(57)【要約】【課題】複数の走査光学系を使用した場合においても、第２のレーザ光が第１の走査光学系の光検出系に進入することを防ぎ、第１の走査光学系のレーザ光により励起された蛍光を効率良く検出することが可能な走査型レーザ顕微鏡を提供する。【解決手段】可視領域にスペクトルを有する第１のレーザ光を試料上で走査して蛍光を励起する第１の走査光学系（Ａ）と、試料からの蛍光を第１のレーザ光の光路から分離する第１ダイクロイックミラーと、第１ダイクロイックミラー（２５）で分離された蛍光を検出する光検出器（１１２）と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され第１のレーザ光を遮断し所望の蛍光を透過する測光フィルタ（１９）と、紫外または赤外領域にスペクトルを有する第２のレーザ光を試料上の特定の部位に導入するための第２の走査光学系（Ｂ）と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され第２のレーザ光の透過を制限する吸収フィルタ（３１）とを備えた走査型レーザ顕微鏡である。【選択図】図１
2010152397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可視領域にスペクトルを有する第１のレーザ光を試料上で走査して蛍光を励起する第１の走査光学系と、
試料からの蛍光を前記第１のレーザ光の光路から分離する第１ダイクロイックミラーと、
第１ダイクロイックミラーで分離された蛍光を検出する光検出器と、
第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第１のレーザ光を遮断し所望の蛍光を透過する測光フィルタと、
紫外または赤外領域にスペクトルを有する第２のレーザ光を試料上の特定の部位に導入するための第２の走査光学系と、
第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第２のレーザ光の透過を制限する吸収フィルタと、
を備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２】
試料を観察するための第１のレーザ光を試料上で走査する第１の走査光学系と、
試料からの光を前記第１のレーザ光の光路から分岐する第１光分岐素子と、
第１光分岐素子で分離された試料からの光を検出する光検出器と、
試料を刺激または操作するための第２のレーザ光を試料上の特定の部位に照射するための第２の走査光学系と、
第１光分岐素子と光検出器との間に配置され、所望の観察光を透過する第１の機能及び第２のレーザ光の透過を制限する第２の機能を有する波長選択素子と
を備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記波長選択素子は、前記第１の機能を有する第１の干渉フィルタと、前記第２の機能を有する第２の干渉フィルタであり、
前記光検出器と前記第１の干渉フィルタが複数設けられ、
これらの光検出器に向けて試料からの光を分光する第２光分岐素子を第１光分岐素子と光検出器との間に備え、
前記第２の干渉フィルタは、第１光分岐素子と第２光分岐素子との間に配置され、
前記第１の干渉フィルタは、それぞれの光検出器と第２光分岐素子との間に配置されることを特徴とする請求項２記載の走査型レーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光を試料上に走査して試料からの蛍光を光検出器により検出する走査型レーザ顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、試料からの蛍光の走査画像を得るための第１の走査光学系Ａと、試料の特定の部位に、例えばケージド試薬の開裂のような特異現象を発現させるための第２の走査光学系Ｂとを備えた走査型レーザ顕微鏡について開示されている。
【０００３】
図７は、従来の走査型レーザ顕微鏡の構成を示す図である。第１の走査光学系Ａのレーザ光の走査に同期して第２の走査光学系Ｂから試料７９にレーザ光を照射して、試料７９が時間的に変化する様子を測定することができる。同期は、コントロールユニット８１が、第１の走査光学系Ａのレーザシャッタ６３と走査光学系ユニット６４および光電変換素子７０と、第２の走査光学系Ｂのレーザシャッタ７２および走査光学系ユニット７３を制御することで行われる。
【０００４】
ケージド試薬とカルシウムイオンなどのイオン濃度に感受性を有する蛍光指示薬とを試料７９に導入する。第２の走査光学系Ｂのレーザ光源７１からのレーザ光をケージド試薬を導入した試料７９に照射する。照射された部位のケージド試薬のケージド基が開裂し、内部に包含されている物質が放出される。この放出による試料７９内のイオン濃度分布の変化を第１の走査光学系Ａのレーザ光源６１からのレーザ光により得られる蛍光画像により測定する。ケージド試薬の開裂に伴い、また、第２のレーザ光源７１のレーザ光の照射によっても、試料７９の蛍光指示薬がある程度の蛍光を生じる。しかし、コントロールユニット８１により各レーザ光のレーザシャッタ６３、７２の開閉タイミングと光電変換素子７０での検出タイミングを時間的に制御しているので、ケージド試薬の開裂に伴う蛍光指示薬からの蛍光強度の変化の影響を受けずに蛍光のスペクトルを光検出器で検出して蛍光画像を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２７５５２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載されている第１および第２の走査光学系を有する走査型レーザ顕微鏡では、第２の走査光学系のレーザ光が第１の走査光学系の光検出器にて検出されてしまう可能性がある。従って、所望の蛍光画像を得るためには更に改善の余地があった。
【０００７】
例えば、ケージド試薬を開裂するための第２の走査光学系Ｂのレーザ光源７１として、ＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）を用いる場合を考える。ケージド試薬を開裂するためには強い光強度が必要であるため、照射した第２の走査光学系のレーザ光の試料７９からの反射光も強くなる。ダイクロイックミラー７５では十分にＵＶパルスレーザ光の反射光が吸収されず、僅かながら第１の走査光学系Ａの光路に透過してしまう。しかし、通常、第１の走査光学系Ａつまり、画像取得用の走査光学系に使用されている、ダイクロイックミラー６２，吸収フィルタ６７等の各フィルタ類は、ＵＶレーザの短波長域についての透過性能を考慮しているものはほとんどない。ＵＶパルスレーザの波長は反射および透過して光電変換素子７０で検出され、鮮明な蛍光画像を得ることができない。
