(57)【要約】【課題】ＨＰＶに基づいた疾患の段階を評価するための方法を提供する。【解決手段】ＨＰＶ感染患者においてＨＰＶ誘導性の前癌、を検出する方法であって、患者から集められた試料の初期遺伝子および後期遺伝子の発現ｍＲＮＡレベルを測定して特定の遺伝子の発現レベルの比を計算することを含み、その比がＨＰＶ誘導性の前癌、を示す、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ感染患者においてＨＰＶ誘導性の前癌を検出する方法であって、以下の工程：
該患者から集められた試料のＨＰＶ発現ｍＲＮＡレベルを測定し、ここでｍＲＮＡはＥ６  ｍＲＮＡおよびＥ７  ｍＲＮＡからなる第１のｍＲＮＡ、およびＬ１  ｍＲＮＡおよびＥ２  ｍＲＮＡからなる第２のｍＲＮＡを含む、工程；
Ｌ１またはＥ２に対するＥ６＋Ｅ７の比が決定されるように、Ｅ６＋Ｅ７の発現レベルおよびＬ１またはＥ２の発現レベルを決定し、ここで４よりも大きな比がＨＰＶ誘導性の前癌を示している、工程
を含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には細胞学的および分子アッセイの分野に、特に、ＨＰＶ誘導癌腫の診断および予後のための敏感なアッセイを用いる、疾患評価のためのアッセイ領域に関している。
【背景技術】
【０００２】
疾患の検出および診断は、疾患処置のために明らかに重要である。疾患の多くの特性が同定されており、多くが疾患診断に使用されている。多くの疾患は感染細胞の状態変化が先に起こり、および状態変化により特徴付けられる。変化には感染細胞におけるウイルス遺伝子の発現、感染細胞における遺伝子発現パターンの変化、および細胞形態学の変化が含まれる。疾患の検出、診断およびモニタリングはそのような細胞状態の評価により可能である。
【０００３】
本発明の一つの態様は、ヒト皮膚および粘膜の良性上皮性増殖を含み、および肛門性器異常増殖癌腫に関連するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に関している。ＨＰＶの無傷のＤＮＡは超らせん状であり、それ故、ねじれた電話コードの無限ループに似ている。この骨組みの内側に、ウイルスＤＮＡは細胞核からのタンパク質、ヒストンおよび関連ペプチド中におよび囲まれて、細胞クロマチンに似た構造に入れられている。（Ｔｕｒｅｋ，（１９９４））。現在までに特徴付けられているヒトパピローマウイルスは皮膚、口角、咽頭および最も重要には肛門性器粘膜の上皮層に制限されている病変に関連している。特異的ヒトパピローマウイルス型（ＨＰＶ６および１１を含む）はしばしば良性粘膜病変を起こし、一方、他の型（ＨＰＶ１６、１８および他の株の宿主）は主として重度の病変および癌に観察されている。すべてのヒトおよび動物パピローマウイルスは、個々のウイルス遺伝子の機能およびそれらの調節は異なってはいるが、類似した遺伝的機構を共有しているようである。子宮頚癌に関連する最も共通の生殖器ＨＰＶ型、ＨＰＶ１６が最も広範囲に研究されている。
【０００４】
ＨＰＶのすべての大きな読み取り枠（ＯＲＦ）は一つのＤＮＡ鎖に存在する。パピローマウイルスｍＲＮＡは感染細胞中で単に一本鎖から転写されるようである。ウイルスゲノムは３つの領域に分割できる；ＨＰＶ複製および遺伝子発現のための制御配列を含む上流調節領域（ＵＲＲ）またはロング制御領域（ＬＣＲ）、中でもＥ２、Ｅ６およびＥ７遺伝子をコードしているウイルス初期遺伝子領域、およびＬ１およびＬ２遺伝子をコードしている後期領域。（Ｔｕｒｅｋ，（１９９４））。
【０００５】
重度な前癌疾患または癌におけるＨＰＶ遺伝子発現は、多分ウイルスＥ６およびＥ７遺伝子により誘導される細胞分化停止のため、初期遺伝子に限定されるようである。活性なＨＰＶ感染と比較して、癌におけるＥ６およびＥ７遺伝子制御はウイルスＵＲＲにおいては突然変異により、組込まれたウイルス断片においてはウイルスＥ２遺伝子の崩壊（Ｅ６およびＥ７ｍＲＮＡの安定化）および細胞組込み部位での影響により乱されている。
【０００６】
Ｅ２遺伝子は侵襲性子宮頚癌における組込まれたＨＰＶ断片中で崩壊または不活性化されており（Ｃｕｌｌｅｎ，（１９９１）；Ｄｕｒｓｔ，（１９８５）；Ｍａｔｓｕｋｕｒａ，（１９８９）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｇａｄｉｃｋｅ，（１９８６）；Ｓｃｈｗａｒｚ（１９８５）；Ｗｉｌｃｚｙｎｓｋｉ，（１９８８））、制御されないＥ６およびＥ７発現のため、Ｅ２の喪失は感染細胞へ選択的増殖の利点を授けていると予想されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｇａｄｉｃｋｅ，（１９８６）；Ｓｃｈｗａｒｚ（１９８５））。実際、複製しているＨＰＶゲノムを含んでいる子宮頚細胞は、培養において組込まれたウイルスゲノムを含む細胞のため急速に分裂および増殖するが（Ｊｅｏｎ（１９９５））、最近までその基礎となる機構はわかっていなかった。完全長ＨＰＶ１６Ｅ２遺伝子産物はいくつかのウイルスにおいてＨＰＶ１Ｅ２に匹敵する強力な転写アクチベーターであるばかりでなく単純には、合成プロモーターでもある（Ｄｅｍｅｒｅｔ（１９９４）；Ｕｓｈｉｋａｉ（１９９４））。
【０００７】
遺伝子Ｅ６およびＥ７は腫瘍発生活性を持っていると考えられている。コードされているタンパク質は、細胞サイクル制御に関係する細胞性タンパク質の生理学的機能と相互作用して妨害する。ＨＰＶ１６、１８および関連する型のＥ６／Ｅ７タンパク質はこの点に関して最も能率的である。これらの活性のいくつかは恒久的に感染しているヒト細胞の遺伝子不安定性を導いている。これは細胞性癌原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子突然変異の確率を促進し、腫瘍進行に寄与する。ＨＰＶ感染の細胞内監視、ウイルスＤＮＡの組込みおよびウイルス転写制御配列の欠損または突然変異に向けられた細胞遺伝子の突然変異は、Ｅ６／Ｅ７遺伝子発現の増加を導き、それは上皮内異常増殖および癌の一致した特性である。ウイルス腫瘍性タンパク質により起こされる遺伝子不安定性、およびウイルスおよび細胞性ゲノムの突然変異により起こされる腫瘍性タンパク質発現の自己触媒的増加は、ウイルスが癌腫進行の主とした推進力であることの証拠である。
【０００８】
粘膜表面に感染するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の個々の型が子宮頚部、肛門、陰茎、喉頭および口腔の癌腫、しばしば爪周囲癌腫ならびに良性生殖器上部いぼの病因と示唆されてきた。特定のＨＰＶ型の同定が悪性腫瘍へ進行する危険性がある前癌病変患者の同定に使用されている。ヒトパピローマウイルスに感染したヒトの一部では目に見える肛門性器病変が存在するが、ＨＰＶ生殖管感染を持つ個体の大多数は臨床的に明らかな疾患を持っていず、子宮頚部スミア物の細胞形態学的形質分析がＨＰＶ感染の検出に使用できる。血清学的アッセイおよび細胞培養における増殖を含む伝統的ウイルス検出は商業的に利用可能ではなくおよび／またはＨＰＶ感染の診断および追跡には適していない。パパニコロー試験は有益なスクリーニング手段であるが、ＨＰＶ感染患者の大部分は陰性である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Turek, Adv Virus Res. :44 305-356 (1994)
【非特許文献２】Cullen et al., J. Virol. 65 (2): 606-6121991)
【非特許文献３】Durst et al., J. Gen. Virol. :66 1515-1522 (1985)
【非特許文献４】Matsukura et al., Virology 172 (1) : 63-72 (1989)
【非特許文献５】Schneider-Gadicke et al., EMBO J. 5: 2285-2292 (1986)
【非特許文献６】Schwarz, et al., Nature :314 111-114 (1985)
