(57)【要約】【課題】アルギン酸塩を用いて、魚の体重増加を賦活する方法もしくはその材料を提供する。【解決手段】少なくとも４０％のＭ含量を有する免疫賦活量のアルギン酸塩、および必要または所望であれば、許容可能なキャリアを含む、魚用の経口免疫賦活材料およびその材料を用いた魚の体重増加を賦活する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫賦活量の賦活材料を魚に経口投与することを含む、免疫賦活を通して魚の体重増加を賦活する方法であって、ここで該材料が、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩および許容可能なキャリアを含み、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚の体重増加を賦活する方法。
【請求項２】
前記Ｍ含量が５０％〜７０％である、請求項１に記載の魚の体重増加を賦活する方法。
【請求項３】
前記Ｍ含量が７０％〜８０％である、請求項１に記載の魚の体重増加を賦活する方法。
【請求項４】
前記Ｍ含量が８０％〜９９．９％である、請求項１に記載の魚の体重増加を賦活する方法。
【請求項５】
免疫賦活量の、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含む、魚用の経口免疫賦活材料であって、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚用の経口免疫賦活材料。
【請求項６】
前記Ｍ含量が５０％〜７０％である、請求項５に記載の魚用の経口免疫賦活材料。
【請求項７】
前記Ｍ含量が７０％〜８０％である、請求項５に記載の魚用の経口免疫賦活材料。
【請求項８】
前記Ｍ含量が８０％〜９９．９％である、請求項５に記載の魚用の経口免疫賦活材料。
【請求項９】
免疫賦活量の免疫賦活材料を魚に経口投与することを含む、魚の免疫系を賦活する方法であって、ここで該材料が、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含み、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚の免疫系を賦活する方法。
【請求項１０】
前記Ｍ含量が５０％〜７０％である、請求項９に記載の魚の免疫系を賦活する方法。
【請求項１１】
前記Ｍ含量が７０％〜８０％である、請求項９に記載の魚の免疫系を賦活する方法。
【請求項１２】
前記Ｍ含量が８０％〜９９．９％である、請求項９に記載の魚の免疫系を賦活する方法。
【請求項１３】
少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含む材料を、魚に経口投与して体重増加を賦活する方法であって、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、方法。
【請求項１４】
前記材料を、魚の寿命(life)の最初の６０日間、２〜２０ｍｇのアルギン酸塩／魚の量で経口投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｍ含量が７０％〜８０％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｍ含量が８０％〜９９．９％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記材料が、さらに許容可能なキャリアを含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、少なくとも４０％の（１−４）結合したβ−Ｄ−マンヌロン酸含量を有する、免疫賦活量のアルギン酸塩、および必要または所望であれば、許容可能なキャリアを含む、哺乳類、鳥類、魚、および爬虫類用の経口免疫賦活材料に関する。本発明はまた、哺乳類、鳥、魚、または爬虫類に本発明の材料を経口投与することを含む、哺乳類、鳥、魚、または爬虫類の免疫系を賦活する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸塩は褐藻から単離される。アルギン酸塩はまた、アゾトバクタービネランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）およびアゾバクタークロコカム（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｏｃｏｃｃｕｍ）等の土壌細菌およびいくつかの異なるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．）において産生される。しかしながら、褐藻は、一般に市販のアルギン酸塩の供給源である。
【０００３】
アルギン酸塩は、アルギン酸の塩であって、本明細書中ではＭと称する（１−４）結合したβ−Ｄ−マンヌロン酸、および本明細書中ではＧと称するα−Ｌ−グルロン酸からなる直鎖状のヘテロ多糖である。これら２種のウロン酸は次式を有する：
【０００４】
【化１】
2010110332.tif 000002
【０００５】
【化２】
2010110332.tif 000003
【０００６】
これらのポリマーは、Ｍブロックと称するマンヌロン酸のホモポリマー配列、Ｇブロックと称するグルロン酸のホモポリマー配列、およびＭＧブロックまたは交互ブロックと称するマンヌロン酸とグルロン酸ユニットの混合配列として存在する。アルギン酸塩の構造を以下のスキームで示す：
【０００７】
【化３】
2010110332.tif 000004
【０００８】
アルギン酸塩は通常、３つのタイプのブロックすべてを含有し、１つのブロックの大半は３〜３０のモノマー単位からなっている。これらブロックの分配はアルギン酸塩が単離される藻のタイプならびに藻類の年齢および部位に依存し、たとえば茎からのアルギン酸塩は葉から単離されたアルギン酸塩とは異なる配列およびブロック組成を有する。藻類を収穫した年もブロック組成および配列に影響する。一般的な知識によれば、最も高いＧ含量は古いハイパーボレア（Ｌ．ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａ）の茎に見出され得る。同種の葉は幾分低いＧ含量および幾分短いＧブロックを有するが、その含量は他の大半の種よりも高い。市販のアルギン酸塩は通常２５〜７０％のＧ含量を有する。
【０００９】
アルギン酸塩は、食品に、ならびに薬学的、歯科的、化粧用、および他の工業製品に使用されることが既知である。最も一般的な工業用途はそれらのヒドロコロイド特性および高分子電解質特性に基づいており、これはゲル形成、増粘、安定化、膨潤および粘度付与の性質のベースを形成する。
【００１０】
