(57)【要約】【課題】  アレルギー疾患の治療剤または予防剤を提供すること。【解決手段】  高められた分子状水素濃度を有する水を含む、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害の液状治療剤または液状予防剤により、上記課題が解決される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高められた分子状水素濃度を有する水を含む、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害の液状治療剤または液状予防剤。
【請求項２】
上記分子状水素濃度が液状治療剤または液状予防剤の全重量を基準として０．０５ｐｐｍ以上である、請求項１記載の液状治療剤または液状予防剤。
【請求項３】
上記Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害が、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、鼻炎、結膜炎、花粉症または蕁麻疹である、請求項１または２のいずれか１つに記載の液状治療剤または液状予防剤。
【請求項４】
液状治療剤または液状予防剤が飲料の形態にある、請求項１〜３のいずれか１つに記載の液状治療剤または液状予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高められた分子状水素濃度を有する水を含む、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害の液状治療剤または液状予防剤、ならびにＩ型アレルギー反応が関連する疾患または障害を患っている患者を治療するための、高められた分子状水素濃度を有する水の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型アレルギーまたは即時型過敏症は、種々のアレルギー性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、鼻炎、結膜炎、花粉症および蕁麻疹に関与している。
【０００３】
Ｉ型アレルギー反応を含む免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）介在型の免疫反応においては、肥満細胞がエフェクター細胞として重要な役割を果たすが、これは造血前駆細胞に由来し、粘膜組織や結合組織において局所的に成熟細胞に分化する。この肥満細胞の表面には高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩ（ＩｇＥの結合するαサブユニットと、βサブユニットおよび２つのγサブユニットとからなる）が発現しており、ＦｃεＲＩに結合しているＩｇＥ分子と抗原が反応することにより、受容体の凝集、情報伝達系の活性化が起こり、その結果として、予め形成されていたヒスタミンや腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα：ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α）のようなメディエーターの脱顆粒・放出やサイトカインの産生、ロイコトリエンの分泌等が生じる（非特許文献１）。
【０００４】
従って、このような肥満細胞の活性化を阻害できる薬剤の開発は、アレルギー性疾患の治療に関して大きな可能性を有するものであると期待される。
【０００５】
ところで、最近になって、分子状水素が多くの酸化ストレス関連疾患の動物モデルにおいて良好な効果を奏することが示されてきた。水素ガスの吸入が酸化ストレスの軽減によって脳梗塞体積を減少させることが最初に示され（非特許文献２）、その後、水素ガスが肝虚血再潅流障害（非特許文献３）、心筋虚血再潅流障害（非特許文献４）、新生児低酸素性脳症（非特許文献５）および小腸移植誘発性炎症（非特許文献６）に対して予防効果を有することが報告されている。
【０００６】
また、非特許文献７〜９では、水素ガスを含有する水素冨化水の経口摂取がストレス性認知障害（非特許文献７）、アテローム硬化症（非特許文献８）、難聴（非特許文献９）およびパーキンソン病（非特許文献１０）に対して有効であることが報告されている。さらに、非特許文献１１では、糖尿病や耐糖能異常を患う患者に水素冨化水を経口摂取させることにより、脂質代謝およびグルコース代謝が改善されたことが報告されている。
【０００７】
しかしながら、水素と、アレルギー性疾患との関係については未だ報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Kalesnikoff, S.J. Galli, New developments in mast cell biology, Nat Immunol 9 (2008) 1215-1223.
【非特許文献２】I. Ohsawa, M. Ishikawa, K. Takahashi, M. Watanabe, K. Nishimaki, K. Yamagata, K. Katsura, Y. Katayama, S. Asoh, S. Ohta, Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals, Nat Med 13 (2007) 688-694.
【非特許文献３】K. Fukuda, S. Asoh, M. Ishikawa, Y. Yamamoto, I. Ohsawa, S. Ohta, Inhalation of hydrogen gas suppresses hepatic injury caused by ischemia/reperfusion through reducing oxidative stress, Biochem Biophys Res Commun 361 (2007) 670-674.
【非特許文献４】K. Hayashida, M. Sano, I. Ohsawa, K. Shinmura, K. Tamaki, K. Kimura, J. Endo, T. Katayama, A. Kawamura, S. Kohsaka, S. Makino, S. Ohta, S. Ogawa, K. Fukuda, Inhalation of hydrogen gas reduces infarct size in the rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury, Biochem Biophys Res Commun 373 (2008) 30-35.
【非特許文献５】J. Cai, Z. Kang, W.W. Liu, X. Luo, S. Qiang, J.H. Zhang, S. Ohta, X. Sun, W. Xu, H. Tao, R. Li, Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model, Neurosci Lett 441 (2008) 167-172.
【非特許文献６】B.M. Buchholz, D.J. Kaczorowski, R. Sugimoto, R. Yang, Y. Wang, T.R. Billiar, K.R. McCurry, A.J. Bauer, A. Nakao, Hydrogen inhalation ameliorates oxidative stress in transplantation induced intestinal graft injury, Am J Transplant 8 (2008) 2015-2024.
【非特許文献７】K. Nagata, N. Nakashima-Kamimura, T. Mikami, I. Ohsawa, S. Ohta, Consumption of molecular hydrogen prevents the stress-induced impairments in hippocampus-dependent learning tasks during chronic physical restraint in mice, Neuropsychopharmacology 34 (2009) 501-508.
