(57)【要約】【課題】本発明は、動物における炎症および／または虚血を診断およびモニタする方法およびキットを提供する。本発明はまた、動物における虫垂炎を診断する改良法およびキットを提供する。【解決手段】動物における炎症および／または虚血を診断およびモニタする方法は、動物の体液中に存在し、かつリン酸化タウ以外の翻訳後修飾タンパク質の量を測定する工程を含む。動物における虫垂炎を診断する改良法は、ｏ−ヒドロキシ馬尿酸と、動物の１つまたは複数の体液に存在する翻訳後修飾タンパク質などの一般的炎症のマーカとの量を測定する工程を含む。【選択図】図１
2010071997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）動物から第１の体液を取得し、さらに該動物から第２の体液を取得する工程であって、該第１の体液および該第２の体液が同じでもよいし、異なっていてもよい工程、
（ｂ）該動物の該第１の体液中に存在するｏ−ヒドロキシ馬尿酸（ＯＨＨＡ）の量が正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に上昇しているかどうかを判定する工程、
（ｃ）該動物の該第２の体液中に存在する一般的炎症のマーカの量が正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に変化しているかどうかを判定する工程、および
（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）で得られた結果を虫垂炎の存在または不在と相関させる工程を含む動物における虫垂炎を診断する方法。
【請求項２】
前記第１の体液が尿である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）が、
診断中の動物から得た尿の一部を、ＯＨＨＡと接触した際に発色する発色試薬と混合する工程、
該尿および該発色試薬を、発色させるのに十分な時間インキュベートする工程、および
生じた色を、比色チャート、または既知量のＯＨＨＡを含むスタンダードによって生じた色と比較して、尿中に存在するＯＨＨＡの量が有意に上昇しているかどうかを判定する工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発色試薬がシリカに結合した第二鉄イオンである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が結合パートナー分析を用いて実施される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）が結合パートナー分析を用いて実施される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の体液が尿である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記一般的炎症のマーカがインターロイキン８である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の体液が血清または血漿である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一般的炎症のマーカが白血球数である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記一般的炎症のマーカが好中球バンド数である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記一般的炎症のマーカが翻訳後修飾タンパク質である請求項１または９に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が翻訳後修飾アルブミンである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記翻訳後修飾タンパク質がシステイン化タンパク質である請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
動物の体液中に存在するｏ−ヒドロキシ馬尿酸（ＯＨＨＡ）の量が正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に上昇しているかどうかを判定するのに有用な試薬を保持する少なくとも１個の容器を含むパーツ（Ａ）、および
該動物の体液中に存在する一般的炎症のマーカの量が正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に変化しているかどうかを判定するのに有用な試薬を保持する少なくとも１個の容器を含むパーツ（Ｂ）を含む虫垂炎を診断するためのキット。
【請求項１６】
パーツ（Ａ）が、ＯＨＨＡと接触した際に発色する発色試薬を保持する容器を含む請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記発色試薬がシリカに結合した第二鉄イオンである請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
比色チャートをさらに含む請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
既知量のＯＨＨＡを含むスタンダードを保持する１個または複数個の容器をさらに含む請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項２０】
パーツ（Ａ）が、ＯＨＨＡに特異的な結合パートナーを保持する容器を含む請求項１５に記載のキット。
【請求項２１】
パーツ（Ｂ）が、翻訳後修飾タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器を含む請求項１５に記載のキット。
【請求項２２】
前記結合パートナーが翻訳後修飾アルブミンに特異的である請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記結合パートナーがシステイン化タンパク質に特異的である請求項２１または２２に記載のキット。
【請求項２４】
パーツ（Ｂ）がサイトカインに特異的な結合パートナーを保持する容器を含む請求項１５に記載のキット。
【請求項２５】
前記サイトカインがインターロイキン８である請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
動物の体液中に存在する一般的炎症のマーカの量が正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に変化しているかどうかを判定するのに有用な試薬を保持する少なくとも１個の容器、および
虫垂炎を診断するために該試薬がどのように使用されるかを指示する取扱説明書を含む虫垂炎を診断するためのキット。
【請求項２７】
前記試薬が一般的炎症のマーカに特異的な結合パートナーである請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
翻訳後修飾タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器を含む請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記結合パートナーが翻訳後修飾アルブミンに特異的である請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記結合パートナーがシステイン化タンパク質に特異的である請求項２８または２９に記載のキット。
【請求項３１】
サイトカインに特異的な結合パートナーを保持する容器を含む請求項２７に記載のキット。
【請求項３２】
前記サイトカインがインターロイキン８である請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
リン酸化アルブミンに特異的な結合パートナー。
【請求項３４】
システイン化血液タンパク質に特異的な結合パートナー。
【請求項３５】
システイン化アルブミンに特異的な請求項３４に記載の結合パートナー。
【請求項３６】
システイン化された器官特異的または組織特異的タンパク質に特異的な結合パートナー。
【請求項３７】
システイン化された心臓特異的タンパク質に特異的な請求項３６に記載の結合パートナー。
【請求項３８】
システイン化トロポニンＩに特異的な請求項３７に記載の結合パートナー。
【請求項３９】
システイン化トロポニンＴに特異的な請求項３７に記載の結合パートナー。
【請求項４０】
翻訳後修飾された妊娠関連タンパク質に特異的な結合パートナー。
【請求項４１】
システイン化された妊娠関連タンパク質に特異的な請求項４０に記載の結合パートナー。
【請求項４２】
システイン化β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、システイン化α−フェトプロテイン、システイン化された妊娠関連タンパク質１Ａ、システイン化エリスロポイエチン、またはシステイン化アンギオテンシンに特異的な請求項４１に記載の結合パートナー。
【請求項４３】
リン酸化された妊娠関連タンパク質に特異的な請求項４２に記載の結合パートナー。
【請求項４４】
リン酸化β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、リン酸化α−フェトプロテイン、リン酸化された妊娠関連タンパク質１Ａ、リン酸化エリスロポイエチン、またはリン酸化アンギオテンシンに特異的な請求項４３に記載の結合パートナー。
【請求項４５】
抗体である請求項３３から４４に記載の結合パートナー。
【請求項４６】
アプタマーである請求項３３から４４に記載の結合パートナー。
【請求項４７】
リン酸化タウ以外の翻訳後修飾タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器、および
炎症を診断またはモニタするために、動物の体液中に存在する該翻訳後修飾タンパク質の量を測定するべく該結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書を含むキット。
【請求項４８】
前記結合パートナーが、一般的炎症を診断またはモニタするために使用され得る翻訳後修飾タンパク質に特異的である請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記結合パートナーが、翻訳後修飾された指標タンパク質に特異的である請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
前記結合パートナーが、翻訳後修飾された器官特異的または組織特異的タンパク質に特異的である請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記結合パートナーが、翻訳後修飾された疾患特異的タンパク質に特異的である請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】
前記結合パートナーがリン酸化タンパク質に特異的である請求項４７から５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
前記結合パートナーがシステイン化タンパク質に特異的である請求項４７から５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
リン酸化タウ以外の翻訳後修飾された１つまたは複数の追加タンパク質に特異的な１つまたは複数の追加結合パートナーを保持する１個または複数個の追加容器、および
炎症を診断またはモニタするために、動物の１つまたは複数の体液中に存在する翻訳後修飾された１つまたは複数の該追加タンパク質の量を測定するべく該追加結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書をさらに含む請求項４７から５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
前記複数の結合パートナーの少なくとも１つが抗体である請求項４７から５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
リン酸化タウ以外の翻訳後修飾された器官特異的または組織特異的タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器、および
器官または組織の虚血を診断またはモニタするために、測定前に該タンパク質を変性させない方法で、動物の体液中に存在する該翻訳後修飾タンパク質の量を測定するべく該結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書を含むキット。
【請求項５７】
前記結合パートナーが翻訳後修飾された心臓特異的タンパク質に特異的である請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記結合パートナーが翻訳後修飾されたトロポニンＩに特異的である請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記結合パートナーが翻訳後修飾されたトロポニンＴに特異的である請求項５７に記載のキット。
【請求項６０】
前記結合パートナーがリン酸化タンパク質に特異的である請求項５６から５９のいずれか一項に記載のキット、
【請求項６１】
前記結合パートナーがシステイン化タンパク質に特異的である請求項５６から５９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６２】
翻訳後修飾された１つまたは複数の追加タンパク質に特異的な１つまたは複数の追加結合パートナーを保持する１個または複数個の追加容器、および
器官または組織の虚血を診断またはモニタするために、測定前に該タンパク質が変性されない方法で、動物の体液中に存在する翻訳後修飾された１つまたは複数の該追加タンパク質の量を測定するべく該追加結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書をさらに含む請求項５６から６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６３】
前記複数の結合パートナーの少なくとも１つが抗体である請求項５６から６２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６４】
翻訳後修飾された妊娠関連タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器、および
胎盤虚血を診断またはモニタするために、妊娠中の動物の体液中に存在する該翻訳後修飾タンパク質の量を測定するべく該結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書を含むキット。
【請求項６５】
前記結合パートナーは、翻訳後修飾されたβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α−フェトプロテイン、妊娠関連タンパク質１Ａ、エリスロポイエチン、アンギオテンシン、またはこれらの組合せに特異的である請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
前記結合パートナーがシステイン化タンパク質に特異的である請求項６４または６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記結合パートナーがリン酸化タンパク質に特異的である請求項６４または６５に記載のキット。
【請求項６８】
翻訳後修飾された１つまたは複数の追加タンパク質に特異的な１つまたは複数の追加結合パートナーを保持する１個または複数個の追加容器、および
胎盤虚血を診断またはモニタするために、妊娠中の動物の体液中に存在する翻訳後修飾された１つまたは複数の該追加タンパク質の量を測定するべく該追加結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書をさらに含む請求項６４から６７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６９】
前記複数の結合パートナーの少なくとも１つが抗体である請求項６４から６８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７０】
体液のリン酸化タンパク質成分に特異的な結合パートナーを保持する容器、および
虚血を診断またはモニタするために、動物の体液中に存在するリン酸化タンパク質の量を測定するべく該結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書を含むキット。
【請求項７１】
システイン化タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器、および
虚血を診断またはモニタするために、動物の体液中に存在する該システイン化タンパク質の量を測定するべく該結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書を含むキット。
【請求項７２】
前記結合パートナーがシステイン化アルブミンに特異的である請求項７１に記載のキット。
【請求項７３】
翻訳後修飾された１つまたは複数の追加タンパク質に特異的な１つまたは複数の追加結合パートナーを保持する１個または複数個の追加容器、および
虚血を診断またはモニタするために、動物の体液中に存在する翻訳後修飾された１つまたは複数の該追加タンパク質の量を測定するべく該追加結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書をさらに含む請求項７０から７２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７４】
前記複数の結合パートナーの少なくとも１つが抗体である請求項７０から７３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７５】
システイン化タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器、および
胎盤虚血を診断またはモニタするために、妊娠中の動物の体液中に存在する該システイン化タンパク質の量を測定するべく該結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書を含むキット。
【請求項７６】
前記結合パートナーはシステイン化アルブミンに特異的である請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
翻訳後修飾された１つまたは複数の追加タンパク質に特異的な１つまたは複数の追加結合パートナーを保持する１個または複数個の追加容器、および
胎盤虚血を診断またはモニタするために、妊娠中の動物の体液中に存在する翻訳後修飾された１つまたは複数の該追加タンパク質の量を測定するべく該追加結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書をさらに含む請求項７５または７６に記載のキット。
【請求項７８】
前記複数の結合パートナーの少なくとも１つが抗体である請求項７５から７７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７９】
翻訳後修飾タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器、および
多臓器不全を診断、モニタ、または予測するために、動物の体液中に存在する該翻訳後修飾タンパク質の量を測定するべく該結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書を含むキット。
【請求項８０】
前記結合パートナーがシステイン化タンパク質に特異的である請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
前記結合パートナーがシステイン化アルブミンに特異的である請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
翻訳後修飾された１つまたは複数の追加タンパク質に特異的な１つまたは複数の追加結合パートナーを保持する１個または複数個の追加容器、および
多臓器不全を診断、モニタ、または予測するために、動物の体液中に存在する翻訳後修飾された１つまたは複数の該追加タンパク質の量を測定するべく該追加結合パートナーが使用されることを指示する取扱説明書をさらに含む請求項７９から８１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８３】
前記複数の結合パートナーの少なくとも１つが抗体である請求項７９から８２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８４】
リン酸化タウ以外のリン酸化タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器、および
ホスファターゼ阻害剤、またはホスファターゼ阻害剤の混合物を保持する容器を含むキット。
【請求項８５】
翻訳後修飾された１つまたは複数の追加タンパク質に特異的な１つまたは複数の追加結合パートナーを保持する１個または複数個の追加容器をさらに含む請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
前記結合パートナーの少なくとも１つが抗体である請求項８４または８５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つまたは複数の翻訳後修飾タンパク質を測定することによって、炎症を診断および／またはモニタすること、ならびに虚血を診断および／またはモニタすることに関する。本発明は、ｏ−ヒドロキシ馬尿酸（ＯＨＨＡ）と、ある種の翻訳後修飾タンパク質を含む一般的な炎症のマーカとを測定することによる虫垂炎の診断方法の改良にも関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、それを通して身体が様々な傷害、感染、およびストレスに応答するカスケード反応である。炎症反応は、ストレス応答、感染の回避、および傷の治癒に極めて重要である一方、身体にダメージを与える場合もある。実際に、炎症は多くの疾患および障害の発病過程における重要な要素である。さらに、癌などの多くの疾患において、炎症があることは予後がよくないことを示すものである。最後に、極端な場合には、適切に処置しなければ、生命に危険を及ぼす全身性反応が炎症によって引き起こされることがある。
【０００３】
炎症を診断およびモニタする現行の方法は不十分なものであり、多くの場合、炎症は未治療のままか、または有効に治療されていない。この結果、患者に大きなダメージが与えられたり、または患者の生命が危険にさらされたりすることが起こり得る。炎症を診断およびモニタするための改良された方法が必要なことは明らかである。
【０００４】
早期の心虚血の診断は困難である。クレアチン・キナーゼ・イソ酵素（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、またはトロポニンなどの心臓における細胞壊死マーカは、一過性心筋虚血のマーカとして信用し得るものではなく、虚血発症後の最初の２から６時間以内に測定された場合には特に信用し得ない。カントス、エム  シー（Ｋｏｎｔｏｓ，Ｍ．Ｃ．）およびアール  エル  ジェシー（Ｒ．Ｌ．Ｊｅｓｓｅ）、Ａｍ、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２０００年、第８５（５Ａ）巻、３２Ｂ〜３９Ｂ頁；イシカワ、ワイ（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、１９９７年、第４３（３）巻、４６７〜７５頁；ブローガン、ジー  エックス  ジュニア（Ｂｒｏｇａｎ，Ｇ．Ｘ．，Ｊｒ．）ら、Ａｃａｄ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、１９９７年、第４（１）巻、６〜１２頁；ヘッジス、ジェー  アール（Ｈｅｄｇｅｓ，Ｊ．Ｒ．）ら、Ａｃａｄ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、１９９６年、第３（１）巻、２７〜３３頁。虚血症状の開始直後に患者を検査する場合には通常、心筋梗塞または心筋虚血の可能性を除外するために、より長時間の観測を必要とする。ゴメス、エム  エー（Ｇｏｍｅｚ，Ｍ．Ａ．）ら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９６年、第２８（１）巻、２５〜３３頁；ザレンスキ、アール  ジェー（Ｚａｌｅｎｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．）ら、Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ、１９９７年、第１５７（１０）巻、１０８５〜９１頁；ド  ウインター、アール  ジェー（ｄｅ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．）ら、Ａｎｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、２０００年、第３５（２）巻、１１３〜２０頁；ピーコック、ダブリュー  アイ（Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｗ．Ｉ．）ら、Ａｎｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、２０００年、第３５（３）巻、２１３〜２０頁。
【０００５】