【非特許文献７】Wilczynski et al., Virology :166 624-267 (1988)
【非特許文献８】Jeon et al., J Virol. 69 (5): 2989-2997 (1995)
【非特許文献９】Demeret et al., J. Virol. 68 (1) : 7075-7082 (1994)
【非特許文献１０】Ushikai et al., J. Virol. 68 (1): 6655-6666 (1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それ故、ＨＰＶに基づいた疾患の段階を評価するための方法を提供するのが本発明の一つの目的である。
ＨＰＶに基づいた疾患の予後的および診断的評価の正確性および信頼性を改良するために他のアッセイと組み合わせることができるアッセイを提供するのが本発明の別の目的である。
【００１１】
ＨＰＶに感染した患者がＨＰＶに基づいた疾患を発生する危険度を評価するための方法を提供するのが本発明のさらに別の目的である。
現在ＨＰＶに感染してはいるが、検出可能なＨＰＶに基づいた疾患がない患者を、疾患進行の危険性のある患者および疾患進行の危険度のない患者へ階級分けするための方法を提供するのが本発明の別の目的である。
【００１２】
ＨＰＶに基づいた疾患を持っている患者の処置計画を同定するための方法を提供するのも本発明の目的である。
ＨＰＶに基づいた疾患処置の有効性をモニタリングするための方法を提供するのも本発明の別の目的である。
【００１３】
ＨＰＶに基づいた疾患の段階を評価するためのキットを提供するのも本発明のさらに別の目的である。
ＨＰＶに基づいた疾患の段階を評価するため、アッセイデータのコンピューターに基づいた操作、分析およびデータ取り扱いを提供するのも本発明の別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一つの態様では、細胞状態に関する遺伝子の発現レベルを測定し、細胞試料における疾患状態の指標としてそれらの発現をお互いにまたは特定の比の参照遺伝子と比較する。本発明は細胞状態により示されるように、疾患の段階または危険度を評価するために使用できる。本発明はまた、示された細胞状態に基づいた適切な治療を同定することにより、または治療されている細胞の状態変化を示すことにより、疾患治療の有効性を指導または評価するためにも使用できる。
【００１５】
本発明の一つの態様において、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染またはＨＰＶに基づいた疾患の段階および予後が評価される。この態様は、二つまたはそれ以上のＨＰＶ遺伝子発現レベル測定を含んでいる。この目的のための遺伝子はＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＥ２遺伝子であるが、Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５およびＬ２のような他のＨＰＶ遺伝子もまた使用できる。これらの遺伝子の発現レベル、お互いの、または参照遺伝子に対するこれらの遺伝子の発現比（または両方）はＨＰＶに基づいた疾患を示すことが発見されている。
【００１６】
遺伝子発現レベルは本発明に従うと、良性から悪性増殖へのＨＰＶ感染進行を評価するために使用される。ＨＰＶ感染はＣＩＮ  ＩからＣＩＮ  ＩＩＩへおよび最終的には悪性癌へと進行する。これらの段階はＨＰＶ遺伝子の比により同定できる。特に、ＣＩＮ  ＩからＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩへの移行（即ち、前癌性への移行）は本発明の比が１を超えた場合に予測できる。本発明において３より大きな比は前癌性から悪性癌への移行を示している。従って、１以下の比はＨＰＶ感染細胞における低レベルのＣＩＮを示している。１および約３の間の比は重度のＣＩＮ（即ち、ＣＩＮ  ＩＩＩ）または前癌状態を示している。および、約３を超える比はＨＰＶ誘導悪性腫瘍を示している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は細胞数／ウェルに対してＥ６／Ｅ７  ｍＲＮＡ／ウェルで示されたＥ６／Ｅ７  ｍＲＮＡ検出のグラフである。
【図２】図２は細胞数／ウェルに対して信号対雑音比−１で示されたＨＰＶ  Ｌ１アッセイ感度のグラフである。
【図３】図３はＨＰＶ１６  Ｌ２（配列ＩＤ番号：２）のためのプローブ配列である。
【図４】図４はＨＰＶ１６  Ｌ１（配列ＩＤ番号：２）のためのプローブ配列である。
【図５】図５はＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７（配列ＩＤ番号：３）のためのプローブ配列である。
【図６】図６はＨＰＶ１６  Ｅ２（配列ＩＤ番号：４）のためのプローブ配列である。
【図７】図７はＨＰＶ１６  Ｅ４（配列ＩＤ番号：５）のためのプローブ配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は所望の細胞の同定およびモニタリングに関している。一つの方法は、細胞状態に関する遺伝子の発現レベルを測定し、細胞状態の指標としてそれらの発現をお互いにまたは参照遺伝子と比較する。そのような測定は疾患状態評価の正確性および信頼性を増加させるために他のアッセイと組み合わせることができる。本発明の一つの方法は細胞状態により示されるような疾患の段階を評価するために使用できる。この方法はまた、示された細胞状態に基づいた適切な治療を同定することにより、または治療されている細胞の状態変化を示すことにより、疾患治療の有効性を指導または評価するためにも使用できる。
【００１９】
多くの疾患は特定の細胞表現型および遺伝子発現パターンにより特徴付けられる。例えば、新生物性および癌性細胞は一般に、ある種の特有の形態学および増殖特性を示している。遺伝子突然変異および遺伝子発現パターンのような分子的特徴もまた、疾患進行の良好な指標である。ウイルス感染細胞は異なった形態学およびウイルス遺伝子を含む遺伝子発現パターンを示すことができる。本発明を使用することにより、細胞形態学または遺伝子発現の変化ような細胞状態の特性を患者試料から決定することができる。
【００２０】
検出されるべき特性は、一般に問題とする細胞状態および細胞試料中に存在していると疑われる疾患に特異的なものである。そのような特性は一般に二つの型、細胞学的特性および分子的特性に分けることができる。本明細書で使用される場合、細胞学的特性とは例えば、全体の細胞の形および様子のような特性である。多くの新生物性および癌性細胞についての最初の同定および分類は伝統的には細胞学的特性を用いて達成されてきた。細胞学的特性の同定は一般的に時間がかかり、比較的高レベルの訓練を必要とし、一般的には容易に自動化できない。本明細書で使用される場合、分子的特性とは、タンパク質、核酸および代謝物のような特定の分子種の存在および状態である。そのような分子的特性は一般的に問題とする特定の分子を検出および測定することにより同定される。
【００２１】
アッセイされる特性は、疾患を直接的に起こさない、または疾患の結果ではないが、ある種の疾患および細胞状態に関係している追加のまたは代用となるマーカー特性を含むことができる。そのような追加のマーカーの例には、多形性マーカー、女性を子宮頚癌にかかり易くするＢ７のようなヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、癌遺伝子、ｐ５３突然変異、他の癌マーカー、癌抑制遺伝子、サイトカイン、増殖因子レセプターおよびホルモンが含まれる。そのようなマーカーは、状態−または疾患−特異的特性を示している細胞に存在でき、または存在せず、そのような存在または不在が例えば、より重度なまたはより軽い疾患状態を示すことができる。これらのマーカーは、異常な評点の数または定量的マーカーの変化の程度に依存して、腫瘍性疾患の危険度がより高いかまたはより低いかを推論するために開示された方法と組み合わせて使用できる。
