(57)【要約】【課題】関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症の可能性を客観的かつ簡便に判定する方法およびその利用を提供する。【解決手段】本発明に係る関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、生体から採取した試料におけるＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出する検出工程を含むものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取した試料におけるＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出する検出工程を含む、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【請求項２】
上記検出工程では、リンパ球におけるＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を検出することを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
上記ＮＫＧ２Ｄレセプターの発現は、上記リンパ球表面上へのＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質の発現であることを特徴とする請求項２に記載の判定方法。
【請求項４】
上記検出工程では、樹状細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を検出することを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
【請求項５】
上記ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、上記樹状細胞表面上へのＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質の発現であることを特徴とする請求項４に記載の判定方法。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の判定方法を実施するために用いるキットであって、
ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出するためのプライマー、プローブ、アレイおよび抗体のうちの少なくとも何れか１つを備えていることを特徴とする関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット。
【請求項７】
体内時計遺伝子の発現を検出する工程をさらに含み、当該工程にて検出した体内時計遺伝子の発現と、上記検出工程にて検出したＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現との両方に基づいて、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定することを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の判定方法。
【請求項８】
上記体内時計遺伝子は、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ１遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子およびＰｅｒ３遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする請求項７に記載の判定方法。
【請求項９】
体内時計遺伝子の発現を検出するためのプライマー、プローブ、アレイおよび抗体のうちの少なくとも何れか１つをさらに備えていることを特徴とする請求項６に記載の判定キット。
【請求項１０】
上記体内時計遺伝子は、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ１遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子およびＰｅｒ３遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする請求項９に記載の判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主な特徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊および変形などを来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。
【０００３】
ＲＡの原因である関節炎と関節破壊の様相、特にそれらの病理過程は、種々の研究を通じて次第に明らかになりつつある。しかし、ＲＡは生活環境を含めた多数の原因因子が重なり合ってはじめて疾患へと発展し、増悪する疾患である。そのため、疾患の正しい解明と適切な診断および治療とをおこなうには、多因子相互作用の本体そのものが明らかにされなければならない。
【０００４】
このような状況下において、特許文献１には、Ｃｒｙ１遺伝子などの時計遺伝子の発現を評価することによるＲＡの発症または発症可能性の判定方法が開示されている。
【０００５】
体内時計遺伝子とは、体内時計を制御する遺伝子の総称である。体内時計は生物が地球の自転により起こる昼夜変化に適応するために獲得した基本形質である。地球上の殆どすべての生物は、２４時間周期の時計機構である体内時計を体内に保持する。この基本形質は、ヒトを含む哺乳類において特に発達している。
【０００６】
哺乳類の体内時計は以下のフィードバックループからなる。（１）転写因子であるＢｍａｌ１およびＣｌｏｃｋが二量体を形成し、時計遺伝子であるＰｅｒ遺伝子およびＣｒｙ遺伝子上にあるＥ  ｂｏｘ配列に結合してこれら遺伝子の転写を促進する。（２）転写されたＰｅｒおよびＣｒｙは二量体を形成し、Ｂｍａｌ／Ｃｌｏｃｋ転写活性を抑制する。このフィードバックループは一日に一周し、それに伴い種々の時計遺伝子が変動して発現する。
【０００７】
特許文献１には、Ｃｒｙ１／２ＫＯマウスが滑膜増殖を起こしやすい表現型を示し、重度の関節炎を発症すること、および、睡眠障害を引き起こすＷｅｅキナーゼの活性上昇がＣｒｙ１／２ＫＯマウスにおいて見られることが記載されている。
【０００８】
ところで、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞免疫応答を司る主たるものとして、ＮＫＧ２ＤレセプターとＮＫＧ２Ｄリガンドとの相互作用が知られている。
【０００９】
ＮＫＧ２レセプターは、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞およびＮＫＴ細胞などに発現しており、ＮＫＧ２Ｄレセプターを介したシグナルは、ＰＩ３キナーゼを介して、インターフェロンγ産生および細胞傷害活性を発揮する。
【００１０】
一方、ＮＫＧ２Ｄリガンドは正常細胞においてほとんど発現していないが、熱ショック等のストレスにより発現が誘導される。また、腫瘍細胞および感染細胞において発現している。ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＲＡ、セリアック病およびＩ型糖尿病等の自己免疫疾患に関わっていることが報告されている（非特許文献１〜４参照）。また、ＮＫＧ２Ｄリガンドの１つであるＲＡＥ１遺伝子は、体内時計遺伝子の１つであるＳＴＲＡ１３を破壊したノックアウトマウスの肝細胞において、そのｍＲＮＡ量が低下していることが報告されている（非特許文献５参照）。
【特許文献１】特開２００７−１７４９５２号公報（平成１９年７月１２日公開）
【非特許文献１】Groh V., Bruhl A., El-Gabalawy H., Nelson J.L., Spies T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100(16), 9452-9457.
