(57)【要約】【課題】光信号検出方法において、簡易的に光応答性標識物質の受ける電場増強効果のばらつきを低減することにより、より定量性の高い測定を可能とする。【解決手段】平坦な金属層１２を含むセンサ部１４を有するセンサチップ１０を用い、光応答性標識物質Ｆにより標識された結合物質Ｂ２をセンサ部１４に結合させ、金属層１２にプラズモンを誘起可能な波長であって、光応答性標識物質Ｆが光応答可能な波長を有する測定光Ｌ０を、センサ部１４に落射照明で照射することにより増強電場Ｄを発生せしめ、増強電場Ｄにより光応答性標識物質Ｆから生じる光信号Ｌｆ１を増強せしめ、この光信号Ｌｆ１の量に基づいて被検出物質Ａの量を検出する。【選択図】図１
2010223802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面の所定領域に設けられた平坦な金属層を含むセンサ部とを有するセンサチップを用い、
前記センサ部に試料を接触させることにより、該試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、光応答性標識物質により標識された結合物質を、前記センサ部に結合させ、
前記金属層にプラズモンを誘起可能な波長であって、前記光応答性標識物質が光応答可能な波長を有する測定光を、前記センサ部に落射照明で照射することにより該センサ部上に増強電場を発生せしめ、
該増強電場により前記光応答性標識物質からの光信号を増強せしめ、該光信号を検出し、
該光信号の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する光信号検出方法であって、
前記光応答性標識物質が、前記測定光に応答して光信号を生ずる複数の光応答物質と、該光応答物質を包含しかつ該光信号を透過する光透過材料とを備えることを特徴とする光信号検出方法。
【請求項２】
前記金属層が、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものであることを特徴とする請求項１に記載の光信号検出方法。
【請求項３】
前記金属層が、ＡｕまたはＡｇを主成分とするものであることを特徴とする請求項２に記載の光信号検出方法。
【請求項４】
前記光応答物質が、蛍光色素分子、蛍光微粒子、および量子ドットからなる群より選択される１の物質であることを特徴とする請求項１から３いずれかに記載の光信号検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に光を照射して光応答性標識物質からの光信号を検出することにより試料中の特定物質の量を検出する光信号検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光材料ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。
【０００３】
上記蛍光法において、試料を流しながら特定の被検出物質のみを効率よく検出できる等の理由から、以下に示す２つの方法により被検出物質をセンサ部表面に固定し、その後蛍光検出を行う手法が一般的である。このような手法の１つは、例えば被検出物質が抗原である場合に、センサ部表面に固定された１次抗体に、抗原を特異的に結合させ、次いで、蛍光標識が付与された、抗原と特異的に結合する２次抗体を、上記抗原に結合させることにより、１次抗体―抗原―２次抗体という結合状態を形成し、結合した２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出する、所謂サンドイッチ法である。また、もう１つは、例えば被検出物質が抗原である場合に、センサ部表面に固定された１次抗体に、抗原と蛍光標識が付与された２次抗体（前述の２次抗体と異なり、１次抗体と特異的に結合する）とを、競合的に１次抗体と結合させ、結合した２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出する、所謂競合法である。
【０００４】
また、例えば特許文献１にあるように、蛍光検出においてＳ／Ｎ比を向上できる等の理由から、上記のような方法によってセンサ部に固定された蛍光標識を、局在プラズモンにより形成される増強電場によって励起する方法が提案されている。局在プラズモンとは、照射光の波長と同程度の大きさの微細構造に局在的に生じるプラズモンである。この局在プラズモンが励起された場合には、当該微細構造の周囲に著しく増強された電場が形成される。例えば、この微細構造が金微粒子の場合には、５２０ｎｍ近傍の光に対して局在プラズモンが誘起される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２４０３６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら特許文献１では、インプリント技術を用いて光学基材上に上記局在プラズモンを生じせしめるための微細構造を形成しているため、センサチップの製造に手間がかかる。また、センサチップの製造中に微細構造が壊れてしまうなどの歩留まりの問題もある。
【０００７】
