(57)【要約】【課題】ポリペプチドの生成を変更するための新規な方法の提供。【解決手段】（ａ）ポリペプチドをコードするDNA 配列を含んで成る細胞中に、核酸構造体を、その核酸構造体が突然変異細胞を生成するために前記ポリペプチドをコードするDNA 配列内に存在しない遺伝子座で細胞のゲノム中に組込む条件下で導入し、ここで前記核酸の組込みが、突然変異細胞及び親細胞が同じ条件下で培養される場合、親細胞に対する突然変異細胞によるポリペプチドの生成を変更し；そして（ｂ）ポリペプチドの変更された生成を有する突然変異細胞を同定することを含んで成る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のＤＮＡ配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii）突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項２】
核酸構成体が、第１のDNA配列と40％未満の相同性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸構成体が該遺伝子座と40％未満の相同性を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子座が第１のDNA配列とは異なる染色体上にあるか又は第１のDNA配列の５' 又は３' 末端から3000bps のところではあるが同じ染色体上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（Ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内に無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入は、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を分断し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項６】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの転写の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも無い１つの遺伝子産で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを発現する；
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項７】
核酸構成体が、第１のDNA配列と40％未満の相同性を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
核酸構成体が該遺伝子座と40％未満の相同性を有している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子座が第１のDNＡ配列とは異なる染色体上にあるか又は第１のDNA配列の５' 又は３' 末端から3000bps のところではあるが同じ染色体上にある、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
（Ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内に無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入は、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を分断し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを発現する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項１１】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの翻訳の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを合成する；
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項１２】
核酸構成体が、第１のDNA配列と40％未満の相同性を有する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
核酸構成体が該遺伝子座と４０％未満の相同性を有している、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子座が第１のDNA配列とは異なる染色体上にあるか又は第１のDNA配列の５' 又は３' 末端から3000bps のところではあるが同じ染色体上にある、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
（Ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内に無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入は、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を分断し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを合成する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項１６】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの分泌の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを分泌する；
培養段階、
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項１７】
核酸構成体が、第１のDNA配列と40％未満の相同性を有する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
核酸構成体が該遺伝子座と40％未満の相同性を有している、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子座が第１のDNA配列とは異なる染色体上にあるか又は第１のDNA配列の５' 又は３' 末端から3000bps のところではあるが同じ染色体上にある、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
（Ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内に無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入は、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を分断し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを分泌する、
培養段階、
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項２１】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、又該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第２のDNA配列内にも無い遺伝子座において、この遺伝子座と相同でない核酸構成体を親細胞のゲノム内に無作為に組込むことによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項２２】
核酸構成体が、制限酵素により媒介される組込みによって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸構成体が選択可能なマーカーを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
選択可能なマーカーが amdＳ，arg Ｂ，bar, hygＢ，nia Ｄ，pyr Ｇ，ｓＣ又は trpＣである請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
親細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
親細胞が細菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
親細胞が真菌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
真菌細胞が糸状真菌細胞である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
糸状真菌細胞が Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humnicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium Scytalidium, Thielavia, Tolypocladium 及び Trichodermaの中から選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
真菌細胞が酵母細胞である、請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドが組換え型ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドが非相同ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドがホルモン、ホルモン変異体、酵素、レセプタ又はその一部分、抗体又はその一部分又はリポータである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
ポリペプチドが、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
ポリペプチドが、アミノペプチターゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボスクレアーゼ、エステラーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファーグルコシターゼ、ベーターグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フイターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はキシラナーゼである、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
突然変異体細胞が、親細胞に比べて増大した無機補因子の摂取量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
突然変異体細胞が、親細胞に比べて更に望ましい形態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
突然変異体細胞が、親細胞に比べて高い、単数又は複数の分泌タンパク質の収量を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
突然変異体細胞が、単数又は複数の必須代謝産物を合成する能力を喪失している、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
突然変異体細胞の表現型が、或る一定の条件下でのみ観察される、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
突然変異体細胞が、親細胞に比べて変化した成長率を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
突然変異体細胞の成長は、ポリペプチド又は代謝産物の高レベルの産生を誘発する条件下で成長させられた時点で、望ましいポリペプチド又は代謝産物の過剰産生によって阻害されない、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
突然変異体細胞は、親細胞よりも低い酸素条件を寛容することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
突然変異体細胞は、親細胞に比べ変化したプロモータの転写活性化物質の産生を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
突然変異体細胞は、親細胞のシグナルトランスダクション経路の遺伝子のうち単数又は複数のものの中に突然変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
突然変異体細胞が隠性イントロンを認識したり誤ってスプライシングしたりしない、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
核酸構成体が、pDSY109，pDSY112，pMT1936，pDSY138，pDSY162，pDSY163，pDSY141，pSMO1204，pSMOH603，p4-8.1，p7-14.1，pHB220，pSMO717，pSMO321，pHowB571又はpSMO810である、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
遺伝子座が、配列番号９，16，25，29，34，39，50，56，63，66，71，76又はそれらのフラグメントである請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
遺伝子座がグルコース輸送体、マンニトール−１−リン酸デヒドロゲナーゼ、キチンシンターゼ、熱ショックタンパク質、マンガンスーパオキシドジスムターゼ又は pacＣの活性化に必要とされる遺伝子をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
遺伝子座が palＢ遺伝子である、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌の正の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも少ないポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項５２】
（ａ）代謝産物の産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、（ｂ）第１のポリペプチドの転写、翻訳又は分泌の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、（ｃ）該条件下で第１のポリペプチドのいずれかを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも、又（ｄ）第２の代謝産物の第２の生合成経路内で第２のポリペプチドをコードする単数又は複数の第４のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、代謝産物の生合成経路内で第１のポリペプチドをコードする単数又は複数の第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで該生合成経路と第２の生合成経路には、同じ中間体の産生が関与し、第２のポリペプチドが中間体の産生後に１つの段階の触媒として作用し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くの代謝産物を産生する、
培養段階、及び
（ｂ）代謝産物を回収する段階、
を含んで成る、代謝産物の産生方法。
【請求項５３】
第１のポリペプチドの産生方法において
（ａ）該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、第２のポリペプチドの転写、翻訳又は分泌の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、第１のポリペプチドの産生を導く条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で、第１のDNA配列を含む親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって突然変異体細胞を形成する段階；
（ｂ）突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する突然変異体細胞を分離する段階；
（ｃ）核酸構成体が組込まれた遺伝子座を同定する段階；
（ｄ）対応する遺伝子座が分断された細胞を産生する段階；
（ｅ）該条件下で細胞を培養する段階、及び
（ｆ）第１のポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る方法。
【請求項５４】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第２のDNA配列内にもない１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入がポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を特異的に増強し、
（ii）突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞によるポリペプチドの生成を変更するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を突然変異誘発することによってポリペプチドに生成を変更するためにいくつかの方法が使用されて来た。たとえば、タンパク質の生成は、突然変異現象の頻度を高めるために突然変異誘発剤としての化学的、物理的及び生物学的物質により細胞を処理することを包含する従来の突然変異誘発により変異細胞を生成することによって変更されて来た。
【０００３】
タンパク質の生成はまた、１つの又は時々、いくつかの抗生物質に対する耐性を通常コードするトランスポゾンと呼ばれる、2000以上の塩基対から成る二本鎖DNA の短い断片による細胞の突然変異誘発により変更されて来た。トランスポゾンは、細菌染色体とプラスミドとの間でさえ、ゲノム内を移動し、又は飛び移ることができ、そしてそれらはゲノム上の多くの異なった部位に組込まれるようになる。構造遺伝子内へのトランスポゾンの挿入は、遺伝子の正常なヌクレオチド配列を中断し、その結果、それは正常な機能的ポリペプチドの合成のための情報をもはや供給し得なくなる（Seifert など., 1986, Proceedings of the National Academy of Science USA 83 : 735-739) 。
【０００４】
挿入はまた、その遺伝子生成物が発現のために必要とされる遺伝子を破壊する（Marquez - Magafla and Chamberlin, 1994, Journal of Bacteriology 176 : 2427-2434)。さらに、Erredeなど. (1980, Cell 22 : 427-436) は、過剰生成を引き起こすイソ−２−チトクロムＣをコードする構造遺伝子に隣接する転移要素の挿入を開示する。さらに、WO96/29414は、トランスポゾン及び標的化された遺伝子を調節することができるDNA 配列を含む転移要素が構成され、その細胞中への導入に基づいて、転移要素が、遺伝子の発現を調節する態様で細胞のゲノム中に組込むことを開示する。
【０００５】
ポリペプチドの生成を高めるための広く使用される方法は、ポリペプチドをコードする遺伝子の複数のコピーを生成するための増幅である。たとえば、アメリカ特許第 5,578,461号は、遺伝子とタンデムに並んで増幅可能選択マーカー遺伝子の相同組換えを通しての包含を開示し、ここで選択マーカーの増幅されたコピーを含む細胞が適切な選択剤の存在下でその細胞を培養することによって選択され得る。
【０００６】
さらに、ポリペプチドの生成は、１つのプロモーターを、異なったプロモーターにより、又は１つのシグナルペプチドコード領域を他の領域により置換することによって高められて来た。アメリカ特許第 5,641,670号を参照のこと。
【０００７】
種々の調節要素をコードする遺伝子を破壊することによって遺伝子発現を変更するための方法がまた記載されている。たとえば、Tomaなど. (1986, Journal of Bacteriology 167 : 740-743) は、npr プロモーター領域における−156 〜−90の欠失がnpr 遺伝子によりコードされる中性プロテアーゼの過剰発現を引き起こしたことを示した。Pero and Sloma (1993, A.L. Sonensheim, J.A. Hoch, and R. Losick, editors, Bucillus subtilis and Other Gram - Positive Bacteria, pp. 939-952, American Society for Microbiology, Washinton, DC)は、胞子形成遺伝子spoOA がプロテアーゼの不十分な合成をもたらし、そしてabrB遺伝子における突然変異が合成を再生することを開示する。
【０００８】
ポリペプチドの生成はまた、ポリペプチドを生成するための条件下で、ポリペプチドをハイブリダイズできるプロテアーゼをコードするDNA 配列を破壊することによって高められて来た。
ポリペプチドの分泌はまた、分泌タンパク質の過剰生成（Ruohonenなど., 1997, Yeast, 13 : 337-351) により、及び超−分泌性細胞の生成（アメリカ特許第 5,312,735号）により変更されて来た。
【０００９】
代謝物の生成を高めるための方法もまた記載されている。たとえば、WO96/41886号は、セファロスポリン経路におけるＬ−リシンのＬ−α−アミノアジピン酸の転換を妨げることによる、クラバム経路の少なくとも一部及びセファロスポリン経路の少なくとも一部を有する生物により生成されるクラバムの高められた生成を開示する。WO94/13813号は、ベタイン、すなわち酵素インジューサーを分解するタンパク質をコードする遺伝子の破壊を開示する。
ポリペプチド及び代謝物の生成を変更するための新規及び改良された方法論を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、細胞によるポリペプチドの生成を変更するための方法に関する。本発明の方法においては、核酸構造体が、特定のポリペプチドをコードするDNA 配列を含む細胞中に導入される。その導入された核酸構造体は、変異細胞を生成するために興味あるDNA 配列内に存在しない遺伝子座で宿主ゲノム中に組込む。遺伝子座中への核酸構造体の組込みが、親細胞に対する変異細胞によるポリペプチドの生成を変更する。次に、変異細胞が同定され、ここでポリペプチドの生成が親細胞に対する変異細胞により変更される。変更は、変異細胞及び親細胞が同じ条件下で培養される場合、ポリペプチドの生成を比較することによって決定される。
【００１１】
本発明の利点は、突然変異が再生され得、そして突然変異に含まないDNA 配列によりコードされるポリペプチドの生成の変更を導びくことである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、pJaL292 の制限地図である。
【図２】図２は、pKS6の制限地図である。
【図３】図３は、pBANe13 の制限地図である。
【図４】図４は、pBANe6の制限地図である。
【図５】図５は、pMHan37 の制限地図である。
【００１３】
【図６】図６は、pBANe8の制限地図である。
【図７】図７は、pSO2の制限地図である。
【図８】図８は、pSO122の制限地図であり、そしてpSO122からのpDSY81及びpDSY82の構成を示す。
【図９】図９は、変異体アスペルギラス  オリザエ（Aspergillus oryzae) DEBY599.3 の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列である（それぞれ、配列番号９及び10）。
【図１０】図10は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY10.3の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号16及び17）である。
【００１４】
【図１１】図11は、pJaL400 の制限地図である。
【図１２】図12は、pMT1935 の構成である。
【図１３】図13は、pJaL394 の制限地図である。
【図１４】図14は、pMT1931 の制限地図である。
【図１５】図15は、pMT1936 の制限地図である。
【００１５】
【図１６】図16は、変異体アスペルギラス  オリザエDZBY932 の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号25及び26）である。
【図１７】図17は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY1058の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号29及び30）である。
【図１８】図18は、pDSY161 の制限地図である。
【図１９】図19は、pDSY162 の制限地図である。
【図２０】図20は、変異体アスペルギラス  オリザエ1204.3.3の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号34）である。
【００１６】
【図２１】図21は、変異体アスペルギラス  オリザエH603の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号39）である。
【図２２】図22は、pGAG3 の制限地図である。
【図２３】図23は、pJaL389 の制限地図である。
【図２４】図24は、pJaL335 の制限地図である。
【図２５】図25は、pJaL399 の制限地図である。
【００１７】
【図２６】図26は、pDM176の制限地図である。
【図２７】図27は、pHB218の制限地図である。
【図２８】図28は、pSE39 の制限地図である。
【図２９】図29は、pDSY153 の制限地図である。
【図３０】図30は、pCaHj505の制限地図である。
【００１８】
【図３１】図31は、pMStr107の制限地図である。
【図３２】図32は、変異体アスペルギラス  オリザエP4-8.1の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（配列番号50及び51）である。
【図３３】図33は、変異体アスペルギラス  オリザエP7-14.1 の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（配列番号56及び57）である。
【図３４】図34は、pMT1612 の制限地図である。
【図３５】図35は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY7-17.2の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（配列番号63及び64）である。
【００１９】
【図３６】図36は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY3-2.1 の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号66）である。
【図３７】図37は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY5-7.1 の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号71）である。
【図３８】図38は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY8-10.1の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号76）である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
第１の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列内に存在せず、前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA 配列内に存在せず、そして前記条件下で前記ポリペプチドを、加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA 配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
“転写を負に調節するタンパク質”とは、DNA 配列に対して相補的な一本鎖RNA を生成するためにRNA ポリメラーゼによりRNA 合成の工程を負に影響を及ぼすリプレッサーとして、又は細胞の生合成又は異化経路により生成される一般的な化学物質である酵素インデューサーを分解するタンパク質として本明細書において定義される。リプレッサーは、 DNA−結合、転写抑制、及びインデューサー又はリプレッサー結合のために必要とされる明確なドメインから成る。
【００２１】
“翻訳を負に調節するタンパク質”とは、タンパク質又は物質として本明細書において定義され、その生成は、遺伝子の転写に由来するmRNAに含まれる情報を解読するリボソームにより実施されるタンパク質合成の工程を質に影響を及ぼすタンパク質により触媒される。たとえば、前記物質は、キャップ−依存性翻訳開始因子、たとえば、p20 (Altmannなど., 1997, EMBO Journal 16 : 1114-1121); 又は性−致死タンパク質、たとえば msl−２の翻訳を調節するショウジョウバエの性−致死タンパク質（Bashaw and Baker, 1997,Cell 89 : 789-798)であり得る。
【００２２】
“分泌を負に調節するタンパク質”とは、タンパク質又は物質として本明細書において定義され、その生成は、膜を通してタンパク質分子を、（ｉ）細胞内区画、たとえば液胞又はミトコンドリア、（ii）細胞周辺腔、又は（iii ）培養培地中にトランスファーする工程、及び真核細胞においては、細胞からの分泌されたタンパク質のエキソサイティク開放を究極的にもたらす小胞性輸送の工程に負の影響を及ぼすタンパク質により触媒される。前記分泌工程は、正しいタンパク質の折りたたみを監督し、そして促進し、いづれかの必要とされる翻訳修飾（たとえばグリコシル化）を仲介し、そして全体として細胞の機能と適合する割合で特定の細胞部位に対するタンパク質を分類し、プロセッシングし、そして標的化する。
【００２３】
そのような物質は、不活性化に基づいて、分泌される異種又は変異体タンパク質のレベルを高めるCa2+−ATP アーゼ活性を有するタンパク質（たとえば、Rudolph など., 1989, Cell 58 : 133-145を参照のこと）；又はアンチセンスRNA の使用により哺乳類細胞において低められる場合、変異体タンパク質の分泌レベルの３倍までの上昇をもたらす、真核細胞の小胞体に見出される ATP−依存性 hsp70−クラスシャペローンである結合タンパク質 BiP (Dornerなど., 1988, Molecular and Cellular Biology 8 : 4063-4070)を包含する。特定の態様においては、前記物質は、ATP アーゼ活性を有するタンパク質又は結合タンパク質 BiPである。
【００２４】
第２の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞が、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA を含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入が、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を破壊し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００２５】
ポリペプチドをより生成する突然変異細胞は、より多くのポリペプチドが親細胞からよりも回収される細胞として本明細書において定義される。
【００２６】
第３の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列内に存在せず、前記ポリペプチドの転写を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA 配列内に存在せず、そして前記条件下で前記ポリペプチドを、加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA 配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより発現し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００２７】
第４の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞が、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA を含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入が、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を破壊し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより発現し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００２８】
ポリペプチドをより“発現する”突然変異細胞は、親細胞よりも、ポリペプチドをコードする機能的mRNAの増加量を細胞として本明細書において定義される。機能的mRNAの増加量とは、ポリペプチドをコードする遺伝子の転写の絶対的な割合の上昇に、及び／又は後−転写プロセッシング、又は転写体の修飾、たとえばmRNAの核−細胞質輸送及び／又は細胞質安定化の変更に起因することができることが理解されるであろう。そのような突然変異体細胞は、従来の技法、たとえばノザンブロット分析、ラン−オフ転写アッセイ、及び同様の方法（但し、それらだけには限定されない）を用いて同定され得る。
【００２９】
第５の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列内に存在せず、前記ポリペプチドの翻訳を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA 配列内に存在せず、そして前記条件下で前記ポリペプチドを、加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA 配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより合成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００３０】
第６の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞が、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA を含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入が、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を破壊し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより合成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００３１】
より多くのポリペプチドを“合成する”突然変異細胞とは、親細胞よりもより多くの量のポリペプチドを蓄積する細胞として本明細書において定義される。蓄積とは、全体として、培養物における、すなわち一緒に取られる細胞内及び細胞外区画の両者におけるポリペプチドの合計量を言及する。そのような突然変異細胞は、いづれか適切な技法、たとえば放射性ラベルされたアミノ酸を用いてのパルス−ラベリング又は定状状態ラベリング；ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いての細胞及び培地画分のイムノブロット分析；生物学的活性のアッセイ；従来のクロマトグラフィー方法による分離；及び同様の方法（但し、それらだけには限定されない）を用いて同定され得る。
【００３２】
第７の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列内に存在せず、前記ポリペプチドの分泌を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA 配列内に存在せず、そして前記条件下で前記ポリペプチドを、加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA 配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより分泌し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００３３】
