(57)【要約】      （修正有）【課題】L-アミノ酸を効率よく生産する製造法を提供する。【解決手段】L-アミノ酸生産能を有し、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼの活性（コピー数）を増強するように、該酵素遺伝子の発現調節配列を改変された腸内細菌科に属する微生物（特にエシェリヒア属、Ｐａｎｔｏｅａ属細菌）を、グリセロールを炭素源として含む培地に培養し、L-アミノ酸（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，等）を生産する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ-アミノ酸生産能を有し、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼの活性を増強されるように改変された腸内細菌科に属する微生物を、グリセロールを炭素源として含む培地に培養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
前記グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより当該酵素の活性が増強された、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジハイドロキシアセトンキナーゼがATPをリン酸供与体とすることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造法。
【請求項４】
さらにグリセロールの取り込み活性が増強されるように改変された微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
さらにトリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ、フルクトース1,6-ビスフォスファターゼ、フルクトース-6-リン酸アルドラーゼからなる群より選択される１以上の酵素活性を増強されるように改変された微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
さらにグリセロールキナーゼ及び/または膜結合型グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を低下されるように改変された微生物である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の製造法。
【請求項７】
前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌またはパントエア属細菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項８】
前記L-アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、L-プロリン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-グルタミン及びＬ−ヒスチジンからなる群より選ばれる１種又は２種以上のL-アミノ酸である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増大するように改変された微生物などが用いられている。(特許文献１〜９）
【０００２】
一般的に微生物を用い、アミノ酸生産を行う際には、基質に糖質を主成分として用いているが、グリセロールも糖質と同様に基質として用いることが可能である。（特許文献１０、１１）
【０００３】
エシェリヒア・コリには複数のグリセロール代謝に関与する遺伝子が存在することが知られている。しかしながら、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子であるglpK、またはグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるglpDのいずれかを欠損させた変異株はグリセロールを単一C源とした培地では生育できないことから、E.coliの主要なグリセロール資化経路はグリセロールキナーゼとグリセロール-３-リン酸デヒドロゲナーゼにより担われていることが明らかとなっている。（非特許文献１）
【０００４】
E.coliのグリセロールデヒドロゲナーゼもまた、グリセロール代謝に関与する酵素のひとつであり、glpK、glpD、glpレギュロンのリプレッサーであるglpRの３遺伝子を欠損した変異株を用いたスクリーニングにおいて、グリセロールを単一C源とした培地での致死性を回復させることが知られている。（非特許文献２）
【０００５】
これまで、上述のようにグリセロール−３−リン酸を経由するグリセロールキナーゼとグリセロール-３-リン酸デヒドロゲナーゼが腸内細菌科に属する微生物の主要な資化経路と考えられており、ジハイドロキシアセトンを経由するグリセロール資化経路は、腸内細菌科に属する微生物のグリセロール資化には不必要な経路だと考えられていた。
【特許文献１】EP0643135B
【特許文献２】EP0733712B
【特許文献３】EP1477565A
【特許文献４】EP0796912A
【特許文献５】EP0837134A
【特許文献６】WO01/53459
【特許文献７】EP1170376A
【特許文献８】WO2005/010175
【特許文献９】WO96/17930
【特許文献１０】EP1715055A
【特許文献１１】EP1715056A
【非特許文献１】J. Bacteriol. 23 (2006)8259-8271
【非特許文献２】J. Bacteriol. 131 (1977)1026-1028
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来よりもさらに改良された、グリセロールを含む基質を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ジハイドロキシアセトンを経由するグリセロール資化経路の酵素であるグリセロールデヒドロゲナーゼ、ジハイドロキシアセトンキナーゼ単独の増強では効果はないが、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼを共に増強させることによって、グリセロールからのL-アミノ酸生産能が大幅に向上することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  Ｌ-アミノ酸生産能を有し、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼの活性を増強されるように改変された腸内細菌科に属する微生物を、グリセロールを炭素源として含む培地に培養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）  前記グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより当該酵素の活性が増強された、（１）に記載の方法。
（３）  前記ジハイドロキシアセトンキナーゼがATPをリン酸供与体とすることを特徴とする、（１）〜（２）に記載の製造法。
（４）  さらにグリセロールの取り込み活性が増強されるように改変された、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造法。
（５）  さらにトリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ、フルクトース1,6-ビスフォスファターゼ、フルクトース-6-リン酸アルドラーゼからなる群より選択される１以上の酵素活性を増強するように改変された微生物である（１）〜（４）に記載の製造法。
（６）  さらにグリセロールキナーゼ及び/または膜結合型グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を低下されるように改変された微生物である（１）〜（５）に記載の製造法。
（７）  前記腸内細菌に属する微生物が、エシェリヒア属細菌またはパントエア属細菌である、（１）〜（６）に記載の製造法。
（８）  前記L-アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、L-プロリン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-グルタミン及びＬ−ヒスチジンからなる群より選ばれる（１）〜（７）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物を用いることにより、効率よくグリセロールからL-アミノ酸を発酵生産できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物  
本発明の微生物は、L-アミノ酸生産能を有し、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼの活性を増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１１】
L-アミノ酸の種類は特に制限されないが、L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L−シトルリン等の塩基性アミノ酸、L-イソロイシン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-グリシン等の脂肪族アミノ酸、L-スレオニン、L-セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、L-プロリン等の環式アミノ酸、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン等の芳香族アミノ酸、L-システイン、L-シスチン、L-メチオニン等の含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、L-グルタミン、L-アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。本発明の微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１２】
本発明の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物を用いることができる。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。
【００１３】
本発明において、「グリセロールデヒドロゲナーゼ」とは、NADを補酵素としてグリセロールをジハイドロキシアセトンに変換する以下の酸化反応を可逆的に触媒する酵素を意味する（EC:1.1.1.6）。
Glycerol+NAD  ⇔Dihydroxyacetone＋NADH＋H+ 
【００１４】
本発明において「グリセロールデヒドロゲナーゼの活性が上昇するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのグリセロールデヒドロゲナーゼの分子の数が増大した場合や、グリセロールデヒドロゲナーゼの分子当たりの活性が向上した場合が該当する。また、野生株では検出できない酵素活性が、検出出来る程度に向上した場合も「活性が上昇した」に包含される。ここで本発明においては、グリセロールデヒドロゲナーゼの活性が検出できればいずれでもよいが、0.05U/mg以上、好ましくは0.25U/mg以上、さらに好ましくは0.5U/mg以上の酵素活性を有するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。グリセロールデヒドロゲナーゼ活性は、Ansis,R.Eらの方法を参考にして測定することができる。（(1953)J.Biol.Chem.2-3,153-159）
【００１５】