【非特許文献８】I. Ohsawa, K. Nishimaki, K. Yamagata, M. Ishikawa, S. Ohta, Consumption of hydrogen water prevents atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice, Biochem Biophys Res Commun 377 (2008) 1195-1198.
【非特許文献９】Y.S. Kikkawa, T. Nakagawa, R.T. Horie, J. Ito, Hydrogen protects auditory hair cells from free radicals, Neuroreport 20 (2009) 689-694.
【非特許文献１０】Y. Fu, M. Ito, Y. Fujita, M. Ito, M. Ichihara, A. Masuda, Y. Suzuki, S. Maesawa, Y. Kajita, M. Hirayama, I. Ohsawa, S. Ohta, K. Ohno, Molecular hydrogen is protective against 6-hydroxydopamine-induced nigrostriatal degeneration in a rat model of Parkinson's disease, Neurosci Lett 453 (2009) 81-85.
【非特許文献１１】S. Kajiyama, G. Hasegawa, M. Asano, H. Hosoda, M. Fukui, N. Nakamura, J. Kitawaki, S. Imai, K. Nakano, M. Ohta, T. Adachi, H. Obayashi, T. Yoshikawa, Supplementation of hydrogen-rich water improves lipid and glucose metabolism in patients with type 2 diabetes or impaired glucose tolerance, Nutr Res 28 (2008) 137-143.
【非特許文献１２】M.K. Choo, E.K. Park, M.J. Han, D.H. Kim, Antiallergic activity of ginseng and its ginsenosides, Plant Med 69 (2003) 518-522.
【非特許文献１３】T.J. Sullivan, K.L. Parker, W. Stenson, C.W. Parker, Modulation of cyclic AMP in purified rat mast cells. I. Responses to pharmacologic, metabolic, and physical stimuli, J Immunol 114 (1975) 1473-1479.
【非特許文献１４】Y. Sato, S. Kajiyama, A. Amano, Y. Kondo, T. Sasaki, S. Handa, R. Takahashi, M. Fukui, G. Hasegawa, N. Nakamura, H. Fujinawa, T. Mori, M. Ohta, H. Obayashi, N. Maruyama, A. Ishigami, Hydrogen-rich pure water prevents superoxide formation in brain slices of vitamin C-depleted SMP30/GNL knockout mice, Biochem Biophys Res Commun 375 (2008) 346-350.
【非特許文献１５】Y. Suzuki, T. Yoshimaru, T. Inoue, O. Niide, C. Ra, Role of oxidants in mast cell activation, Chem Immunol Allergy 87 (2005) 32-42.
【非特許文献１６】J.R. Gordon, S.J. Galli, Release of both preformed and newly synthesized tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha)/cachectin by mouse mast cells stimulated via the Fc epsilon RI. A mechanism for the sustained action of mast cell-derived TNF-alpha during IgE-dependent biological responses, J Exp Med 174 (1991) 103-107.
【非特許文献１７】N. Nakao, T. Kurokawa, T. Nonami, G. Tumurkhuu, N. Koide, T. Yokochi, Hydrogen peroxide induces the production of tumor necrosis factor-alpha in RAW 264.7 macrophage cells via activation of p38 and stress-activated protein kinase, Innate Immun14 (2008) 190-196.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、アレルギー疾患の治療剤または予防剤を提供することである。
【００１０】
本願発明の他の課題は、以下の記載から明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、本発明者らは、高められた分子状水素濃度を有する水がＩ型アレルギー反応の抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
