(57)【要約】【課題】実効的に自己免疫系の過剰活性化を抑制させる手法を提供する。【解決手段】本発明に係る自己免疫過剰活性の抑制方法は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を体内に導入し、ＳＯＣＳを誘導させ、サイトカインシグナルの異常を抑制させることにより、自己免疫の過剰活性を抑制させる。前記（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出されたものである。ＳＯＣＳは、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、又は、ＳＯＣＳ３のいずれかである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を含有する、
ことを特徴とする自己免疫過剰活性抑制剤。
【請求項２】
前記（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出されたものである、
ことを特徴とする請求項１記載の自己免疫過剰活性抑制剤。
【請求項３】
支持材上に、薬剤を含有する薬剤層を積層して形成され、患部に前記薬剤が当接して浸透するように貼り付けて使用する貼付薬シートにおいて、
前記薬剤は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を含有する、
ことを特徴とする貼付薬シート。
【請求項４】
前記（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出されたものである、
ことを特徴とする請求項３記載の貼付薬シート。
【請求項５】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を体内に導入し、ＳＯＣＳを誘導させ、サイトカインシグナルの異常を抑制させることにより、自己免疫の過剰活性を抑制させる、
ことを特徴とする自己免疫過剰活性の抑制方法。
【請求項６】
前記（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出されたものである、
ことを特徴とする請求項５記載の自己免疫過剰活性の抑制方法。
【請求項７】
前記ＳＯＣＳが、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、又は、ＳＯＣＳ３のいずれかである、
ことを特徴とする請求項５又は６記載の自己免疫過剰活性の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫過剰活性抑制剤、貼付薬シート、及び、自己免疫過剰活性の抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、病原体等の外敵から自己を守るために必須の生体機構である。もっとも、免疫系の過剰な活性化は自らの生体組織を破壊し、膠原病等の自己免疫疾患の原因となる。膠原病は、結合組織と血管の炎症を主とし、自己抗体の出現を伴う原因不明の自己免疫性・難治性疾患である。
【０００３】
古典的膠原病としては、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus：以下、「ＳＬＥ」と略記する。）、強皮症（progressive systemic sclerosis）、皮膚筋炎（dermatomyositis）、慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis）、リウマチ熱（rheumatic fever）、結節性多発(性)動脈炎（polyarteritis nodosa）の６疾患がある。
【０００４】
ＳＬＥは、１９４２年にクレンペラー（Klemperer）により提唱された臨床形態学的概念であり、結合組織の系統的疾患であって、全身の膠原繊維にフィブリノイド変性という共通の病変が見られる疾患群の総称である。
【０００５】
近年、生体の免疫応答、造血反応等の生体機能の発現を調節する蛋白因子として数多くのサイトカインが発見され、その構造や作用が解明されるにつれて、サイトカインの作用が免疫系に影響を及ぼし、病態生理とも関連深いことが明らかにされつつある。
【０００６】
例えば、特許文献１には、サイトカインシグナルの異常を抑制させるサイトカイン産生抑制剤が記載されている。
【０００７】
また、例えば、特許文献２には、ファセオルス・ヴルガリス（Phaseolus vulgaris）由来のレクチンを有効成分として含有する全身性エリテマトーデス診断用試薬が記載されている。
【０００８】
しかしながら、これらの技術では、自己の免疫系が過剰に活性化することを適切に抑制できない。そのため、膠原病等の自己免疫の過剰活性に起因する疾患を有効に改善させる手法が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−００２１３２号公報
