(57)【要約】【課題】ペプチド又は蛋白質へのＰＥＧの結合は、一般に１以上のアミノ酸残基へのＰＥＧの非特異的結合を生ずる。従って、この方法の重要な問題点の一つは特定のアミノ酸残基にＰＥＧ分子を共有結合させる適当な化学的方法を見いだすことである。【解決手段】方法は、ｈＧＲＦペプチド及び活性化ＰＥＧ間の結合反応が溶液中に実施され、所望のｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体がクロマトグラフィーにより精製できることを特徴とする、Ｌｙｓ１２及び／又はＬｙｓ２１及び／又はＮαに共有結合した１またはそれ以上のＰＥＧ単位（ｈＧＲＦ当たり）を含むｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体の部位特異的調製方法について記載される。本法により調製された結合体、及び成長ホルモン欠失の治療、予防又は診断へのその使用も本発明の目的である。【選択図】図１
2010024245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモン放出因子（ｈＧＲＦ）ペプチド及び活性化ＰＥＧ間の結合反応をジメチルスルホキシド溶液中にて実施すること、そしてその後所望のｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体を反応混合液より単離して、精製すること
を含む、配列番号：１のＬｙｓ１２、Ｌｙｓ２１の少なくとも一つのアミノ酸及びアミノ末端基（Ｎα）に共有結合した、ヒト成長ホルモン放出因子（ｈＧＲＦ）あたり１または１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位を含む、ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体の部位特異的調製方法。
【請求項２】
ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体が反応混合液から単離され、クロマトグラフィー法により精製される請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｈＧＲＦペプチドがｈ−ＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２ある請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＰＥＧ化反応前にｈＧＲＦペプチドが部位：Ｎα、Ｌｙｓ１２及びＬｙｓ２１の一つまたはそれ以上で保護される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
さらにＰＥＧ化後に脱保護反応を含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がモノ−メトキシ化体にアルキル化またはアシル化されたＰＥＧである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＰＥＧ化反応を周囲温度にて実施する請求項１記載の方法。
【請求項８】
Ｌｙｓ１２及びＬｙｓ２１に関する保護化学基が、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、Ｄｄｅ（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）、Ａｄｐｏｃ（１−（１’−アダマンチル）−１−メチル−エトキシカルボニル）又は２−Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）からなる群から選択される請求項４記載の方法。
【請求項９】
活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、５，０００、１０，０００、及び２０，０００からなる群から選択される分子量を有するモノ−メトキシル化型ＰＥＧである請求項５記載の方法。
【請求項１０】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のヒト成長ホルモン放出因子（ｈＧＲＦ）に対するモル比が１：１、２：１または３：１である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌｙｓ１２及び／又はＬｙｓ２１、及び／またはＮαと共有結合した１またはそれ以上の１ＰＥＧ単位（ｈＧＲＦ当たり）を含むｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体の部位特異的調製方法にあって、ｈＧＦＲペプチドと活性化ＰＥＧ間の結合反応が溶液中で行われ、所望のｈＧＦＲ−ＰＥＧ結合体がクロマトグラフィー法により精製されることを特徴とする方法に関する。
【０００２】
本法により調製された結合体、及び成長ホルモン関連疾患の治療、予防または診断へのその使用も本発明の目的である。
【背景技術】
【０００３】
１９８０年代前半、複数のグループが成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）を単離し解析した。
ＧＲＦ（ソマトレリン（Ｓｏｍａｔｏｒｅｌｉｎ）とも呼ばれる）は脳下垂体より分泌されるペプチドで、そのレセプター上に作用して脳下垂体前葉からの成長ホルモン（ＧＨ）分泌を促進する。４４−、４０−または３７−アミノ酸ペプチドが存在する：４４−アミノ酸型が生理学的により短い型に転換されうる。これら全ての型が活性であると報告されており、その活性は主に先頭の２９アミノ酸残基内に存在している。ヒトＧＲＦの１−２９アミノ酸配列に相当する合成ペプチド［ｈＧＲＦ（１−２９）］はセルモレリン（Ｓｅｒｏｍｏｒｅｌｉｎ）とも呼ばれ、欧州特許ＥＰ１０５７５９号に記載の如く組換え体ＤＮＡ技術により調製される。
【０００４】
セルモレリンは成長ホルモン欠損の診断及び治療では、酢酸塩の形で利用されている。ＧＨ放出促進へのＧＲＦの利用は、長骨成長又は蛋白質同化を促進する生理学的方法である。
【０００５】
ＧＲＦの使用に伴う問題の一つは、その短い生物学的半減期（約１２ないし３０分）に関連している。ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２は酵素分解の対象であり、残基Ａｌａ２及びＡｓｐ３間のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断により、血漿中に急速に分解される。
【０００６】
従って、ＧＲＦの特異的化学修飾を利用した生物学的に安定な、長期作用型ＧＲＦ類縁体の開発は、酵素分解を防止、又は遅延させる上で有益である。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、式中のｎが４以上である一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨで表される親水性で生体適合性の無毒のポリマーである。その分子量は２００から２０，０００ダルトンまで多様である。
【０００７】
モノメトキシ化型ＰＥＧを蛋白質及び／又はペプチドへ化学結合すると、その生物作用の持続期間が延びる。糖蛋白質中の糖質成分同様、ＰＥＧも保護コーティングを提供し、分子サイズを大きくし、その結果代謝性の分解及び腎臓からの排泄を減少させる。
【０００８】
ＰＥＧ結合体は、Ｄａｖｉｓ及びＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、１９７７ａ及び１９７７ｂ）の基礎研究により開拓されたペプチド及び蛋白質供給に関しては既に確立された方法である。ペプチド又は蛋白質へのＰＥＧの結合は、一般に１以上のアミノ酸残基へのＰＥＧの非特異的結合を生ずる。従って、この方法の重要な問題点の一つは特定のアミノ酸残基にＰＥＧ分子を共有結合させる適当な化学的方法を見いだすことである。
【０００９】
例えば、毒性であり、非特異的様式で反応することが知られているトリクロロトリアジン活性化ＰＥＧは、各種ＰＥＧ試薬を利用してアミノ基（Ｂｅｎｃｈａｍｐら、１９８３；Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、１９８５；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９８３；Ｚａｌｉｐｓｋｉら、１９９０；及びＤｅｌｇａｄｏら、１９９０）、スルフィドリル基（Ｓａｒｔｏｒｅら、１９９１；及びＭｏｒｐｕｒｇｏら、１９９６）、またはグアンニジノ基（Ｐａｎｄｅら、１９８０）と特異的に反応できる化学リンカーと後で置換することができる。
【００１０】
各種ＰＥＧ蛋白質結合体は、蛋白質分解から保護され、そして／又は免疫原性が低いことが知られている（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら、１９９５；及びＹａｍｕｓｋｉら、１９８８）。
【００１１】
蛋白質のＰＥＧ化に関する別の技術的困難は、通常ＰＥＧ−蛋白質結合体が多様な数のＰＥＧ分子が結合しており、その結果多様なＰＥＧ：蛋白質化学量論比を持つ結合体の混合体となることに起因する。部位特異的ＰＥＧ化には化学的創意工夫が必要とされる。ＧＨへのＰＥＧの結合は、この様な問題の典型例である（Ｃｌａｒｋら、１９９６）。ＧＨのＬｙｓ残基は無作為位置でＰＥＧ化される。
【００１２】
酵素活性の消失を避け、又は減じるために反応部位がまず保護され、それにより非活性部位に対する酵素によるＰＥＧ化が可能になる（Ｃａｌｉｃｅｔｉら、１９９３）。
固相ペプチド合成法により調製されたＧＲＦの様な低分子ペプチドへの部位特異的ＰＥＧ結合に関し、別の方法が最近報告された。この様な結合体では、前もって調製されたＰＥＧ化されたアミノ酸が固相合成中にペプチド配列中に導入される。しかし、この方法では固相合成で重要であることが知られている生成物の精製を極めて複雑にする。ＰＥＧの存在は、その高分子とその高分散性により受容不可能な不純物を持つ最終生成物及び／又はアミノ酸を欠く生成物を生じる様になり、後者はメリフィールド法では普通に発生すると考えられている。
【００１３】
