(57)【要約】      （修正有）【課題】シンフィリン−１が関与する疾患に対する治療薬のスクリーニングなどに用いることのできるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。【解決手段】シンフィリン−１をコードする遺伝子が導入され、中枢神経組織で発現・蓄積している、トランスジェニック非ヒト動物。また、該動物に試験化合物を投与し、上記遺伝子の転写量、シンフィリン−１の動態又は運動機能障害の有無を観察する、神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法。【選択図】図１
2010110295.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シンフィリン−１（Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１）をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
上記遺伝子が、中枢神経組織にて発現していることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
上記遺伝子の発現産物であるシンフィリン−１が、中枢神経組織に蓄積していることを特徴とする請求項１又は２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
上記遺伝子は、中枢神経組織特異的なプロモータが付加されて導入されていることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
上記遺伝子は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグをコードする配列が付加されて導入されていることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
上記非ヒト動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット及びマウスからなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
上記非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
運動機能障害を有することを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に試験化合物を投与し、上記遺伝子の転写量、シンフィリン−１の動態又は運動機能障害の有無を観察することを特徴とする神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
上記神経変性疾患が、パーキンソン病又はレビー小体型認知症であることを特徴とする請求項９に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患に関わるシンフィリン−１（Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１）をコードする遺伝子が導入されているトランスジェニック非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患の１つであるパーキンソン病は、原因不明の疾患であり、脳幹の中脳にあるドパミン神経が変性あるいは消失し、手足のふるえ、筋肉のこわばり、動作緩慢などといった症状や、小刻み歩行、すくみ足などといった歩行障害が現れる疾患である。
【０００３】
パーキンソン病は、その患者の中脳黒質ドパミン神経細胞内にレビー小体とよばれる封入体が出現するという病理学的特徴を有する。レビー小体は、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ及びシンフィリン−１のタンパク質により構成されており、シンフィリン−１は、レビー小体のコア部分の構成タンパク質であることがわかっている（非特許文献１）。また、パーキンソン病患者の少数において、シンフィリン−１遺伝子変異が報告されている（非特許文献２）。さらに、シンフィリン−１は、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ結合タンパク質として単離されている（非特許文献３）。
【０００４】
さらにまた、シンフィリン−１は、パーキンソン病と同様の神経変性疾患であるレビー小体型認知症（Dementia with Lewy bodies）においても、神経細胞内に生じるレビー小体のコア部分の構成タンパク質であることがわかっている（非特許文献４）。
【０００５】
また、シンフィリン−１は、パーキンソン病の発症に関与するユビキチンリガーゼＰａｒｋｉｎによってユビキチン化修飾を受けることにより分解が促進されることが報告されている（非特許文献５）。
【０００６】
これらの点から、シンフィリン−１は、パーキンソン病及びレビー小体型認知症の発症と、レビー小体の形成とに深く関わるタンパク質であると考えられている。
【非特許文献１】Wakabayashi K, Engelender S, Yoshimoto M, Tsuji S, Ross CA, Takahashi H. Synphilin-1 is present in Lewy bodies in Parkinson's disease. Ann Neurol. 2000; 47(4):521-3.
【非特許文献２】Marx FP, Holzmann C, Strauss KM, Li L, Eberhardt O, Gerhardt E, Cookson MR, Hernandez D, Farrer MJ, Kachergus J, Engelender S, Ross CA, Berger K, Schoels L, Schulz JB, Riess O, Krueger R. Identification and functional characterization of a novel R621C mutation in the synphilin-1 gene in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 2003; 12(11):1223-31.
【非特許文献３】Engelender S, Kaminsky Z, Guo X, Sharp AH, Amaravi RK, Kleiderlein JJ, Margolis RL, Troncoso JC, Lanahan AA, Worley PF, Dawson VL, Dawson TM, Ross CA. Synphilin-1 associates with alpha-synuclein and promotes the formation of cytosolic inclusions. Nat Genet. 1999; 22(1):110-4.
