(57)【要約】【課題】  遺伝子欠損と点変異を同時に精度よく検出する方法を提供すること。【解決手段】  本発明にかかる検出方法は、標的核酸中の所定の遺伝子欠損の有無および前記遺伝子点変異を検出する方法であって、前記遺伝子を増幅可能に構成された１組のプライマーセットと、前記遺伝子が欠損して結合した場合に、結合位置を含む領域を増幅可能となる、１組のプライマーセットを用いて標的核酸をＰＣＲ増幅する工程と、前記工程により増幅された標的核酸に対して、標的配列と特異的に結合可能なプローブの複数が固定されたプローブ担体を用いて、増幅された領域の配列を特定することを特徴とする。【選択図】図１
2010110258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の中の標的遺伝子の欠損の有無および前記標的遺伝子の点変異の有無を同時に検出する、標的遺伝子欠損と標的遺伝子点変異との検出方法であって、
特定の点変異を有する前記標的遺伝子を有する前記標的核酸を増幅するための点変異増幅用プライマーと、前記標的遺伝子を欠損した前記標的核酸を増幅するための欠損増幅用プライマーと、を用いて標的核酸を増幅する増幅工程と、
前記増幅工程により増幅された、点変異を持つ標的遺伝子を有する標的核酸を検出する点変異検出用プローブと、前記増幅工程により増幅された、欠損した標的遺伝子を有する標的核酸を検出する欠損検出用プローブと、を用いて標的核酸を検出する検出工程と
を含む標的遺伝子欠損と標的遺伝子点変異との検出方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子はＣＹＰ２Ｄ６であることを特徴とする請求項１に記載の標的遺伝子欠損と標的遺伝子点変異との検出方法。
【請求項３】
前記欠損検出用プローブが、ＣＹＰ２Ｄ６の５’側にある隣の遺伝子配列の３’側の領域あるいはＣＹＰ２Ｄ６の３’側の領域に互いに非常に相同性が高い配列を持つ約２．５ｋｂの配列を含む所定の長さの塩基配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の標的遺伝子欠損と標的遺伝子点変異との検出方法。
【請求項４】
前記欠損検出用プローブの配列が、
（１）5’-GCCTGGCGACAATTCAAGTGTGG-3’(配列番号１)からなる塩基配列を有するプローブと、
（２）5’-CTCCCAGTAGGGATCAGGCAGG-3’(配列番号２)からなる塩基配列を有するプローブと、
（３）5’-GCAGTGCCCAAGAGTTTCTAATGAGC-3’(配列番号３)からなる塩基配列を有するプローブと、
（４）5’-TCAGAGGCCTCTGCAAAGTAGAAACA-3’(配列番号４)からなる塩基配列を有するプローブと、
（５）5’-ATGAGGCCCAGTCTGTTCACACA-3’(配列番号５)からなる塩基配列を有するプローブと、
（６）5’-ACTGGCCCATCCTTTCCAGGT-3’(配列番号６)からなる塩基配列を有するプローブと、
（７）5’-AGGCTGAGGCAGGAGAATCGA-3’(配列番号７)からなる塩基配列を有するプローブと、
の塩基配列あるいはその相補配列からなるグループから選択された１以上を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の標的遺伝子欠損と標的遺伝子点変異との検出方法。
【請求項５】
前記点変異検出用プローブが、４から１０種の多型を検出し、少なくともＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊１４、ＣＹＰ２Ｄ６＊１８、ＣＹＰ２Ｄ６＊２１、ＣＹＰ２Ｄ６＊３６の配列を含む所定の長さの塩基配列を有することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の標的遺伝子欠損と標的遺伝子点変異との検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子欠損と点変異を同時に検出する方法に関し、特にＣＹＰ２Ｄ６遺伝子欠損と点変異を同時に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子欠損や点変異は薬剤感受性に影響を及ぼすことが明らかになりつつある。
薬剤感受性が明らかになっているものとして、チトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子（ＣＹＰ２Ｄ６）が挙げられる。このＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は、２２番染色体に位置し、主に第Ｉ相薬剤代謝酵素であるデブリソキン・ヒドロキシラーゼをコードする。そのためＣＹＰ２Ｄ６に欠損や点変異が生じた場合、薬剤の代謝能が損失あるいは低下する可能性がある。したがって、薬を投与する前に遺伝子欠損や点変異を同時に調べることは極めて重要となる。