心筋虚血を患う患者で、ヒト・アルブミンに対する外因性コバルト結合が低下していることを測定する新規の血液分析法が記載されている。バール−オール、ディー（Ｂａｒ−Ｏｒ，Ｄ．）、イー  ラウ（Ｅ．Ｌａｕ）、およびジェー  ブイ  ウィンクラー（Ｊ．Ｖ．Ｗｉｎｋｌｅｒ）、Ｊ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、２０００年、第１９（４）巻、３１１〜５頁。アルブミン−コバルト結合（ＡＣＢ）分析は、ヒト・アルブミンのアミノ末端（Ｎ末端）に対する外因性コバルトの結合能を測定する。正常状態では、コバルトを含む遷移金属は、曝露されたアルブミンのＮ末端に強固に結合する。クバール、ジー（Ｋｕｂａｌ、Ｇ．）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９４年、第２２０（３）巻、７８１〜７頁。ＡＣＢ分析は、虚血状態によってアルブミンのＮ末端が変化して、遷移金属に対するその結合能が迅速に低下することがあるという観測に基づいている。ベレンシュタイン、イー（Ｂｅｒｅｎｓｈｔｅｉｎ、Ｅ．）ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９７年、第２９（１１）巻、３０２５〜３４頁；バール−オール、ディー（Ｂａｒ−Ｏｒ，Ｄ．）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００１年、第２６８（１）巻、４２〜７頁。虚血によって引き起こされるアルブミンの変化は、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、またはトロポニンのレベルに異常が検出され得る時間の何分間、または何時間か前に起こるであろうことが予測される。このような利点にもかかわらず、ＡＣＢ分析は心虚血の可能性を除外するためのテストとしてのみに承認されており、心虚血の可能性を除外するだけではなく、これを診断することが可能な分析が強く望まれるものであろう。
【０００６】
現在、脳虚血は臨床診断による。エノラーゼ、Ｓ−１００ファミリーのタンパク質（例えば、Ｓ−１００Ｂ）など、ある種の生化学マーカも記載されているが、臨床医によって利用可能な画像技術の方が信頼性が高く、かつ特異的である。信頼性があり、かつ特異的な脳虚血の生化学マーカは、この疾患の診断およびモニタリングに有用であろう。
【０００７】
出生時低体重（ＬＢＷ）は、世界中で胎児および新生児における罹患および死亡の主要原因となっている。ＬＢＷは、分娩時における体重が２５００グラム未満であることを示すものとして一般に理解されており、新生児が、正期に出産したがその在胎齢にしては小さい（ＳＧＡ）ことによって、在胎齢にふさわしい大きさ（ＡＧＡ）だが早産したことによって、または早産であるとともにＳＧＡであることによって起こり得る。したがって、ＬＢＷは疫学的に複雑かつ多因子性のものである。
【０００８】
ＳＧＡは統計的に定義されるものであり、出生時体重が在胎齢の１０パーセンタイルより少ないことを示す。したがって、定義により１０％の新生児がＳＧＡである。実際には、これらの新生児の中には、小さくても健康で、遺伝上の成長可能性を実現し、差し迫った危険にない新生児もいる。その一方で、他のＳＧＡ新生児には真性の成長障害があり、以下に論じるような様々な要因によって遺伝上の成長可能性を実現し得ないでいる。これらの新生児は、胎児発育不全（ＦＧＲ）を患っているとされる。実際には、ＡＧＡであって、かつＦＧＲを患っている幼児もいると推定される。すなわち、そのような幼児の体重は、遺伝的には８０パーセンタイルとなるようにプログラムされているのに、実際には在胎齢の２０パーセンタイルであるかもしれない。個体の「本来」の体重を先験的に知る方法がないことから、そのような幼児を同定することは、現実的には困難である。
【０００９】
ＦＧＲは、胎児成長を直接的に減失させること、さらにこれに加えて、しばしば、胎児状態の悪化または関連の母性疾患（例えば、子癇前症）による意図的な早産を必要とすることの両方で、ＬＢＷを導く。ＬＢＷおよび／または早産による罹患は多様かつ重大であり、他に詳細に記述されている。さらに、最近のデータは、いわゆる「疾患の胎児起源」またはバーカー仮説、すなわち子宮内の環境が損なわれると成体時の健康に大きな影響があることを示唆している。ＦＧＲは、これらの様々な機構を介して、疾患による大きな苦しみの原因になっている。
【００１０】
ＦＧＲによって困難になった妊娠では、しばしば胎児／新生児が危惧の焦点となるが、このような妊娠は、母親の健康を直接危険にする状態によって困難になっていることが多いことを想起することが重要である。特に、子癇前症は、その正確な病態生理学がいまだに明らかでないが、長い間にわたって、胎盤虚血によって引き起こされるものと思われている。子癇前症およびその合併症は、世界中で妊婦死亡率の主要原因となっている。
【００１１】
ＦＧＲの鑑別診断は様々であり、染色体性、毒性、ウイルス性、および他の病因を含むが、大部分のケースにおいて胎盤機能不全（ＵＰＩ）が病因となっている。ＵＰＩは、様々な母性疾患（高血圧、腎臓疾患、全身性紅斑性狼瘡、抗リン脂質症候群、血栓性因子など）、または妊娠合併症（胎盤早期剥離、子癇前症）に関連していることもあり、または特発性であることもある。何が病因であれ、根底にある共通した病態生理は、母親の循環系、胎児の循環系、またはその両方における胎盤血流量の減少（虚血）によるものと推定されている。
【００１２】
おおまかな目安として、胎盤の重さと胎児の体重との間に直接的関係があることは公知であり、胎児の成長が胎盤からの資源によってある程度制御されているかもしれないことを示唆する。胎盤にはＦＧＲに関連した病変が多数ある。これらは概して、母親および／または胎児の血流を損なうことが予想される病変である。母親および／または胎児における血流の減少（虚血）とＦＧＲとの間の関連は、疾患中の妊娠における多量のドップラー・フロー・データによっても確証されている。多くの場合、このようなドップラー・フロー波形の異常は、胎盤病変の異常と高い相関性を示す。
【００１３】
ＦＧＲの病態生理について多くのことが公知である一方、多くのことが理解されずに残っている。臨床の現場では、ＦＧＲを引き起こす様々な危険因子が認識されているが、それらの因子が有する積極的な予測価値および感度は限定されている。ＦＧＲ胎児を、「ＳＧＡではあるが健康」な胎児から識別するのには、困難が伴いうる。この相違を認識することは、健全な妊娠に不要に介入するのを避けるために重要である。ＦＧＲによる影響を受けることが決定的な妊娠を早期に発見すれば、適切なフォローアップを行う助けになるかもしれない。分娩の時期決定も重要な問題であり、妊娠を進行させることの利益と、虚血環境で継続させることの不利益とのバランスをとらなければならない。最後に、さらに根本的なレベルでは、胎盤虚血を同定し、その重症度を定量化する臨床試験を可能にすることで、最終的には適切な治療または予防を行う助けになるかもしれない。
【００１４】
虫垂炎の診断は医師にとって難題であることが多い。具体的には、虫垂炎は、他の多くの腹部障害および骨盤障害から識別することが極めて困難であり、さらには、完全に発達した様子を医師が見る機会はめったにない。徴候および症候が微妙であったり、非定型的であったりすれば誤診となることが多く、そして、診断が遅くなれば有害な結果を引き起こし得る。ジャーン（Ｊａｈｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６３巻、４３３〜４４３頁（１９９７年）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、７９６〜８０２頁（２０００年）。最近の多施設調査は、腹痛で救急病棟を訪れた患者を、延長した観察を行わずに虫垂炎と診察した場合、その初期診察が誤診である比率が約２０％に達すると報告した。グラフ（Ｇｒａｆｆ）ら、Ａｃａｄ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第７巻、１２４４〜１２５５頁（２０００年）。
【００１５】
白血球数が高いことは非特異的な炎症のマーカとされるが、白血球数の高い値は、虫垂炎の疑いで初期臨床評価を行った際に一貫して有用であった数少ない臨床検査の１つであったことが、以前の報告で示唆されている。ベリー（Ｂｅｒｒｙ）ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、第２００巻、５６７〜５７５頁（１９８４年）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１３３〜１４０頁（１９９９年）。臨床医は、ヘリカルまたはコントラスト・コンピュータ断層撮影（ＣＴ）などの確証的であるが高価な放射線イメージ試験を指示する前に、初期の白血球数結果および臨床評価の組合せに頼ることが多い。ストローマン（Ｓｔｒｏｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１７８巻、４８５〜４８９頁（１９９９年）；ピックース（Ｐｉｃｋｕｔｈ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、３１５〜３１９頁（２０００年）。残念ながら、初期白血球数は急性虫垂炎に対する特異性が低く（３８％から７８％）、中適度の感度（５２％から９３％）を有するのみである。グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、第６１巻、２５７〜２５９頁（１９９５年）；ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第６２巻、９０６〜９０８頁（１９７５年）；イングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｈ）ら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、第４３巻、３９９〜４０２頁（１９７７年）；フェルミューレン（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６１巻、４８３〜４８６頁（１９９５年）；コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、第６４巻、９８３−９８５頁（１９９８年）；ドイホルム（Ｄｕｅｈｏｌｍ）ら、Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ、３２巻、８５５〜８５９頁（１９８９年）；ハーラン（Ｈａｌｌａｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６３巻、５３３〜５３８頁（１９９７年）。このような限界があるにもかかわらず、白血球数は、臨床的な虫垂炎の疑いに対する評価を補助する臨床検査として最も広範に使用され続けている。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１３３〜１４０頁（１９９９年）。ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第６２巻、９０６〜９０８頁（１９７５年）；フェルミューレン（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６１巻、４８３〜４８６頁（１９９５年）；コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）ら、Ａｍ  Ｓｕｒｇ．、第６４巻、９８３〜９８５頁（１９９８年）；ハーラン（Ｈａｌｌａｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６３巻、５３３〜５３８頁（１９９７年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】カントス、エム  シー（Ｋｏｎｔｏｓ，Ｍ．Ｃ．）およびアール  エル  ジェシー（Ｒ．Ｌ．Ｊｅｓｓｅ）、Ａｍ、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２０００年、第８５（５Ａ）巻、３２Ｂ〜３９Ｂ頁
【非特許文献２】イシカワ、ワイ（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、１９９７年、第４３（３）巻、４６７〜７５頁
【非特許文献３】ブローガン、ジー  エックス  ジュニア（Ｂｒｏｇａｎ，Ｇ．Ｘ．，Ｊｒ．）ら、Ａｃａｄ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、１９９７年、第４（１）巻、６〜１２頁
【非特許文献４】ヘッジス、ジェー  アール（Ｈｅｄｇｅｓ，Ｊ．Ｒ．）ら、Ａｃａｄ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、１９９６年、第３（１）巻、２７〜３３頁
【非特許文献５】ゴメス、エム  エー（Ｇｏｍｅｚ，Ｍ．Ａ．）ら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９６年、第２８（１）巻、２５〜３３頁
【非特許文献６】ザレンスキ、アール  ジェー（Ｚａｌｅｎｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．）ら、Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ、１９９７年、第１５７（１０）巻、１０８５〜９１頁
【非特許文献７】ド  ウインター、アール  ジェー（ｄｅ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．）ら、Ａｎｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、２０００年、第３５（２）巻、１１３〜２０頁
【非特許文献８】ピーコック、ダブリュー  アイ（Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｗ．Ｉ．）ら、Ａｎｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、２０００年、第３５（３）巻、２１３〜２０頁
【非特許文献９】バール−オール、ディー（Ｂａｒ−Ｏｒ，Ｄ．）、イー  ラウ（Ｅ．Ｌａｕ）、およびジェー  ブイ  ウィンクラー（Ｊ．Ｖ．Ｗｉｎｋｌｅｒ）、Ｊ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、２０００年、第１９（４）巻、３１１〜５頁
【非特許文献１０】クバール、ジー（Ｋｕｂａｌ、Ｇ．）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９４年、第２２０（３）巻、７８１〜７頁
【非特許文献１１】ベレンシュタイン、イー（Ｂｅｒｅｎｓｈｔｅｉｎ、Ｅ．）ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９７年、第２９（１１）巻、３０２５〜３４頁
【非特許文献１２】バール−オール、ディー（Ｂａｒ−Ｏｒ，Ｄ．）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００１年、第２６８（１）巻、４２〜７頁
【非特許文献１３】ジャーン（Ｊａｈｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６３巻、４３３〜４４３頁（１９９７年）
【非特許文献１４】アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、７９６〜８０２頁（２０００年）
【非特許文献１５】グラフ（Ｇｒａｆｆ）ら、Ａｃａｄ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第７巻、１２４４〜１２５５頁（２０００年）
【非特許文献１６】ベリー（Ｂｅｒｒｙ）ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、第２００巻、５６７〜５７５頁（１９８４年）
【非特許文献１７】アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１３３〜１４０頁（１９９９年）
【非特許文献１８】ストローマン（Ｓｔｒｏｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１７８巻、４８５〜４８９頁（１９９９年）
【非特許文献１９】ピックース（Ｐｉｃｋｕｔｈ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、３１５〜３１９頁（２０００年）
【非特許文献２０】グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、第６１巻、２５７〜２５９頁（１９９５年）
【非特許文献２１】ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第６２巻、９０６〜９０８頁（１９７５年）
【非特許文献２２】イングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｈ）ら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、第４３巻、３９９〜４０２頁（１９７７年）
【非特許文献２３】フェルミューレン（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６１巻、４８３〜４８６頁（１９９５年）
【非特許文献２４】コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、第６４巻、９８３−９８５頁（１９９８年）
【非特許文献２５】ドイホルム（Ｄｕｅｈｏｌｍ）ら、Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ、３２巻、８５５〜８５９頁（１９８９年）
【非特許文献２６】ハーラン（Ｈａｌｌａｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６３巻、５３３〜５３８頁（１９９７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
米国特許第５，４７０，７５０号は、虫垂炎にかかっている疑いがあるヒト患者における尿中のσ−ヒドロキシ馬尿酸（ｏ−ヒドロキシ馬尿酸、サリチル尿酸、Ｎ−（２−ヒドロキシルベンゾイル）グリシン）のレベルを決定することによって虫垂炎を検出する方法を記載している。σ−ヒドロキシ馬尿酸のレベルが閾値より高い場合には虫垂炎のある可能性が高いことを示し、σ−ヒドロキシ馬尿酸のレベルが閾値より低い場合には虫垂炎がない可能性が高いことを示す。σ−ヒドロキシ馬尿酸分析は、白血球数の上昇に比べて虫垂炎を診断する特異性がかなり高い（８０．６％対６７．９％、ｐ＜０．０１；下記実施例９を参照）が、さらに特異性が高く、かつ診断精度がよい分析が望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、動物における炎症を診断またはモニタする方法を提供する。この方法は、動物の体液中に存在し、かつリン酸化タウ以外の翻訳後修飾タンパク質の量を測定する工程を含む。上記翻訳後修飾タンパク質の量が正常動物からの同一体液中におけるレベルと比較して有意に変化している場合には、炎症が存在する。一般的炎症および／または特定のタイプの炎症が診断またはモニタされ得る。
【００１９】
本発明は虚血を診断またはモニタする方法も提供し、この方法は、動物の体液中に存在し、かつリン酸化タウ以外の翻訳後修飾タンパク質の量を測定する工程を含む。翻訳後修飾タンパク質は、器官または組織における虚血を診断およびモニタするために、器官特異的または組織特異的タンパク質（例えば心臓特異的タンパク質）でもよく、胎盤虚血を診断またはモニタするために、システイン化タンパク質および／または妊娠関連タンパク質でもよく、虚血を診断またはモニタするために、システイン化タンパク質（例えばシステイン化アルブミン）でもよく、虚血を診断またはモニタするために、体液のリン酸化タンパク質成分（例えばリン酸化アルブミン）でもよい。翻訳後修飾タンパク質の量が正常動物からの同一体液中におけるレベルと比較して有意に変化している場合には、虚血が存在する。
【００２０】
本発明は多臓器不全を診断、モニタ、または予測する方法も提供し、この方法は、動物からの体液中に存在する翻訳後修飾タンパク質の量を測定する工程を含む。翻訳後修飾タンパク質の量が正常動物からの同一体液中におけるレベルと比較して有意に変化している場合には、多臓器不全が存在するか、または多臓器不全が発症することが予測され得る。
【００２１】
本発明はさらに、リン酸化タウ以外の翻訳後修飾タンパク質を定量するためのキットを提供する。上記キットは１個または複数個の容器を備え、各容器は、翻訳後修飾タンパク質に特異的な結合パートナーと、上記翻訳後修飾タンパク質を定量するために上記結合パートナーをどのように使用するべきかを記載した取扱説明書とを保持する。
【００２２】
本発明は、動物における虫垂炎を診断する改良法も提供する。この方法では、上記動物から、第１の体液と第２の体液とが取得される。第１の体液および上記第２の体液は、同じでもよいし異なってもよい。（ｉ）動物の第１の体液中に存在するｏ−ヒドロキシ馬尿酸（ＯＨＨＡ）の量が、正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に上昇しているかどうか、（ｉｉ）動物の第２の体液中に存在する一般的炎症のマーカの量が、正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に変化しているかどうかが判定される。最後に、工程（ｉ）および工程（ｉｉ）の結果が、虫垂炎の存在または不在と相関される。
【００２３】
本発明はさらに、虫垂炎を診断するキットを提供する。第１の実施形態では、本発明はパーツ（Ａ）および（Ｂ）を備えるキットを提供する。パーツ（Ａ）は、動物の体液中に存在するＯＨＨＡの量が、正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に上昇しているかどうかを判定するのに有用な試薬を保持する少なくとも１個の容器を備える。パーツ（Ｂ）は、動物の体液中に存在する一般的炎症のマーカの量が、正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に変化しているかどうかを判定するのに有用な試薬を保持する少なくとも１個の容器を備える。
【００２４】
本発明は、虫垂炎を診断する別のキットも提供する。上記キットは、動物の体液中に存在する一般的炎症のマーカの量が、正常動物からの同じ体液中でのレベルと比較して有意に変化しているかどうかを判定するのに有用な試薬を保持する少なくとも１個の容器を備える。上記キットはさらに、虫垂炎を診断するのに上記試薬をどのように使用するかを指示する取扱説明書を備える。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】正常なヒトのアルブミン・プロフィールを示す質量分析計のプリントアウト。
【図２Ａ】正常妊娠におけるアルブミン・プロフィールを示す質量分析計のプリントアウト。
【図２Ｂ】胎盤虚血を起こした妊娠におけるアルブミン・プロフィールを示す質量分析計のプリントアウト。
【図３Ａ】正常妊娠（１）および胎盤虚血を起こした妊娠（２）における、天然アルブミンの統計的分析比較を示すボックス・プロット。
【図３Ｂ】正常妊娠（１）および胎盤虚血を起こした妊娠（２）における、システイン化アルブミンの統計的分析比較を示すボックス・プロット。
【図３Ｃ】正常妊娠（１）および胎盤虚血を起こした妊娠（２）における、糖化アルブミンの統計的分析比較を示すボックス・プロット。
【図３Ｄ】正常妊娠（１）および胎盤虚血を起こした妊娠（２）における、システイン化され、かつ糖化されたアルブミンの統計的分析比較を示すボックス・プロット。
【図４Ａ】正常妊娠（１）および胎盤虚血を起こした妊娠（２）におけるＣ末端ロイシンを欠失したアルブミンに関して、天然アルブミン、糖化アルブミン、システイン化アルブミン、およびシステイン化され、かつ糖化されたアルブミンを排除した後で、最正規化されたデータの統計的分析を示すボックス・プロット。
【図４Ｂ】正常妊娠（１）および胎盤虚血を起こした妊娠（２）におけるＮ末端２アミノ酸（アスパラギン酸およびアラニン）を欠失したアルブミンに関して、天然アルブミン、糖化アルブミン、システイン化アルブミン、およびシステイン化され、かつ糖化されたアルブミンを排除した後で、最正規化されたデータの統計的分析を示すボックス・プロット。
【図４Ｃ】正常妊娠（１）および胎盤虚血を起こした妊娠（２）におけるＣ末端ロイシンを欠失しているがホモシステインが付加されたアルブミンに関して、天然アルブミン、糖化アルブミン、システイン化アルブミン、およびシステイン化され、かつ糖化されたアルブミンを排除した後で、最正規化されたデータの統計的分析を示すボックス・プロット。
【図５】硫黄転移経路を示す図。
【図６】リン酸化された心臓トロポニンＩの免疫学的検定を示す図。
