(57)【要約】【課題】変性条件下においても過度の電流を抑制し、再現性及び解像度の高い試料分離を実現するマイクロチップ及び電気泳動方法を提供する。【解決手段】マイクロチップは、基板上に設けられた流路に導入される試料溶液２と流路の両端に導入される陰極液４及び陽極液７とが直接接触しないように試料溶液２と陰極液４及び陽極液７とを離間させる離間部３を有している。離間部３を設けることにより、試料溶液２と陰極液４及び陽極液７とが直接接することがないので、たとえ変性条件下であっても、過度の電流を抑制し、再現性及び解像度の高い試料分離を実現することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に設けられた流路に導入される試料溶液と前記流路の両端に導入される電極液とが直接接触しないように前記試料溶液と前記電極液とを離間させる離間手段を有することを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
前記流路を覆う被覆手段と、
前記被覆手段を貫通して設けられ、前記流路に前記試料溶液を注入するための試料注入手段と、を有することを特徴とする請求項１記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記離間手段は、高分子ポリマーを主体とする溶液を含有することを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記離間手段は、ｃＩＥＦゲル、メチルセルロース溶液、ポリエチレングリコール溶液、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル及びその組み合わせの何れかであることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載のマイクロチップ。
【請求項５】
基板上に設けられた流路に導入される試料溶液と前記流路の両端に導入される電極液とが直接接触しないように前記試料溶液と前記電極液とを離間させる離間手段を、前記流路に形成する離間手段形成ステップと、
前記電極液を前記流路に導入する電極液導入ステップと、を有することを特徴とする電気泳動方法。
【請求項６】
前記試料溶液を前記流路に導入する試料溶液導入ステップを有し、
前記離間手段形成ステップは、前記試料溶液導入ステップの後に前記離間手段を形成することを特徴とする請求項５記載の電気泳動方法。
【請求項７】
前記試料溶液を前記流路に導入する試料溶液導入ステップを有し、
前記離間手段形成ステップは、前記試料溶液導入ステップの前に前記離間手段を形成することを特徴とする請求項５記載の電気泳動方法。
【請求項８】
前記流路を覆う被覆手段を貫通して設けられた試料注入手段を封入する封入ステップを有し、
前記前記試料溶液導入ステップは、前記試料注入手段を介して前記流路に前記試料溶液を導入し、
前記封入ステップは、前記前記試料溶液導入ステップにより前記流路に前記試料溶液を導入した後に、前記試料注入手段を封入することを特徴とする請求項６又は７に記載の電気泳動方法。
【請求項９】
前記電極液に電圧を印加し、前記流路に導入された前記試料溶液の電気泳動を行う電気泳動ステップを有することを特徴とする請求項５から８の何れか１項に記載の電気泳動方法。
【請求項１０】
前記電気泳動ステップは、等電点電気泳動により前記試料溶液の電気泳動を行うことを特徴とする請求項９記載の電気泳動方法。
【請求項１１】
前記試料溶液は、タンパク質変性剤を含有することを特徴とする請求項５から１０の何れか１項に記載の電気泳動方法。
【請求項１２】
前記タンパク質変性剤は、尿素であることを特徴とする請求項１１記載の電気泳動方法。
【請求項１３】
前記離間手段形成ステップは、高分子ポリマーを主体とする溶液により前記離間手段を形成することを特徴とする請求項５から１２の何れか１項に記載の電気泳動方法。
【請求項１４】
