(57)【要約】【課題】  電気泳動法による糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子の分離検出において、疎水性ポリマー膜に親水性層を有する電気泳動用支持体を用いて、良好な分離能で分離された糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を、転写することなく抗体等により高感度に検出する方法を提供する。【解決手段】  疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマーの層を有する支持体を用いて糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を泳動分離した後、該膜に加熱処理を施し、その加熱処理後の膜に抗体や色素などを用いて糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を検出することにより、良好な分離能を確保したうえで、糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を膜上に固定することができる。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマーの層を有する電気泳動用支持体を用いて生体高分子を電気泳動し、泳動後の膜に加熱処理を施した後、膜上に存在する生体高分子を該生体高分子に親和性を持つタンパク質によって検出することを特徴とする生体高分子の分離検出方法。
【請求項２】
前記加熱処理工程に有機溶媒を用いて膜を処理する工程を組み合わせて行うことを特徴とする請求項１に記載の生体高分子の分離検出方法。
【請求項３】
前記親和性を持つタンパク質が抗体である請求項１又は２に記載の生体高分子の分離検出方法。
【請求項４】
前記生体高分子が、糖タンパク質又はムコ多糖である請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体高分子の分離検出方法。
【請求項５】
前記親和性を持つタンパク質がレクチンである請求項４に記載の生体高分子の分離検出方法。
【請求項６】
前記糖タンパク質又はムコ多糖が、ムチン様糖タンパク質、プロテオグリカン型糖タンパク質、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカン、及びヒアルロン酸からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体高分子の分離検出方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体高分子の分離検出方法に用いられる電気泳動用支持体であって、疎水性ポリマー膜上の親水性ポリマー層が、少なくともポリビニルアルコールを含む親水性ポリマーの混合物からなることを特徴とする電気泳動用支持体。
【請求項８】
前記混合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、又はポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレートとの混合物であることを特徴とする請求項７に記載の電気泳動用支持体。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体高分子の分離検出方法に用いられる電気泳動用支持体であって、疎水性ポリマー膜上の親水性ポリマー層が、ビニルアルコールを少なくとも１つの構成単位として含む共重合体からなることを特徴とする電気泳動用支持体。
【請求項１０】
前記共重合体が、他の構成単位として、エチレングリコール、ビニルピロリドン、又は２−ヒドロキシエチルメタクリレートを含むことを特徴とする請求項９に記載の電気泳動用支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来試料のような複雑なタンパク質混合物中に存在する糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を泳動分離し検出する方法、該方法に用いる電気泳動用支持体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に存在するタンパク質は、癌などの疾患時にその発現量が変化することが知られており、疾患により変化した分子群を捕えることで、新規診断マーカーとしての応用が期待できる。特に糖タンパク質は、疾患時の量的変化に加え、その糖鎖構造も変化することが知られており、疾患により変化した糖鎖構造やそれらを含む分子群を捕えることで、より優れた新規診断マーカーとして利用できる可能性がある。そのため、特定の性質によって分類される糖タンパク質群の選択的な分離分析法は、疾患の診断や治療にとって大切な臨床検査の１つとなる可能性が高い。例えば、セルロースアセテート膜電気泳動法は血清タンパク質の分離に使用され、分離パターンの変化や特定の分画の量的変化が臨床検査法として疾患の診断に利用されている。
【０００３】
糖タンパク質の一種であるムチン様糖タンパク質は、粘液中または粘膜上に存在し、セリン又はトレオニンのヒドロキシル基にＯ−グリコシド結合したＮ−アセチルガラクトサミンを介してムチン型糖鎖が結合していることを特徴とする糖タンパク質である。また、ムチン様糖タンパク質は、糖含量が高い高分子量糖タンパク質として知られている。