【図７Ａ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｂ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｃ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｄ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｅ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｆ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｇ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｈ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｉ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｊ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｋ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｌ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｍ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｎ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｏ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｐ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｑ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｒ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図７Ｓ】急性冠状動脈症候群を診断および／または除外するための、トロポニンＩの分析、リン酸化されたトロポニンＩの分析、心電図（ＥＣＧ）、およびこれらの様々な組合せにおける感度および特異性を比較した棒グラフ。
【図８】虚血を診断および／または除外するＡＣＢ（商標）テストによるリン酸化されたトロポニンＩの分析における感度および特異性を比較する棒グラフ。
【図９Ａ】腸虚血後のラットにおけるアルブミン・プロフィールを示す質量分析計のプリントアウト。
【図９Ｂ】対照ラットにおけるアルブミン・プロフィールを示す質量分析計のプリントアウト。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書において、「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、および／または、これらのうちいずれかのフラグメントを意味する。また、本明細書において、特定のタンパク質の名称は、そのタンパク質、および／または、そのタンパク質のフラグメントを意味する。例えば、「アルブミン」とは、本明細書において、アルブミンの完全長タンパク質、および／またはアルブミンのフラグメントを意味し、「トロポニンＩ」は、トロポニンＩの完全長タンパク質、および／またはトロポニンＩのフラグメントを意味する。
【００２７】
本明細書において、「翻訳後修飾」とは、ペプチド結合形成後に起こるタンパク質の任意の修飾を意味する。翻訳後修飾は、限定された数のアミノ酸のシステイン化、リン酸化、ニトロシル化、グリコシル化、アシル化、イソプレニル化、および除去を含む。好ましくは、システイン化およびリン酸化である。
【００２８】
動物の任意の体液が、本発明の方法で使用され得る。適当な体液は、血液試料（例えば、全血、血清、または血漿）、尿、唾液、脳脊髄液、涙、精液、膣分泌液、羊水、および臍帯血を含む。また、洗浄液、組織ホモジネート、および細胞溶解液が使用され得るとともに、本明細書においては、「体液」はそのような試料も含む。体液は、任意の動物から取得されてもよい。好ましくは、動物は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、およびヒトを含む哺乳動物である。最も好ましくは、動物はヒトである。
【００２９】
Ａ．炎症および虚血の診断およびモニタリング
本発明は、炎症および虚血を診断および／またはモニタするのに有用な方法を提供する。これらの方法は、動物の体液中に存在し、かつリン酸化タウ以外の１つまたは複数の翻訳後修飾タンパク質の量を測定する工程を含む。
【００３０】
リン酸化タウを除外する理由は以下の通りである。タウは通常、ニューロンの軸索コンパートメントでの微小管の集合および安定性を促進するタンパク質である。異常にリン酸化されたタウがアルツハイマー病ならびに他の痴呆および脳障害で発見されており、異常にリン酸化されたタウはこれらの疾患の診断において有用なマーカであることが判明している。タウの異常なリン酸化には、リン酸化の増加（過リン酸化）と、正常なリン酸化部位以外の部位におけるリン酸化との両方がある。タウの異常なリン酸化の理由は特定されていない。ヘッセ（Ｈｅｓｓｅ）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、第２９７（３）巻、１８７〜１９０頁（２００１年）を参照のこと。様々なリン酸化形のすべてを含むタウは、例えば虚血によって引き起こされた中枢神経系損傷を診断するのに有用なマーカとしても提案されている。国際公開第００／１４５４６号パンフレットを参照のこと。しかし、リン酸化タウのレベルが虚血性脳卒中を起こした患者で変化しなかったことが判明した。ヘッセ（Ｈｅｓｓｅ）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、第２９７（３）巻、１８７〜１９０頁（２００１年）を参照のこと。以上の理由で、リン酸化タウは炎症または虚血のマーカであるとは考えられず、炎症または虚血を診断またはモニタするためにリン酸化タウを本発明で使用すべきではない。
【００３１】
Ｂ．翻訳後修飾されたタンパク質の測定
体液中に存在する翻訳後修飾タンパク質の量を測定するために、様々な方法のいずれも使用され得る。適当な技法は、質量分析、特定の翻訳後修飾を定量するための特異的分析、結合パートナー分析（例えば免疫学的検定）などを含む。好ましくは結合パートナー分析である。
【００３２】
翻訳後修飾タンパク質の定量に質量分析（ＭＳ）が使用され得る。タンパク質の質量は、翻訳後修飾の数とタイプとに応じて異なるであろうし、異なった質量の異なったタンパク質の量がＭＳによって測定され得る。単一タンパク質における１個の翻訳後修飾、単一タンパク質の２個以上の翻訳後修飾、または２個以上のタンパク質の翻訳後修飾が定量され得る。事実、ＭＳは、体液中に存在する翻訳後修飾タンパク質の多数もしくは全て、または体液中の単一タンパク質における翻訳後修飾の多数もしくは全てを同定または定量する方法を提供し、そのようなＭＳプロフィールは、炎症または虚血を診断およびモニタするのに有用であろう。
【００３３】
当該技術分野で公知であるように、本発明の実施には様々なＭＳ分析法が使用されてもよい。例えば、重要なタンパク質が、液体クロマトグラフィ、２次元ゲル電気泳動、またはアフィニティ・クロマトグラフィなどの適当な技法で体液から単離され得る。その後、タンパク質の翻訳後修飾されたものが、エレクトロスプレイ・イオン化ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィ・タンデムＭＳ法（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ飛行時間ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）などの任意のＭＳ検出法で定量される。例えば、リム（Ｌｉｍ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２９５巻、４５〜５６頁（２００１年）を参照のこと。翻訳後修飾タンパク質は、純粋な組換えタンパク質の基準を用いて、同一体液中における対応する無修飾タンパク質との比率を用いて、または正常な対照からの同一タイプの体液中における同一タンパク質と比較されることによって、定量され得る。
【００３４】
加えて、特定のタイプの翻訳後修飾を十分に引き出す分析が使用され得る。例えば、リン酸化タンパク質のために、その全開示が本願明細書で援用される米国特許出願公開第２００２／００４９３０７号に記載されている全てと同様にして、タンパク質上のリン酸基が標識（例えば放射性標識、同位体標識、蛍光標識、比色分析標識、またはアフィニティ標識）で選択的に（リン酸基がブロックされないまま残される方法で、保護基を用いて選択的にカルボキシル基をブロックすることによって）標識され、次いで測定され得る。タンパク質上のリン酸基は、その全開示が本願明細書に援用される国際公開第９９／３８０１２号パンフレットに記載されている全てと同様にして、求核試薬（例えばチオール、アミン、アミド、またはアルカノール、好ましくはｐ−メルカプトメチル安息香酸またはその誘導体）と反応されて付加物を形成し、これが（例えば免疫化学法、比色法、蛍光、または化学発光によって）測定され得る。最後に、その全開示が本願明細書に援用される国際公開第０２／０６６９８８号パンフレットに記載されている全てと同様にして、（例えば水酸化物によるβ脱離によって）タンパク質からリン酸基が除去され、このタンパク質は、以前にリン酸化されたアミノ酸残基と選択的に反応する標識リン酸反応性基（例えばチオール基、アミン基、アミド基、イミド基、ヒドロキシルアミン基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、亜硫酸基、スルフィン酸基、スルホンアミド基）を含む分子と反応され、この標識が測定され得る。
【００３５】
結合パートナー分析は、結合パートナーを利用する分析である。「結合パートナー」は、翻訳後修飾タンパク質に特異的に結合することが可能な任意の物質である。「特異的に」とは、結合パートナーが、ある翻訳後修飾タンパク質に、他の翻訳後修飾タンパク質を含む他のタンパク質の存在下で選択的に結合することを意味する。例えば、結合パートナーは、翻訳後修飾タンパク質の翻訳後修飾を含む一部分に特異性を有してもよいし、翻訳後修飾タンパク質の翻訳後修飾を含まない一部分に特異性を有してもよいし、翻訳後修飾タンパク質の翻訳後修飾されたアミノ酸残基（例えばリン酸化セリン）に対する特異性を有してもよい。結合パートナーは、翻訳後修飾タンパク質に特異的に結合可能な抗体、アプタマー、レクチン、受容体、ならびに他のタンパク質および分子を含む。好ましくは、抗体およびアプタマー、ならびにこれらを利用する分析である。
【００３６】
本発明における使用に適した抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体、オムニクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、これらのうちいずれかのエピトープ結合フラグメント、および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗体を作製する方法は周知である。様々な免疫学的検定フォーマットのいずれでも抗体が利用され得る。適切な免疫学的検定フォーマットは、ホモジニアス分析、ヘテロジーニアス分析、酵素免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）、競合分析、免疫定量（サンドイッチ）分析、濁度分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙｓ）、ネフェロ分析などを含む。様々な標識および検出方法が使用されてもよい。適当な標識は公知であり、酵素、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、生物発光性標識、比色分析標識、アフィニティ標識、金属コロイド標識、色素がその中に組み込まれているラテックスおよびシリカ粒子、ならびに色素粒子を含む。抗体を標識して翻訳後修飾タンパク質を定量することが可能であり、また、標識された２次もしくは３次抗体または他の抗体結合化合物（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を使用して翻訳後修飾タンパク質を定量することも可能である。免疫学的検定は手動で行われてもよいし、自動分析装置を用いて行われてもよい。
【００３７】
好ましくは酵素免疫測定法である。酵素免疫測定法は、例えば以下の通りに実施されてもよい。体液中の翻訳後修飾タンパク質における無修飾エピトープに特異的な抗体が固体表面に固定される。適当な固体表面は周知であり、ガラス、ガラスフィルタ、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、アガロース、およびヒドロゲルを含む。固定された抗体に体液が接触される。洗浄後、抗体によって固体表面に結合された翻訳後修飾タンパク質は、２次抗体、または翻訳後修飾アミノ酸残基を含有するエピトープに特異的な抗体の混合物と反応される。２次抗体を標識して翻訳後修飾タンパク質を定量することが可能であり、また、２次抗体に結合可能な標識された３次抗体または他の化合物（例えば、プロテインＡまたはストレプトアビジン）を用いて翻訳後修飾タンパク質を定量することも可能である。
【００３８】
酵素免疫測定法のさらに他の方法が実施されることが可能であり、そのような方法では、翻訳後修飾アミノ酸を含有するエピトープに特異的な抗体が固体表面に固定される。洗浄後、固体表面に結合した翻訳後修飾タンパク質が、翻訳後修飾タンパク質にある無修飾エピトープに特異的な酵素標識抗体と反応されて定量される。
【００３９】
別の代替法として、まず翻訳後修飾タンパク質が、体液の他の成分から例えばアフィニティ・クロマトグラフィによって分離され得る。アフィニティ・クロマトグラフィを行うために、翻訳後修飾アミノ酸残基を含有するエピトープに対する抗体は、固体表面（例えば、カラム内のビーズ）に固定され、体液中の翻訳後修飾タンパク質を結合するために用いられる。固体表面の洗浄後、翻訳後修飾タンパク質が溶出され、（例えば上述の方法のうちの１つによって、２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって、または別の方法によって）測定される。
【００４０】
上述した分析のいずれにおいても、また、抗体を利用する他の分析においても、アプタマーは、抗体の代わりに、または抗体と共に用いられ得る。アプタマーは、タンパク質、ペプチド、タンパク質およびペプチドの誘導体、無機分子、ならびに他の非ヌクレオチド分子に対する特異性を有するオリゴヌクレオチドである。例えば、全開示が本願明細書に援用される国際公開第００／７０３２９号パンフレット、国際公開第０１／７９５６２号パンフレット、国際公開第９９／５４５０６号パンフレット、および米国特許第５，７５６，２９１号を参照のこと。本発明における使用に適したアプタマーは、これらの引用文献に記載された方法を用いて調製され得る。簡潔には、ランダム配列を有するオリゴヌクレオチドの異種集団が合成され、このオリゴヌクレオチドの異種集団に翻訳後修飾タンパク質が混合される。このオリゴヌクレオチド集団に存在する配列の全てではなく、それらの一部と複合体が形成される。複合体が単離され、オリゴヌクレオチドが回収されて（例えばＰＣＲによって）増幅される。この結果得られたオリゴヌクレオチドの混合物は、次のラウンドの複合体形成、単離、および増幅を行う出発物質として使用され得るとともに、この工程は通常、十分な特異性を有するアプタマーが得られるか、および／またはコンセンサス・アプタマー配列が同定されるまで何度か反復される。アプタマー用の適当な標識は、色素、酵素、放射性標識などを含む。
【００４１】
リン酸化タンパク質を定量する分析では、リン酸化タンパク質の脱リン酸化を阻止するために、ホスファターゼ阻害剤またはホスファターゼ阻害剤のカクテルを使用することが好ましい。適当なホスファターゼ阻害剤は公知であるとともに、市販されている。例えば、ホスファターゼ阻害剤のカクテルは、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）［ミズーリ州セントルイス所在］から購入可能である。分析を実施する前に体液をしばらく保存しなければならない場合、ホスファターゼ阻害剤の使用が特に重要である。
【００４２】
システイン化タンパク質を直接測定する場合、還元剤または還元条件の使用を回避するべきである。しかし、還元剤または還元条件を用いてシステインをシステイン化タンパク質から遊離させ、遊離されたシステインを上述の方法のうちの任意の方法で定量することによって、システイン化タンパク質を定量することも可能である。
【００４３】
ここまで記載された分析では、体液中の翻訳後修飾タンパク質の量が測定される。翻訳後修飾タンパク質を定量化する任意の方法が用いられてもよい。例えば、翻訳後修飾タンパク質の量は、量（例えばμｇ）でも濃度（例えばμＭ）でもよく、これらのうちどちらも、通常は１つまたは複数のスタンダード（例えば、分析されるタンパク質と同じ翻訳後修飾によって翻訳後修飾された精製組換えタンパク質）を参照することによって測定される。翻訳後修飾タンパク質の量は、同じ体液中における対応する無修飾タンパク質、または正常な対照から得た同じタイプの体液中における同一の翻訳後修飾タンパク質などの別の化合物と比較された比率または割合でもよい。一旦、体液中の翻訳後修飾タンパク質の量が測定されれば、その量が、正常動物からの同一体液中におけるレベルと比較して有意に変化しているかどうかが判定される。「有意に」とは、統計的に有意であることを意味し、統計的分析の適当な方法は当技術分野で周知である。
【００４４】
Ｃ．炎症の診断およびモニタ
炎症は、それを通して身体が様々な傷害、感染、およびストレスに応答するカスケード反応である。炎症反応は侵襲のタイプ、規模、および位置によって異なる。多くの場合、炎症は、マクロファージおよび好中球などの炎症細胞の動員によって特徴付けられる。これらの細胞は、炎症性サイトカインの放出に関わる。これら炎症性サイトカインおよび他の分泌因子は、炎症細胞をさらに蓄積させる。この炎症カスケードの影響は、極めて局所的であることもあるし、また、極端な場合には生命に危険を及ぼす全身性反応を引き起こすこともある。局所的であれ、または広域であれ、炎症は患部の生化学経路を基本的に変える。
【００４５】
詳細には、炎症過程の参加物質として、または局外物質として炎症領域に存在するタンパク質の翻訳後修飾が変化していること、そしてこのように翻訳後修飾が変化したタンパク質が炎症の有用なバイオマーカとなることが判明している。「変化」とは、１つまたは複数の翻訳後修飾のレベル、および／または翻訳後修飾のタイプにおけるいかなる変化も、また、いかなる変化の組合せも意味する。例えば、タンパク質は、初めて翻訳後修飾されてもよいし、特定の翻訳後修飾のレベルが増大、減少、または除去されてもよいし、追加の、または別のタイプの翻訳後修飾によって修飾されてもよい。
【００４６】
１．一般的炎症の診断およびモニタリング
本発明の一実施形態では、動物における炎症の存在、不在、または程度が判定される。この実施形態は、特定のタイプの炎症を測定する本発明の実施形態と区別するために、本明細書において一般的炎症実施形態と呼ばれる。「特定のタイプの炎症」とは、特定の組織または器官における炎症（例えば心臓の炎症）、または特定の疾患、状態、もしくは障害で起こる炎症（例えば心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、または自己免疫疾患に伴う炎症）を意味する。本発明の一般的炎症実施形態では、炎症の特定部位または原因を特定しないとともに、いかなる特異的疾患の診断も提供しない。しかし、炎症の存在、不在、または程度は、疾患の診断を決定、確認、もしくは除外、および／または疾患に対する治療方針の決定に重要であることがある。例えば、本発明の一般的炎症実施形態による炎症の存在、不在または程度の判定は、他の診断パラメータと併せて、多くの疾患を診断する際に非常に有用であり得る。本明細書において、「診断パラメータ」とは、（測定結果、観測結果および／または症候を含む）検査所見および臨床所見を意味する。
【００４７】
本発明の一般的炎症実施形態はまた、炎症治療における有効性の判定を含む動物における炎症経過のモニタにも用いられ得る。これは、多数の疾患、特に敗血症などの広範囲の炎症が起こる疾患において極めて有用にちがいない。特定の治療が炎症の軽減に有効でないと判れば、治療は変更され得る。例えば、薬の用量が増加されることが可能であり、また、効果のない治療が別の治療に転換されることが可能である。本発明の方法はまた、薬剤の最小有効用量、および薬剤投与を必要とする最短の時間を決定するのに用いられ得る。これは、多くの抗炎症薬が、高用量および／または長期間使用された際に、深刻な有害副作用をもつことから重要である。最後に、本発明の方法のこの実施形態は、公知の治療と同様、炎症に対する新規かつ有望な治療の有効性をモニタするのに用いられ得る。
【００４８】
一般的炎症を判定するために、体液中に存在する翻訳後修飾タンパク質の全て、翻訳後修飾タンパク質のサブセット、または翻訳後修飾された単一のタンパク質が測定される。本明細書において、一般的炎症の判定に利用される翻訳後修飾タンパク質のそれぞれを、「一般的炎症のタンパク質マーカ」と呼ぶ。好ましくは、一般的炎症は、体液の成分である１つまたは複数の翻訳後修飾タンパク質を測定することによって判定され、これらのタンパク質は、一般的炎症の好ましいタンパク質マーカである。好ましくは、血液は本質的に身体の全域と接触または情報伝達を行うことから、上記体液は血液である。血液のタンパク質成分は、アルブミンおよび免疫グロブリンを含む。血液試料は、好ましくは血清または血漿である。最も好ましい一般的炎症のタンパク質マーカは、翻訳後修飾アルブミンであり、好ましい翻訳後修飾は、リン酸化およびシステイン化である。
【００４９】
２．特定のタイプの炎症の診断およびモニタリング
本発明はまた、特定のタイプの炎症を診断およびモニタするのに用いられ得る。詳細には、特定の器官または組織における炎症を診断および／またはモニタすることが可能であり、特定の疾患、状態、または障害に関連した（すなわち、これらに存在もしくは関与しているか、またはこれらを引き起こすか、もしくは悪化させる）炎症を診断および／またはモニタすることが可能である。これは、体液中に存在する１つまたは複数の翻訳後修飾された指標タンパク質の量を測定することによって実現される。本明細書において、「指標」タンパク質は、特定の組織もしくは器官からのタンパク質（「組織特異的」または「器官特異的」タンパク質）、または特定の疾患、状態、もしくは障害に関連したタンパク質（「疾患特異的」タンパク質）である。
【００５０】
炎症は、本質的には身体中のどの器官または組織も苦しめ得る。さらに、炎症は、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アレルギー、関節炎、喘息、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症）、気管支炎、癌、心血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、嚢胞性繊維症、肺気腫、心内膜炎、胃炎、移植片対宿主疾患、感染（例えば、細菌性感染、ウイルス性感染、および寄生物感染）、炎症性腸疾患、傷害、虚血（心虚血、脳虚血、および胎盤虚血など）、多臓器不全症候群（多臓器不全）、腎炎、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、眼炎症、痛覚、膵炎、乾せん、敗血症、ショック、移植拒絶反応、外傷、潰瘍（例えば、胃腸潰瘍および潰瘍性大腸炎）、およびその他多数を含めた多数の疾患、障害、および状態に存在もしくは関与するか、またはこれらを引き起こすか、もしくは悪化させる。多くの適当な指標タンパク質が公知である。指標タンパク質の例の一部が以下に示される。
【００５１】
１．心筋梗塞用：トロポニンＩ、トロポニンＴ、クレアチニン・ホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、そのＭＢイソ酵素（ＣＰＫＭＢ）、およびミオグロビン。
２．脳虚血用：Ｓ１００ＢおよびエノラーゼなどのＳ１００タンパク質。
【００５２】
３．アルツハイマー病用：β−アミロイド。
４．パーキンソン病用：α−シヌクレイン。
５．多発性硬化症用：β−アミロイドおよびミエリン塩基性タンパク質。
【００５３】
６．Ｃ型肝炎用：アルブミンおよび肝臓酵素。
７．癌用：ｂｒｃａｌ、ｃｅａ、ｐｓａなど。
８．慢性閉塞性肺疾患用：α１−アンチトリプシンおよびサーファクタント・タンパク質。
【００５４】
９．喘息用：α１−アンチトリプシンおよびサーファクタント・タンパク質。
１０．成人呼吸窮迫症候群用：サーファクタント・タンパク質およびエラスターゼ。
１１．自己免疫疾患用：リウマトイド因子、膠原、およびエラスターゼ。
【００５５】
１２．多臓器不全用：アルブミンおよびエラスターゼ。
１３．敗血症用：リポ多糖結合タンパク質。
１４．子癇および子癇前症用：アンギオテンシンおよびエリスロポイエチン。
【００５６】
特定のタイプの炎症の存在、不在、または程度は、疾患の診断を決定、確認、もしくは除外するために、また、治療方針を決定する際の貴重な情報を提供する。特定のタイプの炎症の存在、不在、または程度の判定結果のみを用いて特定の疾患を診断することも可能かもしれない。しかし、診断を行うには、他の診断パラメータも考慮することが、必須または望ましいであろう。例えば、追加診断パラメータを用いることで、診断における感度および／または特異性が向上するか、かつ／または信頼度が向上し得る。
【００５７】
本発明のこの実施形態は、炎症に対する治療における有効性の判定を含む特定のタイプの炎症の経過をモニタするのに用いられ得る。特定の治療が炎症の軽減に有効でないと判れば、治療は変更され得る。例えば、薬の用量が増加されることが可能であり、また、効果のない治療が別の治療に転換されることが可能である。本発明の方法はまた、薬剤の最小有効用量、および薬剤投与を必要とする最短の時間を決定するのに用いられ得る。これは、多くの抗炎症薬が、高用量および／または長期間使用された際に、深刻な有害副作用をもつことから重要である。最後に、本発明の方法のこの実施形態は、公知の治療と同様、特定のタイプの炎症に対する新規かつ有望な治療の有効性をモニタするのに用いられ得る。
【００５８】
３．リン酸化タンパク質の測定による炎症の診断およびモニタリング
