(57)【要約】【課題】本発明は、生化学物質の非特異的な吸着が極めて少なく、かつ、標的とする生化学物質を極めて高純度かつ高収量で分離する粒子を得ることを目的とする。【解決手段】生物学的試料の中から、生化学物質をプローブとの相互作用を用いて分離するための有機ポリマー粒子であって、該有機ポリマー粒子はプローブを結合するための活性官能基を有しており、かつ粒子の表面積を該活性官能基の量で除した値が２０〜５，０００Å２であり、さらに非イオン性の親水基を有することを特徴とする有機ポリマー粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料の中から、生化学物質をプローブとの相互作用を用いて分離するための有機ポリマー粒子であって、該有機ポリマー粒子はプローブを結合するための活性官能基を有しており、かつ粒子の表面積を該活性官能基の量で除した値が２０〜５，０００Å２であり、さらに非イオン性の親水基を有することを特徴とする有機ポリマー粒子。
【請求項２】
更に磁性体を含有することを特徴とする請求項１に記載の有機ポリマー粒子。
【請求項３】
前記活性官能基がカルボキシル基、アミノ基、およびトシル基からなる群から選ばれる少なくとも１つの基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の有機ポリマー粒子。
【請求項４】
前記非イオン性の親水基として、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の有機ポリマー粒子。
【請求項５】
表面に超常磁性微粒子の層を有する母粒子と、この母粒子を覆うように設けられたプローブを結合するための活性官能基および非イオン性の親水基を有する有機ポリマー層と、を有する請求項２〜４に記載の有機ポリマー粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の有機ポリマー粒子とプローブとを、前記活性官能基を介して結合させた、プローブ結合粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学物質分離用の有機ポリマー粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生化学分野、医薬品分野などにおいて、細胞、タンパク質、核酸などの生化学物質に関する研究が盛んに行われている。これら生化学物質の構造、機能、存在量などについての詳細な研究を行うことにより、例えば、未知の生命現象を科学的に解明したり、優れた効能の医薬品を新たに創製したりすることが可能になると期待されている。
これらの研究を遂行するうえで必要となるのが、生物学的試料（細胞浮遊液、細胞破砕液、血液、唾液など）の中に含まれる特定の生化学物質を、無数の夾雑物の中から分離するという技術である。
【０００３】
従来の生化学物質分離技術は、およそ次の２種類に分類できる。
（Ａ）標的物質の物理化学的性質（大きさ、形状、比重、等電点、極性など）を利用して分離する手法。例えば、濾過器、濾過膜、遠心分離機、電気泳動装置、吸着坦体を用いる分離手法などが挙げられる。
（Ｂ）標的物質の生化学的性質（タンパク質、ＤＮＡ、化合物などに対する親和力など）を利用して分離する手法。例えば、プローブを表面に結合させたゲル坦体、粒子坦体、あるいは、これらの坦体を充填したカラムクロマトグラフィーを用いる分離手法などが挙げられる。
【０００４】
分離技術（Ａ）は、標的物質の物理化学的性質を利用するため、物理化学的性質の似通った２以上の生化学物質を分離する用途には適さない。通常、これらの分離技術は、生化学物質の濃縮や粗精製に用いられることが多い。
一方、分離技術（Ｂ）は、標的物質のプローブとの親和力を利用するため、特定の生化学物質を分離することが、原理的に可能である。ただし、従来技術には幾つかの問題が存在した。
【０００５】
従来の分離技術（Ｂ）の問題点としては、例えば、使用する坦体の表面が生化学物質を非特異的に吸着する性質を有する場合には、分離される標的物質の純度が低くなるという問題があった。また、坦体上でプローブがその活性を維持できない場合には、分離される標的物質の収量が低くなるという問題があった。さらに、プローブが坦体に化学結合を介して結合されていない場合には、標的物質の分離の際、プローブも共に回収されるため、分離される標的物質の純度が低くなるという問題があった。
分離される生化学物質の純度が低く、夾雑物が混在する場合には、目的とする生化学物質の同定や機能解析が困難となったり、あるいは誤った解析結果を導き出す原因となったりする場合がある。また、分離される生化学物質の収量が低い場合には、解析で使用する装置の検出限界以下となり、生化学物質の同定や機能解析が困難となったり、あるいは測定者が分離の事実そのものを見逃したりする場合がある。
よって、標的物質の捕捉量を向上させ、非特異的吸着の量を低減させる必要がある。
【０００６】
従来の分離技術（Ｂ）における問題点をさらに具体的に述べる。
分離技術（Ｂ）に使用される担体としては、アガロース、デキストランなどの糖鎖に基づくゲル担体、ポリスチレンやアクリルなどの有機ポリマー粒子、シリカや磁性体などの無機物を含む有機−無機複合担体などが挙げられる。
これらのうち、ゲル担体においては、担体表面が親水的であるために、生化学物質の非特異的な吸着が比較的少ないという利点がある反面、担体上でプローブの活性を維持できずに、標的物質の収量が少なくなるという問題があった。また、これらゲル担体は機械的強度が低いため、加圧条件下での使用には耐えられないという問題や、耐溶剤性に乏しいという問題がある。
【０００７】
一方、有機ポリマー粒子や有機−無機複合担体においては、担体の機械的強度が高いという利点がある反面、疎水的な担体表面に対し、生化学物質が非特異的に吸着するという問題があった。また、担体上でプローブの活性を維持できずに、標的物質の収量が少なくなるという問題がある。
【０００８】
また、従来の診断薬用に用いられている粒子においては、生化学物質の非特異吸着を抑制するためのブロッキング剤として、アルブミン、カゼイン、スキムミルクなどを使用することができたが、上記のような生化学物質の分離や、解析を目的とした粒子に対しては、分離物質の純度を低下させてしまうために、この手法が適用できないという問題がある。
【０００９】
非特異吸着を抑制する手法として、たとえば、特開２００６−１３１７７１号公報では、粒子をスチレンおよびグリシジルメタクリレートに分散させ、超音波処理で微分散させてから重合する方法が提案されている。しかしながら、磁性体の被覆が不十分であるため、非特異吸着の低減は不十分であり、また、平均粒子径が２００ｎｍ以下と粒子径が小さいため磁気分離性も不十分である。また、磁性体が露出するため、酸などの溶剤中で粒子が崩壊するという問題がある。さらに、この方法では標的物質の収量に改善の余地がある。
【００１０】
さらに、特表２００６−５１１９３５号公報では、粒子表面および内部に磁性体を析出させ、さらにグリシジル基を有するポリマーでコートする提案がなされている。しかしながら、この方法では、粒子表面にまで磁性粒子を析出させた場合、グリシジル基を有するポリマーでのコートのみでは磁性粒子の被覆が不十分であり、非特異吸着性を低減させることができない。
【００１１】
また、特表平１０−５０５１１８号公報では、グリシジル基を導入した磁性粒子に、アミノ基を導入する反応が記載されているが、この磁性粒子はイオン交換を目的とした多孔質の粒子であり、非特異吸着が著しい。
本出願人は、特許第３７３８８４７号公報で、磁性体の脱落、鉄イオンなどの磁性体成分に由来する物質の溶出がなく、均一粒子径を有する診断薬用粒子を簡便かつ効率的に製造することを目的として、２層のポリマーコートを設ける工程を含む磁性粒子の製造方法を開示し、さらに、特開２００５−８３９０４号公報および特開２００５−８３９０５号公報で、非特異吸着を低減した磁性粒子を開示したが、近年、さらに非特異吸着を低減することが望まれている。
【００１２】
このように、従来の生化学物質分離技術には多くの手法が存在するものの、生物学的試料中に含まれる特定の生化学物質（細胞、タンパク質、核酸など）を、無数の夾雑物の中から極めて高い純度で、かつ収率良く分離する用途に適用できる手法はこれまでなかった。
【００１３】
【特許文献１】特開２００６−１３１７７１号公報
【特許文献２】特表２００６−５１１９３５号公報
【特許文献３】特表平１０−５０５１１８号公報
【特許文献４】特許第３７３８８４７号公報
【特許文献５】特開２００５−８３９０４号公報
【特許文献６】特開２００５−８３９０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、生化学物質の非特異的な吸着が極めて少なく、かつ、標的とする生化学物質を極めて高純度かつ高収量で分離する粒子を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、プローブを結合するための活性官能基と、非イオン性の親水基とを有し、かつ、粒子の表面積を活性官能基の量で除した値（パーキングエリア）が２０〜５０００Å２の条件を満たす有機ポリマー粒子に対して、プローブを化学結合を介して結合させることにより得られる担体を用いることにより、生物学的試料の中から、生化学物質を極めて高純度かつ高収量で分離することが可能になることを見出し、本発明を完成させた。
本発明によれば、プローブを結合するための有機ポリマー粒子、およびこの有機ポリマー粒子上にプローブを化学結合を介して結合させたプローブ結合粒子を提供することができる。
【００１６】
本発明における有機ポリマー粒子の態様は、
粒子上にプローブを固定化するための活性官能基と、非イオン性の親水基とを有し、かつ、粒子の表面積を該活性官能基の量で除した値（パーキングエリア）が２０〜５０００Å２の条件を満たすことを特徴とする有機ポリマー粒子。
【００１７】
上記有機ポリマー粒子は、磁性体を含有することができる。
【００１８】
上記有機ポリマー粒子は、活性官能基としてカルボキシル基、アミノ基、トシル基を有することができる。
【００１９】
上記有機ポリマー粒子は、非イオン性の親水基として粒子上に２，３−ジヒドロキシプロピル基を有することができる。
【００２０】
上記有機ポリマー粒子は、表面に超常磁性微粒子の層を有する母粒子と、この母粒子を覆うように設けられたプローブ結合用の活性官能基および非イオン性の親水基を有する有機ポリマー層と、から成る構造を有することができる。
【００２１】
本発明におけるプローブ結合粒子の態様は、
上記有機ポリマー粒子に、粒子上の活性官能基を介して化学結合によりプローブを結合させた、プローブ結合粒子であることを特徴とする。
【００２２】
上記プローブ結合粒子は、プローブとして抗体、抗原、核酸、化合物、アフィニティー用タグ捕捉物質などを有することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の有機ポリマー粒子は、タンパク質、核酸、細胞などの生化学物質の非特異的な吸着が極めて少なく、かつ、プローブを、その活性を高く維持した状態で粒子表面に化学結合を介して結合させることができる。
本発明のプローブ結合粒子は、生物学的試料の中から特定の生化学物質あるいは生化学物質の複合体を、極めて高い純度で分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子、および、プローブ結合粒子について説明する。