【０００３】
遺伝子欠損や点変異を分析する技術として、シークエンシング法がある。シークエンシング法では、２本の染色体の情報が１つの染色体情報としてまとめられて検出される。そのため、遺伝子欠損と点変異を検出するためには、ＣＹＰ２Ｄ６の欠損遺伝子とＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子の各々を増幅した後、シーケンス反応を行い、シーケンスを取得する必要がある。しかしながら、この解析には多大な労力と時間が必要であるし、試薬や装置も非常に高価である。
【０００４】
そこで簡易および安価に遺伝子欠損を分析する方法としては、ＰＣＲ反応と電気泳動を組み合わせた方法がある（例えば、非特許文献１参照）。この方法では、２Ｄ６遺伝子の存在を確認するためのプライマーと、２Ｄ６遺伝子欠損を確認するためのプライマーを入れてＰＣＲを行い、続く電気泳動解析による産物長の検出によって判定する。
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６（２０００）第１０７２−１０７７項
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記方法においては遺伝子欠損の有無は検出できるものの、同時に遺伝子点変異を検出することはできない。薬物投与をする場合、薬物代謝酵素をコードする遺伝子が欠損していなくても点変異を有しているだけで、フレームシフトが生じ、薬物代謝酵素が合成されず、代謝活性が大幅に弱まるか、または無くなることがある。
【０００６】
したがって、遺伝子欠損の有無を検出するに留まらず、遺伝子点変異も同時に検出する必要がある。また、上記ＰＣＲ法では仮に所望でないＰＣＲ産物が出来た場合でも、所望の産物長とほぼ同一の長さであったら、所望の産物が産出されたと誤って検出される恐れがある。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、遺伝子欠損と遺伝子点変異を同時に精度よく決定する方法、特にＣＹＰ２Ｄ６遺伝子欠損と点変異を同時に検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にかかる標的遺伝子欠損と標的遺伝子点変異との検出方法は、標的核酸の中の標的遺伝子の欠損の有無および前記標的遺伝子の点変異の有無を同時に検出する、標的遺伝子欠損と標的遺伝子点変異との検出方法であって、特定の点変異を有する前記標的遺伝子を有する前記標的核酸を増幅するための点変異増幅用プライマーと、前記標的遺伝子を欠損した前記標的核酸を増幅するための欠損増幅用プライマーと、を用いて標的核酸を増幅する増幅工程と、前記増幅工程により増幅された、点変異を持つ標的遺伝子を有する標的核酸を検出する点変異検出用プローブと、前記増幅工程により増幅された、欠損した標的遺伝子を有する標的核酸を検出する欠損検出用プローブと、を用いて標的核酸を検出する検出工程とを含むことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明で用いる点変異検出用プローブ及び欠損検出用プローブは、以下の配列番号１から配列番号７からなるグループから選択されることを特徴とする。
配列番号１：5’-GCCTGGCGACAATTCAAGTGTGG-3’
配列番号２：5’-CTCCCAGTAGGGATCAGGCAGG-3’
配列番号３：5’-GCAGTGCCCAAGAGTTTCTAATGAGC-3’
配列番号４：5’-TCAGAGGCCTCTGCAAAGTAGAAACA-3’
配列番号５：5’-ATGAGGCCCAGTCTGTTCACACA-3’
配列番号６：5’-ACTGGCCCATCCTTTCCAGGT-3’
配列番号７：5’-AGGCTGAGGCAGGAGAATCGA-3’
【００１０】
本発明でいう「標的核酸の中の標的遺伝子の欠損の有無および前記標的遺伝子の点変異の有無を同時に検出する」とは、標的核酸の中の標的遺伝子の欠損の有無を検出するステップと同じステップで前記標的遺伝子の点変異の有無を検出することである。つまり、標的遺伝子の点変異を検出するために別途ステップを設ける必要はなく、また、その逆も同様である。
【００１１】
本発明でいう「標的核酸」とは、標的遺伝子を持つ核酸を意味する。
【００１２】
本発明でいう「遺伝子点変異」とは、一般に点突然変異もしくはポイント・ミューテーションともいい、ＤＮＡの塩基対（１本鎖ＤＮＡでは１塩基）が異なる塩基対（塩基）に変化することという。これは、当該技術分野の当業者にとって一般に理解している範囲内であって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００１３】