一般的炎症および特定のタイプの炎症に関して、診断および／またはモニタするための好ましい翻訳後修飾はリン酸化である。炎症に特有な現象の多くは、細胞レベルおよび分子レベルでのシグナル伝達の増強に関連している。細胞シグナリングにおける重要な特性の１つはリン酸化である。酵素、タンパク質、ペプチド、および他の分子は、リン酸化経路または脱リン酸化経路によって活性化される。多くの場合、活性化事象がリン酸化を含むとき、対向的脱リン酸化工程が後に続くことによって、持続的な刺激とは相反してパルス状のシグナルが伝達される。ホスホリラーゼ／キナーゼとホスファターゼとの間にはバランスが存在する。分子レベルでは、炎症はキナーゼ側に傾いた不均衡として考えられ得る。炎症では、細胞内でキナーゼが発現され、細胞外膜でキナーゼが外在化または活性化され、そして、場合によってはホスファターゼが阻害されてキナーゼの活性が増強される。炎症過程の参加物質または局外物質として、炎症領域に存在するタンパク質は、キナーゼ活性の（膜結合型であろうと、循環性／可溶性であろうと）増強によってリン酸化の基質となる可能性があり、リン酸化タンパク質は炎症の有用なバイオマーカとなる。
【００５９】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、体液中に存在する１つまたは複数のリン酸化タンパク質の量を測定することによって、炎症が診断および／またはモニタされる。リン酸化タンパク質の量が、正常対照からの同一体液中におけるレベルと比較して有意に増加しているなら、患者は炎症を患っている。そのようなタンパク質は、最初に１つまたは複数の部位でリン酸化されていて、そのリン酸化の量が炎症によって引き起こされたキナーゼ活性増大の結果として増加したタンパク質であり得る。一般的炎症を診断および／またはモニタするために、体液中に存在するリン酸化タンパク質の全て、体液中に存在するリン酸化タンパク質の１つ、または体液中に存在するリン酸化タンパク質の何らかのサブセットが測定され得る。特定のタイプの炎症を診断および／またはモニタするために、１つまたは複数の体液中に存在する１つまたは複数のリン酸化された指標タンパク質が測定され得る。
【００６０】
リン酸化タンパク質の定量のために、多くの方法が使用され得る（上記参照）。体液中に存在するリン酸化タンパク質は、好ましくは結合パートナー分析によって、最も好ましくは免疫学的検定によって定量される。多数の適切な免疫学的検定フォーマットが当技術分野で公知である。好ましくは、タンパク質のリン酸化セリン残基、リン酸化トレオニン残基、またはリン酸化チロシン残基を含む１つまたは複数のエピトープに対する抗体が利用される。好ましくは、タンパク質のリン酸化セリン残基、リン酸化トレオニン残基、および／またはリン酸化チロシン残基に対する抗体であって、そのようなリン酸化アミノ酸を含む任意のタンパク質と反応する抗体が利用される。より好ましくは、３タイプ全てのリン酸化アミノ酸残基に対する抗体が利用される。抗体を標識してリン酸化タンパク質を定量することが可能であり、また、標識された２次抗体または他の抗体結合化合物（例えばプロテインＡまたはプロテインＧ）を用いてリン酸化タンパク質を定量することも可能である。多くの適当な標識は公知であり、酵素、ラジオ標識、同位体標識、蛍光標識、化学発光標識、比色分析標識、およびアフィニティ標識を含む。例えば、リン酸化アミノ酸残基に対する抗体は、その抗体がリン酸化タンパク質に結合するまで検出可能にならない標識で標識され得る（すなわち、ホモジニアス・イムノ分析）。
【００６１】
上述のように、一般的炎症を診断および／またはモニタするために、体液中に存在するリン酸化タンパク質の全て、体液中に存在するリン酸化タンパク質の１つ、または体液中に存在するリン酸化タンパク質の何らかのサブセットが測定され得る。一般的炎症を判定する本発明の方法の第１の実施形態では、体液中に存在するリン酸化タンパク質の全てが測定される。好ましくは、体液は血清または血漿である。リン酸化タンパク質は体液の他の成分から分離せずに測定されてもよく、また、リン酸化タンパク質は、例えばアフィニティ・クロマトグラフィによって体液の他の成分から分離されてもよい。例えば、アフィニティ・クロマトグラフィは、流体中のリン酸化タンパク質を結合するのに使用される固体表面（例えば、カラム内のビーズ）に結合したリン酸化アミノ酸残基に対する抗体を用いて行われ得る。固体表面の洗浄後、リン酸化タンパク質は溶出され、（例えば上述の方法のうちの１つによって、２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって、または別の方法によって）測定される。
【００６２】
一般的炎症を判定する本発明の方法の第２の好ましい実施形態では、体液中、好ましくは血清中または血漿中に存在するリン酸化タンパク質の１つ、好ましくはリン酸化アルブミンが測定される。本発明の前には、生体内でアルブミンがリン酸化されることは知られていなかった。したがって、炎症を診断および／またはモニタするためにリン酸化アルブミンの量が用いられ得ることは、かなり驚くべきことである。
【００６３】
リン酸化アルブミンは、いくつかの方法で測定され得るが、好ましくは結合パートナー分析によって、最も好ましくは免疫学的検定によって測定される。多くの適切な免疫学的検定フォーマットが公知である。好ましくは酵素免疫測定法であり、体液中のアルブミンに特異的な抗体（すなわち、体液がヒト体液である場合には抗ヒト・アルブミン抗体、体液がイヌ体液である場合には抗イヌ・アルブミン抗体など）が固体表面に固定される。体液は、固定された抗体に接触される。洗浄後、抗アルブミン抗体によって固体表面に結合されたアルブミンは、リン酸化セリン残基、リン酸化トレオニン残基、および／またはリン酸化チロシン残基に特異的な２次抗体または抗体混合物と反応される。より好ましくは、３タイプ全てのリン酸化アミノ酸残基に対する抗体が利用される。２次抗体を標識してリン酸化アルブミンを定量することが可能であり、また、２次抗体に結合可能な標識された３次抗体または他の化合物（例えば、プロテインＡまたはストレプトアビジン）を用いてリン酸化アルブミンを定量することも可能である。
【００６４】
この酵素免疫測定法の他の方法が実施されることが可能であり、この方法では、リン酸化セリン残基、リン酸化トレオニン残基、および／またはリン酸化チロシン残基に特異的な抗体または抗体混合物が固体表面に固定され、洗浄後、リン酸化アルブミンを定量するために、固体表面に結合されたリン酸化タンパク質は、アルブミンに特異的な抗体と反応される。
【００６５】
この酵素免疫測定法のさらに他の方法実施されることが可能であり、この方法では、リン酸化アルブミンに特異的な抗体（すなわち、アルブミンのリン酸化アミノ酸残基を含むエピトープに特異的な抗体）が固体表面に固定される。洗浄後、リン酸化アルブミンを定量するために、固体表面に結合されたリン酸化アルブミンは、アルブミンに特異的な酵素標識抗体と反応される。当然ながら、これら２つの抗体を逆にして、アルブミンに特異的な抗体を固体表面に固定し、リン酸化アルブミンに特異的な抗体を検出抗体として用いることも可能である。
【００６６】
別の代替法として、まずアルブミンが、体液の他の成分から例えばアフィニティ・クロマトグラフィによって分離され得る。アフィニティ・クロマトグラフィを行うために、体液中に存在するアルブミンに特異的な抗体（例えば、リン酸化されたエピトープに特異的な抗体、および／またはリン酸化されていないエピトープに特異的な抗体）は、固体表面に結合され、アルブミンを結合するために用いられる。固体表面の洗浄後、アルブミンが溶出され、（例えばアルブミンに関する上記の方法の１つ、または別の方法によって）測定される。
【００６７】
一般的炎症を判定する本発明の方法の第３の実施形態では、体液中に存在するリン酸化タンパク質のサブセットが測定される。リン酸化タンパク質の測定は、いくつかの方法で実施され得る。例えば、体液中に存在する他の成分から全てのリン酸化タンパク質を分離するために、アフィニティ・クロマトグラフィが実施され得る。別法として、体液中の全てのリン酸化タンパク質を捕捉するために、リン酸化セリン残基、リン酸化トレオニン残基、および／またはリン酸化チロシン残基に特異的な抗体が固体表面に固定されることにより、酵素免疫測定法が実施され得る。どちらの場合でも、選択されたタンパク質に特異的な抗体の反応混液を用いることにより、タンパク質のサブセットが測定され得る。
【００６８】
特定のタイプの炎症を判定するために、体液中に存在する１つまたは複数の特定のリン酸化指標タンパク質が定量される。１つまたは複数のリン酸化指標タンパク質は、上記の１つまたは複数の方法で測定され得る。好ましくは、リン酸化指標タンパク質は、適切な抗体（例えば指標タンパク質（リン酸化されたエピトープ、および／またはリン酸化されていないエピトープ）に特異的な抗体、および／またはリン酸化セリン残基、リン酸化トレオニン残基、および／またはリン酸化チロシン残基に特異的な抗体）を用いて、好ましくは結合パートナー分析によって、より好ましくは免疫学的検定によって、最も好ましくは酵素免疫測定法によって測定される。
【００６９】
４．システイン化タンパク質の測定による炎症の診断およびモニタリング
炎症を診断および／またはモニタするための別の好ましい翻訳後修飾は、システイン化である。炎症では、少なくとも以下の理由でシステイン化タンパク質のレベルが増大していると考えられている。
【００７０】
まず、シスタチオニンβ−シンセターゼ（ＣＢＳ）は、脳、肝臓、膵臓、腎臓、および胎盤を含む多くの器官および組織内に存在する。ＣＢＳは胎児組織にも存在する。これらの器官および組織、もしくはそれらの部分、または胎児組織における炎症では、ＣＢＳの阻害が引き起こされ、それによってホモシステインが蓄積され、その後、血流と、炎症を起こしていない領域とに流入する。このホモシステインは、炎症を起こしていない領域（例えば血液中、ならびに炎症を起こした器官および組織における炎症を起こしていない領域内）で、阻害されていないＣＢＳによってプロセシングを受け、タンパク質をシステイン化する硫黄転移経路（ｔｒａｎｓｕｌｐｈｕｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）（図５を参照）を介してシスタチオニンおよびシステインとなる。
【００７１】
加えて、炎症ではｐＨおよび酸素濃度が減少し、この結果、Ｃｕ（ＩＩ）が通常結合しているタンパク質からＣｕ（ＩＩ）が遊離する。Ｃｕ（ＩＩ）レベルは、血流中と、器官および組織内との両方で増大し、このため、炎症中におけるタンパク質のシステイン化は、Ｃｕ（ＩＩ）レベルが増大したことによって、さらに増強されるはずである（図５を参照）。
【００７２】
したがって、システイン化タンパク質は、アルブミンなどの血流中で循環するタンパク質を含むことが可能であり、そのような血流中で循環するタンパク質は一般的炎症のタンパク質マーカである。システイン化タンパク質はまた、炎症を起こした器官もしくは組織の炎症を起こしていない領域、または胎児で生成されたタンパク質を含むことが可能であり、したがって、特定のタイプの炎症の診断およびモニタリングに有用である。後者のタイプのシステイン化タンパク質は、システイン化された脳タンパク質（Ｓ１００蛋白質など）、ならびにシステイン化された胎盤タンパク質および胎児のタンパク質（β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α−フェトプロテイン、および妊娠関連タンパク質１Ａなど）を含み得る。
【００７３】
システイン化タンパク質は、上述した１つまたは複数の方法で測定され得る。好ましくは、システイン化タンパク質は、適切な抗体（例えばシステイン化タンパク質（システイン化されたエピトープおよび／またはシステイン化されていないエピトープ）に特異的な抗体）を用いて、好ましくは結合パートナー分析によって、より好ましくは免疫学的検定によって、最も好ましくは酵素免疫測定法によって測定される。
【００７４】
５．炎症パネル
本発明の別の実施形態では、炎症の診断および／またはモニタリングを改善するために、および／または炎症のより完全なプロフィールを提供するために、２つ以上の翻訳後修飾タンパク質が定量される。例えば、一般的炎症の診断および／またはモニタリングを改善するために、１つまたは複数の体液中にある２つ以上の一般的炎症のタンパク質マーカが測定され得る。同様に、特定のタイプの炎症の診断および／またはモニタリングを改善すること、および／または複数の特定のタイプの炎症が動物に存在するかどうかを判定するために、１つまたは複数の体液中にある２つ以上の指標タンパク質の量が測定され得る。最後に、動物における炎症の存在、不在、または程度、ならびに炎症が存在する場合には、炎症、および／または炎症が関連した疾患の部位を判定（一般的炎症を判定）するために、１つまたは複数の体液中にある１つまたは複数の一般的炎症のタンパク質マーカと、１つまたは複数の体液中にある１つまたは複数の指標タンパク質とが測定され得る。
【００７５】
翻訳後修飾タンパク質の定量は、上述した方法のいずれによっても実施され得る。例えば、質量分析は、１つまたは複数の体液中にある翻訳後修飾タンパク質を同定および定量することによって、炎症プロフィールを提供し得る。しかし、好ましくは、注目している翻訳後修飾タンパク質に特異的な結合パートナーのコレクションが提供される。そのようなコレクションは、それぞれが結合パートナーを保持する試験管のコレクションでもよいし、その各ウェルに結合パートナーを含有するマイクロタイター・プレートでもよいし、基質上における結合パートナーのアレイでもよい。その後、結合パートナーのコレクションは、炎症プロフィールを作成するために利用される。
【００７６】
６．翻訳後修飾タンパク質のレベルと、他の診断パラメータとの併用による疾患の診断およびモニタリング
上述のように、本発明の一般的炎症実施形態は、炎症の特定部位および原因を特定せず、またいかなる特異的疾患の診断も提供しない。１つまたは複数の特定タイプの炎症が存在すると判定された場合でさえ、疾患の決定的な診断が得られないことが多い。病気を診断するには通常、一般的炎症および／または特定のタイプの炎症の存在、不在、または程度を、他の診断パラメータと併用する必要がある。例えば、動物の肺で炎症が起きているという判定は、肺炎症の原因となっている可能性があるいくつかの疾患のうちのいずれか１つであると診断するのに十分ではないかもしれない。例えば喘息を呼吸器感染症から識別するには、病歴、ならびに他の検査所見および臨床所見が必要な場合がある。
【００７７】
Ｄ．虚血の診断およびモニタリング
本発明はまた、虚血を診断およびモニタする方法を提供する。本明細書において、虚血は、１つまたは複数の組織または器官における酸素濃度の低減であると定義される。虚血は、血流量の減少によって、または血液の酸素運搬能力の低減によって引き起こされ得る。例えば、虚血は、貧血（組織または器官における赤血球またはヘモグロビンの減少、さらにこれは組織または器官への動脈血流の減少もしくは遮断によって、または出血によって引き起こされ得る）、酸欠（吸気、血液、または組織における酸素が正常レベルより低い状態）、または血液酸素欠乏（吸気、血液、または組織における酸素の欠如、またはほとんど完全な無酸素状態）によって引き起こされ得る。
【００７８】
虚血は、１つの組織または器官で起こることがあり、また、複数の組織および／または器官に影響を及ぼすことがある。特定のタイプの虚血は、心虚血、脳血管虚血、胎盤虚血、および腸虚血などを含む。
【００７９】
上述のように、虚血では炎症が起こる。しかし、虚血部位における嫌気的代謝により、炎症のみの場合と比較して、異なったタイプおよび／または量の翻訳後修飾が虚血の結果として起こり得る。所望または必要に応じて、虚血は炎症と区別され得る。例えば、虚血でのみ存在する特定のタンパク質の翻訳後修飾を含む特定のエピトープに対する抗体、または虚血でのみ存在する特定のタンパク質の特定タイプの翻訳後修飾に対する抗体が使用され得る。別法としては、２つの状態を区別するために、いくつかの翻訳後修飾プロフィールが用いられ得る。
【００８０】
１．一般的虚血
本発明の一実施形態では、動物体内のどこかに虚血が存在するか、存在しないか、またはその程度のみが判定される。この実施形態は、本発明の方法の特定のタイプの虚血を判定する実施形態と区別するために、一般的虚血実施形態と呼ばれる。「特定のタイプの虚血」とは、特定の組織または器官における虚血（例えば心虚血）を意味する。一般的虚血実施形態は、虚血のいかなる特定のタイプの診断を提供しないが、他の診断パラメータと併用して、特定のタイプの虚血を診断する際に極めて有用であろう。
【００８１】
本発明の一般的虚血実施形態は、虚血治療における有効性の判定を含む動物における虚血のモニタに用いられ得る。特定の治療が虚血の軽減に有効でないと判れば、治療は変更され得る。例えば、薬の用量が増加されることが可能であり、また、効果のない治療が別の治療に転換されることが可能である。一般的虚血実施形態はまた、薬剤の最小有効用量、および薬剤または治療の投与を必要とする最短の時間を決定するのに用いられ得る。最後に、この実施形態は、公知の治療と同様、虚血に対する新規かつ有望な治療の有効性をモニタするのに用いられ得る。
【００８２】
一般的虚血を判定するために、体液中に存在する翻訳後修飾タンパク質の全て、翻訳後修飾タンパク質のサブセット、または翻訳後修飾された単一のタンパク質が測定される。本明細書において、一般的虚血の判定に利用される翻訳後修飾タンパク質のそれぞれは、「虚血の一般的マーカ」と呼ばれる。好ましくは、一般的虚血は、体液の成分である１つまたは複数の翻訳後修飾タンパク質を測定することによって判定され、これらのタンパク質は虚血の好ましい一般的マーカである。好ましくは、血液は本質的に身体の全域と接触または情報伝達を行うことから、上記体液は血液である。血液試料は、好ましくは血清または血漿である。虚血の最も好ましい一般的マーカは、翻訳後修飾アルブミンであり、好ましい翻訳後修飾は、リン酸化およびシステイン化である。
【００８３】
２．特定のタイプの虚血の診断およびモニタリング
本発明はまた、特定タイプの虚血を診断および／またはモニタするのに用いられ得る。詳細には、特定の器官または組織における虚血は、診断および／またはモニタされ得る。これは、１つまたは複数の体液中に存在する１つまたは複数の翻訳後修飾された組織特異的または器官特異的タンパク質の量を測定することによって実現される。
【００８４】
特定の器官および組織の虚血を判定するのに適した器官特異的タンパク質および組織特異的タンパク質の一部の例が以下に示される。
１５．心筋梗塞用：トロポニンＩ、トロポニンＴ、クレアチニン・ホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、そのＭＢイソ酵素（ＣＰＫＭＢ）、およびミオグロビン。
【００８５】
１６．脳虚血用：Ｓ１００ＢなどのＳ１００タンパク質。
１７．腸虚血用：アルブミン。
１８．胎盤虚血用：β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α−フェトプロテイン、妊娠関連タンパク質１Ａ、エリスロポイエチン、アンギオテンシンなどの妊娠関連タンパク質、またはアルブミン。
【００８６】
１つまたは複数の体液における１つまたは複数の翻訳後修飾された器官特異的または組織特異的タンパク質の存在、不在、および／またはレベルのみに基づいて、特定のタイプの虚血の確実な診断を行うことも可能かもしれない。しかし、診断を行うには、他の診断パラメータも考慮することが、必須または望ましいであろう。例えば、追加診断パラメータを用いることで、診断における感度および／または特異性が向上するか、かつ／または信頼度が向上し得る。
【００８７】
本発明のこの実施形態は、虚血に対する治療における有効性の判定を含む特定のタイプの虚血をモニタするのに用いられ得る。特定の治療が虚血の軽減に有効でないと判れば、治療は変更され得る。例えば、薬の用量が増加されることが可能であり、また、効果のない治療が別の治療に転換されることが可能である。この実施形態はまた、薬剤の最小有効用量、および薬剤または治療の投与を必要とする最短の時間を決定するのに用いられ得る。最後に、この実施形態は、公知の治療と同様、特定のタイプの虚血に対する新規かつ有望な治療の有効性をモニタするのに用いられ得る。
【００８８】
３．心虚血の早期診断
本発明は心虚血の早期診断に特に有用であることが判明している。「早期診断」とは、胸痛、息切れ、左腕の疼痛または刺痛などの心虚血症を示す症状の発現後における最初の数時間以内（２４時間未満、特に１２時間未満）に心虚血の存在または不在を確認することを意味する。心虚血の標準診断試験は、この時間枠内では決定的でないことが多く、また、信頼可能な初期バイオマーカも存在しない。本発明は、高感度で特異的な診断分析を提供し、これは心虚血の症状の発現後における最初の数時間以内における分析を含み、したがって、心虚血の早期診断を行うのに極めて有用なものに違いない。
【００８９】
４．翻訳後修飾タンパク質に特性を変性する必要がない
例えば心虚血などによる細胞損傷の結果として、患者の血清中に存在する特定の翻訳後修飾された組織特異的および器官特異的タンパク質を検出する方法が記載されている。国際公開第０２／１６９４７号パンフレット、およびラブガー（Ｌａｂｕｇｇｅｒ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第１０２巻、１２２１〜１２２６頁（２０００年）を参照のこと。詳細には、この方法を用いてリン酸化されたトロポニンＩおよびトロポニンＩの分解された形態のいくつかが、急性心筋梗塞を患う患者の血清中に見出されたことが報告されている。しかし、リン酸化されたトロポニンＩ、分解された形態にあるトロポニンＩ、並びに細胞損傷のマーカである組織特異的タンパク質および器官特異的タンパク質の検出を可能にするためには、これらのタンパク質を変性させる必要があった。
【００９０】
したがって、本発明の方法を用いて、翻訳後修飾された器官特異的タンパク質および組織特異的タンパク質を、これらを変性させる必要性なく正確に定量し得ることは、かなり驚くべきことである。例えば、自然状態の（すなわち変性されていない）トロポニンＩを用いてリン酸化されたトロポニンＩを定量する分析が開発されたが、この分析は、心虚血を高特異性かつ高感度で診断することが可能である（実施例４を参照）。本発明の方法は、タンパク質変性に必要な工程および試薬が除かれていることから、当然ながら国際公開第０２／１６９４７号パンフレットおよびラブガー（Ｌａｂｕｇｇｅｒ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第１０２巻、１２２１〜１２２６頁（２０００年）に記載された方法より、迅速、単純、かつ安価である。
【００９１】
５．リン酸化タンパク質の測定による虚血の診断およびモニタリング
本発明の特に好ましい実施形態では、１つまたは複数のリン酸化タンパク質のレベルを定量することによって、虚血が診断および／またはモニタされる。虚血中のタンパク質のリン酸化は、
（ｉ）特異的なキナーゼの作用を介した炎症；および
（ｉｉ）組織または器官の虚血領域もしくは虚血領域近傍における嫌気的代謝の結果として起こる非特異的な基質レベルでのリン酸化の結果として起こると考えられている。虚血領域にあるタンパク質の基質レベルでのリン酸化は、そのタンパク質の多量のリン酸化を引き起こし得るものであり、自然に増幅されるシグナルを生成し、特別に反応性の高い虚血分析を提供する。
【００９２】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、体液中に存在する１つまたは複数のリン酸化タンパク質の量を測定することによって、虚血が診断および／またはモニタされる。リン酸化タンパク質の量が正常対照からの同一体液中におけるレベルと比較して有意に増加しているなら、患者は虚血を患っている。そのようなタンパク質は、最初に１つまたは複数の部位でリン酸化されており、そのリン酸化の量が炎症によって引き起こされたキナーゼ活性増大と、虚血によって引き起こされた基質リン酸化との結果として増大したタンパク質であり得る。
【００９３】
一般的虚血を診断および／またはモニタするために、体液中に存在するリン酸化タンパク質の全て、体液中に存在するリン酸化タンパク質の１つ、または体液中に存在するリン酸化タンパク質の何らかのサブセットが測定され得る。特定のタイプの虚血を診断および／またはモニタするために、１つまたは複数の体液中に存在する１つまたは複数のリン酸化された器官特異的または組織特異的タンパク質が測定され得る。好ましくは、１つまたは複数の体液における１つまたは複数の器官特異的または組織特異的タンパク質が定量される。
【００９４】
リン酸化タンパク質の定量のために、多くの方法が使用され得る（上記参照）。体液中に存在するリン酸化タンパク質は、好ましくは結合パートナー分析によって、最も好ましくは免疫学的検定によって定量される（上記参照）。
【００９５】
６．システイン化タンパク質の測定による虚血の診断およびモニタリング
本発明の別の好ましい実施形態では、体液中に存在する１つまたは複数のシステイン化タンパク質のレベルを定量することによって虚血が診断される。システイン化タンパク質は、上述した１つまたは複数の方法で測定され得る。システイン化タンパク質は、適切な抗体（例えばシステイン化タンパク質（システイン化されたエピトープおよび／またはシステイン化されていないエピトープ）に特異的な抗体）を用いて、好ましくは結合パートナー分析によって、より好ましくは免疫学的検定によって、最も好ましくは酵素免疫測定法によって測定される。
【００９６】
虚血では、以下の理由でシステイン化タンパク質のレベルが増大していると考えられている。まず、シスタチオニンβ−シンセターゼ（ＣＢＳ）は、脳、肝臓、膵臓、腎臓、および胎盤を含む多くの器官および組織内に存在する。ＣＢＳは胎児組織にも存在する。これらの器官および組織、もしくはそれらの部分、または胎児組織における虚血では、ＣＢＳの阻害が引き起こされ、それによってホモシステインが蓄積され、その後、血流と、虚血を起こしていない領域とに流入する。このホモシステインは、虚血を起こしていない領域（例えば血液中ならびに虚血を起こした器官および組織における虚血を起こしていない領域内）で、阻害されていないＣＢＳによってプロセシングを受け、タンパク質をシステイン化する硫黄転移経路（図５を参照）を介してシスタチオニンおよびシステインとなる。したがって、システイン化タンパク質には、アルブミンなどの血流中で循環するタンパク質を含むことが可能であり、そのような血流中で循環するタンパク質は虚血の一般的マーカである。システイン化タンパク質はまた、虚血を起こした器官もしくは組織の虚血を起こしていない領域、または胎児で生成されたタンパク質を含むことが可能であり、したがって、特定のタイプの虚血の診断およびモニタリングに有用である。後者のタイプのシステイン化タンパク質は、システイン化された脳タンパク質（Ｓ１００タンパク質など）、ならびにシステイン化された胎盤タンパク質および胎児のタンパク質（β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α−フェトプロテイン、妊娠関連タンパク質１Ａ、エリスロポイエチン、およびアンギオテンシンなど）を含み得る。