【００２２】
本発明を使用する評価のための疾患状態の例には、異常増殖および癌が含まれるが、それらに制限されるわけではない。問題とする疾患状態は、ＨＰＶ感染、子宮頚部上皮内異常増殖（ＣＩＮ）および癌、有意義性が決定されていない異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、いぼ、コンジローム、いぼ状表皮異形成および他の皮膚疾患、喉頭パピローマ、口腔パピローマおよび結膜パピローマを含むＨＰＶに基づいた疾患である。
【００２３】
本発明の一つの態様は、ある種のＨＰＶ遺伝子の発現レベルの検出および測定である。この十年間にすごい量のデータが蓄積されており、子宮頚癌はある種の型のＨＰＶ感染に関連していることを示している。前癌性病変におけるＨＰＶ  ＤＮＡの存在は子宮頚部異形成および侵襲性癌腫の増加した相対的危険度を示しているが、前癌性子宮頚部病変の臨床的挙動を予測するのは未だに困難である。腫瘍遺伝子を活性化できるおよび／または腫瘍抑制遺伝子を不活性化できる、および／またはＤＮＡ損傷認識および複製に関係する遺伝子の遺伝子変化の蓄積により腫瘍が発生する。
【００２４】
高危険度ＨＰＶ型によりコードされているＥ６およびＥ７腫瘍タンパク質の発現レベルは、癌性病変へ進展するＨＰＶ感染の潜在的危険度のより敏感で正確な尺度である。本発明は、癌性病変を発生する危険度および罹病性の直接的尺度である比、Ｌ１および／またはＥ２に対するＥ６および／またはＥ７の比を決定するためにＨＰＶ感染病変におけるＥ６および／またはＥ７発現レベルおよびＥ２および／またはＬ１の相対量を測定する。ＨＰＶ発現は細胞中のｍＲＮＡまたはタンパク質により測定できる。
【００２５】
本発明の一つの態様において、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染またはＨＰＶに基づく疾患の段階および予後が評価される。本発明のこの態様は、ＨＰＶに基づいた疾患の段階および性質に関係することが発見されている一つまたはそれ以上のＨＰＶ遺伝子の発現レベルの測定を含んでいる。この目的のための遺伝子にはＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＥ２遺伝子が含まれる。これらの遺伝子の発現レベル、お互いの、または参照遺伝子に対するこれらの遺伝子の発現比（または両方）はＨＰＶに基づいた疾患を示していることが発見されている。発現レベルは他のＨＰＶ遺伝子と相対的であり、または発現レベルは非ＨＰＶ遺伝子（本明細書では参照遺伝子と称される）と相対的である。そのような参照遺伝子は任意の適当な遺伝子（ＨＰＶによりコードされていない）であり、例えば、ハウスキーピング遺伝子または他の構成的に発現される遺伝子である。参照遺伝子の例には、アクチン遺伝子、細胞骨格遺伝子、ヒストン遺伝子、チューブリン遺伝子、上皮成長因子レセプター遺伝子、正常ｐ５３遺伝子、正常ｐＲＢ遺伝子、サイクリン遺伝子、β−グロビン遺伝子およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる。参照遺伝子の発現は、ＨＰＶ遺伝子レベルが測定されるものと同じ細胞か、または同一の細胞試料の隣接する細胞で測定されるであろう。そのような場合、参照遺伝子は遺伝子発現の内部対照である。
【００２６】
これらの遺伝子の相対発現レベルとＨＰＶ感染細胞状態の関係は一般的に下記表１に示されている。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
表に示されたＨＰＶに基づいた重度ＣＩＮは癌を導く前癌段階であり、軽度ＣＩＮは悪性の可能性はほとんどない増殖的ウイルス感染であるが、ＨＰＶ感染の拡散に関して公衆衛生的関心が持たれる。正常組織とはＨＰＶで感染されている細胞学的に正常な組織を意味している。この標準に限定するわけではないが、この下限の発現を確立するための一つの標準は、ＤｉｇｅｎｅによりＷＯ９３／１０２６３に記載されているハイブリッド捕捉アッセイを用いて検出可能なレベル以下である。本明細書で使用される場合、Ｅ６／Ｅ７とはＥ６、Ｅ７またはＥ６＋Ｅ７を意味している。例えば、”Ｅ６＋Ｅ７”のような遺伝子の足し算は足し算された遺伝子の合同された発現を意味している。
【００２９】
容易に認めることができるように、各々の主たる疾患状態はこれらの三組の遺伝子の独特な発現パターンにより表される。これらの状態の両方が重度な医薬扶助とみなされる。他のＨＰＶ遺伝子（Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５およびＬ２のような）および他の非ＨＰＶ遺伝子の相対発現レベルを含む別の関係もまた細胞状態を評価するために使用できる。例えば、Ｌ２およびＥ４はしばしば良性ウイルス産生疾患に関連しており、Ｅ１はＥ２とプロフィールが同様であり、悪性腫瘍においてしばしば欠損されている。これらのＨＰＶタンパク質発現のための別の関係が別のＨＰＶに基づいた疾患に存在しており、開示されている方法はその疾患に適切なレベルおよび比を用いて、そのような別の疾患の状態を評価するために使用できる。
【００３０】
異なった細胞状態におけるＨＰＶのレベルおよび比についての情報を用い、疾患の段階がいくつかの方法で評価できる。いくつかの場合、検出可能発現の存在または不在が感染細胞における疾患状態を示している。例えば、より初期の試料または参照試料と比較して、例えば、Ｅ６およびＥ７発現レベルの増加は重度ＣＩＮまたは癌を示しているであろう。Ｅ２発現に対するＥ６／Ｅ７発現の比の変化は、軽度ＣＩＮまたは正常細胞から軽度ＣＩＮへの移行を同定するために使用される。比較に関する多くの他の組み合わせも可能であり、表１の情報から本発明の方法に使用するための別の組み合わせが誘導できる。
【００３１】
ＨＰＶ遺伝子の比がＨＰＶに基づいた疾患状態に関連させることができる一つの方法は、ＨＰＶ遺伝子のグループを参考にすることである。この目的のためには、グループ１遺伝子または遺伝子組はＥ６、Ｅ７およびＥ６＋Ｅ７を含んでいる。グループ２遺伝子または遺伝子組はＬ１、Ｌ２、Ｅ４および任意の組み合わせを含んでいる。グループ３遺伝子または遺伝子組はＥ１、Ｅ２およびＥ５および任意の組み合わせを含んでいる。発現の有用な比には、グループ２またはグループ３の構成物に対するグループ１の構成物の比が挙げられる。これらの比の例は（Ｅ６＋Ｅ７）／（Ｌ１＋Ｌ２）、Ｅ６／Ｌ１、Ｅ７／Ｌ１、Ｅ６／Ｌ２、Ｅ７／Ｌ２、（Ｅ６＋Ｅ７）／Ｌ１、（Ｅ６＋Ｅ７）／Ｌ２、Ｅ６／（Ｌ１＋Ｌ２）および Ｅ７／（Ｌ１＋Ｌ２）である。そのような比に対し、２未満の値は良性ヒトパピローマウイルス感染または軽度上皮内異常増殖を示している。この型の感染はＣＩＮ  Ｉとも分類される。ＣＩＮ  Ｉを超えて進行したＨＰＶ感染は細胞形質転換が起こり、癌性増殖が始まっていることを示している。これらの後期感染（ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ）は２よりも大きな比を持っている。２よりも大きな発現の比は重度上皮内異常増殖または前癌性癌を示している。２よりもかなり大きな発現比（即ち、４を超えて無限大まで）は癌を示している。本発明に使用するための好適な比は（Ｅ６＋Ｅ７）／Ｌ１、（Ｅ６＋Ｅ７）／（Ｌ１＋Ｌ２）、（Ｅ６＋Ｅ７＋Ｅ２＋Ｅ４）／（Ｌ１＋Ｌ２）、（Ｅ６＋Ｅ７）／ （Ｅ２＋Ｅ４）、（Ｅ６＋Ｅ７）／ Ｅ２、（Ｅ６＋Ｅ７＋Ｅ２−Ｅ４）／（Ｌ１＋Ｌ２）である。
【００３２】
測定されたＨＰＶ遺伝子の発現レベルを比較および分類できるいくつかの方法が存在する。例えば、発現の存在または不在が細胞状態示している場合、ＨＰＶ遺伝子発現は他の遺伝子の発現レベルを参照せずに分析される。ＨＰＶ遺伝子発現の相対レベルが細胞状態を示している場合、測定された発現レベルは例えば、異なった細胞試料（同一起源の初期細胞試料またはＨＰＶを運んでいる参照細胞のような）中のＨＰＶ遺伝子の同型の発現レベル、同一のまたは異なった細胞試料中の異なった型のＨＰＶ遺伝子発現レベルと、同一細胞試料中の非ＨＰＶ参照遺伝子の発現レベルと、または参照細胞中の非ＨＰＶ参照遺伝子の発現レベルと比較される。
