(57)【要約】【課題】Ｔ細胞共刺激に関連する細胞内シグナルを操作することによってＴ細胞応答を調節すること。【解決手段】Ｄ３ホスホイノシチドの産生は、Ｔ細胞をホスファチジルイノシトール３−キナーゼのインヒビターまたはアクチベーターと接触させることによって操作しうる。本発明方法にしたがったＴ細胞応答の阻害は、臓器あるいは骨髄移植および自己免疫疾患などの抗原に対する免疫応答を阻害することが望ましい状況において治療上有用である。別法として、本発明方法にしたがったＴ細胞応答の刺激は、被検体における抗腫瘍応答を刺激すること、病原体あるいはワクチン化に対する応答を刺激することなどの抗原に対する免疫応答を強化することにおいて治療上有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞による応答を阻害するための医薬組成物の製造のための、共刺激分子に結合するＣＤ２８細胞表面受容体を発現しているＴ細胞においてＤ−３ホスホイノシチドの産生を細胞内で阻害するように働く作用剤の使用であって、該応答が、Ｔ細胞によるＩＬ−２産生および／またはＴ細胞の増殖を含む使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内シグナル変換操作によるＴ細胞応答の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原特異的Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞上の細胞表面受容体と抗原付与細胞（ＡＰＣｓ）上のリガンドとの間の多重の相互作用によって誘発される。第１の相互作用は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体と抗原付与細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子／抗原ペプチド複合体のとの間の作用である。この相互作用は、Ｔ細胞における第１の、抗原特異的、活性化シグナルの引金となる。第１の活性化シグナルに加えて、Ｔ細胞応答を誘発するには、第２の、共刺激性（costimulatory）シグナルが必要である。適当な共刺激がないと、ＴＣＲシグナリングはＴ細胞にアネルギー状態を誘発する。アネルギーＴ細胞に対し、引き続いて抗原を適当に付与すると、特有の応答を起こさなくなる［シュワルツ，Ｒ．Ｈ．らの(１９９０)Science２４８：１３４９を参照］。
【０００３】
共刺激シグナルは、Ｔ細胞内でＣＤ２８などのＴ細胞表面受容体を通って発信される。たとえば、Ｔ細胞のサブ最適ポリクローナル刺激［たとえば、抗ＣＤ３抗体またはホルボールエステル（これらは第１の活性化シグナルを提供しうる）による刺激］は、ＣＤ２８と抗ＣＤ２８抗体の架橋によって有効化されることが説明されている［リンスリー，Ｐ．Ｓ．らの（１９９１）J.Exp.Med.１７３：７２１；ギミ，Ｃ．Ｄ．らの（１９９１）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.８８：６５７５］。さらに、ＣＤ２８の刺激は、Ｔ細胞クローンにおけるアネルギー状態の誘発を妨げることができる［ハーデイング，Ｆ．Ａ．の（１９９２）Nature３５６：６０７〜６０９］。ＣＤ２８に対する天然のリガンドはＡＰＣｓ上で同定されている。ＣＤ２８リガンドには、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ７０などのプロテインのＢ７ファミリーのメンバーが含まれる［フリードマン，Ａ．Ｓ．らの（１９８７）J.Immunol.１３７：３２６０〜３２６７；フリーマン，Ｇ．Ｊ．らの（１９８９）J.Immunol.１４３：２７１４〜２７２２；フリーマン，Ｇ．Ｊ．らの（１９９１）J.Exp.Med.１７４：６２５〜６３１；フリーマン，Ｇ．Ｊ．らの（１９９３）Science２６２：９０９〜９１１；アズマ，Ｍ．らの（１９９３）Nature３６６：７６〜７９；フリーマン，Ｇ．Ｊ．らの（１９９３）J.Exp.Med.１７８：２１８５〜２１９２］。ＣＤ２８に加えて、Ｂ７ファミリーのプロテインも、ＣＴＬＡ４と呼ばれるＣＤ２８に関連するＴ細胞上の他の表面受容体（これは、またＴ細胞共刺激においても役割を演じる）に結合することがわかっている［リンスリー，Ｐ．Ｓ．らの（１９９１）J.Exp.Med.１７４：５６１〜５６９；フリーマン，Ｇ．Ｊ．らの（１９９３）Science２６２：９０９〜９１１］。
【０００４】
ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４とＢ７ファミリープロテインの受容体：リガンド相互関係の解明および共刺激におけるこの相互作用の役割の解明によって、共刺激分子を結合するというＴ細胞表面受容体の細胞外相互作用処置などの治療用途へのアプローチが導かれた。たとえば、Ｂ７−１とＢ７−２の両方に結合し、それらのＣＤ２８／ＣＴＬＡ４との相互作用を遮断するＣＴＬＡ４Ｉｇ融合プロテインは、同種および異種移植における拒絶反応の阻害のために用いられている［ターカ，Ｌ．Ａ．らの（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.８９：１１１０２〜１１１０５；レンスコー，Ｄ．Ｊ．らの（１９９２）Science２５７：７８９〜７９２などを参照］。同様に、Ｂ７−１および／またはＢ７−２と反応する抗体が、インビトロにおけるＴ細胞の増殖およびＩＬ−２の産生の阻害およびインビトロにおける抗原に対する第１免疫応答の阻害に用いられている［ハスコック，Ｋ．Ｓ．らの（１９９３）Science２６２：９０５〜９０７；アズマ，Ｍ．らの（１９９３）Nature３６６：７６〜７９；パワーズ，Ｇ．Ｄ．らの（１９９４）Cell.Immunol.１５３：２９８〜３１１；チェン，Ｃ．らの（１９９４）J.Immunol.１５２：２１０５〜２１１４］。同時に、これらの研究では、Ｂ７−１およびＢ７−２などの共刺激性分子を結合するＴ細胞表面受容体が免疫応答を操作するための所望標的であることが示されている。
【０００５】
ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４とそれらのリガンド間の細胞外相互作用は、ある程度詳細に解明されているけれども、これらの分子の連結に続いてＴ細胞内で起きる細胞内のイベントについては少ししかわかっていない。Ｔ細胞の共刺激経路はシクロスポリンＡの阻害効果に対して耐性があるので、Ｔ細胞の共刺激は、ＴＣＲを経るシグナリングとは異なる細胞内シグナル変換経路をもつと考えられている［ジューン，Ｃ．Ｈ．らの（１９９０）Immunology Today１１：２１１〜２１６を参照］。プロテインチロシンのリン酸化は、Ｔ細胞内でＣＤ２８との連結により起こることがわかっており、プロテインチロシンキナーゼインヒビターであるハービマイシンＡがＣＤ２８誘発ＩＬ−２産生を阻害しうることが説明されている［ヴァンデンバーグ，Ｐ．らの（１９９２）J.Exp.Med.１７５：９５１〜９６０；ルー，Ｙ．らの（１９９２）Ｊ.Immunol.１４９：２４〜２９］。
【０００６】
ＣＤ２８受容体は、抗原受容体に関係するシグナルならびに抗原受容体とは無関係のシグナルの引金をひくことができることが研究によってわかっている。さらに、ＣＤ２８のオリゴマー形成の度合は、ＣＤ２８媒介シグナル変換において重要な決定要素である［リンスリー，Ｐ．Ｓ．およびレドベター，Ｊ．Ａ．の（１９９３）Annu.Rev.Immunol.１１：１９１およびレドベター，Ｊ．Ａ．らの（１９９０）Blood７５：１５３１］。抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いる研究から、カルシウムシグナリング、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性化、チロシンキナーゼ活性の増加およびｐ２１ｒａｓ活性化のすべてが、受容体結合後の早期に起こることがわかっている［ジューン，Ｃ．Ｈ．らの（１９９４）Immunology Today１５：３２１；およびラッド，Ｃ．Ｅ．らの（１９９４）ＩImmunol.Today１５：２２５］。プロテインチロシンキナーゼｐ７２ｉｔｋおよびｐ５６ｌｃｋ［オーガスト，Ａ．およびデュポン，Ｂ．の（１９９４）Biochem.Biophys.Res.Commun.１９９：１４６６およびオーガスト，Ａ．らの（１９９４）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９１：９３４７］は、ＣＤ２８とＴ細胞抗原受容体の両方によって活性化される、あるいはそれらと物理的に会合すると報告されている。ＣＤ２８媒介カルシウム、ｐ２１ｒａｓおよびｐ７０ｓ６キナーゼシグナルは休止期のＴ細胞よりも幼若化Ｔ細胞において顕著であり、抗原受容体シグナルと比較して一時的に遅い［レドベター，Ｊ．Ａ．らの（１９８７）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.８４：１３８４；ナンズ，Ｊ．Ｓ．らの（１９９３）Biochem.J.２９３：８３５；シーゲル，Ｊ．Ｎ．らの（１９９３）J.Immunol.１５１：４１１６；およびパイ，Ｓ．Ｖ．らの（１９９４）J.Immunol.２４：２３６４］。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞はその両方がＣＤ２８シグナルに応答するけれども、抗ＣＤ２８誘発カルシウムシグナルはＣＤ４＋Ｔ細胞に対して第１に制限される［アベ，Ｒ．Ｐ．らの（１９９５）J.Immunol.印刷中］。これらの研究は共に、ＣＤ２８シグナル変換が数個のシグナル変換カスケードに連結し、シグナルの性質がＴ細胞発達中に規定されることを示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞内シグナル変換操作によるＴ細胞応答の調節に関する。さらに詳しくは本発明は、Ｔ細胞の共刺激において起こる細胞内シグナリングイベントを操作することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、共刺激性分子を結合するＴ細胞の表面受容体の連結から得られる１種あるいはそれ以上の細胞内シグナルを阻害または刺激することによるＴ細胞応答の調節方法を含む。現在、ＣＤ２８受容体刺激によって、Ｔ細胞内にＤ３−ホスホイノシチドが産生されることが発見されている。さらに、Ｔ細胞内のホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性が、リンホカイン産生および細胞増殖などのＴ細胞応答を阻害しうることが発見されている。これらの発見は、共刺激性シグナル変換経路におけるＤ３−ホスホイノシチドの機能的役割を示し、Ｔ細胞応答を調節するための細胞内標的としてのホスファチジルイノシトール３−キナーゼを提供する。したがって、Ｄ３−ホスホイノシチドを含む細胞内シグナリングイベントは、共刺激シグナルの阻害およびそれによるＴ細胞不応答の誘発、あるいは共刺激シグナルの発信およびそれによるＴ細胞応答の産生のいずれかによって調節される。さらに、Ｔ細胞応答を阻害または刺激するのに用いうる、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼのインヒビターまたはアクチベーターを同定するための新規なスクリーニングアッセイも本発明の範囲に含まれる。
