(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭＮ結合および細胞接着中和活性を有するヒト抗体の提供。【解決手段】ＭＮ細胞表面タンパク質のプロテオグリカンドメインに含まれる４個のＧＥＥＤＬＰ反復配列を標的とするヒト抗ＭＮモノクローナル抗体もしくはヒト抗ＭＮ抗体フラグメント。前記抗体もしくは前記抗体フラグメントの、ＦＡＣＳおよび免疫組織化学的方法による癌細胞および腫瘍中のＭＮ発現の定量、およびＭＮがアップレギュレートされている癌の診断のための使用。また、前記抗ＭＮ  ＩｇＧ１が抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害活性により腫瘍細胞を溶解するため、前記抗体によるＭＮがアップレギュレートされている癌の治療もしくは処置のための使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗体であって、該ヒト抗体がＭＮタンパク質のプロテオグリカンドメイン内のＧＥＥＤＬＰ反復領域に結合し、かつ、
（ａ）配列番号９７（ＶＨ１Ａ）、配列番号９８（ＶＨ１Ｂ）、配列番号９９（ＶＨ２）、配列番号１００（ＶＨ３）、配列番号１０１（ＶＨ４）、配列番号１０２（ＶＨ５）および配列番号１０３（ＶＨ６）よりなる群から選ばれる可変重鎖領域であって、該各可変重鎖領域が重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域をふくむものであり、かつ、
（ｉ）重鎖ＣＤＲ１領域が配列番号４８〜６０よりなる群から選択されるアミノ酸配列により置換されており、そして
（ｉｉ）重鎖ＤＲ３領域が配列番号６１〜８０よりなる群から選択されるアミノ酸配列により置換されている、
上記可変重鎖領域、ならびに
（ｂ）配列番号９０（ＶＬκ１）、配列番号９１（ＶＬκ２）、配列番号９２（ＶＬκ３）、配列番号９３（ＶＬκ４）、配列番号９４（ＶＬλ１）、配列番号９５（ＶＬλ２）および配列番号９６（ＶＬλ３）よりなる群から選ばれる可変軽鎖領域であって、該各可変軽鎖領域が軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むものであり、かつ、
（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１領域が配列番号８２および８３よりなる群から選択されるアミノ酸配列により置換されており、そして
（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３領域が配列番号８４〜８９よりなる群から選択されるアミノ酸配列によりちかんされている、
上記可変軽鎖領域
を含んでなることを特徴とする、上記抗体。
【請求項２】
０．６ｎＭないし１８００ｎＭのＫｄでヒトＭＮタンパク質に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
０．６ｎＭないし９０ｎＭのＫｄでヒトＭＮタンパク質に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
可変重鎖ＣＤＲ３が配列番号６４である、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
可変軽鎖ＣＤＲ３が配列番号８１である、請求項１記載の抗体。
【請求項６】
可変軽鎖ＣＤＲ１が配列番号８２である、請求項１記載の抗体。
【請求項７】
可変重鎖ＣＤＲ３領域と可変軽鎖ＣＤＲ３領域が、それぞれ、配列番号６１と８４、配列番号６２と８７、配列番号６３と８９、配列番号６４と８４、配列番号６５と８４、配列番号６６と８５、および配列番号６７と８８よりなる群から選択されるアミノ酸配列対である、請求項１記載の抗体。
【請求項８】
可変重鎖ＣＤＲ３領域と可変軽鎖ＣＤＲ３領域が、それぞれ、配列番号６１と８６、配列番号６１と８５、配列番号６１と８７、配列番号６１と８８、配列番号６１と８９、配列番号６３と８６、配列番号６３と８５、配列番号６３と８７、配列番号６３と８８、および配列番号６３と８４よりなる群から選択されるアミノ酸配列対である、請求項１記載の抗体。
【請求項９】
可変重鎖ＣＤＲ３領域と可変軽鎖ＣＤＲ３領域が、それぞれ、配列番号７１と８７、配列番号６１と８７、配列番号７２と８７、配列番号７３と８７、配列番号７４と８７、配列番号７５と８７、配列番号７６と８７、配列番号７７と８７、配列番号７８と８７、配
列番号７９と８７、および配列番号８０と８７よりなる群から選択されるアミノ酸配列対である、請求項１記載の抗体。
【請求項１０】
可変重鎖ＣＤＲ３領域と可変軽鎖ＣＤＲ３領域が、それぞれ、配列番号６１と８１、配列番号６９と８１、および配列番号７０と８１よりなる群から選択されるアミノ酸配列対である、請求項１記載の抗体。
【請求項１１】
可変重鎖ＣＤＲ３領域と可変軽鎖ＣＤＲ３領域および可変重鎖ＣＤＲ１領域が、それぞれ、配列番号６１と８６および４８、配列番号６１と８６および４９、配列番号６１と８６および５０、配列番号６１と８６および５１、配列番号６１と８６および５２、配列番号６１と８６および５３、配列番号６１と８６および５４、配列番号６１と８６および５５、配列番号６１と８６および５６、ならびに配列番号６１と８６および５７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載の抗体。
【請求項１２】
可変重鎖領域が配列番号１００のアミノ酸配列である、請求項１記載の抗体。
【請求項１３】
可変軽鎖領域が配列番号９４もしくは９５のアミノ酸配列である、請求項１記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１記載の抗体および製薬学的に許容されるキャリヤーを含んでなる製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＭＮ結合ヒト抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＮは多数の臨床的癌腫サンプル中で検出されるが、しかし対応する器官の正常組織中には非存在である細胞表面タンパク質である。ＭＮのｃＤＮＡはクローン化されており（非特許文献１）、そして予測されるタンパク質はシグナルペプチド、プロテオグリカン関連配列、炭酸脱水酵素ドメイン、膜貫通セグメントおよび短い細胞内尾部よりなる。ＭＮは通常、胃および胆管粘膜（非特許文献２）ならびに小腸中に位置する高度に増殖性の正常細胞（非特許文献３）中で発現される。しかしながら、ＭＮは、１００％の腎細胞癌（非特許文献４）、食道癌の１００％（非特許文献５）、子宮頸癌の９０％以上（非特許文献２）、７６％の悪性結腸癌（非特許文献６）、８０％の非小細胞肺癌（非特許文献７）および４８％の乳癌（非特許文献８）で異所性に発現される。
【０００３】
ＭＮに対する抗体が記述されている。マウスモノクローナル抗体Ｇ２５０はマウスモデルにおいて腎細胞癌の腫瘍サイズの低減に有効である（非特許文献９）。この抗体は後にヒトＦｃ領域およびマウス可変領域を含有するキメラ抗体にされた。キメラＧ２５０抗体は６６％のみヒトであり、匹敵する完全にヒトの抗体に比較してヒトにおいて免疫原性のより大きな機会につながる。従って、３３％マウス抗体での処置はヒトの抗マウス免疫原性応答につながり抗癌治療を無効にするかもしれない。キメラ抗体でのこれらの問題はＭＮに対する完全にヒトの抗体に対する必要性を明らかに生じさせる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐａｓｔｏｒｅｋ，Ｊ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９４）、９、２８７７−２８８８
【非特許文献２】Ｌｉａｏ，Ｓ．Ｙ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９４）、１４５、５９８−６０９
【非特許文献３】Ｓａａｍｉｏ，Ｊ．ら、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ（１９９８）４６、４９７−５０４
【非特許文献４】Ｌｉａｏ，Ｓ．Ｙ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９７）５７、２８２７−２８３１
