(57)【要約】      （修正有）【課題】ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を、迅速かつ簡便に評価する方法の提供。【解決手段】（ａ）ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＲＮＡ鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡを準備する工程と、（ｂ）前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを含む反応溶液に、励起光を照射し、蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、一分子蛍光解析法により解析する工程と、（ｃ）ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと、ＡＴＰとを含む反応溶液に、前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを添加して反応させた後、当該反応溶液に、励起光を照射し、蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、一分子蛍光解析法により解析する工程と、（ｄ）工程（ｂ）において得られた解析結果と工程（ｃ）において得られた解析結果とを比較し、前記ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する工程とを有するｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を評価する方法であって、
（ａ）評価対象であるｓｉＲＮＡの、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＲＮＡ鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡを準備する工程と、
（ｂ）前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを含む反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、
（ｃ）ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと、ＡＴＰとを含む反応溶液に、前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを添加して反応させた後、当該反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、
（ｄ）前記工程（ｂ）において得られた解析結果と前記工程（ｃ）において得られた解析結果とを比較し、前記ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する工程と、
を有することを特徴とする、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法。
【請求項２】
評価対象であるｓｉＲＮＡが２種類以上あり、各ｓｉＲＮＡに対して、前記工程（ａ）〜（ｄ）を行うことを特徴する請求項１記載のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を評価する方法であって、
（ａ’）評価対象であるｓｉＲＮＡの、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＲＮＡ鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡを準備する工程と、
（ｂ’）前記蛍光物質により標識されたＲＮＡヘリカーゼの巻き戻しを受けないｓｉＲＮＡ、又は前記蛍光物質により標識されたＲＩＳＣに取り込まれないｓｉＲＮＡを、細胞に導入した後、当該細胞に対して、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、
（ｃ’）前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを細胞に導入して反応させた後、当該細胞に対して、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、
（ｄ’）前記工程（ｂ’）において得られた解析結果と前記工程（ｃ’）において得られた解析結果とを比較し、前記ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する工程と、
を有することを特徴とする、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法。
【請求項４】
前記蛍光標識ｓｉＲＮＡが、センス鎖が蛍光物質により標識されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法。
【請求項５】
前記一分子蛍光分解析法が、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）や蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ）、及び蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＤＡ−ＰＯ）からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を、一分子レベルの解析により評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉法は、線虫、ハエ、植物、動物等の様々な生物の細胞に、二本鎖ＲＮＡが取り込まれることにより、該二本鎖ＲＮＡと相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡが分解される結果、任意の遺伝子発現が抑制される現象である。切断された長い（一般的に２００塩基対以上）の二本鎖ＲＮＡは、細胞内で、リボヌクレアーゼの一種であるＤｉｃｅｒにより、２１〜２５塩基対の短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断される。この短い二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡは、細胞質内でヘリカーゼによる巻き戻しを受けて一本鎖になり、この一本鎖ＲＮＡと、複数のタンパク質からなるＲＩＳＣ（ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）とがＲＩＳＣ複合体を形成する。その後、該ＲＩＳＣ複合体中の一本鎖ＲＮＡと、相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡがさらに該ＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、ＲＩＳＣのリボヌクレアーゼ活性により、該ｍＲＮＡが分解され、ジーンサイレンシング（遺伝子の発現抑制）が起こる。ＲＮＡ干渉により、相同組み換えによるノックアウトマウス作製のような設備と時間を必要とせず、培養細胞やモデル動物の実験系で、標的遺伝子のｍＲＮＡの分解によるノックダウンを簡単に行うことができるため、ＲＮＡ干渉は、遺伝子の機能解析や標的遺伝子のスクリーニング等に活用されている。
【０００３】
但し、ヒト等の哺乳動物においては、長い二本鎖ＲＮＡにより、インターフェロン応答が引き起こされるため、長い二本鎖ＲＮＡをそのまま細胞に導入することはできない。このため、例えば、二本鎖ＲＮＡを組み込んだ発現ベクターとして細胞に導入する手法等がある。該手法では、プロモーター配列の下流にｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）の塩基配列を挿入した発現ベクターを用い、細胞内でｓｈＲＮＡからプロセッシングを経てｓｉＲＮＡを発現させてＲＮＡ干渉を起こさせるというものである。また、発現ベクターの構築には一定の時間がかかるため、より早く簡便に遺伝子発現抑制効果の確認を行いたい場合には、２１塩基対程度の化学合成されたｓｉＲＮＡを、直接細胞に導入する方法が用いられている。
【０００４】
ＲＮＡ干渉においては、細胞内に導入された合成ｓｉＲＮＡは、目的のｍＲＮＡと相互作用し、これを切断することによって目的のタンパク質が翻訳されるのを抑制する。より詳細には、細胞内に導入されたｓｉＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒ等のＲＩＳＣローディングコンプレックスと相互作用し、ＲＩＳＣへと運ばれる。ＲＩＳＣは、二本鎖のｓｉＲＮＡを開裂し、生じた一本鎖ＲＮＡを取り込む。このとき、ＲＩＳＣへアンチセンス鎖が取り込まれることにより、ＲＩＳＣ−アンチセンス鎖複合体が形成される。該複合体がアンチセンス鎖と相補的な塩基配列を有する目的のｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＩＳＣによって該ｍＲＮＡは切断され、目的の遺伝子（標的遺伝子）の発現を抑制することができる。（例えば、非特許文献１参照。）
【０００５】
また、近年の一分子蛍光分析技術の進歩により、細胞内に導入したｓｉＲＮＡの挙動を直接観察することもできるようになってきている。例えば、蛍光標識したｓｉＲＮＡを細胞内に導入した後、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）や蛍光相互相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＣＳ）を用いて、当該ｓｉＲＮＡの挙動を観察することができる。（例えば、非特許文献２参照。）その他、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を用いて、細胞内に導入したｓｉＲＮＡの状態や挙動を観察することもできる。（例えば、非特許文献３参照。）
【０００６】
ｓｉＲＮＡの細胞内への導入による標的遺伝子の発現抑制効果を確認するための手法としては、リアルタイムＰＣＲを用いた手法が一般的である。該手法は、まず、ｓｉＲＮＡを導入した細胞を一定期間培養する。この培養した細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製する。得られたｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、標的遺伝子由来のｍＲＮＡ量を定量的に測定し、標的遺伝子の発現が抑制されているか否かの評価を行う。標的遺伝子の発現が抑制されている場合には、標的遺伝子由来のｍＲＮＡ量が減少している。このため、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入前と比較し、該ｍＲＮＡ量の減少傾向が高いｓｉＲＮＡほど、標的遺伝子の発現抑制効果が高いと評価することができる。
【０００７】