【特許文献２】特開２００２−１６８８６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、実効的に、自己免疫系の過剰活性化を抑制させる自己免疫過剰活性抑制剤、貼付薬シート、及び、その抑制手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、この発明の第１の観点に係る自己免疫過剰活性抑制剤は、
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を含有する、ことを特徴とする。
【００１２】
また、前記（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出されたものである、ことも可能である。
【００１３】
また、上記目的を達成するため、この発明の第２の観点に係る貼付薬シートは、
支持材上に、薬剤を含有する薬剤層を積層して形成され、患部に前記薬剤が当接して浸透するように貼り付けて使用する貼付薬シートにおいて、
前記薬剤は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を含有する、ことを特徴とする。
【００１４】
また、前記（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出されたものである、ことも可能である。
【００１５】
また、上記目的を達成するため、この発明の第３の観点に係る自己免疫過剰活性の抑制方法は、
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を体内に導入し、ＳＯＣＳを誘導させ、サイトカインシグナルの異常を抑制させることにより、自己免疫の過剰活性を抑制させる、ことを特徴とする。
【００１６】
また、前記（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出されたものである、ことも可能である。
【００１７】
前記ＳＯＣＳが、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、又は、ＳＯＣＳ３のいずれかである、ことも可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る自己免疫過剰活性抑制剤は、自己免疫系の過剰活性化を、有効的に抑制させる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＥＧＣＧの化学式を説明する図である。
【図２】本実施形態に係る貼付薬シートの断面を説明する図である。
【図３】ＥＧＣＧにより誘導されたＳＯＣＳ１の発現の結果を説明する図である。
【図４】ＥＧＣＧにより誘導されたＳＯＣＳ３の発現の結果を説明する図である。
【図５】ＥＧＣＧによるＩｇＥ抗体の産出の抑制を説明する図である。
【図６】Ｕ２６６細胞におけるＳＯＣＳ１の発現レベルを説明する図である。
【図７】ＳＬＥ末梢血単核球における、ＥＧＣＧのＩｇＧ抗ＤＮＡ抗体の産生抑制を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（自己免疫過剰活性の抑制方法）
本実施形態の自己免疫過剰活性の抑制方法は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を体内に導入し、ＳＯＣＳ（サイトカインシグナル伝達抑制因子（suppressor of cytokine signaling））を誘導させ、サイトカインシグナルの異常を抑制させることにより、自己免疫の過剰活性を抑制させる。
【００２１】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、図１に示される構造を有している。
【００２２】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、例えば、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出する。なお、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、例えば、アッサム雑種茶や中国種茶から抽出することも可能である。
【００２３】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の緑茶植物の葉からの抽出は、例えば、下記に示す手法にて行うことができる。即ち、まず、緑茶葉を温水で抽出し、茶カテキン及びカフェインを含有する緑茶抽出物を得る。そして、この緑茶溶液をさらに濃縮し、濃縮緑茶抽出物溶液を形成する。そして、濃縮緑茶抽出物溶液をマクロポーラス極性樹脂を充填したカラムに付すことにより、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を分離する。
【００２４】
また、茶抽出物粉末は、例えば Guizhou Highyin Biological Product Co., P.R. China、 または Zhejang Zhongke Plant Technical Co. Ltd., Hangzhou, Zhejang, P. R. Chinaから市販もされている。
