を参照）識別された。分析は２つの入力データセットを有する：（１）STARエレメント（STAR１−STAR65が使用された；表６）のDNA配列、及び（２）ヒトゲノムのDNA配列（1番染色体を除き、それはその大きいサイズにより含むことが実現不可能であった；二分染色体分析にとって、ヒトゲノムDNA配列のランダムサブセット（〜27Mb）が使用された）。
【０１８８】
パターン頻度分析：
分析における第１のステップは、RSA-Toolsソフトウェア（調節配列分析ツール；http://www.ucmb.ulb.ac.be/bioinfomatics/rsa-tools/；参照（ファン  ヘルデンら、1998年；ファン  ヘルデンら、2000年、ファン  ヘルデンら、2000年）を使用し、下記の情報を決定する：（１）ヒトゲノム内の全ての二分染色体及び六量体オリゴヌクレオチドの頻度；（２）65個のSTARエレメントにおけるオリゴヌクレオチド及び二分染色体の頻度；及び（３）ゲノムと比較してSTARエレメント内の過剰に表わされたそれらのオリゴヌクレオチド及び二分染色体の有意性インデックス。対照分析は、表６のSTARエレメントの長さに一致するヒトゲノム（すなわち、2689×103キロ塩基対））からランダムに選択された65個の配列で行われた。
【０１８９】
判別式分析：
過剰に表わされたオリゴヌクレオチド及び二分染色体は、線形判別式分析（ヒューベルティ、1994年）によるSTARエレメントの予測のためのモデルをトレーニングするために使用された。変異体の予備選択は、頻度分析の過剰に表わされたオリゴヌクレオチド（oligos）又は二分染色体から最高の夫々の判別力を有する50個のパターンを選択することによって実行された。次に、これらの予備選択された変異体は、変異体の最も判別できる組み合わせを選択するために（ヒュベルティ、1994年）、ステップワイズ線形判別式分析におけるモデルトレーニングのために使用された。変異体選択は、分類エラー割合（誤ったネガティブ分類のパーセント）を最小化することに基づいていた。さらに、予想されるエラー割合は、（誤ったポジティブ分類のパーセントを最小化する）ランダム配列の対照セットに対する同一の判別アプローチを適用することによって見積もられた。
【０１９０】
判別式分析のトレーニング段階からの予測モデルは、２つの方法でテストされた。第１に、モデル（トレーニングセット）を生成するために使用されたSTARエレメント及びランダム配列が分類された。第２に、19個の候補STARエレメント（上記したように、ゼオシン選択によって最近クローニングされた）のコレクションにおける配列が分類された。これら候補STARエレメントは、表９（配列ID:67-84）にリストされる。
【０１９１】
結果：
パターン頻度分析は、参照配列としてヒトゲノムを使用し、65個のSTARエレメントに対してRSA−Toolsで実行された。166個の六量体のオリゴヌクレオチドがゲノム全体（表４）と比較してSTARエレメントのセット内で過剰に表わされる（sig＞＝0）ことが見つかった。最も大きく過剰に表わされるオリゴヌクレオチド  CCCCACは、65個のSTARエレメント間で107回生じ、しかし49回のみ生じることが予想される。それは8.76の有意性係数を有する；言い換えれば、その過剰に表わされたことがランダム偶然によるものであることの蓋然性は、1／108.76、すなわち5億回に１回よりも少ない。
【０１９２】
オリゴヌクレオチドの95個は、１よりも大きい有意性係数を有し、及びそれ故にSTARエレメントにおいて高く過剰に表わされている。過剰に表わされたオリゴヌクレオチドのうち、それらの観察された、及び予想された事象は、夫々6及び1（オリゴ163について、CGCGAA、sig=0.02）から133及び95（オリゴ120について、CCCAGG、sig=0.49）までの範囲である。予想された事象における相違は、ファクター例えばヒトゲノムのG：C含量を反映する。それ故に、それらの事象の数におけるオリゴヌクレオチド間の相違は、それらの過剰に表わされていることよりも重要ではない；例えば、オリゴ２（CAGCGG）は36/9＝4倍過剰に表わされており、それは5千万回に1回のランダムチャンス（sig=7.75）の蓋然性を有する。
【０１９３】
表４は、夫々の過剰に表わされたオリゴヌクレオチドが見つかったところのSTARエレメントの数をまた表わす。例えば、最も重要なオリゴヌクレオチド、オリゴ１（CCCCAC）は107回生じ、しかし51個のSTARのみにおいて見つかっている。すなわち、それは平均してSTARあたり2コピーとして生じる。最も少なく豊富なオリゴヌクレオチド、番号166（AATCGG）は、平均してSTARあたり単一のコピーとして生じる（11個のSTAR上で13個の事象）；単一のコピーオリゴヌクレオチドはしばしば、特に比較的低い豊富さのオリゴを生じる。他の極端な場合、オリゴ4（CAGCCC）はそれが見つけられるところのSTAR（37個のSTAR）において平均3回生じる。最も広まっているオリゴヌクレオチドは番号120（CCCAGG）であり、それは58個のSTAR上で生じ（STARあたり平均2回）、もっとも少なく広まっているオリゴヌクレオチドは番号114（CGTCGC）であり、それは6個のSTARのみで（STARあたり平均１回のみ）生じる。
【０１９４】