【００３３】
本発明の一つの態様において、ＨＰＶ遺伝子発現のレベルおよび比は、ＨＰＶを含む細胞株（ヒーラーまたはＣａＳｋｉのような）中の同一遺伝子のレベルと比較される。そのような細胞株は、細胞試料中のＨＰＶ遺伝子の発現レベルが比較される基準を提供する。そのような比較は、これらのＨＰＶタンパク質発現の絶対レベルを基準または比較細胞株のレベルと評価および比較するために使用される。この目的に有用な他の細胞株はＨＰＶ１６（Ｗ１２のような）またはＨＰＶ３１（ＣＩＮ−６１２のような；Ｍｅｙｅｒｓ（１９９２））で感染させた非癌性細胞株である。
【００３４】
ＨＰＶ遺伝子発現のレベルおよび比はまた、同一細胞中のまたは一つの細胞株のような参照細胞中の参照遺伝子（ハウスキーピング遺伝子または他の構成的に発現される遺伝子のような）とも比較される。例えば、ＨＰＶ遺伝子および参照遺伝子の発現レベルは同一細胞試料で測定される。そのような測定は、細胞試料での総発現レベルの内部対照を提供し、ＨＰＶ遺伝子の正確な発現レベルの計算に使用され、異なった細胞試料間でのより正確な比較を可能にする。補正の一つの型は規格化と称される。従って、二つまたはそれ以上の細胞試料で一つまたはそれ以上のＨＰＶ遺伝子の発現レベルが、各々の細胞試料における同一参照遺伝子の発現レベルと共に測定できる。ＨＰＶ遺伝子の発現レベルは、各々の試料中の参照遺伝子の測定発現レベルの相違（もしあれば）に基づいてお互いに規格化される。
【００３５】
ＨＰＶに基づいた疾患のいくつかの段階において、特定のＨＰＶ遺伝子の発現は低いかまたは検出不可能である。そのような検出可能発現の喪失は本明細書において予後または診断指標として働く発現パターンを同定するために使用される。他のＨＰＶ遺伝子の発現が平行してまたは同一のアッセイで評価され、評価されるべき一つまたはそれ以上の遺伝子発現の喪失の対照が提供される。このことはいくつかのＨＰＶ遺伝子の発現を一緒にまたは平行して測定することにより達成される。例えば、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｅ４およびＥ２遺伝子の発現を平行して測定するのが有用である（なぜなら、これらの遺伝子の少なくとも一つはＨＰＶに基づいた疾患の全ての段階で発現されている）。本発明の好適な態様において、Ｌ１／Ｅ２に対するＥ６／Ｅ７の比はＨＰＶ感染からの癌発生可能性の指標を提供する。この方法では指標情報が集められ、同時に内部対照が提供される。組み合わされたＬ１、Ｌ２およびＥ４の存在もまた良性疾患の指標であり、一方、Ｅ１および／またはＥ２の不在は腫瘍形成可能性を示している。
【００３６】
上に記載した比較の型はまた、他の遺伝子および他の疾患状態にも使用できる。問題とする遺伝子の測定された発現レベルは例えば、異なった細胞試料（同一起源の初期細胞試料または適当な参照細胞のような）中の遺伝子の同型の発現レベル、同一のまたは異なった細胞試料中の異なった型の遺伝子発現レベルと、同一細胞試料中の参照遺伝子の発現レベルと、または参照細胞中の参照遺伝子の発現レベルと比較される。
【００３７】
問題とする遺伝子発現（ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｅ４およびＥ２遺伝子のような）は適した方法を用いて評価できる。例えば、ＲＮＡはハイブリダイゼーション、増幅または配列決定技術を用いて検出でき、タンパク質は特異的抗体を用いて検出できる。発現生成物の検出による遺伝子発現特異的検出のための多くの技術が知られており、開示された方法で使用できる。問題とする遺伝子の発現レベルを検出および測定するための一つの技術は、問題とする遺伝子から転写されたＲＮＡの検出である。最も信頼できる比較にためには、比較されるべき発現レベルは同一の方法を用いて、同一の様式で実施されなければならない。
【００３８】
ＨＰＶ核酸のハイブリダイゼーション検出のためには、異なったＨＰＶ型からの配列に特異的なプローブ混合物が使用できる。このことは、本方法は含まれているＨＰＶの型に関係なく発現を検出するであろうことを確実にしている。いくつかの目的で、ある種のＨＰＶ型の配列のために設計されたプローブ、またはいくつかのＨＰＶ型のみのプローブ混合物を使用するのが望まれるであろう。そのようなプローブは、検出されるべきＨＰＶ核酸の配列間の相違に依存して、型特異的であるかもしれないし、ないかもしれない。この目的のための一つの有用な混合物は、癌への進行により密接に関連したＨＰＶ型のためのプローブを含んでいるであろう。子宮頚癌に最も共通して関連するＨＰＶ型は型１６および１８である。
【００３９】
細胞試料中の問題とする遺伝子の発現レベルを測定するための有用な技術にはＤｉｇｅｎｅによりＷＯ９３／１０２６３に記載されているハイブリッド捕捉技術、（Ｎｕｏｖｏ，（１９９７））により記載されているＰＣＲインサイチュハイブリダイゼーション技術、分岐ＤＮＡアッセイ（Ｃｈｅｒｎｏｆｆ（１９９７））、転写媒介増幅（ＴＭＡ）（Ｓｔｏｆｌｅｔ（１９８８））、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己持続性配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖弛緩増幅（ＳＤＡ）、およびＱβレプリカーゼによる増幅（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｓｈａｈｗａｒ（１９９１）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９９３）））が挙げられる。
【００４０】
遺伝子発現産物の検出および測定のための多くのアッセイが知られており、開示されたアッセイにおいての問題とする遺伝子の発現レベルを決定するために適用できる。例えば、ＨＰＶ一般または下記の他のＨＰＶ遺伝子発現の検出のための多くの技術もまた、ＨＰＶ遺伝子Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｅ４およびＥ２発現検出のための開示されたアッセイでの使用に適用できる。
【００４１】
開示された方法で使用できる多くのＨＰＶ検出および型分類アッセイが知られており、サザンブロット、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応および溶液ハイブリダイゼーションを含んでいるアッセイが含まれる。Ｍａｎｔ（１９９７）は特定のＨＰＶ型からのＤＮＡを同定するために使用されるＰＣＲアッセイを記載している。Ｃｏｐｅ（１９９７）は共通プライマーを用いるＰＣＲに基づいた試験およびＨＰＶ型検出のハイブリッド捕捉アッセイ（ＨＣＡ）を記載している。ハイブリッド捕捉アッセイはＤｉｇｅｎｅによるＷＯ９３／１０２６３にも記載されている。ハイブリッド捕捉アッセイは、開示されたアッセイと組み合わせて、ＨＰＶの検出およびＨＰＶ型の決定のための有用な方法である。
【００４２】
Ｓｗａｎ（１９９７）はＰＣＲの間に遺伝子型特異的プローブから蛍光色素を放出させることにより蛍光色素からの信号を増加させるため、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を利用したＨＰＶ検出アッセイを記載している。Ｌｉｚａｒｄｉ（１９９７）は非放射性プローブを用い、明視野または蛍光顕微鏡検査法またはレーザー走査共焦点顕微鏡検査法によるインサイチュハイブリダイゼーションを用いたＨＰＶ検出法を記載している。Ｚｅｈｂｅ［１］（１９９７）は信号増幅を含むＨＰＶ検出のためのインサイチュハイブリダイゼーションの改良版を記載している。Ｌｅｉｓｅｒｗｉｔｚ（１９９７）はＨＰＶを検出するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の使用を記載している。Ｚｅｈｂｅ［２］（１９９７）はＨＰＶ検出のための非同位体、酵素結合免疫吸着に基づいたサンドイッチ捕捉ハイブリダイゼーションアッセイを記載している。
【００４３】