本発明において、「ジハイドロキシアセトンキナーゼ」とは、ジハイドロキシアセトンをジハイドロキシアセトンリン酸に変換する以下の反応を可逆的に触媒する酵素であり、ATPをリン酸供与体にするもの（EC 2.7.1.29）と、PEPをリン酸供与体とするもの（EC 2.7.1.29）がある。(Cell. Mol. Life Sci. 63 (2006) 890-900, Biochemistry. 43 (2004) 1337-13045）
ATP+Dihydroxyacetone = ADP + Dihydroxyacetone phosphate（EC 2.7.1.29）
Phosphoenolpyruvate+dihydroxyaceton=pyruvate+ Dihydroxyacetone phosphate
(EC2.7.1.29）
本発明では特にATPをリン酸供与体とするジハイドロキシアセトンキナーゼを用いることが好ましい。
【００１６】
「ジハイドロキシアセトンキナーゼの活性が上昇するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのジハイドロキシアセトンキナーゼの分子の数が増大した場合や、ジハイドロキシアセトンキナーゼの分子当たりの活性が向上した場合が該当する。また、野生株では検出できない酵素活性が、検出出来る程度に向上した場合も「活性が上昇した」に包含される。ジハイドロキシアセトンキナーゼの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。ジハイドロキシアセトンキナーゼ活性は、Johnson EA,らの方法を参考にして測定することができる。（J Bacteriol. 1984 Oct;160(1):55-60）
【００１７】
グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、gldA遺伝子が挙げられ、中でも腸内細菌科に属する微生物由来のgldA遺伝子を用いることが望ましい。
ここで、エシェリヒア・コリの遺伝子としては、例えば、配列番号１のgldA遺伝子(GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号4135955..4137058の相補鎖)が挙げられる。
【００１８】
さらに、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のホモログは、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属、シゲラ属、サルモネラ属、ビブリオ属、アエロモナス属、バチルス属、スタフィロコッカス属、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、サイクロバクター属、コリネバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。表１にエシェリヒア・コリのgldA遺伝子と相同性の高い、本発明においてグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子として利用できる遺伝子の例を示す。
【表１】
2010110217.tif 000002
【００１９】
アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin および AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やPearsonによるFASTA(MethodsEnzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【００２０】
本発明のジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子は、dhaKLM遺伝子、dak1遺伝子、dhaK遺伝子、dhbK遺伝子と命名されている遺伝子を利用することができる。ここで、PEPをリン酸供与体とする遺伝子として、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子が挙げられ、例えば、配列番号３４のdhaK遺伝子(GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号1248991..1250061の相補鎖)、配列番号３６のdhaL遺伝子（GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号1248348..1248980の相補鎖）、配列番号３８のdhaM遺伝子（GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号1246919..1248337の相補鎖）が挙げられる。
【００２１】
本発明においては、ATPをリン酸供与体とするジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子を使用することがより好ましく、ATPをリン酸供与体とするジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子として、酵母由来のdak1遺伝子、アグロバクテリウム属由来dhbK遺伝子、サイトロバクター属由来dhaK遺伝子を使用することが好ましい。
酵母由来のdak1遺伝子として、サッカロマイセス・セルビジエ由来の配列番号３のdak1遺伝子（Genbank Accession No NP_013641.1  GI:6323570）  が挙げられ、アグロバクテリウムのdhbK遺伝子としては、アグロバクテリウム・チュメファシエンス由来の配列番号５のdhbK遺伝子（Genbank Accession No. NP_357070.1  GI:15891398）が挙げられ、
、サイトロバクターの遺伝子dhaK遺伝子としては、サイクロバクター・フェレウンディ由来の配列番号７のdhaK遺伝子(Genbank Accession No.U09771)が挙げられる。
【００２２】
さらに、ジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子のホモログは、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属、シゲラ属、サルモネラ属、ビブリオ属、アエロモナス属、バチルス属、スタフィロコッカス属、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、アグロバクテリウム属、サイクロバクター属、マイコバクテリウム属等の細菌、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピキア属等の酵母等からクローニングされるものであってもよい。
【００２３】
特にATPをリン酸供与体とするジハイドロキシアセトンキナーゼは、以下の配列を用いることができる。表２にサッカロマイセス・セルビジエ由来のdak1遺伝子と相同性の高いジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子、表３にアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のdhbK遺伝子と相同性の高いジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子、表４にサイクロバクター・フェレウンディ由来のdhaK遺伝子と相同性の高いジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子を示す。
【表２】
2010110217.tif 000003
【表３】
2010110217.tif 000004
【表４】
2010110217.tif 000005
【００２４】
上記遺伝子のホモログとは、他の微生物由来または天然もしくは人工の変異型遺伝子で、上述の遺伝子群より選択される遺伝子と構造が高い類似性を示し、宿主に導入あるいは増幅した際にグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ活性を向上させる機能を有する遺伝子を意味する。グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子のホモログは、それぞれ配列番号２，４, ６または８、表１〜４に記載の配列のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有し、かつ、グリセロールデヒドロゲナーゼまたはジハイドロキシアセトンキナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードするものを意味する。なお、グリセロールデヒドロゲナーゼまたはジハイドロキシアセトンキナーゼ活性を有することは、これらの遺伝子を宿主細胞で発現させ、上述の酵素活性測定法により、非改変株と比べて酵素活性が上昇しているかどうかを調べることによって確認できる。また、ホモログであることは対応する野生型遺伝子の破壊株を作製し、破壊株に導入したときに野生型遺伝子の機能を相補しうるか、例えば、遺伝子破壊により低下した酵素活性が回復するかどうかを調べることによって確かめることができる。
【００２５】
また、本発明に用いるグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードするグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼの機能が損なわれない限り、配列番号２，４, ６または８のアミノ酸配列、表１〜４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「１または数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個を意味する。上記置換は保存的置換が好ましく、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等にはグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００２６】
またグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子は、それぞれ配列番号２，４, ６または８に示される塩基配列、表１〜４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２７】
本発明において「各酵素の細胞内の活性が増強される」とは、野生株（例えば、エシェリヒア・コリW3110,MG1655株）または親株（本発明において特定された酵素のすべての細胞内の活性が増強されていない株）に比べて、細胞内の酵素活性が上昇していることを意味し、野生株または親株が有していない酵素活性を有することも包含する。
【００２８】
細胞内の活性を増強する手段としては、下記の手段及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼを増強する手段は、（１）〜（５）のいずれを用いてもよいが、同じ手段でも、別の手段を用いてもよい。
（１）各タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを用いた形質転換によるコピー数の増加
（２）各タンパク質をコードする遺伝子の染色体上への組込みによるコピー数の増加
（３）各タンパク質をコードする遺伝子の発現調節領域の改変による発現量の増加
（４）発現調節に影響を与える因子の改変による発現量の増加
（５）各タンパク質をコードする遺伝子コード領域内の変異導入による酵素活性増大
（６）翻訳効率の向上によるタンパク量の増大  
以下、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子を目的遺伝子と呼ぶことがある。
【００２９】
（１）各タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを用いた形質転換によるコピー数の増加  