【００９７】
システイン化タンパク質のレベルは、他の機構によっても虚血中に増大することがある。例えば、Ｃｕ（ＩＩ）レベルは、血流中と、器官および組織内との両方の虚血で増大し、このため、虚血中におけるタンパク質のシステイン化が増強されるはずである（図５を参照）。最後に、血液中のホモシステインのレベルは、虚血イベントを引き起こす危険にある患者で通常上昇しており、これも血液タンパク質のシステイン化をさらに高いレベルに上げているかもしれない（図５を参照）。
【００９８】
７．虚血パネル
本発明の別の実施形態では、虚血の診断および／またはモニタリングを改善するために、および／または虚血のより完全なプロフィールを提供するために、２つ以上の翻訳後修飾タンパク質が定量される。例えば、一般的虚血の診断および／またはモニタリングを改善するために、１つまたは複数の体液中にある２つ以上の虚血の一般的マーカが測定され得る。同様に、特定タイプの虚血の診断および／またはモニタリングを改善するため、および／または複数の特定タイプの虚血が動物に存在するかどうかを判定するために、１つまたは複数の体液中にある２つ以上の器官特異的または組織特異的タンパク質の量が測定され得る。最後に、動物に虚血が存在するか（一般的虚血の判定）、そして、虚血が存在する場合には虚血の部位を判定するために、１つまたは複数の体液中にある１つまたは複数の虚血の一般的マーカと、１つまたは複数の体液中にある１つまたは複数の器官特異的または組織特異的タンパク質とが測定され得る。
【００９９】
翻訳後修飾タンパク質の定量は、上述した方法のいずれによっても実施され得る。例えば、質量分析を用いて、１つまたは複数の体液中にある翻訳後修飾タンパク質を同定および定量することによって、虚血プロフィールを提供することが可能であろう。しかし、好ましくは、注目している翻訳後修飾タンパク質に特異的な結合パートナーのコレクションが提供される。そのようなコレクションは、それぞれが結合パートナーを保持する試験管のコレクションでもよいし、その各ウェルに結合パートナーを含有するマイクロタイター・プレートでもよいし、基質上における結合パートナーのアレイでもよい。その後、結合パートナーのコレクションは、虚血プロフィールを作成するために利用される。
【０１００】
８．翻訳後修飾タンパク質のレベルと、他の診断パラメータとの併用による虚血の診断およびモニタリング
より高い感度および／または特異性で、かつ／または自信をもって虚血を診断するために、翻訳後修飾タンパク質の存在、不在、またはレベルを、他の診断パラメータと併用することが望ましいであろう。自信をもって虚血を診断または除外するために、例えば、病歴ならびに他の検査所見および臨床所見が有用または必要であることがある。
【０１０１】
一例として、心筋虚血を診断するために、リン酸化トロポニンＩのレベルの測定を、標準的な（リン酸化されていない）トロポニンＩのレベルまたはＣＫ−ＭＢのレベルと併用することが望ましいことがある。別の例としては、心筋虚血を診断するために、リン酸化アルブミンのレベルまたはシステイン化アルブミンのレベルの測定を、標準的な（リン酸化されていない）トロポニンＩのレベルまたはＣＫ−ＭＢのレベルと併用することが望ましいことがある。同様に、脳虚血の診断のために、リン酸化アルブミンのレベルまたはシステイン化アルブミンのレベルの測定を、脳虚血の標準的なマーカと併用することが望ましいことがある。
【０１０２】
Ｅ．虫垂炎の診断の改良法
本発明は、動物、好ましくはヒトにおける虫垂炎を診断する改良法をさらに提供する。この方法の第１工程は、体液中、好ましくは尿中のｏ−ヒドロキシ馬尿酸（ＯＨＨＡ）の量が、正常動物から得た同一体液におけるレベルと比較して有意に上昇しているかどうかを判定することである。
【０１０３】
この工程は、米国特許第５，４７０，７５０号および下記実施例９の記載に従って実施され得る。米国特許第５，４７０，７５０号の全開示は本願明細書に援用される。
米国特許第５，４７０，７５０号は、ＯＨＨＡを測定するいくつかの方法を記載する。これらの方法は、発色化学反応を行い、続いて肉眼、蛍光、紫外線分光法、または可視分光法を用いてその色を検出／測定すること（「比色分析法」）を含む。米国特許第５，４７０，７５０号に開示されたＯＨＨＡの測定法は、質量分析、（薄層クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、およびガス・クロマトグラフィを含む）様々なタイプのクロマトグラフィ、核磁気共鳴、酵素反応、および免疫学的検定をさらに含む。
【０１０４】
米国特許第５，４７０，７５０号の好ましい実施形態は、比色分析スクリーニング・テストである。このスクリーニング・テストを行うために、診断される動物から得られた尿が発色試薬に添加される。好ましくは、この発色試薬は、シリカまたは別の支持物質（Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）、粘土、アルミナ、および／または耐火レンガなど）に結合した第二鉄イオンである。鉄結合シリカは、以下の通りにして調製され得る。４０グラムの硝酸酸化鉄六水和物を４０ｍｌの２５％塩酸に溶解させ、１５分間、超音波処理する。その後、１００グラムのシリカを硝酸酸化鉄溶液に添加し、遊離して流動する粉末が得られるまでゆっくり撹拌する。スクリーニング・テストを行うために、鉄結合シリカ粉末に尿を添加して激しく混合した後、インキュベートして発色させる。液体の最上層が茶色、赤色、または紫色の場合、尿中のＯＨＨＡ量が虫垂炎の閾値より多いことを示す。液体の最上層の色が正常尿の淡黄色か、またはピンクである場合、ＯＨＨＡが存在しないか、または虫垂炎の閾値より少ない量で存在することを示す。色は比色チャートと比較するか、または試験サンプルと同時に検査したスタンダードによって発色した色と比較して判定するのが最良である。比色チャートは、このスクリーニング・テストにおいて、正常尿中で既知量の純粋なＯＨＨＡを使用し、その結果生じた色を写真に撮ることによって作成されてもよい。スタンダードは同様に、純粋、かつ正常尿中に希釈可能なＯＨＨＡの１つまたは複数の既知量を含み、試験サンプルと同時にスクリーニング・テストにかけられる。スタンダードは、虫垂炎の存在を示すＯＨＨＡ量に相当する少なくとも１つの量の純粋なＯＨＨＡを含み、好ましくは、虫垂炎の不在（ネガティブ対照）を示す色と、虫垂炎の存在（ポジティブ対照）を示す色とを包含する範囲の色を生ずるであろういくつかの異なった量の純粋なＯＨＨＡを含むであろう。
【０１０５】
米国特許第５，４７０，７５０号はまた、比色分析スクリーニング・テストにおける陽性の結果（すなわち、虫垂炎の存在を示す色）を確認するのに使用可能な薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）法を記載する。この方法は、尿試料からのＯＨＨＡの抽出を含む。これは、尿を（例えばクエン酸、塩酸、またはイオン交換樹脂を用いて）酸性化し、酸性化された尿をＣ１８結合シリカが充填されたカラムに通し、酢酸ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ６．０）またはメタノールでＯＨＨＡを溶出することによって実施され得る。その後、抽出されたＯＨＨＡはＴＬＣにかけられるが、好ましくは、ガラス、金属、またはプラスチックの裏当ての上に支持された薄層シリカ・プレートを使用して、蛍光指示薬を用いずに行われる。ＴＬＣを行うために、抽出されたＯＨＨＡはプレート上に滴下され、プレートは、適当な移動相を用いて展開される（例えば、メタノールで抽出されたＯＨＨＡに用いる移動相は、１部の氷酢酸および９９部の酢酸エチルである）。ＯＨＨＡは、２５０〜３００ｎｍの紫外線を用いること（ＯＨＨＡが虫垂炎の存在を示す閾値より多く存在する場合には、青色蛍光を発するスポットが生じる）によって、または硝酸酸化鉄のメタノール溶液中にプレートを浸漬もしくは噴霧すること（この場合、ＯＨＨＡが虫垂炎の存在を示す閾値より多いなら、赤いスポットが生じる）によって検出され得る。プレートの展開は常に、虫垂炎の存在を示す閾値濃度の純粋なＯＨＨＡによる少なくとも１つのスタンダードと共に行われる。
【０１０６】
ＯＨＨＡ用の比色定量キットは、ディー  エム  アイ  バイオサイエンス・インコーポレイティッド（ＤＭＩ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）［コロラド州イングルウッド所在］から購入可能である（ＡｐｐｙＴｅｓｔ（登録商標）分析キット）。このキットは米国特許第５，４７０，７５０号に包含され、上記スクリーニング・テストと、上述のＴＬＣ分析との両方を行うための装置、試薬、およびその他の材料を含む。
【０１０７】
しかし、最も好ましくは、体溶液中に存在するＯＨＨＡの量は、ＯＨＨＡに特異的な結合パートナーを用いて、結合パートナー分析によって測定されるだろう。結合パートナー分析は、翻訳後修飾タンパク質を測定するために上述されたいかなる分析でもよく、好ましくは免疫学的検定、最も好ましくは酵素免疫測定法である。また、結合パートナーは、上述されたいずれの結合パートナーでもよく、ＯＨＨＡに特異的な抗体またはアプタマーが好ましい。ＯＨＨＡは小分子であることから、抗体を調製するために、免疫原性担体に結合させなければならないであろう。適当な免疫原性担体（キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、アルブミン、ならびに他の高分子量蛋白質およびポリペプチドなど）、およびこれらに小分子を結合させる方法は、当技術分野で周知である。例えば米国特許第５，４８４，７３５号、およびこれに引用された文献を参照のこと。結合パートナー分析は、体液中に存在するＯＨＨＡの量の定量的尺度を与え、かつ体液中に存在するＯＨＨＡの量が正常動物からの同一体液中におけるレベルと比較して上昇しているかどうかをより正確に判定することを可能にすることから好ましい。
【０１０８】
背景技術で述べたように、総白血球数による方法には限界があるにもかかわらず、臨床的な虫垂炎の疑いに対する評価を補助する臨床検査として最も広範に使用され続けている。上述したＯＨＨＡの比色分析スクリーニング・テストは、白血球数の上昇に比べて虫垂炎を診断する特異性が高い（８０．６％対６７．９％、ｐ＜０．０１；下記実施例９を参照）が、総白血球数またはＯＨＨＡレベルのみによる方法より特異性が高く、かつ診断精度のよい分析が望ましいであろう。本発明は、虫垂炎を診断するそのような分析を提供する。
【０１０９】
詳細には、診断される動物からの体液中に存在する一般的炎症のマーカの量を測定することによっても、ＯＨＨＡアッセイの特異性と精度とを改善することが可能であると判明している。体液は、ＯＨＨＡの測定に用いられた同一の体液でもよいし、第２の異なった体液でもよい。好ましくは、一般的炎症のマーカの測定用体液は、尿、血漿、または血清である。
【０１１０】
一般的炎症のマーカは、総白血球数、好中球カウント、好中球バンド・カウント、またはＣ反応性タンパク質レベルなどの一般的炎症の公知のマーカでもよい。これらのマーカを測定する方法は周知であり、分析室で日常的に行われている。また、これらの値の正常範囲、および炎症の存在を示す値も周知であるか、または経験的に測定され得る。一般的炎症の好ましいマーカは、総白血球数である。成人における総白血球数の正常範囲は５〜１０ｘ１０９／リットルであり、１２ｘ１０９／リットル以上の総白血球数は炎症の存在を示すものである。子供の正常範囲は年齢に応じて変化し、炎症を示す総白血球数も同様に変化する（下記実施例９を参照）。
【０１１１】
一般的炎症の別の好ましいマーカは、インターロイキン８（ＩＬ−８）などの炎症性サイトカインである。体液中のサイトカインの量は、翻訳後修飾タンパク質に関する上の記載と同様にして測定され得る。サイトカインは、好ましくは結合パートナー分析、最も好ましくは免疫学的検定を用いて測定される。好ましい結合パートナーは、サイトカインに特異的な抗体およびアプタマーである。診断される動物の体液中のサイトカインのレベルが正常対照からの同一体液中でのレベルと比較して有意に上昇しているかどうかを、上述の方法などの当技術分野で周知の標準的な統計的方法を用いて判定することが可能である。
【０１１２】
詳細には、虫垂炎を含む炎症および炎症性疾患を患う患者で、尿中のＩＬ−８レベルが上昇していることが判明している。国際公開第０１／１１３７１号パンフレットを参照のこと。尿中のＩＬ−８量は、翻訳後修飾タンパク質に関する上の記載と同様にして測定されてもよい。好ましくは、ＩＬ−８は結合パートナー分析を用いて測定される。結合パートナー分析は、好ましくは免疫学的検定、最も好ましくは酵素免疫測定法である。好ましくは、結合パートナーは、ＩＬ−８に特異的な抗体またはアプタマーである。国際公開第０１／１１３７１号パンフレットには、ＥＬＩＳＡ分析での測定によると、正常対照（２０対照）の尿中に３〜４３ｐｇ／ｍｌのＩＬ−８が含まれていたと報告されている。これと比較して、８人の虫垂炎患者は４４〜４３０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−８を有していた。これらのデータの統計的分析は報告されていないが、正常対照と比較して、８人の虫垂炎患者のうち少なくとも５人では、ＩＬ−８レベルが実質的に上昇していた（７４〜４３０ｐｇ／ｍｌ）。
【０１１３】
一般的炎症の、第３の、そして特に好ましいマーカは、一般的炎症のタンパク質マーカである翻訳後修飾タンパク質である。これらのタンパク質が正常動物からの同一体液中のレベルと比較して有意に上昇しているかどうかを判定する方法も含めて、これらの翻訳後修飾タンパク質およびその測定に関しては上述されている。体液、好ましくは血液の成分である１つまたは複数の翻訳後修飾タンパク質が好ましい。血液のタンパク質成分は、アルブミンおよび免疫グロブリンを含む。血液試料は、好ましくは血清または血漿である。最も好ましい一般的炎症のタンパク質マーカは翻訳後修飾アルブミンであり、好ましい翻訳後修飾はリン酸化およびシステイン化である。
【０１１４】
しかし、患者がアスピリンを摂取した場合には、アスピリン（アセチルサリチル酸）がタンパク質をアセチル化することから、翻訳後修飾タンパク質としてアセチル化タンパク質を用いるべきではない。そのような場合には、アセチル化タンパク質のレベルが炎症の存在を正確に反映しないであろう。
【０１１５】
ＯＨＨＡ分析と、一般的炎症のマーカの分析とを併用した場合、一般的炎症のマーカの分析のみの使用、またはＯＨＨＡ分析のみの使用と比較して特異性および診断精度が改善される。詳細には、ＯＨＨＡ分析の結果と、一般的炎症のマーカの分析の結果とが一致している場合、これによって特異性および精度が実質的に改善されることが判明している（例えば、実施例９を参照）。結果が一致しているとは、両方のテストが陽性であるか、または両方のテストが陰性であることを意味する。例えば、ＯＨＨＡの量が正常対照におけるレベルと比較して有意に上昇しており、かつ一般的炎症のマーカの量も正常対照におけるレベルと比較して有意に変化している場合、虫垂炎が示される。同様に、ＯＨＨＡの量が有意に上昇しておらず、かつ一般的炎症のマーカの量も有意に変化していない場合、虫垂炎は示されない。一方のテストが陽性であり、他方のテストが陰性である場合、診断するために別の情報が必要である。例えば、時間をおいて（例えば８〜１２時間後）２つのテストが反復されてもよい。
【０１１６】
また、ＯＨＨＡ分析と、一般的炎症のマーカの分析とを併用する際には、上述されたＯＨＨＡの比色分析スクリーニング・テストのみを使用することも可能である（例えば、実施例９参照）。時間を要して煩雑なＴＬＣ確認試験の使用を省略することが可能である。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、ＯＨＨＡの比色分析スクリーニング・テストを一般的炎症のマーカの分析と併用して虫垂炎を診断する簡単かつ迅速な方法を提供する。
【０１１７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ＯＨＨＡの結合パートナー分析と、一般的炎症のマーカの結合パートナー分析との組合せを提供する。好ましくは、一方または両方の結合パートナー分析は免疫学的検定である。
【０１１８】
Ｆ．キット
本発明はまた、翻訳後修飾タンパク質の量を測定するためのキット、および虫垂炎を診断するためのキットを提供する。これらのキットは、診断装置（例えば自動分析装置）での使用に合わせてフォーマットされたものでもよいし、自己完結的なものでもよい（例えばポイントオブケア診断用）。
【０１１９】
翻訳後修飾タンパク質の量を測定するためのキットは、分析を行うのに有用な試薬を保持する１つまたは複数の容器を含み、これらの容器は特に、翻訳後修飾タンパク質を定量するのに有用な結合パートナーを保持する容器を含む。キットの試薬を入れる適当な容器は、ボトル、バイアル、試験管、およびマイクロタイター・プレートを含む。また、試薬（例えば結合パートナー）は、基質、テスト・ストリップ（例えば、濾紙、ガラス、金属、プラスチック、またはゲルで作製されたもの）、および基質上の結合パートナーの分析を含む結合パートナー分析を行うのに適当な他の装置の表面または中に組み込まれ得る。翻訳後修飾タンパク質を定量する１つまたは複数の分析を行うための取扱説明書がキットと共に提供されよう（この取扱説明書は、例えば、試薬の一部または全てを保持する同一のパッケージ内に提供され得るか、または別の付属文書として提供され得る）。キットは、緩衝液、酵素基質、希釈剤、およびスタンダードなどの当技術分野で公知の他の物質を含んでもよく、これは、商業的観点からも、およびユーザの観点からも望ましい。最後に、キットは、分析実施用、体液の収集、希釈および／または測定用、および／または試薬希釈用の空容器などの容器を含んでもよい。
【０１２０】
虫垂炎を診断するためのキットは、虫垂炎の診断に有用な試薬を保持する１つまたは複数の容器を含み、これらの容器は特に、ＯＨＨＡを分析するための試薬、および／または一般的炎症のマーカを分析するための試薬を含む。キットは、各パーツが分析の一つを行うための試薬および他の物質を提供する２パーツ・キットでもよい。別法として、２つの異なったキットが提供されてもよい。各分析を行うための取扱説明書がキットと共に提供され得る（この取扱説明書は、例えば２パーツ・キットを保持する同一のパッケージ内に提供され得るか、別々のキットを保持する各パッケージ内に提供され得るか、または別の付属文書として提供され得る）。試薬を入れる適当な容器は、ボトル、バイアル、試験管、およびマイクロタイター・プレートを含む。また、試薬（例えば結合パートナー）は、基質、（例えば、濾紙、ガラス、金属、プラスチック、またはゲルで作製された）テスト・ストリップ、および基質上の結合パートナーのアレイを含む結合パートナー分析を行うのに適当な他の装置の表面または中に組み込まれ得る。キットは、緩衝液、酵素基質、希釈剤、およびスタンダードなどの当技術分野で公知の他の物質を含んでもよく、これは、商業的観点からも、およびユーザの観点からしても望ましい。最後に、キットは、分析実施用、体液の収集、希釈および／または測定用、および／または試薬希釈用の空容器などの容器を含んでもよい。
【０１２１】
キットは、ＯＨＨＡ分析を行うために、発色物質（すなわち、ＯＨＨＡと接触した際に発色反応を行うことが可能な物質）を保持する容器を含んでもよい。好ましくは、発色物質は第二鉄イオンを含む。最も好ましくは、発色物質はシリカに結合した第二鉄イオンである。そのようなキットは、体液収集用の容器（シリンジ、プラスチック、または紙コップなど）、体液を測定するための測定器（点滴器、ピペット、またはミクロピペットなど）、および比色チャートまたは既知量のＯＨＨＡを含むスタンダードを保持する容器をさらに含んでもよい。
【０１２２】
別法として、ＯＨＨＡ分析を行うためのキットは、ＯＨＨＡに特異的な結合パートナーを保持する容器を含んでもよい。そのようなキットは、体液収集用の容器（シリンジ、プラスチック、または紙コップなど）、体液の容積を測定するための測定器（点滴器、ピペット、またはミクロピペットなど）、および既知量のＯＨＨＡを含有するスタンダードを含む緩衝液、酵素、酵素基質、および他の試薬を保持する容器をさらに含んでもよい。
【０１２３】
総白血球数、好中球数、好中球バンド・カウント、およびＣ反応性タンパク質などの一般的炎症のマーカを分析するためのキットおよび試薬は周知である。通常、そのようなキットおよび試薬は臨床検査室で既に利用可能であるが、特に２パーツ・キットの一部として提供されてもよい。
【０１２４】
一般的炎症のマーカがサイトカインまたは翻訳後修飾タンパク質である場合、キットはサイトカインまたは翻訳後修飾タンパク質に特異的な結合パートナーを保持する容器を含んでもよい。そのようなキットは、体液収集用の容器（シリンジ、プラスチック、または紙コップなど）、体液の容積を測定するための測定器（点滴器、ピペット、またはミクロピペットなど）、および既知量のサイトカインまたは翻訳後修飾タンパク質を含有するスタンダードを含む緩衝液、酵素、酵素基質、および他の試薬を保持する容器をさらに含んでもよい。
【０１２５】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【０１２６】
実施例１：リン酸化アルブミンは、炎症および虚血のマーカである。
ヒト・アルブミンに対するマウス・モノクローナル抗体（クローンＨＳＡ−１１、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）［ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］、カタログ番号Ａ−６６８４）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で１μｇ／ｍｌに希釈し、この溶液の１００μｌをＥＬＩＳＡストリップ・ウェルの各ウェル（ヌンク社（Ｎｕｎｃ）、Ｆ１６  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）ストリップ、カタログ番号４６９９１４）に添加した。室温での一夜インキュベーション後、抗体溶液を吸引し、ストリップをペーパー・タオル上でブロッティングして乾燥させた。
【０１２７】
次に、４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳを２００μｌ、各ウェルに添加した。室温で１８〜２４時間インキュベートした後、ＢＳＡ溶液を吸引し、ストリップをペーパー・タオル上で乾燥させてブロッティングした。
【０１２８】
その後、各患者の血清または血漿５０μｌを、デュプリケート（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）でウェルに添加した。バックグランドを測定するため、対照として、４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳを５０μｌ、デュプリケートでウェルに添加した。穏やかに震動させながら室温で１時間インキュベートした後、試料を吸引し、ウェルを洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．９〜８．１、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した（ウェルの上まで満たすことで１回の洗浄とした）。
【０１２９】
次に、４％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのウサギ・ポリクローナル抗リンタンパク質抗体（ザイメッド・ラボラトリーズ社（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号６１−８３００）を、４％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に１：１０，０００で希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラビットＩｇＧ（ＨＲＰ；ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号３１４６００）と混合し、この混合液を１００μｌ、各ウェルに添加した。穏やかに震動させながら１時間インキュベートした後、ウェルを上述の洗浄緩衝液で４回洗浄し、各ウェルに１００μｌのＴＭＢ基質（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号Ｎ−３０１）を添加した。３０分間インキュベートした後、１００μｌの停止液（０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を添加して反応を停止した。
【０１３０】
４５０ｎｍおよび５３０ｎｍにおける各ウェルの光学濃度（ＯＤ）を分光光度計プレート・リーダーで読み取った。４５０ｎｍのＯＤから５３０ｎｍのＯＤを引き、この数値からバックグランド（５３０ｎｍのＯＤから４５０ｎｍのＯＤを引いた）を引いた。結果を下記表１に示す。
【０１３１】
【表１】
2010071997.tif 000003
１バックグランドは０．０６９５であった。
【０１３２】
２試料Ｒ２６０、Ｒ２６１、およびＲ２６２では、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を抗凝血物質として用いた。試料Ｒ２５６およびＲ２５８では、ヘパリンを抗凝血物質として用いた。ＥＤＴＡは、アルカリ性ホスファターゼを阻害することが公知であり、試料のリン酸化状態を「フリーズさせる」のに使用可能である（ホスファターゼ阻害剤は、リン酸化タンパク質およびリン酸化ペプチドの脱リン酸化を減少または阻止する）が、この分析でＨＲＰを阻害することがある。
