(57)【要約】【課題】種々のヒトがんで発現されるＲＡＡＧ１０に結合するモノクローナル抗体を提供すること。【解決手段】本発明は、疾病およびがんに関連する抗原、ＲＡＡＧ１０の同定およびキャラクタリゼーションを提供する。さらに本発明は、抗原ＲＡＡＧ１０を結合するモノクローナル抗体のファミリを提供し、ＲＡＡＧ１０を発現する種々のヒトのがんおよび疾病を診断し処置する方法も提供する。別の態様では、本発明は、年４月９日および年４月２３日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにて保管された特許管理番号ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１７、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１８、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４４、およびＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４５の宿主細胞株の任意の一つによって産生されるモノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本明細書は、２００２年６月１９日出願の米国仮出願第６０／３９０，２０３号の利益を主張する。この出願は、その全体が参考として援用されている。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、生物学および免疫療法の分野にある。より具体的には、疾病およびがんに関連する新規の抗原、ＲＡＡＧ１０、およびＲＡＡＧ１０に結合するモノクローナル抗体のファミリに関する。本発明はさらに、ＲＡＡＧ１０に関連する多様なヒトの疾病およびがんを、抗ＲＡＡＧ１０ファミリ抗体を用いて診断および／または処置することを提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
抗体は、診断学の公知の方法で使用されるほか、治療薬剤として有用であることがわかっている。たとえば、ここ数年、がんを処置するために、免疫療法を用いたり、または治療目的による抗体利用を用いたりしている。受動免疫療法には、モノクローナル抗体を使用しがんを処置することが含まれる。たとえば、非特許文献１を参照すること。これらの抗体には、腫瘍細胞の成長または生存の直接阻害、および体の免疫系による本来の細胞死滅活性を強化する能力の両方があるため、抗体固有の治療的生物活性を有することができる。これらの薬剤は、単独または放射線または化学療法薬と併用して投与することができる。このような治療例としてリツキシマブおよびトラスツズマブの二つがあげられ、それぞれ、非ホジキンリンパ腫および乳がんの処置用として承認されている。あるいは、抗体を使用して抗体コンジュゲートを作ることができる。抗体コンジュゲートでは、抗体が毒性物質に連結しており、その物質を腫瘍を標的とするように、具体的には腫瘍と結合させるようになっている。ゲムツズマブオゾガマイシンは、白血病の処置に使用される承認された抗体コンジュゲートの一例である。がん細胞に結合し、診断および治療への利用が可能とされるモノクローナル抗体は、刊行物に開示されている。たとえば以下の特許明細書、特に標的タンパク質の分子量をいくつか開示しているものを参照すること：特許文献１（２００ｋＤのｃ−ｅｒｂＢ−２（Ｈｅｒ２）のほか、サイズが４０〜２００ＫＤの未知の抗原）および特許文献２（５０ｋＤおよび５５ｋＤの腫瘍胎児タンパク質）。臨床試験中の抗体の例および／または固形腫瘍を処置するものとして承認された例として、トラスツズマブ（抗原：１８０ｋＤ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、エドレコロマブ（抗原：４０〜５０ｋＤ、Ｅｐ−ＣＡＭ）、抗人乳脂肪球（ＨＭＦＧ１）（抗原＞２００ｋＤ、ＨＭＷムチン）、セツキシマブ（抗原：１５０ｋＤおよび１７０ｋＤ、ＥＧＦ受容体）、アレムツズマブ（抗原：２１〜２８ｋＤ、ＣＤ５２）、およびリツキシマブ（抗原：３５ｋＤ、ＣＤ２０）が挙げられる。
【０００４】
乳がんの処置に使用されるトラスツズマブ（Ｈｅｒ−２受容体）および何種類かのがんの処置の臨床試験中であるセツキシマブ（ＥＧＦ受容体）の抗原標的は、皮膚、大腸、肺、卵巣、肝臓、および膵臓を含む広範な成人正常組織上に、ある程度検出可能なレベルで存在する。このような治療法を用いる際の安全性の限界は、発現レベル、または上記部位への抗体のアクセス、または上記部位での抗体活性の違いによって異なると思われる。
【０００５】
別のタイプの免疫療法として、特定のがん（単数または複数）に存在する抗原、または抗原の発現を目的とするＤＮＡコンストラクトを使用する能動免疫療法またはワクチン接種があり、これによって、個体に免疫応答を誘発させる、すなわち個体自身のがんに対する抗体の活発な産生を個体に誘発させる。能動免疫化は、受動免疫療法または免疫毒素ほど使用されていない。
【０００６】
疾病（がんを含む）進行のモデルがいくつか示唆されている。理論は単なる感染／形質転換の発生による原因から、「疾病様」または「がん様」タイプの組織が増殖して最終的には完全な病原性または悪性の組織になる進行まで及ぶ。がんに関する議論がいくつかある。たとえば、悪性になるには変異が発生するだけで十分であるとする議論がある一方で、引き続き変質が生じることも必要であるとする別の議論もある。さらに別の議論もいくつか示唆されている。異常増殖の開始だけでなくその進行には、突然変異荷重および腫瘍の異型度の増加が細胞レベルでの突然変異−選択の連続発生を介して必要である。がん標的は腫瘍組織にのみいくつか発見されていたが、別の標的が正常組織にもあり、腫瘍組織で上方制御されるか、および／または過剰発現する。これを背景とし、悪性の獲得には過剰発現が関連していることを示唆する研究者がいる一方、過剰発現は病状の悪化過程に沿った傾向を示すマーカーであるに過ぎないと示唆する研究者もいる。
細胞表面の標的を特異的に認識する抗体および他の薬剤によって疾病および／またはがんを処置するのに利用することができるような疾病細胞および／またはがん細胞の表面上にある新規の標的が必要とされている。さらに、本明細書に開示されている発見に基づき、ＲＡＡＧ１０の疾病促進活性を低減または増加することによって調節することができる細胞表面上の標的を特異的に認識する新規の抗体および他の薬剤が求められている。
以下に詳細に記載するように、本発明者らは、本明細書にＲＡＡＧ１０と示す新規の抗原を発見した。これは、Ｂ７−Ｈ３Ｌと示すこともあり、本明細書に提示される新規の抗体の抗原標的として同定されるものである。同様のポリペプチドが公知である。たとえば、マウスＢ７−Ｈ３ホモログの同定を記載し、Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生を媒介することが示されているヒトＢ７−Ｈ３遺伝子を特徴付ける非特許文献２を参照すること。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，０５４，５６１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６５６，４４４号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｈａｐｔ．２０  ｐｐ．４９５−５０８
【非特許文献２】ＳｕｎらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２、１６８：６２９４−６２９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要約）
本発明は、種々のヒトがんで発現されるＲＡＡＧ１０に結合するモノクローナル抗体を提供する。一態様によれば、本発明は、ＲＡＡＧ１０に結合するモノクローナル抗体のファミリである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＲＡＡＧ１０に特異的に結合し、以下の特徴を少なくとも一つ以上有する実質的に精製された免疫グロブリンポリペプチドまたはその抗原結合断片：
ａ．がん細胞上のＲＡＡＧ１０に結合する能力、
ｂ．インビトロまたはインビボの生細胞の表面上に露出しているＲＡＡＧ１０の一部に結合する能力、
ｃ．ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞に治療薬剤または検出可能マーカーを送達する能力、および
ｄ．ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞の中へ治療薬剤または検出可能マーカーを送達する能力。
（項目２）
前記がん細胞は、副腎腫瘍、エイズに関連するがん、胞状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん（有棘細胞がん腫および移行上皮がん腫）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨嚢腫、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頚動脈小体腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞がん腫、明細胞がん腫、大腸がん、結腸直腸がん、皮膚の良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液性軟骨肉腫、線維形成不全骨、骨の線維異形成、胆嚢および胆管がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭部および頸部がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞がん腫）、白血病、脂肪腫／良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫／悪性の脂肪性腫瘍、肝がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌異常増殖、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、乳頭甲状腺がん、上皮小体腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、前立腺がん、後方ブドウ膜黒色腫、まれな血液疾患、転移性腎がん、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟部組織の肉腫、扁平細胞がん、胃がん、滑膜肉腫、睾丸がん、胸腺がん腫、胸腺腫、転移性甲状腺がん、および子宮がん（頚部のがん腫、子宮内膜がん腫、および平滑筋腫）からのがん細胞からなる群から選択される、項目１に記載の精製された免疫グロブリンポリペプチドまたは抗原結合断片。
（項目３）
項目１に記載の前記免疫グロブリンポリペプチドまたはその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列。
（項目４）
前記核酸はプロモータに作動可能に連結される、項目３に記載の核酸。
（項目５）
前記プロモータおよび前記核酸は発現ベクターに含まれている、項目４に記載の核酸。
（項目６）
前記ポリペプチドはモノクローナル抗体である、項目３に記載の核酸。
（項目７）
項目３に記載の核酸を含むベクターによって形質移入されるか、形質転換されるか、または感染された細胞株。
（項目８）
実質的に精製された免疫グロブリンポリペプチドまたはその抗原結合断片を産生する方法であって、
ａ．前記免疫グロブリンポリペプチドまたは抗原結合断片が発現するような条件下で、項目３に記載の前記核酸によって形質転換させた細胞株を成長させる工程、および
ｂ．前記発現した免疫グロブリンポリペプチドまたは断片を収集する工程
を含む方法。
（項目９）
前記細胞株はハイブリドーマである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ハイブリドーマは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１７、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１８、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４４、およびＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４５からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記免疫グロブリンポリペプチドはモノクローナル抗体である、項目８に記載の方法。
（項目１２）
治療上有効な量の項目１に記載の前記精製された免疫グロブリンまたは抗原結合断片を薬学的に受容可能な担体とともに含む薬学的組成物。
（項目１３）
ＲＡＡＧ１０に特異的に結合し、以下の特徴を少なくとも一つ以上有する治療上有効な量のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を薬学的に受容可能な担体とともに含む薬学的組成物：
ａ．がん細胞上のＲＡＡＧ１０に結合する能力、
ｂ．インビトロまたはインビボの生細胞の表面上に露出しているＲＡＡＧ１０の一部に結合する能力、
ｃ．ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞に治療薬剤または検出可能マーカーを送達する能力、および
ｄ．ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞の中へ治療薬剤または検出可能マーカーを送達する能力。
（項目１４）
前記組成物は追加の治療的成分を含む、項目１３記載の薬学的組成物。
（項目１５）
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１７、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１８、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４４、およびＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４５、またはその子孫からなる群から選択される単離された細胞株。
（項目１６）
化学療法薬と結合された抗ＲＡＡＧ１０抗体を含む組成物を投与することを含む前記化学療法薬をがん細胞に送達する方法であって、前記がん細胞は、副腎腫瘍、エイズに関連するがん、胞状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん（有棘細胞がん腫および移行上皮がん腫）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨嚢腫、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頚動脈小体腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞がん腫、明細胞がん腫、大腸がん、結腸直腸がん、皮膚の良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液性軟骨肉腫、線維形成不全骨、骨の線維異形成、胆嚢および胆管がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭部および頸部がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞がん腫）、白血病、脂肪腫／良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫／悪性の脂肪性腫瘍、肝がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌異常増殖、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、乳頭甲状腺がん、上皮小体腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、前立腺がん、後方ブドウ膜）黒色腫、まれな血液疾患、転移性腎がん、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟部組織の肉腫、扁平細胞がん、胃がん、滑膜肉腫、睾丸がん、胸腺がん腫、胸腺腫、転移性甲状腺がん、および子宮がん（頚部のがん腫、子宮内膜がん腫、および平滑筋腫）からのがん細胞からなる群から選択される、方法。
（項目１７）
前記化学療法薬は個体に投与される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ハイブリドーマは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１７、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１８、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４４、およびＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４５またはその子孫からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
化学療法薬と結合された抗ＲＡＡＧ１０抗体を含む有効量の組成物を個体に投与することを含む前記個体内でがん細胞の成長を阻害する方法であって、前記がん細胞は、副腎腫瘍、エイズに関連するがん、胞状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん（有棘細胞がん腫および移行上皮がん腫）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨嚢腫、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頚動脈小体腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞がん腫、明細胞がん腫、大腸がん、結腸直腸がん、皮膚の良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液性軟骨肉腫、線維形成不全骨、骨の線維異形成、胆嚢および胆管がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭部および頸部がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞がん腫）、白血病、脂肪腫／良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫／悪性の脂肪性腫瘍、肝がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌異常増殖、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、乳頭甲状腺がん、上皮小体腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、前立腺がん、後方ブドウ膜）黒色腫、まれな血液疾患、転移性腎がん、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟部組織の肉腫、扁平細胞がん、胃がん、滑膜肉腫、睾丸がん、胸腺がん腫、胸腺腫、転移性甲状腺がん、および子宮がん（頚部のがん腫、子宮内膜がん腫、および平滑筋腫）からのがん細胞からなる群から選択される、方法。
（項目２０）
前記化学療法薬は、前記がん細胞の中に送達される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記抗ＲＡＡＧ１０抗体は、細胞株によって発現されるモノクローナル抗体であり、前記ハイブリドーマは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１７、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１８、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４４、およびＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２４５、またはその子孫からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
個体からの細胞を抗ＲＡＡＧ１０抗体に接触させ、存在する場合、前記細胞からのＲＡＡＧ１０と前記抗体との複合体を検出することを含む前記個体内のがん細胞の有無を検出する方法であって、前記がん細胞は、副腎腫瘍、エイズに関連するがん、胞状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん（有棘細胞がん腫および移行上皮がん腫）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨嚢腫、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頚動脈小体腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞がん腫、明細胞がん腫、大腸がん、結腸直腸がん、皮膚の良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液性軟骨肉腫、線維形成不全骨、骨の線維異形成、胆嚢および胆管がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭部および頸部がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞がん腫）、白血病、脂肪腫／良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫／悪性の脂肪性腫瘍、肝がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌異常増殖、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、乳頭甲状腺がん、上皮小体腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、前立腺がん、後方ブドウ膜）黒色腫、まれな血液疾患、転移性腎がん、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟部組織の肉腫、扁平細胞がん、胃がん、滑膜肉腫、睾丸がん、胸腺がん腫、胸腺腫、転移性甲状腺がん、および子宮がん（頚部のがん腫、子宮内膜がん腫、および平滑筋腫）からのがん細胞からなる群から選択される、方法。
（項目２３）
ＲＡＡＧ１０とＲＡＡＧ１０結合パートナーとの間の以下に示す相互作用の少なくとも一つを阻止する薬剤：
ａ．がん細胞上のＲＡＡＧ１０に結合する能力、
ｂ．インビトロまたはインビボの生細胞の表面上に露出しているＲＡＡＧ１０の一部に結合する能力、
ｃ．ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞に治療薬剤または検出可能マーカーを送達する能力、および
ｄ．ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞の中へ治療薬剤または検出可能マーカーを送達する能力。
（項目２４）
治療上有効な量の項目２３に記載の薬剤を薬学的に受容可能な担体とともに含む薬学的組成物。
【００１０】
別の態様では、本発明は、２００２年４月９日および２００２年４月２３日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにて保管された特許管理番号ＰＴＡ−４２１７、ＰＴＡ−４２１８、ＰＴＡ−４２４４、および  ＰＴＡ−４２４５の宿主細胞株の任意の一つによって産生されるモノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０である。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、疾病細胞および／またはがん細胞に反応するモノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０を作製する方法であって、（ａ）免疫原を用いて哺乳類宿主に免疫性を与える工程と、（ｂ）哺乳類からリンパ球を得る工程と、（ｃ）リンパ球（ｂ）を骨髄腫細胞株と融合し、ハイブリドーマを生成する工程と、（ｄ）（ｃ）のハイブリドーマを培養し、モノクローナル抗体を生成する工程と、（ｅ）抗体をスクリーニングし、疾病細胞および／またはがん細胞または細胞株に結合するが非がん性または正常な細胞または細胞株に結合しないか、またはより低いレベルまたは異なる形態で正常細胞に結合するような抗体のみを選択する工程を含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、上記のような抗体またはその子孫をコードする宿主細胞を抗体産生が可能な条件下で培養し、抗ＲＡＡＧ１０抗体を精製することを含む抗ＲＡＡＧ１０ファミリ抗体を作製する方法である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の抗体（またはポリペプチド）を生成する方法を提供する。この方法は、前記抗体をコードする一つ以上のポリヌクレオチド（単一の軽鎖または重鎖として個別に発現することができるか、または軽鎖および重鎖の両方が一つのベクターから発現される）を適切な細胞に発現させ、次に、通常は対象の抗体またはポリペプチドを回収するかおよび／または単離することによるものである。
【００１４】
別の態様では、本発明は、抗ＲＡＡＧ１０抗体のＲＡＡＧ１０への優先的結合を競合的に阻害する抗ＲＡＡＧ１０抗体またはポリペプチド（抗体となり得るか、なり得ないのかは問わない）である。いくつかの実施形態では、本発明は、他の抗ＲＡＡＧ１０抗体としてＲＡＡＧ１０上の同じまたは異なるエピトープに優先的に結合する抗体またはポリペプチド（抗体となり得るか、なり得ないのかは問わない）である。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、ＲＡＡＧ１０のエピトープに対し特異的な抗体によって結合されるＲＡＡＧ１０を含む組成物である。一実施形態では、抗体は抗ＲＡＡＧ１０である。別の実施形態では、二つ以上の抗ＲＡＡＧ１０抗体を、ＲＡＡＧ１０の二つ以上の異なるエピトープにマッピングするような抗体とともに投与する。いくつかの実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体は治療薬剤または検出可能標識に連結されている。
【００１６】
