(57)【要約】      （修正有）【課題】ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）とエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の両高度不飽和脂肪酸を、海洋性微細藻体のうちのプラシノ藻という一つの藻体によって、複雑な精製過程を経ることなく、無臭かつ高い生産性で製造する方法を提供する。【解決手段】海洋性微細藻類のプラシノ藻の藻体を前培養した後、該プラシノ培養藻体に栄養塩としての窒素源および／又はリン酸一水素二カリウム等のリン源を添加・培養して生育させ、該プラシノ生育藻体からＤＨＡ及びＥＰＡの双方を生産する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
海洋性微細藻類のプラシノ藻の藻体を前培養した後、該プラシノ培養藻体に栄養塩としての窒素源および／又はリン源を添加・培養して生育させ、該プラシノ生育藻体からドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の双方を生産することを特徴とするプラシノ藻によるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の生産方法。
【請求項２】
上記窒素源として硝酸カリウムが、上記リン源としてリン酸一水素二カリウムが選択される請求項１に記載のプラシノ藻によるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、海洋性微細藻類のうち、プラシノ藻を利用したドコサヘキサエン酸（以下、「ＤＨＡ」という。）及びエイコサペンタエン酸（以下、「ＥＰＡ」という。）の生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年、油脂の栄養研究が進み、これまで知られていなかった高度不飽和脂肪酸の生理機能が解明されつつある。高度不飽和脂肪酸にはＤＨＡやＥＰＡなどのｎ−３系と、月見草オイルやボラージオイルなどのｎ−６系があるが、その中で特に注目されているのがＤＨＡとＥＰＡである。ＤＨＡやＥＰＡは、ガンへの予防効果、中性脂肪・コレステロールの低減など様々な生理活性を有する。ＤＨＡ，ＥＰＡの供給源はイワシ、マグロ、サバなど主に魚由来であるが、魚由来のものは魚油特有の味や臭い、複雑な精製過程、重金属やダイオキシンをはじめとする環境汚染による品質低下が懸念されていることから、微細藻類由来のＤＨＡ，ＥＰＡが注目されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  微細藻類を用いたＤＨＡやＥＰＡの生産性研究においては、ある種の藻体のＤＨＡ生産株であるＩｓｏｃｒｙｓｉｓ  ｏｆｆｇａｌｂａｎａを培養する生産方法やＥＰＡ生産株であるＭｏｎｏｄｕｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓを培養する方法が知られている。しかし、いずれの生産株もＤＨＡ，ＥＰＡのどちらか一方しか持っていないため、片方のみの生産になってしまい、またその藻体にも特有の臭いがあるため、得られたＤＨＡあるいはＥＰＡにしてもその臭いが残ってしまっている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  海洋性微細藻類のうち、４種類のものにＤＨＡとＥＰＡの両者を含有することは知られ  ているが、本発明者は、これらのうちプラシノ藻にそれらの含有率が最も高く、かつプ  ラシノ藻が無臭であることを知得し、このプラシノ藻を培養することでＤＨＡとＥＰＡ  双方の高い生産性が得られるのではないかとのとの発想を具体化させたものである。【０００５】  すなわち本発明は、海洋性微細藻類のプラシノ藻の藻体を前培養した後、該プラシノ培養藻体に栄養塩としての窒素源および／又はリン源を添加・培養して生育させ、該プラシノ生育藻体からドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の双方を生産することを特徴とするプラシノ藻によるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の生産方法である。
