(57)【要約】【課題】種々の癌におけるＣＯＰ１の過剰発現を検出するための診断的使用、予後的使用および治療的使用を提供すること。【解決手段】本発明は、種々の癌におけるＣＯＰ１の過剰発現を検出するための診断的使用、予後的使用および治療的使用を提供する。本方法および使用は、ｐ５３発現を検出する工程をさらに含む。本発明は、ＣＯＰ１およびｐ５３の結合を妨害する試験化合物のスクリーニングにおける使用のための試薬およびキットもまた提供する。本発明は、被験体の癌を診断する方法に関する。この方法は、この被験体の癌におけるＣＯＰ１レベルまたはＣＯＰ１活性を検出する工程を含む方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の、被験体における癌の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌診断および癌療法の分野のものである。
【背景技術】
【０００２】
代表的な腫瘍抑制遺伝子としてのｐ５３の役割は、十分に確立されている１。生化学的に、ｐ５３は、ｐ５３コンセンサス結合部位を保持するプロモーターからの転写を活性化する、ストレス活性化配列特異的転写因子として機能する２。さらに、ｐ５３はまた、転写の強力なリプレッサーとしても機能し、それゆえ、遺伝子調節のさらなる層を加えている３。このように、それは、血管形成、抗アポトーシスおよび細胞周期の伸展に関与する遺伝子を抑制することに加えて、細胞周期停止、アポトーシスおよびＤＮＡ修復に関与する中心の遺伝子の転写を活性化することにより、種々のストレスシグナル（いくつかを挙げると、ＤＮＡ損傷、ヌクレオチド減損および癌遺伝子活性化など）から細胞を保護する。ｐ５３活性化の生理学的な結果は、本質的に、成長停止またはアポトーシスを導き、それによって細胞が遺伝的に危険なゲノムを自己複製することを妨げる。
【０００３】
ｐ５３は、すべてではないにせよ幾つかの遺伝子において負に制御されるかまたは突然変異される、強力な腫瘍サプレッサータンパク質である２６、２７。ヒト悪性腫瘍におけるｐ５３遺伝子における高頻度の改変またはｐ５３経路の調節解除された構成成分は、発癌を防止するためのｐ５３の完全性の重要度を強調する。この重要性は、６月齢まで自然発生腫瘍を発達させるｐ５３ノックアウトマウスからの観察４によって、さらに支持される。癌におけるｐ５３遺伝子改変の実際の頻度は、２０％から８０％と推定される。この広頻度は、腫瘍の起源である組織、検出方法および／または分析される遺伝子の領域に起因し得る。例えば、乳房腫瘍における遺伝子改変の推定頻度が約２０％である一方で、この頻度は、小細胞肺癌の場合には、＞７０％まで劇的に増加する。卵巣腫瘍は、一般的に野生型ｐ５３遺伝子を有する２８。
【０００４】
ｐ５３は、Ｐｉｒｈ２７およびＭＤＭ２８−１０などのＥ３リガーゼに対する基質認識によるプロテアソーム依存性経路により、非ストレス細胞において迅速に代謝回転され、このＰｉｒｈ２およびＭＤＭ２は、ＵｂｃＨ５ｂなどのＥ２酵素から、多数のリジン残基上の、または基質接合ユビキチン上の基質へユビキチンを転移させ、ポリユビキチン鎖を生成させる。一旦Ｋ４８結合ポリユビキチン鎖の長さが４以上に達すると、上記基質は、分解のためにこの基質を標的とするｈＲａｄ２３ａ１１などのプロテアソームの成分により認識され得る。従って、ＭＤＭ２２５およびＰｉｒｈ２７は、ｐ５３の負のレギュレーターである。Ｐｉｒｈ２およびＭＤＭ２は、ｐ５３誘導性遺伝子７、１２、１３であり、それによって上記ｐ５３反応を止めるためにとられ得る負のフィードバックループを生み出し、細胞周期進行を可能にする。
【０００５】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＣＯＰ１は、植物の光形態形成を阻害するために機能する、ＲＩＮＧフィンガー含有タンパク質である。ＡｔＣＯＰ１は、光媒介遺伝子発現を負に制御することにより苗木の生長をコントロールし１４、そして、マイクロアレイ分析は、ＡｔＣＯＰ１が、すべてではないにせよ、ほとんどの光反応性遺伝子を調節することを示す１５、１６。これは、闇において光成長する植物を代表する表現型を示すＣＯＰ／ＤＥＴ／ＦＵＳタンパク質の機能喪失型突然変異によって例示され得る１７。機構的に、これは、ＬＡＦ１１８およびＨＹ５１９などの光媒介発達のポジティブなレギュレーターを抑制するＡｔＣＯＰ１の能力に起因した。ＣＯＰ１は、インビトロでは内在的Ｅ３リガーゼ活性を有し（非特許文献１、非特許文献２）、ＬＡＦ１を基質として利用し得る。ＣＯＰ１は、植物における重要な光媒介発達のスイッチであるが、哺乳動物細胞におけるその役割は、あまり確立されていない（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｅｏ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｌａｆ１  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＯＰ１  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＳＰＡ１”，Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２４，ｐ．９９５−９
【非特許文献２】Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，  ａ  ＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｊｕｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００３）２７８，ｐ．１９６８２−９０
【非特許文献３】Ｙｉ，Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｗｅｉ，Ｎ．＆Ｄｅｎｇ，Ｘ．Ｗ．”Ａｎ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｗｉｔｃｈ，ＣＯＰ１”ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００２）３，３０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、被験体の癌を診断する方法に関する。この方法は、この被験体の癌におけるＣＯＰ１レベルまたはＣＯＰ１活性を検出する工程を含む方法に関する。さらなる実施形態において、その診断方法は、上記被験体の癌におけるｐ５３レベルまたはｐ５３活性を検出する工程を含む。１つの実施形態においては、検出されるｐ５３分子は、野生型のｐ５３分子である。別の実施形態において、このｐ５３分子は、ヒトｐ５３分子である。別の実施形態においては、このｐ５３分子は、特にｐ５３分子に特異的に結合する抗体を使用して検出される。上記診断方法のさらなる実施形態においては、癌におけるｐ５３の核酸配列が、配列決定される。別の実施形態においては、このｐ５３分子は、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導性アポトーシスの阻害およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少の少なくとも１つから成る群から選択されるｐ５３活性分析を使用して検出される。別の実施形態によれば、上記診断方法は、上記サンプルにおけるｐ２１分子を検出する工程を包含する。別の実施形態によれば、診断される被験体は、ヒトである。なお別の実施形態においては、診断される癌は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌および移行性細胞癌の少なくとも１つから成る群から選択される。なお別の実施形態においては、診断される癌は、漿液性腺癌、類内膜腺癌、明細胞腺癌および粘液性腺癌から成る群から選択される。
【０００８】
本発明は、被験体における癌療法の有効性をモニタリングするか、または予後を評価するための方法に関する。この方法は、この被験体由来のサンプルにおけるＣＯＰ１分子を検出する工程を包含し、ここで、コントロールと比較した上記ＣＯＰ１分子の過剰発現における減少は、この癌療法が有効であることを示す。１つの実施形態においては、上記方法は、上記サンプルにおけるｐ５３分子を検出する工程をさらに包含する。なお別の実施形態においては、検出されるｐ５３分子は、野生型ｐ５３である。別の実施形態においては、このｐ５３分子は、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導性アポトーシスの阻害およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少の少なくとも１つから成る群から選択されるｐ５３活性を観察することにより検出される。１つの実施形態においては、評価される癌療法は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌および移行性細胞癌の少なくとも１つから成る群から選択される癌の処置のためのものである。１つの実施形態においては、評価される癌療法は、漿液性腺癌、類内膜腺癌、明細胞腺癌および粘液性腺癌から成る群の少なくとも１つから選択される癌の処置のためのものである。
【０００９】
本発明は、癌を有するか、またはその危険があると診断された被験体における癌を処置する方法に関する。この方法は、以下：ＣＯＰ１の発現を阻害する第１化合物の薬学的に有効な量を被験体に投与する工程を包含する。１つの実施形態においては、この方法は、ＭＤＭ２またはＰｉｒｈ２の発現を阻害する第２化合物の薬学的に有効な量を被験体に投与する工程をさらに包含する。別の実施形態においては、上記第１化合物または第２化合物は、上記癌を癌療法に対して感作させる。なお別の実施形態においては、上記第１化合物または第２化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三本鎖形成ヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ分子から成る群の少なくとも１つから選択される。上記方法は、上記第１化合物および／または第２化合物の投与前、投与中または投与後に、癌療法の過程中有用であり得る１つ以上の他の治療剤の投与をさらに含み得る。１つの実施形態においては、処置されるべき癌は、野生型ｐ５３を発現する。別の実施形態においては、処置されるべき癌は、コントロールと比較してＣＯＰ１を過剰発現する。別の実施形態においては、処置されるべき癌は、コントロールと比較して減少したｐ５３レベル、または減少したｐ５３活性を発現する。別の実施形態においては、処置されるべき癌は、コントロールと比較して減少したｐ２１発現レベルを発現する。
【００１０】
本発明は、ＣＯＰ１分子のｐ５３分子への結合に干渉する試験化合物をスクリーニングする方法に関する。１つの実施形態においては、この試験化合物は、さらにＣＯＰ１リガーゼ活性を阻害し得る。別の実施形態においては、上記方法は、上記試験化合物がＣＯＰ１を調節するか否かを測定する工程をさらに包含する。１つの実施形態においては、このＣＯＰ１活性は、ｐ５３の分解、ｐ５３のユビキチン化、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導アポトーシスの阻害およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少から成る群の少なくとも１つから選択される。１つの実施形態においては、このＣＯＰ１は、ヒトＣＯＰ１分子である。別の実施形態においては、上記ｐ５３は、ヒトｐ５３分子である。１つの実施形態においては、上記スクリーニング方法は、ＣＯＰ１／ｐ５３結合の途絶または阻害を測定する分析である。別の実施形態においては、上記スクリーニング方法は、レポーター遺伝子分析である。さらなる実施形態においては、上記スクリーニング方法は、ＣＯＰ１活性を検出するさらなる工程を包含する。ここでこの活性は、ｐ５３の分解、ｐ５３のユビキチン化、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導アポトーシスの阻害およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少から成る群の少なくとも１つから選択される。
【００１１】
本発明は、ｐ５３の活性を阻害する化合物をスクリーニングするための方法に関する。この方法は、ＣＯＰ１と結合する試験化合物で哺乳動物細胞を処理し、そしてその処理された細胞におけるｐ５３を検出する工程を包含する。１つの実施形態においては、上記検出する工程は、ｐ５３の分解、ｐ５３のユビキチン化、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導アポトーシスの阻害およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少から成る群の少なくとも１つを測定する工程を含む。１つの実施形態においては、上記哺乳動物細胞は、ＣＯＰ１を発現させるために操作されている。１つの実施形態においては、上記哺乳動物細胞は、ｐ５３を発現させるために操作されている。
【００１２】
本発明は、癌を有するか、またその危険があると診断された被験体における癌を処置するための医薬の調製のために、ＣＯＰ１分子の発現を阻害するか、またはＣＯＰ１リガーゼ活性を阻害する化合物の使用に関する。１つの実施形態によれば、この化合物は、ＣＯＰ１を標的とするＲＮＡｉである。別の実施形態によれば、上記医薬は、ＭＤＭ２もしくはＰｉｒｈ２の発現を阻害する化合物を含み、またはこの医薬のためのラベルは、ＣＯＰ１阻害化合物でＭＤＭ２もしくはＰｉｒｈ２の発現を阻害する化合物を投与することに関する情報を提供する。別の実施形態によれば、この医薬は、ＭＤＭ２分子の発現、またはＭＤＭ２分子の活性を阻害する化合物をさらに含み、かつ／またはこのＭＤＭ２インヒビターを投与するための指示を伴い得る。別の実施形態によれば、この医薬は、Ｐｉｒｈ２分子の発現、またはＰｉｒｈ２分子の活性を阻害する化合物をさらに含み、かつ／またはこのＰｉｒｈ２インヒビターを投与するための指示を伴い得る。
【００１３】
本発明は、哺乳動物細胞におけるｐ５３活性を阻害するための方法に関する。この方法は、細胞におけるＣＯＰ１を過剰発現させ、そして、ＣＯＰ１を過剰発現する細胞におけるｐ５３を検出する工程を包含する。本発明はまた、ｐ５３分子をコードする組換え核酸分子および哺乳動物ＣＯＰ１分子をコードする組換え核酸分子を含む哺乳動物細胞に関する。本発明はまた、ＣＯＰ１分子の発現を増加させるかもしくは減少させる非コード配列、またはｐ５３分子をコードする分子との組み合わせにおいて、ｐ５３分子の発現を増加させるかもしくは減少させる非コード配列（例えば、プロモーター／エンハンサーもしくはアンチセンス配列）を有するように操作された哺乳動物細胞に関する。本発明はまた、細胞がＣＯＰ１分子の発現または活性を改変するように操作することと組み合わせて、ｐ５３が発現されないかまたは変異体として発現されるようにゲノム改変されたｐ５３についてのコード配列を有するように操作された哺乳動物にも関する。本発明はまた、細胞がｐ５３分子の発現または活性を改変するように操作することと組み合わせて、ＣＯＰ１が発現されないかまたは変異体として発現されるようにゲノム改変されたＣＯＰ１についてのコード配列を有するように操作された哺乳動物細胞に関する。
【００１４】
本発明は、減少したＣＯＰ１活性および減少したＭＤＭ２活性を有するように操作された哺乳動物細胞、必要に応じて、さらにｐ５３発現またはｐ５３活性が改変されるように操作された哺乳動物細胞を提供する。本発明は、減少したＣＯＰ１活性、減少したＭＤＭ２活性および減少したＰｉｒｈ２活性を有するように操作された哺乳動物細胞、必要に応じて、さらに改変されたｐ５３発現または改変されたｐ５３活性を有するように操作された哺乳動物細胞を提供する。本発明は、減少したＭＤＭ２活性、減少したＰｉｒｈ２活性および増加したＣＯＰ１活性を有するように操作された哺乳動物細胞を提供する。本発明は、減少したＣＯＰ１活性を有するように操作された哺乳動物細胞を提供する。本発明は、減少したｐ５３活性および増加したＣＯＰ１活性、または正常ＣＯＰ１活性を有するように操作された哺乳動物細胞を提供する。１つの実施形態においては、上記活性は、上記ｐ５３分子または上記ＣＯＰ１分子を標的にするＲＮＡｉ法により、減少される。
【００１５】
本発明は、ＣＯＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子と作動可能に連結された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む第１核酸分子、ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸分子と作動可能に連結されたトランス活性化ドメインを含む第２核酸分子、および上記配列特異的ＤＮＡ結合ドメインにより認識され得る配列に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む第３核酸分子を含む細胞を提供する。本発明はまた、ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸分子と作動可能に連結された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む第１核酸分子、ＣＯＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子と作動可能に連結されたトランス活性化ドメインを含む第２核酸分子、および上記配列特異的ＤＮＡ結合ドメインにより認識され得る配列に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む第３核酸分子を含む、細胞を提供する。
【００１６】
本発明はまた、組換えｐ５３分子の使用と組み合わせて、組換えＣＯＰ１分子の使用を含むアッセイ（例えば、インビトロユビキチン分析、ＣＯＰ１／ｐ５３結合アッセイ、ＣＯＰ１リガーゼアッセイおよびｐ５３活性アッセイ）を提供する。
【００１７】
本発明は、サンプルにおいてＣＯＰ１分子を検出するための試薬と、癌細胞を含むサンプルにおいてＣＯＰ１分子を検出するための指示書を含むパッケージ挿入物とを備えるキットを提供する。１つの実施形態においては、この癌細胞は、野生型ｐ５３発現癌細胞である。別の実施形態においては、この癌細胞は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌および移行性細胞癌の少なくとも１つから成る群から選択される。別の実施形態においては、この癌は、漿液性腺癌、類内膜腺癌、明細胞腺癌および粘液性腺癌の少なくとも１つから成る群から選択される。１つの実施形態においては、上記キットは、サンプルにおいてｐ５３分子を検出するための試薬をさらに含む。
【００１８】
本発明は、薬学的に受容可能なキャリアとともにＣＯＰ１の発現を阻害する化合物を含む薬学的組成物を提供する。１つの実施形態においては、この薬学的組成物は、ＭＤＭ２またはＰｉｒｈ２の発現を阻害する化合物をさらに含む。１つの実施形態において、この化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ分子から成る群の少なくとも１つから選択される。
【００１９】
本発明の組成物および方法の１つの実施形態において、上記ＣＯＰ１分子は、ｐ５３に結合するヒトＣＯＰ１またはその改変体の少なくとも一部を含む。本発明の方法の１つの実施形態において、このｐ５３分子は、ＣＯＰ１に結合するヒトｐ５３またはその改変体の少なくとも一部を含む。本発明の組成物および方法の別の実施形態において、上記ＣＯＰ１分子は、リガーゼ活性を有するＣＯＰ１の一部と組み合わせて、ｐ５３に結合するヒトＣＯＰ１またはその改変体の少なくとも一部を含む。１つの実施形態において、本発明のＣＯＰ１、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＰｉｒｈ２のインヒビターは、ＣＯＰ１、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＰｉｒｈ２、またはＣＯＰ１、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＰｉｒｈ２をコードする遺伝子（これらの遺伝子の非翻訳領域を含む）に結合することにより阻害する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体において癌を診断する方法であって、該方法は、以下：
該被験体由来の該癌のサンプルにおけるＣＯＰ１分子を検出する工程であって、コントロールに対する該ＣＯＰ１分子の過剰発現が癌を示す、工程
を包含する、方法。
（項目２）
上記サンプルにおけるｐ５３分子を検出する工程をさらに包含し、ここでｐ５３の発現レベルにおける減少、またはｐ５３活性の阻害が癌を示す、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ｐ５３分子が、野生型である、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記ｐ５３分子が、ヒトｐ５３分子である、項目２または項目３に記載の方法。
（項目５）
上記ｐ５３分子が、ｐ５３ポリペプチドである、項目２から項目４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
上記ｐ５３ポリペプチドが、上記ｐ５３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用して検出される、項目５に記載の方法。
（項目７）
ｐ５３ポリペプチドが、免疫組織化学を使用して検出される、項目５に記載の方法。
（項目８）
上記ｐ５３活性が、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導性アポトーシスの阻害、およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少の少なくとも１つからなる群から選択される、項目２から項目７のいずれか１つに記載の方法。
（項目９）
上記ＣＯＰ１分子が、ヒトＣＯＰ１である、項目１から項目８のいずれか１つに記載の方法。
（項目１０）
上記ＣＯＰ１分子が、ＣＯＰ１ポリペプチドである、項目１から項目９のいずれか１つに記載の方法。
（項目１１）
上記ＣＯＰ１ポリペプチドが、該ＣＯＰ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用して検出される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記ＣＯＰ１ポリペプチドが、免疫組織化学を使用して検出される、項目１０または項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記ＣＯＰ１分子が、ＣＯＰ１  ｍＲＮＡである、項目１から項目１０のいずれか１つに記載の方法。
（項目１４）
上記ＣＯＰ１  ｍＲＮＡがインサイチュハイブリダイゼーションを使用して検出される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記サンプルにおけるｐ２１分子を検出する工程をさらに包含し、ここで、ｐ２１の発現レベルにおける減少が癌を示す、項目１から項目１４のいずれか１つに記載の方法。
（項目１６）
上記被験体が、ヒトである、項目１から項目１５のいずれか１つに記載の方法。
（項目１７）
上記癌が、野生型ｐ５３を発現する癌である、項目１から項目１６のいずれか１つに記載の方法。
（項目１８）
