(57)【要約】      （修正有）【課題】NAT2遺伝子の一塩基多型を短時間で簡便、且つ安価に検出できる方法の提供。および、該検出に用いる核酸プライマー及び検出用プローブの提供。【解決手段】ヒトNAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を検出するための、LAMP増幅用核酸プライマーセットであって、特定な配列からなる複数のプライマーセットから選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、F3プライマー、及び、B3プライマーを具備する核酸プライマーセット。【選択図】図１
2010011850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトNAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を検出するための、LAMP増幅用核酸プライマーセットであって、
標的核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域及びF1領域、及び3’末端側から順にB3c領域、B2c領域及びB1c領域とし、
核酸プライマーが3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー、3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである場合に、
表５に記載されたプライマーセット１〜１０から選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、
前記FIPプライマー及びBIPプライマーが表５のプライマーセット1〜5及び10から選択される場合に配列番号39の配列から成り、前記FIPプライマー及びBIPプライマーが表５のプライマーセット6〜9から選択される場合に配列番号41の配列から成るF3プライマー、及び、
配列番号40の配列から成るB3プライマー、
を具備する、核酸プライマーセット。
【請求項２】
前記FIPプライマー及びBIPプライマーが、表５に記載されたプライマーセット３、６、９及び１０から選択される、請求項１に記載の核酸プライマーセット。
【請求項３】
前記FIPプライマー及びBIPプライマーが、表５に記載されたプライマーセット６又は１０のプライマーである、請求項１に記載の核酸プライマーセット。
【請求項４】
ヒトNAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を検出するための、請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸プライマーセットを具備するキット。
【請求項５】
前記核酸プライマーセットを用いて標的核酸を増幅することによって得られた増幅産物を検出するための野性型核酸プローブ及び変異型核酸プローブをさらに含み、
前記野性型核酸プローブが、野生型の増幅産物と相補的であり、61〜69℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型T341C部位がその末端から３塩基以上内側に位置することを特徴とし、
前記変異型核酸プローブが、変異型の増幅産物と相補的であり、58〜70℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型T341C部位がその末端から３塩基以上内側に位置することを特徴とする、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記野生型核酸プローブが配列番号72又は73の配列又はそれらの相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号76、77又は78の配列又はそれらの相補配列から成る、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記野性型及び変異型の核酸プローブが固定化された核酸プローブ固定化基体を具備することを特徴とする、請求項５又は６に記載のキット。
【請求項８】
請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸プライマーセットを使用して標的核酸を増幅する工程と、
得られた増幅産物に含まれる、野生型の増幅産物と変異型の増幅産物のそれぞれの量を測定し、比較する工程と
を具備する、ヒトNAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型の検出方法。
【請求項９】
前記増幅産物の測定が、基体に固定化された核酸プローブと該増幅産物とをハイブリダイゼーションさせ、該核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定することによって行われ、
該核酸プローブが、前記野生型の増幅産物と相補的な野性型核酸プローブ、及び、前記変異型の増幅産物と相補的な変異型核酸プローブであることを特徴とする、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記野生型核酸プローブが61〜69℃のTm値を有し、前記変異型核酸プローブが58〜70℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型T341C部位がそれぞれの核酸プローブの末端から３塩基以上内側に位置することを特徴とする、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記野生型核酸プローブが66〜68℃のTm値を有し、前記変異型核酸プローブが63〜69℃のTm値を有することを特徴とする、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
前記野生型核酸プローブが配列番号72又は73の配列又はそれらの相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号76、77又は78の配列又はそれらの相補配列から成る、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記野生型核酸プローブが配列番号72の配列又はその相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号76の配列又はその相補配列から成る、請求項１２に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、N-アセチルトランスフェラーゼ２（NAT2）遺伝子の一塩基多型における遺伝子型を検出するために用いられる核酸プライマーセット及び検出用プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
N-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）は、結核治療薬イソニアジド（INH）やサラゾスルファピリジン等の臨床的に重要な薬物の代謝に関与している。サラゾスルファピリジンは、潰瘍性大腸炎や関節リウマチ等の治療薬である。
【０００３】
NAT2をコードする遺伝子には遺伝子多型が存在することが知られている。NAT2の活性が高い表現型はRapid Acetylator（RA）と呼ばれ、活性が低い表現型はSlow Acetylator（SA）と呼ばれている。日本人では、野生型NAT2*4を含む4種類の多型（NAT2*4、NAT2*5、NAT*6、NAT2*7）が存在すると言われている。変異アレルNAT2*5、NAT*6、NAT2*7は、各々、一塩基多型T341C、G590A、G857Aにおける遺伝子型を検査することにより判別することができる。この変異アレルのホモ接合体、または複合ヘテロ接合体を有する人はSAの可能性が高く、副作用の発生確率が高くなる。
【０００４】
このように、NAT2遺伝子の変異を検査することは、薬物の副作用を回避するために有用である。また、NAT2遺伝子の遺伝子型を明らかにすることにより、個々人に適した薬物投与や治療を選択することが出来る。
【０００５】
