(57)【要約】【課題】液相合成法による疎水性環境下でのオリゴヌクレオチドの合成に利用できる化合物であって、従来行われていた液相合成法における分離・回収操作を行うことに起因するオリゴヌクレオチドの合成反応全体の収率の低下の問題を解決可能な疎水性基結合ヌクレオシド、これを溶解した疎水性基結合ヌクレオシド溶液、及びこれを用いた疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法を提供すること。【解決手段】下記一般式（１）で示される疎水性基結合ヌクレオシド。2010275254.tif 000016【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で示される疎水性基結合ヌクレオシド。
【化１】
2010275254.tif 000015
［上記一般式（１）において、Ｒ１は炭素原子数１以上１２以下の炭化水素鎖であり、Ｒ２は炭素原子数１以上２２以下の２価の炭化水素鎖であり、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、炭素原子数１以上２２以下の炭化水素基、又はＲ３及びＲ４が互いに結合して形成される炭素原子数１以上２２以下の２価の炭化水素鎖（ヘテロ原子を含んでいてもよい）であり、Ｒ５は炭素原子数０以上２２以下の２価の炭化水素鎖であり、Ｒ６はそれぞれ独立に炭素原子数６以上３０以下の炭化水素鎖であり、ｎは２以上６以下の整数であり、Ｘは水素原子、水酸基、又は保護基により保護された水酸基であり、Ｙは酸性条件下で脱保護可能な保護基であり、Ｚは、極性基が保護基により保護されていてもよい、アデニル基、グアニル基、シトシル基、チミニル基、若しくはウラシル基、又はこれらの誘導体である。］
【請求項２】
上記一般式（１）において、ｎが３であり、Ｒ６が炭素原子数６から３０のアルキル基であって、Ｒ５に対して３位、４位、及び５位に炭素原子数６から３０のアルコキシ基が結合する請求項１に記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
【請求項３】
Ｒ２が炭素原子数１以上２２以下のアルキレン鎖であり、Ｒ３及びＲ４が互いに結合して炭素原子数１以上２２以下のアルキレン鎖を形成する請求項１又は２に記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２がエチレン鎖であり、Ｒ３及びＲ４が互いに結合してエチレン鎖を形成し、Ｒ５が単結合である請求項１から３のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
【請求項５】
Ｙで示される酸性条件下で脱保護可能な保護基がジメトキシトリチル基である請求項１から４のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシドを非極性溶媒に溶解させた疎水性基結合ヌクレオシド溶液。
【請求項７】
前記非極性溶媒が、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、及び酢酸エチルからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６に記載の疎水性基結合ヌクレオシド溶液。
【請求項８】
非極性溶媒中において、請求項１から５のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシド又は前記疎水性基結合ヌクレオシドが有する５単糖残基の５位の炭素原子に結合する基にヌクレオシドホスホロアミダイト化合物が結合した化合物と、酸・アゾール複合体化合物により活性化されたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物と、を液相合成法により結合させる反応を複数回行う段階を含み、前記疎水性基結合ヌクレオシド又はこれに結合したヌクレオシド残基の有する５単糖残基の５位の炭素原子と、その５’末端側に隣接するヌクレオシド残基の有する５単糖残基の３位の炭素原子とが、リン酸基を介して連続的に結合した構造を有する疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成する工程と、
疎水性基結合オリゴヌクレオチドに結合した保護基を脱保護する工程と、
溶液温度及び／又は溶液組成を変化させることにより、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを分離する工程と、を有する疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法。
【請求項９】
１０量体以上の疎水性基結合オリゴヌクレオチドを９７％以上の収率で合成する請求項８に記載のオリゴヌクレオチド合成方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチド合成プラントにおいて行われる請求項８又は９に記載の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性基結合ヌクレオシド、及び疎水性基結合ヌクレオシド溶液、並びに簡易的に構築可能な疎水性環境下での液相合成法による疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、オリゴヌクレオチドの合成は、一般には、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法により行われている（非特許文献１、２）。ここで、ホスホロアミダイト法を用いたオリゴヌクレオチドの合成は、オリゴヌクレオチドやヌクレオシドを溶解可能な親水性溶媒中で行われている。しかしながら、親水性溶媒中に存在する水により、ホスホロアミダイト法において用いられるヌクレオシドホスホロアミダイト化合物の、酸・アゾール複合体化合物による活性化が阻害される。このため、水存在下においても、速やかに反応を完結させ、且つ目的とするオリゴヌクレオチドの収率を高めるためには、大過剰のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物と、テトラゾール系化合物と、を使用しなければならないという問題点がある（非特許文献２）。
【０００３】
また、上記固相合成法は、容積が約１〜１０ｍｌ程度の小さな反応容器を備えた専用の自動合成機を用いて行われる。反応容器内においては、固相担体の自由度がきわめて制限され、しかも合成反応の起こる場所が固相担体と反応溶液との界面に限定されてしまう。したがって、合成反応の効率を向上させ、目的とするオリゴヌクレオチドをより高い収率で合成するためには、固相担体に微細孔を形成する等、固相担体と反応溶液との界面の面積を増加させる必要がある。しかしながら、固相担体と反応溶液との界面の面積を増加させた場合であっても、オリゴヌクレオチド合成反応は、固相担体による立体障害の影響により円滑に進行しない可能性があり、しかも固相担体の強度も、微細孔の形成により低下してしまうという不都合がある。
【０００４】
固相合成法においては、固相担体として広く一般的にＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）が使用されている。しかしながら、ＣＰＧは、それ自身が親水性基を有しているため、いわゆる親水性環境下での化学反応に用いられるものであり、水の存在しない疎水性環境下でのオリゴヌクレオチドの合成には好適に用いることができないという欠点がある。
【０００５】
また、固相担体としてポリスチレンを用いた固相合成法も開発されている。しかしながら、この固相合成法においては、反応容器内（カラム）においてポリスチレンが膨潤し、その結果、通液抵抗の増大による余分な試薬類、副反応物等の洗浄不良、あるいは反応容器の変形を誘発することがある等の問題点を有する。
【０００６】
