(57)【要約】【課題】操作性や効率が向上した核酸増幅方法を提供すること。【解決手段】  ウェルプレートを用いてＰＣＲにより増幅を行う核酸増幅方法であって、  （ｉ）複数のウェルを備えたウェルプレートであって、各ウェルにおいてウェル底面からウェル開口部に向かって延在する隆起部が少なくとも１つ形成されているウェルプレートを用意する工程、（ｉｉ）プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズの分散液をウェルプレートに供する工程、（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応液をウェルプレートに供する工程、および、（ｉｖ）鋳型核酸をウェルプレートに供する工程を含んで成り、工程（ｉｉ）において、マイクロビーズをウェルの各々に１個ずつ収容させることを特徴とする、核酸増幅方法。【選択図】図３３
2010110262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェルプレートを用いてＰＣＲにより増幅を行う核酸増幅方法であって、
（ｉ）複数のウェルを備えたウェルプレートであって、各ウェルにおいてウェル底面からウェル開口部に向かって延在する隆起部が少なくとも１つ形成されているウェルプレートを用意する工程、
（ｉｉ）プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズの分散液を前記ウェルプレートに供する工程、
（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応液を前記ウェルプレートに供する工程、および
（ｉｖ）鋳型核酸を前記ウェルプレートに供する工程
を含んで成り、
前記工程（ｉｉ）において、前記マイクロビーズを前記ウェルの各々に１個ずつ収容させることを特徴とする、核酸増幅方法。
【請求項２】
前記隆起部が前記ウェルの周縁部分の少なくとも一部と一体化していることを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記隆起部の水平方向断面が矩形状、台形状もしくはかまぼこ状となっていることを特徴とする、請求項２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記隆起部が前記ウェルの周縁部分に対して離隔していることを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
前記隆起部が、各ウェルにおけるマイクロビーズの収容空間を少なくとも部分的に取り囲むように設けられていることを特徴とする、請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
前記隆起部が各ウェルにおいて２〜８個設けられていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
前記ウェルの各々が、マイクロビーズの直径寸法Ｄよりも大きい幅寸法および深さ寸法を有していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
各ウェルの内部に１個のマイクロビーズとＰＣＲ反応液とを収容させており、
各ウェルでは、収容されているマイクロビーズの体積（Ｖｍ）に対するＰＣＲ反応液の体積（Ｖｐ）の比（Ｖｐ／Ｖｍ）が３〜１００となっていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
前記工程（ｉｉ）と前記工程（ｉｉｉ）とを同時に行うことを特徴としており、前記マイクロビーズと前記ＰＣＲ反応液とを混合して得られる分散液を前記ウェルプレートに供することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
前記工程（ｉｉｉ）と前記工程（ｉｖ）とを同時に行うことを特徴としており、前記鋳型核酸を含んで成る前記ＰＣＲ反応液を前記ウェルプレートに供することを特徴とする、請求項１〜９に記載の核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウェルプレートを用いた核酸増幅法に関する。より詳細には、本発明は、ＰＣＲにとって好適なウェル構造を備えたウェルプレートを用いた核酸増幅法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子等のＤＮＡ（デオキシリボ核酸、Deoxyribo Nucleic Acid） の増幅 は、遺伝子検査等において重要な技術であり、ＤＮＡポリメラーゼを利用したＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、polymerase chain reaction）による増幅法が知られている。かかるＰＣＲは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよび基質等を用いており、温度サイクルによってＤＮＡの変性、アニーリング及び伸長の反応を繰り返して行うことでＤＮＡを増幅する方法である（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