【００２５】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の体内への導入は、例えば、後述するように、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を有効成分として含有する錠剤を経口投与にて導入することができる。
【００２６】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が体内に導入されることにより、ＳＯＣＳが誘導される。ＳＯＣＳ（サイトカインシグナル伝達抑制因子（suppressor of cytokine signaling））は、サイトカイン誘導性の細胞内分子である。
【００２７】
サイトカインは、細胞の分化、増殖、生存等に重要な機能を有し、生体にとって必要不可欠な細胞間の情報伝達物質であるものの、サイトカインが過剰に存在したり、そのシグナルが過剰に伝達されると、自己免疫疾患や炎症性疾患等が引き起こされる。しかしながら、本実施形態に係る自己免疫過剰活性の抑制方法によると、ＳＯＣＳの誘導により、サイトカインシグナルの異常を抑制させることができるのである。
【００２８】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の導入により、サイトカインシグナルの異常を抑制させるサイトカインとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−β等がある。
【００２９】
このうちＩＬ−４は、活性化されたＣＤ４Ｔ細胞（Ｔｈ２細胞）、ＣＤ８Ｔ細胞、マスト細胞（肥満細胞）、好塩基球、ＮＫＴ細胞から産生される。ＩＬ−４は、活性化されたＢ細胞に作用し、ＩｇＭから、ＩｇＧ１、ＩｇＥへのクラススイッチを促進させ、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＥ抗体の産生を促進する。
【００３０】
本実施形態に係る自己免疫過剰活性の抑制方法によって誘導されるＳＯＣＳは、特に限定されるものではないが、例えば、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、又は、ＳＯＣＳ３のいずれかである。ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、又は、ＳＯＣＳ３は、それぞれ、異なった分子機序でサイトカインシグナル伝達を制御する。
【００３１】
ＳＯＣＳ１は、チロシンキナーゼの一つであるＪＡＫ分子と結合して、その機能を抑制することでサイトカインシグナルを制御する。
【００３２】
ＳＯＣＳ２は、受容体のリン酸化チロシンと結合し、ＳＴＡＴ分子を競合阻害することで、サイトカインシグナルを制御する。
【００３３】
ＳＯＣＳ３は、受容体のリン酸化チロシンと結合し、ＪＡＫ分子にアクセスすることで、ＪＡＫ分子の機能を阻害して、サイトカインシグナルを制御する。
【００３４】
サイトカインシグナルの異常を抑制させることにより、自己免疫の過剰活性に伴う疾患を実効的に改善させることができる。本実施形態に係る自己免疫過剰活性の抑制方法にて改善できる疾患としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＳＬＥ、強皮症（systemic sclerosis）、皮膚筋炎（dermatomyositis）、関節リウマチ（rheumatoid arthritis）、リウマチ熱（rheumatic fever）、結節性多発(性)動脈炎（polyarteritis nodosa）等があげられ、さらには、エンドトキシンショック、ＡＲＤＳ、熱傷、喘息、ウィルス性心筋炎の急性期、特発性拡張型心筋症、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）からの臓器不全への移行、多臓器不全、クローン病、高γグロブリン血症、多発性硬化症、癌転移抑制、モノクローナルＢ細胞異常症、ポリクローナルＢ細胞異常症、心房粘液腫、キャッスルマン症候群、原発性糸球体腎炎、メサンギュウム増殖性腎炎、癌カヘキシー、悪性リンパ腫、乾癬、アトピー性皮膚炎、エイズに伴うカポシ肉腫、閉経後骨粗しょう症、敗血症、肝炎等もあげられる。
【００３５】
本実施形態に係る自己免疫過剰活性の抑制方法にて改善できる患者、患蓄としては、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等）を例示することができるが、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、無脊椎動物等、任意である。
【００３６】
（自己免疫過剰活性抑制剤）
本実施形態における自己免疫過剰活性抑制剤は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を有効成分量含有する。