Ｍ含量に富んだアルギン酸塩はまた、米国特許第５，１６９，８４０号に記載されるとおり、ワクチンアジュバントとして有用な免疫賦活活性および創傷治癒組成を有することが示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
［発明の概要］
本発明は、少なくとも４０％のＭ含量を有する免疫賦活量のアルギン酸塩、および必要または所望であれば、許容可能なキャリアを含む、哺乳類、鳥類、魚、および爬虫類用の経口免疫賦活材料に関する。
【００１２】
本発明はまた、免疫賦活量の免疫賦活摂取（ingestible）材料を上記哺乳類、鳥、魚、および爬虫類に経口投与することを含む、哺乳類、鳥、魚、および爬虫類の免疫系を賦活する方法に関し、上記材料は、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩、および必要または所望であれば、許容可能なキャリアを含む。
さらに具体的には、
（１）免疫賦活量の、少なくとも４０％のマンヌロン酸（Ｍ）含量を有するアルギン酸塩、および許容可能なキャリアを含む、魚用の経口免疫賦活材料であって、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚用の経口免疫賦活材料、
（２）免疫賦活量の免疫賦活材料を魚に経口投与することを含む、前記魚の免疫系を賦活する方法であって、該材料が、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩および許容可能なキャリアを含み、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚の免疫系を賦活する方法、
（３）免疫賦活量の、少なくとも８０％のＭ含量を有するアルギン酸塩、および許容可能なキャリアを含む、魚用の経口免疫賦活材料であって、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該アルギン酸塩が、ダービリア海草を水に混合かつ膨潤させること、少なくとも３０分間、約２０℃を超える温度で、約２．３を超えるｐＨに維持すること、ダービリア海草と水との混合物から可溶化フラクションを単離すること、および酸、塩、またはアルコールでの沈殿により該可溶化フラクションから前記少なくとも８０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を回収することにより作られ、該材料は（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚用の経口免疫賦活材料、
（４）免疫賦活量の賦活材料を魚に経口投与することを含む、免疫賦活を通して魚の体重増加を賦活する方法であって、ここで該材料が、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩および許容可能なキャリアを含み、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚の体重増加を賦活する方法、
（５）免疫賦活量の、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含む、魚用の経口免疫賦活材料であって、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚用の経口免疫賦活材料、
（６）免疫賦活量の免疫賦活材料を魚に経口投与することを含む、魚の免疫系を賦活する方法であって、ここで該材料が、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含み、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚の免疫系を賦活する方法、
（７）免疫賦活量の、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含むが、ただし該アルギン酸塩が合成的に作られるか、または海草もしくは細菌源から単離されるかのいずれかである、魚用の経口免疫賦活材料であって、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚用の経口免疫賦活材料、
（８）免疫賦活量の免疫賦活材料を魚に経口投与することを含む、前記魚の免疫系を賦活する方法であって、ここで該材料は、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含むが、ただし該アルギン酸塩は合成的に作られるか、または海草もしくは細菌源から単離されるかのいずれかであり、該免疫賦活量が魚の体重増加を賦活するために有効な量であり、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、魚の免疫系を賦活する方法。
（９）少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含む材料を、魚に経口投与して体重増加を賦活する方法であって、該材料が、（ｉ）薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形、（ｉｉ）固体食、あるいは（ｉｉｉ）固体の栄養補助物である、方法、である。
【００１３】
以下の略語が図面で使用される；ダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌｅａ）水抽出物＝ＤＷＥ、ダービリア標準抽出物＝Ｓｔｄ．ＤＡ、レッソニア（Ｌｅｓｓｏｎｉａ）標準抽出物＝Ｓｔｄ．ＬＮ。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１２週の期間にわたり本発明のアルギン酸塩を含む餌を与えられたブタの重量増加を示すグラフである。
【図２】本発明のアルギン酸塩で試験したブタにおける全白血球の血清レベルを、対照との比較として示すグラフである。
【図３】本発明のアルギン酸塩で試験したブタにおける単球の血清レベルを、対照との比較として示すグラフである。
【図４】本発明のアルギン酸塩で試験したブタにおけるリンパ球の血清レベルを、対照との比較として示すグラフである。
【図５】ダービリア水抽出物を給餌されたブタからの血液を用いて測定された食作用のレベルを、対照との比較として示す。
【図６】ダービリア水抽出物を給餌されたブタからの血液を用いて測定された活性酸素生成を、対照との比較として示す。
【図７】ダービリア標準抽出物、ダービリア水抽出物、およびレッソニア標準抽出物を給餌されたブタについて、注射されたヒト血清アルブミン実験用ワクチンに対する免疫応答を、対照との比較として示す。
【図８】６０日の期間にわたりダービリア水抽出物を含む餌を経口で給餌されたスポッティドウルフフィッシュの比成長速度（１日あたりの成長％）を対照群の比成長速度と比べて示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［発明の詳細な説明］