かかるＰＣＲ法は、通常、“ＰＣＲチューブ”や“マイクロウェルプレートのウェル”において行われる。具体的には、チューブ内またはウェル内において、「２本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ伸長反応のためのプライマーの１本鎖ＤＮＡへの結合、および、ＤＮＡ伸長反応」が温度を変えることで繰り返して行われる。これにより、核酸増幅反応が進行するので、ＰＣＲ産物が得られることになる。
【０００４】
ＤＮＡを断片化して各々の断片を増幅してビーズに固定する場合などには、エマルジョンＰＣＲ法が利用される。これはエマルジョン内において核酸増幅反応を行うものであり、理想的には１つのエマルジョン内に１つの鋳型ＤＮＡ断片と１つのビーズが入り、最終的に各ビーズには各々１種類の増幅されたＤＮＡ断片が固定されることになる。これにより、各々のＤＮＡ断片について塩基配列解析等が可能になる。
【特許文献１】特公平４−６７９５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のＰＣＲは、必ずしも満足のいくものではなく、操作効率の向上などが望まれている。例えば、マイクロビーズがエマルジョンに供される際、あるエマルジョンでは１個のマイクロビーズしか収納されないのに対して、別のエマルジョンでは２個や３個のマイクロビーズが収納される可能性がある。かかる場合、各エマルジョンにおけるＰＣＲ産物が複数のマイクロビーズに分配されて１ビーズあたりのＤＮＡ結合量が減って測定感度が不足したりすることがあった。また、エマルジョンＰＣＲにおいては、マイクロビーズの比重が大きいと、マイクロビーズが重力によって下方へと引かれるために、安定したエマルジョンを得ることができない。更に、１個のエマルジョン中に１個のマイクロビーズを入れる制御や、エマルジョン・サイズの制御など、ハンドリングの向上が望まれている。
【０００６】
本発明はかかる事情に鑑みて為されたものである。即ち、本発明の課題は、操作性や効率の点で好ましい核酸増幅方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明は、ウェルプレートを用いて行う核酸増幅方法であって、
（ｉ）複数のウェルを備えたウェルプレートであって、各ウェルにおいてウェル底面からウェル開口部に向かって延在する隆起部が少なくとも１つ形成されているウェルプレートを用意する工程、
（ｉｉ）「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズの分散液」をウェルプレートに供する工程、
（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応液（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、２種類のプライマー、ｄＮＴＰ、緩衝液などを含んで成り、場合によってはプライマーや鋳型核酸なども含んで成る液体）をウェルプレートに供する工程、および
（ｉｖ）鋳型核酸（目的核酸）をウェルプレートに供する工程
を含んで成り、
工程（ｉｉ）において、マイクロビーズをウェルの各々に１個ずつ収容させることを特徴とする、核酸増幅方法を提供する。工程（ｉｖ）の後では、（１）核酸の１本鎖への変性、（２）１本鎖核酸とプライマーとのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼによる核酸の伸長反応といった３段階の反応を、加熱温度を変化させて繰り返し行う。その結果、所望量の核酸が増幅されることになる。
【０００８】
本発明は、各ウェルに対してマイクロビーズを１個ずつ収容させることを特徴としている。つまり、本発明の核酸増幅法では、マイクロビーズとＰＣＲ反応液量と比がいずれのウェルにおいても実質的に一定となっている。その結果、工程（ｉｉ）の後に実施するＰＣＲは、複数のウェル間でバラツキなく行うことができる。
【０００９】
