(57)【要約】【課題】本発明は、腎不全や血圧異常の治療薬の開発や病態の解析、あるいは、薬物の腎排出の解析に対する有用性が見込まれる、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子導入モデル非ヒト動物や、該モデル非ヒト動物を用いた腎機能向上作用や血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。【解決手段】生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入され、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓で発現するトランスジェニックモデル非ヒト動物を用いることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入され、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓で発現するトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項２】
ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が、以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列からなることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
（Ｄ）配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列；
（Ｅ）配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列において、１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列であって、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
（Ｆ）配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
【請求項３】
ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子内の配列番号１のヌクレオチド番号２０〜２３、３５９〜３６２、１０２５〜１０２８及び１５８９〜１５９２におけるヌクレオチド配列又はそれに相当するヌクレオチド配列が、ＡＧＧＴ又はＡＧＧＣからなるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項１又は２に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項４】
ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子内の配列番号１のヌクレオチド番号２０〜２３、３５９〜３６２及び１０２５〜１０２８におけるヌクレオチド配列又はそれに相当するヌクレオチド配列が、ＡＧＧＴからなるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項１又は２に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項５】
ＡＧＧＴからなるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列が、ＡＧＧＧからなるヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項３又は４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が、腎臓特異的な発現制御配列の制御下に発現していることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項７】
ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が、腎臓特異的に発現するプロモーターの制御下に発現していることを特徴とする請求項６に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項８】
腎臓特異的に発現するプロモーターが、グルコーストランスポーターｓｇｌｔ２のプロモーターであることを特徴とする請求項７に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項９】
トランスジェニックモデルラットであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項１０】
腎機能向上モデル非ヒト動物である請求項１〜９のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項１１】
低血圧モデル非ヒト動物である請求項１〜９のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項１２】
薬物排泄解析モデル非ヒト動物である請求項１〜９のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物に由来し、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを発現する細胞。
【請求項１４】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、腎機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法。工程（Ａ）：請求項１〜１０のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程；
工程（Ｂ）：トランスジェニックモデル非ヒト動物の腎機能を測定する工程；
工程（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られた腎機能の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較する工程；
工程（Ｄ）：被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較して優れているときは、その被検物質を腎機能向上作用を有する物質と評価し、被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較して劣るときは、その被検物質を腎機能低下作用を有する物質と評価する工程；
【請求項１５】
トランスジェニックモデル非ヒト動物が、腎臓の一部の機能を物理的に低下させたトランスジェニックモデル非ヒト動物であることを特徴とする請求項１４に記載の腎機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法。
工程（Ａ）：請求項１〜９及び１１のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程；
工程（Ｂ）：トランスジェニックモデル非ヒト動物の血圧を測定する工程；
工程（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られた血圧の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧と比較する工程；
工程（Ｄ）：被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値と比較して高いときは、その被検物質を昇圧物質と評価し、被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値と比較して低いときは、その被検物質を降圧物質と評価する工程；
【請求項１７】
トランスジェニックモデル非ヒト動物が、腎臓の一部の機能を物理的に低下させたトランスジェニックモデル非ヒト動物であることを特徴とする請求項１６に記載の血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、ヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物であるかどうかを判定する方法。
工程（Ａ）：請求項１〜９及び１２のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物に被検薬物を投与する工程；
工程（Ｂ）：トランスジェニックモデル非ヒト動物の尿中の被検薬物又はその代謝産物を測定する工程；
工程（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られた被検薬物又はその代謝産物の測定値を、被検薬物を投与した非トランスジェニックモデル非ヒト動物の尿中の被検薬物又はその代謝産物の測定値と比較する工程；
工程（Ｄ）：トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値より高いときは、その被検薬物をヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物であると判定し、トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値と同等か又は低いときは、その被検物質をヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物ではないと判定する工程；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎不全や血圧異常の治療薬の開発や病態の解析、あるいは、薬物の腎排出の解析に対する有用性が見込まれる、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子導入モデル非ヒト動物や、該モデル非ヒト動物を用いた腎機能向上作用や血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎不全患者、特に腎透析を受ける患者の数は年々増加の一途を辿っており、現在２０万人の患者が維持透治療を行っており、さらに毎年３万人以上が新たに透析導入に至っている。透析療法には、一人あたり年間約５００万円の費用がかかるため、２０万人に対して約１兆円の医療費が恒常的に必要となっている。従って、腎不全の症状を緩和したり、透析導入を遅らせる治療法が開発されれば、患者のＱＯＬ（クオリティオブライフ）に資するだけでなく、医療費の大幅な削減が可能となり社会に大きく貢献することが出来る。
【０００３】
生体内での異物、毒物、尿毒症物質の排泄には、肝臓と腎臓が大きく関与している。なかでも水溶性物質、あるいは体内代謝により水溶性となった物質は、腎臓から尿中に排泄される。しかしながら、尿毒症物質のうち、ヒト腎臓からの排泄や、腎排泄にかかわる因子について詳細な解析がなされているのは、インドキシル硫酸しかなかった。また、透析では除去できない尿毒症物質の体内への蓄積による腎障害の発生という悪性サイクルが臨床で問題となっており、腎透析とは異なる新たな尿毒症物質排泄システムの早急な構築が求められていた。
【０００４】
また、高血圧や低血圧などの血圧異常は生活習慣病の１種とされ、患者の数も増加傾向にあるとされる。低血圧は、頭痛、めまい、全身倦怠感、不眠、食欲不振、吐き気、下痢、動悸、息切れ等を引き起こし、社会生活に支障を来たす。一方、高血圧は、虚血性心疾患、脳卒中、腎不全などの発症リスクともなるため、予防・治療の必要性はより高いといえる。また、血圧異常の中には、従来の治療薬が十分な効果を奏さない場合があり、あらたな作用機序の血圧異常治療薬の開発が求められていた。
【０００５】