【発明の効果】
【０００６】  ＤＨＡとＥＰＡの両方の高度不飽和脂肪酸を、海洋性微細藻類のうちのプラシノ藻という一つの藻体によって複雑な精製過程を経ることなく高い生産性で生産でき、かつ、無臭のＤＨＡとＥＰＡが得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】  本発明方法で用いられるプラシノ藻としては、本発明者がプラシノ藻の中から特にＤＨＡ及びＥＰＡの含有率の高い藻体を抽出し、これを「ＳＫ０８０１」と名付けたものを選択するのが好ましいが、これよりは含有率の劣るプラシノ藻を用いることも元より可能である。【０００８】  本発明方法でプラシノ藻の藻体に添加される栄養源である窒素源としては硝酸カリウム（ＫＮＯ３）が、リン源としてはリン酸一水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）がそれぞれ選択される。【０００９】    プラシノ藻の培養に用いるＥｓｅ培地は、栄養添加人工海水培地Ｅｐｐｌｅｙ培地にＳｏｉｌ  Ｅｘｔｒａｃｔを添加調整したものが用いられる。培地中の栄養塩の濃度は、ＫＮＯ３の場合で０．２５〜２．５ｍＭ、Ｋ２ＨＰＯ４で０．００５〜０．３５ｍＭが好ましい。【００１０】  プラシノ藻の藻体は、Ｅｓｅ培地により前培養された後、上記各栄養塩の濃度調整をしたＥｓｅ培地に植菌してさらに培養し、培養中の生育量の測定と比増殖速度の測定を経て、定常期に入った藻体を乾燥試料にする。そして、この乾燥試料を所定量秤量し、所定の方法で所定の機器を用いて脂肪酸分析行ない、ＤＨＡ及びＥＰＡの生産性を求める。
【実施例】
【００１１】「実施例１」硝酸カリウム（ＫＮＯ３）によるＤＮＡ及びＥＰＡの生産
（１）試薬
本実施例で使用した試薬は市販特級品及び市販一級品を用いた。蒸留水はオートスチール（商品名「アクエリアスＧＳ−２０００」  ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用い、イオン交換水を蒸留したものを用いた。培養に用いた水は、水１Ｌに人工海塩（商品名「潮」  光アクリウム社製）を３４．５ｇ溶かしたものを用いた。【００１２】（２）藻体の前培養
藻体は鹿児島県硫黄島から採取した海洋性微細藻類プラシノ藻ＳＫ０８０１を用いた。Ｅｓｅ培地は、栄養添加人工海水培地Ｅｐｐｌｅｙ培地にＳｏｉｌ  Ｅｘｔｒａｃｔを１０ｍｌ／Ｌ添加し調整した。培地はオートクレープ（商品名「ＫＳ−３２２」  ＴＯＭＹ社製）を用いて１２１℃１０分間減菌処理を施した。藻体の前培養は、１Ｌの三角フラスコを用い、培養条件は培養温度２５±２℃、光強度１４０μＥ／ｍ２・ｓ、通気量１ｍＬ（ａｉｒ）ｍＬ・ｍｉｎの条件下で行った。【００１３】（３）培地中の窒素源である硝酸カリウム（ＫＮＯ３）濃度の検討
藻体の培養は大型試験管（Φ３０ｍｍ，２００ｍｍ）を用い培地量を５０ｍＬとし、Ｅｓｅ培地におけるＫＮＯ３濃度を０，０．２５，１．０，２．５ｍＭに調整した。培地条件は前培養と同様にし、培養を行った。【００１４】（４）植菌
前培養において定常期に達した藻体を植菌に用いた。植菌量は前培養の藻体を分光光度計による７５０ｎｍでの濁度を測定し、以下の式に代入し求めることにより、培養初期濃度を一定にした。
植菌量（ｍＬ／Ｌ）＝１０÷吸光度（ａｔ７５０ｎｍ）【００１５】（５）生育量測定
本藻体の生育量は濁度法を用いて測定を行った。濁度法は、細菌，酵母など単細胞に適用される迅速で正確な方法であり、この方法は細胞という粒子の濃度によって光の透過度が異なることを利用して細胞の量を測定する。生育量は以下の式により得られる。
生育量（ｇ  ｃｅｌｌ／Ｌ）＝吸光度（ａｔ７５０ｎｍ）×生育係数
生育係数は藻体ごとに異なるため、各濁度での体積当たりの乾燥細胞重量を測定し生育係数を求めた。その結果、プラシノ藻の濁度法による生育量を求める式は以下のようになった。
生育量（ｇ  ｃｅｌｌ／Ｌ）＝吸光度（ａｔ７５０ｎｍ）×０．１９【００１６】（６）比増殖速度
細胞の量は反応速度論的表示によれば細胞速度として表わすのが適切であり、それをＸ（ｇ  ｃｅｌｌ／Ｌ）とすると、反応速度ｒｘは、
ｒｘ∝Ｘ