さらに、特許文献１にあるような高さ１００〜１０００ｎｍ、幅２０〜１０００ｎｍ、アスペクト比２〜１０の多数の凸部を有するセンサ部表面に、蛍光標識等の標識物質を固定する場合には、標識物質の固定場所が凸部の頂上か或いは凸部同士の間かによって、増強電場によって標識物質の受ける影響が異なってくる。例えば、抗原抗体反応で前述のサンドイッチアッセイを行う場合には、固定されている部分のセンサ部表面から標識物質は５０ｎｍ以上も離れてしまうため、凸部の頂上に固定された標識物質は、増強電場による信号増強の恩恵を受けることができない場合がある。このように標識物質の固定位置の違いは信号増強度の違いとなるため、測定の定量性を下げる要因となりうる。
【０００８】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、光信号検出方法において、簡易的に光応答性標識物質の受ける電場増強効果のばらつきを低減することにより、より定量性の高い測定を可能とする光信号検出方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本出願人は、平坦な金属層を備えるセンサ部上に存在する光応答性標識物質に対して、測定光を落射照明で照射すると、金属層にプラズモンが誘起することに注目し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち上記課題を解決するために、本発明に係る光信号検出方法は、
誘電体プレートと、この誘電体プレートの一面の所定領域に設けられた平坦な金属層を含むセンサ部とを有するセンサチップを用い、
センサ部に試料を接触させることにより、この試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、光応答性標識物質により標識された結合物質を、センサ部に結合させ、
金属層にプラズモンを誘起可能な波長であって、光応答性標識物質が光応答可能な波長を有する測定光を、センサ部に落射照明で照射することによりセンサ部上に増強電場を発生せしめ、
増強電場により光応答性標識物質からの光信号を増強せしめ、この光信号を検出し、
この光信号の量に基づいて、被検出物質の量を検出する光信号検出方法であって、
光応答性標識物質が、測定光に応答して光信号を生ずる複数の光応答物質と、この光応答物質を包含しかつ光信号を透過する光透過材料とを備えることを特徴とするものである。
【００１１】
ここで、「平坦な金属層」とは、金属微粒子等の微細構造のない誘電体プレートの一面に形成された金属膜を意味するものとする。つまり、測定光の照射により局在プラズモンを生じる微細構造を有さない金属膜である。
【００１２】
「結合物質」とは、ある特定の対象物質と特異的に結合する物質を意味するものとする。例えば、特定の対象物質として抗原を考える場合には、結合物質としてこの抗原と特異的に結合する抗体が挙げられる。
【００１３】
「光応答性標識物質」とは、測定光の照射に起因して光信号を生ずる標識物質を意味するものとする。ここで、例えば光信号として蛍光を挙げることができる。光応答性標識物質は、粒子状の光透過材料中に複数の光応答物質が存在するものである。複数の光応答物質のうち、一部が光透過材料の外部に露出していてもよい。また、光透過材料中における光応答物質の分布状態はどのようであってもよく、均一に分布していてもよいし、均一に分布していなくてもよい。さらに、粒子状の光応答性標識物質の中心部においては、光応答物質が存在しない領域が存在してもよい。
【００１４】
アッセイでは、センサ部上に固定され被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質を介して、被検出物質の量に応じた量だけ、光応答性標識物質により標識された結合物質をセンサ部上に結合させる。この光応答性標識物質により標識された結合物質を「センサ部に結合させ」る方法としては以下の２つがある。例えば、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、当該結合物質として被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質を用いる。これにより、第１の結合物質−被検出物質−第２の結合物質のサンドイッチ構造が作られる。ここで、被検出物質の第１の結合物質に対する結合部位と第２の結合物質に対する結合部位とは異なる。一方、競合法によるアッセイを行う場合には、当該結合物質として被検出物質と競合して上記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質を用いる。これにより、第１の結合物質−第３の結合物質の結合が作られる。
【００１５】
「被検出物質の量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無の検出を含み、定性的な量のみならず定量的な量および活性の程度を検出することを意味するものとする。
【００１６】
さらに、本発明に係る光信号検出方法において、金属層は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものであることが好ましく、特にＡｕまたはＡｇを主成分とするものであることが好ましい。
【００１７】