第８の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA を含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入が、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を破壊し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより分泌し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００３４】
より多くのポリペプチドを“分泌する”突然変異細胞とは、細胞外培地中に開放されるペプチドの量が親細胞よりも高められている細胞として本明細書において定義される。そのような突然変異細胞は、たとえば具体化される新しく合成されたポリペプチドの割合、及び親細胞に対する突然変異細胞に開放される絶対量を定量化するために、免疫沈殿法と共にパルス−チースラベリングを用いて同定され得る。イムノブロット分析、生物学的活性アッセイ、及び物理的−化学的分離方法がまた、突然変異細胞対親細胞に開放されるポリペプチドの絶対量を定量化するためにも使用され得る。
【００３５】
第９の態様においては、本発明はポリペプチドの生成方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し；ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列内にも、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする第２DNA 配列内にも存在しない遺伝子座で、親細胞のゲノム中への、前記遺伝子座と相同でない核酸構造体のランダム組込みにより、前記第１DNA 配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドをより生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００３６】
第10の態様においては、本発明は、ポリペプチドの生成方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し；ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、ポリペプチドをコードする第１DNA配列及びポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を正に調節するタンパク質をコードする第２DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA 配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドを低く生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００３７】
ポリペプチドを低く“生成する”突然変異細胞は、ポリペプチドの低い量が親細胞に対して回収される細胞として本明細書において定義される。
“転写を正に調節するタンパク質”とは、DNA 配列に対して相補的な一本鎖RNA を生成するためにRNA ポリメラーゼによりRNA 合成の工程に陽性的に影響を及ぼす活性化因子又はインデューサーとして本明細書において定義される。前記活性化因子は、 DNA−結合、転写活性化、及びインデューサー又はリプレッサー結合のために必要とされる異なったドメインから成る。インデューサーは一般的に、細胞の生合成又は異化経路により生成される化学物質である。特定の態様において、物質は、活性化因子又はインデューサーである。
【００３８】
“翻訳を正に調節するタンパク質”とは、タンパク質又は物質として本明細書において定義され、その生成は、遺伝子の転写に由来するmRNAに含まれる情報を解読するリボソームにより実施されるタンパク質合成の工程に陽性的に影響を及ぼすタンパク質により触媒される。特定の態様において、前記物質は開始因子又は延長因子である。
【００３９】
“分泌を正に調節するタンパク質”とは、タンパク質又は物質として本明細書において定義され、その生成は、膜を通してタンパク質分子を、（ｉ）細胞内区画、たとえば液胞又はミトコンドリア、（ii）細胞周辺腔、又は（iii ）培養培地中にトランスファーする工程に陽性的に影響を及ぼすか、又は上記のような小胞輸送に陽性的に影響を及ぼすタンパク質により触媒される。そのような物質は、折りたたみタンパク質、たとえばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及びペプチジルプロイルイソメラーゼイソフォーム；シャペローン、たとえば熱ショックタンパク質、シグナル認識粒子、PrsA,SecD, SecF及びBiP ; トラスロケートする鎖−関連膜タンパク質（TRAM) ；トランスロカーゼ複合体；及びプロセッシング酵素、たとえばグリコシル化酵素；シグナルペプチダーゼ；プロ領域ペプチダーゼを包含する。特定の態様において、前記物質は、折りたたみタンパク質、シアペローン、シグナル認識粒子、PrsA, SecD, SecF，BiP 、トラスロケートする鎖−関連膜、トランスロカーゼ複合体又はプロセッシング酵素である。
【００４０】
本発明の他の態様は、第10の態様に記載されるようなポリペプチドを生成するための方法に関し、但し前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドを少なく発現し、合成し、又は分泌する。
【００４１】
ポリペプチドを低く“発現する”突然変異細胞は、親細胞よりも、ポリペプチドをコードする機能的mRNAの減少量を細胞として本明細書において定義される。機能的mRNAの減少量とは、ポリペプチドをコードする遺伝子の転写の絶対的な割合の低下に、及び／又は後−転写プロセッシング、又は転写体の修飾、たとえばmRNAの核−細胞質輸送及び／又は細胞質安定化の変更に起因することができることが理解されるであろう。そのような突然変異体細胞は、従来の技法、たとえばノザンブロット分析、ラン−オフ転写アッセイ、及び同様の方法（但し、それらだけには限定されない）を用いて同定され得る。
【００４２】
より少量のポリペプチドを“合成する”突然変異細胞とは、親細胞よりもより少量のポリペプチドを蓄積する細胞として本明細書において定義される。蓄積とは、全体として、培養物における、すなわち一緒に取られる細胞内及び細胞外区画の両者におけるポリペプチドの合計量を言及する。そのような突然変異細胞は、いづれか適切な技法、たとえば放射性ラベルされたアミノ酸を用いてのパルス−ラベリング又は定状状態ラベリング；ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いての細胞及び培養画分のイムノブロット分析；生物学的活性のアッセイ；従来のクロマトグラフィー方法による分離；及び同様の方法（但し、それらだけには限定されない）を用いて同定され得る。
【００４３】
より少量のポリペプチドを“分泌する”突然変異細胞とは、細胞外培地中に開放されるポリペプチドの量が親細胞よりも低められている細胞として本明細書において定義される。そのような突然変異細胞は、たとえば具体化される新しく合成されたポリペプチドの割合、及び親細胞に対する突然変異細胞に開放される絶対量を定量化するために、免疫沈殿法と共にパルス−チースラベリングを用いて同定され得る。イムノブロット分析、生物学的活性アッセイ、及び物理的−化学的分離方法がまた、突然変異細胞対親細胞に開放されるポリペプチドの絶対量を定量化するためにも使用され得る。
【００４４】
本発明はまた、代謝物を生成するための方法にも関し、前記方法は、
（Ａ）前記代謝物の生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、（ａ）前記代謝物の生合成経路における第１ポリペプチドをコードする第１DNA 配列、（ｂ）前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を負に調節する物質をコードする第２DNA 配列、（ｃ）前記条件下で前記第１ポリペプチドのいづれかを加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA 配列、及び（ｄ）第２代謝物の第２生合成経路における第２ポリペプチドをコードする１又は複数の第４DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、１又は複数の前記第１DNA 配列を含んで成る親細胞に関連し、ここで前記生合成経路及び第２生合成経路は同じ中間体の生成に関与し、そして前記第２ポリペプチドは前記中間体の生成の後の段階を触媒し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも代謝物をより生成し；そして
（Ｂ）前記代謝物を回収することを含んで成る。
【００４５】
本発明はまた、代謝物を生成するための方法にも関し、前記方法は、
（Ａ）前記代謝物の生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、（ａ）前記代謝物の生合成経路における第１ポリペプチドをコードする第１DNA 配列、（ｂ）前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA 配列、及び（ｃ）第２代謝物の第２生合成経路における第２ポリペプチドをコードする１又は複数の第３DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、１又は複数の前記第１DNA 配列を含んで成る親細胞に関連し、ここで前記生合成経路及び第２生合成経路は同じ中間体の生成に関与し、そして前記第２ポリペプチドは前記中間体の生成の後の段階を触媒し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも代謝物をより低く生成し；そして
（Ｂ）前記代謝物を回収することを含んで成る。
【００４６】
本発明の方法はまた、第１ポリペプチドを生成するための方法にも関し、前記方法は、
（ａ）前記第１DNA 配列内に存在せず、前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA 配列内に存在せず、そして前記第１ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により突然変異細胞を形成し；
（ｂ）両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドをより生成する突然変異細胞を単離し；
（ｃ）前記核酸構造体が組込まれている遺伝子座を同定し；
（ｄ）対応する遺伝子座が破壊されている細胞を生成し；
（ｅ）前記助けとなる条件下で前記細胞を培養し；そして
（ｆ）前記第１ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００４７】
対応する遺伝子座とは、救援された遺伝子座によりコードされるポリペプチドと同じ機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子座として本明細書において定義される。
【００４８】
本発明はまた、ポリペプチドを生成するための方法にも関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA 配列、及び前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする第２DNA 配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA DNA を含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入は、前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を特異的に増強し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより多く生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【００４９】
転写、翻訳、又は分泌の“特異的”増強とは、興味あるポリペプチドに限定され、そして細胞における他のポリペプチドに対する全体的な効果を付随しないポリペプチドの生物発生及び生成の１又は複数の観点の増強を言及するために本明細書において使用される。好ましくは、特異的増強は、少数のポリペプチド、たとえば興味あるペプチドのみに影響を及ぼす。より好ましくは、特異的増強は、興味あるポリペプチドのみに影響を及ぼす。
それらの生物発生工程の全体的な増強は、当業界において良く知られている従来の方法を用いての特定の増強とは区別され得る。
【００５０】
たとえば、3Ｈ−ウリジンによる生合成パラス−ラベリング（続く、RNA 中に組込まれる合計の放射能の定量化）は、突然変異細胞がそれが関係する親細胞よりも早いか又は遅い速度でmRNAを一般的に合成しないことを決定するために使用され得る。同様に、たとえば３５Ｓ−メチオニンによるパラス−ラベリング（続く、タンパク質中に組込まれる合計の放射能の定量化）は、突然変異細胞がそれが関係する親細胞よりも早いか又は遅い速度でタンパク質を一般的に合成しないことを決定するために使用され得る。分泌の一般的な速度は、放射性アミノ酸又は糖を用いてのパルス−チェースラベリング、続く細胞外放射能対細胞内放射能の定量化により突然変異細胞と親細胞との間で比較され得る。
【００５１】
それらの方法はまた、限定された数の他のポリペプチドの転写、翻訳又は分泌がまた、突然変異細胞において影響され得るかどうかを決定するためにも使用され得る。たとえば、固定されたオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションによる特定の放射性ラベルされたRNA 転写体の捕獲は、個々の遺伝子の転写速度を評価するために使用され得る。たとえば SDS−PAGE（個々のタンパク質の免疫沈殿を伴うか又は伴わない）による放射性ラベルされた新生タンパク質の決定が、個々のタンパク質の翻訳及び／又は分泌の瞬間的な速度を比較するために使用され得る。
【００５２】
ポリペプチド
用語“ポリペプチド”とは、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含し、そして従って、コードされた生成物の特定の長さには限定されない。ポリペプチドは、細胞に対して生来のものであり、又は異種ポリペプチドであり得る。好ましくは、それは異種ポリペプチドである。ポリペプチドはまた、遺伝子に対して外来性の１又は複数の制御配列を含んで成る核酸配列によりコードされる、細胞に対して生来のポリペプチドである組換えポリペプチドでもあり得る。ポリペプチドは、野生型ポリペプチド又はその変異体であり得る。ポリペプチドはまた、１又は複数のポリペプチドが細胞に対して異種である、少なくとも２種の異なったポリペプチドから得られる部分的又は完全なポリペプチド配列の組合せを含むハイブリッドポリペプチドでもあり得る。
【００５３】
ポリペプチドはさらに、天然に存在する対立遺伝子、及び上記ポリペプチドの構築された変異体を包含する。
好ましい態様において、ポリペプチドは抗体又はその一部である。
好ましい態様において、ポリペプチドは抗原である。
好ましい態様において、ポリペプチドは凝固因子である。
好ましい態様において、ポリペプチドは酵素である。
好ましい態様において、ポリペプチドは、ホルモン又はホルモン変異体である。
好ましい態様において、ポリペプチドは受容体又はその一部である。
好ましい態様において、ポリペプチドは調節タンパク質である。
【００５４】
好ましい態様において、ポリペプチドは構造タンパク質である。
好ましい態様において、ポリペプチドはレポーターである。
好ましい態様において、ポリペプチドは輸送タンパク質である。
より好ましい態様において、ポリペプチドはオキシドレダクターゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはトランスフェラーゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはヒドロラーゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはリアーゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはイソメラーゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはリガーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはアミノペプチダーゼである。
【００５５】
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはアミラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはカルボヒドラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはカルボキシペプチダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはカタラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはセルラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはキチナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはクチナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはデオキシリボヌクレアーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはデキストラナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはエステラーゼである。
【００５６】
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはα−ガラクトシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはβ−ガラクトシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはグルコアミラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはα−グルコシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはβ−グルコシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはハロペルオキシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはインバーターゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはラッカーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはリパーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはマンノシダーゼである。
【００５７】
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはムタナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはオキシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはペクチン分解酵素である。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはペルオキシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはフィターゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはポリフェノールオキシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはタンパク質分解酵素である。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはリボヌクレアーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはトランスグルタミナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはキシラナーゼである。
【００５８】
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドは、ヒトインシュリン又はその類似体である。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはヒト成長ホルモンである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはエリトロポエチンである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはインシュリノトロピンである。
【００５９】
ポリペプチドはまた、特定の代謝物の生合成に関与する酵素でもあり得る。代謝物の生合成は一般的に、１又は複数の段階が速度制限性でありえる一連の酵素−触媒された化学反応段階を含む生合成、経路を包含する。本発明のこの態様においては、細胞のゲノム中への核酸構造体の組込みが、１又は複数のそれらの酵素−触媒された段階を変性することによって代謝物の生成を変性する。
【００６０】
代謝物は、細胞の酵素−触媒された化学反応による前駆体有機化合物の形質転換により生成された細胞のいづれかの有機化合物であり得る。代謝物は、一次代謝物又は二次代謝物であり得る。さらに、代謝物は、生合成経路中間体、又は生合成経路生成物であり得る。好ましくは、代謝物は、アルカロイド、アミノ酸、抗生物質、補因子、薬物、脂肪酸、抗菌剤、除草剤、殺昆虫剤、有機酸、人工器官グループ、殺鼠薬、甘味剤、ビタミン、デオキシ糖、界面活性剤、マイコトキシン、有機酸、糖アルコール、毒性代謝物又はトキシンである。
【００６１】
核酸構造体
本発明の方法に使用される核酸構造体は、“標識された核酸構造体”と呼ばれる。“標識された核酸構造体”は、１又は複数の遺伝子座で細胞のゲノム中に組込み、それにより遺伝子座を製造する同定できる核酸配列を含む核酸分子である。ゲノムは、染色体及び人工染色体DNA 及び染色体外DNA 、すなわち自己−複製性遺伝子要素を含む細胞の完全なDNA 組である。
【００６２】
核酸構造体は、合成DNA であり、天然に存在する遺伝子から単離され、又は天然に存在しない態様で組合され、そして並置される核酸のセグメントを含むよう修飾されている、一本鎖又は二本鎖のいづれかの核酸分子であり得る。核酸構造体は環状又は直線状であり得る。さらに、核酸構造体は、ベクターに含まれ得、制限酵素切断された、線状化されたフラグメントであり得、又はPCR 増幅された線状フラグメントであり得る。
核酸構造体は、いづれかのサイズのいづれかの核酸配列を含むことができる。１つの態様において、核酸構造体は、約10〜20,000bpの長さ、好ましくは 100〜15,000bpの長さ、より好ましくは 500〜15,000bpの長さ、さらにより好ましくは 1,000〜15,000bpの長さ、及び最とも好ましくは 1,000〜10,000bpの長さのものである。
【００６３】
好ましくは、核酸構造体は、その遺伝子座と、40％以下の相同性、好ましくは30％以下の相同性、より好ましくは20％以下の相同性、さらにより好ましくは10％以下の相同性を有し、及び最とも好ましくは相同性を有さない。
好ましくは、核酸構造体は、興味あるポリペプチドをコードするDNA 配列と、40％以下の相同性、好ましくは30％以下の同一性、より好ましくは20％以下の同一性、さらに好ましくは10％以下の同一性を有し、及び最とも好ましくは相同性を有さない。
【００６４】
核酸構造体は、複数の別れたフラグメントとして細胞中に導入され得る。２つのフラグメントが使用される現象においては、それらの２つのフラグメントは、１つのフラグメントの３’末端で及び他の５’末端でDNA 配列相同性（オーバーラップ）を共有する。細胞中への導入に基づいて、それらの２つのフラグメントは、単一のフラグメントを形成するために相同組換えを受けることができる。次に、生成物フラグメントは、細胞配列との組換えのために適切な形で存在する。細胞配列との組換えのために適切な生成物を究極的には形成するために、お互いとの相同組換えを受けるであろうように企画された複数のフラグメントが使用され得る。
【００６５】
複数の核酸構造体は、フラグメントが上記のようなオーバーラップ領域を含まない、本発明の方法に使用する環状又は線状フラグメントとして細胞中に導入され得ることがさらに理解されるであろう。いくつかの生物に関して、細胞中への複数の構造体の導入が同じ遺伝子座でのそれらの組込みをもたらすことは、当業界において良く知られている。
核酸構造体は、コード又は非コードDNA 配列を含むことができる。コード配列は、mRNA中に転写され得、そして適切な制御配列の制御下に置かれる場合、ポリペプチドに翻訳され得る配列である。コード配列の境界は、一般的に、５’−末端での翻訳開始コドンATG及び３’−末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、DNA ，cDNA及び組換え核酸配列を包含するが；但しそれらだけには限定されない。
【００６６】
好ましい態様において、核酸構造体は、同定できる核酸配列として選択マーカーを含む。選択マーカーは遺伝子であり、その生成物は殺生物又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、原栄養性に対する栄養要求性、又は同様のものを提供する。宿主細胞のゲノム中への選択マーカーの組込みは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする。本発明の方法に使用するための選択マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（amdS) 、５−アミノレブリン酸シンターゼ（hemA) 、アントラニル酸シンターゼ（trpC) 、グルホシネート耐性遺伝子、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hygB) 、硝酸レダクターゼ（niaD) 、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argB) 、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（pyrG)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(bar) 、及び硫酸アデニルトランスフェラーゼ（sC) 、並びに他の種からの同等物を包含するが、但し、それらだけには限定されない。
【００６７】
より好ましい態様において、選択マーカーは、アスペルギラス  ニジュランス（Aspergillus nidulans) 又はアスペルギラス  オリザエ（Aspergillus oryzae) のamdS遺伝子、ストレプトマイセス  ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus) のbar 遺伝子、アスペルギラス  オリザエのhemA遺伝子、又はアスペルギラス  ニジュランス又はアスペルギラス  オリザエのpyrG遺伝子である。本発明の方法に使用するための他の選択マーカーは、バシラス  スブチリス（Bacillus subtills)又はバシラス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis) からのdal 遺伝子、又は抗生物質耐性、たとえばアンピシリン(amp) 、カナマイシン(kan) 、クロラムフェニコール(cam) 又はテトラサイクリン耐性(tet) を付与するマーカーである。時おり使用される哺乳類マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（dfhr) である。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1、及びURA3である。
【００６８】
もう１つの好ましい態様において、構造体は、ベクター配列を単独で、又は選択マーカーと組合して含んで成り、ここで前記ベクター配列は、複製の起点、たとえばＥ．コリベクター配列、たとえばpUC19, pBR322 又はpBluescript を含む。たとえば、複製の起点を含むＥ．コリベクターは、複製のＥ．コリ起点ために、組込みの後、宿主ゲノムからの構造体の回収を促進することができる。構造体は、制限エンドヌクレアーゼによるゲノムDNA の消化、続く、回収された構造体の連結、及びＥ．コリの形質転換により宿主ゲノムから回収され得る。
【００６９】
好ましい態様において、核酸構造体は、ポリペプチドのためのDNA 配列のコード配列又はその一部を含まない。さらに好ましい態様において、核酸構造体は、興味あるDNA 配列を組込み、又は破壊することから構造体を阻止するために、ポリペプチドをコードするDNA 配列に対して相同でない配列を含む。
【００７０】
もう１つの好ましい態様において、核酸構造体は、制御配列に操作可能に連結されるポリペプチドをコードするDNA 配列の１つ又は複数のコピーを含む。この態様において、ポリペプチドの生成は、遺伝子不活性化、及びDNA 配列の１又は複数のコピーの導入の両者により変更されるであろう。
【００７１】
もう１つの好ましい態様においては、核酸構造体は、転移因子、たとえばトランスポゾンを含まない。トランスポゾンは、同じ細胞内の他のDNA 配列における多くの異なった部位中にそれ自体挿入することができるDNA の別々の断片である。転移工程のために必要なタンパク質は、トランスポゾン内にコードされる。トランスポゾンのコピーは、転移の後、元の部位に保持され得る。トランスポゾンの末端は通常、同一であるが、しかしお互いに対して逆の配向で存在する。
【００７２】
さらに好ましい態様においては、核酸構造体は、１又は複数の制御配列、たとえばプロモーターを単独で、又は選択マーカーと組合して含むことができ、ここで前記制御配列は、組込みに基づいて、興味あるポリペプチドをコードするDNA 配列に操作可能的に連結されない。用語“操作可能的に連結される”とは、制御配列が、一次RNA 転写体の生成を方向づけるようなDNA 配列のコード配列に関する位置に適切に配置されている形状として本明細書において定義される。そのような制御配列は、プロモーター、シグナル配列、プロペプチド配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、アテニュエーター配列、及びイントロンスプライス部位配列である。個々の制御配列は、細胞又はポリペプチド−コード配列に対して生来のものであっても又はそれらに対して外来性のものであっても良い。
【００７３】
核酸構造体における強いプロモーターの存在は、構造遺伝子（又は機能的転写プロモーター又はmRNA終結領域）中への挿入による遺伝子不活性化の他に、追加の遺伝的効効果を可能にする。プロモーターは、その転写を増強するために構造遺伝子の上流に挿入することができる。他方では、プロモーター配列がアンチセンスRNA を生成するために、逆の遺伝子配向に挿入する場合、二倍体、又はより高い倍数性の細胞における遺伝子不活性化の可能性が存在する。同じ機構によれば、逆配向でのプロモーター配列の挿入は、遺伝子生成物活性をコードする複数遺伝子ファミリーの不活性化をもたらすことができる。
もう１つの好ましい態様においては、核酸構造体は、プロモーター以外の制御配列を含む。
もう１つの好ましい態様においては、核酸構造体は、制御配列を含まない。
【００７４】
遺伝子座
本発明の方法においては、核酸構造体は、“興味あるDNA 配列内に存在しない遺伝子座”、又は核酸構造体がポリペプチド−コード配列、その制御配列及び前記コード配列内のいづれかのイントロン配列中に導入されないことを意味する“代謝物の生合成経路におけるポリペプチドをコードするDNA 配列内に存在しない遺伝子座”で導入される。
制御配列は、DNA 配列に操作可能的に連結され、そしてポリペプチド−コード配列の発現に関与するすべての成分を包含する。そのような制御配列は、プロモーター、シグナル配列、プロペプチド配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、アテニュエーター配列、及びイントロンスプライス部位配列である。個々の制御配列は、コード配列に対して生来のものであっても又は外来性のものであっても良い。
【００７５】
プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、変異、切断された及びハイブリッドプロモーターを包含するいづれかのプロモーター配列であり得る。
【００７６】
シグナルペプチドコード領域は、細胞の分泌経路中に発現されたポリペプチドを方向づけることができるポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードする。
プロペプチドコード領域は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードする。その得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又はいくつかの場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟活性ポリペプチドに転換され得る。
【００７７】
ターミネーターは、ポリペプチドコード配列の３’末端に操作可能的に連結される配列であり、そしてポリペプチドコード配列の転写を終結するために細胞により認識される。
ポリアデニル化配列は、DNA 配列の３’末端に操作可能的に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして細胞により認識される配列である。
【００７８】
エンハンサー配列は、遺伝子から数キロ塩基までに位置する場合、その遺伝子からの転写を高めることができる配列である。エンハンサー配列は通常、遺伝子の上流に存在する。
アテニュエーター配列は、その転写体を含むmRNA分子が完結されているか又は否なかを決定することによって、遺伝子の発現を調節する配列である。
【００７９】
イントロン配列は、遺伝子のタンパク質生成物に表わされない遺伝子の配列である。イントロン配列は、RNA 中に転写され、そして切除されるべきであり、そしてRNA 分子が、それが翻訳される前、イントロンスプライシングと呼ばれる工程を通して再連結される。
遺伝子座は、上記配列と隣接しなくても又は隣接しても良い。好ましくは、遺伝子座は隣接しない。遺伝子座は、興味あるDNA 配列のものと同じ染色体又は同じ染色体外要素上に、又はそれとは異なった染色体又は異なった染色体外要素上に存在することができる。さらに、遺伝子座は、細胞に対して生来のものであっても、又は外来性のものであっても良い。
【００８０】
好ましい態様において、遺伝子座は、興味あるDNA 配列の５’又は３’末端からの、少なくとも1,000bp 、より好ましくは少なくとも2,000bp 、及びさらにより好ましくは少なくとも3,000bp 、さらにより好ましくは少なくとも4,000bp 、さらにより好ましくは少なくとも5,000bp 及び最とも好ましくは少なくとも10,000bpである。
さらに好ましい態様において、遺伝子座は、興味あるポリペプチドをコードするDNA 配列よりも異なった染色体上に存在する。
【００８１】
本発明の種々の方法においては、核酸構造体は、生理学的条件下でポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードするDNA 配列内に存在する遺伝子座で導入され、このことは、核酸構造体がプロテアーゼ−コード配列、その制御配列、コード配列内のいずれかのイントロン配列、及びプロテアーゼの転写、翻訳又は分泌を陽性的に調節するタンパク質をコードするいずれかのDNA 配列中に導入されないことを意味する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、DNA 配列によりコードされるポリペプチドとは異るポリペプチドをコードする。