固相合成法を利用して［Ａｌａ１５］−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２の特定アミノ酸残基に対する、１ＰＥＧ分子のみを結合させることを意味するモノＰＥＧ化が最近文献に報告された（Ｆｅｌｉｘら、１９９５）。この研究では、残基２１または２５がＰＥＧ化された［Ａｌａ１５］−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２が親である［Ａｌａ１５］−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２の完全なｉｎ−ｖｉｔｒｏ能を保持していることを示した。しかし、これらＰＥＧ化結合体が非ＰＥＧ化結合体に比べより長い活性期間を保有するかどうかを示すｉｎ−ｖｉｖｏデータは無かった。
【００１４】
さらに最近、様々な分子量を持つＰＥＧをｈＧＲＦの複数の類縁体のＣ−末端に結合すると、非ＰＥＧ化分子に比べてブタ及びマウスモデルでは作用期間が延長されることが示された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、１９９７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】欧州特許ＥＰ１０５７５９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem.,252,3571-3581
【非特許文献２】Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem., 252,3582-3586
【非特許文献３】Benchamp C. O. et al., Anal. Biochem., 131,25-33,1983
【非特許文献４】Veronese F. M., et al., Appl. Biochem., ll, 141-152 (1985)
【非特許文献５】Zalipsky S. et la, Europ. Polym. J., 19,1177-1183,1983
【非特許文献６】Zalipsky S. et al., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-110 ACS Symposium series 469,1990
【非特許文献７】Delgado C. et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 12,119-128,1990
【非特許文献５】Sartore L. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27,45,1991
【非特許文献６】Sartore L., et al., Applied Biochem. Biotechnol,31,213-22,1991
【非特許文献７】Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7,363-368,1996
【非特許文献８】Pande C. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. lJ5XA,77,895-899,1980
【非特許文献９】Monfardini et al., Biocon. Chem, 6,62-69,1995
【非特許文献１０】Yamsuki et al., Agric. Biol. Chem., 52,2185-2196,1988
【非特許文献１１】Clark R. et al.,. J. Biol. Chem.,36,21969-21977,1996
【非特許文献１２】Caliceti et al., J. Bioactive Compatible Polymer, 8,41-50,1993
【非特許文献１３】Campbell R. et al. J. Peptide Res.,49,527-537,1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記モノＰＥＧ化されたｈＧＲＦの固相調製法に対し、本発明は液相中でのｈＧＲＦの部位特異的ＰＥＧ化に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２のアミノ酸配列を示す。矢印はＰＥＧ化可能位置を示す。
【図２】図２は、実施例１記載の、ＤＭＳＯ中にてＰＤＧ化実施後得られた混合体の逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す。最初の２つの主要ピークはｈＧＲＦモル当たり１ＰＥＧ鎖を含む結合体を示す。その後のマイナーピークはｈＧＲＦ：２ＰＥＧ結合体を、最後のピークはｈＧＲＦ：３ＰＥＧ結合体を示す。
【図３ａ】図３ａは、ズブチリシンによる本発明のｈＧＲＦ（１−２９）及びＰＥＧ結合体の分解を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、キモトリプシンによる本発明のｈＧＲＦ（１−２９）及びＰＥＧ結合体の分解を示す。
【図４】図４は、円二色性による［Ｌｙｓ（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）１２，２１−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２］の分光特性を示す。スペクトラは「天然」ｈＧＲＦのスペクトラに重複した。
【図５】図５は、ＣＨＯ−ｈＧＲＦＲ−ＬＵＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに於ける各種ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（初回ＤＭＳＯ調製物由来）の生物作用を示す。
【図６】図６は、ＣＨＯ−ｈＧＲＦＲ−ＬＵＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに於ける各種ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（第２回ＤＭＳＯ調製物由来）の生物作用を示す。データは２回の独立した実験の平均を示す。
【図７】図７は、ＣＨＯ−ｈＧＲＦＲ−ＬＵＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに於ける各種ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（ニコチンアミド調製物由来）の生物作用を示す。データは２回の独立した実験の平均を示す。
【図８】図８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに於けるラット下垂体からのＧＨ放出に及ぼす各種ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（初回ＤＭＳＯ調製物由来）の生物作用を示す。
【図９】図９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに於けるラット下垂体からのＧＨ放出に及ぼす各種ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（第２回ＤＭＳＯ調製物由来）の生物作用を示す。
【図１０】図１０は、オスラットに於けるｈＧＲＦ（４００μｇ／ラット）ｉ．ｖ．注射後の血漿ｈＧＲＦ及び血清ＣＨレベルの時間−反応曲線を示す。
【図１１】図１１Ａは、オスラットに於ける４００μｇ／ラットのｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（ＤＭＳＯ調製物）ｉ．ｖ．注射後の血漿ＧＨレベルの時間−反応曲線を示す。各点は３匹のラットの平均値を示す。図１１Ｂは、オスラットに於ける４００μｇ／ラットのｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（ＤＭＳＯ調製物）ｉ．ｖ．注射後の血漿ｈＧＲＦレベルの時間−反応曲線を示す。各点は３匹のラットの平均値を示す。
【図１２】図１２は、ＧＲＦ活性評価の為のレポーター遺伝子アッセイに用いたプラスミドｐｃＤＮＡ３−ｈＧＲＦ−Ｒの制限酵素マップを示す。
【図１３】図１３は、ＧＲＦ活性評価の為のレポーター遺伝子アッセイに用いたプラスミドｐＴＦ５−５３ＬＵＣの制限酵素マップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ｈＧＲＦは最も効率的なＰＥＧ化反応が起こる化学的状態である中性／アルカリ性緩衝液中には低溶解性であることが知られている。希釈されたｈＧＲＦ溶液中では、活性化ＰＥＧ（ＰＥＧエステルの様な）の加水分解によってＰＥＧ化反応の収率が減少する傾向にある。
【００２０】
ｈＧＲＦが高い溶解性を持つ好適溶媒中では、部位特異的ＰＥＧ化反応が液相中に実施できることが出願者らにより発見された。この場合、出発ｈＧＲＦペプチドが非保護型の場合でも、ＰＥＧ鎖は高率、且つ殆どが反応条件によりＬｙｓ１２、Ｌｙｓ２１及び／又はＮαの一次アミノ基（ε−アミノ基）に優先的に結合する。本発明によっても包含されている以下４種類の結合体を、主にｈＧＲＦに対するＰＥＧ比に依存した結合体中ｈＧＲＦ：ＰＥＧ化学量論比に得た：
１ＰＥＧ分子がＬｙｓ１２に共有結合したｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体、
１ＰＥＧ分子がＬｙｓ２１に共有結合したｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体、
２ＰＥＧ分子がＬｙｓ１２及びＬｙｓ２１に共有結合したｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体、及び
３ＰＥＧ分子がＬｙｓ１２、Ｌｙｓ２１及びＮα共有結合したｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体である。
【００２１】
本発明に於ける「Ｎα」とは、ペプチドのＮ末端位置（Ｔｙｒ）にあるアミノ基を意味する。
このステップに続き、更に反応で得た結合体を、水／アセトニトリル勾配により溶出されるゲル濾過、又はＣ１８ＨＰＬＣカラムへの直接の適用のいずれかを利用した簡便なクロマトグラフィー分画が実施できる。生成物の大規模な調製及び精製が可能であることから、２番目の方法が好ましい。
【００２２】