【００３７】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、特に限定されるものではないが、例えば、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出されたものである。
【００３８】
なお、ＥＧＣＧは、緑茶植物から抽出されたものに限定されず、ＥＧＣＧ抽出前の緑茶植物、緑茶抽出物、ＥＧＣＧを含むカテキン、ＥＧＣＧ誘導体、及び、人工的に合成された合成ＥＧＣＧも含まれる。
また、ＥＧＣＧは、緑茶以外の例えば、アッサム雑種茶、中国種茶、烏龍茶及び紅茶等の茶葉、また、ＥＧＣＧが含まれる植物、薬品及び食品から抽出することもできる。ＥＧＣＧが含まれる食品等は、例えば、ポリフェノン（登録商標）（三井農林株式会社）、カテキンが含まれる特定保健用食品、及び、健康食品等、任意である。
【００３９】
緑茶に含まれているカテキンは８種類あるが、その主なものは（−）−エピカテキン（ＥＣ;茶葉全カテキン中の比率＝１０％）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ;２２％）、（−）−エピカテキンガレート（ＥＣＧ;１１％）、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ;５４％）であり、これらの中でＥＧＣＧが主成分である。
【００４０】
自己免疫過剰活性抑制剤は、特に限定されるものではないが、例えば、錠剤、カプセル剤等の形状を有するものとすることも可能である。錠剤中若しくはカプセル中には、リジン、プロリン、アルギニン、ビタミンＣ、マグネシウム等の種々の健康促進機能を有する物質を含有させることができる。
【００４１】
また、渋み等を改善させるために、錠剤中に、グレープフルーツ等のかんきつ類果汁、苦味マスキングペプチド等を、渋みをマスキングする成分として含有させることも可能である。
【００４２】
錠剤中における（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の有効成分濃度は、この範囲に限定されるものではないが、例えば６〜４０重量％濃度とすることができる。
【００４３】
（貼付薬シート）
本実施形態に係る貼付薬シート９００は、図２に示されるように、支持材１００上に、薬剤を含有する薬剤層２００を積層して形成される。
【００４４】
貼付薬シート９００は、患部に薬剤が当接して浸透するように貼り付けて使用する。
【００４５】
薬剤層２００に含有される薬剤には、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が有効成分として含有されている。
【００４６】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、特に限定されるものではないが、例えば、緑茶植物ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓの葉から抽出されたものを使用できる。
【００４７】
薬剤層２００には、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が含有される以外に、有粘着成分としての粘着剤（軟膏）が含有される。
【００４８】
支持材１００は、透明性を有する高分子フィルム１１０と、編布１２０と、を有して構成される。
【００４９】
支持材１００は、透明性を有する高分子フィルム１１０を有して構成されるから、患部に貼付薬シート９００を貼り付けたとしても目立ちにくい。透明性を有する高分子フィルム１１０としては、例えばポリエステルフィルムを使用できる。
【００５０】
また、支持材１００は、編布１２０を有して構成されるから、支持材１００は所定の強度を有するとともに、編布１２０と薬剤層２００との間の剥離が生じにくい。
【００５１】
編布としては、横編み、縦編みいずれでもよく、例えば、ミラニーズ編布、ラッセル編布、メリヤス編布等にて形成される。
【００５２】
薬剤層２００は、図２に示されるように、離型フィルム３００にて被覆される。貼付薬シート９００を使用する際には、離型フィルム３００を剥離させて、薬剤層２００を露出させ、患部に貼付させて使用する。
【００５３】
貼付薬シート９００は、自己免疫の過剰活性により皮膚に疾患が生じている患部に貼り付けて使用する。そのため、貼付薬シート９００を使用することにより、疾患患部を集中的かつ直接的に治療することができる。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
緑茶から抽出されたＥＧＣＧについて、ヒト血液細胞におけるＳＯＣＳの発現の誘導を調べた。
【００５５】
（末梢血単核球の準備）