受身皮下アナフィラキシー（ＰＣＡ：Ｐａｓｓｉｖｅ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）は即時型アレルギー反応の動物モデルであり、抗アレルギー薬の評価に頻繁に使用されているが、ＰＣＡ反応における水素の効果について試験を行ったところ、水素水で処理したマウスにおいてＰＣＡ反応が阻害されること、そしてその際にヒスタミンの放出も抑制されることが見出された。また、水素によるアレルギー反応阻害の分子機構を解析することにより、ＰＣＡ反応の阻害効果には肥満細胞中のＴＮＦαの発現抑制が関与することも見出された。
【００１３】
なお、分子状水素は、細胞内に存在する活性酸素種のうち主にヒドロキシルラジカルを選択的に水に変えて無毒化するといわれているが、細胞にとって有益な役割も果たしている活性酸素種であるスーパーオキサイド、過酸化水素にはあまり影響を与えないことが報告されている（非特許文献２）。
【００１４】
従って、本発明は、高められた分子状水素濃度を有する水を含む、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害の液状治療剤または液状予防剤に関する。
【００１５】
本発明はまた、上記分子状水素濃度が液状治療剤または液状予防剤の全重量を基準として０．０５ｐｐｍ以上である、上記液状治療剤または液状予防剤に関する。
【００１６】
本発明はまた、上記Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害が、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、鼻炎、結膜炎、花粉症または蕁麻疹である、上記液状治療剤または液状予防剤に関する。
【００１７】
本発明はまた、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害を患っている患者を治療するための、高められた分子状水素濃度を有する水の使用に関する。
【００１８】
本発明はまた、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害に罹るのを予防するための、高められた分子状水素濃度を有する水の使用に関する。
【００１９】
本発明はまた、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害の液状治療剤または液状予防剤を製造するための、高められた分子状水素濃度を有する水の使用に関する。
【００２０】
本発明はまた、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害を患っているヒトを含む動物の治療方法であって、高められた分子状水素濃度を有する水の治療的有効量を上記ヒトを含む動物に投与することを含む、上記治療方法に関する。
【００２１】
本発明はまた、ヒトを含む動物においてＩ型アレルギー反応が関連する疾患または障害に罹るのを予防する方法であって、高められた分子状水素濃度を有する水の予防的有効量を、上記ヒトを含む動物に投与することを含む、上記予防方法に関する。
【００２２】
本発明はまた、高められた分子状水素濃度を有する水であって、ヒトを含めた動物に投与することにより、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害の治療または予防に使用するための上記高められた分子状水素濃度を有する水に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＩＣＲマウスでのＰＣＡ反応における水素水経口摂取の効果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＩＣＲマウスでのＰＣＡ反応における水素水経口摂取の効果を示す。
【図２】図２は、ＩＣＲマウスでの血清ヒスタミンおよび８−ＯＨｄＧレベルにおける水素水経口摂取の効果を示す。
【図３】図３は、ＩＣＲマウスから得られた腹腔滲出細胞中の肥満細胞数における水素水経口摂取の効果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＩＣＲマウスから得られた肥満細胞におけるアレルギー関連遺伝子の発現における水素水経口摂取の効果を示す（ｍＲＮＡ発現レベル）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＩＣＲマウスから得られた肥満細胞におけるアレルギー関連遺伝子の発現における水素水経口摂取の効果を示す（蛋白質発現レベル）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩＣＲマウスから得られた肥満細胞におけるアレルギー関連遺伝子の発現における水素水経口摂取の効果を示す（蛋白質発現レベル）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明では、「高められた分子状水素濃度を有する水」が使用される。「高められた分子状水素濃度」とは、通常の飲用水、例えば水道水もしくは天然水、またはこれらを処理して得られる蒸留水、脱イオン水などの水の常温・常圧における分子状水素（Ｈ２）濃度（０．００ｐｐｍ）よりも高い溶存分子状水素濃度を意味し、好ましくは、「高められた分子状水素濃度を有する水」の全重量を基準として０．０５ｐｐｍ以上の分子状水素濃度を意味する。ここで、分子状水素濃度の上限は、水素の水への溶解度、すなわち、飽和溶存水素量に依存するだけで特に制限はない。飽和溶存水素量は、２５℃、常圧においては１．５５ｐｐｍである。上記「高められた分子状水素濃度を有する水」の分子状水素濃度は、温度・圧力等の条件にもよるが、例えば、０．１〜２．０ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ〜１．６ｐｐｍ、０．８ｐｐｍ〜１．２ｐｐｍの範囲にある。なお、本明細書においては、このような「高められた分子状水素濃度を有する水」を「水素水」とも呼ぶ。