となる。ここで比例定数は増殖の活性を表わす係数であり、比増殖速度といい、一般にμで表される。比増殖速度は濁度法によって測定した生育量と測定日数を以下の式に代入することにより求めた。なお、Ｘは生育量（ｇ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、ｔは培養日数である。
μ＝Ｉｎ（Ｘｔ／Ｘ０）／ｔ【００１７】（７）乾燥試料の作製
定常期に入った藻体に１４００×ｇで３分間遠心分離を施し、上澄みを取り除いた後に３％ＮａＣｌ水溶液で洗い込みをした。再び１４００×ｇで２分間遠心分離を施し、上澄みを取り除き−３０℃で１日凍結させた後、凍結乾燥機で乾燥させ乾燥試料とした。【００１８】（８）脂肪酸分析
乾燥試料１０ｍｇ精秤し、標準物質としてペプタデカン酸を０．５ｍｇ加え、さらに５％ＨＣｌ−ＭｅＯＨを１ｍＬ加え、１００℃で３時間還流することにより、藻体中の脂肪酸をメチルエステル化させた。室温まで放冷した後、ｎ−ヘキサンを１ｍＬ加え５分間攪拌し静置した。静置し、２層に分離した内の上層ｎ−ヘキサン層を移し、減圧濃縮を行った。その後、無水硫酸ナトリウムを加え脱水を行った。得られたサンプルはガスクロマトグラフィー（商品名「Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−１４」  島津製作所製）を用いて脂肪酸分析を行った。分析条件は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ：Ｆｒａｍｅ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いてカラム（３０ｍ×０．２５２ｍｍ  ＯＶ−１７  Ｊ＆Ｗ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）温度１５０〜２７５℃、初期温度保持時間１分、温度上昇速度５℃／ｍｉｎ、最終温度保持時間０分、気化室および検出器温度２００℃とした。各脂肪酸の定性は市販の標準物質を用いて、各保持時間を求めることにより行ない、定量は内標準物質のピーク面積との比較により行なった。【００１９】  各ＫＮＯ３濃度で検討を行ったときの生育量を図１に、最大比増殖速度を図２に示す。ＫＮＯ３濃度１．０ｍＭにおいて最も高い生育量を示し０．２０ｇ  ｃｅｌｌ／Ｌであった。窒素源を加えなかった培養では生育が確認できなかった。１．０，２．５ｍＭは０．２５，０．５ｍＭのときと比べて定常期の期間が短いことが確認された。図２から、最大比増殖速度は１．０ｍＭのとき最も高い値１．４５ｄａｙ−１を示した。一般に、藻体は高い窒素濃度下において増殖速度に阻害作用を示すことが知られているが、本藻体では濃度が高くなるにつれて上昇していることから、高濃度になっても増殖速度を阻害しないと考えられる。ＤＨＡおよびＥＰＡ含有量を図３に示す。０．５ｍＭのときにＤＨＡ、ＥＰＡともに最も高い含有量を示し、それぞれ乾燥試料１ｇ当たり５．５ｍｇと１３．３ｍｇであった。生産性は、これまでに得られた定常期における最大生育量、最大比増殖速度、各脂肪酸の含有量を掛けることにより求めた。求めた生産性を図４に示す。１．０ｍＭのときＤＨＡ，ＥＰＡ共に最も高い生産性を示し、それぞれ０．６，１．９ｍｇ／Ｌ・ｄａｙであった。また、ＤＨＡの生産性において０．５ｍＭと１．０ｍＭで同様の値を示した。ＤＨＡ，ＥＰＡの生産性において、共に１．０ｍＭのときに最も高い生産性を示したことから、ＫＮＯ３濃度はＤＨＡおよびＥＰＡの合成経路に同様に作用すると考えられる。【００２０】  大型試験管を用いて、Ｅｓｅ培地におけるＫＮＯ３濃度をそれぞれ０，０．０２５，０．５，１．０，２．５ｍＭに調整し、プラシノ藻のＤＨＡおよびＥＰＡの生産性の検討を行った結果、ＤＨＡ，ＥＰＡ共に１．０ｍＭが最適濃度であることが確認された。そして、１．０ｍＭにおける生産性は、ＤＨＡ，ＥＰＡそれぞれ０．６，１．９ｍｇ／Ｌ・ｄａｙであった。【００２１】「実施例２」リン酸一水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）によるＤＨＡ及びＥＰＡの生産