【００８２】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座はグルコーストランスポーターをコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号９の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００８３】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座はマンニトール−１−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号25の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００８４】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座はキチンシンターゼをコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号56の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００８５】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は熱ショックタンパク質をコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号50の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００８６】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座はマンガンスーパーオキシドジスムターゼをコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号29の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００８７】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、pacC、好ましくはpalB遺伝子の活性化のために必要とされる遺伝子である。好ましくは、遺伝子座は、配列番号16の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００８８】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号34の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００８９】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号39の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００９０】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号63の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００９１】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号66の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００９２】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号71の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００９３】
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号76の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
【００９４】
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はアミノペプチダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はアミラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はカルボヒドラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はカルボキシペプチダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はカタラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はセルラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はキチナーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はクチナーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はデオキシリボヌクレアーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はデキストラナーゼをコードする。
【００９５】
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はエステラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はα−ガラクトシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はβ−ガラクトシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はグルコアミラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はα−グルコシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はβ−グルコシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はグルコアミラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はα−グルコシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はβ−グルコシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はハロペルオキシダーゼをコードする。
【００９６】
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はインバーターゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はラッカーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はリパーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はマンノシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はムタナーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はオキシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はペクチン分解酵素をコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はペルオキシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はフィターゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はポリフェノールオキシダーゼをコードする。
【００９７】
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はタンパク質分解酵素をコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はリボヌクレアーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はトランスグルタミナーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はキシラナーゼをコードする。
より好ましい態様において、遺伝子座はpDSY109 に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpDSY112 に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpDSY138 に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は、pDSY141 に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpDSY162 に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpMT1936 に含まれる配列である。
【００９８】
より好ましい態様において、遺伝子座はpSMO1204に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpSMOH603に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号９の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号16の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号25の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号29の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号34の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号39の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はp4-8.1に含まれる配列である。
【００９９】
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はp7-14.1 に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpHB220に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpSMO717 に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpSMO321 に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpHowB571に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpSMO810 に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号50の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号56の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号63の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号66の配列である。
【０１００】
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号71の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号76の配列である。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座は、興味あるDNA 配列のtrans 因子をコードしない。“trans 因子”は、DNA 配列の転写を活性化し、又は抑制する興味あるDNA 配列とは異なる遺伝子によりコードされる因子である。より好ましい態様において、遺伝子座は、興味あるDNA 配列のリプレッサーをコードしない。より好ましい態様において、遺伝子座は興味あるDNA 配列の活性化因子をコードしない。
【０１０１】
細胞
本発明の方法は、興味あるポリペプチドをコードするDNA 配列を含むいづれかの細胞、たとえば原核細胞、たとえば細菌、又は真核細胞、たとえば哺乳類、昆虫、植物及び菌類細胞により使用され得る。DNA 配列は、細胞に対して生来のものであっても、又はそれに対して外来性のものであっても良い。細胞は単細胞微生物又は非単細胞微生物であり得る。さらに、細胞は野生型又は突然変異細胞であり得る。たとえば、突然変異細胞は、従来の突然変異誘発又は遺伝子操作を受けた細胞であり得る。
【０１０２】
有用な真核細胞は、細菌細胞、たとえばグラム陽性細菌、たとえばバシラス細胞、たとえばバシラス  アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus)、バシラス  アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens) 、バシラス  ブレビス（Bacillus brevis)、バシラス  サーキュランス（Bacillus circulans) 、バシラス  コーギュランス（Bacillus Coagulans) 、バシラス  ラウタス（Bacillus lautus)、バシラス  レンタス（lentus) 、バシラス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis) 、バシラス  メガテリウム（Bacillus megaterium)、バシラス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus)、バシラス  スブチリス（Bacillus subtilis)、及びバシラス  サリンジエンシス（Bacillus thuringiensis) ; 又はストレプトミセス細胞、たとえばストレプトミセス  リビダンス（Streptomyces lividans)又はストレプトミセス  ムリナス（Streptmiyces murimus) 、又はグラム陰性細菌、たとえばＥ．コリ及びプソイドモナス sp. (Pseudamonus sp.)であるが、但しそれらだけには限定されない。好ましい態様において、細菌細胞は、バシラス  レンタス、バシラス  リケニホルミス、バシラス  ステアロサーモフィラス又はバシラス  スブチリス細胞である。
【０１０３】
好ましい態様において、細胞は菌類細胞である。“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota)、バシジオミコタ(Basidiomycota) 、キトリジオミコタ(Chytridiomycota) 及びヅイゴミコタ（Zygomycota) (Hawksworth など., Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK により定義されるような）、並びにオーミコタ（Oomycota) (Hawksworthなど., 1995 、前記、p171に引用されるような）、及びすべての栄養胞子性菌類（Hawksworthなど.,1995、前記）を包含する。
【０１０４】
アスコミコタの代表的なグループは、たとえばニューロスポラ（Neurospora) 、ユーペニシリウム（Eupenicillium) (＝ペニシリウム（Penicillium)) 、エメリセラ（Emericella)  (＝アスペルギラス（Aspergillus)) 、ユーロチウム（Ewotium) (＝アスペルギラス）、及び酵母を包含する。バシジオミコタの例は、マッシュルーム、サビ菌及び黒穂病菌を包含する。キトクジオミコタの代表的なグループは、たとえばアロミセス（Allomyces)、ブラストクラジエラ（Blastocladiella)、コエロモミセス（Coelomomyces) 、及び水性菌類を包含する。オーミコタの代表的なグループは、たとえばサプロレグニオミセタス水性菌類（水性カビ）、たとえばアキルヤ（Achlya) を包含する。栄養胞子性菌類の例は、アルテルナリア（Alternaria)、アスペルギラス、カンジダ(Candida) 及びペニシリウムを包含する。ヅイゴミコタの代表的な例は、ムコル(Mucor) 及びリゾパス（Rhizopus) を包含する。
【０１０５】
好ましい態様において、菌類細胞は酵母細胞である。“酵母”は、本明細書において使用される場合、子ノウ胞子性酵母（エンドミセタレス（Endomycetales)) 、担子胞子性酵母、及び菌類インペルフェクチ（Imperfecti）に属する酵母（ブラストミセテス（Blastomycetes)) を包含する。子ノウ胞子性酵母は、科スペルモフィソラセアエ(Spermophthoraceae) 及びサッカロミセタセア（Saccharomycetaceae) に分けられる。
【０１０６】
後者は、４種の亜科、すなわちシゾサッカロミコイデアエ (Schizosaccharamycoideae)（たとえば属シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces)) 、ナドソニオイデアエ（Nadsonioideae)、リポミコイデアエ（Lipomycoideae)、及びサッカロミコイデアエ（Saccharomycoideae)（たとえば属クルイベロミセス（Kluyveromyces)、ピチア（Pichia) 及びサッカロミセス（Saccharomyces)) から成る。
【０１０７】
担子胞子性酵母は、属フィロバシジエラ（Filobasidiella) 、フィロバシジウム（Filobasidium) 、レウコスポリジム（Leucosporidim)、ロードスポリジウム（Rhodosporidium)及びスポリジオボラス(Sporidiobolus) を包含する。菌類インペルフェクチに属する酵母は、２種類の科、すなわちスポロボロミセタセアエ（Sporobolomycetaceae) (たとえば属ブレラ(Bullera) 及びソロボロミセス（Sorobolomyces)) 及びクリプトコカセアエ (Cryptococcaceae)（たとえば属カンジダ（Candida)) に分けられる。
【０１０８】
酵母の分類は未来においては変化するので、本発明の目的のためには、酵母は、Biology and Activities of Yeast (Skinnerなど., 1980, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) に記載のようにして定義されるであろう。酵母の生物学、及び酵母遺伝学の操作は、当業界において良く知られている（たとえば、Biochemistry and Genetics of Yeast, (Bacil, M., Horecket, B.J., andStopani, A.O.M., editors) 、2nd Edition ; The Yeasts (Rose,A.H., and Hurrison, J.S., editors), 2nd Edition, 1987 ; 及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathernなど., editors, 1981) 。
【０１０９】
より好ましい態様において、酵母細胞は、カンジダ（Candida)、クルイベロミセス（Kluyveromyces)、ピチア（Pichia) 、サッカロミセス、シゾサッカロミセス又はヤロウイア（Yarrowia) の種の細胞である。
【０１１０】
最とも好ましい態様においては、酵母細胞は、サッカロミセスカルリスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis) 、サッカロミセス  セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae) 、サッカロミセス  ジアスタリカス（Saccharomyces diastaricus)、サッカロミセス  ドウグラシ（Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス  クルイベリ（Saccharomyces kluyveri) 、サッカロミセス  ノルベンシス（Saccharomyces norbensis)、又はサッカロミセス  オビホルミス（Saccharomyces oviformis)細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、酵母細胞はクルイベロミセス  ラクチス細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、酵母細胞は、ヤロウイア  リポリチカ（Yarrowia lipolytica)細胞である。
【０１１１】
もう１つの好ましい態様において、菌類細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”は、ユーミコタ及びオーミコタのすべての糸状形を包含する（Huwksworthなど., 1995 、前記により定義されたような）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類から構成される菌糸体壁により特徴づけられる。生長は、菌子の延長であり、そして炭素異化は絶対好気性である。対照的に、酵母、たとえばサッカロミセス  セレビシアエの生長は、単細胞葉状体の発芽によってであり、そして炭素異化は発酵性であり得る。より好ましい態様において、糸状菌細胞は、アクレモニウム（Acremonium) 、アスペルギラス、フサリウム（Fusarium) 、ヒューミコラ（Humicola) 、ムコル（Mucor)、マイセリオプソラ（Myceliophthora) 、ニューロスポラ（Neurospora) 、ペニシリウム、スシタリジウム（Scytalidium)、チエラビア（Thielavia)、トリポクラジウム（Tolypocladium)及びトリコダーマ(Trichoderma) の種の細胞であるが、但し、それらだけには限定されない。
【０１１２】
さらにより好ましい態様においては、糸状菌細胞は、アスペルギラス細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞は、アクレモニウム細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞は、フサリウム細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞はヒューミコラ細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞はムコル細胞である。さらにもう１つのより好ましい態様において、糸状菌細胞はマイセリオプソラ細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞はニューロスポラ細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞はペニシリウム細胞である。もう１つのより好ましい態様において、糸状菌はチエラビア細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌はトリポリラジウム細胞である。もう１つのより好ましい態様において、糸状菌細胞はトリコダーマ細胞である。
【０１１３】
最とも好ましい態様において、糸状菌細胞は、アスペルギラス  アワモリ（Aspergillus awamori)、アスペルギラス  ホエチダス（Aspergillus foetidus) 、アスペルギラス  ジャポニカス（Aspergillus japonicus)、アスペルギラス  ニジュランス（Aspergillus  nidulans) 、アスペルギラス  ニガー（Aspergillus niger)、又はアスペルギラス  オリザエ（Aspergillus oryzae) 細胞である。
【０１１４】
もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞は、フサリウム  バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides) 、フサリウム  セレアリス（Fusarium cerealis)、フサリウム  クルックウエレンス（Fusarium crookwellense) 、フサリウム  クルモラム（Fusarium culmorum)、フサリウム  グラミネアラム（Fusarium graminearum) 、フサリウム  グラミニナム（Fusarium graminum)、フサリウム  ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum)、フサリウム  ネグンジ（Fusarium negundi) 、フサリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum) 、フサリウム  レチクラタム（Fusarium reticulatum) 、フサリウム  ロゼウム（Fusarium roseum)、フサリウム  サムブシナム（Fusarium sambucinum)、フサリウム  サルコクロウム（Fusarium sarcochroum) 、フサリウム  スルフレウム（Fusarium sulphureum)、フサリウム  トルロセウム（Fusarium toruloseum)、フサリウム  トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides)又はフサリウム  ベネナタム（Fusarium venenatum) 細胞である。
【０１１５】
最とも好ましい態様において、糸状菌細胞は、フサリウム  ベネナタム細胞（Nirenberg sp. nov.) である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞は、ヒューミコラ  インソレンス（Humicola insolens)細胞又はヒューミコラ  ラヌギノサ（Humicola lanuginosa)細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞はムコル  ミエヘイ（Mucor miehei) 細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞はマイセリオプソラ  サーモフィラ（Myceliophthora thermophila) 細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞はニューロスポラ  クラサ（Neurospora crassa)細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌はペニシリウム  プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum) 細胞である。
【０１１６】
もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞はチエラビア  テレストリス（Thielavia terrestris) 細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌はトリコダーマ  ハルジアナム（Trichoderma harzianum)、トリコダーマ  コニンジ（Trichoderma koningii) 、トリコダーマ  ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum)、トリコダーマ  リーセイ（Trichoderma reesei) 、又はトリコダーマビリデ（Trichoderma viride) 細胞である。
【０１１７】
有用な哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO) 細胞、HeLa細胞、子供のハムスターの腎臓(BHK) 細胞、COS 細胞、又はたとえばAmerican Type Culture Collectionから入手できる不滅化された細胞のいずれかを包含する。
【０１１８】
細胞中への核酸構造体の導入
核酸構造体は、当業界において知られている種々の物理的又は化学的方法、たとえばトランスフェクション又はトランスダクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微小発射物衝撃、アルカリ塩、又はプロトプラスト−仲介形質転換（但し、それらだけには限定されない）により、細胞中に導入され得る。
【０１１９】
挿入的突然変異誘発のためへの細胞中への核酸構造体の導入は、“ DNA−標識された突然変異誘発”として言及される。“ DNA−標識された突然変異誘発”は、細胞のゲノムの１又は複数の遺伝子座中への核酸分子の１又は複数の挿入を導びき、それにより、核酸分子が挿入される遺伝子座を製造する、細胞中への核酸分子の導入として本明細書において定義される。 DNA−標識された突然変異誘発により生成される突然変異細胞は、標識された変異体と呼ばれる。
【０１２０】
アスペルギラス細胞の形質転換のための適切な方法は、EP238023号及びYeltonなど., 1984, Proceedings of the National Academy of Science USA 81 : 1470-1474に記載されている。フサリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardier など., 1989, Gene 78 : 147-156により、又はWO96/00787号に記載される。酵母は、Becker and Guarente, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods of Enzymology 194 : 182-187 ; Ito など., 1983, Journal of Bacteriology 153 : 163；及びHinnenなど., 1978, Proceedings of the National Academy of Science USA 75 : 1920 により記載される方法を用いて形質転換され得る。
【０１２１】
細菌の形質転換は、たとえばプロトプラスト形質転換（たとえば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168 : 111-115 を参照のこと）により、コンピテント細胞を用いて（たとえば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81 : 823-829、又はDubnau and Davidoff - Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56 : 209-221を参照のこと）、エレクトロポレーション（たとえば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechnigues 6 : 742-751を参照のこと）により、又は接合（たとえばKoehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169 : 5771-5278 を参照のこと）により達成され得る。
【０１２２】
哺乳類細胞は、Graham and Van der Eb, 1978, Virology 52 : 546のリン酸カルシウム沈殿方法を用いて、直接的な摂取により形質転換され得る。他の方法、たとえば当業界において知られているエレクトロポレーションも使用され得る。
核酸構造体がベクターである場合、細胞のゲノム中への組込みは、選択する細胞に依存して、相同及び／又は非相同組換えによりランダムに生じる。
【０１２３】
好ましい態様において、核酸構造体は、制限酵素−仲介の組込み（REMI) により親細胞中に導入される。Schiestl and Petes, 1991, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88 : 7585-7589に記載されるREMIは、制限酵素により消化されたプラスミドDNA のその制限酵素と共に細胞中への導入であり、これは続いて、添加された制限酵素により特定された部位でしばしば、ゲノム中へのプラスミドDNA の組込みを導びく。REMI DNA−標識された突然変異誘発の利点は、それが分子基準で容易に同定され得る突然変異誘発を生成できることである。
【０１２４】
核酸構造体が制限酵素切断された線状DNA フラグメントである場合、適切な制限酵素の存在下でのREMIを通しての細胞ゲノム中への構造体の挿入は、ゲノムに存在する制限部位のランダム性のためにランダムである。核酸構造体は、単一の遺伝子座又は異なった遺伝子座で単一コピーとして又は複数コピーとして細胞のゲノム中に挿入することができる。核酸構造体は、標識された遺伝子座の同定及び回収を促進するために単一コピーとして挿入することが好ましい。
【０１２５】
突然変異細胞のスクリーニング
本発明はまた、突然変異細胞及び親細胞の両者が一定条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチド又は代謝物をより生成し、発現し、合成し、又は分泌する突然変異細胞にも関する。
【０１２６】
細胞中への核酸構造体の導入に続いて、次の段階は、推定上の突然変異細胞の集団からポリペプチドの変更された生成を有する突然変異細胞を単離することである。突然変異細胞の単離は好ましくは、突然変異細胞及び親細胞が同じ条件下で培養される場合、親細胞に対する突然変異細胞によるポリペプチド又は代謝物の生成の測定に依存する。
【０１２７】
句“ポリペプチドの変更された生成”とは、親細胞に対する突然変異細胞によるポリペプチド又は代謝物の生成における段階の変更又は変化を包含する。そのような段階は、転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾、分泌、発酵、タンパク質分解、下流プロセッシング、回収、及び精製を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１２８】
突然変異細胞は、たとえば特定のポリペプチド又は代謝物の改良された生成性を有する突然変異細胞、又は特定のポリペプチド又は代謝物をもはや生成できないか又は減じられた生成能力を有する突然変異細胞であり得る。さらに、突然変異細胞は、無機補因子の高められた摂取を有する突然変異細胞であり得る。
【０１２９】
突然変異細胞はまた、ポリペプチド又は代謝物の生成を変更する、親細胞よりもより所望の表現型を有することもできる。用語“表現型”とは、その遺伝子型により決定され、そしてその環境により調節される細胞の観察できるか又は外面的な特徴として本明細書において定義される。所望する表現型を有するそのような突然変異細胞は、形態学的突然変異細胞、分泌突然変異細胞、栄養要求突然変異細胞、条件づけ突然変異体、親細胞に対して所望する条件下で変更された増殖速度を示す突然変異細胞、過剰発現介在の増殖阻害の除去をもたらす突然変異細胞、又は低酸素条件を耐えることができる突然変異細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１３０】
さらに、突然変異細胞は、プロモーター又は隠れたイントロン−スプライシング欠損突然変異細胞の転写活性化因子の変更された生成を有する突然変異細胞であるものとして特徴づけられ得る。
【０１３１】
突然変異細胞の単離は、所望する表現型、及び／又は興味あるポリペプチド又は代謝物に対して特異的な、当業界において知られているスクリーニング方法を包含する。一般的に、所望する表現型が関与する場合、所望する表現型に対して特異的な方法が最初に、突然変異細胞を同定するために使用され、次にポリペプチド又は代謝物に対して特異的な方法が使用される。
【０１３２】
突然変異細胞を生成するために生物の細胞中に核酸構造体を導入することによって得られる推定上の変異体の集団は、まず標準のプレート技法、たとえば従来の突然変異誘発に使用される技法（たとえば、Lawrence, C.W., 1991, Christine Guthrie and Gerald R. Fink, editors, Methods in Enzymology, Volume 194, p273-281, Academic Press, Inc., San Diego)、単一孔単離、又は富化技法を用いて精製される。標準のプレート技法は好ましくは、所望する表現型及び／又はポリペプチド又は代謝物を検出する手段と組合して実施される。
【０１３３】
次の異なった富化技法が、突然変異細胞の野生型又は親同等物に比較して突然変異細胞の百分率を高めるために使用され得る：（１）変異体の増殖を非常に好む増殖条件を利用する直接的な選択；（２）親細胞を殺害する条件を用いる逆選択；（３）突然変異細胞のそれらの親細胞からの物理的分離を可能にする突然変異細胞のユニーク性質を包含する物理的選択；及び（４）所望する物質の量の直接的な測定。しかしながら、所望する表現型及び／又は興味あるポリペプチド又は代謝物に関して、突然変異細胞を同定するための手段がプレート媒体中に組込まれても、又はいなくても、精製された推定上の変異体はその変異体の正体を確認するためにさらなる特徴化を必要とする。変異体をさらに特徴づけ、そして確認するために使用される方法の例は、下記に示される。
【０１３４】
特定のポリペプチド又は特定の代謝物の改良された生成を有する変異体は、そのポリペプチド又は代謝物に対して特異的である、当業界において知られている検出方法を用いることによって同定され得る。ポリペプチドの検出方法は、特異的抗体、酵素生成物の形成又は酵素基質の消出を測定することによる酵素活性、酵素基質を含む寒天プレート上の透明な領域、及び生物学的活性のアッセイの使用を包含するが、但しそれらだけには限定されない。代謝物の検出方法は、薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分光学、生物学的活性アッセイ、バイオアッセイ、及び螢光活性化細胞ソーティングを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１３５】
好ましい態様において、特に所望の突然変異細胞は、特定のポリペプチドの改良された生成を有する突然変異細胞である。
もう１つの好ましい態様において、特に所望の変異体は、次の特定の代謝物の改良された生成を有する変異体である：より好ましくはアルカロイド、アミノ酸、抗生物質、補因子、薬物、脂肪酸、殺カビ剤、除草剤、殺昆虫剤、有機酸、色素、プラスチック前駆体、ポリエステル前駆体、置換基、殺そ薬、甘味剤、又はビタミン；及び最とも好ましくはクエン酸又は乳酸。
【０１３６】
ポリペプチドの構成成分であり、そして／又は生物学的活性のために必要とされる置換基又は有機補因子は、本発明の方法に従って変異体を単離することによって過剰生成され得る。そのような変異体は、置換基又は補因子の生合成が、生物学的活性形、たとえばヘム、たとえばシトクロム、特にシトクロムP450、シトクロムｂ、シトクロムC1 、シトクロムＣを含むヘムタンパク質；グロビン、特にヘモグロビン又はミオグロビン；オキシドレダクターゼ、特にカタラーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、又はペルオキシダーゼ；又は置換基としてヘムを含む他のポリペプチド形で、ポリペプチドの生成において速度−制限現象である場合に特に重要である。
