(57)【要約】【課題】特異的なSGLT種を標的とする治療的化合物を提供すること。【解決手段】SGLT2をコードする核酸分子を標的とする8〜80核酸塩基長のオリゴマー化合物であって、ここで該化合物が、SGLT2をコードする核酸分子に対して少なくとも70％相補的であり、かつここで該化合物がSGLT2 mRNAの発現を少なくとも10％阻害する、オリゴマー化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SGLT2をコードする核酸分子を標的とする8〜80核酸塩基長のオリゴマー化合物であって、ここで該化合物が、SGLT2をコードする核酸分子に対して少なくとも70％相補的であり、かつここで該化合物がSGLT2 mRNAの発現を少なくとも10％阻害する、オリゴマー化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願についてのクロスリファレンス）
この出願は、2003年11月3日に出願された米国仮出願番号第60/517,334号に対する優先権の恩恵、および2004年9月21日に出願された米国出願番号第10/946,498号に対する優先権の恩恵を主張し、その各出願の全体が参照として本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明はSGLT2の発現を調節するための組成物および方法を提供する。詳細には、本発明は、アンチセンス化合物、特に、好ましい態様において、SGLT2をコードする核酸分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド化合物に関する。本明細書中では、このような化合物が、SGLT2発現を調節することを示す。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
エネルギー代謝の基本的な構成はグルコース輸送である。細胞膜を通過するグルコースの輸送は、代謝の過程に必要不可欠であり、相対的に一定な血液グルコース濃度の維持ならびに貯蔵および利用のための周辺の組織へのグルコースの送達を含む。細胞膜は本質的にグルコースに対して不浸透性であるので、膜を通過するグルコースの移動はタンパク質トランスポーターによりなされるはずである（非特許文献１）。
【０００４】
媒介されるグルコース輸送は、二次的能動輸送および促進的輸送の二形態で起こる。グルコースが急速に代謝される細胞においては、形質膜を通過する濃度勾配により促進的輸送が働き、能動機構は必要ない。グルコースの二次的能動輸送により、細胞の濃度勾配に逆らったグルコースの輸送が可能になる。この機構は、細胞の先端表面を通過するグルコースおよびナトリウムイオンの共輸送を伴い、エネルギーは基底外側膜内のナトリウム／カリウムATPアーゼにより維持されるナトリウム勾配により提供される。次いで、細胞から血流へのグルコースの流出は促進的トランスポーターにより媒介される（非特許文献１;非特許文献２）。
【０００５】
グルコースの二次的能動輸送は、腸の粘膜細胞および腎臓の近位細管細胞において作用し、効果的に食物のグルコースの取り込みおよび最小限の尿の喪失を確保するために機能する。血漿グルコースは通常、糸球体の腎臓において濾過され、近位細管において活発に再吸収される。グルコースは本質的に、刷子縁膜（brush border membrane（BBM））に位置するナトリウム−グルコース共トランスポーター（sodium-glucose cotranspoter（SGLT））の作用を通じて、腎臓の近位細管における尿から完全に再吸収される。ウサギ腎臓の外部皮質および外部髄質から調製される近位細管BBM小胞のグルコース輸送特性の比較により、二つの明確なナトリウムがカップリングしたDグルコース輸送系の存在が明らかになった。外部皮質の調製物は低親和性／大容量活性（Km=6mM）を示し、一方外部髄質は高親和性／小容量活性（Km=0.35mm）を示した（非特許文献３;非特許文献２）。腎外皮質BBM輸送系のさらなる特徴により、ナトリウムに対するグルコースカップリングが１：１の割合であり、一方外部髄質組織より単離した小胞における該割合は２：１であることが明らかになった（非特許文献４）。
【０００６】
SGLTをコードする核酸分子の単離により複数の輸送系の存在が確認された。ヒトSGLT2をコードするcDNA（溶解担体ファミリー２、メンバー５、ナトリウム依存型グルコース共トランスポーター２またはSLC2A5としても公知である）は、ヒト腎臓より調製されたcDNAライブラリ−におけるナトリウム共トランスポーター様の配列に対するスクリーニングによって同定された（非特許文献５;非特許文献６）。ヒトSGLT2は染色体16p11.2に局在する（非特許文献７）。ヒトSGLT2の次の研究によりSGLT2は、低親和性、ナトリウム依存型グルコース共トランスポーターの特徴を示す機能的な特性を有することが明らかになった。
【０００７】
ツメガエル卵母細胞に注入したヒトSGLT2の研究により、このタンパク質は、α-MeGlcに対して1.6mMのKm値およびグルコースに対し１：１の割合でカップリングするナトリウムによるDグルコースおよびα-メチル-D-グルコピラノシド（α-MeGlc; グルコースアナログ）のナトリウム依存型輸送を媒介するということが実証された（非特許文献５;非特許文献８）。この輸送活性は、グルコース部位に結合するが輸送されず、かくしてSGLT2を阻害する植物グリコシドであるフロリジンにより抑制された（非特許文献８）。これらの発見により、SGLT2はウサギ腎臓の外部皮質由来のBBM小胞調製物において観察される低親和性輸送の原因であるということが示された。
【０００８】
SGLT2の組織分布により、この共トランスポーターは腎臓の低親和性グルコーストランスポーターであることがさらに示唆された。ノザンブロットによりヒトSGLT2は主として腎臓に発現するということが明らかになり、ラット腎臓組織に対するヒトSGLT2プローブのインサイチュハイブリダイゼーションにより、SGLT2は外部皮質の近位細管S1セグメントに発現することが実証された（非特許文献５;非特許文献６）。この局在パターンにより、SGLT2は外部髄質の近位細管S3セグメントに発現する高親和性／小容量のナトリウム／グルコーストランスポーターであるSGLT1と識別され、この場合SGLT1は、近位細管S1セグメントにおいてSGLT2により再吸収されなかった濾過されたグルコースの余りを再吸収するために適切に設置される。
【０００９】
ヒトSGLT2様のラットSGLT2は、近位S1セグメントで強く発現し、この発現は胚期１７日目における発現の出現、１９日目までの漸次の増加およびその後１９日目から出生の間の減少を伴い発生段階的に制御される。興味深いことには、ラットSGLT2 mRNAは出生前は2.6kbで出生後は2.2kbとなり、成体と比較して胚期の腎臓における異なるスプライスバリアントの存在が示唆されている（非特許文献８）。
【００１０】
ラットSGLT2の輸送特性、すなわち3.0mMのKmおよびグルコースに対して１：１でカップリングするナトリウムはまた、腎臓皮質低親和性輸送系の特徴でもある。ラット腎臓表層の皮質mRNAをラットSGLT2コード領域の５’部に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドと混合させたハイブリッド欠損研究により、mRNA／オリゴヌクレオチド混合物を注入されたツメガエル卵母細胞におけるα-MeGlcの取り込みが完全に抑制された。SGLT1を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドはα-MeGlcの取り込みに何の効果も有さなかった。これらのデータにより、α-MeGlcの取り込みは完全にラットSGLT2の発現のためであることが実証され、SGLT2は主要な腎臓皮質低親和性グルコーストランスポーターであるという提案が支持される（非特許文献８）。
【００１１】
SAAT-pSGLT2と名付けられた第二の低親和性SGLTが、ブタの腎臓細胞から単離され、初めに主要な低親和性グルコーストランスポーターであることが提唱された。しかしながら、さらなる研究により、SAAT-pSGLT2の分子特徴がSGLT2の分子特徴と異なることが明らかとなり、結果としてSAAT-pSGLT2はSGLT3と名付けられた（非特許文献９;非特許文献１０;非特許文献１１;非特許文献８）。生理学的に関連性のある様式でSGLT3がグルコースの再吸収に寄与しているか否かは明らかでない。
【００１２】
糖尿病であり、尿のグルコース消失により特徴付けられた腎臓のファンコーニ症候群にも罹患している、肝細胞核因子１α（HNF1α）欠損動物におけるSGLT2の機能の重要性が実証された。HNF1αは肝臓、腎臓、膵臓および腸に発現する転写アクチベーターである。これらのマウスにおける腎臓部の欠損はSGLT2発現の80〜90％の減少のためである。かくしてHNF1αは、SGLT2の発現を制御する一つの遺伝子産物であり、インビボにおける適切なグルコースの再吸収のために必要不可欠である（非特許文献１２）。
【００１３】
SGLT2 mRNAの減少はまた、ナトリウム依存型のグルコースアナログα-MeGlcの取り込みの阻害に沿った、マウスの腎臓皮質細胞のカドミウムへの曝露の際に観察された。興味深いことに、SGLT1およびSGLT2 mRNAのどちらもカドミウムに曝露されたマウスの腎臓皮質細胞において減少したが、SGLT3 mRNAはアップレギュレートされ、個々のSGLT種は同様の様式により調節されてはいないことが示唆された（非特許文献１３）。グルコースまたはナトリウムの濾過される割合の変化によってもまた、ナトリウム-グルコーストランスポーターmRNAの発現は調節される。糖尿を伴う糖尿病のラットおよび高ナトリウム食を与えられたラットは、腎臓の近位細管において増大したSGLTの発現を示した。これらのラットにおけるSGLT1のレベルがSGLT2のレベルと同程度に変化しないという発見は、共トランスポーターが特異的に調節されているという仮説をさらに支持する（非特許文献１４）。
【００１４】
ラット、マウス、ブタ、ウサギおよびイヌを含む複数の哺乳動物種におけるSGLTの機能および局在の研究により、SGLT2は低親和性腎臓SGLTであることが示されたにもかかわらず、ヒト近位細管の刷子縁を通過するグルコースの再吸収の原因であるヒトSGLTの同一性は不明確のままであった。腎臓の刷子縁におけるSGLTタンパク質の局在について記載されている情報の欠如により、ヒト低親和性SGLTの同定はさらに妨げられている。SGLT1およびSGLT2の分子遺伝的解析により、SGLT2遺伝子における遺伝的変化は、上昇した尿中のグルコースの排泄によって特徴付けられる状態である、腎性糖尿のもっともらしい原因であることが示された（非特許文献１５）。グルコースの再吸収におけるSGLT機能の直接的な証拠は、先天的な散発的（隔離された）腎性糖尿病を有する患者におけるSGLT2遺伝子の解析から得られる。配列解析により、共輸送機能を欠くと予想される切形されたタンパク質の形成を誘導するようなSGLT2遺伝子のエキソン11における同系接合のナンセンス変異が明らかにされた（非特許文献１６）。
【００１５】
SGLT2欠損によりグルコースの再吸収は阻害されるが、SGLT2の上昇は潜在的にグルコースの取り込みの増大を可能にし、転移性病変の肺癌において観察される。SGLT2の遺伝子発現の定量により、正常な肺組織および初期の肺癌の間に有意差はないことが明かにされた。しかしながら、転移性病変の肝臓およびリンパ節の両方では、有意により高いSGLT2の発現が示された（非特許文献１７）。この発見は、正常組織と比較した際に、インビボにおいて異なる臨床的な腫瘍が有意に増大したグルコースの取り込みを示すという証拠を考えると重要である。代謝におけるかかる変化は、腫瘍細胞に生存および侵襲可能となるような利点を与える。さらに、グルコースの取り込みは腫瘍の攻撃性および予後と相関している（非特許文献１８）。
【００１６】
糖尿病はインシュリン作用の欠損のための高血糖症により特徴付けられる障害である。慢性の高血糖症は、心臓病、網膜症、腎障害および神経障害を含む糖尿病に関連した合併症に対しての主要な危険因子である。腎臓が血漿グルコースレベルの調節において主要な役割を果たす際に、腎臓のグルコーストランスポーターは魅力的な薬物ターゲットとなろう（非特許文献２）。ナトリウム／グルコーストランスポーターの特異的な阻害剤であるフロリジン由来の合成薬剤が設計され、T-1095およびその代謝的に活性な形態のT-1095Aを含む（非特許文献１９）。フロリジン、T-1095およびT-1095Aは全て、正常および糖尿病のラット腎臓、ラット小腸、マウス腎臓およびイヌ腎臓より調製された刷子縁膜ならびにヒトSGLT mRNAを注入したツメガエル卵母細胞におけるナトリウム依存型のグルコースの取り込みを阻害した（非特許文献２０;非特許文献２１）。これらの薬剤は、遺伝的およびストレプトゾトシンにより誘導される糖尿病に罹患した実験動物において、抗糖尿病化合物として試験されている。これらのモデルにおいて、これらの化合物の投与により腎臓SGLTの活性が阻害され、尿のグルコース排泄が増加し、グルコース耐性、高血糖症および低インシュリン血症が改善された（非特許文献２２;非特許文献２０;非特許文献２１）。T-1095を用いたdb／dbマウスの長期的な処置により同様の結果が生じ、またほとんど完全に尿のアルブミンの増加が抑制され、腎臓糸球体の病状が改善し、腎臓の機能不全における有益な作用および腎障害に対する保護効果がそれぞれ示された（非特許文献２２）。糖尿病の腎障害は、糖尿病に罹患した多くの患者に発生する末期の腎臓疾患の最も一般的な原因である。ズッカー糖尿病肥満ラットにおいて、T-1095を用いた長期間の処置により、摂食したグルコースレベルおよび絶食しているグルコースレベルの両方が正常な範囲に近づくように低下した。また、骨格筋におけるグルコース利用率の有意な改善無しに、回復した肝臓のグルコース産生率およびグルコース利用率も観察され、糖尿病のこのラットモデルにおいて、高血糖症が肝臓組織および脂肪組織におけるインシュリン抵抗性に寄与することを示す。これらの結果により、糖毒性は長期間の高血糖症の結果として生じるが、糖尿病患者において組織依存的なインシュリン抵抗性を引き起こすことがさらに示唆される（非特許文献２３）。
【００１７】
特許文献１に開示されているｃアシルグルコシド等の、他のSGLT2阻害化合物は当該分野において公知であり、腸および腎臓において発見されたナトリウム依存型グルコーストランスポーターの阻害剤であり、単独でまたは他の抗糖尿病薬剤と組み合わせて用いる際に糖尿病、高血糖症および関連した疾患を処置するよう考えられている、（Ellsworthら, 2002）。
【００１８】
特許文献２は、SGLT2を含む群より選択される単離された変異タンパク質、前記変異タンパク質をコードする類似した核酸分子、前記変異タンパク質をコードする核酸配列の単離されたアンチセンス誘導体、ならびに高血圧、糖尿病、インシュリン感受性、肥満、脂肪血症異常および脳卒中を処置するまたは妨げるための前記アンチセンス核酸誘導体の送達方法を開示する。この出願はまた、アンチセンス分子がDNAもしくはRNAまたは一本鎖もしくは二本鎖のキメラ混合物となり得、またはリボザイムもしくは触媒性RNAを含み得ることを開示する（Shimkets, 2003）。
【００１９】
特許文献３および特許文献４は、ヒトSGLT2をコードする核酸配列を含むいずれか一つの配列の群の核酸配列のタンパク質コード領域を含むポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列に対してまたはその相補鎖に対して少なくとも15ヌクレオチドの相補を含むオリゴヌクレオチド、および開示されたポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたはその一部を開示する。これらの出願は、本発明のポリペプチドの発現を抑制するためおよび遺伝子治療のための前記アンチセンスポリヌクレオチドの使用を開示する（Isogaiら, 2003, ; Isogaiら, 2003）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第6,414,126号
【特許文献２】米国特許交付前公開第20030055019号
【特許文献３】欧州特許出願EP 1 293 569号
【特許文献４】EP 1 308 459号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Brown, J. Inherit. Metab. Dis., 2000, 23, 237-246
【非特許文献２】Wright, Am. J. Physiol. Renal Physiol., 2001, 280, F10-18
【非特許文献３】TurnerおよびMoran, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 1982, 242, F406-414
【非特許文献４】TurnerおよびMoran, J. Membr. Biol., 1982, 67, 73-80
【非特許文献５】Kanaiら, J. Clin. Invest., 1994, 93, 397-404
【非特許文献６】Wellsら, Am. J. Phsyol. Endocrinol. Metab., 1992, 263, F459-465
【非特許文献７】Wellsら, Genomics, 1993, 17, 787-789
【非特許文献８】Youら, J. Biol. Chem., 1995, 270, 29365-29371
【非特許文献９】Kongら, J. Biol. Chem., 1993, 268, 1509-1512
【非特許文献１０】Mackenzieら, J. Biol. Chem., 1996, 271, 32678-32683
【非特許文献１１】Mackenzieら, J. Biol. Chem., 1994, 269, 22488-22491
【非特許文献１２】Pontoglioら, EMBO Rep., 2000, 1, 359-365
【非特許文献１３】Tabatabaiら, Toxicol. Appl. Pharmacol., 2001, 177, 163-173
【非特許文献１４】Vestriら, J. Membr. Biol., 2001, 182, 105-112
【非特許文献１５】Hedigerら, Klin. Wochenschr., 1989, 67, 843-846
【非特許文献１６】van den Heuvelら, Hum. Gent., 2002, 111, 544-547
【非特許文献１７】Ishikawaら, Jpn. J. Cancer Res., 2001, 92, 874-879
【非特許文献１８】DangおよびSemenza, Trends Biochem. Sci., 1999, 24, 68-72
【非特許文献１９】Tsujiharaら, J. Med. Chem., 1999, 42, 5311-5324
【非特許文献２０】Okuら, Diabetes, 1999, 48, 1794-1800
【非特許文献２１】Okuら, Eur. J. Pharmacol., 2000, 391, 183-192
【非特許文献２２】Arakawaら, Br. J. Pharmacol., 2001, 132, 578-586
【非特許文献２３】Nawanoら, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2000, 278, E535-545
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
フロリジンおよびその誘導体はナトリウム-グルコース共トランスポーターの強力な阻害剤であるにもかかわらず、これらの薬剤はSGLTの単一種を特異的に阻害せず、かくして全組織中の全てのSGLTが影響を受ける。かくして、特異的なSGLT種を標的とする治療的化合物の必要性が残っている。アンチセンス技術は、特異的遺伝子産物の発現の減少に対する有効な手段であり、従ってSGLT2発現調節のための多くの治療的、診断的および研究的適用において比類なく有用であることが証明され得る。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕SGLT2をコードする核酸分子を標的とする8〜80核酸塩基長のオリゴマー化合物であって、ここで該化合物が、SGLT2をコードする核酸分子に対して少なくとも70％相補的であり、かつここで該化合物がSGLT2 mRNAの発現を少なくとも10％阻害する、オリゴマー化合物
に関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、特異的なSGLT種を標的とする治療的化合物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、SGLT2発現を調節する化合物および方法を提供する。
【００２６】
（発明の概要）
本発明は、SGLT2をコードする核酸を標的とし、かつ、SGLT2発現を調節するオリゴマー化合物、特に、アンチセンス化合物等の核酸および核酸様オリゴマーに関する。本発明の化合物を含む医薬および他の組成物もまた提供される。さらに、SGLT2の調節剤のスクリーニング方法、および細胞、組織または動物においてSGLT2発現を調節する方法であって、該細胞、組織または動物を、一つ以上の本発明の化合物または組成物と接触させることを含む方法も提供される。さらに、本発明の一つ以上の化合物を用いて試料中のSGLT2の存在の確認によって罹患状態を確認するための診断方法も提供される。SGLT2発現に関連する疾患または症状を有する疑いがあるか、または罹患し易い動物、特にヒトの処置方法もまた本明細書中に記載する。当該方法は、治療的または予防的有効量の一つ以上の本発明の化合物または組成物を、処置を必要とし得る人の誰であろうと投与することを含む。
【００２７】
また、アンチセンス化合物等の本発明の化合物を用いた、腎臓細胞および腎臓組織におけるあらかじめ選択された細胞RNA標的の発現の阻害促進方法も提供される。さらに、動物における疾患または状態の開始の妨害または遅延方法が提供され、ここで該疾患または状態は、腎臓、特にSGLT2において発現したあらかじめ選択された細胞RNA標的の発現と関連がある。動物における血液グルコースレベルを低下させる方法、および２型糖尿病の開始の遅延または妨害方法もまた本明細書中に記載される。当該方法は、治療的または予防的有効量の一つ以上の本発明の化合物を、処置を必要とし得る動物へ投与することを含む。腎臓細胞または腎臓組織におけるSGLT2の発現の阻害促進方法が本明細書中で提供され、該細胞または組織を、アンチセンス化合物等の一つ以上の本発明の化合物と接触させることを含む。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、オリゴマー化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチド、およびSGLT2をコードする核酸分子の機能または作用を調節するのに用いるための、アンチセンス化合物等の同様の種を用いる。これは、SGLT2をコードする一つ以上の核酸分子と、特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにより達成される。
【００２９】
一つの態様において、本発明のオリゴマー化合物は、キメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、２'-デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域から構成され、２'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される「ウイング」が両側（5'および3'方向）に隣接する。いくつかの態様において、ヌクレオシド間（主鎖）結合はオリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（P=S）である。いくつかの態様において、一つ以上のシチジン残基が５−メチルシチジンである。
【００３０】
別の態様において、本発明のオリゴマー化合物は、混合されたホスホロチオエートおよびホスホジエステル主鎖を有するキメラオリゴヌクレオチドであり、本明細書中で「混合主鎖化合物」として言う。本発明の混合主鎖化合物は、各領域において少なくとも一つの２'-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる二つの「ウイング」領域が両側に隣接する少なくとも5つの連続した２'-デオキシヌクレオシドからなる中心「ギャップ」領域を有し得る。混合主鎖化合物のヌクレオシド間結合は、中心「ギャップ」領域においてはホスホロチオエート結合であり得、2つの「ウイング」領域においてはホスホジエステル結合であり得る。別の態様において、混合主鎖化合物は、オリゴヌクレオチドの５’および３’最末端の一つまたは両方における一つのホスホジエステル結合を除いて、「ウイング」領域でホスホジエステル結合を有する。
【００３１】
本明細書中において、混合主鎖化合物は効果的に腎臓に送達され、混合主鎖化合物を用いた処置により肝臓または腎臓毒性なしに、腎臓における標的遺伝子発現の効果的な調節が生じることを示す。本明細書中においてさらに、2型糖尿病の動物モデルにおける混合主鎖化合物を用いた処置により、糖尿病の動物において血液グルコースレベルが減少することを示す。
【００３２】
本明細書中で用いる用語「標的核酸」および「SGLT2をコードする核酸分子」は、SGLT2をコードするDNA、当該DNAから複写されたRNA（プレmRNAおよびmRNAまたはその部分を含む）、および当該RNAから誘導されたcDNAを含めて簡便に用いられる。本発明の化合物のその標的核酸でのハイブリダイゼーションは、一般的に「アンチセンス」と呼ばれる。結果として、本発明のいくつかの態様の実施に含まれると考えられる一つのメカニズムを、本明細書中で「アンチセンス阻害」という。このようなアンチセンス阻害は、代表的には、オリゴヌクレオチド鎖またはセグメントの水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づき、その結果、少なくとも一つの鎖またはセグメントは、切断されるか、分解されるか、または作動不可能になる。これに関し、このようなアンチセンス阻害のための特異的核酸分子およびその機能が標的となり得る。
【００３３】
妨害すべきDNAの機能には複製および転写を挙げることができる。複製および転写は、例えば、内因性細胞テンプレート、ベクター、プラスミド構築物またはその他に由来し得る。妨害すべきRNAの機能には、例えば、タンパク質翻訳の部位へのRNAの転座、細胞内のRNA合成部位から離れた部位へのRNAの転座、RNA由来のタンパク質の翻訳、一つ以上のRNA種を得るためのRNAのスプライシング、およびRNAに従事し得るかまたはRNAにより促進され得るRNAに関する触媒活性または複合体形成、等の機能が挙げられる。標的核酸機能のこのような妨害の一つの結果は、SGLT2発現の調節である。本発明の文脈において、「調節」および「発現の調節」は、遺伝子をコードする、例えばDNAまたはRNAのような核酸分子の量またはレベルの増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。阻害はしばしば、発現の調節の所望の形態であり、mRNAはしばしば、所望の標的核酸である。
【００３４】
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成の一つのメカニズムには、水素結合が挙げられ、これはオリゴマー化合物の鎖の相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）の間のWatson-Crick、Hoogsteenまたは逆Hoogsteen水素結合であり得る。例えば、アデニンおよびチミンは水素結合の形成により対を形成する相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは種々の環境下で起こり得る。
【００３５】
アンチセンス化合物等のオリゴマー化合物は、化合物の標的核酸への結合が標的核酸の正常な機能を妨害して活性の損失を引き起こし、かつ、特異的結合が望まれる条件下、すなわちインビボアッセイまたは治療的処理における生理学的条件下、およびインビトロアッセイでアッセイが行われる条件下でアンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００３６】
本発明において、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列へのハイブリダイズは最小数となるような条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境下で異なり、また本発明の文脈において、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の性質および組成、ならびに研究されているアッセイによって決定される。
【００３７】
本明細書中で用いる「相補的」は、オリゴマー化合物の2核酸塩基間の正確な対形成に対する能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）のある位置における核酸塩基が、標的核酸のある位置における核酸塩基と水素結合し得る場合（前記標的核酸はDNA、RNAまたはオリゴヌクレオチド分子であり、）オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置が相補的位置であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびさらなるDNA、RNAまたはオリゴヌクレオチド分子は、各分子中で、十分な数の相補的位置が、互いに水素結合し得る核酸塩基に占有される場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間で安定かつ特異的な結合が起こるように、十分な数の核酸塩基に対して十分な程度の正確な対または相補性があることを示すのに用いられる用語である。
【００３８】
オリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるその標的核酸の配列に100％相補的である必要はないことが当該分野で理解されている。さらに、介在または隣接するセグメントはハイブリダイゼーション事象に関与しないために、オリゴマー化合物は一つ以上のセグメントにハイブリダイズし得る（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。本発明のアンチセンス化合物は標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列相補性を含み得る。例えば、アンチセンス化合物の20核酸塩基のうち18が標的領域に相補的であり、それ故特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、90％の相補性を示すであろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、クラスター化され得るかまたは相補的核酸塩基と共に散在し得、互いにまたは相補的核酸塩基に対して接触している必要はない。従って、標的核酸と完全に相補的な2つの領域と隣接している、4つの非相補的核酸塩基を有する18核酸塩基長のアンチセンス化合物は、標的核酸と77.8％の全相補性を有するので、本発明の範囲内に入るであろう。標的核酸の領域を有するアンチセンス化合物の相補性百分率は、当該分野で公知のBLAST（basic local alignment search tools）プログラムおよびPowerBLASTプログラムを用いて常套的に決定することができる（Altschulら, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhangおよび Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）。
【００３９】
相同性百分率、配列同一性または相補性は、例えば、Gapプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI）により、SmithおよびWatermanのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を用いる初期設定を用いて、決定し得る。いくつかの態様では、オリゴマーと標的との間の相同性、配列同一性または相補性は、約50％〜約60％、約60％〜約70％、約70％〜約80％、約80％〜約90％、約90％、約92％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％である。本明細書中で用いられるように、用語「約」は変更される値（value modified）の±5％を意味する。
【００４０】