一塩基多型の検出は、一般に、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法によって標的核酸を増幅し、特異的なプローブで野生型及び変異型のそれぞれの増幅産物を検出することによって行われる（非特許文献１）。しかしながら、PCR法は核酸抽出などの前処理が煩雑である。また、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御が必須であり、さらに反応時間に2時間以上を要するなどの不都合がある。また、PCR法による増幅産物は2本鎖であるため、相補鎖が、検出の際にプローブに対するコンペティターとなり、検出感度を低下させるという問題があった。そこで、増幅産物を1本鎖にするため、酵素や磁気ビーズを用いて、相補鎖を分解又は分離する方法がとられているが、いずれも操作が煩雑であり、また費用がかかるという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jain K.K., Application of Amplicip CYP450, Mol Diagn 9,119-27 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記問題に鑑み、本発明は、NAT2遺伝子の一塩基多型を短時間で簡便、且つ安価に検出できる方法を提供するために、該検出に用いる核酸プライマー及び検出用プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明によれば、ヒトNAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を検出するための、LAMP増幅用核酸プライマーセットであって、表５に記載されたプライマーセット１〜１０から選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、前記FIPプライマー及びBIPプライマーが表５のプライマーセット1〜5及び10から選択される場合に配列番号39の配列から成り、前記FIPプライマー及びBIPプライマーが表５のプライマーセット6〜9から選択される場合に配列番号41の配列から成るF3プライマー、及び、配列番号40の配列から成るB3プライマーを具備する核酸プライマーセットが提供される。
【０００９】
ここにおいて、表５に記載されたプライマーセット１〜１０は、次のプライマーから成る：
プライマーセット１：配列番号33のFIPプライマー及び配列番号30のBIPプライマー、
プライマーセット２：配列番号33のFIPプライマー及び配列番号31のBIPプライマー、
プライマーセット３：配列番号33のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット４：配列番号34のFIPプライマー及び配列番号30のBIPプライマー、
プライマーセット５：配列番号34のFIPプライマー及び配列番号31のBIPプライマー、
プライマーセット６：配列番号34のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット７：配列番号35のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット８：配列番号36のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット９：配列番号37のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット１０：配列番号38のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー。
【００１０】
他の態様において、ヒトNAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を検出するための、上記核酸プライマーセットを具備するキットが提供される。該キットは、上記核酸プライマーセットを用いて標的核酸を増幅することによって得られた増幅産物を検出するための野性型核酸プローブ及び変異型核酸プローブをさらに含んでよい。
【００１１】
他の態様において、上記核酸プライマーセットを使用して標的核酸を増幅する工程と、得られた増幅産物に含まれる、野生型の増幅産物と変異型の増幅産物のそれぞれの量を測定し、比較する工程とを具備するヒトNAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型の検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、NAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、該プライマーセット及び任意に検出用プローブを含むキット、及び該一塩基多型の検出方法が提供される。本発明に従えば、NAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を、安価で簡便に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】LAMP法の概要図。
【図２】LAMP法の中間産物及びインナープライマー（FIP、BIP）のアニール位置を示す模式図。
【図３】ループプライマーの配置を示す概要図。
【図４】LAMP法の中間産物及びループプライマー（LFc、LBc）のアニール位置を示す模式図。
【図５】増幅産物の検出位置を示す模式図。
【図６】プローブ固定化基体の一実施形態の平面模式図。
【図７】プローブ固定化基体の一実施形態の平面模式図。
【図８】FIPプライマーの配置を示す模式図。
【図９Ａ】NAT1及びNAT2遺伝子の配列。
【図９Ｂ】図９Ａに続くNAT1及びNAT2遺伝子の配列。
【図１０】本発明のプライマーセットによる増幅の電気泳動図。
【図１１】本発明のプライマーセットによる増幅の電気泳動図。
【図１２】非特異的増幅を示す電気泳動図。
【図１３】G590A検出用プローブについての試験結果１。
【図１４】G590A検出用プローブについての試験結果２。
【図１５Ａ】G590A検出用プローブについての試験結果３（野性型）。
【図１５Ｂ】G590A検出用プローブについての試験結果３（変異型）。
【図１５Ｃ】G590A検出用プローブについての試験結果３（ヘテロ型）。
【図１６Ａ】G857A検出用プローブについての試験結果１（プライマーセット1）。
【図１６Ｂ】G857A検出用プローブについての試験結果１（プライマーセット5）。
【図１７】G857A検出用プローブについての試験結果２。
【図１８Ａ】T341C検出用プローブについての試験結果１（プライマーセット6）。
【図１８Ｂ】T341C検出用プローブについての試験結果１（プライマーセット10）。
【図１９】G590A、G857Aの同時増幅の結果。
【図２０Ａ】G590A、G857A、T341Aの同時検出結果（T341C用プライマーセット6）。
【図２０Ｂ】G590A、G857A、T341Aの同時検出結果（T341C用プライマーセット10）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一塩基多型の検出にはPCR法が用いられることが多いが、PCR法には上記したような不都合な点がある。よって、本発明では、PCR法に替わってLAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法を利用して一塩基多型を検出する。LAMP法とは、核酸を等温条件下60〜65℃で増幅する技術である。LAMP法はPCR法と比較して、短時間で多量の増幅産物が得られるという利点を有する。また、サンプル中の不純物の影響を受けにくいとも報告されている。LAMP法を用いることによって、簡便に標的核酸を増幅することが可能である。
【００１５】
本発明の検出方法では、LAMP法によって標的核酸を増幅し、得られた増幅産物中の、野生型の増幅産物と変異型の増幅産物の量をそれぞれ測定する。野生型の増幅産物が多い場合は、試験に供された標的核酸の遺伝子型は野性型であると判定できる。反対に、変異型の増幅産物が多い場合は、該標的核酸は変異型であると判定できる。また、野生型と変異型の増幅産物がほぼ等量である場合は、ヘテロ型の遺伝子であると判定できる。
【００１６】
増幅産物の量は、これに限定されないが、例えば核酸プローブを用いて測定することができる。核酸プローブは、野生型の増幅産物と相補的な核酸プローブと、変異型の増幅産物と相補的な核酸プローブを用いる。増幅産物とそれぞれの核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせ、それぞれの核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定する。野生型の核酸プローブに結合した増幅産物の量と、変異型の核酸プローブに結合した増幅産物の量を比較することによって、標的核酸の遺伝子型を判定することができる。
