(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便で汎用性の高い化学物質が有する発生毒性の予測方法を提供する。【解決手段】化学物質が有する発生毒性の予測方法であって、（１）被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における特定の塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、（２）第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性の予測方法。【選択図】図１
2010011843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質が有する発生毒性の予測方法であって、
（１）被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、
（２）第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性の予測方法。
（１）  配列番号１で示される塩基配列
（２）  配列番号２で示される塩基配列
（３）  配列番号３で示される塩基配列
（４）  配列番号４で示される塩基配列
（５）  配列番号５で示される塩基配列
（６）  配列番号６で示される塩基配列
（７）  配列番号７で示される塩基配列
（８）  配列番号８で示される塩基配列
（９）  配列番号９で示される塩基配列
（１０）配列番号１０で示される塩基配列
（１１）配列番号１１で示される塩基配列
（１２）配列番号１２で示される塩基配列
（１３）配列番号１３で示される塩基配列
（１４）配列番号１４で示される塩基配列
（１５）配列番号１５で示される塩基配列
（１６）配列番号１６で示される塩基配列
（１７）配列番号１７で示される塩基配列
（１８）配列番号１８で示される塩基配列
（１９）配列番号１９で示される塩基配列
（２０）配列番号２０で示される塩基配列
（２１）配列番号２１で示される塩基配列
（２２）配列番号２２で示される塩基配列
（２３）配列番号２３で示される塩基配列
（２４）配列番号２４で示される塩基配列
（２５）配列番号２５で示される塩基配列
（２６）配列番号２６で示される塩基配列
（２７）配列番号２７で示される塩基配列
（２８）配列番号２８で示される塩基配列
（２９）配列番号２９で示される塩基配列
（３０）配列番号３０で示される塩基配列
（３１）配列番号３１で示される塩基配列
（３２）配列番号３２で示される塩基配列
（３３）配列番号３３で示される塩基配列
（３４）配列番号３４で示される塩基配列
（３５）配列番号３５で示される塩基配列
（３６）配列番号３６で示される塩基配列
（３７）配列番号３７で示される塩基配列
（３８）配列番号３８で示される塩基配列
（３９）配列番号３９で示される塩基配列
（４０）配列番号４０で示される塩基配列
（４１）配列番号４１で示される塩基配列
（４２）配列番号４２で示される塩基配列
（４３）配列番号４３で示される塩基配列
（４４）配列番号４４で示される塩基配列
（４５）配列番号４５で示される塩基配列
（４６）配列番号４６で示される塩基配列
（４７）配列番号４７で示される塩基配列
（４８）配列番号４８で示される塩基配列
（４９）配列番号４９で示される塩基配列
（５０）配列番号５０で示される塩基配列
（５１）配列番号５１で示される塩基配列
（５２）配列番号５２で示される塩基配列
（５３）配列番号５３で示される塩基配列
（５４）配列番号５４で示される塩基配列
（５５）配列番号５５で示される塩基配列
（５６）配列番号５６で示される塩基配列
（５７）配列番号５７で示される塩基配列
（５８）配列番号５８で示される塩基配列
（５９）配列番号５９で示される塩基配列
（６０）配列番号６０で示される塩基配列
（６１）配列番号６１で示される塩基配列
（６２）配列番号６２で示される塩基配列
（６３）配列番号６３で示される塩基配列
（６４）配列番号６４で示される塩基配列
（６５）配列番号６５で示される塩基配列
（６６）配列番号６６で示される塩基配列
（６７）配列番号６７で示される塩基配列
（６８）配列番号６８で示される塩基配列
（６９）配列番号６９で示される塩基配列
（７０）配列番号７０で示される塩基配列
（７１）配列番号７１で示される塩基配列
（７２）配列番号７２で示される塩基配列
（７３）配列番号７３で示される塩基配列
（７４）配列番号７４で示される塩基配列
（７５）配列番号７５で示される塩基配列
（７６）配列番号７６で示される塩基配列
（７７）配列番号７７で示される塩基配列
（７８）配列番号７８で示される塩基配列
（１０１）配列番号１０１で示される塩基配列
（１０２）配列番号１０２で示される塩基配列
（１０３）配列番号１０３で示される塩基配列
（１０４）配列番号１０４で示される塩基配列
（１０５）配列番号１０５で示される塩基配列
（１０６）配列番号１０６で示される塩基配列
（１０７）配列番号１０７で示される塩基配列
（１０８）配列番号１０８で示される塩基配列
（１０９）配列番号１０９で示される塩基配列
（１１０）配列番号１１０で示される塩基配列
（１１１）配列番号１１１で示される塩基配列
（１１２）配列番号１１２で示される塩基配列
（１１３）配列番号１１３で示される塩基配列
（１１４）配列番号１１４で示される塩基配列
（１１５）配列番号１１５で示される塩基配列
（１１６）配列番号１１６で示される塩基配列
（１１７）配列番号１１７で示される塩基配列
（１１８）配列番号１１８で示される塩基配列
（１１９）配列番号１１９で示される塩基配列
（１２０）配列番号１２０で示される塩基配列
（１２１）配列番号１２１で示される塩基配列
（１２２）配列番号１２２で示される塩基配列
（１２３）配列番号１２３で示される塩基配列
（１２４）配列番号１２４で示される塩基配列
（１２５）配列番号１２５で示される塩基配列
（１２６）配列番号１２６で示される塩基配列
（１２７）配列番号１２７で示される塩基配列
（１２８）配列番号１２８で示される塩基配列
（１２９）配列番号１２９で示される塩基配列
（１３０）配列番号１３０で示される塩基配列
（１３１）配列番号１３１で示される塩基配列
（１３２）配列番号１３２で示される塩基配列
（１３３）配列番号１３３で示される塩基配列
（１３４）配列番号１３４で示される塩基配列
（１３５）配列番号１３５で示される塩基配列
（１３６）配列番号１３６で示される塩基配列
（１３７）配列番号１３７で示される塩基配列
（１３８）配列番号１３８で示される塩基配列
（１３９）配列番号１３９で示される塩基配列
（１４０）配列番号１４０で示される塩基配列
（１４１）配列番号１４１で示される塩基配列
（１４２）配列番号１４２で示される塩基配列
（１４３）配列番号１４３で示される塩基配列
（１４４）配列番号１４４で示される塩基配列
（１４５）配列番号１４５で示される塩基配列
（１４６）配列番号１４６で示される塩基配列
（１４７）配列番号１４７で示される塩基配列
（１４８）配列番号１４８で示される塩基配列
（１４９）配列番号１４９で示される塩基配列
（１５０）配列番号１５０で示される塩基配列
（１５１）配列番号１５１で示される塩基配列
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（１５３）配列番号１５３で示される塩基配列
（１５４）配列番号１５４で示される塩基配列
（１５５）配列番号１５５で示される塩基配列
（１５６）配列番号１５６で示される塩基配列
（１５７）配列番号１５７で示される塩基配列
（１５８）配列番号１５８で示される塩基配列
（１５９）配列番号１５９で示される塩基配列
（１６０）配列番号１６０で示される塩基配列
（１６１）配列番号１６１で示される塩基配列
（１６２）配列番号１６２で示される塩基配列
（１６３）配列番号１６３で示される塩基配列
（１６４）配列番号１６４で示される塩基配列
（１６５）配列番号１６５で示される塩基配列
（１６６）配列番号１６６で示される塩基配列
（１６７）配列番号１６７で示される塩基配列
（１６８）配列番号１６８で示される塩基配列
（１６９）配列番号１６９で示される塩基配列
（１７０）配列番号１７０で示される塩基配列
（１７１）配列番号１７１で示される塩基配列
（１７２）配列番号１７２で示される塩基配列
（１７３）配列番号１７３で示される塩基配列
（１７４）配列番号１７４で示される塩基配列
（１７５）配列番号１７５で示される塩基配列
（１７６）配列番号１７６で示される塩基配列
（１７７）配列番号１７７で示される塩基配列
（１７８）配列番号１７８で示される塩基配列
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（１８０）配列番号１８０で示される塩基配列
（１８１）配列番号１８１で示される塩基配列
（１８２）配列番号１８２で示される塩基配列
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（１８４）配列番号１８４で示される塩基配列
（１８５）配列番号１８５で示される塩基配列
（１８６）配列番号１８６で示される塩基配列
（１８７）配列番号１８７で示される塩基配列
（１８８）配列番号１８８で示される塩基配列
（１８９）配列番号１８９で示される塩基配列
（１９０）配列番号１９０で示される塩基配列
（１９１）配列番号１９１で示される塩基配列
（１９２）配列番号１９２で示される塩基配列
（１９３）配列番号１９３で示される塩基配列
（１９４）配列番号１９４で示される塩基配列
（１９５）配列番号１９５で示される塩基配列
（１９６）配列番号１９６で示される塩基配列
（１９７）配列番号１９７で示される塩基配列
（１９８）配列番号１９８で示される塩基配列
（１９９）配列番号１９９で示される塩基配列
（２００）配列番号２００で示される塩基配列
（２０１）配列番号２０１で示される塩基配列
（２０２）配列番号２０２で示される塩基配列
（２０３）配列番号２０３で示される塩基配列
（２０４）配列番号２０４で示される塩基配列
（２０５）配列番号２０５で示される塩基配列
（２０６）配列番号２０６で示される塩基配列
（２０７）配列番号２０７で示される塩基配列
（２０８）配列番号２０８で示される塩基配列
（２０９）配列番号２０９で示される塩基配列
（２１０）配列番号２１０で示される塩基配列
（２１１）配列番号２１１で示される塩基配列
（２１２）配列番号２１２で示される塩基配列
（２１３）配列番号２１３で示される塩基配列
（２１４）配列番号２１４で示される塩基配列
（２１５）配列番号２１５で示される塩基配列
（２１６）配列番号２１６で示される塩基配列
（２１７）配列番号２１７で示される塩基配列
（２１８）配列番号２１８で示される塩基配列
（２１９）配列番号２１９で示される塩基配列
（２２０）配列番号２２０で示される塩基配列
（２２１）配列番号２２１で示される塩基配列
（２２２）配列番号２２２で示される塩基配列
（２２３）配列番号２２３で示される塩基配列
（２２４）配列番号２２４で示される塩基配列
（２２５）配列番号２２５で示される塩基配列
（２２６）配列番号２２６で示される塩基配列
（２２７）配列番号２２７で示される塩基配列
（２２８）配列番号２２８で示される塩基配列
（２２９）配列番号２２９で示される塩基配列
（２３０）配列番号２３０で示される塩基配列
【請求項２】
検体が、幹細胞、胚性幹細胞、心臓組織細胞、脳組織細胞、神経組織細胞、筋組織細胞、骨格組織細胞、妊娠非ヒト動物個体又は非ヒト胎児動物個体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルの測定が、転写産物量又は翻訳産物量の測定によりなされる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルの対照値が、該被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における該遺伝子の発現レベルの測定値である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により評価された化学物質が有する発生毒性のレベルに基づいて、発生毒性を有する化学物質を選抜する工程を更に有する発生毒性を有する化学物質の探索方法。
【請求項６】
化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
（１）幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において被験化学物質に接触した該組織細胞における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する第Ａ工程と、
（２）第Ａ工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定する第Ｂ工程と、
（３）第Ｂ工程で特定された遺伝子を取得する第Ｃ工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
（１）  配列番号１で示される塩基配列
（２）  配列番号２で示される塩基配列
（３）  配列番号３で示される塩基配列
（４）  配列番号４で示される塩基配列
（５）  配列番号５で示される塩基配列
（６）  配列番号６で示される塩基配列
（７）  配列番号７で示される塩基配列
（８）  配列番号８で示される塩基配列
（９）  配列番号９で示される塩基配列
（１０）配列番号１０で示される塩基配列
（１１）配列番号１１で示される塩基配列
（１２）配列番号１２で示される塩基配列
（１３）配列番号１３で示される塩基配列
（１４）配列番号１４で示される塩基配列
（１５）配列番号１５で示される塩基配列
（１６）配列番号１６で示される塩基配列
（１７）配列番号１７で示される塩基配列
（１８）配列番号１８で示される塩基配列
（１９）配列番号１９で示される塩基配列
（２０）配列番号２０で示される塩基配列
（２１）配列番号２１で示される塩基配列
（２２）配列番号２２で示される塩基配列
（２３）配列番号２３で示される塩基配列
（２４）配列番号２４で示される塩基配列
（２５）配列番号２５で示される塩基配列
（２６）配列番号２６で示される塩基配列
（２７）配列番号２７で示される塩基配列
（２８）配列番号２８で示される塩基配列
（２９）配列番号２９で示される塩基配列
（３０）配列番号３０で示される塩基配列
（３１）配列番号３１で示される塩基配列
（３２）配列番号３２で示される塩基配列
（３３）配列番号３３で示される塩基配列
（３４）配列番号３４で示される塩基配列
（３５）配列番号３５で示される塩基配列
（３６）配列番号３６で示される塩基配列
（３７）配列番号３７で示される塩基配列
（３８）配列番号３８で示される塩基配列
（３９）配列番号３９で示される塩基配列
（４０）配列番号４０で示される塩基配列
（４１）配列番号４１で示される塩基配列
（４２）配列番号４２で示される塩基配列
（４３）配列番号４３で示される塩基配列
（４４）配列番号４４で示される塩基配列
（４５）配列番号４５で示される塩基配列
（４６）配列番号４６で示される塩基配列
（４７）配列番号４７で示される塩基配列
（４８）配列番号４８で示される塩基配列
（４９）配列番号４９で示される塩基配列
（５０）配列番号５０で示される塩基配列
（５１）配列番号５１で示される塩基配列
（５２）配列番号５２で示される塩基配列
（５３）配列番号５３で示される塩基配列
（５４）配列番号５４で示される塩基配列
（５５）配列番号５５で示される塩基配列
（５６）配列番号５６で示される塩基配列
（５７）配列番号５７で示される塩基配列
（５８）配列番号５８で示される塩基配列
（５９）配列番号５９で示される塩基配列
（６０）配列番号６０で示される塩基配列
（６１）配列番号６１で示される塩基配列
（６２）配列番号６２で示される塩基配列
（６３）配列番号６３で示される塩基配列
（６４）配列番号６４で示される塩基配列
（６５）配列番号６５で示される塩基配列
（６６）配列番号６６で示される塩基配列
（６７）配列番号６７で示される塩基配列
（６８）配列番号６８で示される塩基配列
（６９）配列番号６９で示される塩基配列
（７０）配列番号７０で示される塩基配列
（７１）配列番号７１で示される塩基配列
（７２）配列番号７２で示される塩基配列
（７３）配列番号７３で示される塩基配列
（７４）配列番号７４で示される塩基配列
（７５）配列番号７５で示される塩基配列
（７６）配列番号７６で示される塩基配列
（７７）配列番号７７で示される塩基配列
（７８）配列番号７８で示される塩基配列
（１０１）配列番号１０１で示される塩基配列
（１０２）配列番号１０２で示される塩基配列
（１０３）配列番号１０３で示される塩基配列
（１０４）配列番号１０４で示される塩基配列
（１０５）配列番号１０５で示される塩基配列
（１０６）配列番号１０６で示される塩基配列
（１０７）配列番号１０７で示される塩基配列
（１０８）配列番号１０８で示される塩基配列
（１０９）配列番号１０９で示される塩基配列
（１１０）配列番号１１０で示される塩基配列
（１１１）配列番号１１１で示される塩基配列
（１１２）配列番号１１２で示される塩基配列
（１１３）配列番号１１３で示される塩基配列
（１１４）配列番号１１４で示される塩基配列
（１１５）配列番号１１５で示される塩基配列
（１１６）配列番号１１６で示される塩基配列
（１１７）配列番号１１７で示される塩基配列
（１１８）配列番号１１８で示される塩基配列
（１１９）配列番号１１９で示される塩基配列
（１２０）配列番号１２０で示される塩基配列
（１２１）配列番号１２１で示される塩基配列
（１２２）配列番号１２２で示される塩基配列
（１２３）配列番号１２３で示される塩基配列
（１２４）配列番号１２４で示される塩基配列
（１２５）配列番号１２５で示される塩基配列
（１２６）配列番号１２６で示される塩基配列
（１２７）配列番号１２７で示される塩基配列
（１２８）配列番号１２８で示される塩基配列
（１２９）配列番号１２９で示される塩基配列
（１３０）配列番号１３０で示される塩基配列
（１３１）配列番号１３１で示される塩基配列
（１３２）配列番号１３２で示される塩基配列
（１３３）配列番号１３３で示される塩基配列
（１３４）配列番号１３４で示される塩基配列
（１３５）配列番号１３５で示される塩基配列
（１３６）配列番号１３６で示される塩基配列
（１３７）配列番号１３７で示される塩基配列
（１３８）配列番号１３８で示される塩基配列
（１３９）配列番号１３９で示される塩基配列
（１４０）配列番号１４０で示される塩基配列
（１４１）配列番号１４１で示される塩基配列
（１４２）配列番号１４２で示される塩基配列
（１４３）配列番号１４３で示される塩基配列
（１４４）配列番号１４４で示される塩基配列
（１４５）配列番号１４５で示される塩基配列
（１４６）配列番号１４６で示される塩基配列
（１４７）配列番号１４７で示される塩基配列
（１４８）配列番号１４８で示される塩基配列
（１４９）配列番号１４９で示される塩基配列
（１５０）配列番号１５０で示される塩基配列
（１５１）配列番号１５１で示される塩基配列
（１５２）配列番号１５２で示される塩基配列
（１５３）配列番号１５３で示される塩基配列
（１５４）配列番号１５４で示される塩基配列
（１５５）配列番号１５５で示される塩基配列
（１５６）配列番号１５６で示される塩基配列
（１５７）配列番号１５７で示される塩基配列
（１５８）配列番号１５８で示される塩基配列
（１５９）配列番号１５９で示される塩基配列
（１６０）配列番号１６０で示される塩基配列
（１６１）配列番号１６１で示される塩基配列
（１６２）配列番号１６２で示される塩基配列
（１６３）配列番号１６３で示される塩基配列
（１６４）配列番号１６４で示される塩基配列
（１６５）配列番号１６５で示される塩基配列
（１６６）配列番号１６６で示される塩基配列
（１６７）配列番号１６７で示される塩基配列
（１６８）配列番号１６８で示される塩基配列
（１６９）配列番号１６９で示される塩基配列
（１７０）配列番号１７０で示される塩基配列
（１７１）配列番号１７１で示される塩基配列
（１７２）配列番号１７２で示される塩基配列
（１７３）配列番号１７３で示される塩基配列
（１７４）配列番号１７４で示される塩基配列
（１７５）配列番号１７５で示される塩基配列
（１７６）配列番号１７６で示される塩基配列
（１７７）配列番号１７７で示される塩基配列
（１７８）配列番号１７８で示される塩基配列
（１７９）配列番号１７９で示される塩基配列
（１８０）配列番号１８０で示される塩基配列
（１８１）配列番号１８１で示される塩基配列
（１８２）配列番号１８２で示される塩基配列
（１８３）配列番号１８３で示される塩基配列
（１８４）配列番号１８４で示される塩基配列
（１８５）配列番号１８５で示される塩基配列
（１８６）配列番号１８６で示される塩基配列
（１８７）配列番号１８７で示される塩基配列
（１８８）配列番号１８８で示される塩基配列
（１８９）配列番号１８９で示される塩基配列
（１９０）配列番号１９０で示される塩基配列
（１９１）配列番号１９１で示される塩基配列
（１９２）配列番号１９２で示される塩基配列
（１９３）配列番号１９３で示される塩基配列
（１９４）配列番号１９４で示される塩基配列
（１９５）配列番号１９５で示される塩基配列
（１９６）配列番号１９６で示される塩基配列
（１９７）配列番号１９７で示される塩基配列
（１９８）配列番号１９８で示される塩基配列
（１９９）配列番号１９９で示される塩基配列
（２００）配列番号２００で示される塩基配列
（２０１）配列番号２０１で示される塩基配列
（２０２）配列番号２０２で示される塩基配列
（２０３）配列番号２０３で示される塩基配列
（２０４）配列番号２０４で示される塩基配列
（２０５）配列番号２０５で示される塩基配列
（２０６）配列番号２０６で示される塩基配列
（２０７）配列番号２０７で示される塩基配列
（２０８）配列番号２０８で示される塩基配列
（２０９）配列番号２０９で示される塩基配列
（２１０）配列番号２１０で示される塩基配列
（２１１）配列番号２１１で示される塩基配列
（２１２）配列番号２１２で示される塩基配列
（２１３）配列番号２１３で示される塩基配列
（２１４）配列番号２１４で示される塩基配列
（２１５）配列番号２１５で示される塩基配列
（２１６）配列番号２１６で示される塩基配列
（２１７）配列番号２１７で示される塩基配列
（２１８）配列番号２１８で示される塩基配列
（２１９）配列番号２１９で示される塩基配列
（２２０）配列番号２２０で示される塩基配列
（２２１）配列番号２２１で示される塩基配列
（２２２）配列番号２２２で示される塩基配列
（２２３）配列番号２２３で示される塩基配列
（２２４）配列番号２２４で示される塩基配列
（２２５）配列番号２２５で示される塩基配列
（２２６）配列番号２２６で示される塩基配列
（２２７）配列番号２２７で示される塩基配列
（２２８）配列番号２２８で示される塩基配列
（２２９）配列番号２２９で示される塩基配列
（２３０）配列番号２３０で示される塩基配列
【請求項７】
化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
（１）幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において、該分化過程における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現変動を測定し、変動する遺伝子を特定するＡ工程と、
（２）第Ａ工程で特定した遺伝子について、被験化学物質に接触した該組織細胞における遺伝子の発現レベルを測定する第Ｂ工程と、
（３）第Ｂ工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定し取得する第Ｃ工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
（１）  配列番号１で示される塩基配列
（２）  配列番号２で示される塩基配列
（３）  配列番号３で示される塩基配列
（４）  配列番号４で示される塩基配列
（５）  配列番号５で示される塩基配列
（６）  配列番号６で示される塩基配列
（７）  配列番号７で示される塩基配列
（８）  配列番号８で示される塩基配列
（９）  配列番号９で示される塩基配列
（１０）配列番号１０で示される塩基配列
（１１）配列番号１１で示される塩基配列
（１２）配列番号１２で示される塩基配列
（１３）配列番号１３で示される塩基配列
（１４）配列番号１４で示される塩基配列
（１５）配列番号１５で示される塩基配列
（１６）配列番号１６で示される塩基配列
（１７）配列番号１７で示される塩基配列
（１８）配列番号１８で示される塩基配列
（１９）配列番号１９で示される塩基配列
（２０）配列番号２０で示される塩基配列
（２１）配列番号２１で示される塩基配列
（２２）配列番号２２で示される塩基配列
（２３）配列番号２３で示される塩基配列
（２４）配列番号２４で示される塩基配列
（２５）配列番号２５で示される塩基配列
（２６）配列番号２６で示される塩基配列
（２７）配列番号２７で示される塩基配列
（２８）配列番号２８で示される塩基配列
（２９）配列番号２９で示される塩基配列
（３０）配列番号３０で示される塩基配列
（３１）配列番号３１で示される塩基配列
（３２）配列番号３２で示される塩基配列
（３３）配列番号３３で示される塩基配列
（３４）配列番号３４で示される塩基配列
（３５）配列番号３５で示される塩基配列
（３６）配列番号３６で示される塩基配列
（３７）配列番号３７で示される塩基配列
（３８）配列番号３８で示される塩基配列
（３９）配列番号３９で示される塩基配列
（４０）配列番号４０で示される塩基配列
（４１）配列番号４１で示される塩基配列
（４２）配列番号４２で示される塩基配列
（４３）配列番号４３で示される塩基配列
（４４）配列番号４４で示される塩基配列
（４５）配列番号４５で示される塩基配列
（４６）配列番号４６で示される塩基配列
（４７）配列番号４７で示される塩基配列
（４８）配列番号４８で示される塩基配列
（４９）配列番号４９で示される塩基配列
（５０）配列番号５０で示される塩基配列
（５１）配列番号５１で示される塩基配列
（５２）配列番号５２で示される塩基配列
（５３）配列番号５３で示される塩基配列
（５４）配列番号５４で示される塩基配列
（５５）配列番号５５で示される塩基配列
（５６）配列番号５６で示される塩基配列
（５７）配列番号５７で示される塩基配列
（５８）配列番号５８で示される塩基配列
（５９）配列番号５９で示される塩基配列
（６０）配列番号６０で示される塩基配列
（６１）配列番号６１で示される塩基配列
（６２）配列番号６２で示される塩基配列
（６３）配列番号６３で示される塩基配列
（６４）配列番号６４で示される塩基配列
（６５）配列番号６５で示される塩基配列
（６６）配列番号６６で示される塩基配列
（６７）配列番号６７で示される塩基配列
（６８）配列番号６８で示される塩基配列
（６９）配列番号６９で示される塩基配列
（７０）配列番号７０で示される塩基配列
（７１）配列番号７１で示される塩基配列
（７２）配列番号７２で示される塩基配列
（７３）配列番号７３で示される塩基配列
（７４）配列番号７４で示される塩基配列
（７５）配列番号７５で示される塩基配列
（７６）配列番号７６で示される塩基配列
（７７）配列番号７７で示される塩基配列
（７８）配列番号７８で示される塩基配列
（１０１）配列番号１０１で示される塩基配列
（１０２）配列番号１０２で示される塩基配列
（１０３）配列番号１０３で示される塩基配列
（１０４）配列番号１０４で示される塩基配列
（１０５）配列番号１０５で示される塩基配列
（１０６）配列番号１０６で示される塩基配列
（１０７）配列番号１０７で示される塩基配列
（１０８）配列番号１０８で示される塩基配列
（１０９）配列番号１０９で示される塩基配列
（１１０）配列番号１１０で示される塩基配列
（１１１）配列番号１１１で示される塩基配列
（１１２）配列番号１１２で示される塩基配列
（１１３）配列番号１１３で示される塩基配列
（１１４）配列番号１１４で示される塩基配列
（１１５）配列番号１１５で示される塩基配列
（１１６）配列番号１１６で示される塩基配列
（１１７）配列番号１１７で示される塩基配列
（１１８）配列番号１１８で示される塩基配列
（１１９）配列番号１１９で示される塩基配列
（１２０）配列番号１２０で示される塩基配列
（１２１）配列番号１２１で示される塩基配列
（１２２）配列番号１２２で示される塩基配列
（１２３）配列番号１２３で示される塩基配列
（１２４）配列番号１２４で示される塩基配列
（１２５）配列番号１２５で示される塩基配列
（１２６）配列番号１２６で示される塩基配列
（１２７）配列番号１２７で示される塩基配列
（１２８）配列番号１２８で示される塩基配列
（１２９）配列番号１２９で示される塩基配列
（１３０）配列番号１３０で示される塩基配列
（１３１）配列番号１３１で示される塩基配列
（１３２）配列番号１３２で示される塩基配列
（１３３）配列番号１３３で示される塩基配列
（１３４）配列番号１３４で示される塩基配列
（１３５）配列番号１３５で示される塩基配列
（１３６）配列番号１３６で示される塩基配列
（１３７）配列番号１３７で示される塩基配列
（１３８）配列番号１３８で示される塩基配列
（１３９）配列番号１３９で示される塩基配列
（１４０）配列番号１４０で示される塩基配列
（１４１）配列番号１４１で示される塩基配列
（１４２）配列番号１４２で示される塩基配列
（１４３）配列番号１４３で示される塩基配列
（１４４）配列番号１４４で示される塩基配列
（１４５）配列番号１４５で示される塩基配列
（１４６）配列番号１４６で示される塩基配列
（１４７）配列番号１４７で示される塩基配列
（１４８）配列番号１４８で示される塩基配列
（１４９）配列番号１４９で示される塩基配列
（１５０）配列番号１５０で示される塩基配列
（１５１）配列番号１５１で示される塩基配列
（１５２）配列番号１５２で示される塩基配列
（１５３）配列番号１５３で示される塩基配列
（１５４）配列番号１５４で示される塩基配列
（１５５）配列番号１５５で示される塩基配列
（１５６）配列番号１５６で示される塩基配列
（１５７）配列番号１５７で示される塩基配列
（１５８）配列番号１５８で示される塩基配列
（１５９）配列番号１５９で示される塩基配列
（１６０）配列番号１６０で示される塩基配列
（１６１）配列番号１６１で示される塩基配列
（１６２）配列番号１６２で示される塩基配列
（１６３）配列番号１６３で示される塩基配列
（１６４）配列番号１６４で示される塩基配列
（１６５）配列番号１６５で示される塩基配列
（１６６）配列番号１６６で示される塩基配列
（１６７）配列番号１６７で示される塩基配列
（１６８）配列番号１６８で示される塩基配列
（１６９）配列番号１６９で示される塩基配列
（１７０）配列番号１７０で示される塩基配列
（１７１）配列番号１７１で示される塩基配列
（１７２）配列番号１７２で示される塩基配列
（１７３）配列番号１７３で示される塩基配列
（１７４）配列番号１７４で示される塩基配列
（１７５）配列番号１７５で示される塩基配列
（１７６）配列番号１７６で示される塩基配列
（１７７）配列番号１７７で示される塩基配列
（１７８）配列番号１７８で示される塩基配列
（１７９）配列番号１７９で示される塩基配列
（１８０）配列番号１８０で示される塩基配列
（１８１）配列番号１８１で示される塩基配列
（１８２）配列番号１８２で示される塩基配列
（１８３）配列番号１８３で示される塩基配列
（１８４）配列番号１８４で示される塩基配列
（１８５）配列番号１８５で示される塩基配列
（１８６）配列番号１８６で示される塩基配列
（１８７）配列番号１８７で示される塩基配列
（１８８）配列番号１８８で示される塩基配列
（１８９）配列番号１８９で示される塩基配列
（１９０）配列番号１９０で示される塩基配列
（１９１）配列番号１９１で示される塩基配列
（１９２）配列番号１９２で示される塩基配列
（１９３）配列番号１９３で示される塩基配列
（１９４）配列番号１９４で示される塩基配列
（１９５）配列番号１９５で示される塩基配列
（１９６）配列番号１９６で示される塩基配列
（１９７）配列番号１９７で示される塩基配列
（１９８）配列番号１９８で示される塩基配列
（１９９）配列番号１９９で示される塩基配列
（２００）配列番号２００で示される塩基配列
（２０１）配列番号２０１で示される塩基配列
（２０２）配列番号２０２で示される塩基配列
（２０３）配列番号２０３で示される塩基配列
（２０４）配列番号２０４で示される塩基配列
（２０５）配列番号２０５で示される塩基配列
（２０６）配列番号２０６で示される塩基配列
（２０７）配列番号２０７で示される塩基配列
（２０８）配列番号２０８で示される塩基配列
（２０９）配列番号２０９で示される塩基配列
（２１０）配列番号２１０で示される塩基配列
（２１１）配列番号２１１で示される塩基配列
（２１２）配列番号２１２で示される塩基配列
（２１３）配列番号２１３で示される塩基配列
（２１４）配列番号２１４で示される塩基配列
（２１５）配列番号２１５で示される塩基配列
（２１６）配列番号２１６で示される塩基配列
（２１７）配列番号２１７で示される塩基配列
（２１８）配列番号２１８で示される塩基配列
（２１９）配列番号２１９で示される塩基配列
（２２０）配列番号２２０で示される塩基配列
（２２１）配列番号２２１で示される塩基配列
（２２２）配列番号２２２で示される塩基配列
（２２３）配列番号２２３で示される塩基配列
（２２４）配列番号２２４で示される塩基配列
（２２５）配列番号２２５で示される塩基配列
（２２６）配列番号２２６で示される塩基配列
（２２７）配列番号２２７で示される塩基配列
（２２８）配列番号２２８で示される塩基配列
（２２９）配列番号２２９で示される塩基配列
（２３０）配列番号２３０で示される塩基配列
【請求項８】
請求項１に記載の方法における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子としての使用方法。
（１）  配列番号１で示される塩基配列
（２）  配列番号２で示される塩基配列
（３）  配列番号３で示される塩基配列
（４）  配列番号４で示される塩基配列
（５）  配列番号５で示される塩基配列
（６）  配列番号６で示される塩基配列
（７）  配列番号７で示される塩基配列
（８）  配列番号８で示される塩基配列
（９）  配列番号９で示される塩基配列
（１０）配列番号１０で示される塩基配列
（１１）配列番号１１で示される塩基配列
（１２）配列番号１２で示される塩基配列
（１３）配列番号１３で示される塩基配列
（１４）配列番号１４で示される塩基配列
（１５）配列番号１５で示される塩基配列
（１６）配列番号１６で示される塩基配列
（１７）配列番号１７で示される塩基配列
（１８）配列番号１８で示される塩基配列
（１９）配列番号１９で示される塩基配列
（２０）配列番号２０で示される塩基配列
（２１）配列番号２１で示される塩基配列
（２２）配列番号２２で示される塩基配列
（２３）配列番号２３で示される塩基配列
（２４）配列番号２４で示される塩基配列
（２５）配列番号２５で示される塩基配列
（２６）配列番号２６で示される塩基配列
（２７）配列番号２７で示される塩基配列
（２８）配列番号２８で示される塩基配列
（２９）配列番号２９で示される塩基配列
（３０）配列番号３０で示される塩基配列
（３１）配列番号３１で示される塩基配列
（３２）配列番号３２で示される塩基配列
（３３）配列番号３３で示される塩基配列
（３４）配列番号３４で示される塩基配列
（３５）配列番号３５で示される塩基配列
（３６）配列番号３６で示される塩基配列
（３７）配列番号３７で示される塩基配列
（３８）配列番号３８で示される塩基配列
（３９）配列番号３９で示される塩基配列
（４０）配列番号４０で示される塩基配列
（４１）配列番号４１で示される塩基配列
（４２）配列番号４２で示される塩基配列
（４３）配列番号４３で示される塩基配列
（４４）配列番号４４で示される塩基配列
（４５）配列番号４５で示される塩基配列
（４６）配列番号４６で示される塩基配列
（４７）配列番号４７で示される塩基配列
（４８）配列番号４８で示される塩基配列
（４９）配列番号４９で示される塩基配列
（５０）配列番号５０で示される塩基配列
（５１）配列番号５１で示される塩基配列
（５２）配列番号５２で示される塩基配列
（５３）配列番号５３で示される塩基配列
（５４）配列番号５４で示される塩基配列
（５５）配列番号５５で示される塩基配列
（５６）配列番号５６で示される塩基配列
（５７）配列番号５７で示される塩基配列
（５８）配列番号５８で示される塩基配列
（５９）配列番号５９で示される塩基配列
（６０）配列番号６０で示される塩基配列
（６１）配列番号６１で示される塩基配列
（６２）配列番号６２で示される塩基配列
（６３）配列番号６３で示される塩基配列
（６４）配列番号６４で示される塩基配列
（６５）配列番号６５で示される塩基配列
（６６）配列番号６６で示される塩基配列
（６７）配列番号６７で示される塩基配列
（６８）配列番号６８で示される塩基配列
（６９）配列番号６９で示される塩基配列
（７０）配列番号７０で示される塩基配列
（７１）配列番号７１で示される塩基配列
（７２）配列番号７２で示される塩基配列
（７３）配列番号７３で示される塩基配列
（７４）配列番号７４で示される塩基配列
（７５）配列番号７５で示される塩基配列
（７６）配列番号７６で示される塩基配列
（７７）配列番号７７で示される塩基配列
（７８）配列番号７８で示される塩基配列
（１０１）配列番号１０１で示される塩基配列
（１０２）配列番号１０２で示される塩基配列
（１０３）配列番号１０３で示される塩基配列
（１０４）配列番号１０４で示される塩基配列
（１０５）配列番号１０５で示される塩基配列
（１０６）配列番号１０６で示される塩基配列
（１０７）配列番号１０７で示される塩基配列
（１０８）配列番号１０８で示される塩基配列
（１０９）配列番号１０９で示される塩基配列
（１１０）配列番号１１０で示される塩基配列
（１１１）配列番号１１１で示される塩基配列
（１１２）配列番号１１２で示される塩基配列
（１１３）配列番号１１３で示される塩基配列
（１１４）配列番号１１４で示される塩基配列
（１１５）配列番号１１５で示される塩基配列
（１１６）配列番号１１６で示される塩基配列
（１１７）配列番号１１７で示される塩基配列