本発明によれば、アンチセンス化合物等のオリゴマー化合物には、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（EGS）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー（alternate splicer）、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が挙げられる。従って、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状またはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入され得、かつ、内部または末端突出物またはループのような構造的要素を含み得る。本発明の化合物は、一旦システム内に導入されると、一つ以上の酵素または構成タンパク質の作用を惹起して、標的核酸の修飾を起こし得る。
【００４１】
このような酵素の非限定的な一つの例はRNアーゼH（RNaseH）であり、これは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。「DNA様」の一本鎖アンチセンス化合物がRNアーゼH（RNaseH）を惹起することは、当該分野で公知である。それ故に、RNアーゼHの活性化は、RNA標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介阻害効率を非常に高める。同様の役割は、酵素のRNアーゼIIIおよびリボヌクレアーゼLファミリーにおけるリボヌクレアーゼのような他のリボヌクレアーゼにおいても仮定されている。
【００４２】
アンチセンス化合物の一つの形態は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、多くの種では、二本鎖RNA（dsRNA）分子のような二本鎖構造の導入は、遺伝子またはその関連遺伝子産物の機能の強力かつ特異的なアンチセンス媒介的減少を引き起こすことが示されている。この現象は、植物および動物の両方で起こり、ウイルス防御およびトランスポゾンサイレンシングに進化的な関係を有すると考えられている。
【００４３】
動物においてdsRNAが遺伝子サイレンシングをもたらし得たことの第1の証拠は、1995年に、線虫（Caenorhabditis elegans）の研究から得られた（GuoおよびKempheus, Cell, 1995, 81, 611-620）。Montgomeryらは、dsRNAの主な阻害効果は転写後であることを示した（Montgomeryら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507）。二本鎖RNA（dsRNA）への曝露により得られた、線虫において定義された転写後アンチセンスメカニズムは、当時からRNA干渉（RNAi）を示してきた。この用語は、内因性標的mRNAレベルの配列特異的減少をもたらすdsRNAの導入に関与するアンチセンス媒介遺伝子サイレンシングを意味するのに一般化されてきた（Fireら, Nature, 1998, 391, 806-811）。最近、実際、RNAiの強力な導入因子であるdsRNAのアンチセンス極性の一本鎖RNAオリゴマーが示されている（Tijstermanら, Science, 2002, 295, 694-697）。
【００４４】
本発明のオリゴマー化合物はまた、異なる塩基が化合物中の一つ以上のヌクレオチド位置に存在する修飾化合物も含む。例えば、第1のヌクレオチドがアデノシンである場合、チミジン、グアノシンまたはシチジンをこの位置に含む修飾化合物が調製され得る。これは、アンチセンス化合物の任意の位置でも起こり得る。次いで、化合物は、本明細書中に記載の方法で試験され、SGLT2 mRNAの発現を阻害する能力を測定する。
【００４５】
本発明の文脈において、用語「オリゴマー化合物」は、複数のモノマー単位を含むポリマーまたはオリゴマーを意味する。本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（RNA）もしくはデオキシリボ核酸（DNA）またはそれらの模倣剤（mimetics）、キメラ、アナログおよびホモログのオリゴマーもしくはポリマーを意味する。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド（主鎖）間結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、ネイティブ型に対してしばしば望ましい。なぜなら、例えば、細胞取り込みの増強、標的核酸への親和性の増強およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような望ましい特性を有するからである。
【００４６】
オリゴヌクレオチドは本発明のアンチセンス化合物の一つの形態であるが、本発明はアンチセンス化合物の他のファミリー、ならびに本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドアナログおよび模倣剤（しかし、これらに限定されない）を含む。
【００４７】
本発明に従うアンチセンス化合物は約8〜約80核酸塩基（すなわち、約8〜約80の結合ヌクレオシド）を含み得る。当業者は本発明が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79または80核酸塩基の長さ、またはこの中の任意の範囲の化合物を包含することを理解するであろう。
【００４８】
一つの態様においては、本発明のアンチセンス化合物は10〜50核酸塩基長である。当業者は本発明が、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50核酸塩基の長さ、またはこの中の任意の範囲の化合物を包含することを理解するであろう。
【００４９】
別の態様においては、本発明のアンチセンス化合物は13〜30核酸塩基長である。当業者は本発明が、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30核酸塩基の長さ、またはこの中の任意の範囲の化合物を包含することを理解するであろう。
【００５０】
別の態様においては、本発明のアンチセンス化合物は15〜25核酸塩基長である。当業者は本発明が、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25核酸塩基の長さ、またはこの中の任意の範囲の化合物を包含することを理解するであろう。
【００５１】
別の態様においては、本発明のアンチセンス化合物は18〜22核酸塩基長である。当業者は本発明が、18、19、20、21または22核酸塩基の長さ、またはこの中の任意の範囲の化合物を包含することを理解するであろう。
【００５２】
特に適切な化合物は約10〜約50核酸塩基、約13〜約30核酸塩基、約15〜約25および約18〜約22核酸塩基のオリゴヌクレオチドである。
【００５３】
例示したアンチセンス化合物の範囲内から選ばれる、少なくとも8個の連続した核酸塩基のストレッチを含む8〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物もまた、同様に適切なアンチセンス化合物であると考えられる。
【００５４】
具体例としてのアンチセンス化合物は、例示したアンチセンス化合物の一つの5'末端から連続する少なくとも8個の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列（残りの核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物の5'末端のすぐ上流から開始し、オリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで連続する、同じオリゴヌクレオチドの連続するストレッチである）を含む。同様に適切なアンチセンス化合物は、例示したアンチセンス化合物の一つの3'末端から連続する少なくとも8個の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列（残りの核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物の3'末端のすぐ下流から開始し、オリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで連続する、同じオリゴヌクレオチドの連続するストレッチである）により表される。アンチセンス化合物は、例示したアンチセンス化合物の配列の内部からの少なくとも8個の連続する核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列により表され得、かつオリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで、いずれかまたは両方の方向に延長され得ることもまた理解される。
【００５５】
本明細書中で例示されたアンチセンス化合物の経験を積んだ当業者は、過度の実験を行うことなく、さらなるアンチセンス化合物を同定することができるであろう。
【００５６】
アンチセンス化合物の特定の核酸分子に対する「ターゲッティング」は、本発明の文脈において複数工程のプロセスであり得る。該プロセスは、通常、機能を調節すべき標的核酸を同定することから始まる。この標的核酸は、例えば、その発現が特定の疾患または疾患状態に関連する細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたmRNA）、あるいは感染性因子由来の核酸分子であり得る。本発明において、標的核酸はSGLT2をコードする。
【００５７】
また、このターゲッティングプロセスは、通常、所望の効果（例えば、発現の調節）が生じるように、アンチセンス相互作用を起こすための標的核酸内の標的領域、セグメントまたは部位のうち少なくとも一つを決定することを含む。本発明の文脈において、用語「領域」とは、同定可能な構造、機能または特性の少なくとも一つを有する標的核酸の部分であると定義される。標的核酸の領域内は、セグメントである。「セグメント」とは、標的核酸内の領域のより小さなまたは下位の部分であると定義される。本発明で用いられる「部位」は、標的核酸内の位置であると定義される。
【００５８】
当該分野で公知のように、翻訳開始コドンは、代表的には5'-AUG （転写mRNA分子内;対応するDNA分子内の5'-ATG）であるので、翻訳開始コドンはまた「AUGコドン」、「開始コドン」または「AUG開始コドン」とも呼ばれる。RNA配列5'-GUG、5'-UUGまたは5'-CUG、ならびに5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有する遺伝子のうち少数は、インビボで機能することが示されている。従って、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、それぞれの場合における開始アミノ酸が代表的にメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）である場合でさえも、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物遺伝子および原核生物遺伝子が2つ以上の代替の開始コドンを有し得、そのいずれか一つが、特定の細胞型または組織で、あるいは特定の一連の条件下で、翻訳開始のために優先的に用いられ得ることもまた当該分野で公知である。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、SGLT2をコードする遺伝子から転写されたmRNAの翻訳を開始するためにインビボで用いられるコドン（単数または複数）を意味し、当該コドンの配列にはかかわらない。遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は、3つの配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列は、それぞれ5'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGAである）のうちの一つを有し得ることもまた当該分野で公知である。
【００５９】
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、約25〜約50の連続するヌクレオチドを、翻訳開始コドンの部分からのいずれかの方向（すなわち、5'または3'）に含む、mRNAまたは遺伝子の翻訳開始コドンの部分を意味する。同様に、用語「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、約25〜約50の連続するヌクレオチドを、翻訳終止コドンの部分からのいずれかの方向（すなわち、5'または3'）に含む、mRNAまたは遺伝子の翻訳終止コドンの部分を意味する。結果として、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「停止コドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物で効果的に標的化され得る全ての領域である。
【００６０】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味することが当該分野で公知であるオープンリーディングフレーム（ORF）または「コード領域」もまた、効果的に標的化され得る領域である。本発明の文脈において、適切な領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを包含する遺伝子間領域である。
【００６１】
他の標的領域は、翻訳開始コドンからの5'方向のmRNAの部分を意味することが当該分野で公知であり、従って、mRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コドンとの間にヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む5'非翻訳領域（5'UTR）を含み；かつ、翻訳終止コドンからの3'方向のmRNAの部分を意味することが当該分野で公知であり、従って、mRNAの3'末端部位と翻訳終止コドンとの間にヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む3'非翻訳領域（3'UTR）を含む。mRNAの5'キャップ部位は、5'-5'三リン酸結合を介してmRNAの5'最末端残基に結合したN7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造それ自体およびキャップ部位に隣接する始めの50ヌクレオチドを含むと考えられている。5'キャップ領域を標的化することもまた適している。
【００６２】
いくつかの真核生物mRNA転写は直接翻訳されるが、多くのものは、翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られる一つ以上の領域を含む。残りの（すなわち、翻訳された）領域は、「エキソン」として知られ、共にスプライシングされて連続的mRNA配列を形成する。標的スプライス部位、すなわち、イントロン-エキソン接合またはエキソン-イントロン接合はまた、異常なスプライシングが疾患に関連する状況で、または特定のスプライス産物の過産生が疾患に関連する状況でも有用であり得る。再組換えまたは欠失による異常な融合接合もまた適当な標的部位である。異なる遺伝子源からの2つの（またはそれ以上の）mRNAのスプライシングのプロセスを介して生じたmRNA転写物は、「融合転写物」として公知である。イントロンは、例えば、DNAまたはプレmRNAを標的としたアンチセンス化合物を用いて効果的に標的化され得ることもまた知られている。
【００６３】
代替のRNA転写物が、DNAの同じゲノム領域から生じ得ることもまた当該分野で公知である。これらの代替の転写物は、一般的に「バリアント」として知られる。より詳細には、「プレmRNAバリアント」は、その開始または停止位置において、同じゲノムDNAから生じた他の転写物とは異なる同じゲノムDNAから生じ、イントロンおよびエキソン配列の両方を含む転写物である。
【００６４】
スプライシングの際に、一つ以上のエキソンまたはイントロン領域あるいはその部分の切除において、プレmRNAバリアントは、より小さい「mRNAバリアント」を産生する。結果として、mRNAバリアントは、加工されたプレmRNAバリアントであり、スプライシングの結果、各独自のプレmRNAバリアントは常に、独自のmRNAバリアントを生じるはずである。これらのmRNAバリアントはまた、「選択的スプライスバリアント」としても知られる。プレmRNAバリアントのスプライシングが起こらない場合、プレmRNAバリアントは、mRNAバリアントと同一である。
【００６５】
バリアントは、転写を開始または停止するための代替シグナルの使用により産生され得ること、また、プレmRNAおよびmRNAは、一つ以上の開始コドンまたは停止コドンを有し得ることが当該分野で公知である。代替の開始コドンを用いる、プレmRNAまたはmRNAを起源とするバリアントは、当該プレmRNAまたはmRNAの「代替の開始バリアント」として公知である。代替停止コドンを用いるこれらの転写は、当該プレ-mRNAまたはmRNAの「代替停止バリアント」として公知である。代替停止バリアントの一つの特異的な型は、転写機構による「ポリA停止シグナル」の一つの代替の選択の結果から、複数の転写が生じ、それによって独自のポリA部位で終止する転写を生じる「ポリAバリアント」である。本発明の文脈の範囲内で、本明細書中に記載の変異体の型もまた好適な標的核酸である。
【００６６】
アンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、本明細書中の以下で「好適な標的セグメント」と呼ぶ。本明細書中で用いる用語「好適な標的セグメント」は、活性なアンチセンス化合物が標的化される標的領域の少なくとも8核酸塩基部分であると定義される。理論に束縛されることは望まないが、現在、これらの標的セグメントは、ハイブリダイゼーションのためにアクセス可能な標的核酸の部分を表すと考えられている。
【００６７】
特定の好ましい標的セグメントの特異的配列が本明細書中に記載されているが、当業者は、これらは本発明の範囲内の特定の態様を例示および記載する働きをすることを理解するであろう。さらなる標的セグメントは、当業者により同定され得る。
【００６８】
例示した標的セグメントの範囲から選択される少なくとも8個の連続する核酸塩基のストレッチを含む8〜80核酸塩基長の標的セグメントもまた同様に、ターゲッティングに好適であると考えられる。
【００６９】
標的セグメントは、例示した標的セグメントの一つの5'末端から連続する少なくとも8個の核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列（残りの核酸塩基は、標的セグメントの5'末端のすぐ上流から開始し、かつDNAまたはRNAが約8〜約80核酸塩基を含むまで連続する、同じDNAまたはRNAの連続するストレッチである）を含み得る。標的セグメントはまた、例示した標的セグメントの一つの3'末端から連続する少なくとも8個の核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列（残りの核酸塩基は、標的セグメントの3'末端のすぐ下流から開始し、かつDNAまたはRNAが約8〜約80核酸塩基を含むまで連続する、同じDNAまたはRNAの連続するストレッチである）で表される。アンチセンス標的セグメントは、例示した標的セグメントの配列の内部からの少なくとも8の連続する核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列により表され、オリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで、いずれかまたは両方の方向に延長され得ることもまた理解される。本明細書中で例示された標的セグメントの経験を積んだ当業者は、過度の実験を行うことなく、さらに標的セグメントを同定できるであろう。
【００７０】
一旦、一つ以上の標的領域、セグメントまたは部位が同定されると、アンチセンス化合物は、所望の効果を与えるように標的に対して十分に相補的であるように（すなわち、十分な特異性で十分に良くハイブリダイズするように）選択される。
【００７１】
オリゴマーアンチセンス化合物もまた、1〜80、81〜160、161〜240、241〜320、321〜400、401〜480、481〜560、561〜640、641〜720、721〜800、801〜880、881〜960、961〜1040、1041〜1120、1121〜1200、1201〜1280、1281〜1360、1361〜1440、1441〜1520、1521〜1600、1601〜1680、1681〜1760、1761〜1840、1841〜1920、1921〜2000、2001〜2080、2081〜2160、2161〜2240、2241〜2273、核酸塩基、またはその任意の組み合わせを含む標的核酸塩基配列（例えば、実施例16において開示されるもの等）の領域に対して標的化され得る。
【００７２】
さらなる態様では、本明細書中で同定される「好適な標的セグメント」は、SGLT2発現を調節するさらなる化合物のスクリーニングにおいて用いられ得る。「調節剤」は、SGLT2をコードする核酸分子の発現を減少または増加し、標的セグメントに相補的な少なくとも8核酸塩基部分を含む化合物である。スクリーニング方法は、SGLT2をコードする核酸分子の標的セグメントを、一つ以上の候補調節剤と接触させる工程、およびSGLT2をコードする核酸分子の発現を減少または増加する一つ以上の候補の調節剤を選択する工程を含む。一旦、候補の調節剤または調節剤がSGLT2をコードする核酸分子の発現を調節（例えば、減少するかまたは増加するかのいずれか）可能であることが示されると、調節剤は、SGLT2の機能のさらなる調査的研究に、あるいは本発明に従って研究薬、診断薬または治療剤に用いられ得る。
【００７３】
本発明の標的セグメントはまた、各々の本発明の相補的アンチセンス化合物と組み合わされて、安定な（二本鎖）二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し得る。
【００７４】
このような二本鎖オリゴヌクレオチド部位は、アンチセンスメカニズムによって、標的の発現を調節し、かつ翻訳およびRNAプロセシングを調節することが当該分野で示されている。さらに、二本鎖部位は化学修飾に供してもよい（Fireら, Nature, 1998, 391, 806-811; TimmonsおよびFire, Nature 1998, 395, 854; Timmonsら, Gene, 2001, 263, 103-112; Tabaraら, Science, 1998, 282, 430-431; Montgomeryら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507; Tuschlら, Genes Dev., 1999, 13, 3191-3197; Elbashirら, Nature, 2001, 411, 494-498; Elbashirら, Gene Dev. 2001, 15, 188-200）。例えば、このような二本鎖部位は、標的に対する二本鎖アンチセンス鎖の標準的なハイブリダイゼーションにより、標的を阻害し、それによって標的の酵素分解を引き起こすことが示される （Tijstermanら, Science, 2002, 295, 694-697）。
【００７５】
本発明のアンチセンス化合物はまた、薬物の発見および標的の評価の分野に応用され得る。本発明は、SGLT2と、疾患状態、表現型または症状との間に存在する関係を解明するために薬物を発見する試みにおいて、本明細書中で同定された化合物および標的セグメントを使用することを包含する。これらの方法は、SGLT2を検出または調節することを含み、試料、組織、細胞または生体を、本発明の化合物と接触させること、SGLT2の核酸またはタンパク質のレベルおよび／または処理後所定時間経過後の関連形質または化学的終点を測定すること、および、必要に応じて、測定した値を、非処理試料または追加の本発明の化合物で処理した試料と比較することを含む。これらの方法はまた、他の実験と並行してまたは組み合わせて行うことにより、標的の妥当性評価のプロセスのための未知の遺伝子の機能を決定するか、または特定の疾患、症状または表現型の処置または予防のための標的としての特定の遺伝子産物の妥当性を決定することができる。別の態様において、本発明は、本明細書中に開示された任意のおよび全ての状態の処置のための薬剤の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【００７６】
本発明のアンチセンス化合物は、診断学、治療学、および予防のために、ならびに研究試薬、およびキットとして利用され得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、優れた特異性で遺伝子発現を阻害し得るが、特定の遺伝子の機能を解明するために、または生物学的経路の種々の要素の機能を識別するために、当業者にしばしば用いられる。
【００７７】
キットおよび診断に係る使用においては、本発明の化合物は、単独で、または他の化合物、もしくは治療と組み合わせて、細胞および組織内で発現された遺伝子の一部または全部の相補体の発現パターンを解明するための識別解析および／または組合せ解析におけるツールとして用いられ得る。
【００７８】
一つの制限のない例として、一つ以上のアンチセンス化合物で処理された細胞または組織内の発現パターンは、アンチセンス化合物で処理されていない対照細胞または組織と比較され、生成されたパターンは、例えば、検査された遺伝子の、疾患との係り、シグナル経路、細胞局在、発現レベル、大きさ、構造または機能と関連するので、遺伝子発現の識別レベルについて、解析される。かかる解析は、刺激された、または刺激されていない細胞について、および発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在または不在のもとで、なされ得る。
【００７９】
当該分野で公知の遺伝子発現解析方法の例としては、DNAアレイまたはマイクロアレイ（BrazmaおよびVilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celisら, FEBS Lett., 2000, 480, 2-16）、SAGE（遺伝子発現の連続解析）（Maddenら, Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425）、READS（消化cDNAの制限酵素増幅）（PrasharおよびWeissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72）、TOGA（総合的遺伝子発現解析）（Sutcliffeら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81）、プロテインアレイおよびプロテオミクス（Celisら, FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblutら, Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10）、発現配列タグ（EST）塩基配列決定法（Celisら, FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larssonら, J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57）、サブトラクティブRNAフィンガープリント（SuRF）（Fuchsら, Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larsonら, Cytometry, 2000, 41, 203-208）、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（DD）（JurecicおよびBelmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Carulliら, J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96）、FTSH（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）法（GoingおよびGustersonら, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904）ならびに質量分析法（To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41）が挙げられる。
【００８０】
本発明のアンチセンス化合物は、SGLT2をコードする核酸にハイブリダイズするため、研究および診断学に有用である。例えば、効果的なSGLT2阻害剤であると同様に、本明細書中に開示されるようなかかる効率を伴い、およびかかる条件下でハイブリダイズすると示されるオリゴヌクレオチドはまた、好都合な遺伝子増幅または検出それぞれの条件下で、効果的なプライマーまたはプローブにもなろう。これらのプライマーおよびプローブは、SGLT2をコードする核酸分子の特異的検出を要する方法において、およびSGLT2のさらなる研究において検出するための、または使用するための、該核酸分子の増幅において、有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にプライマーおよびプローブとSGLT2をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の手段によって、検出され得る。かかる手段としては、酵素とオリゴヌクレオチド、放射性標識化のオリゴヌクレオチドまたは任意の他の適当な検出手段との結合が挙げられ得る。試料中のSGLT2のレベルを検出するためのかかる検出手段を用いたキットもまた、調製され得る。
【００８１】
アンチセンスの特異性および感受性はまた、治療上の使用のために当業者により利用されている。アンチセンス化合物は、ヒトを含め、動物の疾患状態の処置において、治療法の一部として用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬は、リボザイムを含め、安全におよび有効に、ヒトに投与されており、多数の臨床試験が現在進行中である。したがって、アンチセンス化合物は、細胞、組織、および動物、特にヒトの処置のための処置養生において有用であるよう設計され得る有用な治療様式になり得ることが確立されている。
【００８２】
治療学のために、SGLT2の発現を調節することにより処置され得る疾患または障害を有する疑いのあるヒト等の動物が、本発明に従って、アンチセンス化合物を投与することにより、治療されている。例えば、ある制限のない態様では、該方法は、動物に治療上有効な量のSGLT2阻害剤を投与することを含む。動物は処置が必要であるものとしてすでに明らかにされ得るかまたはされ得ない。すなわち、動物は特定の疾患もしくは障害を有すると診断され得るか、またはされ得ない。本発明のSGLT2阻害剤は、SGLT2タンパク質の活性を有効に阻害するか、またはSGLT2タンパク質の発現を阻害する。いくつかの態様では、動物または細胞におけるSGLT2の活性または発現は、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、少なくとも約99％、または100％阻害される。
【００８３】
例えば、SGLT2の発現の減少は、動物の、血清、脂肪組織、肝臓または任意の他の体液、組織または器官の中で、測定され得る。分析される該体液、組織または器官の中に含まれる細胞は、SGLT2タンパク質をコードする核酸分子、および／またはSGLT2タンパク質自体を含み得る。
【００８４】
本発明のアンチセンス化合物は、適当な、薬学的に許容され得る希釈剤または担体に、有効な量の化合物を添加することにより、医薬組成物において、利用され得る。本発明の化合物および方法の使用はまた、予防上有用であり得る。
【００８５】
当該分野で公知であるように、ヌクレオシドは塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は、時々「核酸塩基」または単に「塩基」と呼ばれるヘテロ環塩基である。かかるヘテロ環塩基の2つの最も一般的な種類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノース糖を含むかかるヌクレオシドは、リン酸基が、該糖の2’、3’、または5’ヒドロキシル部のどちらかに結合し得る。オリゴヌクレオチドの形成においては、該リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させ、線状高分子化合物を形成する。次に、かかる線状高分子化合物の各末端がさらに結合し、環状化合物を形成し得るが、線状化合物が一般に望ましい。さらに、線状化合物は、内部核酸塩基相補性を有し得るため、完全に、または部分的に、二本鎖化合物を生じるように、折りたたまれ得る。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するものと一般に称されている。RNAおよびDNAの通常の結合または主鎖は、3’から5’へのリン酸ジエステル結合である。
【００８６】
修飾されたヌクレオシド間結合（主鎖）
