(57)【要約】      （修正有）【課題】植物の燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物の提供。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制された、タバコ属植物：（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）特定のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質、（ｃ）特定のアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質。【選択図】図９
2010136624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制された、タバコ属植物。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質
【請求項２】
前記遺伝子が、
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列に対して８５％以上の同一性を有し、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号５に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｇ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む、請求項１に記載のタバコ属植物。
【請求項３】
前記カルボニル類が、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アセトン、アクロレイン、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、メチルエチルケトンおよびブチルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１または２に記載のタバコ属植物。
【請求項４】
前記カルボニル類が、ホルムアルデヒドまたはアクロレインである、請求項３に記載のタバコ属植物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタバコ属植物の組織または細胞。
【請求項６】
前記組織が葉である、請求項５に記載の組織または細胞。
【請求項７】
配列番号５に示す塩基配列、配列番号７に示す塩基配列、それらの配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列、およびそれらの塩基配列の２０塩基以上の部分配列からなる群から選択される塩基配列を含む、遺伝子発現抑制用ベクター。
【請求項８】
前記塩基配列の連続した２０塩基以上からなる塩基配列をアンチセンス方向に含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記塩基配列のセンス鎖および該センス鎖に対合するアンチセンス鎖を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項１０】
前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、前記塩基配列の連続した２０塩基以上からなる、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記センス鎖とアンチセンス鎖の間にスペーサーを有する、請求項９または１０に記載のベクター。
【請求項１２】
植物細胞内で作動可能なプロモーターを有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
タバコ属植物の細胞または組織を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法および転写因子を制御する方法から選択されるいずれかの方法を用いて、請求項１および２に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制し、植物体を再生することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタバコ属植物を作製する方法。
【請求項１４】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載のベクターを、植物細胞または組織に導入し、植物体を再生する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物体を母本として後代を作出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタバコ属植物の後代であって、請求項１または２に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現が抑制されたことを特徴とする、後代。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタバコ属植物または請求項１６に記載の後代の葉から作製されたたばこ製品。
【請求項１８】
タバコ属植物において、請求項１または２に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制することを含む、タバコ属植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を低減する方法。
【請求項１９】
前記遺伝子の発現の抑制を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法および転写因子を制御する方法からなる群から選択される方法によって行うことを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載のベクターを植物細胞または組織に導入する、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物及びその作製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
たばこ製品に対しては，その燃焼煙に含まれるカルボニル類を低減することが望まれている。たばこ製品の燃焼煙中に含まれるカルボニル類を低減する方法として、従来、吸着剤として活性炭を添加したフィルターを用いるのが一般的であり、このほかにも、種々の吸着剤の使用が試みられている。
【０００３】
一方で、タールやニコチンに代表される主流煙中の成分のある部分は、喫煙の満足感や香喫味に直接関わる部分であり、これら成分の量を相対的に高いレベルに保ったまま、煙成分中のカルボニル類のみ選択的に除去することが望ましい。
【０００４】
しかし、従来使用されている吸着剤は、カルボニル類だけでなく他の成分も吸着するため、たばこ製品の香喫味へ悪影響を及ぼす可能性があった。例えば、特許文献１〜７は、ホルムアルデヒドの吸着等を目的としてアミン系物質を添加したフィルターを開示する。しかし、これらは、煙成分中のカルボニル類を低減することができるが、タールやニコチンも同時に除去してしまう。また、添加したアミン系物質の分解のために特有のアミン臭を呈するなど、臭い、安全性、効果などに問題があり、実際にたばこ製品に利用するには実用的なものがなかった。更に特許文献７は、燃焼煙中のカルボニル類を低減する目的で燃焼改善剤としてアンモニウム含有化合物を添着したシガレット巻紙についても開示するが、上述したようにタールやニコチンを除去してしまうので、実用的でない。また、特許文献８は、タバコ煙中のアルデヒドを除去するためにグリシンの如き一定のアミノ酸の使用を開示する。グリシンはタバコ煙中のホルムアルデヒドのレベルを減らすことができるが、紙巻きタバコフィルター製造工程では安定していないことが知られている。さらに、それは貯蔵中にアンモニア臭を放出するため、たばこ製品に用いるには不適当であった。
【０００５】
煙成分中のカルボニル類のみを選択的に除去する方法もいくつか提案されている。例えば、引用文献９はホルムアルデヒドを選択除去できるハイドロタルサイト類化合物を添加したフィルターを開示する。明細書において、チャコールフィルターが全有機蒸気（ＶＯＣ）を無差別に低減することによりホルムアルデヒドの低減を実現するのに対し、ハイドロタルサイト類化合物添加フィルターは全有機蒸気の大きな低減無しにチャコールフィルターと同等のホルムアルデヒド低減を実現することが示されている。
【０００６】
特許文献１０は、特異な吸着特性をもつ結晶性ゼオライトを利用することにより選択性を高めていると考えられる。しかし、これを組み込んだフィルターはアクロレインを５０％以上低減するなど、９種の成分を低減することが示されているが、その他成分への影響については明らかにされていない。特許文献１１は、塩基性ポリペプチドを添加したフィルターが、活性炭やキトサンと異なり、ニコチンやタールを除去することなくホルムアルデヒドを市販品と比べて約１５％低減することを開示する。
【０００７】
以上のように、たばこ製品の燃焼煙中に含まれる低級アルデヒドを特異的に低減する方法として、幾種かの、特異的吸着剤を添加したフィルターの利用が有効であると考えられる。しかし、このようなフィルターの高機能化は、通気抵抗の増大を招き、正常な燃焼煙を得ることが難しくなるなど、実用には限界があった。
【０００８】
そこで、フィルターとは別種の方法により、たばこ製品の燃焼煙中のカルボニル類を低減する方法が求められていた。燃焼煙中のカルボニル類含量の少ないタバコ植物の開発はその方法の一つとして考えられる。また、このようなタバコ植物をシガレット等の原料として用いれば、高機能フィルターの開発および製造にかかる負担を軽減できるため、製造コストの低減に繋がることが期待できる。
【０００９】
【特許文献１】特開昭５９−０８８０７８号公報
【特許文献２】特開昭５９−１５１８８２号公報
【特許文献３】特開昭６０−０５４６６９号公報
【特許文献４】特開平０９−１６８７３６号公報
【特許文献５】特表２００２−５２８１０５号公報
【特許文献６】特表２００２−５２８１０６号公報
【特許文献７】特表２００３−５０５６１８号公報
【特許文献８】米国特許第２９６８３０６号明細書
【特許文献９】国際公開第２００３／０５６９４７号パンフレット
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／０１３３０４７号明細書