【０００９】
さらに本発明は、共刺激性分子を結合する表面受容体を発現するというＴ細胞による応答の阻害方法に関する。このような方法には、Ｔ細胞中のＤ３−ホスホイノシチドの産生を阻害する作用剤にＴ細胞を接触させることが包含される。ひとつの具体例においては、該作用剤は、真菌代謝物であるウォルトマンニンまたはバイオフラボノイドであるクエルセチンあるいはそれらの類縁体など（たとえばＬＹ２９４００２）のホスファチジルイノシトール３−キナーゼのインヒビターである。本発明方法の別の具体例においては、プロテインチロシンリン酸化などの共刺激に関連する異なる細胞内シグナルを阻害する作用剤の少なくとも１種にＴ細胞を接触させる。たとえば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびプロテインチロシンキナーゼのインヒビターにＴ細胞を接触させることができる。好ましいプロテインチロシンキナーゼのインヒビターはハービマイシンＡである。別法として、チロシンホスファターゼまたはチロシンホスファターゼのアクチベーターによってＴ細胞内でのプロテインチロシンリン酸化を阻害することができる。この具体例においては、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよび細胞チロシンホスファターゼに結合して活性化させる抗体などの分子（たとえばＣＤ４５またはＨｃｐｈ）にＴ細胞を接触させることができる。本発明方法の別の好ましい具体例においては、プロテインセリンキナーゼのインヒビターまたはセリンホスファターゼのアクチベーターにＴ細胞を接触させる。
【００１０】
さらに本発明は、Ｔ細胞内の共刺激に関連する細胞内シグナルを妨害しながらＴ細胞における第１の、抗原特異的シグナルの引金をひくことによってＴ細胞内に抗原に対する不応答を誘発する方法を提供する。共刺激性シグナル変換の妨害の結果として、抗原の存在下でＴ細胞が適当な共刺激性シグナルを受け取ることができず、抗原特異的不応答がＴ細胞内に誘発される。Ｔ細胞の不応答を誘発するために、Ｔ細胞における第１の活性化シグナルの刺激に適した形体の抗原およびＴ細胞内におけるＤ３−ホスホイノシチドの産生を阻害する作用剤に抗原特異的Ｔ細胞を接触させる。たとえば、ＡＰＣによって供与される抗原およびウォルトマンニンまたはクエルセチンあるいはそれらの誘導体または類縁体など（たとえばＬＹ２９４００２）のホスファチジルイノシトール３−キナーゼのインヒビターにＴ細胞を接触させることができる。さらに、プロテインチロシンリン酸化および／またはプロテインセリンリン酸化などの共刺激に関連する他の細胞内シグナルをＴ細胞内で阻害することができる。
【００１１】
Ｔ細胞応答の阻害方法およびＴ細胞不応答の誘発方法は、たとえば、移植を受ける被験体（臓器移植または骨髄移植など）または自己免疫疾患あるいは異常免疫応答に関連する他の疾病に罹患している被験体などの免疫応答を下降方向に調節することが望ましい状況において有用である。共刺激に関連するシグナル変換を阻害する作用剤（たとえばイノシトールリン酸３−キナーゼのインヒビターなど）を被験体に投与することができ、また別法として被験体からＴ細胞を採取し、本明細書に記載したようにインビトロで処理し、それを被験体に投与することもできる。
【００１２】
さらに本発明は、第１の活性化シグナルを受け、共刺激分子を結合する表面受容体を発現したＴ細胞によって応答を刺激する方法に関する。このような方法には、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼなどのＴ細胞中のＤ−３ホスホイノシチドの産生を刺激する作用剤にＴ細胞を接触させることが包含される。別の具体例においては、Ｄ３−ホスホイノシチドの産生を刺激する作用剤およびプロテインチロシンリン酸化などの共刺激に関連する異なる細胞内シグナルを刺激する作用剤の少なくとも１種にＴ細胞を接触させる。たとえば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよび過バナジウム酸塩などのプロテインチロシンキナーゼのアクチベーターにＴ細胞を接触させることができる。本発明の別の具体例においては、さらに、プロテインセリンキナーゼを活性化する作用剤にＴ細胞を接触させる。別法として、ＣＤ４５またはＨｃｐｈなどの細胞ホスファターゼのインヒビターをＰＩ３Ｋアクチベーターとともに用いることができる。さらなる本発明の他の具体例においては、抗原特異的Ｔ細胞を抗原およびＴ細胞内でＤ−３ホスホイノシチドの産生を刺激する作用剤に接触させることによって抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激し、それによってＴ細胞内における第１の活性化シグナルおよび共刺激性シグナルの両方を刺激する。本発明の別の具体例においては、１種またはそれ以上のプロテインチロシンおよび／またはプロテインセリンキナーゼを活性化する作用剤に抗原特異的Ｔ細胞を接触させることによって、抗原特異的Ｔ細胞応答をさらに刺激する。
【００１３】
Ｔ細胞応答を刺激する方法は、免疫応答を上昇方向に調節することが望ましい状況において有用である。たとえば、腫瘍ができている被験体における腫瘍に対する応答、あるいは被験体の病原体（たとえばバクテリア、ＨＩＶなどのウイルス、真菌、寄生虫など）に対する応答を刺激することができる。さらに、本発明方法は、ワクチン接種の効能を増強するのに用いることができる。共刺激に関連する細胞内シグナルを刺激する作用剤（イノシトールホスファターゼ３−キナーゼのアクチベーターなど）を被験体に投与するかまたは別法としてインビトロにてＴ細胞を刺激し、次いでそれを被験体に投与することができる。
【００１４】
本発明はさらに、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼのインヒビターまたはアクチベーターを同定するためのスクリーニングアッセイに関する。ひとつの具体例においては、共刺激性分子を結合する細胞表面受容体を発現するＴ細胞（ＣＤ２８など）が用いられる。インヒビターを同定するには、Ｔ細胞における受容体に関連する細胞内シグナル変換経路を、被検作用剤の存在下に刺激し、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの少なくとも１種の産生を阻害する能力に基づいてインヒビターを同定する。アクチベーターを同定するには、被検作用剤にＴ細胞を接触させ、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの少なくとも１種の産生を刺激する能力に基づいてアクチベーターを同定する。
本発明はさらに、ＣＤ２８を介して刺激されたＴ細胞におけるＣＤ２８に関連するおよそ６７ｋＤａの新規なチロシン−リン酸化プロテインに関する。該プロテインの活性化あるいは該プロテインのＣＤ２８との相互作用を遮断する方法、または別法として、該６７Ｋプロテインの活性化あるいは該プロテインのＣＤ２８との相互作用を刺激する方法もまた本発明に包含される。
【００１５】
本発明は、Ｔ細胞上の表面受容体の共刺激分子への結合などの共刺激によってＴ細胞において産生される細胞内シグナルを調節することによるＴ細胞応答の調節方法に関するものである。さらに詳しくは本発明は、共刺激性シグナルを阻害または刺激し、それによってＴ細胞応答を阻害または刺激するためのＴ細胞におけるＤ−３ホスホイノイシチド産生の調節に関する。共刺激に関連するシグナル変換の妨害による共刺激性シグナルの阻害を利用してさらに、Ｔ細胞不応答を誘発することができる。本発明は、ＣＤ２８表面受容体を介するＴ細胞の刺激によってＴ細胞にＤ−３ホスホイノシチドが産生され、ＣＤ２８が連結したＴ細胞においてホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（本明細書においてＰＩ３Ｋとも称する）のインヒビターがＤ−３ホスホイノシチドの産生を阻害するという発見に少なくとも部分的には基づいている。さらに本発明は、Ｔ細胞におけるＰＩ３Ｋ活性を阻害すると、サイトカイン産生および細胞増殖などのＴ細胞応答が阻害されるという発見に少なくとも部分的には基づいている。
【００１６】
したがって、さらに本発明は、シグナル変換に関連する細胞内シグナル変換を妨害することによるＴ細胞の応答を阻害する方法に関する。ひとつの具体例においては、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生を阻害する作用剤に、共刺激性分子を結合する細胞表面受容体を発現しているＴ細胞を接触させることによって細胞内シグナルを阻害する。語句「共刺激性分子に結合する細胞表面受容体を発現しているＴ細胞」とは、ＣＤ２８および／またはＣＲＬＡ４、あるいはＢ７−１、Ｂ７−２または他のＢ７ファミリーのメンバーなどの共刺激性分子を結合する能力をもつ他の受容体を発現しているＴ細胞を意味する。
【００１７】
Ｔ細胞による「応答」とは、Ｔ細胞における第１の活性化シグナルおよび共刺激性シグナルの引金をひくことによって生じるＴ細胞応答を意味し、リンホカインの産生（ＩＬ−２産生など）およびＴ細胞の増殖が含まれる。Ｔ細胞応答の阻害には、応答の完全遮断（無応答など）または応答の大きさの程度の減少（応答の部分的阻害など）も含まれる。
「Ｄ−３ホスホイノシチド」とは、イノシトール環のＤ−３位でリン酸化されるホスファチジルイノシトールの誘導体を意味し、ホスファチジルイノシトール（３）−モノリン酸塩（ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ）、ホスファチジルイノシトール（３，４）−ビスリン酸塩（ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２）およびホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリリン酸塩（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３）などの化合物が含まれる。
Ｄ−３ホスホイノシチドはホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性によって細胞内的に産生される。ＰＩ３Ｋは、そのＳＨ２ドメインを介してチロシル−リン酸化プロテインを結合する８５ｋＤａのサブユニットおよび１１０ｋＤａの触媒サブユニットからなるヘテロ二量体である。ＰＩ３Ｋは最初、ホスファチジルイノシトール、ＰｔｄＩｎｓ（４）ＰおよびＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２のイノシトール環のＤ−３位をリン酸化する脂質キナーゼとして同定された。最近の２つの研究では、ＰＩ３Ｋが、事実、脂質およびセリンキナーゼ活性の両方を有する２重特異的キナーゼであることが説明されている［ジャンド，Ｒ．らの（１９９１）EMBO J.１３：５２２およびカーペンター，Ｃ．Ｌ．らの（１９９３）Mol.Crll Biol.１３：１６５７］。
