(57)【要約】      （修正有）【課題】癌発生に関して大きな集団をスクリーニングするための試験として、炎症性腸疾患のような非悪性疾患を有する患者は検出されず、結腸直腸癌を有する患者の早期発見を可能にする特異的検出法を提供する。【解決手段】体液試料中のメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）の総濃度を表すパラメータを決定し、パラメータが識別値またはそれ以上であれば個人が癌を有する可能性が高いことを示す。さらに、遊離のＴＩＭＰ−１濃度と組み合わせてパラメータを決定する。組み合わせる段階がロジスティク回帰分析法を用いる。【選択図】図１６
2010266455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人が癌を有する可能性があるか否かを決定する方法であり、以下の段階を含む方法：
体液試料中のTIMP-1濃度を表す第一のパラメータを決定する段階；
パラメータが識別値またはそれ以上であれば個人が癌を有する可能性が高いことを示す段階；及び
パラメータが識別値またはそれ以上でなければ個人が癌を有する可能性が低いことを示す段階。
【請求項２】
第一のパラメータがTIMP-1の総濃度である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
識別値が、健康な対照集団及び癌であることが既知の集団の双方において少なくとも1つの第一のパラメータを測定することによって決定され、それによって、既定の特異性または既定の感度をもつ癌集団を同定する識別値を決定する、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
決定された少なくとも1つの第一のパラメータが、総TIMP-1濃度と遊離TIMP-1濃度とを組み合わせることによって得られた値である、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
組み合わせる段階がロジスティック回帰分析によって行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
第二のパラメータが任意の型のTIMP-1と異なるさらなるマーカーの濃度を表す、個人由来の体液試料において少なくとも1つの第二のパラメータを決定する段階をさらに含む、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
複合パラメータをもたらし、かつ複合パラメータが識別値またはそれ以上である場合個人が癌を有する可能性が高いことを示し、複合パラメータが識別値またはそれ以上でない場合個人が癌を有する可能性が低いことを示すように、体液試料中のTIMP-1の濃度を表す第一のパラメータ及び、任意の型のTIMP-1と異なる少なくとも1つの第二のパラメータとを組み合わせた、請求項6記載の方法。
【請求項８】
組み合わせる段階がロジスティック回帰分析によって行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
複合パラメータの識別値が、健康な対照集団及び癌であることが既知の集団の双方における該複合パラメータの決定により決定された値であり、それによって既定の特異性または既定の感度をもつ癌集団を同定する識別値が決定される、請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
測定された少なくとも1つの第二のパラメータが腫瘍マーカーの濃度を表すパラメータである、請求項6から9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
標識された腫瘍が、CEA、可溶性u-PAR、カテプシンB、HER2-neu、CA15-3、およびYKL-40からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
測定された少なくとも1つの第二のパラメータがCEAの濃度である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
個人が非選択集団のメンバーである、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
個人が、癌を発症するリスクが増加していると既に同定されてた集団のメンバーである、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
原発（primary）癌について治療されている患者が転移癌を有する可能性があるか否かを決定する方法であり、以下の段階を含む方法：
体液試料においてTIMP-1の濃度を表す第一のパラメータを決定する段階；
パラメータが識別値またはそれ以上であれば個人が転移癌を有する可能性が高いことを示す段階；及び
パラメータが識別値またはそれ以上でなければ個人が転移癌を有する可能性が低いことを示す段階。
【請求項１６】
第一のパラメータがTIMP-1の総濃度である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
識別値が、健康な対照集団及び転移癌を有することが既知である集団の双方において少なくとも1つの第一のパラメータの測定によって決定される値であり、それによって、既定の特異性または既定の感度をもつ転移癌集団を同定する識別値を決定する、請求項15または16記載の方法。
【請求項１８】
測定された少なくとも1つの第一のパラメータが、総TIMP-1濃度と遊離TIMP-1の濃度とを組み合わせることによって得られた値である、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
組み合わせる段階が、ロジスティック回帰分析によって行われる、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
第二のパラメータが任意の型のTIMP-1と異なるさらなるマーカーの濃度を表す、個人の体液試料において少なくとも1つの第二のパラメータをさらに決定する段階を含む、請求項15〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
複合パラメータをもたらし、複合パラメータが識別値またはそれ以上ならば個人が転移癌を有する可能性が高いことを示し、複合パラメータが識別値またはそれ以上でなければ個人が癌を有する可能性が低いことを示すように、体液試料においてTIMP-1濃度を表す第一のパラメータ及び、任意の型のTIMP-1と異なる少なくとも1つの第二のパラメータとを組み合わせる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
組み合わせる段階がロジスティック回帰分析によって行われる、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
複合パラメータの識別値が、健康な対照集団及び転移癌を有することが既知である集団の双方における該複合パラメータを測定することによって決定された値である、それによって、既定の特異性または既定の感度をもつ転移癌集団を同定する識別値を決定する、請求項21または22記載の方法。
【請求項２４】
測定された少なくとも1つの第二のパラメータが腫瘍マーカーの濃度を表すパラメータである、請求項20〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
標識された腫瘍がCEA、可溶性u-PAR、カテプシンB、HER2-neu、CA15-3、およびYKL-40からなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
測定された少なくとも1つの第二のパラメータがCEAの濃度である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
原発癌の治療後に、癌患者のモニタリングの一部として一定の間隔でいくつかの時点で測定が飛び飛びに行われる、請求項15〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
初期段階の癌を検出するために用いられる、請求項１〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
初期段階の癌が、結腸癌デュークスA期、結腸癌デュークスB期、結腸癌デュークスC期、直腸癌デュークスA期、直腸癌デュークスB期および直腸癌デュークスC期からなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
体液が血液（血清および血漿）、便、尿ならびに脳脊髄液からなる群より選択される、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
体液が血漿である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
体液が血液である、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
体液が尿である、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
濃度の測定が、イムノアッセイまたは活性アッセイによって行われる、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
イムノアッセイがELISAである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
活性アッセイが酵素電気泳動法（zymography）である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
癌の種類が結腸癌、直腸癌および転移性乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、肝臓癌ならびに胃癌からなる群より選択される、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
結腸直腸癌は、西欧世界において最も多く認められる癌の第４位であり、アメリカでは毎年新しい症例約130,000例が認められる。全ての結腸直腸癌患者の40〜50％が初期段階の疾患（デュークスのAまたはB期）であると診断されるであろう。初期段階の結腸直腸癌を有するこれらの患者のほとんどが、手術のみによって治癒することが可能である。このように、再発のリスクは、初回手術時の疾患の段階に密接に関連し、デュークスのA期では再発率は約10％、デュークスのB期では再発率は25〜30％である。デュークスのC期の患者は術後の５年再発率が70％であり、アジュバント化学療法を受ける。再発後、疾患のために死亡するリスクは有意である。このように、生存を改善する一つの方法は、初期段階であると診断される患者数を増加させることである。結腸直腸癌のスクリーニングは、生存を改善させることが示されているが、しかし、現行の検査は、コンプライアンスの欠如、低い感度、および厳密な食事制限の必要性という欠点を有する。このように、結腸直腸癌の早期検出のために新しい、改善された試験を開発することが必要である。
【０００２】