本発明において有用なアンチセンス化合物の特異的な例としては、修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書中に定義される場合、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドとしては、主鎖中にリン原子を保持するもの、および主鎖中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、かつ当該分野で時々引用されるように、該ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。
【００８７】
リン原子をその中に含む修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、通常の3’-5’結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル（aminoalkylphosphotriaminoalkylphosphotriester）、3’-アルキレンホスホネート、5’-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2’-5’結合された類似体、ならびにその中の一つ以上のヌクレオチド間結合が3’から3’、5’から5’、または2’から2’への結合である、逆の極性を有するもの、が挙げられる。逆の極性を有するオリゴヌクレオチドは、3’末端ヌクレオチド間結合において、単一の、3’から3’への結合、すなわち、無塩基であり得る単一の逆のヌクレオシド残基（核酸塩基が、欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）を含み得る。種々の塩、混合塩、および遊離酸の形もまた、含まれる。
【００８８】
上記リン含有結合の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：3,687,808号;
4,469,863号; 4,476,301号; 5,023,243号; 5,177,196号; 5,188,897号;
5,264,423号; 5,276,019号; 5,278,302号; 5,286,717号; 5,321,131号;
5,399,676号; 5,405,939号; 5,453,496号; 5,455,233号; 5,466,677号;
5,476,925号; 5,519,126号; 5,536,821号; 5,541,306号; 5,550,111号;
5,563,253号; 5,571,799号; 5,587,361号; 5,194,599号; 5,565,555号;
5,527,899号; 5,721,218号; 5,672,697号および5,625,050号が挙げられる。
【００８９】
リン原子をその中に含有しない修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルが混合されたヌクレオシド間結合、または一つ以上の、短鎖ヘテロ原子の、もしくはヘテロ環式の、ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有し得る。これらとしては、（一部はヌクレオシドの糖部分から形成された）モルホリノ結合を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル（riboacetyl）主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合されたN、O、S、およびCH2成分部分を有する他のものが挙げられる。
【００９０】
上記オリゴヌクレオシドの調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：5,034,506号; 5,166,315号;
5,185,444号; 5,214,134号; 5,216,141号; 5,235,033号; 5,264,562号;
5,264,564号; 5,405,938号; 5,434,257号; 5,466,677号; 5,470,967号;
5,489,677号; 5,541,307号; 5,561,225号; 5,596,086号; 5,602,240号;
5,610,289号; 5,602,240号; 5,608,046号; 5,610,289号; 5,618,704号;
5,623,070号; 5,663,312号; 5,633,360号; 5,677,437号; 5,792,608号;
5,646,269号および5,677,439号が挙げられる。
【００９１】
修飾された糖およびヌクレオシド間結合−模倣剤
他のアンチセンス化合物、例えばオリゴヌクレオチド模倣剤においては、該ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方（すなわち主鎖）が、新規な基により置換される。該核酸塩基単位は、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されてきた、ある、かかる化合物オリゴヌクレオチド模倣剤は、ペプチド核酸（PNA）と称される。PNA化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖であるアミド含有主鎖で置換される。該核酸塩基は、保持され、該主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に、直接、または間接的に、結合する。PNA化合物の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：5,539,082号; 5,714,331号および5,719,262号が挙げられる。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出し得る。
【００９２】
本発明のいくつかの態様には、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシド、ならびに特に、上記引用された米国特許第5,489,677号の、-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-（メチレン（メチルイミノ）またはMMI主鎖として公知の）、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-、および-O-N(CH3)-CH2-CH2-（ここで、天然のホスホジエステル主鎖は-O-P-O-CH2-と表される）、ならびに上記引用された米国特許第5,602,240号のアミド主鎖が挙げられる。上記引用された米国特許第5,034,506号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた適している。
【００９３】
修飾された糖
修飾されたアンチセンス化合物はまた、一つ以上の置換された糖部分を含有し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド等のアンチセンス化合物は、2’位で、次のもの：OH、F、O-、S-、もしくはN-アルキル、O-、S-、もしくはN-アルケニル、O-、S-もしくはN-アルキニル、またはO-アルキル-O-アルキルの一つを含み得、ここでアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換された、または置換されていないC1からC10のアルキル、またはC2からC10のアルケニルおよびアルキニルであり得る。O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON((CH2)nCH3)2もまた適しており、ここで、nおよびmは、1から約10である。他のオリゴヌクレオチドは、2’位に次のもの：C1からC10の低級アルキル、置換された低級の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル、もしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を向上するための基、および類似の性質を有する他の置換基、の一つを含み得る。ある修飾としては、2’-メトキシエトキシ（2’-O-（2-メトキシエチル）または2’-MOEとしてもまた公知の2’-O-CH2CH2OCH3）（Martinら, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）すなわち、アルコキシアルコキシ基、が挙げられる。別の修飾としては、本明細書中以下の実施例に記載されるように、2’-DMAOEとしてもまた公知の2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2基、およびまた本明細書中以下の実施例に記載されるように、（当該分野でまた2’-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2’-DMAEOEとして公知の）2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち、2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2が挙げられる。
【００９４】
他の修飾としては、2’-メトキシ（2’-O-CH3）、2’-アミノプロポキシ（2’-OCH2CH2CH2NH2）、2’-アリル（2’-CH2-CH=CH2）、2’-O-アリル（2’-O-CH2-CH=CH2）および2’-フルオロ（2’-F）が挙げられる。該2’-修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位に存在し得る。好ましい2’-アラビノ修飾は、2’-Fである。類似の修飾もまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に、3’末端ヌクレオチドまたは2’-5’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の3’位、および5’末端ヌクレオチドの5’位になされ得る。アンチセンス化合物はまた、ペントフラノース糖の代わりにシクロブチル部分等の糖の模倣剤を有し得る。かかる修飾された糖構造の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：4,981,957号; 5,118,800号;
5,319,080号; 5,359,044号; 5,393,878号; 5,446,137号; 5,466,786号;
5,514,785号; 5,519,134号; 5,567,811号; 5,576,427号; 5,591,722号;
5,597,909号; 5,610,300号; 5,627,053号; 5,639,873号; 5,646,265号;
5,658,873号; 5,670,633号; 5,792,747号および5,700,920号が挙げられる。
【００９５】
別の糖のさらなる修飾としては、その2’-ヒドロキシル基が、糖の環の3’または4’炭素原子に結合し、それにより、二環式糖部分を形成するロックト核酸（LNA）が挙げられる。該結合は、2’酸素原子および4’炭素原子を架橋する、nが1または2であるメチレン（-CH2-）n基であり得る。LNAおよびその調製法は、WO 98/39352号、およびWO 99/14226号に記載されている。
【００９６】
天然の、及び修飾された核酸塩基
アンチセンス化合物はまた、核酸塩基（当該分野でヘテロ環式塩基、または単に「塩基」としばしば称される）修飾または置換を含み得る。本明細書中で使用される場合、「非修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基であるアデニン（A）及びグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）及びウラシル（U）が挙げられる。修飾された核酸塩基としては、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニル（-C≡C-CH3）ウラシル及びシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル（偽ウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン、及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン、及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン、及び7-デアザアデニン、及び3-デアザグアニン、及び3-デアザアデニンなどの他の合成、及び天然核酸塩基が挙げられる。さらなる修飾された核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（1H-ピリミド（5,4-b）（1,4）ベンゾキサジン-2(3H)-オン）、フェノチアジンシチジン（1H-ピリミド（5,4-b）（1,4）ベンゾチアジン-2(3H)-オン）、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド（5,4-b）（1,4）ベンゾキサジン-2(3H)-オン）などのGクランプ、カルバゾールシチジン（2H-ピリミド（4,5-b）インドール-2-オン）、ピリドインドールシチジン（H-ピリド（3’,2’:4,5）ピロロ（2,3-d）ピリミジン-2-オン）などの三環式ピリミジンが挙げられる。修飾された核酸塩基としてはまた、該プリンまたはピリミジン塩基が、他のヘテロ環、例えば7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン、及び2-ピリドンで置換されたものが挙げられ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第3,687,808号に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859ページ, Kroschwitz, J.I., 編John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englischら, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613により開示されたもの、及びSanghvi, Y.S., 15章, Antisense Research and Applications, 289-302ページ, Crooke, S.T.及びLebleu, B., 編, CRC Press, 1993により開示されたものが挙げられる。かかる核酸塩基のいくつかは、本発明の化合物の結合親和性を増大させるのに、特に有用である。これらとしては、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、及び5-プロピニルシトシンを含む5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、及びO-6置換プリンが挙げられる。5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を0.6〜1.2℃増大させることが示され、現在適当な塩基置換、より詳しくは2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合である。
【００９７】
上記修飾された核酸塩基のいくつかならびに他の修飾された核酸塩基の調製法も教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、上記米国第3,687,808号ならびに
米国特許第：4,845,205号; 5,130,302号; 5,134,066号;5,175,273号; 5,367,066号; 5,432,272号; 5,457,187号; 5,459,255号;5,484,908号; 5,502,177号; 5,525,711号; 5,552,540号; 5,587,469号;5,594,121号, 5,596,091号; 5,614,617号; 5,645,985号; 5,830,653号;5,763,588号; 6,005,096号;及び5,681,941号、及び米国特許第5,750,692号が挙げられる。
【００９８】
結合体
本発明のアンチセンス化合物の別の修飾としては、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを高める一つ以上の部分または結合体をアンチセンス化合物に化学的に連結することが挙げられる。かかる部分または結合体としては、第一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した結合体群が挙げられ得る。本発明の結合体群としては、限定されないが、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を高める群、及びオリゴマーの薬物動態学的性質を高める群が挙げられる。典型的な結合体群としては、限定されないが、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が挙げられる。薬力学的性質を高める群としては、本発明の関係においては、取り込みを向上させ、分解耐性を高め、及び／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する群が挙げられる。薬物動態学的性質を高める群としては、本発明の関係においては、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、または排出を向上させる群が挙げられる。代表的な結合体群は、1992年10月23日に出願された国際特許出願第PCT/US92/09196号、及び米国特許第6,287,860号に開示されている。結合体部分としては、限定されないが、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール、もしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール、もしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコール鎖、または、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、または、オクタデシルアミン、もしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分などの脂質部分が挙げられる。本発明のアンチセンス化合物はまた、活性のある製剤原料、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、ホリニン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロサイアザイド、ジアゼピン、インドメチシン（indomethicin）、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌物質、または抗生物質に結合し得る。オリゴヌクレオチド−薬物結合体及びその調製法は、米国特許出願第09/334,130号（1999年6月15日に出願）に記載されている。
【００９９】
かかるオリゴヌクレオチド結合体の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：4,828,979号; 4,948,882号;5,218,105号; 5,525,465号; 5,541,313号; 5,545,730号; 5,552,538号;5,578,717号, 5,580,731号; 5,580,731号; 5,591,584号; 5,109,124号;5,118,802号; 5,138,045号; 5,414,077号; 5,486,603号; 5,512,439号;5,578,718号; 5,608,046号; 4,587,044号; 4,605,735号; 4,667,025号;4,762,779号; 4,789,737号; 4,824,941号; 4,835,263号; 4,876,335号;4,904,582号; 4,958,013号; 5,082,830号; 5,112,963号; 5,214,136号;5,082,830号; 5,112,963号; 5,214,136号; 5,245,022号; 5,254,469号;5,258,506号; 5,262,536号; 5,272,250号; 5,292,873号; 5,317,098号;5,371,241号, 5,391,723号; 5,416,203号, 5,451,463号; 5,510,475号;5,512,667号; 5,514,785号; 5,565,552号; 5,567,810号; 5,574,142号;5,585,481号; 5,587,371号; 5,595,726号; 5,597,696号; 5,599,923号;5,599,928号及び5,688,941号が挙げられる。
【０１００】
キメラ化合物
所定の化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には前記修飾の一つ以上が、単一の化合物に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ、組み込まれ得る。
【０１０１】
本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。「キメラ」アンチセンス化合物、または「キメラ」は、本発明の関係においては、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであり、これは、各々少なくとも一つのモノマー単位からなる、二つ以上の化学的に異なる領域、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合におけるヌクレオチド、を含有する。
キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従って、アンチセンス化合物の形態である。かかるオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解への増大した耐性、増大した細胞取り込み、増大した安定性、及び／または標的核酸に対する増大した結合親和性をオリゴヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された、少なくとも一つの領域を典型的には含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断し得る酵素の基質としてはたらき得る。例として、RNアーゼ(RNAse) Hは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。RNアーゼ Hの活性化は、したがって、RNA標的の切断を生じ、その結果オリゴヌクレオチドに媒介された遺伝子発現の阻害の有効性を大いに高める。RNA:RNAハイブリッドの切断は、同様に、細胞及びウイルスのRNAの両方を切断するRNアーゼL(RNAseL)などのエンドリボヌクレアーゼの作用を通じて達成され得る。RNA標的の切断は、通常通り、ゲル電気泳動、及び必要に応じて、当該分野で公知の、関連する核酸ハイブリダイゼーション法によって、検出され得る。
【０１０２】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、二つ以上の、上記のようなオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び／またはオリゴヌクレオチド模倣剤の複合構造として形成され得る。かかる化合物はまた、当該分野でハイブリッドまたはギャップマーと呼ばれてきた。かかるハイブリッド構造の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：5,013,830号; 5,149,797号; 5,220,007号;5,256,775号; 5,366,878号; 5,403,711号; 5,491,133号; 5,565,350号;5,623,065号; 5,652,355号; 5,652,356号、及び5,700,922号が挙げられる。
【０１０３】
本発明の化合物はまた、取り込み、分布及び／または吸収を助けるために、混合され、カプセルに入れられ、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所、もしくは他の製剤などの他の分子、分子構造もしくは化合物の混合物と結合され、または他の場合には会合され得る。かかる取り込み、分布及び／または吸収を助ける製剤の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：5,108,921号;5,354,844号; 5,416,016号; 5,459,127号; 5,521,291号; 5,543,158号;5,547,932号; 5,583,020号; 5,591,721号; 4,426,330号; 4,534,899号;5,013,556号; 5,108,921号; 5,213,804号; 5,227,170号; 5,264,221号;5,356,633号; 5,395,619号; 5,416,016号; 5,417,978号; 5,462,854号;5,469,854号; 5,512,295号; 5,527,528号; 5,534,259号; 5,543,152号;5,556,948号; 5,580,575号及び5,595,756号が挙げられる。
【０１０４】
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容され得る塩、エステル、もしくはかかるエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与すると、その生物学的に活性のある代謝産物もしくは残留物を（直接もしくは間接的に）提供し得る任意の他の化合物を含む。
【０１０５】
用語「薬学的に許容され得る塩」は、本発明の化合物の生理学的に及び薬学的に許容され得る塩、すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒物学的効果をそれに付与しない塩のことを言う。オリゴヌクレオチドについての、薬学的に許容され得る塩及びその使用の例は、さらに米国特許第6,287,860号に記載されている。カリウムおよびナトリウム塩は典型的な塩である。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含有する医薬組成物及び製剤を含む。本発明の医薬組成物は、局所または全身治療が望まれるかどうか、及び治療される部分により、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所的（眼、ならびに膣及び直腸送達を含む粘膜へを含む）、例えば噴霧器によることを含む粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは通気により肺に、気管内、鼻腔内、表皮に、ならびに経皮的）、経口または非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは点滴、または頭蓋内、例えば髄腔内もしくは脳室内投与が挙げられる。少なくとも一つの2’-O-メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、特に経口投与に有用であると考えられている。局所投与用医薬組成物及び製剤としては、経皮貼付剤、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、噴霧剤、液体、及び粉末が挙げられ得る。従来の医薬担体、水性の、粉末または油性の基剤、増粘剤などが必要であり得るかまたは望まれ得る。コーティングされたコンドーム、手袋などもまた有用であり得る。
【０１０７】
本発明の医薬製剤は、従来単位投薬形態でもたらされ得るが、製薬産業で周知の従来技術にしたがって調製され得る。かかる技術としては、活性成分を薬学的担体または賦形剤と関連させる工程が挙げられる。一般的に製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と一様にかつ緻密に関連させ、次いで必要に応じて生成物を形作ることで調製される。
【０１０８】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ剤、ソフトゲル、坐薬および浣腸等の、しかしこれらに限定されない任意の可能性のある多くの投薬形態へと製剤化され得る。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体における懸濁液として製剤化され得る。水性懸濁液はさらに、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む懸濁液の粘性を増大させる物質を含み得る。懸濁液はまた安定剤を含み得る。
【０１０９】
本発明の医薬組成物としては、溶液、乳状液、泡およびリポソーム含有製剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物および製剤は、1つ以上の浸透促進剤、担体、賦形剤、または他の活性もしくは不活性成分を含み得る。
【０１１０】
乳状液は、通常直径0.1μmを超える小滴の形で別の液体の中に分散しているある液体の一般的に不均一な系である。水相、油性相もしくは分離相それ自体のいずれかの溶液として存在し得る分散相および活性薬物に加え、乳状液はさらなる構成要素を含み得る。マイクロエマルジョンは、本発明の態様として含まれる。乳状液およびその使用は、当該分野にて周知であり、さらに米国特許第6,287,860号に記載されている。
【０１１１】
本発明の製剤としては、リポソーム製剤が挙げられる。本発明で使用する場合、用語「リポソーム」は、球状の二分子層または複数の二分子層に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。リポソームは、脂肪親和物質から形成される膜および送達される組成物を含有する水性の内部を有する単層状または多層状の小胞である。陽イオン性リポソームは、負電荷を有するDNA分子と相互作用して安定した複合体を形成すると考えられる、正電荷を有するリポソームである。pH感受性または負電荷を有するリポソームは、DNAと複合体を形成するよりもDNAを取り込むと考えられる。陽イオン性および非陽イオン性リポソームのどちらも、DNAを細胞へ送達するのに使用された。
【０１１２】
本明細書中で用いられる場合、リポソームはまた、リポソームに取り込まれる場合に特殊化した脂質を欠くリポソームに関連して増大した循環寿命を生じる一つ以上の特殊化した脂質を含むリポソームを指す用語「立体的に安定した」を含む。立体的に安定したリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が1つ以上の糖脂質を含有するもの、またはポリエチレングリコール（PEG）部分等の1つ以上の親水性ポリマーで誘導されているものである。リポソームおよびその使用は、さらに米国特許第6,287,860号に記載されている。
【０１１３】
本発明の医薬製剤および医薬組成物はまた界面活性剤を含有し得る。薬物製品、製剤および乳状液中の界面活性剤の使用は、当該分野において周知である。界面活性剤およびその使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
【０１１４】
ある態様において、本発明は核酸、特にオリゴヌクレオチドの、効率的な送達を実施するために、様々な浸透促進剤を使用する。非脂肪親和性薬物の細胞膜を横切る拡散を促進するのに加え、浸透促進剤はまた、脂肪親和性薬物の浸透性を高める。浸透促進剤は５つの大きなカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート非界面活性剤の１つに属するものとして分類され得る。浸透促進剤およびその使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
【０１１５】
当業者は、製剤がそれらの意図された使用、すなわち、投与の経路に応じて決まりきった手順で設計されることを認めるだろう。
【０１１６】
局所投与のための製剤としては、本発明のオリゴヌクレオチドが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤等の局所送達薬剤と混合されているものが挙げられる。脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン）陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセリンDMPG）および陽イオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA）が挙げられる。
【０１１７】