前記離間手段形成ステップは、ｃＩＥＦゲル、メチルセルロース溶液、ポリエチレングリコール溶液、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル及びその組み合わせの何れかにより前記離間手段を形成することを特徴とする請求項５から１３の何れか１項に記載の電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上に流路が形成されたマイクロチップ及び電気泳動方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のプロテオミクス技術の飛躍的な進展により、ゲノム情報からは得られないタンパク質やペプチドの発現状態を個々人で調べることが可能になってきた。例えば、リン酸化、アセチル化、糖鎖付加、ＲＮＡ（RiboNucleic Acid）プロセシングやタンパク質プロセシングによるアイソフォーム生成等、多様な翻訳後修飾の検出が行われるようになっている。さらに、このようなタンパク質発現情報を患者と健常者の間で比較することによって、疾患の早期診断につながるバイオマーカの探索が精力的に行われる等、いわゆるテーラーメード医療の実現に向けた基礎的研究が活発に行われている。
【０００３】
特に、血清タンパク質の発現解析は、個人の肉体的及び精神的負担が少ないうえに全身をくまなく循環する血液中に含まれるタンパク質を解析することから、疾患のマーカとなりうるタンパク質やペプチドがその中に含まれることが期待されている。また、血清タンパク質の発現解析は、臨床的にも有用な情報を与えるものと期待されているため、精力的な研究が行われている。
【０００４】
上述したような血清試料からタンパク質やペプチドを分離及び解析するプロテオミクス技術として、様々な技術が実用化されている。例えば、２次元ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（Poly- Acrylamide Gel Electrophoresis ））やＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマロトグラフ−タンデム質量分析）等の網羅的解析方法が実用化されている。
【０００５】
２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質を網羅的に解析することができ、翻訳後修飾をうけたタンパク質群の定量性に優れているが、スループット性や実験技法の習熟難度の高さ等が問題となっていた。近年、検出方法の技術進歩により再現性はかなり改善されてきているが、スループット性については未だに問題が残されたままである。
【０００６】
また、上記２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに関連して、薄膜状に形成されたスライスゲルを試料泳動方向に何枚も重ねて分離層としたゲルを試料泳動用ゲルに適用する技術が開示されている（例えば、特許文献１）。上記分離層をゲルとして利用することで、電気泳動による試料分離後、所望する位置に留まったタンパク質やペプチドを容易に取り出すことができる。
【０００７】
他方、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用したいわゆるショットガン解析は、タンパク質を網羅的に解析することができ、スループット性が非常に高く、非常に多くのタンパク質発現様態を明らかにすることができる。しかし、翻訳後修飾等、疾患関連タンパク質に多く見られるヘテロジェナイティの網羅的検出及びその定量的解析には未だ多くの問題があった。
【０００８】
また、タンパク質やペプチドを分離及び精製する方法として、微細加工技術を使ってガラス基板上に形成した微細加工流路を備えたマイクロチップを用いる微量タンパク質分離技術が開示されている（例えば、特許文献２）。上記特許文献２のマイクロチップを用いることにより、微量のタンパク質を等電点電気泳動により短時間で分離することができ、翻訳後修飾のハイスループット検出方法として期待されている。
【０００９】