健康的な人間から採取された２０ｍｌのへパリナイズされた静脈血液を、リン酸緩衝食塩水ＰＢＳ（Nacalai Tesque Inc.,product code 1429-95）にて１：１で希釈した。その後、５０ｍｌの遠心分離チューブ（Corning Inc.,product code 430291）の中で１０ｍｌのリンフォプレップ（Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway）の上に積層し、室温にて、３０分間、２０００ｒｐｍで、遠心分離した（Tomy EX-126, Tomy Digital Biology Company Ltd）。採取されたリンパ球は、ＰＢＳにて三回、洗浄し、その後、室温にて、５分間、１５００ｒｐｍで、遠心分離した。こうして、密度沈降により静脈血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を精製した。
【００５６】
（リンパ球分別）
末梢血単核球を、ＭＡＣＳ磁気ラベルされた抗体（Miltenyi Biotec, Inc., Auburn）を使用することにより、Ｂ細胞と、単球と、Ｔ細胞と、に分別した。Ｂ細胞の分別に使用したＭＡＣＳ抗体は、抗ヒトＣＤ１９抗体（product code 130-050-301）であった。単球の分別に使用されたＭＡＣＳ抗体は、抗ヒトＣＤ１４抗体（product code 130-050-201）であった。Ｔ細胞の分別に使用されたＭＡＣＳ抗体は、抗ヒトＣＤ３抗体（product code 130-050-101）であった。これらのＭＡＣＳ抗体を使用した細胞分別は、通常のマニュアル手法により実行された。なお、当該細胞分別には、公知のいかなる方法も用いることができる。
【００５７】
（血液細胞のＥＧＣＧ処理）
ＭＡＣＳ抗体により分離されたＢ細胞と、単球と、Ｔ細胞とは、１０％の牛胎児の血清（Hyclone Ltd.,product code SV30014.03）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液（Nacalai Tesque, Inc.,product code 26253-84）を含有するＲＰＭＩ媒体（Wako Pure Chemical Industries Ltd.,product code 189-02025）中で培養された。そして、３７℃、５％二酸化炭素存在下にて、一晩、１２ウェルコースタープレート（Corning, Inc）にて、１×１０６セル／ｍｌの濃度にて静置した。緑茶パウダー（Sigma-Aldrich, Inc.,product code E4143）から得られたＥＧＣＧを１０ｍＭの濃度で水に溶解させ、１０μＭの濃度で細胞処理に使用した。
【００５８】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＰＢＭＣ（末梢血単核球）におけるＳＯＣＳ誘導の定量）
ＥＧＣＧ処理を行ったＰＢＭＣ（末梢血単核球）を得た後、ＲＮＡ（ribonucleic acid）を、通常のマニュアル手法により、Qiagen Rneasyキット（Qiagen, Inc., Valencia,product code 74106）を使用して精製した。ＳＯＣＳ発現の確認は、リバース転写及びリアルタイムＰＣＲにて実行した。ＰＢＭＣ  ｃＤＮＡは、Quantitect Reverse Transcriptionキット（Qiagen, Inc., Valencia,product code 205311）を使用し、通常のマニュアル手法にて、１μｇのＰＢＭＣ  ＲＮＡを用いて準備し、容量にして３０μｌのｃＤＮＡサンプルを得た。
【００５９】
QuantiTect SYBR green ＰＣＲキット（Qiagen, Inc., Valencia）を使用して、血液細胞ｃＤＮＡサンプルに対し、半定量的リアルタイムＰＣＲによる測定を行った。そして、ＳＯＣＳ１及びＳＯＣＳ３の発現レベルをBio-Rad iCycler (Bio-Rad Laboratories, Inc)にて測定した。ＰＢＭＣ  ｃＤＮＡサンプルにおけるヒトβアクチンの発現レベルも測定し、ＳＯＣＳ１及びＳＯＣＳ３の発現レベルを補正した。ＰＣＲ反応は、１０μｌの２ｘＳＹＢＲグリーンＰＣＲバッファ、１μｌのｃＤＮＡ（前述した３０μｌのｃＤＮＡサンプルから得たもの）、１μｌのフォワードプライマー（０．５μＭの最終濃度）、１μｌのリバースプライマー（０．５μＭの最終濃度）、３μｌの無菌水、にて行われた。個々のｃＤＮＡサンプルのＰＣＲ反応は、各ＰＣＲランにおいて３回ずつ行った。
【００６０】
最終のＰＣＲサイクル実行後に融解曲線作製が実行され、ＰＣＲ産物組成を確認するために６０℃から９５℃（０．３℃毎に蛍光が判読された）までの温度上昇に対して蛍光強度をプロットして融解曲線を得た。Bio-Rad光学システムソフトウェアを使用して光学グラフを得、ＰＣＲサイクルに対する個々のサンプル反応の蛍光強度を示した。サイクルスレッショルド（Ｃｔ）値（Bio-Rad装置の任意の閾値デフォルトレベルに到達する蛍光レベルに必要なＰＣＲサイクル数の値）は、各々の反応にて決定した。全てのＰＣＲランにおいては、対応のターゲット遺伝子に対する標準キャリブレーション曲線を同時に作製した。この際のサンプルは、ｃＤＮＡサンプル反応を欠く水コントロールと、ＳＯＣＳ１及びＳＯＣＳ３を高いレベルで発現することが確認されたＰＢＭＣ  ｃＤＮＡサンプルの２倍希釈系列を含有するものであった。