【非特許文献２】Ogasawara K., Hamerman J.A., Hsin H., Chikuma S., Bour-Jordan H., Chen T., Pertel T., Carnaud C., Bluestone J.A., Lanier L.L., Immunity 2003, 18(1), 41-51.
【非特許文献３】Ogasawara K., Hamerman J.A., Ehrlich L.R., Bour-Jordan H., Santamaria P., Bluestone J.A., Lanier L.L., Immunity 2004, 20(6), 757-767.
【非特許文献４】Hue S., Mention J.J., Monteiro R.C., Zhang S., Cellier C., Schmitz J., Verkarre V., Fodil N., Bahram S., Cerf-Bensussan N., Caillat-Zucman S., Immunity 2004, 21(3), 367-377.
【非特許文献５】Grechez-Cassiau A., Panda S., Lacoche S., Teboul M., Azmi S., Laudet V., Hogenesch J.B., Taneja R., Delaunay F., J. Biol. Chem. 2004, 279(2), 1141-1150.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように関節リウマチを含む自己免疫疾患についての研究成果が数多く報告されているが、関節リウマチまたは関節リウマチによる睡眠障害の発症を客観的に判定する技術は未だ充分に確立されているとはいい難い。
【００１２】
このため、関節リウマチまたは関節リウマチによる睡眠障害の発症について客観的かつ簡便な判定に寄与できる、新たな技術の確立が強く望まれていた。
【００１３】
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性について、客観的かつ簡便な診断を可能とするための判定方法およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、Ｃｒｙ１遺伝子およびＣｒｙ２遺伝子の両方を破壊したＣｒｙ１／２ＫＯマウスは、免疫担当細胞においてＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低下していることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な方法またはその利用として、以下の発明を包含するものである。
【００１５】
本発明に係る関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、生体から採取した試料におけるＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る判定方法においては、上記検出工程では、リンパ球におけるＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を検出することが好ましい。
【００１７】
本発明に係る判定方法においては、上記ＮＫＧ２Ｄレセプターの発現は、上記リンパ球表面上へのＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質の発現であることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る判定方法においては、上記検出工程では、樹状細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を検出することが好ましい。
【００１９】
本発明に係る判定方法においては、上記ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、上記樹状細胞表面上へのＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質の発現であることが好ましい。
【００２０】
また、本発明には、上記判定方法を実施するために用いるキットであって、
ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出するためのプライマー、プローブ、アレイおよび抗体のうちの少なくとも何れか１つを備えていることを特徴とする関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定キットが包含される。
【００２１】
本発明に係る判定方法においては、体内時計遺伝子の発現を検出する工程をさらに含み、当該工程にて検出した体内時計遺伝子の発現と、上記検出工程にて検出したＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現との両方に基づいて、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定することが好ましい。
【００２２】
本発明に係る判定方法においては、上記体内時計遺伝子は、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ１遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子およびＰｅｒ３遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る判定キットにおいては、体内時計遺伝子の発現を検出するためのプライマー、プローブ、アレイおよび抗体のうちの少なくとも何れか１つをさらに備えていることが好ましい。
【００２４】
本発明に係る判定キットにおいては、上記体内時計遺伝子は、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ１遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子およびＰｅｒ３遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、以上のように、生体から採取した試料におけるＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出するものである。そのため、簡便に、かつ客観的に、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性を判定できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
上述したように、Ｃｒｙ１遺伝子およびＣｒｙ２遺伝子を破壊したＣｒｙ１／２ＫＯマウスにおいては、関節リウマチによる睡眠障害が引き起こされることが知られている。本発明者らは、Ｃｒｙ１／２ＫＯマウスにおいて、免疫担当細胞においてＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低下していることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２７】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
〔ＲＡの発症またはその可能性の判定方法〕
本発明に係る関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、生体から採取した試料におけるＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出する検出工程を含めばよく、その他の具体的な工程、ならびに使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
【００２９】
本明細書において、「発症可能性」は、関節リウマチによる睡眠障害が発生する危険度を示す指標をいい、発症可能性が高ければそれだけ関節リウマチによる睡眠障害に罹患しやすく、逆に発症可能性が低ければ関節リウマチによる睡眠障害に罹患し難いということを示すものである。
【００３０】
なお、本発明によれば、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性を判定するのみならず、関節リウマチの発症または発症可能性を判定できる。
【００３１】
ＮＫＧ２Ｄレセプターは、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞などのリンパ球の細胞表面に発現しており、下記のＮＫＧ２Ｄリガンドと相互作用する。ＮＫＧ２Ｄレセプターは、ＮＫＧ２Ｄリガンドを認識すると、ＰＩ３キナーゼを介して、ＩＦＮγ産生および細胞傷害活性などの免疫応答を引き起こすシグナルを自己の細胞内に伝達する。