例えば、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。目的遺伝子は、エシェリヒア・コリや酵母、サイトロバクター、アグロバクテリウムの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、目的遺伝子を取得することができる。他の微生物の目的遺伝子も、それぞれその微生物において公知の目的遺伝子もしくは他種の微生物の目的遺伝子又は当該タンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００３０】
次に、PCR法により増幅された目的遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。
【００３１】
腸内細菌科に属する微生物の細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010（Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）, pBR322, pMW219、pMW119（pMWはニッポンジーン社より入手可）、pSTV28、pSTV29（宝バイオ社製）等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００３２】
これらの遺伝子を上記ベクターに連結して組み換えＤＮＡを調製するには、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００３３】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。また、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）を使用することもできる。
【００３４】
（２）各タンパク質をコードするDNAの染色体上への組込みによるコピー数の増加
一方、各酵素の細胞内の活性が増強することは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に導入することによりコピー数を増加させることによって達成できる。微生物の染色体DNA上に目的遺伝子を導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に導入することも可能である。また、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することにより、目的遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、P１ファージ等のファージを用いたtransductionや、接合伝達ベクターによる染色体上への目的遺伝子の導入も可能である。染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、これらの遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。コピー数が増幅されたことの確認は、目的遺伝子と相補的なプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションによって行うことができる。コピー数は、１コピー以上増幅されていればいずれでもよいが、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、２コピー以上、より好ましくは３コピー以上、さらに好ましくは５コピー以上増幅されていることが好ましく、ジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子は、２コピー以上、より好ましくは３コピー以上、さらに好ましくは５コピー以上増幅されていることが好ましい。また、宿主微生物が元来有さない遺伝子を導入する場合には、1コピー以上導入されていればいずれでもよい。
【００３５】
（３）各タンパク質をコードする遺伝子の発現調節領域の改変による発現量の増加
さらに、各酵素の細胞内の活性が増強することは、上述の目的遺伝子のコピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載された方法で、染色体DNA上またはプラスミド上のこれらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成できる。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーター、ｔｅｔプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。特に本発明においては、グリセロールデヒドロゲナーゼの増幅にはtacMプロモーター（配列番号１０）を使用することが好適である。また、エシェリヒア・コリのジハイドロキシアセトンキナーゼをコードするdhaK,dhaL,dhaMはオペロン構造をとっており、dhaK上流のプロモーターを強化することによって、3遺伝子とも発現量が向上する。
【００３６】
また、目的遺伝子のプロモーター領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変により目的遺伝子の発現が強化される。
【００３７】
染色体上のプロモーターを強いプロモーターと置換することは、PCR等で増幅した強いプロモーターを含むＤＮＡで腸内細菌科に属する微生物に形質転換し、強いプロモーターとゲノム上の野生型のプロモーター間で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子上流のプロモーターを強力なプロモーターに置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）と組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖上ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などが利用できる（Datsenko, K.A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000); 米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。  
【００３８】
（４）発現調節に影響を与える因子の改変による発現量の増加
発現調節に影響を与える因子の改変による発現量の増加は、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子の発現を上昇させるようなアクチベーターをコードする遺伝子を増幅、これらの遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターをコードする遺伝子を欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、ジハイドロキシアセトンキナーゼをコードするdhaKLMのアクチベーターとして、dhaR(配列番号65、GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号1250289..1252208)が挙げられ、dhaR遺伝子の変異によってジハイドロキシアセトンキナーゼをコードするdhaKLMの発現量が上昇する。（1: EMBO J. 2005 Jan 26;24(2):283-93）また、ptsI遺伝子（配列番号86 GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号2532088..2533815）の破壊によってもジハイドロキシアセトンキナーゼをコードするdhaKLMの発現量が上昇する。（Microbiology 147 (2001) 247-253）
【００３９】
（５）各タンパク質をコードする遺伝子のコード領域内の変異導入による酵素活性増大
さらに、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼの活性を増強するために、タンパク質の比活性が高くなるような、あるいは酵素の基質特異性が向上するような変異を目的遺伝子のコード領域内に変異を導入することによっても達成できる。
【００４０】
このような酵素をコードする遺伝子、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号１、３、５又は７の塩基配列、表１〜４に記載の塩基配列中のコード領域を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号１、３、５又は７の塩基配列、表１〜４に記載の塩基配列、又はこれらの塩基配列中のコード領域の配列をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えば腸内細菌科に属する微生物を、紫外線またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プローンPCR(Cadwell,R.C. PCR Meth. Appl. 2, 28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P. Nature 370, 389(1994))、StEP-PCR(Zhao,H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998))によって、遺伝子組換えにより人工的にグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子に変異を導入して活性の高いグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子を取得することが出来る。これらの変異型酵素がグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼをコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子をＬ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する微生物に導入し、グリセロールを炭素源とする培地で培養して、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上するかどうか、また上述の方法で酵素活性を測定することにより、確かめることができる。
【００４１】
（６）翻訳効率の向上によるタンパク量の増大  
目的とするタンパク質の翻訳効率を向上させ、タンパク量を増大させるには、宿主内の使用頻度の低いコドンに対応するtRNAを増加させることにより、また宿主内で使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように目的遺伝子を改変することによって達成できる。（(1989) Gene 85, 109-114, (1992) Biochemistry 31, 2598-2608.(1993) J. Bacteriol. 175, 716-722, Protein Expression and Purification 50 (2006) 49-57）目的とするタンパク質量が非改変株、野生株と比較して上昇していることの確認は、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る。（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。
【００４２】
本発明の製造法に使用する微生物は、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ増強に加えて、さらにグリセロールの取り込み活性が増強されるように改変された微生物でもよい。グリセロールの取り込み活性とは、グリセロールをCytoplasmに取り込む活性を意味し、膜タンパク質であるグリセロールファシリテーターが関与している。グリセロールファシリテーターをコードする遺伝子は、例えば、エシェリヒア・コリのglpF遺伝子 (配列番号１６：GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号4115268..4116113の相補鎖)が挙げられる。