腎臓には多種多様なトランスポーターが存在し、多様な物質輸送に関与している。なかでも有機アニオントランスポーター（ＯＡＴＰ：organic anion transporting polypeptide）ファミリーは、その幅広い基質認識性と多岐にわたる臓器分布から、内因性物質や薬物の体内動態において重要な役割を行うトランスポーターと考えられている。本発明者は、世界に先駆けて１５個以上の有機アニオントランスポーターを単離し、胆汁酸、甲状腺ホルモン、ステロイドホルモン、プロスタグランジン類等が単に拡散でなく有機アニオントランスポーターにより細胞膜輸送されるという知見を世界に先駆けて報告してきた。更に、本発明者は、ヒト腎臓にのみ発現している有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｒ（ＯＡＴＰ４Ｃ１やＯＡＴＰ−Ｍ１とも呼ばれる）を世界で初めて発見し（非特許文献１参照）、その内容に関する特許出願が日本において特許登録された（特許文献１参照）。
【０００６】
ラットやマウスには複数の有機アニオントランスポーターが、血管側と尿管側の両方に存在するが、ヒト腎臓においてはヒトＯＡＴＰ−Ｒが近位尿細管血管側だけに発現しており、血液から腎臓に内因性物質や各種薬物を送り込む輸送タンパク質であることが明らかになった（非特許文献１参照）。更に、非特許文献１により、ヒトＯＡＴＰ−Ｒは心不全や不整脈の治療に用いられるジゴキシンや尿毒症物質の腎臓からの排泄に関与する重要な遺伝子であること、また腎不全状態においてはＯＡＴＰ−Ｒの発現は著しく低下することから、ＯＡＴＰ−Ｒが尿毒症物質や薬物の腎排泄を規定する重要な遺伝子であることが明らかとなった（図１）。しかし、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを発現する非ヒト動物は、これまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】日本国特許第４００８４８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】PNAS March 9, 2004. vol.101, no.10, 3569-3574
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、腎不全や血圧異常の治療薬の開発や病態の解析、あるいは、薬物の腎排出の解析に対する有用性が見込まれる、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子導入モデル非ヒト動物や、該モデル非ヒト動物を用いた腎機能向上作用や血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するのに先立ち、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を発現する、イヌ腎臓由来ＭＤＣＫII培養細胞の作製を試みた。すなわち、ヒトＯＡＴＰ−Ｒのコード領域を含む発現ベクターを培養細胞に導入して、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを培養細胞内で強制発現させることを試みた。しかし、得られたほとんどの細胞が死滅してしまい、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ強制発現細胞を確立することができなかった。また、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子導入ラットの作製を試みたが、目的とするヒトＯＡＴＰ−Ｒの発現を確認することができなかった。そこで、本発明者は、前述のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現ベクターを導入した培養細胞からｍＲＮＡを抽出して解析を行なったところ、ヒトＯＡＴＰ−ＲのｍＲＮＡのサイズがほとんどの細胞で小さくなっていた。さらに、これらのヒトＯＡＴＰ−ＲのｍＲＮＡの配列を常法により決定したところ、正常なヒト腎臓細胞では起こらない４ヶ所のスプライシング部位で新たにスプライシングが生じており（図２参照）、その結果、トランスポーターとして機能しない構造となっていた。このことは、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を含む発現ベクターが導入された細胞が、ヒトＯＡＴＰ−Ｒによる取り込み基質の毒性を避けるべく、ヒトＯＡＴＰ−ＲのｍＲＮＡをスプライシングしてその発現をキャンセルすることで、無毒化を図っていると考えられた。ヒトＯＡＴＰ−ＲのｍＲＮＡについての同様の短小化は、本発明者がヒトＯＡＴＰ−Ｒを導入したトランスジェニックマウスでも確認されており、このｍＲＮＡの短小化は生体の防御機構であると考えられた。そこで、本発明者は、鋭意検討し、ヒトＯＡＴＰ−Ｒにおける前述の４ヶ所のスプライシング部位のうち、３ヶ所のスプライシング部位に変異を導入し、該ヒトＯＡＴＰ−Ｒの生体内におけるスプライシングを抑制した変異ヒトＯＡＴＰ−Ｒを、近位尿細管特異的に発現しているグルコーストランスポーターｓｇｌｔ２のプロモーターの下流に配置した発現ベクターをラットに導入することによって、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子腎臓特異的に発現するトランスジェニックラットの作製に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入され、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓で発現するトランスジェニックモデル非ヒト動物や、（２）ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が、以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列からなることを特徴とする上記（１）に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物；（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；（Ｄ）配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列；（Ｅ）配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列において、１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列であって、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；（Ｆ）配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；や、（３）ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子内の配列番号１のヌクレオチド番号２０〜２３、３５９〜３６２、１０２５〜１０２８及び１５８９〜１５９２におけるヌクレオチド配列又はそれに相当するヌクレオチド配列が、ＡＧＧＴ又はＡＧＧＣからなるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物や、（４）ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子内の配列番号１のヌクレオチド番号２０〜２３、３５９〜３６２及び１０２５〜１０２８におけるヌクレオチド配列又はそれに相当するヌクレオチド配列が、ＡＧＧＴからなるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物や、（５）ＡＧＧＴからなるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列が、ＡＧＧＧからなるヌクレオチド配列であることを特徴とする上記（３）又は（４）に記載のトランスジェニック非ヒト動物や、（６）ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が、腎臓特異的な発現制御配列の制御下に発現していることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物や、（７）ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が、腎臓特異的に発現するプロモーターの制御下に発現していることを特徴とする上記（６）に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物や、（８）腎臓特異的に発現するプロモーターが、グルコーストランスポーターｓｇｌｔ２のプロモーターであることを特徴とする上記（７）に記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物や、（９）トランスジェニックモデルラットであることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物や（１０）腎機能向上モデル非ヒト動物である上記（１）〜（９）のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物や、（１１）低血圧モデル非ヒト動物である上記（１）〜（９）のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物や、（１２）薬物排泄解析モデル非ヒト動物である上記（１）〜（９）のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物や、（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物に由来し、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを発現する細胞に関する。
【００１２】
また本発明は、（１４）以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、腎機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法；上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程（Ａ）；トランスジェニックモデル非ヒト動物の腎機能を測定する工程（Ｂ）；工程（Ｂ）で得られた腎機能の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較する工程（Ｃ）；被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較して優れているときは、その被検物質を腎機能向上作用を有する物質と評価し、被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較して劣るときは、その被検物質を腎機能低下作用を有する物質と評価する工程（Ｄ）；や、（１５）トランスジェニックモデル非ヒト動物が、腎臓の一部の機能を物理的に低下させたトランスジェニックモデル非ヒト動物であることを特徴とする上記（１４）に記載の腎機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、（１６）以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法；上記（１）〜（９）及び（１１）のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程（Ａ）；トランスジェニックモデル非ヒト動物の血圧を測定する工程（Ｂ）；工程（Ｂ）で得られた血圧の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧と比較する工程（Ｃ）；被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値と比較して高いときは、その被検物質を昇圧物質と評価し、被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値と比較して低いときは、その被検物質を降圧物質と評価する工程（Ｄ）；や、（１７）トランスジェニックモデル非ヒト動物が、腎臓の一部の機能を物理的に低下させたトランスジェニックモデル非ヒト動物であることを特徴とする上記（１６）に記載の血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【００１４】