【００３２】
ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＮＫＧ２Ｄレセプターにより認識されるリガンドである。ＮＫＧ２Ｄリガンドは、正常細胞においてはほとんど発現しておらず、熱ショックなどのストレスにより発現が誘導されるタンパク質である。また、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の細胞表面に発現している。ＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、ヒトにおけるＭＩＣＡおよびＭＩＣＡと呼ばれる組織適合抗原、ならびにマウスにおけるＲＡＥ１等が挙げられる。
【００３３】
ＮＫＧ２Ｄレセプターをコードする遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿１４９０６９（マウスＮＫＧ２Ｄレセプター、Mus musculus killer cell lectin-like receptor subfamily K, member 1（Ｋｌｒｋ１））またはＮＰ＿０３１３８６（ヒトＮＫＧ２Ｄレセプター、Homo sapiens killer cell lectin-like receptor subfamily K, member 1（ＫＬＲＫ１））に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０３３０７８に登録されている塩基配列の９９番目から７９７番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子、およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７３６０に登録されている塩基配列の１６５番目から８１５番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００３４】
また、ＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３３０４２（マウスＮＫＧ２Ｄリガンド、Mus musculus retinoic acid early transcript 1, alpha（Ｒａｅｔ１ａ））、ＮＰ＿０３４５３０（マウスＮＫＧ２Ｄリガンド、Mus musculus histocompatibility 60a（Ｈ６０ａ））、ＡＡＰ７６２２３（マウスＮＫＧ２Ｄリガンド、Mus musculus UL16-binding protein-like transcript 1 splicing variant precursor（Ｍｕｌｔ１））、ＮＰ＿０００２３８（ヒトＮＫＧ２Ｄリガンド、MHC class I chain-related gene A protein（ＭＩＣＡ））、ＮＰ＿０７９４９４（ヒトＮＫＧ２Ｄリガンド、Homo sapiens UL16 binding protein 1（ＵＬＢＰ１））またはＮＰ＿６３１９０４（ヒトＮＫＧ２Ｄリガンド、Homo sapiens retinoic acid early transcript 1E（ＲＡＥＴ１Ｅ））に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９０１６に登録されている塩基配列の３９７番目から１１５８番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１０４００に登録されている塩基配列の２０４番目から９９２番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ２４９０２１に登録されている塩基配列の２１番目から７７０番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００２４７に登録されている塩基配列の４０番目から１１９１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２５２１８に登録されている塩基配列の４４番目から７７８番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子、およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１３９１６５に登録されている塩基配列の６１番目から８５２番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００３５】
なお、本発明に用いるＮＫＧ２Ｄレセプターをコードする遺伝子およびＮＫＧ２リガンドをコードする遺伝子は、上述したものに限定されるものではなく、上述した遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズし、かつ、上述した遺伝子の翻訳産物と同様の機能を有する翻訳産物を生じる遺伝子であってもよい。
【００３６】
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法でおこなうことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、また塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
【００３７】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子としては、一般的には、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在する遺伝子が挙げられる。
【００３８】
本明細書において、「ＮＫＧ２Ｄレセプターの発現またはＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を検出する」とは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の何れをも包含するものである。
（ｉ）ＮＫＧ２ＤレセプターまたはＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする遺伝子（以下、それぞれ、「ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子」および「ＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子」ともいう）の転写産物であるｍＲＮＡの発現量を測定する。
（ｉｉ）ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子、またはＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の発現量を測定する。
（ｉｉｉ）ＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質またはＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質を細胞表面に発現している免疫担当細胞の割合を測定する。
【００３９】
本明細書において、「遺伝子の発現量」とは、その遺伝子の転写量、すなわち、その遺伝子のｍＲＮＡ量、およびその遺伝子の翻訳産物であるタンパク質量のいずれをも含む意味で用いている。
【００４０】
また、「発現を検出する」とは、発現しているか否かを検出する意味のみならず、発現が低下または上昇しているか、ならびに、発現の低下および上昇の度合いが大きいか否か等の意味も包含するものである。
【００４１】
また、「免疫担当細胞」とは、免疫細胞とも称し、複数の細胞の相互反応によって成立する免疫応答において、この相互反応に関与し免疫応答を成立させる細胞のことを意図する。具体的には、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）などのリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）ならびにマクロファージ等が挙げられる。
【００４２】
ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子およびＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子（以下、「ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等」ともいう）の発現を検出する方法として、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量を測定する方法を用いる場合、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量の測定方法は、特に限定されるものではない。具体的には、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量の測定方法は、ｍＲＮＡレベルでＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量を測定する方法もしくはタンパク質レベルでＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量の測定する方法、またはその両方を測定する方法であってもよい。より具体的には、（Ａ）ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を定量することにより、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量を測定する方法、（Ｂ）ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の翻訳産物であるタンパク質を定量することにより、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量を測定する方法のいずれをも用いることができる。また、上記（Ａ）および（Ｂ）の両方の方法でＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量を測定してもよい。そうすることにより、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量をより正確に測定することができる。以下、上記（Ａ）および（Ｂ）の方法について説明する。
【００４３】
（Ａ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者から採取した試料より抽出したｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを用いて、ノザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法等により、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等のｍＲＮＡを定量することができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
【００４４】
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合うことができる異なる蛍光色素で標識したプライマーを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲが進んでＴａｑポリメラーゼの５'−３'エクソヌクレアーゼ活性により、このプライマーが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。上記検出対象についてコピー数の明らかな標準試料についても同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods and Applications 4(6):357-362;Heid,C.A.et al.,Genome Research 6:986-994;Gibson,E.M.U.et al.,1996,Genome Research 6:995-1001を参照）。これにより、検出対象を定量することができる。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
【００４５】
上記プライマーは、特に限定されるものではなく、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等のｃＤＮＡの塩基配列を利用して、従来公知の方法で設計すればよい。
【００４６】
採取した試料からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出することができる。採取する試料としては、リンパ球または樹状細胞が含まれていることが好ましく、具体的には、胸腺、肝臓、脾臓およびリンパ節を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
また、ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーならびにノザンハイブリダイゼーション法およびドットブロット法に用いるプローブを蛍光色素などにより標識する場合には、その標識方法は特に限定されるものではない。例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーション法、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識法、クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識法（Berger SL,Kimmel AR.(1987)Guide to Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology,Academic Press;Hames BD,Higgins SJ(1985)Genes Probes:A Practical Approach.IRL Press;Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.(1989)Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照）、ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識法（Melton DA,Krieg,PA,Rebagkiati MR,Maniatis T,Zinn K,Green MR.(1984)Nucleic Acid Res.,12,7035−7056を参照）、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Krick a LJ.(1992)Nonisotopic DNA Probing Techniques.Academic Pressを参照）などを用いることができる。また、アルカリホスファターゼ等の酵素を化学架橋によって核酸に直接結合させて、プローブを標識することも可能である。
【００４８】
（Ｂ）タンパク質を用いる方法
タンパク質を用いる場合、分析対象となるＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の翻訳産物であるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ法などの従来公知の免疫化学的手法によりタンパク質を定量することができる。また、本発明はこれに限定されず、従来公知のあらゆる手法を用いて、タンパク質を定量することができる。このように、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の翻訳産物であるタンパク質を定量することで、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等の発現量を測定することができる。
【００４９】
採取した試料からタンパク質を抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記タンパク質を含有する生物学的試料（例えば、細胞、および組織等）などから、タンパク質が分解されない条件下で、従来公知の緩衝液および装置、キット等を用いてタンパク質を抽出することができる。生物学的試料としては、リンパ球または樹状細胞が含まれているものであることが好ましく、具体的には、胸腺、肝臓、脾臓およびリンパ節を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、抗体の取得方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離することにより取得することができる。また、ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。さらに、必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離してもよい。
【００５１】
また、モノクローナル抗体は、例えば、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させて得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収することにより取得することができる。
【００５２】