【００２５】
１．有機ポリマー粒子およびその製造方法
本発明の有機ポリマー粒子は、生物学的試料の中から、生化学物質をプローブとの相互作用を用いて分離するための有機ポリマー粒子であって、該有機ポリマー粒子はプローブを結合するための活性官能基を有しており、かつ粒子の表面積を該活性官能基の量で除した値が２０〜５０００Å２であり、さらに非イオン性の親水基を有する。
本発明において、「生物学的試料」とは、生物学的な被検試料であり、例えば、細胞、組織、血液、骨髄、体液、唾液、精液、尿、口腔スワブなどが挙げられる。
本発明において、「生化学物質」とは、生体に関わるすべての物質をいう。生化学物質としては、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質などが挙げられる。
【００２６】
本発明における「プローブ」とは、生物学的試料の中の特定の生化学物質と結合し得る抗原・抗体などのタンパク質、核酸、糖鎖、化学物質などをいう。
本発明における「活性官能基」とは、プローブと化学反応を介して結合し得る官能基であり、カルボキシル基、アミノ基、トシル基、エポキシ基、カルボニル基、メルカプト基、コハク酸イミド基、シラノール基などをいう。官能基の保存安定性、プローブの導入の容易さ、導入後のプローブの活性などの点から、好ましい活性官能基は、カルボキシル基、アミノ基、トシル基である。これらの官能基の導入方法は後述する。
【００２７】
本発明の有機ポリマー粒子の表面積を該活性官能基の量で除した値（以下、「パーキングエリア」という）は、２０〜５０００Å２である。より好適な範囲、限定理由などは後述する。  
【００２８】
本発明における「非イオン性の親水基」とは、水酸基、エチレンオキシド基、アミド基などの官能基であり、好ましくはアルコール性水酸基、さらに好ましくは、２，３−ジヒドロキシプロピル基である。非イオン性の親水基は、生物学的試料中の夾雑物が粒子へ吸着することを防ぎ、目的の生化学物質を高い純度で分離するための必須成分である。なお、非イオン性の親水基の導入量の指標として、有機ポリマー粒子の水分散液から得られる乾燥塗膜と水との接触角は、好ましくは６０°以下、さらに好ましくは５〜５０°、最も好ましくは１０〜４０°である。非イオン性の親水基の導入量が不十分である場合、すなわち接触角が６０°を超える場合、非特異吸着が多くなる場合がある。有機ポリマー粒子の水分散液から得られる乾燥塗膜と水との接触角の測定法については、特開２００７−１２７４２６に記載した通りである。
本発明の有機ポリマー粒子の内部構造として、粒子全体が均質であってもよく、母粒子を核として該母粒子の上に有機ポリマー層が形成された層構造をであってもよい。以下に述べる製造方法では、特に層構造を有する有機ポリマー粒子について、述べる。
【００２９】
１．有機ポリマー粒子およびその製造方法
本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子は、磁性体を含んでいても良い母粒子と、この母粒子を覆うように設けられた有機ポリマー層とから成り、該有機ポリマー層は、プローブを結合するための活性官能基および非イオン性の親水基を有する。さらに、粒子の表面積を該活性官能基の量で除した値は２０〜５０００Å２、より好ましくは２０〜１０００Å２の範囲内であることを特徴とする。
本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子の製造方法は、磁性体を含んでいても良い母粒子を作製後、該母粒子の上に有機ポリマー層を形成する工程を経て、該有機ポリマー粒子を得る。活性官能基および親水基は、該有機ポリマー層作製工程にて導入しても良いし、該有機ポリマー層作製工程の後で導入しても良い。
【００３０】
１．１．母粒子
母粒子の形態としては、例えば（Ｉ）有機ポリマーなどの非磁性体からなる粒子、（ＩＩ）有機ポリマーなどの非磁性体の連続相中に超常磁性微粒子が分散している粒子、（ＩＩＩ）超常磁性微粒子の２次凝集体をコアとし、有機ポリマーなどの非磁性体をシェルとする粒子、（ＩＶ）有機ポリマーなどの非磁性体からなる粒子をコアとし、超常磁性微粒子の２次凝集体層（磁性体層）をシェルとする粒子、が挙げられる。
粒子がアフィニティーカラムクロマトグラフィーの坦体などの用途で使用される場合には、磁性体を含有しない（Ｉ）の形態の母粒子がより好ましい。一方、磁石による磁気分離操作が可能な磁性粒子などの用途で使用される場合には、優れた磁気応答性を有し、かつ粒子径を均一に制御できるという点で、（ＩＶ）の形態の母粒子がより好ましい。
（ＩＶ）の形態の母粒子は、（Ｉ）の形態の母粒子の上に、超常磁性微粒子の２次凝集体層（磁性体層）を設けることによって得られる。以下、（Ｉ）および（ＩＶ）の形態の母粒子の構成および製造法について説明する。
【００３１】
１．１．１．母粒子（Ｉ）
母粒子は、基本的に非磁性物質であり、有機物質および無機物質のいずれも使用可能である。有機物質の代表例としては、例えばポリマーを挙げることができる。かかるポリマーとしては、特に、ビニル系ポリマーが好ましく、最も好ましくは、架橋ポリスチレン、架橋ポリメチルメタクリレートである。これらポリマーは、カルボキシル基などの官能基が導入されていても良い。
母粒子の材質は、複合化の際の加工性、軽量性の観点からポリマーなどの有機物質であることが好ましい。
【００３２】
母粒子の平均粒子径は、好ましくは、０．１〜２００μｍ、さらに好ましくは０．５〜１００μｍ、最も好ましくは０．８〜２０μｍである。母粒子の平均粒子径が０．１μｍ未満では、粒子と分散媒との分離が困難になる場合がある。一方、母粒子の平均粒子径が２００μｍを超えると、粒子の重力沈降が著しくなるため、プローブ結合粒子として試料と反応させる場合に、反応場が不均一となる場合がある。また、粒子の重量当たりの有効表面積が小さくなるため、反応効率が低下する場合がある。
【００３３】
上述した特定範囲の平均粒子径を有する母粒子としてのポリマー粒子は、例えばビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることもできる。均一な粒子径を有する核粒子の作製方法としては、特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、あるいは本出願人が先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２号公報、同６１−２１５６０３号公報、同６１−２１５６０４号公報）によって容易に製造することができる。
【００３４】
１．１．２．母粒子（ＩＶ）
母粒子（ＩＶ）は、母粒子（Ｉ）をコアとし、超常磁性微粒子の２次凝集体層（磁性体層）をシェルとする。
１．１．２．１．超常磁性微粒子
超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５〜２０ｎｍ）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＭＦｅ２Ｏ４（Ｍ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５など）で表現されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表現されるマグネタイト、あるいはγ−Ｆｅ２Ｏ３を挙げることができる。特に、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４のいずれか一方を含むことが好ましい。
【００３５】
超常磁性微粒子は、コアと後工程で使用するモノマーとの親和性や相溶性との観点から、表面が疎水化されたものが望ましい。磁性体微粒子の表面の疎水化処理方法としては、特許第３７３８８４７号に記載の方法が挙げられる。このような超常磁性微粒子は、公知の磁性流体から適当な貧溶媒で粒子を析出、洗浄することによっても得られる。
【００３６】
１．１．２．２．磁性体層が表面に設けられた母粒子（母粒子（ＩＶ））
超常磁性微粒子を含む磁性体層をコア（母粒子（Ｉ））の表面に形成する方法としては、コアと超常磁性微粒子とを混合し、コアの表面に超常磁性微粒子を物理的に吸着させることにより、磁性体層を形成する方法が好ましい。本発明において、「物理的吸着法」とは、化学反応を伴わない吸着法、結合法を指すものである。コアの表面に超常磁性微粒子を吸着させる方法としては、例えば、コアと超常磁性微粒子とをドライブレンドして、物理的に強い力を外部から加えることにより双方の粒子を複合化させる方法により作製する方法が挙げられる。物理的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいは、ジェットミル、ハイブリダイザー等の高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理的吸着力が強いことが望ましい。物理的吸着力が強い複合化を実施するには、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で複合化を実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、核粒子の表面に超常磁性微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率などの点から自ずと決定される。
【００３７】
コア上に超常磁性微粒子の２次凝集体層を設ける際の混合比（コア：超常磁性微粒子）は、重量比で９５：５〜２０：８０が好ましい。超常磁性微粒子がこの範囲の量より少ないと、得られる磁性粒子の磁気分離性が劣る場合がある。一方、超常磁性微粒子がこの範囲の量より多いと、一部の過剰な超常磁性微粒子が複合化されずに系中に残り、この影響で、プローブ結合粒子として試料と反応させる場合に、反応場が不均一となる場合がある。
【００３８】
１．２．活性官能基および親水基を有する有機ポリマー層
母粒子上に形成するプローブを結合するための活性官能基および非イオン性の親水基を有する有機ポリマー層の形態としては、例えば、（Ｖ）母粒子の表面に直接、活性官能基および親水基を有するポリマー層を設けた粒子、（ＶＩ）母粒子の表面に先ず疎水性の第１ポリマー層（以下、単に「第１ポリマー層」ともいう。）を形成した後、さらにその表面に活性官能基および親水基を有する第２ポリマー層（以下、単に「第２ポリマー層」ともいう。）を設けた粒子、が挙げられる。
超常磁性微粒子を含有する母粒子を使用する場合には、超常磁性微粒子の露出を抑制できるという点で、（ＶＩ）の形態の有機ポリマー層がより好ましい。超常磁性微粒子が露出していると、生化学物質の非特異的な吸着が増え、分離物質の純度が低下する。また、酸などの添加で、超常磁性微粒子が溶解する場合がある。
以下、（ＶＩ）の形態の有機ポリマー層の製造法について説明する。
【００３９】
母粒子上に（ＶＩ）の形態の有機ポリマー層を形成する製造法としては、母粒子の表面に疎水性の第１ポリマー層を形成した後に、例えば、（ＶＩＩ）活性官能基を有するモノマーと、親水基を有するモノマーと、を共重合させる方法、（ＶＩＩＩ）活性官能基を有するモノマーおよび／または親水基を有するモノマーを（共）重合させた後に、活性官能基および／または親水基を化学修飾にて導入する方法、などにより第２ポリマー層を形成する方法が挙げられる。これらの中では、（ＶＩＩＩ）の製造法が、有機ポリマー粒子に導入する官能基の量を制御し易いという点で、より好ましい。