二分染色体頻度分析の結果が、表５に与えられる。730個の二分染色体が、参照配列と比較してSTARエレメントのセットにおいて過剰に表わされていた（sig＞＝0）。最も著しく過剰に表わされた二分染色体、CCCN{2}CGGは、65個のSTARエレメントの間で36回生じ、しかし7回のみ生じると予測される。それは、9.31の有意性係数を有する；言い換えれば、その過剰に表わされてさいることは偶然によるものであることの蓋然性は、1／109.31、すなわち20億回に１回よりも少ない。
【０１９５】
397個の二分染色体は、１よりも多い有意性係数を有し、且つそれ故にSTARエレメント内で高く過剰に表わされている。該過剰に表わされている二分染色体の間で、観察された、及び予想されたそれらの事象は、夫々9及び１（5個の二分染色体（番号380、435、493、640及び665）について）から118及び63（番号30（AGGN{2}GGG）について、sig＞＝4.44）までの範囲である。
【０１９６】
パターン頻度分析によってSTARエレメントにおいて過剰に表わされていることが見つかったオリゴヌクレオチド及び二分染色体は、線形判別式分析によってそれらの判別の能力について試験された。判別モデルは、50個の最も判別できるオリゴヌクレオチド（表４）又は二分染色体（表５）パターンの間で最良の組み合わせのステップワイズ選択によってトレーニングされた。該モデルは、4個の（二分染色体）又は5個の変異体の組み込み後に最適なエラー割合で達成された。オリゴ分析から判別可能な変異体は、番号11、30、94、122及び160（表４）であり；二分染色体解析からのそれらは、番号73、194、419及び497（表５）である。
【０１９７】
次に、判別モデルは、トレーニングセットおよびそれらの関連付けられたランダム配列において65個のSTARエレメントを分類するために使用された。オリゴヌクレオチド変異体を使用する該モデルは、STARエレメント（真のポジティブ）として65個のSTARエレメントのうち46個を分類し；二分染色体モデルは、真のポジティブとしてSTARエレメントのうち49個を分類する。組み合わせで、該モデルは、STARエレメントとして65個のSTARエレメントのうち59個を分類する（91%、図２２）。誤ったポジティブ割合（STARとして分類されるランダム配列）は、二分染色体モデルにつき7個、オリゴヌクレオチドモデルにつき8個及び2つのモデルの結合された予測について13個（20％）であった。LDAによってSTARとして分類されなかった表６のSTARエレメントは、STAR7、22、35、44、46及び65である。これらのエレメントは、機能的アッセイにおいて抗リプレッサー活性の安定化を示し、それ故にLDAによってそれらはSTARとして分類されないという事実はそれらがSTARエレメントの他のクラス（又は複数のクラス）を表していることを示唆する。
【０１９８】
次に、該モデルは、表９にリストされたテストセットにおいて19個の候補STARエレメントを分類するために使用された。二分染色体モデルは、STARエレメントとしてこれらの候補STARの12個を分類し、オリゴヌクレオチドモデルは、STARとして14個を分類する。STARエレメントとして分類される候補の組合わされた数は、15(79%)個である。これは、65個のSTARのトレーニングセットで得られるよりも低い割合の分類であり；これは、2つの理由から予想される。第一に、判別モデルは表６の65個のSTARでトレーニングされ、このトレーニングセットに基づく判別可能な変異体は、テストセットにおいて比較的よく表わされていないかも知れない。第二に、テストセットにおける候補STAR配列は、イン  ビボ（in vivo）機能の観点から十分にまだ特徴付けられていず、弱い抗抑制特性のみを有するエレメントを含んでいるかも知れない。
【０１９９】
この分析は、STARエレメントのバイオインフォマティックス分類に対する統計的アプローチの能力を示す。STAR配列は、全体としてヒトゲノムと比較して有意に過剰に表わされている多くの二分染色体及び六量体オリゴヌクレオチドパターンを含む。これらのパターンは、STAR活性を与えるタンパク質の結合部位を表してもよく；いずれにしても、それらはSTARエレメント配列を認識するために使用されうる配列モチーフのセットを形成する。
【０２００】
判別式分析によってSTARエレメントを認識するためにこれらのパターンを使用し、本発明の遺伝子的スクリーンによって取得されるエレメントの高い割合が、STARとして事実上分類される。これは、これらのエレメントの間の基礎的な配列及び機能的な類似性を反映する。本明細書に記載されている方法（パターン頻度分析及び引き続く判別式分析）の重要な観点は、それが反復可能であることである；例えば一つのトレーニングセット内において表６の66個のSTARエレメントを有する表９の19個の候補STARエレメントを含むことによって、改善された判別モデルがトレーングされうる。次に、この改善されたモデルは、STARとして他の候補調節エレメントを分類するために使用されうる。本発明の方法を使用し、バイオインフォマティックス分析の反復と組み合わせた、ゲノム配列の大規模イン  ビボ（in vivo）スクリーニングは、ゲノムがその全体でスクリーンされる場合にエレメントの100%認識及び予測に漸近的に近づく、STARエレメントを判別する手段を提供する。STAR機能のこれら説得力のある且つ総合的な予測は、全てのヒトSTARエレメントが認識され且つ導入遺伝子発現を改善する際に使用するために利用可能であるということを保証する。
【実施例１４】
【０２０１】
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からのSTARエレメントのクローニング及び特徴付け
