(57)【要約】【課題】インターカレーター等のように発がん性を有する化合物を使用しないため安全性に優れ、簡便かつ精度の良好な二本鎖ＤＮＡの検出方法を提供する。特に、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等に代表される遺伝子増幅反応により得られる二本鎖ＤＮＡの検出方法を提供する。【解決手段】二本鎖ＤＮＡの検出方法であって、二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターを含む試料溶液を電極に接触させて、該電極表面におけるメディエーターの酸化還元電位を測定することを特徴とする二本鎖ＤＮＡの検出方法である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡの検出方法であって、二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターを含む試料溶液を電極に接触させて、該電極表面におけるメディエーターの酸化還元電位を測定することを特徴とする二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【請求項２】
試料溶液中のメディエーターの濃度が０．０１〜１００ｍＭである請求項１記載の二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【請求項３】
試料溶液中の二本鎖ＤＮＡの濃度が１０−９〜１０−５Ｍである請求項１又は２記載の二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【請求項４】
試料溶液が更に塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを含む請求項１〜３のいずれか記載の二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【請求項５】
二本鎖ＤＮＡが遺伝子増幅反応により得られたものである請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【請求項６】
遺伝子増幅反応により二本鎖ＤＮＡを含む被検試料を得てから、該被検試料とメディエーターを含む検出試料とを混合して得られる試料溶液を電極に接触させる請求項５記載の二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電極表面において電子の授受が行われるメディエーターを用いた二本鎖ＤＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の検出や濃度測定方法として、核酸塩基に由来する２６０ｎｍ付近の吸収極大波長を測定する方法、二本鎖ＤＮＡの塩基対の間に挿入されることにより一本鎖ＤＮＡには結合しないが二本鎖ＤＮＡと特異的に結合するインターカレーターを用いて電気化学的に測定する方法等が知られている。例えば、特許文献１には、一本鎖ＤＮＡには結合しないが二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する電気化学的に活性な遺伝子結合性物質を用いて、遺伝子合成反応前における遺伝子結合性物質及び被検試料を含む混合液の電気化学的応答と、遺伝子合成反応後における該混合液の電気学的応答とを比較することを特徴とする遺伝子の検出方法について記載されている。しかしながら、インターカレーターのような遺伝子結合性物質は発がん性を有するため、安全面での問題があり改善が望まれていた。
【０００３】
一方、電極表面において電子の授受が行われるメディエーターを用いて一本鎖ＤＮＡを検出する方法が知られている。例えば、特許文献２には、電極にプローブ核酸単鎖が結合された修飾電極を、分析物核酸単鎖とメディエーターである酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、酸化還元マーカーの酸化還元反応を測定する核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法について記載されている。これによれば、１塩基のミスマッチまでも高い精度で検出できるため遺伝的疾患やウィルス性疾患を診断することが可能であるとされている。しかしながら、検出するにあたってプローブ核酸単鎖を電極に固定する必要があるとともに、プローブ核酸単鎖と相補的に結合させるために二本鎖ＤＮＡを核酸単鎖にする過程が必要であり、より簡便に検出可能な測定方法が望まれていた。また、特許文献２に記載の検出方法では特定の核酸単鎖については検出できるが、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等に代表される遺伝子増幅反応によって得られる二本鎖ＤＮＡを検出することができず改善が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２１８９９８号公報
