(57)【要約】      （修正有）【課題】標本に複数の波長の光を同時かつ同一の照射強度分布で照射することができる顕微鏡を提供する。【解決手段】白色光源と、出射光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、分岐された夫々の照射光の光路上に夫々設けられ各照射光の波長を選択する波長選択手段及び各照射光の強度を調整する光量調整手段と、波長が選択された複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、合成された光束を試料に照射する方向に導くとともに、試料からの光を透過するミラーと、ミラーと試料との間に配置された対物レンズと、対物レンズ及びミラーを通過した試料からの蛍光を、夫々の波長で励起された蛍光毎に分離して撮像する複数の撮像素子と、これら複数の撮像素子で撮像された蛍光像を合成処理する画像処理手段と、を具備し、光量調整手段及び画像処理手段の少なくとも一つを用いて、夫々の波長で励起された蛍光の蛍光強度を同等にする。【選択図】図１
2010152367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白色光源と、
この白色光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、
この光束分割手段により分岐されたそれぞれの照射光の光路上にそれぞれ設けられ、各照射光の波長を選択する波長選択手段と、
上記光束分割手段により分岐されたそれぞれの照射光の光路上にそれぞれ設けられ、各照射光の強度を調整する光量調整手段と、
波長が選択された上記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、
この光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導くとともに、試料からの光を透過するミラーと、
このミラーと試料との間に配置された対物レンズと、
この対物レンズおよび上記ミラーを通過した上記試料からの蛍光を、それぞれの波長で励起された蛍光毎に分離して撮像する複数の撮像素子と、
これら複数の撮像素子で撮像された蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記光量調整手段および上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記それぞれの波長で励起された蛍光の、励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【請求項２】
白色光源と、
この白色光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、
上記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、
上記第１の照射光の強度を調整する第１の光量調整手段と、
上記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、
上記第２の照射光の強度を調整する第２の光量調整手段と、
波長が選択された上記第１の照射光の光束と波長が選択された上記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、
上記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導くとともに、試料からの光を透過するミラーと、
上記ミラーと試料との間に配置された対物レンズと、
上記対物レンズおよび上記ミラーを通過した上記試料からの蛍光の内、第１の波長で励起された第１の蛍光を撮像する第１の撮像素子と、
上記対物レンズおよび上記ミラーを通過した上記試料からの蛍光の内、第２の波長で励起された第２の蛍光を撮像する第２の撮像素子と、
上記第１および第２の撮像素子で撮像した第１および第２の蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記第１の光量調整手段、上記第２の光量調整手段および上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記第１の蛍光と上記第２蛍光の、双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【請求項３】
白色光源と、
この白色光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、
この光束分割手段により分岐されたそれぞれの照射光の光路上にそれぞれ設けられ、各照射光の波長を選択する波長選択手段と、
上記光束分割手段により分岐されたそれぞれの照射光の光路上にそれぞれ設けられ、各照射光の強度を調整する光量調整手段と、
波長が選択された上記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、
この光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導く第１の対物レンズと、
上記試料を挟んで上記第１の対物レンズに対向して配置された第２の対物レンズと、
この第２の対物レンズを通過した上記試料からの蛍光を、それぞれの波長で励起された蛍光毎に分離して撮像する複数の撮像素子と、
これら複数の撮像素子で撮像された蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記光量調整手段および上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記それぞれの波長で励起された蛍光の、励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【請求項４】
白色光源と、
この白色光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、
上記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、
上記第１の照射光の強度を調整する第１の光量調整手段と、
上記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、
上記第２の照射光の強度を調整する第２の光量調整手段と、
波長が選択された上記第１の照射光の光束と波長が選択された上記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、
この光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導く第１の対物レンズと、
上記試料を挟んで上記第１の対物レンズに対向して配置された第２の対物レンズと、
この第２の対物レンズを通過した上記試料からの蛍光の内、第１の波長で励起された第１の蛍光を撮像する第１の撮像素子と、
上記第２の対物レンズを通過した上記試料からの蛍光の内、第２の波長で励起された第２の蛍光を撮像する第２の撮像素子と、
上記第１および第２の撮像素子で撮像した第１および第２の蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記第１の光量調整手段、上記第２の光量調整手段および上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記第１の蛍光と第２の蛍光の双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の光の波長を自由に選択でき、かつ、その光強度を独立して調整でき、それらの光を同時に試料に照射しうる顕微鏡画像処理装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、蛍光顕微鏡は、医学や生物学をはじめ、その他の分野において生物組織や細胞の蛍光標識を施したタンパク質や遺伝子等を検出する目的で広く用いられている。特に近年では、複数の蛍光色素で染色した標本や複数の蛍光タンパク質を発現させた標本を時間的に一度に観察する多重蛍光検出が、遺伝子の解析や、細胞内構造の解明に威力を発揮している。多重蛍光検出では、多重蛍光標本を励起するために複数波長による照射光を標本に照射する手段が広く用いられているが、これに際しては、それぞれの波長を照射する時間的間隔が短いこと、また、標本面上での波長毎の照射光強度分布が時間的かつ空間的に変化しないことが、観察データの正確性を左右する重要な要素となる。
【０００３】
従来、多重蛍光標本を励起するための複数波長による照射光を標本に照射する手段としては、フィルタ切換手段を用いて励起光の波長を時分割するようにした装置（例えば、特許文献１参照）や、二つの独立した光源を用いた装置（例えば、特許文献２参照）が提案されている。また、従来、単一の光源からの光を分割して標本に照射するようにした装置（例えば、特許文献３）が提案されている。
【０００４】
特許文献１に記載の装置は、図１１に示すように、測定対象の生体組織を複数の蛍光処理で予め処理し、複数の励起光選択用フィルタ１５１ａを一つの回転円板１５１ｂ内の所定箇所に設置したフィルタ切換手段１５１と、複数の蛍光選択用フィルタ１５２ａを回転円板１５２ｂ内の他の箇所に設置したフィルタ切換手段１５２とを用い、それらを同期して回転させることにより、第１の励起光と第２の励起光を時分割で該生体組織に照射するとともに、該生体組織から生ずる第１の蛍光と第２の蛍光を順次記録し、例えば、細胞内イオン濃度の変化と膜電位変化それぞれを実質的に同時に測定するように構成されている。
【０００５】
また、特許文献２に記載の装置は、図１２に示すように、キセノンランプ等の白色光源１６１Ａ，１６１Ｂを二つ用い、それぞれのランプからの光をコレクタレンズ１６２Ａ，１６２Ｂを介して集光した後、透過波長域の異なる励起フィルタ１６３Ａ，１６３Ｂを透過させて波長の選択を行ない、選択された波長の光をダイクロイックミラー１６４で合成して、観察光学系１６５に導入するように構成されている。特許文献２に記載の装置によれば、励起フィルタ１６３Ａ，１６３Ｂを適宜交換することにより、所望の波長で照明することができる。
【０００６】
また、特許文献３に記載の装置は、図１３に示すように、照射用光源１７１から出射される照射光を、分岐光学系１７２を介して分割し、それぞれの光Ａ，Ｂを試料１７３上の異なる部位に照射するように構成されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平０９−００５２４３号公報
【特許文献２】特開平０７−０５６０９２号公報
【特許文献３】特開平１０−０９０６０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、特許文献１に記載の装置では、第１の励起光を選択するフィルタと第２の励起光を選択するフィルタまたは第１の蛍光を選択するフィルタと第２の蛍光を選択するフィルタを回転によって切り替えるためのわずかな時間のロスが生じ、この時間のロスは線虫のような動きの速い試料や心筋内のカルシウムイオン濃度の伝播等のような変化の速い現象を測定するには不適である。
【０００９】