本明細書において「隆起部」とは、各ウェルにてＰＣＲ反応液の収容を許容しつつも、マイクロビーズが所望個数（即ち、１個）収まることになるように機能するウェル内部形状ないしはウェル内部構造を実質的に意味している。つまり、「隆起部」が各ウェルに収容されるマイクロビーズの個数を制限していると考えることができるので、本発明にいう「隆起部」は「収容制限部」または「個数制限部」と称することもできる。
【００１０】
本明細書において「ウェルプレート」とは、一般にメディカルサイエンス分野やバイオサイエンス分野等で計測または検査等の用途に用いられる「複数の“くぼみ”を有するデバイスまたは部材」を意味しており、その全体的な外観形態は「プレート状」に限定されるものでなく、その形態や厚さによっては「シート状」または「チップ状」となり得るものである。ちなみに、「ウェルプレート」は、その有する形態などに応じて、マイクロウェルプレート、マイクロプレート、ディープウェルプレート、シャローウェルプレート、マルチウェルプレートまたはマイクロタイタープレート等とも呼ばれるものである。また、ウェルプレートに対して蓋を設けたり、ウェルプレート同士を積層したりしてもよく、その際にそれらの間にスペーサー等を介してもよい。さらに他の部材を付加的に組み合わせてもよい。尚、本明細書において「マイクロビーズ」とは、同じくメディカルサイエンス分野やバイオサイエンス分野等でウェルプレートと共に用いられるビーズのことを指しており、例えば、セファロース、アガロース、合成ポリマー、シリカ、アルミナ、酸化ジルコニウム、イットリウム添加酸化ジルコニウム、または酸化鉄等の材質から成る直径１μｍ〜５ｍｍ程度の粒子である。尚、本発明においてはビーズをウェルに入れるため、遠心操作なしで自重でウェルに入る比重の高いビーズがより好ましく、例えばアルミナ、酸化ジルコニウム、イットリウム添加酸化ジルコニウム、または酸化鉄等の材質から成る粒子が好ましい。  
【００１１】
更に、本明細書でいう「マイクロ」とは、隆起部などの構造物の寸法がミクロン〜ミリメートルのオーダー（１μｍ〜数十ｍｍ程度）であること、または、ウェルプレート全体がミリメートル〜センチメートルのオーダー（１ｍｍ〜数十ｃｍ程度）であることを実質的に意味している。
【００１２】
ある好適な態様において、隆起部は、各々のウェルの周縁部分の少なくとも一部と一体化した形態を有している。つまり、隆起部はウェルの側壁（内壁）と陸続きとなった“半島”の形態を有している。また、別のある好適な態様では、隆起部は、各々のウェルの周縁部分に対して離隔した形態を有している。つまり、隆起部はウェルの側壁（内壁）から陸続きとなっていない独立した“島状”または“ピラー（柱）”の形態を有している。
【００１３】
本発明に用いるウェルプレートは、ウェルの各々が、マイクロビーズの直径寸法Ｄよりも大きい幅寸法および深さ寸法を有している。従って、ウェルにマイクロビーズが収容されたとしてもウェル内にＰＣＲ反応液をある程度収容することができる。ここで、本発明では、各ウェル内に１個のマイクロビーズとＰＣＲ反応液とを共に収容させることになるが、各ウェルでは、マイクロビーズの体積（Ｖｍ）に対するＰＣＲ反応液の体積（Ｖｐ）の比（Ｖｐ／Ｖｍ）が好ましくは３〜１００、より好ましくは９〜３０となっている。
【００１４】
隆起部がウェルの周縁部分の少なくとも一部と一体化した形態を有する場合、本発明のウェルプレートは、「ウェルの側壁の一部が変形した形態で構成されているデバイス」とみなすことができる。このように隆起部がウェルの周縁部分と一体化した形態を有する場合、隆起部の水平方向断面が矩形状、正方形、台形状あるいはかまぼこ状となっていることが好ましい。つまり、隆起部がウェル周縁部分から“堤防”のように突き出た形態を有していることが好ましい。尚、隆起部の形状は、被収容物を制限するものであれば特に制限はない。例えば、隆起部の水平方向断面が多角形状、丸形状もしくは楕円形状などであってもよく、あるいは、上記の“矩形状の水平方向断面”のコーナー（角部）が丸みを帯びていてもよい。
【００１５】
また、隆起部がウェルの周縁部分に対して離隔した形態を有する場合では、隆起部は、各ウェル内においてマイクロビーズの収容空間を少なくとも部分的に取り囲むように設けられていることが好ましい。つまり、隆起部が、円周方向に沿って整列していることが好ましい。また、隆起部がウェルの周縁部分に対して離隔した形態となっている場合、隆起部とウェル周縁部分との間に形成されている間隙の寸法が、螺旋方向に沿うようにウェルの周縁部分から中央へと向かうにつれて、徐々に広くなっていることが好ましい。つまり、ウェル内の空間部又は溝部の幅は、ウェル中央へと集束するにつれて徐々に広くなるようになっていることが好ましい。これにより、マイクロビーズがウェルの中央部へと容易に導かれることになり、マイクロビーズの確実な収容が促進される。