【０１３７】
より好ましい態様において、特に所望の突然変異細胞は、アデノシンリン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、ビオシチン、ビオチン、補酵素Ａ、補酵素Ｑ（ユビキノン）、５’−デオキシアデノシルコバラミン、フェレドキシン、フラビン補酵素、ヘム、リポ酸、ヌクレオシド二リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ホスホアデノシン、ホスホスルフェート、ピリドキサールリン酸、テトラヒドロ葉酸、チアミンピロリン酸、又はチオレドキシンを過剰生成する突然変異細胞である。
【０１３８】
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、無機補因子の高められた摂取により特徴づけられる突然変異細胞である。ポリペプチドの構成成分であり、そして／又は生物学的活性のために必要とされる無機補因子の細胞による摂取は、本発明の方法に従って変異体を単離することによって高められ得る。そのような変異体は、無機補因子の摂取が生物学的活性形でのポリペプチドの生成において速度−制限現象である場合に特に重要である。より好ましい態様においては、特に所望する突然変異細胞は、Co2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+，Ｋ+ ，Mg2+，Mn2+，Mo，Ni2+，Se、又はZn2+の高められた摂取により特徴づけられる突然変異細胞である。
【０１３９】
好ましい態様において、ポリペプチド又は代謝物は、親細胞よりも、少なくとも20％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも 100％、より好ましくは少なくとも 100％〜1000％、さらにより好ましくは少なくとも 200％〜1000％及び最とも好ましくは少なくとも 500％〜1000％高い量で突然変異細胞により生成される。
【０１４０】
もう１つの好ましい態様においては、特に所望する突然変異細胞は、特定のポリペプチドをもはや生成できないか又は減じられた生成能力を有する突然変異細胞である。特定のポリペプチドをもはや生成できないか又は減じられた生成能力を有する突然変異細胞は、ポリペプチドについての上記の同じ方法を用いて同定され得るが、しかし生成が存在しないか又は減じられた生成が存在するかは、親細胞に対して測定される。
【０１４１】
より好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、ポリペプチドをもはや生成できないか又はその減じられた生成能力を有することができる突然変異細胞である。
もう１つの好ましい態様においては、ポリペプチドは、親細胞よりも、少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも75％及び最とも好ましくは 100％低い量で突然変異細胞により生成される。
【０１４２】
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、特定の代謝物をもはや生成できないか又はその減じられた生成能力を有する突然変異細胞である。特定の代謝物をもはや生成できないか又はその減じられた生成能力を有する突然変異細胞は、代謝物についての上記同じか又は類似する方法を用いて同定され得るが、しかし生成が存在しないか又は減じられた生成が存在するかは、親細胞に対して測定される。
【０１４３】
より好ましい態様においては、特に所望する突然変異細胞は、デオキシ糖、界面活性剤、マイコトキシン、有機酸、糖アルコール、毒性代謝物又はトキシン；及び好ましくはα−トキシン、β−トキシン、シクロピアゾン酸、エンニアチン、フサリン、カノサミン、マンニトール、シュウ酸、サーファクチン (surfactin)、トリコセセン、ゼアラレノール、又はゼアラレノンをもはや生成できないか又はその減じられた生成能力を有する突然変異細胞である。
【０１４４】
もう１つの好ましい態様において、代謝物は、親細胞よりも少なくとも20％、より好ましくは50％、さらにより好ましくは75％及び最とも好ましくは 100％低い量で、突然変異細胞により生成される。
【０１４５】
もう１つの好ましい態様において、突然変異細胞は形態学的突然変異細胞である。“形態学的突然変異細胞”は、親細胞に対する所望する形態学的を誘発する増殖培地を用いる標準のプレート技法を用いることにより、顕微鏡試験により、又は螢光活性化された細胞分類により活動的に増殖する細胞を分類することによって同定され得る。
【０１４６】
そのような形態学的変異体は、卓越した流動学的性質を有するものとして特徴づけられた変異体、たとえば高く枝分れした菌類変異体、制限されたコロニー性菌類変異体又は急速な増殖及び低い粘度成長特性を有する高く枝分れした、制限されたコロニー性菌類変異体；ペレット形に比較して、発酵の間、糸状形を有する変異体；発酵器表面のコロニー化を妨げる低い“粘性”である変異体；発酵の間、予測できる粘度を有する変異体；培養物の純度及び培養物によるポリペプチドの高い生成のモニター及び維持の助けとなる色彩変異体；たとえば細胞壁、又は構造性疎水性タンパク質、たとえばヒドロホビンを欠いている湿潤性細胞；細胞の増殖を改良する浸透応力−無感受性変異体；細胞の増殖を改良する乾燥−無感受性変異体；ポリペプチドの生成を増強する非胞子形成変異体；及び低い粘度生長を有する非粘着性生成変異体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１４７】
好ましくは、形態学的突然変異細胞は、色彩変異体、湿潤性突然変異細胞、卓越した流動学的性質を有するものとして特徴づけられる変異体、乾燥−無感受性変異体、非胞子形成性変異体、又は非粘着性生成変異体、及び最とも好ましくは、高く枝分れした菌類変異体、制限されたコロニー性菌類変異体又は高く枝分れした制限されたコロニー性菌類変異体である。
【０１４８】
もう１つの好ましい態様において、突然変異細胞は分泌突然変異細胞である。“分泌突然変異細胞”とは、１又は複数の分泌されるタンパク質のより高い生産量を生成する突然変異細胞として本明細書において定義される。分泌突然変異細胞は、ポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている検出方法を用い、そして同じ時間で、１又は複数の既知の分泌されるポリペプチドに対するその生産量を比較することによって同定され得る。ポリペプチドの検出方法は、特定の抗体、酵素生成物の形成又は酵素基質の消出を測定することによる酵素活性酵素基質を含む寒天プレート上の透明な領域、生物学的活性アッセイ；及び螢光活性化細胞の分類の使用を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１４９】
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は栄養要求突然変異細胞である。“栄養要求突然変異細胞”とは、１又は複数の必須代謝物を合成するその能力又は１又は複数の代謝物を代謝するその能力を失なっている突然変異細胞として本明細書において定義され、そしてその突然変異細胞によりポリペプチドの生成が変更化される。すべての栄養要求突然変異細胞は、必須代謝物の不在及び存在下で、推定上の変異体を増殖することによって標準のプレート技法を用いて同定され得る。栄養要求変異体は必須代謝物の不在下で増殖しないであろう。栄養要求変異体は、興味ある特定のポリペプチドを生成する変異体を選択的にスクリーンするために都合良く使用され得る。
【０１５０】
より好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は１又は複数のアミノ酸、脂肪酸、有機酸、ピリミジン、プリン又は糖；及びより好ましくは５−アミノレブリン酸、ビオチン、グルコース、ラクトース又はマルトースを代謝し又は合成することができない栄養要求突然変異細胞である。
【０１５１】
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、条件突然変異細胞である。“条件突然変異細胞”は、その表現型が一定の条件下で単に観察される１又は複数の突然変異を含み、そしてその突然変異細胞によりポリペプチド又は代謝物の生成を変更する突然変異細胞として本明細書において定義される。条件突然変異は、実質的にすべての遺伝子、たとえば高分子合成、変性、及び超分子構造へのアセンブリーにおける段階を制御する遺伝子において生じ得る。条件突然変異細胞は、許容できる及び制限条件下で推定上の変異体を増殖することによって標準のプレート技法を用いて同定され得る。たとえば、窒素制限された条件下で所望しないタンパク質分解活性を生成しない変異体株が、窒素制限された条件下でタンパク質分解活性を生成する親株に比較される。追加の例は、アルカリ性pHで増殖しないが、しかし所望するポリペプチドの生成を高めることも又は低めることもできるアルカリ性pH感受性変異体である。さらなる例は、特定の増殖条件下で増殖し得ない変異体である。
【０１５２】
より好ましい態様においては、条件突然変異細胞は、感温性、酸性pH感受性、アルカリ性pH感受性、抗生物質耐性、抗生物質感受性、トキシン耐性、トキシン感受性、ウィルス耐性、又はパラコート感受性細胞；及び最とも好ましくは、アルカリ性pH感受性突然変異細胞である。
【０１５３】
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、親細胞に対して変更された増殖速度を示す突然変異細胞である。“変更された増殖速度を示す突然変異細胞”とは、親細胞の倍加時間とは異なる倍加時間を有する突然変異細胞として本明細書において定義される。そのような突然変異細胞は、調節された発酵条件下で突然変異細胞及び親細胞の増殖を比較することによって同定され得る。そのような突然変異体細胞は、改良された発酵特徴、たとえば生産性を高めるためのより短い発酵時間、又は培養物の酸素要求を、調節するためのより長い発酵時間を有することができる。
【０１５４】
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、過剰発現介在の増殖阻害の除去をもたらす突然変異細胞である。“過剰発現介在の増殖阻害の除去をもたらす突然変異細胞”とは、ポリペプチド又は代謝物の高レベル生成を誘発する条件下で増殖される場合、所望するポリペプチド又は代謝物の過剰生成により、その増殖が阻害されない突然変異細胞として、本明細書において定義される。そのような変異体は、誘発性炭素源、たとえばマルトースを有するプレート上での標準のプレート技法により同定され得る。変異体はその誘発性炭素源上で良く増殖できるが、ところが親細胞はあまり増殖しない。そのような変異体は、ポリペプチドの過剰発現が細胞に対して毒性であることがいくつかの細胞において知られているので、有用である。
【０１５５】
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、低酸素条件を耐えることができる突然変異細胞である。“低酸素条件を耐えることができる突然変異細胞”とは、溶解された酸素濃度が低い増殖条件下で所望するポリペプチド又は代謝物を増殖し、そして生成することができる突然変異細胞として本明細書において定義される。そのような突然変異細胞は、高い細胞密度の生産性が酸素移行により低下する発酵に関して特に好都合である。低酸素耐性変異体は好ましくは、低レベルの酸素の存在下で固体又は液体培地において、親細胞に対する突然変異細胞を増殖することによって検出される。
【０１５６】
より好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、約０〜約50％の飽和、好ましくは約０〜約40％の飽和、さらにより好ましくは約０〜約30％の飽和、より好ましくは約０〜約20％の飽和、最とも好ましくは約０〜約10％の飽和、及びさらに最とも好ましくは約０〜約５％の飽和の低い酸素条件を耐えることができる突然変異細胞である。
【０１５７】
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、シグナルトランスダクション経路突然変異細胞である。“シグナルトランスダクション経路突然変異細胞”とは、興味あるDNA 配列によりコードされるポリペプチドの生成を変更する経路の１又は複数の遺伝子における突然変異を有する突然変異細胞として本明細書において定義される。用語“シグナルトランスダクション経路”とは、もう１つのシグナルポリペプチドの活性化又は不活性化のためにすべて必要とされるポリペプチドをコードする遺伝子のカスケードとして本明細書において定義される。その経路は、シグナルを検知し、そして遺伝子のカスケードを通して、シグナルがトランスダクトされ、そして１又は複数のポリペプチドの活性化又は不活性化を導びく。そのような変異体は、好ましくは、興味あるポリペプチドの生成を変更する所望する表現型に対して特異的である方法を用いて検出される。
【０１５８】
より好ましい態様において、シグナルトランスダクション経路突然変異細胞は、グルコース輸送シグナルトランスダクション経路変異体又はpHシグナルトランスダクション経路変異体、さらにより好ましくは、pacCの活性化のために必要とされる遺伝子が破壊されている変異体、及び最とも好ましくはgluT遺伝子変異体又はpalB遺伝子変異体である。
【０１５９】
もう１つの好ましい態様においては、特に所望する突然変異細胞は、プロモーターの転写活性化因子の変更された生成を示す突然変異細胞である。プロモーターの“転写活性化因子の変更された生成を示す突然変異細胞”とは、興味あるポリペプチドをコードするDNA 配列のプロモーターを“ターン−アップ”又は“ターン−ダウン”する転写活性化因子をコードする遺伝子における突然変異を有する突然変異細胞として本明細書において定義される。
【０１６０】
細菌細胞におけるそのようなプロモーターの例は、バシラス  アミロリクエファシエンス  α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バシラス  リケニホルミス  α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バシラス  リケニホルミス  ペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バシラス  ステアロサーモフィラス  マルトゲン性アミラーゼ遺伝子（amyM）、バシラス  スブチリス  レバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス  スブチリスxylA及びxylB遺伝子、Ｅ．コリlac オペロン、ストレプトミセス  コエリカラー（Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子（dagA) 、及び原核β−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーター（Villa - Kamaroffなど., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 : 3727-3731)、及びtaC プロモーター（DeBoerなど., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 : 21-25)である。さらなるプロモーターは、“Useful Proteins from recombinant bacteria ”、Scientobic American, 1980, 242 : 74-94；及びJ. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載される。
【０１６１】
糸状菌細胞におけるそのようなプロモーターの例は、アスペルギラス  ニジュランス  アセトアミダーゼ、アスペルギラス  ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス  ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス  アワモリ又はアスペルギラス  ニガー  グルコアミラーゼ（glaA）、アスペルギラス  オリザエ  アルカリプロテアーゼ、アスペルギラス  オリザエ  TAKAアミラーゼ、アスペルギラス  オリザエ  トリオースリン酸イソメラーゼ、フサリウム  オキシスポラム  トリプシン−様プロテアーゼ（引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第 4,288,627号に記載されるような）、リゾムコル  ミエヘイ（Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテアーゼ、リゾムコル  ミエヘイ  リパーゼをコードする遺伝子のプロモーター、及びそれらの突然変異、切断された、及びハイブリッドプロモーターである。糸状菌細胞における特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA２−tpi(アスペルギラス  ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス  オリザエ  トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）及びglaAプロモーターである。
【０１６２】
酵母細胞におけるそのようなプロモーターの例は、サッカロミセス  セレビシアエ  エノラーゼ(ENO−１）遺伝子、サッカロミセス  セレビシアエ  ガラクトキナーゼ遺伝子（GAL1) 、サッカロミセス  セレビシアエアルコール  デヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH2／GAP)、及びサッカロミセス  セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子をフードする遺伝子のプロモーターである。他の酵母プロモーターは、Romanos など., 1992, Yeast 8 : 423-488に記載されている。
哺乳類細胞におけるそのようなプロモーターの例は、ウィルスプロモーター、たとえばシミアンウィルス40（SV40）、ラウス肉腫ウィルス(RSV) 、アデノウィルス、及びウシ乳頭腫ウィルス(BPV) のプロモーターである。
【０１６３】
より好ましい態様において、突然変異細胞は、TAKA, TAKA／NA２、フサリウム  オキシスポラム  トリプシン−様プロテアーゼ、又はグルコアミラーゼプロモーターの転写活性化因子の変更された生成を示す。
【０１６４】
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、隠れたイントロン−スプライシング−欠損突然変異細胞である。“隠れたイントロン−スプライシング−欠損突然変異細胞”とは、mRNA合成の間、真のイントロンとして隠れたイントロンをもはや認識しないか及び誤ってスプライスする突然変異細胞として本明細書において定義される。隠れたイントロン−スプライシング−欠損突然変異細胞は、生物学的活性物質が生成されるよう、一次転写体からの誤った隠れた核プレ−mRNAイントロンの切除又はスプライシングを阻止するために特に有用である。
【０１６５】
この情況下で、隠れたイントロンは、コード配列の実際的な部分であり、そして従って、真のイントロンではないが、しかしそれ自体誤って認識され、そしてmRNA合成の間、誤ってスプライスされ、そして親細胞によりプロセッシングされる。親細胞、たとえば菌類宿主細胞、特に糸状菌宿主細胞中への異種ポリペプチドをコードするDNA 配列の導入は、コード配列の誤った又は正道をはずれたスプライシングのこのタイプをもたらす。隠れたイントロン−スプライシング−欠損突然変異細胞は、ポリペプチドの生成をほとんど又はまったく誘導しない隠れたイントロンを有することが知られているDNA 配列によりコードされるポリペプチドの高められた生成をスクリーニングすることによって同定され得る。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する変異体は、上記の複数の突然変異を含む変異体であり得る。
【０１６６】
本発明の突然変異細胞の同定
本発明者は、親細胞における一定の遺伝子座が破壊される場合、その得られる突然変異細胞はポリペプチドの変更された生成を有することを発見した。上記のように、核酸構造体自体は、ポリペプチドの生成に対して効果を有することができる。たとえば、核酸構造体は、ポリペプチドをコードする核酸配列の１又は複数のコピーを含んで成ることができる。さらに、核酸構造体は、プロモーター、転写活性化因子、及びリプレッサ、等を含むことができる。
【０１６７】
核酸構造体自体が、本発明の突然変異細胞が生成されているかどうかを決定するために、生成され、発現され、合成され、又は分泌されるポリペプチドの量に対する効果を有する場合、下記のような遺伝子座を救援し、そして同じ遺伝子座に、効果を有さないもう１つの核酸構造体、たとえば選択マーカーを導入すべきである。同じ遺伝子座に他の核酸構造体を導入することによって生成される突然変異細胞が生成され、発現され、合成され又は分泌されるポリペプチドの量に対して効果を有する場合、元の突然変異細胞は本発明の突然変異細胞である。
【０１６８】
挿入された核酸構造体による遺伝子座の救援及び標的化構造体の使用
本発明はさらに、同定された突然変異細胞から、（ｉ）核酸構造体、及び（ii）核酸構造体が組込まれているゲノムの遺伝子座の３’及び５’フランキング領域を単離し；そしてその遺伝子座の３’及び５’フランキング領域を同定することを含んで成る、挿入された核酸構造体により遺伝子座を救援するための方法にも関する。
【０１６９】
核酸構造体及びフランキング領域は、当業界において良く知られている方法、たとえば制限酵素による切断及び続くＥ．コリの連結及び形質転換、逆PCR 、ランダムプライムされたウォーキングPCR、又は標識された変異体のライブラリーのプローピングにより単離又は救援され得る。３’及び５’フランキング領域のいずれか又は両者を有する単離された核酸構造体は、“標的化構造体”として本明細書において定義される。
標的化構造体は、核酸構造体の組込み部位の上流及び／又は下流の 100〜9,000bp 、好ましくは 200〜9,000bp 、より好ましくは 500〜7,000bp 、さらにより好ましくは 1,000〜7,000bp 及び最とも好ましくは 1,000〜3,000bp 間を含む。
【０１７０】
本発明の標的化構造体は、元の細胞において修飾されたポリペプチドに類似するか又は同一の又はそれとは完全に異なるポリペプチドの生成を変更するために異なった細胞中に導入され得る。他の細胞は、元の細胞と同じか又は異なった種又は異なった属のものであり得る。その元の細胞が菌類細胞である場合、他の細胞は好ましくは、菌類細胞である。その元の細胞が細菌細胞である場合、他の細胞は好ましくは細菌細胞である。元の細胞が哺乳類細胞である場合、他の細胞は好ましくは哺乳類細胞である。
【０１７１】
細胞が異なった細胞である場合、標的化構造体の組込みは好ましくは、標的化構造体が得られる元の細胞の遺伝子座配列に対して相同であり、すなわち標的化配列及び細胞DNA が所望する突然変異を生成するために相同組換えを受けることができるよう同一であるか又は十分に類似する標的遺伝子座で生じる。従って、標的化構造体の配列は好ましくは、相同組込みが生じる細胞染色体DNA の予備選択された部位に対して相同である。しかしながら、標的遺伝子座で再挿入する標的化構造体の傾向は、相同組換え頻度は、酵母サッカロミセス  セレビシアエにおいてほとんど 100％〜アスペルギラスにおいて１％ほどまでの範囲であるので、細胞に依存するであろうことが、当業者により理解されるであろう。標的化構造体は、興味あるポリペプチドをコードするDNA 配列内に存在しないが、しかしポリペプチドの生成の変更をもたらす非標的遺伝子座での非相同組換えにより組込むことができる。
【０１７２】
好ましくは、標的遺伝子座は、その標的化構造体のフランキング配列と、40％以上の相同性、好ましくは60％以上の相同性、より好ましくは70％以上の相同性、さらにより好ましくは80％以上の相同性、及び最とも好ましくは90％以上の相同性を有するDNA 配列を含む。
【０１７３】
標的化構造体は、一回の交差又は置換が所望されるかどうかに依存して３’及び５’領域のいずれか又は両者を含むことができる。さらに、標的化構造体は、始め救援された遺伝子座で、細胞のゲノム中への元の核酸構造体の導入及び組込みの間に生じる、いづれかの誤った現象、たとえば転移、反復、欠失、又は挿入を正すために修飾され得る。
上記の標的化構造体は、すなわち制限酵素切断された線状ヌクレオチド配列として使用され得、又は環状化され、又は適切なベクター中に挿入され得る。たとえば、環状プラスミド又はDNA フラグメントは好ましくは、一本の標的化配列を用いる。
【０１７４】
線状プラスミド又はDNA フラグメントは好ましくは、２本の標的化配列を用いる。興味あるポリペプチドをコードするDNA 配列を含んで成る細胞中への導入に基づいてのその標的化構造体、標的遺伝子座で、又は非標的遺伝子座で、しかし好ましくは、興味あるポリペプチドをコードするDNA 配列内に存在しない標的遺伝子座で細胞のゲノム中に組込む。標的遺伝子座は、興味あるDNA 配列のものと同じ染色体又は同じ染色体外要素上に、又は異なった染色体又は異なった染色体要素上に存在することができる。その組込みが、突然変異細胞及び親細胞が同じ条件下で培養される場合、親細胞に対する突然変異細胞によるポリペプチド又は代謝物の生成を変更する。好ましい態様において、その標的化構造体は選択マーカーを含む。
【０１７５】
任意には、標的化構造体は、複数の別々のフラグメントとして細胞中に導入され得る。２つのフラグメントが使用されるその現象においては、フラグメントは、１つのフラグメントの３’末端及び他のフラグメントの５’末端でDNA 配列相同性（オーバ−ラップ）を共有し、そして１つは第１の標的化配列を担持し、そして他は第２の標的化配列を担持する。細胞中への導入に基づいて、２つのフラグメントは、２つの元のフラグメント間のオーバ−ラップの領域を端に有する第１及び第２標的化配列を有する第１フラグメントを形成するために相同組換えを受けることができる。次に、その生成物フラグメントは、細胞標的配列との相同組換えのために適切な形で存在する。複数のフラグメントが、それらが細胞標的配列との相同組換えのために適切な生成物を究極的に形成するために、お互いとの相同組換えを受けるであろうよう、使用され、企画され得る。
【０１７６】
細胞中への標的化構造体の導入に基づいて、その標的化構造体は、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含む細胞が適切な選択マーカーの存在下でその細胞を培養することによって選択され得る性質を有する増幅できる選択マーカー遺伝子の包含によりさらに増幅され得る。
【０１７７】
特定の態様において、その標的化構造体は、 SplＩにより線状化されたpDSY109, HpaＩにより線状化されたpDSY112, AsnＩ／ PvuＩにより線状化されたpMT1936, NdeＩにより線状化されたpDSY138, AsnＩ／ PvuＩにより線状化されたpDSY162, BglIIにより線状化された p4-8.1, BglIIにより線状化された p4-8.1, NarＩにより線状化されたp7-14.1, BglIIにより線状化されたpSMO717, BglIIにより線状化されたpSMO321, NdeＩにより線状化されたpHowB571又は NdeＩにより線状化されたpSMO810 である。
【０１７８】
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY109 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY112 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpMT1936 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY138 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY162 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY163 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY141 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMO1204である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMOH603である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はp4-8.1である。
【０１７９】
最とも好ましい態様において、核酸構造体はp7-14.1 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpHB220である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMO717 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMO321 である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpHowB571である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMO810 である。
【０１８０】
好ましい態様において、１又は複数の標的化構造体は、標的遺伝子座中に導入される。もう１つの好ましい態様において、個々の標的化構造体は、異なったポリペプチド、又は異なった代謝物、又はそれらの組合せの生成を変更し、又は異なったポリペプチド、又は異なった代謝物又はそれらの組合せの生成を変更する異なった表現型をもたらす。もう１つの態様において、複数の標的化構造体は、標的遺伝子座中に導入される場合、ポリペプチド又は代謝物の生成を変更するために付加的に又は相剰的に作用する。
【０１８１】
突然変異細胞からの所望するポリペプチド又は代謝物の生成方法
本発明はさらに、宿主細胞として所望する表現型を有する突然変異細胞に関する。所望するポリペプチド又は代謝物の高められた生成のために選択された突然変異細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ポリペプチド又は代謝物の生成のために適切な栄養培地において培養される。たとえば、細胞は、ポリペプチド又は代謝物の発現及び／又は単離を可能にする適切な培地において、及び条件下で実施される実験室又は産業発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給物−バッチ、又は固体状態発酵を包含する）により培養され得る。
【０１８２】
培養は、当業界において知られている方法（たとえば、細菌及び酵母についての引用文献；Bennett, J.W. and LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991 を参照のこと）を用いて、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において生じる。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開されている組成（たとえば、American Type Culture Collectionのカタログにおけるような）に従って調製され得る。ポリペプチド又は代謝物が栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチド又は代謝物が分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。
【０１８３】
ポリペプチド及び代謝物は、ポリペプチド及び代謝物に対して特異的である、当業界において知られている方法、たとえば前記記載された方法及び例に記載される方法を用いて検出され得る。
【０１８４】
得られるポリペプチド又は代謝物は、当業界において知られている方法により回収され得る。たとえば、ポリペプチド又は代謝物は、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿方法（但し、それらだけには限定されない）により栄養培地から回収され得る。
【０１８５】
本発明のポリペプチド及び代謝物は、当業界において知られている種々の方法、たとえばクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（たとえば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（たとえば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（たとえば、Protein Puridication, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 を参照のこと）（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る。
【実施例】
【０１８６】
種々の構築物を作り、本発明の方法を実施する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために下記の実施例を記載するが、これらの実施例は本発明者らが発明と見なす範囲を限定しない。特記しない限り、部は重量部であり、温度はセ氏であり、そして圧力は大気圧またはその付近である。使用した数（例えば、ＤＮＡ配列の長さ、分子量、量、特定の成分、およびその他）に関する正確度を保証しようと努力されたが、多少の変動は説明されるであろう。
【０１８７】
実施例１：菌株および材料
出発菌株は下記の通りである：pyrG−マイナスのアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）HowB425 、 pyrG-マイナスのアスペルギルス・オリゼHowB101 、アスペルギルス・オリゼJaL250、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger)JRoy3(pyrG△）、大腸菌（E.coli)DH5α(GIBCO-BRL、マリイランド州ガイザーバーグ）、および大腸菌HB101 (GIBCO-BRL、マリイランド州ガイザーバーグ）。
【０１８８】
PDAプレートは39g/lのジャガイモデキストロース寒天（Difco)を含有し、特記しない限り、pyrG栄養要求性のための10 mMのウリジンが補充されていた。
MY25培地、pH 6.5は、１リットル当たり、25gのマルトース、2.0gのMgSO4・7H2 O、2.0ｇのクエン酸、10ｇの酵母エキス、2.0ｇのK2SO4 、2.0ｇの尿素、および0.5 mlの微量金属溶液から構成されていた。MY25震盪フラスコの培地を、マイクロタイター成長実験において使用するためにガラス蒸留水で1:100または1:1000に希釈した（MY25/100またはMY25/1000）。培養物を34℃において成長させた。
【０１８９】
２×MY塩pH 6.5溶液は、１リットル当たり、4gのMgSO4・7H2O、4gのK2SO4 、20gのKH2PO4 、４ｇのクエン酸、１mlの微量金属、および２mlのCaCl2・2H2O（100g/l貯蔵液）から構成されていた。
【０１９０】
最小培地の形質転換プレートは、１リットル当たり、6gのNaNO3 、0.52gのKCl、1.52gのKH2PO4 、１mlの微量金属溶液、１ｇのグルコース、500mgのMgSO4・7H2O、342.3gのスクロースおよび20ｇのノーブル（Noble)寒天／ｌ（pH 6.5）から構成されていた。最小培地の転移プレート（pH 6.5）は、１リットル当たり、６ｇのNaNO3 、0.52gのKCl、1.52gのKH2PO4 、１mlの微量元素、１ｇのグルコース、500mgのMgSO4・7H2O、および20gのノーブル寒天から構成されていた。
【０１９１】
微量金属溶液（1000×）は、１リットル当たり、22gのZnSO4・7H2O、11gのH3BO3 、５ｇのMnCl2・4H2O、５ｇのFeSO4・7H2O、1.6gのCoCl2・5H2O、1.6gの(NH4)6 Mo7O24、および50gのNa4 EDTAから構成されていた。
【０１９２】
COVEプレートは、１リットル当たり、343.3gのスクロース、20mlのCOVE塩溶液、10mlの1Mのアセトアミド、10mlの3MのCsCl、および25gのノーブル寒天から構成されていた。COVE塩（50×）溶液は、26gのKCl、26gのMgSO4・7H2O、76gのKH2PO4 、および50mlのCOVE微量金属溶液から構成されていた。COVE微量金属溶液は下記の成分から構成されていた（／ｌ）：0.04gのNaB4O7・10H2O、0.040gのCuSO4・5H2O、0.70gのFeSO4・H2O、0.80gのNa2MoO2・2H2O、およびZnSO4 。
【０１９３】
YEG培地は、１リットル当たり、５ｇの酵母エキスおよび２０ｇのデキストロースから構成されていた。
CM-1寒天平板、pH 6.5は、１リットル当たり、0.25gのNaCl、0.5gのMgSO4・7H2O、1.9gのK2HPO4 、3.6gのKH2PO4 、0.1mlの微量金属溶液、30gのBacto寒天（Difco）、pH6.5、11mlの10％の尿素、および67mlの30％のマルトースから構成されていた。
【０１９４】