【００１８】
したがって、ひとつの具体例においては、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生を阻害する作用剤は、ＰＩ３Ｋの活性を阻害する作用剤である。Ｔ細胞におけるＰＩ３Ｋ活性を阻害する好ましい作用剤は、真菌代謝物であるウォルトマンニンまたはその誘導体あるいは類縁体である。ウォルトマンニンはＴ・ウォルトマンニイ（T.wortmannii）（協和発酵株式会社）またはＰ．フミクロスム（P.fumiculsum）(シグマ)から誘導されるインヒビターである。ウォルトマンニン誘導体または類縁体には、ＰＩ３ＫおよびＴ細胞応答を阻害する能力をもつウォルトマンニンに構造的に関連する化合物が含まれる。ウォルトマンニン誘導体よび類縁体の例は、ワイシンガー，Ｄ．らの（１９７４）Experientia３０：１３５〜１３６；クロッス，Ａ．らの（１９８１）J.Med.Chem.２４：１４６５〜１４７１；およびバッジョリーニ，Ｍ．らの（１９８７）Exp.Cell Res.１６９：４０８〜４１８に開示されている。使用しうるその他のＰＩ３Ｋ活性のインヒビターは、バイオフラボノイドであるクエルセチンまたはその誘導体あるいは類縁体である。クエルセチン誘導体または類縁体には、ＰＩ３ＫおよびＴ細胞応答を阻害する能力をもつクエルセチンに構造的に関連する化合物が含まれる。クエルセチン誘導体および類縁体の例は、ブラホス，Ｃ．Ｊ．らの（１９９４）J.Biol.Chem.２６９：５２４１〜５２８４に開示されている。ＰＩ３Ｋ活性を阻害する好ましいクエルセチン誘導体は、ＬＹ２９４００［２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］（リリー、インデイアナポリス、ＩＮ）（上記ブラホスらに記載）。別法として、後記方法で同定される他のＰＩ３Ｋインヒビターを用いることもできる。
【００１９】
本発明の別の態様としては、共刺激に関連する２種またはそれ以上の細胞内シグナリングイベントの妨害によるＴ細胞応答の阻害が含まれる。たとえば、ＣＤ２８の刺激によってＴ細胞におけるプロテインチロシンリン酸化が起こることが示されている［ヴァンデンバーグ，Ｐ．らの（１９９２）J.Exp.Med.１７５：９５１〜９６０；ルー，Ｙ．らの（１９９２）J.Immunol.１４９：２４〜２９などを参照］。したがって、ひとつの具体例においては、Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞における少なくとも１種のＤ−３ホスホイノシチドの産生を阻害する第１作用剤およびＴ細胞におけるチロシンリン酸化を阻害する第２作用剤にＴ細胞を接触させることによって阻害される。たとえば、Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ活性を阻害する作用剤およびプロテインチロシンキナーゼ活性を阻害する作用剤の両方に接触させることができる。好ましいプロテインチロシンキナーゼインヒビターは、srcプロテインチロシンキナーゼを阻害するものである。ひとつの具体例においては、該srcプロテインチロシンキナーゼインヒビターは、ハービマイシンＡまたはその誘導体もしくは類縁体である。ハービマイシンＡの誘導体もしくは類縁体には、構造的にハービマイシンＡに関連し、プロテインチロシンキナーゼを阻害する能力をもつ化合物が含まれる。別の具体例においては、プロテインチロシンリン酸化を阻害する作用剤は、プロテインチロシンホスファターゼまたはプロテインチロシンホスファターゼのアクチベーターである。Ｔ細胞におけるチロシンホスファターゼ活性の増加によって、プロテインチロシンリン酸化の正味量が減少する。プロテインチロシンホスファターゼは、Ｔ細胞内においてはＣＤ４５またはＨcphなどの細胞プロテインチロシンホスファターゼとなりうる。Ｔ細胞上の細胞表面チロシンホスファターゼの活性は、ホスファターゼに結合し、その活性を刺激する分子に、Ｔ細胞を接触させることによって活性化することができる。たとえば、ＣＤ４５に対する抗体を用いて、ＣＤ４５をその表面に発現するＴ細胞におけるチロシンホスファターゼの活性を刺激することができる。したがって、ひとつの具体例においては、Ｔ細胞内においてプロテインチロシンリン酸化を阻害する作用剤は、抗ＣＤ４５抗体またはＣＤ４５の活性を刺激する能力をもつそのフラグメントである。抗体フラグメントの例として、ＦabおよびＦ(ab')２フラグメントが挙げられる。抗体またはそのフラグメントは、多量体化または固定化などの刺激性形体で提供することができる。
【００２０】
共刺激に関連する他の細胞内シグナルは、Ｄ−３ホスホイノシチド産生の阻害とともに阻害され、その結果としてＴ細胞応答を阻害することができる。たとえば、ＣＤ２８の連結は、ホスホリパーゼＣの活性の増加［ナン，Ｊ．らの（１９９３）Ｂiochem．Ｊ．２９３：８３５〜８４２を参照）、および細胞内カルシウム濃度の増加［レドベター，Ｊ.Ａ．らの（１９９０）Ｂlood  ７５：１５３１〜１５３９および実施例を参照］に関連することがわかっている。したがって、ＰＩ３Ｋ活性を阻害する第１作用剤およびホスホリパーゼＣ活性を阻害および／または細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する第２作用剤に、Ｔ細胞を接触させる。実施例に示すように、チロシンキナーゼインヒビターであるハービマイシンＡもまたＴ細胞におけるＣＤ２８誘発性カルシウム代謝を阻害する。
【００２１】
さらに、実施例に示すように、ＣＤ２８を介する刺激の結果として、ハービマイシン耐性のＴ細胞によるＩＬ−２の産生が起こり、これは、関係するシグナル変換経路に、プロテインセリンキナーゼなどのさらなるプロテインキナーゼが含まれることを示唆する。
【００２２】
いくつかの研究によって、プロテインセリンキナーゼが、ＣＤ２８に関連するシグナル変換経路に含まれることが示されている［シーゲル，Ｊ.Ｎ．らの（１９９３）Ｊ．Ｉmmunol．１５１：４１６〜４１２７およびパイ，Ｓ.Ｖ．らの（１９９４）Ｊ．Ｉmmunol．２４：２３６４］。かくして、本発明の特定の具体例においては、ＰＩ３Ｋ活性を阻害する作用剤およびセリンキナーゼを阻害する作用剤に、Ｔ細胞を接触させることによって、Ｔ細胞応答が阻害される。別の具体例においては、このようなＴ細胞をさらに、プロテインチロシンキナーゼを阻害する作用剤に接触させる。さらに別の具体例においては、ＰＩ３Ｋ、プロテインチロシンキナーゼ、プロテインセリンキナーゼ、ホスホリパーゼＣ活性を阻害する作用剤の種々の組合せ、または細胞内カルシウムの増加を阻害する作用剤に、Ｔ細胞を接触させることによってＴ細胞応答を阻害する。
Ｔ細胞応答は、本発明方法にしたがってインビトロまたはインビボのいずれにおいても阻害することができる。たとえば、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生を阻害する作用剤を、Ｔ細胞応答を阻害するのに十分な用量および期間において被験体に投与することができる。別法として、被験体からＴ細胞を採取し、インビトロにてＴ細胞を作用剤に接触させ、被験体に再投与することができる。「被験体」とは、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスおよびそれらのトランスジェニック種などの哺乳動物などの免疫応答を起こす動物を意味する。Ｔ細胞応答を阻害しうる被験体には、免疫応答を下降調節することが望ましい被験体が含まれる。下降調節とは、リンホカイン産生およびＴ細胞増殖などのＴ細胞応答の部分的および完全阻害を意味する。たとえば、自己免疫疾患または免疫応答異常に関連する他の疾病の被験体、あるいは骨髄移植または他の臓器移植などの移植を受ける者に対し、本発明方法を適用することができる。
【００２３】
本発明のひとつの具体例においては、Ｔ細胞内において共刺激性シグナルを阻害することによって抗原特異的Ｔ細胞不応答を誘発する。したがって、本発明の別の態様は、抗原に対するＴ細胞不応答を誘発する方法である。本明細書で用いる「Ｔ細胞不応答」とは、抗原（または抗原性部分）に対して、さらされた時にＴ細胞によるＴ細胞応答（増殖、リンホカイン分泌またはエフェクター機能の誘発など）が減少するかまたは応答しなくなり、Ｔ細胞が不応答になることを意味する。「Ｔ細胞不応答」および「Ｔ細胞アネルギー」は、本明細書においては互換的に用いられる。抗原に対する不応答は、Ｔ細胞における抗原特異的第１活性化シグナル（ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介する活性化など）が、共刺激性シグナルが無い状態で引金を引かれることによって誘発することができる。本発明方法においては、共刺激に関連する細胞内シグナルを妨害する作用剤に、Ｔ細胞を接触させることによって、Ｔ細胞における共刺激性シグナルを遮断する。特に、共刺激性シグナルを阻害するためのＴ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生を阻害する作用剤の存在下に、Ｔ細胞における第１の活性化シグナルの引金をひくのに適した形体の抗原に、抗原特異的Ｔ細胞（すなわち、抗原を認識するＴＣＲを発現しているＴ細胞）を接触させることによって、抗原に対するＴ細胞不応答を誘発することができる。該抗原は、たとえば、自己免疫反応を刺激する抗原または移植された細胞の拒絶反応を刺激するアロ抗原である。おそらく、Ｄ−３ホスホイノシチドの産生を阻害する作用剤が、ウォルトマンニンまたはクエルセチンなどのＴ細胞におけるＰＩ３Ｋまたはその誘導体もしくは類縁体（ＬＹ２９４００２など）の活性を阻害する。共刺激に関連する他の細胞内シグナルを阻害する追加の作用剤（前述）もまた、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生を阻害する作用剤とともに用いることができる。たとえば、ＰＩ３ＫならびにハービマイシンＡなどのプロテインチロシンキナーゼに、Ｔ細胞を接触させることができる。
【００２４】
Ｔ細胞不応答を誘発するために、Ｔ細胞において第１の活性化シグナルの引金をひくのに適した形体の抗原に、抗原特異的Ｔ細胞を接触させるが、このことは、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナルが引金を引かれるように抗原をＴ細胞に対して付与することを意味する。たとえば、ＭＨＣ分子に関連して細胞を付与する抗原によって、Ｔ細胞に対して抗原を付与することができる。Ｂ細胞、マクロファージ、モノサイト、樹状細胞、ランゲルハンス細胞またはＴ細胞に対して抗原を付与するその他の細胞などのシンジェネティックな抗原付与細胞を、抗原付与細胞がＴ細胞に対して抗原を付与するような抗原の存在下に、Ｔ細胞とともにインキュベートすることができる。別法として、アロ抗原に対するアネルギーを誘発するために、Ｔ細胞に対するアロ抗原を付与するアロジェネティックな細胞とともにＴ細胞をインキュベートすることができる。