別の態様では、本発明は、抗ＲＡＡＧ１０抗体の断片または領域を含む抗体である。一実施形態では、断片は抗体の軽鎖である。別の実施形態では、断片は抗体の重鎖である。さらに別の実施形態では、断片は、抗体の軽鎖および／または重鎖からの一つ以上の可変領域を含む。さらに別の実施形態では、断片は、抗体の軽鎖および／または重鎖からの一つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、以下の任意のものを含むポリペプチド（抗体となり得るか、なり得ないのかは問わない）を提供する：ａ）軽鎖または重鎖からの一つ以上のＣＤＲ（またはその断片）、ｂ）軽鎖からの三つのＣＤＲ、ｃ）重鎖からの三つのＣＤＲ、ｄ）軽鎖由来の三つのＣＤＲおよび重鎖からの三つのＣＤＲ、ｅ）軽鎖可変領域、ｆ）抗ＲＡＡＧ１０抗体の重鎖可変領域。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト抗ＲＡＡＧ１０抗体の一つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、他の抗ＲＡＡＧ１０抗体として同じまたは異なるエピトープ（単数または複数）に結合する。通常、本発明のヒト化抗体は、元になっている非ヒト抗ＲＡＡＧ１０抗体のＣＤＲ（単数または複数）と同じであるかおよび／または由来する一つ以上（１、２、３、４、５、６、またはその断片）のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、別の抗ＲＡＡＧ１０抗体として同じまたは異なるエピトープ（単数または複数）に結合する。別の態様によれば、本発明は、非ヒト抗ＲＡＡＧ１０抗体の重鎖および軽鎖の可変領域由来の可変領域とヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域由来の定常領域とを含むキメラ抗体である。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１７、ＰＴＡ−４２１８、ＰＴＡ−４２４４、またはＰＴＡ−４２４５の管理番号をもつ宿主細胞またはその子孫によってそれぞれ産生される抗体ＬＵＣＡ１、ＢＬＡ８、ＰＡ２０、またはＳＫＩＮ２の任意の一つをコードする単離ポリヌクレオチドである。本発明は、上記に特定されている任意の抗体の特有な結合または生物学的活性を有する抗体ポリペプチドを包含する。別の態様では、本発明は、任意の抗体（抗体断片を含む）をコードするポリヌクレオチドのほか、本明細書に記載の他の任意のポリペプチドを提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、任意のポリペプチド（本明細書に記載の任意の抗体を含む）または本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む薬学的組成物であり、このような薬学的組成物は、化学療法薬に連結されている抗ＲＡＡＧ１０抗体、抗ＲＡＡＧ１０抗体の断片を含む抗体、非ヒト抗ＲＡＡＧ１０抗体のヒト化抗体、非ヒト抗ＲＡＡＧ１０抗体の可変領域由来の可変領域とヒト抗体の定常領域由来の定常領域とを含むキメラ抗体、または非ヒト抗ＲＡＡＧ１０抗体の特性を一つ以上備えるヒト抗体、または化学療法薬（放射性成分など）に連結されている本明細書に記載の任意の抗ＲＡＡＧ１０抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【００２１】
一態様によれば、本発明は、疾病細胞またはがん細胞上にあるＲＡＡＧ１０に結合されている抗ＲＡＡＧ１０抗体を含む組成物である。好ましい実施形態では、がん細胞は、卵巣、肺、前立腺、膵臓、大腸、および乳房のがん細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がん細胞は単離されている。いくつかの実施形態では、がん細胞は生物試料中にある。通常、生物試料は、ヒトなどの個体からのものである。
【００２２】
別の態様では、本発明は、個体から得られる細胞上のＲＡＡＧ１０を検出することによって個体の疾病、炎症反応または自己免疫応答に関連する疾病または疾患を診断する方法である。本発明の別の態様では、個体の炎症反応または自己免疫応答を調節する方法が提供される。本発明の組成物および方法を使用する処置を施してもよい炎症および自己免疫性疾患に起因する疾病および状態を例示すると、多発性硬化症、髄膜炎、脳炎、脳卒中、他の大脳外傷、潰瘍性結腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患、重症筋無力症、ループス、リウマチ様関節炎、喘息、急性若年型糖尿病、エイズ痴呆、アテローム動脈硬化、腎炎、網膜炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、心筋虚血および白血球媒介性急性肺傷害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
このほか、本発明の抗体および他の治療薬剤の治療用途にはさらに、器官または移植片の拒絶の危険性のある個体への投与が含まれる。近年、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓および骨髄などの組織および器官を移植する外科技術の効率性に著しい改善が見られる。際立って重要な問題は、移植された同種移植片または器官に対する免疫トレランスを被移植者に誘導する薬剤として満足のいく薬剤が得られていないことであると考えられる。同種異系細胞または器官が宿主（すなわち、提供者および被提供者が同種であるが異なる個体である）に移植される場合、宿主の免疫系は、移植物の外部抗原に対し免疫応答（宿主対移植片の疾病）を開始し、移植された組織の破壊につながると考えられる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、個体ががんを有しているのかを診断する方法であり、個体から選択して得た細胞上にＲＡＡＧ１０の発現があるのか判断することを含む。なお、前記細胞上のＲＡＡＧ１０の発現は、前記がんの存在を示すものである。いくつかの実施形態では、ＲＡＡＧ１０の発現は、抗ＲＡＡＧ１０抗体を用いて判断される。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞からＲＡＡＧ１０発現レベルを検出することを含む。本明細書で使用する用語「検出」には、対照との対比の有無とは関係なく質的および／または定量的検出（測定レベル）が含まれる。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、個体の細胞上または細胞から放出されるＲＡＡＧ１０を検出することによって個体のがんを診断する方法である。なお、がんは、副腎腫瘍、エイズに関連するがん、胞状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん（有棘細胞がん腫および移行上皮がん腫）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様（ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ）骨嚢腫、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頚動脈小体腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫（ｄｈｏｒｄｏｍａ）、嫌色素性腎細胞がん腫、明細胞がん腫、大腸がん、結腸直腸がん、皮膚の良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液性軟骨肉腫、線維形成不全骨、骨の線維異形成、胆嚢および胆管がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭部および頸部がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞がん腫）、白血病、脂肪腫／良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫／悪性の脂肪性腫瘍、肝がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌異常増殖、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、乳頭甲状腺がん、上皮小体腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、前立腺がん、後方ブドウ膜（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｕｎｖｅａｌ））黒色腫、まれな血液疾患、転移性腎がん、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ）、肉腫、皮膚がん、軟部組織の肉腫、扁平細胞がん、胃がん、滑膜肉腫、睾丸がん、胸腺がん腫、胸腺腫、転移性甲状腺がん、および子宮がん（頚部のがん腫、子宮内膜がん腫、および平滑筋腫）を含む群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
別の態様では、本発明は、個体からの生物試料中のＲＡＡＧ１０の発現を判断することを含む個体のがん（たとえば卵巣、肺、前立腺、膵臓、大腸、または乳がんなどがあるが、これらに限定されるものではない）を診断を補助する方法である。いくつかの実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体を使用してＲＡＡＧ１０の発現を判断する。いくつかの実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体は、本明細書で特定して名付けたファミリメンバーである。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＡＡＧ１０発現のレベルを細胞から検出することである。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、がん細胞の成長を縮小するのに十分なように、ＲＡＡＧ１０に結合する抗体を有効量投与することによってがんを処置する方法である。ある実施形態では、抗体は、抗ＲＡＡＧ１０抗体である。いくつかの実施形態では、がん細胞は、副腎腫瘍、エイズに関連するがん、胞状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん（有棘細胞がん腫および移行上皮がん腫）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様（ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ）骨嚢腫、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頚動脈小体腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫（ｄｈｏｒｄｏｍａ）、嫌色素性腎細胞がん腫、明細胞がん腫、大腸がん、結腸直腸がん、皮膚の良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液性軟骨肉腫、線維形成不全骨、骨の線維異形成、胆嚢および胆管がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭部および頸部がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞がん腫）、白血病、脂肪腫／良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫／悪性の脂肪性腫瘍、肝がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌異常増殖、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、乳頭甲状腺がん、上皮小体腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、前立腺がん、後方ブドウ膜（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｕｎｖｅａｌ）黒色腫、まれな血液疾患、転移性腎がん、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ）、肉腫、皮膚がん、軟部組織の肉腫、扁平細胞がん、胃がん、滑膜肉腫、睾丸がん、胸腺がん腫、胸腺腫、転移性甲状腺がん、および子宮がん（頚部のがん腫、子宮内膜がん腫、および平滑筋腫）を含む群から選択されるが、これらに限定されるものではない。ある好ましい実施形態では、がん細胞は、乳がん、大腸がん、前立腺がん、肺がん、肉腫、転移性腎がん、転移性甲状腺がん、および明細胞がん腫を含む固形腫瘍の群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、ＲＡＡＧ１０に特異的に結合する抗体の少なくとも一つのファミリを有効量投与することを含むがんを有する個体内での転移の進行を遅延する方法である。一実施形態では、抗体は抗ＲＡＡＧ１０抗体である。別の態様では、本発明は、化学療法薬と連繋する（そこに連結していることを含む）抗ＲＡＡＧ１０抗体を含む組成物を有効量、細胞培養物または試料、または個体に投与することを含むインビトロまたは個体内でがん細胞の成長および／または増殖を阻害する方法である。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、ＲＡＡＧ１０に特異的に結合する抗体ファミリの少なくとも一つのメンバーを有効量、個体に投与することによって個体内のがん細胞に治療薬剤を送達する方法である。別の実施形態では、別の治療薬剤と組み合わせて（そこに連結していることを含む）抗ＲＡＡＧ１０抗体を個体に送達する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体は、本明細書で名付けた抗体ファミリメンバー（通常、抗体の部分的または無傷のＣＤＲを一つ以上含むが、必ずしもそうであるとは限らない）由来のヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体は、名付けた抗体ファミリメンバーの一つ以上の特性を備えるヒト抗体である。いくつかの実施形態では、化学療法薬（毒素または放射性分子など）をがん細胞に送達する（内部移行させる）。いくつかの実施形態では、薬剤はサポリンである。
【００３１】
別の態様では、本発明は、化学療法薬と連繋する（そこに連結されることを含む）抗ＲＡＡＧ１０抗体を含む組成物を個体に有効量投与することを含む個体内のがんを処置する方法である。
【００３２】
本発明はさらに、細胞質シグナル伝達パートナーとＲＡＡＧ１０との連繋を強化するかまたは低減するかのどちらかによって調節する方法を提供する。細胞表面上に存在するＲＡＡＧ１０分子を、ＲＡＡＧ１０とシグナル伝達パートナーとの結合を調節する薬剤に接触させることによって、細胞質シグナル伝達パートナーとＲＡＡＧ１０との連繋に影響を及ぼすことができる。ＲＡＡＧ１０と結合および／またはシグナル伝達パートナーとのＲＡＡＧ１０の連繋性を阻止または低減する薬剤を使用し、ＲＡＡＧ１０媒介性炎症または免疫応答に含まれる生物学的および病理学的プロセスを調節することができる。この作用を含む病理学的プロセスには、腫瘍に関連する細胞成長が含まれる。
【００３３】
薬剤は、ＲＡＡＧ１０と抗ＲＡＡＧ１０抗体などの結合パートナーとの連繋を阻止する能力、低減する能力、強化する能力、そうでなければ調節する能力についてテストをすることができる。具体的には、ＲＡＡＧ１０相互作用部位（典型的には、無傷の生細胞上に存在するときの自然なコンホメーションにある）を含むペプチドを結合パートナーおよびテスト薬剤とインキュベートし、結合パートナーとＲＡＡＧ１０ペプチドとの結合をテスト薬剤が低減しているのか、または強化しているのかを判断することによって、上記のような相互作用の調節能力について薬剤をテストすることができる。特にアゴニスト、アンタゴニスト、およびその他のモジュレータが対象となる。
【００３４】
本発明の別の態様は、本明細書ではＲＡＡＧ１０として示されている同定された新規の抗原に関する。この抗原は、免疫原として使用するのに適しており、種々の研究、診断上および治療上の目的に適うものである。
ある態様では、本発明は、（ｉ）個体から得られる血液または組織の試料中のＲＡＡＧ１０の存在を分析する工程と、（ｉｉ）前記試料中のＲＡＡＧ１０マーカーの量が、正常（非疾病）血液または組織の試料と比べて増加しているのかを検出する工程と、（ｉｉｉ）前記マーカーの量の増加を疾病陽性診断と関連付けるか、前記マーカーの量の増加無しを疾病陰性診断と関連付ける工程を含む個体の疾病の診断を補助する方法である。ある実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体を使用してマーカーを検出する。ある実施形態では、本方法は、放射性核種イメージング、流動細胞計測法、および免疫組織化学からなる群から選択される技術によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＬＵＣＡ１抗体を用い、抗体の内部移行について実験した結果を示す。ＭａｂＺＡＰが高濃度になると線が分かれる。これはＬＵＣＡ１が内部移行されていることを示している。
【図２】図２は、Ｂ７Ｈ３およびその突然変異体の図示を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、乳がん、大腸がん、肺がん、および前立腺がんを含むがこれらに限定されるものではない種々のタイプの組織のがん細胞上に発現される新規の抗原、ＲＡＡＧ１０を提供する。さらに、本発明は、ＲＡＡＧ１０に結合するモノクローナル抗体およびポリペプチドを提供し、これらの抗体およびポリペプチドを作製し使用して、ＲＡＡＧ１０の発現および／または過剰発現に関連する種々の疾病ヒトがんを診断し処置する方法を提供する。
【００３７】
（Ｉ．技術全般）
本発明の実施は、特に断り書きのない限り、当該技術の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を利用する。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３−８）Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｒｎｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９  １）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）のような文献に十分説明されている。
【００３８】
（ＩＩ．定義）
「ＲＡＡＧ１０」および「Ｂ７−Ｈ３Ｌ」は、本発明の抗体をいい、グリコシル化分子の分子量が約１００ｋＤである上記の新規のポリペプチド抗原のことをいう。本明細書により詳細に記載しているように、この抗原は、異なるエピトープを一つより多く有する。本発明の好ましい抗体の実施形態のいくつかは、ＲＡＡＧ１０抗原の三つの特異的エピトープうち一つを標的とする。ＲＡＡＧ１０は、正常組織を相手にする場合と比較すると、特定のがん細胞上で過剰発現すると現在考えている。
【００３９】
「抗体」は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのような標的に、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも一つの抗原認識部位を介して特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用するように、この用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を包含するだけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、自然に発生する変異体、所要の特異性がある抗原認識部位をもつ抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および所要の特異性がある抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の別の修飾構造体も包含する。
【００４０】
「モノクローナル抗体」は、均質な抗体群のことをいう。モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に含まれるアミノ酸（天然に存在するものおよび非天然に存在するもの）から構成される。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一抗原部位を標的とする。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体およびモノクローナル抗体の全長を包含するだけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、および所要の特異性と抗原への結合能力とがある抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の別の修飾構造も包含する。抗体源またはその作製手法（たとえばハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、遺伝子組換え動物などによる手法）に関し限定はない。この用語は、免疫グロブリン全体のほか、「抗体」の定義の中で既に記載したような断片なども含む。
【００４１】
「ヒト化」抗体は、非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有し、それ以外の免疫グロブリンの分子構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づくものであり、組換え技術を用いて通常調製されるキメラ分子のことをいう。抗原結合部位は、定常領域上に融合されている可変領域を完全に含んでもよいし、または可変領域中の適切なフレームワーク領域上にグラフト化されている相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでもよい。抗原結合部位は、野生型であってもよいし、一つ以上のアミノ酸置換によって修飾されていてもよい。これによって、ヒト個体の免疫原としての定常領域が排除されることになるが、外来性の可変領域に対する免疫応答の可能性は残っている（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４）。別のアプローチでは、ヒト由来の定常領域を提供することに着目するだけでなく、可変領域も修飾し、それらをヒトでの形態にできるだけ近くなるよう形を整える。重鎖および軽鎖両方の可変領域は、問題の抗原に応答して変化し且つ結合能力を決定付ける三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、所定の種に比較的維持され且つＣＤＲに足場材料を提供していると推測されている四つのフレームワーク領域（ＦＲ）によって枠組みが作られていることは公知である。特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する場合、非ヒト抗体由来のＣＤＲを被修飾ヒト抗体に存在するＦＲ上にグラフト化することによって、可変領域の「再形成する（ｒｅｓｈａｐｅｄ）」または可変領域を「ヒト化する」。このアプローチを種々の抗体に適用することは、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８５１−８５６．Ｒｉｅｃｈｍａｍｉ，Ｌ．ら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら（１９９１）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９；およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４によって以前から報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＣＤＲ配列をすべて保つ（たとえば、マウス抗体由来の六つのＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。別の実施形態では、ヒト化抗体は、元の抗体に対して作り変えられたＣＤＲを一つ以上（１、２、３、４、５、６）有しており、これを、元の抗体の一つ以上のＣＤＲ「に由来する」一つ以上のＣＤＲと呼ぶこともある。
【００４２】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書では同義的に使用される）エピトープは、当該技術分野では汎用的な用語であり、このような特異的または優先的結合を測定する方法も当該技術分野では公知である。分子が特定の細胞または物質と反応または連繋し、それが別の細胞または物質に比べて頻繁か、迅速か、その持続時間が長いか、および／またはその親和性が強い場合、分子は「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言う。抗体が標的に結合する場合、別の物質と結合する場合に比べ親和性が強いか、結合力が強いか、結合が容易か、および／または持続時間が長い場合、抗体は標的に「特異的に結合している」または「優先的に結合している」。たとえば、特異的または優先的にＲＡＡＧ１０エピトープに結合する抗体は、他のＲＡＡＧ１０エピトープまたは非ＲＡＡＧ１０エピトープに結合する場合に比べ、より大きな親和力によってか、より大きな結合力によってか、容易にか、および／または持続時間が長くこのＲＡＡＧ１０エピトープに結合する抗体である。たとえば、特異的または優先的に第１の標的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）は、特異的または優先的に第２の標的に結合してもよいし、しなくてもよいことも、この定義を読めば明らかである。このように、「特異的結合」または「優先的結合」は、独占的結合を必ず必要とするものではない（が、独占的結合を含んでもよい）。通常、結合と示されていれば、優先的結合を意味するが、いつもそうであるとは限らない。
【００４３】
エピトープが「免疫学的活性を維持している」または活性がある場合、用語「免疫学的活性」は、種々の条件下での抗体、たとえばエピトープが低減条件および変性条件に曝された後の抗体（たとえば抗ＲＡＡＧ１０抗体）のエピトープ結合能力のことをいう。
【００４４】
種々の生物学的機能が、（以下に限定されるものではないが、卵巣、前立腺、膵臓、肺、大腸、または乳房のがん細胞を含むがん細胞上のＲＡＡＧ１０を含む）ＲＡＡＧ１０に結合する能力、インビトロまたはインビボの生細胞の表面上に露出しているＲＡＡＧ１０の一部に結合する能力、ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞（卵巣、前立腺、膵臓、肺、大腸、または乳房のがん細胞など）へ化学療法薬を送達する能力、ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞の中へ治療薬剤または検出可能マーカーを送達する能力を備える抗ＲＡＡＧ１０抗体と関連している。なお、能力はこれらに限定されるものではない。本明細書で議論しているように、本発明のポリペプチド（抗体を含む）は、これらの特徴を任意に一つ以上有するものであってもよい。