（１１８）配列番号１１８で示される塩基配列
（１１９）配列番号１１９で示される塩基配列
（１２０）配列番号１２０で示される塩基配列
（１２１）配列番号１２１で示される塩基配列
（１２２）配列番号１２２で示される塩基配列
（１２３）配列番号１２３で示される塩基配列
（１２４）配列番号１２４で示される塩基配列
（１２５）配列番号１２５で示される塩基配列
（１２６）配列番号１２６で示される塩基配列
（１２７）配列番号１２７で示される塩基配列
（１２８）配列番号１２８で示される塩基配列
（１２９）配列番号１２９で示される塩基配列
（１３０）配列番号１３０で示される塩基配列
（１３１）配列番号１３１で示される塩基配列
（１３２）配列番号１３２で示される塩基配列
（１３３）配列番号１３３で示される塩基配列
（１３４）配列番号１３４で示される塩基配列
（１３５）配列番号１３５で示される塩基配列
（１３６）配列番号１３６で示される塩基配列
（１３７）配列番号１３７で示される塩基配列
（１３８）配列番号１３８で示される塩基配列
（１３９）配列番号１３９で示される塩基配列
（１４０）配列番号１４０で示される塩基配列
（１４１）配列番号１４１で示される塩基配列
（１４２）配列番号１４２で示される塩基配列
（１４３）配列番号１４３で示される塩基配列
（１４４）配列番号１４４で示される塩基配列
（１４５）配列番号１４５で示される塩基配列
（１４６）配列番号１４６で示される塩基配列
（１４７）配列番号１４７で示される塩基配列
（１４８）配列番号１４８で示される塩基配列
（１４９）配列番号１４９で示される塩基配列
（１５０）配列番号１５０で示される塩基配列
（１５１）配列番号１５１で示される塩基配列
（１５２）配列番号１５２で示される塩基配列
（１５３）配列番号１５３で示される塩基配列
（１５４）配列番号１５４で示される塩基配列
（１５５）配列番号１５５で示される塩基配列
（１５６）配列番号１５６で示される塩基配列
（１５７）配列番号１５７で示される塩基配列
（１５８）配列番号１５８で示される塩基配列
（１５９）配列番号１５９で示される塩基配列
（１６０）配列番号１６０で示される塩基配列
（１６１）配列番号１６１で示される塩基配列
（１６２）配列番号１６２で示される塩基配列
（１６３）配列番号１６３で示される塩基配列
（１６４）配列番号１６４で示される塩基配列
（１６５）配列番号１６５で示される塩基配列
（１６６）配列番号１６６で示される塩基配列
（１６７）配列番号１６７で示される塩基配列
（１６８）配列番号１６８で示される塩基配列
（１６９）配列番号１６９で示される塩基配列
（１７０）配列番号１７０で示される塩基配列
（１７１）配列番号１７１で示される塩基配列
（１７２）配列番号１７２で示される塩基配列
（１７３）配列番号１７３で示される塩基配列
（１７４）配列番号１７４で示される塩基配列
（１７５）配列番号１７５で示される塩基配列
（１７６）配列番号１７６で示される塩基配列
（１７７）配列番号１７７で示される塩基配列
（１７８）配列番号１７８で示される塩基配列
（１７９）配列番号１７９で示される塩基配列
（１８０）配列番号１８０で示される塩基配列
（１８１）配列番号１８１で示される塩基配列
（１８２）配列番号１８２で示される塩基配列
（１８３）配列番号１８３で示される塩基配列
（１８４）配列番号１８４で示される塩基配列
（１８５）配列番号１８５で示される塩基配列
（１８６）配列番号１８６で示される塩基配列
（１８７）配列番号１８７で示される塩基配列
（１８８）配列番号１８８で示される塩基配列
（１８９）配列番号１８９で示される塩基配列
（１９０）配列番号１９０で示される塩基配列
（１９１）配列番号１９１で示される塩基配列
（１９２）配列番号１９２で示される塩基配列
（１９３）配列番号１９３で示される塩基配列
（１９４）配列番号１９４で示される塩基配列
（１９５）配列番号１９５で示される塩基配列
（１９６）配列番号１９６で示される塩基配列
（１９７）配列番号１９７で示される塩基配列
（１９８）配列番号１９８で示される塩基配列
（１９９）配列番号１９９で示される塩基配列
（２００）配列番号２００で示される塩基配列
（２０１）配列番号２０１で示される塩基配列
（２０２）配列番号２０２で示される塩基配列
（２０３）配列番号２０３で示される塩基配列
（２０４）配列番号２０４で示される塩基配列
（２０５）配列番号２０５で示される塩基配列
（２０６）配列番号２０６で示される塩基配列
（２０７）配列番号２０７で示される塩基配列
（２０８）配列番号２０８で示される塩基配列
（２０９）配列番号２０９で示される塩基配列
（２１０）配列番号２１０で示される塩基配列
（２１１）配列番号２１１で示される塩基配列
（２１２）配列番号２１２で示される塩基配列
（２１３）配列番号２１３で示される塩基配列
（２１４）配列番号２１４で示される塩基配列
（２１５）配列番号２１５で示される塩基配列
（２１６）配列番号２１６で示される塩基配列
（２１７）配列番号２１７で示される塩基配列
（２１８）配列番号２１８で示される塩基配列
（２１９）配列番号２１９で示される塩基配列
（２２０）配列番号２２０で示される塩基配列
（２２１）配列番号２２１で示される塩基配列
（２２２）配列番号２２２で示される塩基配列
（２２３）配列番号２２３で示される塩基配列
（２２４）配列番号２２４で示される塩基配列
（２２５）配列番号２２５で示される塩基配列
（２２６）配列番号２２６で示される塩基配列
（２２７）配列番号２２７で示される塩基配列
（２２８）配列番号２２８で示される塩基配列
（２２９）配列番号２２９で示される塩基配列
（２３０）配列番号２３０で示される塩基配列
【請求項９】
遺伝子がHand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子、Hba-x遺伝子、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp2遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子またはPax6遺伝子である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５に記載の方法であって、遺伝子の発現レベルを、該遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを指標として測定する方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子を含む核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸構築物又は請求項１２に記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項１４】
宿主細胞が動物細胞である請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
宿主細胞が幹細胞である請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１６】
宿主細胞が胚性幹細胞である請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１７】
請求項１１に記載の核酸構築物又は請求項１２に記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１６に記載の形質転換体の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
【請求項１９】
請求項１１に記載の核酸構築物又は請求項１２に記載のベクターが導入された遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の遺伝子改変非ヒト動物の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質が有する発生毒性の予測方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬、農薬、化粧品、工業製品等の化学物質のヒトに対する安全性を評価するためには、通常、非ヒト動物個体を用いた多くの毒性試験が行われる。これらの毒性試験のうち、生殖性や胎児・新生児の発生等に対する毒性は、総じて生殖・発生毒性と称され、医薬、農薬及び他の化学物質においては、その製造・販売に際し、これらの生殖毒性や発生毒性に関する試験を実施することが求められている。発生毒性試験の一例として、化学物質を非ヒト哺乳動物の妊娠期に投与し、該哺乳動物の胎児に及ぼす形態的な変化の有無及びその程度等を調べる試験を催奇形性試験といい、一般的には、化学物質をラット、マウス、ウサギ、サル等の非ヒト動物個体の妊娠雌動物に一定期間投与し、該動物個体の胎児の外形、内臓及び骨格等を詳細に観察することにより、該化学物質が有する発生毒性評価が行われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、非ヒト動物個体を使用した発生毒性試験は、動物個体を飼育する等の多大な時間と経費を要する。そこで、より簡便な発生毒性試験法として様々な手法（哺乳動物の細胞や組織等を用いた試験系としては、マウス胚性幹細胞（以下、ES細胞と記すこともある。）を用いた試験法（EST : Embryonic Stem cell Test）（H. Spielmann, I. Pohl, B. Doring, M. Liebsch, F. Moldenhauer, In vitro toxicology, 10(1), p119-127, 1997、E. Genschow, H. Spielmann, G. Scholz, I. Pohl, A. Seiler, N. Clemann, S. Bremer, K. Becker, ATLA 32, p209-244, 2004）、ラット胎児の肢芽を用いる小塊培養法（Micro mass culture）及びラットの初期胚を用いた全胚培養法（Whole embryo culture）（E. Genschow, H. Spielmann, G. Scholz, A. Seiler, N. Brown, A. Piersma, M. Brady, N. Clemann, H. Huuskonen, F. Paillard, S. Bremer, K. Becker, ATLA 30, p151-176, 2002）等が試みられているが、いずれの方法も精度上の信頼性が確立されていない。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便で汎用性の高い化学物質が有する発生毒性の予測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は以下の発明を含む。
[発明１]
化学物質が有する発生毒性の予測方法であって、
（１）被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、
（２）第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性の予測方法。
（１）  配列番号１で示される塩基配列
（２）  配列番号２で示される塩基配列
（３）  配列番号３で示される塩基配列
（４）  配列番号４で示される塩基配列
（５）  配列番号５で示される塩基配列
（６）  配列番号６で示される塩基配列
（７）  配列番号７で示される塩基配列
（８）  配列番号８で示される塩基配列
（９）  配列番号９で示される塩基配列
（１０）配列番号１０で示される塩基配列
（１１）配列番号１１で示される塩基配列
（１２）配列番号１２で示される塩基配列
（１３）配列番号１３で示される塩基配列
（１４）配列番号１４で示される塩基配列
（１５）配列番号１５で示される塩基配列
（１６）配列番号１６で示される塩基配列
（１７）配列番号１７で示される塩基配列
（１８）配列番号１８で示される塩基配列
（１９）配列番号１９で示される塩基配列
（２０）配列番号２０で示される塩基配列
（２１）配列番号２１で示される塩基配列
（２２）配列番号２２で示される塩基配列
（２３）配列番号２３で示される塩基配列
（２４）配列番号２４で示される塩基配列
（２５）配列番号２５で示される塩基配列
（２６）配列番号２６で示される塩基配列
（２７）配列番号２７で示される塩基配列
（２８）配列番号２８で示される塩基配列
（２９）配列番号２９で示される塩基配列
（３０）配列番号３０で示される塩基配列
（３１）配列番号３１で示される塩基配列
（３２）配列番号３２で示される塩基配列
（３３）配列番号３３で示される塩基配列
（３４）配列番号３４で示される塩基配列
（３５）配列番号３５で示される塩基配列
（３６）配列番号３６で示される塩基配列
（３７）配列番号３７で示される塩基配列
（３８）配列番号３８で示される塩基配列
（３９）配列番号３９で示される塩基配列
（４０）配列番号４０で示される塩基配列
（４１）配列番号４１で示される塩基配列
（４２）配列番号４２で示される塩基配列
（４３）配列番号４３で示される塩基配列
（４４）配列番号４４で示される塩基配列
（４５）配列番号４５で示される塩基配列
（４６）配列番号４６で示される塩基配列
（４７）配列番号４７で示される塩基配列
（４８）配列番号４８で示される塩基配列
（４９）配列番号４９で示される塩基配列
（５０）配列番号５０で示される塩基配列
（５１）配列番号５１で示される塩基配列
（５２）配列番号５２で示される塩基配列
（５３）配列番号５３で示される塩基配列
（５４）配列番号５４で示される塩基配列
（５５）配列番号５５で示される塩基配列
（５６）配列番号５６で示される塩基配列
（５７）配列番号５７で示される塩基配列
（５８）配列番号５８で示される塩基配列
（５９）配列番号５９で示される塩基配列
（６０）配列番号６０で示される塩基配列
（６１）配列番号６１で示される塩基配列
（６２）配列番号６２で示される塩基配列
（６３）配列番号６３で示される塩基配列
（６４）配列番号６４で示される塩基配列
（６５）配列番号６５で示される塩基配列
（６６）配列番号６６で示される塩基配列
（６７）配列番号６７で示される塩基配列
（６８）配列番号６８で示される塩基配列
（６９）配列番号６９で示される塩基配列
（７０）配列番号７０で示される塩基配列
（７１）配列番号７１で示される塩基配列
（７２）配列番号７２で示される塩基配列
（７３）配列番号７３で示される塩基配列
（７４）配列番号７４で示される塩基配列
（７５）配列番号７５で示される塩基配列
（７６）配列番号７６で示される塩基配列
（７７）配列番号７７で示される塩基配列
（７８）配列番号７８で示される塩基配列
（１０１）配列番号１０１で示される塩基配列
（１０２）配列番号１０２で示される塩基配列
（１０３）配列番号１０３で示される塩基配列
（１０４）配列番号１０４で示される塩基配列
（１０５）配列番号１０５で示される塩基配列
（１０６）配列番号１０６で示される塩基配列
（１０７）配列番号１０７で示される塩基配列
（１０８）配列番号１０８で示される塩基配列
（１０９）配列番号１０９で示される塩基配列
（１１０）配列番号１１０で示される塩基配列
（１１１）配列番号１１１で示される塩基配列
（１１２）配列番号１１２で示される塩基配列
（１１３）配列番号１１３で示される塩基配列
（１１４）配列番号１１４で示される塩基配列
（１１５）配列番号１１５で示される塩基配列
（１１６）配列番号１１６で示される塩基配列
（１１７）配列番号１１７で示される塩基配列
（１１８）配列番号１１８で示される塩基配列
（１１９）配列番号１１９で示される塩基配列
（１２０）配列番号１２０で示される塩基配列
（１２１）配列番号１２１で示される塩基配列
（１２２）配列番号１２２で示される塩基配列
（１２３）配列番号１２３で示される塩基配列
（１２４）配列番号１２４で示される塩基配列
（１２５）配列番号１２５で示される塩基配列
（１２６）配列番号１２６で示される塩基配列
（１２７）配列番号１２７で示される塩基配列
（１２８）配列番号１２８で示される塩基配列
（１２９）配列番号１２９で示される塩基配列
（１３０）配列番号１３０で示される塩基配列
（１３１）配列番号１３１で示される塩基配列
（１３２）配列番号１３２で示される塩基配列
（１３３）配列番号１３３で示される塩基配列
（１３４）配列番号１３４で示される塩基配列
（１３５）配列番号１３５で示される塩基配列
（１３６）配列番号１３６で示される塩基配列
（１３７）配列番号１３７で示される塩基配列
（１３８）配列番号１３８で示される塩基配列
（１３９）配列番号１３９で示される塩基配列
（１４０）配列番号１４０で示される塩基配列
（１４１）配列番号１４１で示される塩基配列
（１４２）配列番号１４２で示される塩基配列
（１４３）配列番号１４３で示される塩基配列
（１４４）配列番号１４４で示される塩基配列
（１４５）配列番号１４５で示される塩基配列
（１４６）配列番号１４６で示される塩基配列
（１４７）配列番号１４７で示される塩基配列
（１４８）配列番号１４８で示される塩基配列
（１４９）配列番号１４９で示される塩基配列
（１５０）配列番号１５０で示される塩基配列
（１５１）配列番号１５１で示される塩基配列
（１５２）配列番号１５２で示される塩基配列
（１５３）配列番号１５３で示される塩基配列
（１５４）配列番号１５４で示される塩基配列
（１５５）配列番号１５５で示される塩基配列
（１５６）配列番号１５６で示される塩基配列
（１５７）配列番号１５７で示される塩基配列
（１５８）配列番号１５８で示される塩基配列
（１５９）配列番号１５９で示される塩基配列
（１６０）配列番号１６０で示される塩基配列
（１６１）配列番号１６１で示される塩基配列
（１６２）配列番号１６２で示される塩基配列
（１６３）配列番号１６３で示される塩基配列
（１６４）配列番号１６４で示される塩基配列
（１６５）配列番号１６５で示される塩基配列
（１６６）配列番号１６６で示される塩基配列
（１６７）配列番号１６７で示される塩基配列
（１６８）配列番号１６８で示される塩基配列
（１６９）配列番号１６９で示される塩基配列
（１７０）配列番号１７０で示される塩基配列
（１７１）配列番号１７１で示される塩基配列
（１７２）配列番号１７２で示される塩基配列
（１７３）配列番号１７３で示される塩基配列
（１７４）配列番号１７４で示される塩基配列
（１７５）配列番号１７５で示される塩基配列
（１７６）配列番号１７６で示される塩基配列
（１７７）配列番号１７７で示される塩基配列
（１７８）配列番号１７８で示される塩基配列
（１７９）配列番号１７９で示される塩基配列
（１８０）配列番号１８０で示される塩基配列
（１８１）配列番号１８１で示される塩基配列
（１８２）配列番号１８２で示される塩基配列
（１８３）配列番号１８３で示される塩基配列
（１８４）配列番号１８４で示される塩基配列
（１８５）配列番号１８５で示される塩基配列
（１８６）配列番号１８６で示される塩基配列
（１８７）配列番号１８７で示される塩基配列
（１８８）配列番号１８８で示される塩基配列
（１８９）配列番号１８９で示される塩基配列
（１９０）配列番号１９０で示される塩基配列
（１９１）配列番号１９１で示される塩基配列
（１９２）配列番号１９２で示される塩基配列
（１９３）配列番号１９３で示される塩基配列
（１９４）配列番号１９４で示される塩基配列
（１９５）配列番号１９５で示される塩基配列
（１９６）配列番号１９６で示される塩基配列
（１９７）配列番号１９７で示される塩基配列
（１９８）配列番号１９８で示される塩基配列
（１９９）配列番号１９９で示される塩基配列
（２００）配列番号２００で示される塩基配列
（２０１）配列番号２０１で示される塩基配列
（２０２）配列番号２０２で示される塩基配列
（２０３）配列番号２０３で示される塩基配列
（２０４）配列番号２０４で示される塩基配列
（２０５）配列番号２０５で示される塩基配列
（２０６）配列番号２０６で示される塩基配列
（２０７）配列番号２０７で示される塩基配列
（２０８）配列番号２０８で示される塩基配列
（２０９）配列番号２０９で示される塩基配列
（２１０）配列番号２１０で示される塩基配列
（２１１）配列番号２１１で示される塩基配列
（２１２）配列番号２１２で示される塩基配列
（２１３）配列番号２１３で示される塩基配列
（２１４）配列番号２１４で示される塩基配列
（２１５）配列番号２１５で示される塩基配列
（２１６）配列番号２１６で示される塩基配列
（２１７）配列番号２１７で示される塩基配列
（２１８）配列番号２１８で示される塩基配列
（２１９）配列番号２１９で示される塩基配列
（２２０）配列番号２２０で示される塩基配列
（２２１）配列番号２２１で示される塩基配列
（２２２）配列番号２２２で示される塩基配列
（２２３）配列番号２２３で示される塩基配列
（２２４）配列番号２２４で示される塩基配列
（２２５）配列番号２２５で示される塩基配列
（２２６）配列番号２２６で示される塩基配列
（２２７）配列番号２２７で示される塩基配列
（２２８）配列番号２２８で示される塩基配列
（２２９）配列番号２２９で示される塩基配列
（２３０）配列番号２３０で示される塩基配列
[発明２]
検体が、幹細胞、胚性幹細胞、心臓組織細胞、脳組織細胞、神経組織細胞、筋組織細胞、骨格組織細胞、妊娠非ヒト動物個体又は非ヒト胎児動物個体である発明１に記載の方法。
[発明３]
遺伝子の発現レベルの測定が、転写産物量又は翻訳産物量の測定によりなされる発明１又は２に記載の方法。
[発明４]
遺伝子の発現レベルの対照値が、該被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における該遺伝子の発現レベルの測定値である発明１〜３のいずれか一項に記載の方法。
[発明５]
発明１〜４のいずれか一項に記載の方法により評価された化学物質が有する発生毒性のレベルに基づいて、発生毒性を有する化学物質を選抜する工程を更に有する発生毒性を有する化学物質の探索方法。
[発明６]
化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
（１）幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において被験化学物質に接触した該組織細胞における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する第Ａ工程と、
（２）第Ａ工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定する第Ｂ工程と、
（３）第Ｂ工程で特定された遺伝子を取得する第Ｃ工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
（１）  配列番号１で示される塩基配列
（２）  配列番号２で示される塩基配列
（３）  配列番号３で示される塩基配列
（４）  配列番号４で示される塩基配列
（５）  配列番号５で示される塩基配列
（６）  配列番号６で示される塩基配列
（７）  配列番号７で示される塩基配列
（８）  配列番号８で示される塩基配列
（９）  配列番号９で示される塩基配列
（１０）配列番号１０で示される塩基配列
（１１）配列番号１１で示される塩基配列
（１２）配列番号１２で示される塩基配列
（１３）配列番号１３で示される塩基配列
（１４）配列番号１４で示される塩基配列
（１５）配列番号１５で示される塩基配列
（１６）配列番号１６で示される塩基配列
（１７）配列番号１７で示される塩基配列
（１８）配列番号１８で示される塩基配列
（１９）配列番号１９で示される塩基配列
（２０）配列番号２０で示される塩基配列
（２１）配列番号２１で示される塩基配列
（２２）配列番号２２で示される塩基配列
（２３）配列番号２３で示される塩基配列
（２４）配列番号２４で示される塩基配列
（２５）配列番号２５で示される塩基配列
（２６）配列番号２６で示される塩基配列
（２７）配列番号２７で示される塩基配列
（２８）配列番号２８で示される塩基配列
（２９）配列番号２９で示される塩基配列
（３０）配列番号３０で示される塩基配列
（３１）配列番号３１で示される塩基配列
（３２）配列番号３２で示される塩基配列
（３３）配列番号３３で示される塩基配列
（３４）配列番号３４で示される塩基配列
（３５）配列番号３５で示される塩基配列
（３６）配列番号３６で示される塩基配列
（３７）配列番号３７で示される塩基配列
（３８）配列番号３８で示される塩基配列
（３９）配列番号３９で示される塩基配列
（４０）配列番号４０で示される塩基配列
（４１）配列番号４１で示される塩基配列
（４２）配列番号４２で示される塩基配列
（４３）配列番号４３で示される塩基配列
（４４）配列番号４４で示される塩基配列
（４５）配列番号４５で示される塩基配列
（４６）配列番号４６で示される塩基配列
（４７）配列番号４７で示される塩基配列
（４８）配列番号４８で示される塩基配列
（４９）配列番号４９で示される塩基配列
（５０）配列番号５０で示される塩基配列
（５１）配列番号５１で示される塩基配列
（５２）配列番号５２で示される塩基配列
（５３）配列番号５３で示される塩基配列
（５４）配列番号５４で示される塩基配列
（５５）配列番号５５で示される塩基配列
（５６）配列番号５６で示される塩基配列
（５７）配列番号５７で示される塩基配列
（５８）配列番号５８で示される塩基配列
（５９）配列番号５９で示される塩基配列
（６０）配列番号６０で示される塩基配列
（６１）配列番号６１で示される塩基配列
（６２）配列番号６２で示される塩基配列
（６３）配列番号６３で示される塩基配列
（６４）配列番号６４で示される塩基配列
（６５）配列番号６５で示される塩基配列
（６６）配列番号６６で示される塩基配列
（６７）配列番号６７で示される塩基配列
（６８）配列番号６８で示される塩基配列
（６９）配列番号６９で示される塩基配列
（７０）配列番号７０で示される塩基配列
（７１）配列番号７１で示される塩基配列
（７２）配列番号７２で示される塩基配列
（７３）配列番号７３で示される塩基配列
（７４）配列番号７４で示される塩基配列
（７５）配列番号７５で示される塩基配列
（７６）配列番号７６で示される塩基配列
（７７）配列番号７７で示される塩基配列
（７８）配列番号７８で示される塩基配列
（１０１）配列番号１０１で示される塩基配列
（１０２）配列番号１０２で示される塩基配列
（１０３）配列番号１０３で示される塩基配列
（１０４）配列番号１０４で示される塩基配列
（１０５）配列番号１０５で示される塩基配列
（１０６）配列番号１０６で示される塩基配列
（１０７）配列番号１０７で示される塩基配列
（１０８）配列番号１０８で示される塩基配列
（１０９）配列番号１０９で示される塩基配列
（１１０）配列番号１１０で示される塩基配列
（１１１）配列番号１１１で示される塩基配列
（１１２）配列番号１１２で示される塩基配列
（１１３）配列番号１１３で示される塩基配列
（１１４）配列番号１１４で示される塩基配列
（１１５）配列番号１１５で示される塩基配列
（１１６）配列番号１１６で示される塩基配列
（１１７）配列番号１１７で示される塩基配列
（１１８）配列番号１１８で示される塩基配列
（１１９）配列番号１１９で示される塩基配列
（１２０）配列番号１２０で示される塩基配列
（１２１）配列番号１２１で示される塩基配列
（１２２）配列番号１２２で示される塩基配列
（１２３）配列番号１２３で示される塩基配列
（１２４）配列番号１２４で示される塩基配列
（１２５）配列番号１２５で示される塩基配列
（１２６）配列番号１２６で示される塩基配列
（１２７）配列番号１２７で示される塩基配列
（１２８）配列番号１２８で示される塩基配列
（１２９）配列番号１２９で示される塩基配列
（１３０）配列番号１３０で示される塩基配列
（１３１）配列番号１３１で示される塩基配列
（１３２）配列番号１３２で示される塩基配列
（１３３）配列番号１３３で示される塩基配列
（１３４）配列番号１３４で示される塩基配列
（１３５）配列番号１３５で示される塩基配列
（１３６）配列番号１３６で示される塩基配列
（１３７）配列番号１３７で示される塩基配列
（１３８）配列番号１３８で示される塩基配列
（１３９）配列番号１３９で示される塩基配列
（１４０）配列番号１４０で示される塩基配列
（１４１）配列番号１４１で示される塩基配列
（１４２）配列番号１４２で示される塩基配列
（１４３）配列番号１４３で示される塩基配列
（１４４）配列番号１４４で示される塩基配列
（１４５）配列番号１４５で示される塩基配列
（１４６）配列番号１４６で示される塩基配列
（１４７）配列番号１４７で示される塩基配列
（１４８）配列番号１４８で示される塩基配列
（１４９）配列番号１４９で示される塩基配列
（１５０）配列番号１５０で示される塩基配列
（１５１）配列番号１５１で示される塩基配列
（１５２）配列番号１５２で示される塩基配列
（１５３）配列番号１５３で示される塩基配列
（１５４）配列番号１５４で示される塩基配列
（１５５）配列番号１５５で示される塩基配列
（１５６）配列番号１５６で示される塩基配列
（１５７）配列番号１５７で示される塩基配列
（１５８）配列番号１５８で示される塩基配列
（１５９）配列番号１５９で示される塩基配列
（１６０）配列番号１６０で示される塩基配列
（１６１）配列番号１６１で示される塩基配列
（１６２）配列番号１６２で示される塩基配列
（１６３）配列番号１６３で示される塩基配列
（１６４）配列番号１６４で示される塩基配列
（１６５）配列番号１６５で示される塩基配列
（１６６）配列番号１６６で示される塩基配列
（１６７）配列番号１６７で示される塩基配列
（１６８）配列番号１６８で示される塩基配列
（１６９）配列番号１６９で示される塩基配列
（１７０）配列番号１７０で示される塩基配列
（１７１）配列番号１７１で示される塩基配列
（１７２）配列番号１７２で示される塩基配列
（１７３）配列番号１７３で示される塩基配列
（１７４）配列番号１７４で示される塩基配列
（１７５）配列番号１７５で示される塩基配列
（１７６）配列番号１７６で示される塩基配列
（１７７）配列番号１７７で示される塩基配列
（１７８）配列番号１７８で示される塩基配列
（１７９）配列番号１７９で示される塩基配列
（１８０）配列番号１８０で示される塩基配列
（１８１）配列番号１８１で示される塩基配列
（１８２）配列番号１８２で示される塩基配列
（１８３）配列番号１８３で示される塩基配列
（１８４）配列番号１８４で示される塩基配列
（１８５）配列番号１８５で示される塩基配列
（１８６）配列番号１８６で示される塩基配列
（１８７）配列番号１８７で示される塩基配列
（１８８）配列番号１８８で示される塩基配列
（１８９）配列番号１８９で示される塩基配列
（１９０）配列番号１９０で示される塩基配列
（１９１）配列番号１９１で示される塩基配列
（１９２）配列番号１９２で示される塩基配列
（１９３）配列番号１９３で示される塩基配列
（１９４）配列番号１９４で示される塩基配列
（１９５）配列番号１９５で示される塩基配列
（１９６）配列番号１９６で示される塩基配列
（１９７）配列番号１９７で示される塩基配列
（１９８）配列番号１９８で示される塩基配列
（１９９）配列番号１９９で示される塩基配列
（２００）配列番号２００で示される塩基配列
（２０１）配列番号２０１で示される塩基配列
（２０２）配列番号２０２で示される塩基配列
（２０３）配列番号２０３で示される塩基配列
（２０４）配列番号２０４で示される塩基配列
（２０５）配列番号２０５で示される塩基配列
（２０６）配列番号２０６で示される塩基配列
（２０７）配列番号２０７で示される塩基配列
（２０８）配列番号２０８で示される塩基配列
（２０９）配列番号２０９で示される塩基配列
（２１０）配列番号２１０で示される塩基配列
（２１１）配列番号２１１で示される塩基配列
（２１２）配列番号２１２で示される塩基配列
（２１３）配列番号２１３で示される塩基配列
（２１４）配列番号２１４で示される塩基配列
（２１５）配列番号２１５で示される塩基配列
（２１６）配列番号２１６で示される塩基配列
（２１７）配列番号２１７で示される塩基配列
（２１８）配列番号２１８で示される塩基配列
（２１９）配列番号２１９で示される塩基配列
（２２０）配列番号２２０で示される塩基配列
（２２１）配列番号２２１で示される塩基配列
（２２２）配列番号２２２で示される塩基配列
（２２３）配列番号２２３で示される塩基配列
（２２４）配列番号２２４で示される塩基配列
（２２５）配列番号２２５で示される塩基配列
（２２６）配列番号２２６で示される塩基配列
（２２７）配列番号２２７で示される塩基配列
（２２８）配列番号２２８で示される塩基配列
（２２９）配列番号２２９で示される塩基配列
（２３０）配列番号２３０で示される塩基配列
[発明７]
化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
（１）幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において、該分化過程における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現変動を測定し、変動する遺伝子を特定するＡ工程と、
（２）第Ａ工程で特定した遺伝子について、被験化学物質に接触した該組織細胞における遺伝子の発現レベルを測定する第Ｂ工程と、
（３）第Ｂ工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定し取得する第Ｃ工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
（１）  配列番号１で示される塩基配列
（２）  配列番号２で示される塩基配列
（３）  配列番号３で示される塩基配列
（４）  配列番号４で示される塩基配列
（５）  配列番号５で示される塩基配列
（６）  配列番号６で示される塩基配列
（７）  配列番号７で示される塩基配列
（８）  配列番号８で示される塩基配列
（９）  配列番号９で示される塩基配列
（１０）配列番号１０で示される塩基配列
（１１）配列番号１１で示される塩基配列
（１２）配列番号１２で示される塩基配列
（１３）配列番号１３で示される塩基配列
（１４）配列番号１４で示される塩基配列
（１５）配列番号１５で示される塩基配列
（１６）配列番号１６で示される塩基配列
（１７）配列番号１７で示される塩基配列
（１８）配列番号１８で示される塩基配列
（１９）配列番号１９で示される塩基配列
（２０）配列番号２０で示される塩基配列
（２１）配列番号２１で示される塩基配列
（２２）配列番号２２で示される塩基配列
（２３）配列番号２３で示される塩基配列
（２４）配列番号２４で示される塩基配列
（２５）配列番号２５で示される塩基配列
（２６）配列番号２６で示される塩基配列
（２７）配列番号２７で示される塩基配列
（２８）配列番号２８で示される塩基配列
（２９）配列番号２９で示される塩基配列
（３０）配列番号３０で示される塩基配列
（３１）配列番号３１で示される塩基配列
（３２）配列番号３２で示される塩基配列
（３３）配列番号３３で示される塩基配列
（３４）配列番号３４で示される塩基配列
（３５）配列番号３５で示される塩基配列
（３６）配列番号３６で示される塩基配列
（３７）配列番号３７で示される塩基配列
（３８）配列番号３８で示される塩基配列
（３９）配列番号３９で示される塩基配列
（４０）配列番号４０で示される塩基配列
（４１）配列番号４１で示される塩基配列
（４２）配列番号４２で示される塩基配列
（４３）配列番号４３で示される塩基配列
（４４）配列番号４４で示される塩基配列
（４５）配列番号４５で示される塩基配列
（４６）配列番号４６で示される塩基配列
（４７）配列番号４７で示される塩基配列
（４８）配列番号４８で示される塩基配列
（４９）配列番号４９で示される塩基配列
（５０）配列番号５０で示される塩基配列
（５１）配列番号５１で示される塩基配列
（５２）配列番号５２で示される塩基配列
（５３）配列番号５３で示される塩基配列
（５４）配列番号５４で示される塩基配列
（５５）配列番号５５で示される塩基配列
（５６）配列番号５６で示される塩基配列
（５７）配列番号５７で示される塩基配列
（５８）配列番号５８で示される塩基配列
（５９）配列番号５９で示される塩基配列
（６０）配列番号６０で示される塩基配列
（６１）配列番号６１で示される塩基配列
（６２）配列番号６２で示される塩基配列
（６３）配列番号６３で示される塩基配列
（６４）配列番号６４で示される塩基配列
（６５）配列番号６５で示される塩基配列
（６６）配列番号６６で示される塩基配列
（６７）配列番号６７で示される塩基配列
（６８）配列番号６８で示される塩基配列
（６９）配列番号６９で示される塩基配列
（７０）配列番号７０で示される塩基配列
（７１）配列番号７１で示される塩基配列
（７２）配列番号７２で示される塩基配列
（７３）配列番号７３で示される塩基配列
（７４）配列番号７４で示される塩基配列
（７５）配列番号７５で示される塩基配列
（７６）配列番号７６で示される塩基配列
（７７）配列番号７７で示される塩基配列
（７８）配列番号７８で示される塩基配列
（１０１）配列番号１０１で示される塩基配列
（１０２）配列番号１０２で示される塩基配列
（１０３）配列番号１０３で示される塩基配列
（１０４）配列番号１０４で示される塩基配列
（１０５）配列番号１０５で示される塩基配列
（１０６）配列番号１０６で示される塩基配列
（１０７）配列番号１０７で示される塩基配列
（１０８）配列番号１０８で示される塩基配列
（１０９）配列番号１０９で示される塩基配列
（１１０）配列番号１１０で示される塩基配列
（１１１）配列番号１１１で示される塩基配列
（１１２）配列番号１１２で示される塩基配列
（１１３）配列番号１１３で示される塩基配列
（１１４）配列番号１１４で示される塩基配列
（１１５）配列番号１１５で示される塩基配列
（１１６）配列番号１１６で示される塩基配列
（１１７）配列番号１１７で示される塩基配列
（１１８）配列番号１１８で示される塩基配列
（１１９）配列番号１１９で示される塩基配列
（１２０）配列番号１２０で示される塩基配列
（１２１）配列番号１２１で示される塩基配列
（１２２）配列番号１２２で示される塩基配列
（１２３）配列番号１２３で示される塩基配列
（１２４）配列番号１２４で示される塩基配列
（１２５）配列番号１２５で示される塩基配列
（１２６）配列番号１２６で示される塩基配列
（１２７）配列番号１２７で示される塩基配列
（１２８）配列番号１２８で示される塩基配列