上記マイクロチップを用いて等電点電気泳動を行う際に、タンパク質やペプチドを予め蛍光標識する技術もある。この技術では、微細加工流路内で蛍光標識されたタンパク質やペプチドの等電点電気泳動を行い、等電点により分離された個々のタンパク質やペプチドを引き続き分離を維持した状態で蛍光検出することによって、タンパク質やペプチドの等電点と発現量に関する情報を同時に取得することができる。
【００１０】
しかし、タンパク質の電荷が全体としてゼロになる等電点において、タンパク質の溶解性が最も低くなるためにタンパク質が凝集し、いわゆる等電点沈殿が生じてしまうという問題があった。上記問題を解決し、タンパク質を可溶化状態にしておくために、等電点電気泳動を実施する際、尿素等のタンパク質変性剤を試料溶液に添加する技術が開示されている（例えば、特許文献３）。上述したように試料溶液にタンパク質変性剤を添加し、タンパク質の可溶化状態を保つことで、イモビライン・ゲルなどを用いる通常の等電点電気泳動において、ゲル中でタンパク質がそれぞれの等電点に到達すると、泳動ゲル内でのイオンの流れは殆ど見られなくなり、タンパク質の等電点分離が達成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−１５０８５４号公報
【特許文献２】再特ＷＯ２００５／０２６７４２号公報
【特許文献３】特表平１１−５０５５０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、タンパク質を可溶化して解析するために、尿素を含む試料溶液を微細加工流路内に導入後、試料溶液に接するように酸及びアルカリを主成分とする電極液をそれぞれ陽極及び陰極リザーバに導入し、等電点電気泳動を行うと、時間経過とともに電流値が異常に上昇してしまうという問題があった。また、分離したタンパク質バンドの陰極側へのシフトやバンドのゆがみ等、分離状態が悪化してしまうという問題があった。
【００１３】
尿素は水の存在下において、酸、アルカリや熱により容易に加水分解され、二酸化炭素とアンモニアを生じることが知られている。このことが異常な電流上昇の一因であり、ひいては分離されたタンパク質の陰極側への移動やタンパク質分離状態の攪乱をもたらすものと考えられている。
【００１４】
上記特許文献２や特許文献３では、尿素存在下での良好なタンパク質分離を実現する技術については開示も示唆もされていないため、電流値の異常上昇や分離後タンパク質の分離状態悪化という問題を解決することができないという課題があった。
【００１５】
本発明はこのような実情を鑑みてなされたものであり、上記課題を解決し、変性条件下においても過度の電流を抑制し、再現性及び解像度の高い試料分離を実現するマイクロチップ及び電気泳動方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明のマイクロチップは、基板上に設けられた流路に導入される試料溶液と流路の両端に導入される電極液とが直接接触しないように試料溶液と電極液とを離間させる離間手段を有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の電気泳動方法は、基板上に設けられた流路に導入される試料溶液と流路の両端に導入される電極液とが直接接触しないように試料溶液と電極液とを離間させる離間手段を、流路に形成する離間手段形成ステップと、電極液を流路に導入する電極液導入ステップと、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、過度の電流を抑制し、再現性及び解像度の高い試料分離を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本実施形態に係る電気泳動方法に適用するマイクロチップの構成例を示す縦断概観図である。
【図２】本実施形態に係るマイクロチップの構成例を示す縦断概観図である。
【図３】本実施形態において、離間部を設ける場合（ａ）と離間部を設けない場合（ｂ）の等電点電気泳動時の電流値の変化例を示す図である。
【図４】本実施形態において、離間部を設ける場合（ａ）と離間部を設けない場合（ｂ）の蛍光マーカの分離位置の例を示す図である。