一方で、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子発現抑制までの過程において、細胞に導入されたｓｉＲＮＡがヘリカーゼによって播き戻され、開裂により生じた一本鎖ＲＮＡがＲＩＳＣに取り込まれる際に、アンチセンス鎖ではなくセンス鎖が取り込まれ、ＲＩＳＣ−センス鎖複合体が形成されてしまう場合がある。この場合には、ＲＩＳＣ−センス鎖複合体によって、センス鎖と相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡが切断されてしまい、標的遺伝子とは別の遺伝子の発現が抑制される。このような、標的遺伝子以外の遺伝子が発現抑制される効果を、オフターゲット効果と呼ぶ。その他、ＲＩＳＣ−アンチセンス鎖複合体が形成された場合に、ミスマッチにより、アンチセンス鎖と非相補的な配列を有するｍＲＮＡを認識して切断してしまい、標的遺伝子とは別の遺伝子の発現が抑制されることもある。このような効果もオフターゲット効果として知られている。
【０００８】
このようなオフターゲット効果を回避するために、導入するｓｉＲＮＡの設計に関していくつかの工夫がなされている。ＲＩＳＣ−アンチセンス鎖複合体を優先的に形成するためには、ＲＩＳＣを構成するＲＮＡヘリカーゼによるｓｉＲＮＡの開裂を、ｓｉＲＮＡのセンス鎖側から行うことが好ましい。そこで、例えば、ｓｉＲＮＡの設計において、アンチセンス鎖の３’末端及びセンス鎖の５’末端の塩基配列を、グアニンやシトシンの多い配列（Ｇ／Ｃリッチ配列）とする一方で、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端の塩基配列を、アデニンやウラシルの多い配列（Ａ／Ｕリッチ配列）とすることにより、アンチセンス鎖とセンス鎖との結合力を、センス鎖の５’末端側のほうがセンス鎖の３’末端側よりも弱くなるようにし、ＲＩＳＣによる開裂を、優先的にセンス鎖側から行うようにする方法がある。その他、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基に修飾を行うことにより、ＲＩＳＣによる開裂を、優先的にセンス鎖側から行うようにする方法もある。
【非特許文献１】マルチネズ（Martinez）、外４名、セル（Cell）、２００２年、第１１０巻、５６３〜５７４ページ。
【非特許文献２】オート（Ohrt）、外７名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、２００８年、第３６巻第２０号、６４３９〜６４４９ページ。
【非特許文献３】ジャーヴ（Jarve）、外１１名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、２００７年、第３５巻第１８号、ｅ１２４。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
いずれにせよ、あるｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有するか否かの確認は、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入、該細胞の培養、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの定量又は発現産物（タンパク質）の解析等の、一連の工程を必要とする。これらの作業は、非常に煩雑であるうえに、ｓｉＲＮＡ導入から細胞培養までの工程に２〜３日を要し、さらにその後の作業にも半日〜１日程度を要する。
【００１０】
一方で、ｓｉＲＮＡの標的遺伝子発現抑制効果やオフターゲット効果は、主にｓｉＲＮＡの設計（塩基配列や修飾）に依存する。このため、例えば、ある標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を行うために合成したｓｉＲＮＡが、オフターゲット効果の影響が大きいものであった場合には、新たなｓｉＲＮＡを設計し、この新しいｓｉＲＮＡに対して、上記一連の確認工程を再度行い、効果の評価を行う。これを、標的遺伝子発現抑制効果が高く、オフターゲット効果の低い良好なｓｉＲＮＡが得られるまで繰り返すことになる。一般的には、複数の候補ｓｉＲＮＡについて、上記工程を繰り返し、それぞれの効果を評価して、最適なｓｉＲＮＡを選抜する。
しかしながら、複数のｓｉＲＮＡに対して、上記工程を繰り返すことは、非常に時間と労力を要する、という問題がある。そこで、ｓｉＲＮＡの標的遺伝子発現抑制効果やオフターゲット効果を、より迅速かつ簡便に評価し得る方法の開発が求められている。
【００１１】
本発明は、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を、迅速かつ簡便に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ｓｉＲＮＡの開裂とそれにより生じたアンチセンス鎖のＲＩＳＣへの取り込み状態を調べることにより、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の遺伝子発現抑制効果を評価し得ること、及び、一分子蛍光分析技術を応用することにより、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの定量等の一連の煩雑な作業を要することなく、当該効果を評価し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）  ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を評価する方法であって、（ａ）評価対象であるｓｉＲＮＡの、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＲＮＡ鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡを準備する工程と、（ｂ）前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを含む反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、（ｃ）ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと、ＡＴＰとを含む反応溶液に、前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを添加して反応させた後、当該反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、（ｄ）前記工程（ｂ）において得られた解析結果と前記工程（ｃ）において得られた解析結果とを比較し、前記ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する工程と、を有することを特徴とする、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法、
（２）  評価対象であるｓｉＲＮＡが２種類以上あり、各ｓｉＲＮＡに対して、前記工程（ａ）〜（ｄ）を行うことを特徴する前記（１）記載のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法、
（３）  ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を評価する方法であって、（ａ’）評価対象であるｓｉＲＮＡの、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＲＮＡ鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡを準備する工程と、（ｂ’）前記蛍光物質により標識されたＲＮＡヘリカーゼの巻き戻しを受けないｓｉＲＮＡ、又は前記蛍光物質により標識されたＲＩＳＣに取り込まれないｓｉＲＮＡを、細胞に導入した後、当該細胞に対して、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、（ｃ’）前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを細胞に導入して反応させた後、当該細胞に対して、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、（ｄ’）前記工程（ｂ’）において得られた解析結果と前記工程（ｃ’）において得られた解析結果とを比較し、前記ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する工程と、を有することを特徴とする、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法、
（４）  前記蛍光標識ｓｉＲＮＡが、センス鎖が蛍光物質により標識されたものであることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法、
（５）  前記一分子蛍光分解析法が、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）や蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ）、及び蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＤＡ−ＰＯ）からなる群より選択されるものであることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法は、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの取り込み状態を、蛍光標識したｓｉＲＮＡを用いて、一分子蛍光分析法により測定することにより、オフターゲット効果の程度を確認することができる。このため、本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法を用いることにより、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの定量等の一連の煩雑な作業を要することなく、迅速かつ簡便に評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を評価する方法であって、下記の工程を有することを特徴とする。
（ａ）評価対象であるｓｉＲＮＡの、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＲＮＡ鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡを準備する工程と、
（ｂ）前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを含む反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、
（ｃ）ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと、ＡＴＰとを含む反応溶液に、前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを添加して反応させた後、当該反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程と、