【００１７】
＜LAMP法の概要＞
以下にLAMP法の概要を説明する。なお、本明細書では、一塩基多型の検出に供される核酸（ゲノムＤＮＡ等を含む）を検体核酸と称する。また、LAMP法によって増幅されるNAT2遺伝子内の領域を標的核酸と称する。また、LAMP法によって得られた産物を増幅産物と称する。また、ヒトゲノムDNAを含む溶液を試料溶液と称する。
【００１８】
LAMP法では、標的核酸に対してその5’末端側から順にF3領域、F2領域、F1領域を設定し、3’末端側から順にB3c領域、B2c領域、及びB1c領域を設定する。そして、図１に示すような4種のプライマーを用いて標的核酸を増幅する。なお、F1c、F2c、F3c、B1、B2、及びB3領域はそれぞれ、F1、F2、F3、B1c、B2c、及びB3c領域の相補鎖における領域を示している。
【００１９】
LAMP法において核酸を増幅するために使用される4種のプライマーとは、（１）3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し、且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー；（２）前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー；（３）3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し、且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー；及び、（４）前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである。一般に、FIPプライマー及びBIPプライマーはインナープライマーと呼ばれ、F3プライマー及びB3プライマーはアウタープライマーと呼ばれる。
【００２０】
上記4種のプライマーを用いてLAMP増幅を行うと、図２に示すようなダンベル構造を有する中間産物が生成される。一本鎖ループ内のF2c及びB2c領域にFIP及びBIPプライマーが結合し、該プライマーの3’末端及び中間産物自体の3’末端から伸長反応が進行する。詳細には、特許第3313358号を参照されたい。
【００２１】
LAMP法ではさらに、ループプライマーと呼ばれるさらなるプライマーを任意に用いることによって、増幅時間を短縮させることができる。この場合、図３に示すように、前記F2領域からF1領域にかけての部分においてLF領域を設定し、前記B2c領域からB1c領域にかけての部分においてLBc領域を設定する。これらはループプライマー領域と称する。そして、上記の４種のプライマーに加えて、LF領域と相補的な配列から成るループプライマーLFｃ、及び上記LBｃ領域と同じ配列から成るループプライマーLBｃを用いる。詳細には、WO2002/0249028号を参照されたい。これらのループプライマーLFｃ及びLBｃは、同時に用いてもよいが、何れか一方のみを用いてもよい。ループプライマーは、図４に示すように、FIP及びBIPプライマーがアニールするループとは別のループにアニールし、さらなる合成起点を与えることによって増幅を促進させる。
【００２２】
＜LAMP増幅産物の検出；核酸プローブ＞
一塩基多型を検出する場合は、検出される多型部位を図５に示すFP領域又はBPc領域に位置させる。或いは、FP領域及びBPc領域のそれぞれに異なる多型を位置させてもよい。図５に記載したように、F2領域からF1領域にかけての部分は、増幅産物中で一本鎖となる部分である。同様に、B2c領域からB1c領域にかけての部分も増幅産物中で一本鎖となる部分である。一本鎖である部分に検出すべき多型部位を位置させることによって、核酸プローブによる検出を簡便にすることができる。
【００２３】
核酸プローブは、多型部位を含むFP領域又はBPc領域と結合するように設計する。即ち、核酸プローブは、FP領域又はBPc領域のうち、多型部位を含む領域の配列と相補的な配列を有する。
【００２４】
なお、増幅産物中には、FP領域及びBPc領域とそれぞれ相補的なFPc領域及びBP領域も存在する。よって、これらのFPc領域及びBP領域を検出に利用することも可能である。
【００２５】
本明細書においては、野生型の増幅産物と相補的な配列を含む核酸プローブを野性型核酸プローブと称し、変異型の増幅産物と相補的な配列を含む核酸プローブを変異型核酸プローブと称する。
【００２６】
核酸プローブは、特に限定されないが、DNA、RNA、PNA、LNA、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の人工核酸鎖から構成されて良い。基体に固定化するために、末端をアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基で修飾してもよい。該官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入することも可能である。スペーサーには、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いることができる。
【００２７】
＜核酸プローブ固定化基体＞
核酸プローブは、これに限定されないが、基体上に固定化して用いることができる。核酸プローブ固定化基体は、DNAチップ、DNAマイクロアレイと称されるそれ自身公知の装置を利用しても良い。
【００２８】
プローブ固定化基体の一実施態様の模式図を図６に示した。プローブは、基体１上の固定化領域２に固定化される。基体１は例えばシリコン基板などから製造することができるが、これに限定されない。プローブの固定化は、公知の手段によって行えばよい。1つの基体１に固定化されるプローブは１種でも複数種類であってもよく、その配置や数は当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。後述するように、プローブを蛍光検出する場合には、本実施態様のようなプローブ固定化基体を用いることができる。
【００２９】
プローブ固定化基体の他の実施態様の模式図を図７に示した。本実施態様においては、基体１１に電極１２が備えられる。プローブは電極１２に固定化される。電極１２は、電気的情報を取り出すためのパット１３に接続される。基体１１は例えばシリコン基板などから製造することができるが、これに限定されない。電極の製造及びプローブの固定化は、公知の手段によって行えばよい。電極は、特に限定されるものではないが、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム及びタングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボンのような炭素、及びこれらの酸化物又は化合物で製造することができる。
【００３０】
図７の固定化基体は１０個の電極を備えるが、これに限定されず、1つの基体に配置される電極の数は任意に変更できる。また電極の配置パターンも図に示したものに限定されず、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。基体１には、必要に応じて、参照電極および対極を設けても良い。後述するように、プローブを電気化学的に検出する場合には、本実施態様のようなプローブ固定化基体を用いることができる。
【００３１】
＜核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーション＞
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションは適切な条件下で行う。適切な条件は、増幅産物の種類や構造、検出配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダーゼション促進剤である硫酸デキストラン、並びにサケ精子DNA、牛胸腺DNAやEDTAおよび界面活性剤などを添加しても良い。反応温度は、例えば10℃〜90℃の範囲で行い、攪拌や振盪などで反応効率を高めても良い。反応後の洗浄には、例えばイオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００３２】
＜検出方法＞