転移性疾患は、癌患者の罹患率および死亡率の主な原因であるため、腫瘍の浸潤および転移の調節に関与する分子は、可能性がある診断/予後標的として魅力的である。癌細胞によってまたは腫瘍間質の細胞によって誘導される蛋白質溶解酵素は、細胞外組織の分解に関与し、これが癌細胞の浸潤および転移に至ることは十分に確立されている。多くの酵素がこのプロセスに関与しており、中でも最も十分に研究されている酵素は、コラゲナーゼおよびストロメリシンのようなメタロプロテイナーゼ、ならびにプラスミンのようなセリンプロテアーゼである。最近、これらの分子は、遊離で、または複合体と結合して、腫瘍組織から放出されて、循環中に入ることを示すデータが発表されている。
【０００３】
マトリクスメタロプロテイナーゼ（MMP's）は、癌の増殖および体内伝播に中心的な役割を有しており、細胞外マトリクスの酵素的分解に関与している（リオッタら（Liotta）、1991；ステトラー・スティーブンソン（Stetler-Stevenson）ら、1993；マクドーガル＆マトリシアン（MacDougall and Matrisian）、1995）。MMP'sの天然に存在する阻害剤である、MMP's組織阻害剤（TIMP's）は、MMP'sの活性型と堅固な1：1化学量論的複合体を形成し（ウェイガス（Weigus）ら、1985；クライナー（Kleiner）ら、1993）、それによってこれらの酵素の触媒活性を阻害する（ステトラー・スティーブンソン（Stetier-Stevenson）ら、1996；ゴールドバーグ（Goldberg）ら、1992；ビルケダール・ハンセン（Birkedal-Hansen）ら、1993）。MMP'sのマトリクス分解特性とTIMP'sの阻害作用との均衡は、正常な生理条件において厳密に調節されており（マトリシアン（Matrisian）、1992；ソールガイアソン（Thorgeirsson）ら、1993；ビルケダール・ハンセン（Birkedal-Hansen）ら、1993）、悪性組織ではこの均衡が破壊されている可能性がある。
【０００４】
TIMP-1（コダマ（Kodama）ら、1989；クックスレイ（Cooksley）ら、1990；クラーク（Clark）ら、1991）およびTIMP-2（フジモト（Fujimoto）ら、1993）を検出するために多くの酵素結合イムノアッセイが記述されている。これらのアッセイは、体液、例えば血清、血漿、羊水、脳脊髄液、尿に適用されているが、調べた試料の数は、健康な人におけるTIMPレベルの正常範囲を確立するには十分ではなかった（コダマ（Kodama）ら、1989；クラーク（Clark）ら、1991）。さらに、これらのアッセイのいずれも、技術面での実施または臨床での使用に関して十分に確認されていない。
【０００５】
胃癌患者においてTIMP-1 mRNAの腫瘍組織レベルを調べたミモリら（Mimori、1997）の研究において、TIMP-1 mRNAの高い腫瘍/正常組織比が、浸潤の増加と予後の不良に関連することが判明した。しかし、前立腺癌患者および健康な献血者の血清中のTIMP-1蛋白質レベルは、高度の重なりを示した（ベイカー（Baker）ら、1994）。同様に、前立腺癌患者と健康献血者の血漿を個々に調べたところ、２群のTIMP-1レベルに差を認めなかった（ユング（Jung）ら、1997）。
【０００６】
進行胃腸管癌および婦人科癌患者の血清におけるMMP-9と複合体を形成したTIMP-1の研究（ツッカー（Zucker）ら、1995）から、健康な対照者と比較して転移疾患を有する癌患者の血液試料では有意に高いレベルを示し、TIMP-1：MMP-9複合体のレベルが高い患者は生存期間がより短いことが示された（ツッカー（Zucker）ら、1995、および米国特許第5,324,634号）。しかし、この研究には、総TIMP-1または遊離TIMP-1の測定が含まれておらず、現在までに約24個が同定されているMMP'sの1つとTIMP-1との複合体を調べたに過ぎなかった。さらに、これらの研究では、乳癌患者と健康献血者のあいだで複合体レベルの差を認めなかった。同様に、この研究には、初期段階の癌患者が含まれていなかった。
【発明の概要】
【０００７】
発明の簡単な説明
本発明は、癌の発生に関して大きい集団をスクリーニングするために用いられる試験に関する。方法は、体液中のメタロプロテイナーゼ1の組織阻害剤（TIMP-1）の測定に基づいている。本発明によって、結腸直腸癌を有する患者の早期発見が可能となる。本発明は非常に特異的であり、炎症性腸疾患のような非悪性疾患を有する患者は検出されない。もう一つの類似の阻害剤であるTIMP-2の測定は、同等の臨床的価値を示さず、このことは、本発明のさらなる特異性レベルを示している。
【０００８】
試験は、血漿、血清、便および尿を含む様々な体液における1型メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（TIMP-1）の測定に基づく。TIMP-1濃度は、総TIMP-1濃度、遊離TIMP-1濃度、TIMP-1とMMP'sとの複合体の濃度および/またはその比および分画のいずれかとして決定することができ、以降、これらをTIMP-1レベルと呼ぶ。本発明に従って、癌、例えば結腸癌を有する可能性が高い人は、体液中のTIMP-1レベルの上昇によって特定することができ、TIMP-1レベルが低い人は、癌、例えば結腸癌を有する可能性が低い。このように、本発明は、初期段階の非症候性の癌、例えば結腸癌を有する可能性が高い人を特定するために用いることができる。特定された人は、精密検査を行わなければならず、癌が発見されれば、患者は手術、放射線照射、および/またはアジュバント抗新生物治療を受け、それによって、個人の癌を治癒する可能性は増加するはずである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】TIMP-1のカイネティックアッセイ。405 nmでの吸光度の変化に関する経過曲線は、固相結合アルカリフォスファターゼ免疫結合体による燐酸p-ニトロフェノールの加水分解によって得られた。示したデータは、精製組換え型TIMP-1の４つの異なる濃度によって処理した個々のアッセイウェル４個から得られた；10 μg/L（▽-▽）、2.5 μg/L（△-△）、0.63 μg/L（□-□）、および0.16 μg/L（○-○）。示した線は単純な直線回帰に適合させている。
【図２】TIMP-1標準曲線。0〜５μg/Lの範囲のTIMP-1標準物質の３個ずつの吸光度単位を60分のあいだ自動的に得て、値は405 nmで10分ごとに読み取った。各ウェルについて経過曲線を計算して、得られた速度を式y＝d＋[(a-d)/(1＋(x/c)b)]の４パラメータ等式を用いて標準曲線に適合させる。示した例において、４つの誘導パラメータは、以下の値を有した：a＝1.87、b＝1.11、c＝3.35、d＝73.5。適合させた曲線の相関係数は＞0.999である。
【図３】アッセイ希釈緩衝液（□-□）、EDTA血漿プールの100倍希釈液（△-△）、クエン酸血漿プールの100倍希釈液（▽-▽）、およびヘパリン血漿プールの100倍希釈液（○-○）に増加濃度で加えた標準物質TIMP-1からのシグナルの回収。示した値は、１試料あたり３個の平均値である。各適合曲線の相関係数は0.99以上である。
【図４】免疫吸収した患者の血漿試料のウェスタンブロッティング。レーン１：標準物質TIMP-1；レーン２：10倍希釈してヒツジポリクローナル抗TIMP-1によって免疫吸収した患者のクエン酸血漿試料の溶出物。非還元標準物質TIMP-1のバンドと、血漿試料から単離したTIMP-1のバンドはいずれも30 kDaのすぐ下に見える。
【図５】図5aは、ボランティア献血者100人の組において同じ人からのクエン酸血漿（○）およびEDTA血漿（△）において測定したTIMP-1レベル（μg/L）のパーセンタイルプロット。図5bは、同じ100人からのEDTA血漿試料と比較したクエン酸血漿試料におけるTIMP-1レベルの直線回帰プロット。適合させた線の等式は、y＝0.93xであり、回帰係数は0.99である。
【図６】異なる時間にボランティア献血者から同じ技法によって得た２組のクエン酸血漿試料において測定したTIMP-1レベル（μg/L）のパーセンタイルプロット。５月に得た試料100個は97（△）であり、９月に得た試料100個は96（□）であった。
【図７】ボランティア献血者からのクエン酸血漿試料194個において測定し、男性107人（△）および女性87人（○）によって性別に層化したTIMP-1レベル（μg/L）のパーセンタイルプロット。
【図８】TIMP-9：MMP-9複合体ELISAのグラフ。
【図９】遊離TIMP-1 ELISAのグラフ。
【図１０】プレートをポリクローナル抗MMP-9抗体によってコーティングした。TIMP-1：MMP-9複合体、遊離MMP-9、遊離TIMP-1の異なる濃度およびブランク対照を加えた。TIMP-1：MMP-9複合体および遊離MMP-9のみが捕獲ポリクローナル抗MMP-9抗体に結合した。次に抗原を検出するためにMAC19を加えた。TIMP-1：MMP-9複合体も遊離MMP-9のいずれもMAC19によって検出されず、遊離TIMP-9に対するこの抗体の特異性を明らかにした。
【図１１】プレートをポリクローナル抗MMP-9抗体によってコーティングした。TIMP-1：MMP-9複合体、遊離MMP-9、遊離TIMP-1の異なる濃度およびブランク対照を加えた。TIMP-1：MMP-9複合体および遊離MMP-9のみが捕獲ポリクローナル抗MMP-9抗体に結合した。次に抗原を検出するためにMAC15を加えた。捕獲ポリクローナル抗MMP-9抗体に結合したTIMP-1：MMP-9複合体のみがMAC15によって検出された。遊離MMP-9はMAC15によって検出されなかった。
【図１２】アッセイ緩衝液希釈液（□-□）、EDTA血漿プール希釈液（△-△）、クエン酸血漿プール希釈液（▽-▽）、およびヘパリン血漿プール希釈液（○-○）に増加濃度で加えた標準物質TIMP-1からの遊離TIMP-1アッセイにおけるシグナルの回収。示した値は、１試料あたり３個ずつの平均値である。各適合曲線の相関係数は0.99以上である。
【図１３】全ての結腸直腸癌患者、個々の直腸癌患者および結腸癌患者における総TIMP-1のROC曲線。健康な対照被験者として、健康献血者108人のコホートを用いた（括弧内の数値＝曲線下面積）。
【図１４】デュークスAまたはB期疾患を有する全ての結腸直腸癌患者における総TIMP-1のROC曲線。さらに、結腸癌または右側結腸癌を有するデュークスAまたはB期患者のROC曲線も含まれる（括弧内の数値＝曲線下面積）。
【図１５】健康な献血者と比較した結腸直腸癌患者64人の独立した組からの総TIMP-1のROC曲線を示す（AUC＝曲線下面積）。
【図１６】健康献血者、クローン病患者、潰瘍性大腸炎患者および結腸直腸癌患者の血漿における総TIMP-1濃度を示すボックスプロット。中央値、10、25、75、および90パーセンタイルを示す。
【図１７】右側結腸癌患者と健康献血者108人における総TIMP-1、CEA、および総TIMP-1とCEAの組合せに関するROC曲線（括弧内の数値＝曲線下面積）。
【図１８】CRC患者64人と献血者108人における血漿遊離TIMP-1、血漿総TIMP-1、およびその組合せに関するROC曲線（括弧内の数値＝曲線下面積）。
【図１９】原発性乳癌患者322人と献血者108人のROC曲線（括弧内の数値＝曲線下面積）。