【非特許文献４】Iseki E, Takayama N, Furukawa Y, Marui W, Nakai T, Miura S, Ueda K, Kosaka K. Immunohistochemical study of synphilin-1 in brains of patients with dementia with Lewy bodies - synphilin-1 is non-specifically implicated in the formation of different neuronal cytoskeletal inclusions.Neurosci Lett. 2002; 326(3):211-5.
【非特許文献５】Chung KK, Zhang Y, Lim KL, Tanaka Y, Huang H, Gao J, Ross CA, Dawson VL,Dawson TM. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nat Med. 2001, 7(10):1144-50.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、シンフィリン−１は、種々の生理機能や神経変性疾患に関与していることがわかっている。しかし、これまで、シンフィリン−１をコードする遺伝子が導入されたモデル動物は作製されておらず、また、シンフィリン−１に着目した医薬の開発もなされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者らは、上記課題を解決するために、シンフィリン−１（Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１）に着目して研究した結果、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を完成させた。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、シンフィリン−１をコードする遺伝子が発現可能に導入されており、シンフィリン−１が発症に関与する疾患の治療薬のスクリーニング、研究開発モデルなどに有用であることを見出した。
【０００９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、シンフィリン−１（Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１）をコードする遺伝子が導入されていることを特徴としている。
【００１０】
上記の構成であれば、シンフィリン−１に関する研究、及びシンフィリン−１が関与する疾患に対する治療薬のスクリーニング、治療法の開発などに用いることができる。
【００１１】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物では、上記遺伝子が、中枢神経組織にて発現していることが好ましい。
【００１２】
上記の構成であれば、中枢神経組織にシンフィリン−１タンパク質が発現するので、中枢神経組織におけるシンフィリン−１の動態について解析することができる。
【００１３】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物では、上記遺伝子の発現産物であるシンフィリン−１が、中枢神経組織に蓄積していることが好ましい。
【００１４】
上記の構成であれば、中枢神経組織にシンフィリン−１が蓄積しているので、中枢神経組織におけるシンフィリン−１の動態についての解析を効率よく行うことができる。
【００１５】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物では、上記遺伝子は、中枢神経組織特異的なプロモータが付加されて導入されていることが好ましい。
【００１６】
上記の構成であれば、シンフィリン−１遺伝子を、中枢神経組織に特異的に発現させることができる。
【００１７】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物では、上記遺伝子は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグをコードする配列が付加されて導入されていることが好ましい。
【００１８】
上記の構成であれば、シンフィリン−１にＨＡタグを付加させることができるので、抗ＨＡ抗体を用いてシンフィリン−１を容易に検出することができ、その結果、シンフィリン−１の発現量、局在などについて容易に解析することができる。
【００１９】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物では、上記非ヒト動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット及びマウスからなる群より選択されることが好ましく、マウスであることがより好ましい。
【００２０】
上記の構成であれば、研究開発、医薬のスクリーニング等に好適に用いることができる。
【００２１】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、運動機能障害を有することが好ましい。
【００２２】
上記の構成であれば、治療薬や治療法などのスクリーニングにおいて運動機能障害の有無を指標にすることができるので、スクリーニングを効率よく行うことができる。