【特許文献１１】特開２００６−３４１２７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、タバコ属植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能な遺伝子を見出し、その遺伝子の発現を抑制することにより煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物を作製し、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、原料葉たばこの品質に影響を及ぼす遺伝子の同定を目的として、タバコ葉の成熟度合いが原料葉たばこの品質を大きく左右する点に着目し、土耕栽培した成熟期のタバコの葉において、あるいは、窒素施肥量を減じることによって擬似的に成熟を誘導した水耕栽培タバコの葉において、発現量が大きく変化する遺伝子を探索した。その結果、タバコ属植物の葉の成熟度合いを制御可能な遺伝子を同定することに成功し、この遺伝子の発現を抑制することにより、タバコ葉の成熟を促し、乾燥容易性を付与できるなど、原料葉たばこの品質を向上できることを見出し、また、驚くべきことに、該遺伝子の発現を抑制することにより、乾燥葉たばこの燃焼煙中のカルボニル類含量を低減できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
本発明の特徴は、要約すると以下の通りである。
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制された、タバコ属植物。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質
（２）前記遺伝子が、
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列に対して８５％以上の同一性を有し、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号５に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｇ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む、（１）に記載のタバコ属植物。
（３）前記カルボニル類が、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アセトン、アクロレイン、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、メチルエチルケトンおよびブチルアルデヒドからなる群から選択される、（１）または（２）に記載のタバコ属植物。
（４）前記カルボニル類が、ホルムアルデヒドまたはアクロレインである、（３）に記載のタバコ属植物。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のタバコ属植物の組織または細胞。
（６）前記組織が葉である、（５）に記載の組織または細胞。
（７）配列番号５に示す塩基配列、配列番号７に示す塩基配列、それらの配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列、およびそれらの塩基配列の２０塩基以上の部分配列からなる群から選択される塩基配列を含む、遺伝子発現抑制用ベクター。
（８）前記塩基配列の連続した２０塩基以上からなる塩基配列をアンチセンス方向に含む、（７）に記載のベクター。
（９）前記塩基配列のセンス鎖および該センス鎖に対合するアンチセンス鎖を含む、（７）に記載のベクター。
（１０）前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、前記塩基配列の連続した２０塩基以上からなる、（９）に記載のベクター。
（１１）前記センス鎖とアンチセンス鎖の間にスペーサーを有する、（９）または（１０）に記載のベクター。
（１２）植物細胞内で作動可能なプロモーターを有する、（９）〜（１１）のいずれかに記載のベクター。
【００１３】
（１３）タバコ属植物の細胞または組織を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法および転写因子を制御する方法から選択されるいずれかの方法を用いて、（１）および（２）に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制し、植物体を再生することを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のタバコ属植物を作製する方法。
（１４）（７）〜（１２）のいずれかに記載のベクターを、植物細胞または組織に導入し、植物体を再生する、（１３）に記載の方法。
（１５）前記植物体を母本として後代を作出する、（１４）に記載の方法。
（１６）（１）〜（４）のいずれかに記載のタバコ属植物の後代であって、（１）または（２）に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現が抑制されたことを特徴とする、後代。
（１７）（１）〜（４）のいずれかに記載のタバコ属植物または（１６）に記載の後代の葉から作製されたたばこ製品。
（１８）タバコ属植物において、（１）または（２）に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制することを含む、タバコ属植物の乾燥葉たばこの燃焼煙中のカルボニル類含量を低減する方法。
（１９）前記遺伝子の発現の抑制を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法および転写因子を制御する方法からなる群から選択される方法によって行うことを含む、（１８）に記載の方法。
（２０）（７）〜（１２）のいずれかに記載のベクターを植物細胞または組織に導入する、（１８）または（１９）に記載の方法。
【００１４】
なお、本明細書において「植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質」とは、タバコ属植物の組織、例えば乾燥された葉などを燃やした際に発生する燃焼煙中に含まれるカルボニル類の前駆物質となる、または、燃焼反応によるカルボニル類の生成を阻害する、植物の内容成分の生合成または分解に関与するタンパク質をいう。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたことを特徴とするタバコ植物および乾燥葉たばこを提供することができる。
【００１６】
また、通常、形質転換を行ったタバコ属植物は、形態的な影響、たとえば葉が矮小化する、葉の枚数が少なくなるなどの影響が見られ、収量が減少するが、本発明において見出された遺伝子の発現を抑制したタバコ属植物は、意外なことに形態的な影響が見られず、しかも形質転換していないタバコ属植物よりも早く成熟が進み、かつ乾燥が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
１．本発明のタバコ属植物
本発明の燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物は、
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質、または
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質
をコードする遺伝子の発現が抑制されるか、または
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列に対して８５％以上の同一性を有し、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号５に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｇ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む遺伝子の発現が抑制されることを特徴とする。
【００１８】
タバコ属植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能な遺伝子は、配列番号５に示す塩基配列(全長ｃＤＮＡ配列)を有し、配列番号６に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子である（以下、＃１０４９１遺伝子ということがある）。
【００１９】
＃１０４９１遺伝子は、タバコ葉の成熟度合いが原料葉タバコの品質を大きく左右する点に着目し、タバコのＤＮＡマイクロアレイを用いて、タバコ葉の成熟過程において発現量が大きく変化した遺伝子を調べた結果、選抜されたものである。
【００２０】
＃１０４９１遺伝子のＤＮＡは、当業者においては、一般的に公知の方法により単離することが可能である。例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９７５，９８，５０３．）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，  ＲＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０．、Ｓａｉｋｉ，  ＲＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８，２３９，４８７．）を利用する方法が挙げられる。具体的には、配列番号１（タバコのＤＮＡマイクロアレイ上に固定化されているプローブの配列）に記載の塩基配列からなるＤＮＡもしくはその一部をプローブとして、また配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、タバコ属植物の異なる品種、またはタバコ属植物以外の植物から配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと高い同一性(８５％以上)を有するＤＮＡを単離する。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもまた、本発明に適用される。
【００２１】
ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイズ可能であれば特に限定されないが、例えば、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で６０℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で６０℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回実施する条件が好ましい。
【００２２】
