(57)【要約】      （修正有）【課題】識別対象としない変異を含む標的核酸の検出において、検出に必要な核酸材料の種類を減らし、より簡易な検出系を提供する。【解決手段】識別対象としない塩基変異が存在する第１の塩基配列領域を含む標的核酸の、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プライマーを含む核酸増幅用溶液を調製する工程と、前記核酸増幅用溶液に、前記標的核酸が存在する可能性がある検体を添加する工程と、前記検体を添加した前記核酸増幅用溶液を用いて増幅反応を行う工程と、前記増幅反応の増幅効率から前記第１の塩基配列領域の存在の有無、または前記第１の塩基配列領域中に存在する前記塩基変異以外の変異の有無を判定する工程と、を含む標的核酸の検出方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
識別対象としない塩基変異が存在する第１の塩基配列領域を含む標的核酸の、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プライマーを含む核酸増幅用溶液を調製する工程と、
前記核酸増幅用溶液に、前記標的核酸が存在する可能性がある検体を添加する工程と、
前記検体を添加した前記核酸増幅用溶液を用いて増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応の増幅効率から前記第１の塩基配列領域の存在の有無、または前記第１の塩基配列領域中に存在する前記塩基変異以外の変異の有無を判定する工程と、
を含む標的核酸の検出方法。
【請求項２】
前記増幅反応が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、およびＳＭＡＰ法からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅反応効率の評価が、電気泳動法、比濁法、および電気化学測定法からなる群から選択された検出方法によって行われることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
識別対象としない塩基変異が存在する第１の塩基配列領域を含む標的核酸の、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブに、前記標的核酸が存在する可能性がある検体を反応させる工程と、
前記核酸プローブと前記標的核酸とのハイブリッド形成量から、前記第１の塩基配列領域の存在の有無、または前記第１の塩基配列領域中に存在する前記塩基変異以外の塩基の有無を判定する工程と、
を含む標的核酸の検出方法。
【請求項５】
前記核酸プローブが核酸検出用基体上に固定され、前記核酸検用基体上に前記標的核酸を添加する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイブリッド形成量を、電気化学的に検出することを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ハイブリッド形成量を、光学的に検出することを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
それぞれ識別対象としない塩基変異が存在する、第１、および第２の塩基配列領域を含む標的核酸があって、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プライマーを含む核酸増幅用溶液を調製する工程と、
前記核酸増幅用溶液に、標的核酸が存在する可能性がある検体を添加する工程と、
検体を添加した前記核酸増幅用溶液を用いて増幅反応を行う工程と、
前記塩基変異に対応する位置以外は、前記第２の塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ第２の塩基配列領域に存在する前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブに、前記増幅反応で得られた増幅産物を反応させる工程と、
前記核酸プローブと前記増幅産物とのハイブリッド形成量から、前記第１、および第２の塩基配列領域の存在の有無、または第１、および第２の塩基配列領域中に存在する前記塩基変異以外の変異の有無を判定する工程と、
を含む標的核酸の検出方法。
【請求項９】
前記増幅反応が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、およびＳＭＡＰ法からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリッド形成量を、電気化学的に検出することを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイブリッド形成量を、光学的に検出することを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
識別対象としない塩基変異が存在する塩基配列領域を含む標的核酸を検出するための核酸プライマーであって、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プライマー。
【請求項１３】
識別対象としない塩基変異が存在する塩基配列領域を含む標的核酸を検出するための核酸プローブであって、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸検出用の核酸プライマーおよび／または核酸プローブを使用した標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
塩基配列（例えばウイルスRND/DNA、細菌、またはヒトの塩基配列）には、様々な塩基変異が存在する。ヒトの塩基配列に存在する変異は、病気の羅患リスクや、薬の効果や副作用に関与することが知られており、細菌やウイルスの塩基配列に存在する変異は、それらの薬剤耐性に関与することが知られている。従って、塩基配列中の特定の変異を検出（識別）することにより、医療分野において必要な情報を提供することができる。
【０００３】
このような塩基配列中には、上記のような塩基変異、つまり識別する必要のある塩基変異の他に、アミノ酸変異を伴わない、伴ったとしても上記のような医療分野における必要性とは無関係であるなどの理由で、識別対象としない塩基変異が存在する。一方、識別対象の塩基変異は、この識別対象としない塩基変異の有無に関わらず、識別される必要がある。
【０００４】
従来技術として、識別対象としない塩基変異に対応する部位に、修飾塩基（イノシン）を配置する等が考えられる（図９を参照）。しかしながら、イノシンは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、全ての塩基に対して水素結合を形成するものの、その結合力には差異がある（C>A>T>>G）（図１０を参照）。従って、識別対象の１塩基を識別する条件下では、この差異が大きく影響し、使用が困難であった。その結果、識別対象としない塩基変異と結合する塩基（A, G, C, or T）を含む核酸プライマーまたは核酸プローブを別途用意する必要があり（図１１を参照）、核酸プライマーまたは核酸プローブの本数が増大するといった問題があった。
【０００５】
一方、塩基を含まない脱塩基ヌクレオチド(abasic nucleotide)を含む核酸分子を合成可能であることがわかっており、脱塩基部位（Apurinic/Apyrimidinic site (AP-site)）を生じることが知られている。（特許文献１）。
【特許文献１】特許第3940407号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
識別対象としない変異を含む塩基配列（例えばウイルスRND/DNA、細菌）の検出において、識別対象としない変異に対応する塩基を含む核酸プローブあるいは核酸プライマーを設計することにより、核酸プローブあるいは核酸プライマーの種類が増え、開発時間、開発コスト、製品コストが増える。
【０００７】
本発明の目的は、識別対象としない変異を含む標的核酸の検出において、検出に必要な核酸材料の種類を減らし、より簡易な検出系を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意研究の結果、識別対象としない変異塩基が存在する位置に脱塩基核酸(abasic nucleotide)が配置された核酸プライマーおよび核酸プローブを使用して標的核酸を検出することに成功した。上記位置に脱塩基核酸が配置された核酸プライマーおよび核酸プローブを使用することによって、識別対象としない変異塩基の種類に対応した核酸プライマーおよび核酸プローブをそれぞれ別個に用意する必要がなくなり、少ない種類の核酸プライマーおよび核酸プローブによる効率的な核酸の検出が実現される。
【０００９】
すなわち、核酸プライマーを使用して核酸を検出する場合、本発明は、識別対象としない塩基変異が存在する第１の塩基配列領域を含む標的核酸の、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プライマーを含む核酸増幅用溶液を調製する工程と、前記核酸増幅用溶液に、前記標的核酸が存在する可能性がある検体を添加する工程と、前記検体を添加した前記核酸増幅用溶液を用いて増幅反応を行う工程と、前記増幅反応の増幅効率から前記第１の塩基配列領域の存在の有無、または前記第１の塩基配列領域中に存在する前記塩基変異以外の変異の有無を判定する工程と、を含む標的核酸の検出方法を提供する。
【００１０】
また、核酸プローブを使用して核酸を検出する場合、本発明は、識別対象としない塩基変異が存在する第１の塩基配列領域を含む標的核酸の、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブに、前記標的核酸が存在する可能性がある検体を反応させる工程と、前記核酸プローブと前記標的核酸とのハイブリッド形成量から、前記第１の塩基配列領域の存在の有無、または前記第１の塩基配列領域中に存在する前記塩基変異以外の塩基の有無を判定する工程と、を含む標的核酸の検出方法を提供する。
【００１１】
さらにまた、核酸プライマーおよび核酸プローブを使用して核酸を検出する場合、本発明は、それぞれ識別対象としない塩基変異が存在する、第１、および第２の塩基配列領域を含む標的核酸があって、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プライマーを含む核酸増幅用溶液を調製する工程と、前記核酸増幅用溶液に、標的核酸が存在する可能性がある検体を添加する工程と、検体を添加した前記核酸増幅用溶液を用いて増幅反応を行う工程と、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記第２の塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ第２の塩基配列領域に存在する前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブに、前記増幅反応で得られた増幅産物を反応させる工程と、前記核酸プローブと前記増幅産物とのハイブリッド形成量から、前記第１、および第２の塩基配列領域の存在の有無、または第１、および第２の塩基配列領域中に存在する前記塩基変異以外の変異の有無を判定する工程と、を含む標的核酸の検出方法を提供する。