本発明の一つの態様において、ＲＮＡは溶液に基づいた方法により直接的に分析された。マイクロタイタープレートの細胞が含まれているウェルへタンパク質分解性酵素を添加することにより細胞を最初に溶解させた。本発明で使用するための酵素の非制限的例には、プロテイナーゼＫまたはプロナーゼが挙げられる。細胞はまた、界面活性剤溶解または浸透圧溶解またはフレンチプレスにかけることもできる。インキュベーション後、各々のウェルにビオチニル化ＤＮＡプローブを加えた。ストレプトアビジン被覆マイクロプレートへ移すことにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが固相上に捕捉された。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対するアルカリ性ホスファターゼ結合抗体をハイブリダイゼーションマイクロプレートの各々のプレートへ加え、Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（Ｔｒｏｐｉｘ）とともにＣＤＰ−ＳｔａｒＲのような化学発光試薬を各々のプレートへ添加することにより信号を発生させた。信号はマイクロプレートから読みとられた。溶液に基づいたＤＮＡ分析はＲＮＡ分析と同様に実施された、ただし、マイクロタイタープレートは抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体で被覆され、プローブはＲＮＡプローブであった。
【００４４】
開示された方法で使用できるＨＰＶ感染検出および評価のための別の方法は、米国特許第５，４１５，９９５号、第４，７７７，２３９号、第５，４８４，６９９号、第４，９８３，７２８号、第５，５２７，８９８号、第５，３６４，７５８号、第５，６３９，８７１号、第５，５０１，９４７号、第５，６６５，５３３号、第４，７４８，１０９号、第５，６２３，９３２号、第５，６６５，５７１号および第５，６４８，４５９号に記載されている。これらはＨＰＶ検出および型分類アッセイの単なる例であり、開示された分子アッセイと組み合わせて使用されるであろう。上に記載された技術の多くは、ＨＰＶ遺伝子発現検出のための開示されたアッセイにおける使用にも適用できる。
【００４５】
開示されたアッセイおよび他の方法は連続的に組み合わせることができる。即ち、第一の一つの型のアッセイが実施でき、次に、結果に依存して別のアッセイが実施できる。例えば、最初にＨＰＶ（またはＨＰＶ型）を検出するアッセイが実施でき、もしＨＰＶが存在していれば、開示された分子アッセイが実施される。別の例として、開示された分子アッセイが最初に行われ、もしアッセイの結果が重度ＣＩＮまたは癌を示せば、細胞学的アッセイまたは生検が実施される。そのような連続的組み合わせは、高度な危険度と同定された患者および試料のより広範囲は試験を限定するために特に有用である。
【００４６】
有用なアッセイの連続的順序は以下のようである；（１）ＨＰＶアッセイ、続いての一つまたはそれ以上の他のマーカーのためのアッセイ、続いての細胞学的または組織学的アッセイ；（２）細胞学的または組織学的アッセイ、続いてのＨＰＶアッセイまたは一つまたはそれ以上の他のマーカーのためのアッセイ、続いてのＨＰＶアッセイまたは一つまたはそれ以上の他のマーカーのためのアッセイ（どちらも最初に実施されていない）；（３）細胞学的または組織学的アッセイ、続いての組み合わされたまたは同時のＨＰＶおよびマーカーアッセイ；（４）組み合わされたまたは同時のＨＰＶおよびマーカーアッセイ、続いての細胞学的または組織学的アッセイ；および（５）ＨＰＶの検出、ＨＰＶ型の検出、ＨＰＶアッセイ、および細胞学的または組織学的アッセイ。アッセイの各々の組み合わせに続いて、組み合わされたアッセイ結果を用いて、細胞状態、疾患状態、患者状態、患者予後の評価または本明細書に記載されているような他の評価が行われる。
【００４７】
最初のアッセイの結果が曖昧であるかまたは疾患のより重度段階を示唆した場合、最初の結果を明瞭化および確認するためにさらなるアッセイが有用である。例えば、細胞試料がＨＰＶにより良性で感染されたいくつかの細胞と重度の異常増殖または癌を示している他の細胞とのモザイクである場合、ＨＰＶ遺伝子の発現を測定するアッセイは曖昧な結果を与えるであろう。形態学的アッセイによる追跡調査により、重度の異常増殖性または癌性細胞の存在が確立できる。この場合、開示された方法の利点はアッセイされた細胞試料のいくつかのみが（曖昧または重度の結果をあたえたもの）さらに試験されることが必要とされるということである。
【００４８】
開示された方法はまた、処置計画と組み合わせることができる。例えば、開示されたアッセイまたは方法の結果が重度の異常増殖または癌の指標であれば、疾患のこれらの段階ではしばしばゲノム内へのＨＰＶ組込みは達成されているので、抗ウイルス治療は有効ではないであろうことを示唆している。一方、アッセイまたは方法の結果が正常または軽度の疾患段階を示していれば、この段階では一般的にＨＰＶは組み込まれていないので、抗ウイルス処置が示唆される。抗ウイルス処置には、例えば、薬剤または治療ワクチンが含まれる。開示された方法の結果が良性細胞状態を示している場合、処置は全く回避できる。そのような評価を信頼できるおよび正確にする能力は、開示されたアッセイの著しい利点である。
【００４９】
開示された方法は前記のような分子アッセイと細胞試料中の細胞の疾患または状態を評価するための他のアッセイとの組み合わせを含むことができる。例えば、ＨＰＶ遺伝子発現のレベルまたは比を測定する分子アッセイは、細胞学的アッセイ、組織学的アッセイ、存在するＨＰＶ型の決定、存在するＨＰＶレベルの決定、腫瘍タンパク質または腫瘍抑制遺伝子のような他の細胞マーカーの検出またはこれらのアッセイの組み合わせと組み合わせることができる。そのようなアッセイは既知であり、ＨＰＶ感染またはＨＰＶに基づいた疾患の診断および疾患段階の評価に使用することができる。分子アッセイおよび一つまたはそれ以上の追加のアッセイの結果は、ＨＰＶに基づいた疾患の評価、予後、診断またはモニタリングの信頼性を増加させるために組み合わせることができる。この組み合わせの可能性は、前記のＨＰＶ分子アッセイが他のアッセイと異なったＨＰＶに基づいた疾患についての情報を提供するので、開示された方法の特に有用な特色である。多数のアッセイが同じ予後的または診断的方向を指した場合、評価の信頼性が増加する。有用な組み合わせには、組織学的アッセイおよび開示された分子アッセイ、ＨＰＶ型を決定するためのアッセイおよび開示された分子アッセイ、および組織学的アッセイ、型分類アッセイ、癌マーカー検出アッセイおよび開示された分子アッセイの組み合わせが挙げられる。組み合わされたアッセイは任意の順番でおよび任意の時間的関係で実施できる。例えば、種々のアッセイは平行してまたは同時に実施できる。そのようなアッセイは同一人により同一装置で、異なった装置でまたは同一のまたは異なった場所でのような任意の様式で実施できる。
【００５０】
ＨＰＶに基づいた疾患の段階評価において使用される細胞学的アッセイは既知であり、開示された方法において使用できる。よく確立されているＰａｐスミアおよびヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）は好適な例である。ＰａｐスミアおよびＨ＆Ｅ染色の使用および分析は本分野ではよく知られている。
【００５１】
用語としての細胞試料は本明細書において、主として患者から集められた細胞である。細胞を得る一つの方法は非侵襲的手段を通したものであり、それは本明細書においては患者を穿刺することなく得られることと定義される。非侵襲的手段の例は、例えば、尿または鼻、上皮、子宮頚部または他の細胞表面削り取りである。患者細胞はまた、例えば、針生検または組織生検を含む他の手段によっても得ることができる。
【００５２】