【図５】本実施形態において、離間部を設ける場合（ａ）と離間部を設けない場合（ｂ）のＣｙ３蛍光のピーク例を示す図である。
【図６】本実施形態において、離間部を設ける場合（ａ）と離間部を設けない場合（ｂ）の蛍光イメージの例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明の実施形態の例について、図面を用いて詳細に説明する。以下、マイクロチップとしてタンパク質等電点電気泳動分離チップを例に挙げ、電気泳動方法としてタンパク質等電点電気泳動方法を例に挙げて説明するが、これに限定されるものではないことは言うまでもない。
【００２１】
図１は、試料溶液導入後の、本実施形態に係る電気泳動方法を適用したマイクロチップの構成例を示す。本実施形態に係る電気泳動方法は、基板１、基板１上に設けられた流路、陰極・陽極リザーバ、を備えるマイクロチップに適用することができる。図１に示すように、本実施形態に係る電気泳動方法を適用した試料溶液導入後のマイクロチップは、基板１、微細加工流路に導入された試料溶液２、離間部３、陰極リザーバに導入された電極液である陰極液４、ガラス蓋５、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）蓋６、陽極リザーバに導入された電極液である陽極液７、を有している。尚、本実施形態に係る電気泳動方法に適用できるマイクロチップの例として、基板１、基板１上に設けられた流路、陰極・陽極リザーバ、を備えるマイクロチップを例に挙げて説明したが、これに限定されるものではない。
【００２２】
基板１は、例えばガラスやプラスチック等により形成されており、表面に微細加工流路を備えている。微細加工流路に導入された試料溶液２は、例えばタンパク質やペプチド等の分離・解析対象となる試料を含有している。離間部３は、微細加工流路に導入された試料溶液２と、陰極液４及び陽極液７と、が直に接することを防ぐ手段である。離間部３としては、導電性を確保しつつ熱拡散を抑制できる、例えば、高分子ポリマーを主体とする粘性の高い液体やゲル等を適用することができる。具体的には、離間部３としてメチルセルロースやポリエチレングリコールの溶液、キャピラリー電気泳動用（ｃＩＥＦ）ゲル、アガロースあるいはポリアクリルアミドを含有するゲル等を適用することができるが、これに限定されるものではない。また、本実施形態では、例えば、陰極液４としてはアルカリを含む溶液を適用し、陽極液７としては酸を含む溶液を適用する。
【００２３】
本実施形態に係るタンパク質等電点電気泳動分離チップは、縦２ｍｍ、横３５ｍｍの流路が基板１上に加工されている。流路内部には、等間隔（例えば、縦２ｍｍ、横２ｍｍの正方形内に約１．５万本）に設けられたピラー構造を備えている。ピラー構造は、例えば横２０μｍ、縦１０μｍ、高さ１０μｍの柱構造である。流路はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製の蓋６で覆うことで密閉構造となる。ガラス蓋４は、ＰＤＭＳ蓋６の上に重ねて設けられ、ＰＤＭＳ蓋６をサポートする。ＰＤＭＳ蓋６の流路両端に接する部分は円筒状に切り抜かれており、電極液を導入するための区画（リザーバ）となっている。さらに流路内壁面及びピラー構造の壁面には線形ポリアクリルアミドをコートしており、これにより流路内を親水性に保つと同時に等電点電気泳動時の電気浸透流を抑制する。
【００２４】
上述したような等電点電気泳動チップの微細加工流路に、タンパク質変性剤としての尿素を含む試料溶液を導入する。尚、タンパク質等電点電気泳動用チップには、あらかじめＰＤＭＳ蓋６が密着されており、流路外に試料であるタンパク質やペプチド溶液が漏れないようされている。ここで、試料溶液は、例えば、試料となるタンパク質やペプチドをｃＩＥＦゲル溶液と混合し、さらにキャリアアンフォライトと混合して調合される。この際、等電点電気泳動をモニターするために、蛍光ラベルされた各種の等電点マーカを同時に混入させてもよい。
【００２５】