【非特許文献５】Ｔｕｒｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ、（１９９７）２８、７４０−７４４
【非特許文献６】Ｓａａｍｉｏ，Ｊ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９８）１５３、２７９−２８５
【非特許文献７】Ｖｅｒｍｙｌｅｎ，Ｐ．ら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ（１９９９）、１４、８０６−８１１
【非特許文献８】Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００１）１９、３６６０−３６６８
【非特許文献９】ｖａｎ  Ｄｉｊｋ、Ｊ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９４）５６、２６２−２６８
【発明の概要】
【０００５】
本発明はプロテオグリカンドメイン内のＧＥＥＤＬＰ（配列番号１１８）反復を標的とするモノクローナルヒトＭＮ抗体もしくはＭＮ抗体フラグメントより構成される。ＭＮ細胞表面タンパク質のプロテオグリカンドメインは４個の同一のこれらＧＥＥＤＬＰ（配列
番号１１８）反復を含有する。所望のエピトープへの結合は競合的ＥＬＩＳＡにより確認され、ここでＥＬＩＳＡシグナルは本反復を含有するペプチド（ＰＧＥＥＤＬＰＧＥＥＤＬＰ）（配列番号１１９）との共インキュベーションにより減弱されうる。結合のこの阻害はまた、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）アッセイを使用しても確認することができ、ここでは固定されたＭＮもしくはプロテオグリカンペプチドへの所望の抗体の結合が該ペプチド反復により阻害されうる。ペプチド反復への結合に加え、ヒト抗ＭＮ抗体はＭＮ被覆プラスチック製プレートへのＣＧＬ−１細胞の細胞接着を阻害することができる。ヒト抗ＭＮ抗体は、ＦＡＣＳおよび免疫組織化学的方法を使用して癌細胞および腫瘍中のＭＮ発現を診断および定量するのに使用されている。ヒト抗ＭＮ  ＩｇＧ１が抗体依存性の細胞媒介性の細胞傷害性により腫瘍細胞の溶解を媒介する一例もまた提供される。従って、これらの抗体は、ＭＮがアップレギュレートされている癌の処置に有用であることができるか、もしくは、ＭＮがアップレギュレートされている癌の診断に有用となり得る。
【０００６】
［発明の詳細な説明］
本発明はＭＮに結合するヒト抗体を提供する。これらの抗体は多様な治療および診断目的上有用である。これらの目的は以下を包含する：
【０００７】
ヒトＭＮ抗体の特徴
本明細書で使用されるところの「抗体」は無傷の免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）ならびにヒトＭＮタンパク質のエピトープに特異的に結合することが可能であるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖを包含する。ＭＮに特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイで使用される場合に他のタンパク質で提供される検出シグナルより最低５、１０もしくは２０倍より高い検出シグナルを提供する。好ましくは、ヒトＭＮに特異的に結合する抗体は免疫化学的アッセイで他のタンパク質を検出せずかつＭＮを溶液から免疫沈降させることができる。
【０００８】
本明細におけるＶＬ２および／もしくはＶＬ３への言及はＬ鎖のラムダ（λ）クラスを示すことを意図している。
【０００９】
ＭＮへのヒト抗体結合のＫｄは、リアルタイム生体分子相互作用分析（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）（ＳｊｏｌａｎｄｅｒとＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３、２３３８−２３４５、１９９１、およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５、６９９−７０５、１９９５）のような技術を包含する当該技術分野で既知のいずれかの方法を使用してアッセイすることができる。ＢＩＡは相互作用体のいずれも標識することなく実時間で生物特異的相互作用を研究するための技術である（たとえばビアコア［ＢＩＡｃｏｒｅ］ＴＭ）。光学的現象、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を生物学的分子間の実時間反応の指標として使用することができる。
【００１０】
ビアコア［ＢＩＡｃｏｒｅ］ＴＭアッセイにおいては、本発明のヒト抗体は約０．６ｎＭ（６×１０−１０ｎＭ）から約１８００ｎＭ（１．８×１０−６ｎＭ）までの範囲のＫｄでヒトＭＮに特異的に結合する。図６を参照されたい。本発明のより好ましいヒト抗体はおよそ０．６ｎＭないし約９０ｎＭのＫｄでヒトＭＮに特異的に結合し、本発明のもっとも好ましい抗体はおよそ４ｎＭのＫｄでヒトＭＮタンパク質を結合する。
【００１１】
好ましくは、想定される本発明の抗体は、４個の同一のＧＥＥＤＬＰ（配列番号１１８）反復を含有するプロテオグリカンドメイン内のこれらの反復に結合することができる。所望のエピトープへの結合は競合的ＥＬＩＳＡ（Ｚａｖａｄａら、Ｂｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８２、１８０８−１８１３、２０００）のような技術を包含する当該技術分野
で既知のいずれかの方法を使用して確認することができ、ここでＥＬＩＳＡシグナルは、この反復を含有するペプチド（ＰＧＥＥＤＬＰＧＥＥＤＬＰ）（配列番号１１９）との共インキュベーションにより減弱されうるが、しかしまた該プロテオグリカンドメイン内にある類似のペプチド（ＰＳＥＥＤＳＰＲＥＥＤＰ）（配列番号１２０）によっては阻害されることができない。このパターンの結合阻害はまた、固定されたＭＮもしくはプロテオグリカンペプチドへの所望の抗体の結合が該ペプチド反復とのインキュベーションにより阻害されることができるビアコア［ＢＩＡｃｏｒｅ］ＴＭ技術を使用しても確認することができる。好ましくは、本発明の抗体はまた、ＭＮ被覆プラスチック製プレートＥＬＩＳＡへのＭＮ発現細胞の細胞接着も阻害することができる（Ｚａｖａｄａら、Ｂｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８２、１８０８−１８１３、２０００）。
【００１２】
本発明はＭＮタンパク質に対する完全にヒトの抗体を生成させるためのＭｏｒｐｈｏｓｙｓファージ−抗体技術を使用する。Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓライブラリーはヒトのバックボーンに基づいており、免疫原性の確率を大きく低下させる。
【００１３】
上述されたＭＮ結合および細胞接着中和の特徴を有する多数のヒト抗体がＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  Ｆａｂライブラリーをスクリーニングすることにより同定されている。ＨｕＣＡＬライブラリーのため集成されたＣＤＲカセットは、位置９５から１０２までの伸長を包含する５から２８アミノ酸残基までの範囲にわたる長さ分布を達成するように設計した。Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６、５７−８６、２０００。上述されたＭＮ結合および細胞接着中和の特徴を有する多数のヒト抗体がＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬＦａｂライブラリーをスクリーニングすることにより同定されている。ＨｕＣＡＬライブラリーのため集成されたＣＤＲカセットは、位置９５から１０２までの伸長を包含する５から２８アミノ酸残基までの範囲にわたる長さ分布を達成するように設計した。Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６、５７−８６、２０００。本発明のいくつかの態様において、ヒト抗体のＶＨ３−ＣＤＲ３領域は図２に配列番号６１−８０に示されるアミノ酸配列を有する。本発明の他の態様において、ヒトＭＮ抗体のＶＬλ１−ＣＤＲ３、ＶＬλ２−ＣＤＲ３およびＶＬλ２−ＣＤＲ１領域は、配列番号４８−６０に示されるところの至適化されたＶＨ３−ＣＤＲ１配列を伴い図２に配列番号８１−８９に示されるところのアミノ酸配列を有し、双方は図２に示される。ＭＮ結合および細胞接着中和活性を有するヒト抗体を表１および２に示し；これらの抗体内の可変領域（ＣＤＲ３ループ）を表１および２に示す。