導入遺伝子サイレンシングは、転写的及び転写後のレベルのいずれにおいても形質転換植物において生じる（メイヤー、2000年；ヴァンス及びヴァウチェルト、2001年）。いずれの場合にも、導入遺伝子発現の望ましい結果は、サイレンシングによって危うくされうる；導入遺伝子の低い発現及び不安定性は望ましい形質（例えば害虫耐性）の貧しい発現又は組み換えタンパク質の低い収率を生じる。それは、貧弱な予測可能性をまた生じる：バイオテクノロジー的に有益なレベルで導入遺伝子を発現する形質転換植物の割合は低く、それは、有益な発現特性を有するもののために形質転換された個体の骨の折れ且つ高価なスクリーニングを必要とする。本実施例は、形質転換植物における転写的な導入遺伝子サイレンシングを防ぐ際に使用するための、双子葉植物  シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のゲノムからのSTARエレメントの分離を記載する。シロイヌナズナは、それが十分に研究されたモデル生物体である故に、本実施例のために選択された：それはコンパクトなゲノムを有し、それは遺伝子的及び組み換えDNA操作に対して敏感に反応し、かつそのゲノムは配列決定されている（ベヴァンら、2001年、イニチアティブ、2000年、マインケら、1998年）。
【０２０２】
材料及び方法
ゲノムDNAは、記載されているように（スタムら、1998年）、Arabidopsis thaliana ecotype Columbiaから分離され、且つMboIで部分的に消化された。該消化されたDNAは、アガロースゲル電気泳動及び該ゲルからの精製（QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN 28706）によって0.5〜2キロ塩基対にサイズフラクションされ、引き続きpSelectベクター（上述）内にライゲーションされた。U-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1細胞株内へのトランスフェクション及び低いドキシサイクリン濃度でのゼオシン耐性の選択は、前記した様に（上述）実行された。プラスミドは、ゼオシン耐性コロニーから分離され且つU-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1細胞株内にトランスフェクションされた。
【０２０３】
再トランスフェクションに応答してゼオシン耐性を与えられたシロイヌナズナゲノムDNAフラグメントの配列決定は、前記した様に（上述）実行された。DNA配列は、BLAST分析（（アルツシュルら、1990年）；URLhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast）によってシロイヌナズナゲノムの配列と比較された。
【０２０４】
STAR活性は、逆転写PCR（RT-PCR）によって組み換え宿主細胞におけるハイグロマイシン-及びゼオシン-耐性遺伝子のmRNAレベルを測定することによってさらにテストされた。U-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1細胞株の細胞は、シロイヌナズナSTARエレメント、又はショウジョウバエscsエレメントを含むpSelectプラスミド又は挿入物を含まないもの（上述）でトランスフェクションされた。これらは、高いドキシサイクリン濃度で2週間の間、ハイグロマイシンで培養され、その後ドキシサイクリン濃度は、lexA-HP1リプレッサータンパク質を導出するために0.1ng/mlに少なくされた。10日後、総RNAは、RNeasy mini kit（QIAGEN 74104）によって製造者によって記載されてように単離された。第一ストランドcDNA合成は、oligo(dT)18プライマーを使用するRevert Aid First Strand cDNA Synthesis ki（MBIFermenta1622）を使用して製造者によって記載されているように実行された。cDNAの分けた一部分（aliquot）は、（ゼオシンマーカーについて）プライマーD58及びD80、及び（ハイグロマイシンマーカーについて）D70及びD71を使用し、並びにTaq DNAポリメラーゼ（Promega M2661）を使用しPCR反応におけるテンプレートとして使用された。反応条件は、１分間の間94℃、１分間の間54℃、及び90秒の間72℃の15〜20サイクルであった。これらの条件は、投入したRNAとPCR生成物DNAの間に直線関係を生じる。PCR生成物はアガロースゲル電気泳動法によって分離され、及びゼオシン及びハイグロマイシンバンドは、テンプレートとして、精製されたpSelectプラスミドを有する前記の様に生成されたPCR生成物を使用し、前記したように（サムブルックら、1989年）サザンブロット法によって検出された。ゼオシンとハイグロマイシンシグナルの割合は、ゼオシン遺伝子の正規化された発現レベルに対応する。
【０２０５】
結果：
pSelectベクターにおけるシロイヌナズナゲノムDNAのライブラリーは、大腸菌内に69,000個のプライマリークローンを含み、その80%が挿入物を持っていた。平均の挿入物サイズは、ほぼ1000塩基対であった；それ故にライブラリーは、シロイヌナズナゲノムのほぼ40%を表す。
【０２０６】