【特許文献２】特許第３９５６２１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、インターカレーター等のように発がん性を有する化合物を使用しないため安全性に優れ、簡便かつ精度の良好な二本鎖ＤＮＡの検出方法を提供することを目的とするものである。また、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等に代表される遺伝子増幅反応により得られる二本鎖ＤＮＡの検出方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題は、二本鎖ＤＮＡの検出方法であって、二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターを含む試料溶液を電極に接触させて、該電極表面におけるメディエーターの酸化還元電位を測定することを特徴とする二本鎖ＤＮＡの検出方法を提供することによって解決される。
【０００７】
このとき、試料溶液中のメディエーターの濃度が０．０１〜１００ｍＭであることが好適であり、試料溶液中の二本鎖ＤＮＡの濃度が１０−９〜１０−５Ｍであることが好適である。試料溶液が更に塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを含むことが好適であり、二本鎖ＤＮＡが遺伝子増幅反応により得られたものであることも好適である。また、遺伝子増幅反応により二本鎖ＤＮＡを含む被検試料を得てから、該被検試料とメディエーターを含む検出試料とを混合して得られる試料溶液を電極に接触させる二本鎖ＤＮＡの検出方法が本発明の好適な実施態様である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、簡便かつ精度の良好な二本鎖ＤＮＡの検出方法を提供することができる。特に、インターカレーター等のように発がん性を有する化合物を使用しないため安全性に優れており、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等に代表される遺伝子増幅反応により得られる二本鎖ＤＮＡを検出することができるため、様々な種類の二本鎖ＤＮＡを検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明で用いられる印刷電極の一例を示した図である。
【図２】本発明で用いられる参照電極から１ｍｍ程度の位置でカットされた印刷電極の一例を示した図である。
【図３】実施例１において、ＤＰＶにより得られた電流電圧曲線である。
【図４】実施例２において、ＤＰＶにより得られた電流電圧曲線である。
【図５】実施例３において、ＤＰＶにより得られた電流電圧曲線である。
【図６】実施例４において、ＤＰＶにより得られた電流電圧曲線である。
【図７】実施例５において、ＤＰＶにより得られた電流電圧曲線である。
【図８】実施例６において、ＤＰＶにより得られたピーク電流値と二本鎖ＤＮＡ濃度との関係を示す図である。
【図９】実施例７において、ＤＰＶにより得られた電流電圧曲線である。
【図１０】実施例８において、ＤＰＶにより得られた電流電圧曲線である。
【図１１】実施例９において、ＤＰＶにより得られた電流電圧曲線である。
【図１２】実施例１０において、ＣＶにより得られたサイクリックボルタモグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の二本鎖ＤＮＡの検出方法は、二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターを含む試料溶液を電極に接触させて、該電極表面におけるメディエーターの酸化還元電位を測定することを特徴とする。本発明者らにより、二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターを含む試料溶液を電極に接触させ、該電極表面におけるメディエーターの酸化還元電位を測定する際に、マイナスのチャージを帯びた二本鎖ＤＮＡが電極表面に存在することにより、二本鎖ＤＮＡが存在しない場合と比べてメディエーターの酸化還元電位のピーク電流値が低下することが明らかとなった。即ち、本発明の二本鎖ＤＮＡの検出方法は、マイナスのチャージを帯びた二本鎖ＤＮＡが電極表面に存在した場合に該電極表面におけるメディエーターの電子移動が阻害されることを利用したものである。また、本発明では、電極表面に存在する二本鎖ＤＮＡの量に伴ってメディエーターの酸化還元電位のピーク電流値の変化量が異なるため、二本鎖ＤＮＡの有無を検出できるだけでなく、二本鎖ＤＮＡの濃度測定が可能である。
【００１１】