【００１４】
［ヒト抗体の取得］
上述されたＭＮ結合および細胞接着中和活性をもつヒト抗体は以下のとおりＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬライブラリーから同定することができる。ヒトＭＮをマイクロタイタープレート上に被覆しそしてＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂファージライブラリーとともにインキュベートする（実施例１を参照されたい）。ＭＮに結合しないファージ連結Ｆａｂをプレートから洗い流してＭＮにきつく結合するファージのみを残すことができる。結合されたファージはｐＨの変化により溶出しかつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主の感染により増幅することができる。このパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）過程を１回もしくは２回反復してＭＮにきつく結合するファージ連結抗体の集団について濃縮することができる。濃縮されたプールからのＦａｂをその後発現させ、精製しかつＥＬＩＳＡアッセイでスクリーニングする。同定されたヒットをその後ビアコア［ＢＩＡｃｏｒｅ］ＴＭアッセイを使用して結合について試験し、そしてこれらのヒットを下述されるところの細胞接着アッセイでさらにスクリーニングすることができる。
【００１５】
ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂライブラリーの初期パニングはまた、第１回に抗原としてＭＮ、次いで第２回にＢＳＡもしくはトランスフェリンのような担体タンパク質に融合されたＭＮペプチド、および第３回に再度ＭＮ抗原を用いて実施することもできる。パニングに使用
することができるヒトＭＮペプチドはヒトＭＮ配列番号４５−４７を包含する。これらのペプチド配列は、細胞接着に関与すると考えられているＭＮプロテオグリカン配列由来である。
【００１６】
あるいは、パニングは抗原としてＭＮ発現細胞を使用して実施することができる。例えばＭＮ抗原でトランスフェクトした細胞をビオチンで標識することができる。その後、これらのトランスフェクトした細胞を１：１０の標識：未標識比で未標識のＭＮでトランスフェクトされない細胞と混合する。ファージライブラリーを細胞に添加しそしてビオチニル化し、磁石に結合されているストレプトアビジン結合磁性ビーズでＭＮをもつ細胞を捕捉する。非特異的ファージを洗い流し、そして、磁場を除去することにより、ＭＮをもつ細胞が特異的に溶出される。これらの特異的に結合されたファージはさらなる回の細胞パニングのため増幅することができるか、またはペプチドおよび／もしくはタンパク質のパニングと交替させることができる。
【００１７】
スクリーニング過程の詳細は下の特定の実施例に記述する。高度に活性の特異的抗体もしくは抗体フラグメントの他の選択方法は当業者により予見されかつヒトＭＮ抗体を同定するのに使用されることができる。
【００１８】
上述された特徴をもつヒト抗体はまた、抗体をコードする発現構築物でトランスフェクトした宿主細胞を包含する抗体を発現するいかなる細胞からも精製することができる。宿主細胞はそれによりヒト抗体が発現される条件下で培養する。精製されたヒト抗体を、当該技術分野で公知の方法を使用して、ある種のタンパク質、炭水化物もしくは脂質のような細胞中で該抗体と通常会合している他の化合物から分離する。こうした方法は、限定されるものでないがサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび調製的ゲル電気泳動を挙げることができる。精製されたヒト抗体の調製物は最低８０％純粋であり；好ましくは、調製物は９０％、９５％もしくは９９％純粋である。調製物の純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当該技術分野で既知のいずれかの手段により評価することができる。本発明の精製されたヒト抗体の調製物は、上述されたＭＮ結合および中和の特徴をもつ１以上の型のヒト抗体を含有する可能性がある。
【００１９】
あるいは、ヒト抗体は、固相技術を使用する直接ペプチド合成によるようなそのアミノ酸配列の化学合成方法を使用して製造することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９−２１５４、１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９、２０２−２０４、１９９５）。タンパク質合成は人的技術を使用してもしくは自動化により実施することができる。自動化合成は例えばアプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３１Ａペプチド合成機（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））を使用して達成することができる。場合によっては、ヒト抗体のフラグメントを別個に合成しかつ化学的方法を使用して結合して完全長の分子を製造することができる。
【００２０】
新たに合成された分子は調製的高速液体クロマトグラフィーにより実質的に精製することができる（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ  ＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ、ＷＨ  フリーマン  アンド  カンパニー（ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８３）。合成ポリペプチドの組成はアミノ酸分析もしくは（例えばエドマン分解を使用する）配列決定により確認することができる。
【００２１】
［ヒト抗体の治療的利用性の評価］
癌を治療するのに治療上有用である特定の抗体の能力を評価するために、一例として、
抗体をマウス異種移植腫瘍モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験することができる。所望の場合は、ヒトＦａｂ  ＭＮ抗体は治療的評価前にＩｇＧ１抗体に転化することができる。本転化は実施例５に記述し、また、治療モデルの一例を実施例９に記述する。利用性はまた、実施例１３に記述されるところの抗体依存性の細胞媒介性の細胞傷害性を使用しても試験することができる。
【００２２】
［ヒトＭＮ抗体をコードするポリヌクレオチド］
本発明はヒトＭＮ抗体をコードするポリヌクレオチドもまた提供する。これらのポリヌクレオチドを例えば治療的もしくは診断的使用のための相当量の抗体を製造するのに使用することができる。
【００２３】
ＶＨ−ＣＤＲ３領域をコードするのに使用することができるポリヌクレオチドを配列番号１４−３３に示す。示されるＶＬ−ＣＤＲ３領域をコードするのに使用することができるポリヌクレオチドを配列番号３４−４４に示す。ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬライブラリーから単離された本発明のヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードするポリヌクレオチドは図２に示す。追加の至適化されたＶＨ３−ＣＤＲ１配列を配列番号１−１３に示す。
【００２４】
宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドは、膜成分、タンパク質および脂質のような他の細胞成分を含まずに単離することができる。ポリヌクレオチドは細胞により作成されかつ標準的な核酸精製技術を使用して単離することができるか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を使用して、もしくは自動合成機を使用することにより合成することができる。ポリヌクレオチドの単離方法は当該技術分野で慣例である。ポリヌクレオチドを得るためのいずれかのこうした技術を使用して本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを得ることができる。例えば制限酵素およびプローブを使用して該抗体をコードするポリヌクレオチドを単離することができる。単離されたポリヌクレオチドは他の分子を含まないか、または最低７０％、８０％もしくは９０％含まない調製物中にある。