（シロイヌナズナゲノムのほぼ16%を表している）このライブラリーの部分は、U-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1細胞株内にトランスフェクションされた。ハイグロマイシン選択は、形質転換体を分離するために行われ、それは27,000個の生き残ったクローンをもたらした。その後、これらは、低いドキシサイクリン濃度でゼオシン選択に付された。56個のゼオシン耐性コロニーからの想定されるSTAR含有プラスミドが大腸菌内にレスキューされ且つU-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1細胞内に再トランスフェクションされた。これらのプラスミドの44個（テストされたプラスミドの79%）は、低いドキシサイクリン濃度で宿主細胞に対してゼオシン耐性を与え、プラスミドがSTARエレメントを有することを示している。これは、ヒトU-2 OS細胞におけるpSelectスクリーンは、植物ゲノムDNAからのSTARエレメントの検出で高く効率的であることを示す。
【０２０７】
これら44個の候補STARエレメントのDNA配列が決定された。それらのうち35個は、シロイヌナズナ核ゲノム配列のデータベースにおける単一座であるとして識別された（表１０；配列ID:85〜配列ID:119）。他の4個は、葉緑体ゲノム由来であるとして識別され、4個は2つの座からのDNAフラグメントのキメラであり、及び１個はシロイヌナズナゲノムデータベースにおいて見つからなかった。
【０２０８】
クローニングされたシロイヌナズナSTARエレメントの強度は、RT-PCRアッセイを使用し、ゼオシン耐性遺伝子の転写抑制を防ぐそれらの能力を評価することによってテストされた。それらのサンプルの間で投入されたRNAの対照として、各STARトランスフェクションのためのハイグロマイシン耐性遺伝子の転写レベルもまた評価された。この分析は、シロイヌナズナSTARエレメントの12個について実行されている。該結果（図２３）は、シロイヌナズナSTARエレメントが、転写抑制からゼオシン耐性遺伝子を保護するそれらの能力においてショウジョウバエscsエレメント（ポジティブ対照）及びエンプティベクター（「SV40」；ネガティブ対照）よりも優れていることを示す。特に、STAR-A28及びSTAR-A30は、lexA-HP1リプレッサーが発現される場合、（ハイグロマイシン耐性遺伝子mRNAの内部対照に正規化された）scsエレメントよりも2倍高いゼオシン耐性遺伝子発現のレベルを可能にする。
【０２０９】
これらの結果は、本願発明の方法が、ヒト以外の他の種のゲノムからSTARエレメントを回収するために成功裡に適用されうることを示す。植物ゲノムからのSTARエレメントに対するその成功な適用は特に重要である。何故ならば、それは本発明の方法が適用可能であるところの広い分類学的範囲を示すからであり且つ植物はバイオテクノロジー的発展の重要なターゲットであるからである。
【実施例１５】
【０２１０】
複数のベクター上に存在するSTAR−保護された遺伝子は、CHO細胞中で同時に発現される
STARエレメントは、導入遺伝子発現ユニットへの転写抑制影響の効果をブロックするために機能する。異種のタンパク質生産のためのSTARエレメントの利点のうちの1つは、高く発現する初期組み換え宿主細胞を見つけることの増加された予測可能性である。この特徴は、複数の、別々のベクター上に存在する異なる遺伝子の同時発現を可能にする。本実施例では、我々は2つの異なるベクター上に配置された2つの異なるSTAR7−保護された遺伝子、GFP及びREDを使用する。これら2つのベクターがチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に同時にトランスフェクションされる場合、両方が発現され、一方、対応する、しかし保護されていないGFP及びRED遺伝子は、ほとんどそのような同時発現を示さない。
【０２１１】
材料及び方法
STAR7エレメントは、ppGIZ-STAR7及びppRIP-STAR7ベクター(図２４)中でテストされる。pPlug&Play(ppGIZ及びppRIP)ベクターの構築は、下記に記載される。プラスミドpGFP(Clontech6010-1)は、pGFP-リンクを生成するために、BsiWI部位でリンカーの挿入によって修飾される。該リンカー(オリゴヌクレオチド 5'GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG3' 及び 5'GTACCTTAATTAAAGATCTGATATCC3’をアニーリングすることにより作られた)は、PacI、BglII及びEcoRV制限エンドヌクレアーゼのための部位を導入する。これは、STARエレメントの挿入のためのマルチクローニング部位MCSIIを作成する。次に、プライマー(5'GATCAGATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG3')及び(5'AGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG3')が、pIRES-stufを生成するために、pGFPから0.37 kbの領域を増幅するために使用され、これはpIRES(Clontech 6028-1)のBglII部位内に挿入される。これは、MCSIに、AscI及びSwaI制限酵エンドヌクレアーゼのための部位を導入し、及びSTARエレメントと、近傍のプロモーターとの間の潜在的な干渉を避けるためにめに「スタッファーフラグメント」として働く。pIRES-stufは、スタッファーフラグメント、CMVプロモーター、（マルチクローニング部位MCS A及び MCS Bによって隣接された）IRESエレメント、及びSV40ポリアデニレーションシグナルから成るDNAフラグメントを自由にするためにBglII及びFspIで消化される。このフラグメントは、pIRES-リンクを生成するために、BamHI及びStuIで消化することによって生成されたpGFP-リンクのベクターバックボーンでライゲーションされる。