【００１２】
さらにまた、本発明は、識別対象としない塩基変異が存在する塩基配列領域を含む標的核酸を検出するための核酸プライマーであって、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プライマーを提供する。
【００１３】
さらにまた、本発明は、識別対象としない塩基変異が存在する塩基配列領域を含む標的核酸を検出するための核酸プローブであって、前記塩基変異に対応する位置以外は、前記塩基配列領域に相補的な配列領域を有し、かつ前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、識別対象としない塩基変異の配列を考慮することなく、検出対象である塩基配列領域に対応した核酸プライマーあるいは核酸プローブのみを作製すればよい。したがって、検出に必要な核酸プライマーおよび核酸プローブの種類を著しく減らすことができ、効率的かつ低コストな検出系を実現することができる。特に、本発明は、識別の必要の無い変異部位が多数存在する配列領域の存在を検出するような場合、またはその配列領域中に存在する、前記（識別対象としない）塩基変異以外の、識別対象とする変異の有無を判定する場合に威力を発揮し、このような場合であっても、検出に必要な核酸プライマーおよび／または核酸プローブの種類が少ない、効率的かつ低コストな検出系を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施態様について説明する。なお、以下に示す実施態様は、本発明の構成を詳細に説明するために例示的に示したものに過ぎない。従って、本発明は、以下の実施態様に記載された説明に基づいて限定解釈されるべきではない。本発明の範囲には、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内にある限り、以下の実施態様の種々の変形、改良形態を含む全ての実施態様が含まれる。
【００１６】
なお、発明の理解を容易にする目的で、以下に、各実施態様の構成について簡単に表にまとめ、これを示す。
【表１Ａ】
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【００１７】
＜第１の実施態様＞
１．核酸プライマーを使用した標的核酸の検出方法
（１）標的核酸の調製
第１の実施態様において検出対象となる標的核酸は、特に限定されないが、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、培養細胞、喀痰、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、食品、土壌、排水、廃水、空気などの試料から抽出される核酸、または、これらの核酸を鋳型として、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、およびＳＭＡＰ法などの核酸増幅方法により増幅された増幅産物となる。特に、ウイルスおよび細菌類の遺伝物質には多くの変異部位が存在するため、ウイルスまたは細菌感染症の検出において第１の実施態様における検出方法は極めて有効である。検出対象となるウイルス感染症には、たとえば、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型）、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、ヘルペス群ウイルス、アデノウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ムンプスウイルス、ヒトロタウイルス、エンテロウイルス、日本脳炎ウイルス、天然痘ウイルス、コロナウイルス、SARS、デングウイルス、風疹ウイルス、ＨＴＬＶなどのウイルス感染症がある。また、検出対象となる細菌感染症には、たとえば、黄色ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコバクターピロリ菌、カンピロバクター、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、炭疽菌、エルシニア、淋菌、リステリア菌、レプトスピラ、レジオネラ菌、スピロヘータ、肺炎マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、マラリア、赤痢アメーバ、病原真菌などの細菌感染症がある。
【００１８】
さらに、第１の実施態様における検出方法は、上記感染症を発症させるウイルス等の型の判定（ジェノタイピング）に用いることもできる。たとえば、Ｃ型肝炎ウイルスの１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、およびヒトパピローマウイルスの癌化に関連している１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５４、５６、５８、５９、６６、６８、６９、および癌化に関連していない６、１１、３４、４０、４２、４３、４４、７０などの遺伝子型を決定することができる。さらに、薬剤耐性遺伝子を検出することもでき、たとえば、結核菌、エイズウイルス、および呼吸器感染症を引き起こす細菌の薬剤耐性遺伝子などの検出に威力を発揮する。
【００１９】
その他、遺伝性疾患、網膜芽細胞腫、ウイルス腫瘍、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、神経腺維腫症、家族性乳ガン、色素性乾皮症、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃ガン、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺ガン、甲状腺腫瘍、乳腺腫瘍、泌尿器腫瘍、男性器腫瘍、女性器腫瘍、皮膚腫瘍、骨・軟部腫瘍、白血病、リンパ腫、および固形腫瘍などの腫瘍性疾患における遺伝子検査に適用することができる。また、第１の実施態様における核酸の検出方法は、医療分野以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業など、遺伝子検査が必要な全ての技術分野において適用することができる。
【００２０】
第１の実施態様において、標的核酸の調製は、上述した検査対象となる試料から核酸成分を抽出することによって行われる。抽出方法は特に限定されないが、たとえばフェノール−クロロホルム法などの液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）などの市販の核酸抽出方法を利用することもできる。抽出した核酸は、適切な溶液に溶解しておくことが好ましい。
【００２１】
第１の実施態様において検出対象となる標的核酸は、検出対象となる塩基配列領域の中に、識別対象としない塩基変異を含む。本明細書では、識別対象としない塩基変異が存在する塩基配列領域を「第１の塩基配列領域」という。第１の実施態様において、第１の塩基配列領域は、核酸プライマーがハイブリダイズする領域として定義される。第１の実施態様において、第１の塩基配列領域は比較的狭い領域であることが好ましい。これは識別対象としない塩基変異による、核酸プライマーのハイブリダイズ効率への影響が大きいことを意味し、本願発明の効果がより大きいものとなる。具体的には１５０個以下のヌクレオチド、好ましくは２個〜４０個のヌクレオチドで構成される。
【００２２】
（２）核酸プライマーの調製
第１の実施態様において使用する核酸プライマーは、標的核酸の識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている点に特徴がある。ここで「脱塩基ヌクレオチド」とは、本明細書中において、ヌクレオチドの構成単位である塩基が脱落した化合物を意味し、脱塩基部位(Apurinic/Apyrimidinic site (AP-site))を形成する。AP-siteは、自然界においてDNAの損傷修復機構の過程で、損傷塩基、不対塩基がDNAグリコシラーゼによって除去されることによって生じる塩基欠落部位である。図８にAP-siteを含むポリヌクレオチドを示す。このAP-siteを標的核酸の第１の塩基配列領域に存在する識別対象としない塩基変異に対応する位置に配置することによって、核酸プライマーは、識別対象としない塩基変異の影響を受けることなく、標的核酸にハイブリダイズすることができる。
【００２３】
従来、第１の塩基配列領域に識別対象としない塩基変異が存在する場合、可能性のある全ての塩基を含む核酸プライマーを作製する必要があった（図１１を参照）。組み合わせ数は、識別対象としない塩基変異の箇所および各位置における変異の種類が増えるにつれて飛躍的に増大するため、検出に必要な核酸プライマーの数も飛躍的に増大し、検出プロセスの煩雑化および検出コストの高額化が問題であった。
【００２４】
これに対し、第１の実施態様における核酸の検出方法では、第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有する核酸プライマーであって、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プライマーを調製する。前記核酸プライマーは、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されているため、識別対象としない塩基変異に対応した異なる別個の核酸プライマーを調製する必要がない。すなわち、第１の実施態様において、核酸プライマーは、識別対象としない塩基変異の数および各位置における変異数に影響されることなく、第１の塩基配列領域に対応した核酸プライマーのみを調製すれば足りる。
【００２５】
図１は、第１の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図である。図１の事例において、標的核酸には、第１の塩基配列領域中、識別対象としない塩基変異部位がアデニン（Ａ）であるもの（標的核酸１）、グアニン（Ｇ）であるもの（標的核酸２）、の２種類の標的核酸が存在する。従来、これらの標的核酸から第１の塩基配列領域を検出するためには、これらの２種類の標的核酸（標的核酸１および２）のそれぞれに対応する核酸プライマー、すなわち２種類の核酸プライマーを作製しなければならなかった。
【００２６】
一方、第１の実施態様において使用される核酸プライマーは、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチド（すなわち、AP-site）が存在するため（図中では記号Ｐとして表わす）、識別対象としない塩基変異の種類に応じた核酸プライマーを作製する必要がなくなり、結果として、１種類の核酸プライマーを調製すればよい。第１の実施態様では、AP-siteを含まない従来の核酸プライマーと比較して作製すべき核酸プライマーの種類が減少し、簡易な検出系を実現することができる。なお、図１では、説明の便宜上、識別対象としない塩基変異を１塩基からなる変異（すなわち、ＳＮＰ）としたが、これに限定されるわけではなく、２塩基以上からなる変異であってもよい。