【００４５】
「抗ＲＡＡＧ１０等価抗体」または「抗ＲＡＡＧ１０等価ポリペプチド」は、抗ＲＡＡＧ１０抗体と関連し、たとえば結合特異性のような一つ以上の生物学的機能を有する抗体またはポリペプチドのことをいう。
【００４６】
本明細書での使用からもわかるように、「薬剤」とは、生物学的、薬学的、または化学的化合物のことをいう。例として、単体または複合体の有機または無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体断片、ビタミン誘導体、炭水化物、毒素、または化学療法化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。種々の化合物を合成することができ、たとえば、低分子物およびオリゴマー（たとえば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、および種々のコア構造に基づく合成有機化合物がある。さらに、植物または動物からの抽出物など種々の天然源からスクリーニング用の化合物が提供される。本発明の薬剤の構造的特徴に制限がないことは、当業者であればすぐにわかることである。
【００４７】
本発明の方法に利用される薬剤は、無作為に選択するか、または合理的に選択または設計することができる。本明細書での使用からもわかるように、本来の結合パートナーまたは公知の抗体とＲＡＡＧ１０との連繋に含まれる特異的配列を考慮することなく薬剤を無作為に選択する場合を、薬剤を無作為に選択するという。無作為に選択する薬剤の例は、化学的ライブラリまたはペプチド・コンビナトリアル・ライブラリを使用する場合である。
【００４８】
本明細書での使用からもわかるように、薬剤の作用に関連する標的部位の配列および／またはそのコンホメーションを考慮し作為的な根拠に基づき薬剤を選択する場合を、薬剤を合理的に選択または設計するという。抗ＲＡＡＧ１０剤については、抗体産生のきっかけを与えるエピトープがＲＡＡＧ１０上に少なくとも三つ存在し、したがって、ＲＡＡＧ１０／抗ＲＡＡＧ１０の相互作用を阻止する薬剤に対する作用部位が少なくとも三つ存在すると現在考えられている。本発明はさらに、ＲＡＡＧ１０とその本来の結合パートナーとの相互作用の部位で作用する薬剤を包含するが、他のリガンドおよびその活性のあるＲＡＡＧ１０−相互作用部位も本発明の範囲内に包含し、これらは現在公知であるか、将来同定されるものかには関係ない。薬剤は、受容体／リガンドおよび／またはＲＡＡＧ１０／抗ＲＡＡＧ１０抗体の複合体の接触部位を作り出すペプチド配列を利用することによって、合理的に選択するかまたは合理的に設計することができる。たとえば、合理的に選択されるペプチド薬剤は、本来の環境にある生細胞の表面上に露出しＲＡＡＧ１０上に現れるエピトープと同一であるアミノ酸配列のペプチドとすることができる。このような薬剤は、必要に応じて抗ＲＡＡＧ１０抗体または本来のリガンドに結合させることによって、抗ＲＡＡＧ１０抗体とＲＡＡＧ１０との連繋または本来のリガンドとＲＡＡＧ１０との連繋を低減または阻止すると考えられる。
【００４９】
本明細書での使用からもわかるように、抗体に関する用語「標識される」は、放射性薬剤またはフルオロフォア（たとえばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ））などの検出可能物質を抗体に接続（すなわち、物理的連結）することによって抗体を直接標識することのほか、検出可能物質との反応性によってプローブまたは抗体を間接的に標識することも包含しようとするものである。
【００５０】
本明細書での使用からもわかるように、抗体に関する用語「連繋」は、薬剤（たとえば、化学療法薬）への共有および非共有的な付着または結合を含む。抗体によって薬剤が抗体の結合するがん細胞に局在化するように、共通する基盤への付着を介して直接結合または間接的に結合させることによって、抗体を薬剤（たとえば、化学療法薬）と連繋させることができる。このとき、抗体の結合する同じがん細胞を薬剤が標的としないように、または薬剤の有効性が低下しないように、抗体および薬剤は生理学的条件下で実質上解離しない。
【００５１】
「生物試料」は、個体から得られる種々のタイプの試料を包含し、診断分析またはモニタリング分析に使用することができる。この定義は、血液および他の液体試料を包含する生物源、生検標本または組織培養物またはそこから得られる細胞、およびその子孫などの固形組織試料、たとえば、がんの疑いのある個体から収集される組織試料から得られる細胞、好ましい実施形態では、卵巣、肺、前立腺、膵臓、大腸、および乳房の組織から得られる細胞である。この定義はさらに、タンパク質またはポリヌクレオチドなど、ある組成物を試薬、可溶化、または濃縮によって処置するか、または切片化のために半固形または固形のマトリックスに包埋するなど任意の方法によって、調達後の試料に操作を加えた試料も含む。用語「生物試料」は、臨床試料を包含し、培養細胞、細胞上清、細胞可溶化物、血清、血漿、生物学的流体、および組織試料も含む。
【００５２】
「宿主細胞」は、挿入ポリヌクレオチドの取り込みをさせるためのベクター（単数または複数）の受容体になることができるか、または既に受容体である個体の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、自然発生的、偶発的または意図的な突然変異があるため、必ずしも本来の親細胞と（形態学的またはゲノムＤＮＡの相補性上）全く同一であるとは限らない。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（単数または複数）によってインビボで形質移入された細胞が含まれる。
【００５３】
本明細書での使用からもわかるように「転移の進行を遅延する」は、転移の進行を保留する、妨害する、減速する、抑制する、一定に保つ、および／または後延ばしにすることを意味する。このような遅延の時間の長さは、がんの進み具合および／または処置対象の個体に応じて異なる可能性がある。当業者であればわかることであるが、十分または有意の遅延には、実際には個体に転移を進行させない阻止を含めることができる。
【００５４】
薬学的組成物の「有効量」とは、一実施形態では、以下に限定されるものではないが、腫瘍（がんの場合であれば、たとえば、乳がんまたは前立腺がん）のサイズを縮める、がん細胞の成長を遅延する、転移の進行を遅延する、疾病によって生じる症状を減らす、疾病を患う個体の生活の質を向上させる、疾病を処置するのに必要な他の薬剤の投薬量を減らす、ターゲッティングおよび／または内部移行などによって別の投薬の効果を強化する、疾病の進行を遅延する、および／または個体の生存を延ばすなどの臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を生じるのに十分な量のことである。有効量の投与回数は、一回以上とすることができる。本発明の目的によれば、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量とは、直接または間接的のどちからかによって、がん細胞の増殖を減らし（または破壊し）、がん細胞の転移の発生または成長を減らすかおよび／または遅延するのに十分な量のことである。いくつかの実施形態では、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量とは、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と組み合わせて達成されるものであってもよいし、そうでなくてもよい。したがって、「有効量」は、一つ以上の化学療法薬を投与する場合として考えることもできるし、一つ以上の他の薬剤と組み合わせて所望の結果が達成されると思われるか、または達成される場合、一種類の薬剤が有効量投与されると考えることもできる。個々のニーズは異なり、各組成物の有効量の最善の範囲を決定することは、当該技術の範囲内である。典型的な投薬量には、０．１から１００ｍｇ／ｋｇ／体重が含まれる。好ましい投薬量には、１から１００ｍｇ／ｋｇ／体重が含まれる。最も好ましい投薬量には、１０から１００ｍｇ／ｋｇ／体重が含まれる。
【００５５】
本明細書での使用からもわかるように、核酸分子、薬剤、抗体、組成物、または細胞などがその供給源に混入している核酸分子、抗体、薬剤、組成物、または細胞などから実質的に分離されている場合に、核酸分子または薬剤、抗体、組成物または細胞などは「単離されている」という。
【００５６】
「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類には、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、マウスおよびラットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを示すために本明細書では同義的に使用される。ポリマーは直鎖であっても、分枝であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよい。また、非アミノ酸によって割り込みを受けていてもよい。この用語にはさらに、自然にまたは処理によって既に修飾されているアミノ酸ポリマーも包含され、処理には、たとえば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加反応、アセチル化、リン酸反応、または任意の他の操作または修飾、たとえば標識組成物とのコンジュゲートなどがある。さらに、この定義の範囲には、たとえば、アミノ酸（たとえば、非天然アミノ酸などを含む）の類似体を一つ以上含むポリペプチドのほか、当該技術分野では公知である他の修飾物も含まれる。当然のことながら、本発明のポリペプチドは抗体に基づいたものであるので、ポリペプチドは単鎖または連繋鎖として存在することができる。
【００５８】
本明細書での使用からもわかるように、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち混入物がない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋、またはそれ以上純粋である材料のことをいう。
【００５９】
「毒素」とは、細胞内で有害な反応をもたらす任意の物質のことをいう。たとえば、がん細胞に対する毒素とは、がん細胞に対し有害な効果、時には悪影響を有するものであるということができる。毒素の例として、放射性同位体、カリチアマイシン、およびメイタンシノイドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
本明細書での使用からもわかるように、「処置」または「処置する」は、および好ましくは臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的によれば、有益なまたは所望の臨床結果には、以下のものが一つ以上含まれるが、これらに限定されるものではない：がん細胞または他の疾病細胞の増殖を減らす（または破壊する）、がんにみられるがん細胞の転移を減らす、腫瘍のサイズを縮める、疾病によって生じる症状を減らす、疾病を患う個体の生活の質を向上させる、疾病を処置するのに必要な他の薬剤の投薬量を減らす、疾病の進行を遅延する、および／または個体の生存を延ばす。
【００６１】
（ＩＩＩ．抗体の作製方法）
モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。利用することができる一方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）の方法またはそれを改良した方法である。典型的には、モノクローナル抗体は、マウスなどの非ヒト種で発生させる。通常、免疫化にはマウスまたはラットを使用するが、他の動物を使用してもよい。ヒトＲＡＡＧ１０を含み免疫原性を示す量の細胞、細胞抽出物、またはタンパク質調製物を用いマウスに免疫性を与えることによって抗体が産生する。免疫原は、初代細胞、培養細胞株、がん細胞、核酸、または組織とすることができるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、ヒト胎児性膀胱細胞を使用する。別の実施形態では、ヒト膵臓の前駆細胞を使用する。ヒト胎児性膀胱細胞およびヒト膵臓の前駆細胞を単離し培養する方法は、実施例１で詳しく説明する。免疫原、たとえば、ヒト胎児性膀胱細胞またはヒト膵臓の前駆細胞に使用される細胞は、免疫原としてそれらを使用する前に、ある期間（少なくとも２４時間）培養してもよい。細胞（たとえば、ヒト胎児性膀胱細胞またはヒト膵臓の前駆細胞）自体を免疫源として、またはリビ（Ｒｉｂｉ）などの非変性佐剤と組み合わせて免疫原として使用してもよい。通常、細胞は免疫原として使用するとき、無傷の状態、好ましくは生存可能な状態を維持していなければならない。免疫性付与を受けた動物では、無傷細胞の方が、裂けた細胞よりも良好に抗原を検出することができる。変性剤またはきつい佐剤、たとえばフロイント剤（Ｆｒｅｕｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ）を使用すると、ヒト胎児性膀胱細胞またはヒト膵臓の前駆細胞を破裂させる虞があるため、これらの使用は避ける。免疫原は、複数回、定期的に、たとえば２週毎または毎週投与してもよいし、動物（たとえば組換え組織）内での生存度を維持できるような方法で投与してもよい。抗ＲＡＡＧ１０抗体の産生に使用される方法、およびＲＡＡＧ１０に結合する他のモノクローナル抗体の産生に使用することのできる方法を実施例２に記載する。
【００６２】
一実施形態では、ＲＡＡＧ１０に結合するモノクローナル抗体は、免疫原としてＲＡＡＧ１０を過剰発現する宿主細胞を使用することによって得られる。
【００６３】
抗体反応をモニターするために、小さい生物試料（たとえば血液）を動物から得て、免疫原に対する抗体価の検査をしてもよい。脾臓および／またはいくつかの大きいリンパ節は取り出して単細胞に解離させることができる。必要に応じて、脾臓細胞のスクリーニングを、抗原がコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を塗布することによって実施してもよい（非特異的に接着している細胞を除去後）。抗原に特異的な膜結合型の免疫グロブリンを発現するＢ−細胞がプレートに結合することになり、これは懸濁液の残りと一緒になって洗い流されることはない。次に、生じたＢ−細胞または解離した全脾臓細胞を骨髄腫細胞（たとえば、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびソーク・インスティテュート（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、セル・ディストリビューション・センター（Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）、サン・ディエゴ、カリフォルニアから得られる細胞）と融合することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用し、脾臓またはリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを形成してもよい。次にハイブリドーマを選択培地（たとえば、「ＨＡＴ培地」としても知られているヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンの培地）で培養する。次に、得られたハイブリドーマを限界希釈によってプレートに蒔き、ＦＡＣＳまたは免疫組織化学（ＩＨＣスクリーニング）を使用することによって、免疫原（たとえばＨＦＢ細胞の表面、がん細胞株の表面、胎児性膀胱切片など）に特異的に結合する抗体の産生を分析する。次に、選択されたモノクローナル抗体−分泌ハイブリドーマを、インビトロ（たとえば組織培養ビンまたはホローファイバー型反応器中）、またはインビボ（たとえばマウスの腹水中）のどちらかで培養する。抗ＲＡＡＧ１０抗体の獲得およびスクリーニングに利用される方法のさらなる詳細は実施例３に示す。
【００６４】
細胞融合技術の別の選択肢として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用し、本発明のモノクローナル抗体を産生してもよい。ハイブリドーマを増やし、サブクローン化し、必要に応じて、従来の検定法手順（たとえば、ＦＡＣＳ、ＩＨＣ、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫学的検定、蛍光免疫学的検定など）によって、抗免疫原活性について上清を分析する。
【００６５】
別の選択肢では、モノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０および任意の他の等価抗体の配列を決定し、当該技術分野では公知の任意の手段（たとえばヒト化、ヒト抗体を完全に産生する遺伝子組換えマウスの使用、ファージ提示法など）による組み換えによって産生することができる。一実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０モノクローナル抗体の配列を決定し、次に、発現または増殖のためにポリヌクレオチド配列をベクターへクローニングする。対象の抗体をコードする配列は、宿主細胞のベクター中に保持してもよい。このとき将来の使用に備えて宿主細胞を増殖させ、凍結しておくことができる。
【００６６】
モノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０および任意の他の等価抗体のポリヌクレオチド配列を遺伝子操作に使用し、「ヒト化」抗体を産生したり、親和力または抗体の他の特徴を改善したりしてもよい。抗体のヒト化の一般的原理には、抗体の抗原結合性部分の基本配列を保有させつつ、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換することが含まれる。モノクローナル抗体のヒト化には一般的な工程が四つあり、（１）開始抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列予測の決定、（２）ヒト化抗体の設計、すなわち、ヒト化プロセスに使用する抗体のフレームワーク領域の決定、（３）ヒト化の実際的な方法論／技術および（４）ヒト化抗体の形質移入および発現である。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；第５，８６６，６９２号；および第６，３３１，４１５号を参照すること。
【００６７】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原−結合部位を含む複数の「ヒト化」抗体分子が既に報告されており、ヒト定常領域に融合されるげっ歯類または改良げっ歯類のＶ領域およびこれらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体が含まれる。たとえば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１）、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４（１９８９）、Ｓｈａｗら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７）、およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３（１９８７）を参照すること。他の文献には、適切なヒト抗体の定常領域と融合する前にヒトの支持フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされているげっ歯類のＣＤＲが記載されている。たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）を参照すること。別の文献には、組み換えによって化粧張りされるげっ歯類のフレームワーク領域によって支持されるげっ歯類のＣＤＲが記載されている。たとえば、欧州特許出願公開第５１９，５９６号を参照すること。このような「ヒト化」分子は、治療目的で受容者に適用する際に適用部分での持続時間および有効性を限定してしまうげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する好ましくない免疫応答が最小限に抑えられるように設計される。抗体をヒト化する別の方法として利用することができるものは、ＤａｕｇＨｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：２４７１−２４７６（１９９１）および米国特許第６，１８０，３７７号；第６，０５４，２９７号；第５，９９７，８６７号；および第５，８６６，６９２号にも開示されている。
【００６８】
本発明は、ｍＫＩＤ２など、本発明の抗体の単鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）も包含する。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用して軽鎖および／または重鎖の可変領域を連結することによって作製される。Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６には、一可変領域のカルボキシ末端と他の可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを架橋結合する連結ペプチド類の例が記載されている。別の配列のリンカーが既に設計され使用されている、Ｂｉｒｄら（１９８８）。リンカーも同じく、薬物の付着または固体支持物への付着などさらなる機能のために修飾することができる。この単鎖変異体は組み換えによってまたは合成的に産生することができる。ｓｃＦｖを合成的に産生するために自動化合成器を使用することができる。ｓｃＦｖを組換えによって産生するためには、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫または哺乳類などの真核生物の細胞、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物のいずれかの適切な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドのライゲーションなど通常の操作によって、対象のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを作製することができる。結果として得られたｓｃＦｖは、当該技術分野では公知である標準的なタンパク質精製技術を使用して単離することができる。
【００６９】
本発明は抗体への修飾を含み、抗体は、抗体の特性および強化または低減された活性を有するその変異体に重大な影響を及ぼさない機能的に等価な抗体およびポリペプチドを含む。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野では日常的に実施されるものであり、本明細書で詳細に記載する必要はない。修飾ポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換、機能的活性が非常に悪化するほど変化させることはないアミノ酸の一つ以上の欠失または付加、または化学的類似体の使用を伴うポリペプチドが含まれる。相互に保存的に置換することができるアミノ酸残基には、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン（ｔｒｙｏｓｉｎｅ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。上記のようなポリペプチドには、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチドのほか、たとえば種々の異なる糖とのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸反応など他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含まれる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的とし、すなわち、置換アミノ酸は、元のアミノ酸と同様の化学的特性を有するものとする。このような保存的置換は当該技術分野では公知であり、例は既に上記に示している。アミノ酸修飾は、一つ以上のアミノ酸の変化または修飾から、可変領域などの領域の完全な再設計まで多岐にわたる。可変領域の変化は、結合親和力および／または特異性を変えることができる。修飾の別の方法には、酵素学的手段、酸化的置換およびキレート化を含む当該技術分野では公知である接続技術の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。修飾は、たとえばラジオイムノアッセイ用の放射性成分の付着など免疫学的検定用の標識の付着のために使用することができる。修飾ポリペプチドは、当該技術分野では確立済みの手順を使用して作製され、当該技術分野では公知である標準的な分析を使用してスクリーニングすることができる。
【００７０】
さらに本発明は、本発明の抗体からの一つ以上の断片または領域を含む融合タンパク質を包含する。一実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも１０個連続するアミノ酸および可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリンの定常領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書に記載のようなＡＴＣＣに保管されたハイブリドーマから産生される抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。本発明の目的によれば、抗体融合タンパク質は一つ以上の抗ＲＡＡＧ１０ポリペプチド、および元の分子には付着されていない別のアミノ酸配列、たとえば異種配列または別の領域からの相同的配列を含む。抗ＲＡＡＧ１０ポリペプチドは、当該技術分野では公知である方法によって、たとえば合成的にまたは組み換えによって作り出すことができる。
【００７１】