本発明でいう「遺伝子欠損」とは、染色体からＤＮＡの一部が失われ、機能あるいは構造体を失うことになり、復帰変異は認められないことをいう。これは、当該技術分野の当業者にとって一般に理解している範囲内であって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、遺伝子欠損および遺伝子点変異を同時に精度よく決定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（第１実施形態）
本発明に係る第１実施形態は、図１と図２とに示されている。よって、図１と図２とを用いて第１実施形態を説明する。
【００１６】
本実施形態の標的核酸３０１は図１（Ａ）に示されているとおり、５’側に第１の遺伝子３０３を、３’側に第２の遺伝子３０５を有する。また前記第１の遺伝子の３’側に前記第２の遺伝子の３’側と非常に相同性の高い塩基配列を持つ第１の相同領域３０７を有する。また前記第２の遺伝子の３’側に前記第１の遺伝子の３’側と非常に相同性の高い塩基配列を持つ第２の相同領域３０９を有する。
【００１７】
本実施形態においては、前記相同領域３０７と第２の遺伝子の３’側とは８０％から１００％のホモロジーを有することが好ましい。特に９０〜１００％であることが好ましい。さらに、９２、９４、９６、９８％であることが好ましい。
【００１８】
図１（Ｂ）は、核酸３０１の第１の相同領域３０７と第２の相同領域３０９との間において組換えが起こり、第２の遺伝子欠損を示している。そこには、第１遺伝子３０３と、第１の相同領域３０７の前半と第２の相同領域３０９の後半とが結合してできた新たな相同領域３１０とからなる標的核酸３１１が示されている。
【００１９】
次に標的核酸３０１と３１１とにおいて、第２の遺伝子３０５の欠損および第２の遺伝子３０５の点変異を検出するためのプライマーを準備する。まず第２の遺伝子３０５の点変異を検出するための順方向プライマー３１３と逆方向プライマー３１５とからなる点変異増幅用プライマーを用意する。この点変異増幅用プライマーは、図１および図２にあるように第２の遺伝子上に位置しているか、あるいは第２の遺伝子を挟む位置に設計されることが好ましい。または、第２の遺伝子点変異を特定可能であれば、遺伝子と離れた位置でも構わない。
【００２０】
次に、遺伝子欠損を確認するためのプライマーを用意する。まず、第１の遺伝子３０３と第１の相同領域３０７との間に位置する順方向プライマー３１７と第２の相同領域より３’側に位置する逆方向プライマー３１９とからなる欠損増幅用プライマーを用意する。
【００２１】
本実施形態は、特定の点変異を有する標的遺伝子（第２の遺伝子３０５）を有する標的核酸３０１を増幅するための点変異増幅用プライマーセットと、標的遺伝子（第２の遺伝子３０５）を欠損した標的核酸３０１を増幅するための欠損増幅用プライマーセットと、を用いて標的核酸を増幅する増幅工程を行う。ここで、用意した点変異増幅用プライマーと欠損増幅用プライマーと標的核酸とを用いて、増幅工程（ＰＣＲ増幅）を行う。
【００２２】
図１（Ａ）の遺伝子を持つ標的核酸３０１を有する場合、ＰＣＲ反応によって増幅するのは、第２の遺伝子点変異を検出するための順方向プライマー３１３と逆方向プライマー３１５とからなる点変異増幅用プライマーのみである。これは、第２の遺伝子欠損を検出するためのプライマー３１７とプライマー３１９とからなる欠損増幅用プライマーにおける産物は産物長が長過ぎるため増幅されないためである。
【００２３】
一方、図１（Ｂ）の遺伝子を持つ標的核酸３１１を有する場合、ＰＣＲ反応によって増幅するのは、第２の遺伝子欠損を検出するためのプライマー３１７とプライマー３１９とからなる欠損増幅用プライマーのみからである。これは第２の遺伝子が欠損している場合、順方向プライマー３１３と逆方向プライマー３１５とからなる点変異増幅用プライマーの間では増幅がかからないからである。
【００２４】
図１の（Ａ）と（Ｂ）との遺伝子を持つ標的核酸であった場合は、ＰＣＲ反応によって増幅するのは、第２の遺伝子欠損を検出するためのプライマー３１７、３１９からなる欠損増幅用プライマーと、第２の遺伝子点変異を検出するためのプライマー３１３、３１５からなる点変異増幅用プライマーとである。
【００２５】
本実施形態においては、第２の遺伝子３０５の欠損を検出するための欠損検出用プローブ３２３が、相同領域３１０の核酸配列を有するもので、下記の塩基配列あるいはその相補配列からなるグループから選択された１以上を含んでなる。
【００２６】
配列番号１：5’-GCCTGGCGACAATTCAAGTGTGG-3’
配列番号２：5’-CTCCCAGTAGGGATCAGGCAGG-3’
配列番号３：5’-GCAGTGCCCAAGAGTTTCTAATGAGC-3’