また、このような回転円板を駆動するための手段としては、一般にモータ等が用いられるが、モータによって発生する振動の影響で焦点がずれてしまう等の問題が生じる。したがって、回転円板を駆動する際に生じる振動を低減するために顕微鏡一式を空気ばね等で構成される防振台の上に載せる等の措置が必要となる。
【００１０】
回転円板等の機械的駆動部を有しない手法としては、複数の特定の波長において透過率がピークを持つような干渉フィルタ（励起フィルタ）を用い、これにより試料に複数の波長の光を完全の同時に照射する手法が考えられる。この手法によれば、機械的駆動部を有しないため振動の発生等の問題も生じない。しかし、このような特性を持つように作製された励起フィルタは、製作後にその透過特性を改変することが困難である。したがって、例えば、２色の異なる色素で染色された試料を測定する場合、一方の色素に対応する蛍光が強く、他方の色素に対応する蛍光が弱い場合には、それぞれの色素に対応する波長の励起光の強度の調整ができないといった問題がある。
【００１１】
また、特許文献１に記載の装置では、励起光を試料１５７に導くダイクロイックミラー１５８には、二つあるいは三つの特定の波長にのみ高い反射特性をもつダイクロイックミラーが用いられる。一般に、まず、このダイクロイックミラーを作成し、次いでダイクロイックミラーの反射特性に合わせて励起フィルタが設計・製作されるが、このダイクロイックミラーの反射ピーク波長と励起フィルタの透過ピーク波長とを完全に合致させることは難しく、結果として非常にコストが高価なものになってしまうという問題もある。
【００１２】
また、特許文献２に記載の装置では、光源の強度は二つの光源ごとにランダムに変動するため、それぞれの光源からの光で励起された蛍光像のレシオを計算した場合、この変動によってレシオ値が不確かなものとなってしまうという問題がある。
【００１３】
また、特許文献３に記載の装置は、単一波長の光源からの光を分割して試料上の異なる複数の部位に照射することを目的として構成されたものであり、分割した光を再び同一の光束として合成する手段や波長を分離する手段を具備していないため、標本に複数の波長の光を同一の照射強度分布で照射することができない。
【００１４】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、標本に複数の波長の光を同時にかつ同一の照射強度分布で照射することができ、それぞれの光の波長や強度を独立して設定することができる顕微鏡画像処理装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本第１の発明による顕微鏡画像処理装置は、白色光源と、この白色光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、この光束分割手段により分岐されたそれぞれの照射光の光路上にそれぞれ設けられ、各照射光の波長を選択する波長選択手段と、上記光束分割手段により分岐されたそれぞれの照射光の光路上にそれぞれ設けられ、各照射光の強度を調整する光量調整手段と、波長が選択された上記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、この光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導くとともに、試料からの光を透過するミラーと、このミラーと試料との間に配置された対物レンズと、この対物レンズおよび上記ミラーを通過した上記試料からの蛍光を、それぞれの波長で励起された蛍光毎に分離して撮像する複数の撮像素子と、これら複数の撮像素子で撮像された蛍光像を合成処理する画像処理手段と、を具備しており、上記光量調整手段および上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記それぞれの波長で励起された蛍光の、励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする。
【００１６】
また、本第２の発明による顕微鏡画像処理装置は、白色光源と、この白色光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、上記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、上記第１の照射光の強度を調整する第１の光量調整手段と、上記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、上記第２の照射光の強度を調整する第２の光量調整手段と、波長が選択された上記第１の照射光の光束と波長が選択された上記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、上記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導くとともに、試料からの光を透過するミラーと、上記ミラーと試料との間に配置された対物レンズと、上記対物レンズおよび上記ミラーを通過した上記試料からの蛍光の内、第１の波長で励起された第１の蛍光を撮像する第１の撮像素子と、上記対物レンズおよび上記ミラーを通過した上記試料からの蛍光の内、第２の波長で励起された第２の蛍光を撮像する第２の撮像素子と、上記第１および第２の撮像素子で撮像した第１および第２の蛍光像を合成処理する画像処理手段と、を具備しており、上記第１の光量調整手段、上記第２の光量調整手段および上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記第１の蛍光と上記第２蛍光の、双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする。
【００１７】
また、本第３の発明による顕微鏡画像処理装置は、白色光源と、この白色光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、この光束分割手段により分岐されたそれぞれの照射光の光路上にそれぞれ設けられ、各照射光の波長を選択する波長選択手段と、上記光束分割手段により分岐されたそれぞれの照射光の光路上にそれぞれ設けられ、各照射光の強度を調整する光量調整手段と、波長が選択された上記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、この光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導く第１の対物レンズと、上記試料を挟んで上記第１の対物レンズに対向して配置された第２の対物レンズと、この第２の対物レンズを通過した上記試料からの蛍光を、それぞれの波長で励起された蛍光毎に分離して撮像する複数の撮像素子と、これら複数の撮像素子で撮像された蛍光像を合成処理する画像処理手段と、を具備しており、上記光量調整手段および上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記それぞれの波長で励起された蛍光の、励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする。
【００１８】
また、本第４の発明による顕微鏡画像処理装置は、白色光源と、この白色光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、上記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、上記第１の照射光の強度を調整する第１の光量調整手段と、上記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、上記第２の照射光の強度を調整する第２の光量調整手段と、波長が選択された上記第１の照射光の光束と波長が選択された上記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、この光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導く第１の対物レンズと、上記試料を挟んで上記第１の対物レンズに対向して配置された第２の対物レンズと、この第２の対物レンズを通過した上記試料からの蛍光の内、第１の波長で励起された第１の蛍光を撮像する第１の撮像素子と、上記第２の対物レンズを通過した上記試料からの蛍光の内、第２の波長で励起された第２の蛍光を撮像する第２の撮像素子と、上記第１および第２の撮像素子で撮像した第１および第２の蛍光像を合成処理する画像処理手段と、を具備しており、上記第１の光量調整手段、上記第２の光量調整手段および上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記第１の蛍光と第２の蛍光の双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、標本に複数の波長の光を同時にかつ同一の照射強度分布で照射することができ、それぞれの光の波長や強度を独立して設定することができる顕微鏡画像処理装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施例１にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図２】本発明の実施例１の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明部の変形例を示す概略構成図である。
【図３】本発明の実施例２にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図４】本発明の実施例２の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図５】実施例３にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図６】本発明の実施例４にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図７】本発明の実施例５にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図８】本発明の実施例６にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図９】本発明の実施例７にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図１０】実施例７の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図１１】従来の多重蛍光標本を励起するための複数波長による照射光を標本に照射する一手段を示す概略構成図である。
【図１２】従来の多重蛍光標本を励起するための複数波長による照射光を標本に照射する他の手段を示す概略構成図である。
【図１３】単一の光源からの光を分割して標本に照射するようにした装置の従来例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
実施例の説明に先立ち、本発明の作用効果について説明する。
本第１または第２の発明のように構成すると、１個の光源のみで、異なる複数または二つの波長域の光で試料を照明することができるので、複数の光源を用いた場合のように、各光源の空間的な強度分布の違いの影響を受けることなく均一な照明が可能となる。