CD培地は、１リットル当たり、１ｇのMgSO4・7H2O、１ｇのK2SO4 、15gのKH2PO4 、0.25mlの微量金属溶液、0.7gの酵母エキス（Difco）、20gのベータ−シクロデキストリン（Sigma C-4767）、3mlの50％の尿素、および2mlの15％のCaCl2・2H2Oから構成されていた。
G1-gly培地は、１リットル当たり、18gの酵母エキス（Difco)、80gの75％のグリセロール、および0.5gのCaCl2・2H2Oから構成されていた。
【０１９５】
OL-1培地（pH7.0）は、１リットル当たり、15gのKH2PO4 、１ｇのMgSO4・7H2O、１ｇのK2SO4 、0.25mlの微量金属溶液、0.3gのCaCl2・2H2O（別々にオートクレーブ処理された）、２ｇのディフコ（Difco)酵母エキス（Difco)、0.5gの尿素（別々にオートクレーブ処理された）、および10gのグルコースから構成されていた。
【０１９６】
OL-6培地（pH7.0）は、１リットル当たり、15gのKH2PO4 、１ｇのMgSO4・7H2O、１ｇのK2SO4 、0.25mlの微量金属溶液、0.3gのCaCl2・2H2O（別々にオートクレーブ処理された）、２ｇのディフコ酵母エキス（Difco）、３ｇの尿素（別々にオートクレーブ処理された）、および60gのグルコースから構成されていた。
【０１９７】
YPM培地を500mlの水中に溶解した10gのバクトペプトンおよび5gの酵母エキスから構成し、オートクレーブ処理し、これに50mlの滅菌した20％のマルトース溶液を添加した。
MTBCDUY は、１リットル当たり、0.3gのMgSO4・7H2O、0.3gのK2SO4 、5gのKH2PO4 、0.013gの尿素、0.01gの酵母エキス、0.1gのマルトース、4.88gのウリジン、および0.25mlの微量金属溶液１（pH6.5）から構成されていた。
【０１９８】
４×MTBCDUY は、１リットル当たり、0.3gのMgSO4・7H2O、0.3gのK2SO4 、5gのKH2PO4 、0.052gの尿素、0.04gの酵母エキス、0.4gのマルトース、4.88gのウリジン、および0.25mlの微量金属溶液１から構成されていた。
【０１９９】
MDU1B は、１リットル当たり、45gのマルトデキストリンMD01、1.0gのMgSO4・7H2O、1.0gのNaCl、2.0gのK2SO4 、12.0gのKH2PO4 、7.0gの酵母エキス、0.5mlの微量金属溶液、および0.1mlのプルロン酸から構成されていた。微量金属溶液は、13.9gのFeSO4・7H2O、8.45gのMnSO4・H2O2 、6.8gのZnCl2 、2.5gのCuSO4・5H2O、2.5gのNiCl2・6H2O、および３ｇのクエン酸から成っていた。震盪フラスコの培地のｐＨを、オートクレーブ処理の前に、5.0に調節した。
【０２００】
1/5MDU2BPは、１リットル当たり、9gのマルトース、0.2gのMgSO4・7H2O、0.4gのK2SO4 、0.2gのNaCl、2.4gのKH2PO4 、1.0gの尿素、1.4gの酵母エキス、および1.0mlの微量金属溶液１から構成されていた。
微量金属溶液１は、１リットル当たり、13.8gのFeSO4・7H2O、8.5gのMnSO4・H2O、14.3gのZnSO4・7H2O、2.5gのCuSO4・5H2O、0.5gのNiCl2・6H2O、および3.0gのクエン酸から構成されていた。
YPGプレートは、１リットル当たり、4.0gの酵母エキス、1.0gのKH2PO4 、0.5gのMgSO4 ・7H2 O、15.0gのデキストロース、および20.0gの寒天から構成されていた。
【０２０１】
実施例２：アスペルギルス・オリゼHowB430 の構築
フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa)からのリパーゼ遺伝子（LIPOLASEＴＭ遺伝子、Novo Nordisk A/S、デンマーク国バグスバード）を含有するように、アスペルギルス・オリゼHowB430 を構築した。
後述するように、TAKA/NA2-tpiリーダーハイブリッドプロモーター、フミコラ・ラヌギノサからのリパーゼ遺伝子、ＡＭＧターミネーター、および選択可能なマーカーとして全長のアスペルギルス・ニヅランス（Aspergillus nidulans）のamdS遺伝子を含有するようにpBANe8を構築した。
【０２０２】
ＰＣＲにより、下記のプライマー１および２を使用してpToC90(Christensen et al. 、1988、Biotechnology 6:1419-1422)の完全なａｍｄＳ遺伝子をフランクするNsiI部位を挿入し、そして下記のプライマー３および４を使用してpJaL292(第１図）のNA2-tpi リーダーハイブリッドプロモーターの５’末端にEcoRI部位および３’末端にSwaI部位を挿入した。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）394型DNA/RNA合成装置を使用して、プライマーを合成した。
【０２０３】
プライマー１：5'-ATGCATCTGGAAACGCAACCCTGA-3'（配列識別NO:1）
プライマー２：5'-ATGCATTCTACGCCAGGACCGAGC-3'（配列識別NO:2）
プライマー３：5'-TGGTGTACAGGGGCATAAAAT-3' （配列識別NO:3）
プライマー４：5'-ATTTAAATCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGTGG-3'（配列識別NO:4）。
【０２０４】
鋳型としてほぼ0.2μgのpToC90またはpJaL292 を使用して、増幅反応物（100μl）を調製した。各反応物は下記の成分を含有した：0.2μgのプラスミドDNA、48.4pmolの前方プライマー、48.4pmolの逆プライマー、1mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPの各々、1×Taqポリメラーゼ緩衝液、および2.5UのTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp.、ニュージャージイ州ブランチバーグ）。反応物を次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー（Ericomp Thermal Cycler）中でインキュベートした：１サイクル、95℃、５分間、次いで30サイクル、各々95℃、１分間、55℃、１分間、および72℃、２分間。
【０２０５】
PCR生成物を１％のアガロースゲル上で電気泳動させて、2.7kbのamdSフラグメントおよび0.6kgのNA2-tpiフラグメントの存在を確証した。
【０２０６】
引き続いて、製造業者の使用説明書に従いTAクローニングキット（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、PCR生成物をpCRIIの中にサブクローニングした。製造業者の使用説明書に従いQIAwell-8プラスミドキット（Qiagen,Inc.、カリフォルニア州チャッツワース）を使用して、形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、プラスミドＤＮＡをＮｓｉＩまたはＥｃｏＲＩ／ＳｗａＩで制限消化し、次いでアガロース電気泳動により、NsiIのamdSフラグメントおよびSwaI/EcoRIのNA2-tpiフラグメントについての正しい大きさ、それぞれ、2.7kbおよび0.6kbのフラグメントの存在を確証することによって、形質転換体をスクリーニングした。
【０２０７】
PCR生成物を確証するために、生成物をアプライド・バイオシステムスの373A型自動化ＤＮＡ配列決定装置（Applied Biosystems,Inc. 、米国カリフォルニア州フォスターシティー）により双方の鎖について色素ターミネーター化学を用いるプライマーウォーキング技術（Giesecke et al. 、1992、Journal of Virol.Methods 38:47-60 ）に従いM13逆（−48）およびＭ１３前方（−20）プライマー（New England Biolabs 、マサチュセッツ州ベバーリイ）および配列決定するＤＮＡに対してユニークなプライマーを使用して配列決定した。次いで正しい形質転換体からのプラスミドを、プラスミドの消化に使用した制限酵素で消化し、１％のアガロースゲル上で分離し、製造業者の使用説明書に従いＦＭＣのSpinBindキット（FMC、メイン州ロックランド）を使用して精製した。
【０２０８】
pKS6（第２図）は、ＴＡＫＡプロモーター、ポリリンカー、ＡＭＧターミネーター、およびアスペルギルス・ニヅランスのｐｙｒＧ遺伝子を含有し、これをＥｃｏＲＩおよびＳｗａＩで消化して、TAKAプロモーターの一部分を除去した。この領域をNA2-tpiPCR生成物で置換して、pBANe13 を生成した（第３図）。
【０２０９】
pBANe13 をNsiIで消化して、アスペルギルス・ニヅランスのpyrG遺伝子を除去した。次いで、この領域を前述の全長のamdS遺伝子のPCR生成物で置換して、pBANe6（第４図）。
PCRにより、下記のプライマー５および６を使用して、pMHan37 の全長のフミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子上にSwaIおよびPacIフランキング部位を挿入した。前述したように、プライマー５および６を合成した。
【０２１０】
プライマー５：5'-ATTTAAATGATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3'（配列識別NO:5）
プライマー６：5'-TTAATTAACTAGAGTCGACCCAGCCGCGC-3' （配列識別NO:6）
増幅反応物（100μl）は下記の成分を含有した：0.2μgのpMHan37、48.4pmolのプライマー5、48.4pmolのプライマー６、1MのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPの各々、1×Taqポリメラーゼ緩衝液、および2.5UのTaqポリメラーゼ。次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー中で、反応物をインキュベートした：１サイクル、95℃、５分間、次いで30サイクル、各々95℃、１分間、55℃、１分間、および72℃、２分間。2μlの反応物をアガロースゲル上で電気泳動させて、ほぼ900bpのリパーゼ遺伝子産物の増幅を確証した。
【０２１１】
次いで、PCR増幅されたリパーゼ遺伝子産物をTAクローニングキットを使用してpCRIIの中にサブクローニングした。QIAwell-8プラスミドキットを使用して、形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、プラスミドDNAをSwaI/PacIで制限消化し、前述の方法に従いDNAを配列決定してPCR生成物を確証することによって、形質転換体をスクリーニングした。
リパーゼ遺伝子をSwaIおよびPacIで消化してpCRIIプラスミドから切除し、引き続いてSwaI/PacI消化したpBANe6の中にサブクローニングしてpBANe8（第６図）を生産した。
pBANe8をPmeIで消化し、そしてNA2-tpiプロモーター、フミコラ・ラヌギノサからのリパーゼ遺伝子、およびAMGターミネーターを含有する直鎖状PmeIフラグメントを調製用アガロース電気泳動により、40mMのTris−酢酸塩−1mMのEDTA（TAE）緩衝液を使用して単離した。
【０２１２】
下記の手順に従いアスペルギルス・オリゼHowB425を直鎖状PmeIフラグメントで形質転換することによって、アスペルギルス・オリゼHowB430を発生させた。
【０２１３】
アスペルギルス・オリゼHowB425を100mlの１％の酵母エキス−２％のペプトン−１％のグルコース中で32℃において16〜18時間撹拌しながら150rpmで成長させた。フィルター上にほぼ10mlが残留するまで、0.45μmのフィルターを通す濾過により菌糸体を回収し、25mlの1.0〜1.2MのMgSO4−10mMのリン酸ナトリウムpH6.5で洗浄し、前述したように濾過し、前述したように10mlが残留するまで再び洗浄し、次いで125mlのエルレンマイヤーフラスコ中で1.2MのMgSO4−10mMのリン酸ナトリウムpH6.5（0.45μmで濾過した）中の10mlの5mg/mlのNOVOZYM234TM（Novo Nordisk A/S、デンマーク国バグスバード）の中に再懸濁させた。
【０２１４】
懸濁液をおだやかに震盪しながら50rpmでほぼ１時間37℃においてインキュベートして、プロトプラストを発生させた。10mlの体積のプロトプラスト／菌糸体の調製物を30mlのコレックス（Corex）遠心管に添加し、5mlの0.6Mのソルビトール−10mMのTris-HCl、pH7.5をオーバーレイし、揺動バケットローター中の3600×gで15分間遠心してプロトプラストを回収した。プロトプラストを緩衝液の界面からパスツールピペットで回収した。次いでプロトプラストをSTCの中で2×107 プロトプラスト/mlの最終濃度に再懸濁させた。
【０２１５】
2×107 プロトプラスト/mlの濃度においてプロトプラストを使用して、amdS選択のためのアスペルギルス・オリゼHowB425の形質転換を実施した。10μgのDNAを100μｌのプロトプラストに添加した。次いで250μlのPEG溶液（60%のPEG4000−10mMのCaCl2−10mMのTris-HCl、pH8.0）を添加し、そして混合物を37℃において30分間配置した。3mlの1Mのソルビトール−10mMのCaCl2-10mMのTris pH7.5（STC）を添加し、amdSについて選択するために、この混合物をCoveプレート上にプレートした。プレートを34℃において７〜10日間インキュベートした。形質転換体を同一培地のプレートに移し、37℃において３〜５日間インキュベートした。同一条件下にスクロースを含まない同一培地の同一プレートを使用して、胞子をストリークし、隔離されたコロニーを取り上げることによって、形質転換体を精製した。
【０２１６】
実施例３：アスペルギルス・オリゼHowB427の構築
アスペルギルス・オリゼHowB425をpMHan37およびpSO2（第７図）で共形質転換して、TAKAプロモーターの背後にリパーゼ遺伝子を含有するアスペルギルス・オリゼHowB427を構築した。
【０２１７】
pSO2（第７図）をアスペルギルス・オリゼ1560のゲノムのライブラリーから構築した。まずアスペルギルス・オリゼ1560のゲノムのDNAをSau3A（New England Biolabs 、マサチュセッツ州ベバーリイ）で部分的に消化することによって、アスペルギルス・オリゼ1560のゲノムのライブラリーを構築した。製造業者により推奨される条件を使用して、４単位のSau3Aを使用して10μgのアスペルギルス・オリゼ1560のゲノムのDNAを消化した。反応を65℃において実施し、試料を５分の間隔で（０から50分まで）採った。反応物を氷上に配置し、EDTAを10mMに添加することによって反応を停止させた。次いでこれらの消化物を臭化エチジウムを含む１％のアガロースゲル上で実施し、3kb〜9kbのDNAを含有するゲルの領域を切除した。
【０２１８】
次いで、製造業者（New England Biolabs 、マサチュセッツ州ベバーリイ）により提供されるプロトコールに従いベータ−アガロースＩを使用して、DNAをゲルスライスから精製した。次いで、製造業者の使用説明書に従い（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）製造業者により推奨される条件下に16℃において一夜、大きさで選択したＤＮＡをEMBL4 アームの中に結合した。製造業者のプロトコールに従いGigapack II パッケージングキット（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）を使用して、結合反応物をパッケージし、力価決定した。合計16,000の組換えプラークが得られ、そしてライブラリーを製造業者により提供されるプロトコールに従い増幅した。
【０２１９】
EMBL4アームとともに提供されるプロトコールに記載されているように、ゲノムのライブラリーを適当に希釈して7000プラーク/150mmのペトリプレートを得た。標準的プロトコール（Sambrook et al. 、1989、前掲）に従い、プラークをHybond-Nプラス円形フィルター（Amersham、オハイオ州クレブランド）にリフトした。フィルターをＵＶ架橋により固定し、42℃において前ハイブリダイゼーションした（5×SSPE、35％のホルムアミド）。ランダムプライムDNA標識キット（Boehringer Mannheim 、インジアナ州インジアナポリス）を使用して32Pで標識化されたアスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子から成る500bpのフラグメントで、ゲノムのライブラリーを低いストリンジェンシイ（35％のホルムアミド、5×SSPE、42℃）においてプローブした。3.8kbのHindIIIフラグメントを１つのファージから単離し、pUC118クローニングベクターの中にサブクローニングしてpSO2を生成した。
【０２２０】
実施例２に記載する手順に従いアスペルギルス・オリゼHowB425の共形質転換を実施したが、ただし選択を最小培地の形質転換プレート上で行った。形質転換体を最小培地の形質転換プレートに移し、37℃において３〜５日間インキュベートした。次いで同一培地の同一転移プレートを使用して、胞子をストリークし、隔離されたコロニーを取り上げることによって、形質転換体を精製した。
【０２２１】
実施例４：プラスミドpSO122、pDSY81およびpDSY82の構築
後述するように、アスペルギルス・オリゼのpyrG遺伝子の1.5kbのフラグメントを含有するpSO122を構築した。
PCRにより、下に示すプライマー７および８を使用して、pSO2のpyrG遺伝子の5’末端にBamHI制限部位を導入することによって、pSO122を発生させた。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムスの394型DNA/RNA合成装置により、プライマー７および８を合成した。
【０２２２】
プライマー７：5'-GCGGGATCCCTAGAGTAGGGGGTGGTGG-3'（配列識別NO:7）
プライマー８：5'-GCGGGATCCCCCCTAAGGATAGGCCCTA-3'（配列識別NO:8）
増幅反応物（50μl）は下記の成分を含有した：2ngのpSO2、48.4pmolの前方プライマー、48.4pmolの逆プライマー、1mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPの各々、１×Taqポリメラーゼ緩衝液、および2.5UのTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp.、ニュージャージイ州ブランチバーグ）。次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー中で、反応物をインキュベートした：１サイクル、95℃、５分間、次いで30サイクル、各々95℃、１分間、55℃、１分間、および72℃、２分間。PCR生成物を１％のアガロースゲル上の電気泳動により単離した。
【０２２３】
単離したPCR生成物をBamHIで消化し、pBluescript SK-(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）のBamHI部位の中にクローニングしてpSO122を生成した（第８図）。実施例２に記載するようにpyrGフラグメントの残部はアスペルギルス・オリゼHowB430 から欠失されたので、アスペルギルス・オリゼのHowB430 およびpSO122のゲノムの間の唯一の相同性はpyrGインサートの５’末端の中に存在した。
【０２２４】
ゲノム中のこの相同領域にターゲッティングする頻度を減少するために、pSO122は2つのBamHI部位を含有するので、BamHI部位の１つが破壊された、pSO122、pDSY81およびpDSY82の２つの誘導体（第８図）を構築した。pSO122をBamHIで部分的に消化し、５’オーバーハングの中にクレノー断片を充填し、結合によりプラスミドを閉じ、引き続いて大腸菌DH5αの中に形質転換することによって、プラスミドpDSY81およびpDSY82を構築した（Sambrook et al. 、1989、前掲）。次いで、QIAwell-8 プラスミドキットを使用して、形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、プラスミドDNAをBamHIで制限消化して、BamHI部位の１つが破壊されたかどうかを決定することによって、形質転換体をスクリーニングした。BamHI部位の１つが破壊されたプラスミドをNsiI/BamHIで消化して、どのBamHI部位が破壊したかを決定した。
【０２２５】
実施例５：pSO122、pDSY81またはpDSY82を使用するアスペルギルス・オリゼHowB430 の形質転換
実施例２に記載されているように、アスペルギルス・オリゼHowB430のプロトプラストを調製した。DNAの５〜15μlのアリコート（円形pSO122、４〜12UのEcoRIで線状化したpDSY81、または15UのBamHIで線状化したpDSY82）を、14mlのファルコン（Falcon）ポリプロピレン管の中の0.1mlのプロトプラストに２×107 プロトプラスト/mlの濃度で添加し、次いで250μlの60%のPEG4000-10mMのCaCl2-10mMのTris-HCl、pH7を添加し、おだやかに混合し、37℃において30分間インキュベートした。
【０２２６】
5μgの円形pSO122、6μgの線状化pDSY81、または6μgの線状化pDSY82を使用して、形質転換を実施した。次いで3mlのSPTC（1.2Mのソルビトール−10mMのCaCl2-10mMのTris pH8）を添加し、懸濁液をおだやかに混合した。懸濁液を12mlの溶融オーバーレイ寒天（１×COVE塩、１％のNZアミン、0.8Mのスクロース、0.6％のノーブル寒天）または3mlのSTC培地と混合し、懸濁液を最小培地のプレート上に注いだ。プレートを37℃において３〜５日間インキュベートした。
【０２２７】
円形pSO122の形質転換の形質転換頻度は、約100〜200形質転換体/μgの範囲であった。アスペルギルス・オリゼHowB430 の約120,000DNA標識化形質転換体のライブラリーが得られた。
EcoRI REMI pDSY81の形質転換の形質転換頻度は、約60〜100形質転換体/μgの範囲であった。アスペルギルス・オリゼHowB430の約28,000DNA標識化形質転換体のEcoRI REMIライブラリーが発生した。
【０２２８】
EcoRI REMI pDSY82の形質転換の形質転換頻度は、約80〜110形質転換体/μgの範囲であった。アスペルギルス・オリゼHowB430の約27,000DNA標識化形質転換体のEcoRI REMIライブラリーが得られた。
また、前述したように、pDSY81を使用して、アスペルギルス・オリゼHowB430のHindIIおよびSalI REMIライブラリーを調製した。
【０２２９】
HindII REMI pDSY81の形質転換の形質転換頻度は、約80〜120/μgの範囲であった。アスペルギルス・オリゼHowB430の約35,000DNA標識化形質転換体のHindII REMIライブラリーが発生した。
SalI REMI pDSY81の形質転換の形質転換頻度は、約80〜120/μgの範囲であった。アスペルギルス・オリゼHowB430の約25,000DNA標識化形質転換体のSalI REMIライブラリーが発生した。
【０２３０】
アスペルギルス・オリゼHowB430標識化突然変異株のライブラリーのプールをpSO122について「ｈ」；EcoRIで消化し、引き続いてEcoRIの存在において形質転換したpDSY81について「ｅ」；BamHIで消化し、引き続いてBamHIの存在において形質転換したpDSY82について「ｂ」；HindIIIで消化し、引き続いてHindIIIの存在において形質転換したpDSY81について「hIII」；そしてSalIで消化し、引き続いてSalIの存在において形質転換したpDSY81について「ｓ」と表示する。123「ｈ」プール、28「ｅ」プール、23「ｃ」プール、55「hIII」プール、および25「ｓ」プールが存在した。
前述のライブラリーを約1000形質転換体のグループにプールし、−80℃において10％のグリセロールの中に貯蔵した。
【０２３１】
実施例６：「REMI」アスペルギルス・オリゼHowB430形質転換体における組込み事象の特性決定
下記の手順に従い、実施例５に記載する26のEcoRI REMI形質転換体（「ｅ」プール）から、ゲノムDNAを単離した。各形質転換体を小さいペトリプレート中の5mlのYEG培地中で37℃において24時間成長させた。次いでワットマン（Whatman）濾紙No.1（Whatman 、英国スプリングフィールドミル）を通して濾過することによって、菌糸体を各培養物から収集し、1.7mlの遠心管の中に移した。菌糸体調製物をドライアイス中で凍結させ、SpeedVac(Savant Instruments 、Inc.、ニューヨーク州ファーミングデイル）中で一夜室温において乾燥した。凍結した菌糸体調製物を予備のスパチュラで微細粉末に粉砕し、次いで粉砕した菌糸体を0.5mlの溶解緩衝液（100mMのEDTA、10mMのTris pH8.0、1％のトリトン−X100、50mMのグアニジン・HCl、200mMのNaCl）の中に再懸濁させた。
【０２３２】
RNアーゼを各調製物に20μg/mlの最終濃度に添加し、調製物を37℃において30分間インキュベートした。次いでプロテアーゼＫを各調製物に0.1mg/mlの最終濃度に添加し、調製物を50℃において１時間インキュベートした。調製物を13,000×gにおいて15分間遠心し、上清をQIAprep−８−ウェルのストリップ（Qiagen、カリフォルニア州テャツワース）に適用した。製造業者（Qiagen、カリフォルニア州テャツワース）により供給されたPBの0.5mlおよびPEの0.75mlで、ウェルを１回洗浄した。各ウェルから過剰のPEを形成し、200μlのTE緩衝液（10mMのTris-1mMのEDTA、pH7.0）の中にDNAをウェルから溶離した。
【０２３３】
Sambrook et al. 、1989、前掲に記載されている手順に従うサザンハイブリダイゼーションにより、ゲノムDNAをEcoRIで消化してEcoRI部位の中への組込みが起こったかどうかを決定するか、あるいはSnaBIで消化して組込み事象がランダムであるか否かを決定した。製造業者の使用説明書に従いジェニウス・キット（Genius Kit）を使用してジオキシゲニンで標識化したpSO122（第８図）から得られた1.6kbのNheI pyrGフラグメントで、消化物のサザンブロットをプローブした。ブロットを２時間前ハイブリダイゼーションし、ＤＩＧイージイ（Easy）Hyb中で42℃において一夜ハイブリダイゼーションした。製造業者が推奨するように、ブロットを洗浄し、プロセシングした。
【０２３４】
サザンブロットにより、26の形質転換体のうちの13において、EcoRI線状化pDSY81はゲノム中のEcoRI部位の中に組込まれ、そして組込み事象の分布はランダムであることが証明された。26の形質転換体のうちの20において、プラスミドの単一のコピーのみが組込まれたが、形質転換体のうちの６において、少なくとも２つのコピーが同一遺伝子座に組込まれた。EcoRI部位における組込みに向かうバイアス（50％の）がREMIのためであるかどうかを決定するために、ゲノムDNAを前述したように16アスペルギルス・オリゼHowB425形質転換体（ここでEcoRI酵素は実施例５に記載されている手順に従いEcoRI線状化pDSY81で形質転換する前に熱不活性化されている）から単離し、前述したようにサザンブロット分析に付した。これらの形質転換体のサザン分析において、形質転換体のいずれにおいても、プラスミドはゲノムの中のEcoRI部位に組込まれなかったことが証明された。
【０２３５】
実施例７：リパーゼの発現のスクリーニング
実施例５に記載されているアスペルギルス・オリゼHowB430 標識化突然変異株のライブラリー「ｈ」、「ｅ」、および「ｂ」プールをリパーゼの発現についてアッセイした。
96ウェルのプレートのスクリーンについて、等しい体積の無菌の水および2×MY塩pH6.5溶液から調製された希釈剤で、MY25培地を1000倍に希釈した。24ウェルのプレートの方法について、等しい体積の無菌の水および２×MY塩pH6.5溶液から調製された希釈剤で、MY25培地を100倍に希釈した。
【０２３６】
一次的96ウェルのプレートのスクリーンは、50μlの培地ウェルの中に分配したとき、平均１胞子/ウェルが接種されるように、明確なプールからの胞子をMY25/1000に希釈することを含んだ。接種後、96ウェルのプレートを静的条件下に34℃において７日間成長させた。次いで後述するように、培養物をリパーゼ活性についてアッセイした。MY25/100を含有する24ウェルのプレートの中に問題の突然変異株を直接接種し、37℃において７日間成長させた。次いで後述するように、培養物をリパーゼ活性についてアッセイした。次いで、問題の突然変異株をCOVEプレート上にプレートして胞子を生産し、PDAプレート上に広げて単一のコロニーを生産し、次いで各分離株からの４つの単一のコロニーを前述の24ウェルのプレートの方法で試験した。
【０２３７】
使用直前にMC緩衝液（4mMのCaCl2-100mMのMOPS pH7.5）の中にｎ−ニトロフェニルブチレート貯蔵基質（21μlのｎ−ニトロフェニルブチレート/mlのDMSO）を1:50に希釈することによって、リパーゼアッセイ基質を調製した。40LU/mlの0.02％のアルファ−オレフィンスルホネート（AOS）洗浄剤を含有するＭＣ緩衝液を含有する、標準的リパーゼ（LIPLASETM、Novo Nordisk A/S、デンマーク国バグスバード）を調製した。使用するまで、標準を４℃において貯蔵した。使用直前に、標準的リパーゼをMC緩衝液中で1/40に希釈した。0.02%のAOSを含有するＭＣ緩衝液中のブロス試料を希釈し、20μlのアリコートを96ウェルのプレートの各ウェルに分配し、次いで200μlの希釈した基質を分配した。プレートリーダーを使用して、ほぼ１分の間隔において取った２つの読みの差として、405nmにおける吸収を記録した。
【０２３８】
それ以上の評価のために、96ウェルのスクリーンおよび引き続く24ウェルのスクリーンの結果はpSO122形質転換体からの53の形質転換体およびpDSY81またはpDSY82のREMI形質転換体からの44の形質転換体を同定した。これらの同定された形質転換体は、対照の株アスペルギルス・オリゼHowB427またはアスペルギルス・オリゼHowB430よりも高いレベルのリパーゼを生産した。
【０２３９】
実施例８：震盪フラスコおよび発酵の評価
次いで、実施例７に記載する最高のリパーゼ産生DNA標識化突然変異株をCOVEプレート上に配置して、震盪フラスコおよび発酵の評価のための胞子を生産した。
300〜500μlの胞子懸濁液（0.02％のツイーン80＋COVEプレートからの胞子）を125mlの震盪フラスコ中の25mlのMY25培地の中にpH6.5において接種することによって、震盪フラスコの評価を実施した。震盪フラスコを34℃において200rpmで３日間インキュベートした。試料を第２日および第３日に採り、リパーゼ活性を実施例７に記載するように測定した。
【０２４０】
ヌトリオース（Nutriose）、酵母エキス、（NH4SO4、MgSO4・7H2O、クエン酸、K2SO4 、CaCl2・H2O、および微量金属溶液から構成された培地を含有する２リットルの実験室用発酵槽中で、同一DNA標識化突然変異株を34℃、pH7、1000〜1200rpmにおいて８日間成長させた。実施例７に記載するように、リパーゼ活性を測定した。
得られた結果を下表１に示し、ここで対照としてアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２７またはアスペルギルス・オリゼHowB430のリパーゼ収量が1.0に正規化されている。
【０２４１】
【表１】
2010011865.tif 000002
【０２４２】
表１に示すように、突然変異株は、震盪フラスコ中で成長させたとき、対照株アスペルギルス・オリゼHowB427よりもほぼ２〜４倍多いリパーゼを生産し、そして対照株アスペルギルス・オリゼHowB430よりもほぼ３〜６倍多いリパーゼを生産した。突然変異株は、また、発酵槽中で成長させたとき、対照株アスペルギルス・オリゼHowB427よりもほぼ２〜５倍多いリパーゼを生産した。
【０２４３】
実施例９：高いリパーゼを発現する突然変異株からのプラスミドDNAおよびフランキングDNAのレスキュー
プラスミドDNA（pSO122、pDSY81またはpDSY82）およびゲノムのフランキング遺伝子座を、突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY10.3、DEBY599.3、DEBY932、DEBY1058、DEBY1204.3.3およびHIN603から単離した。
【０２４４】
下記の手順に従い、ゲノムDNAを突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY10.3、DEBY599.3、DEBY932、DEBY1058、DEBY1204.3.3およびHIN603から単離した。各突然変異株の胞子の系統を150mlのYEG培地の中に接種し、37℃および250rpmにおいて一夜成長させた。ミラクロス（Miracloth)(Calbiochem 、カリフォルニア州ラジョラ）を通す濾過により、菌糸体を各培養物から収集し、TEで２回すすいだ。次いで菌糸体調製物を液体窒素中で急速凍結し、乳鉢および乳棒により微粉末に粉砕した。粉末化菌糸体調製物の各々を50mlの管に移し、20mlの溶解緩衝液を添加した。RNアーゼを各調製物に20μg/mlの最終濃度に添加し、調製物を37℃において30分間インキュベートした。
【０２４５】
次いでプロテアーゼＫを各調製物に0.1mg/mlの最終濃度に添加し、調製物を50℃において１時間インキュベートした。次いで調製物を15,000×gで20分間インキュベートして、不溶性物質を沈降させた。製造業者により提供されるQBTと平衡化したクイアゲン（Qiagen）MAXIカラム（Qiagen、カリフォルニア州テャツワース）に、各上清を適用した。次いで製造業者により提供されるQCの30mlで、DNAを各カラムから溶離し、次いで0.7体積のイソプロパノールで沈降させ、15,000×gにおいて20分間遠心することによって回収した。ペレットを最後に5μlの70％のエタノールで洗浄し、空気乾燥し、200μlのTE中に溶解した。
【０２４６】
アスペルギルス・オリゼDEBY10.3、DEBY599.3、DEBY932、DEBY1058、DEBY1204.3.3およびHIN603のゲノムDNA調製物の各々の2μlのアリコートを、別々に、BglII、HpaI、NarI，SphIおよびStuIで消化した。制限エンドヌクレアーゼはpDSY82を切断せず、これは組込まれたプラスミドおよびフランキングゲノムDNAの単離を可能とした。次いで消化されたゲノムDNAを20μlの反応物中で、T4DNAリガーゼで結合した。
【０２４７】
結合したDNA調製物の各々を大腸菌HB101または大腸菌DH5αの中に形質転換した。次いで、形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、インサートを制限消化して、それらがpDSY82から誘導されたことを確証し、前述の方法に従いpDSY82に対して特異的なプライマーを使用してインサートを配列決定した。
【０２４８】
形質転換体大腸菌HB101-pDSY112は、突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY599.3からのHpaIレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌HB101-pDSY109は、突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY10.3からのSphIレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌HB101-pDSY138は、突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY932からのNdeIレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌HB101-pDSY141は、突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY1058からのBglIIレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌DH5α-pSMO1204は、突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY1204.3.3からのBglIIレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌DH5α-pSMOH603は、突然変異株アスペルギルス・オリゼHIN603からのBglIIレスキュード遺伝子座を含有した。
【０２４９】
実施例10：アスペルギルス・オリゼDEBY599.3レスキュード遺伝子座pDSY112の特性決定
1625bpを含有するアスペルギルス・オリゼDEBY599.3レスキュード遺伝子座pDSY112を、実施例２に記載する方法に従い配列決定した。核酸配列（配列識別NO:9）および推定されたアミノ酸配列（配列識別NO:10）を第９図に示す。核酸配列は、ATG開始コドンの約150bp上流のグルコーストランスポーターのプロモーター内に組込みが起こったことを示唆した。オープンリーディングフレームはイントロンにより句読を切られていた。
【０２５０】