【図２０】女性乳癌患者（○）からのEDTA血漿試料19例および健康な献血者87人（△）においてELISAによって測定した総TIMP-1レベル（μg/L）のパーセンタイルプロット。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
多くの癌のタイプにおいて、悪性疾患の有無に関して大きい集団をスクリーニングするために非常に感度がよく特異的なマーカーは、重大でアンメット（unmet）に必要である。そのようなマーカーは、初期段階の癌を有する確率が高い患者を特定することができるはずである。これらの人は精密検査を行わなければならず、癌が発見されれば、彼らはその後手術、放射線照射、またはアジュバント抗新生物治療を受けなければならない。
【００１１】
プロテイナーゼおよびその受容体と阻害剤は、癌の浸潤に至る基礎となるメカニズムにおいて中心的な役割を果たしているように思われるため、これらの分子は、癌発生プロセスにおいて非常に初期の時点で発現されている可能性がある。これらの分子の多くが、細胞外でその生物作用を発揮するため、それらは初期段階の浸潤性悪性疾患を有する患者においても、体液中のレベルが上昇している可能性がある。その上、これらの分子は、悪性進行のより基礎的な特徴、例えば浸潤および転移に関与しているため、どのタイプの癌がこれらの分子の増加を示すかを調べなければならない。
【００１２】
本発明は、血液、血清、血漿、尿、便、または脳脊髄液のような体液における総、複合および/または遊離TIMP-1レベルの量、ならびにその比および分画を決定することを含む、患者において結腸直腸癌の診断に役立つ方法に関する。
【００１３】
本発明の一つの局面は、体液試料中のTIMP-1の濃度を表す第一のパラメータを決定する段階、およびパラメータが識別値またはそれ以上であれば、個人が癌を有する可能性が高いこと、パラメータが識別値またはそれ以上でなければ個人が癌を有する可能性が低いことを示す段階を含む、人が癌を有する可能性があるか否かを決定する方法に関する。
【００１４】
TIMP-1濃度を表すパラメータは、TIMP-1の濃度そのものであってもよい。TIMP-1は遊離型とメタロプロテイナーゼとの複合型の両者として存在し、重要なパラメータはTIMP-1の総濃度、すなわち、遊離型のTIMP-1および複合型のTIMP-1の総和であることが判明した。濃度そのもの以外の他の発現も、例えば係数を乗じた濃度等も、濃度を表しうると理解され、そのような他の表示も、対応する調節が行われる限り、本発明の目的に等しく良好に用いることができると理解される。
【００１５】
識別値は、本明細書の実施例におけるより詳細な考察から明らかとなるように、健康な対照集団と癌であることが既知の集団の両者においてパラメータを測定し、それによって健康な対照集団と癌患者集団のパラメータ値と既知の臨床データとの関係の分析に基づいて既定の特異性または既定の感度のいずれかによって、癌集団を同定する識別値を決定することによって決定された値である。このようにして決定された識別値は、今後の個々の試験において同じ実験設定に関して有効である。
【００１６】
特異性は、本発明の説明された方法によって正確に同定される陽性者（すなわち、体液試料において既定の診断レベルより高いTIMP-1濃度を表すパラメータを有する人）の割合として定義される。感度は、記述の方法によって正確に同定される陰性者（すなわち、体液試料において、既定の診断レベルより低いTIMP-1濃度を表すパラメータを有する人）の割合として定義される。
【００１７】
本発明は、個人および集団全体の両者に用いてもよい。
【００１８】
本明細書において記述の特定の実験設定において、識別値として有用な総TIMP-1の濃度閾値は、特異性90％で総TIMP-1の50〜160 μg/Lの範囲であることが判明した。他の実験設定および他のパラメータによっては他の値となるが、これらは本明細書の教示に従って決定することができるであろう。
【００１９】
方法は、非選択集団に適用することができるが、より適切には、癌を発症するリスクが増加していると既に特定された集団、例えば、遺伝的素因を有する人、発癌物質に暴露された人、または癌の素因となる非悪性疾患を有する人に適用する。結腸直腸癌の場合、本発明のために選択される集団は、ポリープの既往を有する人、クローン病または潰瘍性大腸炎患者、家族の１人またはそれ以上に結腸直腸癌の既往を有する人、または早期結腸直腸癌を切除したことが個人となりうるであろう。
【００２０】
個人がその体液中に高いTIMP-1レベルを有すると特定された場合、個人は精密検査に回付しなければならない。癌が発見されれば、患者は、癌患者の治癒をねらいとした手術、放射線照射、またはアジュバント抗新生物治療を受けることができる。
【００２１】
実施例1は、高い分析感度および特異性で総TIMP-1を測定するアッセイの準備および確認について記述する。健康な献血者の血清総TIMP-1の範囲は非常に狭いことが記述されている。
【００２２】
実施例2では、TIMP-1：MMP-9 ELISAの体裁を記述する。このアッセイの体裁、実行、および確認は、MMP-9に対するポリクローナル抗体を捕獲段階で用いることを除いては、総TIMP-1の場合と類似である。MMP-9抗体を別のMMPに対する抗体と置換することによって、TIMP-1と別のMMP'sとの複合体を定量することができる。
【００２３】
実施例3では、遊離TIMP-1のみを測定するTIMP-1アッセイの体裁について記述する。このアッセイは、非複合体型のTIMP-1のみを認識するモノクローナル抗TIMP-1抗体（MAC 19）を利用する。このように、このアッセイは、試料中の遊離TIMP-1量を測定するであろう。このアッセイの実行および確認は、総TIMP-1に関するアッセイの場合と同様である。
【００２４】
生体試料中の遊離TIMP-1濃度を総TIMP-1濃度から差し引くことによって、TIMP-1の全ての複合体型の濃度を決定することができる。TIMP-1 は、多くのMMP'sと複合体を形成することが可能であり、したがって、TIMP-1の総量から1つのタイプの複合体を差し引いても、この特異的MMPと複合体を形成していないTIMP-1の分画に関する情報を提供するに過ぎないことを強調しなければならない。
【００２５】
実施例4において、結腸直腸癌を有する患者は、術前の血漿試料中の総TIMP-1レベルが有意に上昇していることを示す。全ての結腸直腸癌患者および健康な献血者の血漿における総TIMP-1レベルのパーセンタイルプロットから、119.1 μg/Lという総TIMP-1濃度が、健康献血者の90％パーセンタイルであることが示される。このカットオフを用いると、結腸直腸癌患者の68％が血漿TIMP-1レベルが上昇していると特定された。結腸癌患者を個別に分析すると、血漿中の総TIMP-1測定によって、90％の診断特異性で（健康献血者の10％は高いと分類された）結腸癌患者の75％（診断感度）が特定されることが示された。同様に、直腸癌患者単独についても、血漿中の総TIMP-1測定により、90％の診断特異性で直腸癌患者の60％が特定された。より高いまたはより低い感度または特異性が望ましい場合、カットオフ値を変化させることができる。これは図13において説明し、結腸直腸癌患者からの血漿における総TIMP-1のROC曲線を示す。さらに、結腸および直腸癌患者の個々の群に関しても、ROC曲線を含める。これらのROC曲線に由来しうる他の任意の情報は、本発明の範囲内に入る。
【００２６】
結腸癌（n＝43）または直腸癌（n＝21）患者64人からの術前の血清試料を含む独立したプロスペクティブ試験によって、上記の試験から得られたデータが確認された（図15）。自動イムノアッセイにおいて異なる抗体（抗TIMP-1 11E/C6、抗TIMP-1 PRU-T6）を用いる健康な献血者180人と結腸直腸癌患者20人に関するさらなる試験は、これまでの臨床結果のさらなる確証となった。その上、自動アッセイから得られた絶対値は、実施例1に記載したアッセイによって得られた値と高い程度の相関を示した（r＝0.9）。
【００２７】
癌のスクリーニングのマーカーとしての臨床値は、おそらく生存に影響を及ぼす疾患の初期段階の検出能に関連している。総TIMP-1は、結腸直腸癌患者の総集団の場合と同様に、初期結腸直腸癌（デュークスAおよびB期）においても効率的なスクリーニングマーカーであることが示された（図14）。このように、総TIMP-1を用いたスクリーニングによって、初期段階の癌であると診断される患者の数が増加するであろう。同様に、図14に由来しうる任意の情報は、本発明の範囲内である。
【００２８】
結腸癌患者を２群、すなわちそれぞれ左側と右側の腫瘍を有する患者に分けることによって、総TIMP-1の測定は、初期段階の右側の結腸癌病変を有する患者を同定するために特に有用であることが判明した（図14）。
【００２９】
所定の癌スクリーニング試験の特異性は、癌を有する患者のみを同定する試験の効率に基づいているが、非悪性疾患を有する患者は、疑陽性被験者として特定されてはならない。結腸直腸癌の場合、試行中の試験は、結腸と直腸の悪性疾患と非悪性疾患とを識別できることが重要である。クローン病および潰瘍性大腸炎のような疾患を有する患者は癌を発症するリスクがより高いために、このことは、これらの疾患の場合には特に重要である。
【００３０】
実施例5において、総TIMP-1レベルは、結腸直腸癌患者では炎症性腸疾患（IBD）患者より有意に高いことが示され、このことはIBD患者の集団において総TIMP-1を結腸直腸癌のスクリーニングに用いることができることを示している。TIMP-1が非悪性疾患では増加していないことは、リウマチ性関節炎患者は血漿TIMP-1レベルが増加していないことを証明した最近の論文（ケイサー（Keyser）ら、1999）からも支持されている。同様に、IBD患者（急性活動期疾患であると臨床的に評価された患者は除く、n＝４）と健康な献血者における総TIMP-1レベルを比較しても、総血漿TIMP-1レベルに有意差は認められず（p＝0.56）、このことは、これらの非悪性疾患が疑陽性試験結果を生じないことを示している。
【００３１】
実施例6において、さらなる結腸直腸癌マーカーを測定する相加作用について記述する。癌胎児抗原（CEA）を、全ての癌患者および健康な献血者試料において測定した。CEAと、実施例1において記載したアッセイによって測定したTIMP-1レベルとを組み合わせると、CEA単独では98％特異性で35％感度を生じるのに対し、ロジスティック回帰分析によって決定したCEAと総TIMP-1とを組み合わせた感度は、特異性を犠牲にすることなく57％に増加することが示された。
【００３２】
実施例7において、結腸直腸癌を有する患者は、術前の血漿試料中の遊離TIMP-1レベルが有意に上昇していることが示される。健康な献血者からの遊離TIMP-1レベルと共に結腸直腸癌患者からの遊離TIMP-1レベルを含むパーセンタイルプロットにより、結腸直腸癌患者の遊離TIMP-1レベルが献血者と比較して有意に上昇していることを示した、p＝0.02。これらの患者と献血者についてROC曲線を作製したところ（図18）、遊離TIMP-1の曲線下面積（AUC）が0.61を示すことが認められた。
【００３３】
実施例8において、結腸直腸癌の診断に役立てるためにTIMP-1：MMP複合体アッセイを用いることについて記述する。
【００３４】