従って、本発明の主な実施態様は、Ｌｙｓ１２及び／又はＬｙｓ２１、及び／又はＮαに共有結合した（ｈＧＲＦ当たり）１またはそれ以上のＰＥＧ単位を含む各種ｈＧＲＦ-ＰＥＧ結合体の部位特異的調製法にあって、ＰＥＧ化反応が液中に実施され、所望のｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体が、例えばクロマトグラフィー法により精製されることを特徴とするものである。
【００２３】
Ｌｙｓ１２及び／又はＬｙｓ２１、及び／又はＮαに共有結合した（ｈＧＲＦモル当たり）１またはそれ以上のＰＥＧ単位を含むｈＧＲＦ-ＰＥＧ結合体も本発明に包含される。１ＰＥＧ分子がＬｙｓ１２又はＬｙｓ２１に共有結合したｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体が本発明の好適生成物である。
【００２４】
本発明の別の実施態様によれば、もしＰＥＧ鎖が結合した上記３種類のアミノ基の１つ又はそれ以上が特定の化学基によりＰＥＧ化より可逆的に保護されていれば、ＰＥＧ化反応は特定のＰＥＧ部位を持つ所望の結合体を直接提供でき、続いてこれらを例えば限外濾過又はその他のクロマトグラフィー法により反応混合液より分離することができる。この場合、調製方法はさらに脱保護反応を随意含むことができる。
【００２５】
脱保護反応は公知方法により、取り除かれる化学保護基に合わせ実施されることが好ましい。
本発明によれば、「ｈＧＲＦ」という語は別記無き限り、特に１−４４，１−４０、１−２９ペプチド、及びそれぞれのアミド（Ｎ−末端またはＣ−末端にアミド基を含む）にて参照されるいずれかのヒトＧＲＦペプチドを包含するものである。好適なｈＧＲＦペプチドは、アミノ酸配列が配列番号：１に報告されているｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２である。
【００２６】
「活性化ＰＥＧ」（または「ＰＥＧ化作用物質」）は、蛋白質／ペプチド中の官能基と反応し、ＰＥＧ−蛋白質／ペプチド結合体を生成できる官能基を含む結合体を蛋白質変性剤として利用できるいずれかのＰＥＧ誘導体である。蛋白質変性剤として有益なＰＥＧ誘導体の概説はＨａｒｒｉｓ（１９８５）に見ることができる。活性化ＰＥＧは、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧエポキシド、又はＰＥＧトレシレートの様なアルキル化剤、又はＰＥＧエステルの様なアシル化剤が利用できる。
【００２７】
活性化ＰＥＧはモノ−メトキシル化型で利用するのが好ましい。分子量は２，０００ないし２０，０００が好ましい。本発明による活性化ＰＥＧの調製にはモノ−メトキシル化ＰＥＧ５，０００が特に好ましい。
【００２８】
活性化ＰＥＧがアシル化剤の場合、アミド結合によりＰＥＧ成分と結合したノルロイシンまたはオルニチン残基を含むことが好ましい。これら残基により、ペプチドモル当たりの結合ＰＥＧユニットを正確に決定できる（例えばＳａｒｔｏｒｅら、１９９１参照）。従って、より具体的には、好適な活性化ＰＥＧは、アミド結合によりスクシニミジルエステルの様なカルボキシル基で活性化されるノルロイシンのアルファアミノ基に結合したモノ−メトキシル化ＰＷＧ５，０００である。
【００２９】
分枝型ＰＥＧｓも広く利用される。分枝型ＰＥＧｓは式中のＲがペンタエリスリトール又はグリセロールの様な中心核成分を表し、ｍが分枝腕の数を表すＲ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍで表すことができる。分枝腕数（ｍ）は３ないし１００またはそれ以上の範囲である。ヒドロキシ基は化学修飾の対象である。
【００３０】
ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９６／２１４６９に記載の如くの別の分枝型は、化学修飾の対象となる単独末端を持つ。この型のＰＥＧは、式中のｐが２または３であり、Ｒがリジン又はグリセロールの様な中心核成分を表し、Ｘが化学的活性化の対象であるカルボキシルの様な官能基を表す（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−）ｐＲ−Ｘで表すことができる。さらに別の分枝型、「ペンダントＰＥＧ」はＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧ骨格に沿ってカルボキシルの様な反応基を有している。
【００３１】
これら全ての分枝型ＰＥＧｓは上記同様にして「活性化」することができる。
「クロマトグラフィー法」とは、支持体（固定相）に溶媒（移動相）を流す方法により、混合体の成分分離に利用できる何れかの技術を意味する。クロマトグラフィーの分離原理は、固定相と移動相の異なる物理特性に基づいている。
【００３２】
文献公知のクロマトグラフィー法の特定の型には、液体、高圧液体、イオン交換、吸着、アフィニティー、分配、疎水性、逆相、ゲル濾過、限外濾過または薄層クロマトグラフィーが含まれる。
【００３３】
「ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）」は、活性化ＰＥＧと対応する蛋白質／ペプチドより出発してＰＥＧ−蛋白質／ペプチド結合体を得ることができる反応である。
ＰＥＧ：ｈＧＲＦのモル比は、高収率が期待される結合体種類により１：１、２：１または３：１である。
【００３４】
ＰＥＧ化反応の溶媒は、高濃縮ニコチンアミド水溶液、変性剤（尿素の様な）の緩衝化水溶液、又はジメチルスルホキシド、ジメチルフォルムアミド／緩衝液またはアセトニトリル／緩衝液より選択される極性有機溶媒を含むグループより選択される。
【００３５】
液のｐＨは通常は７ないし９の範囲に維持される。
Ｌｙｓ１２及びＬｙｓ２１に関する保護化学基の非限定的リストには、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、Ｄｄｅ（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）、Ａｄｐｏｃ（１−（１’−アダマンチル）−１−メチル−エトキシカルボニル）又は２−Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）を含む。Ａｌｌｏｃはリジン基の好適な保護基である。
【００３６】
ＰＥＧ化後、ＡｌｌｏｃはＧｒｅｅｎｅ  Ｔ．Ｗ．ら、（１９９１）記載の方法の一つにより除去できる。Ｄｄｅは２％ヒドラジンＤＭＦ液により除去できる（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎら、１９９５参照）。ＡｄｐｏｃはＡｌｌｏｃと同様にして除去できる（Ｄｉｃｋ  Ｆら、１９９７も参照）。２−Ｃｌ−Ｚはより強い酸脱保護剤（ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、ＨＢｒ）または水素添加（Ｔａｍら、１９８７も参照）が必要である。
【００３７】
Ｎαの保護基はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ベンジル、又はシクロヘキシルの様なアルキル基である。これらアルキル基は還元的アルキル化により導入できる（Ｍｕｒｐｈら、１９８８又はＨｏｃａｒｔら、１９８７参照）。
【００３８】
［Ｎα−イソプロピル−Ｔｈｒ１、Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）１２］−ｈＧＲＦ及び［Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）１２，２１］−ｈＧＲＦも、ＰＥＧ化反応の有用かつ新規中間体として本発明に包含される。
【００３９】
本発明のＰＥＧ化は、１．ペプチドの立体構造を変えず、
２．蛋白質分解変性に対する耐性を増し、
３．ＰＥＧ化の程度に関わらず生物活性に影響しないか、または僅かに低下させるだけであり、そして
４．水性緩衝液中でより安定な生成体を獲得させる。
【００４０】
本発明の別の目的は、活性成分として医薬組成物の使用に好適な様にｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体を本質的に純化した形状で提供することである。
更に別の観点では、本発明は例えば成長ホルモン欠損症（ＧＨＤ）、特に先天性成長ホルモン欠損症の様な成長ホルモン関連障害の治療、予防、又は診断用医薬品の製造への本発明の結合体の使用を提供する。
【００４１】
医薬品は、本発明の結合体と、１またはそれ以上の医薬品として利用可能な担体及び／又は添加物を共に含む医薬組成物の形状でもたらされることが好ましい。この様な医薬組成物は、本発明のさらに別の観点も形成する。
【００４２】
本発明の１つの実施態様は、本発明の結合体の医薬活性量を、成長ホルモン関連障害を発症するリスクにある被検体、又は既にそのような病気を発症している被検体に投与することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、本発明の結合体の有効量を、１またはそれ以上の医薬品として許容される添加物存在下に投与することを含む、成長ホルモン関連障害の治療、予防、又は診断法である。
【００４４】
”有効量”とは、上記障害の経過及び重症度に作用し、これら病理の軽減または寛解をもたらすのに十分な活性成分量を意味する。有効量は、投与経路及び患者の状態に依存するだろう。
【００４５】
”医薬品として許容される”とは、活性成分の生物活性の有効性に干渉せず、また投与される宿主に有毒でない担体を含むことを意味する。例えば、非腸管的投与では、上記活性成分は生理食塩水、デキストロール液、血清アルブミン及びリンガー液の様な賦形剤注射液の単位投与形状に製剤化されるだろう。
【００４６】
医薬品として許容される担体以外に、本発明の組成物は安定化剤、賦形剤、緩衝剤及び保存剤の様な添加物を少量含むこともできる。
活性成分に適したいずれの投与経路も利用できる。皮下、筋肉内、又は静脈注射の様な非腸管投与が好適である。投与される活性成分量は、患者の年齢、体重、個別の反応性に応じた医学的処方に基づく。
【００４７】
ヒト治療に関する活性成分投与量は、５ないし６，０００μｇ／ｋｇ体順の間であり、好適投与量は１０ないし３００μｇ／ｋｇ体重の間である。