少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩は、本発明において、哺乳類、鳥類、魚、および爬虫類用の経口免疫賦活体として利用される。より詳細には、５０％〜７０％（レッソニア、ダービリア、およびラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）由来など）；７０％〜８０％（ダービリア由来など）および８０％〜９９．９％（細菌および例えば、以下の実施例に従って調製されるようなダービリアなどのアルギン酸塩の水抽出物に由来など）のＭ含量を有するアルギン酸塩が使用され得る。これらのアルギン酸塩は、異物による細胞攻撃および細胞の物理的損傷により引き起こされる疾患または外傷に対して、哺乳類、鳥類、魚、および爬虫類の免疫応答を賦活する。異物として、微生物、粒状物質、化学剤などが挙げられる。物理的損傷として、機械的創傷（擦過傷、裂傷、挫傷、創傷など）が挙げられる。
【００１６】
本発明の経口免疫賦活材料および方法は、少なくとも４０％のＭ含量を有する免疫賦活量のアルギン酸塩を利用する。免疫賦活量は、免疫賦活材料を摂取することになっている被検体および必要な免疫賦活レベルに応じて変化し得る。例えば、制限することなく、魚の寿命(life)の最初の６０日間、２〜２０ｍｇのアルギン酸塩／魚を経口投与する。もちろん、より成熟した魚はより多くの量を必要とするだろう。
【００１７】
少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含む経口免疫賦活材料は、薬学的、獣医学的、または栄養補助的な、固体剤形（錠剤、カプレット（caplets）、カプセル剤など）または粉末もしくは液体配合物であってもよい。これはまた、任意の型の、哺乳類、トリ、魚、または爬虫類消費用の固体または液体食（ペットフードなど）であってもよい。これはまた、固体、半固体、または液体の栄養補助物（フードバー、飲み物など）であってもよい。
【００１８】
許容可能なキャリアは、薬学的、獣医学的、または栄養補助的な液体もしくは固体剤形、液体、固体および半固体食、ならびに液体および固体栄養補助物に従来から使用されるもののいずれかであり得る。
【００１９】
実施例で以下に実証されるように、本発明のアルギン酸塩の免疫賦活活性は、対照と比較して、アルギン酸塩を摂取している哺乳類（ブタで以下に実証されている（図１参照））および魚（スポッティドウルフフィッシュ（ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｏｌｆｆｉｓｈ）で以下に実証されている（図８参照））で体重増加を賦活することもまた見いだされている。この態様は、そのようなアルギン酸塩が若い哺乳類に経口で与えられる場合に、特に有用でありかつ望ましい。したがって、本発明はまた、免疫賦活量の免疫賦活材料を哺乳類、鳥、魚、または爬虫類に経口投与することを含む、免疫賦活を通じた哺乳類、鳥類、魚、および爬虫類の体重増加を賦活する方法に関し、ここで材料は、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩、および必要または所望であれば、許容可能なキャリアを含む。より詳細には、この方法はまた、５０％〜７０％、７０％〜８０％、または８０％〜９９．９％のＭ含量を有するアルギン酸塩の投与を含む。免疫賦活材料は、上記に記載されるもののいずれであってもよい。
【００２０】
本発明の経口免疫賦活材料は、合成的にもたらされるか、またはアルギン酸塩産生細菌種もしくは海草源のいずれかから単離される、少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩を含み得る。
【００２１】
少なくとも４０％のＭ含量を有するアルギン酸塩は、当該技術分野で既知の多くのプロセスにより海草から得られ得る。要求されるＭ含量を有するアルギン酸塩の出発物質は、藻類または海草、特に褐藻類であり、これは一般にフェノールを定着させて藻類を保存するために、ホルムアルデヒドで処理される。さらに、藻類は、高粘度のラミナランおよびフコグリカン（fucoglycans）を除去するために酸で洗われ得る。好ましくは、それらはまた、発熱物質の含量を減少させるために、アルカリで処理され得る。藻類は任意の既知の様式で前処理され得ることが理解される。市販のアルギン酸塩、最も好ましくは乾燥して破砕されたダービリア種の藻類が使用され得るが、ダービリア、ラミナリア、レッソニア、エクロニア（Ｅｃｋｌｏｎｉａ）、マクロシスティス（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、またはアスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の新鮮な、全体または破砕されていない藻類もまた、出発物質として適している。
【００２２】
そのようなアルギン酸塩を生成するプロセスが、例えば、Greenの米国特許第２，０３６，９３４号、およびLe Gloahecの米国特許第２，１２８，５５１号に記載されており、そしてそのようなプロセスを、援用して本明細書の一部とする。本発明に有用な、アルギン酸塩を得る他の方法は、本明細書中以下、実施例で提供される。例えば、本発明のアルギン酸塩はまた、膨潤工程（少なくとも３０分間、２０℃より高い温度で、約２．３より高いｐＨを維持する）で高いＭ含量を有するアルギン酸塩源を水と１：３〜１：２０の比で混合すること、および可溶化アルギン酸塩フラクションを濾過により固体材料から単離することによる、水抽出プロセスを用いて調製され得る。要求されるＭ含量を有するアルギン酸塩は、酸、塩、またはアルコールでの沈殿により、溶液から回収され得る。
【００２３】
以下に記載される実施例は、本発明の態様の代表的な例を含む。実施例は、本発明の範囲を制限することを意味せず、むしろ例示の目的で機能する。他に示されない限り、全ての割合、パーセントなどは、重量によるものである。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
異なるダービリア種、Ｄ．ポタトルヌ（Ｄ．ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）（粉砕）（試料１）、およびＤ．アンタルクティカ（Ｄ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（未粉砕）（試料２）からの出発原材料に、以下の表に記載される量で水を加え、３．５時間、５５℃の温度で、時々手で攪拌した。周辺温度で一晩置いた後、藻類を５５℃で１時間、２度抽出し、次いで２．５ｍｌのホルムアルデヒドを加えて抽出を１時間続けた。
【００２５】
【表１】
2010110332.tif 000005
【００２６】