【００４３】
グリセロールファシリテーターをコードする遺伝子は、配列番号１６の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールの取り込みの活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。また、配列番号１７のタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。また、腸内細菌科に属する微生物に導入したときに、グリセロールの取り込み能を上昇するものである限り、配列番号１７のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。
【００４４】
また、グリセロールの取り込み活性が損なわれない限り、配列番号１７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。活性は、上述のグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ増強と同様の方法により増強できる。
【００４５】
グリセロール取り込みの活性は、膜タンパクを介したトランスポートアッセイ法（Voegele, R. T., Sweet, G. D., and Boos, W. J. Bacteriol. 175:1087-1094 (1993)）を用いて測定することが出来る。
【００４６】
本発明の製造法に使用する微生物は、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ増強、グリセロールの取り込み活性が増強に加えて、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ、フルクトース1,6-ビスフォスファターゼ、フルクトース-6-リン酸-アルドラーゼからなる群より選択される1以上の酵素活性を増強するように改変された微生物でもよい。
【００４７】
トリオースリン酸イソメラーゼとは、ジハイドロキシアセトンリン酸をグリセロアルデヒド-３-リン酸に可逆的に変換する反応を触媒する酵素である。（EC:5.3.1.1）
Dihydroxyacetone phosphate =D-glyceraldehyde 3-phosphate
【００４８】
「トリオースリン酸イソメラーゼの活性が上昇するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのトリオースリン酸イソメラーゼの分子の数が増大した場合や、トリオースリン酸イソメラーゼの分子当たりの活性が向上した場合が該当する。トリオースリン酸イソメラーゼの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。
【００４９】
トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子として、エシェリヒア・コリ由来のtpiA遺伝子 (配列番号１８：GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号4108763..4109530の相補鎖)が挙げられる。
【００５０】
トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子は、配列番号１８の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。また、配列番号１９のタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。また、腸内細菌科に属する微生物に導入したときに、トリオースリン酸イソメラーゼ活性が上昇するものである限り、配列番号１９のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。
【００５１】
また、トリオースリン酸イソメラーゼ活性が損なわれない限り、配列番号１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
【００５２】
トリオースリン酸イソメラーゼの活性は、Andersen and Cooperの方法（FEBS Lett:4 19-20(1969)）を用いて測定することが出来る。活性は、上述のグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ増強と同様の方法により増強できる。
【００５３】
本発明において、「フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ」とは、ジハイドロキシアセトンリン酸とグリセロアルデヒド-３-リン酸から、D-フルクトース-1,6-ビスリン酸に変換する以下の反応を可逆的に触媒する酵素である。(EC:4.1.2.13)    
Dihydroxyacetone phosphate （glycerone phosphate）+ D-glyceraldehyde-
3-phosphate= D-fructose 1,6-bisphosphate 
【００５４】
「フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼの活性が上昇するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのフルクトースビスフォスフェートアルドラーゼの分子の数が増大した場合や、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼの分子当たりの活性が向上した場合が該当する。フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。
【００５５】
フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼをコードする遺伝子として、エシェリヒア・コリ由来のfbaA遺伝子 (配列番号２０：GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号3068187..3069266の相補鎖)とfbaB遺伝子（配列番号７２：GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号2175534..2176586の相補鎖）が挙げられる。
【００５６】
フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼをコードする遺伝子は、配列番号２０、７２の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。また、配列番号２１、７３のタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。また、腸内細菌科に属する微生物に導入したときに、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ活性上昇するものである限り、配列番号２１のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。
【００５７】
また、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ活性が損なわれない限り、配列番号２１、７３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
【００５８】
フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼの活性は、Richard&Rutterの方法（J.Biol.Chem.236,3177-3184）を用いて測定することが出来る。活性は、上述のグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ増強と同様の方法により増強できる。
【００５９】
フルクトース1,6-ビスフォスファターゼとは、D-フルクトース-1,6-ビスリン酸をD-フルクトース6-リン酸に変換する以下の反応を可逆的に触媒する酵素である。（EC: 3.1.3.11）
D-fructose 1,6-bisphosphate + H2O = D-fructose 6-phosphate +phosphate
【００６０】
「フルクトース1,6-ビスフォスファターゼの活性が上昇するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのフルクトース1,6-ビスフォスファターゼの分子の数が増大した場合や、フルクトース1,6-ビスフォスファターゼの分子当たりの活性が向上した場合が該当する。フルクトース1,6-ビスフォスファターゼの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。
【００６１】
フルクトース1,6-ビスフォスファターゼをコードする遺伝子として、エシェリヒア・コリ由来のglpX遺伝子 (配列番号２２：GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号4112592..4113602の相補鎖)、fbp遺伝子（配列番号８２：GenBank Accession No. NC_000913の塩基番号4452634..4453632）、ybhA遺伝子（配列番号８４：GenBank Accession No. NC_000913の塩基番号796836..7976554）が挙げられる。フルクトース1,6-ビスフォスファターゼをコードする遺伝子は、配列番号２２、８２、８４の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトース1,6-ビスフォスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。また、配列番号２３、８３、８５のタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。また、腸内細菌科に属する微生物に導入したときに、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ活性上昇するものである限り、配列番号２３、８３、８５のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。
【００６２】
また、フルクトース1,6-ビスフォスファターゼ活性が損なわれない限り、配列番号２３、８３、８５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
【００６３】
フルクトース1,6-ビスフォスファターゼの活性は、中島らの方法（蛋白質核酸酵素 22,1585-1589）を用いて測定することが出来る。活性は、上述のグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ増強と同様の方法により増強できる。
【００６４】
本発明において、「フルクトース-6-リン酸アルドラーゼ」とは、ジハイドロキシアセトンをフルクトース-6-リン酸に変換する以下の反応を可逆的に触媒する酵素である。
D-fructose-6-phosphate = dihydroxy-acetone + D-glyceraldehyde-3-phosphate
【００６５】
「フルクトース-6-リン酸アルドラーゼの活性が上昇するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのフルクトース-6-リン酸アルドラーゼの分子の数が増大した場合や、フルクトース-6-リン酸アルドラーゼの分子当たりの活性が向上した場合が該当する。フルクトース-6-リン酸アルドラーゼの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。