藻体の培養は、実施例１と同様の大型試験管（Φ３０ｍｍ，２００ｍｍ）を用い培地量を５０ｍＬとし、Ｅｓｅ培地におけるリン源Ｋ２ＨＰＯ４濃度を０．０５，０．１０，０．２５ｍＭに調整した。培養条件は前培養と同様にし、培養を行った。なお、試薬、藻体の前培養、植菌、生育量の測定、比増殖速度、乾燥資料の作成及び脂肪酸分析については実施例１に準じる。【００２２】  培養の結果、生育量の変化を図５に、最大比増殖速度を図６に示す。図６に示すように、いずれの濃度でも高い生育量を示し、最大で０．１４ｇ  ｃｅｌｌ  ／Ｌであった。また、最大比増殖速度についても、濃度に差のない高い値をそれぞれ示し、最大で１．５６ｄａｙ−１であった。脂肪酸含有量を図７に、得られた生産性を図８に示す。脂肪酸含有量についても、各濃度での差異は殆んどなく、藻体中のＤＨＡ，ＥＰＡの含有量はそれぞれ６．７，１２．８ｍｇ／ｇｄ．ｗ．ｃと高い値を示した。得られた結果から生産性を求めると、Ｋ２ＨＰＯ４濃度０．０５〜０．２５ｍＭの範囲でほぼ一定の値を示し、ＤＨＡは１．３ｍｇ／Ｌ・ｄａｙ、ＥＰＡは２．７ｍｇ／Ｌ・ｄａｙであった。【００２３】「実施例３」硝酸カリウム（ＫＮＯ３）とリン酸一水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）との二重栄養制御によるＤＨＡ及びＥＰＡの生産
Ｅｓｅ培地におけるＫＮＯ３とＫ２ＨＰＯ４濃度を以下に示す表に従い調整した。表１中、ＫＮＯ３濃度０．５ｍＭ、Ｋ２ＨＰＯ４濃度０．０５ｍＭで調整したものをｃｏｎｔｒｏｌとした。なお、試薬、藻体の前培養、植菌、生育量の測定、比増殖速度、乾燥資料の作成及び脂肪酸分析については実施例１に準じる。【００２４】
【表１】
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【００２５】  上記の二重栄養制御による培養を行い得られた生育量、比増殖速度をそれぞれ図９及び図１０に示す。図９に示すように、▲５▼、▲６▼、▲９▼、▲１０▼の培地組成において０．１８〜０．２０ｇ  ｃｅｌｌ／Ｌの高い生育量を示し、▲１０▼のとき最大生育量０．２０ｇ  ｃｅｌｌ／Ｌであった。比増殖速度については、図１０に示すように、▲４▼〜▲７▼とｃｏｎｔｒｏｌにおいて１．８５〜２．０１ｄａｙ−１の高い比増産速度を示し、▲４▼のとき最も高い比増産比率２．０１ｄａｙ−１だった。一般に、藻体は富栄養下では栄養素の取り込み能は低く、貧栄養下では取り込み能が高くなる。このことから、ＫＮＯ３とＫ２ＨＰＯ４の濃度ともに最も低い▲７▼の比増殖速度が高くなったと考えられる。また、リン濃度の高い▲４▼、▲５▼、▲６▼においても高い比増殖速度を示したことから、二重栄養制御においてリン濃度は栄養素の取り込み速度、増殖速度に作用し、濃度が高いほど増殖速度は高くなると考えられる。【００２６】  脂肪酸分析により得られた脂肪酸含有量、脂肪酸含有率をそれぞれ図１１、図１２に示す。図１１に示すように、脂肪酸含有量について、ＤＨＡ、ＥＰＡ共に▲５▼のときに最も高い含有量を示し、それぞれ９．２，２０．０ｍｇ／ｇｄ．ｗ．ｃであった。また、図１２に示すように、ＤＨＡ及びＥＰＡの総脂肪酸量（ＴＦＡ）における含有率に関して、含有量と比べると各培養条件による差は少なく、ＥＰＡに関しては１４〜１６％の間でほぼ一定の値をとり、ＤＨＡに関しては▲４▼、▲５▼で７．５％と最も高い含有率を示した。脂肪酸分析の結果より、各培養条件におけるＤＨＡ、ＥＰＡの含有量の変化とＴＦＡの含有量の変化が同様に変化しており、ＤＨＡ、ＥＰＡの脂肪酸含有率もほぼ一定の値を示していることから、本実施例の培養条件においては、ＤＨＡ、ＥＰＡの含有量の変化は藻体中の脂肪酸組成の変化に因るものではなく、ＴＦＡの変化に依存していると考えられる。よって、Ｎ／Ｐの物質量比は総脂肪酸の生合成に大きな影響を与えると考えられる。図１３に、生育量、比増殖速度、脂肪酸含有量から算出した生産性を示す。この図から分かるように、ＤＨＡ、ＥＰＡ共に▲５▼のとき最も高い生産性を示し、それぞれ３．２，７．０ｍｇ／Ｌ−ｄａｙであった。【００２７】  Ｋ２ＨＰＯ４濃度をさらに高濃度（０．３５ｍＭ）にした場合の生産性の結果を図１４に、比増殖速度の結果を図１５に示す。生産性については、ｃｏｎｔｏｒｏｌと▲１２▼において高い生育量を示し、それぞれ０．１４ｇ  ｃｅｌｌ／Ｌであった。