また、１個の光源のみで、異なる複数または二つの波長域光で試料を励起することができるので、複数の光源を用いた場合のように、各光源の時間的な変動の違いの影響を受けることなく、レシオ画像を確実に得ることができる。
また、異なる複数または二つの波長の光で時間的に完全に同時に励起した蛍光像を取得できるので、変化の速い現象や、動きの速い試料を観察することができる。
また、ミラーの反射ピーク波長に合わせて最適な励起フィルタを選ぶことができるので、高価なデュアルピークの励起フィルタなど、ピーク波長が複数となる特性を有する励起フィルタを用いる必要がなく、結果としてコストを低減させることができる。
【００２２】
本第３または第４の発明のように構成すると、励起光と蛍光が別の光路をとるため、ダイクロイックミラーや半透鏡を入れて励起光と蛍光を分離する必要がなくなる。このため、励起光および蛍光を効率良く伝送することができ、特に暗い蛍光試料を観察する場合に有効となる。
また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
【００２３】
さらに、本第１または第３の発明による顕微鏡画像処理装置においては、上記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照射光の強度を調整する光量調整手段を備えている。
また、本第２または第４の発明による顕微鏡画像処理装置においては、上記第１の照射光の強度を調整する第１の光量調整手段と上記第２の照射光の強度を調整する第２の光量調整手段の双方またはいずれか一方を備えている。
【００２４】
本第１〜第４の発明は、このような構成をしているため、複数または二つの励起光強度のバランスを自由に変えることができ、一方の励起光に対応する蛍光の強度が、他方の励起光に対応する蛍光の強度よりも極端に強い場合でも、励起光強度のバランスを調整して、双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることにより、カメラのダイナミックレンジを有効に活用することができる。
また、減光フィルタを時間的に切り替える必要がなく、不要な振動の発生を抑え、振動にともなう焦点位置がずれることもない。
【００２５】
また、本第５の発明として、本第１または第３の発明による顕微鏡画像処理装置は、上記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照射光の偏光方向を選択する偏光方向選択手段をさらに備えるのが好ましい。
また、本第６の発明として、本第２または第４の発明による顕微鏡画像処理装置は、上記第１の照射光の偏光方向を選択する第１の偏光方向選択手段と上記第２の照射光の偏光方向を選択する第２の偏光方向選択手段の双方またはいずれか一方をさらに備えるのが好ましい。
【００２６】
本第５または第６の発明のように構成すると、励起スペクトルが双峰型でかつ、その励起スペクトルの形が、例えばカルシウムイオンの濃度に依存して変化するような蛍光物質を用いる場合、偏光方向が互いに直行する二つの波長の励起光で同時に試料を励起して蛍光を発生させる。その蛍光のうち、それぞれの励起光の偏光方向と同一の偏光方向を有する成分を分離して画像化し、さらには、得られた二つの画像の比を計算してレシオ画像を測定することにより、例えば、カルシウムイオンの濃度の変化を時間のずれをまったく生じさせずに完全に同一の時間で測定することができ、変化が早い現象や動きの速い試料でも測定することが可能となる。
【００２７】
また、本第７の発明として、本第１または第３の発明による顕微鏡画像処理装置は、上記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照射光の波長分布を監視する波長分布監視手段をさらに備えるのが好ましい。
また、本第８の発明として、本第２または第４の発明による顕微鏡画像処理装置は、上記第１および上記第２の照射光の双方または一方の波長分布を監視する波長分布監視手段をさらに備えるのが好ましい。
【００２８】
本第７または第８の発明のように構成すると、試料に入射する光の波長分布を確実に監視することができる。
【００２９】
また、本第９の発明として、本第１または第２の発明による顕微鏡画像処理装置は、上記ミラーが半透鏡であるのが好ましい。
【００３０】
本第９の発明のように構成すると、反射率および透過率に波長依存性がほとんどない半透鏡を用いることで、ミラーの反射特性に制約されずに、用いる蛍光物質に合わせて励起フィルタおよび蛍光フィルタを最適に選択することができる。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
【００３１】
また、本第１０の発明として、本第１〜第４のいずれかの発明による顕微鏡画像処理装置は、上記光束分割手段および上記光束合成手段がダイクロイックミラーであるのが好ましい。
【００３２】
本第１０の発明のように構成すると、光束分割手段および光束合成手段として半透鏡を用いた場合と比べて励起光のロスを最小限に抑え、試料を励起することができるので、特に暗い試料を観察する場合に有効である。
【００３３】
また、本第１１の発明として、本第１〜第４のいずれかの発明による顕微鏡画像処理装置は、上記光束分割手段および上記光束合成手段が偏光ビームスプリッタであるのが好ましい。
【００３４】
本第１１の発明のように、光束分割手段および光束合成手段として偏光ビームスプリッタを用いると、光学系を簡素化することができ、かつ、本第５または第６の発明と同等の効果を得ることができる。また、半透鏡を用いるのに比べて光源から出射した光のロスが少なく、効率良く試料に光を照明することができる。
【００３５】
なお、本第１２の発明として、本第１、第３、第５、第７のいずれかの発明による顕微鏡画像処理装置は、上記複数の波長選択手段のうちの少なくともいずれかが、上記光路分岐手段により分岐された光路上に挿脱可能に配置されるのが好ましい。
また、本第１３の発明として、本第２、第４、第６、第８のいずれかの発明による顕微鏡画像処理装置は、上記第１の波長選択手段と上記第２の波長選択手段の少なくともいずれかが、上記光路分岐手段により分岐された光路上に挿脱可能に配置されるのが好ましい。
【００３６】
以下、図面を参照しながら、各実施例について説明する。
【実施例１】
【００３７】
図１は本発明の実施例１にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置は、アークやフィラメントやＬＥＤ等により点灯される白色光源１１と、光源１１から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段である半透鏡２１と、第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段である励起フィルタ２４Ａと、第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段である励起フィルタ２４Ｂと、波長が選択された第１の照射光の光束と波長が選択された第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段である半透過鏡２５と、半透過鏡２５で合成された光束を試料４３に照射する方向に導くとともに、試料４３からの光を透過するミラーであるダイクロイックミラー４１と、ダイクロイックミラー４１と試料４３との間に配置された対物レンズ４２と、対物レンズ４２およびダイクロイックミラー４１を通過した試料４３からの蛍光をそれぞれの波長で励起された蛍光に分離して撮像する撮像素子であるカメラ５３Ａ，５３Ｂと、カメラ５３Ａ，５３Ｂで撮像された蛍光像を処理する画像処理手段である画像処理部６１を有して構成されている。
【００３８】
光源１１は、紫外波長域から可視波長域の光を発する水銀ランプやキセノンランプを用いた光源で構成されている。光源１１から発せられた光は、コレクタレンズ１２に入射するようになっている。コレクタレンズ１２は、光源１１からの光を平行光束に変換するように構成されている。コレクタレンズ１２を介して平行光束に変換された光は、光束分割手段である半透鏡２１に入射するようになっている。
【００３９】
半透鏡２１は、入射光束の一部を反射させ、残りを透過させる機能を有している。
半透鏡２１を透過した光束Ａの光路上には、反射鏡２２Ａと、減光フィルタ２３Ａと、励起フィルタ２４Ａが配置されている。また、半透鏡２１で反射した光束Ｂの光路上には、反射鏡２２Ｂと、減光フィルタ２３Ｂと、励起フィルタ２４Ｂが配置されている。
【００４０】
反射鏡２２Ａおよび反射鏡２２Ｂには、光束Ａおよび光束Ｂが半透鏡２５を経た後の進行方向および光路上の位置を完全に一致させるための傾き調整機構（不図示）が備えられている。
減光フィルタ２３Ａおよび２３Ｂは、それぞれ光束Ａの光量および光束Ｂの光量を個別に独立して調整することができるようになっている。
また、減光フィルタ２３Ａおよび２３Ｂは、それぞれターレットまたはスライダーを介して光束Ａおよび光束Ｂの光路に容易に挿脱可能に設けられている。
励起フィルタ２４Ａおよび２４Ｂは、それぞれ光束Ａおよび光束Ｂにおける特定の波長域の光のみを透過させる性質を有しており、それぞれターレットまたはスライダーを介して光束Ａおよび光束Ｂの光路に容易に挿脱可能に設けられている。
【００４１】
半透鏡２５は、光束Ａの一部を透過させ、光束Ｂの一部を反射させる特性を有している。半透鏡２５を経た後の光束Ａと光束Ｂは、上述の傾き調整機構を介して反射鏡２２Ａおよび反射鏡２２Ｂの傾き調整が施されることにより進行方向および光路上の位置が完全に一致している。
【００４２】
図中、３１は半透鏡２５で合成された光束Ａおよび光束Ｂの光源像を対物レンズ４２の瞳面に導く投影レンズ、４４はダイクロイックミラー４１を透過した試料４３からの蛍光を反射鏡４５で反射させてカメラ５３Ａおよび５３Ｂの撮像面上に結像させる結像レンズである。
ダイクロイックミラー４１は、その反射ピーク波長が二つある反射特性を有するデュアルダイクロイックミラーを用いて構成されており、投影レンズ３１を透過した光を対物レンズ４２側に反射すると共に、試料４３から発した蛍光を透過するようになっている。
【００４３】
また、図中、５１は試料４３からの蛍光をその波長によって透過あるいは反射させるダイクロイックミラー、５２Ａおよび５２Ｂはダイクロイックミラー５１を介して分割された光束Ａ’および光束Ｂ’の光において、それぞれ特定の波長域のみを透過させる蛍光フィルタである。
蛍光フィルタ５２Ａおよび５２Ｂは、それぞれターレットまたはスライダーを介して光束Ａ’および光束Ｂ’の光路に容易に挿脱可能に設けられている。
カメラ５３Ａおよび５３Ｂは、蛍光フィルタ５２Ａおよび５２Ｂを透過した光束Ａ’および光束Ｂ’を撮像するように設けられている。
【００４４】
画像処理部６１は、カメラ５３Ａおよびカメラ５３Ｂから出力される電気信号をメモリーに蓄積し、さらに、得られた試料４３の蛍光画像の種々の演算を行なうように構成されている。
図中、６２は画像表示部である。画像表示部６２は、画像処理部６１で処理された画像を表示する機能を有している。
【００４５】
また、本実施例では、半透過鏡２５と投影レンズ３１との間に半透過鏡７１が配置されており、半透鏡２５を反射および透過した光束Ａおよび光束Ｂの光の一部を、半透鏡７１を介して分光器７２に入射させるようにしてある。分光器７２は入射した光束Ａおよび光束Ｂのそれぞれの光の波長分布を測定する機能を有している。