また、＃１０４９１遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを取得する方法は、特に限定されず、当該遺伝子を有する生物のｃＤＮＡライブラリーなどから適切な制限酵素で切り出し、精製すればよい。ゲノムＤＮＡは、例えば、植物細胞または組織からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、このライブラリーから、配列番号５に示す塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより取得することができる。
【００２３】
また、一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、または本遺伝子のｃＤＮＡないしゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより得ることができる。
【００２４】
なお、配列番号５の塩基配列についてＢＬＡＳＴによる配列比較解析（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｉ．  ＵＳＡ，１９９０，８７，２２６４−２２６８，Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３）を行ったところ、エチレン処理により誘導されるチトクロームＰ４５０遺伝子の一つと同一であることが分かった。これらチトクロームＰ４５０遺伝子の中には、ニコチンをノルニコチンへ変換するニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子が含まれていたが、配列番号５の塩基配列についてその機能を推定させる実施例は示されておらず、また、その利用法についても開示されていない（参照文献：米国特許出願公開第２００５／０３８０１８号、第２００５／０３８０３３号、第２００５／１１１２１７号、第２００６／００３７０９６号、第２００６／００４１９４９号）。
【００２５】
また、タバコ以外の遺伝子では、米国特許第７０７１３７６号明細書に開示されるシロイヌナズナのｐ−ｃｏｕｍａｒａｔｅ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｃ３Ｈ）をコードするＣＹＰ９８Ａ３遺伝子と塩基配列で約７０％、アミノ酸配列で７４％の同一性があることがわかった。しかし、前記明細書はリグニンについて述べており、リグニンと燃焼煙中のカルボニル類の関連性については何ら述べておらず、また当業者においてもリグニンと燃焼煙中のカルボニル類の関連性は知られていない。
【００２６】
従って、＃１０４９１遺伝子が、燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能であることは新規の知見である。
【００２７】
＃１０４９１遺伝子によりコードされるタンパク質は、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であるが、本発明においては該タンパク質に限定されず、タバコ属植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質である限り、配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、あるいは配列番号６に示すアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質でもよい。
【００２８】
ここで、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列とは、具体的には、配列番号６に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が変異により欠失、または他のアミノ酸に置換、あるいは付加された配列をいう。変異は、人為的に導入された変異または天然に存在する変異でもよい。
【００２９】
また、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、９９％以上の同一性であることが望ましい。配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
【００３０】
上記タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドであるがこれに限定されず、タバコ属植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なポリヌクレオチドである限り、配列番号５に示す塩基配列に対して８５％以上の同一性を有するポリヌクレオチド、または配列番号５に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドでもよい。
【００３１】
ここで、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列とは、具体的には、配列番号５に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が変異により欠失、または他の塩基に置換、あるいは付加された配列をいう。変異は、人為的に導入された変異または天然に存在する変異でもよい。
【００３２】
また、配列番号５に示す塩基配列に対して８５％以上の同一性を有する塩基配列は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、９９％以上の同一性であることが望ましい。配列の同一性は、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどの配列比較分析ツールにより決定することができる。なお、本明細書では、塩基配列の同一性の算出はデフォルトパラメータでＢＬＡＳＴ解析を行うことにより算出される。
【００３３】
また、ストリンジェントな条件は、例えば上記ハイブリダイゼーション条件を使用することができ、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件である。
【００３４】
上記タンパク質をコードする遺伝子の発現の抑制には、該遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれ、遺伝子の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。遺伝子が人為的または天然に変異、破壊されたり、あるいは各種遺伝子工学的手法、例えばＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、リボザイム法、共抑制法、転写因子を制御する方法などを用いることにより、発現不能または抑制される。
【００３５】
本発明のタバコ属植物は、植物、特に乾燥された葉を燃やした際に発生する燃焼煙の中に含まれるカルボニル類の含量が低減することを特徴とする。
【００３６】
乾燥葉たばこの燃焼煙中には多種多様な成分が存在することが知られている（Ｇｒｅｅｎ  ＣＲ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖ．  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｃｉ．２２：１３１−３０４）。よって、これら燃焼煙中の成分は複雑に関係しあい、喫煙の満足感や香喫味に繋がると考えられる。つまり、燃焼煙中の成分のバランスを大きく変化させると喫煙の満足感や香喫味を損なう可能性がある。したがって、燃焼煙中に含まれる特定の成分の低減は選択性の高い方法で実施することが望ましい。本発明では、たった１遺伝子（＃１０４９１遺伝子）の発現を抑制することにより乾燥葉たばこの燃焼煙中に含まれるカルボニル類を低減できた。乾燥葉たばこの燃焼煙中に含まれるカルボニル類は、具体的には、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アセトン、アクロレイン、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、メチルエチルケトン、ブチルアルデヒドなどである。
【００３７】
一般に、たばこの燃焼煙中の成分の測定は、刻んだ乾燥葉たばこを巻紙で巻いたものをＩＳＯ準拠の喫煙条件で自動喫煙させた煙を捕集して行う。一方、より簡便に、より少量のサンプルから、燃焼煙中の成分を捕集および測定する方法として、熱分解による方法が報告されている（Ｔｒｉｋａｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．；４２：１４０９−１７．）（Ｔｒｉｋａｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．；４３：５５９−６８．）。本発明では、この熱分解法により燃焼煙中のカルボニル類を測定したがこれに限るものでない。
【００３８】
なお、本発明には、本発明のタバコ属植物の組織または細胞（例えば根、茎、葉、花、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、約、花粉、カルス、プロトプラスト、懸濁培養細胞など）も包含される。
【００３９】
２．遺伝子発現抑制用ベクター
本発明の遺伝子発現抑制用ベクターは、
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質、または
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質、
をコードする遺伝子、あるいは
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列に対して８５％以上の同一性を有し、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号５に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｇ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を制御可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
の発現を抑制するための核酸分子を適当なベクターに挿入したものである。
【００４０】
本発明のベクターは、例えば、配列番号５に示す塩基配列、配列番号７に示す塩基配列、それらの配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列、およびそれらの塩基配列の２０塩基以上の部分配列からなる群から選択される塩基配列を含む。このようなベクターとして、アンチセンスベクターまたはＲＮＡ干渉誘導ベクターなどがある。
【００４１】