【００２５】
インビボにおいて抗原に対するＴ細胞不応答を誘発するために、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生を阻害する作用剤を、抗原に対するＴ細胞不応答を誘発するのに十分な用量と期間で、被験体に投与する。作用剤投与に続いて、抗原（たとえば内因的に細胞によって発現される自己抗原）を抗原特異的Ｔ細胞に内因的に接触させる。別法として、抗原に対する不応答を、インビトロにて誘発することができる。この場合、Ｔ細胞を被験体から採取し、インビトロにて抗原ならびに抗原不応答を誘発する作用剤に接触させ、次いで被験体にＴ細胞を再投与する。たとえば、移植片を移植を受ける者に移植する前に、移植を受ける者から採取したＴ細胞を、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチド産生を阻害する作用剤（たとえばウォルトマンニン、クエルセチン、ＬＹ２９４００２）および／または共刺激に関連する他の細胞内シグネルの１種あるいはそれ以上を阻害する１種あるいはそれ以上の作用剤とともに移植片ドナーからのアロジェニックな細胞に接触させて、アロ抗原特異的Ｔ細胞不応答を誘発することができる。次いで、ドナーの抗原に対して不応答になった移植を受ける者のＴ細胞を、該移植を受ける者に再投与する。別法として、骨髄移植の場合、移植される骨髄（いずれかの残留Ｔ細胞を含む）を、インビトロにて、Ｄ−３ホスホイノシチドの産生および／または他の共刺激に関連する細胞内シグナルを阻害する作用剤とともに骨髄移植を受ける者のアロジェネティックな細胞に接触させて、移植を受ける者のアロ抗原に対するドナーＴ細胞における不応答を誘発する。この前処理によって移植片と移植を受けた者の間で生じる疾患を阻害することができる。
【００２６】
該Ｔ細胞不応答誘発方法は、臓器移植および骨髄移植などの移植、および自己免疫疾患および異常免疫応答に関連する他の疾病などの免疫応答を下降調節することが望ましい状況において治療的に適用することができる。自己免疫疾患または不適当あるいは異常免疫応答に関連する他の疾病の例として、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、乾せん性関節炎、アレルギー、接触性皮膚炎、乾せん、癩病性逆反応、癩病性結節性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、全身性紅斑性狼瘡、急性壊死性出血性脳障害、突発性両側性進行性感覚神経聴力損失、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、突発性血小板血症、多発性軟骨炎、強皮症、ウェジナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スチーブン−ジョンソン症候群、突発性スプルー、偏平苔せん、クローン病、グレイブス眼病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、原発性若年性糖尿病、シェーグレン症候群関連乾き眼、後ぶどう膜炎および間質性肺繊維症が挙げられる。
【００２７】
本発明の他の態様は、共刺激性シグナルをＴ細胞に与えることによってＴ細胞応答を刺激することに関する。第１活性化シグナルにつづく共刺激シグナルの伝達によってＴ細胞応答を発生させることができる。本発明方法においては、共刺激性シグナルは、Ｔ細胞においてＤ−３ホスホイノシチドの産生を刺激する作用剤に、第１活性化シグナルを受けたＴ細胞を接触させることにより付与される。Ｔ細胞の「応答」とは、Ｔ細胞（ＩＬ−２など）による少なくとも１種のリンホカインの細胞および／またはＴ細胞の増殖を意味する。第１活性化シグナルは、抗ＣＤ３抗体またはＭＨＣ／抗原複合体などのＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介してＴ細胞を刺激すること、またはホルボールエステル（ＰＭＡ）などのこの刺激を模倣する作用剤を用いることによってＴ細胞に伝達される。本明細書中で用いる語句「作用剤」とは、Ｔ細胞表面受容体と共刺激分子の間に相互作用を要求することなくＴ細胞において共刺激シグナルを刺激する化学薬品および他の薬剤化合物を意味する。たとえば、該作用剤は、細胞内的に作用して、共刺激関連シグナルを刺激する。ひとつの具体例においては、該作用剤は非プロテイン性化合物である。本発明方法に用いる該作用剤は、天然の受容体：リガンド共刺激メカニズムをバイパスすることを意図しており、語句「作用剤」には、Ｂ７−１および／またはＢ７−２などの天然のリガンドＣＤ２８／ＣＴＬＡ４を発現している細胞を含まない。
【００２８】
おそらく、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生は、ＰＩ３ＫのアクチベーターにＴ細胞を接触させることによって刺激される。ＰＩ３Ｋの活性化は、たとえば、後述の方法によって同定することができる。共刺激に関連する１種またはそれ以上の他の細胞内シグナルを刺激する追加の作用剤を、Ｄ−３ホスホイノシチド産生のアクチベーターとともに用いることができる。たとえば、ＰＩ３Ｋを刺激する第１作用剤およびＴ細胞内におけるプロテインチロシンリン酸化を刺激する第２作用剤の両方に、Ｔ細胞を接触させる。Ｔ細胞におけるプロテインチロシンリン酸化は、過バナジン酸塩などのプロテインチロシンキナーゼのアクチベーターに、Ｔ細胞を接触させることによって刺激することができる［オシア，Ｊ．Ｊ．らの（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８９：１０３０６〜１０３１０；およびシーリスト，Ｊ．Ｐ．の（１９９３）J.Biol.Chem.２６８：５８８６〜５８９３を参照］。たとえば、ＰＩ３Ｋを刺激する第１作用剤、およびプロテインセリンキナーゼのアクチベーターにＴ細胞を接触させるなどのＴ細胞内におけるプロテインセリンリン酸化を刺激する第２作用剤にＴ細胞を接触させてもよい。別の具体例においては、プロテインチロシンリン酸化を刺激する第３の作用剤にさらにＴ細胞を接触させる。別法として、ＰＩ３Ｋのアクチベーター、およびＴ細胞における正味のプロテインチロシンリン酸化を増加するためのＣＤ４５などの細胞プロテインチロシンホスファターゼの活性および／または細胞プロテインセリンホスファターゼの活性を阻害する作用剤の両方にＴ細胞を接触させる。本発明には、ホスホリパーゼＣ活性の刺激および／または細胞内カルシウム濃度の増加などのＴ細胞の共刺激に関連する他の細胞内シグナルを刺激することも含まれる。
【００２９】
本発明の他の具体例は、抗原特異的Ｔ細胞による抗原に対する特異的応答を刺激する方法を提供する。Ｔ細胞応答を刺激するために、抗原ならびにＴ細胞においてＤ−３ホスホイノシチドの産生を刺激する作用剤に、抗原特異的Ｔ細胞を接触させ、それによってＴ細胞における共刺激シグナルの引金をひく。おそらく、Ｔ細胞においてＤ−３ホスホイノシチドの産生を刺激する作用剤はＰＩ３Ｋのアクチベーターである。ＭＨＣ分子に関連の、Ｔ細胞における第１の活性化シグナルを刺激するのに適した形体の抗原に、Ｔ細胞を接触させる（ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するなど）。抗原付与細胞（Ｂ細胞、マクロファージ、モノサイト、樹状細胞、ランゲルハンス細胞またはＴ細胞に対して抗原を付与するその他の細胞など）を、抗原（可溶性抗原など）の存在下にＴ細胞とインキュベートすることができる。別法として、対象となる抗原を発現している細胞をＴ細胞とインキュベートすることができる。たとえば、腫瘍関連抗原を発現している腫瘍細胞を、Ｔ細胞ならびに細胞内共刺激シグナルを誘発する作用剤とともにインキュベートして腫瘍特異的応答を誘発することができる。別法として、ウイルスなどの病原性抗原を付与する病原体に感染した細胞を、作用剤の存在下にＴ細胞とインキュベートすることができる。Ｔ細胞においてＤ−３ホスホイノシチドの産生を刺激することに加えて、たとえば過バナジン酸塩またはセリンキナーゼのアクチベーターなどのプロテインチロシンキナーゼのアクチベーターなどのＣＤ２８連結に関連する１種またはそれ以上の追加の細胞内シグナルを刺激する１種またはそれ以上の作用剤に、Ｔ細胞を接触させることができる。
【００３０】
ＰＩ３ＫのアクチベーターなどのＴ細胞においてＣＤ２８関連細胞内シグナルを刺激する作用剤を、インビボにて被検体に投与することができる。またあるいは別法として、被検体から採取したＴ細胞をインビトロにて刺激し、被検体に再投与してもよい。Ｔ細胞を刺激する方法は、免疫応答を上昇調節することが望ましい状況（たとえば応答の誘発または存在する応答の強化）において治療上有用である。たとえば、該方法を用いて腫瘍関連抗原に対するＴ細胞応答を強化することができる。被検体からの腫瘍細胞は、典型的に腫瘍関連抗原を発現するが、Ｔ細胞における共刺激シグナルを刺激することはできない（たとえば、それらは共刺激分子の発現が欠如しているからである）。したがって、被検体からのＴ細胞ならびにＴ細胞においてＤ−３ホスホイノシチドを刺激する作用剤に、腫瘍細胞を接触させてＴ細胞における共刺激の引金をひくことができる。別法として、本明細書中に記載したようにＴ細胞を刺激して、病原性作用剤（ウイルス（ヒト免疫不全ウイルスなど）、バクテリア、寄生虫および真菌など）に対する応答性を誘発または強化することができる。さらに、このような病原性作用剤に対するワクチンの効能を増強することもできる。たとえば、Ｔ細胞においてＤ−３ホスホイノシチドの産生を刺激する作用剤を、病原性作用剤に感染した被検体に投与することができ、またはワクチンとともに投与して、ワクチンの抗原に対するＴ細胞の応答性を強化することができる。別法として、病原性作用剤からの抗原を発現する抗原付与細胞ならびに共刺激に関連する細胞内シグナルを刺激する作用剤（ＰＩ３Ｋのアクチベーター）とともに、Ｔ細胞をインビトロで培養することができる。
【００３１】
さらに本発明のＴ細胞応答を刺激する方法は、ＣＤ２８および／または共刺激に関連する他の細胞表面分子（ＣＴＬＡ４など）を介するシグナル変換が不良である患者に適用することができる。たとえば、突発性血小板減少症を患っている患者が、おそらく先天性欠陥であろうが、ＣＤ２８介在性シグナル変換不良を呈することが報告されている［ペレッツ−ブラス，Ｍ．らの（１９９１）Clin.Exp.Immunol.８５：４２４〜４２８］。ＣＤ２８シグナリング能力不全の患者においては、正常ＣＤ２８連結によって生成する細胞内シグナルを刺激する１種またはそれ以上の作用剤を、患者のＴ細胞に接触させることによって、該不良をバイパスし、ＣＤ２８依存性Ｔ細胞活性化を回復することが可能である。たとえば、ＣＤ２８連結によるＤ−３ホスホイノシチドの産生が低下または欠如していることによる不良をもつ患者を、Ｔ細胞においてＤ−３ホスホイノシチドの産生を刺激する作用剤に患者からのＴ細胞を接触させることによって、治療することができる。