次いで、懸濁液を６０メッシュのフィルターで濾して、過剰の水で２回洗った。次いで溶液を、吸引漏斗で濾過助剤を用いて、その後グラスフィルターのプレフィルターで濾過した。次いで溶液を１０℃に冷却させ、次いでＮａＣｌを０．５％濃度まで加えた。その後、磁気撹拌しながら、ｐＨ１．８まで希５．５Ｍ塩酸を滴下した。白色沈殿物が形成された。３０分間１０℃に維持した後、懸濁液を１２０メッシュのフィルター布で濾し、そして手で圧縮して、ペースト状の黄色の固まりを得て、これは圧縮後細かい線維になった。酸材料を全て２５０ＭＬの容器に移し、そして水を加えて２００ｍｌにしてから、磁気撹拌しながら、固体ソーダ灰でｐＨ７に中和した。溶液をもう一度、硝酸セルロースの０．８ミクロンフィルター膜で濾過した。濾液を１０℃に冷却し、そして１：１の比のイソプロピルアルコールで沈殿させた。形成した線維を、７０体積％イソプロピルアルコールで１回、次いで２回目は１００体積％イソプロピルアルコールで洗った。線維をハサミで取り出して凍結乾燥させた。結果を以下の表に示す。
【００２７】
【表２】
2010110332.tif 000006
【００２８】
【表３】
2010110332.tif 000007
【００２９】
【表４】
2010110332.tif 000008
【００３０】
以下の表は、この実施例のプロセスに従って、他の海草試料から調製されたＭの収率を示す。
【００３１】
【表５】
2010110332.tif 000009
【００３２】
（実施例２）
７０メッシュより大きい粒子に破砕した１９９６年８月のダービリア・アンタルクティカからの試料を、出発物質として使用した。乾燥させた藻類３０グラムを容器に量り取った。１００ｍｌの０．２ＭのＨＣｌを加え、そして材料を水で５００ｍｌに希釈した。撹拌して数分後、ｐＨが２．３よりも上がったので、酸を加えてｐＨを２．３未満（ＰＨ１．８）に維持した。２分後、２．５ｍｌの０．２ＭのＨＣｌを加えた。ｐＨを常にｐＨ２．３より低く、ｐＨ１．８に維持した場合、純水で膨潤させるのと比較して、材料はほとんど膨潤しなかった。１時間膨潤後、材料を、６０メッシュの濾過布で濾し、手で圧縮し、そして容器に移した。次いで、得られる材料に５００ｍｌの水および５０ｍｌソーダ灰／水酸化ナトリウム溶液を加え、そして５５℃で１時間抽出した。材料は非常に速く膨潤し、そしてペーストまたはパルプのようにどろどろになった。これを、次の日まで周辺温度に置いておいた。次いで、材料を５５℃で１時間さらに抽出し、次いでミキサーユニットで破砕した。総量は、５４９グラムの重さになった。１５０グラムの材料を、撹拌しながら７００グラムの水で希釈した。次いで、濾過助剤を加えた後、溶液を、水吸引からの減圧により、濾紙で濾過した。濾液の量は、測定すると５６４グラムとなり、これを１０℃に冷却した。これに塩化ナトリウムを０．５％まで加え、そして希塩酸（１：１）を滴下してｐＨを１．６に調整した。柔らかい沈殿物が形成された。次いで、材料を１２０メッシュ濾過布で濾し、そして手で注意して圧縮した。次いで、材料を水に懸濁させ、そして２０℃の温度で、約２００ｍｌの体積に希釈した。磁気攪拌を使用して、溶液のｐＨを固体ソーダ灰粉末で７に中和した。ガラス棒で攪拌することにより、同等の割合のイソプロピルアルコールで溶液が沈殿した。沈澱した線維を、７０体積％イソプロピルアルコール溶液で１回洗った。次いで、純粋な１００体積％イソプロピルアルコールで再度洗った。１２０メッシュ濾過布で濾して圧縮した後、線維をハサミで取り出し、次いで一晩真空で凍結乾燥させた。収量は、重さ１．０４グラムのアルギン酸塩となり、ダービリア・アンタルクティカ出発物質から３．６重量％に相当した。Ｍ含量は、７０％であり、そしてアルギン酸塩のブロック分布はＮＭＲにより以下のように測定された。
【００３３】
【表６】
2010110332.tif 000010
【００３４】
（実施例３）
抽出前工程において塩を加えることにより、マンヌロン酸の含量をさらに増加させることが可能である。１９９６年８月のチリからのダービリア・アンタルクティカ（破砕された＞７０メッシュの粗い粒子）藻類２０グラムに５００ｍｌの水およびある量のＮａＣｌを加え、そして攪拌速度１４０ｒｐｍで、温度２０℃で２時間、ジャー(Jar)検査機械での攪拌下、抽出した。以下の表に記載されるとおりの溶液濃度まで塩を加えた。
【００３５】
【表７】
2010110332.tif 000011
【００３６】
次いで、材料を４００メッシュ濾過布で濾して、手で圧縮した。以下の表に与えられるように、濾した溶液の重さを計り、そしてｐＨを測定した。
【００３７】
【表８】
2010110332.tif 000012
【００３８】
次いで、濾した溶液を濾紙を用いて漏斗で減圧（水吸引ポンプ）濾過した。濾液の粘度をガラス管で測定し、その結果を以下の表に示す。
【００３９】
【表９】
2010110332.tif 000013
【００４０】
濾液を１５℃以下に冷却し、そして磁気攪拌機で撹拌しながら、試料それぞれに、ｐＨが１．８〜２．０に達するまで５．５Ｍの塩酸を滴下した。線維状の沈殿が形成された。次いで、沈殿物を４００メッシュ濾過布で濾して手で圧縮した。次いで、アルギン酸を水で希釈して、完全に溶解するまで、攪拌しながら固体ソーダ灰でｐＨ６〜７に中和した。次いで、溶液を冷却し、そして同等の割合のイソプロピルアルコールで沈殿させた。その後、７０体積％のイソプロピルアルコールで洗い、そして純粋な１００体積％のイソプロピルアルコールで繰り返し洗った。沈澱した繊維を、ハサミで取り出して容器に移し、そして真空で一晩凍結乾燥させた。結果を以下の表に示すが、ここで、アルギン酸塩の損失はなく、そして全てのアルギン酸塩が加えた水に溶解すると仮定して、収量を計算した。
【００４１】
【表１０】
2010110332.tif 000014
【００４２】
（実施例４）
別々のフラクション中のマンヌロン酸含量は、ＣａＣｌ２を加えることによりさらに増加した。出発物質は、＞７０メッシュの粗い粒子に破砕された、チリ産のＤ．アンタルクティカであった。抽出前工程の量および条件は、以下の表に記載される。抽出前工程を、ジャー検査機で約１４０ｒｐｍでの攪拌下行った。
【００４３】
【表１１】
2010110332.tif 000015
【００４４】
次いで、材料を４００メッシュフィルターで濾して手で圧縮した。次いで、溶液を約３０℃に加熱し、そして減圧吸引フラスコで濾紙を用いて濾過した。
【００４５】
【表１２】
2010110332.tif 000016
【００４６】