【００６６】
フルクトース-6-リン酸アルドラーゼをコードする遺伝子として、I型アルドラーゼをコードするエシェリヒア・コリ由来のfsaA遺伝子 (配列番号６８：GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号862865..863527)、II型アルドラーゼをコードするfsaB遺伝子（talC遺伝子）（配列番号70：GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号4137069..4137731の相補鎖）が挙げられる。
【００６７】
フルクトース-6-リン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、配列番号68、70の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトース-6-リン酸アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。また、配列番号６９、７１のタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。また、腸内細菌科に属する微生物に導入したときに、フルクトース-6-リン酸アルドラーゼ活性が上昇するものである限り、配列番号６９、７１のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。
【００６８】
また、フルクトース-6-リン酸アルドラーゼ活性が損なわれない限り、配列番号６９、７１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
【００６９】
フルクトース-6-リン酸アルドラーゼの活性は、Schurmann M, Sprenger GAらの方法（J Biol Chem. 2001 Apr 6;276(14):11055-61）を用いて測定することが出来る。活性は、上述のグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ増強と同様の方法により増強できる。
【００７０】
本発明の製造法に使用する微生物は、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ増強、グリセロールの取り込みの活性の増強、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ、フルクトース1,6-ビスフォスファターゼ、フルクトース-6-リン酸アルドラーゼからなる群より選択される1以上の酵素活性の増強に加えて、グリセロールキナーゼ及び/又は、膜結合型グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼの活性を低下するように改変することが好ましい。
【００７１】
本発明において「グリセロールキナーゼ」とは、グリセロールとATPからグリセロール3−リン酸とADPを生成する以下の反応を可逆的に触媒する酵素を意味する。（EC 2.7.1.30）      
ATP + glycerol = ADP + sn-glycerol 3-phosphate
「グリセロールキナーゼの活性が低下するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのグリセロールキナーゼの分子の数が減少した場合や、グリセロールキナーゼの分子当たりの活性が低下した場合が該当する。グリセロールキナーゼの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり70%以下、好ましくは50％以下、さらに望ましくは30％以下、最も好ましくは菌体当たり20%以下に低下するように改変されていることが好ましく、酵素活性を喪失させてもよい。酵素活性は、同酵素をコードする遺伝子の発現量を低下させることにより減少させることができる。遺伝子の発現量の低下には、同遺伝子から転写されるmRNAの転写量の低下、及び同mRNAの翻訳量の低下が含まれる。また、酵素タンパク質分子を全く生成させなくすること、あるいは酵素タンパク質の分子当たりの活性を低下又は喪失させることは、同酵素をコードする遺伝子を破壊することによって達成される。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。
【００７２】
グリセロールキナーゼをコードする遺伝子として、エシェリヒア・コリ由来のglpK遺伝子 (配列番号24：GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号4113737..4115245の相補鎖)が挙げられる。グリセロールキナーゼの酵素活性は、Thorner&Paulusの方法で測定することができる。（The Enzymes(3rd ed.)8,487-508）
【００７３】
本発明において、「膜結合型グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ」とは、グリセロール-3-リン酸からジハイドロキシアセトンリン酸の酸化反応を触媒する酵素であり、以下の反応を可逆的に触媒する酵素である。
Sn-glycerol-3P +ubiquinone = dihydroxyacseton-P+ ubiquinol（EC:1.1.99.5） 
【００７４】
「膜結合型のグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりの膜結合型のグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼの分子の数が減少した場合や、膜結合型のグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼゼの分子当たりの活性が低下した場合が該当する。膜結合型のグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり70%以下、好ましくは50％以下、さらに望ましくは菌体当たり30%以下に低下するように改変されていることが好ましく、酵素活性を喪失させてもよい。酵素活性は、同酵素をコードする遺伝子の発現量を低下させることにより減少させることができる。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。
【００７５】
膜結合型のグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼは、glpABCオペロン、glpD遺伝子によってコードされており、エシェリヒア・コリのglpA遺伝子としては配列番号26（GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号2350669..2352297)、glpB遺伝子としては、
配列番号28（GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号2352287..2353546）glpC遺伝子としては配列番号30（GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号2353543..2354733）、glpC遺伝子としては配列番号32（GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号3560036..3561541）が挙げられる。
【００７６】
上述のグリセロールキナーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ等の目的酵素の活性の低下は、
（１）目的酵素をコードする遺伝子のコード領域内の変異導入による酵素活性の低下または喪失
（２）目的酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を改変することによる酵素活性の低下または喪失
によって達成できる。
【００７７】
（１）目的酵素をコードする遺伝子のコード領域内の変異導入による酵素活性の低下または喪失
目的酵素をコードする遺伝子のコード領域内の変異導入は、遺伝子組換えにより、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによって、達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。またコード領域内の遺伝子の一部又は全部を欠損させることによっても達成できる。具体的には、配列番号24、26、28、30、32のDNAの一部に変異導入、あるいはDNAの一部・あるいは全部を欠失することによって達成できる。
【００７８】
これらの変異導入は、コード領域が欠失また変異が導入された変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を変異型遺伝子と置換すること、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００７９】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する微生物に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）と組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖上ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（Datsenko, K.A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000); 米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。また、酵素活性の低下または喪失は、Ｘ線もしくは紫外線を照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の変異処理によって、目的遺伝子のコード領域内に変異を導入する改変であってもよい。
【００８０】
（２）目的酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を改変することによる酵素活性の低下または喪失
目的酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を改変することによる酵素活性の低下または喪失は、染色体DNA上のプロモーター、SD配列等の発現調節配列に変異を導入し、発現量を低下させること、これらの遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターをコードする遺伝子を増幅、これらの遺伝子の発現を向上させるようなアクチベーターをコードする遺伝子を欠失または弱化させることによっても達成される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。特にglpA,B,C遺伝子はオペロン構造をとっているので、glpAの上流のプロモーター領域等の発現調節領域に変異を導入することによって、発現量を低下させることが出来る。
＜２＞本発明の製造方法  
本発明の方法は、上述の腸内細菌科に属し、L-アミノ酸生産能を有する細菌を、グリセロールを培地中に含む培地に培養し、培地中または菌体内にL-アミノ酸を生成蓄積させ、該培地または菌体からL-アミノ酸を採取することを特徴とするL-アミノ酸の製造法である。ここで本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができ、培地中のグリセロールは初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよいし、これらの両方に含まれていてもよい。
【００８１】