【００４６】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、光源１１を点灯すると、光源１１から発せられた光は、コレクタレンズ１２を介して平行光束に変換され、半透鏡２１を介して二つの光束Ａ，Ｂに分割される。
半透鏡２１を透過した光束Ａは、反射鏡２２Ａで反射した後、減光フィルタ２３Ａを所定の透過率で透過する。さらに、励起フィルタ２４Ａを所定の波長域の光が透過し、半透鏡２５に入射する。半透鏡２５を透過し、半透鏡７１を透過した光束Ａは、投影レンズ３１を通りダイクロイックミラー４１で反射し対物レンズ４２を経て、試料４３を照射する。試料４３は光束Ａの光を照射されることで励起され、蛍光を発する。
光束Ａを照射することにより試料４３で発した蛍光は、対物レンズ４２を逆進し、ダイクロイックミラー４１、結像レンズ４４を透過し、反射鏡４５で反射し、ダイクロイックミラー５１で反射する。次いで、蛍光フィルタ５２Ａを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ａにより撮像される。
【００４７】
一方、半透鏡２１で反射した光束Ｂは、反射鏡２２Ｂで反射した後、減光フィルタ２３Ｂを所定の透過率で透過する。さらに、励起フィルタ２４Ｂを所定の波長域で透過し、半透鏡２５に入射する。半透鏡２５を反射し、半透鏡７１を透過した光束Ｂは、投影レンズ３１を通りダイクロイックミラー４１で反射し対物レンズ４２を経て、試料４３を照射する。試料４３は光束Ｂの光を照射されることで励起され、蛍光を発する。
光束Ｂを照射することにより試料４３で発した蛍光は、対物レンズ４２を逆進し、ダイクロイックミラー４１、結像レンズ４４を透過し、反射鏡４５で反射し、ダイクロイックミラー５１を透過する。次いで、蛍光フィルタ５２Ｂを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ｂにより撮像される。
【００４８】
さらに、カメラ５３Ａおよび５３Ｂで撮像された試料４３の蛍光像は、画像処理部６１においてそれらの画像間の輝度比が演算され、画像表示部６２に原画像およびレシオ画像が表示される。
また、半透鏡２５を経た光束Ａおよび光束Ｂのそれぞれ一部の光は、半透鏡７１を反射し、分光器７２に入射して、それぞれの波長分布が監視される。
【００４９】
従って、本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、１個の光源１１のみで異なる二つの波長域で試料を照明することができるので、従来の複数の光源を用いた装置のように、各光源の視野ムラなどの空間的な強度分布の違いの影響を受けることなく均一な照明が可能となる。
また、１個の光源１１のみで異なる二つの波長域で試料を励起することができるので、従来の複数の光源を用いた装置のように、各光源の経時的な変化に伴う特性の変化やノイズなどの時間的な変動の違いの影響を受けることなく、レシオ画像を確実に得ることができる。
また、時間的に完全に同時に異なる２波長で励起した蛍光像を取得できるので、変化の速い現象や、動きの速い試料を多重蛍光観察することができる。
また、ダイクロイックミラー４１の反射ピーク波長に合わせて最適な励起フィルタを選択することができるので、高価なデュアルピークの励起フィルタを用いる必要がなく、結果としてコストを低減することができる。
さらに、二つの励起光強度のバランスを自由に変えることができるので、一方の励起光に対応する蛍光の強度が、他方の励起光に対応する蛍光の強度よりも極端に強い場合でも、励起光強度のバランスを調整して、双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることにより、カメラのダイナミックレンジを有効に活用することができる。
また、減光フィルタを時間的に切り替える必要がなく、不要な振動の発生を抑えることができ、振動にともなう焦点位置がずれることがない。
また、分光器７２により顕微鏡に入射する光の波長分布を確実に監視することができる。
【００５０】
図２は本発明の実施例１の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明部の変形例を示す概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
図１に示した構成では、光束分割手段および光束合成手段にそれぞれ半透鏡２１および２５を用いたが、それらの代わりに、図２に示すように、ダイクロイックミラー２８Ａおよび２８Ｂを用いてもよい。ダイクロイックミラー２８Ａおよび２８Ｂは、ある波長λより短波長の入射光を反射させ、波長λより長波長の入射光を透過させる特性を有している。
本変形例では、励起フィルタ２４Ａには、透過波長域が波長λより長波長の励起フィルタを用い、励起フィルタ２４Ｂには、透過波長域が波長λより短波長の励起フィルタを用いている。
【００５１】
このように構成された本変形例の照明部によれば、光源１１からの光のうち波長λより長波長の光は、ダイクロイックミラー２８Ａを透過し、反射鏡２２Ａで反射し、減光フィルタ２３Ａおよび励起フィルタ２４Ａを透過し、ダイクロイックミラー２８Ｂを透過して試料４３側に導かれる。一方、光源１１からの光のうち波長λより短波長の光は、ダイクロイックミラー２８Ａで反射し、反射鏡２２Ｂで反射し、光フィルタ２３Ｂおよび励起フィルタ２４Ｂを透過し、ダイクロイックミラー２８Ｂで反射して試料４３側に導かれる。
従って、本変形例の光源部によれば、光束分割手段および光束合成手段として図１に示したような半透鏡２１，２５を用いた場合に比べて、励起光のロスを最小限に抑えて試料を励起することができるので、特に暗い試料を観察する場合に有効となる。
【００５２】
なお、実施例１における半透鏡２１および２５、あるいはダイクロイックミラー２８Ａおよび２８Ｂは、光束分割手段あるいは光束合成手段の一例を示したに過ぎず、これらに限定されるものではない。光束分割手段あるいは光束合成手段のその他の例としては、例えば、２分岐バンドルファイバー（図示省略）を用いても良い。
半透鏡２１の代わりに２分岐バンドルファイバーを用いる場合、バンドルファイバーの合成端をコレクタレンズ１２の直後に配置し、また、バンドルファイバーの分岐端をそれぞれ反射鏡２２Ａ，２２Ｂの直前に配置すればよい。
このようにすれば、光源１１から発せられた光をコレクタレンズ１２により完全に平行光束にしなくても、バンドルファイバーに入射させることができれば、反射鏡２２Ａ，２２Ｂに入射させることができるので、光学系の調整が容易になる。
【００５３】
さらに、半透鏡２５にかえて２分岐バンドルファイバーを用いた場合、バンドルファイバーの分岐端をそれぞれ励起フィルタ２４Ａおよび２４Ｂの直後に配置すればよい。
このようにすれば、励起フィルタ２４Ａおよび２４Ｂを透過した光がバンドルファイバーの分岐端のそれぞれに入射できるようにすれば合成できるので、減光フィルタ２３Ａ，２３Ｂ，励起フィルタ２４Ａ，２４Ｂの配置の自由度を大きくすることができる。
【００５４】
なお、実施例１における励起フィルタ２４Ａおよび２４Ｂは、波長選択手段の一例を示したに過ぎず、これらに限定されるものではない。波長選択手段のその他の例としては、例えば、励起フィルタ２４Ａおよび２４Ｂの代わりにモノクロメータを用いても良い。このようにすれば、複数の励起フィルタを予め用意しておく必要がなくなる。
【００５５】
また、ダイクロイックミラー５１の代わりに半透鏡を用いてもよい。この場合、半透鏡はその反射率および透過率の波長特性がほとんど一様であるので、ダイクロイックミラー５１を用いる場合のような、試料内の蛍光物質を変えるごとにその蛍光に応じて透過あるいは反射させる特性を持つダイクロイックミラー５１に交換しなければならないというような手間を省くことができる。
【実施例２】
【００５６】
図３は本発明の実施例２にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
実施例２では、半透鏡２１を透過した光束Ａの光路上には、反射鏡２２Ａ、減光フィルタ２３Ａ、励起フィルタ２４Ａに加えて、偏光板２６Ａが配置されている。また、半透鏡２１で反射した光束Ｂの光路上には、反射鏡２２Ｂ、減光フィルタ２３Ｂ、励起フィルタ２４Ｂに加えて、偏光板２６Ｂが配置されている。偏光板２６Ａおよび２６Ｂは、光源１１からの入射光束の偏光方向を選択する特性を有している。
【００５７】
また、実施例２では、反射鏡４５の反射側の光路上に蛍光フィルタ５２と、蛍光フィルタ５２を透過した光束を光束Ａ’と光束Ｂ’とに分割する半透鏡５６が配置され、半透鏡５６を介して分割された二つの光束Ａ’，Ｂ’の光路上に偏光板５４Ａ，偏光板５４Ｂが配置されており、偏光板５４Ａおよび５４Ｂを透過した蛍光がそれぞれカメラ５３Ａ，５３Ｂで撮像されるようになっている。
蛍光フィルタ５２は、試料４３からの光のうち特定の波長域のみの光を透過させる特性を有している。
偏光板５４Ａおよび５４Ｂは、半透鏡５６で分割された光束Ａ’および光束Ｂ’のそれぞれを特定の偏光方向の成分の光のみを透過させる特性を有している。
【００５８】
ここで、偏光板２６Ａと偏光板２６Ｂ、偏光板５４Ａと偏光板５４Ｂの透過偏光軸の方向関係について述べる。
偏光板２６Ａと偏光板２６Ｂとは、透過偏光軸が互いに垂直になっており、偏光板５４Ａと偏光板５４Ｂとは、透過偏光軸が互いに垂直になっている。また、偏光板２６Ａと偏光板５４Ａとは、透過偏光軸が互いに平行になっており、偏光板２６Ｂと偏光板５４Ｂとは、透過偏光軸が互いに平行になっている。
このようにすると、偏光板２６Ａを透過した所定の偏光方向を有する光束Ａによって励起された試料４３の蛍光の偏光方向は、励起光（光束Ａ）の偏光方向と平行の成分が支配的であるので、その成分は偏光板５４Ａを透過することができるが、偏光板５４Ｂを透過することはできない。また逆に、試料４３の蛍光のうち、励起光（光束Ａ）の偏光方向と垂直な成分は、偏光板５４Ｂを透過することができるが、偏光板５４Ａを透過することはできない。他方、偏光板２６Ｂを透過した所定の偏光方向を有する光束Ｂによって励起された試料４３の蛍光の偏光方向は、励起光（光束Ｂ）の偏光方向と平行の成分が支配的であるので、その成分は、偏光板５４Ｂを透過することができるが、偏光板５４Ａを透過することはできない。また逆に、試料４３の蛍光のうち、励起光（光束Ｂ）の偏光方向と垂直な成分は、偏光板５４Ａを透過することができるが、偏光板５４Ｂを透過することはできない。
【００５９】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、光源１１を点灯すると、光源１１から発せられた光は、コレクタレンズ１２を介して平行光束に変換され、半透鏡２１に入射し、二つの光束Ａ，Ｂに分割される。
半透鏡２１を透過した光束Ａは、反射鏡２２Ａで反射した後、減光フィルタ２３Ａを所定の透過率で透過する。また、励起フィルタ２４Ａを所定の波長域の光が透過し、さらに、偏光板２５Ａを介して所定の偏光方向の成分の光が選択され、半透鏡２５に入射する。半透鏡２５を透過し、半透鏡７１を透過した光束Ａは、投影レンズ３１を通りダイクロイックミラー４１で反射し対物レンズ４２を経て、試料４３を照射する。試料４３は光束Ａの光を照射されることで励起され、蛍光を発する。