本発明で用いられるメディエーターとしては、二本鎖ＤＮＡに結合するものではなく、電極表面において電子の授受が行われるものであって酸化還元電位の測定が可能であれば特に限定されない。このようなメディエーターを用いて酸化還元電位を測定することにより、二本鎖ＤＮＡの検出が可能となる。本発明で用いられるメディエーターの具体例としては、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム、フェロシアン化リチウム等に代表されるフェロシアン化アルカリ金属化合物などの２価の鉄塩及びその誘導体；フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェリシアン化リチウム等に代表されるフェリシアン化アルカリ金属化合物などの３価の鉄塩及びその誘導体；ｐ−ベンゾキノン、１，４−ナフトキノン、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）などのキノン系化合物及びその誘導体；フェロセン、フェロセンカルボン酸などのフェロセン及びその誘導体；インドフェノール、２，６−ジクロロインドフェノールなどのインドフェノール及びその誘導体；フェナジンメトサルフェート、フェナジンエトサルフェートなどのフェナジン系化合物及びその誘導体；その他、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、チオニン化合物、ガロシアニン化合物、メチレンブルーなどが挙げられる。精度良く測定できるとともに安全性に優れる観点から、メディエーターとしては、２価の鉄塩及びその誘導体が好ましく用いられ、中でもフェロシアン化アルカリ金属化合物がより好ましく用いられる。
【００１２】
本発明で用いられるメディエーターの濃度としては特に限定されず、試料溶液中のメディエーターの濃度が０．０１〜１００ｍＭであることが好ましい。試料溶液中のメディエーターの濃度が０．０１ｍＭ未満の場合、二本鎖ＤＮＡの検出が困難となるおそれがあり、０．０２ｍＭ以上であることがより好ましく、０．０３ｍＭ以上であることが更に好ましい。一方、試料溶液中のメディエーターの濃度が１００ｍＭを超える場合、測定精度が低下するおそれがあり、５０ｍＭ以下であることがより好ましく、１０ｍＭ以下であることが更に好ましく、５ｍＭ以下であることが特に好ましい。ここで、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等に代表される遺伝子増幅反応を行い、得られた二本鎖ＤＮＡを含む反応溶液を用いて酸化還元電位の測定を行う場合には、反応溶液に含まれるＭｇイオンや遊離の塩基等が電気化学特性に影響を与えるおそれがあるため、メディエーターの濃度がそれ程度低くない方が好ましいことを本発明者らは確認している。具体的には、メディエーターの濃度が１ｍＭ以上であることが特に好ましい。
【００１３】
本発明では、検出対象が二本鎖ＤＮＡであれば特に限定されない。好適には遺伝子増幅反応により得られた二本鎖ＤＮＡであり、鋳型ＤＮＡが微量しか存在しない場合であっても検出が可能となる利点を有する。また、遺伝子増幅反応で用いられる鋳型としては、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても構わない。遺伝子増幅反応としては特に限定されず、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などが挙げられる。中でもＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法が好ましく用いられ、等温条件下でより簡便に二本鎖ＤＮＡの検出方法が提供できる観点からは、ＬＡＭＰ法がより好ましく用いられる。
【００１４】
上記ＰＣＲ法を用いて遺伝子増幅反応を行う場合は、例えば、鋳型ＤＮＡやプライマーとともにＴａｑポリメラーゼに代表される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を用いて、初期変性反応を９５〜９７℃で数分間実施した後に、（１）ＤＮＡの変性工程（９０〜９４℃で約３０秒間）、（２）一本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程（５０〜６０℃で約３０秒間）、（３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応（７０〜７５℃で約１〜２分間）からなる（１）〜（３）の増幅サイクルを１５〜４５回繰り返すことにより好適に行われる。
【００１５】
また、ＬＡＭＰ法を用いて遺伝子増幅反応を行う場合は、例えば、６箇所の領域を含む４種類のプライマーを設定して等温条件下で約１時間反応させることにより好適に行われる。等温条件下で遺伝子増幅反応を行うことができるため、二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの変性工程が不要であり、より簡便な二本鎖ＤＮＡの検出方法が提供できるため好ましい。
【００１６】
また、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて遺伝子増幅反応を行う場合は、例えば、鋳型ＲＮＡに対して逆転写酵素やオリゴ（ｄＴ）プライマー等を用いて逆転写反応を実施した後、ＰＣＲ法と同様に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた上記（１）〜（３）の増幅サイクルを繰り返すことにより好適に行われる。
【００１７】
