(57)【要約】【課題】補因子が結合した標的分子を鋳型分子として合成した分子インプリントポリマーにおいて、分子インプリントポリマーと補因子との結合および解離に煩雑な作業を必要とせず、その場で簡便かつ容易に、穏やかな条件で行うことができる分子インプリントポリマーを提供する。【解決手段】補因子が結合した標的分子を鋳型分子として合成された分子インプリントポリマーの鋳型分子インプリント部位に、補因子と非共有結合可能な官能基を少なくとも１個有する分子インプリントポリマーは、官能基と標的分子とが補因子を介して結合することができ、官能基と補因子との結合を容易に解離することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子インプリントポリマーの鋳型分子インプリント部位に、標的分子の補因子と非共有結合可能な官能基を少なくとも１個有し、該官能基に非共有結合した前記補因子を介して標的分子を捕捉することを特徴とする分子インプリントポリマー。
【請求項２】
前記補因子が、標的分子と非共有結合することを特徴とする請求項１に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項３】
前記官能基を２個以上有することを特徴とする請求項１または２に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項４】
２種類以上の前記官能基を有することを特徴とする請求項３に記載の分子インプリントポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子インプリントポリマーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標的分子を特異的に認識できる人工レセプター合成法の１つとして、モレキュラーインプリンティング法（以下「ＭＩ法」ともいう。）が知られている。ＭＩ法とは、認識対象である分子（標的分子）を鋳型として、その標的分子に選択性のある結合部位を人工的に材料中に構築する方法である。ＭＩ法を用いて合成されるポリマーは分子インプリントポリマー（以下「ＭＩＰ」ともいう。）と呼ばれる。ＭＩＰは、鋳型分子（標的分子あるいはその誘導体）と機能性モノマー（鋳型分子に対して特異的に相互作用する部位とビニル基などの重合可能な官能基とを持つ分子）とを架橋剤とともにラジカル重合させ、鋳型分子をポリマー内から除去することによって構築される（非特許文献１）。この方法の利点は特別な分子設計をすることなく、簡単な操作で高い選択性と親和性を持つ架橋性高分子が合成でき、かつその高分子が天然の高分子が苦手とする領域である有機溶媒中や、酸や塩基中においてもその機能を発現できる点である。
【０００３】
本発明者は、補因子が結合した標的分子を鋳型分子としてＭＩ法により合成したＭＩＰを用いて、補因子によるＭＩＰと標的分子との結合調節について研究を進め、鋳型分子インプリント部位（標的分子結合部位）に補因子が共有結合したＭＩＰの評価について報告している（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】蒲池幹治、遠藤剛監修者、『ラジカル重合ハンドブック』（1999）エヌティーエス
【非特許文献２】Toshifumi Takeuchi, “MOLECULARLY IMPRINYED COFACTOR-COUPLED BINDING SITES” 5th International Workshop on Molecular Imprinting, Abstract IL1.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献２によれば、鋳型分子インプリント部位に補因子を共有結合させることにより、高い選択性で標的分子と結合できる安定な標的分子結合部位を構築することができる。しかしながら、ＭＩＰに補因子を共有結合させる作業が必要であり、また、ＭＩＰから補因子が結合した標的分子を取り外す際もＭＩＰと補因子との共有結合を切断する作業が必要である。このため、補因子の着脱が容易でないという問題があった。さらに共有結合切断の反応条件によっては、ＭＩＰにダメージを与えるという問題があった。
そこで本発明は、ＭＩＰと補因子との着脱に煩雑な作業を必要とせず、その場で、簡便かつ容易に、穏やかな条件で補因子の着脱を行うことができるＭＩＰを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の［１］〜［４］を包含する。