そして、光応答物質は、蛍光色素分子、蛍光微粒子および量子ドットからなる群より選択される１の物質であることが好ましい。つまり、「光応答物質」は、測定光に対し光応答性を有するものであればよく、測定光の照射により蛍光を生じる蛍光色素分子、蛍光微粒子、量子ドット（半導体微粒子）などであってもよい。したがって、「光応答性標識物質からの光」とは、測定光が照射されて光応答物質から生じる光（蛍光および燐光等）を意味するものとする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る光信号検出方法は、平坦な金属層を備えるセンサ部上に存在する光応答性標識物質に対して、測定光を落射照明で照射することによって、金属層にプラズモンを誘起している。これは、光応答性標識物質からの光信号によって金属層にプラズモンが誘起されていると考えられる。したがって、このプラズモンによる電場増強効果によってセンサ部上の電場を増強することができる。このことは、微細構造の形成や全反射照明光学系の調整等を必要とせず、センサ部上に単に落射照明を行うだけで容易に増強電場を形成することができることを示している。また、金属層が平坦であるため、それぞれの光応答性標識物質と金属層との位置関係がほぼ一定となり、それぞれの光応答性標識物質がほぼ均一の増強度となるように電場増強効果を得ることができる。この結果、光信号検出方法において、簡易的に光応答性標識物質の受ける電場増強効果のばらつきを低減することができ、より定量性の高い測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】第１の実施形態に係る光信号検出方法に用いる装置を示す概略断面図
【図２Ａ】第２の実施形態に係る光信号検出方法に用いるチップを示す概略平面図
【図２Ｂ】第２の実施形態に係る光信号検出方法に用いるチップを示す概略断面図
【図３】第２の実施形態に係る光信号検出方法のアッセイの工程を示す概略断面図
【図４】競合法によるアッセイの原理を説明する概略断面図
【図５】第３の実施形態に係る光信号検出方法のアッセイの工程を示す概略断面図
【図６】光応答性標識物質の設計変更例を示す概略断面図
【図７】実施例および比較例の測定結果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２１】
＜光信号検出方法の第１の実施形態＞
まず、本実施形態に係る光信号検出方法に用いる光信号検出装置１の構成について説明する。図１は、本実施形態に係る光信号検出装置１の全体構成を示す概略断面図である。各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００２２】
図１に示すように光信号検出装置１は、誘電体プレート１１の一面の所定領域に設けられた金属層１２を備えたセンサ部１４を有するセンサチップ１０、測定光Ｌ０をセンサ部上に落射照明で照射する落射照明光学系２０と、光応答性標識物質Ｆにより標識された結合物質Ｂ２が金属層１２に接触している試料中に存在する場合に、光応答性標識物質Ｆから生じる光を検出する光検出器３０とを備えている。
【００２３】
落射照明光学系２０は、測定光Ｌ０を出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、測定光Ｌ０を反射してセンサチップ１０へ導光するハーフミラー２３とを備えている。ハーフミラー２３は、測定光Ｌ０を反射し、光応答性標識物質から生じる光を透過するものである。
【００２４】
センサチップ１０は、流路を有する誘電体プレート１１の流路内の所定領域に金属層１２として金属膜が成膜されたものである。
【００２５】
誘電体プレート１１は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プレート１１は樹脂から形成されたものが好ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより好ましい。
【００２６】
金属層１２は、所定領域に開口を有するマスクを誘電体プレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。また、金属層１２は、光の照射によって局在プラズモンを誘起しうるような微細構造を有さないものである。金属層１２の厚みは、金属膜の材料と、測定光Ｌ０の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが好ましい。例えば、測定光Ｌ０として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属層１２としてＡｕ膜を用いる場合、金属層１２の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属層１２は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましく、特にＡｕまたはＡｇが好ましい。ここで、「主成分」とは、含量９０質量％以上の成分と定義する。Ａｇを金属層として用いる場合は、Ａｇが酸化しやすいためその表面に酸化防止膜を形成することが好ましい。酸化防止膜としては、ＳｉＯ２膜等の酸化物膜やＡｕ膜等の他の酸化しにくい金属膜を用いることができる。
【００２７】
以下においては、図１に示す実施形態の光信号検出装置を蛍光検出装置として用いるものとし、光信号検出方法として蛍光検出方法について説明する。また、光応答性標識物質Ｆとして蛍光色素分子を内包する蛍光標識物質を用い、光信号として蛍光を検出するものとする。