【０１３３】
３ＡＲＤＳ＝成人呼吸窮迫症候群。
４後に、この患者はステロイド治療を受けていたことが判明した。
実施例２：リン酸化アルブミンは、炎症および虚血のマーカである。
【０１３４】
実施例１で記載された分析を、追加の血清および血漿試料を用いて反復した。結果を下記表２に示す。
【０１３５】
【表２】
2010071997.tif 000004
５ＡＭＩ＝急性心筋梗塞
６ＣＰ＝胸痛
７ＰＴＣＡ＝経皮血管形成術
８ＣＡＢＧ＝冠状動脈バイパス移植。
【０１３６】
９タリウム（放射性）の静脈内注入と、心臓に焦点を定めたカメラを用いた放射能分布の検出とを加えた通常のトレッドミル・テスト。運動によって虚血となる領域は灌流が悪く、他の領域や静止時と比較してタリウム・カウントが低い領域として観測される。
【０１３７】
１０ＣＯＰＤ＝慢性閉塞性肺疾患。
１１非Ｑ＝心電図でｑ波が観測されない。
実施例３：リン酸化されたトロポニンＩは、心臓炎症および心虚血のマーカである。
【０１３８】
ヒト心臓トロポニンＩに対するヤギ・モノクローナル抗体（Ｃ−１９、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、カタログ番号ｓｃ−８１１８）を１μｇ／ｍｌでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に希釈し、この溶液１００μｌをＥＬＩＳＡストリップ・ウェル（ヌンク社（Ｎｕｎｃ）、Ｆ１６  Ｍａｘｉｓｏｒｐストリップ、カタログ番号４６９９１４）の各ウェルに添加した。室温での一夜インキュベーション後、抗体溶液を吸引し、ストリップをペーパー・タオル上でブロッティングして乾燥させた。
【０１３９】
次に、４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ２００μｌを、各ウェルに添加した。室温で１８〜２４時間インキュベートした後、ＢＳＡ溶液を吸引し、ストリップをペーパー・タオル上でブロッティングして乾燥させた。
【０１４０】
その後、各患者の血清または血漿５０μｌを、デュプリケートでウェルに添加した。バックグランドを測定するため、対照として、４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳを５０μｌ、デュプリケートでウェルに添加した。穏やかに震動させながら室温で４５分間インキュベートした後、試料を吸引し、ウェルを洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．９〜８．１、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した（ウェルの上まで満たすことで１回の洗浄とした）。
【０１４１】
次に、４％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのウサギのポリクローナル抗リンタンパク質抗体（ザイメッド・ラボラトリーズ社（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号６１−８３００）を、４％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に１：１００００で希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラビットＩｇＧ（ＨＲＰ；ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号３１４６００）と混合し、この混合液を１００μｌ、各ウェルに添加した。穏やかに震動させながら４５分間インキュベートした後、ウェルを上述の洗浄緩衝液で４回洗浄し、各ウェルに１００μｌのＴＭＢ基質（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号Ｎ−３０１）を添加した。３０分間インキュベートした後、１００μｌの停止液（０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を添加して反応を停止した。
【０１４２】
４５０ｎｍおよび５３０ｎｍにおける各ウェルの光学濃度（ＯＤ）を分光光度計プレート・リーダーで測定した。４５０ｎｍのＯＤから５３０ｎｍのＯＤを引き、この数値からバックグランド（５３０ｎｍのＯＤから４５０ｎｍのＯＤを引いた）を引いた。結果を下記表３に示す。
【０１４３】
【表３】
2010071997.tif 000005
１２患者は多血管性疾患を有する７４歳の女性であった。患者は左前下行枝（ＬＡＤ）ステントによるＰＴＣＡを受け、側枝咬合による合併症を起こしていた。患者は、バルーンのインフレーション中に胸痛、心室性律動不整、およびＳＴ変化（心電図におけるＳＴセグメントの変化）を引き起こした。
【０１４４】
実施例４：リン酸化されたトロポニンＩは、心臓炎症および心虚血のマーカである。
米国では毎年、約６００から８００万人の人が胸痛または他の心臓症候（例えば、息切れ、および左腕の疼痛または刺痛）で病院の救急室（ＥＲ）を訪れる。残念ながら、ＥＲから家に帰される３００から４００万人のうち約２〜５％が誤診されている。胸痛の誤診は救急医療過誤審判の主要原因である。
【０１４５】
入院する残りの３００から４００万人のうち、約６０〜７５％は心臓病にかかっていない。入院した各患者の最小コストは＄３，０００〜５，０００であることから、毎年６０億ドル以上の医療費がこれらの不要な入院のために浪費されていることを意味する。
【０１４６】
心電図（ＥＣＧ）が診断をするのに十分特徴的でない場合、信頼可能な初期バイオマーカは存在しない。トロポニンＩまたはトロポニンＴのレベルは、症状の発現後における最初の６〜２４時間の間は感度が低いことから信頼性が低い。ＣＫ−ＭＢおよびミオグロビンは心臓に特異的なものではない。
【０１４７】
検査集団は、胸痛、または急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）を示す症状で来院したＥＲ患者であった。症状の発現後に各患者から採取した最初の血液試料において、正常な心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）およびリン酸化された心臓トロポニンＩ（ＰＯ４−ｃＴｎＩまたはＰＯ４−Ｔｒｏｐ）を測定した。ＰＯ４−ｃＴｎＩは、ヒトｃＴｎＩに特異的なポリクローナル抗体（サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を使用したことを除いては、実施例３の記載の通りに測定した（図６を参照）。レシーバー・オペレーティング・カーブ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）（ＲＯＣ）によって測定された閾値は０．１１４であった。ｃＴｎＩは、デイド・ベーリング社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）のＤｉｍｅｎｓｉｏｎテスト（閾値−ＲＯＣによると０．５９）を用いて測定した。ＥＣＧは、各患者から血液試料を採取した際に行った（閾値−ＳＴＥＭＩすなわち「高リスク」（新規のＳＴ下降における一過性ＳＴ上昇＞０．５ｍｍ））。ＡＣＳは冠動脈造影または医師診断によって診断した。
【０１４８】
患者集団および患者治療成績の詳細を表４に示す。
【０１４９】
【表４】
2010071997.tif 000006
図７Ａ〜７Ｓは、ＡＣＳの診断および除外を行うためのＥＣＧ、ｃＴｎＩ、リン酸化ｃＴｎＩ（ＰＯ４−ｃＴｎＩまたはＰＯ４−Ｔｒｏｐ）、ならびにこれら３つのパラメータの組合せの感度および特異性を示して比較する。感度＝真の陽性／（真の陽性＋偽陰性）。特異性＝真の陰性／（真の陰性＋偽陽性）。図７Ａ〜７Ｓにおいて、下記の略語は下記の意味を有する。Ｓｅｎｓ＝感度；Ｓｐｅｃ＝特異性；ＳＴＥＭＩ＝ＳＴ上昇心筋梗塞；およびＵＡ＝不安定狭心症。
【０１５０】
図７Ａは、デイド・ベーリング社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）のＤｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｃＴｎＩテストがＡＣＳに低感度および高特異性を有することを示す。図７Ｂは、ＡＣＳ開始後の最初の数時間において、ＡＣＳに対するｃＴｎＩテストの感度が非常に低いことを示す。図７Ｃは、ＥＣＧおよびｃＴｎＩテストの結果とを併用することによって、ＡＣＳを除外する感度の増大が実現したことを示す。図７Ｄは、ＥＣＧおよびｃＴｎＩテストの結果とを併用することによって、ＡＣＳ開始後の初期数時間におけるＡＣＳを除外する感度が増大したことを示す。図７Ｅは、全ての患者（ｎ＝６７）でのｃＴｎＩテストおよびＰＯ４−ｃＴｎＩテストの感度および特異性の比較を示す。図７Ｆは、症状の発現後の最初の数時間におけるｃＴｎＩテストおよびＰＯ４−ｃＴｎＩテストの感度の比較を示す（テストは最初の血液採取でのみ行ったので、患者数が異なる）。図７Ｇは、症状の発現後の最初の数時間におけるｃＴｎＩテストおよびＰＯ４−ｃＴｎＩテストの特異性の比較を示す。図７Ｈは、ＥＣＧ、ｃＴｎＩ、およびＰＯ４−ｃＴｎＩの結果を併用することによって、ＡＣＳ（全患者、ｎ＝６７）を除外する感度が、各テスト単独またはＥＣＧおよびｃＴｎＩの併用と比較して増大したことを示す。図７Ｉは、ＥＣＧ、ｃＴｎＩ、およびＰＯ４−ｃＴｎＩの結果を併用することによって、症状の発現後の最初の数時間におけるＡＣＳ（全患者、ｎ＝６７）を除外する感度が、ＥＣＧ結果およびｃＴｎＩ結果の併用と比較して増大したことを示す。図７Ｊは、ｃＴｎＩおよびＰＯ４−ｃＴｎＩの結果を併用することによって、ＳＴＥＭＩサブグループの患者（ｎ＝１７）でＡＣＳに対する感度が増大したことを示す。図７Ｋは、ＵＡかつ非ＳＴＥＭＩサブグループの患者（ｎ＝２１）で、ＰＯ４−ｃＴｎＩテストにおけるＡＣＳを除外する感度がはるかに大きく、ＥＣＧ、ｃＴｎＩ、およびＰＯ４−ｃＴｎＩの結果を併用することによって、ＡＣＳを除外する感度が増大したことを示す。図７Ｌは、ＵＡおよび非ＳＴＥＭＩサブグループの患者（ｎ＝２１）で、ＥＣＧ、ｃＴｎＩ、およびＰＯ４−ｃＴｎのＩ結果を併用することによって、ＥＣＧおよびｃＴｎＩの併用と比較して、症状の発現後の初期数時間におけるＡＣＳを除外する感度が増大したことを示す。図７Ｍは低リスクＥＣＧサブグループの患者（ｎ＝４２）で、ＰＯ４−ｃＴｎＩテストにおけるＡＣＳを除外する感度が他より高く、ｃＴｎＩ、およびＰＯ４−ｃＴｎＩの結果を併用することによって、ＡＣＳを除外する感度が増大したことを示す。図７Ｎは、ＵＡサブグループの患者（ｎ＝１０）で、ＰＯ４−ｃＴｎＩテストにおけるＡＣＳを除外する感度が１００％であり、ｃＴｎＩおよびＰＯ４−ｃＴｎＩの結果を併用することによって、ＡＣＳを除外する感度の増大がないことを示す。図７Ｏは、症状の発現後の最初の数時間におけるＥＣＧおよびＰＯ４−ｃＴｎＩのＡＣＳに対する特異性を示す。図７Ｐおよび７Ｑは、ＥＣＧのＡＣＳに対する低感度および高特異性を示す。図７Ｒは、全ての患者（ｎ＝６７）でのＥＣＧおよびＰＯ４−ｃＴｎＩのＡＣＳに対する感度および特異性の比較を示す。図７Ｓは、全ての患者（ｎ＝６７）で、ＥＣＧと比較して��Ｏ４−ｃＴｎＩテストにおけるＡＣＳに対する感度がはるかに高いことを示す。
【０１５１】
図７Ａ〜７Ｓに見られるように、ＰＯ４−ｃＴｎＩの測定は、ｃＴｎＩ、ＥＣＧ、およびこれらの２つのパラメータの併用と比較して、特に症状の発現後、最初の１２〜２４時間の間で非常に高い感度を示す。ＰＯ４−ｃＴｎＩによって実現された特異性も非常に高かったが、ｃＴｎＩまたはＥＣＧによって実現された特異性ほどは高くなかった。
【０１５２】
図８は、本発明のＰＯ４−ｃＴｎＩ分析と、ＡＣＢ（商標）テスト（イスキミア・テクノロジー社（Ｉｓｃｈｅｍｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）［コロラド州アルバダ（Ａｒｖａｄａ）所在］）との感度および特異性の比較を示す。ＡＣＢ（商標）テストの感度および特異性は、ウー（Ｗｕ）ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｔｏｘｉｃｏｌ、第１巻、１〜５頁（２００１年）、およびクリステンソン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ）ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、第４７巻、４６４〜４７０頁（２００１年）に報告されているものの加重（各検査における患者数で調整された）平均である。ＡＣＢ（商標）テストは、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  Ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認された心虚血を除外するための比色分析法である。アルブミンに対するコバルト結合の変化が測定される。図８に見られるように、本発明のＰＯ４−ｃＴｎＩ分析は、ＡＣＢ（商標）テストで見られるものよりはるかに高い感度と、はるかに良い特異性との両方を示した。
【０１５３】
実施例５：胎盤虚血の診断およびモニタリング
アルブミンは最も多量に含まれている血漿タンパク質であるが、主に翻訳後修飾の結果として生じる様々な分子種の集合として存在している。高分離度質量分光分析法を用いてこれらの分子種を正確に可視化して、これらの分子種の相対量を定量することで、アルブミン・プロフィールを作成することが可能である。
【０１５４】
血漿試料を１７人の妊娠女性から収集したが、これらの女性のうち、１２人の妊娠は胎児発育不全（ＦＧＲ）の影響を受けたものであった。検査対象は、母体胎児医学（ＭＦＭ）の実践において合併症を伴う妊娠とされた患者の中から選択された。パイロット研究のための試験対象患者基準は以下の通りであった。すなわち、
超音波による推定胎児体重＜在胎齢における１０パーセンタイルであり、これに加えて、
・羊水指標（ＡＦＩ）＜８、または
・脈波ドップラー測定による心臓収縮期対弛緩期（Ｓ／Ｄ）の臍動脈血流速度比＞３、または
・標準的な臨床規準で定義される子癇前症。
【０１５５】
この検査グループには１２人の患者がいたが、このうち１１人が単胎妊娠であり、１人が双生児妊娠であった。１人の双生児の妊娠を含んでいる対照グループには５人の患者がいた。検査グループにおける生下時の在胎齢は２６．３〜３８週の間で、平均在胎齢が３０．２週であったが、これに対して、対照グループでは平均在胎齢が３８週であった。平均生下時体重は、検査グループでは１０１６グラムであり、これに対して対照グループでは３１１４グラムであった。検査グループの出生時体重パーセンテージは平均＜１０％であったが、これに対して対照グループでは４３％であった。１２人の検査患者のうちの１０人で臍動脈ドップラー血流検査の結果を得た。これらの結果はすべて異常であったが、２人の患者で拡張終期血流の逆流があり、６人で拡張終期血流の途絶があり、そして、２人がＳ／Ｄ比＞３．０を有していた。１２人の検査患者のうちの９人は、子癇前症を有していた。１２人の検査患者のうちの２人は、ＨＥＬＬＰ症候群を有していた。
【０１５６】
正常患者から得た標本アルブミン・プロフィールを図１に示す。多数の分子種があることに留意されたし。各分子種を以下に同定する。
・天然アルブミン
・システイン化天然アルブミン（シスタチオニンβ−シンセターゼの阻害）
・Ｃ末端ロイシンを失った天然アルブミン（カルボキシペプチダーゼ活性の増大）
・Ｎ末端のアスパラギン酸−アラニンを失った天然アルブミン（Ｎ末端の環化）
・Ｃ末端ロイシンを失っており、かつシステイン化された天然アルブミン
・Ｎ末端のアスパラギン酸−アラニンを失っており、かつシステイン化された天然アルブミン
・糖化天然アルブミン−最大３箇所のグリケーション（高血糖ストレス関連）
・システイン化され、かつ糖化された天然アルブミン
・リン酸化天然アルブミン（表面キナーゼ活性の増大）
・Ｃ末端ロイシンを失っており、かつホモシステインを付加された天然アルブミン。
【０１５７】
７つの分子種のアルブミンが、胎盤虚血を起こした女性と正常妊娠の女性との間で相違を示すものとして同定された。示されたこれらの分子種それぞれの総アルブミン量の割合を計算した。検出された分子種とそれらの相対的な割合とに関する概要を下記に示す（表５）。
【０１５８】
表５：胎盤虚血のパイロット研究における、アルブミンの多様な分子種の相対的レベル
【０１５９】
【表５】
2010071997.tif 000007
１３Ａｌｂ．＝アルブミン
１４＋Ｃｙｓ＝システイン化
１５−Ｌｅｕ＝Ｃ末端ロイシンを欠失
１６−ＤＡ＝Ｎ末端の２つのアミノ酸、アスパラギン酸およびアラニンを欠失
１７＋Ｈｏｍｏｃｙｓ＝ホモシステイン化
１８ＰＩ＝胎盤虚血
有意差があったかどうかを明らかにするために、これら２つのグループ（正常および胎盤虚血）を比較した。研究者のｔ検定による両側検定を用いた。これらのグループ相互における最も明白な相違が、天然アルブミン対システイン化アルブミンの比率であるのが見て取れた。図２を参照のこと。図２は、正常妊娠から胎盤虚血を伴う妊娠に向かって、システイン化が増大しているシフトの例を示す。システイン化型対天然型の完全な反転があることに留意されたし。胎盤虚血を伴った妊娠と比較した正常妊娠におけるシステイン化アルブミンのレベルの相違は、統計的に有意性が高いことが判明した（図３を参照）。
【０１６０】
これらのグループ間で最も明白な相違が天然アルブミン対システイン化アルブミンの比率であり、かつ相対的比率が分析されたことから、この大幅な相違が他のものの相対的な割合にも影響を及ぼしているかもしれないと推論した。この現象を最小化し、残りマーカにおける相違が本当に有意なものであったのかどうかを明らかにするため、システイン化アルブミンとそれらに対応する天然種を排除することによって、データを再度正規化した（図４を参照）。
【０１６１】
図３および図４は、これら２つのグループ（胎盤虚血対正常）相互の相違を示す１セットのボックス・プロットおよびｐ値を示す。７個の初期マーカの全てが有意であると示されたことに留意されたい。
【０１６２】
胎盤虚血における有意性の高いシステイン化アルブミンの増大は、以下の通りに説明され得る。末梢血管系疾患および虚血中における血漿中の銅、ホモシステイン、およびシステイン化アルブミンの公知の増加は、硫黄転移経路（図５）を通して一体化され得る。この経路の調節における重要酵素はシスタチオニンβ−シンセターゼ（ＣＢＳ）である。この酵素は、ホモシステイン尿症で欠失しており、ヘム含有酵素であるので酸化還元センサーであるかもしれない。バネルジー、アール（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｒ．）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、２００３年、第１６４７（１−２）巻、３０〜５頁。酸化性条件下では、明らかにこの酵素の活性が促進される。対照的に、還元条件下では活性が低下する。この酵素が胎盤虚血（還元条件）中に阻害されるなら、それによって血漿ホモシステインのレベルの上昇が説明される。このホモシステインが次に、母親における酸化性条件下でシステインに変換され、この結果母体循環におけるシステイン化アルブミンのレベルの上昇がもたらされる。末梢血管系疾患の患者における血漿中の総ホモシステインと銅との間の相関関係が報告されているが（マンソール、エム  エー（Ｍａｎｓｏｏｒ，Ｍ．Ａ．）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２０００年、第４６（３）巻、３８５〜９１頁）、胎盤虚血後にもこの関係があるかはまだ知られていない。これが実際にその通りなら、公知であるＣｕ（Ｉ）とＣｕ（ＩＩ）との間の酸化還元フラックスそれ自体、または、銅および血漿アスコルビン酸からのフリー・ラジカルの生成（バールオール、ディー（Ｂａｒ−Ｏｒ，Ｄ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２００１年、第２８４（３）巻、８５６〜６２頁）さえも、硫黄転移経路を通る流れの方向に影響を及ぼし得る。このようにして、血漿中の遊離銅の増加のみでも血漿ホモシステインの逐次的増加、ならびに、それに続くシステインの変換、およびシステイン化アルブミンの生成を引き起こすかもしれない。硫黄転移経路によって、胎盤虚血を患う患者で観測されたシステイン化アルブミンのレベルの上昇が説明される。
【０１６３】
β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、および妊娠関連タンパク質１Ａ（ＰＡＰ  １Ａ）などの胎盤特異的または胎児特異的な他のタンパク質のシステイン化と、アシル化、リン酸化、グリコシル化、およびニトロシル化などの他の翻訳後修飾とが分析される。上述したタンパク質は、母体血漿、羊水、および胎児臍静脈血漿から抽出され、注目している様々な分子種（アセチル化、リン酸化、糖化、システイン化、およびニトロシル化）の存在がＬＣ  ＥＳＩ／ＭＳによって分析される。詳細には、システイン化、リン酸化、およびニトロシル化経路が虚血および炎症に関連しており、システイン化、リン酸化および／または、ニトロシル化されたタンパク質（例えば、アルブミン、βＨＣＧ、ＡＦＰ、およびＰＡＰ  １Ａ）のレベルが虚血の程度を示すと予測される。
【０１６４】
実施例６：ＥＬＩＳＡによる胎盤虚血の診断およびモニタリング
母親のシステイン化アルブミン・レベルの上昇は、ヒト血清アルブミンのシステイン化したシステイン残基を含有するペプチドに対して産生させた抗血清を用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を行うことによって、検出および定量化され得る。抗血清は以下の通りに作製される。ヒト血清アルブミンのアミノ酸２８から４１に対応するペプチドが合成される。遊離システインの存在下において、わずかにアルカリ性の環境でペプチドを加熱することによって、残基３４のシステインのシステイン化が起こる。質量分析によるペプチド・システイン化の検証が行われ、その後、抗原が担体タンパク質に結合される。２５０μｇの抗原による一次免疫が２頭のウサギに注射され、それに続いて１００μｇの追加注射が３回なされる。７０日目に両方の動物から得た血清に、反応性抗体が含まれるか検査される。
【０１６５】
上述した方法で得られたウサギ抗血清と、抗ヒト血清アルブミン捕捉抗体とを用いて、システイン化アルブミンＥＬＩＳＡが開発される。ＥＬＩＳＡストリップ・ウェル・プレート上にコーティングされた抗ヒト血清アルブミン抗体を用いることで、患者の血漿および／または血清から得た母性血清アルブミンが捕捉される。ウェル中に存在するシステイン化アルブミンを定量するために、抗システイン化アルブミン抗血清およびホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧの逐次インキュベーションが行われる。ＥＬＩＳＡの検証および検出限界は、インビトロで生成された既知レベルのシステイン化アルブミンを用いることで測定される。
【０１６６】
ＥＬＩＳＡに用いられる抗体は、１つの抗体がもう一方の抗体の結合部位を遮蔽しないことを確実にするために、適切に適合される。抗原部位がシステイン化部位から離れている捕獲抗体を選択することで、システイン化アルブミンを捕捉する確率が増大する。さらに、システイン残基３４が抗体産生に選択されたが、別の残基が含まれてもよい。ヒト血清アルブミンのシステイン３４は、天然タンパク質の上の唯一の遊離システインであるが、他のシステイン残基も虚血イベント中に曝露されるかもしれない。
【０１６７】
また、システイン化アルブミンのレベルは、葉酸による処理によって影響されることがある。葉酸はホモシステインをメチオニンに再メチル化し、これによってシステインの形成が回避されることが公知である。摂取された葉酸の量も考慮に入れられる。
【０１６８】
βＨＣＧ、ＡＦＰ、およびＰＡＰ１Ａなどの胎盤特異的または胎児特異的な他のタンパク質のシステイン化と、リン酸化、ニトロシル化などの他の翻訳後修飾とがＥＬＩＳＡで分析される。システイン化、リン酸化、およびニトロシル化経路は虚血および炎症に関連しており、システイン化、リン酸化および／またはニトロシル化されたタンパク質（例えば、アルブミン、βＨＣＧ、ＡＦＰ、およびＰＡＰ  １Ａ）のレベルは、虚血の程度を示すはずである。
【０１６９】
実施例７：胎盤虚血を早期検出するための妊娠モニタリング
虚血バイオマーカの中には、ＦＧＲが臨床上明らかになる前にレベルが上昇するものもあると予想される。したがって、妊娠中の連続的試料採取のために、様々な危険因子を有する患者が正常妊娠の女性と共に選ばれる。
【０１７０】
ＦＧＲのリスクがある妊娠を同定するために、以下の試験対象患者基準が用いられる。すなわち、
・以前における重度子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）新生児（＜５パーセンタイル）の妊娠；
・以前における胎児体重が＜１０パーセンタイルである子宮内胎児仮死（ＩＵＦＤ）；
・中レベルまたは高レベルの抗カルジオリピンＩｇＧ；
・高血圧の有無にかかわらず、血清クレアチニン（ＳＣｒ）が＞１．５ｍｇ／ｄｌである腎臓疾患；そして、
・未経産、かつ２番目の三半期におけるスクリーニングで母方α−フェトプロテイン（ＭＳａＦＰ）および／または母方ヒト絨毛性ゴナドトロピン（（ＭＳｈＣＧ）＞＝３．０中央値倍数（ＭＯＭ）。
【０１７１】
正常対照妊娠は、通常の超音波予定日判定のために来診した以下の臨床的特徴のいずれもない女性の中から選択される。すなわち、
超音波による推定胎児体重＜在胎齢における１０パーセンタイルであり、これに加えて、
・羊水指標（ＡＦＩ）＜８、または
・脈波ドップラー測定による心臓収縮期対弛緩期（Ｓ／Ｄ）の臍動脈血流速度比＞３、または
・標準的な臨床規準で定義される子癇前症、および
以下に示す胎盤不全の他の危険因子がない：
・以前における重度ＩＵＧＲ新生児（＜５パーセンタイル）の妊娠；
・以前における胎児体重＜１０パーセンタイルのＩＵＦＤ；