［１］分子インプリントポリマーの鋳型分子インプリント部位に、標的分子の補因子と非共有結合可能な官能基を少なくとも１個有し、該官能基に非共有結合した前記補因子を介して標的分子を捕捉することを特徴とする分子インプリントポリマー。
［２］前記補因子が、標的分子と非共有結合することを特徴とする前記［１］に記載の分子インプリントポリマー。
［３］前記官能基を２個以上有することを特徴とする前記［１］または［２］に記載の分子インプリントポリマー。
［４］２種類以上の前記官能基を有することを特徴とする前記［３］に記載の分子インプリントポリマー。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、分子インプリントポリマーと補因子との着脱に煩雑な作業を必要とせず、その場で、簡便かつ容易に、穏やかな条件で補因子の着脱を行うことができる分子インプリントポリマーを提供することができる。それゆえ、本発明の分子インプリントポリマーは、標的分子のセンシング素材や標的分子の分離および回収のための素材として高い有用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本願の実施例１で合成したＩＰ（ＳＯ３Ｈ）について各エチレンジアミン濃度におけるＢＰＡ結合量を評価した結果を示す図である。
【図２】本願の実施例１で合成したＩＰ（ＳＯ３Ｈ）について標的分子選択性を評価した結果を示す図である。
【図３】本願の実施例１で合成したＩＰ（ＳＯ３Ｈ）について各種ジアミンを用いた場合におけるＢＰＡ結合量を評価した結果を示す図である。
【図４】エチレンジアミンを介したＩＰ（ＳＯ３Ｈ）とＢＰＡとの結合に対して、ｎ−プロピルアミンの添加が及ぼす影響を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔分子インプリントポリマー〕
本発明の分子インプリントポリマーは、鋳型分子インプリント部位に標的分子の補因子と非共有結合可能な官能基を少なくとも１個有し、該官能基に非共有結合した補因子を介して標的分子を捕捉可能なものであればよい。
【００１０】
標的分子は特に限定されず、薬剤等の低分子化合物からタンパク質などの高分子化合物まで広範囲の分子を標的分子とすることができる。具体的には、例えば除草剤、薬物、殺虫剤、タンパク質、ペプチド、コレステロール、染料、炭水化物などが挙げられる。好ましい標的分子としては、生体分子が挙げられる。生体分子は生物中に存在する分子であればよい。生体分子を標的分子とすることにより、病気の診断、臨床検査、生物学の基礎研究などに利用可能な分子インプリントポリマーを提供することができる。
【００１１】
補因子は標的分子とインプリントポリマーの両方に結合可能な官能基をもつ物質であればよく、特に限定されない。具体的には、例えば、インプリントポリマーの結合部位が酸性官能基の場合は塩基性官能基をもつ補因子、結合部位が塩基性の場合は酸性官能基を持つ補因子、標的分子が酸性官能基をもつ場合は塩基性補因子、塩基性の官能基をもつ場合には酸性補因子を用いる。
【００１２】
補因子と非共有結合可能な官能基としては特に限定されず、酸性官能基であっても塩基性官能基であってもよい。好ましい官能基としては、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、ホウ酸基、アミノ基、ピリジル基、イミダゾール基、ヒドラジン基、グアニジン基およびそれらの誘導体などが挙げられる。非共有結合としては、水素結合、イオン結合、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。
【００１３】
本発明の分子インプリントポリマーを、補因子の存在下で標的分子と接触させることにより、当該分子インプリントポリマーに標的分子を捕捉することができる。このとき、分子インプリントポリマーの鋳型分子インプリント部位（標的分子認識部位）に存在する官能基には補因子が非共有結合し、さらに補因子と標的分子とが結合することで、標的分子は分子インプリントポリマーに捕捉される。つまり、標的分子は、分子インプリントポリマーと直接結合するのではなく、補因子を介して分子インプリントポリマーに捕捉される。したがって、「補因子を介して標的分子を捕捉する」とは、分子インプリントポリマーと標的分子とが直接結合していない状態を意味するものである。なお、標的分子は鋳型分子として用いた分子に限定されない。本発明の分子インプリントポリマーでは、補因子を種々変更することにより、異なる標的分子を捕捉することが可能となる。また、補因子を変更することにより、標的分子に対する結合力を調整することが可能となる。