次いで、溶液を１０℃に冷却して、０．５％まで塩化ナトリウムを加えた。次いで、注意して磁気攪拌しながら、ｐＨ１．８まで、５．５ＭのＨＣｌを滴下して加えた。白色沈殿物が形成された。次いで、材料の懸濁液を３０分放置し、そして４００メッシュ濾過布で濾して手で注意して圧縮した。材料は、ペースト状の黄色の塊で、これは圧縮後、光沢のある細かい繊維になった。次いで、酸材料を２５０ｍｌの容器に移して水を加えて２００ｍｌにし、次いで、磁気攪拌しながら固体ソーダ灰でｐＨ７に中和した。次いで、濾液を１０℃に冷却して、１：１の比で１００体積％のイソプロピルアルコールを用いて、攪拌で沈殿させた。巨大繊維が沈殿した。繊維を７０体積％イソプロピルアルコールで２回、そして最後に１００体積％イソプロピルアルコールで洗った。次いで、繊維をハサミで取り出し、その後真空下で一晩凍結乾燥させた。結果を、収率を示す表９および表１０に示す、８０％より多いＭを含むアルギン酸塩中のマンヌロン酸含量の増加は、塩が加えられなかった場合には最大９１％であったのが、塩が抽出前工程に加えられた場合には最大９５％であった。
【００４７】
【表１３】
2010110332.tif 000017
【００４８】
【表１４】
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【００４９】
（実施例５）
６腹からの、平均初期重量１３．０７ｋｇ（ＳＴＤ１．９８）である、全部で４８匹の交雑した［（ノルウェジアン・ランドレース（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ）×ヨークシャ（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ））×ノルウェジアン・ランドレース］３５〜３８日齢の乳ばなれしたばかりのブタを、実験給餌研究のため４つの群に分け、そして環境を制御した保育舎に置いた。最初に、２．５ｍ×２．５ｍの囲いあたり４匹のブタで、ブタを飼育した。給餌の６週間後、ブタを、個別の給餌区画のある１５平方メートルの囲いに、囲いあたり６匹のブタで、移した。ブタには、無制限に、餌および水を取らせた。週１回の頻度で、個別にブタの重さを量った。ブタには、囲いに適合するための４日間の準備期間と標準的な市販の離乳用のブタの餌を取らせた。市販の餌（１３％の水分含量）は、成長に必要なビタミンおよびミネラルで強化され、約１８〜１９％の原タンパク質含量、１４〜１５％の消化性タンパク質含量、４０〜５０％のデンプン含量、および約２．６％の原脂肪含量を有した。
【００５０】
市販の餌への最初の適合後、それぞれ１２匹のブタからなる４つの群に、異なる食事を１０週間与えた。研究の最後の２週間、ブタは全て、市販の餌が与えられた。対照群のブタには、標準的な市販の餌を給餌したが、一方他の３つの群のブタには、１．２５％（ｗ／ｗ）のアルギン酸塩が配合されている、同じ市販の餌を給餌した。検査した３種のアルギン酸塩は、１．ダービリア・アンタルクティカ水抽出物（８９％のＭ）、２．ダービリアンタルクティカ標準抽出物（６３％のＭ）、および３．レッソニア・ニグレッセンス標準抽出物（５５％のＭ）であった。固有粘度および１Ｈ  ＮＭＲ分光測定により特性決定されるとおりのこれらのアルギン酸塩粉末は、以下のとおりにさらに記載される：
【００５１】
ダービリア・アンタルクティカ標準抽出物は、７．０ｇ／ｄｌの固有粘度を有した。これはマーク・ホーウィンク式を用いて、２１０，０００ダルトンの平均分子量の推定重量に相当する。このダービリアルギン酸塩試料は、マンヌロン酸（Ｍ）単位で０．６３、およびグルロン酸（Ｇ）単位で０．３７のモルフラクション含量を有した。ＭからＭへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＭ）は、０．４４であった。ＧからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＧＧ）は、０．１８であった。ＭからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＧ）は、ＧからＭへの結合のフラクション含量Ｆ（ＧＭ）と等しく、０．１９であった。
【００５２】
高いＭ含量を有するアルギン酸塩フラクションの選択的沈殿により得られた、ダービリア・アンタルクティカ水抽出物、すなわちダービリア水抽出物は、４．７ｇ／ｄｌの固有粘度を有した。これはマーク・ホーウィンク式を用いて、８５，０００ダルトンの平均分子量の推定重量に相当する。このダービリア水抽出物のアルギン酸塩試料は、マンヌロン酸（Ｍ）単位で０．８８、およびグルロン酸（Ｇ）単位で０．１２のモルフラクション含量を有した。ＭからＭへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＭ）は、０．８０であった。ＧからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＧＧ）は、０．０４であった。ＭからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＧ）は、ＧからＭへの結合のフラクション含量Ｆ（ＧＭ）と等しく、０．０８であった。
【００５３】
レッソニア・ニグレッセンス標準抽出物は、１３．４ｇ／ｄｌの固有粘度を有した。これはマーク・ホーウィンク式を用いて、３７０，０００ダルトンの平均分子量の推定重量に相当する。このレッソニアアルギン酸塩試料は、マンヌロン酸（Ｍ）単位で０．５５、およびグルロン酸（Ｇ）単位で０．４５のモルフラクション含量を有した。ＭからＭへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＭ）は、０．３５であった。ＧからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＧＧ）は、０．２５であった。ＭからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＧ）は、ＧからＭへの結合のフラクション含量Ｆ（ＧＭ）と等しく、０．２０であった。
【００５４】
アルギン酸塩固有粘度を、「固定化材料としてのアルギン酸塩−いくつかの分子および機能性についての研究（Alginates as immobilization materials - A study of some molecular and functional properties」(Martinsen, Anita) Thesis; NTH-University of Trondheim, 1990に開示される方法を用いて決定した。重量平均である分子量を、固有粘度データおよびマーク・ホーウィンク式に基づいて推定した。単量体の組成および配列の並び順を、Grasdale等著「アルギン酸塩中のウロン酸残基の組成および配列のＮＭＲ研究（A NMR studie of composition and sequence of uronate residues in alginate）」、Carbohydrate research 1979; 68: 23 、および H. Grasdalen著「アルギン酸塩の高磁場１Ｈ  ＮＭＲ分光法：配列構造および結合配座（High Field 1H NMR spectroscopy of alginate: sequential structure and linkage conformation）」、 Carbohydrate Research, 1983 ; 118 : 255に記載されるように、Ｂｒｕｃｋｅｒ４００ＷＭ分光計で１Ｈ−ＮＭＲ分光法により分析した。