配列番号４：5’-TCAGAGGCCTCTGCAAAGTAGAAACA-3’
配列番号５：5’-ATGAGGCCCAGTCTGTTCACACA-3’
配列番号６：5’-ACTGGCCCATCCTTTCCAGGT-3’
配列番号７：5’-AGGCTGAGGCAGGAGAATCGA-3’
【００２７】
また、本実施形態の欠損検出用プローブ３２３は、標的遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６の５’側にある隣の遺伝子配列の３’側の領域あるいはＣＹＰ２Ｄ６の３’側の領域に互いに非常に相同性が高い配列を持つ約２．５ｋｂの配列を含む所定の長さの塩基配列を有する。本実施形態は、第２の遺伝子３０５の欠損を検出するための欠損検出用プローブ３２３もマイクロアレイ３２２に固定して、前記増幅工程により増幅された、欠損した標的遺伝子を有する標的核酸を検出する。
【００２８】
本実施形態においては、第２の遺伝子３０５の点変異を検出するための点変異検出用プローブ３２１は、４から１０種の多型を検出し、少なくともＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊１４、ＣＹＰ２Ｄ６＊１８、ＣＹＰ２Ｄ６＊２１、ＣＹＰ２Ｄ６＊３６の配列を含む所定の長さの塩基配列を有する。
【００２９】
よって、点変異検出用プローブ３２１は、少なくともＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊１４、ＣＹＰ２Ｄ６＊１８、ＣＹＰ２Ｄ６＊２１、ＣＹＰ２Ｄ６＊３６を検出可能である。これらのアレルは変異が生じると代謝酵素活性がなくなるものである。
【００３０】
本発明でいう、ＣＹＰ２Ｄ６＊４とは、ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子のｃＤＮＡの１８４６位のＧがＡに置換する変異（Ｇ１８４６Ａ変異）を持つ遺伝子をいう。ＣＹＰ２Ｄ６＊１４とは、Ｐｒｏ３４からＳｅｒに、Ｇｌｙ１６９からＡｒｇに、Ａｒｇ２９６からＣｙｓに、Ｓｅｒ４８６からＴｈｒに置換を引き起こす変異遺伝子をいう。ＣＹＰ２Ｄ６＊１８とはｃＤＮＡの４１５２位から９塩基重複を起こしている遺伝子をいう。ＣＹＰ２Ｄ６＊２１とはｃＤＮＡの２５７３位で一塩基Ｃの挿入によりフレームシフトが起こる遺伝子をいう。ＣＹＰ２Ｄ６＊３６とはＴｈｒ４７０からＡｌａに、Ｐｒｏ４９０からＡｌａに置換を引き起こす変異遺伝子をいう。
【００３１】
本実施形態においては、点変異検出用プローブ３２１は第２の遺伝子点変異において、野生型および変異型に対応するプローブを用意する。本発明における遺伝子点変異の検出には、特にアレル特異的増幅法を用いることが好ましい。
【００３２】
これらの点変異を検出するための点変異検出用プローブ３２１は、下記の配列もしくはその相補鎖配列からなるグループから選択される少なくとも１つの配列を含んでなる。なお小文字での表記は、多型と対応するものを示している。
【００３３】
配列番号  ８：5’-TGCACGCTACcCACCAGGC-3’
配列番号  ９：5’-GCACGCTACtCACCAGGCCC-3’
配列番号１０：5’-TGGGTTTcGGGCCGCGT-3’
配列番号１１：5’-CCTGGGTTTtGGGCCGCG-3’
配列番号１２：5’-GCTTCTCCGTgTCCACCTTGCG-3’
配列番号１３：5’-GCTTCTCCGTcTCCACCTTGCG-3’
配列番号１４：5’-CCACTCCgGTGGGTGATGGG-3’
配列番号１５：5’-CCACTCCtGTGGGTGATGGGC-3’
配列番号１６：5’-CCCCCAgGACGCCCCTT-3’
配列番号１７：5’-CACCCCCAaGACGCCCCTT-3’
配列番号１８：5’-GAGAACCTGcGCATAGTGGTGGC-3’
配列番号１９：5’-ATGAGAACCTGtGCATAGTGGTGGC-3’
配列番号２０：5’-CCTGGTGAgCCCATCCCCC-3’
配列番号２１：5’-CCTGGTGAcCCCATCCCCC-3’
配列番号２２：5’-CAGCTTCTCGGTGCCCACTGGA-3’
配列番号２３：5’-TCTCGGgtgcccactTGCC-3’
配列番号２４：5’-ACCCAGCCCaGCCCCCCC-3’
配列番号２５：5’-ACCCAGCCCcAGCCCCCC-3’
【００３４】
ここで配列番号８はＣ１００Ｔの野生型に対応し、配列番号９はＣ１００Ｔの変異型に対応する。また配列番号１０はＣ１０３９Ｔの野生型に対応し、配列番号１１はＣ１０３９Ｔの変異型に対応する。また配列番号１２はＧ１６６１Ｃの野生型に対応し、配列番号１３はＧ１６６１Ｃの変異型に対応する。また配列番号１４はＧ１７５８Ａの野生型に対応し、配列番号１５はＧ１７５８Ａの変異型に対応する。また配列番号１６はＧ１８４６Ａの野生型に対応し、配列番号１７はＧ１８４６Ａの変異型に対応する。