ここで、本発明において上記流加培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また連続培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加するとともに容器から培地（通常、流加する培地と等量）を抜き取る方法をいう。また、初発培地とは、流加培養または連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地（培養開始時の培地）のことを意味し、流加培地とは流加培養または連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地を意味する。また、回分培養（batch培養）とは、一回毎に新たな培地を用意し、そこへ株を植えて収穫まで培地を加えない方法を意味する。
【００８２】
本発明の培地に含まれるグリセロールは、単独の炭素源であってもよいし、グリセロールに加え、他の炭素源を添加した混合培地を用いてもよい。好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。混合培地を用いる場合、培地中のグリセロールの比率は50％以上、60％以上、望ましくは70％以上、さらに望ましくは80％以上、特に望ましくは90％以上含まれていることが望ましい。特にグリセロールは、バイオディーゼルの副生物として得られるものを利用することが好ましい。（Mu Y, et al, Biotechnol Lett., 28, 1755-91759 (2006), Haas MJ,et al; Bioresour Technol. 97, 4, 671-8678 (2006)）
【００８３】
培地中にその他に添加する成分としては、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。
【００８４】
本発明の培地には、炭素源、窒素源、硫黄の他にリン酸源、硫黄源を含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【００８５】
また、培地には、炭素源、窒素源、硫黄の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【００８６】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ−リジン生産菌は、後述のようにＬ−リジン生合成経路が強化されており、Ｌ−リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。
【００８７】
初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、硫黄濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００８８】
培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−アミノ酸が蓄積される。蓄積されるＬ−アミノ酸の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。
【００８９】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から遠心分離等によって菌体を除去した後に、濃縮晶析することによって採取される。
【００９０】
本発明においては、Ｌ−アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
【００９１】
本発明において、流加培養あるいは、連続培養を行う際には、一時的にグリセロールまたはその他の炭素源の流加が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。
【００９２】
流加培養に用いられる流加培地は、グリセロールまたはその他の炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましく、発酵培地中のグリセロール濃度、その他の炭素源の濃度が一定以下になるように制御してもよい  その他の炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトースが好ましく、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。またリン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。また、流加培地は１種でもよく、２種以上の培地を混合してもよい。２種以上の流加培地を用いる場合、それらの培地は混合して１つのフィード缶により流加させてもよいし、複数のフィード缶で流加させてもよい。
【００９３】
本発明で連続培養法を用いる場合には、引き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一部引き抜いたあとで流加を行ってもよい。また培養液をＬ−アミノ酸と細胞を含んだまま引き抜いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用する連続培養法でもよい（フランス特許2669935号明細書参照）。連続的あるいは間欠的に栄養源を流加する方法は流加培養と同様の方法が用いられる。
【００９４】
菌体を再利用する連続培養法とは、予定したアミノ酸濃度に達したときに、発酵培地を間欠的にあるいは連続して引き抜き、Ｌ−アミノ酸のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させる方法であり、例えばフランス特許2669935号明細書を参照にして実施することができる。
【００９５】
ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したＬ−アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ−アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を流加して培養を行うとよい。また、添加する培地の量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同量になるように設定することが好ましい。ここで同量とは、引き抜く前の培養液量と９３〜１０７％の程度の量を意味する。
【００９６】
培養液を連続的に引き抜く場合には、栄養培地を流加させると同時に、あるいは流加させたあとに引き抜きを開始することが望ましく、例えば引き抜きの開始時間としては流加を始めてから5時間以内、望ましくは3時間以内、さらに望ましくは1時間以内である。また引き抜く培養液量としては、流加させる量と同量で引き抜くことが好ましい。
＜３＞本発明の微生物の親株として用いられる微生物
本発明においては、腸内細菌科に属し、グリセロールを炭素源として代謝することが可能なＬ−アミノ酸生産能を有する細菌を親株として使用し、上述のような方法で本発明の性質を付与することができる。
【００９７】
ここで、腸内細菌科細菌は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、エルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。
【００９８】
エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。本発明において使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（E. coli）が挙げられるが、これに限定されない。
【００９９】
本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、Bachmannらの著書のTable 1（Bachmann, B. J. 1996. p. 2460-2488. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【０１００】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所  12301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. 43: 162-173)。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【０１０１】
本発明において、L-アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、Ｌ−アミノ酸を生産し、培地中に分泌する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とするＬ−アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積させることができる細菌をいう。Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンを含む。特に、Ｌ−スレオニン及びＬ−リジンが好ましい。
本発明の親株においては、グリセロールを資化できるものである限り、これまでに報告されたL-アミノ酸生産菌を使用できる。
以下、本発明の方法において使用することのできる各Ｌ−アミノ酸生産菌について説明する。
【０１０２】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【０１０４】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。
【０１０５】
好ましくは、本発明に用いる細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
−スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
−ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
−スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
−推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
−アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
−アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【０１０６】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【０１０７】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【０１０８】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【０１０９】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T. J., Arnheim, N., and Erlich, H. A. 1989. Trends Genet. 5: 185-189参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【０１１０】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【０１１１】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びE. coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【０１１２】
WC196株は、E. coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【０１１３】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大している株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子(dapA)、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)及びアスパルターゼ遺伝子(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(gdhA)(Gene23:199-209(1983))または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。なお、カッコ内は、その遺伝子の略記号である。