さらに別の選択肢では、特異的ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することによって完全なヒト抗体を得てもよい。また、ヒト化またはヒト抗体の産生のために、さらに望ましい（たとえば完全なヒト抗体）またはさらに強い免疫応答を生じるように設計されている遺伝子組換え動物を使用してもよい。このような技術の例として、アブジェニクス・インク（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）（フレモント、カリフォルニア）のゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標））およびメダレックス・インク（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）（プリンストン、ニュージャージー）のＨｕＭＡｂ−マウス（ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標））およびＴＣマウス（ＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標））がある。
【００７２】
ある選択肢では、抗体は、当該技術分野では公知である任意の方法を使用し、組み換えによって作製し発現させてもよい。抗体は、宿主動物から作られた抗体をまず単離し、遺伝子配列を得、この遺伝子配列を使用し、この抗体を組み換えによって宿主細胞（たとえばＣＨＯ細胞）中に発現させる組み換えによって作製してもよい。利用することのできる別の方法は、植物（たとえばタバコ）または遺伝子組換え乳に抗体配列を発現させることである。組み換えによって植物または乳中に抗体を発現させる方法は既に開示されている。たとえば、Ｐｅｅｔｅｒｓら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５；およびＰｏｌｌｏｃｋら（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７を参照すること。抗体の誘導体、たとえばヒト化したもの、単鎖などを作製する方法は、当該技術分野では公知である。別の選択肢では、抗体をファージ提示技術による組み換えによって作製してもよい。たとえば、米国特許第第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号；第６，２６５，１５０号；およびＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）を参照すること。
【００７３】
当業者には公知であるエドマン分解によって対象の抗体またはタンパク質を配列決定してもよい。質量分析法またはエドマン分解から得られるペプチド情報は、対象のタンパク質のクローン化に使用されるプローブまたはプライマーの設計に用いることができる。
【００７４】
対象のタンパク質をクローン化する別の方法は、対象の抗体またはタンパク質を発現する細胞にＡＬＣＡＭを使用する「パニング」によるものである。「パニング」手順は、対象の抗体またはタンパク質を発現する組織または細胞からｃＤＮＡライブラリを得、第２の細胞タイプにｃＤＮＡを過剰発現させ、ＡＬＣＡＭへの特異的結合について第２の細胞タイプの形質移入細胞をスクリーニングすることによって実施される。細胞表面のタンパク質をコードする哺乳類の遺伝子のクローン化に使用される「パニング」による方法の詳細な記載は、当該技術分野で見つけることができる。たとえば、Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、８５７３−８５７７（１９８７）およびＳｔｅｐｈａｎ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：  ５８４１−５８５４（１９９９）を参照すること。
【００７５】
ｃＤＮＡは、当該技術分野では標準的である方法に従い、特定の細胞型からのｍＲＮＡを逆転写することによって得ることができる。特に、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上記文献に説明されている手順に従い種々の溶解酵素または化学溶液を使用するか、または製造業者（たとえばキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、インビトロジェン、プロメガ）から市販されている核酸結合樹脂を用い添付の説明書に従って抽出することによって単離することができる。次に、合成されたｃＤＮＡを発現ベクターへ導入し、第２のタイプの細胞中で対象の抗体またはタンパク質を産生させる。発現ベクターは、エピソームまたは染色体ＤＮＡの不可欠な成分として宿主細胞中で複製することができなければならないことが示唆されている。適切な発現ベクターには、プラスミド、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルスおよびコスミドを含むウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
対象のポリヌクレオチドを含むベクターは、電気穿孔法、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用する形質移入；微粒子銃；リポフェクション；および感染（たとえばベクターがワクシニアウイルスのような感染性剤である場合）を含む複数の適切な手段のうち任意の手段によって、宿主細胞へ導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドの導入について何を選択するのかは、宿主細胞の性質によって決まることが多い。
【００７７】
対象の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために、異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を使用することができる。哺乳類の宿主細胞の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、宿主細胞は、対象の抗体またはタンパク質に該当するものが宿主細胞中に存在するのであれば、その内在性の抗体またはタンパク質のｃＤＮＡよりも約５倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらにより好ましくは２０倍以上高いレベルでｃＤＮＡを発現する。ＲＡＡＧ１０への特異的結合に対する宿主細胞のスクリーニングは、免疫学的検定またはＦＡＣＳによって達成される。対象の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞は同定することができる。
【００７８】
本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野では公知である手順によってによって作製することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解またはその他の分解による分解物、上記記載のような組換え法（すなわち単一または融合ポリペプチド）、または化学合成によって産生することができる。抗体のポリペプチド、特に最大で約５０アミノ酸の短いポリペプチドが化学合成によって好適に作製できる。化学合成の方法は当該技術分野では公知であり、市販品を利用することができる。たとえば、抗ＲＡＡＧ１０ポリペプチドの場合、固相法を利用する自動ポリペプチド合成器によって生成することができる。
【００７９】
（ＩＶ．モノクローナル抗体のスクリーニング方法）
ＲＡＡＧ１０に結合するモノクローナル抗体をスクリーニングするためにいくつかの方法を使用することができる。当然のことながら、「結合」とは免疫学的に関連のある結合、すなわち免疫グロブリン分子がコードされている特定の抗原に特異的である結合のことであり、非特異的標的に対し非常に高い濃度で免疫グロブリンを使用するときに生じると考えられる非特異的結合のことではない。一実施形態では、標準的なスクリーニング技術を用い、ＲＡＡＧ１０結合についてモノクローナル抗体をスクリーニングする。このようにして抗ＲＡＡＧ１０モノクローナル抗体を得た。ブタペスト条約に従い、２００２年４月９日、抗ＲＡＡＧ１０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１  ユニバーシティ通り（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．）、マナッサス、バージニア、２０１１０−２２０９に保管した。特許管理表示はＰＴＡ−４２１７、ＰＴＡ−４２１８、ＰＴＡ−４２４４、およびＰＴＡ−４２４５である。
【００８０】
ＲＡＡＧ１０に結合するモノクローナル抗体を、がん組織および非がん細胞への結合性についてスクリーニングする。一実施形態では、ＲＡＡＧ１０に結合し、ヒトがん細胞または組織に対し交差反応性もあるが、正常細胞または組織に対し同程度の反応性を示さないモノクローナル抗体を選択する。スクリーニングに利用することのできる一方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。標準的な免疫組織化学技術は当該技術分野の平均的な当業者には公知である。たとえば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＤ．Ｂａｒｎｅｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第５７巻、第１８章および第１９章、３１４−３５０ページ、１９９８年）を参照すること。生物学的試料（たとえば組織）は、生検、死体解剖、または検視から得てもよい。ＲＡＡＧ１０ががん細胞上にのみ存在しているのかを確かめるために、抗ＲＡＡＧ１０抗体を使用し、がんをもつ個体からの組織上にＲＡＡＧ１０が存在するのかを検出してもよく、そのとき、がんに罹患している個体の別の非がん組織またはがんのない個体からの組織を対照として使用する。組織は、凍結中の損傷を防ぐ固体または半固体物質（たとえばアガロースゲルまたはＯＣＴ）に包埋し、次に染色用に切片化することができる。異なる器官および異なる段階のがんを使用し、モノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。スクリーニング目的に使用してもよい組織の例には、卵巣、乳房、肺、前立腺、大腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓が含まれるが、これらに限定されるものではない。スクリーニング目的に使用してもよい異なるがんのタイプの例には、がん腫、腺がん、肉腫、腺肉腫、リンパ腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
さらに別の選択肢では、ＳＫ−Ｏｖ−３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ７７）、ＬｎＣａｐ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７４０）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１８５）、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４６９）、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ３０）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ５８）、ＨＴ−２９（ＨＴＢ−３８）、ＳＷ  ４８０（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２８）、ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６８２）、Ｃａｐａｎ−１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ７９）、ＣＦＰＡＣ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１９１８）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１９９７）、Ｈｓ−７００Ｔ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ１４７）、ＥＳ−２（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１９７８）、ＰＣ−３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５）、Ｄｕ−１４５（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１）、Ｃａｌｕ３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−５５）、Ａ４９８（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−７９０８）、Ｃａｋｉ−２（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−４７）、７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１９３２）、Ｈｓ  ７６６Ｔ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３４）、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）、ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２０）、Ｒａｖ  ＣＡ１３０（レイブン・バイオテクノロジーズ・インク（Ｒａｖｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．）が独自開発した肺がん株）、Ｒａｖ９９２６（レイブンが独自開発した膵臓がん細胞株）、および２２Ｒｖ１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２５０５）などのがん細胞株および各組織からの正常細胞を使用し、がん組織に特異的なモノクローナル抗体についてスクリーニングしてもよい。卵巣、乳房、肺、前立腺、大腸、腎臓、皮膚、甲状腺、大動脈平滑筋、および内皮細胞を含むがこれらに限定されるものではない異なる器官からの正常組織に由来する初代または低継代の細胞培養をネガティブコントロールとして使用することができる。がん細胞または非がん細胞をスライドガラスまたはカバーガラス上で、またはプラスチック表面上で成長させるか、または国際公開ＷＯ０１／４３８６９に記載のようなセルアレイ（ＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標））中で調製し、組織に対し上記記載のようなＩＨＣを使用することによって抗体の結合についてスクリーニングすることができる。あるいは、非タンパク質分解手段を使用して細胞を成長表面から除去し、これを回転させてペレット状にしてもよく、この後、上記記載のようなＩＨＣ分析用の組織として包埋し処置する。別の選択肢では、初代抗体、抗体蛍光性分子に連結されている二次の「レポータ」とともにインキュベートすることによって単細胞をスクリーニングし、次に蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して分析してもよい。
【００８２】
組織切片に対する抗体の結合を検出するために、いくつかの種々の検出システムを利用することができる。典型的には、免疫組織化学法には、組織へ初代抗体を結合させることが含まれ、次に、初代抗体からの種に対し反応性のある二次抗体を産生し、検出可能マーカー（たとえば西洋わさびペルオキシダーゼ、ＨＲＰ、またはジアミノベンゼジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｅｄｉｎｅ）、ＤＡＢ）にコンジュゲートさせた。使用してもよい別の方法の一つに、ポリクローナル鏡像相補抗体またはｐｏｌｙＭＩＣＡがある。Ｄ．Ｃ．ＭａｎｇｈａｍおよびＰ．Ｇ．Ｉｓａａｃｓｏｎ（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９９）３５（２）：１２９−３３）によって記載されるＰｏ１ｙＭＩＣＡ（ポリクローナル鏡像的相補抗体）技術は、初代抗体（たとえば抗ＲＡＡＧ１０抗体）の正常組織およびがん組織への結合を検査するために使用することができる。いくつかの種類のｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットがバインディング・サイト・リミテッド（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（私書箱４０７３、バーミンガムＢ２９  ６ＡＴ  イングランド）から市販されている。製品番号ＨＫ００４．ＤがＤＡＢクロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）を用いるｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットである。製品番号ＨＫ００４．ＡがＡＥＣクロマゲンを用いるｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットである。あるいは、初代抗体を検出可能マーカーによって直接標識してもよい。
【００８３】
適切な抗体を選択するためのＩＨＣスクリーニングの第一段階は、マウス（たとえば抗ＲＡＡＧ１０抗体）で産生される初代抗体を一つ以上の免疫原（たとえば細胞または組織試料）に結合させることである。一実施形態では、組織試料は、異なる器官から得た凍結組織の切片である。細胞または組織の試料は、がん性または非がん性の試料とすることができる。
【００８４】
当業者には公知である任意の複数の方法のいずれかによって、凍結組織を調製し、固定の有無とは関係なく切片化し、ＩＨＣを実施することができる。たとえば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１２：２６４−２７７（１９９９）、およびＳｔｅｐｈａｎらＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４０：５８４１−５４（１９９９）を参照すること。
【００８５】
（Ｖ．抗ＲＡＡＧ１０抗体のキャラクタリゼーションの方法）
抗ＲＡＡＧ１０抗体のキャラクタリゼーションのためにいくつかの方法を使用することができる。一つの方法は、抗体が結合するエピトープを同定することである。エピトープマッピングが種々の販売元、たとえばペプスキャン・システムズ（Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（エデルヘルトウェグ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ）１５、８２１９、ＰＨ  レリースタッド（Ｌｅｌｙｓｔａｄ）、オランダ）から市販されている。抗ＲＡＡＧ１０抗体が結合している配列を決定するのにエピトープマッピングを使用することができる。エピトープは、直鎖エピトープ、すなわちアミノ酸の単一伸張部に含まれるエピトープ、または単一伸張部に必ずしも含まれなくてもよいアミノ酸の３次元的相互作用によって形成されるコンホメーションのエピトープとすることができる。長さの異なるペプチド類（たとえば少なくとも４〜６のアミノ酸長）を単離または合成し（たとえば組み換えによって）、抗ＲＡＡＧ１０抗体の結合分析に使用することができる。抗ＲＡＡＧ１０抗体が結合するエピトープは、細胞外配列に由来する重複ペプチド類を使用し、抗ＲＡＡＧ１０抗体によって結合を決定する系統的なスクリーニングによって決定することができる。ＲＡＡＧ１０のエピトープマッピングについては実施例で詳しく説明する。我々は、ＲＡＡＧ１０エピトープが一つより多く存在することを突き止めたほか、一つのエピトープに結合する我々の抗体ＫＩＤ１３、ＬＵＣＡ１およびＧＢ８、第２のエピトープに結合する我々の抗体ＳＫＩＮ２、ＰＡ２０、およびＫＩＤ１、および第３のエピトープに結合する我々の抗体ＢＬＡ８を決定した。これらの抗体は、同様の固有の結合性および生物学的特徴をもつ新規の抗体群からの例示に過ぎず、これらはすべて本発明の範囲内に特に包含されるものである。
【００８６】
抗ＲＡＡＧ１０抗体を特徴付けるのに使用することができるさらに別の方法は、同じ抗原、すなわちＲＡＡＧ１０に結合する公知の別の抗体を用い、抗ＲＡＡＧ１０抗体が別の抗体と同じエピトープに結合するか判断する競合分析の利用である。ＲＡＡＧ１０に対する市販の抗体は、そのまま利用してもよいし、本明細書に教示の結合分析を使用して同定してもよい。競合分析は、当業者に公知であり、このような手順および具体的なデータは、実施例でさらに詳しく説明する。抗ＲＡＡＧ１０抗体は、さらに、これらが結合する組織、がんのタイプまたは腫瘍のタイプによって特徴付けることができる。
【００８７】
抗ＲＡＡＧ１０抗体を特徴付ける別の方法は、抗体が結合する抗原による方法である。抗ＲＡＡＧ１０抗体は、種々のヒトがんからの細胞可溶化物とともにウエスタンブロットで使用した。当業者に知られているように、ウエスタンブロッティングには、細胞可溶化物および／または細胞画分を変性または非変性ゲル上に流し、タンパク質をニトロセルロース紙に転写し、次に抗体（たとえば抗ＲＡＡＧ１０抗体）によってブロットをプローブし、この抗体がどのタンパク質に結合しているのかを見ることを含めることができる。この手順は、さらに実施例４で詳しく説明する。抗ＲＡＡＧ１０抗体が結合しているバンドを単離し、さらに実施例５および６に記載のような質量分析を使用し分析した。抗ＲＡＡＧ１０抗体が結合している抗原はＲＡＡＧ１０であることがわかった。ＲＡＡＧ１０は、大腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、膵臓、腎臓のほか、肉腫のような他のタイプのがんを含むがこれらに限定されるものではない異なる組織の種々のヒトがんと連繋している。ＲＡＡＧ１０については、さらに実施例６および７に記載する。
【００８８】
（ＶＩ．抗ＲＡＡＧ１０抗体を使用してがんを診断する方法）
本明細書に開示の方法によって作製されるＲＡＡＧ１０に対するモノクローナル抗体を使用し、卵巣、乳房、肺、前立腺、大腸、腎臓、膵臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、および上部消化管を含むがこれらに限定されるものではない種々の組織中のがん細胞の有無を診断目的で同定することができる。本明細書に開示の方法によって作製されるＲＡＡＧ１０に対するモノクローナル抗体を使用し、固形腫瘍から放出された後に血液中を循環するがん細胞の有無またはそのレベルを同定してもよい。このように循環している抗原は、本明細書に教示されている方法に従って検出することのできる状態を保つ無傷ＲＡＡＧ１０抗原またはその断片であると考えられる。このような検出は、当該技術分野では一般に使用される標準的な方法を使用し、ＦＡＣＳ分析によって実施してもよい。
【００８９】
このような使用に伴い、特異的にＲＡＡＧ１０に結合する抗体とＲＡＡＧ１０との間に複合体を形成させることができる。このような抗体の例には、ＡＴＣＣに保管されている記号表示ＰＴＡ−４２１７、ＰＴＡ−４２１８、ＰＴＡ−４２４４、およびＰＴＡ−４２４５のハイブリドーマによって産生される上記の抗ＲＡＡＧ１０モノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような複合体の形成は、インビトロまたはインビボで可能である。理論による裏づけがあるわけではないが、モノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０は、ＲＡＡＧ１０の細胞外ドメインを介してＲＡＡＧ１０に結合することができ、その結果内部移行するものと思われる。
【００９０】
本発明の診断法の好ましい一実施形態によれば、抗体は検出可能な標識を有している。使用してもよい標識の例には、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリトリンなど、放射性薬剤またはフルオロフォアが含まれる。
【００９１】
診断および治療の目的で商業ベースで利用されている他の公知の抗体と同じく、本発明の標的抗原は正常組織中に広く発現し、また、いくつかの腫瘍中では上方制御される。それため、診断または治療薬剤のために使用するときの本発明の抗体の特定の投薬量および産生経路は、現在手がけている特定の腫瘍または病状のほか、処置する特定の個体に合わせることになる。
【００９２】
診断に抗体を使用する一つの方法は、放射性または放射線不透過性薬剤に抗体を連結させ、この抗体を個体に投与し、Ｘ線または他の画像処理機械を使用して、がん細胞表面で抗原を発現する標識された抗体の局在化を可視化するインビボの腫瘍画像処理である。抗体は、生理学的条件下で結合を促進する濃度で投与される。
【００９３】
ＲＡＧ１０を検出するインビトロ技術は、当該技術分野では通常の技術であり、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、酵素免疫学的検定（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット分析が含まれる。
【００９４】
本発明の態様では、腫瘍または新生物のラジオイメージング方法、またはラジオ標識された抗体を用いて処置方法の有効性を測定する方法は、本発明の実施によってラジオ標識された腫瘍−特異的抗体を個体に投与する工程を含む。ラジオ標識された抗体は、ラジオ標識、好ましくはテクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１、ヨウ素−１３１、レニウム−１８６、レニウム−１８８、サマリウム−１５３、ルテチウム−１７７、銅−６４、スカンジウム−４７、イットリウム−９０からなる群から選択されるラジオ標識を含むモノクローナルまたはポリクローナル抗体とすることができる。抗体の免疫活性を損なわず、インビボで壊れないヨウ素−１３１、レニウム−１８８、ホルミウム−１６６、サマリウム−１５３およびスカンジウム−４７のような治療用放射性核種によって標識されたモノクローナル抗体が特に好ましい。当業者は、公知の放射性同位体がほかにもあり、これらが特定の用途に適切であると考えられることを十分承知している。ラジオイメージングは、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ポジション（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴画像処理（ＭＲＩ）を使用して実施してもよい。さらに広い解剖学的定義による転移の場所をラジオイムノイメージングによって示すことのできる相関画像処理も考慮される。
【００９５】
他の方法では、がん細胞を除去し、当該技術分野では公知である方法（たとえば、固定の有無に関係なく凍結化合物中へ包埋し、凍結し、切片化する；抗原の回収および対比染色法の種々の方法に関係なく固定しパラフィン包埋する）によって免疫組織化学用に組織を調製する。さらに、モノクローナル抗体を使用して異なる発生段階にあるがん細胞を同定してもよい。さらに、どの個体の腫瘍がそれらの表面上で所定のレベルの抗原を発現しているのか、この抗体を使用して決定することができる。このため、この抗体は、前記抗原を標的とする抗体を使用する免疫療法の候補物質である。この抗体は、ＲＡＡＧ１０を発現する卵巣、前立腺および膵臓の原発性および転移性がんの両方、および肺の原発性がんを認識することができる。本明細書での使用からもわかるように、検出には、質的および／または定量的検出を含めてもよく、がん細胞中のＲＡＡＧ１０の発現の増加レベルを知るために正常細胞で測定されたレベルを比較することを含めてもよい。