（ｄ）前記工程（ｂ）において得られた解析結果と前記工程（ｃ）において得られた解析結果とを比較し、前記ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する工程。
【００１６】
ＲＩＳＣ等の影響を受ける前（ＲＮＡ干渉前）と、ＲＩＳＣ等の影響を受けた後における、蛍光標識されたｓｉＲＮＡの状態を、一分子蛍光解析法により解析して比較することにより、蛍光標識ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖とアンチセンス鎖のどちらがＲＩＳＣへ取り込まれたのかを確認することができる。ＲＩＳＣへアンチセンス鎖が優先的に取り込まれる場合には、当該ｓｉＲＮＡは、オフターゲット効果が小さく、標的遺伝子の遺伝子発現抑制効果（オンターゲット効果）が大きく、遺伝子発現抑制効果が高いと評価することができる。一方、ＲＩＳＣへセンス鎖が優先的に取り込まれる場合には、当該ｓｉＲＮＡは、オフターゲット効果が大きく、オンターゲット効果が小さく、遺伝子発現抑制効果が低い、と評価することができる。
【００１７】
以下、工程ごとに説明する。
まず、工程（ａ）として、評価対象であるｓｉＲＮＡの、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＲＮＡ鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡを準備する。
【００１８】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、標的遺伝子（ＲＮＡ干渉により、当該遺伝子又は当該遺伝子の発現産物の機能を抑制・阻害する対象である遺伝子）から転写されるｍＲＮＡ（標的遺伝子由来ｍＲＮＡ）の一部又は全部と相同的な塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡであるセンス鎖と、該センス鎖と相補的な塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡであるアンチセンス鎖とからなる二本鎖ＲＮＡである。該センス鎖には、標的遺伝子由来ｍＲＮＡと相同的な塩基配列以外にも、付加的な塩基配列を有していてもよく、また、リン酸化や２’−Ｏ−メチル化等による修飾がされていてもよい。アンチセンス鎖も、同様に、修飾がされていてもよい。
【００１９】
なお、標的遺伝子は、構造遺伝子であってもよく、非構造遺伝子であってもよい。また、標的遺伝子の由来する生物種は特に限定されるものではなく、線虫、ハエ等の昆虫、植物、動物のいずれであってもよい。本発明においては、ヒトをはじめとする哺乳動物由来の遺伝子であることが好ましい。
【００２０】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡの塩基対長は、ＲＮＡ干渉において有効な長さであれば特に限定されるものではなく、標的遺伝子の種類や塩基配列、標的遺伝子が由来する生物種、細胞等への導入方法等を考慮して、適宜決定することができる。ヒト等の哺乳動物に対するＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡとしては、標的遺伝子由来ｍＲＮＡと相補的な配列部分が１５〜２５塩基対長であることが好ましい。
【００２１】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、当該技術分野において公知のいずれの手法により設計し、合成してもよい。例えば、標的遺伝子由来ｍＲＮＡの塩基配列情報に基づき、ｓｉＲＮＡの塩基配列を常法により設計した後、該設計に基づき、公知の核酸合成反応により合成することができる。ｓｉＲＮＡの合成は、例えば、市販の合成機を用いて独自に合成してもよく、受託サービスを利用して合成することもできる。例えば、センス鎖とアンチセンス鎖とを別個に合成した後、両者をアニーリングさせることによっても、ｓｉＲＮＡを合成することができる。なお、アニーリング後には、残存する一本鎖ＲＮＡはエキソヌクレアーゼ処理等により除去しておくことが好ましい。
【００２２】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＲＮＡ鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡである。蛍光物質により標識されるＲＮＡ鎖中の部位は、ヘリカーゼによる巻き戻しや、ＲＩＳＣによる開裂、標的遺伝子由来ｍＲＮＡの認識、及び標的遺伝子由来ｍＲＮＡの切断等の、ＲＮＡ干渉の一連の工程を阻害しない領域であれば、特に限定されるものではなく、蛍光標識の方法、用いられる一分子蛍光解析法の種類等を考慮して、適宜決定することができる。具体的には、例えば、５’末端に蛍光物質を結合させたプライマーを用いて、一本鎖ＲＮＡを合成することにより、５’末端が蛍光標識されたセンス鎖又はアンチセンス鎖を得ることができる。
【００２３】
ｓｉＲＮＡの蛍光標識に用いられる蛍光物質としては、特に限定されるものではなく、一般的に核酸の蛍光標識に用いられる蛍光物質の中から適宜決定することができる。このような蛍光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（インビトロジェン社製）、ＡＴＴＯ６６３等のＡＴＴＯ  ｄｙｅシリーズ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）等がある。特に、ＴＡＭＲＡ、ＴＭＲ等のように、連続して光照射を行った場合でも比較的安定して蛍光を発する色素であることが好ましい。このように退色し難い蛍光物質を標識として用いることにより、光照射の時間や回数の影響を抑えて、計測値ごとのばらつきを防止し、より安定した解析結果を得ることができる。
【００２４】
本発明においては、センス鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡであることが好ましい。ＲＮＡ干渉において、標的遺伝子の発現抑制効果が得られるためには、ＲＩＳＣにアンチセンス鎖が優先的に取り込まれる必要がある。一本鎖ＲＮＡとなったセンス鎖は、エキソヌクレアーゼ等により切断され、細分化される。このように、オンターゲット効果が奏される場合には、アンチセンス鎖よりもセンス鎖のほうが、ＲＮＡ干渉の工程において、分子の大きさ等の変化が大きい。このために、センス鎖を蛍光標識したほうが、アンチセンス鎖を蛍光標識した場合よりも、一分子蛍光解析法により、ＲＩＳＣに取り込まれたＲＮＡ鎖がセンス鎖かアンチセンス鎖かの判別が比較的容易であるためである。
【００２５】
次に、工程（ｂ）として、前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを含む反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する。この工程により、ＲＩＳＣ等の影響を受ける前（ＲＮＡ干渉前）の蛍光標識されたｓｉＲＮＡの状態を調べることができる。
【００２６】
工程（ｂ）において用いられる反応溶液は、蛍光標識ｓｉＲＮＡを含む溶液であって、ＲＮＡ干渉の生じない反応溶液であれば特に限定されるものではなく、核酸試料の調製等において一般的に用いられる溶液の中から、適宜選択して用いることができる。なお、「ＲＮＡ干渉の生じない反応溶液」とは、ＲＮＡヘリカーゼを含まない反応溶液やＲＩＳＣを含まない反応溶液等のように、ＲＮＡ干渉、特にｓｉＲＮＡの開裂とＲＩＳＣへの取り込みに必須の構成成分の少なくとも１種を含まない反応溶液を意味する。その他、ＡＴＰを含まない反応溶液であることも好ましい。一般的に、ｓｉＲＮＡの巻き戻しが行われるためには、ＡＴＰによりＲＩＳＣが活性化されることを要するためである。
【００２７】
本発明においては、工程（ｂ）において用いられる反応溶液としては、バッファーに蛍光標識ｓｉＲＮＡを添加したものであることが好ましい。ｓｉＲＮＡの標識に用いた蛍光物質の種類によっては、ｐＨ等の影響を受けやすいことがあるためである。該バッファーとして、例えば、ｐＨ７〜８の、リン酸バッファー、１０−２００ｍＭのトリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｈｕｎｋｓバッファー等が挙げられる。その他、工程（ｂ）において用いられる反応溶液には、ＲＮａｓｉｎ等のＲＮＡ分解酵素インヒビター等を添加されていることも好ましい。
【００２８】
さらに、工程（ｃ）として、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと、ＡＴＰとを含む反応溶液に、前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを添加して反応させた後、当該反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する。この工程により、ＲＩＳＣ等の影響を受けた後の蛍光標識されたｓｉＲＮＡの状態を調べることができる。
【００２９】
工程（ｃ）において用いられる反応溶液としては、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと、ＡＴＰとの両方を含む以外は、工程（ｂ）において用いられる反応溶液として挙げられた反応溶液と同様のものを使用することができる。本発明においては、工程（ｃ）において用いられる反応溶液は、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣとＡＴＰとの両方を含む以外は、工程（ｂ）において用いられる反応溶液と同じ組成であることが好ましい。
【００３０】
ＲＩＳＣは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２やＲＮＡヘリカーゼ等の複数のタンパク質からなる複合体である。本発明において用いられるＲＩＳＣは、培養細胞等から常法により抽出・精製したものを用いることができる。
【００３１】
また、本発明においては、ｓｉＲＮＡの開裂と、それにより生ずる一本鎖ＲＮＡのＲＩＳＣへの取り込みの観測を行うことによって、ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果やオンターゲット効果の程度を確認し、遺伝子発現抑制効果を評価する。このため、特にｓｉＲＮＡと直接相互作用して、二本鎖を巻き戻し開裂させる機能を持つＲＮＡヘリカーゼ又はこれを含むＲＩＳＣのユニットのみを反応溶液に添加してもよい。ＲＮＡヘリカーゼ又はこれを含むＲＩＳＣのユニットは、ＲＩＳＣと同様に、培養細胞等から常法により抽出・精製したものを用いることができる。また、ＲＮＡヘリカーゼは、市販の酵素を用いてもよい。
【００３２】
その他、工程（ｂ）において用いられる反応溶液に細胞抽出液を添加したものを、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣとＡＴＰと蛍光標識ｓｉＲＮＡとを含む反応溶液としてもよい。細胞抽出液中には、通常、ＲＩＳＣやＲＮＡヘリカーゼ、ＡＴＰ等が含まれているためである。細胞抽出液は、Ｄｉｇｎａｍらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８３年、第１１巻、第１４７５〜１４８９ページ参照。）等の常法により調製することができる。