【００１６】
隆起部がウェル周縁部分と一体化した形態となっているか、あるいは、ウェル周縁部分に対して離隔した形態となっているかに拘わらず、マイクロビーズのウェルへの収容が促進されることになるように、隆起部は種々の形態を有していてよい。例えば、「プレートにおいてウェルを成していない非ウェル面」と「隆起部の上面」とが非面一となっていてよい。特に、隆起部の上面の高さが“非ウェル面”よりも低くなっていることが好ましい。
【００１７】
また、マイクロビーズがウェルへと収容され易くなるように、隆起部の高さが、ウェル周縁部分から中央へと向かって徐々に低くなっていてもよく、それに加えて又はそれとは別に、隆起部の上面が水平面に対して一定の方向（例えば円周方向）に傾いた傾斜面を成していてもよい。即ち、隆起部の上面又は頂面がテーパー状に形成されていてよい。
【００１８】
ある好適な態様では、ウェルの各々に対して隆起部が２〜１０個（例えば２〜８個）形成されている。各ウェルに隆起部が複数設けられている場合、マイクロビーズのウェルへの収容が促進されるように、各ウェルでは円周方向に沿って隆起部の高さが順次変化するようになっていてよい。つまり、各ウェルでは隆起部の各々の高さがそれぞれ異なっていてよい。
【００１９】
尚、工程（ｉｉ）および／または工程（ｉｉｉ）および／または工程（ｉｖ）においてマイクロビーズの分散液および／またはＰＣＲ反応液および／または鋳型核酸がウェルに容易に流れ込むことになるように、ウェルおよび／または非ウェル面が親水性を有していることが好ましい。つまり、ウェルプレートに“親水性”を施すことが好ましい。ウェルプレートに対して親水性を施すために、ＵＶ処理、ＵＶオゾン処理、プラズマ処理、親水性有機物コート処理、親水性基コート処理または金属薄膜コート処理を行ってよい。このように親水化処理すると、付加的な効果として、マイクロビーズの分散液、ＰＣＲ反応液や鋳型核酸液から気泡が抜けやすくなったり、あるいは、核酸や蛋白がウェルプレート面に吸着しにくくなったりする点でも有利である。
【００２０】
ある好適な態様では、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）とを実質的に同時に行う。具体的には、「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」とＰＣＲ反応液とを混合して得られる分散液をウェルプレートに供し、それによって、マイクロビーズを各ウェルに１個ずつ収容させると共に、マイクロビーズを分散させているＰＣＲ反応液も各ウェルに収容させる。また別のある好適な態様では、工程（ｉｉｉ）と工程（ｉｖ）とを実質的に同時に行う。具体的には、鋳型核酸とＰＣＲ反応液とを混ぜることで得られる混合液（即ち、鋳型核酸を含んで成るＰＣＲ反応液）をウェルプレートに供する。また、更に別のある好適な態様では、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）と工程（ｉｖ）とを実質的に同時に行う。具体的には、「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」とＰＣＲ反応液とを混合して得られる分散液に対して鋳型核酸を添加し、それによって得られる分散液をウェルプレートに供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の核酸増幅法に用いるウェルプレートは、必要とされる量のＰＣＲ反応液を収容しつつ、各ウェルに所定の個数（即ち、１個）のマイクロビーズを収容することができる。具体的には、工程（ｉｉ）では「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズの分散液」をウェルプレート（特に、複数のウェルが形成されている面）に供するが、その際に、“隆起部”の働きによって各々のウェルにマイクロビーズを１個ずつ収容することができる。本発明では、各ウェルにマイクロビーズが１個ずつ収容されるにも拘わらず、その各ウェルには適量のＰＣＲ反応液も収容される点で有益である。つまり、従来技術のウェルにおいてマイクロビーズを１個収容するためには、ウェルのサイズを小さくしなければならず必然的にＰＣＲ反応液の収容量も減じられる結果となっていたものの、本発明ではマイクロビーズを１個ずつ収容しつつもＰＣＲ反応液の収容量が不必要に減じられていない点で特に有利な効果が奏されている。ある好適な態様では、ＰＣＲ反応液は各ウェルの内部領域全体を自由に往来することができる。
【００２２】