・中レベルまたは高レベルの抗カルジオリピンＩｇＧ；
・高血圧の有無にかかわらず、ＳＣｒ＞１．５ｍｇ／ｄｌである腎臓疾患；
・２番目の三半期におけるスクリーニングでＭＳａＦＰおよび／またはＭＳｈＣＧ＞＝３．０  ＭＯＭ；および
・同定されたプロトロンビン条件（プロテインＳ、プロテインＣ、またはアンチトロンビンＩＩＩの欠乏、あるいは因子Ｖ、因子ＩＩ、またはメチルテトラヒドロ葉酸環元酵素（ＭＴＨＦＲ）の通常変異）。
【０１７２】
ＦＧＲ新生児を分娩した対照妊娠は事後に除外される。
これらの規準を用いて、３つの集団が現れる。すなわち、ＦＧＲ乳児を分娩する検査患者、ＡＧＡ乳児を分娩する検査患者、およびＡＧＡ乳児を分娩する対照患者である。これらの３つの集団が別々に分析される。
【０１７３】
検査患者（リスクのある妊娠）および対照患者は妊娠１６〜２０週間で同定される。母親血清の試料（妊娠１６〜２０、２４〜２８、および３２〜３６週）および新生児静脈および動脈臍帯血の試料は、＋／−２週間に在胎齢を合わせて収集される。検査患者および対照患者が臨床適応のために羊水穿刺を行う際には、１〜２ｃｃアリコートの羊水も分析用に収集される。
【０１７４】
試料は、質量分析とＥＬＩＳＡによって、少なくともシステイン化タンパク質、リン酸化タンパク質、およびニトロシル化タンパク質を含む翻訳後修飾タンパク質について分析される。
【０１７５】
実施例８：システイン化アルブミンは腸虚血マーカであり、かつ多臓器不全の初期マーカである。
ホモシステインは、メチオニンの代謝における中間体であり、硫黄転移経路におけるシステインの前駆体である（図５）。シスタチオニンβ−シンセターゼ（ＣＢＳ）は、硫黄転移経路における主要調節酵素である（図５）。ＣＢＳは酸化還元センサーであり得る。明らかにＣＢＳの活性は還元環境（↓ｐＨ、低Ｏ２）で低下し、酸化性環境（↑ｐＨ、↑Ｏ２）で上昇している。したがって、アシドーシスと低酸素濃度（すなわち、還元条件）とを特徴とする虚血イベント中では、ＣＢＳの活性が阻害されるはずであり、ＣＢＳの阻害は、虚血組織および高ホモシステイン血症で、血流中におけるホモシステインの蓄積を引き起こすはずである。この仮説を腸虚血および多臓器不全（ＭＯＦ）のラット・モデルでテストした。
【０１７６】
１０頭の対照グループ病原体不在オスＳＤ系ＣＤラットを、まずイソフルランによって、そして、それに続いてペントパルビトンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｅｎｔｏｐａｒｂｉｔｏｎｅ）（６０ｍｇ／ｋｇ体重）を静脈内注入するよって麻酔にかけた。各ラットの気管にポリエチレン・チューブのカニューレを挿入し、必要に応じて右頚静脈にもペントパルビトン（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔｏｎｅ）の追加投与用にポリエチレン・チューブのカニューレを挿入した。正中腹部切開を行って再縫合した。手術の２時間後に縫合を取り除き、スペンサー・ウェルズ（Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｗｅｌｌｓ）で固定することによって閉腹した。ラットはさらに１時間麻痺状態におき、その後、全採血して犠牲にした。
【０１７７】
１０頭の実験グループ病原体不在オスＳＤ系ＣＤラットに、対照グループと同じ処理を行ったが、その際、腹部切開を縫合する前に小さな金属動脈クリップを上腸間膜動脈に配置した。金属クリップを２時間後に取り外し、腹部切開をスペンサー・ウェルズで閉腹した。これら実験グループ・ラットは、動脈クリップの除去１時間後に全採血して犠牲にした。
【０１７８】
血液をヘパリン化チューブ中に収集し、４℃、４０００ｒｐｍで、１０分間遠心して血漿を調製した。血漿試料はその後の分析用に−８０℃で凍結した。
ホモシステイン・レベルは、ＩＭＭＵＬＩＴＥ２０００分析器と、Ｌ−ホモシステイン定量測定用キットとを用いて測定した。
【０１７９】
総アルブミンは、ブロモクレゾールグリーン（ＢＣＧ）分析（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）［ミゼリー州セントルイス所在］）を用いて測定した。簡潔には、血漿５μｌとアルブミン試薬（ＢＣＧ）１ｍｌとを混合した。６２８ｎｍにおける測定を、島津製作所（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）製ＵＶ１６０Ｕ分光光度計を用いて、デュプリケートでアルブミン試薬なしのブランクとの比較において行った。
【０１８０】
アルブミンは、ＳｗｅｌｌＧｅｌ（登録商標）Ｂｌｕｅ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌキット（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）［イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在］）を用いて単離した。簡潔には、血漿１００μｌを、水和したＣｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｌｕｅ樹脂を含んだカラムに添加した。カラムを結合／洗浄緩衝液でリンスし、１Ｍ  ＮａＣｌでアルブミンを溶出した。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０フィルター（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）［マサチューセッツ州ベドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）所在］）を用い、蒸留水でリンスすることによって試料を脱塩した。
【０１８１】
アルブミンを分析するために、ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ）製２７９４ＨＰＬＣシステムを使用し、Ｃ−４  ２５０ｍｍ分析用カラム、および水／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）アセトニトリル／ＴＦＡ勾配系、ならびに＋ＥＳＩのＭｉｃｒｏｍａｓｓＬＣＴ質量分析計を用いてＥＳＩ／ＭＳ法およびＬＣ−ＭＳ法を行った。システイン化の割合は、この結果得られた質量スペクトログラムにおける全アルブミン種の血中濃度曲線下面積から計算された。
【０１８２】
実験グループ・ラットでは、血漿中のホモシステイン・レベルが対照グループ・ラットより２．５倍高かった（ｐ＝０．００００００１７）。ホモシステイン・レベルは、実験グループ・ラットでは８．５±１．５μＭであり、対照グループ・ラットでは３．３±１．１μＭであった。
【０１８３】
これら２つのグループのアルブミン・レベルには差がなかった。対照グループと実験グループにおけるアルブミン・レベルは、それぞれ２４．３±２と２３．１±１．９ｍｇ／ｍｌであった。
【０１８４】
ＬＣ−ＭＳおよびＥＳＩ／ＭＳによって、実験グループ・ラットのアルブミンの全てが様々なシステイン化分子種として存在する（すなわち、１００％のアルブミンがシステイン化されている）ことが示された。対照グループでは、総アルブミンの５１．１５±８．７７％のみがシステイン化されていた。対照グループ・ラットおよび実験グループ・ラットにおけるアルブミンの典型的なＭＳプロフィールを図９Ａおよび９Ｂに示す。上腸間膜動脈の結紮は重度の腸虚血をもたらす。この結紮は、単独で、そして虚血腸の再潅流と組み合わせて、腸虚血のモデル、およびＭＯＦ誘導のモデルとして用いられている。
【０１８５】
この研究では、腸虚血および再潅流が血漿ホモシステイン・レベルの有意な増大に関連することが実証された。このホモシステインは、おそらく虚血腸で形成され、その後、体循環系に放出されたものである。酸化物質の存在下において正常な末梢循環中のホモシステインは、システインに代謝され、このシステインが次にシスチンに転換される（図５）。シスチンは、遊離チオールの存在下でタンパク質をシステイン化する。
【０１８６】
実験グループでは、アルブミンのシステイン化分子種の形成が確証的に示されている。アルブミン・システイン化の生理的重要性を過小評価するべきではない。例えば、ヒト・アルブミンにおけるＣｙｓ３４の遊離チオールは血漿抗酸化物質還元能の９０％以上を提供する。これらの遊離チオール基がシステイン化によって酸化されると、酸化的ストレスに対処する血漿の緩衝能力が著しく低下して組織障害の原因となる。
【０１８７】
データは、システイン化アルブミンが腸虚血のバイオマーカであることを示す。さらに、システイン化アルブミンの量は、虚血傷害の重篤度の指標（すなわち、システイン化アルブミンの量が多いほど、虚血が重度である）としても有用であり得る。
【０１８８】
虚血イベント中において、中間体であるホモシステインのレベルが高いことは、担体タンパク質からの銅の遊離と併せて、観測される組織障害の原因となる。銅の存在はアシドーシス／虚血を起こした組織で一般的であるが、銅の存在下ではホモシステイン銅複合体が形成される。ホモシステイン銅複合体は、内皮細胞に対して有害であり、また、他の細胞系列に対しても潜在的に有害である。
【０１８９】
上述のように、上腸間膜動脈結紮モデルは、多臓器不全（ＭＯＦ）のモデルとして認められており、ラットは、再潅流フェーズ後にＭＯＦを発症する。したがって、システイン化アルブミンは、ＭＯＦの初期マーカでもあることが判明している。
【０１９０】
この結論は、ヒトＭＯＦ患者におけるホモシステイン・レベルが測定され、１．５倍から２．０倍の増大があることが見いだされたという事実によっても支持される。例えば、ある患者は、ＭＯＦを患っている間、１６．７μＭのホモシステイン・レベルを有した。この患者に集中治療を行い、そして患者がＭＯＦから回復した後では、ホモシステイン・レベルが３．１μＭにまで低下していた（正常ヒトのホモシステイン・レベルは５〜１２μｍである）。
【０１９１】
実施例９：虫垂炎診断の改良法
腹痛は救急科および医師の診療室で患者が訴えることの最も多い病訴の１つであり、かつ、虫垂炎は緊急の外科的介入を必要とする急性腹痛の最も一般的な原因である。グラフ（Ｇｒａｆｆ）ら、Ａｃａｄ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第７巻、１２４４〜１２５５頁（２０００年）；ベリー（Ｂｅｒｒｙ）ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、第２００巻、５６７〜５７５頁（１９８４年）。急性虫垂炎の疑いがある患者の初期臨床評価は通常、外科医ではなく、むしろ救急医師や家庭医が行う。急性虫垂炎の正しい診断は、臨床医の技術および経験に大きく依存している。スターンバッハ（Ｓｔｅｒｎｂａｃｈ）ら、Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１３巻、９５〜９６頁（１９９５年）；ヘール（Ｈａｌｅ）ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、第２２５巻、２５２〜２６１頁（１９９７年）。徴候および症候が微妙で非定型的な場合には、誤診となることが多く、そして、診断が遅れれば治療成績の悪化につながり得る。ジャーン（Ｊａｈｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６３巻、４３３〜４４３頁（１９９７年）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、７９８〜８０２頁（２０００年）。最近の多施設調査では、腹痛で救急病棟を訪れた患者を、延長した観察を行わずに虫垂炎と診察した場合、その初期診察が誤診である比率が約２０％に達すると報告された。グラフ（Ｇｒａｆｆ）ら、Ａｃａｄ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第７巻、１２４４〜１２５５頁（２０００年）。急性虫垂炎の初期誤診率は、女性および子供で顕著に高くなっている。ロスロック（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ）ら、Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１３巻、１〜８頁（１９９５年）；ロスロック（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ）ら、Ａｎｎ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第３６巻、３９〜５１頁（２０００年）。
【０１９２】
ｏ−ヒドロキシ馬尿酸（ＯＨＨＡ）は、ヒト尿の正常成分である。予備的な臨床知見は、尿中におけるＯＨＨＡの増加と急性虫垂炎との間に関連がある可能性を示唆する。急性腹痛に苦しむ救急科患者に対するこの前向きで非介入的な研究において、急性虫垂炎の疑いに対する初期臨床評価を行う際に、尿中ＯＨＨＡの迅速かつ簡単なテスト（ＡｐｐｙＴｅｓｔ（登録商標）分析、ディーエムアイ・バイオサイエンスインコーポレティッド（ＤＭＩ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）［コロラド州イングルウッド（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ）所在］）を単独で行った場合の診断価値と、初期白血球数と併用した場合の診断価値とを検討した。特異性および診断精度を向上させる単純な診断試験は、費用に敏感な医療環境において臨床医が急性虫垂炎の疑いのある患者を効率的かつ経済的に評価する補助となり得る。
【０１９３】
Ａ．方法および材料
都市および郊外の教育提携がある３つの共同体付託病院、すなわちヘルスワン・スウェーディッシュ・メディカル・センター（ＨｅａｌｔｈＯｎｅ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）［コロラド州イングルウッド（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ）所在］、エクゼンプラ・セント・ヨゼフ病院（Ｅｘｅｍｐｌａ  Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）［コロラド州デンバー（Ｄｅｎｖｅｒ）所在］、およびセンチュラ・ヘルス・ポーター・アドベンティスト病院（Ｃｅｎｔｕｒａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｏｒｔｅｒ  Ａｄｖｅｎｔｉｓｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）［コロラド州デンバー（Ｄｅｎｖｅｒ）所在］で、虫垂炎の疑いのある急性腹痛で救急科に来院した患者を、この前向き研究に１日２４時間連続的に登録した。各施設において施設内審査委員会承認を得て、全ての患者または患者の正式代表者からインフォームド・コンセントを得た。試験対象患者基準は以下の通りである。すなわち、いかなる年齢でもよく、症候に最近開始した腹痛が含まれ、かつ初期問診および身体検査で経験豊富な救急専門医によって急性虫垂炎の疑いがあると診断された患者である。患者の問診、試料の取り扱い、および研究に関連したすべてのデータ収集は、独立した臨床試験代表者の責任でなされた。病歴および身体検査データを含めた患者情報は、救急科における初期検査の間に、そして、いかなる診断試験結果が知られる前に、形式化されたデータ機器に記録した。
【０１９４】
除外規準は以下の通りであった。すなわち、以前の虫垂切除、病前腹部病態（例えば、外傷、膵炎、腸閉塞症、切迫流産、胃腸出血）、臨床的黄疸、転移癌、腹部外科手術の経歴もしくは先行３カ月以内における腹痛の病訴、または、研究の検査前＞７２時間に症候の開始を有する患者である。フェノール成分（例えばフェノチアジン）およびサリチル酸は、擬陽性のＯＨＨＡ結果を引き起こし得る（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅ）ら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、第１５巻、１１１〜１１７頁（１９７４年））。したがって、先行２４時間以内にそれらの化合物を摂取した病歴を有する患者は除外した。抗生物質は腸内細菌に影響を与え得るので、先行２４時間以内に経口抗生物質を摂取した患者は除外した。尿試料収集の１２時間以上後まで外科的介入が遅延した患者はこの研究から除外した。ＯＨＨＡ分析結果を知らされず、かつ経験が豊富で完全に訓練された救急専門医および外科専門医が、治療のローカル・スタンダードに従って、全ての診断および処置決定を行った。臨床成果を記録するために、研究代表者は初期検査の７日以内に患者に電話問診を行い、それぞれの医療記録を再検討した。
【０１９５】
最初に救急科に来院した際に全患者の尿試料を収集して４℃で冷蔵した。尿試料は、白血球数試料を取得する時間の１時間以内に収集した。ＯＨＨＡの比色分析（ＡｐｐｙＴｅｓｔ（登録商標）分析キット、ディーエムアイ・バイオサイエンスインコーポレティッド（ＤＭＩ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）［コロラド州イングルウッド（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ）所在］）は、１〜７日以内に独立した臨床検査室（コロラド大学健康科学センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）［コロラド州デンバー（Ｄｅｎｖｅｒ）所在］）で、訓練された検査技師が盲検法によって行った。簡潔には、ＯＨＨＡ分析法は、１５滴の尿を発色試薬に添加することと、３０秒間混合することとからなり、ピンクから暗褐色または紫色（比色チャートと比較する）に色が変化した場合にテストが陽性であることを示す。再現精度が＞９５％となるＯＨＨＡ分析の視覚検出閾値は、高速液体クロマトグラフィによって尿中ＯＨＨＡ濃度で４０ｍｇ／Ｌに相当することが判明しており、この分析は、最長７日間まで４℃で冷蔵された尿試料において、許容可能な安定性、正当性、および再現精度を有する（データは示されていない）。決定的でない尿中ＯＨＨＡ結果は、ＯＨＨＡ分析比色チャートにない非標準的な色変化として定義され、そのような患者は研究から除外した。この研究の間、医師、医員、患者、臨床試験代表者、および治験依頼者の全員がＯＨＨＡ分析結果を知らずにいた。患者が登録、診断、および治療された後に、独立した研究コーディネーターが症例記録表からの全診断結果および治療成績研究データを集録した。
【０１９６】
総白血球数の自動計数を、救急科来院中に各病院の臨床検査室で行った。白血球数の結果は、以下に示す年齢調整された閾値を超えた際に高いとみなされた。すなわち、≧１８歳、１２．０×１０９／Ｌ；１１〜１７歳、１３．０×１０９／Ｌ；７〜１０歳、１３．５×１０９／Ｌ；４〜６歳、１４．５×１０９／Ｌ；２〜３歳、１５．５×１０９／Ｌである（２歳より幼い患者はいなかった）。この研究の目的においては、年齢調整された白血球数が増加していない場合、その白血球数は「正常である」とみなされた。白血球数が記録されていなかった患者は分析から除外した。
【０１９７】
ＯＨＨＡ分析結果および白血球数を併用した診断指標（特異性、感度、精度、および予測的価値）を、白血球数のみによる診断指標と比較し、論理演算子「ＡＮＤ」を用いて検査した。患者が、１）「陽性で一致している」結果−陽性のＯＨＨＡ結果および高い白血球数、または２）「陰性で一致している」結果−陰性のＯＨＨＡ結果および増加していない白血球数検査結果のどちらかを有した場合、テスト結果が一致しているとみなされた。
【０１９８】
急性虫垂炎の診断は、初期救急評価の後に外科的介入を受けた患者の組織病理学レポートによって確認した。虫垂周囲炎、すなわち虫垂周囲の組織における炎症が存在しても、虫垂の壁内部に炎症がない場合は、急性虫垂炎に関しては陰性であるとみなした。組織病理学検査を行った病理学者は、ＯＨＨＡ分析の結果を知らずにいた。登録された患者のうち、外科的介入が行われずに退院したすべての患者は、１〜７日後に連絡を取り、患者に急性虫垂炎の症候がなく、初期検査の後１２時間以内にいかなる試験開腹もなされなかった場合、急性虫垂炎に関して陰性であるとみなされた。
【０１９９】
診断指標および９５％信頼区間（ＣＩ）の標準的な計算はコンピュータ・プログラムで行った（Ｅｘｃｅｌ  ２０００（登録商標）、マイクロソフト・コーポレイション（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ）、およびＳ−ＰＬＵＳ（登録商標）、インサイトフル・コーポレイション（Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ  Ｃｏｒｐ））。ＯＨＨＡ分析および白血球数結果は、独立性のカイ２乗検定を用いて比較した。有用な２値変数に関連したＯＨＨＡ分析のいかなる他の値も同定するために、ロジスティック回帰を用いた。統計的な有意性は０．０５の信頼度に定めた。
【０２００】
Ｂ．結果
適格であって、かつ７カ月の研究中に参加に同意した３００人の患者のうち、３６人の患者が以下の理由で分析から除外された。すなわち、１８人はＯＨＨＡ分析の結果が決定的でなく、８人の患者は初期臨床評価中に白血球数が取得されず、そして、１０人の患者は他の欠損データがあった。さらに、外科的介入が尿ＯＨＨＡ分析後１２時間以上後まで遅延した５５人の患者が分析から除外され、この結果２０９人の患者が研究グループに残った。研究グループの２０９人の患者のうち、５９人（２８．２％）は救急科から直接移されて外科的介入が行われ、１５０人（７１．８％）は帰宅が許された。帰宅を許された患者には、追跡調査の際に、急性虫垂炎と一致する症候を有した患者も、最初に救急科に来院した後に外科的診査を受けた患者もいなかった。人口統計的データ、および診断データを表６に示す。ＯＨＨＡ分析結果が決定的でなかったために研究から除外された１８人の患者のうち、３人（１６．７％）が虫垂炎にかかっていた。外科的介入が遅延した５５人の患者のうち、３５人（６３．６％）が虫垂炎にかかっていた。
【０２０１】
外科的介入が即座に行われた患者の診断結果は以下の通りであった。すなわち、４４人／５９人（７４．６％）は組織病理学で急性虫垂炎が確認され、８人／５９人（１３．６％）は正常な虫垂を有し、そして７人／５９人（１１．９％）は、亜急性虫垂周囲炎、炎症性リンパ様過形成、虫垂の癒着、臍ヘルニア、卵巣癌、メッケル憩室炎、および卵巣上体嚢胞を含めた他の外科的診断を有していた。急性虫垂炎であった４４人の患者のうち、７人（１５．９％）は、穿孔性虫垂炎を有することが組織病理学で確認された（表６）。
【０２０２】
急性虫垂炎であった４４人の患者の平均年齢は２８．３歳（７歳から６５歳まで）であり、３３人／４４人（７５．０％）が男性で、１１人／４４人（２５．０％）が女性であった（表６）。虫垂炎罹患率は、男性で３３人／８２人（４０．２％）、女性で１１人／１２７人（８．７％）、＞１５歳の成人で３１人／１５８人（１９．６％）、そして≦１５歳の子供で１３人／５１人（２５．５％）であった。医師の記録によると、急性虫垂炎患者のうち、３９人／４４人（８８．６％）に腹壁防御があり、２７人／４４人（６１．４％）に反跳腹部圧痛があり、そして、４１人／４４人（９３．２％）には、右下腹部にのみ局在した腹痛があった。
【０２０３】
【表６】
2010071997.tif 000008
＊組織病理学による診断
全体的に見て、ＯＨＨＡ分析は、５３人／２０９人（２５．４％）の患者で陽性であり、１５６人／２０９人（７４．６％）の患者で陰性であった。白血球数は、８１人／２０９人（３８．８％）の患者で高く、１２８人／２０９人（６１．２％）で正常であった。ＯＨＨＡ分析および白血球数の診断指標を表７に示す。ＯＨＨＡ分析の特異性である８０．６％（９５％ＣＩ、７３．６％〜８６．２％；ｐ＜０．０１）は、白血球数の特異性である６７．９％（９５％ＣＩ、６０．１％〜７４．８％）より有意に高かった。ＯＨＨＡの感度である４７．７％（９５％ＣＩ、３２．７％〜６３．１％）は、白血球数の感度である６３．６％（９５％ＣＩ、４７．７％〜７７．２％）と有意に異なっていなかった。腹部外科手術によって別の外科的診断がなされて正常な虫垂の存在が明らかにされた７人の患者のうち、６人（８５．７％）は陰性のＯＨＨＡ分析結果を有していた。尿比重は１９８人の患者（９４．７％）で記録された。尿比重＜１．０１０であった２６人の患者のうち、２３人は急性虫垂炎に関しての真に陰性であり、２人は偽陰性であり、および１人は真に陽性であった。
【０２０４】
陽性ＯＨＨＡ分析「ＡＮＤ」高白血球数の両方の組合せを陽性結果とする分析は、白血球数のみによる場合の特異性である６７．９％（９５％ＣＩ、６０．１％〜７４．８％）より有意に高い９２．１％（９５％ＣＩ、８６．６％〜９５．６％；ｐ＜０．００１）の特異性を有することを実証した（表７）。この同じ組合せのテスト結果は、診断精度においても、白血球数のみによる場合の６７．０％（９５％ＣＩ、６０．１％〜７３．２％）と比較して有意に高い７８．９％（９５％ＣＩ、７２．７％〜８４．１％；ｐ＝０．００６）という値を示した（表７）。陽性ＯＨＨＡ分析「ＡＮＤ」高白血球数の両方の組合せによる感度は２９．５％（９５％ＣＩ、１７．２％〜４５．４％；ｐ＝０．００１）であり、これは白血球数のみによる場合の感度である６３．６％（９５％ＣＩ、４７．７％〜７７．２％）より有意に低かった（表７）。ＯＨＨＡ分析、および陽性ＯＨＨＡ分析「ＡＮＤ」高白血球数の両方というテストの同じ組合せにおける診断指標を、以下のサブグループ、すなわち男性、女性、＞１５歳の患者、および≦１５歳の患者に関して決定した。各サブグループにおける特異性および精度は、全体的な結果と有意に異なってはいなかった。
【０２０５】