また、比増殖速度では、▲１１▼、▲１２▼が高い値を示し▲１２▼のとき最も高い比増殖速度１．９７ｄａｙ−１だった。【００２８】  また、Ｋ２ＨＰＯ４濃度を０．３５ｍＭにした場合における脂肪酸含有量を図１６に、ＤＨＡ、ＥＰＡの生産性を図１７に示す。図１６に示すように、ＤＨＡ、ＥＰＡの含有量は、▲１２▼の場合が▲５▼の培養条件に続く高い値を示し、それぞれ６．７，１８．６ｍｇ／ｇｄ．ｗ．ｃであった。また、ＤＨＡ、ＥＰＡの生産性も、図１７に示すように、▲１２▼が▲５▼の培養条件に続く高い値を示し、それぞれ１．８，５．０ｍｇ／Ｌ・ｄａｙであった。【００２９】  上記のＫＮＯ３とＫ２ＨＰＯ４との二重栄養制御による結果から、Ｎ／Ｐの物質量比が、藻体の生産量、比増殖速度、ＤＨＡ、ＥＰＡの合成に影響を及ぼすことが考えられるため、各培地組成の物質量比を表２に示した。【００３０】
【表２】
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【００３１】  表２に示すように、ＤＨＡ，ＥＰＡ共に生産性の高かった▲５▼の培地組成が、物質量比でＮ／Ｐ＝４となっていることが分かる。すなわち、窒素源、リン源の濃度に加え、Ｎ／Ｐの物質量比にも着目し、Ｎ／Ｐ＝４の物質量比の場合がプラシノ藻のＤＨＡ及びＥＰＡの生産において最適培養条件となることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】  本発明方法の第一の実施例であって、各ＫＮＯ３濃度で検討を行ったときのプラシノ藻の生育量の変化を示す図である。
【図２】  同藻の最大比増殖速度を示すグラフである。
【図３】  同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの含有量を示すグラフである。
【図４】  同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの生産性の変化を示すグラフである。
【図５】  本発明方法の第二の実施例であって、各Ｋ２ＨＰＯ４濃度で検討を行ったときのプラシノ藻の生育量の変化を示す図である。
【図６】  同藻の最大比増殖速度を示すグラフである。
【図７】  同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの含有量を示すグラフである。
【図８】  同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの生産性の変化を示すグラフである。
【図９】  本発明方法の第三の実施例であって、ＫＮＯ３とＫ２ＨＰＯ４の二重栄養濃度で行ったときのプラシノ藻の生育量の変化を示す図である。
【図１０】  同藻の最大比増殖速度を示すグラフである。
【図１１】  同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの含有量を示すグラフである。
【図１２】  同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの含有率を示すグラフである。
【図１３】  同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの生産性を示すグラフである。
【図１４】  Ｋ２ＨＰＯ４の濃度を上げた場合の同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの生産量の変化を示す図である。
【図１５】  Ｋ２ＨＰＯ４の濃度を上げた場合の同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの最大比増殖速度を示すグラフである。
【図１６】  Ｋ２ＨＰＯ４の濃度を上げた場合の同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの含有量を示すグラフである。
【図１７】  Ｋ２ＨＰＯ４の濃度を上げた場合の同藻によるＤＨＡ及びＥＰＡの生産性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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