上記癌が、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌および移行性細胞癌の少なくとも１つから成る群から選択される、項目１から項目１７のいずれか１つに記載の方法。
（項目１９）
上記卵巣癌が、漿液性腺癌、類内膜腺癌、明細胞腺癌および粘液性腺癌から成る群の少なくとも１つから選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
被験体における癌療法の有効性をモニタリングするための方法であって、該方法は、以下：
該被験体由来のサンプルを提供する工程；および
該サンプルにおけるＣＯＰ１分子を検出する工程であって、コントロールに対する該ＣＯＰ１分子の過剰発現の減少が、該癌療法が有効であることを示す、工程；
を包含する、方法。
（項目２１）
癌を有する被験体に対する予後を評価する方法であって、該方法は、以下：
被験体由来のサンプルを提供する工程；および
該サンプルにおけるＣＯＰ１分子を検出する工程であって、コントロールに対するＣＯＰ１分子の過剰発現の減少が、改善された予後を示す、工程；
を包含する、方法。
（項目２２）
上記サンプルにおけるｐ５３分子を検出する工程をさらに包含し、ここでｐ５３の発現レベルにおける増加またはｐ５３活性における増加が、有効な癌療法または改善された予後を示す、項目２０または項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記ｐ５３分子が、野生型である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記ｐ５３分子が、ヒトｐ５３分子である、項目２２または項目２３に記載の方法。
（項目２５）
上記ｐ５３分子が、ｐ５３ポリペプチドである、項目２２から項目２４のいずれか１つに記載の方法。
（項目２６）
上記ｐ５３ポリペプチドが、該ｐ５３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用して検出される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
ｐ５３ポリペプチドが、免疫組織化学を使用して検出される、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
上記ｐ５３活性が、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導性アポトーシスの阻害、およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少の少なくとも１つを含む群から選択される、項目２２から項目２７のいずれか１つに記載の方法。
（項目２９）
上記ＣＯＰ１分子が、ヒトＣＯＰ１である、項目２０から項目２８のいずれか１つに記載の方法。
（項目３０）
上記ＣＯＰ１分子が、ＣＯＰ１ポリペプチドである、項目２０から項目２９のいずれか１つに記載の方法。
（項目３１）
上記ＣＯＰ１ポリペプチドが、該ＣＯＰ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用して検出される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記ＣＯＰ１ポリペプチドが、免疫組織化学を使用して検出される、項目３０または項目３１に記載の方法。
（項目３３）
上記ＣＯＰ１分子が、ＣＯＰ１  ｍＲＮＡである、項目２０から項目２９のいずれか１つに記載の方法。
（項目３４）
上記ＣＯＰ１  ｍＲＮＡが、インサイチュハイブリダイゼーションを使用して検出される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上記サンプルにおけるｐ２１分子を検出する工程をさらに包含し、ここでｐ２１の発現レベルにおける減少が、癌を示す、項目２０から項目３４のいずれか１つに記載の方法。
（項目３６）
上記被験体が、ヒトである、項目２０から項目３５のいずれか１つに記載の方法。
（項目３７）
上記癌が、野生型ｐ５３を発現する癌である、項目２０から項目３６のいずれか１つに記載の方法。
（項目３８）
上記癌が、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌および移行性細胞癌の少なくとも１つから成る群から選択される、項目２０から項目３７のいずれか１つに記載の方法。
（項目３９）
上記卵巣癌が、漿液性腺癌、類内膜腺癌、明細胞腺癌および粘液性腺癌から成る群の少なくとも１つから選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
癌を有すると診断されたか、または癌の危険性があると診断された被験体において癌を処置する方法であって、該方法は、該被験体に、治療有効量のＣＯＰ１の発現を阻害する第１化合物を投与する工程を包含する、方法。
（項目４１）
ＭＤＭ２、またはＰｉｒｈ２の発現を阻害する第２化合物の治療有効量を上記被験体に投与する工程をさらに包含する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
上記第１化合物または第２化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三本鎖形成オリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ分子から成る群の少なくとも１つから選択される、項目４０または項目４１に記載の方法。
（項目４３）
上記第１化合物または第２化合物が、上記癌を癌療法に対して感作させる、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
上記癌療法を施す工程をさらに包含する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
上記第１化合物または第２化合物が、上記癌療法の前に施される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
上記第１化合物または第２化合物が、上記癌療法中に投与される、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
上記癌療法が、放射線治療または化学療法を含む、項目４３から項目４６のいずれか１つに記載の方法。
（項目４８）
上記癌が、野生型ｐ５３を発現する癌である、項目４０から項目４７のいずれか１つに記載の方法。
（項目４９）
ＣＯＰ１が、コントロールと比較して癌において過剰発現される、項目４０から項目４８のいずれか１つに記載の方法。
（項目５０）
ｐ５３発現レベルが、コントロールと比較して癌において減少される、項目４０から項目４９のいずれか１つに記載の方法。
（項目５１）
ｐ２１発現レベルが、コントロールと比較して癌において減少される、項目４０から項目５０のいずれか１つに記載の方法。
（項目５２）
上記被験体がヒトである、項目４０から項目５１のいずれか１つに記載の方法。
（項目５３）
ＣＯＰ１分子のｐ５３分子への結合に干渉する試験化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、ならびに該第１ポリペプチドおよび該第２ポリペプチドの結合に干渉する能力について試験される試験化合物を、容器中に提供する工程と；
ｂ）該第２ポリペプチドと結合するか、置換されるか、または結合するのを妨害される該第１ポリペプチドの量を定量する工程と、
を包含し、
ここで、該第１ポリペプチドはＣＯＰ１ポリペプチドであり、かつ該第２ポリペプチドはｐ５３ポリペプチドであるか、または、該第１ポリペプチドはｐ５３ポリペプチドであり、かつ該第２ポリペプチドはＣＯＰ１ポリペプチドであり；そして、該第２ポリペプチドと結合する該第１ポリペプチドの量を減少させる化合物、または該第２ポリペプチドと結合する該第１ポリペプチドを置換する化合物、または該第１ポリペプチドが該第２ポリペプチドと結合するのを妨害する化合物が、ＣＯＰ１分子とｐ５３分子との結合に干渉する化合物として同定される、方法。
（項目５４）
上記試験化合物がＣＯＰ１活性を調節するか否かを決定する工程をさらに包含する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
上記ＣＯＰ１活性が、ｐ５３の分解、ｐ５３のユビキチン化、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導性アポトーシスの阻害およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少から成る群の少なくとも１つから選択される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
上記ＣＯＰ１が、ヒトＣＯＰ１である、項目５３から項目５５のいずれか１つに記載の方法。
（項目５７）
上記ｐ５３が、ヒトｐ５３である、項目５３から項目５６のいずれか１つに記載の方法。
（項目５８）
ＣＯＰ１分子のｐ５３分子への結合に干渉する試験化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）第１ポリペプチドをコードする核酸分子と作動可能に連結された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む第１核酸分子、第２ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結されたトランス活性化ドメインを含む第２核酸分子、該配列特異的ＤＮＡ結合ドメインにより認識され得る配列に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む第３核酸分子、ならびに細胞における該第１ポリペプチドおよび該第２ポリペプチドの結合に干渉する能力を試験される試験化合物を提供する工程であって、該第１ポリペプチドはＣＯＰ１で
あり、かつ該第２ポリペプチドはｐ５３ポリペプチドであるか、または該第１ポリペプチドはｐ５３ポリペプチドであり、かつ該第２ポリペプチドはＣＯＰ１ポリペプチドである工程と、
ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを決定する工程であって、ここで該レポーター遺伝子の発現を減少させる化合物がＣＯＰ１分子のｐ５３分子への結合に干渉する化合物である工程と、
を包含する、方法。
（項目５９）
上記試験化合物がＣＯＰ１活性を調節するか否かを決定する工程をさらに包含する、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
上記ＣＯＰ１活性が、ｐ５３の分解、ｐ５３のユビキチン化、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導性アポトーシスの阻害およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少から成る群の少なくとも１つから選択される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
上記ＣＯＰ１が、ヒトＣＯＰ１である、項目５８から項目６０のいずれか１つに記載の方法。
（項目６２）
上記ｐ５３が、ヒトｐ５３である、項目５８から項目６１のいずれか１つに記載の方法。
（項目６３）
ｐ５３の活性を阻害する試験化合物についてスクリーニングする方法であって、該方法は、ＣＯＰ１に結合する試験化合物で哺乳動物細胞を処理する工程、および該処理された細胞におけるｐ５３を検出する工程を包含する、方法。
（項目６４）
上記検出する工程が、ｐ５３の分解、ｐ５３のユビキチン化、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導性アポトーシスの阻害およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少から成る群の少なくとも１つを決定する工程を包含する、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
上記哺乳動物細胞が、ＣＯＰ１を発現するように設計されている、項目６３または項目６４に記載の方法。
（項目６６）
上記哺乳動物細胞が、ｐ５３を発現するように設計されている、項目６３から項目６５のいずれか１つに記載の方法。
（項目６７）
上記ＣＯＰ１が、ヒトＣＯＰ１である、項目６３から項目６６のいずれか１つに記載の方法。
（項目６８）
上記ｐ５３が、ヒトｐ５３である、項目６３から項目６７のいずれか１つに記載の方法。
（項目６９）
癌を有すると診断されたか、または癌の危険があると診断された被験体における癌を処置する医薬の調製のための、ＣＯＰ１分子の発現を阻害するかまたはＣＯＰ１リガーゼ活性を阻害する化合物の、使用。
（項目７０）
コントロールと比較して、上記癌がＣＯＰ１分子の過剰発現を有する、項目６９に記載の使用。
（項目７１）
コントロールと比較して、上記癌がｐ５３活性を減少する、項目６９または項目７０に記載の使用。
（項目７２）
コントロールと比較して、上記癌が、該癌におけるｐ５３レベルの減少を有する、項目６９から項目７１のいずれか１つに記載の使用。
（項目７３）
コントロールと比較して、上記癌が、該癌におけるｐ２１レベルの減少を有する、項目６９から項目７２のいずれか１つに記載の使用。
（項目７４）
上記野生型ｐ５３が、上記癌において発現する、項目６９から項目７３のいずれか１つに記載の使用。
（項目７５）
上記化合物が、ＣＯＰ１を標的とするＲＮＡｉである、項目６９から項目７４のいずれか１つに記載の使用。
（項目７６）
ＭＤＭ２またはＰｉｒｈ２の発現を阻害する化合物の使用をさらに含む、項目６９から項目７４のいずれか１つに記載の使用。
（項目７７）
上記ＣＯＰ１が、ヒトＣＯＰ１である、項目６９から項目７６のいずれか１つに記載の方法。
（項目７８）
上記ｐ５３が、ヒトｐ５３である、項目６９から項目７７のいずれか１つに記載の方法。
（項目７９）
上記ＭＤＭ２が、ヒトＭＤＭ２である、項目６９から項目７８のいずれか１つに記載の方法。
（項目８０）
上記Ｐｉｒｈ２が、ヒトＰｉｒｈ２である、項目６９から項目７９のいずれか１つに記載の方法。
（項目８１）
哺乳動物細胞におけるｐ５３活性を阻害する方法であって、該方法は、細胞においてＣＯＰ１を過剰発現させる工程、およびＣＯＰ１を過剰発現する該細胞におけるｐ５３を検出する工程を包含する、方法。
（項目８２）
上記検出する工程が、ｐ５３の分解、ｐ５３のユビキチン化、ｐ５３依存性トランス活性化の阻害、ｐ５３誘導性アポトーシスの阻害およびｐ２１  ｍＲＮＡレベルの減少から成る群の少なくとも１つを決定する工程を包含する、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
上記哺乳動物細胞が、ｐ５３を発現するように設計されている、項目８１または項目８２のいずれか１つに記載の方法。
（項目８４）
上記ｐ５３が、野生型ｐ５３である、項目８１から項目８３のいずれか１つに記載の方法。
（項目８５）
上記哺乳動物細胞が、減少したＭＤＭ２活性の発現を有するように設計されている、項目８１から項目８４のいずれか１つに記載の方法。
（項目８６）
上記哺乳動物細胞が、Ｐｉｒｈ２活性の発現を減少するように設計されている、項目８１から項目８５のいずれか１つに記載の方法。
（項目８７）
上記ＣＯＰ１が、ヒトＣＯＰ１である、項目８１から項目８６のいずれか１つに記載の方法。
（項目８８）
上記ｐ５３が、ヒトｐ５３である、項目８１から項目８７のいずれか１つに記載の方法。
（項目８９）
上記ＭＤＭ２が、ヒトＭＤＭ２である、項目８１から項目８８のいずれか１つに記載の方法。
（項目９０）
上記Ｐｉｒｈ２が、ヒトＰｉｒｈ２である、項目８１から項目８９のいずれか１つに記載の方法。
（項目９１）
ｐ５３分子をコードする組換え核酸分子および哺乳動物ＣＯＰ１分子をコードする組換え核酸分子を含む、哺乳動物細胞。
（項目９２）
減少したＣＯＰ１活性および減少したＭＤＭ２活性を有するように設計された、哺乳動物細胞。
（項目９３）
減少したＣＯＰ１活性および減少したＰｉｒｈ２活性を有するように設計された、哺乳動物細胞。
（項目９４）
減少したＣＯＰ１活性、減少したＭＤＭ２活性および減少したＰｉｒｈ２活性を有するように設計された、哺乳動物細胞。
（項目９５）
上記哺乳動物細胞が、ｐ５３を発現するようにさらに設計された、項目９１から項目９４のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞。
（項目９６）
減少したＭＤＭ２活性、減少したＰｉｒｈ２活性および増加したＣＯＰ１活性を有するように設計された、哺乳動物細胞。
（項目９７）
減少したｐ５３活性および増加したＣＯＰ１活性、または正常ＣＯＰ１活性を有するように設計された、哺乳動物細胞。
（項目９８）
上記活性が、ＲＮＡｉ法により減少される、項目９１から項目９７のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞。
（項目９９）
上記ＣＯＰ１活性が、上記細胞にＣＯＰ１分子をコードするＤＮＡ分子を導入することにより増加される、項目９１から項目９８のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞。
（項目１００）
ＣＯＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む第１核酸分子、ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結されたトランス活性化ドメインを含む第２核酸分子、および該配列特異的ＤＮＡ結合ドメインにより認識され得る配列に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む第３核酸分子を含む、細胞。
（項目１０１）
ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む第１核酸分子、ＣＯＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結されたトランス活性化ドメインを含む第２核酸分子、および該配列特異的ＤＮＡ結合ドメインにより認識され得る配列に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む第３核酸分子を含む、細胞。
（項目１０２）
上記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼである、項目１００または項目１０１に記載の哺乳動物細胞。
（項目１０３）
ｐ５３分子へのＣＯＰ１細胞の結合に干渉する試験化合物についてスクリーニングするための、項目９１から項目１０２のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞の使用。
（項目１０４）
サンプルにおけるＣＯＰ１分子を検出するための試薬、および癌細胞を含むサンプルにおけるＣＯＰ１分子を検出するための指示を含む包装挿入物を含む、キット。
（項目１０５）
上記癌細胞が、野生型ｐ５３を発現する癌細胞である、項目１０４に記載のキット。
（項目１０６）
上記癌細胞が、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌および移行性細胞癌から成る群から選択される、項目１０４または項目１０５に記載のキット。
（項目１０７）
上記卵巣癌が、漿液性腺癌、類内膜腺癌、明細胞腺癌および粘液性腺癌から成る群の少なくとも１つから選択される、項目１０４から項目１０６のいずれか１つに記載のキット。
（項目１０８）
上記キットが、サンプルにおけるｐ５３分子を検出するための試薬をさらに含む、項目１０４から項目１０７のいずれか１つに記載のキット。
（項目１０９）
サンプルにおけるＣＯＰ１分子を検出するための試薬およびサンプルにおけるｐ５３分子を検出するための試薬を含む、キット。
（項目１１０）
薬学的に受容可能なキャリアとともに、ＣＯＰ１の発現を阻害する化合物を含む、薬学的組成物。
（項目１１１）
薬学的に受容可能なキャリアとともに、ＭＤＭ２またはＰｉｒｈ２の発現を阻害する化合物をさらに含む、項目１１０に記載の薬学的組成物。
（項目１１２）
上記化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三本鎖形成オリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ分子から成る群のうちの少なくとも１つから選択される、項目１１０または項目１１１に記載の薬学的組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】ＣＯＰ１、およびｐ５３とのＣＯＰ１の相互作用。Ａ：Ｆｌａｇ−ペプチドベースの溶出からの銀染色したＳＤＳ。質量分析法による適合ペプチド（下線部）を伴うｐ５３タンパク質（下のパネル）（配列番号１）の配列。Ｂ：ＣＯＰ１は、インビボで外因性ｐ５３と相互作用する。Ｓａｏｓ−２細胞を、示されるように、トランスフェクションし、免疫沈降し、そして免疫ブロット（ウェスタンブロット、ＷＢ）した。
【図１−２】ＣＯＰ１、およびｐ５３とのＣＯＰ１の相互作用。Ｃ：ＣＯＰ１は、インビボで外因性ｐ５３と相互作用する。Ｕ２−ＯＳ細胞を、示されるように、ＣＯＰ１でトランスフェクションするか、またはＣＯＰ１なしでトランスフェクションし、免疫沈降し、そして免疫ブロットした。Ｄ：内因性ｐ５３は、内因性ＣＯＰ１と相互作用する。Ｕ２−ＯＳ細胞を、抗ｐ５３または抗Ｍｙｃで免疫沈降し、そして抗ＣＯＰ１で免疫ブロットした。Ｅ：ＣＯＰ１は、インビトロでｐ５３と相互作用する。ＧＳＴまたはＧＳＴ−ｐ５３を、インビトロで翻訳されたＨＡ−ＣＯＰ１と一緒にインキュベートし、そして結合したＣＯＰ１を、抗ＨＡ免疫ブロッティングにより検出した。この下のパネルは、ＨＡ−ＣＯＰ１の総インプット量の２０％を示す。
【図２−１】ＣＯＰ１は、ｐ５３発現およびトランス活性化活性を負に制御し、そして、ＭＤＭ２またはＰｉｒｈ２の非存在下でｐ５３を分解する能力を維持する。Ａ：ＣＯＰ１は、外因性ｐ５３タンパク質の定常状態レベルを妨害する。ＣＯＰ１、またはＣＯＰ１ΔＲＩＮＧを、ｐ５３でＳａｏｓ−２（ｐ５３非存在）細胞へとトランスフェクションし、そして、ｐ５３の定常状態レベルは、免疫ブロッティングにより評価された。Ｂ：ＣＯＰ１は、内因性ｐ５３タンパク質の定常状態レベルを妨害する。ＣＯＰ１またはＣＯＰ１ΔＲＩＮＧを、Ｕ２−ＯＳ細胞へとトランスフェクションし、そして内因性ｐ５３の定常状態レベルを、免疫ブロッティングにより評価した。Ｃ：ＣＯＰ１は、ｐ５３  ｍＲＮＡレベルを改変しない。ＣＯＰ１、またはＣＯＰ１ΔＲＩＮＧでトランスフェクションされたＵ２−ＯＳ細胞由来のＲＮＡが抽出され、そしてｐ５３  ｍＲＮＡレベルがリアルタイムＰＣＲにより評価され、βアクチンのｍＲＮＡによって正規化した。Ｄ：ＣＯＰ１は、ｐ５３代謝回転を増加させる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＣＯＰ１でトランスフェクションされるか、またはＣＯＰ１なしでトランスフェクションされ、そして内因性ｐ５３の半減期は、パルスチェイス代謝標識によって測定した。