【００２５】
このような水素水自体は既知であり、例えば、実用新案登録第３１３９４６０号公報の記載に従い、スタティックミキサーを有する気液混合部、途中に加圧ポンプを経る液体供給配管によって上記の気液混合部に接続される原料液体容器、気体供給配管によって上記気液混合部に接続される水素ボンベ、および製造された水素水を回収するための水素水回収配管を備えた装置を用いる連続加圧流通方式によって、水素（気体）を水に溶解させることにより製造することができる。具体的には、水を加圧ポンプによって加圧して液体供給配管によって気液混合部に供給し、一方で、加圧された状態で水素ボンベに充填された水素ガスも該ボンベ内の圧力を利用して気体供給配管によって気液混合部に供給する。この気液混合部に送られた水と水素ガス（両者とも加圧された状態である）を上記混合部内のミキサーに送り、加圧下において撹拌しながら水素を水に溶解させる。このような方法により、大量の本発明水素水を連続的に製造することが可能である。
【００２６】
水素水は、常温常圧の開放系で静置すると、時間の経過とともに、溶存していた水素分子が水から放出されてしまう。そのため、水素水は、密封可能な容器中に保存する必要がある。例えばアルミニウム製の缶やアルミパウチにおいて保存するのが好ましく、使用の直前に開封するのが好ましい。
【００２７】
上記水素水に含まれる分子状水素濃度は、市販のＨ２−Ｎ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｎｅｅｄｌｅ ｓｅｎｓｏｒ（Ｕｎｉｓｅｎｓｅ社、Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）及びＰＡ２０００ ２ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｉｃｏａｍｍｅｔｅｒ（Ｕｎｉｓｅｎｓｅ社、Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）を使用して、常温（２５℃）で測定することができる。
具体的には、容器に入れた水素水に、ＰＡ−２０００に接続したＨ２−Ｎのセンサー部分を浸し、ＰＡ２０００に表示される電流値が安定するまで５分ほど待って、電流値を読み取る。また、これとは別に、分子状水素を含有しない通常の飲用水（水道水）の電流値と、分子状水素を飽和に含した飽和水素水の電流値も同様に測定する（ここで、２５℃における水道水の分子状水素濃度は０．００ｐｐｍであり、２５℃における飽和水素水の分子状水素濃度は１．５５ｐｐｍである）。水道水および飽和水素水の電流値の測定結果から、分子状水素濃度および電流値に関する検量線を作成し、測定対象である水素水において得られた電流値を当該検量線に当てはめることによって、当該水素水に含まれる分子状水素濃度を求めることができる。
【００２８】
本発明では、上記水素水を、アレルギー疾患、特にＩ型アレルギー反応が関連するアレルギー疾患または障害の治療・予防に治療剤または予防剤として使用する。すなわち、本発明において、水素水とは、アレルギー疾患、特にＩ型アレルギー反応が関連するアレルギー疾患または障害の治療または予防のための有効成分としての分子状水素と、それを溶存させるためのキャリアーとしての水とを含む医薬組成物である。この際、典型的には、純粋な水素水が使用されるが、必要ならば、水素水の効果を損なわないことを条件として、水素水は、他の添加剤、例えばフレーバー、着色料、他の有効物質、ゲル化剤、防腐剤等を含んでいてもよい。これらの任意付加的に使用される添加剤は、それの種類によって、水素水の原料となる水に最初から加えるか、製造過程もしくは製造直後、または使用直前に加えることができる。
【００２９】
Ｉ型アレルギー反応とは、肥満細胞や好塩基球表面に結合したＩｇＥクラスに属する抗体に対応抗原が結合すると、その刺激によりヒスタミン、ロイコトリエン等の化学伝達物質が放出されるが、その作用によってもたらされる血管透過性亢進、末梢血管拡張、平滑筋収縮、粘液分泌亢進、白血球遊走等の反応を含めた、典型的な即時型アレルギーまたは即時型過敏反応を意味する。
【００３０】
このようなＩ型アレルギー反応に関連するアレルギー疾患または障害としては、例えば、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、鼻炎、結膜炎、花粉症または蕁麻疹が挙げられる。
【００３１】
本発明においては、治療または予防の対象者は、ヒトを含む動物、好ましくはヒトである。本明細書において使用する場合に「患者」は、ヒトを含む動物、好ましくはヒトを意味する。
【００３２】
本発明の治療剤または予防剤は、例えば、経口的に摂取することができ、あるいは入浴やシャワー等によっても摂取することができる。経口によって摂取する場合には、そのまま飲料として摂取することができ、それにより、水素水中の水素分子が効率的に体内に吸収され、全身の細胞内に効率的に取り込まれる。水素分子は分子が小さいために細胞膜を透過しやすく、細胞の隅々まで到達することができる。また、ガスで摂取する場合と比べると、吸入器などが不要であるので、より簡便に流通、使用することができ、また細胞内への取り込みがより直接的に行えるという利点がある。
【００３３】
投与量は、副作用がないのでさほど厳密な投与量の管理を必要とするものではないが、通常、０．１ｐｐｍの溶存水素量（水素水全重量を基準として）を有する水素水に換算して、１日につき成人１人あたり３００ｍｌ〜２０００ｍｌの範囲である。この際、これらの用量は、１日あたり１回またはそれ以上の回数によって投与することができ、特に２００ｍｌ〜３００ｍｌの範囲の用量ずつに分けて、それを１日あたり数回投与するのが好ましい。上記投与量は、治療・予防の対象者の年齢、体重や一般的な健康状態、治療・予防されるべき疾患、障害もしくは状態の性質や重症度等を考慮して調節することができる。