【００４０】
本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子は、プローブを結合するための、活性官能基を有する。活性官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、およびトシル基からなる群から選ばれる少なくとも１つの基を有することが好ましい。これらの活性官能基を、上記（ＶＩＩＩ）の製造法で製造した有機ポリマー層に対して、化学修飾にて導入する方法としては、例えば、下記の方法が挙げられる。
（ａ）カルボキシル基の導入
有機ポリマー層上の水酸基に対しカルボキシル化剤を反応させる。
（ｂ）アミノ基の導入
有機ポリマー層上のエポキシ基に対しアミノ化剤を反応させる。
（ｃ）トシル基の導入
有機ポリマー層上の水酸基に対しトシル化剤を反応させる。
【００４１】
ここで、エポキシ基を加水分解することにより、水酸基が得られることは公知の技術である。よって、上記（ＶＩＩＩ）の製造法において、疎水性の第１ポリマー層と、エポキシ基を有する第２ポリマー層とを形成した後に、適宜、加水分解を施し、さらに、上記（ａ）〜（ｃ）の方法で活性官能基を導入することにより、本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子を得ることができる（以下、本製造法を製造法（ＩＸ）という。）。製造法（ＩＸ）は、有機ポリマー粒子に導入する官能基の量を制御し易いという点だけでなく、１つのベースとなる粒子から複数種の活性官能基を有する粒子に容易に変換できるという点で、好ましい。
なお、第２ポリマー層上に導入されるエポキシ基も、プローブを結合するための活性官能基として使用することができる。
以下、上記（ＩＸ）の製造法について詳細に説明する。
【００４２】
１．２．１．疎水性の第1ポリマー層の形成
疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマー（以下、「第１モノマー部」ともいう。）は、８０重量％以上の疎水性モノマーを含み、好ましくは９５重量％以上の疎水性モノマーを含み、さらに好ましくは９８重量％以上の疎水性モノマーを含む。第１モノマー部中の疎水性モノマーが８０重量％未満であると、非特異吸着が悪化する場合がある。ここで、疎水性モノマーとは、２５℃における水への溶解度が２．５重量％以下の重合性モノマーの単体および混合物である。疎水性モノマーは単官能性（非架橋性）モノマー、架橋性モノマーのいずれであってもよく、単官能性モノマーおよび架橋性モノマーの混合物でもよい。
【００４３】
母粒子の存在下で、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加された液体中で、主原料である８０重量％以上の疎水性モノマーを含む第１モノマー部を重合することにより、第１ポリマー層を形成することができる。母粒子が磁性体を含有する場合には特に、このように、重合によって第１ポリマー層を形成することにより、磁性体を効果的に被覆することができ、かつ、非特異吸着を効果的に低減させることができる。
【００４４】
第１モノマー部に使用可能な疎水性モノマーのうち単官能性モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル単量体、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどを例示することができる。また、疎水性モノマーのうち架橋性モノマーとしては、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。
【００４５】
第１モノマー部は、２０重量％未満の非疎水性モノマー（親水性モノマー）を含んでいてもよい。非疎水性モノマーのうち、単官能性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸などのカルボキシル基を有するモノマー、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールアクリレート、グリセロールメタクリレート、メトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ポリプロピレングリコールアクリレート、ポリプロピレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレートなどの親水性官能基（例えば水酸基、アミノ基、アルコキシ基、など）を有する（メタ）アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミド、Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミドなどを例示できる。非疎水性モノマーのうち、架橋性モノマーとして、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリビニルアルコールのポリ（メタ）アクリルエステルなどの親水性のモノマーを例示することができる。第１モノマー部に含まれる非疎水性モノマーは、２０重量％未満であり、好ましくは５重量％未満であり、さらに好ましくは２重量％未満である。
【００４６】
第１モノマー部中の架橋性モノマー（疎水性モノマー、非疎水性モノマーあわせて）の比率は、第１ポリマー層を構成するモノマー部１００重量％中に好ましくは１〜４０重量％であり、さらに好ましくは５〜２０重量％である。第１モノマー部中の架橋性モノマーの比率が４０重量％を超えると、粒子が多孔質化して非特異的な吸着を増加させることがある。
【００４７】
重合開始剤としては、水への溶解性の観点から分類すると、油溶性重合開始剤が好ましい。水溶性の重合開始剤を用いると、母粒子表面での重合よりも、疎水性モノマーのみの重合が優先し、新粒子が多量に生じる傾向がある。
【００４８】
油溶性重合開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルペルオキシド、アゾビスイソブチロニトリルなどの過酸化化合物、アゾ化合物などを挙げることができる。
【００４９】
水溶性開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウムなどの過硫酸塩、過酸化水素、２−２アゾビス（２−アミノプロパン）鉱酸塩、アゾビスシアノ吉草酸およびそのアルカリ金属塩およびアンモニウム塩などが挙げられ、また、過硫酸塩、過酸化水素塩と重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化第一鉄などを組み合わせたレドックス開始剤も挙げられ、中でも過硫酸塩が好適に用いられる。
これらの重合開始剤のモノマー全体に対する割合は０．０１〜８重量％の範囲が好適に用いられる。
【００５０】
乳化剤としては、通常使用されている陰イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤などを単独もしくは組み合わせて用いることができる。例えば陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸のアルカリ金属塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルの硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルのリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ナトリウムのホルマリン縮合物などの陰イオン性界面活性剤の他、エレミノールＪＳ−２、ＪＳ−５〔製品名、三洋化成（株）製〕、ラテムルＳ−１２０、Ｓ−１８０Ａ、Ｓ−１８０、ＰＤ−１０４〔製品名、花王（株）製〕、アクアロンＨＳ−１０、ＨＳ−２０、ＫＨ−１０〔製品名、第一工業製薬（株）製〕、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ、ＳＲ−１０〔製品名、旭電化工業（株）製〕などの反応性乳化剤などを挙げることができる。
【００５１】
また、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのほか、アクアロンＲＳ−２０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＮＥ−２０（旭電化工業（株）製）などの反応性非イオン性界面活性剤を挙げることができる。
【００５２】
第１ポリマー層の形成における重合系へのモノマーの添加方法は、特に制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常１０〜９０℃好ましくは３０〜８５℃であり、重合に要する時間は通常１〜３０時間程度である。
【００５３】
また、第１ポリマー層の厚さは、好ましくは０．００５〜２０μｍであり、より好ましくは０．０１〜５μｍである。また、母粒子に磁性体を含有する場合、第１ポリマー層は磁性体を完全に被覆することが好ましい。
【００５４】
１．２．２．エポキシ基を有する第２ポリマー層の形成
第２ポリマー層を形成するためのモノマー（以下、「第２モノマー部」ともいう。）は、２０重量％以上のエポキシ基含有モノマーを含み、好ましくは４０重量％以上のエポキシ基含有モノマーを含み、さらに好ましくは８０重量％以上のエポキシ基含有モノマーを含む。第２ポリマー層を構成するその他のモノマーとしては、上記第１モノマー部に使用するモノマーとして例示した、疎水性モノマーおよび／または非疎水性（親水性）モノマーを使用することができる。
所定量のエポキシ基含有モノマーを含む第２モノマー部を重合することにより、エポキシ基を有する第２ポリマー層を得ることができる。
【００５５】
第２ポリマー層は、第１ポリマー層の形成方法と基本的に同様の方法にて形成することができる。すなわち、第１ポリマー層が形成された粒子の存在下で、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加された液体中で、主原料である第２モノマー部の重合を行なうことにより、第２ポリマー層を形成することができる。
【００５６】
ここで、エポキシ基を含む共重合性モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテルなどを例示できる。
【００５７】
第２モノマー部には、架橋性モノマーがさらに含まれることが好ましく、その比率は、第２モノマー部１００重量％中に好ましくは１〜４０重量％であり、さらに好ましくは５〜２０重量％である。第２モノマー部中の架橋性モノマーの比率が４０重量％を超えると、粒子が多孔質化して非特異的な吸着を増加させることがある。
【００５８】
第２ポリマー層の形成における重合系へのモノマーの添加方法は、特に制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常１０〜９０℃好ましくは３０〜８５℃であり、重合に要する時間は通常１〜３０時間程度である。
【００５９】
第２ポリマー層の厚さは、第１ポリマー層に比較して薄くすることが可能であり、好ましくは０．００５〜５μｍであり、より好ましくは０．００５〜１μｍである。