【００３２】
本発明のさらに別の態様は、ＰＩ３Ｋのインヒビターおよびアクチベーターを同定するためのスクリーニングアッセイであり、それらを用いてＴ細胞応答をそれぞれ阻害または刺激することができる。ＰＩ３Ｋは調節および触媒サブユニットからなるヘテロ二量体である。基質としてＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を優先的に用い、ウォルトマンニンによって阻害しうる２つの形体の酵素が記載されている［オツ，Ｍ．らの（１９９１）Cell６５：９１〜１０４；ヒュー，Ｐ．らの（１９９３）Mol.Cell.Biol.１３：７６７７〜７６８８；およびハイルス，Ｉ．Ｄ．らの（１９９２）Cell７０：４１９を参照］。基質としてＰｔｄＩｎｓを優先的に用い、ウォルトマンニンによって阻害されない別の形体の酵素もまた記載されている［スティーブンス，Ｌ．らの（１９９４）Curr.Biol.４：２０３〜２１４を参照］。ＰＩ３Ｋの特異的インヒビターまたはアクチベーターの同定は、望まない逆の副作用を回避するための共刺激シグナルに必要とされるＰＩ３Ｋの好適な細胞内形体に対して特異的でなければならないことが認識されよう。したがって、共刺激に必要とされるＰＩ３Ｋの形体(たとえば、ウォルトマンニンによっても阻害しうる形体)を特異的に阻害または活性化する作用剤が好ましい。
【００３３】
ひとつの具体例において、本発明のスクリーニングアッセイは、Ｔ細胞において少なくとも１種のＤ−３ホスホイノシチド（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３が好ましい）の産生をそれぞれ阻害または刺激する、ＰＩ３Ｋのインヒビターまたはアクチベーター能力に基づいている。ＰＩ３Ｋのインヒビターを同定するために、被検基質の存在あるいは不在下に、共刺激分子を結合する細胞表面受容体を介してＴ細胞を刺激する（すなわち、共刺激シグナルを受容したＴ細胞）。好ましくは、ＣＤ２８を発現するＴ細胞をアッセイに用いる。別法として、ＣＴＬＡ４を発現するＴ細胞を用いてもよい。ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４に対するリガンドに、Ｔ細胞を接触させることによって、Ｔ細胞における共刺激シグナルを刺激することができる。該リガンドは、Ｔ細胞表面受容体に対する抗体よりもむしろ膜結合Ｂ７−１またはＢ７−２などの生理学的リガンドであることが好ましい。天然にＢ７−１および／またはＢ７−２を発現する細胞を用いることができるが、共刺激分子を発現するようにトランスフェクトされた細胞（ＣＨＯ細胞など）を用いるのが、より好ましい。ＰＩ３Ｋのインヒビターの存在下に、共刺激分子（ＣＤ２８など）を結合する表面受容体を介するＴ細胞を刺激する結果として、該インヒビターの不在下における刺激と比較して、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生が低減化される。Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生は、当業者には公知の適当な方法のいずれかによって測定することができる。たとえば、高圧液体クロマトグラフィーによって、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生を測定することができる（実施例に記載）。別法として、薄層クロマトグラフィーによってＤ−３ホスホイノシチドの産生を評価することができる［オカダ，Ｔ．らの（１９９４）J.Biol.Chem.２６９：３５６３〜３５６７］。細胞内産生を評価しえたＤ−３ホスホイノシチドとして、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２およびＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３が挙げられる。被検基質の存在下に、Ｔ細胞におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の産生を検出するのが好ましい。
【００３４】
ＰＩ３Ｋのアクチベーターを同定するために、共刺激分子を結合する細胞表面受容体を発現するＴ細胞を、被検基質と接触させる。Ｔ細胞において少なくとも１種のＤ−３ホスホイノシチド（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３が好ましい）の産生を刺激する能力に基づいてＰＩ３Ｋのアクチベーターを同定する。したがって、ＰＩ３Ｋアクチベーターの存在下において、Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの量は、基質不在下におけるＴ細胞中のＤ−３ホスホイノシチドの量と比較して増加する。Ｔ細胞におけるＤ−３ホスホイノシチド［ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２およびＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３］の産生は、高圧液体クロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィーなどの標準的方法によって評価することができる。
【００３５】
本発明スクリーニングアッセイの別の具体例においては、細胞から単離されるＰＩ３Ｋの活性を直接阻害または刺激するための基質の能力を評価し、次いで、ＰＩ３Ｋのインヒビターまたはアクチベーターとして同定された基質を、Ｔ細胞に接触させて、Ｔ細胞応答を阻害または刺激する基質の能力を決定する。たとえば、単離されたＰＩ３Ｋを、放射標識されたホスフェートドナーおよび被検物質の存在下に、基質（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２など）とともにインキュベートする。ＰＩ３Ｋのキナーゼ活性のインヒビターは、インヒビター不在下におけるリン酸化と比較して、基質のリン酸化を低下させるであろう。一方、アクチベーターの不在下におけるリン酸化と比較して、アクチベーターは基質のリン酸化を増加するであろう。次いで、このように同定されたインヒビターまたはアクチベーターを、Ｔ細胞に接触させて、インヒビターまたはアクチベーターのＴ細胞応答（ＩＬ−２の産生など）の阻害または刺激能力をそれぞれ決定する。
【００３６】
さらに本発明は、実施例に記載するように、ジャーカット細胞および末梢血液Ｔ細胞におけるＣＤ２８に関連する約６７ｋＤａのホスホチロシンプロテインに関する。６７Ｋと称するこの新規なタンパク質は、ｉｔｋ／ｅｍｔプロテインチロシンキナーゼ、ｌｃｋおよびＰＩ３Ｋとは異なると考えられ、ＣＤ２８に関連するシグナル変換経路に含まれるようである。本発明の特定の具体例において、該６７Ｋが含まれるＣＤ２８シグナル変換経路は、たとえば、そのリン酸化の遮断などによって６７Ｋの活性化を遮断することによって阻害される。別法として、該６７Ｋに関連するシグナル変換経路は、６７ＫとＣＤ２８の相互作用を阻害することによって遮断される。本発明の別の具体例においては、６７Ｋに関連するシグナル変換経路は、６７Ｋを活性化することによるかまたは６７ＫとＣＤ２８の相互作用を刺激することによって刺激される。６７Ｋを含むシグナル変換経路の活性化または阻害を、上述の具体例のいずれかによって行うことができ、それによってＴ細胞応答が遮断されるかまたは別法においてはＴ細胞応答が刺激される。
【００３７】
他の具体例
Ｔ細胞以外にも、ＣＤ２８をその表面に発現する他のタイプの細胞が文献に記載されている。このような細胞のタイプには、プラズマ細胞［コズボール,Ｄ.らの(１９８７)J.Immunol.１３８：４１２８〜４１３２］および骨髄誘導マスト細胞が含まれる。ＣＤ２８を介する他のＣＤ２８＋細胞の刺激によっても、該細胞においてＤ−３ホスホイノシチドの産生および特異的細胞応答の発生が誘導される。本発明方法による、これらの細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの阻害および活性化もまた、他のＣＤ２８＋細胞型による応答を阻害または刺激するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】第１図は、ＣＤ２８＋Ｔ細胞（ジャーカット細胞）における、該細胞を培地、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２８抗体で刺激した後のホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリリン酸塩の産生を示すグラフであり、ＣＤ３またはＣＤ２８を介した刺激におけるホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化の独特の動力学を表している。
【図２】第２図は、ＣＤ２８＋Ｔ細胞（ジャーカット細胞）における、該細胞をＢ７−１またはＢ７−２を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞で刺激した後のホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリリン酸塩の産生を示すグラフであり、Ｂ７−１またはＢ７−２による刺激におけるホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化の独特の動力学を表している。
【図３】第３図は、ＣＤ２８＋Ｔ細胞（ジャーカット細胞）における、該細胞をＢ７−２を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞で刺激した後のホスファチジルイノシトール（３,４,５）−トリリン酸塩の産生に関する種々の濃度のウォルトマンニン(０〜１００ｍＭ)の効果を示すグラフである。
【図４】第４図は、ＣＤ２８と抗ＣＤ２８抗体の連結によって誘発されたＴ細胞におけるカルシウム代謝速度に関するウォルトマンニンまたはハービマイシンの効果を示すグラフである。
【図５】第５図は、ジャーカット細胞をＣＨＯ−ｎｅｏ、ＣＨＯ−Ｂ７−１またはＣＨＯ−Ｂ７−２細胞のいずれかとともにインキュベートする細胞−コンジュゲートアッセイから得た一連のフローサイトメトリーのプロフィールである。カルシウム代謝速度をＹ軸に、細胞コンジュゲーションをＸ軸に示す。
【図６】第６図は、精製ヒト末梢血液Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生に関する、抗ＣＤ３抗体と組み合わせた場合の膜結合Ｂ７−１およびＢ７−２の効果を示すグラフであり、Ｂ７−１またはＢ７−２のいずれかの共刺激によるＩＬ−２の産生における用量依存性の増加を表している。