一方、オリゴヌクレオチド合成法の開発初期より、いわゆる液相合成法を用いたオリゴヌクレオチドの合成も試みられている。一般的な液相合成法は複数の反応工程からなるため、反応工程毎に生成物の分離及び回収操作が必要となる。したがって、液相合成法を用いたオリゴヌクレオチドの合成は、各反応工程における操作が煩雑であり、各反応工程における分離・回収操作での中間生成物の回収効率が許容範囲内ものであったとしても、オリゴヌクレオチド合成反応全体としてみた収率は、著しく低下してしまうという問題点を有する。このため、液相合成法は、例えば合成オリゴヌクレオチドの主な使用例である多種のＰＣＲ用プライマーを迅速に合成する手法としては適していない。また、液相合成法によるオリゴヌクレオチドの合成は、自動化あるいは機械化が困難であり、せいぜい３量体や４量体のオリゴヌクレオチドを数ミリグラム程度、手動で合成するに留まり、それ以上の重合度を有するオリゴヌクレオチドを大量且つ迅速に合成することはできないものである。
【０００７】
液相合成法の一例として、ポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」という。）を結合させたＰＥＧ結合ヌクレオシドを使用したホスホロアミダイト法による合成方法がある（例えば、特許文献１）。ＰＥＧ結合ヌクレオシドを使用したホスホロアミダイト法においては、ＰＥＧ結合ヌクレオシドを構成するＰＥＧ分子自身が単分子ではないため、薄層クロマトグラフィーやＭＳスペクトルを用いて測定しても、カップリング反応の進行状況を確認することは困難である。このため、上記液相合成法においては、合成されたオリゴヌクレオチドの５’末端を保護するトリチル基を切断し、その発色を都度測定することが固相合成法と同様に行われている（非特許文献３）。上記ＰＥＧ結合ヌクレオシドは、親水性化合物であり、液相合成法による親水性環境下でのオリゴヌクレオチドの合成にのみ利用できる化合物である。したがって、ＰＥＧ結合ヌクレオシドを使用した合成方法は、極性溶媒を用いた親水性環境下で合成が行われ、合成段階において反応容器中の水分を含んでしまうという問題点を有する（非特許文献１）。なお、本件特許出願人は、本件発明に関連する文献公知発明が記載された刊行物として、以下の技術文献を開示する
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓ．  Ｌ．  Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｂｅｒｇｓｔｏｒｍ，  Ｇ．  Ｄ．  Ｇｌｉｃｋ，  Ｒ．  Ａ．  Ｊｏｎｅｓ；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（２０００）
【非特許文献２】関根光雄、齋藤烈編、「ゲノムケミストリー−人工核酸を活用する科学的アプローチ」、講談社サイエンティフィック（２００３）
【非特許文献３】Ｇ．  Ｍ．  Ｂｏｎｏｒａ，  Ｇ．  Ｂｉａｎｃｏｔｔｏ，  Ｍ．  Ｍａｆｆｉｎｉ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｓｃｒｅｍｉｎ；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；  １９９３，  Ｖｏｌ．２１，  Ｎｏ．５，  ｐｐ．１２１３−１２１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、液相合成法による疎水性環境下において、オリゴヌクレオチドの合成に利用できる疎水性基結合ヌクレオシドを提供することにある。また、本発明の課題は、簡易且つ容易にしかも高収率にて、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成することが可能な合成方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、保護基により保護されたヌクレオシドの有するリボース又はデオキシリボース残基の３位の水酸基に、所定の疎水性基（有機系単分子ナノキャリア）を導入することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、以下の技術的事項から構成される。即ち、本発明は以下のものを提供する。
【００１２】
［１］  下記一般式（１）で示される疎水性基結合ヌクレオシド。
【化１】
2010275254.tif 000002
［上記一般式（１）において、Ｒ１は炭素原子数１以上１２以下の炭化水素鎖であり、Ｒ２は炭素原子数１以上２２以下の２価の炭化水素鎖であり、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、炭素原子数１以上２２以下の炭化水素基、又はＲ３及びＲ４が互いに結合して形成される炭素原子数１以上２２以下の２価の炭化水素鎖（ヘテロ原子を含んでいてもよい）であり、Ｒ５は炭素原子数０以上２２以下の２価の炭化水素鎖であり、Ｒ６はそれぞれ独立に炭素原子数６以上３０以下の炭化水素鎖であり、ｎは２以上６以下の整数であり、Ｘは水素原子、水酸基、又は保護基により保護された水酸基であり、Ｙは酸性条件下で脱保護可能な保護基であり、Ｚは、極性基が保護基により保護されていてもよい、アデニル基、グアニル基、シトシル基、チミニル基、若しくはウラシル基、又はこれらの誘導体である。］
【００１３】
［１］に記載の疎水性基結合ヌクレオシドにおいては、５単糖残基の３位の炭素原子に結合する酸素原子を介して、疎水性基である有機系単分子ナノキャリアが結合することにより、両親媒性となっている。このため、疎水性基結合ヌクレオシドは、非極性溶媒に容易に溶解可能であり、水の存在しない疎水性環境下におけるオリゴヌクレオチド合成反応にも容易に適用することができる。
【００１４】
更に、上記疎水性基は、ベンゼン環上に炭素原子数６以上３０以下の炭化水素鎖が、酸素原子を介して２以上６以下結合した基を有する。上記疎水性基にこのような芳香族基が結合していることにより、溶液組成及び／又は溶液温度の変化に伴い、上記疎水性基結合ヌクレオシド及びこれを用いて合成される疎水性基結合オリゴヌクレオチドを晶析させることができ、液相合成法によるオリゴヌクレオチド合成反応においても、中間生成物や最終生成物を高収率で分離・回収することができる。
【００１５】
更に、上記疎水性基は、２つのカルボニル基を有する炭化水素鎖部分、２つの３級アミノ基を有する炭化水素鎖部分、及びカルボニル基を有する芳香族基部分からなるものである。上記疎水性基がこのような構成を有することにより、ヌクレオシドと、２つのカルボキシル基を有する炭化水素化合物と、２つの２級アミノ基を有する炭化水素化合物と、カルボキシル基を有する芳香族化合物と、を適切な手法により結合させることにより、上記疎水性基を有する疎水性基結合ヌクレオシドを容易に合成することができる。
【００１６】
［２］  上記一般式（１）において、ｎが３であり、Ｒ６が炭素原子数６から３０のアルキル基であって、Ｒ５に対して３位、４位、及び５位に炭素原子数６から３０のアルコキシ基が結合する［１］に記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
【００１７】
［３］  Ｒ２が炭素原子数１以上２２以下のアルキレン鎖であり、Ｒ３及びＲ４が互いに結合して炭素原子数１以上２２以下のアルキレン鎖を形成する［１］又は［２］に記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
【００１８】
［４］  Ｒ１及びＲ２がエチレン鎖であり、Ｒ３及びＲ４が互いに結合してエチレン鎖を形成し、Ｒ５が単結合である［１］から［３］のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
【００１９】
［５］  Ｙで示される酸性条件下で脱保護可能な保護基がジメトキシトリチル基である［１］から［４］のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
【００２０】