【０００８】
同様に、ケージド試薬を開裂するための第２の走査光学系のレーザ光源７１として、ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を用いる場合を考える。なお、このＩＲパルスレーザは２光子励起を引き起こすことのできるレーザとする。このＩＲパルスレーザについても、試料７９からの強い反射光がダイクロイックミラー７５で十分に反射されずに、僅かながら第１の走査光学系Ａの光路に透過してしまう。通常、第１の走査光学系Ａつまり、画像取得用の走査光学系に使用されている各フィルタ類は、短波長を反射，長波長を透過するロングパスフィルタを使用している場合が多い。そして、これらの吸収フィルタについては、ＩＲの長波長域での透過特性が考慮されていない。そのため、蛍光波長より長波長のＩＲパルスレーザ光の波長はこれらの吸収フィルタを透過してしまい、光検出器で検出される。したがって、鮮明な蛍光画像を得ることができない。
【０００９】
また、上記の現象を防ぐために、特許文献１に記載されているようにレーザ照射のタイミングをずらすなどの第１および第２の走査光学系をコントロールユニット８１で制御して、第２の走査光学系Ｂのレーザ光の影響を避けることが考えられる。しかし、この場合、走査光学系と検出光学系の制御を、同時かつ高速に行うことが必要であるため、これを実現するためには複雑な制御が必要となる。さらに、特許文献１に記載された技術では同時に２つのレーザ光を照射することができない。このため、試料７９の時間的な変化を測定する際にはリアルタイム性が低下してしまう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡は、可視領域にスペクトルを有する第１のレーザ光を試料上で走査して蛍光を励起する第１の走査光学系と、試料からの蛍光を前記第１のレーザ光の光路から分離する第１ダイクロイックミラーと、第１ダイクロイックミラーで分離された蛍光を検出する光検出器と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第１のレーザ光を遮断し所望の蛍光を透過する測光フィルタと、紫外または赤外領域にスペクトルを有する第２のレーザ光を試料上の特定の部位に導入するための第２の走査光学系と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第２のレーザ光の透過を制限する吸収フィルタとを備えた。
【００１１】
また本発明に係る請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡は、試料を観察するための第１のレーザ光を試料上で走査する第１の走査光学系と、試料からの光を前記第１のレーザ光の光路から分岐する第１光分岐素子と、第１光分岐素子で分離された試料からの光を検出する光検出器と、試料を刺激または操作するための第２のレーザ光を試料上の特定の部位に照射するための第２の走査光学系と、第１光分岐素子と光検出器との間に配置され、所望の観察光を透過する第１の機能及び第２のレーザ光の透過を制限する第２の機能を有する波長選択素子とを備えた。
【００１２】
また本発明に係る請求項３に記載の走査型レーザ顕微鏡は、上記記載の発明である走査型レーザ顕微鏡において、前記波長選択素子は、前記第１の機能を有する第１の干渉フィルタと、前記第２の機能を有する第２の干渉フィルタであり、前記光検出器と前記第１の干渉フィルタが複数設けられ、これらの光検出器に向けて試料からの光を分光する第２光分岐素子を第１光分岐素子と光検出器との間に備え、前記第２の干渉フィルタは、第１光分岐素子と第２光分岐素子との間に配置され、前記第１の干渉フィルタは、それぞれの光検出器と第２光分岐素子との間に配置される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、検出光路上に特異現象を発現させるレーザ光を遮断するフィルタを配置することで、画像取得用レーザ光と特異現象発現用レーザ光を同時に照射でき、鮮明な蛍光画像を取得できる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【００１４】
また、画像取得用の走査光学系および特異現象を発現させる走査光学系の結像レンズを別構成とすることで、システムアップを行いやすい走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の構成図。
【図２】フィルタの透過率波長特性を示す図。
【図３】ダイクロイックミラーの透過率波長特性を示す図。
【図４】吸収フィルタの特性と構成を説明する概念図。
【図５】他の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の構成図。
【図６】他の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の構成図。
【図７】従来の走査型レーザ顕微鏡の構成を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［第１の実施の形態］
本発明の第１の実施の形態について説明する。図１は本発明に係る走査型レーザ顕微鏡の構成図である。
【００１７】
この走査型レーザ顕微鏡は、第１の走査光学系Ａと第２の走査光学系Ｂを備えている。第１の走査光学系Ａは、第１のレーザ光源１１から出力されるレーザ光１１ａで試料２９面上を走査する観察用の光学系である。第２の走査光学系Ｂは試料の特定部位に特異現象を発現させるための光学系である。即ち、第２の走査光学系Ｂは、第２のレーザ光源２１から出力されるレーザ光２１ａを試料２９の任意の位置に照射して、ケージド試薬を解除させる。
【００１８】
第１の走査光学系Ａは、第１のレーザ光源１１、ダイクロイックミラー１２、第１のレーザシャッタ１３、第１の走査光学ユニット１４、瞳投影レンズ１５およびミラー１６から構成される。さらに第１の走査光学系Ａのダイクロイックミラー１２の分岐光路上には、検出光学系Ｃが配置されている。この検出光学系Ｃは、吸収フィルタ３１、ダイクロイックミラー１７、ミラー１８、蛍光測光フィルタ１９ａおよび１９ｂ、共焦点レンズ１１０ａおよび１１０ｂ、共焦点絞り１１１ａおよび１１１ｂおよび光電変換素子１１２ａおよび１１２ｂにより構成される。