本発明で検出される二本鎖ＤＮＡの濃度としては特に限定されず、試料溶液中の二本鎖ＤＮＡの濃度が１０−９〜１０−５Ｍであることが好ましい。試料溶液中の二本鎖ＤＮＡの濃度が１０−９Ｍ未満の場合、二本鎖ＤＮＡの検出が困難となるおそれがあり、２×１０−９Ｍ以上であることがより好ましく、３×１０−９Ｍ以上であることが更に好ましい。一方、試料溶液中の二本鎖ＤＮＡの濃度が１０−５Ｍを超える場合、二本鎖ＤＮＡの定量が困難となるおそれがあり、５×１０−6Ｍ以下であることがより好ましく、１０−６Ｍ以下であることが更に好ましい。
【００１８】
本発明で用いられる電極としては、作用電極、参照電極及び対極を備えており、酸化還元電位が測定可能であれば特に限定されない。二本鎖ＤＮＡを簡便に検出できるとともに、少量の試料溶液で測定できる観点から、作用電極、参照電極及び対極が所定のパターンで印刷形成された印刷電極が好適に用いられる。また、後述する実施例１と実施例２との比較からも分かるように、電極面積を小さくすることにより二本鎖ＤＮＡを感度良く測定できることが本発明者らにより確認されている。また、印刷電極は、その形状が平板状であり装置等に固定することが容易であるため、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等に代表される遺伝子増幅反応を行ってそのままメディエーターの酸化還元電位を測定する方法を好適に採用することができる。
【００１９】
本発明の二本鎖ＤＮＡの検出方法は、二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターを含む試料溶液を電極に接触させて、該電極表面におけるメディエーターの酸化還元電位を測定することを特徴とする。二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターを含む試料溶液を電極に接触させるに際しては、二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターが予め均一に混合された試料溶液に電極を浸けて接触させる態様であってもよいし、該試料溶液を電極上に滴下して接触させる態様であってもよい。本発明では、上述のように電極に接触された試料溶液に電圧を印加することにより電極表面におけるメディエーターの酸化還元電位が測定される。酸化還元電位を測定する方法としては特に限定されず、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）、微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）、クロノアンペロメトリー（ＣＡ）等が挙げられる。
【００２０】
本発明では、二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターを含む試料溶液に、更に塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを含むことが好ましい。試料溶液に塩化ナトリウムが含まれることにより、指示電解質の役割として機能する利点を有する。塩化ナトリウムを添加する場合は、塩化ナトリウム水溶液の形態で用いられることが好ましい。用いられる塩化ナトリウムの濃度としては特に限定されず、試料溶液中の塩化ナトリウム濃度が０．０１〜５Ｍであることが好ましい。また、後述する実施例７からも分かるように、本発明で使用した印刷電極を用いる場合、試料溶液に塩化カリウムが含まれることにより、検出対象である二本鎖ＤＮＡの濃度差が大きい場合であっても得られる電流ピークの横軸における位置が揃うため、より精度の高い測定を行うことができる利点を有する。塩化カリウムを添加する場合は、塩化カリウム水溶液の形態で用いられることが好ましい。用いられる塩化カリウムの濃度としては特に限定されず、試料溶液中の塩化カリウム濃度が０．０１Ｍ以上であり飽和濃度以下であることが好ましい。
【００２１】
上述のように、本発明の二本鎖ＤＮＡの検出方法は、二本鎖ＤＮＡ及びメディエーターを含む試料溶液を電極に接触させて、該電極表面におけるメディエーターの酸化還元電位を測定することを特徴とする。このとき、遺伝子増幅反応により二本鎖ＤＮＡを含む被検試料を得てから、該被検試料とメディエーターを含む検出試料とを混合して得られる試料溶液を電極に接触させることが本発明の好適な実施態様である。試料溶液を調製するにあたっては、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等に代表される遺伝子増幅反応を行って二本鎖ＤＮＡを含む被検試料を得た後に、得られた被検試料と予め調製しておいたメディエーターを含む検出試料とを混合する方法が好適に採用される。
【００２２】
また、遺伝子増幅反応により得られた二本鎖ＤＮＡを検出する場合、遺伝子増幅反応させる際の反応容器内において被検試料と検出試料とが隔離されており、遺伝子増幅反応後に被検試料と検出試料とを適宜混合してそのままメディエーターの酸化還元電位を測定する検出方法も好適に採用される。更に、遺伝子増幅反応させる際の反応容器内において被検試料と検出試料とが隔離されておらず、電極表面におけるメディエーターの酸化還元電位を適宜測定することにより、遺伝子増幅反応により得られた二本鎖ＤＮＡをリアルタイムで検出する方法も好適に採用される。このとき、メディエーターの濃度がそれ程高くない方が遺伝子増幅反応に影響を与えないため好ましいことを本発明者らは確認している。