（１２９）配列番号１２９で示される塩基配列
（１３０）配列番号１３０で示される塩基配列
（１３１）配列番号１３１で示される塩基配列
（１３２）配列番号１３２で示される塩基配列
（１３３）配列番号１３３で示される塩基配列
（１３４）配列番号１３４で示される塩基配列
（１３５）配列番号１３５で示される塩基配列
（１３６）配列番号１３６で示される塩基配列
（１３７）配列番号１３７で示される塩基配列
（１３８）配列番号１３８で示される塩基配列
（１３９）配列番号１３９で示される塩基配列
（１４０）配列番号１４０で示される塩基配列
（１４１）配列番号１４１で示される塩基配列
（１４２）配列番号１４２で示される塩基配列
（１４３）配列番号１４３で示される塩基配列
（１４４）配列番号１４４で示される塩基配列
（１４５）配列番号１４５で示される塩基配列
（１４６）配列番号１４６で示される塩基配列
（１４７）配列番号１４７で示される塩基配列
（１４８）配列番号１４８で示される塩基配列
（１４９）配列番号１４９で示される塩基配列
（１５０）配列番号１５０で示される塩基配列
（１５１）配列番号１５１で示される塩基配列
（１５２）配列番号１５２で示される塩基配列
（１５３）配列番号１５３で示される塩基配列
（１５４）配列番号１５４で示される塩基配列
（１５５）配列番号１５５で示される塩基配列
（１５６）配列番号１５６で示される塩基配列
（１５７）配列番号１５７で示される塩基配列
（１５８）配列番号１５８で示される塩基配列
（１５９）配列番号１５９で示される塩基配列
（１６０）配列番号１６０で示される塩基配列
（１６１）配列番号１６１で示される塩基配列
（１６２）配列番号１６２で示される塩基配列
（１６３）配列番号１６３で示される塩基配列
（１６４）配列番号１６４で示される塩基配列
（１６５）配列番号１６５で示される塩基配列
（１６６）配列番号１６６で示される塩基配列
（１６７）配列番号１６７で示される塩基配列
（１６８）配列番号１６８で示される塩基配列
（１６９）配列番号１６９で示される塩基配列
（１７０）配列番号１７０で示される塩基配列
（１７１）配列番号１７１で示される塩基配列
（１７２）配列番号１７２で示される塩基配列
（１７３）配列番号１７３で示される塩基配列
（１７４）配列番号１７４で示される塩基配列
（１７５）配列番号１７５で示される塩基配列
（１７６）配列番号１７６で示される塩基配列
（１７７）配列番号１７７で示される塩基配列
（１７８）配列番号１７８で示される塩基配列
（１７９）配列番号１７９で示される塩基配列
（１８０）配列番号１８０で示される塩基配列
（１８１）配列番号１８１で示される塩基配列
（１８２）配列番号１８２で示される塩基配列
（１８３）配列番号１８３で示される塩基配列
（１８４）配列番号１８４で示される塩基配列
（１８５）配列番号１８５で示される塩基配列
（１８６）配列番号１８６で示される塩基配列
（１８７）配列番号１８７で示される塩基配列
（１８８）配列番号１８８で示される塩基配列
（１８９）配列番号１８９で示される塩基配列
（１９０）配列番号１９０で示される塩基配列
（１９１）配列番号１９１で示される塩基配列
（１９２）配列番号１９２で示される塩基配列
（１９３）配列番号１９３で示される塩基配列
（１９４）配列番号１９４で示される塩基配列
（１９５）配列番号１９５で示される塩基配列
（１９６）配列番号１９６で示される塩基配列
（１９７）配列番号１９７で示される塩基配列
（１９８）配列番号１９８で示される塩基配列
（１９９）配列番号１９９で示される塩基配列
（２００）配列番号２００で示される塩基配列
（２０１）配列番号２０１で示される塩基配列
（２０２）配列番号２０２で示される塩基配列
（２０３）配列番号２０３で示される塩基配列
（２０４）配列番号２０４で示される塩基配列
（２０５）配列番号２０５で示される塩基配列
（２０６）配列番号２０６で示される塩基配列
（２０７）配列番号２０７で示される塩基配列
（２０８）配列番号２０８で示される塩基配列
（２０９）配列番号２０９で示される塩基配列
（２１０）配列番号２１０で示される塩基配列
（２１１）配列番号２１１で示される塩基配列
（２１２）配列番号２１２で示される塩基配列
（２１３）配列番号２１３で示される塩基配列
（２１４）配列番号２１４で示される塩基配列
（２１５）配列番号２１５で示される塩基配列
（２１６）配列番号２１６で示される塩基配列
（２１７）配列番号２１７で示される塩基配列
（２１８）配列番号２１８で示される塩基配列
（２１９）配列番号２１９で示される塩基配列
（２２０）配列番号２２０で示される塩基配列
（２２１）配列番号２２１で示される塩基配列
（２２２）配列番号２２２で示される塩基配列
（２２３）配列番号２２３で示される塩基配列
（２２４）配列番号２２４で示される塩基配列
（２２５）配列番号２２５で示される塩基配列
（２２６）配列番号２２６で示される塩基配列
（２２７）配列番号２２７で示される塩基配列
（２２８）配列番号２２８で示される塩基配列
（２２９）配列番号２２９で示される塩基配列
（２３０）配列番号２３０で示される塩基配列
[発明８]
発明１に記載の方法における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子としての使用方法。
（１）  配列番号１で示される塩基配列
（２）  配列番号２で示される塩基配列
（３）  配列番号３で示される塩基配列
（４）  配列番号４で示される塩基配列
（５）  配列番号５で示される塩基配列
（６）  配列番号６で示される塩基配列
（７）  配列番号７で示される塩基配列
（８）  配列番号８で示される塩基配列
（９）  配列番号９で示される塩基配列
（１０）配列番号１０で示される塩基配列
（１１）配列番号１１で示される塩基配列
（１２）配列番号１２で示される塩基配列
（１３）配列番号１３で示される塩基配列
（１４）配列番号１４で示される塩基配列
（１５）配列番号１５で示される塩基配列
（１６）配列番号１６で示される塩基配列
（１７）配列番号１７で示される塩基配列
（１８）配列番号１８で示される塩基配列
（１９）配列番号１９で示される塩基配列
（２０）配列番号２０で示される塩基配列
（２１）配列番号２１で示される塩基配列
（２２）配列番号２２で示される塩基配列
（２３）配列番号２３で示される塩基配列
（２４）配列番号２４で示される塩基配列
（２５）配列番号２５で示される塩基配列
（２６）配列番号２６で示される塩基配列
（２７）配列番号２７で示される塩基配列
（２８）配列番号２８で示される塩基配列
（２９）配列番号２９で示される塩基配列
（３０）配列番号３０で示される塩基配列
（３１）配列番号３１で示される塩基配列
（３２）配列番号３２で示される塩基配列
（３３）配列番号３３で示される塩基配列
（３４）配列番号３４で示される塩基配列
（３５）配列番号３５で示される塩基配列
（３６）配列番号３６で示される塩基配列
（３７）配列番号３７で示される塩基配列
（３８）配列番号３８で示される塩基配列
（３９）配列番号３９で示される塩基配列
（４０）配列番号４０で示される塩基配列
（４１）配列番号４１で示される塩基配列
（４２）配列番号４２で示される塩基配列
（４３）配列番号４３で示される塩基配列
（４４）配列番号４４で示される塩基配列
（４５）配列番号４５で示される塩基配列
（４６）配列番号４６で示される塩基配列
（４７）配列番号４７で示される塩基配列
（４８）配列番号４８で示される塩基配列
（４９）配列番号４９で示される塩基配列
（５０）配列番号５０で示される塩基配列
（５１）配列番号５１で示される塩基配列
（５２）配列番号５２で示される塩基配列
（５３）配列番号５３で示される塩基配列
（５４）配列番号５４で示される塩基配列
（５５）配列番号５５で示される塩基配列
（５６）配列番号５６で示される塩基配列
（５７）配列番号５７で示される塩基配列
（５８）配列番号５８で示される塩基配列
（５９）配列番号５９で示される塩基配列
（６０）配列番号６０で示される塩基配列
（６１）配列番号６１で示される塩基配列
（６２）配列番号６２で示される塩基配列
（６３）配列番号６３で示される塩基配列
（６４）配列番号６４で示される塩基配列
（６５）配列番号６５で示される塩基配列
（６６）配列番号６６で示される塩基配列
（６７）配列番号６７で示される塩基配列
（６８）配列番号６８で示される塩基配列
（６９）配列番号６９で示される塩基配列
（７０）配列番号７０で示される塩基配列
（７１）配列番号７１で示される塩基配列
（７２）配列番号７２で示される塩基配列
（７３）配列番号７３で示される塩基配列
（７４）配列番号７４で示される塩基配列
（７５）配列番号７５で示される塩基配列
（７６）配列番号７６で示される塩基配列
（７７）配列番号７７で示される塩基配列
（７８）配列番号７８で示される塩基配列
（１０１）配列番号１０１で示される塩基配列
（１０２）配列番号１０２で示される塩基配列
（１０３）配列番号１０３で示される塩基配列
（１０４）配列番号１０４で示される塩基配列
（１０５）配列番号１０５で示される塩基配列
（１０６）配列番号１０６で示される塩基配列
（１０７）配列番号１０７で示される塩基配列
（１０８）配列番号１０８で示される塩基配列
（１０９）配列番号１０９で示される塩基配列
（１１０）配列番号１１０で示される塩基配列
（１１１）配列番号１１１で示される塩基配列
（１１２）配列番号１１２で示される塩基配列
（１１３）配列番号１１３で示される塩基配列
（１１４）配列番号１１４で示される塩基配列
（１１５）配列番号１１５で示される塩基配列
（１１６）配列番号１１６で示される塩基配列
（１１７）配列番号１１７で示される塩基配列
（１１８）配列番号１１８で示される塩基配列
（１１９）配列番号１１９で示される塩基配列
（１２０）配列番号１２０で示される塩基配列
（１２１）配列番号１２１で示される塩基配列
（１２２）配列番号１２２で示される塩基配列
（１２３）配列番号１２３で示される塩基配列
（１２４）配列番号１２４で示される塩基配列
（１２５）配列番号１２５で示される塩基配列
（１２６）配列番号１２６で示される塩基配列
（１２７）配列番号１２７で示される塩基配列
（１２８）配列番号１２８で示される塩基配列
（１２９）配列番号１２９で示される塩基配列
（１３０）配列番号１３０で示される塩基配列
（１３１）配列番号１３１で示される塩基配列
（１３２）配列番号１３２で示される塩基配列
（１３３）配列番号１３３で示される塩基配列
（１３４）配列番号１３４で示される塩基配列
（１３５）配列番号１３５で示される塩基配列
（１３６）配列番号１３６で示される塩基配列
（１３７）配列番号１３７で示される塩基配列
（１３８）配列番号１３８で示される塩基配列
（１３９）配列番号１３９で示される塩基配列
（１４０）配列番号１４０で示される塩基配列
（１４１）配列番号１４１で示される塩基配列
（１４２）配列番号１４２で示される塩基配列
（１４３）配列番号１４３で示される塩基配列
（１４４）配列番号１４４で示される塩基配列
（１４５）配列番号１４５で示される塩基配列
（１４６）配列番号１４６で示される塩基配列
（１４７）配列番号１４７で示される塩基配列
（１４８）配列番号１４８で示される塩基配列
（１４９）配列番号１４９で示される塩基配列
（１５０）配列番号１５０で示される塩基配列
（１５１）配列番号１５１で示される塩基配列
（１５２）配列番号１５２で示される塩基配列
（１５３）配列番号１５３で示される塩基配列
（１５４）配列番号１５４で示される塩基配列
（１５５）配列番号１５５で示される塩基配列
（１５６）配列番号１５６で示される塩基配列
（１５７）配列番号１５７で示される塩基配列
（１５８）配列番号１５８で示される塩基配列
（１５９）配列番号１５９で示される塩基配列
（１６０）配列番号１６０で示される塩基配列
（１６１）配列番号１６１で示される塩基配列
（１６２）配列番号１６２で示される塩基配列
（１６３）配列番号１６３で示される塩基配列
（１６４）配列番号１６４で示される塩基配列
（１６５）配列番号１６５で示される塩基配列
（１６６）配列番号１６６で示される塩基配列
（１６７）配列番号１６７で示される塩基配列
（１６８）配列番号１６８で示される塩基配列
（１６９）配列番号１６９で示される塩基配列
（１７０）配列番号１７０で示される塩基配列
（１７１）配列番号１７１で示される塩基配列
（１７２）配列番号１７２で示される塩基配列
（１７３）配列番号１７３で示される塩基配列
（１７４）配列番号１７４で示される塩基配列
（１７５）配列番号１７５で示される塩基配列
（１７６）配列番号１７６で示される塩基配列
（１７７）配列番号１７７で示される塩基配列
（１７８）配列番号１７８で示される塩基配列
（１７９）配列番号１７９で示される塩基配列
（１８０）配列番号１８０で示される塩基配列
（１８１）配列番号１８１で示される塩基配列
（１８２）配列番号１８２で示される塩基配列
（１８３）配列番号１８３で示される塩基配列
（１８４）配列番号１８４で示される塩基配列
（１８５）配列番号１８５で示される塩基配列
（１８６）配列番号１８６で示される塩基配列
（１８７）配列番号１８７で示される塩基配列
（１８８）配列番号１８８で示される塩基配列
（１８９）配列番号１８９で示される塩基配列
（１９０）配列番号１９０で示される塩基配列
（１９１）配列番号１９１で示される塩基配列
（１９２）配列番号１９２で示される塩基配列
（１９３）配列番号１９３で示される塩基配列
（１９４）配列番号１９４で示される塩基配列
（１９５）配列番号１９５で示される塩基配列
（１９６）配列番号１９６で示される塩基配列
（１９７）配列番号１９７で示される塩基配列
（１９８）配列番号１９８で示される塩基配列
（１９９）配列番号１９９で示される塩基配列
（２００）配列番号２００で示される塩基配列
（２０１）配列番号２０１で示される塩基配列
（２０２）配列番号２０２で示される塩基配列
（２０３）配列番号２０３で示される塩基配列
（２０４）配列番号２０４で示される塩基配列
（２０５）配列番号２０５で示される塩基配列
（２０６）配列番号２０６で示される塩基配列
（２０７）配列番号２０７で示される塩基配列
（２０８）配列番号２０８で示される塩基配列
（２０９）配列番号２０９で示される塩基配列
（２１０）配列番号２１０で示される塩基配列
（２１１）配列番号２１１で示される塩基配列
（２１２）配列番号２１２で示される塩基配列
（２１３）配列番号２１３で示される塩基配列
（２１４）配列番号２１４で示される塩基配列
（２１５）配列番号２１５で示される塩基配列
（２１６）配列番号２１６で示される塩基配列
（２１７）配列番号２１７で示される塩基配列
（２１８）配列番号２１８で示される塩基配列
（２１９）配列番号２１９で示される塩基配列
（２２０）配列番号２２０で示される塩基配列
（２２１）配列番号２２１で示される塩基配列
（２２２）配列番号２２２で示される塩基配列
（２２３）配列番号２２３で示される塩基配列
（２２４）配列番号２２４で示される塩基配列
（２２５）配列番号２２５で示される塩基配列
（２２６）配列番号２２６で示される塩基配列
（２２７）配列番号２２７で示される塩基配列
（２２８）配列番号２２８で示される塩基配列
（２２９）配列番号２２９で示される塩基配列
（２３０）配列番号２３０で示される塩基配列
[発明９]
遺伝子がHand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子、Hba-x遺伝子、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子またはPax6遺伝子である発明１〜８のいずれか一項に記載の方法。
[発明１０]
発明１〜５に記載の方法であって、遺伝子の発現レベルを、該遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを指標として測定する方法。
[発明１１]
発明９に記載の遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子を含む核酸構築物。
[発明１２]
発明１１に記載の核酸構築物を含むベクター。
[発明１３]
発明１１に記載の核酸構築物又は発明１２に記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
[発明１４]
宿主細胞が動物細胞である発明１３に記載の形質転換体。
[発明１５]
宿主細胞が幹細胞である発明１３に記載の形質転換体。
[発明１６]
宿主細胞が胚性幹細胞である発明１３に記載の形質転換体。
[発明１７]
発明１１に記載の核酸構築物又は発明１２に記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。
[発明１８]
発明１３〜１６に記載の形質転換体の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
[発明１９]
発明１１に記載の核酸構築物又は発明１２に記載のベクターが導入された遺伝子改変非ヒト動物。
[発明２０]
発明１９に記載の遺伝子改変非ヒト動物の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、簡便で汎用性の高い化学物質が有する発生毒性の予測方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群（5-Fluorouracil、hydroxyurea、6- aminonicotinamide）、発生毒性陰性化合物処理群（saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid）について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量定量し、相対発現量を示した図である（実施例３）。
【図２】溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群（5-Fluorouracil、hydroxyurea、6- aminonicotinamide）、発生毒性陰性化合物処理群（saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid）について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量定量し、相対発現量を示した図である（実施例３）。
【図３】溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群（5-bromo-2'-deoxyuridine、 methotrexate、all-trans -retinoic acid）、発生毒性陰性化合物処理群（penicillin G、 sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor）について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量定量し、相対発現量を示した図である（実施例４）。
【図４】溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群（5-bromo-2'-deoxyuridine、 methotrexate、all-trans -retinoic acid）、発生毒性陰性化合物処理群（penicillin G sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor）について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量定量し、相対発現量を示した図である（実施例４）。
【図５】a）リアルタイムPCRを用いた分化誘導後の内在性Hand1遺伝子の経時的な発現変動、およびb）Hand1-ES細胞の分化誘導後の経時的なルシフェラーゼ活性の変動を示した図である。c）リアルタイムPCRを用いた分化誘導後の内在性Smyd1遺伝子の経時的な発現変動、およびd）Smyd1-ES細胞の分化誘導後の経時的なルシフェラーゼ活性の変動を示した図である。（実施例５）
【図６】溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群（5-Fluorouracil、hydroxyurea、methotrexate）、発生毒性陰性化合物処理群（Saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid、penicillin G sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor）について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量を定量し、相対発現量を示した図である（実施例１１）。
【図７】溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群（5-Fluorouracil、hydroxyurea、methotrexate）、発生毒性陰性化合物処理群（Saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid、penicillin G sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor）について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量を定量し、相対発現量を示した図である（実施例１１）。
【図８】溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群（5-Fluorouracil、hydroxyurea、methotrexate）、発生毒性陰性化合物処理群（Saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid、penicillin G sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor）について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量を定量し、相対発現量を示した図である（実施例１１）。
【図９】発生毒性陽性の4化合物（5-fluorouracil、hydroxyurea、dexamethasone、5-bromo-2'-deoxyuridine）について、Hand1-ES細胞および3T3細胞による試験結果を溶媒対照に対する相対値として示した図である（実施例１２）
【図１０】発生毒性陽性の2化合物（ascorbic acid、acrylamide）について、Hand1-ES細胞および3T3細胞による試験結果を溶媒対照に対する相対値として示した図である（実施例１２）
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を説明する。本発明の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本発明において使用される用語は、特に言及しない限り、該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【０００８】
本発明の化学物質が有する発生毒性の予測方法は、
（１）被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、
（２）第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、を有する。
（１）  配列番号１で示される塩基配列
（２）  配列番号２で示される塩基配列
（３）  配列番号３で示される塩基配列
（４）  配列番号４で示される塩基配列
（５）  配列番号５で示される塩基配列
（６）  配列番号６で示される塩基配列
（７）  配列番号７で示される塩基配列
（８）  配列番号８で示される塩基配列
（９）  配列番号９で示される塩基配列
（１０）配列番号１０で示される塩基配列
（１１）配列番号１１で示される塩基配列
（１２）配列番号１２で示される塩基配列
（１３）配列番号１３で示される塩基配列
（１４）配列番号１４で示される塩基配列
（１５）配列番号１５で示される塩基配列
（１６）配列番号１６で示される塩基配列
（１７）配列番号１７で示される塩基配列
（１８）配列番号１８で示される塩基配列
（１９）配列番号１９で示される塩基配列
（２０）配列番号２０で示される塩基配列
（２１）配列番号２１で示される塩基配列
（２２）配列番号２２で示される塩基配列
（２３）配列番号２３で示される塩基配列
（２４）配列番号２４で示される塩基配列
（２５）配列番号２５で示される塩基配列
（２６）配列番号２６で示される塩基配列
（２７）配列番号２７で示される塩基配列
（２８）配列番号２８で示される塩基配列
（２９）配列番号２９で示される塩基配列
（３０）配列番号３０で示される塩基配列
（３１）配列番号３１で示される塩基配列
（３２）配列番号３２で示される塩基配列
（３３）配列番号３３で示される塩基配列
（３４）配列番号３４で示される塩基配列
（３５）配列番号３５で示される塩基配列
（３６）配列番号３６で示される塩基配列
（３７）配列番号３７で示される塩基配列
（３８）配列番号３８で示される塩基配列
（３９）配列番号３９で示される塩基配列
（４０）配列番号４０で示される塩基配列
（４１）配列番号４１で示される塩基配列
（４２）配列番号４２で示される塩基配列
（４３）配列番号４３で示される塩基配列
（４４）配列番号４４で示される塩基配列
（４５）配列番号４５で示される塩基配列
（４６）配列番号４６で示される塩基配列
（４７）配列番号４７で示される塩基配列
（４８）配列番号４８で示される塩基配列
（４９）配列番号４９で示される塩基配列
（５０）配列番号５０で示される塩基配列
（５１）配列番号５１で示される塩基配列
（５２）配列番号５２で示される塩基配列
（５３）配列番号５３で示される塩基配列
（５４）配列番号５４で示される塩基配列
（５５）配列番号５５で示される塩基配列
（５６）配列番号５６で示される塩基配列
（５７）配列番号５７で示される塩基配列
（５８）配列番号５８で示される塩基配列
（５９）配列番号５９で示される塩基配列
（６０）配列番号６０で示される塩基配列
（６１）配列番号６１で示される塩基配列
（６２）配列番号６２で示される塩基配列
（６３）配列番号６３で示される塩基配列
（６４）配列番号６４で示される塩基配列
（６５）配列番号６５で示される塩基配列
（６６）配列番号６６で示される塩基配列
（６７）配列番号６７で示される塩基配列
（６８）配列番号６８で示される塩基配列
（６９）配列番号６９で示される塩基配列
（７０）配列番号７０で示される塩基配列
（７１）配列番号７１で示される塩基配列
（７２）配列番号７２で示される塩基配列
（７３）配列番号７３で示される塩基配列
（７４）配列番号７４で示される塩基配列
（７５）配列番号７５で示される塩基配列
（７６）配列番号７６で示される塩基配列
（７７）配列番号７７で示される塩基配列
（７８）配列番号７８で示される塩基配列
（１０１）配列番号１０１で示される塩基配列
（１０２）配列番号１０２で示される塩基配列
（１０３）配列番号１０３で示される塩基配列
（１０４）配列番号１０４で示される塩基配列
（１０５）配列番号１０５で示される塩基配列
（１０６）配列番号１０６で示される塩基配列
（１０７）配列番号１０７で示される塩基配列
（１０８）配列番号１０８で示される塩基配列
（１０９）配列番号１０９で示される塩基配列
（１１０）配列番号１１０で示される塩基配列
（１１１）配列番号１１１で示される塩基配列
（１１２）配列番号１１２で示される塩基配列
（１１３）配列番号１１３で示される塩基配列
（１１４）配列番号１１４で示される塩基配列
（１１５）配列番号１１５で示される塩基配列
（１１６）配列番号１１６で示される塩基配列
（１１７）配列番号１１７で示される塩基配列
（１１８）配列番号１１８で示される塩基配列
（１１９）配列番号１１９で示される塩基配列
（１２０）配列番号１２０で示される塩基配列
（１２１）配列番号１２１で示される塩基配列
（１２２）配列番号１２２で示される塩基配列
（１２３）配列番号１２３で示される塩基配列
（１２４）配列番号１２４で示される塩基配列
（１２５）配列番号１２５で示される塩基配列
（１２６）配列番号１２６で示される塩基配列
（１２７）配列番号１２７で示される塩基配列
（１２８）配列番号１２８で示される塩基配列
（１２９）配列番号１２９で示される塩基配列
（１３０）配列番号１３０で示される塩基配列
（１３１）配列番号１３１で示される塩基配列
（１３２）配列番号１３２で示される塩基配列
（１３３）配列番号１３３で示される塩基配列
（１３４）配列番号１３４で示される塩基配列
（１３５）配列番号１３５で示される塩基配列
（１３６）配列番号１３６で示される塩基配列
（１３７）配列番号１３７で示される塩基配列
（１３８）配列番号１３８で示される塩基配列
（１３９）配列番号１３９で示される塩基配列
（１４０）配列番号１４０で示される塩基配列
（１４１）配列番号１４１で示される塩基配列
（１４２）配列番号１４２で示される塩基配列
（１４３）配列番号１４３で示される塩基配列
（１４４）配列番号１４４で示される塩基配列
（１４５）配列番号１４５で示される塩基配列
（１４６）配列番号１４６で示される塩基配列
（１４７）配列番号１４７で示される塩基配列
（１４８）配列番号１４８で示される塩基配列
（１４９）配列番号１４９で示される塩基配列
（１５０）配列番号１５０で示される塩基配列
（１５１）配列番号１５１で示される塩基配列
（１５２）配列番号１５２で示される塩基配列
（１５３）配列番号１５３で示される塩基配列
（１５４）配列番号１５４で示される塩基配列
（１５５）配列番号１５５で示される塩基配列
（１５６）配列番号１５６で示される塩基配列
（１５７）配列番号１５７で示される塩基配列
（１５８）配列番号１５８で示される塩基配列
（１５９）配列番号１５９で示される塩基配列
（１６０）配列番号１６０で示される塩基配列
（１６１）配列番号１６１で示される塩基配列
（１６２）配列番号１６２で示される塩基配列
（１６３）配列番号１６３で示される塩基配列
（１６４）配列番号１６４で示される塩基配列
（１６５）配列番号１６５で示される塩基配列
（１６６）配列番号１６６で示される塩基配列
（１６７）配列番号１６７で示される塩基配列
（１６８）配列番号１６８で示される塩基配列
（１６９）配列番号１６９で示される塩基配列
（１７０）配列番号１７０で示される塩基配列
（１７１）配列番号１７１で示される塩基配列
（１７２）配列番号１７２で示される塩基配列
（１７３）配列番号１７３で示される塩基配列
（１７４）配列番号１７４で示される塩基配列
（１７５）配列番号１７５で示される塩基配列
（１７６）配列番号１７６で示される塩基配列
（１７７）配列番号１７７で示される塩基配列
（１７８）配列番号１７８で示される塩基配列
（１７９）配列番号１７９で示される塩基配列
（１８０）配列番号１８０で示される塩基配列
（１８１）配列番号１８１で示される塩基配列
（１８２）配列番号１８２で示される塩基配列
（１８３）配列番号１８３で示される塩基配列
（１８４）配列番号１８４で示される塩基配列
（１８５）配列番号１８５で示される塩基配列
（１８６）配列番号１８６で示される塩基配列
（１８７）配列番号１８７で示される塩基配列
（１８８）配列番号１８８で示される塩基配列
（１８９）配列番号１８９で示される塩基配列
（１９０）配列番号１９０で示される塩基配列
（１９１）配列番号１９１で示される塩基配列
（１９２）配列番号１９２で示される塩基配列
（１９３）配列番号１９３で示される塩基配列
（１９４）配列番号１９４で示される塩基配列
（１９５）配列番号１９５で示される塩基配列
（１９６）配列番号１９６で示される塩基配列
（１９７）配列番号１９７で示される塩基配列
（１９８）配列番号１９８で示される塩基配列
（１９９）配列番号１９９で示される塩基配列
（２００）配列番号２００で示される塩基配列
（２０１）配列番号２０１で示される塩基配列
（２０２）配列番号２０２で示される塩基配列
（２０３）配列番号２０３で示される塩基配列
（２０４）配列番号２０４で示される塩基配列
（２０５）配列番号２０５で示される塩基配列
（２０６）配列番号２０６で示される塩基配列
（２０７）配列番号２０７で示される塩基配列
（２０８）配列番号２０８で示される塩基配列
（２０９）配列番号２０９で示される塩基配列
（２１０）配列番号２１０で示される塩基配列
（２１１）配列番号２１１で示される塩基配列
（２１２）配列番号２１２で示される塩基配列
（２１３）配列番号２１３で示される塩基配列
（２１４）配列番号２１４で示される塩基配列
（２１５）配列番号２１５で示される塩基配列
（２１６）配列番号２１６で示される塩基配列
（２１７）配列番号２１７で示される塩基配列
（２１８）配列番号２１８で示される塩基配列
（２１９）配列番号２１９で示される塩基配列
（２２０）配列番号２２０で示される塩基配列
（２２１）配列番号２２１で示される塩基配列
（２２２）配列番号２２２で示される塩基配列
（２２３）配列番号２２３で示される塩基配列
（２２４）配列番号２２４で示される塩基配列
（２２５）配列番号２２５で示される塩基配列
（２２６）配列番号２２６で示される塩基配列
（２２７）配列番号２２７で示される塩基配列
（２２８）配列番号２２８で示される塩基配列
（２２９）配列番号２２９で示される塩基配列
（２３０）配列番号２３０で示される塩基配列
【０００９】
本発明において「化学物質」とは、動物試験データ及びヒトでの疫学的データにより、発生毒性の有無が報告された化学物質や発生毒性が未知の化学物質を指す。発生毒性が知られている化学物質としては具体的に、5-Fluorouracil、hydroxyurea、6-aminonicotinamide、5-bromo-2'-deoxyuridine、methotrexate、all-trans -retinoic acid、phenytonin、varpoic acid、phenobarbital Na、thalidomide、ribavirin、cyclophosphamide、leflunomide、warfarin、sulfadimetcin、6-mercaptopurine、aspirin、acetazolamide、cyclizine HCl、estrogene、testosterone、lead acetate、arsenic、retinol、toluene、aminopterine、azathiopurine、captafol、methadone、acutane等が知られており、米国NTP（National Toxicology Program）の公表するNTP abstractに記載されている。本発明においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【００１０】
本発明において「発生毒性」とは、受精、受胎に係る胎児の発達(発生)に対する悪影響及び異常を引き起こす有害作用の総称であり、胎児に奇形を引き起こす催奇形性又は催奇性も含む。発生毒性により引き起こされる悪影響や異常として具体的には、発育遅滞や機能・知能の障害等の肉眼形態的又は機能的な異常を示す先天異常、胎生期の胎児の死亡が挙げられるがそれらに限定されない。
【００１１】
本発明において「非ヒト哺乳動物」としては、毒性試験、薬理試験等に使用される哺乳動物種が挙げられる。例えば、ラット、マウス、サル、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモット等の哺乳類が知られているがそれらに限定されない。
本発明において「哺乳動物細胞」としては、例えば、ヒト、ラット、マウス、サル、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモット等の哺乳類動物の細胞が挙げられる。
【００１２】
本発明において「検体」としては、幹細胞、胚性幹細胞、心臓組織細胞、脳組織細胞、神経組織細胞、筋組織細胞、骨格組織細胞、妊娠非ヒト動物個体又は非ヒト胎児動物個体等が挙げられる。
【００１３】
本発明において「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞のことであり、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。ここで幹細胞は、胚性幹細胞又は組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞ともいう）、又は人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell細胞）であり得るがそれらに限定されない。
【００１４】
本発明において「胚性幹細胞（ES細胞）」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性「pluripotency」）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。人工多能性幹細胞は繊維芽細胞等分化した細胞をOct3/4、sox2、klf4、myc等数種類の遺伝子の発現により直接初期化して多分化能を誘導した細胞であり、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Takahashi K, Yamanaka S.Cell. 2006, 126(4), p663-676）。2007年、ヒト繊維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する（Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell.2007, 131(5),p861-872. 、 Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA.,Science. 2007, 318 (5858), p1917-1920. 、Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106）。本発明において使用される場合は、幹細胞は好ましくは胚性幹細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞又は人工多能性幹細胞も使用され得る。