前記基体に固定化されたプローブと増幅産物とがハイブリダイズすると2本鎖核酸が生じる。この2本鎖核酸は、電気化学的に又は蛍光により検出することができる。
【００３３】
(a)電流検出方式
電気化学的に2本鎖核酸を検出する方法を説明する。この方法では、2本鎖核酸を特異的に認識する2本鎖認識体を用いる。2本鎖認識体の例には、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーターなどが含まれるが、これらに限定されない。更に、これらの物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾することも可能である。
【００３４】
2本鎖認識体の濃度はその種類によって異なるが、一般的には１ng/mL〜1mg/mLの範囲で使用する。この際には、イオン強度0.001〜5の範囲でpH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００３５】
ハイブリダイゼーション反応中又は反応後、反応溶液中に2本鎖認識体を添加する。ハイブリダイズによって2本鎖核酸が生じている場合は、2本鎖認識体がこれに結合する。そこで、例えば2本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加して、2本鎖認識体に由来する反応電流値を測定することができる。この際、電位は定速で印加するか、あるいは、パルスで印加するかあるいな定電位を印加してもよい。測定の際に、例えばポテンショスタット、デジタルマルチメーター、およびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば特開平10-146183号公報に記載された公知の電気化学的検出手段が好適に用いられる。
【００３６】
(ｂ)蛍光検出法
蛍光によって２本鎖核酸を検出する方法を説明する。予め、プライマーを蛍光学的に活性な物質で標識しておく。又は、蛍光学的に活性な物質で標識した2次プローブを用いて検出する。或いは、複数の標識を使用してもよい。蛍光学的に活性な物質は、これらに限定されないが、FITC、Cy3、Cy5、もしくはローダミンなどの蛍光色素を含む。蛍光物質は、例えば蛍光検出器を用いて検出される。標識の種類に応じた適宜の検出装置を用い、標識された検出配列又は2次プローブを検出する。
【００３７】
＜核酸プライマーの選択＞
図８に一塩基多型G590AをF2とF1の間、すなわちFP領域に位置させた場合の模式図を示した。FIPプライマーは、F2領域と同じ配列、及び、F1領域と相補的な配列を有するプライマーである。このF2領域とF1領域とが、G590Aを挟んで位置する限り、様々な種類のプライマーを設計することが可能である。
【００３８】
しかしながら、プライマーの種類によってLAMP法の増幅効率が異なることが、本発明者らの研究によって明らかとなった。例えば、図８に4種のプライマーを例示する。その他の３種のプライマー（BIP、F3、及びB3プライマー）は共通のものを使用してそれぞれ増幅する。その結果、プライマー1は、十分な増幅時間、例えば2時間かけても増幅しない。プライマー2は、約1時間で増幅するが、プライマー同士の非特異的な増幅が起きる。プライマー3はプライマー同士の非特異的な増幅はないが、増幅に1.5〜2時間要する。プライマー4は、プライマー同士の非特異的な増幅もみられず、増幅も1時間以内で終了する。このような場合、増幅のために良好なプライマーは3または4であり、最良のプライマーは4である。即ち、優れたプライマーとは、増幅効率が高く短時間で増幅し、且つ非特異的な増幅が見られないプライマーである。
【００３９】
さらに、増幅産物を核酸プローブを用いて検出する場合には、増幅産物と核酸プローブとのハイブリダイゼーションが、高効率で生じることが望ましい。よって、ハイブリダイゼーションの効率が優れた増幅産物であるかどうかも、上記プライマーを評価する際に考慮される。
【００４０】
さらに、ヒトNAT2遺伝子はヒトNAT1と非常に高い相同性を示す。図９Ａ及びＢに、NAT2遺伝子及びNAT1遺伝子の配列を示した。NAT2遺伝子はNAT1遺伝子と相同性が高いため、NAT2を特異的に増幅するためには、NAT2とNAT1とで配列が異なる領域にプライマーを設計する必要がある。
【００４１】
よって、何れかのプライマーは、NAT2とNAT1で配列が異なる領域に設計する。好ましくは、F1領域、F2領域、B1領域、B2領域の少なくとも一つがNAT2とNAT1で配列が異なる領域に設計する。また、図９に示したように変異が報告されている箇所にはプライマーを設計しない。場合によって、変異箇所にプライマーを設計せざるを得ない場合には、mixの塩基またはdeoxyinosine(dI)などのユニバーサルな塩基を導入する。一塩基多型を間に挟まないもう一方のインナープライマーについては、F2からB2までの長さが450bp以下、より好ましくは350bp以下となる領域に設計することが好ましい。また、1本鎖ループの長さは、100bp以下、より好ましくは70bp以下となるように両インナープライマーを設計することが好ましい。
【００４２】
プライマー同士の非特異的な増幅はLAMP反応でしばしば見られる現象である。FIPプライマーはF1c領域とF2領域を含むため、長鎖の核酸となる。同じくBIPプライマーもB1c領域とB2領域を含むため、長鎖の核酸となる。よって、FIPプライマー同士、BIPプライマー同士、またはFIPプライマーとBIPプライマーが互いに絡み合い、プライマーを鋳型として増幅してしまう確率が高くなる。また、LAMP反応は、F3プライマー、B3プライマー、さらに場合によってはLFcプライマー、LBcプライマーも反応液中に存在するため、PCR反応と比較して非特異反応の確率はさらに高くなる。このような非特異反応が発生すると、検体核酸を鋳型とする所望のLAMP産物の量が低下する。
【００４３】
また、検体核酸を添加していないネガティブコントロール反応液において非特異反応が発生すると、増幅に伴い放出されるピロリン酸とMgの白色沈殿が、非特異的な増幅によるものなのか、コンタミネーションによって生じたものなのか区別することができない。従って、非特異増幅が発生するプライマーを排除することは重要である。
【００４４】
そこで本発明者らはNAT2遺伝子の一塩基多型G590Aについて、そしてさらにG857A及びT341Cについて、該一塩基多型部分を増幅するために最適な核酸プライマーを選択するための試験を行った。
【００４５】
［試験１−１：G590A用プライマー；FP領域］
NAT2 G590Aの多型部位をFP領域に設計した6種類の核酸プライマーセットを用い、63℃で1時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表１に記載した組成で行った。鋳型ＤＮＡにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
【００４６】
用いた核酸プライマーセットを表２に示す。
【表１】
2010011850.tif 000003
【００４７】
【表２】
2010011850.tif 000004
【００４８】
F3プライマーは配列番号8、B3プライマーは配列番号9を用い、全てのセットに共通で使用した。
【００４９】
［試験１−１：結果］
表２の６種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。その結果を図１０に示す。1時間増幅した場合、プライマーセット3および4で十分量の増幅産物が得られた（レーン５，６）。2時間増幅した場合、プライマーセット1、2、3及び4で十分量の増幅産物が得られた（レーン１，２，５及び６）。プライマーセット18、19（レーン３及び４）では、増幅産物が少ないか、または増幅が確認されなかった。また、全てのセットにおいて、非特異増幅は見られなかった。以上から、良好なプライマーセットは1、2、3、4であり、最良のプライマーセットは3、4であることが明らかになった。上記の結果を表２にまとめた。
【００５０】
［試験１−２：G590A用プライマー；BP領域］
NAT2 G590Aの多型部位をBP領域に設計した16種類のプライマーセットを用い、63℃で1時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表１に記載した組成で行った。鋳型ＤＮＡにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
【００５１】
用いた核酸プライマーセットを表３に示す。
【表３】