アンチセンスベクターとは、アンチセンス法にて＃１０４９１遺伝子、その変異体または相同体の発現を抑制する核酸分子を含むベクターをいう。相同体とは、＃１０４９１遺伝子に対応する遺伝子であって、タバコ属植物品種間で、またはタバコ属植物以外の植物で、異なる塩基配列を有する遺伝子をいう。
【００４２】
アンチセンス法とは、目的遺伝子から転写されたｍＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡを発現させて、該アンチセンスＲＮＡを目的遺伝子と相補的に結合させ、目的遺伝子の転写を妨げ、その結果として該遺伝子の発現を抑制する方法をいう。具体的には、植物で機能するプロモーターの下流に、＃１０４９１遺伝子、その変異体または相同体、あるいはそれらの断片をアンチセンス方向につないで植物細胞または組織に導入すると、上記ｍＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡを産生することができる。
【００４３】
アンチセンスベクターに導入する＃１０４９１遺伝子、その変異体または相同体の発現を抑制する核酸分子は、例えば、＃１０４９１遺伝子の塩基配列（配列番号５）の全長のアンチセンス核酸分子であってもよいが、配列番号５に示す塩基配列に対して９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列のアンチセンス核酸分子でもよく、これらの核酸分子の塩基配列中の連続した２０塩基以上から全長未満、好ましくは１００塩基以上から全長未満、より好ましくは５００塩基以上から全長未満からなる塩基配列を有するアンチセンス核酸分子でもよい。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い（参考文献：特開昭６０−２３２０９２、特開２０００−２３６８５）。
【００４４】
ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、ＲＮＡ干渉のトリガーとなるｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ、ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）の鋳型となるＤＮＡを含むベクターである。該ベクターを用いて細胞内で形成されたｄｓＲＮＡは、２本鎖ＲＮＡ特異的なＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）により約２１〜２５塩基のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断され、その後、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の一部として複合体を形成し、標的ｍＲＮＡを相同性により認識・分解する。
【００４５】
植物のＲＮＡ干渉では、ヘアピン型ｄｓＲＮＡとして発現するベクターが好適に利用される。これは十数〜数十塩基または数十〜数百塩基のリンカー（スペーサー）配列の両端にＩＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ：逆位反復）となるようにＲＮＡ干渉のトリガーとなる配列を配置し、植物体内で高発現するプロモーターによりヘアピン型ｄｓＲＮＡを転写し、細胞内でｓｉＲＮＡを産生するシステムである。また、ｓｉＲＮＡ発現システムには上記のようなヘアピンタイプのほか、タンデムタイプもある。タンデムタイプでは、２つのプロモーターからセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが転写され、細胞内でハイブリダイズしてｓｉＲＮＡが産生される。ＲＮＡ干渉のトリガーの鋳型となるＤＮＡの配列は、例えば、配列番号７の塩基配列または該配列に対して９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列の連続した２０塩基以上、好ましくは１００塩基以上、さらに好ましくは２００塩基以上を含む塩基配列およびその相補配列が用いられる（参考文献：ＷＯ／１９９９／０５３０５０、ＷＯ１９９９／３２６１９Ａ、ＷＯ２００１／７５１６４Ａ、Ｃｈｕａｎｇ  ＣＦ  ＆  Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ  ＥＭ：  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：４９８５，２０００）。
【００４６】
本発明において用いるＲＮＡ干渉誘導ベクターとしては、配列番号７に示す塩基配列のセンス鎖とそのセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖を、スペーサー（ループを形成する配列）をはさんでＩＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ：逆位反復）となるように同一のベクターに含むものが好ましい。
【００４７】
ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特に、バイナリーベクター系（ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１．２等）、または中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ等）のプラスミドが好ましい。バイナリーベクターはＴ−ＤＮＡ領域の右側ボーダー（ＲＢ）と左側ボーダー（ＬＢ）を含み、両ボーダー間に目的遺伝子とともにプロモーターや植物選抜マーカーなどのエレメントを含むことができ、通常、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことが可能である（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１０（３），６９７−７０４（１９９１））。一方、ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
【００４８】
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ、ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等の方法を用いて導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質転換に用いる。
【００４９】
また、上記の方法以外にも、三者接合法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２：８７１１（１９８４））によって、目的遺伝子を含む植物感染用アグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えば、ｐＲＫ２０１３等）を保有する大腸菌、およびアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシリンおよびカナマイシンを含む培地上で培養することにより植物感染用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。
【００５０】
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００５１】
また、ベクターには、目的遺伝子のほかに、例えばプロモーター、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー遺伝子などを配置することができる。
【００５２】
プロモーターとしては、植物体内または植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。
【００５３】
ターミネーターとしては、植物体内または植物細胞において機能し、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ターミネーター等が挙げられる。
【００５４】
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光または発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。
【００５５】
また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
【００５６】
本発明で使用可能なバイナリーベクターの構築例は、後述の実施例２に示されている。即ち、２個のｌｏｘＰを含むプラスミドｐＤＮＲ−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）のｌｏｘＰ間に３５Ｓプロモーター、スペーサー、ＮＯＳターミネーターを挿入したプラスミドｐＳＰ１４８（図２）を作製し、ＮＯＳターミネーターとスペーサーの間およびスペーサーと３５Ｓプロモーターの間にＲＮＡｉのトリガーとなる２種の目的ＤＮＡ断片を互いに逆向きに配置するようにトリガーを挿入し（図３、プラスミドｐＳＰ１４８＿＃１０４９１ＦＲ）、このヘアピン型ｄｓＲＮＡ発現カセットを、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え（米国特許第６，４１０，３１７号）によって、プラスミドｐＳＰ１０７（図４）に組み換えて、バイナリーベクターｐＳＰ１０７＿＃１０４９１（図５）を作製することができる。
【００５７】
２個のトリガーは、互いに向き合う方向でもよいし、あるいは互いに背を向け合う方向でもよい。またスペーサーの配列は、ヘアピンループを形成する配列であればいかなるものでもよいが、例えばｒａｓ遺伝子配列、イントロン配列を例示することができ、そのサイズは例えば数十〜数百ベース程度である。
【００５８】
３．本発明のタバコ属植物の作製方法
本発明のタバコ属植物の作製方法は、タバコ属植物の細胞または組織を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法および転写因子を制御する方法から選択されるいずれかの方法を用いて、上記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子および（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制し、植物体を再生することを含む。
【００５９】