なお、本実施例においては、試料４３内における蛍光物質として、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）やＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等のように分子量が大きな蛍光物質を用いる。分子量が大きいと、蛍光物質の回転運動が遅く、試料４３から発した蛍光の偏光方向は、試料に照射した励起光の偏光方向と平行な成分が支配的であり、また、その平行な成分と励起光の偏光方向と垂直な成分の比は、ほぼ一定となる。
光束Ａを照射することにより試料４３で発された蛍光は、対物レンズ４２を逆進し、ダイクロイックミラー４１、結像レンズ４４を透過し、反射鏡４５で反射し、蛍光フィルタ５２を透過し、半透鏡５６で透過および反射する。次いで、蛍光のうち光束Ａの偏光方向と平行な成分は、偏光板５４Ａを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ａにより撮像され、垂直な成分は、偏光板５４Ｂを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ｂにより撮像される。
【００６０】
一方、半透鏡２１で反射した光束Ｂは、反射鏡２２Ｂで反射した後、減光フィルタ２３Ｂで所定の透過率で透過する。また、励起フィルタ２４Ｂを所定の波長域の光が透過し、さらに、偏光板２５Ｂを介して所定の偏光方向の成分の光が選択され、半透鏡２５に入射する。半透鏡２５で反射し、半透鏡７１を透過した光束Ｂは、投影レンズ３１を通りダイクロイックミラー４１で反射し対物レンズ４２を経て、試料４３を照射する。試料４３は光束Ｂの光を照射されることで励起され、蛍光を発する。
光束Ｂを照射することにより試料４３で発された蛍光は、対物レンズ４２を逆進し、ダイクロイックミラー４１、結像レンズ４４を透過し、反射鏡４５で反射し、蛍光フィルタ５２を透過し、半透鏡５６を透過および反射する。次いで、蛍光のうち光束Ｂの偏光方向と平行な成分は、偏光板５４Ｂを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ｂにより撮像され、垂直な成分は、偏光板５４Ａを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ａにより撮像される。
【００６１】
次に、本実施例の構成、作用による効果について説明する。
ＧＦＰのように励起スペクトルが双峰型でかつ、その励起スペクトルの形が、例えばカルシウムイオンの濃度に依存して変化するような蛍光物質を用いる場合、従来では、当該双峰に対応する二つの波長の励起光を同時にあて、発する蛍光からカルシウムイオンの濃度の変化を抽出することは、困難であった。
しかし、本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、上述したように偏光方向が互いに直行する二つの波長の励起光で同時に試料を励起して蛍光を発生させ、その蛍光のうち、偏光方向が互いに直交する２成分を二つのカメラで同時に撮像した後、得られた二つの画像をもとに演算すると、それぞれの波長の励起光で単独に励起した場合に得られる蛍光像と同等な蛍光像を分離して求めることができる。さらには、得られた二つの画像の比を計算してレシオ画像を測定することにより、例えば、カルシウムイオンの濃度の変化を時間のずれをまったく生じずに完全に同一の時間で測定することができ、変化が早い現象や動きの速い試料でも測定することが可能となる。
【００６２】
なお、第２の実施例においては、偏光方向選択手段として偏光板２６Ａおよび２６Ｂを用いたが、これらの代わりに偏光ビームスプリッタを用いても良い。
図４は本発明の実施例２の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１および図３と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
本変形例では、図１に示した半透鏡２１および２５の代わりに、図４に示すように、偏光ビームスプリッタ２７Ａ，２７Ｂを用いている。
偏光ビームスプリッタ２７Ａは、コレクタレンズ１２を経た平行光束が入射する位置に配置されている。偏光ビームスプリッタ２７Ａは、入射光束のうち紙面に対して平行な偏光方向の成分の光を透過し、紙面に対して垂直な偏光方向の成分の光を反射する特性を有し、入射光束をその偏光方向に応じて光束Ａ，Ｂに分割するように構成されている。
そして、偏光ビームスプリッタ２７Ａを透過した光束Ａの光路上には、反射鏡２２Ａと、減光フィルタ２３Ａと、励起フィルタ２４Ａが配置されている。また、偏光ビームスプリッタ２７Ａで反射した光束Ｂの光路上には、反射鏡２２Ｂと、減光フィルタ２３Ｂと、励起フィルタ２４Ｂが配置されている。
【００６３】
偏光ビームスプリッタ２７Ｂは、励起フィルタ２４Ａを経た光束Ａおよび励起フィルタ２４Ｂを経た光束Ｂが入射する位置に配置されている。そして、偏光ビームスプリッタ２７Ｂは、偏光ビームスプリッタ２７Ａと同様な機能を有し、紙面に対して平行な偏光成分を有する光束Ａを透過し、紙面に対して垂直な偏光方向の成分を有する光束Ｂを反射することにより、光束Ａおよび光束Ｂを合成する。
また、本変形例では、反射鏡４５の反射側の光路上に蛍光フィルタ５２と、蛍光フィルタを透過した光束を偏光方向の違いによって光束Ａ’と光束Ｂ’とに分割する偏光ビームスプリッタ５５が配置され、偏光ビームスプリッタ５５で分割された蛍光がそれぞれカメラ５３Ａ，５３Ｂで撮像されるようになっている。
偏光ビームスプリッタ５５は、入射光束のうち紙面に対して平行な偏光方向の成分の光を透過し、紙面に対して垂直な偏光方向の成分の光を反射する特性を有し、入射光束をその偏光方向に応じて光束Ａ’，Ｂ’に分割するように構成されている。
【００６４】
このように構成された本変形例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、偏光ビームスプリッタ２７Ａおよび２７Ｂが、偏光方向選択手段の機能に加えて、光束分割手段および光束合成手段の機能をも兼ね備えるので、半透鏡２１および半透鏡２５を省略することができ、光学系の簡素化が可能となる。また、本変形例では、偏光ビームスプリッタ２７Ａ，２７Ｂを用いると、半透鏡２１，２５を用いるのに比べて、光源１１からの光のロスが少なくなるので、効率良く試料に光を照射することができる。また、偏光ビームスプリッタ５５が、図３における半透鏡５１および偏光板５４Ａおよび５４Ｂの役割を果たすので、光学系の簡素化が図れるのみならずシステムの安定性の向上が図れる。また、偏光ビームスプリッタ５５を用いると、半透鏡５６を用いるのに比べて、試料から発した光のロスが少なくなるので、効率よく蛍光を検出することができる。
また、本変形例によれば、１個の光源１１のみで異なる二つの波長域で試料を励起することができるので、図１，２に示した実施例１と同様な効果を奏する。また、図３に示した構成と同様の効果を有する。
【実施例３】
【００６５】
図５は本発明の実施例３にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
実施例３では、図１に示した実施例１の装置におけるダイクロイックミラー４１に代えて半透鏡４６が配置されている。半透鏡４６は、入射した光の一部を反射し、一部を透過する機能を有し、その反射率および透過率の波長依存性がほとんどないという特性を有している。そして、半透鏡２５で合成された光束Ａおよび光束Ｂの一部を対物レンズ４２側に反射させるとともに、試料４３から発した蛍光の一部を透過させている。
【００６６】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、反射率および透過率に波長依存性がほとんどない半透鏡４６を用いたので、ダイクロイックミラー４１を用いた実施例のように反射特性に制約されることがなく、試料４３に用いる蛍光物質に合わせて励起フィルタおよび蛍光フィルタを最適に選択することができる。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
また、１個の光源１１のみで異なる二つの波長域で試料を励起することができるので、第１の実施の形態と同様な効果を奏する。
【実施例４】
【００６７】
図６は本発明の実施例４にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
実施例４は、半透鏡７１から反射鏡４５に至るまでの光路上の構成が図１に示した実施例１と異なっており、この間の光路上には、投影レンズ３１と、反射鏡４７と、第１の対物レンズである対物レンズ４２Ａと、第２の対物レンズである対物レンズ４２Ｂと、結像レンズ４４が配置されており、透過型の蛍光観察を行なうように構成されている。
投影レンズ３１は、半透鏡２５で合成された光束Ａおよび光束Ｂの光源像を第１の対物レンズ４２Ａの瞳面に導いている。反射鏡４７は、投影レンズ３１を透過した光を反射させて対物レンズ４２Ａに導いている。対物レンズ４２Ａは、半透鏡２５で合成された光束を試料４３に照射するように配置されている。対物レンズ４２Ｂは、試料４３を挟んで対物レンズ４２Ａに対向して配置されており、試料４３から発した蛍光を透過し、結像レンズ４４を介して反射鏡４５で反射させることによってカメラ５３Ａおよび５３Ｂの撮像面上に結像させるようになっている。また、第１の対物レンズ４２Ａは光軸方向に沿って上下動して試料４３に照射する光の径を調整することができるようになっている。
【００６８】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、励起光と蛍光とが別の光路を辿るため、図１に示したダイクロイックミラー４１あるいは図５に示した半透鏡４６を用いて励起光と蛍光とを分離する必要がない。このため、励起光および蛍光を効率良く伝送することができるので、特に暗い蛍光試料を観察する場合に有効である。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
また、１個の光源１１のみで異なる二つの波長域で試料を励起することができるので、第１の実施の形態と同様な効果が得られる。
なお、実施例４においても、顕微鏡の照明部を図２に示したような構成にすることはもちろん可能であり、その場合には同様の効果が得られる。
【実施例５】
【００６９】
図７は本発明の実施例５にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図３の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
実施例５は、半透鏡２５、半透鏡７１から反射鏡４５に至るまでの光路上の構成が図３に示した実施例２と異なり、この間の光路上には、実施例４と同様に、投影レンズ３１と、反射鏡４７と、第１の対物レンズである対物レンズ４２Ａと、第２の対物レンズである対物レンズ４２Ｂと、結像レンズ４４が配置されている。
【００７０】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、実施例４と同様に、励起光と蛍光とが別の光路を辿るため、図３に示したダイクロイックミラー４１あるいは半透鏡を用いて励起光と蛍光とを分離する必要がなくなる。このため、励起光および蛍光を効率良く伝送することができ、特に暗い蛍光試料を観察する場合に有効である。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
その他の効果は、図３に示した実施例２とほぼ同じである。