【０１１４】
エシェリヒア・コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型アスパルトキナーゼはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA遺伝子及びlysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。
【０１１５】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【０１１６】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。RSFD80で形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【０１１７】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。ここで、リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい。（国際公開第WO2006/038695号パンフレット）
【０１１８】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coli株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【０１２１】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【０１２３】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【０１２４】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【０１２５】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレートシンターゼ(gltA)、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。
【０１２６】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
【０１２７】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【０１２８】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【０１２９】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【０１３０】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【０１３１】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の例としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株としては、Pantoea ananatis AJ13356(米国特許第6,331,419号)がある。Pantoea ananatis AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。Pantoea ananatis AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、Enterobacter agglomeransと同定され、Enterobacter agglomerans AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、Pantoea ananatisに再分類された。AJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。
【０１３２】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【０１３３】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【０１３４】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【０１３５】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【０１３６】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【０１３８】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【０１３９】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【０１４１】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【０１４２】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【実施例】
【０１４３】
［実施例１］グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ活性を増強したＬ−リジン生産菌の構築
＜１−1＞  dak1遺伝子発現用プラスミドの構築
サッカロマイセス・セルビジエの染色体の全塩基配列は既に明らかにされている(Science 25 (1996))。この文献に報告されているdak1遺伝子の塩基配列に基づいて、５’側プライマーとして配列番号14の合成オリゴヌクレオチド、3’側プライマーとして配列番号15に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いて、サッカロマイセス・セルビジエJCM7255株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行った。精製したPCR産物を、HindIII, SalIで消化したベクターpMW119（タカラバイオ社製）に連結して、dak1発現用プラスミドpMW-dak1を構築した。なお、JCM7255は、埼玉県和光市広沢２−１（独立行政法人）理化学研究所「微生物系統保存施設」に保管されている菌株である。
＜１−2＞  グリセロールデヒドロゲナーゼ活性向上株の構築
配列番号10に示す構造を有するWC196ΔcadAΔldcC株を構築した。この構造を有する株の構築には、配列番号9で示す配列（PCR産物）を用いた。配列番号9に示される配列において、
塩基番号１番目から７２番目までが、λファージのattR配列、配列番号324番目から983番目までがクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）、塩基配列1540番目から1653番目までが、λファージのattL配列、塩基番号1654番目から1733番目までが、tacMプロモーターである。
なお、tacMプロモーターは、tacプロモーター（Gene 25 (2-3), 167-178 (1983)）のー35領域のTTGACA配列をTTCACAに置換することで構築することができる。
配列番号９の配列は、pMW118-attL-Cm-attR(WO2005/010175)を参考に構築することが可能である。 
【０１４４】
配列番号９の配列を鋳型として、配列番号１２と配列番号１３に示すプライマーを用いたPCRにより増幅し、この増幅産物をλ−RED法(WO2005/010175)により染色体上に挿入し、gldA上流のプロモーター配列が置換した株を取得した。これによって、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性が向上した株WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm株を得た。
【０１４５】
＜１−３＞グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ活性を増強したL-リジン生産菌の構築
WC196ΔcadAΔldcC株（国際公開第WO2006/038695号パンフレット参照）、WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm株をdapA、dapB及びLysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC /pCABD2株、WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm/pCABD2を得た。さらに、WC196ΔcadAΔldcC /pCABD2株、WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm/pCABD2株をdak1発現用プラスミドpMW-dak1で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC /pCABD2, pMW-dak1株、WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm/pCABD2, pMW-dak1株を得た。
【０１４６】
これらの株を20mg/Lのストレプトマイシンまたは、20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを含むＬ培地にて終ＯＤ600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
［実施例２］グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ活性を強化したＬ−リジン生産菌の評価
【０１４７】
上記グリセロールストックを融解し、各100μLを、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500mL坂口フラスコの、20mg/Lのストレプトマイシンまたは、20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間培養した。培養後、培地中に蓄積したリジンの量を公知の方法（サクラ精機  バイオテックアナライザーAS210）により測定した。
【０１４８】
2010110217.tif 000006
KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ（但しグリセロール及びMgSO４・7H２Oは別殺）
局方CaCO３   30g/L（180℃で２時間乾熱滅菌したもの）を入れる。
抗生物質として、20mg/Lのストレプトマイシンまたは、20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを添加した。培養は、温度３７℃、攪拌115rpmの条件下で48時間行った。
【０１４９】
結果を表4に示す（ODは吸光度660nmで26倍希釈した菌体量、Lys(g/L)はフラスコに蓄積したＬ−リジン蓄積量、yield(%)は基質からのＬ−リジン収率を示す）。
グリセロールデヒドロゲナーゼを単独強化した株、ジハイドロキシアセトンキナーゼを単独強化した株は、非改変株と比べ、収率、生産性ともに変わらなかったが、グリセロールデヒドロゲナーゼとATPをリン酸供与体とするジハイドロキシアセトンキナーゼをともに強化しているWC196ΔcadAΔldcCCPtacMgldA::Cm/pCABD2, pMW-dak1株のみが、他株と比較して多量のL-リジンを蓄積した。
【表５】
2010110217.tif 000007