細胞表面に発現しているＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質またはＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質を用いる場合、上述したＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質およびＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質の抗体を用いて、蛍光活性化セルソータ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ：ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーなどの従来公知の免疫化学的手法により、ＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質またはＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質を細胞表面に発現している免疫担当細胞の数を定量することができる。またこのときに、抗体など細胞を識別するために用いられる従来公知の識別マーカーを用いてＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞など特定種の細胞を分離することにより、その細胞種におけるＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質発現細胞およびＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質発現細胞の割合を定量化することができる。分子マーカーを用いて細胞を分離する方法としては、フローサイトメトリーによる方法および磁気ビーズを用いた方法など従来公知の方法を用いることができる。
【００５３】
ＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質の細胞表面への発現を検出するための細胞としては、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞が好ましい。
【００５４】
また、ＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質の細胞表面への発現を検出するための細胞としては、樹状細胞およびリウマチ患者（ＲＡ）滑膜細胞などが好ましい。
【００５５】
上述したように、また後述する実施例に示すように、Ｃｒｙ１遺伝子およびＣｒｙ２遺伝子の発現が低下するとＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が減少する。また、Ｃｒｙ１遺伝子およびＣｒｙ２遺伝子の発現が低下すると関節リウマチによる睡眠障害が引き起こされる。したがって、ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの発現の減少が検出された場合には、Ｃｒｙ１遺伝子およびＣｒｙ２遺伝子の発現の低下により引き起こされる関節リウマチによる睡眠障害を現在発症しているか、または将来的に発症する可能性がある。
【００５６】
本発明の判定方法においては、上述した方法により、採取した試料におけるＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出する。その後、その発現量を、同様の方法で測定した健常者から採取した試料における発現量と比較する。両者の間で有意な相違が見られた場合には、この被験者は、関節リウマチによる睡眠障害を現在発症しているか、または将来的に発症する可能性があると判定することができる。より具体的にいえば、ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現が健常者と比較して減少していれば、関節リウマチによる睡眠障害を現在発症しているか、または将来的に発症する可能性があると判定する。
【００５７】
本発明の判定方法においてＮＫＧ２ＤレセプターまたはＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を検出する場合、ｍＲＮＡの発現量の検出、タンパク質の発現量の検出、およびタンパク質を細胞表面に発現している免疫担当細胞の検出の何れか１つをおこなうものであってもよく、または複数の検出方法を組み合わせておこなうものであってもよい。複数の検出方法を組み合わせることにより、判定精度をより高めることができる。
【００５８】
（体内時計遺伝子検出工程）
特許文献１に開示されているように、体内時計遺伝子の発現を評価することにより、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性を判定できる。したがって、本発明の判定方法においては、生体から採取した試料における、体内時計遺伝子の発現を検出する工程をさらに含むことが好ましい。また体内時計遺伝子としては、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ１遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子およびＰｅｒ３遺伝子が好ましい。本発明に係る判定方法においては、上記列記した体内時計遺伝子から、少なくとも１つの遺伝子の発現を検出すればよい。
【００５９】
体内時計遺伝子の発現を検出する工程にて検出した体内時計遺伝子の発現と、上記検出工程にて検出したＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現との両方に基づいて、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定することにより、判定精度をより高めることが可能となる。
【００６０】
体内時計遺伝子の発現を検出する工程は、ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出する検出工程の前、または同時に、または検出工程の後におこなうことができる。
【００６１】
本明細書において、「体内時計遺伝子」とは、体内時計を制御する遺伝子を意味する。また、「体内時計」とは、生物が地球の自転により起こる昼夜変化に適応するために獲得した基本形質を意味する。体内時計のセンターは視床下部の小神経核である視交叉上核である。一方で、皮膚をはじめ肝、腸管、腎などの臓器では個々に体内時計遺伝子が発現し、それら遺伝子が互いにその発現を調節しながら作用して体内ホルモンの分泌や代謝に日内リズムをもたらす。その結果として、生体内では、２４時間周期の機能的変動が起こる。
【００６２】
Ｃｒｙ１遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３１７９７またはＮＰ＿００４０６６に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７７７１に登録されている塩基配列の５８４番目から２４０４番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」ともいう）として有する遺伝子、およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４０７５に登録されている塩基配列の５８７番目から２３４７番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００６３】
Ｃｒｙ２遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４０９３またはＮＰ＿０６６９４０に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９９６３に登録されている塩基配列の６番目から１７８４番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子、およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１１１７に登録されている塩基配列の１４番目から１７９５番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００６４】
Ｃｌｏｃｋ遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３１７４１またはＮＰ＿００４８８９に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７７１５に登録されている塩基配列の３８９番目から２９５６番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子、およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８９８に登録されている塩基配列の３３９番目から２８７９番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００６５】