【実施例６】
【００７１】
図８は本発明の実施例６にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図４の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
実施例６は、偏光ビームスプリッタ２７Ｂ、半透鏡７１から反射鏡４５に至るまでの光路上の構成が図４に示した実施例２の変形例と異なり、この間の光路上には、投影レンズ３１と、反射鏡４７と、第１の対物レンズである対物レンズ４２Ａと、第２の対物レンズである対物レンズ４２Ｂと、結像レンズ４４が配置されている。
【００７２】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、実施例４と同様に、励起光と蛍光とが別の光路を辿るため、図４に示したダイクロイックミラー４１あるいは半透鏡を用いて励起光と蛍光とを分離する必要がなくなる。このため、励起光および蛍光を効率良く伝送することができるので、特に暗い蛍光試料を観察する場合に有効となる。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
その他の効果は、図４に示した実施例２の変形例とほぼ同じである。
【実施例７】
【００７３】
図９は本発明の実施例７にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
実施例７では、半透鏡２１および半透鏡８１を介して、光源１１から出射された光束を三つの照射光の光束に分岐し、励起フィルタ２４Ａ〜２４Ｃを介してこれらの光束分割手段により分岐されたそれぞれの照射光の波長を選択するとともに、半透鏡８２および半透鏡２５を介して、波長が選択された複数の照射光の光束を単一の光束に合成するように構成されている。
【００７４】
コレクタレンズ１２を介して平行光束に変換された光は、光束分割手段である半透鏡２１に入射する。半透鏡２１は、入射光束の一部を反射させ、残りを透過させる特性を有している。
半透鏡２１を透過した光束Ａの光路上には、光束分割手段としての半透鏡８１が配置されている。半透鏡８１は、入射光束の一部を反射させ、残りを透過させる特性を有している。
半透鏡８１を透過した光束Ａの光路上には、反射鏡２２Ａと、減光フィルタ２３Ａと、励起フィルタ２４Ａが配置されている。
また、半透鏡８１で反射した光束Ｃの光路上には、減光フィルタ２３Ｃ、励起フィルタ２４Ｃと、半透鏡８２が配置されている。
一方、半透鏡２１で反射した光束Ｂの光路上には、減光フィルタ２３Ｂと、励起フィルタ２４Ｂと、反射鏡２２Ｂが配置されている。
【００７５】
反射鏡２２Ａ，２２Ｂ、半透鏡８１，８２には、光束Ａ、光束Ｂ、光束Ｃが半透鏡２５を経た後の進行方向および光路上の位置を完全に一致させるための傾き調整機構（不図示）が備えられている。
減光フィルタ２３Ａ，２３Ｂ，２３Ｃは、それぞれ光束Ａの光量，光束Ｂの光量，および光束Ｃの光量を独立して調整することができるようになっている。
また、減光フィルタ２３Ａ，２３Ｂ，および２３Ｃは、それぞれターレットまたはスライダーを介して光束Ａ，光束Ｂ，および光束Ｃの光路に容易に挿脱可能に設けられている。
励起フィルタ２４Ａ，２４Ｂ，および２４Ｃは、それぞれ光束Ａ，光束Ｂ，および光束Ｃにおける特定の波長域の光のみを透過させる特性を有しており、それぞれターレットまたはスライダーを介して光束Ａ，光束Ｂ，および光束Ｂの光路に容易に挿脱可能に設けられている。
【００７６】
半透鏡８２は、入射光の一部を透過させ一部を反射させる特性を有しており、半透鏡８２を透過した平行光束Ｂと、半透鏡を反射した平行光束Ｃが合成されて半透鏡２５に入射するように構成されている。さらに、半透鏡２５は、入射光の一部を透過させ一部を反射させる特性を有しており、半透鏡２５を透過した平行光束Ａと半透鏡２５を反射した平行光束ＢおよびＣは合成されるようになっている。その際、上述の傾き調整機構を介して反射鏡２２Ａ、反射鏡２２Ｂ、半透鏡８１および８２の傾き調整が施されることにより、半透鏡２５を通った平行光束Ａ、ＢおよびＣは進行方向および光路上の位置が完全に一致している。
【００７７】
また、本実施例では、ダイクロイックミラー４１には、反射ピークが三つ以上ある反射特性を有するマルチクロイックミラーが用いられている。そして、励起フィルタ２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃは、ダイクロイックミラー４１の反射ピークに合わせて選択されている。
また、本実施例では、カメラ９１として、試料４３からの蛍光を三つの波長成分に分割して撮像する３板式のカラーＣＣＤカメラが用いられており、図１の実施例に示したようなダイクロイックミラー５１や蛍光フィルタ５２Ａ，５２Ｂに相当する光学部材は省かれている。
【００７８】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置によれば、１個の光源１１のみで異なる三つの波長域で試料を励起することができるので、上記実施例１と同様な効果を奏する。さらに、三つ以上の波長域で試料を同時に励起し、三つ以上の蛍光を同時に観察することができるので、例えば、カルシウムイオン濃度の変化に加えて、クロライドイオン濃度の変化も同時に観察することができるといった効果が得られる。
なお、本実施例では照射光束を三つに分割する例を示したが、４つ以上の分割も可能である。また、ダイクロイックミラー４１の代わりに半透鏡を用いれば、実施例３と同様の効果が得られる。
【００７９】
なお、図９の例では、カメラ９１として、試料４３からの蛍光を三つの波長成分に分割して撮像する３板式のカラーＣＣＤカメラを用いたが、図１の実施例に示したようなダイクロイックミラー５１を用いて三つの光路に分割し、それぞれの光路に蛍光フィルタと、単板式のＣＣＤカメラを配置してもよい。
図１０は実施例７の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置およびその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図９の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
本変形例では、反射鏡４５の反射側の光路上にダイクロイックミラー５１が配置されて、反射鏡４５で反射された光束を光束Ｂ’とそれ以外の光束に分割するとともに、さらに、ダイクロイックミラー５１を透過した光束の光路上にダイクロイックミラー５１’が配置されており、ダイクロイックミラー５１を透過した光束を光束Ａ’、光束Ｃ’に分割している。
そして、分割されたそれぞれの光束Ａ’，Ｂ’，Ｃ’の光路上には、それぞれ特定の波長域のみを透過させる蛍光フィルタ５２Ａ，５２Ｂ，５２Ｃと、カメラ５３Ａ，５３Ｂ，５３Ｃが設けられている。カメラ５３Ａ，５３Ｂ，５３Ｃには、それぞれ単板式のＣＣＤカメラが用いられている。
本変形例のように構成すれば、図９に示した３板式のＣＤＤカメラを用いた場合と比べて単板式のＣＣＤカメラが安価であるため、装置全体の製造コストを低減することができる。
また、三つに分割された光束Ａ’，Ｂ’，Ｃ’の光路にそれぞれ蛍光フィルタを配置する構成であるため、試料内の蛍光物質を変えても、その蛍光に応じた特性を備えた蛍光フィルタを光束Ａ’，Ｂ’，Ｃ’の光路に挿脱することができ、３板式ＣＣＤカメラを用いる場合のようにＣＣＤカメラを取りかえることなく蛍光撮影ができる。
その他の効果は図９に示した実施例と同様である。
【００８０】
なお、図９および図１０に示した実施例７の構成は、半透鏡２５、半透鏡７１から反射鏡４５に至るまでの光路上の構成に関し、図６の実施例に示したように、投影レンズ３１と、反射鏡４７と、第１の対物レンズである対物レンズ４２Ａと、第２の対物レンズである対物レンズ４２Ｂと、結像レンズ４４が配置された構成の装置においても適用可能である。
【００８１】
以上説明したように、本発明の顕微鏡画像処理装置は、特許請求の範囲に記載された発明の他に、次に示すような特徴も備えている。
【００８２】
（１）上記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照射光の偏光方向を選択する偏光方向選択手段をさらに備えることを特徴とする請求項１または３に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００８３】
（２）上記第１の照射光の偏光方向を選択する第１の偏光方向選択手段と上記第２の照射光の偏光方向を選択する第２の偏光方向選択手段の双方またはいずれか一方をさらに備えることを特徴とする請求項２または４に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００８４】
（３）上記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照射光の波長分布を監視する波長分布監視手段をさらに備えることを特徴とする請求項１または３に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００８５】
（４）上記第１および上記第２の照射光の双方または一方の波長分布を監視する波長分布監視手段をさらに備えることを特徴とする請求項２または４に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００８６】
（５）上記ミラーが半透鏡であることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００８７】
（６）上記光束分割手段および上記光束合成手段がダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の顕微鏡画像処理装置。
【００８８】
（７）上記光束分割手段および上記光束合成手段が偏光ビームスプリッタであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の顕微鏡画像処理装置。
【００８９】
（８）上記複数の波長選択手段のうちの少なくともいずれかが、上記光路分岐手段により分岐された光路上に挿脱可能に配置されることを特徴とする請求項１、３、上記（１）、（３）のいずれかに記載の顕微鏡画像処理装置。
【００９０】
（９）上記第１の波長選択手段と上記第２の波長選択手段の少なくともいずれかが、上記光路分岐手段により分岐された光路上に挿脱可能に配置されることを特徴とする請求項２、４、上記（２）、（４）のいずれかに記載の顕微鏡画像処理装置。
【００９１】
（１０）白色光源と、
この白色光源から出射された光束を、第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分割する光束分割手段と、
上記第１の照射光の強度を調整する第１の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第２の照射光の強度を調整する第２の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第１の照射光の波長を選択する第１の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第２の照射光の波長を選択する第２の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第１の励起フィルタにより波長が選択された上記第１の照射光の光束と、上記第２の励起フィルタにより波長が選択された上記第２の照射光の光束を、単一の光束に合成する光束合成手段と、