【００２７】
また、第１の実施態様における方法は、識別対象としない複数の塩基変異が密集するような多変異領域において検出を行う場合に特に有効である。識別対象としない塩基変異が２以上存在する場合、第１の塩基配列領域のバリエーションは飛躍的に増大する。この場合であっても、第１の実施態様における方法を使用すれば、識別対象としない塩基変異の変異数に影響されることなく、少ないプライマー数で第１の塩基配列領域について検出を行うことができる。
【００２８】
さらに、第１の実施態様における方法は、識別対象としない塩基変異が多様である場合（たとえば、３種類および４種類）に特に有効である。上述した例では、識別対象としない塩基変異の種類は、２種類（ＡおよびＧ）として説明したが、識別対象としない塩基変異の種類が３種類以上存在する場合、第１の塩基配列領域のバリエーションが飛躍的に増大する。この場合であっても、第１の実施態様における方法を使用すれば、識別対象としない塩基変異の変異数に影響されることなく、少ないプライマー数で第１の塩基配列領域について検出を行うことができる。
【００２９】
第１の実施態様において使用する核酸プライマーは、当業者に既知の技術的手法によって合成することができる。たとえば、ホスホトリエステル法やホスホアミダイト法などによる化学合成が一般的である。特に、ホスホアミダイト法は、３価のリンをもつことにより既に活性化しているホスファイト体を用いるので、縮合剤による副反応の心配がなく高い収率を達成することができる。
【００３０】
ホスホアミダイト法によるＤＮＡ／ＲＮＡの化学合成は、ＣＰＧと呼ばれるガラスビーズや架橋されたポリスチレンビーズにエステル結合したモノマーＤＮＡを開始剤として使用する。前記モノマーＤＮＡのリボースの5'位の保護基であるジメトキシトリチルを酸処理により除去した後、この脱トリチル化された5'位の水酸基に対して、リボースの3'位の水酸基がリン酸シアノエチルアミダイト誘導体である２番目のヌクレオチドを塩基触媒を用いて結合させる。この２番目のヌクレオチドもまたジメトキシトリチル保護基を備えており、以下、上記と同様に、サイクルプロセスにおいて逐次的に合成を行う。第１の実施態様では、該サイクルプロセスにおいて以下の化学構造式（Ｉ）によって表わされる脱塩基ヌクレオチドを取り込ませ、AP-siteを形成させる。
【化１】
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【００３１】
式中、DMTはジメトキシトリチル、CEはシアノエチル、iPrはイソプロピルを表わす。
【００３２】
脱塩基ヌクレオチドを取り込ませることによって、標的核酸とハイブリダイズしたときに識別対象としない塩基変異の部位にAP-siteが存在する核酸プライマーを合成することができる。
【００３３】
（３）標的核酸の増幅
標的核酸および核酸プライマーの調製後、前記核酸プライマーを含む核酸増幅用溶液中に前記標的核酸を含む可能性のある検体を添加し、増幅反応を行う。
【００３４】
第１の実施態様における増幅反応は、特に限定されることなく、当業者に既知の全ての増幅反応が含まれる。具体的には、たとえば、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮおよびＳＭＡＰ法からなる群から選択された増幅反応によって標的核酸を増幅させることができる。
【００３５】
核酸増幅用溶液には、第１の実施態様において使用される前記核酸プライマーの他、増幅反応に必要な化学物質、たとえば、ポリメラーゼやＮＴＰ基質、種々の核酸鎖安定物質などが含まれる。ポリメラーゼは、選択された増幅反応に適合したものが用いられ、たとえば、ＰＣＲ法により増幅反応を行う場合は、耐熱性ポリメラーゼを使用し、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行う場合は、鎖置換型ポリメラーゼを使用する。
【００３６】
「増幅反応を行う」とは、試料核酸の添加後に増幅用溶液を所定の温度に加熱することを意味する。加熱制御の条件は、選択された増幅反応によって異なり、各増幅反応に適合した加熱制御を行う。例えば、ＰＣＲ法を用いて増幅反応を行う場合、熱変性温度（約９８℃）と鎖伸長反応温度（約６５℃）を交互に繰り返し、ＬＡＭＰ法を用いて増幅反応を行う場合、約６５℃で温度を一定に維持する。
【００３７】
いずれの増幅反応を選択した場合であっても、第１の実施態様において使用される前記核酸プライマーは、標的核酸の識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されているので、第１の塩基配列領域が存在すれば、識別対象としない塩基変異の種類に影響を受けることなく、標的核酸の第１の塩基配列領域にハイブリダイズすることができる。第１の塩基配列領域に結合した核酸プライマーは、増幅反応の起点となり、自動化されたサイクルプロセスにおいて連続的に標的核酸の増幅が行われる。
【００３８】
（４）第１の塩基配列領域の検出
前記増幅反応後、標的核酸の第１の塩基配列領域の有無の判定を行う。検出の方法には、標的核酸の増幅の有無またはその効率に基づいて行われる当業者に既知の全ての検出手法が含まれる。具体的には、例えば、電気泳動法、比濁法、および電気化学測定法などが挙げられる。
【００３９】
電気泳動法による検出の場合、増幅反応後の核酸試料を電気泳動に供し、検出されたバンドの位置および太さから増幅の有無、またはその効率について判定を行う。比濁法による検出の場合、増幅反応後の核酸試料溶液の吸光度を測定し、得られた吸光度の値から増幅の有無、またはその効率について判定を行う。電気化学測定法による検出の場合、例えば、増幅反応溶液中に金属イオンを添加して錯化合物を形成させ、該錯化合物の電気化学的特性を測定する方法、標的核酸を構成するグアニン塩基の酸化により生じる電気化学的特性の変化を測定する方法、および核酸増幅過程において生成されるピロリン酸の濃度を電気化学的に測定する方法などがあるが、いずれの方法の場合であっても、得られた電流値から増幅の有無、またはその効率について判定を行う。
【００４０】
第１の実施態様において使用される核酸プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしたとき、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが存在するため、識別対象としない塩基変異の種類に影響されることなく、標的核酸にハイブリダイズすることができる。したがって、標的核酸の増幅が十分に行なわれた場合、検出対象である第１の塩基配列領域が検体に含まれていたという判定をすることができ、逆に、標的核酸の増幅が十分に行われなかった場合、検出対象である第１の塩基配列領域が含まれていなかったという判定をすることができる。
【００４１】
＜第２の実施態様＞
２．核酸プライマーを使用した標的核酸中の変異識別方法
（１）標的核酸の調製
第２の実施態様において、検出対象となる標的核酸には、第１の実施態様において使用する標的核酸と同様、上述した全てのものが含まれる。
【００４２】
さらに、第２の実施態様において検出対象となる標的核酸は、識別対象としない塩基変異の他に、識別対象とする塩基変異を含む。本明細書では、識別対象とする塩基変異を「第１の塩基変異」といい、識別対象としない塩基変異を「第２の塩基変異」という。そして、第１の塩基変異と第２の塩基変異が存在する配列領域を「第１の塩基配列領域」という。第２の実施態様において、第１の塩基配列領域は、核酸プライマーがハイブリダイズする領域として定義される。
【００４３】
（２）核酸プライマーの調製
第２の実施態様において使用する核酸プライマーには、第１の実施態様において使用する核酸プライマー全てが含まれる。
【００４４】
さらに、第２の実施態様において使用される核酸プライマーは、第１の塩基変異に対応する塩基を含む核酸プライマーであることを特徴とする。
【００４５】
従来、識別対象とする第１の塩基変異に近接して識別対象としない第２の塩基変異が存在する場合、第１の塩基変異と第２の塩基変異との組み合わせによって作り出される可能性のある全ての種類の核酸プライマーを作製する必要があった。組み合わせ数は、識別対象としない第２の塩基変異の箇所および各位置における変異の種類が増えるにつれて飛躍的に増大するため、検出に必要な核酸プライマーの数も飛躍的に増大し、検出プロセスの煩雑化および検出コストの高額化が問題であった。
【００４６】
これに対し、第２の実施態様における核酸の検出方法では、第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有する核酸プライマーであって、前記第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プライマーを調製する。前記核酸プライマーは、識別対象としない第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されているため、第２の塩基変異に対応した異なる別個の核酸プライマーを調製する必要がない。すなわち、第２の実施態様において、核酸プライマーは、識別対象としない第２の塩基変異の数および各位置における変異数に影響されることなく、識別対象とする第１の塩基変異の種類に対応した核酸プライマーのみを調製すれば足りる。
【００４７】
図２は、第２の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図である。図２の事例において、標的核酸には、第１の塩基配列領域中、第１の塩基変異がアデニン（Ａ）、第２の塩基変異がアデニン（Ａ）であるもの（標的核酸１）、第１の塩基変異がアデニン（Ａ）、第２の塩基変異がグアニン（Ｇ）であるもの（標的核酸２）、第１の塩基変異がシトシン（Ｃ）、第２の塩基変異がアデニン（Ａ）であるもの（標的核酸３）、および、第１の塩基変異がシトシン（Ｃ）、第２の塩基変異がグアニン（Ｇ）であるもの（標的核酸４）、以上の４種類の標的核酸が存在する。従来、これらの標的核酸から特定の第１の塩基変異を有するもの（たとえば、第１の塩基変異がアデニン（Ａ）である標的核酸１および２）を検出するためには、これらの２種類の標的核酸のそれぞれに対応する核酸プライマー、すなわち２種類の核酸プライマーを作製しなければならなかった。
【００４８】
一方、第２の実施態様において使用される核酸プライマーは、第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチド（すなわち、AP-site）が存在するため（図中では記号Ｐとして表わす）、第２の塩基変異の種類に応じた核酸プライマーを作製する必要がないため、結果として１種類の核酸プライマー、すなわち、第１の塩基変異に対応する位置にチミン（Ｔ）が配置されたもの（核酸プライマー１）のみを作製すればよい。第２の実施態様では、AP-siteを含まない従来の核酸プライマーと比較して作製すべき核酸プライマーの種類が減少し、簡易な検出系を実現することができる。
【００４９】
第２の実施態様における方法は、第１の実施態様と同様、ＳＮＰ（１塩基多型）のみならず、２塩基以上からなる変異についても適用可能である。また、第２の実施態様における方法は、第１の実施態様と同様、識別対象としない塩基変異が多様である場合（たとえば、３種類および４種類）、検出対象の変異の近傍に識別対象としない複数の塩基変異が密集するような多変異領域において検出を行う場合に特に有効である。