［２］から［５］に記載の疎水性基結合ヌクレオシドは、［１］に記載の疎水性基結合ヌクレオシドをより好ましい態様に限定したものである。したがって、［２］から［５］に記載の疎水性基結合ヌクレオシドによれば、［１］に記載の疎水性基結合ヌクレオシドと同等の効果を得ることができる。
【００２１】
［６］  ［１］から［５］のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシドを非極性溶媒に溶解させた疎水性基結合ヌクレオシド溶液。
【００２２】
［６］に記載の疎水性基結合ヌクレオシド溶液は、［１］から［５］に記載の疎水性基結合ヌクレオシドを非極性溶媒中に溶解させたものである。上記疎水性基結合ヌクレオシドは、上記所定の疎水性基（有機系単分子ナノキャリア）を有するので、非極性溶媒中においても均一に溶解することができる。即ち、上記疎水性基結合ヌクレオシド溶液は、従来公知のヌクレオシド誘導体を非極性溶媒に溶解させたヌクレオシド溶液と比べても、より均一に溶解された溶液となるとともに、疎水性環境下におけるオリゴヌクレオチド合成方法にも好適に用いることができる。
【００２３】
［７］  前記非極性溶媒が、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、及び酢酸エチルからなる群から選ばれる少なくとも一種である［６］に記載の疎水性基結合ヌクレオシド溶液。
【００２４】
［６］に記載の疎水性基結合ヌクレオシド溶液において、非極性溶媒を［７］に記載の非極性溶媒に限定することにより、疎水性基結合ヌクレオシド溶液中における疎水性基結合ヌクレオシドの溶解度が向上し、且つ、より疎水性が強い疎水性環境を構築することができる。
【００２５】
［８］  非極性溶媒中において、［１］から［５］のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシド又は前記疎水性基結合ヌクレオシドが有する５単糖残基の５位の炭素原子に結合する基にヌクレオシドホスホロアミダイト化合物が結合した化合物と、酸・アゾール複合体化合物により活性化されたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物と、を液相合成法により結合させる反応を複数回行う段階を含み、前記疎水性基結合ヌクレオシド又はこれに結合したヌクレオシド残基の有する５単糖残基の５位の炭素原子と、その５’末端側に隣接するヌクレオシド残基の有する５単糖残基の３位の炭素原子とが、リン酸基を介して連続的に結合した構造を有する疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成する工程と、疎水性基結合オリゴヌクレオチドに結合した保護基を脱保護する工程と、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させることにより、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを分離する工程と、を有する疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法。
【００２６】
［８］に記載の発明によれば、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドを用いて、液相合成法により疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成する反応を行う。上記疎水性基結合ヌクレオシドは、非極性溶媒に容易に溶解可能であるため、疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成反応を水が存在しない条件下で容易に行うことができる。このため、疎水性基結合オリゴヌクレオチドの合成の際に用いられるヌクレオシドホスホロアミダイト化合物の、酸・アゾール複合体化合物による活性化が阻害されない。したがって、オリゴヌクレオチド合成量を向上させるために、大過剰のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物と、酸・アゾール複合体化合物と、を用いる必要がなく、疎水性基結合オリゴヌクレオチドの合成反応を、高収率にて行うことができる。
【００２７】
更に、［８］に記載の発明において用いられる、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドは、溶液温度及び／溶液組成の変化により晶析するため、液相合成法によるオリゴヌクレオチド合成反応においても、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させることにより、中間生成物や最終生成物を高収率にて分離・回収することができる。
【００２８】
［９］  １０量体以上の疎水性基結合オリゴヌクレオチドを９７％以上のカップリング収率で合成する［８］に記載のオリゴヌクレオチド合成方法。
【００２９】
［１０］  オリゴヌクレオチド合成プラントにおいて行われる［８］又は［９］に記載の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法。
【００３０】
［９］に記載の発明においては、本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の結果得られるオリゴヌクレオチドの重合状態及び、疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の収率を規定したものである。本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法は、上述したような効果を有するため、多量体のオリゴヌクレオチドを高収率にて合成・回収することが難しい液相合成法においても、９７％以上の高い収率で、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００３１】
また、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドを用いて合成される疎水性基結合オリゴヌクレオチドは、カルボニル基を有する芳香族基を有しているので、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させることにより晶析する。このため、液相合成法によるオリゴヌクレオチド合成反応においても、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させることにより、中間生成物や最終生成物を、簡易且つ容易にしかも高収率にて分離・回収することができる。したがって、本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法を、合成プラント等において大容量の溶液中で行う場合であっても、簡易且つ容易にしかも高収率にて、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいては、５単糖残基の３位の炭素原子に結合する酸素原子を介して、疎水性を有する基が結合している。このため、上記疎水性基結合ヌクレオシドは、非極性溶媒に容易に溶解可能であり、水の存在しない疎水性環境下におけるオリゴヌクレオチド合成反応にも容易に適用することができる。
【００３３】
更に、上記疎水性基は、ベンゼン環上に炭素原子数６以上３０以下の炭化水素鎖が、酸素原子を介して２以上６以下結合している。上記疎水性基にこのような芳香族基が結合していることにより、溶液組成及び／又は溶液温度の変化に伴い、上記疎水性基結合ヌクレオシド及びこれを用いて合成される疎水性基結合オリゴヌクレオチドを、晶析させることができ、液相合成法によるオリゴヌクレオチド合成反応においても、中間生成物や最終生成物を高収率にて分離・回収することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００３５】