予測されたタンパク質（配列識別NO:10）は、それぞれ、酵母（配列識別NO:11）およびヒト（配列識別NO:12）からのグルコーストランスポーターと31.6%および24.8％の同一性を共有し、そして酵母（配列識別NO:13）からのイノシトールトランスポーターと20.1％の同一性を共有した。グルコーストランスポーターは、12の膜スパニングドメインをもつ、非常に独特な予測された二次構造を有する。アスペルギルス・オリゼDEBY599.3レスキュード遺伝子座のカイト・ドーリトル（Kyte-Doolittle）プロットは、酵母およびヒトのグルコーストランスポーターに類似する12の膜スパニングドメインを予測した。
【０２５１】
レスキュードフランキングDNAがアスペルギルス・オリゼDEBY599.3において分裂された遺伝子であることを確証するために、実施例６に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼHowB101およびアスペルギルス・オリゼDEBY599.3のBglIIで消化したゲノムDNA調製物のサザンブロットを調製し、分析した。DIGイージイHyb中で42℃において、ブロットをアスペルギルス・オリゼDEBY599.3レスキュードフランキングDNAでプローブした。次いでブロットを洗浄し、ゲニウス・キットとともに提供されるプロトコールによりプロセシングした。
【０２５２】
アスペルギルス・オリゼHowB101からの2.7kbのBglIIバンドはプローブとハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼDEBY599.3からの約8kbのBglIIバンドはプローブに対してハイブリダイゼーションした。大きさの差はREMIの間に組込まれたプラスミドの長さに対応し、アスペルギルス・オリゼDEBY599.3からレスキューされたDNAが挿入をフランクしていることを確証した。
【０２５３】
実施例11：HpaI線状化pDSY112を使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびリパーゼの発現のスクリーニング
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼHowB430をHpaI線状化pDSY112で形質転換し、形質転換体を回収した。合計、216の形質転換体を24ウェルのプレートにおいて1/100強度のMY25培地中で成長させた。実施例７に記載するように、試料を第４日および第６日に採り、リパーゼ活性についてアッセイした。等しい数の低い、平均のおよび高い生産性のリパーゼ形質転換体を胞子精製し、前述したように、24ウェルのマイクロタイタープレートの培養において再試験した。実施例８に記載するように、これらの精製された形質転換体を、また、震盪フラスコにおいて完全強度のＭＹ２５培地中で再試験した。実施例７に記載するように、リパーゼ活性を測定した。
得られた結果を下表２に示し、ここでアスペルギルス・オリゼHowB430のリパーゼ収量を1.0に正規化した。
【０２５４】
【表２】
2010011865.tif 000003
【０２５５】
発酵条件下に成長させたとき、すべての５つの形質転換体はもとの標識化株アスペルギルス・オリゼDEBY599.3とほぼ同一レベルのリパーゼ活性を生産した。pDSY112がゲノム中の同一の相同遺伝子座に組込まれたかどうかを決定するために、実施例６に記載する手順に従い、アスペルギルス・オリゼHowB430、アスペルギルス・オリゼDEBY599.3およびpDSY112形質転換体のBglIIで消化したDNA調製物のサザンブロットを調製し、分析した。DIGイージイHyb中で42℃において、ブロットをアスペルギルス・オリゼDEBY599.3レスキュードフランキングDNAでプローブした。次いでブロットを洗浄し、ゲニウス・キットとともに提供されるプロトコールによりプロセシングした。
【０２５６】
アスペルギルス・オリゼHowB101からの2.7kbのBglIIバンドはプローブとハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼDEBY599.3からの約8kbのBglIIバンドはプローブに対してハイブリダイゼーションした。2.7kbの野生型BglIIバンドおよび形質転換するDNAに対応する第２バンドは、形質転換体のすべてのにおいてプローブにハイブリダイゼーションした。したがって、形質転換体のいずれも正確な遺伝子の置換をもたなかった。
【０２５７】
実施例12：アスペルギルス・オリゼDEBY10.3レスキュード遺伝子座pDSY109の特性決定
実施例２に記載する手順に従い、アスペルギルス・オリゼDEBY10.3レスキュード遺伝子座pDSY109の組込みの事象の両側の3.4および2.2kbの領域を配列決定した。核酸配列は、palB遺伝子のオープンリーディングフレーム内で組込みの事象が起こったことを示唆した。palB遺伝子は、周囲ｐＨをシグナルするシグナル形質導入経路に関係するシステインプロテアーゼをコードする。
【０２５８】
まずTsp509Iでアスペルギルス・オリゼHowB430ゲノムDNAを部分的に消化することによって、アスペルギルス・オリゼHowB430のゲノムのライブラリーを構築した。製造業者が推奨する条件下に、４単位のTsp509を使用して3.5μgのアスペルギルス・オリゼHowB430 ゲノムDNAを消化した。反応を65℃において実施し、試料を５分間隔（０から50分まで）で採った。反応物を氷上に配置し、EDTAを10mMに添加することによって反応を停止させた。次いでこれらの消化物を臭化エチジウムを含む１％のアガロースゲル上で実施し、3kb〜9kbのDNAを含有するゲルの領域を切除した。
【０２５９】
次いで、製造業者（New England Biolabs 、マサチュセッツ州ベバーリイ）により提供されるプロトコールに従いベータ−アガロースＩを使用して、DNAをゲルスライスから精製した。次いで、製造業者の使用説明書に従い製造業者により推奨される条件下に16℃において一夜、大きさで選択したDNAをラムダZipLoxのEcoRIアームの中に結合した。製造業者のプロトコールに従いGigapack GoldIIIパッケージングキットを使用して、結合反応物をパッケージし、力価決定した。8×106 の組換えプラークが得られ、そしてライブラリーを製造業者により提供されるプロトコールに従い増幅した。
【０２６０】
ゲノムのライブラリーをスクリーニングして、palBのゲノムのクローンを得た。ラムダZipLoxのEcoRIアームとともに提供されるプロトコールに記載されているように、ゲノムのライブラリーを適当に希釈して7000プラーク/150mmのペトリプレートを得た。標準的プロトコール（Sambrook et al. 、1989、前掲）に従い、プラークをHybond-Nプラス円形フィルターにリフトした。フィルターをUV架橋により固定し、DIGイージイHyb中で42℃において前ハイブリダイゼーションした。フィルターをDIG標識化0.25kbのpalBプローブとハイブリダイゼーションさせた。プローブをゲニウス・キットによりジオキシゲニンで標識化し、そして製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムスの394型DNA/RNA合成装置により合成した下記のプライマーを使用してPCR増幅した：
5'-CTGCCGTCGAAGGTGTCCAAG-3' （配列識別NO:14）
5'-ATTGTGGCCCCTATGTGGATT-3' （配列識別NO:15）
【０２６１】
PCRのパラメーターは実施例２に記載する通りである。フィルターを洗浄し、ゲニウス・キットとともに提供されるプロトコールに従い、ハイブリダイゼーション後、プロセシングした。標準的プロトコール（Sambrook et al. 、1989、前掲）に従い、いくつかの陽性のプラークを同定し、均質に精製した。
【０２６２】
実施例２に記載する手順に従い、ヌクレオチド配列をpalB遺伝子について決定した。核酸配列（配列識別NO:16）および推定されたアミノ酸配列（配列識別NO:17）を第10図に示す。オープンリーディングフレームは３つのイントロンで中断されている。アスペルギルス・オリゼPalBタンパク質（配列識別NO:17）は、アスペルギルス・ニヅランスPalBタンパク質（配列識別NO:18）と66.4％の同一性を共有した。挿入部位は、また、37アミノ酸（配列識別NO:19）の高度に保存されたドメインを含有し、このドメインは、多分大腸菌における形質転換またはレスキューの間に挿入されたミトコンドリアのＤＮＡの片である、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）NADHデヒドロゲナーゼから誘導されたもの（配列識別NO:20）に類似した。
【０２６３】
実施例６に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼDEBY10.3およびアスペルギルス・オリゼHowB101 のBglIIで消化したゲノムDNAのサザンブロットを調製した。ブロットをアスペルギルス・オリゼDEBY10.3レスキュードフランキングDNAでプローブして、レスキュードフランキングDNAがアスペルギルス・オリゼDEBY10.3における分裂した遺伝子であることを確証した。
【０２６４】
アスペルギルス・オリゼHowB101からの約7.5kbの野生型BglIIバンドはプローブとハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼDEBY10.3からの12kbのバンドはプローブに対してハイブリダイゼーションした。大きさの差は組込れる１つのプラスミドのコピーについて期待された大きさであり、レスキューされた遺伝子座がアスペルギルス・オリゼDEBY10.3において分裂されていることを確証した。
【０２６５】
アスペルギルス・オリゼDEBY10.3における組込みの事象は非機能的PalBタンパク質に導いたので、アスペルギルス・オリゼDEBY10.3をpH8.0およびpH6.5における成長について試験した。アスペルギルス・ニヅランスpalBマイナス株pH8.0において成長することができないが、pH6.5において成長することができる。10mMのウリジンを含む最小培地中でpH8.0またはpH6.5において、アスペルギルス・オリゼHowB430およびアスペルギルス・オリゼDEBY10.3を成長させた。予測されたように、アスペルギルス・オリゼDEBY10.3はpH8.0において成長することができなかった。
【０２６６】
実施例13：pMT1936の構築
製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムスの394型DNA/RNA合成装置により合成した下記のプライマーを使用して、palBの分裂カセットを含有するpMT1936を構築した。
100752:5'-GGTTGCATGCTCTAGACTTCGTCACCTTATTAGCCC-3' （配列識別NO:21)
100753:5'-TTCGCGCGCATCAGTCTCGAGATCGTGTGTCGCGAGTACG-3' （配列識別NO:22)
100754:5'-GATCTCGAGACTAGTGCGCGCGAACAGACATCACAGGAACC-3'（配列識別NO:23)
100755:5'-CAACATATGCGGCCGCGAATTCACTTCATTCCCACTGCGTGG-3' （配列識別NO:24)
【０２６７】
実施例２に記載する方法に従い得られたアスペルギルス・オリゼA1560から、アスペルギルス・オリゼpalB5’フランキング配列およびpalB産物のＮ−末端部分をコードする配列をＰＣＲ増幅した。ほぼ0.05μgのDNA鋳型および5pmolの２つのプライマー100755および100754の各々を使用した。製造業者（Boehringer Mannheim 、インジアナ州インジアナポリス）が記載するように、ポリメラーゼPwoを使用して増幅を実施した。40サイクルを通して、増幅を進行させた。反応生成物の一部分をフェノール抽出し、エタノール沈降させた、制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化し、ほぼ1.05kbのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。
【０２６８】
前述したように、アスペルギルス・オリゼpalB3’フランキング配列およびpalB遺伝子産物のＣ−末端部分をコードする配列を得たが、プライマー100753および100752を増幅に使用し、PCR生成物を制限酵素XhoIおよびXbaIで消化した後、ゲル電気泳動にかけてほぼ1.50kbのフラグメントを回収した。
【０２６９】
前述の２つの消化し、精製したPCRフラグメントを、２つの部分の結合において、ベクターpJaL400（第11図）から精製された2.7kbのEcoRI-XbaIフラグメントと結合して、pMT1935（第12図）を生成した。PCRプライマー100754および100753を介して導入されたBssHII，SpeIおよびXhoI部位により、pMT1935のpalB5’および3’フランクを分離した。
pMT1935のpalB5’フランクおよび3’フランクの間にアスペルギルス・オリゼpyrG遺伝子を挿入するために、HindIII切断し、脱リン酸化し、精製したpBluescript II SK(-)の中に、反復フランクドpyrG遺伝子を含有するpJaL394（第13図）の3.5kbのHindIIIフラグメントをクローニングした。いずれかの向きにインサートを有するプラスミドが得られた。１つのプラスミド、pMT1931（第14図）を選択し、このプラスミドにおいて、pBluescript ポリリンカーのSpeI部位はpyrG遺伝子の下流に存在し、そしてXhoI部位はpyrG遺伝子の上流に存在した。pyrG遺伝子は3.5kbのSpeI-XhoIフラグメントとして単離し、そしてSpeIおよびXhoIで消化し、精製したpMT1935の中に挿入して、分裂プラスミドpMT1936（第15図）を生成した。
【０２７０】
pyrG選択可能なpalB分裂カセットをpMT1936から、6.2kbのNotIフラグメント（ポリリンカーにおけるNotI切断）として、あるいは5.5kbのAseI-PvuIフラグメント（実際のpalB5’および3’フランキング配列内のAseIおよびPvuI切断）として単離することができる。
【０２７１】
実施例14：pMT1936からのAseI/PvuIpalB分裂カセットを使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびリパーゼのスクリーニング
実施例５に記載する同一の形質転換手順に従い、pMT1936から得られた5.5kbのAseI/PvuIフラグメントを使用して、アスペルギルス・オリゼHowB430 を形質転換した。製造業者の使用説明書に従いQIAクエンチゲル抽出キットにより、pMT1936をAseIおよびPvuIで消化し、１％のアガロースゲル上で分離することによって、形質転換のための線状フラグメントを単離した。次いで、pH6.5またはpH8.0における最小培地のプレート上の成長について、形質転換体を試験した。
【０２７２】
これらの結果が示すように、試験した128形質転換体のうちの13は、pH8.0において成長することができず、palBマイナス表現型を有した。13のpalBマイナス株およびpH8.0において成長することができる13の形質転換体を胞子精製し、次いで、それぞれ、実施例７および８に記載する方法に従い、24ウェルのプレートおよび震盪フラスコの培養においてリパーゼの生産について評価した。結果を下表３に示す。
【０２７３】
アスペルギルス・オリゼpalBマイナス突然変異株、アスペルギルス・オリゼpalBプラス株およびアスペルギルス・オリゼHowB430からのゲノムDNAのサザンブロットを実施して、AsnI/PvuI形質転換DNAフラグメントがpalB遺伝子座の中への完全な置換として組込まれたかどうかを決定した。実施例９に記載する手順に従い、ゲノムDNAを調製し、PvuIで消化し、0.8％のアガロースゲル上で電気泳動させた。0.4N NaOHおよび毛管作用を使用して、DNAをハイボンド（Hybond）N+ 膜に移した。ブロットをUV架橋した後、RapidHyb中で65℃において前ハイブリダイゼーションした。次いでブロットをpMT1936からの0.9kbのAsnI/SpeIフラグメントでプローブした。
【０２７４】
１％のアガロースゲル上の電気泳動後、QiaQuickスピンカラムを使用して、アガロースゲルのスライスから0.9kbのフラグメントを単離した。ビストラ（Vistra）ECFランダムプライム標識化キットを使用して、フラグメントを標識化した。ブロットを前ハイブリダイゼーションし、65℃においてRapid Hyb（Amersham、オハイオ州クレブランド）中でハイブリダイゼーションし、次いで65℃において2×SSC、0.1%SDS中で５分間２回洗浄し、65℃において0.2×SSC、0.1%SDS中で２回洗浄した。洗浄後、ブロットを検出のためにビストラECFランダムプライム標識化キット（Amersham、オハイオ州クレブランド）およびSTORM860映像システム（Molecular Dynamics、カリフォルニア州サニイベイル）によりプロセシングした。
【０２７５】
サザンブロットの結果により、プローブはアスペルギルス・オリゼHowB430 からの6kbのバンドにハイブリダイゼーションすることが証明された。完全な分裂物は約8kbのPvuIバンドにハイブリダイゼーションすることが期待されるであろう。サザンブロットの結果がさらに示すように、palBマイナス株のあるものは完全な分裂を有したが、他のものはもたなかった。サザンブロットの結果を表３に要約する。
【０２７６】
また、３つのpalBマイナス株を実施例８に記載する手順に従い発酵条件下に成長させた。得られた結果を表３に示し、ここでアスペルギルス・オリゼHowB430 のリパーゼ収量を1.0に正規化した。３つのpalBマイナス株は、もとの標識化突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY10.3と同一のものよりも優れるか、あるいはそれに密接した性能を有した。
【０２７７】
【表３】
2010011865.tif 000004
【０２７８】
実施例15：アスペルギルス・オリゼDEBY932レスキュード遺伝子座pDSY138の特性決定
実施例２に記載する方法に従い、1625bpを含有するアスペルギルス・オリゼDEBY932レスキュード遺伝子座pDSY138を合成した。核酸配列（配列識別NO:25）および推定されたアミノ酸配列（配列識別NO:26）を第16図に示す。核酸配列が示すように、REMI組込みのEcoRI部位はオープンリーディングフレームについてATG開始コドンの810bp上流に存在し、そして推定されたアミノ酸配列（配列識別NO:26）は大腸菌およびバシラス・サチリス（Bacillus subtilis)からのマンニトール−１−リン酸塩デヒドロゲナーゼに対して有意な同一性を有した。オープンリーディングフレームは319アミノ酸の予測されたタンパク質をコードし、そして、それぞれ、大腸菌（配列識別NO:27）およびバシラス・サチリス（配列識別NO:28）のマンニトール−１−リン酸塩デヒドロゲナーゼと13.3%および34.7％の同一性を共有した。
【０２７９】
実施例14に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼDEBY932およびアスペルギルス・オリゼHowB430のNdeIで消化したゲノムDNA調製物のサザンブロットを調製し、分析した。ブロットをアスペルギルス・オリゼDEBY932レスキュードDNAでプローブして、レスキュードフランキングDNAがDEBY932において分裂された遺伝子であることを確証した。
アスペルギルス・オリゼHowB430からのほぼ5kbのNdeIバンドはレスキュード遺伝子座にハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼDEBY932からのほぼ10kbのバンドはプローブにハイブリダイゼーションして、アスペルギルス・オリゼDEBY932における分裂した遺伝子座であることを確証した。
【０２８０】
実施例16：NdeI線状化pDSY138を使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびリパーゼの発現のスクリーニング
アスペルギルス・オリゼHowB430をNdeI消化pDSY138で形質転換し、形質転換体を実施例５に記載する方法に従い回収した。合計して、180の回収された形質転換体を24ウェルのマイクロタイタープレート中の1/100強度のMY25中で成長させ、試料を実施例７に記載するようにリパーゼアッセイのために第４日および第６日に採った。上部の11の最高のリパーゼ産生形質転換体および１つの平均のリパーゼ産生形質転換体を胞子精製し、２４ウェルのマイクロタイター培養において再試験した。実施例８に記載するように、これらの精製した形質転換体を、また、震盪フラスコにおいて完全な強度のMY25中で評価した。実施例８に記載するように、上部の２つの生産株をまた２リットルの発酵槽中で成長させた。実施例７に記載するように、リパーゼ活性を測定した。
【０２８１】
得られた結果を下表４に示し、ここでアスペルギルス・オリゼHowB430のリパーゼ収量を1.0に正規化した。上部の２つの生産株は、もとの標識化突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY932と本質的に同一量のリパーゼ活性を生産した。
【０２８２】
【表４】
2010011865.tif 000005
【０２８３】
実施例14に記載するように、アスペルギルス・オリゼDEBY932、アスペルギルス・オリゼHowB430およびpDSY138のNdeIで消化したゲノムDNA調製物のサザンブロットを調製し、分析して、プローブとしてアスペルギルス・オリゼDEBY932レスキュードフランキングDNAを使用して形質転換体における相同遺伝子座産生遺伝子置換において組込まれたかどうかを決定した。
【０２８４】
アスペルギルス・オリゼHowB430からのほぼ5kbのNdeIバンドはレスキュード遺伝子座にハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼDEBY932からのほぼ10kbのバンドはプローブにハイブリダイゼーションしたことを、サザンブロットは示した。表４において、サザン結果と表示する列は、形質転換体が親株のアスペルギルス・オリゼHowB430において観測された大きさの野生型NdeIフラグメントを有したかどうかを示すか、あるいは形質転換体がアスペルギルス・オリゼDEBY932において観測された分裂した大きさに対応するバンドを有したかどうかを示した。
【０２８５】
実施例17：アスペルギルス・オリゼDEBY1058レスキュードpDSY141の特性決定
実施例２に記載する方法に従い、ほぼ11kbを含有するアスペルギルス・オリゼDEBY1058レスキュードpDSY141を配列決定した。核酸配列は、レスキュード遺伝子座がBamHIREMIの組込みの事象のただ１つの側からのフランキングDNAを含有し、そしてpDSY141配列が再配列されたことを証明した。
【０２８６】
実施例14に記載するように、アスペルギルス・オリゼDEBY1058のBamHIで消化したゲノムDNAのサザンブロットをアスペルギルス・オリゼDEBY1058レスキュードフランキングDNA調製物でプローブし、分析して、レスキュードフランキングDNAがアスペルギルス・オリゼDEBY1058における分裂した遺伝子であることを確証した。
サザンブロット分析は、pDSY82DNAがBamHI部位にREMI事象として組込まれたが、pDSY82の１つのコピーが組込まれたことを示し、これはレスキュードプラスミドが再配列され、フランキングDNAの１つの側のみを含有する理由を示唆した。
【０２８７】
他のフランキング片を得るために、アスペルギルス・オリゼDEBY1058からのレスキュードゲノムDNAの32P標識化0.5kbのフラグメントを使用して、実施例６に記載するように調製した、アスペルギルス・オリゼHowB430ゲノムのライブラリーから、ゲノムクローン（pDSY163）を単離した。製造業者の使用説明書に従い（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）Prime-Itキットを使用して、プローブを標識化した。ほぼ7000プラークの５つのプレートをプレートし、実施例12に記載するように、プラークをHybond-N+ にリフトした。フィルターを42℃において50％のホルムアミド、5×SSPE、0.3%のSDSおよび200μg/mlの剪断、変性されたサケ精子DNA中で１時間前ハイブリダイゼーションした。
【０２８８】
変性されたプローブを添加し、フィルターを42℃において一夜ハイブリダイゼーションした。フィルターを1×SSC、0.1%のSDS中で65℃において５分間２回洗浄し、0.1×SSC、0.1%のSDS中の65℃において15分間２回洗浄し、2×SSC中の室温において10分間洗浄した。フィルターをＸ線フィルムに対して露出し、標準的プロトコール（Sambrook et al．、1989、前掲）を使用して12の陽性プラークを取り上げ、精製した。ラムダZipLox EcoRIアームキットとともに提供される切除プロトコールを使用して、精製したゲノムのクローンからプラスミドDNAを単離した。
【０２８９】
実施例２に記載するように、ゲノムのクローンの3.6kbのヌクレオチド配列を決定した。核酸配列（配列識別NO:29）および推定されたアミノ酸配列（配列識別NO:30）を第17図に示す。核酸配列は、突然変異株における組込みのBamHI部位がタンパク質（配列識別NO:30）をコードするオープンリーディングフレームの停止コドンの250bp下流に存在することを示し、前記タンパク質はサッカロミセス・セレビシエからのマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（配列識別NO:31）と有意な同一性を共有した。
【０２９０】
アスペルギルス・オリゼDEBY1058における組込み部位はマンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の停止コドンの250bp下流に存在したので、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの発現に対するこの組込みの効果を決定した。機能的マンガンスーパーオキシドジスムターゼを欠如するサッカロミセス・セレビシエ株は、酸素が存在するとき、パラクアットに対して感受性である。アスペルギルス・オリゼDEBY1058およびアスペルギルス・オリゼHowB430を、24ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、10mMのウリジンおよび０、２、４、６、８、１０または20mMのパラクアットを補充した１mlのYEG培地中で34℃において震盪しながら成長させた。
【０２９１】
アスペルギルス・オリゼHowB430は8mMまでのパラクアットの濃度において成長したが、アスペルギルス・オリゼDEBY1058の成長は２ｍＭのパラクアットにより阻害された。データが示すように、アスペルギルス・オリゼDEBY1058におけるマンガンスーパーオキシドジスムターゼの停止コドンの250bp下流の組込みの事象はマンガンスーパーオキシドジスムターゼの発現を減少させた。
【０２９２】
実施例18：pDSY162の構築
製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス394型DNA/RNA合成装置を使用して合成された下記のプライマーを使用して、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を含有するゲノムDNAの3179bpのXbaI/KpnIフラグメントのPCR増幅により、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂カセットを含有するpDSY162を構築した。
970738:5'-GCTCTAGATCGTCGGAGCTCATGTCGGCGATTTTAC-3' （配列識別NO:32)
970739:5'-GCGGTACCACGCCTAGAGCAAAGTATAAATAAGGAA-3' （配列識別NO:33)
【０２９３】
増幅反応物（100μl）は下記の成分を含有した：0.2μgのpDSY163、48.4pmolのプライマー970738、48.4pmolのプライマー979739、1mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPの各々、１×Taqポリメラーゼ緩衝液、および2.5UのTaqポリメラーゼ。次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー中で、反応物をインキュベートした：１サイクル、95℃、５分間、次いで30サイクル、各々95℃、１分間、55℃、１分間、および72℃、２分間。2μlの反応物をアガロースゲル上で電気泳動させて、ほぼ3179bpのPCR生成物の増幅を確証した。
【０２９４】
TOPO TAクローニングキット（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、PCR生成物をpCRR TOPOの中にサブクローニングした。次いで、製造業者の使用説明書に従いQIAwell-8 プラスミドキットを使用して形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、XbaI/KpnIを使用してプラスミドDNAを制限消化して、正しい大きさのフラグメントの存在を確証し、そして実施例２に記載する方法に従いDNAを配列決定してPCR生成物を確証することによって、形質転換体をスクリーニングした。
【０２９５】
マンガンスーパーオキシドジスムターゼのインサートを含有するプラスミドをXbaIおよびKpnIで消化し、１％のアガロースゲル上で分離した。製造業者の使用説明書に従いQIAquick Gel抽出キットを使用して、3.1kbのマンガンスーパーオキシドジスムターゼのフラグメントを精製した。精製したフラグメントを、XbaIおよびKpnIで消化したpBluescript SKと結合して、pDSY161（第18図）を生成した。結合反応物を使用して大腸菌DH5αを形質転換した。
【０２９６】
次いで、製造業者の使用説明書に従いQIAwell-8プラスミドキットを使用して形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、プラスミドをHindIIIで消化して、どのクローンが正しいかを決定することによって、形質転換体をスクリーニングした。
pDSY161をHindIIIで消化して600bpのフラグメントを除去し、消化物を１％のアガロースゲル上で電気泳動させた。製造業者の使用説明書に従いQIAquick Gel抽出キットを使用して、5.4kbのベクターフラグメントを単離し、pyrG遺伝子反復を含有するpJaL394（第13図）からの3.5kbのHindIIIフラグメントに結合してpDSY162（第19図）を生成した。結合反応物を使用して大腸菌DH5αを形質転換した。
【０２９７】
次いで、製造業者の使用説明書に従いQIAwell-8プラスミドキットを使用して形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、それらをHindIIIで消化して、どのプラスミドがpDSY162中の期待する3.5kbのHindIIIフラグメントを含有するかを決定することによって、形質転換体をスクリーニングした。
【０２９８】
実施例19：AsnI/PvuIマンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂カセットを使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびリパーゼのスクリーニング
実施例２に記載する同一の形質転換手順に従い、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂カセットを含有する5.8kbのAseI/PvuIフラグメントで、アスペルギルス・オリゼHowB430 で形質転換した。pDSY162をAseIおよびPvuIで消化し、そして製造業者の使用説明書に従いQIAquick Gel抽出キットを使用して１％のアガロースゲル上で分離することによって、形質転換のための線状フラグメントを単離した。次いで、pH6.5において最小培地のプレート上の成長について形質転換体を試験した。
【０２９９】
実施例17に記載するように、６つの形質転換体を調製し、パラクアットに対する感受性について試験した。６つの形質転換体のうちの４つはパラクアット感受性であり、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂マイナスを示したが、４つのパラクアット感受性株はパラクアットに対して等しく感受性ではなかった。下表５に示すように、ダッシュはパラクアットに対して非感受性であることを意味し、++は中間レベルのパラクアットに対して感受性であることを意味し、そして+++は2mMのパラクアットによってさえ阻害されることを意味する。
【０３００】
実施例７および８に記載する手順に従い、すべての形質転換体を胞子精製し、24ウェルおよび震盪フラスコの培養においてリパーゼの生産について試験した。下表５に記載する結果が示すように、アスペルギルス・オリゼHowB430をマンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂カセットで形質転換した後、パラクアットに対して感受性である形質転換体は平均してアスペルギルス・オリゼHowB430より高いLIPLASETMレベルを生成した。
【０３０１】
実施例14に記載するように、マンガンスーパーオキシドジスムターゼがマイナスのアスペルギルス・オリゼの突然変異株、マンガンスーパーオキシドジスムターゼがプラスのアスペルギルス・オリゼの株、およびアスペルギルス・オリゼHowB430からのゲノムDNAのサザンブロットを実施して、AsnI/PvuI形質転換DNAフラグメントがマンガンスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子座の中に完全な置換体として組込まれたかどうかを決定した。
【０３０２】
サザンブロットの結果（表５）が示すように、2mMのパラクアットに対してさえ感受性の株はマンガンスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子座において分裂したが、中間レベルのパラクアットに対して感受性の株は野生型遺伝子座および分裂カセットの遺伝子座の双方を有する。サザンブロットおよびLIPLASETMの収量の結果が総合して示すように、同一細胞における全長全およびトランケートの双方のマンガンスーパーオキシドジスムターゼの発現は、パラクアットに対する中間の感受性およびLIPLASETM産生の増加に導く。これは下記の事実により説明される。すなわち、マンガンスーパーオキシドジスムターゼはホモダイマーであるので、それぞれ、野生型および分裂カセットによりコードされる野生型およびトランケートの形態の発現は、非機能的であるか、あるいは部分的に機能的であるヘテロダイマーに導く。
【０３０３】
【表５】
2010011865.tif 000006
【０３０４】
実施例20：アスペルギルス・オリゼDEBY1204.3.3レスキュード遺伝子座pSMO1204の特性決定
実施例２に記載する手順に従い、2.0kbを含有するアスペルギルス・オリゼDEBY1204.3.3レスキュード遺伝子座pSMO1204を配列決定した。第20図に示す核酸配列（配列識別NO:34）は、発表された配列に対する相同性をもたなかった。
【０３０５】
サザン分析およびゲノムのクローンの配列決定を使用して、標識化突然変異株を発生させたとき、欠失が起こらなかったことを確証した。実施例14に記載するように、種々の制限エンドヌクレアーゼ（BamHI、BglII、SalIおよびSphI）で消化したアスペルギルス・オリゼHowB430ゲノムDNAのサザンブロットを調製し、分析した。下記のプライマーを使用するPCRにより、レスキュードプラスミドの両端からのプローブを発生させた。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス394型DNA/RNA合成装置を使用して、プライマーを合成した。
【０３０６】
97052 5'-CTATGATTGGCCGATAGG-3'（配列識別NO:35)
97053 5'-CCAGGCTCGCACGCTTTC-3'（配列識別NO:36)
97054 5'-CTTGCAACTAACGGGGTT-3'（配列識別NO:37)
97055 5'-TGAGAAAGACCAAGAATG-3'（配列識別NO:38)
【０３０７】
プライマー97052および97053を使用するPCRにより、レスキュード遺伝子座の１端から、プローブ１を発生させた。プライマー97054および97055を使用するPCRにより、レスキュード遺伝子座の他端から、プローブ２を発生させた。増幅／標識化反応物（50μl）は下記の成分を含有した：10ngのレスキュードプラスミドpSMO1204、プローブ１について50pmolのプライマー97052および97053ので各またはプライマー２について50pmolのプライマー97054および97055ので各、１×DIG標識化混合物（Boehringer Mannheim、インジアナ州インジアナポリス）、１×Taqポリメラーゼ緩衝液、および2.5UのTaqポリメラーゼ。次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー中で、反応物をインキュベートした：１サイクル、95℃、５分間、次いで30サイクル、各々95℃、１分間、55℃、１分間、および72℃、1.5分間。
【０３０８】
