(57)【要約】      （修正有）【課題】ペクチネイタス・ハイカラエを、正確、迅速、かつ簡便に識別できるプローブおよびプライマーの提供。【解決手段】特定な配列からなる塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・ハイカラエ検出用プローブまたはプライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・ハイカラエ（Pectinatus haikarae）検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、または配列番号１の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、
配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列の相補配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドであり、
配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドである、
請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーを少なくとも１種含んでなる、ペクチネイタス・ハイカラエ検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーと、配列番号３の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるペクチネイタス・ハイカラエ検出用プライマーとからなる、ペクチネイタス・ハイカラエ検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項７】
配列番号３の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号３の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、または配列番号３の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、請求項６に記載のプライマーセット。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブもしくはプライマー、または請求項５〜７のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・ハイカラエの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ペクチネイタス・ハイカラエの検出用プローブおよびプライマーに関し、詳細には、ペクチネイタス・ハイカラエの検出用のＰＣＲ法プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は深刻な問題をもたらす。製品となったビール中で増殖する菌種としてはラクトバチラス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）の乳酸菌の報告例が多いが、１９７０年代以降から、グラム陰性の偏性嫌気性細菌が混濁したビールから分離されている。ペクチネイタス属細菌（Pectinatus）は、ビール混濁能を持つ胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、ペクチネイタス・セレビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）、ペクチネイタス・フリシンゲンシス（Pectinatus frisingensis）、ペクチネイタス・ハイカラエ（Pectinatus haikarae）という菌種が提唱されている（Lee, S. Y. et al. 1978 International Journal of Systematic Bacteriology 28, 582-594、Haikara, A. et al. 1981 Applied and Environmental Microbiology 41, 511-517、Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27、Juvonen, R and Shihko, M. L. 2006 Int J Syst Evol Microbiol. 56(Pt 4), 695-702）。グラム陰性球菌の偏性嫌気性ビール混濁菌としては、メガスフェラ・セレビシェ（Megasphaera cerevisiae）（Weiss, N. et al. 1979 Brauwissenschaft 32, 189-194）、メガスフェラ・スーシエンシス（Megasphaera sueciensis）、メガスフェラ・パウシボランス（Megasphaera paucivorans）Juvonen, R and Shihko, M. L. 2006 Int J Syst Evol Microbiol. 56(Pt 4), 695-702）が報告されている。ザイモフィラス・パウシボランス（Zymophilus paucivorans）は、胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、遺伝学的背景がペクチネイタス属と近く、ビール製造に用いられる添加酵母から分離されている（Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27）。これらの細菌がビール中で増殖すると、混濁を起こすのみならず硫化水素や脂肪酸などの不快な香気成分を生産し、ビールの品質を著しく低下させる（Haikara, A. 1985 Monatsschr. fuer Brauwissenschaft 38, 239-243）。従って、これらの細菌を検出し、同定する技術はビール製造における品質管理に非常に重要である。
【０００３】
これまでに、ペクチネイタス・セレビシフィラスとペクチネイタス・フリシンゲンシスについてリボタイピングでハイブリダイズするＤＮＡ断片を比較してこれらの細菌の存在を同定する技術（特開平１０−２４３７９９号公報）が報告されている。また、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プライマー（特開２００４−１２１２５９号公報（特許文献１））、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスのそれぞれに優先的にハイブリダイズするプローブ、及びペクチネイタス属、メガスフェラ属、ザイモフィラス属、セレノモナス属菌に優先的にハイブリダイズするプローブ（特開２００１−１４５４９２号公報）、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の塩基配列を用いた検出用プライマー（特開２００１−２１８５９８号公報）、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プローブ（特開２００２−１７３５６号公報）、ペクチネイタス属の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プライマー（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス属ＤＳＭ２０７６４菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プライマー（ＷＯ９７／２００７１号公報）、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス属の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プライマー（特開２００１−１４５４９２号公報）、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プライマー（ＷＯ００／０９６８３号公報）、が報告されている。さらに、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子及び５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域の塩基配列から開発されたＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ用のプローブ（特表２００３−５１００９１号公報）、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を使ったネスティッドＰＣＲ法用のプライマー（特開２００５−６５５６号公報）が報告されている。
【０００４】
しかし、ペクチネイタス・ハイカラエを特異的に検出する手段は、まだ報告されていない。
【特許文献１】特開２００４−１２１２５９号公報
【発明の概要】
【０００５】