また、ムコ多糖の代表であるグリコサミノグリカンは、動物の結合組織を中心にあらゆる組織に普遍的に存在し、多くの場合、プロテオグリカンとしてタンパク質に付加した形で存在している。プロテオグリカン型糖タンパク質は、セリンのヒドロキシル基にＯ−グリコシド結合したキシロースを介してグリコサミノグリカン鎖を持つことを特徴とする糖タンパク質である。また、タンパク質に結合してないグリコサミノグリカンとしてはヒアルロン酸が知られている。ヒアルロン酸は細胞外マトリクスに存在し、中皮腫のマーカー分子としても知られている。これらの糖タンパク質およびムコ多糖群はともに、疾患との関連が報告されており、新規診断マーカーのターゲット分子として重要である。また、肝癌マーカーや前立腺癌マーカーとして知られるαフェトプロテインや前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などは、血清中に含まれる糖タンパク質である。このように、血清糖タンパク質もまた新規診断マーカーのターゲット分子として重要である。
【０００４】
従来、これらの糖タンパク質又はムコ多糖を分離する技術としては、分離状態を視覚的にとらえることができる電気泳動法が好ましく用いられており、具体的には、血清糖タンパク質を例にした場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、セルロースアセテート膜電気泳動、等電点ゲル電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を組み合わせた２次元電気泳動等がある。また、ムチン様糖タンパク質やプロテオグリカン型糖タンパク質を例にした場合、アガロースゲル或いはアガロース／ポリアクリルアミド混成ゲルを用いた電気泳動（非特許文献１，２参照）、又はセルロースアセテート膜電気泳動（非特許文献３参照）等がある。
さらに、電気泳動法により分離した糖タンパク質の糖鎖を解析するためには、従来公知の転写法が適用できる。すなわち、電気泳動法により分離された糖タンパク質を、ゲルからポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ,polyvinylidene difluoride）膜に転写した後、該膜上での酵素反応やアルカリ処理によるβ−エリミネーション(β-elimination)反応により糖鎖を切り出し、切り出された糖鎖を質量分析計で解析する方法が用いられる（非特許文献２）。
【０００５】
一方、電気泳動法による蛋白質の分離分析方法においては、特許文献１に、分子量４万〜２００万のデキストラン等の親水性高分子を含有させたセルロースアセテート膜を用いて電気泳動法により検体中のリポ蛋白質を分離する方法、及び分離したリポ蛋白質ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を確認することにより、脂質代謝異常に起因する疾患を検出することが提案されている。
【０００６】
しかしながら、従来公知のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点ゲル電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を組み合わせた２次元電気泳動、または非特許文献１，２に記載されたアガロースゲル或いはアガロース／ポリアクリルアミド混成ゲルを用いた電気泳動法は、糖タンパク質を分離した後にＰＶＤＦ膜に転写する工程を経るため、スループット性に欠け、臨床での診断法としての応用は困難である。また、転写効率に起因する定量性の低下などが問題となる。
また、特許文献１に記載の方法は、リポ蛋白質に関するものであって、糖タンパク質またはムコ多糖については何ら記載がないばかりでなく、この方法においても、電気泳動後のリポ蛋白質を、ＰＶＤＦ膜、ニトロセルロース膜等に転写した後、転写膜上のリポ蛋白質を確認しているため、非特許文献１、２に記載された方法の場合と同様の問題がある。
【０００７】
一方、非特許文献３に記載されたセルロースアセテート膜電気泳動は、膜上でのムチン様糖タンパク質及びプロテオグリカン型糖タンパク質の分離が可能であり、転写工程の省略が期待できる。しかしながら、β−エリミネーション反応により生じる膜由来のセルロース誘導体が後の糖鎖分析の妨害となるため、この方法ではムチン様糖タンパク質及びプロテオグリカン型糖タンパク質の糖鎖構造情報を得ることができない。
【０００８】
以上のとおり、糖タンパク質またはムコ多糖を電気泳動法によって分離した後、電気泳動に用いた膜のまま糖鎖遊離処理を行い、糖タンパク質またはムコ多糖の糖鎖分析を可能とする膜電気泳動法はこれまでなかった。また、電気泳動に用いた膜のまま抗体やレクチン等を利用する染色によって検出することを可能とする膜電気泳動法はこれまでなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−２４８１３１号公報
【特許文献２】特開２００９−２６５０７８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Spurr-MichaudS et al.Assay of mucins in human tear fluid. Exp. Eye Res. 2007, 84, 939-950
【非特許文献２】Thomsson KA, Schulz BL, Packer NH, KarlssonNG. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretorstatus. Glycobiology 2005, 15, 791-804.