【００２３】
本発明の二本鎖ＤＮＡの検出方法によれば、光学系装置を必要としないため検出装置を小型化することが容易であり、バイオセンサー、バイオチップ、リアルタイムＰＣＲ等に利用することが可能である。また、本発明で用いられるメディエーターは、インターカレーター等のように発がん性を有しないので安全性に優れており、家庭や生産現場等で好適に使用され、廃棄等の問題も生じない。例えば、病原性菌の検出や食肉検査等に応用することが可能である。特に、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等に代表される遺伝子増幅反応により得られる二本鎖ＤＮＡを検出することもできるため、安全かつ簡便な検出方法を提供することができ、プライマーの設計により様々な種類の二本鎖ＤＮＡを検出することが可能である。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。
【００２５】
実施例１
メディエーターの一例として純水で濃度調製した１０ｍＭのフェロシアン化カリウム（Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］）水溶液を用いた。また、１０ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ（「Ｓｈｅａｒｅｄ  Ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ」バイオダイナミクス社製）を５ＭのＮａＣｌ水溶液で希釈して１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。上記１０ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液０．１ｍＬと、上記１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液０．１ｍＬとをそれぞれ混ぜて混合溶液を調製した。印刷電極（「Ｄｅｐ−Ｃｈｉｐ」作用電極：カーボン、参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ、対極：カーボン、作用電極面積：約８ｍｍ２）上に混合溶液２０μＬをそれぞれ滴下して、ＥＣＯ  ＣＨＥＭＩＥ社製の「μＡｕｔｏｌａｂｏIII」を用いて微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）により電気化学特性を測定した。ＤＰＶによる測定は、作用電極の電位を０Ｖから０．７Ｖに変化させていき、電位増加０．０４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス期間０．２秒、掃引速度０．０１Ｖ／ｓで行った。得られた電流電圧曲線を図３に示す。二本鎖ＤＮＡが含まれないネガティブコントロールと比べて、二本鎖ＤＮＡ溶液の濃度が高くなるにつれてピーク電流値の低下が確認された。
【００２６】
実施例２
実施例１において、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液をそれぞれ調製し、１０ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液とそれぞれ混ぜて得られた混合溶液を参照電極から１ｍｍ程度の位置でカットした印刷電極（作用電極面積：約４ｍｍ２）上に１０μＬずつ滴下した以外は、実施例１と同様にしてＤＰＶにより電気化学特性を測定した。得られた電流電圧曲線を図４に示す。二本鎖ＤＮＡが含まれないネガティブコントロールと比べて、二本鎖ＤＮＡ溶液の濃度が高くなるにつれてピーク電流値の低下が確認された。
【００２７】
実施例３
実施例１において、１０ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液の代わりに２０ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液を用い、５ＭのＮａＣｌ水溶液の代わりに２ＭのＮａＣｌ水溶液を用いて１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した以外は、実施例１と同様にしてＤＰＶにより電気化学特性を測定した。得られた電流電圧曲線を図５に示す。二本鎖ＤＮＡが含まれないネガティブコントロールと比べて、二本鎖ＤＮＡ溶液の濃度が高くなるにつれてピーク電流値の低下が確認された。
【００２８】
実施例４
実施例１において、１０ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液の代わりに１００ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液を用い、５ＭのＮａＣｌ水溶液の代わりに２ＭのＮａＣｌ水溶液を用いて１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した以外は、実施例１と同様にしてＤＰＶにより電気化学特性を測定した。得られた電流電圧曲線を図６に示す。二本鎖ＤＮＡが含まれないネガティブコントロールと比べて、二本鎖ＤＮＡ溶液の濃度が高くなるにつれてピーク電流値の低下が確認された。