【００３４】
上述のように、上記水素水はＩ型アレルギー反応を抑制し、従って、Ｉ型アレルギー反応に関連する疾患または障害の治療、予防に有用である。
【００３５】
本発明はさらに、治療的有効量または予防的有効量の水素水および場合により少なくとも１種の添加剤を混合することを含む、Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害用の液状治療剤または予防剤を製造する方法を提供する。
【００３６】
本明細書において使用する場合に「治療的有効量」とは、所与の疾患または障害の臨床症状を治癒、軽減、または部分的に抑止するのに十分な量を意味する。Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害に対しての上記水素水の治療的有効量は、通常、０．１ｐｐｍの溶存水素量を有する水素水に換算して、１日につき成人１人あたり３００ｍｌ〜２０００ｍｌの範囲である。
【００３７】
本明細書において使用する場合に「予防的有効量」とは、対象者（ヒトを含む動物）が所与の疾患または障害の臨床症状に罹らないように予防するのに十分な量を意味する。Ｉ型アレルギー反応が関連する疾患または障害に対しての上記水素水の予防的有効量は、通常、０．１ｐｐｍの溶存水素量を有する水素水に換算して、１日につき成人１人あたり３００ｍｌ〜２０００ｍｌの範囲である。
【００３８】
これらの量は、対象者の体重や一般的な健康状態、あるいは疾患または障害の性質や重症度を考慮して調節することができる。
【実施例】
【００３９】
以下において、本発明の複数の実施例を示すが、本発明は、これらの実施例等によって何等限定されるものではなく、特許請求の範囲によって特定されるものであることはいうまでもない。
【００４０】
＜材料および方法＞
試薬
マウスモノクローナル抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）ＩｇＥは、ヤマサ（東京、日本）から購入した。コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルはＲｏｃｈｅ社（Ｎｕｔｌｅｙ、米国）から入手した。ＦｃεＲＩα、ＣＤ４４、ＴＮＦαおよびＩＣＡＭ１（細胞間接着分子１：ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）に対する抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、米国）から入手した。β-アクチンに対する抗体は、Ｓｉｇｍａ社（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、米国）から入手した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体、およびＥＣＬ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｋｉｔはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、米国）から入手した。水素水については、アルミパウチ容器タイプの水素水（商品名：「おいしい水素水」、アルミパウチ容器タイプ５００ｍｌ）をブルー・マーキュリー社（東京、日本）から提供を受けた。
【００４１】
動物および処置
４週齢のオスのＩＣＲマウス（日本ＳＬＣ、浜松、日本）を温湿度管理された飼育室で１２時間明暗サイクルの下、飼育した。実験に先立って、全てのマウスにＣＥ−２ペレット（日本クレア、東京、日本）および水を１週間自由に摂取させ、周囲環境に馴化させた。その後、マウスに、ＣＥ−２ダイエット（ＣＥ−２ ｄｉｅｔｓ）を摂取させ、水素水または対照水を２週間または４週間自由に摂取させた。対照水は、水素水を大気開放下で穏やかに２４時間撹拌することによって製造した。各群につき６匹のマウスを使用した。分子状水素濃度はＨ２−Ｎ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｎｅｅｄｌｅ ｓｅｎｓｏｒ（水素針センサー）（Ｕｎｉｓｅｎｓｅ社、Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）を用いて測定した。水素水における分子状水素濃度は約１ｐｐｍであり、一方、対照水の分子状水素濃度は水道水の分子状水素濃度と同等であった。アルミパウチ容器の水素水は開封直後に６０ｍｌのガラス容器に入れ、その後容器内の空気を抜いてから蓋をした。摂取の間に水素が失われるのを最小限にするために、容器の蓋には、ボールベアリングを含む金属チューブを設けた。毎日、水素水を含有する容器を新たに用意し、マウスに付与した。実験を通して、体重、食餌の消費、および水の摂取量を毎日記録した。この試験は、岐阜県国際バイオ研究所の委員会によって承認されたものであり、動物は、岐阜県国際バイオ研究所の実験動物に関するガイドラインに従って扱った。
【００４２】
受身皮下アナフィラキシー反応の測定
ＰＣＡ反応は非特許文献１２に記載された方法にわずかな改変を施して行った。ＩＣＲマウスの背部の毛を剃った２箇所の皮膚にそれぞれ１０μｇの抗ＤＮＰ−ＩｇＥを注射した。２４時間後に、マウスに１μｇ／μｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）標識ＤＮＰおよび１％のエバンスブルー（Ｓｉｇｍａ社）を含む２００μｌのＰＢＳを尾静脈から静脈内に注射した。１時間後、マウスを屠殺し、背部の皮膚を剥がした。皮膚の写真を撮った後、抗ＤＮＰ−ＩｇＥを注射した皮膚領域（１ｃｍ×１ｃｍ）を１ＮのＫＯＨに３７℃で２４時間溶解し、漏出したエバンスブルー色素を、アセトンと０．２Ｍリン酸との混合液（１３：５）を用いて抽出した。色素の量を６２０ｎｍで光学的に測定した。
【００４３】
血清解析