【非特許文献３】Yasueda SI, Yamakawa K, Nakanishi Y, Kinoshita M, Kakehi K.Decreased mucin concentrations in tear fluids of contact lens wearers. J.Pharm. Biomed. Anal. 2005, 39, 187-195.
【非特許文献４】第５６回質量分析総合討論会  講演要旨集第４７６〜４７７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、前述の従来技術における問題を解決し、マーカー探索や臨床現場での疾患診断に利用できる簡便な糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子の分離・分析方法を提供するべく、鋭意検討した結果、疎水性ポリマー膜上に親水性の層を有する電気泳動用支持体を用いて糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を泳動分離することにより、分離した糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子が、別の疎水性ポリマー膜へ転写することなく、色素や抗体などで染色し検出することができることを見いだした（上記特許文献２、非特許文献４参照）。
【００１２】
本発明者らが該知見に基づいて更に検討を重ねたところ、比較的親水性の高い分子であるムチン様糖タンパク質やプロテオグリカンなどは、抗体やレクチン等により検出する際の洗浄操作により、その大部分が膜から剥がれ落ちてしまい、感度良く検出できないという問題点があることが判明した。特に、泳動分離における分離能が最も高いポリビニルアルコールをコーティングした疎水性ポリマー膜を用いた場合、ムチン様糖タンパク質が膜から剥がれおちる現象が顕著であった。
【００１３】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、電気泳動法による糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子の分離検出において、疎水性ポリマー膜に親水性層を有する電気泳動用支持体を用いた場合の上記の問題点を解決し、良好な分離能で分離された糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を、転写することなく抗体やレクチン等により高感度に検出する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマーの層を有する支持体を用いて糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を泳動分離した後、該膜に加熱処理を施し、その加熱処理後の膜に、抗体やレクチン等を用いて糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を検出することにより上記の問題点を解決できることを見いだした。また、前記親水性ポリマーとして、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）と他の親水性ポリマー（ＰＥＧやＰＶＰ等）を混合したポリマー溶液、或いはビニルアルコールを構成成分の一つとして含む共重合ポリマーの溶液を作成し、これを疎水性ポリマー膜にコーティングして得られる膜を電気泳動用支持体として用いることにより、より優れた泳動分離と加熱による支持体への固定化効果が得られることも判明した。
【００１５】
本発明はこれらの知見に基づいて完成に至ったものであり、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマーの層を有する電気泳動用支持体を用いて生体高分子を電気泳動し、泳動後の膜に加熱処理を施した後、膜上に存在する生体高分子を該生体高分子に親和性を持つタンパク質によって検出することを特徴とする生体高分子の分離検出方法。
［２］前記加熱処理工程に有機溶媒を用いて膜を処理する工程を組み合わせて行うことを特徴とする上記［１］の生体高分子の分離検出方法。
［３］前記親和性を持つタンパク質が抗体である上記［１］又は［２］の生体高分子の分離検出方法。
［４］前記生体高分子が、糖タンパク質又はムコ多糖である上記［１］〜［３］の生体高分子の分離検出方法。
［５］前記親和性を持つタンパク質がレクチンである上記［４］の生体高分子の分離検出方法。
［６］前記糖タンパク質又はムコ多糖が、ムチン様糖タンパク質、プロテオグリカン型糖タンパク質、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカン、及びヒアルロン酸からなる群から選ばれるものであることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれかの生体高分子の分離検出方法。