【００２３】
本発明の神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法は、上記の何れかのトランスジェニック非ヒト動物に試験化合物を投与し、上記遺伝子の転写量、シンフィリン−１の動態又は運動機能障害の有無を観察することを特徴としている。
【００２４】
また、本発明の神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法では、上記神経変性疾患が、パーキンソン病又はレビー小体型認知症であることが好ましい。
【００２５】
上記の構成であれば、シンフィリン−１の動態に影響を与える試験化合物、又は運動機能障害の抑制などに関与する試験化合物をスクリーニングすることができる。このようにスクリーニングされ選択された試験化合物は、パーキンソン病、レビー小体型認知症などを含む神経変性疾患の治療薬の候補となりうる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物及び治療薬のスクリーニング方法を用いれば、シンフィリン−１が関与する疾患に対する治療薬のスクリーニングなどが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に、本発明に係る実施形態について説明する。
【００２８】
＜トランスジェニック非ヒト動物＞
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、シンフィリン−１（Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１）をコードする遺伝子（以下、「シンフィリン−１遺伝子」と称する）が導入されているものである。ここで、「シンフィリン−１遺伝子が導入されている」とは、外来遺伝子としてのシンフィリン−１遺伝子が、非ヒト動物中で発現可能に導入されている状態を指し、当該遺伝子が現実に発現している場合はもとより、一時的に当該遺伝子の発現が抑制されている状態であってもよい。
【００２９】
トランスジェニック非ヒト動物に用いる非ヒト動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等が挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス又はラットであり、なかでもモルモット、ハムスター、マウス、ラット等の齧歯目が好ましく、とりわけマウスが好ましい。
【００３０】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、該動物の個体（その子孫も含む概念）、その組織及び細胞をも含む概念であり、これら個体、組織及び細胞にはシンフィリン−１遺伝子以外の外来遺伝子が導入されていてもよい。すなわち、シンフィリン−１遺伝子が発現可能に導入された非ヒト動物由来のｉＰＳ細胞（induced Pluripotent stem cell）等も、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に含まれる。
【００３１】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物には、その調節遺伝子領域（プロモータなど）を含んでもよいシンフィリン−１遺伝子のみが導入されていてもよいが、シンフィリン−１遺伝子を含む組換え遺伝子が導入されていることが好ましい。当該組換え遺伝子の作製方法及び非ヒト動物への導入方法については、後述する。
【００３２】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の個体において、シンフィリン−１遺伝子は、全身にて発現していてもよいが、中枢神経に関わる神経変性疾患のモデルとして用いる場合は、中枢神経組織にて発現していることがより好ましく、また、中脳黒質緻密層にあるドパミン神経細胞に発現していることがさらに好ましい。さらにまた、シンフィリン−１遺伝子は、中枢神経組織特異的に発現していることが好ましい。なお、シンフィリン−１遺伝子が中枢神経組織に発現している場合、その翻訳産物たるシンフィリン−１が中枢神経組織に蓄積していることが好ましい。
【００３３】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、運動機能障害を有していることが好ましい。運動機能障害としては、例えば、神経変性疾患特有のものであることが好ましく、例えば、小刻み歩行などの歩行障害、動作緩慢、協調運動障害などが挙げられる。
【００３４】
＜トランスジェニック非ヒト動物の作製方法＞
以下に、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作製方法について説明する。
【００３５】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、シンフィリン−１遺伝子を、上述した非ヒト動物に導入することにより作製される。該シンフィリン−１遺伝子は、当該遺伝子と付加配列（後述する）とからなる組換え遺伝子（組換えＤＮＡ）として導入されることが好ましい。
【００３６】
まず、シンフィリン−１遺伝子を含む組換え遺伝子について説明する。
【００３７】