上記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導く第１のダイクロイックミラーと、
この第１のダイクロイックミラーと上記試料との間に配置された対物レンズと、
この対物レンズおよび上記第１のダイクロイックミラーを通過して上記試料で発生された蛍光が入射し、該蛍光を、上記第１の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第１の蛍光と上記第２の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第２の蛍光に分岐する、第２のダイクロイックミラーと、
上記第１の蛍光を撮像する第１の撮像素子と、
上記第２の蛍光を撮像する第２の撮像素子と、
上記第２のミラーと上記第１の撮像素子との間に配置され、上記第１の励起フィルタと組み合わせて使用する第１の蛍光フィルタと、
上記第２のミラーと上記第２の撮像素子との間に配置され、上記第２の励起フィルタと組み合わせて使用する第２の蛍光フィルタと、
上記第１の撮像素子と第２の撮像素子とでそれぞれ撮像した蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記第１の減光フィルタ、第２の減光フィルタ、および上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記第１の蛍光と第２の蛍光の双方向の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【００９２】
（１１）上記第１および第２の減光フィルタは、それぞれ光路に交換および挿脱可能に設けられていることを特徴とする、上記（１０）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００９３】
（１２）上記第１および第２の照射光のいずれか一方の波長分布を監視する波長分布監視手段を備えたことを特徴とする、上記（１０）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００９４】
（１３）上記第１のミラーがダイクロイックミラーであることを特徴とする、上記（１０）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００９５】
（１４）上記光束分割手段が偏光ビームスプリッタであることを特徴とする、上記（１０）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００９６】
（１５）上記第１，第２の波長選択手段は、光路に交換および挿脱可能に設けられていることを特徴とする、（１０）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００９７】
（１６）上記光束分割手段がハーフミラーであることを特徴とする、上記（１０）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００９８】
（１７）上記光束合成手段がハーフミラーであることを特徴とする、上記（１０）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【００９９】
（１８）白色光源と、
この白色光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分割する光束分割手段と、
上記第１の照射光の強度を調整する第１の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第２の照射光の強度を調整する第２の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第１の照射光の波長を選択する第１の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第２の照射光の波長を選択する第２の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第１の励起フィルタにより波長が選択された上記第１の照射光の光束と、上記第２の励起フィルタにより波長が選択された上記第２の照射光の光束を、単一の光束に合成する光束合成手段と、
上記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導くハーフミラーと、
このハーフミラーと上記試料との間に配置された対物レンズと、
この対物レンズおよび上記ハーフミラーを通過した上記試料で発せられた蛍光が入射し、この蛍光のうち、上記第１の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第１の蛍光と上記第２の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第２の蛍光に分岐するダイクロイックミラーと、
上記第１の蛍光を撮像する第１の撮像手段と、
上記第２の蛍光を撮像する第２の撮像手段と、
上記ダイクロイックミラーと上記第１の撮像手段との間に設けられ、上記第１の励起フィルタと組み合わせて使用する第１の蛍光フィルタと、
上記ダイクロイックミラーと上記第２の撮像手段との間に設けられ、上記第２の励起フィルタと組み合わせて使用する第１の蛍光フィルタと、
上記第１の撮像手段と第２の撮像手段とでそれぞれ撮像した蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記第１の減光フィルタ，上記第２の減光フィルタ，そして上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記第１の蛍光と第２の蛍光の双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【０１００】
（１９）白色光源と、
この白色光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分割する光束分割手段と、
上記第１の照射光の強度を調整する第１の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第２の照射光の強度を調整する第２の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第１の照射光の波長を選択する第１の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第２の照射光の波長を選択する第２の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第１の励起フィルタにより波長が選択された上記第１の照射光の光束と、上記第２の励起フィルタにより波長が選択された上記第２の照射光の光束を、単一の光束に合成し、合成された光束を試料に照射する光束合成手段と、
この光束合成手段と上記試料との間に配置された照明用対物レンズと、
上記試料を観察する観察用対物レンズと、
この観察用対物レンズを通過して上記試料で発せられた蛍光が入射し、この蛍光のうち、上記第１の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第１の蛍光と上記第２の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第２の蛍光に分岐するダイクロイックミラーと、
上記第１の蛍光を撮像する第１の撮像手段と、
上記第２の蛍光を撮像する第２の撮像手段と、
上記ダイクロイックミラーと上記第１の撮像手段との間に設けられ、上記第１の励起フィルタと組み合わせて使用する第１の蛍光フィルタと、
上記ダイクロイックミラーと上記第２の撮像手段との間に設けられ、上記第２の励起フィルタと組み合わせて使用する第１の蛍光フィルタと、
上記第１の撮像手段と第２の撮像手段とでそれぞれ撮像した蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記第１の減光フィルタ，上記第２の減光フィルタ，そして上記画像処理手段の少なくとも一つを用いて、上記第１の蛍光と第２の蛍光の双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【０１０１】
（２０）白色光源と、
この白色光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分割する光束分割手段と、
上記第１の照射光の強度を調整する第１の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第２の照射光の強度を調整する第２の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第１の照射光の波長を選択する第１の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第２の照射光の波長を選択する第２の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第１の照射光の偏光方向を選択する第１の偏光フィルタ（偏光手段）と、
上記第２の照射光の偏光方向を選択する第２の偏光フィルタ（偏光手段）と、
上記第１の励起フィルタにより波長が選択された上記第１の照射光の光束と、上記第２の励起フィルタにより波長が選択された上記第２の照射光の光束を、単一の光束に合成し、合成された光束を試料に導く光束合成手段と、
上記試料を観察する対物レンズと、
この対物レンズを通過して上記試料で発せられた蛍光が入射する蛍光フィルタと、
この蛍光フィルタを通過した上記試料で発せられた蛍光のうち、上記第１の励起フィルタおよび第１の偏光フィルタで選択された照射光により励起された第１の蛍光と、上記第２の励起フィルタおよび第２の偏光フィルタで選択された照射光により励起された第２の蛍光とに分岐するハーフミラーと、
上記第１の蛍光を撮像する第１の撮像手段と、
上記第２の蛍光を撮像する第２の撮像手段と、
上記ハーフミラーと第１の撮像手段の間に設けられた第３の偏光フィルタ（偏光手段）と、
上記ハーフミラーと第２の撮像手段の間に設けられた第４の偏光フィルタ（偏光手段）と、
上記第１の撮像手段と第２の撮像手段とでそれぞれ撮像した蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記第１の減光フィルタと第２の減光フィルタにて上記第１の蛍光と第２の蛍光を所定の蛍光強度とするとともに、上記画像処理手段を用いて得られた二つの画像の比を計算してレシオ画像を測定することを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【０１０２】
（２１）さらに、上記対物レンズと上記蛍光フィルタの間に配置されており、上記光束合成手段により合成した光束を上記対物レンズを介して上記試料に導く、ダイクロイックミラーを備えたことを特徴とする、上記（２０）記載の顕微鏡画像処理装置。
【０１０３】