【０２１２】
ゼオシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームは、次のようにしてpIRES-リンク中のMCS BのBamHI/NotI部位内に挿入される：ゼオシン耐性ORFは、pIRES-リンク-zeoを生成するために、プラスミドpEM7/zeoからプライマー5'GATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC3' 及び5'AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC3' を用いてPCRによって増幅され、BamHI及びNotIで消化され、そしてBamHI/NotI-消化されたpIRES-リンクでライゲーションされる。GFPレポーターORFは、プライマー5'GATCGAATTCTCGCGAATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG3' 及び5'AGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG3' を用いるphr-GFP-1の増幅、そしてpIRES-リンク-zeo プラスミドのMCS A中のEcoRI部位内へのEcoRI-消化されたGFPカセットの挿入によって、pIRES-リンク-zero内に導入される。これは、(ppGFP―IRES-zeoのための)ppGIZを作成し、5'STAR7 はSalI部位内にクローニングされ、及び3'STAR7はPacI部位内にクローニングされる。
【０２１３】
ピューロマイシン耐性ORFは、pIRES-リンク-puroを生成するために、プラスミドpBabe-Puro(モルゲンステルン及びランド、1990年)からのプライマー5'GATCGGATCCTTCGAAATGACCGAGTACAAGCCCACG3'及び 5'AGGCGCGGCCGCTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTC3' を用いるPCRによって増幅され、BamHI及びNotIで消化され、そしてBamHI/NotI-消化されたpIRES-リンクでライゲーションされる。RED 遺伝子は、(ppRED-IRES-puroのための)ppRIP を生成するために、プラスミド pDsRed2 (Clontech6943-1)からプライマー5'GATCTCTAGATCGCGAATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC3'及び 5'AGGCACGCGTTCGCGACTACAGGAACAGGTGGTGGCG3'を用いるPCRによって増幅され、XbaI及びMluIで消化され、そしてNheI-MluI-消化されたpIRES-リンク-puroでライゲーションされる。5'STAR7はSalI部位内にクローニングされ、及び3'STAR7は、PacI部位内にクローニングされる。
【０２１４】
CHO細胞のトランスフェクション及び培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1（ATCC CCL-61）が、HAMS-F12培地＋2mMグルタミン、100 U/mlペニシリン及び100マイクログラム/ml ストレプトマイシンを含む10%ウシ胎仔血清内で、37℃/5%CO2下で培養される。細胞は、製造者によって記載されたようにLipofectamine 2000（Invitrogen）を使用し、該プラスミドでトランスフェクションされる。簡単に言えば、細胞は、培養容器に接種され、そして70〜90％コンフルエンスにまで一晩成長される。Lipofectamine試薬は、7.5マイクロリットル/3マイクログラムの割合（例えば10cmペトリ皿に、20マイクログラムDNA及び120マイクロリットルLipofectamine）でプラスミドDNAと一緒にされ、且つ細胞に25℃で30分間のインキュべーション後に添加される。6時間のインキュベーション後、トランスフェクション混合物は、新鮮な培地で置き換えられ、そしてトランスフェクションされた細胞はさらにインキュベートされる。一晩の培養後、細胞はトリプシン化され、そして100μg／mlの濃度にまで添加されたゼオシンを有する新鮮な培地を有する新鮮なペトリ皿に接種され、そして該細胞はさらに培養される。個々のコロニーが見えるようになった時に（トランスフェクションのほぼ10日後）、培地は除去され、そして新鮮な培地（ピューロマイシン）で置換される。
【０２１５】
個々のコロニーは単離され、そしてゼオシンを有する培地中の24-ウェルプレートに移される。GFP及びREDリポーター遺伝子の発現は、トランスフェクションのほぼ3週間後に評価される。
【０２１６】
１つのテストされた構築物は、GFP遺伝子、IRES及び、CMVプロモーターの制御下でゼオシン耐性遺伝子を有するモノシストロニックな遺伝子から成る（しかし、全構築物（図２４）に隣接するためのSTAR7エレメントあり又は無しのいずれかである）。他の構築物は、RED遺伝子、IRES及び、CMVプロモーターの制御下でピューロマイシン耐性遺伝子を有するモノシストロニックな遺伝子から成る（しかし、全構築物（図２４）に隣接するためのSTAR7エレメントあり又は無しのいずれかである）。