【００５５】
給餌の２週間後、ブタを免疫化し（７週齢で）、そして４週間後にそれらに追加免疫注射を与えた（１１週齢で）。全てのブタを、０．２５ｍｌのウマヘルペスウイルス１（ＥＨＶ）含有Ｐｎｅｕｍａｂｏｒｔ  Ｋ（登録商標）（１０２ＢＹ０００２, Fort Dodge Laboratories）と０．２５ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（２００μｇ／ｍｌ）(Sigma)との混合物０．５ｍｌを用いて筋肉内で、０．５ｍｌのインフルエンザウイルスＡ／Ｅｑｕｉ１、Ａ／Ｅｑｕｉ２／Ｍ、Ａ／Ｅｑｕｉ２／Ｆ（ＥＩＶ）含有Ｐｒｅｖａｃｕｎ  Ｆ（登録商標）（０２７０２１Ｅ, Hoechst Roussel Vet, Germany)、ならびに１．０ｍｌのジフテリアトキソイド（３０Ｌｆ／ｍｌ）および破傷風トキソイド（７．５Ｌｆ／ｍｌ）含有ジフテリア／破傷風ワクチン（登録商標）(ＤＴ９１６９ａｌ, SBL Vaccin AB, Stockholm) を用いて皮下で、免疫化した。
【００５６】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）(Sigma Chemical Industries, USA) およびジフテリアトキソイド（ＤＩＦ）（国立公衆衛生研究所（National Institute of Public Health））に対する特異的抗体を、受身(passive)赤血球擬集反応法により測定した(Avrameas et al 1969)。検査した希釈下限は、１：８であった。阻害を示さなかった血清は、統計計算に使用するために力価４が与えられた。抗体力価の値をｌｏｇ２変換して分布を規格化した。
【００５７】
血清学、血液学、ならびに貪食細胞およびリンパ球の機能的特性決定のため、血液試料を２週間隔で集めた。血清を単離し、そして処理されるまで−２０℃で貯蔵した。安定化（ヘパリン化およびＥＤＴＡ）血液試料を朝集めて、ただちに分析した。ノルウェー獣医学大学（The Norwegian School of Veterinary Science, Oslo）の中央臨床研究室（Central Clinical Laboratory）で、血液試料を分析した（Technicon H-1)。全白血球数（ＷＢＣ×１０９／Ｌ）、単球、好中球、および好酸球の数（×１０９／Ｌ）を、電子的に測定し、そしてリンパ球数ならびにリンパ球、単球、好中球、および好酸球の相対数（％）を推定した。全赤血球数（ＲＢＣ×１０１２／Ｌ）、平均細胞体積（ＭＣＶ  ｆＬ）、およびヘモグロビン（ＨＧＢｇ／Ｌ）を測定し、そしてヘマトクリット（ＨＣＴＬ／Ｌ）を推定した。
【００５８】
血液中の顆粒球の貪食活性を、Ｐｈａｇｏｔｅｓｔ（登録商標） (Orpegen Pharma, Heidelberg) を用いて、使用説明書（operator's manual）に従いアッセイした。ヘパリン化（１５ＩＵ／ｍｌ）全血を混合し、そして５ｍｌバイアル(Falcon)の底部に分取（１００μｌ）して、氷上で１０分間インキュベートしてから、２０μｌの予冷、安定化、かつオプソニン化したＦＩＴＣ標識化大腸菌懸濁液（検査キット）を加えた。全てのバイアルを振盪し、そして試験試料を水浴中３７℃で１０分間インキュベートしたが、一方対照試料は氷上に置いたままだった。次いで、食作用を止めるために、全ての試料を同時に氷上に置き、そして１００μｌの氷冷したクエンチ溶液を各試料に加えてボルテックスミキサーで混合した。次いで、試料に３ｍｌの洗浄溶液を加え、混合し、そして細胞を遠沈した（２５０×ｇ、５分、４℃）。次いで洗浄手順を繰り返してから、２００μｌのＤＮＡ染色溶液を加えた。試料を混合して氷上で１０分間インキュベートし、そして細胞を青−緑励起光（４８８ｎｍ）を用いてフローサイトメトリー(ＦＡＣＳｃａｎ（商標）、ＬＹＳＩＳ（商標）ソフトウェア) で分析した。食作用を示していた細胞の割合を分析した。
【００５９】
活性酸素生成（oxidative burst）活性の見積もりを、Ｐｈａｇｏｂｕｒｓｔ（登録商標）(Orpegen Pharma, Heidelberg)を用いて使用説明書に従って、フローサイトメトリーで行った。ヘパリン化（１５ＩＵ／ｍｌ）全血を混合して５ｍｌバイアル（Ｆａｌｃｏｎ）の底部に分取（１００μｌ）し、そして氷上で１０分間インキュベートしてから２０μｌの予冷、安定化、かつオプソニン化した大腸菌懸濁液（検査キット）を加えた。検査された各動物に対して３本の対照バイアルが含まれた；１本の管には２０μｌの洗浄溶液（ネガティブ対照）を加え、１本の管には２０μＩの走化性ペプチドｆＭＬＰ使用溶液（「低対照」）を加え、そして１本の管には２０μｌのホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）使用溶液（「高対照」）を加えた。全てのバイアルを混合し、そして検査試料を水浴中３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、全ての試料に２０μｌの基質溶液を加え、十分に混合して、水浴中３７℃でさらに１０分間インキュベートした。次いで、全ての試料を水浴から同時に取り出し、そして全血を２ｍｌのあらかじめ温めた溶解溶液で溶解および固定し、混合し、そして室温で２０分間インキュベートした。試料を遠沈し（２５０×ｇ、５分、４℃）、そして３ｍｌの洗浄溶液を加えて１回洗浄した（２５０×ｇ、５分、４℃）。上清をデカントし、そして２００μｌのＤＮＡ染色溶液を加え、試料を混合して氷上で１０分間インキュベートした（光保護して）。細胞を青−緑励起光（４８８ｎｍ）を用いてフローサイトメトリー(ＦＡＣＳｃａｎ（商標）、ＬＹＳＩＳ（商標）ソフトウェア) で分析した。反応性酸素代謝産物を産生していた細胞の割合、ならびにそれらの平均蛍光強度を分析した。
【００６０】
図１は、４つの群のブタについて給餌時間の関数として平均重量を示す。顕著な重量増加が、対照群と比較して、ダービリア水抽出物群およびレッソニア群のブタについて見られた。重量の差異は、３週間後に統計的に有意と判断されるが、図１は、１週間後で対照群よりも速く重さが増加する、ダービリア水抽出物群およびレッソニア群で一貫した重量増加の傾向を示す。ダービリア群と対照群との間の実際の重量の差異はダービリア水抽出物群とレッソニア群とについて見られるものほど劇的ではないものの、ダービリア群の平均重量が一貫して対照よりも高かったことが留意されるべきである。対照群の個々のブタは、アルギン酸塩含有餌を与えられた３つの群の個体と比較して、重量において高いばらつきを有したが、これは、対照群の個体の中には免疫応答の減少したものがおり、そのためそれらは外傷および／またはストレスに抗する能力がより劣っていたことを示唆する。ホルモンのコルチゾールは、ブタで、栄養素を筋肉および脂肪組織から分配して、動物が疾患ストレスに抗することを可能にする。
