(57)【要約】【課題】ＯＣＰは骨芽細胞の分化を促進する反面、生体内における分解吸収速度が比較的速く、骨芽細胞が再生すべき足場を確保できないという問題があり、ここに本発明が解決せんとする課題がある。【解決手段】本発明は、上記の如き実情に鑑みこれらの課題を解決することを目的として創作されたものであって、ＯＣＰと、ＡＣＰ又は低結晶性のＯＣＰからなる混合燐酸カルシウムを含むことを特徴とする人工骨材である。この混合燐酸カルシウムは、主に（１）ＯＣＰにＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰを析出する、（２）ＯＣＰとＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰが同時に製造されるような条件で製造する、（３）ＡＣＰ、ＤＣＰ又はＤＣＰＤを部分的にＯＣＰとなるよう結晶化する、（４）ＯＣＰを部分的に低結晶化する等の方法で製造され得る。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）と、非晶質燐酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）、第２燐酸カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ４）、第２燐酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、低結晶性のハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）又は低結晶性の第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）からなる混合燐酸カルシウムを含むことを特徴とする人工骨材。
【請求項２】
混合燐酸カルシウムは、第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）に、非晶質燐酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）、第２燐酸カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ４）、第２燐酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、低結晶性のハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）又は低結晶性の第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）を析出して製造され得るものであることを特徴とする請求項１に記載の人工骨材。
【請求項３】
混合燐酸カルシウムは、第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）と、非晶質燐酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）、第２燐酸カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ４）、第２燐酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、低結晶性のハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）又は低結晶性の第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）が同時に製造されるような条件で製造され得るものであることを特徴とする請求項１に記載の人工骨材。
【請求項４】
混合燐酸カルシウムは、非晶質燐酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）、第２燐酸カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ４）又は第２燐酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）を部分的に第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）となるよう結晶化して製造され得るものであることを特徴とする請求項１に記載の人工骨材。
【請求項５】
混合燐酸カルシウムは、第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）を部分的に低結晶化して製造され得るものであることを特徴とする請求項１に記載の人工骨材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）と、非晶質燐酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）、第２燐酸カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ４）、第２燐酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、低結晶性のハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）又は低結晶性の第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）からなる混合燐酸カルシウムを含む人工骨材に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２：以下「ＨＡ」と略記する）の前駆体である第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ：以下「ＯＣＰ」と略記する）は、生理的環境下で準安定相であり、骨形成にとって適度な溶解度を有することで、優れた骨伝導能を示すこと（非特許文献１）、破骨細胞による吸収性を有すること（非特許文献２）、そして用量依存的に骨芽細胞の分化を促進すること（非特許文献３）が知られている。