(57)【要約】【課題】副作用がなく安全で、血圧低下作用を有し、医薬品や食品として摂取することができる血圧低下作用を有する成分を提供すること【解決手段】Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ、Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒのいずれか１種以上を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤である。【選択図】  図２
2010024165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（i）ないし（xiii）のアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩のいずれか１種以上を有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
（i）Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ
（ii）Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ
（iii）Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
（iv）Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
（v）Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ
（vi）Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ
（vii）Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
（viii）Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ
（ix）Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
（x）Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
（xi）Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
（xii）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
（xiii）Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
【請求項２】
オキアミタンパク質の蛋白質分解酵素による分解物からなる請求項１のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
蛋白質分解酵素がサーモライシンである請求項２のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項４】
請求項１ないし３いずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分とする血圧降下剤。
【請求項５】
請求項１ないし３いずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する高血圧の予防及び／又は治療に用いる機能性食品。
【請求項６】
高血圧症の予防及び／又は改善に有効であることを表示した食品である請求項５の機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、血圧低下作用を有するペプチドを含有する組成物、その組成物を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤、およびその組成物を有効成分とする血圧低下剤および高血圧症の予防・改善に用いることのできる機能性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の血圧調節はレニンーアンギオテンシン−アルドステロン（RAA）系、カリクレイン−キニン系、及びプロスタグランジン合成系等が相補的に関与していることが知られている。中でもRAA系は体液系での昇圧調節の中心的役割を担っているとされている。すなわち、肝臓で産生されたアンギオテンシノーゲンは腎由来の酵素レニンによって血中内で10アミノ酸残基のアンギオテンシン−Iに分解され、次いで主に肺に存在するアンギオテンシン−II変換酵素（ACE）の作用により8アミノ酸残基のアンギオテンシン−IIに変換される。アンギオテンシン−IIは生体内において最も強力な昇圧物質であり、血管平滑筋を収縮させる直接的昇圧作用を有しているだけでなく、副腎でのアルドステロン分泌を刺激し、ナトリウムや水の貯留量増大を引き起こし間接的な血圧上昇にも関与する。従って、RAA系の亢進阻害が血圧上昇抑制に有効であることが臨床的に知られており、薬物療法的にはカプトプリル等のACE阻害剤、あるいはロサルタン等のアンギオテンシン−IIレセプターアンタゴニストの使用が有効である。
近年、食品成分をターゲットとしたACE阻害性物質の研究が進み、種々のタンパク質由来ペプチドが有効なACE阻害活性、更には血圧降下作用を示すことが知られている（特許文献１−５等）。
【０００３】
【特許文献１】特開平３−８１２９１号
【特許文献２】特開平５−２７１２９７号
【特許文献３】特開２００５−１４５８２７号
【特許文献４】特開２００８−３７７６６号
【特許文献５】特開２００１−１１２４７０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、副作用がなく安全で、血圧低下作用を有し、医薬品や食品として摂取することができる血圧低下成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