細胞試料は、問題とする細胞状態に関連する異なった特性の二つまたはそれ以上のアッセイの組み合わせを可能にする採取培地に保存できる。本明細書で使用される場合、アッセイとは特異的特性の検出または測定を意味しており、その結果は、一つまたはそれ以上の疾患で感染されていると疑われる細胞の全体評価ついての他の特性のそのような測定と組み合わされるであろう。これらのアッセイには、例えば、形態学的アッセイおよびそのレベルが疾患の存在または予後の特異的指標を提供する特定のＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質の定量の組み合わせが含まれる。もしくは、例えば、採取培地は細胞試料中の細胞の形態学を同定するアッセイと含まれているＨＰＶ型を同定する、および、例えば、同定されたＨＰＶ型がＨＰＶ誘導細胞形質転換および癌の発生に関して高い危険度または低い危険度のＨＰＶ型であるかどうかを同定する一つまたはそれ以上のアッセイを組み合わせるために使用できる。
【００５３】
例えば、ＨＰＶに基づいた疾患評価のための細胞試料源には子宮頚部、膣、外陰部、肛門、陰茎、喉頭、口腔、リンパ節、人体の任意部分の悪性沈着物および表皮（これらの全てはＨＰＶ感染および病理学の既知の部位である）が含まれる。
【００５４】
本発明で使用するための細胞試料は液体培地に採取および保存できる。有用な細胞採取培地の例はＳＴＭ（Ｄｉｇｅｎｅ）、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔＲ（Ｃｙｔｙｃ）およびＣｙｔｏＲｉｃｈＴＭ（Ａｕｔｏｃｙｔｅ）である。これらの培地（ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔＲおよびＣｙｔｏＲｉｃｈＴＭ）は細胞学的試料を集めるために開発されたが、分子アッセイでの使用に適用できる。
【００５５】
本発明の方法で使用する細胞試料は実施されるアッセイに矛盾のない様式で固定または処理できる。例えば、細胞学的および分子的アッセイの両方が、例えば、スライドのような固体基質上に固定された細胞を用いて実施できる。実施されるアッセイの必要条件が一般的に、使用されるべき試料処理を規定するであろう。
【００５６】
本発明は、試薬および試料採取および取り扱い材料のような、本方法に必要とされる一つまたはそれ以上の物質を含んでいるキットを用いて都合よく実施できる。例えば、キットは細胞採取培地、試料保存試薬、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１またはＬ２遺伝子の一つまたはそれ以上のＤＮＡおよび／または発現産物（ＲＮＡまたはタンパク質）特異的検出のための試薬、および試料取り扱い容器を含むことができる。ＨＰＶ遺伝子発現の検出に有用な試薬は、これらの遺伝子のための核酸プローブである。キットはまた、対照試料または試薬、または開示されたアッセイと組み合わされるべき他のアッセイを実施するための試薬および材料を含んでいてもよい。加えて、キットは他の細胞成分からＲＮＡおよび／またはＤＮＡを分離するための試薬を含むことができる。
【００５７】
本発明は本方法に適合した装置を用いて実施できる。類似のアッセイを実施するための多くの装置が知られおよび使用されており、開示されたアッセイおよび方法で使用するために適用できる。例えば、試料アッセイおよびアッセイでの試料取り扱いの全ての部分を自動化するための装置が知られている。
【００５８】
開示された方法の全ての部分を特別な目的のコンピュータープログラムを用いて制御または処理できる。開示された方法から集められたデータ、および組み合わせて使用された他のアッセイからのデータは特別な目的のコンピュータープログラムを用いて編集、分析および種々の目的のための種々の形で出力できる。そのようなプログラムは他の患者またはデータ管理コンピュータープログラムとともに、または組み合わせて使用できる。そのようなプログラムの有用性は組み合わされる測定または評価の数、および全体の評価に対する、測定された各々の型の相対的重要性とともに増加する。開示された方法で使用するためのコンピュータープログラムは一般的な目的のコンピューター、または開示された方法の制御、取り扱いおよび開示された方法からのデータ分析のための特別な目的のコンピューターまたはコンピューター化装置、またはその両方で使用できる。
【実施例】
【００５９】
本明細書の実施例は本発明を実施する種々の態様を例示していることを意味しており、どのようにも本発明の制限を意図しているものではない。
実施例１：核酸分析の一般法
核酸のアッセイはＤｉｇｅｎｅによりＷＯ９３／１０２６３に記載されているＤｉｇｅｎｅハイブリッド捕捉ＨＩＶ試験によりＨＩＶ  ＲＮＡを検出する一般原理および方法に従った。簡単には、溶解後、５０μｌのプローブ混合物（ＤＮＡビオチニル化プローブを含んでいる）を各々のウェルに加えた。プレートをシールし、６５℃で２時間ハイブリダイゼーションを起こすためにインキュベートした。ハイブリダイゼーション後、試料をストレプトアビジン被覆マイクロプレートへ移し、２５μｌの抗ハイブリッド抗体を各々のウェルに加えた。プレートは室温で１時間、１１００ＲＰＭでかき混ぜた。ウェルは６５℃の洗浄緩衝液で６回洗浄し、続いて蒸留水で１回洗浄した。１００μｌの化学発光基質を各々のウェルへ加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。プレートはＤＭＬ２０００ルミノメーターで読み取った。データは信号対雑音として表された。検量線を用い、各々の試料から発生した化学発光信号を細胞当たりのｍＲＮＡコピーへ変換された。前記のアッセイは全溶解細胞または他の細胞成分から分離された核酸の両方で実行できる。
実施例２：ＨＰＶの定量
この実施例は開示された方法で使用するためのＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７発現の測定を例示している。ＨＰＶ  ｍＲＮＡ（Ｅ６／Ｅ７およびｍＲＮＡを含む）を検出および定量する方法が開発された。この実施例ではＣａＳｋｉ細胞での発現を測定しているが、本方法は他の細胞株および臨床試料にも一般的に応用可能である。ＣａＳｋｉ細胞は組み込まれた高危険度のＨＰＶ−１６ゲノムを含んでいる（約６００コピー／細胞）。ＣａＳｋｉ細胞は、１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含んでいるＲＭＰＩ１６４０培地でサブコンフルエントで維持された。この実施例のため、ＣａＳｋｉ細胞をコンフルエントまで増殖させ、０．１％トリプシン−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡでの処理により培養皿から除去した。トリパンブルーを用いて、生きている細胞を顕微鏡で計数した。細胞はウェル当たり１０、１０２、１０３、１０４および１０５細胞の最終濃度でポリスチレン、組織培養処理、９６ウェルプレートへ１０μｌ容量で播種した。各々の希釈が実施され、３重に播種された。
【００６０】
細胞はトリス−ＥＤＴＡ−緩衝化ＳＤＳ中、プロテイナーゼＫ（３０単位）で溶解された。プレート溶液（２０ｍＭトリスｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５’）をシールし、１１００ＲＰＭで３０秒かき混ぜ、３７℃で３０分インキュベートした。ＨＰＶ  ｍＲＮＡ試験はＤｉｇｅｎｅによりＷＯ９３／１０２６３に記載されているＤｉｇｅｎｅハイブリッド捕捉ＨＩＶ試験によりＨＩＶ  ＲＮＡを検出する一般原理および方法に従った。簡単には、溶解後、５０μｌのプローブ混合物（Ｅ６／Ｅ７ＤＮＡビオチニル化プローブを含んでいる）を各々のウェルに加えた。プレートをシールし、６５℃で２時間ハイブリダイゼーションを起こすためにインキュベートした。ハイブリダイゼーション後、試料をストレプトアビジン被覆マイクロプレートへ移し、２５μｌの抗ハイブリッド抗体を各々のウェルに加えた。プレートは室温で１時間、１１００ＲＰＭでかき混ぜた。ウェルは６５℃の洗浄緩衝液で６回洗浄し、続いて蒸留水で１回洗浄した。１００μｌの化学発光基質を各々のウェルへ加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。プレートはＤＭＬ２０００ルミノメーターで読み取った。データは信号対雑音として表された。検量線を用い、各々の試料から発生した化学発光信号を細胞当たりのｍＲＮＡコピーへ変換した。ＣａＳｋｉ細胞からのＨＰＶ  ｍＲＮＡ直接検出のデータは図１に示されている。この方法はＥ６／Ｅ７  ｍＲＮＡの検出および定量により例示されたが、ＣａＳｋｉ細胞からの他のｍＲＮＡ分子（例えば、ＨＰＶ  Ｌ１  ｍＲＮＡ）の定量にも応用されている（図２）。