［７］上記［１］〜［６］のいずれかの生体高分子の分離検出方法に用いられる電気泳動用支持体であって、疎水性ポリマー膜上の親水性ポリマー層が、少なくともポリビニルアルコールを含む親水性ポリマーの混合物からなることを特徴とする電気泳動用支持体。
［８］前記混合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、又はポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレートとの混合物であることを特徴とする上記［７］の電気泳動用支持体。
［９］上記［１］〜［６］のいずれかの生体高分子の分離検出方法に用いられる電気泳動用支持体であって、疎水性ポリマー膜上の親水性ポリマー層が、ビニルアルコールを少なくとも１つの構成単位として含む共重合体からなることを特徴とする電気泳動用支持体。
［１０］前記共重合体が、他の構成単位として、エチレングリコール、ビニルピロリドン、又は２−ヒドロキシエチルメタクリレートを含むことを特徴とする上記［９］の電気泳動用支持体。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、良好な分離能を確保したうえで、糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を膜上に固定化できることから、抗体等のプローブを用いる糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子の高感度検出が可能となる。また、そのため、迅速・簡便・高感度検出が可能となり、糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を指標とする診断キットへの応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】各種親水性ポリマー混合物の層を有する膜支持体のＰＳＭの分離における効果を検討した結果を示す図。
【図２】ＰＥＧとＰＶＰを１：１の割合で含むものを親水性ポリマー層としてＰＳＭを泳動した結果を示す図。
【図３】ＰＶＡのみおよびＰＥＧとＰＶＡを４：１の割合で含むものを親水性ポリマー層として使用し、ＰＳＭを用いて固定化における効果を検討した結果を示す図。
【図４】電気泳動後のムチンの免疫染色におけるＰＥＧとＰＶＡのポリマー混合物の層を有する膜支持体の効果を示す図。
【図５】本発明により電気泳動後のムチンをレクチンにより染色した結果を示す図。
【図６】電気泳動後のムチンの免疫染色におけるビニルピロリドンとビニルアルコールの共重合ポリマーの層を有する膜支持体の効果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の、糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子の分離分析法は、親水性ポリマー層を形成した疎水性のポリマー膜を用いた電気泳動法によるものである。
本発明に用いる疎水性のポリマー膜とは、タンパク質を疎水性相互作用によって強く結合保持する性質を有するポリマー膜であって、特にポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、ナイロン（Nylon）膜を挙げることができるが、分解能の点からＰＶＤＦ膜が最も好ましい。
これらの疎水性のポリマー膜とは、特許文献１、非特許文献２に記載されているように、本来、この膜に、精製したタンパク質溶液を添加するか、又はゲル電気泳動によって分離したタンパク質を転写し、膜上で糖タンパクや抗原タンパクなどの同定をおこなうために、もっぱら、タンパク質固定化用に用いられているものである。
【００１９】
本発明に用いる疎水性のポリマー膜には、従来、電気泳動法により分離されたタンパク質を転写する膜として用いられているものをそのまま使用できる。
該疎水性のポリマー膜上に、親水性のポリマー層を形成する方法としては、具体的には、疎水性のポリマー膜を親水性ポリマー溶液中に浸漬する方法、疎水性のポリマー膜上に親水性ポリマーを塗布する方法、親水性ポリマーフィルムを積層する等の方法が挙げられる。
【００２０】
本発明において、親水性の層を形成するポリマーとしては、ポリマーの構成ユニットに酸素や窒素のようなヘテロ原子を少なくとも一つ含むポリマーであって水接触角が６０°以下の水との親和性を有するポリマーである。例としてポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシドなどが挙げられるが、特に、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールが、分離能の点から好ましく、最も好ましいのは、ポリビニルアルコールである。なお、本発明の目的からみて、本発明に用いる親水性ポリマーには、デキストリン等の多糖系のポリマーが含まれないことは当然のことである。