Ｂｍａｌ１遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡＡ１９９３５に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢ０００８１２に登録されている塩基配列の４１番目から１９２１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００６６】
Ｐｅｒ１遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３５１９５またはＮＰ＿００２６０７に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６５に登録されている塩基配列の２２６番目から４１０１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子、およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２６１６に登録されている塩基配列の１８８番目から４０６０番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００６７】
Ｐｅｒ２遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３５１９６またはＮＰ＿０７３７２８に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６６に登録されている塩基配列の１４５番目から３９１８番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子、およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２２８１７に登録されている塩基配列の１２３番目から３８９０番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００６８】
Ｐｅｒ３遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３５１９７またはＮＰ＿０５８５１５に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６７に登録されている塩基配列の３５８番目から３６９９番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子、およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１６８３１に登録されている塩基配列の１７６番目から３７８１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００６９】
なお、本発明に係る体内時計遺伝子は、上述したものに限定されるものではなく、上述した遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズし、かつ、上述した遺伝子の翻訳産物と同様の機能を有する翻訳産物を生じる遺伝子であってもよい。
【００７０】
「体内時計遺伝子の発現を検出する」とは、以下の（ｉｖ）〜（ｖｉｉｉ）の何れをも包含するものである。
（ｉｖ）体内時計遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量を測定する。
（ｖ）体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の発現量を測定する。
（ｖｉ）体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質に由来する活性量を測定する。
（ｖｉｉ）体内時計遺伝子の変異の有無を調べる。
（ｖｉｉｉ）体内時計遺伝子の有無を調べる。
【００７１】
ｍＲＮＡを用いた発現量の測定、およびタンパク質を用いた発現量の測定については、上述のＮＫＧ２Ｄレセプター（リガンド）遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定、およびＮＫＧ２Ｄレセプター（リガンド）タンパク質の発現量の測定、に関する説明をそれぞれ準用できる。
【００７２】
また、体内時計遺伝子の発現を検出する方法として、体内時計遺伝子の変異の有無を調べる方法を用いることもできる。この場合の体内時計遺伝子の変異は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）、または翻訳産物であるタンパク質を用いて、従来公知の方法により調べることができる。
【００７３】
具体的には、ゲノムＤＮＡを用いる場合、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＨＰＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法、タイリング・アレイ法、および変性勾配ゲル電気泳動法などを用いて変異の有無を調べることができる。ゲノムＤＮＡは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢血リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、末梢血から得ることも可能である。
【００７４】
得られたゲノムは、そのまま用いてもよいし、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いてもよい。
【００７５】
また、ｍＲＮＡを用いる場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、対象遺伝子の領域を増幅後、増幅断片の塩基配列を直接シーケンスすることにより、またはＤＮＡアレイを用いることにより、またはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、体内時計遺伝子の変異の有無を決定することができる。
【００７６】
また、被験者の細胞より調製したタンパク質を用いる場合、通常のタンパク質のシーケンス方法に準ずればよく、例えば、正常型もしくは変異型の体内時計タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシーケンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられる。
【００７７】
このように、体内時計遺伝子の発現を検出する方法として、体内時計遺伝子の変異の有無を調べる方法を用いる場合、体内時計遺伝子における変異が検出されれば、ＲＡによる睡眠障害を現在発症しているか、または将来的にＲＡによる睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。この場合、さらに、翻訳産物であるタンパク質の定量や活性を評価することにより、健常者と比較して、体内時計遺伝子の発現に異常がないか調べることが好ましい。これにより、評価精度をより高めることができる。
【００７８】
例えば、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子、またはＰｅｒ３遺伝子に変異が検出され、その結果、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡによる睡眠障害を現在発症しているか、または将来的にＲＡによる睡眠障害を発症する可能性があると判定できる。また、Ｃｌｏｃｋ遺伝子またはＢｍａｌ１遺伝子に変異があり、その結果、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して上昇していれば、ＲＡによる睡眠障害を現在発症しているか、または将来的にＲＡによる睡眠障害を発症する可能性があると判定できる。
【００７９】
また、本発明では、体内時計遺伝子の発現を検出する方法として、体内時計遺伝子の有無を調べる方法を用いることもできる。具体的には、被験者のゲノムＤＮＡ上に、体内時計遺伝子が存在するかを従来公知の方法により調べることで、体内時計遺伝子の有無を調べることができる。
【００８０】
具体的にいえば、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子、またはＰｅｒ３遺伝子が欠損している場合、ＲＡによる睡眠障害を現在発症しているか、または将来的にＲＡによる睡眠障害を発症する可能性があると判定できる。
【００８１】