【００１４】
本発明の分子インプリントポリマーは、鋳型分子インプリント部位に少なくとも１個の補因子と非共有結合可能な官能基を有していればよいが、２個以上有していることが好ましい。当該官能基を２個以上有することにより、標的分子の分子形状をより正確に認識することが可能となる。また、補因子と非共有結合可能な官能基を２個以上有する場合、２種類以上の官能基を用いることができる。２種類以上の官能基を用いることにより、２種類以上の補因子を使用することが可能となり、標的分子の範囲が広がるとともに認識能力も向上する。
【００１５】
分子インプリントポリマーは、例えば、参考文献「Komiyama, M., Takeuchi, T., Mukawa, T., Asanuma, H. "Molecular Imprinting", WILEY-VCH, Weinheim, 2002.」に記載された公知の方法によって合成することができる。本発明の分子インプリントポリマーの合成に用いる鋳型分子としては、上述の標的分子やその誘導体を好適に用いることができるが、好ましくは標的分子と補因子との複合体である。標的分子と補因子との複合体における両者の結合様式は特に限定されず、共有結合、非共有結合のいずれでもよい。予め結合させる必要がなく、着脱を容易に行うことができる点で非共有結合が好ましい。
【００１６】
本発明の分子インプリントポリマーの合成方法は限定されるものではないが、例えば以下方法で合成することができる。まず、公知の方法により標的分子と補因子との複合体を得る。続いて補因子と結合可能な官能基および重合可能な官能基を併せ持つ機能性モノマーを補因子に結合させる。なお、この複合体を形成するための結合は、切断可能であれば共有結合でも非共有結合でも構わない。次に、この標的分子／機能性モノマー複合体に架橋剤および重合開始剤を加え、重合反応を行なう。これにより鋳型分子の形状ならびに相互作用点の配置を記憶した有機高分子が得られる。次に、得られた高分子から鋳型分子を切断除去することにより、鋳型分子インプリント部位（標的分子認識部位）が形成された分子インプリントポリマーが得られる。得られた分子インプリントポリマーの鋳型分子インプリント部位には機能性モノマーに由来する官能基が存在し、これが補因子と非共有結合可能な官能基に該当する。機能性モノマーに由来する官能基と異なる官能基を用いる場合には、所望の官能基に置換等するための反応を行えばよい。
【００１７】
〔分子インプリントポリマーの利用〕
本発明の分子インプリントポリマーは、標的分子のセンシング、標的分子の分離および回収、触媒等に好適に利用することができる。中でも、標的分子のセンシング、標的分子の分離および回収に特に好ましく用いることができる。
【００１８】
標的分子のセンシングに利用する場合、その実施形態は特に限定されないが、例えば、本発明の分子インプリントポリマーを適当な基板に固定化して使用することができる。また、分子インプリントポリマーと標的分子との相互作用の検出手段には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）法、水晶振動子センサー、電気化学的方法、蛍光法、発光法、発色法、光導波路分光法などの公知の方法を適用することができる。ここで、上記のいずれかの検出手段により検出可能なシグナルを発信する物質を補因子に用いることが好ましい。例えば、蛍光物質、発光物質、発色物質、電気化学的シグナルを発する物質などが挙げられる。具体的な物質は特に限定されず、公知物質から適宜選択して用いることができる。
【００１９】
また、本発明の分子インプリントポリマーは、鋳型分子インプリント部位に存在する官能基が補因子と非共有結合し、この補因子を介して標的分子を捕捉するので、官能基と補因子との非共有結合を容易に外すことができる。例えば、水や緩衝液で補因子を希釈することにより容易に結合を外すことができる。したがって、センシング後の洗浄が容易であり、洗浄により標的分子の残存がほとんどなくなり、ポリマーに与えるダメージも少ない。また、補因子を混合することで容易にもとの性能を回復できるので、繰り返し使用に非常に優れたセンシング素材を提供することができる。
【００２０】