また、本発明において用いられる親水性ポリマーの分子量としては、１，０００〜４，０００，０００が好ましい。
【００２１】
本発明においては、これらの親水性ポリマーの中でも、分離能からすると、特に、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が好ましく用いられる。
また、その他の親水性ポリマーのうち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、或いは、ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレート（２ＨＥＭＡ）は、いずれも、単独で用いた場合には、分離能が不十分であるが、ＰＶＡと混合することにより、あるいはビニルアルコールとの共重合ポリマーとして使用することにより分離能が改善され、ＰＶＡのみの場合とほぼ同様の良好な泳動パターンを得ることができる。
【００２２】
本発明の方法に用いる装置としては、従来のセルロースアセテート膜電気泳動装置をそのまま用いることができ、具体的には、EPC105AA型セルロースアセテート膜電気泳動装置（アドバンテック）などが使用できる。
本発明の前記電気泳動用支持体を用いた電気泳動は、「蛋白質・酵素の基礎実験法」（南江堂）、「新生化学実験講座3・糖質II」（東京化学同人）等に記載された手法に従っておこなう。
すなわち、電気泳動用緩衝液としては、ベロナール緩衝液、トリス緩衝液、ピリジン−ギ酸緩衝液等を使用する。タンパク質および糖タンパク質の分離にはベロナール緩衝液やトリス緩衝液を中性付近のｐＨで使用するのが好ましい。ムチン様糖タンパク質およびプロテオグリカン型糖タンパク質に対してより明確な分離を行うにはピリジン−ギ酸緩衝液（ｐＨ３．０〜ｐＨ５．０）が好ましい。また、検体の塗布量は、一般的には、１スポットあたり、あるいは幅１ｃｍあたり、０．８〜２．４μＬとされており、通電条件としては、幅１ｃｍあたり０．５〜１．５ｍＡ程度の電流を流すことが好ましい。また、電気泳動中の支持体の温度は、一般的に１０〜２０℃の範囲において、一定とする。
【００２３】
本発明においては、前記の疎水性のポリマー膜上に親水性ポリマー層を形成した電気泳動用支持体を用いることにより、糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子を分離することが可能となるものである。そして、本発明の前記電気泳動用支持体上で分離された糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子は、親水性ポリマー層を有する疎水性のポリマー膜上にあるため、さらに別の膜に転写することなく、そのまま、前記生体高分子に親和性を持つ、抗体やレクチン等のタンパク質を用いて特異的かつ高感度に検出することができるものである。
【００２４】
本願発明では、この抗体やレクチン等により検出する工程の前に必要な洗浄操作により、膜上の分離された糖タンパク質又はムコ多糖等の生体高分子が膜から剥がれ落ちてしまうという問題を解決するため、泳動後の膜に加熱処理を施すことを特徴としている。
該加熱処理にはＴＬＣ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｔｔｅｒ（ＡＣ５９７０型、アトー社製）などが使用できる。該加熱処理の温度としては、１００℃から１８０℃、好ましくは１２０℃から１６０℃、より好ましくは１５０℃が利用できる。また処理時間としては、１分間から１０分間、好ましくは３分間から７分間、より好ましくは5分間が利用できる。
【００２５】
また、前述の親水性ポリマーの中でも、分離能からすると、特に、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が好ましいが、一方、洗浄操作によるタンパク質の剥がれ落ちの問題は、ＰＶＡの場合が特に顕著である。しかしながら、この問題は、ＰＶＡに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、或いは、ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレート（２ＨＥＭＡ）等を混合すること、あるいはビニルアルコールを構成成分として含む共重合ポリマーを使用することにより改善することが可能となる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
〈実施例１〉