当該組換え遺伝子は、シンフィリン−１遺伝子を含んでいる。シンフィリン−１遺伝子の由来は限定されずすでに同定されている遺伝子を用いることができるが、ヒトの病態モデルとして本発明のトランスジェニック非ヒト動物を利用する場合にはヒト由来のシンフィリン−１遺伝子（非特許文献３、Gene Bank accession No. NM_005460）を用いることが好ましい。なお、ヒト由来のシンフィリン−１は、翻訳領域に対応するｃＤＮＡが２７６０ｂｐと長いため、該ｃＤＮＡを用いる遺伝子クローニング、遺伝子操作は困難である。
【００３８】
当該組換え遺伝子は、上記付加配列として、特に限定されないが、例えば、ＧＦＰ（Ｇreen fluorescent protein）等をコードするレポータ遺伝子（マーカー遺伝子）、プロモータ等の調節遺伝子領域、又は、タグをコードする配列（タグ配列）、等を含む。当該付加配列の中でも、中枢神経組織特異的なプロモータを含んでいることが好ましく、さらにまた、抗体結合性のタグをコードする配列を含んでいることがより好ましい。当該プロモータは、シンフィリン−１遺伝子の上流に導入されることが好ましい。また、当該タグ配列は、シンフィリン−１遺伝子のコード領域の上流または下流に導入されることが好ましい。
【００３９】
プロモータは、当該組換え遺伝子が導入される非ヒト動物（宿主）において機能し得るものであることが好ましい。したがって、例えば、当該組換え遺伝子が導入される宿主において内在性の遺伝子が有するプロモータ、あるいは、当該宿主において下流の遺伝子を発現させる機能を有する外来性のプロモータ、などを好適に用いることができる。また、温度や化合物などによる調節因子によって活性が調節可能なプロモータなどを用いてもよい。また、プロモータは、下流に配される遺伝子を、中枢神経組織において特異的に発現させる中枢神経組織特異的なものであることがより好ましい。中枢神経組織特異的なプロモータの好適な例としては、例えばプリオンタンパクプロモータ、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）プロモータ、ＴＨ（チロシン水酸化酵素）プロモータ、ＰＤＧＦβ（血小板由来成長因子β）プロモータ、ＣａＭ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ（カルモジュリンキナーゼＩＩ）プロモータなどが挙げられる。
【００４０】
抗体結合性のタグとしては、特に限定されないが、例えば、ＨＡタグ（赤血球凝集素タグ）、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、６×Ｈｉｓ（シックスヒスチジン）タグ、ＧＦＰタグ、ＧＳＴ（Glutathione S Transferase）タグなどを用いることができる。
シンフィリン−１遺伝子の上流または下流に、抗体結合性のタグをコードする配列を付加することにより、発現するシンフィリン−１のアミノ末端またはカルボキシル末端に当該タグが付加するので、当該タグに結合する抗体を用いてシンフィリン−１を検出することが可能になる。例えば抗体結合性のタグとしてＨＡタグを用いる場合は、シンフィリン−１のアミノ末端に、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むペプチドをＨＡタグとして付加してもよい。
【００４１】
本発明における当該組換え遺伝子についての好ましい形態は、例えば、抗体結合性のタグをコードする配列を含む塩基配列が、シンフィリン−１遺伝子の上流または下流に導入され、さらにシンフィリン−１遺伝子と上記タグ配列との上流に、プロモータ配列が導入されている形態である。
【００４２】
なお、上記組換え遺伝子は、定法により調製することができる。
【００４３】
次に、上述した組換え遺伝子を非ヒト動物に導入する方法について、以下に説明する。このような方法には、定法を用いることができる。以下に、その一例について説明するが、本発明は特にこれに限定されない。
【００４４】
まず、非ヒト動物の受精卵に組換え遺伝子を導入し、その受精卵を当該動物の雌に着床させる。受精卵としては、雄精前核時期（受精後約１２時間）のものを用いることが好ましい。
【００４５】
組換え遺伝子を受精卵に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などが挙げられる。これらのうち、マイクロインジェクション法を用いることがより好ましい。
【００４６】
受精卵を雌に着床させる手段としては、例えば、偽妊娠雌性動物の卵管に人工的に移植、着床させる手段などを用いることが好ましい。
【００４７】
次に、上記受精卵を着床させた雌から生まれた子の中から、シンフィリン−１遺伝子を含んでおり、さらに該遺伝子を発現している個体を選別し、当該個体を継代する。
【００４８】
導入した組換え遺伝子が非ヒト動物に含まれているか否かは、該動物のＤＮＡを採取し、導入した組換え遺伝子の配列を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、確認できる。
【００４９】
さらに、上記組換え遺伝子が含まれている非ヒト動物がシンフィリン−１遺伝子を発現しているか否かは、該動物から細胞破砕液を調製し、シンフィリン−１タンパク質を認識する抗体を用いて、ウエスタンブロット法などを行うことにより確認できる。特に、中枢神経組織にて発現しているか否かは、該動物から中枢神経組織の細胞破砕液を調製することにより確認することができる。
【００５０】