実施例３：保存採取培地を用いるＨＰＶ  ｍＲＮＡの定量
ＣａＳｋｉ細胞は０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡと３７℃で５分間インキュベートすることによりトリプシン処理された。細胞はＳｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００遠心分離機中、８００ｒｐｍで３分間遠心分離して懸濁液からペレット化した。細胞ペレットは５００μｌの１Ｘ  ＰＢＳに再懸濁し、トリパンブルー溶液を顕微鏡で計数した。細胞を１Ｘ  ＰＢＳ中、５０および５００細胞／μｌに希釈した。ゼロ点（１０μｌの１Ｘ  ＰＢＳ）を含む各々の細胞濃度の１０μｌを３ｍｌのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ試薬へ加えた。細胞ペレットの可視化を助けるために、各々のタブに１００μｌの試料変換緩衝液を加えた。全ての試料はよく混合し、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００遠心分離機中、３８００ｒｐｍで１５分間遠心分離して分離させた。上清液は捨て、遠心管は実験台上で２から５分キムタオル上に逆さにすることにより水を排出させた。全てのペレットは５０μｌの溶解試薬（５０単位のプロテイナーゼＫ）で再懸濁し、混合物はストレプトアビジンで被覆されたプレートへ移された。プレートをプレートシーラーで覆い、１５分ごとにかき混ぜながら、３７℃で３０分間インキュベートした（ヒートブロック）。
【００６１】
試料中のｍＲＮＡのための検量線を作るため、指示されたウェルへ１０、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７および１０８分子／ウェルで各々５０μｌのＥ６／Ｅ７  ＲＮＡ標品を加えた。各々のウェルへ５０μｌのプローブ混合物を加えた。プレートをプレートシーラーで覆い、ベンチトップシェーカー上、１１００ｒｐｍで１分間かき混ぜた。試料はヒートブロック中、６５℃で１．５時間インキュベートした（ハイブリダイゼーション反応）。プレートをベンチトップシェーカーに移し、室温にて１１００ｒｐｍで１時間かき混ぜながらインキュベートした（捕捉反応）。各々のウェルへ２５μｌの検出試薬１を加え、プレートはかき混ぜることなく室温にて１時間インキュベートした。
【００６２】
プレートの内容物を捨て、プレートを６５℃にて洗浄緩衝液で６回洗浄し、蒸留水で１回室温にて洗浄した。プレートはキムタオルで水を排出させ、各々のウェルへ１００μｌの検出試薬２を加えた。プレートは光を遮って室温で３０分インキュベートした。インキュベーション時間が終わったら、プレートをＤｉｇｅｎｅ  ＤＭＬ２０００ルミノメーターで読み取り、データは信号対雑音比として表された。
実施例４：エピソーム性および組み込まれたＨＰＶ１６ＤＮＡを含んでいる細胞株中のＥ６／Ｅ７  ＲＮＡおよびＬ１  ＲＮＡ発現の比較
試験された細胞株
以下の細胞株が上に概説された方法に従って試験された。
【００６３】
ＨａＣａＴ：不死化ヒトケラチノサイト細胞株（Ｂｏｕｋａｍｐ（１９８８））
ＳｉＨａ：ヒト癌細胞株（Ｆｒｉｅｄｌ（１９７０））
Ｗ１２：非腫瘍発生性ヒト子宮頚部ケラチノサイト細胞株（Ｓｔａｎｌｅｙ（１９８９））
ＨＰＶ感染状態
ＨａＣａＴ細胞株はＷｈｉｔｅらの方法（Ｗｈｉｔｅ（１９９８））によりＨＰＶ１６で感染させ、エピソーム（非組込み、全配列、スプライスされていない）ＨＰＶ感染を起こさせた。４０細胞毎にＨＰＶ１６の約１コピーが存在していた。これらの細胞は初期段階感染またはＣＩＮ  Ｉ（子宮頚部上皮内異常増殖）の代表と考えられた。Ｗ１２細胞は約１００コピーのエピソームＨＰＶ１６ＤＮＡを含んでおり、前癌性、不死化細胞またはＣＩＮ  ＩＩまたはＣＩＮ  ＩＩＩを代表している。ＳｉＨａ細胞はゲノム内へ組込まれたＨＰＶ１６の１−２コピーを含んでいる。これらの細胞は癌を代表すると考えられた。
方法
ＲＮＡ分析は実施例１に従ってまたは以下の方法で行われた。特異的ＨＰＶ１６遺伝子配列を含んでいる一本鎖、ビオチニル化ＤＮＡプローブが調製された。ＨａＣａＴおよびＳｉＨａ細胞株については、細胞はコンフルエントまで増殖させ、細胞を採取し、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を用いて精製された。Ｗ１２では、全細胞が分析に使用された。完全ＨＰＶゲノムを含んでいるＲＮＡ標品は完全ＨＰＶ１６ゲノムを含んでいるプラスミドからの（＋）センスＲＮＡのＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写により調製された。ＲＮＡは次に５０μｌ当たり１０３、１０４、１０５、１０６、および１０７コピーに希釈された。細胞ＲＮＡの一部を５０μｌに希釈し、５０μｌのプローブ混合物（ビオチニル化、一本鎖ＤＮＡプローブを含んでいる）を加えて６５℃で２時間ＲＮＡ試料へハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション反応液はストレプトアビジン被覆マイクロプレートへ移し、２５μｌの検出試薬１を各々のウェルに加えた。（検出試薬１はアルカリ性ホスファターゼ−抗ＲＮＡ：ＤＮＡモノクローナル抗体結合体を含んでいる。）１時間の振盪しながらのインキュベーションの間に、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドはストレプトアビジン被覆プレート上へ捕捉され、同時に抗ハイブリッド抗体結合体と反応する。いくつかの洗浄工程後、化学発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ  ＣＤＰ−ｓｔａｒおよびＥｍｒａｌｄ）をウェルへ加え、室温で３０分間インキュベーション後にマイクロプレートルミノメーターで光出力を測定した。
定量
ＨＰＶ  ｍＲＮＡの定量は以下のように実施された。ＲＮＡ標品からの結果は検量線の作製に使用された。回帰方程式はコピーの対数に対する信号対雑音比から１を引いたものの［（Ｓ／Ｎ）−１］対数から計算された。回帰方程式は続いて細胞ＲＮＡ試料中のｍＲＮＡコピー数を計算するために使用された。
比の結果
各々の細胞型に対するＨＰＶ１６  Ｅ６、Ｅ７、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１およびＬ２の比が計算された。結果は表２に示されている。これらの結果はエピソームにおける初期感染では（Ｅ６＋Ｅ７）／Ｌ１の比は約０．７であり、前癌性不死化細胞株においては該比は約４であり、および癌性細胞株においては該比は無限大に到達することを示している。
【００６４】
【表２】
2010136729.tif 000003
【００６５】
＊Ｌ１遺伝子転写体はＳｉＨａ細胞においては検出できなかった。従って、Ｌ１遺伝子転写体に対する他の遺伝子転写体の比は無限に大きい。
本明細書に引用された出版物およびそれらが引用されている資料は特に本明細書において援用される。
【００６６】
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を、わずかなルーチン実験を用いて認識または確認できるであろう。そのような均等物は特許請求の範囲に包含されていることが意図されている。
文献
【００６７】
【表３】
2010136729.tif 000004
【図１】
2010136729.tif 000005
【図２】
2010136729.tif 000006
【図３】
2010136729.tif 000007