本実施例ではブタ胃ムチン（ＰＳＭ）を用いて、親水性ポリマー混合物の層を有する膜支持体の分離における効果を検討した。
（親水性ポリマー層を有するＰＶＤＦ膜の作成）
市販のＰＶＤＦ膜（Immobilon-P, ミリポア社製）を適した大きさに切り取り、メタノールに数分間浸した。ついで、該ＰＶＤＦ膜をメタノールから取りだし、０．２５％の親水性ポリマーあるいは親水性ポリマー混合物を含む泳動用緩衝液（０．１Ｍピリジン−ギ酸緩衝液、ｐＨ４．０）に３０分間浸した。
試料をスポットする直前に、前記泳動用緩衝液から膜を取りだし、膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、使用した。
【００２７】
（使用した親水性ポリマー）
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、分子量２２０００、和光純薬社製のものを使用した。ＰＶＡには工業用途で市販されるポバール（クラレ）やゴーセノール（日本合成化学工業(株)）等も利用できる。
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、分子量３６００００、シグマ-アルドリッチ社製のものを使用した。ＰＶＰには工業用途で市販されるピッツコール（第一工業製薬）なども利用できる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、分子量２００００、ナカライテスク社製のものを使用した。ＰＥＧには工業用途で市販されるマクロゴール（三洋化成株式会社）なども利用できる。
ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレート（２ＨＥＭＡ）は、シグマ-アルドリッチ社製のものを使用した。
【００２８】
（分析試料の前処理）
ＰＳＭ（１００μｇ）を２０ｍＭジチオトレイトールおよび８Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６、１０μｌ）に溶解し、室温で３時間反応させた。その後、２５０ｍＭヨードアセタミド水溶液（１μｌ、最終濃度２５ｍＭ）を加え、室温で１時間、暗所にて反応させた。
反応後、試料溶液の一部（１μｌ）を、前記の親水性ポリマー層を有するＰＶＤＦ膜上にスポットし、電気泳動に供した。
【００２９】
（電気泳動）
泳動槽には、セルロースアセテート膜電気泳動装置（ＥＰＣ１０５ＡＡ型、アドバンテック社製）を使用した。通電条件は、膜の幅１ｃｍあたり１．０ｍＡとし、泳動時間は２０分間とした。
【００３０】
（染色方法）
１％酢酸に溶解した０．１％アルシアンブルー８ＧＸ溶液を使用した。
【００３１】
（泳動結果）
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とＰＶＡを混合した親水性ポリマー層を使用した時の泳動結果を図１の左の図に示す。
左のレーンから順に、ＰＥＧのみ、ＰＥＧとＰＶＡを４：１の割合で含むもの、ＰＥＧとＰＶＡを３：２の割合で含むもの、そしてＰＶＡのみを用いた場合の結果を示している。親水性ポリマー層がＰＥＧのみの場合ではスポット１と２の分離が不十分であり、またスポット３の著しいテーリングが観察された。ＰＥＧとＰＶＡを４：１の割合で含む場合では、スポット１と２の分離とスポット３のテーリングが改善された。ＰＥＧとＰＶＡを３：２の割合で含む場合では、ＰＶＡのみの場合とほぼ同様の良好な泳動パターンが観察された。この現象はＰＥＧの代わりにポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、中央の図）やポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレート（２ＨＥＭＡ、右の図）を用いた場合でも同様に観察された。一方、ＰＥＧとＰＶＰを混合した場合では、当然分離の改善は観察されない（図２）。
【００３２】
このことから、ＰＶＡと他の親水性ポリマーを混合したものを親水性ポリマー層として有する疎水性ポリマー膜を電気泳動支持体として用いることで、ＰＶＡ以外の親水性ポリマーのみを用いた場合に比べて分離能が改善されることが分かった。
【００３３】
〈実施例２〉
本実施例ではＰＳＭを用いて、スポットの膜への固定化における親水性ポリマー混合物の効果を検討した。
（親水性ポリマー層を有するＰＶＤＦ膜の作成）
実施例１と同様の手順により作成した。
（分析試料の前処理）
実施例１と同様の手順により実施した。
（電気泳動）
実施例１と同様の手順により実施した。
（固定化方法）
泳動後の膜をアセトン中で３０分間振とうした後、ＴＬＣ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｔｔｅｒ（ＡＣ５９７０型、アトー社製）により熱処理を加えることでスポットを膜へ固定化した。熱処理の条件は、１５０℃、５分間とした。