【００９６】
さらに本発明は、ＲＡＡＧ１０に結合する任意の抗体を使用して個体内のがん（卵巣、肺、膵臓、前立腺、大腸、または乳房のがんなど）の診断を補助する方法、およびＲＡＡＧ１０発現のレベルを決定するのに使用することのできる任意の別の方法を提供する。本明細書での使用からもわかるように、「診断を補助する」方法とは、これらの方法が、がんの分類または特徴に関する臨床的な定量を実施するのに役に立ち、最も確実だと思われる診断に対して最終的な是非の判断を下してもよいことを意味する。したがって、がんの診断を補助する方法は、個体からの生物試料中のＲＡＡＧ１０のレベルを検出し、および／または試料中のＲＡＡＧ１０発現のレベルを決定する工程を含むことができる。さらに、抗原を認識する抗体を使用し、血液、唾液、尿、肺液、または腹水液を含むがこれらに限定されるものではない体液中の生きているまたは瀕死のがん細胞から放出されるまたは分泌される抗原を検出するための診断用イムノアッセイを開発してもよい。
【００９７】
対象である特定の腫瘍中の細胞がすべてＲＡＡＧ１０を発現するわけではなく、他の組織のがん細胞がＲＡＡＧ１０を発現する場合もあるので、個体は、がん細胞上のＲＡＡＧ１０の有無についてスクリーニングし、個体中の免疫療法の有効性を決定する必要がある。がんであると診断された個体が、ＲＡＡＧ１０を標的とする抗体を使用する免疫療法に対する候補になり得るのかを、本明細書に開示の方法によって作製される抗ＲＡＡＧ１０抗体を使用して決定してもよい。一実施形態では、ＲＡＡＧ１０を標的とする抗体を使用し、ＲＡＡＧ１０の発現についてがん腫瘍または生検試料を検査してもよい。ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞をもつ個体が、ＲＡＡＧ１０を標的とする抗体を使用する免疫療法の適切な候補である。抗ＲＡＡＧ１０抗体による染色を使用し、がん組織を正常組織と区別してもよい。
【００９８】
診断目的で抗ＲＡＡＧ１０抗体を使用する方法は、任意の形式の抗がん処置、たとえば化学療法または放射線治療の前後に、所定の処置、がん個体の予後、腫瘍のサブタイプまたは転移性疾病の起源、および疾病の進行または処置への反応に対し、どの腫瘍が最も反応しやすいのか決定するのに役立つ。
【００９９】
さらに、本発明の組成物は、既に概ねを記載した方法を他の疾病（非がん性）細胞に対して使用し、がん以外の病状を診断するのにも適している。本発明の方法の使用に適切な病状には、個体の炎症反応または自己免疫応答に関連する疾病または疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。上記記載の方法は、個体の炎症反応または自己免疫応答を調節するのに使用してもよい。本発明の組成物および方法を使用する診断および／または処置を施してもよい疾病、ならびに炎症および自己免疫性疾患が原因の病状には、多発性硬化症、髄膜炎、脳炎、脳卒中、他の大脳外傷、潰瘍性結腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患、重症筋無力症、ループス、リウマチ様関節炎、喘息、急性若年型糖尿病、エイズ痴呆、アテローム動脈硬化、腎炎、網膜炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、心筋虚血および白血球媒介性急性肺傷害が含まれるが、これらは例示であって、限定するものではない。
【０１００】
このほか、本発明の抗体および他の治療薬剤の診断的および／または治療的な用途にはさらに、器官または移植片の拒絶の危険性のある個体への投与が含まれる。近年、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓および骨髄などの組織および器官を移植する外科技術の効率性に著しい改善が見られる。際立って重要な問題は、移植された同種移植片または器官に対する免疫トレランスを被移植者に誘導する薬剤として満足のいく薬剤が得られていないことである考えられる。同種異系細胞または器官が宿主（すなわち、提供者および被提供者が同種であるが異なる個体である）に移植される場合、宿主の免疫系は、移植物の外部抗原に対し免疫応答（宿主対移植片の疾病）を開始し、移植された組織の破壊につながると考えられる。
。
【０１０１】
（ＶＩＩ．本発明の組成物）
さらに、本発明は、抗ＲＡＡＧ１０抗体、抗ＲＡＡＧ１０抗体由来のポリペプチド、抗ＲＡＡＧ１０抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチド、および本明細書に記載のような他の薬剤を含む薬学的組成物を含む組成物も包含する。本明細書での使用からもわかるように、組成物は、さらに、ＲＡＡＧ１０に結合する一つ以上の抗体、ポリペプチドおよび／またはタンパク質、および／またはＲＡＡＧ１０に結合する一つ以上の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列を含む一つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０１０２】
本発明の抗体、薬剤、ポリペプチドおよびタンパク質は、任意（一つ以上の）の以下の判定基準によってさらに同定され、特徴付けられる：（ａ）（以下に限定されるものではないが、卵巣、前立腺、膵臓、肺、大腸、または乳房のがん細胞を含むがん細胞上のＲＡＡＧ１０を含む）ＲＡＡＧ１０に結合する能力、（ｂ）公知の抗ＲＡＡＧ１０抗体のＲＡＡＧ１０への優先的結合を競合的に阻害する能力であって、本来の抗体が優先的に結合するエピトープと同じＲＡＡＧ１０エピトープに優先的に結合する能力を含む能力、（ｃ）インビトロまたはインビボの生細胞の表面上に露出しているＲＡＡＧ１０の一部に結合する能力、（ｄ）以下に限定されるものではないが卵巣、前立腺、膵臓、肺、大腸、または乳房のがん細胞などのがん生細胞の表面上に露出されるＲＡＡＧ１０の一部に結合する能力、（ｅ）ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞（以下に限定されるものではないが卵巣、前立腺、膵臓、肺、大腸、または乳房のがん細胞など）へ化学療法薬または検出可能マーカーを送達する能力、（ｆ）ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞（以下に限定されるものではないが卵巣がん細胞）へ治療薬剤を送達する能力。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４２１７、４２１８、４２４４または４２４５の任意の一つの管理番号をもつ宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体である。さらに本発明は、上記の保管されたハイブリドーマによって産生される抗体および等価抗体またはポリペプチド断片（たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、および所要の特異性の抗原（ＲＡＡＧ１０）、認識部位を含む任意の上記抗体または等価抗体の任意の他の修飾構造体の種々の構築も包含する。さらに本発明は、抗ＲＡＡＧ１０ファミリメンバーの生物学的特徴を一つ以上示すヒト抗体も提供する。抗ＲＡＡＧ１０ファミリ（ヒト化抗体およびヒト抗体を含む）の等価抗体、ポリペプチド断片、および任意のこれらの断片を含むポリペプチドが同定され、上記記載の五つの判定基準うち任意（一つ以上の）の基準によって特徴付けられる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＲＡＡＧ１０に結合する本発明の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書に特定されている抗ＲＡＡＧ１０抗体のＲＡＡＧ１０への優先的結合を競合的に阻害する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体、ポリペプチドおよびタンパク質は、抗体ＬＵＣＡ１、ＢＬＡ８、ＰＡ２０、およびＳＫＩＮ２の一つが優先的に結合するエピトープと同じであるＲＡＡＧ１０上のエピトープに優先的に結合する。
【０１０５】
従って、本発明は、任意の以下のもの（または任意の以下のものを含む薬学的組成物を含む組成物）を提供する：（ａ）上記に示した管理番号の宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体、（ｂ）上記のような抗体のヒト化型、（ｃ）上記のような抗体の軽鎖および／または重鎖の可変領域を一つ以上含む抗体、（ｄ）上記のような抗体の重鎖および軽鎖の可変領域に相同的なまたはそれに由来する可変領域とヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域に相同的なまたはそれに由来する定常領域とを含むキメラ抗体、（ｅ）上記のような抗体の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ（少なくとも１、２、３、４、５、または６）を一つ以上含む抗体、（ｆ）上記のような抗体の重鎖および／または軽鎖を含む抗体、（ｇ）上記のような抗体と等価なヒト抗体。ヒト化型の抗体は、その元になっている抗体または上記に示した管理番号の宿主細胞によって産生された抗体と同一のＣＤＲを有してもよいし、有していなくてもよい。ＣＤＲ領域の決定は当該技術において公知である。いくつかの実施形態では、本発明は、上記で特定し保管されているハイブリドーマ（またはいくつかの実施形態では、上記抗体のうち一つの抗体の六つのＣＤＲすべてに実質的に相同であるか、または上記抗体のうち一つに由来する）の一つによって産生される抗体の少なくとも一つのＣＤＲ、少なくとも二つの、少なくとも三つの、少なくとも四つの、少なくとも５つのＣＤＲに実質的に相同であるＣＤＲを少なくとも一つ含む抗体、または上記に示した管理番号の宿主細胞によって産生される抗体を提供する。他の実施形態は、本明細書に特定したような保管されているハイブリドーマから産生される抗体のＣＤＲまたは上記のような抗体からのＣＤＲの少なくとも二つ、三つ、四つ、五つまたは六つに実質的に相同である少なくとも二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲ（単数または複数）を有する抗体を含む。当然のことながら、本発明の目的のために、結合特異性および／または全体的な活性（これは、化学療法薬をがん細胞へまたはがん細胞の中に送達し、がん細胞の成長および／または増殖を減らし、がん細胞にアポトーシスの細胞死を引き起こし、転移の進行を遅延させる、および／または対症的に処置することに関する活性としてもよい）はほぼ維持されるが、保管されているハイブリドーマによって産生される抗体に比べ、活性の範囲は（多かれ少なかれ）異なるものと考えられる。さらに本発明は、上記抗体の任意の抗体を作製する方法も提供する。抗体を作製する方法は、当該技術分野では公知であり、本明細書に記載されている。
【０１０６】
さらに本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体の軽鎖および／または重鎖の可変領域を一つ以上含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲを一つ以上含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体の軽鎖および／または重鎖の三つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、任意の以下のものを有する抗体のアミノ酸配列を含む：元の抗体の配列の少なくとも５個連続するアミノ酸、少なくとも８個連続するアミノ酸、少なくとも約１０個連続するアミノ酸、少なくとも約１５個連続するアミノ酸、少なくとも約２０個連続するアミノ酸、少なくとも約２５個連続するアミノ酸、少なくとも約３０個連続するアミノ酸、なお少なくとも３個のアミノ酸は抗体の可変領域からのものとする。一実施形態では、可変領域は、元の抗体の軽鎖からのものである。別の実施形態では、可変領域は、抗体の重鎖からのものである。別の実施形態では、５（またはそれ以上）個連続するアミノ酸は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からのものである。
【０１０７】
（ＶＩＩＩ．治療目的で抗ＲＡＡＧ１０抗体を使用する方法）
ＲＡＡＧ１０に対するモノクローナル抗体は、がんまたは他の疾病を患う個体に治療目的で使用してもよい。抗ＲＡＡＧ１０抗体による治療には、上記記載のようなインビトロおよびインビボでの複合体の形成が伴うと考えられる。一実施形態では、モノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０は、がん細胞に結合し、がん細胞の増殖を減らすことができる。当然のことながら、抗体は、生理学的（たとえばインビボ）条件下での結合を促進する濃度で投与される。別の実施形態では、大腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、膵臓、腎臓などの種々の組織のがん細胞および肉腫などその他のタイプのがんに対する免疫療法のために、ＲＡＡＧ１０に対するモノクローナル抗体を使用することができる。別の実施形態では、モノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０が単独でがん細胞に結合し、がん細胞にアポトーシス細胞死を引き起こすことができる。別の実施形態では、モノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０は、がん細胞に結合し、転移の進行を遅延させることができる。さらに別の実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体による対症療法をがん個体に処方する。がん個体に対する対症療法には、疾病の有害な症状、またはがんの進行には直接影響を及ぼさない疾病のために施された他の処置が原因の医原性症状の処置または低減が含まれる。これには、痛み、栄養的補給、性の問題、心理学的な悩み、抑圧、疲労、精神医学的疾患、吐き気、嘔吐などを緩和する処置が含まれる。
【０１０８】
このような状況のとき、ＡＤＣＣを強める薬剤のように個体自身の免疫応答を強化するかまたは導く薬剤とともに、抗ＲＡＡＧ１０抗体を投与してもよい。
【０１０９】
さらに別の実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体は、放射性分子、毒素（たとえばカリケアマイシン）、化学療法分子、あるいは化学療法化合物を含むリポソームまたは他のベシクルにコンジュゲートまたは連繋させておき、上記のような処置を必要とする個体に投与し、抗体によって認識される抗原を含むがん細胞に上記の化合物を向かわせ、これによってがん性または疾病細胞を除去する。特定の何らかの理論に制限されるものではないが、抗ＲＡＡＧ１０抗体は、ＲＡＡＧ１０を表面上にもつ細胞によって内部移行され、これによってコンジュゲート成分を細胞へ送達し、治療的効果がもたらされる。さらに別の実施形態では、転移の進行を遅延させるために、抗原を発現するがんの外科切除時に補助治療として抗体を利用することができる。また抗体は、抗原を発現する腫瘍のある個体に手術をする前に（ネオアジュバント治療）、腫瘍のサイズを小さくし、これによって、手術を可能または容易にするために、手術中に組織を残しておくために、および／または外観の損傷を減らすために、投与することができる。
【０１１０】
化学療法薬には、放射性分子、がん細胞の生存度に有害な任意の薬剤を含み細胞毒または細胞毒性薬とも呼ばれる毒素、薬剤、および化学療法化合物を含むリポソームまたはその他のベシクルが含まれる。適切な化学療法薬の例には、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシルデカルバジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アクチノマイシン  Ｄ、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アルキル化剤、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、抗分裂剤、ｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、ジアミノジクロロ白金、アントラサイクリン、抗生物質、代謝拮抗剤、アスパラギナーゼ、生ＢＣＧ（小胞内）、リン酸ベタメタゾンナトリウムおよび酢酸ベタメタゾン、ビカルタミド、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルシウム  ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｕｏｒｉｎ）、カリケアマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルヒチン、共役エストロゲン、シクロホスファミド、シクロフォスファミド（Ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、シタラビン、シタラビン、サイトカラシンＢ、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｉｒｕｂｉｃｉｎ）ＨＣＬ、クエン酸ダウノルビシン、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ  ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、デクスラゾキサン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ドセタキセル、メシル酸ドラセトロン、ドキソルビシンＨＣＬ、ドロナビノール、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ−アスパラギナーゼ、エメチン、エポエチンアルファ、エルビニアＬ−アスパラギナーゼ、エステル化エストロゲン、エストラジオール、リン酸エストラムスチンナトリウム、臭化エチジウム、エチニルエストラジオール、エチドロネート、エトポシド・シトロロラン（ｃｉｔｒｏｒｏｒｕｍ）因子、リン酸エトポシド、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルコナゾール、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸、ゲムシタビンＨＣＬ、糖質コルチコイド、酢酸ゴセレリン、グラミシジンＤ、グラニセトロンＨＣＬ、ヒドロキシ尿素、イダルビシンＨＣＬ、イホスファミド、インターフェロンα−２ｂ、イリノテカンＨＣＬ、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、酢酸ロイプロリド、レバミゾールＨＣＬ、リドカイン、ロムスチン、メイタンシノイド、メクロレタミンＨＣＬ、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファランＨＣＬ、メルカプチプリン（ｍｅｒｃａｐｔｉｐｕｒｉｎｅ）、メスナ、メトトレキセート、メチルテストステロン、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、酢酸オクトレオチド、オンダンセトロンＨＣＬ、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペントスタチン、ピロカルピンＨＣＬ、プリマイシン（ｐｌｉｍｙｃｉｎ）、カルムスチンインプラントを伴うポリフェプロサン（ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓ���ｎ）２０、ポルフィマーナトリウム、プロカイン、プロカルバジンＨＣＬ、プロプラノロール、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾトシン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テストラクトン、テトラカイン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロランブシル、チオグアニン、チオテパ、トポテカンＨＣＬ、クエン酸トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、バルルビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、および酒石酸ビノレルビンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
好ましい一実施形態では、細胞毒素が細胞を分割、または迅速に分割するのに特に効果的であるが、これは非分割細胞が毒性効果から逃れやすいためである。
【０１１２】
たとえば、有害な活性を生じさせるために内部移行する必要のある毒素を細胞へ送達することによって、抗体の結合する疾病細胞またはがん腫細胞中へ本発明の抗体を内部移行させることができ、このため、抗体は治療用途に特に有益である。このような毒素の例には、サポリン、カリケアマイシン、オリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、およびメイタンシノイドが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
本発明の抗体またはポリペプチドは、共有的または非共有的に、直接的または間接的に、放射性分子、毒素、または他の治療薬剤、または治療薬剤を含むリポソームまたは他のベシクルに連繋することができる（コンジュゲートまたは連結を含む）。抗体は、放射性分子、毒素、または化学療法分子と、抗体に沿った任意の位置で連結させてもよく、その位置は、抗体がその標的ＲＡＡＧ１０に結合できるのであれば、どの位置でもよい。
【０１１４】
毒素または化学療法薬は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的（たとえばリンカー基を介するか、または、代替として、米国特許第５，５５２，３９１号に記載されるような基盤分子など適切な付着部位をもつ連結分子を介する）接続していてもよい（たとえば共有結合してもよい）。本発明の毒素および化学療法薬は、当該技術分野では公知である方法を使用することによって、特定の標的タンパク質に直接接続することができる。たとえば、薬剤および抗体が互いに反応することのできる置換基を有する場合、両者の直接反応が可能である。たとえば、一方にあるアミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基が、他方にある無水物または酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基、または良好な脱離基（たとえば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応できるようにしてもよい。
【０１１５】
さらに抗体またはポリペプチドは、マイクロキャリアを介して化学療法薬に連結させることができる。マイクロキャリアとは、生物分解性または非生物分解性の粒子のことで、水に不溶で、大きさが約１５０、１２０または１００μｍ未満のサイズを有し、より一般的なのは約５０〜６０μｍ未満、好ましくは約１０、５、２．５、２または１．５μｍ未満である。マイクロキャリアには、約１μｍ未満、好ましくは約５００ｎｍ未満のサイズを有するマイクロキャリアである「ナノキャリア」が含まれる。このような粒子は当該技術分野では公知である。固相マイクロキャリアは、アガロースまたは架橋結合アガロースのほか、当該技術分野では公知である他の生物分解性材料から形成されるマイクロキャリアを含んでも含まなくてもよい生体適合性のある天然性ポリマー、合成ポリマーまたは合成コポリマーから形成される粒子としてもよい。生物分解性固相マイクロキャリアは、哺乳類の生理学的条件下で分解可能な（たとえばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびそのコポリマー）または浸食性のある（たとえば３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン（ＤＥＴＯＳＵ）のようなポリ（オルトエステル、またはセバシン酸のポリ（無水物）のようなポリ（無水物））ポリマーから形成してもよい。マイクロキャリアは（たとえば油または脂質ベースの）液相であってもよく、リポソーム、抗原のないｉｓｃｏｍｓ（コレステロール、およびリン脂質、アジュバント作用のあるサポニンの安定な複合体である免疫刺激複合体（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ））、または水中油型または油中水型乳剤に見られる液滴またはミセルなどがあり、この液相マイクロキャリアは生物分解性とする。生物分解性液相マイクロキャリアは、典型的には、バイオデグレイデアブル（ｂｉｏｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）な油を組み入れ、このような油として、スクアレンおよび植物性油脂を含む複数のものが当該技術分野では公知である。マイクロキャリアは、典型的には球状であるが、球状以外のマイクロキャリアも許容可能である（たとえば、エリプソイド（ｅｌｉｐｓｏｉｄ）、桿状など）。マイクロキャリアは、（水に対して）不溶なため、水および水−ベースの（水性）溶液から濾過することができる。
【０１１６】
本発明の抗体またはポリペプチドのコンジュゲートには、毒性物質または化学療法薬に接続することのできる基と抗体に接続することのできる基との両方を含む二官能性リンカーを含むものとしてよい。リンカーは、結合能力に干渉しないように抗体と薬剤とを離すためのスペーサーとして機能することができる。リンカーは、切断が可能であってもよいし不可能であってもよい。さらにリンカーは、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性を高め、これによって接続効率を上げる働きをすることもできる。さらに化学反応性の増加により、不可能であると考えられていた薬剤または薬剤上の官能基の使用が容易になると考えられる。二官能性リンカーは、当該技術分野の公知の手段によって抗体に接続することができる。たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど活性のあるエステル成分を含むリンカーを使用し、抗体中のリジン残基にアミド結合を介して接続することができる。別の例では、求核アミンまたはヒドラジン残基を含むリンカーは、抗体炭水化物残基の解糖酸化によって産生されるアルデヒド基に接続することができる。このような直接的な接続方法のほか、リンカーは、アミノデキストランなどの媒介担体によって抗体に間接的に接続することができる。このような実施形態では、修飾的連結はリジン、炭水化物、または媒介担体を介している。一実施形態では、リンカーは、タンパク質中の遊離のチオール残基に部位選択的に接続している。タンパク質上のチオール基への選択的接続に適している成分は、当該技術分野では公知である。例として、二硫化物化合物、α−ハロカルボニルおよびα−ハロカルボキシル化合物、およびマレイミドが含まれる。求核アミン官能基がα−ハロカルボニルまたはカルボキシル基と同じ分子にある場合、アミンの分子内アルキル化を介して環化を生じる可能性がある。この問題を避ける方法は、当該技術分野の当業者には公知であり、たとえば、望ましくない環化が立体化学的に好ましくないようにするアリール基またはｔｒａｎｓ−アルケンなどの不動性の基によって、アミンおよびα−ハロ官能基が隔てられている分子を調製することによる方法がある。たとえば、二硫化物成分を介してメイタンシノイドと抗体とをコンジュゲートする調製に関する米国特許第６，４４１，１６３号を参照すること。