ここで、シンフィリン−１が、抗体結合性のタグなどにより修飾されている場合は、該タグを認識する抗体を用いることができる。例えば、ＨＡタグにより修飾されている場合は、抗ＨＡ抗体を用いることができる。
【００５１】
さらに、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の脳におけるシンフィリン−１タンパク質の発現は、該動物の脳を定法に従って４％パラホルムアルデヒドにて灌流固定して作製した凍結切片あるいはパラフィン切片に対して、当該シンフィリン−１を認識する抗体、例えばシンフィリン−１がＨＡタグにより修飾されている場合は抗ＨＡ抗体など、を用いた免疫組織化学を用いることにより、確認することができる。
【００５２】
上述した方法を用いることにより、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。なお、その調節遺伝子領域を含んでもよいシンフィリン−１遺伝子のみを導入する場合も、上記した組換え遺伝子を非ヒト動物に導入する方法に準じて行えばよい。
【００５３】
＜トランスジェニック非ヒト動物の用途＞
以下に、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物の用途について、説明する。
【００５４】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、神経変性疾患の治療薬のスクリーニングに用いることができる。ここで、治療薬とは、ヒトを含む動物に対する治療薬を指すが、ヒトの治療薬であることが好ましい。また、治療薬とは、疾患を改善する、疾患の進行を遅らせる、疾患を予防する（再発防止も含む）、その他の、治療効果を示す化合物を広く意味し、製品化される以前の医薬候補化合物も含む概念である。
【００５５】
例えば、神経変性疾患の治療薬のスクリーニングは、１）本発明のトランスジェニック非ヒト動物に試験化合物を投与する工程と、次いで、２）当該トランスジェニック非ヒト動物の中枢神経組織、好ましくは脳、より好ましくは中脳、における、シンフィリン−１遺伝子の転写量を測定する工程と、次いで、３）試験化合物を投与する前と比較して、シンフィリン−１遺伝子の転写量が低下している場合に、当該試験化合物を治療薬として選択する工程と、を含んでなる。試験化合物の投与量としては、その化合物がトランスジェニック非ヒト動物に作用し得る好適な量を用いることが好ましい。
【００５６】
また、上記スクリーニングにおいて、シンフィリン−１遺伝子の転写量を測定する代わりに、シンフィリン−１の動態を観察することによって、例えばシンフィリン−１の蓄積量を測定してもよい。この場合には、シンフィリン−１の蓄積量が低下している場合に、当該試験化合物を治療薬として選択することが好ましい。
【００５７】
シンフィリン−１の蓄積量は、当該トランスジェニック非ヒト動物から、好ましくは中枢神経組織から、調製した細胞破砕液を用いて、ウエスタンブロット法などを行うことにより測定してもよい。また、当該トランスジェニック非ヒト動物の脳の切片を用いた免疫組織化学などにより測定してもよい。
【００５８】
また、例えば、神経変性疾患の治療薬のスクリーニングは、１）本発明のトランスジェニック非ヒト動物に試験化合物を投与する工程と、次いで、２）当該トランスジェニック非ヒト動物の運動機能障害の有無を判定する工程と、次いで、３）試験化合物を投与する前と比較して、運動機能障害が無くなっているか、あるいは抑制されている場合に、当該試験化合物を治療薬として選択する工程と、を含んでなっていてもよい。
【００５９】
上述した方法において治療薬として選択された試験化合物は、パーキンソン病、レビー小体型認知症などの神経変性疾患の治療薬となり得る。
【００６０】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、神経変性疾患の治療法のスクリーニングに用いることができる。ここで、治療法とは、ヒトを含む動物に対する治療法を指すが、ヒトの治療法であることが好ましい。また、治療法とは、疾患を改善する、疾患の進行を遅らせる、疾患を予防する（再発防止も含む）、その他の、治療効果を示す方法を広く意味する。このような治療法としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを含む様々な幹細胞を用いた細胞治療法などが挙げられる。
【００６１】
例えば、神経変性疾患の治療法のスクリーニングは、１）本発明のトランスジェニック非ヒト動物に治療試験を施す工程と、次いで、２）当該トランスジェニック非ヒト動物の中枢神経組織、好ましくは脳、より好ましくは中脳、における、シンフィリン−１遺伝子の発現量を測定する工程と、次いで、３）治療試験を施す前と比較して、シンフィリン−１遺伝子の発現量が低下している場合に、当該治療試験に用いた方法を治療法として選択する工程と、を含んでなる。
【００６２】
また、例えば、神経変性疾患の治療法のスクリーニングは、１）本発明のトランスジェニック非ヒト動物に治療試験を施す工程と、次いで、２）当該トランスジェニック非ヒト動物の運動機能障害の有無を判定する工程と、次いで、３）治療試験を施す前と比較して、運動機能障害が無くなっているか、あるいは抑制されている場合に、当該治療試験に用いた方法を治療法として選択する工程と、を含んでなっていてもよい。
【００６３】