TIMP-1は、遊離分子として、またはMMP's、好ましくはMMP-9との複合体のいずれかとして存在することが知られている。総TIMP-1、複合体形成TIMP-1および遊離TIMP-1の測定によって、診断的価値の可能性に関してこれらの種のそれぞれを確認することが可能である。さらに、異なる種間の比または由来するアルゴリズムを計算することが可能であり、これはさらなる診断的価値を提供するであろう。
【００３５】
実施例9において、総TIMP-1と遊離TIMP-1を組み合わせた診断的価値を記述する。
【００３６】
ロジスティック回帰分析によって遊離TIMP-1測定値と総TIMP-1測定値とを組み合わせると、AUCの有意な増加が示されることを、データは示している。図18に由来しうる任意の情報は、本発明の範囲内に含まれる。
【００３７】
所定の癌スクリーニング試験の特異性は、癌を有する患者のみを特定する試験の有効性に基づくが、非悪性疾患を有する患者は疑陽性として同定されてはならない。しかし、試験は、全ての癌のマーカーであるよりは、特定のタイプの癌、例えば結腸癌に対して特異的であることが望ましいであろう。
【００３８】
実施例10において、原発性乳癌患者（I期およびII期）322人のコホートからの術前の血液試料における総血漿TIMP-1値を、健康な献血者108人における総TIMP-1レベルと比較して記述する。乳癌患者は総TIMP-1レベルの中央値が88.3 μg/Lであるのに対し、健康献血者は、総TIMP-1の血漿濃度の中央値が88.9 μg/Lであることが示された。これらの値の差は、臨床的に有意ではなく、結腸直腸癌の診断に関するTIMP-1レベルの特異性の根拠となる。しかし、血清中TIMP-1レベルの上昇が初期の非結腸直腸癌患者において発見されるか否かを調べなければならない。
【００３９】
実施例11では、転移性乳癌患者における総TIMP-1レベルを記述する。
【００４０】
注目すべきは、転移性乳癌の女性の血漿中の総TIMP-1は、中央値が236 μg/Lであり、健康な献血者のレベルより有意に高い。これは、乳癌患者の管理に血漿TIMP-1レベルを用いる可能性を示している。
【００４１】
実施例12では、結腸直腸癌患者の術前の血漿試料中のTIMP-2濃度を記述する。
【００４２】
TIMP-2は、TIMP-1と高度の相同性を有するメタロプロテイナーゼのもう一つの組織阻害剤である。TIMP-2に対する特異的イムノアッセイを用いて、この阻害剤の濃度を、結腸直腸癌患者と健康な献血者の血漿試料において決定した。２つの集団の血漿TIMP-2レベルには有意差を認めず、結腸直腸癌の早期診断の補助としてのTIMP-1の独自の価値を支持している。
【実施例】
【００４３】
実施例1
ヒト血漿における総TIMP-1濃度を定量するためのELISAの準備。
本実施例は、血漿における総TIMP-1レベルを測定するELISAの準備および確認について説明する。さらに、本実施例は、男女の健康な献血者におけると共に異なる血漿調製物におけるTIMP-1レベルに関する情報を提供する。
【００４４】
材料および方法
献血者
血液試料は、年齢19〜59歳の男性51人（中央値；41歳）および年齢20〜64歳の女性43人（中央値；36歳）を含む、見かけ上健康なボランティア献血者94人からまず得た。その後の採血において、年齢19〜59歳の男性56人（中央値；42歳）および年齢20〜60歳の女性44人（中央値；36.5人）を含む献血者試料100例を得た。献血者全員からインフォームドコンセントを得て、地域の倫理委員会から許可を得た。
【００４５】
採血と血漿の分離
うっ血を最小限にして（必要であれば、最大で＋2 kPaの止血帯による最大で２分間のうっ血が認められた）末梢血を予め冷却したクエン酸、EDTA、またはヘパリン回収管（ベクトン・ディッキンソン社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）に採取して、倒立させて５回混合し、直ちに氷中で冷却した。可能な限り速やかに（採血後1.5時間以内）血漿と血球を４℃で1,200×gで30分間遠心分離して、アッセイするまで-80℃で凍結保存した。血漿プールは、献血者少なくとも10人から新しく採取した試料について作製し、-80℃で凍結保存した。分析する場合は、試料を37℃の水浴中で急速に融解して、必要となるまで氷中で保存した。
【００４６】
総TIMP-1 ELISA
ストレンジウェイズ・ラボラトリーズ社が開発したTIMP-1抗体（ヘンブリー（Hembry）ら、1995）を用いて、感度のよい特異的サンドイッチELISAを準備した。ヒツジポリクローナル抗TIMP-1抗血清（ヘンブリー（Hembry）ら、1985；マーフィー（Murphy）ら、1991）を抗原捕獲のために用いて、マウスモノクローナル抗TIMP-1 IgG1（MAC-15）（クックスレイ（Cooksley）ら、1990）を抗原検出のために用いた。ウサギ抗マウス免疫グロブリン/アルカリフォスファターゼ結合体（カタログ番号D0314、ダコ社、グロストルップ、デンマーク）は二次検出試薬であった。後者の結合体は、ヒトIgGに対して予め吸収して供給され、このため、血漿試料中のIgGと交叉反応性がない。モノクローナル検出抗体MAC-15は、遊離TIMP-1およびTIMP-1とMMP'sとの複合体の両者を認識するため（クックスレイ（Cooksley）ら、1990）、ヒツジポリクローナル抗TIMP-1抗血清によって捕獲された総TIMP-1含有量をELISAによって定量した。
【００４７】
96ウェルマイクロタイタープレート（マキシソープ、ヌンク社、ロスクライド、デンマーク）をポリクローナルヒツジ抗TIMP-1の0.1 モル/L炭酸緩衝液溶液、pH 9.5の100 μL/ウェルによって37℃で１時間コーティングした。次に、燐酸緩衝生理食塩液（PBS）によって1：1に希釈したスーパーブロックJ溶液（ピアスケミカルズ社、ロックフォード、イリノイ州）200 μL/ウェルによって、ウェルを２回すすいだ。マイクロタイタープレートは-20℃で14日間まで保存した。分析当日、プレートを室温で融解して、1 g/Lツイーンを含むPBSで５回洗浄した。
【００４８】
一連の精製した組換え型ヒトTIMP-1標準物質を用いて、各プレートを較正した。標準物質は、精製TIMP-1の保存液を連続希釈することによって調製した。標準物質の濃度は、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、および0.156 μg/Lであった。各プレートには、試料希釈緩衝液のみを含むブランクおよびクエン酸血漿プールの100倍希釈から調製した対照２個を含めた。プレートの最初の試料として第一の対照を加えて、第二の対照を最後として加えた。血漿試料は全て、50 mol/L燐酸、pH 7.2、0.1 mol/L NaCl、10 g/Lウシ血清アルブミン（分画V、ベーリンガー・マンハイム社、ペングバーグ、ドイツ）および1 g/Lツイーン20からなる試料緩衝液で100倍希釈した。各標準物質、ブランク、対照および患者の試料全体で100 μL/ウェルを30℃で１時間プレート上でインキュベートした。標準物質、ブランク、対照、および試料は全て、アッセイ毎に各プレートについて１試料あたりウェル３個で行った。最初のインキュベーション後、ウェルを５回洗浄してから、精製MAC-15モノクローナル抗体（0.5 mg/L）の試料希釈緩衝液溶液の100 μL/ウェルによって30℃で１時間処理した。さらに５回洗浄した後、ウェルを試料希釈緩衝液で2000倍希釈したウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ig）/アルカリフォスファターゼ結合体100 μL/ウェルと共に30℃で１時間インキュベートした。洗浄液によって５回洗浄して、蒸留水で３回洗浄した後、新たに調製した燐酸p-ニトロフェノール（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）基質溶液（0.1 mol/Lトリス塩酸、pH 9.5、0.1 mol/L NaCl、５ mmol/L MgCl2において1.7 g/L）100 μLを各ウェルに加えた。プレートはセレス900Jプレートリーダー（バイオテックインストルメンツ、ウィノースキー、バーモント州）に置いて、23℃で黄色の発色を自動的にモニターした。読みは、405 nmで空気ブランクに対して10分ごとに１時間読み取った。キネティカルクIIソフトウェアを用いて各ウェルの色の形成速度を計算することによってデータを分析し（直線回帰分析）、４パラメータ適合標準曲線を作製して、各血漿試料のTIMP-1濃度を計算した。
【００４９】
回収実験
TIMP-1シグナルの回収は、クエン酸、EDTA、またはヘパリン血漿プールの100倍希釈液を加えた後に測定した。精製TIMP-1を血漿プールに加えて、0〜10 μg/Lの範囲の最終濃度を得た。それぞれの場合の回収率は、濃度の関数としてTIMP-1シグナルを表す直線の勾配から計算し、100％回収は、TIMP-1を試料緩衝液において希釈した場合に得られた勾配として定義した。
【００５０】
イムノブロッティング
血液中にTIMP-1の高レベルを有する患者（634 μg/L、ELISAによって測定）からのクエン酸血漿を10倍希釈して、ポリクローナルヒツジ抗TIMP-1と共に予めインキュベートしたプロテインA-セファロースカラムに加えた。５サイクル後、結合した蛋白質をカラムから溶出させて、得られた溶出液50 μLを12％SDS-ゲル電気泳動上で泳動させた（レディゲルJ、バイオラド社）。低分子量（ファルマシア社）および高分子量マーカー（バイオラド社）ならびにTIMP-1標準物質（100 μg/L）50 μLのラムリ試料緩衝液での混合液をゲル上で泳動させた。蛋白質は、電気泳動によってゲルから二フッ化ビニリデン樹脂（PVDF）メンブレン（ミリポア社）に転写させた。メンブレンを1％スキムミルク粉末のTBS溶液と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、メンブレンをMAC-15 20 mlと共に室温で１時間インキュベートした。次に、メンブレンを洗浄して、1000倍希釈したウサギ抗マウスIg/アルカリフォスファターゼ結合体20 mlと共に室温でさらに１時間インキュベートした。最後に、メンブレンを洗浄して、燐酸基質溶液（NBT/BCIP）を加えて発色させた。
【００５１】
結果
ELISAの実施
各ウェルにおける発色は、これらの実験において総TIMP-1の全ての濃度に関して時間の比例関数として進行し（図１）、適合させた直線の相関係数は典型的に0.99以上であった。TIMP-1濃度に対してプロットした速度の標準曲線は、直線およびS字曲線の上部曲線領域（0〜５μg/Lの範囲）からなり、４パラメータ適合の相関係数は典型的に0.999より良好であった（図２）。TIMP-1なし（空気ブランクに対する読み）の速度は、1.21±0.15（平均値±SD）ミリ吸光度単位/分であったのに対し（n＝29）、標準物質TIMP-1の10 μg/Lによる速度は、50.3±6.01ミリ吸光度単位/分（n＝29）であった。TIMP-1ブランクに関して平均値より上の3SDのシグナルに対応するTIMP-1の濃度として定義されるアッセイの検出限界は、0.089 μg/Lであった。この値は、健康なクエン酸血漿試料においてTIMP-1の測定濃度の平均値の13％であった。対照クエン酸血漿プール16個に関するアッセイ間変動係数（CV）は、5.3％であり、血漿プールの29連続アッセイに関するアッセイ間CV（異なる日に実施）は6.2％であった。この血漿プールは57.8 μg/LというTIMP-1濃度を有し、正常な人の22パーセンタイルに相当する。