【００２８】
蛍光検出装置１を用いた蛍光検出の原理について説明する。
落射照明光学系２０により測定光Ｌ０がセンサ部１４上に落射照明で照射されることにより、蛍光標識物質Ｆから蛍光Ｌｆが生じる。この時、センサ部に固定されている蛍光標識物質Ｆ１からの蛍光Ｌｆ１は、以下に示す２つの効果により増強される。１つは、金属層１２による「鏡面効果」である。この鏡面効果により蛍光標識物質Ｆ１に照射される測定光Ｌ０の量が増加するため、蛍光標識物質Ｆ１から生じる蛍光量が増大される。そしてもう１つは、表面プラズモンによる電場増強効果である。この表面プラズモンは、蛍光標識物質Ｆから生じた蛍光Ｌｆの一部が金属層１２に吸収されることにより、この金属層１２中に誘起されるものであると考えられる。この結果、この表面プラズモンにより金属層１２表面に電界分布が生じ、電場増強領域Ｄが形成される。このとき、電場増強領域Ｄにおいて蛍光標識物質Ｆ（図１のＦ１）が存在する場合、その蛍光標識物質Ｆ１がさらに励起されて蛍光Ｌｆ１が発生する。光検出器３０は、図示しない集光レンズ等により蛍光を集光し、この蛍光Ｌｆの検出を行う。ここで、電場増強領域Ｄ外に蛍光標識物質Ｆ（図１のＦ２）が存在する場合には蛍光Ｌｆ２は増強されない。このようにして、光検出器３０は増強された蛍光Ｌｆ１を検出する。ここで、試料中に浮遊している蛍光標識物質Ｆ２を洗い流してから蛍光測定を行うことが好ましい。
【００２９】
本実施形態において、蛍光標識物質Ｆは、光応答物質である複数の蛍光色素分子１５と、この複数の蛍光色素分子１５を包含しかつ蛍光を透過する光透過材料１６とを備えている。したがって、蛍光標識物質Ｆは複数の蛍光色素分子１５を内包するものであるため、従来の蛍光色素分子１５自体を標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増大させることができる。また、蛍光標識物質Ｆは、拡散時間の点から粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましい。また、蛍光量およびセンサ部上への最密充填密度の観点および、表面プラズモンの擾乱の観点から１００ｎｍ〜７００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。ここで、蛍光標識物質（光応答性標識物質）Ｆの粒径は、略球状の粒子の場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅との平均の長さで定義するものとする。光透過材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ２などの誘電体が挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、該蛍光色素分子１５からの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
【００３０】
なお、蛍光標識物質中の光応答物質として蛍光色素分子に代えて、蛍光微粒子および量子ドット（半導体微粒子）等を備えてもよい。
【００３１】
本実施形態で用いられる蛍光標識物質Ｆは、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％ｓｏｌｉｄ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社、ＢＯＤＩＰＹ―ＦＬ―ＳＥ、製品番号Ｄ２１８４）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。以上の工程により、ポリスチレンにより蛍光色素分子を内包してなる蛍光標識物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素分子を含浸させて作製された蛍光標識物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００３２】
上記構成の蛍光検出装置１を用いた蛍光検出方法を用いたセンシングについて説明する。
まず、センサチップ１０の金属層１２を備えたセンサ部１４に検査対象となる試料Ｓを接触させる。ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。金属層１２上には抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が修飾されている。センサチップ１０の流路中に試料Ｓが流され、次いで同様に抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２が表面に修飾された蛍光標識物質Ｆが流される。この場合、金属層１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と蛍光標識物質Ｆに表面修飾される２次抗体Ｂ２とは、抗体Ａに対して互いに別の部位に結合するものが用いられる。その後、センサ部１４上に向けて落射照明光学系２０から測定光Ｌ０が照射され、光検出器３０により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器３０によって所定の蛍光Ｌｆが検出されたなら、上記２次抗体Ｂ２と抗原Ａとの結合、すなわち試料中における抗原Ａの存在を確認できることになる。