【００１５】
本発明において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（例えば、「プロモーター」）という。本発明では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」又は「核酸」を指すことがある。本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。
【００１６】
本発明において「遺伝子の発現」は、遺伝子に応じて発現されたポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び核酸ならびに／又はタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドの発現を包含する。本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。
【００１７】
本発明において「遺伝子の発現レベルを測定」する方法としては、目的の細胞等において例えば、遺伝子の転写産物量や翻訳産物量を測定する方法等が挙げられる。遺伝子の転写産物量を測定する方法としては、例えばｍＲＮＡの発現量を測定する方法をあげることができ、具体的にはノーザンブロット法、ドットブロット法、PCR法、リアルタイムPCR法等の分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法が挙げられる。遺伝子の翻訳産物量を測定する方法としては該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現量を測定する方法をあげることができ、具体的にはELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等の免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法が挙げられる。また、遺伝子の発現変動とは、通常の分子生物学的測定方法又は免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価されるｍＲＮＡレベル又はポリペプチドレベルでの発現量が増加或いは減少することを意味する。
遺伝子の発現レベルは、該遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを指標として測定することもできる。
【００１８】
分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法又はＰＣＲ法等が例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、ELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫染色法等が例示される。またさらに免疫染色の検出法として文献(A. Seiler, A. Visan, R. Buesen, E. Genschow, H. Spielmann, Reproductive Toxicology 18, p231-240 (2004)) に例示されるフトーサイトメトリーまたはFACS（fluorescence activated cell sorting）を用いた解析方法によっても行われ得る。また、アレイ（例えば、DNAアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。DNAアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat Genet. ２００２ Dec；３２ Suppl：５２６−３２に詳述されている。上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two-hybridシステム、インビトロ翻訳等が挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法 ・ 中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）等に記載されており、本発明においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【００１９】
本発明の予測方法の第一工程において、前記化学物質に接触した前記非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における配列番号１〜７８および１０１〜２３０に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子（以下、一括して本遺伝子ということがある。）から選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを前記の手法により測定する。
【００２０】
配列番号１〜７８および１０１〜２３０に示される塩基配列は、Hand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子、Hba-x遺伝子、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子またはPax6遺伝子の塩基配列であり、マウス、ヒト、サル、ラット、イヌ等の様々な動物種の該遺伝子の配列である。配列番号１〜７８および１０１〜２３０に示される塩基配列はNCBI（National Center for Biotechnology Information）に登録されている塩基配列であり、これらは、NCBIのWEBペ−ジ（URL；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から、遺伝子名や部分配列をもとにデータベースを検索することによって入手することができる。
【００２１】
配列番号１〜５に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのhand1遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号６〜１４に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒトのアイソフォーム１およびアイソフォーム２、チンパンジーの4種、イヌ、及びラットのADAM19遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１５〜１８に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、イヌ、及びラットのCmya1遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１９〜３５に示される塩基配列は、それぞれマウスのアイソフォームｃ、a、b、ヒトのアイソフォームc、b、及びa、チンパンジーの6種、イヌの３種、並びにラットのアイソフォーム1および２のPitx2遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号３６〜４０に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、イヌの2種、及びラットのSmyd1遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号４１〜４４に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、及びイヌのPim2遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号４５〜５０に示される塩基配列は、それぞれマウスのアイソフォームb及びa、チンパンジー、イヌの３種のTbx20遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号５１〜５６に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒトの2種、チンパンジー、イヌの2種のMyl4遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号５７〜６０に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、及びラットのMyl7遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号６１〜６５に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのHbb-bh1遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号６６〜７０に示される塩基配列は後述するHba-a1遺伝子をコードするものであり、マウス、ヒトのアイソフォームα2及びα1、並びにラットのアイソフォームα1及びα2のHba-a1遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号７１〜７５に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのCol1a2遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号７６〜７８に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、及びチンパンジーのHba-x遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１０１〜１０６に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのbasp1遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１０７〜１１０に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ及びマウスのCpe遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１１１〜１１９に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォームb、アイソフォームa、及びアイソフォームc、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウスのアイソフォーム１及びアイソフォーム２、並びにラットのDdr1遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１２０〜１２５に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのMarcks遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１２６〜１３１に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのNdn遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１３２〜１３９に示される塩基配列は、ヒトのアイソフォームa及びアイソフォームb、チンパンジー、イヌ、マウスのアイソフォームa及びアイソフォームb、並びにラットのアイソフォームa及びアイソフォームbのNnat遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１４０〜１４５に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのPtbp2遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１４６〜１５１に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのSfrp2遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１５２〜１５５に示される塩基配列は、それぞれヒト、ウシ、マウス、及びラットのSox11遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１５６〜１６２に示される塩基配列は、それぞれヒトの２種、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのTtc3遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１６３〜１６７に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのTubb2b遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１６８〜１７３に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、及びラットのUbqln2遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１７４〜１７９に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのVim遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１８０〜１８４に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、ウシ、マウス、及びラットのSix3遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１８５〜１８８に示される塩基配列は、それぞれヒト、イヌ、マウス、及びラットのArx遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１８９〜１９９に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォームa、アイソフォームc、アイソフォームb及びアイソフォームc、チンパンジー、イヌ、マウスのアイソフォームaの２種、アイソフォームb及びアイソフォームc、並びにラットのDcx遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号２００〜２０６に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォーム１及びアイソフォーム２、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、並びにラットのL1cam遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号２０７〜２１２に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットEmx2遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号２１３〜２１８に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのWnt1遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号２１９〜２２５に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォームa及びアイソフォームb、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、並びにラットのReln遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号２２６〜２３０に示される塩基配列は、マウス、ヒトのアイソフォームaの２種及びアイソフォームb、並びにラットのPax6遺伝子の完全長ｍＲＮＡをコードする塩基配列である。
配列番号１〜７８および１０１〜２３０に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子のオーソログな遺伝子としては、該塩基配列に生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。
【００２２】
本発明の予測方法の第二工程において、第一工程で得られた検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を本遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する。
【００２３】
「遺伝子の発現レベルの対照値」としては、例えば被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を挙げることができる。かかる対照値は、被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における該遺伝子の発現レベルと併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。例えば、被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、本遺伝子の発現レベルの測定値が対照値と有意に異なれば、該化学物質は発生毒性を有すると評価することができる。
具体的に例えば、被験化学物質が発生毒性を有する場合、該化学物質に接触していないES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号１〜７８に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該化学物質に接触したES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号１〜７８に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該化学物質に発生毒性があると評価することができる。また、被験化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触したES細胞および接触していないES細胞の心筋分化過程における配列番号１〜７８に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50％分化抑制濃度（ID50）を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。
また例えば、被験化学物質が発生毒性を有する場合、該化学物質に接触していないES細胞由来の神経分化細胞における配列番号１０１〜２３０に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該化学物質に接触したES細胞由来の神経分化細胞における配列番号１０１〜２３０に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該化学物質に発生毒性があると評価することができる。また、化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触および接触していないES細胞の神経分化過程における配列番号１０１〜２３０に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50％分化抑制濃度（ID50）を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価することができる。
【００２４】
本発明の方法により評価された前記化学物質が有する発生毒性のレベルに基づいて、発生毒性を有する化学物質を選抜することが可能となり、換言すると発生毒性を有する化学物質を探索することが可能となる。具体的に例えば、特定の化学物質に接触していないES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号１〜７８に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該特定の化学物質に接触したES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号１〜７８に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該特定の化学物質が発生毒性を有する化学物質であることが分かる。また、化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触および接触していないES細胞の心筋分化過程における配列番号１〜７８に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50％分化抑制濃度（ID50）を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有する化学物質であることが分かる。
また例えば、特定の化学物質に接触していないES細胞由来の神経分化細胞における配列番号１０１〜２３０に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該特定の化学物質に接触したES細胞由来の神経分化細胞における配列番号１０１〜２３０に示される塩基配列を有する遺伝子又オ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該特定の化学物質が発生毒性を有する化学物質であることが分かる。また、化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触および接触していないES細胞の神経分化過程における配列番号１０１〜２３０に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50％分化抑制濃度（ID50）を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有する化学物質であることが分かる。
【００２５】
また、前記配列番号１〜７８および１０１〜２３０に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子は、化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子として使用することが可能である。
【００２６】
本発明において「心臓組織細胞」とは心臓を形成する組織細胞を指し、心筋細胞、弁、血管、心室及び心房を含む組織又は細胞である。機能的に、律動的な収縮によって血液の循環を行うポンプの役目を担う組織細胞を指す。心臓の構造は、収縮することで心臓外に血液を拍出する心室、心室の上流にあって心室に入る前の血液を貯留し心室へ血液を送り込む心房、血管及び血液の逆流を防ぐ弁から構成される。心筋は、不随意に律動的な収縮を行う心筋細胞から構成され、幹細胞から分化誘導することも可能である。分化心筋を特定する方法としては、心筋ミオシン軽鎖Myh6遺伝子、心房性ナトリウム利尿ペプチドANP遺伝子等の発現で確認できるが、それらに限定されない。
【００２７】
本発明において「脳・神経組織」とは情報の統合のため体正中部に集合して存在する中枢神経系と、中枢外に存在し、個別に線維として認識される末梢神経系を含む神経系組織細胞を指す。神経系組織細胞は神経細胞 (別名：ニューロン)、神経膠細胞（別名：グリア細胞）から構成される。神経細胞の基本的な機能は、神経細胞へ入力刺激が入ってきた場合に、活動電位を発生させ、他の細胞に情報を伝達することである。一つの神経細胞に複数の細胞から入力したり、活動電位がおきる閾値を変化させることにより、情報の修飾が行われる。また、神経膠細胞（アストロサイト及びオリゴデンドロサイト）は、神経系の維持に関与する細胞群である。神経細胞、グリア細胞は、幹細胞から分化誘導することも可能である。分化神経を特定する方法としては、MAP2遺伝子、GFAP遺伝子等の神経系細胞特異的に発現する遺伝子の発現で確認できるが、それらに限定されない。
【００２８】
本発明において「筋・骨格組織」とは、横紋筋、平滑筋、腱等の骨格を構成／形成する筋と、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞等の骨を構成／形成する細胞を含む。筋・骨格組織は、幹細胞から分化誘導することも可能である。分化した筋・骨格組織の細胞を特定する方法としては、骨芽細胞ではRunx2遺伝子やosteoproteogerin遺伝子、筋肉ではMyoD遺伝子等の遺伝子発現で確認できるが、それらに限定されない。
【００２９】
本発明において、「分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的及び／又は機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生等はっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を、ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内或いは細胞外の因子又は条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
【００３０】
本発明において「特定の組織細胞」とは、機能及び形態が特殊化した細胞をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、又はほとんどない。特定の組織細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等が挙げられる。
【００３１】
「Hand1」遺伝子とは「heart and neural crest derivatives expressed transcript 1」遺伝子であり、Hand1以外にもHxt、Th1、eHAND、Ehand1、Thing1として記載される場合もある。National center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースにおいて、例えばマウスHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_008213.2として、また該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_032239.1として掲載されている。ヒトHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_004821.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_004812.1として掲載されている。チンパンジーHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_518050.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_518050.2として掲載されている。イヌHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_546282.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_546282.2として掲載されている。ラットHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号 NM_021592.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_067603.1として掲載されている。上記Hand1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１〜５に示されている。
【００３２】
「ADAM19」遺伝子とは、「a disintegrin and metallopeptidase domain 19」遺伝子又は「meltrin beta」遺伝子であり、M[b]、Mltnb、AL024287として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_009616.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_033746.1として掲載されている。ヒトADAM19遺伝子のアイソフォーム１のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_023038.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_075525.2として掲載されており、アイソフォーム２のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_033274.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_150377.1として掲載されている。チンパンジーADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001137770.1、XM_001137856.1、XM_001137686.1、及びXM_001137600.1として、前記塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_001137770.1、XP_001137856.1、XP_001137686.1、及びXP_001137600.1として掲載されている。イヌADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_546274.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_546274.2として掲載されている。ラットADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001069002.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001069002.1として掲載されている。上記ADAM19遺伝子の塩基配列は本願の配列番号６〜１４に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_414565.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号XP_414565.2として掲載されている。ゼブラフィシュADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_688620.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_693712.2として掲載されている。
【００３３】
「Cmya1」遺伝子とは、「xin actin-binding repeat containing 1」遺伝子であり、Xirp1、Xin、mXin、AI415219、MGC144145、MGC144146として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスcmya1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001081339.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001074808.1として掲載されている。ヒトcmya1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_194293.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_919269.2として掲載されている。イヌcmya1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_846492.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_851585.1として掲載されている。ラットcmya1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_236702.4又はXM_001077697.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_236702.4又はXP_001077697.1として掲載されている。上記cmya1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１５〜１８に示されている。
【００３４】
「Pitx2」遺伝子とは、「paired-like homeodomain transcription factor 2」遺伝子であり、Brx1、Ptx2、Rieg、Brx1a、Brx1b、Otlx2、Munc30、Pitx2a、Pitx2b、Pitx2c、solurshin、9430085M16Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスpitx2遺伝子のアイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001042502.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001035967.1として記載されており、アイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001042504.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001035969.1として記載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_011098.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_035228.2として記載されている。ヒトpitx2遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_153427.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_700476.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_153426.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_700475.1として掲載されており、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000325.5として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000316.2として掲載されている。チンパンジーpitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001141151.1、XM_517398.2、XM_001141078.1、XM_001141403.1、XM_001141320.1、及びXM_001141234.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_001141151.1、XP_517398.2、XP_001141078.1、XP_001141403.1、XP_001141320.1、及びXP_001141234.1として掲載されている。イヌpitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_858568.1、XM_545025.2、及びXM_846277.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_863661.1、XP_545025.2、及びXP_851370.1として掲載されている。ラットpitx2遺伝子のアイソフォーム１のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001042505.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番NP_001035970.1として掲載されており、アイソフォーム２のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_019334.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_062207.1として掲載されている。上記pitx2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１９〜３５に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリpitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_205010.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_990341.1として掲載されている。ゼブラフィッシュpitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_130975.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_571050.1として掲載されている。ショウジョウバエpitx2遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_170531.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_733410.2として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_176593.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_788770.1として掲載されおり、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_206591.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_996314.1として掲載されて��る。線虫pitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001042502.1又はNM_001026106.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_001021276.1又はNP_001021277.1として掲載されている。