【０１１７】
抗体−薬物コンジュゲートの調製に使用することのできる切断可能なリンカーの一つに、受容体を介するエンドサイトシス中に見られるエンドソーム、およびリソソームなど種々の細胞内区画の酸性環境を活用するｃｉｓ−アコニット酸に基づき酸に不安定であるリンカーがある。たとえば、ダウノルビシンと高分子担体とのコンジュゲートの調製に関してはＳｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８−１０５４（１９８１）；ダウノルビシンと抗黒色腫抗体とのコンジュゲートの調製に関してはＹａｎｇら、Ｊ  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８０：１１５４−１１５９（１９８８）；酸に不安定なリンカーを同じ方法で使用しダウノルビシンと抗Ｔ細胞抗体とのコンジュゲートを調製することに関してはＤｉｌｉｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：６０９７−６１０２（１９８８）；ペプチド・スペーサー・アームを介する抗体へのダウノルビシンの連結に関してはＴｒｏｕｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６２６−６２９（１９８２）を参照すること。
【０１１８】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、当該技術分野では公知である任意の方法によって放射性分子にコンジュゲート（連結）してもよい。放射標識抗体の方法について議論は、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＴ」、Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボカ・ラトン、１９９５）を参照すること。
【０１１９】
あるいは、抗体は第二抗体とコンジュゲートし、米国特許第４，６７６，９８０号にＳｅｇａｌによって記載されるているような抗体ヘテロコンジュゲートを形成することができる。架橋結合抗体の形成は、たとえばＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞または疾病細胞など細胞の特定のタイプに対する免疫系を標的とすることができる。
【０１２０】
さらに本発明は、抗ＲＡＡＧ１０抗体を使用するか、または化学療法薬に連結されるＲＡＡＧ１０に結合する他の実施形態を使用し、がん（前立腺、肺、乳房、卵巣、膵臓、または大腸がんを含むがこれらに限定されるものではない）に罹患している個体内で転移の進行を遅延させる方法も提供する。いくつかの実施形態では、抗体は非ヒト抗ＲＡＡＧ１０抗体のヒト化型またはキメラ型である。
【０１２１】
さらに別の実施形態では、転移の進行を遅延させるために、抗原を発現するがんの外科切除時に補助治療として抗体を利用することができる。また抗体または化学療法薬と連繋する抗体は、抗原を発現する腫瘍のある個体に手術をする前に（ネオアジュバント治療）、腫瘍のサイズを小さくし、これによって、手術を可能または容易にするために、手術中に組織を残しておくために、および／または外観の損傷を減らすために、投与することができる。
【０１２２】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載の任意のＲＡＡＧ１０結合実施形態は、ＲＡＡＧ１０−発現がん細胞に結合し、ＲＡＡＧ１０を発現するがん細胞に対し活性的な免疫応答を誘発することができる。場合によっては、活性的な免疫応答によって、がん細胞を死に至らせることができる（たとえば、がん細胞との抗体結合がアポトーシス細胞死を誘発する）か、またはがん細胞の成長を阻害する（たとえば、細胞周期の進行を阻止する）。ほかの場合では、本明細書に記載の新規の抗体のいずれかが、がん細胞に結合することができ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって、抗ＲＡＡＧ１０が結合しているがん細胞を排除することができる。従って、本発明は、本明細書に記載の任意の組成物を投与することを含む免疫応答の刺激方法を提供する。
【０１２３】
場合によっては、抗体結合は、細胞性および体液性免疫応答を両方とも活性化し、ナチュラルキラー細胞をさらに強化することができるか、またはがん細胞を破壊するためにさらに個体の免疫系を活性化するサイトカイン（たとえばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなど）の産生を増加。さらに別の実施形態では、ｍＫＩＤ２ががん細胞に結合することができ、マクロファージまたはその他の食作用性細胞によってがん細胞にオプソニンを作用させることができる。
【０１２４】
抗ＲＡＡＧ１０抗体またはその断片の投与には、種々の剤形を使用してもよい。いくつかの実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体またはその断片を手際よく投与することができる。本発明の組成物は、薬理学的に活性のある薬剤に加え、当該技術分野では公知であって、薬理学的に効果的な物質の投与を容易にするか、または作用部位への送達用として薬学的に使用することのできる調製物に活性化合物を加工するのを容易にする相対的に不活性な物質である賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に受容可能な担体を含んでもよい。たとえば、賦形剤は剤形または一貫性を付与することができるか、希釈剤として作用する。適切な賦形剤には、分解防止剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変化させる塩類、カプセル化剤、緩衝剤、および皮膚浸透賦活剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
非経口投与用の適切な剤形は、水溶性型、たとえば水溶性塩類型の活性化合物の水溶液を含む。さらに、注入用油性懸濁液に適しているような活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適切な親油性溶媒または媒体には、脂肪油、たとえば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、たとえば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが含まれる。注入用水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増やす物質を含み、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含んでもよい。任意ではあるが、懸濁液は安定剤をさらに含んでもよい。細胞へ送達するために、リポソームを使用して薬剤をカプセルに包むこともできる。
【０１２６】
本発明による全身投与用の医薬剤形は、経腸、非経口的または局所的投与として処方してもよい。実際には、活性成分の全身投与を達成するために、三つのタイプの処方をすべて同時に使用してもよい。賦形剤のほか、非経口的および非経口的でない薬物送達についての処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に説明されている。
【０１２７】
経口投与用の適切な剤形には、硬質または軟質ゼラチンカプセル、ピル、被覆錠剤を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、またはこれらの吸入式および徐放式のものが含まれる。
【０１２８】
通常、これらの薬剤は、注入（たとえば腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）によって投与用に処方されるが、他の投与方式（たとえば経口、粘膜など）も使用できる。したがって、抗ＲＡＡＧ１０抗体は、好ましくは、食塩液、リンゲル液、ブドウ糖溶液などのような薬学的に受容可能な媒体と組み合わせる。
【０１２９】
特定の投与計画、すなわち、用量、タイミングおよび回数は、特定の個体およびその個体の病歴によって決まる。通常、用量は、少なくとも約１００ｕｇ／ｋｇ体重、より好ましくは少なくとも約２５０ｕｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは少なくとも約７５０ｕｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重を投与する。
【０１３０】
投薬量を決定する際は、一般に半減期などの経験的な検討を加えるとよい。ヒト化抗体または完全なヒト抗体などヒト免疫系に適合する抗体を使用し、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されないようにしてもよい。治療過程の間を通じて、投与回数を決定し、調節してもよく、回数は、がん細胞数の減少、がん細胞減少の維持、がん細胞増殖の減少、または転移進行の遅延に基づく。あるいは、抗ＲＡＡＧ１０抗体を持続して連続的に放出させる処方が適切であると思われる。持続的な放出を実現するための種々の処方および装置は、当該技術分野では公知である。
【０１３１】
一実施形態では、抗ＲＡＡＧ１０抗体の投薬量は、既に一回以上の投与（単数または複数）を受けた個体から経験的に決定してもよい。抗ＲＡＡＧ１０抗体を増量投与にして個体に投与する。抗ＲＡＡＧ１０抗体の有効性を判断するために、続いて特定のがんの病状の指標を出すことができる。これらには、触診または視覚的観察による腫瘍サイズの直接測定、Ｘ線または他の画像処理技術による腫瘍サイズの間接的測定；腫瘍の直接生検および腫瘍試料の鏡検によって判断される改善性；間接的腫瘍マーカー（たとえば前立腺がんにはＰＳＡ）、痛みまたは麻痺の減少の測定；腫瘍に関連する言語、視覚、呼吸または他の能力障害の改善；食欲の増進；または認可済みテストによって測られる生活の質の向上または生存の延長が含まれる。個体、がんのタイプ、がんの段階に応じて、どのがんが個体の別の場所に転移し始めたのかに応じて、および使用された過去の処置および同時に使用されている処置に応じて投薬量が変わるのは、当業者には自明のことである。
【０１３２】
他の剤形には、リポソームなどの担体を含むがこれに限定されるものではない当該技術分野では公知の適切な送達方式が含まれる。たとえば、Ｍａｈａｔｏら（１９９７）Ｐｈａｒｎａ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９を参照すること。リポソームの調製物には、サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎｓ）、多重膜ベシクルおよび単層のベシクルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、二つ以上の抗体が存在してもよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルとすることができる。このような組成物には、がん腫、腺がん、肉腫、または腺肉腫に対して反応する少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つの異なる抗体を含むようにしてもよい。抗ＲＡＡＧ１０抗体は、卵巣、乳房、肺、前立腺、大腸、腎臓、皮膚、甲状腺、骨、上部消化管、および膵臓を含むがこれらに限定されるものではない器官中のがん腫、腺がん、肉腫、または腺肉腫に対して反応する一つ以上の抗体と混合することができる。一実施形態では、異なる抗ＲＡＡＧ１０抗体の混合物が使用される。当該技術分野ではよく示されるような抗体の混合物が、広範囲の個体群の処置に特に役立つと考えられる。
【０１３４】
以下の実施例は、例示のために示すものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１３５】
（実施例１．免疫原としてのヒト胎児性膀胱細胞およびヒト膵臓細胞（ｈＰＥＤ）の調製）
免疫原として使用するヒト胎児性膀胱細胞を調製するために、以下の方法を使用した。妊娠週令が１４から２１週のヒト胎児性膀胱をアラメダ・カウンティ、カリフォルニアのアドバンスド・バイオサイエンス・リサーチ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から得た。膀胱を調達し、組織培地として氷で冷やしながら実験所に輸送した。到着後すぐに、膀胱を２０ｍｌの冷却ＰＢＳで３回洗った。解剖顕微鏡下で、膀胱周辺の余分な組織を取って膀胱をきれいにし、冷却ＰＢＳで２回洗った。かみそりの刃を用い、乾いた１００ｍｍ培養シャーレの中で膀胱を１ｍｍ角に細分化した。１０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ、カタログ番号２２６００）を加えた。ＰＢＳに溶かした５％ＢＳＡによって予め覆っておいた１５ｍｌ遠心管へ組織片を５ｍｌピペットで移した。次に組織片を１０００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを６ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に再懸濁した。以下の成長因子（それぞれ培地１ミリリットル中の最終濃度で示す）を含む３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を６ウェルプレートの各ウェルに入れ、そこで組織を培養した：インスリン１０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン１０μｇ／ｍｌ、ビタミンＥ  ５μｇ／ｍｌ、アプロチニン２５μｇ／ｍｌ、プロゲステロン３ｎｇ／ｍｌ、ＫＧＦ１０ｎｇ／ｍｌ、ヘレグリン５ｎＭ、ゲンタマイシン１００μｇ／ｍｌ（最初の２日間細胞培養に加えた）。この条件下で、上皮細胞が遊出し、上皮細胞コロニーを形成した。初期の培養物には線維芽細胞の限定的な成長が観察されたが、これらの細胞を短時間トリプシン処理して除去した。注入の３日前に、最終濃度０．０５％でトリプシン（ギブコＢＲＬ、カタログ番号２５３００−０５４）を加え、線維芽細胞を取り出した。
【０１３６】
別の実施形態では、組織源をヒト胎児性組織由来のヒト前駆細胞株とし、増殖させ、一つ以上の成熟したヒト細胞タイプへ前駆細胞が分化および成熟するのを促進するように選択されたラットまたはマウスの間葉と再結合させ、ヒト／げっ歯類組換え組織を形成する。このような組換え組織は、たとえば米国特許第６，４３６，７０４号に記載のように単離し成長させたヒト膵臓前駆細胞（ｈＰＥＤ）、米国特許第６，４１６，９９９号に記載のように単離し成長させたヒトミューラー前駆細胞、国際公開ＷＯ０１／７７３０３に記載のように単離し成長させたヒト卵巣前駆細胞、または係属中の特許明細書ＰＣＴ／ＵＳ０３／０４５４７に記載のようなヒト膀胱前駆細胞（ｈＢＬＡ）とすることができ、特にこれらの教示は、全て本明細書に参照として組み込む。
【０１３７】
細胞を収集するために、細胞を無カルシウムおよび無マグネシウムのハンクス生理的食塩水で１回すすぎ、ハンクス生理的食塩水に溶かした０．０２％ＥＤＴＡ中で３７℃１５分間インキュベートした。軽くたたいて培養表面から細胞を剥離した。１０００ｒｐｍ１０分間遠心分離にかけて細胞懸濁液を沈殿させた。その上清を除き、適切な非変性佐剤を含む無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）に細胞を再懸濁した。
【０１３８】
免疫原として使用するヒト膵臓前駆細胞を調製するために、以下の方法を使用した。これらの方法は上記に示した米国特許第６，４３６，７０４号に記載されている。酵素学的解離をする前に、立体顕微鏡下で胎児性膵臓（妊娠週令１４〜２２週）を顕微解剖によって機械的にばらした。酵素処置は、５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ−ディスパーゼ、２０μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤および５０μｇ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素を含む１ｍｌのＦ１２／ＤＭＥＭ培地に、部分的に解離されている組織を摂氏３７度で１５分間置くことからなるものとした。
【０１３９】
細胞の集合体を５％（体積で）ＢＳＡ勾配の上に層状に重ね、６分間、９００ｒｐｍの遠心によって洗った。以下の要素を含むＣＭＲＬ１０６６栄養培地からなる成長培地に、凝集体のままのペレット状細胞を再懸濁した：
インスリン                      １０μｇ／ｍｌ
トランスフェリン                １０μｇ／ｍｌ
上皮成長因子                    ５ｎｇ／ｍｌ
エタノールアミン                １０−６Ｍ
ホスホエタノールアミン          １０−６Ｍ
セレン                          ２．５×１０−８Ｍ
トリヨードサイロニン            １０−１２Ｍ
プロゲステロン                  １０−９Ｍ
ヒドロコルチゾン                １０−９Ｍ
フォルスコリン                  １μＭ
ヘレグリン                      １０ｎＭ
アプロチニン                    ２５μｇ／ｍｌ
ウシの下垂体抽出物              ７５μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン                  １００μｇ／ｍｌ
再懸濁した細胞集合体を２４ウェルシャーレのフィブロネクチン被覆のウェル（６〜１２）に分注し、加湿器付の５％ＣＯ２インキュベータ中で７２時間、摂氏３７度でインキュベートした。７２時間後、上皮細胞は、浮遊する球状構造体を形成し、間葉細胞または間質細胞がウェルの表面に付着していた。１．２ｇｍ／Ｌの重炭酸塩および１０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファを含むＦ１２／ＤＭＥＭ（５０：５０）培地に上記のホルモンを追加し、これをフィブロネクチン被覆のプレート（個体群の成長に合わせ１２ウェル、次に６ウェル、次に６０ｍｍ、次に１００ｍｍのプレート）上に塗布したものを用い、細胞を１：２の分割比で４日毎に継代培養した。
【０１４０】
本発明を実施する中で、いくつかの他の細胞タイプを免疫原として使用し、上記記載の方法に従って、本発明の新規の抗ＲＡＡＧ１０モノクローナル抗体を産生し発見した。
【０１４１】
（実施例２．モノクローナル抗体の産生）
１１から１６日培養したヒト胎児性膀胱（ＨＦＢ）細胞を使用し、モノクローナル抗体を産生させた。免疫原としての注入、および主に継代数３から５の抗体のスクリーニングのためにヒト膵臓前駆（ｈＰＥＤ）細胞を使用した。マウス１匹当り約１０６ＨＦＢまたはヒト膵臓前駆細胞を足蹠からＢａｌｂ／ｃマウスに週に１度注入した。非変性佐剤（たとえばＲｉｂｉ）を使用した。毎週注入してから６週間後、免疫性を付与された各動物の尾から血液滴を得、ＦＡＣＳ分析を使用し、ＨＦＢに対する抗体のタイターを検査した。タイターが少なくとも１：２０００に達していたマウスをＣＯ２チャンバー内で頚椎脱臼により屠殺した。ハイブリドーマ調製のためにリンパ節を回収した。
【０１４２】
３５％ポリエチレングリコール４０００を使用して、高タイターのマウスリンパ球をマウスの骨髄腫株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合させた。融合してから１０日目に、ＨＦＢまたはヒト膵臓前駆細胞特異的モノクローナル抗体の存在について、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によってハイブリドーマの上清をスクリーニングした。各ハイブリドーマからの馴化培地を一定分量のＨＦＢ細胞またはヒト膵臓前駆細胞とともに３０分間インキュベートした。温置した後、細胞試料を洗い、０．１ｍｌ希釈液に再懸濁し、ヤギ抗マウスＩｇＧのＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片１μｇ／ｍｌとともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗い、０．５ｍｌＦＡＣＳ希釈液に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎセルソーター（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；サンノゼ、カリフォルニア）を使用して分析した。ハイブリドーマクローンを選択し、さらなる増殖、クローン化、およびＦＡＣＳによって判定できるようなＨＦＢ細胞表面またはヒト膵臓前駆細胞表面への結合に基づくキャラクタリゼーションに備えた。この最初のスクリーニングによって、１００個のハイブリドーマクローンが陽性であることがわかった。
【０１４３】
陽性のハイブリドーマは、さらに、正常組織切片に対するそれらの反応についてのスクリーニングをした。腎臓、肺および皮膚組織切片で陰性のハイブリドーマクローンを集めた。抗ＲＡＡＧ１０ファミリ抗体を指定するモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマを選択した。
【０１４４】
（実施例３．抗ＲＡＡＧ１０ファミリモノクローナル抗体の精製）
抗ＲＡＡＧ１０ファミリ抗体、上清の体積を測定し、同量のバインディング・バッファを上清に加えた。この混合物を室温で平衡化させた。上清を０．２２μｍフィルタに通して濁りを取った。上清はＧｒａｄｉＦｒａｃシステムを使用して、プロテイン−Ｇカラム上へ添加した。カラムは５〜１０カラム体積のバインディング・バッファで洗浄した。モノクローナル抗体は溶出バッファで溶出し、２ｍｌの画分を集めた。画分はＯＤ２８０で読み取り、モノクローナル抗体を含んでいる画分をプールした。溶出されたモノクローナル抗体画分は、３Ｍトリスを１／２０体積加えることによって中和した。試料は、４℃で１Ｘ  ＰＢＳの中で透析した（１回当たり少なくとも３時間、３回バッファを交換）。精製したモノクローナル抗体を無菌ろ過し（０．２ｕＭ）、２〜８℃で貯蔵した。
【０１４５】
ハイブリドーマ上清からの抗ＲＡＡＧ１０ファミリモノクローナル抗体を精製した後、ＨＦＢ細胞またはｈＰＥＤへの結合について再検査した。細胞試料は、実施例４に既に記載したように調製し、種々の濃度の精製抗体をインキュベートした。インキュベーションの後に、細胞を洗浄し、０．１ｍｌの希釈剤に再懸濁し、ヤギ抗マウス免疫ＩｇＧのＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片１μｇとともに、４℃、３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．５ｍｌのＦＡＣＳ希釈剤に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎセルソーター（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；サンノゼ、カリフォルニア州）を使用し分析した。ＦＡＣＳｃａｎヒストグラム上に右側シフトが見られ、これによりＨＦＢ細胞またはｈＰＥＤに精製抗体が結合したままであることがわかった。
【０１４６】
四つのモノクローナル抗体が精製され、本明細書中では、それぞれＢＬＡ８、ＬＵＣＡ１、ＰＡ２０およびＳＫＩＮ２と呼ぶことにする。これら各抗体を産生するハイブリドーマはＡＴＣＣ管理番号が付いており、ＰＴＡ−４２１８、ＰＴＡ−４２１７、ＰＴＡ−４２４４およびＰＴＡ−４２４５である。続いて、さらに別の五つのモノクローナル抗体が精製され、本明細書中ではＬＵＣＡ１、ＧＢ８、ＫＩＤ１、ＫＩＤ１３およびＯＶＣＡ２２と呼ぶ。
【０１４７】
（実施例４．抗ＲＡＡＧ１０ファミリ抗体が結合する抗原の同定およびキャラクタリゼーション）
抗体ＢＬＡ８：  ＢＬＡ８が反応した抗原を同定するために、免疫沈降実験を実施した。免疫沈降をするために、濃縮ＬｎＣａｐ細胞１０ｍｌを、４０ｍｌの溶解バッファで溶解した。溶解バッファは、２％トリトンＸ−１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（５ｍｌの溶解バッファ当たり、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のコンプリートｍｉｎｉＥＤＴＡフリー・プロテアーゼ・カクテルを１タブレット）、０．１％アジ化ナトリウムおよび２ｍＭのＰＭＳＦによって補強されたハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ＋）からなるものとした。細胞溶解物を４℃で３０分間２４，０００×ｇによって濁りを取ってから、２ｍｇ／ｍｌのマウスＩｇＧコンジュゲートＣＮＢｒ  ６ＭＢセファロースビーズからなるカラムに通し、ここで溶解物は、事前に不要物が取り除かれるものとする。次に、事前に不要物を取り除いたＬｎＣａｐ溶解物を、ＢＬＡ８コンジュゲートＣＮＢｒセファロース６ＭＢのカラムに通した。ＢＬＡ８カラムは、膨張したＣＮＢｒ  ６ＭＢセファロースビーズ１ｍｌ当たり３ｍｇのＢＬＡ８をコンジュゲートさせたものとした。次に、ビーズ（マウスＩｇＧおよびＢＬＡ８の両方とも）を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶出する前に溶解バッファで３回洗浄した。溶離液は１カラム体積の画分で集め、最終濃度０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．０で中和し、最終ｐＨを約７．２にした。次に、中和した画分を、マイクロ濃縮器（ミリポアのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０）によって画分体積の１０％にまで濃縮した。次に、濃縮溶離液の１０％をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法によって分離した。同時に、溶離液の３０％をさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥに適している体積に濃縮し、コマシー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色によって分離した。