【００１９】
吸収フィルタ３１は、試料２９からの第２の走査光学系Ｂのレーザ光２１ａの反射光を吸収する特性を有する。通常、ケージド試薬の解除にはＵＶ光が使用される。そこで、以下のようなレーザ光源を使用することが考えられる。
【００２０】
（ａ）第２のレーザ光源２１として、ＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）を使用する。
【００２１】
（ｂ）第２のレーザ光源２１として、ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を使用する。なお、ＩＲパルスレーザは、２光子励起現象を引き起こすことのできるレーザとする。
【００２２】
従って、吸収フィルタ３１の特性としては、上記のレーザ光を吸収する特性を有するものであり、具体的には図２に示すような特性を有するフィルタを用いる。
【００２３】
図２（ａ）は、ＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）を遮断するフィルタ特性を示す図であり、図２（ｂ）は、ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を遮断するフィルタ特性を示す図である。
【００２４】
第２の走査光学系Ｂは、ケージド試薬を解除させるための第２のレーザ光源２１、第２のレーザシャッタ２２、第２の走査光学ユニット２３、瞳投影レンズ２４およびダイクロイックミラー２５から構成される。第１の走査光学系Ａの光軸と第２の走査光学系の光軸とは、ダイクロイックミラー２５により合成され、結像レンズ２６、対物レンズ２７に導かれる。また、瞳投影レンズ１５および瞳投影レンズ２４の焦点位置は、結像レンズ２６の焦点位置と一致するように配置されている。試料２９はステージ２８上に置かれている。
【００２５】
ここで、第１のレーザ光源１１と第２のレーザ光源２１として考えられる組合せと、その条件に適合するダイクロイックミラー２５の特性は以下のとおりである。
【００２６】
第１のレーザ光源１１に可視連続レーザ（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２１としてＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）を用いる場合は、ダイクロイックミラー２５の透過率波長特性は、図３（ａ）に示すように、可視連続光レーザ（波長４８８ｎｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、ＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）を反射する特性を有している。
【００２７】
第１のレーザ光源１１に可視連続レーザ（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２１としてＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を用いる場合は、ダイクロイックミラー２５の透過率波長特性は、図３（ｂ）に示すように、ダイクロイックミラー２５は、可視連続光レーザ（波長４８８ｎｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｍ）を反射する特性を有している。
【００２８】
第１のレーザ光源１１にＩＲパルスレーザ（波長８５０ｎｍ）、第２のレーザ光源２１としてＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を用いる場合は、ダイクロイックミラー２５の透過率波長特性は、図３（ｃ）に示すように、ＩＲパルスレーザ（波長８５０ｎｍ）及び波長５３０ｎｍの蛍光を透過し、ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を反射する特性を有している。
【００２９】
なお、ここで使用するＩＲパルスレーザは、２光子励起現象を引き起こすことのできるレーザである。
【００３０】
前記第１のレーザシャッタ１３、第２のレーザシャッタ２２、第１の光学走査ユニット１４、第２の光学走査ユニット２３、光電変換素子１１２ａおよび光電変換素子１１２ｂは、コントロールユニット２１１に接続されている。このコントロールユニット２１１には、ＣＲＴディスプレイ２１２が接続されている。コントロールユニット２１１は後述するように、第２の走査光学系Ｂからのレーザ光の試料２９への照射を第１の走査光学系Ａの走査に同期させる。
【００３１】
次に、このように構成した走査型レーザ顕微鏡の作用を説明する。第１のレーザ光源１１からのレーザ光１１ａは、コントロールユニット２１１により開閉制御される第１のレーザシャッタ１３が開状態のときに通過する。そしてレーザ光１１ａは、第１の走査光学ユニット１４へ導かれ、コントロールユニット２１１により制御されて任意の方向に走査される。レーザ光１１ａはさらに、瞳投影レンズ１５、ミラー１６、ダイクロイックミラー２５、結像レンズ２６、対物レンズ２７を介して、試料２９の断面２１０上に集光され、試料の断面２１０内を２次元走査する。
【００３２】
試料２９には、第１のレーザ光源１１の波長によって励起される蛍光指示薬（例えばｆｌｕｏ−３、励起波長４８８ｍ，蛍光波長５３０ｎｍ）が導入されている。試料の断面２１０内をレーザ光が走査することにより、蛍光指示薬が励起されて蛍光を生じる。対物レンズ２７に入射した蛍光は、上記レーザ光と同じ光路を逆向きに進み、対物レンズ２７、結像レンズ２６、ダイクロイックミラー１２へ導かれる。ダイクロイックミラー１２は、第１のレーザ光源１１からのレーザ光１１ａの波長より長波長の光を反射する特性を備えている。従って、これにより上記蛍光はダイクロイックミラー１２により反射され、検出光学系Ｃへ導入される。
【００３３】
検出光学系Ｃにおいて、試料２９が多重染色されている場合、吸収フィルタ３１を通過した蛍光は、ダイクロイックミラー１７により各波長の蛍光に分光される。分光した光のうち特定の波長の光が、それぞれ蛍光測光フィルタ１９ａおよび１９ｂを通過し、共焦点レンズ１１０ａおよび１１０ｂで集光される。そして、試料の断面２１０と光学的に共役な位置に設けられている共焦点絞り１１１ａおよび１１１ｂによって、試料の断面２１０からの光のみが光電変換素子１１２ａおよび１１２ｂへ入射する。