【００２５】
本発明のヒト抗体をコードするｃＤＮＡ分子は、鋳型としてｍＲＮＡを使用する標準的分子生物学技術を用いて作成することができる。その後、ｃＤＮＡ分子は、当該技術分野で既知かつＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）のような手引き書に開示される分子生物学技術を使用して複製することができる。ＰＣＲのような増幅技術を使用して該ポリヌクレオチドの追加のコピーを得ることができる。
【００２６】
あるいは、合成化学技術を使用して本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを合成することができる。遺伝暗号の縮重は、例えば配列番号４８−８９に示されるそれぞれＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１もしくはＶＬ−ＣＤＲ３、Ｌ鎖またはＨ鎖アミノ酸配列の１種を有する抗体をコードする代替のヌクレオチド配列が合成されることを可能にする。
【００２７】
［ポリヌクレオチドの発現］
本発明のヒト抗体をコードするポリヌクレオチドを発現させるために、ポリヌクレオチドを、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な因子を含有する発現ベクターに挿入することができる。当業者に公知である方法を使用して、ヒト抗体をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御因子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ  ｖｏｖｏ遺伝子組換えを包含する。こうした技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９５に記述される。下の実施例１−３もまた参照されたい。
【００２８】
多様な発現ベクター／宿主系を利用して本発明のヒト抗体をコードする配列を含有かつ発現することができる。これらは、限定されるものでないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系、あるいは動物細胞系を挙げることができる。
【００２９】
制御因子もしくは調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実施するベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。こうした因子はそれらの強さおよび特異性が変動する可能性がある。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成的および誘導可能なプロモーターを包含するいずれかの数の適する転写および翻訳因子を使用することができる。例えば、細菌の系でクローン化する場合に、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）もしくはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導可能なプロモーターを使用することができる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞中で使用することができる。植物細胞のゲノム（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯおよび貯蔵タンパク質の遺伝子）または植物ウイルス（例えばウイルスプロモーターもしくはリーダー配列）由来のプロモーターもしくはエンハンサーをベクター中にクローン化することができる。哺乳動物細胞系では哺乳動物遺伝子もしくは哺乳動物ウイルスからのプロモーターが好ましい。複数コピーのヒト抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する細胞系を生成させることが必要である場合は、ＳＶ４０もしくはＥＢＶに基づくベクターを適切な選択可能なマーカーとともに使用することができる。
【００３０】
［製薬学的組成物］
上述されたヒトＭＮ抗体のいずれも製薬学的に許容できる担体を含んでなる製薬学的組成物中で提供することができる。製薬学的に許容できる担体は好ましくは非発熱原性である。該組成物は単独でもしくは安定化する化合物のような最低１種の他の作用物質とともに投与することができ、それらは、限定されるものでないが生理的食塩水、緩衝生理的食塩水、Ｄ−ブドウ糖および水を挙げることができるいずれかの滅菌の生物適合性の製薬学的担体中で投与することができる。多様な水性担体、例えば０．４％生理的食塩水、０．３％グリシンなどを使用してよい。これらの溶液は無菌かつ一般に粒子状物質を含まない。これらの溶液は慣習的な公知の滅菌技術（例えば濾過）により滅菌してよい。該組成物は、ｐＨ調節および緩衝剤などのような生理学的条件に近づけるのに必要とされるところの製薬学的に許容できる補助物質を含有してよい。こうした製薬学的製剤中の本発明の抗体の濃度は広範に、すなわち約０．５％未満から、通常は約１％もしくは最低約１％から約１５もしくは２０重量％まで変動することができ、そして、選択された特定の投与様式に従って、主として液体の容量、粘度などに基づいて選択することができる。米国特許第５，８５１，５２５号明細書を参照されたい。所望の場合は、例えばＭＮ結合について異なるＫｄをもつ１以上の型のヒト抗体を製薬学的組成物中に包含することができる。
【００３１】
該組成物は単独でまたは他の作用物質、薬物もしくはホルモンとともに患者に投与することができる。有効成分に加え、これらの製薬学的組成物は、製薬学的に使用することができる製剤へと有効成分を加工するのを助長する、賦形剤および補助物質を含む適する製薬学的に許容できる担体を含有することができる。本発明の製薬学的組成物は、限定されるものでないが経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下、脳室内、経皮、皮下、
腹腔内、鼻内、非経口、局所、舌下もしくは直腸の手段を挙げることができるいずれかの数の経路により投与することができる。
【００３２】
製薬学的組成物を製造した後に、それらは適切な容器中に入れかつ指定された状態の処置のためラベルを付けることができる。こうしたラベル付けは量、頻度および投与方法を包含することができる。
［診断方法］
本発明はまた、限定されるものでないが血清、肺、肝、心、乳房、腎、結腸、細胞培養系もしくは細胞を含まない系（例えば組織ホモジェネート）のサンプルを挙げることができる試験調製物中でヒトＭＮを検出することができる診断方法も提供する。こうした診断方法は、例えばＭＮが上昇している障害を診断するのに使用することができる。こうした障害は、限定されるものでないが腎、食道、乳房、子宮頸部、結腸および肺の癌を挙げることができる。診断に使用される場合、正常サンプル中の抗体−ＭＮ複合体の量より大きい患者からの試験サンプル中の該複合体の量の検出は、該障害を有する見込みがあると該患者を同定する。癌組織中のＭＮの免疫組織化学的検出方法は実施例１２に記述する。
【００３３】
試験調製物を本発明のヒト抗体と接触させ、そして該試験調製物をその後抗体−ＭＮ複合体の存在についてアッセイする。所望の場合は、ヒト抗体は蛍光、放射性同位元素、化学発光、またはワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼのような酵素標識のような検出可能な標識を含むことができる。ＭＮを発現する腫瘍細胞の検出のための蛍光に基づくアッセイを実施例１１に示す。
【００３４】