【００３５】
「Smyd1」遺伝子とは、正式名称は「SET and MYND domain containing 1」遺伝子であり、Bop、C78565、Zmynd18、4632404M21Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_009762.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_033892.1として掲載されている。ヒトsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_198274.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_938015.1として掲載されている。イヌsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_532967.2及びXM_847011.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_532967.1及びXP_852104.1として掲載されている。ラットsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001106595.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001100065.1として掲載されている。上記smyd1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号３６〜４０に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ラットsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_216172.4及びXM_001062526.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列がそれぞれ登録番号XP_216172.4及びXP_001062526.1として掲載されている。ニワトリsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_204155.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_989486.1として掲載されている。ゼブラフィッシュsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001039636.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001034725.1として掲載されている。
【００３６】
「Pim2」遺伝子とは「proviral integration site 2」遺伝子であり、Pim-2、DXCch3として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_138606.2として掲載されており、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_613072.1として掲載されている。ヒトpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_006875.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_006866.2として掲載されている。チンパンジーpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_528972.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_528972.2として掲載されている。イヌpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_548990.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_548990.2として掲載されている。上記pim2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号４１〜４４に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ゼブラフィッシュpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号 NM_131539.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_571614.1として掲載されている。
【００３７】
「Tbx20」遺伝子とは、「T-box 20」遺伝子であり、Tbx12、AL022859、9430010M06Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスtbx20遺伝子アイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_194263.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_919239.1として掲載されており、マウスのtbx20遺伝子アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_020496.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_065242.1として掲載されている。チンパンジーtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_522453.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_522453.2として掲載されている。イヌtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_539513.2、XM_860427.1及びXM_860408.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_539513.2、XP_865520.1及びXP_865501.1として掲載されている。上記tbx20遺伝子の塩基配列は本願の配列番号４５〜５０に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_204144.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_989475.1として掲載されている。ゼブラフィッシュtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_131506.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_571581.1として掲載されている。また、ショウジョウバエtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_135083.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_608927.2として掲載されている。線虫tbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_061349.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_493750.1として掲載されている。
【００３８】
「Myl4」遺伝子とは「myosin, light polypeptide 4」遺伝子であり、ELC、GT1、ALC1、AMLC、Myla、ELC1a、MLC1aとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスMyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_010858.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_034988.2として掲載されている。ヒトmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001002841.1及びNM_002476.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_001002841.1及びNP_002467.1として掲載されている。チンパンジーmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_511623.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_511623.1として掲載されている。イヌmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_537609.2及びXM_854741.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_537609.1及びXP_859834.1として掲載されている。上記my14遺伝子の塩基配列は本願の配列番号５１〜５６に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_205479.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_990810.1として掲載されている。ゼブラフィッシュmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_131692.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_571767.1として掲載されている。
【００３９】
「Myl7」遺伝子とは「myosin, light polypeptide 7, regulatory」遺伝子であり、MLC2a、MYL2A、RLC-A、Mylc2a、MLC-2alpha として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_022879.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_075017.2として掲載されている。ヒトmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_021223.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_067046.1として掲載されている。チンパンジーmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_519549.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_519549.2として掲載されている。ラットmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001106017.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001099487.1として掲載されている。上記my17遺伝子の塩基配列は本願の配列番号５７〜６０に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ラットmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_214074.4及びXM_001069249.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列がそれぞれ登録番号XP_214074.4及びXP_001069249.1として掲載されている。ゼブラフィッシュmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列番号NM_131329.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_571404.1として掲載されている。
【００４０】
「Hbb-bh1」遺伝子とは、「hemoglobin Z, beta-like embryonic chain」遺伝子であり、betaH1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_008219.3として、アミノ酸配列番号NP_032245.1として掲載されている。ヒトHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000559.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000550.2として掲載されている。チンパンジーHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001161821.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001161821.1として掲載されている。イヌHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_542373.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_542373.2として掲載されている。ラットHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_172093.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_742090.1として掲載されている。上記Hbb-bh1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号６１〜６５に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、チンパンジーHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録NM_001071779.1、XM_001161863.1、XM_001161978.1、XM_001161706.1、XM_001162021.1、XM_001161903.1、XM_001161943.1、XM_001161662.1、XM_001162055.1、XM_508243.2、及びXM_001161615.1として掲載されており、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_001065247.1、XP_001161863.1、XP_001161978.1、XP_001161706.1、XP_001162021.1、XP_001161903.1、XP_001161943.1、XP_001161662.1、XP_001162055.1、XP_508243.1、及びXP_001161615.1として掲載されている。ニワトリHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001031489.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001026660.1として掲載されている。ゼブラフィッシュHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001015058.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001015058.1として掲載されている。
【００４１】
「Hba-a1」遺伝子とは「hemoglobin alpha, adult chain 1」遺伝子であり、Hba1 として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスHba-a1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_008218.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_032244.2として掲載されている。ヒトHba-a1遺伝子のアイソフォームα1のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000558.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000549.1として掲載されており、アイソフォームα2のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000517.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000508.1として掲載されている。ラットHba-a1遺伝子のアイソフォームα1のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013096.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_037228.1として掲載されており、アイソフォームα2のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001007722.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001007723.1として掲載されている。上記Hba-a1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号６６〜７０に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリHba-a1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001004376.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001004376.1として掲載されている。
【００４２】
「Col1a2」遺伝子とは「procollagen, type I, alpha 2」遺伝子であり、oim、Cola2、Cola-2、Col1a-2、AA960264、AI325291 として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_007743.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_031769.2として掲載されている。ヒトCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000089.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000080.2として掲載されている。チンパンジーCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_519207.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001168704.1として掲載されている。イヌCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001003187.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001003187.1として掲載されている。ラットCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_053356.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号 NP_445808.1として掲載されている。上記Colla2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号７１〜７５に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_001234350.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号XP_001234351.1として掲載されている。ゼブラフィッシュCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_182968.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_892013.2として掲載されている。
【００４３】
「Hba-x」遺伝子とは、「hemoglobin X, alpha-like embryonic chain in Hba complex」遺伝子であり、AI450015として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスHba-x遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_010405.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_034535.1として掲載されている。ヒトHba-x遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_005332.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_005323.1として掲載されている。チンパンジーHba-x遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001151282.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録XP_001151282.1として掲載されている。上記Hba-x遺伝子の塩基配列は本願の配列番号７６〜７８に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリHba-x遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001004374.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録NP_001004374.1として掲載されている。
【００４４】
「basp1」遺伝子とは「brain abundant, membrane attached signal」遺伝子であり、2610024P12Rik、CAP-23、CAP23、Ckap3、NAP-22、NAP22として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトbasp1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_006317.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_006308.3として掲載されている。チンパンジーbasp1遺伝子のmRNAは登録配列番号XM_001175409.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001175409.1として掲載されている。イヌbasp1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_863690.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_868783.1として掲載されている。ウシbasp1遺伝子のmRNAは登録配列番号NM_174780.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_777205.1として掲載されている。マウスbasp1遺伝子のmRNA配列は登録番号NM_027395.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_081671.1として掲載されている。ラットbasp1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_022300.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_071636.1として掲載されている。上記basp1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１０１〜１０６に示されている。
【００４５】
「cpe」遺伝子とは「carboxypeptidase E」遺伝子であり、CPH、Cph-1、Cph1、MGC7101、R74677、Fatとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトcpe遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001873.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001864.1として掲載されている。チンパンジーcpe遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001098559.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001092029.1として掲載されている。イヌcpe遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_532715.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_532715.2として掲載されている。マウスcpe遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013494.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_038522.2として掲載されている。上記cpe遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１０７〜１１０に示されている。
【００４６】
「ddr1」遺伝子とは「discoidin domain receptor family, member 1」遺伝子であり、6030432F18、AI323681、CD167a、Cak、Nep、PTK3Aとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトddr1遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_013993.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_054699.2として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001954.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001945.3として掲載されており、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_013994.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_054700.2として掲載されている。チンパンジーddr1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001045502.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001038967.1として掲載されている。イヌddr1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_532062.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_532062.2として掲載されている。ウシddr1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001076012.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001069480.2として掲載されている。マウスddr1遺伝子のアイソフォーム１のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_007584.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_031610.1として掲載されており、アイソフォーム２のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_172962.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_766550.1として掲載されている。ラットddr1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013137.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_037269.1として掲載されている。上記ddr1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１１１〜１１９に示されている。
【００４７】
「marcks」遺伝子とは「myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate」遺伝子であり、Macs、PKCSLとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_002356.5として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_002347.5として掲載されている。チンパンジーmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001159872.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001159872.1として掲載されている。イヌmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_850164.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_855257.1として掲載されている。ウシmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001076276.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001069744.1として掲載されている。マウスmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_008538.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_032564.1として掲載されている。ラットmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001060954.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001060954.1として掲載されている。上記marcks遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１２０〜１２５に示されている。
【００４８】
「ndn」遺伝子とは「necdin」遺伝子であり、AI528698、Peg6として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_002487.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_002478.1として掲載されている。チンパンジーndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_510257.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_510257.2として掲載されている。イヌndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_545810.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_545810.1として掲載されている。ウシndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001014982.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001014982.1として掲載されている。マウスndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_010882.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035012.2として掲載されている。ラットndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001008558.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001008558.1として掲載されている。上記ndn遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１２６〜１３１に示されている。
【００４９】
「nnat」遺伝子とは「neuronatin」遺伝子であり、5730414I02Rik、AW107673、Peg5、RP23-169M4.6として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトnnat遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_005386.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_005377.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_181689.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_859017.1として掲載されている。チンパンジーnnat遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001141473.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001141473.1として掲載されている。イヌnnat遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_847444.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_852537.1として掲載されている。マウスnnat遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_010923.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035053.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_180960.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_851291.1として掲載されている。ラットnnat遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_053601.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_446053.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_181687.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_859015.1として掲載されている。上記nnat遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１３２〜１３９に示されている。