【図２−２】ＣＯＰ１は、ｐ５３発現およびトランス活性化活性を負に制御し、そして、ＭＤＭ２またはＰｉｒｈ２の非存在下でｐ５３を分解する能力を維持する。Ｅ：ｐ５３のＣＯＰ１分解は、機能的２６Ｓプロテアソームを必要とする。溶解物を収集する６時間前にプロテアソームインヒビターＡＬＬＮで処理したか、またはプロテアソームインヒビターＡＬＬＮなしで処理した場合を除いて、Ｕ２−ＯＳ細胞は、Ｂと同様にトランスフェクションした。Ｆ：ＣＯＰ１は、インビボでｐ５３のユビキチン化を促進する。Ｓａｏｓ−２細胞を、ＨＡ−ユビキチン、ｐ５３およびＣＯＰ１、またはＣＯＰ１ΔＲＩＮＧでトランスフェクションし、そしてＡＬＬＮで処理した。ユビキチン化されたｐ５３が、抗ＨＡを用いた免疫沈降および抗ｐ５３を用いた免疫ブロッティングによって検出された。Ｇ：ＣＯＰ１は、インビボでｐ５３を直接ユビキチン化する。細菌的に発現され、精製されたユビキチン成分は、示されるようにインビトロで翻訳され、免疫沈降されたｐ５３と一緒に、インキュベートされた。ユビキチン化されたｐ５３は、抗Ｆｌａｇで検出され、そして、＞５３キロダルトンの生成物として表される。Ｈ：ＣＯＰ１は、ｐ２１プロモーター上のｐ５３のトランス活性化機能を抑制する。Ｓａｏｓ−２細胞は、ｐ２１−Ｌｕｃレポーターおよび内部コントロールｐＣＭＶ−ｂ−Ｇａｌプラスミドを含有するｐ５３およびＣＯＰ１、またはＣＯＰ１ΔＲＩＮＧでトランスフェクションした。ＲＬＵ（相対照度単位）。Ｉ：ＣＯＰ１は、ｐ５３依存性アポトーシスを阻害する。Ｓａｏｓ−２細胞を、示されるようにｐ５３およびＣＯＰ１でトランスフェクションした。一時的にトランスフェクションされた細胞を、ＥＧＦＰの共トランスフェクションにより選択し、そして得られたサブＧ１集団を、細胞死の概算のためにヨウ化プロピジウム染色により評価した。
【図２−３】ＣＯＰ１は、ｐ５３発現およびトランス活性化活性を負に制御し、そして、ＭＤＭ２またはＰｉｒｈ２の非存在下でｐ５３を分解する能力を維持する。Ｊ：ＣＯＰ１は、ＭＤＭ２依存様式でｐ５３分解を促進する。ｐ５３／ＭＤＭ２欠損マウスに由来するＭＥＦを、示されるような構築物でトランスフェクションし、そして溶解物を、ｐ５３、アクチン、ＭＤＭ２およびＦＬＡＧに対する抗体を用いる免疫ブロッティングに供した。Ｋ：ＣＯＰ１は、Ｐｉｒｈ２依存様式でｐ５３分解を促進する。Ｓａｏｓ−２細胞は、ｓｉＲＮＡによりＰｉｒｈ２を消耗し、そして、引き続いて、ｐ５３およびＦＬＡＧ−ＣＯＰ１、またはＭＤＭ２でトランスフェクションした。ｐ５３の定常状態レベルについての効果は、免疫ブロッティングによって評価した。Ｐｉｒｈ２  ｍＲＮＡ除去は、リアルタイムＰＣＲによって確認した。Ｌ：ＣＯＰ１は、ｂａｘプロモーター由来のｐ５３依存性転写を阻害する。Ｓａｏｓ−２細胞を、レポーターｂａｘ−Ｌｕｃおよび内部コントロールｐＣＭＶ−β−Ｇａｌを組み込んでいるｐ５３およびＦＬＡＧ−ＣＯＰ１、またはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧでトランスフェクションした。相対的なトランス活性化活性は、ルシフェラーゼをβ−Ｇａｌ活性に対して正規化することによって評価した。Ｍ：ＣＯＰ１は、内因性ｐ５３のトランス活性化活性を阻害する。Ｕ２−ＯＳ細胞を、ｐＧ１３−Ｌｕｃ、またはＮＳ−Ｌｕｃで、および増加量のＦＬＡＧ−ＣＯＰ１、またはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧを含有するｐＣＭＶβ−Ｇａｌでトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、１０μＭエトポシド、またはＤＭＳＯでトランスフェクションし、処理の６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図３】ＣＯＰ１のｓｉＲＮＡ抑制は、ｐ５３タンパク質の蓄積を引き起こし、そしてＧ１停止を誘発する。Ａ：ＣＯＰ１のｓｉＲＮＡ抑制は、ｐ５３タンパク質の定常状態レベルを増加させ、そしてｐ２１遺伝子およびＰｉｒｈ２遺伝子のトランス活性化を増加させる。Ｕ２−ＯＳ細胞およびＨ１２９９細胞を、ＣＯＰ１またはコントロールとしての逆向きにされたＣＯＰ１に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。溶解物を、示される抗体で免疫ブロットし、そして標的遺伝子のｍＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって検出した。Ｂ：ＣＯＰ１のｓｉＲＮＡ抑制は、ｐ５３依存性であるＧ１停止を誘発する。Ｕ２−ＯＳ（Ｂ）細胞またはＨ１２９９（Ｃ）細胞を、ＣＯＰ１または逆向きのＣＯＰ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、そして細胞周期プロファイルを、ヨウ化プロピジウム染色およびＦＡＣＳによって測定した。Ｃ：ＣＯＰ１のｓｉＲＮＡ抑制は、ｐ５３依存性であるＧ１停止を誘発する。Ｕ２−ＯＳ（Ｂ）細胞またはＨ１２９９（Ｃ）細胞を、ＣＯＰ１または逆向きのＣＯＰ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、そして細胞周期プロファイルを、ヨウ化プロピジウム染色およびＦＡＣＳによって測定した。Ｄ：２つのさらに別個のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによるＣＯＰ１抑制は、タンパク質レベルにおけるｐ５３の蓄積を引き起こす。Ｕ２−ＯＳ細胞を、ＣＯＰ１  ｓｉＲＮＡ２か、またはＣＯＰ１  ｓｉＲＮＡ３かのいずれか、および溶解物でトランスフェクションした。
【図４−１】ｓｉＲＮＡによるＣＯＰ１、Ｐｉｒｈ２およびＭＤＭ２抑制は、ｐ５３を安定化および活性化する。Ａ：ＣＯＰ１の抑制は、ｐ５３を安定化する。Ｕ２−ＯＳ細胞を、ＣＯＰ１、ＭＤＭ２および／またはＰｉｒｈ２に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、引き続いて、示された時間パルスチェイスした。次いで、溶解物を収集し、抗ｐ５３で免疫沈降し、そして蛍光影像器において定量した。Ｂ：ｐ５３のトランス活性化活性は、ＣＯＰ１の減少の際に増加する。Ｕ２−ＯＳ細胞を、示されるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびｐ２１−Ｌｕｃレポーターでトランスフェクションし、そして相対的なトランス活性化活性を、ルシフェラーゼを内部トランスフェクションコントロール（ｐＣＭＶ−β−Ｇａｌ活性）に対して正規化することによって測定した。Ｃ：ｐ５３およびその下流の標的ｐ２１は、ＣＯＰ１の抑制に応答してタンパク質レベルで蓄積し、さらにＭＤＭ２の共抑制によって刺激される。ｂからの溶解物を、ｐ５３、ｐ２１、アクチン、ＭＤＭ２およびＣＯＰ１に対する抗体でプローブした。
【図４−２】ｓｉＲＮＡによるＣＯＰ１、Ｐｉｒｈ２およびＭＤＭ２抑制は、ｐ５３を安定化および活性化する。Ｄ：ＣＯＰ１は、正常細胞においてｐ５３を負に制御する。ＢＪ線維芽細胞を、ＣにおけるようにｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、そして溶解物を収集し、ｐ５３、ｐ２１、アクチン、ＭＤＭ２およびＣＯＰ１に対する抗体で免疫ブロットした。Ｅ：ｓｉＲＮＡによるＣＯＰ１およびＭＤＭ２の除去は、Ｕ２−ＯＳ細胞をＩＲ誘導性細胞死に感作させる。Ｕ２−ＯＳ細胞は、示されるように、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで事前処理し、２０  Ｇｙ  ＩＲに供し、そして細胞死をヨウ化プロピジウム染色によって測定した。
【図５】ＣＯＰ１は、ｐ５３誘導性遺伝子である。Ａ：ＣＯＰ１プロモーター上のｐ５３コンセンサス部位の同定。下線部の配列は、ｐ５３十量体である。Ｂ：ＣＯＰ１プロモーターからのｐ５３コンセンサス部位は、ｐ５３依存性転写を行い得る。２コピーのｐ５３に対するＣＯＰ１コンセンサス部位を、ｐＧＬ３プロモータールシフェラーゼレポーター構築物の上流に導入し、そして野生型ｐ５３または突然変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈで共トランスフェクションした。相対活性を、ｐＣＭＶ−β−Ｇａｌ活性に対して正規化することによって測定した。Ｃ：ＣＯＰ１  ｍＲＮＡは、ｐ５３によって誘導される。Ｈ１２９９細胞を、ｐ５３またはＲ１７５Ｈ突然変異体でトランスフェクションし、そしてＲＮＡを分離し、ＣＯＰ１  ｍＲＮＡおよび正規化されたｔｏｂ−アクチンｍＲＮＡに対して特異的であるプローブを使用するリアルタイムＰＣＲに供した。Ｄ：ＣＯＰ１タンパク質レベルは、ｐ５３によって増加される。Ｃからの溶解物を、ｐ５３、ｐ２１、アクチンおよびＣＯＰ１に対する抗体で免疫ブロットした。Ｅ：ＣＯＰ１タンパク質レベルは、ＩＲに応答して増加される。Ｕ２−ＯＳ細胞を、１０  Ｇｙ  ＩＲで照射し、そして８時間後に収集した。溶解物を、ｐ５３、アクチンおよびＣＯＰ１に対する抗体で免疫ブロットした。
【図６】ＣＯＰ１のマウス組織における発現。Ａ：正常な精巣におけるＣＯＰ１のＩＳＨ分析。左のパネルは、明視野を表し、右のパネルは、暗視野を表す。Ｂ：第１鎖ｃＤＮＡパネルを使用した完全長ＣＯＰ１のＲＴ−ＰＣＲ。Ｃ：完全長ＣＯＰ１発現のノザンブロット分析。
【図７】卵巣腺癌におけるＣＯＰ１過剰発現。Ａ：卵巣腫瘍由来のｃｏｐ１  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析。ＲＮＡは、適合する正常コントロールと共に腫瘍サンプルから調製し、そして、リアルタイムＰＣＲ  Ｔａｑｍａｎ分析に供した。データは、適合した正常ｃｏｐ１  ｍＲＮＡに対する増加の倍数として示され、そしてＲＰＬ１９  ｍＲＮＡに対して正規化した。Ｂ：ＩＳＨによるｃｏｐ１  ｍＲＮＡの過剰発現。ｃｏｐ１発現は、腫瘍性上皮細胞において明白であったが、付随する支質においては明白ではなかった；正常卵巣細胞は陰性であった。Ｃ：卵巣腺癌のタンパク質レベルにおけるＣＯＰ１の過剰発現。Ｂと同じ卵巣腺癌例は、腫瘍性上皮細胞の細胞質および核においてＣＯＰ１免疫反応を示すが、付随する支質においては示さない。Ｄ：卵巣細胞におけるｐ５３遺伝子の状態、およびｐ２１  ｍＲＮＡにおける減少とＣＯＰ１過剰発現との相関関係。ＤＮＡを、Ａにおけるサンプルから抽出し、ｐ５３遺伝子のエキソン５〜８のＰＣＲに供した。この産物は、ＤＮＡ配列決定により分析され、そして野生型（ｗｔ）または突然変異体（ｍｕ）と指定される。ｐ５３遺伝子の状態の下のグラフは、過剰発現したＣＯＰ１がまた、ｐ２１  ｍＲＮＡを減少させた、Ａ由来の同じサンプルを示す。ｐ２１  ｍＲＮＡの相対レベルを、ＡのようにリアルタイムＰＣＲによって測定し、そしてＲＰＬ１９  ｍＲＮＡに対して正規化した。データは、ｐ２１メッセンジャーにおける減少倍数として示される。
【図８】乳房腺癌におけるＣＯＰ１の過剰発現。乳房腺癌の３２事例を含む組織マイクロアレイを、ＣＯＰ１発現についての免疫組織化学によって評価した。ＣＯＰ１免疫反応は、乳房腺癌の３２事例中２５事例において同定された。Ａ：腫瘍性上皮細胞においてＣＯＰ１免疫反応を示す、代表的な乳房腺癌。Ｂ：Ａに示される事例の、より大きな拡大図。Ｃ：同じ乳房腺癌は、分散した支質細胞は陽性であったが、腫瘍性上皮においてｐ５３免疫反応に対して陰性であった。Ｄ：Ｃに示される事例の、より大きな拡大図。Ｅ：乳房腺癌の１事例における陽性ｐ５３免疫反応。全体で、３２事例中３事例が、ｐ５３に対して陽性だった。Ｆ：Ｅにおいて示される事例の、より大きな拡大図。Ｇ：ｐ５３突然変異（アミノ酸置換Ｃ２４２Ｆをもたらす、ＧからＴへのトランスバージョン）を、ＥおよびＦにおいて示されたＩＨＣ陽性の事例において確認した。オリジナルの倍率：×１００（Ａ、ＣおよびＦ）；×２００（Ｂ、ＣおよびＦ）。
【図９】乳房腫瘍におけるＣＯＰ１定常状態レベルおよびｐ５３定常状態レベル。Ａ：溶解物を、正常乳房サンプルまたは腫瘍サンプルから収集し、そしてｐ５３、ＣＯＰ１およびアクチンに対する抗体を用いる免疫ブロッティングに供した。Ｂ：乳房腫瘍サンプルにおけるｐ５３遺伝子の状態。ＤＮＡを、Ａにおけるサンプルから抽出し、そしてｐ５３遺伝子のイントロン−エキソン境界およびエキソン５〜８のＰＣＲに供した。この産物は、ＤＮＡ配列決定によって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、部分的に、ＣＯＰ１が種々の癌において過剰発現していることを示し、そしてＣＯＰ１相互作用タンパク質として、腫瘍抑制タンパク質であるｐ５３を同定する。機能的に、ＣＯＰ１は、プロテアソームによってｐ５３を分解し、ＭＤＭ２依存性様式においてインビボでｐ５３を直接にユビキチン化し、インビトロではｐ５３トランス活性化電位を阻害し、そしてｐ５３誘導性アポトーシスを阻害する。さらに、ＣＯＰ１のｓｉＲＮＡ抑制は、ｐ５３を安定化させ、その下流の標的遺伝子であるｐ２１のトランス活性化を増加させ、その結果、この細胞周期のＧ１期において細胞を停止させる。ＣＯＰ１はまた、自己調節フィードバックループに関与するｐ５３誘導性遺伝子として同定された。さらに、ＣＯＰ１を過剰発現する癌は、ｐ２１  ｍＲＮＡの減少を示す。
【００２２】
したがって、ＣＯＰ１の過剰発現は、種々の癌、または種々の細胞型を診断するために使用され得る。幾つかの実施形態において、野生型ｐ５３を発現する細胞または組織におけるＣＯＰ１の過剰発現が、癌についての診断となる。
【００２３】
本発明の種々の代替的な実施形態および実施例が、本明細書中に記載される。これらの実施形態および実施例は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００２４】
（異常細胞増殖）
「細胞増殖性異常」および「増殖性異常」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う障害をいう。１つの実施形態において、この異常細胞増殖は、癌である。
【００２５】
「癌（ｃａｎｃｅｒ）」、「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）」、「新形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」、「悪性腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」、「癌性（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」、または「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」は、代表的に制御されない細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態をいうか、または説明することを意味する。一般的に、新生物または癌の細胞（例えば、新形成細胞）は、正常の細胞分裂制御から解放されている。すなわち、その成長または増殖が細胞環境における通常の生化学的影響および通常の物理的な影響によって調節されない細胞であり、そして、非制御成長、局部組織浸潤、転移などの特徴を示す。一般に、新生物細胞は、増殖し、良性または悪性のいずれかである細胞のクローンを形成する。それゆえ、癌または新生物という用語は、専門的には良性であるが、悪性になる危険を伴う細胞成長を包含する。「悪性」は、任意の細胞または任意の組織の異常成長または異常増殖を意味する。悪性細胞または悪性組織は、同じ型の正常細胞または正常組織と比較した場合に、分化／方向の脱分化または欠損を阻害し得、そして、浸潤能力および転移能力を示し得る。
【００２６】
本明細書中において使用される「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうと、全ての新形成細胞成長および新形成細胞増殖、ならびに全ての前癌性細胞および組織ならびに癌性細胞および癌性組織をいう。
【００２７】
ほとんどの癌は、以下の３つの広範な組織学的分類内に該当する：優性な癌であり、上皮細胞、または臓器、腺、もしくは他の身体構造（例えば、皮膚、子宮、肺、乳房、前立腺、胃、腸）の外部表面または内部表面を覆う細胞の癌であり、そして、転移しやすい、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；結合組織または支持組織（例えば、骨、軟骨、腱、靭帯、脂肪、筋肉）に由来する、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）；ならびに、骨髄およびリンパ組織に由来する、血液学的腫瘍。癌腫は、腺癌（乳房、肺、結腸、前立腺、または膀胱のような、分泌し得る器官または腺において一般に発症する）であることもあるし、または扁平細胞腺癌（扁平上皮において発生し、一般的に身体のほとんどの領域において発症する）であることもある。肉腫は、骨肉腫もしくは骨原性肉腫(骨）、軟骨肉腫（軟骨）、平滑筋肉腫（平滑筋）、横紋筋肉腫（骨格筋）、中皮肉腫もしくは中皮腫（体腔の膜の内張り）、繊維肉腫（繊維組織）、血管腫もしくは血管内皮芽細胞腫（血管）、脂肪肉腫（脂肪組織）、グリオームもしくは星状腫（脳において見られる神経性結合組織）、粘液肉腫（原始胚結合組織）、間葉組織腫もしくは混合中胚葉性腫瘍（混合結合組織型）であり得る。血液学的腫瘍は、骨髄の血漿細胞において発生する骨髄腫；「体液癌」であり、骨髄の癌であり、そして、骨髄性白血病もしくは顆粒球性白血病（骨髄性白血球および顆粒球性白血球）、リンパ性白血病、リンパ球性白血病もしくはリンパ芽球性白血病（リンパ球およびリンパ球性白血球）（例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性単核球性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病など、または真性多血球血症もしくは赤血病（種々の血球生成物、ただし赤血球が多い）であり得る、白血病；固形腫瘍であり得、リンパ系の腺もしくは節において発症し、ホジキンリンパ腫もしくは非ホジキンリンパ腫、またはバーキットリンパ腫などを含み得る、リンパ腫であり得る。さらに、腺扁平上皮癌、混合中胚葉性腫瘍、癌肉腫、または奇形腫などの混合型の癌も存在する。
【００２８】
癌はまた、癌が発生する器官、すなわち「原発部位」（例えば、乳房、脳、肺、肝臓、皮膚、前立腺、睾丸、膀胱、結腸、直腸、子宮頚部、子宮など）に基づいて命名され得る。この命名は、癌がその原発部位とは異なる、身体の別の部分に転移する場合にさえ維持され、そして本発明に従う癌は、原発癌だけでなく転移した癌も含む。
【００２９】
原発部位に基づいて命名された癌は、組織学的分類と相関し得る。例えば、肺癌は、一般に、扁平上皮細胞悪性腫瘍、腺癌、または大細胞型悪性腫瘍であり得る、小細胞型肺癌または非小細胞肺癌である；皮膚癌は、一般に、基底細胞癌、扁平上皮癌、または黒色腫（例えば、悪性黒色腫）である。リンパ腫は、腹部リンパ節、または腋性リンパ節もしくは鼠蹊部リンパ節とともに、頭部、首および乳房に付随するリンパ節において生じ得る。癌の型および段階の同定および分類は、例えば、Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｓ（ＳＥＥＲ）Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｕｔｉｔｕｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅ
ｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｕｂｌｉｃｄａｔａ／ａｃｃｅｓｓ．ｈｔｍｌ）（これは、アメリカ合衆国における癌の発生および生存に関する権威ある情報源であり、かつ世界中で認知されている。）によって提供された情報を使用することによって実施され得る。このＳＥＥＲ  Ｐｒｏｇｒａｍの発生および生存データは、具体的な癌の部位および段階に対する標準的な生存に対してアクセスするために使用され得る。例えば、最適な比較群を保証するために、具体的な基準が、診断および正確な段階のデータを含むデータから選択され得る。癌の同定はまた、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１７版、Ｍ．Ｈ．ＢｅｅｒｓおよびＲ．Ｂａｒｋｏｗ編、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳａｎｓ、１９９９のような診断マニュアルにおいて提供される情報を使用することによって実施され得る。
【００３０】
癌または新生物の例としてはまた、制限されずに、当業者には公知なように、形質転換および不死化された細胞、固形腫瘍、骨髄増殖性疾患、芽細胞腫、上皮細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、小細胞型肺癌を含む肺癌、非小細胞型肺癌、肺腺癌および肺上皮悪性腫瘍、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒまたはｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮悪性腫瘍、漿液性腺癌、類内膜腺癌、明細胞腺癌、粘液性腺癌、ブレンナー腫、奇形腫、未分化胚細胞腫、絨毛膜癌腫、繊維腫、顆粒膜細胞腫瘍、セルトリ−ライディヒ細胞腫瘍、未分化卵巣悪性腫瘍、唾液腺悪性腫瘍、腎臓癌、または腎性癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝性癌、肛門悪性腫瘍、ペニス悪性腫瘍、頭部および／または頚部の癌、ユーイング肉腫、血管内皮腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、末梢神経上皮腫、滑膜肉腫、ホジキン病などが挙げられる。
【００３１】
本発明による癌は、癌細胞または癌組織がＣＯＰ１分子を過剰発現ている任意の癌、またはＣＯＰ１活性がアップレギュレートされている任意の癌を包含する。幾つかの実施形態において、本発明による癌は、癌細胞または癌組織がまた、野生型ｐ５３分子を過剰発現している任意の癌を含む。
【００３２】
（ポリペプチド、核酸分子および試験化合物）
本発明による化合物は、制限されずに、ＣＯＰ１およびｐ５３の核酸分子、ポリペプチドおよび／またはアナログ、改変体、相同体ならびにそれらのフラグメントを含む。そのような化合物は、診断、予後、治療、スクリーニングなどの本発明の方法のいずれかにおいて使用され得る。化合物は、例えば、ＣＯＰ１またはｐ５３のペプチドもしくはペプチドアナログの任意の位置におけるアミノ酸残基を、他の保存的なアミノ酸残基（すなわち、同様の物理的特性、生物学的特性もしくは化学的特性を有する残基）または非保存的なアミノ酸残基で、置換、欠失、または挿入し、そしてｐ５３（化合物がＣＯＰ１分子である場合）またはＣＯＰ１（化合物がｐ５３分子である場合）に対する結合を媒介するこの化合物の能力をスクリーニングすることによって、調製され得る。幾つかの実施形態においては、本発明の化合物は、特異的にＣＯＰ１またはｐ５３（例えば、突然変異体ｐ５３または野生型ｐ５３）と結合する抗体を含む。このような抗体は、例えば、ヒト化された抗体であり得る。
【００３３】
抗体は、この抗体がある抗原を認識し、結合するが、サンプルにおける他の分子は実質的に認識せず、結合しない場合に、その抗原と「特異的に結合する」。例えば、ＣＯＰ１抗体は、ＣＯＰ１分子と特異的に結合するが、癌細胞または癌組織に存在する分子などの他のいかなる分子とも実質的に結合しない。幾つかの実施形態においては、ＣＯＰ１抗体は、ヒトＣＯＰ１分子と特異的に結合し得るが、他の種由来のＣＯＰ１分子とは特異的に結合し得ない。別の実施形態においては、ｐ５３抗体は、ｐ５３分子と特異的に結合するが、癌細胞または癌組織に存在する分子のような他のいかなる分子とも実質的に結合しない。幾つかの実施形態においては、ｐ５３抗体は、ヒトｐ５３分子と特異的に結合し得るが、他の種由来のｐ５３分子とは特異的に結合し得ない。幾つかの実施形態においては、ｐ５３抗体は、突然変異体ｐ５３分子と特異的に結合し得るが、野生型ｐ５３分子とは特異的に結合し得ない。幾つかの実施形態においては、ｐ５３抗体は、野生型ｐ５３分子と特異的に結合し得るが、突然変異体ｐ５３分子とは特異的に結合し得ない。ある抗原と特異的に結合する抗体は、例えば、サンプルにおける別の参照分子に対する抗体の親和性よりも、少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、または１００００倍大きいこの抗原に対する親和性を有する。