本発明の核酸増幅法に用いるウェルプレートは、隆起部の作用によってマイクロビーズが１個ずつウェルに収容されるように制限している。かかる隆起部が過度に作用しすぎないように（即ち、マイクロビーズがウェルに入っていかないといった不都合を防止するために）、隆起部の形態はウェルの中央へとマイクロビーズを導くことができるようになっている。
【００２３】
このように、本発明では、どのウェルであっても１個のマイクロビーズとＰＣＲ反応液とを相対的に等しく収容させることができるので、マイクロビーズの体積に対するＰＣＲ反応液の体積の比がウェル間で一定となり得る。その結果、ウェルプレートに設けられた複数のウェル間でバラツキなくＤＮＡ断片やＲＮＡを増幅でき、高い信頼性、高い収量を有するＰＣＲを実現できる。特に、本発明ではウェルおよび隆起部のそれぞれについて好適な形態を適宜採用することによって、各ウェルにおけるＰＣＲ反応液の収容量を自由に変更することができる。その結果、１個のウェル内に１個のマイクロビーズを入れる制御が容易となり、また、反応液の容量の制御なども容易となる。つまり、ハンドリング性が向上し、かつ、自動化も容易に行うことが可能である。
【００２４】
更に、例えば比重の重いマイクロビーズ（ジルコニアビーズなど）をＰＣＲチューブに仕込んで、同様に核酸増幅法を実施する場合では、マイクロビーズが沈殿・集積してしまいＰＣＲの効率が低下してしまう虞があるものの、本発明の核酸増幅法では、比重の重いマイクロビーズであっても、それぞれ個々に分かれて各ウェルに１個ずつ収容されるので、ＰＣＲの確実な実施に供し得る。また、従来技術においてマイクロビーズの比重が大きいと、マイクロビーズが重力によって下方へと引かれるために、安定したエマルジョンを得にくかったものの、本発明では、重力によってウェルの底方向に引かれるために容易にウェルにビーズが入るので好ましい（かかる本発明の場合では、エマルジョンＰＣＲを行わなくてもウェルがエマルジョンの代わりとして機能し得る。つまり、ウェルの中にてエマルジョンＰＣＲを行わなくて済む）。マイクロビーズ（より具体的には「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」）の密度は３．５ｇ／ｃｍ３以上が好ましく、例えばアルミナ、酸化ジルコニウム、イットリウム添加酸化ジルコニウム、または酸化鉄等の材質から成る粒子が好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下では、図面を参照して本発明をより詳細に説明する。まず、本発明の核酸増幅法に用いるウェルプレートについて説明を行い、その後、本発明の各工程などの説明を行う。
【００２６】
《本発明で用いるウェルプレートの一般的な特徴》
本発明の核酸増幅方法に用いるウェルプレート１００は、図１に示すように、プレート状部材５０に複数のウェル３０が形成されて成り、ウェルの各内部には隆起部２５が形成されている。かかる隆起部２５は、ウェル３０の各々にＰＣＲ反応液を収容しつつ、ウェル３０の各々にマイクロビーズを１個ずつ収容するように機能する。かかるウェルプレート１００は、ウェルの容量について使用目的に応じて自由に設計可能となっていると共に、そのウェルにはマイクロビーズが目的とする個数しか入らないように制御している。このようなウェルプレート１００は、各ウェルにおいてマイクロビーズを仕込んでＰＣＲ反応を行うことができることから、「ＰＣＲを複数並列して行うための反応容器集合体」とみなすことができる。
【００２７】
ウェルプレート１００の材質（即ち、プレート状部材５０の材質）は、特に制限されるわけではないが、シクロオレフィン樹脂(ノルボルネン樹脂)、シクロオレフィン共重合体樹脂、ポリカーボネート、アモルファスポリオレフィン、ポリジメチルシロキサン、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、アクリロニトリル樹脂、ブタジエン樹脂、スチレン樹脂、アクリル樹脂、ポリアミド、ポリアセタール、変性ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンスルファイド、ポリスルホン、ポリエーテルサルフォン、非晶ポリアリレート、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトンおよびポアミドイミドから成る群から選択される少なくとも１種以上のポリマーであってよい。また、ウェルプレート１００の材質は、シリコンあるいはガラスであってもよい。ウェルプレートの寸法は、特に制限されるわけではないが、一例を挙げるとすると図１に示すような長さ（Ｌ、Ｈ、Ｗ）は、Ｌ＝５〜３００ｍｍ、Ｈ＝０．２〜５０ｍｍ、Ｗ＝１０〜３００ｍｍ程度であり得る。