【００３３】
なお、工程（ｂ）において蛍光シグナルを検出した反応溶液に、さらにＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣを添加して、工程（ｃ）を行ってもよく、工程（ｂ）における反応溶液と、工程（ｃ）における反応溶液とは別個に調製したものであってもよい。後者の場合、工程（ｂ）の後に工程（ｃ）をしてもよく、工程（ｃ）の後に工程（ｂ）をしてもよく、両工程を同時にしてもよい。
【００３４】
また、工程（ｂ）及び（ｃ）における反応溶液は、細胞外の溶液であってもよく、細胞内溶液であってもよい。すなわち、工程（ｂ）及び（ｃ）における反応や蛍光シグナルの検出をｉｎ  ｖｉｖｏで行っても良い。細胞内におけるｓｉＲＮＡの状態を観測することによって、より生理的な環境下におけるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価が得られる。
【００３５】
例えば、工程（ｂ）における反応溶液としては、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣを発現していない細胞を使用し、工程（ｃ）における反応溶液としては、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣを発現している細胞を使用することにより、細胞外溶液を用いた場合と同様に、ＲＩＳＣ等の影響を受ける前（ＲＮＡ干渉前）と、ＲＩＳＣ等の影響を受けた後における、蛍光標識されたｓｉＲＮＡの状態を観測することができる。ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣを発現していない細胞としては、例えば、Ｄｈａｍａｃｏｎや、ＲＩＳＣノックダウン細胞、ＲＩＳＣを構成しているＲＮＡヘリカーゼに絞り込んでノックダウンした細胞等を用いることができる。一方、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣを発現している細胞としては、通常用いられている培養細胞等を用いることができる。なお、一般的に、核酸導入効率は、培養細胞株の種類によって異なる傾向がある。このため、工程（ｂ）において用いられる細胞は、工程（ｃ）において用いられる細胞と同種の細胞株から作製されたノックダウン細胞等であることが好ましい。
【００３６】
工程（ｂ）における反応溶液として、細胞外溶液であって、細胞質の環境に近似した溶液を用い、工程（ｃ）における反応溶液としては、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣを発現している細胞を使用してもよい。このような細胞外溶液としては、例えば、高濃度（３００〜４００ｍｇ／ｍｌ）のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液等が挙げられる。このように、工程（ｂ）における反応溶液を細胞外溶液とすることにより、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣを発現していない細胞を入手することが困難である場合であっても、細胞内という、実際にＲＮＡ干渉が生じる環境におけるｓｉＲＮＡの状態を観測することができる。
【００３７】
工程（ｂ）及び（ｃ）における細胞への蛍光標識ｓｉＲＮＡの導入は、当該技術分野において公知のいずれの手法により行ってもよい。該手法としては、リポフェクチン等の脂質を用いた手法、エレクトロポレーション等の電気的な手法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。その他、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）等の市販の核酸導入試薬を用いることにより簡便に行うことができる。例えば、培養液と脂質とで調整した蛍光標識ｓｉＲＮＡを、終濃度が１０ｎＭとなるように調製したものを、培養細胞へ導入する。導入処理後、全反射蛍光顕微鏡等を用いることにより、一分子レベルで蛍光観測することによって、導入の状態を確認することも可能である。
【００３８】
工程（ｃ）において、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと、ＡＴＰとを含む反応溶液に、前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを添加して反応させる反応時間は、当該蛍光標識ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡヘリカーゼにより巻き戻されて開裂するのに十分な時間であれば、特に限定されるものではなく、反応溶液の種類、反応温度、使用するＲＮＡヘリカーゼやＲＩＳＣの活性、蛍光標識ｓｉＲＮＡの濃度等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、反応溶液が細胞外の溶液である場合（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う場合）の反応時間としては、３７℃では、１０分間〜２時間程度が好ましく、１５分間〜１時間程度がより好ましい。一方、反応溶液が細胞内溶液である場合（ｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合）の反応時間としては、３７℃の培養条件において、蛍光標識ｓｉＲＮＡ導入後、１〜１０時間程度が好ましく、１〜５時間程度が好ましい。
【００３９】
但し、ｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合には、蛍光標識ｓｉＲＮＡを導入後から、経時的に蛍光シグナルの検出を行うことが好ましい。細胞内においては、導入されたｓｉＲＮＡは異物と判断され、細胞内に存在する二本鎖ＲＮＡ特異的ＲＮａｓｅ等により分解されたり、エキソサイトーシスにより細胞外へ排出されたりすることにより代謝されてしまう場合がある。このため、細胞内に導入されたｓｉＲＮＡの全てがＤｉｃｅｒやＲＩＳＣとの相互作用からプロセッシングを受けて、標的遺伝子のｍＲＮＡの分解に寄与するとは限らないが、導入後すぐに蛍光シグナルの検出を行うことにより、蛍光標識ｓｉＲＮＡの細胞への導入状況や細胞内での分解状況等を知ることができる。経時的に蛍光シグナルの検出を行う場合、検出を開始する時期は特に限定されるものではなく、蛍光標識ｓｉＲＮＡの導入直後からであってもよく、蛍光標識ｓｉＲＮＡの導入方法等を考慮して適宜決定してもよい。例えば、蛍光標識ｓｉＲＮＡの導入をエレクトロポレーション法により行った場合には、パルス処理後から３０分間ほど経過した時点から、リポフェクチンを用いたリポフェクション法により行った場合には、細胞培養培地にリポフェクチン添加処理後１時間ほど経過した時点から、経時的に蛍光シグナルの検出を行ってもよい。
【００４０】
例えば、工程（ｂ）及び（ｃ）を、蛍光標識ｓｉＲＮＡを細胞内に導入した後、経時的に蛍光シグナルの検出を行うことにより、当該蛍光標識ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣに取り込まれるタイミングを知ることができる。その他、エキソヌクレアーゼによる分解が行われるかどうかといった、当該蛍光標識ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣに取り込まれなかった場合の挙動も明らかにすることが可能である。
【００４１】
その他、工程（ｃ）をｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合には、ＲＮＡヘリカーゼによる巻き戻しや、開裂により一本鎖ＲＮＡとなったアンチセンス鎖がＲＩＳＣへ取り込まれることが確認されている蛍光標識されたｓｉＲＮＡをポジティブコントロールｓｉＲＮＡとしてもよい。具体的には、工程（ｃ）において蛍光標識ｓｉＲＮＡを導入する細胞に対して、当該ポジティブコントロールｓｉＲＮＡを導入して反応させた後、工程（ｃ）と同様にして、適当な波長の光を照射して検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する。ポジティブコントロールｓｉＲＮＡを標識する蛍光物質は、工程（ｃ）において導入される蛍光標識ｓｉＲＮＡと同種の蛍光物質であってもよく、異種の蛍光物質であってもよい。このようなポジティブコントロールｓｉＲＮＡとして、例えば、ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製）等の、ＲＮＡ干渉のポジティブコントロールとして一般的に用いられている蛍光標識されたｓｉＲＮＡを用いることができる。
【００４２】
工程（ｂ）及び（ｃ）における蛍光シグナルの検出は、具体的には、共焦点（コンフォーカル）光学系を有する蛍光光度計に、該反応溶液を設置し、常法により蛍光シグナルを検出することができる。また、該反応溶液が細胞内溶液である場合には、蛍光標識ｓｉＲＮＡを導入した細胞を、共焦点光学系を有する蛍光顕微鏡に設置し、常法により蛍光シグナルを検出することができる（例えば、非特許文献２参照。）。なお、ＦＣＳ等の一分子蛍光解析法により解析される蛍光シグナルの検出は、一般的には、共焦点光学系を利用するものであるが、一分子蛍光解析を行うための一分子由来の蛍光シグナルを取得することができる光学系であれば、特に限定されるものではなく、共焦点光学系以外の他の光学系を用いることも可能である。  
【００４３】
蛍光シグナルの計測条件は、使用する蛍光光度計や蛍光顕微鏡の仕様により、適宜決定することができるが、例えば、１サンプル当たり、１５秒間で５回程度行う。計測時間はこれ以上長くても良く、回数もこれ以上多くても良い。但し、検出に用いる装置の種類によっては、計測時間が１０秒間以下等の短時間である場合や、測定回数が１回程度のみである場合には、データの再現性、信頼性が低下するおそれがある。また、蛍光シグナルを計測するサンプルに対して焦点位置を走査させることにより、より多数の分子から情報（蛍光シグナル）を取得することができ、統計的な精度を高めることも可能である。
【００４４】
本発明において用いられる一分子蛍光解析法としては、例えば、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）や蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＤＡ−ＰＯ）等がある。
【００４５】
ＦＣＳは、反応溶液中の蛍光標識された分子（蛍光標識分子）の拡散する時間（並進拡散時間）を求めることができる手法である。並進拡散時間は、分子の大きさによって異なる。例えば、大きな分子の並進拡散時間は、小さな分子の並進拡散時間よりも長い。このため、ＦＣＳは、分子の相互作用や、分解、凝集等による大きさの変化をモニターするために利用される手法である。また、観測領域中に、並進拡散時間の異なる蛍光標識分子（すなわち、大きさの異なる分子）が存在する場合には、２成分解析を行うことにより、それぞれの大きさの分子の数や割合を算出することも可能である。