【００３４】
光電変換素子１１２ａおよび１１２ｂからの出力信号は、コントロールユニット２１１へ導かれる。出力信号は走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置に対応してＣＲＴディスプレィ画面２１２上に表示される。表示された画像は、試料の断面２１０での蛍光輝度の２次元分布である蛍光画像、すなわち所望のイオン濃度の断面２１０内での分布を示している。
【００３５】
一方、第２のレーザ光源２１からのレーザ光２１ａは、コントロールユニット２１１が開閉制御する第２のレーザシャッタ２２が開状態のときに通過する。レーザ光２１ａは、第２の走査光学ユニット２３、瞳投影レンズ２４、ダイクロイックミラー２５を介して第１の走査光学系Ａからのレーザ光１１ａと同じ光軸上を進行する。そしてレーザ光２１ａは、結像レンズ２６、対物レンズ２７を通過して、試料２９の断面２１０上に照射される。この時、コントロール２１１により第２の走査光学ユニット２３を制御することで、第１の走査光学系Ａの走査位置と独立に断面２１０内での照射位置を選択することができる。
【００３６】
第２のレーザ光源２１からのレーザ光２１ａが、ケージド試薬を導入した試料２９に照射されると、照射された部位のケージド試薬のケージド基が開裂し、内部に包含されている物質が放出される。この放出による試料２９内の上記イオン濃度分布の変化を、第１の走査光学系Ａにより得られる蛍光画像により測定できる。
【００３７】
このとき、試料２９上で反射した第２のレーザ光源２１からのレーザ光２１ａを含む反射光は、試料２９の断面２１０上で発生した蛍光と同じ光路を進行する。ダイクロイックミラー２５へ達したレーザ光２１ａを含む反射光のうち数％の光はダイクロイックミラー２５を透過して第１の走査光学系Ａの光路へ導入される。第１の走査光学系Ａへ導入された第２のレーザ光を含む反射光は、ミラー１６、瞳投影レンズ１５、走査光学ユニット１４を通過して、ダイクロイックミラー１２で反射され検出光学系の光路へ導かれる。
【００３８】
ダイクロイックミラー１２で反射されたレーザ光２１ａを含む反射光は、予め検出光学系Ｃの光路上に配置されたレーザ光２１ａを吸収する特性を備えた吸収フィルタ３１で吸収される。従って、蛍光のみが吸収フィルタ３１を通過し、光電変換素子１１２ａ、１１２ｂで検出されるようになる。
【００３９】
ここで、本実施の形態において用いる吸収フィルタ３１の透過特性について説明する。
【００４０】
試料２９に照射される励起レーザ光である第２の走査光学系Ｂからのレーザ光２１ａの強度に対して、試料２９より発生する蛍光の強度は非常に弱い。従って、試料２９で反射したレーザ光２１ａが試料や途中の光学系で反射することによって減衰したとしても、試料２９から発生して検出器１１２ａ、１１２ｂに向う蛍光の強度に比較して、１０００倍または、それ以上となることが多い。従って、これらの反射したレーザ光２１ａの影響を受けずに蛍光画像を鮮明に取得するには蛍光を透過させる吸収フィルタ特性として、反射したレーザ光２１ａの透過率を少なくとも０．０１％以下にする必要がある。
【００４１】
ところで、このような特性を実現するために、多層膜コーティングを用いた干渉フィルタが使用される。干渉フィルタは、屈折率や膜厚の異なる層を多数重ねあわせ、光を干渉させて透過率を制御する。しかし干渉フィルタは、波長帯域に対してフラットな透過率特性を実現するのは困難なため、通常は、目的とする透過波長と遮断波長を設定し、その波長で所望の特性が得られるように製造される。従来、蛍光波長を選択する吸収フィルタとして実際に製造されるものは、蛍光に対応する励起波長のみを透過率０．０１％以下とするのが一般的であった。
【００４２】
即ち、従来の吸収フィルタは、「蛍光を取り出す機能」を有するフィルタであって、本実施の形態で用いる吸収フィルタ３１が更に有する、第２走査光学系を設けた場合の「第２レーザ光」を遮断する機能を備えていないと考えられる。
【００４３】
図４（ａ）は、本実施の形態の吸収フィルタの特性を説明する図である。
【００４４】
図４（ａ）では、第１のレーザ光を可視連続レーザ光（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光をＵＶパルスレーザ光（波長３５１ｎｍ）、試料からの光を蛍光（波長５３０ｎｍ）として表わしている。
【００４５】
図４（ａ）の上部には、第１のレーザ光、第２のレーザ光及び試料からの光の強度分布を示している。この図に示すように、第２のレーザ光の強度は、第１のレーザ光の強度よりも強い場合が多い。これは、第２のレーザ光が試料に刺激を与えたり、試料を操作する目的で用いられるためである。このことから、第２のレーザ光を第１のレーザ光よりも確実に遮断する必要性が高いことがわかる。
【００４６】
図４（ａ）の下部には、本実施の形態の吸収フィルタの透過特性の概念を示している。
【００４７】
上述のように、本実施の形態の吸収フィルタは２つの機能を備えている。即ち、「蛍光を取り出す機能」である第１の機能を実現するための透過機能と、「第２のレーザ光を遮断する機能」である第２の機能を実現するための透過特性と備えている。この２つの機能を備えることで明瞭な蛍光像を得ることが可能となる。
【００４８】
本実施の形態の吸収フィルタを実現するために、図１に示すように「蛍光を取り出す機能」（第１の機能）を持つ蛍光測光フィルタ１９ａ、１９ｂと「第２レーザ光遮断機能」（第２の機能）を持つ吸収フィルタ３１とをそれぞれ配置する。また図４（ｂ）に示すように、一枚のガラスの両面にそれぞれの機能をもつフィルタ膜３１ａ、３２ａを生成しても良い。図４（ｂ）に示すフィルタを使用する場合、図１のフィルタ１９ａ、１９ｂの代わりに使用すれば良い。このとき、フィルタ３１は必要でない。
【００４９】
このように、検出光学系Ｃに上述の透過特性を持つ吸収フィルタ３１を用いて構成することで、試料２９からの反射光に含まれるレーザ光２１ａを確実に除去することができ、鮮明な蛍光画像が得られる。また第１のレーザ光１１ａと第２のレーザ光２１ａの同時照射も可能となる。更に、試料２９が多重染色されている場合、図１に示すように吸収フィルタ３１は検出光学系Ｃの共通光路へ配設すれば良いため、容易に構成することができる。
【００５０】
［第２の実施の形態］