【００６０】
１．２．３．第２ポリマー層上にカルボキシル基を導入する反応
カルボキシル基を導入する反応としては、例えば、（ｉ）第２ポリマー層に含まれるエポキシ基にカルボキシル化剤（例えば、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、あるいは、分子中に３個以上のカルボキシル基を有する有機化合物）を作用させる反応、（ｉｉ）第２ポリマー層に含まれるエポキシ基を加水分解して得られた水酸基に、カルボキシル化剤（例えば、カルボン酸無水物、カルボン酸塩化物）を作用させる反応、（ｉｉｉ）適当な脱水触媒の存在下で、第２ポリマー層に含まれるエポキシ基を加水分解して得られた水酸基に、分子中に２個以上のカルボキシル基を有する有機化合物（例えば、ジカルボン酸、あるいは、分子中に３個以上のカルボキシル基を有する有機化合物）を作用させる反応などが挙げられる。この反応により、カルボキシル基が導入されたポリマー粒子が得られる。このカルボキシル基導入粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。
【００６１】
導入されるカルボキシル基量の制御のし易さから、上記（ｉｉ）の反応が好ましく、（ｉｉ）第２ポリマー層に含まれるエポキシ基を加水分解して得られた水酸基に、カルボキシル化剤としてカルボン酸無水物を作用させる反応が特に好ましい。ここで、カルボン酸無水物は、多価カルボン酸無水物であり、その具体例としては、無水イタコン酸、無水コハク酸、無水シトラコン酸、無水ドデセニルコハク酸、無水トリカルバニル酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸、無水ヘキサヒドロフタル酸、無水メチルテトラヒドロフタル酸、無水ハイミック酸などの脂肪族ジカルボン酸無水物；１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸二無水物、シクロペンタンテトラカルボン酸二無水物などの脂環族多価カルボン酸二無水物；無水フタル酸、無水ピロメリット酸、無水トリメリット酸、無水ベンゾフェノンテトラカルボン酸などの芳香族多価カルボン酸無水物を挙げることができる。このうち、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸などの１，２−ジカルボン酸無水物がより好ましい。
【００６２】
エポキシ基の加水分解は、例えば、水系溶媒中で適当な酸触媒または塩基触媒によって進行する。好ましくは、水溶媒中で、硫酸などの酸触媒を用いてエポキシ基を加水分解する。これにより、加水分解を速やかにかつ確実に行うことができる。この場合、加水分解の好ましい温度は４〜１００℃、さらに好ましくは２０〜８０℃であり、加水分解の好ましい時間は５分〜２４時間、さらに好ましくは３０分〜１２時間である。
エポキシ基の加水分解により、非イオン性の親水基である水酸基が粒子上に生成する。特に、有機ポリマー粒子上のエポキシ基がグリシジル基由来である場合、加水分解により、非イオン性の親水基である２，３−ジヒドロキシプロピル基が粒子上に生成する。
粒子上の水酸基により、非特異的な吸着を低減することができる。
【００６３】
第２ポリマー層に含まれるエポキシ基を加水分解して得られた水酸基に、カルボキシル化剤としてカルボン酸無水物を作用させる具体的な方法としては、例えば、カルボン酸無水物を溶解させた有機溶剤に、加水分解した粒子の乾燥粉体を分散し、室温〜８０℃で１〜２４時間攪拌する方法が挙げられる。ここで用いられる有機溶剤としては、限定されないが、例えば、ピリジン、アセトン、メチルエチルケトン、１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジクロロホルム、クロロホルム、トルエンなどが挙げられる。また、触媒としては、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸、塩化亜鉛、酢酸ナトリウム、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、４−ピロリジノピリジン、トリエチルアミンを使用してもよい。これらの有機溶剤、触媒のうち、ピリジンが有機溶剤兼触媒として用いることができるため、好適である。
【００６４】
なお、カルボキシル基を導入する反応では、全ての水酸基がエステル化される必要はない。水酸基の一部がエステル化されずに、そのまま有機ポリマー粒子上に、非イオン性の親水基として残ることが好ましい。ポリマー粒子へのカルボキシル基導入量の最適範囲については後述する。
【００６５】
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の場合、カルボキシル基を導入する反応の前に、２以上のエポキシ基の一部を加水分解するか、あるいは、カルボキシル基を導入する反応と同時に、２以上のエポキシ基の一部を加水分解するのが好ましい。また、上記（ｉ）の場合、カルボキシル基を導入する反応の後に、残留するエポキシ基の全てあるいは一部を加水分解してもよい。
【００６６】
１．２．４．第２ポリマー層上にアミノ基を導入する反応
アミノ基を導入する反応としては、例えば、エポキシ基を有するポリマー層が形成された粒子にアミノ化剤を作用させることにより、ポリマー層にアミノ基を導入する反応が挙げられる。この反応により、アミノ基が導入されたポリマー粒子が得られる。このアミノ基導入粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。
【００６７】
アミノ化剤としては、例えば、アンモニア、分子中に２個のアミノ基を有する有機化合物（ジアミン）、あるいは、分子中に３個以上のアミノ基を有する有機化合物を挙げることができ、分子中に２個以上のアミノ基を有する有機化合物がより好ましい。
【００６８】
ここで、ジアミンとしては、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ｏ−フェニレンジアミンなどの１級ジアミンなどが挙げられる。また、分子中に３個以上のアミノ基を有する有機化合物としては、１，２，３−トリアミノプロパン、テトラ（アミノメチル）メタン、１，３，５-トリアミノベンゼン、１，２，３，４−テトラアミノベンゼンなどが
挙げられる。
【００６９】
アミノ基を導入する反応は、水系溶媒に分散させた状態のエポキシ基を有するポリマー粒子にアミノ化剤を添加して実施しても良いし、エポキシ基を有するポリマー粒子を乾燥させた後に、この乾燥粒子をアミノ化剤に分散させて実施しても良い。水系溶媒とは、水溶性有機溶媒と水との混合溶媒、あるいは、水である。ここで、水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミドなどを例示できる。アミノ基を導入する反応の好ましい温度、時間は、ポリマー層中のエポキシ基の量、溶媒の有無、溶媒の種類などによって異なるが、通常、４〜１００℃、好ましくは、２０〜８０℃で、通常、１０分〜４８時間、好ましくは、１〜２４時間である。
なお、アミノ基を導入する反応では、全てのエポキシ基がアミノ化される必要はない。ポリマー粒子へのアミノ基導入量の最適範囲については後述する。
【００７０】
アミノ基を導入する反応の前に、２以上のエポキシ基の一部を加水分解してもよい。また、アミノ基を導入する反応と同時に、２以上のエポキシ基の一部を加水分解してもよい。また、アミノ基導入後に残留するエポキシ基の一部または全てを加水分解してもよい。
【００７１】
エポキシ基の加水分解は、例えば、水系溶媒中で適当な酸触媒または塩基触媒によって進行する。好ましくは、アミノ基を導入する反応の前または後に、水溶媒中で、硫酸などの酸触媒を用いてエポキシ基を加水分解する。これにより、加水分解を速やかにかつ確実に行うことができる。この場合、加水分解の好ましい温度は４〜１００℃、さらに好ましくは２０〜８０℃であり、加水分解の好ましい時間は５分〜２４時間、さらに好ましくは３０分〜１２時間である。
エポキシ基の加水分解により、非イオン性の親水基である水酸基が粒子上に生成する。特に、有機ポリマー粒子上のエポキシ基がグリシジル基由来である場合、加水分解により、非イオン性の親水基である２，３−ジヒドロキシプロピル基が粒子上に生成する。
粒子上の水酸基により、非特異的な吸着を低減することができる。
【００７２】
１．２．５．第２ポリマー層上にトシル基を導入する反応
トシル基を導入する反応としては、例えば、エポキシ基を有するポリマー粒子を加水分解して、水酸基を有するポリマー粒子を得た後、乾燥し、有機溶剤中で粒子上の水酸基をトシル化剤と作用させることにより導入する方法が挙げられる。
得られるトシル基導入粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。
【００７３】
エポキシ基の加水分解の条件は、上記カルボキシル基を導入する反応で説明した通りである。エポキシ基の加水分解により、非イオン性の親水基である水酸基が粒子上に生成する。特に、有機ポリマー粒子上のエポキシ基がグリシジル基由来である場合、加水分解により、非イオン性の親水基である２，３−ジヒドロキシプロピル基が粒子上に生成する。
ポリマー粒子を乾燥する手段としては、例えば、真空乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。
トシル化剤としては、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸クロライド、ｐ−トルエンスルホン酸などを挙げることができる。好適な有機溶剤としては、ピリジンなどを挙げることができる。
【００７４】
トシル基を導入する反応は、例えば、水酸基を有するポリマー粒子を真空乾燥にて乾燥させた後、この乾燥粒子をピリジンなどの有機溶剤に分散させ、ｐ−トルエンスルホン酸クロライドを添加し、室温で１〜６時間反応させることにより行う。あるいは、ポリマー粒子が有する水酸基とｐ−トルエンスルホン酸とを脱水縮合させることにより、前記トシル化を行っても良い。
なお、トシル基を導入する反応では、全ての水酸基がトシル化される必要はない。水酸基の一部がトシル化されずに、そのまま有機ポリマー粒子上に、非イオン性の親水基として残ることが好ましい。粒子上の水酸基により、非特異的な吸着を低減することができる。
ポリマー粒子へのトシル基導入量の最適範囲については後述する。
【００７５】
１．２．６．後処理、保存
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、水系分散体または乾燥粉体として保存される。水系分散体は、通常、活性官能基の導入工程の後、蒸留水などの水系溶媒で洗浄し、水系溶媒を加えて分散させることにより得られる。乾燥粉体は、水系分散体の加熱乾燥、真空乾燥、スプレードライ、凍結乾燥などによって得られる。
【００７６】
１．３．粒子径
本実施形態に係る有機ポリマー粒子の平均粒子径は、好ましくは０．１〜２００μｍ、さらに好ましくは０．５〜１００μｍ、最も好ましくは０．８〜２０μｍである。平均粒子径が０．１μｍ未満では、粒子と分散媒との分離が困難になる場合がある。一方、平均粒子径が２００μｍを超えると、粒子の重力沈降が著しくなるため、プローブ結合粒子として試料と反応させる場合に、反応場が不均一になる場合がある。また、粒子の重量当たりの有効表面積が小さくなるため、反応効率が低下する場合がある。