さらにまた本発明は、（１８）以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、ヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物であるかどうかを判定する方法；上記（１）〜（９）及び（１２）のいずれかに記載のトランスジェニックモデル非ヒト動物に被検薬物を投与する工程（Ａ）；トランスジェニックモデル非ヒト動物の尿中の被検薬物又はその代謝産物を測定する工程（Ｂ）；工程（Ｂ）で得られた被検薬物又はその代謝産物の測定値を、被検薬物を投与した非トランスジェニックモデル非ヒト動物の尿中の被検薬物又はその代謝産物の測定値と比較する工程（Ｃ）；トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値より高いときは、その被検薬物をヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物であると判定し、トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値と同等か又は低いときは、その被検物質をヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物ではないと判定する工程（Ｄ）；に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物によれば、これまでとは異なるアプローチによって、腎不全や血圧異常の治療薬の開発や病態の解析、あるいは、薬物の腎排出の解析を行なうことができると考えられる。特に、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ等のトランスポーターの機能は、転写、翻訳レベルのみで決定するものではなく、膜への移行や輸送能、生体内での他のトランスポーターとのバランスによって決定する。このため、本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物を用いることで、生体内にかなり近い状況でのヒトＯＡＴＰ−Ｒの機能を解析することが可能となる。また、本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物は、腎機能向上モデル非ヒト動物や、低血圧モデル非ヒト動物や、薬物排泄解析モデル非ヒト動物等として好適に用いることができる。そのため、本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物は、腎機能向上作用を有する物質や血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法のほか、ヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物であるかどうかの判定方法にも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】尿細管細胞におけるジゴキシン輸送の概略を示す図である。
【図２】過剰発現系におけるＯＡＴＰ４Ｃ１（ヒトＯＡＴＰ−Ｒ）の選択的スプライシングを示す図である。
【図３】pGL2-sglt2 5pr-mut-Cre vectorの概要を示す図である。
【図４】pGL2-sglt2 5pr-mut XhoＩ- MluＩBlunt vectorの概要を示す図である。
【図５】左パネル：本発明のトランスジェニック非ヒト動物のゲノムと、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を増幅し得るプライマーとを用いたゲノミックＰＣＲの結果を示す図である。  右パネル：本発明のトランスジェニック非ヒト動物の腎臓組織由来のトータルＲＮＡと、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を増幅し得るプライマーとを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図６】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等における、投与ジゴキシン量に対する尿中ジゴキシン排泄量の比を示す図である。
【図７】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等における、収縮期の血圧を示す図である。グラフの横軸は、腎摘手術からの経過日数を示し、縦軸は血圧（ｍｍＨｇ）を示す。
【図８】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等における平均体重の推移を示す図である。
【図９】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等における血清クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄｌ）の推移を示す図である。
【図１０】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の心臓の左室後壁厚の推移（ｍｍ）を示す図である。
【図１１】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の血漿中のグアジニノコハク酸濃度（左パネル）、及び、尿中のグアジニノコハク酸濃度（右パネル）を示す図である。
【図１２】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の血漿中のβ−アラニン濃度（左パネル）、及び、尿中のβ−アラニン濃度（右パネル）を示す図である。
【図１３】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の血漿中のタウリン濃度（左パネル）、及び、尿中のタウリン濃度（右パネル）を示す図である。
【図１４】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の血漿中のグアニジウムコハク酸濃度（左パネル）、及び、トランスアコニット酸濃度（右パネル）を示す図である。
【図１５】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の血漿中の非対称ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）濃度（ｎｍｏｌ／ｍｌ）（左パネル）、及び、ＡＤＭＡの尿クリアランス（右パネル）を示す図である。
【図１６】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の腎臓におけるＤＤＡＨ１及びＤＤＡＨ２の発現を示す図である。なお、図中、白抜きの棒グラフは腎摘ＴＧ（＋）ラット群の結果を表し、黒塗りの棒グラフは腎摘ＴＧ（−）ラット群の結果を表す。
【図１７】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の腎組織中のＣＤ６８陽性細胞数を示す図である。
【図１８】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の腎臓細胞中のカリクレインの発現を示す図である。
【図１９】本発明のトランスジェニック非ヒト動物等の血漿中の各物質の濃度を示す図である。なお、図中、白抜きの棒グラフは腎摘ＴＧ（＋）ラット群の結果を表し、黒塗りの棒グラフは腎摘ＴＧ（−）ラット群の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物としては、生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入され、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓で発現するトランスジェニックモデル非ヒト動物であれば特に制限はされず、上記の「ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入され」とは、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入された結果、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が体細胞染色体に組み込まれていることを意味する。本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物は、生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入され、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓で発現するので、特にヒトＯＡＴＰ−Ｒ等に関連した薬物排泄解析モデル非ヒト動物として好適に使用することができる。また、本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物は、腎機能が向上しており、また、血圧が低下しあるいは血圧上昇が抑制されているため、腎機能向上モデル非ヒト動物や低血圧モデル非ヒト動物や血圧上昇抑制モデル非ヒト動物として好適に使用することができる。
【００１８】
上記非ヒト動物としては、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等の非ヒト哺乳動物を好ましく例示することができ、中でも、ラット、マウス、モルモット、ハムスター等の齧歯目動物をより好ましく例示することができ、実験動物としての汎用性や利便性を考慮してラット、マウスをさらに好ましく例示することができ、より幅広い生理学的検討が行い易いことから、ラットを最も好ましく例示することができる。
【００１９】
上記生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子とは、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を導入する非ヒト動物の生体内で、ｍＲＮＡ前駆体から成熟ｍＲＮＡを形成する際にヒトＯＡＴＰ−Ｒのコード領域がスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を意味し、より具体的には、後述の実施例２の系のゲノミックＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲにおいて、ヒトＯＡＴＰ−Ｒのコード領域全域が確認できるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を意味する。生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の具体例としては、以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列からなるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を好適に例示することができる。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
（Ｄ）配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列；
（Ｅ）配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列において、１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列であって、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
（Ｆ）配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列；
【００２０】