本発明の第２の実施の形態について説明する。図５は本発明に係る走査型レーザ顕微鏡の構成図である。第１の実施形態と同一部分には、同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００５１】
第２の実施の形態では、第２の走査光学系Ｂのレーザには、ＵＶパルスレーザ３４と波長可変可能で２光子励起現象を引き起こすことができるＩＲパルスレーザ３５とが用いられる。そして、これらのレーザ３４、３５はレーザシャッタ３６および３７の開閉制御により選択して使用することができる。また、第１の走査光学系Ａからのレーザ光１１ａの光軸と第２の走査光学系Ｂからのレーザ光３４ａもしくは３５ａの光軸とを合成する位置にダイクロイックミラー２５が配置されている。ダイクロイックミラー２５は、複数のダイクロイックミラーを備えることのできる電動ターレット３２に少なくとも一つ配設されている。
【００５２】
さらに、第２の走査光学系Ｂのレーザ光源からのレーザ光３４ａもしくは３５ａを遮断するために、吸収フィルタ３１が検出光学系Ｃの光路上に配置されている。この吸収フィルタ３１は複数の吸収フィルタを備えることのできる電動ターレット３３に少なくとも一つ配設されている。
【００５３】
なお、電動ターレット３２および３３は、通常、回転式であるが必要に応じてスライダ式としても良い。
【００５４】
また、前記電動ターレット３２、３３、レーザシャッタ３６、３７は、それぞれコントローラーユニット２１１に接続され、コントローラーユニット２１１より制御が可能である。
【００５５】
このように構成した走査型レーザ顕微鏡の作用を説明する。第２の走査光学系Ｂのレーザ光源としてＵＶパルスレーザ３４を用いる。第１の走査光学系Ａのレーザ光源１１からレーザ光１１ａおよび、第２の走査光学系Ｂのレーザ光源より出力されるＵＶパルスレーザ光３４ａは、第１の実施の形態で述べたと同様に各光学素子を通過する。そして、第１の走査光学系Ａからのレーザ光１１ａの光軸と第２の走査光学系ＢからのＵＶパルスレーザ光３４ａの光軸が、ダイクロイックミラー２５で合成される。ダイクロイックミラー２５は、第１の走査光学系Ａからのレーザ光１１ａを透過し、第２の走査光学系Ｂからのレーザ光であるＵＶパルスレーザ光３４ａを反射するような特性を有する。ダイクロイックミラー２５は、レーザシャッタ３６の開閉動作と連動して動作する電動ターレット３２によって光路上に配置される。
【００５６】
ダイクロイックミラー２５で合成された第１および第２のレーザ光源からの各レーザ光は、第１の実施の形態と同様に、結像レンズ２６，対物レンズ２７を透過して、試料２９の断面２１０上に集光される。ＵＶパルスレーザ光３４ａによりケージド試薬が解除され、第１の走査光学系Ａからのレーザ光１１ａにより、蛍光指示薬が励起されて蛍光が発生する。
【００５７】
試料２９より発生した蛍光と試料からの反射光であるＵＶパルスレーザ光３４ａが、第１の走査光学系Ａの光路を逆方向に進行し、ダイクロイックミラー１２を介して蛍光およびＵＶパルスレーザ光３４ａの反射光が検出光学系Ｃに導入される。
【００５８】
検出光学系Ｃに導入された蛍光およびＵＶパルスレーザ光３４ａのうち蛍光は、吸収フィルタ３１を通過し、ＵＶパルスレーザ光は吸収フィルタ３１で吸収される。尚、電動ターレット３３はレーザシャッタ３６の開閉動作と連動して動作し、ＵＶパルスレーザ光を吸収するような透過特性を有する吸収フィルタ３１を光路上に予め配置する。
【００５９】
吸収フィルタ３１を通過した蛍光は第１の実施の形態で述べたと同様に各光学素子を通過する。そして蛍光は、光電変換素子１１２ａおよび１１２ｂで検出される。検出信号はコントローラーユニット２１１で信号処理された後、ＣＲＴディスプレイ２１２上に表示される。
【００６０】
一方、ケージド試薬を解除するため、もしくは、タンパク質（例えばＹＦＰ）を発現させた試料を光褪色させるために、第２の走査光学系Ｂのレーザ光としてＩＲパルスレーザ３５を用いる場合がある。この場合、第１の走査光学系Ａからのレーザ光の光軸と第２の走査光学系ＢからのＩＲパルスレーザ光３５ａを合成するダイクロイックミラー２５は、第１の走査光学系Ａからのレーザ光１１ａを透過し、ＩＲパルスレーザ光３５ａを反射する透過特性を有する。そして電動ターレット３２は、レーザシャッタ３７の開閉動作と連動してダイクロイックミラー２５を光路上に予め配置する。
【００６１】
また、検出光学系Ｃにおいても、吸収フィルタ３１は蛍光を透過し、反射光であるＩＲパルスレーザ光３５ａを吸収するような透過特性を有している。そして、電動ターレット３３がレーザシャッタ３７の開閉動作と連動して吸収フィルタ３１を予め光路上に配置する。
【００６２】
このように第２の実施の形態においては、第１の走査光学系Ａからのレーザ光の光軸と第２の走査光学系Ｂからのレーザ光の光軸とを合成するダイクロイックミラー２５を電動ターレット上に備えている。更に、検出光学系Ｃに試料２９からの反射光である第２の走査光学系Ｂのレーザ光を吸収するような吸収フィルタ３１を電動ターレット３３に備えている。そして、前記電動ターレット３２および３３をレーザシャッタ３６および３７の開閉動作と連動して動作させる。これによって、ケージド試薬の解除等に使用する第２の走査光学系Ｂのレーザ光源として、ＵＶパルスレーザ３４もしくはＩＲパルスレーザ３５のいずれかを選択して使用することが可能なシステムを提供することができる。
【００６３】
また、電動ターレット３２、３３に代えて手動ターレットを用いれば、同様の性能を有するシステムを安価で提供することができる。
【００６４】
［第３の実施の形態］
本発明の第３の実施の形態について説明する。図６は本発明に係る走査型レーザ顕微鏡の構成図である。第１および第２の実施形態と同一部分には、同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００６５】
本実施の形態の走査型レーザ顕微鏡は、観察用の第１の走査光学系Ａの結像レンズ４１と第２の走査光学系Ｂの結像レンズ４３をそれぞれ独立に配置し、対物レンズ２７を共用する構成になっている。
【００６６】
第１の走査光学系Ａは、走査型レーザ顕微鏡Ｄとして構成されている。第１の走査光学系Ａは、第１のレーザ光源１１、第１のレーザシャッタ１３、ダイクロイックミラー１２、第１の走査光学ユニット１４、瞳投影レンズ１５、結像レンズ４１、ダイクロイックミラー４２および対物レンズ２７から構成される。ダイクロイックミラー４２は、複数のダイクロイックミラーを備えることのできる電動ターレット４７に少なくとも一つ配置されている。さらに第１の走査光学系Ａのダイクロイックミラー１２の分岐光路上には、検出光学系Ｃが配置されている。検出光学系Ｃについては、第２の実施の形態と同様なので、説明を省略する。