【００３４】
本明細書中で使用される「ＣＯＰ１分子」は、以下：ＣＯＰ１ポリペプチド；ＣＯＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子；ＣＯＰ１核酸分子；ならびにそれらのアイソフォーム、フラグメント、アナログ、または改変体と実質的に同一である分子をいう。例えば、ＣＯＰ１分子は、ｐ５３と結合する能力および／またはＣＯＰ１リガーゼ活性を有する、哺乳動物由来のＣＯＰ１ポリペプチドのアイソフォーム、フラグメント、アナログ、または改変体を含み得る。
【００３５】
ＣＯＰ１分子は、制限されずに、以下のアクセッション番号に示される配列と実質的に同一である配列を含むポリペプチド、または核酸分子を含む。
【００３６】
【化１−１】
2010223966.tif 000002
【００３７】
【化１−２】
2010223966.tif 000003
ＣＯＰ１分子は、Ｂｉａｎｃｈｉら３０、Ｗａｎｇら３９、Ｙｉら２０において記載される分子であり得る。ＣＯＰ１分子は、ＣＯＰ１のドメインに対応する配列、例えば、アクセッション番号ＮＰ＿０７１９０２（上記ＲＩＮＧドメイン）の残基１３６位から残基１７７位；アクセッション番号ＮＰ＿０７１９０２（コイルドコイルドメイン）の残基２３１位から残基３０６位；および／またはＮＰ＿０７１９０２（ＷＤ４０ドメイン）の残基４１０位から残基７２７位を含む分子を含み得る。幾つかの実施形態においては、ＣＯＰ１ポリペプチドは、ｐ５３ポリペプチドと直接に結合し、そして／またはｐ５３活性またはｐ５３機能を阻害し得る、本明細書中で示される配列と実質的に同一である分子を含む。いずれの具体的な仮説にも束縛されないが、ＣＯＰ１ポリペプチドはホモダイマーを形成し、ｐ５３を負に制御し得る。したがって、ＣＯＰ１分子は、ホモダイマー化し得る、本明細書中で示される配列と実質的に同一である分子を含み得る。幾つかの実施形態においては、本明細書中で示される配列を有するＣＯＰ１ポリペプチドまたは核酸分子は、本発明による特定の方法（例えば、ＣＯＰ１レベルを検出することによって、特定の癌（例えば、乳癌）を診断する方法）からは具体的に排除され得る。
【００３８】
「ｐ５３」は、３９３アミノ酸リンタンパク質をコードする、強力な腫瘍抑制タンパク質２６、２７である。ｐ５３は、多くの癌において負に調節されるか４０−４３、または突然変異される。ｐ５３の欠損またはｐ５３の不活性化は、癌に寄与し得る。広範に種々のｐ５３が存在する。「野生型」ｐ５３は、正常細胞（例えば、非癌性細胞）において見出されるｐ５３、または癌と相関がある突然変異体を有さないｐ５３である。サンプルのｐ５３の状態（例えば、このサンプルが、野生型ｐ５３を含むか、または突然変異体ｐ５３を含むかのいずれかであるか）は、例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎらに発行された米国特許第６，０９０，５６６号に記載されるように、または本明細書中に記載されるかもしくは当業者に公知な標準技術を使用して、評価され得る。ｐ５３分子は、制限されずに、例えば、アクセッション番号Ｐ０４６３７に示される配列と実質的に同一である配列を含むポリペプチドおよびこれらの配列によってコードされる核酸分子を含み得る。
【００３９】
ＭＤＭ２分子またはＰｉｒｈ２分子は、ポリユビキチン鎖を生成するために、Ｅ２酵素由来のユビキチン（例えば、ＵｂｃＨ５ｂ）を、複数のリジン残基上または基質結合体化ユビキチン上の基質に転移させるリガーゼを含み７−１０、そしてｐ５３のネガティブレギュレーターである７、２５。ＭＤＭ２分子またはＰｉｒｈ２分子は、アクセッション番号ＡＦ５２７８４０（ＭＤＭ２）およびアクセッション番号ＡＦ２５５６６６（Ｐｉｒｈ２）に示される配列と実質的に同一である配列を有する分子、およびそれらの配列によってコードされる核酸分子を含む。
【００４０】
ｐ２１、または「ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１」は、サイクリン依存性キナーゼの普遍的インヒビターとして元々は記載された。このｐ２１または「ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１」は、ｐ５３依存性機構およびｐ５３非依存性機構の両方によって誘導され、そして細胞増殖のインヒビターと考えられている。ｐ２１分子は、アクセッション番号Ｕ０３１０６において示される配列と実質的に同一である配列を有する分子、およびそれらの配列によってコードされる核酸分子を含む。
【００４１】
「実質的に同一である」配列は、本明細書中において考察される１つ以上の保存的な置換によって、またはアミノ酸分子もしくは核酸分子の生物学的機能を破壊しない配列位置における１つ以上の非保存的置換、欠失もしくは挿入によってのみ、参照配列と異なるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列である。このような配列は、例えば、Ｇｅｎｅｔｅｃｈによって開発されたＡｌｉｇｎ−２  Ｐｒｏｇｒａｍを使用した比較のために使用される配列に対してアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで最適に整列された場合に、１０％から９９％の任意の整数、またはより一般的には少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％もしくは６０％、または少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％、または約９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり得る。ポリペプチドに対しては、比較配列の長さは、少なくとも２個、５個、１０個もしくは１５個のアミノ酸、または少なくとも２０個、２５個もしくは３０個のアミノ酸であり得る。別の実施形態において、比較配列の長さは、少なくとも３５個、４０個もしくは５０個のアミノ酸、または６０個、８０個もしくは１００個を超えるアミノ酸であり得る。核酸分子に対しては、比較配列の長さは、少なくとも５個、１０個、１５個、２０個もしくは２５個のヌクレオチド、または少なくとも３０個、４０個もしくは５０個のヌクレオチドであり得る。別の実施形態において、比較配列の長さは、少なくとも６０個、７０個、８０個もしくは９０個のヌクレオチド、または１００個、２００個もしくは５００個を超えるヌクレオチドであり得る。
【００４２】
本明細書中における「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大パーセント配列の同一性を達成するように、配列をアライメントし（必要な場合には）ギャップを導入した後に、選択した配列のアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの市販のコンピュータソフトウェアを使用して、当該分野の技術内にある種々の方法において達成され得る。当業者は、比較される配列の全長に対する最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定し得る。しかしながら、本明細書中の目的に対して、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって、以下に記載されるように入手される。配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２は、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著され、そして、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５９９において使用者文書でファイルされた。このＡＬＩＧＮ−２は、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７の下に登録され、そして、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを介して市販されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）作動システム（好ましくは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄ）における使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターはこのＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変わらない。
【００４３】
あるいは、またはさらに、２つの核酸配列が、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合には、「実質的に同一」であり得る。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって迅速に決定され得、そして、一般に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な算出値である。一般的に、より長いプローブは、正確なアニーリングのためにより高温を必要とする一方で、より短いプローブは、より低温しか必要としない。ハイブリダイゼーションは、一般に、変性したＤＮＡの、相補鎖がその融点以下の環境で存在する場合に再アニールする能力に依存する。上記プローブとハイブリダイズし得る配列との間の所望される相同性の程度が高いほど、使用され得る相対的な温度も高くなる。結果として、より高温は、その反応条件をよりストリンジェントにする一方で、より低温は、その反応条件をストリンジェントではないようにする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００４４】
１つの実施形態によれば、上記ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件下にある。本明細書中に定義される「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェンシー条件」は、以下：（１）洗浄のために、低イオン強度および高温（例えば、５０℃における０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のラウリル硫酸ナトリウム）を用いる；（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアルデヒドのようなの変性剤（例えば、４２℃における７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有するｐＨ６．５の０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤を含有する５０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド）を用いる；または（３）５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％の硫酸デキストランを用いる溶液中での一晩のハイブリダイゼーション（０．２×ＳＳＣ中で４２℃で１０分間洗浄し、次いで５５℃においてＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる１０分間の高ストリンジェンシーの洗浄を行うことを伴う）、のようなものによって同定され得る。
【００４５】
「中ストリンジェント条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されるように同定され得、そして、上述のものよりもストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度およびＳＤＳ％）および洗浄溶液の使用を含む。中ストリンジェント条件の例は、以下：２０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液において３７℃にて一晩のインキュベーション（その後、約３７℃から約５０℃において１×ＳＳＣでフィルターを洗浄する）である。当業者は、プローブ長などの要素に適合するために必要とされる、温度、イオン強度などをどのように調整するかを認識する。
【００４６】
ハイブリダイゼーションは、約２０分から約３０分、または約２時間から約６時間、または約１０時間から約１５時間、または２４時間以上の時間に及び実行され得る。高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションもまた、高ストリンジェントなＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、単鎖遺伝的多型配座解析およびインサイチュハイブリダイゼーションなどの分子生物学者によって慣習的に実施される多数の技術の成功に依存する。ノザンハイブリダイゼーションおよびサザンハイブリダイゼーションと対照的に、それらの技術は、通常比較的に短いプローブ（例えば、ＰＣＲ、または配列決定のためには、通常約１６ヌクレオチド長以上およびインサイチュハイブリダイゼーションのためには、約４０ヌクレオチド長以上）で実行される。
【００４７】
生物学的に等価なポリペプチドを入手するために、このポリペプチドの生物学的機能を実質的に改変することなく、ポリペプチドの構造において幾つかの改変および変更を為し得ることは、当業者には周知である。本発明の１つの局面において、本発明のポリペプチドはまた、生物学的機能に影響しないアミノ酸置換によって、本発明のポリペプチドの配列の一部と異なる生物学的に等価なポリペプチドへと拡張される。
【００４８】
本明細書中で使用される、「保存的アミノ酸置換」という用語は、関連する機能の実質的には変更しない、このペプチドの所定の位置における別のペプチドとのアミノ酸の置換をいう。このような変更を行うことにおいて、類似のアミノ酸残基の置換は、側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらのサイズ、荷電、疎水性、親水性などに基づいて為され得、そしてこのような置換は、慣習的な試験によってそのペプチドの機能におけるその置換の影響についてアッセイされ得る。
【００４９】
本明細書中で使用される「アミノ酸」という用語は、天然に存在するタンパク質において共通して見出されるＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、および改変されたもののようなアミノ酸を意味する。したがって、本発明のアミノ酸は、例えば、以下：アミノアジピン酸；３−アミノアジピン酸；β−アラニン；β−アミノプロピオン酸；２−アミノ酪酸；４−アミノ酪酸；ピペリジニン酸（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、６−アミノカプロン酸；２−アミノへプタン酸；２−アミノイソ酪酸；３−アミノイソ酪酸；２−アミノピメリン酸；２，４ジアミノ酪酸；デスモシン；２，２’−ジアミノピメリン酸；２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎ−エチルグリシン；Ｎ−エチルアスパラギン；ヒドロキシリシン；アロ−ヒドロキシリシン；３−ヒドロキシプロリン；４−ヒドロキシプロリン；イソデスモシン；アロ−イソロイシン；Ｎ−メチルグリシン；サルコシン；Ｎ−メチルイソロイシン；６−Ｎ−メチルリジン；Ｎ−メチルバリン；ノルバリン；ノルロイシン；およびオルニチンを含み得る。
【００５０】
幾つかの実施形態において、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似する親水性の値（例えば、プラス２もしくはマイナス２、またはプラス１．５もしくはマイナス１．５、またはプラス１もしくはマイナス１、プラス０．５もしくはマイナス０．５の値の範囲内）を有する別のアミノ酸残基と置換する場合に為され得る。ここで、以下：
【化２】
2010223966.tif 000004
は、アミノ酸残基（米国特許番号第４，５５４，１０１号において詳説され、本明細書により参考として援用される）に割り当てられたＴｙｒ（−１．３）、またはＰｒｏ（−１．６）などの約−１．６のヒドロパチー指数を有するアミノ酸であり得る。
【００５１】
代替的な実施形態において、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似のヒドロパチー指数を有する別のアミノ酸残基と置換される場合に、為され得る（例えば、プラス２もしくはマイナス２、またはプラス１．５もしくはマイナス１．５、またはプラス１もしくはマイナス１、プラス０．５もしくはマイナス０．５の値の範囲内）。このような実施形態によれば、各アミノ酸残基は、以下：
【化３】
2010223966.tif 000005
の通り、疎水性および荷電特性を基礎にヒドロパチー指数を割り当てられ得る。
【００５２】
別の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、市販の類似マトリックスファミリーを使用して為され得る。
【００５３】
【数１−１】
2010223966.tif 000006
【数１−２】
2010223966.tif 000007
ＰＡＭマトリックスは進化モデルに由来する計数に基づく一方で、Ｂｌｏｓｕｍマトリックスは、アライメント内の高度に保存されたブロックに由来する計数に基づく。ＰＡＭマトリックスまたはＢｌｏｓｕｍマトリックスのいずれかにおける、ゼロを超える類似性スコアが、保存的アミノ酸置換を作製するために使用され得る。
【００５４】
別の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同じ種類の別のアミノ酸残基と置換する場合に、為され得る。この場合に、このアミノ酸は、以下：
【化４】
2010223966.tif 000008
のように、非極性種、酸性種、塩基性種および中性種に区別される。
【００５５】
保存的アミノ酸変更は、Ｌ−アミノ酸の保存的置換だけでなく、その対応するＤ−アミノ酸による、保守性Ｄ−アミノ酸による、または天然に存在しない、遺伝的にコードされない形態のアミノ酸による、Ｌ−アミノ酸の置換を含み得る。天然に存在しない、遺伝的にコードされないアミノ酸としては、β−アラニン、３−アミノ−プロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４−アミノ−酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロへキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、ベータ−２−チエニルアラニン、メチオニンスルフォキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリジン、２−アミノ酪酸、２，４−ジアミノ酪酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、イプシロン−アミノ−ヘキサン酸、デルタ−アミノバレリアン酸、または２，３−ジアミノ酪酸が挙げられる。
【００５６】
別の実施形態において、保存的アミノ酸変更は、親水性もしくは疎水性、サイズもしくは量、または荷電の考慮に基づく変更を含む。アミノ酸は、一般にアミノ酸側鎖の特性に主に依存して、疎水性または親水性と特徴付けられ得る。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Ｊ．Ｍｏｌ／Ｂｉｏ．１７９：１２５−１４２，１８４）の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに基づいて、疎水性アミノ酸は、ゼロより大きい疎水性を示し、そして親水性アミノ酸は、ゼロより小さい親水性を示す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＭｅｔおよびＴｒｐが挙げられ、そして遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸としては、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＬｙｓが挙げられる。遺伝的にコードされない疎水性アミノ酸としてはｔ−ブチルアラニンが挙げられ、遺伝的にコードされない親水性アミノ酸としては、シトルリンおよびホモシステインが挙げられる。
【００５７】
疎水性アミノ酸、または親水性アミノ酸は、それらの側鎖の特徴に基づいてさらに再区分され得る。例えば、芳香族アミノ酸は、側鎖が少なくとも１つの芳香環、または芳香族複素環を含有する疎水性アミノ酸である。この芳香環または芳香族複素環は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどの１つ以上の置換基を含み得、ここでＲは、独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アルカリル、置換（Ｃ６−Ｃ２６）アルカリル、５員〜２０員のヘテロアリール、５員〜２０員の置換ヘテロアリール、６員〜２６員のアルクヘテロアリール、６員〜２６員の置換アルクヘテロアリールである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸としてはＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐが挙げられ、遺伝的にコードされない芳香族アミノ酸としては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニンおよび４−フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
【００５８】
非極性アミノ酸は、生理学的ｐＨにおいて荷電されておらず、そして、２つの原子によって共有される電子の対が、一般に、その２つの原子の各々によって同等に保有される結合を有する側鎖（すなわち、その側鎖は極性ではない）を有する、疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた非極性アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＡｌａおよびＭｅｔが挙げられ、遺伝的にコードされない非極性アミノ酸としてはシクロへキシルアラニンが挙げられる。非極性アミノ酸は、脂肪性アミノ酸（脂肪性炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸）を含むようにさらに再区分され得る。遺伝的にコードされた脂肪性アミノ酸としてはＡｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅが挙げられ、遺伝的にコードされない脂肪性アミノ酸としては、ノルロイシンが挙げられる。
【００５９】
極性アミノ酸は、生理学的ｐＨにおいては荷電されていないが、２つの原子によって共有される電子の対が、その電子の１つによってより密接に保有される１つの結合を有する側鎖を有する、親水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた極性アミノ酸としてはＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎが挙げられ、遺伝的にコードされない極性アミノ酸としては、シトルリン、Ｎ−アセチルリジンおよびメチオニンスルフォキシドが挙げられる。