【００３３】
なお、被検出物質（抗原Ａ）の標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光標識物質を添加しておいてもよい。
【００３４】
以上のように、本実施形態に係る光信号検出方法は、平坦な金属層を備えるセンサ部上に存在する光応答性標識物質に対して、測定光を落射照明で照射することによって、金属層にプラズモンを誘起している。これは、光応答性標識物質からの光信号によって金属層にプラズモンが誘起されていると考えられる。したがって、このプラズモンによる電場増強効果によってセンサ部上の電場を増強することができる。このことは、微細構造の形成や全反射照明光学系の調整等を必要とせず、センサ部上に単に落射照明を行うだけで容易に増強電場を形成することができることを示している。また、金属層が平坦であるため、それぞれの光応答性標識物質と金属層との位置関係がほぼ一定となり、それぞれの光応答性標識物質がほぼ均一の増強度となるように電場増強効果を得ることができる。この結果、光信号検出方法において、簡易的に光応答性標識物質の受ける電場増強効果のばらつきを低減することができ、より定量性の高い測定が可能となる。
（設計変更）
第１の実施形態において、落射照明光学系として同軸落射型の光学系を用いて説明してきたが、特にこれに限定されるものではない。また、落射照明は、必ずしも図１に示すようにセンサ部に対して垂直となるように照射する必要はなく、斜めから照射してもよい。
【００３５】
＜光信号検出方法の第２の実施形態＞
本実施形態に係る光信号検出方法は、図２ＡおよびＢに示すような試料セル５０を用いてセンシングを行う方法である。図２Ａは試料セル５０の構成を示す平面図、図２Ｂは試料セル５０の側断面図である。本実施形態においても、光応答性標識物質として蛍光色素分子を内包する蛍光標識物質を例にして説明する。
【００３６】
試料セル５０は、誘電体プレートからなる基台５１と、基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とから構成され、流路５２の注入口５４ａと空気孔５４ｂとの間の試料接触面となる基台５１の所定領域上に設けられた金属層からなるセンサ部５８ａ、５９ａが備えられている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。
【００３７】
本実施形態においては、基台５１が誘電体プレートから構成され、センサ部の誘電体プレートを兼ねているが、基台としては、センサ部が構成される部分のみ誘電体プレートで構成されたものを用いてもよい。
【００３８】
試料セル５０の基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２が表面修飾された蛍光標識物質Ｆを物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体（第１の結合物質）Ｂ１が金属層５８ａ上に固定された第１の測定エリア５８、被検出物質である抗原とは結合せず標識２次抗体ＢＦと特異的に結合する１次抗体Ｂ０が金属層５９ａ上に固定された第２の測定エリア５９が順に設けられている。つまり、上記のセンサ部５８ａ、５９ａが形成されている領域が、それぞれ第１および第２の測定エリア５８，５９に相当する。ここで、標識２次抗体ＢＦとは、蛍光標識物質Ｆに標識された２次抗体（第２の結合物質）を意味するものとする。また本例では、流路５２内に２つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは１つのみであってもよい。
【００３９】
第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９の、基台５１上にはそれぞれ金属層として、Ａｕ膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８のＡｕ膜５８ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２の測定エリア５９のＡｕ膜５９ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１とは異なる１次抗体Ｂ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は、第１の測定エリア５８と第２の測定エリア５９は同一の構成である。第２の測定エリア５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、２次抗体Ｂ２と直接結合するものである。これにより、流路５２を流れた標識２次抗体ＢＦの量、活性など反応に関する変動要因と落射照明光学系２０、Ａｕ膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。
【００４０】
なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光標識物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光標識物質であってもよい。さらには金属微粒子など他の光応答物質であってもよい。この場合、落射照明光学系２０、Ａｕ膜５８ａ、５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に１次抗体Ｂ０、既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的・方法によって適宜定めればよい。
【００４１】
試料セル５０を用いることにより、第１の測定エリア５８からの蛍光検出測定の後、第２の測定エリア５９を蛍光検出位置に移動させて第２の測定エリア５９からの蛍光検出を行うことができる。
【００４２】
落射照明光学系については、第１の実施形態と同様の光学系を用いることができる。
【００４３】
さらに、本実施形態の検出用試料セル５０および蛍光検出方法を利用して、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図３を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図３中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。反応を早め検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図３中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光標識物質Ｆ（標識２次抗体ＢＦ）とが混ぜ合わされ、血漿中の抗原Ａが２次抗体Ｂ２と結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、２次抗体Ｂ２と結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着しているものを洗い流す。
【００４４】
このように、血液を注入口から注入し、第１の測定エリア５８上に抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの蛍光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出できるように試料セル５０を移動し、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの蛍光信号は標識２次抗体ＢＦの流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリア５８からの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、既述の通り、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質等）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの蛍光信号をリファレンスとして第１の測定エリア５８からの信号を補正することができる。
【００４５】
ここで、図３では、第１の測定エリア５８に固定されている１次抗体Ｂ１は、金属層５９ａ表面に二次元的に設けられているが、この他に、金属層５８ａ上に３次元的に広がったメンブレンを配置し、このメンブレンに１次抗体Ｂ１を固定してもよい。
【００４６】
以上のように、本実施形態に係る光信号検出方法でも、平坦な金属層を備えるセンサ部上に存在する光応答性標識物質に対して、測定光を落射照明で照射することによって、金属層にプラズモンを誘起している。つまり、上記の試料セル５０を用いた光信号検出方法（蛍光検出方法）の原理は、第１の実施形態と同様であり、本実施形態においても第１の実施形態と同様の効果を得ることができ、簡易な方法でより定量性の高い測定を行うことが可能となる。
【００４７】
＜光信号検出方法の第３の実施形態＞
本実施形態に係る光信号検出方法は、第２の実施形態と同様の試料セルを用いてセンシングを行う方法である。本実施形態は、競合法によるアッセイを行う点で第２の実施形態と異なる。したがって、第２の実施形態と同様の要素については、同じ符号を付し、また特に必要のない限り詳細な説明は省略する。本実施形態においても、光応答性標識物質として蛍光色素分子を内包する蛍光標識物質を例にして説明する。
【００４８】
図４を参照して、競合法について簡単に説明する。
図４（Ａ）に示すように、被検出物質（例えば、抗原）Ａと同一の免疫反応を示す第３の結合物質（例えば、競合抗原）Ｃ３を蛍光標識物質Ｆに修飾させておく。金属層１２上には、抗原Ａおよび競合抗原Ｃ３といずれとも特異的に結合する第１の結合物質Ｃ１（例えば、１次抗体）を固定化しておく。競合抗原Ｃ３が修飾された蛍光標識物質Ｆ（標識競合物質ＣＦ）を所定濃度で、抗原Ａと混合し、金属層１２上に固定化された１次抗体Ｃ１に競合的に反応させる（抗原−抗体反応）。抗原Ａと標識競合物質ＣＦとの混合時における標識競合物質ＣＦの濃度は既知である。
【００４９】