標的分子の分離および回収に利用する場合、その実施形態は特に限定されないが、例えば、本発明のインプリントポリマーを適当なカラムに充填して使用することができる。標的分子および補因子を含む試料を準備し、試料と本発明のインプリントポリマーとを適当な時間インキュベーションすることにより、標的分子が補因子を介して分子インプリントポリマーに捕捉される。その後、例えば水や緩衝液で補因子を希釈して鋳型分子インプリント部位の官能基と補因子との非共有結合を外すことにより、ダメージを受けていない標的分子を容易に高収率で回収することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
〔実施例１：分子インプリントポリマーの合成〕
鋳型分子インプリント部位にスルホン酸基を有する分子インプリントポリマー（ＩＰ（ＳＯ３Ｈ））を以下の手順で合成した。
１−１  テンプレートの合成
（ａ）化合物１の合成（チオール、ジスルフィド交換反応）
以下のスキーム１に従って、化合物１を合成した。すなわち、Allyldisulfide 25ml (135mmol)、4-Mercaptobenzoic acid 2.54g (16.5mmol)、トリエチルアミン (TEA) 4.6ml (33mmol)を60℃ 8h撹拌した後、pH 4 HClaq 50mlで洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2：MeOH＝20：1 Rf=0.2）で精製した。1H-NMRおよびESI-MS (negative mode)にて化合物１であることを確認した（収量 2.77g、収率 74.3%）。
【００２３】
【化１】
2010275403.tif 000002
【００２４】
（ｂ）化合物２（テンプレート）の合成（ビスエステル誘導体化反応）
以下のスキーム１に従って、化合物２を合成した。化合物１ 2.26g (10mmol), ビスフェノールＡ(BPA) 1.14g (5mmol), ジメチルアミノピリジン(DMAP) 1.22g (10mmol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride (WSC) 2.30g (12mmol)をdry CH2Cl2 200mlに溶解させ、室温で12h 反応させた。CH2Cl2/純水で抽出を行った後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2 Rf=0.4）にて精製した。1H-NMRおよびESI-MS (negative mode)にて化合物２であることを確認した（収量 2.12g、収率 65.9%）。
【００２５】
【化２】
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【００２６】
１−２  ＩＰ（ＳＯ３Ｈ）の合成
下記のスキームに従って、ＩＰ（ＳＯ３Ｈ）を合成した。
【００２７】
【化３】
2010275403.tif 000004
【００２８】
（ａ）重合
１−１で得られた化合物２をテンプレートとし、テンプレート644.9mg（1mmol）、ジビニルベンゼン 2.85ml（20mmol）、スチレン2.85ml（4mmol）、2,2'-アゾビスイソブチロニトリル (AIBN) 164.2mg（1mmol）をdry CHCl3 4mlに溶解させ５分間窒素を吹き込んだ後24h、25℃で光重合させた。重合後得られたポリマーを乳鉢で63μm以下に砕き一晩ソックスレー(CH2Cl2)にて洗浄し、真空乾燥させＩＰを得た（収量 2.93g、収率 80%）。
【００２９】
（ｂ）還元（テンプレートの切り出し）
上記（ａ）で得られたIP 2.00gをdry THF 100ml中で撹拌ながらLiAlH4 0.40g (10.5mmol)を加え24h、室温で還元を行い、テンプレートを切り出した。ポリマーは濾過した後1N HClaq、THFで２回ずつ洗浄し真空乾燥させＩＰ（ＳＨ）を得た。
【００３０】
（ｃ）酸化
上記（ｂ）で得られたＩＰ（ＳＨ）500mgを30% H2O2aq 20ml、酢酸 20ml中で24h、室温で撹拌しポリマーをろ別した。1N HClaq、MeOHで順に洗浄を行い真空乾燥させＩＰ（ＳＯ３Ｈ）とした。
【００３１】
〔実施例２：ＩＰ（ＳＯ３Ｈ）の評価〕
（ａ）各エチレンジアミン濃度におけるＢＰＡ結合量
ＩＰ（ＳＯ３Ｈ）3mgに各種濃度のエチレンジアミン（0、0.5、1.0、2.0mM）とＢＰＡ（1.0mM）トルエン溶液 1.5mlを24h、25℃でインキュベーションした後ポリマーを除去し、ろ液を1ml取り遠心エバポレーターで溶媒を留去した。アセトニトリル1mlに再溶解させHPLCにてろ液濃度を測定した。それぞれ３サンプルずつ測定を行った。
【００３２】