【００７７】
１．４．活性官能基の導入量（パーキングエリア）
本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子は、活性官能基として、例えば、カルボキシル基、アミノ基、およびトシル基からなる群から選ばれる少なくとも１つの基を有する。
活性官能基の量はパーキングエリアで表す。パーキングエリアは、活性官能基１分子が粒子表面で占有する平均面積を意味する。粒子の単位面積当たりの官能基数（官能基密度）が大きくなるとパーキングエリアは小さくなり、逆に、単位面積当たりの官能基密度が小さくなるとパーキングエリアは大きくなる。
【００７８】
パーキングエリアの算出に用いる「粒子の表面積」に関しては、平均粒径と比重から予想される計算値を用いるのではなく、ガス吸着法などから求めた有効表面積の測定値を用いる。このことにより、仮に、粒子表面が凹凸形状である場合であっても、有効表面積を正確に見積もることができ、粒子表面の実際の官能基密度をより正確に表すことができる。また、官能基密度を粒子の比重に依存しない形で表現できるという利点がある。
本実施形態に係る有機ポリマー粒子に導入される活性官能基のパーキングエリアは、好ましくは２０〜５０００Å２であり、より好ましくは２０〜１０００Å２である。活性官能基のパーキングエリアが２０Å２未満では、プローブをポリマー粒子に結合する際、プローブの活性が損なわれるために、生化学物質の特異的捕捉の量が少なくなる場合がある。また、プローブとの結合に使用されない活性官能基が粒子上に多く残留するため、生化学物質の非特異的吸着の量が多くなる場合がある。一方、活性官能基のパーキングエリアが５０００Å２を超えると、ポリマー粒子へのプローブの結合量が少なくなるため、生化学物質の特異的捕捉の量が少なくなる場合がある。
【００７９】
１．４．１．パーキングエリアの測定方法
本発明におけるパーキングエリアは、次の式（１）を用いて算出しされるものである。計算で必要となる比表面積、活性官能基量の測定方法に関しては、後述する。
2010260877.tif 000002
・・・式（１）
１．４．１．１．粒子の比表面積
粒子の比表面積は、粒子１ｇ当たりの表面積である。粒子を水で洗浄後、乾燥させた後、ガス吸着量測定装置により測定し、この乾燥粒子の比表面積を「粒子の比表面積」とした。
【００８０】
１．４．１．２．粒子上の活性官能基量
本発明における活性官能基量としての、カルボキシル基、アミノ基およびトシル基の
１．４．１．２．１．カルボキシル基量の定量
粒子１ｇ（固形分）を含む水分散体を用いて、特開平１０−２７０２３３号公報に記載された電導度滴定によって、この粒子の見かけの表面荷電量（Ｘ）を求め、さらに、分散媒（水）のみを用いた同様の測定でバックグラウンドの荷電量（Ｙ）を求めたうえで、これらの荷電量の差（Ｘ−Ｙ）を、粒子１ｇ当たりのカルボキシル基量とした。
【００８１】
１．４．１．２．２．アミノ基量の定量
粒子５ｍｇ分（固形分）をチューブに取り、上清を除去した後、Ｎ−スクシンイミジル３−（２ピリジルジチオ）プロピオナート（同仁化学製）の１００ｍＭメタノール溶液１ｍｌを加え、２５℃で６０分反応させる。メタノールを用いて粒子を２回洗浄後、炭酸緩衝溶液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）とメタノールの１：１混合溶液に溶解させたジチオスレイトール溶液（２０ｍＭ、１ｍＬ）を加え、室温で３０分、還元反応させる。その後、この還元反応によって遊離したピリジン２−チオンの量を、紫外可視分光光度計を用いて定量し、この遊離したピリジン２−チオンの量を、粒子上にあったアミノ基の量に相当するとした。粒子１ｇ当たりの量に換算し、これをアミノ基量とした。なお、ピリジン２−チオンの定量においては、波長３４３nmにおける吸光度を測定し、モル吸光係数εには８０８０を用いる。
【００８２】
１．４．１．２．３．トシル基（ｐ−トルエンスルホニル基）量の定量
粒子５ｍｇ分（固形分）をチューブに取り、上清を除去した後、１０％トリス水溶液１ｍｌを加え、攪拌条件下、７０℃で１６時間反応させる。反応後、遠心分離または磁気分離を行い、上清に遊離したｐ−トルエンスルホン酸の量を、紫外可視分光光度計を用いて定量し、この遊離したｐ−トルエンスルホン酸の量を、粒子上にあったトシル基の量に相当するとした。粒子１ｇ当たりの量に換算し、これをトシル基量とした。なお、ｐ−トルエンスルホン酸の定量においては、波長２６１nmにおける吸光度を測定し、モル吸光係数εには３８０を用いる。
【００８３】
１．５．用途
本実施形態に係る有機ポリマー粒子のうち、カルボキシル基またはアミノ基が導入された粒子によれば、実際に使用するに当たり、プローブと該粒子とを混合したうえで、水溶性カルボジイミドなどの公知の活性化剤により、該粒子またはプローブ上のカルボキシル基を活性化させることにより、該粒子の表面にプローブを化学的に結合させることができる。
【００８４】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子のうち、トシル基導入粒子によれば、実際に使用するに当たり、プローブと該粒子とを混合させるだけで、該粒子の表面にプローブを化学的に結合させることができる。
【００８５】
プローブを該粒子の表面に結合させた後、過剰のプローブを洗浄し、必要に応じて未反応の活性基を不活化する。不活化剤として、エタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下「トリス」という。）などの水酸基を含有する不活化剤を使用するのが好ましい。以降は、粒子を用いた通常の工程に移行すればよい。
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、プローブ結合用の粒子担体として好適に使用することができる。
【００８６】
２．プローブ結合粒子およびその製造方法
本発明の一実施形態に係るプローブ結合粒子の製造方法は、例えば、活性官能基としてカルボキシル基、アミノ基、およびトシル基の群からなる少なくとも１つの基を有する前記有機ポリマー粒子の表面に、プローブを化学結合を介して導入する工程を含む。
【００８７】
２．１．カルボキシル基またはアミノ基を有する有機ポリマー粒子へのプローブの導入
カルボキシル基またはアミノ基を有する有機ポリマー粒子へ、プローブを化学結合を介して導入する反応としては、例えば、前記有機ポリマー粒子上にプローブを物理的に吸着させた後、適当な活性化剤で粒子とプローブ間に化学結合を形成させる方法が挙げられる。適当な活性化剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートが挙げられる。
【００８８】
プローブを導入する具体的な方法としては、例えば、カルボキシル基またはアミノ基を有する有機ポリマー粒子の水分散体に、プローブを添加した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を加えて、２〜８０℃で１〜２４時間攪拌する方法が挙げられる。
【００８９】
２．２．トシル基を有する有機ポリマー粒子へのプローブの導入
トシル基を有する有機ポリマー粒子へ、プローブを化学結合を介して導入する反応としては、例えば、トシル基を有する有機ポリマー粒子の水分散体に、プローブを添加し、２〜８０℃で１〜７２時間攪拌する方法が挙げられる。
【００９０】
２．３．後処理、保存
本実施形態に係るプローブ結合粒子は、通常、プローブの導入工程の後、過剰のプローブを洗浄し、必要に応じて未反応の活性基を不活化した後に、水系溶媒を加えて分散させることにより得られる。不活化剤としては、エタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどの水酸基を含有する不活化剤を使用することが好ましい。
なお、プローブ結合粒子を生化学物質の分離用途で使用する場合には、該粒子の表面に、アルブミン、スキムミルク、カゼインなどのタンパク質でのブロッキングは不要である。
本実施形態に係るプローブ結合粒子は、通常、水系分散体として保存される。
【００９１】
２．４．用途
本実施形態に係るプローブ結合粒子は、生化学分野、医薬品分野における、生化学物質の濃縮、精製、分離のためのアフィニティー担体として好適に使用することができ、極めて高い純度で標的とする生化学物質、あるいは、この生化学物質を含む複合体を、濃縮、精製、分離することができる。分離物質は、既知物質、未知物質のいずれであってもよい。
本実施形態に係るプローブ結合粒子を用いた生化学物質の濃縮、精製、分離は、マイクロチューブなどの容器内で行うことができ、また、カラムクロマトグラフィーに充填し、アフィニティーカラムとして使用することもできる。
本実施形態に係るプローブ結合粒子のうち、磁性体を含有するものは、磁石を用いた磁気分離が可能であるため、生化学物質の濃縮、精製、分離工程を、簡便な手法で実施できる。また、本工程を自動化または半自動化することもできる。
本実施形態に係るプローブ結合粒子は、生物学的試料の中から、特定の細胞を分離する用途、特定のタンパク質を分離する用途、特定の核酸を分離する用途、タンパク質−タンパク質複合体、ＤＮＡ−転写因子の複合体などを分離する用途などに好適に使用することができる。また、これらの分離物質は、生化学物質の機能解析などに役立てることができる。
また、本実施形態に係るプローブ結合粒子は、免疫検査用途にも好適に使用することができる。
【００９２】
本実施形態に係るプローブ結合用粒子において、プローブの捕捉対象となる物質は、生物学的試料に含まれる生化学物質、化学物質、生物、およびこれらの複合体である。プローブがこれらを捕捉することにより、これらを分離または検査することができる。
【００９３】
分離または検査対象となる生化学物質は特に限定されないが、例えば、タンパク質（例えば、酵素、抗体、アプタマー、受容体など）、ペプチド（例えばグルタチオンなど）、核酸（例えば、ＤＮＡやＲＮＡなど）、糖質、脂質、ホルモン（例えば、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インシュリン、グルカゴン、成長ホルモンなど）、およびその他の細胞または物質（例えば、血小板、赤血球、白血球などの各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞や、ウイルス・細菌・真菌・原虫・寄生虫などの構成要素であるタンパク質や核酸）が挙げられる。タンパク質としては、より具体的には、生体由来のタンパク質、前立腺特異マーカー、膀胱ガンマーカーなどの各種ガンのマーカーとなるタンパク質、あるいは転写因子などが挙げられる。
【００９４】
分離または検査対象となる化学物質は特に限定されないが、例えば、医薬品（例えば、抗生物質、抗がん剤、抗てんかん剤など）、ダイオキシン類などの環境汚染物質などが挙げられる。
【００９５】
分離または検査対象となる生物は特に限定されないが、例えば、各種癌細胞、各種浮遊細胞、ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルスなど）、細菌（例えば、淋菌、ＭＲＳＡ、大腸菌など）、真菌（例えば、カンジダ、白癬菌、クリプトコックス、アルペルギルスなど）、原虫・寄生虫（例えば、トキソプラズマ、マラリアなど）などが挙げられる。