【００３５】
また配列番号１８はＣ２８５０Ｔの野生型に対応し、配列番号１９はＣ２８５０Ｔの変異型に対応する。また配列番号２０はＧ４１８０Ｃの野生型に対応し、配列番号２１はＧ４１８０Ｃの変異型に対応する。また配列番号２２は４１２５−４１３３のインサーションの野生型に対応し、配列番号２３は４１２５−４１３３のインサーションの変異型に対応する。また配列番号２４は２５７３のＣのインサーションの野生型に対応し、配列番号２５は２５７３のＣにインサーションの変異型に対応する。
【００３６】
本実施形態において、第２の遺伝子３０５の点変異を検出するための点変異検出用プローブ３２１を固定した前記マイクロアレイ３２２を用意して、前記増幅工程により増幅された、点変異を持つ標的遺伝子を有する標的核酸を検出する。
【００３７】
次いで、増幅工程により増幅された、点変異を持つ標的遺伝子を有する標的核酸を検出する点変異検出用プローブ３２１と、前記増幅工程により増幅された、欠損した標的遺伝子を有する標的核酸を検出する欠損検出用プローブ３２３と、を用いて標的核酸を検出する検出工程を行う。
【００３８】
本実施形態において、前記増幅工程と検出工程とが行われれば、標的核酸の中の標的遺伝子の欠損の有無および前記標的遺伝子の点変異の有無を同時に検出することができる。本実施形態において、標的遺伝子がＣＹＰ２Ｄ６である。
【００３９】
本実施形態において、前記プローブを前記マイクロアレイ上に固定し、アレル判定に用いることができる。下表では、各アレルと変異や欠失の対応表１を示す。表１中で「○」がついているものが、変異型に対応している。
【００４０】
【表１】
2010110258.tif 000003
【００４１】
なお、上記の欠損検出用プローブ３２１の配列および点変異検出用プローブ３２３の配列は、プローブとしての機能を損なわない範囲内、すなわち、検出対象としての標的核酸配列と二本鎖を形成してこれを検出可能な範囲内での変異を有するものである。なかでも、ストリンジェントな条件での検出対象としての標的核酸配列と二本鎖を形成し得る範囲での変異を有することが好ましい。変異の範囲を規定するハイブリダイゼーションの好ましい条件としては、後述する実施例における条件を挙げることができる。
【００４２】
なお、ここでいう検出対象とは、ハイブリダイゼーションを行う試料中に含まれるもので、相同領域３１０に特有な塩基配列そのものであっても良いし、この特有な塩基配列の相補配列であってもよい。更に、かかる変異としては、１から数個の塩基の欠失、置換または挿入がプローブ機能を保持する範囲内で行なわれた変異配列を挙げることができる。
【００４３】
上記で用意したプローブが結合されたマイクロアレイに、前記で行ったＰＣＲ増幅産物を反応させると、遺伝子欠損および遺伝子点変異の同時検出が可能となる。
【００４４】
以上のとおり、本発明によれば、マイクロアレイ３２２上の２本鎖核酸の形成を示すシグナルの位置から、遺伝子欠損および点変異が決定される。本発明において用いられるシグナルとして、例えばプローブに対して既知の方法で蛍光処理を施すことができる。本発明はＣｙ３による標識を行うことが好ましい。
【００４５】
(マイクロアレイの構成)
図３のとおりにマイクロアレイ上にプローブが固定されている様子が示されている。本発明のマイクロアレイの構成は、プローブの固定は特開平１１−１８７９００に詳細が示されているように、表面処理を行った基板にインクジェットにより３’末端をチオール化されたオリゴＤＮＡを吐出する方法を用いることができるが、この方法に限らない。ここでプローブとなるＤＮＡは例えば２５塩基程度の長さをもつものが適当に用い得る。
【００４６】
(ブロッキング)
ハイブリダイゼーション反応を行う前に、マイクロアレイのプローブ以外の部分に核酸分子が吸着することを防ぐ目的でブロッキングを行うことが好ましい。一般的にハイブリダイゼーションの直前に行うことが好ましい。具体的な方法としては、例えば、ＢＳＡ（牛血清アルブミンFraction V : Sigma社の製品）を１ｗｔ％となるように１００ｍＭ  ＮａＣｌ/１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、この溶液にＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸す。ブロッキング終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む０．１×ＳＳＣ溶液（クエン酸三ナトリウムとＮａＣｌ）と、ＳＤＳを含まないＳＳＣ溶液で洗浄し、超純水でリンス後、スピンドライで水切りを行う。
【００４７】
(遺伝子欠損および点変異検出用のＰＣＲ)