＜疎水性基結合ヌクレオシド＞
本発明の疎水性基結合ヌクレオシドは、下記一般式（１）で示される化合物である。
【化２】
2010275254.tif 000003
［上記一般式（１）において、Ｒ１は炭素原子数１以上１２以下の炭化水素鎖であり、Ｒ２は炭素原子数１以上２２以下の２価の炭化水素鎖であり、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、炭素原子数１以上２２以下の炭化水素基、又はＲ３及びＲ４が互いに結合して形成される炭素原子数１以上２２以下の２価の炭化水素鎖（ヘテロ原子を含んでいてもよい）であり、Ｒ５は炭素原子数０以上２２以下の２価の炭化水素鎖であり、Ｒ６はそれぞれ独立に炭素原子数６以上３０以下の炭化水素鎖であり、ｎは２以上６以下の整数であり、Ｘは水素原子、水酸基、又は保護基により保護された水酸基であり、Ｙは酸性条件下で脱保護可能な保護基であり、Ｚは、極性基が保護基により保護されていてもよい、アデニル基、グアニル基、シトシル基、チミニル基、若しくはウラシル基、又はこれらの誘導体である。］
【００３６】
［Ｒ１からＲ６で表される炭化水素基又は炭化水素鎖］
ここで、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいて、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ５で表される炭化水素鎖、並びにＲ３及びＲ４が互いに結合して形成される炭化水素鎖は、それぞれ独立に、飽和炭化水素鎖であっても、不飽和炭化水素鎖であってもよく、直鎖炭化水素鎖であっても、分岐鎖炭化水素鎖であってもよい。しかしながら、各炭化水素鎖は、それぞれ独立に、飽和炭化水素鎖であることが好ましく、直鎖飽和炭化水素鎖であることが更に好ましい
【００３７】
同様に、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいて、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ６で表される炭化水素基は、それぞれ独立に、飽和炭化水素基であっても、不飽和炭化水素基であってもよく、直鎖炭化水素基であっても、分岐鎖炭化水素基であってもよい。しかしながら、各炭化水素基は、それぞれ独立に、飽和炭化水素基であることが好ましく、直鎖飽和炭化水素基であることが更に好ましい。
【００３８】
Ｒ１で表される炭化水素鎖の炭素原子数は、１以上２２以下であり、１以上６以下であることが好ましい。Ｒ１としては、具体的には、メチレン鎖、エチレン鎖、プロピレン鎖、イソプロピレン鎖、ブチレン鎖、ペンチレン鎖、ヘキシレン鎖等を挙げることができる。これらの中でも、メチレン鎖、エチレン鎖、及びヘキシレン鎖が好ましく、エチレン鎖であることが更に好ましい。
【００３９】
特に、Ｒ１で表される炭化水素鎖として、エチレン鎖を採用する場合、Ｒ１で表される炭化水素鎖の両端に二価のカルボキシル基が結合した化合物は、コハク酸となる。コハク酸は安価で、且つ大量に入手することができるので、Ｒ１で表される炭化水素鎖として、エチレン鎖を採用することにより、低コストで本発明の疎水性基結合ヌクレオシドを合成することができる。
【００４０】
本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいて、Ｒ２は炭素原子数１以上２２以下の２価の炭化水素鎖であり、炭素原子数２以上２２以下の２価のアルキレン鎖であることが好ましい。このような２価の炭化水素鎖としては、具体的には、メチレン鎖、エチレン鎖、プロピレン鎖、イソプロピレン鎖、ブチレン鎖、ペンチレン鎖、ヘキシレン鎖等を挙げることができる。これらの中でも、後述するＲ３及びＲ４が、互いに結合して２価の炭化水素鎖を形成する場合に、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が互いに結合して形成される炭化水素鎖、並びに窒素原子を含む環が構造的に安定して存在するために、Ｒ２がエチレン鎖であることが好ましい。
【００４１】
また、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいて、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、炭素原子数１以上２２以下の炭化水素基、又はＲ３及びＲ４が互いに結合して形成される炭素原子数１以上２２以下の２価の炭化水素鎖である。この炭化水素鎖は、ヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ）を含んでいてもよい。Ｒ３及びＲ４が、上記条件を充足することにより、Ｒ３及びＲ４が結合する窒素原子により形成されるアミノ基が３級アミノ基となるため、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドの疎水性を向上させることができる。
【００４２】
Ｒ３及びＲ４が、それぞれ独立に炭化水素基となる場合、当該炭化水素基の炭素原子数は、１以上２２以下であることが好ましい。Ｒ３及びＲ４としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。また、Ｒ３及びＲ４が互いに結合して、２価の炭化水素鎖を形成する場合には、当該炭化水素鎖の炭素原子数は、２以上２２以下であることが好ましい。
【００４３】
ここで、特にＲ３及びＲ４は、互いに結合して炭素原子数１以上２２以下の２価の炭化水素鎖を形成することが好ましい。このような場合、上述したＲ２、及び２つの窒素原子とともに形成される環状構造を有する２価の基を形成することとなる。このような２価の基としては、ホモピペラジニル基、ピペラジニル基、ｃｉｓ−２，６−ジメチルピペラジニル基、ｔｒａｎｓ−２，５−ジメチルピペラジニル基、２−メチルピペラジニル基等を挙げることができる。これらの中でも、ｃｉｓ−２，６−ジメチルピペラジニル基、ピペラジニル基、及びｔｒａｎｓ−２，５−ジメチルピペラジニル基が好ましく、ピペラジニル基が特に好ましい。
【００４４】
本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいて、Ｒ５は炭素原子数０以上２２以下の２価の炭化水素鎖である。このような２価の炭化水素鎖としては、具体的には、炭素原子数０の単結合のほか、メチレン鎖、エチレン鎖、プロピレン鎖、イソプロピレン鎖、ブチレン鎖、ペンチレン鎖、ヘキシレン鎖等を挙げることができる。これらの中でも、合成の容易性の観点から、単結合、メチレン鎖、エチレン鎖、及びヘキセン鎖が好ましく、単結合が更に好ましい。
【００４５】
上述のとおり、上記一般式（１）で表される化合物において、Ｒ６はそれぞれ独立に炭素原子数６以上３０以下の炭化水素鎖であり、ｎは２以上６以下の整数である。ここで、ｎは３以上６以下であることが好ましく、３であることが更に好ましい。また、Ｒ６は炭素原子数１８以上３０以下のアルキル基であることが好ましく、炭素原子数１８のアルキル基（オクタデシルオキシ基）であることが更に好ましい。炭素原子数６から３０の炭化水素基であるＲ６の置換位置は、Ｒ５に対して３位、４位、及び５位であることが好ましい。
【００４６】
ｎの値を上記範囲内で調整することにより、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドの、非極性溶媒に対する溶解能を調整することができる。また、Ｒ６が炭素原子数６から３０のアルキル基であることにより、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドの合成が容易となるばかりでなく、溶解度・分離能の向上という効果を得ることができる。
【００４７】
ここで、Ｒ１からＲ５で表される炭化水素基又は炭化水素鎖の組み合わせとしては、下記一般式（２）のように、Ｒ１及びＲ２としてエチレン鎖、Ｒ３及びＲ４として、これらが互いに結合して形成されたエチレン鎖、Ｒ５として単結合である組み合わせが好ましい。また、上述のとおり、Ｒ６は炭素原子数１８から３０のアルキル基（以下、Ｒ６’と示す）であることが更に好ましい。