（膜の洗浄）
固定化した膜をＰＢＳ−Ｔ中で振とう洗浄した。５分間の洗浄を９回繰り返した後、ＰＢＳで洗浄し、最後に水で洗浄した後に染色に使用した。
（染色方法）
実施例１と同様の手順により実施した。
【００３４】
（結果）
泳動後のＰＳＭを上記の方法により固定化し、ＰＢＳ−Ｔで十分に振とう洗浄した後、アルシアンブルーにより染色した結果を図３に示す。左の図はＰＶＡのみ、右の図はＰＥＧとＰＶＡを４：１の割合で含むものを親水性ポリマー層として使用した場合をそれぞれ示している。両図共に左のレーンから順に固定化後に染色した結果（a）、固定化せずに洗浄し染色した結果（b）、そして固定化後に洗浄し染色した結果（c）をそれぞれ示している。ＰＶＡのみの場合では固定化操作の有無に関わらずＰＢＳ−Ｔによる洗浄操作により、ＰＳＭが膜から剥がれ落ちていることがわかる。一方、ＰＥＧとＰＶＡを４：１の割合で含む親水性ポリマー層を用いた場合、固定化することによってＰＢＳ−Ｔによる洗浄操作後においてもスポットが検出されたことから、本発明により良好な分離を確保したまま膜上にスポットを固定化できることが分かった。
スポット１および２はそれぞれ、ＰＳＭ中に混在しているコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンとヒアルロン酸であり、そしてスポット３はムチン型糖タンパク質であることから、本発明はムチン型糖タンパク質やプロテオグリカン、ムコ多糖の検出に適用できることが分かった。
【００３５】
〈実施例３〉
本実施例では膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−２）の培養上清から調製したムチンを抗ＣＡ１９−９抗体により染色することで、ムチンの固定化とその後の抗体染色における親水性ポリマー混合物層を有する膜支持体の性能を評価した。
（親水性ポリマー層を有するＰＶＤＦ膜の作成）
実施例１と同様の手順により作成した。
（分析試料の前処理）
Ｃａｐａｎ−２の培養上清（１０ｍｌ）に３倍量（３０ｍｌ）のエタノールを加えた後、4℃で一晩放置しムチンを含むタンパク質画分を沈澱させた。得られた沈澱を２Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６、１０ｍｌ）に溶解し、還元アルキル化した後、限外ろ過膜（１００ｋＤaカット）により試薬除去を行った。濃縮液（１ｍｌ）に上記緩衝液を加えて１０ｍｌとした後、トリプシン（１ｍｇ）を加えて37℃で48時間反応させた。反応液を限外ろ過膜（１００ｋＤaカット）により１５０μｌまで濃縮し、生成したペプチドを除去したものを粗ムチン分画とした。得られた粗ムチン分画は上記緩衝液で希釈して電気泳動に供した。
（電気泳動）
実施例１と同様の手順により行った。
（染色方法）
抗体による免疫染色は、実施例２と同様の手順によりムチンを膜に固定化した後、従来公知の方法に従い実施した。すなわち、固定化後の膜をＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ中で１時間振とうしてブロッキングした。膜をＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄後、抗ＣＡ１９−９マウスＩｇＧをＰＢＳ−Ｔで３００倍希釈した溶液に浸し、一晩反応させた。膜をＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧをＰＢＳ−Ｔで２０００倍希釈した溶液に浸し、１時間振とうした。ＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄後、ＥＣＬ法により検出した。フィルムへの感光時間は２０秒とした。
【００３６】
（泳動・染色結果）
Ｃａｐａｎ−２の培養上清由来ムチンを泳動後に固定化し、抗ＣＡ１９−９抗体で染色した結果を図４に示す。左から順に、親水性ポリマー層としてＰＥＧのみを用いた場合、ＰＥＧとＰＶＡを４：１の割合で含むポリマー混合物を用いた場合、そしてＰＶＡのみを用いて泳動した後に新しいＰＶＤＦ膜に転写した場合の結果をそれぞれ示している。ＰＥＧのみを用いた場合では、膜に固定化されたムチンのスポットが僅かに観察されたが、バックグラウンドが高くこの方法による免疫染色には適していないことが分かる（左図）。ＰＥＧとＰＶＡを４：１の割合で含む混合物を用いた場合では、バックグラウンドが低く、ムチンのスポット（矢印）が明確に観察される良好な結果を与えた（中央図）。一方、ＰＶＡのみを用いて泳動した後に新しいＰＶＤＦ膜に転写した場合では、ムチンスポットがほとんど観察されなかったことから、転写効率に起因するサンプルのロスが考えられる（右図）。従って本発明は、免疫染色においても優れた効果を発揮することが分かった。また従来の転写を必要とする方法に比べて濃いスポットとして観察されたことから、高感度かつ定量的なムチン様糖タンパク質の免疫染色が可能であることが分かった。