【０２１７】
該構築物は、CHO-K1細胞にトランスフェクションされる。ゼオシンとピューロマイシンの両方に耐性である安定なコロニーは、GFP及びREDシグナルがXL-MCLベックマン  コールター  フローサイトメーター(Beckman Coulter flowcytometer）で決定される前に展開される。GFPシグナル及びREDシグナルの両方に２重ポジティブである一つのコロニー中の細胞のパーセントは、両方のタンパク質の同時発現のために尺度として取られ、そしてこれは図２４中にプロットされる。
【０２１８】
結果
図２４は、STARエレメントによって隣接されるGFP及びREDレポーター遺伝子の独立したゼオシン及びピューロマイシン耐性CHOコロニー中の同時発現は、STAR7エレメント無しの対照ベクターと比較して、GFP及びREDタンパク質の両方を発現する細胞のより大きい数を結果することを示す。それ故に、STAR7エレメントは、CHO細胞中の導入遺伝子発現の予測可能性のより高い程度を与える。STAR無しのコロニーでは、20個のコロニーのうちの高々9個のコロニーが二重のGFP/REDポジティブ細胞を含む。二重ポジティブ細胞のパーセンテージは、10〜40%の間の範囲に及ぶ。20個のコロニーのうちの残りの11個は、10%より下のGFP/REDポジティブ細胞を有する。対照的に、STAR−保護されたGFP及びRED遺伝子を含む20個のコロニーのうちの19個では、GFP/RED二重ポジティブ細胞のパーセントは、25〜75%の間の範囲に及ぶ。これら19個の二重ポジティブコロニーのうちの15個では、GFP/RED二重ポジティブ細胞のパーセントは、40％よりも高い。この結果は、遺伝子がSTARエレメントに隣接されている場合、これら２つの遺伝子の同時発現が達成される可能性がより高いようであることを示す。
【実施例１６】
【０２１９】
２つの別々のプラスミドからの機能的抗体の発現は、STARエレメントが重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に隣接する場合に容易に得られる
タンパク質発現へのより高い予測可能性を与えるためのSTARエレメントの能力により、2つの遺伝子は別々のベクターから同時に発現されうる。これは、2つのレポーター遺伝子、GFP及びREDについて実施例１５中に示される。今、軽い及び重い抗体鎖の同時発現がテストされる。実施例１６では、別々のベクター上に存在するSTAR7−保護された軽い及び重い抗体cDNAが、チャイニーズハムスター卵巣細胞に同時にトランスフェクションされる。これは機能的抗体の生産を生じ、重鎖及び軽鎖の両方が同時に発現されることを示す。対照的に、保護されていない軽い及び重い抗体cDNAの同時トランスフェクションは、機能的抗体の発現をほとんど示さない。
【０２２０】
材料及び方法
該テストされた構築物は、GFP遺伝子が、RING1抗体(ハマーら、2002年)の軽鎖をコードする遺伝子によって置換されること及びRED遺伝子が、RING1抗体の重鎖をコードする遺伝子によって置換されること以外は実施例１５中に記載されているのと同じである。軽鎖は、プライマー 5'CAAGAATTCAATGGATTTTCAAGTGCAG3' 及び5'CAAGCGGCCGCTTTGTCTCTAACACTCATTCC3' を使用して、RT-PCRによってRING1ハイブリドーマ(ハマーら、2002年)から増幅される。PCR生成物は、EcoRI及びNotIでの制限消化後にpcDNA3内にクローニングされ、そして該配列内の潜在的なフレームシフトを検出するために配列決定される。該cDNAはEcoRI及びNotIで切り出され、平滑にされ、そしてppGIZプラスミド中にクローニングされる。重鎖は、プライマー5'ACAGAATTCTTACCATGGATTTTGGGCTG3' 及び5'ACAGCGGCCGCTCATTTACCAGGAGAGTGGG3' を使用して、RT-PCRによってRING1ハイブリドーマ(ハマーら、2002年)から増幅される。PCR生成物は、EcoRI及びNotIでの制限消化後にpcDNA3内にクローニングされ、そして該配列内の潜在的なフレームシフトを検出するために配列決定される。該cDNAはEcoRI及びNotIで切り出され、平滑にされ、そしてppRIPプラスミド中にクローニングされる。
【０２２１】
結果
CHOコロニーは、2つの別々のベクター上に存在するRING1軽鎖(LC)及びRING1重鎖(HC)cDNAsで同時にトランスフェクションされる。軽鎖はIRESを介してゼオシン耐性遺伝子に結合され、重鎖はIRESを介してピューロマイシン耐性遺伝子に結合される。図２５は、重鎖及び軽鎖をコードするcDNAのCHO細胞への同時トランスフェクションが、独立したゼオシン耐性コロニー及びピューロマイシン耐性コロニーの確立を結果することを示す。該構築物がSTAR7エレメントによって隣接されている場合、これは、STAR７エレメント無しの対照配列と比較して、機能的RING1抗体のより高い生産を生じる。それ故に、STAR7エレメントは、CHO細胞中の抗体発現の予測可能性のより高い程度を与える。
【０２２２】