【化３】
2010275254.tif 000004
［上記一般式（２）において、Ｒ６’はそれぞれ独立に炭素原子数１８以上３０以下のアルキル基である。］
【００４８】
特に、上記一般式（２）で示される化合物の中でも、Ｒ６’が炭素原子数１８のアルキル基（オクタデシルオキシ基）であることが好ましい。
【００４９】
［Ｘ、Ｙ、又はＺで表される基］
本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいて、Ｘは水素原子、水酸基、又は保護基により保護された水酸基である。ここで、Ｘが水素原子の場合、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドに含まれる５単糖残基は、デオキシリボース残基となる。このため、Ｘが水素原子の場合、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドは、疎水性基結合デオキシリボヌクレオシドとなり、疎水性基結合オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成に用いることができる。同様に、Ｘが水酸基又は保護基により保護された水酸基の場合、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドに含まれる５単糖残基は、２位の水酸基が保護されていてもよいリボース残基となる。このため、Ｘが水酸基又は保護基により保護された水酸基の場合、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドは、リボース残基の２位の水酸基が保護されていてもよい疎水性基結合リボヌクレオシドとなり、リボース残基の２位の水酸基が保護されていてもよい疎水性基結合オリゴリボヌクレオチドの合成に用いることができる。
【００５０】
リボース残基の２位の水酸基を保護していてもよい保護基としては、水酸基の保護基として用いることができる任意の保護基を挙げることができる。具体的には、メチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基、２−テトラヒドロピラニル基、エトキシエチル基、アセチル基、ヒバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）基、１−（４−クロロフェニル）−４−エトキシピペリジン−４−イル（Ｃｐｅｐ）基等を挙げることができる。これらの中でも、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）基、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基であることが好ましく、経済性及び入手の容易さの観点から、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基であることが特に好ましい。
【００５１】
本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいて、Ｙは酸性条件下で脱保護可能な保護基である。Ｙが酸性条件下で脱保護可能な保護基であることにより、疎水性基結合ヌクレオシドに、酸・アゾール複合体化合物により活性化されたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を結合させるにあたって、疎水性基結合ヌクレオシドを酸性条件下におくことにより、容易にＹを脱保護することができる。
【００５２】
Ｙとして用いることができる保護基としては、酸性条件下で脱保護可能であり、水酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、メチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基、２−テトラヒドロピラニル基、エトキシエチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、１，１−ビス（４−メトシキフェニル）−１−フェニルメチル基等のジメトキシトリチル基、１−（４−メトキシフェニル）−１，１−ジフェニルメチル基等のモノメトキシトリチル基等を挙げることができる。これらの中でも、脱保護のしやすさ、入手の容易さの観点から、ジメトキシトリチル基であることが好ましい。
【００５３】
Ｚは、極性基が保護基により保護されていてもよい、アデニル基、グアニル基、シトシル基、チミニル基、若しくはウラシル基、又はこれらの誘導体である。即ち、Ｚとしては、従来ＤＮＡ及びＲＮＡの塩基として知られている任意の塩基、並びにこれらの誘導体であって、塩基の極性基が任意に保護されたものを使用することができる。誘導体としては、８−ブロモアデニル基、８−ブロモグアニル基、５−ブロモシトシル基、５−ヨードシトシル基、５−ブロモウラシル基、５−ヨードウラシル基、５−フルオロウラシル基、５−メチルシトシル基、８−オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等を挙げることができる。
【００５４】
Ｚ中、塩基の極性基に結合する保護基としては、特に限定されないが、一般には、１級アミノ基、及びカルボニル基の保護基として使用できる基を挙げることができる。１級アミノ基の保護基としては、ピバロイル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジニル基等を挙げることができる。これらの中でも、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、及びジメチルホルムアミジニル基が好ましい。また、カルボニル基を保護する場合は、メタノール、エチレングリコール、及び１，３−プロパンジオール等をカルボニル基に反応させて、アセタールを形成させることができる。ここで、カルボニル基の保護基については、特に導入しなくてもよい場合がある。
【００５５】
＜疎水性基結合ヌクレオシド溶液＞
本発明の疎水性基結合ヌクレオシド溶液は、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドを非極性溶媒に溶解させたものである。ここで、非極性溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、及び酢酸エチルからなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましく、ジクロロメタンであることが更に好ましい。非極性溶媒を上記溶媒とすることにより、疎水性基結合ヌクレオシド溶液中における疎水性基結合ヌクレオシドの溶解度が向上し、且つより疎水性が強い疎水性環境を構築することができる。
【００５６】
本発明の疎水性基結合ヌクレオシドは、所定の疎水性基を有するので、非極性溶媒中においても均一に溶解することができる。即ち、本発明の疎水性基結合ヌクレオシド溶液は、従来公知のヌクレオシド誘導体を非極性溶媒に溶解させたヌクレオシド溶液と比べても、より均一に溶解された溶液となるとともに、疎水性環境下におけるオリゴヌクレオシド合成方法にも好適に用いることができる。
【００５７】
＜疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法＞