また、ＨＡの前駆体である非晶質燐酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ：以下「ＡＣＰ」と略記する）についても、準安定相であるゆえ一部溶解してＯＣＰに結晶化することから、ＯＣＰと同様の性質があることが報告されている（非特許文献１及び非特許文献４参照）。さらにまた、同じくＨＡの前駆体である第２燐酸カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ４：以下「ＤＣＰ」と略記する）、第２燐酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：以下「ＤＣＰＤ」と略記する）についてもＯＣＰと同様の性質があることが報告されている（非特許文献１及び非特許文献５参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｓｕｚｕｋｉ  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｎｇ．Ｍｅｄ．，１６４：３７−５０，１９９１．
【非特許文献２】Ｉｍａｉｚｕｍｉ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．７８：４５−５４，２００６．
【非特許文献３】Ａｎａｄａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，１４：９６５−９７８，２００８
【非特許文献４】Ｍｅｙｅｒ  ＪＬ，Ｅａｎｅｓ  ＥＤ，ＣＴＩ  １９７８
【非特許文献５】Ｅｉｄｅｌｍａｎ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．，４１：１８−２６，１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、ＯＣＰは骨芽細胞の分化を促進する反面、生体内における分解吸収速度が比較的速く、ラット頭蓋冠骨欠損では生体内吸収に合わせ、骨と置換していく傾向があるが、大腿骨のような長管骨の骨髄内では、生体内吸収に合わせ、形成された新生骨も吸収を受けてしまう（非特許文献２参照）。骨置換性の観点から整形外科領域における骨再生を目標とした場合には、現状の骨再生能を維持したまま、あるいは、より自家骨に近い骨再生能を獲得した新規な性質を有するＯＣＰの開発が渇望されてきた。しかし、現状では、骨髄内では骨芽細胞が再生すべき足場を確保できないという問題がある。しかし、材料の吸収性が小さいと骨再生能に劣ることが一般的であり（非特許文献２参照）、ここに本発明が解決せんとする課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上記の如き実情に鑑みこれらの課題を解決することを目的として創作されたものであって、請求項１の発明は、ＯＣＰと、ＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰからなる混合燐酸カルシウムを含むことを特徴とする人工骨材である。
請求項２の発明は、混合燐酸カルシウムは、ＯＣＰにＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰを析出して製造され得るものであることを特徴とする請求項１に記載の人工骨材である。
請求項３の発明は、混合燐酸カルシウムは、ＯＣＰと、ＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ又は低結晶性のＨＡが同時に製造されるような条件で製造され得るものであることを特徴とする請求項１に記載又は低結晶性のＯＣＰの人工骨材である。
請求項４の発明は、混合燐酸カルシウムは、ＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤを部分的にＯＣＰとなるよう結晶化して製造され得るものであることを特徴とする請求項１に記載の人工骨材である。
請求項５の発明は、混合燐酸カルシウムは、ＯＣＰを部分的に低結晶化して製造され得るものであることを特徴とする請求項１に記載の人工骨材である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の人工骨材は、骨芽細胞の分化促進というＯＣＰの特性を有するだけでなく、その機能をさらに向上させ、その上で、生体内における耐分解吸収性を有し、骨芽細胞が再生すべき足場を確保することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の発明者等は、ＯＣＰと、ＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰからなる混合燐酸カルシウムを人工骨材として使用したところ、骨芽細胞の分化促進というＯＣＰの特性を有するだけでなく、その機能をさらに向上させ、その上で、生体内における耐分解吸収性を有し、骨芽細胞が再生すべき足場を確保することができたことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の人工骨材は、ラットの脛骨骨幹端内部に埋植した場合、埋植５６日目における骨形成率は約３０％である一方、生体内におけるこの燐酸カルシウムの残存率は約４０％と比較的多く残っていた（図３参照）。つまり、本発明の人工骨材は、骨芽細胞の分化促進というＯＣＰの特性を有しつつも、生体内における耐分解吸収性を有し、骨芽細胞が再生すべき足場を確保することができるのである。