タバコ属植物は、例えば、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）、ハナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｘ  ｓａｎｄｅｒａｅ）などが挙げられ、特に限定されないが、ニコチアナ・タバカムが好ましい。また品種については、紙巻製品の主原料となる黄色種、紙巻製品の緩和料となるバーレー種、葉巻たばこの原料に用いられる葉巻種、オリエント地域で栽培され独自の香気を持つオリエント種、たばこ種子が日本に伝来して以来、各地の気候風土に適応し分化した在来種を含む。
【００６０】
また本発明のタバコ属植物を作製するための植物材料としては、植物体および植物組織（例えば根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等）やその切片、細胞、カルス、それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト、懸濁培養細胞等の植物培養細胞が挙げられる。
【００６１】
上記遺伝子の発現を抑制するには、種々の遺伝子工学的手法を用いることができ、特に限定されないが、たとえばＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法または転写因子を制御する方法を挙げることができる。
【００６２】
ＲＮＡ干渉法は、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクター、または、例えば配列番号５若しくは７に示されるポリヌクレオチドあるいは配列番号５または７と９０％以上同一性を有するポリヌクレオチドに相同な２本鎖ＲＮＡ（その中の連続した例えば約１５〜３５塩基の２本鎖ＲＮＡが好ましい）を植物細胞または組織に導入して行うことができる。
【００６３】
また、アンチセンス法は、例えば上記アンチセンスベクターを植物細胞または組織に導入することにより、行うことができる。
【００６４】
これらのベクターを導入するには、例えばアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法が挙げられ、特に限定されないが、アグロバクテリウム法が好ましい。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、培養細胞を用いる場合、組織片（葉片、カルスなど）を用いる場合がある。
【００６５】
プロトプラストを用いる場合は、Ｔｉプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、培養細胞を用いる場合は、Ｔｉプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。
【００６６】
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物について電気泳動を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等により増幅産物を確認したり、リアルタイムＰＣＲで比較Ｃｔ法を用いて増幅率に基づいたＤＮＡの定量を行ってもよい。
【００６７】
あるいは、上述の種々のレポーター遺伝子を目的遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、該ベクター導入したアグロバクテリムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認してもよい。
【００６８】
遺伝子破壊法は、各種トランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡなどを用いて行うことができる。
【００６９】
トランスポゾンを利用した遺伝子破壊はトランスポゾンのゲノムへの遺伝子挿入機構を利用した方法である。特に、内在性のトランスポゾンを用いる方法は、非組換え体として、一度に多数の遺伝子破壊系統を作出することができる点で優れている。このような内在性の挿入因子として、タバコ属植物ではトランスポゾンの一種であるレトロトランスポゾンＴｔｏ１が知られている(ＷＯ００／０７１６９９)。
【００７０】
Ｔ−ＤＮＡを利用した遺伝子破壊は、標的遺伝子の中に薬剤耐性遺伝子などの外来遺伝子を組込み、これを右ボーダー（ＲＢ）と左ボーダー（ＬＢ）の間に挿入したＴ−ＤＮＡベクターを作製し、アグロバクテリウム法にてタバコ属植物を形質転換する方法である。
【００７１】
人為的突然変異法は、例えば、各種放射線（電磁波、紫外線、Ｘ線、γ線、粒子線、中性子線、α線、β線など）を植物に照射することにより、また各種変異原性化学物質（アルキル化剤、核酸塩基アナログ、アジ化ナトリウムなど）で処理することにより、行うことができる。
【００７２】
共抑制法とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す（Ｓｍｙｔｈ  ＤＲ：Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ７：Ｒ７９３，１９９７，Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ  Ｒ：Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ６：８１０，１９９６）。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部はＲＮＡｉの機構と重複していると考えられている。例えば、＃１０４９１遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、＃１０４９１遺伝子、または、これらと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターを使用して目的の植物を形質転換すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００７３】
リボザイム法で用いるリボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子の総称であるが、特に本明細書ではＲＮＡを部位特異的に切断するよう設計されたＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子：蛋白質核酸酵素、３５：２１９１，１９９０）。標的を切断できるように設計されたリボザイム は、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ３： ７３３， １９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ ＡＭ ＆Ｂｕｊａｒｓｋｉ ＪＪ： Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６： ４８２３， １９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ ＣＡ ＆ ＣｅｃｈＴＲ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ３８７５， １９９１、Ｔａｉｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：５１２５，１９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ Ｎ， ｅｔ ａｌ： Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １８６： １２７１， １９９２）。このように、リボザイム を用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００７４】
転写因子を制御する方法は、標的遺伝子の発現を調節する転写因子の発現を増減させることにより、間接的に標的遺伝子の発現を増減させる方法である。転写因子は標的遺伝子のプロモーター領域の特定配列（シスエレメント）に結合することにより、当該遺伝子の発現をコントロールする。例えば、転写因子を発現させることによって、代謝遺伝子の遺伝子発現を抑制することが可能である（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６  ６２：８０９−８２３）。
【００７５】
上記遺伝子工学的手法において植物組織または細胞を材料とした場合は、得られた植物組織または細胞から既知の組織培養法により器官または個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、以下のように行うことができる。
【００７６】
まず、形質転換の対象とする植物材料として植物組織またはプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
【００７７】
カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。
【００７８】
なお、本発明の方法により作製されたタバコ属植物は、形質転換処理を施した再分化当代である「Ｔ０世代」のほか、Ｔ０世代の植物を母本として、その植物の種子から得られた後代である「Ｔ１世代」、薬剤選抜あるいはサザン法等による解析によりトランスジェニックであることが判明した「Ｔ１世代」植物の花を自家受粉して得られる次世代（Ｔ２世代）などの後代植物をも含むものとする。
【００７９】
これらのタバコ属植物、またはその葉をたばこ製品の原料として、シガレット、葉巻、パイプたばこなどの各種たばこ製品を製造することができる。
【００８０】
たばこ製品の原料となる乾燥葉たばこの品質は、栽培中のタバコ葉の成熟度に大きく左右される。芯止めから収穫までの数十日間において肥料は枯渇し、タバコ葉は、乾物重の増大とともに、次第に成熟すると考えられている。この期間にタバコ葉の内容成分は、アルカロイド含量の増大、クロロフィルの分解など、大きく変化する。つまり、乾燥葉たばこの香喫味に関連する成分は成熟期の劇的な代謝の変動に伴い生成蓄積される。したがって、乾燥葉たばこの品質はタバコ葉の成熟に関連して発現する遺伝子によりコントロールできると考えられる。
【００８１】