上記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列からなるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のうち、（Ａ）〜（Ｃ）及び（Ｅ）〜（Ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列からなるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子（以下、「ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子変異体」ともいう。）は、例えば上記（Ｄ）のヌクレオチド配列をベースとして、スプライシング部位となり得る配列を含まないように改変することによって、改変したヌクレオチド配列でありながら、ＯＡＴＰ−Ｒ活性を保持し、さらに生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列を得ることができる。上記のスプライシング部位となり得る配列としては、２箇所以上の「ＡＧＧＴ」や「ＡＧＧＣ」を例示することができ、「ＡＧＧＴ」を特に好適に例示することができる。例えば、スプライシング部位となり得ることがよく知られる２箇所以上の「ＡＧＧＴ」の場合、５’側の「ＧＴ」から３’側の「ＡＧ」に対応するｍＲＮＡがイントロン（ＧＵ−ＡＧイントロン）として切り出される。これらのスプライシング部位となり得るヌクレオチド配列を、そのヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列とする（例えば１つ又は２個以上のヌクレオチド配列をスプライシング部位となり得る配列とは異なるヌクレオチド配列に置換する）ことによって、生体内でスプライシングされることがないヌクレオチド配列とすることができる。生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子変異体としてより具体的には、配列番号１のヌクレオチド番号２０〜２３、３５９〜３６２、１０２５〜１０２８及び１５８９〜１５９２におけるヌクレオチド配列又はそれに相当するヌクレオチド配列が、ＡＧＧＴ又はＡＧＧＣからなるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列であるものを好適に例示することができ、配列番号１のヌクレオチド番号２０〜２３、３５９〜３６２及び１０２５〜１０２８におけるヌクレオチド配列又はそれに相当するヌクレオチド配列が、ＡＧＧＴからなるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列であるものをより好適に例示することができ、これらの配列において、上記のＡＧＧＴからなるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列がＡＧＧＧからなるヌクレオチド配列であるものとさらに好適に例示することができる。前述の配列番号１のヌクレオチド番号２０〜２３、３５９〜３６２、１０２５〜１０２８及び１５８９〜１５９２におけるヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列とは、初期設定のＣＬＵＳＴＡＬＷ（version 1.83）を用いて、配列番号１のヌクレオチド配列とアラインメントを作成した場合に、配列番号１のヌクレオチド番号２０〜２３、３５９〜３６２、１０２５〜１０２８及び１５８９〜１５９２に対応するヌクレオチド配列を意味する。なお、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子変異体が生体内でスプライシングされているかどうかは、そのヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子変異体のコード領域の５’末端付近と３’末端付近に対応するプライマーを作製し、トランスジェニックモデル非ヒト動物の腎臓の組織から抽出したトータルＲＮＡを鋳型として、前述のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行ない、そのＲＴ−ＰＣＲ産物中のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子変異体の配列を決定してその配列を調べることによって確認することができる。
【００２１】
上記ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子変異体がコードするヒトＯＡＴＰ−Ｒ変異体がヒトＯＡＴＰ−Ｒ活性を有しているかどうかは、ヒトＯＡＴＰ−Ｒの輸送基質として知られるジゴキシン、甲状腺ホルモン、エストロン−３−硫酸を輸送するかどうかを調べることにより確認することができる。また、この確認には、ヒトＯＡＴＰ−Ｒに特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット法を利用することもできる。ヒトＯＡＴＰ−Ｒ変異体がジゴキシン等を輸送することは、作製したトランスジェニックモデル非ヒト動物にジゴキシンを静脈注射し、尿中に排泄されるジゴキシン量が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物に同様にジゴキシンを静脈注射して尿中に排泄されるジゴキシン量より多いことを確認することによって調べることができる。
【００２２】
上記「１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。また。上記「少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」としては、対照となるアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を意味し、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を好適に例示することができる。
【００２３】
例えば、これら１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子）に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２４】
その他、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の配列情報や、配列番号２に示されるアミノ酸配列の配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。具体的には、本発明におけるポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）が単離されたヒトより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明におけるポリヌクレオチドに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子変異体等のポリヌクレオチドを取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、ヒト由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明におけるポリヌクレオチドをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００２５】
前述したのと同様の方法を用いて、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子や、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子や、配列番号１のヌクレオチド番号６〜２１７７からなるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を得ることができる。
【００２６】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるヌクレオチド配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.（以後 "モレキュラークローニング第２版"と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２７】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列としては、プローブとして使用するヌクレオチド配列（ポリヌクレオチド）のヌクレオチド配列と一定以上の相同性を有するヌクレオチド配列を挙げることができ、例えば、プローブとして使用するヌクレオチド配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を好適に例示することができる。
【００２８】
本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ（ＯＡＴＰ−Ｒ変異体を含む）の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のヒトＯＡＴＰ−Ｒでも、化学合成したヒトＯＡＴＰ−Ｒでも、遺伝子組換え技術により作製した組換えヒトＯＡＴＰ−Ｒの何れでもよい。天然由来のヒトＯＡＴＰ−Ｒを取得する場合には、かかるヒトＯＡＴＰ−Ｒを発現している細胞又は組織からヒトＯＡＴＰ−Ｒの単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のヒトＯＡＴＰ−Ｒを取得することができる。化学合成によりヒトＯＡＴＰ−Ｒを調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒを合成することもできる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒを合成することもできる。遺伝子組換え技術によりヒトＯＡＴＰ−Ｒ（ヒトＯＡＴＰ−Ｒ変異体を含む）を調製する場合には、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ（ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子変異体）をコードするヌクレオチド配列からなるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子（特にＤＮＡ）を好適な発現系に導入することにより本発明のヒトＯＡＴＰ−ＲやヒトＯＡＴＰ−Ｒ変異体を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００２９】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒを調製する場合、かかるヒトＯＡＴＰ−Ｒを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒに対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのヒトＯＡＴＰ−Ｒの精製物を得ることができる。また、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒが細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
【００３０】