本発明に係る関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、ヒトに対してだけでなく、非ヒト哺乳動物に対しても適用できる。
【００８２】
ヒトに対する本発明の判定方法の有用性は述べるまでもなく、関節リウマチおよび関節リウマチによる睡眠障害の診断に適用することが可能である。また、非ヒト哺乳動物に対しては、例えば、関節リウマチおよび関節リウマチによる睡眠障害の治療薬を開発する際の動物実験およびスクリーニング等に非常に有用であろう。
【００８３】
〔判定キット〕
本発明に係る判定キットは、上述した判定方法を実施するために用いる、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性の判定用のキットであって、ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出するためのプライマー、プローブ、アレイおよび抗体のうちの少なくとも何れか１つを備えている。
【００８４】
ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を検出するためのプライマー、プローブ、アレイおよび抗体は、ＮＫＧ２Ｄレセプター等の発現を検出できるものであればよく、上記判定方法の説明において例示したプライマー、プローブ、アレイおよび抗体を用いることができる。
【００８５】
また、本発明のキットは、体内時計遺伝子、例えば、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ１遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子およびＰｅｒ３遺伝子を検出するためのプライマー、プローブ、アレイおよび抗体のうちの少なくとも何れか１つをさらに備えていてもよい。これらプライマー、プローブ、アレイおよび抗体の説明については、上記判定方法におけるＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子等のプライマー、プローブ、アレイおよび抗体についての説明を準用できる。
【００８６】
また、キットの構成としては上述したものに限定されるものではなく、酵素、試薬、洗浄液、培養器具および測定器具等を備えていてもよい。
【００８７】
本発明に係る判定キットを用いれば、ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を指標として、関節リウマチによる睡眠障害の発症または発症可能性を、簡便かつ客観的に判定することができる。
【００８８】
本発明に係る判定キットが適用される被験者は、特に限定されるものではないが、自覚症状として、睡眠障害、例えば、不眠を訴えている者や、関節炎を疑わせる症状を有する者であることが好ましい。
【００８９】
なお、本発明に係る判定キットは、関節リウマチの発症または発症可能性の判定用にも用いることができる。
【００９０】
〔その他の利用〕
本発明においては、生体から採取した試料における、体内時計遺伝子の発現を検出することにより、該生体のリンパ球におけるＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を評価することもまた可能である。ＮＫＧ２Ｄレセプターの発現は、リンパ球細胞表面上へのＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質の発現であることが好ましい。
【００９１】
また、この場合に、検出する体内時計遺伝子としては、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ１遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子およびＰｅｒ３遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることが好ましい。
【００９２】
また、本発明においては、生体から採取した細胞または非ヒト哺乳動物において、体内時計遺伝子の発現を調節することにより、ＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を調節することが可能である。より具体的には、Ｃｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子およびＰｅｒ３遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を低下させることにより、ＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を低下させることが可能である。ＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を調節する調節方法は、生体から採取した細胞または非ヒト哺乳動物において、体内時計遺伝子の発現を調節することによりおこなわれればよく、その他の具体的な工程、ならびに使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
【００９３】
なお、ここで、「生体から採取した細胞」は、生体から採取した細胞自体だけでなく、生体から採取した細胞を継代培養した細胞をも包含している。
【００９４】
本発明に係る調節方法において、生体から細胞を採取する方法は特に限定されず、従来公知の方法により採取すればよい。また採取する細胞としては、胸腺、肝臓、脾臓または四肢関節周囲軟部組織から採取した細胞、末梢血リンパ球、および胸腺または脾臓より採取したリンパ球を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
また、非ヒト哺乳動物としては、ヒト以外の哺乳動物であれば限定されるものではないが、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物が好ましい。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびイヌ等が挙げられる。
【００９６】
本明細書において、「体内時計遺伝子の発現を調節」は、体内時計遺伝子のｍＲＮＡ量またはタンパク質量を増加または減少させること、および体内時計遺伝子のタンパク質の活性を上昇または低下させることの何れをも包含するものである。また、その調節方法としては、遺伝子破壊、ｍＲＮＡの翻訳阻害または分解等の転写後調節、転写量を上昇または低下させる転写調節領域への変異の導入、アミノ酸配列の変異を引き起こす変異の導入、タンパク質の活性の変化を引き起こす変異の導入、および抗体によるタンパク質の活性の阻害等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの発現の調節とは、ＮＫＧ２Ｄレセプター遺伝子またはＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子のｍＲＮＡ量またはタンパク質量を増加または減少させること、それぞれのタンパク質の細胞表面への発現を増加または減少させること、ＮＫＧ２Ｄレセプタータンパク質またはＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質の何れかを細胞表面に発現している細胞の割合を増加または減少させることを意図するものである。
【００９８】
例えば、体内時計遺伝子がＣｒｙ１遺伝子、Ｃｒｙ２遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子またはＰｅｒ３遺伝子である場合、これら遺伝子の発現を低下させることにより、ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を低下させることができる。
【００９９】
上記調節方法によれば、簡便に、ＮＫＧ２ＤレセプターおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも何れかの発現を調節できる。したがって、簡便に、免疫担当細胞の細胞活性、および非ヒト哺乳動物における自己免疫疾患の発症可能性を調節でき、自己免疫疾患の治療薬を開発する際の動物実験およびスクリーニング等に非常に有用であろう。
【０１００】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患と、特異性のない疾患の２つに大別される。臓器特異的自己免疫疾患としては、橋本甲状腺炎（慢性甲状腺炎）、原発性粘膜水腫、甲状腺中毒症（甲状腺剤中毒症）、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎（自己免疫性萎縮性胃炎）、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症（発作性ヘモグロビン尿症）、突発性血小板減少性紫斑病、およびシェーグレン症候群が挙げられる。臓器非特異的自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病が挙げられる。本発明の適用対象としての自己免疫疾患は、関節リウマチであることが好ましい。