【００４６】
図１は、センス鎖の５’末端に蛍光物質を結合させたｓｉＲＮＡの、ＲＩＳＣへの取り込み示した概念図である。５’末端に蛍光物質（Ｆ）が結合したセンス鎖（１ｓ）と、これと相補的なアンチセンス鎖（１ａ）とからなるｓｉＲＮＡ（１）に対して、ＲＮＡヘリカーゼ（２）を含むＲＩＳＣ（３）が、センス鎖（１ｓ）の３’末端側から作用した場合には、アンチセンス鎖（１ａ）がＲＩＳＣ（３）に取り込まれ、センス鎖（１ｓ）が解離する。その後、アンチセンス鎖（１ａ）と相補的な塩基配列を有する標的遺伝子のｍＲＮＡ（４）がＲＩＳＣ（３）に取り込まれ、切断される（オンターゲット効果）。解離したセンス鎖（１ｓ）は、エキソヌクレアーゼ（６）等の働きにより分解される。一方、ｓｉＲＮＡ（１）に対して、ＲＮＡヘリカーゼ（２）を含むＲＩＳＣ（３）が、センス鎖（１ｓ）の５’末端側から作用した場合には、センス鎖（１ｓ）がＲＩＳＣ（３）に取り込まれ、アンチセンス鎖（１ａ）が解離する。その後、センス鎖（１ｓ）と相補的な塩基配列を有する標的遺伝子以外の遺伝子のｍＲＮＡ（５）がＲＩＳＣ（３）に取り込まれ、切断される（オフターゲット効果）。解離したアンチセンス鎖（１ａ）は、エキソヌクレアーゼ（６）等の働きにより分解される。
【００４７】
このため、センス鎖の５’末端に蛍光物質を結合させた蛍光標識ｓｉＲＮＡを用いて本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法を行った場合に、オンターゲット効果が生じる場合、すなわち、アンチセンス鎖がＲＩＳＣへ取り込まれた場合や、ＲＮＡヘリカーゼがセンス鎖の３’末端側から作用することにより開裂された場合には、センス鎖は解離して一本鎖となるため、工程（ｂ）における解析によって得られた並進拡散時間（ｔ１）よりも、工程（ｃ）における解析によって得られた並進拡散時間（ｔ２）のほうが短くなる。さらに、反応溶液中にエキソヌクレアーゼ等の一本鎖ＲＮＡ特異的な分解酵素等が存在している場合には、遊離の一本鎖ＲＮＡであるセンス鎖が分解される結果、工程（ｃ）における解析によって得られた並進拡散時間（ｔ２）はより短くなる。逆に、オフターゲット効果が生じる場合、すなわち、センス鎖がＲＩＳＣへ取り込まれた場合や、ＲＮＡヘリカーゼがセンス鎖の５’末端側から作用することにより開裂された場合には、センス鎖は、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと結合しているため、工程（ｂ）における解析によって得られた並進拡散時間（ｔ１）よりも、工程（ｃ）における解析によって得られた並進拡散時間（ｔ２）のほうが長くなる。
【００４８】
よって、工程（ｄ）においては、並進拡散時間（ｔ１）よりも並進拡散時間（ｔ２）のほうが短い場合には、当該蛍光標識ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖が優先的にＲＩＳＣに取り込まれ、オンターゲット効果が大きく、遺伝子発現抑制効果が高いと評価する。逆に、並進拡散時間（ｔ１）よりも並進拡散時間（ｔ２）のほうが長い場合には、センス鎖が優先的にＲＩＳＣに取り込まれ、オフターゲット効果が大きく、遺伝子発現抑制効果が低いと評価する。
【００４９】
ある蛍光標識ｓｉＲＮＡに対して、オンターゲット効果とオフターゲット効果の両方が生じている場合には、反応溶液中に、並進拡散時間の異なるこれらの分子が混在するが、２成分解析を行うことにより、それぞれの並進拡散時間を有する分子の割合を算出することができる。このため、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの取り込み効率を算出することが可能である。なお、本発明において、「ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの取り込み効率」とは、[オンターゲット効果が生じたｓｉＲＮＡ分子の数]／{[オンターゲット効果が生じたｓｉＲＮＡ分子の数]＋[オフターゲット効果が生じたｓｉＲＮＡ分子の数]}を意味する。
【００５０】
ＦＩＤＡは、反応溶液中の蛍光標識分子の一分子当たりの蛍光強度と、その数を求めることができる手法である。蛍光物質の種類によって、蛍光特性は異なるため、結合している核酸の状態によって、一分子当たりの蛍光強度が変化する場合がある。すなわち、蛍光標識されたＲＮＡは、塩基配列や長さ、二本鎖ＲＮＡか、一本鎖ＲＮＡか等の、蛍光物質の環境状態によって、一分子当たりの蛍光強度が異なる場合がある。
【００５１】
このため、ＦＩＤＡを用いて解析することにより、工程（ｂ）における解析によって得られた蛍光強度（Ｑ１）（すなわち、二本鎖ＲＮＡである蛍光標識ｓｉＲＮＡの一分子当たりの蛍光強度）と、工程（ｃ）における解析によって得られた蛍光強度（Ｑ２）とを比較することにより、工程（ｃ）の反応溶液中に存在する蛍光標識分子が、開裂により一本鎖ＲＮＡとなった状態であるのか、分解によりさらに短鎖の一本鎖ＲＮＡとなった状態であるのか、又はＲＮＡヘリカーゼ等のタンパク質と結合した状態であるのかを推測することができる。例えば、蛍光物質としてＴＡＭＲＡを用いた場合には、蛍光強度（Ｑ２）が蛍光強度（Ｑ１）より小さい場合は、工程（ｃ）の反応溶液中に存在する蛍光標識分子が、開裂により一本鎖ＲＮＡとなった状態であると考えられる。さらにエキソヌクレアーゼ等によって分解されると、一分子当たりの蛍光強度が小さくなる。
【００５２】
よって、蛍光物質としてＴＡＭＲＡを用いた場合には、工程（ｄ）においては、蛍光強度（Ｑ１）よりも蛍光強度（Ｑ２）のほうが小さい場合には、当該蛍光標識ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖が優先的にＲＩＳＣに取り込まれ、オンターゲット効果が大きく、遺伝子発現抑制効果が高いと評価する。逆に、蛍光強度（Ｑ１）よりも蛍光強度（Ｑ２）のほうが大きい場合には、センス鎖が優先的にＲＩＳＣに取り込まれ、オフターゲット効果が大きく、遺伝子発現抑制効果が低いと評価する。
【００５３】
なお、ＦＩＤＡにおいても、観測領域中に、蛍光強度の異なる蛍光標識分子（すなわち、状態の異なる分子）が存在する場合には、２成分解析を行うことにより、それぞれの状態の分子の数や割合を算出することも可能である。よって、ＦＩＤＡを用いて解析した場合にも、ＦＣＳと同様に、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの取り込み効率を算出することが可能である。
【００５４】
ＦＩＤＡ−ＰＯは、蛍光強度分布と蛍光偏光解析を複合させた手法であり、蛍光標識分子の蛍光偏光度とその分子数を求めることができる。蛍光偏光度は、分子の大きさによって異なり、例えば、小さな分子は、大きな分子よりも分子の回転運動が速く、蛍光偏光度が小さくなる。
【００５５】
このため、センス鎖の５’末端に蛍光物質を結合させた蛍光標識ｓｉＲＮＡを用いて本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法を行った場合に、オンターゲット効果が生じる場合、すなわち、アンチセンス鎖がＲＩＳＣへ取り込まれた場合や、ＲＮＡヘリカーゼがセンス鎖の３’末端側から作用することにより開裂された場合には、センス鎖は解離して一本鎖となるため、工程（ｂ）における解析によって得られた蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも、工程（ｃ）における解析によって得られた蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが小さくなる。さらに、反応溶液中にエキソヌクレアーゼ等の一本鎖ＲＮＡ特異的な分解酵素等が存在している場合には、遊離の一本鎖ＲＮＡであるセンス鎖が分解される結果、工程（ｃ）における解析によって得られた蛍光偏光度（ｍＰ２）はより小さくなる。逆に、オフターゲット効果が生じる場合、すなわち、センス鎖がＲＩＳＣへ取り込まれた場合や、ＲＮＡヘリカーゼがセンス鎖の５’末端側から作用することにより開裂された場合には、センス鎖は、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと結合しているため、工程（ｂ）における解析によって得られた蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも、工程（ｃ）における解析によって得られた蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが大きくなる。
【００５６】
よって、工程（ｄ）においては、蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが小さい場合には、当該蛍光標識ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖が優先的にＲＩＳＣに取り込まれ、オンターゲット効果が大きく、遺伝子発現抑制効果が高いと評価する。逆に、蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが大きい場合には、センス鎖が優先的にＲＩＳＣに取り込まれ、オフターゲット効果が大きく、遺伝子発現抑制効果が低いと評価する。
【００５７】
また、ＦＩＤＡ−ＰＯにおいても、観測領域中に、蛍光偏光度の異なる蛍光標識分子（すなわち、大きさの異なる分子）が存在する場合には、２成分解析を行うことにより、それぞれの大きさの分子の数や割合を算出することも可能である。よって、ＦＩＤＡ−ＰＯを用いて解析した場合にも、ＦＣＳと同様に、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの取り込み効率を算出することが可能である。
【００５８】
工程（ｂ）又は（ｃ）における反応溶液として、細胞内溶液を用いた場合、つまり、蛍光標識ｓｉＲＮＡを細胞に導入して蛍光シグナルを検出する場合には、解析に分子の拡散運動のパラメータを含まないＦＩＤＡやＦＩＤＡ−ＰＯを用いることにより、データの解釈が容易となる。これは、細胞内は均一な媒質ではなく、細胞骨格や小胞体やミトコンドリア等のオルガネラで満たされた状態であるため、細胞内の蛍光標識分子は均一な拡散運動をしているわけではない。ＦＣＳにおいては、分子の拡散を観測しているが、これは自由拡散を前提としているため、細胞内の蛍光分子から検出された蛍光シグナルをＦＣＳにより解析する場合には、データの解析が複雑になる場合がある。
【００５９】
評価対象であるｓｉＲＮＡが、工程（ｄ）において遺伝子発現抑制効果が低いと評価された場合には、再度ｓｉＲＮＡの設計をやり直して新たなｓｉＲＮＡを合成し、これについて、同様に工程（ａ）〜（ｄ）を行い、遺伝子発現抑制効果を評価することができる。この操作を繰り返すことにより、標的遺伝子のＲＮＡ干渉を行うために最適なｓｉＲＮＡを得ることができる。
【００６０】
また、評価対象であるｓｉＲＮＡが２種類以上ある場合には、各ｓｉＲＮＡに対して、前記工程（ａ）〜（ｄ）を行い、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価することにより、これらのｓｉＲＮＡの中から、最も評価の高いｓｉＲＮＡを、標的遺伝子のＲＮＡ干渉を行うために最適なｓｉＲＮＡとして選択することもできる。