2010011850.tif 000005
【００５２】
F3プライマーは配列番号18、B3プライマーは配列番号19を用い、全てのセットに共通で使用した。
【００５３】
［試験１−２：結果］
表３の16種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。その結果を図１１に示す。1時間増幅した場合、プライマーセット9で十分量の増幅産物が得られた（レーン７）。2時間増幅した場合、プライマーセット5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、21で十分量の増幅産物が得られた。プライマーセット22、23では、増幅が見られなかった。プライマーセット20、21においては、図１２に示すような非特異増幅が見られた。以上から、良好なプライマーセットは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及び16であり、最良のプライマーセットは9であることが明らかになった。上記の結果を表３にまとめた。
【００５４】
［試験２：G857A用プライマー；BP領域］
NAT2 G857Aの多型部位をBP領域に設計した6種類のプライマーセットを用い、63℃で1時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表１に記載した組成で行った。鋳型ＤＮＡにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
【００５５】
用いた核酸プライマーセットを表４に示す。
【表４】
2010011850.tif 000006
【００５６】
F3プライマーは配列番号27、B3プライマーは配列番号28を用い、全てのセットに共通で使用した。
【００５７】
［試験２：結果］
表４の6種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。1時間増幅した場合、プライマーセット1、2、3、4及び5で十分量の増幅産物が得られた。2時間増幅した場合にも、同様にプライマーセット1、2、3、4及び5で十分量の増幅産物が得られた。プライマーセット6では、2時間増幅した場合でも増幅は見られなかった。また、全てのセットにおいて、非特異増幅は見られなかった。以上から、最良のプライマーセットは1、2、3、4、及び5であることが明らかになった。上記の結果を表4にまとめた。
【００５８】
［試験３：T341C用プライマー；BP領域］
NAT2 T341Cの多型部位をBP領域に設計した13種類の核酸プライマーセットを用い、63℃で1時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表１に記載した組成で行った。鋳型ＤＮＡにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
【００５９】
用いた核酸プライマーセットを表５に示す。
【表５】
2010011850.tif 000007
【００６０】
F3プライマーは、プライマーセット1、2、3、4、5、10、11、12および13については、配列番号39を用いた。プライマーセット6、7、8および9については、配列番号41を用いた。B3プライマーは配列番号40を用い、全てのセットに共通で使用した。
【００６１】
［試験３：結果］
表５の13種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。1時間増幅した場合、プライマーセット3、6、9、10で十分量の増幅産物が得られた。2時間増幅した場合には、プライマーセット1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び11で十分量の増幅産物が得られた。プライマーセット12、13では、2時間増幅した場合でも増幅は見られなかった。プライマーセットセット11においては、非特異増幅が見られた。プライマーセット1、2、3、4、5、6、7、8、9、10においては、非特異増幅が見られなかった。このことから、良好なプライマーセットは1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10であり、最良のプライマーセットは3、6、9、10であることが明らかになった。上記の結果を表５にまとめた。
【００６２】
＜G590A及びG857Aの多型部位を同時に増幅するための核酸プライマーの選択＞
多型部位は、FP領域とBP領域の各々に配置することもできる。これにより、1つの増幅産物で、2箇所以上の一塩基多型を測定することができる。例えば、G590AとG857Aの場合、G590AをFP領域に設計し、G857AをFPc領域に設計することができる。G590AとG857Aは少し離れて位置するため、ターゲット長(F2からB2までの長さ)は350bp程度となり、若干増幅効率は低下するものの、ループプライマーの導入などにより、1時間以内で増幅することができる。G590AとG857Aを同時に増幅する方法として、1つの反応チューブで各々の産物をマルチ増幅する方法もあるが、マルチ増幅は、条件設定を厳密に制御しなくてはならない。また、厳密に制御しても片方の産物のみが優先的に増幅し、もう一方の産物が増幅しない場合もありうる。よって、上述の方法により1つの増幅産物で2箇所以上の一塩基多型を測定できることは、大きな利点となる。
【００６３】
［試験４：G590A用プライマー（FP領域）、G857A用プライマー（BP領域）］
NAT2 G590Aの多型部位をFP領域に設計し、NAT2 G857Aの多型部位をBPc領域に設計した11種類の核酸プライマーセットを用い、63℃で1時間、1.5時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表１に記載した組成で行った。鋳型ＤＮＡにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
【００６４】
用いた核酸プライマーセットを表６に示す。
【表６】
2010011850.tif 000008
【００６５】
F3プライマーは配列番号49、B3プライマーは配列番号50を用いて全てのセットに共通で使用した。
【００６６】
［試験４：結果］
表６の11種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。1時間増幅した場合、いずれのプライマーセットにおいても増幅は見られなかった。1.5時間増幅した場合、プライマーセット1、6、7、8で十分量の増幅産物が得られた。2時間増幅した場合には、プライマーセット1、2、3、4、5、6、7、8及び10で十分量の増幅産物が得られた。プライマーセット9、11では、2時間増幅した場合でも増幅は見られなかった。プライマーセットセット10においては、非特異増幅が見られた。1、2、3、4、5、6、7、8においては、非特異増幅が見られなかった。このことから、良好なプライマーセットは1、2、3、4、5、6、7及び8であり、最良のプライマーセットは1、6、7、8であることが明らかになった。上記の結果を表６にまとめた。
【００６７】
以上の試験から、本発明で提供される好ましいインナープライマーが決定された。当業者には明らかなように、LAMP反応において最も重要なプライマーはインナープライマーである。増幅反応にインナープライマーは必須であるが、アウタープライマー、ループプライマーは必須ではない。アウタープライマー、ループプライマーを増幅反応液に入れることで、増幅効率は高まるが、位置による増幅効率の変化はインナープライマーと比較して少ない。よって、アウタープライマー（F3及びB3プライマー）は、任意の配列を用いてよい。例えば、F2領域の５’末端から60塩基以内の領域及びB2c領域の３’末端から60塩基以内の領域に結合するように設計されることが好ましい。即ち、F3プライマーと同じ配列であるF3領域が、F2領域の５’末端から60塩基以内に位置し、B3プライマーと相補的な配列であるB3c領域が、B2c領域の３’末端から60塩基以内に位置することが好ましい。また、ループプライマーはインナープライマーが結合するループとは別のループに結合するように設計し、インナープライマー領域と重ならない領域に設計されていればよい。
【００６８】
＜核酸プローブの選択＞