【００６０】
酸性アミノ酸は、７未満の側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、代表的に、水素イオンの喪失に起因して、生理学的ｐＨにおいて負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸は、７より大きい側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、代表的にはヒドロニウムイオンの付随に起因して、生理学的ｐＨにおいて正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸としてはＡｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓが挙げられ、遺伝的にコードされない塩基性アミノ酸としては、非環式アミノ酸オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンが挙げられる。
【００６１】
上述の分類は、絶対的なものではなく、そして、アミノ酸は、１つ以上のカテゴリーに分類され得るということが、当業者によって認識される。さらに、アミノ酸は、既知の挙動、および／または特定のアッセイに基づくかもしくは以前に同定されたアミノ酸と比較して、特徴的な化学的特性、物理的特性または生物学的特性に基づいて、分類され得る。アミノ酸はまた、アミノ酸類似側鎖を有する二官能基部分を含み得る。
【００６２】
保存的変更はまた、例えば、アミノ酸の機能的側鎖基の反応によって、非誘導体化残基に対する化学的に誘導体化された部分の置換を含み得る。従って、これらの置換は、遊離アミノ基が塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−臭化オキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基に誘導体化された化合物を含み得る。同様に、遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルエステルおよびエチルエステル、もしくは多くの型のエステル、またはヒドラジドを形成し得、そして側鎖は、誘導体化されて、遊離ヒドロキシル基に対するＯ−アシルもしくはＯ−アルキル、またはヒスチジンのイミダゾール窒素に対するＮ−イミ−ベンジルヒスチジンを形成し得る。ペプチドアナログはまた、例えば、メチル化によって、アルキルアミン（例えば、エチルアミン、エタノールアミン、またはエチレンジアミン）によるＣ末端アミノ酸のアミド化によって、またはアミノ酸側鎖のアシル化もしくはメチル化（例えば、リジンのεアミノ基のアシル化など）によって、化学的に改変されたアミノ酸を含む。ペプチドアナログはまた、置換アミド（例えば、式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲの基、ここでＲは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、または置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニルである）、またはアミド結合の同配体（例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、もしくは−ＣＨ２ＳＯ−）とのペプチドにおけるアミド結合の置換を含み得る。
【００６３】
上記化合物は、例えばポリマー化または結合体化によって共有結合され、ホモポリマーまたはヘテロポリマーを形成し得る。代表的に中性の低分子からなるスペーサーまたはリンカー（例えば、生理学的条件の下で非荷電であるアミノ酸）が使用され得る。結合は、多数の様式で達成され得る。例えば、システイン残基がペプチド末端に付加され得、そして複数のペプチドが制御された参加によって共有結合され得る。あるいは、ヘテロ二機能性因子（例えば、ジスルフィド／アミド形成因子またはチオエーテル／アミド形成因子）が使用され得る。この化合物はまた、例えば癌細胞を標的とし得るかまたは癌細胞の成長もしくは増殖を阻害し得る別の化合物に連結され得る。この化合物はまた、例えば環状部分を有することによって束縛され得る。
【００６４】
ペプチドまたはペプチドアナログは、標準的な化学技術（例えば、液相または固相合成法を使用する自動合成による）によって合成され得る。自動ペプチド合成器は事犯されており、当該分野で周知の技術を使用する。ペプチドおよびペプチドアナログはまた、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９４）に記載されているもののような標準的な方法を使用する組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、ＣＯＰ１、ＭＤＭ２、ｐ２１またはｐ５３核酸分子もしくはそれらのフラグメントと実質的に同一の核酸分子を含むか、またはＣＯＰ１、ＭＤＭ２、ｐ２１またはｐ５３核酸分子もしくはそれらのフラグメントに相補的な核酸分子を含む。そのような核酸分子は、例えば、本発明のアッセイおよび方法におけるプローブまたはプライマーとして使用され得る。「プローブ」または「プライマー」は、相補的な配列を含有する第２ＤＮＡまたはＲＮＡ分子（標的）と対合し得る規定された配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。生じるハイブリッド分子の安定性は、生じた対合の程度に依存し、プローブと標的分子との間の相補性の程度、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度のようなパラメーターによって影響される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの程度は、温度、塩濃度、および有機分子（例えば、ホルムアミド）の濃度のようなパラメーターによって影響され、そして当業者に周知の方法によって決定される。本明細書に記載される核酸配列またはその一部に特異的なプローブまたはプライマーは、そのプローブまたはプライマーが使用される目的および条件に依存して、少なくとも８ヌクレオチド〜５００ヌクレオチド超（その間の任意の値を含む）の任意の整数の長さで変動し得る。例えば、プローブまたはプライマーは、８ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長または２５ヌクレオチド長であり得るか、あるいは少なくとも３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長または６０ヌクレオチド長であり得るか、あるいは１００ヌクレオチド長以上、２００ヌクレオチド長以上、５００ヌクレオチド長以上、または１０００ヌクレオチド長以上であり得る。本明細書中に記載される核酸分子に特異的なプローブまたはプライマーは、本明細書中に記載される核酸配列に対して、２０〜３０％の配列同一性、または少なくとも５５〜７５％の配列同一性、または少なくとも７５〜８５％の配列同一性、または少なくとも８５〜９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する。
【００６６】
プローブまたはプライマーは、例えば増幅によってゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから、あるいはクローニングされたＤＮＡセグメントから由来し得、単一の個体由来の単一遺伝子の全てまたは一部を代表するゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のいずれかを含有し得る。プローブは、固有の配列（例えば、ＣＯＰ１もしくはｐ５３核酸分子に１００％の同一性）を有し、かつ／または公知の配列を有し得る。プローブまたはプライマーは、化学的に合成され得る。
【００６７】
プローブまたはプライマーは、当該分野で公知の方法によって、放射性または非放射性のいずれかで、検出可能に標識され得る。プローブまたはプライマーは、核酸ハイブリダイゼーションに関する方法（例えば、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応による増殖、一本鎖立体多型（ＳＳＣＰ）分析、制限酵素フラグメント多型（ＲＦＬＰ）分析、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、電気泳動移動度変動アッセイ（ＥＭＳＡ）、および当業者に公知の他の方法）のために使用され得る。
【００６８】
核酸分子はまた、例えば細胞における標的分子の発現を減少させるために使用され得る、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、またはトリプルヘリックス分子であり得る。核酸に関して本明細書中で使用される場合、「アンチセンス」により、核酸分子（例えば、ＣＯＰ１遺伝子、ｍｄｍ２遺伝子、ｐ２１遺伝子またはｐ５３遺伝子のような遺伝子）のコード鎖に相補的な核酸配列を意味する。いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、いずれもが細胞内で発現される場合に、相補的遺伝子によってコードされるポリペプチドのレベルを低下させ得るものである。いくつかの実施形態において、このポリペプチドレベルは、その遺伝子のみを発現し、相補的核酸分子を発現していない細胞におけるポリペプチドと比較して、少なくとも１０％〜少なくとも２５％の任意の値、または少なくとも２５％〜少なくとも５０％の任意の値、または少なくとも５０％〜少なくとも７５％の任意の値、または少なくとも７５％〜１００％の任意の値、または少なくとも２倍〜少なくとも１０倍の任意の値、または少なくとも１００倍低下される。
【００６９】
「ｓｉＲＮＡ」分子または「ＲＮＡｉ」分子とは、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸をいい、この二本鎖ＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡが遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞において発現された場合に、その遺伝子または標的遺伝子の発現を減少させるかまたは阻害する能力を有する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」とは、相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡをいう。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成するｓｉＲＮＡの相補部分は、代表的に、実質的または完全に同一である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡとは、標的遺伝子に対して実質的または完全な同一性を有し、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する核酸をいう。このｓｉＲＮＡの配列は、全長標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。代表的に、このｓｉＲＮＡは、少なくとも１５〜５０ヌクレオチド長（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列が、１５〜５０ヌクレオチド長であり、そしてその二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５〜５０塩基対の長さであり、好ましくは約２０〜３０塩基ヌクレオチド長であり、好ましくは約２０〜２５ヌクレオチド長または約２４〜２９ヌクレオチド長であり、例えば２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長または３０ヌクレオチド長）である。ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２３７（本明細書中にその全体が参考として援用される）もまた参照のこと。ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉが標的核酸を発現する細胞において発現されるときに少なくとも約１０％その標的核酸の発現を減少させる場合、そのｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子はその標的核酸に対して「特異的」である。
【００７０】
本明細書中で説明される治療剤（核酸分子を含む）は、その生物学的利用可能特性、薬物動態学特性、および薬力学的特性を向上させるように、改変または合成され得る。例えば、治療的核酸分子は、当該分野で公知の技術を使用して、１つ以上のホスホロチオエートと一緒に合成され得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、有機低分子を包含する。「有機低分子」とは、約５０ダルトンより大きく、かつ約２５００ダルトン未満の分子量、好ましくは約２０００ダルトン未満の分子量、好ましくは約１００ダルトンと約１０００ダルトンとの間の分子量、より好ましくは約２００ダルトンと約５００ダルトンとの間の分子量を有する、天然に存在するかまたは合成的かのいずれかの、有機分子をいう。有機低分子は、ユビキチンリガーゼインヒビター（例えば、Ｒｏ１０６−９９２０およびそのアナログ）であり得る４４。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態において、試験化合物は、ＣＯＰ１／ｐ５３相互作用または結合に干渉し得る抗体を包含する。試験化合物としてはまた、ＣＯＰ１／ｐ５３相互作用または結合に干渉し得、かつ／またはＣＯＰ１活性（例えば、ＣＯＰ１酵素活性）を阻害し得る、ペプチド、核酸分子または低分子が挙げられ得る。
【００７３】
候補化合物または試験化合物は、当該分野で公知の方法に従って、天然産物または合成（または半合成）抽出物の両方の大きなライブラリあるいは化学ライブラリから同定され得る。薬物探索および開発の分野の当業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源は本発明の方法には重要でないことを理解する。したがって、実質的に任意の数の化学抽出物または化合物が、本明細書中に記載される例示的な方法を使用してスクリーニングされ得る。そのような抽出物または化合物の例としては、植物ベースの抽出物、真菌ベースの抽出物、原核生物ベースの抽出物もしくは動物ベースの抽出物、醗酵ブロス、および合成化合物、ならびに既存の化合物の修飾物が挙げられるが、これらに限定されない。多数の方法もまた、任意の数の化合物（例えば、サッカリドベースの化合物、ペプチドベースの化合物、および核酸ベースの化合物）のランダム合成または指向性合成（例えば、半合成または総合成）の生成のために利用可能である。合成化合物ライブラリは、市販されている。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブ拉致は、多数の供給元から市販されている。この供給元としては、Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ，ＦＬ，ＵＳＡ）、およびＰｈａｒｍａＭａｒ，ＭＡ，ＵＳＡが挙げられる。さらに、所望される場合は、当該分野で公知の方法（例えば、標準的な抽出および分画法によって）に従って、天然産物ライブラリおよび合成産物ライブラリが作製される。さらに、所望される場合は、任意のライブラリまたは化合物は、標準的な化学的方法、物理的方法、または生化学的方法によって容易に改変される。
【００７４】
粗抽出物が例えばＣＯＰ１／ｐ５３相互作用を阻害することが見出された場合は、陽性のリード抽出物のさらなる画分が、観察された効果を担う化学的構成成分を単離するために必要であり得る。したがって、抽出、分画および精製プロセスのゴールは、ＣＯＰ１／ｐ５３結合阻害活性を有する粗物質内の化学的実体の注意深い特徴付けおよび同定である。化合物の混合物における活性の検出のための、本明細書中で記載される同じアッセイが、活性成分を精製するため、およびその誘導体を試験するために使用され得る。そのような異種抽出物の分画および精製の方法は、当該分野で公知である。所望される場合は、処置のために有用であることが示された化合物が、当該分野で公知の方法に従って化学的に改変される。治療的価値、予防的価値、診断的価値または他の価値があるものと同定された化合物は、その後、例えば癌のための動物モデルを使用して、分析される。
【００７５】
（診断的、治療的、予防的および／またはスクリーニング用の使用、アッセイおよび試薬）
本発明に従う化合物、組成物（例えば、薬学的組成物）および方法は、癌を診断するため、または被験体における癌を処置もしくは予防するため、または癌を処置もしくは予防するのに有用な試験化合物をスクリーニングするために使用され得る。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ハエ、蠕中などであり得る。この被験体は、臨床患者、治験ボランティア、実験動物などであり得る。この被験体は、癌を有する疑いがあるかもしくは癌を有する危険がある疑いがあるか、癌を有すると診断されたか、または癌を有さないことが確認されたコントロールの被験体であり得る。１つの好ましい実施形態において、この被験体はヒトである。
【００７７】
癌の診断法および癌診断の臨床的描写は、当業者に公知である。本明細書中で考察されるように、種々の癌が、ＣＯＰ１発現レベルを測定することによって診断または検出され得、ここでＣＯＰ１の過剰発現が癌の診断を示す。「過剰発現」により、コントロールに対する（例えば、非癌性細胞によって正常に産生される発現のレベルに対する）、特定の分子（例えば、ＣＯＰ１）のｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の増加を意味する。ＣＯＰ１分子の過剰発現を示す癌はまた、ｐ５３分子（例えば、ｐ５３ポリペプチド）の発現低下、またはｐ２１分子（例えば、ｐ２１  ｍＲＮＡ）の発現低下を示し得る。「発現レベルにおける低下」によって、コントロールに対する（例えば、非癌性細胞によって正常に産生される発現のレベルに対する）、特定の分子（例えば、ｐ５３またはｐ２１）のｍＲＮＡ発現またはポリペプチド発現における低下を意味する。そのような増加または低下は、コントロールと比較した場合、１０％と９０％との間の任意の値、または３０％と６０％との間の任意の値、または１００％以上であり得、あるいは２倍と１０倍との間の任意の値（２倍および１０倍を含む）またはそれ以上（例えば、１００倍）の変化であり得る。過剰発現もしくは増加、または低下または減少の正確な量は、その過剰発現または低下が統計的に有意である限り、重要ではない。
【００７８】
本発明にしたがう試薬は、本明細書中に記載される化合物を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される化合物を含む細胞（例えば、哺乳動物細胞）を包含する。例えば、哺乳動物細胞は、組換えｐ５３分子、組換えＰｉｒｈ２分子、組換えＭＤＭ２分子、および／もしくは組換えＣＯＰ１分子を含むように、または内因
性のタンパク質発現を低下もしくはノックアウトするように、またはそれらのタンパク質をコードする遺伝子を改変することによってそれらのタンパク質を変異させるように、例えば組換え技術によって設計され得る。これらの分子の発現レベルまたは活性は、例えばこれらの分子に対して特異的に指向されるｓｉＲＮＡを使用して、低下され得る。そのような哺乳動物細胞は、ｐ５３／ＣＯＰ１結合に干渉するかまたはｐ５３もしくはＣＯＰ１活性を阻害する試験化合物についてスクリーニングするために使用される。
【００７９】
例えば、癌または細胞増殖性障害の処置においける使用のための試験化合物をスクリーニングするために、コントロール細胞は、低下したレベルまたはゼロレベルのｐ５３を発現し、そして正常または増加したレベルのＣＯＰ１を発現し得る。そのような細胞は、試験化合物とインキュベートされ、そして、細胞周期、ｐ２１発現、ｐ５３誘導性アポトーシス、ｐ５３依存性トランス活性化、ＣＯＰ１リガーゼ活性などにおける変化についてアッセイされる。ｐ２１−ルシフェラーゼのようなレポーターベースの構築物が、バックグラウンドとしての内部ルシフェラーゼと一緒に、ならびにＲＴ−ＰＣＲ技術と一緒に、使用され得る。そのような哺乳動物細胞は、例えば、ＣＯＰ１分子を過剰発現するように設計され得るｐ５３野生型細胞株（Ｕ２−ＯＳ細胞）またはｐ５３ヌル細胞株（Ｈ１２９９）のような、既存の細胞株において設計され得る。
【００８０】
本発明に従うアッセイは、標準的な供給源から標準的な手順によって得られたサンプルを使用して、インビボ、インビトロ、またはエキソビボで実施され得る。「サンプル」は、被験体から単離された任意の臓器、組織、細胞または細胞抽出物であり得る。例えば、サンプルとしては、患者（ヒトまたは動物）、試験被験体、または実験動物から得られた、骨、脳、乳房、結腸、筋肉、神経、卵巣、前立腺、網膜、皮膚、呼格菌、腸、精巣、心臓、肝臓、腎臓、胃、膵臓、子宮、副腎、扁桃、脾臓、軟部組織、末梢血、全血、赤血球濃縮液、血小板濃縮液、白血球濃縮液、血球たんぱく質、血漿、血小板リッチの血漿、血漿濃縮液、血漿の任意の画分由来の沈殿物、血漿の任意の画分由来の上清、血漿タンパク質画分、精製もしくは部分精製された血液タンパク質もしくは他の成分、漿液、精液、哺乳動物初乳、乳、尿、糞、唾液、脳脊髄液、心膜液、腹膜液、胎盤抽出物、羊水、寒冷沈降物、寒冷上清、細胞溶解物、血球中に存在するタンパク質、固形主要、もしくは任意の他の標本、またはそれらの任意の抽出物が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルにおいて、非癌性細胞から癌性細胞を単離することが所望され得る。
【００８１】
サンプルはまた、限定されずに、正常細胞または形質転換細胞（例えば、組換えＤＮＡ技術またはモノクローナル抗体技術による）によって細胞培養において産生された産物を含み得る。サンプルとしてはまた、非哺乳動物被験体（例えば、昆虫または蠕虫）から単離された任意の臓器、組織、細胞または細胞抽出物が挙げられ得るが、これらに限定されない。「サンプル」はまた、被験体から直接単離されたものではない、実験条件下で作製された細胞または細胞株でもあり得る。サンプルはまた、細胞を含まないものであってもよいし、人工的に誘導されたものでもよいし、合成されたものでもよい。サンプルはまた、癌性であることが既知の、癌性であることが疑われる、または癌性でないと考えられている（例えば、正常またはコントロール）細胞または組織に由来し得る。
【００８２】
「コントロール」は、ベースラインの発現または活性を決定するのに使用するために得られたサンプルを含む。従って、コントロールサンプルは、多数の手段によって得られ得る。この手段としては、非癌性細胞または組織（例えば、被験体の腫瘍または癌性細胞を囲んでいる細胞）から；癌を有さない被験体から；癌の危険があると疑われない患者から；またはそのような患者由来の細胞または細胞株から、が挙げられる。コントロールはまた、既に確立された標準も含む。従って、本発明に従って実施される任意の試験またはアッセイは、その確立された標準と比較され得、各回において比較のためにコントロールサンプルを得る必要はない、インビトロユビキチン化アッセイにおいて、コントロールは、ｐ５３分子をユビキチン化する能力が低下しているＣＯＰ１分子（例えば、ＣＯＰ１ΔＲｉｎｇのようなそのリガーゼドメインに欠損を有する分子）であり得る。