【００６１】
本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法を用いることにより、ｓｉＲＮＡを導入した細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応及びリアルタイムＰＣＲ等の作業をすることなく、迅速にｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価することができる。特に、反応溶液として細胞外溶液を用いて、工程（ｂ）又は（ｃ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う場合には、煩雑な細胞培養操作等を要さず、単にｓｉＲＮＡ等の試薬を添加して混合し、蛍光シグナルを検出して解析することができるため、評価対象であるｓｉＲＮＡが多数である場合にも、迅速に評価を行うことができる。
【００６２】
本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法を用いることにより、細胞を使うことなくオフターゲット効果の確認ができるため、複数の候補となる目的のｓｉＲＮＡの中から最適なｓｉＲＮＡを絞りこむことができ、簡便にｓｉＲＮＡの設計精度を向上させることが可能である。また、工程（ｂ）又は（ｃ）を細胞内において行う場合にも、細胞を破砕することなくＲＩＳＣへの取り込みを簡便に確認することが可能となり、ＲＮＡ干渉をより容易に行うことができる。
【００６３】
なお、工程（ｂ）又は（ｃ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う場合のほうが、ｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合よりも簡便であり、かつＲＩＳＣ以外のタンパク質等の影響が除かれた評価を得ることができる。このため、一のｓｉＲＮＡを評価する場合において、工程（ｂ）又は（ｃ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行い、遺伝子発現抑制効果が高いと評価されたｓｉＲＮＡについてのみ、工程（ｂ）又は（ｃ）をｉｎ  ｖｉｖｏで行い、本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法により評価することもできる。
【００６４】
なお、本発明においては、ＲＩＳＣへのアンチセンス鎖の取り込み工程を対象として遺伝子発現抑制効果を評価しており、その後の工程については評価の対象とされてはいない。このため、本発明において遺伝子発現抑制効果が高いと評価されたｓｉＲＮＡについて、当該ｓｉＲＮＡが導入された細胞から、常法により、ｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応及びリアルタイムＰＣＲ等の常法により、標的遺伝子のｍＲＮＡ量が減少していることを確認することも好ましい。
【００６５】
図２は、センス鎖の５’末端に蛍光物質ＴＡＭＲＡを結合させた蛍光標識ｓｉＲＮＡを用いて、細胞外溶液を反応溶液とした場合の、本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図である。なお、本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法が、該態様に限定されるものではないことは言うまでもない。まず、工程（ａ）として、遺伝子発現抑制効果の評価対象となるセンス鎖の５’末端にＴＡＭＲＡを結合させた蛍光標識ｓｉＲＮＡ（ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡ）の塩基配列を設計し（ステップ０１）、これを合成する。次に、工程（ｂ）として、ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡを含む反応溶液を調製し（ステップ０２）、この反応溶液に対して、ＴＡＭＲＡの励起光を照射し、蛍光シグナルを検出し、一分子蛍光解析法により解析する（ステップ０３−１〜３）。ＦＣＳを用いて解析した場合には並進拡散時間（ｔ１）を、ＦＩＤＡを用いて解析した場合には蛍光強度（Ｑ１）を、ＦＩＤＡ−ＰＯを用いて解析した場合には蛍光偏光度（ｍＰ１）を、それぞれ算出する。次に、工程（ｃ）として、ＲＩＳＣとＡＴＰとを含む反応溶液に、ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡを添加して反応させた後（ステップ０４）、当該反応溶液に対して、ＴＡＭＲＡの励起光を照射し、蛍光シグナルを検出し、一分子蛍光解析法により解析する（ステップ０５−１〜３）。ＦＣＳを用いて解析した場合には並進拡散時間（ｔ２）を、ＦＩＤＡを用いて解析した場合には蛍光強度（Ｑ２）を、ＦＩＤＡ−ＰＯを用いて解析した場合には蛍光偏光度（ｍＰ２）を、それぞれ算出する。さらに、工程（ｄ）として、ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する（ステップ０６−１〜３）。並進拡散時間（ｔ１）よりも並進拡散時間（ｔ２）のほうが長い場合、蛍光強度（Ｑ１）よりも蛍光強度（Ｑ２）のほうが大きい場合、蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが大きい場合には、遺伝子発現抑制効果が低いと評価し、再度ｓｉＲＮＡを設計し直し（ステップ０１）、ステップ０２〜ステップ０６を繰り返す。一方、並進拡散時間（ｔ１）よりも並進拡散時間（ｔ２）のほうが短い場合、蛍光強度（Ｑ１）よりも蛍光強度（Ｑ２）のほうが小さい場合、蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが小さい場合には、遺伝子発現抑制効果が高いと評価し、２成分解析を行い（ステップ０７）、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの取り込み効率（反応効率）を求める（ステップ０８）。反応効率が良好なｓｉＲＮＡについては、培養細胞に導入し、より生理的な条件における遺伝子発現抑制効果を確認することもできる。
【００６６】
図３は、センス鎖の５’末端に蛍光物質ＴＡＭＲＡを結合させた蛍光標識ｓｉＲＮＡを用いて、細胞内溶液を反応溶液とした場合の、本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図である。なお、本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法が、該態様に限定されるものではないことは言うまでもない。まず、工程（ａ）として、遺伝子発現抑制効果の評価対象となるセンス鎖の５’末端にＴＡＭＲＡを結合させた蛍光標識ｓｉＲＮＡ（ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡ）の塩基配列を設計し（ステップ１０１）、これを合成する。次に、工程（ｂ）として、ＲＩＳＣノックダウン細胞にＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡを導入し（ステップ１０２）、該細胞を培養し（ステップ１０３）、細胞を観察し、導入の状態を確認する（ステップ１０４）。ステップ１０２〜１０４に換えて、細胞外溶液を用いてＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡを含む反応溶液を調製してもよい（ステップ１０５）。ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡが導入された細胞又はＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡを含む細胞外溶液に対して、ＴＡＭＲＡの励起光を照射し、蛍光シグナルを検出し、一分子蛍光解析法により解析する（ステップ１０６−１〜３）。ＦＣＳを用いて解析した場合には並進拡散時間（ｔ１）を、ＦＩＤＡを用いて解析した場合には蛍光強度（Ｑ１）を、ＦＩＤＡ−ＰＯを用いて解析した場合には蛍光偏光度（ｍＰ１）を、それぞれ算出する。次に、工程（ｃ）として、ＲＩＳＣを発現している細胞にＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡを導入し（ステップ１０７）、細胞を観察し、導入の状態を確認する（ステップ１０８）。ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡが導入された細胞に対して、ＴＡＭＲＡの励起光を照射し、蛍光シグナルを検出し、一分子蛍光解析法により解析する（ステップ１０９−１〜３）。ＦＣＳを用いて解析した場合には並進拡散時間（ｔ２）を、ＦＩＤＡを用いて解析した場合には蛍光強度（Ｑ２）を、ＦＩＤＡ−ＰＯを用いて解析した場合には蛍光偏光度（ｍＰ２）を、それぞれ算出する。さらに、工程（ｄ）として、ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する（ステップ１１０−１〜３）。並進拡散時間（ｔ１）よりも並進拡散時間（ｔ２）のほうが長い場合、蛍光強度（Ｑ１）よりも蛍光強度（Ｑ２）のほうが大きい場合、蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが大きい場合には、遺伝子発現抑制効果が低いと評価し、再度ｓｉＲＮＡを設計し直し（ステップ１０１）、ステップ１０２〜ステップ１０９を繰り返す。一方、並進拡散時間（ｔ１）よりも並進拡散時間（ｔ２）のほうが短い場合、蛍光強度（Ｑ１）よりも蛍光強度（Ｑ２）のほうが小さい場合、蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが小さい場合には、遺伝子発現抑制効果が高いと評価する。その後、さらに、該細胞のｍＲＮＡを抽出し、実際に標的遺伝子のｍＲＮＡ量が減少していることを確認してもよい（ステップ１１１）。
【００６７】
前述したように、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣを発現していない細胞を入手することが困難である場合が多い。一方、一分子蛍光解析においては、ＲＮＡ干渉が生じない状態の細胞内における蛍光標識分子の挙動は、同種の蛍光物質により標識されている二本鎖ＲＮＡ同士ではほぼ等しい。
そこで、工程（ｂ）に換えて、ＲＮＡヘリカーゼにより巻き戻しや開裂がなされず、ＲＩＳＣに取り込まれないｓｉＲＮＡであって、同種の蛍光物質により標識されたｓｉＲＮＡを用いることにより、ＲＮＡヘリカーゼ等を発現している細胞を用いて、ＲＩＳＣ等の影響を受ける前（ＲＮＡ干渉前）の細胞内における蛍光標識ｓｉＲＮＡの蛍光シグナルを検出し、解析することができる。
【００６８】
具体的には、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を評価する方法であって、下記の工程（ａ’）〜（ｄ’）を有することを特徴とする。
（ａ’）評価対象であるｓｉＲＮＡの、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＲＮＡ鎖が蛍光物質により標識された蛍光標識ｓｉＲＮＡを準備する工程。