２つのテストの結果の組合せは、１２７／２０９人（６０．８％）の患者で、陽性または陰性で一致し、８２人／２０９人（３９．２％）の患者で一致しなかった。ＯＨＨＡおよび白血球数の一致した結果は、白血球数のみの場合の特異性である６７．９％（９５％ＣＩ、６０．１％〜７４．８％）より有意に高い８７．７％（９５％ＣＩ、７９．６％〜９３．１％；ｐ＜０．００１）の特異性を有することを実証した（表８）。ＯＨＨＡおよび白血球数の一致した結果はまた、白血球数のみによる場合の診断精度である６７．０％（９５％ＣＩ、６０．１％〜７３．２％）と比較して有意に高い８３．５％（９５％ＣＩ、７５．６％〜８９．２％；ｐ＜０．００１）の診断精度を有することを実証した（表８）。陰性で一致した結果、すなわち陰性ＯＨＨＡ分析および正常白血球数の組合せは、９２．１％（９５％ＣＩ、８４．５％〜９６．３％）の陰性予測的価値をもたらし、感度および予測的価値は白血球数のみによる場合と有意に異なってはいなかった。
【０２０６】
９６人の患者からなるサブセットの分析では、ＯＨＨＡの増大と、未成熟「バンド」好中性白血球が＞１０％であることの組合せによっても、虫垂炎の診断精度が改善されるであろうことが予備的に示された。
【０２０７】
目的は、各患者から請求された重要な変数を回帰方程式に含むこと、および虫垂炎との相関関係に効果がないか、あってもほとんどない変数を排除することであった。急性虫垂炎の変数と他の２値変数との間での独立性のカイ二乗検定は、有意である場合には、急性虫垂炎治療成績とは独立でない変数を示し得る。逆に、急性虫垂炎の変数と他の２値変数との間での独立性のカイ二乗検定は、有意でない場合には、ＯＨＨＡ治療成績から独立している変数を示唆し得るものであり、それによって、ＯＨＨＡが予測に寄与する確立をさらに高める。２つの変数が相互に密接な関連を示す場合（例えば、食欲低下および吐き気、または吐き気および嘔吐）、モデルには１つのみが含まれた。この研究では、食欲低下、熱、吐き気、および嘔吐の変数は急性虫垂炎を予測する際にいかなる価値も持っていなかった。以前の報告と同様に、この研究も、白血球数、性別、不壁防御、反跳痛、および腹痛位置を、正しい診断の予測に最も有用な変数として同定した（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１３３〜１４０頁（１９９９年））。この研究では、これらの有用な変数にＯＨＨＡ分析結果を加えることで、残差対数尤度（逸脱）スコアが有意に低下した（１１４．５１対１２０．７５、ｐ＝０．０１３）。これは有用な変数の全てが考慮された場合、ＯＨＨＡ結果が正しい診断に寄与したことを示す。
【０２０８】
【表７】
2010071997.tif 000009
＊白血球数と比較した場合
【０２０９】
【表８】
2010071997.tif 000010
＊白血球数と比較した場合
Ｃ．考察
救急医および初期診療医は多数の腹痛患者の検査を行うが、それらの患者のうち、実際に虫垂炎にかかっている患者はごくわずかである。グラフ（Ｇｒａｆｆ）ら、Ａｃａｄ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第７巻、１２４４〜１２５５頁（２０００年）。虫垂炎の疑いがある患者の初期評価における精度は、臨床医の技術、慎重な観測、および個人的な経験に依存している。スターンバック（Ｓｔｅｒｎｂａｃｋ）ら、Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１３巻、９５〜９６頁（１９９５年）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１３３〜１４０頁（１９９９年）；ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第６２巻、９０６〜９０８頁（１９７５年）；フェルミューレン（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ）ら、Ｅｕｒ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６１巻、４８３〜４８６頁（１９９５年）。現在、急性虫垂炎の診断を確認するために利用可能な特異的な生化学マーカは存在しない。初期の臨床評価は、疼痛の病歴、腹部圧痛の発見、および炎症の非特異的なマーカの結果を統合したものに依存している。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、７９８〜８０２頁（２０００年）。虫垂炎の診断が遅れれば、罹患率および死亡率の増大となり得る。その結果、初期検査法を行った臨床医が、高価な放射線画像診断試験を指示したり、救急の外科診断を要請したり、または院内観測の延長の用意をしたりすることも多い。ストローマン（Ｓｔｒｏｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１７８巻、４８５〜４８９頁（１９９９年）；バクー（Ｂａｃｈｏｏ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．Ｍｔ．、第１７巻、１２５〜１２８頁（２００１年）。ヘリカルＣＴおよびコントラストＣＴ、ならびにおそらく超音波検査は、外科的介入の前に虫垂炎の診断を確認するのを補助するのに十分高い特異性と感度とを有するかもしれない。ストローマン（Ｓｔｒｏｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１７８巻、４８５〜４８９頁（１９９９年）；ピクース（Ｐｉｃｋｕｔｈ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、３１５〜３１９頁（２０００年）；フランキ（Ｆｒａｎｋｅ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１４１〜１４６頁（１９９９年）。しかし、放射線学画像診断試験は、高価で、資源集約的で、かつ多くの臨床状況では容易に利用し得ないものであることから、腹痛の患者の日常的検査には推奨されない。ジャーン（Ｊａｈｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６３巻、４３３〜４４３頁（１９９７年）；フランキ（Ｆｒａｎｋｅ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１４１〜１４６頁（１９９９年）；サルファチ（Ｓａｒｆａｔｉ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、６６０〜６６４頁（１９９３年）。
【０２１０】
知る限りにおいては、この研究は、尿中ＯＨＨＡレベルの上昇と、臨床における急性虫垂炎の疑いを評価する際の特異性および診断精度とを関連づけた初めての研究である。この研究の結果は、急性虫垂炎の疑いがある際に、尿中ＯＨＨＡの閾値濃度を測定する単純かつ迅速な分析が、初期白血球数より有意に高い診断特異性を有することを示す。ＯＨＨＡ分析の特異性がより高いものであることは、単独においても、または初期白血球数と併用した場合でも実証された。
【０２１１】
実に多くの調査が、急性虫垂炎の疑いがある患者の初期臨床評価での診断補助として、総白血球を用いることを推奨している。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、７９８〜８０２頁（２０００年）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１３３〜１４０頁（１９９９年）；ドゥーホルム（Ｄｕｅｈｏｌｍ）ら、Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ、第３２巻、８５５〜８５９頁（１９８９年）；ハーラン（Ｈａｌｌａｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６３巻、５３３〜５３８頁（１９９７年）；グロンロース（Ｇｒｏｎｒｏｏｓ）ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、第４０巻、１７５７〜１７６０頁（１９９４年）。ある報告は、白血球数などの炎症変数には、臨床所見と同等に重要な診断情報が含まれるということさえ示唆している。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１３３〜１４０頁（１９９９）。しかし、広く受け入れられているにもかかわらず、白血球数の擬陽性および偽陰性の両方による虫垂炎の誤診が広く報告されている。ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第６２巻、９０６〜９０８頁（１９７５年）；イングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｈ）ら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、第４３巻、３９９〜４０２頁（１９７７年）；コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、第６４巻、９８３〜９８５頁（１９９８年）。虫垂炎に適合的な病歴、マックバーネー圧痛点における疼痛、および高白血球数からなる古典的な３主徴による診断の精度は、８０％に満たないことが報告されている。グロンロース（Ｇｒｏｎｒｏｏｓ）ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、４０巻、１７５７〜１７６０頁（１９９４年）。精度を向上させるために診断試験を併用することは、徴候および症候があいまいな疾患に対する有用なアプローチである。リン（Ｌｉｎ）、Ｊ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｓｔａｔ．、第９（１）巻、８１〜８８頁（１９９９年）；クライン（Ｋｌｉｎｅ）ら、ＪＡＭＡ、２８５巻、７６１〜７６８頁（２００１年）。しかし、総白血球数を、Ｃ反応性タンパク質、ホスホリパーゼＡ２、好中球数、およびバンド好中球数などの他の実験室パラメータと併用した以前の調査では、急性虫垂炎に対する特異性の増大は報告されていない。グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、第６１巻、２５７〜２５９頁（１９９５年）；ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第６２巻、９０６〜９０８頁（１９７５年）；ドゥーホルム（Ｄｕｅｈｏｌｍ）ら、Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ、第３２巻、８５５〜８５９頁（１９８９年）；ハーラン（Ｈａｌｌａｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６３巻、５３３〜５３８頁（１９９７年）；グロンロース（Ｇｒｏｎｒｏｏｓ）ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、第４０巻、１７５７〜１７６０頁（１９９４年）；オーステルハイス（Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１５９巻、１１５〜１１９頁（１９９３年）。
【０２１２】
この研究結果は、（有意に高い特異性を有する）ＯＨＨＡ分析結果と、（より高い感度を有する）総白血球数と併用することで、急性虫垂炎の疑いに対する初期臨床評価の診断精度が改善されることを示す。陽性の尿中ＯＨＨＡ結果と高い初期白血球数との組合せは、白血球数のみの場合より有意に高い特異性と診断精度とをもたらした。陰性のＯＨＨＡ分析結果と、陰性の白血球数との組合せには、９２％という陰性の予測的価値があることを実証した。臨床上の見地から言って、臨床における虫垂炎の疑いを評価する補助に最も有用なテストの組合せは、一致した検査結果であることが判明した。この研究では、患者の大部分（６０．８％）で一致した検査結果が得られた。ＯＨＨＡ分析の結果と白血球数の結果とが一致していないことは、虫垂炎の有無を判定するには診断テストをさらに行う必要があることを示す。
【０２１３】
この研究における性別サブグループおよび年齢別サブグループの全体的な有病率は、急性虫垂炎に関する最近の他の調査と同様であった。ヘール（Ｈａｌｅ）ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、第２２５巻、２５２〜２６１頁（１９９７年）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、７９６〜８０２頁（２０００年）；グス（Ｇｕｓｓ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１８巻、３７２〜３７５頁（２０００年）。虫垂炎の疑いがある女性患者および小児科患者は、臨床的な評価がより困難であることを、いくつかの報告が示している。ロスロック（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ）ら、Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１３巻、１〜８頁（１９９５年）；ロスロック（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ）ら、Ａｎｎ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第３６巻、３９〜５１頁（２０００年）；ボルグスタイン（Ｂｏｒｇｓｔｅｉｎ）ら、Ｓｕｒｇ．Ｅｎｃｌｏｓｃ、１１巻、９２３〜９２７頁（１９９７年）。婦人科疾患を模擬する臨床症状のため、妊娠可能年齢の女性における虫垂炎の誤診率は、男性と比べて顕著に高いものとなっている。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１６６巻、７９６〜８０２頁（２０００年）；ロスロック（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ）ら、Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１３巻、１〜８頁（１９９５年）；グス（Ｇｕｓｓ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１８巻、３７２〜３７５頁（２０００年）；ボルグスタイン（Ｂｏｒｇｓｔｅｉｎ）ら、Ｓｕｒｇ．Ｅｎｄｏｓｃ、１１巻、９２３〜９２７頁（１９９７年）。さらに、女性では、手術による介入の遅れが、特に穿孔性虫垂の場合により長時間になっていることが示されている。ロスロック（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ）ら、Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１３巻、１〜８頁（１９９５年）；グス（Ｇｕｓｓ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１８巻、３７２〜３７５頁（２０００年）。小児科患者も急性虫垂炎の誤診率が高く、診断の遅れがより長時間であり、さらに罹患率および死亡率も増大している。ロスロック（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ）ら、Ａｎｎ．Ｅｍｅｒｇ．Ｓｕｒｇ．、第３６巻、３９〜５１頁（２０００年）；バクー（Ｂａｃｈｏｏ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．Ｉｎｔ、１７巻、１２５〜１２８頁（２００１年）。この研究では、各性別サブグループおよび年齢別サブグループで、陽性ＯＨＨＡ結果および高白血球数の両方の組合せによって、全体の結果と統計的に匹敵する診断特異性および精度の増大が得られることが実証された。これらのテストの併用による特異性および精度の向上は、臨床上虫垂炎の疑いがある女性患者および小児科患者の初期評価に特に有用であると判明され得る。
【０２１４】
この研究の結果は、ＯＨＨＡ分析が単独で急性虫垂炎の確認試験となることを示唆するものではないが、初期白血球数と併用した際、ＯＨＨＡ分析によって有意に増大した診断価値を付加することが可能である。貢献的な診断試験は、臨床評価と統合される必要のある診断情報を提供する。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第２３巻、１３３〜１４０頁（１９９９年）。ＯＨＨＡ分析および初期白血球数などの有意に診断精度を改善する貢献的試験を併用することによって、虫垂炎の疑いを臨床評価する際の擬陰性および擬陽性を減少させる補助とすることが可能である。虫垂炎の初期診断精度を改善する迅速で比較的安価なテストを用いることによって、放射線画像診断試験、外科診断、院内観測の延長、身体検査の反復、および連続的臨床試験などの他の診断介入の使用を費用対効果において最適化することが可能である。ＯＨＨＡ分析は、便利で非侵襲的な尿試料採取と、迅速な分析方法とを組み合わせたものであることから、高レベルの臨床妥当性が予期される。さらに、単純なＯＨＨＡ分析法は、どんな病院でも、通院患者実験室でも、またはベッドサイドでも容易に行われ得る。
【０２１５】
この研究にはいくつかの制限がある。尿試料は、限られた人数の検査技師による標準化された分析を容易にするために、ＯＨＨＡ分析を行う前にバッチにまとめられた。収集後１時間以内に分析を完了させたならば、より忠実な結果が臨床利用に反映されたであろう。過度に薄い尿試料も、ＯＨＨＡ分析結果に影響を与えたかもしれないが、この研究は、そのようなサブセットの結果に対処するように設計されてはいなかった。データの示す傾向は、尿比重が≧１．０１０であれば、さらに信頼性の高い結果が得られると期待されるであろうことを示唆する。この研究では、ＯＨＨＡ分析および白血球数の結果と、同時になされた急性虫垂炎の外科診断、および外科的介入の遅延とによって除外したが、その多くが後で虫垂炎と診断された患者とを比較した。将来、連続的なＯＨＨＡ結果と白血球数結果とを用いた研究を行えば、観測の延長が必要な患者にもこのテストが有用であるかどうかを判定するのに有用かもしれない。手術を受けなかった患者の急性虫垂炎が自発的に解消された事例が以前に記載されており（ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第６２巻、９０６〜９０８頁（１９７５年））、結果には、そのような自発的解消も影響を与えているかもしれない。この研究は、初期臨床評価と共に用いた際にＯＨＨＡ分析を評価するように設計されており、コントラストＴＣＴおよびヘリカルＣＴなどの確認的放射線操作との比較を含んでいなかった。この研究における多くの患者は総白血球のみが計数され、識別的な白血球計数が指示されていなかったため、好中球数またはバンド好中球数とのいかなる比較も非実用的であった。炎症の他のマーカと併用した際に、ＯＨＨＡ分析によって急性虫垂炎の診断価値が改善されるかどうかを判定するには、さらなる研究を行う必要がある。
【０２１６】
この研究の結果は、尿中ＯＨＨＡに増大があるかどうかの分析が、臨床上、急性虫垂炎の疑いがある患者に対して、血中総白血球より有意に高い特異性を有することを示す。高白血球数と陽性尿中ＯＨＨＡ分析との組合せは、白血球数のみの場合より有意に高い特異性および診断精度をもたらした。陰性のＯＨＨＡ結果と正常な白血球数との併用によって、虫垂炎にかかっている確率が低い患者におけるヘルスケア資源の効率的かつ費用対効果に優れた使用が補助されるかもしれない。ＯＨＨＡ分析は、白血球数または他の炎症マーカと併用して初期診断精度を増強し、急性虫垂炎の疑いに対する初期臨床評価を補助することが可能な単純かつ非侵襲的なテストである。
【０２１７】
Ｄ．結論
急性虫垂炎の疑いがある患者の初期評価は、いまだに診断上の難問であり、総白血球数は、特異性が低いにもかかわらず臨床方針の決定を補助するのに頻繁に用いられている。急性虫垂炎の疑いがある２０９人の連続的な救急科患者において、尿中ｏ−ヒドロキシ馬尿酸（ＯＨＨＡ）の新規な分析を、それ単独の場合と、白血球数と組み合わせた場合との診断特異性が、先を見越して調査された。即座に外科を受けた５９人の患者のうち、４４人に急性虫垂炎があることが組織病理学的に確認された。ＯＨＨＡ分析の特異性は、白血球数の特異性より有意に高いものであった（８０．６％対６７．９％、ｐ＜０．０１）。陽性ＯＨＨＡ「および」高白血球数の組合せは、白血球数のみの場合より有意に高い特異性を示した（９２．１％対６７．９％、ｐ＜０．０００１）。一致したテスト結果、すなわち陽性ＯＨＨＡおよび高白血球数の組合せ、または陰性ＯＨＨＡおよび正常白血球数の組合せは、白血球数のみの場合より有意に高い特異性および診断精度を有した（それぞれ８７．７％対６７．９％、および８３．５％対６７．０％、ｐ＜０．００１）。陰性で一致したテスト結果は、９２．１％の陰性の予測的価値を有した。単純かつ非侵襲的なＯＨＨＡ分析は、急性虫垂炎に対する特異性が白血球数より有意に高く、ＯＨＨＡおよび白血球数の一致した結果は、白血球数のみの場合より有意に高い特異性および診断精度を提供する。
【０２１８】
実施例１０：システイン化アルブミンに対する抗体の調製
Ａ．抗原としてのシステイン化ＨＳＡ
システイン化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、１．５ｍｍのＨＳＡ（シグマ・ケミカル・コーポレイション（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））を５ｍｍのシスチン（シグマ・ケミカル・コーポレイション（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））と４０℃で２時間インキュベートすることによって調製した。この結果得られた産物を一夜加水分解し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを通した（３０，０００ｋＤａでカットオフ）後、質量分析（ＭＳ法）で分析した。ＭＳ分析法によって、少なくとも３分子種、すなわちシステイン化ＨＳＡ、システイン化され、かつ糖化されたＨＳＡ、およびシステイン化され、かつ２重糖化されたＨＳＡが形成されたことが示された。この溶液を凍結乾燥し、約７００ｍｇのシステイン化ＨＳＡを得た。システイン化ＨＳＡは、システイン化ＨＳＡに特異的な抗体を調製するための抗原として用いられ得る。
【０２１９】
Ｂ．抗原としてのシステイン化ＨＳＡペプチド
Ｃｙｓ３４のどちらの側のＨＳＡ配列のアミノ酸も含むシステイン化ペプチドを調製した。上記実施例８の記載のように、Ｃｙｓ３４は、ＨＳＡ上でジスルフィド結合していない唯一のシステインである（すなわち、Ｃｙｓ３４は遊離チオールを有してシステイン化され得る）。このシステイン化ペプチドの配列は、Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ（Ｃｙｓ）Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ［配列番号１］であった。この配列は、システイン化部位に架橋するエピトープに対して抗体が産生されるように、隣接残基数が制限されるように設計した。
【０２２０】
システイン化ペプチドをＫＬＨに結合させ、この結果得られた結合体を抗システイン化ＨＳＡ抗体の調製用抗原として用いた。抗体を調製するために、２頭のウサギに１、２８、５６、および７０日目に１００μｇのシステイン化ペプチド−ＫＬＨ結合体を注入した。各免疫処置の前にウサギから採血した。粗製抗血清をテストし、システイン化ペプチドに特異性を示すことが判明した。
【０２２１】
抗血清は、システイン化ペプチドを用いて、アフィニティ・クロマトグラフィで精製される。このカラムから溶出された抗体は、非システイン化ペプチドを用いてアフィニティ精製される。これら２回のアフィニティ・クロマトグラフィ精製によって、システイン化ＨＳＰと特異的に反応する抗体が濃縮され、無修飾のペプチドと反応する抗体は枯渇される。抗体集団が精製されていることを確認するために、この結果得られる調製物は、システイン化ペプチドおよび非システイン化ペプチドに対するＥＬＩＳＡでテストされる。
【０２２２】
実施例を含む本発明の上記記述は、本発明の例示のみを目的とするものであり、本発明を限定するものではない。当業者ならば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、上記記述に照らして多数の変形、修正、および改変を行うことが可能である。
【図４】
2010071997.tif 000011
【図５】
2010071997.tif 000012
【図６】
2010071997.tif 000013
【図７Ａ】
2010071997.tif 000014
【図７Ｂ】
2010071997.tif 000015
【図７Ｃ】
2010071997.tif 000016
【図７Ｄ】
2010071997.tif 000017
【図７Ｅ】
2010071997.tif 000018
【図７Ｆ】
2010071997.tif 000019
【図７Ｇ】
2010071997.tif 000020
【図７Ｈ】
2010071997.tif 000021
【図７Ｉ】
2010071997.tif 000022
【図７Ｊ】
2010071997.tif 000023
【図７Ｋ】
2010071997.tif 000024
【図７Ｌ】
2010071997.tif 000025
【図７Ｍ】
2010071997.tif 000026
【図７Ｎ】
2010071997.tif 000027
【図７Ｏ】
2010071997.tif 000028
【図７Ｐ】
2010071997.tif 000029
【図７Ｑ】
2010071997.tif 000030
【図７Ｒ】
2010071997.tif 000031
【図７Ｓ】
2010071997.tif 000032
【図８】
2010071997.tif 000033
【図９Ａ】
2010071997.tif 000034
【図９Ｂ】
2010071997.tif 000035
【図１】
2010071997.tif 000036
【図２】
2010071997.tif 000037
【図３】
2010071997.tif 000038
【配列表】
2010071997000001.app