本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物は、生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入されている他には、そのヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓で発現していればよいが、より優れたトランスジェニックモデル非ヒト動物を得る観点から、腎臓特異的に発現していることが好ましい。本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物が、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓で発現しているかどうかを確認する方法としては特に制限されず、そのトランスジェニックモデル非ヒト動物の腎臓組織を採取し、その腎臓組織のトータルＲＮＡ中に、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡが含まれていることを調べたり、そのヒトＯＡＴＰ−Ｒに特異的に結合する抗体を作製して、前述の腎臓組織中のタンパク質中に該抗体が特異的に結合するタンパク質が含まれていることを調べたりすることによって、容易に確認することができる。上記のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法としては、簡便かつ迅速に検出し得ることから、後述の実施例２に記載するような、ｓｇｌｔ２プライマーとｈＯＡＴＰ−Ｒプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを好適に例示することができる。
【００３１】
本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物は、公知のトランスジェニック動物の作出方法（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384,1980）を用いて作出することができる。より具体的には、上述の本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を、例えば、非ヒト動物の腎臓（細胞内）で機能する発現制御配列を有する非ヒト動物細胞用発現ベクターに導入し、この遺伝子発現ベクターをリニアライズした、導入遺伝子（ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子）を含む直鎖ＤＮＡフラグメントを、ラット等の非ヒト動物由来の分化全能性細胞に導入し、導入後仮親に移植する。移植した分化全能性細胞から個体を発生させ、その個体の組織から抽出したＤＮＡを用いたＰＣＲ法等により、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が体細胞染色体中に組み込まれた個体を選別することによって、本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物を得ることができる。ＤＮＡフラグメントの分化全能性細胞への導入としては、マイクロインジェクション法を好ましく例示することができる。トランスジェニックモデル非ヒト動物を作製するために用いる分化全能性細胞としては、受精卵、初期胚の他、多分化能を有するＥＳ細胞等の培養細胞を例示することができる。
【００３２】
上記の「非ヒト動物の腎臓で機能する発現制御配列」としては、非ヒト動物の腎臓で機能する発現制御配列である限り特に制限されないが、非ヒト動物の腎臓で特異的に機能する発現制御配列であることが好ましく、非ヒト動物の腎臓で特異的に機能するプロモーターであることがより好ましい。非ヒト動物の腎臓で特異的に機能するプロモーター等の発現制御配列を用いると、得られるトランスジェニックモデル非ヒト動物において、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が腎臓特異的な発現制御配列（好ましくはプロモーター）の制御下に発現するため、腎臓以外の組織において、ヒトＯＡＴＰ−Ｒによる取り込み基質の毒性の影響を回避することができる点で好ましい。なお、腎臓では、ヒトＯＡＴＰ−Ｒによる取り込み基質は速やかに排出されるため、該基質による毒性は特に問題とならない。なお、非ヒト動物の腎臓で特異的に発現するプロモーターとしては、近位尿細管特異的に発現しているマウス由来のグルコーストランスポーターｓｇｌｔ２のプロモーター（配列番号３；Genbank acc.# AJ292928 に記載されているポリヌクレオチドのヌクレオチド番号５５〜２６９１からなるヌクレオチド配列）を特に好適に例示することができる。
【００３３】
上記の「非ヒト動物細胞用発現ベクター」として、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（クローンテック社製）、ｐＧＢＴ−９(クローンテック社製)、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３.１（インビトロジェン社製）、ｐＥＦ−ＢＯＳ (Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990)、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
【００３４】
上述の導入遺伝子（ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子）の存在が確認された個体を交配することにより、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を腎臓で安定的に発現可能なように染色体の一部に組み込んだトランスジェニックモデル非ヒト動物を効率よく作出することができる。例えば、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の存在が確認された個体を野生型の個体と交配させると、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子をヘテロに有するトランスジェニックモデル非ヒト動物を得ることができる。また、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の存在が確認された個体同士を交配させると、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子をホモに有するトランスジェニックモデル非ヒト動物を得ることができる。
【００３５】
本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物は、生体内でスプライシングされることがないヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入され、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓で発現するので、腎機能が向上しており、また、血圧が低下しあるいは血圧上昇が抑制されている。したがって、本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物は、腎機能向上モデル非ヒト動物や低血圧モデル非ヒト動物や血圧上昇抑制モデル非ヒト動物として好適に使用することができる。
【００３６】
得られたトランスジェニックモデル非ヒト動物の腎機能が向上しているかどうかは、例えば、後述の実施例３に記載の方法にしたがって、そのトランスジェニックモデル非ヒト動物にジゴキシンを静脈注射し、尿中に排泄されるジゴキシン量が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物（トランスジェニックモデル非ヒト動物の作製に用いた非ヒト動物と同種の動物であって、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入されていない、同性別、同週齢のモデル非ヒト動物）に同様にジゴキシンを静脈注射して尿中に排泄されるジゴキシン量より多いことを確認することによって決定することができる。本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の向上の程度としては特に制限されないが、例えば後述の実施例３に記載されたジゴキシン投与アッセイにおける「投与ジゴキシン量に対する尿中ジゴキシン排泄量の比（％）」が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物におけるその比（％）に対して、割合として好ましくは５％以上、より好ましくは９％以上、さらに好ましくは１４％以上高い程度を例示することができる。
【００３７】
また、得られたトランスジェニックモデル非ヒト動物の血圧が低下しあるいは血圧上昇が抑制されているかどうかは、例えば、テイルカフ（tail cuff）における収縮期の血圧（最高血圧）が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物と比較して低いことを確認することによって決定することができる。
【００３８】
また、得られたトランスジェニックモデル非ヒト動物は、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓で発現することから、特にヒトＯＡＴＰ−Ｒ等に関連した薬物排泄解析モデル非ヒト動物として好適に使用することができる。
【００３９】
本発明の細胞としては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に由来し、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを発現する細胞である限り特に制限されないが、中でも、本発明の非ヒト動物の腎臓に由来する細胞であることがより好ましい。本発明の細胞を本発明のトランスジェニック非ヒト動物から採取する方法としては特に制限されず、例えば公知の方法により、本発明の細胞を採取することができる。
【００４０】
本発明の、腎機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法としては、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含んでいる限り特に制限されない。
工程（Ａ）：本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程；工程（Ｂ）：トランスジェニックモデル非ヒト動物の腎機能を測定する工程；
工程（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られた腎機能の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較する工程；
工程（Ｄ）：被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較して優れているときは、その被検物質を腎機能向上作用を有する物質と評価し、被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較して劣るときは、その被検物質を腎機能低下作用を有する物質と評価する工程；
【００４１】
上記工程（Ａ）における被検物質の投与方法としては、特に制限されず、経口投与や静脈投与等を例示することができる。また、上記工程（Ｂ）における腎機能としては、腎臓の尿生成や排泄機能を意味し、該腎機能を測定する方法としては、例えば、ジゴキシン投与後の尿中ジゴキシン排泄量、血中のクレアチニン濃度、血中の尿素窒素濃度、尿中のヘモグロビン濃度、尿中のアルブミン濃度、尿中のβ２−マイクログロブリンなどの腎機能マーカーを常法にしたがって測定する方法を好適に例示することができ、中でも、より正確な腎機能の測定が可能であることから、ジゴキシン投与後の尿中ジゴキシン排泄量をより好適に例示することができる。ジゴキシン投与後の尿中ジゴキシン排泄量がより多い場合、血中のクレアチニン濃度がより低い場合、血中の尿素窒素濃度がより低い場合、尿中のヘモグロビン濃度がより低い場合、尿中のアルブミン濃度がより低い場合、尿中のマイクログロブリンがより低い場合などを、腎機能がより高いと評価することができ、これらと逆の場合などを腎機能がより低いと評価することができる。腎機能をより正確に測定する観点から、上記の腎機能マーカーを２つ以上組み合わせて用いることが好ましい。
【００４２】
上記工程（Ｃ）等の、本発明における「被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物」としては、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物であればよいが、工程（Ａ）や（Ｂ）におけるトランスジェニックモデル非ヒト動物と同腹のトランスジェニックモデル非ヒト動物であることが、腎機能をより正確に評価する観点から好ましい。