各種タンパク質由来のペプチドにアンジオテンシン変換酵素阻害活性があることが知られている。本出願人は、先にオキアミから得たトリペプチド（Leu-Lys-Tyr）がアンジオテンシンＩ転換酵素（ACE）阻害活性を有することを見出している（特許文献１）。本発明はさらに有効なACE阻害剤を見出すため、オキアミを各種分解酵素で分解し、それらに含まれるペプチドを検討し、本願発明を完成させた。
【０００６】
本発明は、（１）〜（３）のアンジオテンシン変換酵素阻害剤、及び、（４）〜（６）の血圧降下剤、機能性食品を要旨とする。
（１）下記（i）ないし（xiii）のアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩のいずれか１種以上を有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
（i）Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ
（ii）Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ
（iii）Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
（iv）Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
（v）Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ
（vi）Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ
（vii）Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
（viii）Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ
（ix）Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
（x）Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
（xi）Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
（xii）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
（xiii）Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
【０００７】
（２）オキアミタンパク質の蛋白質分解酵素による分解物からなる（１）のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
（３）蛋白質分解酵素がサーモライシンである（２）のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【０００８】
（４）（１）ないし（３）いずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分とする血圧降下剤。
（５）（１）ないし（３）いずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する機能性食品。
（６）高血圧症の予防・改善に有効であることを表示した食品である（５）の機能性食品。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のペプチドはアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、経口投与により血圧低下作用を有するので、経口投与で高血圧の予防、治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明においてオキアミとは資源量が豊富な南極オキアミ（Euphausia pacifica）が好ましいが、その他のオキアミでも同様に使用できる。本発明の活性成分は、これらオキアミのタンパク質をタンパク質分解酵素で分解したペプチドである。
本発明のオキアミタンパク質の酵素分解物は、オキアミを酵素処理に適するように前処理したうえで、蛋白質分解酵素処理しペプチドを生成させ、これを必要に応じて、分離、濾過、濃縮、殺菌処理することによって得ることができる。
【００１１】
本発明の組成物はオキアミを原料として製造するものであるが、頭や殻がついたままでも、頭や殻を除去したものでもどちらでもかまわない。処理しやすいのは頭や殻を除去した剥き身である。剥き身であればそのまま酵素処理にかけることができる。頭や殻付きの場合でも、そのままあるいは裁断して酵素処理することができる。好ましくはホモジナイザーなどで裁断すると効率よく酵素処理することができる。酵素処理後、分解しなかった殻などを濾過などにより除去する。
【００１２】
酵素処理は、原料重量に対して１／２量〜２０倍量、好ましくは等量〜１０倍量の加水を行った後、アンモニア水、水酸化ナトリウム（カリウム）水溶液等アルカリ剤を加えて、使用する蛋白分解酵素の適値にｐＨを調整し、温度も酵素適温（使用酵素によって異なるが、２０〜６５℃、室温でも十分に反応する）に加温し、蛋白分解酵素を加えて３０分〜３０時間（好ましくは５〜２０時間）処理する。
【００１３】
蛋白分解酵素としては、中性又はアルカリ性条件下で蛋白質を分解し得る酵素であればすべての酵素が単独で又は混合して使用し得る。その起源は、動植物のほかに微生物に求めることができ、ペプシン、レニン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメレインのほか、細菌プロテアーゼ、糸状菌プロテアーゼ、放線菌プロテアーゼ等も広く利用できる。これらの酵素は、通常、市販されているものが使用されるが、未精製の酵素、酵素を含有した培養液、麹といった固体又は液体の酵素含有物も、目的により必要に応じて使用することができる。酵素の添加量としては０．１％〜５．０％程度でよい。