本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法においては、非極性溶媒中において、本発明の疎水性基結合ヌクレオシド又は前記疎水性基結合ヌクレオシドが有する５単糖残基の５位の炭素原子に結合する基にヌクレオシドホスホロアミダイト化合物が結合した化合物と、酸・アゾール複合体化合物により活性化されたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物と、を液相合成法により結合させる反応を複数回行う段階（以下、「段階Ａ」ともいう）を含み、前記疎水性基結合ヌクレオシド又はこれに結合したヌクレオシド残基の有する５単糖残基の５位の炭素原子と、その５’末端側に隣接するヌクレオシド残基の有する５単糖残基の３位の炭素原子とが、リン酸基を介して連続的に結合した構造を有する疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成する工程（以下、「工程Ａ」ともいう）と、疎水性基結合オリゴヌクレオチドに結合した保護基を脱保護する工程（以下、「工程Ｂ」ともいう）と、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させることにより、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを分離する工程（以下、「工程Ｃ」ともいう）と、を有するものである。
【００５８】
以下、斯かる疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の具体例について説明する。
【００５９】
［工程Ａ］
（段階Ａ）
段階Ａにおいては、まず、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおける保護基であるＹを、酸性溶液を用いて脱保護させ、その後、還元剤を添加することで脱保護反応を停止させる。ここで、酸性溶液に用いられる酸としては、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、モノクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸等を挙げることができる。これらの中でもジクロロ酢酸が好ましい。また、遊離保護基の捕捉剤としては、メタノール、トリエチルシラン、トリイソプロピルシラン、アニソール、チオアニソール、エタンジチオール等を挙げることができるが、メタノール及びトリエチルシランであることが好ましい。保護基であるＹを脱保護した場合、下記一般式（１−１）で示される化合物が得られるが、この化合物については、後述する「分離段階」により晶析させて分離・回収することができる。
【化４】
2010275254.tif 000005
［上記一般式（１−１）において、Ｚ１はＺで表される基の一例である。］
【００６０】
次いで、上記一般式（１−１）で示される化合物を、上述の非極性溶媒に溶解させ、この溶液に酸・アゾール複合体化合物により活性化されたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を添加する。一般式（１−１）で示される化合物に、酸・アゾール複合体化合物で活性化されたヌクレシドホスホロアミダイト化合物を添加することにより、一般式（１−１）で示される化合物と、ホスホロアミダイト化合物のカップリング反応が生起し、下記一般式（１−２）で示される化合物が得られる。ここで、酸・アゾール複合体化合物としては、５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ−１Ｈテトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、１Ｈテトラゾール、ベンズイミダゾリウムトリフラート、Ｎ−フェニルベンズイミダゾリウムトリフラート等を挙げることができる。
【化５】
2010275254.tif 000006
［上記一般式（１−２）において、Ｚ２はＺで表される基の一例であり、Ｚ１及びＺ２は、同一であっても異なっていてもよい。］
【００６１】
また、ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物としては、目的とする疎水性基結合オリゴヌクレオチドの特性に応じて、適宜選択することができ、必要に応じて５単糖残基の２位の水酸基及び５位の水酸基が保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイト化合物及びデオキシリボヌクレシドホスホロアミダイト化合物のいずれをも用いることができ、塩基として、必要に応じて極性基に保護基が結合した、アデニル基、グアニル基、シトシル基、チミニル基、ウラシル基、８−ブロモアデニル基、８−ブロモグアニル基、５−ブロモシトシル基、５−ヨードシトシル基、５−ブロモウラシル基、５−ヨードウラシル基、５−フルオロウラシル基、５−メチルシトシル基、８−オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等を有するものを用いることができる。
【００６２】
ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物において、５単糖残基の２位の水酸基及び５位の水酸基、並びに塩基の極性基の保護基としては、疎水性基結合ヌクレオシド化合物において対応する基の保護基と同様のものを用いることができる。
【００６３】
なお、上記一般式（１−１）で示される化合物と同様、上記一般式（１−２）で示される化合物についても、後述する「分離段階」により晶析させて分離・回収することができる。
【００６４】
次いで、上記一般式（１−２）で示される化合物を、上述の非極性溶媒に溶解させ、酸化剤を加えて、酸化反応を生起させることにより、下記一般式（１−３）で示される化合物を得る。酸化剤としてはヨウ素／水／ピリジン混合物、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド／トルエン溶液、２−ブタノンペルオキシド／塩化メチレン溶液等を挙げることができる。具体的な反応手法としては、上記一般式（１−２）で示される化合物をジクロロメタン等に溶解させた溶液に、ヨウ素／水／テトラヒドロフラン／ピリジンの混合溶液を添加する手法を挙げることができる。
【化６】
2010275254.tif 000007
【００６５】
なお、上記一般式（１−１）で示される化合物と同様、上記一般式（１−３）で示される化合物についても、後述する「分離段階」により晶析させて分離・回収することができる。
【００６６】
上記一般式（１−１）から（１−３）で示される化合物の生成反応を繰り返すことにより、疎水性基結合ヌクレオシド又はこれに結合したヌクレオシド残基の有する５単糖残基の５位の炭素原子と、その５’末端側に隣接するヌクレオシド残基の有する５単糖残基の３位の炭素原子とが、リン酸基を介して連続的に結合した構造を有する疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００６７】
（分離段階）
工程Ａは、任意の化学反応の後に、分離段階を有していてもよい。分離段階としては、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させる手法を用いる段階を挙げることができる。特に、本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法においては、上記一般式（１）で示される疎水性基結合ヌクレオシドを用いるので、溶液温度及び／又は溶液温度を変化させる手法を用いる段階により、疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成反応の中間生成物を容易に分離・回収することができる。
【００６８】
（溶液温度を変化させる手法）
溶液温度を変化させる手法としては、特に制限されるものではないが、例えば、反応溶液を冷却する手段を挙げることができる。例えば、疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の中間生成物を溶解している溶媒としてジクロロメタン／メタノール混合溶液、あるいはジクロロメタン／アセトニトリル混合溶液を用いた場合には、０℃以下に冷却することにより、当該中間生成物を晶析させることが可能となる。
【００６９】
（溶液組成を変化させる手法）