局所または他の投与のために、本発明のオリゴヌクレオチドはリポソーム内に封入され得るか、またはそれとの複合体、特に陽イオン性リポソームとの複合体を形成し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは脂質、特に陽イオン性脂質と錯体を形成し得る。脂肪酸およびエステル、薬学的に許容され得るその塩、ならびにその使用は米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。局所製剤は、1999年5月20日に出願された米国特許出願第09/315,298号に詳細に記載されている。
【０１１８】
経口投与のための組成物および製剤としては、散剤または顆粒剤、ミクロ微粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェ、錠剤または小型錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または接合剤が望ましくあり得る。適当な経口製剤としては、本発明のオリゴヌクレオチドが1つ以上の浸透促進剤、界面活性剤およびキレート剤とともに投与されるものが挙げられる。界面活性剤としては、脂肪酸および/もしくはエステルまたはその塩、胆汁酸および/またはその塩が挙げられる。胆汁酸/塩および脂肪酸ならびにその使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸/塩と組み合わせた脂肪酸/塩もまた適当である。特に適当な組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸およびUDCAのナトリウム塩である。さらに浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒状形態またはマイクロもしくはナノ粒子を形成する錯体形態で、経口的に送達され得る。オリゴヌクレオチド錯化剤およびその使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。オリゴヌクレオチドの経口製剤およびその調製は、米国特許出願第09/108,673号（1998年7月1日出願）、第09/315,298号（1999年5月20日出願）および第10/071,822号（2002年2月8日出願）ならびに米国特許公開第2003-0027780号に詳細に記載されている。
【０１１９】
非経口、髄膜下または心室内投与のための組成物および製剤としては、緩衝剤、希釈剤ならびに浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容され得る担体または賦形剤等で、しかしこれらに限定されない他の適切な添加剤をまた含み得る滅菌水溶液が挙げられ得る。
【０１２０】
本発明のある態様は、1つ以上の低重合体化合物および非アンチテンス機構により機能する1つ以上の他の化学療法薬剤を含む医薬組成物を提供する。かかる化学療法薬剤の例としては、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトザントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-FUdR）、メトトレキサート（MTX）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（VP-16）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DES）等の癌化学療法薬物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物とともに使用される場合、かかる化学療法薬剤は、個々に（例えば、5-FUおよびオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、5-FUおよびオリゴヌクレオチドのある期間の後にMTXおよびオリゴヌクレオチドが続く）、または1つ以上の他のかかる化学療法薬剤（例えば5-FU、MTXおよびオリゴヌクレオチド、または5-FU、放射線療法およびオリゴヌクレオチド）と組み合わせて使用され得る。非ステロイド性抗炎症薬物およびコルチコステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症薬物、ならびにリビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むがこれらに限定されない抗ウイルス性薬物はまた、本発明の組成物に組み込まれ得る。アンチセンス化合物および他の非アンチセンス薬物の組み合わせはまた、本発明の範囲内である。2つ以上の結合した化合物は、一緒にまたは連続して使用され得る。
【０１２１】
別の関連ある態様において、本発明の組成物は、第1の核酸を標的にする1つ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第2の核酸標的を標的にする1つ以上のさらなるアンチセンス化合物を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域を標的にした2つ以上のアンチセンス化合物を含み得る。アンチセンス化合物の多数の例が当該分野において公知である。2つ以上の結合した化合物が、一緒にまたは連続して使用され得る。
【０１２２】
治療用組成物の製剤化およびその引き続く投与(administration)(投与(dosing))は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。投与は、数日〜数ヶ月続く治療の過程内で、または治癒が達成されたもしくは疾患状態の減少が達成されるまで、治療すべき疾患状態の重篤度および反応性に依存する。最適な投与スケジュールは、患者の身体内での薬物の蓄積を測定することにより計算され得る。当業者は、最適な投薬量、投与方法および頻度を容易に決定し得る。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効能に依存して変動し得、一般的には、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であることが見出されているEC50に基づいて評価され得る。一般的に、投薬量は、体重1kg当たり0.01μg〜100 g、体重1kg当たり0.1μg〜10 g、体重1kg当たり1μg〜1 g、体重1kg当たり10μg〜100 mg、体重1kg当たり100μg〜10 mg、または体重1kg当たり100μg〜1 mgであり、1日毎に、1週間毎に、1ヶ月毎にもしくは1年毎に1回以上、または2〜20年毎に1回でも投与され得る。当業者は、投与の頻度を、体液または組織中での測定された薬物の滞留時間および濃度に基づいて容易に評価し得る。首尾良い治療の後、患者に、疾患状態の再発を予防するための維持療法を受けさせることが望ましくあり得るが、この場合、オリゴヌクレオチドを、体重1kg当たり0.0001μg〜100 gの範囲内で、1日毎に1回以上〜20年毎に1回、維持投薬量で投与する。
【０１２３】
本明細書中で開示された発明が、より効果的に理解され得るために、以下に実施例を提供する。これらの実施例は、例証目的のためだけであり、いかなるようにも、発明を制限するように構成してはならないことを理解されたい。これらの実施例を通して、分子クローニング反応、および他の標準的な組換えDNA技術が、別に記載の無い限り、Maniatisら., Molecular Cloning - A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Press (1989)に記載された方法に従い、市販にて入手可能な試薬を使用して実行された。
【実施例１】
【０１２４】
ヌクレオシドホスホルアミダイトの合成
アミダイトおよびその中間体を含む以下の化合物は、米国特許第6,426,220号およびPCT公開第WO 02／36743号に記載のように調製された; 5-メチル dC アミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-チミジン中間体、5-メチル-dCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-5-メチルシチジン中間体、5-メチルdCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジンの最後から2番目の中間体、（5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル）-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（5-メチルdCアミダイト）、2'-フルオロデオキシアデノシン、2'-フルオロデオキシグアノシン、2'-フルオロウリジン、2'-フルオロデオキシシチジン、2'-O-（2-メトキシエチル）修飾アミダイト、2'-O-（2-メトキシエチル）-5-メチルウリジン中間体、5'-O-DMT-2'-O-（2-メトキシエチル）-5-メチルウリジンの最後から2番目の中間体、（5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-O-（2-メトキシエチル）-5-メチルウリジン-3'-O-イル）-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（MOE Tアミダイト）、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-（2-メトキシエチル）-5-メチルシチジン中間体、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-（2-メトキシエチル）-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジンの最後から2番目の中間体、(5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-O-（2-メトキシエチル）-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（MOE 5-Me-Cアミダイト）、（5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-O-（2-メトキシエチル）-N6-ベンゾイルアデノシン-3'-O-イル）-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（MOE Aアミダイト）、（5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-O-（2-メトキシエチル）-N4-イソブチリルグアノシン-3'-O-イル）-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（MOE Gアミダイト）、2'-O-（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび2'-O-（ジメチルアミノ-オキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチルウリジン、2'-O-（（2-フタルイミドキシ）エチル）-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（（2-ホルムアドキシイミノオキシ）エチル）-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（N,Nジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'-（（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト）、2'-（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-（2-エチルアセチル）-5'-O-（4,4'-ジメトキシトリチル）グアノシン-3'-（（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト）、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（2'-DMAEOE）ヌクレオシドアミダイト、2'-O-（2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）エチル）-5-メチルウリジン、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-（2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）-エチル)）-5-メチルウリジンおよび5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-（2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）-エチル)）-5-メチルウリジン-3'-O-（シアノエチル-N,N-ジイソプロピル）ホスホルアミダイト。
【実施例２】
【０１２５】
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドの合成
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技術により、簡便かつ決まりきった手順で調製し得る。かかる合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems（Foster City, CA）を含むいくつかの販売業社により販売されている。当該分野で公知のかかる合成の任意の他の手段が、さらにまたは代替的に使用され得る。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチドを調製することが周知である。
【０１２６】
オリゴヌクレオチド：
未置換および置換ホスホジエステル（P＝O）オリゴヌクレオチドは、ヨウ素で酸化する標準的なホスホルアミダイト化学を用いる自動化DNA合成機 （Applied Biosystemsモデル394）で合成される。
【０１２７】
ホスホロチオエート（P＝S）は、ホスファイト結合を酸化するための3,H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシドの10％ w／vアセトニトリル溶液を利用してチオ化を行うこと以外、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成される。チオ化反応工程の時間は、180秒まで延長し、通常のキャッピング工程を先に行った。CPGカラムからの切断および55℃での濃縮水酸化アンモニウム中での脱保護（12〜16時間）の後、オリゴヌクレオチドを、3容積より多いエタノールを用いて、1 M NH4OAc溶液から沈殿させることにより回収した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,508,270号に記載のように調製される。
【０１２８】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第4,469,863号に記載のように調製される。
【０１２９】
3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,610,289号または同第5,625,050号に記載のように調製される。
【０１３０】
ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,256,775号または同第5,366,878号に記載のように調製される。
【０１３１】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、PCT特許公開第PCT／US94／00902号および同第PCT／US93／06976号（それぞれ第WO 94／17093号および第WO 94／02499号として公開されている）に記載のように調製される。
【０１３２】
3'-デオキシ-3'-アミノ ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,476,925号に記載のように調製される。
【０１３３】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,023,243号に記載のように調製される。
【０１３４】
ボラノリン酸オリゴヌクレオチドは、米国特許第5,130,302号および同第5,177,198号に記載のように調製される。
【０１３５】
オリゴヌクレオシド：
MMI結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド-3結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド-4結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴ-ヌクレオシド、ならびに、例えば、交互にMMIおよびP＝OまたはP＝S結合を有する混合骨格化合物は、米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号および同第5,610,289号に記載のように調製される。
【０１３６】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,264,562号および同第5,264,564号に記載のように調製される。
【０１３７】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,223,618号に記載のように調製する。
【実施例３】
【０１３８】
RNA合成
一般的に、RNA合成化学は、戦略的な中間体反応における種々の保護基の選択的組み込みに基づく。当業者は、有機合成における保護基の使用を理解するであろうが、有用な保護基の種類には、シリルエーテルが含まれる。特定のかさ高いシリルエーテルは、2'-ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基と組み合わせて、5'-ヒドロキシルを保護するのに用いられる。次いで、この保護基の組は、標準的な固相合成技術により使用される。全ての他の合成工程後、酸に不安定なオルトエステル保護基を最後に除去することが重要である。さらに、必要に応じて、合成の間に早期にシリル保護基を使用することにより、2'-ヒドロキシルの望まない脱保護が起こることなく、容易な除去が確実になる。
【０１３９】
異なるように除去されかつ異なるように化学的に不安定な保護基での2'-ヒドロキシルの保護と組み合わせた5'-ヒドロキシルの連続的保護のためのこの手順に従って、RNAオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１４０】
RNAオリゴヌクレオチドは、段階的な様式で合成される。それぞれのヌクレオチドを、（3'-から5'-の方向に）順に、固相支持体に結合させたオリゴヌクレオチドに添加する。鎖の3'末端における第1のヌクレオシドを、固相支持体に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび活性化剤を添加し、第2の塩基を、第1のヌクレオシドの5'末端にカップリングさせる。支持体を洗浄し、任意の未反応の5'-ヒドロキシル基を無水酢酸でキャップして、5'-アセチル部分を得る。次いで、結合を、より安定で、かつ最終的に所望されるP（V）結合に酸化する。ヌクレオチド付加サイクルの最後に、5'-シリル基をフッ化物で切断する。該サイクルを、それぞれの次のヌクレオチドについて繰り返す。
【０１４１】
合成後、リン酸塩上のメチル保護基を、DMF中の1 M ジナトリウム-2-カルバモイル-2-シアノエチレン-1,1-ジチオレート三水和物（S2Na2）を利用して、30分間で切断する。脱保護溶液を、水を使用して、固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドから洗い流す。次いで、支持体を、水中の40％メチルアミンで10分間、55℃にて処理する。これによりRNAオリゴヌクレオチドが溶液中に遊離し、環外アミンを脱保護し、かつ2'-基を修飾する。オリゴヌクレオチドを、この段階で、陰イオン交換HPLCにより分析し得る。
【０１４２】
2'-オルトエステル基は、除去すべき最後の保護基である。Dharmacon Research, Inc. （Lafayette, CO）が開発したエチレングリコールモノ酢酸オルトエステル保護基は、有用なオルトエステル保護基の一例であり、以下の重要な特性を有する。これはヌクレオシドホスホルアミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の条件に安定である。しかしながら、オリゴヌクレオチド合成後、オリゴヌクレオチドはメチルアミンで処理されるが、該メチルアミンはオリゴヌクレオチドを固相支持体から切断するのみならず、オルトエステルからアセチル基を除去する。得られるオルトエステル上の2-エチルヒドロキシル置換基は、アセチル化前駆体よりも電子吸引性が低い。結果として、修飾オルトエステルは、酸触媒加水分解に対してより不安定になる。詳細には、アセチル基が除去された後、切断速度はおよそ10倍速くなる。従って、このオルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成に適合するための十分な安定性を有し、さらに引き続いて修飾される場合、最終的なRNAオリゴヌクレオチド産物と適合する比較的穏やかな水性条件下で脱保護を行うことを可能にする。
【０１４３】
さらに、RNA合成の方法は、当該分野で周知である（Scaringe, S. A.博士論文, University of Colorado, 1996; Scaringe, S. A.ら,J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 11820-11821; Matteucci, M. D.およびCaruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 3185-3191; Beaucage, S. L.およびCaruthers, M. H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; Dahl, B. J.ら, Acta Chem. Scand,. 1990, 44, 639-641; Reddy, M. P.ら, Tetrahedrom Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott, F.ら, Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684; Griffin, B. E.ら, Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313; Griffin, B. E.ら, Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331）。
【０１４４】
本発明のRNAアンチセンス化合物（RNAオリゴヌクレオチド）は、本明細書中に記載の方法により合成され得るか、またはDharmacon Research, Inc （Lafayette, CO）から購入し得る。相補的RNAアンチセンス化合物を合成し、次いで、当該分野で公知の方法によりアニーリングして、二重鎖（二本鎖）アンチセンス化合物を形成し得る。例えば、二本鎖は、30μlのRNAオリゴヌクレオチドの各相補的鎖（50 μM RNAオリゴヌクレオチド溶液）および15μlの5Ｘアニーリング緩衝液（100 mMの酢酸カリウム、30 mMのHEPES-KOH（pH 7.4）、2 mMの酢酸マグネシウム）を組み合わせ、次いで、90℃で1分、次いで37℃で1時間加熱することにより、形成され得る。得られる二本鎖アンチセンス化合物は、標的核酸の役割を研究するためのキット、分析、スクリーニングもしくは他の方法に、または診断目的もしくは治療目的のために使用され得る。
【実施例４】
【０１４５】
キメラ化合物の合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型のものであり得る。これらには、結合ヌクレオシドの「ギャップ」部分が結合ヌクレオシドの5'と3'の「ウイング」部分の間に位置する第1の型、および「ギャップ」部分がオリゴマー化合物の3'または5'末端のいずれかに位置する第2の「開放末端」型が挙げられる。第1の型のオリゴヌクレオチドはまた、「ギャップマー（gapmer）」またはギャップトオリゴヌクレオチドとしても当該分野で公知である。第2の型のオリゴヌクレオチドは、「ヘミマー（hemimer）」または「ウイングマー（wingmer）」としても当該分野で公知である。
【０１４６】
（2'-O-Me）--（2'-デオキシ）--（2'-O-Me） キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド部分を有するキメラオリゴヌクレオチドは、上述のApplied Biosystems自動化DNA合成機モデル394を用いて合成される。オリゴヌクレオチドは、自動化合成機ならびにDNA部分用の2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホルアミダイトおよび5'と3'ウイング用の5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホルアミダイトを使用して合成される。標準的な合成サイクルは、5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホルアミダイト用に反応時間を長くしたカップリング工程を導入することにより変更する。完全に保護したオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、濃縮アンモニア（NH40H）中で12〜16時間、55℃で脱保護する。次いで、脱保護オリゴを、適切な方法（沈殿、カラムクロマトグラフィー、真空中での容積減少、ならびにキャピラリー電気泳動および質量分析法による収率および純度の分光学的分析）で回収する。
【０１４７】
（2'-O-（2-メトキシエチル））--（2'-デオキシ）--（2'-O-（メトキシエチル））キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
（2'-O-（2-メトキシエチル））--（2'-デオキシ）--（-2'-O-（メトキシエチル））キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイトを2'-O-（メトキシエチル）アミダイトに置換し、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上述した手順により調製された。
【０１４８】
（2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル）--（2'-デオキシホスホロチオエート）--（2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル）キメラオリゴヌクレオチド
（2'-O-（2-メトキシエチル ホスホジエステル）--（2'-デオキシホスホロチオエート）--（2'-O-（2-メトキシエチル） ホスホジエステル）キメラオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上述した手順により、2'-O-メチル アミダイトを2'-O-（メトキシエチル）アミダイトに置換し、ヨウ素で酸化してキメラ構造のウイング部内でホスホジエステルヌクレオチド間結合を形成し、3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド（Beaucage試薬）を利用して硫化することによりセンターギャップにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を形成することによって、調製される。
【０１４９】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第5,623,065号に従って合成される。
【実施例５】
【０１５０】
SGLT2を標的とする二本鎖アンチセンス化合物の設計およびスクリーニング
本発明によれば、一連の核酸二本鎖は、本発明のアンチセンス化合物およびその相補物を含み、SGLT2を標的とするように設計され得る。二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、表1のオリゴヌクレオチドの少なくとも8核酸塩基部分を含む。鎖の末端は、1つ以上の天然または修飾された核酸塩基の付加により修飾されて、突出を形成し得る。次いで、dsRNAのセンス鎖を、アンチセンス鎖の相補物として設計および合成するが、これもまたいずれかの末端に修飾または付加を含み得る。例えば、ある態様において、dsRNA二本鎖の鎖は両方とも、中央の核酸塩基に対して相補的であり、各々が一方または両方の末端に突出を有するであろう。
【０１５１】
例えば、配列CGAGAGGCGGACGGGACCG（配列番号：268）およびデオキシチミジン（dT）の2つの核酸塩基突出を有するアンチセンス鎖を含む二本鎖は、以下の構造を有する:
2010136725.tif 000002
【０１５２】
別の態様において、同じ配列CGAGAGGCGGACGGGACCG（配列番号：268）を有するアンチセンス鎖を含む二本鎖は、平滑末端（一本鎖突出を有しない）を用いて、以下のように調製され得る:
2010136725.tif 000003
【０１５３】
二本鎖のRNA鎖は、本明細書中で開示される方法により合成されるか、またはDharmacon Research Inc.,（Lafayette, CO）から購入し得る。相補鎖は合成されると、アニーリングする。一本鎖を等分し、50μMの濃度に希釈する。希釈すると、各鎖の30μLを、15μLのアニ−リング緩衝液の5x溶液と合わせる。当該緩衝液の最終濃度は、100 mM酢酸カリウム、30 mM HEPES-KOH（pH 7.4）および2 mM酢酸マグネシウムである。最終容積は、75μLである。この溶液を、90℃で1分インキュベートし、次いで、15秒間遠心分離する。管を37℃で1時間静置するが、このときにdsRNA二本鎖を実験に用いる。dsRNA二本鎖の最終濃度は20μMである。この溶液は、冷凍（-20℃）保存し得、5回まで凍結融解することができる。
【０１５４】
二本鎖アンチセンス化合物を調製し、そのSGLT2発現を調節する能力を評価する。
【０１５５】
細胞が80％のコンフルエンシーに達したとき、本発明の二本鎖アンチセンス化合物で処理する。細胞96ウェルプレートで生育させた細胞について、ウェルを200μLのOPTI-MEM-1血漿減少培地（GibcoBRL）で1回洗浄し、次いで、12μg／mLのLIPOFECTIN（Gibco BRL）を含む130μLのOPTI-MEM-1で処理し、所望の二本鎖アンチセンス化合物を最終濃度200 nMで得る。処理の5時間後、培地を新鮮な培地で置き換える。処理の16時間後に細胞を採取し、このときにRNAを単離して、標的の減少をRT-PCRにより測定する。
【実施例６】
【０１５６】
オリゴヌクレオチドの単離
制御された多孔質ガラス固相支持体からの切断および濃水酸化アンモニウム中で、55℃で12-16時間脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、3容積未満のエタノールを用いて、1 M NH40Acから沈殿によって回収する。合成したオリゴヌクレオチドを、電子スプレー質量分析法（分子量測定）およびキャピラリーゲル電気泳動により分析し、全長の少なくとも70％の物質であると決定した。この合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、-16 amu産物（＋／- 32＋／-48）に対する正確な分子量の比により測定した。いくつかの研究については、オリゴヌクレオチドを、Chiangら, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171に記載のように、HPLCにより精製した。HPLCで精製した物質について得られた結果は、HPLCで精製しなかった物質について得られた結果と同様であった。
【実施例７】
【０１５７】
オリゴヌクレオチド合成-96ウェルプレートフォーマット
オリゴヌクレオチドは、固相P（III）ホスホルアミダイト化学により、96ウェル形式で同時に96配列を集めることができる自動化合成機で合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素での酸化により得た。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中の3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1 ジオキシド（Beaucage 試薬）を利用した硫化により生じた。標準的な塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトは、商業販売業者（例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAまたはPharmacia, Piscataway, NJ）から購入した。非標準的ヌクレオシドは、標準的なまたは特許された方法のように合成される。これらは、塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして利用される。