好ましい蛋白分解酵素としては、Aspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus melleus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus stearothermophilus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Rhizopus oryzae属菌株由来ペプチダーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来ペプチダーゼなどが例示される。特に好ましいのは、Bacillus stearothermophilus属菌株由来プロテアーゼであるサーモライシンである。
【００１４】
酵素処理後、必要あれば中和処理を行った後、７０℃（好適には８０℃）以上の温度に２〜６０分間（好適には５〜３０分間）保持し、酵素を失活させるとともに後に行う分離を良好ならしめる。加熱失活処理後、ハイブロスクリーン等による濾過によって粗分離し、必要によりジェクター処理した後、遠心分離処理して、浮遊物、沈殿物を除去する。そのままでもアンジオテンシン転換酵素阻害活性を有するのでそのまま用いてもよいが、原料由来の独特の味や臭いがあるので、使用目的によってはさらに濾過、活性炭処理などにより、脱臭、脱色、精製する。殺菌、噴霧乾燥、凍結乾燥なども必要に応じて行う。
【００１５】
本発明のオキアミタンパク質の蛋白質酵素分解物を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤は実施例に示すようにすぐれたＡＣＥ阻害活性を有することが確認されたので、ＡＣＥ阻害剤、あるいは、血圧降下を目的とした医薬品、健康食品、特に特定保健用食品としても使用することができる。食品として使用する場合には、酵素分解物をそのまま添加したり、他の食品ないしは食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。常法にしたがい、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤とすることができる。
本発明のアンジオテンシン転換酵素阻害剤であるオキアミタンパク質酵素分解物の使用のめやすは、約０．１〜６０００ｍｇ／日であり、１日に１〜２回経口投与するのが好ましい。また必要ある場合には、他の薬剤との併用も可能である。本発明のオキアミタンパク質の蛋白質酵素分解物は食品として長い食経験のあるオキアミの酵素分解物であり、安全性が高く、安心して使用できる。
【００１６】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
オキアミタンパク質由来ペプチド粉末の製造
オキアミ剥き身１ｋｇ（日本水産株式会社製）に等量の水を加え、70℃になるまで加温した後に、オキアミ剥き身に対して重量比0.15%となるようにサモアーゼPC-10F（天野エンザイム社製）を加え、攪拌しながら70℃で20時間の酵素反応を行った。酵素反応の後に100℃で30分間保温し酵素を失活させた。遠心分離及び濾過による残渣の除去後、エバポレーターを用いた濃縮を行い、スプレードライを用いてペプチド乾燥粉末体を得た（７５ｇ）（本発明品）。ペプチド粉末は使用するまで-20℃で保存した。
【００１８】
ゲル電気泳動分析
得られたオキアミタンパク質由来ペプチドの分子量分布を調べるために、SMART system（GE healthcare bioscience）上で、Superdex Peptide PC 3.2/30ゲル濾過カラム（GE
healthcare bioscience）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行った。溶媒には、150 mM NaCl、6 Mグアニジン塩酸塩を含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.4）を用いて行い、サイズスタンダードとして、cytochrome C, aprotinin, gastrin I, bradykinin, varyl-tyrosine及びグリシンを用いて行った。
ゲル濾過クロマトグラフィーの結果、オキアミタンパク質由来ペプチドは、分子量10,000以下に分布していることが確認された（図1）。これはタンパク質が十分に分解されている状態である。
【実施例２】
【００１９】
アンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害活性の測定
ウサギ肺由来ACE、ACEの基質であるN-[3-(Furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly（FAPGG）、及び陽性対照として用いたバリルチロシンはSigma社製を用いた。ACE阻害活性の測定はPetersonらの方法（Anal. Biochem. 125; 420-426 (1982)）を改変して行った。すなわち、18 μLの250 mM HEPES pH 8.3、1.5 M NaCl、10 μLの90 μg/mLに調製したACE、及び適宜希釈した被験物質を混合し90 μLとし室温で15分間、室温でプレインキュベーションを行った。次いで、上記反応液に10 μLの50 mM HEPES pH 8.3、300 mM NaCl及び1.5 mM FAPGGを加え室温で2-3時間、インキュベーションを行った。阻害活性の測定は320 nmの吸光度を測定することで行い、ACEを50％阻害する被験物質量をIC50として阻害活性を表した。
実施例１において製造した本発明品のオキアミタンパク質由来ペプチドのACE阻害活性は、IC50で約1.9 mg/mLであった。
【実施例３】
【００２０】
単回経口投与によるオキアミ由来ペプチドの降圧作用
本試験には7週齢雌性ラット（SHR/Izm、SPF）（日本エスエルシー）を用いた。ラットは室温22±3℃、相対湿度50±20％、照明時間12時間/日、換気回数13-17回/時間の条件下で固型飼料（ラボMRストック（日本農産工業製））を与えて飼育し飲料水は自由に接種させた。