結果を図１に示した。図１からわかるように、エチレンジアミン濃度1.0mMまではエチレンジアミン濃度に依存してＢＰＡの結合量が増加し、エチレンジアミン濃度1.0mMを超えるとＢＰＡの結合量は減少した。この結果から、エチレンジアミンの添加によりＩＰ（ＳＯ３Ｈ）のスルホン酸基とエチレンジアミンとの静電結合が良好に進行したことが示された。また、過剰なエチレンジアミンは、エチレンジアミンを介したＢＰＡとＩＰ（ＳＯ３Ｈ）との結合を妨害することが示された。
【００３３】
（ｂ）標的分子選択性
ＢＰＡおよびＢＰＡと構造類似の４化合物（ビスフェノールＢ（BPB）、ヘキセストロール（Hexestrol）、4,4’-ジメトキシベンゾフェノン（DMP）、4,4’-ジアミノジフェニルメタン（DAD）を用いてＩＰ（ＳＯ３Ｈ）の標的分子選択性を検討した。ＩＰ（ＳＯ３Ｈ）3mgにエチレンジアミン（1mM）と各化合物（1mM）のトルエン溶液1.5mlを24h、25℃でインキュベーションした後ポリマーを除去した。BPA、BPB、HEX、DMP、DAD はろ液を1ml取り遠心エバポレーターで溶媒を留去した後、アセトニトリル1mlに再溶解させHPLCにてろ液濃度を測定した。それぞれ３サンプルずつ測定を行った。
【００３４】
結果を図２に示した。図２からわかるように、ＢＰＢの結合量およびヘキセストロールの結合量はＢＰＡの結合量と同等であり、ＢＰＡ、ＢＰＢおよびヘキセストロール間に選択性は見られなかった。一方、ＤＭＰの結合量およびＤＡＤの結合量はＢＰＡの結合量と比較して著しく低かった。
この結果は、エチレンジアミンを添加したインプリントポリマーの選択性を示しており、ＢＰＡ、ＢＰＢ、ＨＥＸの区別はされなかったが、静電的相互作用が弱いＤＭＰの結合は弱く、アミノ基を持ち、スルホン酸と強い相互作用をすることが予想されるＤＡＤの結合も弱かったことから、インプリントポリマー中のほとんどのスルホン酸基は添加されたエチレンジアミンと結合してＢＰＡの結合部位を形成していることがわかった。
【００３５】
（ｃ）各種ジアミンを用いた場合におけるＢＰＡ結合量
補因子として、下記に示すエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンおよびｐ−キシレンジアミンの３種類のジアミンを用い、ＢＰＡの結合量を評価した。
【００３６】
【化４】
2010275403.tif 000005
【００３７】
ＩＰ（ＳＯ３Ｈ）3mgに各ジアミン1mMとＢＰＡ1mMのトルエン溶液1.5mlをサーモミキサーを用いて24h、25℃でインキュベーションした後ポリマーを除去し、ろ液を1ml取り遠心エバポレーターで溶媒を留去した。アセトニトリル1mlに再溶解させHPLCにてろ液濃度を測定した。それぞれ３サンプルずつ測定を行った。
【００３８】
結果を図３に示した。図３からわかるように、エチレンジアミンを用いた場合とヘキサメチレンジアミンを用いた場合のＢＰＡの結合量に差は認められなかった。一方、ｐ−キシレンジアミンを用いた場合のＢＰＡの結合量は、エチレンジアミンを用いた場合に比べて低下した。この結果は、ヘキサメチレンジアミンのリンカー部分が柔軟であることに対してｐ−キシレンジアミンのリンカー部分が剛直であることの違いによるものと考えられた。ＢＰＡの結合の際に添加する補因子を変化させることで結合力の調整が可能なことが分かった。
【００３９】
（ｄ）エチレンジアミンを介したＩＰ（ＳＯ３Ｈ）とＢＰＡとの結合に対して、ｎ−プロピルアミンの添加が及ぼす影響
ＩＰ（ＳＯ３Ｈ）3mgにエチレンジアミン1mMと各ｎ−プロピルアミン濃度（0.5、1.0、2.0、5.0mM）とＢＰＡ1mMのトルエン溶液 1.5mlをサーモミキサーを用いて24h、25℃でインキュベーションした後ポリマーを除去し、ろ液を1ml取り遠心エバポレーターで溶媒を留去した。アセトニトリル1mlに再溶解させHPLCにてろ液濃度を測定した。それぞれ３サンプルずつ測定を行った。
【００４０】
結果を図４に示した。図４からわかるように、ｎ−プロピルアミンの濃度上昇に伴いＢＰＡの結合量が減少した。この結果は、ＩＰ（ＳＯ３Ｈ）のスルホン酸基とエチレンジアミンとの結合が競合するｎ−プロピルアミンによって置換された結果、ｎ−プロピルアミンが結合したＩＰ（ＳＯ３Ｈ）はＢＰＡと結合することができなくなり、確かにエチレンジアミンが補因子として結合に関与していることが分かった。
【図１】
2010275403.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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