【００８３】
例えば、ＣＯＰ１またはｐ５３分子は、癌細胞、組織または細胞溶解物において提供されてもよいし、組換え技術を使用して構築されてもよい。マイクロアレイ（例えば、組織マイクロアレイ）が使用され得る。組換えタンパク質、細胞および／または細胞株は、商業的な供給元（例えば、細胞または細胞株については、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得ることができる。
【００８４】
癌のための適した動物モデルは、例えば、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡから得ることができる。いくつかの実施形態において、ＣＯＰ１またはｐ５３の発現または活性を有する動物モデルが、使用され得る。
【００８５】
ＣＯＰ１またはｐ５３の核酸分子またはポリペプチド発現または活性、あるいはＣＯＰ１／ｐ５３結合は、種々の技術を使用してアッセイされ得る。この技術としては、免疫組織化学（ＩＨＣ）、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ノザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、リアルタイム定量ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ）、抗体ベースのアッセイ（例えば、免疫沈降）、免疫蛍光、ウェスタンブロッティング、核酸配列決定などが挙げられる。例えば、サンプル由来のＰＣＲ産物の配列決定、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）分析、または制限酵素フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析が、ＣＯＰ１またはｐ５３遺伝子における変異の検出に使用され得；免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングが、ＣＯＰ１またはｐ５３ポリペプチドまたは結合のレベルを測定するために使用され得；ＣＯＰ１またはｐ５３の遺伝子またはｍＲＮＡの発現が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、または三本鎖形成オリゴヌクレオチドを使用してダウンレギュレートされて、転写または翻訳を阻害し得；ノザンブロッティングがＣＯＰ１またはｐ５３  ｍＲＮＡレベルを測定するために使用され得、あるいはＰＣＲがＣＯＰ１またはｐ５３核酸分子のレベルを測定するために使用され得る。そのようなアッセイは、ＣＯＰ１またはｐ５３の任意の形態または全ての形態（前駆体、フラグメント（例えば、内部タンパク質分解酵素の分解によって作製されたもの）、翻訳後修飾形態など）の検出を含む。本発明の方法は、ＣＯＰ１に関連する生物学的活性（例えば、ｐ５３の分解、ｐ５３のユビキチン化、ｐ５３のトランス活性化の阻害、ｐ５３誘導性アポトーシスの阻害、ｐ２１  ｍＲＮＡの減少など）についてアッセイする工程を包含する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、被験体における細胞は、インビボで、必要に応じて検出可能に標識（例えば、放射性同位体）された抗体（例えば、ＣＯＰ１抗体またはｐ５３抗体、またはその両方）に曝露され得、そしてその抗体のその細胞への結合が、例えば放射能についての外部走査または生検の分析によって評価され得る。
【００８７】
上記アッセイは、検出可能に標識された分子、すなわち分子（例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、遺伝子またはそのフラグメント、ペプチド、またはｃＤＮＡ分子）の存在をマークまたは同定するための任意の手段を使用して、実施され得る。分子を検出可能に標識するための方法は、当該分野で周知であり、この方法としては、放射能標識（３２Ｐまたは３５Ｓのような同位体による）および非放射性標識、例えば、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを使用する）、化学発光標識、蛍光標識（例えば、フルオレセインを使用する）、生物発光標識、またはプローブに結合されたリガンドの抗体検出が挙げられるが、これらに限定されない。間接的な手段によって検出可能に標識された分子もまた、この定義内に含まれる。この分子は、第一部分（例えば、ビオチン）に結合され、次いで、観察またはアッセイされ得る第２部分（例えば、フルオレセイン標識されたストレプトアビジン）に結合された分子である。標識としてはまた、ジゴキシゲニン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
【００８８】
「検出する」によって、物質の存在または非存在を決定すること、または物質の量を定量することを包含することが意図される。従って、この用語は、定性的決定および定量的決定のための本発明の物質、組成物、および方法の使用をいう。一般的に、検出のために使用される具体的な技術は、本発明の実施のために重要ではない。例えば、本発明に従う「検出する」は当該分野で公知の方法または以下に記載される方法を使用して、以下：ＣＯＰ１、ｍｄｍ２、ｐ２１、もしくはｐ５３遺伝子、ゲノムもしくは核酸分子またはＣＯＰ１、ｍｄｍ２、ｐ２１、もしくはｐ５３ポリペプチドの存在もしくは非存在；ＣＯＰ１、ｍｄｍ２、ｐ２１、もしくはｐ５３遺伝子における変異；ＣＯＰ１、ｍｄｍ２、ｐ２１、もしくはｐ５３の核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはポリペプチドの発現レベルにおける変化；ＣＯＰ１ポリペプチドの生物学的機能／活性（例えば、ＣＯＰ１リガーゼ活性、ｐ５３代謝回転、ｐ５３依存性トランス活性化活性）またはｐ５３ポリペプチドの生物学的機能／活性（例えば、ｐ５３結合、ｐ５３依存性トランス活性化、ＣＯＰ１結合、ｐ２１のトランス活性化など）における変化、を検出することを包含する。いくつかの実施形態において、「検出する」は、野生型ｐ５３を検出することを包含する。いくつかの実施形態において、「検出する」は、変異ｐ５３を検出することを包含する。検出することは、コントロールと比較した場合に、１０％と９０％との間の任意の値の変化（増加または減少）、または３０％と６０％との間の任意の値の変化、または１００％以上の任意の値の変化を定量することを包含する。検出することは、２倍と１０倍との間（２倍および１０倍を含む）、またはそれ以上（例えば、１００倍）の任意の値の変化を定量することを含む。
【００８９】
（薬学的および獣医学的組成物、投薬量および投与）
本発明の化合物は、単独で、あるいはリポソーム、アジュバント、または任意の薬学的に受容可能なキャリアの存在下で、哺乳動物（例えば、ヒト、マウスなど）への投与に適した形態で、他の化合物（例えば、核酸分子、低分子、ペプチド、またはペプチドアナログ）と組み合わせて、提供され得る。所望される場合、本発明に従う化合物での処理は、化学療法のような癌のためのより慣習的かつ既存の治療（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、抗微小管化合物（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ、ＣＰＴ１１、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、放射線治療（例えば、電離放射線）など））と組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、本発明に従う治療的化合物は、ＣＯＰ１、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２またはＰｉｒｈ２分子に対して指向されるｓｉＲＮＡ分子を含む。本発明に従う化合物は、慢性的または断続的に提供され得る。「慢性的」投与とは、最初の治療効果（活性）を維持するように、急性の短期間の用量を投与するのではなく長期間の連続的な化合物の投与をいう。「断続的」投与とは、その特定の化合物の処置がない期間が介在する処置をいう。
【００９０】
慣習的な薬学的実施は、上記化合物を、癌に罹患している患者または癌の診断前の患者に投与するのに適した処方物または組成物を提供するように採用され得る。任意の適切な投与経路が採用され得る。この経路は、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、眼窩内投与、眼内投与、心室内投与、嚢内投与、脊髄内投与、くも膜下投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻内投与、局所的投与、または経口投与である。治療的処方物は、液体溶液または懸濁液の形態であり得；経口投与のためには、処方物は錠剤またはカプセルの形態であり得；そして鼻内投与のためには、粉末、点鼻薬、またはエアロゾルの形態であり得る。
【００９１】
処方物を作製するための当該分野で周知の方法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第１９版）Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９５、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａにおいて見出される。非経口投与のための処方物は、例えば、賦形剤、滅菌水または生理食塩水、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物由来のオイル、または水素化ナフタレンを含有し得る。生体適合性の、生物分解性のラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）ポリマー、ラクチド／グリコールコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、上記化合物の放出を制御するために使用され得る。他の潜在的に有用な非経口送達系としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能注入系、およびリポソームが挙げられる。吸入のための処方物は、賦形剤（ラクトース）を含んでもよいし、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート、およびデオキシコレートを含む水溶液であってもよいし、点鼻薬の形態における投与のための油性溶液（すなわち、ゲルとして）であってもよい。治療的または予防的または防止的組成物のために、上記化合物は、癌に依存して、癌の増殖または進行を予防、阻害または遅くするのに十分な量で、個体に投与される。この化合物の有効性の指標としては、以下の１つ以上の観察可能かつ／または測定可能な減少、または非存在が挙げられる：癌細胞の数における減少または癌細胞の非存在、腫瘍サイズにおける減少；周辺器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、予防する、阻害する、遅くする、または停止させる）；ある程度の腫瘍増殖の阻害；ならびに／あるいはある程度の具体的な癌に付随する１つ以上の症状の軽減、ならびに罹病率および死亡率の低下。
【００９２】
本発明に従う化合物の「有効量」は、治療有効量または予防有効量を含む。「治療有効量」とは、必要とされる投薬および期間において、所望の治療的結果を得るために有効な量をいう。この所望の治療的結果は、例えば以下のうちの１つ以上の観察可能および／もしくは測定可能な減少、または以下のうちの１つ以上の非存在である：癌細胞の数における減少または癌細胞の非存在、腫瘍サイズにおける減少；周辺器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、予防する、阻害する、遅くする、または停止させる）；ある程度の腫瘍増殖の阻害；ならびに／あるいはある程度の具体的な癌に付随する１つ以上の症状の軽減、ならびに罹病率および死亡率の低下。化合物の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびにその化合物のその個体において所望の応答を惹起する能力のような要因に従って変わり得る。投薬レジメンは、最適の治療的応答を提供するように調整され得る。治療有効量はまた、その化合物の任意の毒性効果または有害な効果よりも、その治療的に有益な効果がまさる量でもある。「予防有効量」とは、必要とされる投薬および期間において、所望の予防的結果を得るために有効な量をいう。この所望の予防的結果は、例えば以下のうちの１つ以上の観察可能および／もしくは測定可能な減少、または以下のうちの１つ以上の非存在である：癌細胞の数における減少または癌細胞の非存在、腫瘍サイズにおける減少；周辺器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、予防する、阻害する、遅くする、または停止させる）；ある程度の腫瘍増殖の阻害；ならびに／あるいはある程度の具体的な癌に付随する１つ以上の症状の軽減、ならびに罹病率および死亡率の低下。代表的に、予防的用量は、疾患の前または疾患の早期段階において被験体において使用され、その結果、予防有効量は、治療有効量よりも少ないものであり得る。化合物の治療有効量または予防有効量のための好ましい範囲は、０．１ｎＭ〜０．１Ｍ、０．１ｎＭ〜０．０５Ｍ、０．０５ｎＭ〜１５μＭ、または０．０１ｎＭ〜１０μＭの任意の整数であり得る。
【００９３】
用量の値は、軽減されるべき状態の重篤度によって変わり得ることに注意されたい。任意の特定の被験体について、特異的な投薬レジメンは、個々の必要性および上記化合物を投与しているかまたはその化合物の投与を管理している専門家の判断に従って、経時的に調整され得る。本明細書中に記載される用量範囲は、単なる例示であり、医療実務者によって選択され得る用量範囲を限定しない。組成物中の活性化合物の量は、被験体の疾患状態、年齢、性別および体重に従って変わり得る。投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与されてもよいし、分割された用量が経時的に投与されてもよいし、またはその用量は、治療的状況の緊急性によって示されるように比例的に減少もしくは増加されてもよい。投与が容易なため、および用量の均一性のために、単位投薬形態において非経口組成物を処方するのが有利であり得る。
【００９４】
ワクチン処方物の場合、免疫学的に有効量の本発明の化合物が、単独で、あるいは他の化合物、免疫学的アジュバント（例えば、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント）、水酸化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、または水酸化アルミニウムと組み合わせて、提供され得る。この化合物はまた、免疫原性を高めるために、キャリア分子（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に連結され得る。
【００９５】
一般的に、本発明の化合物は、実質的な毒性を引き起こすことなく使用されるべきである。本発明の化合物の毒性は、標準的な技術によって、例えば、細胞培養または実験動物において試験し、そして治療指数（すなわち、ＬＤ５０（集団の５０％に致死である用量）とＬＤ１００（集団の１００％に致死である用量）との間の比）を決定することによって、決定され得る。しかしながら、いくつかの状況（例えば、重篤な疾患状態）では、実質的に過剰量の組成物を投与することが必要とされ得る。
【実施例】
【００９６】
（実施例１  材料および方法）
（発現ベクター、組換えタンパク質および抗体）
Ｆｌａｇ−ＣＯＰ１は、以前に説明されている３３。ＨＡ−ＣＯＰ１は、ＰＣＲによってＣＯＰ１をｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングすることにより生成し、そしてＧＳＴ−ＣＯＰ１は、ＣＯＰ１をｐＧＥＸ６Ｐ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へサブクローニングすることにより生成した。ｐｃＤＮＡ３．１＋５３、ｐＧ１３−Ｌｕｃ、ｐ２１−Ｌｕｃ、ｂａｘ−Ｌｕｃ、ＮＳ−ＬｕｃおよびｐＣＭＶ−ＭＤＭ２は、以前に説明されている２１，２２、３５。
【００９７】
全長ＣＯＰ１は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に由来するｃＤＮＡから増幅した。ＨＡ−ＣＯＰ１を、ＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングし、ＧＳＴ−ＣＯＰ１は、ＰＣＲにより、ｐＧＥＸ６Ｐ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へサブクローニングすることによって生成した。ＣＯＰ１−ＬｕｃおよびＣＯＰ１ｍｕｔ−Ｌｕｃは、ｐＧＬ３−プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）へのＣＯＰ１プロモーターに由来する２つのコピーのｐ５３コンセンサス部位の含むか、またはコンセンサス部位の突然改変体を含むオリゴヌクレオチドのライゲーションによって生成した。
【００９８】
すべてのＧＳＴ組換えタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＦ３）コドン＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において発現させ、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームと一緒に超音波分解し、プロテアーゼインヒビターミックス（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＰＢＳ中で１％のトリトンＸ−１００で可溶化し、続いて、グルタチオンセファロース４Ｂバッチ法を使用して精製し、還元グルタチオンか、またはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で切断されたグルタチオンのいずれかで溶出した。組換えタンパク質のインビトロ転写／翻訳は、ＴｎＴキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）と組み合わせたＴ７／Ｔ３か、またはＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）（Ｒｏｃｈｅ）のいずれかを使用して実行した。
【００９９】
抗ｐ５３（ＤＯ−１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ｐ５３（１８０１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ｐ５３（ＦＬ−３９３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ｐ２１（Ａｂ−１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ＭＤＭ２（２Ａ１０；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗Ｆｌａｇ（Ｍ２；Ｓｉｇｍａ）、抗Ｍｙｃ（９Ｅ１０；Ｒｏｃｈｅ）、抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ）、抗アクチン（ＩＣＮ）、抗ＧＳＴ（Ｂ−１４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ）は、製造業者の推奨に従って使用した。抗ＣＯＰ１は、ヒトＣＯＰ１のアミノ酸７１位から２７０位に対して惹起されたモノクローナル抗体である。
【０１００】
（細胞、トランスフェクション、レポーター分析およびアポトーシスアッセイ）
Ｕ２−ＯＳ、Ｓａｏｓ−２、ＨＥＫ２９３ＴおよびＢＪ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、そして、
ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）媒体において維持した。ｐ５３−／−ＭＤＭ２−／−ＭＥＦは、１０％のＦＢＳおよび１×Ｌ−グルタミン含有ＤＭＥＭにおいて増殖させた。Ｈ１２９９細胞は、ＲＰＭＩで増殖させた。
【０１０１】
全てのトランスフェクションは、製造業者の推奨に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行した。ＣＯＰ１のｐ５３の定常状態レベルについての影響を評価するために、Ｓａｏｓ−２細胞を、２５０ｎｇもしくは５００ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１＋ｐ５３を含有する増加量のＦＬＡＧ−ＣＯＰ１もしくはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧでトランスフェクションしたか、またはＵ２−ＯＳ細胞を、増加量（０．５μｇ、１μｇおよび２μｇ）のｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１もしくはｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧとともに、またはそれらを伴わずにトランスフェクションし、そして、示される場合には、細胞を収集する前に６時間５０μＭのＡＬＬＮで処理した。
【０１０２】
レポーター分析のために、Ｓａｏｓ−２細胞またはＨ１２９９細胞を、増加量（０．５μｇ、１μｇおよび２μｇ）のｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１もしくはｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧとともに、またはそれらを伴わずに、１５０ｎｇ、または２５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１＋ｐ５３、またはｐｃＤＮＡ３．１＋ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、１００ｎｇのｐ２１−Ｌｕｃ、ｂａｘ−Ｌｕｃ、ＣＯＰ１−Ｌｕｃ、ＣＯＰ１ｍｕｔ−Ｌｕｃ、またはＮＳ−Ｌｕｃおよび１０ｎｇのｐＣＭＶβ−Ｇａｌで、一時的にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ分析は、製造業者の指示に従って実行し、そして、β−ガラクトシダーゼ活性（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対して正規化した。
【０１０３】
ｐ５３依存性細胞死アッセイのために、Ｓａｏｓ−２細胞を、１μｇの強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）および５μｇのｐｃＤＮＡ３．１＋、ｐｃＤＮＡ３．１＋ｐ５３、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１またはｐｃＤＮＡ３．１＋ｐ５３、およびｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１で４８時間、一時的にトランスフェクションした。細胞を収集し、そして蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）による分析のためにヨウ化プロピジウムで染色した。トランスフェクションされた細胞を選択し、その後、細胞周期プロファイルを、ＤＮＡ含量に従って決定した。