本発明者は、ペクチネイタス・ハイカラエの１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子において、種のレベルで保存され、かつペクチネイタス・ハイカラエに特異的な塩基配列を見出した。具体的には、ペクチネイタス・ハイカラエの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号３）において、配列番号１の塩基配列がペクチネイタス・ハイカラエに特異的であることを見出した。本発明者はまた、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス・ハイカラエ検出用ＰＣＲ法プライマーセットによってペクチネイタス・ハイカラエを正確に検出できることを見いだした。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００６】
本発明は、ペクチネイタス・ハイカラエを正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。本発明は、また、ペクチネイタス・ハイカラエの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）配列番号１の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・ハイカラエ（Pectinatus haikarae）検出用プローブまたはプライマー。
（２）配列番号１の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、または配列番号１の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（３）配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（４）配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列の相補配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドであり、配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（５）前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のプライマーを少なくとも１種含んでなる、ペクチネイタス・ハイカラエ検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（６）前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のプライマーと、配列番号３の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるペクチネイタス・ハイカラエ検出用プライマーとからなる、ペクチネイタス・ハイカラエ検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（７）配列番号３の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号３の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、または配列番号３の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、前記（６）に記載のプライマーセット。
（７’）配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号４〜７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号４〜７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、配列番号３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号４〜７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号４〜７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、前記（６）に記載のプローブまたはプライマー。
（７”）配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号４〜７の塩基配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドであり、配列番号３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号４〜７の塩基配列の相補配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドである、前記（６）に記載のプローブまたはプライマー。
（８）前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のプローブもしくはプライマー、または前記（５）〜（７）のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・ハイカラエの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【０００８】
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、ペクチネイタス・ハイカラエを正確に検出することができる。特に、本発明によるプライマーセットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、ペクチネイタス・ハイカラエを、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【０００９】
ペクチネイタス・ハイカラエは、ビール、発泡酒、およびワインなどの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【発明の具体的説明】
【００１０】
プライマー、プローブ、およびプライマーセット
本発明では、配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、並びに配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、ペクチネイタス・ハイカラエ検出用のプライマーやプローブとして用いることができる（以下、「本発明による第一の態様のプライマーまたはプローブ」ということがある）。
【００１１】
本発明では、また、配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、並びに配列番号３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、ペクチネイタス・ハイカラエ検出用のプライマーとして用いることができる（以下、「本発明による第二の態様のプライマー」ということがある）。
【００１２】
本発明による第二の態様のプライマーを、本発明による第一の態様のプライマーと組み合わせてＰＣＲプライマーとして使用する場合には、本発明による第二の態様のプライマーは、配列番号３の１〜１７７番目もしくは２３４〜１５３５番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドであることができ、好ましくは、配列番号３の２５３〜４５８番目、５１３〜５９６番目、６７１〜８２９番目、または８７３〜９３５番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドである。
【００１３】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００１４】
配列番号１の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜２５塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【００１５】
配列番号３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜２５塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【００１６】
配列番号１の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１２〜３０塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【００１７】
本発明では、配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号１の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）とすることができる。
【００１８】
本発明による第一の態様のプライマーおよびプローブの具体例としては、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、更にはこれらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１９】
本発明では、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、第一の態様のプライマーやプローブとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーやプローブとして用いることができることはいうまでもない。
【００２０】