【００５２】
血漿特異的回収における希釈後の組換え型TIMP-1の回収は、血漿プール複製体のパネルに精製TIMP-1の増加濃度を加えた後に、シグナルを測定することによって決定した。回収は、クエン酸血漿において104％であり、希釈したEDTA血漿では101％、および希釈したヘパリン血漿では87％（図３）であった。このように、内部標準物質からのTIMP-1シグナルの回収は、血漿の全ての調製物に関して許容された。
【００５３】
総血漿TIMP-1シグナルの希釈曲線
クエン酸、EDTA、およびヘパリン血漿プールの連続希釈液を作製して、TIMP-1シグナルの直線的な減少に関して調べた。クエン酸、EDTAおよびヘパリン血漿は全て、希釈の関数としてシグナルの良好な直線性を示した。その後の定量のために選択した1％血漿希釈液は、この直線希釈曲線の範囲内に入っている。
【００５４】
総血漿TIMP-1のイムノブロッティング
免疫吸収した患者の血漿試料のウェスタンブロットは、複合体を形成していない遊離TIMP-1（図４、レーン１）に対応する28 kDaの明確なバンド（図４、レーン２）を示した。MMP'sとTIMP-1との複合体、すなわちMMP-2：TIMP-1、100 kDaに対応する予想されるより高い分子量にバンドを認めなかった。このことは、TIMP-1の主な部分が血漿において遊離型として存在するか、または複合体がSDS-PAGEの際に解離したかのいずれかであることを示している。試料は、血漿試料中に存在する任意の複合体も保持するために非還元で加熱されないままであったが、MMP：TIMP複合体が、非還元状態においても（モウシアキス（Moutsiakis）ら、1992）SDS-PAGEにおいて不安定である可能性が報告されている（ウィルヘルム（Wilhelm）ら、1989；ステトラー・スティーブンソン（Stetler-Stevenson）ら、1989；モール（Moll）ら、1990）。
【００５５】
同じ健康な献血者から得たクエン酸およびEDTA血漿における総TIMP-1
健康な献血者100人からクエン酸およびEDTA血漿試料を同時に採取して、この試験に利用した。これらの試料は、乏血小板血漿として特に採取しなかった。しかし、乏血小板血漿として調製した試料の少数の代表的な試料は、総TIMP-1値に有意差を示さなかった。これらの試料における総TIMP-1レベルのパーセンタイルプロットを図5aに示す。各セットにおける値は、正規分布を近似した。クエン酸血漿TIMP-1レベルは、55.0〜90.3 μg/Lの範囲（10〜90パーセンタイル）であり、平均値は69.2±13.1 μg/Lであった。同様に、EDTA血漿TIMP-1レベルは、58.0〜91.8 μg/Lの範囲であり、平均値は73.5±14.2 μg/Lであった。クエン酸とEDTA血漿の両者に関して、TIMP-1の平均値は、中央値のレベルに近似していた（表１）。対応のある平均値の比較により、クエン酸血漿におけるTIMP-1のレベルは、同じ人からのEDTA血漿レベルより4.34 μg/L（95％CI、2.34〜6.33（p＜0.0001））有意に低いことが示された。しかし、この差は、血漿採取の際の採取手順の変動による可能性がある。EDTA血漿管は、乾燥抗凝固剤を含むのに対し、クエン酸血漿管は少量の液体クエン酸緩衝液を含み、これは小さく多様な希釈の定誤差を生じた（×9/10）。クエン酸血漿におけるTIMP-1レベルは、同じ人からのEDTA血漿のレベルと相関した。図5bに示す直線回帰プロットは、適合線0.93の勾配で回帰係数0.99を示し、おそらくこの小さい希釈誤差を説明している。データセットにスピアマンの非母数階数相関検定を行うと、rho値は0.62でp＜0.0001を生じた。
【００５６】
クエン酸血漿における総TIMP-1レベル
１回目に採取した試料94本と、異なる組の献血者から９ヶ月後に採取した試料100本とを含む、健康な献血者から採取したクエン酸血漿試料全194本をアッセイした。図６は、これらの２つの独立した群において測定したTIMP-1レベルのパーセンタイルプロットを示す。最初の採取からのクエン酸血漿におけるTIMP-1レベルの基準範囲は53.3〜77.7 μg/L（10〜90パーセンタイル）で、平均値は65.4±10.1 μg/Lであり、これは中央値とほぼ類似で（表１）、正規分布を近似した。２回目の採取についてのTIMP-1レベルの平均値は、69.2±13.1 μg/L（基準範囲55.0〜90.3 μg/L）であった。対応のない平均値の比較により、異なる期間に採取した２つの組の試料におけるTIMP-1レベルの差は3.82 μg/Lに過ぎないことが示された（95％CI；0.50〜7.14 μg/L；p＝0.024）。その上、各組のアッセイに含めた対照（n＝８）のあいだに有意差を認めなかった（平均の差0.36 μg/L；95％CI、1.71〜2.44 μg/L；p＝0.69）。クエン酸血漿試料194本全てのTIMP-1レベルの平均値は、67.3±11.8 μg/Lであり、中央値66.1 μg/Lに近似しており、このレベルはまた、正規分布を近似した（基準範囲54.0〜82.7 μg/L）。
【００５７】
〔表１〕  健康献血者からの血液において決定した総TIMP-1レベルの概要
2010266455.tif 000003
*基準範囲は、10〜90パーセンタイルとして定義する。
**これらの試料は同じ献血者から採取した。
【００５８】
献血者の性別と年齢との相関を調べる試験
これらの試験において、各アッセイにおいて測定した対照値のCVは2.7％であった。性別に従って計算したクエン酸血漿試料194本におけるTIMP-1レベルのパーセンタイルを、図７に示す。男性献血者107人のTIMP-1値の平均値は、70.4±12.0 μg/L（中央値、69.4 μg/L）であり、基準範囲は56.2〜86.6 μg/Lであったのに対し、女性献血者87人のTIMP-1値の平均値は63.5±10.5 μg/L（中央値、62.0 μg/L）であり、基準範囲は51.8〜77.0 μg/Lであった。２群にはTIMP-1レベルの平均値において有意差（p＜0.0001）を認め、男性は女性より高いTIMP-1レベルを示した。血漿TIMP-1は年齢と共に増加傾向を認めたが（スピアマンのrho＝0.33、p＝0.0011）、性によっては増加しなかった（女性：スピアマンのrho＝0.29、p＝0.006；男性：スピアマンのrho＝0.35、p＝0.0003）。EDTA血漿において、男性56人のTIMP-1の平均値は、76.9±15.0 μg/L（中央値、75.1 μg/L）であり、範囲は58.8〜96.9 μg/Lであったのに対し、女性献血者44人のTIMP-1レベルの平均値は69.3±11.8 μg/L（中央値：67.9）で、基準範囲は56.1〜85.5 μg/Lであった。この場合も、男性と女性のあいだで有意差を認めた（p＝0.0076、対応のない平均値の比較）。
【００５９】
考察
上記のアッセイによって、ヒト血漿試料における総TIMP-1の正確な定量が可能となる。結合抗原のカイネティック速度アッセイは容易に行うことができ、これによって、速度曲線の自動的な適合が可能となり、これは単一のエンドポイント測定よりかなり信頼できることが証明されている。迅速な遮断剤と緩衝能が高い希釈緩衝液を用いることも、アッセイの再現性に貢献した。これらの要因を全て最終的なアッセイに組み入れると、感度、特異性、安定性、および内部標準物質を良好に回収するという要件が満たされた。
【００６０】
健康な献血者からの血液における定量的研究から、クエン酸とEDTA血漿試料がいずれもTIMP-1測定に適していることが示された。健康な献血者からのTIMP-1に関する他の公表された研究（ユング（Jung）ら、1996；ユング（Jung）ら、1996）と比較すると、本研究のレベルは、非常に狭い範囲に入った。血清での結果を報告した研究もあるが、本研究では、TIMP-1の測定値に対する血小板活性化の様々な関与を防止するために血漿を選択した（クーパー（Cooper）ら、1985）。本研究において用いた血漿試料は、乏血小板血漿として特別に調製されたものではなかったが、研究室において行った試験に基づくと、これは値を変化させないことが示された。献血者の材料は十分に大量で、健康者におけるTIMP-1レベル（EDTAおよびクエン酸の両者）が、男性と共に女性に関しても正規分布に近似したことを証明することが可能であった。TIMP-1レベルの平均値は、EDTAおよびクエン酸血漿の双方について男性では女性より約10％高かった。これに対する1つの説明は、活性化血小板から血液へのTIMP-1の高い放出速度であり、これは、男性集団における血栓塞栓症の発生率がより高い傾向を反映している。男性と女性を個別に検討すると、全集団について認められるように、TIMP-1と年齢とのあいだに弱い相関を認めた（上記参照）。
【００６１】
実施例2
血漿におけるTIMP-1：MMP-9複合体を定量するためのELISAの準備
以下の実施例は、体液中のTIMP-1：MMP-9複合体の濃度を決定するためのアッセイについて記述する。アッセイは、この複合体の正常範囲を確立するために、健康な献血者の血漿試料を用いている（ホルテン・アンダーセン（Holten Andersen）ら、1999）。
【００６２】
材料および方法
TIMP-1：MMP-9複合体のELISA
上記のTIMP-1抗体、MAC-15、およびデンマークのリグス病院（Rigshospitalet）の血液部門において開発されたウサギMMP-9ポリクローナル抗体（ケルドセン（Kjeldsen）ら、1992）を用いて、感度のよい特異的サンドイッチELISAを準備した。MMP-9抗体は、抗原捕獲のために用い、MAC-15は抗原検出のために用いた。ウサギ抗マウスIg/アルカリフォスファターゼ結合体（ダコ社、グロストルップ、デンマーク）によって、キネティック速度アッセイが可能となった（図８）。後者の結合体は、ヒトIgGに対して予め吸収して供給され、このため、血漿試料中のIgGと交叉反応性を示さない。MMP-9抗体は、遊離MMP-9およびTIMP-1と複合体を形成したMMP-9の両者を捕獲するが、MAC-15はTIMP-1のみを認識する。したがって、TIMP-1：MMP-9複合体のみがこの試薬対によって定量された。
【００６３】
採血中およびアッセイ技法中での自然発生のエクスビボTIMP-1：MMP-9複合体形成を防止するために、融解後の血漿試料にプロテアーゼ阻害剤（すなわち、ガラディン、バティマスタット、マリマスタット）を加えた。プロテアーゼ阻害剤を加えることによって、メタロプロテイナーゼの触媒活性の阻害によってインビトロ複合体形成が阻害された。
【００６４】
TIMP-1：MMP-9アッセイは、総TIMP-1アッセイに関して先に記述した方法と類似の方法によって準備および確認した。TIMP-1：MMP-9標準物質は、精製組換え型TIMP-1とMMP-9（APMAを加えて活性化された）との等モル量をPBS中で37℃で１時間インキュベートすることによって調製した。
【００６５】