【００６７】
前記第１の走査光学系Ａの電動ターレット４７に備えられているダイクロイックミラー４２は、第１の走査光学系Ａからのレーザ光の波長および長波長の光を反射すると共に、第２の走査光学系Ｂからのレーザ光を透過する特性を有している。
【００６８】
第２の走査光学系Ｂは、照明光導入装置Ｅとして構成されている。第２の走査光学系Ｂは、第２のレーザ光源２１、第２のレーザシャッタ２２、第２の走査光学ユニット２３、瞳投影レンズ２４、結像レンズ４３およびミラー４４から構成される。
【００６９】
なお、第２の走査光学系Ｂは、第２の走査光学ユニット２３を省略して構成しても良い。
【００７０】
第２のレーザシャッタ２２と第２の走査光学ユニット２３は第２のコントロールユニット４５で制御される。第２のコントロールユニット４５は第１の走査光学系Ａとの同期制御のために第１のコントロールユニット４６に接続されている。
【００７１】
なお、第２のコントロールユニット４５は必ずしも必要ではない。第２のレーザシャッタ２２と第２の走査光学ユニット２３とを、直接第１のコントロールユニット４６に接続しても良い。
【００７２】
また、本実施の形態では走査型レーザ顕微鏡Ｄ、照明光導入装置Ｅは、それぞれ独立したユニットとして構成されており、かつ両者は、例えばアリ構造またはボルト締結などにより、取り付け、取り外しが可能な構造になっている。
【００７３】
次に、このように構成した走査型レーザ顕微鏡の作用について説明する。第１の走査光学系Ａのレーザ光源１１から出射したレーザ光１１ａは、第１の走査光学系Ａの各光学素子を通過し、結像レンズ４１で平行光となる。そしてレーザ光１１ａは、ダイクロイックミラー４２で反射され対物レンズ２７で集光され試料２９の断面２１０上を走査する。試料２９の断面２１０からの蛍光は、第１の実施の形態で述べたと同様な光路を進み検出光学系Ｃで検出される。
【００７４】
一方、第２の走査光学系Ｂのレーザ光源２１から出射したレーザ光２１ａは、第２の走査光学系Ｂの各光学素子を通過して結像レンズ４３で平行光となる。そしてレーザ光２１ａは、ミラー４４で反射されダイクロイックミラー４２を介して、第１の走査光学系Ａからの光軸と合成される。そしてレーザ光２１ａは、対物レンズ２７で集光され、試料２９の断面２１０上に照射される。
【００７５】
第１のコントロールユニット４６は第２のコントロールユニット４５および第２の走査光学ユニット２３を制御することで、第１の走査光学ユニット１４の走査位置および範囲と独立した第２の走査光学系Ｂによる照射位置および範囲を選択することができる。
【００７６】
このように第３の実施の形態においては、第１の走査光学系Ａは結像レンズ４１を備え、第２の走査光学系Ｂは結像レンズ４３を備えている。従って、結像レンズ４１、４３を透過したレーザ光は平行光となるため、第１の走査光学系Ａの光軸と第２の走査光学系Ｂの光軸を容易に合わせることができる。
【００７７】
つまり、第１の走査光学系Ａを備える走査型レーザ顕微鏡Ｄと第２の走査光学系Ｂを備える照明光導入装置Ｅとの接続部分の光束が平行光になるので、走査型レーザ顕微鏡Ｄと照明光導入装置Ｅを接続する際の光軸合せが簡単になる。
【００７８】
また、第１の走査光学系Ａを走査型レーザ顕微鏡Ｄとして構成し、第２の走査光学系Ｂを照明光導入装置Ｅとして構成することができる。従って、それぞれを異なる装置として構成することができるため、照明光導入装置Ｅを走査型レーザ顕微鏡Ｄのシステムアップ用の装置として提供できる。
【００７９】
また、照明光導入装置Ｅを第２の走査光学系Ｂの走査光学ユニット２３を含まない構成とすれば、制御が容易で安価な装置として提供できる。
【００８０】
なお、本発明に係る走査型レーザ顕微鏡は上述の各実施の形態に基づいて次のように構成することが可能である。
【００８１】
（１）可視領域にスペクトルを有する第１のレーザ光を試料上で走査して蛍光を励起する第１の走査光学系と、試料からの蛍光を前記第１のレーザ光の光路から分離する第１ダイクロイックミラーと、第１ダイクロイックミラーで分離された蛍光を検出する光検出器と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第１のレーザ光を遮断し所望の蛍光を透過する測光フィルタと、紫外または赤外領域にスペクトルを有する第２のレーザ光を試料上の特定の部位に導入するための第２の走査光学系と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第２のレーザ光の透過を制限する吸収フィルタとを備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【００８２】
（２）前記光検出器と前記測光フィルタが複数設けられ、これらの光検出器に向けて試料からの蛍光を分光する第２ダイクロイックミラーを前記第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に備え、前記吸収フィルタは、第１ダイクロイックミラーと第２ダイクロイックミラーとの間に配置され、前記測光フィルタはそれぞれの光検出器と第２ダイクロイックミラーとの間に配置されることを特徴とする（１）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００８３】
（３）第２のレーザ光の波長を切り換える波長切り換え部と、第２のレーザ光の波長に応じて前記吸収フィルタを切り換えるフィルタ切り換え部とを備えることを特徴とする（１）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００８４】
（４）第２の走査光学系は、第１の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡本体に対して着脱可能であることを特徴とする（１）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００８５】
（５）前記測光フィルタは、前記第１のレーザ光の透過率が０．０１％以下であり、前記吸収フィルタは、前記第２のレーザ光の透過率が０．０１％以下であることを特徴とする（１）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００８６】