【００５０】
第２の実施態様において使用する核酸プライマーは、第１の実施態様と同様、当業者に既知の技術的手法によって合成することができる。
【００５１】
（３）標的核酸の増幅
標的核酸および核酸プライマーの調製後、前記核酸プライマーを含む核酸増幅用溶液中に前記標的核酸を含む可能性のある検体を添加し、増幅反応を行う。
【００５２】
第２の実施態様における増幅反応は、特に限定されることなく、第１の実施態様に記載した全てのものが含まれる。
【００５３】
（４）第１の塩基変異についての検出
前記増幅反応後、標的核酸の第１の塩基変異について検出を行う。検出の方法には、第１の実施態様に記載の全ての方法が含まれる。
【００５４】
第１の実施態様において使用される核酸プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしたとき、識別対象としない第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが存在するため、第２の塩基変異の種類に影響されることなく、標的核酸にハイブリダイズすることができる。一方、識別対象とする第１の塩基変異に対応する位置には特定の塩基が配置されているため、第１の塩基変異に対しては特異性を示し、検出対象である特定の第１の塩基変異を有する標的核酸にのみハイブリダイズすることができる。したがって、標的核酸の増幅が十分に行なわれた場合、検出対象である特定の第１の塩基変異が含まれていたという判定をすることができ、逆に、標的核酸の増幅が十分に行われなかった場合、検出対象である特定の第１の塩基変異が含まれていなかったという判定をすることができる。
【００５５】
＜第３の実施態様＞
３．核酸プローブを使用した標的核酸の検出方法
（１）標的核酸の調製
第３の実施態様において検出対象となる標的核酸には、第１の実施態様において使用する標的核酸と同様、上述した全てのものが含まれる。ただし、第３の実施態様において、第１の塩基配列領域は、「核酸プローブ」がハイブリダイズする領域として定義される。また、核酸プローブは、核酸プライマーと比較してより長い配列領域を設定することができるので、その好ましい塩基配列領域の範囲は、核酸プライマーとは異なり、具体的には５００個以下のヌクレオチド、好ましくは２個〜２００個のヌクレオチド、最も好ましくは２個〜１００個のヌクレオチドで構成される。
【００５６】
（２）核酸プローブの調製
第３の実施態様において使用する核酸プローブは、標的核酸の識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている点に特徴がある。すなわち、第３の実施態様における核酸の検出方法では、第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有する核酸プローブであって、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブを調製する。
【００５７】
前記核酸プローブは、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されているため、識別対象としない塩基変異に対応した異なる別個の核酸プライマーを調製する必要がない。すなわち、第３の実施態様において、核酸プローブは、識別対象としない塩基変異の数および各位置における変異数に影響されることなく、第１の塩基配列領域に対応した核酸プローブのみを調製すれば足りる。
【００５８】
図３は、第３の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図である。図３の事例において、標的核酸には、第１の塩基配列領域中、識別対象としない塩基変異がアデニン（Ａ）であるもの（標的核酸１）、グアニン（Ｇ）であるもの（標的核酸２）、の２種類の標的核酸が存在する。従来、これらの標的核酸から第１の塩基配列領域を検出するためには、これらの２種類の標的核酸のそれぞれに対応する核酸プローブ、すなわち２種類の核酸プローブを作製しなければならなかった。
【００５９】
一方、第３の実施態様において使用される核酸プローブは、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチド（すなわち、AP-site）が存在するため（図中では記号Ｐとして表わす）、識別対象としない塩基変異の種類に応じた核酸プローブを作製する必要がないため、結果として１種類の核酸プローブを調製すればよい。第３の実施態様では、AP-siteを含まない従来の核酸プローブと比較して作製すべき核酸プローブの種類が減少し、簡易な検出系を実現することができる。
【００６０】
第３の実施態様における方法は、第１の実施態様と同様、ＳＮＰ（１塩基多型）のみならず、２塩基以上からなる変異についても適用可能である。また、第３の実施態様における方法は、第１の実施態様と同様、識別対象としない塩基変異が多様である場合（たとえば、３種類および４種類）、検出対象の変異の近傍に識別対象としない複数の塩基変異が密集するような多変異領域において検出を行う場合に特に有効である。
【００６１】
第３の実施態様において使用する核酸プローブの合成方法は、第１の実施態様における核酸プライマーの合成方法と同様である。すなわち、ホスホトリエステル法やホスホアミダイト法などを使用してオリゴヌクレオチドを逐次的に合成し、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドを取り込ませ、AP-siteを形成させる。
【００６２】
第３の実施態様における核酸プローブは、核酸検出用基体に固定されて検出に用いられてもよい。核酸検出用基体は、たとえば、一般的なＤＮＡチップ、マイクロタイタープレートであり、基体上に設けられた１以上の検出区画内に核酸プローブが固定される。
【００６３】
核酸検出用基体には、任意の材料を使用することができるが、好ましくは、シリコン、ガラス、石英ガラス、石英などのシリカ含有基体、ポリアクリルアミド、ポリスチレンおよびポリカーボネートなどのプラスチック基体が使用される。
【００６４】
電気化学測定を行う場合、各検出区画に電極を配置し、電気信号を検出可能な構成とする。このとき各検出区画内に設置される電極は、特に限定されるものではないが、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ、ＴｉＯ2、ＧａＡｓのような半導体電極、チタンなどによって形成することができる。これらの電極は、導電性高分子によって被覆しても、単分子膜によって被覆してもよく、所望に応じてその他の表面処理剤を処理してもよい。
【００６５】
核酸プローブの核酸検出用基体への固定は、当業者に既知の任意の技術的手法によって行えばよい。たとえば、物理吸着、化学吸着、疎水結合、抱埋、および共有結合などによって固定することができる。より具体的には、たとえばプローブの末端に導入したアミノ基を介して、カルボジイミドなどの縮合剤を用いて基板上に共有結合することができる。また、基板上にアニオン性の有機物を被覆しておくことで、イオン結合で固定することもできる。さらに、プローブの末端にビオチンを導入しておくと、ビオチン-アビジン結合で固定することもできる。また、プローブの末端にチオール基を導入しておき、基板上に被覆したチオール含有物質との間でＳ−Ｓを形成させ、強固に固定することもできる。これらの場合、あらかじめ基板表面を官能基を有する分子で修飾しておくことによって、固定を容易にすることができる。なお、プローブと末端の修飾基の間には基板表面とプローブとの立体障害を抑制するためにスペーサーを導入してもよい。スペーサー分子は特に限定されないが、たとえばアルカン骨格、アルキン骨格、アルケン骨格、エチレングリコール骨格、さらには核酸鎖であってもよい。また、分子構造は、直鎖であっても、分岐鎖であってもよい。スペーサー部分の長さは特に限定されないが、好ましくは、炭素-炭素結合に換算して10〜500、好ましくは20〜200、さらに好ましくは50〜100である。
【００６６】
基板上への核酸プローブの固定の際には、DNAスポッターやDNAアレイヤ−と呼ばれる固定化装置を用いると核酸プローブの前記基体への固定を容易に行うことができる。この際、表面を傷つけないために、インクジェット方式や静電方式のスポッターを用いることが望ましい。また、前記基体表面で直接、核酸鎖の合成を行うこともできる。
【００６７】
（３）第１の塩基配列領域の検出
続いて、前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブに、標的核酸が存在する可能性がある検体を反応させる。そして、前記核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド形成量から、前記塩基配列領域の存在について判定を行う。
【００６８】
第３の実施態様における検出の手法には、ＤＮＡチップやマイクロアレイのような核酸検出用基体を用いた当業者に既知の全ての検出手法が含まれる。たとえば、蛍光物質を用いた検出や、放射性同位元素を用いた検出、挿入剤分子の電気化学応答を用いた検出、静電容量変化による検出などが挙げられる。特に、代表的な検出手法として、蛍光による検出と電気化学的な検出がある。蛍光による検出は、結果を視覚的に認識することができるので、検出結果の判定ミスを防止することができる。一方、電気化学的な検出は、電流値のみによって検査を行うことができるので、装置の小型化、検査費用の低額化、検査時間の短縮化が可能になる。なお、電気化学的な検出を行う場合、前記基体の各検出区画は電極として構成され、電極上に各核酸プローブが固定される。
【００６９】
蛍光による検出の場合、標的核酸を予め蛍光物質で標識しておく。例えば、蛍光物質で標識されたプライマーを使用して標的核酸をＰＣＲ増幅させることによって、蛍光物質で標識された標的核酸が作製される。標的核酸を核酸検出用基体に添加後、核酸プローブとハイブリッド鎖を形成した標的核酸は、洗浄後も検出区画内にとどまるため、蛍光発光が得られる。蛍光物質には、公知の任意のものを使用することができ、例えば、FITC、Cy3、Cy5またはローダミンなどが使用される。蛍光物質の発光は、蛍光検出器を用いて検出することができる。得られた蛍光発光量から各核酸プローブに対応する標的核酸の存在の有無を識別することができる。
【００７０】
さらに、蛍光検出方法において、核酸プローブ固定化領域上への核酸や蛍光色素などの非特異的な吸着を抑制するために、核酸プローブ固定化領域の表面を、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘプタノール、メルカプトエチレングリコール、メルカプトオリゴエチレングリコール、メルカプトポリエチレングリコール、炭素鎖が30〜50のアルカンチオールなどのメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質、界面活性剤、アルブミン、核酸などで被覆することが望ましい。
【００７１】