【００４３】
上記工程（Ｄ）における「被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較して優れている」とは、被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物の測定値に比べて、腎機能がより高いことを示していることを意味し、「被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値と比較して劣る」とは、被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における腎機能の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物の測定値に比べて、腎機能がより低いことを示していることを意味する。
【００４４】
本発明の、血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法としては、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含んでいる限り特に制限されない。
工程（Ａ）：発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程；
工程（Ｂ）：トランスジェニックモデル非ヒト動物の血圧を測定する工程；
工程（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られた血圧の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧と比較する工程；
工程（Ｄ）：被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値と比較して高いときは、その被検物質を昇圧物質と評価し、被検物質を投与した場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のトランスジェニックモデル非ヒト動物における血圧の測定値と比較して低いときは、その被検物質を降圧物質と評価する工程；
【００４５】
上記工程（Ｂ）における血圧測定方法としては、特に制限はされず、非ヒト動物の種類に応じた常法にしたがって、血圧を測定することができる。例えば非ヒト動物がラット等の齧歯目動物の場合は、テイルカフ（tail cuff）を尾に嵌めて血圧を測定することが好
ましい。なお、測定する血圧は、収縮期の血圧（最高血圧）であってもよいし、拡張期の血圧（最低血圧）であってもよく、改善の目的とする血圧異常に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
上記工程（Ｄ）により得られた昇圧物質は、昇圧剤として利用することができ、降圧物質は、降圧剤として利用することができる。上記の血圧異常としては、低血圧や高血圧を例示することができる。低血圧の患者には昇圧剤（昇圧物質）を、高血圧の患者には降圧剤（降圧物質）を用いることにより、血圧異常を改善することができる。
【００４７】
なお、上記の「腎機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法」や「血圧異常改善作用を有する物質のスクリーニング方法」に用いるトランスジェニックモデル非ヒト動物として、腎臓の一部の機能を物理的に低下させた本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物を用いることもできる。本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物の腎臓の一部の機能を物理的に低下させると、腎不全等の腎機能が低下した状態に近づき、また、血圧も高くなるため、腎機能向上作用を有する物質や高血圧改善作用を有する物質のスクリーニングに好適に用いることができる。また、腎臓の一部の機能とは、腎臓の一部の「尿生成や排泄機能」を意味し、「腎臓の一部の機能を物理的に低下させる」とは、腎臓の一部を切除したり、結紮したりすることによって、腎臓の一部の機能を低下させることを意味する。
【００４８】
本発明の、ヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物であるかどうかを判定する方法としては、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含んでいる限り特に制限されない。
工程（Ａ）：本発明のトランスジェニックモデル非ヒト動物に被検薬物を投与する工程；工程（Ｂ）：トランスジェニックモデル非ヒト動物の尿中の被検薬物又はその代謝産物を測定する工程；
工程（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られた被検薬物又はその代謝産物の測定値を、被検薬物を投与した非トランスジェニックモデル非ヒト動物の尿中の被検薬物又はその代謝産物の測定値と比較する工程；
工程（Ｄ）：トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値より高いときは、その被検薬物をヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物であると判定し、トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値と同等か又は低いときは、その被検物質をヒトＯＡＴＰ−Ｒにより排泄される薬物ではないと判定する工程；
【００４９】
上記工程（Ａ）における被検薬物の投与方法としては、特に制限されず、経口投与や静脈投与等を例示することができる。また、上記工程（Ｂ）における尿中の被検薬物又はその代謝産物を測定する方法としては、特に制限されないが、質量分析計による測定方法を好適に例示することができる。また、上記代謝産物としては、その被検薬物が非ヒト動物の体内で代謝された産物であれば特に制限されない。
【００５０】
上記工程（Ｃ）における「非トランスジェニックモデル非ヒト動物」とは、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入されていない非ヒト動物であって、上記工程（Ａ）や（Ｂ）におけるトランスジェニックモデル非ヒト動物と同種の非ヒト動物であればよいが、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子が導入されていないこと以外、上記工程（Ａ）や（Ｂ）におけるトランスジェニックモデル非ヒト動物と同じであることが、より正確な比較を可能とする観点から好ましい。上記工程（Ｄ）における「トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値より高いとき」としては、前者の測定値が後者の測定値より高ければよいが、前者の測定値が後者の測定値より割合として５％以上高いことが好ましく、１０％以上高いことがより好ましく、２０％以上高いことがさらに好ましく、４０％以上高いことが最も好ましい。また、上記工程（Ｄ）における「トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値が、非トランスジェニックモデル非ヒト動物における被検薬物又はその代謝産物の測定値と同等か又は低いとき」としては、前者の測定値が後者の測定値以下であればよいが、前者の測定値が後者の測定値より割合として５％以上低いことが好ましく、１０％以上低いことがより好ましく、２０％以上低いことがさらに好ましく、４０％以上低いことが最も好ましい。
【００５１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５２】
［ヒトＯＡＴＰ−Ｒ発現ベクターの作製］
ヒトＯＡＴＰ−Ｒ（ｈＯＡＴＰ−Ｒ）を腎臓特異的に発現するトランスジェニックラットを作製するのに先立ち、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓特異的に発現するような発現ベクターの作製を行なった。具体的には以下のような方法で作製した。
まず、Rubera I らから、pGL2-sglt2 5pr-mut-Cre vector（図３参照）を入手した。pGL2-sglt2 5pr-mut-Cre vectorは、近位尿細管特異的に発現しているグルコーストランスポーターｓｇｌｔ２のプロモーター遺伝子領域（sglt2 5pr-mut promoter；配列番号３）と、その下流に連結されたＣｒｅ遺伝子を含んでいる。このsglt2 5pr-mut promoterの発現特異性により、Ｃｒｅタンパク質が、近位尿細管特異的に発現することが報告されている（Rubera I et al. J Am Soc Nephrol 15: 2050-2056, 2004）。上記pGL2-sglt2 5pr-mut-Cre vectorにおけるＣｒｅ断片を、XhoＩ及びMluＩにて切り出し、次いで、ベクター側の断片をKlenow fragment処理して断片の両端を平滑末端とした。得られた断片の配列を常法の配列決定法で確認した後、この断片をpGL2-sglt2 5pr-mut XhoＩ- MluＩBlunt vectorと命名した（図４参照）。
【００５３】
次に、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を含む発現ベクターを用意し、ヒトＯＡＴＰ−ＲのｍＲＮＡが生体内でスプライシングされることがないようにＰＣＲにて部位特異的に変異を導入して、ｈＯＡＴＰ−Ｒ ｍｕｔ３と命名した。ｈＯＡＴＰ−Ｒ ｍｕｔ３は、変異が導入された結果、配列番号１（変異導入後のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子）における２３、３６２及び１０２８番目のヌクレオチドがそれぞれ変異導入前のチミンからグアニンへと置換されている。なお、ｈＯＡＴＰ−Ｒ ｍｕｔ３は、配列番号１における１８８３番目のヌクレオチドがグアニンからアラニンへと置換されているが、アミノ酸配列には変化がない上、この部分はスプライシング部位とは無関係の配列であるため、本発明の効果には無関係である。このｈＯＡＴＰ−Ｒ ｍｕｔ３をBamH I及びEcoR Vで切り出し、次いで、そのｈＯＡＴＰ−Ｒ ｍｕｔ３断片をKlenow fragment処理して断片の両端を平滑末端としたｃＤＮＡを得た。このｈＯＡＴＰ−Ｒ ｍｕｔ３断片を、ライゲーション反応によって、前述のpGL2-sglt2 5pr-mut XhoＩ- MluＩBlunt vectorの両平滑末端の間に挿入した。得られたベクターの配列を常法の配列決定法で確認した後、このベクターをpGL2-sglt2 5pr-mut hOATP-R mut3 vectorと命名した。
【実施例２】
【００５４】
［ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの作製］
pGL2-sglt2 5pr-mut hOATP-R mut3 vectorを高度に精製した後、ラット前核期受精卵へＤＮＡマイクロインジェクションを行うことにより、ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの作製を行なった。具体的には、以下のような方法で行なった。