【０１０４】
３０ベースのｄＴｄＴオーバーハングを有する
【０１０５】
【化５】
2010223966.tif 000009
を、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈまたはＤｈａｒｍａｃｏｎにより合成した。実験におけるコントロールｓｉＲＮＡは、逆方向ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの混合物をいう。Ｕ２−ＯＳ、Ｈ１２９９、Ｓａｏｓ−２およびＢＪ細胞を、２４時間から３６時間間隔で３回、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、そして、接触阻害を防止するのに必要な程度まで増殖させた。
【０１０６】
（免疫沈降およびＧＳＴプルダウンアッセイ）
細胞を、免疫沈降（ＩＰ）溶解緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）およびプロテアーゼインヒビターミックス）または放射性免疫沈降（ＲＩＰＡ）緩衝液（０．１％のＳＤＳ、１％のＮＰ−４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のデオキシコレート、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）およびプロテアーゼインヒビターミックス）において溶解し、予備洗浄し、標的抗体およびタンパク質Ａ／Ｇ  ＰＬＵＳビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）で免疫沈降した。ＣＯＰ１と相互作用するタンパク質の同定は、Ｆｌａｇ−ＣＯＰ１を安定して発現するＵ２−ＯＳ細胞が生成されたことを除いて、以前に説明されたように実行した３３。
【０１０７】
ＧＳＴプルダウンアッセイは、ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）におけるインビトロで翻訳されたＨＡ−ＣＯＰと合わせ、そして１時間氷上でインキュベートされた５μｇのＧＳＴまたはＧＳＴ−ｐ５３を用いて実行した。次いで、グルタチオンセファロース４Ｂビーズをその混合物に添加し、１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで５回洗浄した。ＧＳＴ結合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに抗ＨＡおよび抗ＧＳＴを用いる免疫ブロットに供した。ＩＰを、必要に応じて高濃度の塩で、溶解緩衝液において洗浄した。パルスチェイス実験を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４時間ｐＣＭＶ−Ｆｌａｇ６ａ、またはｐＣＭＶ−Ｆｌａｇ−ＣＯＰ１でトランスフェクションし、そしてＵ２−ＯＳ細胞を示されるようにｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクションしたことを除いては、以前に説明されたように、実行した７。
【０１０８】
（インサイチュハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲおよびノザンブロット）
同位体インサイチュハイブリダイゼーションを、ＣＯＰ−１特異的６８８ｂｐ３３Ｐ標識アンチセンスリボプローブを使用して、以前に説明されたように、パラフィン包埋組織および組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の区画上で実施した２３。このプローブは、ヌクレオチド３６４において始まるＣＯＰ−１に対する翻訳配列の５’側の半分のほとんどを含む。同じテンプレートから転写され、かつ各ハイブリダイゼーション実験に含まれるセンスコントロールプローブは、いかなる上記組織においても、バックグラウンドを超えるシグナルを示さなかった。正常組織および卵巣腫瘍を代表するＴＭＡを、以前に説明されたように構築した２４。子宮腫瘍ＴＭＡは、７８上皮腫瘍とともに、正常卵巣、輸卵管および子宮のサンプルから構成される。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙキットを使用して、細胞または組織から抽出し、そしてプローブは、ＣＯＰ１、ｐ２１、ＲＰＬ１９およびβアクチンｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲのために設計した。全ての反応を、ＡＢＩ７７００配列検出器を使用して、製造業者の推奨に従って実行した。
【０１０９】
Ｍｏｕｓｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、完全長の、３２Ｐ標識されたマウスＣＯＰ１  ｃＤＮＡに、Ｃｈｕｒｃｈ緩衝液（３５．５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１７％（ｖ／ｖ）のＨ３ＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン、１ｍＭのＥＤＴＡ、７％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ）中、６５℃で一晩ハイブリダイズした。濾過器を、４０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）／１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで６５℃にて洗浄し、−７０℃でフィルムに曝露した。
【０１１０】
（インビトロユビキチン化アッセイおよびインビボユビキチン化アッセイ）
インビトロユビキチン化アッセイのために、インビトロで翻訳されたｐ５３を、抗ｐ５３（ＤＯ−１および１８０１）で免疫沈降し、ＰＢＳＴで５回洗浄し、そして反応を、タンパク質Ａ／Ｇビーズ上で実行した。室温で３０分間、２０μＭのＺｎＣｌ２でプレインキュベートした、１０μｇのＨｉｓ−ユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）もしくはＦＬＡＧ−ユビキチン（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇのＵｂｃ５Ｈｂ（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２０ｎｇのウサギＥ１（Ｓｉｇｍａ）および５００ｎｇのＧＳＴ−ＣＯＰ１（Ｅ３）を、総量３０μｌで、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液中でインキュベートした。３０℃で２時間のインキュベーション後に、反応物を、５分間１％のＳＤＳを含むＰＢＳＴでボイルし、次いで抗ｐ５３（ＤＯ−１およびＦＬ−３９３）との再免疫沈降のためにＳＤＳを０．２％に減らした。最後に、２−メルカプトエタノールと一緒に、ＳＤＳサンプル緩衝液中９５℃でインキュベートし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ）または抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（Ｍ２）との免疫ブロットを行ってユビキチン化された種のｐ５３を検出した。
【０１１１】
インビボアッセイのために、Ｈ１２９９、またはｐ５３−／−／ＭＤＭ２−／−ＭＥＦを、１００ｎｇのＨＡ−Ｕｂ、５００ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１＋ｐ５３、２μｇのｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１、またはｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧでトランスフェクションし、そして収集および抗ＨＡでの免疫沈降および抗ｐ５３（ＤＯ−１）でのウェスタンブロットの前に、５０μＭのＡＬＬＮで２時間処理した。
【０１１２】
（ＣＯＰ１と相互作用するタンパク質の同定）
ｐｃＤＮＡ３．１＋で共トランスフェクションし、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）耐性について選択することにより、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１またはｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａを発現するＵ２−ＯＳ安定細胞株を、生成した。ＦＬＡＧまたはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１発現クローンを増殖させ、そして、低張性溶解緩衝液（１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＤＴＴ、プロテアーゼインヒビターミックス）で収集する前に、５０μＭのＡＬＬＮで２時間処理し、その後ホモジナイズした。次いで、遠心分離により浄化した溶解物を、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）とのインキュベーションに供した。一晩のインキュベーション後、ビーズを、洗浄緩衝液１（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、４２０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５％のグリセロールおよびプロテアーゼインヒビターミックス）で１回洗浄し、洗浄緩衝液２（０．１％のＮＰ−４０、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌおよびプロテアーゼインヒビターミックス）で５回洗浄した。結合したタンパク質を、３００μｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ）で溶出し、その後、ＳＤＳおよび銀染色によって分析した。目的のバンドを切り出し、インサイチュでトリプシン消化し、得られたペプチドをキャピラリー液体クロマトグラフィー−イオントラップタンデム型質量分析により配列決定した。
【０１１３】
（ｐ５３遺伝子配列決定、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティング）
腫瘍サンプルを、単離し、激しくボルテクスしながら溶解緩衝液（１％のＳＤＳ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＥＤＴＡおよび４００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁し、５００μｇ／ｍｌのタンパク質分解酵素Ｋ（Ｓｉｇｍａ）を補充し、そしてサンプルが完全に消化されるまで一晩５５℃でインキュベートした。このサンプルを、次いで、１：１の割合でフェノールークロロフォルムーイソアミルアルコール（２５：２４：１）に再懸濁し、そして室温で３０分間インキュベートし、その後１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、上部の水相を、等量のイソプロパノールに再懸濁し、そしてさらに１５分間遠心分離した。得られたペレットを、７０％エタノールで洗浄し、そしてヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏ中に再懸濁した。上記パラフィン包埋組織のマイクロアレイサンプルについては、ＤＮＡを、３０μｌのＰｉｃｏＰｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ抽出緩衝液（Ａｒｃｔｕｒｕｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）中で顕微解剖した腫瘍組織を６５℃で４８時間インキュベートすることによって抽出した。この消化物を、１０分間９５℃で熱不活性化し、そしてＰＣＲ反応（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）へ直接添加した。単離されたゲノムＤＮＡを、Ｍ１３特異的配列を組み込んだｐ５３遺伝子のエキソン５〜８に対する以下：
【０１１４】
【化６】
2010223966.tif 000010
のプライマーによるＰＣＲに供した。
【０１１５】
ＰＣＲ産物は、Ｍ１３Ｆ配列決定プライマーおよびＭ１３Ｒ配列決定プライマーを用いて蛍光色素ターミネーター化学（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、配列決定した。
【０１１６】
リアルタイムＰＣＲは、正常サンプルおよび腫瘍サンプルから単離された総ＲＮＡから、以下のＣＯＰ１、ｐ２１、Ｐｉｒｈ２、β−アクチンおよびＲＰＬ１９に対する特異的プローブを用いて実行した。全ての反応は、ＡＢＩ７７００配列検出器を使用して製造業者の推奨に従って実行した。
【０１１７】
ＲＴ−ＰＣＲプライマー配列：（すべてのプライマーは、各遺伝子に対する３’ＵＴＲセグメントを増幅する）
【０１１８】
【化７】
2010223966.tif 000011
ＲＰＬ１９配列：
【０１１９】
【化８】
2010223966.tif 000012
組織を、ＴＬＢ（０．５％のＮＰ４０、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、プロテアーゼインヒビターミックス（Ｒｏｃｈｅ））で収集し、その後ホモジナイズした。溶解物を、２０、０００×ｇにおける６０分間の遠心分離により浄化し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。膜は、ＣＯＰ１、ｐ５３（ＤＯ−１および１８０１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびアクチン（ＩＣＮ）に対する抗体でブローブした。
【０１２０】
（ＣＯＰ１およびｐ５３についての免疫組織化学）
組織を収集し、１０％中性緩衝ホルマリンにおいて固定し、そしてパラフィンで包埋した。ガラススライド上の５μ切片を脱パラフィンし、蒸留水で水和した。ｐ５３染色のために、スライドを、９９℃のＤａｋｏ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ（Ｄａｋｏ，Ｓ１７００）溶液において２０分間インキュベートし、次いで、スライドを、ＴＢＳＴでリンスした。内因性ペルオキシターゼ、アビジンおよびビオチンを、各々、ＫＰＬブロッキング緩衝液（ＫＰＬ，３７−００−８４）およびＶｅｃｔｏｒアビジン／ビオチンキット（Ｖｅｃｔｏｒ，ＳＰ２００１）を使用してクエンチし、次いでＴＢＳＴでリンスした。スライドを、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で、１０％正常ウマ血清と一緒に３０分間インキュベートした。次いで、スライドを、室温で６０分間、５μｇ／ｍｌの抗ｐ５３抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢ２００−１０４）中でインキュベートした。ＴＢＳＴでの洗浄後、スライドを、室温で３０分間、２．５μｇ／ｍｌのビオチン化ウマ抗マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ，ＢＡ２００１）と一緒にインキュベートした。ＴＢＳＴ洗浄の後、スライドを、室温で３０分間、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ，ＰＫ６１００）と一緒にインキュベートした。次いで、スライドをＴＢＳＴでリンスし、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢと一緒に４分間インキュベートし、そして水でリンスした。次いで、スライドを、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、マウントし、そして明視野観察のためにカバーガラスを載せた。ＣＯＰ１染色については、スライドを、９９℃で、Ｄａｋｏ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｈｉｇｈ  ｐＨ溶液（Ｄａｋｏ、Ｓ３３０８）中で２０分間インキュベートし、次いで、スライドを、ＴＢＳＴ中でリンスした。内因性ペルオキシターゼ、アビジンおよびビオチンを、ＫＰＬブロッキング緩衝液およびＶｅｃｔｏｒアビジン／ビオチンキットを使用してクエンチし、その後ＴＢＳＴでリンスした。スライドを、３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で、１０％正常ウマ血清と一緒に３０分間インキュベートした。次いで、スライドを、室温で６０分間、１μｇ／ｍｌの抗ＣＯＰ１（クローン１Ｄ５）抗体中でインキュベートした。ＴＢＳＴ洗浄後、スライドを、室温で３０分間、２．５μｇ／ｍｌのビオチン化ウマ抗マウス二次抗体と一緒にインキュベートした。ＴＢＳＴ洗浄後、スライドは、室温で３０分間、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔと一緒にインキュベートした。次いで、スライドを、ビオチン化チラミド試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＮＥＬ７００）中で３分間インキュベートし、その後、ＴＢＳＴで洗浄し、次いで、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔと一緒に３０分間インキュベートした。ＴＢＳＴ洗浄後、スライドを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢと一緒に４分間インキュベートし、そして、水でリンスし、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、マウントし、そしてカバーガラスを載せた。
【０１２１】
（実施例２：ｐ５３は、ＣＯＰ１に対する基質である）
ＣＯＰがどのように細胞プロセスを調節し得るかの理解を得るために、ＦＬＡＧタグの付いたＣＯＰ１または空ベクターを安定して発現するＵ２−ＯＳ細胞由来の溶解物を、抗ＦＬＡＧを用いる免疫沈降に供し、そして結合したタンパク質を、ＦＬＡＧペプチドによって溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、特異的なバンドを質量分析によって配列決定した（図１Ａ）。約５３キロダルトンにおけるバンドの質量分析により、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３由来の５個の適合するペプチドが明らかになった。この相互作用が正真正銘のものであることを確認するために、ｐ５３を有さないＳｏａｓ−２細胞を、ｐ５３およびＭｙｃ−ＣＯＰ１でトランスフェクションし、抗ｐ５３（ＤＯ−１）で免疫沈降し、そして抗Ｍｙｃで免疫ブロットした（図１Ｂ）。ＣＯＰ１は、ｐ５３が存在する場合にのみ免疫沈降された。このことによって、ＣＯＰ１はｐ５３と相互作用し得ることが示された。この相互作用はまた、トランスフェクションしたｐ５３および内因性ｐ５３においても見られた（図１Ｃ）。さらに、Ｕ２−ＯＳ細胞の内因性タンパク質レベルにおいて、ｐ５３とＣＯＰ１との間に、相互作用が存在した（図１Ｄ）。そして、インビトロで翻訳された赤血球凝集素（ＨＡ）−ＣＯＰ１は、インビトロで、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ｐ５３と相互作用し得た（図１Ｅ）。
【０１２２】
ＣＯＰ１がｐ５３タンパク質の定常状態レベルに影響する潜在能力を、一定量のｐ５３を、増加量のＦＬＡＧ−ＣＯＰ１、または、ＲＩＮＧフィンガードメインを欠くＣＯＰ１の突然改変体（すなわち、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧ）でトランスフェクションすることによって、評価した。ＣＯＰ１のトランスフェクションは、外因性ｐ５３タンパク質の定常状態レベルにおける減少をもたらした。これは、ＲＩＮＧフィンガードメインの欠失において解消された（図２Ａ）。ＣＯＰ１が内因性ｐ５３の定常状態レベルに影響するかどうかを評価するために、Ｕ２−ＯＳ細胞を、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１、またはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧでトランスフェクションした（図２Ｂ）。内因性ｐ５３の場合のように、ＣＯＰ１は、内因性ｐ５３の定常状態レベルを減少し得、これはＣＯＰ１のＲＩＮＧフィンガードメインに依存した。
【０１２３】
ｐ５３タンパク質レベルのこの減少の機構へのさらなる洞察を得るために、リアルタイムＰＣＲをｐ５３遺伝子について実行し、ＣＯＰ１がｐ５３遺伝子転写を阻害したかどうかを決定した（図２Ｃ）。Ｕ２−ＯＳ細胞におけるＦｌａｇ−ＣＯＰ１またはＦｌａｇ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧのトランスフェクションは、ｐ５３メッセンジャーＲＮＡレベルにおける重要な変化をもたらさなかった。しかしながら、パルスチェイス分析を使用して、ヒト胎芽腎臓ＨＥＫ２９３ＴにおけるＣＯＰ１のトランスフェクションは、空ベクターコントロールと比較してｐ５３の半減期における明確な減少を示した。このことはＣＯＰ１活性がｐ５３代謝回転を増加させることを示している。ｐ５３の半減期がＣＯＰ１の過剰発現によってかなり短縮され、かつこの短縮が、ｐ５３  ｍＲＮＡ効果、またはＭＤＭ２のタンパク質レベルに関するいかなる直接的な効果からも独立したものであることを考慮すると、この効果は、翻訳後のものであり得る。
【０１２４】
上記仮説を試験するために、Ｕ２−ＯＳ細胞を、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１またはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧでトランスフェクションし、そして、ＤＭＳＯまたはプロテアソームインヒビターＡＬＬＮで処理した（図２Ｅ）。ＡＬＬＮの添加は、ｐ５３タンパク質のレベル（これは、Ｆｌａｇ−ＣＯＰ１のトランスフェクションによって以前に減少された）を増加させ、このことは、ＣＯＰ１がプロテアソーム媒介性の分解についてｐ５３を指向することを示している。
【０１２５】
上記プロテアソームによるｐ５３のＣＯＰ１媒介性分解が、ｐ５３ユビキチン化の結果であるか否かを決定するために、Ｈ１２９９またはＳａｏｓ−２細胞を、ｐ５３、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１、またはＦＬＡＧ−ＣＯＰ１ΔＲＩＮＧおよびＨＡ−ユビキチンでトランスフェクションした（図２Ｆ）。抗ＨＡを用いた免疫沈降および抗ｐ５３を用いた免疫ブロッティングは、ＦＬＡＧ−ＣＯＰ１を共トランスフェクションした場合にのみ、ｐ５３のユビキチン化種の存在を明らかにした。これらのデータは、ＣＯＰ１が、ユビキチン化によって、プロテアソームによる分解のためにｐ５３を標的にすることを示唆する。
【０１２６】