（２２）上記光束合成手段と試料との間に照明用対物レンズを備えたことを特徴とする、上記（２０）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【０１０４】
（２３）白色光源と、
この白色光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分割する第１の光束分割手段と、
上記第１の照射光の強度を調整する第１の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第２の照射光の強度を調整する第２の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第１の照射光の波長を選択する第１の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第２の照射光の波長を選択する第２の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第１の照射光の偏光方向を選択する第１の偏光フィルタ（偏光手段）と、
上記第２の照射光の偏光方向を選択する第２の偏光フィルタ（偏光手段）と、
上記第１の励起フィルタにより波長が選択された上記第１の照射光の光束と、上記第２の励起フィルタにより波長が選択された上記第２の照射光の光束を、単一の光束に合成し、合成された光束を試料に導く第２の偏光ビームスプリッタと、
上記試料を観察する対物レンズと、
この対物レンズを通過して上記試料で発せられた蛍光が入射する蛍光フィルタと、
この蛍光フィルタを通過した上記試料で発せられた蛍光のうち、上記第１の励起フィルタ，第１および第２の偏光ビームスプリッタで選択された照射光により励起された第１の蛍光と、上記第２の励起フィルタ，第１および第２の偏光ビームスプリッタで選択された照射光により励起された第２の蛍光とに分岐する第３の偏光ビームスプリッタと、
上記第１の蛍光を撮像する第１の撮像手段と、
上記第２の蛍光を撮像する第２の撮像手段と、
上記第１の撮像手段と第２の撮像手段とでそれぞれ撮像した蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記第１および第２の減光フィルタで上記第１の蛍光と第２の蛍光を所定の蛍光強度とするとともに、上記画像処理手段を用いて得られた二つの画像の比を計算してレシオ画像を測定することを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【０１０５】
（２４）さらに、上記対物レンズと上記蛍光フィルタの間に配置されており、上記光束合成手段により合成した光束を上記対物レンズを介して上記試料に導く、ダイクロイックミラーを備えたことを特徴とする、上記（２３）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【０１０６】
（２５）さらに、上記光束合成手段と上記試料との間に照明用対物レンズを備えたことを特徴とする、上記（２３）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【０１０７】
（２６）白色光源と、
この白色光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分割する第１の光束分割手段と、
上記第１の照射光の強度を調整する第１の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第２の照射光の強度を調整する第２の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第１の照射光の波長を選択する第１の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第２の照射光の波長を選択する第２の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第１の励起フィルタにより波長が選択された上記第１の照射光の光束と、上記第２の励起フィルタにより波長が選択された上記第２の照射光を、単一の光束に合成し、該合成した光束を試料に導く第１の光束合成手段と、
上記試料を観察する対物レンズと、
この対物レンズを通過して上記試料で発せられ、上記第１の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第１の蛍光像と、上記第２の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第２の蛍光像とを撮像する撮像手段と、
この撮像手段で撮像した第１の蛍光像と第２の蛍光像を合成処理する画像処理手段と、
を具備しており、
上記第１の減光フィルタ，第２の減光フィルタ，そして画像処理手段の少なくともいずれか一つを用いて、上記第１の蛍光像と第２の蛍光像の双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることを特徴とする顕微鏡画像処理装置。
【０１０８】
（２７）上記対物レンズと画像処理手段との間に配置されたダイクロイックミラーと、
上記第１の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された上記第１の蛍光像を得る第１の蛍光フィルタと、
上記第２の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された上記第２の蛍光像を得る第２の蛍光フィルタと、
を具備しており、
上記撮像手段は第１および第２の蛍光像に対応した二つの撮像手段であることを特徴とする、上記（２６）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【０１０９】
（２８）上記光束分割手段と光束合成手段は、ハーフミラーまたはダイクロイックミラーのいずれか一つであることを特徴とする、上記（２７）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【０１１０】
（２９）上記第１の光束合成手段で合成した光束を上記対物レンズを介して上記試料に導くとともに、上記対物レンズと上記蛍光フィルタの間に配置されたダイクロイックミラーもしくはハーフミラーの何れか一つを備えたことを特徴とする、上記（２７）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【０１１１】
（３０）さらに、上記第１の光束合成手段と試料との間に配置された照明用対物レンズを備えたことを特徴とする、上記（２７）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【０１１２】
（３１）上記第１の光束分割手段と第１の光束合成手段の間に設けられ、第１の照射光の光束もしくは第２の照射光の光束を、第１もしくは第２の照射光の光束と第３の照射光の光束とに分割する第２の光束分割手段と、
上記第３の照射光の強度を調整する第３の減光フィルタ（光量調整手段）と、
上記第３の照射光の波長を選択する第３の励起フィルタ（波長選択手段）と、
上記第１の光束合成手段で合成された光束を上記試料に導く、反射ピークを三つ以上備えたマルチダイクロイックミラーと、
を具備しており、
上記第３の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第３の蛍光像を上記撮像手段によりさらに撮像することを特徴とする、上記（２６）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【０１１３】
（３２）上記対物レンズと画像処理手段との間に設けられたダイクロイックミラーと、
上記第１の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第１の蛍光像を得る第１の蛍光フィルタと、
上記第２の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第２の蛍光像を得る第２の蛍光フィルタと、
上記第３の励起フィルタで選択された波長の照射光で励起された第３の蛍光像を得る第３の蛍光フィルタと、
を具備しており、
上記撮像手段は、第１，第２，第３の蛍光像に対応した三つの撮像手段を備えたことを特徴とする、上記（３１）に記載の顕微鏡画像処理装置。
【符号の説明】
【０１１４】
１１  光源
１２  コレクタレンズ
２１，２５，５６，４６，７１，８１，８２  半透鏡
２２Ａ，２２Ｂ，４５，４７                反射鏡
２３Ａ，２３Ｂ，２３Ｃ                    減光フィルタ
２４Ａ，２４Ｂ，２４Ｃ                    励起フィルタ
２６Ａ，２６Ｂ，５４Ａ，５４Ｂ            偏光板
２７Ａ，２７Ｂ，５５                      偏光ビームスプリッタ
３１                                      投影レンズ
２８Ａ，２８Ｂ，４１，５１，５１’        ダイクロイックミラー
４２，４２Ａ，４２Ｂ                      対物レンズ
４３                                      試料
４４                                      結像レンズ
５２，５２Ａ，５２Ｂ，５２Ｃ              蛍光フィルタ
５３Ａ，５３Ｂ，５３Ｃ                    カメラ
９１                                      ３板式ＣＣＤカメラ
６１                                      画像処理部
６２                                      画像表示部
７２                                      分光器
１５１                                    フィルタ切換手段
１５１ａ                                  励起光選択用フィルタ
１５１ｂ                                  回転円板
１５２ａ                                  蛍光選択用フィルタ
１５８，１６４                            ダイクロイックミラー
１６１Ａ，１６１Ｂ                        白色光源
１６２Ａ，１６２Ｂ                        コレクタレンズ
１６３Ａ，１６３Ｂ                        励起フィルタ
１６５                                    観察光学系
１７１                                    照射用光源
１７２                                    分岐光学系
１７３                                    試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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