STAR無しコロニーでは、12個のコロニーのうちの1個のみが、検出可能な抗体を発現する。対照的に、STAR−保護された軽鎖及び重鎖遺伝子を含む12個のコロニーのうちの7個が、ELISAアッセイでRING１抗体を検出する機能的RING1抗体を生産する。有意的に、これら全ての7つのコロニーは、最高の対照コロニー(任意に100%にセット)よりもRING1抗体のより高いレベルを生産する。この結果は、２つの遺伝子がSTARエレメントで隣接される場合、２つの抗体鎖をコードするこれら２つの遺伝子の同時発現が達成される可能性がより高いようであることを示す。
【０２２３】
【表１】
2010011859.tif 000003
2010011859.tif 000004
【０２２４】
【表２】
2010011859.tif 000005
【０２２５】
【表３】
2010011859.tif 000006
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2010011859.tif 000008
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【０２２６】
【表４】
2010011859.tif 000011
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【０２２７】
【表５】
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【０２２８】
【表６】
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【０２２９】
【表７】
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【０２３０】
【表８】
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【０２３１】
【表９】
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【０２３２】
【表１０】
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【０２３３】
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【０２３４】
図面は、本発明のDNA分子の代表的なバージョンを示す。１つ又は複数のタンパク質発現ユニットと云われる、DNAのこれらの部分は、ベクター例えば組み換えプラスミド分子及び／又は組み換えウィルスゲノム中で作成され且つ操作される。該タンパク質発現ユニットは、本発明の方法の一部として宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、概要の図面が、ベクター分子及び宿主細胞ゲノムの両方における発現ユニット中のDNAエレメントの配置を表わす。
【図１】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図６−１３】
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【図６−１７】
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【図６−１８】
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【図６−１９】
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【図６−２０】
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【図６−２１】
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【図６−２３】
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【図６−２４】
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【図６−２５】
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【図６−２６】
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【図６−２７】
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【図６−２８】
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【図６−２９】
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【図６−３０】
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【図６−３１】
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【図６−３２】
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【図６−３３】
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【図６−３４】
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【図６−３５】
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【図６−３６】
