(57)【要約】【課題】エポチロンＢの製造、単離および精製のための改良された方法に関する。【解決手段】本発明は、エポチロンＢの製造のための発酵プロセス、樹脂上への吸着による単離およびその後の精製を含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エポチロンＡまたはＢを製造する微生物の培養方法であって、
エポチロンの製造を促進するよう選択された条件下に培養する微生物の培養物にプロピオン酸、その前駆体、またはそれらの１つの塩を供給し、
プロピオン酸、その前駆体、またはそれらの１つの塩の供給のタイミングと量は、プロピオン酸、その前駆体、またはそれらの１つの塩の不存在下で培養した微生物の培養物により製造されるエポチロンＢのエポチロンＡに対する比と比較して、エポチロンＢのエポチロンＡに対する比が少なくとも２倍の増加を提供するよう選択し；そして
培養物からエポチロンＢを単離することを含む方法。
【請求項２】
プロピオン酸、その前駆体、またはそれらの１つの塩の接触のタイミングと量が、エポチロンＢのエポチロンＡに対する比が少なくとも３倍増加を供給するよう選択する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
接触のタイミングとプロピオン酸、その前駆体、またはそれらの１つの塩の量が、エポチロンＢのエポチロンＡに対する比の少なくとも１．５までの増加を供給するよう選択する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物がSorangium cellulosumの株である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
プロピオン酸、その前駆体、またはそれらの１つの塩を培養物の増殖期の間または後に添加することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ビタミン、ミネラル、炭水化物源、またはアミノ酸源を、それらの供給がない場合に製造されるエポチロンＢの量に比べて、製造されるエポチロンＢの量を増加させる量で培養物に供給する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
一塩基性または二塩基性リン酸の混合物を培養物に供給することを更に含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
エポチロンＢまたはその溶媒和物を、式：
【化１】
2010011873.tif 000040
を有する誘導体１または塩またはそれらの溶媒和物に変換することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
エポチロンＢまたはその溶媒和物を、式：
【化２】
2010011873.tif 000041
を有する誘導体２またはその溶媒和物に変換することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
エポチロンＢまたはその溶媒和物を、式：
【化３】
2010011873.tif 000042
を有する誘導体３またはそれらの溶媒和物に変換することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
エポチロンＢ比較製造条件下で少なくとも５ｍｇのエポチロンＢ／ｇ樹脂を製造するSorangium cellulosumの株。
【請求項１２】
少なくとも１．０のエポチロンＢ／Ａでエポチロンを製造する請求項１１に記載の株。
【請求項１３】
ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３８８０として寄託されたSorangium cellulosumの株。
【請求項１４】
ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３８８１として寄託されたSorangium cellulosumの株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はエポチロンＢの製造、単離、および精製の改良された方法に関する。これらの方法は例えばエポチロンＢの製造のための発酵方法、樹脂への吸着による単離、およびその後の精製を含む
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エポチロンは粘液細菌（Sorangium cellulosum）の発酵により初めて得られた比較的新しい種類のマクロライド化合物である。これらの化合物は最初、それらの抗真菌性のため植物保護剤として研究された。エポチロンは次に動物細胞へのそれらの細胞毒性のため興味が引かれ、その後チューブリン重合剤としてキャラクタライズされた。エポチロンは、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ(登録商標)）に似た微小管安定化剤効果、および腫瘍細胞および他の過度に増殖性の細胞の病気等の休息に増殖する細胞にたいして細胞毒性活性を発揮することが今知られている。化学治療剤としてのエポチロンの使用はBollag,et al., Cancer Research 55,2325,1995に記載されている。
エポチロンＡおよびＢ（それぞれｅｐｏＡまたはｅｐｏＢ）は次の構造を有している。
【化１】
2010011873.tif 000002
エポチロンを得るための１つのスキームは、ＷＯ９３／１０１２１にＨｏｆｌｅ等により明らかにされた。Ｈｏｆｌｅは炭素源、窒素源およびミネラル塩を含む培地中でSorangium cellulosumの株を培養した。吸着剤樹脂はその株の培養の間に添加された。エポチロンは吸着性の樹脂から溶媒で溶出された。様々なエポチロンが逆相クロマトグラフィーにより分離され、結晶化された。しかしながら、Ｈｏｆｌｅ等は、この方法はほんの少量のエポチロンＢを製造すること、および発酵におけるエポチロンＡに対するエポチロンＢの割合は低いことを認めた。エポチロンＡに対するエポチロンＢのこの低い割合は純粋なエポチロンＢの回収を困難にする。しかしがら、エポチロンＡに優ってエポチロンＢを製造する改良された発酵方法、およびエポチロンＢの単離と精製の改良された方法について必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題と課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の概要
本発明はエポチロンＢの製造のための改良された発酵方法に関する。
本発明は更にエポチロンの製造のため突然変異誘発により得られたSorangium cellulosumの新規な株を含む。
本発明は更に発酵に添加物を供給することによりSorangium cellulosumの新規な株により製造されるエポチロンＢのＡに対する比を改良するをも含む。１つの好ましい態様では、添加物はプロピオン酸塩、適当なｐＨ調節をしたプロピオン酸、または他のプロピオン酸前駆体である。
本発明は樹脂を用いる発酵培地からエポチロンＢの単離のための改良された抽出方法をも含む。エポチロンにとんだ樹脂を洗浄して不純物レベルを下げ、下流の処理を改良する方法をも含む。
本発明はエポチロンＢの精製のための改良された方法をも含む。１態様では、精製は結晶化を用いて行われる。他の態様では精製は順相クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー的方法により達成される。さらに他の態様では精製は結晶化並びに順相および逆相クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーによる試料の精製により達成される。更なる態様では樹脂抽出は結晶化のみにより処理される。
エポチロンＢ（「ｅｐｏＢ］）は誘導体１（「Ｄ１」）（米国特許第６２６２０９４号に記載され、本明細書の一部を構成する）の製造における中間体として有用である。その誘導体ではチアゾール環の２−メチルがアミンで置換されている。
【化２】
2010011873.tif 000003
エポチロンＢは誘導体２（「Ｄ２」）の製造にも有用である（エポチロンＢのラクトンの誘導体２のラクタムへの変換はBorzilleri et al., J. Amer. Chem. Soc. 122, 8890 に記載されており、本明細書の一部を構成する）
【化３】
2010011873.tif 000004
更に、エポチロンＢ（「ｅｐｏＢ］）は誘導体３（エポチロンＤ、「Ｄ３」）（米国特許第６３２００４５号に記載され、本明細書の一部を構成する）の製造に有用である
【化４】
2010011873.tif 000005
更に、本発明は本明細書に記載された方法および材料を用いて製造されるエポチロンＢの結晶形をも含む。
前に記載した一般的な記述および次の詳細な記載は例示的であり、限定的でないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ｅｐｏＢ−ＥＡβからの単斜晶系単位格子における分子構造を示し、２分子のエポチロンＢおよび単斜晶系単位格子のゲストチャネルにおける２分子の酢酸エチルを有する。
【図２】ｅｐｏＢ−ＡＮβからの単斜晶系単位格子における分子構造を示し、２分子のエポチロンＢおよび単斜晶系単位格子のゲストチャネルにおける２分子のアセトニトリルを有する。
【図３】ｅｐｏＢ−Ｉｐβからの単斜晶系単位格子における分子構造を示し、２分子のエポチロンＢおよび単斜晶系単位格子のゲストチャネルにおける２分子のイソプロパノールを有する。
【図４】ｅｐｏＢ−Ｔｏβからの単斜晶系単位格子における分子構造を示し、２分子のエポチロンＢおよび単斜晶系単位格子のゲストチャネルにおける２分子のトルエンを有する。
【図５】エポチロンＢの酢酸エチル溶媒和物（ｅｐｏＢ−ＥＡβからの結晶）についての観測された（上）およびシミュレートした（下）ＰＸＤＰパターンを示す。図５において、シミュレートパターンは−３３℃における単斜晶系結晶構造におけるリファインされた原子パラメーターから計算され、観測パターンは＋２３℃で測定された。
【図６】エポチロンＢのトルエン溶媒和物（ｅｐｏＢ−ＴＯβからの結晶）についての観測された（上）およびシミュレートした（下）ＰＸＤＰパターンを示す。図６において、シミュレートパターンは−３３℃における単斜晶系結晶構造におけるリファインされた原子パラメーターから計算され、観測パターンは＋２３℃で測定された。
【図７】エポチロンＢのアセトニトリル溶媒和物（ｅｐｏＢ−ＡＮβからの結晶）についての観測された（上）およびシミュレートした（下）ＰＸＤＰパターンを示す。図７において、シミュレートパターンは−４０℃における単斜晶系結晶構造におけるリファインされた原子パラメーターから計算され、観測されたパターンは＋２３℃で測定された。
【図８】エポチロンＢのイソプロピルアルコール溶媒和物（ｅｐｏＢ−ＩＰβからの結晶）についての観測された（上）およびシミュレートした（下）ＰＸＤＰパターンを示す。図５において、シミュレートパターンは−３℃における単斜晶系結晶構造におけるリファインされた原子パラメーターから計算され、観測されたパターンは＋２３℃で測定された。
【図９】実施例７，工程Ａで記載した方法に従って製造したエポチロンＢのトルエン含有プライマリーグレード溶媒和物についてのＰＸＲＤパターンを示す。
【図１０】実施例９のトルエン含有プライマリーグレード溶媒和物についての熱分析（ＤＳＣおよびＴＧＡ）を示す。
【図１１】実施例７，工程Ｂに記載した方法に従って製造したエポチロンＢのトルエン含有再結晶溶媒和物についての観測されたＰＸＲＤパターンを示す。
【図１２】図１１のトルエン含有再結晶溶媒和物についての熱分析（ＤＳＣおよびＴＧＡ）を示す。
【図１３】実施例７，工程Ｃに記載した方法に従って製造したエポチロンＢの酢酸エチル含有溶媒和物のＰＸＲＤパターンを示す。
【図１４】図１３の酢酸エチル含有溶媒和物の熱分析（ＤＳＣおよびＴＧＡ）を示す。
【図１５】実施例７Ｃに記載方法に従って製造したトルエン含有溶媒和物についての観測された（上）ＰＸＲＰパターンおよび室温でエポチロンＢのトルエン溶媒和物についてのシミュレートした（下）ＰＸＲＰパターンを示す。
【図１６】図１５のトルエン含有溶媒和物についての熱分析（ＤＳＣおよびＴＧＡ）を示す。
【０００５】
発明の詳細な記述
本発明は、特別な方法およびSorangium cellulosumの新規な変異体株に関し、主に発酵の間に製造されるエポチロンＡの割合を減少させることにより、それらは一緒にまたは別々に改良されたエポチロンＢを有する発酵物を製造する。Sorangium cellulosumまたは他の適当な微生物の細胞は、例えば、１以上の最初の増殖段階培養により拡大し、エポチロン製造発酵のための接種物を提供するのに用いられる。例えば２４−７２時間の近辺の、発酵の最初の時間の間、細胞増殖は細胞が培地中の栄養を利用するので生ずる。その後、ビタミン、ミネラル、炭水化物、アミノ酸（またはアミノ酸前駆体のような他の炭素または窒素源）等の栄養をエポチロンの製造に資する量培地に加える。１態様において、ビタミン、ミネラル、炭水化物、アミノ酸等の栄養は発酵の間エポチロンＡまたはエポチロンＢの最大製造を維持する量加える。１態様において、エポチロンＡまたはエポチロンＢの最大製造速度は、添加物または栄養の添加がない場合と比べてより大量のエポチロンＡまたはエポチロンＢが製造される製造割合か、もし添加物または栄養が至適より少ない量加えたなら生じたであろうより大きい製造割合をもたらす。発酵の間、プロピオン酸、その前駆体、またはそれらの塩をエポチロンＡに対するエポチロンＢの割合（生産物比）を増加させるに有効な量加える。
【０００６】
本発明はエポチロンの製造に有用なSorangium cellulosumの新しい株にも関する。これらの新株、特に株ＳＣ１６４０８は突然変異後にランダム選択によるにより得られた。
【０００７】
Sorangium cellulosumは１９８５年南アフリカのザムベシ河の堤防から採取された土壌サンプルから単離された。その生物はＨｏｌｆｅ（上に引用）によりエポチロンの製造について最初に記述された。Ｈｏｌｆｅにより用いられた株はＳｏ  ｃｅ９０と呼ばれ、Deutsche Sammlung von Mokroorganismen(微生物のドイツコレクション、ＤＳＭ)に寄託番号６７７３で寄託された。株Ｓｏ  ｃｅ９０はＵＶ突然変異に続くランダム選択に付され、株Ｓｏ  ｃｅ９０Ｂ２を生じた。株Ｓｏ  ｃｅ９０Ｂ２（ＳＣ１６２２４とも呼ばれる）は、振とうフラスコ（フラスコあたり、例えば１．８W/V％の樹脂を含む）中で、約５０ｍｇ／Lまたは２．８ｍｇ／ｇ樹脂（例えば３．５または４．５ｍｇ／ｇの範囲であり得る）のエポチロンＢ力価、および約０．６のエポチロンＢ／Ａの比を生じた。
【０００８】
本発明において、株Ｓｏ  ｃｅ９０Ｂ２またはその誘導体はニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による突然変異、その後のランダム選択に付され、株ＳＣ１６４０８（ＡＴＣＣ番号Ｎｏ．  ＰＴＡ−３８８０として寄託）、およびＳＣ１６４４９（ＡＴＣＣ番号Ｎｏ．  ＰＴＡ−３８８１として寄託）を生じた。これらの後者の２つの株は、ブタペスト条約に従う特許寄託としてアメリカンタイプコレクションに寄託された。選択方法の詳細は実施例に説明する。
【０００９】
一態様において本発明は、ブロス体積１リッターあたり、少なくとも約１００ｍｇのエポチロンＢを製造する（例えば、下に定義する製造条件下に）Sorangium cellulosum株を提供する。他の態様において、エポチロンＢ比較製造条件下において、ブロス体積１リッターあたり少なくとも８０ｍｇのエポチロンＢおよび少なくとも１の、エポチロンＢのエポチロンＡに対する比を製造する株を提供する。一態様において本発明は、樹脂１ｇあたり５ｍｇのエポチロンＢまたは少なくとも１．０のエポチロンＢ／Ａ比で樹脂１ｇあたり５ｍｇを製造する株を提供する。他の態様において、エポチロンＢ／Ａ比は少なくとも１．５である。更に、他の態様においてエポチロンＢ／Ａ比は１．５−４．０である。
【００１０】
本発明は発酵に添加物を供給することにより、Sorangium cellulosumにより製造されるエポチロンＢのエポチロンＡに対する比を改良する方法に関する。好ましい態様において，添加物は、細胞が９６時間まで増殖した後であるが、好ましくは約２４−４８時間増殖した後添加するプロピオン酸塩を含む。ある好ましい態様では、細胞は約３４時間増殖した後、プロピオン酸塩を加える。ＧＢＦによる初期の研究では、発酵に影響する他の要因の中で、０．１％のレベルにおける培地への一度のプロピオン酸塩添加の影響を調査された。本発明者は、振とうフラスコ、１４Ｌファーメンター、製造ファーメンターにおいて製造されたおよびエポチロン、特にエポチロンＢの力価およびＢ／Ａ比はプロピオン酸塩、即ちプロピオン酸ナトリウムの供給により著しく改良された。プロピオン酸塩、即ちプロピオン酸ナトリウムの供給は、エポチロンＢの力価の顕著な改良をもたらした。例えばエポチロンＢのフラスコ製造は、プロピオン酸ナトリウムの補給により改良され、好ましい範囲は一度供給が開始されると、定期的に（例えば１日あたり）０．０５−０．８０ｍｇ／ｍｌ（０．００５−０．０８％）、より好ましくは０．００５−０．０４％の範囲であった。１態様では、培養中のプロピオン酸塩の量は０．０２％以下を目標にする。更に、限定するものではないが、プロピオン酸メチルエステル、およびプロピオン酸エチルエステルを含プロピオン酸関連化合物もエポチロンＢおよびその後Ｂ／Ａ比を改良することが見出された。
【００１１】
一態様において、特にフラスコ発酵に有用である、１塩基性または２塩基性リン酸塩の混合物を含む更なる供給が添加され、比は適当なｐＨを支持するよう選択する。この供給はプロピオン酸供給に導入するか別に添加する。
【００１２】
本発明において樹脂添加を首尾よく用いる大規模エポチロン精製の方法を記載する。樹脂の包含はエポチロンの単離と精製に有用であり、エポチロンの力価を劇的に改良することが見出された。本発明の１つの好ましい態様において、樹脂は、ＸＡＤ樹脂、好ましくはＸＡＤ−１６またはその均等物（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO または Rohm and Haas Co. Philadelphia, PAからアンバーライトＸＡＤとして利用可能）等のスチレン／ジビニルベンゼンポリマー樹脂である。スチレンをベースにするＸＡＤ−４，ＸＡＤ−１１８０またはＸＡＤ−１６００（Rohm and Haas Co.）等の疎水性表面を有する他のアンバーライト樹脂、そしてまたスチレンをベースにするＸＤ−２０７，ＨＰ２０，ＨＰ２１，ＳＰ８２５，ＳＰ８５０，ＳＰ７００またはＳＰ２０７（これらは付加された臭素基のためより疎水性である）（これらの樹脂はMitsubishi、東京、日本またはMitsubishi Chemical America, Inc., White Plains, NYから)も本発明に有用である。樹脂は、0.2w/v%−5.0 w/v%、好ましくは1.5w/v%−4.0 w/v%等の広い範囲で培地中に導入できる。
【００１３】
発酵からのエポチロンを含む樹脂は場合により水および２０−３０％アセトニトリル水溶液またはメタノール水溶液で洗浄し不純物を除き、または界面活性剤を含む溶液、好ましくはアルキルサルフェートをベースにするイオン性界面活性剤およびある量のアミン（塩基形で溶液に添加）で洗浄する。量は樹脂から後に得られるエポチロンの品質を改良するように選択する。１つの好ましい水性の洗浄は０．５w/v%のドデシル硫酸ナトリウムおよび０．５w/v%のアンモニアを用いる。この最後の態様において、溶媒抽出まえの樹脂は好ましくは１回またはそれ以上水で洗浄する。
【００１４】
発酵からのエポチロンを含む樹脂は好ましくは酢酸エチルまたはメチル−ｔ−ブチルエーテル(MTBE)等の水相と混和しない（相分離）溶媒で抽出し、樹脂中に吸着されたエポチロンを除去する。エポチロンＢを抽出するのに有用でありうるさらなる溶媒はｎ−ブタノール、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチルを含む。豊富な溶媒抽出物は好ましくは濃縮し、エポチロンＢを濃縮物から結晶化させる。１態様において、豊富な溶媒は水で洗浄し、水で洗浄した豊富な溶媒は濃縮し、場合によりポリッシュ濾過する。酢酸エチルのように溶媒が適当な場合は、蒸留的溶媒交換を非溶媒中で行うことによりエポチロンＢを結晶化させる。換言すれば、エポチロンＢが本質的に不溶性の比較的高沸点の第二溶媒をリッチ溶媒に加え、リッチ溶媒を結晶化可能な十分な程度まで留去する。真空を用いて蒸留を促進してもよい。１態様において、溶媒を濃縮して適当な量の非溶媒を加える。有用な非溶媒はトルエン、ヘキサン、およびヘプタンを含む。生じたスラリーを加熱し、設定温度まで冷却し、生ずる結晶の品質を高める。温度振動を用いて結晶純度を改良し、微粉を最小にし、早く濾過するスラリーを製造する。ＭＴＶＥ等いくつかの他の溶媒について、リッチ溶媒の蒸留的除去は冷却すると有効な結晶化環境を生み出す（非溶媒の使用なしに）。生じた結晶は好ましくは濾過し、プライマリーグレードのエポチロンＢを得る。生じた結晶は好ましくは濾過し、プライマリーグレードのエポチロンＢを生ずる。
抽出と最初の結晶化の間にエポチロンＢは最初の抽出物中に存在下するたいていの不純物、特にエポチロンＡから分離される。プライマリーグレードのエポチロンＢは典型的には主な不純物としてエポチロンＡを含む。発酵に由来する２つの他の構造的に類似した不純物、即ち次のオキサゾールアナログおよびエチルチアゾールアナログも典型的には存在する。
【化５】
2010011873.tif 000006
エポチロンＢについて本明細書に記載した、後に適用する精製方法（再結晶およびクロマトグラフィー工程を含む）は、特に、これら２つの化合物をそれらがもはや重要であると考えられないレベルまで除去することを含む。
【００１５】
好ましくは上述のようにして得たプライマリーのグレードのエポチロンＢ（即ち、トルエンを含む結晶形ｅｐｏＢ、プライマリーグレード）は次に酢酸エチル中で加熱し、その後加熱を続けながらトルエンを添加することにより再結晶できる。次にその混合物を冷却し、生じた結晶スラリーを濾過し、ケーキをトルエンで洗浄し、一度再結晶化したエポチロンＢを得る（即ちトルエン含有結晶形ｅｐｏＢ，再結晶）。あるいはプライマリーグレードのエポチロンＢは、実施例に説明するように製造高速逆相クロマトグラフィー工程（例えば、カラム形ＲＰ／Ｃ−１８で）により処理できる。場合により、カラムにエポチロン試料をロードする前に、上記の容積の適当な有機溶媒または有機溶媒の混合物を添加しエポチロンの沈澱を減少させる。一態様において、有機溶媒はジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒である。場合により、トレイリング容積の適当な有機溶媒または有機溶媒の混合物を添加しエポチロンの沈澱を減少させる。エポチロンは次に適当な有機溶媒、有機溶媒の混合物または有機溶媒の水溶液で溶出させる。一態様において、エポチロンはアセトニトリルおよび水の混合物で溶出させる。これらの溶媒を用いる溶出プロフィールは例えば線形またはグラジエントであり得、低い不純物レベルを得るよう選択する。所望の純度のエポチロンＢを含む画分をプールし、濃縮し、限定するものではないが酢酸エチルを含む溶媒で抽出する。リッチ溶媒抽出物を次に濃縮し、例えばｎ−ヘプタンまたはヘプタン類等の低極性溶媒の添加により結晶化させ、場合により冷却する。そのスラリ−を濾過し、溶媒／非溶媒（顕著な量のエポチロンＢを溶解しないように選択した比および量で）、例えば２：１の比で酢酸エチル／ｎ−ヘプタンで洗浄する。洗浄した結晶は乾燥し、高品質のエポチロンＢを得る。
【００１６】
シリカ等の順相またはシリカをベースにする順相でのクロマトグラフィー等の他の精製方法を用いることができる。例えば、高速順相クロマトグラフィーを用いることが出来る。試料はメチレンクロライド等の比較的低い極性の溶媒中でカラムにロードし、エポチロンを酢酸エチルおよびヘプタンの混合物等の高い極性の溶媒中で溶出する。これらの溶媒を用いる溶出プロフィールは例えば線形またはグラジエントであり得、低不純物レベルを得るように選択する。所望の画分をプールし、濃縮し、例えばｎ−ヘプタン、ヘプタン類、またはトルエン等の低極性溶媒の添加により酢酸エチルから結晶化する。そのスラリ−を濾過し、溶媒／非溶媒（顕著な量のエポチロンＢを溶解しないように選択した比および量で）、例えば２：１の比で酢酸エチル／ｎ−ヘプタンまたは酢酸エチル／トルエンで洗浄する。洗浄した結晶は乾燥し、高品質のエポチロンＢを得る。
【００１７】
Ｄ１の合成のようにエチルチアゾールまたはオキサゾールアナログの広範な除去が必要でないある場合には、エポチロンＢは結晶化のみにより精製できる。固体エポチロンＢ材料は例えば暖かい酢酸エチル中に溶解し、常温またはより冷たく冷却することにより結晶化（または再結晶化）し、その後濾過し、乾燥する（例えば真空で）。結晶化を２，３度繰り返し、所望の純度を得る。
【００１８】
エポチロンを製造する微生物の増殖培地は、例えば以下のように処方できる：
【表１】
2010011873.tif 000007
【００１９】
エポチロン製造微生物の増殖のための、およびエポチロンの製造のための、特に振とうフラスコの中での、製造培地は例えば以上のように処方し、グリセロールおよび次の樹脂の添加に関し次の相違がある。
【表２】
2010011873.tif 000008
【００２０】
有用な栄養供給溶液、特に振とうフラスコにおける使用のためのは、以下のものを含む。
【表３】
2010011873.tif 000009
【００２１】
そのような栄養供給は以下のように２塩基性リン酸ナトリウムおよびリン酸塩一ナトリウムの混合物を更に含みうる。
【表４】
2010011873.tif 000010
リン酸２ナトリウムとリン酸１ナトリウムの比は、供給の添加により所望のｐＨからの培養のｐＨ移動を最小にするよう選択する。
【００２２】
ファーメンター中での使用のために、上に記載した栄養成分は、除くことが好ましいＨＥＰＳの例外があるが、抗泡剤（例えば、Dow Corming, AF Emulsion, Food Grade）と共に以下のように好ましくは用いられる。
【表５】
2010011873.tif 000011
【００２３】
カセイ（ナトリウムまたは水酸化ナトリウム溶液）は必要に応じて培地に添加し有用なｐＨ範囲を維持できる、樹脂は次のように添加できる。
【表６】
2010011873.tif 000012
【００２４】
生産発酵においては、プロピオン酸塩および栄養物を必要に応じて別に好ましくは添加する。プロピオン酸塩供給は、例えば、８０−１５０ｇ／Ｌプロピオン酸ナトリウムであり、その量は、０．０５−０．２０ｍｇ／ｍＬのプロピオン酸塩レベル（例えば、ＨＰＬＣにより測定して）維持するよう好ましくは添加する。プロピオン酸塩添加は種培養物をファーメンターに添加した後２０−４０時間に開始しうる。栄養物は例えば滅菌したフィダーストックとともに次の様に補充する
【表７】
2010011873.tif 000013
【００２５】
より長期の発酵のために更なる栄養物を好ましくは例えば以下の滅菌したフィダーストック（前のフィダーストックに比べより大量添加する）から添加する。
【表８】
2010011873.tif 000014
上記２つの供給のこれらの栄養物は増殖期を開始することを避けるように選択しうる。
【００２６】
本発明はエポチロンＢの製造方法を含み、エポチロンＢ（「ｅｐｏＢ」）を米国特許第６２６２０９４号に記載のように誘導体１（「Ｄ１」）に変換する。同特許は本明細書の一部を構成するする。誘導体１は以下の式を有する。
【化６】
2010011873.tif 000015
【００２７】
本発明はエポチロンＢの製造方法を含み、エポチロンＢを誘導体２（「Ｄ２」）に変換する（Borzillevi, et al., J. Am. Chem. Soc., 122, 8990, 2000 および WO 99/02514 に記載されている）。これらは本明細書の一部を構成するする。誘導体２は以下の式を有する。
【化７】
2010011873.tif 000016
【００２８】
本発明はエポチロンＢの製造方法を含み、エポチロンＢ（「ｅｐｏＢ」）を米国特許第６３２００４５号に記載のように誘導体３（「Ｄ３」）に変換する。同特許は本明細書の一部を構成するする。誘導体１は以下の式を有する。
【化８】
2010011873.tif 000017
【００２９】
エポチロンＢの結晶形
出願人は本明細書に記載の発明的方法および材料を用いて様々なエポチロンＢの結晶形を作った。エポチロンＢ結晶は様々な溶媒および溶媒システムを用いて得られた。例えば出願人はトルエンを含有するエポチロンＢ溶媒和結晶形を発見した。これをｅｐｏＢ−Ｔｏβと名付け、単位格子データを表１に示す。エポチロンＢのトルエンを含有する溶媒和結晶形をさらに図９−１２および図１５および１６に説明する。出願人は更にアセトニトリル（即ち、ｅｐｏＢ−ＡＮβ）、酢酸エチル（即ち、ｅｐｏＢ−ＥＡβ）およびイソプロピルアルコール（即ち、ｅｐｏＢ−ＩＰβ）、そしてまた実施例に記載した溶媒システムも用いてエポチロンＢ結晶をも得た。これらの結晶学的に同型構造の形は結晶のｂ軸にそって延びる親油性溶媒チャネルを含む（１チャネル／単位格子）Ｐ２１スペース群を有する単斜晶系の包接構造を有する。各チャネルは、トルエン、アセトニトリル、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、またはＭＴＢＥ（理想的にはエポチロンＢの１：１溶媒和物を生ずる）等の２までの溶媒分子を含み得る。トルエン／酢酸エチル溶媒混合物、例えば１：１混合物）からの結晶化は包接チャネル中にトルエンの優先的な導入を生ずる（即ちｅｐｏＢ−ＥＡβではなく、ｅｐｏＢ−Ｔｏβを得る）。エポチロンＢの両方の水素結合ドナー（ヒドロキシル）はエポチロン間水素結合に関与し、ゲスト溶媒に結合し束縛するのに利用されない。
【００３０】
ｅｐｏＢ−ＡＮβ、ｅｐｏＢ−ＥＡβ、ｅｐｏＢ−ＩＰβ、およびｅｐｏＢ−ＴＯβ形は表１に示す単位格子データを示す。トルエン、アセトニトリル、酢酸エチルおよびイソプロパノールを含むこれらの結晶形を得るための結晶化条件は以下の実施例に示す。実施例７に記載した方法を用いて製造した結晶についてのＲＸＰＤパターンは以下に記載した図９，１１，および１３で説明する。
【００３１】
これらの結晶形についての表にした具体的な例示的パラメーターは以下のようであり、表１に示す。
【表９】
2010011873.tif 000018
【００３２】
ｅｐｏＢ−ＡＮβ、ｅｐｏＢ−ＥＡβ、ｅｐｏＢ−ＩＰβおよびｅｐｏＢ−ＴＯβの原子座標は表２，３，４および５にそれぞれ示す。図９，１１および１３に記載したＰＸＲＤパターンは、表６，７，および８にリストされたデータにより特徴づけられる。
【表１０】
2010011873.tif 000019
【表１１】
2010011873.tif 000020
【表１２】
2010011873.tif 000021
【表１３】
2010011873.tif 000022
【表１４】
2010011873.tif 000023
【表１５】
2010011873.tif 000024
【表１６】
2010011873.tif 000025
【表１７】
2010011873.tif 000026
【００３３】
定義
以下の用語は本願の目的のために以下に説明するそれぞれの意味を有する。
【００３４】
「エポチロンＢ比較製造条件」。エポチロンＢのエポチロンＡに対する製造比、または株間の正味のエポチロンＢ製造を測定するために、標準条件が必要である。「エポチロンＢ比較製造条件」は下に説明する。標準条件は実施例に記載するように適当にスケールされ得る（例えば、実施例２による１２５ｍＬ製造フラスコ）。
【００３５】
１）Ｆ１段階
凍結バイアルまたは維持フラスコからの１ｍＬを約１０ｍＬの培地Ｅ（成分は以下に記載）を含む１２５ｍＬのフルオロに移す。Ｆ１フラスコは３−４日、３０℃および１６０ｒｐｍでインキュベートする。
【００３６】
２）Ｆ２段階
Ｆ１フラスコ（約１０ｍＬ）からの全内容を９０ｍＬの培地Ｅを含む２５０ｍＬのフラスコに移す（１０％）。このＦ２フラスコは同様に３−４日、３０℃および１６０ｒｐｍでインキュベートする。
【００３７】
３）製造段階
製造フラスコ（９０ｍＬの培地Ｅを含む２５０ｍＬフラスコ）をＦ２段階からの１０％レベル（１０ｍＬ）でインキュベートする。或いは、「維持フラスコ」を用いてもよく、これらは５％−１０％の範囲のレベルで３−４日毎に培養物のルーチンなフラスコ移転に由来する。その製造相は少なくとも１５ｇ／Ｌの樹脂を導入する。接種すると、製造フラスコ３０℃および１６０ｒｐｍで１４日間インキュベートする。供給をエポチロンＢのＡに対する比を改良するため導入する。供給添加は以下のように接種後７２時間で開始する。
【００３８】
１ｍＬの供給を３−１１日に１日あたり製造フラスコに加え（１００ｍＬ培養容量）、添加物も示した場合１４の間続ける。
【００３９】
プロピオン酸塩含有供給物は１０％のMartrin-M040、４％のプロピオン酸ナトリウムおよび３％のTastone-154を含み、１００倍希釈で記載したように添加した場合、１日あたり、培養ブロス中の最終濃度は、０．１％のMartrin-M040、０．０４％のプロピオン酸ナトリウムおよび０．０３％のTastone-154となる（前の添加からの残存レベルを除く）。フラスコは接種後１４日に試験のため収穫する。
【００４０】
「プロピオン酸前駆体」は、エポチロンＢのエポチロンＡに対する比を増加させるに有効なプロピオン酸を生成するのに有効な量で適当な培養に加え得るいずれかの化合物をいう。プロピオン酸は細胞酵素の作用により例えば不安定なエステルで自発的に生成する。当業者はプロピオン酸を生成すための、またはエポチロンＢのエポチロンＡに対する比を増加させるために容易に試験できる候補化合物を認識するであろう。例としては、プロピオン酸のメチルおよびエチルエステルを含む。
【００４１】
「供給」とは、プロピオン酸塩、プロピオン酸ナトリウム、混合物または溶液を含むプロピオン酸ナトリウム、ビタミン、ミネラル、炭水化物源、またはアミノ酸源等の少なくとも１またはそれ以上の栄養物または添加物を１回以上、発酵の課程の間に、例えば周期的に、パルス供給で、実質的に連続供給等で添加することを言う。発酵の間の連続的供給は「１回以上の添加」という用語の意味の範囲内にふくまれる。
「トルエン含有」とは、当業者により用いられる分析技術により測定したトルエンのある量を主に含む溶媒和物をいい、トルエン含有溶媒和は１以上の他の溶媒を含んでもよく、含まなくてもよい。
【００４２】
「酢酸エチル含有」とは当業者により用いられる分析技術により測定した酢酸エチルのある量を主に含む溶媒和物をいい、酢酸エチル含有溶媒和は１以上の他の溶媒を含んでもよく、含まなくてもよい。
【実施例】
【００４３】
実施例
以下の実施例は外に詳細に記載した場合を除き当業者によく知られ、ルーチンである標準的な技術により実施される。
【００４４】
実施例１
細胞バンクの突然変異および選択および製造による株ＳＣ１６４０８の製造
株ＳＣ１６４０８は、株Ｓｏ  ｃｅ９０Ｂ２（ＳＣ１６２２４）のニトロソグアジニン（ＮＴＧ）処理、その後のランダム選択に由来した。従ってＳＣ１６２２４を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に懸濁し、６０分間ｐＨ８．２で１ｍｇ／ｍＬ  ＮＴＧに付した。ＮＴＧでの処理後、コロニー細胞ラインをコロニー選択により得、エポチロンＢ生産性およびＢ／Ａ比について試験した。単離したコロニーはフラスコに移し、８−１４日培養し、その後増殖培地（培地Ｅ）に３−４日毎に移した。
【００４５】
振とうフラスコ用の増殖培地Ｅは
【表１８】
2010011873.tif 000027
上の成分を蒸留水に加え、ｐＨを１０％ＮａＯＨ（またはＫＯＨ）でｐＨ７．２に調節し、３０分間１２１℃で滅菌した。
【００４６】
リサーチ細胞バンクの調製：株ＳＣ１６４０８の３日培養物からの１０ｍＬの容積を培地Ｅ９０ｍＬを含む２５０ｍＬにフラスコ移した。そのフラスコを３０℃、１６０ｒｐｍで２日間次に培養した。２日の終わりに、１．８ｍＬのアリコートをフラスコから取り出し、極低温のバイアルに移し、次に−７０℃でフリーザー中に貯蔵した。
【００４７】
マスター細胞バンクの調製：リサーチ細胞バンクからの２バイアルを解凍し、１０ｍＬの培地Ｅを含む２ｘ１２５ｍＬのフラスコに移し、次に３０℃、１６０ｒｐｍで４−５日間インキュベートした。次に、２ｘ１０ｍｌを９０ｍｌＬの培地Ｅを含む２ｘ２５０ｍＬのフラスコに移し、３０℃、１６０ｒｐｍで２−４日間インキュベートした。最後にこれら２つのフラスコをプールし、１．８ｍｌのアリコートを極低温のバイアルに移し、次に−７０℃でフリーザー中に貯蔵した。
【００４８】
ワーキング細胞バンクの調製：マスター細胞バンクからの５バイアルを解凍し、１０ｍＬの培地Ｅを含む５ｘ１２５ｍＬのフラスコに移し、３０℃、１６０ｒｐｍで３−６日間次に培養した。次に、５ｘ１０ｍＬを９０ｍＬの培地Ｅを含む５ｘ２５０ｍＬフラスコに移し、３０℃、１６０ｒｐｍで２−４日間培養した。これら５つのフラスコ中の細胞を用いて、９０ｍＬの培地Ｅを含む１２ｘ２５０ｍＬフラスコに接種し、再度３０℃、１６０ｒｐｍで２−４日間インキュベートした。最後にこれらのフラスコを一緒にプールし、１．８ｍＬのアリコートを極低温バイアルに移し、−７０℃でフリーザー中に貯えた。約５００−６００バイアルをこのワ−キング細胞バンクのために作った。
【００４９】
実施例２
振とうフラスコ発酵によるエポチロンＢを製造するための培養
凍結バイアル（１．５ｍＬ）からの細胞を１２５ｍｌフラスコ中の４５ｍＬの培地Ｅに接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで４−８日間増殖させた（Ｆ１段階）。次に、５ｍＬのＦ１段階を、４５ｍＬの培地を含む新しい１２５ｍＬフラスコに移し、３−４日間増殖させた（Ｆ２段階）。Ｆ２段階細胞を次にエポチロンＢ発酵のための接種として用いた。１０％の接種（５．０ｍＬ）を４５ｍＬの製造培地を含む１２５ｍＬフラスコに移した。次にフラスコを３０℃で２週間シェーカー（１６０ｒｐｍ）中でインキュベートした。製造培地は改変した培地Ｅであり、１．６％（０．８ｇ）のＸＡＤ−１６樹脂を含む。振とうフラスコのための製造培地の組成を示す。
【表１９】
2010011873.tif 000028
上の成分を蒸留水に溶解し、ｐＨを１０％ＮａＯＨ（またはＫＯＨ）で７．２に調節し、３０分間１２１℃で滅菌する
【００５０】
振とうフラスコエポチロンＢ発酵のための供給溶液の組成は、４％プロピオン酸ナトリウム、１０％Ｍａｌｔｒｉｎ−Ｍ０４０および３％Ｔａｓｔｏｎｅ−１５４である。供給（２５０ｍＬフラスコ中の１００ｍＬ）をＮａＯＨでｐＨ６．８−７．０に調節し、３０分間１２１℃で滅菌する。接種後３−１４日に０．５ｍｌの供給溶液を各発酵フラスコに添加する。或いは、匹敵する結果が供給レベルを２倍にし、３，５，７および１０日に添加を行うことによって、達成されうることが見出された。改良された結果が、１．５％の２塩基性リン酸ナトリウムおよび０．５％１塩基性リン酸ナトリウムの形でリン酸塩を上記供給溶液に更に補い、培地中へ１００倍希釈された場合、以前の添加からの残存レベルを除いて、最終レベルがそれぞれ０．０１５％および０．００５％となるようにすることによって達成しうる。リン酸塩添加の更なる利点は、ｐＨ調節を行う必要がないということである。１０−２０％という高い更なる収率改良がリン酸塩補給により達成しうる。
【００５１】
エポチロンの試験のために、樹脂試料（０．８ｇ）を収穫し、ＨＰＬＣにより試験した。振とうフラスコによるエポチロン製造は、１４日に次の力価を与える。
エポチロンＡ：５．０−７．０ｍｇ／ｇ樹脂
エポチロンＢ：８．０−１２．０ｍｇ／ｇ樹脂
Ｂ／Ａ比    ：１．１−２．０
以前の株に比べ、ＳＣ１６４０８培養は振とうフラスコでより多いエポチロンＢを生ずる。
【００５２】
実施例３
１４Ｌファーメンターにおけるエポチロンを製造する培養                        
Ｆ１段階：２つの凍結バイアルからの３．０ｍＬのアリコートを２５０ｍＬフラスコ中の９０ｍＬの培地Ｅに接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで４−８日間増殖させる。
Ｆ２段階：２０ｍＬ（１０％）のＦ１段階細胞を５００ｍＬのフラスコ中の１８０ｍＬの培地Ｅに移し、３０℃、１６０ｒｐｍで２−４日間増殖させる。
Ｆ３段階：接種量を増加させるためにＦ２段階を繰り返す。各１８０ｍＬの培地Ｅを含む６−８ｘ５００ｍＬフラスコにＦ２段階からの２０ｍｌの接種物を移し、３０℃、１６０ｒｐｍで２−４日間増殖させる。
Ｆ４段階：４Ｌのアスピレーターボトル中に１０８０ｍＬの培地ＥにＦ３段階からの１２０ｍＬ（１０％）を移し、次に３０℃、１６０ｒｐｍで２−４日間増殖させる。  
【００５３】
培地Ｅを用いて１４Ｌファーメンターのための接種物を作る。振とうフラスコおよびアスピレーターボトル段階についてのオートクレーブ時間はそれぞれ３０および６０分である。ファーメンターのために製造培地を６０分１２１℃で滅菌した。１４Ｌファーメンター製造培地は、改変した振とうフラスコ製造培地（上述）であり、ＨＥＰＥＳが除かれて、２．５ｇ／Ｌの泡防止剤（Antifoam AF, Dow Corming）を添加した。６Ｌの製造培地（ｐＨを７．２−７．４に調節）を１４Ｌのファーメンターに入れ、滅菌した。以下の表は１４Ｌのファーメンタースケールにおける製造パラメーターを要約する。ベンチトップ製造パラメーター
【表２０】
2010011873.tif 000029
【表２１】
2010011873.tif 000030
１４ＬのファーメンターにおけるエポチロンＢの力価範囲を以下に要約する
エポチロンＢ力価（ｍｇ／ｍＬ樹脂）            Ｂ／Ａ比
５−１２                            １．０−３．０
【００５４】
実施例４
エポチロンの製造プロセス
５０Ｌのファーメンター接種段階
Ｆ１段階として、培地Ｅ（２Ｌ）を作り、９０ｍＬを１７の別の２５０ｍＬフラスコに分配する。次にフラスコを１２１℃で３０分間オートクレーブすること、により滅菌する。一つの凍結したバイアルからの細胞を各フラスコに接種し、約３０℃１６０ｒｐｍで４−８日間増殖させる。
【００５５】
Ｆ２段階として、２７Ｌの培地Ｅを作り、１．５Ｌを１７の別の４Ｌフラスコに分配し、上記のように滅菌した。各４ＬフラスコはＦ１段階からのフラスコの全内容物を接種し、約３０℃で１６０ｒｐｍで、２−４日間次に増殖させる。
【００５６】
Ｆ３段階として、８０Ｌの培地Ｅ＊を作り、２つの５０Ｌステンレススチール接種ファーメンターに分け、各５０Ｌのファーメンターに、Ｆ２段階からの３つの４Ｌフラスコの内容を接種した。その５０Ｌファーメンターを２−４日間、３０−３３℃で増殖させ、次に一緒にして８００Ｌファーメンターに接種するために用いた。
培地Ｅ＊は、
【表２２】
2010011873.tif 000031
【００５７】
８００Ｌファーメンター接種段階：
接種物を８００Ｌアウテンレススチールファーメンターで、細胞の質量が次の接種段階（５０００Lファーメンター）を接種するに十分となるまで増殖させた。バッチのための
【００５８】
バッチのための培地E＊を脱イオン水中で作り（４００L）、混合物（ｐH８．７−８．９）を１７ｐｓｉｇ、１２４℃で６０分間滅菌した。培地を滅菌器から８００Lファーメンターに移し、ｐHを７．１−７．３に調節する。次にファーメンターにF3段階かの８０Lを接種する。バッチを次のコントロールセットポイントで操作した。
【表２３】
2010011873.tif 000032
必要に応じ苛性（水酸化ナトリウムまたはカリウム溶液）を滅菌した供給器から添加しｐＨを７．１−７．３に保つ。そのバッチを間隔をおいてサンプリングし、滅菌性、ｐＨ、沈殿物、グルコース濃度について分析した。ベントオフＣＯ２およびＯ２をモニターする。約４８−６０時間に、グルコース濃度が落ち始めた時、８００Lファーメンターの内容物（約４４０−４８０L）を５０００Lファーメンターに移す。
【００５９】
５０００Lファーメンター接種段階：
５０００Lステンレススチールファーメンターをこの段階で接種工程で用いる。接種物をファーメンターで、細胞の質量が４００００L製造ファーメンターを接種するに十分となるまで増殖させた。
【００６０】
上のようにして作った（脱イオン水２６００L中で）培地E＊を５０００Lファーメンターに移し、８００Lファーメンターからの接種物約４４０−４８０Lを接種する。そのバッチをコントロールセットポイントで操作し、上記をモニターした。再び、ｐＨを７．１−７．３の範囲に維持した。４８−７２時間に、グルコース濃度が落ち始めた時、５０００Lファーメンターの内容物を４００００Lファーメンターに移す。
【００６１】
４００００Ｌファーメンター製造段階：
４００００Ｌステンレススチールファーメンターをエポチロンの製造に用いる。ファーメンターを滅菌し、滅菌した培地を満たしたとき、５０００Lファーメンターで製造した種を接種する。具体的な製造パラメーターが達成された時、製造ファーメンターの内容を収穫する。
【００６２】
製造ファーメンターの培地を２部分で滅菌する。樹脂を２８００Lの水中に添加し、混合物を１７ｐｓｉｇ、１２４℃で７５分間滅菌する。
【表２４】
2010011873.tif 000033
【００６３】
１８０００Ｌの培地を作るために、次の成分を脱イオン水（１５０００Ｌ）に加え、ｐＨを７．１−７．３に調節する。培地を連続滅菌器で１５０℃で滅菌する（保持時間１００秒、出口温度６０℃）
【表２５】
2010011873.tif 000034
【００６４】
培地および樹脂を製造ファーメンターに移し、次に５０００Lファーメンターからの接種物約３１００Lを接種する。空気流速が０．２−０．４ｖｖｍであることを除いてバッチを上記のコントロールセットポイントで操作する。必要に応じ、ｐＨを苛性で上げる（０−８０時間）。８０時間後、ｐＨを硫酸で下げる。必要に応じ、泡立ちを泡防止剤で調節する。ファーメンターは滅菌性、ｐＨ、沈殿物、グルコース、プロピオン酸塩、エポチロンＢ濃度のために少なくとも１日１度サンプリングする。排出ガス中のＣＯ２をモニターし、記録する。ＣＯ２が少なくとも０．３％であるかぎり約３０−６０時間に供給を開始する。
【００６５】
ファーメンターにプロピオン酸ナトリウム（１０２ｇ／Ｌ）を１．９Ｌ／シヨット（範囲１．５−３．０）のシヨットサイズで供給する。シヨット間の間隔は６０分で開始し、最小１２分まで１２時間毎に減少させる。プロピオン酸塩は２８００Ｌの脱イオン水に加え、溶液を１７ｐｓｉｇ、１２４℃で７５分間滅菌する。好ましい態様では、プロピオン酸ナトリウム供給は他の培地成分を含む供給とは別にする。
【００６６】
ファーメンターにMaltrin−M040およびTastone-154を１４．５Lのシヨットサイズで供給する。シヨット間の間隔は６０分で開始し、１０４時間で４０分に変化させる。その成分を脱イオン水（３０００L)に加え、溶液を１７ｐｓｉｇ、１２４℃で７５分間滅菌する。その供給物は
【表２６】
2010011873.tif 000035
よりなる。
【００６７】
操作の間、粉末スキムミルク、Ｍａｌｔｒｉｎ−Ｍ０４０，およびグリセロール等の培地成分のあるものは使い尽くされる。約１１５時間で出発し、前の供給を中止し、１４．５Ｌのシヨットサイズの次の混合物を４０分間隔で製造ファーメンターに添加する。成分を脱イオン水（３０００Ｌ）に加え、混合物ｐＨ８．７−８．９を１７ｐｓｉｇ、１２４℃で７５分間滅菌する。
【表２７】
2010011873.tif 000036
所望のエポチロンＢ濃度が達成された場合（通常９−２１日後）、容器の内容物を収穫する。エポチロンＢ力価は約５−２４ｍｇ／ｇ樹脂の範囲であり、Ｂ／Ａ比は約１．５−４である。
【００６８】
実施例５
MTBEによるXAD−１６樹脂からのエポチロンＢの抽出および固体エポチロンＢを与える結晶化：逆相クロマトグラフィーによる精製；および高品質エポチロンＢの最終単離
収穫し、水洗した、エポチロン（約５．０３ｋｇのエポチロンＢ）を含むＸＡＤ−１６樹脂（約５５０ｋｇ）をメタノール水溶液と混合し、抽出カラムにスラリーとしてロードした。パックされた樹脂をメタノール水溶液（３０％次に５０％のメタノールの各１ベッド容積）で洗浄し高度に極性の不要の物質を除去した。エポチロンはＭＴＢＥ洗浄（約４ベッド容積）により除去した。豊富な溶出液を集め、ポリッシュ濾過する。水相を除去するための重力沈降の後、豊富なＭＴＢＥを濃縮する。濃縮物を重力沈降し水層を除去し、更なるＭＴＢＥ（２ベッド容積）をバッチに加える。そのバッチを約５−１５ｇエポチロンＢ／Ｌの濃度まで再濃縮する。バッチを５−６時間かけて約０℃に徐々に冷却することにより結晶化させる。結晶性の固体を濾過し、洗浄し、乾燥する。生じた生成物ケーキは暖かい酢酸エチルに溶解し、ポリッシュ濾過する。豊富な濾液を２０−４５ｇエポチロンＢ／Ｌの濃度まで真空下に濃縮する。７０℃まで加熱後、バッチを次に０℃までゆっくり冷却し、結晶性スラリーを得、それを濾過し、冷酢酸エチルで洗浄し、４０℃以下で乾燥し、単離された再結晶されたエポチロンＢを得る（樹脂から８４％の収率で）。この洗浄を逆相クロマトグラフィーにより次に精製する。
【００６９】
逆相静止サポートＲＰ／Ｃ−１８を充填したクロマトグラフィーカラム（１１ｃｍ直径ｘ４０ｃｍベッド長）をアセトニトリル水溶液（３０−５０％ｖ／ｖ）で平衡化させた。再結晶化生成物をジメチルスルホオキシドに溶解し（ＤＭＳＯ，１−１．５Ｌ／ｋｇ）、混合物を濾過し不溶性の物質を除去し、次に、１００％ＤＭＳＯのアリコートにより先立たれ、等量のＤＭＳＯにより追跡され、水性の移動相の導入により試料の沈澱を減少させる、カラムにロードした。試料はアセトニトリル水溶液（３０−５０％ｖ／ｖ）を用いてカラムから溶出させ、溶出液をＵＶ検知器により２９０ｎｍでモニターする。エポチロンＢ生成物ピークは多くの画分で集められた。その画分をエポチロンＡおよびＢ並びに他の関連する不純物についてＨＰＬＣにより試験する。
【００７０】
所望のプールしたカラム画分を蒸留容器に入れ、バッチを真空濃縮し、４０℃以下でアセトニトリルを除去する。生じた水相を酢酸エチルで３回まで抽出し、有機溶液を４０℃以下の温度で真空下に濃縮し、エポチロンＢの０．１−０．２ｇ／ｍＬの濃度を得た。ん−ヘプタン（またはヘプタン類）を４０℃でバッチに添加し、次にバッチを２――１０℃ゆっくり冷却し、少なくとも２時間保持する。結晶性スラリーを濾過し、酢酸エチル／ｎ−ヘプタン溶液で洗浄し、次に最終のエポチロンＢケーキを真空下に３５−４０℃で乾燥し、３．０９ｋｇのエポチロンＢ活性に等量の９１．７％力価を有する３．３６７ｋｇを得た。樹脂からの収率は６１．４％であった。ＨＰＬＣは９９．６面積％のエポチロンＢ、０．４面積％のエポチロンＡであり、＞０．１面積％存在する他の不純物はなかった。
【００７１】
実施例６
酢酸エチルによるＸＡＤ−１６樹脂からのエポチロンＢの抽出および非溶媒としてトルエンを用いて結晶化して固体のエポチロンＢを得ること；逆相クロマトグラフィーによる精製；高品質エポチロンＢの最終単離
エポチロンＢを含むＸＡＤ−１６樹脂を振動するスクリーン（ＳＷＥＣＯ  ＴＭ）上で水により洗浄し、樹脂をきれいにした。この一部分（１５．６ｇのエポチロンＢを含む約６．６Ｌ、１ｇの樹脂あたり２．３６ｍｇのエポチロンＢ）を、水で樹脂を濯ぐため約５Ｌの水を用いて２０Ｌの容器に移す。酢酸エチル（投入樹脂の約２ベッド容積（ＢＶ））を次に容器に添加する。そのスラリーを約１時間攪拌し、６００ｍＬのスクリューキャップ遠心分離ジャーを用いて、３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、相を分離する。最初の豊富な酢酸エチル上澄をデカントし、その容積を測定する。次に中身のない水性樹脂を含む底相を容器にプールし、酢酸エチル（２ＢＶ）を容器に加える。スラリーを約１時間攪拌し、次に遠心分離し相分離させる。第二の豊富な酢酸エチル上澄をデカントし、その体積を測定する。
【００７２】
水（投入樹脂の約０．３ＢＶ）を一緒にした豊富な第一および第二酢酸エチルの流れに次に添加し、約５分間攪拌する。層を約３０分間沈降させる。次に、下の水相を上の豊富な酢酸エチル相から分離する。その豊富な洗浄した酢酸エチル相を４５℃以下の温度でリッターあたり約１０ｇのエポチロンＢ活性の濃度まで濃縮する。濃縮した豊富な酢酸エチル溶液を次にポリッシュ濾過し、エポチロンＢの２０−２５ｇ／Ｌまで濃縮する。
【００７３】
濃縮後、トルエンを添加し、バッチを５０℃以下で真空下にバッチの容積まで再濃縮し、トルエンを添加する。バッチを約１時間にわたって約１８℃まで冷却し、次にこの温度で約１６時間攪拌し、生成物結晶を得る。次に結晶化バッチを濾過し、トルエン（約０．２ＢＶ）で洗浄し、固体を乾燥させて１３．５ｇのエポチロンＢ活性をフラスコ約３０．４ｇの固体を得る。出発樹脂からの活性収率は８７％である。
【００７４】
逆相クロマトグラフィーによる精製は、上の方法を用いて樹脂から抽出された固体のエポチロンＢについて行う。カラム（Phenomenex Luna, 15, C18(2), 5.0cmx25cm, column BV 400mL)を３ＢＶの４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル−水で前もって平衡化させる。約４−６ｇの固体のエポチロンＢを約６ｍＬのＤＭＳＯへ約４０℃で溶解し、次に混合物を濾紙で濾過し、微粒子を除く。約１．５ｍＬのＤＭＳＯを試料ループに注入し、チューブ中のエポチロンの沈澱を防ぐ。エポチロンに富む濾液を次に試料ループに注入する。注入の後、エポチロン濾液容器を約０．５ｍＬのＤＭＳＯで洗浄し、約１ｍＬのＤＭＳＯと共に試料ループに注入する。エポチロン試料の注入後のＤＭＳＯ注入はチューブ中の沈澱を防ぐ。試料ループの内容を約５ｍＬ／分の流速でカラムに充填する。
【００７５】
エポチロンをカラムにロードした後、４０％アセトニトリル−水溶液を次にポンプでカラムを通す。３−４分後、流速を約６０ｍＬ／分まで増加させる。エポチロンＡおよびＢのピークを画分に集める。豊富なエポチロンＢを含む画分を約２．５−３．２５Ｌ溶出容積の間のカットで得る（エポチロンＢのピークは約６および８ベッド容積の間に典型的には溶出する）。プールした画分の容積は約０．７５Ｌである。エポチロンＢについてのピークがベースラインにほとんど達した後（ピーク高さの＜１０％）、アセトニトリルをポンプでカラムを通す。クロマトグラムが２９０ｎｍにおける吸収が本質的にベースラインにもどったことを示したとき、カラムの再平衡化を、４０％アセトニトリル−水溶液液をポンプでカラムを通すことにより次の試験のために開始する。典型的には、１００％アセトニトリルの２ＢＶおよび３ＢＶの４０％アセトニトリルを用いてカラムを洗浄し、再平衡化した。
【００７６】
画分を試験して、ＨＰＬＣ分析を用いて純度を測定し、所望の画分をプールした。典型的な収率は９０−９８％である。
【００７７】
プールしたエポチロンＢ画分を４０℃以下で真空下に最初の容積の約５０％まで濃縮する。濃縮した画分は酢酸エチルで抽出する。プールした酢酸エチル抽出物を、約０．１ｇ／ｍＬエポチロンＢまで約４０℃のバス温度で濃縮する。攪拌しながら、ｎ−ヘプタン（ヘプタン）（酢酸エチル溶液の５０％の容積を用いて）を約１５分の期間にわたって添加する。抽出物を５℃に冷却し、少なくとも２時間その温度に保つ。生成物結晶を濾過し、１：２（ｖ：ｖ）ｎ−ヘプタン：酢酸エチル溶液で洗浄する。最後に結晶を約４０℃で約１２時間真空下に乾燥する。様々なバッチについてＨＰＬＣは９９．５−９９．７面積％エポチロンＢおよび０．３−０．５面積％エポチロンＡを示した。
【００７８】
実施例７
酢酸エチルによるＸＡＤ−１６からのエポチロンＢの抽出および非溶媒としてのトルエンによる結晶化に続くプライマリーグレードエポチロンＢを与える再結晶化；順相クロマトグラフィーによる精製；および高品質エポチロンＢの最終単離
工程Ａ．ＥｔＯＡｃ抽出−トルエン結晶化を用いるプライマリーグレードエポチロンＢの製造
水で洗ったエポチロンＢの豊富な樹脂（１３５０ｇ）をカラムに充填した。水（２７００ｍＬ）を用いてカラムに充填し濯いだ。エポチロン活性は９４５０ｍＬ（７ベッド容積）の酢酸エチルを通すことのより溶出させた。酢酸エチル溶出液を少なくとも１時間沈降させた。暗褐色の水層およびエマルジョン層を除去した。豊富な酢酸エチル溶液を約２０ｇのエポチロンＢ／Ｌの標的濃度まで真空下に濃縮する。濃縮物を２時間放置し、２０℃まで冷却した。冷却した濃縮物はポリッシュ濾過し、フィルターを酢酸エチル（３６ｍＬ）で洗浄した。一緒にした濾液および洗浄を約８０ｇのエポチロンＢ／Ｌまで濃縮する。等容量のトルエンを攪拌しながら１０−１５分にわたって添加し、温度を６０℃以上に保った。温度を６５℃で３０分間保ち、次に１．５時間にわたって４０℃に下げ、次に２時間にわたって１℃に温度を下げた。生じた結晶性スラリーは少なくとも６０分の間１℃で攪拌する。その固体を濾別し、トルエン（スラリー容量の２０％）で洗浄する。（この方法の様々な繰り返しで、母液は２−６％の投入エポチロンＢ活性を典型的には含む）。その固体を真空下にオーブン中で４０−４５℃で少なくとも４時間乾燥する。或いは、その固体を約４０℃と室温の間の温度で真空下にオーブン中で乾燥する。
【００７９】
乾燥したプラマリーのエポチロンＢケーキ重量は、８．４−２０ｇの範囲であり、エポチロンＢ力価は６５０−７１３μｇ／ｍｇの範囲である。ケーキは１２−１６％のエポチロンＡ（面積％）を含む。残存溶媒レベルは０．７５％（ｗ／ｗ）ＥｔＯＡおよび１３％（ｗ／ｗ）トルエンであった。
評価した５つのロットについて
【表２８】
2010011873.tif 000037
【００８０】
単離工程の全体的ロスは、平均して９．４％であった。プライマリーケーキへの樹脂からのエポチロンＢに対するエポチロンＡのパーセントは平均４９％から１９％に落ちた。ＰＸＲＤパターンおよびこの工程で記載した方法に従って得た結晶溶媒和についての熱分析を図９および１０にそれぞれ説明する。図９のＰＸＲＤパターンは表６に報告したデータにより更に特徴付けられる。
【００８１】
工程Ｂ、エポチロンＢの再結晶化
ＥｔＯＡｃ（０．１４Ｌ）を１５ｇのプラマリーグレードエポチロンＢ（７１０μｇ／ｍｇ）に添加し、攪拌しながら６５−６８℃に加熱する。（エポチロンＢの標的濃度は７５−８０ｇ活性／Ｌである）。トルエン（０．１４Ｌ）を２０分かけて添加し、温度を６０℃以上の温度に保持した。生じたスラリーを６５℃で０．２５−１時間保つ。次にバッチ３時間かけて４０℃に冷却する。バッチの冷却を０−２℃まで２時間続ける。生じた結晶性スラリーを次に濾過し、ケーキをトルエン（２ｘ０．０２８Ｌ）で洗浄する。典型的には、３％未満の投入エポチロンＢ活性が一緒にした母液および洗浄へと失われる。そのケーキは真空オーブン中で４２℃および２９ｉｎ．Ｈｇで２時間乾燥する。或いは、ケーキは真空オーブン中で４０℃および室温の間の温度で、２９ｉｎ．Ｈｇで２時間乾燥する。乾燥ケーキ重量は１３．６ｇであり、力価は７６４μｇ／ｍｇである。残存溶媒はＥｔＯＡｃ（０．９％）およびトルエン（１３．２％）を含む。典型的には、ＥｔＯＡｃおよびトルエンは１３−１４重量％の合わせたレベルで存在する。再結晶化されたケーキについてエポチロンＢに対するエポチロンＡの面積５は平均６．９％まで落ちた。
【００８２】
この工程で記載した方法により得れた結晶溶媒和物のＰＸＲＤパターンおよび熱分析を図１１および１２にそれぞれ示す。図１１のＰＸＰＤパターンは上の表７に報告されたデータにより更に、特徴付けられる。
【００８３】
順相クロマトグラフィー
次の移動層を調製する：
２０％（ｖ／ｖ）酢酸エチル／ｎ−ヘプタン溶液（約１０Ｌ）
４０％酢酸エチル／ｎ−ヘプタン溶液（約１０Ｌ）、および
１００％酢酸エチル（約１０Ｌ）。
次の装置を準備した：
Walters Delta Prep4000; 検出器：290nmにおけるUVセット;カラム:Phenomenex Luna,10 ミクロン、シリカ（２）、５．０ｘ２５ｃｍ（カラム容積約４９０ｍＬ）。
【００８４】
カラムをエポチロン溶液の注入の前に３ベッド容積の２０（ｖ／ｖ）酢酸エチル／ｎ−ヘプタン溶液で平衡化させた。
【００８５】
エポチロンＢケーキ（５．５ｇ）を５５ｍＬのメチレンクロライドに溶解する。そのバッチを１ミクロンＰＴＦＥフィルターを通して濾過し、存在しうる微粒子を除く。メチレンクロライド（２−５ｍＬ）を用いてフィルターを濯ぐ。その豊富なメチレンクロライド濾液を流速５ｍＬ／分で最初の３０秒間カラムに注入し、続いて、試料が完全に充填されるまで流速を２０ｍＬ／分まで増加させる。エポチロン濾液を含む容器をメチレンクロライド（２−５ｍＬ）で濯ぎ、濯ぎ液もカラムに充填する
【００８６】
溶離を２０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタンで始め、流速を１１８ｍＬ／分まで増加させる。流速が１１８ｍＬ／分に到達した後、ポンププログラムコントローラーを用いて所望のポンププログラムを行う。次のポンププログラムを用いる。
【表２９】
2010011873.tif 000038
【００８７】
画分を集め、ＨＰＬＣを用いて純度を試験する
【００８８】
５つのバッチにおいて、集めた画分におけるエポチロンＢの面積％は９９．５９−９９．９３％であり、収率の平均は９１％であった。
【００８９】
場合により、イソクラチック４０％酢酸エチル／ｎ−ヘプタン溶離工程を用いてクロマトグラフィーを同様に行い、同様の１００％酢酸エチルカラム洗浄工程に続く４０％酢酸エチルによる再平衡化を行った。より小さい直径のカラム１．０ｃｍｘ２５ｃｍで同じクロマトグラフィー装置を用いた。ハートカット画分におけるエポチロンＢ（１６４ｍｇ）のクロマトグラフィー収率は８６％であり、集めた画分におけるエポチロンＢの面積％は９９．４％であった。ハートカットで溶出する３１−３５ｇのｅｐｏＢについては上のイソクラチック方法を１１ｃｍの軸圧縮カラム上で行い、クロマトグラフィー収率は約９０−９４％であった。集めたハートカットにおけるエポチロンＢの面積％は９９．６−９９．９％であった。カラムは複数回再利用できる。
【００９０】
工程Ｃ．最後の結晶化
所望のハートカット画分をプールし、１．６２−１．７３Lのバッチ容積を得る。溶媒を真空下に４０−４５℃で除去する。標的蒸留容積は２５−２８ｍＬである（エポチロンＢ濃度約２００−２１０ｇ／Ｌ）。濃縮物に暖かい（約４０℃）ヘプタン（５０ｍＬ）を加える。或いは、暖かい（約４０℃）ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）をこの段階で濃縮物に加えうる。生じたスラリーを約４０℃で約２時間攪拌し、次に５時間かけて約０℃に冷却し、約０℃で最低５時間攪拌する。中間の早さの機械的攪拌を結晶化中用いる。結晶性のスラリーを濾過し、ケーキを冷１：１ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（２５ｍＬ）で洗浄する。その固体を真空下に４０−４５℃で５−６時間乾燥させる。或いは、固体を真空オーブン中で４０℃および室温の間の温度で５−６時間乾燥させる。単離されたエポチロンＢの重量（５バッチについて）は結晶化（１回）エポチロンＢから約４．２−５．０ｇ（８３．５−８５．６％活性収率）であり、ＨＰＬＣ純度は９９．７８−９９．９３％面積パーセント（平均９９．８０％）である。母液中に失われたエポチロンＢは、クロマトグラフィーへのエポチロンＢ活性投入に関して約４％である。ケーキ中の残存溶媒はＥｔＯＡｃ（５．８−６．０％ｗ／ｗおよびヘプタン（０．６−０．７％ｗ／ｗ）である。最後のエポチロンＢケーキの力価は９１．５−９２．７％ｗ／ｗである。ＨＰＬＣ純度は９９．７面積パーセント以上である。この工程で記載した方法に従って得られた結晶溶媒和物のＰＸＲＤパターンおよび熱分析を図１３および１４に示す。図１４に見られるように、上の方法により製造し乾燥した酢酸エチル溶媒和物についての融点は約１０２℃である。図１３のＰＸＲＤパターンは上の表８に記録されたデータによりさらに特徴付けられる。
【００９１】
或いは、４．８３ＫｇのＥｐｏＢ（１７９０Ｌ）を含むプールしたハートカットを２００−２１０ｇ／Ｌの標的濃度まで＜３０℃で真空下に濃縮し、ｎ−ヘプタン（６０ｋｇ）を次に添加する。この濃縮を繰り返し、更に６０Kgのヘプタンを添加する。スラリーを３時間かけて２０℃まで冷却し、次に集めて３０ｋｇのヘプタンで洗浄する。その固体を２０−３６℃で１６時間真空下に乾燥する。全５．１４１Ｋｇの固体を＞９９．６面積％のＨＰＬＣ純度で得た。ケーキ中の残存溶媒は１０．６％酢酸エチルおよび１．４％ヘプタンであった。
【００９２】
実施例７Ａ
樹脂からのエポチロンＢの抽出とその後の繰り返し再結晶化
見積もられた４．１０ＫｇのエポチロンＢ活性（エポチロンＢについての面積％＝５８．０％；エポチロンＡ＝２９．２％）を含む水洗したエポチロン豊富な樹脂（５４９．８ｋｇ）を水でスラリー化し、カラムに充填した。カラムをドレインし、窒素を吹き込んだ。酢酸エチル（２９６９Ｋｇ）を次に全体で約６ベッド容積に対して１時間あたり約１ベッド容積の速度でカラムを通して溶出させた。一緒にした豊富な酢酸エチル溶出物を１時間重力沈降させ、下の水層を除去した。その豊富な酢酸エチルを次に約５７４ｋｇまで次に濃度した。濃縮した豊富な酢酸エチルを次に約２０℃で２日間放置したのちポリッシュ濾過した。フィルターおよびラインを酢酸エチル（全体約１１５ｋｇ）で洗浄した。ポリッシュ濾液および洗浄を次に約６４Ｌの容積まで濃縮し、次に約６５℃まで暖めた。等しい容積の暖かいトルエンを次に攪拌しながら加え、その物質を約６５℃に約３０分保った。次にそのバッチを約４時間かけて約４０℃にゆっくり冷却後、約２．５時間かけて０℃まで冷却した。その冷スラリーを約０℃に約１時間保った。生じた結晶性スラリーを次に濾過し、ケーキをトルエン（約６４Ｌ）で洗浄した。その生じたケーキを真空下に短く乾燥し、次に温酢酸エチル（約２００ｋｇ）を用いてフィルタードライアーから再溶解した
【００９３】
最初の結晶化は豊富な酢酸エチルを約６５Ｌまで濃縮することにより同様に行った。６５℃まで暖めた後。等しい容量のトルエンを攪拌しながら加え、その材料を約６５℃で約３０分間保った。そのバッチを上と同様に冷却し、生じた結晶性スラリーを濾過し上と同じ方法および装置を用いて洗浄した。
【００９４】
２つの更なる、上記と類似の再結晶化を行い、（４．３８４Ｋｇ）（８１．５％ｗ／ｗ）（３．５７３ｋｇエポチロンＢ）（ＨＰＬＣ面積％：エポチロンＢ＝９７．１８；エポチロンＡ＝１．４０；エポチロンＦ＝０．３０；オキサゾールアナログ＝０．３０およびエチルチアゾールアナログ＝０．５６）でエポチロンＢの結晶性ケーキを得た。０．１面積パーセント以上でＨＰＬＣによる他の不純物は検出されなかった。その生成物は１３．８％ｗ／ｗのトルエンおよび０．８ｗ／ｗの酢酸エチルを含んでいた。樹脂から単離され精製されたエポチロンＢの全体の活性収率は８７％であった。
【００９５】
実施例７Ｂ
母液ストリームからのＥｐｏ  Ｂの回収
ＭＴＢＥまたはＥＴＯＡｃ抽出からＥｐｏ  Ｂの結晶化からの母液を一緒にし、溶液１リッター当たり２．２ｇのＥｐｏ  Ｂおよび４．８ｇのＥｐｏ  Ａを含んでいた。この溶液１０Ｌを真空下に＜５０℃で１１−１５ｇＥｐｏ  Ｂ／Ｌまで濃縮した。１容量のトルエンを加え、固体が形成しはじめた。１１−１５ｇのＥｐｏ  Ｂ／Ｌの濃度が再び達成されるまで蒸留を続けた。１容量のトルエンを再び加え、蒸留をもう１度繰り返し１１−１５ｇＥｐｏ  Ｂ／Ｌに達した。そのスラリーを１時間かけて室温まで冷却し、次に９０分撹拌した。その混合物を約５０℃まで再加熱し、１時間攪拌し、１時間かけて室温まで冷却した。最低３時間攪拌後、その固体を濾過により集め、トルエンで洗浄し、次に真空下に約４０℃で乾燥し、約９２％のＥｐｏ  Ｂ活性を回収した。その固体は１６％ｗ／ｗを有する４２．９％ｗ／ｗのＥｐｏ  Ｂと分析された。母液は６６％の投入エポチロンＡおよび僅か５％の投入エポチロンＢを含んでいた。
【００９６】
実施例７Ｃ
６４６ｍｇのＥｐｏ  Ｂを含む、を実施例７で説明した順相クロマトグラフィーからの、プールしたハートカット（２００ｍＬ）を４３ｍＬのトルエンにゆっくり加え、ジャケット温度約６５℃で約４３ｍLまで真空下に濃縮した。トルエン（４３ｍＬ）を真空下に加え、蒸留をジャケット温度約６５℃で続けた。そのスラリー約４３ｍｌまで濃縮し、次に約３時間かけて約２０℃まで冷却した。結晶を集め、２ｘ５ｍＬのトルエンで洗浄し、真空下に（２９’’Ｈｇ）約４０℃で３０分間乾燥し、７２９ｍｇの単離した結晶性ケーキを得た（８５．３％ｗ／ｗ  Ｅｐｏ  Ｂ）。ＨＰＬＣ純度は９９．７７面積％であった（トルエン面積％を除く）。ケーキ中の残存溶媒は１５．３％ｗ／ｗトルエンおよび０．３％ｗ／ｗ EtOAｃであった。母液および洗浄液は僅か５％のエポチロンＢ投入活性を含んでいた。
【００９７】
この工程で記載した方法に従って得られた結晶溶媒和物についての観測されたＰＸＲＤパターン（上のパターン）を、室温でのトルエン溶媒和物につてのシュミレートしたＰＸＲＤパターン（下のパターン）と共に、図１５に示す。この結晶溶媒和物の熱分析を図１６に示す。
【００９８】
実施例８
特殊な結晶形の製造
実施例８Ａ：ｅｐｏＢ−ＴＯβの製造
エポチロンＢトルエン溶媒和物の製造
ｅｐｏＢを約１３ｍＬの酢酸エチルに約４０℃で溶解した。１容量のトルエンを加え、バス温度＜４０℃で９ｍＬまで濃縮した。これを約５５℃まで再加熱した後、もう１容量のトルエンを添加した。これを次に約１０ｍＬまで濃縮し、１８℃まで冷却した。そのスラリーをｘ線構造決定に用いた
【００９９】
上述の方法によって得たｅｐｏＢ−ＴＯβの単斜晶系の単位格子形の分子構造、およびｅｐｏＢ−ＴＯβのＰＸＲＤパターンを図４および６にそれぞれ示す。
【０１００】
実施例８Ｂ：ｅｐｏＢ−ＡＮβの製造
エポチロンＢアセトニトリル溶媒和物の製造
アセトニトリル水溶液中の実質的に純粋なエポチロンＢの溶液（実施例５の逆相クロマトグラフィーから生じたプールされたカラム画分からの）を室温でゆっくりと蒸発させ、アセトニトリル−水からの結晶スラリーを得た。その結晶スラリーはＸ線分散により直接的に調べた。
【０１０１】
上述の方法によって得たｅｐｏＢ−ＡＮβの単斜晶系の単位格子形の分子構造、およびｅｐｏＢ−ＡＮβのＰＸＲＤパターンを図２および７にそれぞれ示す。
【０１０２】
実施例８Ｃ：ｅｐｏＢ−ＥＡβの製造
エポチロンＢ  ＥｔＯＡｃ溶媒和物の製造
１：１ＥｔＯＡｃ／ヘプタン中のエポチロンＢの溶液を約１９０−１９５ｇ／Ｌの標的濃度まで濃縮した。エポチロンＢのこの粘ちょうなスラリーに攪拌しながら１０容量のＥｔＯＡｃを約４０℃で添加した。生じたスラリーを４０℃で２時間攪拌し、５時間かけて０℃まで冷却し、最低５時間０℃で更に攪拌した。そのスラリーを濾過し、そのケーキを冷たい１：１ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで洗浄する。そのケーキを真空オーブン中で５−６時間乾燥し、約５−１４％のＥｔＯＡｃを有する最終エポチロンＢを得た。
【０１０３】
上述の方法によって得たｅｐｏＢ−ＥＡβの単斜晶系の単位格子形の分子構造、およびｅｐｏＢ−ＥＡβのＰＸＲＤパターンを図１および５にそれぞれ示す。
【０１０４】
実施例８Ｄ：ｅｐｏＢ−ＩＰβの製造
エポチロンＢ  ＩＰＡ溶媒和物の製造
エポチロンＢ（７０ｍｇ）を４ｍＬのＩＰＡに、透明な溶液ができるまでその溶液を加熱することにより溶解した。この溶液を常温まで冷却した。直ちに生じた固体を濾過により除去した。透明な濾液を小さい試験管に入れ、数個のピンホールを有するアルミニウムホイルでカバーした。溶媒を、常温で非常にゆっくりと数日かけて、実質的な結晶成長が観察されるまで蒸発させた。結晶を湿潤スラリーとしてｘ線分析のため提供した。
【０１０５】
上述の方法によって得たｅｐｏＢ−ＩＰβの単斜晶系の単位格子形の分子構造、およびｅｐｏＢ−ＩＰβのＰＸＲＤパターンを図３および８にそれぞれ示す。
【０１０６】
実施例９
エポチロンＢ（ラクトン）からの誘導体２（ラクタム）形成
テトラブチルアンモニウムアジド（ＴＢＡアジド）溶液を、ＴＨＦ／ＤＭＦ中のテトラブチルアンモニウムクロライドおよびアジドナトリウムを混合することにより、製造した。生じたＴＢＡアジド溶液を濾過によるＮａＣｌ結晶の除去により回収した。トリス（ジベンジレデンアセトン）−ジパラジウム等の触媒量の試薬またはアリルカチオンを安定化させるために選択されたこの触媒のクロロホルム付加物、塩化アンモニウム、エポチロンＢおよびＴＢＡアジドのＴＨＦ／ＤＭＦ溶液を攪拌しながらフラスコに入れた。そのスラリーを約２５分間０−５℃で窒素をバブリングすることにより脱酸素した。トリメチルフォスフィンを０−５℃で添加した。その反応混合物を３２−３８℃まで加熱し、攪拌を４−１６時間続け、エステル官能性の破損から生じるアミノ酸中間体を製造した。反応混合物を１８−２４℃に冷却し、濾過し固体を除去した。その固体をＴＨＦで洗浄し、濾液を豊富な濾液と一緒にした。この溶液を９−１０時間かけて、１−供給ロキシベンゾトリアゾール水和物、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩および炭酸カリウムのＴＨＦ／ＤＭＦスラリーに３０−３７℃で滴加した。生じた混合物を０−１２℃に冷却し、温度を＜１０℃に保ちながら水でクエンチした。その混合物を酢酸エチルで３−４回抽出し、一緒にした酢酸エチル層をシクロヘキサンで希釈し（３：１酢酸エチル−シクロヘキサン比）、水で逆抽出する。有機層を更なるシクロヘキサンにより２：１酢酸エチル−シクロヘキサン比まで希釈し、Ｚｅｔａ  Ｐａｄ  Ｒ５１ＳＰまたはＲ５３Ｓｐ等の活性炭浸せきカートリッジを通した。トリエチルアミン（１％）を有機の濾液に加え、その溶液を１％のトリエチルアミンを含む２：１酢酸エチル−シクロヘキサンを用いるショートシリカゲル濾過により精製した。豊富な溶出液を集め、＜３７℃で最終濃度１１−１４ｍＬ／ｇまで濃縮した。更なるシクロヘキサンを添加し、スラリーを６７−７８℃で４５−６０分加熱する。そのスラリーを約２１℃までゆっくり冷却し、濾過し、結晶性固体を１：１酢酸エチル−シクロヘキサンで洗浄した。湿ったケーキを真空下に＜４５℃で乾燥し、約５６Ｍ％収率でエポチロンＢの結晶性ラクタムアナログを得た。
【０１０７】
実施例１０
エポチロンＢからのアミノ置換エポチロンＢ誘導体（誘導体１）の形成
エポチロンＢを、エポチロンＢのチアゾール環の２−メチル基の酵素的供給ロキシル化によりエポチロンＦに変換した。その変換は、エポチロンＢへのactinomycete株の作用により達成される。この工程で使用するためのactinomycete株は、２００２年１２月１７日に出願された米国特許出願第１０／３２１１８８号およびＷＯ 00/39276号に開示されており、両者は本明細書の一部を構成する。
【０１０８】
エタノール中のエポチロンＢ（５％ｖ／ｗ）を１６−１８℃で適当な培地中で増殖させたその微生物に添加し、ｐＨを５０％ｗ／ｖ水酸化ナトリウムまたは３０ｗ／ｖ硫酸で、６．９−７．１に維持した。生物学的変換はエポチロンＢの濃度がその最初の価の３−５％まで減少するまで続けた。エポチロンＦを吸着できるＸＡＤ−１６またはＳＰ２０７等の樹脂を発酵タンクに加え（５％ｖ／ｗ）１６−７２時間１０−１８℃で攪拌した。発酵ブロースをデカントし、樹脂を水で洗浄した（２：１水−樹脂比）。洗浄を更に２回繰り返した。残存する水の大部分はブッフナーロートでの濾過により除去される。
【０１０９】
予め吸着したエポチロンＦを有するＸＡＤ−１６樹脂を水でスラリーにし、カラムに充填した。樹脂カラムは酢酸エチルで抽出し、豊富な溶出液を集めた。水層を流去し、豊富な酢酸エチル画分を次に５％炭酸水素ナトリウム溶液および水で洗浄し、脱色した。豊富な有機画分を減圧下に濃縮し、次にシリカであらかじめコートしたフィルターを通し、１０μＭポリッシュ濾過した。その生成物は次に真空下に蒸留し、プライマリーエポチロンＦを非溶媒としてトルエンを攪拌しながら加えることにより結晶化させた。その豊富なトルエン混合物を更に濃縮して酢酸エチル含量を減らし更なるトルエンを添加した。結晶性スラリーを濾過し、トルエンで洗浄した。
【０１１０】
エポチロンＦをメチレンクロライドまたはメチレンクロライド／酢酸エチル混合物に溶解し、次に６０−８０：４０−２０の酢酸エチル：ｎ―ヘプタン混合物（ｖ／ｖ）で平衡化しておいたＨＰＬＣグレードシリカを充填したクロマトグラフィーカラムにロードした。
【０１１１】
生成物をカラムから、６０−８０：４０−２０の酢酸エチル：ｎ―ヘプタン混合物（ｖ／ｖ）のイソクラチックまたはステップグラジエント、その後の６０−８０：４０−２０の酢酸エチル：ｎ―ヘプタン混合物でカラムから溶出させた。試料およびプロセスは２９０ｎｍでのＵＶ検出によりモニターした。エポチロンＦ生成物ピークは分画し、近くに溶出する不純物を最小にした。豊富なプールした画分は標的濃度約１００ｇ／Ｌまで真空下に蒸留する。エポチロンＦのスラリーに等しい量のｎ−ヘプタンを攪拌しながら加える。そのバッチを標的濃度約１００ｇ／Ｌまで真空下に再蒸留し、酢酸エチルを添加し、スラリーを４０℃に維持する。そのバッチを２〜−１０℃まで冷却し、少なくとも５時間その温度に維持し、溶液から生成物を結晶化させる。生じたスラリーを濾過し、冷１：１酢酸エチル：ｎ―ヘプタン溶液で洗浄する。最終エポチロンＦケーキを真空下に３５−４０℃で乾燥する。
【０１１２】
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデス−７−エン（ＤＢＵ，１．８等量）を、テトラ供給ロフラン（前もって３Ａ  ＭＳ上で乾燥）中のエポチロンＦおよびジフェニルホスホリルアジド（１．５等量）の懸濁液にゆっくり添加し、その反応を１０−２５℃で１２−２４時間攪拌する。トリメチルホスフィン／テトラ供給ロフラン溶液（１．０Ｍ，１．１等量）を反応混合物にゆっくり添加する。水および水酸化アンモニウムを添加し、混合物を更に３０分間攪拌する。反応混合物を水で希釈し、水層をジクロロメタンで３回抽出した。有機層を次に希釈した水酸化アンモニウムおよび半飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、絶乾し、チアゾールメチル基でより機能化された粗のアミノ誘導体（誘導体１）を得る。
【０１１３】
その粗生成物を２．５％メタノール−０．２％のトリエチルアミン−ジクロロメタンで前処理したシリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製する。適当な品質の画分を併せ、ミクロ濾過し、絶乾し、クロマトグラフィーした誘導体１を得る。この物質を酢酸エチルに添加し、生じた懸濁液を７２−７５℃に加熱し、溶液を得る。非溶媒ン−ヘプタンをゆっくり加え、混合物を攪拌しながら１５−２５℃で種の存在下ゆっくり冷却する。冷却および約５℃での保持後、生じた固体を濾過により単離し、真空下に乾燥し精製された結晶性のアミノ誘導体（誘導体１）を、エポチロンＦからの約７０Ｍ％収率で得た。
【０１１４】
実施例１１
エポチロンＢからエポチロンＤ（誘導体３）の製造
【化９】
2010011873.tif 000039
[４Ｓ-[４Ｒ＊,７Ｓ＊，８Ｒ＊，９Ｒ＊，１５Ｒ＊（Ｅ）]]−４，８−ジ供給ロキシ−５，５，７，９，１３−ペンタメチル−１６−[１−メチル−２−(２−メチル−４−チアゾリル)エテニル]−１−オキサ−１３（Ｚ）−シクロヘキサデセン−２，６−ジオン（エポチロンＤ，誘導体３）
アルゴン下の−７８℃の無水ＴＨＦ（５ｍｌ）にＷＣＩ６（１９８ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、次にｎＢｕＬｉ（ヘキサン中の１．６Ｍ溶液の０．６２５ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応は２０分の期間にわたって室温まで暖めた。タングステン試薬のアリコート（０．５０ｍｌ、０．０５ｍｍｏｌ）を除去し、アルゴン下にエポチロンＢ（９．０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）に添加し、反応混合物を１５分攪拌し、次に飽和ＮａＨＣＯ３（１ｍｌ）の添加によりクエンチした。反応混合物をＥｔＯＡｃ（３ｘ１ｍｌ）で抽出し、併せた抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発物を真空下に除去した。残渣を３５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンでクロマトグラフィーし、標記化合物（７．０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：４９２．３（Ｍ＋＋Ｈ）
【０１１５】
本発明の利点、性質および様々な特徴は図面を考慮することにより、より完全に現れる。これらの図面は本発明の概念を説明する目的のためであり、限定するものではない。図１〜４のそれぞれにおいて、エポチロンのすべてのメチルおよびメチレン水素原子は明確化のため省略した。図１〜４において分子間の水素結合はダッシュ棒としてダイアグラムの下右および上左部分に示し、Ｈ結合距離（オングストローム）は分子間酸素−酸素距離を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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