ウェルの幅寸法および深さ寸法は、マイクロビーズの直径寸法Ｄよりも大きい寸法を有していることが好ましく、それによって、ＰＣＲ反応液を各ウェルに適量収容できるようになっている。一例を挙げるとすると、ウェルの幅寸法ｗは０．０５μｍ〜２０ｍｍ程度であって、ウェルの深さ寸法ｈは０．０１μｍ〜１０ｍｍ程度であってよい（図１参照）。尚、ウェルの幅寸法および深さ寸法は大きくなればＰＣＲ反応液量が増えるので好ましい場合が多いといえるものの、移動距離が大きくなることに起因して必要成分が反応が生じる部分に到達できなかったり、必要成分の量が反応に必要十分とされる量を超えてしまうことに起因して不要な反応液コストを要することになる。このため、ウェルおよび隆起部の形態にもよるが、ウェルの幅寸法および深さ寸法の下限としては、約１０Ｄ以下が好ましいといえ、約５Ｄ以下が更に好ましい（Ｄ：マイクロビーズの平均サイズ）。ちなみに、振動等に付すことによって効率的な攪拌が可能である場合には、必要成分を広範囲に移動させることが可能となるため、更に大きな幅寸法および深さ寸法のウェルであってもよい。
【００２８】
ウェルプレート１００に設けられているウェルの個数は、特に制限されるわけではないが、好ましくは２５００〜１億個、より好ましくは１万〜５千万個、更に好ましくは５万〜１千万個である。尚、ウェルの開口部分の形状は、特に制限はなく、円形、楕円形、多角形（例えば、四角形または六角形）などであってよい。
【００２９】
ウェルプレート１００は、本発明の工程（ｉｉ）において、マイクロビーズの分散液と共に用いられる。具体的には、ウェルプレートのウェルが設けられている面に対して、「プライマーが固定可能な表面処理が施されたマイクロビーズの分散液（例えば水分散液）」を供すことによって、ウェルの各々にマイクロビーズを収容させる。かかる収容に際しては、マイクロビーズの自重に起因した沈降作用を利用してよいものの、必要に応じて振揺に付したり、あるいは遠心処理に付したりしてもよい。
【００３０】
隆起部２５は、各ウェルの内部に設けられている。特に、隆起部２５はウェルの内部空間の一部を占めるように設けられている。かかる隆起部２５によって、ウェルの各内部には「マイクロビーズの収容空間」と「ＰＣＲ反応液の収容空間」とが形成される。「マイクロビーズの収容空間」は、１個のマイクロビーズを収容できるサイズまたは形状を有しているものの、２個以上のマイクロビーズの収容は許容しないサイズまたは形状を有している。換言すれば、隆起部２５は、１個のマイクロビーズが収容されるようにウェルの内部空間を部分的に制限しているといえる。
【００３１】
隆起部２５は、例えば、図２（ａ）および（ｂ）に示すように、ウェル周縁部分（またはウェル開口部の縁）の少なくとも一部と一体化した形態を有しており、ウェルの周縁部分から突き出るように延在している。また、隆起部２５は、例えば、図３（ａ）および（ｂ）または図５（ａ）および（ｂ）に示すように、ウェル周縁部分に対して離隔した形態を有していてもよい。
【００３２】
隆起部２５がウェル周縁部分から延在している場合、隆起部２５は、例えば図２（ｂ）に示すように、ウェルの側壁（内壁）と陸続きとなった“半島”の形態を有している。換言すれば、ウェルは、その中央部を避けて周縁部分から一体型の半島が突き出たような壁状構造を有しているといえる。
【００３３】
図２（ａ）および（ｂ）に示されるように、マイクロビーズの収容空間３０ａの周囲にはＰＣＲ反応液の収容空間３０ｂが形成されている。一般的に、粒子と液体とから成る分散液がウェルプレート１００に供された場合では、粒子は重力沈降などに起因してウェル内部へと収納されることになるが、ウェル内部には隆起部２５が存在しているので、それを避けるようにして粒子がウェル内へと導かれることになる。粒子がウェルに入っていくと共に、粒子を分散させている液体もウェルに入っていく。本発明では、工程（ｉｉ）において、「マイクロビーズの分散液（例えば水分散液）」をウェルプレートに供して、マイクロビーズを各々のウェルに収容させており、その際に分散媒たる液体Ａ（例えば、水）もウェルに収容されることになる。ここで、ウェルに収容された液体Ａを一旦除去した後、あるいは、液体Ａをウェル内にある程度残した状態で、引き続いて、工程（ｉｉｉ）でＰＣＲ反応液をウェルプレートに供することによって、各々のウェルにＰＣＲ反応液を収容する。尚、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）とを実質的に同時に実施する場合（即ち、ＰＣＲ反応液中にマイクロビーズを分散させて成る分散液をウェルプレートに供する場合）では、マイクロビーズがウェルに入っていくと共に、マイクロビーズを分散させているＰＣＲ反応液もウェルに入っていくことになる。