品質の高い乾燥葉たばこは、適度に成熟したタバコ葉を適切に乾燥処理することによってのみ、生産することが可能である。例えば、品質の良好な黄色種タバコの乾燥葉は鮮黄色に仕上がり、芳香があり、緩和で甘みのある香喫味を特徴とする。色調は乾燥葉の品質を判断する上での重要な要素であり、黄色種タバコでは、レモン、オレンジなどの鮮やかな色調のものが品質良好で、まだらや緑がかったものは品質が悪いとされている（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｅ−Ｃｕｒｅｄ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｕ．Ｓ．  Ｔｙｐｅｓ  １１，１２，１３，１４，＆Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｔｙｐｅ  ９２，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）。また、乾燥葉たばこの品質は乾燥処理によっても大きく左右される。葉たばこの乾燥処理は、単に葉の乾燥を目的としているわけでなく、葉中の成分を変化させ、葉たばこ特有の色と香喫味を発現させる、葉たばこ生産上の極めて重要な工程である。また、特に温湿度や葉の吊り込み密度など乾燥処理における管理に問題があると、乾燥葉たばこは、例えば急乾葉、ムレ葉、帯青葉などの乾燥異常葉となり、原料葉たばことしての商品価値を大きく損なうことになる。こうした乾燥処理における異常葉の出現や乾燥処理の容易さは、上記成熟度合いの他に、品種や土壌環境にも左右される。例えば、遺伝形質としての“乾燥容易性”は品種の育成にも利用されている。
【００８２】
本発明の＃１０４９１遺伝子の発現を抑制したトランスジェニックタバコ（＃１０４９１タバコ）は、その葉を乾燥させたところ、ベクターコントロールを導入した対照タバコで認められた褐変がほとんどなく、黄色の鮮やかな色調を有し、良好な品質の原料となりうる。また、本発明の＃１０４９１タバコは、対照タバコと比較して成熟が早いという特長も認められた。
【００８３】
なお、上記葉たばこ生産に関することがらは、当業者にとって周知のことであり、ＤＡＶＩＳ  ＤＬ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｂａｃｃｏ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＷＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｅ−Ｃｕｒｅｄ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３）（Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），河田，葉たばこの耕作法（１９９１）（日本たばこ産業）などの成書にも記されている。
【００８４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００８５】
[成熟期において発現量が大きく変化する遺伝子（＃１０４９１遺伝子）の同定]
本発明者らは、原料葉たばこの品質に影響を及ぼす遺伝子の同定を目的として、タバコ葉の成熟度合いが原料葉たばこの品質を大きく左右する点に着目し，土耕栽培した成熟期のタバコの葉において、あるいは、窒素施肥量を減じることによって擬似的に成熟を誘導した水耕栽培タバコの葉において、発現量が大きく変化する遺伝子を探索した。その結果、タバコ葉の成熟時に特異的に発現が上昇する遺伝子の一つとして＃１０４９１遺伝子を同定した。
【００８６】
（１）タバコの栽培および葉からのＲＮＡサンプル抽出
土耕栽培タバコ（つくば１号）は、播種後６週目に４号素焼き鉢(テラコッタ；  径１２４ｍｍ，  高さ１１０ｍｍ）に移植して、人工気象器（コイトトロン：小糸工業株式会社製）に入れて育成した。鉢用肥土は土：堆肥：赤玉土（大）、赤玉土（小）：バーミキュライト＝３：４：１：１：１の組成の肥土１００リットル当たりバーレーＳ６２５（肥料）１ｋｇを混合したものを使用した。人工気象器は，明期：６：３０−１８：３０、温度２６℃、湿度６０％（ＲＨ）、暗期：１８：３０−６：３０、温度１８℃、湿度８０％（ＲＨ）に設定した。土が乾かないように１日１回程度潅水し、水量は生育にあわせて適宜調整した。移植に合わせて苗の地上部を全て採取し、移植０日目の試料とした（Ｎ＝８）。さらに，移植後１４、２８、４５、５２日目の午前９：００に，下から１１枚目の葉を採集した。（１４日目  Ｎ＝３６、２８−５２日目  Ｎ＝６、４５日目  Ｎ＝９）。
【００８７】
また、水耕栽培タバコ（つくば１号）は、発芽２８日目にハイドロボール(小粒)を充填したポリポット（丸型、１２．０ｃｍ、９．８ｃｍ、底穴１箇所）へ移植し、１５ｍＭ  ＫＮＯ３を含む水耕液（２．５ｍＭ  Ｋｐｉ：ｐＨ５．５、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  Ｆｅ−ＥＤＴＡ、７０μＭ  Ｈ３ＢＯ３、１４μＭ  ＭｎＣｌ２、０．５μＭ  ＣｕＳＯ４、１μＭ  ＺｎＳＯ４、０．２μＭ  ＮａＭｏＯ４、１０μＭ  ＮａＣｌ、０．０１μＭ  ＣｏＣｌ２）を底面潅水して、土耕栽培タバコと同様に人工気象器の中で育成した。減少した水耕液は適宜補充して量を維持した。水耕開始７日目（発芽３５日目）に一部の植物は０．３ｍＭ  ＫＮＯ３を含む水耕液へ移して成熟を誘導した。一方、そのまま１５ｍＭ  ＫＮＯ３を含む水耕液で栽培した植物は対照とした。これら植物から、水耕開始７日目以降の数日間にわたって、午前９時に下から７枚目の葉を採取した。
【００８８】
採集した葉は、液体窒素で凍らせた後に磨砕してＲＮＡ抽出用のサンプルとした。なお、移植時の苗は地上部全体をサンプルとして用いた。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡはＣｏｎｃｅｒｔ  Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社）を用いて（メーカー記載の操作方法を実施）、約４ｇの試料から精製した。さらに、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡはＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １，０００μｇからオリゴｄＴ−セルロースアフィニティーカラム法(ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ｍＲＮＡ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ, Ｓｉｇｍａ社）を用いて精製した（メーカー記載の操作方法を実施）。
【００８９】
（２）ｃＤＮＡマイクロアレイ解析
上記のようにして得たｐｏｌｙ（Ａ）  ＲＮＡは理化学研究所のタバコ培養細胞由来の約１７０００種のＥＳＴを搭載したＢＹ−２  ＥＳＴマイクロアレイを用いて解析した。理化学研究所のＢＹ−２−ＥＳＴマイクロアレイに関する詳細はＭａｔｓｕｏｋａら（２００４，Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ＢＹ−２  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．；４５：１２８０−９）およびＧａｌｉｓら（２００６，Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｒ２Ｒ３  ＭＹＢ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮｔＭＹＢＪＳ１  ｉｓ  ａ  ｍｅｔｈｙｌ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４６：５７３−９２．）の報告およびＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧＥＯ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ）のホームページにて公開されている。
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＰＬ４７０６）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＰＬ４７０７）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＰＬ４７０８）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＰＬ４７０９）
【００９０】
各試料から精製したｐｏｌｙ（Ａ）  ＲＮＡとマイクロアレイ解析の処理手順や直線性や感度、精度を確認するためのインターナルコントロールとしてカナマイシン耐性遺伝子のｃＲＮＡを添加した核酸を鋳型にして、Ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｄＴ２５プライマー(ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社)、Ｒａｎｄｏｍ  ９ｍｅｒｓプライマー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）の混合プライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を用いて（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）一本鎖ｃＤＮＡプローブを合成し、同時に蛍光色素Ｃｙ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で標識した核酸をｃＤＮＡプローブ中に取り込ませた。ｃＤＮＡプローブとオリゴＡ８０、Ｃｙ３標識ベクター、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を混合してプローブ溶液とした。プローブのハイブリダイゼーションとスキャンニングは前述の松岡らの方法に従った。データは、Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）によって解析した。マイクロアレイ解析の結果、タバコ葉の成熟時に特異的に発現が上昇する遺伝子の一つとして、発現タグ（ＥＳＴ）である１０４９１ｆ１配列（配列番号１）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ：５２８２９５２７）と相同である遺伝子を見いだした。
【００９１】
（３）＃１０４９１遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列の単離