競合法では、図４（Ｂ）に示すように、被検出物質Ａの濃度が高ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する標識競合物質ＣＦの量が少なくなる、すなわち金属層１２上の蛍光標識物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなる。一方、図４（Ｃ）に示すように、被検出物質Ａの濃度が低ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する標識競合物質ＣＦの量が多くなる、すなわち金属層１２上の蛍光標識物質Ｆの数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は被検出物質にエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
【００５０】
図５の５０’は、競合法によるアッセイに適した第３の実施形態の試料セルを示すものである。本実施形態の試料セル５０’においては、第１の測定エリア５８’のＡｕ膜５８ａ上にさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２の測定エリア５９’のＡｕ膜５９ａ上に後述する物質Ｄ1が固定されている。互いに異なる物質が設けられている点以外は第１の測定エリア５８’と第２の測定エリア５９’は同一の構成である。抗原Ａおよび競合抗原Ｃ３は、第１の測定エリア５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２の測定エリア５９’に固定されている物質Ｄ1は、抗原Ａおよび競合抗原Ｃ３とは結合せず、競合抗原Ｃ３と共に蛍光標識物質Ｆの表面に修飾されている物質Ｄ2と特異的に結合するものである。これにより、流路を流れた標識競合物質ＣＦの量、活性など反応に関する変動要因と落射照明光学系、Ａｕ膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。
【００５１】
なお、第２の測定エリアには物質Ｄ1ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は競合抗原により表面修飾された蛍光標識物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光標識物質であってもよい。この場合、落射照明光学系、Ａｕ膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９’に物質Ｄ1、既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的・方法によって適宜、選択することができる。
【００５２】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０’を用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、競合法によるアッセイを行う手順について図５を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図５中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図５中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと競合抗原Ｃ３が付与された蛍光標識物質Ｆ（標識競合物質ＣＦ）とが混ぜ合わされる。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと標識競合物質ＣＦとが競合して、第１の測定エリア５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。
ｓｔｅｐ６：第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識競合物質ＣＦの一部は、その標識競合物質ＣＦの物質Ｄ２が第２の測定エリア５９’上に固定されている物質Ｄ１と結合し、第２の測定エリア５９’上に固定される。さらに１次抗体Ｃ１および物質Ｄ１と結合していない標識競合物質ＣＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していたものを洗い流す。
【００５３】
このように、血液を注入口から注入し、第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび標識競合物質ＣＦが競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８’からの検出信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９’からの検出信号を検出できるように検出用試料セル５０’を移動し、第２の測定エリア５９’からの検出信号を検出し、この検出信号をリファレンスとして、第１の測定エリア５８’からの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。
【００５４】
以上のように、本実施形態に係る光信号検出方法でも、平坦な金属層を備えるセンサ部上に存在する光応答性標識物質に対して、測定光を落射照明で照射することによって、金属層にプラズモンを誘起している。つまり、上記の試料セル５０’を用いた光信号検出方法（蛍光検出方法）の原理は、第１の実施形態と同様であり、本実施形態においても第１の実施形態と同様の効果を得ることができ、簡易な方法でより定量性の高い測定を行うことが可能となる。