実施例14に記載する手順に従い、種々の制限酵素で消化したアスペルギルス・オリゼHowB430ゲノムDNAのサザンブロットを調製し、分析した。ブロットを独立にプローブ１およびプローブ２にハイブリダイゼーションさせた。双方のプローブを有する消化物の同一のバンディングパターンは、欠失が起こらなかったことを示唆する。サザン分析の条件は下記の通りであった：ブロットをEasy Hyb中で42℃において１時間前ハイブリダイゼーションさせ、一夜ハイブリダイゼーションさせた。ブロットを2×SSC、0.1%のSDS中の室温において各15分間２回洗浄し、次いで２回65℃において0.1×SSC、0.1%のSDS中で各15分間洗浄した。ベーリンガー・マンヘイムのDIG洗浄ブロック緩衝液系からの緩衝液および試薬を使用して、検出を続けた。CDPスター（Boehringer Mannheim、インジアナ州インジアナポリス）を使用して、化学発光反応を検出した。フィルムをほぼ１時間露出した。
【０３０９】
サザンブロットの結果は、異なる消化物を使用して同一のバンディングパターンを示し、標識化プラスミドの直接的挿入を示唆した。実施例12に記載するように得られたアスペルギルス・オリゼZiploxライブラリーを標識化突然変異株アスペルギルス・オリゼDEBY1204からのプローブでプローブすることによって、ゲノムのクローンを得た。アスペルギルス・オリゼHowB430のZiploxライブラリーをプローブ１でスクリーニングした。ゲノムのクローンを単離し、配列決定して（実施例２）標識化事象の間に欠失が起こらなかったことおよび標識化プラスミドがEcoRI部位の中に挿入されたことを確証した。
【０３１０】
実施例21：アスペルギルス・オリゼ突然変異株HIN603レスキュード遺伝子座pSMOH603の構築
実施例２に記載する手順に従い、1.0kbを含有するアスペルギルス・オリゼHIN603レスキュード遺伝子座pSMOH603を配列決定した。第21図に示す核酸配列（配列識別NO:39）は、発表された配列に対する相同性を示さなかった。
【０３１１】
制限酵素SphI、SalIおよびBamHIで消化したアスペルギルス・オリゼHowB430ゲノムDNAのサザンブロットを、レスキュードプラスミドの両端から作ったプローブにハイブリダイゼーションさせた。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス394型DNA/RNA合成装置により合成した下に示すプライマー970858およびプライマー970859を使用するPCRにより、プローブ３を発生させた。プライマー970860およびプライマー970861を使用するPCRにより、プローブ４を発生させた。50μlのPCR標識化反応の鋳型は、10ngのレスキュードプラスミドpSMOH603であった。PCRサイクルおよび条件は実施例20に記載する通りであった。サザン条件は実施例20に記載する通りであった。
【０３１２】
970858:5'-TGTAGTCTGACTAGCATG-3' （配列識別NO:40)
970859:5'-GGATCTTCACCTAGATCC-3' （配列識別NO:41)
970860:5'-CATAGTGTCGACCAAGC-3'（配列識別NO:42)
970851:5'-CAATCGAGCTTGCCTATG-3' （配列識別NO:43)
【０３１３】
サザン上の異なるバンディングパターンは、標識化が起こったところで欠失が起こったことを示唆した。500ngのアスペルギルス・オリゼHowB430 ゲノムDNAをプライマー090858および090860を使用するPCR反応において鋳型として使用したとき、3kbの生成物が適用され、2.5kbの欠失が起こったことを示唆した。標識化アスペルギルス・オリゼHIN603株から調製し、HindIIIで消化し、アスペルギルス・オリゼpyrGからのNheIフラグメントでプローブした、ゲノムDNAのサザン分析は、標識化突然変異株がREMI事象により発生しなかったことを示唆した。
【０３１４】
実施例22：アスペルギルス・オリゼHowB432の構築
NA2-tpiプロモーター、フミコラ・ラヌギノサからのセルラーゼ遺伝子（CAREZYMETM、Novo Nordisk A/S、デンマーク国  バグスバード）およびプラスミドpGAG3（第22図）から得られたAMGターミネーターを含有する線状フラグメントでアスペルギルス・オリゼJaL250を形質転換することによって、アスペルギルス・オリゼHowB432を発生させた。
【０３１５】
アスペルギルス・オリゼJaL142（Christensen et al.、1988、Bio/Technology 6:1419-1422)から中性プロテアーゼＩ遺伝子（npI）を欠失することによって、アスペルギルス・オリゼJaL250を構築した。npI遺伝子をコードする5.5kbのSacIゲノムフラグメントを含有するプラスミドpJaL389（第23図）中のnpI遺伝子に中央部分をコードする1.1kbのBalIフラグメントを、反復によりフランクされたpyrG遺伝子を含有するpJaL335（第24図）からの3.5kbのHindIIIフラグメントを交換し、これによりプラスミドpJaL399（第25図）をつくることによって、npI欠失プラスミドを構築した。アスペルギルス・オリゼJaL142を7.9kbのSacIフラグメントで形質転換した。最小培地のプレート上のウリジン要件の緩和により、形質転換体を選択した。実施例14に記載するサザン分析および標準的方法に従うIEFプロテアーゼプロフィル分析により、形質転換体を分析した。
【０３１６】
35の形質転換体のうちの２つは親株に比較して変更したサザンプロフィルを有し、IEFにより中性のプロテアーゼＩ活性を示さなかった。さらに、サザン分析は２つの形質転換体のうちの１つはnpI遺伝子の完全な欠失を有することを示し、これをアスペルギルス・オリゼJaL228と表示した。
【０３１７】
0.1％の５−フルオロ−オロチン酸（FOA）および10mMのウリジンを補充した最小培地のプレート上に、アスペルギルス・オリゼJaL228の合計2.3×107 の分生子を広げた。８つのFOA耐性コロニーが得られた。８つのコロニーからのBamHI消化ゲノムDNAのサザンブロットを401bpのpyrG反復領域でプローブして、pyrG遺伝子が反復領域における組換えにより切除されていることが証明された。アスペルギルス・オリゼJaL228は、反復領域の２コピーから由来する2.7および3.1kbの期待された大きさの２つのバンドを示した。反復領域の間の組換えによりpyrG遺伝子が喪失された場合、3.1kbのバンドは消失し、2.7kbのみが残ったであろう。すべての８つのFOA耐性コロニーは、バンドのこのパターンを示した。８つのコロニーの中に残留するnpI遺伝子と401反復のコピーとの間の結合部をカバーするPCRフラグメントの配列決定は、pyrG遺伝子が反復の間の組換えにより切除されたことを確証した。コロニーの１つをアスペルギルス・オリゼJaL250と表示した。
【０３１８】
pDM176（第26図）からフミコラ・ラヌギノサのセルラーゼ遺伝子を含有するSwaI/PacIフラグメントを単離し、このフラグメントをSwaI/PacI消化pBANe6の中に結合することによって、pGAG3を構築した。pDM176からのSwaI/PacIフラグメントおよびSwaI/PacI消化pBANe6を１％のアガロースゲル上で分離し、製造業者の使用説明書に従いQIAquick Gel抽出キット（Qiagen，Inc.、カリフォルニア州チャッツワース）を使用して単離した。結合を使用して大腸菌DH5α細胞を形質転換し、次いで製造業者の使用説明書に従いQIAwell-8プラスミドキットを使用して形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、実施例２に記載する方法に従い、プラスミドDNAを制限消化して、正しい大きさのフラグメントの存在を確証し、DNAを配列決定することによって、形質転換体をスクリーニングした。
【０３１９】
次いでpGAG3をPmeIで消化し、TAE緩衝液を使用する調製用アガロース電気泳動により、線状発現カセットを単離した。次いで線状カセットを使用してアスペルギルス・オリゼJaL250を形質転換した。
【０３２０】
実施例２に記載するように調製した2×107 プロトプラスト/mlの濃度のプロトプラストを使用して、アスペルギルス・オリゼJaL250の形質転換体をamdSについて選択した。10μgの前述の線状フラグメントを100μlのプロトプラストに添加した。次いで250μlの体積のPEG（60％のPEG400-10mMのCaCl2-10mMのTris-HCl、pH8.0）を添加し、この混合物を37℃において30分間配置した。３mlのSTC培地を添加し、この混合物をamdSの選択のために10mMのウリジンを補充したＣｏｖｅプレート上にプレートした。プレートを34℃において７〜10日間インキュベートした。次いで形質転換体を同一培地のプレートに移し、34℃において３〜５日間インキュベートした。スクロースを含まない同一培地のプレートを使用して、胞子をストリークし、分離したコロニーを取り上げることによって、形質転換体を精製した。
【０３２１】
実施例23：HpaI線状化pDSY112を使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびセルラーゼ発現のスクリーニング
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼHowB432をHpaI消化pDSY112で形質転換し、形質転換体を回収した。全体的に、104の回収される形質転換体を24ウェルのマイクロタイタープレートにおいて1/4強度のMY25中で成長させた。試料を第５日および第７日に採り、後述するようにセルラーゼ活性についてアッセイした。
【０３２２】
要求に応じてNovo Nordisk A/S、デンマーク国バグスバードから入手可能であるNovo Nordisk法AF302.1/1-GBから誘導される、下記のプロトコールに従い、セルラーゼ活性を測定した。アゾカルボキシメチルセルロースを100mMのMOPS、pH7.0、緩衝液の中に80℃において10分間溶解することによって、２％のアゾカルボキシメチルセルロースを含有する基質溶液を調製した。CAREZYMEＴＭ（Novo Nordisk A/S、デンマーク国バグスバード）を標準として使用し、対応して100mMのMOPS、pH7.0、緩衝液の中に希釈することによって、2.5〜25ECU/mlの貯蔵液を調製して標準曲線を構成した。標準および試料（震盪フラスコおよび発酵のために希釈した）の5μlのアリコートを、96ウェルのプレートの個々のウェルの中にピペットで入れた。
【０３２３】
65μlの体積の２％のアゾカルボキシメチルセルロース溶液をウェルの各々の中にピペットで入れ、混合した。反応物を45℃において30分間インキュベートし、次いで215μlの停止試薬を添加し、次いで混合して反応を停止させた。まず0.2gのZnCl2 を20mlの250mMのMOPS、pH7.0の中に懸濁させ、この懸濁液を80mlの1.1mlの濃HCl/リットルのエタノールを含有する酸性化エタノールに添加することによって、停止試薬を調製した。次いで、停止された反応を含有するプレートを3000rpmで10分間遠心した。各懸濁液の100μlのアリコートを96ウェルのプレートの中にピペットで入れ、600nmにおける吸収を測定した。線形回帰を使用して、勾配、交差、および相関係数を標準および試料について決定した。
【０３２４】
24ウェルのプレートからの上部の10の形質転換体生産するセルラーゼを胞子精製し、前述したように24ウェルの培養において再成長させ、セルラーゼ活性についてアッセイした。また、精製した株を125mlの震盪フラスコにおいてMY25 pH6.5中で34℃において成長させ、セルラーゼのアッセイのために第３日および第５日に試料を採った。また、アスペルギルス・オリゼ HowB432 pDSY112 84-1-1およびアスペルギルス・オリゼ HowB432 pDSY112 94-1-1を実施例８に記載するように発酵槽（２リットル）中で成長させた。前述したように、セルラーゼ活性を測定した。
【０３２５】
24ウェルおよび震盪フラスコの培養からの結果を表６に記載し、ここでアスペルギルス・オリゼHowB432 のセルラーゼ収量を1.0に正規化した。
【０３２６】
【表６】
2010011865.tif 000007
【０３２７】
実施例14に記載するように、BglIIで消化したアスペルギルス・オリゼHowB432、アスペルギルス・オリゼDEBY599.3およびpDSY112の形質転換体のゲノムDNAのサザンブロットを調製し、分析して、プローブとしてアスペルギルス・オリゼDEBY599.3レスキュードフランキングDNAを使用して、ゲノム中の相同遺伝子座においてpDSY112が組込まれたかどかを決定した。
【０３２８】
アスペルギルス・オリゼHowB432 からの2.7kbのBglIIバンドはプローブにハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼDEBY599.3からの約8kbのBglIIバンドはプローブにハイブリダイゼーションした。すべての形質転換体において、2.7kbの野生型BglIIバンドおよび形質転換ＤＮＡに対応する第２バンドはプローブにハイブリダイゼーションした。したがって、形質転換体のいずれも正確な置換をもたなかった。
【０３２９】
実施例24：NdeI線状化pDSY138を使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびセルラーゼ発現のスクリーニング
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼHowB432 をNdeI消化pDSY138で形質転換した。合計２40の形質転換体が回収され、これらを実施例８に記載するように24ウェルのマイクロタイタープレートにおいて1/4強度のMY25中で成長させたが、ただし実施例23に記載するようにセルラーゼ活性のアッセイのために第３日および第５日に試料を採った。上部の20のセルラーゼ産生形質転換体を胞子精製し、24ウェルのマイクロタイタープレートにおいて再試験した。
【０３３０】
上部の８つのセルラーゼを産生する１回精製した形質転換体を第２回の胞子精製に付し、実施例８に記載するように、震盪フラスコにおいて完全強度のMY25中で試験した。また、実施例８に記載するように、上部の２つの産生株を２リットルの発酵槽中で成長させた。実施例23に記載するように、セルラーゼ活性を測定した。
得られた結果を表７に記載し、ここでアスペルギルス・オリゼHowB432のセルラーゼ収量を1.0に正規化する。
【０３３１】
【表７】
2010011865.tif 000008
【０３３２】
実施例14に記載するように、NdeIで消化したアスペルギルス・オリゼDEBY932、アスペルギルス・オリゼHowB432およびpDSY112の形質転換体のゲノムDNAのサザンブロットを調製し、分析して、プローブとしてアスペルギルス・オリゼDEBY932レスキュードフランキングDNAを使用して、ゲノム中の相同遺伝子座においてpDSY138DNAが組込まれたかどかを決定した。
【０３３３】
サザンブロットの結果が証明するように、アスペルギルス・オリゼHowB432からのほぼ5kbのNdeIバンドはレスキュード遺伝子座にハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼDEBY932からのほぼ10kbのバンドはプローブにハイブリダイゼーションした。表７において、サザンの結果と表示する列は、親株アスペルギルス・オリゼHowB432において観測された大きさの野生型NdeIフラグメントを有するかどうかを示すか、あるいはアスペルギルス・オリゼDEBY932において観測された分裂した大きさに対応するバンドを形質転換体が有するかどうかを示した。
【０３３４】
実施例25：pMT1936からのAseI/PvuI palB分裂カセットを使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびセルラーゼのスクリーニング
実施例５に記載する同一の形質転換体手順に従い、palB分裂カセットを含有するAseI/PvuIフラグメントでアスペルギルス・オリゼHowB432を形質転換体した。pMT1936をAseIおよびPvuIで消化し、製造業者の使用説明書に従いQIAquick Gel抽出キットを使用して１％のアガロースゲル上で分離することによって、形質転換のための線状フラグメントを単離した。次いで、得られた形質転換体を最小培地のプレート上でpH6.5またはpH8.0において成長について評価した。
【０３３５】
これらの結果が示すように、312の形質転換体のうちの10はpH8.0において成長することができず、palBマイナスの表現型を示した。10のpalBマイナス形質転換体およびpH8.0において成長することができた10の形質転換体を胞子精製し、実施例23に記載する手順に従いセルラーゼの生産について24ウェルおよび震盪フラスコの培養において試験した。下表８に記載する結果が示すように、palBマイナス株はpalBプラス株よりもすぐれたセルラーゼ生産株であった。
【０３３６】
実施例14に記載するように、アスペルギルス・オリゼpalBマイナス突然変異株、アスペルギルス・オリゼpalBプラス株、およびアスペルギルス・オリゼHowB432からのゲノムDNAのサザンブロットを実施して、AseI/PvuI形質転換DNAフラグメントが完全な置換としてpalB遺伝子座の中に組込まれたかどうかを決定した。
サザンブロットの結果（表８）が証明するように、palBマイナス株のいくつかは完全な分裂を有したが、他の株はもたなかった。
【０３３７】
【表８】
2010011865.tif 000009
【０３３８】
実施例26：AsnI/PvuIマンガンスーパーオキシドジスムターゼ分裂カセットを使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびセルラーゼのスクリーニング
実施例５に記載する同一手順に従い、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ分裂カセットを含有する5.8kbのAsnI/PvuIフラグメントを使用して、アスペルギルス・オリゼHowB432を形質転換した。
【０３３９】
実施例17に記載するように、24の形質転換体を調製し、パラクアットに対する感受性について試験した。20の形質転換体のうちの７つはマンガンスーパーオキシドジスムターゼマイナス表現型を示すパラクアット感受性であったが、それらは下表９に示すように異なるレベルのパラクアットに対して感受性である。パラクアット感受性について+++として示すものは2mM程度に低いパラクアットに対して感受性であるが、−および++と表示するものは、それぞれ、パラクアットに対して感受性でなく、そして中間レベルのパラクアットに対して感受性である。形質転換体のすべてを胞子精製し、実施例23に記載するように、24ウェルの培養においてセルラーゼの生産について試験した。実施例23に記載するように、また、株を125mlの震盪フラスコの培養において試験した。結果を下表９に示す。パラクアット感受性である株は、パラクアット感受性ではない株よりも、平均して、より多いCAREZYMEＴＭを生産する。
【０３４０】
実施例14に記載するように、形質転換体およびアスペルギルス・オリゼHowB432 のサザンブロットを調製し、分析して、AsnI/PvuIマンガンスーパーオキシドジスムターゼ分裂カセットが組込まれて、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ分裂カセットの遺伝子座の中への完全な置換を与えたかどうかを決定した。
【０３４１】
下記表９に記載するサザンブロットの結果が示すように、2mMのパラクアットに対して感受性の株はマンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂した遺伝子座のみを有するが、中間レベルのパラクアットに対して感受性である株は野生型遺伝子座および分裂カセットの双方を有する。パラクアットに対して中間の感受性は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼがホモダイマーであり、そして分裂カセットによりコードされる野生型およびトランケートのマンガンスーパーオキシドジスムターゼが多分機能的ではないヘテロダイマーを産生するであろうという事実により説明することができる。
【０３４２】
【表９】
2010011865.tif 000010
【０３４３】
実施例27：グルコーストランスポーター遺伝子を過度に発現するプラスミドpHB218およびpDSY153および停止制御プラスミドpDSY152およびpDSY155の構築
アスペルギルス・オリゼDEBY599.3からのグルコーストランスポーターレスキュード遺伝子座を過度に発現するプラスミドを構築して、グルコーストランスポーターの過度の発現がフミコラ・ラヌギノサのリパーゼおよびセルラーゼの収量の増加に導くかどうかを決定した。グルコーストランスポーターのオープンリーディングフレームをPCR増幅して、それぞれ、５’および３’末端においてSwaIおよびPacI部位を配置した。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス394型DNA/RNA合成装置で合成した下記のプライマーを、増幅において0.2μgのpDSY112と組み合わせて使用した：
961176:5'-ATTTAAATGGTCCTCGGTGGATCAAGC-3'（配列識別NO:44)
961177:5'-TTAATTAATTAGTCCTGTCGCGCTGGT-3'（配列識別NO:45)
【０３４４】
増幅のために使用した条件およびパラメーターは実施例２に記載する通りであった。10μgのPCR反応物をアガロースゲル上で電気泳動させ、そして期待されるように1.5kbの生成物が得られた。製造業者のプロトコールに従いpPCR-ScripTMキット（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）を使用して、PCR生成物をクローニングした。結合反応物を使用して大腸菌DH5α細胞を形質転換し、QIAwell-8 プラスミドキットを使用して、いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを単離した。プラスミドをNotIおよびEcoRIで消化して、どのクローンが1.5kbのインサートを有するかを決定した。分析した11のクローンのうちの６つは、アガロースゲル上の電気泳動により、正しい大きさのインサートを有することが決定された。
【０３４５】
クローンの１つのpDSY119をPacIおよびSwaIで消化し、消化物をアガロースゲル上で展開させた。1.5kbのSwaI/PacIバンドをゲルから切除し、QIAquick Gel抽出キットを使用してゲルのスライスから精製した。標準的条件（Sambrook et al. 、1989、前掲）下に、1.5kbのフラグメントをSwaI/PacI切断pBANe13（第３図）と結合した。結合物を使用して大腸菌DH5α細胞を形質転換し、形質転換体のいくつかからプラスミドDNAを単離した。プラスミドをSwaI/PacIで消化して、どのクローンが期待した1.5kbのインサートを有するかを決定した。最終プラスミドをpHB218（第27図）と表示した。
【０３４６】
過度の発現の対照として、停止コドンがグルコーストランスポーターのオープンリーディングフレーム中のアミノ酸９に挿入されているpHB218の誘導体を部位特異的突然変異誘発により調製した。MORPHTM部位特異的プラスミドDNA突然変異誘発キット５プライム→３プライムを突然変異誘発のために使用し、キットとともに提供されるプロトコールに従った。反応物は鋳型としてpHB218を含有し、使用した突然変異誘発プライマーは下記の通りであった：
970545:5'-CGGTGGATCAAGCGGTTAATTAATCACTCCGTACCTGAT-3'（配列識別NO:46)
【０３４７】
プロトコールに従っていくつかの大腸菌のコロニーが得られ、QIAwell-8 プラスミドキットを使用してコロニーからプラスミドDNAを単離した。突然変異誘発のためのマーカーとして働くPacI部位を突然変異誘発プライマーが導入したので、プラスミドをPacIで消化した。成功した突然変異誘発を示す余分のPacI部位を有するプラスミドの２つを実施例２に記載するように配列決定して、ORF中のアミノ酸９における停止コドンの存在を確証した。アミノ酸９に停止コドンを有するpHB218誘導体をpDSY152と表示した。
【０３４８】
pyrGプラスである株の形質転換のために、選択可能なマーカーがbar遺伝子であるpHB218およびpDSY152の変異型を構築した。pHB218およびpDSY152からのSwaI/PacIインサートを制限消化により単離し、アガロースゲル上で電気泳動させ、QIAquick Gel抽出キットを使用して精製した。インサートをpSE39（第28図）の中に結合し、SwaI/PacIで消化した。結合反応物を使用して大腸菌DH5αを形質転換し、前述したように、プラスミドDNAをコロニーから単離した。プラスミドをSwaI/PacIで消化して、どのクローンが期待する1.5kbのインサートを含有するかを決定した。プラスミドを実施例２に記載するように配列決定して、それぞれ、pDSY155およびpDSY153（第29図）中のアミノ酸９における停止コドンの存在または非存在を確証した。pDSY155およびpDSY153の間の唯一の差は、pDSY155中のORFのアミノ酸９における停止コドンであった。
【０３４９】
実施例28：pHB218およびpDSY152を使用するアスペルギルス・オリゼHowB430 およびアスペルギルス・オリゼHowB432 の形質転換および、それぞれ、リパーゼおよびセルラーゼのスクリーニング
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼHowB430をpHB218またはpDSY152で形質転換し、形質転換体を回収した。各々がpHB218およびpDSY152を有する120の形質転換体が回収され、これらを24ウェルのマイクロタイタープレートにおいて1/100強度のMY25中で成長させ、実施例８に記載するように、３および５日後にリパーゼ活性についてアッセイした。アッセイの結果が示すように、pDSY152の形質転換体に対してpHB218の形質転換体においてリパーゼ生産のより高い方に向かうシフトが存在し、グルコーストランスポーターの過度の発現がリパーゼの発現に対して陽性の作用を有するという考えを支持した。
【０３５０】
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼHowB432をpHB218およびpDSY152で形質転換し、形質転換体を回収した。各々がpHB218およびpDSY152を有する100の形質転換体が回収され、これらを24ウェルのマイクロタイタープレートにおいて1/4強度のMY25中で成長させ、実施例23に記載するように、３および５日後にリパーゼ活性についてアッセイした。アッセイの結果が示すように、pDSY152の形質転換体に対してpHB218の形質転換体においてセルラーゼ生産のより高い方に向かうシフトが存在し、グルコーストランスポーターの過度の発現がセルラーゼの発現に対して陽性の作用を有することを示した。
【０３５１】
例29．pDSY153及びpDSY155を用いたAspergillus oryzae DEBY10. 3の形質転換及びリパーゼスクリーニング
Ａspergillus oryzae DEBY10.3を、pDSY153及びpDSY155で形質転換し、形質転換体を例５で記述した方法を用いて回収した。pDSY153及びpDSY155でそれぞれ216及び144の形質転換体を回収し、1/100 強度のMY25中で、24ウェルのマイクロタイター平板内で成長させ、例８で記述した通りに４日目と６日目にリパーゼ活性について検定した。pDSY153形質転換体内ではpDSY155形質転換体に比べて高いリパーゼ産生に向かってのシフトが存在し、このことはグルコース輸送体の過剰発現がリパーゼ産生の増加を導いたことを表わし、又、paIBマイナス効果とグルコース輸送体の過剰発現が相加的であることを示唆していた。
【０３５２】
例30．Ａspergillus oryzae HowL795内のタグ付けされた事象の同定
例９に従って、Ａspergillus oryzae HowL795からゲノミックDNAを調製した、SnaB1又はNsiIのいずれかを用いて１μgのDNAを消化した。両方の酵素共、タグ付け構成体上に含まれた pyrＧ遺伝子内で分割する。その後、DNAを4ng/μlまで希釈し、18時間22℃でT4リガーゼを用いて再度環状化した。その後、メーカーの指示事項に従ってＡpplied Biosystems の394型DNA/RNA合成装置を用いて合成した以下に示すプライマを使用して、再環状化されたDNA約500ngを用いて逆PCRを行なった。両方のプライマ共、NsiI及びSnaBI部位の下流に位置づけされていた。
プライマｘ：  5'-GCACTCGAATGACTACT-3' （配列番号47）
プライマｙ：  5'-CGCATCATACTTGCGACA-3'（配列番号48）
【０３５３】
逆PCR増幅反応は、以下の構成成分を含んでいた：
500ngの再環状化されたDNA，150p moles のプライマｘ，150p moles のプライマｙ、各々１mMずつのdATP，dCTP，dGTP，及びdTTP，１×Ｔaqポリメラーゼ緩衝液、及び2.5UのTaqポリメラーゼ。以下のようにプログラミングされた Ericomp Thermal Cycler の中で反応をインキュベートした：  ５分間９５℃で１サイクル、それに続いて各々１分間９５℃，１分間55℃，及び２分間72℃で30サイクル。PCR産物を１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離した。
【０３５４】
再連結されたSnaBI DNAのPCRは、4kbのフラグメントを増幅させたのに対し、再連結されたNsiIDNAは、2kbのフラグメントを増幅させた。PCRは、より大きいSnaBIフラグメント内により小さいNsiIフラグメントが含まれていることを確認した。
プライマＡを用いて例２に記述されている手順に従ってDNA配列分析を行なった。この分析は、プラスミドpBANe8内に含まれた amdＳ遺伝子の３' 未翻訳領域内でpSO122の挿入が起こることを同定した。
【０３５５】
例31：  Aspergillus oryzae MStr107の構築
pMStr15からのDNAフラグメントを用いてＡspergillus oryzae How B101を形質転換することにより、未縮重アルファアミラーゼ（TAKA）遺伝子（FUNGAMYLＴＭ遺伝子、Ｎovo ＮordiskA/S．Bagsvaerd. デンマーク）のうちの１つの遺伝子の追加コピーを含むように、Ａspergillus oryzae MStr107を構築した。pMStr15を、以下で記述するように、pCaHj505及びpTAKA17から構築した。指摘がある場合を除き、標準的方法（Sambrook et al.,1989，前出）を利用した。
【０３５６】
以下のフラグメントから、Aspergillus oryzae NA-14アルファアミラーゼ（TAKA）プロモータ，Aspergillus nigerグルコアミラーゼ（AMG）ターミネータ及びAspergillus nidulansamd S遺伝子を含むように、pCaHj505（図30）を構築した：
ａ）  EcoRI及びXbaIで消化したベクターpToC65（W091/17243）：
ｂ）  amd S遺伝子を支持するAspergillus nidulans からの2.7kbのXbaIフラグメント（Corrick et al.,1987．Gene 53:63-71）。真菌形質転換においては、選択性マーカーとして amdS遺伝子を用いた。 amdS遺伝子は、この遺伝子内に通常存在するBamHI部位が破壊されるような形で修飾された。これは、AGAAATCGGGTATCCTTTCAG （配列番号49）を用いて、沈黙点突然変異を導入することによって行なわれた。
【０３５７】
ｃ）  Ａspergillus oryzae NA-14アルファアミラーゼプロモータを支持する0.6kbのEcoRI-BamHIフラグメント、
ｄ）  Aspergillus'nigerグルコアミラーゼ転写ターミネータを支持する675bpのXbaIフラグメント。プラスミドpICAMG/Term （EP238023）からフラグメントを分離した。フラグメントｃのBamHI部位を、pIC19Rリンク（BamHIからXbaI）を介して、フラグメントｄ上の転写ターミネータの前のＸbaＩ部位を連結させた（Boehringer Mannheim, Indianapolis.IN）。
【０３５８】
Aspergillus oryzae NA-14アルファアミラーゼプロモータ、遺伝子及びターミネータ、及びAspergillus nidulans amd S遺伝子を含むように、pMStr15（図31）を構築した。プロモータ及びターミネータを伴うアルファアミラーゼ遺伝子を、2.9kbのEcoRI-Hind III フラグメントとしてPTAKA17から切除し（欧州特許0238023号）、ベクターpCaHj505内でEcoRI-XbaIプロモータ／ターミネータフラグメントを置換することによって、このベクターpCaHj505内の amdS遺伝子に隣接してクローニングさせた。クローニングを容易にするため、Hind III 及びXbaI消化によって生成された陥凹３' 末端を充てんした。
【０３５９】
NotIでpMStr15を消化し、アガロースゲル電気泳動を用いてベクター及びインサート配列を分解させ、ゲルから適切なDNAバンドを切除し、メーカーの指示（Supelco, Bellefonte,PA）に従って Gen EluteTMアガローススピンカラムを用いてアガロースからDNAを精製することによって、アルファアミラーゼ遺伝子及び amdS遺伝子の両方を含む単一の線形DNAフラグメントを得た。例２で記述した形質転換プロトコル及び選択培地を用いて、Aspergillus oryzae MStr107を構築するよう、Aspergillus oryzae HowB101を形質転換するべく、この5.6kbのNotIフラグメントを用いた。付加的なスクリーンを行なう前に、0.1％のトリトンX100を伴うCOVE培地上で連続２回、単集落から形質転換体を増殖させた。
【０３６０】
Aspergillus oryzae MStr107は、Aspergillus oryzae HowB101よりも多くのアルファアミラーゼを産生するその能力に基づいて、形質転換体の中から選択された。アルファアミラーゼを産生する形質転換体の能力は、30℃で４日間10mlのYPM培地内でそれらを振とうさせながら培養し、標準的方法に従ってSDS-PAGEにより5μlの培地を分解することによって決定された。これらの条件下で大部分のアルファアミラーゼを産生する菌株をAspergillus oryzae MStr107として選択し、３リットルの発酵培地内でAspergillus oryzae HowB101と比較した。培地は、マルトースシロップ、酵母エキス、KH2PO4 ，K2SO4 ，（NH4)2SO4 ，クエン酸、MgSO4 ，極微量の金属及びウリジンで構成されていた。これらの条件下で、Aspergillus oryzae MStr107は、360％のAspergillus oryzae HowB101を産生した。
【０３６１】
例32：  線形化されたpDSY82でのAspergillus oryzae Mstr 107形質転換
例２に記述されている通りに、Aspergillus oryzae Mstr 107の原形質体を調製した。1.25UのXbaIで線形化されたpDSY82（6μg）の５〜15μlのアリコートを、14ml入りFalcon ポリプロピレン試験管内で１mlあたり2×107 個の原形質体という濃度で、0.1mlの原形質体に添加し、その後、60%のPEG4000-10mMのCaCl2-10mMのトリス-HClpH7を250μl加え、穏やかに混合し、30分間37℃でインキュベートした。その後、3mlのSPTCを添加し、懸濁液を穏やかに混合した。12mlの融解したオーバーレイ寒天（１×COVE塩、１％のNZアミン、0.8Mのスクロース、0.6％のノーブル寒天）又は3mlのSTC培地と懸濁液を混合し、最小培地平板上に注ぎ込んだ。平板を３〜５日間、37℃でインキュベートした。
【０３６２】
pDSY82及びXbaIを用いたAspergillus oryzae MSt107の形質転換頻度は、DNA 1μgにつき約200の形質転換体であった。約30000の形質転換体のライブラリが得られた。各プール内に約400の形質転換体を伴う700プールからの胞子を収集し、20％のグリセロール、0.1%の Tween80中で-80℃で保存した。これらのライブラリからプール及び形質転換体は、「Ｘ」という文字で示されている。
【０３６３】
例33：  「REMI」Aspergillus oryzae MStr107形質転換体中の組込み事象の特徴づけ
例６に記述されているとおりに、pDSY82及びXbaIでのAspergillus oryzae MStr107の形質転換体（ライブラリ「Ｘ」）を分析した。プール（X15）から20,20のさまざまなプールから20の合計40の形質転換体から、ゲノミックDNAを分離した。DNA標本をHind III で切断し、分解し、ブロットし、放射標識付けしたpDSY82でプローブ探査した。40のうち33が、見かけ上新規のバンドパターンを表わし、プラスミドの組込みがゲノム内の異なる部位に分散していること示唆していた。40の形質転換体のうち19について、バンドパターンは、ゲノム内にpDSY82のコピーがわずか１つしか組込まれなかったことを示唆しており、一方残りの21の形質転換体内には複数のコピーが見られた。さまざまなプールからとられた20の形質転換体からのDNAも同様に、例６で記述したとおり、XbaIで切断し、分解し、ブロットし、放射標識づけしたpDSY82でプローブ探査した。単一のプラスミドサイズのバンドが観察され、REMIが9つの形質転換体の中でXbaI部位で起こったことを示していた。
【０３６４】
例34：  FUNGAMYLTM発現スクリーニング
例32で記述されたAspergillus oryzae のMStr107でタグ付けされた突然変異体ライブラリ「Ｘ」プールを、FUNGAMYLTM発現について検定した。