一方、電気化学的な検出の場合は、例えば、電気化学的活性を有する分子を用いる。電気化学的活性を有する分子とは、ハイブリッド鎖に結合し、電位の印加によって電子を放出する分子を意味する。前記分子には、公知の任意のものを使用することができ、例えば、ヘキスト33258（登録商標）（カルビオケム(CALBIOCHEM)より入手可能）、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーターなどが使用される。特に好ましくは、ヘキスト（Hoechst）33258が使用される。ヘキスト33258は、化学物質p-(5-(5-(4-メチルピペラジン-1-イル)ベンズイミダゾール-2-イル)ベンズイミダゾール-2-イル)フェノールによって構成された分子である。さらに、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン（ジシクロペンタジエニル鉄）、ビオロゲンなどで修飾してもよい。前記分子の濃度は適宜選択されるが、一般的には1ng/mL〜1000ng/mLの範囲内である。この際、イオン強度0.01〜5、pH 5〜10の範囲内の緩衝液を使用することができる。
【００７２】
前記分子は、前記ハイブリッド鎖を認識し、これにインターカレートする。ここで、電極に電位を印加すると、酸化還元反応が起こり、インターカレートした前記分子から電子が放出されて電流が流れる。この際、電位は定速で掃引するか、パルスで印加するか、あるいは定電位を印加してもよい。電位掃引速度は、10〜1000mV/secの範囲内である。測定の際、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。前記分子に由来する電流が電極に流れ、この電流値を測定することによって各核酸プローブに対応する標的核酸の存在の有無を検出することができる。
【００７３】
さらに、電気化学的検出方法において、核酸プローブ固定化領域（電極）上への核酸や挿入剤などの非特異的な吸着を抑制するために、電極表面を、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘプタノール、メルカプトエチレングリコール、メルカプトオリゴエチレングリコール、メルカプトポリエチレングリコール、炭素鎖が30〜50のアルカンチオールなどのメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質、界面活性剤、アルブミン、核酸などで被覆することが望ましい。
【００７４】
第３の実施態様において使用される核酸プローブは、標的核酸とハイブリッド鎖を形成したときに標的核酸の識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている。したがって、標的核酸は、識別対象としない塩基変異の種類に影響されることなく、核酸プローブにハイブリダイズすることができる。したがって、前記核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド鎖の形成が十分に行われた場合、検出対象である第１の塩基配列領域が検体に含まれていたという判定をすることができ、逆に、前記核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド鎖の形成が十分に行われなかった場合、検出対象である第１の塩基配列領域が含まれていなかったという判定をすることができる。
【００７５】
＜第４の実施態様＞
４．核酸プローブを使用した標的核酸中の変異識別方法
（１）標的核酸の調製
第４の実施態様において、検出対象となる標的核酸には、第１の実施態様において使用する標的核酸と同様、上述した全てのものが含まれる。
【００７６】
さらに、第４の実施態様において検出対象となる標的核酸は、識別対象としない塩基変異の他に、識別対象とする塩基変異を含む。本明細書では、識別対象とする塩基変異を「第１の塩基変異」といい、識別対象としない塩基変異を「第２の塩基変異」という。そして、第１の塩基変異と第２の塩基変異が存在する配列領域を「第１の塩基配列領域」という。第４の実施態様において、第１の塩基配列領域は、核酸プローブがハイブリダイズする領域として定義される。
【００７７】
（２）核酸プローブの調製
第４の実施態様において使用する核酸プローブには、第３の実施態様において使用する核酸プローブ全てが含まれる。
【００７８】
さらに、第４の実施態様において使用される核酸プローブは、第１の塩基変異に対応する塩基を含む核酸プローブであることを特徴とする。
【００７９】
従来、識別対象とする第１の塩基変異に近接して識別対象としない第２の塩基変異が存在する場合、第１の塩基変異と第２の塩基変異との組み合わせによって作り出される可能性のある全ての種類の核酸プローブを作製する必要があった。組み合わせ数は、識別対象としない第２の塩基変異の箇所および各位置における変異の種類が増えるにつれて飛躍的に増大するため、検出に必要な核酸プローブの数も飛躍的に増大し、検出プロセスの煩雑化および検出コストの高額化が問題であった。
【００８０】
これに対し、第４の実施態様における核酸の検出方法では、第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有する核酸プローブであって、前記第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブを調製する。前記核酸プローブは、識別対象としない第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されているため、第２の塩基変異に対応した異なる別個の核酸プローブを調製する必要がない。すなわち、第２の実施態様において、核酸プローブは、識別対象としない第２の塩基変異の数および各位置における変異数に影響されることなく、識別対象とする第１の塩基変異の種類に対応した核酸プローブのみを調製すれば足りる。
【００８１】
図４は、第４の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図である。図４の事例において、標的核酸には、第１の塩基配列領域中、第１の塩基変異がアデニン（Ａ）、第２の塩基変異がアデニン（Ａ）であるもの（標的核酸１）、第１の塩基変異がアデニン（Ａ）、第２の塩基変異がグアニン（Ｇ）であるもの（標的核酸２）、第１の塩基変異がシトシン（Ｃ）、第２の塩基変異がアデニン（Ａ）であるもの（標的核酸３）、および、第１の塩基変異がシトシン（Ｃ）、第２の塩基変異がグアニン（Ｇ）であるもの（標的核酸４）、以上の４種類の標的核酸が存在する。従来、これらの標的核酸から特定の第１の塩基変異を有するもの（たとえば、第１の塩基変異がアデニン（Ａ）である標的核酸１および２）を検出するためには、これらの２種類の標的核酸のそれぞれに対応する核酸プローブ、すなわち２種類の核酸プローブを作製しなければならなかった。
【００８２】
一方、第４の実施態様において使用される核酸プローブは、第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチド（すなわち、AP-site）が存在するため（図中では記号Ｐとして表わす）、第２の塩基変異の種類に応じた核酸プローブを作製する必要がないため、結果として１種類の核酸プローブ、すなわち、第１の塩基変異に対応する位置にチミン（Ｔ）が配置されたもの（核酸プローブ１）のみを作製すればよい。第４の実施態様では、第１の実施態様と同様、AP-siteを含まない従来の核酸プローブと比較して作製すべき核酸プローブの種類が減少し、簡易な検出系を実現することができる。
【００８３】
第４の実施態様における方法は、第３の実施態様と同様、ＳＮＰ（１塩基多型）のみならず、２塩基以上からなる変異についても適用可能である。また、第４の実施態様における方法は、第３の実施態様と同様、識別対象としない塩基変異が多様である場合（たとえば、３種類および４種類）、検出対象の変異の近傍に識別対象としない複数の塩基変異が密集するような多変異領域において検出を行う場合に特に有効である。
【００８４】
第３の実施態様において使用する核酸プローブの合成方法は、第３の実施態様と同様、当業者に既知の技術的手法によって合成することができる。
【００８５】
（３）第１の塩基変異についての検出
続いて、前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブに、標的核酸が存在する可能性がある検体を反応させる。そして、前記核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド形成量から、前記塩基配列領域中に存在する前記塩基変異以外の塩基の有無、すなわち、第１の塩基変異の有無について判定を行う。検出の方法には、第３の実施態様に記載の全ての方法が含まれる。
【００８６】
第４の実施態様において使用される核酸プローブには、標的核酸とハイブリッド鎖を形成したときに標的核酸の識別対象としない第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている。したがって、標的核酸は、第２の塩基変異の種類に影響されることなく、核酸プローブにハイブリダイズすることができる。一方、前記核酸プローブには、標的核酸とハイブリッド鎖を形成したとき、標的核酸の識別対象とする第１の塩基変異に対応する位置に特定の塩基が配置されている。したがって、標的核酸は、第１の塩基変異の種類に対して特異性を示し、識別対象とする特定の第１の塩基変異を有する核酸プローブにのみハイブリダイズすることができる。したがって、核酸プローブが標的核酸とハイブリッド鎖を十分に形成した場合、識別対象とする特定の第１の塩基変異が含まれていたという判定をすることができ、逆に、核酸プローブが標的核酸とハイブリッド鎖を十分に形成しなかった場合、識別対象とする特定の第１の塩基変異が含まれていなかったという判定をすることができる。
【００８７】
＜第５の実施態様＞
５．核酸プライマーおよび核酸プローブを使用した標的核酸の検出方法
（１）標的核酸の調製
第５の実施態様において検出対象となる標的核酸には、第１〜第４の実施態様において使用する標的核酸と同様、上述した全てのものが含まれる。
【００８８】
第１〜第４の実施態様は、いずれも１つの塩基配列領域の存在の有無、または該塩基配列領域中に存在する特定の塩基変異の有無を検出する方法である。これに対し、第５の実施態様は、独立した２つの塩基配列領域の存在の有無を検出する方法である。
【００８９】
第５の実施態様において検出対象となる標的核酸は、識別対象としない塩基変異が存在する「第１の塩基配列領域」と、識別対象としない塩基変異が存在する「第２の塩基配列領域」とを含む。第５の実施態様において、第１の塩基配列領域は、核酸プライマーがハイブリダイズする領域として定義され、第２の塩基配列領域は、核酸プローブがハイブリダイズする領域として定義される。第２の塩基配列領域は、第１の塩基配列領域とは独立した領域である。特に限定されるわけではないが、例示的には、第２の塩基配列領域は、第１の塩基配列領域から離れた位置に存在する。ここで、「離れた位置」とは、第１の塩基配列領域と第２の塩基配列領域とが重複せずに存在することを意味する。
【００９０】