【００５５】
＜第１から３の実施形態についての設計変更＞
なお、第１から第３の実施形態においては、光応答性標識物質として、図６に示すように、さらに、光透過材料１６の表面に光応答物質から生じる光を透過する厚みの金属被膜１９が設けられたものを用いてもよい。金属被膜１９は、光透過材料１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく一部表面が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜１９の材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができる。
【００５６】
光応答性標識物質の表面に金属被膜１９を備えた場合、センサチップ１０の金属層１２に発生した表面プラズモンあるいは局在プラズモンが金属被膜１９のウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、光応答性標識物質Ｆ内の光応答物質１５をさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
【００５７】
光応答性標識物質への金属被膜方法の一例を挙げる。
まず、前述手順により光応答性標識物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（例えば、商品名：エポミン（登録商標）、株式会社日本触媒）を修飾する。
次に、光応答性標識物質表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍ程度のＰｄナノ粒子(例えば、平均粒径１９ｎｍ、株式会社徳力本店)を吸着させる。
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品株式会社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、光応答性標識物質表面にＡｕ膜を作製する。
【００５８】
＜実施例＞
本発明に係る光信号検出方法の実施例を以下に示す。
【００５９】
センサチップ１０は以下の方法により製造した。まずゼオネックス（登録商標）基板に５０ｎｍのＡｕ膜を形成した。そしてＡｕ膜を形成したセンサ部に第１の実施形態で述べた蛍光標識物質を固定し、波長６６０ｎｍの半導体レーザを照射して、蛍光量測定を行った。
【００６０】
そして、蛍光標識物質の固定方法は以下の通りである。まず、Ａｕ膜付きゼオネックス基板にＵＶ処理を３０秒間行った。そして、その後このゼオネックス基板上にテフロン（登録商標）キュベットを置き治具で固定した。次に、蛍光標識物質の濃度が０．００２％となるように調整した水溶液をキュベットに２０ｕＬずつ分注して一時間静置した。ここで、蛍光標識物質として、ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製の蛍光粒子（商品名：ＦＣ０２Ｆ、平均粒径０．２１ｕｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６９０ｎｍ）を用いた。
【００６１】
また、蛍光色素分子（光応答物質）を内部に包含しない粒子を上記同様にセンサ部上に固定したときの散乱光量も測定した。
【００６２】
＜比較例＞
実施例１に対する比較例として、Ａｕ膜を形成していないゼオネックス基板を用いて、所定領域に実施例１と同様に蛍光標識物質を固定し、このセンサチップに対して実施例１と同様に蛍光量測定を行った。
【００６３】
また、実施例１と同様に、蛍光色素分子（光応答物質）を内部に包含しない粒子を上記同様にセンサ部上に固定したときの散乱光量も測定した。ここで、比較例の散乱光量と実施例の散乱光量とが同等となるように測定光量を調整している。
【００６４】
＜結果＞
図７は、上記実施例および比較例の測定結果を示すグラフである。この結果において、光応答物質ありの信号量（蛍光量）から光応答物質なしの信号量（散乱光量）を引いた値をシグナルとすると、Ａｕ膜を設けることによってＡｕ膜なしに比べて約２．９倍信号量（蛍光量）が増大した。これより、本発明に係る光信号検出方法によれば、測定光がＡｕ膜によって反射して測定光量が増える鏡面効果以上の光信号の増大率が得られることが実証された。
【符号の説明】
【００６５】
１、２ 光信号検出装置
１０   センサチップ
１１   誘電体プレート
１２   金属膜
１４   センサ部
１５   光応答物質
１６   光透過材料
２０   落射照明光学系
２１   光源
２３   ハーフミラー
３０   光検出器
５０、５０’  試料セル
Ａ     被検出物質
Ｄ     電場増強領域
Ｆ     光応答性標識物質
Ｌｆ   蛍光
Ｌ０    測定光
Ｌｓ   散乱光
Ｓ     試料
【図１】
2010223802.tif 000003
【図２Ａ】
2010223802.tif 000004
【図２Ｂ】
2010223802.tif 000005
【図３】
2010223802.tif 000006
【図４】
2010223802.tif 000007
【図５】
2010223802.tif 000008
【図６】
2010223802.tif 000009
【図７】
2010223802.tif 000010