【００９６】
本実施形態に係るプローブ結合用粒子に担持することができるプローブとしては、プローブ結合用粒子が有する官能基の少なくとも１つと反応しうる官能基を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、抗体、抗原、核酸、ペプチド核酸、ホルモン、分子量５００〜１００万のタンパク質、糖鎖、多糖類、細胞、アプタマー、ウイルス、酵素、各種のアフィニティー用タグ捕捉物質、ビオチンなどの補酵素、特定の生理活性作用を有する（あるいは、特定の生理活性作用を有する可能性がある）化学物質などを使用することができる。
【００９７】
プローブとして担持する抗原または抗体としては、生物学的試料の中に一般に含まれている成分に反応するものであれば特に制限されないが、例えば、生化学的研究用の抗原または抗体、免疫診断用の抗原または抗体などが挙げられる。また、抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。
生化学的研究用の抗体の例としては、抗プロテアソーム抗体、抗Ａｋｔ-1抗体、抗ＡＵＦ1抗体、抗Ｃａｓｐａｓｅ３抗体、抗Ｃａｓｐａｓｅ６抗体、抗ｃｄｋ２抗体、抗ＣＲＥＢ抗体、抗Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１抗体、抗Ｄ４−ＧＤＩ抗体、抗ＦＡＫ抗体、抗ＦＲＡ−１抗体、抗ＧＳＫ３β抗体、抗ＨＤＡＣ１抗体、抗Ｊａｋ２抗体、抗ＭＥＫ１抗体、抗Ｍｉｂ１抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、抗Ｎｒｆ抗体、抗Ｐａｘｉｌｌｉｎ抗体、抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ抗体、抗ＰＬＣ−γ１抗体、抗ＰＰ２Ａ抗体などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
免疫診断用の抗原または抗体の例としては、アンチプラスミン検査用抗アンチプラスミン抗体、Ｄダイマー検査用抗Ｄダイマー抗体、ＦＤＰ検査用抗ＦＤＰ抗体、ｔＰＡ検査用抗ｔＰＡ抗体、ＴＡＴ検査用抗トロンビン＝アンチトロンビン複合体抗体、ＦＰＡ検査用抗ＦＰＡ抗体などの凝固線溶関連検査用抗原または抗体；ＢＦＰ検査用抗ＢＦＰ抗体、ＣＥＡ検査用抗ＣＥＡ抗体、ＡＦＰ検査用抗ＡＦＰ抗体、フェリチン検査用抗フェリチン抗体、ＣＡ１９−９検査用抗ＣＡ１９−９抗体などの腫瘍関連検査用抗原または抗体；アポリポタンパク検査用抗アポリポタンパク抗体、β２−ミクロブロブリン検査用抗β２−ミクロブロブリン抗体、α１−ミクログロブリン検査用抗α１―ミクログロブリン抗体、免疫グロブリン検査用抗免疫グロブリン抗体、ＣＲＰ検査用抗ＣＲＰ抗体などの血清蛋白関連検査用抗原または抗体；ＨＣＧ検査用抗ＨＣＧ抗体などの内分泌機能検査用抗原または抗体；ＨＢｓ抗原検査用抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗体検査用ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体検査用ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ−１抗体用ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗体検査用ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ−１検査用ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ症検査用マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ検査用トキソプラズマ抗原、ＡＳＯ検査用ストレプトリジンＯ抗原などの感染症関連検査用抗原または抗体；抗ＤＮＡ抗体検査用ＤＮＡ抗原、ＲＦ検査用熱変成ヒトＩｇＧなど自己免疫関連検査用抗原または抗体；ジゴキシン検査用抗ジゴキシン抗体、リドカイン検査用抗リドカイン抗体などの薬物分析用抗原または抗体などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
また、本実施形態に係るプローブ結合用粒子に担持することができるプローブとしては、酵素・ホルモンなどのタンパク質、ＤＮＡ・ＲＮＡなどの核酸、脂質、あるいは生理活性糖鎖化合物を挙げることができ、粒子表面に化学結合法で結合させてアフィニティー担体として利用することができる。さらに、本実施形態に係るプローブ結合用粒子に、解析対象の化学物質（被解析化学物質；リガンド分子に該当する）を化学結合により固定化し、被解析化学物質と特異的な相互作用を有するタンパク質など（ターゲット分子に該当する）を分離し、精製することが可能である。
【０１００】
３．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、各実施例および比較例において、評価は以下の方法で行った。
【０１０１】
３．１．評価方法
３．１．１．粒子径
レーザ回折式粒度分布測定装置（（株）島津製作所製）ＳＡＬＤ−２００Ｖにより、粒子の数平均粒子径を測定し、これを粒子の粒子径とした。
【０１０２】
３．１．２．粒子の表面積
粒子を水で洗浄後、乾燥させた後、ガス吸着量測定装置（ユアサ  アイオニクス（(株)）製）ＡＵＴＯＳＯＲＢ−１−ＭＰ  により、この乾燥粒子の比表面積を測定し、これを粒子１ｇ当たりの表面積とした。
【０１０３】
３．１．３．粒子上の活性官能基量
３．１．３．１．カルボキシル基量の定量
粒子１ｇ（固形分）を含む水分散体を用いて、特開平１０−２７０２３３号公報に記載された電導度滴定によって、この粒子の見かけの表面荷電量（Ｘ）を求め、さらに、分散媒（水）のみを用いた同様の測定でバックグラウンドの荷電量（Ｙ）を求めたうえで、これらの荷電量の差（Ｘ−Ｙ）を、粒子１ｇ当たりのカルボキシル基量とした。
【０１０４】
３．１．３．２．アミノ基量の定量
粒子５ｍｇ分（固形分）をチューブに取り、上清を除去した後、Ｎ−スクシンイミジル３−（２ピリジルジチオ）プロピオナート（同仁化学製）の１００ｍＭメタノール溶液１ｍｌを加え、２５℃で６０分反応させた。メタノールを用いて粒子を２回洗浄後、炭酸緩衝溶液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）とメタノールの１：１混合溶液に溶解させたジチオスレイトール溶液（２０ｍＭ、１ｍＬ）を加え、室温で３０分、還元反応させた。その後、この還元反応によって遊離したピリジン２−チオンの量を、紫外可視分光光度計を用いて定量した。この遊離したピリジン２−チオンの量が、粒子上にあったアミノ基の量に相当するとした。粒子１ｇ当たりの量に換算し、これをアミノ基量とした。なお、ピリジン２−チオンの定量においては、波長３４３nmにおける吸光度を測定し、モル吸光係数εには８０８０を用いた。
【０１０５】
３．１．３．３．ｐ−トルエンスルホニル基（トシル基）量の定量
粒子５ｍｇ分（固形分）をチューブに取り、上清を除去した後、１０％トリス水溶液１ｍｌを加え、攪拌条件下、７０℃で１６時間反応させた。反応後、遠心分離または磁気分離を行い、上清に遊離したｐ−トルエンスルホン酸の量を、紫外可視分光光度計を用いて定量した。この遊離したｐ−トルエンスルホン酸の量が、粒子上にあったトシル基の量に相当するとした。粒子１ｇ当たりの量に換算し、これをトシル基量とした。なお、ｐ−トルエンスルホン酸の定量においては、波長２６１nmにおける吸光度を測定し、モル吸光係数εには３８０を用いた。
【０１０６】
３．１．４．パーキングエリア
パーキングエリアは、次の式（１）を用いて算出した。計算で必要となる比表面積、活性官能基量に関しては、前記の測定法で求めた値を用いた。
2010260877.tif 000003
・・・式（１）
【０１０７】
３．１．５．プローブ結合粒子の性能
プローブ結合粒子の特異的捕捉の程度、および非特異的吸着の程度については、下記に示す方法で評価を行った。本評価は、細胞破砕液中に含まれる２０Ｓプロテアソームを標的としたモデル実験である。
【０１０８】
３．１．５．１．特異的捕捉の程度
プローブが固定化された粒子の１重量％分散液５０μＬをチューブに取り、遠心分離または磁気分離にて上澄みを除去した。これに、標的物質である蛋白質（２０Ｓプロテアソーム）を含むことが確認されているＪｕｒｋａｔ細胞破砕液２０μｌを注ぎ、さらにタッチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた後、常温にて２時間振盪させた。続いて、遠心分離または磁気分離にて上澄みを除去し、０．０５％非イオン性界面活性剤ＮＰ４０を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  １ｍｌを注いでタッチミキサーで前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに２回繰り返した後、内容物を別の未使用のチューブに移し、遠心分離または磁気分離にて上澄みを除去した。引き続きこのチューブに抽出液として０．５％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２５μｌを注いでタッチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。１０分間放置した後、遠心分離または磁気分離を行い、上澄み２０μｌを採取した（抽出工程）。バイオラッド社製プレミックスサンプルバッファー中での濃度が２ｗｔ％になるように２−メルカプトエタノールを溶解させ、このうち２０μｌをチューブに採取した。これに上記抽出工程で採取した上澄み２０μｌを混ぜ、チューブヒーターにて９５℃で５分間加熱した。バイオラッド社製縦型電気泳動システム「ミニプロティアン３」、バイオラッド社製プレキャストポリアクリルアミドゲル「レディーゲルＪ（１２．５％）」、およびバイオラッド社製プレミックス泳動バッファーを用いて、ゲル１レーンあたり１０μｌをアプライし、電気泳動を行った。染色はバイオラッド社製シルバーステインプラスキットを用いて標準的な手法で行った。染色されたゲルはバイオラッド社製デンシトメーター「ＧＳ−７００」でスキャンして画像化した。
染色されたゲルの画像において、２０Ｓプロテアソームのサブユニットを構成する蛋白質に相当する分子量３１ｋ付近の数本のバンドが明瞭に確認された場合を「良好」、不明瞭であるが確認された場合を「やや良好」、それ以外を「不良」とした。
【０１０９】
３．１．５．２．非特異的吸着の程度
上記の特異的捕捉についての評価で得られたゲルの画像で、分子量３１ｋ付近以外にバンドがほとんど確認されない場合を「良好」、不明瞭であるが確認された場合を「やや良好」、それ以外を「不良」とした。
【０１１０】
３．２．合成例
３．２．１．合成例１  有機ポリマー粒子の作製
３．２．１．１．母粒子の作製