まず、ラットとしてチャールズリバーのCrlj:WI系統を使用した。この系統のメスラットにＰＭＳＧ（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）やｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を投与することによって過剰排卵を誘起し、ｈＣＧ投与から１７時間後にオスラットと交配させた。交配後のメスラットを頸椎脱臼により屠殺し、卵管を灌流して前核期胚を採取した。５ｎｇ／μＬに希釈したpGL2-sglt2 5pr-mut hOATP-R mut3 vectorのＤＮＡ溶液を、前述の前核期胚に注入した。ＤＮＡ溶液を注入処理した前核期受精卵を、精巣結紮オスラットと交配した偽妊娠メスラットの卵管内に移植した。２８８個の前核期胚にＤＮＡ溶液の注入を行い、そのうち２７７個の前核期受精卵を移植し、９２匹の産子を得て、最終的にトランスジェニックラットファウンダー（Ｆ０ラット）１０匹を得ることができた。該Ｆ０ラットにｈＯＡＴＰ−Ｒ ｍｕｔ３遺伝子が導入されているかどうかを確認するために、離乳後のＦ０ラットの尻尾から、常法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、そのゲノムＤＮＡについて常法に従ってサザンブロット及びＰＣＲを行なった。サザンブロットのプローブとしては、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子からPvu II及びPst Iにより切り出したｈＯＡＴＰ−Ｒ ｍｕｔ３遺伝子の１１２３〜１６８０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを用い、ＰＣＲのプローブとしては、ｈＯＡＴＰ−Ｒ ｍｕｔ３遺伝子のほぼ全長を増幅するｓｇｌｔ２プライマー（配列番号４；TCCCCCCACTTCTGTTTCCCAGTCTATGT）とｈＯＡＴＰ−Ｒプライマー（配列番号５；CTCGGGTTCGATTAAGACGTCTAGCGCA）（それぞれ図４の矢印部分に対応）を用いた。これらのサザンブロット及びＰＣＲのいずれの結果からも、Ｆ０ラットのゲノムＤＮＡへトランスジーンが導入されていることが確認することができた。
【００５５】
次に、上記のＦ０ラットにおけるトランスジーンが、子供に伝わるかどうかを調べるため、以下の交配試験を行なった。
上記のＦ０ラットと、非トランスジェニックラット（チャールズリバーのCrlj:WI系統）とを交配して、子ラット（Ｆ１ラット）を得た。離乳後のＦ１ラットの尻尾から、常法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、前述のｓｇｌｔ２プライマー及びhOATP-R-TG-R5プライマー（配列番号６；ACGCGATCTGCAGAATTAGCTTGGGCTC）を用いてゲノミックＰＣＲを行なった。そのゲノミックＰＣＲの結果を図５の左パネルに示す。図５の左パネルの結果から分かるように、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子に相当する約２．２ｋｂのＰＣＲ産物を、左から２、３、９、１２番目のレーンにおいて確認することができた。
【００５６】
また、トランスジーンを備えたＦ１ラットから片側の腎臓を摘出し、その組織からトータルＲＮＡを抽出した。該トータルＲＮＡに対して、前述のｓｇｌｔ２プライマーとｈＯＡＴＰ−Ｒプライマーを用い、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲを行なった。また、ヒトＯＡＴＰ−Ｒの全長に対応するプローブ及び前述のトータルＲＮＡを用いて、常法にしたがってノザンブロット法を行なった。図５の右パネルにはＲＴ−ＰＣＲの結果のみを示すが、ＲＴ−ＰＣＲ及びノザンブロット法のいずれ実験でも、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の腎臓組織における発現がｍＲＮＡレベルで確認された。なお、上記のＦ１ラットから腎臓以外の別の組織を摘出して、同様のＲＴ−ＰＣＲ及びノザンブロット法を行なったが、ヒトＯＡＴＰ−Ｒの発現は確認されなかった。
【００５７】
以上の結果から、本実験で得られたラットは、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを腎臓特異的に発現するヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットであることが示された。さらに、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットのフェノタイプを明らかにするために、以下の実施例に記載する解析を行なった。これらの解析では、特に記載がない限り、ラットは、１２時間毎の明暗サイクルのある東北大学動物実験施設内の一室にて飼育した。
【実施例３】
【００５８】
［ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの腎排出能の解析］
ヒトＯＡＴＰ−Ｒは腎臓からのジゴキシン排泄に関与することが知られている（Mikkaichi T et al.Proc Natl Acad Sci USA 101: 3569-3574, 2004）。そこで、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの尿中ジゴキシン排泄について、以下の方法で解析を行なった。
まず、上記実施例２におけるＰＣＲにより、トランスジーン（ＴＧ）が存在することが確認された８〜１０週齢（体重２００−３２０ｇ）のＦ１ラット（以下、「ＴＧ（＋）」という。）と、ＴＧが存在しなかった８〜１０週齢（体重２００−３２０ｇ）のＦ１ラット（以下「ＴＧ（−）」という。）（コントロールラット）を用意した。ＴＧ（＋）ラットに、ラット体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ（５０ｍｇ／ｋｇ）の麻酔薬（ネンブタール）を腹腔内投与し、左右一方の大腿動脈、大腿静脈にそれぞれＰ５０チューブを挿入した。さらに膀胱にも同様にＰ５０チューブを挿入し、２−０絹糸にてそのチューブを固定した。静脈ライン（前述の大腿静脈に挿入したチューブのライン）から１００μｇ／ｋｇのジゴキシンを投与し、投与後５、１０、３０、６０、１２０、１８０、２４０分後にそれぞれ動脈ライン（前述の大腿動脈に挿入したチューブのライン）から、粉ヘパリン加エッペンドルフチューブに採血を行なった。各採血後はヘパリンを添加した生理食塩水（ヘパリン生食）にてチューブをロックした。尿はカテーテルにて採取し、ジゴキシン投与から２４０分後まで蓄尿を行なった。これらの各尿中のジゴキシン濃度は、ＩＭＸ（登録商標）システム（Abott Japan社製）を用いて、検量線上で測定可能なように、ラット正常血清にて適当倍に希釈してから測定を行なった。同様のジゴキシン濃度の測定を、ＴＧ（＋）ラットに代えてＴＧ（−）ラットを用いて行なった。これらの結果から、ＴＧ（＋）ラット（Ｎ＝６）では、ＴＧ（−）ラット（Ｎ＝５）に比べて、投与ジゴキシン量に対する尿中ジゴキシン排泄量の比（％）が有意に増加していることが確認できた（図６）。
【実施例４】
【００５９】
［５／６腎臓摘出ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの血圧変化の解析］
前述のように、ヒトＯＡＴＰ−Ｒは各種の腎不全物質を輸送することが知られている。そこで、本発明におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットについて５／６腎臓摘出を行い、腎不全モデルを作製することで、腎不全状態におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒの役割や、血圧を始めとした生理的機能について、以下の方法で解析を行なった。
【００６０】
まず、上記実施例２におけるＰＣＲにより、トランスジーン（ＴＧ）が存在することが確認された７〜８週齢（体重２００−３００ｇ）のＦ１ラット（ＴＧ（＋）ラット）と、ＴＧが存在しなかった７〜８週齢（体重２００−３００ｇ）のＦ１ラット（ＴＧ（−）ラット）（コントロールラット）を用意した。このＴＧ（＋）ラットに、睡眠薬（４３ｍｇ／ｋｇのケタミン及び２．９ｍｇ／ｋｇのキシラジン）を腹腔内投与した後、正中より開腹して、右腎動脈、右腎静脈及び尿管を４−０絹糸にて結紮し、右腎臓を切除した。左腎動脈は血流残存部分が１／３となるように分枝を７−０絹糸にて結紮し、開腹前の総腎臓量に対してトータルで１／６腎臓のみ残るようにした。このようにして、５／６腎臓摘出（５／６腎摘）ＴＧ（＋）ラット（以下、「腎摘ＴＧ（＋）ラット」ともいう。）を作製した。同様の方法により、５／６腎摘ＴＧ（−）ラット（以下、「腎摘ＴＧ（−）ラット」ともいう。）を作製した。
【００６１】
これらの腎摘ＴＧ（＋）ラットと腎摘（−）ラットの血圧を随時測定するために、テレメトリーの本体をラット腹腔内に設置し、センサー部分を左大腿動から挿入、固定した。５／６腎摘手術後は、各ラットを個別にケージにて飼育し、テレメトリーにて３分毎に１０秒間の血圧測定を２４時間行なった。なお、腎摘ＴＧ（＋）ラット群及び腎摘ＴＧ（−）ラット群はそれぞれ腎摘手術を行なう前にテイルカフ（tail cuff）にて血圧を測定し、両群間に血圧差がないことを確認した。また、検査、処置による血圧変動時は、血圧がベースラインに戻ることを確認して測定を再開した。また、テレメトリーシステムとしては、Data Sciences International（DSI）製を使用し、それぞれテレメトリー送信器：TA11PA-C40、テレメトリー用受信機：RPC-1、大気圧校正装置：APR-1、データ変換マトリクス：DEM、データ取得・解析ソフトウェア：DataquestART Silver Version2.2 を使用した。このようにして腎摘ＴＧ（＋）ラット群（Ｎ＝５）及び腎摘ＴＧ（−）ラット群（Ｎ＝５）について収縮期の血圧を測定し、各時間における各群の平均血圧を算出した結果を図７に示す。図７から分かるように、腎摘ＴＧ（＋）ラット群は、腎摘ＴＧ（−）ラット群と比較して、血圧が有意に低下した。
【実施例５】
【００６２】
［５／６腎臓摘出ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの体重変化の解析］
また、上記実施例４の腎摘ＴＧ（＋）ラット群及び腎摘ＴＧ（−）ラット群について、腎摘手術前（術前）、腎摘手術後１週間（１Ｗ）、２週間（２Ｗ）、３週間（３Ｗ）に測定し、各時期における各群の平均体重を算出した結果を図８に示す。図８から分かるように、体重については、ＴＧの有無による有意な差は認められなかった。
【実施例６】
【００６３】
［５／６腎臓摘出ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの血清クレアチニン濃度の解析］
上記実施例４の腎摘ＴＧ（＋）ラット群及び腎摘ＴＧ（−）ラット群について、腎機能の指標としてよく知られる血清クレアチニン濃度（血清Ｃｒ濃度）の測定を、腎摘手術前（術前）、腎摘手術後２週間（２Ｗ）、３週間（３Ｗ）に行なった。血清は、採血した血液を遠心分離して採取した。各時期における各群の平均血清クレアチニン濃度を図９に示す。図９から分かるように、腎摘手術から３週間経過後の血清クレアチニン濃度は、腎摘ＴＧ（＋）ラット群において、腎摘ＴＧ（−）ラット群と比較して有意な低下が認められた。これは、ＴＧにより、腎不全状態がやや緩和したことを示すものといえる。
【実施例７】
【００６４】
［５／６腎臓摘出ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの心エコーの解析］
上記実施例４の腎摘ＴＧ（＋）ラット群及び腎摘ＴＧ（−）ラット群について、心エコー（「Aplio」：10MHz トランスデューサープローブ；東芝メディカルシステムズ社製）を用いて実施した。心エコーは、腎摘手術前（術前）、腎摘手術後２週間（２Ｗ）、腎摘手術後３週間（３Ｗ）に行なった。その結果、図１０に示されているように、腎摘手術後３週間において、腎摘ＴＧ（＋）ラット群では、腎摘ＴＧ（−）ラット群に比べて、心臓の左室後壁厚の有意な減少が認められた。これは、ＴＧにより、左室の肥大が抑制されていることを示すものといえる。
【実施例８】
【００６５】
［５／６腎臓摘出ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの血漿中及び尿中物質の解析］