96ウェルの平板スクリーンについて、MTB-CDYU培地を使用した。24ウェル平板方法については、４×MTBCDYU培地を使用した。
【０３６５】
一次96ウェル平板スクリーンには、ウェル内に100μlの培地が送り出された時点で１ウェルあたり平均１つの胞子が接種されるような形で、MTBCDYU内への異なるプールからの胞子の希釈が関与していた。接種の後、96ウェルの平板を３〜４日間34℃の静的条件下で成長させた。その後、以下に記述する通り、FUNGAMYLTM活性について培養を検定した。問題の突然変異体を、YPG又はCove 平板上で２度分離させ、単集落をCove 寒天斜面に移した。Cove 斜面からの胞子を、ウェルあたり約103 個の胞子を伴う４×MTBCDYUを含む24ウェル平板の中に接種し、34℃で４日間静的条件下で成長させた。その後培養を、以下で記述する通り、FUNGAMYLTM活性について検定した。
【０３６６】
メーカー（Boehringer Mannheim, Indianapolis,IN）により与えられた指示事項との関係において、1/2の強度の溶液としてFUNGAMYLTM検定基質（４−ニトロフェニル−アルファ−Ｄ−マルトヘプタシド−４. ６−０−エチリデン、EPS）を調製した。HEPESpH7.0の緩衝液の中で基質を調製した。HEPES pH7.0の緩衝液中に2FAU/mlを含有するように、FUNGAMYLTM標準（FUNGAMYLTM，Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd, Denmark）を調製した。使用するまでこの標準を−20℃で保存した。使用直前に0.02〜0.2FAU/mlの標準系列を得るべく、FUNGAMYLTM株を適切に希釈させた。HEPES緩衝液中で肉汁標本を希釈させ、25μlのアリコートを96ウェル平板内のウェルに送り出し、その後180μlの希釈した基質を送り出した。平板読取り装置を用いて、405nmでの吸収度を約１分の間隔で読みとった２つの値の差として記録した。FUNGAMYLTM標準溶液との関係においてFUNGAMYLTM単位/ml（FAU/ml）を計算した。
【０３６７】
96ウェルスクリーンとそれに続く24ウェルスクリーンの結果から、pDSY82及びXBaI形質転換からの51の形質転換体がさらなる評価のために同定された。これらの同定された形質転換体は、対照株Aspergillus oryzae MStr107よりも高いレベルのFUNGAMYLTMを産生した。
【０３６８】
例35：  振とうフラスコ及び発酵評価
例34中に記述されているFUNGAMYLTMを最高に産生するDNAタグ付き突然変異体を、振とうフラスコ及び発酵装置内で評価した。
振とうフラスコ評価は、500ml入り振とうフラスコ内でpH7.0のGl-gly 培地100mlの中に、0.02%のTWEEN-80を含む適量の無菌水内で懸濁させたCOVE斜面の胞子含有量の半分を接種することによって行なわれた。Gl-gly 振とうフラスコを、270rpmで１日間34℃でインキュベートした。次に、5mlのG1-gly 培地を、500ml入り振とうフラスコ内で100mlのpH6.5の 1/5MDU2BP内に接種した。３日目に標本を採取し、例34で記述したとおりにFUNGAMYLTM活性を測定した。
【０３６９】
Nutriose, 酵母エキス、MgSO4 ，KH2PO4 ，クエン酸，K2SO4，（NH4)2SO4 及び超微量金属の溶液から成る培地を含む３リットルの１ab発酵装置の中で、DNAタグ付き突然変異体X70-25及び257D11を成長させた。34℃の温度、pH7で発酵を行ない、1000〜1200rpmの間で５日間撹拌を維持した。EPSからG2 及びG3 誘導体（Ｇ＝グルコース）への部分的分解により、FUNGAMYLTM活性を測定した。その後、余剰のアルファ−グルコシダーゼを添加することによって、G2 及びG3 誘導体をグルコース及び黄色がかったｐ−ニトロフェノレート陰イオンへと分解した。2.5分間の予備インキュベーションの後、37℃及びpH7.1で、単位時間（３分）あたり405nmでの吸収度の変化として分析出力を決定した。FUNGAMYLTMを標準として用いた。
得られた結果は、対照としてのAspergillus oryzae MStr107のFUNGAMYLTM収量が1.0に正規化された下表10に示されている。
【０３７０】
【表１０】
2010011865.tif 000011
【０３７１】
表10に示されている通り突然変異体は、24ウェル平板中で成長させられたとき及び振とうフラスコ内で成長させられたとき、対照菌株Aspergillus oryzae MStr107におけるよりも約30〜60％多くFUNGAMYLTMを産生した。突然変異体Aspergillus oryzae X70-25は、発酵装置内で成長させられたとき、対照菌株Aspergillus oryzae MStr107よりも約20％多くFUNGAMYLTMを産生した。
【０３７２】
例36：  形態突然変異体についてのスクリーニング
例５に記述された５つの「ｅ」プール及び５つの「ｂ」プールを、CM-1寒天上で平板固定し34℃で４日間インキュベートすることによって、変化した形態についてスクリーニングした。
【０３７３】
変化した平板形態を有しプール内の形態的変動を網羅する24のコロニーを新鮮なCM-1 平板内に移し、単集落分離のため34℃で５日間インキュベートした。平板上の各々の形態（大部分の場合１）を単集落からCM-1平板及びPDA平板の中心まで移し、６〜８日間34℃でインキュベートし、その後、形態すなわち直径及び外観を評価した。合計２１８の形態突然変異体をCOVE平板に移し、１，２週間34℃でインキュベートして胞子を生成させた。
【０３７４】
例37：  形態突然変異体の評価
例36で分離された形態突然変異体を、例７に記述されている手順に従ってリパーゼ産生のため、24ウェルの平板内で評価した。収量が最も多い突然変異体を、CM-1寒天上の平板形態との関係において比較し、観察された形態的変異を網羅する23の突然変異体を、CD培地を含む振とうフラスコ内でさらにテストしてリパーゼ産生を評価した。
125ml入りPPフラスコ内の25mlのG1-gly 培地の中に、CM-1平板からの約0.25mlの胞子懸濁液を接種し、24時間34℃でインキュベートした。その後、125ml入りのPPフラスコの中で1.0μlのFUNGAMYLTM800L（Novo NordiskA/S，Bagvaerd, Denmark ）を補足した50mlのCD培地に、0.5mlの24時間の種子フラスコを移し、200rpm，34℃でインキュベートした。２〜３日後に、培地を標本採取し、図７に記述された通りに、リパーゼ活性について検定した。
【０３７５】
分離した突然変異体は又、酵素が制限された培地内で以下の要領でテストされた。すなわち、Aspergillus oryzae How L536.3が野生型形態をもち成長のためにウリジンを必要としなかったことから、これを対照として使用した。25mlのOL-1培地を含む125ml入りの振とうフラスコ内に約250μlの胞子懸濁液を接種し、DIASTIXTM（Bayer, Elｋhart，IN）を用いて測定した残留グルコースが、１g/l未満となるまで200rpm ，34℃でインキュベートした。その後、75mlのOL-6培地を各フラスコに添加し、Aspergillus oryzae HowL536.3フラスコ内の残りのグルコースが約5g/lとなるまで約25時間200rpm ，34℃でさらにインキュベートした。この時点で、残りのグリコースについて全てのフラスコを検定し、著しく低いグルコース（０〜２g/l）を伴うフラスコを陽性とみなした。大部分のフラスコは、平均５〜10g/l前後であった。
【０３７６】
平均より速くグルコースを転換させる20の突然変異体を、通気が比較的容易となりうるものとみなし、リパーゼ発現を評価するため上述の通りCD培地の入った振とうフラスコ内でさらにテストした。
これらのテストに基づいて、１４の突然変異体を同定し、例８で記述した手順に従って、実験室用発酵装置内でさらにこれを評価した。下表11に列挙した形態突然変異体が同定された：
【０３７７】
【表１１】
2010011865.tif 000012
【０３７８】
例38：  形態突然変異体からのプラスミドDNA及びフランキングDNAの救援
制限エンドヌクレアーゼが使用されるという点を除いて、例９に記述された手順を用いて、突然変異体Aspergillus oryzae P4-8.1及びP7-14.1からプラスミドDNA及びゲノミックフランキング遺伝子座を分離した。形質転換体E.coli HB101P4-8.1は、突然変異体Aspergillus oryzae P4-8.1からのBglII 救援遺伝子座を含んでいた。形質転換体E.coli HB101P7-14.1は、突然変異体Aspergillus oryzae P7-14.1からのNarI救援遺伝子座を含んでいた。
【０３７９】
プラスミドDNA及びゲノミックフランキング遺伝子座を突然変異体Aspergillus oryzae DEBY7-17.2，DEBY3-2.1，DEBY5-7.1，及びDEBY8-10.1から分離した。救援されたプラスミドは、救援されたpSMO717，pSMO321，pHowB571，及びpSMO810が形質転換されたE.coli DH5α細胞から分離されたという点を除いて、例９で前述した通りに生成された。
形質転換体E. coliDH5αpSMO717は、突然変異体Aspergillus oryzae DEBY7-17.2からのBglII 救援遺伝子座を含んでいた。形質転換体E.coli DH5αpSMO321は、突然変異体Aspergillus oryzae DEBY3-2.1からのBglII 救援遺伝子座を含んでいた。形質転換体E.coli DH5αpHowB571は、突然変異体Aspergillus oryzae DEBY5-7.1からのNdeI救援遺伝子座を含んでいた。形質転換体E.coli DH5αpSMO810は、突然変異体Aspergillus oryzae DEBY8-10.1からのNdeI救援遺伝子座を含んでいた。
【０３８０】
例39：  形態突然変異体Aspergillus oryzae P4-8.1救援遺伝子座p4-8.1の特徴づけ
組込み事象のいずれかの側に915及び665bpの領域を含むAspergillus oryzae P4-8.1救援遺伝子座p4-8.1を、例２に記述された手順に従って配列決定した。図32には、核酸配列（配列番号50）及び演繹されたアミノ酸配列（配列51）が示されている。核酸配列は、組込み事象が、Saccharomyces cerevisiae YHM4熱ショックタンパク質遺伝子の相同体について読取り枠内で発生したことを示唆している。演繹されたアミノ酸配列（配列番号51）は、Saccharomyces cerevisiae YHM4熱ショックタンパク質（配列番号52）に対する40.2％の同一性と、Schizzosaccharomyces pompe熱ショックタンパク質70（配列番号53）に対する41.8％の同一性を示した。
【０３８１】
例40：  BglII で線形化されたP4-8.1でのAspergillus oryzae の形質転換及び形態スクリーニング
Aspergillus oryzae P4-8.1について観察された平板形態と救援されたゲノミック遺伝子座の間のリンクを確認するため、例５に記述した手順を用いて、Aspergillus oryzae P4-8.1の BglII 線形化救援遺伝子座P4-8.1を用いて、Aspergillus oryzae How B430を形質転換した。
【０３８２】
66の形質転換体が得られ、これをCM-1寒天に移し、形態を評価するため３〜４日間34℃でインキュベートした。正しい平板形態をもつ１６の形質転換体を、中心コロニーとして新鮮なCM-1平板に移し、34℃で４日間の後平板形態を維持している12の形質転換体を、プローブとして救援された遺伝子座のＰＣＲ増幅された300bpのフラグメントを用いてサザンブロット分析によって分析した。メーカーの指示事項に従ってApplied Biosystems 394型DNA/RNA合成装置で合成された以下のプライマを用いて、フラグメントをPCR増幅した。
HSP-1:5'-TACGGTTGACAGTGGAGC-3'（配列番号54）
HSP-3r:5'-CACTGACTTCTCCGATGC-3' （配列番号55）
【０３８３】
増幅反応（50μl）は、以下の構成成分を含有していた：0.2ngのp4-8.1，50p mol のプライマHSP-1，50pmol のプライマHSP-3r，各々0.25mMのdATP，dCTP，dGTP及びdTTP，１ｘTaqポリメラーゼ緩衝液及び2.5UのTaqポリメラーゼ。以下のようにプログラミングされた Ericomp Thermal Cycler の中で反応をインキュベートした：３分間95℃で１サイクル；  各々１分間95℃，１分間58℃，及び1.5分間72℃で30サイクル、そして５分間72℃で１サイクル。PCR産物を１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離した。
【０３８４】
例９に記述した方法に従って得られた12の形質転換体の各々から、ゲノミックDNAの標本を得た。ゲノミックDNAをBglIIで消化し、例14に記述されている手順に従ってサザン分析に付した。
12の形質転換体全てが、救援された遺伝子で割当てられ、この遺伝子座と観察された平板形態の間の関わり合いを示唆していた。
【０３８５】
例41：  形態突然変異体Ａspergillus oryzae P7-14.1の救援遺伝子座p7-14.1の特徴づけ
組込み事象のいずれかの側に1040及び520bpの領域を含むAspergillus oryzae P7-14.1の救援遺伝子座p7-14.1を、例２で記述した手順に従って配列決定した。図33には、核酸配列（配列番号56）及び演繹されたアミノ酸配列（配列57）が示されている。核酸配列は、組込み事象が、Aspergillus nidulans キチンシンターゼＢ（chs B) 遺伝子及びAspergillus fumiganusキチンシンターゼＧ（chs Ｇ）遺伝子の相同体について読取り枠内で発生したということを示唆している。救援された遺伝子座の両側の演繹されたアミノ酸配列（配列番号57），chs B遺伝子（配列番号58）及びchs G遺伝子（配列番号59）を比較すると、94％及び80％の同一性が発見された。
【０３８６】
Aspergillus nidulans 内の chsB遺伝子の分断は、形態を大幅に変えることが知られており（Ｙanai et al.,1994，Biosci, Biotech, Biochem. 58:1828-1835），Aspergillus fumigatus内では、chs B遺伝子の分断が、Aspergillus oryzae P7-14.1の観察された表現型であるコロニー状の形態をひき起こすことがわかっている（Mellado et al., 1996，MolecularMicrobiology 20;667~679）。
【０３８７】
例42：  線形 chsフラグメントでのAspergillus oryzae の形質転換及び形態スクリーニング
例６で記述されている通りに調製したAspergillus oryzae How8430ゲノミックDNAを鋳型として用いてPCRにより1.9kbのDNAフラグメントを生成した。救援された chs Aspergillus oryzae 相同体から、プライマＡ，5'-CACCAAGTCAGAGCGTC-3' （配列番号60）を誘導した。Aspergillus fumigarus chsG及びAspergillus nidulanns chsB遺伝子のコンセンサス配列に基づいて、プライマ５，5'-GGICCITTYGAYGAYCCICA-3' （配列番号61）を縮重したものであった。
【０３８８】
増幅反応（50μl）には、以下の構成成分が含まれていた：10ngのpHB220，48.4p mol の各プライマ、各々1m MのdATP，dCTP，dGTP，及びdTTP及び Advantage−GCTMTth Polymerase Mix(Clon tech, Palo Alto, CA) 。以下のようにプログラミングされた Ericomp Thermal Cycler の中で反応をインキュベートした：３分間95℃で１サイクル；  各々１分間95℃，１分間58℃，及び３分間７２℃で30サイクル、及び５分間72℃で１サイクル。PCR産物を１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離した。
【０３８９】
DNAフラグメントをPCR−ブラントクローニングベクター（Invitrogen, San Diego,ＣＡ）へとクローニングした。DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで充てんすることにより、マルチクローニング部位内の HindIII 部位を破壊した。Bialaphos に対する耐性を付与する Basta遺伝子を含む２ｋｂの HindIII-EcoRIフラグメントをpMT1612（図34）から得、chs フラグメントの中で約0.7kbのところに位置づけされた chs HindIII 部位の中に挿入した。結果として得られたプラスミドをpHB220と標識づけした。
【０３９０】
鋳型としてpHB220を用い、プライマＡ及び5'-GGGCCGTTTGACAATCCGCAT-3' （配列番号62）を使用して、4kbのPCRフラグメントを生成した。増幅反応は、以下のようにプログラミングされた Ericomp Thermal Cycler の中で反応をインキュベートしたという点を除き、上述の通りに実施した：３分間95℃で１サイクル；各々１分間95℃、１分間58℃，及び６分間72℃で30サイクル、及び５分間72℃で１サイクル。PCR産物を１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離した。
【０３９１】
次に、例５に記述された手順に従ってAspergillus oryzae HowL795から調製された原形質体を形質転換するために、直接PCRフラグメントを使用した。100個の形質転換体のうち、３つが、最小培地平板及びPDA平板上で「コロニー状の」平板形態を有すると思われた。
【０３９２】
2kbのDIG標識づけされた chsフラグメントをプローブとして用いて、対照としてのAspergillus oryzae HowB430と３つの形質転換体について、サザン分析を行なった。例９に記述されている通りに、３つの菌株及び対照菌株からゲノミックＤＮＡを調製した。HindIIIで消化した３つの形質転換体の各々からのゲノミックDNAの標本を、例14に記述した手順に従ってサザン分析に付した。
【０３９３】
サザン分析は、３つの形質転換体の各々が、chs/basta 構成体を野生型 chs遺伝子と置換する遺伝子置換を受けていたことを示した。結果は、chs でタグ付けされた菌株Aspergillus oryzae P7-14.1内で観察されたコロニー形態が chs遺伝子の突然変異と関連性をもつことを確認するものであった。
【０３９４】
例８に記述されたとおりに行なわれたMY25培地を含む振とうフラスコ培養の中に、コロニー形態に対する chs遺伝子の明白な効果が観察された。肉汁の中のコロニーの沈殿物質量は、Aspergillus oryzae How L795に比べてＡspergillus oryzae How L795の chs突然変異体において密度が低いと思われた。
【０３９５】
chs遺伝子の遺伝子分断を含むAspergillus oryzae How L795の２つの誘導体について、例８で記述された通りに発酵も行なった。両方の菌株内のリパーゼ収量は、Aspergillus oryzae How L795よりも約21％多いものであった。酵素産生の反応速度は、発酵の後方段階において chs突然変異体で速くなったと思われ、このことはこれらの菌株がより最適なタンク形態を示したことを示唆していた。
【０３９６】
例43：  形態突然変異体Aspergillus oryzae DEBY7-17.2の救援遺伝子座pSMO717の特徴づけ
例２で記述した方法に従って、400bpを含んだAspergillus oryzae DEBY7-17.2救援遺伝子座pSMO717を配列決定した。核酸配列（配列番号63）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号64）は図35に示されている。演繹されたアミノ酸配列（配列番号64）は、Aspergillus nidulans (AC000133）のORFの演繹されたアミノ酸配列（配列番号65）に対する44%の同一性を示した。
【０３９７】
例44：  形質突然変異体Aspergillus oryzae DEBY3-2.1の救援遺伝子座pSMO321の特徴づけ
1.0kbを含むAspergillus oryzae DEBY3-2.1の救援遺伝子座pSMO321を、例２で記述した方法に従って配列決定した。図36に示した核酸配列（配列番号66）は、公表されたいずれの配列に対しても全く相同性を示さなかった。
【０３９８】
救援プラスミドpSMO321のいずれかの末端からのプローブをPCRにより生成した。以下に示すプライマ970850及び970851を用いてプローブ５を生成した。以下に示すプライマ970852及びプライマ970853を用いてプローブ６を生成した。メーカーの指示事項に従ってＡpplied Biosystems の394型DNA/RNA合成装置を用いてこれらのプライマを合成した。50μlのPCR標識付け反応のための鋳型は10ngの救援プラスミドpSMO321であった。PCRのサイクル及び条件は、例２０で記した通りであった。
970850:5'-GTTCTATTGAGATACGCG-3' （配列番号67）
970851:5'-ACAAGCCGACCGGTTTTG-3' （配列番号68）
970852:5'-CGATAAGGACTCCAAGAG-3' （配列番号69）
970853:5'-GTCGCGCATAATATGAAG-3' （配列番号70）
【０３９９】
SphI，SalI及び BamHIで消化されたAspergillus oryzae How B430ゲノミックDNAのサザンブロットを、例14に記述した方法に従って調製し分析した。ブロットを、救援プラスミドの末端から作られたプローブ５及び６に対し独立してハイブリッド形成させた。
サザンブロットの分析は、いかなる欠失も発生しなかったことを示唆していた。プライマ090850及び090852を用いてAspergillus oryzae How B430から500ngのゲノミックDNAを用いてPCRを行なった時点で、予測通り、500bpの産物が増幅され、いかなる欠失も起こらなかったことを確認した。
【０４００】
例９に記述した通りタグ付けされた突然変異体菌株Aspergillus oryzae DEBY3-2.1からゲノミックDNAを調製し、REMIのために用いた制限酵素（BamHI）で消化し、ブロットし、Aspergillus oryzae pyr GからNheIフラグメントでプローブ探査した。このブロットのサザン分析は、タグ付けされたプラスミドが、ゲノム内の BamHI部位内に挿入されたことを示唆していた。
【０４０１】
例45：  形態突然変異体Aspergillus oryzae DEBY5-7.1の救援遺伝子座pHowB571の特徴づけ
例２に記述した方法に従って、600bpを含むAspergillus oryzae DEBY5-7.1の救援遺伝子座pHowB571を配列決定した。図37に示された核酸配列（配列番号71）は、公表されているいずれかの配列に対しても全く相同性を示さなかった。
【０４０２】
タグ付け中に欠失が発生したか否かをテストするために、SphI，SalI及びBamHIで消化させたAspergillus oryzae HowB430からのゲノミックDNAを用いて例14で記述した方法に従ってサザンブロットを調製し分析した。PCRにより、救援されたタグ付きプラスミドpSMO571のいずれかの末端からのプローブを生成した。以下に示すプライマ970936及びプライマ970937でプローブ７を生成した。以下に示すプライマ970938及びプライマ970939でプローブ８を生成した。これらのプライマは、メーカーの指示事項に従い、Applied Biosystems 394型のDNA/RNA合成装置を用いて合成した。PCR標識付け反応のための鋳型は、10ngのpSMO571であった。PCRのサイクル及び条件は、例20に記した通りであった。
【０４０３】
970936:5'-CTTCCTCATAAACCACCC-3' （配列番号72）
970937:5'-AACTGACAGGACAAGACC-3' （配列番号73）
970938:5'-GACTTGCATCACTTCCTC-3' （配列番号74）
970939:5'-TGAAGCTGAGAGTAGGTG-3' （配列番号75）
【０４０４】
結果は、両方のプローブからの同一の横縞模様を示し、いかなる欠失も発生しなかったことを示唆していた。例20に記述した方法を用いて、いかなる欠失も発生しなかったことを確認するためPCRを使用した。プライマ970936及びプライマ970939と共に鋳型としてAspergillus oryzae HowB430からの合計500ngのゲノミックDNAを使用した。予測通り、550bpの産物を増幅した。pyr GのNheIフラグメントに対しハイブリッド形成させられた、BamHIで消化させたタグ付き突然変異体Aspergillus oryzae DEBY5-7.1から得たゲノミックDNAからのサザンのデータは、タグ付きプラスミドがゲノム内でBamHI部位内に挿入されたことを示唆していた。サザンブロット条件は以上で記述した通りである。
【０４０５】
サザン及びPCR分析は、タグ付きプラスミドがBamHI部位内に直接挿入されたことを立証した。Aspergillus oryzae DEBY5-7.1の救援末端からのプライマでAspergillus oryzae HowB430ゲノミックDNAを用いて生成されたPCR産物をTOPOpCR11ベクターでクローニングしその後例２に従って配列決定することで、この結果が確認された。
【０４０６】
例46：  形態突然変異体Aspergillus oryzae DEBY8-10.1 pSMO810の特徴づけ
750bpを含むAspergillus oryzae DEBY8-10.1の救援遺伝子座pSMO810を、例２に記した方法に従って配列決定した。図38に示された核酸配列（配列番号76）は、公表されているいずれの配列に対しても全て相同性を示さなかった。
【０４０７】
PCRにより、救援されたタグ付きプラスミドpSMO810のいずれかの末端からのプローブを生成した。以下に示すプライマ970854及びプライマ970855でプローブ９を生成した。以下に示すプライマ970856及びプライマ970857でプローブ10を生成した。これらのプライマは、メーカーの指示事項に従い、Applied Biosystems 394型のDNA/RNA合成装置を用いて合成した。PCR標識付け反応のための鋳型は、10ngのpSMO810であった。PCRのサイクル及び条件は、例20に記した通りであった。
970854:5'-GTTTCGGTATTGTCACTG-3' （配列番号77）
970855:5'-ACAGGTGAACAACTGAGG-3' （配列番号78）
970856:5'-CGACCAAACTAGACAAGC-3' （配列番号79）
970857:5'-CTTTCCTCTTGGACACAC-3' （配列番号80）
【０４０８】
サザン分析を、例14に記述した通りに行なった。プローブ９及び10で独立してハイブリッド形成されたSphI，SalI及びBamHIで消化されたAspergillus oryzae HowB430からのゲノミックDNAのサザン分析は、タグ付きプラスミドの挿入中いかなる欠失も発生しなかったこと示唆していた。プライマ970854及びプライマ970856と共に鋳型としてAspergillus oryzae HowB430のゲノミックDNAを合計500ng使用したPCRは、欠失無しで、予測通り550bpの産物を増幅した。突然変異体Aspergillus oryzae DEBY8-10.1から調製され、EcoRIで消化され pyrGのNheIフラグメントに対しプローブ探査されたゲノミックDNAのサザン分析は、プラスミドがゲノム内でEcoRI部位内に組込まれたことを示唆していた。Aspergillus oryzae DEBY8-10.1の救援末端からのプライマでAspergillus oryzae HowB430ゲノミックDNAを用いて生成されたPCR産物をTOPOpCR11ベクターでクローニングしその後例２に従って配列決定することで、この結果が確認された。
【０４０９】
例47：  高産生体についての低炭素供給原上でのスクリーニング
HindIII の存在下でHindIII 消化されたpDSY81で生成されたもの11個とSalIの存在下でSalIで消化されたpDSY81で生成されたもの7個の計18のAspergillus oryzae HowB430形質転換体（例５参照）を、高いリパーゼ産生体であった突然変異体を同定するべく、低炭素供給源上でスクリーニングした。グリセロール上ではリパーゼの発現が非常に低いことから低炭素供給源としてグリセロールが使用されたが、例えばキシロース、スクロース及びマンニトールやソルビトールといったポリオールなどの数多くのその他の炭素供給源も類似の要素で使用することができる。
【０４１０】
例７に記した通りに一次96ウェル平板スクリーンを実施したが、ここでは、50倍に希釈した１リットルあたり２％の尿素100ml，25％のグリセロール100ml, 10%の酵母エキス100mlから成るGLY25培地を用いた。例７で記述した通り、リパーゼ検定を行なった。
次に、問題の突然変異体を、以上のものと同じ培地を含む24ウェルの平板内に直接接種し、６日間34℃100rpm で成長させた。次に、例７に記述した通りリパーゼ活性について培養を検定し、問題の突然変異体をCOVE平板上に固定し、PDA平板上に展延させて単集落を生成させ、次にCM−グリセロール寒天（CM-1寒天と同様、ただし炭素供給源としてグリセロールがマルトースに置換わった）上で各々の突然変異体の４つの単一分離株を成長させて、上述のとおりの24ウェル平板の接種のための胞子を産生させた。
【０４１１】
24ウェル平板の後、振とうフラスコの中でのさらなる評価のため、10個の形質転換体を同定した。振とうフラスコには、1gのMgSO4-7H2 O，1g/lのK2SO4 ，15gのKH2PO4 ，0.25mlの超微量金属溶液、0.7gの酵母エキス、3mlの50％尿素、2mlの15%CaCl2 2H2O及び２％の炭素供給源（マルトース、グルコース、スクロース又はグリセロールのいずれか）から成るpH6.5の培地が50ml入っていた。125PP入りフラスコ内に50mlの培地が入った振とうフラスコに、0.5mlのGl-gly の一晩経過した培養を接種し、34℃，200rpm でインキュベートし、２〜３日後に標本採取した。上述のとおりにリパーゼ活性を測定した。
炭素供給源としてのグリセロール上で成長させられたAspergillus oryzae HowB430によるリパーゼ産生が1.0に正規化されている表12の中に、結果が示されている。
【０４１２】
【表１２】
2010011865.tif 000013
【０４１３】
リパーゼの相対的発現は、異なる炭素供給源に対し異なる形で応答しており、リパーゼ発現の調節がこれらの形質転換体の中で変調させられたことを示唆していた。
【０４１４】
例48：  α−シクロピアゾン酸突然変異体についてのスクリーニング
α−シクロピアゾン酸陰性菌株についてのスクリーニングにおいては、例５で記述されたEcoR1ライブラリからのプールe1-e26を使用した。血球計において該当する希釈溶液を計数することによって、異なるプールを含むバイアル中の胞子数を決定し、約30〜50の胞子誘導型コロニーが９cmのスクリーニング平板毎に存在するような形で希釈系列を構築した。スクリーニング培地は１リットルあたり、30gのマンニトール、10gのグルコース、10gのコハク酸、３ｇのカザミノ酸、１ｇのKH2PO4 ，0.3gのMgSO4-7H2O，0.2gのFeSO4-7H2 O，100μlのトリトンX100及び20gのDifcoBacto寒天で構成されていた。オートクレーブに付す前に、pHを14%のNH4OHで5.6に調整した。第１鉄イオンは、α−シクロピアゾン酸と赤色錯体を形成する。この錯体は、コロニーの逆側に見られる。
【０４１５】
各プールから約2000〜2500のコロニーをスクリーニングした。34℃で７日間のインキュベーションの後、逆側が全く赤色に着色していないコロニーをスクリーニング培地上で再度分離し、７日間34℃でインキュベートした。６つの異なるプールに由来する10個のコロニーは、赤色でない逆着色を示し、ひきつづき以下の通りに作られたＣove −Ｎ斜面上に接種された：すなわち、20mlのCove 塩溶液、4.2gのNaNO3及び60gのグルコースを脱イオン水の中に溶解させ、体積を1000 mlにした。培地を2%のDifco Bacto寒天で凝固させた。
【０４１６】
0.01%の水性Tween 80を10ml添加してCove 斜面から作られた胞子懸濁液5mlを、100mlのMDU1B振とうフラスコ培地を含む500mlのバッフル付き振とうフラスコ内に接種した。接種時点で1.3mlの50％の無菌ろ過済み尿素を各振とうフラスコに添加した。５日間34℃、２50rmp で振とうフラスコをインキュベートした。
【０４１７】
作製後５日経った振とうフラスコ培養から得られた10μlの上清を、20cm×20cmのＴＬＣ平板（Merck Silica Gel 60）の反対側縁部に適用した。次に平板を、クロロホルム：アセトン：プロパン−２−オン（85：15：20）溶媒系（CAP）の中で15分間走らせ、乾燥させ、反転させ、反対側をトルエン：酢酸エチル：蟻酸（5:4:1）溶媒系（TEF）の中で１５分間走らせた。エールリッヒ試薬（96％エタノール85mlと37%塩酸15ml中の2gの４−ジメチルアミノベンズアルデヒド）での噴霧の前に、平板を煙霧フード内で１時間徹底的に乾燥させた。α−シクロピアゾン酸は、CAP溶媒系（中性系）の中で標準的に低いRf値をもつ青紫色のキノコ形の斑点として見え、一方ＴＥＦ溶媒系は、標準的に高いRf値の長いしみを生み出した。標準としては、エタノール、メタノール及びクロロホルムの１：１：１溶液中の30.15及び7.5ppm のα−シクロピアゾン酸溶液（Sigma Chemical Co., St.Louis,MO）を使用した。
【０４１８】
10個の推定上のα−シクロピアゾン酸を含まない形質転換体のTLC分析は、α−シクロピアゾン酸のいかなる非候も示さなかった。振とうフラスコの残りの内容物を、Miracloth を通してろ過し、各ろ液60mlに対し10mlの0.1M塩酸を添加した。酸性化したろ液を次に３〜５分間50mlのクロロホルムと共に勢いよく振とうさせた。底部相（約25ml）を各々、相分離（３時間）の後300ml入りビーカーに移し、クロロホルムを蒸発させた。残渣を各々、300μlのクロロホルム中に再度溶解させ、各濃縮物10μlずつを上述の通りTLCにより分析した。
10の菌株抽出物のうちいずれも、検出可能なα−シクロピアゾン酸を含有していなかった。
【０４１９】
生物学的材料の寄託
ブダペスト条約に従って、以下の菌株を Agricultural Research Service Patent Culture Collection（NRRL），北部地方研究所、1815 University Street, Peovia, Illinois61604, USAに寄託した：
【０４２０】
【表１３】
2010011865.tif 000014
【０４２１】
これらの菌株は、本特許出願の係属中、37C. F. R§1. 14及び35U. S. C. §122の下でその権限が付与される特許、商標局長によって決定された者が培養にアクセスできるようにする条件の下で寄託されている。これらの寄託は、各々の寄託された菌株の実質的に純粋な培養を表わしている。寄託物は、主題となる出願の対応物又はその後代が提供されている外国において当該国の特許法により要求される場合に利用可能である。ただし、１つの寄託物の利用可能性は、政府の行為により付与される特許権を侵害して主題となる発明をを実施すことの許諾を構成するものではない。
【０４２２】
本書で開示されている特定の実施形態は、本発明のいくつかの側面の例示として意図されていることから、本書で記述され請求されている本発明は、これらの実施形態により制限されるものではない。等価のあらゆる実施形態が本発明の範囲内に入るものと考えられる。実際、本書で示され記述されているものに加えて本発明のさまざまな修正が、当業者にとって、以上の記述から明白となるだろう。かかる修正は、添付のクレームの範囲内に入るものと意図されている。
【０４２３】
本書で記載されている全ての刊行物は、それが引用された目的である特定の情報を記述し開示するため、本書に参考として内含される。上述の刊行物は、単に本出願の提出日以前のその開示に関してのみ提供されている。本書中の何も、以前の発明のためにかかる開示を実際以前の日に設定する権利を発明人がもたないということを容認するものとみなされるべきではない。
【０４２４】
記述された特定の方法及び組成物は当然変動しうることから、本発明がこれらの方法及び組成物に制限されるものではないということを理解すべきである。又、本発明の範囲は添付のクレームによってのみ制限されることから、本書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記述するためのものであって、制限的意味をもたない、ということも理解すべきである。
【０４２５】
相反する規定のないかぎり、本書で用いられている全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては本書に記述されるものと類似又は等価のあらゆる材料又は方法を使用することができるが、ここでは好ましい方法及び材料が記述されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2010011865000001.pdf