【０００９】
本発明の人工骨材は、ＯＣＰと、ＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰからなる混合燐酸カルシウムを含んでなる。本発明の混合燐酸カルシウムは、ＨＰＯ４／Ｐ値で約２５〜３５％、ＣａとＰのモル比で約１．２０〜１．４０の値をとる。ちなみに、化学量論的ＯＣＰはＨＰＯ４／Ｐ値が約３３％、Ｃａ／Ｐモル比が約１．３３であるが、本発明の実施例で用いているＯＣＰは、非化学量論組成を持ち、ＨＰＯ４／Ｐ値は約３８．３％であり、Ｃａ／Ｐモル比は約１．２６を有する。また、化学量論的ＨＡのＨＰＯ４／Ｐ値は１０．６％であり、Ｃａ／Ｐモル比は約１．６７であるが、本発明の実施例で用いているＨＡのＨＰＯ４／Ｐ値は約１０．６％、Ｃａ／Ｐモル比は約１．５５である。
【００１０】
この混合燐酸カルシウムは、主に下記（１）〜（４）の方法により製造することができる。
（１）ＯＣＰにＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰを析出する。
（２）ＯＣＰとＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰが同時に製造されるような条件で製造する。
（３）ＡＣＰ、ＤＣＰ又はＤＣＰＤを部分的にＯＣＰとなるよう結晶化する。
（４）ＯＣＰを部分的に低結晶化する。
【００１１】
尚、低結晶性のＯＣＰとは、非特許文献１で得た結晶性の比較的高いＯＣＰの構造が示すＸ線回折（ＸＲＤ）の結果よりもピーク強度の低い状態を有するＯＣＰであって、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つの状態のＯＣＰをいう。
（Ａ）結晶性が低い
（Ｂ）部分的に加水分解している
（Ｃ）低結晶性又は非晶質のＨＡが一部混在する
（Ｄ）ＡＣＰ、ＤＣＰ又はＤＣＰＤが一部混在する
本発明において低結晶性のＯＣＰは、ＯＣＰから完全にＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ又は低結晶性のＨＡに構造転移したものでない場合もあるため、本発明者らはこのような名称で特定している。尚、低結晶性のＯＣＰは、上記方法においては、例えば、（４）の方法により得ることができると考えられる。
【００１２】
図１（ａ）は、本発明を実施した混合燐酸カルシウム（後述する実施例１）の粉末Ｘ線測定（ＭｉＮｉＦｌｅｘ，株式会社リガク）の結果である。比較対象としてＯＣＰの粉末Ｘ線測定（ＭｉＮｉＦｌｅｘ，株式会社リガク）の結果も示す（図１（ｂ））。回折角４．７度にＯＣＰ特有のピークがあり（図中矢印）、さらに回折角２５〜３５度辺りにＡＣＰに起因するベースラインの隆起が伺える（図中破線丸枠）。ちなみに、図１（ｂ）は、ＯＣＰの粉末Ｘ線測定の結果であるが、回折角４．７度におけるＯＣＰ特有のピークは、図１（ａ）よりも大きいことが伺える。
【００１３】
以下、前記（１）〜（４）の製造方法を順に説明する。尚、下記（１）〜（４）の中では、製造条件の設定が容易である観点から、（１）の方法が好ましいが、本発明は（１）の方法に必ずしも限定されるものではない。
【００１４】
第１の方法は、ＯＣＰに、ＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰを析出する方法である。より詳細には、ＯＣＰをＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰが製造される条件下でシードする方法である。ＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰが製造される条件は、当業者により適宜設定されるものであるが、例えば、ＡＣＰを製造する場合は、燐酸カルシウム濃度が自発沈殿を生じる程度まで高い過飽和条件（highly supersaturated condition）であればよい。原材料となるＯＣＰは、当業者により適宜製造できるものであるが、例えば、非特許文献１や、Ｙ．  Ｈｏｎｄａ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ｂ，ｖｏｌ．８０（２）．ｐａｇｅ  ２８１−２８９（２００７）を参考にすることができる。また、ＯＣＰにＤＣＰＤを析出する方法としては、非特許文献１の方法において、ＯＣＰが析出た直後の懸濁液を、さらに約４５〜８５℃で１００時間以上の長時間で撹拌する方法も挙げられる。
【００１５】
第２の方法は、ＯＣＰと、ＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰが同時に製造されるような条件で製造する方法である。より詳細には、横軸を溶液のｐＨ、縦軸を燐酸又はカルシウム濃度とした相図において、ＯＣＰとＡＣＰ、ＤＣＰ、ＤＣＰＤ、低結晶性のＨＡ又は低結晶性のＯＣＰとの臨界領域付近で製造する方法である。例えば、ＯＣＰとＡＣＰの混晶を製造する方法としては、ＯＣＰの種結晶を、水に分散させ、２５℃のスラリー状態とした水溶液に、硝酸カルシウム塩と水酸化アンモニウムの水溶液、および、燐酸水素アンモニウム塩と水酸化アンモニウムの水溶液を迅速に混合・攪拌する方法等が挙げられる。
【００１６】