【０１０１】
また、本発明によれば、免疫担当細胞の細胞活性を評価する活性評価方法であって、生体から採取した試料における体内時計遺伝子の発現を検出することにより、生体の免疫担当細胞におけるＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を評価することによりおこなわれる活性評価方法を提供することができる。
【０１０２】
例えば、上述したＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を評価する発現評価方法において、ＮＫＧ２Ｄレセプターの発現が低下していると評価した場合には、免疫担当細胞の細胞活性が低下していると評価することができる。
【０１０３】
本明細書において、「免疫担当細胞の細胞活性」は、免疫担当細胞が、細胞の内外からのシグナルに応答して発現する、当該免疫担当細胞に特有の機能の活性が意図される。例えば、ＮＫ細胞における細胞傷害活性およびインターフェロンγ等のサイトカイン産生活性、樹状細胞における抗原提示能、その他免疫機構を活性化させる働きが意図される。
【０１０４】
上記活性評価方法においては、その他の具体的な工程、ならびに使用する器具および装置は特に限定されるものではない。例えば、さらにＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を評価してもよい。上記活性評価方法によれば、簡便に、免疫担当細胞の細胞活性を評価することができる。
【０１０５】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【０１０６】
〔１．体内時計の破壊によるＮＫＧ２Ｄ陽性リンパ球細胞の減少〕
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）、ならびにＣｒｙ１遺伝子およびＣｒｙ２遺伝子を破壊したマウス（以下、「ＣｒｙＫＯマウス」とも称する。）を屠殺し、脾臓細胞を採取した。それぞれの脾臓細胞におけるリンパ球細胞に占めるＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の割合を、抗ＣＤ３抗体および抗ＮＫ１．１抗体を使用してフローサイトメーターにより測定した。さらに、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞において、細胞表面上でのＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を使用してフローサイトメーターにより測定し、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞におけるＮＫＧ２Ｄレセプター陽性細胞の割合を測定した。結果を図１および図２に示す。
【０１０７】
図１（Ａ）および図２（Ａ）に示すように、野生型マウスとＣｒｙＫＯマウスとの間において、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の細胞数に差は見られなかった。
【０１０８】
しかしながら、図１（Ｂ）に示すように、ＣｒｙＫＯマウスにおけるＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の割合は、野生型マウスにおけるＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の割合と比較して有意に減少していた（野生型マウス：ＣｒｙＫＯマウス＝６０．６％±５．９：３８．３％±９．１  （ｐ＜０．０５））。
【０１０９】
また、図２（Ｂ）に示すように、ＣｒｙＫＯマウスにおけるＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫＴ細胞の割合は、野生型マウスにおけるＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫＴ細胞の割合と比較して有意に減少していた（野生型マウス：ＣｒｙＫＯマウス＝３４．１％±５．２：２３．４％±１．０  （ｐ＜０．０５））。
【０１１０】
〔２．体内時計の破壊によるＲＡＥ１陽性樹状細胞の減少〕
野生型マウスおよびＣｒｙＫＯマウスを屠殺し、脾臓細胞を採取した。それぞれの脾臓細胞における樹状細胞（ＤＣ）の割合を、抗ＣＤ１１ｃ抗体を使用してフローサイトメーターにより測定した。さらに、樹状細胞において、細胞表面上でのＲＡＥ１（ＮＫＧ２Ｄリガンド）の発現を、抗ＲＡＥ１抗体を使用してフローサイトメーターにより測定し、樹状細胞におけるＲＡＥ１陽性細胞の割合を測定した。結果を図３に示す。
【０１１１】
図３（Ａ）に示すように、ＣｒｙＫＯマウスにおける樹状細胞の数は、野生型マウスにおける樹状細胞の数と比較して、有意に減少していた（野生型マウス：ＣｒｙＫＯマウス＝２．８％±０．７：１．９％±０．７  （ｐ＜０．０５））。また図３（Ｂ）に示すように、ＣｒｙＫＯマウスにおけるＲＡＥ１陽性ＤＣの割合は、野生型マウスにおけるＲＡＥ１陽性ＤＣの割合と比較して有意に減少していた（野生型マウス：ＣｒｙＫＯマウス＝９．９％±１．１：７．０％±２．３  （ｐ＜０．０５））。
【０１１２】
〔参考例〕
〔１．体内時計の破壊によるＮＫＧ２Ｄ陽性リンパ球細胞の減少〕
野生型マウスおよびＣｒｙＫＯマウスを屠殺し、脾臓細胞を採取した。それぞれの脾臓細胞におけるリンパ球細胞に占めるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ８抗体を使用してフローサイトメーターにより測定した。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞において、細胞表面上でのＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を使用してフローサイトメーターにより測定し、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄレセプター陽性細胞の割合を測定した。結果を図４に示す。
【０１１３】
図４（Ａ）に示すように、野生型マウスとＣｒｙＫＯマウスとの間において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞数に差は見られなかった。また、図３（Ｂ）に示すように、ＣｒｙＫＯマウスにおけるＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と野生型マウスにおけるＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合との間に有意差はみられなかった（ｐ≧０．０５）。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
以上のように、本発明では免疫応答に関わるレセプターおよびリガンドの発現を簡便に評価することができる。したがって、本発明は、免疫応答または免疫疾患の診断医療分野、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】（Ａ）は、ＮＫ細胞の割合を測定した結果を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。（Ａ）および（Ｂ）においてＢ６は野生型マウスを表す。
【図２】（Ａ）は、ＮＫＴ細胞の割合を測定した結果を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫＴ細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。（Ａ）および（Ｂ）においてＢ６は野生型マウスを表す。
【図３】（Ａ）は、樹状細胞の割合を測定した結果を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＲＡＥ１陽性ＤＣの割合を測定した結果を示すグラフである。（Ａ）および（Ｂ）においてＢ６は野生型マウスを表す。
【図４】（Ａ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を測定した結果を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。（Ａ）および（Ｂ）においてＢ６は野生型マウスを表す。
【図１】
2010011776.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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