本発明は具体的実施態様を参照しながら記載されるが、明細書の内容にはクレームの意味及び目的を逸脱すること無しに当業者により実施可能なあらゆる変更および置換が含まれる。
【００４８】
次に本発明を以下の実施例を用いて記述するが、もとよりこれらはいずれも本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４９】
略語
アセトニトリル（ＡＣＮ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジル（ＢＺＬ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、Ｎ−メチルピロロリドン（ＮＭＰ）、２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマンー６−スルフォニル（Ｐｍｃ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）。
実施例１：ｈＧＦＲの液層ＰＥＧ化
これら実験では、スクシニミジルエステルの様なカルボキシ基で活性化されたノルロイシンのアルファアミノ基に、アミド結合により結合されたモノ−メトキシル化ＰＥＧ５，０００（ＭＰＥＧ５，０００）をＰＥＧ化試薬として用いた。それは例えばＬｕら、１９９４記載の如くにして調製できる。
【００５０】
Ｂａｈｅｍより供給されたヒトＧＲＦ１−２９ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２をｈＧＲＦペプチドとして利用した。
低水溶性ｈＧＲＦ（１−２９）を、ＰＥＧ化に必要な中性または弱アルカリ性にするために、ＡないしＥの各種反応条件を適用した：
Ａ．ジメチルスルホオキシド：２０ｍｇのペプチドを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、適当量のＰＥＧ化試薬を一度に加えた。
Ｂ．ジメチルフォルムアミド／０．２Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．０、容積比１：１：ペプチド及び適当量のＰＥＧ化試薬を一度に加えた。
Ｃ．高濃縮ニコチンアミド水溶液（２００ｍｇ／ｍｌ）：２００ｍｇのニコチンアミドを４０ｍｇのｈＧＲＦ（１−２９）を含む１０ｍＭ酢酸液１ｍｌに加えた。適当量のＰＥＧ化試薬を加える前に、ｐＨ８．０の０．２Ｍホウ酸緩衝液１ｍｌをこの酸性液に加え、所望ｐＨにした。
Ｄ．アセトニトリル／０．２Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．０容積比１：１及び適当量のＰＥＧ化試薬を一度に加えた。
Ｅ．０．２Ｍホウ酸緩衝液、５Ｍ尿素、ｐＨ８．０及び適当量のＰＥＧ化試薬を一度に加えた。
【００５１】
乾燥ＰＥＧ試薬を攪拌しながら加え、最終ＰＥＧ：ｈＧＲＦモル比を１：１、２：１または３：１にした。比２：１が好ましい。
様々なＰＥＧ：ｈＧＲＦモル比を使い、主要結合体が所望結合体である反応混合体を調製した。
【００５２】
反応液は精製前に５時間室温に放置した。
以下４種類のｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（Ａ１−Ａ４）を得た：
Ａ１：［Ｌｙｓ（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）１２−ｈＧＦ（１−２９）−ＮＨ２］、
Ａ２：［Ｌｙｓ（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）２１−ｈＧＦ（１−２９）−ＮＨ２］、
Ａ３：［Ｌｙｓ（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）１２，２１−ｈＧＦ（１−２９）−ＮＨ２］、及び
Ａ４：Ｎα−（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）［Ｌｙｓ（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）１２，２１−ｈＧＦ（１−２９）−ＮＨ２］。
【００５３】
過剰のＤＭＳＯ、ジメチルフォルムアミド、アセトニトリル又は尿素、及び反応副産物（ヒドロキシスクシニミド）を１，０００Ｄカットオフ膜を使ったゲル濾過により除去した。１０ｍＭ酢酸で容積を１０ｍｌとし、続いて１ｍｌに減じた。この操作を３回繰り返した。
【００５４】
ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体はゲル濾過クロマトグラフィーまたは、逆相クロマトグラフィーにて単離した。
実施例２：ゲル濾過クロマトグラフィー
ゲル濾過クロマトグラフィーにより、成分の分子量差に基づき生成物を分画した（本例では、結合体ｈＧＲＦ−ＰＥＧ１：１ＭＷ＝８，３５８、ｈＧＲＦ−ＰＥＧ１：２ＭＷ＝１３，３５８、及びｈＧＲＦ−ＰＥＧ１：３ＭＥ＝１８，３５８。未結合型ｈＧＲＦＭＷ＝３３５８）。分離は、流速１．５ｍｌ／分で１０ｍｌの酢酸にて溶出する連続カラムシステムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２樹脂（Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行った。
【００５５】
収集分画１ｍｌについて２８０ｎｍのＯＤ分析し蛋白質含量を調べ、ヨード試験にてＰＥＧ含量を調べた（Ｓｉｍｓら、１９８０）。
モル比１：１ｈＧＲＦ：ＰＥＧを用いたＤＭＳＯ中のＰＥＧ化後、３つのピークを得た：
溶出容積１３２ｍｌのｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（主ピーク）；
溶出容積１０８ｍｌのｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（マイナーピーク）；及び
溶出容積１０８ｍｌの未結合型ｈＧＲＦ（マイナーピーク）である。
【００５６】
モル比１：２のｈＧＲＦ：ＰＥＧを用いたＤＭＳＯ中のＰＥＧ化後、３つのピークを得た：
溶出容積１０８ｍｌのｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（主ピーク）；
溶出容積１３２ｍｌのｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（マイナーピーク）；及び
溶出容積７３ｍｌの未結合型ｈＧＲＦ（マイナーピーク）である。
【００５７】
モル比１：３のｈＧＲＦ：ＰＥＧを用いたＤＭＳＯ中のＰＥＧ化後、２つのピークを得た：
溶出容積７３ｍｌのｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（主ピーク）；及び
溶出容積１０８ｍｌのｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（マイナーピーク）である。
【００５８】
溶出ピークを集め、１，０００Ｄカットオフ膜を用いた限外濾過により濃縮し、凍結乾燥後、１０ｍＭ酢酸中に溶解し、その同定及び定量を以下報告する如くに調べた。
７３ｍｌの溶出容積のピークは化合物Ａ４に相当することが判明した。
【００５９】
１３２ｍｌの溶出容積のピークは化合物Ａ３に相当することが判明した。
１０８ｍｌの溶出容積のピークは化合物Ａ２及びＡ１の混合体に相当することが判明した。
【００６０】
２３２ｍｌの溶出容積のピークは未結合型ｈＧＲＦに相当することが判明した。
しかし、この精製法では同一分子量ではあるがＰＥＧ化部位の異なるｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（位置異性体）を分離することはできない。
実施例３：逆相クロマトグラフイー
より特異的な分画は、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラムを用いた親水性クロマトグラフィーにより実施した。この方法は同一分子量を持つ異性体を分離することができる。実際、この方法によって、ゲル濾過により得た１ＰＥＧ共有結合型の結合体に対応する単一ピークが２つのピークに分かれることが判明した。    
【００６１】
逆相クロマトグラフィーを、Ｈ２Ｏ／０．０５％ＴＦＡ（溶出液Ａ）及びアセトニトリル／＝．０５％ＴＦＡ（溶出液Ｂ）の勾配で溶出するＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８調製用カラム（Ｖｙｄａｃ）を用い、以下実施した：
０−５分      ３５％Ａ
５−３５分    ３５Ａ→２％Ａ
３５−３８分  ２％Ａ
３８−４０分  ２％Ａ→３５％Ａ
流速：１０ｍｌ／分；ループ１μｌ；ＵＶ−Ｖｉｓ検出器、２８０ｎｍ。
【００６２】
モル比１：１のｈＧＲＦ−ＰＥＧを用いＤＭＳＯ中にＰＥＧ化すると、４つのピークを得た：
１．  １３．２分      主ピーク；
２．  １３．７分      主ピーク；
３．  １４．４分      マイナーピーク；及び
４．  ８．９分        マイナーピーク。
【００６３】
モル比１：２のｈＧＲＦ−ＰＥＧを用いＤＭＳＯ中にＰＥＧ化すると、４つのピークを得た：
１．  １３．２分      マイナーピーク；
２．  １３．７分      マイナーピーク；
３．  １４．４分      主ピーク；及び
４．  １５．５分      マイナーピーク。
【００６４】
モル比１：３のｈＧＲＦ−ＰＥＧを用いＤＭＳＯ中にＰＥＧ化すると、２つのピークを得た：
１．  １４．４分      マイナーピーク；及び
２．  １５．５分      主ピーク。
【００６５】
溶出ピークを集め、蒸発してアセトニトリルとＴＦＡを除いた後、凍結乾燥した。乾燥生成体を１０ｍＭの酢酸液に溶解し、以下記載の如くに分析し、単離種の同定及び定量を行った。
【００６６】
１３．２分に溶出されたｈＧＦＲ−ＰＥＧ結合体は、化合物Ａ１（ＧＲＦ−１ＰＥＧ、第１ピーク）に相当することが判明した。
１３．７分に溶出されたｈＧＦＲ−ＰＥＧ結合体は、化合物Ａ２（ＧＲＦ−１ＰＥＧ、第２ピーク）に相当することが判明した。
【００６７】
１４．４分に溶出されたｈＧＦＲ−ＰＥＧ結合体は、化合物Ａ３（ＧＲＦ−２ＰＥＧ）に相当することが判明した。
１５．５分に溶出されたｈＧＦＲ−ＰＥＧ結合体は、化合物Ａ４（ＧＲＦ−３ＰＥＧ）に相当することが判明した。
【００６８】
８．９分に溶出されたピークは未結合型ｈＧＲＦであることが判明した。典型