さらに、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、シンフィリン−１と相互作用するタンパク質、脂質などの因子のスクリーニングに供することができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物が、中枢神経系組織においてシンフィリン−１を発現している場合は、中枢神経系組織内にてシンフィリン−１と相互作用するタンパク質、脂質などの因子のスクリーニングに供することができる。
【００６４】
シンフィリン−１と相互作用するタンパク質、脂質などの因子は、シンフィリン−１の生理機能を調節する因子である可能性があり、さらに、神経変性疾患の発症に関与するシンフィリン−１の機能を調節する因子である可能性がある。神経変性疾患の発症に関与している場合には、当該因子は、神経変性疾患の治療薬、治療法などの新たな標的となりうる。
【００６５】
例えば、上記因子のスクリーニングは、１）本発明のトランスジェニック非ヒト動物の中枢神経組織から細胞破砕液を調製する工程と、次いで、２）当該細胞破砕液から、共免疫沈降法などを用いて、シンフィリン−１、及びシンフィリン−１と相互作用するタンパク質、脂質などからなる複合体を精製する工程と、次いで、３）精製した当該タンパク質、脂質などを同定する工程と、を含んでなる。
【００６６】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６７】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００６８】
本実施例においては、ヒトシンフィリン−１の組換え遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスを作製した。その方法を以下に説明する。
【００６９】
＜トランスジェニックマウスの作製＞
（１）ＤＮＡ断片ＭｏＰｒＰ−ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１の作製
合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により、シンフィリン−１遺伝子のｃＤＮＡにおけるセンス方向の上流に、配列番号１に示されるＨＡタグのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を導入した。これにより、シンフィリン−１のアミノ末端にＨＡタグが付加されたタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１を得た。
【００７０】
次に、ＤＮＡ断片ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１をＭｏＰｒＰ（マウスプリオンタンパク）プロモータの下流に導入し、ＤＮＡ断片ＭｏＰｒＰ−ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１を得た（図１）。図１は、ＤＮＡ断片ＭｏＰｒＰ−ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１の模式図を示す。
【００７１】
（２）マウスへの導入
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの受精卵に、ＤＮＡ断片ＭｏＰｒＰ−ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１をマイクロインジェクション法により導入し、偽妊娠雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの卵管に人工的に移植、着床させた。その結果生まれた子にＤＮＡ断片が導入されていることを確認し、ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１トランスジェニックマウスを得た。その後、遺伝的に安定させるために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配を続け、世代間を安定的にＭｏＰｒＰ−ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１のＤＮＡ断片が遺伝していくことを確認した。
【００７２】
本実施例のトランスジェニックマウスにＤＮＡ断片が導入されているかどうかは、ＰＣＲ法を用いて遺伝子型を判定するジェノタイピングにより確認した。まず、非トランスジェニックマウス（Ｎ）、トランスジェニックマウス（Ｌ１およびＬ２）、および野生型マウス（ｗｔ）の尾部から、定法に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。また、ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１遺伝子を発現させたヒト培養細胞ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ）からＤＮＡを抽出した。次に、これらのＤＮＡをそれぞれ鋳型にしてTg-synphFプライマー（配列番号２）とTg-synphR1プライマー（配列番号３）とを用いてＰＣＲ法により増幅を行い、ＤＮＡ断片ＭｏＰｒＰ−ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１内の約２００ｂｐ（図２にＨＡ＋５’ｓｙｎｐｈとして示す）が増幅されるかどうかを確認することにより、遺伝子型を判定した（図２）。