【０１４８】
アルキル化ＢＬＡ８、およびＢＬＡ８に対するものとしてマウスＩｇＧの溶離液をウェスタンブロット法で検出すると、ＢＬＡ８溶離液に固有のものとして、大量にグリコシル化されたのタンパク質（＞２２３ｋＤａ、約２００ｋＤａおよび１００ｋＤａ）が３組観察され、１００ｋＤａバンドが最も顕著であった。３本のバンド（つまり、２００ｋＤａは１００ｋＤａが２重になったもので、＞２２３ｋＤａバンドは１００ｋＤａバンドの３重になったものであると思われる）には線形性があるため、ＢＬＡ８抗原のモノマー、二量体、三量体から３本のバンドがなっていると仮説をたてた。精製された抗原のスタッキング効果から、抗原が本来の状態で良好に二量化されているが、濃縮によってタンパク質の相互作用の頻度が人為的に高められているものと考えることができる。コマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色すると、ＢＬＡ８に固有の対の線が１００ｋＤａと約２００ｋＤａに観察された。かすかではあるが第３のバンドが＞２２３ｋＤａに観察された。我々の仮説を確かめるために、１００ｋＤａおよび約２００ｋＤａのバンドの両方を切断し、それぞれＬＯ（１００ｋＤａ）およびＨＩ（２００ｋＤａ）と標識した。これら２本のバンドは、引き続きマススペック分析に供する。
【０１４９】
同様の方法に従って、モノクローナル抗体ＬＵＣＡ１、ＰＡ２０およびＳＫＩＮ２が結合する抗原を同定し特徴付けると、同様の結果が得られた。
【０１５０】
ウェスタンブロッティング分析によってＭＡｂのＢＬＡ８、ＬＵＣＡ１、ＰＡ２０およびＳＫＩＮ２の標的抗原の分子量を決定するために、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＰＡＦ−ＩＩ、ＬｎＣＡＰ、Ｐａｎｃ−１、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＫ−ＭＥＳ、ＳＫ−ＯＶ−３など、いくつかの市販のヒト癌細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た。これらの細胞株を、Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清を含むＦ１２培地（ギブコＢＲＬ、カタログ番号２１７００−０９１）およびＤＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ、カタログ番号１２１００−０６１）の１：１混合物中で成長させた。細胞は、３７℃にした５％ＣＯ２のインキュベータでコンフルエントになるまで成長させた。各細胞株のおよそ３０〜５０個のコンフルエントなＴ１７５フラスコからリン酸緩衝生理食塩水に溶かした１０ｍＭのＥＤＴＡを使用して収集した。収集した細胞は、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＧＳ−６ＫＲの卓上用遠心分離機中で１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、Ｔ１７５フラスコ（シグマ、カタログ番号Ｐ８３４０）１個につき、脱イオン水０．５ｍＬおよび１０μＬプロテアーゼ阻害剤カクテルを入れた中で再懸濁した。細胞懸濁液は−８０℃で冷凍したのち、解凍した。この凍結／解凍サイクルは細胞膜を分離させるために合計５回繰り返した。
【０１５１】
次に、分離させた細胞膜を、バイオフュージ・マイクロフュージ（Ｂｉｏｆｕｇｅ  ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）（ハエロイス（Ｈａｅｒｅｕｓ））により、４℃で１５分間、最高速度で遠心分離し集めた。その上清には細胞質と核タンパク質が含まれている。上清は詳しい分析のために取り出し保持した。細胞膜断片を含むペレットを、２％のエンピゲン（Ｅｍｐｉｇｅｎ）ＢＢ（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、カタログ番号３２４６９０）を含むおよそ４ｍＬのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号１４１７５−０７９）および１００μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ７．０の中に再懸濁し可溶化した。可溶細胞膜タンパク質を回転板上で４℃にして一晩インキュベートした。
【０１５２】
不溶の組織細片をすべて除去するために、細胞膜タンパク質の抽出物をバイオフュージ（Ｂｉｏｆｕｇｅ）微量遠心管で４℃にして最大速度で１５分間、遠心分離した。上清には抽出細胞膜タンパク質が含まれている。上清を集め、ウエスタンブロッティング分析に使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１５３】
あらかじめ成形しておいた４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ０３２２）を使用し、電気泳動によって細胞膜タンパク質抽出物を分離した。抽出物をＬＤＳサンプルバッファ（インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ００７）で１０倍に希釈し、７０℃で１０分間加熱し、次に微量遠心機で遠心分離し、ボルテックスで混合した。各レーンにつき全量３．０μＬのタンパク質抽出物をゲル上にロードした。染色済み分子量スタンダード（バイオラド、カタログ番号１６１−０３７２）も加えた。次に電気泳動を製造業者の使用説明書に従って実施した。電気泳動後、同様に製造業者の使用説明書に従ってゲルをニトロセルロース膜（インビトロジェン、カタログ番号ＬＣ２０００）上に転写した。転写されたタンパク質は、ニトロセルロースをＰＢＳ中で電子レンジの強によって３分間加熱することによって膜に結合させた。次に、非特異的結合を減らすために、膜をブロッキングバッファ中で３０分間インキュベートした。次にプロテインＧ精製モノクローナル抗体を使用し、ニトロセルロース膜を検査した。ＭＡｂのＢＬＡ８（ロット０８０−０６）、ＬＵＣＡ１（ロット１０２−０６）、ＰＡ２０（ロット１０２−１０）およびＳＫＩＮ２（ロット０８３−９５）をブロッキングバッファで約４μｇ／ｍＬに希釈した。８ｍＬの希釈ＭＡｂを用い、ニトロセルロース膜を１時間室温にて振動機上でインキュベートした。ウエスタン・ブリーズ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅ）・ウエスタンブロッティングキット（インビトロジェン、カタログ番号ＷＢ７１０３）を使用し、製造業者の使用説明書に従ってウエスタンブロットを展開させた。上記の手法を用い、各モノクローナル抗体につき、グリコシル化タンパク質のバンドを分子量およそ８５〜９０ｋＤのところで観察した。種々の細胞膜タンパク質抽出物に対する結合の強度およびパターンは、このファミリの抗体すべてで一致していた。
【０１５４】
さらに、細胞膜タンパク質抽出物および組織切片ホモジェネートを少なくしてウエスタンブロッティング分析を実施した。凍結した正常ヒト乳房、腎臓、肺および皮膚の切片をエッペンドルフチューブに集めた。切片をＰＢＳで洗い、試料をエッペンドルフ微量遠心機で１６，０００ｒｐｍ、４℃にして１５分間遠心分離した。ブランソン・ソニファイアー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）２５０を使用し、２０μＬプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＨＢＳＳに溶かした２％エンピゲンＢＢ１００μＬに組織のペレットを３０秒間氷上で可溶化させた。
【０１５５】
不溶の組織細片をすべて除去するために、組織抽出物をエッペンドルフ微量遠心機で４℃、最大速度で１５分間遠心分離した。上清には抽出組織タンパク質が含まれている。上清を集め、ウエスタンブロッティング分析に使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１５６】
あらかじめ成形しておいた４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲルを使用し、電気泳動をすることによって、組織抽出物、選択された細胞膜タンパク質抽出物、およびアフィニティ精製したＭＡｂ  ＢＬＡ８の抗原を分離した。抽出物は、還元剤ＤＴＴ（インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ０００４）を含むＬＤＳサンプルバッファ（インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ００７）で希釈し、１０分間７０℃で加熱し、次に、微量遠心機で遠心分離し、ボルテックスで混合した。各レーンにつき全量６．０μＬの組織タンパク質抽出物または精製抗原をゲル上にロードした。染色済み分子量スタンダード（バイオラド、カタログ番号１６１−０３７２）も加えた。次に、ランニングバッファに酸化防止剤（インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ０００５）を追加するほかは、製造業者の使用説明書に従い、電気泳動を実施した。電気泳動後、同様に製造業者の使用説明書に従ってゲルをニトロセルロース膜（インビトロジェン、カタログ番号ＬＣ２０００）上に転写した。転写されたタンパク質は、ニトロセルロースをＰＢＳ中で電子レンジの強によって３分間加熱することによって膜に結合させた。次に、非特異的結合を減らすために、膜をブロッキングバッファ中で３０分間インキュベートした。次にプロテインＧ精製モノクローナル抗体を使用し、ニトロセルロース膜を検査した。ＭＡｂのＢＬＡ８（ロット０８０−０６）、ＬＵＣＡ１（ロット１０２−０６）、ＰＡ２０（ロット１０２−１０）およびＳＫＩＮ２（ロット０８３−９５）をブロッキングバッファで約４μｇ／ｍＬに希釈した。８ｍＬの希釈ＭＡｂを用い、ニトロセルロース膜を１時間室温にて振動機上でインキュベートした。ウエスタン・ブリーズ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅ）・ウエスタンブロッティングキット（インビトロジェン、カタログ番号ＷＢ７１０３）を使用し、製造業者の使用説明書に従ってウエスタンブロットを展開させた。上記の手順を用い、各モノクローナル抗体について、グリコシル化タンパク質のバンドを分子量およそ８５〜９０ｋＤのところで観察した。量を減らしたタンパク質バンドへの結合強度は、量を減らさない場合より小さいが、ＭＡｂのバンドが四つとも認められた。この結果は、各ＭＡｂについて結合が強いことを示しており、このことは精製ＢＬＡ８抗原よりも細胞膜タンパク質抽出物においてはっきりと現れている。抗原は正常組織の試料中には観察されなかった。
【０１５７】
量を減らしたウェスタンブロットでも、量を減らしていないウェスタンブロットでも、マウスＩｇＧを対照として使用した。マウスＩｇＧをモノクローナル抗体プローブとして使用するときは、同じ濃度のマウスＩｇＧを使用した。これらの対照によって、実際には、ウェスタンブロット中に人為的な免疫グロブリンが約２５および５０ｋＤのバンドに存在していることがわかる。これらの人為産物は、組織断片中にある内因性のＩｇＧに由来する軽鎖および重鎖の存在によるものであるか、またはＢＬＡ８抗原のアフィニティ精製の結果である。
【０１５８】
（実施例５．質量分析用の抗ＲＡＡＧ１０抗体の抗原の単離）
精製抗体抗ＲＡＡＧ１０は、膨張したセファロースビーズ体積１ｍｌ当たり２ｍｇのＢＬＡ８  ｍＡｂ濃度とし、製造業者の使用説明書に従って、臭化シアン活性化（ＣＮＢｒ）セファロース４Ｂ樹脂（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、カタログ番号１７−０４３０−０１）共有結合であった。新しく成長させたＬＮＣａｐ細胞を３０個のコンフルエントなＴ−１７５培養フラスコから収集した。細胞は遠心してペレット状にし、溶解バッファの定量をＴ１７５フラスコ１個当たり５００μｌにして、（２％トリトンＸ−１００、プロテアーゼ阻害剤および０．１％のアジ化ナトリウムを含むハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ＋））溶解バッファに再懸濁した。細胞はセルスクレーパーでこすって取った。細胞／溶解バッファの懸濁物をボルテックスで混合し、次に、４ｏＣで４５分間２４，０００×ｇで遠心分離によって濁りを取った。濁りを取った溶解物を取り出し、マウスＩｇＧコンジュゲートＣＮＢｒセファロースに４ｏＣで２時間かけ事前に不要物を取り除いた。次に、事前に不要物を取り除いた溶解物を、ＢＬＡ８  ＣＮＢｒセファロース・マトリックスに通した。次に、ＢＬＡ８ビーズを、ｐＨ２．５の０．１Ｍグリシンで溶出する前に、溶解バッファ（少なくとも１０カラム体積）で多数回洗浄した。マトリックスは合計で５カラム体積の溶出バッファで溶出した。溶離液は１カラム体積分の画分にして集めた。各ファクションはそれぞれ独立して、セントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０濃縮装置（ミリポア、＃４２０６）により、体積が約６０μｌに達するまで濃縮した。溶離液の１０％をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ウェスタンブロット法によって分析した。残りの９０％は、単一のレーン上にロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびコマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色することによって分離した。コマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色によって、糖タンパク質に典型的な３本のバンドが１００、２００、および２５０＋ｋＤａ範囲とこれらの周辺とに観察され、最も強いバンドは１００ｋＤａバンドで、その次が２００ｋＤａバンドで、２５０ｋＤａ＋バンドは着色が最も薄かった。これらのバンドは、ウェスタンブロット法によって観察されたバンドに相当し、単一のタンパク質のモノマー（１００ｋＤａ）型、ホモ二量体（２００ｋＤａ）型およびホモ三量体（２５０＋ｋＤａ）型を示すと理論付けられた。１００ｋＤａおよび２００ｋＤａのバンドは切除し、質量分光分析に供した。
【０１５９】
（実施例６．ＭＡＬＤＩ質量分析法）
抗ＲＡＡＧ１０抗体が結合する抗原を、実施例４および５に記載のように単離し、ＭＡＬＤＩ質量分析をした。免疫親和性カラムの溶離液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、バンドを切除して抽出する。ゲル・スライスは、トリプシンによって「ゲル中」消化する（Ｇｈａｒａｈｄａｇｈｉ，Ｆ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｒ．，Ｍｅａｇｈｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｉｍａｉ，Ｂ．Ｓ．およびＭｉｓｃｈｅ，Ｓ．Ｍ．（１９９９）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２０，６０１−６０５）。抽出したペプチドを、クラトス（Ｋｒａｔｏｓ）、ＡＸＩＭＡ  ＣＦＲのマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ）によって分析する。ペプチド質量は１００ｐｐｍ以内で決定し、カーブドフィールドリフレクトロンをもつ時間イオンゲートを利用し、ポストソース分解（ＰＳＤ）によってペプチドの単離および切断をする。検索は、プロテイン・プロスペクター・プログラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ）（Ｃｌａｕｓｅｒ  Ｋ．Ｒ．，Ｂａｋｅｒ  Ｐ．Ｒ．およびＢｕｒｌｉｎｇａｎｉｅ  Ａ．Ｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第７１巻、１４，２８７１−（１９９９））ＭＳＦｉｔおよびＭＳＴａｇによって実施する。
【０１６０】
五つの主要ペプチド・ピークが、１１７３．６０１６（ペプチド１）、１６０１．７６３４（ペプチド２）、１６８６．９１７９（ペプチド３）および１９９１．０３１０（ペプチド４）、ならびに２６２０．３８３４（ペプチド５）の質量で同定された。ヒトタンパク質データ・ベースの検索によって、ペプチド２および３が「ｂ７ホモログ３」という名前のタンパク質から生成されている可能性が示された（ＮＣＢＩアクセッション番号１３３７６８５２）。選択したペプチドのポストソース分解分析によって、これらのペプチドの同一性を正確な配列として確認した。仮説のタンパク質配列に関しＥＳＴ（発現遺伝子配列断片）データ・ベースでさらに選別すると、５つのペプチド・ペプチドをすべて含む別のタンパク質を特定した（ポストソース分解によって同一性を確認するとともに）。このタンパク質は、ヒトＥＳＴに由来し、以下のように示される：６０２３０９９２２Ｆ１  ＮＩＨ＿ＭＧＣ＿８８  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＩＭＡＧＥ：４４０１１７３  ５’。
【０１６１】
五つの質量およびＰＳＤ分析はすべてこの仮説のタンパク質の配列と一致した。ＤＮＡ、ＥＳＴからの誘導タンパク質、およびＢ７ホモログ３の配列からの誘導タンパク質の配列を比較すると、配列の大部分が重複することがわかった。異なった配列はシグナル配列の直後のＢ７ホモログ３のアミノ末端中の領域で始まっていた。これは、実際は、ＥＳＴが、５’方向に未知数延びているコード領域をもち、Ｂ７ホモログ３の別のスプライスバリアントのｃＤＮＡクローンからのものであることを示す。脱グリコシル化精製抗原は、およそ６０，０００のダルトンの分子量を有している（また、Ｂ７ホモログ３の抗原はおよそ３０，０００のダルトンの分子量を有している）ので、このタンパク質データは、Ｂ７ホモログ３として公知であった配列に加え追加のコード配列を含む実際のタンパク質と一致する。
【０１６２】
何らかの特別な理論または機序に結び付けようとするものではないが、ペプチドのうちの一つ（ペプチド４）が、疎水領域（推定上の膜貫通領域）の直前のＢ７ホモログ３内の配列と相同性が極めて高いので、Ｂ７ホモログ３の細胞外領域（二つのＩｇＧ様領域からなる）の複製からＲＡＡＧ１０抗原が発生し、四つのＩｇＧ様領域、膜貫通領域、および細胞質の「尾部」からなる推定上のタンパク質を生成すると思われる。
【０１６３】
ＲＡＡＧ１０抗原の正確な構造体の決定については、ＥＳＴおよびＢ７ホモログ３に対する既存の配列情報を利用し、開始ＡＵＧコドンが同定されるまで５’方向にｃＤＮＡ配列を延ばす標準的な技術を使用すれば決定される。本明細書に別記した細胞株は、いずれも本研究用のｃＤＮＡライブラリ源として使用することができる。
【０１６４】
（実施例７．ＢＬＡ８抗原のキャラクタリゼーション）
ＢＬＡ８が反応した抗原を同定するために、免疫沈降（Ｉｐｐｔ）実験を実施した。Ｉｐｐｔをするために、濃縮ＬｎＣａｐ細胞１０ｍｌを、４０ｍｌの溶解バッファで溶解した。溶解バッファは、２％トリトンＸ−１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（５ｍｌの溶解バッファ当たり、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のコンプリートｍｉｎｉＥＤＴＡフリー・プロテアーゼ・カクテルを１タブレット）、０．１％アジ化ナトリウムおよび２ｍＭのＰＭＳＦによって補強されたハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ＋）からなるものとした。細胞溶解物を４℃で３０分間２４，０００×ｇによって濁りを取ってから、２ｍｇ／ｍｌのマウスＩｇＧコンジュゲートＣＮＢｒ  ６ＭＢセファロースビーズからなるカラムに通し、ここで溶解物は、事前に不要物が取り除かれるものとする。次に、事前に不要物を取り除いたＬｎＣａｐ溶解物を、ＢＬＡ８コンジュゲートＣＮＢｒセファロース６ＭＢのカラムに通した。ＢＬＡ８カラムは、膨張したＣＮＢｒ  ６ＭＢセファロースビーズ１ｍｌ当たり３ｍｇのＢＬＡ８をコンジュゲートさせたものとした。次に、ビーズ（マウスＩｇＧおよびＢＬＡ８の両方で）を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶出する前に溶解バッファで３回洗浄した。溶離液は１カラム体積の画分で集め、最終濃度０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．０で中和し、最終ｐＨを約７．２にした。次に、中和した画分を、マイクロ濃縮器（ミリポアのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０）によって画分体積の１０％にまで濃縮した。次に、濃縮溶離液の１０％をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法によって分離した。同時に、溶離液の３０％をさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥに適している体積に濃縮し、コマシー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色によって分離した。
【０１６５】
アルキル化ＢＬＡ８、およびＢＬＡ８に対するものとしてマウスＩｇＧの溶離液をウェスタンブロット法で検出すると、ＢＬＡ８溶離液に固有のものとして、大量にグリコシル化されたのタンパク質（＞２２３ｋＤａ、約２００ｋＤａおよび１００ｋＤａ）が３組観察され、１００ｋＤａバンドが最も顕著であった。３本のバンド（つまり、２００ｋＤａは１００ｋＤａが２重になったもので、＞２２３ｋＤａバンドは１００ｋＤａバンドの３重になったものであると思われる）には線形性があるため、ＢＬＡ８抗原のモノマー、二量体、三量体から３本のバンドがなっていると仮説をたてた。精製された抗原のスタッキング効果から、抗原が本来の状態で良好に二量化されているが、濃縮によってタンパク質の相互作用の頻度が人為的に高められているものと考えることができる。コマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色すると、ＢＬＡ８に固有の対の線が１００ｋＤａと約２００ｋＤａに観察された。かすかではあるが第３のバンドが＞２２３ｋＤａに観察された。我々の仮説を確かめるために、１００ｋＤａおよび約２００ｋＤａのバンドの両方を切断し、それぞれＬＯ（１００ｋＤａ）およびＨＩ（２００ｋＤａ）と標識した。これら２本のバンドは、引き続きマススペック分析に供する。
【０１６６】
マススペック分析によって、２本のバンド（ＨＩおよびＬＯ）が消化性ピークと同一のピークを示すことがわかり、これは２本のバンドが同一の抗原からなっていることを示している。これによって、ウェスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察されたバンドが、実際にはグリコシル化分子の分子量約１００ｋＤａを有する抗原のポリマーであると考えた我々の仮説が確認された。さらに、マススペックによって、ＢＬＡ８抗原について同定をした。ＢＬＡ８抗原のペプチド配列は、保存済みの二つの配列に匹敵し、一番目は最近同定されたタンパク質Ｂ７−Ｈ３、二番目は、Ｂ７−Ｈ３の細胞外領域配列と＞９０％の相同性を共有するが、非常に大きい配列をコードしているＥＳＴ配列である。我々は、Ｂ７−Ｈ３に似ている新規の抗原にＢＬＡ８が結合していることを発見した。我々はこの抗原をＢ７−Ｈ３Ｌと名付ける。
【０１６７】
（実施例８．抗体ＬＵＣＡ１、ＳＫＩＮ２、ＰＡ２０およびＢＬＡ８はすべて同じ抗原を標的とする）
ウェスタンブロットの結果、抗体ＬＵＣＡ１、ＳＫＩＮ２、ＰＡ２０およびＢＬＡ８がすべて同じ抗原にブロットすると思われることが示されたが、この結果を確認するために、ＬｎＣａｐ細胞からの精製ＢＬＡ８抗原を使用して固相プレートＥＬＩＳＡを実施した。精製抗原は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ＋）に１：２５で希釈（ウェル一つにつき５０μｌ）し、ＮＵＮＣマキソーブ（ｍａｘｉｓｏｒｂ）プレート（ＶＷＲ）に室温で２時間結合させた。次に、１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ＋をウェル一つ当たり２００μｌ用い結合プレートを３０分間ブロックした。ブロックした後、ＬＵＣＡ１、ＳＫＩＮ２、ＰＡ２０、およびＢＬＡ８（すべて０．５μｇ／ウェル、ブロッキングバッファに希釈）を、マキソーブプレートに加え、室温で１時間相互作用させた。マウスＩｇＧ、およびＬｎＣａｐ細胞に対して反応性のある無関係な抗体を、負の対照としてウェル一つ当たり同じ濃度にして使用した。プレートをＨＢＳＳ＋で十分洗浄した。次に、０．０４μｇ／ウェルで使用する第２の抗体、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖に特異的）をウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＨＢＳＳ＋で十分に洗浄し、次に、ＨＲＰに基づく色変化反応用のＴＭＢ基質に晒した。１Ｍリン酸を追加（基質に対して１：１）して、この反応を止めた。次に、この反応をＯ．Ｄ．４５０で読んだ。このＥＬＩＳＡによって、ＬＵＣＡ１、ＳＫＩＮ２、ＰＡ２０およびＢＬＡ８はすべて、ＢＬＡ８抗原に強く反応する（Ｏ．Ｄ．４５０は負の対照よりも少なくとも２倍増加）一方、負の対照は、ほとんどまたは全く反応を示さなかった。
【０１６８】
同時に、四つの抗体を使用して生細胞ＥＬＩＳＡを実施した。四つの抗体はすべて同じ細胞反応を示すことを発見した。さらに、ＬＵＣＡ１、ＰＡ２０、ＳＫＩＮ２およびＢＬＡ８を、ＢＬＡ８精製抗原に対するウェスタンブロットに使用した。四つの抗体はすべて、ＢＬＡ８精製抗原に強く反応した。
【０１６９】
実施した二つの実験から、抗体ＬＵＣＡ１、ＰＡ２０、ＳＫＩＮ２およびＢＬＡ８は、すべて同じ抗原に反応すると結論付けた。
【０１７０】
（実施例９．ＢＬＡ８ファミリおよびエピトープの競合）
我々は、単一の抗原に対する抗体を多数生成してきたので、ｍＡｂｓのＢＬＡ８ファミリの四つの抗体（ＬＵＣＡ１、ＰＡ２０、ＳＫＩＮ２およびＢＬＡ８）間にエピトープの違いがあるのか判断するために実験を始めた。量的に制限があったため、ＬＵＣＡ１、ＰＡ２０およびＢＬＡ８だけをビオチン化した。ビオチン化するために、２００ｕｇビオチン／抗体ｍｇの比率のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチンを用い、濃度２ｍｇ／ｍｌの各抗体２５０ｕｇをＰＢＳ中で室温で２時間インキュベートした。ｐＨ８．０の１Ｍトリスを最終濃度が１００ｍＭになるよう追加することによってビオチン化の反応を停止させた。反応停止のために、室温でさらに２０分インキュベートした。次に、ビオチン化済み抗体のバッファをＰＢＳに交換した。