【００２９】
実施例５
ＤＮＡ濃度測定の一例として、純水で濃度調製した２５ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液を用いて電気化学特性の測定を行った。また、１０ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ（「Ｓｈｅａｒｅｄ  Ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ」バイオダイナミクス社製）を純水で希釈して５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。上記２５ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液１μＬ及び飽和ＫＣｌ水溶液３７５μＬと、上記５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液３７５μＬとをそれぞれ混ぜて混合溶液を調製した。得られた混合溶液を９６ｗｅｌｌプレートに２５０μＬずつ入れ、そこに印刷電極（「Ｄｅｐ−Ｃｈｉｐ」作用電極：カーボン、参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ、対極：カーボン、作用電極面積：約８ｍｍ２）を浸してＥＣＯ  ＣＨＥＭＩＥ社製の「μＡｕｔｏｌａｂｏIII」を用いて微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）により電気化学特性を測定した。ＤＰＶによる測定は、作用電極の電位を０Ｖから０．７Ｖに変化させていき、電位増加０．０４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス期間０．２秒、掃引速度０．０１Ｖ／ｓで行った。得られた電流電圧曲線を図７に示す。二本鎖ＤＮＡが含まれないネガティブコントロールと比べて、二本鎖ＤＮＡ溶液の濃度が高くなるにつれてピーク電流値の低下が確認された。
【００３０】
実施例６
実施例５において、１０ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ（「Ｓｈｅａｒｅｄ  Ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ」バイオダイナミクス社製）を純水で希釈して３μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液をそれぞれ調製し、飽和ＫＣｌ溶液とそれぞれ混ぜて得られた混合溶液を９６ｗｅｌｌプレートに２２０μＬずつ入れた以外は、実施例５と同様にしてＤＰＶにより電気化学特性を測定した。ＤＰＶにより得られたピーク電流値とＤＮＡ濃度との関係を図８に示す。
【００３１】
実施例７
メディエーターの一例として純水で濃度調製した１００ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液を用いた。また、１０ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ（「Ｓｈｅａｒｅｄ  Ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ」バイオダイナミクス社製）を飽和ＫＣｌ水溶液で希釈して１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。上記１００ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液１μＬ及び飽和ＫＣｌ水溶液２５μＬと、上記１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液２５μＬとをそれぞれ混ぜて混合溶液を調製した。得られた混合溶液を参照電極から１ｍｍ程度の位置でカットした印刷電極（「Ｄｅｐ−Ｃｈｉｐ」作用電極：カーボン、参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ、対極：カーボン、作用電極面積：約４ｍｍ２）上に１０μＬ滴下して、ＥＣＯ  ＣＨＥＭＩＥ社製の「μＡｕｔｏｌａｂｏIII」を用いてＤＰＶにより電気化学特性を測定した。得られた電流電圧曲線を図９に示す。二本鎖ＤＮＡが含まれないネガティブコントロールと比べて、二本鎖ＤＮＡ溶液の濃度が高くなるにつれてピーク電流値の低下が確認された。
【００３２】
実施例８
遺伝子増幅産物の測定の一例として、純水で濃度調製した１００ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液を用いて電気化学特性の測定を行った。Ｔａｋａｒａ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。鋳型ＤＮＡとしては、キット中のポジティブコントロール遺伝子を用いた。ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社製の（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ「ＳｔｅｐＯｎｅ」）を用いて、以下に示される反応条件で行った。