【００７３】
図２は、本実施例におけるトランスジェニックマウスの遺伝子型を確認した結果を示す図である。図２に示すように、トランスジェニックマウス（Ｌ１およびＬ２）からのＤＮＡを鋳型にしたときには、約２００ｂｐ（ＨＡ＋５’ｓｙｎｐｈ）のＤＮＡ断片が増幅されることが確認できた。またこのとき、解析の陽性対照として、マウスアクチン遺伝子内の配列を増幅するためのアクチンＦプライマー（配列番号４）とアクチンＲプライマー（配列番号５）とを同時に用いた結果、マウス由来のＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは、マウスアクチン遺伝子内の約２５０ｂｐ（図２にａｃｔｉｎとして示す）が増幅されることを確認した（図２）。これにより、本解析の正確性が証明された。
【００７４】
＜シンフィリン−１の局所的発現についての解析＞
次に、本実施例におけるトランスジェニックマウスを用いてシンフィリン−１の局所的発現について解析を行った。
【００７５】
（３）まず、脳組織におけるＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質の有無について確認した。まず、定法に従って摘出した脳をテフロンホモジナイザーに供することで組織を破壊し、その後０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下においてタンパク質を抽出し、さらに遠心により不溶物質を取り除くことで細胞破砕液を調製した。次に、その細胞破砕液を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質を分子量に基づいて分離した後、抗ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロット法を行い、ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１を検出した（図３）。図３は、本実施例におけるトランスジェニックマウスの脳組織細胞破砕液中において抗ＨＡ抗体を用いてＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質を検出したウエスタンブロット法の結果を示す図である。図３に示すように、ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１は、非トランスジェニックマウス（Ｎ）では検出されなかったが、トランスジェニックマウス（Ｌ１〜Ｌ５）では、約１２０ｋＤａのタンパク質として検出された。これにより、脳組織にＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質が発現していることを確認した。
【００７６】
（４）次に、中枢神経組織におけるＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質の発現について確認した。まず、定法に従って、マウス脳を４％パラホルムアルデヒドにて灌流固定し、凍結切片およびパラフィン切片を作製した。次に、当該切片に対して、抗ＨＡ抗体を用いた免疫組織化学法を行った（図４）。図４は、本実施例におけるトランスジェニックマウスの中枢神経組織における免疫組織化学法による解析結果を示す図である。図４（ａ）〜図４（ｄ）は、抗ＨＡ抗体を用いてＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質を検出した結果を示す図である。
【００７７】
図４（ａ）は、矢状断のマウス脳の切片を解析した結果を示しており、中枢神経組織の広範においてＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質が発現していることが確認された。図４（ｂ）は、抗ＨＡ抗体を、抗原であるＨＡペプチドにより吸着させた後に、これを用いて、図４（ａ）における切片に近接した切片について解析した結果を示す。図４（ｂ）に示すように、ＨＡペプチドにより吸着された抗ＨＡ抗体が免疫染色性を消失していることから、抗ＨＡ抗体の染色特異性が証明された。
【００７８】
図４（ｃ）は、大脳皮質神経細胞における解析結果を示す。また、図４（ｄ）は、中脳黒質緻密層の神経細胞における解析結果を示す。図４（ｃ）および図４（ｄ）に示すように、大脳皮質神経細胞及び中脳黒質緻密層の神経細胞のどちらにおいても、細胞質と神経突起とにおいて、ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質が発現していることが確認された。
【００７９】
図４（ｅ）は、図４（ｄ）における切片に近接した切片に対して、抗チロシン水酸化酵素抗体を用いて免疫組織化学法による解析を行った結果に関するもので、中脳黒質緻密層の神経細胞の細胞質と神経突起とが免疫染色されたことを示している。したがって、図４（ｄ）においてＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質が発現していることが確認された神経細胞は、チロシン水酸化酵素陽性のドパミン神経であることが証明された。
【００８０】
これらの結果から、大脳皮質の神経細胞、および中脳黒質緻密層の神経細胞における、細胞質と軸索とに、ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質の発現を確認した。なお、図４（ｃ）〜図４（ｅ）に示したスケールバーは２０μｍを示す。