上記のようにして明らかにしたＢＹ−２  ＥＳＴの１０４９１ｆ配列（配列番号１）に相当する完全長ｃＤＮＡは、出願人保有のｃＤＮＡライブラリーから相同性検索により得ることができた。出願人保有のｃＤＮＡライブラリーとは、タバコ(品種つくば１号)の完全長ｃＤＮＡクローンを個別に単離し、末端配列情報とともに整理したものである。この様にして得た３種のクローン（Ｎｏ．００１５＿２＿Ｅ０３、Ｎｏ．００５２＿２＿Ｆ０８、Ｎｏ．００７７＿１＿Ｆ０７）をＬＢ（５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む）液体培地中で終夜培養し、シークエンス解析の鋳型とするために、各クローンに含まれるプラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。＃１０４９１遺伝子の未解読領域のシークエンス解析のためのプライマーは、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて上記３種のクローンのｃＤＮＡ末端配列情報に基づき設計した配列番号２〜４、およびＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（タカラバイオ社）、Ｍ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（タカラバイオ社）を用いた。シークエンス解析は，ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）および３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、キットおよび装置の指示書に従って行った。上記のようにして得た配列を塩基配列解析ソフト（ＡＴＧＣ  ｖｅｒ．4，ＧＥＮＥＴＹＸ；ゼネティックス社）を用いて、１０４９１ｆ配列（配列番号１）および上記３種のクローンのｃＤＮＡ末端配列と結合処理することにより、１７２０ｂｐの＃１０４９１遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列（配列番号５、＃１０４９１＿ｃＤＮＡ）を明らかにし、また、＃１０４９１遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号６、＃１０４９１＿ｐｒｏｔｅｉｎ）を推定した。＃１０４９１遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列（配列番号５）は、ＢＬＡＳＴによる配列比較解析を行ったところ、チトクロームＰ４５０の一種と推定された。
【実施例２】
【００９２】
[＃１０４９１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型ｄｓＲＮＡ発現カセットを含むバイナリーベクターの構築]
ＲＮＡｉのトリガーとなるＤＮＡ配列（配列番号７、＃１０４９１＿ｔｒｉｇｅｒ）はクローンＮｏ．００１５＿２＿Ｅ０３のプラスミドを鋳型として、配列番号８および９、あるいは配列番号１０および１１のプライマー組み合わせを用いて図１に示す同一の領域からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、９５℃２分の後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクル、７２℃でさらに１０分反応させて行った。増幅した２種のＤＮＡ断片は、それぞれ５’／３’末端に、プライマーにより付与されたＮｏｔＩ／ＰｓｔＩまたはＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ認識配列を持つ（図１）。得られた増幅ＤＮＡは、それぞれ５’／３’末端に付与された制限酵素で二重消化し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した。
【００９３】
逆向反復配列（即ち、正方向配列と逆方向配列の反復）を構築するためのベクターは、ｐＤＮＲ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を改変したｐＳＰ１４８（図２）を利用した。ｐＳＰ１４８（図２）の２個のｌｏｘＰ部位の間には、３５Ｓプロモーター、マルチクローニングサイト１（ＭＣＳ１）、スペーサー配列、マルチクローニングサイト２（ＭＣＳ２）、ＮＯＳターミネーターの順で存在する。このベクターのＭＣＳ１のＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ配列導入部位およびＭＣＳ２のＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ配列導入部位に前述の制限酵素で二重消化した増幅DNA断片をそれぞれ連結することにより、ヘアピン型ｄｓＲＮＡ発現カセットを含むｐＳＰ１４８＿＃１０４９１ＦＲを作製した（図３）。
【００９４】
次に、ｐＳＰ１４８＿＃１０４９１ＦＲ上で構築したヘアピン型ｄｓＲＮＡ発現カセットは、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え（米国特許第６，４１０，３１７号）を利用して、バイナリーベクターｐＳＰ１０７（図４）に載せ替えた。バイナリーベクターｐＳＰ１０７（図４）とはｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＣｒｅａｔｏｒ  Ａｃｃｅｐｔｏｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて改変したものである。即ち、Ｃｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて指示書に従いＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換えを行うことにより、ｐＳＰ１４８＿＃１０４９１ＦＲ上のヘアピン型ｄｓＲＮＡ発現カセットを含む２個のｌｏｘＰ間の断片をｐＳＰ１０７上のｌｏｘＰ部位に載せ替えた、バイナリーベクターｐＳＰ１０７＿＃１０４９１を作製した（図５）。
【実施例３】
【００９５】
[＃１０４９１遺伝子の発現を抑制したトランスジェニックタバコの作出]
構築したバイナリーベクターｐＳＰ１０７＿＃１０４９１およびｐＳＰ１０７（対照；ベクターコントロール）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの菌種ＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：１７９−１８０）に凍結融解法により導入し、カナマイシン耐性で選抜することにより、目的とするｐＳＰ１０７＿＃１０４９１およびｐＳＰ１０７（対照）がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの菌種ＬＢＡ４４０４に導入されたコロニーを得た。
【００９６】
培養約２週間後、カナマイシン耐性を示すカルス様の細胞塊をＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇの１／２無機塩類、シュークロース１５ｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ及びゲランガム０．３％を含む二次選抜培地（ｐＨ  ５．８）に置床した。
【００９７】
温室内で約１．５ヵ月栽培したタバコ品種つくば１号の最上位展開葉より採取したタバコの葉を、有効塩素１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液（Ｔｗｅｅｎ  ２０を数滴／Ｌ加える）で約５分間表面殺菌を行い、滅菌水で３回洗浄した後、メスを用いて約５ｍｍ角の葉片を調製した。この葉片とｐＳＰ１０７＿＃１０４９１あるいはｐＳＰ１０７（対照、ＧＦＰ遺伝子とｎｐｔＩＩ遺伝子のみ発現させるベクター）を導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ約１０８細胞とをＬｉｎｓｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（１９６５）の無機塩類と３０ｇ／Ｌのシュクロースより成る液体培地中で４８時間共存培養を行った。その後、葉片をセフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ及びカルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌを含む滅菌水で３回洗浄して細菌を洗い落とした後、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ  の無機塩類、シュークロース３０ｇ／Ｌ、インドール酢酸０．３ｍｇ／Ｌ、６−（γ，γ−ｄｉｍｅｔｙｌａｌｌｙｌ−ａｍｉｎｏ）ｐｕｒｉｎｅ  １０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌ、及びゲランガム０．３％を含む一次選抜培地（ｐＨ５．８）に置床した。培養約２週間後、カナマイシン耐性を示すカルス様の細胞塊をＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇの１／２無機塩類、シュークロース１５ｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ及びゲランガム０．３％を含む二次選抜培地（ｐＨ  ５．８）に置床した。
【００９８】
二次選抜培地にてカナマイシン耐性を示すカルス様の細胞塊を約３週間培養した後、再分化した個体から採取した５ｍｍ×５ｍｍの葉片をＧＵＳ  ａｓｓａｙ（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）に供試した。ＧＵＳ  ａｓｓａｙにより選抜された個体を再び二次選抜培地（プラントボックス）に置床した。さらに、約３週間培養した後に、発根した個体を４号素焼き鉢（テラコッタ；径１２４ｍｍ、高さ１１０ｍｍ）に移植した。
【００９９】
このようにして、最終的に、バイナリーベクターｐＳＰ１０７＿＃１０４９１を用いて形質転換したトランスジェニックタバコ(以下、＃１０４９１タバコ)を２０個体、ｐＳＰ１０７を用いて形質転換したトランスジェニックタバコ(以下、対照タバコ)を６個体作成したトランスジェニックタバコは、自然光のもと冷房装置およびボイラー装置を用いて昼夜温度が約２３℃に調節された閉鎖系温室内で栽培した。鉢用肥土は土：堆肥：赤玉土（大）、赤玉土（小）：バーミキュライト＝３：４：１：１：１の組成の肥土１００リットル当たりバーレーＳ６２５（肥料）１ｋｇを混合したものを使用した。
【０１００】