７５％ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（日本油脂製「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、以下、「パーロイル」という。）２質量部を１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒子径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３質量部および水４１質量部の入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間攪拌した。別の容器でメチルメタクリレート（以下、「ＭＭＡ」という。）９５質量部およびトリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）５質量部を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００質量部に乳化し、前記リアクターに入れ、４０℃で２時間攪拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。これを母粒子Ａ−１とする。粒子径は１．５μｍであった。
【０１１１】
３．２．１．２．グリシジル基を有するポリマー層の形成
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、母粒子Ａ−１  ２２ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液１００ｇに、ＭＭＡ１８ｇ、ＴＭＰ２ｇ、およびパーロイル０．４ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。
【０１１２】
滴下終了後、６０℃に保持して１時間攪拌した後、別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液７５ｇに、グリシジルメタクリレート１０．５ｇ、ＴＭＰ１．５ｇ、およびパーロイル０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温し、さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。
【０１１３】
次いで、遠心分離により前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、蒸留水を用いて洗浄した。以上の工程により、グリシジル基を有するポリマー層が形成された有機ポリマー粒子Ａ−２（粒子径：２．２μｍ）を得た。
【０１１４】
３．２．２．合成例２  磁性体含有ポリマー粒子の作製
３．２．２．１．母粒子の作製（磁性体層の形成）
油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。
【０１１５】
母粒子Ａ−１  １５ｇおよび上記疎水化された超常磁性微粒子２０ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、超常磁性微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子Ａ−３（粒子径：１．７μｍ）を得た。
【０１１６】
３．２．２．２．グリシジル基を有するポリマー層の形成
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、母粒子Ａ−３  １５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液１００ｇに、ＭＭＡ１８ｇ、ＴＭＰ２ｇ、およびパーロイル０．４ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。
【０１１７】
滴下終了後、６０℃に保持して１時間攪拌した後、別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液７５ｇに、グリシジルメタクリレート１０．５ｇ、ＴＭＰ１．５ｇ、およびパーロイル０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温し、さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。
【０１１８】
次いで、磁気を用いて前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、蒸留水を用いて洗浄した。以上の工程により、グリシジル基を有するポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−４（粒子径：２．７μｍ）を得た。
【０１１９】
３．２．３．  活性官能基を有するポリマー粒子の作製
３．２．３．１．  合成例３  カルボキシル基を有するポリマー粒子（Ｐ−１）の作製
グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された有機ポリマー粒子Ａ−２の水分散液から遠心分離して単離した粒子１．０ｇに、１％硫酸水溶液１０ｇを加え、間接超音波を２０分間照射して分散させ、次いで、６０℃で５時間攪拌した（グリシジル基の加水分解）。
【０１２０】
続いて、遠心分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ洗浄する操作を５回繰り返し、さらに乾燥させ、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するポリマー粒子Ａ−５を得た。この乾燥粒子Ａ−５  １．５ｇを１０ｍｌのピリジンで洗浄してから、１０ｍｌのピリジンに４０ｍｇの無水コハク酸を溶解した溶液を加え、室温で４時間撹拌した（カルボキシル基の導入）。
【０１２１】
反応後、遠心分離により前記粒子を単離し、アセトンで３回、続いて蒸留水で４回洗浄してから蒸留水に分散させて、１．０ｇのカルボキシル基を有するポリマー粒子Ｐ−１を含む１％分散液を得た。粒子径は２．２μｍ、比表面積は２．６ｍ２／ｇ、カルボキシル基量は９μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは４８Å２であった。
【０１２２】
３．２．３．２．  合成例４  カルボキシル基を有する磁性粒子（Ｃ−１）の作製
グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−４の水分散液から磁気分離して単離した粒子１．０ｇに、１％硫酸水溶液１０ｇを加え、間接超音波を２０分間照射して分散させ、次いで、６０℃で５時間攪拌した（グリシジル基の加水分解）。
【０１２３】
続いて、磁気分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ洗浄する操作を５回繰り返し、さらに乾燥させ、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する磁性粒子Ａ−６を得た。この乾燥粒子Ａ−６  １．０ｇを１０ｍｌのピリジンで洗浄してから、１０ｍｌのピリジンに２ｍｇの無水コハク酸を溶解した溶液を加え、室温で４時間撹拌した（カルボキシル基の導入）。
【０１２４】
反応後、磁気分離により前記粒子を単離し、アセトンで３回、続いて蒸留水で４回洗浄してから蒸留水に分散させて、１．０ｇのカルボキシル基を有するポリマー粒子Ｃ−１を含む１％分散液を得た。粒子径は２．７μｍ、比表面積は１．６ｍ２／ｇ、カルボキシル基量は０．５μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは５３１Å２であった。
【０１２５】
３．２．３．３．  合成例５  カルボキシル基を有する磁性粒子（Ｃ−２）の作製
無水コハク酸量が１２ｍｇであること以外は、合成例４記載のＣ−１の作製法と同様にして、１．０ｇのカルボキシル基を有するポリマー粒子Ｃ−２を含む１％分散液を得た。粒子径は２．７μｍ、比表面積は１．６ｍ２／ｇ、カルボキシル基量は３μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは８９Å２であった。
【０１２６】
３．２．３．３．  合成例６  カルボキシル基を有する磁性粒子（Ｃ−３）の作製
無水コハク酸量が２５ｍｇであること以外は、合成例４記載のＣ−１の作製法と同様にして、１．０ｇのカルボキシル基を有するポリマー粒子Ｃ−３を含む１％分散液を得た。粒子径は２．７μｍ、比表面積は１．６ｍ２／ｇ、カルボキシル基量は６μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは４４Å２であった。
【０１２７】
３．２．３．４．  合成例７  カルボキシル基を有する磁性粒子（Ｃ−４）の作製
無水コハク酸量が４０ｍｇであること以外は、合成例４記載のＣ−１の作製法と同様にして、１．０ｇのカルボキシル基を有するポリマー粒子Ｃ−４を含む１％分散液を得た。粒子径は２．７μｍ、比表面積は１．６ｍ２／ｇ、カルボキシル基量は１０μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは２７Å２であった。
【０１２８】
３．２．３．８．  合成例８  アミノ基を有する磁性粒子（Ｍ−１）の作製
グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−４の水分散液から磁気分離によって単離した粒子をアセトンに分散させ、磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、前記粒子を再びアセトンに分散させ、磁気分離により上清を除去した後、該粒子を乾燥させた。次に、該粒子０．５０ｇを１００ｍｌフラスコに入れ、エチレンジアミン２５ｇを加えた後、間接超音波を２０分間照射して分散させてから、窒素雰囲気下で５０℃にて３時間加熱攪拌した（アミノ基の導入）。
【０１２９】
冷却後、磁気分離により前記粒子を単離し、該粒子を蒸留水に分散させ、磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、磁気分離により上清を除去し、次に、１％硫酸水溶液５ｇに該粒子を加え、間接超音波を２０分間照射して分散させ、次いで、６０℃で５時間攪拌した（残留グリシジル基の加水分解）。
【０１３０】
続いて、磁気分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、蒸留水に分散させて、０．４９ｇのアミノ基を有する磁性粒子Ｍ−１を含む１％分散液を得た。粒子径は２．８μｍ、比表面積は１．７ｍ２／ｇ、アミノ基量は６μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは４７Å２であった。
【０１３１】
３．２．３．９．  合成例９  トシル基を有する磁性粒子（Ｔ−１）の作製
２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する磁性粒子Ａ−６  １．０ｇを８ｍｌのピリジンに分散させた後、ｐ−トシルクロライド１５ｍｇを加えて室温で２時間攪拌した。反応後、磁気分離によって粒子を単離し、アセトンで４回、蒸留水で４回洗浄した後、蒸留水に分散させて、１．０ｇのトシルル基を有するポリマー粒子Ｔ−１を含む１％分散液を得た。粒子径は２．７μｍ、比表面積は１．７ｍ２／ｇ、トシル基量は５μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは５６Å２であった。
【０１３２】
３．３．  比較合成例