【０１５８】
オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、濃NH40Hを用いて高温（55〜60℃）で12-16時間脱保護し、次いで、遊離した産物を減圧乾燥した。次いで、乾燥した産物を、滅菌水中に再懸濁してマスタープレートを得たが、ここから、全ての分析および試験プレート試料を、ロボットピペッターを利用して希釈する。
【実施例８】
【０１５９】
オリゴヌクレオチド分析-96ウェルプレート形式
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈およびUV吸収スペクトル測定により評価した。個々の産物の全長完全性は、96ウェル形式（Beckman P／ACETMMDQ）のそれぞれにおけるキャピラリー電気泳動（CE）により評価したか、または個々に調製した試料については、市販のCE装置（例えば、Beckman P／ACETM5000, ABI 270）により評価した。基本および骨格の組成を、電子スプレー質量分析法を利用した化合物の質量分析により確認した。全てのアッセイ試験プレートを、単チャネルまたは多チャネルロボットピペッターを用いて、マスタープレートから希釈した。プレートは、プレート上の少なくとも85％の化合物が全長の少なくとも85％であった場合、許容可能であると判定した。
【実施例９】
【０１６０】
細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
アンチセンス化合物が標的核酸の発現に与える影響は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する限り、多様な細胞型のいずれかで試験することができる。これは、例えば、PCRまたはノーザンブロット分析を用いて、常套的に測定することができる。以下の細胞型は、例示の目的のために提供されるが、標的が選択された細胞型中で発現する限り、他の細胞型も常套的に用いることができる。これは、例えば、ノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはリアルタイムPCRのような、当該分野で常套的な方法により容易に測定することができる。
【０１６１】
T-24細胞:
ヒト移行細胞膀胱癌細胞株T-24は、American Type Culture Collection （ATCC） （Manassas, VA）から入手した。T-24細胞を、10％子ウシ胎児血清（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）、ペニシリン（1mL当たり100単位）およびストレプトマイシン（1mL当たり100μg）（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を補給した完全McCoy5A基礎培地（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）中で常套的に培養した。細胞を、90％コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。RT-PCR分析で用いるため、細胞を、96ウェルプレート（Falcon-Primaria #353872）に、7000細胞／ウェルの密度で播種した。
【０１６２】
A549細胞:
ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection （ATCC） （Manassas, VA）から入手した。A549細胞を、10％子ウシ胎児血清（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）、ペニシリン（1mL当たり100単位）およびストレプトマイシン（1mL当たり100μg）（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を補給したDMEM基礎培地（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）中で常套的に培養した。細胞を、90％コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。
【０１６３】
NHDF細胞:
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（NHDF）は、Clonetics Corporation （Walkersville, MD）から入手した。NHDFは、供給業者により推奨されるように補給された線維芽細胞増殖培地（Clonetics Corporation, Walkersville, MD）中で常套的に維持した。細胞を、供給業者により推奨されるように、10回の継代培養まで維持した。
【０１６４】
HEK細胞:
ヒト胚ケラチノサイト（HEK）は、Clonetics Corporation （Walkersville, MD）から入手した。HEKは、供給業者により推奨されるように処方されたケラチノサイト増殖培地 （Clonetics Corporation, Walkersville, MD）中で常套的に維持した。細胞を、供給業者により推奨されるように、10回の継代培養まで常套的に維持した。
【０１６５】
HK-2細胞：
HK-2（ヒト腎臓2）は、ヒト乳頭腫ウイルス16（HPV-16）E6/E7遺伝子（CRL-2190, American Type Culture Collection, Manassus, VA）による形質導入により不死化した、通常の腎細胞に由来する近位曲尿細管細胞（PTC）株である。HK-2細胞を、5ng/ml組換え表皮成長因子および0.05mg/mlウシ下垂体エキスを含む、ケラチノサイト血清を有さない培地（17005-042, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）中で常套的に培養した。細胞を、トリプシン処理により常套的に継代培養し、70-80％コンフルエンスに達したときに、1：4の比率で割った。ある日トランスフェクションに先立って、細胞を、96ウェルプレート（Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences, Bedford, MA）に、10,000細胞／ウェルの密度で播種した。
【０１６６】
b.END細胞:
マウス脳内皮細胞株b.ENDは、Max Plank Institute（Bad Nauheim, Germany）のWerner Risau博士から入手した。b.END細胞を、DMEM、10％子ウシ胎児血清（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）を補給した高グルコース（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）で常套的に培養した。細胞を、90％コンフルエンスに達したときに、トリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。RT-PCR分析で用いるため、細胞を、96ウェルプレート（Falcon-Primaria #3872）に、3000細胞／ウェルの密度で播種した。
【０１６７】
アンチセンス化合物での処理:
細胞が65-75％コンフルエンシーに達したとき、それらをオリゴヌクレオチドで処理する。96ウェルプレートで増殖した細胞について、ウェルを、100μLのOPTI-MEMTM-1血清使用量低減培地（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）で1回洗浄し、次いで、3.75μg／mLのLIPOFECTINTM（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含む130μLのOPTI-MEMTM-1で処理した。細胞を処理し、データを3連で得た。37℃での4-7時間の処理後、培地を新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチド処理の16-24時間後、細胞を採集した。
【０１６８】
用いたオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株によって変動する。特定の細胞株について最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を、一定範囲の濃度で、陽性対照オリゴヌクレオチドで処理する。ヒト細胞について、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトH-rasに標的化したISIS 13920
（
2010136725.tif 000004
、配列番号：１）、
またはヒトJun-N末端キナーゼ-2（JNK2）に標的化したISIS 18078
（
2010136725.tif 000005
、配列番号：２）のいずれかから選択される。両方の対照は、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（太字で示す2'-O-メトキシエチル）である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラットc-rafの両方に標的化したISIS 15770、
2010136725.tif 000006
、配列番号：３、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（太字で示す2'-O-メトキシエチル）である。次いで、c-H-ras（ISIS 13920に対して）、JNK2（ISIS 18078に対して）またはc-raf（ISIS 15770に対して）mRNAについて80％阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、当該細胞株の引き続く実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。80％阻害が達成できない場合、c-H-ras、JNK2またはc-raf mRNAの60％阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、該細胞株の引き続く実験における新規オリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として用いる。60％阻害が達成されない場合、当該特定の細胞株は、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に不適切であるとみなす。本明細書中で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、50 nM〜300 nMである。
【０１６９】
ノーザンブロッティングまたは他の分析のために、細胞は、100 mmまたは他の標準的な組織培養プレート上に播種され、適切な容積の培地およびオリゴヌクレオチドを用いて、同様に処理され得る。
【実施例１０】
【０１７０】
SGLT2発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
SGLT2発現のアンチセンス調節は、当該分野で公知の種々の方法でアッセイすることができる。例えば、SGLT2 mRNAレベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはリアルタイムPCR（RT-PCR）により定量することができる。リアルタイム定量PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ（A）＋mRNA上で行うことができる。本発明のRNA分析の好ましい方法は、本明細書中の他の実施例に記載の全細胞RNAの使用である。RNAの単離の方法は当該分野で周知である。ノーザンブロット分析もまた当該分野で常套的である。リアルタイム定量（PCR）は、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAから市販されている市販のABI PRISMTM7600、7700または7900 Sequence Detection Systemを用い、製造業者の使用説明書に従って簡便に達成することができる。
【０１７１】
SGLT2のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析（免疫ブロッティング）、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）または蛍光活性化細胞選別機（FACS）等の当該分野で周知の種々の方法で定量することができる。SGLT2に指向した抗体は、抗体のMSRSカタログ（Aerie Corporation, Birmingham, MI）等の種々の供給源から同定されかつ得ることができるか、あるいは、当該分野で周知の従来のモノクローナルまたはポリクローナル抗体産生方法により調製することができる。
【実施例１１】
【０１７２】
SGLT2阻害剤を使用するための表現型アッセイの設計
表現型アッセイ
SGLT2阻害剤を、本明細書中で開示された方法により同定し、該化合物を、特定の疾患状態または状態の治療の効率を予測できる測定可能な終点をそれぞれ有する1つまたはそれ以上の表現型アッセイでさらに研究する。表現型アッセイ、それらの使用のためのキットおよび試薬は当業者に周知であり、健康および疾患におけるSGLT2の役割および／または関連を研究するために、本明細書中で用いられる。いくつかの商業用の供給業者のいずれか1つから購入できる代表的な表現型アッセイには、細胞生存率、細胞毒性、増殖または細胞生存を測定するもの（Molecular Probes, Eugene, OR; PerkinElmer, Boston, MA）、酵素アッセイを含むタンパク質ベースのアッセイ（Panvera, LLC, Madison, WI ; BD Biosciences, Franklin Lakes,NJ ; Oncogene Research Products, San Diego, CA）、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化プロセスおよびアポトーシス（Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI）、トリグリセリド蓄積（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、血管新生アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイならびに代謝アッセイ（Chemicon International Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられる。
【０１７３】
ある非限定的実施例では、特定の表現型アッセイに適切であると決定された細胞（すなわち、乳癌の研究のために選択されたMCF-7細胞;肥満の研究のための脂肪細胞）を、インビトロの研究から同定されたSGLT2阻害剤ならびに上述の方法で測定された最適濃度の対照化合物で処理する。処理期間の最後に、処理および未処理細胞を、アッセイに特有の1つ以上の方法で分析して、形質の結果および終点を決定する。
【０１７４】
形質終点には、時間または処理用量に対する細胞形態の変化、ならびにタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類または金属のような細胞成分のレベルの変化が挙げられる。pH、細胞周期の段階、細胞による生物学的指標の摂取または排出を含む細胞状態の測定もまた、目的の終点である。
【０１７５】
処理後の細胞の遺伝子型の分析（細胞の1つ以上の遺伝子の発現の測定）もまた、SGLT2阻害剤の効率または効力の指標として用いられる。Hallmark遺伝子、あるいは特定の疾患状態、状態または表現型に関連することが疑われる遺伝子は、処理および未処理細胞の両方において測定される。
【実施例１２】
【０１７６】
RNA単離
ポリ（A）＋mANA単離
ポリ（A）＋mRNAを、Miuraら（Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764）に従って単離した。ポリ（A）＋mRNAを単離する他の方法は、当該分野で常套的である。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖した細胞について、増殖培地を細胞から除去し、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μL溶解緩衝液（10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5％ NP-40、20 mM バナジル-リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、次いで、室温で5分インキュベートした。55μLの溶解物を、オリゴd（T）被覆96ウェルプレート（AGCT Inc., Irvine CA）に移した。プレートを室温で60分インキュベートし、200μLの洗浄緩衝液（10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl）で3回洗浄した。最後の洗浄後、プレートをペーパータオル上にブロットして過剰な洗浄緩衝液を除去し、次いで5分間風乾した。70℃に予熱した60μlの溶出緩衝液（5 mM Tris-HCl pH 7.6）を各ウェルに添加し、プレートを90℃のホットプレート上で5分間インキュベートし、次いで、溶出液を新鮮な96ウェルプレートに移した。
【０１７７】
100 mmまたは他の標準的なプレートで増殖した細胞は、適当な容積の全ての溶液を用いて同様に処理することができる。
【０１７８】
全RNA単離
Qiagen, Inc.（Valencia, CA）から購入したRNEASY 96TMキットおよび緩衝液を用い、製造業者が推奨する手順に従って、全RNAを単離した。手短にいえば、96ウェルプレート上で増殖した細胞について、増殖培地を細胞から除去し、各ウェルを200μLの冷PBSを用いて洗浄した。150μLの緩衝液RLTを各ウェルに添加し、プレートを20秒間激しく振とうした。次いで、150μLの70％エタノールを各ウェルに添加し、内容物を、3回上下にピペッティングすることにより混合した。次いで、試料を、廃液回収トレーを備え、かつ減圧源に取り付けられたQIAVACTMマニホルドに取り付けられた、RNEASY 96TMウェルプレートに移した。1分間減圧した。500μLの緩衝液RW1を、RNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、15分インキュベートし、再び1分間減圧した。追加の500μLの緩衝液RW1を、RNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、2分間減圧した。次いで、1 mLの緩衝液RPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、90秒間減圧した。次いで、緩衝液RPEでの洗浄を繰り返し、さらに3分間減圧した。次いで、プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、ペーパータオルにブロットし、乾燥させた。次いで、プレートを、1.2 mL回収管を含む回収管ラックを備えたQIAVACTMマニホルドに再び取り付けた。次いで、140μLのRNアーゼ（RNAse）を含まない水を各ウェルにピペッティングし、1分間インキュベートし、次いで3分間減圧することにより、RNAを溶出させた。
【０１７９】
繰り返しのピペッティングおよび溶出工程は、QIAGEN Bio-Robot9604（Qiagen, Inc., Valencia CA）を用いて自動化され得る。基本的に、培養プレート上で細胞を溶解した後、プレートをロボットデッキに移し、ここでピペッティング、DNase処理および溶出工程を行う。
【実施例１３】
【０１８０】
SGLT2 mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析
SGLT2 mRNAレベルの定量は、ABI PRISMTM7600、7700または7900 Sequence Detection System（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を用い、製造業者の使用説明書に従って、リアルタイム定量PCRにより達成した。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物のリアルタイムでの高スループット定量を可能にする、閉鎖した管の非ゲルベースの蛍光検出システムである。PCRが完了した後に増幅産物を定量する標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量PCRの産物は、それらが蓄積されるにつれて定量される。これは、フォワードおよびリバースPCRプライマーの間で特異的にアニ−リングし、かつ2つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを、PCR反応に含むことにより達成される。レポーター色素（例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかから入手したFAMまたはJOE）をプローブの5'末端に付加させ、クエンチャー色素（例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかから入手したTAMRA）をプローブの3'末端に付加させる。プローブおよび色素がインタクトである場合、レポーター色素発光を、3'クエンチャー色素の近傍でクエンチングする。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングにより、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性により切断され得る基質を生じる。PCR増幅サイクルの伸長期の間、プローブのTaqポリメラーゼによる切断により、プローブの残りから（すなわち、クエンチャー部分から）レポーター色素が放出され、配列特異的蛍光シグナルが生じる。各サイクルについて、さらなるレポーター色素分子を、それらの各々のプローブから切断し、蛍光強度を、通常の間隔で、ABI PRISMTMSequence Detection System内に配置したレーザー光学機械によりモニタリングする。各アッセイにおいて、未処理対照試料からのmRNAの連続的希釈を含む一連の平行反応により、標準曲線が得られ、これを、試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害率を定量するのに用いる。
【０１８１】
定量PCR分析に先立ち、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー-プローブセットがGAPDH増幅反応で「マルチプレックス化（multiplexed）」される能力を評価する。重複化の際、標的遺伝子および内部標準遺伝子GAPDHを、単一の試料中で同時に増幅する。この分析において、未処理細胞から単離したmRNAを連続的に希釈する。各希釈物を、GAPDHのみ、標的遺伝子のみ（「シングルプレックス化（single-plexing）」）または両方（マルチプレックス化）に特異的なプライマー-プローブセットの存在下で増幅する。PCR増幅後、希釈の機能としてのGAPDHおよび標的mRNAシグナルの標準曲線を、シングルプレックス化およびマルチプレックス化試料の両方から得る。マルチプレックス化試料から得たGAPDHおよび標的シグナルの勾配および相関係数の両方が、シングルプレックス化試料から得た対応する値の10％の範囲内であれば、該標的に特異的なプライマー-プローブセットは、マルチプレックス化可能であるとみなす。PCRの他の方法もまた当該分野で公知である。
【０１８２】
PCR試薬は、Invitrogen Corporation（Carlsbad, CA）から入手した。RT-PCR反応は、20μLのPCRカクテル（2.5x PCR緩衝液−MgCl2、6.6 mMのMgCl2、それぞれ375μMのdATP、dCTP、dCTPおよびdGTP、それぞれ375 nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、125 nMのプローブ、4単位のRNアーゼ（RNAse）阻害剤、1.25単位のPLATINUM（登録商標）Taq、5単位のMuLV逆転写酵素、ならびに2.5x ROX色素）を30μLの全RNA溶液（20-200 ng）を含む96-ウェルプレートに添加することにより行った。RT反応は、30分間48℃でインキュベーションすることにより行った。10分間95℃でインキュベーションすることによりPLATINUM（登録商標）Taqを活性化した後、40サイクルの2工程PCRプロトコールを95℃で15秒間（変性）、次いで60℃で1.5分（アニーリング／伸長）で行った。
【０１８３】
リアルタイムRT-PCRにより得られた遺伝子標的の量を、GAPDH（発現が一定である遺伝子）の発現レベルのいずれかを用いて、あるいはRiboGreenTM（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR）を用いて全RNAを定量することによって標準化する。GAPDH発現は、リアルタイムRT-PCRにより、標的と同時に、マルチプレックス化によりまたは別々に作動させてリアルタイムに定量する。全RNAは、RiboGreenTM RNA定量試薬（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR）を用いて定量する。RiboGreenTMによるRNA定量方法は、Jones, L. J.,ら, （Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374）に教示される。
【０１８４】
このアッセイにおいて、170μLのRiboGreenTM作動薬（l0mM Tris-HCl中で1:350に希釈されたRiboGreenTM試薬、1 mM EDTA, pH 7.5）を、30μLの精製した細胞RNAを含む96ウェルプレート中にピペッティングする。プレートを、CytoFluor 4000（PE Applied Biosystems）中で、485 nmでの励起および530 nmでの発光を用いて読み取る。
【０１８５】
ヒトSGLT2に対するプローブおよびプライマーは、公開された配列情報（本明細書中で配列番号：４として援用されるGENBANK受託番号NM_003041.1）を用いて、ヒトSGLT2配列にハイブリダイズするように設計した。ヒトSGLT2について、PCRプライマーは：
フォワードプライマー:TCGGCGTGCCCAGCT（配列番号：５）
リバースプライマー:AGAACAGCACAATGGCGAAGT（配列番号：６）
であり、PCRプローブは：
FAM-TCCTCTGCGGCGTGCACTACCTC-TAMRA（配列番号：７）
であった（FAMは蛍光色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である）。ヒトGAPDHについて、PCRプライマーは：
フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC（配列番号：８）
リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列番号：９）
であり、PCRプローブは：
5'JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA3'（配列番号：10）
（JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素）であった。
【０１８６】
マウスSGLT2に対するプローブおよびプライマーは、公開された配列情報（本明細書中で配列番号：11として援用されるGENBANK受託番号による連鎖の配列：AJ292928、AW106808、AI789450、AW046901、AI647605の相補物、AW107250の相補物、およびAI788744の相補物）を用いて、マウスSGLT2配列にハイブリダイズするように設計された。マウスSGLT2について、PCRプライマーは：
フォワードプライマー:TGTTGGACCCTCACAAAGAGTAAG（配列番号：12）
リバースプライマー:GCTGTATTCTTGCCCTGTTCCT（配列番号：13）
であり、PCRプローブは:
FAM-TTCTGGGATCCACTCCAAGCTGCTCA-TAMRA（配列番号：14）
であった（FAMは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である）。マウスGAPDHについて、PCR プライマーは:
フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT（配列番号：15）
リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT（配列番号：16）
であり、PCRプローブは：
5'JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA3'（配列番号：17）
（JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素）であった。
【実施例１４】
【０１８７】
SGLT2 mRNAレベルのノーザンブロット分析
アンチセンス処理の18時間後、細胞単層を冷PBSで2回洗浄し、1 mLのRNAZOLTM（TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX）中で溶解した。全RNAを、製造業者が推奨するプロトコールに従って調製した。20μgの全RNAを、MOPS緩衝液システム（AMRESCO, Inc. Solon, OH）を用いて、1.1％のホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲルを通して電気泳動することにより分画した。RNAを、Northern／Southern Transfer buffer system（TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX）を用いる一晩の毛細管移動により、ゲルからHYBONDTM-N＋ナイロン膜（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）に移した。RNAの移動は、UV可視化により確認した。STRATALINKERTM UV Crosslinker 2400（Stratagene, Inc, La Jolla, CA）を用いるUV架橋により膜を固定化し、次いで、QUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液（Stratagene, La Jolla, CA）を用い、ストリンジェントな条件についての製造業者の推奨を用いてプローブした。
【０１８８】
ヒトSGLT2を検出するため、フォワードプライマーTCGGCGTGCCCAGCT（配列番号：５）およびリバースプライマーAGAACAGCACAATGGCGAAGT（配列番号：６）を用いるPCRにより、ヒトSGLT2特異的プローブを調製した。負荷および移動効率の変動について標準化するため、膜をストリッピングし、ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（Clontech, Palo Alto, CA）についてプローブした。
【０１８９】
マウスSGLT2を検出するため、フォワードプライマーTGTTGGACCCTCACAAAGAGTAAG（配列番号：12）およびリバースプライマーGCTGTATTCTTGCCCTGTTCCT（配列番号：13）を用いるPCRにより、マウスSGLT2特異的プローブを調製した。負荷および移動効率の変動について標準化するため、膜をストリッピングし、マウスグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（Clontech, Palo Alto, CA）についてプローブした。
【０１９０】
ハイブリダイズした膜を、PHOSPHORIMAGERTMおよびIMAGEQUANTTMソフトウェアV3.3（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用いて視覚化し、定量した。データを、未処理対照のGAPDHレベルに対して標準化した。
【実施例１５】
【０１９１】