【００６１】
全ての反応におけるＣｔ値は、Bio-Rad光学システムソフトウェアを使用して決定し、そして、ターゲット遺伝子の発現レベルの任意の値を得るために標準カーブと比較分析された。コントロールサンプル（cDNA reactions lacking reverse-transcriptase enzyme）から得られた値は、並行使用したｃＤＮＡサンプルから得られた発現値から減算した。ＰＣＲ産物は、ときに２％アガロースゲルにて電気泳動を行い、融解曲線データと相関する増幅産物純度であることを確認した。
【００６２】
使用されたプライマーシークエンスとＰＣＲ条件は、以下に示すものであった。即ち、ヒトＳＯＣＳ１フォワードプライマー（5’-agaccccttctcacctcttg-3’)、ヒトＳＯＣＳ１リバースプライマー(5’-gcacagcagaaaaataaagc-3’)。増幅サイクルは、３０秒、９５℃での初期変性サイクルの後、１０秒、９５℃での変性サイクル、１５秒，６２℃でのアニーリング、１０秒、７２℃での延長加熱を計４５サイクル行った。ヒトＳＯＣＳ３フォワードプライマー（5’-cccgccggcacctttctg-3’）、リバースプライマー（5’-aggggccggctcaacacc-3’）、増幅サイクルは、３０秒、９５℃での初期変性サイクルの後、１０秒、９６℃の変性サイクル、１５秒、６８℃でのアニーリング、１５秒、７２℃での延長加熱を計４５回行った。ヒトβアクチンフォワードプライマー（5’-agcctcgcctttgccga-3’）、ヒトβアクチンリバースプライマー（5’-ctggtgcctggggcg-3’）。増幅サイクルは、３０秒、９５℃での初期変性サイクルの後、３０秒、９５℃の変性サイクル、３０秒、６０℃でのアニーリング、１５秒、７２℃での延長加熱を計４５回行った。
【００６３】
図３は、Ｂ細胞（図中ではＢ）、単球（図中ではＭ）、Ｔ細胞（図中ではＴ）において、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）により誘導されたＳＯＣＳ１の発現の結果である。また、図４は、Ｂ細胞（図中ではＢ）、単球（図中ではＭ）、Ｔ細胞（図中ではＴ）において、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）により誘導されたＳＯＣＳ３の発現の結果である。Ｂ細胞では、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）により、ＳＯＣＳ１もＳＯＣＳ３もともに強く誘導されていた。単球では、ＳＯＣＳ３の誘導の程度は弱いものの、ＳＯＣＳ１は強く誘導されていた。
【００６４】
（実施例２）
次に、緑茶から抽出されたＥＧＣＧのヒトＢ細胞ＩｇＥ抗体に対する作用を調べた。
【００６５】
（Ｕ２６６細胞の培養及び緑茶から得られたＥＧＣＧによる細胞の処理）
Ｕ２６６（ＩｇＥ  アイソタイプ産生のＢ細胞株）を、１０％牛胎児血清（Hyclone Ltd., product code SV30014.03）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液（Nacalai Tesque, Inc.,product code 26253-84）を含有するＲＰＭＩ媒体（Wako Pure Chemical Industries Ltd.,product code 189-02025）中で培養した。そして、３７℃、５％二酸化炭素のインキュベータにて、一晩、１２ウェルコースタープレート（Corning, Inc）にて、１×１０６セル／ｍｌの濃度にて載置した。緑茶パウダーから得られたＥＧＣＧ（Sigma-Aldrich, Inc.,product code E4143）は１０ｍＭの濃度で水に溶解させ、細胞の処理に１０μＭの濃度で使用した。
【００６６】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＵ２６６細胞におけるＩｇＥ発現の定量）
ＥＧＣＧ処理を行ったＵ２６６細胞を回収した後、ＲＮＡを、通常のマニュアル手法により、Qiagen Rneasyキット（Qiagen, Inc., Valencia,product code 74106）を使用して精製した。ＩｇＥ発現の確定は、リバース転写及びリアルタイムＰＣＲにて実行した。Ｕ２６６  ｃＤＮＡは、Quantitect Reverse Transcriptionキット（Qiagen, Inc., Valencia,product code 205311）を使用して通常のマニュアル手法により、１μｇの一定分量のＵ２６６  ＲＮＡをもとに作製し、容量にして３０μｌのｃＤＮＡサンプルを得た。
【００６７】