核酸プローブの鎖長は、短すぎても長すぎても好ましくない。塩基の種類により結合力に差はあるが、一般的に鎖長は長くなれば長くなるほど結合力は増加する。核酸プローブの鎖長が短すぎる場合、核酸プローブと増幅産物とハイブリ効率は低くなる。一方、核酸プローブの鎖長が長すぎる場合、野生型核酸プローブと変異型核酸プローブとの1塩基の差が小さくなる。そのため、野生型増幅産物と変異型核酸プローブとの非特異的な結合、また、変異型増幅産物と野生型核酸プローブとの非特異的な結合が増加する。よって、一塩基多型を検出するためには、例えば10〜35塩基のような、適切な鎖長の核酸プローブを用いることが好ましい。
【００６９】
上記結合力は、2本鎖核酸が解離する温度Tm値によって表すことができる。Tm値を計算する手法としては、例えば、最近接塩基対法、Wallance法、GC％法などがある。本発明では、最近接塩基対法(Breslauer et. al. 1986、Freier et.al. 1986, Schildkraut et.al. 1965)を採用する。本発明においては、Na+濃度：50ｍM、核酸プローブ(オリゴヌクレオチド)の濃度：0.5μMという条件下で算出した。
【００７０】
以下、本発明に従って得られた増幅産物の検出に好適に用いられる核酸プローブを選択するための試験を行った。
【００７１】
［試験５−１：G590A検出用プローブ］
PCR-RFLP(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)解析によってヘテロ型であると判明したヒトゲノムを鋳型に用い、G590A検出用プライマーセット9を用いて、63℃で1時間LAMP増幅を行った。G590A検出用プライマーセット9は上記試験１−２の結果、最良のプライマーであることが判明したセットである。得られた増幅産物を、電流検出型のDNAチップで検出した。
【００７２】
核酸プローブ：
試験した核酸プローブの塩基配列を表７に示した。核酸プローブは、プラス鎖のものを用いた。核酸プローブは、電極に固定化するために3’末端をチオール修飾した。ネガティブコントロールプローブについては、NAT2遺伝子配列とは全く無関係な配列を示すものを使用した。
【表７】
2010011850.tif 000009
【００７３】
核酸プローブ固定化基体：
ＤＮＡチップ上に金電極を作製し、これに核酸プローブを固定化した。固定化は、チオールと金との強い結合性を利用して行った。末端をチオール修飾した核酸プローブを含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、１時間静置後、1mMメルカプトヘキサノール溶液に浸し、その後、0.2×SSC溶液で洗浄した。同一プローブは2電極ずつスポットした。洗浄後、超純水で洗浄、風乾し、核酸プローブ固定化基体とした。
【００７４】
核酸プローブは以下の通りに各電極に割り当てた：
1−2電極  ネガティブプローブ(配列番号51) 
3−4電極  野生型核酸プローブ  17mer  (配列番号52)
5−6電極  野生型核酸プローブ  21mer  (配列番号53)
7−8電極  野生型核酸プローブ  26mer  (配列番号54)
9−10電極  野生型核酸プローブ  29mer  (配列番号55)
11−12電極  変異型核酸プローブ  19mer  (配列番号56)
13−14電極  変異型核酸プローブ  21mer  (配列番号57)
15−16電極  変異型核酸プローブ  23mer  (配列番号58)
17−18電極  変異型核酸プローブ  27mer  (配列番号59)
19−20電極  変異型核酸プローブ  30mer  (配列番号60)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出：
上記増幅によって得られた増幅産物に終濃度2×SSCの塩を添加し、電極に固定化された核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させた。反応温度は、35℃、45℃、50℃、55℃、60℃とし、60分間反応させた。その後、超純水で軽く洗浄した。電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μＭ含むリン酸緩衝液中に10分間浸漬した後、洗浄し、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
【００７５】
［試験５−１：結果］
結果を図１３に示す。反応温度が上昇すると共に、得られる信号が増加した。よって、反応温度が高い程、ハイブリダイゼーションの効率が上昇することが示された。反応温度55℃と60℃では、ほぼ同じ結果であった。
【００７６】
［試験５−２：G590A検出用プローブ］
次に、反応温度を55℃とし、反応時間を10分、20分、40分、60分、120分間として、試験５−１と同様に行った。
【００７７】
［試験５−２：結果］
結果を図１４に示す。反応時間10分と120分により得られた結果は、ほぼ同じであった。このことから、反応時間10分でハイブリダイゼーション反応が飽和状態に達することが明らかになった。
【００７８】
鎖長が比較的短い野生型核酸プローブ（17G：配列番号52）及び変異型核酸プローブ（19A：配列番号56、21A：配列番号57、23A：配列番号58）は、得られた信号が比較的低かった。野生型核酸プローブ（21G：配列番号53、26G：配列番号54、29G：配列番号55）及び変異型核酸プローブ（27A：配列番号59、30A：配列番号60）はほぼ同程度の高い信号が得られた。
【００７９】
［試験５−３：G590A検出用プローブ］
次に、反応温度55℃、反応時間20分で、試験５−１と同様にハイブリダイゼーションを行った。その後、核酸プローブ固定化基体を40℃、45℃、50℃の0.2×SSC洗浄バッファーに20分間浸漬して洗浄した。なお、本試験で増幅に用いた検体核酸は、PCR-RFLP解析により、野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明している3種類のヒトゲノムを用いた。
【００８０】
［試験５−３：結果］
結果を図１５Ａ〜Ｃに示す。洗浄なし(超純粋で軽く洗浄しただけのもの)の場合、野生型の増幅産物が変異型核酸プローブによって検出され、同様に変異型の増幅産物が野生型核酸プローブから検出され、非特異的なハイブリダイゼーションが確認された。洗浄温度40℃の結果は、洗浄なしとほぼ同一であった。
【００８１】
洗浄温度45℃では、野生型増幅産物では、野生型核酸プローブ（21G、26G）によって高い信号値が検出され、変異型核酸プローブ（27A）によってはほとんど信号値が検出されなかった。同様に、変異型増幅産物では、変異型核酸プローブ（27A）によって高い信号値が検出され、野生型核酸プローブ（21G、26G）によってはほとんど信号値が検出されなかった。よって、45℃の洗浄により、非特異的なハイブリダイゼーションによる結合が剥離されたことが示された。また、ヘテロ型の増幅産物では、野生型核酸プローブ（21G、26G）および変異型核酸プローブ（27A）の双方により高い信号値が検出された。
【００８２】
洗浄温度50℃では、検出される電流値が低く、洗浄によって増幅産物が核酸プローブから剥離することが確認された。洗浄温度50℃において、野生型核酸プローブ（29G）は、野生型の増幅産物の信号値が減少したにも関わらず、変異型の増幅産物の信号値が残り、非特異的な結合が依然としてあることが示された。同様に、変異型核酸プローブ（30A）も、変異型の増幅産物の信号値が減少したにも関わらず、野生型の増幅産物の信号値が残った。
【００８３】
以上の結果、野生型核酸プローブ（21G、26G）及び変異型核酸プローブ（27A）によって理想的な検出パターンが得られることが判明した。よって、本発明に従って用いられる最適な核酸プローブは、野生型核酸プローブ（21G：配列番号53、26G：配列番号54）及び変異型核酸プローブ（27A：配列番号59）である。
【００８４】
表７に、試験に用いた核酸プローブのTm値を併せて示した。表７から分かるように、本発明において好適に用いられる核酸プローブは、Tm値が62〜70℃、好ましくは62〜66℃である野生型核酸プローブであり、Tm値が61〜69℃、好ましくは66〜67℃である変異型核酸プローブである。
【００８５】
［試験６−１：G857A検出用プローブ］
PCR-RFLP解析によってヘテロ型であると判明したヒトゲノムを鋳型に用い、G857A検出用プライマーセット1及び5を用いて、63℃で1時間LAMP増幅を行った。G857A検出用プライマーセット1及び5は上記試験２の結果、最良のプライマーであることが判明したセットである。得られた増幅産物を、電流検出型のDNAチップで検出した。