検体由来の核酸の増幅反応(ＰＣＲ)の例を以下に説明する。
先ず、増幅反応液を用意する。増幅反応液の組成の例を以下に示す。
【００４８】
--ＰＣＲ溶液組成--
Expand Long Enzyme Mix (Roche)                 ０．３Ｌ
Template  Genome  DNA                          〜５ｎｇ
Forward/  Reverse  Primer（点変異検出用）      各０．１２Ｍ
Forward/Reverse  Primer（欠損検出用）          各０．０６Ｍ
dNTP  mix                                      ０．７Ｌ
buffer  3                                      ２Ｌ
H2O                                            ９Ｌ
Total                                          ２０Ｌ
【００４９】
※   
ｄＮＴＰ混合組成
Ａ、Ｇ、Ｔ        各１０ｍＭ
Ｃ                ２ｍＭ
Ｃｙ３−ｄＣＴＰ  ２ｍＭ
【００５０】
上記組成の反応液を、以下に例を示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。
【００５１】
（ＰＣＲサイクル）
第１ステップ  ９４℃          １分
第２ステップ  ９４℃          ６０秒
第３ステップ  ６６．５℃      ３０秒
第４ステップ  ６８℃          ５分
第５ステップ  ６８℃          ７分
第６ステップ  １５℃          ∞
（前記第２ステップから第５ステップを３５サイクル行う）
【００５２】
反応終了後、精製用カラム（QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit、QUIGEN社の製品）を用いてプライマーを除去した後、電気泳動（BioAnalyzer、Agilent社製の製品）により、増幅産物の定量を行う。
【００５３】
（超音波による断片化）
上記ＰＣＲ産物を超音波破砕装置（アナログソニファイア２５０、Branson社製の製品）を利用して、以下の条件で断片化を行う。
【００５４】
（断片化条件）
２００Ｗ、２０秒
【００５５】
（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Hybridization Station、Genomic Solutions Inc.社の製品）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行う。また、ハイブリダイゼーション専用装置を用いずに、スライドガラスとハイブリダイゼーション用のチャンバーとを用いてマニュアルで反応を行ってもよい。
【００５６】
（ハイブリダイゼーション溶液）
以下にハイブリダイゼーション溶液の組成の一例を示す。
６×ＳＳＰＥ／１０％  ホルムアミド（Formamide）／標的核酸（未知検体由来の核酸）（ＰＣＲ産物  ５０mｌ）／０．０５％  ＳＤＳ
【００５７】
前述の増幅した標的核酸（未知検体由来の核酸）５０mｌ相当をバッファー（ＳＳＰＥ）に溶かし、最終濃度が１０％になるようにホルムアミドを加える。この溶液に最終濃度が０．０５％になるようにＳＤＳ溶液を加え、ハイブリダイゼーション溶液とする。なお、バッファー（ＳＳＰＥ）の濃度は、最終溶液の状態で６×ＳＳＰＥとなるよう、予め計算しておく。
【００５８】
上記ハイブリダイゼーション溶液を、９２℃に加温し２分間保持したあと、さらに５０℃で４時間保持する。その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、４０℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンス、スピンドライ装置で水切りを行う。
【００５９】
（蛍光測定）
前述のＤＮＡマイクロアレイを、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（GenePix  4000B、Axon社の製品、）を用いて、Ｃｙ３標識の蛍光測定を行う。蛍光測定値が３００００以下となるように励起光の強さを調整して測定する。
【００６０】
（スポット解析）
蛍光測定結果の画像を、マイクロアレイ用のデータ解析ソフトArrayPro（Media  Cybernetics社の製品）で解析を行い、各スポットに対する輝度値のデータを得る。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００６２】