QuantiTect SYBR green ＰＣＲキット（Qiagen, Inc., Valencia）を使用して、Ｕ２６６ｃＤＮＡサンプルに対し、半定量的リアルタイムＰＣＲによる測定を行った。そして、ＩｇＥ発現レベルをBio-Rad iCycler (Bio-Rad Laboratories, Inc)にて測定した。Ｕ２６６  ｃＤＮＡサンプルにおけるヒトβアクチンの発現レベルも測定し、ＳＯＣＳ１及びＳＯＣＳ３の発現レベルを補正した。ＰＣＲ反応は、１０μｌの２ｘＳＹＢＲグリーンＰＣＲバッファ、１μｌのｃＤＮＡ（前述した３０μｌのｃＤＮＡサンプルから得たもの）、１μｌのフォワードプライマー（０．５μＭの最終濃度）、１μｌのリバースプライマー（０．５μＭの最終濃度）、３μｌの無菌水、にて行った。個々のｃＤＮＡサンプルのＰＣＲ反応は、各々のＰＣＲランにおいて３回ずつ行った。
【００６８】
最終のＰＣＲサイクル実行後に融解曲線の作成が実行され、ＰＣＲ産物組成を確認するために６０℃から９５℃（０．３℃毎に蛍光が判読された）までの温度上昇に対して蛍光強度をプロットして融解曲線を得た。Bio-Rad光学システムソフトウェアを使用して光学グラフを得、ＰＣＲサイクルに対する個々のサンプル反応の蛍光強度を示した。サイクルスレッショルド（Ｃｔ）値（Bio-Rad装置の任意の閾値デフォルトレベルに到達する蛍光レベルに必要なＰＣＲサイクル数の値）は、各々の反応にて決定した。全てのＰＣＲランにおいては、対応のターゲット遺伝子に対する標準キャリブレーション曲線を同時に作製し、ｃＤＮＡサンプルを欠く水コントロールを同時に使用した。
【００６９】
全ての反応におけるＣｔ値は、Bio-Rad光学システムソフトウェアを使用して決定し、そして、ターゲット遺伝子の発現レベルの任意の値を得るために標準カーブと比較分析された。コントロールサンプル（cDNA reactions lacking reverse-transcriptase enzyme）から得られた値は、並行使用したｃＤＮＡサンプルから得られた発現値から減算した。ＰＣＲ産物は、ときに２％アガロースゲルにて電気泳動を行い、融解曲線データと相関する増幅産物純度であることを確認した。
【００７０】
使用されたプライマーシークエンスは、以下に示すものであった。即ち、ヒトＩｇＥフォワードプライマー（5’-accctggtcaccgtctcctca-3’)、ヒトＩｇＥリバースプライマー（5’-ccaccagacaggtgatcgtg-3’)。増幅サイクルは、３０秒、９５℃での初期変性サイクルの後、１０秒、９５℃での変性サイクル、１５秒、６２℃でのアニーリング、１０秒、７２℃での延長加熱を計４５回繰り返した。ヒトβアクチンプライマー及びサイクリング条件は、上述した条件と同じであった。
【００７１】
図５は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）によるＩｇＥ抗体の産出の抑制を示すものである。図５の最下段において、＋は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が含有されていることを示し、−は、含有されていないことを示す。図５から明らかなように、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が、ＩＬ−４および抗ＣＤ４０抗体によって誘導されるＩｇＥの産出を抑制している。なお、４時間後の抗体の産出抑制の程度が、２時間後の抗体の産出抑制の程度と比較してやや弱いのは、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の安定度が４時間以上経過することによりやや損なわれることが原因であると推察される。
【００７２】
図６は、Ｕ２６６細胞におけるＳＯＣＳ１の発現レベルを示すものである。図６において、＋は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が含有されていることを示し、−は、含有されていないことを示す。図６から明らかなように、ＳＯＣＳ１の誘導量は（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）に依存する。
【００７３】
（実施例３）
次に、緑茶から抽出されたＥＧＣＧについて、ＳＬＥ患者の培養ＰＢＭＣにおける抗ＤＮＡ抗体の生産を調べた。
【００７４】
（サンプル患者）
ＳＬＥ患者１０人（８人の女性、２人の男性、年齢３７〜５８歳、平均年齢４２歳）につき、ＰＢＭＣにおける抗ＤＮＡ抗体の生産を評価した。これらの患者の民族分析は、７人がコーカサス白人であり、２人がアフロカリビアンであり、１人が南アジア人であった。全てのＳＬＥ患者が、American College of Rheumatology (ACR）の疾患分類における改訂基準を充足した。これらの患者の疾患活動性は、ＢＩＬＡＧを使用して評価した。８つの組織乃至システム（体格、粘膜・皮膚、中枢神経、筋肉、心臓血管、血管、腎臓、血液細胞）は、分離して評価され、評価Ａ（最も活動性が高い）から評価Ｅ（活動性が認められない）にてランクした。評価Ａ，Ｂ，Ｃの場合は、組織乃至システムにおける疾患活動性ありとした。全患者からの静脈血のサンプルは、ロンドン単科大学のリウマチセンターでの外来のＳＬＥ患者から取得した。また、静脈血のサンプルは、午前中に取得した。
【００７５】
（患者の隔離とＩｇＧ抗体の枯渇）
ＳＬＥ患者のへパリナイズされた全血液サンプル２０ｍｌから、室温にて、１０００ｘ  ｒｐｍで、１０分間の遠心分離（Beckman, Beckman Ltd）を行い、血清サンプルを得た。分離した血清は、プロテインＧセファロースファストフロー４（GE Healthcare Life Sciences,Buckinghamshire;Product code 17-0618-01.）にて、ＩｇＧの除去を行った。すなわち、個々のＳＬＥ患者から単離された血清サンプルを、２５％のプロテインＧセファロースを含有するＰＢＳにて１：１で希釈し、室温下、ローターにて１５分間インキュベートした。血清サンプルは、セファロースを取り除いた後に、遠心分離にて得られた。
【００７６】
（ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）の準備）
ＰＢＭＣを密度沈降により静脈血から精製した。個々のＳＬＥ患者から得られた、２０ｍｌのへパリナイズされたヒト静脈血（血清が除去されたもの）は、ＰＢＳ（Nacalai Tesque Inc.; product code 1429-95）にて１：１で希釈され、そして、５０ｍｌの遠心分離チューブ（Corning Inc.,product code 430291）の中で、１０ｍｌのリンフォプレップ（Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway）の上に積層され、室温にて、３０分間、２０００ｒｐｍで、遠心分離された（Tomy EX-126, Tomy Digital Biology Company Ltd）。採取されたＰＢＭＣを、ＰＢＳ（Nacalai Tesque Inc; product code 1429-95）にて三回洗浄し、その後、室温にて、５分間、１５００ｒｐｍで、遠心分離した。こうして、密度沈降により静脈血からヒトＰＢＭＣを精製した。
【００７７】
（ＰＢＭＣ細胞の培養及びＥＧＣＧ処理）
密度沈降により以下の処理を行った。個々のＳＬＥ患者から得たＰＢＭＣを、２０％のＩｇＧ除去患者血清（ＰＢＳで１：１に希釈されたもの）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液（Sigma）を含有するＲＰＭＩ媒体中で培養した。そして、３７℃、５％二酸化炭素のインキュベータ中の、１２ウェルプレート（Corning, Inc）にて、１×１０６セル／ｍｌの濃度にて載置した。各々の患者のコントロールとして、ミディアムプラス患者の血清（細胞フリー）を載置した。緑茶パウダーから得られたＥＧＣＧ（Sigma-Aldrich, Inc.,product code E4143）を１０ｍＭの濃度で水に溶解させ、ＰＢＭＣに対する処理（最終濃度１０μＭ）に用いた。ＩｇＧ抗ＤＮＡ抗体の生産の分析のため、培養３日目で、培養上清および細胞なしのコントロールサンプルを回収した。
【００７８】
（抗ＤＮＡ抗体の生産のためのＥＬＩＳＡ）
抗ＤＮＡ抗体産生についてＥＬＩＳＡによって測定した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ８．０のクエン酸塩緩衝液に溶いた５００ｐｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ（シングル螺旋及び二重螺旋）にて、２時間３７℃でコートし、続いてＰＢＳで洗浄した。ブロッキングステップは必要ではなかった。培養上清は希釈なしでＤＮＡでコートされたプレートにて２時間３７℃でインキュベートされ、その後１％ツイン２０で補足されたＰＢＳで三回洗浄された。アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Sigma, Poole）を１：１０００で希釈し、４℃にて一晩インキュベートした。ＩｇＥの値は、４０５ｎｍの３回繰り返しの平均吸光度を測定し、抗原非存在下で得られたバックグランド値で補正したのち、標準コントロール（既知の高値抗ＤＮＡ抗体を有する活動期ＳＬＥ患者からの１：１０００希釈血清サンプル）に対する相対値として表した。
【００７９】
図７は、ＳＬＥ末梢血単核球における、ＥＧＣＧのＩｇＧ抗ＤＮＡ抗体産生抑制の効果を示すものである。図７から明らかなように、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）により、ＩｇＧ抗ＤＮＡ抗体の産出が抑制される。そのため、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、例えばＳＬＥ疾患の治療に対して非常に有効であることが判明した。
【符号の説明】
【００８０】
１００  支持材
１１０  高分子フィルム
１２０  編布
２００  薬剤層
３００  離型フィルム
９００  貼付薬シート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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