第３の方法は、ＡＣＰ、ＤＣＰ又はＤＣＰＤを部分的にＯＣＰとなるよう結晶化する方法である。具体的には、ＡＣＰ、ＤＣＰ又はＤＣＰＤからＯＣＰへの構造転移が生じる条件（主に温度処理）を短時間行う方法である。例えば、ＡＣＰを部分的にＯＣＰとなるよう結晶化する方法としては、ＯＣＰの種結晶を、水に分散させ、２５℃のスラリー状態とした水溶液に、硝酸カルシウム塩と水酸化アンモニウムの水溶液、および、燐酸水素アンモニウム塩と水酸化アンモニウムの水溶液を迅速に混合・攪拌して析出させた後、酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．８〜５．６）に適当な時間分散浸漬する方法等が挙げられる。
【００１７】
第４の方法は、ＯＣＰを部分的に低結晶化する方法である。具体的には、ＯＣＰを短時間加水分解する。加水分解の方法は、固液比および顆粒径を適切に調節して、ＯＣＰを熱水に浸漬・撹拌して実施できるが、反応時間の短縮を目的として、酸又はアルカリ条件下としたものであってもよい。但し、生体内における安全性を考慮すると、熱水における撹拌が望ましいと考える。より詳細には、例えば、ＯＣＰを４５〜８５℃の熱水に分散し、１〜３６時間撹拌することにより製造され得るものが挙げられる。もちろん、水温を上記温度範囲より高くしたり、加水分解の環境を酸又はアルカリ環境とすれば反応時間を短くすることができ、逆に、水温を上記温度範囲より低くすれば、反応時間は長くすることができる。尚、２００メッシュアンダーの乾燥粉体あるいは合成後のスラリーの、７０℃の熱水による加水分解の条件においては、約４８時間撹拌することによりＯＣＰは、結晶構造が転移しＨＡになる。従って、ＯＣＰがＨＡになる最小反応時間を明らかにすれば、その１／８〜１／２程度の反応時間を採用し、かつ反応時間以外の反応条件を変えないことにより、本発明の燐酸カルシウムを得ることができるものと考える。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定して解釈してはならない。
【００１９】
＜実施例１＞  第４の方法により製造した混合燐酸カルシウムを含む人工骨材
ＯＣＰ０．５ｇを、５ｍｇ／ｍＬの比で７０度の熱水に６時間撹拌し、その後に回収した燐酸カルシウムを人工骨材とした。図１（ａ）は、本実施例により得られた混合燐酸カルシウムの粉末Ｘ線回折測定の結果である。
【００２０】
＜比較例１＞  ＯＣＰのみからなる人工骨材
ＯＣＰをそのまま骨再生材料として用いた。
【００２１】
＜比較例２＞  ＨＡのみからなる人工骨材
ＨＡをそのまま骨再生材料として用いた。
【００２２】
＜実験例＞  埋植実験
実施例１、比較例１及び２の人工骨材をそれぞれラットの脛骨骨幹端内部に埋植した。埋植１４、２８及び５６日後のＨＥ染色の結果から、組織形態計測による新生骨の定量により求めた骨形成率を図２（ａ）に、人工骨材の残存率を図２（ｂ）に示す。実施例１の人工骨材で埋植したラットの骨形成率は約３０％と比較例よりも高い値を示した。一方、それにも関わらず生体内における人工骨材の残存率は約４０％と比較的多く残っていた。つまり、本発明の人工骨材は、骨芽細胞の分化促進というＯＣＰの特性を有しつつも、生体内における耐分解吸収性を有し、骨芽細胞が再生すべき足場を確保することができると考えられる。
【００２３】
また、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により各ラットのＩＬ−１βの発現量を評価した。その結果を図３に示す。実施例１のラットのＩＬ−１βの発現量は、埋植６日後以降は比較例１よりも抑制されていることが明らかとなった。つまり、ＯＣＰそのものよりも緩慢な条件で骨再生がなされていることが明らかとなった。
【００２４】
＜実施例２＞  第１の方法により製造した混合燐酸カルシウムを含む人工骨材
１０ｇのＯＣＰの種結晶を、５００ｍＬの水に分散させ、２５℃、３００ｒｐｍで回転させてスラリー状態とした水溶液を調整する。次に、０．２５ｍｏｌの硝酸カルシウム塩と０．１７ｍｏｌの水酸化アンモニウムの水溶液８００ｍＬ、及び、０．１６ｍｏｌの燐酸二水素アンモニウム塩と１．１ｍｏｌの水酸化アンモニウムの水溶液８００ｍＬを、迅速に混合・攪拌する。反応後、迅速に濾過して、洗浄中にＡＣＰを安定化させるためにＭｇ２＋を含む水溶液で数回洗浄して、最後にアセトンで置換洗浄して、凍結乾燥する。
【００２５】
＜実施例３＞  第２の方法により製造した混合燐酸カルシウムを含む人工骨材
非特許文献１の手法でＯＣＰを製造した直後の状態で、さらに、１２０ｒｐｍ、７０．０℃で３６０分熟成し、濾過、乾燥させた。図４（ａ）は、本実施例により得られた混合燐酸カルシウムの粉末Ｘ線回折測定装置（メーカー名：理学電機、型式：ＲＩＮＴ２５００ＶＨＦ）により測定した結果である。回折角４．７度にＯＣＰ特有のピークがあり、かつ、回折角１１．６度及び２９．２６度にＤＣＰＤ特有のピークがあることがわかる。また、図４（ｂ）は、ＯＣＰの粉末Ｘ線測定（メーカー名：理学電機、型式：ＲＩＮＴ２５００ＶＨＦ）の結果である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】（ａ）実施例１により得られた混合燐酸カルシウムの粉末Ｘ線回折測定の結果と、（ｂ）ＯＣＰの粉末Ｘ線回折測定の結果を示す図である。
【図２】実施例１、比較例１及び２の人工骨材をラットに埋植した際の（ａ）骨形成率と（ｂ）骨形成材料の残存率の結果を示す図である。
【図３】実施例１、比較例１及び２の人工骨材を埋植したラットのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によるＩＬ−１βの発現量の結果を示す図である。
【図４】（ａ）実施例３により得られた混合燐酸カルシウムの粉末Ｘ線回折測定の結果と、（ｂ）ＯＣＰの粉末Ｘ線回折測定の結果を示す図である。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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