上述したように微細加工流路に導入された試料溶液２に接するように、離間部３として機能するゲル等を陽極リザーバ及び陰極リザーバに導入する。さらに、この離間部３の上に陰極液４あるいは陽極液７を導入する。この際、離間部３を乱すと尿素を含む試料溶液が、陰極液４又は陽極液７に含まれるアルカリ又は酸に接する可能性があるので、離間部３を攪乱しないようにする必要がある。
【００２６】
本実施形態では、陽極液７としてリン酸水溶液、陰極液４として水酸化ナトリウム水溶液を使用する。電気泳動は、例えば両極に１５００Ｖの電圧を１分間印加後、３０００Ｖで１２分間印可することにより行う。電気泳動時の温度は、例えばペルチエ素子により１０℃を維持する。泳動終了後、電気泳動チップを直ちに液体窒素雰囲気下におき、流路内の溶液を凍結させる。凍結後、ＰＤＭＳ蓋６を取り外し、−２０℃において減圧し凍結乾燥を行う。これによりタンパク質やペプチドは等電点分離が達成された流路の特定位置に分離された状態で保持され、常温に戻しても、静かに取り扱えば分離されたタンパク質やペプチドが移動・拡散・混合することはない。
【００２７】
尚、上記では、マイクロチップの微細加工流路に試料溶液を導入後に、離間部をマイクロチップの陽極リザーバ及び陰極リザーバに形成する例を説明したが、これに限定されるものではない。例えば、本実施形態に係るマイクロチップは、図２に示すように予め離間部を備える構成とすることも可能である。予め離間部を備えるマイクロチップには、微細加工流路に試料溶液を導入するための試料注入部８を設けるとよい。
【００２８】
試料注入部８は、ガラス蓋５とＰＤＭＳ蓋６を貫通して形成されている。試料注入部８の構成としては、微細加工流路に導入された試料溶液が漏れ出てしまわない程度の大きさが好適であり、図２では、ガラス蓋５から微細加工流路に向かって直径が小さくなる試料注入部８を例として示している。図２に示すような試料注入部８では、毛細管現象により試料溶液を微細加工流路に導入することができる。
【００２９】
試料注入部８から微細加工流路に試料溶液を導入した後、試料注入部８をパラフィンオイル等で封入する。そして、上述したようにリザーバに電極液を重層し、電気泳動を行う。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は、かかる実施例により何ら限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
本実施例では、タンパク質等電点電気泳動用チップを用いて、リザーバ内に試料溶液と電極液との間を隔てる離間部を設けた場合の電気泳動時の電流変化、蛍光マーカの分離状況及びタンパク質の分離状況例について説明する。
【００３２】
＜試料溶液調合＞
ｃＩＥＦゲル４μｌ、７Ｍ尿素を含むｃＩＥＦゲル２９μｌ、キャリアアンフォライト（ｐＨ４．０−６．０）１μｌ、蛍光マーカ（ｐＩ４．０、４．５及び５．５の混合液）２μｌ、蛍光色素Ｃｙ３標識トランスサイレチン（Ｃｙ３−ＴＴＲ）０．５μｇに水を添加し、全量を５０μｌとした。尿素の最終濃度は４Ｍである。
【００３３】
＜電極液調合＞
陽極の電極液は、１Ｍリン酸溶液５μｌとｃＩＥＦゲル５０μｌとのｃＩＥＦゲル混合液１０μｌと、ｃＩＥＦゲル９０μｌと、を混合して作製した。陰極の電極液には３０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を用いた。
【００３４】
＜試料溶液の導入＞
上記した図１に示すように、マイクロピペットを用いて１μｌの試料溶液を陽極リザーバに注入し、毛細管現象及び陰極側からの真空ポンプによる吸引によって微細加工流路に導入した。陰極リザーバ及び陽極リザーバに８μｌのｃＩＥＦゲルを注入後、全量を回収し、さらに３μｌのｃＩＥＦゲルを注入し、離間部を形成した。さらに、その上に静かにそれぞれの電極液を重層し、電極をセットした。
【００３５】
＜等電点電気泳動＞