【００８６】
核酸プローブ：
試験した核酸プローブの塩基配列を表８に示した。核酸プローブは、プラス鎖のものを用いた。核酸プローブは、電極に固定化するために3’末端をチオール修飾した。ネガティブコントロールプローブについては、NAT2遺伝子配列とは全く無関係な配列を示すものを使用した。
【表８】
2010011850.tif 000010
【００８７】
核酸プローブ固定化基体：
核酸プローブ固定化基体は試験５−１と同様に作製した。
【００８８】
核酸プローブは以下の通りに各電極に割り当てた：
1−2電極  ネガティブプローブ(配列番号51)
3−4電極  野生型核酸プローブ  20mer  (配列番号61)
5−6電極  野生型核酸プローブ  23mer  (配列番号62)
7−8電極  野生型核酸プローブ  24mer  (配列番号63)
9−10電極  野生型核酸プローブ  25mer  (配列番号64)
11−12電極  野生型核酸プローブ  30mer  (配列番号65)
13−14電極  変異型核酸プローブ  24mer  (配列番号66)
15−16電極  変異型核酸プローブ  26mer  (配列番号67)
17−18電極  変異型核酸プローブ  28mer  (配列番号68)
19−20電極  変異型核酸プローブ  29mer  (配列番号69)
21−22電極  変異型核酸プローブ  31mer  (配列番号70)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出：
上記増幅によって得られた増幅産物に終濃度2×SSCの塩を添加し、電極に固定化された核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させた。反応温度は、35℃、45℃、50℃、55℃、60℃とし、20分間反応させた。その後、超純水で軽く洗浄した。電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μＭ含むリン酸緩衝液中に10分間浸漬した後、洗浄し、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
【００８９】
［試験６−１：結果］
結果を図１６に示す。図１６Ａはプライマーセット１の結果であり、図１６Ｂはプライマーセット５の結果である。反応温度が上昇すると共に、得られる信号が増加した。よって、反応温度が高い程、ハイブリダイゼーションの効率が上昇することが示された。反応温度55℃と60℃では、ほぼ同じ結果であった。  
G857A検出用プライマーセット1および5を用いて増幅したLAMP産物を検出した結果、G857A検出用プライマーセット1と比較して5の方がよりハイブリに伴う信号増加が高かった。プライマーセット1と5で、信号増加量が異なる理由は不明である。原因の一つとして、増幅産物中の一本鎖部分の長さや、核酸プローブと結合する位置によって、ハイブリダイゼーションの効率が変化することが考えられる。或いは、増幅産物中に挿入されるヘキスト33258の量が若干異なる可能性も考えられる。
【００９０】
［試験６−２：G857A検出用プローブ］
次に、プライマーセット5を用いて増幅した産物について、反応温度55℃、反応時間20分で、試験５−３と同様にハイブリダイゼーションを行った。その後、核酸プローブ固定化基体を45℃の0.2×SSC洗浄バッファーに20分間浸漬して洗浄した。なお、本試験で増幅に用いた検体核酸は、PCR-RFLP解析により、野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明している3種類のヒトゲノムを用いた。
【００９１】
［試験６−２：結果］
結果を図１７に示す。野生型増幅産物では、野生型核酸プローブ（23G、24G、25G）によって高い信号値が検出され、変異型核酸プローブ（26A、28A、29A）によってはほとんど信号値が検出されなかった。同様に、変異型増幅産物では、変異型核酸プローブ（26A、28A、29A）によって高い信号値が検出され、野生型核酸プローブ（23G、24G、25G）によってはほとんど信号値が検出されなかった。また、ヘテロ型の増幅産物では、野生型核酸プローブ（23G、24G、25G）および変異型核酸プローブ（26A、28A、29A）の双方により高い信号値が検出された。
【００９２】
以上の結果、野生型核酸プローブ（23G、24G、25G）及び変異型核酸プローブ（26A、28A、29A）によって理想的な検出パターンが得られることが判明した。よって、本発明に従って用いられる最適な核酸プローブは、野生型核酸プローブ（23G：配列番号62、24G：配列番号63、25G：配列番号64）及び変異型核酸プローブ（26A：配列番号67、28A：配列番号68、29A：配列番号69）である。
【００９３】
表８には、試験に用いた核酸プローブのTm値を併せて示した。表８から分かるように、本発明において好適に用いられる核酸プローブは、Tm値が59〜68℃、好ましくは64〜65℃である野生型核酸プローブであり、Tm値が58〜68℃、好ましくは64〜66℃である変異型核酸プローブである。
【００９４】
［試験７−１：T341C検出用プローブ］
シークエンス解析によって野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明したヒトゲノムを鋳型に用い、T341C検出用プライマーセット6及び10を用いて、63℃で1時間LAMP増幅を行った。T341C検出用プライマーセット6及び10は上記試験３の結果、最良のプライマーであることが判明したセットである。得られた増幅産物を、電流検出型のDNAチップで検出した。
【００９５】
核酸プローブ：
試験した核酸プローブの塩基配列を表９に示した。核酸プローブは、プラス鎖のものを用いた。核酸プローブは、電極に固定化するために3’末端をチオール修飾した。ネガティブコントロールプローブについては、NAT2遺伝子配列とは全く無関係な配列を示すものを使用した。
【表９】
2010011850.tif 000011
【００９６】
核酸プローブ固定化基体：
核酸プローブ固定化基体は試験５−１と同様に作製した。
【００９７】
核酸プローブは以下の通りに各電極に割り当てた：
1−2電極  ネガティブプローブ(配列番号51)
3−4電極  野生型核酸プローブ  16mer  (配列番号71)
5−6電極  野生型核酸プローブ  18mer  (配列番号72)
7−8電極  野生型核酸プローブ  19mer  (配列番号73)
9−10電極  野生型核酸プローブ  20mer  (配列番号74)
11−12電極  変異型核酸プローブ  16mer  (配列番号75)
13−14電極  変異型核酸プローブ  17mer  (配列番号76)
15−16電極  変異型核酸プローブ  18mer  (配列番号77)
17−18電極  変異型核酸プローブ  19mer  (配列番号78)
19−20電極  変異型核酸プローブ  20mer  (配列番号79)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出：
上記増幅によって得られた増幅産物に終濃度2×SSCの塩を添加し、電極に固定化された核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させた。反応温度は、55℃で20分間反応させた。その後、45℃で20分洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μＭ含むリン酸緩衝液中に10分間浸漬した後、洗浄し、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
【００９８】
［試験７−１：結果］
結果を図１８に示す。図１８Ａはプライマーセット６の結果であり、図１８Ｂはプライマーセット１０の結果である。野生型検出用核酸プローブ（18T、19T）及び、変異型検出用核酸プローブ（17C、18C、19C）で理想的な検出パターンを示した。野生型増幅産物においては、野生型検出用核酸プローブ（18T、19T）から高い信号増加が検出され、変異型検出用核酸プローブ（17C、18C、19C）では非特異的なハイブリが剥離され、信号増加はほとんど見られなかった。同様に、変異型増幅産物においては、変異型検出用核酸プローブ（17C、18C、19C）から高い信号増加が検出され、野生型検出用核酸プローブ（18T、19T）では非特異的なハイブリが剥離され、信号増加はほとんど見られなかった。また、ヘテロ型の増幅産物においては、野生型検出用核酸プローブ（18T、19T）および変異型検出用核酸プローブ（17C、18C、19C）から高い信号増加が検出された。また、T341C検出用プライマーセット6及び10のそれぞれを用いて得られた増幅産物は、ほぼ同一の検出パターンを示した。