第５の実施態様は、検出対象である塩基配列領域が互いに遠位に存在する場合における検出方法である。検出対象である塩基配列領域が互いに遠位に存在する場合、プライマーおよびプローブの設計上の観点から、これら２つの塩基配列領域を１つの塩基配列領域として定義することなく、互いに独立した２つの塩基配列領域として定義するとよい。そして、第１の塩基配列領域に対応する核酸プライマーと、第２の塩基配列領域に対応する核酸プローブをそれぞれ設計し、前記核酸プライマーを用いて第２の塩基配列領域を含むように標的核酸を増幅後、前記核酸プローブを用いて増幅された標的核酸を検出する。最終的に標的核酸が検出された場合、該標的核酸中に第１および第２の塩基配列領域が存在していたと判定することができる。
【００９１】
第１および第２の塩基配列領域は比較的狭い領域であることが好ましく、設計する核酸プライマーおよび核酸プローブの長さを短くすることによって、より正確な検出系を実現することができる。第１の塩基配列領域は、具体的には１５０個以下のヌクレオチド、好ましくは２個〜４０個のヌクレオチドで構成される。他方、第２の塩基配列領域は、具体的には５００個以下のヌクレオチド、好ましくは２個〜２００個のヌクレオチド、最も好ましくは２個〜１００個のヌクレオチドで構成される。
【００９２】
（２）核酸プライマーおよび核酸プローブの調製
第５の実施態様において使用する核酸プライマーは、前記第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有する核酸プライマーであって、前記識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている。前記核酸プライマーは、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されているため、識別対象としない塩基変異に対応した異なる別個の核酸プライマーを調製する必要がない。すなわち、第５の実施態様において、核酸プライマーは、識別対象としない塩基変異の数および各位置における変異数に影響されることなく、原則として１種類のプライマー対を用意すれば足りる。
【００９３】
次に、第５の実施態様において使用する核酸プローブは、第２の塩基配列領域に相補的な配列領域を有する核酸プローブであって、前記識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている。前記核酸プローブは、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されているため、識別対象としない塩基変異に対応した異なる別個の核酸プローブを調製する必要がない。また、第１の塩基配列領域中に存在する識別対象としない塩基変異は前記核酸プライマーによって既に脱塩基ヌクレオチドに置換されているので、識別対象としない塩基変異の影響を受けることもない。すなわち、第５の実施態様において、核酸プローブは、第１、および第２の塩基配列領域中の識別対象としない塩基変異の影響を受けずに、第１、および第２の塩基配列領域の存在の有無を判定することができる。
【００９４】
図５は、第５の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図である。図５の事例において、標的核酸は、第１の塩基配列領域と、第２の塩基配列領域とを含む。そして、第１の塩基配列領域中には、識別対象としない塩基変異部位がチミン（Ｔ）であるもの、グアニン（Ｇ）であるもの、の２種類が存在し、また、第２の塩基配列領域中には、識別対象としない塩基変異部位がアデニン（Ａ）であるもの、グアニン（Ｇ）であるもの、の２種類が存在し、合計４種類の標的核酸（標的核酸１〜４）が存在する（図５ａ）。従来、これらの標的核酸から第１、および第２の塩基配列領域を検出するためには、第１の塩基配列領域に対して２種類の核酸プライマーを作製し、第２の塩基配列領域に対して２種類の核酸プローブを作製しなければならなかった。
【００９５】
一方、第５の実施態様において使用される核酸プライマーおよび核酸プローブは、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチド（すなわち、AP-site）が存在するため（図中では記号Ｐとして表わす）、識別対象としない塩基変異の種類に応じた核酸プライマーおよび核酸プローブを作製する必要がないため、結果として１種類の核酸プライマーと、１種類の核酸プローブを調製すればよい。
【００９６】
先ず、第１の塩基配列領域に対応する位置に第１の核酸プライマー（核酸プライマー１）を設計し、第２の塩基配列領域を挟み込むように第２の核酸プライマー（核酸プライマー２）を設計し、該核酸プライマー対を使用して増幅反応を行う。増幅反応によって産生された増幅産物は、第１および第２の塩基配列領域を含み、かつ第１の塩基配列領域内に存在する識別対象としない塩基変異が脱塩基ヌクレオチド（図中の記号Ｐ）に置換されている（図５ｂ）。
【００９７】
次に、第２の塩基配列領域中に存在する前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチド（図中の記号Ｐ）が配置されている核酸プローブに、前記増幅反応で得られた増幅産物を反応させる（図５ｃ）。そして、前記核酸プローブと前記増幅産物とのハイブリッド形成量から、前記第１、および第２の塩基配列領域の存在の有無を判定する。
【００９８】
第５の実施態様では、AP-siteを含まない従来の核酸プライマーおよび核酸プローブと比較して作製すべき核酸プライマーおよび核酸プローブの種類が減少し、簡易な検出系を実現することができる。
【００９９】
第５の実施態様における方法は、第１〜第４の実施態様と同様、ＳＮＰ（１塩基多型）のみならず、２塩基以上からなる変異についても適用可能である。また、第５の実施態様における方法は、第１〜第４の実施態様と同様、識別対象としない塩基変異が多様である場合（たとえば、３種類および４種類）、検出対象の変異の近傍に識別対象としない複数の塩基変異が密集するような多変異領域において検出を行う場合に特に有効である。
【０１００】
第５の実施態様において使用する核酸プライマーおよび核酸プローブの合成方法は、第１〜第４の実施態様と同様、当業者に既知の技術的手法によって合成することができる。
【０１０１】
（３）標的核酸の増幅
標的核酸および核酸プライマーの調製後、前記核酸プライマーを含む核酸増幅用溶液中に前記標的核酸を含む可能性のある検体を添加し、増幅反応を行う。
【０１０２】
第５の実施態様における増幅反応は、第１〜４の実施態様と同様、当業者に既知の技術的手法によって行われる。
【０１０３】
第５の実施態様において使用される核酸プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしたとき、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが存在するため、識別対象としない塩基変異の種類に影響されることなく、標的核酸にハイブリダイズすることができる。したがって、検出対象である第１の塩基配列領域が検体に含まれていれば、標的核酸の増幅が十分に行なわれる。
【０１０４】
（４）第１、および第２の塩基配列領域の検出
続いて、前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブに、前記増幅反応で得られた増幅産物を反応させる。そして、前記核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド形成量から、前記第１、および第２の塩基配列領域の存在について判定を行う。
【０１０５】
第５の実施態様における検出方法は、第１〜第４の実施態様と同様、当業者に既知の技術的手法によって行われる。
【０１０６】
第５の実施態様において使用される核酸プローブは、前記増幅反応で得られた増幅産物とハイブリッド鎖を形成したときに、前記増幅産物の識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている。したがって、前記増幅産物は、識別対象としない塩基変異の種類に影響されることなく、核酸プローブにハイブリダイズすることができる。したがって、前記核酸プローブと前記増幅産物とのハイブリッド鎖の形成が十分に行われた場合、検出対象である第２の塩基配列領域が検体に含まれていたという判定をすることができる。そしてこのとき、そもそも標的核酸が十分に増幅された時点で、標的核酸に第１の塩基配列領域が含まれていたことになるので、結果として、第１、および第２の塩基配列領域が検体に含まれていたという判定をすることができる。逆に、前記核酸プローブと前記増幅産物とのハイブリッド鎖の形成が十分に行われなかった場合、そもそも、標的核酸が第１の塩基配列領域を含まず、十分な増幅反応が起こらなかったのか、あるいは第１の塩基配列領域を含んでおり、十分な量の増幅産物が得られたが、第２の塩基配列領域が存在せず、核酸プローブとの十分なハイブリッド鎖の形成がなされなかったのか、いずれかであると判定することができる。
【０１０７】
＜第６の実施態様＞
６．核酸プライマーおよび核酸プローブを使用した標的核酸中の変異識別方法
第６の実施態様は、独立した２つの塩基配列領域中にそれぞれ存在する塩基変異の有無を検出する方法である。
【０１０８】
（１）標的核酸の調製
第６の実施態様において検出対象となる標的核酸には、第１〜第４の実施態様において使用する標的核酸と同様、上述した全てのものが含まれる。
【０１０９】
第６の実施態様において検出対象となる標的核酸は、「識別対象とする第１の塩基変異」および「識別対象としない第２の塩基変異」が存在する「第１の塩基配列領域」と、「識別対象とする第３の塩基変異」および「識別対象としない第４の塩基変異」が存在する「第２の塩基配列領域」とを含む。第６の実施態様において、第１の塩基配列領域は、核酸プライマーがハイブリダイズする領域として定義され、第２の塩基配列領域は、核酸プローブがハイブリダイズする領域として定義される。第３および第４の塩基変異が存在する第２の塩基配列領域は、第１および第２の塩基変異が存在する第１の塩基配列領域とは独立した領域である。特に限定されるわけではないが、例示的には、第２の塩基配列領域は、第１の塩基配列領域から離れた位置に存在する。ここで、「離れた位置」とは、第１の塩基配列領域と第２の塩基配列領域とが重複せずに存在することを意味する。
【０１１０】
第６の実施態様は、識別対象である２以上の塩基変異（第１および第３の塩基変異）が互いに遠位に存在し、かつ各塩基変異の近傍に、識別対象としない塩基変異（第２および第４の塩基変異）が散在し、識別対象としない塩基変異が存在しない位置にプライマーやプローブを設計することが困難な場合に極めて有効である。
【０１１１】
識別対象である第１の塩基変異と、同じく識別対象である第３の塩基変異とが互いに遠位に存在する場合、プライマーおよびプローブの設計上の観点から、これらの２つの塩基変異を１つの塩基配列領域に含めることなく、２つの独立した塩基配列領域を規定するとよい。第１の塩基配列領域を核酸プライマーによる検出領域として割り当て、第２の塩基配列領域を核酸プローブによる検出領域として割り当てることによって、互いに遠位に存在する識別対象である第１および第３の塩基変異の有無を検出することができる。
【０１１２】
（２）核酸プライマーおよび核酸プローブの調製