【００６１】
図２〜図４は、全白血球、単球、およびリンパ球についての血液分析から得られたデータを示す。統計的に有意ではないものの、図２は、ダービリア水抽出物群についての全白血球が対照群より高いことを示す。ダービリア水抽出物群について観測された白血球数増加は、対照群と比較したダービリア水抽出物群についての、それぞれ６週間後および１０週間後に単球（図３）およびリンパ球（図４）の両方での顕著な増加によるものである。レッソニア群についてのリンパ球は、ダービリア水抽出物群と比較して増加が遅い（１０週目）ことを示す。ダービリア水抽出物群（および対照群）から採取された血を、食細胞活性についてもアッセイし、そして図５に見られるように、４週目で対照群と比較してダービリア水抽出物群に顕著な増加が測定された。図６に示される活性酸素生成データは、４週目および８週目の両方で、対照群と比較してダービリア水抽出物を給餌されたブタについて食細胞応答がより高いレベルであることをさらに支持する。レスピラトリーバースト(respiratory burst)を伴う根底にある化学プロセスがある種の細菌を殺すために必要であることから、対照群と比較してダービリア水抽出物群について４週目および８週目で活性酸素生成が持続して増加していることには意義があり、そしてこれは食作用の効果の改善を示す。
【００６２】
図７は、ワクチン接種に対する免疫応答を示す。ヒト血清アルブミン実験ワクチンの注射に対する免疫応答（図７）は、ダービリア水抽出物群およびレッソニア群について８週目で顕著な増加を示し、これは対照と比較して改善された免疫応答を示す。
【００６３】
（実施例６）
ダービリア水抽出物アルギン酸塩（実施例５に記載されるとおり）を水に溶解し、そして短い超音波処理後、１リットルあたり４．２グラムのアルギン酸塩の濃度で溶解したアルギン酸塩を含む溶液を、市販の餌粒(Skretting/Nutreco, Dirdal, Norge)上に噴霧して餌に０．０２％および０．０６％のアルギン酸塩（重量％）を加えた。餌粒を２日間空気乾燥させてから、孵化したばかりのスポッティドウルフフィッシュ（アナリカス・マイナー（Ａｎａｒｈｉｃｈａｓ  ｍｉｎｏｒ））稚魚に経口投与した。このダービリア・アンタルクティカ水抽出物は、８．３ｄｌ／ｇの固有粘度を有し、これはマーク・ホーウィンク式を用いて、推定重量、１６００００ダルトンの平均分子量に相当する。このダービリア水抽出物のアルギン酸塩試料は、マンヌロン酸（Ｍ）単位で０．８９、およびグルロン酸（Ｇ）単位で０．１１のモルフラクション含量を有する。ＭからＭへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＭ）は、０．８１であった。ＧからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＧＧ）は、０．０３であった。ＭからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＧ）は、ＧからＭへの結合のフラクション含量Ｆ（ＧＭ）と等しく、０．０９であった。
【００６４】
各条件について、５０匹の稚魚からなる複製(replicate)群３つを、魚に連続して給餌する６０日間の給餌研究に使用した。魚あたりの平均重量は、給餌研究の開始時で約０．４ｇであった。研究の間、稚魚の重さを１０日毎に測定した（湿潤重量）。検査条件は、３種の異なる餌を含んだ：対照（０％アルギン酸塩）、０．０２％アルギン酸塩、および０．０６％アルギン酸塩。対照餌を給餌される魚のさらなる群を、海水１リットルあたり０．１ｇのアルギン酸塩を含む浴槽に、１回の処置サイクルあたり１２〜２４時間の処置で魚を移すことにより６０日間の給餌期間の間に２回浴槽処置し、次いで給餌研究した。
【００６５】
図８に示されるとおり、アルギン酸塩含有餌を給餌された魚は、６０日の成長期間にわたり、アルギン酸塩を加えなかった対照餌を給餌された魚と比較して（１日あたり４．８５７％の成長）、１日あたり５．１９７％の成長（０．０２％アルギン酸塩について）および１日あたり５．２４７％の成長（０．０６％アルギン酸塩について）のより高い成長の比速度を示した。６０日の研究中に２回断続的に浴槽処置された魚は、対照群と比較してそれらの成長の比速度に顕著な違いを示さなかった（それぞれ、１日当たり４．７４５％成長対１日当たり４．８５７％成長）。図８における比成長速度は、以下の式による毎日の成長の割合として計算した：１００％×［ｌｎ（研究終了時の重さ）−ｌｎ（研究の０日目の重さ）］÷研究日数（注：ｌｎは自然対数である）。
【００６６】
（実施例７）
ダービリア水抽出物アルギン酸塩（実施例５に記載されるとおり）を水に溶解し、そして３％の濃度のアルギン酸塩を加えた。このダービリア・アンタルクティカ水抽出物は、４．７ｄｌ／ｇの固有粘度を有し、これはマーク・ホーウィンク式を用いて、推定重量、８５０００ダルトンの平均分子量に相当する。このダービリア水抽出物のアルギン酸塩試料は、マンヌロン酸（Ｍ）単位で０．８８、およびグルロン酸（Ｇ）単位で０．１２のモルフラクション含量を有する。ＭからＭへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＭ）は、０．８０であった。ＧからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＧＧ）は、０．０４であった。ＭからＧへの結合のフラクション含量、Ｆ（ＭＧ）は、ＧからＭへの結合のフラクション含量Ｆ（ＧＭ）と等しく、０．０８であった。
【００６７】
約１２００グラムの市販の餌(Biomar Ecoweaner ＥＭＢ  １６２４４) の一部に、以下の条件下、ベンチトップ流動床反応器（bench top fluidised bed reactor）で異なる量のアルギン酸塩溶液を噴霧コーティングした：粒子を流動化するのに十分な気流、４０〜５０℃、および１時間あたり６０ｍｌのアルギン酸塩溶液の流れ。乾燥餌粒子を、最初に投入した乾燥粉末の重量あたりにコーティングされたアルギン酸塩濃度およびアルギン酸塩溶液の量に基づいて計算されたとおりの異なる濃度のアルギン酸塩（０．０１％、０．０６％、および０．１０％）で戻した。最低濃度について、０．５％に希釈したアルギン酸塩溶液を代わりに使用した。対照試料は、さらなる処理なしに使用した。０．６ｍｍおよび１．０ｍｍの粒子径を有する餌両方を、それぞれ初期および後期給餌期間に使用した。コーティングした、およびコーティングしていない餌粒子を顕微鏡で視覚的に検査し、そして外見または粒子径に差異は見られなかった。処理直後の乾燥物重量は、未コーティング（９０％）と比較してコーティング粒子（９５％）でわずかに高かった。