このようにして、マイクロビーズの収容空間以外のウェル内部がＰＣＲ反応液で満たされることになる。図２（ｂ）に示す態様から分かるように、各ウェルの内部においては、比較的多くのＰＣＲ反応液が収容されることになり、好ましくはＰＣＲ反応液が各ウェルの内部にて比較的に自由に流動できるようになっている（かかる観点からＰＣＲ反応液の収容空間３０ｂを「流路」と称することもできる）。このように、ウェルプレートでは、増幅反応で用いられるＰＣＲ反応液を各ウェルに適量収容できるようになっている。尚、収容されるマイクロビーズを１個に制限しつつＰＣＲ反応液の収容空間３０ｂをある程度多く確保する観点から、隆起部２５は、図２（ｂ）に図示するように直方体形状を有していることが好ましい。つまり、隆起部２５の断面は図２（ａ）に示すように矩形状を有していることが好ましい。
【００３４】
隆起部２５がウェル周縁部分（またはウェル開口部の縁）から離隔した形態を有している場合では、隆起部２５は、例えば図３（ａ）および（ｂ）に示すように、ウェルの側壁（内壁）から独立した“ピラー（柱）”の形態を有していてよい。好ましくは、図３（ｂ）に示すように、マイクロビーズの収容空間３０ａを少なくとも部分的に取り囲むように隆起部２５が設けられる。かかる場合、マイクロビーズの収容空間３０ａの周囲にＰＣＲ反応液の収容空間３０ｂが形成されることになる。一般的に、粒子と液体とから成る分散液がウェルプレートに供された場合、粒子は重力沈降などに起因してウェル内部へと収納されることになるが、ウェル内部には隆起部２５が存在しているので、その内側へと粒子が収容されることになる（図４参照）。粒子がウェル内に入っていくと共に、液体もウェル内に入っていく。本発明では、上述したように、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を経ることによって、各ウェルでは、マイクロビーズが占める空間以外のウェル内部空間がＰＣＲ反応液で満たされることになる。図３（ｂ）に示す態様から理解できるように、ＰＣＲ反応液が各ウェルの内部において適量確保されることになり、好ましくはＰＣＲ反応液がウェルの内部で比較的に自由に流動できるようになっている。換言するならば、図示するように「ピラー状の隆起部」と「ウェル周縁部分」との間に形成される空隙は外周部で連結した構造となっているので、ウェル内に収容されたＰＣＲ反応液はウェル内の空間全体を自由に往来できるようになっている。図２に示した“半島”形態の隆起部２５と比較すると、図３に示すような “ピラー（柱）”形態の隆起部２５では、ＰＣＲ反応液のウェル収容量を一般的にはより多くできる。
【００３５】
各ウェルにおける隆起部２５の個数は、特に“１個”に限定されるわけではなく、２〜１２個程度であってもよく、好ましくは２〜１０個程度、更に好ましくは２〜８個程度（例えば２〜６個）であってもよい。各ウェルにおいて隆起部２５の個数が増すと、マイクロビーズの収容にとって好ましい形態を適宜採用できるので、用途に応じたウェルの自由な設計が可能となる（例えば、一旦収容されたマイクロビーズがウェルから飛び出さないような設計も可能となる）。一般的には、隆起部２５の個数が増すと、隆起部２５が占める体積に起因してＰＣＲ反応液のウェル収容量が減じられることになるものの、“ＰＣＲ反応液の液溜め空間”を別途設けることによって（例えば、後述する図１１の態様を参照のこと）、ＰＣＲ反応液の収容量の減少を回避できる。
【００３６】
隆起部２５がウェル周縁部分から離隔した形態を有している場合、隆起部２５は、例えば図５（ａ）および（ｂ）に示すように、ウェルの側壁（内壁）から独立した“島状”または“孤島状”の形態を有していてもよい。特に、隆起部とウェル周縁部分との間に形成された間隙Ｃの寸法が、螺旋方向に沿うようにウェル周縁部分からウェル中央へと向かうにつれて、徐々に広くなっていることが好ましい。これにより、間隙Ｃにより形成される“溝”がウェル周縁部分からウェル中央に向かって連続した継ぎ目のない構造となるので、より効率的にマイクロビーズをウェル中央へと誘導できる。かかる態様であっても、各々のウェルにおいて、マイクロビーズの収容空間３０ａの周囲にはＰＣＲ反応液の収容空間３０ｂが形成されている。従って、一般的に、粒子と液体とから成る分散液がウェルプレートに供された場合、粒子は、中央へと向かうにつれて徐々に広くなる間隙Ｃに沿って外側からウェルの中央へと収容され得る。粒子がウェル内に入っていくと共に、液体もウェル内に入っていくことになり、最終的に、粒子の収容空間以外のウェルの内部が液体で満たされることになる。本発明では、上述したように、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を経ることによって、マイクロビーズ（ウェルに収容されているマイクロビーズが占める空間）以外のウェル内部の空間がＰＣＲ反応液で満たされることになる。