（６）試料を観察するための第１のレーザ光を試料上で走査する第１の走査光学系と、試料からの光を前記第１のレーザ光の光路から分岐する第１光分岐素子と、第１光分岐素子で分離された試料からの光を検出する光検出器と、試料を刺激または操作するための第２のレーザ光を試料上の特定の部位に照射するための第２の走査光学系と、第１光分岐素子と光検出器との間に配置され、所望の観察光を透過する第１の機能及び第２のレーザ光の透過を制限する第２の機能を有する波長選択素子とを備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【００８７】
（７）前記波長選択素子は、干渉フィルタであることを特徴とする（６）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００８８】
（８）前記波長選択素子は、第２のレーザ光の透過率が０．０１％以下であることを特徴とする（６）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００８９】
（９）前記波長選択素子は、前記第１の機能を有する第１の干渉フィルタと、前記第２の機能を有する第２の干渉フィルタであることを特徴とする（８）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９０】
（１０）前記波長選択素子は、基板の一方の面に第１の機能を果たす第１の干渉フィルタ膜を持ち、他方の面に第２の機能を果たす第２の干渉フィルタ膜を持つ干渉フィルタであることを特徴とする（８）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９１】
（１１）前記第２レーザ光は、紫外光または赤外光であることを特徴とする（８）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９２】
（１２）前記波長選択素子は、前記第１の機能を有する第１の干渉フィルタと、前記第２の機能を有する第２の干渉フィルタであることを特徴とする（７）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９３】
（１３）前記光検出器と前記第１の干渉フィルタが複数設けられ、これらの光検出器に向けて試料からの光を分光する第２光分岐素子を第１光分岐素子と光検出器との間に備え、前記第２の干渉フィルタは、第１光分岐素子と第２光分岐素子との間に配置され、前記第１の干渉フィルタは、それぞれの光検出器と第２光分岐素子との間に配置されることを特徴とする（１２）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９４】
（１４）第２のレーザ光の波長を切り換える波長切り換え部と、第２のレーザ光の波長に応じて前記第２の干渉フィルタを切り換えるフィルタ切り換え部とを備えたことを特徴とする（１２）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９５】
（１５）前記波長選択素子は、前記第１の機能を有する第１干渉フィルタ膜と、前記第２の機能を有する第２干渉フィルタ膜を有することを特徴とする（７）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９６】
（１６）前記第２レーザ光は、紫外光または赤外光であることを特徴とする（６）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９７】
（１７）前記波長選択素子は、前記第１の機能を有する第１の干渉フィルタと、前記第２の機能を有する第２の干渉フィルタであることを特徴とする（１６）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９８】
（１８）前記光検出器と前記第１の干渉フィルタが複数設けられ、これらの光検出器に向けて試料からの光を分光する第２光分岐素子を第１光分岐素子と光検出器との間に備え、前記第２の干渉フィルタは、第１光分岐素子と第２光分岐素子との間に配置され、前記第１の干渉フィルタは、それぞれの光検出器と第２光分岐素子との間に配置されることを特徴とする（１７）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【００９９】
（１９）所望の観察光は、第１のレーザ光で励起された蛍光であることを特徴とする（６）に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【０１００】
なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
【符号の説明】
【０１０１】
１１…第1のレーザ光源、１２…第1のレーザシャッタ、１３…ダイクロイックミラー、１４…第1の走査光学ユニット、１９ａ…吸収フィルタ、１９ｂ…吸収フィルタ、２１…第2のレーザ光源、２２…第2のレーザシャッタ、２３…第2の走査光学ユニット
２５…ダイクロイックミラー、２９…試料、３１…吸収フィルタ、３１ａ…フィルタ膜、３１ｂ…フィルタ膜、３２…電動ターレット、３３…電動ターレット、３４…UVパルスレーザ、３５…波長可変IRパルスレーザ、３６…レーザシャッタ、３７…レーザシャッタ、４７…電動ターレット、１１２ａ…光電変換素子、１１２ｂ…光電変換素子。
【図１】
2010152397.tif 000003
【図２】
2010152397.tif 000004
【図３】
2010152397.tif 000005
【図４】
2010152397.tif 000006
【図５】
2010152397.tif 000007
【図６】
2010152397.tif 000008
【図７】