ＰＣＡ反応後、血液サンプルを腹大動脈から採取し、直ちに遠心分離により血清を分離した。血清ヒスタミンおよび８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）のレベルを、それぞれヒスタミンＥＬＩＳＡキット（塩野義製薬、大阪、日本）および８−ＯＨｄＧ  ＥＬＩＳＡキット（日研ザイル、静岡、日本）を用いて測定した。
【００４４】
腹腔滲出細胞の調製
５ｍｌのＣａ２＋不含Ｔｙｒｏｄｅバッファーを腹腔内に注射した後に、腹部を穏やかに２分間マッサージした。その後、２１Ｇの注射針とシリンジとを用いて腹水を回収した。非特許文献１３の方法に従って、肥満細胞を冨化した腹腔滲出細胞を調製した。回収した腹水に２ｍｌの３１．５％ＢＳＡを添加し、３００×ｇで１０分間遠心分離を行った後、上層と中間層とを捨て、底に形成した細胞ペレットを解析用に保存した。
【００４５】
肥満細胞数の計測
腹腔滲出細胞における肥満細胞数を測定するために、肥満細胞をトルイジンブルー（Ｓｉｇｍａ社）で３分間染色した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、顕微鏡ＢＺ−８０００（キーエンス、大阪、日本）下で細胞数を計数した。
【００４６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ｔｏｔａｌ ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｈｉｌｄｅｎ、独国）を用いて単離し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（宝酒造、大津、日本）を用いてｃＤＮＡをｔｏｔａｌ ＲＮＡから合成した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ Ｋｉｔ（宝酒造）と以下のプライマーセット：
ＦｃεＲＩα-センス鎖：5’-CCATAGCAGGAAAGGGTCAC-3’
ＦｃεＲＩα-アンチセンス鎖：5’-CGATGGTCACTGGAAGGTCT-3’；
ＴＮＦα-センス鎖：5’-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3’
ＴＮＦα-アンチセンス鎖：5’-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3’; 
ＣＤ４４-センス鎖：5’-TTTAACCTATATGCAGCAAGCCACT-3’
ＣＤ４４-アンチセンス鎖：5’-CAGAATCATCACCACTATGGCAAG-3’;
ＩＣＡＭ１-センス鎖：5’-CAATTCACACTGAATGCCAGCTC-3’
ＩＣＡＭ１-アンチセンス鎖：5’-CAAGCAGTCCGTCTCGTCCA-3’; 
β-アクチン-センス鎖：5’-CACCACACCTTCTACAATGAGCTG-3’
β-アクチン-アンチセンス鎖：5’-CACAGCTTCTCTTTGATGTCACGC-3’
を用いて、サーマルサイクラーＤｉｃｅ（宝酒造、大津、日本）で行った。β‐アクチンを内部対照として使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の最初の変性段階と、９５℃−５秒間および６０℃−３０秒間の４０サイクルからなる。
【００４７】
ウエスタンブロット解析
肥満細胞を冨化した腹腔滲出細胞ペレットをコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルを含有するＲＩＰＡ溶解バッファーに再懸濁した。蛋白質濃度をＤＣプロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、米国）を用いて測定した。細胞溶解液をドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、ＰＶＤＦ膜（Ｄｕ Ｐｏｎｔ社、Ｂｏｓｔｏｎ、米国）に電気的にブロッティングした。５％の脱脂乳を含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）において１時間ブロッキングを行った後、膜を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。その後、膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後に、ＥＣＬ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｋｉｔおよびＬＡＳ−４０００ルミノ・イメージアナライザー（富士フィルム、東京、日本）を用いて蛋白質を検出した。全てのデータはＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定により解析した。差は、ｐ<０．０５の場合に有意であるとした。
【００４８】
＜結果＞
水素水の経口摂取は、受身皮下アナフィラキシー反応を改善する。
水素水の経口摂取が即時型アレルギー反応に影響を及ぼし得るかどうかを調べるために、動物モデルとしてＰＣＡ反応を使用した。ＩＣＲマウスを水素水または対照水のいずれかで２〜４週間飼育し、その後にＰＣＡ試験に付した。実験期間を通して２つの群の間に、体重、飼料消費量および水分摂取量に関して有意な差はなかった。図１Ａに示すように、対照水で処置されたマウスと比較すると、水素水で２週間および４週間処置したマウスでは血液循環から皮膚へのエバンスブルー色素の漏出がほぼ完全に抑制されていた。ＩｇＥのみ（ＤＮＰ−ＢＳＡおよびエバンスブルー色素なし）を注射したマウスも対照として示す。即時型アレルギー反応における水素水の阻害効果を確認するために、皮膚から抽出したエバンスブルー色素を測定した（図１Ｂ）。水素水で２〜４週間マウスを処置すると、漏出する色素の量が、対照水で処置したマウスの約４０％にまで減少した（それぞれｐ<０．０５およびｐ<０．０１）。これらの結果は、水素水の経口摂取がI型アレルギー反応を改善することを示すものである。
【００４９】