場合によっては、抗体はアッセイの自動化を適応させることができる固体支持体に結合することができる。適する固体支持体は、限定されるものでないがガラスもしくはプラスチック製スライドガラス、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップまたはビーズ（限定されるものでないがラテックス、ポリスチレンもしくはガラスビーズを挙げることができる）のような粒子を挙げることができる。共有および非共有結合、受動的吸収、もしくは抗体および固体支持体に結合された結合部分の対の使用を包含する当該技術分野で既知のいずれかの方法を使用して抗体を固体支持体に結合することができる。ＭＮおよび抗体の結合は反応体を含有するのに適するいかなる容器中でも達成することができる。こうした容器の例はマイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を包含する。
【００３５】
［治療法］
本発明はまた、ＭＮが上昇されている障害の症状の軽減方法も提供する。これらの障害は、限定されるものでないが腎、食道、乳房、子宮頸部、結腸および肺の癌を挙げることができる。例えば（Ｌｉａｏ，Ｓ．Ｙ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９７）５７、２８２７−２８３１）、（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ、（１９９７）２８、７４０−７４４）、（Ｌｉａｏ，Ｓ．Ｙ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９４）、１４５、５９８−６０９）、（Ｓａａｍｉｏ，Ｊ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９８）１５３、２７９−２８５）および（Ｖｅｒｍｙｌｅｎ，Ｐ．ら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ（１９９９）、１４、８０６−８１１）を参照されたい。
【００３６】
本発明の一態様において、治療上有効な用量の本発明のヒト抗体を、上述された癌のようなＭＮが上昇されている障害を有する患者に投与する。
【００３７】
［治療上有効な用量の決定］
治療上有効な用量の決定は当業者の能力内に十分ある。治療上有効な用量は、治療上有効な用量の非存在下で明らかである効力と比較して癌を効果的に治療するのに使用されるヒト抗体の量を指す。
【００３８】
治療上有効な用量は最初に動物モデル、通常はラット、マウス、ウサギ、イヌもしくはブタで推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのにも使用することができる。こうした情報をその後、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定するのに使用することができる。皮下マウス異種移植モデルを実施例９に記述する。
【００３９】
ヒト抗体の治療的有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対し致死的な用量）は細胞培養物もしくは実験動物において標準的薬学的手順により決定することができる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、そしてそれは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。
【００４０】
大きな治療指数を表す製薬学的組成物が好ましい。動物試験から得られるデータを使用してヒトの使用のための投薬量範囲を案出する。こうした組成物中に含有される投薬量は、好ましくはほとんどもしくは全く毒性を伴わないＥＤ５０を包含する循環濃度範囲内である。該投薬量は、使用される投薬形態、患者の感受性および投与経路に依存してこの範囲内で変動する。
【００４１】
正確な投薬量は処置を必要とする患者に関する因子を鑑み実地医家により決定することができる。投薬量および投与は十分なレベルのヒト抗体を提供するかもしくは所望の効果を維持するように調節する。考慮に入れられる可能性のある因子は、疾患状態の重症度、被験体の全身健康状態、被験体の齢、重量および性、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組合せ剤（１種もしくは複数）、反応の感受性ならびに治療に対する忍容性／応答を包含する。長時間作用型の製薬学的組成物は、特定の製剤の半減期および消失速度に依存して３ないし４日ごと、毎週もしくは２週間ごとに１回投与することができる。
【００４２】
本発明のヒト抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、そして限定されるものでないがトランスフェリン−ポリカチオン媒介性のＤＮＡ移入、裸のもしくは被包化された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介性の細胞融合、ＤＮＡ被覆されたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔法、「遺伝子銃」およびＤＥＡＥもしくはリン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションを挙げることができる十分に確立した技術を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞中に導入することができる。
【００４３】
抗体の有効なｉｎ  ｖｉｖｏ投薬量は、約５μｇないし約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇないし約５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇないし約５００μｇ／ｋｇ患者体重、および約２００ないし約２５０μｇ／ｋｇ患者体重の範囲にある。抗体をコードするポリヌクレオチドの投与について、有効なｉｎ  ｖｉｖｏ投薬量は約１００ｎｇないし約２００ｎｇ、５００ｎｇないし約５０ｍｇ、約１μｇないし約２ｍｇ、約５μｇないし約５００μｇ、および約２０μｇないし約１００μｇのＤＮＡの範囲にある。
【００４４】
本発明のヒト抗体を含有する製薬学的組成物の投与様式は、宿主に抗体を送達するいずれの適する経路であることもできる。本発明の製薬学的組成物は非経口投与、すなわち皮下、筋肉内、静脈内もしくは鼻内投与にとりわけ有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＰＣ３ｍｍ２ヒト前立腺癌細胞はＦＡＣＳによりアッセイされるとおりＭＮを発現する。
【図２】配列番号１から配列番号３３までの配列
【図３】配列番号３４から配列番号６０までの配列
【図４】配列番号６１から配列番号８９までの配列
【図５】ＦａｂディスプレイベクターｐＭＯＲＰＨ１８  Ｆａｂ  １
【図６】ｐＭＯＲＰＨｘ９＿Ｆａｂ１＿ＦＳのベクター地図
【図７】抗ＭＮ抗体ＭＮ−３での細胞接着の遮断の画像
【図８】ＭＮ抗体１から３９の１から２２についての抗体結合対。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）結合親和性を表示する。
【図９】ＭＮ抗体１から３９の２３から３９についての抗体結合対。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）結合親和性を表示する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本開示で引用される全部の特許および特許出願は引用することにより本明細書に明らかに組込まれる。上の開示は本発明を一般的に記述する。より完全な理解は以下の特定の実施例への言及により得ることができ、それは具体的説明のみの目的にて提供されかつ本発明の範囲を制限することを意図していない。
【実施例１】
【００４７】
ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂ  １）の構築
ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂ  １のクローニング。ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂ  １はＦａｂ抗体フラグメント形式の完全に合成のモジュール型ヒト抗体ライブラリーである。ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂ  １は抗体ライブラリーから出発して一本鎖形式（ＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖ；Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６（２０００）５５）で集成した。ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂ  １をファージミド発現ベクターｐＭＯＲＰＨ１８  Ｆａｂ１にクローン化した（図３）。このベクターは、線状ファージの短縮された遺伝子ＩＩＩタンパク質にＣ末端で融合されたｐｈｏＡシグナル配列を伴うＦｄフラグメントを含んでなり、かつ、ｏｍｐＡシグナル配列を伴うＬ鎖ＶＬ−ＣＬをさらに含んでなる。双方の鎖はｌａｃオペロンの制御下にある。定常ドメインＣλ、ＣκおよびＣＨはＨｕＣＡＬのモジュラー系と完全に適合性の合成遺伝子である（Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００）。
【００４８】
最初に、ＶλおよびＶκライブラリーを、それぞれＥｃｏＲＶ／ＤｒａＩＩＩおよびＥｃｏＲＶ／ＢｓｉＷＩを使用する制限消化によりＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖから単離した。これらのＶλおよびＶκライブラリーを、それぞれＥｃｏＲＶ／ＤｒａＩＩＩおよびＥｃｏＲＶ／ＢｓｉＷＩで切断したｐＭＯＲＰＨ１８  Ｆａｂ１にクローン化した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ−１中への連結および形質転換後に、それぞれ４．１４×１０８および１．６×１０８のライブラリーの大きさを得、双方の場合にＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖのＶＬの多様性を超えた。
【００４９】
同様にＶＨライブラリーをＳｔｙＩ／ＭｕｎＩを使用する制限消化によりＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖから単離した。ＶＨライブラリーを、ＳｔｙＩ／ＭｕｎＩで切断したｐＭＯＲＰＨ１８−ＶλおよびＶκライブラリーにクローン化した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ−１中への連結および形質転換後に、（２０７クローンの配列決定により同定されるところの）６７％の正しいクローンを伴う２．０９×１０１０のライブラリー全体の大きさを得た。
【００５０】
ファージミドレスキュー、ファージ増幅および精製。ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂは３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％ブドウ糖を含有する２×ＴＹ培地（２×ＴＹ−ＣＧ）中で増幅した。３７℃で約０．５のＯＤ６００でのヘルパーファージ感染（ＶＣＳＭ１３）、遠心分離および２×ＴＹ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌカナマイシン中での再懸濁後に細胞を３０℃で一夜成長させた。ファージを上清からＰＥＧ沈殿させ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８）、ＰＢＳ／２０％グリセロールに再懸濁しそして−８０℃で保存した。２回のパニングの間のファージ増幅は以下のとお
り実施した。すなわち、対数中期のＴＧ１細胞を溶出されたファージに感染させ、そして１％のブドウ糖および３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充されたＬＢ寒天上でプレーティングした。３０℃での一夜インキュベーション後にコロニーを掻き取りかつ０．５のＯＤ６００に調節した。ヘルパーファージを上述されたとおり添加した。
【実施例２】
【００５１】
固相パニング
マキシソープ［Ｍａｘｉｓｏｒｐ］ＴＭマイクロタイタープレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））のウェルをＰＢＳ中ヒトＭＮタンパク質で被覆した（２μｇ／ウェル）。ＰＢＳ中５％脱脂粉乳でブロッキングした後に、上のとおり精製した１〜５×１０１２ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂファージを２０℃で１時間添加した。数回の洗浄段階後に、結合されたファージを１００ｍＭトリエチルアミンでのｐＨ溶出により溶出し、そしてその後１Ｍトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．０でした。３回のパニングを実施し、各回の間に上述されたとおりにファージ増幅を実施した。
【実施例３】
【００５２】
発現のための選択したＦａｂフラグメントのサブクローニング
選択したＨｕＣＡＬ  ＦａｂフラグメントのＦａｂをコードする挿入物を発現ベクターｐＭＯＲＰＨｘ７＿ＦＳにサブクローニングして、可溶性Ｆａｂの迅速な発現を助長した。選択したＨｕＣＡＬ  ＦａｂクローンのＤＮＡ調製物をＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化してかようにＦａｂをコードする挿入物（ｏｍｐＡ−ＶＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ）を切り離した。ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＭＯＲＰＨｘ７ベクター（以前はｓｃＦｖ挿入物を担持）中への精製した挿入物のサブクローニングは、ｐＭＯＲＰＨｘ９＿Ｆａｂ１＿ＦＳと呼称されるＦａｂ発現ベクターを導く（図４）。このベクター中で発現されるＦａｂは検出および精製のための２種のＣ末端標識（ＦＬＡＧおよびＳｔｒｅｐ）を担持する。
【実施例４】
【００５３】
ＥＬＩＳＡによるＭＮに結合するＦａｂフラグメントの同定
マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、被覆緩衝液で希釈された５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＭＮの１００μｌ／ウェルの溶液で被覆した。個々のＦａｂの発現を３０℃で１２時間の０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。可溶性Ｆａｂを浸透圧ショックにより周辺質から抽出し（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８）そしてＥＬＩＳＡで使用した。Ｆａｂフラグメントを抗Ｆａｂ抗体（ダイアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））で検出した。３７０ｎｍの値を、ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体およびＰＯＤ可溶性基質（ロシュ  ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））の添加後に読み取った。
【実施例５】
【００５４】
ＨｕＣＡＬ免疫グロブリン発現ベクターの構築
Ｈ鎖のクローニング。ｐｃＤＮＡ３．１＋（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のマルチクローニング部位を除去し（ＮｈｅＩ／ＡｐａＩ）、そして、ＨｕＣＡＬの設計に使用した制限部位と適合性のスタッファーをリーダー配列（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ）、ＶＨドメイン（ＥｃｏＲＩ／ＢｌｐＩ）および免疫グロブリン定常領域（ＢｌｐＩ／ＡｐａＩ）の連結のため挿入した。リーダー配列（ＥＭＢＬ  Ｍ８３１３３）はコザック配列（Ｋｏｚａｋ、１９８７）を装備された。ヒトＩｇＧ１（ＰＩＲ  Ｊ００２２８）、ＩｇＧ４（ＥＭＢＬ  Ｋ０１３１６）および血清ＩｇＡ１（ＥＭＢＬ  Ｊ００２２０）の定常領域を、約７０塩基の長さをもつ重複するオリゴヌクレオチドへと切断した。サイレント突然変異を導入してＨｕＣＡＬの設計と非適合性の制限部位を除去した。オリゴヌクレオチドは重複伸長ＰＣＲにより継ぎ合わせた。