【００５０】
「ptbp2」遺伝子とは「polypyrimidine tract binding protein 2」遺伝子であり、Ptb2、brPTB、nPTBとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_021190.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_067013.1として掲載されている。チンパンジーptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001157727.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001157727.1として掲載されている。イヌptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_861727.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_866820.1として掲載されている。ウシptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001110081.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001103551.1として掲載されている。マウスptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_019550.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_062423.1として掲載されている。ラットptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001005555.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001005555.1として掲載されている。上記ptbp2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１４０〜１４５に示されている。
【００５１】
「sfrp2」遺伝子とは「secreted frizzled-related protein 2」遺伝子であり、AI851596、Sdf5として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_003013.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_003004.1として掲載されている。チンパンジーsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001155803.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸は登録配列番号XP_001155803.1として掲載されている。イヌsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001002987.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001002987.1として掲載されている。ウシsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001034393.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001029565.1として掲載されている。マウスsfrp遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_009144.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_033170.1として掲載されている。ラットsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001100700.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001094170.1として掲載されている。上記sfrp2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１４６〜１５１に示されている。
【００５２】
「sox11」遺伝子とは「SRY-box 11」遺伝子であり、1110038H03Rik、6230403H02Rik、AI836553、end1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトsox11遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_003108.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_003099.1として掲載されている。ウシsox11遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001250191.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号XP_001250192.1として掲載されている。マウスsox11遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_009234.5として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_033260.4として掲載されている。ラットsox11遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_053349.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_445801.1として掲載されている。上記sox11遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１５２〜１５５に示されている。
【００５３】
「ttc3」遺伝子とは「tetratricopeptide repeat domain 3」遺伝子であり、2610202A04Rik、AA409221、D16Ium21、D16Ium21e、KIAA4119、TPRD、mKIAA4119として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001001894.1及びNM_003316.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列がそれぞれ登録番号NP_001001894.1及びNP_003307.3として掲載されている。チンパンジーttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001169886.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001169886.1として掲載されている。イヌttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_844474.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_849567.1として掲載されている。ウシttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001109767.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001103237.1として掲載されている。マウスttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_009441.2、アミノ酸配列番号NP_033467.2として掲載されている。ラットttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001108315.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001101785.1として掲載されている。上記ttc3遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１５６〜１６２に示されている。
【００５４】
「tubb2b」遺伝子とは「tubulin, beta 2b」遺伝子であり、2410129E14Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、マウスtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_023716.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_076205.1として掲載されている。ヒトtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_178012.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_821080.1として掲載されている。チンパンジーtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001162039.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001162039.1として掲載されている。イヌtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_851105.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_856198.1として掲載されている。ラットtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001013886.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001013908.2として掲載されている。上記tubb2b遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１６３〜１６７に示されている。
【００５５】
「ubqln2」遺伝子とは「ubiquilin 2」遺伝子であり、Chap1、Dsk2、HRIHFB2157、Plic-2、Plic2、RP23-240F13.1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスubqln2遺伝子はmRNA配列番号NM_018798.2、アミノ酸配列番号NP_061268.2として掲載されている。ヒトubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013444.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_038472.2として掲載されている。チンパンジーubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001148609.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001148609.1として掲載されている。イヌubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_549029.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_549029.2として掲載されている。ウシubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_587928.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_587928.3として掲載されている。ラットubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001061090.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001061090.1として掲載されている。上記ubqln2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１６４〜１７３に示されている。
【００５６】
「vim」遺伝子とは「vimentin」遺伝子であり、MGC102095、RP23-185P20.1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_003380.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_003371.2として掲載されている。チンパンジーvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001009148.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001009148.1として掲載されている。イヌvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_851385.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_856478.1として掲載されている。ウシvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_173969.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_776394.2として掲載されている。マウスvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_011701.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035831.2として掲載されている。ラットvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_031140.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_112402.1として掲載されている。上記vim遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１７４〜１７９に示されている。
【００５７】
「six3」遺伝子とは「sine oculis homeobox homolog 3」遺伝子であり、Six3a、Six3alpha、Six3b、Six3betaとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_005413.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_005404.1として掲載されている。チンパンジーsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_525749.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_525749.2として掲載されている。ウシsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_868863.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_873956.2として掲載されている。マウスsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_011381.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035511.2として掲載されている。ラットsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_023990.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_076480.1として掲載されている。上記six3遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１８０〜１８４に示されている。
【００５８】
「arx」遺伝子とは「aristaless related homeobox」遺伝子であり、RP23-53K18.1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトarx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_139058.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_620689.1として掲載されている。イヌarx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001114666.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001108138.1として掲載されている。マウスarx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_007492.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_031518.2として掲載されている。ラットarx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001100174.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001093644.1として掲載されている。上記arx遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１８５〜１８８に示されている。
【００５９】
「dcx」遺伝子とは「doublecortin」遺伝子であり、DBCN、DC、LISX、RP5-914P14.1、SCLH、XLISとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトdcx遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_000555.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_000546.2として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_178152.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_835365.1として、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_178151.1及びNM_178153.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_835364.1及びNP_835366.1として掲載されている。チンパンジーdcx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_529107.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_529107.2として掲載されている。イヌdcx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_848089.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_853182.1として掲載されており、ラットdcx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_053379.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_445831.2として掲載されている。マウスdcx遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001110222.1及びNM_001110223.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_001103692.1及びNP_001103693.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001110224.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001103694.1として掲載されており、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_010025.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_034155.2として掲載されている。上記dcx遺伝子の塩基配列は本願の配列番号１８９〜１９９に示されている。
【００６０】
「L1cam」遺伝子とは「L1 cell adhesion molecule」遺伝子であり、CAML1、CD171、HSAS、HSAS1、MASA、MIC5、N-CAML1、S10、SPG1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトL1cam遺伝子のアイソフォーム１のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_000425.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_000416.1として掲載されており、アイソフォーム２のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_024003.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_076493.1として掲載されている。チンパンジーL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001139376.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001139376.1として掲載されている。イヌL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_549364.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_549364.2として掲載されている。ウシL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001250423.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001250424.1として掲載されている。マウスL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_008478.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_032504.3として掲載されている。ラットL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_017345.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_059041.1として掲載されている。上記L1cam遺伝子の塩基配列は本願の配列番号２００〜２０６に示されている。
【００６１】
「emx2」遺伝子とは「empty spiracles homeobox 2」遺伝子であり、Pdoとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_004098.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_004089.1として掲載されている。チンパンジーemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001152098.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001152098.1として掲載されている。イヌemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_848240.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_853333.1として掲載されている。ウシemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001075845.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001069313.1として掲載されている。マウスemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_010132.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_034262.2として掲載されている。ラットemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001109169.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001102639.1として掲載されている。上記emx2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号２０７〜２１２に示されている。
【００６２】
「wnt1」遺伝子とは「wingless-type MMTV integration site family, member 1」遺伝子であり、Int-1、Wnt-1、sw、swayingとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_005430.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_005421.1として掲載されている。チンパンジーwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001159566.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001159566.1として掲載されている。イヌwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_543686.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_543686.2として掲載されている。ウシwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001114191.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001107663.1として掲載されている。マウスwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_021279.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_067254.1として掲載されている。ラットwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001105714.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001099184.1として掲載されている。上記wnt1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号２１３〜２１８に示されている。
【００６３】
「reln遺伝子」とは「reelin」遺伝子であり、reeler、rlとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトreln遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_005045.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_005036.2として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_173054.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_774959.1として掲載されている。チンパンジーreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_519291.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_519291.2として掲載されている。イヌreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_844371.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_849464.1として掲載されている。ウシreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001105321.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001098791.1として掲載されている。マウスreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_011261.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035391.2として掲載されている。ラットreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_080394.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_536319.2として掲載されている。上記reln遺伝子の塩基配列は本願の配列番号２１９〜２２５に示されている。
【００６４】
「pax6」遺伝子とは「paired box 6」遺伝子であり、AN、AN2、MGDA、WAGR、D11S812E、MGC17209、Dey、Sey、AEY11、Gsfaey11、1500038E17Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、マウスpax6遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_013627.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_038655.1として掲載されている。ヒトpax6遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000280.3及びNM_001127612.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_000271.1及びNP_001121084.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001604.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001595.2として掲載されている。ラットpax6遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013001.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_037133.1として掲載されている。上記pax6遺伝子の塩基配列は本願の配列番号２２６〜２３０に示されている。
【００６５】
また、本発明は、化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
（１）幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において被験化学物質に接触した該組織細胞における配列番号１〜７８および１０１〜２３０に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する第Ａ工程と、
（２）第Ａ工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定する第Ｂ工程と、（３）第Ｂ工程で特定された遺伝子を取得する第Ｃ工程と、を有する。
第Ａ工程では、具体的には例えば、発生毒性を示す化学物質又は発生毒性を示さない複数の化学物質に接触した該組織分化過程における細胞を継時的に取得して、前記配列番号１〜７８および１０１〜２３０に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する。
第Ｂ工程では、化学物質に接触しない該組織分化過程における細胞を継時的に取得して該遺伝子の発現量を測定して対照値とし、第Ａ工程の遺伝子発現レベルと各時点で比較して該遺伝子の各化学物質に対する発現変動の差異のパターンを明らかにする。そして、複数の化学物質に対する特徴的な遺伝子発現変動のパターンが該遺伝子の発現変動パターンと同様のパターンを示す別の遺伝子を発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子として特定する。第Ｃ工程では、第Ｂ工程で特定した遺伝子をPCR法などにより取得する。
【００６６】
また、本発明は、化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
（１）幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において、該分化過程における配列番号１〜７８および１０１〜２３０に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現変動を測定し、変動する遺伝子を特定するＡ工程と、
（２）第Ａ工程で特定した遺伝子について、被験化学物質に接触した該組織細胞における遺伝子の発現レベルを測定する第Ｂ工程と、
（３）第Ｂ工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定し取得する第Ｃ工程と、を有する。
【００６７】
第Ａ工程では、幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において経時的に取得した該組織細胞における配列番号１〜７８および１０１〜２３０に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する。具体的に例えば、該組織分化過程における細胞を継時的に取得して該遺伝子発現を測定し、０日の発現量と比較して優位に発現変動する遺伝子を特定する。第Ｂ工程では、第Ａ工程で特定した遺伝子について、動物において発生毒性を示す化学物質又は発生毒性を示さない複数の化学物質を接触した該組織細胞の発現量を測定する。そして、第Ｃ工程では、化学物質に接触しない該組織分化過程における細胞を継時的に取得して該遺伝子の発現量を測定して対照値とし、第B工程の遺伝子発現レベルと各時点で比較して該遺伝子の各化学物質に対する発現変動の差異のパターンを明らかにする。そして、複数の化学物質に対する特徴的な遺伝子発現変動のパターンが特定した遺伝子の発現変動パターンと同様のパターンを示す別の遺伝子を発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子として特定する。
【００６８】