簡単に説明すると、96ウェルマイクロタイタープレートをウサギポリクローナル抗MMP-9抗血清の0.1 mol/L炭酸緩衝液溶液、pH 9.5の100 μL/ウェルによって４℃で一晩コーティングした。使用前に、アッセイウェルを、燐酸緩衝生理食塩液（PBS）によって1：1に希釈したスーパーブロック溶液200 μL/ウェルによって２回すすいだ後、1 g/Lツイーン20を含むPBS中で５回洗浄した。次にウェルを試料緩衝液で希釈した血漿100 μL/ウェルと共に30℃で１時間インキュベートした。一連の精製TIMP-1：MMP-9標準物質を用いて各プレートを較正した。標準物質は、精製TIMP-1：MMP-9複合体の保存溶液を連続希釈することによって調製した。各プレートには、試料希釈緩衝液のみを含むブランクと、クエン酸血漿プールからなる対照２個を含めた。第一の対照血漿プールを第一の試料として加え、第二の対照を最後の試料として加えた。標準物質、ブランク、対照および試料は全て、アッセイ毎に各プレートに関して１試料あたり３個ずつ実施した。試料をインキュベートして、TIMP-1：MMP-9複合体を結合させた後、ウェルを５回洗浄して、その後MAC-15の試料希釈緩衝液溶液100 μL/ウェルによって30℃で１時間処理した。さらに５回洗浄した後、ウェルを、試料希釈緩衝液で希釈したウサギ抗マウスIg/アルカリフォスファターゼ結合体100 μL/ウェルと共に30℃で１時間インキュベートした。洗浄溶液で５回洗浄して、蒸留水でさらに３回洗浄した後、新しく調製した燐酸p-ニトロフェノール溶液を各ウェルに加えた。プレートを23℃でセレス900Jプレートリーダーに置いて、黄色の発色を自動的にモニターした。空気ブランクに対して値を405 nmで10分ごとに１時間読み取った。キネティカルクIIソフトウェアを用いて、各ウェルの色の形成速度を計算することによってデータを分析し（直線回帰分析）、4-パラメータ適合標準曲線を得て、各血漿試料のTIMP-1：MMP-9濃度を計算した。
【００６６】
回収実験
特異的回収は、TIMP-1：MMP-9複合体を一連のクエン酸、EDTA、またはヘパリン血漿プールに加えることによって決定した。それぞれの場合についての回収は、濃度の関数としてTIMP-1：MMP-9複合体シグナルを表す線の勾配から計算し、100％回収は、TIMP-1：MMP-9複合体を試料希釈緩衝液で希釈した場合に得られた勾配として定義した。
【００６７】
結果
ELISAの実施
各ウェルにおける発色は、これらの実験において測定したTIMP-1：MMP-9複合体の全ての濃度について時間の一次関数であり、自動的に適合させた線の相関係数は典型的に0.9以上であった。4-パラメータ適合の相関係数は、典型的に0.999以上であった。
【００６８】
血漿中で希釈後のTIMP-1：MMP-9複合体の回収
特異的回収は、TIMP-1：MMP-9の増加濃度を血漿プールに加えて、その後特異的シグナルを測定することによって決定した。
【００６９】
血漿TIMP-1：MMP-9の希釈曲線
クエン酸およびEDTA血漿プールの連続希釈液を作製して、アッセイの直線性を決定するために複合体レベルを定量した。クエン酸およびEDTA血漿は全て、希釈の関数としてシグナルの良好な直線性を示した。
【００７０】
実施例3
血漿における遊離TIMP-1レベルを定量するためのELISAの準備
以下の実施例は、体液中の遊離TIMP-1レベルの濃度を決定するアッセイを記述する。アッセイは、遊離TIMP-1の正常範囲を確立するために健康な献血者の血漿試料に適用する。
【００７１】
材料および方法
遊離TIMP-1 ELISA
イギリスのストレンジウェイズ・ラボラトリーズ社が開発したTIMP-1モノクローナルIgG1抗体（MAC-19）（クックスレイ（Cooksley）ら、1990）およびヒツジポリクローナル抗TIMP-1抗体を用いて、感度のよい特異的サンドイッチイムノアッセイを準備した。ヒツジポリクローナル抗TIMP-1抗体は抗原捕獲のために用い、マウスモノクローナルMAC-19は抗原検出のために用いた。ウサギ抗マウスIg/アルカリフォスファターゼ結合体は二次検出試薬であった（図９）。後者の結合体はヒトIgGに対して予め吸収して供給されるため、血漿試料中のIgGと交叉反応性を示さない。MAC-19モノクローナル抗体は、遊離TIMP-1に対して完全に特異的であり、したがって、このアッセイにおいて定量される唯一の型である。
【００７２】
MAC 19がTIMP-1とMMP-9との複合体と反応しないことを調べるために、実施例2に記載のウサギポリクローナル抗MMP-9抗体を抗原捕獲のために用いて、マウスモノクローナル抗体MAC19を抗原検出に用いた。ウサギ抗マウスIg/アルカリフォスファターゼ結合体は二次標識試薬として用いた。標準的なTIMP-1：MMP-9複合体、遊離MMP-9、遊離TIMP-1およびブランク対照をアッセイした。図10は、ポリクローナル抗MMP-9抗体に結合したTIMP-1：MMP-9複合体がMAC 19によって検出されないことを示している。MAC 19をMAC 15に置換して同等の実験を実施した。図11は、この実験の結果を示している。MAC 15は、ポリクローナル抗MMP-9抗体に結合したTIMP-1：MMP-9複合体を検出することが認められる。
【００７３】
採血中およびアッセイ技法中でのエクスビボTIMP-1：MMP-9複合体形成を防止するために、融解後の血漿試料にプロテアーゼ阻害剤（すなわち、ガラディン、バティマスタット、マリマスタット）を加えた。プロテアーゼ阻害剤を加えること、メタロプロテイナーゼの触媒活性の阻害によってインビトロ複合体形成が阻害された。
【００７４】
96ウェルマイクロタイタープレートを、ポリクローナルヒツジ抗TIMP-1（４ mg/L）の0.1 モル/L炭酸緩衝液溶液、pH 9.5の100 μL/ウェルによって37℃で１時間コーティングした。次に、アッセイウェルを、燐酸緩衝生理食塩液（PBS）によって1：1に希釈したスーパーブロック溶液200 μL/ウェルによって、ウェルを２回すすいだ。マイクロタイタープレートは-20℃で14日間まで保存した。使用当日、プレートを室温で融解して、1 g/Lツイーンを含むPBSで５回洗浄した。次に、ウェルを、50 mol/L燐酸、pH 7.2、0.1 mol/L NaCl、10 g/Lウシ血清アルブミン（分画V、ベーリンガー・マンハイム社、ペングバーグ、ドイツ）および1 g/Lツイーン20からなる同じ試料緩衝液で作製した血漿の25倍希釈液100 μL/ウェルを１試料あたり３個ずつ加えて30℃で１時間インキュベートした。標準物質は、遊離精製TIMP-1の保存液を連続希釈することによって調製し、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、および0.156 μg/Lの濃度を得た。各プレートには、試料希釈緩衝液のみを含むブランクおよび25倍希釈したクエン酸血漿プールから調製した対照２個を含めた。プレートに最初の試料として第一の対照を加えて、第二の対照を最後として加えた。標準物質、ブランク、対照、および試料は全て、アッセイ毎に各プレートについて１試料あたりウェル３個で行った。TIMP-1が結合した後、ウェルを５回洗浄してから、精製マウスモノクローナル抗TIMP MAC-19（0.5 mg/L）の試料希釈緩衝液溶液の100 μL/ウェルによって30℃で１時間処理した。さらに５回洗浄した後、ウェルを試料希釈緩衝液で2000倍希釈したウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ig）/アルカリフォスファターゼ結合体100 μL/ウェルと共に30℃で１時間インキュベートした。洗浄液によって５回洗浄して、蒸留水で３回洗浄した後、新たに調製した燐酸p-ニトロフェノール（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）基質溶液（0.1 mol/Lトリス塩酸、pH 9.5、0.1 mol/L NaCl、５ mmol/L MgCl2において1.7 g/L）100 μLを各ウェルに加えて、プレートをセレス900Jプレートリーダー（バイオテックインストルメンツ、ウィノースキー、バーモント州）に23℃で置いた。黄色の発色を自動的にモニターして、値は、405 nmで空気ブランクに対して10分ごとに１時間読み取った。キネティカルクIIソフトウェアを用いて各ウェルの色の形成速度を計算することによってデータを分析し（直線回帰分析）、４パラメータ適合標準曲線を作製して、各血漿試料の遊離TIMP-1濃度を計算した。
【００７５】
希釈曲線と回収実験
これらの実験は、本質的に、実施例1に記載したとおりに実施したが、遊離TIMP-1を検出するためにMAC 15の代わりにMAC 19を用いた（上記のように）。
【００７６】
健康な献血者
献血者108人の血漿試料を得た。献血者は、自発的に献血し、全員、見かけ上健康であった。インフォームドコンセントを献血者全員から得て、地域の倫理委員会から許可を得た。採血と取り扱いは、実施例1に記載の通りに実施した。
【００７７】
結果
ELISAの実施
各ウェルにおける発色は、これらの実験において測定した遊離TIMP-1の全ての濃度に関して時間の一次関数であり、自動的に適合させた線の相関係数は典型的に0.9より良好であった。４パラメータ適合の相関係数は典型的に0.999以上であった。対照血漿プールの１試料あたり３個ずつの測定24回のアッセイ間変動は9.6％であった。
【００７８】
血漿で希釈後の組換え型TIMP-1の回収
特異的シグナル回収は、精製TIMP-1標準物質の増加濃度を血漿プールに加えた後にELISAシグナルを測定することによって決定した。希釈したクエン酸血漿プールにおいて、105％の回収が得られたが、希釈したEDTA血漿プールでは96％の回収が得られた（図12）。
【００７９】
遊離血漿TIMP-1シグナルの希釈曲線
クエン酸およびEDTA血漿プールの連続希釈液を作製して、遊離TIMP-1レベルをELISAシグナルにおける直線的な減少を調べるためにアッセイした。クエン酸およびEDTA血漿は全て、希釈の関数としてシグナルの良好な直線性を示した。
【００８０】
健康な献血者
遊離TIMP-1は全ての血漿試料において測定可能であった。遊離TIMP-1濃度の中央値は70.9 μg/Lであった（範囲：32.3〜169.7 μg/L）。
【００８１】
考察
このアッセイは血漿中の遊離TIMP-1レベルを直接測定する。遊離TIMP-1レベルを、健康な献血者108人の総TIMP-1レベルと比較すると（後者は実施例1において記述したアッセイによって測定した）、相関係数0.46（Rho、スピアマン階数相関検定、p＜0.0001）が得られた。
【００８２】
実施例4
結腸直腸癌患者における総TIMP-1の診断価値
結腸直腸癌患者591人（結腸癌338人と直腸癌253人）の血漿、および年齢と性別をマッチさせた健康な人108人の血漿における総TIMP-1レベルを、実施例1に記載のTIMP-1アッセイによって測定した。TIMP-1値は、標準的な生物統計パラメータを用いて分析および比較した。
【００８３】
材料および方法
患者
病理学的に確認された結腸直腸癌に対して予定手術を受ける患者591人を試験に含めた。ヘルシンキ宣言に従って患者全員からインフォームドコンセントを術前に得て血液試料を採取して、デンマークのビドブル（Hvidovre）病院の地域倫理委員会の許可を得た。患者は全員、病理学的に確認された結腸または直腸の腺癌を有した。患者59人（10％）はデュークスのA期疾患であると分類され、219人（37％）はデュークスのB期、170人（29％）はデュークスのC期、および143人（24％）はデュークスのD期であると分類されることが判明した。腫瘍338例が結腸癌であり、253例が直腸癌であった。年齢、性別および術後の生存期間のような臨床データを収集した。患者の年齢の中央値は69歳（範囲33〜90歳）であり、患者コホートは女性237人と男性354人であった。