例として、２：１ＰＥＧ：ｈＧＲＦモル比を用いて得たＰＥＧ化生成体の逆相クロマトグラフィーを図２に報告する。
【００６９】
溶媒蒸発／凍結乾燥により乾燥生成物を得た。
実施例３ａ：ＰＥＧ１０，０００を用いたｈＧＲＦの液相ＰＥＧ化
本実施例では、スペーサーとしてリジンを持つ分子量１０，０００ダルトンの分枝型  モノメトキシＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社より供給された）を用いた。この分枝型ＰＥＧは、ＰＥＧ５，０００をリジンの各アミノ基に結合させて得た。
【００７０】
スクシニミジルエステルとして活性化されたスペーサーリジンのカルボキシル基をＤＭＳＯ中にｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２のアミノ基と、ＧＲＦ１モルに対しＰＥＧ０．９モルのモル比で反応させた。
【００７１】
調製用カラムＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＴＭによるゲル排除クロマトグラフィーを行い、溶媒を除き残査を分画した。２種類のｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体に該当する２つのピークが溶出された。最初のマイナーピークはｈＧＲＦに２ユニットのＰＥＧ１０，０００を有する結合体に相当し、２番目の主ピークはｈＧＲＦ当たり１ユニットのＰＥＧ１０，０００を含む結合体に相当した。
実施例３ｂ：ＰＥＧ２０，０００を用いたｈＧＲＦの液相ＰＥＧ化
本実施例では、スペーサーとしてリジンを持つ分子量２０，０００ダルトンの分枝型  モノメトキシＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社より供給された）を用いた。この分枝型ＰＥＧは、ＰＥＧ１０，０００をリジンの各アミノ基に結合させて得た。
【００７２】
スクシニミジルエステルとして活性化されたスペーサーリジンのカルボキシル基をＤＭＳＯ中にｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２のアミノ基と、ＧＲＦ１モルに対しＰＥＧ０．９モルのモル比で反応させた。
【００７３】
溶媒を凍結乾燥して除き、残査を調製用カラムＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＴＭによるゲル排除クロマトグラフィーで分画した。１種類の、ｈＧＲＦ当たり１ユニットのＰＥＧ２０，０００を有する結合体に相当するピークを得た。
実施例４：ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体の分析特性
上記により得た生成物に関し、以下のアッセイを基に結合ＰＥＧ鎖について調べた：
１．遊離型アミノ基測定にはトリニトロベンゼンスルフォネートを基にした比色分析を用いた（Ｈａｂｅｅｄら、１９９６記載）；
２．ＰＥＧ含有量測定には、ヨードアッセイに基づく比色分析を用いた（Ｓｉｍｓら、１９８０記載）；
３．アミノ酸分析に於ける鎖レポーターとしては、ノルロイシンに基づくＰＥＧ鎖数を利用した（Ｓａｒｔｏｒｅら、１９９１記載）；
４．結合体の分子量はマススペクトロスコピーを用い測定した。
【００７４】
結合体の分子量、及び出発材料ＰＥＧの多分散性による結合体の多分散性についてはＭＡＬＤ１−マススペクトロメトリーを利用して調べた。
ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体のＰＥＧ結合部位分析は、アミノ酸配列により評価した。各サンプルは１００倍に希釈された。続いてこの溶液１０μｌ（約５０ｐｍｏｌ）をシークエンサーにかけた。
【００７５】
最終産物の純度もＲＰ−ＨＰＬＣ分析クロマトグラフィーで確認した。
分析は、Ｃ１８分析カラム（Ｖｙｄａｃ）を利用し、以下のＨ２Ｏ／０．０５％ＴＦＡ（溶出液Ａ）及びアセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ（溶出液Ｂ）の勾配溶出にて実施した；
０−５分      ８０％Ａ
５−５０分    ８０％Ａ→５％Ａ
５０−５２分  ５％Ａ
５２−５４分  ５％Ａ→８０％Ａ
流速１ｍｌ／分、ループ２０μｌ、ＵＶ−Ｖｉｓ．検出器２２６ｎｍ。
【００７６】
未結合型ｈＧＲＦは２０．７分に溶出された。
化合物Ａ１は２２．９分に溶出され、化合物Ａ２は２３．４分に溶出され、化合物Ａ３は２４．４分に、化合物Ａ４は２５．５分に溶出した。
【００７７】
”天然”及びポリマー結合ペプチドの立体特性は円二色性分析により実施された。
未結合型ｈＧＲＦ及びｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体の分光特性分析は１９０−３００ｎｍの範囲の円二色性分析により実施した。サンプル（５０μｇ／ｍｌ）は１０ｍＭの酢酸またはメタノール／１０ｍＭ酢酸に３０：７９及び６０：４０のモル比に溶解された。上記いずれの溶液も、未結合型ｈＧＲＦ及びｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体は、Ａ３に関する図４に示した様に重複挙動を示した。酢酸液では、ペプチドはランダムな立体構造を取り、メタノール含有量を増加させるとペプチドはα螺旋構造を取ると推定される。
【００７８】
結果は、ＰＥＧ結合体はペプチドの構造特性を大きく変えないことを示している。
実施例５：ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体の安定性評価
ｈＧＲＦ及びｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合の蛋白質分解安定性をズブチリシン及びキモトリプシンの様な蛋白質分解酵素を用い調べた。
【００７９】
ズブチリシンによる研究は、４℃、ｐＨ８．０、０．１ＭのＴｒｉｓＨＣｌ、０．０５ＭのＣａＣｌ２中に０．２９７ｍＭペプチド液をペプチド／蛋白質分解酵素モル比１：５０，０００で反応して行った。
【００８０】
キモトリプシンの場合は、ペプチドを０．０８ＭのＴｒｉｓＨＣｌ、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．８に溶解し、ペプチド／蛋白質分解酵素モル比１：１５，０００で用いた。
【００８１】
分解の経過は、実施例４報告と同一条件下、Ｃ１８カラムを用いた分析ＲＰ−ＨＰＬＣで追った。蛋白質分解酵素と反応する前、及び反応予定時間後に出発化合物のピーク位置の高さを計算した。予定時間に残存した高さの割合を計算し、図３ａ及びｂに報告した。
実施例６：ＰＥＧのアルカリ化によるＰＥＧ化
ｈＧＲＦを各種アシル化基及びアルキル化基で活性化されたモノ−メトキシ化ＰＥＧと結合した。
【００８２】
アルキル化ＰＥＧは、リジン残基位置の陽電荷を維持する結合体の生産に利点を示す。
実施例１−４記載の如くにして単離及び分析を行った。
実施例７：ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体の活性評価
材料
試験化合物
ヒトＧＲＦ１−２９ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２、バッチ１２９９２０１，Ｂａｃｈｅｍ販売；
ヒトＧＲＦ３−２９ｈＧＲＦ（３−２９），Ｂａｃｈｅｍ販売；
ヒトＧＲＦ３−２９，ＩＳＬ販売；及び
上記の如く調製されたｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体。
試薬
ＣＨＯ−ｈＧＲＦＲ−ＬＵＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
１０％胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）＋６００μｇ／ｍｌゲネティシンＧ４１８硫酸塩（Ｇｉｂｃｏ）添加リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド（Ｇｉｂｃｏ）入りＭＥＭアルファ培地：
細胞培養体溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）
ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）
ルクライト（Ｌｕｃｌｉｔｅ）（Ｐａｃｋａｒｄ）。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏラット下垂体細胞バイオアッセイ
５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ）添加アール（Ｅａｒｌｅ）のバランス塩（ＥＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ）。
１２．５％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン硫酸塩入りアール塩入り培地１９９（Ｍ１９９）。
Ａｍｅｒｓｈａｍ社販売ラットＧＨアッセイキット。
組織分解用酵素液（３０ｍｌのＥＢＳＳとして）
１２０ｍｇコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）
３０ｍｇヒアルウロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）
３０ｍｇＤｎａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）
９００ｍｇＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）
調製後、溶液を濾過−滅菌し、３７℃に置いた。
Ｉｎ  ｖｉｖｏバイオアッセイ
Ａｍｅｒｓｈａｍ販売のＲａｔのＧＨ放射免疫アッセイキット。
Ｐｈｏｅｎｉｘ製薬販売のヒトＧＲＨ（１−４４）放射免疫アッセイキット。
動物
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社販売のＳＰＦ成体オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、体重２００−２５０ｇを、最低７日間の順応期間後に利用した。
方法