【０１７１】
ＢＬＡ８精製抗原をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ＋）に１：２５で希釈し、ウェル一つ当たり２μｌの濃度にして２時間インキュベートすることによってＮＵＮＣマキソーブプレート上に固定した。次に、被覆されたプレートを、１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ＋に室温で３０分間ブロックした。次に、ブロッキングバッファをプレートから除き、競合抗体の非ビオチン化ＬＵＣＡ１、ＰＡ２０、ＳＫＩＮ２またはＢＬＡ８をブロッキングバッファに希釈したものを滴定によって室温で３０分間かけて加えた。なお、滴定は、２ｕｇ／ウェルから開始し、最後は３．８ｎｇ／ウェルとした（５０ｕｌ／ウェル）。３０分間インキュベートした後、競合抗体を含む５０μｌ／ウェルのウェルにビオチン化済み抗体（ＬＵＣＡ１、ＰＡ２０またはＢＬＡ８）を導入した。ビオチン化済み抗体は、５００ナノグラム／ｍｌの濃度で加えた。競合抗体およびビオチン化済み抗体のカクテルを室温でさらに１時間インキュベートした。次に、プレートをＨＢＳＳ＋で十分に洗浄した。次に、ＨＢＳＳ＋に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートストレプトアビジンを５０ｕｌ／ウェルにして室温で３０分間インキュベートさせた。プレートをＨＢＳＳ＋でさらに洗い、ＨＲＰに基づく着色をするために、ＴＭＢ基質でインキュベートした。この反応は１Ｍリン酸を追加することによって止めた。次に、プレートをＯ．Ｄ．４５０で読んだ。
【０１７２】
競合分析から、ＰＡ２０およびＳＫＩＮ２が交差的に競合することがわかり、これらが同じエピトープを共有することが示された。一方、ＬＵＣＡ１およびＢＬＡ８は自身によってのみ競合し、どちらも異なるエピトープに結合されていることが示された。したがって、抗体のＢＬＡ８ファミリでは、ＰＡ２０、ＫＩＤ１およびＳＫＩＮ２は、我々がエピトープＡと名付けたエピトープに結合し、ＬＵＣＡ１、ＫＩＤ１３およびＧＢ８は、我々がエピトープＢと名付けたエピトープに結合し、ＢＬＡ８は、我々がエピトープＣと名付けたエピトープに結合している。
【０１７３】
（実施例１０．ＲＡＡＧ１０のクローニング）
Ｂ７Ｈ３全長に相補的なＤＮＡのクローニング。  ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ（商標））ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６ベクター（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）に構築されたヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３  ｃＤＮＡライブラリを、標準的なプロトコルを使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に形質移入した。細胞表面上にＢＬＡ８抗原を発現する形質移入体は、ＢＬＡ８抗体上で２回「パニングする」ことによって濃縮した。濃縮後、ＤＮＡを放出させるために細胞を溶解した。粗溶解物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＢ７Ｈ３クローニング用の鋳型として使用した。つまり、遺伝子バンクで購入できるＥＳＴ配列に基づいたＢ７Ｈ３のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に隣接するように、１対のＢ７Ｈ３特異的プライマー（センス：５’―ＡＧＣＣＧＣＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴ−３’、およびアンチセンス：５’―ＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴ−３’）を設計した。Ｂ７Ｈ３特異的プライマー各５０ｐｍｏｌ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ、１Ｘ  ＰＣＲバッファ、ｄＮＴＰ各２００μＭ、および２．５Ｕプラチナ・ハイフィデリティ・ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）と１．５μｌ細胞溶解物とを組み合わせることによりＰＣＲを実施した。反応液を２分間９４℃でインキュベートし、続いて１０秒間９４℃での鋳型変性および３分間６８℃でのプライマーのアニーリング／伸張を２８サイクル、および１０分間６８℃で最終伸張を実施した。一定分量のＰＣＲ生成物を１．２％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。約１．６ｋｂに優勢なバンドが同定され、これをゲル精製し、ｐＴａｒｇｅＴ（商標）哺乳類発現ベクター（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）へクローン化した。ＨｉｎｄＩＩＩを使用し制限酵素断片分析をすることによって形質転換体を特徴づけ、ｃＤＮＡ挿入断片の配向をＰＣＲによって決定した。ヌクレオチド配列を決定するために、同じ制限酵素パターンおよび正確な配向を備えるクローンを選択した。これらのクローンのうち７つから１６０５ｂｐＯＲＦが発見され、これらはすべて、遺伝子バンクで購入できるＢ７Ｈ３  ＥＳＴ配列と重複していた。これらのｃＤＮＡクローンをＣＨＯ細胞中で発現させた後、ＢＬＡ８抗体で染色した結果からも、これらｃＤＮＡクローンが確定的であることを確認した。
【０１７４】
Ｂ７Ｈ３突然変異体の構築およびキャラクタリゼーション。  Ｂ７Ｈ３のどの領域（単数または複数）が各ＢＬＡ８抗体ファミリ結合の原因であったのか判断するために、一連のＢ７Ｈ３突然変異体を構築し、ＣＨＯ細胞中に発現させ、種々の方法によって特徴づけた。つまり、ＢＬＡ８抗体によって最も強く染色されるｐＴａｒｇｅＴ／Ｂ７Ｈ３  ｃＤＮＡクローンを選択し、隣接する制限酵素（ＢａｍＢＩおよびＮｏｔＩ）、またはＢ７Ｈ３  ｃＤＮＡの範囲内にある制限酵素（Ｅｃｏ４７ＩＩＩ）を種々に組み合わせてクローンを消化した。ライゲーションの後、表１にまとめたように、一連の突然変異体を作製した。ＰＣＲおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素による消化によって検査し、各突然変異体を確認した。標準的なプロトコルを使用して、各突然変異体のクローンを少なくとも三つ、ＣＨＯ細胞へ形質移入した。次に、Ｂ７Ｈ３の突然変異体を形質移入したＣＨＯ細胞を２週間１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８存在下で選別した。種々の方法を使用し、細胞の種々の区画のＢ７Ｈ３含有量を分析した：１）表面上または形質移入体内部で免疫応答性Ｂ７Ｈ３の局在化について、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いた；２）形質移入体中のｍＲＮＡ発現を検出するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いた；３）培養上清中の分泌Ｂ７Ｈ３を検出するためにサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた。各方法につき独立した実験を少なくとも３回してから結果を得た。
【０１７５】
Ｂ７Ｈ３突然変異体を形質移入したＣＨＯ細胞の免疫組織化学染色。  形質移入体中に免疫応答性Ｂ７Ｈ３が存在することがＩＨＣによって判明した。Ｂ７Ｈ３がＣＨＯ細胞の表面上で発現したのか判断するために、生細胞のＩＨＣを実施した。つまり、細胞を、１０μｇ／ｍｌのＢＬＡ８抗体ファミリ（ＢＬＡ８、ＬＵＣＡ１またはＰＡ２０）と３７℃で１時間インキュベートした。無血清のハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ１２栄養混合物およびダルベッコ改変イーグル培地（Ｆ１２／ＤＭＥＭ、１：１、ｖ／ｖ）中で細胞を３回洗浄し、氷冷の１００％のエタノールに１５分間固定してから完全に風乾した。氷冷の２％Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳで１５分間細胞をインキュベートすることによって、内部のペルオキシダーゼ活性を停止した。ＰＢＳですすいだ後、細胞を５％正常ヤギ血清／ＰＢＳで１時間ブロックし、次に、ブロッキングバッファ中ペルオキシダーゼ−コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・イムノリサーチ・ラブズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）、ウェスト・グルーブ、ペンシルベニア州）２μｇ／ｍｌで１時間インキュベートした。洗浄した後、３，３’−ジアミノベンゼジン（ＤＡＢ）およびＨ２Ｏ２を含む酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）で細胞をインキュベートすることによって細胞表面上の免疫応答性Ｂ７Ｈ３を可視化した。ＣＨＯ細胞内の免疫応答性Ｂ７Ｈ３の検出については、固定細胞のＩＨＣ法を上記と同様の手法によって実施した。氷冷の１００％エタノール中で細胞をまず固定し、完全に風乾させた。内部のペルオキシダーゼ活性を停止させた後、細胞を洗浄し、ブロックし、次に１０μｇ／ｍｌのＢＬＡ８抗体ファミリと１時間３７℃でインキュベートした。洗浄した後、同じペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗体で細胞をインキュベートした。洗浄後染色シグナルを発生させた。負の対照は、トリスバッファ形質移入によるＣＨＯ細胞をＢＬＡ８抗体ファミリによって染色することにより得た。倒立顕微鏡によって染色を評価した。その結果を表３のＩＨＣの列にまとめた。染色陽性の場合「＋」、弱い染色陽性の場合「＋／−」、または染色陰性の場合「−」として、結果を分類した。
【０１７６】
ＲＴ−ＰＣＲによるＢ７Ｈ３  ｍＲＮＡ発現の検出。  Ｂ７Ｈ３  ｍＲＮＡが形質移入体中で本当に発現されたのか判断するためにＲＴ−ＰＣＲを実施した。製造業者の使用説明書に従い、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）によってＢ７Ｈ３突然変異体を形質移入したＣＨＯ細胞から全ＲＮＡを分離した。ＲＮＡの濃度を２６０ｎｍの吸光度によって測定した。製造業者のプロトコルに従ってスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩリボヌクレアーゼＨ逆転写システム（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用し、およそ２〜３μｇの全ＲＮＡを０．５μｇオリゴ−ｄＴ１５で逆転写した。Ｂ７Ｈ３プライマー各５０ｐｍｏｌ（詳細に関しては表２を参照）、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ、１Ｘ  ＰＣＲバッファ、ｄＮＴＰ各２００μＭ、および２．５ＵプラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）と１μｌ逆転写生成物とを組み合わせることによりＰＣＲを上記と同様のサイクル条件で実施した。得られたＰＣＲ生成物を１．２％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。結果を表３のＲＴ−ＰＣＲの列にまとめ、正確なアンプリコンをもつ突然変異体が検出された場合を「＋」、またはアンプリコンが検出されない場合は「−」として分類した。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡによる培養上清中の免疫応答性Ｂ７Ｈ３の検出。  Ｂ７Ｈ３の一部が細胞表面上に固着する代わりに分泌される可能性を探るために、サンドイッチＥＬＩＳＡを発展させ、培養上清中の免疫応答性Ｂ７Ｈ３の含有量を分析した。つまり、炭酸塩バッファ（ｐＨ９．０）中ＢＬＡ８抗体４μｇ／ｍｌによって９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩コーティングした。プレートを０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０／ＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロックした。培養上清（１０倍希釈を４回、きれいな状態から開始して１／１０００にする）、およびＢＬＡ８抗原標準（２倍希釈を８回、１６μｇ／ｍｌから開始して１２５ｎｇ／ｍｌにする）の複製を、３％ＢＳＡおよび０．０５％トゥイーン−２０を含むＰＢＳ中に調製し、１時間インキュベートした。洗浄した後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のビオチン化ＬＵＣＡ１抗体４μｇ／ｍｌとともにプレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ヴェクタステイン・エリート（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ）ＡＢＣ試薬（ベクター・ラブズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）、バーリンゲーム、カリフォルニア州）とともにさらに１時間インキュベートした。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミンおよびＨ２Ｏ２を含むクエン酸リン酸バッファ中での着色によって結合Ｂ７Ｈ３を可視化した。２．５ＮのＨ２ＳＯ４を追加することによって所望の着色強度を得た。ソフトマックス・プロ・ソフトウェア（ＳＯＦＴｍａｘ  Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）（モレキュラー・デバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーベール、カリフォルニア州）と接続されているモレキュラー・デバイシズ・Ｅマックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｅｍａｘ）ＥＬＩＳＡプレート読取装置（モレキュラー・デバイシズ、サニーベール、カリフォルニア州）によって４９０ｎｍの吸光度を測った。トリスバッファ形質移入によるＣＨＯ細胞の上清を使用することによってブランクを得た。結果を表３のＥＬＩＳＡの列にまとめ、吸光度の読み取り値がブランクより大きかった場合を「＋」、または吸光度の読み取り値がブランク以下だった場合を「−」として分類した。
【０１７８】
【表１】
2010110329.tif 000002
【０１７９】
【表２】
2010110329.tif 000003
【０１８０】
【表３】
2010110329.tif 000004
１「突然変異体Δ３’ｓ」の上清中の免疫応答性Ｂ７Ｈ３の濃度は、約２．１４８±０．４８μｇ／ｍｌであった。
【０１８１】
Ｂ７Ｈ３およびその突然変異体の図示を図２に示す。
【０１８２】
（実施例１１．抗ＲＡＡＧ１０ファミリ抗体の腫瘍組織への結合に関する免疫組織化学）
凍結した組織試料をＯＣＴ化合物に包埋し、ドライアイスで冷やしたイソペンタンで急速凍結した。ライカ（Ｌｅｉｃａ）３０５０ＣＭミクトロトーム（ｍｉｃｔｒｏｔｏｍｅ）で厚さ５μｍに凍結切片を切断し、スライドガラス上に解凍標本を作製した。切片を−２０℃でエタノールで固定し、室温にて一晩風乾させた。固定した切片を使用するまで−８０℃で貯蔵した。免疫組織化学を実施するために、組織切片を戻し、まず、ブロッキングバッファ（ＰＢＳ、５％正常ヤギ血清）で３０分間、室温でインキュベートし、次にブロッキングバッファ（５μｇ／ｍｌ）に希釈した抗ＲＡＡＧ１０抗体および対照モノクローナル抗体とともに一晩インキュベートした。次に切片をブロッキングバッファで３回洗浄した。結合モノクローナル抗体を、ｐＨ５．０５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファおよび０．００３％の過酸化水素（シグマ、カタログ番号Ｈ１００９）中ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２−ペルオキシダーゼコンジュゲートおよびペルオキシダーゼ基質ジアミノベンゼジン（１ｍｇ／ｍｌ、シグマ、カタログ番号Ｄ５６３７）によって検出した。染色するスライドは、ヘマトキシリンによって対比染色し、ニコンの顕微鏡によって観察した。
【０１８３】
いくつかの例では、適切な抗原回収法を実施した後、パラフィンに包埋したホルムアルデヒド固定組織を免疫組織化学に使用人であった。このような抗原回収法の一つがＭａｎｇｈａｍおよびＩｓａａｃｓｏｎ、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ３５：１２９−３３（１９９９）に記載されている。当業者は抗原回収および／または検出に別の方法を使用してもよい。回収した抗原とともに凍結組織または必要に応じて固定組織を使用した同様の実験およびｐｏｌｙＭＩＣＡ検出からの結果を実施した。抗ＲＡＡＧ１０抗体の種々の正常組織およびがん組織への結合を評価した。どの例でも、対照の固定組織中の抗体結合は、凍結組織の抗体結合と相関関係にあった。これら二つが対照に一致しない場合、凍結組織からの結果のみを使用した。便宜上、抗ＲＡＡＧ１０抗体による主な５タイプの腫瘍の染色結果を組み合わせて表４に示した。染色には異なる五つの組織源からの凍結腫瘍組織を使用した。抗ＲＡＡＧ１０抗体の抗原、すなわちＲＡＡＧ１０に対するテストが陽性であった腫瘍の数、および上記のテストをした腫瘍の全体数を、（＋／全体）とし、各腫瘍タイプについて示した。抗ＲＡＡＧ１０抗体を結合する腫瘍のパーセンテージも示した。
【０１８４】
【表４】
2010110329.tif 000005
表５は、抗ＲＡＡＧ１０抗体による五つの転移性腫瘍タイプの染色結果を組み合わせたものを示す。染色には固定または凍結腫瘍組織を使用した。抗ＲＡＡＧ１０抗体の抗原に対するテストが陽性であった腫瘍の数、および上記のテストをした腫瘍の全体数を（＋／全体）とし、各腫瘍タイプについて示した。抗ＲＡＡＧ１０抗体を結合する腫瘍のパーセンテージも示した。表５に示すように、抗ＲＡＡＧ１０抗体は、テストした転移性腫瘍タイプの約９４％に結合していた。
【０１８５】
【表５】
2010110329.tif 000006
（実施例１２．  セルアレイ（ＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標））からの免疫細胞学的結果）
モノクローナル抗体抗ＲＡＡＧ１０を使用し、異なるタイプの組織からの種々の細胞株について反応性をテストした。プロテアーゼを使用せずに異なる株化細胞系からの細胞を成長表面から除去し、ＯＣＴ化合物に充填し包埋した。細胞を凍結し、切片化し、次に標準的ＩＨＣプロトコルを使用して染色した。セルアレイ（ＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標））技術については、国際公開第ＷＯ０１／４３８６９号に記載されている。弱い染色陽性の場合「＋」、中程度の染色陽性の場合「＋＋」、強い染色陽性の場合「＋＋＋」、および染色陰性の場合「−」として、得られた結果を得点化した。種々の細胞株（がん細胞株を含む）への抗ＲＡＡＧ１０抗体の結合を示すセルアレイ結合実験からの結果を表６にまとめた。
【０１８６】
【表６】
2010110329.tif 000007
ＭＡｂ濃度＝５μｇ／ｍｌ、標準プロトコル
＊ＣＣ−−Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ
（実施例１３．  抗ＲＡＡＧ１０抗体の腫瘍および正常組織への結合）
外科的切除によって得られる正常組織および腫瘍組織を凍結し、標本にした。ライカ（Ｌｅｉｃａ）３０５０ＣＭミクトロトーム（ｍｉｃｔｒｏｔｏｍｅ）で厚さ５μｍに凍結切片を切断し、ベクタバウンド（ｖｅｃｔａｂｏｕｎｄ）−コーティングスライド上に解凍標本を作製した。切片を−２０℃でエタノールで固定し、室温にて一晩風乾させた。一次抗体抗ＲＡＡＧ１０を１対１００（最終濃度１ｕｇ／ｍｌ）に希釈して使用した。組織切片を回収し、まず、ブロッキングバッファ（ＰＢＳ、５％正常ヤギ血清）で３０分間、室温でインキュベートし、次にブロッキングバッファ（５μｇ／ｍｌ）に希釈した抗ＲＡＡＧ１０抗体および対照モノクローナル抗体とともに一晩インキュベートした。次に切片をブロッキングバッファで３回洗浄した。結合したモノクローナル抗体を、ｐＨ５．０５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファおよび０．００３％の過酸化水素（シグマ、カタログ番号Ｈ１００９）中でヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２−ペルオキシダーゼ複合体およびペルオキシダーゼ基質ジアミノベンゼジン（１ｍｇ／ｍｌ、シグマ、カタログ番号Ｄ５６３７）で検出した。染色するスライドは、ヘマトキシリンによって対比染色し、ニコンの顕微鏡によって観察したＰｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットを使用し、抗ＲＡＡＧ１０抗体の結合を判断した。
【０１８７】
弱い染色陽性の場合「＋」、中程度の染色陽性の場合「＋＋」、強い染色陽性の場合「＋＋＋」、および染色陰性の場合「−」として、得られた結果を得点化した。抗ＲＡＡＧ１０抗体の腫瘍組織試料への結合を表７に示す。抗ＲＡＡＧ１０抗体による正常組織の染色結果を表８に示す。
【０１８８】
比較的感度の高いプロトコル（ＡＢＣまたはダコ・エンヴィジョン（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ））を使用した結果、副腎、子宮、皮膚、肺、腎臓、膵臓、肝臓および前立腺の正常組織に染色が見られた。正常な乳房、大腸、十二指腸、心臓、肺、卵巣、前立腺、骨格筋、皮膚、胃および子宮の組織では、間質（結合組織）染色が見られた。正常脳組織は陰性であった。
【０１８９】
【表７】
2010110329.tif 000008
＊＝局所的染色
【０１９０】
【表８】
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（実施例１４．  抗ＲＡＡＧ１０抗体および毒素−コンジュゲート抗マウスＩｇＧの内部移行）
ＭＡｂ−ＺＡＰ（アドバンスド・ターゲティング・システムズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）は、サポリンにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧであって、タンパク質合成を阻害する毒素である。この毒素は、細胞膜に不透過性である。モノクローナル抗体が内部移行可能な細胞表面抗原に結合されている場合、毒素−コンジュゲートは、結合されているモノクローナルに結合し内部移行することができ、その結果、細胞を死滅させる。毒性活性を示すには内部移行に依存するので、細胞毒性効果を発現させる内部移行に依存する任意の毒素に対する適切な標的として所定の表面抗原が有効であるのかを判断するにはＭＡｂ−ＺＡＰが有用であると考えられる。このように、ＭＡｂ−ＺＡＰは、メイタンシノイドおよびカリケアマイシンなど上記のような内部移行依存性毒素のモデルとして有用である。
【０１９１】
抗ＲＡＡＧ１０抗体およびサポリンコンジュゲート抗マウスＩｇＧの内部移行、ならびにタンパク質合成阻害剤サポリンが内部移行した後の腫瘍細胞成長の阻害効果についてテストをするために、検定法にマウスモノクローナル抗ＲＡＡＧ１０抗体ＬＵＣＡ１を使用した。ヒト肺扁平上皮がん細胞、ＳＫ−ＭＥＳ−１を１０ｍＭのＥＤＴＡのはいった貯蔵用フラスコから取り出し、遠心分離した。適切な培地中に細胞を５０，０００／ｍｌにして再懸濁し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌ塗布した。抗体ＬＵＣＡ１を１０×濃縮物として適切なウェルに直ちに加え、最終濃度を１０μｇ／ｍｌにした。室温で１５分置いてから、ＭＡｂ−ＺＡＰ（カタログ＃ＩＴ−０４、アドバンスド・ターゲティング・システムズ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）を１０×濃縮物として適切なウェルに加え、最終濃度を０．００１ｐＭから１０４ｐＭとした。４日間成長させた後、３７℃で４時間、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌＰＢＳで貯蔵しておき、ウェルに入れるときは１：１０希釈する）を加えた。次に全ウェルから培地を取り出し、１００μｌ／ウェルのＤＭＳＯを加えた。プレートを優しく回転させ、青色のＭＴＴ沈殿物を可溶化し、プレート読み取り機によってこのプレートを５４０ｎｍで読み取った。テトラゾリウム色素ＭＴＴの減少のＯＤ測定値は、細胞数の代用である。
【０１９２】
図１に示すように、ＭＡｂ−ＺＡＰを加えると、ＬＵＣＡ１モノクローナル抗体の存在下（実線）では、ＬＵＣＡ１の非存在下（点線）の染色に比べて、ＳＫ−ＭＥＳ−１細胞中でＭＴＴ染色の減少があった。このことは、ヒト肺扁平上皮がん細胞ＳＫ−ＭＥＳ−１の成長がＬＵＣＡ１モノクローナル抗体およびＭＡｂ−ＺＡＰ（タンパク質合成阻害剤サポリンにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ）の存在下で阻害されていることを示している。ＭａｂＺＡＰが高濃度になると線が分かれる。これはＬＵＣＡ１が内部移行されていることを示している。ＬＵＣＡ１と同様の実験を腫瘍細胞株ＳＫ−ＯＶ−３およびＬＮＣａＰについて実施した。さらにＬＵＣＡ１の標的エピトープとは別のエピトープを標的とする二つの別の抗ＲＡＡＧ１０抗体であるＢＬＡ８およびＫＩＤ２モノクローナル抗体をもつこれら三つの細胞株に関し、同じように内部移行したとの結果が得られた。
【０１９３】
当然のことながら、本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示のみを目的とするものであり、これらに関する種々の変更または変形は、当業者には示唆されており、本明細書の精神および範囲内に含まれるものである。本明細書に挙げた刊行物、特許および特許明細書はすべて、各出版物、特許または特許明細書それぞれを参照によって組み込んでいることを特定し個別に示す場合と同じく、あらゆる目的にかなうように、その全体を参照により本明細書に組み込むものである。
【図１】
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【図２】
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