（実施例１）
ＣＹＰ２Ｄ６の欠損と点変異を同時に決定するため、表２に示した検体に関して実験を行った。まずマイクロアレイ上に載せる２Ｄ６の点変異および数塩基の欠損の検出用プローブとして、配列番号１~２５を合成した。これらは実施様態と同様の配列である。
【００６３】
【表２】
2010110258.tif 000004
【００６４】
続いて、各検体に関して下記プライマーを用いてＰＣＲ後、精製および電気泳動による定量を行い、超音波による断片化を行った。精製および電気泳動および断片化の各工程は前記実施様態に従った。なお２Ｄ６の欠損を検出するための順方向プライマー３１７には配列番号２６を、逆方向プライマー３１９には配列番号２７を使用した。また２Ｄ６の点変異および数塩基の欠損を検出するための順方向プライマー３１３には配列番号２８を、逆方向プライマー３１５には配列番号２９を使用した。
【００６５】
配列番号２６：5’-CACACCGGGCACCTGTACTCCTCA-3’
配列番号２７：5’-CAGGCATGAGCTAAGGCACCCAGAC-3’
配列番号２８：5’-GTTATCCCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3’
配列番号２９：5’-GCCGACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA-3’
【００６６】
上記工程で得られた増幅産物を実施様態に沿って、ハイブリダイゼーション反応に供した。
【００６７】
ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイの蛍光輝度は、蛍光検出装置を用いて測定した。測定は「Ｃｙ３」励起に波長５３２ｎｍを選択した。得られた蛍光輝度画像および解析結果からＣＹＰ２Ｄ６の欠損および点変異を検出した。蛍光輝度測定に関する工程およびスポット解析は実施様態に従った。
【００６８】
以下、各検体に関して得られた解析結果を図示し、遺伝子欠損の有無と点変異の決定を行う。
【００６９】
（アレル１/１）
図４は、鋳型ＤＮＡとしてＣＹＰ２Ｄ６の全ての多型に関して野生型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図４に示したとおり、ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を検出するためのプローブからはシグナルが検出されなかった。また、点変異検出用のプローブの検出輝度から、全ての点変異において野生型であることが分かる。以上のことから、本検体のアレルは1/1と決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７０】
（アレル１/５）
図５は、鋳型ＤＮＡとしてＣＹＰ２Ｄ６を欠損した検体と、ＣＹＰ２Ｄ６の全ての多型に関して野生型を有する検体とを用いた場合の解析結果である。図５に示したとおり、ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を検出するためのプローブからシグナルが検出された。また、点変異検出用のプローブの検出輝度から、全ての点変異において野生型であることが分かる。以上のことから、本検体のアレルは1/５と決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７１】
（アレル４/５）
図６は、鋳型ＤＮＡとしてＣＹＰ２Ｄ６を欠損した検体と、ＣＹＰ２Ｄ６のＣ１００ＴとＣ１０３９ＴとＧ１６６１ＣとＧ１８４６ＡとＣ２８５０ＴとＧ４１８０Ｃにおいて変異型を有する検体とを用いた場合の解析結果である。図６に示したとおり、ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を検出するためのプローブからシグナルが検出された。また、点変異検出用のプローブの検出輝度から、Ｃ１００ＴとＣ１０３９ＴとＧ１６６１ＣとＧ１８４６ＡとＣ２８５０ＴとＧ４１８０Ｃで変異型を有し、またＧ１７５８Ａや２５７３ｉｎｓや４１２５ｉｎｓにおいては野生型を有することが分かる。以上のことから、本検体のアレルは４/５と決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７２】
（アレル５/１４）
図７は、鋳型ＤＮＡとしてＣＹＰ２Ｄ６を欠損した検体と、ＣＹＰ２Ｄ６のＧ１６６１ＣとＧ１７５８ＡとＣ２８５０ＴとＧ４１８０Ｃにおいて変異型を有する検体とを用いた場合の解析結果である。図7に示したとおり、ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を検出するためのプローブからシグナルが検出された。また、点変異検出用のプローブの検出輝度から、Ｇ１６６１ＣとＧ１７５８ＡとＣ２８５０ＴとＧ４１８０Ｃで変異型を有し、またＣ１００ＴとＣ１０３９ＴとＧ１８４６Ａと２５７３ｉｎｓと４１２５ｉｎｓにおいては野生型を有することが分かる。以上のことから、本検体のアレルは５/１４と決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７３】