ＣＨＯ−ｇＧＲＦＲ−ＬＵＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ＣＨＯ−ｈＧＲＦＲ−ＬＵＣ（クローン１−１１−２０）はｐｃＤＮＡ３−ｈＧＲＦ−Ｒ及びｐＴＦ５−５３ＬＵＣベクターをＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞株内にトランスフェクトし得たクローン化細胞株である。
【００８３】
プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｈＧＲＦ−Ｒは、ヒト成長ホルモン放出因子レセプター（ｈＧＲＦ−Ｒ）ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３発現ベクターに挿入し構築した。ｈＧＲＦ−ＲｃＤＮＡを含むブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミドは好意によりＤｒ．Ｂ．Ｇａｙｌｉｎｎ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ大学）より提供され、ｐｃＤＮＡ３哺乳動物発現ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より得た。ｈＧＲＦ−Ｒコーディング配列はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターより得た。制限酵素地図を図１２に示す。
【００８４】
プラスミドｐＴＦ５−５３ＬＵＣは、ｃ−ｆｏｓｃＡＭＰ反応エレメントをプラスミドｐｏＬｕｃ内のルシフェラーゼコーディング配列の上流にある内因性プロモーターに繋げ挿入して構築した。ｃＡＭＰ反応エレメント及びｃ−ｆｏｓプロモーターはプラスミドｐＴＦ５−５３より得た（Ｆｉｓｈら記載、１９８９）。ルシフェラーゼコーディング配列の上流に複数のクローニングサイトを持つ無プロモータレポーター遺伝子ベクター（ｐｏＬｕｃ）はＤｒ．Ｂｒａｓｉｅｒ（テキサス大学、Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ）より得た。その制限酵素地図は図１３に報告した。
【００８５】
上記同時トランスフェクションにより得たこれらＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞は常に１０％胎児ウシ血清＋６００μｇ／ｍｌゲネチシンＧ４１８硫酸塩を添加されたリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含ＭＥＭアルファ培地で増殖した。
【００８６】
細胞は白色の９６ウエル型プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に播き、アッセイ前に２００μｌの増殖培地内で１６−１８時間培養した。
翌日、培地を取り除き、３７℃、５％ＣＯ２で２時間プレートを反応する前に各種濃度のｈＧＲＦ（１−２９）自家製標準物質（Ｂａｃｈｅｍ）または各種濃度のｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体を含む培地と交換した。反応終了時、ＣＨＯ−ｈＧＲＦＲ−ＬＵＣ細胞を２００μｌのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄し、続いて５０μｌの細胞培養体溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウエルに添加し、溶解した。さらに１５分間室温で反応した後、１５０μｌのルシフェラーゼアッセイ氏アデノシンキナ−ゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えてからプレートをルミノメーター（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）で測定した。
【００８７】
別法として、ウエル当たり５０，０００細胞で接種されたＣＨＯ−ｈＧＲＦＲ−ＬＵＣ細胞を、各種ｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体と反応終了した時点で上記の如くにＰＢＳで洗浄した。１００μｌのルシライト（Ｐａｃｌａｒｄ）を加える前に、各ウエルにカルシウム及びマグネシウムイオンを含む１００μｌのＰＢＳを加えた。室温、１０分間反応させた後、プレートをルミノメータ（Ｌｕｍｉｃｏｕｎｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）にて読みとった。
【００８８】
結果は相対光単位（ＲＬＵ）で表した。
ｈＧＲＦ（１−２９）に関するＩｎ  ｖｉｔｒｏラット下垂体細胞アッセイ
動物（体重２００ｇＳＰＦオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）をＣＯ２吸入で屠殺し、下垂体を取り出した。その組織を細かく擦り潰し、組織分解用酵素液入りボトル内に入れた。このボトルを３７℃の反応器内に１時間置いた。
【００８９】
分解された組織を回収し、細胞を２回洗浄してから数を調べ、５×１０５／ｍｌに濃度を調製した。この細胞を４８ウエルプレート内に加え（２００μｌ／ウエル）てからプレートを反応器内に７２時間置いた。
【００９０】
７２時間後、細胞を各種濃度のｈＧＲＦと４時間反応させた。反応が終了した時点で上清を集め、−８０℃にて保管した。
各サンプルのＧＨ含有量は、市販のラットＧＨ放射免疫キットにてアッセイした。
Ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
動物にｈＧＲＦ（１−２９）（４００μｇ／ラット）を静脈注射した。採血数分前に動物を麻酔（ケタミン−キシラジン）した。各ラットの下大静脈より２ｍｌの血液を採取した。サンプルは２分割した：１ｍｌは同様に採取し、３７℃で約３時間反応し、続いて遠心分離し血清を得た；残りの１ｍｌは５０μｌの４ｍｇ／ｍｌヘパリン液を含むバイアルに採取し、すぐ氷上に保管し、４℃で遠心分離し血漿を得た。
【００９１】
異なる動物を用い試験化合物を注射した後、様々な時点で血液サンプルを採取した。各実験では、各時点について合計３匹のラットを使った。
血漿及び血清サンプルはすぐに凍結し、−２０℃にて保管した。
【００９２】
ＧＨ血清レベルは市販のＲＩＡキットを用いた測定した；ｈＧＲＦ血漿レベルは市販のｈＧＲＦ（１−４４）用ＲＩＡキットにて測定した。
結果
注意：
本章及び関連図面では、”ＧＲＦ−１ＰＥＧ  １ｓｔピーク”は［Ｌｙｓ（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）２１−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２］、”ＧＲＦ−１ＰＥＧ２ｎｄピーク”は［Ｌｙｓ（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）１２−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２］、”ＧＲＦ−２ＰＥＧ  １ｓｔピーク”は［Ｌｙｓ（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）１２，２１−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２］及び”ＧＲＦ−３ＰＥＧ  １ｓｔピーク”はＮα−（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）［Ｌｙｓ（ＭＰＥＧ５，０００−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＣＯ）１２，２１−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２］に対応する。
ＣＨＯ−ｈＧＲＦＲ−ＬＵＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ＣＨＯ−ｈＧＲＦＲ−ＬＵＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに於ける、共にＤＭＳＯを用い調製されたｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体の２種類のバッチの活性を図５及び６に示した。
【００９３】
標本は全て「天然」ｈＧＲＦ（ＰＥＧ化化合物に使用した同一精製工程にかけたｈＧＲＦ）に比較し程度は低いものの活性型であり、ＧＲＦ−１ＰＥＧ（共に１ｓｔ及び２ｎｄピーク）はＧＲＦ−２ＰＥＧ及びＧＲＦ−３ＰＥＧに比べより活性であることが判明した。ｈＧＲＦと「天然」ｈＧＲＦに差は認められなかった（データ未提示）
ＤＭＳＯ調製されたバッチ由来のｈＧＲＦ−ＰＥＧ結合体（図５対図６）及びニコチンアミド液を用いて調製された結合体（図７）に関しても、同様のｉｎ  ｖｉｖｏ生体活性が観察された。図６も、２種類のｈＧＲＦ（３−２９）標本はｈＧＲＦ（１−２９）に比べて大きなｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を持たないことを示している。
ｈＧＲＦ１−２９に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏラット下垂体細胞アッセイ
２種類のＤＭＳＯ標本由来のｈＧＲＦ−ＰＥＧを用いて行われた両アッセイで、ＧＲＦ−１ＰＥＧ第１ピークが最も活性な化合物であり、続いてＧＲＦ−１ＰＥＧ第２ピーク、ＧＲＦ−２ＰＥＧ、そしてＧＲＦ−３ＰＥＧの順であることが判明した（図８及び９）。これら所見はレポーター遺伝子アッセイで得られた結果に良く一致した。
Ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
予備実験では、４００μｇｈＧＲＦを静脈注射した後、ラットに於ける血清ＧＨ及び血漿ｈＧＲＦレベルを決定した。得られた結果は図１０に示した。図示の如く、ＧＨ及びｈＧＲＦはｈＧＲＦ注射後１０分にピークを形成した。その後、血清ＧＨ濃度は急激に低下し、６０分後には基礎レベルまで戻ったが、血漿ｈＧＲＦ濃度は同一期間一定レベルを保った。
【００９４】