【図７Ａ】第７Ａ図は、培地、固定化抗ＣＤ３＋ＣＨＯ−Ｂ７−１、固定化抗ＣＤ３＋ＣＨＯ−Ｂ７−２、ＰＭＡ＋ＣＨＯ−Ｂ７−１またはＰＭＡ＋ＣＨＯ−Ｂ７−２で休止期ヒトＴ細胞を刺激した２４時間後の、該細胞によるＩＬ−２の産生に関する、ウォルトマンニン処理（１ｎＭ〜１ｍＭ）の効果を示すグラフである。
【図７Ｂ】第７Ｂ図は、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）ならびにＢ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−１とＢ７−２の両方を発現するＣＨＯ細胞で２４時間刺激されたヒトＴ細胞によるＩＬ−産生、またはＰＭＡならびにＢ７−１またはＢ７−２を発現するＣＨＯで刺激されたＴ細胞によるＩＬ−産生に関する、ウォルトマンニン（１〜１００ｎＭ）による阻害パーセントを示すグラフである。
【図８】第８図は、抗ＣＤ２８ｍＡｂ（９．３）、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｂ７−１またはＣＨＯ−Ｂ７−２で刺激されたジャーカット細胞によるホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリリン酸塩の産生に関する、ハービマイシン処理の効果を示すグラフである。
【図９】第９図は、ハービマイシンの存在（＋）または不在（−）下で、抗ＣＤ２８ｍＡｂ（９．３）またはＣＨＯ−Ｂ７−１（Ｂ７）細胞で刺激した後の異なる時点におけるジャーカット細胞によって産生されたホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリリン酸塩の量を示す薄層クロマトグラフィーである。
【図１０Ａ】第１０Ａ図は、ハービマイシンＡの存在または不在下で、ＰＭＡ単独またはＰＭＡとＣＨＯ−Ｂ７−１（ＰＭＡ＋ＣＨＯＢ７１）、ＰＭＡとＣＨＯ−Ｂ７−２（ＰＭＡ＋ＣＨＯＢ７−２）、ＰＭＡと９．３ｍＡｂ溶液（ＰＭＡ＋９．３）、ＰＭＡとビーズ上の９．３ｍＡｂ（ＰＭＡ＋９．３ビーズ）、ＰＭＡとイオノマイシン（ＰＭＡ＋イオノマイシン）あるいはＰＭＡとイオノマイシンと可溶性９．３ｍＡｂ（ＰＭＡ＋イオノ＋９．３）で刺激された末梢血液Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌を示すグラフである。
【図１０Ｂ】第１０Ｂ図は、イオノマイシンの存在（＋イオノ）または不在下で、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）単独またはＯＫＴ３とＣＨＯ−Ｂ７−１（ＯＫＴ３＋ＣＨＯＢ７１）、ＯＫＴ３とＣＨＯ−Ｂ７−２（ＯＫＴ３＋ＣＨＯＢ７−２）またはＯＫＴ３と９．３ｍＡｂ（ＯＫＴ３＋９．３）で刺激された末梢血液Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌を示すグラフである。
【図１１】第１１図は、およそ６ｋＤａのホスホチロシンプロテインが抗ＣＤ２８抗体で共免疫沈降されることを示すイムノブロットのオートラジオグラフィーである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
次の実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書に引用されたすべての参考文献、特許および特許出願公報はすべて、本発明の引例文献である。
【実施例１】
【００４０】
ＣＤ２８の連結はＤ−３ホスホイノシチドの産生を刺激する
この実施例では、ＣＤ２８またはＣＤ３を介するジャーカット細胞の刺激によるＣＤ２８＋ジャーカット細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生を試験した。次のようにしてジャーカット細胞をキャリヤーフリーの３２Ｐオルトホスフェート（３２Ｐｉ）で標識した：ジャーカット細胞をホスフェートフリーの培地（ＤＭＥＭ／ＲＰＭＩ）で３回洗浄し、３７℃で１０分間、洗浄の間に１０分間インキュベートした。細胞を２０mＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４および５％の透析したコウシ血清（生理的食塩水で一夜透析）を含む１０mlのホスフェートフリーの培地に再懸濁した。細胞（１mＣi／１０ml細胞）にキャリヤーフリーの（３２Ｐｉ）を加え、該細胞を３７℃で４〜６時間インキュベートした。標識後、細胞をホスフェートフリーの培地で３回洗浄し、２０mＭＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。
【００４１】
種々の実験において、３２Ｐｉ標識ジャーカット細胞（０．１５ml；２×１０７細胞）のアリコートを培地単独、抗ＣＤ３抗体（Ｇ１９〜４）、抗ＣＤ２８抗体（９．３）、非トランスフェクトＣＨＯ細胞またはＣＤ２８を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ヒトＢ７−１：ＣＨＯ−Ｂ７−１またはヒトＢ７−２：ＣＨＯ−Ｂ７−２のいずれか）で刺激した［Ｄｒ．Ｇ．フリーマンおよびＬ．ナドラーから入手；ＣＨＯ細胞をヒトＢ７−１をコードするｃＤＮＡ（該配列は、フリーマン，Ｄ．Ｊ．らの（１９８９）J.Immunol.１４３：２７１４〜２７２２に開示されている）またはヒトＢ７−２をコードするｃＤＮＡ配列（該配列は、フリーマン，Ｄ．Ｊ．らの（１９９３）Science２６２：９０９〜９１１に開示されている）含有組換え発現ベクターによって標準的技術を用いてトランスフェクトした］。ＣＨＯ細胞を刺激するために、ジャーカット細胞を１０７ＣＨＯ細胞とともにインキュベートし、マイクロ遠心管による５秒間の低速度遠心分離によって細胞の接触を達成した。刺激に続いて種々の時間間隔（約１〜２５分間の範囲）において、細胞を溶解し、ホスホリピッドを抽出し、脱アシル化し、アニオン交換ＨＰＬＣによって分離した［基本的に、ウォード，Ｓ．Ｇ．らの（１９９２）J.Immunol.２２：４５の記載に準じ、下記の変更を加えた］。
【００４２】
７５０mlのＣＨＣｌ３／メタノール／水（３２．６％／６５．３％／２．１％v/v/v）を添加してインキュベーションを終了した。細胞の反応を停止するとすぐに、次の抽出中を通じてサンプルを氷上で保持した。７２５mlのＣＨＣｌ３（１０mgのフロックリピッドを含有；たとえばシグマ，カタログＮｏ．Ｂ１５０２から入手）および１７２mlの２．４ＭＨＣｌ、５ｍＭの硫酸テトラブチルアンモニウムを各サンプルに加えることによって相分離を行った。サンプルを渦巻き撹拌し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって相を分離した。下の相を除去し、１／２容の１Ｍ ＨＣｌ、２５ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５、０．５ｍＭ硫酸テトラブチルアンモニウムを管に加えた。サンプルを再遠心分離して相を分離し、底の相を除去し、清浄な管に入れ、サンプルを減圧乾燥した。サンプルに１mlのメチルアミン試薬（４０％水／メタノール／ｎ−ブタノール（４：４：１ｖ／ｖ／ｖ）溶液）を加えて渦巻き撹拌し、５３℃で４０分間インキュベートして脱アシル化した。サンプルを氷上に置き、次いで減圧乾燥した。サンプルを０．５mlの滅菌蒸留水に再懸濁し、渦巻き撹拌して混合した。サンプルを０．７mlのｎ−ブタノール（４０〜６０％石油エーテル／ギ酸エチル（２０：４：１ｖ／ｖ／ｖ））で２回抽した。底の水相を減圧乾燥し、ＨＰＬＣ分析を行うまで−７０℃で貯蔵した。緩衝液Ａ（水）／Ｂ［１．２５Ｍ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４］（Ｈ３ＰＯ４にて２５℃でｐＨ３．８に調節）に基づく溶離勾配およびＰartisphereＳＡＸカラム（ワットマン社から購入）を用いてＨＰＬＣを行った。脱アシル化したホスホリピッドサンプルを０．１mlの蒸留水に再懸濁し、該カラムに注入した。溶出液をＣanberra Ｐackard Ａ−５００ Ｆlo−Ｏneオンラインベータ線検出装置に導入し、３部のＦlo−ＳcintＩＶシンチレーションカクテルと混合し、結果をＦlo−Ｏneデータプログラム(ラジオマチック,ＵＳＡ)によって分析した。溶出したピークを［３Ｈ］ＰｔｄＩｎｓ、［３Ｈ］ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐおよび［３Ｈ］ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２（アマーシャム・インターナショナル社から購入）から調製した標準液の保持時間と比較した。ウォード，Ｓ．Ｇ．らの（１９９２）J.Biol.Chem.２６７：２３８６２の記載にしたがって、単離したホスファチジルイノシトール３−キナーゼをＰｔｄＩｎｓ（シグマ社から購入）とともにインキュベートすることによって標準の［３２Ｐ］ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、［３２Ｐ］ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２および［３２Ｐ］ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を調製した。
【００４３】
抗ＣＤ３または抗ＣＤ２８抗体で１〜５分間刺激した後のジャーカット細胞におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の産生を第１図に示す。その結果から、ＣＤ３またはＣＤ２８のいずれかを介する刺激はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の産生を誘発するけれども、２つの経路の誘発動力学は別々であることがわかる。ＣＤ３による刺激によって早期（すなわち２分以内）にＰＩ３Ｋの活性化（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の産生によって評価される）が増加する。逆に、ＣＤ２８刺激によって誘発されるＰＩ３Ｋの活性化はＣＤ３刺激による活性化よりも遅く（すなわち５分あるいはそれよりも遅くまで最大にはならない）、ＣＤ３刺激による活性化よりも長く持続する。このような結果から、ＣＤ３またはＣＤ２８連結のいずれかによって仲介されるＰＩ３Ｋ活性化には別のメカニズムが含まれることが示される。
【００４４】
ＣＨＯ−Ｂ７−１またはＣＨＯ−Ｂ７−２細胞で０〜２０分間刺激した後のジャーカット細胞におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の産生を第２図に示す。その結果から、Ｂ７−１またはＢ７−２のいずれかによる刺激は有効な活性化（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の産生によって評価される）を誘発することが示される。誘発の動力学は２つのＣＤ２８リガンドとはわずかに異なっている：Ｂ７−１とＢ７−２のプラトーは同じレベルであるが、Ｂ７−１はＢ７−２よりも早期に活性化を刺激する。Ｂ７−１またはＢ７−２のいずれかによるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３産生の刺激は非常に強く、持続的である（すなわち２０分以上継続する）。