（ｂ’）前記蛍光物質により標識されたＲＮＡヘリカーゼの巻き戻しを受けないｓｉＲＮＡ、又は前記蛍光物質により標識されたＲＩＳＣに取り込まれないｓｉＲＮＡを、細胞に導入した後、当該細胞に対して、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程。
（ｃ’）前記蛍光標識ｓｉＲＮＡを細胞に導入して反応させた後、当該細胞に対して、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出し、検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析する工程。
（ｄ’）前記工程（ｂ’）において得られた解析結果と前記工程（ｃ’）において得られた解析結果とを比較し、前記ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する工程。
【００６９】
ここで、工程（ａ’）は、前述の工程（ａ）と同様である。
工程（ｂ’）は、前述の工程（ｂ）において、評価対象である蛍光標識ｓｉＲＮＡに換えて、ＲＮＡヘリカーゼの巻き戻しを受けないｓｉＲＮＡ又はＲＩＳＣに取り込まれないｓｉＲＮＡ（ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ）を評価対象であるｓｉＲＮＡの標識と同種の蛍光物質により蛍光標識したｓｉＲＮＡを用いた以外は、反応溶液が細胞内溶液である場合と同様である。
【００７０】
ネガティブコントロールｓｉＲＮＡとして、ＲＮＡヘリカーゼによる巻き戻しを受けないｓｉＲＮＡや、ＲＮＡヘリカーゼにより巻き戻され開裂された一本鎖ＲＮＡがＲＩＳＣへ取り込まれないｓｉＲＮＡを用いることにより、工程（ｃ’）と同じ細胞を用いた場合であっても、ＲＩＳＣ等の影響を受ける前の細胞内における蛍光標識されたｓｉＲＮＡの挙動を観測することができる。このようなネガティブコントロールｓｉＲＮＡとしては、例えば、鎖間を共有結合させたｓｉＲＮＡ等を用いることができる。
【００７１】
ネガティブコントロールｓｉＲＮＡの塩基対長は、特に限定されるものではないが、評価対象であるｓｉＲＮＡの塩基対長と同程度（±５ｂｐ程度）であることが好ましく、同じ塩基対長であることがより好ましい。塩基対長が同程度である場合のほうが、大きく相違する場合よりも、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡの細胞内における蛍光標識分子の挙動が、よりＲＮＡ干渉が生じない状態の細胞内における評価対象である蛍光標識ｓｉＲＮＡとより近似するためである。
【００７２】
工程（ｃ’）は、前述の工程（ｃ）において、反応溶液が細胞内溶液である場合と同様である。
さらに、工程（ｄ’）における評価も、工程（ｂ’）において得られた解析結果と前記工程（ｃ’）において得られた解析結果とを、工程（ｄ）と同様にして比較することにより、評価対象である蛍光標識ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価することができる。
【００７３】
評価対象であるｓｉＲＮＡが、工程（ｄ’）において遺伝子発現抑制効果が低いと評価された場合には、再度ｓｉＲＮＡの設計をやり直して新たなｓｉＲＮＡを合成し、これについて、同様に工程（ａ’）〜（ｄ’）を行い、遺伝子発現抑制効果を評価することができる。この操作を繰り返すことにより、標的遺伝子のＲＮＡ干渉を行うために最適なｓｉＲＮＡを得ることができる。
【００７４】
また、評価対象であるｓｉＲＮＡが２種類以上ある場合には、各ｓｉＲＮＡに対して、前記工程（ａ’）〜（ｄ’）を行い、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価することにより、これらのｓｉＲＮＡの中から、最も評価の高いｓｉＲＮＡを、標的遺伝子のＲＮＡ干渉を行うために最適なｓｉＲＮＡとして選択することもできる。
【００７５】
なお、前述と同様に、工程（ｂ’）及び（ｃ’）においてｓｉＲＮＡを導入する細胞に対して、前記のポジティブコントロールｓｉＲＮＡを導入して反応させた後、工程（ｃ）と同様にして、適当な波長の光を照射して検出された蛍光シグナルを一分子蛍光解析法により解析してもよい。
【００７６】
図４は、センス鎖の５’末端に蛍光物質ＴＡＭＲＡを結合させた蛍光標識ｓｉＲＮＡと、同じくＴＡＭＲＡを結合させたネガティブコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合の、工程（ａ’）〜（ｄ’）を有する本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図である。なお、本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法が、該態様に限定されるものではないことは言うまでもない。まず、工程（ａ’）として、遺伝子発現抑制効果の評価対象となるセンス鎖の５’末端にＴＡＭＲＡを結合させた蛍光標識ｓｉＲＮＡ（ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡ）の塩基配列を設計し（ステップ２０１）、これを合成する。次に、工程（ｂ’）として、ＴＡＭＲＡを結合させたネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（コントロールＴＡＭＲＡ標識ｓｉＲＮＡ）を、細胞に導入し（ステップ２０２）、該細胞を培養し（ステップ２０３）、細胞を観察し、導入の状態を確認する（ステップ２０４）。コントロールＴＡＭＲＡ標識ｓｉＲＮＡが導入された細胞に対して、ＴＡＭＲＡの励起光を照射し、蛍光シグナルを検出し、一分子蛍光解析法により解析する（ステップ２０６−１〜３）。ＦＣＳを用いて解析した場合には並進拡散時間（ｔ１）を、ＦＩＤＡを用いて解析した場合には蛍光強度（Ｑ１）を、ＦＩＤＡ−ＰＯを用いて解析した場合には蛍光偏光度（ｍＰ１）を、それぞれ算出する。次に、工程（ｃ’）として、ステップ２０２で用いた細胞と同種の細胞に対してＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡを導入し（ステップ２０７）、細胞を観察し、導入の状態を確認する（ステップ２０８）。ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡが導入された細胞に対して、ＴＡＭＲＡの励起光を照射し、蛍光シグナルを検出し、一分子蛍光解析法により解析する（ステップ２０９−１〜３）。ＦＣＳを用いて解析した場合には並進拡散時間（ｔ２）を、ＦＩＤＡを用いて解析した場合には蛍光強度（Ｑ２）を、ＦＩＤＡ−ＰＯを用いて解析した場合には蛍光偏光度（ｍＰ２）を、それぞれ算出する。さらに、工程（ｄ’）として、ＴＡＭＲＡ−ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価する（ステップ２１０−１〜３）。並進拡散時間（ｔ１）よりも並進拡散時間（ｔ２）のほうが長い場合、蛍光強度（Ｑ１）よりも蛍光強度（Ｑ２）のほうが大きい場合、蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが大きい場合には、遺伝子発現抑制効果が低いと評価し、再度ｓｉＲＮＡを設計し直し（ステップ２０１）、ステップ２０２〜ステップ２０９を繰り返す。一方、並進拡散時間（ｔ１）よりも並進拡散時間（ｔ２）のほうが短い場合、蛍光強度（Ｑ１）よりも蛍光強度（Ｑ２）のほうが小さい場合、蛍光偏光度（ｍＰ１）よりも蛍光偏光度（ｍＰ２）のほうが小さい場合には、遺伝子発現抑制効果が高いと評価する。その後、さらに、該細胞のｍＲＮＡを抽出し、実際に標的遺伝子のｍＲＮＡ量が減少していることを確認してもよい（ステップ２１１）。
【００７７】
その他、本発明においては、一分子蛍光解析法として、ＦＣＣＳを行うことによっても、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価することができる。例えば、評価対象であるｓｉＲＮＡの標識に用いた蛍光物質とは異なる分光特性を有する蛍光物質を用いて標識したＲＩＳＣを発現する細胞（蛍光標識ＲＩＳＣ細胞）に、蛍光標識ｓｉＲＮＡを導入し、各蛍光物質をそれぞれ励起し得る２種類の波長の光を照射し、それぞれの蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出してＦＣＣＳにより解析する。ＦＣＣＳ解析により、蛍光標識ＲＩＳＣと蛍光標識ｓｉＲＮＡとが相互作用をするか否かが分かるため、ＦＣＳ等を用いた場合と同様に、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価することができる。なお、蛍光標識ＲＩＳＣ細胞としては、例えば、ＲＩＳＣの構成タンパク質であるＡｇｏをＧＦＰ等の蛍光タンパク質で修飾したキメラタンパク質を発現させた細胞を用いることができる（例えば、非特許文献２参照。）。
【００７８】
経時的に蛍光シグナルの検出を行い、ＦＣＣＳ計測による相互相関の変化を時間計測することによって、蛍光標識ＲＩＳＣと蛍光標識ｓｉＲＮＡとの相互作用をより詳細に測定することができる。例えば、センス鎖を標識した蛍光標識ｓｉＲＮＡを導入した直後又は比較的早い時期に相互相関があり、その後の時間経過により相互相関がなくなった場合には、蛍光標識ｓｉＲＮＡが蛍光標識ＲＩＳＣと相互作用してＲＮＡヘリカーゼにより開裂され、その後、開裂により生じたアンチセンス鎖がＲＩＳＣに取り込まれ、センス鎖が解離しており（オンターゲット効果）、当該ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果は高いと評価することができる。一方、導入した直後又は比較的早い時期に相互相関があり、その後の時間が経過した場合でも相互相関がある場合には、開裂により生じたセンス鎖がＲＩＳＣに取り込まれており（オフターゲット効果）、当該ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果は低いと評価することができる。
【００７９】
なお、本発明においては、ＲＩＳＣ等の影響を受ける前（ＲＮＡ干渉前）と、ＲＩＳＣ等の影響を受けた後における、蛍光標識ｓｉＲＮＡの状態を、別個の反応溶液中で観測し、それぞれの状態を比較することによってｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価しているが、ＲＮＡヘリカーゼ又はＲＩＳＣと、ＡＴＰとを含む反応溶液に、評価対象である蛍光標識ｓｉＲＮＡを添加した直後から、経時的に蛍光シグナルを検出し、一分子蛍光解析を行うことにより、当該反応溶液中の蛍光標識ｓｉＲＮＡの経時変化のみから、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価することも可能である。当該反応溶液に添加した直後の標識ｓｉＲＮＡの状態は、ＲＩＳＣ等の影響を受ける前（ＲＮＡ干渉前）の状態に相当し、添加直後の解析結果は、前述の工程（ｂ）において得られる解析結果に相当するためである。この方法においては、前述の工程（ｃ）における反応溶液と同様に、細胞外溶液中で行ってもよく、細胞に蛍光標識ｓｉＲＮＡを導入して、細胞内において行ってもよい。
【実施例】