溶液組成を変化させる手法としては、特に制限されるものではないが、例えば、非極性溶媒中に疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の中間生成物を溶解した溶液に、上記非極性溶媒への親和性の高い溶媒を、更に添加する手法を挙げることができる。この場合、反応溶液が相分離することなく一相のみで維持される。
【００７０】
上記非極性溶媒に親和性の高い溶媒としては、非極性溶媒として用いられた溶媒と同一の溶媒でも、異なった溶媒であってもよいが、例えば、非極性溶媒として、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン等を用いた場合には、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、メタノール等を用いることができる。
【００７１】
また、溶液組成を変化させる別の好ましい手法としては、例えば、非極性溶媒中に疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の中間生成物を溶解した溶液を濃縮する公知の手法を挙げることができる。
【００７２】
これら分離段階としては、具体的には、ジクロロメタン中に疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の中間生成物を溶解した溶液に、アセトニトリルを添加し、溶媒を揮発させて濃縮し、冷却させて、晶析したジクロロメタン中に疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の中間生成物を吸引濾過等の手法を用いて分離する段階を例示することができる。
【００７３】
また、ジクロロメタン中に疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の中間生成物を溶解した溶液に、メタノールを添加し、溶媒を揮発させて濃縮し、遠心分離することで疎水性基結合オリゴヌクレオチドを分離する段階を例示できる。
【００７４】
［工程Ｂ］
工程Ｂにおいては、疎水性基結合オリゴヌクレオチドに結合した保護基を脱保護する。保護基の脱保護については、疎水性基結合オリゴヌクレオチドに結合した保護基の種類・性質に応じて、当業者に周知の手法を適宜用いることができる。
【００７５】
例えば、５単糖残基の２位の水酸基の保護基として、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を用いる場合、Ｎ−メチルピロリドン／トリエチルアミン・３ＨＦ／トリエチルアミン混合溶液にて６０℃で９０分間処理する条件で反応を行うことによって脱保護することができる。また、塩基の有する極性基の保護基として、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、及びイソブチリル基を用いる場合、アンモニア：エタノール＝３：１溶液にて、８０℃で９０分間処理する条件で反応を行うことによって脱保護することができる。なお、５単糖残基の５位の水酸基の保護基の脱保護反応については、工程Ａに記載の手法と同様の手法を用いればよい。
【００７６】
［工程Ｃ］
工程Ｃにおいては、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させることにより、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを分離する。ここで、工程Ｃにおいて、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させる手法としては、上記工程Ａにおける分離段階と同様の条件で行うことができる。
【００７７】
［重合状態、反応収率等］
本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法に用いられる、疎水性基結合ヌクレオシドは、所定の疎水性基を有するため、非極性溶媒中、水の存在しない疎水性環境下でオリゴヌクレオチドの合成反応を行うことができる。このため、疎水性基結合オリゴヌクレオチドの合成の際に用いられるヌクレオシドホスホロアミダイト化合物の、酸・アゾール複合体化合物による活性化が阻害されない。したがって、疎水性基結合オリゴヌクレオチドの合成反応の収率を向上させることができる。
【００７８】
これにより、特に１０量体以上のオリゴヌクレオチドのように、従来、液相合成法での合成が困難であったオリゴヌクレオチドであっても、９７％以上の収率で合成することができる。
【００７９】
また、本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法に用いられる、疎水性基結合ヌクレオシドは、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させることにより晶析する性質を有する。このため、液相合成法によるオリゴヌクレオチド合成反応においても、溶液温度及び／又は溶液組成を変化させることにより、中間生成物や最終生成物を、簡易且つ容易にしかも高収率にて分離・回収することができる。したがって、本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法を、合成プラント等において大容量の溶液中で行う場合であっても、簡易且つ容易にしかも高収率にて、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成することができる。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明の実施例について、詳細に説明する。なお、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００８１】
＜合成例１；疎水性基結合ヌクレオシドの合成＞
３，４，５−トリス（オクタデシロキシ）フェニル酢酸９２７．６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）に、４−ブトキシカルボニルピペラジン５５８．８ｍｇ（３ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）４０５．４ｍｇ（３ｍｍｏｌ）、２−（１Ｈ−１−ベンゾトリアゾリル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）１．１３７８ｇ（１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を５２３μｌ（３ｍｍｏｌ）を加え、３，４，５−トリス（オクタデシロキシ）フェニル酢酸−４−ブトキシカルボニルピペラジンを合成した。これに４Ｎ塩酸を作用させて、３，４，５−トリス（オクタデシロキシ）フェニル酢酸ピペラジン塩酸塩を合成した。
【００８２】
チミニル基の５位の水酸基がジメトキシトリチル基により保護された５’−Ｏ−（１，１−ビス（４−メトシキフェニル）−１−フェニルメチル）チミジン５．０８ｇを適当量のジクロロメタンに溶解し、無水コハク酸１．５２ｇ、トリエチルアミン１０ｍｌを加えて撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて反応の完結を確認した後、０．２Ｍトリエチルアミンリン酸塩水溶液とともに分液漏斗に移して有機層を回収し、エバポレーターで濃縮・乾燥させて、チミニル基の５位の水酸基がジメトキシトリチル基により保護された３’−Ｏ−スクシニル−５’−Ｏ−（１，１−ビス（４−メトシキフェニル）−１−フェニルメチル）チミジンを得た。
【００８３】