本発明の「レポーター遺伝子」は、本遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含む。レポータータンパク質としては、ホタルルシフェラーゼ（firefly luc）、ウミシイタケルシフェラーゼ（renilla luc）、β-ガラクトシダーゼ、もしくはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素、又は核酸構築物が導入される宿主での視覚での選択を可能にする選択マーカータンパク質等が挙げられる。そのような選択マーカータンパク質としては、例えば、緑色蛍光プロテイン（GFP）、青色蛍光プロテイン（CFP）、黄色蛍光プロテイン（YFP）及び赤色蛍光プロテイン（dsRed）等の生細胞での観察が可能な蛍光色素マーカー又は色素マーカーが挙げられる。上記レポータータンパク質は、本発明の核酸構築物が導入される宿主に対して実質的に毒性を示さないことが好ましい。また、レポーター遺伝子発現の検出は、レポータータンパク質が酵素である場合も蛍光プロテインである場合も、それ自体が既知の検出方法により行うことができる。
【００６９】
本発明において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するDNA上の領域をいい、通常RNAポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本発明においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター配列」という。プロモーターの配列は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約５kbp以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター配列を推定することはできる。ＤＮＡ解析用ソフトウェアは例えばDNASISソフトウェア（日立ソフトウェア）、GENETYX（株式会社ゼネティックス）等が使用できる。推定プロモーター配列は、構造遺伝子ごとに異なり、通常構造遺伝子の上流にあるが、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【００７０】
本発明において、プロモーター配列と予測されるDNA配列をNCBIデータベースより入手する方法について、マウスHand1遺伝子を例にして具体的に記載する。マウスHand1遺伝子のmRNA配列としては、インターネット上のNCBIホームページで「hand1」をキーワードとして検索することにより、登録番号NM_008213.2で登録された塩基配列を入手することができる。次に、マウス総ゲノム配列を対象としたblast検索法により、NM_008213.2にて登録された配列のうち、転写開始点周辺配列と相同な配列を含むゲノム配列を検索する。その結果、登録番号ref|NT_096135.5|Mm11_95772_37のマウス11番染色体全体配列の中から、Hand1遺伝子周辺1Mbpのゲノム情報を知ることができる。表示される範囲を10kbp程度まで絞込んだのち、ダウンロードを指示することにより、Hand1遺伝子周辺10kbp程度のゲノム配列を入手することができる。得られたゲノム配列とmRNA配列とをDNA解析用ソフトウェアを用いて分析することにより、転写開始点より上流の約5kbpのDNA配列を入手することができる。ＤＮＡ解析用ソフトウェアは例えばDNASISソフトウェア（日立ソフトウェア）、GENETYX（株式会社ゼネティックス）等が使用できる。
【００７１】
本発明において「プロモーター配列に作動可能に連結される」とは、所望の遺伝子の発現（作動）があるプロモーター配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが構造遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その構造遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。本遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子において、そのようなプロモーター配列は、配列の転写開始点から上流5kbpの間の領域であり得る。この領域には、Sp1及びAP-2等の既知転写調節因子の結合可能配列が存在し、この領域が発現制御に重要な働きをすることが予想されるからである。このことから少なくともこれらの領域に転写を誘導するために必要十分な塩基配列（プロモーター配列）を含むと推測される。プロモーター配列は、レポータータンパク質コード配列と作動可能に連結して機能すればよく、長さに限定されない。
【００７２】
本発明において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体及び植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、該分野において多数存在し、販売元により、その構造上の違い（例えばマルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列）から名前を変えて販売されている。例えば、 ‘Molecular Cloning（3rd edition）’ by  Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3 (Volume 3)， Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)） に代表的なものが記載（発売元も記載）されており、そのようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
【００７３】
本発明において「ベクター」は「発現ベクター」、「レポーターベクター」、「組換えベクター」も含有し、「発現ベクター」においては、構造遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されていてもよい。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー及び、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプ及び使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００７４】
本発明において使用される「組換えベクター」としては、例えば、ゲノムライブラリーのスクリーニングにはラムダFIXベクター（ファージベクター）を、cDNAのスクリーニングではラムダZAPベクター（ファージベクター）を利用することができる。ゲノムＤＮＡのクローニングにはpBluescript II SK＋/−, pGEM，pCR2.1ベクター（プラスミドベクター）等を使用することができる。発現ベクターとしてpSV2/neoベクター、pcDNAベクター、pUC18ベクター、pUC19ベクター、pRc/RSVベクター、pLenti6/V5-Destベクター、pAd/CMV/V5-DESTベクター、pDON-AI-2/neoベクター、pMEI-5/neoベクター等（プラスミドベクター）を利用することができる。レポーターベクターとしてpGL2ベクター、pGL3ベクター、pGL4.10ベクター、pGL4.11ベクター、pGL4.12ベクター、pGL4.70ベクター、pGL4.71ベクター、pGL4.72ベクター、pSLGベクター、pSLOベクター、pSLRベクター、pEGFPベクター、pAcGFPベクター、pDsRedベクター等を利用することができる。このようなベクターは、前出のMolecular Cloning誌を参考にして適宜使用することができる。
【００７５】
本発明において、核酸分子を細胞に導入する技術としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション等が挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel F. A.ら編（１９８８）、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J.ら（１９８７）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.及びその第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７等に記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本発明に記載される方法又は他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【００７６】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にDNAを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換等（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法等）が挙げられる。
【００７７】
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞等の生命体の全部又は一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主等ともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【００７８】
本発明において遺伝子操作等において原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Eschericia属、Serratia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Microbacterium属、Pseudomonas属等に属する原核生物細胞、例えば、Eschericia XL1-Blue、Eschericia XL2-Blue、Eschericia DH1が例示され、そのような細胞は、‘Molecular Cloning（3rd edition）’ by Sambrook，J and Russell, D.W., Appendix 3（Volume３），Vectors and Bacterial strains. A3.2（Cold Spring Harbor USA 2001） に記載されている。
【００７９】
本発明において「遺伝子改変非ヒト動物」とは、遺伝子操作により外部から特定の遺伝子（ＤＮＡ）を導入し作出させたトランスジェニック非ヒト動物（マウス、ラット）や特定の遺伝子を破壊して欠失させたノックアウトマウス、逆に特定の遺伝子に付加置換したノックインマウス等の総称である。
【実施例】
【００８０】
本発明を以下の実施例によって、更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００８１】
実施例１
（ES細胞の心筋への分化誘導）
ATCC（American Type Culture Collection）よりマウスES細胞（ES-D3株）を入手した。ES-D3株は、マウスLIF（白血病阻害因子：leukemia inhibitory factor）を添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地において、未分化維持培養を行った後、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて細胞を分散させた。LIFを含まない15%の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、１滴あたり約750個の細胞を含むように、直径10ｃｍディッシュに懸滴培養（本培養方法をハンギングドロップ培養又はハンギングドロップ法とも呼ぶ）により３７℃、５％CO2インキュベーター内で３日間培養を行い、胚様体(embryoid body)を形成させた。この胚様体を更に２日間、非接着系のシャーレの中で浮遊培養した後、胚様体を接着系のシャーレに移行した。ハンギングドロップ開始から10日後に、収縮を繰り返す心筋細胞を顕微鏡下で確認した。ES細胞から心筋への分化過程で発現変動する遺伝子を経時的、網羅的把握するため、１２０００滴以上の懸滴培養を開始し、先述の分化誘導過程において０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日の各日当たり５０個以上の細胞を混合して1群とし、４群以上の細胞を回収した。本操作を１０日目まで実施した。
【００８２】
実施例２
（心筋分化過程の網羅的発現変動解析）
分化誘導後０日、２日、４日、６日、８日、１０日目、計６時点の保存サンプル合計２４サンプル（１日あたり4群）より、RNeasy RNA抽出キット（キアゲン社）を用いてRNAを抽出した。抽出したすべてのRNAはRiboGreen RNA定量キット（インビトロジェン社）による濃度測定、及び電気泳動によるRNA分解の品質確認を行った。濃度測定の結果に基づき4μgに調製したRNAを用いて、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array（アフィメトリクス社）を利用して網羅的に遺伝子発現変動プロファイルデータを収集、解析した。具体的な解析法は、まずバイオインフォマティクス解析ソフトを利用して各時点で全ての群に共通に発現変動する遺伝子を抽出した。次いで経時的に発現パターン分類を行い、抽出遺伝子をグループ化した。０日に対して各日（２日、４日、６日、８日、１０日）において発現変化を示したHand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子又は、Hba-x遺伝子を候補遺伝子として抽出した。
【００８３】
実施例３
発生毒性陽性および陰性の化学物質を用いて、候補遺伝子の発現量の変動を定量的PCRにより解析することによりマーカー遺伝子を特定する方法について説明する。
（心筋分化誘導時の被験物質接触サンプルの回収）
ES-D3細胞株を、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により３７℃、５％CO2インキュベーター内で未分化維持培養を行った。分化誘導方法においては、まず0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、LIFを含まない１５％の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、一滴あたり約750個の細胞を含むように、直径１０ｃｍシャーレに懸滴培養により３日間培養を行った。形成した胚様体を更に2日間、非接着性６ｃｍシャーレ（グライナー社）の中で浮遊培養した後、胚様体を２４ウェルプレート（BDファルコン社）に播種した。これら一連の分化誘導は溶媒対照群と発生毒性陽性化合物処理群（0.05μg/mL  5-Fluorouracil、4.0μg/mL  hydroxyurea、1.0μg/mL 6- aminonicotinamide）、および発生毒性陰性化合物処理群（1000μg/mL  saccharin sodium hydrate、7.5μg/mL  ascorbic acid、125μg/mL isoniazide）を添加した培地で行った。ハンギングドロップ開始から３日目及び５日目に再度調製した化合物を添加した培地に交換して１０日間の培養を行った。ハンギングドロップ開始から１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日の各日当たり５０個以上の細胞を混合して1群とし、４群以上の細胞を回収した。回収した細胞はTrisol液（インビトロジェン社）１００μlに溶解して-８０℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit（キアゲン社）により精製した。
【００８４】
（候補遺伝子の定量的PCRによる発現解析）
RiboGreen RNA定量キット（インビトロジェン社）を用いてRNA濃度を測定し、３００ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT（インビトロジェン社）の逆転写酵素を用いて、４２℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製した。得られたcDNA１μＬ、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL（アプライドバイオシステムズ）を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施した。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Hand1遺伝子はMm00433931_m1、ADAM19遺伝子はMm00477337_m1、Pitx2遺伝子はMm00440826_m1、Cmya1遺伝子はMm00495998_m1、Smyd1遺伝子はMm00477663_m1、Pim2遺伝子はMm00454579_m1、Tbx20遺伝子はMm00451515_m1、Myl4遺伝子はMm00440378_m1、Myl7遺伝子はMm00491655_m1、Hbb-bh1遺伝子はMm00433932_g1、Hba-a1遺伝子はMm00845395_s1、Col1a2遺伝子はMm00483888_m1、Hba-x遺伝子はMm00439255_m1（すべてアプライドバイオシステム社製）を使用した。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μＬとcDNA1 μＬ用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得した。解析により得られたデータは、分化誘導各日の候補遺伝子発現量を、同日のマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各マーカー遺伝子発現量を評価した。測定日に関しては各候補遺伝子の最も発現上昇する日数とした。その結果、図1および2に示すように、Hand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子およびHba-x遺伝子は発生毒性陰性化合物処理群に比べ発生毒性陽性化合物処理群で強く抑制され、マーカー遺伝子として特定された。
【００８５】
実施例４
実施例3において特定したマーカー遺伝子について、発生毒性の予測性を実施例３で用いた以外の発生毒性陽性および陰性の化学物質を用いて検証する工程を記載する。
（心筋分化誘導時の被験物質接触サンプルの回収）
ES-D3細胞株を、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により３７℃、５％CO2インキュベーター内で未分化維持培養を行った。分化誘導方法においては、まず0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、LIFを含まない１５％の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、一滴あたり約750個の細胞を含むように、直径１０ｃｍシャーレに懸滴培養により３日間培養を行った。形成した胚様体を更に2日間、非接着性６ｃｍシャーレ（グライナー社）の中で浮遊培養した後、胚様体を２４ウェルプレート（BDファルコン社）に播種した。これら一連の分化誘導は溶媒対照群と発生毒性陽性化合物処理群（1.5μg/mL 5-bromo-2'-deoxyuridine、 0.6μg/mL methotrexate、0.001μg/mL  all-trans -retinoic acid）、および発生毒性陰性化合物処理群（1500μg/mL  penicillin G sodium salt、25μg/mL  acrylamide、100μg/mL  D-(+)-camphor）を添加した培地で行った。ハンギングドロップ開始から３日目及び５日目に再度調製した化合物を添加した培地に交換して１０日間の培養を行った。ハンギングドロップ開始から１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日の各日当たり５０個以上の細胞を混合して1群とし、４群以上の細胞を回収した。回収した細胞はTrisol液（インビトロジェン社）１００μlに溶解して-８０℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit（キアゲン社）により精製した。
【００８６】
（マーカー遺伝子の定量的PCRによる発現解析）
RiboGreen RNA定量キット（インビトロジェン社）を用いてRNA濃度を測定し、３００ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT（インビトロジェン社）の逆転写酵素を用いて、４２℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製した。得られたcDNA１μＬ、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL（アプライドバイオシステムズ）を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施した。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Hand1遺伝子はMm00433931_m1、ADAM19遺伝子はMm00477337_m1、Pitx2遺伝子はMm00440826_m1、Cmya1遺伝子はMm00495998_m1、Smyd1遺伝子はMm00477663_m1、Pim2遺伝子はMm00454579_m1、Tbx20遺伝子はMm00451515_m1、Myl4遺伝子はMm00440378_m1、Myl7遺伝子はMm00491655_m1、Hbb-bh1遺伝子はMm00433932_g1、Hba-a1遺伝子はMm00845395_s1、Col1a2遺伝子はMm00483888_m1、Hba-x遺伝子はMm00439255_m1（すべてアプライドバイオシステム社製）を使用した。
また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μＬとcDNA1 μＬ用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得した。解析により得られたデータは、分化誘導各日のマーカー遺伝子発現量を、同日のマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各マーカー遺伝子発現量を評価した。測定日に関しては各マーカー遺伝子の最も発現上昇する日数とした。その結果、図3および4に示すように、Hand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子およびHba-x遺伝子は発生毒性陰性化合物処理群に比べ発生毒性陽性化合物処理群で強く抑制される傾向が認められ、マーカー遺伝子として検証された。
【００８７】
実施例５
以下に、マーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞の作製法を記載する。
（マーカー遺伝子のプロモーターのクローニングとレポータープラスミドの作製）
本発明の各マーカー遺伝子のプロモーター領域は以下に示すプライマーを用いてPCRによりクローニングした。
【００８８】
Hand1遺伝子のプロモーター領域５kbを増幅する場合には配列番号７９記載のプライマーと配列番号８２記載のプライマー、プロモーター領域２kbを増幅する場合には配列番号８０記載のプライマーと配列番号８２記載のプライマー、プロモーター領域１kbを増幅する場合には配列番号８１記載のプライマーと配列番号８２記載のプライマーを用いた。ES-D3細胞より抽出したゲノムDNA２０ngと１０μMに調製した上記の各プライマーとをPlatinum Taq polymerase（インビトロジェン社）を用いてPCR法にて増幅した。PCR反応はGeneAmp PCR System９７００（アプライドバイオシステム社）にて、９５℃５分間反応させた後、９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を３０サイクル行い、７２℃７分間の反応条件で実施した。
【００８９】
Smyd1遺伝子のプロモーター領域５kbを増幅する場合には配列番号８３記載のプライマーと配列番号８６記載のプライマー、プロモーター領域２kbを増幅する場合には配列番号８４記載のプライマーと配列番号８６記載のプライマー、プロモーター領域１kbを増幅する場合には配列番号８５記載のプライマーと配列番号８６記載のプライマーを用いた。
【００９０】
Pitx2遺伝子のプロモーター領域５kbを増幅する場合には配列番号８７記載のプライマーと配列番号９０記載のプライマー、プロモーター領域２kbを増幅する場合には配列番号８８記載のプライマーと配列番号９０記載のプライマー、プロモーター領域１kbを増幅する場合には配列番号８９記載のプライマーと配列番号９０記載のプライマーを用いた。
【００９１】
Cmya1遺伝子のプロモーター領域５kbを増幅する場合には配列番号９１記載のプライマーと配列番号９４記載のプライマー、プロモーター領域２kbを増幅する場合には配列番号９２記載のプライマーと配列番号９４記載のプライマー、プロモーター領域１kbを増幅する場合には配列番号９３記載のプライマーと配列番号９４記載のプライマーを用いた。
【００９２】
Pim2遺伝子のプロモーター領域５kbを増幅する場合には配列番号９５記載のプライマーと配列番号９８記載のプライマー、プロモーター領域２kbを増幅する場合には配列番号９６記載のプライマーと配列番号９８記載のプライマー、プロモーター領域１kbを増幅する場合には配列番号９７記載のプライマーと配列番号９８記載のプライマーを用いた。
【００９３】
ADAM19遺伝子のプロモーター領域５kbを増幅する場合には配列番号９９記載のプライマーと配列番号１００記載のプライマーを用いた。
【００９４】
Cmya1遺伝子の各PCR産物はHind III（タカラバイオ社）、Hand1、ADAM19、Smyd1、Pitx2及びPim2遺伝子の各PCR産物はKpn I（タカラバイオ社）にて消化した後、電気泳動を行い、ゲル中より精製した。精製したDNA断片はそれぞれ、Hind III又はKpn Iにて消化し、Alkaline phosphatase（タカラバイオ社）にて脱リン酸化処理を行ったpGL4.17[Luc2/Neo]vector（プロメガ社）とLigation kit（タカラバイオ社）を用いて連結し、DH5αコンピテンセル（タカラバイオ社）に形質転換して、３７℃でLB/アンピシリン培地にて一晩培養した。出現したコロニーはLB/アンピシリン液体培地にて培養し、増殖した大腸菌よりプラスミドDNAを抽出した。取得したプラスミドDNAは挿入断片のシークエンスを決定し、変異等の有無を確認した。
ES細胞へトランスフェクションに用いるため、各プラスミドはQiafilterプラスミド抽出キット（キアゲン社）にて再度抽出した。得られたプラスミドDNA２０μgをCmya1、Hand1、Pim2、ADAM19、Pitx2プロモーターに関してはSal Iにて、Smyd1についてはNot Iにて制限酵素処理を行った後、精製を行い、線状化DNAを取得した。
【００９５】
（組換えES細胞の作製方法）
未分化維持培養を行ったES-D3細胞を、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、0.1％ゼラチンコートした３５mmシャーレ中に0.3X10５個の細胞を播種し、LIFを添加した１５%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により培養した。その後、Opti-MEM培地と４μgの線状化DNA、１２μLのリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）とを混合し、３０分間室温にて反応させた後、全量を細胞培養液中に添加した。
３７℃にて５％CO２インキュベーターで１時間培養したのち、LIFを添加した１５%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に交換した。１２時間後、各細胞を0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、0.1％ゼラチンコートした１０cmシャーレに１００μg/mLのG４１８(インビトロジェン社)を含むLIF添加１５%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を用いて播種し、薬剤選択培養を開始した。７日〜１０日後、実体顕微鏡下でシャーレ中に形成したES細胞コロニーを単離し、９６ウェルプレートに播種し、薬剤選択培養を継続した。３日毎に培地交換を行い、７〜１０日後に増殖した細胞を継代培養して４８ウェルプレートに播種して薬剤選択培養を継続し、薬剤耐性の安定形質転換細胞株を取得した。
【００９６】
（細胞株の選別法）
取得した細胞株は、１００μg/mLのG４１８を含むLIF添加１５%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行い、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた。LIF未添加の１５%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に培地交換を行ったのち、750cell/20μLの容量で３日間のハンギング培養を実施し、２日間の浮遊培養、５日間の接着培養を経て心筋へ分化誘導を行った。各細胞株について、２日毎に１０日間、５０以上の胚葉体を回収して1サンプルとし、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit（キアゲン社）により精製した。RiboGreenキット（インビトロジェン社）を用いてRNA濃度を測定後、１μｇ相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT（インビトロジェン社）の逆転写酵素を用いて、４２℃、1時間反応させcDNAを合成した。各細胞株のそれぞれ０日、２日、４日、６日、８日１０日のサンプルについて、Luc２遺伝子を増幅可能なプライマー対（5'-agtagtggcagtaccggat -3'及び5'-ctcgtgcaagttgcttagg -3'）及びExTaq polymerase（タカラバイオ）を用いてPCRを行い、その後PCR産物のゲル電気泳動を行った。また、各マーカー遺伝子、及びβアクチン遺伝子についても発現量を比較し、分化誘導に伴ってLuc２遺伝子が発現誘導される細胞株を選択した。更に、選択した細胞株の分化誘導後のルシフェラーゼ活性測定は以下の通り実施した。まず、１００μg/mLのG４１８を含むLIF添加１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行い、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた。LIF未添加の１５%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に培地交換を行ったのち、750cell/20μLの容量でハンギングドロップ法により心筋分化誘導を開始し、3日間浮遊培養を行った。3日後に１００μLのLIF未添加、１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を追加して2日間浮遊培養を継続した後、5日目に、形成した胚葉体を接着培養用９６ウエルプレート（コーニング社）に移し、接着培養を開始した。分化誘導開始6日目から10日目の各日毎に、培養液を吸引除去した４枚の９６ウエルプレートの各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Gloを５０μL添加した。１０分間振とうした後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター（パッカードジャパン社）にてルシフェラーゼ活性を測定した。例えば、hand1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞（以下、Hand1-ES細胞と記す）およびsmyd1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞（以下、smyd1-ES細胞と記す）について、内在性のhand1またはsmyd1遺伝子、およびルシフェラーゼ活性の経時的な測定結果を図５に示す。Hand1-ES細胞およびsmyd1-ES細胞は内在性の遺伝子発現とルシフェラーゼ活性誘導のパターンが一致することが明らかとなった。
【００９７】
実施例６
以下に、選定した組換えES細胞を利用した心筋分化過程での発生毒性評価法を記載する。
取得した組換えES細胞株は、１００μg/mLのG４１８を含むLIF添加１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行う。未分化なコロニーは、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、LIF添加１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去し、LIFを含まない１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントする。溶媒対象群としてPBS(-)のみを添加した分化培地、陽性対象（心筋への分化が阻害される陽性化合物及び濃度）群として最終濃度4.0μg/mLになるようにhydroxyurea溶液（PBS（-）に溶解）を添加した分化培地、及び被験物質を公比１０にて５段階に希釈して調製した分化培地を作製した後、各分化培地に１mL当たり3.75X104個の細胞数になるように細胞懸濁液を調製し、750cell/20μLの容量でハンギングドロップ法による心筋分化誘導を開始し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した分化培地及び該被験物質を添加した分化培地１００μLを追加して2日間浮遊培養を継続する。5日目に、形成した胚葉体を、再度調製した分化培地及び該被験物質を添加した分化培地を予め分注した接着培養系９６ウエルプレート（コーニング社）に移し、接着培養を開始する。分化誘導開始6日目から10日目の各日毎に、培養液を吸引除去した４枚の９６ウエルプレートの各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Gloを５０μL添加する。１０分間振とうした後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター（パッカードジャパン社）にてルシフェラーゼ活性を測定する。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、陽性対照群及び該被験物質の濃度毎に集計する。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、陽性対照群及び該被験物質の濃度毎に集計する。これらの方法を用いて、溶媒対照群、陽性対照群、該被験物質のルシフェラーゼ活性の変化量を比較し、該被験物質の心筋分化を阻害する濃度を決定することができる。
【００９８】
実施例７
（ES細胞の神経への分化誘導）
実施例１〜５に記載した工程により、心臓組織に対する発生毒性を予測するマーカーを特定すること、及びマーカー遺伝子の核酸構築物及び形質転換された細胞を用いることにより被験物質の心臓組織に対する発生毒性を評価することが可能となった。以下に示す、ES細胞から脳・神経への分化誘導方法を応用すれば、脳・神経に対する発生毒性評価方法も心臓組織と同様に実施可能である。以下にES細胞の神経細胞への分化誘導方法を示した。
ES-D3細胞は、37℃、５%CO2インキュベーター内で、LIF添加１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、LIF添加１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、５%KSR（インビトロジェン社）、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM ２-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁した。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、非接着系の１０cmシャーレ中に5X105/mL個の細胞密度にて10mLの細胞を播種し、37℃、５%CO2インキュベーター内、又は37℃、５%CO2及び５%O2インキュベーター内で培養した。分化開始から３日に10mLの神経分化培地を追加して2日間の浮遊培養を継続した。分化開始から５日目にすべての細胞及び培養液を遠心管に移し、室温で１０分間静置して、胚様体を沈降させた。静かに上清を除いたのち、神経分化培地にて胚様体を懸濁して６cmシャーレに移行した。前記６cmシャーレ中の胚様体を実体顕微鏡を用いて、５μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート２４ウェルプレートの各ウェルに１０〜２０個の胚様体になるように播種し、更に５日間、37℃、５%CO2インキュベーター内、又は37℃、５%CO2及び５%O2インキュベーター内で培養を継続した。分化開始より１０日目に、一部のウェルについて位相差顕微鏡下で神経突起を観察、更に神経分化の代表マーカー遺伝子MAP2に対する抗体を用いて免疫染色を実施し、MAP2陽性細胞の有無を確認した。
【００９９】
実施例８
（ES細胞の骨芽細胞への分化誘導）