本発明では、配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号３の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号３の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）とすることができるが、好ましくは、配列番号３の１〜１７７番目または２３４〜１５３５番目の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号３の１〜１７７番目または２３４〜１５３５番目の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）であり、より好ましくは、配列番号３の２５３〜４５８番目、５１３〜５９６番目、６７１〜８２９番目、または８７３〜９３５番目の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号３の２５３〜４５８番目、５１３〜５９６番目、６７１〜８２９番目、または８７３〜９３５番目の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である。
【００２１】
本発明による第二の態様のプライマーの具体例としては、配列番号４〜７のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチド、更にはこれらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２２】
本発明では、配列番号４〜７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号４〜７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、第二の態様のプライマーとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーとして用いることができることはいうまでもない。
【００２３】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００２４】
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２５】
配列番号４〜７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号４〜７の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号４〜７の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２６】
本発明においては、配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・ハイカラエを検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号３の塩基配列（好ましくは、配列番号３の１〜１７７番目または２３４〜１５３５番目の塩基配列、より好ましくは、配列番号３の２５３〜４５８番目、５１３〜５９６番目、６７１〜８２９番目、または８７３〜９３５番目の塩基配列）の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号３の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号３の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。
【００２７】
配列番号１の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号１の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる
【００２８】
配列番号３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号３の塩基配列（好ましくは、配列番号３の１〜１７７番目または２３４〜１５３５番目の塩基配列、より好ましくは、配列番号３の２５３〜４５８番目、５１３〜５９６番目、６７１〜８２９番目、または８７３〜９３５番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる
【００２９】
本発明においては、また、配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・ハイカラエを検出するためのプローブを選択することができる。
【００３０】
配列番号１の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号１の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１２個（例えば、１２〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプローブとして使用できる。
【００３１】
相同ポリヌクレオチド、並びに配列番号１および配列番号３の塩基配列やその相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００３２】
相同ポリヌクレオチド、並びに配列番号１および配列番号３の塩基配列やその相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００３３】
本願明細書において、「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００３４】
本発明による第一の態様のプローブまたはプライマーの好ましい態様としては、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号２の塩基配列からなり、かつ配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３５】
本発明による第二の態様のプライマーの好ましい態様としては、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号７の塩基配列からなり、かつ配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３６】
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットの好ましい態様としては、本発明による好ましい第一の態様のプライマーと、本発明による好ましい第二の態様のプライマーとからなる、ＰＣＲ法プライマーセットが挙げられる。
【００３７】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００３８】
本発明によるプライマーおよびプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M. et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００３９】
本発明によるプライマーセットは、単独で使用しても、他のプライマーセットと適宜組み合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施することにより、ペクチネイタス・ハイカラエをより正確に区別して検出することが可能となる。
【００４０】
本発明によるプライマーセットは、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、本発明によるプライマーセットを含んでなる、ペクチネイタス・ハイカラエの検出キットが提供される。
【００４１】
本発明によるプライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法等による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００４２】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、各種飲料（例えば、酒類）の品質低下の原因となる偏性嫌気性細菌を正確に識別することができる。ペクチネイタス・ハイカラエは、ビール、発泡酒、およびワインの製造工程あるいは最終製品の品質に影響する能力を持つ細菌種である。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００４３】
検出方法および判定方法
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、ペクチネイタス・ハイカラエの検出に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・ハイカラエの検出方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、ペクチネイタス・ハイカラエの検出方法が提供される。
【００４４】
ペクチネイタス・ハイカラエは各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）を混濁させる原因菌である。従って、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、ペクチネイタス・ハイカラエの検出のみならず、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の混濁可能性の判定に用いることができる。すなわち、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットによりペクチネイタス・ハイカラエが検出された場合には、混濁菌が試料中に存在していると、あるいは試料が混濁する見込みがあると判定することができる。