【００４５】
この実施例は、ＣＤ２８の天然リガンドであるＢ７−１およびＢ７−２または抗ＣＤ２８抗体のいずれかによるＣＤ２８を介するＴ細胞の刺激が、Ｔ細胞内においてＤ−３ホスホイノシチドの産生を誘発することを証明し、ＣＤ２８連結に基づくＰＩ３Ｋの活性化が示される。さらに、この実施例は、ジャーカット細胞がＣＴＬＡ４−ではなくＣＤ２８＋であり、ＣＴＬＡ４を発現するようには誘発されえないので［リンステン，Ｔ．の（１９９３）J.Immunol.１５１：３４８９〜３４９９に示される］、ＣＤ２８が通例Ｂ７−１とＢ７−２を生理的リガンドとして分けもつことを証明する。したがって、ＣＴＬＡ４は明らかにＢ７誘発シグナル変換において要求されず、Ｂ７−１とＢ７−２の両方がＣＤ２８に対する生理的リガンドである。
【実施例２】
【００４６】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼインヒビターはＣＤ２８連結によって誘発されるＤ−３ホスホイノシチドの産生を阻害する
この実施例では、ＣＤ２８が仲介するジャーカット細胞におけるＤ−３ホスホイノシチドの産生に関するホスファチジルイノシトール３−キナーゼのインヒビターとしての効果を試験した。実施例１に記載したようにジャーカット細胞をオルトホスフェートで標識し、Ｂ７−２を発現するようにトランスフェクトさせたＣＨＯ細胞で刺激した。さらに、刺激を行っている期間中、種々の濃度（０〜１００ｍＭ）の真菌代謝物ウォルトマンニン（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼのインヒビターである）の存在下で細胞をインキュベートした。ウォルトマンニンはシグマ・ケミカル・コーポレイションから購入し、１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液として−４０℃で貯蔵した。それを培養中の細胞に添加する直前に培地で希釈した。ウォルトマンニンの存在あるいは不在下において刺激を行った後、実施例１に記載したようにＨＰＬＣによって細胞内に産生されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の量を測定した。結果を第３図に示す。第３図はＣＨＯ−Ｂ７−２で刺激する際にウォルトマンニン処理されたジャーカット細胞において検出されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の量を、ＣＨＯ−Ｂ７−２で刺激された非処理ジャーカット細胞において検出されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の量に対するパーセントとしてプロットしてグラフ化したものである。その結果から、ジャーカット細胞を濃度増加ウォルトマンニンで処理することにより、Ｂ７−２によりＣＤ２８が連結した細胞において産生されるＤ−３ホスホイノシチドの量が減少することが示される。したがって、この実施例は、Ｔ細胞内におけるホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性を阻害することによって、ＣＤ２８を介するＴ細胞の刺激の結果としての細胞内的Ｄ−３ホスホイノシチドの産生を阻害しうることを証明している。
【実施例３】
【００４７】
ＣＤ２８仲介カルシウム代謝における薬物的インヒビターの効果
この実施例では、ＣＤ２８抗体によって誘発されるジャーカット細胞におけるカルシウム代謝速度に関する薬物的インヒビターの効果を試験した。研究した薬物的インヒビターはＰＩ３Ｋの活性を阻害するウォルトマンニンおよびプロテインチロシンキナーゼの活性を阻害するハービマイシンＡである。培地単独あるいはウォルトマンニンもしくはハービマイシンＡの存在下のいずれかにおいて抗ＣＤ２８抗体でジャーカット細胞を刺激し、細胞中の平均カルシウム濃度（ｎＭ）を刺激後数分にわたって測定した。第４図に示すように、ハービマイシンＡはＣＤ２８抗体誘発カルシウム代謝を阻害する能力があった。逆に、ウォルトマンニンはＣＤ２８抗体誘発カルシウム流出を阻害することができなかった。これらの結果は、Ｔ細胞におけるウォルトマンニンの効果が、カルシウム代謝を妨害することによって仲介されないことを示している。さらにそのうえ、Ｂ７−１またはＢ７−２によって誘発されるＩＬ−２の産生として測定されたところの“ウォルトマンニンが補刺激を阻害すること”を示している後記実施例５の結果、このデータは、ＣＤ２８が誘発するカルシウム濃度上昇が、特異的にＴ細胞不応答（すなわちアネルギー）または共刺激を誘発する化合物の評価という目的に対して、おそらく読み取りの誤りによるものであろうということを示している。
【実施例４】
【００４８】
天然のＣＤ２８リガンドによるカルシウム代謝の誘発
この実施例では、ＣＨＯ−Ｂ７−１またはＣＨＯ−Ｂ７−２のジャーカット細胞への接着ならびにＣＨＯ−Ｂ７−１およびＣＨＯ−Ｂ７−２による刺激に応じたジャーカット細胞におけるカルシウム可動化を試験した。アベ，Ｒ．らの（１９９２）J.Exp.Med.１７６：４５９〜４６８に記載されているフローサイトメトリー細胞カルシウム−コンジュゲートアッセイを用いた。該細胞コンジュゲートアッセイでは、カルシウム感受性蛍光プローブｉｎｄｏ−１（青色および緑色のシグナルを発する）でＴ細胞を着色する。コントロールプラスミド（ＣＨＯ−ｎｅｏ）でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞またはＢ７−１あるいはＢ７−２を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞をトレーサー着色剤ＤｉｌＣ２２（３）（赤色のシグナルを発する：モレキュラー・プローブ社から購入）で着色する。ジャーカット細胞−ＣＨＯ複合体をフローサイトメトリーによって分析する。Ｔ細胞とＣＨＯ細胞からなる複合体は赤色のシグナルを補足することによって測定でき、カルシウム濃度は青色または緑色のシグナルを補足することによってＴ細胞内で測定できる。第５図に示すように、一連の２つのパラメーターの点プロットとして結果を表示する。カルシウム（ｉｎｄｏ−１比）をＹ軸に、細胞複合体（赤色トレーサー）をＸ軸に示す。右上のカドラントにおける細胞は、ＣＨＯ細胞に複合したカルシウム濃度の高いジャーカット細胞を表す。右下のカドラントの細胞は、ＣＨＯ細胞に複合したカルシウム濃度が正常であるジャーカット細胞を表す。左の上下のカドラントにおける細胞は、それぞれ高濃度または低濃度のカルシウムを含む非複合ジャーカット細胞を表す。
データは、Ｂ７−１およびＢ７−２の両方がジャーカット細胞への接着を仲介することができることを示している。しかし、両方のリガンドのカルシウム可動化の増加を引き起こす能力は乏しい。したがって、Ｂ７−１およびＢ７−２は、カルシウム可動化よりもＰＩ３Ｋ活性化を誘発することにおける能力が高い（実施例１参照）。逆に、抗ＣＤ２８抗体は、ＰＩ３Ｋ活性化（実施例１参照）およびカルシウム代謝（実施例３参照）の両方を刺激する能力がある。したがって、刺激を天然のリガンド（Ｂ７−１またはＢ７−２など）を用いて行うか抗体を用いて行うかによって、ＣＤ２８の連結を介して発生する細胞内シグナルに違いがあると考えられる。ナンズ，Ｊ．らの（１９９３）Int.Immunol.５：３１１〜３１５に、ＣＤ２８抗体が、Ｔ細胞のシグナル変換および活性化（ＩＬ−２の産生など）という生化学的局面において多重かつ異種の効果をもつことが既に記載されている。これらの観察から、ＣＤ２８に関するこれまでの結果からの外挿に基づいてＤ−３代謝物の産生におけるＣＤ２８の天然のリガンド（すなわち膜結合Ｂ７−１およびＢ７−２）生化学的効果を予測することは不可能であることがさらに示される。
【実施例５】
【００４９】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼインヒビターはＣＤ２８の連結によって誘発されるインターロイキン２の産生を阻害することができる
この実施例では、Ｔ細胞によるインターロイキン２のＣＤ２８依存性産生におけるホスファチジルイノシトール３−キナーゼのインヒビターとしての効果を試験した。最初の一連の実験では、ウォルトマンニンの不在下でのＩＬ−２の産生における、ＣＤ２８を介するＴ細胞刺激の効果（ＣＤ３を介する刺激に関連して）を評価した。高純度ヒト末梢血液Ｔ細胞を、固定化抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）単独、または抗ＣＤ２８抗体（９．３）あるいは非トランスフェクトまたはＢ７−１またはＢ７−２を発現するようにトランスフェクトされたマイトマイシンＣ処理ＣＨＯ細胞とともに２４時間インキュベートした。２４時間培養後、ＥＬＩＳＡにて標準的技術を用いてＩＬ−２産生について培養上清をアッセイした。第６図に示すように、培地単独で、ＯＫＴ３単独でまたはＯＫＴ３と非トランスフェクトＣＨＯ細胞とともにインキュベートされた細胞はＩＬ−２を産生しなかった。逆に、ＯＫＴ３およびＢ７−１またはＢ７−２を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞とともに培養された細胞は、用量依存的にＩＬ−２の産生を刺激された。ＯＫＴ３と９．３抗体との培養もまたＩＬ−２の産生を刺激した。これらの結果から、たとえばＢ７−１またはＢ７−２刺激によるＣＤ２８の連結がリンホカイン産生に対する共刺激シグナルを提供することができることが確認される。
【００５０】
次の一連の実験では、休止期ヒトＴ細胞をそれぞれ：１）固定化ＯＫＴ３＋ＣＨＯ−Ｂ７−１，２、２）固定化ＯＫＴ３＋ＣＨＯ−Ｂ７−２，３、３）固定化ＯＫＴ３＋ＣＨＯ−Ｂ７−１＋Ｂ７−２、４）ＰＭＡ＋ＣＨＯ−Ｂ７−１、または５）ＰＭＡ＋Ｂ７−２で刺激した。培地単独中、またはウォルトマンニンを１ｎＭ〜１ｍＭの濃度で含有する培地中でＴ細胞の刺激を行った。培養の２４時間後、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２の産生について上清をアッセイした。結果を第７Ａ図および第７Ｂ図に示す。該結果は、ウォルトマンニンが、ＣＤ３刺激に関連したＢ７−１またはＢ７−２のいずれかによって刺激されるＩＬ−２の産生を阻害することができることを示す。ＩＬ−２のウォルトマンニン仲介阻害は用量依存性であった。Ｂ７−２仲介刺激の阻害のＩＤ５０は約１０nＭであった。Ｂ７−１仲介刺激の阻害のＩＤ５０は１０〜１００ｎＭであった。これらのウォルトマンニンの用量は細胞に対して一般的に毒性ではなく、非特異的メカニズムによるＩＬ−２の産生を阻害しない。ＰＭＡおよび膜結合Ｂ７−１またはＢ７−２によって刺激されるによって刺激されるＩＬ−２の産生が、１ｍＭという高濃度のウォルトマンニンによって阻害されないという事実が証拠である。この実施例は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体およびＣＤ２８を介する刺激に応じたＩＬ−２の産生によって評価されるように、Ｔ細胞内のホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性を阻害する作用剤でＴ細胞を処理することによってＴ細胞の活性化を阻害しうることを証明する。