３，４，５−トリス（オクタデシロキシ）フェニル酢酸ピペラジン塩酸塩５００ｍｇを、ジクロロメタン５０ｍｌに溶解し、チミニル基の５位水酸基がジメトキシトリチル基により保護された３’−スクシニル−５’−Ｏ−（１，１−ビス（４−メトシキフェニル）−１−フェニルメチル）チミジンを６４４ｍｇ、２−（１Ｈ−１−ベンゾトリアゾリル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）１１３７ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン５１０μｌを加えて撹拌し、薄層クロマトグラフィーにて反応の完結を確認した後、エバポレーターで濃縮し、吸引濾過によって下記化学式（３）で示される化合物を得た（化合物名：５’−О−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−О−スクシニルピペラジン−４−（１−カルボニル−３，４，５−トリス（オクタデシロキシ））。
【化７】
2010275254.tif 000008
［上記化学式（３）において、Ｚ１はチミニル基であり、Ｙ’は１，１−ビス（４−メトシキフェニル）−１−フェニルメチル基である。］
【００８４】
＜実施例１＞
（反応１）
ナスフラスコ容器中に、上記化学式（３）で示される化合物３２４．４ｍｇ（１００μｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍｌに溶解させた溶液と、３％トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液１０ｍｌとを投入して均一に撹拌した。これを室温で５分間放置した後、メタノールを添加し、反応溶液の一部を分取して薄層クロマトグラフィーにて反応の完結を確認した。反応溶液をナスフラスコ容器からエバポレーターに移して濃縮し、キリヤマ漏斗を用いた吸引濾過によって、下記化学式（３−１）で示される化合物を得た。
【化８】
2010275254.tif 000009
【００８５】
（反応２）
ナスフラスコ容器中に、上記化学式（３−１）で示される化合物２９５．６ｍｇをジクロロメタン１０ｍｌに溶解させた溶液と、チミニル基の５位水酸基がジメトキシトリチル基により保護されたチミジンデオキシリボヌクレオシドホスホロアミダイト３３３．５ｍｇ（２．０当量）と、０．２５Ｍ  ５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾール溶液２ｍｌとを投入して６０分間撹拌し、反応溶液の一部を分取して薄層クロマトグラフィーにて反応の完結を確認した。反応溶液をナスフラスコ容器からエバポレーターに移して濃縮し、吸引濾過によって、下記化学式（３−２）で示される化合物を得た。
【化９】
2010275254.tif 000010
［上記化学式（３−２）において、Ｚ２はチミニル基である。］
【００８６】
（反応３）
ナスフラスコ容器中に、上記化学式（３−２）で示される化合物３０２．１ｍｇをジクロロメタン１０ｍｌに溶解させた溶液と、０．０２Ｍヨウ素／水／ピリジン溶液１０ｍｌと投入して室温で１０分間撹拌した。反応溶液をナスフラスコ容器からエバポレーターで濃縮し、キリヤマ漏斗を用いた吸引濾過によって、下記化学式（３−３）で示される化合物を得た。
【化１０】
2010275254.tif 000011
【００８７】
（脱保護反応１）
反応３で得られる化合物について、反応１から反応３を繰り返して目的とする疎水性基結合オリゴヌクレオチドの１０量体ｒ（ＵＡＣＵＵＣＧＡ）ｄ（ＴＴ）に保護基が結合した化合物を得た。ここで、フタ付チューブ容器中に、最終的に得られた上記疎水性基結合オリゴヌクレオチドの１０量体と、アンモニア水：エタノール＝３：１の溶液１ｍｌとを加え、８５℃で９０分間加熱した後、反応溶液をフタ付チューブ容器から遠心エバポレーターに移して乾燥させて、下記化学式（３−４）で示される化合物を得た。なお、塩基の極性基に結合した保護基であるフェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、リン酸基に結合しているシアノエチル基、及び疎水性基である有機系単分子ナノキャリアは、この操作にて脱保護又は脱離される。
【化１１】
2010275254.tif 000012
［上記化学式（３−４）において、Ｚ１及びＺ２はチミニル基であり、Ｚｎは３’側の構成単位からアデニル基、グアニル基、シトシニル基、ウラニル基、ウラニル基、シトシニル基、アデニル基であり、Ｚ10はウラニル基であり、Ｒはｔ−ブチルジメチルシリル基である。］
【００８８】
（脱保護反応２）
フタ付チューブ容器中に、上記化学式（３−４）で示される化合物５ｍｇをＮ−メチルピロリドン：トリエチルアミン：３−ヒドロキシフラボン＝１３０：９０：１００の溶液３２０μｌに溶解させた溶液を投入し、６０℃で９０分間加熱した後、室温に戻して下記化学式（３−５）で示される化合物の溶液を得た。なお、５単糖残基の２位の水酸基の保護基であるｔ−ブチルジメチルシリル基は、この操作によって脱保護される。
【化１２】
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【００８９】
下記化学式（３−５）で示される化合物の溶液を、市販の逆相カートリッジカラムに通して吸着させ、０．１Ｍトリエチルアミン酢酸溶液１ｍｌで洗浄し、カラムに２％トリフルオロ酢酸水溶液を添加して、カラムに充填された樹脂の表面で５分間反応させることにより、５’末端のヌクレオチド残基中の５単糖残基の５位の水酸基に結合した保護基であるジメトキシトリチル基を脱保護し、２０％アセトニトリル水溶液で溶出して下記化学式（３−６）で示される化合物の溶液を得た。
【化１３】
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【００９０】
（同定）
化学式（３−６）で示される化合物について、ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ質量分析装置を用いて、目的とするオリゴヌクレオチドの１０量体が得られていることを確認した。疎水性基結合オリゴヌクレオチドの１０量体の合成反応全体の反応収率は９７．５％であった。
ＨＰＬＣ（ｓｈｏｄｅｘ  ＯＤＰ（４．６φ×１５０ｍｍ），ＡｃＣＮ，ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）：ｔＲ＝１７．２４１ｍｉｎ（８０．１３％）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ：３０７７．８９［Ｍ−Ｈ］−
【００９１】
＜実施例２＞
実施例１と同様の方法で反応１から反応３を２０回ずつ繰り返して、目的とする疎水性基結合オリゴヌクレオチドの２１量体（配列ｒ（ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧ）−ｄ（ＴＴ））に保護基が結合した化合物を得た。この化合物に、脱保護反応１及び脱保護反応２を行って全ての保護基を脱保護し、ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ質量分析装置を用いて、目的とするオリゴヌクレオチドの２１量体が得られていることを確認した。２１量体の疎水性基結合オリゴヌクレオチドの２１量体の合成反応全体の反応収率は９７．３％であった。
ＨＰＬＣ（ｓｈｏｄｅｘ  ＯＤＰ（４．６φ×１５０ｍｍ），ＡｃＣＮ，ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）：ｔＲ＝１９．３１１ｍｉｎ（５７．２９％）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ：６６８９．１１［Ｍ−Ｈ］−
【００９２】
以上に見られるように、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドを用いた疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法は、各反応における反応操作や分離操作が単純であり、且つ各工程の収率が高く、１０量体以上の疎水性基結合オリゴヌクレオチドの合成を行う場合であっても、高い収率で目的とする生成物を得ることができる。