【００８０】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８１】
［実施例１］
＜ＲＮＡヘリカーゼの調製＞
ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅのＦＬＪ１０３８３（ＴＯＹＯＢＯ、ＮＣＢＩ ｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ: Ｋ００１２４５）のｃＤＮＡ配列のうち、全長１〜１３６２までの部分領域を、大腸菌におけるタンパク質の発現ベクターｐＥＴ２１ａ（ｎｏｖａｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトに組み込み、ＲＮＡヘリカーゼ発現ベクター（ｐＥＴ２１ａ−ＲＮＡｈｅｌｉｃａｓｅ）を構築した。
このｐＥＴ２１ａ−ＲＮＡｈｅｌｉｃａｓｅを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入し、一晩培養することによってＲＮＡヘリカーゼを発現した大腸菌を含む培養液を得た。その後、該培養液から回収した大腸菌を、ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｎｏｖａｇｅｎ社製）を添加して大腸菌を破砕し、タンパク質を可溶化し、さらにプロテアーゼインヒビターを添加して、２４℃で２０分間処理することによって、細胞抽出液を得た。Ｈｉｓ−Ｓｐｉｎｔｒａｐ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたＨｉｓ−Ｔａｇ精製を行うことにより、該細胞抽出液からＲＮＡヘリカーゼを精製した。Ｈｉｓ−ＳｐｉｎｔｒａｐカラムからのＲＮＡヘリカーゼの溶出には、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてバンドを確認（分子量４８６４７Ｄａ、約４８ＫＤａ）することによって、発現させたＲＮＡヘリカーゼが精製されていることを確認した。
【００８２】
＜蛍光標識ｓｉＲＮＡとの反応＞
蛍光標識ｓｉＲＮＡとしては、ＦＡＭ−ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ）（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いた。このＦＡＭ−ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉における陽性コントロールとして市販されているものであり、オフターゲット効果は小さいと考えられる。なお、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡにおいて、ＦＡＭはセンス鎖の５’末端に結合している。
このＦＡＭ−ｓｉＲＮＡと上記で調製したＲＮＡヘリカーゼを用いて、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡのＧＡＰＤＨ遺伝子発現抑制効果の評価を行った。ＲＮＡヘリカーゼによる反応は、Ｈｕａｎｇらの方法（Journal of Biological Chemistry、２００２年、第２７７巻第１２８１０ページ参照。）を参考にして行った。
まず、最終濃度が表１記載の濃度となるように、バッファー（７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、４０ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｉｎ（Ｎ２１１１  Ｐｒｏｍｅｇａ社製））に、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ、ＡＴＰ（Ａ３３７７  Ｓｉｇｍａ社製）、及びＲＮＡヘリカーゼを添加することにより、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡを含む４種類の反応溶液（試料１〜４；最終容量２０μｌ）を調製した。なお、表中、ＲＮＡヘリカーゼの濃度は、上記で調製したＲＮＡヘリカーゼ精製物の総タンパク質あたりの濃度を意味する。
【００８３】
【表１】
2010151550.tif 000003
【００８４】
調製された試料１〜４を、３７℃で６０分間インキュベートして反応させた後、一分子蛍光分析装置ＭＦ２０（オリンパス社製）を用いて、これらの試料に、４８８ｎｍのレーザ光（レーザパワー：１００μＷ）を照射し、蛍光シグナルを検出した。計測メソッドは、ＦＣＳ又はＦＩＤＡを用いて、１サンプルあたり１５秒間５回計測した。
【００８５】
図５（Ａ）は、各試料から、ＦＣＳ解析により得られた並進拡散時間（μ秒）を示した図である。また、図５（Ｂ）は、試料１におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、図５（Ｃ）は、試料２におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、図５（Ｄ）は、試料３及び４におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、模式的に示した図である。
【００８６】
試料１が、ＲＮＡヘリカーゼの影響を受ける前の二本鎖ＲＮＡであるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの並進拡散時間である。ＡＴＰ濃度が０ｎＭである試料２では、試料１よりも並進拡散時間が長くなった。これは、試料２中のＲＮＡヘリカーゼがＦＡＭ−ｓｉＲＮＡに結合したため、一分子当たりの大きさが大きくなったためと推察される。一方、ＡＴＰを添加した試料３及び４では、試料２よりも並進拡散時間が減少していた。これは、ＡＴＰによってＲＮＡヘリカーゼが活性化され、二本鎖のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡが巻き戻されており、より分子量の小さい一本鎖ＲＮＡとして存在しているためと推察される。なお、ＡＴＰを１６ｍＭ添加した試料４においても、試料１よりも並進拡散時間が長かったが、これは、試料中にＲＩＳＣが存在していないため、ＲＮＡヘリカーゼがＦＡＭ標識されたセンス鎖と、標識されていないアンチセンス鎖のどちらかに結合している状態のものが混在しており、そのため、並進拡散時間は平均的に、ＦＡＭ標識されたセンス鎖のみで存在している場合よりも、長くなっていると考えられる。
【００８７】
図６（Ａ）は、各試料から、ＦＩＤＡ解析により得られた蛍光強度Ｑ（ｋＨｚ）を示した図である。また、図６（Ｂ）は、試料１におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、図６（Ｃ）は、試料２におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、図６（Ｄ）は、試料３及び４におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、模式的に示した図である。
【００８８】
ＦＣＳと同様に、試料１が、ＲＮＡヘリカーゼの影響を受ける前の二本鎖ＲＮＡであるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの蛍光強度である。ＡＴＰ濃度が０ｎＭである試料２では、試料１よりも蛍光強度が増加なった。これは、試料２中のＲＮＡヘリカーゼがＦＡＭ−ｓｉＲＮＡに結合したため、ＦＡＭの周囲の環境が疎水的になり、蛍光強度が増加したと推察される。一方、ＡＴＰを添加した試料３及び４では、試料２よりも蛍光強度が減少していた。これは、ＡＴＰによってＲＮＡヘリカーゼが活性化され、二本鎖のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡが巻き戻されており、かつ、ＲＮＡヘリカーゼが、ＦＡＭ標識されたセンス鎖よりも標識されていないアンチセンス鎖に結合しているものが多いため、ＦＡＭの周囲の環境が親水的になり、蛍光強度が減少したと推察される。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法を用いることにより、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を、迅速かつ簡便に評価することができるため、多数の候補分子の中から、ＲＮＡ干渉効果の高いｓｉＲＮＡを簡便にスクリーニングすることも可能であり、学術研究分野のみならず、ｓｉＲＮＡを応用した核酸医薬の開発の分野においても利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】センス鎖の５’末端に蛍光物質を結合させたｓｉＲＮＡの、ＲＩＳＣへの取り込み示した概念図である。
【図２】細胞外溶液を反応溶液とした場合の、本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図である
【図３】細胞内溶液を反応溶液とした場合の、本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図である。
【図４】センス鎖の５’末端に蛍光物質ＴＡＭＲＡを結合させた蛍光標識ｓｉＲＮＡと、同じくＴＡＭＲＡを結合させたネガティブコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合の、工程（ａ’）〜（ｄ’）を有する本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図である。
【図５】図５（Ａ）は、実施例１において、各試料から、ＦＣＳ解析により得られた並進拡散時間（μ秒）を示した図である。また、図５（Ｂ）は、試料１におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、図５（Ｃ）は、試料２におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、図５（Ｄ）は、試料３及び４におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、模式的に示した図である。
【図６】図６（Ａ）は、実施例１において、各試料から、ＦＩＤＡ解析により得られた蛍光強度Ｑ（ｋＨｚ）を示した図である。また、図６（Ｂ）は、試料１におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、図６（Ｃ）は、試料２におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、図６（Ｄ）は、試料３及び４におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの状態を、模式的に示した図である。
【符号の説明】
【００９１】
Ｆ…蛍光物質、１…ｓｉＲＮＡ、１ｓ…センス鎖、１ａ…アンチセンス鎖、２…ＲＮＡヘリカーゼ、３…ＲＩＳＣ、４…標的遺伝子のｍＲＮＡ、５…標的遺伝子以外の遺伝子のｍＲＮＡ、６…エキソヌクレアーゼ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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