【００８１】
＜トランスジェニックマウスの行動解析＞
さらに、本実施例におけるトランスジェニックマウスの行動解析を行った。
【００８２】
（５）まず、本実施例のトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と、非トランスジェニックマウス（Ｎ）とにおける運動機能を、ロータロッド試験により比較した。
【００８３】
トランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスとをそれぞれロータロッドに乗せ、毎分４回転（ｒｐｍ）から毎分４０回転まで加速回転した場合と、毎分３２回転で一定速度にて回転した場合とにおいて、マウスが落下するまでの時間を測定した。その結果を図５に示す。図５は、本実施例のトランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスとにおけるロータロッド試験の結果を示すグラフである。また図５には、それぞれ１２匹のマウスについて解析した結果の平均を示す。
【００８４】
図５（ａ）および図５（ｂ）に示すように、毎分４回転から毎分４０回転まで加速回転した場合（図５（ａ））と、毎分３２回転で一定速度にて回転した場合（図５（ｂ））との両方において、トランスジェニックマウスは、非トランスジェニックマウスと比較して落下するまでの時間が早かった。したがって、この結果は、トランスジェニックマウスの運動機能が低下していることを示唆している。
【００８５】
（６）次に、本実施例のトランスジェニックマウス（Ｔｇ）と非トランスジェニックマウス（Ｎ）とに対して、歩行試験を行った。
【００８６】
トランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスとのそれぞれの前足にインクを付けて紙の上を歩かせた後、その足跡から歩幅を測定した。その結果を図６に示す。図６は、本実施例のトランスジェニックマウスと野生型マウスとにおける歩行試験の結果を示す図である。図６（ａ）は、それぞれのマウスの足跡について、それぞれ２つの例を示した図であり、図６（ｂ）は、それぞれ１２匹のマウスについて、１歩〜６歩までの各歩幅を測定し、その平均を示したグラフである。
【００８７】
図６（ａ）および図６（ｂ）が示すように、トランスジェニックマウスは、非トランスジェニックマウスと比較して歩幅が短かった。したがって、この結果は、トランスジェニックマウスの運動機能が低下していることを示唆している。
【００８８】
上記（５）および（６）における結果は、非トランスジェニックマウスと比較すると、トランスジェニックマウスが運動機能障害を有することを示唆している。
【００８９】
なお、上記（５）および（６）における結果は、４０〜４１週齢のトランスジェニックマウスを用いた場合を示した。３０週齢以内のトランスジェニックマウスを用いた場合には、非トランスジェニックマウスと比較して、上述のような運動機能障害は観察されなかった。
【００９０】
上記（１）〜（６）における結果から、本実施例におけるトランスジェニック非ヒト動物は、中枢神経組織にシンフィリン−１を蓄積しており、さらに運動機能障害を有していることが明らかになった。したがって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、神経変性疾患と同様の特徴を有しており、シンフィリン−１が関与する神経変性疾患などのモデル動物として利用し得ることが、これらの結果からも証明された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、シンフィリン−１遺伝子が導入されているので、シンフィリン−１が関与する疾患に対する治療薬のスクリーニングなどに好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＤＮＡ断片ＭｏＰｒＰ−ＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１の模式図を示す。
【図２】本実施例におけるトランスジェニックマウスの遺伝子型を確認した結果を示す図である。
【図３】本実施例におけるトランスジェニックマウスの脳組織細胞破砕液中において抗ＨＡ抗体を用いてＨＡ−Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１タンパク質を検出したウエスタンブロット法の結果を示す図である。
【図４】本実施例におけるトランスジェニックマウスの中枢神経組織における免疫組織化学法による解析結果を示す図である。
【図５】本実施例のトランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスとにおけるロータロッド試験の結果を示すグラフである。
【図６】本実施例のトランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスとにおける歩行試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図４】
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【配列表】
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