第６の実施態様において使用する核酸プライマーは、前記第１の塩基配列領域に相補的な配列領域を有する核酸プライマーであって、前記第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている。前記核酸プライマーは、識別対象としない第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されているため、第２の塩基変異に対応した異なる別個の核酸プライマーを調製する必要がない。すなわち、第６の実施態様において、核酸プライマーは、識別対象としない第２の塩基変異の数および各位置における変異数に影響されることなく、原則として１種類のプライマー対を用意すれば足りる。
【０１１３】
次に、第６の実施態様において使用する核酸プローブは、第２の塩基配列領域に相補的な配列領域を有する核酸プローブであって、前記第４の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている。前記核酸プローブは、識別対象としない第４の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されているため、第４の塩基変異に対応した異なる別個の核酸プローブを調製する必要がない。また、第２の塩基変異は前記核酸プライマーによって既に脱塩基ヌクレオチドに置換されているので、第２の塩基変異の影響を受けることもない。すなわち、第６の実施態様において、核酸プローブは、識別対象としない第２および第４の塩基変異の影響を受けずに、識別対象とする第１および第３の塩基変異の種類によってのみ検出を行うことができる。
【０１１４】
図６および７は、第６の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図である。図６および７の事例において、標的核酸は、第１の塩基配列領域と、第２の塩基配列領域とを含む。そして、第１の塩基配列領域中には、識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異；アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ））と、識別対象としない塩基変異（第２の塩基変異；チミン（Ｔ）またはグアニン（Ｇ））が存在する。一方、第２の塩基配列領域中には、識別対象とする塩基変異（第３の塩基変異；アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ））と、識別対象としない塩基変異（第４の塩基変異；アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））が存在する。これらの組み合わせから、合計１６種類の標的核酸（標的核酸１〜１６）が存在する（図６）。従来、例えば、これらの標的核酸１〜１６から、第１の塩基変異がアデニン（Ａ）であり、かつ第３の塩基変異もアデニン（Ａ）である標的核酸１〜４を検出するためには、第１の塩基配列領域に対して２種類の核酸プライマーを作製し、第２の塩基配列領域に対して２種類の核酸プローブを作製しなければならなかった。
【０１１５】
一方、第６の実施態様において使用される核酸プライマーおよび核酸プローブは、識別対象としない塩基変異（すなわち、第２および第４の塩基変異）に対応する位置に脱塩基ヌクレオチド（すなわち、AP-site）が存在するため（図中では記号Ｐとして表わす）、識別対象としない塩基変異の種類に応じた核酸プライマーおよび核酸プローブを作製する必要がなく、識別対象とする塩基変異（すなわち、第１および第３の塩基変異）に対応した核酸プライマーおよび核酸プローブを調製すれば足りる。結果として１種類の核酸プライマーと、１種類の核酸プローブを調製すればよい。
【０１１６】
具体的には、先ず、第１の塩基配列領域に対応する位置に第１の核酸プライマー（核酸プライマー１）を設計し、第２の塩基配列領域を挟み込むように第２の核酸プライマー（核酸プライマー２）を設計し、該核酸プライマー対を使用して増幅反応を行う（図６）。増幅反応によって産生された増幅産物は、第１および第２の塩基配列領域を含み、かつ第１の塩基配列領域内に存在する第２の塩基変異が脱塩基ヌクレオチドに置換されている（図７ａ）。
【０１１７】
次に、この増幅産物を核酸プローブ（核酸プローブ１）が固定された核酸検出用基体に添加し、ハイブリダイゼーションの有無について検出する（図７ｂ）。このとき、増幅産物の第２の塩基変異は脱塩基ヌクレオチドに置換されているため、ハイブリダイゼーションの結果に影響を与えない。また、核酸プローブ１は、第２の塩基配列領域に対応する配列領域を有し、第４の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチド（図中の記号Ｐ）が配置されている。したがって、標的核酸は、第２および第４の塩基変異に影響されることなく、第１および第３の塩基変異の種類によってのみ検出される（図中では第１および第３の塩基変異がアデニン（Ａ）である標的核酸１’〜４’）。
【０１１８】
核酸プライマーおよび核酸プローブの合成方法は、第１〜第５の実施態様に記載されたとおりである。また、核酸プローブが固定される核酸検出用基体は、第２の実施態様に記載されたとおりである。そしてまた、前記核酸プライマーを含む核酸増幅試薬、増幅反応、検出手法など、その他の第６の実施態様を構成する要素は、特に言及しない限り、第１〜第５の実施態様に記載されたとおりである。
【０１１９】
（３）標的核酸の増幅
標的核酸および核酸プライマーの調製後、前記核酸プライマーを含む核酸増幅用溶液中に前記標的核酸を含む可能性のある検体を添加し、増幅反応を行う。
【０１２０】
第６の実施態様における増幅反応は、第１〜５の実施態様と同様、当業者に既知の技術的手法によって行われる。
【０１２１】
第６の実施態様において使用される核酸プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしたとき、識別対象としない塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが存在するため、識別対象としない塩基変異の種類に影響されることなく、標的核酸にハイブリダイズすることができる。したがって、検出対象である第１の塩基配列領域が検体に含まれていれば、標的核酸の増幅が十分に行なわれる。
【０１２２】
（４）第１、および第２の塩基配列領域の検出
続いて、前記塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている核酸プローブに、前記増幅反応で得られた増幅産物を反応させる。そして、前記核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド形成量から、前記第１、および第２の塩基配列領域の存在について判定を行う。
【０１２３】
第６の実施態様における検出方法は、第１〜第５の実施態様と同様、当業者に既知の技術的手法によって行われる。
【０１２４】
第６の実施態様において使用される核酸プローブは、前記増幅反応で得られた増幅産物とハイブリッド鎖を形成したときに、第４の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチドが配置されている。したがって、前記増幅産物は、第４の塩基変異の種類に影響されることなく、核酸プローブにハイブリダイズすることができる。したがって、前記核酸プローブと前記増幅産物とのハイブリッド鎖の形成が十分に行われた場合、検出対象である特定の第３の塩基変異（図中ではアデニン（Ａ））が検体に含まれていたという判定をすることができる。そしてこのとき、そもそも標的核酸が十分に増幅された時点で、標的核酸に特定の第１の塩基変異（図中ではアデニン（Ａ））が含まれていたことになるので、結果として、特定の第１、および第３の塩基変異（図中ではいずれもアデニン（Ａ））が検体に含まれていたという判定をすることができる。逆に、前記核酸プローブと前記増幅産物とのハイブリッド鎖の形成が十分に行われなかった場合、そもそも、標的核酸が特定の第１の塩基変異（図中ではアデニン（Ａ））を含まず、十分な増幅反応が起こらなかったのか、あるいは特定の第１の塩基変異（図中ではアデニン（Ａ））を含んでおり、十分な量の増幅産物が得られたが、特定の第３の塩基変異（図中ではアデニン（Ａ））が存在せず、核酸プローブとの十分なハイブリッド鎖の形成がなされなかったのか、いずれかであると判定することができる。
【実施例】
【０１２５】
以下、第４の実施態様における検出方法、すなわち、脱塩基ヌクレオチド（AP-site）を含む核酸プローブを用いた標的核酸中の変異識別方法について実施例を示す。しかしながら、上述したように、本発明の検出方法は、第１〜第６の実施態様ともに、脱塩基ヌクレオチドを識別対象としない塩基変異に対応づけるという点で共通している。本発明を第１〜第６の実施態様に分類した理由は、当業者による本発明の理解をより容易にするためである。第１〜第６の実施態様は、標的核酸の塩基変異の態様に応じて適宜選択することができ、これらの発明の本質は何ら相違せず、一群の発明を構成するものである。そして、その検出機構は、第１〜第６の実施態様のいずれか１つを例証すれば足りるものであり、下記第４の実施態様における検出方法における例証をもって、第１〜第６の全ての実施態様における検出方法の実効性が確認される。
【０１２６】
なお、下記実施例では、標的核酸（鋳型DNA）をLAMP法を用いて増幅し、十分な核酸量を得た後に検出を行った。
【０１２７】
（１）標的核酸の調製
標的核酸を調製するために、以下の表１に示した塩基配列を有する、４種類のプラスミドDNA（鋳型DNA１〜４）を用いた。
【０１２８】
鋳型DNA1の配列のうち、枠中の配列「GAC」が第１の塩基配列領域に該当する。また、第１の塩基配列領域の左端に位置する「G」が第２の塩基変異に該当し、右端に位置する「C」が第１の塩基変異に該当する。なお、下線部は鋳型DNAから増幅される標的核酸（Target DNA）の配列領域を示す。
【表１】
2010136692.tif 000005
【０１２９】
次に、標的核酸（Target DNA１〜４）を調製するために、上述した鋳型DNA１〜４をLAMP法（Loop-mediated isothermal amplification method）を用いて増幅した。増幅に使用するプライマーDNA、および該プライマーDNAを含む増幅反応溶液の組成をそれぞれ以下の表２および表３に示した。
【表２】
2010136692.tif 000006
【０１３０】
【表３】
2010136692.tif 000007
【０１３１】
調製した増幅反応溶液を63℃で60分反応させ、LAMP反応を行った。LAMP反応後の反応液に20×SSC溶液を1/10量添加し、検出に必要な十分量の標的核酸（Target DNA１〜４）を調製した。以下の表４に、LAMP法による増幅産物としての４種類の標的核酸（Target DNA１〜４）を示す。各Target DNAの配列のうち、枠中の配列が第１の塩基配列領域に該当する。また、第１の塩基配列領域の左端に位置する塩基が識別対象としない第２の塩基変異（G or A）に該当し、右端に位置する塩基が検出対象の第１の塩基変異(C or A)に該当する。Target DNA１〜４の第１および第２の塩基変異に着目し、これらをそれぞれT(G-C)、T(G-A)、T(A-C)、およびT(A-A)として表記した。