ES-D3細胞は、37℃、５%CO2インキュベーター内で、LIF添加１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁し、遠心操作および上清の吸引操作により、残余トリプシンおよび血清を除去した。その後、１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に再度懸濁し、少量の細胞溶液を用いて細胞数を計測した。計測後、0.1%ゼラチンコートを施した35mm dishに、1.0x104cells/mlの濃度となるように調製した細胞懸濁液を2ml加え、37℃、５%CO2インキュベーター内で培養を開始した。培養開始より4日後にPBSによりディッシュを洗浄し、アスコルビン酸を50μg/ml、ベータグリセロリン酸を10mMの濃度で添加した１５%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地へと培地交換を行った。その後、2乃至3日毎に同様の組成の培地へと培地交換を行った。培養開始より4、10、15、20日目にサンプルを回収し、一部はアリザリン染色によりカルシウムの沈着を検出した。一方でTotal RNAを抽出した後に骨芽細胞系に特異的な遺伝子(Runx2、Osteoprotegerin、Osteopontin、Collagen1a1)について、内部標準にACTBを用いて相対的な発現量を比較し、その結果特異的遺伝子の発現が確認できた。
【０１００】
実施例９
（神経分化過程の網羅的発現変動解析）
実施例７の方法により分化誘導後0日、2日、4日、6日、8日、10日目、計6時点の保存サンプル合計24サンプル（1日あたり4群）より、RNeasy RNA抽出キット（キアゲン社）を用いてRNAを抽出した。抽出したすべてのRNAはRiboGreen RNA定量キット（インビトロジェン社）による濃度測定、及び電気泳動によるRNA分解の品質確認を行った。濃度測定の結果に基づき4μgに調製したRNAを用いて、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array（アフィメトリクス社）を利用して網羅的に遺伝子発現変動プロファイルデータを収集、解析した。具体的な解析法は、まずバイオインフォマティクス解析ソフトを利用して各時点で全ての群に共通に発現変動する遺伝子を抽出した。次いで経時的に発現パターン分類を行い、抽出遺伝子をグループ化した。0日に対して各日（2日、4日、6日、8日、10日）において発現変化を示したBasp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp2遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子およびPax6遺伝子を候補遺伝子として抽出した。
【０１０１】
実施例１０
発生毒性陽性および陰性の化学物質を用いて、候補遺伝子の発現量の変動を定量的PCRにより解析することによりマーカー遺伝子を特定する方法について説明する。
（神経分化誘導時の被験物質接触サンプルの回収）
ES-D3細胞は、37℃、5%CO2インキュベーター内で、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR（インビトロジェン社）、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁した。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、非接着系の10cmシャーレ中に5×105/mL個の細胞密度にて10mLの細胞を播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5%O2インキュベーター内で培養した。分化開始から3日に10mLの神経分化培地を追加して2日間の浮遊培養を継続した。分化開始から5日目にすべての細胞及び培養液を遠心管に移し、室温で10分間静置して、胚様体を沈降させた。静かに上清を除いたのち、神経分化培地にて胚様体を懸濁して6cmシャーレに移行した。前記6cmシャーレ中の胚様体を実体顕微鏡を用いて、5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート24ウェルプレートの各ウェルに10〜20個の胚様体になるように播種し、更に5日間、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び５% O2インキュベーター内で培養を継続した。これら一連の分化誘導は溶媒対照群と発生毒性陽性化合物処理群（0.03μg/mL  5-Fluorouracil、4.0μg/mL  hydroxyurea、0.2μg/mL  methotrexate）、および発生毒性陰性化合物処理群（4,000μg/mL  saccharin sodium hydrate、20μg/mL  ascorbic acid、150μg/mL  isoniazide、600μg/mL  penicillin G sodium salt、50μg/mL  acrylamide、100μg/mL  D-(+)-camphor）を添加した培地で行った。分化誘導開始から3日目及び5日目に再度調製した化合物を添加した培地に交換して10日間の培養を行った。分化誘導開始から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日の各日当たり50個以上の細胞を混合して1群とし、4群以上の細胞を回収した。回収した細胞はTrisol液（インビトロジェン社）100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit（キアゲン社）により精製した。分化開始より10日目に、一部のウェルについて位相差顕微鏡下で神経突起を確認した。
【０１０２】
実施例１１
（候補遺伝子の定量的PCRによる発現解析）
実施例１０で抽出したRNAは、RiboGreen RNA定量キット（インビトロジェン社）を用いてRNA濃度を測定し、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT（インビトロジェン社）の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製した。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL（アプライドバイオシステムズ）を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施した。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Basp1遺伝子はMm02344032_s1、Cpe遺伝子はMm00516341_m1、DDR1遺伝子はMm01273494_g1、Marcks遺伝子はMm02524303_s1、NDN遺伝子はMm02524479_s1、Nnat遺伝子はMm00731416_s1、Ptbp2遺伝子はMm00497922_m1、Sfrp2遺伝子はMm01213947_m1、Sox11遺伝子はMm01281943_s1、Ttc3遺伝子はMm00493917_m1、Tubb2b遺伝子はMm00849948_g1、Ubqln2遺伝子はMm00834570_s1、Vim遺伝子はMm00449201_m1、Six3遺伝子はMm01237639_m1、Arx遺伝子はMm00545903_m1、Dcx遺伝子はMm00438401_m1、L1cam遺伝子はMm00493049_m1、Emx2遺伝子はMm00550241_m1、Wnt1遺伝はMm00810320_s1、Reln遺伝子はMm00465200_m1、Pax6遺伝子はMm00443081_m1（すべてアプライドバイオシステム社製）を使用した。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得した。解析により得られたデータは、分化誘導各日のマーカー遺伝子発現量を、同日のマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各マーカー遺伝子発現量を評価した。測定日に関しては各マーカー遺伝子の最も発現上昇する日数とした。その結果、図6、図7および８に示すように、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp2遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子およびPax6遺伝子は、発生毒性陰性化合物処理群に比べ発生毒性陽性化合物処理群で強く抑制され、マーカー遺伝子として特定された。
【０１０３】
実施例１２
以下に、hand1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたHand1-ES細胞を利用した被験物質の発生毒性予測法を記載する。
Hand1-ES細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。未分化なHand1-ES細胞は、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地（以下、心筋分化培地）に細胞を懸濁した。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、15,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液（心筋分化培地）を調製した。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行った。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した心筋分化培地50μLを追加して3日間浮遊培養を継続した。６日目に各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Glo（プロメガ社）を100μL添加し30分間振盪した後、全量を96ウェル白色プレートに移し替えTopCount NXTルミネッセンス検出カウンター（パッカードジャパン社）にてルシフェラーゼ活性を測定した。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した。
またATCCより入手したbalb/c 3T3細胞cloneA31（以下3T3細胞とする）を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価した。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地（3T3用培地）で37℃、5％CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁した。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁した。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行った。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続した。6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット（プロメガ社）中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定した。被験物質はin vivoでの発生毒性が陽性の4化合物（5-fluorouracil、hydroxyurea、dexamethasone、5-bromo-2'-deoxyuridine）、および陰性の2化合物（ascorbic acid、acrylamide）について実施した。Hand1-ES細胞および3T3細胞の各試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出した。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をhand1-ES細胞のルシフェラーゼ活性の測定値から、50%ルシフェラーゼ活性が阻害される濃度として50％分化抑制濃度（ID50）を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。今回評価した発生毒性が陽性の4化合物については、Hand1-ES ID50濃度と3T3 IC50濃度はそれぞれ、5-fluorouracil（Hand1-ES ID50 : 0.02μg/mL / 3T3 IC50 : 0.16 μg/mL）、hydroxyurea（Hand1-ES ID50 : 2.5μg/mL / 3T3 IC50 : 4.7 μg/mL）、dexamethasone（Hand1-ES ID50 : 15.6 μg/mL / 3T3 IC50 : 36.7 μg/mL ）、5-bromo-2'-deoxyuridine（Hand1-ES ID50 : 0.12μg/mL /3T3 IC50 : 0.80μg/mL ）となり、ID50 ＜IC50の関係が認められ、母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価することができる。また、発生毒性が陰性のascorbic acidおよびacrylamideについては、Hand1-ES ID50濃度と3T3 IC50濃度はそれぞれascorbic acid（Hand1-ES ID50 : 28.3μg/mL /3T3 IC50 : 2.0μg/mL ）、acrylamide（Hand1-ES ID50 : 85.3μg/mL /3T3 IC50 : 54.0μg/mL ）となり、Hand1-ES ID50 ＞3T3 IC50の関係が認められ、母動物に比べ胎児への影響が弱いと考えられ発生毒性を示さないと評価することができる。以上の工程により従来のEST法よりも短期間にまた簡便に被験物質の発生毒性を予測することが可能となった。
【０１０４】
実施例１３
Hand1の発現量測定による被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地（以下、心筋分化培地）に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、15,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液（心筋分化培地）を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した心筋分化培地50μLを追加して3日間浮遊培養を継続する。6日目に各ウェルの細胞を回収し、Trisol液（インビトロジェン社）100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit（キアゲン社）により精製する。RNAの濃度を決定した後、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT（インビトロジェン社）の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製する。得られたcDNA1μL、Hand1遺伝子評価用のTaqManプローブ（Mm00433931_m1）1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL（アプライドバイオシステムズ）を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施する。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Hand1遺伝子はMm00433931_m1を使用する。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得する。解析により得られたデータは、各サンプルのhand1遺伝子発現量を、同一サンプルのマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各サンプルのhand1遺伝子の発現量変化を評価する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地（3T3用培地）で37℃、5％CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。リアルタイムPCRを用いたHand1遺伝子の相対発現量、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をhand1の発現量が50%阻害される濃度として50％分化抑制濃度（ID50）を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50＞IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。
【０１０５】
実施例１４
マーカー遺伝子Hand1の発現量をフローサイトメトリーまたはFACSにより測定する方法による被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。-未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地（以下、心筋分化培地）に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、15,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液（心筋分化培地）を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した心筋分化培地50μLを追加して3日間浮遊培養を継続する。6日目に各ウェルの細胞を回収し、トリプシン/EDTA溶液を用いて細胞を分散した後、パラホルムアルデヒド溶液で細胞固定する。Saponin溶液等で細胞透過処理後、normal goat serumでブロッキングを行う。Hand1遺伝子産物（タンパク質）を認識する抗hand1抗体（abcam社）や抗eHAND (H-100)抗体（Santa cruz社)を添加して数時間反応した後、3回程度洗浄する。またさらに1次抗体を認識する蛍光物質等の標識化2次抗体を反応した後、3回程度洗浄する。先述工程により得られたサンプルをそれぞれEpics Altra（Beckman Coulter）等のフローサイトメトリーによりhand1遺伝子産物を発現する陽性細胞（以下、hand1陽性細胞）を算定する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地（3T3用培地）で37℃、5％CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。フローサイトメトリーを用いたHand1陽性細胞数、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をhand1陽性細胞数が50%阻害される濃度として50％分化抑制濃度（ID50）を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50＞IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。
【０１０６】
実施例１５
以下に、神経分化過程におけるマーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞の作製法を記載する。
（神経分化過程におけるマーカー遺伝子のプロモーターのクローニングとレポータープラスミドの作製）
本発明の各マーカー遺伝子のプロモーター領域は以下に示すプライマーを用いてPCRによりクローニングする。
【０１０７】
Ndn遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号２３１記載のプライマーと配列番号２３２記載のプライマーを用いる。ES-D3細胞より抽出したゲノムDNA20ngと10μMに調製した上記の各プライマーとをPlatinum Taq polymerase（インビトロジェン社）を用いてPCR法にて増幅する。PCR反応はGeneAmp PCR System9700（アプライドバイオシステム社）にて、95℃5分間反応させた後、95℃30秒間、55℃30秒間、72℃1分間を30サイクル行い、72℃7分間の反応条件で実施する。
【０１０８】
Cpe遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号２３３記載のプライマーと配列番号２３４記載のプライマーを用いる。
【０１０９】
L1cam遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号２３５記載のプライマーと配列番号２３６記載のプライマーを用いる。
【０１１０】
L1cam遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号２３７記載のプライマーと配列番号２３８記載のプライマーを用いる。
【０１１１】
各PCR産物は電気泳動を行った後、ゲル中より精製し、精製したDNA断片はそれぞれ末端リン酸化反応を行う。各断片は、EcoR Vを用いて消化した後にAlkaline phosphatase（タカラバイオ社）にて脱リン酸化処理を行ったpGL4.17[Luc2/Neo]vector（プロメガ社）とLigation kit（タカラバイオ社）を用いて連結し、DH5αコンピテンセル（タカラバイオ社）に形質転換して、37℃でLB/アンピシリン培地にて一晩培養する。出現したコロニーはLB/アンピシリン液体培地にて培養し、増殖した大腸菌よりプラスミドDNAを抽出する。取得したプラスミドDNAは挿入断片のシークエンスを決定し、変異等の有無を確認する。ES細胞へのトランスフェクションに用いるため、各プラスミドはQiafilterプラスミド抽出キット（キアゲン社）にて再度抽出する。得られたプラスミドDNA20μgは適した制限酵素により消化した後、精製を行い、線状化DNAを取得する。
【０１１２】
（神経分化過程におけるマーカー遺伝子の組換えES細胞の作製方法）
未分化維持培養を行ったES-D3細胞を、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、0.1％ゼラチンコートした35mmシャーレ中に0.3×10５個の細胞を播種し、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により培養する。その後、Opti-MEM培地と4μgの線状化DNA、12μLのリポフェクトアミン2000（インビトロジェン社）とを混合し、30分室温にて反応させた後、全量を細胞培養液中に添加する。
37℃にて5％CO２インキュベーターで1時間培養したのち、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に交換する。12時間後、各細胞を0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、0.1％ゼラチンコートした10cmシャーレに100μg/mLのG418(インビトロジェン社)を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を用いて播種し、薬剤選択培養を開始する。7〜10日後、実体顕微鏡下でシャーレ中に形成したES細胞コロニーを単離し、96ウェルプレートに播種し、薬剤選択培養を継続する。3日毎に培地交換を行い、7〜10日後に増殖した細胞を継代培養して48ウェルプレートに播種して薬剤選択培養を継続し、薬剤耐性の安定形質転換細胞株を取得する。
【０１１３】
（細胞株の選別法）
取得した細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行い、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR（インビトロジェン社）、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製した後、50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び５%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。各細胞株について、2日毎に10日間、24ウェル分以上の細胞を回収して1サンプルとし、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit（キアゲン社）により精製する。RiboGreenキット（インビトロジェン社）を用いてRNA濃度を測定後、1μｇ相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT（インビトロジェン社）の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させcDNAを合成する。各細胞株のそれぞれ0日、2日、4日、6日、8日および10日のサンプルについて、Luc2遺伝子を増幅可能なプライマー対（5'-agtagtggcagtaccggat -3'及び5'-ctcgtgcaagttgcttagg -3'）及びExTaq polymerase（タカラバイオ）を用いてPCRを行い、その後PCR産物のゲル電気泳動を行う。また、各マーカー遺伝子、及びβアクチン遺伝子についても発現量を比較し、分化誘導に伴ってLuc2遺伝子が発現誘導される細胞株を選択する。更に、選択した細胞株の分化誘導後のルシフェラーゼ活性測定は以下の通り実施する。まず先述の神経分化誘導法に従って培養した後、分化誘導開始6日目から10日目の各日毎に、96ウェルプレートの各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Gloを50μL添加する。30分間振とうした後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター（パッカードジャパン社）にてルシフェラーゼ活性を測定する。神経分化過程でのマーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞のルシフェラーゼ活性と内在性のマーカー遺伝子の発現パターンが一致するES細胞を選択し、それぞれの細胞株をNdn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞およびPax6-ES細胞と命名する。
【０１１４】
実施例１６
以下に、神経分化過程でのマーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞、Ndn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞およびPax6-ES細胞を利用した被験物質の発生毒性予測法を記載する。それぞれの細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った後、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR（インビトロジェン社）、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び５%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。分化誘導開始から8〜10日後、各ウェルにルシフェラーゼ発光試薬Steady-Glo（プロメガ社）を100μL添加し30分間振盪した後、全量を96ウェル白色プレートに移し替えTopCount NXTルミネッセンス検出カウンター（パッカードジャパン社）にてルシフェラーゼ活性を測定する。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計する。
またATCCより入手したbalb/c 3T3細胞cloneA31（以下3T3細胞とする）を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地（3T3用培地）で37℃、5％CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行なう。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。分化誘導開始8〜10日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット（プロメガ社）中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。Ndn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞、Pax6-ES細胞および3T3細胞の各試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をNdn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞およびPax6-ESのルシフェラーゼ活性の測定値から、50%ルシフェラーゼ活性が阻害される濃度として50％分化抑制濃度（ID50）を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。以上の工程により被験物質の神経分化過程での発生毒性を予測することが可能となる。
【０１１５】
実施例１７
神経分化過程でのマーカー遺伝子の発現量測定による被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR（インビトロジェン社）、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び５%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。8〜10日目に各ウェルの細胞を回収し、Trisol液（インビトロジェン社）100μlに溶解して-80℃にて保存する。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit（キアゲン社）により精製する。RNAの濃度を決定した後、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT（インビトロジェン社）の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製する。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL（アプライドバイオシステムズ）を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施する。各サンプルについては3反復にて実施する。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブは実施例１１記載のプローブを使用する。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得する。解析により得られたデータは、各サンプルのマーカー遺伝子発現量を、同一サンプルのマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各サンプルのマーカー遺伝子の発現量変化を評価する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地（3T3用培地）で37℃、5％CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して培養を継続する。8〜10日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。リアルタイムPCRを用いたマーカー遺伝子の相対発現量、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をマーカー遺伝子の発現量が50%阻害される濃度として50％分化抑制濃度（ID50）を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50＞IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。以上の工程により被験物質の神経分化過程での発生毒性を予測することが可能となる。
【０１１６】
実施例１８
神経分化過程におけるマーカー遺伝子の発現量をフローサイトメトリーまたはFACSにより測定する方法により被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR（インビトロジェン社）、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び５%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。分化誘導から8〜10日目に各ウェルの細胞を回収し、トリプシン/EDTA溶液を用いて細胞を分散した後、パラホルムアルデヒド溶液で細胞固定する。Saponin溶液等で細胞透過処理後、normal goat serumでブロッキングを行う。各マーカー遺伝子の遺伝子産物（タンパク質）を認識する抗体を添加して数時間反応した後、3回程度洗浄する。抗体としては例えば、抗necdin抗体（abcam社）、抗Cpe抗体（Santa cruz社）、抗L1CAM抗体（abcam社）、抗Pax6抗体（abcam社）等を1次抗体として使用する。またさらに1次抗体を認識する蛍光物質等の標識化2次抗体を反応した後、3回程度洗浄する。先述工程により得られたサンプルをそれぞれEpics Altra（Beckman Coulter）等のフローサイトメトリーにより各マーカー遺伝子産物を発現する陽性細胞（以下、マーカー遺伝子産物陽性細胞）を算定する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地（3T3用培地）で37℃、5％CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン／1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。8〜10日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。フローサイトメトリーを用いたマーカー遺伝子産物陽性細胞数、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をマーカー遺伝子産物陽性細胞数が50%阻害される濃度として50％分化抑制濃度（ID50）を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50＞IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。以上の工程により被験物質の神経分化過程での発生毒性を予測することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明により、簡便で汎用性の高い化学物質が有する発生毒性の予測方法を提供するこ
とができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号７９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８０
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配列番号８１
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配列番号８２
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配列番号８３
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配列番号８４
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配列番号８５
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配列番号８６
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配列番号８７
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配列番号９２
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配列番号９４
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配列番号９５
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配列番号９６
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配列番号９７
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配列番号９８
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配列番号９９
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配列番号１００
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３２
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配列番号２３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３４
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配列番号２３５
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配列番号２３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月1日(2009.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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