2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトSGLT2発現のアンチセンス阻害
本発明に従い、一連のアンチセンス化合物を、公開された配列（本明細書中で配列番号：４として援用されるGenBank受託番号NM_003041.1）を用いて、ヒトSGLT2 RNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物を表1に示す。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の第1の（5'最末端）ヌクレオチド番号を示す。表1中の全ての化合物は、両側（5'および3'方向）に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。化合物をヒトSGLT2 mRNAレベルに与える影響について、本明細書中の他の実施例に記載した定量リアルタイムPCRにより分析した。HK-2細胞を、15 μg/mLのLIPOFECTINと混合した500 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。データは、HK-2細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した3回の実験の平均である。「N.D.」は、存在する場合、「データがない」ことを示す。
【０１９２】
【表１】
2010136725.tif 000007
2010136725.tif 000008
2010136725.tif 000009
【０１９３】
表1に示すように、配列番号：19、20、21、22、23、26、27、28、29、32、33、34、35、37、38、39、40、41、43、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、66、67、68、69、70、73、74、77、79、80、82、85、88、90、91、92、93、94および95は、本アッセイにおいてヒトSGLT2発現の少なくとも30％阻害を示した。これらの配列が相補的である標的領域は、本明細書中で「好適な標的セグメント」と呼ばれ、それ故に本発明の化合物による標的化に好適である。これらの標的セグメントを表3に示す。これらの配列は、チミン（T）を含むことが示されているが、当業者は、RNA配列においてチミン（T）は一般的にウラシル（U）で置換されることを理解するであろう。配列は、表1に示す好適なアンチセンス化合物の逆の相補体を示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の第1の（5'最末端）ヌクレオチド番号を示す。好適な標的セグメントのそれぞれが見出された種もまた、表3に示す。
【実施例１６】
【０１９４】
2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスSGLT2発現のアンチセンス阻害
本発明に従い、第二の一連のアンチセンス化合物を、公開された配列(本明細書中で配列番号：11として援用されるGenBank受託番号：AJ292928、AW106808、AI789450、AW046901、AI647605の相補体、AW107250の相補体、およびAI788744の相補体；本明細書中で配列番号：96として援用されるGenBank受託番号AJ292928.1；ならびに本明細書中で配列番号：97として援用されるGenBank受託番号AW045170.1の一連の配列)を用いて、マウスSGLT2 RNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物を、表2に示す。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的核酸上の第1の（5'最末端）ヌクレオチド番号を示す。表2中の全ての化合物は、両側（5'および3'方向）に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。化合物をマウスSGLT2 mRNAレベルに及ぼす影響について、本明細書中の他の実施例に記載した定量リアルタイムPCRにより分析した。データは、b.END細胞を100 nMの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した3回の実験の平均である。各データポイントの陽性対照は表中にて配列番号により特定している。「N.D.」は、存在する場合は、「データがない」ことを示す。
【０１９５】
【表２】
2010136725.tif 000010
2010136725.tif 000011
【０１９６】
表2に示すように、配列番号99、105、107、109、110、117、121、124、125、126、130、131、132、136、138、139、142、147、148、150、153、155、162、173および175は、本実験においてマウスSGLT2発現の少なくとも20％阻害を示した。好適であるのはまた配列番号105、119および135である。これらの配列が相補的である標的領域は、本明細書中で「好適な標的セグメント」と呼ばれ、それ故に本発明の化合物による標的化に好適である。これらの標的セグメントを表3に示す。これらの配列は、チミン（T）を含むことが示されているが、当業者は、RNA配列においてチミン（T）は一般的にウラシル（U）で置換されることを理解するであろう。配列は、表1および2に示す好ましいアンチセンス化合物の逆の相補体を示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の第1の（5'最末端）ヌクレオチド番号を示す。表3に示したのはまた好適な標的セグメントのそれぞれが見出された種である。
【０１９７】
【表３】
2010136725.tif 000012
2010136725.tif 000013
【０１９８】
これらの「好適な標的セグメント」は、実験により、本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションに対して開放しており、かつ接近可能なことが見出されたので、当業者は、これらの好適な標的セグメントに特異的にハイブリダイズし、かつ結果としてSGLT2発現を阻害する他の化合物を包含する本発明のさらなる態様を、常套的な実験だけを用いて、理解するかまたは確認することができるであろう。
【０１９９】
本発明によれば、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（EGS）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー（alternate splicers）、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他の短いオリゴマー化合物を含む。
【実施例１７】
【０２００】
SGLT2タンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析（免疫ブロット分析）は、標準的な方法を用いて行う。細胞を、オリゴヌクレオチド処理の16〜20時間後に採取し、PBSで1回洗浄し、Laemmli緩衝液（100μl／ウェル）中に懸濁し、5分間煮沸し、16％SDS-PAGEゲル上に装填する。ゲルを、1.5時間、150Vで作動させ、ウエスタンブロッティング用の膜に移す。SGLT2に指向した適切な一次抗体を、一次抗体種に対して指向した、放射標識または蛍光標識した二次抗体と共に用いる。バンドをPHOSPHORIMAGERTM（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）を用いて可視化する。
【実施例１８】
【０２０１】
SGLT2を標的とする化学的に修飾されたアンチセンス化合物の設計
ISIS 145733（配列番号：106）、ISIS 145742（配列番号：265）またはISIS 145746（配列番号：266）の配列を用いて、一連の化学的に修飾されたアンチセンス化合物を設計した。オリゴヌクレオチドが、完全なホスホロチオエート主鎖、またはホスホロチオエートとホスホジエステルとの混合主鎖（混合主鎖化合物）のいずれかからなるように、ヌクレオシド間結合を修飾した。修飾したアンチセンス化合物はまた、2’-メトキシエチル（2’-MOE）または2’-O-ジメチルアミノエトキシエチル（2’-DMAEOE）を含む、2’位置での糖部分置換を含んだ。さらなる修飾は核酸塩基置換を含み、ここで非修飾シトシン核酸塩基をアンチセンス化合物のある位置にある修飾した5-メチルシトシンの代わりに用いた。化合物を表4に示す。
【０２０２】
ISIS 145733（配列番号：106）、ISIS 145742（配列番号：265）、およびISIS 145746（配列番号：266）はオリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート結合を有し、2’-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラオリゴヌクレオチドである。ISIS 257016（配列番号：106）、ISIS 341699（配列番号：265）、およびISIS 351642（配列番号：266）は、ウイングにホスホジエステル結合、およびギャップにホスホロチオエート結合を有する2’-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラオリゴヌクレオチドである。ISIS 351641（配列番号：106）、ISIS 360886（配列番号：106）、およびISIS 360887（配列番号：106）は、5’最末端（ISIS 360886)、3’最末端（ISIS 360887)、または5’および3’最末端の双方（ISIS 351641）のいずれかにおけるウイングの一つのホスホロチオエート結合を除き、ギャップにホスホロチオエート結合、およびウイングにホスホジエステル結合を有する2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラオリゴヌクレオチドである。
【０２０３】
ISIS 323294（配列番号：106）は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート結合を有し、1、2、3、4、17および19の位置で2'-MOEヌクレオチド、5、16、18および20の位置で2'-DMAEOEヌクレオチド、ならびに6〜15の位置で2'-デオキシヌクレオチドからなる。ISIS 323295（配列番号：106）は、1、2、3、4、17および19の位置で、2'-MOEヌクレオチド、5、16、18および20の位置で、2'-DMAEOEヌクレオチド、ならびに6〜15の位置で2'-デオキシヌクレオチドからなり、ここで最初と最後の4ヌクレオシド間結合はホスホジエステルであり、中央のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである。
【０２０４】
ISIS 251017および257018の3'最末端位置のヌクレオチドは、（表4にアステリスクにより示される）シトシン残基である。上掲のオリゴヌクレオチドのすべての他のシトシン残基は5-メチルシトシンである。化合物を表4に示す。ホスホジエステル（P=O）ヌクレオシド間結合は、ヌクレオチド位置間の「o」によって示す。ホスホロチオエート（P=S）ヌクレオシド間結合は、ヌクレオチド位置間の「s」によって示す。2'-MOEヌクレオチドは下線を引き、2'-DMAEOEヌクレオチドは太字体にしている。表4のすべての化合物はネズミSGLT2のコード領域（本明細書中に配列番号：11として与えられる）を標的とする。
【０２０５】
【表４】
2010136725.tif 000014
【実施例１９】
【０２０６】
マウスにおけるSGLT2のアンチセンス阻害の影響：種々の化学的性質の比較
本発明に従って、実施例18に記載したSGLT2アンチセンス化合物をそのインビボの活性について、研究した。ISIS 29837(TCGATCTCCTTTTATGCCCG, 配列番号：256)は対照化合物となり、両側（5'および3'方向）に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
【０２０７】
雄の生後6週間のBalb/cマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、25 mg/kgの用量で、週に2回、2週間、ISIS 145733、ISIS 257016、ISIS 323294、ISIS 323295またはISIS 29837の腹腔内注射をした。生理食塩水を注射した動物をまた、対照とした。各処置群は4匹の動物を含んだ。マウスは、4度目、かつ最終の用量のオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の投与の2日後に屠殺した。
【０２０８】
マウスを腎臓におけるSGLT2レベルについて評価した。標的レベルを本明細書中で他の実施例により記載した定量リアルタイムPCRにより測定した。PCRの結果は、至る所で発現されるマウスシクロフィリンA遺伝子に対して標準化した。
【０２０９】
マウスSGLT2に対するプローブおよびプライマーは、公開された配列情報（本明細書中に配列番号：11として援用される）を用いて、マウスSGLT2配列にハイブリダイズするように設計した。マウスSGLT2に対するPCRプライマーは、
順方向プライマー：CTCGTCTCATACCCGAGTTCTTCT（配列番号：257）
逆方向プライマー：AATGATGGCGAAATAGAGGTAGTGTAC（配列番号：258）
であり、PCRプローブは、
FAM-TGCGACCCTCAGCGTGCCC-TAMRA（配列番号：259）
であった。ここで、FAMは蛍光色素であり、TAMRAは消光色素である。マウスシクロフィリンAに対するPCRプライマーは、
順方向プライマー：TCGCCGCTTGCTGCA（配列番号：260）
逆方向プライマー：ATCGGCCGTGATGTCGA（配列番号：261）
であり、PCRプローブは、
5'JOE-CCATGGTCAACCCCACCGTGTTC-3'（配列番号：262）
であった。ここで、JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAは消光色素である。
【０２１０】
データは生理食塩水処理した動物に対する変化百分率（「-」は減少を示す）として表し、表5に示す。
【０２１１】
【表５】
2010136725.tif 000015
【０２１２】
かかるデータは、種々の化学的性質のアンチセンス化合物がマウス腎臓におけるSGLT2 mRNAの発現を阻害することを示す。
【０２１３】
マウスはさらに総体重、肝臓重量および脾臓重量について評価した。脾臓重量、肝臓重量、または体重における有意な変化は、特定の化合物が毒性効果を生じることを示し得る。データは生理食塩水対照に対する変化百分率（「+」は増大を示し、「-」は減少を示す）として表す。結果を表6に示す。
【０２１４】
【表６】
2010136725.tif 000016
【０２１５】
すべての変化は実験誤差の幅の中に入った。体重における有意な変化は、処置の間、または研究終了時に観察されなかった。肝臓または脾臓重量における有意な変化は観察されなかった。
【０２１６】
インビボで投与された化合物の毒性の効果もまた、肝臓または腎臓の疾患または損傷と関連する酵素およびタンパク質のレベルを測定することにより評価され得る。血清トランスアミナーゼアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のレベルの増加は、しばしば肝臓の疾患または損傷の指標である。血清総ビリルビンは、肝臓および胆管機能の指標であり、アルブミンおよび血中尿素窒素(BUN)は腎臓機能の指標である。グルコースおよびトリグリセリドレベルは処置の毒性により変わることがある。血清グルコースはまた、いくぶんかはSGLT2の活性による。
【０２１７】
本発明に従い、ALT、AST、総ビリルビン、アルブミン、BUN、グルコースおよびトリグリセリドのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスで測定した。血清は、LabCorp Testing Facility (San Diego, CA)にて分析した。結果を測定した単位量として表し、表7に示す。
【０２１８】
【表７】
2010136725.tif 000017
【０２１９】
* Balb/c系統のマウスにおいて、トリグリセリドおよびグルコースレベルは他の系統のマウスに比べて普通は高い。
【０２２０】
肝臓および腎臓の損傷および疾患の普通の臨床的指標のレベルは通常の範囲内であり、生理食塩水処理した動物に対して有意に変化しておらず、本発明の化合物は、腎臓または肝臓機能に有意に影響を及ぼさないことを示している。トリグリセリドおよびグルコースレベルは、Balb/c系統においてよく見られることであるが、ほとんどのマウスについての正常な範囲の外にあるが、生理食塩水処理した動物に対して有意に上昇していない。
【０２２１】
ISIS 145733、257016、323294および323295を注射したマウスはまた、常套的手順に従って、組織学的に評価した。肝臓、脾臓、腎臓、腸、膵臓、肺、皮膚、心臓および筋肉の試料を得、10％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色の処理をし、核および細胞質を可視化するか、または抗オリゴヌクレオチドIgG1抗体2E1-B5 (Berkeley Antibody Company, Berkeley, CA)で処理し、オリゴヌクレオチド染色パターンを評価した。大部分の組織でのヘマトキシリンおよびエオシン染色は、生理食塩水処理とオリゴヌクレオチド処理の動物との間で有意な差を示さなかった。323294および323295で処理した動物の心臓切片は、生理食塩水処理したマウスの心臓に比べ、高い炎症量を示した。2E1-B5抗体は、同一特異性の抗IgG2ホースラディシュペルオキシダーゼ結合二次抗体(Zymed, San Francisco, CA)を用いて識別し、3,3'-ジアミノベンジジン（3,3'-diaminobenzidene）(DAKO, Carpenteria, CA)で免疫染色を展開した。2E1-B5染色は二連で行い、染色は腎近位尿細管において観察されたが、有意に肝臓を染色する化学的性質はないことを示した。
【０２２２】
かかる実験において示される結果は、種々の化学的性質のアンチセンス化合物が腎臓に送達され、インビボのSGLT2発現を減少させること、およびかかる化合物での処理は肝臓または腎臓の毒性をもたらさないことを示す。
【実施例２０】
【０２２３】
アンチセンス化合物がインビボでSGLT2 mRNA発現に及ぼす影響：混合主鎖と完全なホスホロチオエート主鎖とを比較する用量応答研究
ISIS 145733およびISIS 257016をマウスにおける用量応答研究のために選択した。雄の生後8週間のBalb/cマウス(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)に、6.25、12.5、25および50 mg/kgの用量で、週に2回、2週間、ISIS 145733、またはISIS 257016のいずれかの腹腔内注射をした。生理食塩水を注射した動物を対照とした。各群につき合計4匹の動物に注射した。マウスは、4度目、かつ最終の用量のオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の投与の2日後に屠殺した。
【０２２４】
マウスを腎臓におけるSGLT2レベルについて評価した。標的レベルを本明細書中で他の実施例により記載した定量リアルタイムPCRにより測定した。PCRの結果は、実施例１９に記載したシクロフィリンに対して標準化した。データは生理食塩水処理した動物に対する変化百分率（「+」は増大を示し、「-」は減少を示す）として表し、表8に示す。
【０２２５】
【表８】
2010136725.tif 000018
【０２２６】
かかる結果は、本発明の化合物、すなわち完全なホスホロチオエート主鎖と混合主鎖のオリゴヌクレオチドの双方が、インビボでSGLT2の発現を用量に依存して阻害することを示す。
【０２２７】
SGLT2発現のレベルはまた、プールした、および個々のRNA試料の双方のノーザンブロット分析により評価し、リアルタイムPCRにより観察される標的減少を検証した。全RNAは、製造業者が推奨するプロトコールに従って、屠殺したマウスから得た組織から、ホモジナイゼーションにより、2-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を含有するGITC緩衝液(Invitrogen, Carlsbad, CA)中で調製し、次いでCsClの緩衝を介した超遠心分離を行った。20μgの全RNAを、MOPS緩衝液システム（AMRESCO, Inc. Solon, OH）を用いて、1.1％のホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲルを通して電気泳動することにより分画した。RNAを、一晩の毛細管移動により、ゲルからHYBONDTM-N＋ナイロン膜（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）に移した。RNAの移動は、UV可視化により確認した。STRATALINKERTM UV Crosslinker 2400 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA)を用いるUV架橋により膜を固定化し、次いで、RapidHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を用い、ストリンジェントな条件についての製造業者の推奨を用いてプローブした。
【０２２８】
マウスSGLT2を検出するため、フォワードプライマー5'-ATGGAGCAACACGTAGAGGCAGGCT-3'(配列番号: 263)およびリバースプライマー5'-GAGTGCCGCCAGCCCTCCTGTCACA-3'(配列番号: 264)ならびに精製したゲルを用いるPCRにより、マウスSGLT2特異的鋳型を調製した。精製した鋳型、およびプローブを標識する32P CTPを導入したリバースプライマーを用いて、非対称PCRにより、プローブを調製した。ハイブリダイゼーションの後、ブロットをphosphorimager screen (Molecular Dynamics, Amersham)に一晩暴露し、定量した。負荷および移動効率の変動について標準化するため、膜をストリッピングし、マウスグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（Clontech, Palo Alto, CA）についてプローブした。
【０２２９】
プールした試料の分析のために、同じ処置でマウス腎臓から単離した等量のRNAを合わせて総計20 μgとし、プールした試料をノーザンブロット分析に供した。プールした試料の分析の結果を表9に示し、生理食塩水対照に対して標準化する（「+」は増大を示し、「-」は減少を示す）。
【０２３０】
【表９】
2010136725.tif 000019
2010136725.tif 000020
【０２３１】
かかる結果は、プールした試料のノーザンブロット分析によって測定した場合、ISIS 257016は、全用量のアンチセンス化合物において、用量に依存して、SGLT2の発現を阻害し、SGLT2の発現を阻害するが、（where as）ISIS 145733はSGLT2の発現を2つの高用量のアンチセンス化合物において、阻害することを示す。
【０２３２】
個々のマウスの腎臓RNA試料の標的レベルもまた、ノーザンブロット分析によって測定した。等量のRNAをそれぞれノーザンブロット分析に供し、SLGT2のレベルを測定した。次いで各処置群の標的レベルの測定値を平均した。結果を表10に示し、生理食塩水対照に対して標準化する（「-」は減少を示す）。
【０２３３】
【表１０】
2010136725.tif 000021
【０２３４】
処置したマウスは、全体重、肝臓重量、および脾臓重量に関する処置期間の終了時にさらに評価した。データは生理食塩水対照に対する変化百分率（「+」は増大を示し、「-」は減少を示す）として表す。結果を表11に示す。
【０２３５】
【表１１】
2010136725.tif 000022
【０２３６】
かかるデータは4つの異なる用量で、ISIS 145733またはISIS 257016での処置の後、全体重、肝臓重量、または脾臓重量において、有意な変化が観察されないことを示す。処置の期間中または研究終了時に、全体重の変化は観察されなかった。
【０２３７】
実施例19に記載した毒性の指標に加え、クレアチニンレベルをまた用い、腎臓機能を評価する。本発明に従い、ALT、AST、全ビリルビン、クレアチニン、BUN、グルコースおよびトリグリセリドのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスにおいて測定した。血清は、LabCorp Testing Facility (San Diego, CA)にて分析した。結果を測定単位量として表し、表12に示す。
【０２３８】
【表１２】
2010136725.tif 000023
【０２３９】
* Balb/c系統のマウスにおいて、トリグリセリドおよびグルコースレベルは他の系統のマウスに比べて普通は高い。
【０２４０】
生理食塩水処理したマウスのALTレベルと同様に、25 mg/kgのISIS 145733で処理した動物のASTレベルは、正常な範囲よりわずかに低い。他の点では、肝臓および腎臓の損傷および疾患の普通の臨床的指標のレベルは通常の範囲内であり、生理食塩水処理した動物に対して有意に変化しておらず、本発明の化合物は、腎臓または肝臓機能に有意に影響を及ぼさないことを示している。トリグリセリドおよびグルコースのレベルは、Balb/c系統においてよく見られることで、正常な範囲の外にあるが、生理食塩水処理した動物に対して有意に上昇していない。
【０２４１】
ISIS 145733および257016を6.25〜50 mg/kgの用量で注射したマウスはまた、常套的手順に従って、組織学的に評価した。肝臓および腎臓の試料を得、10％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色の処理をし、核および細胞質を可視化するか、または抗オリゴヌクレオチドIgG1抗体2E1-B5 (Berkeley Antibody Company, Berkeley, CA)で処理し、オリゴヌクレオチド染色パターンを評価した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、生理食塩水処理とオリゴヌクレオチド処理の動物との間で有意な差を示さなかった。2E1-B5抗体は、同一特異性の抗IgG2ホースラディシュペルオキシダーゼ結合二次抗体(Zymed, San Francisco, CA)を用いて識別し、3,3'-ジアミノベンジジン（3,3'-diaminobenzidene）(DAKO, Carpenteria, CA)で免疫染色を展開した。2E1染色は肝臓において検出され得るオリゴヌクレオチドを示さなかったが、染色は腎近位尿細管において観察された。染色強度はオリゴヌクレオチドの用量の減少に伴い、減少した。
【０２４２】
かかる実施例において示される結果は、種々の化学的性質のアンチセンス化合物が腎臓に送達され、インビボのSGLT2発現を用量に依存して減少させ、かかる化合物での処理は肝臓または腎臓の毒性をもたらさないことを示す。
【実施例２１】
【０２４３】
アンチセンス化合物がインビボでSGLT2 mRNA発現に及ぼす影響：混合主鎖と完全なホスホロチオエート主鎖とを比較するさらなる用量応答研究
実施例20において用いた用量に関して、2つの同一の用量および2つの低い用量を用いて、ISIS 145733およびISIS 257016をマウスにおける用量応答研究のために選択した。
【０２４４】
雄の生後8週間のBalb/cマウス(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)に、1、5、25または50 mg/kgの用量で、週に2回、2週間、ISIS 145733、またはISIS 257016の腹腔内注射をした。生理食塩水を注射した動物を対照とした。また、特異性対照として、同じ用量のSGLT2アンチセンスオリゴマー化合物は、腎臓細胞においてSGLT1 mRNAの発現を有意に阻害しない。各処置群は4匹のマウスを含んだ。マウスは、4度目、かつ最終の用量のオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の投与の2日後に屠殺した。
【０２４５】
マウスを腎臓および肝臓におけるSGLT2レベルについて評価した。標的レベルを本明細書中で他の実施例により記載した定量リアルタイムPCRにより測定した。PCRの結果は、シクロフィリンに対して標準化した。データは生理食塩水処理した動物に対する変化百分率として表し（「+」は増大を示し、「-」は減少を示す）、表13に示す。
【０２４６】
【表１３】
2010136725.tif 000024
【０２４７】
かかる結果は、本発明の化合物、すなわち完全なホスホロチオエート主鎖と混合主鎖のオリゴヌクレオチドの双方が、腎臓SGLT2の発現を用量に依存して阻害し得ることを示す。より大きな阻害が混合主鎖アンチセンス化合物であるISIS 257016で処理したマウスの腎臓において観察される。SGLT2は肝臓において高度に発現されておらず、そのため標的レベルが処置前に低く、そのため正確に測定することはより困難である。ISIS 145733およびISIS 257016はまた、肝臓SGLT2の発現を低下させたが、145733は混合主鎖のISIS 257016より肝臓においてより大きな効果を有していた。
【０２４８】
処置したマウスはさらに肝臓重量および脾臓重量について評価した。データは生理食塩水対照に対する変化百分率（「+」は増大を示し、「-」は減少を示す）として表す。結果を表14に示す。
【０２４９】
【表１４】
2010136725.tif 000025
【０２５０】
研究の全体にわたる時点または終了時において、全体重の有意な変化は観察されなかった。25 mg/kgのISIS 145733および50 mg/kgの257016による処置はそれぞれ、肝臓重量における減少および増加をもたらしたが、かかる変化はデータの誤差の幅の中に入り、そのため有意ではない。
【０２５１】
本明細書中に記載される他の血清の指標に加え、コレステロールレベルは毒性の尺度として用いられ得る。本発明に従い、本発明の化合物で処理したマウスにおける、ALT、AST、全ビリルビン、アルブミン、クレアチニン、BUN、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを測定した。血漿試料は、Olympus AU400e自動化学分析計(Olympus America, Irving, TX)を用いて分析した。結果は測定単位量として表し、ISIS 145733については表15に、ISIS 257016については表16に示す。
【０２５２】
【表１５】
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【０２５３】
【表１６】
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2010136725.tif 000028
【０２５４】
* Balb/c系統のマウスにおいて、トリグリセリドおよびグルコースレベルは他の系統のマウスに比べて普通は高い。
【０２５５】
肝臓および腎臓の損傷および疾患の普通の臨床的指標のレベルは通常の範囲内であり、生理食塩水処理した動物に対して有意に変化しておらず、本発明の化合物は、腎臓または肝臓の機能に有意に影響を及ぼさないことを示している。トリグリセリドおよびグルコースレベルは、トリグリセリドおよびグルコースのレベルは、Balb/c系統においてよく見られることで、正常な範囲の外にあるが、生理食塩水処理した動物に対して有意に上昇していない。
【０２５６】
ISIS 145733および257016を1〜50 mg/kgで注射したマウスはまた、常套的手順に従って、組織学的に評価した。肝臓および腎臓の試料を得、10％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色の処理をし、核および細胞質を可視化するか、または抗オリゴヌクレオチドIgG1抗体2E1-B5 (Berkeley Antibody Company, Berkeley, CA)で処理し、オリゴヌクレオチド染色パターンを評価した。ほとんどの組織におけるヘマトキシリンおよびエオシン染色は、肝臓組織におけるわずかな炎症細胞の浸入を除くと、生理食塩水処理と145733処理の動物との間で有意な差を示さなかった。ISIS 257016で処理したマウスの肝臓は、50 mg/kgで核分解および有糸分裂、ならびに25 mg/kgでわずかな有糸分裂の証拠を示した。ISIS 257016による腎臓は生理食塩水処理した腎臓に比べ有意な差を示さなかった。2E1-B5抗体は、同一特異性の抗IgG2ホースラディシュペルオキシダーゼ結合二次抗体(Zymed, San Francisco, CA)を用いて識別し、3,3'-ジアミノベンジジン（3,3'-diaminobenzidene）(DAKO, Carpenteria, CA)で免疫染色を展開した。2E1抗体での染色は、ISIS 145733で処理した動物の肝臓および腎臓において弱い染色を示したが、ISIS 257016で処理した動物の肝臓および腎臓においては染色は強かった。腎臓の2E1染色は斑点状のパターンで現れる。