【００６８】
餌粒子からのアルギン酸塩の損失を測定するため、ダービリア・アンタルクティカ水抽出物アルギン酸塩を、続く、海水中コーティング粒子から放出されるアルギン酸塩の測定で放射標識した。１００ｍｇのアルギン酸塩を、５０ｍｌの０．０５Ｍホウ酸塩緩衝液にｐＨ８．０で溶解させた。１００ｍｇのｐ−ＯＨメチルベンズイミデート（benzimidate）（ＭＰＨＢＩＭ）を加え、そして溶液を２４時間３７℃で振盪した。溶液を、１％のナトリウムアジドを含む蒸留水に対して２日間透析した。分子量６０００を有するポリエチレングリコールに対してさらなる透析を３日間行い、より濃縮されたアルギン酸塩溶液にした。全ての透析溶液は、１日に２回交換した。標識化アルギン酸塩の溶液を０．４５ミクロンフィルターで濾過し、それから１２５ヨウ素（１２５Ｉ）でさらに標識した。５０マイクロリットルのヨードゲン（１，３，４，６−テトラクロロ−３α，６α−ジフェニルグリコールウリル）をエレッルマン管（Ellermann tube）に加えた。溶液を管から蒸発させると、それを水で５回フラッシュして圧縮空気で乾燥させた。管に、５０マイクロリットルのホスフェート緩衝溶液、４マイクロリットルの１２５Ｉ２、および２ｍｌのＭＰＨＢＩＭ標識化アルギン酸塩溶液を加えた。１時間後、１００マイクロリットルの０．１Ｍ重亜硫酸ナトリウムを加えて反応を停止させた。未反応の同位体化合物を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５材料を用いてゲルクロマトグラフィーで除去した。未反応（non-reactor）化合物および標識化アルギン酸塩をガンマ計数器を用いて同定した。餌粒子を、１２５Ｉ２−ＭＰＨＢＩＭ−標識化アルギン酸塩で、実施例６におけるようにコーティングした。コーティングした餌粒子を海水中で５分間振盪し、水の試料の沈降後、ガンマ計数器での分析に用いた。６つ平行に分析し、そしてアルギン酸塩の損失は５．２％〜８．０％と測定された。したがって、給餌試験での実験的損失は、非常に少ないと判断される。なぜなら、幼生(larvae)は通常餌を数秒で消費するからである。
【００６９】
孵化したばかりのスポッティドウルフフィッシュの幼生（約０．３グラム）を１２個の容器に、それぞれ約８０匹入れた。容器の大きさは４０×２０ｃｍあり、そして容器を通る連続した水の流れが得られるように、一端から連続して流れる水が個別に供給された。水温は、実験中を通して８℃であった。消費されなかった餌および排泄物は連続的に除去された。３個の平行容器には各濃度でアルギン酸塩餌が入れられ、そして３個の容器には対照餌が入れられた。餌は、日中の間数回与えられ（約１時間毎）餌が制限要因とならないことを確実にした。１０日ごとに３０匹の幼生の重さを測定した。実験は６０日間続いた。「＊」印のついた棒は、有意差（ｐ＜０．０５）を示す。比成長速度の結果を図９に示す。
【００７０】
（実施例８）
ダービリア水抽出物アルギン酸塩（実施例５に記載されるとおり）を水に溶解し、そして市販の餌（Biomar Ecoweaner ＥＭＢ  １６２４４）の一部をベンチトップ流動床反応器で異なる量のアルギン酸塩溶液を噴霧コーティングした。乾燥餌粒子を、実施例７におけるように、異なる濃度のアルギン酸塩（０．０１％、０．０６％、および０．１０％）で戻した。
【００７１】
実験の開始前に、タラの幼生を合計で１０日間、慣らした。この最初の１０日間の間、幼生は全て対照餌を給餌され、そして０．５〜１．０ｇの重さに達した。実験開始の３日前に、幼生を、１２個の３０リットル円形容器（直径４０ｃｍおよび高さ６０ｃｍ）に各容器７０匹の幼生で分けた。各容器は、底にプラスチックのふるいを備えた。水の体積は、実験を通じて１５リットル〜２０リットルの間で変化した。同じ期間中、水温は、自然の海水温に従い、そして８〜１２℃上昇した。容器は、１分あたり約１．５リットルの個別の水供給および一定の光曝露を有した。消費されなかった餌は除去され、そして必要であれば容器は清掃された。幼生の重さを量るときに、容器は空にされて完全に清掃された。各容器での３０匹の幼生についての基準重量を、試験給餌の開始前に決定した。３個の平行容器には各濃度のアルギン酸塩餌が入れられ、そして３個の容器には対照餌が入れられた。餌は、日中の間数回与えられ（約１時間毎）、餌が制限要因とならないことを確実にした。
【００７２】
１０日ごとに３０匹の幼生の重さを測定した。実験は６０日間続いた。比成長速度は実施例５のように計算された。比成長速度の結果を図１０に示す。「＊」印のついた棒は、有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【００７３】
（実施例９）
実施例７でのスポッティドウルフフィッシュの幼生の成長研究における死亡率が記録され、そして図１１に示される。いずれの群の間にも有意差は測定されなかった（Ｐ＜０．０５）。
【００７４】
（実施例１０）
実施例８でのタラの幼生の成長研究における死亡率が記録され、そして図１２に示される。いずれの群の間にも有意差は測定されなかった（Ｐ＜０．０５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年3月26日(2010.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】１２週の期間にわたり本発明のアルギン酸塩を含む餌を与えられたブタの重量増加を示すグラフである。
【図２】本発明のアルギン酸塩で試験したブタにおける全白血球の血清レベルを、対照との比較として示すグラフである。
【図３】本発明のアルギン酸塩で試験したブタにおける単球の血清レベルを、対照との比較として示すグラフである。
【図４】本発明のアルギン酸塩で試験したブタにおけるリンパ球の血清レベルを、対照との比較として示すグラフである。
【図５】ダービリア水抽出物を給餌されたブタからの血液を用いて測定された食作用のレベルを、対照との比較として示す。
【図６】ダービリア水抽出物を給餌されたブタからの血液を用いて測定された活性酸素生成を、対照との比較として示す。
【図７】ダービリア標準抽出物、ダービリア水抽出物、およびレッソニア標準抽出物を給餌されたブタについて、注射されたヒト血清アルブミン実験用ワクチンに対する免疫応答を、対照との比較として示す。
【図８】６０日の期間にわたりダービリア水抽出物を含む餌を経口で給餌されたスポッティドウルフフィッシュの比成長速度（１日あたりの成長％）を対照群の比成長速度と比べて示す。
【図９】スポッティドウルフフィッシュの幼生の比成長速度の結果を示した図である。
【図１０】タラの幼生の比成長速度の結果を示した図である。
【図１１】スポッティドウルフフィッシュの幼生の成長研究における死亡率を示した図である。
【図１２】タラの幼生の成長研究における死亡率を示した図である。