【００５５】
Ｌ鎖のクローニング。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ＋（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のマルチクローニング部位を２種の異なるスタッファーにより置き換えた。κ−スタッファーはκ−リーダー（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＶ）、ＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖ  Ｖκ−ドメイン（ＥｃｏＲＶ／ＢｓｉＷＩ、）およびκ鎖定常領域（ＢｓｉＷＩ／ＡｐａＩ）の挿入のための制限部位を提供した。λ−スタッファー中の対応する制限部位は、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＶ（ｌ−リーダー）、ＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ（Ｖｌ−ドメイン）およびＨｐａＩ／ＡｐａＩ（λ鎖定常領域）であった。κ−リーダー（ＥＭＢＬ  Ｚ０００２２）ならびにλ−リーダー（ＥＭＢＬ  Ｌ２７６９２）は双方ともコザック配列を装備された。ヒトκ（ＥＭＢＬ  Ｊ００２４１）およびλ鎖（ＥＭＢＬ  Ｍ１８６４５）の定常領域は上述されたとおり重複伸長ＰＣＲにより集成した。
【００５６】
ＩｇＧを発現するＣＨＯ細胞の生成。ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＩｇＧのＨおよびＬ鎖発現ベクターの等モル混合物でコトランスフェクトした。二重耐性トランスフェクション体を６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および３００μｇ／ｍｌゼオシン（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））次いで限界希釈で選択した。単一クローンの上清を捕捉ＥＬＩＳＡ（下を参照されたい）によりＩｇＧ発現について評価した。陽性クローンを、１０％超低ＩｇＧ−ＦＣＳ（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））補充ＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。上清のｐＨを８．０に調節しかつ滅菌濾過後に、溶液を標準的プロテインＡカラムクロマトグラフィー（ポロス（Ｐｏｒｏｓ）２０Ａ、ＰＥ  バイオシステムズ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にかけた。
【実施例６】
【００５７】
ＣＤＲ３ライブラリーの設計
Ｖλの位置１および２。元のＨｕＣＡＬマスター遺伝子はそれらの真正のＮ末端、すなわちＶＬλ１：ＱＳ（ＣＡＧＡＧＣ）（配列番号１２１）、ＶＬλ２：ＱＳ（ＣＡＧＡＧＣ）（配列番号１２１）およびＶＬλ３：ＳＹ（ＡＧＣＴＡＴ）（配列番号１２２）を伴い構築した。これらのアミノ酸を含有する配列は第ＷＯ  ９７／０８３２０号明細書に示される。ＨｕＣＡＬライブラリー構築の間に最初の２アミノ酸をＤＩに変えてライブラリーのクローニングを助長した（ＥｃｏＲＩ部位）。全部のＨｕＣＡＬライブラリーは５’端にＥｃｏＲＶ部位ＧＡＴＡＴＣ（配列番号１２２）（ＤＩ）をもつＶＬλ遺伝子を含有する。全部のＨｕＣＡＬ  κ遺伝子（マスター遺伝子およびライブラリー中の全遺伝子）は５’端にＤＩを含有する。
【００５８】
ＶＨの位置１。元のＨｕＣＡＬマスター遺伝子はそれらの真正のＮ末端、すなわち第一のアミノ酸としてＱ（＝ＣＡＧ）を伴うＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２、ＶＨ４およびＶＨ６、ならびに第一のアミノ酸としてＥ（＝ＧＡＡ）を伴うＶＨ３およびＶＨ５を伴い構築した。これらのアミノ酸を含有する配列は第ＷＯ  ９７／０８３２０号明細書に示される。ＨｕＣＡＬ  Ｆａｂ  １ライブラリー中で、全部のＶＨ鎖は第一の位置にＱ（＝ＣＡＧ）を含有する。
【００５９】
Ｖκ１／Ｖκ３の位置８５。ＣＤＲ３ライブラリーを導入するのに使用したカセット突然変異誘発手順（Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６、５７−８６、２０００）のため、Ｖκ１およびＶκ３の位置８５はＴもしくはＶのいずれかである可能性がある。従って、ＨｕＣＡＬ  ｓｃＦｖ  １ライブラリー構築の間に、Ｖκ１およびＶκ３の位置８５を以下のとおり変えた。すなわち、元のＶκ１、８５Ｔ（コドンＡＣＣ）；Ｖκ１ライブラリー、８５Ｔもしくは８５Ｖ（ＴＲＩＭコドンＡＣＴもしくはＧＴＴ）；元のＶκ３、８５Ｖ（コドンＧＴＧ）；Ｖκ３ライブラリー、８５Ｔもしくは８５Ｖ（ＴＲＩＭコドンＡＣＴもしくはＧＴＴ）；同じことがＨｕＣａｌ  Ｆａｂ１に当てはまる。
【００６０】
ＣＤＲ３の設計。一定を保った全ＣＤＲ３残基を表１および２（配列番号９０−１１７）に示す。
【００６１】
ＣＤＲ３の長さ。設計されたＣＤＲ３の長さ分布は以下のとおりである。変えられた残基は図２に示されるところの配列表中に示す。Ｖκ  ＣＤＲ３、８アミノ酸残基（位置８９ないし９６）（ときに７残基）、Ｑ９０は固定；Ｖλ  ＣＤＲ３、８ないし１０アミノ酸残基（位置８９ないし９６）（ときに７−１０残基）、Ｑ８９、Ｓ９０および９２は固定；ならびにＶＨ  ＣＤＲ３、５ないし２８アミノ酸残基（位置９５ないし１０２）（ときに４−２８）、Ｄ１０１は固定。
【実施例７】
【００６２】
エピトープマッピングのための競合ＥＬＩＳＡ
ヌンク（Ｎｕｎｃ）マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロタイタープレートを、５μｇ／ｍＬの濃度のＰＢＳ中ＭＮもしくはＭＮ−ペプチド結合ＢＳＡ１００μＬで４℃で一夜被覆した。各ウェルはＰＢＳ中５％脱脂乳でマイクロタイタープレート振とう機上ＲＴで２時間ブロッキングする。プレートを０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含むＰＢＳで洗浄する。ウェルあたり２００μＬの抗体または抗体＋プロテオグリカンペプチドＡ、ＢもしくはＣ（配列番号２０−２２）をウェルに添加する。抗体およびプロテオグリカンペプチド濃度は５０％終点の決定において最大の容易さを生じるよう至適化した。これらの抗体／ペプチド混合物をマイクロタイタープレート振とう機上ＲＴで１．５時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートは０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有するＴＢＳで迅速に５回洗浄する。結合された抗体を、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗Ｆａｂ  ＩｇＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を使用して試験した。ＴＢＳ−トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）でさらに洗浄した後に１００μＬのＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を添加する。３０分のインキュベーション後に吸光度を３７０ｎｍで読み取る。
【実施例８】
【００６３】
細胞接着アッセイ
５０ｍＭ重炭酸緩衝液ｐＨ９．２中の１μｇ／ｍＬの精製されたＭＮを３０μＬの滴で細菌学的５ｃｍペトリ皿の底に１．５時間吸着させた。滴を除去しかつＰＢＳで３回すすいだ。その後、滴をＤＭＥＭ中５０％ウシ胎児血清でブロッキングした。滴を３０ｍＬの２０〜１００μｇ／ｍＬ抗ＭＮ  ＩｇＧもしくは対照としてのＰＢＳおよび無関係の抗体でさらに処理した。ＰＢＳで滴を洗浄した後に、斑点（ｓｐｏｔ）を３０μＬのＣＧＬ−１細胞懸濁物（１０５細胞／ｍＬ）とともにインキュベートしかつ一夜インキュベートした。ＭＮ被覆されたプレートへのＣＧＬ−１細胞の接着を遮断する抗ＭＮ抗体の能力を、滴をＰＢＳで洗浄した後に評価した。本実験の一例を図５に示し、ここでは２０μｇ／ｍｌの抗ＭＮ抗体ＭＮ−３（図５Ａ）が、対照のガンマグロブリン（図５Ｂ）および抗体処置なし（図５Ｃ）に比較して細胞接着を阻害している。