【実施例２２】
【０２５７】
混合主鎖と完全なホスホロチオエート主鎖とを比較する用量応答の研究：第二のSGLT2アンチセンス配列
第二の混合主鎖SGLT2オリゴヌクレオチドであるISIS 341699（配列番号：２６５）および対照ホスホロチオエートSGLT2オリゴヌクレオチドであるISIS 145742（配列番号：２６５）を、マウスにおける用量応答の研究のために選択した。比較のために、ISIS 257016（混合主鎖；配列番号：１０６）もまた、本研究に含んだ。
【０２５８】
8週齢の雄Balb/cマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、表１７に示される用量で週に2回、2週間、ISIS 341699、ISIS 145742またはISIS 257016を腹腔内注射した。生理食塩水を注射した動物を対照とした。各処理群は4匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の4回目かつ最後の用量の投与の2日後に、マウスを屠殺した。
【０２５９】
腎臓中のSGLT2レベルについてマウスを評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して正規化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表１７に示す。
【０２６０】
【表１７】
2010136725.tif 000029
【０２６１】
これらの結果から、本発明の化合物は、完全なホスホロチオエートおよび混合主鎖オリゴヌクレオチドの両方とも、用量依存的に腎臓SGLT2の発現を阻害し得ることが示される。しかしながら、処理マウス由来の腎臓におけるSGLT2発現の阻害は、より低い用量の混合主鎖化合物を要する。
【０２６２】
処理マウスを、さらに肝臓および脾臓重量について評価した。データを、体重または器官重量の変化率（％）として表す（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）。結果を、表１８および表１９に示す。
【０２６３】
【表１８】
2010136725.tif 000030
【０２６４】
【表１９】
2010136725.tif 000031
【０２６５】
研究を通じての、または終了の時点で、全体重、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０２６６】
本発明の化合物で処理したマウスにおいて、BUN、クレアチニン、AST、ALT、アルブミン、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを測定した。Olympus AU400e自動化学分析装置（Olympus America, Irving, TX）を用いて血漿試料を分析した。結果は測定された単位として表し、ISIS 145742については表２０、ISIS 341699については表２１、ISIS 257016については表２２に示す。
【０２６７】
【表２０】
2010136725.tif 000032
2010136725.tif 000033
【０２６８】
【表２１】
2010136725.tif 000034
【０２６９】
【表２２】
2010136725.tif 000035
2010136725.tif 000036
【０２７０】
*トリグリセリドおよびグルコースレベルは、通常Balb/c系のマウスにおいて、他の系のマウスよりも高い。
【０２７１】
いくつかのオリゴヌクレオチド処理動物において、コレステロールレベルは正常な範囲よりも高い；しかしながら、この上昇は、生理食塩水で処理した動物もまた正常な範囲よりも高いコレステロールレベルを示したために、有意ではない。残りの肝臓および腎臓の損傷および疾患の通常の臨床指標のレベルは正常な範囲内であり、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物が腎臓または肝臓の機能に実質的に影響しないことが実証される。トリグリセリドおよびグルコースレベルは、Balb/c系でよく見られるように正常な範囲の外であるが、生理食塩水処理動物に関して有意に上昇していない。
【０２７２】
ISIS 145742、ISIS 341699およびISIS 257016を0.2〜50mg/kgで注射したマウスもまた、通常の手順に従って組織学的に評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、肝臓および腎臓試料を作製し、10％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリン−エオシンでの、または抗オリゴヌクレオチドIgG1抗体2E1-B5での染色のために処理した。肝臓および腎臓組織の両方のヘマトキシリン−エオシン染色は、生理食塩水処理動物とアンチセンスオリゴヌクレオチド処理動物との間で有意な差を示さなかった。2E1抗体での染色は、生理食塩水処理動物由来の肝臓の洞様毛細血管組織において高いバックグラウンドを示したので、オリゴヌクレオチド処理肝臓におけるポジティブ染色を解釈するのが困難になった。生理食塩水処理動物および0.2 mg/kg ISIS 257016で処理した動物由来の腎臓試料は、陽性のオリゴヌクレオチド染色を示さなかった；しかしながら、残りのオリゴヌクレオチド処理動物は、近位の細管（proximal tubule）において高レベルの染色を示し、これは用量に応じて増大した。
【０２７３】
本実施例に示された結果から、種々の化学的性質のアンチセンス化合物が腎臓に送達されて、用量依存的にインビボのSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物での処理は肝臓または腎臓の毒性をもたらさないことが実証される。結果から、混合主鎖化合物ISIS 341699およびISIS 257016は、腎臓における標的mRNAレベルの減少に特に効果的であることがさらに実証される。
【実施例２３】
【０２７４】
混合主鎖と完全なホスホロチオエート主鎖とを比較した用量応答の研究：第三のSGLT2アンチセンス配列
第三の混合主鎖SGLT2オリゴヌクレオチドであるISIS 351642（配列番号：２６６）、および対照ホスホロチオエートSGLT2オリゴヌクレオチドであるISIS 145746（配列番号：２６６）を、マウスにおける用量応答の研究のために選択した。
【０２７５】
7週齢の雄Balb/cマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、表２３に示す用量で、週に2回、2週間、ISIS 145746またはISIS 351642を腹腔内注射した。生理食塩水処理動物を対照とした。各処理群は4匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の4回目かつ最後の用量の投与の2日後に、マウスを屠殺した。
【０２７６】
マウスを、腎臓におけるSGLT2レベルについて評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して正規化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表２３に示す。
【０２７７】
【表２３】
2010136725.tif 000037
【０２７８】
これらの結果から、本発明の化合物は、完全なホスホロチオエートおよび混合主鎖オリゴヌクレオチドの両方とも、腎臓SGLT2の発現を用量依存的に阻害し得ることが実証される。5および25 mg/kgの用量で、ISIS 351462で処理したマウス由来の腎臓に、より大きい阻害が見られ、混合主鎖アンチセンス化合物が、腎臓における標的mRNA発現のより効率的な阻害剤であると示唆される。
【０２７９】
処理マウスを、さらに体重、肝臓重量および脾臓重量について評価した。データを、体重または器官重量の変化率（％）として表す（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）。結果を表２４に示す。
【０２８０】
【表２４】
2010136725.tif 000038
【０２８１】
研究を通じての、または終了の時点で、全体重、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０２８２】
本発明の化合物で処理したマウスにおいて、BUN、クレアチニン、AST、ALT、アルブミン、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを測定した。Olympus AU400e自動化学分析装置（Olympus America, Irving, TX）を用いて、血漿試料を分析した。結果は測定された単位として表し、ISIS 145746については表２５、ISIS 351642については表２６に示す。
【０２８３】
【表２５】
2010136725.tif 000039
2010136725.tif 000040
【０２８４】
【表２６】
2010136725.tif 000041
【０２８５】
*トリグリセリドおよびグルコースレベルは、通常Balb/c系のマウスにおいて、他の系のマウスよりも高い。
【０２８６】
肝臓および腎臓の損傷および疾患の通常の臨床指標のレベルは正常な範囲内であり、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物が腎臓および肝臓の機能に実質的に影響しないことが実証される。トリグリセリドおよびグルコースレベルは、Balb/c系でよく見られるように正常な範囲の外であるが、生理食塩水処理動物に関して有意に上昇していない。
【０２８７】
本実施例に示された結果から、種々の化学的性質のアンチセンス化合物が腎臓に送達されて、用量依存的にインビボのSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物での処理が肝臓または腎臓の毒性をもたらさないことが実証される。結果から、混合主鎖化合物ISIS 351642が、腎臓における、特に低用量での標的mRNAレベルの減少において、完全なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドよりも効果的であることをさらがさらに示唆される。
【実施例２４】
【０２８８】
標準的な混合主鎖化合物と5’および3’最末端にホスホロチオエート結合を有する混合主鎖化合物との比較：単一用量実験
本発明に従って、ISIS 257016（配列番号：１０６）およびISIS 351641（配列番号：１０６）を、インビボのSGLT2発現を阻害する能力について解析した。ISIS 257016は、2’-MOEウイングおよびデオキシギャップを有し、ウイングにホスホジエステル結合を有し、ギャップにホスホロチオエート結合を有する、標準的な混合主鎖化合物である。ISIS 351641は、ウイングの5’および3’最末端のそれぞれに１つのホスホロチオエート結合を有することで、標準的な混合主鎖化合物と異なる。
【０２８９】
8週齢の雄Balb/cマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、ISIS 257016またはISIS 351641を1、5、25または50 mg/kgの用量で単回腹腔内注射した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は4匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の単一用量の投与の2日後に、マウスを屠殺した。
【０２９０】
腎臓におけるSGLT2レベルについて、マウスを評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して正規化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表２７に示す。
【０２９１】
【表２７】
2010136725.tif 000042
【０２９２】
これらの結果から、本発明の混合主鎖化合物は、ウイングに完全なホスホジエステル結合を有するもの、または5’および3’最末端がホスホロチオエート結合に置換されたもののいずれも、用量依存的に腎臓SGLT2の発現を阻害することが示される。しかしながら、ウイング中に全てのホスホジエステル結合を含むISIS 257016で処理されたマウス由来の腎臓において、より大きい阻害が観察される。
【０２９３】
処理マウスを、さらに体重ならびに肝臓および脾臓重量について評価した。データを、体重または器官重量の変化率（％）として表す（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）。結果を表２８に示す。
【０２９４】
【表２８】
2010136725.tif 000043
【０２９５】
研究を通じての、または終了の時点で、全体重、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０２９６】
クレアチニン、AST、ALT、アルブミン、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスにおいて測定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置（Olympus America, Irving, TX）を用いて分析した。結果は測定された単位として表し、ISIS 257016については表２９、ISIS 351641については表３０に示す。
【０２９７】
【表２９】
2010136725.tif 000044
2010136725.tif 000045
【０２９８】
【表３０】
2010136725.tif 000046
【０２９９】
*トリグリセリドおよびグルコースレベルは、通常Balb/c系のマウスにおいて、他の系のマウスよりも高い。
【０３００】
肝臓および腎臓の損傷および疾患の通常の臨床指標のレベルは正常な範囲内であり、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物が腎臓および肝臓の機能に実質的に影響しないことが実証される。トリグリセリドおよびグルコースレベルは、Balb/c系においてよく見られるように正常な範囲の外であるが、生理食塩水処理動物に関して有意に上昇していない。
【０３０１】
本実施例に示された結果から、種々の化学的性質の混合主鎖化合物が腎臓に送達されてインビボのSGLT2発現を減少させること、ならびにこれらの化合物での処理によって腎臓または肝臓の毒性がもたらされないということが実証される。結果から、完全にホスホジエステル結合で構成されるウイングを有する混合主鎖化合物が、標的mRNAの、より効率的な阻害因子であることが、さらに示される。
【実施例２５】
【０３０２】
インビボのSGLT2 mRNA発現に対する修飾アンチセンス化合物の効果：二用量または三用量プロトコール
本発明に従って、混合主鎖化合物ISIS 257016（配列番号；１０６）を、二用量または三用量のいずれかで投与した場合に、インビボのSGLT2発現を阻害する能力について解析した。ISIS 353003（CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC；配列番号：２６７）、ヒトPTP1Bを標的とする混合主鎖オリゴヌクレオチドを対照として用いた。
【０３０３】
8週齢の雄Balb/cマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、ISIS 257016またはISIS 353003を、3日間隔で、2回または3回腹腔内注射した。ISIS 257016は、1、5または25 mg/kgの用量で投与し、ISIS 353003は25 mg/kgの用量で投与した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は4匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の最後の用量の投与の2日後に、マウスを屠殺した。
【０３０４】
マウスを、腎臓におけるSGLT2レベルについて評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して正規化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表３１に示す。
【０３０５】
【表３１】
2010136725.tif 000047
【０３０６】
これらの結果から、本発明の混合主鎖化合物は腎臓SGLT2の発現を、用量依存的に効率的に阻害することが示される。さらに、投与される用量の数と共に阻害は増大する。
【０３０７】
処理マウスを、さらに体重、腎臓重量、肝臓重量および脾臓重量について評価した。データを、体重または器官重量の変化率（％）として表す（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）。結果を、表３２および表３３に示す。
【０３０８】
【表３２】
2010136725.tif 000048
【０３０９】
【表３３】
2010136725.tif 000049
【０３１０】
研究を通じての、または終了の時点で、全体重、腎臓重量、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０３１１】
BUN、クレアチニン、ビリルビン、AST、ALT、アルブミン、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスにおいて測定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置（Olympus America, Irving, TX）を用いて分析した。結果は、測定された単位として表し、二用量プロトコールについては表３４、三用量プロトコールについては表３５に示す。
【０３１２】
【表３４】
2010136725.tif 000050
2010136725.tif 000051
【０３１３】
【表３５】
2010136725.tif 000052
【０３１４】
*トリグリセリドおよびグルコースレベルは、通常Balb/c系のマウスにおいて、他の系のマウスよりも高い。
【０３１５】
肝臓および腎臓の損傷および疾患の通常の臨床指標のレベルは正常な範囲内であり、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物が腎臓または肝臓の機能に実質的に影響しないことが実証される。トリグリセリドおよびグルコースレベルは、Balb/c系によく見られるように正常な範囲の外であるが、生理食塩水処理動物に関して有意に上昇していない。
【０３１６】
ISIS 257016を注射したマウスおよび対照動物もまた、通常の手順にしたがって組織学的に評価した。肝臓および腎臓試料を作製し、10％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリン−エオシンでの染色のために処理した。ヘマトキシリン−エオシン染色は、生理食塩水処理動物とオリゴヌクレオチド処理動物との間で有意な差を示さなかった。全ての組織試料は、正常な腎臓および肝臓形態を示した。
【０３１７】
本実施例に示された結果から、混合主鎖化合物は腎臓に送達されてインビボのSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物での処理によって肝臓および腎臓の毒性がもたらされないことが実証される。結果から、腎臓における標的mRNA発現の阻害が、投与される用量の数と共に増大することがさらに示される。
【実施例２６】
【０３１８】
インビボのSGLT2 mRNA発現に対する、混合主鎖アンチセンス化合物の効果：2〜5日の連続した日用量プロトコール
本発明に従って、混合主鎖化合物ISIS 257016（配列番号：１０６）を、2〜5用量（連続した日用量）で投与した場合にインビボのSGLT2発現を阻害する能力について解析した。ISIS 353003（配列番号：２６７）、ヒトPTP1Bを標的とする混合主鎖オリゴヌクレオチドを対照として用いた。
【０３１９】
9週齢の雄Balb/cマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、ISIS 257016またはISIS 353003を、処理期間の間1日1回、2、3、4または5回腹腔内注射した。ISIS 257016は、2.5または25 mg/kgの用量で投与し、ISIS 353003は25 mg/kgの用量で投与した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は4匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の最後の用量の投与の2日後にマウスを屠殺した。
【０３２０】
マウスを、腎臓におけるSGLT2レベルについて評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して正規化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表３６に示す。
【０３２１】
【表３６】
2010136725.tif 000053
【０３２２】
これらの結果から、本発明の混合主鎖化合物は、腎臓SGLT2の発現を効率的に阻害し、阻害が投与される用量の数と共に増大することが示される。
【０３２３】
処理マウスを、さらに体重、腎臓重量、肝臓重量および脾臓重量について評価する。データは、体重または器官重量の変化率（％）として表す（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）。結果を、表３７〜４０に示す。
【０３２４】
【表３７】
2010136725.tif 000054
【０３２５】
【表３８】
2010136725.tif 000055
【０３２６】
【表３９】
2010136725.tif 000056
【０３２７】
【表４０】
2010136725.tif 000057
【０３２８】
研究を通じての、または終了の時点で、全体重、腎臓重量、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０３２９】
クレアチニン、AST、ALT、アルブミン、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスにおいて測定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置（Olympus America, Irving, TX）を用いて分析した。結果は測定された単位として表し、表４１〜４４に示す。
【０３３０】
【表４１】
2010136725.tif 000058
2010136725.tif 000059
【０３３１】
【表４２】
2010136725.tif 000060
【０３３２】
【表４３】
2010136725.tif 000061
2010136725.tif 000062
【０３３３】
【表４４】
2010136725.tif 000063
【０３３４】
*トリグリセリドおよびグルコースレベルは、通常Balb/c系のマウスにおいて、他の系のマウスよりも高い。
【０３３５】
肝臓および腎臓の損傷および疾患の通常の臨床指標のレベルは正常な範囲内であり、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物が腎臓または肝臓の機能に実質的に影響しないことが示される。
【０３３６】
本実施例に示された結果から、混合主鎖化合物は腎臓に送達されて、インビボのSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物での処理によって肝臓または腎臓の毒性がもたらされないことが実証される。結果から、腎臓における標的mRNA発現の阻害が、投与される用量の数と共に増加することがさらに示される。
【実施例２７】
【０３３７】
標準的な混合主鎖化合物と、5’および3’最末端のいずれかまたは両方にホスホロチオエート結合を有する混合主鎖化合物との比較：四用量プロトコール
本発明に従って、ISIS 257016（配列番号：１０６）、ISIS 351641（配列番号：１０６）、ISIS 360886（配列番号：１０６）およびISIS 360887（配列番号：１０６）を、インビボのSGLT2発現を阻害する能力について解析した。ISIS 257016は2’-MOEウイングおよびデオキシギャップを有する標準的な混合主鎖化合物であり、ウイングにホスホジエステル結合、ギャップにホスホロチオエート結合を有する。ISIS 351641は、ウイングの5’および3’最末端のそれぞれに1つのホスホロチオエート結合を有することで、標準的な混合主鎖化合物と異なる。ISIS 360886およびISIS 360887は、それぞれ5’および3’最末端に1つのホスホロチオエート結合を有する混合主鎖化合物である。
【０３３８】
7週齢の雄Balb/cマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、ISIS 257016、ISIS 351641、ISIS 360886またはISIS 360887を、週に2回、2週間、1.56、6.25または25 mg/kgの用量で腹腔内注射した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は4匹のマウスを含んでいた。マウスを、オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の最後の用量の投与の2日後に屠殺した。
【０３３９】
マウスを、腎臓におけるSGLT2レベルについてさらに評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して正規化した。データは生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表４５に示す。
【０３４０】
【表４５】
2010136725.tif 000064
【０３４１】
これらの結果から、本発明の混合主鎖化合物はウイングに完全なホスホジエステル結合を有するものでも、または5’および3’最末端がホスホロチオエート結合に置換されたものであっても、腎臓SGLT2の発現を用量依存的に阻害し得る。ISIS 360887を除いて、標的mRNAの阻害は用量依存的であった。全ての混合主鎖化合物はSGLT2発現を阻害したが、ウイングに全てのホスホジエステル結合を含む混合主鎖化合物であるISIS 257016で処理したマウス由来の腎臓で、より大きな阻害が見られる。
【０３４２】
処理マウスを、さらに体重、腎臓重量、肝臓重量および脾臓重量について評価した。データを、体重または器官重量の変化率（％）として表す（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）。結果を表４６に示す。
【０３４３】
【表４６】
2010136725.tif 000065
【０３４４】
研究を通じての、または終了の時点で、全体重、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０３４５】
BUN、クレアチニン、ビリルビン、AST、ALT、アルブミン、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスにおいて測定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置（Olympus America, Irving, TX）を用いて分析した。結果は測定された単位として表し、表４７〜５０に示す。
【０３４６】
【表４７】
2010136725.tif 000066
2010136725.tif 000067
【０３４７】
【表４８】
2010136725.tif 000068
【０３４８】
【表４９】
2010136725.tif 000069
2010136725.tif 000070
【０３４９】
【表５０】
2010136725.tif 000071
【０３５０】
*トリグリセリドおよびグルコースレベルは、通常Balb/c系のマウスにおいて、他の系のマウスよりも高い。
【０３５１】
6.25または25 mg/kgいずれかで処理したマウスのコレステロールレベルは、わずかに上昇した；しかしながら、これらのレベルは生理食塩水処理対照動物において見られたコレステロールレベルよりも有意に大きくはない。他の点では、肝臓および腎臓の損傷および疾患の通常の臨床指標のレベルは正常な範囲内であり、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物が腎臓または肝臓の機能に実質的に影響しないことが実証される。トリグリセリドおよびグルコースレベルは、Balb/c系によく見られるように正常な範囲の外であるが、生理食塩水処理動物に関して有意に上昇していない。
【０３５２】
生理食塩水注射およびオリゴヌクレオチド注射動物もまた、通常の手順に従って組織学的に評価した。肝臓および腎臓試料を作製し、10％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリン−エオシンでの染色のために処理した。ヘマトキシリン−エオシン染色は、対照とオリゴヌクレオチド処理動物との間で有意な差を示さなかった。
【０３５３】
本実施例に示された結果から、混合主鎖化合物は腎臓に送達されて、インビボのSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物での処理は肝臓または腎臓の毒性をもたらさないことが実証される。結果から、ウイングに完全なホスホジエステル結合を有する混合主鎖化合物が、5’および3’最末端の一方または両方にホスホロチオエート結合を有する混合主鎖化合物よりも、腎臓における標的mRNA発現の、より効果的な調節因子であることがさらに示される。
【実施例２８】
【０３５４】
標準的な混合主鎖化合物と、5'および3'最末端のいずれかまたは両方にホスホロチオエート結合を有する混合主鎖化合物との比較：八用量プロトコル
SGLT2アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 257016、ISIS 351641、ISIS 360886およびISIS 360887の第２の研究を、４週間以上、八用量を受け取るマウスにおいて行った。前記のように、ISIS 257016は、２’-MOEウイングおよびデオキシギャップを有し、ウイングにホスホジエステル結合を有し、ギャップにホスホロチオエート結合を伴う、標準的な混合主鎖化合物である。ISI 351641は、ウイングの5'および3'最末端のそれぞれに１つのホスホロチオエート結合を有することで、標準的な混合主鎖化合物と異なる。
【０３５５】
８週齢の雄 Balb/c マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、ISIS 257016、ISIS 351641、ISIS 360886またはISIS 360887を、1、5、25mg/kgの用量で、４週間にわたり、１週間につき２回腹腔内注射した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は、４匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の最終用量の投与２日後に、マウスを犠牲にした。
【０３５６】
腎臓におけるSGLT2レベルについて、マウスを評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して標準化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表５１中に示す。
【０３５７】
【表５１】
2010136725.tif 000072
【０３５８】
これらの結果から、本発明の混合主鎖化合物は、ウイングに完全なホスホジエステル結合を有するもの、または5'および3'最末端がホスホロチオエート結合に置換されたもののいずれも、用量依存的様式で、腎臓SGLT2の発現を阻害し得ることが示される。しかしながら、ウイング中に全てのホスホジエステル結合を含む ISIS 257016で処理されたマウス由来の腎臓において、より大きい阻害が観察される。
【０３５９】
処理マウスを、さらに体重ならびに肝臓および脾臓重量について評価した。データを、体重または器官重量の変化率（％）として表す（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）。結果を表５２中に示す。
【０３６０】
【表５２】
2010136725.tif 000073
【０３６１】
研究を通じての、または終了時点で、全体重、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０３６２】