【００８４】
第二の患者コホートをプロスペクティブに募集した。このコホートは、直腸癌21人と結腸癌患者43人で構成された。デュークスのA期患者は11人、デュークスのB期患者は27人、デュークスのC期患者は14人、およびデュークスのD期患者は13人であった。
【００８５】
健康献血者
実施例3に記載の同じ献血者集団。
【００８６】
血液試料
血液試料（５ ml）を手術当日に患者全員から術前に採取した。有効なTIMP-1測定を確保するために、先に記述したプロトコールに従って末梢血を最小のうっ血によって採取して、EDTA抗凝固剤の入った試験管（ベクトン・ディッキンソン社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）に採取した。
【００８７】
TIMP-1 ELISA
TIMP-1レベルは、実施例1に記載したアッセイを用いて、EDTA血漿試料において測定した。
【００８８】
結果
血漿中の総TIMP-1レベル
キネティック速度アッセイを用いて、総TIMP-1レベルを全ての患者および健康献血者血漿試料において決定した。全ての血漿試料は、TIMP-1の測定可能なレベルを有し、総TIMP-1の中央値は結腸直腸癌患者591人について141.1 μg/L（範囲、53.7〜788.7 μg/L）であった。結腸および直腸癌について階層化すると、中央値は結腸について158.6 μg/L（範囲：53.7〜788.7 μg/L）および直腸癌について126.3 μg/L（範囲；64.1〜640 μg/L）であった。患者の材料をデュークスの段階に従って階層化すると、デュークスAは最低であり、デュークスDは最高であった（クルスカル・ワリス検定、p＜0.0001）。しかし、最高のTIMP-1レベルは、進行疾患に限定されず、デュークスA〜C疾患患者では、総血漿TIMP-1レベルに有意差を認めなかった。血漿TIMP-1と年齢とのあいだには比較的弱い相関を認めた（r＝0.35；p＜0.0001）。男性と女性のTIMP-1レベルに有意差を認めなかった（p＝0.97）。
【００８９】
健康献血者の血漿におけるTIMP-1の中央値は88.6 μg/Lであり、範囲は51.0〜156.2 μg/Lであった。結腸直腸癌患者と健康な献血者では、総血漿TIMP-1値に非常に統計学的な差を認めた。
【００９０】
結腸直腸癌患者64人の総TIMP-1値の中央値は138.2 μg/L（範囲：80.7〜790.6 μg/L）であった。患者を結腸癌と直腸癌に階層化すると、総TIMP-1値の中央値は結腸癌に関して152.2 μg/L（範囲：80.7〜626.2 μg/L）、および直腸癌に関して133.6 μg/L（範囲84.3〜790.6 μg/L）であった。結腸癌患者と直腸癌患者とをそれぞれ健康献血者と比較すると総血漿TIMP-1値に非常に統計学的な差を認めた。
【００９１】
総TIMP-1の診断的価値
健康な献血者と結腸直腸癌患者591人からの血漿において測定した総TIMP-1レベルを用いて、受信者動作特性（ROC）曲線を作製して、総TIMP-1の診断的価値を評価した。図13に示すように、ROC曲線は当初急勾配であり、このことは、結腸直腸癌のマーカーとしての総TIMP-1の高い感度と特異性を示している。結腸癌では直腸癌よりAUCが大きいように思われる。図14は、初期の結腸直腸癌、すなわちデュークスのA期またはB期疾患を有する患者のみを含む類似のROC曲線を示す。初期段階（デュークスのA期およびB期）の右側の結腸癌に関するROC曲線も示す。
【００９２】
健康な献血者と結腸直腸癌患者64人の第二のコホートの血漿における総TIMP-1レベルを用いて、ROC曲線を再度作製して、TIMP-1の診断的価値を確認した。図15に示すように、この場合も曲線は当初急勾配であり、このことは、結腸直腸癌のマーカーとしての総TIMP-1の高い感度と特異性を示している。
【００９３】
自動イムノアッセイにおいて異なる抗体（抗TIMP-1 11E/C6、抗TIMP-1 RRU-T6）（これらの抗体を産生する２つのクローンはATTCに2000年４月10日に寄託された）を用いた、健康な献血者180人と結腸直腸癌患者20人に関するさらなる研究は、これまでの臨床結果をさらに確証した。その上、自動アッセイによって得られた絶対値は、実施例1に記載したアッセイによって得られたものと高い程度の相関を示した（r＝0.9）。
【００９４】
考察
これらのデータは、血漿中の総TIMP-1の測定が、結腸直腸癌を有するリスクが高い患者を特定するために役立つスクリーニング技法として用いることができることを示唆している。特に、総TIMP-1は、より進行疾患を有する患者を同定する場合と共に初期癌（デュークスのA＋B期）を有する患者を特定するために有効であった。同様に、総TIMP-1は、初期段階の患者、右側の結腸癌、従来の診断技法では難しい診断を特定するために、さらにより有効であった。右側の結腸癌は、標準的な結腸癌スクリーニング方法である柔軟なS字結腸鏡によって可視化することができない。これは、左側の病変より潜行的に発現し、臨床症状は後期疾患になって初めて発現する。右側の結腸癌の初期診断は、この疾患の死亡率を減少させる可能性がある。
【００９５】
その上、より小さいプロスペクティブ臨床試験は、より大きいレトロスペクティブ試験の結果を確証し、さらに、結腸直腸癌を有する患者における総TIMP-1の診断的価値を確認した。
【００９６】
実施例5
炎症性腸疾患を有する患者の血漿における総TIMP-1の定量
患者
IBD患者（炎症性腸疾患）46人を試験に含めた。患者22人は、潰瘍性大腸炎であり、患者24人はクローン病であった。健康な献血者および結腸直腸癌患者からのEDTA血漿中の総TIMP-1レベル（実施例3および４）を比較のために含めた。
【００９７】
総TIMP-1値
実施例1に記載のサンドイッチアッセイを用いてEDTA血漿試料における総TIMP-1レベルを測定した。
【００９８】
結果
測定した総TIMP-1値を表２に示す。
【００９９】
〔表２〕
2010266455.tif 000004
【０１００】
IBD患者と健康な献血者の総TIMP-1値を比較したところ（マン・ホイットニー検定；p＝0.45）、有意差を認めなかった。IBD患者と結腸直腸癌患者591人の総血漿TIMP-1レベルには非常に有意差を認めた（マン・ホイットニー検定；p＜0.0001）。これらの結果のグラフを図16に示す。
【０１０１】
考察
これらの結果は、結腸直腸癌患者は、IBD患者より有意に高い総TIMP-1血漿レベルを有することを証明している。その上、IBD患者は健康献血者において認められるレベルと同等の総TIMP-1レベルを示し、このことは血漿総TIMP-1を、胃腸管の非悪性疾患と悪性疾患とを識別するために、非常に感度がよく特異的なマーカーとして用いることができることを示している。
【０１０２】
実施例6
結腸直腸癌患者におけるCEAと組み合わせた総TIMP-1の診断的価値
結腸直腸癌患者591人（結腸癌338人と直腸癌253人）および年齢と性別をマッチさせた健康者108人の血漿における総TIMP-1を、実施例1に記載のTIMP-1アッセイを用いて測定した。さらに、CEAは市販の化学発光CEA EIAキット（イムライトCEA、DPC（登録商標）、ロサンゼルス、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて、対応する患者および献血者の血清試料において測定した。健康な献血者および癌患者からのTIMP-1およびCEA値は、ロジスティック回帰分析によって組み合わせて、ROC曲線を作製した。
【０１０３】
結果
総TIMP-1とCEAの診断的価値
健康な献血者108人を含めて、結腸直腸癌患者591人におけるCEAの感度および特異性を計算すると、98％特異性を提供するカットオフの感度は35％であった。患者を結腸または直腸癌に階層化すると、感度は同じレベルの特異性でそれぞれ、37％および33％であった。右側の結腸癌患者のみを含めると、感度は45％に増加することが図17において示された。
【０１０４】
実施例4からの総TIMP-1値をCEAと共に含めると、マーカーの組合せの感度は、ロジスティック回帰分析によって52％であることが判明した。血清中のCEA測定を加えることによって得られたさらなる診断感度は、非常に有意である（p＜0.0001）。患者のコホートを結腸癌と直腸癌に階層化すると、感度は98％特異性レベルでそれぞれ、61％と39％であった。右側の結腸癌患者のみを含めると、感度は74％であった。これらの結果のグラフを図17に示す。
【０１０５】
考察
これらのデータは、さらなるマーカーを加えることによって、98％という高い特異性を維持しながら、総TIMP-1の診断感度における改善を得ることができることを示している。このように、CEAとTIMP-1とを組み合わせると、結腸直腸癌を有するリスクが高い患者を特定するためのスクリーニング技法として有用である。特に、この組合せは、初期段階の癌（デュークスA＋B期）の患者を特定するために有効であった。同様に、この組合せは、初期段階の右側の結腸癌を有する患者を特定するために非常に有効であった。
【０１０６】
実施例7
結腸直腸癌患者における血漿の遊離TIMP-1レベルの診断的価値の欠如
【０１０７】
材料および方法
結腸直腸癌患者64人（結腸癌43人と直腸癌21人）からの血漿および年齢をマッチさせた健康な人108人の血漿における遊離TIMP-1レベルを、実施例3に記載のTIMP-1アッセイを用いて測定した。遊離TIMP-1レベルは、標準的な生物統計パラメータを用いて分析および比較した。
【０１０８】
結果
血漿中の遊離TIMP-1レベル
実施例3に記載したカイネティック速度ELISAを用いて、遊離TIMP-1レベルを全ての患者および健康な献血者血漿試料において測定した。試料は全て、遊離TIMP-1の測定可能なレベルを有し、遊離TIMP-1レベルの中央値は、結腸直腸癌患者に関して82.0 μg/L（範囲：44.7〜424.0 μg/L）であった。健康な献血者の血漿中の遊離TIMP-1レベルの中央値は70.9 μg/Lであり、範囲は32.3〜169.7 μg/Lであった。デュークスのA〜C期疾患患者では遊離TIMP-1レベルに有意差を認めなかったが、デュークスのD期患者は、シュークスのAおよびB期疾患患者と比較して遊離血漿TIMP-1レベルが有意に上昇していた。これらの結腸直腸癌患者64人の血漿における総TIMP-1値を遊離TIMP-1値と比較すると、相関係数0.91（Rho、スピアマン階数相関検定、p＜0.0001）を認めた。
【０１０９】
遊離TIMP-1の診断的価値の欠如
図18は、遊離TIMP-1の血漿での測定から生じたROC曲線を示す。遊離TIMP-1の診断成績を決定する場合のAUCは0.61である。
【０１１０】
考察
これらのデータは、遊離TIMP-1単独では、結腸直腸癌を有するリスクが高い患者を特定するためのスクリーニングマーカーとして有用でない可能性があることを示している。
【０１１１】
実施例8