【実施例９】
【００６４】
皮下異種移植癌モデル
抗ＭＮ抗体の抗腫瘍効果を、免疫不全マウスの皮下異種移植モデルを使用して評価した。ＨＴ−２９細胞は１０％ＦＢＳを補充されたＤＭＥＭ中で接着培養物として維持した。６〜７週齢のＳＣＩＤマウスに、０．１ｍＬの培地中の１×１０７細胞を右脇腹に皮下に接種した。モノクローナル抗体を５００μｇの用量で毎日ｉ．ｐ．投与した。対照マウスはＰＢＳもしくは無関係のモノクローナル抗体で処理した。腫瘍を滑りカリパスで週２回測定した。抗腫瘍効果は、対照処置に対して抗ＭＮ抗体処置の腫瘍サイズを比較することにより評価した。
【実施例１０】
【００６５】
免疫複合体を用いる皮下異種移植癌モデル
抗ＭＮ抗体を、当該技術分野で既知であるプロトコル（例えばＣ．Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）、９３、８６１８−８６２３）を使用して細胞傷害性の低分子に複合させた。ＨＴ−２９細胞は１０％ＦＢＳを補充されたＤＭＥＭ中で接着培養物として維持した。６〜７週齢の雌性ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスに、０．１ｍＬの培地中の１×１０ｅ７腫瘍細胞を右脇腹に皮下に接種した。腫瘍サイズが６５ｍｍ３に達した後に、動物に０．５ｍｇの抗体複合体を連続５日間毎日注入した。対照マウスはＰＢＳ、無関係のモノクローナル抗体もしくは遊離の複合されない薬物で処理した。腫瘍を滑りカリパスで週２回測定した。抗腫瘍効果は、対照処置に対して抗ＭＮ抗体処置の腫瘍サイズを比較することにより評価した。
【実施例１１】
【００６６】
蛍光標示式細胞分取アッセイ（ＦＡＣＳアッセイ）
細胞を診断ツールとしてＭＮ発現についてアッセイすることができる。接着細胞系については、最初にそれらの培地を除去すること、それらを氷冷ＰＢＳで１回すすぐこと、およびそれらをＰＢＳ中１ｍＭ  ＥＤＴＡで細胞系に依存して５ないし１０分間処理すること（フラスコを定期的に叩くことにより促進する）により、それらのフラスコから細胞をはがす。細胞を遠沈し（１５００ｒｐｍ、５分）かつ氷冷染色緩衝液（１０％ＦＢＳ、０．１％アジ化ナトリウム、ＰＢＳ）で細胞を１回洗浄する。細胞を２００μｌ中百万個の細胞で氷冷染色緩衝液に再懸濁する。一次抗体を３．２Ｅ−１１ないし３．２Ｅ−８Ｍで添加しかつ氷上で１時間インキュベートする。結合されない抗体を氷冷染色緩衝液で洗浄する。細胞ペレットを２００μｌの氷冷染色緩衝液に再懸濁し、そして２００μｌの細胞あたり２０μｌのＦＩＴＣ結合抗ヒト二次抗体（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を添加する。氷上で１時間インキュベートする。結合されない抗体を洗浄し、そして細胞を２００μｌの染色緩衝液中２．５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に再懸濁する（死細胞について排除（ｇａｔｅ）するため）。ＰＩを取り込む細胞を排除する（ｇａｔｉｎｇ  ｏｕｔ）ＦＡＣＳ分析を始める。ＰＣ３ｍｍ２ヒト前立腺癌細胞は図７に示されるところのＦＡＣＳにより示されるとおりＭＮを発現する。赤線はヒト抗ＭＮ抗体での染色を表す一方、黒線は対照のアイソタイプを一致させたヒト抗体を表す。
【実施例１２】
【００６７】
腫瘍サンプルの免疫組織化学的分析
腫瘍切片をＭＮ発現について試験することができる。ＭＮは癌で高度に発現されかつ低発現レベルが正常組織に存在するため、ＭＮ発現を分析することは患者サンプル中の癌の診断および検出に有用である。組織切片の分析に標準的免疫組織化学的技術を使用することができる。ＰＣ−３前立腺癌を含有する組織切片をＳＣＩＤマウスに埋植した。２０マイクログラム／ｍＬの抗ＭＮ抗体を脱蝋パラフィン切片とともにインキュベートし、そしてペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用してスライドガラスを発色させ、また、ＤＡＢ色原体を使用して発色させた。強い膜関連シグナルが容易に観察され、そして前立腺癌細胞中の高いＭＮ発現に特徴的である。
【実施例１３】
【００６８】
抗体依存性の細胞媒介性の細胞傷害性アッセイ（ＡＤＣＣアッセイ）
抗ＭＮ  ＩｇＧｇの抗腫瘍活性はＡＤＣＣアッセイにより媒介させることができる。ＭＮを発現するＰＣ−３ｍｍ２細胞およびＭＮを発現しないＨＣＴ−１１６細胞を、２５０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬもしくは２０００ｎｇ／ｍＬのヒト抗ＭＮ  ＩｇＧ１もしくは対照ヒトＩｇＧ１抗ジゴキシン抗体とともにインキュベートする。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして：５０：１、２５：１および５：１の比の標的比でこれらの細胞に添
加する。クロム−５１放出アッセイを実施して標的細胞の溶解のレベルを測定する。少量の溶解がＨＣＴ−１１６もしくはＰＣ−３ｍｍ２細胞の存在下で対照抗体もしくは抗体なしのインキュベーションに際して観察される。この自発的レベルの溶解は５０：１、２５：１および５：１の標的エフェクター比についてそれぞれ１０〜１５％、５〜１０％もしくは２〜３％である。同様に、ＭＮを発現しないＨＣＴ−１１６細胞の溶解は抗ＭＮ抗体とともにインキュベートされた場合に０〜１０％範囲にあった。しかしながら、ヒト抗ＭＮ  ＩｇＧとともにインキュベートされた場合のＰＣ−３ｍｍ２細胞の溶解は対照より有意により高かった。４０、５０および６０％の溶解が、５０：１の標的：エフェクター比で２５０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬおよび２０００ｎｇ／ｍＬを使用した場合に観察された。同様に、３０、３３および３８％の溶解が２５：１の比で観察され、そして最後に８、１０および１５％の溶解が５：１の標的：エフェクター比で観察された。これらの実験は、ヒト抗ＭＮ抗体が抗腫瘍性ＡＤＣＣ活性を媒介しかつ癌の治療的処置に使用してよいことを示す。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
【表２】
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【００７１】
【表３】
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【００７２】
【表４】
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【００７３】
【表５】
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【００７４】
【表６】
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【００７５】
【表７】
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【００７６】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００７７】
ヒト抗ＭＮ抗体は、ＦＡＣＳおよび免疫組織化学的方法を使用して癌細胞および腫瘍中のＭＮ発現を診断および定量するのに使用されているので、本発明のヒト抗ＭＮ  ＩｇＧ１が抗体依存性の細胞媒介性の細胞傷害性により腫瘍細胞の溶解を媒介する一例もまた提供される。従って、本発明の抗体は、ＭＮがアップレギュレートされている癌の処置に有用であり得、もしくは、ＭＮがアップレギュレートされている癌の診断に有用であり得る。よって、医薬または診断薬製造業で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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