【００３７】
〈実施例４〉
本実施例ではウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）をシアル酸結合レクチンであるニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）により染色することで、レクチン染色における本発明の有効性を評価した。
（親水性ポリマー層を有するＰＶＤＦ膜の作成）
実施例１と同様の手順により作成した。
（分析試料の前処理）
実施例１と同様の手順により行い、ＢＳＭとして５００ｎｇ相当をスポットし、電気泳動に供した。
（電気泳動）
実施例１と同様の手順により行った。
（染色方法）
レクチン染色は、実施例２と同様の手順によりムチンを膜に固定化した後、従来公知の方法に従い実施した。すなわち、固定化後の膜をＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ中で１時間振とうしてブロッキングした。膜をＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄後、ビオチン標識レクチンをＰＢＳ−Ｔで３μｇ/ｍｌの濃度に調製した溶液に浸し、３時間反応させた。膜をＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンをＰＢＳ−Ｔで３μｇ/ｍｌの濃度に調製した溶液に浸し、１時間振とうした。ＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄後、ＰＢＳで洗浄しコニカイムノステインキット（イムノステインHRP-1000、コニカミノルタ社製）により検出した。
【００３８】
（染色結果）
ＰＥＧとＰＶＡを４：１の割合で含むポリマー混合物を親水性ポリマー層として使用し、ＢＳＭを泳動後に染色した結果を図５に示す。左から順に、アルシアンブルーで染色した結果、固定化せずにＳＳＡで染色した結果、固定化後にＳＳＡで染色した結果をそれぞれ示している。ＢＳＭを固定化後にＳＳＡで染色した場合、アルシアンブルーで染色されたＢＳＭのスポットと同じ泳動位置（矢印）にスポットが観察された（右図）。一方、固定化しない場合、ＢＳＭは洗浄操作により剥がれ落ちてしまい検出されない（中央図）。従って本発明は、レクチン染色においても優れた効果を発揮することが分かった。
【００３９】
〈実施例５〉
本実施例では膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−２）の培養上清から調製したムチンを抗ＣＡ１９−９抗体により染色することで、ムチンの固定化とその後の抗体染色における共重合親水性ポリマーの層を有する膜支持体の性能を評価した。
（ビニルアルコールを含む共重合ポリマーの調製）
ビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合ポリマーの酢酸ビニル部分をけん化することにより調製した。すなわち、該共重合ポリマー（Ｐ０３８５、ＰＶＰ：ＰＶＡ＝３：７、東京化成製）の５０％エタノール溶液１ｍＬに９ｍＬの水と１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を１．８ｍＬ加えた後、一昼夜攪拌したものを共重合ポリマー溶液として使用した。
（親水性ポリマー層を有するＰＶＤＦ膜の作成）
実施例１と同様の手順により作成した。
（分析試料の前処理）
実施例３と同様の手順により行った。
（電気泳動）
実施例１と同様の手順により行った。
（染色方法）
実施例３と同様の手順により行った。
【００４０】
（泳動・染色結果）
ビニルピロリドンとビニルアルコールの共重合ポリマー（ビニルピロリドン：酢酸ビニル＝３：７の共重合ポリマーをけん化したもの）を親水性ポリマー層として使用した場合の結果を図６に示す。左の図はＰＳＭを泳動してアルシアンブルーで染色した結果、右の図はＣａｐａｎ−２の培養上清由来ムチンを泳動後に固定化し、抗ＣＡ１９−９抗体で染色した結果をそれぞれ示している。図のように該共重合ポリマーを親水性ポリマーとして使用した場合においてもＰＳＭは良好な分離を示した（左図）。また、抗体染色においてもポリマー混合物を用いた場合（実施例３参照）と同様の良好な結果を与え、ムチンのスポット（矢印）が明確に観察された（右図）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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