7週齢のラットを上記の環境で1週間予備飼育し馴化して収縮期血圧がほぼ同一になるように群分けを行った（各群６尾）。群分けの後に一晩絶食させたラットに被験物質を強制的に単回経口投与し、投与2、4、6、8及び24時間後に小動物無加温型非観血圧計MK-2000（室町機械製）で血圧及び心拍数の測定を行った。被験物質としては、実施例１において製造したオキアミタンパク質由来ペプチド粉末を水溶液とし、1 mg/kg、10 mg/kg及び100 mg/kg投与群で行った。コントロール群には同量の水を投与した。）
【００２１】
1、10若しくは100 mg/kgのオキアミタンパク質由来ペプチドの投与群で、投与2時間後の収縮期血圧の低下量はそれぞれ、17 ± 1.59 mmHg、28 ± 4.97 mmHg及び24 ± 4.15 mmHgであり、有意な低下がみられた（図2）。その後、収縮期血圧は8時間後にほぼ元の値に戻った。また、オキアミタンパク質由来ペプチド投与群及び対照区において、オキアミタンパク質由来ペプチド投与後の心拍数に有意な差はみられなかった。
【実施例４】
【００２２】
ACE阻害ペプチドの単離及び構造解析
ペプチド粉末を26.5 mMのギ酸に溶解させた後にAKTAexplorer 100システム（GE healthcare bioscience）上でSP10/16XL陽イオン交換カラム（GE healthcare bioscience）を用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。溶出は0-1 M NaClの直線グラジエントで行い、クロマトグラフィーの流速は2 mL/分で行った。また、溶出ペプチドのモニタリングは214 nmの吸光度を測定することで行った。ACE阻害活性の高かった画分を凍結乾燥し、ゲル濾過クロマトグラフィーに供した。ゲル濾過クロマトグラフィーは、凍結乾燥した画分を蒸留水に溶解させた後に、AKTAexplorer 100システム上でSuperdex Peptide 10/300 GLゲル濾過カラム（GE healthcare bioscience）を用いて行った。溶出には蒸留水を用いて行い、流速は0.9 mL/分で行った。溶出ペプチドのモニタリングは214 nmの吸光度を測定することで行った。最もACE阻害活性の高かった画分を凍結乾燥した後に26.5 mMのギ酸に溶解し、SMART system上でODS-80TM column (Tosoh corp.)カラムを用いた逆相クロマトグラフィーを行った。溶出は0-40%アセトニトリルの直線グラジエントで行い、流速は0.5 mL/分で行った。溶出ペプチドのモニタリングは214 nmの吸光度を測定することで行った。ACE阻害活性の高かった画分を凍結乾燥した後に0.1%トリフルオロ酢酸に溶解し、μRPC C2/C18 SC 2.1/10カラム（GE healthcare bioscience）を用いてペプチドの単離を行った。単離したペプチドはProcise 494 HTシークエンサー（Applied biosystems）を用いて、配列決定を行った。
【００２３】
結果
オキアミタンパク質由来ペプチドの陽イオン交換クロマトグラフィー及び各フラクションのACE阻害活性を図３に示した。ACE阻害活性の高かったフラクション24-25を次いでゲル濾過クロマトグラフィーに供した。フラクション24-25のゲル濾過クロマトグラフィー及び各フラクションのACE阻害活性を図４に示した。ACE阻害活性の高かったフラクション19を次いで逆相クロマトグラフィーに供した。溶出フラクションのACE阻害活性を図５に示した。得られたACE阻害活性ピークI-VIに含まれるペプチドを単離し、アミノ酸シークエンサーによる構造解析に供した。得られたペプチドシークエンスは、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ、Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒであった。
中でも、ピークII及びIIIに含まれていたＶａｌ−ＴｒｐおよびＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒが高いACE阻害活性を示し（それぞれのIC50 = 2.75μg/mLおよび4.02μg/mL）、これらがオキアミタンパク質由来ペプチドの血圧降下作用に大きく寄与していることが考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明のオキアミタンパク質の酵素分解物はアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有し、血圧降下作用を有するので高血圧症の治療・予防薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】オキアミタンパク質の酵素分解物の分子量分布を見るために行ったゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示した写真である。
【図２】オキアミタンパク質の酵素分解物の単回経口投与のラットの血圧に対する効果を示す図である。（*：p<0.05、**：p<0.01、Dunnet検定）
【図３】オキアミタンパク質酵素分解物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画し、各フラクションのACE阻害活性を示した図である。
【図４】図３のフラクション２４-２５をさらにゲル濾過クロマトグラフィーにて分画し、各フラクションのACE阻害活性を示した図である。
【図５】図４のフラクション１９をさらに逆相クロマトグラフィーにて分画し、各フラクションのACE阻害活性を示した図である。
【図１】
2010024165.tif 000003
【図２】
2010024165.tif 000004
【図３】
2010024165.tif 000005
【図４】
2010024165.tif 000006
【図５】
2010024165.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月15日(2009.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010024165000001.app