［実施例３］グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼを強化したスレオニン生産株の評価
（１）エシェリヒア・コリのスレオニン生産株B3996、B5318からのグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼを強化株の構築
【０１５０】
スレオニン生産菌B3996株、B5318株からのグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ強化株の構築は、実施例１と同様の方法で構築することができる。
【０１５１】
（２）エシェリヒア・コリのスレオニン生産株B3996、B3996グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ強化株のＬ−スレオニン生産能の評価
B3996、B3996由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼ強化株を、下記のようにして培養した後、培養液のＬ−スレオニンを定量し、対照の非増幅株と比べてスレオニン収率が高いことを示すことができる。
【０１５２】
（培地）
グルコース 40.0 g/l (A), K２HPO４ 0.7 g/l (B), Thiamine HCl 0.2mg/l (C), MgSO４・7aq 1.0 g/l (D), (NH４) ２SO４ 16.0 g/l (D), FeSO４・7aq 0.01 g/l (D), MnSO４・5aq 0.01 g/l,イーストエキストラクト2.0 g/l (D), L-イソロイシン0.05 g/l (D)。A, B, Dは、それぞれKOHでpH7.0にあわせ、別々に殺菌 (115℃，10分オートクレーブ) した後混合し、フィルター滅菌した(C) を添加する。
【０１５３】
（培養方法）
LB培地で一晩培養した培養液1 mlを、20 mlの上記培地に植菌し、500 ml坂口フラスコにて37℃で振とう培養する。
【０１５４】
（分析方法）
培養液を15,000rpmで５分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈し、アミノ酸アナライザーL-8500で測定する。
〔配列表の説明〕
配列番号１：エシェリヒア・コリのgldA遺伝子配列(1104bp)
配列番号２：エシェリヒア・コリのGldAアミノ酸配列(367AA)
配列番号３：サッカロマイセス・セレビジエのdakA1遺伝子配列(1755bp)  
配列番号４：サッカロマイセス・セレビジエのDakAアミノ酸配列(584AA)  
配列番号５：Agrobacterium tumefaciensのdhbK1遺伝子配列(1695bp)
配列番号６：Agrobacterium tumefaciensのDhbk1アミノ酸配列(564AA)
配列番号７：Cytrobacter freundiiのdhaK遺伝子配列(1659bp)
配列番号８：Cytrobacter freundiiのDhaKアミノ酸配列(552AA)
配列番号９：attR-cat-attL-ptacM-SD-spacer配列(1740bp)
配列番号１０：tacMプロモーター(80bp)
配列番号１１：PtacMgld::Cm配列
配列番号１２： atL-Ptac-gldA(gldA染色体上強化用PCRプライマー)  
配列番号１３： atR-Ptac-fsaB1  (gldA染色体上強化用PCRプライマー)  
配列番号１４： pMW-dak1F（dakAクローニング用プライマー）   
配列番号１５： pMW-dak1R（dakAクローニング用プライマー）      
配列番号１６：エシェリヒア・コリのglpF遺伝子配列(846bp)
配列番号１７：エシェリヒア・コリのGlpFアミノ酸配列(281AA)
配列番号１８：エシェリヒア・コリのtpi遺伝子配列(768bp)
配列番号１９：エシェリヒア・コリのTpiアミノ酸配列(255AA)
配列番号２０：エシェリヒア・コリのfbaA遺伝子配列(1080bp)
配列番号２１：エシェリヒア・コリのFbaAアミノ酸配列(359AA)
配列番号２２：エシェリヒア・コリのglpX遺伝子配列(1011bp)
配列番号２３：エシェリヒア・コリのGlpXアミノ酸配列(336AA)  
配列番号２４：エシェリヒア・コリのglpK遺伝子配列(1509bp)
配列番号２５：エシェリヒア・コリのGlpKアミノ酸配列(502AA)
配列番号２６：エシェリヒア・コリのglpA遺伝子配列(1629bp)
配列番号２７：エシェリヒア・コリのGlpAアミノ酸配列(542AA) 
配列番号２８：エシェリヒア・コリのglpB遺伝子配列(1260bp)
配列番号２９：エシェリヒア・コリのGlpBアミノ酸配列(419AA)
配列番号３０：エシェリヒア・コリのglpC遺伝子配列(1191bp)
配列番号３１：エシェリヒア・コリのGlpCアミノ酸配列(396AA)
配列番号３２：エシェリヒア・コリのglpD遺伝子配列(1506bp)
配列番号３３：エシェリヒア・コリのGlpDアミノ酸配列(501AA)
配列番号３４：エシェリヒア・コリのdhaK遺伝子配列(1071bp)
配列番号３５：エシェリヒア・コリのDhaKアミノ酸配列(356AA)
配列番号３６：エシェリヒア・コリのdhaL遺伝子配列(633bp)
配列番号３７：エシェリヒア・コリのDhaLアミノ酸配列(210AA)
配列番号３８：エシェリヒア・コリのdhaM遺伝子配列(1419bp)
配列番号３９；エシェリヒア・コリのDhaMアミノ酸配列(472AA)
配列番号４０：Schizosaccharomyces pombeのジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1776bp)
配列番号４１：Schizosaccharomyces pombeのジハイドロキシアセトンキナーゼ(591AA)
配列番号４２：Pichia angustaのジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1830bp)
配列番号４３：Pichia angustaのジハイドロキシアセトンキナーゼ(609AA) 
配列番号４４：Pichia pastorisのジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1827bp)
配列番号４５：Pichia pastorisのジハイドロキシアセトンキナーゼ（608AA）
配列番号４６：Debaryomyces hansenii のジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1824bp)
配列番号４７：Debaryomyces hansenii のジハイドロキシアセトンキナーゼ(607AA)
配列番号４８：Escherichia blattaeのジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1752bp)
配列番号４９：Escherichia blattaeのジハイドロキシアセトンキナーゼ(583AA)
配列番号５０：Enterobacter sp. 638のジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1647bp)
配列番号５１：Enterobacter sp. 638のジハイドロキシアセトンキナーゼ(548AA)
配列番号５２：Psychromonas sp. CNPT3のジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1695bp)
配列番号５３：Psychromonas sp. CNPT3のジハイドロキシアセトンキナーゼ(564AA)
配列番号５４：Stappia aggregata のジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1647bp)
配列番号５５：Stappia aggregata のジハイドロキシアセトンキナーゼ(548AA)
配列番号５６：Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841のジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1641bp)
配列番号５７：Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841のジハイドロキシアセトンキナーゼ(546AA)
配列番号５８：Myxococcus xanthus DK 1622のジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1701bp)
配列番号５９：Myxococcus xanthus DK 1622のジハイドロキシアセトンキナーゼ(566AA)
配列番号６０：Burkholderia sp. 383のジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1701bp)
配列番号６１：Burkholderia sp. 383のジハイドロキシアセトンキナーゼ(566AA)
配列番号６２：Burkholderia thailandensis E264のジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1704bp)
配列番号６３：Burkholderia thailandensis E264のジハイドロキシアセトンキナーゼ(567AA)
配列番号６４：Burkholderia multivorans ATCC 17616のジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(1851bp)
配列番号６５：Burkholderia multivorans ATCC 17616のジハイドロキシアセトンキナーゼ
(616AA) 
配列番号６６：エシェリヒア・コリのdhaR遺伝子(1920bp)
配列番号６７：エシェリヒア・コリのDhaRアミノ酸配列(639AA)
配列番号６８：エシェリヒア・コリのfsaA遺伝子(663bp)
配列番号６９：エシェリヒア・コリのFsaAアミノ酸配列(220AA)
配列番号７０：エシェリヒア・コリのfsaB遺伝子(663bp)
配列番号７１：エシェリヒア・コリのFsaBアミノ酸配列(220AA)  
配列番号７２：エシェリヒア・コリのfbaB遺伝子(1053bp)  
配列番号７３：エシェリヒア・コリのFbaBアミノ酸配列(350AA)   
配列番号７４： Shigella dysenteriae Sd197のgldA遺伝子(1143bp)
配列番号７５：Shigella dysenteriae Sd197のGldAアミノ酸配列(380AA)  
配列番号７６：Salmonella typhimurium LT2のgldA遺伝子(1104bp)
配列番号７７：Salmonella typhimurium LT2のGldAアミノ酸配列(367AA)  
配列番号７８：Pseudomonas putidaのgldA遺伝子(1098bp)
配列番号７９：Pseudomonas putidaのGldAアミノ酸配列(365AA)
配列番号８０：Bacillus coagulans36D1のgldA遺伝子（1104bp）
配列番号８１；Bacillus coagulans36D1のGldAアミノ酸配列(367AA)   
配列番号８２；エシェリヒア・コリのfbp遺伝子（999bp）
配列番号８３：エシェリヒア・コリのFbpアミノ酸配列(322AA)
配列番号８４：エシェリヒア・コリのybhA遺伝子(819bp)
配列番号８５：エシェリヒア・コリのYbhAアミノ酸配列(272AA)
配列番号８６：エシェリヒア・コリのptsI遺伝子(1782bp)
配列番号８７：エシェリヒア・コリのPtsIアミノ酸配列(575AA)
【配列表】
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