両極に１５００Ｖの電圧を１分間印加後、３０００Ｖで１２分間印可することにより電気泳動を行った。電気泳動時の温度は、ペルチエ素子により１０℃を維持した。泳動終了後、電気泳動チップを直ちに液体窒素雰囲気下におき、流路内の溶液を凍結させた。凍結後、ＰＤＭＳ製の蓋を取り外し、−２０℃において凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、蛍光顕微鏡を用いて蛍光マーカとＣｙ３−ＴＴＲの位置を検出するとともに、蛍光スキャナを用いてＣｙ３蛍光のイメージを取得した。
【００３６】
本実施例における等電点電気泳動時の電流値変化を図３の（ａ）に示す。図３の（ａ）に示すように、離間部を設けた場合の等電点電気泳動時の電流は低下したままほぼ一定であり、電流値の異常上昇は観測されなかった。また、最終電流は５μＡ以下であった。
【００３７】
上述したように凍結乾燥した等電点電気泳動チップを蛍光顕微鏡下で流路方向にスキャンし、添加した蛍光マーカの分離位置を検出した結果を図４の（ａ）に示す。尚、図４の（ａ）の横軸は流路の陽極端からの距離、縦軸は蛍光強度を示している。本実施例では、添加したキャリアアンフォライト（ｐＨ４．０−６．０）から予想されるような流路内の位置にｐＩ４．０、４．５及び５．５のピークが観察された。
【００３８】
上述したように凍結乾燥した等電点電気泳動チップを蛍光顕微鏡下で流路方向にスキャンし、Ｃｙ３蛍光のピークを検出した結果を図５の（ａ）に示す。尚、図５の（ａ）の横軸は流路の陽極端からの距離、縦軸は蛍光強度を示している。また、本実施例における蛍光スキャナにより流路の蛍光イメージを取得した結果を図６の（ａ）に示す。本実施例では、図５の（ａ）及び図６の（ａ）に示すように、ｐＩ４．５の蛍光マーカの陰極側にメジャーとマイナーとの２本のＣｙ３−ＴＴＲのピークを検出した。流路の蛍光イメージにおいても明瞭に２本のバンドが認められた。
【００３９】
（実施例２）
本実施例では、試料溶液と電極液との間を隔てる離間部をリザーバ内に予め設けた図２に示すようなタンパク質等電点電気泳動用チップを適用した場合の、電気泳動時の電流変化、蛍光マーカの分離状況及びタンパク質の分離状況例について説明する。
【００４０】
本実施例のタンパク質等電点電気泳動用チップには、陰極リザーバ及び陽極リザーバにｃＩＥＦゲルを注入することで離間部が予め形成されている。また、本実施例のタンパク質等電点電気泳動用チップは試料溶液を注入するための試料注入部を備えている。本実施例では、試料溶液を試料注入部から流路に導入し、試料溶液注入後に試料注入部をパラフィンオイルで封入した。尚、上記以外は、実施例１と同様の方法で電気泳動時の電流変化、蛍光マーカの分離状況及びタンパク質の分離状況を検出した。その結果、上記実施例１と同様な結果を得た。
【００４１】
（比較例１）
比較例１では、タンパク質等電点電気泳動用チップを用いて、リザーバ内に試料溶液と電極液との間を隔てる離間部を設けない場合の電気泳動時の電流変化、蛍光マーカの分離状況及びタンパク質の分離状況例について説明する。
【００４２】
＜試料溶液調合＞
ｃＩＥＦゲル４μｌ、７Ｍ尿素を含むｃＩＥＦゲル２９μｌ、キャリアアンフォライト（ｐＨ４．０−６．０）１μｌ、蛍光マーカ（ｐＩ４．０、４．５及び５．５の混合液）２μｌ、蛍光色素Ｃｙ３標識トランスサイレチン（Ｃｙ３−ＴＴＲ）０．５μｇに水を添加し、全量を５０μｌとした。尿素の最終濃度は４Ｍである。
【００４３】
＜電極液調合＞
陽極の電極液は、１Ｍリン酸溶液５μｌとｃＩＥＦゲル５０μｌとのｃＩＥＦゲル混合液１０μｌと、ｃＩＥＦゲル９０μｌと、を混合して作製した。陰極の電極液には３０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を用いた。
【００４４】
＜試料溶液の導入＞
マイクロピペットを用いて１μｌの試料溶液を陽極リザーバに注入し、毛細管現象及び陰極側からの真空ポンプによる吸引によって微細加工流路に導入した。試料溶液を流路に導入した後、陰極リザーバ及び陽極リザーバをそれぞれの電極液７μｌで洗浄し、その後７μｌの電極液を各リザーバに注入した。
【００４５】
＜等電点電気泳動＞