BUN、クレアチニン、ビリルビン、AST、ALT、アルブミン、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスにおいて測定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置(Olympus America, Irving, TX)を用いて分析した。結果は測定された単位として表し、表５３〜５６中に示す。
【０３６３】
【表５３】
2010136725.tif 000074
【０３６４】
【表５４】
2010136725.tif 000075
2010136725.tif 000076
【０３６５】
【表５５】
2010136725.tif 000077
【０３６６】
【表５６】
2010136725.tif 000078
2010136725.tif 000079
【０３６７】
＊トリグリセリドおよびグルコースレベルは、通常マウスBalb/c系統において、他のマウス系統よりも高い。
【０３６８】
肝臓および腎臓の損傷および疾患の通常の臨床指標は正常な範囲内であり、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物が腎臓および肝臓の機能に有意に影響しないことが実証される。トリグリセリドおよびグルコースレベルは、Balb/c系統で共通であるように正常な範囲の外であるが、生理食塩水処理動物に関して有意に上昇していない。
【０３６９】
本実施例に示された結果から、混合主鎖化合物が腎臓に送達されて、インビボのSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物での処理は、肝臓または腎臓の毒性をもたらさないことが実証される。更に、八用量プロトコルは、肝臓において、実施例２２中で示される四用量プロトコルに対して観察されたものより、標的mRNAレベルの、より大きい阻害を生じた。
【実施例２９】
【０３７０】
２型糖尿病モデルマウス中のSGLT2のアンチセンス阻害：完全なホスホロチオエートおよび混合主鎖オリゴヌクレオチドの比較
Animal Models of Diabetic Complications Consortium(AMDCC)は、多数のモデル動物における糖尿病の誘発のためのプロトコルを開発した。２型糖尿病と関連する糖尿病の腎障害の研究のための適切なモデルシステムとして、遺伝的C57BLKS/J Lepdb/ Lepdb モデルは、AMDCCによって認められた。
【０３７１】
レプチンは、脂肪により産生され、食欲を調節するホルモンである。ヒトおよび非ヒト動物の両方において、このホルモンが欠如すると、肥満を生じる。Lepdb/ Lepdb マウスは、レプチン受容遺伝子に変異を有し、それにより肥満および高血糖を生じる。従って、これらのマウスは、肥満および糖尿病の研究ならびにこれらの状態を処理するために設計された処置のための有用なモデルである。本発明に従って、本発明のオリゴマー化合物を、２型糖尿病のLepdb/ Lepdbモデルにおいてテストした。
【０３７２】
雄Lepdb/ Lepdb(db/db)マウスに、混合主鎖を有するISIS 257016（配列番号：106）、またはホスホロチオエート主鎖を有するISIS 145733(配列番号：106)を、12.5、25または37.5mg/kgの用量で、４週間の間、１週間につき２回腹腔内注射した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は、６匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の最終用量の投与２日後に、マウスを犠牲にした。
【０３７３】
腎臓におけるSGLT2レベルについて、マウスを評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して標準化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表５７に示す。
【０３７４】
【表５７】
2010136725.tif 000080
【０３７５】
これらの結果は、混合主鎖化合物(ISIS 257016)および完全なホスホロチオエート化合物ISIS 145733の両方が、効果的に腎臓 SGLT2発現を阻害することを示す。しかしながら、ウイング中に全てのホスホジエステル結合を含む ISIS 257016で処理されたマウス由来の腎臓において、特に12.5mg/kgの最も低い用量で、より大きい阻害が観察される。
【０３７６】
処理マウスを、さらに体重ならびに肝臓および脾臓重量について評価した。データを、体重としてグラムで表わす。結果を表５８中で示す。
【０３７７】
【表５８】
2010136725.tif 000081
2010136725.tif 000082
【０３７８】
研究を通じて、または終了時点で、全体重、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０３７９】
AST、ALT、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスにおいて測定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置(Olympus America, Irving, TX)を用いて分析した。結果は測定された単位として表し、表５９および表６０中に示す。
【０３８０】
【表５９】
2010136725.tif 000083
【０３８１】
【表６０】
2010136725.tif 000084
【０３８２】
＊トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースレベルは、通常マウスLepdb/ Lepdb系統において、他のマウス系統よりも高い。
【０３８３】
肝臓の損傷および疾患の通常の臨床指標は正常な範囲内であり、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物が肝臓の機能に有意に影響しないことが実証される。Lepdb/ Lepdbマウスの遺伝的欠損およびこれらのマウスによって示された糖尿病性の表現型が与えられ、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースレベルは、正常な範囲を超えるであろうことが予測される。重要なことに、SGLT2アンチセンス化合物のいずれかによる処理は、血液グルコースレベル中で、有意な減少を生じ、混合主鎖化合物であるISIS 257016により、標的mRNA2阻害のより大きいレベルに達した。ISIS 257016による処理はまた、血清トリグリセリドレベルにおいて、有意な減少を生じた。
【０３８４】
本実施例に示された結果から、混合主鎖化合物が腎臓に効果的に送達されて、インビボのSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物による処理は、肝臓または他の毒性をもたらさないことが実証される。更に、これらの結果は、SGLT2に標的にされた混合主鎖化合物は、２型糖尿病モデルマウスにおいて、血液グルコースレベルおよび血清トリグリセリドレベルを効果的に減少させることが示される。
【実施例３０】
【０３８５】
２型糖尿病のモデルマウスにおけるSGLT2のアンチセンス阻害：完全なホスホロチオエートおよび混合主鎖オリゴヌクレオチドの低用量の比較
ISIS 257016による処理は、12.5mg/kgの最低用量においてでさえ、SGLT2発現レベルにおいて有意な減少を生じたので、第２の用量応答研究を、1.56、3.12および6.25 mg/kgのより低い用量範囲を使用して行った。雄Lepdb/ Lepdbマウスに、混合主鎖化合物ISIS 257016または完全なホスホロチオエート化合物ISIS 145733のいずれかを、1.56、3.12、または6.25mg/kgの用量で、４週間の間、１週間につき２回腹腔内注射した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は、４匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の投与の最終用量の投与２日後に、マウスを犠牲にした。
【０３８６】
腎臓におけるSGLT2レベルについて、マウスを評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して標準化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表６１に示す。
【０３８７】
【表６１】
2010136725.tif 000085
【０３８８】
これらの結果は、混合主鎖化合物であるISIS 257016が、特に低用量のオリゴヌクレオチドで、腎臓中のSGLT2 mRNA発現の、より効果的な阻害剤であることを示す。
【０３８９】
グルコースのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスにおいて測定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置(Olympus America, Irving, TX)を用いて分析した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表６２中に示す。
【０３９０】
【表６２】
2010136725.tif 000086
【０３９１】
結果は、混合主鎖化合物ISIS 257016による処理が、血液グルコースレベルにおいて有意な減少を生じ、該混合主鎖化合物が、低下する血液グルコースレベルにおいて、完全なホスホロチオエートアンチセンス化合物よりも、より効果的であることを実証する。
【０３９２】
ISIS 257016によるSGLT2のアンチセンス阻害をさらに0.39、0.78、および1.56 mg/kgの用量範囲を使用して、評価した。上記のように、雄Lepdb/ Lepdbマウスに、混合主鎖化合物ISIS 257016を、４週間の間、１週間につき２回腹腔内注射した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は、４匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の最終用量の投与の２日後に、マウスを犠牲にした。
【０３９３】
腎臓におけるSGLT2レベルについて、マウスを評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して標準化した。血液グルコースレベルをまた決定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置(Olympus America, Irving, TX)を用いて分析した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表６３中に示す。
【０３９４】
【表６３】
2010136725.tif 000087
【０３９５】
これらの結果は更に、オリゴヌクレオチドを非常に低用量で投与する場合の、腎臓中のSGLT2発現阻害および血液グルコースレベルの低下における混合主鎖化合物の効果を実証する。
【０３９６】
本発明の化合物によって処理されたマウスはまた、肝臓および腎臓の毒性、器官重量および体重、ならびに組織の組織学(tissue histology)に対して評価された。これらの研究は、毒性の有意なレベル、または体重もしくは器官重量における変化を実証せず、混合主鎖化合物が、動物に対する毒性無しで、インビボで効果的であることを示した。
【０３９７】
本実施例で示された結果は、混合主鎖化合物を腎臓に効果的に送達し、インビボにおけるSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物による処理が、糖尿病の動物における血液グルコースレベルを低下させることを実証する。
【実施例３１】
【０３９８】
混合主鎖化合物を使用する、肥満および糖尿病のモデルマウスにおけるSGLT2のアンチセンス阻害
レプチンは、脂肪により産生され、食欲を調節するホルモンである。ヒトおよび非ヒト動物の両方において、このホルモンが欠如すると、肥満を生じる。C57B1/6J-Lep ob/obマウスは、レプチン遺伝子に変異を有し、それにより肥満および高血糖を生じる。従って、これらのマウスは、肥満および糖尿病の研究ならびにこれらの状態を処理するために設計された処理のための有用なモデルである。本発明に従って、本発明のオリゴマー化合物を、肥満および糖尿病のob/obモデルにおいてテストした。
【０３９９】
雄 C57B1/6J-Lep ob/obマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）に、ISIS 257016（配列番号：106）を、25mg/kgの用量で、４週間の間、１週間につき２回皮下注射した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は、４匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の最終用量の投与２日後に、マウスを犠牲にした。
【０４００】
腎臓におけるSGLT2レベルについて、マウスを評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して標準化した。血液グルコースレベルをまた、決定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置(Olympus America, Irving, TX)を用いて分析した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表６４中に示す。
【０４０１】
【表６４】
2010136725.tif 000088
【０４０２】
結果は、混合主鎖 SGLT2 アンチセンス化合物による処理が、糖尿病のマウスの腎臓中のSGLT2 mRNA 発現において、有意な減少を生じることを実証する。重要なことに、血液グルコースレベルはまた、処理された動物において、有意に減少する。
【実施例３２】
【０４０３】
１６〜２０核酸塩基長混合主鎖化合物の比較
本発明に従って、20核酸塩基未満の混合主鎖化合物を、腎臓中のSGLT2 発現を阻害する能力に対して評価した。４つの化合物を、ISIS 257016（配列番号：106）の配列に基づいて合成した。ISIS 366847、ISIS 366848、ISIS 366849、およびISIS 366850は、ISIS 257016の、5'-末端19、18、17および16核酸塩基それぞれからなる（表６５参照）。ISIS 257016は、各５核酸塩基の２’-MOEウイングおよび10核酸塩基のデオキシギャップを有する。ISIS 366847、ISIS 366848、ISIS 366849、およびISIS 366850は、5'末端に、10核酸塩基ギャップ、５核酸塩基2'-MOEウイングを有するが、１〜４核酸塩基の短くされた3'ウイングを含む。
【０４０４】
【表６５】
2010136725.tif 000089
【０４０５】
６週齢の雄 Balb/c マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、ISIS 257016、ISIS 366847、ISIS 366848、ISIS 366849またはISIS 366850を、キログラムあたり0.14、0.7または3.5マイクロモル(μM/kg)用量で、４週間の間、１週間につき２回腹腔内注射した。生理食塩水注射動物を対照とした。各処理群は、４匹のマウスを含んでいた。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の最終用量の投与２日後に、マウスを犠牲にした。
【０４０６】
腎臓におけるSGLT2レベルについて、マウスを評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して標準化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表６６中に示す。
【０４０７】
【表６６】
2010136725.tif 000090
【０４０８】
これらの結果は、16〜20核酸塩基を含む、本発明の混合主鎖化合物が、腎臓中のSGLT2 発現の効果的な阻害剤であることを示す。
【０４０９】
処理マウスを、さらに体重、腎臓重量、肝臓重量および脾臓重量について評価した。データを、体重または器官重量の変化率（％）として表す（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）。結果を表６７中に示す。
【０４１０】
【表６７】
2010136725.tif 000091
【０４１１】
研究を通じて、または終了時点で、全体重、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０４１２】
BUN、クレアチニン、ビリルビン、AST、ALT、アルブミン、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを、本発明の化合物で処理したマウスにおいて測定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置(Olympus America, Irving, TX)を用いて分析した。結果は測定された単位として表し、表６８〜７２中に示す。
【０４１３】
【表６８】
2010136725.tif 000092
2010136725.tif 000093
【０４１４】
【表６９】
2010136725.tif 000094
【０４１５】
【表７０】
2010136725.tif 000095
2010136725.tif 000096
【０４１６】
【表７１】
2010136725.tif 000097
【０４１７】
【表７２】
2010136725.tif 000098
2010136725.tif 000099
【０４１８】
＊トリグリセリドおよびグルコースレベルは、通常Balb/c系統のマウスにおいて、他の系統のマウスよりも高い。
【０４１９】
何匹かのオリゴヌクレオチド処理動物は、コレステロールの上昇したレベルを示した。しかしながら、食塩水対照動物はまた、正常の範囲のハイエンド(high end)においてのコレステロールレベルを実証した。かくして、わずかに上昇したコレステロールレベルが有意であることは、はっきりしない。一方、肝臓および腎臓の損傷および疾患の通常の臨床指標は正常な範囲内であり、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物が腎臓または肝臓の機能に有意に影響しないことが実証される。トリグリセリドおよびグルコースレベルは、Balb/c系統で共通であるように正常な範囲の外であるが、生理食塩水処理動物に関して有意に上昇していない。
【０４２０】
本実施例に示された結果から、16〜20の核酸塩基の混合主鎖化合物が腎臓に送達されて、インビボのSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物での処理は、肝臓または腎臓の毒性をもたらさないことが実証される。
【実施例３３】
【０４２１】
Sprague Dawley ラットにおけるSGLT 2のアンチセンス阻害
本発明に従って、７週齢のSprague Dawley ラット（Charles River Labs, Wilmington, MA から購入）を、SGLT2混合主鎖化合物ISIS 257016（配列番号：106）またはSGLT2完全ホスホロチオエート化合物ISIS 145733（配列番号：106）で処理した。ラットに、10mg/kgのオリゴヌクレオチドを、３週間の間、１週間につき２回腹腔内(i.p.)注射した。生理食塩水注射動物を対照とした。オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の最終用量の投与２日後に、ラットを犠牲にした。
【０４２２】
腎臓におけるSGLT2レベルについて、ラットを評価した。本明細書中の他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって標的レベルを決定した。PCRの結果をシクロフィリンに対して標準化した。データを、生理食塩水処理動物に関する変化率（％）として表し（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）、表７３中に示す。
【０４２３】
【表７３】
2010136725.tif 000100
【０４２４】
これらの結果は、完全なホスホロチオエートおよび混合主鎖化合物が、ラットの腎臓におけるSGLT2 発現を阻害することを示す。しかしながら、混合主鎖化合物は、SGLT2の、より効果的な阻害剤である。
【０４２５】
処理ラットを、さらに体重、腎臓重量、肝臓重量および脾臓重量について評価した。体重に対して、データを、体重の変化率（％）として表す（「+」は増加を示し、「-」は減少を示す）。器官重量に対して、結果を、体重に対して標準化される生理食塩水対照のパーセント（％）として表わす。結果を表７４および表７５中に示す。
【０４２６】
【表７４】
2010136725.tif 000101
【０４２７】
【表７５】
2010136725.tif 000102
【０４２８】
研究を通じて、または終了時点で、全体重、腎臓重量、肝臓重量または脾臓重量に有意な変化は見られなかった。
【０４２９】
BUN、クレアチニン、ビリルビン、AST、ALT、アルブミン、トリグリセリド、コレステロールおよびグルコースのレベルを、本発明の化合物で処理したラットにおいて測定した。血漿試料を、Olympus AU400e自動化学分析装置(Olympus America, Irving, TX)を用いて分析した。結果は測定された単位として表し、表７６中に示す。
【０４３０】
【表７６】
2010136725.tif 000103
【０４３１】
肝臓および腎臓の損傷の通常の臨床指標のレベルは、生理食塩水処理動物に関して有意に変化せず、本発明の化合物がラットの腎臓または肝臓の機能に有意に影響しないことが実証される。
【０４３２】
本実施例に示された結果から、完全なホスホロチオエートおよび混合主鎖化合物が腎臓に送達されて、インビボのSGLT2発現を減少させること、およびこれらの化合物での処理は、肝臓または腎臓の毒性をもたらさないことが実証される。結果は更に、該混合主鎖化合物が、インビボのSGLT2発現のより効果的な阻害剤であることを示す。
【０４３３】
本明細書に記載のものに加えての、本発明の様々な改変は、前の記載より当業者によって明らかであろう。このような改変はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本出願で引用した、それぞれの参照（刊行物、しかし限定されずに、米国および非米国特許、特許出願公開、国際特許出願、ジーンバンク受託番号など）は、本明細書中で参考として、その全体が援用される。
【０４３４】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］SGLT2をコードする核酸分子を標的とする8〜80核酸塩基長のオリゴマー化合物であって、ここで該化合物が、SGLT2をコードする核酸分子に対して少なくとも70％相補的であり、かつここで該化合物がSGLT2 mRNAの発現を少なくとも10％阻害する、オリゴマー化合物。
［２］１０〜５０核酸塩基長を含む、［１］記載の化合物。
［３］１３〜３０核酸塩基長を含む、［２］記載の化合物。
［４］１５〜２５核酸塩基長を含む、［３］記載の化合物。
［５］１８〜２２核酸塩基長を含む、［４］記載の化合物。
［６］オリゴヌクレオチドを含む、［１］記載の化合物。
［７］DNAオリゴヌクレオチドを含む、［６］記載の化合物。
［８］RNAオリゴヌクレオチドを含む、［６］記載の化合物。
［９］キメラオリゴヌクレオチドを含む、［６］記載の化合物。
［１０］化合物の少なくとも一部がRNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二本鎖を形成する、［６］記載の化合物。
［１１］SGLT2をコードする核酸分子と少なくとも80％の相補性を含む、［１］記載の化合物。
［１２］SGLT2をコードする核酸分子と少なくとも90％の相補性を含む、［１］記載の化合物。
［１３］SGLT2をコードする核酸分子と少なくとも95％の相補性を含む、［１］記載の化合物。
［１４］SGLT2をコードする核酸分子と少なくとも99％の相補性を含む、［１］記載の化合物。
［１５］少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基を含む、［１］記載の化合物。
［１６］少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル糖部分を含む、［１］記載の化合物。
［１７］少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、［１］記載の化合物。
［１８］少なくとも1つのシトシンが、5-メチルシトシンである、［１］記載の化合物。
［１９］SGLT2の発現が阻害されるように、細胞または組織を［１］記載の化合物と接触させることを含む、細胞または組織においてSGLT2の発現を阻害する方法。
［２０］SGLT2をコードする核酸分子の標的セグメントを、SGLT2の1つ以上の候補調節因子と接触させること、および
SGLT2の発現を調節するSGLT2発現の1つ以上の調節因子を同定すること
を含む、SGLT2の調節因子をスクリーニングする方法。
［２１］SGLT2発現の調節因子が、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド−RNA二本鎖を形成することができる、前記RNAオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を有するRNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドを含む、［２０］記載の方法。
［２２］配列番号：５もしくは配列番号：６を含むプライマーまたは配列番号：７を含むプローブの少なくとも1つを用いて、試料中の、SGLT2の存在を確認することを含む、罹患状態を確認する、方法。
［２３］［１］の化合物を含む、キットまたは分析装置。
［２４］SGLT2に関連のある疾患または状態を有する動物を処置する方法であって、SGLT2の発現が阻害されるように、該動物に治療的または予防的有効量の［１］の化合物を投与することを含む、方法。
［２５］疾患または状態が高増殖性または代謝性障害である、［２４］記載の方法。
［２６］配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２８、２９、３２、３３、３４、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４３、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７３、７４、７７、７９、８０、８２、８５、８８、９０、９１、９２、９３、９４または９５の少なくとも８核酸塩基部を含む、［１］記載の化合物。
［２７］化合物が、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２８、２９、３２、３３、３４、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４３、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７３、７４、７７、７９、８０、８２、８５、８８、９０、９１、９２、９３、９４または９５を含む、［２６］記載の化合物。
［２８］化合物が、配列番号：９９、１０５、１０７、１０９、１１０、１１７、１２１、１２４、１２５、１２６、１３０、１３１、１３２、１３６、１３８、１３９、１４２、１４７、１４８、１５０、１５３、１５５、１６２、１７３または１７５の少なくとも８核酸塩基部を含む、［１］記載の化合物。
［２９］化合物が、配列番号：９９、１０５、１０７、１０９、１１０、１１７、１２１、１２４、１２５、１２６、１３０、１３１、１３２、１３６、１３８、１３９、１４２、１４７、１４８、１５０、１５３、１５５、１６２、１７３または１７５を含む、［２８］記載の化合物。
［３０］化合物が、SGLT2をコードする核酸分子の5’-非翻訳領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［３１］化合物が、SGLT2をコードする核酸分子の開始領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［３２］化合物が、SGLT2をコードする核酸分子のコード領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［３３］アンチセンス化合物が、SGLT2をコードする核酸分子の終止領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［３４］アンチセンス化合物が、SGLT2をコードする核酸分子の3’-非翻訳領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［３５］第２および第３の領域が隣接する少なくとも５つの連続した２'デオキシヌクレオシドから成る第１の領域を含む、［１］記載の化合物であって、ここで第２および第３の領域のそれぞれは、独立して、少なくとも１つの２'-O-メトキシエチルヌクレオシドを含み、ならびにここで第１の領域のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、第２および第３の領域のヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である化合物。
［３６］腎臓細胞または腎臓組織を、［３５］記載の化合物と接触させることを含む、腎臓細胞または腎臓組織におけるSGLT2の発現を阻害する方法。
［３７］SGLT2の発現が阻害されるように、腎臓細胞または腎臓組織を、［３５］記載の化合物と接触させることを含む、腎臓細胞または腎臓組織におけるSGLT2の発現の阻害を促進する方法。
［３８］化合物が、配列番号：１０６、２５５または２５６を含む、［３７］記載の方法。
［３９］動物における疾患または状態の開始を予防または遅延させる方法であって、SGLT2の発現を阻害するように、該動物に［３５］記載の化合物の有効量を投与することを含み、ここで、該疾患または状態が腎臓におけるSGLT2の発現と関連する、方法。
［４０］化合物が、配列番号：１０６、２５５または２５６を含む、［３９］記載の方法。
［４１］動物における２型糖尿病の開始を予防または遅延させる方法であって、SGLT2の発現を阻害するように、該動物に［３５］記載の化合物を投与することを含む方法。
［４２］前記動物が、霊長類またはげっ歯類である、［４１］記載の方法。
［４３］化合物が、配列番号：１０６、２５５または２５６を含む、［４１］記載の方法。
［４４］動物における血液グルコースレベルの増加の開始を予防または遅延させる方法であって、SGLT2の発現を阻害するように、該動物に［３５］記載の化合物を投与することを含む方法。
［４５］動物が、霊長類またはげっ歯類である、［４４］記載の方法。
［４６］血液グルコースレベルが、血漿グルコースレベルまたは血清グルコースレベルである、［４４］記載の方法。
［４７］動物が、糖尿病の動物である、［４４］記載の方法。
［４８］動物が、正常の動物と比べて、インシュリン抵抗性である、［４４］記載の方法。
［４９］化合物が、配列番号：１０６、２５５または２５６を含む、［４４］記載の方法。
［５０］動物における血液グルコースレベルを低下させる方法であって、SGLT2の発現を阻害するように、該動物に［３５］記載の化合物を投与することを含む方法。
［５１］該動物が、霊長類またはげっ歯類である、［５０］記載の方法。
［５２］血液グルコースレベルが、血漿グルコースレベルまたは血清グルコースレベルである、［５０］記載の方法。
［５３］動物が、糖尿病の動物である、［５０］記載の方法。
［５４］動物が、正常の動物と比べてインシュリン抵抗性である、［５０］記載の方法。
［５５］化合物が、配列番号：１０６、２５５、または２５６を含む、［５０］記載の方法。
［５６］肝臓細胞または腎臓組織におけるSGLT2の発現の阻害を促進させる方法であって、RNA標的の発現が阻害されるように、第２の５’領域および第３の３’領域が隣接する少なくとも５つの連続した２'デオキシヌクレオシドを含む第１の中央の領域を含むアンチセンス化合物と、細胞または組織とを接触させることを含み、ここで第２および第３の領域のそれぞれは、独立して、少なくとも１つの２'-O-メトキシエチルヌクレオシドを含み、およびここで第１の領域のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、５’末端結合および３’末端結合の一方または両方がホスホロチオエート結合であることを除いて第２および第３の領域のヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である、方法。
【配列表】
2010136725000001.app