【００４５】
従って、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００４６】
ここで、ハイブリダイゼーションの検出方法は周知であり、その検出のための装置、器具は市販のものを用いることができる。ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、ＰＣＲ法など周知の核酸増幅法を使用して増幅産物の有無等を検出することにより、あるいはサザンブロット法など周知の核酸検出法を使用してハイブリダイゼーション複合体の有無等を検出することにより、実施することができる。
【００４７】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＰＣＲ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００４８】
すなわち、本発明によれば、
（ａ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・ハイカラエの存在を示す、ペクチネイタス・ハイカラエの検出方法が提供される。
【００４９】
本発明によれば、また、
（ａ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００５０】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００５１】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＰＣＲ法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればＰＣＲ法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、ＰＣＲ法を実施することができる。
【００５２】
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００５３】
すなわち、本発明によれば、
（ａ’）本発明のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ’）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス・ハイカラエの存在を示す、ペクチネイタス・ハイカラエの検出方法が提供される。
【００５４】
本発明によれば、また、
（ａ’）本発明のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ’）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００５５】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素（例えば、３２Ｐおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素反応に関与する分子（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。
【００５６】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体の検出に先立って、未結合プローブやハイブリダイズしないその他の成分を除去してもよい。
【００５７】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、ペクチネイタス・ハイカラエの識別に用いることができる。
【００５８】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００５９】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【００６０】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００６１】
これらをＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする細菌株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする細菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白  核酸  酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００６２】
本発明によるペクチネイタス・ハイカラエの検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００６３】
まず、試料中に存在すると考えられるペクチネイタス・ハイカラエを適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＰＣＲ法を実施し、ペクチネイタス・ハイカラエの特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６５】
実施例：ペクチネイタス・ハイカラエの検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出した。１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）２７μlを加えて混和することで中和した後、遠心分離した上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０７ｃｆｕ／ｍｌ程度であった。
【００６６】
（ｂ）ＰＣＲ用プライマーの合成
ペクチネイタス・ハイカラエ用プライマーを、ホスホアミダイド法で化学合成した（化学合成はシグマアルドリッチジャパン株式会社に委託）。
［プライマーセット１］
正規鎖側プライマー：    GTAAGAGTAC TGCATGGTAC  （配列番号２）
逆鎖側プライマー  ：    CCGTCAATTC CTTTGAGTTT  （配列番号７）
【００６７】
（ｃ）ＰＣＲ反応溶液の調製およびＰＣＲ反応
ゲノムＤＮＡ溶液１μlに、１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μl（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  ｅｘＴａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液４μl（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  ｅｘＴａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）、正規鎖側プライマー２０ｐｍｏｌ、逆鎖側プライマー２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  ｅｘＴａｑ）０．２５μlを加え、水で５０μlとし、これをＰＣＲ反応溶液とした。
【００６８】
（ｄ）ＰＣＲ反応
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを２５サイクル繰り返し反応させた。
【００６９】
反応溶液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムによる染色を行った。電気泳動は２％のアガロースゲルを使用し、ＴＡＥバッファーの中、１００ボルトで３０分間行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分間浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この時、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流して相対比較することにより、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。
【００７０】
（ｅ）ペクチネイタス・ハイカラエ用プライマーの特異性評価
ペクチネイタス・ハイカラエ用プライマーとして開発したプライマーセット１について、各種偏性嫌気性菌標準株を用いてＰＣＲ法で特異性を評価した。その結果、プライマーセット１は、ペクチネイタス・ハイカラエの菌株と反応させた場合にのみＤＮＡ増幅が観察された（表１）。
【表１】
2010110300.tif 000002
なお、表中の＋は、約７５０塩基対に相当する大きさの増幅物（すなわち、配列番号３の１８０〜９３５番目の塩基配列に相当）が観察されたことを示している。
【００７１】
以上により、ペクチネイタス・ハイカラエに対して作成した本発明によるプライマーセットは、検査対象とするペクチネイタス・ハイカラエを菌種レベルで正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけで、ペクチネイタス・ハイカラエを同定・検出することができる。
【配列表】
2010110300000001.app