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【図６−３７】
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【図６−３８】
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【図６−３９】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
2010011859000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月3日(2009.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
夫々が目的の少なくとも１つのポリペプチドをコードする２つのポリペプチド発現ユニットを含む細胞であって、該ポリペプチド発現ユニット夫々が少なくとも１つの安定化抗リプレッサー（Stabilizing Anti-Repressor:STAR）配列を含むことを特徴とし、ここで該発現ユニットのうちの１つについての該STAR配列が、（ｉ）図６の配列ＩＤ：１７、（ｉｉ）１以上の塩基の欠損、改変及び／又は挿入により図６中の配列ＩＤ：１７から得られる配列、及び（ｉｉｉ）図６の配列ＩＤ：１７の機能的フラグメントからなる群から選ばれ、且つ、該発現ユニットのうちの他方についての該STAR配列が、（ａ）図６の配列ＩＤ：１〜配列ＩＤ：６５のいずれか１つ、（ｂ）１以上の塩基の欠損、改変及び／又は挿入により図６中の配列ＩＤ：１〜６５から得られる配列、及び（ｃ）図６の配列ＩＤ：１〜配列ＩＤ：６５のいずれか１つの機能的フラグメントからなる群から選ばれる、上記細胞。
【請求項２】
２つのポリペプチド発現ユニット夫々が、異なる選択マーカーをさらにコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ポリペプチド発現ユニットの少なくとも１つが目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子を含み、及び該モノシストロニックな遺伝子が機能的プロモーターの制御下にある、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
ポリペプチド発現ユニットの少なくとも１つが、下記順で：（ｉ）目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、（ｉｉ）内部リボソーム侵入部位（IRES：Internal Ribosome Entry Site）、及び（ｉｉｉ）選択マーカーを含むバイシストロニックな遺伝子を含み、及び該バイシストロニックな遺伝子が機能的プロモーターの制御下にある、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項５】
ポリペプチド発現ユニットの少なくとも１つは、ポリペプチド発現ユニットがSTAR配列の少なくとも１つによって両側で隣接されているように配置された該STAR配列の少なくとも２つを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
少なくとも２つのSTAR配列が同一である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
目的の少なくとも１つのポリペプチドがイムノグロブリン重鎖又はイムノグロブリン軽鎖を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
目的の少なくとも１つのポリペプチドがイムノグロブリン重鎖を含み且つ目的の他方のポリペプチドがイムノグロブリン軽鎖を含み、且つ該重鎖及び軽鎖が機能的抗体を形成しうる、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
細胞において目的の少なくとも２つのポリペプチドを発現するための方法であって、ポリペプチド発現ユニットが発現される条件下で請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含む方法。
【請求項１０】
下記順で：（ｉ）目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、（ｉｉ）内部リボソーム侵入部位（IRES：Internal Ribosome Entry Site）、及び（ｉｉｉ）選択マーカー、を含むバイシストロニックな遺伝子、ここで該バイシストロニックな遺伝子は機能的プロモーターの制御下にある、及び
少なくとも１つのSTAR配列、ここで該STAR配列は（ａ)図６の配列ＩＤ：１７；（ｂ）１以上の塩基の欠損、改変及び／又は挿入により図６中の配列ＩＤ：１７から得られる配列；及び（ｃ）図６の配列ＩＤ：１７の機能的フラグメントからなる群から選択される、
を含むポリペプチド発現ユニット。
【請求項１１】
ポリペプチド発現ユニットがSTAR配列の少なくとも１つによって両側で隣接されているように配置された該STAR配列の少なくとも２つを含む、請求項１０に記載のポリペプチド発現ユニット。
【請求項１２】
該少なくとも２つのSTAR配列が同一である、請求項１１に記載のポリペプチド発現ユニット。
【請求項１３】
目的のポリペプチドがイムノグロブリン重鎖又はイムノグロブリン軽鎖を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド発現ユニット。