さらに、＃１０４９１タバコにおける＃１０４９１遺伝子の発現抑制をリアルタイムＰＣＲ（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３９：７５−８５）により確認するために、上記のようにして得た鉢上げ後約２ヶ月のトランスジェニックタバコから、直径約１０ｍｍのリーフディスクをポンチで打ち抜き、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）中で保存したものをリアルタイムＰＣＲの材料とした。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出し、さらに、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて逆転写反応を行った。この逆転写反応液の一部をリアルタイムＰＣＲに供試した。リアルタイムＰＣＲに用いる＃１０４９１およびβ−ａｃｔｉｎのＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ＰｒｏｂｅとｐｒｉｍｅｒはＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計した（配列番号１２−１７）。リアルタイムＰＣＲは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行い、キット添付の「ＴａｑＭａｎプローブを用いたＤｕｐｌｅｘリアルタイム定量ＰＣＲ」プロトコールに従い、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上で、９５℃１５分の後、９４℃１分、６０℃１分で４５サイクル反応させることによって行った。比較Ｃｔ法（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＃２，ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により解析した、リアルタイムＰＣＲの結果を図６に示す。調査した２０種の＃１０４９１タバコの全てにおいて、＃１０４９１遺伝子の発現が対照の平均１５％に抑制されていることを確認した。
【実施例４】
【０１０１】
［トランスジェニックタバコの解析］
（１）  トランスジェニックタバコの形態、葉色
上記のようにして得た、鉢上げ後約二ヶ月のトランスジェニックタバコの上位葉、中位葉、下位葉について、タバコ葉の成熟の指標とするために、コニカミノルタ製葉緑素計（ＳＰＡＤ−５０２）を用いてＳＰＡＤ値（植物の葉に含まれるクロロフィル量を表す数値）を測定したところ、表１に示すように＃１０４９１タバコ(ｎ＝１５)のＳＰＡＤ値は対照タバコ(ｎ＝６)と比べて有意に低い値を示し、＃１０４９１タバコではクロロフィルが減少し、成熟が進んでいることが示唆された。また、図７に示すように、＃１０４９１タバコは、対照タバコと比べて、形態に大きな差は認められない。
【０１０２】
（２）  トランスジェニックタバコの乾燥葉たばこの性状
上記の鉢上げ後約２ヶ月のタバコから葉を収穫して黄色乾燥を行い、乾燥葉を作製した。黄色乾燥は13のステップから構成されるプログラムによりＥＳＰＥＣ社の恒温恒湿器を用いて行った。各ステップは以下の通りである。
【０１０３】
ステップ１：乾燥開始後３時間かけて昇温／加湿し、温度３８℃／相対湿度１００％に到達後、本条件で８時間処理。ステップ２：次に１時間かけて昇温／排湿し、温度４０℃／相対湿度８７％に到達後、本条件で１５時間処理。ステップ３：次に１時間かけて昇温／排湿し、温度４３℃／相対湿度６３％に到達後、本条件で１５時間処理。ステップ４：次に１時間かけて昇温／排湿し、温度４５℃／相対湿度５２％に到達後、本条件で１５時間処理。ステップ５：次に１時間かけて昇温／排湿し、温度４８℃／相対湿度４３％に到達後、本条件で１５時間処理。ステップ６：次に１時間かけて昇温／排湿し、温度５０℃／相対湿度３７％に到達後、本条件で１０時間処理。ステップ７：次に１時間かけて昇温／排湿し、温度５３℃／相対湿度３１％に到達後、本条件で８時間処理。ステップ８：次に１時間かけて昇温／排湿し、温度５６℃／相対湿度２６％に到達後、本条件で６時間処理。ステップ９：次に１時間かけて昇温／排湿し、温度６０℃／相対湿度２０％に到達後、本条件で６時間処理。ステップ１０：次に１時間かけて昇温／排湿し、温度６３℃／相対湿度１６％に到達後、本条件で６時間処理。ステップ１１：次に２時間かけて昇温し、温度６５℃／相対湿度１６％に到達後、本条件で２時間処理。ステップ１２：次に１時間で昇温し、温度６８℃／相対湿度１６％に到達後、本条件で８時間処理。ステップ１３：５時間かけて、温度３０℃／相対湿度６０％まで降温／加湿し乾燥を終了。
【０１０４】
原料葉たばこの品質の指標となる乾燥葉の仕上がりを２種のトランスジェニックタバコ間で比較すると、図８に示すように、対照タバコの乾燥葉は褐変が認められるのに対し、＃１０４９１タバコの乾燥葉の仕上がりは非常にきれいにであった。この結果は、成熟の進んだタバコ葉から品質の高い原料葉たばこが生産されるという、葉たばこ生産におけるセオリーと極めてよく合致した。これらの結果から、＃１０４９１遺伝子の発現抑制はタバコ葉の成熟を促し、乾燥葉たばこの仕上がりを向上させるなど、タバコ葉に乾燥容易性を付与したと結論できた。
【０１０５】
（３）  トランスジェニックタバコの乾燥葉の燃焼煙中に含まれるカルボニル類の含量
上記のように作製したトランスジェニックタバコの乾燥葉は、４０℃、９５％ＲＨで２時間調湿して細刻してタバコ刻とした後、２５℃、６０％ＲＨで１週間以上調湿してから、石英管をリアクターとする赤外線イメージ炉（Ｕｌｖａｃ−Ｒｉｋｏ  Ｉｎｃ．）による熱分解試験に供試し、煙中ホルムアルデヒドおよびアクロレインの含量を測定した。キャリヤーガスに１００％の窒素ガスを用いて、流量はＳＥＣ−Ｂ４０  ｍａｓｓ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｈｏｒｉｂａ  Ｓｔｅｃ  Ｉｎｃ．）を用いて１０００ｍｌ／ｍｉｎに調整した。サンプルとしてタバコ刻１５０ｍｇを用いて、石英管の中央に１２．５ｍｍの幅に詰めた。１分間キャリアーガスで石英管内の空気を置換した後、室温から１６．７℃／ｓの割合で温度を８００℃まで上昇させ、８００℃で５秒間温度を固定した。この温度制御に関しては、ＴＰＣ−１０００  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｅｍｐｅｒａｒｕｒｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｕｌｖａｃ−Ｒｉｋｏ  Ｉｎｃ．）を用いた。熱分解により生成した煙は、１００ｍｌの２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ溶液を含むインピンジャーと４４−ｎｍフィルター（Ｈｅｉｎｒ．  Ｂｏｒｇｗａｌｄｔ  Ｔｅｃｈｎｉｋ）に捕集した。上記の手法はＴｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）の方法に従った。なお２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ溶液は、２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ（水分５０％含有品）９．５１０７ｇを秤量し、アセトニトリル５００ｍＬに溶解させ、６０％過塩素酸２．８ｍＬを加えて混合した後、超純水を加えて１Ｌの水溶液とした。煙を捕集した４４−ｎｍフィルターに３０ｍＬの２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ溶液を加えて３０分間振とうさせた後、煙を捕集して７０分間静置した２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ溶液（インピンジャー）と混合した。２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ混合溶液とＴｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ溶液を２：３  の割合で混合し、０．４５−μｍ  ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅメンブレンフィルターでろ過した後、高速液体クロマトグラフィーによる分析を行った。上記の手法は前述のＴｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）の方法に従った。また高速液体クロマトグラフィーによる分析方法は、Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｎｏ．Ｔ−１０４に準拠した。なおＴｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ  溶液は、Ｔｒｉｚｍａ  ｂａｓｅを０．４ｇ秤量し、超純水４０ｍＬに溶解させ、アセトニトリルを加えて２００ｍＬの水溶液とした。
【０１０６】
＃１０４９１タバコおよび対照タバコの赤外線イメージ炉による煙中ホルムアルデヒドおよびアクロレインの解析を行った結果を図９に示す。なお解析にあたっては、＃１０４９１タバコを３個体、対照タバコを３個体について測定し、対照タバコにおける煙中ホルムアルデヒドおよびアクロレイン生成量を１００％とした時の相対値（％）を算出した。その結果、＃１０４９１遺伝子の発現を抑制した＃１０４９１タバコでは、煙中のホルムアルデヒドおよびアクロレイン含量が、対照のそれぞれ平均４５％および６８％と、大きく低減していた。上記の＃１０４９１タバコにおける燃焼煙中のカルボニル類の含量の低減は、燃焼煙中のカルボニル類の前駆物質である、葉中の何らかの成分の生成が低減されたことに起因すると考えられる。したがって、乾燥葉タバコの燃焼煙中のカルボニル類の制御は＃１０４９１遺伝子の発現を制御したタバコ葉を利用することにより実現できる。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、燃焼煙中のカルボニル類が低減したタバコ属植物を提供することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】＃１０４９１遺伝子のＰＣＲ増幅領域を示す。
【図２】ベクターｐＳＰ１４８の構造を示す。
【図３】ベクターｐＳＰ１４８＿＃１０４９１ＦＲの構造を示す。
【図４】ベクターｐＳＰ１０７の構造を示す。
【図５】ベクターｐＳＰ１０７＿＃１０４９１の構造を示す。
【図６】トランスジェニックタバコにおける＃１０４１９遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す。
【図７】トランスジェニックタバコ（Ｔ１世代、Ｔ０世代の自殖後代）の形態（発蕾期）を示す。
【図８】トランスジェニックタバコの乾燥葉を示す。
【図９】Ａは、トランスジェニックタバコの乾燥葉の燃焼煙中のホルムアルデヒド含量を示す。Ｂは、同様に燃焼煙中のアクロレイン含量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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