2010152397.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月26日(2010.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明に係る請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡は、可視領域にスペクトルを有する第１のレーザ光を試料上で走査して前記試料を励起して蛍光を発生させる第１の走査光学系と、前記第１の走査光学系内の光路中に配されて前記試料からの蛍光を前記第１のレーザ光の光路から分離する第１ダイクロイックミラーと、第１ダイクロイックミラーで分離された蛍光を検出する光検出器と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第１のレーザ光を遮断し前記蛍光を透過する測光フィルタと、紫外または赤外領域にスペクトルを有する第２のレーザ光を試料上の特定の部位に導入するための第２の走査光学系と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第２のレーザ光の透過を制限する吸収フィルタとを備えた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明に係る請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡は、可視領域にスペクトルを有する第１のレーザ光を試料上で走査して前記試料を励起して蛍光を発生させる第１の走査光学系と、前記第１の走査光学系内の光路中に配されて前記試料からの蛍光を前記第１のレーザ光の光路から分離する第１ダイクロイックミラーと、第１ダイクロイックミラーで分離された蛍光を検出する光検出器と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第１のレーザ光を遮断し前記蛍光を透過する測光フィルタと、試料に特異現象を発現させるための第２のレーザ光を試料上の特定の部位に導入するための第２の走査光学系と、第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第２のレーザ光の透過を制限する吸収フィルタとを備えた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明に係る請求項３に記載の走査型レーザ顕微鏡は、上記記載の発明である走査型レーザ顕微鏡において、前記特異現象は、少なくともケージド試薬の開裂、光褪色のいずれかを含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可視領域にスペクトルを有する第１のレーザ光を試料上で走査して前記試料を励起して蛍光を発生させる第１の走査光学系と、
前記第１の走査光学系内の光路中に配されて前記試料からの蛍光を前記第１のレーザ光の光路から分離する第１ダイクロイックミラーと、
第１ダイクロイックミラーで分離された蛍光を検出する光検出器と、
第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第１のレーザ光を遮断し前記蛍光を透過する測光フィルタと、
紫外または赤外領域にスペクトルを有する第２のレーザ光を試料上の特定の部位に導入するための第２の走査光学系と、
第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第２のレーザ光の透過を制限する吸収フィルタと、
を備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２】
可視領域にスペクトルを有する第１のレーザ光を試料上で走査して前記試料を励起して蛍光を発生させる第１の走査光学系と、
前記第１の走査光学系内の光路中に配されて前記試料からの蛍光を前記第１のレーザ光の光路から分離する第１ダイクロイックミラーと、
第１ダイクロイックミラーで分離された蛍光を検出する光検出器と、
第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第１のレーザ光を遮断し前記蛍光を透過する測光フィルタと、
試料に特異現象を発現させるための第２のレーザ光を試料上の特定の部位に導入するための第２の走査光学系と、
第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に配置され前記第２のレーザ光の透過を制限する吸収フィルタと、
を備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記特異現象は、少なくともケージド試薬の開裂、光褪色のいずれかを含むことを特徴とする請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記光検出器と前記測光フィルタが複数設けられ、
これらの光検出器に向けて試料からの蛍光を分光する第２ダイクロイックミラーを前記第１ダイクロイックミラーと光検出器との間に備え、
前記吸収フィルタは、前記第１ダイクロイックミラーと前記第２ダイクロイックミラーとの間に配置され、
前記測光フィルタは、それぞれの光検出器と前記第２ダイクロイックミラーとの間に配置されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記第２のレーザ光の波長を切り換える波長切り換え部と、
この第２のレーザ光の波長に応じて前記吸収フィルタを切り換えるフィルタ切り換え部とを備えることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項６】
前記測光フィルタは基板の一方の面に配置され、前記吸収フィルタは前記基板の他方の面に配置されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項７】
前記第の２レーザ光は多光子励起現象を引き起こすことができるＩＲパルスレーザであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項８】
前記第２の走査光学系は、前記第１の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡本体に対して着脱可能であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項９】
前記測光フィルタは、前記第１のレーザ光の透過率が０．０１％以下であり、前記吸収フィルタは、前記第２のレーザ光の透過率が０．０１％以下であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項１０】
前記測光フィルタ及び吸収フィルタは、干渉フィルタであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡。