(57)【要約】【課題】励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）に基づき測定対象物と当該測定対象物から抽出されたサンプル間の成分分布の差異を分析する場合であっても、測定対象物とサンプル間における溶媒含有率の影響を除去することができ、測定対象物の特定の成分をより明確に分析することができる、成分分布分析方法および成分分布分析装置を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、測定対象物およびサンプルのＥＥＭを測定し、主成分分析を用いて解析し、主成分分析の結果である主成分得点プロットにおいて、溶媒軸と直交する成分軸を抽出し、成分軸上で測定対象物およびサンプルの成分分布の差異の判別し、この成分軸に色軸を対応させて各プロットを色軸に沿って着色することによって測定対象物およびサンプルの成分分布を可視化する。【選択図】図９
2010266380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物および当該測定対象物から抽出されたサンプルの成分分布を分析する成分分布分析方法であって、
所定の励起波長範囲および所定の蛍光波長範囲で、照射する励起波長および観測する蛍光波長を段階的に変化させながら、前記測定対象物および前記サンプル上の複数の測定箇所における蛍光強度を測定することにより、前記測定対象物および前記サンプル上の各測定箇所の励起・蛍光マトリクス情報を取得する励起・蛍光マトリクス情報取得工程、および、
前記励起・蛍光マトリクス情報取得工程にて各測定箇所ごとに取得した前記励起・蛍光マトリクス情報に対して主成分分析を行い、主成分にて表される前記測定対象物および前記サンプルの成分の値である主成分得点を座標としてプロットすることにより主成分得点プロットを作成し、当該主成分得点プロット上で、前記サンプルに含まれる溶媒含有率の異なる溶媒軸決定用サンプルの成分を示すプロット群のうち、当該溶媒含有率の高い第１のプロット群の重心と当該溶媒含有率の低い第２のプロット群の重心とを通る軸、または、前記溶媒軸決定用サンプルのプロット群の近似直線を、溶媒軸として設定し、当該溶媒軸に直交する軸を前記溶媒含有率の影響を受けない成分軸として設定し、前記測定対象物および前記サンプルの成分を示すプロットを前記成分軸上に投影することにより、各測定箇所の前記成分の違いをパラメータ化するデータ解析工程、
を含むことを特徴とする、成分分布分析方法。
【請求項２】
前記データ解析工程にて前記成分軸上に投影された前記プロットに基づいて各測定箇所に彩色すべき色を決定する色決定工程、および、
前記色決定工程にて決定された前記各測定箇所に彩色すべき色をカラーマッピングすることにより、前記測定対象物および前記サンプルの前記成分分布を可視化する成分分布可視化工程、
を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の成分分布分析方法。
【請求項３】
前記励起・蛍光マトリクス情報取得工程において、
前記測定対象物および前記サンプルについて、前記照射する励起波長および前記観測する蛍光波長の異なる複数の蛍光画像を撮影し、
前記蛍光画像における各画素の前記蛍光強度から、前記測定対象物および前記サンプル上の各測定箇所における前記励起・蛍光マトリクス情報を取得することを特徴とする、請求項１または２に記載の成分分布分析方法。
【請求項４】
前記測定対象物は、穀粉製品を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の成分分布分析方法。
【請求項５】
前記成分は、タンパク質、澱粉、多糖類、ミネラル、脂質からなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の成分分布分析方法。
【請求項６】
前記溶媒は、水、アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の成分分布分析方法。
【請求項７】
測定対象物および当該測定対象物から抽出されたサンプルに所定の励起波長を照射する分光照明装置と、所定の蛍光波長で前記測定対象物および前記サンプルを観察する分光撮影装置とを備えた、前記測定対象物および前記サンプルの成分分布を分析する成分分布分析装置であって、少なくとも
前記測定対象物および前記サンプル上の複数の測定箇所において、励起・蛍光マトリクス情報を取得する励起・蛍光マトリクス測定部、および、
前記励起・蛍光マトリクス測定部により各測定箇所ごとに取得した前記励起・蛍光マトリクス情報に対して主成分分析を行い、主成分にて表される前記測定対象物および前記サンプルの成分の値である主成分得点を座標としてプロットすることにより主成分得点プロットを作成し、当該主成分得点プロット上で、前記サンプルに含まれる溶媒含有率の異なる溶媒軸決定用サンプルの成分を示すプロット群のうち、当該溶媒含有率の高い第１のプロット群の重心と当該溶媒含有率の低い第２のプロット群の重心とを通る軸、または、前記溶媒軸決定用サンプルのプロット群の近似直線を、溶媒軸として設定し、当該溶媒軸に直交する軸を前記溶媒含有率の影響を受けない成分軸として設定し、前記測定対象物および前記サンプルの成分を示すプロットを前記成分軸上に投影することにより、各測定箇所の前記成分の違いをパラメータ化するデータ解析部、
を備えたことを特徴とする、成分分布分析装置。
【請求項８】
前記データ解析部により前記成分軸上に投影された前記プロットに基づいて各測定箇所に彩色すべき色を決定し、当該各測定箇所に彩色すべき色をカラーマッピングすることにより、前記測定対象物および前記サンプルの前記成分分布を可視化する成分分布可視化部、
を更に備えたことを特徴とする、請求項７に記載の成分分布分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成分分布分析方法および成分分布分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、蛍光染色された測定対象物を蛍光観察することにより測定対象物の内部構造を可視化する技術が報告されている。
【０００３】
例えば、特許文献１および２に記載の組織構造の解析方法では、澱粉、蛋白質、脂質等を含有する多成分分散系食品を蛍光色素（例えば、コンゴレッド、フルオレスカスミン、ナイルブルー等）で染色した後、蛍光観察することにより、多成分分散系食品の組織構造を立体的画像として解析している。
【０００４】
また、特許文献３に記載の小麦粉製品観察方法では、脂質と蛋白質をそれぞれ異なる染色液（例えば、オイルレッドＯ、ヘマトキシリン等）で別色に染色する二重染色を行うことにより、小麦粉製品中のグルテン骨格、油滴、澱粉粒の状態を光学顕微鏡により同時に観察している。
【０００５】
また、特許文献４に記載の組織構造画像の形成方法では、トリフェニルメタン骨格を有する蛍光染色剤（例えば、マゼンタＩＩ等）で染色した加工食品または加工食品の製造原料を励起照射し、染色した加工食品または加工食品の製造原料を、少なくとも３種の観察光を用いて観察し、観察結果に基づいて加工食品の内部組織の微細構造を示す鮮明な画像を形成している。
【０００６】
ここで、図１を参照し、蛍光染色による蛋白質の可視化の一例について説明する。測定対象物の一例として、小麦粉食品（例えば、パン類、麺類、菓子類等）は世界中で食されており、小麦粉食品のおいしさを考慮する上で食感が重要な要素となっている。小麦粉食品の食感に対して大きな影響を与えるグルテンは、小麦粉と水を捏ねたときに生成する粘弾性のあるタンパク性の物質であり、小麦粉生地を捏ねていくことによって形状が変化する。したがって、グルテンの形状によって小麦粉食品のおいしさにつながる食感が決定される。そこで、蛍光染色により蛋白質を可視化する技術（特許文献１〜４等）においては、図１に示すような測定対象物であるパン生地の断面を観察していた。図１において、染色された部分は測定対象物の成分のタンパク質を示し、白い部分は測定対象物の成分のデンプン粒を示している。
【０００７】
しかし、従来の蛍光染色により蛋白質を可視化する技術（特許文献１〜４等）においては、染色を行うことで人工物が添加されるため製造ラインで使用することができなかった。また、図１に示すように、タンパク質のみを染色する試薬を用いているため、測定対象物の特定の成分（例えば、グルテン等）だけでなく、測定対象物の小麦粉中に含まれる他のタンパク質も染色されてしまい、測定対象物の特定の成分のみを可視化することができなかった。
【０００８】
そこで、近年、測定対象物を染色することなく測定対象物の特定の成分をより明確に分析する手法の開発が望まれていた。
【０００９】
例えば、本出願人による特許文献５に記載の成分分布可視化方法は、測定対象物を染色することなく、測定対象物に対して照射する励起波長、および、測定対象物から観測する蛍光波長を段階的に変化させながら蛍光強度を測定することにより取得した励起・蛍光マトリクス（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ：ＥＥＭ）を統計解析処理で圧縮して蛍光特性を抽出し、抽出した蛍光特性に対応する色を用いてカラーマッピングすることにより測定対象物の複数成分を同時に画像表示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第３７６２３０８号公報
【特許文献２】特許第３７７１８６１号公報
【特許文献３】特開２００８−１２２４０１号公報
【特許文献４】国際公開第２００８／０７８７５２号
【特許文献５】特許第３７０６９１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、従来技術（特許文献５等）においては、測定対象物を染色することなく、励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）に基づき測定対象物の複数成分を同時に画像表示できるものの、測定対象物（例えば、パン生地等）および測定対象物から抽出されたサンプル（例えば、グルテンやプライマリースターチ（パン生地から抽出した純粋な澱粉分）等）を一緒に分析する場合、サンプルの抽出過程において水等の溶媒が追加される操作が入るため、測定対象物中の抽出前のサンプル（例えば、澱粉等）の水分含量と、抽出されたサンプル単体（例えば、プライマリースターチ等）の水分含量とが異なってしまい、水分含量を合わせた上で測定対象物とサンプル間の成分分布の差異を明確に分析することが困難であるという問題点を有していた。
【００１２】
すなわち、従来技術（特許文献５等）においては、測定対象物および当該測定対象物から抽出されたサンプル間における溶媒含有率の影響を除去できないため、励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）に基づき測定対象物とサンプル間の成分分布の差異を分析する際、測定対象物の特定の成分に関しては明確に分析できないという問題点を有していた。
【００１３】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）に基づき測定対象物と当該測定対象物から抽出されたサンプル間の成分分布の差異を分析する場合であっても、測定対象物とサンプル間における溶媒含有率の影響を除去することができ、測定対象物の特定の成分（例えば、グルテン等）をより明確に分析することができる、成分分布分析方法および成分分布分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このような目的を達成するため、本発明の成分分布分析方法は、測定対象物および当該測定対象物から抽出されたサンプルの成分分布を分析する成分分布分析方法であって、所定の励起波長範囲および所定の蛍光波長範囲で、照射する励起波長および観測する蛍光波長を段階的に変化させながら、前記測定対象物および前記サンプル上の複数の測定箇所における蛍光強度を測定することにより、前記測定対象物および前記サンプル上の各測定箇所の励起・蛍光マトリクス情報を取得する励起・蛍光マトリクス情報取得工程、および、前記励起・蛍光マトリクス情報取得工程にて各測定箇所ごとに取得した前記励起・蛍光マトリクス情報に対して主成分分析を行い、主成分にて表される前記測定対象物および前記サンプルの成分の値である主成分得点を座標としてプロットすることにより主成分得点プロットを作成し、当該主成分得点プロット上で、前記サンプルに含まれる溶媒含有率の異なる溶媒軸決定用サンプルの成分を示すプロット群のうち、当該溶媒含有率の高い第１のプロット群の重心と当該溶媒含有率の低い第２のプロット群の重心とを通る軸、または、前記溶媒軸決定用サンプルのプロット群の近似直線を、溶媒軸として設定し、当該溶媒軸に直交する軸を前記溶媒含有率の影響を受けない成分軸として設定し、前記測定対象物および前記サンプルの成分を示すプロットを前記成分軸上に投影することにより、各測定箇所の前記成分の違いをパラメータ化するデータ解析工程、を含むことを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の成分分布分析方法は、上記記載の成分分布分析方法において、前記データ解析工程にて前記成分軸上に投影された前記プロットに基づいて各測定箇所に彩色すべき色を決定する色決定工程、および、前記色決定工程にて決定された前記各測定箇所に彩色すべき色をカラーマッピングすることにより、前記測定対象物および前記サンプルの前記成分分布を可視化する成分分布可視化工程、を更に含むことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の成分分布分析方法は、上記記載の成分分布分析方法において、前記励起・蛍光マトリクス情報取得工程において、前記測定対象物および前記サンプルについて、前記照射する励起波長および前記観測する蛍光波長の異なる複数の蛍光画像を撮影し、前記蛍光画像における各画素の前記蛍光強度から、前記測定対象物および前記サンプル上の各測定箇所における前記励起・蛍光マトリクス情報を取得することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の成分分布分析方法は、上記記載の成分分布分析方法において、前記測定対象物は、穀粉製品を少なくとも含むことを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の成分分布分析方法は、上記記載の成分分布分析方法において、前記成分は、タンパク質、澱粉、多糖類、ミネラル、脂質からなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の成分分布分析方法は、上記記載の成分分布分析方法において、前記溶媒は、水、アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の成分分布分析装置は、測定対象物および当該測定対象物から抽出されたサンプルに所定の励起波長を照射する分光照明装置と、所定の蛍光波長で前記測定対象物および前記サンプルを観察する分光撮影装置とを備えた、前記測定対象物および前記サンプルの成分分布を分析する成分分布分析装置であって、少なくとも前記測定対象物および前記サンプル上の複数の測定箇所において、励起・蛍光マトリクス情報を取得する励起・蛍光マトリクス測定部、および、前記励起・蛍光マトリクス測定部により各測定箇所ごとに取得した前記励起・蛍光マトリクス情報に対して主成分分析を行い、主成分にて表される前記測定対象物および前記サンプルの成分の値である主成分得点を座標としてプロットすることにより主成分得点プロットを作成し、当該主成分得点プロット上で、前記サンプルに含まれる溶媒含有率の異なる溶媒軸決定用サンプルの成分を示すプロット群のうち、当該溶媒含有率の高い第１のプロット群の重心と当該溶媒含有率の低い第２のプロット群の重心とを通る軸、または、前記溶媒軸決定用サンプルのプロット群の近似直線を、溶媒軸として設定し、当該溶媒軸に直交する軸を前記溶媒含有率の影響を受けない成分軸として設定し、前記測定対象物および前記サンプルの成分を示すプロットを前記成分軸上に投影することにより、各測定箇所の前記成分の違いをパラメータ化するデータ解析部、を備えたことを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の成分分布分析装置は、上記記載の成分分布分析装置において、前記データ解析部により前記成分軸上に投影された前記プロットに基づいて各測定箇所に彩色すべき色を決定し、当該各測定箇所に彩色すべき色をカラーマッピングすることにより、前記測定対象物および前記サンプルの前記成分分布を可視化する成分分布可視化部、を更に備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
この発明によれば、励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）に基づき測定対象物と当該測定対象物から抽出されたサンプル間の成分分布の差異を分析する場合であっても、測定対象物とサンプル間における溶媒含有率の影響を除去することができ、測定対象物の特定の成分をより明確に分析することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、従来の蛍光染色による蛋白質の可視化の一例を示す図である。
【図２】図２は、励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）の一例を示す図である。
【図３】図３は、本発明の成分分布分析方法の基本処理を示すフローチャートである。
【図４】図４は、測定対象物およびサンプルの作成工程の一例を示す図である。
【図５】図５は、測定対象物およびサンプルの一例を示す図である。
【図６】図６は、測定用セルの一例を示す図である。
【図７】図７は、蛍光画像の一例を示す図である。
【図８】図８は、各画素におけるＥＥＭの一例を示す図である。
【図９】図９は、主成分プロット上の溶媒軸および成分軸の一例を示す図である。
【図１０】図１０は、色軸と成分軸上のプロットの一例の詳細を示す図である。
【図１１】図１１は、成分分布の可視化画像の一例を示す図である。
【図１２】図１２は、本実施形態の成分分布分析システムの構成の一例を示すブロック図である。
【図１３】図１３は、蛍光画像撮影装置の一例を示すブロック図である。
【図１４】図１４は、蛍光画像撮影装置の一例を示す斜視図である。
【図１５】図１５は、沈殿物の一例を示す図である。
【図１６】図１６は、Ｆ７０００光学系の一例を示す図である。
【図１７】図１７は、分光蛍光光度計の測定条件の一例を示す図である。
【図１８】図１８は、塩無添加グルテンのＥＥＭの一例を示す図である。
【図１９】図１９は、塩添加グルテンのＥＥＭの一例を示す図である。
【図２０】図２０は、水を加えていないプライマリースターチのＥＥＭの一例を示す図である。
【図２１】図２１は、粉対水比１０：７のプライマリースターチのＥＥＭの一例を示す図である。
【図２２】図２２は、パン生地のＥＥＭの一例を示す図である。
【図２３】図２３は、主成分分析寄与率の一例を示す図である。
【図２４】図２４は、第１主成分の主成分付加量の一例を示す図である。
【図２５】図２５は、第２主成分の主成分付加量の一例を示す図である。
【図２６】図２６は、第３主成分の主成分付加量の一例を示す図である。
【図２７】図２７は、第１主成分と第２主成分の主成分得点プロットの一例を示す図である。
【図２８】図２８は、主成分得点プロットと「溶媒軸」の一例を示す図である。
【図２９】図２９は、第１主成分と第３主成分の主成分得点プロットの一例を示す図である。
【図３０】図３０は、励起・蛍光マトリクスイメージングの一例を示す図である。
【図３１】図３１は、ＥＭＭ−ＩＳの測定条件の一例を示す図である。
【図３２】図３２は、撮影範囲と解析範囲の一例を示す図である。
【図３３】図３３は、次元の調整の一例を示す図である。
【図３４】図３４は、「溶媒軸」と「成分軸」の一例を示す図である。
【図３５】図３５は、「成分軸」における座標の一例を示す図である。
【図３６】図３６は、色軸との対応の一例を示す図である。
【図３７】図３７は、励起波長／蛍光波長：３５０／５００ｎｍにおける蛍光画像の一例を示す図である。
【図３８】図３８は、励起波長／蛍光波長：４３０／７１０ｎｍにおける蛍光画像の一例を示す図である。
【図３９】図３９は、グルテン、プライマリースターチ（加水）の主成分負荷量の寄与率の一例を示す図である。
【図４０】図４０は、第１主成分の主成分負荷量の一例を示す図である。
【図４１】図４１は、第２主成分の主成分負荷量と詳細図の一例を示す図である。
【図４２】図４２は、第３主成分の主成分負荷量と詳細図の一例を示す図である。
【図４３】図４３は、グルテン、ＰＳ（加水）の主成分得点プロットの一例を示す図である。
【図４４】図４４は、「溶媒軸」の計算の一例を示す図である。
【図４５】図４５は、パン生地、グルテン、プライマリースターチの画像の一例を示す図である。
【図４６】図４６は、パン生地の固有ベクトルの主成分寄与率を示す図である。
【図４７】図４７は、第１主成分の主成分負荷量の一例を示す図である。
【図４８】図４８は、第２主成分の主成分負荷量の一例を示す図である。
【図４９】図４９は、第３主成分の主成分負荷量の一例を示す図である。
【図５０】図５０は、パン生地の主成分得点プロットを示す図である。
【図５１】図５１は、「溶媒軸」の計算の別の一例を示す図である。
【図５２】図５２は、パン生地、グルテン、プライマリースターチの画像の別の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に、本発明にかかる〔Ｉ〕成分分布分析方法および〔ＩＩ〕成分分布分析システム並びにプログラムの好適な実施の形態の例を、図２〜図１４を参照し詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００２５】
〔Ｉ〕成分分布分析方法
まず、図２を参照し、励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）について説明する。本発明において、「励起・蛍光マトリクス」とは、図２の左図に示すように、試料（例えば、測定対象物およびサンプル等）に照射する励起波長λＥｘ、試料から発する発光の蛍光波長λＥｍ、試料の蛍光強度ＩＥｘ，Ｅｍの３軸からなる３次元データの等高線状のグラフ（蛍光指紋）である。
【００２６】
図２の右図に示すように、励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）は、横軸を蛍光波長、縦軸を励起波長として各ポイントの蛍光強度を等高線プロットすることにより平面的に表すことができる。励起・蛍光マトリクスは、試料に対し蛍光染色等の前処理をせずにキャラクタリゼーションが可能であること、操作が容易で短時間で測定できること、さらに紫外部吸光度に比べ感度が高いなどの長所を有することから、食品等の内部構造の分析や、大気中の浮遊物の測定や、染料の原料特定などに汎用されている手法である。本発明は、この励起・蛍光マトリクスを利用して、膨大な情報量から目的とする成分情報のみを抽出し、物質の内部の成分分布を可視化するものである。
【００２７】
以下、一例として、測定対象物としてパン生地、および、サンプルとしてパン生地から抽出されるグルテンや水分含有率の異なるプライマリースターチの断面をＥＥＭに基づいて計測・解析することによりパン生地中のグルテン分布を可視化する処理について、図３のフローチャートに沿って適宜図４〜図１１を参照しつつ説明する。
【００２８】
図３に示すように、本発明の成分分布分析方法において、まず前提として成分分布を分析する測定対象物およびサンプルが測定者により作成される（ステップＳ１）。
【００２９】
本発明において、「測定対象物」とは、ＥＥＭを用いて成分分布を分析する際の測定対象である試料を意味し、例えば、測定対象物は、穀粉製品（例えば、パン生地、うどんやそば等の麺類、クッキーやケーキ等の菓子類など）を少なくとも含んでもよい。また、「サンプル」とは、後述する所定の処理により抽出される試料を意味し、例えば、サンプルは、測定対象物がパン生地の場合、パン生地から抽出されるグルテンや、パン生地から抽出した純粋な澱粉分であるプライマリースターチ（ＰＳ）などであってもよい。また、「
溶媒軸決定用サンプル」とは、サンプルのうち、溶媒軸を決定する際に用いる溶媒含有率の異なるサンプルを意味し、一例として、測定対象物がパン生地の場合、パン生地から抽出される水分含有率の異なるプライマリースターチ（例えば、７０％加水ＰＳ、６０％加水ＰＳ、５０％加水ＰＳ、４０％加水ＰＳ、３０％加水ＰＳ、２０％加水ＰＳ、無加水ＰＳ等）であってもよい。また、「溶媒」は、水、アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含んでもよい。また、「成分」は、タンパク質（例えば、グルテン等）、澱粉（例えば、プライマリースターチ等）、多糖類、ミネラル、脂質からなる群より選ばれる少なくとも１つを含んでもよい。
【００３０】
ここで、図４および図５を参照し、ステップＳ１の測定対象物およびサンプルの作成処理の一例の詳細について説明する。
【００３１】
図４に示すように、まず、測定者は、ミキサー等を用いて強力粉と水をミキシングすることにより測定対象物となるパン生地（図５（ａ）を参照）を作成する。そして、測定者は、作成したパン生地を水の中で揉み出すことにより、デンプン等を水とともに流出させて、サンプルとなるグルテン（図５（ｂ）を参照）のみを抽出する。そして、測定者は、流出させたデンプン等を含んだ液を遠心分離する。そして、測定者は、遠心分離した主にデンプン（すなわち、プライマリースターチ）からなる沈殿部分を取り出し、凍結乾燥させる（図５（ｃ）を参照）。そして、測定者は、凍結乾燥させたデンプンに水分を加えることにより、例えば加水率７０％のデンプンを作成する（図５（ｄ）を参照）。このように、ステップＳ１の測定対象物およびサンプルの作成処理において、測定者により、測定対象物となるパン生地、および、当該測定対象物から抽出されるサンプルとなるグルテンやプライマリースターチが作成される。
【００３２】
図３に戻り、本発明の成分分布分析方法では、次に励起・蛍光マトリクス情報取得工程において、ステップＳ１にて作成された測定対象物及びサンプル断面のＥＥＭを各画素ごとに測定する（ステップＳ２）。
【００３３】
すなわち、ステップＳ２の励起・蛍光マトリクス情報取得工程において、所定の励起波長範囲および所定の蛍光波長範囲で、照射する励起波長および観測する蛍光波長を段階的に変化させながら、測定対象物およびサンプル上の複数の測定箇所における蛍光強度を測定することにより、測定対象物およびサンプル上の各測定箇所の励起・蛍光マトリクス情報を取得する。
【００３４】
ここで、図５〜図８を参照し、ステップＳ２の励起・蛍光マトリクス情報取得工程の一例の詳細について説明する。
【００３５】
図５に示すように、測定者は、作成された測定対象物となるパン生地（図５（ａ）を参照）、および、サンプルとなるグルテン（図５（ｂ）を参照）やデンプン（図５（ｃ），（ｄ）を参照）に対しＥＥＭを測定する。ここで、デンプンは、粉状のサンプル（図５（ｃ）を参照）と、パン生地と同じ割合で水を加えた例えば加水率７０％の団子状のサンプル（図５（ｄ）を参照）の２種類を用意する。そして、測定者は、測定対象物およびサンプルを、図６に示すような測定用セルに詰め、四角で囲った例えば約１．９×１．５ｍｍの長方形の範囲を測定箇所として蛍光画像を撮影することによりＥＥＭを測定する。そして、測定者は、図７に示すように、撮影された例えば５６１枚の蛍光画像の測定範囲内における例えば１３４４×１０２４の画素（ピクセル）１つずつについてＥＥＭを測定する。この際、測定者は、励起波長と蛍光波長の組み合わせを変えながら測定対象物およびサンプル断面を測定する。ここで、図８に示すように、例えばサンプルの断面から測定されたＥＥＭデータは、１画素について見る場合、その画素におけるＥＥＭになっている。
【００３６】
すなわち、励起・蛍光マトリクス情報取得工程において、測定対象物およびサンプルについて、照射する励起波長および観測する蛍光波長の異なる複数の蛍光画像を撮影し、蛍光画像における各画素の蛍光強度から、測定対象物およびサンプル上の各測定箇所における励起・蛍光マトリクス情報を取得する。
【００３７】
図３に戻り、本発明の成分分布分析方法では、次にデータ解析工程において、ステップＳ２にて画素数分だけ測定したＥＥＭから、必要な情報だけを効率的にとりだすために、主成分分析を用いて解析を行う（ステップＳ３）。
【００３８】
すなわち、ステップＳ３のデータ解析工程において、ステップＳ２の励起・蛍光マトリクス情報取得工程にて各測定箇所ごとに取得した励起・蛍光マトリクス情報に対して主成分分析を行い、主成分にて表される測定対象物およびサンプルの成分の値である主成分得点を座標としてプロットすることにより主成分得点プロットを作成し、当該主成分得点プロット上で、サンプルに含まれる溶媒含有率の異なる溶媒軸決定用サンプルの成分を示すプロット群のうち、当該溶媒含有率の高い第１のプロット群の重心と当該溶媒含有率の低い第２のプロット群の重心とを通る軸、または、溶媒軸決定用サンプルのプロット群の近似直線を、溶媒軸として設定し、当該溶媒軸に直交する軸を溶媒含有率の影響を受けない成分軸として設定し、測定対象物およびサンプルの成分を示すプロットを成分軸上に投影することにより、各測定箇所の成分の違いをパラメータ化（数値化）する。
【００３９】
本発明において、「主成分分析」とは、一組の変量群（多変量データ）のもつばらつきを、なるべく少数の変量によって正確に表現する情報圧縮方法の１つである。情報圧縮方法には、変量間のどのような関係に着目するかによって様々な手法があるが、変量間の相関関係に着目したものが主成分分析であり、外的基準がない場合に用いられる。また、外的基準とは、予想対象としている事象を表す変量であり、具体的には成分含量（糖度、酸度、タンパク質含量など）や物理的指標（硬度、温度など）などを示す。
【００４０】
ここで、図９を参照し、ステップＳ３のデータ解析工程の一例の詳細について説明する。
【００４１】
図９に示すように、データ解析工程において、まず、多変量のデータを少数の主成分に要約する主成分分析を行い、第１主成分と第２主成分を軸とする平面上に各測定対象物およびサンプルを位置づけた主成分得点プロットを作成する。
【００４２】
図９に示す主成分得点プロットにおいて、各測定対象物および各サンプルの相違が視覚的に表現される。具体的には、図９に示すＥＥＭ測定した測定対象物およびサンプルの主成分得点プロットにおいて、「サンプル」としてグルテン（図９において、十字印のプロット）と、粉状デンプンおよび加水デンプンを含む２種類のデンプン（図９において、丸印のプロット、および、四角印のプロット）と、「測定対象物」としてパン生地（図９において、バツ印のプロット）とが分布している。また、サンプルのうち、粉状デンプンと加水デンプンは、「溶媒軸決定用サンプル」に相当する。
【００４３】
また、図９に示す主成分得点プロットにおいて、粉状デンプンと加水デンプンのプロットは直線上に並んでいる。図９に示すように、粉状デンプンと加水デンプンでは、溶媒含有率となる水分量のみが異なっており、この直線に沿って水分量が変化している。これにより、図９に示す主成分得点プロットにおいて、加水デンプンの分布（図９において、第１のプロット群）の重心と、粉状デンプンの分布（図９において、第２のプロット群）の重心を計算し、これらの重心を通る軸を引くことができる。すなわち、２つのデンプンサンプルの差異は水分量のみにあり、この軸が水分量の違いを表しているため、図９に示すように「溶媒軸」（水分軸）として設定することができる。また、本実施形態において、図９に示す主成分得点プロットにおいて、加水デンプンの分布（図９において、第１のプロット群）と、粉状デンプンの分布（図９において、第２のプロット群）とを通る近似直線を引き、この近似直線を「溶媒軸」として設定してもよい。ここで、近似直線は、一例として、含有率の高いプロット群および含有率の低いプロット群の高低２つのグループから引いてもよく、また、散在している様々な含有率のプロットから引いてもよい。
【００４４】
続いて、図９に示すように、「溶媒軸」と直交する軸を「成分軸」（グルテン−デンプン軸）として設定することができる。これにより、溶媒軸と直交する成分軸では、溶媒である水分の影響が除去されているため、より明確にグルテンとデンプンの差を分析することができる。図９において、加水デンプン以外のパン生地、グルテン、粉状デンプンを示す各画素（ピクセル）のプロット（主成分得点）を成分軸上に投影することにより、溶媒である水分の影響を取り除いた成分の差異を求めることができる。
【００４５】
このように、ステップＳ３のデータ解析工程において、各画素が持つ励起・蛍光マトリクス情報は、主成分分析により２次元の情報に圧縮されることが好ましい。各画素が持つ励起・蛍光マトリクス情報をｎ次元（例えば、図７において、５６１次元）から主成分分析を用いて２次元の情報に圧縮することにより、励起・蛍光マトリクス情報の特徴を保持しながら、後述するステップＳ４の色決定工程および成分分布可視化工程において、励起・蛍光マトリクス情報の違いを色の違いで可視化することが可能となる。
【００４６】
図３に戻り、本発明の成分分布分析方法では、次に色決定工程において、ステップＳ３における主成分分析の結果から各画素の色を決定し、更に成分分布可視化工程において、決定された色に従って色づけを行うことにより、画像を作成する（ステップＳ４）。
【００４７】
すなわち、ステップＳ４の色決定工程において、ステップＳ３のデータ解析工程にて成分軸上に投影されたプロットに基づいて各測定箇所に彩色すべき色を決定する。そして、ステップＳ４の成分分布可視化工程において、色決定工程にて決定された各測定箇所に彩色すべき色をカラーマッピングすることにより、測定対象物およびサンプルの成分分布を可視化する。
【００４８】
ここで、図１０および図１１を参照し、ステップＳ４の色決定工程および成分分布可視化工程の一例の詳細について説明する。
【００４９】
図１０に示すように、色決定工程において、成分軸を取り出し、この成分軸に対して色軸を当てはめることにより、成分軸上のプロットの位置によって色を決定する。これにより、成分軸上に投影された溶媒軸決定用サンプルの第１のプロット群（図９において、加水デンプン）以外の測定対象物およびサンプルの各プロットに対して、ＥＥＭの主成分分析値（主成分得点）から色を決定できるので、図１１に示すような同じ成分を同じ色で示した画像を作成することができる。
【００５０】
したがって、図１１に示すように、成分分布可視化工程において、パン生地、グルテン、デンプンの画像が得ることができる。図１１（ａ）に示すパン生地の画像において、図１１（ｂ）に示すグルテンに近い青色を示す部分はグルテンが多く、図１１（ｃ），（ｄ）に示すデンプンに近い赤色を示す部分はデンプンが多い。このように、本発明は、測定対象物のパン生地中の特定の成分であるグルテン分布を可視化することができる。
【００５１】
以上、上述したように、本発明の成分分析方法は、グルテン、デンプン、パン生地のＥＥＭを測定し、主成分分析を用いて解析し、主成分分析の結果である主成分得点プロットにおいて、溶媒軸と直交する成分軸を抽出し、成分軸上でグルテンとデンプンを判別し、この成分軸に色軸を対応させて各プロットを色軸に沿って着色することによってパン生地中のグルテン分布を可視化する。
【００５２】
なお、本実施形態において、パン生地、グルテン、デンプンの切断面の成分分布の可視化を例に、本発明の成分分布分析方法について説明したが、測定対象物およびサンプル、励起・蛍光マトリクスの測定条件、主成分分析等の情報圧縮方法、カラーマッピング等の各種条件については、本発明の目的を逸脱しない範囲で適宜選択できる。
【００５３】
〔ＩＩ〕成分分布分析システム
次に、本発明の成分分布分析システムの構成について図１２〜図１４を参照し実施形態を例に挙げて説明する。なお、本発明の成分分布分析システムが備える蛍光画像撮影装置および成分分布分析装置は、前述の本発明の成分分布分析方法に好適に使用できるものであるが、本発明の成分分布分析方法に用いる測定装置はこれに限定されるものではない。
【００５４】
ここで、図１２は、本実施形態の成分分布分析システムの構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
【００５５】
図１２に示すように、成分分布分析システムは、蛍光画像撮影装置１０および成分分布分析装置２０を備えている。蛍光画像撮影装置１０は、励起・蛍光マトリクス情報を取得する装置であり、分光照明装置１１および分光撮影装置１２を備えている。また、成分分布分析装置２０は、蛍光画像撮影装置１０で取得した励起・蛍光マトリクス情報から、測定対象物・サンプル１３の成分分布を分析し可視化する装置であり、メモリ２１、制御部２３、計算処理部２４を備えており、測定者はキーボード・マウス２２により、成分分布分析装置２０に測定条件等を入力する。
【００５６】
すなわち、本発明において、分光照明装置１１は、測定対象物および当該測定対象物から抽出されたサンプルに所定の励起波長を照射し、分光撮影装置１２は、所定の蛍光波長で測定対象物およびサンプルを観察する。また、成分分布分析装置２０は、分光照明装置１１および分光撮影装置１２を備えて構成され、測定対象物およびサンプルの成分分布を分析する。
【００５７】
ここで、図１３は、蛍光画像撮影装置１０の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
【００５８】
図１３に示すように、蛍光画像撮影装置１０は、分光照明装置１１および分光撮影装置１２を備えている。分光照明装置１１は、測定対象物・サンプル１３に、所定の波長の励起光を照射して測定対象物・サンプル１３の成分から蛍光を生じさせる装置である。分光照明装置１１は、照射する励起波長を任意に変える励起波長可変手段を有する。
【００５９】
分光撮影装置１２は、所定の蛍光波長において、測定対象物・サンプル１３の蛍光画像を撮影し、画像情報を成分分布分析装置２０に送信する装置である。分光撮影装置１２は、測定対象物・サンプル１３が発した蛍光のうち、特定の蛍光波長を選択的に捕えて、蛍光画像を撮影する。分光撮影装置１２は、観察する蛍光波長を任意に変える蛍光波長可変手段を有する。
【００６０】
ここで、図１４に蛍光画像撮影装置１０の一例を示す斜視図を示す。
【００６１】
図１４の例において、分光照明装置１１は、光源１１０、分光装置１１２、励起波長調節部１１４、光ファイバー１１６、励起光照射部１１８を備えている。また、分光撮影装置１２は、光学部１２０、分光装置１２２、画像撮影装置１２４を備えている。
【００６２】
分光照明装置１１の光源１１０としては、キセノンランプ、タングステンランプ、波長可変レーザー等を用いることができる。光源１１０から発した光は、分光装置１１２において、所定の波長を有する励起光に分光される。測定者は、励起波長調節部１１４を調節することにより、励起光を任意の波長に設定することができる。光源１１０として波長可変レーザーを用いる場合、直接光源から所望の波長を有する励起光が得られるので、分光装置１１２は不要である。
【００６３】
分光装置１１２としては、ＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ）、液晶チューナブルフィルタ、干渉フィルタ、回折格子などを用いることができる。
【００６４】
分光装置１１２において所定の波長を有する励起光に変換された光は、光ファイバー１１６を経由して励起光照射部１１８に送られ、励起光照射部１１８から測定対象物・サンプル１３に照射される。所定の励起波長を有する励起光を照射することにより、測定対象物・サンプル１３は、成分特有のパターンの蛍光を発する。
【００６５】
光学部１２０により、測定対象物・サンプル１３を画像撮影に適した大きさに拡大する。光学部１２０は、例えば、顕微鏡、ズームレンズ、マクロレンズ、広角レンズ等である。測定対象物・サンプル１３が画像を撮影するために十分な大きさを有する場合は、光学部１２０を使用しなくても撮影可能である。
【００６６】
励起光を照射することにより、測定対象物・サンプル１３が発した蛍光は、分光装置１２２により所定の波長を有する光に分光される。分光装置１２２は、観測する蛍光波長を任意に設定する手段を有する。分光装置１２２としては、ＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ）、液晶チューナブルフィルタ、ＰＧＰ（プリズム・グレーティング・プリズム）、干渉フィルタ、回折格子などを用いることができる。
【００６７】
分光装置１２２を通過することにより、測定対象物・サンプル１３が発した蛍光のうち所定の波長を有する光のみが画像撮影装置１２４によって画像として撮影される。画像撮影装置１２４としては、ＣＣＤカメラ、走査型画像カメラ等を用いることができる。
【００６８】
画像撮影装置１２４により得られた画像の各画素の明度から、測定対象物・サンプル１３上の各測定箇所における蛍光強度が判明する。すなわち、測定対象物・サンプル１３上の各測定箇所について、各測定箇所の対応する位置の画素の明度から、特定の励起波長λＥｘ（照射波長）および特定の蛍光波長λＥｍ（観測波長）における蛍光強度ＩＥｘ，Ｅｍの情報が得られる。したがって、蛍光画像撮影装置１０を用いることにより、測定対象物・サンプル１３上の全ての点（画素）において、特定の励起波長および蛍光波長における蛍光強度を、一度に測定することが可能となる。
【００６９】
測定対象物・サンプル１３上の各点においてｎ次元の励起・蛍光マトリクス情報を取得する場合は、励起波長および蛍光波長の組み合わせを変えながらｎ枚の蛍光画像を撮影する。画像撮影装置１２４によって撮影されたｎ枚の蛍光画像の画像情報は、成分分布分析装置２０に転送される。
【００７０】
照射する励起波長および観測する蛍光波長は、手動または自動で、測定者が任意に変えることができる。好ましくは、蛍光画像撮影装置１０は、励起波長、蛍光波長を自動的に変更する手段を有する。
【００７１】
ここで、図１２に戻り、成分分布分析装置２０について説明する。
【００７２】
図１２に示すように、成分分布分析装置２０は、分光撮影装置１２の画像撮影装置１２４によって撮影されたｎ枚の蛍光画像の画像情報から、各画素ごとに励起・蛍光マトリクス情報を取得する（図１２において、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１による処理）。次いで、取得された励起・蛍光マトリクス情報を主成分分析して主成分プロットを作成し、主成分プロット上で溶媒軸と直交する成分軸を設定し、溶媒軸決定用サンプルのうち溶媒含有率の高い第１のプロット以外の測定対象物およびサンプルの成分を示すプロットを成分軸上に投影することにより各測定箇所の成分の違いをパラメータ化する（図１２において、データ解析部２４−２による処理）。次いで、成分軸上に投影されたプロットに基づいて各測定箇所に彩色すべき色を決定し、決定された色を各測定箇所に対応する画素で表示させてカラーマッピングすることにより、測定対象物の成分分布を可視化する（図１２において、成分分布可視化部２４−３による処理）。なお、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１、データ解析部２４−２、成分分布可視化部２４−３の詳細は計算処理部２４の説明にて後述する。
【００７３】
メモリ２１は、画像撮影装置１２４から成分分布分析装置２０へ転送され、計算処理部２４の励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された画像情報や、計算処理部２４のデータ解析部２４−２で主成分分析により抽出された蛍光特性からパラメータ化された各測定箇所の成分の違いを示すデータ（例えば、励起・蛍光マトリクス情報から抽出された目的とする成分情報）等を格納する。
【００７４】
制御部２３は、測定者の入力した励起波長範囲、蛍光波長範囲、波長ピッチで測定対象物・サンプルル１３の蛍光画像を撮影するように、分光照明装置１１が照射する励起波長、および、分光撮影装置１２が観測する蛍光波長を調整する指示を出したり、得られた励起・蛍光マトリクス情報から目的とする成分情報を抽出するよう計算処理部２４のデータ解析部２４−２に主成分分析を行うよう命令する。
【００７５】
計算処理部２４の励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により、測定対象物・サンプル１３上の複数の測定箇所において、取得された励起・蛍光マトリクス情報（すなわち、蛍光画像撮影装置１０から転送されたｎ枚の蛍光画像の画像情報）は、成分分布分析装置２０のメモリ２１に格納される。測定者がキーボード・マウス２２を通じて、計算処理部２４のデータ解析部２４−２に対して主成分分析を指示すると、計算処理部２４のデータ解析部２４−２は、メモリ２１に格納されたｎ枚の蛍光画像の画像情報から、各画素ごとにｎ次元の励起・蛍光マトリクス情報を抽出する。次に、計算処理部２４のデータ解析部２４−２は、測定者が指定した主成分分析法により、各画素ごとに得られたｎ次元の励起・蛍光マトリクス情報を、好ましくは２次元に情報圧縮する。２次元に圧縮された励起・蛍光マトリクス情報は、メモリ２１に格納される。
【００７６】
すなわち、データ解析部２４−２は、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により各測定箇所ごとに取得した励起・蛍光マトリクス情報に対して主成分分析を行い、主成分にて表される測定対象物およびサンプルの成分の値である主成分得点を座標としてプロットすることにより主成分得点プロットを作成し、当該主成分得点プロット上で、サンプルに含まれる溶媒含有率の異なる溶媒軸決定用サンプルの成分を示すプロット群のうち、当該溶媒含有率の高い第１のプロット群の重心と当該溶媒含有率の低い第２のプロット群の重心とを通る軸、または、溶媒軸決定用サンプルのプロット群の近似直線を、溶媒軸として設定し、当該溶媒軸に直交する軸を溶媒含有率の影響を受けない成分軸として設定し、測定対象物およびサンプルの成分を示すプロットを成分軸上に投影することにより、各測定箇所の成分の違いをパラメータ化する。
【００７７】
測定者がキーボード・マウス２２を通じて制御部２３にカラーマッピングするよう指示を入力すると、制御部２３は、計算処理部２４の成分分布可視化部２４−３に、メモリ２１に格納されている主成分分析により抽出された蛍光特性からパラメータ化された各測定箇所の成分の違いを示すデータ（例えば、励起・蛍光マトリクス情報から抽出された目的とする成分情報を示す成分軸上に投影されたプロット）を読み出し、測定者が指定したカラーインデックスに基づいて、各画素に彩色すべき色を指定するよう命令する。
【００７８】
計算処理部２４の成分分布可視化部２４−３は、各画素に彩色すべき色が決定されると、ディスプレイ３０に各画素に彩色すべき色の情報を送信する。ディスプレイ３０上で各画素をカラーマッピングすることにより、測定対象物の成分分布が可視化される。なお、成分分布の可視化は、必ずしもディスプレイ３０上で行う必要はなく、プリンターで成分分布可視化画像を印刷する等、測定対象物の成分分布を可視化できるいかなる手法を用いてもよい。
【００７９】
すなわち、成分分布可視化部２４−３は、データ解析部２４−２により成分軸上に投影されたプロットに基づいて各測定箇所に彩色すべき色を決定し、当該各測定箇所に彩色すべき色をカラーマッピングすることにより、測定対象物・サンプル１３の成分分布を可視化する。
【実施例】
【００８０】
続いて、上述した本成分分布分析システムにおける実施例について、図５、図６、図８、図１４〜図５２を参照して説明する。
【００８１】
［工程１．試料の作成］
（１−１．小麦粉画分の作成）
本実施例では、成分分析システムにおいて、測定対象物としてパン生地、および、サンプルとして小麦粉画分であるグルテンやプライマリースターチのＥＥＭを測定する。そこで、工程１においては、測定者による測定対象物およびサンプルの作成処理の工程について説明する。なお、本工程１は、上述の図３のステップＳ１に対応する。
【００８２】
本工程１において、サンプルの小麦粉画分を作成する際の元となる測定対象物のパン生地は、塩を２％添加したパン生地と、塩を添加しないパン生地の、２種類を作成した。塩を添加したパン生地は実際のパン生地に近いため、製造現場に近い測定対象物となる。また、塩無添加のパン生地はより単純な系となり、測定対象物から抽出されたサンプルのグルテンやデンプン等の対象物質の解析が容易になるという利点がある。
【００８３】
以下にサンプルの小麦粉画分の作成方法を述べる。
【００８４】
小麦粉（カメリヤ（商品名）、日清フーズ（会社名））２ｋｇに水（水道水）１４００ｍｌを加え、塩添加のパン生地にはさらに４０ｇの塩を添加し、ミキサー（エスケーミキサー（会社名）、Ｄ−ＴＭ−４０（型番））を用いて低速（１００ｒｐｍ）で２分間、中低速（２００ｒｐｍ）で６分間ミキシングした。合計８分ミキシングしたところ、測定対象物のパン生地はディベロップ段階（後述の１−２を参照）の中間から後半にかけての弾力性が最大となる状態になった。
【００８５】
ミキシングした測定対象物のパン生地を溶媒の水を張ったボールに入れ、３０分休ませた後、水の中でパン生地を揉んだ。この作業により、サンプルとなるデンプンや可溶性のタンパク質などは測定対象物のパン生地から遊離し、サンプルとなるグルテンのみが残った。水を替えながら、測定対象物の塩無添加のパン生地および塩添加のパン生地をともに６０分程度揉み出した。６０分程度揉み出した後は、新たに水の中に入れて揉んでも水がデンプン粒で濁らなくなった。このようにして得られたサンプルのグルテンを、２ｃｍ四方程度の塊に切り、ラップで包み、−４０℃の冷凍庫で凍結保存した。サンプルの作成の２週間ほど後に、−８０℃の冷凍庫に移し、使用時まで保存した。
【００８６】
測定対象物のパン生地を揉んだ際に溶媒の水の中に遊離したサンプルとなるデンプンなどの物質を遠心分離器にかけ、沈殿物と液体に分けた。遠心分離により、図１５に示すように底に近い部分には純粋なデンプン分であるプライマリースターチ（ＰＳ）が沈殿した。沈殿上部には小デンプン粒とグルテン破片、破壊デンプン、脂質、灰分などを含んだゲル状のテーリングスターチが沈殿した。液体部分には可溶性タンパク質などが溶けこんでいた。沈殿物はサンプルとなるプライマリースターチとテーリングスターチに分け、それぞれを凍結乾燥させた。液体部分も凍結乾燥させ、サンプルとなる水溶性タンパク質を含む粉状の物質を得た。すべて使用時まで−２０℃で冷凍保存した。
【００８７】
以降、測定対象物のパン生地から分画したサンプルとなる純粋なデンプン分を「プライマリースターチ（ＰＳ）」とよび、成分としてのデンプンは「デンプン」とよぶ（例えば、測定対象物のパン生地中に存在する物質は「デンプン」であり、「プライマリースターチ」ではない）。
【００８８】
上述の図５に、測定対象物のパン生地、サンプルのプライマリースターチおよびグルテンの写真を示す。図５（ａ）に示すパン生地と図５（ｂ）に示すグルテンは一度凍結させたものを解凍した、測定直前の試料である。図５（ｄ）に示すプライマリースターチは凍結乾燥させた粉状のサンプルに溶媒の蒸留水を加えて混ぜた状態である。サンプルのグルテンは強い弾力があり、伸ばしてもすぐ元の形に戻った。測定対象物のパン生地の弾力はグルテンより弱く、伸展性もあった。サンプルのプライマリースターチは水を加えても弾力はなく、少量の水を加えると粒状に固まる傾向があった。
【００８９】
（１−２．パン生地試料の作成）
サンプルの小麦粉画分とは別に様々なミキシング段階における測定対象物のパン生地を作成した。グルテンの形状とパン生地の状態を比較するために作成した。
【００９０】
小麦粉と水を質量比１０：７で混ぜ、ミキサーを用いて捏ね、ピックアップ、クリーンアップ、ディベロップ（３段階）、ファイナル（２段階）、オーバー、レットダウンの計９段階における生地をサンプリングした。
【００９１】
それぞれを７ｇ程度の小片に分け、アルミトレーの上に並べて冷凍庫に入れ、固まったところでチャック付きのビニール袋に入れて−８０℃の冷凍庫で保存した。
【００９２】
以下にミキシングの各段階の測定対象物のパン生地の状態を述べる。
【００９３】
ピックアップ段階は小麦粉に水が行きわたり、粉状の部分が見えなくなる段階であり、パン生地における水分分布は不均一であった。
【００９４】
クリーンアップ段階では生地が均一になり、一つに纏まってミキシングボールから離れるようになった。しかし、グルテンがまだあまり発達していないので、引き延ばす方向に力を加えるとすぐ切れてしまった。
【００９５】
ディベロップ段階を通じてグルテンが形成され、ディベロップ段階の後半からファイナル段階にかけて生地の粘弾性が最大となった。パン生地は膜のように薄く伸びた。
【００９６】
ファイナルからオーバーにかけてパン生地はさらに伸びやすくなったが、徐々に弾力がなくなり、べたつくようになった。
【００９７】
そしてレットダウン段階に到達するとべたつきがひどくなり、引っ張ると長く細く伸びた。
【００９８】
（１−３．工程１のまとめ）
以上、上述したように、工程１において、測定者が強力粉と水を捏ねた測定対象物のパン生地を溶媒である水の中で揉み出すことにより、サンプルのグルテンを抽出した。そして、サンプル抽出の際に溶媒の水中に流れ出たデンプンは遠心分離器にかけ、底に沈殿した純粋なデンプンを凍結乾燥させ、サンプルのプライマリースターチとした。
【００９９】
また、工程１において、強力粉と水を捏ね、ピックアップ、クリーンアップ、ディベロップ（３段階）、ファイナル（２段階）、オーバー、レットダウンの計９段階における測定対象物のパン生地をサンプリングした。
【０１００】
以上で、工程１の説明を終える。
【０１０１】
［工程２．分光蛍光光度計によるＥＥＭ測定とグルテンの判別条件］
（２−１．工程２の目的）
本実施例の最終的な目的はサンプルのグルテンを可視化することであるため、まず、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたＥＥＭに基づいて、データ解析部２４−２によりサンプルのグルテンが測定対象物のパン生地中の他の成分から判別可能かを調べる必要がある。そこで、工程２においては、サンプルのグルテンやプライマリースターチなどのパン生地画分のＥＥＭを励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により個別に測定し、そのＥＥＭをデータ解析部２４−２により主成分分析で分析することによって、グルテンを他の成分から判別するための手法を確立することを目指した。なお、本工程２は、上述の図３の励起・蛍光マトリクス測定部２４−１によるステップＳ２の処理、および、データ解析部２４−２によるステップＳ３の処理に主に対応する。
【０１０２】
（２−２．工程２の材料と方法）
（２−２−１．分光蛍光光度計）
分光蛍光光度計は、特定の波長の励起光を試料に照射したときの蛍光スペクトルを測定するための装置である。本工程２において用いた分光蛍光光度計（Ｆ−７０００（型番）、日立ハイテクノロジーズ（会社名）：以降Ｆ７０００）では、励起光の波長を変えながら各励起波長における蛍光スペクトルを測定し、ＥＥＭを測定することができる。測定対象物およびサンプル全体の蛍光スペクトルを測定するので、１つの測定対象物およびサンプルにつきＥＥＭは１つ得られる。なお、本実施例の分光蛍光光度計は、蛍光画像撮影装置１０に相当する。
【０１０３】
Ｆ７０００の光学系を図１６に示す。図１６において、Ｌはレンズ、Ｓはスリット、ＢＳはビームスプリッターを示す。光源として使用しているキセノンランプから出た光は、レンズＬ１、Ｌ２により励起側分光器の入射スリットＳ１に集光される。Ｓ１を通過した光は回折格子によって分光され、出射スリットＳ２から励起側分光器を出る。光の一部は、ビームスプリッターＢＳにより分離され、検知器に照射され励起光量が測定される。残りの励起光はレンズＬ３を通り、試料セルに集光される。なお、本実施例の励起側分光器は、分光照明装置１１に相当する。
【０１０４】
試料（例えば測定対象物およびサンプル等）が発した蛍光は、レンズＬ４、Ｌ５により集光され、スリットＳ３から蛍光側分光器に入る。蛍光側分光器では回折格子により分光され、出射スリットＳ４を通り、最後に光電子増倍管（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ：以降ホトマル）に入り、増幅されるとともに強度が測定される。なお、本実施例の蛍光側分光器およびホトマルは、分光撮影装置１２に相当する。
【０１０５】
Ｆ７０００ではＥＥＭを測定する際、測定条件を操作できる。以下に操作できる測定条件を述べる。
【０１０６】
ホトマルは、試料が発する微弱な蛍光を増幅させ検出する機械であり、ホトマルにかける電圧を上げることによって増倍率を上げられる。Ｆ７０００では、ホトマル電圧は２５０Ｖ、４００Ｖ、７００Ｖ、９５０Ｖの４段階から選ぶことができる。ホトマル電圧４００Ｖに対して、７００Ｖでは増幅率は約１００倍になる。しかし、試料の蛍光とともにノイズも増幅される。
【０１０７】
励起側スリットは図１６のＳ１、Ｓ２、蛍光側スリットは図１６のＳ３、Ｓ４である。スリットの幅は、１．０ｎｍ、２．５ｎｍ、５．０ｎｍ、１０．０ｎｍ、２０．０ｎｍから選択できる。試料に照射される励起光量は、励起側スリット幅によって調節し、検出器に入る蛍光量は、蛍光側スリット幅によって調節できる。ホトマルの許容信号強度を超えない限り強い蛍光を測定できた方がよいが、蛍光側スリット幅が大きすぎると蛍光スペクトルの波長分解能が悪化したり、励起側スリット幅が大きく励起光が強すぎると試料が劣化したりする可能性がある。したがって、スリット幅とホトマル電圧を調整し、十分な蛍光強度が得られ、かつ精度も保てる条件を見つけ出す必要がある。
【０１０８】
励起光、蛍光の最大波長範囲は、いずれも２００ｎｍ〜９００ｎｍ、波長間隔は蛍光が１〜５０ｎｍ、蛍光波長間隔は１〜１０ｎｍである。分光蛍光光度計の分光器やホトマルには波長特性があるため、試料固有のスペクトルを正確に測定するためには補正を行う必要があり、補正を行うための装置関数は波長帯によって異なる。したがって、測定波長範囲を大きくすると装置の特性や装置関数など純粋な試料の蛍光以外の要素を測定値に含めてしまう可能性が大きくなる。試料の特徴を十分に捉えるのに過不足ない波長帯を決定することが必要となる。
【０１０９】
スキャンスピードは、１分間に計測できる波長範囲を示し、３０ｎｍから６００００ｎｍまで設定できる。
【０１１０】
レスポンスは、試料に励起光を照射してから蛍光を測定するまでの時間であり、スキャンスピードに合わせて自動的に決定するか、０．００２〜８．０秒の範囲で、手動で設定することもできる。
【０１１１】
（２−２−２．解析ソフト）
分光蛍光光度計の測定値の読み込みにはＦＬ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（商品名）、データの記述にはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３（商品名）、データの解析にはＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を用いた。ＦＬ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓは本工程２において用いた分光蛍光光度計Ｆ７０００付属のソフトウェアであり、Ｆ７０００の制御、スペクトルの補正、データの出力、ピーク検出などを行うことができる。本工程２ではＦ７０００の制御とスペクトルの補正のみに用い、データはエクセル形式で出力した。なお、本解析ソフトの処理は、計算処理部２４の励起・蛍光マトリクス測定部２４−１およびデータ解析部２４−２の処理に主に相当する。
【０１１２】
データの解析にはすべて数値解析ソフトウェア（ＭＡＴＬＡＢ  Ｒ２００７ｂ（商品名）、Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，  Ｉｎｃ．（会社名））を用いた。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）は数値計算用ソフトウェアであり、行列計算、データ解析、画像処理などの豊富なライブラリを持つ。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（商品名）を用いて保存したデータを読み込み、主成分分析を行い、グラフなどで出力するまでの工程にＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を用いた。主成分得点のグラフや、主成分負荷量の図などの出力データに合わせて、データの読み込みから結果の出力までを一連の流れとしてプログラムを組んだ。
【０１１３】
（２−２−３．測定試料）
励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定する試料（例えば測定対象物およびサンプル等）は、測定対象物のパン生地画分であるサンプルのグルテンやプライマリースターチ、および、測定対象物のパン生地そのものである。これらの試料を上述の図６に示すＦ７０００の測定用セル（粉体ホルダー）に入れて測定した。
【０１１４】
サンプルのグルテンは、塩を添加した測定対象物のパン生地から抽出したグルテン（塩添加グルテン）と、塩を添加していない測定対象物のパン生地から抽出したグルテン（塩無添加グルテン）の２種類をそれぞれ５サンプルずつ用意した。−８０℃の冷凍庫で冷凍保存したものを常温で解凍し、測定用セルに入れ、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定を行った。
【０１１５】
サンプルのプライマリースターチは凍結乾燥させ、−２０℃で保存したものを常温で解凍し、溶媒の水を加えない粉状のプライマリースターチ、及び、粉状のプライマリースターチと溶媒の蒸留水を１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７の割合で混合した７種類のサンプルを作成した。粉状のプライマリースターチと溶媒含有率（粉対水比）１０：７のプライマリースターチはそれぞれ５サンプル、他は２サンプルずつ作成した。なお、粉対水比１０：７はパン生地自体の小麦粉対水比と等しく、これ以上水を加えると水が分離してしまい、測定用セルの隙間からしみ出てしまう。
【０１１６】
測定対象物のパン生地は、十分にグルテンが発達しているファイナル段階の物（上述の１−２を参照）を用いた。−８０℃の冷凍庫で冷凍保存したものを常温で解凍し、５サンプルを励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定した。
【０１１７】
（２−２−４．測定条件）
図１７にＦ７０００における測定条件を示す。
【０１１８】
サンプルのグルテンを構成するアミノ酸の蛍光スペクトルのピークは７００ｎｍ以下の範囲で検出できることから、測定範囲を２００−７００ｎｍとした。
【０１１９】
予備実験においてスリット幅を５ｎｍと１０ｎｍに設定し、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定を行ったところ、１０ｎｍスリットで測定したデータのほうが、サンプルのグルテンとプライマリースターチが明確に判別できた。そのため、本工程２では１０ｎｍスリットを採用した。
【０１２０】
ホトマル電圧は４００Ｖと７００Ｖの間で選択できるが、７００Ｖでは蛍光強度が最大値を超えてしまう波長条件が存在したため、４００Ｖとした。
【０１２１】
レスポンスは最短の０．００２秒に設定した。
【０１２２】
（２−２−５．データの前処理）
Ｆ７０００を用いて励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定したＥＥＭは、そのままではデータ解析部２４−２により主成分分析を行うことができないため、データに対して前処理を行うことが必要となる。前処理は、主に蛍光以外を由来とするデータの削除とデータの並び替えからなる。なお、前処理は、計算処理部２４の励起・蛍光マトリクス測定部２４−１において行われる。
【０１２３】
試料が励起光を吸収し蛍光を発するとき、その蛍光波長は吸収した励起光よりも長くなる。これは、Ｓｔｏｋｅｓの法則により分子の蛍光エネルギーは常に励起光エネルギー以下になるため、蛍光は励起光よりも長い波長を持つことになるからである。Ｆ７０００を用いたＥＥＭ測定では、設定した波長範囲でのすべての励起光と蛍光について調べるため、蛍光波長のほうが励起波長よりも短波長側にあるデータも存在する。
【０１２４】
さらに、紛体などサンプルに励起光を当てると、その励起光と同じ波長の散乱光、および２倍、３倍の波長の２次光、３次光が観察されるが、データ解析においては、これらのデータを除いて解析を行った。
【０１２５】
励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により散乱光の影響を取り除いたデータは、そのままでは３次元データになるため、励起波長と蛍光波長の組み合わせを「波長条件」として扱い、データ解析部２４−２により２次元データに展開した。これは、あるデータセットに対して主成分分析を行う場合、そのデータセットは（測定対象物・サンプル数）×（変量数）の２次元マトリクスで記述される必要があるからである。その結果、（１０１の励起波長）×（１０１の蛍光波長）からなる計１０２０１の波長条件となった。
【０１２６】
（２−２−６．主成分分析）
上述の２−２−５において励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により前処理を行ったデータに対して、データ解析部２４−２により主成分分析を行った。
【０１２７】
データ解析部２４−２において行われる主成分分析は、データから変量ごとに固有ベクトルを計算する過程と、その固有ベクトルからデータの主成分得点を求める過程からなる。固有ベクトルの計算は、データを説明する「ものさし」を作成する過程、主成分得点の算出はその「ものさし」を使って各サンプルの位置を計算する過程ということができる。したがって、あるデータセットで固有ベクトルを計算して「ものさし」を作成し、測定変量（本実施例では波長条件）が同じであれば、その「ものさし」を別のデータセットに適用することが可能になる。
【０１２８】
本工程２では、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された、サンプルとなる塩無添加グルテン、塩添加グルテン、粉対水比１０：７のプライマリースターチそれぞれ５サンプルの計１５サンプルのＥＥＭデータから、データ解析部２４−２により主成分固有ベクトルを求め、その固有ベクトルを用いて２種類のサンプルのグルテン、７種類のサンプルのプライマリースターチ、測定対象物のパン生地の主成分得点を求めた。つまり、データ解析部２４−２により、サンプルとなるグルテンとデンプンという測定対象物のパン生地を構成する主要成分から「ものさし」をつくり、その「ものさし」における各サンプルの位置づけを調べたことになる。
【０１２９】
（２−３．工程２の結果と考察）
（２−３−１．ＥＥＭ）
励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された、サンプルの塩無添加グルテン、塩添加グルテン、溶媒の水を加えていないプライマリースターチ、溶媒含有率（粉対水比）１０：７のプライマリースターチと、測定対象物のパン生地のそれぞれについてＥＥＭを図１８〜図２２に示す。
【０１３０】
図１８および図１９に示すように、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された、サンプルの塩無添加グルテンのＥＥＭとサンプルの塩添加グルテンのＥＥＭとは、ほぼ違いがなく、励起波長／蛍光波長：３００ｎｍ／３３０−３４０ｎｍに高い蛍光ピークが見られ、２００−２２０ｎｍ／３３０−３４０ｎｍ、３００ｎｍ／６９０ｎｍ低いピークが見られる。
【０１３１】
図２０に示すように、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された、溶媒の水を加えていないプライマリースターチのＥＥＭでは、励起波長／蛍光波長：２８０ｎｍ／３３０ｎｍに低いピークが見られ、励起波長２００ｎｍ付近に蛍光強度の高いピークの裾のようなものが見られる。特に、蛍光波長３２０ｎｍ付近では、励起波長２００ｎｍ以下の範囲にピークが存在することが推測される。励起波長／蛍光波長：２８０ｎｍ／３３０ｎｍのピークは、図１８および図１９に示したグルテンに比べ明確ではない。
【０１３２】
図２１に示すように、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された、溶媒含有率（粉対水比）１０：７のプライマリースターチのＥＥＭは、ピークの位置は、図２０に示した溶媒の水を加えていないプライマリースターチと同じだが、ピークの高さは低い。つまり、溶媒の水が加わることによって新たな蛍光ピークが現れるのではなく、単純にサンプルのプライマリースターチの蛍光が弱くなることを示している。
【０１３３】
図２２に示すように、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された、測定対象物のパン生地のＥＥＭは、図１８および図１９に示した、サンプルのグルテン類のＥＥＭに近く、励起波長／蛍光波長：２９０ｎｍ／３４０ｎｍに明確なピークが見られる。また、図１８および図１９に示したグルテン類のＥＥＭに比べて、２００−２５０ｎｍ／３３０ｎｍの範囲の蛍光が強い。図２０および図２１に示したプライマリースターチのＥＥＭでは、この範囲にピークの裾が見られることから、この蛍光ピークは、サンプルのプライマリースターチによるものだと考えられる。
【０１３４】
（２−３−２．寄与率）
データ解析部２４−２により抽出された、各主成分によって説明されるデータの割合である寄与率を図２３に示す。図２３に示すように、第１主成分の寄与率は９７％を超え、１つの軸によってデータの大部分が説明されている。逆に第３主成分以降は寄与率が１％以下となる。ここで、寄与率とは、主成分の分散、すなわち固有値をデータ全体の分散で除した値であり、寄与率が１に近いほど、その主成分は元のデータを良く表しているといえる。
【０１３５】
（２−３−３．主成分負荷量）
データ解析部２４−２により抽出された、第１主成分から第３主成分までの主成分負荷量を図２４〜図２６に示す。ここで、主成分負荷量とは、主成分と元の変量との相関係数、すなわち固有ベクトルであり、主成分と元の変量の関連を示す。主成分負荷量を参照することにより、主成分の解釈を行うことができる。例えば、ある主成分の主成分負荷量が特定の波長範囲で大きな値をとり、その波長範囲がある物質の蛍光ピークが観察される波長範囲に一致するとき、その主成分と物質を関連づけることができる。
【０１３６】
図２４に示すように、データ解析部２４−２により抽出された、第１主成分の主成分負荷量では、励起波長／蛍光波長：３００ｎｍ／３４０ｎｍと３００ｎｍ／６９０ｎｍに負のピークがあり、励起波長２００−２３０ｎｍの範囲で正の相関が大きい。言い換えれば、サンプルのグルテンのＥＥＭのピークに当たる波長帯は負の相関が大きく、サンプルのプライマリースターチのＥＥＭが高い蛍光強度を示す波長帯は正の相関が大きいと言える。これらの波長帯がそれぞれグルテンとプライマリースターチの特徴になっていることが示されている。
【０１３７】
図２５に示すように、データ解析部２４−２により抽出された、第２主成分の主成分負荷量では、ピークの位置は図２４に示した第１主成分と同じ位置にあるが、励起波長／蛍光波長：３００ｎｍ／３４０ｎｍのピークの中心は負の値をとり、まわりは正の値をとっている。
【０１３８】
図２６に示すように、データ解析部２４−２により抽出された、第３主成分の主成分負荷量では、図２５に示した第２主成分のほぼ逆となっており、励起波長３００ｎｍにおいて長波長側に正のピーク、短波長側に負のピークが見られる。
【０１３９】
（２−３−４．主成分得点プロット）
図２７に、データ解析部２４−２により作成された、第１主成分と第２主成分の主成分得点を軸にとった各測定対象物およびサンプルの主成分得点プロットを示す。主に第１主成分によってサンプルのグルテンとプライマリースターチが分離でき、主に第２主成分により溶媒含有率（含水率）が説明される。ここで、主成分得点は、新たに求めた主成分という変量で表される測定対象物およびサンプルの値である。主成分得点プロットは、２つの主成分を軸とする平面上に、主成分得点を座標として各測定対象物およびサンプルを位置づけることにより、主成分により説明される測定対象物およびサンプル間の差異が視覚的に表現できる図である。
【０１４０】
より厳密には、主成分得点プロット上で、溶媒である水の水分割合を変えたサンプルのプライマリースターチの主成分得点は、図２８の点線のようにある傾きをもった直線上に並ぶ。これらのプライマリースターチサンプル間の差は溶媒量（水分量）のみで説明されるため、データ解析部２４−２によりこの直線は「溶媒軸」（水分軸）と定義することができる（図２８の点線）。さらに、データ解析部２４−２に設定された、溶媒軸に垂直な（すなわち、直交する）「成分軸」（図２８の実線）では、溶媒である水分の影響が取り除かれるため、水分量を考慮せずに測定対象物およびサンプルの属性を考察することができると考えられる。
【０１４１】
サンプルのグルテンは、元々測定対象物のパン生地に含まれていた物質であるが、上述の工程１に示した抽出の過程で溶媒である水を加える操作が入るため、測定対象物のパン生地中のグルテンと、抽出されたグルテン単体の溶媒含有率（水分量）が異なっている可能性がある。サンプルのプライマリースターチの場合も、抽出されたサンプル単体として測定するプライマリースターチの水分含量を測定対象物のパン生地中のデンプンの水分含量に合わせることは困難である。したがって、抽出したサンプルのグルテンとプライマリースターチを測定対象物のパン生地中のグルテンやデンプンに対応させて考える上で、データ解析部２４−２により、溶媒含有率（水分含量）を考慮せずに測定対象物およびサンプル間の差異を調べる本工程２の方法は大変有効である。
【０１４２】
データ解析部２４−２により作成された、第１主成分と第３主成分の主成分得点プロットを図２９に示す。図２９に示すように、データ解析部２４−２により作成された、第１主成分と第２主成分の主成分得点プロットに比べて、サンプルのプライマリースターチサンプルの並び方にばらつきが見られ、「溶媒軸」を見出すことは難しい。しかし、やはり第１主成分によって、サンプルのグルテン、測定対象物のパン生地、サンプルのプライマリースターチは分けることができる。
【０１４３】
なお、塩の有無はＥＥＭに全く反映されなかったため、データ解析部２４−２による主成分分析においても２種類のグルテンを分離することはできなかった。
【０１４４】
（２−４．工程２のまとめ）
以上、上述したように、工程２において、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたＥＥＭに基づいて、データ解析部２４−２によりサンプルのグルテンと測定対象物のパン生地中の他の成分の判別可能性を調べ、判別のための手法を確立した。
【０１４５】
具体的には、工程２において、分光蛍光光度計は、特定の波長の励起光を試料に照射したときの蛍光スペクトルを測定するための装置であるＦ７０００を用いて、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１によりＥＥＭの測定も行うことができ、１試料（例えば測定対象物およびサンプル）につき１つのＥＥＭが測定される。また、工程２において、サンプルのグルテン、プライマリースターチ、測定対象物のパン生地のＥＥＭを励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により計測し、散乱光の除去や次元の調節を行った後、データ解析部２４−２により主成分分析を用いて分析することにより、サンプルのグルテンと測定対象物のパン生地中の他の成分（主にプライマリースターチ）の判別が可能であった。また、工程２において、溶媒含有率（含水率）を変えた溶媒含有サンプルのプライマリースターチは、データ解析部２４−２により第１主成分と第２主成分の主成分得点プロット上で１直線上に並んだ。
【０１４６】
以上で、工程２の説明を終える。
【０１４７】
［工程３．ＥＥＭ  イメージングシステムによるパン生地断面の撮影とグルテン分布の可視化］
続いて、工程３について以下に説明する。
【０１４８】
（３−１．工程３の目的）
上記工程２にて上述した通り、蛍光分光光度計を用いた励起・蛍光マトリクス測定部２４−１によるＥＥＭ測定と、データ解析部２４−２によるＥＥＭデータの主成分分析によって、グルテンとプライマリースターチが判別可能であった。そこで、本工程３では、この工程２の手法を画像計測に応用し、成分分布可視化部２４−３により測定対象物のパン生地断面の平面領域内を１画素ずつ分析することによって、測定対象物のパン生地断面におけるサンプルのグルテン分布を調べ、視覚的にわかりやすい画像という形で表示することを目指した。なお、本工程３は、上述の図３の成分分布可視化部２４−３によるステップＳ４の処理に主に対応する。
【０１４９】
（３−２．工程３の材料と方法）
（３−２−１  励起・蛍光マトリクス）
励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）を測定する方法は大別して２種類ある。１つ目の方法は、上述の図８に示すように、測定機器の素子の位置をｘｙ方向に変えながら、試料断面の１画素にあたる領域の励起・蛍光マトリクスを順次測定していくＸＹ走査法、ライン走査法などである。ＸＹ走査法では、単素子の検出器で試料断面の励起・蛍光マトリクスを測定し、ライン走査法では、単素子が１列に並んだ検出器で一度に複数の画素の励起・蛍光マトリクスを測定する。しかし、いずれの方法も試料断面が大きい場合は測定に時間を要する。
【０１５０】
２つ目の方法は、図３０に示すように、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により、試料断面全体を特定の励起波長の光で照射し、観察蛍光波長を次々に変えて撮影をおこなうという操作を，励起波長も変えながら繰り返していくイメージ撮影法であり、画像の取得が迅速なことが特徴である。本工程３においても、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１によりこのイメージ撮影法を用いている。しかし、試料を完全に均一な励起光で照らすことは難しく、照明ムラを取り除く作業が必要な場合もある。
【０１５１】
（３−２−２．ＥＥＭイメージングシステム）
以下に本工程３において用いた測定機器について説明する。励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により、イメージ撮影法によってＥＥＭデータを測定するＥＥＭイメージングシステム（ＥＥＭ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＥＥＭ−ＩＳ）の概要を上述の図１４に示す。なお、ＥＥＭイメージングシステムは、蛍光画像撮影装置１０に相当する。
【０１５２】
図１４に示すように、ＥＥＭ−ＩＳは、分光照明装置１１（分光照明部）と分光撮影装置１２（分光観察部）によって構成されている。分光照明装置１１は、光源１１０として１５０Ｗのキセノンランプ光源に、分光装置１１２としてグレーティング型分光器を取り付けた装置（相馬光学（会社名）製の特注品）であり、励起光の波長範囲は２００−１０００ｎｍ、波長誤差は±１ｎｍである。また、半値幅（ピークの最大値に対して半分の強度となる波長範囲。ピークの幅を示す）は１０ｎｍである。
【０１５３】
分光撮影装置１２は、光学部１２０として蛍光顕微鏡（ＢＸＦＭ（型番），オリンパス（会社名））、分光装置１２２として液晶チューナブルフィルタ（ＶＳ−ＶＩＳ２−１０−ＭＣ−３５（型番），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．（会社名））及び、画像撮影装置１２４としてＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス（会社名）製のＯＲＣＡ−ＥＲ−１３９４（型番））からなる。液晶チューナブルフィルタ（ＬＣＴＦ）は、内蔵された液晶チューニングエレメントに印加する電圧を変えることによってフィルタを透過する蛍光の波長を４００−７２０ｎｍの範囲、波長誤差１．２５ｎｍで変えることができる。蛍光の半値幅は２０ｎｍである。ＣＣＤカメラの画素数は１，３４４×１，０２４、階調度は１２ｂｉｔ（４０９６段階）である。
【０１５４】
キセノンランプから発せられた光は分光器によって単一波長に分光され、測定対象物・サンプル１３に照射される。測定対象物・サンプル１３が発する蛍光スペクトルのうち、液晶チューナブルフィルタを透過した波長の光のみがＣＣＤカメラに到達し、測定対象物およびサンプル１３の断面の撮影が行われる。分光器を通る励起光の波長を一定に保ったまま、液晶チューナブルフィルタを透過可能な蛍光の波長を変えながら試料断面を撮影していくことにより、その励起光のもとでの蛍光スペクトルを測定できる。次に分光器を通る励起光の波長を変え、同じように蛍光スペクトルを測定する。これを繰り返すことにより、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１によりＥＥＭを測定できる。
【０１５５】
（３−２−３．測定試料）
励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定する試料（例えば測定対象物およびサンプル等）には、サンプルとして塩を添加したグルテン、サンプルとして２通りの溶媒含有率（水分含量）に設定したプライマリースターチ、測定対象物としてディベロップ段階のパン生地を用いた。サンプルのグルテンと測定対象物のパン生地は、凍結保存されたものを常温に戻し、完全に解凍されてから測定用セルに入れて、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定した。
【０１５６】
測定対象物のパン生地から抽出したサンプルのグルテンとプライマリースターチと、測定対象物のパン生地中のグルテンとデンプンを対応させるためには、サンプルのプライマリースターチを測定対象物のパン生地中のデンプンと同じ溶媒含有率（含水率）に調整する必要がある。本工程３では、２通りの溶媒含有率（水分量）に調整した。以下に２通りの水分量と、その水分量に決めた理由を述べる。
【０１５７】
Ｂａｋｅｒらによると、測定対象物のパン生地中のデンプン粒は水和物として存在しており、デンプン粒が吸収している水分量は、デンプンを飽和蒸気圧下に放置したときに吸収する水分の量に等しい。そこで、本工程３では、１つ目のプライマリースターチのサンプルとして、凍結乾燥させたプライマリースターチを解凍して蒸発プレートに入れ、グルテンと同じ濃度（２．０％）の食塩水と共に密閉容器内で４８時間放置し、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定した。放置前と放置後では、放置前の質量を基準として１．９１％質量が増加した。状態としては、多少湿っていたが、粉状であった。
【０１５８】
２つ目のプライマリースターチのサンプルでは、解凍したプライマリースターチと溶媒の水を１０：７の割合で混合した。これは、測定対象物のパン生地作成の際の小麦粉と水の割合（溶媒含有率）に等しい。つまり、小麦粉に対して加えた溶媒の水分がデンプンにもグルテンにも均一に分布していることを前提としている。以降、１つ目のプライマリースターチは「ＰＳ（粉状）」、２つ目のプライマリースターチは「ＰＳ（加水）」と記述する。
【０１５９】
（３−２−４．測定条件）
励起・蛍光マトリクス測定部２４−１による測定条件を図３１にまとめる。
【０１６０】
図３１に示すように、蛍光波長範囲は、一般的な液晶チューナブルフィルタにおいて測定可能な最大範囲である。散乱光の影響を取り除くため、測定蛍光波長を励起波長よりも５０ｎｍ以上長波長側に設定している。
【０１６１】
ノイズの影響を最小化するためには、測定蛍光強度を大きくする必要がある。そのために、露光時間は最長の１０秒に設定した。
【０１６２】
ビニングは、ＣＣＤカメラの画素を一定数ひとまとめにし、受光面積を大きくすることにより感度を上げることを表し、ビニング２×２とは、縦２画素、横２画素の計４画素をまとめることを意味する。ビニングを大きくすると、弱い蛍光をとらえることが可能になるが、解像度は下がる。ＥＥＭ−ＩＳのビニングは、１×１から最大８×８まで指定できる。本工程３では、蛍光強度はある程度犠牲にしても解像度を上げるため、ビニングを２×２に設定した。
【０１６３】
倍率は、結像レンズでは１倍、対物レンズでは２．５倍とした。
【０１６４】
カメラの画素数とビニング、顕微鏡倍率から、１視野の大きさは１．８９ｍｍ×１．４４ｍｍ、解像度は２．８１μｍ／ピクセルとなった。ただし、データ量が多いこと、及び視野の縁部分は照明ムラの影響を受けやすいことから、実際に励起・蛍光マトリクス測定部２４−１による測定に使ったものは、画像の中心の、縦・横の長さが元の画像の１／４となる範囲である（図３２を参照）。
【０１６５】
（３−２−５．ダーク補正とフラット補正）
ＥＥＭ−ＩＳにおいて測定したデータには、カメラのノイズや装置の照明ムラが含まれてしまう。そこで、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１によりカメラのノイズを取り除くダーク補正と照明ムラを補正するフラット補正を行った。
【０１６６】
ＣＣＤカメラには熱雑音などにより発生する暗電流ノイズが存在する。暗電流ノイズの程度は露光時間や温度に依存する。これを補正するために、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１によりＥＥＭと同じ露光時間・ビニングに装置を設定し、カメラのシャッターを閉じた状態でダーク画像を撮影した。励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により１６枚のダーク画像を積算平均したものを最終的なダーク画像とし、各波長条件で撮影したサンプル画像からダーク画像を差し引いた。
【０１６７】
本工程３において用いる上述の図３０に示したイメージ撮影法では、試料（例えば測定対象物およびサンプル等）表面に励起光が不均一に当たる照明ムラが生じることがある。これを補正するために、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により標準白色板の反射光を撮影したフラット画像の輝度値で各測定対象物およびサンプルの画像を割った。具体的には、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により、４２０ｎｍ−６７０ｎｍの範囲で１０ｎｍごとに設定した励起光を標準白色板に当て、同波長での蛍光画像を各波長につき４枚撮影した。２６波長条件×４枚、計１０４枚の画像を積算平均したものをフラット画像とした。
【０１６８】
以下の数式１に示すように、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により各波長における補正サンプル画像を求め、ＥＥＭスペクトルデータ（励起・蛍光マトリクス情報に相当）とした。
補正サンプル画像＝（サンプル画像−ダーク画像）／（フラット画像−ダーク画像）・・・（数式１）
【０１６９】
（３−２−６．次元の調整）
空間情報を含まない単純なＥＥＭに対して主成分分析を行う際と同様、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたＥＥＭデータに対してデータ解析部２４−２により主成分分析を行う際は、次元の調整を行う必要がある。ＥＥＭデータは、そのままでは（励起波長）×（蛍光波長）×（試料のｘ方向の画素数）×（試料のｙ方向の画素数）という４次元の形をしている。これを以下のように、データ解析部２４−２により主成分分析で解析できる２次元の形に展開した。
【０１７０】
まず波長については、単純なＥＥＭと同様、励起波長と蛍光波長を合わせて波長条件として扱った。位置情報については、データ解析部２４−２により２次元画像を図３３に示すように１画素の幅で切っていき、例えば１行目の右端の画素の次は２行目の左端画素というようにつなげ、１次元に展開した。結果として総画素数×波長条件の２次元データが得られ、各画素を１つずつの測定対象物およびサンプルとして、各波長条件を変量として扱うことにより、データ解析部２４−２により主成分分析を行うことができた。
【０１７１】
（３−２−７．主成分分析）
本工程３では、データ解析部２４−２により２通りの主成分固有ベクトルを用いて主成分分析を行った。すなわち、サンプルのグルテンとＰＳ（加水）のＥＥＭデータから計算した固有ベクトルと、測定対象物のパン生地のＥＥＭデータから計算した固有ベクトルである。
【０１７２】
測定対象物のパン生地には、グルテンとデンプンが含まれているため、パン生地断面を十分な解像度で励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定すれば、グルテンが観察される画素とデンプンが観察される画素が存在するはずである。つまり、サンプルのグルテンとプライマリースターチを励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により別々に測定したデータと似たようなデータが得られるはずである。励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたＥＥＭのデータは直接比べることができないため、データ解析部２４−２により主成分分析から得られた結果を比べることになる。
【０１７３】
そこで、データ解析部２４−２により、サンプルのグルテンとＰＳ（加水）からの固有ベクトルと、測定対象物のパン生地からの固有ベクトルを求め、データ解析部２４−２により各測定対象物およびサンプルにおける各画素の主成分得点を求めた。
【０１７４】
全画素の主成分得点を主成分得点プロットで表現することは、画素数が多すぎるため、データ解析部２４−２により主成分得点プロットを作成する際、ランダムサンプリングを用いて、各測定対象物およびサンプル断面の画像から５０画素を選び、画像全体を代表する点とした。
【０１７５】
（３−２−８．水分の影響の除去）
データ解析部２４−２により主成分分析の結果として求まる主成分得点は、測定対象物およびサンプル間の溶媒含有率（水分含量）の差に影響を受ける（上述の２−３−４を参照）。一方、測定対象物のパン生地から抽出したサンプルのグルテンには抽出する際に使用された溶媒の水が残っているため、測定対象物のパン生地中のグルテンと溶媒含有率（含水率）が異なっている可能性がある。また、測定対象物のパン生地中のデンプンと同じ溶媒含有率（含水率）にするためにサンプルのプライマリースターチに加えるべき水の量に関して考察したが（上述の２−２−３を参照）、実際の溶媒含有率（含水率）は未知である。したがって、測定対象物のパン生地中のグルテンやデンプンと、測定対象物のパン生地から抽出したサンプルのグルテンやプライマリースターチを同列に扱うには溶媒の水分の影響を取り除く必要がある。本工程３では、データ解析部２４−２により次に述べるような方法で主成分得点に対し溶媒の水分の影響を取り除く処理を行った。
【０１７６】
図３４に示す第１主成分（ｘ軸）と第２主成分（ｙ軸）の主成分得点プロットを用いてデータ解析部２４−２の処理を説明する。図３４の上図に示すように、ＰＳ（粉状）とＰＳ（加水）のサンプルの差異は溶媒含有率（水分含量）にある。したがって、データ解析部２４−２により、サンプルのＰＳ（粉状）とＰＳ（加水）それぞれについて、主成分得点プロットにおける分布の重心を求め、２点を通る直線を引くと、この直線は溶媒含有率（水分含量）を表す軸ということができる（以降「溶媒軸」）。
【０１７７】
次に、データ解析部２４−２により、「溶媒軸」と直交する方向に新たな軸をとった。「溶媒軸」と直交するということは、溶媒量（水分量）の影響を受けないということである。この軸を便宜上「成分軸」とよぶ。図３４の下図に示すように、ｘ軸を「成分軸」、ｙ軸を「溶媒軸」とする新たな直交座標系を考えると、ｙ座標は測定対象物およびサンプルの溶媒含有率（水分含量）を表し、ｘ座標は溶媒の水分以外の測定対象物およびサンプルの差を表す。
【０１７８】
ここで、図３５に「成分軸」における座標の一例として、重心座標（ｘＧ１，ｙＧ１）、（ｘＧ２，ｙＧ２）を示す。
【０１７９】
（３−２−９．主成分得点の画像化）
成分分布可視化部２４−３により、図３６に示すように青〜黄色〜赤の色軸を「成分軸」に当てはめ、「成分軸」における座標を色に変換した。
【０１８０】
具体的な計算方法を示す。
【０１８１】
上述の３−２−８にてデータ解析部２４−２により求めた「成分軸」における座標Ｗについて、成分分布可視化部２４−３によりすべてのピクセルの平均値をμ、標準偏差をσとする。図３６に示すように、成分分布可視化部２４−３により、青〜黄色〜赤の色が連続的に並ぶ色軸に対して、（μ−σ）から（μ＋σ）の範囲の値を対応させた。座標Ｗが（μ−σ）となる点は濃青、（μ＋σ）となる点は濃赤、その間の点は位置に応じた色となった。また、座標Ｗが（μ−σ）未満の場合は濃青、（μ＋σ）より大きい場合は濃赤となった。
【０１８２】
以上の成分分布可視化部２４−３の処理により、一つ一つの画素の主成分得点によって色が決まり、成分分布を反映した画像が得られた。
【０１８３】
（３−３．工程３の結果と考察）
（３−３−１．単一励起蛍光波長による試料断面撮影画像）
図３７および図３８に、成分分布可視化部２４−３により可視化された、励起波長／蛍光波長：３８０／５００ｎｍ、４３０／７１０ｎｍの単一励起蛍光波長による各試料の断面撮影画像を示す。単一波長による撮影なので、その励起蛍光波長における蛍光強度が明暗として現れる。ここで選択した波長４８条件は、主成分分析固有ベクトルの絶対値が大きい波長帯である（後述する３−３−２および３−３−３を参照）。
【０１８４】
図３７に示すように、励起波長／蛍光波長：３５０／５００ｎｍでは、サンプルのグルテンが最も暗く写り、サンプルのプライマリースターチ（粉状）が最も明るい。測定対象物のパン生地の明度はサンプルのグルテンとプライマリースターチ（粉状）の中間である。サンプルのプライマリースターチ（加水）の明度は測定対象物のパン生地に近い。測定対象物のパン生地断面の明度は概ね均一であり、単一波長による測定ではサンプルのグルテンの分布は観察できない。
【０１８５】
図３８に示すように、励起波長／蛍光波長：４３０／７１０ｎｍにおける断面画像も測定対象物およびサンプル間では明度に違いが見られる。この波長帯でも、サンプルのプライマリースターチ（粉状）の画像は他よりも明るい。しかし、励起波長／蛍光波長：３５０／５００ｎｍに比べて、測定対象物およびサンプル間の差は小さい。
【０１８６】
（３−３−２．グルテン、プライマリースターチ（加水）の固有ベクトルによる主成分分析）
励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された、サンプルのグルテンとＰＳ（加水）のＥＥＭデータを用いた、データ解析部２４−２による主成分分析結果から示す。まず、第１から第６主成分の寄与率を図３９に示す。図３９に示すように、第１主成分の寄与率が大きいことがわかる。
【０１８７】
データ解析部２４−２により得られた、第１主成分から第３主成分の主成分負荷量を図４０〜図４２に示す。図４０〜図４２において、主成分負荷量はＥＥＭの形で表示されてお、各波長条件の主成分に対する寄与率が色で表されている。工程２では、データ解析部２４−２により測定対象物およびサンプルのＥＥＭパターンを反映した主成分負荷量が得られたが、ＥＥＭ−ＩＳによる測定データではピークのようなものは見られなかった。
【０１８８】
図３９に示すように、第１主成分によりデータの９５％以上が説明されるため、第１主成分に大きく寄与している励起波長・蛍光波長の組み合わせは結果を左右する波長条件といえる。図４０に示すように、データ解析部２４−２により得られた第１主成分の主成分負荷量では、励起波長４００ｎｍ前後の範囲ですべての蛍光波長において相関が高い。この原因として、ＥＥＭ−ＩＳの分光照明が４００ｎｍ前後で高い強度の励起光を照射する装置特性をもつことが考えられる。励起光強度が高ければ、当然蛍光強度も高くなるため、蛍光波長に関わらず高い相関が見られるのだと考えられる。Ｆ７０００による測定のような成分の蛍光ピークを得るには、装置関数などを導入して分光装置の特性を補正する必要がある。
【０１８９】
図４１および図４２に示すように、データ解析部２４−２により得られた第２、第３主成分の主成分負荷量では、ある１波長条件を除いて主成分との相関は低い。主成分と負の相関が高いのは励起波長／蛍光波長：４３０ｎｍ／７１０ｎｍの組み合わせである。つまり、第２主成分、第３主成分の主成分得点は、この波長条件での蛍光強度によって決まることになる。
【０１９０】
図４３にデータ解析部２４−２により作成された第１主成分と第２主成分の主成分得点プロットを示す。前述の通り、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された各測定対象物およびサンプル画像から５０画素を選び、データ解析部２４−２により作成されたその主成分得点を示した。図４３に示すように、第１主成分と第２主成分の主成分得点プロットでは、サンプルのＰＳ（粉状）が他の試料から大きく離れて分布する。他の３種類の試料は分布範囲が近いが、サンプルのグルテンとＰＳ（加水）の分布はお互いに重ならない。測定対象物のパン生地の分布は、サンプルのグルテンとＰＳ（加水）の中間あたりに位置する。
【０１９１】
図４４に示すように、上述の３−２−８および３−２−９におけるデータ解析部２４−２の処理により、溶媒含有率（含水率）の影響を取り除いた。まず、データ解析部２４−２により、サンプルのＰＳ（粉状）とＰＳ（加水）の重心と求めたところ、サンプルのＰＳ（粉状）の第１主成分の主成分得点平均は２．０４、第２主成分の主成分得点平均は−０．０６９１となった。同様に、データ解析部２４−２により得られた、サンプルのＰＳ（加水）の第１主成分得点平均は１．０３、第２主成分の主成分得点平均は−０．０３２５となった。なお、平均の値は主成分得点プロット上の点だけでなく、全画素の主成分得点から求めている。データ解析部２４−２により得られた、サンプルのＰＳ（粉状）とＰＳ（加水）の主成分得点の平均から、溶媒軸の傾きは、下記の数式２のようになる。なお、数式２において、ｘ軸は第１主成分軸、ｙ軸は第２主成分軸である。
０．０３６６ｘ  ＋  １．０１ｙ・・・（数式２）
【０１９２】
したがって、第１主成分の主成分得点がＸ、第２主成分の主成分得点がＹである画素の「成分軸」上の座標は、下記の数式３のようになる。なお、ここでは「溶媒軸」と「成分軸」の交点を０としている。
０．０３６６Ｘ  ＋  １．０１Ｙ・・・（数式３）
【０１９３】
成分分布可視化部２４−３により主成分得点を画像化した結果を図４５に示す。図４５に示すように、サンプルのグルテンとＰＳは、それぞれ色軸の両端の色である青と赤で表示され、測定対象物のパン生地は青から赤までの色がまだらになっている。測定対象物のパン生地の画像の中で、青に近い色で表示されている部分はグルテンに近い成分が、赤に近い色で表示されている部分はデンプンに近い成分が存在すると考えられる。
【０１９４】
図４５に示すように、測定対象物のパン生地の画像全体に水色〜緑のまだらが見られ、デンプン粒だと考えられるが、その輪郭は明確ではない。原因としては、まず解像度が足りなかったことが考えられる。１画素にデンプンとグルテンが両方含まれると、データ解析部２４−２により得られた主成分得点はグルテンとデンプンの中間になってしまい、デンプン粒とグルテンの境は曖昧になる。これを解決するには、ビニングを小さくするか、顕微鏡倍率を大きくすることが考えられる。
【０１９５】
もう一つの原因として、励起光が測定対象物およびサンプルの表面だけでなくある程度の深さ迄透過し、その間の物質の蛍光が励起・蛍光マトリクス測定部２４−１によりすべて観察されているということが考えられる。測定対象物およびサンプルの断面の表面にグルテンが存在する場合も、そのすぐ下にデンプン粒がありデンプン粒にも励起光が達すれば、観察される蛍光はグルテンとデンプンの中間となる。これを防ぐためには、試料を薄片化して観察するか、励起光の強度を上げすぎないことが考えられる。
【０１９６】
（３−３−３．パン生地の固有ベクトルによる主成分分析）
励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された、測定対象物のパン生地のＥＥＭデータから、データ解析部２４−２により求めた主成分分析結果を示す。
【０１９７】
データ解析部２４−２により得られた、第１主成分から第６主成分の主成分寄与率を図４６に示す。励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたサンプルのグルテンとＰＣ（加水）のＥＥＭから、データ解析部２４−２により求めた固有ベクトルの寄与率に比べ第１主成分の寄与率は小さいが、第２主成分以降の寄与率に比べ大きい。
【０１９８】
データ解析部２４−２により得られた、第１主成分から第３主成分の主成分負荷量図を図４７〜図４９に示す。励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたサンプルのグルテンとプライマリースターチのＥＥＭから、データ解析部２４−２により求めた主成分固有ベクトルと同様、励起波長４００ｎｍ前後における蛍光強度が大きく、分光照明装置１１の特性を反映していると考えられる。励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたサンプルのグルテンとプライマリースターチのＥＥＭから、データ解析部２４−２により求めた固有ベクトルでは、第２、第３主成分の主成分負荷量は第１主成分の主成分負荷量と全く異なる分布をもつが、図４７〜図４９に示すように、ここではどれも励起波長４００ｎｍ前後に特徴をもつ。
【０１９９】
図５０は、データ解析部２４−２により作成された、第１主成分と第３主成分の主成分得点プロットである。図５０に示すように、測定対象物のパン生地画像中の画素の値の分散を最大化する計算となるため、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたサンプルのグルテンとＰＳ（加水）のＥＥＭデータから、データ解析部２４−２により求めた主成分分析の結果に比べて測定対象物のパン生地中の画素が広い範囲に広がっている。サンプルのＰＣ（粉状）が他の試料と離れて分布している点や、サンプルのグルテンとＰＣ（加水）の分布が重なっていない点は、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたサンプルのグルテンとＰＳ（加水）のＥＥＭデータから、データ解析部２４−２により求めた主成分分析の結果と一致する。
【０２００】
ここで、図５１にデータ解析部２４−２により作成された第１主成分と第３主成分の主成分得点プロットを示しているのは、図４４に示すように、データ解析部２４−２により作成された第１主成分と第２主成分の主成分得点プロットでは、サンプルのグルテンとＰＳ（加水）の分布が重なってしまったからである。データ解析部２４−２における主成分分析では、単純に寄与率の大きい主成分を選択するのではなく、目的とする成分が検出できるように主成分を組み合わせる必要がある。
【０２０１】
図５１に示すように、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたサンプルのグルテンとＰＳ（加水）の固有ベクトルから、データ解析部２４−２により主成分分析により溶媒含有率である含水率の影響を取り除いた。データ解析部２４−２により、サンプルのＰＳ（粉状）とＰＳ（加水）の重心と求めたところ、サンプルのＰＳ（粉状）の第１主成分の主成分得点平均は２．０５、第２主成分の主成分得点平均は−０．０２１６となった。同様に、サンプルのＰＳ（加水）の第１主成分得点平均は１．０３、第２主成分の主成分得点平均は−０．００７６となった。サンプルのＰＳ（粉状）とＰＳ（加水）の主成分得点の平均から、溶媒軸の傾きは、下記の数式４にようになる。なお、数式７において、ｘ軸は第１主成分軸、ｙ軸は第２主成分軸である。
０．０１４ｘ  ＋  １．０２ｙ・・・（数式４）
【０２０２】
したがって、データ解析部２４−２により得られた、第１主成分の主成分得点がＸ、第２主成分の主成分得点がＹである画素の「溶媒軸」上の座標は、下記の数式５にようになる。上述の３−３−２と同様、「溶媒軸」と「成分軸」の交点を０としている。
０．０１４Ｘ  ＋  １．０２Ｙ・・・（数式５）
【０２０３】
図５２に、データ解析部２４−２により得られた測定対象物のパン生地の主成分固有ベクトルから、成分分布可視化部２４−３により求めた４サンプルの画像を示す。励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたサンプルのグルテンとプライマリースターチのＥＥＭから、データ解析部２４−２により計算した主成分固有ベクトルを用いて、成分分布可視化部２４−３により可視化した画像と比べて、測定対象物のパン生地における画素ごとのコントラストが明確である。
【０２０４】
図５２に示すように、図４５と同様に、サンプルのグルテンの画像はおおむね青、サンプルのプライマリースターチの画像はおおむね赤で表示され、測定対象物のパン生地中の青い部分はグルテンが多く、赤い部分はデンプンが多いと考えられる。画像の解像度はやはり低く、デンプン粒の輪郭が見られる画像を得るためには工夫が必要だと思われる。
【０２０５】
図５２に示すように、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたサンプルのグルテンとプライマリースターチのＥＥＭから、データ解析部２４−２により計算した固有ベクトルを成分分布可視化部２４−３により可視化した画像と、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された測定対象物のパン生地のＥＥＭから、データ解析部２４−２により計算した固有ベクトルを成分分布可視化部２４−３により可視化した画像とは、コントラストの違いはあるものの、グルテンやデンプンの大体の分布は似ている。これは、データ解析部２４−２により得られた第１主成分の固有ベクトルが似ているからだと考えられる。寄与率が大きい第１主成分の固有ベクトルが似ているという性質を用いることにより、測定対象物のパン生地中のグルテンを成分分布可視化部２４−３により可視化する際、測定対象物から抽出することでサンプルのグルテンやプライマリースターチを用意しなくても、測定対象物パン生地のＥＥＭデータだけで同じような結果が得られる可能性がある。これは測定や解析の簡便化を考える上で重要である。
【０２０６】
（３−４．工程３のまとめ）
以上、上述したように、工程３において、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された光学的情報と試料断面上の位置情報を合わせもつ励起・蛍光マトリクスを用い、データ解析部２４−２により測定対象物のパン生地断面の平面領域内を１点ずつ分析することによって、測定対象物のパン生地断面におけるグルテン分布を調べ、成分分布可視化部２４−３により可視化した。
【０２０７】
また、工程３において、ＥＥＭをＥＥＭイメージングシステムを用いて、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定した。分光器を通る励起光の波長を一定に保ったまま、蛍光の波長を変えながら試料断面を撮影していくことにより、その励起光のもとでの励起・蛍光マトリクスを励起・蛍光マトリクス測定部２４−１にて測定できる。次に分光器を通る励起光の波長を変え、同じように励起・蛍光マトリクスを励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により測定する。このように様々な励起光・蛍光の組み合わせで測定対象物およびサンプルを撮影することにより励起・蛍光マトリクス測定部２４−１にて励起・蛍光マトリクスを得た。
【０２０８】
また、工程３において、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得されたサンプルのグルテンとプライマリースターチ（加水）のＥＥＭデータから、データ解析部２４−２により計算した固有ベクトルと、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１により取得された測定対象物のパン生地のＥＥＭデータから、データ解析部２４−２により計算した固有ベクトルから主成分得点を求めた。
【０２０９】
また、工程３において、溶媒含有率が異なる２つのプライマリースターチのサンプルについて、データ解析部２４−２によりそれぞれの主成分得点の分布の重心を通る直線を「溶媒軸」と定義し、「溶媒軸」と直交する「成分軸」を成分分布可視化部２４−３にて画像作成に用いることにより、溶媒の影響を取り除いた。データ解析部２４−２により設定された「溶媒軸」と直交する「成分軸」に対して、成分分布可視化部２４−３により色軸を対応させることにより各画素の色を決め、測定対象物のパン生地中のグルテンとデンプンの分布を可視化することに成功した。
【０２１０】
また、工程３において、データ解析部２４−２により得られた異なる２つの固有ベクトルから、成分分布可視化部２４−３により求めた画像では、グルテンやデンプンの分布が似ており、測定対象物のパン生地のみのデータで、測定対象物のパン生地中の成分分布が可視化できる可能性が示唆された。
【０２１１】
また、工程３において、励起・蛍光マトリクス測定部２４−１にて取得される画像の解像度を上げるためには、カメラの解像度を上げることや、励起光強度を調節する必要がある。
【０２１２】
以上で、工程３についての説明を終える。
【０２１３】
［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。
【０２１４】
また、実施の形態において説明した各処理のうち、自動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を手動的に行うこともでき、あるいは、手動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を公知の方法で自動的に行うこともできる。
【０２１５】
このほか、上記文献中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各処理の登録データや検索条件等のパラメータを含む情報、画面例、データベース構成については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
【０２１６】
また、成分分布分析システムに関して、図示の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。
【０２１７】
例えば、成分分布分析装置２０の各装置が備える処理機能、特に計算処理部２４にて行われる各処理機能については、その全部または任意の一部を、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）および当該ＣＰＵにて解釈実行されるプログラムにて実現してもよく、また、ワイヤードロジックによるハードウェアとして実現してもよい。尚、プログラムは、後述する記録媒体に記録されており、必要に応じて成分分布分析装置２０に機械的に読み取られる。すなわち、ＲＯＭまたはＨＤなどのメモリ２１などは、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）として協働してＣＰＵに命令を与え、各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されている。このコンピュータプログラムは、ＲＡＭにロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働して制御部を構成する。
【０２１８】
また、このコンピュータプログラムは、成分分布分析装置２０に対して任意のネットワークを介して接続されたアプリケーションプログラムサーバに記憶されていてもよく、必要に応じてその全部または一部をダウンロードすることも可能である。
【０２１９】
また、本発明に係るプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ等の任意の「可搬用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。
【０２２０】
また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
【０２２１】
メモリ２１に格納される各種のデータベース等は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等のストレージ手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラムやテーブルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。
【０２２２】
また、成分分布分析装置２０は、既知のパーソナルコンピュータ、ワークステーション等の情報処理装置を接続し、該情報処理装置に本発明の方法を実現させるソフトウェア（プログラム、データ等を含む）を実装することにより実現してもよい。
【０２２３】
更に、装置の分散・統合の具体的形態は図示するものに限られず、その全部または一部を、各種の付加等に応じて、または、機能負荷に応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。
【産業上の利用可能性】
【０２２４】
以上詳述に説明したように、本発明によれば、励起・蛍光マトリクス（ＥＥＭ）に基づき測定対象物と当該測定対象物から抽出されたサンプル間の成分分布の差異を分析する場合であっても、測定対象物とサンプル間における溶媒含有率の影響を除去することができ、測定対象物の特定の成分をより明確に分析することができる、成分分布分析方法および成分分布分析装置を提供することができるので、食品等の内部の構造の分析など様々な用途に好適に利用できる。
【符号の説明】
【０２２５】
１０  蛍光画像撮影装置
１１  分光照明装置
１１０  光源
１１２  分光装置
１１４  励起波長調節部
１１６  光ファイバー
１１８  励起光照射部
１２  分光撮影装置
１２０  光学部
１２２  分光装置
１２４  画像撮影装置
１３  測定対象物・サンプル
２０  成分分布分析装置
２１  メモリ
２２  キーボード・マウス
２３  制御部
２４  計算処理部
２４−１  励起・蛍光マトリクス測定部
２４−２  データ解析部
２４−３  成分分布可視化部
３０  ディスプレイ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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