【実施例６】
【００５１】
抗ＣＤ２８またはＣＤ２８の天然のリガンドで刺激したジャーカット細胞のＰＩ３Ｋ活性化へのハービマイシンの異なる効果
ＰＩ３キナーゼ活性化の意味を評価するため、ジャーカットＴ細胞（２０×１０６細胞）を抗ＣＤ２８ｍＡｂ９.３（１０μg）またはＢ７−１またはＢ７−２（１０×１０６細胞）を発現しているＣＨＯ細胞で刺激した。該細胞を実施例１で記載したように３２Ｐオルトホスフェートで標識し、ついでビヒクル希釈薬または３μＭのハービマイシンＡを含む培地で前もってインキュベートした。５分後、該細胞は溶解し、ＰＩ３キナーゼを実施例１に記載したようにＨＰＬＣによって、ＰｔｄＩｎｓ（３,４,５）Ｐ３の測定により評価した。
該結果を図８に示す。９.３抗体で刺激したジャーカット細胞によるＰｔｄＩｎｓ（３,４,５）Ｐ３の産生をハービマイシンの前処置によって妨げた。予期せず、ＰｔｄＩｎｓ（３,４,５）Ｐ３の産生によって測定されたようにＰＩ３キナーゼ活性を誘発したＢ７−１およびＢ７−２はハービマイシンの前処置に耐性を示した。これらの結果は、ＣＤ２８によってＰＩ３キナーゼの活性に関するハービマイシンの独立した経路が存在することを示し、さらにハービマイシンは様々なｓｒｃファミリーキナーゼを抑制することを示しているのでＣＤ２８はｓｒｃファミリープロテインチロシンキナーゼから独立してＰＩ３キナーゼを活性化することができることを示す。
【００５２】
この両分をさらに調査するため、２０×１０６ジャーカット細胞を９.３ｍＡｂ（１０μg）または１０×１０６ＣＨＯ−Ｂ７−１細胞で刺激した。該細胞をハービマイシンＡ ３μＭまたはビヒクル内で前もってインキュベートした。該ＣＤ２８ ｍＡｂにさらにヤギ抗マウスＩｇＧを結合させ、該細胞を５〜１０分後溶解した。ＰＩ３キナーゼ活性化はイン・ビボリピッドキナーゼアッセイを使用して薄層クロマトグラフィーによって評価した（ウォード（Ｗard,Ｓ.Ｇ.）ら（１９９５）Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．２５：５２６−５３２に記載のように）。
該結果を図９に示す。抗ＣＤ２８ ９.３ｍＡｂおよびＣＨＯ−Ｂ７細胞の両者は、コントロールレーンと１０分後の９.３ｍＡｂレーンおよび５分後のＢ７レーンとの比較から明らかなようにＰＩ３キナーゼ活性を誘発する。再び、ＰＩの反対のキナーゼの産物は９.３ｍＡｂ刺激後ハービマイシンによって抑制され、Ｂ７刺激後ハービマイシンに耐性を示した。
従って、ハービマイシンは抗ＣＤ２８で刺激したジャーカット細胞でＰＩ３Ｋのハービマイシンの活性化を遮断するが、ＣＨＯ−Ｂ７−１またはＣＨＯ−Ｂ７−２細胞で刺激したジャーカット細胞においては遮断せず、ＣＤ２８によるＰＩ３キナーゼの活性化のハービマイシンの独立した経路が存在することを示した。      
【実施例７】
【００５３】
Ｔ細胞によるＩＬ−２の分泌へのへルビマイシンの異なる効果
さらに、ＣＤ２８受容体ライゲーションに関するシグナル変換経路を決定するため、ＣＤ２８＋Ｔ細胞（抹消血Ｔ細胞のネガティブセレクションによって調製した）を種々の濃度のハービマイシン（０.１〜３μＭ）にて一晩培養し、ついでＰＭＡを３ｎｇ／ｍｌだけまたは、１μg／ｍｌの溶液内のｍＡｂ ９.３、ｍＡｂ９.３コートしたビーズ、０.０８μg／ｍｌのイオノマイシン、ＣＨＯ−Ｂ７−１またはＣＨＯ−Ｂ７−２細胞で刺激した。上清を２４時間後に回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２含有を分析した。
該結果を図１０パネルＡに示す。該結果はＰＭＡプラス９.３ｍＡｂが誘発したＩＬ−２分泌が約０.２μＭのＩＤ５０を有するハービマイシンに感受性を有することを示す。同様に、ＰＭＡプラスＣＨＯ−Ｂ７−１細胞によって誘発したＩＬ−２分泌はまたハービマイシンにも感受性があった。対照的に、ＩＬ−２分泌は細胞が３μＭより大きいＩＤ５０を有するＰＭＡプラスイオノマイシンで刺激した場合、完全に耐性があった。ハービマイシンによる抑制のメカニズムをさらに試験するため、細胞をイオノマイシンの存在下または不在下でも刺激した。ＰＭＡプラスイオノマシインプラス９.３ｍＡｂで刺激した細胞におけるＩＬ−２分泌はハービマイシン、３μＭのハービマイシンＡにさえ完全耐性となる。
【００５４】
さらにハービマイシン感受性および耐性を有するＩＬ−２分泌の結果を試験するため、Ｔ細胞を、ＣＨＯ−Ｂ７−１もしくはＣＨＯ−Ｂ７−２細胞またはイオノマイシンの存在下もしくは不在下にて９.３ｍＡｂを有するビーズに不動化したＣＤ３抗体ＯＫＴ３で刺激した。上清を２４時間後に回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２の量を決定した。
該結果を図１０パネルＢに示す。ＰＭＡおよびＢ７−１またはＢ７−２でのＴ細胞の刺激による結果のハービマイシンに対して感受性を有すると分かったＩＬ−２分泌に反して、ＰＭＡが抗ＣＤ３で置換された場合、ＩＬ−２分泌はハービマイシンに完全に耐性を有すると分かった。これらの結果は、ＣＤ２８はハービマイシン耐性ＩＬ−２分泌をシグナルの状況に依存して開始することができることを示す。Ｔ細胞がカルシウムシグナル（すなわち、ＰＭＡプラス抗ＣＤ２８）を開始しないような方法で活性化された場合、ＩＬ−２分泌はハービマイシンに感受性を有する。Ｔ細胞がカルシウムシグナル（すなわち、ＰＭＡプラスイオノマイシンプラスＢ７または抗ＣＤ２８）の存在下で活性化された場合、該シグナルはハービマシンに対して耐性を示した。これはＣＤ２８はハービマイシン感受性のチロシンキナーゼによって提供される不可欠なシグナルを必要としないかまたは代わって、ＣＤ２８によって開始される不可欠なチロシンキナーゼカスケードの必要性を無視することができるかもしれないことを示している。
【実施例８】
【００５５】
ＣＤ２８に関連した６７ｋＤａのチロシンホスホプロテインの同定
現在までに、ＣＤ２８と物理的な関連を示す唯一報告されたプロテインはＰＩ３キナーゼ（トルイット（Ｔruitt，Ｋ．Ｅ.）ら（１９９４）Ｊ．Ｅxp．Ｍed．１７９：１０７１−１０７６）およびｓｒｃファミリーキナーゼｌｃｋ（オーガスト（Ａugust，Ａ.）およびデュポン（Ｄupont，Ｂ.）（１９９４）Ｂiochem.Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun．１９９：１４６６−１４７３）である。ＣＤ２８媒介シグナル変換をさらに研究するため、ＣＤ２８と物理的に関連のあるタンパク質に関するジャーカット細胞およびＴ細胞において研究を開始した。細胞を何度も９.３ｍＡｂで刺激し、ＮＰ−４０清浄剤で溶解し、ブドウ球菌タンパク質Ａで免疫沈降した。該免疫沈降物を洗浄し、抽出しついで還元条件のもとでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。トランスファーの後、西洋ワサビペルオキシダーゼとともに抗ホスホチロシンＡｂ４Ｇ１０を使用してイムノブロットを行った。チロシンリン酸化タンパク質をＥＣＬを使用して化学発光によって同定した。
該結果を図１１に示すが、これはイムノブロットのオートラジオグラフィーを示している。〜６７ｋＤａの相対的な移動を示すバンドをＣＤ２８免疫沈降物内に同定した。ホスホプロテインに対応するバンドはＣＤ２８刺激後３分以内にジャーカット細胞に即座に現れた。同様のまたは同一のタンパク質をＴ細胞幼若細胞において同定した。このタンパク質はｉｔｋ／ｅｍｔプロテインチロシンキナーゼではないようであった。というのはｉｔｋに対する抗体はＣＤ２８免疫沈降物内にｉｔｋを明らかにしないからである。さらにその上、このＣＤ２８関連タンパク質の分子量がｌｃｋまたはＰＩ３と一致していない。
従って、該結果は約６７ｋＤａの新規なホスホチロシンタンパク質がＣＤ２８を通じて刺激したジャーカット細胞およびＴ細胞幼若細胞内におけるＣＤ２８と関連を有することを示す。
【００５６】
均等物
当業者は、本明細書に記載の発明の特定の態様に均等な多くのものについて認識するか、常套的な実験を使用するだけで確認することができるであろう。そのような均等物は以下の請求の範囲に包含するよう意図されている。
【図１】
2010260868.tif 000002
【図２】
2010260868.tif 000003
【図３】
2010260868.tif 000004
【図４】
2010260868.tif 000005
【図５】
2010260868.tif 000006
【図６】
2010260868.tif 000007
【図７Ａ】
2010260868.tif 000008
【図７Ｂ】
2010260868.tif 000009
【図８】
2010260868.tif 000010
【図９】
2010260868.tif 000011
【図１０Ａ】
2010260868.tif 000012
【図１０Ｂ】
2010260868.tif 000013
【図１１】
2010260868.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月20日(2010.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リウマチ性関節炎またはアレルギーを患っている患者においてＴ細胞活性化を抑制することによってリウマチ性関節炎またはアレルギーを治療するための医薬組成物の製造のための作用剤の使用であって、該作用剤が、Ｂ７−１およびＢ７−２によって刺激されるＴ細胞に適用されると、少なくとも５０％までインビトロでインターロイキン−２の産生を抑制する使用。
【請求項２】
医薬組成物が、さらにＴ細胞をＴ細胞内のプロテインチロシンリン酸化を抑制する第２の作用剤を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
第２の作用剤が、プロテインチロシンキナーゼの阻害剤である請求項２に記載の使用。
【請求項４】
第２の作用剤が、チロシンホスファターゼまたはチロシンホスファターゼの活性化物質である請求項２に記載の使用。
【請求項５】
チロシンホスファターゼが、細胞性チロシンホスファターゼである請求項４に記載の使用。
【請求項６】
細胞性チロシンホスファターゼが、ＣＤ４５またはＨｃｐｈである請求項５に記載の使用。
【請求項７】
第２の作用剤が、ＣＤ４５に結合し活性化させる分子である請求項６に記載の使用。
【請求項８】
第２の作用剤が、抗ＣＤ４５抗体またはその断片である請求項７に記載の使用。
【請求項９】
作用剤がウォルトマンニンでない請求項１に記載の使用。