図１１Ａ及びＢには、ＧＲＦ−１ＰＥＧ第１及び第２ピーク、ＧＲＦ−２ＰＥＧ、及びＧＲＦ−３ＰＥＧ（ＤＭＳＯ標本）４００μｇで処理したラットに於ける、４８時間までの各種時点でのＧＨ及びＧＲＦの血液レベルが報告されている。  ＰＥＧ化標本は全て、ｈＧＲＦ１−２９と同様に静脈注射１０分後にＧＨ血清ピークを誘導した。しかし、ＧＲＦ−１ＰＥＧ第１及び第２ピーク、及びＧＲＦ−２ＰＥＧはｈＧＲＦ１−２９と同程度のＧＨレベルを誘導したが、ＧＲＦ−３ＰＥＧはｉｎ  ｖｉｔｒｏの場合同様活性は低かった。
【００９５】
ＧＲＦ血漿レベルを調べた例では、使用した標本（ＤＭＳＯまたはニコチンアミド）の種類に関わらずＧＲＦ−２ＰＥＧ及びＧＲＦ−３ＰＥＧに比べＧＲＦ−ＰＥＧ第１ピーク及び第２ピークには全く異なるパターンが観察された。ＧＲＦ−１ＰＥＧ第１及び第２ピーク注射４８時間後、ＧＲＦ血漿喉は基礎レベルに戻ったが、ＧＲＦ−２ＰＥＧ及びＧＲＦ−３ＰＥＧについてはレベルはより維持された。
実施例８：ＰＥＧ化工程に於ける出発化合物としての部位保護されたｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２の固相合成
リジン１２及び２１の一次アミノ基位置に特異的保護基（Ｎ−アルコキシカルボニル基）を含むｊｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２誘導体の固相合成を行った。これは、Ｎα−末端の部位特異的ＰＥＧ化を可能にする。その他のアミノ保護誘導体は、アシル化によるＮα末端ブロッキングと、Ｎ−アルコキシカルボニル基によるリジン１２をブロッキングにより調製される。この誘導体はリジン２１位置の部位特異的ＰＥＧ化に利用される。
材料と方法
ペプチド合成方法
まずアプライドバイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｉｎｃ）モデル４３１Ａペプチド合成装置を用い、低置換型（０．１６ｍｍｏｌ／ｇ）ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂と各残基に関して粗生成体の量と純度を最適化するためダブルカップル−キャッピング法を利用し、Ｆｍｏｃ化学により全てのｈＧＲＦ誘導体ペプチド樹脂を合成した。更に［Ｎ−イソプロピル−Ｔｙｒ１，Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）１２］−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２ペプチド樹脂を用手法的に還元型アルカリ化法で処理し、Ｎ−末端にイソプロピル基を加えた。
【００９６】
全てのペプチド樹脂はＴＦＡ／１．２−エタンジチオール／チオアニソール／水［１０：０．５：０．５：０．５（ｖ／ｖ）］で２時間切断し、ＭＴＢＥ中への沈殿と遠心分離により粗ペプチドを単離した。０．１％ＴＦＡ／水／アセトニトリル緩衝液システムを用いたＶｙｄａｃＣ１８調製用カラムを利用した逆相勾配ＨＰＬＣにて凍結乾燥粗ペプチドを精製した。精製ペプチドは全て、分析逆相ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより分析した。
材料
Ｆｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）、ＤＭＦ、２０リッタドラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、ピペリジン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｈｅｍ−ｌｍｐｅｘ）、ＨＢＴＵ（Ｒａｉｎｉｎ，Ｒｉｅｈｅｌｉｅｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＭＭ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、無水酢酸（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、樹脂（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）ａ−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸（Ｓｉｇｍａ）、シナピン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）、アセトニトリル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、ＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｉｅｒｃｅ）、脱イオン水（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｉ−Ｑ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）。その他の溶媒及び試薬は以下掲載の通りである：
試薬／溶媒                      販社
ＮＭＰ            Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＪＴＢａｋｅｒ
ＨＢＴＵ          Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
Ｒｉｃｈｅｌｉｅｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社
0.5M HOBt DMF液  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
2.0M DIEA DMP液  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
ピペリジン        Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
ジクロロメタン    Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
無水酢酸          Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
アミノ酸：ＡＢＩ４３１Ａ合成装置で用いた大部分のＦＭＯＣアミノ酸はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより秤量済み１．０ｍｍｏｌカートリッジとして販売されていた。ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨはＰｅｒｓｐｅｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）よりバルクで販売されており、自社にてカートリッジに充填された。使用した全てのアミノ酸はＬ型であった。
【００９７】
樹脂：ｈＧＲＦ類縁体に用いた一次樹脂はＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｍｉｄｅ  Ｌｉｎｋｅｒ−Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ−Ｐｏｌｙｓｔｒｅｎｅ）樹脂である。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ販売のＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ支持体は粗生成物の純度及び収率に置いて常に優れた結果を示した。０．１６ｍｍｏｌ／ｇの低置換型樹脂を全ての誘導体に使用した。低置換型樹脂は、伸長しつつあるペプチド鎖内の立体障害及びβシート形成を減少させることで、長い、困難な配列の結合を向上させるために良く使用される。
方法
鎖の組立−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社モデル  ４３１Ａペプチド合成装置
保護されたペプチド鎖はまずＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社モデル４３１Ａペプチド合成装置を利用し、プログラムされた迅速ＦＭＯＣサイクル（ＦａｓｔＭｏｃＴＭ）を用いたＦＭＯＣ法により組み立てた。ＨＢＴＵは活性化と結合に用いられた。脱保護用の２０％ピペラジン及びＮＭＰは、脱保護、アミノ酸溶解及び樹脂の洗浄に用いた主溶媒である。アミノ酸は秤量済み１．０ｍｍｏｌカートリッジ内に導入された。０．２５ｍｍｏｌＦａｓｔＭｏｃＴＭサイクルでは、１．０ｍｍｏｌカートリッジと４０ｍｌ反応容器を使用する。
鎖の組立−方法
０．２５ｍｍｏｌスケールのプログラムサイクルの工程は以下の用にまとめることができる：
１．ピペリジン脱保護−樹脂をまずＮＭＰで洗浄し、続いて１８％ピペリジン／ＮＭＰ液を加え、３分間脱保護する。反応容器をドレーンし、２０％ピペリジン液を供給、脱保護を約８分間続ける。
２．アミノ酸−ＮＭＰ（２．１ｇ）溶解液及び０．４５Ｍ  ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔのＤＭＦ液０．９ｍｍｏｌ（２．０ｇ）をカートリッジに加え、６分間混合する。
３．ＮＭＰ洗浄−反応容器をドレーンし、樹脂をＮＭＰで５回洗浄する。
４．アミノ酸の活性化及び反応容器（ＲＶ）への移動−２ＭのＤＩＥＡのＮＭＰ液１ｍｌをカートリッジに加え、溶解したアミノ酸の活性化を開始し、続いてカートリッジからＲＣに移した。
５．結合及び最終洗浄−活性化アミノ酸及びＮ−末端脱保護ペプチド−樹脂間の結合反応を約２０分間行い、続いてＲＶをドレーンし樹脂をＮＭＰで洗浄した。
６．結合（必要な場合）−およそ１２ｍｌの０．５Ｍ無水酢酸、０．１２５ＭのＤＩＥＡ及び０．０１５ＭのＨＯＢｔのＮＭＰ液を反応容器に加え、３分間攪拌した。これにより樹脂上の未結合部位をアセチル化し、配列を削除するのではなくむしろ切り揃え、後の精製工程を単純化した。
【００９８】
これらサイクルの完全なプロトコールは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のユーザーブリティンＮｏ．３５（モデル４３１ＡでのＦａｓｔＭｏｃＴＭ０．２５及び０．１０）に見ることができる。
典型的な合成に関する標準的プロトコール