結腸直腸癌患者におけるTIMP-1：MMP-9複合体測定の診断的価値
結腸直腸癌患者の血漿および年齢と性別をマッチさせた健康な人の血漿におけるTIMP-1：MMP-9複合体レベルは、実施例2に記載のTIMP-1：MMP-9アッセイを用いて測定することができる。健康な献血者および癌患者からのTIMP-1：MMP-9複合体の値を比較して、診断的価値を決定した。
【０１１２】
遊離、総、およびTIMP-1：MMP-9複合体レベルの測定値を用いて、比または分画の診断値を計算することができる。さらに、他の分子、例えば、血清CEAをこれらの計算に加えて、全体的な診断価値を増加させるために数学的アルゴリズムを作製することができる。
【０１１３】
実施例9
結腸直腸癌患者における血漿総TIMP-1および血漿遊離TIMP-1の組合せの診断的価値
結腸直腸癌患者64人および年齢と性別をマッチさせた健康な人108人からの血漿における総TIMP-1レベルを、実施例1に記載のTIMP-1アッセイによって測を定した。実施例3に記載したアッセイを用いて、血漿の遊離TIMP-1レベル、上記のように同じ人において測定した。総および遊離TIMP-1値は、ロジスティック回帰分析を用いて分析および比較した。
【０１１４】
材料および方法
患者
病理学的に確認された結腸直腸癌に対して予定手術を受ける患者64人を試験に含めた。コホートは直腸癌患者21人および結腸癌患者43人で構成された。患者11人はデュークスのA期疾患であると分類され、27人はデュークスのB期、14人はデュークスのC期、および13人はデュークスのD期であった。ヘルシンキ宣言に従って患者全員からインフォームドコンセントを得て術前に血液試料を採取して、デンマークのビドブル（Hvidovre）病院の地域倫理委員会の許可を得た。患者は全員、病理学的に確認された結腸または直腸の腺癌を有した。年齢、性別および術後の生存期間のような臨床データを収集した。
【０１１５】
健康献血者
実施例3に記載の同じ献血者集団。
【０１１６】
血液試料
血液試料（５ ml）を手術当日に患者全員から術前に採取した。有効なTIMP-1測定を確保するために、最小のうっ血によって末梢血を採取して、先に記述したプロトコールに従って（実施例1）、EDTA抗凝固剤の入った試験管（ベクトン・ディッキンソン、マウンテンビュー、カリフォルニア州）に採取した。
【０１１７】
総および遊離TIMP-1血漿測定値
TIMP-1レベルは、実施例1および実施例3に記載したアッセイを用いてEDTA血漿試料において測定した。
【０１１８】
結果
血漿中のTIMP-1レベル
これらの結腸直腸癌患者64人における総TIMP-1レベルを実施例4に記載し、これらの患者における遊離TIMP-1レベルを実施例7に記載する。
【０１１９】
健康な献血者および結腸直腸癌患者64人の血漿における総および遊離TIMP-1レベルを用いて、これらのTIMP-1型のそれぞれに関してROC曲線を作製した。得られた総TIMP-1値は、結腸直腸癌患者における総TIMP-1測定の診断値を確認する。図15に示すように、曲線はこの場合も当初急勾配であり、結腸直腸癌のマーカーとしての総TIMP-1の高い感度と特異性を示している。遊離TIMP-1のROC曲線は実施例7に考察した。
【０１２０】
この患者集団における総TIMP-1の対応するデータはAUC 0.88を生じた。しかし、遊離および総TIMP-1（AUC＝0.94）を組み合わせると、診断的価値の増加が得られた。この増加は、統計学的に非常に有意であり、p＜0.0001、同じ分析において遊離および総TIMP-1の両者を用いると重要な態様が価値があることを示す。
【０１２１】
考察
これらのデータは、総TIMP-1および遊離TIMP-1測定の組合せが、結腸直腸癌を有するリスクが高い患者を特定するために役立つスクリーニング技法として用いることができることを示唆している。
【０１２２】
本実施例に記述の方法と類似のように、遊離と総TIMP-1値のあいだのその他の比および/または組合せまたは数学的順列を、診断目的のために計算して用いることができる。
【０１２３】
総および遊離TIMP-1、複合体の総濃度（総TIMP-1-遊離TIMP-1）、および/またはTIMP-1：MMP-9の濃度を含むTIMP-1の全ての様々な型における関係の計算は、管理において、特に、非悪性疾患患者と癌患者を区別する診断において有用となる可能性がある。
【０１２４】
実施例10
原発性（I期およびII期）乳癌患者における総TIMP-1測定の診断値の欠如
【０１２５】
材料および方法
実施例1に記載の総TIMP-1アッセイを用いて、原発性乳癌患者322人の術前の血漿試料を総TIMP-1含有量に関して分析した。さらに、健康な献血者108人の血漿試料を評価した。乳癌患者に関する総TIMP-1の中央値は88.3 μg/L（範囲：45.5〜289.3 μg/L）であったのに対し、健康献血者の総TIMP-1レベルの中央値は88.9 μg/L（範囲：51.0〜156.2 μg/L）であった。２群では総TIMP-1血漿レベルに統計学的な有意差を認めなかった（マン・ホイットニー検定、p＝0.87）。図19は、上記のデータを含むROC曲線を示す。
【０１２６】
考察
これらのデータは、原発性乳癌患者が健康な献血者とは有意差を示さない総TIMP-1値を有することを証明している。このように、これらのデータは、結腸直腸癌患者の診断におけるTIMP-1測定の特異性の根拠となる。
【０１２７】
実施例11
転移性（IV期）乳癌患者における血漿総TIMP-1の診断的価値
本実施例は、IV期乳癌患者からの総TIMP-1測定について記述する。
【０１２８】
材料および方法
患者および献血者
血液は、デンマーク、コペンハーゲンのヘルレフ大学病院の腫瘍学部門でIV期乳癌患者19人（年齢45〜70歳）および健康な女性献血者87人から採取した（実施例1）。
【０１２９】
総TIMP-1血漿レベル
総TIMP-1レベルは、実施例1に記載のアッセイを用いて全てのEDTA血漿試料において測定した。
【０１３０】
結果
進行乳癌患者からの血漿における総TIMP-1
総TIMP-1は、VI期疾患を有する乳癌患者19人のEDTA血漿試料において測定した。これらのレベルを健康な女性献血者87人の総TIMP-1レベルと比較した。乳癌患者19人において測定した総TIMP-1レベルは、292±331 μg/L（中央値：236 μg/L）であるのに対し、健康な女性献血者87人では総TIMP-1レベルの平均値は63.5±10.5 μg/L（中央値：62.0 μg/L）であった。ワルド・ウォルフォビッツの連検定は、患者の総TIMP-1レベルと健康な献血者のレベルとのあいだに非常に有意な差（p＜0.0001）を示した。図20は、乳癌患者19人からの総TIMP-1レベルおよび健康な女性献血者87人の血漿において認められるTIMP-1レベルのパーセンタイルプロットを示す。
【０１３１】
考察
これらのデータは、血漿TIMP-1測定を、疾患の再発に関して乳癌患者をモニターするために用いることができることを示している。
【０１３２】
実施例12
結腸直腸癌患者におけるTIMP-2測定の診断的価値
材料および方法
TIMP-2レベルを、結腸直腸癌患者64人（結腸癌43人および直腸癌21人）の血漿および年齢をマッチさせた健康な人108人の血漿において施設内TIMP-2アッセイによって測定した。健康なドナーおよび癌患者の測定したTIMP-2値を比較した。
【０１３３】
結果
TIMP-2は、全ての試料において測定可能であった。健康な献血者と結腸直腸癌患者では、TIMP-2レベルに有意差を認めなかった。
【０１３４】
考察
これらのデータは、結腸直腸癌患者の診断におけるTIMP-1測定の特異性の根拠となり、結腸直腸癌の早期診断に役立てるためのTIMP-1の独自の価値を支持する。
【０１３５】
参照
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2010266455.tif 000007
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月5日(2010.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性（primary）乳癌について治療されている患者が転移乳癌を有する可能性があるか否かを決定する方法であって、
血漿試料中のＴＩＭＰ−１の総濃度を表す第一のパラメータを決定する段階；
パラメータが識別値またはそれ以上の値である場合、個人が転移癌を有する可能性が高いことを示す段階；及び
パラメータが識別値またはそれ以上の値でない場合、個人が転移癌を有する可能性が低いことを示す段階を含み、
該識別値が、健康な対照集団及び転移癌であることが既知である集団の双方における該少なくとも１つの第一のパラメータを測定することにより決定され、それによって、既定の特異性または既定の感度をもつ転移癌集団を同定する識別値を決定する方法。
【請求項２】
組み合わせる段階が、ロジスティック回帰分析によって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第二のパラメータが任意の型のＴＩＭＰ−１と異なるさらなるマーカーの濃度を表す、個人由来の血漿試料中の少なくとも１つの第二のパラメータを決定する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
複合パラメータをもたらし、かつ複合パラメータが識別値またはそれ以上の値である場合、個人が転移癌を有する可能性が高いことを示し、複合パラメータが識別値またはそれ以上の値でない場合、個人が転移癌を有する可能性が低いことを示すように、血漿試料中のＴＩＭＰ−１濃度を表す第一のパラメータ、及び任意の型のＴＩＭＰ−１と異なる少なくとも１つの第二のパラメータとを組み合わせた、請求項３記載の方法。
【請求項５】
組み合わせる段階がロジスティック回帰分析によって行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
複合パラメータの識別値が、健康な対照集団及び転移癌であることが既知である集団の双方における該複合パラメータを測定することによって決定され、それによって、既定の特異性または既定の感度をもつ転移癌集団を同定する識別値を決定する、請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
測定された少なくとも１つの第二のパラメータが腫瘍マーカーの濃度を表すパラメータである、請求項３〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
腫瘍マーカーがＣＥＡ、可溶性ｕ−ＰＡＲ、カテプシンＢ、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、ＣＡ１５−３、およびＹＫＬ−４０からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
測定された少なくとも１つの第二のパラメータがＣＥＡの濃度である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
原発癌の治療後に、癌患者のモニタリングの一部として一定の間隔でいくつかの時点で測定が飛び飛びに行われる、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。