両極に１５００Ｖの電圧を１分間印加後、３０００Ｖで１２分間印可することにより電気泳動を行った。電気泳動時の温度は、ペルチエ素子により１０℃を維持した。泳動終了後、電気泳動チップを直ちに液体窒素雰囲気下におき、流路内の溶液を凍結させた。凍結後、ＰＤＭＳ製の蓋を取り外し、−２０℃において凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、蛍光顕微鏡を用いて蛍光マーカとＣｙ３−ＴＴＲの位置を検出するとともに、蛍光スキャナを用いてＣｙ３蛍光のイメージを取得した。
【００４６】
比較例１における等電点電気泳動時の電流値変化を図３の（ｂ）に示す。図３の（ｂ）に示すように、離間部を設けない場合は、３０００Ｖ印可後、いったん電流は低下するが、４−５分で再び電流値が上昇し始め、最終電流は１０μＡを越えていた。
【００４７】
上述したように比較例１において凍結乾燥した等電点電気泳動チップを蛍光顕微鏡下で流路方向にスキャンし、添加した蛍光マーカの分離位置を検出した結果を図４の（ｂ）に示す。尚、図４の（ｂ）の横軸は流路の陽極端からの距離、縦軸は蛍光強度を示している。図４の（ｂ）に示すように、離間部を設けない場合には、上記実施例１や実施例２のように離間部を設けた場合と比べ、蛍光マーカのピークが陰極側にシフトしており、ｐＩ５．５のマーカは流路から流れ出ていた。
【００４８】
上述したように比較例１において凍結乾燥した等電点電気泳動チップを蛍光顕微鏡下で流路方向にスキャンし、Ｃｙ３蛍光のピークを検出した結果を図５の（ｂ）に示す。尚、図５の（ｂ）の横軸は流路の陽極端からの距離、縦軸は蛍光強度を示している。また、比較例１における蛍光スキャナにより流路の蛍光イメージを取得した結果を図６の（ｂ）に示す。図５の（ｂ）及び図６の（ｃ）に示すように、離間部を設けない場合には、蛍光マーカとの相対位置から、Ｃｙ３−ＴＴＲがもつｐＩに対応する位置に分離されていることがわかるものの、蛍光マーカと同様にＣｙ３−ＴＴＲのピークも陰極側に大きくシフトしていた。また、図５の（ｂ）及び図６の（ｂ）に示すピーク及び蛍光イメージから、分離されたバンドの幅は広く、等電点電気泳動におけるフォーカシングが良好ではないことが分かった。さらに、蛍光イメージからメジャーバンドとマイナーバンドの分離もできていないことが分かった。
【００４９】
以上から、尿素存在下で微細加工流路を用いて等電点電気泳動を実施する場合において、流路内に導入した試料溶液と陰極及び陽極電極液との間に、両者が直接接触することを回避するための離間部を設けることで、離間部を設けない方法では避けられなかった陰極側へのタンパク質や蛍光マーカのシフトを抑制し、よりシャープな標的分子の分離を実現することができた。
【００５０】
本実施形態により、流路内に導入した試料溶液と電極液との間に、例えば粘性の高い液体又はゲルからなる分離部を設け、導電性を確保しつつ熱拡散を抑制することにより、タンパク質変性剤存在下であっても、電流値の上昇や等電点分離された試料の陰極側へのシフトを抑制することが可能となる。また、結果として、微細加工流路を用いて尿素存在下で実施する試料の等電点分離において、より解像度の高い試料分離を実現することが可能となる。したがって、本実施形態により、微細加工流路を用いる等電点電気泳動は、より多様なタンパク質等の試料に適用することが可能になる。
【００５１】
以上好適な実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は上述したマイクロチップ及び電気泳動方法に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であるということは言うまでもない。
【符号の説明】
【００５２】
１    基板
２    試料溶液
３    離間部
４    陰極液
５    ガラス蓋
６    ＰＤＭＳ蓋
７    陽極液
８    試料注入部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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