【００９９】
以上の結果、本発明に従って用いられる最適な核酸プローブは、野生型検出用核酸プローブ（18T：配列番号72、19T：配列番号73）及び変異型検出用核酸プローブ（17C：配列番号76、18C：配列番号77、19C：配列番号78）である。
【０１００】
表９には、試験に用いた核酸プローブのTm値を併せて示した。表９から分かるように、本発明において好適に用いられる核酸プローブは、Tm値が61〜69℃、好ましくは66〜68℃である野生型核酸プローブであり、Tm値が58〜70℃、好ましくは63〜69℃である変異型核酸プローブである。
【０１０１】
［試験８−１：G590A及びG857A検出用プローブ］
PCR-RFLP解析によって野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明したヒトゲノムを鋳型に用い、G590AおよびG857A検出用プライマーセット6を用いて、63℃でLAMP増幅を行った。G590AおよびG857A検出用プライマーセット6は上記試験４の結果、最良のプライマーであることが判明したセットである。得られた増幅産物を、電流検出型のDNAチップで検出した。
【０１０２】
ループプライマーによる増幅時間の短縮：
G590A及びG857A検出用プライマーセットは、増幅に1.5時間近くかかる。よって、ループプライマーを導入し、増幅時間の短縮を検証した。ループプライマーは表６に記載のLBプライマー(配列番号80)を用い、25μｌ反応液中、40pmoｌ添加した。増幅の結果、ループプライマーの導入により1時間以内で増幅することが明らかになった。
【０１０３】
ＤＮＡチップ検出結果：
ループプライマーを導入して増幅したG590A及びG857A検出用プライマーセット6の増幅産物について、試験５及び６における検討の結果、最適な核酸プローブであることが判明している以下の核酸プローブを用いて検出した。
【０１０４】
核酸プローブ：
G590Aについては、表７に示す野生型検出用プローブ（配列番号54）、変異型検出用プローブ（配列番号59）を用い、G857Aについては、表８に示す野生型検出用プローブ（配列番号62）、変異型検出用プローブ（配列番号67）を用いた。G590A検出用核酸プローブはマイナス鎖のもの、G857A検出用核酸プローブはプラス鎖のものを用いた。核酸プローブは、電極に固定化するために3’末端をチオール修飾した。
【０１０５】
核酸プローブ固定化基体：
核酸プローブ固定化基体は試験５−１と同様に作製した。
【０１０６】
核酸プローブは以下の通りに各電極に割り当てた：
1−2電極  ネガティブプローブ(配列番号51) 
3−4電極  野生型核酸プローブ  26mer  (配列番号54)
5−6電極  変異型核酸プローブ  27mer  (配列番号59)
7−8電極  野生型核酸プローブ  23mer  (配列番号62)
9−10電極  変異型核酸プローブ  26mer  (配列番号67)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出：
上記試験７と同様の方法で行った。
【０１０７】
［試験８−１：結果］
結果を図１９に示す。G590A野生型検出用プローブ（配列番号54）、変異型検出用プローブ（配列番号59）、G857A野生型検出用プローブ（配列番号62）、変異型検出用プローブ（配列番号67）を用いることで、理想的な検出結果が得られた。
【０１０８】
＜検体試料＞
本発明が対象とする検体は特に限定される物ではなく、例えば、ヒトから採取した血液、血清、白血球、毛根、口腔粘膜などを用いることができる。これら検体試料から核酸成分の抽出を行い、標的核酸の検出試験に供される試料溶液を調製する。抽出方法は特に限定されないが、例えば、市販の核酸抽出方法QIAamp(QIAGEN社製）、スマイテスト（住友金属社製）等を利用することも可能である。
【０１０９】
＜キット＞
本発明の他の側面から、本発明の検出方法に用いるための、LAMP法のための上記プライマーセットを具備するキットが提供される。該キットは、任意に、鎖置換型DNA合成酵素、合成基質、及び緩衝溶液などを具備することができる。
【０１１０】
他の側面から、LAMP法のための上記プライマーセットによって増幅された増幅産物を検出するための核酸プローブが提供される。さらに、該核酸プローブが固定化された核酸プローブ固定化基体が提供される。該プローブ固定化基体は、好ましくはＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイとして提供される。  
また、該核酸プローブ又は核酸プローブ固定化基体をさらに具備する上記キットも提供される。
【０１１１】
また、本発明の他の態様において、NAT2の一塩基多型G590A、G857A及びT341Cを同時に検出する方法が提供される。本態様においては、上記の通りにG590A、G857A及びT341Cについて別々に増幅工程を行い、その後、増幅産物を混合して混合液を調製する。この混合液を上記と同様の検出方法に供する。本態様に従えば、G590A、G857A及びT341Cについての遺伝子型を同時に検出することができる。
【実施例】
【０１１２】
［G590A、G857A、T341Cの同時検出］
G590A、G857A、T341Cを同時に検出する試験を行った。G590A検出用核酸プライマーセット9（試験１−２）、G857A検出用核酸プライマーセット5（試験２）、又はT341C検出用核酸プライマーセット6及び10（試験３）のそれぞれを用いて、ヒトゲノムを63℃で1時間増幅した。ヒトゲノムは、PCR-RFLP解析またはシークエンス解析により、野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明している3種類のヒトゲノムを用いた。増幅反応後、3つの増幅産物を混合し、混合反応液を調製した。
【０１１３】
核酸プローブ：
この混合反応液を、G590A用の核酸プローブ、G857A用の核酸プローブ、及びT341C用の核酸プローブを用いる検出に供した。用いた核酸プローブは、次の通りである：
G590A    野生型核酸プローブ（配列番号54）、変異型核酸プローブ（配列番号59）、
G857A    野生型核酸プローブ（配列番号62）、変異型核酸プローブ（配列番号67）
T341C    野生型核酸プローブ（配列番号72）、変異型核酸プローブ（配列番号76）
核酸プローブは全てプラス鎖のものを用い、3’末端をチオール修飾した。
【０１１４】
プローブ核酸固定化電極の作製：
上記試験５−１に記載の方法と同様にプローブ核酸固定化電極を作製した。
【０１１５】
核酸プローブは以下の通りに各電極に割り当てた：
1−2電極  ネガティブプローブ(配列番号51)
3−4電極  G590A野生型核酸プローブ  26mer  (配列番号54)
5−6電極  G590A  変異型核酸プローブ  27mer  (配列番号59)
7−8電極  G857A  野生型核酸プローブ  23mer  (配列番号62)
9−10電極  G857A  変異型核酸プローブ  26mer  (配列番号67)
11−12電極  T341C  野生型核酸プローブ  18mer  (配列番号72)
13−14電極  T341C  変異型核酸プローブ  17mer  (配列番号76)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出：
上記試験７と同様に行った。
【０１１６】
［結果］
結果を図２０に示す。図２０Ａはプライマーセット９，５，６を用いた結果であり、図２０Ｂはプライマーセット９，５，１０を用いた結果である。G590A、G857A、T341Cの各型において、理想的な検出パターンを示した。このことから、DNAチップを用いてG590A、G857A、T341Cを同時検出できることが示された。
【符号の説明】
【０１１７】
１…基体、２…固定化領域、１１…基体、１２…電極、１３…パット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【配列表】
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