３．３．１．  活性官能基のパーキングエリアが本発明の範囲外の粒子の作製
３．３．１．１．  比較合成例１  カルボキシル基を有する磁性粒子（Ｃ−５）の作製
無水コハク酸量が７０ｍｇであること以外は、合成例４記載のＣ−１の作製法と同様にして、１．０ｇのカルボキシル基を有するポリマー粒子Ｃ−５を含む１％分散液を得た。粒子径は２．７μｍ、比表面積は１．６ｍ２／ｇ、カルボキシル基量は１７μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは１６Å２であった。
【０１３３】
３．３．１．２．  比較合成例２  カルボキシル基を有する磁性粒子（Ｃ−６）の作製
無水コハク酸量が１００ｍｇであること以外は、合成例４記載のＣ−１の作製法と同様にして、１．０ｇのカルボキシル基を有するポリマー粒子Ｃ−６を含む１％分散液を得た。粒子径は２．７μｍ、比表面積は１．６ｍ２／ｇ、カルボキシル基量は２５μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは１１Å２であった。
【０１３４】
３．３．１．３．  比較合成例３  カルボキシル基を有する磁性粒子（Ｃ−７）の作製
無水コハク酸量が２５０ｍｇであること以外は、合成例４記載のＣ−１の作製法と同様にして、１．０ｇのカルボキシル基を有するポリマー粒子Ｃ−７を含む１％分散液を得た。粒子径は２．７μｍ、比表面積は１．６ｍ２／ｇ、カルボキシル基量は３６μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは７Å２であった。
【０１３５】
３．３．２．  比較合成例４  親水性官能基を含有しない磁性粒子（Ｄ−１）の作製
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、磁性体層を表面に有する母粒子Ａ−３  １５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液１００ｇに、スチレン１５ｇ、メタクリル酸４ｇ、およびパーロイル０．８ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに２時間かけて滴下した。
滴下終了後、７５℃に昇温し、さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。
【０１３６】
次いで、磁気を用いて前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、蒸留水を用いて洗浄した。その後、蒸留水に分散させることにより、活性官能基としてカルボキシル基を含有し、かつ親水性官能基を含有しない磁性粒子Ｄ−１を含む１％分散液を得た。粒子径は２．２μｍ、比表面積は２．２ｍ２／ｇ、カルボキシル基量は１５μｍｏｌ／ｇであり、パーキングエリアは２４Å２であった。
【０１３７】
３．３．実施例
３．３．１．実施例１
カルボキシル基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが５３１Å２であるＣ−１粒子の１％分散液５０μｌをチューブに取り、磁気分離により上澄みを除去した。５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６（以下、「Ｂｕｆｆｅｒ−１」という。）にて３回洗浄後、１００μｌのＢｕｆｆｅｒ−１に分散し、これに標的物質である２０Ｓプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質（抗２０Ｓプロテアソームα６・マウスＩｇＧ抗体）の溶液（濃度：５ｍｇ／ｍＬ）を５μｌ添加し、さらに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド５０μｇを加え撹拌した後、室温下２時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離により上澄みを除去した。次いで、０．０５％非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液（以下、「ＴＢＳ−Ｔ」という。）  １００μｌを加え、室温で３０分間撹拌を行った。さらに、ＴＢＳ−Ｔにて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液で前記粒子を分散させて、プローブ結合粒子を含む１％分散液を得た。
このプローブ結合粒子の性能を評価方法に記載の手順で評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図１のとおりであり、特異的捕捉の程度は「良好」でかつ非特異吸着の程度は「良好」であった。
【０１３８】
３．３．２．実施例２
カルボキシル基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが８９Å２のＣ−２粒子を用いたこと以外は、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図１のとおりであり、特異的捕捉の程度は「良好」でかつ非特異吸着の程度は「良好」であった。
【０１３９】
３．３．３．実施例３
カルボキシル基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが４４Å２のＣ−３粒子を用いたこと以外は、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図１および図２のとおりであり、特異的捕捉の程度は「良好」でかつ非特異吸着の程度は「良好」であった。
【０１４０】
３．３．４．実施例４
カルボキシル基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが２７Å２のＣ−４粒子を用いたこと以外は、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図１のとおりであり、特異的捕捉の程度は「やや良好」でかつ非特異吸着の程度は「やや良好」であった。
【０１４１】
３．３．５．実施例５
アミノ基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが４７Å２のＭ−１粒子を用いたこと以外は、カルボキシル基粒子と同様、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図２のとおりであり、特異的捕捉の程度は「良好」でかつ非特異吸着の程度は「良好」であった。
【０１４２】
３．３．６．実施例６
トシル基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが５６Å２のＴ−１粒子の１％分散液５０μｌをチューブに取り、磁気分離により上澄みを除去した後、１００μｌのｐＨ９．５のホウ酸緩衝液に分散させた。これに標的物質である２０Ｓプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質（抗２０Ｓプロテアソームα６・マウスＩｇＧ抗体）５μｇを添加し、３７℃で１６時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離により上澄みを除去した。次いで、ＴＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液で前記粒子を分散させて、プローブ結合粒子Ｔ−１ａを含む１％分散液を得た。
このプローブ結合粒子の性能を評価方法に記載の手順で評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図２のとおりであり、特異的捕捉の程度は「良好」でかつ非特異吸着の程度は「良好」であった。
【０１４３】
３．３．７．実施例７
カルボキシル基を有する非磁性のポリマー粒子として４８Å２のＰ−１粒子を用いたこと、および粒子の分離に遠心分離を用いたこと以外は、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図２のとおりであり、特異的捕捉の程度は「良好」でかつ非特異吸着の程度は「良好」であった。
【０１４４】
３．４．比較例
３．４．１．比較例１．パーキングエリアが発明の範囲外の磁性粒子（１）
カルボキシル基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが１６Å２のＣ−５粒子を用いたこと以外は、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図１のとおりであり、特異的捕捉の程度は「不良」でかつ非特異吸着の程度は「不良」であった。
【０１４５】
３．４．２．比較例２．パーキングエリアが発明の範囲外の磁性粒子（２）
カルボキシル基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが１１Å２のＣ−６粒子を用いたこと以外は、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図１のとおりであり、特異的捕捉の程度は「不良」でかつ非特異吸着の程度は「不良」であった。
【０１４６】
３．４．３．比較例３．パーキングエリアが発明の範囲外の磁性粒子（３）
カルボキシル基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが７Å２のＣ−７粒子を用いたこと以外は、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図１のとおりであり、特異的捕捉の程度は「不良」でかつ非特異吸着の程度は「不良」であった。
【０１４７】
３．４．４．比較例４．親水性官能基を含有しない磁性粒子
パーキングエリアが２４Å２のカルボキシル基を有する磁性粒子であって、親水性の官能基を含有しないＤ−１粒子を用いたこと以外は、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図２のとおりであり、特異的捕捉の程度は「不良」でかつ非特異吸着の程度は「不良」であった。
【０１４８】
３．４．５．比較例５．パーキングエリアが発明の範囲外の磁性粒子（４）
カルボキシル基を有する磁性粒子としてパーキングエリアが３Å２の市販の磁性粒子（Ｄｙｎａｌ社製  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ、粒子径２．８μｍ、官能基量１５０μｍｏｌ／ｇ、比表面積２．６ｍ２／ｇ）を用いたこと以外は、実施例１記載の方法でプローブを結合させ、性能評価した。その結果得られた電気泳動の染色ゲルの画像は図２のとおりであり、特異的捕捉の程度は「不良」でかつ非特異吸着の程度は「不良」であった。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】実施例１〜４で得られたプローブ結合粒子の特異的捕捉の程度および非特異的吸着の程度を示す電気泳動パターンである。
【図２】実施例３、５〜７で得られたプローブ結合粒子の特異的捕捉の程度および非特異的吸着の程度を示す電気泳動パターンである。
【図１】
2010260877.tif 000004
【図２】
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