実施例４の腎摘ＴＧ（＋）ラット群及び腎摘ＴＧ（−）ラット群について、血漿中の物質と、尿中の物質との相違に関する検討を行なった。サンプル用の尿としては、各ラットについて、腎摘手術前の２４時間にメタボリックケージにて蓄積した尿と、腎摘手術後３週間経過後の２４時間に同様に蓄積した尿を用いた。また、サンプル用の血漿としては、各ラットについて、腎摘手術前に採取した血液から分離した血漿と、腎摘手術後３週間経過後に採取した血液から分離した血漿を用いた。サンプル用の尿や血漿は、内標準物質を調整したメタノール溶液にて撹拌し、さらにＣＨＣｌ３を添加して撹拌し、４６００ｇで５分間遠心分離した後、上清を限外ろ過フィルター（分画分子量５０００）にとり、４℃、９１００ｇで２時間遠心分離し、得られたろ液を遠心濃縮したものをＣＥ−ＴＯＦＭＳ（キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計）にセットしてサンプル内の様々な物質の濃度を測定した。測定の結果を検討したところ、腎摘ＴＧ（＋）ラット群において、腎摘ＴＧ（−）ラット群と比較して濃度に大きな差が見られた物質として、グアジニノコハク酸（Guanidinosuccinate）、β−アラニン（beta-alanine）、タウリン（taurine）、グアニジウムコハク酸（Guanidium succinic acid；ＧＳＡ）、トランスアコニット酸（trans-Aconitate）が見い出された。血漿中及び尿中に含まれる上記３種類の物質（グアジニノコハク酸、β−アラニン、タウリン）の濃度を、各ラット群の平均値で示した結果を図１１〜１３に示し、血漿中に含まれる２種類の物質（ＧＳＡ、トランスアコニット酸）の濃度を図１４に示す。図１１から分かるように、グアジニノコハク酸については、血漿中及び尿中のいずれの場合も、腎摘手術後３週間において、腎摘ＴＧ（＋）ラット群では腎摘ＴＧ（−）ラット群と比較して有意に低い濃度を示した。グアジニノコハク酸が腎不全物質として知られていることを考慮すると、ＴＧであるヒトＯＡＴＰ−Ｒの発現によって、腎不全状態が改善することが示された。また、図１２から分かるように、β−アラニンについては、腎摘手術後３週間における血漿中では、腎摘ＴＧ（＋）ラット群は腎摘ＴＧ（−）ラット群と比較して有意に低い濃度を示したが、尿中では腎摘手術前及び腎摘手術後３週間のいずれでも、腎摘ＴＧ（＋）ラット群は腎摘ＴＧ（−）ラット群よりも有意に高い濃度を示した。さらに、図１３から分かるように、タウリンについては、血漿中及び尿中のいずれの場合も、腎摘手術後３週間において、腎摘ＴＧ（＋）ラット群では腎摘ＴＧ（−）ラット群よりも有意に高い濃度を示した。β−アラニンやタウリンは、血圧との関係が報告されている（Mozaffari MS et al. Kidney Int 70: 329-337, 2006）。また、図１４の左パネルから分かるように、グアニジウムコハク酸については、腎摘手術後３週間において、腎摘ＴＧ（＋）ラット群では腎摘ＴＧ（−）ラット群と比較して有意に低い濃度を示した。さらに、図１４の右パネルから分かるように、トランスアコニット酸についても、腎摘手術後３週間において、腎摘ＴＧ（＋）ラット群では腎摘ＴＧ（−）ラット群と比較して有意に低い濃度を示した。グアジウムコハク酸やトランスアコニット酸が腎不全物質として知られていることを考慮すると、ＴＧである���トＯＡＴＰ−Ｒの発現によって、腎不全状態が改善することが示された。
【００６６】
腎不全においては、前述のグアジニノコハク酸を始めとする様々な腎不全物質が蓄積することが知られているが（Vanholder R et al. Kidney Int 63: 1934-1943, 2003）、その中でも、非対称ジメチルアルギニン（asymmetrical dimethylarginine；ＡＤＭＡ）は一酸化窒素の合成を抑制し、血圧上昇作用を有する事が知られている（Vallance P et al. Lancet 339: 572-575, 1992）。そこで、株式会社エスアールエル（東京）に委託して、腎摘ＴＧ（＋）ラット及び腎摘ＴＧ（−）ラットについて、腎不全後の血漿中のＡＤＭＡ濃度をＨＰＬＣにより測定した。各群の測定結果の平均値を図１５の左パネルに示す。図１５の左パネルから分かるように、腎摘ＴＧ（＋）ラット群では腎摘ＴＧ（−）ラット群と比較して、血漿中のＡＤＭＡ濃度（ｎｍｏｌ／ｍｌ）が有意に低下していた。また、腎摘ＴＧ（−）ラットに降圧剤であるヒドララジンを投与した場合の血漿中のＡＤＭＡ濃度も測定したが（図１５の左パネル参照）、そのＡＤＭＡ濃度には特に影響がなかった。以上のことから、腎摘ＴＧ（＋）ラットにはＡＤＭＡを排泄する能力があることが示された。また、前述の腎摘ＴＧ（＋）ラット群と腎摘ラット（−）ラット群について、腎クリアランス（ｍｌ／ｍｉｎ）を測定した結果を図１５の右パネルに示す。図１５の右パネルの結果から分かるように、腎摘ＴＧ（＋）ラット群では、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の導入によって、ＡＤＭＡの排泄速度が上昇していることが分かった。
【００６７】
なお、腎摘ＴＧ（＋）ラット群の血漿中においてＡＤＭＡ濃度が低い理由が、ＡＤＭＡ分解の亢進でないことを確認するために、生体内のＡＤＭＡ分解酵素であるＤＤＡＨ１とＤＤＡＨ２の腎臓での発現を定量ＰＣＲにより調べた。その結果を図１６に示す。その結果、腎摘ＴＧ（＋）ラット群におけるＤＤＡＨ１やＤＤＡＨ２のｍＲＮＡ発現は、腎摘ＴＧ（−）ラット群より低かった。このことから、腎摘ＴＧ（＋）ラット群の血漿中においてＡＤＭＡ濃度が低いのは、ＡＤＭＡの分解が亢進していることによるものではないことが示された。すなわち、腎摘ＴＧ（＋）ラット群の血漿中においてＡＤＭＡ濃度が低いのは、ＯＡＴＰ−Ｒによる排泄によるものであることが示された。
【００６８】
腎摘ＴＧ（＋）ラット群における血清クレアチニン、グアジニノコハク酸、トランスアコニット酸などの腎不全物質の血中濃度低下や、ＡＤＭＡなどの昇圧物質の血中濃度低下は、ヒトＯＡＴＰ−Ｒを介した輸送あるいは別の輸送基質の排泄に伴う何らかの作用により生じていると考えられる。
【実施例９】
【００６９】
［５／６腎臓摘出ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの腎組織中のＣＤ６８陽性細胞数の解析］
ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の導入が腎臓の炎症にどのような影響を与えるかを調べるため、組織での炎症マーカーとして、単球／マクロファージに特有なタンパク質ＣＤ６８に対する抗体で、腎摘ＴＧ（＋）ラット群及び腎摘ＴＧ（−）ラット群の腎組織を免疫染色した。その結果を図１７に示す。図１７の結果から分かるように、腎摘手術の前後（pre Nx, post Nx）を問わず、腎摘ＴＧ（＋）ラット群では、全ての部位においてＣＤ陽性細胞数が減少しており、炎症が抑制されていると考えられた。すなわち、本発明のトランスジェニック非ヒト動物では、腎臓の炎症が抑制されることが示された。
【実施例１０】
【００７０】
［５／６腎臓摘出ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットにおけるカリクレイン発現の解析］
腎摘ＴＧ（＋）ラットと腎摘ＴＧ（−）ラットの腎不全時における腎臓での遺伝子発現量の変化をｍＲＮＡマイクロアレー法で解析したところ、カリクレイン７の発現量に差がある可能性が示唆された。そこで、腎摘ＴＧ（＋）ラット群における血圧低下（あるいは血圧上昇抑制）の作用機作の一端を調べるために、血圧降下に関連するタンパク質分解酵素の一種であるカリクレインの腎臓細胞における発現をＱＴ−ＰＣＲ（アプライドバイオシステム社製）を用いて調べた。その結果を図１８に示す。図１８から分かるように、腎摘手術後３週間において、腎摘ＴＧ（＋）ラット群では腎摘ＴＧ（−）ラット群に比べて実際にカリクレイン７の発現が上昇していることが分かった。以上の結果と、J Hypertens. 1994 Jun;12(6):653-61の示唆（タウリンが腎臓のカリクレインを増幅し、その結果、食塩誘発性高血圧を抑制する）とを併せて考慮すると、本発明の腎臓へのＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の導入により何等かの機構でタウリンの血中濃度を上昇させ、それによりカリクレイン７の発現を上昇させて、血圧低下に関与している可能性が示唆された。
【実施例１１】
【００７１】
［５／６腎臓摘出ヒトＯＡＴＰ−Ｒトランスジェニックラットの血漿中物質の解析］
実施例４の腎摘ＴＧ（＋）ラット群及び腎摘ＴＧ（−）ラット群について、両群間の血漿中の物質の相違に関する検討を行なった。サンプル用の血漿としては、各ラットについて、腎摘手術前に採取した血液から分離した血漿と、腎摘手術後３週間経過後に採取した血液から分離した血漿を用いた。サンプル用の血漿は、内標準物質を調整したメタノール溶液にて撹拌し、さらにＣＨＣｌ３を添加して撹拌し、４６００ｇで５分間遠心分離した後、上清を限外ろ過フィルター（分画分子量５０００）にとり、４℃、９１００ｇで２時間遠心分離し、得られたろ液を遠心濃縮したものをＣＥ−ＴＯＦＭＳ（キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計）にセットしてサンプル内の様々な物質の濃度を測定した。測定の結果を検討したところ、腎摘手術後３週間経過後の腎摘ＴＧ（＋）ラット群において、腎摘手術後３週間経過後の腎摘ＴＧ（−）ラット群と比較して濃度差が見られた物質として、インドキシル硫酸（Indoxyl sulfate）、トランスアコニット酸（Trans-aconitate）、４−アセチル酪酸（4-Acetylbutyrate）、ヘキサン酸（Hexanoate）、２−ヒドロキシペンタン酸（2-Hydroxypentanoate）、アルギニノコハク酸（Argininosuccinate）等の６種類のアニオンや、クレアチニン（Creatinine）、グアジニノコハク酸（Guanidinosuccinate）、α−アミノアジピン酸（α-Aminoadipate）、シトルリン（Citrulline）、ピペコリン酸（Pipecolate）、３−メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、アラントイン（Allantoin）、トリメチルアミン Ｎ−オキシド（Trimethylamine N-oxide）、グアジニノ酢酸（Guanidinoacetate）、カルニチン（Carnitine）、デセチルアトラジン（Desethylatrazine）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、メチオニンスルホキシド（Methionine sulfoxide）等の１５種類のカチオンが見い出された。血漿中に含まれる上記２１種類の物質の濃度について、各ラット群の平均値で示した結果を図１９に示す。図１９に示されるこれら２１種類の物質のうち、トランスアコニット酸、４−アセチル酪酸、ヘキサン酸、２−ヒドロキシペンタン酸、アルギニノコハク酸、α−アミノアジピン酸、ピペコリン酸、デセチルアトラジン、メチオニンスルホキシドを除く１２種類の物質は、腎不全物質であることが既に知られている。図１９の結果から、ＴＧであるヒトＯＡＴＰ−Ｒの発現によって、ＡＤＭＡ、グアジニノコハク酸、トランスアコニット酸の腎不全での蓄積が改善することが示された。なお、前述の２１種類の物質のうち、トランスアコニット酸、４−アセチル酪酸、ヘキサン酸、２−ヒドロキシペンタン酸、アルギニノコハク酸、α−アミノアジピン酸、ピペコリン酸、デセチルアトラジン、メチオニンスルホキシドは、これまで腎不全物質としては知られていなかったが、本実験の結果により、腎不全物質であることが示唆された。また、本明細書中における「カチオン」には、塩基性条件下でカチオンとなる物質も含まれ、例えば、塩基性条件下でカチオンとなるアミノ酸類も含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、腎不全や血圧異常の治療薬の開発や病態の解析、あるいは、薬物の腎排出の解析の分野で有用に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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