初期変性工程：９４℃、５分
（１）ＤＮＡの変性工程：９４℃、３０秒
（２）アニーリング工程：５５℃、３０秒
（３）ＤＮＡの伸長工程：７２℃、３０秒
（１）〜（３）の工程を３５回繰り返した。
【００３３】
上記１００ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液１μＬ、ＰＣＲ反応により得られたＰＣＲ反応液２０μＬ、及び飽和ＫＣｌ水溶液３０μＬを混ぜて混合溶液を調製した。参照電極から１ｍｍ程度の位置でカットした印刷電極（「Ｄｅｐ−Ｃｈｉｐ」作用電極：カーボン、参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ、対極：カーボン、作用電極面積：約４ｍｍ２）上に混合溶液１０μＬを滴下して、ＥＣＯ  ＣＨＥＭＩＥ社製の「μＡｕｔｏｌａｂｏIII」を用いてＤＰＶにより電気化学特性を測定した。得られた電流電圧曲線を図１０に示す。ＰＣＲ反応液が含まれないネガティブコントロールと比べてピーク電流値の低下が確認された。
【００３４】
実施例９
遺伝子増幅産物の測定の一例として、純水で濃度調製した２０ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液を用いて電気化学特性の測定を行った。Ｌｏｏｐ  Ｌａｍｐ  Ｏ１５７  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（栄研化学株式会社製）を用いてＬａｍｐ法により遺伝子増幅反応を行った。鋳型ＤＮＡとしてキット中のＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏ１５７を用い、Ｌａｍｐ法による遺伝子増幅反応は、アズワン社製のドライブロックバス「ＥＢ−３０３」を用いて６５℃で１時間、キットの説明書に従い反応を行った。
【００３５】
上記２０ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液２５μＬ、Ｌａｍｐ法により得られたＬａｍｐ反応液１０μＬ、及び５ＭのＮａＣｌ水溶液１５μＬを混ぜて混合溶液を調製した。参照電極から１ｍｍ程度の位置でカットした印刷電極（「Ｄｅｐ−Ｃｈｉｐ」作用電極：カーボン、参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ、対極：カーボン、作用電極面積：約４ｍｍ２）上に混合溶液１０μＬを滴下して、ＥＣＯ  ＣＨＥＭＩＥ社製の「μＡｕｔｏｌａｂｏIII」を用いてＤＰＶにより電気化学特性を測定した。得られた電流電圧曲線を図１１に示す。Ｌａｍｐ反応液が含まれないネガティブコントロールと比べてピーク電流値の低下が確認された。
【００３６】
実施例１０
ＤＰＶ以外の測定法の一例として、純水で濃度調製した１ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液を用いて電気化学特性の測定を行った。また、１０ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ（「Ｓｈｅａｒｅｄ  Ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ」バイオダイナミクス社製）を５ＭのＮａＣｌ水溶液で希釈して５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。上記１ｍＭのフェロシアン化カリウム水溶液０．１ｍＬと、上記５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液０．１ｍＬとをそれぞれ混ぜて混合溶液を調製した。印刷電極（「Ｄｅｐ−Ｃｈｉｐ」作用電極：カーボン、参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ、対極：カーボン、作用電極面積：約８ｍｍ２）上に混合溶液２０μＬをそれぞれ滴下して、ＥＣＯ  ＣＨＥＭＩＥ社製の「μＡｕｔｏｌａｂｏIII」を用いて、Ｓｔｅｐ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：１ｍＶ、Ｓｃａｎ  ｒａｔｅ：１００ｍＶ／ｓｅｃの測定条件でサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）により電気化学特性を測定した。得られたサイクリックボルタモグラムを図１２に示す。二本鎖ＤＮＡが含まれないネガティブコントロールと比べて、二本鎖ＤＮＡ溶液の濃度が高くなるにつれてピーク電流値の低下が確認された。
【符号の説明】
【００３７】
１  印刷電極
２  カットした印刷電極
３  参照電極
４  作用電極
５  対極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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