水素水の経口摂取は、血清ヒスタミンレベルを減少させるが、８−ＯＨｄＧレベルは減少させない。
血清ヒスタミンレベルを肥満細胞活性化および急性全身アナフィラキシーのマーカーとして測定した。ＰＣＡ試験の結果（図１）と同じく、血清ヒスタミンレベルが、対照水で処置したマウスと比較して、水素水で４週間処置したマウスにおいて顕著に減少した（ｐ<０．０１）（図２Ａ）。水素水で２週間処置した場合には、ヒスタミンレベルは穏やかな減少を示したが、この減少は統計学的に有意ではなかった。水素がヒドロキシラジカルを除去できることが報告されているので（非特許文献２）、８−ＯＨｄＧ（酸化的ＤＮＡ損傷の感受性マーカー）の血清レベルにおける、水素水での処置の効果の評価を行った。しかしながら、水素水または対照水で２または４週間処置したマウスの間で血清レベルにおける差は見られなかった（図２Ｂ）。これらの血清分析は、水素水の経口摂取は急性の全身アナフィラキシーを軽減させるが、全身性の酸化ストレスには直接影響を及ぼさないことを示唆するものである。
【００５０】
水素水の経口摂取は、腹腔滲出細胞における肥満細胞数には影響を及ぼさない。
水素水の経口摂取によるＩ型アレルギー反応の阻害が、肥満細胞の総数の減少によって起こっている可能性もありうる。従って、水素水か対照水のどちらかを４週間自由に摂取させたマウスから得られた腹腔滲出細胞における肥満細胞の数を計測した。図３Ａおよび３Ｂに示すように、肥満細胞数は、水素水処置マウスおよび対照水処置マウスに由来する腹腔滲出細胞との間で差を示さなかった。これらの結果は、水素水の経口摂取が腹腔滲出細胞における肥満細胞数に影響を及ぼさないことを示唆するものである。
【００５１】
水素水の経口摂取は、肥満細胞におけるＴＮＦαの発現をｍＲＮＡレベルと蛋白質レベルの両方で減少させる。
腹腔滲出細胞における肥満細胞数は水素水処置により変化しなかったので、水素水処置が肥満細胞におけるアレルギー関連遺伝子の発現を変化させるかどうかを調べた。水素水または対照水のいずれかを４週間自由摂取させた後に、１群あたり６匹のマウスからプールした腹腔滲出細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離し、選択した遺伝子（ＦｃεＲＩα、ＣＤ４４、ＴＮＦαおよびＩＣＡＭ１）に関してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。図４Ａに示すように、水素水処置マウスにおけるＴＮＦα ｍＲＮＡの発現が、対照水処置マウス（ｐ<０．０１）におけるよりも有意に低下し、一方、ＦｃεＲＩα、ＣＤ４４およびＩＣＡＭ１に関しては大きな差は観察されなかった。同様の結果が、別に行った２つの独立した実験においても得られた。その後、細胞全溶解液を各個体の腹腔滲出細胞から調製し、ウエスタンブロット解析をＦｃεＲＩα、ＣＤ４４、ＴＮＦαおよびＩＣＡＭ１蛋白質に関して実施した。個々の動物間で多少のばらつきが観察されたが（図４Ｂ）、定量性デンシトメトリック解析では、水素水を摂取したマウスにおけるＴＮＦαの発現レベルが、対照水を摂取させたマウスと比較して有意に減少し（ｐ<０．０５）（図４Ｃ）、これはｑＲＴ−ＰＣＲの結果と一致した（図４Ａ）。しかしながら、他の蛋白質に関しては２群間で大きな差は見られなかった。これらの全てのデータを考慮すると、水素水の経口摂取が肥満細胞におけるＴＮＦαの発現をｍＲＮＡレベルおよび蛋白質レベルの両方で減少させるものと考えられる。
【００５２】
＜考察＞
今回、水素水の経口摂取がＩ型アレルギーを改善できることを、即時型アレルギー反応のｉｎ ｖｉｖｏ実験モデルとしてのＰＣＡを用いて実証した。気体形態にある水素や水素水の有益な効果が、種々の酸化ストレス関連疾患、例えば脳梗塞、心筋梗塞およびパーキンソン病に関して報告されているが（非特許文献２〜１１）、今回得られた結果は、アレルギー疾患における水素の予防効果を初めて実証するものである。
【００５３】
活性酸素種（ＲＯＳ：ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばスーパーオキサイド、過酸化水素およびヒドロキシルラジカルは、核酸、蛋白質および脂質への損傷を引き起こし、これらは細胞機能障害をもたらすものである。これらのうち、低レベルのスーパーオキサイドや過酸化水素は細胞の情報伝達を制御し、正常な細胞の機能において重要な役割を果たすが、一方、ヒドロキシルラジカルは極めて毒性であり、上記のような生理学的機能は知られていない。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、水素はヒドロキシルラジカルを減少させるが、スーパーオキサイドや過酸化水素は減少させない（非特許文献２）。水素のこのような選択的な捕捉特性は、他の非特異的抗酸化物質、例えばビタミンＣと比べて有利なものであると考えられる。しかしながら、水素水がマウスの脳切片においてスーパーオキサイドの形成を妨げることが最近報告されていることから（非特許文献１４）、水素は、ｉｎ ｖｉｖｏの一定の条件下でスーパーオキサイドとヒドロキシルラジカルの両方を減少させ得るものと考えることができる。ＲＯＳに対する水素の捕捉効果は、細胞や組織の状況によって異なるのかもしれない。
【００５４】
即時型アレルギー反応において、受容体に結合したＩｇＥと抗原との架橋による肥満細胞活性化は、ＲＯＳ、例えばスーパーオキサイドおよび過酸化水素の産生を誘導する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼにより起こると考えられるＲＯＳの産生、およびチロシンキナーゼおよびホスファチジルイノシトール‐３−キナーゼの活性化は、脱顆粒、サイトカイン産生およびロイコトリエン分泌を含む肥満細胞応答の制御において重要な役割を果たしている（非特許文献１５）。従って、水素が誘導するＰＣＡ反応の減弱（図１）および血清ヒスタミンレベルの抑制（図２）は、細胞内ＲＯＳレベルの減少によって引き起こされるであろう、肥満細胞における脱顆粒の阻害によるものであると考えられる。