【図４】
2010136729.tif 000008
【図５】
2010136729.tif 000009
【図６】
2010136729.tif 000010
【図７】
2010136729.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月9日(2010.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ感染患者から集められた試料においてＨＰＶ誘導性の細胞形質転換を検出することによりＨＰＶ誘導性腫瘍形成の危険性を検出する方法であって、以下の工程：
該患者から集められた試料の少なくとも２つのＨＰＶｍＲＮＡのレベルを定量し、ここで該ｍＲＮＡは、Ｅ６  ｍＲＮＡおよびＥ７  ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも第１のｍＲＮＡ、およびＥ２  ｍＲＮＡ、Ｌ１  ｍＲＮＡおよびＬ２  ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも第２のｍＲＮＡを含む、工程；
Ｌ１および／またはＬ２および／またはＥ２のｍＲＮＡに対する、Ｅ６および／またはＥ７のｍＲＮＡの比を決定し、ここで２よりも大きな比がＨＰＶ誘導性の細胞形質転換および腫瘍形成の危険性を示している、工程
を含む上記方法。
【請求項２】
Ｌ１＋Ｌ２に対するＥ６＋Ｅ７の比を決定し、３若しくは３より大きな比がＨＰＶ誘導性前癌を示す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｌ１またはＥ２に対するＥ６＋Ｅ７の比を決定し、４若しくは４より大きな比がＨＰＶ誘導性前癌を示す、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＨＰＶ感染患者から集められた試料におけるＨＰＶ誘導性腫瘍形成の発症を検出する方法であって、以下の工程：
該患者から集められた試料のグループ１およびグループ２および／またはグループ３のＨＰＶのｍＲＮＡを定量する、工程；および
グループ２および／またはグループ３のｍＲＮＡレベルに対するグループ１のｍＲＮＡレベルの比を決定し、ここで２より大きな比はＨＰＶ誘導性腫瘍形成の発症を示している、工程
を含む方法。
【請求項５】
ＨＰＶ感染患者から集められた試料においてＨＰＶ誘導性疾患の初期段階を検出する方法であって、以下の工程：
該患者から集められた試料のＨＰＶ  ｍＲＮＡのレベルを定量し；
Ｅ６および／またはＥ７のｍＲＮＡのレベルおよびＥ２および／またはＬ１および／またはＬ２のｍＲＮＡのレベルを決定し；そして
Ｌ１および／またはＬ２および／またはＥ２のｍＲＮＡのレベルに対する、Ｅ６および／またはＥ７のｍＲＮＡのレベルの比を決定し、ここで２よりも大きな比がＨＰＶ誘導性疾患の初期段階を示しており、それによりＨＰＶ感染患者から集められた試料においてＨＰＶ誘導性疾患の初期段階を検出する、工程
を含む上記方法。
【請求項６】
Ｌ１＋Ｌ２に対するＥ６＋Ｅ７の比を決定し、３若しくは３より大きな比がＨＰＶ誘導性疾患の初期段階を示す、請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｌ１またはＥ２に対するＥ６＋Ｅ７の比を決定し、４若しくは４より大きな比がＨＰＶ誘導性疾患の初期段階を示す、請求項５記載の方法。
【請求項８】
ＨＰＶ感染患者から集められた試料においてＨＰＶ誘導性癌を検出する方法であって、以下の工程：
該患者から集められた試料の少なくとも２つのＨＰＶｍＲＮＡレベルを定量し、ここで該ｍＲＮＡは、Ｅ６  ｍＲＮＡおよびＥ７  ｍＲＮＡからなる群から選択される第１のｍＲＮＡ、およびＥ２  ｍＲＮＡ、Ｌ１  ｍＲＮＡおよびＬ２  ｍＲＮＡからなる群から選択される第２のｍＲＮＡを含む、工程；
Ｌ１および／またはＬ２および／またはＥ２のｍＲＮＡに対する、Ｅ６および／またはＥ７のｍＲＮＡの比を決定し、ここで４よりも大きな比がＨＰＶ誘導性の癌を示している、工程
を含む上記方法。
【請求項９】
Ｌ１＋Ｌ２に対するＥ６＋Ｅ７の比を決定する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｌ１またはＥ２に対するＥ６＋Ｅ７の比を決定し、１０若しくは１０より大きな比がＨＰＶ誘導性疾患の初期段階を示す、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ感染患者から集められた試料におけるＨＰＶ誘導性癌の危険性または発症を検出する方法であって、以下の工程：
該患者から集められた試料のグループ１およびグループ２および／またはグループ３  ＨＰＶのｍＲＮＡを定量する、工程；および
グループ２および／またはグループ３  ｍＲＮＡレベルに対するグループ１  ｍＲＮＡレベルの比を決定し、ここで４より大きな比はＨＰＶ誘導性癌の高い危険性または発症を示している、工程
を含む方法。
【請求項１２】
ＨＰＶ感染患者から集められた試料においてＨＰＶ誘導性前癌を検出する方法であって、以下の工程：
該患者から集められた試料のＨＰＶ発現ｍＲＮＡレベルを測定し、ここでｍＲＮＡは、Ｅ６  ｍＲＮＡ、Ｅ７  ｍＲＮＡ、Ｅ２  ｍＲＮＡおよびＥ４  ｍＲＮＡからなる群から選択される第１のｍＲＮＡ、およびＬ１  ｍＲＮＡおよびＬ２  ｍＲＮＡからなる群から選択される第２のｍＲＮＡを含む、工程；
Ｅ２，Ｅ４，Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１，およびＬ２の発現レベルを決定する工程；および
Ｌ１＋Ｌ２に対する、Ｅ６および／またはＥ７および／またはＥ２および／またはＥ４の比を計算し、
ここで６よりも大きな比がＨＰＶ誘導性前癌を示している、工程
を含む上記方法。
【請求項１３】
ＨＰＶ感染患者から集められた試料においてＨＰＶ誘導性前癌を検出する方法であって、以下の工程：
該患者から集められた試料のＨＰＶ発現ｍＲＮＡレベルを測定し、ここでｍＲＮＡは、Ｅ６  ｍＲＮＡおよびＥ７  ｍＲＮＡからなる群から選択される第１のｍＲＮＡ、およびＥ２  ｍＲＮＡおよびＥ４  ｍＲＮＡからなる群から選択される第２のｍＲＮＡを含む、工程；および
Ｅ６＋Ｅ７の発現レベルおよびＥ２＋Ｅ４の発現レベルを決定することにより、Ｅ２＋Ｅ４に対するＥ６＋Ｅ７の比を決定し、ここで１．０よりも大きな比がＨＰＶ誘導性前癌を示している、工程
を含む上記方法。
【請求項１４】
ＨＰＶ感染患者から集められた試料においてＨＰＶ誘導性前癌を検出する方法であって、以下の工程：
該患者から集められた試料のＨＰＶ発現ｍＲＮＡレベルを測定し、ここでｍＲＮＡは、Ｅ６  ｍＲＮＡ、Ｅ７  ｍＲＮＡ、Ｅ２  ｍＲＮＡおよびＥ４  ｍＲＮＡからなる群から選択される第１のｍＲＮＡ、およびＬ１  ｍＲＮＡおよびＬ２  ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも第２のｍＲＮＡを含む、工程；および
Ｅ６＋Ｅ７＋Ｅ２−Ｅ４の発現レベルおよびＬ１＋Ｌ２の発現レベルを決定することにより、Ｌ１＋Ｌ２に対するＥ６＋Ｅ７＋Ｅ２−Ｅ４の比を決定し、ここで１よりも大きな比がＨＰＶ誘導性前癌を示している、工程
を含む上記方法。
【請求項１５】
個体から集められた試料においてＨＰＶの初期段階の感染を検出する方法であって、以下の工程：
該個体から集められた試料のＨＰＶ発現ｍＲＮＡレベルを測定し、ここでｍＲＮＡは、Ｅ６  ｍＲＮＡおよびＥ７  ｍＲＮＡからなる群から選択される第１のｍＲＮＡ、およびＬ１  ｍＲＮＡからなる群から選択される第２のｍＲＮＡを含む、工程；および
Ｅ６＋Ｅ７の発現レベルおよびＬ１の発現レベルを決定することにより、Ｌ１に対するＥ６＋Ｅ７の比を決定し、ここで０．６よりも大きな比がＨＰＶの初期段階の感染を示している、工程
を含む上記方法。
【請求項１６】
ＨＰＶが高危険性ＨＰＶである、請求項１乃至１５の何れか１項記載の方法。
【請求項１７】
高危険性ＨＰＶが、ＨＰＶ  １６，１８，３１および４５からなる群から選択される、請求項１６記載の方法。