【０１３２】
なお、実施例の理解を容易にするため、Target DNA１〜４の配列は、鋳型と同じForward鎖の塩基配列で表わした。すなわち、実際のTarget DNA１〜４の配列は、以下の表４に記載された配列の相補鎖となる。
【表４】
2010136692.tif 000008
【０１３３】
（２）核酸プローブが固定された核酸検出用基体の作製
上記した標的核酸（Target DNA１〜４）を検出するために、以下の表５に記載された、脱塩基ヌクレオチドを含む核酸プローブ（Probe DNA）をホスホアミダイト法を用いて合成した。
【表５】
2010136692.tif 000009
【０１３４】
実施例１として、核酸プローブP(P-C)を使用した。核酸プローブP(P-C)は、標的核酸の第２の塩基変異に対応する位置に脱塩基ヌクレオチド「P」が配置され、かつ第１の塩基変異に対応する位置にシトシン「C」が配置されたプローブであり、従って、第２の塩基変異の影響を受けず、第１の塩基変異「G」のみを検出することができる。一方、比較例１として、核酸プローブP(G-C)を使用した。核酸プローブP(G-C)は、標的核酸の第２の塩基変異に対応する位置にグアニン「G」が配置され、かつ第１の塩基変異に対応する位置にシトシン「C」が配置されたプローブである。また、比較例２として、核酸プローブP(I-C)を使用した。核酸プローブP(I-C)は、標的核酸の第２の塩基変異に対応する位置にイノシン「I」が配置され、かつ第１の塩基変異に対応する位置にシトシン「C」が配置されたプローブである。
【０１３５】
各Probe DNAの核酸検出用基体（DNAチップ基板）への固定は、先ず、各Probe DNAを3μM、NaClを100mM含む各Probe DNA溶液を調製し、続いて、調製した各Probe DNA溶液をDNAチップ基板に100nL滴下することによって行われる。各Probe DNAは、DNAチップ基板への滴下後、室温で60分静置した後、蒸留水で洗浄し、乾燥させることによって基板上に固定される。Probe DNAが固定されたDNAチップ基板は、「プローブ固定化DNAチップ」として以下の実験に使用した。
【０１３６】
ここで、DNAチップ基板は、Lab on a Chip, 2001, 1, 61-63に記載されているものを使用した。該基板は、電気化学的測定が可能なタイプであり、基板内に配置された各検出区画にはそれぞれ独立した電極が配置されている。各Probe DNAはそれぞれ異なる電極上に固定されているので、各電極から各Probe DNAに起因した電流を検出することができる。
【０１３７】
（３）プローブ固定化DNAチップを用いた標的核酸の検出
前記調製した各Target DNA１〜４の溶液50μLを、前記作製したプローブ固定化DNAチップ上に滴下し、40℃で20分間ハイブリダイゼーション反応を行った。その後、Target DNA１〜４        の溶液を蒸留水で洗浄した後、洗浄溶液(0.2×SSC)を滴下して30℃で10分間洗浄を行った。10分間の洗浄後、洗浄溶液を蒸留水で洗浄し、50μMのHoechst 33258溶液を滴下し、各作用極に電圧を印加し、Hoechst 33258の酸化反応で得られる電流値を測定した。
【０１３８】
なお、これらの操作は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp.265-270 に記載されているGenelyzerTMを用いて行った。
【０１３９】
（４）検出結果
前記電流値の測定によって得られた結果を以下の表６に示した。上段は、本発明の脱塩基ヌクレオチドを含む核酸プローブP(P-C)が固定された電極上で得られた電流値の結果である。得られた電流値を、上述した４種類のTarget DNAごとに記載した。中段は、比較例１の核酸プローブP(G-C)が固定された電極上で得られた電流値の結果である。下段は、比較例２の核酸プローブP(I-C)が固定された電極上で得られた電流値の結果である。
【０１４０】
なお、上述したように、Target DNAの表記は全て鋳型DNAの配列を基に付けており、実際のTarget DNAの配列は、これに相補的な配列となる。
【表６】
2010136692.tif 000010
【０１４１】
（比較例１）
プローブP(G-C)に対して、相補的な配列をもつターゲットT(G-C)を反応させた場合、高い電流値(45nA)が検出され、識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）部位が相補的でないターゲットT(G-A)を反応させた場合、低い電流値（18nA）が検出された。これらの結果は、プローブP(G-C)が、ターゲットT(G-C)およびT(G-A)、つまり識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）を識別可能であることを示している。
【０１４２】
しかしながら、このプローブP(G-C)に対して、ターゲットT(A-C)およびT(A-A)を反応させたところ、共に低い電流値（それぞれ19nA, 20nA）が検出された。これは、ターゲットT(A-C)およびT(A-A)の識別対象としない塩基変異（第２の塩基変異）部位が「Ｇ」から「Ａ」に置換されているため、識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）の種類に関らず、ターゲットの配列はプローブの配列と相補的にならず、結果として十分なハイブリッド鎖の形成がなされず、低い電流値しか得られなかった、つまり識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）を識別することができないことを示している。
【０１４３】
（比較例２）
また、プローブの塩基配列において、識別対象としない塩基変異（第２の塩基変異）にハイブリダイズする塩基をイノシンに置き換えたプローブP(I-C)に、識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）が相補的な配列をもつターゲットT(G-C)を反応させた場合、高い電流値(45nA)が検出され、第１の塩基変異が相補的でないターゲットT(G-A)を反応させた場合、低い電流値（17nA）が検出された。これらの結果は、プローブP(I-C)が、ターゲットT(G-C)およびT(G-A) 、つまり識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）を識別可能であることを示している。
【０１４４】
しかしながら、このプローブP(I-C)に対して、識別対象とする塩基（第１の塩基変異）が相補的な配列をもつターゲットT(A-C)を反応させた場合、若干高いものの、十分ではない電流値(25nA)が検出され、識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）が相補的でない配列をもつターゲットT(A-A)を反応させた場合、低い電流値（18nA）が検出された。これは、ターゲットT(A-C)およびT(A-A)における識別対象としない塩基変異（第２の塩基変異）部位が「Ｇ」から「Ａ」に置換されていることから、塩基「Ａ」（上述したように、実際には相補塩基の「Ｔ」）のイノシンに対する結合力が、塩基「Ｇ」（上述したように、実際には相補塩基の「Ｃ」）のイノシンに対する結合力と比較して小さいためと考えられる。すなわち、識別対象としない塩基変異（第２の塩基変異）にハイブリダイズする部分にイノシンを挿入した場合、第２の塩基変異の種類によって、結合力に大きな差異が生じることを示している。
【０１４５】
（実施例１）
一方、プローブの塩基配列において、識別対象としない塩基変異（第２の塩基変異）にハイブリダイズする塩基を脱塩基核酸（AP-site）に置き換えた本発明のプローブP(P-C)に対して、識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）部位に相補的な配列をもつターゲットT(G-C)を反応させた場合、高い電流値(40nA)が検出され、第１の塩基変異が相補的でないターゲットT(G-A)を反応させた場合、低い電流値（21nA）が検出された。これらの結果は、プローブP(P-C)が、ターゲットT(G-C)およびT(G-A)、つまり識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）を識別可能であることを示している。
【０１４６】
さらに、このプローブP(P-C)に対して、識別対象とする塩基変異（第１の塩基変異）が相補的な配列であって、かつ識別対象としない塩基変異（第２の塩基変異）が「Ｇ」から「Ａ」に置換されたターゲットT(A-C)を反応させた場合、高い電流値(45nA)が検出され、第１の塩基変異が相補的でないターゲットT(A-A)を反応させた場合、低い電流値(20nA)が検出された。これは、脱塩基核酸（AP-site）は、比較例２のイノシンのように対となる塩基と結合を形成することがないので、第２の塩基変異の種類による影響を受けないことを意味している。この結果から、プローブP(P-C)は、比較例１および２とは対照的に、識別対象としない塩基（第２の塩基変異）の種類に関わらず、第１の塩基変異の種類を識別可能であることが実証された。
【０１４７】
以上、本発明の脱塩基ヌクレオチドを挿入したプローブDNAを使用することにより、識別対象としない塩基（第２の塩基変異）の種類によらず、識別対象とする塩基（第１の塩基変異）の識別をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】第１の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図
【図２】第２の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図
【図３】第３の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図
【図４】第４の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図
【図５】第５の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図
【図６】第６の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図
【図７】第６の実施態様における核酸の検出方法を例示的に示した模式図
【図８】AP-siteを含むポリヌクレオチドを示した模式図
【図９】従来のイノシンを利用した核酸プライマーまたはプローブの模式図
【図１０】従来のイノシンを利用した核酸プライマーまたはプローブの標的核酸に対する結合力を示すグラフ。
【図１１】従来の脱塩基ヌクレオチドを含まない核酸プライマーまたはプローブの模式図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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