ＣＯＰ１がｐ５３分解を調節するためにＭＤＭ２またはＰｉｒｈ２を介して作用するか否かを確認するために、ｐ５３およびＣＯＰ１、またはＣＯＰ１ΔＲＩＮＧでの一時的なトランスフェクションを、ｐ５３−／−／ＭＤＭ２−／−マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）において、またはｓｉＲＮＡによりＰｉｒｈ２を欠損したＳａｏｓ−２細胞において実行し、そして、定常状態レベルに影響を与える能力を評価した（図２Ｊ、図２Ｋ）。本質的に、ＣＯＰ１は、ＭＤＭ２およびＰｉｒｈ含有細胞において達成したｐ５３の負の制御を反復し得た。これらの結果は、ＣＯＰ１が、ｐ５３の制御においてＭＤＭ２から独立して機能し得ることを示唆する。
【０１２７】
ＣＯＰ１はインビボでｐ５３のユビキチン化を調節する（図２Ｆ）ので、本発明者らは、ｐ５３がインビトロでＣＯＰ１に対する直接的な基質であるかを決定することを望んだ。ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＣＯＰ１を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、精製し、その後、インビトロで翻訳されたｐ５３を用いるユビキチン化アッセイのために使用した（図２Ｇ）。全ての反応成分およびｐ５３の存在にとともにのみ、ＣＯＰ１は、ｐ５３を直接的にユビキチン化し得た。それゆえ、これらのデータは、ＣＯＰ１が、ｐ５３に対するＥ３−リガーゼとして機能していることを示す。
【０１２８】
（実施例３）
ｐ５３依存トランス活性化に対するＣＯＰ１の過剰発現の効果を測定するために、Ｓａｏｓ−２細胞を、ｐ５３およびＣＯＰ１またはＣＯＰ１ΔＲＩＮＧ、およびｐ２１−ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）またはｂａｘ−Ｌｕｃでトランスフェクションした（図２Ｈ、図２Ｌ）。ＣＯＰ１の添加は、ｐ２１およびｂａｘプロモーターからトランス活性化するｐ５３の能力を顕著に減少させた。さらに、ＤＮＡ損傷により誘導されたものとともに、内因性ｐ５３のトランス活性化能力は、同じ様式において、ＣＯＰ１の過剰発現により解消された（図２Ｍ）。ｐ５３を負に制御するＣＯＰ１の能力をさらに評価するために、本発明者らは、Ｓａｏｓ−２細胞におけるｐ５３誘導細胞死をＣＯＰ１が阻害し得るか否かを確認した（図２Ｉ）。ｐ５３のトランスフェクションは、ＳｕｂＧ１集団における細胞の個体数を顕著に増加させた；それにもかかわらず、この増加は、ＣＯＰ１の共トランスフェクションにより著しく阻害された。このことは、ＣＯＰ１がｐ５３誘導性細胞しを阻害することを示唆している。ＣＯＰ１のトランスフェクションのみでは、細胞周期の分布に対して意味のある影響はなかった。
【０１２９】
より生理学的な設定においてＣＯＰ１の役割を明らかにするために、内因性ＣＯＰ１を、ｓｉＲＮＡによる抑制に供し、そして内因性ｐ５３の定常状態レベルに関する任意の効果を評価した（図３Ａ）。ＣＯＰ１のノックダウンを、リアルタイムＰＣＲおよび免疫ブロッティングにより評価した。Ｕ２−ＯＳ細胞におけるｓｉＲＮＡによるＣＯＰ１の欠失は、ｐ５３タンパク質の著しい蓄積を引き起こした。これらの結果は、２種のさらなる独立したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでも再現可能であり（図３Ｄ）、このことはＣＯＰ１がストレスのない細胞において、ｐ５３を負に制御することを示している。ｐ５３タンパク質レベルのそのような劇的な蓄積について、次いで、本発明者らは、ｐ５３がその下流の標的遺伝子であるｐ２１およびＰｉｒｈ２を誘導し得るか否かを確認した。リアルタイムＰＣＲを使用して、本発明者らは、ＣＯＰ１の抑制に応答して、ｐ２１  ｍＲＮＡおよびＰｉｒｈ２  ｍＲＮＡにおける顕著な増加を観察した。このことは、ｐ５３依存転写における増加を示す。さらに、総ｐ２１タンパク質レベルは、ＣＯＰ１  ｓｉＲＮＡの導入により劇的に増加した。対照的に、ｐ５３を含まない細胞株Ｈ１２９９へのＣＯＰ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、ｐ２１タンパク質レベル、またはｐ２１  ｍＲＮＡレベルおよびＰｉｒｈ２  ｍＲＮＡレベルに対して全く影響がなかった。さらに、Ｕ２−ＯＳ細胞におけるＣＯＰ１の欠失は、Ｇ１／Ｓ比率（１．８２対３．７１）における顕著な増加を引き起こしたが、Ｈ１２９９細胞にはいかなる影響も有さなかった。このことは、Ｇ１停止がｐ５３依存性様式で引き起こされることを示す。
【０１３０】
ＣＯＰ１がストレスのない細胞においてｐ５３代謝回転を媒介することを確認するために、パルスチェイス分析を、ＣＯＰ１を欠失したＵ２−ＯＳ細胞において実行した（図４Ａ）。ＣＯＰ１タンパク質の抑制は、ｐ５３の半減期をコントロールと比較して２倍増加させた。Ｐｉｒｈ２およびＭＤＭ２もまた、パルスチェイス分析のためにｓｉＲＮＡにより抑制し、ＣＯＰ１と比較した。Ｐｉｒｈ２の欠失はｐ５３の半減期を１．５倍に増加させ、ＭＤＭ２の欠失はｐ５３の半減期をコントロールと比較して２倍に増加させた。ＣＯＰ１をＭＤＭ２およびＰｉｒｈ２の状況下にすると、ｓｉＲＮＡによるＣＯＰ１およびＰｉｒｈ２の共切除は、ｐ５３の半減期のさらなる増強（コントロールに対して３．５倍）をもたらした。驚くべきことに、ＣＯＰ１およびＭＤＭ２を共に抑制することは、ｐ５３の半減期の相乗的な８倍の増加をもたらした。これは、同時にＰｉｒｈ２を欠失することによっては増強されなかった。このことは、ｐ５３の半減期がその具体的な系における最大値に達したことを示している。レポーターアッセイを、ｐ５３のトランス活性化機能を測定するために実行した（図４Ｂ）。ｐ５３の半減期における増加と一致して、ＣＯＰ１、Ｐｉｒｈ２、またはＭＤＭ２の抑制に関してｐ２１プロモーターからのトランス活性化における中程度の増加が存在し、最高の刺激はＭＤＭ２の抑制に由来した。これらの観察はまた、タンパク質レベルでも確認された（図４Ｃ）。上記ｐ２１プロモーターからの顕著な刺激およびＣＯＰ１およびＭＤＭ２の共抑制に応答したタンパク質レベルにおける増加もまた存在した（図４Ａ、図４Ｂ）。全てのＥ３リガーゼの抑制に応答して、ｐ５３タンパク質レベルもしくはｐ２１タンパク質レベルのさらなる増強（図４Ｃ）、またはプロモーター活性のさらなる増強（図４Ｂ）は存在せず、このことは、増殖する細胞が、ｐ２１および／またはｐ５３に対する限界閾値を有し得ることを示している。さらに、ＣＯＰ１、Ｐｉｒｈ２、またはＭＤＭ２の抑制は、正常ＢＪ線維芽細胞におけるｐ５３定常状態レベルおよびｐ２１定常状態レベルにおける増加を引き起こし（図４Ｄ）、このことは各リガーゼが正常細胞においてｐ５３を負に制御することにおいて役割を有することを示している。
【０１３１】
ＣＯＰ１およびＭＤＭ２の抑制がｐ５３応答を引き起こしたという観察で、本発明者らは、ＣＯＰ１および／またはＭＤＭ２の欠失が、Ｕ２−ＯＳ細胞における通常のＤＮＡ損傷応答を回復させるか否かを試験した。なぜなら、それらは、電離放射線（ＩＲ）誘導細胞死に対する高度の耐性がある３１ことが知られているからである。Ｕ２−ＯＳ細胞を、ＣＯＰ１および／またはＭＤＭ２に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、その後、２０  Ｇｙ  ＩＲで処理し、細胞死をヨウ化プロピジウム染色により評価した（図４Ｅ）。コントロールｓｉＲＮＡで前処理したＵ２−ＯＳ細胞は、ＩＲをによる処理後、細胞死に対して高度に耐性であった；しかしながら、ＣＯＰ１またはＭＤＭ２  ｓｉＲＮＡで前処理された細胞は、ＩＲ誘導細胞死に感受性である細胞の部分集団をもたらした。より著しく、ｓｉＲＮＡによるＣＯＰ１およびＭＤＭ２の同時抑制は、ＩＲによる細胞死に対して協働的な感作をもたらした。
【０１３２】
（ＣＯＰ１は、負のフィードバックループに参加するｐ５３誘導性遺伝子である）
ＭＤＭ２およびＰｉｒｈ２が自己調節的フィードバックループを形成することを考慮して、本発明者らは、ＣＯＰ１もまたこの調節機構の一部であり得る可能性について調査した。ＣＯＰ１遺伝子のプロモーター領域を走査することにより、転写開始部位（＋１）に対して、−２０９４〜−２０７３にｐ５３コンセンサス結合部位３２の存在が明らかになった（図５Ａ）。この２コピーのコンセンサス部位（ＣＯＰ１−Ｌｕｃ）、またはこのコンセンサス部位の変異体（ＣＯＰ１ｍｕｔ−Ｌｕｃ）を、最小のプロモーターを含むルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１＋、ｐ５３もしくはＤＮＡ結合変異体のｐ５３Ｒ１７５ＨでＨ１２９９細胞にトランスフェクションした（図５Ｂ）。ｐ５３のトランスフェクションは、ＣＯＰ１−Ｌｕｃのルシフェラーゼ活性を増加させたが、ＣＯＰ１ｍｕｔ−Ｌｕｃレポーター構築物のルシフェラーゼ活性は増加させず、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ変異体は、ＣＯＰ１−ＬｕｃにもＣＯＰ１ｍｕｔ−Ｌｕｃにも意味のある影響を有さなかった。さらに、ｐ５３のトランスフェクションは、リアルタイムＰＣＲにより評価された場合、Ｈ１２９９細胞内のＣＯＰ１  ｍＲＮＡレベルを実質的に増加させた（図５Ｃ）。総ＣＯＰ１タンパク質における増加はまた、抗ＣＯＰ１を用いたウェスタンブロットにより検出した（図５Ｄ）。さらに、ｐ５３依存転写を活性化し、かつｐ５３を安定させる、ＩＲで処理されたＵ２−ＯＳ細胞は、未処理細胞と比較してＣＯＰ１タンパク質レベルにおける増加を生じた（図５Ｅ）。コントロールとして、ｐ２１タンパク質レベルおよびｐ５３タンパク質レベルもまた、免疫ブロッティングにより評価し、ＩＲ傷害がｐ５３応答を惹起することを証明した。合わせて考慮すると、これらのデータは、ＣＯＰ１が負のフィードバックループに関与するｐ５３誘導性遺伝子であることを示唆する。
【０１３３】
（ＣＯＰ１は、癌細胞において過剰発現される）
ＣＯＰ１発現を、リアルタイムＰＣＲおよびインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）技術により、哺乳動物細胞／組織において試験した。本発明者らは、ＩＳＨ（図６Ａ）、ＲＴ−ＰＣＲ（図６Ｂ）およびノーザンブロット（図６Ｃ）により、正常マウス組織における発現分析を実施した。ＩＳＨ分析は、ｃｏｐ１が、正常マウス骨格筋、腸および精巣で発現されることを示した。精巣において、顕著な発現がライディヒ細胞においては明白であったが、中程度のシグナルもまた、生殖細胞に存在した(図６Ａ）。ノザンブ
ロットパネルにより、ｃｏｐ１が心臓、肝臓および腎臓、ならびに精巣において発現されたことを確認した（図６Ｃ）。ｃＤＮＡパネルＲＴ−ＰＣＲはまた、ｃｏｐ１が脳、胃、小腸、膵臓、副腎、子宮および前立腺において発現されたことを示した。ＲＴ−ＰＣＲおよびノザンブロットパネルは、完全長のｃｏｐ１  ｍＲＮＡ発現の組織分布に対して良好な一致にあった。マウスの組織に加えて、本発明者らは、ＩＳＨによってヒト組織を評価し、正常ヒト扁桃腺、脾臓、精巣、膵臓および結腸においてｃｏｐ１発現を同定した。このことは、正常ヒト精巣、胸腺、結腸、心臓、前立腺、脾臓、腸および肝臓における、ノザンブロットによる顕著なｃｏｐ１発現を示す以前の発見３６と一致する。
【０１３４】
癌においてＣＯＰ１遺伝子発現が改変されたかどうかを決定するために、総ＲＮＡを、種々の通常サンプルおよび腫瘍サンプルから収集し、そして、相対的ｃｏｐ１発現を、リアルタイムＰＣＲおよびＲＰＬ１９  ｍＲＮＡに対する正規化によって決定した。正常コントロールに対して、ｃｏｐ１  ｍＲＮＡにおいて２倍から８倍の著しい増加が存在した（図７Ａ）。従って、本発明者らは、三連で、６７種の卵巣腺癌事例の０．６ｍｍコアから成る卵巣組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に対して、ＩＳＨのためのｃｏｐ１特異的プローブを使用して、より大規模な研究を実行した。漿液性腺癌の３０％（８／２７）の事例が、悪性細胞内においてのみ陽性シグナルを示した一方で、支質区画内（図７Ｂ）または正常卵巣組織内においては、シグナルは観察されなかった。さらに、類内膜腺癌の１６％（３／１９）の事例および明細胞腺癌の２７％（３／１１）の事例は、ｍＲＮＡコードＣＯＰ１.に対する陽性シグナルを示した（表１）。
【０１３５】
（表１：組織マイクロアレイについての卵巣腺癌事例の概要。ＣＯＰ１発現は、ＩＳＨおよびＩＨＣによって実証された。）
【０１３６】
【表１】
2010223966.tif 000013
ＣＯＰ１がタンパク質レベルでこれらの腫瘍において発現されることを確認するために、ＣＯＰ１に対する特異的抗体を使用したＩＨＣ分析を、上述のものと同じ卵巣ＴＭＡならびに図７ＡにおけるＲＴ−ＰＣＲのために使用された卵巣サンプルに対して行った。このＴＭＡに対する結果は、表１に要約され、漿液性腺癌の４７％（１１／２７）、類内膜腺癌の６３％（１２／１９）、明細胞腺癌の３６％（４／１１）および粘液性腺癌の５０％（５／１０）が、悪性細胞の核区画および細胞質区画においてロバストなＣＯＰ１免疫反応を示した；しかしながら、支質においてはシグナルは検出されなかった（図７Ｃ）。さらに、正常組織は、ＣＯＰ１抗体とのいかなる反応に対しても陰性であった。集合的に、これらのデータは、ＣＯＰ１  ｍＲＮＡおよびＣＯＰ１タンパク質が、悪性細胞において特異的に過剰発現されていることを示す。ＩＳＨデータおよびＩＨＣデータとの良好な一致が存在し；類内膜腺癌および粘液性腺癌は、ＩＳＨデータと比較して、ＩＨＣデータによってより高いパーセンテージのＣＯＰ１陽性サンプルを示した。このことは、ＣＯＰ１の転写後調節を示唆している。
【０１３７】
次に、本発明者らは、ＣＯＰ１を過剰発現する腫瘍サンプルのいずれかが、ｐ５３依存反応における欠陥を有するか否かを決定することを望んだ。この問題に取り組むために、本発明者らは、ｐ５３標的遺伝子およびサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ｐ２１／ＷＡＦ１）に特異的なプローブを使用して、ＣＯＰ１を過剰発現する卵巣腫瘍に対してリアルタイムＰＣＲを実行した(図７Ａ）。ここで、正常コントロールサンプルと比較す
ることによってｍＲＮＡにおける変化倍数が評価された。ＣＯＰ１を過剰発現するサンプルの大多数は、適合する正常コントロールに対して、ｐ２１ｍ  ＲＮＡにおける著しい増加を示した（図７Ｄ）。これらの結果は、ＣＯＰ１がｐ２１の転写を活性化するｐ５３の能力を負に制御することと一致する。
【０１３８】
ｐ５３が卵巣癌において突然変異され得ることを考慮すると、これらのサンプルにおけるｐ５３遺伝子の状態を測定することが重要である。なぜなら、ｐ５３の特異的変異体は、ｐ２１プロモーターからトランス活性化する固有の能力を喪失するからである。例えば、ＣＯＰ１が過剰発現されるサンプルにおいてｐ５３が突然変異される場合、観察されたｐ２１  ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、ｐ５３から独立したものであるかもしれない。それゆえ、本発明者らは、ｐ５３突然変異がしばしば同定されるエキソン５〜８およびイントロン−エキソン境界を配列決定し、これらのサンプルの７／８は野生型であり、１／８はＲ２４９Ｓ突然変異を有したことを見出した。この突然変異は、ｐ５３ＤＮＡ結合領域に位置し、かつ正常乳房上皮細胞を不死化することが示されている３７。さらに、上記Ｒ２４９Ｓ突然変異卵巣サンプル（番号８）は、正常レベルのｐ２１  ｍＲＮＡを有し、ＣＯＰ１による野生型ｐ５３依存性転写の抑制と一致した。
【０１３９】
ＣＯＰ１特異的抗体を使用して、１ｍｍコアに整列された、乳房腺癌の３２事例を特徴付けるＴＭＡにおいて、ＩＨＣを実行した。著しく、８１％（２５/３２）の事例が、悪
性細胞にのみ存在するＣＯＰ１抗体と強い免疫反応を示した（図８Ａおよび８Ｂ）が、支質細胞または上皮細胞内では免疫反応は示さなかった。タンパク質リン酸化により影響されない、１８０１  ｐ５３特異的抗体３８を使用したＩＨＣ分析は、陽性シグナルを伴う３／３２のみの事例を明らかにした（図８Ｅおよび図８Ｆ）。対照的に、ＣＯＰ１に対して陽性であるほとんどの事例は、ｐ５３に対しては陰性であった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。ＤＮＡ損傷剤または遺伝子突然変異により安定化されていなければ、ｐ５３はＩＨＣによって組織において検出をすることが困難であることを考慮して、乳房ＴＭＡ由来のｐ５３遺伝子を配列決定し、その具体的なサンプルが、確かに突然変異ｐ５３であったことを確認した（図８Ｇ）。３つの事例の各々で同定された突然変異は、Ｃ２４２Ｆ、Ｐ２７８ＳおよびＲ１７５Ｈのアミノ酸置換をもたらした。
【０１４０】
乳癌サンプルにおけるｐ５３およびＣＯＰ１のタンパク質レベルをより定量的に比較するために、本発明者らは、腫瘍溶解物のウェスタンブロット分析を実施した（図９Ａ、図９Ｂ）。抗ＣＯＰ１を用いた免疫ブロッティングは、正常乳房組織においては極めて弱いシグナルを示したが、ＣＯＰ１における顕著な増加が、６７％（１０／１５）の事例で検出され、このことによって、ＣＯＰ１が真に乳房腺癌で過剰発現される乳房ＴＭＡでの以前の観察（図８Ａおよび８Ｂ）を確認した。ｐ５３レベルは、５３％（８／１５）におい
て減少したが、正常乳房組織と比較した場合に、この事例の２０％（３／１５）で著しく増加した。
【０１４１】
ｐ５３に対するＣＯＰ１の過剰発現の結果をさらに解明するために、これらのサンプル内のｐ５３遺伝子の状態を決定することが必要であった。それゆえ、エキソン５〜８を配列決定し、そして、エキソンの突然変異とともに、イントロン−エキソン境界における突然変異について分析した。事例の２７％（４／１６）が、エキソン８内に突然変異を有し（図９Ｂ）；サンプルＴ６およびＴ１２は、Ｒ２９０Ｈ突然変異を含み、一方、サンプルＴ７およびＴ１０は、Ｒ２７３Ｈ突然変異を有した。ＣＯＰ１が乳房腫瘍において過剰発現された場合のｐ５３の定常状態タンパク質レベルは、野生型ｐ５３レベルが劇的に減少される事例の７５％（６／８）において、ＣＯＰ１が過剰発現されたことを示した。わずか２５％（６／８）の事例のみが、ｐ５３レベルにおける減少を示した。ＣＯＰ１が過剰発現され、かつｐ５３レベルにおける付随する減少は観察されなかった場合には、ｐ５３遺伝子の状態は突然変異であり、それによりＣＯＰ１が、野生型ｐ５３を負に制御する能力を有することを示した。
【０１４２】
この結果は、卵巣腺癌の少なくとも４５％および乳房腺癌の８０％が、ＣＯＰ１のロバストな過剰発現を有し、そしてｐ５３機能または定常状態のタンパク質レベルにおける欠陥は野生型ｐ５３および過剰発現したＣＯＰ１を含んだ幾つかのサンプルにおいては見られたが、突然変異ｐ５３および過剰発現したＣＯＰ１を含んだサンプルにおいては見ることができなかったことを実証する（図７Ａ〜Ｄおよび図９Ａ〜Ｂ）。ＣＯＰ１の過剰発現を野生型ｐ５３含有癌においては主に（しかし排他的ではない）検出した。このことはＣＯＰ１の主要な役割の１つが、ｐ５３依存性腫瘍抑制を抑圧することであることを示す。
【０１４３】
種々の癌におけるＣＯＰ１レベルおよびｐ５３レベルの試験から、以下の結果を得た：結腸腺癌については、１２／３８の事例がｐ５３陽性であり、この１２事例のｐ５３陽性事例の中の５事例はＣＯＰ１にもまた陽性であり、８事例はＣＯＰ１陽性Ｐ５３陰性であった；乳房腺癌については、３／３２事例がｐ５３陽性であり、３事例のｐ５３陽性事例中２事例はＩＨＣによりＣＯＰ１にも陽性、２３／３２事例はＣＯＰ１陽性ｐ５３陰性であった；移行上皮癌（腎臓、前立腺、膀胱）については、３／３がｐ５３陽性かつＣＯＰ１陽性であった；肺腺癌に対しては、１／３がｐ５３陽性かつＣＯＰ１陽性であった；リンパ腫に対しては、１／３がｐ５３陽性かつＣＯＰ１陽性であった；卵巣腺癌に対しては、３２／６７がＣＯＰ１陽性であり、ＣＯＰ１陽性サブタイプは以下：漿液性腺癌では、１１／２７が陽性；類内膜腺癌では、１２／１９が陽性；明細胞腺癌では、４／１１が陽性；粘液性腺癌では、５／１０、であった。
【０１４４】
このように、ＣＯＰ１は、乳癌、卵巣癌などを含む多くの癌において過剰発現され、そしてこれは、野生型ｐ５３定常状態タンパク質レベルまたはｐ５３依存性転写における減少を伴う。本発明者らはまた、卵巣漿液性腺癌、類内膜腺癌および粘液性腺癌の幾つかの事例において、ＩＨＣによりＣＯＰ１を検出した。ここで、ＩＳＨによるｍＲＮＡレベルにおいては、検出可能なシグナルは観察されず、このことは、ＣＯＰ１タンパク質の定常状態レベルにおける増加はまた、転写の増加よりもむしろ翻訳後レベルにおいて起こり得ることも示す。
【０１４５】
（参考文献）
以下の刊行物は、本明細書により参考として援用される。
【０１４６】
【数２−１】
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【０１４７】
【数２−２】
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【０１４８】
【数２−３】
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【０１４９】
【数２−４】
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（他の実施形態）
本発明の種々の実施形態は、本明細書中に開示されるが、多くの適用および改変を、当業者の一般的な知識に従って、本発明の範囲内で行い得る。これらの改変は、実質的に同じ方法において同じ結果を達成するための、本発明の任意の局面に対する公知の等価物による置き換えを含む。本発明で使用されるアクセッション番号は、多数のデータベースからのアクセッション番号をいう。このデータベースとしては、ヌクレオチド配列については、ＧｅｎＢａｎｋ、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）、ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、またはＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ（ＧＳＤＢ）が挙げられ、ポリペプチド配列については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＰＲＦ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（解明された構造由来の配列）、ならびにＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、またはＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列由来のアノテーションが付けられた翻訳からのものが挙げられる。数字の範囲は、その範囲を規定する数を含む。本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、実質的に「を含むが、それに限定されない」という句に相当する無制限の用語として使用され、そして「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という語は、対応する意味を有する。本明細書中の参考文献の引用は、これらの参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものと解釈されるべきではない。すべての刊行物は、あたかも各個別の刊行物が、本明細書により参考として援用されることを明示的に別個に示されたかのように、そしてあたかも本明細書中に完全に記載されたかのように、本明細書によって参考として援用される。本発明は、実質的に本明細書中で以上で説明された全ての実施形態およびバリエーション、およびそれらの実施例および図面を参照した実施形態およびバリエーションの全てを包含する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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