【００５５】
水素水処置マウスの肥満細胞において起こっている分子レベルの事象を理解するべく、肥満細胞を冨化した腹腔滲出細胞を調製し、分析した。水素は容易に蒸発するが、調製手順が迅速且つ簡単なため、単離した腹腔滲出細胞はｉｎ ｖｉｖｏの条件を反映しているものと思われる。腹腔滲出細胞のトルイジンブルー染色により、肥満細胞数は水素水摂取マウスと対照水摂取マウスの間で相違しないことが示された（図３）。その後、アレルギー関連遺伝子（ＦｃεＲＩα、ＣＤ４４、ＴＮＦαおよびＩＣＡＭ１）の腹腔滲出細胞における発現レベルを調べたが、ｍＲＮＡレベルおよび蛋白質レベルの両方において、ＴＮＦαの発現レベルが、対照水を摂取させたマウスと比較して水素水を摂取したマウスにおいて有意に減少し、他の遺伝子の発現レベルは変わらなかった（図４）。肥満細胞の活性化により、予め蓄えられていたＴＮＦαが急速に放出され、引き続いて大量のＴＮＦαが合成され持続的に放出される（非特許文献１６）。従って、水素による前処置は、顆粒中に予め蓄えられるＴＮＦαのレベルを減少させることができ、そしておそらくは抗原チャレンジに応答したＴＮＦαの新規合成を阻害することもでき、これらがアレルギー反応の軽減に寄与するものであると考えられる。最近、過酸化水素がｐ３８およびストレス活性化プロテインキナーゼの活性化を介して、マクロファージ細胞におけるＴＮＦαの産生を誘導することが報告された（非特許文献１７）。水素は細胞内ＲＯＳレベルの減少を介してＴＮＦαの発現を阻害する可能性が高いのかもしれない。本発明者等の知る限りでは、これが、水素処置によって生じる遺伝子発現変化を実証した最初の報告である。
【００５６】
本発明者等の今回の発明は、水素水の経口摂取がＩ型アレルギー反応において予防効果を有すること、およびヒスタミン放出およびＴＮＦαの発現の抑制が上記反応の阻害作用を仲介することを示すものである。
【００５７】
＜図面の説明＞
図１：ＩＣＲマウスでのＰＣＡ反応における水素水経口摂取の効果
ＩＣＲマウスに、水素水または対照水を２または４週間自由に摂取させた。その後、抗ＤＮＰ−ＩｇＥ（１０μｇ）を背部の皮膚２箇所にそれぞれ注射した。２４時間後、１μｇ／μｌのＤＮＰ−ＢＳＡおよび１％のエバンスブルー色素を含む２００μｌのＰＢＳを尾静脈から静脈内に注射した。（Ａ）１時間後、マウスを屠殺し、背面の皮膚を剥がして撮影した。示した写真は、３つの独立した実験（それぞれ１群あたり６匹のマウスを含む）を表すものである。（Ｂ）写真を撮った後、抗ＤＮＰ−ＩｇＥを注射した皮膚領域（１ｃｍ×１ｃｍ）を採り、１ＮのＫＯＨに溶解し、その中のエバンスブルー色素の量を光学的に測定した。ＰＣＡ反応の阻害は、対照水摂取マウスにおけるエバンスブルー含有量に対してのパーセントとして表される。値は１群６匹の平均±ＳＤである。アスタリスクは統計学的に有意であることを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。対照：ＩｇＥは注射したが、ＤＮＰ−ＢＳＡおよびエバンスブルー色素は注射していないマウス。
【００５８】
図２：ＩＣＲマウスでの血清ヒスタミンおよび８−ＯＨｄＧレベルにおける水素水経口摂取の効果
水素水または対照水を２または４週間自由に摂取させた後に、ＩＣＲマウスの皮下に抗ＤＮＰ−ＩｇＥを注射し、引き続いて２４時間後にＤＮＰ−ＢＳＡおよびエバンスブルー色素の静脈注射を行った。１時間後、マウスを屠殺し、腹大動脈から血液サンプルを採取し、遠心分離により血清を分離した。血清ヒスタミンレベル（Ａ）および血清８−ＯＨｄＧレベル（Ｂ）を市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。値は１群６匹の平均±ＳＤである。アスタリスクは統計学的に有意であることを示す（＊ｐ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．：有意性なし）。
【００５９】
図３：ＩＣＲマウスから得られた腹腔滲出細胞中の肥満細胞数における水素水経口摂取の効果
ＩＣＲマウスに、水素水または対照水のいずれかを４週間自由に摂取させた。その後、５ｍｌのＣａ２＋不含Ｔｙｒｏｄｅバッファーを腹腔内に注射し、腹部を穏やかにマッサージした。腹水を回収した後、肥満細胞を冨化した腹腔滲出細胞を３１．５％ＢＳＡ（比重１．０７）−密度勾配遠心法によって調製した。腹腔滲出細胞をトルイジンブルーで３分間染色して、写真を撮り（Ａ）、そして肥満細胞数を顕微鏡下で計測した（Ｂ）。値は１群６匹の平均±ＳＤである。
【００６０】
図４：ＩＣＲマウスから得られた肥満細胞におけるアレルギー関連遺伝子の発現における水素水経口摂取の効果
水素水または対照水のいずれかを４週間自由に摂取させた後に、Ｃａ２＋不含Ｔｙｒｏｄｅバッファーを腹腔内に注射し、腹部を穏やかにマッサージした。腹水を回収して、３１．５％ＢＳＡ（比重１．０７）−密度勾配遠心法に付すことにより、肥満細胞を冨化した腹腔滲出細胞を単離した。（Ａ）ｔｏｔａｌ ＲＮＡを１群あたり６匹のマウスからプールした腹腔滲出細胞から単離し、アレルギー関連遺伝子（ＦｃεＲＩα、ＣＤ４４、ＴＮＦαおよびＩＣＡＭ１）および内部参照用遺伝子（β‐アクチン）に関するｑＲＴ−ＰＣＲに付した。アスタリスクは統計学的に有意であることを示す（＊＊ｐ＜０．０１）。値は３回の独立したｑＲＴ−ＰＣＲ反応の平均±ＳＤである。（ＢおよびＣ）細胞全溶解液を各腹腔滲出細胞から調製し、アレルギー関連蛋白質（ＦｃεＲＩα、ＣＤ４４、ＴＮＦαおよびＩＣＡＭ１）およびβ‐アクチンに関するウエスタンブロット解析に付し、引き続いて定量性デンシトメトリック解析を行った。値は各群における６匹の動物の平均±ＳＤである。アスタリスクは統計学的に有意であることを示す（＊ｐ＜０．０５）。値は１群６匹の平均±ＳＤである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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