（アレル１/１８）
図８は、鋳型ＤＮＡとしてＣＹＰ２Ｄ６の全ての多型に関して野生型を有する検体と、ＣＹＰ２Ｄ６の４１２５ｉｎｓにおいて変異型を有する検体とを用いた場合の解析結果である。図８に示したとおり、ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を検出するためのプローブからはシグナルが検出されなかった。また、点変異検出用のプローブの検出輝度から、４１２５ｉｎｓで変異型を有し、またＣ１００ＴとＣ１０３９ＴとＧ１６６１ＣとＧ１７５８ＡとＧ１８４６ＡとＣ２８５０ＴとＧ４１８０Ｃと２５７３ｉｎｓにおいては野生型を有することが分かる。以上のことから、本検体のアレルは１/１８と決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７４】
（アレル１/２１）
図９は、鋳型ＤＮＡとしてＣＹＰ２Ｄ６の全ての多型に関して野生型を有する検体と、ＣＹＰ２Ｄ６のＧ１６６１ＣとＧ４１８０Ｃと２５７３ｉｎｓにおいて変異型を有する検体とを用いた場合の解析結果である。図９に示したとおり、ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を検出するためのプローブからはシグナルが検出されなかった。また、点変異検出用のプローブの検出輝度から、Ｇ１６６１ＣとＧ４１８０Ｃと２５７３ｉｎｓにおいて変異型を有し、またＣ１００ＴとＣ１０３９ＴとＧ１７５８ＡとＧ１８４６ＡとＣ２８５０Ｔと４１２５ｉｎｓにおいては野生型を有することが分かる。以上のことから、本検体のアレルは１／２１と決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７５】
（アレル５/３６）
図１０は、鋳型ＤＮＡとしてＣＹＰ２Ｄ６が欠損している検体と、ＣＹＰ２Ｄ６のＣ１００ＴとＣ１０３９ＴとＧ１６６１ＣとＧ４１８０Ｃにおいて変異型を有する検体とを用いた場合の解析結果である。図１０に示したとおり、ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を検出するためのプローブからはシグナルが検出された。また、点変異検出用のプローブの検出輝度から、Ｃ１００ＴとＣ１０３９ＴとＧ１６６１ＣとＧ４１８０Ｃにおいて変異型を有し、またＧ１７５８ＡとＧ１８４６ＡとＣ２８５０Ｔと２５７３ｉｎｓと４１２５ｉｎｓにおいては野生型を有することが分かる。以上のことから、本検体のアレルは５／３６と決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７６】
上記実施例で示したとおり、本発明の手法で得られる輝度パターンはアレルから予想されるパターンと一致する。従って、本発明を用いることで遺伝子欠損と点変異を同時に精度よく検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の説明図
【図２】本発明の説明図
【図３】核酸マイクロアレイの概略平面図
【図４】アレル1/1検体の解析結果
【図５】アレル1/5検体の解析結果
【図６】アレル4/5検体の解析結果
【図７】アレル5/14検体の解析結果
【図８】アレル1/18検体の解析結果
【図９】アレル1/21検体の解析結果
【図１０】アレル5/36検体の解析結果
【符号の説明】
【００７８】
３０１：標的核酸
３０３：第１遺伝子
３０５：第２遺伝子
３０７：第１の相同領域
３０９：第２の相同領域
３１０：第１の相同領域と第２の相同領域の組換えにより生じた相同領域 
３１１：標的核酸 
３１３：第２の遺伝子点変異を増幅するための点変異増幅用プライマー（順方向）
３１５：第２の遺伝子点変異を増幅するための点変異増幅用プライマー（逆方向）
３１７：第２の遺伝子欠損を増幅するための欠損増幅用プライマー（順方向）
３１９：第２の遺伝子欠損を増幅するための欠損増幅用プライマー（逆方向）
３２１：第２の遺伝子点変異を検出するための点変異検出用プローブ
３２２：マイクロアレイ
３２３：第２の遺伝子欠損を検出するためのプローブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010110258.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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