ステップ１．樹脂をＤＭＦで３回洗浄する。
ステップ２．２０％ピペリジン／ＤＭＦ５分の脱保護を２回行う。
ステップ３．樹脂をＤＭＦで６回洗浄する。
ステップ４．ＨＢＴＵ／ＮＭＭのＤＭＦ液で活性化したアミノ酸と４５分間結合させる。
ステップ５．樹脂をＤＭＦで３回洗浄する。
【００９９】
困難な配列に関してはキャッピングステップが挿入できるが、結合後にさらに７０％無水酢酸のＤＭＦ液を用いて２０分間ペプチド−樹脂上の未結合部位をアセチル化し、最終粗生成物内の欠失配列ではなく末端切除配列をもたらす。
【０１００】
切断／抽出
側鎖保護基を除き、樹脂よりペプチドを切り離すために用いた切断カクテルは、アルギニン及び／又はメチオニンを含むペプチドに用いられる通常の混合物である。０．１−１．５ｇペプチド−樹脂の場合、１０ｍｌのトリフルオロ酢酸、０．５ｍｌのＤ．Ｉ．水、０．５ｍｌのチオアニソール、０．５ｍｌのエタンジチオール（８７％トリフルオロ酢酸、４．３％Ｄ．Ｉ．水、４．３％チオアニソール、４．３％エタンジチオール）。
切断方法
ペプチド−樹脂１００ｍｇ−１ｇを２０ｍｌのガラス製容器内に入れ、氷槽中で冷却した。切断カクテルを調製し、同様に氷槽中にて冷却し、続いて最終容量約１０ｍｌになるようにペプチド−樹脂に加えた。
【０１０１】
容器を氷槽より取り出し、室温まで暖めた。容器に蓋をし、反応混合液を室温で２時間攪拌した。
２時間後、溶液を中−粗孔径フィルターを通し、約３０ｍｌの冷ＭＴＢＥ中に真空濾過した。反応容器を１ｍｌのＴＦＡで洗浄、同フィルターファンネルを通して冷ＭＴＢＥ中に濾過した。続いて全懸濁液を５０ｍｌの遠心チューブに移し、約１０分間、２，０００ｒｐｍ、室温で遠心分離した。上清を吸引し、沈殿を４０ｍｌの冷ＭＴＢＥに再懸濁し、再度遠心分離した。この工程をもう一度繰り返した。最終懸濁液を吸引し、沈殿を窒素でパージして残ったエーテルの大部分を蒸発させた。
【０１０２】
次にペプチドを２０−３０ｍｌの１％−１０％酢酸水溶液に溶解し、脱イオン水にて約１００−１５０ｍｌに希釈し、凍結、凍結乾燥した。
精製
ＲＰ−ＨＰＬＣ法
システム−Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ４０００
カラム−Ｖｙｄａｃ逆相Ｃ１８、１０μｍ、２．２×２５ｃｍ（カタログ番号２１８ＴＰ１０２２）
緩衝液−Ａ：水／０．１％ＴＦＡ    Ｂ：アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
流量−１５ｍｌ／分
検出−Ｗａｔｅｒｓ４８４ＵＶ検出器、２２０ｎｍ
勾配−様々、通常０．２％Ｂ／分から１．０％Ｂ／分
50-100mgのペプチドを２００ｍｌの０．１％ＴＦＡ水溶液で溶解し、凍結乾燥ペプチドを調製した。次にペプチド液を”Ａ”緩衝液リザーバーラインを通し調製カラムに直接かけ、勾配プログラムを作動させた。
【０１０３】
収集分画は一晩オートサンプラー付き分析ＨＰＬＣシステムにかけた。ピーク積分により純度＞９２％と判定された分画をプールし、Ｄ．Ｉ．水で４：１に希釈、凍結後Ｖｉｒｔｉｓ２５ＳＬ凍結乾燥機にかけて凍結乾燥した。
分析
逆相ＨＰＬＣ
条件：
システム−Ｗａｔｅｒｓ５１０ポンプ、７１７オートサンプラー、４９０多波長ＵＶ検出器
カラム−ＶｙｄａｃＣ１８，５μｍ、０．４６×２５ｃｍ（カタログ番号２１８ＴＰ５４）
緩衝液−Ａ：Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ  Ｂ：ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ
流量−１ｍｌ／分
検出−ＵＶ：２１４ｎｍ、２８０ｎｍ
勾配−２％Ｂ／分
０．２ｍｇ−１．０ｍｇのペプチドを０．１％ＴＦＡに濃度が０．５−１．０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、精製凍結乾燥ペプチドサンプルを調製した。
【０１０４】
１５−１８μｌをカラムに注入し、２５分間かけて０−５０％のＡＣＮ勾配プログラムで溶出した。クロマトグラムデータはＷａｔｅｒｓ  Ｅｘｐｅｒｔ−Ｅａｓｅソフトウエアーシステムで収集、保存した。
マススペクトロメトリー
型：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援型レーザー離脱／イオン化飛行時間（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）
システム：Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ
マトリックス：１０ｍｇ／ｍｌのａ−シアノ４−ヒドロキシケイ皮酸の６７％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ液、又は１０ｍｇ／ｍｌのシナピン酸の５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ液
ペプチドサンプルは５０％ＡＮＣ／０．１％ＴＦＡ中に１−２０μｍｏｌ濃度に調製した。０．５μｌのマトリックス液、続いて０．５μｌのペプチドサンプルを分析プレートウエルに加え、乾燥させた。分析プレートを装置に乗せ、サンプルをペプチドに最適化されたリフレクタ遅延励起法を用いてスキャンし分析した。各サンプルについて、３２−１２８レーザーショットの集積データシグナルを集め、分析した。測定毎に、キャリブレーション用に標準ペプチドの入ったサンプルウエルを置いた。
特異的合成
［Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）１２．２１］−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２の調製
まず、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１Ａペプチド合成装置（上記合成法を参照）を用い、Ｎ−末端残基Ｆｍｏｃ基の脱保護を含むＦｍｏｃ化学により［Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）１２．２１］−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ−樹脂を調製した。
【０１０５】
ペプチド樹脂をＴＦＡ：１，２−エタンジチオール：チオアニソール：水［１０：０．５：０．５：０．５（ｖ／ｖ）］混合液で２時間切断し、ＭＴＢＥ中に沈殿させてペプチドを単離し、祖ペプチド２４０ｍｇを得た。ＶｙｄａｃＣ１８カラム（２．２×２５０ｍｍ）を用いた調製逆相ＨＰＬＣにより６０ｍｇの精製産物を得た（分析ＨＰＬＣにより＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトメトリー：計算値：３５２３．８、実測値：３５２４．２
［Ｎα−イソプロピル−Ｔｙｒ１，Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）１２］−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２の調製
初期［Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）１２］−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ−樹脂の組立
まず、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１Ａペプチド合成装置（上記合成法を参照）を用い、Ｎ−末端残基Ｆｍｏｃ基の脱保護を含むＦｍｏｃ化学により［Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）１２］−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ−樹脂を組み立てた。
【０１０６】
還元アルカリ化によるＮα−イソプロピル化
Ｈｏｃａｒｔら、１９８７記載の如くに、シアノボロヒドライドナトリウム及び対応するケトンを用いペプチド−樹脂を還元アルカリ化し、Ｎα−イソプロピル基を付加した。８８０ｍｇのペプチド−樹脂（約７０μモル）を５ｍｌのＤＣＭ中に３０分間膨潤させ、続いて１０ｍｍｏｌ（１７４μｌ）のアセトンを加えた７ｍｌのＭｅＯＨ／１％ＨＯＡｃ液を加え、混合液をすぐに２分間、室温にて攪拌した。続いて２モル（１２９ｍｇ）のシアノボロヒドライドナトリウムを含む１２ｍｌのＭｅＯＨ／１％ＨＯＡｃ液を加え、混合液を杉２時間攪拌し、一晩（１５時間）放置した。定性的ニンヒドリンモニタリングより、反応の終了が示された（青色にならない）。ペプチド−樹脂をＴＦＡ：１，２−エタンジチオール：チオアニソール：水［１０：０．５：０．５：０．５］混合体で２時間切断し、ペプチドをＭＴＢＥ中に沈殿し単離して、およそ２００ｍｇの祖ペプチドを得た。水／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶媒による、ＢｙｄａｃＣ１８カラム（２．２×２５０ｍｍ）を用いた調製用逆相勾配ＨＰＬＣによる精製の結果、純粋な生成物５０ｍｇを得た（分析ＨＰＬＣにて＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー：計算値：３４８１．９、実測値：３４８１．８。
実施例９：保護型ｈＧＲＦ（１−２９）のＰＥＧ化
実施例８記載のｈＧＲＦ誘導体に、実施例１及び６記載の活性化ＰＥＧを結合した。
【０１０７】
本例に於ける精製は過剰試薬及び副産物からの分離のみであり、実施例２及び３記載の操作の実施は必要としなかった。
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
2010024245.tif 000005
【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010024245.tif 000011
【図９】
2010024245.tif 000012
【図１０】
2010024245.tif 000013
【図１１】
2010024245.tif 000014
【図１２】
2010024245.tif 000015
【図１３】
2010024245.tif 000016
【配列表】
2010024245000001.xml