図５（ｂ）に示す態様から理解できるように、ＰＣＲ反応液がウェルの内部において適量確保され、好ましくはＰＣＲ反応液がウェル内で比較的に自由に流動できるようになっている。換言するならば、図示するように「島状の隆起部」と「ウェル周縁部分」との間に形成される空隙が外周部で連結した構造となっていることに起因して、ウェル内に収容されたＰＣＲ反応液がウェル内の空間全体を自由に往来できるようになっている。特に、島状の隆起部は、鉛直方向上向きに幅寸法が小さくなるテーパー形状を好ましくは有しているので、ウェル内でのＰＣＲ反応液が特に流動し易くなっている。図２に示した“半島状”の隆起部２５と比較すると、図５に示すような “島状”または“孤島状”の隆起部２５では、ＰＣＲ反応液のウェル収容量を一般的により多くすることができる。
【００３７】
尚、隆起部２５がウェル周縁部分から離隔した形態を有している場合、「プレートにおいてウェルを成していない非ウェル面」と「隆起部の上面」とが非面一となっていてよい。特に、隆起部の上面の高さが“非ウェル面”よりも低くなっていることが好ましい。これにより、本発明で用いるウェルプレートでは、マイクロビーズの収容が促進されるといった効果が奏されることになる。例えば、隆起部の上面が“非ウェル面” よりも０（０を含まず）〜０．４Ｄμｍ程度低く、より好ましくは０．０５Ｄ〜０．３Ｄ程度低くなっていることが好ましい（但し、Ｄは被収容物Ａの直径寸法）。
【００３８】
“隆起部”の態様としては、その他に種々の形態が考えられる。以下それについて詳述する。
【００３９】
（半島を２つ備えた形態）
各ウェルに隆起部が２つ形成された態様を図６（ａ）および（ｂ）ならびに図７（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様は、いわゆる“半島”が２つ形成された態様である。つまり、２つの隆起部がウェル周縁部分からそれぞれ中央に向かって延在している。特に、図示するように、相互に対称的な位置関係となるように２つの隆起部が設けられている。図６（ａ）および（ｂ）に示す態様では、隆起部２５の延在方向が放射方向からずれており、２つの隆起部とウェル周縁部とによって、マイクロビーズが捕捉されることになる。図７（ａ）および（ｂ）に示す態様では、２つの隆起部２５がウェルの放射方向に沿って延在しており、かかる２つの隆起部によって両側からマイクロビーズが捕捉される。
【００４０】
図６（ａ）および６（ｂ）に示す態様では、収容されたマイクロビーズが３点（ｅ点、ｆ点、ｇ点）で捕捉される形態となるので、ウェル内部においてマイクロビーズの移動が効果的に防止でき、ひいては、収容されたマイクロビーズ（特に比重の小さいマイクロビーズ）がウェルから容易に飛び出しにくいといった点で有利な効果が奏され得る。また、図７（ａ）および７（ｂ）に示す態様では、隆起部２５でもって両側から均等にマイクロビーズを捕捉するので、マイクロビーズをよりウェル中央にて収容することができ、ひいては、ビーズ表面のいずれの箇所においても等しく核酸増幅を行うことができるといった有利な効果が奏され得る。
【００４１】
（半島を５つ備えた形態）
各ウェルに隆起部が５つ形成された態様を図８（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様は、いわゆる“半島”が５つ形成された態様である。つまり、５つの隆起部がウェル周縁部分からそれぞれ中央に向かって延在している。特に、図示するように、放射方向に沿って５つの隆起部２５が設けられている。図示する態様から分かるように、５つの隆起部でもって５点でマイクロビーズが捕捉される。５点で捕捉されるので、ウェル内部でのマイクロビーズの移動を効果的に防止でき、ひいては、収容されたマイクロビーズ（特に比重の小さいマイクロビーズ）がウェルから容易に飛び出しにくいといった有利な効果が奏され得る。
【００４２】
（半島を６つ備えた形態）
各ウェルに隆起部が６つ形成された態様を図９（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様は、いわゆる“半島”が６つ形成された態様である。つまり、６つの隆起部がウェル周縁部分からそれぞれ中央に向かって延在している。特に、図示するように、放射方向に沿って６つの隆起部が設けられている。図示する態様から分かるように、６つの隆起部でもって６点でマイクロビーズが捕捉される。６点で捕捉されるので、ウェル内部でのマイクロビーズの移動が効果的に防止でき、ひいては、収容されたマイクロビーズがウェルから容易に飛び出しにくいといった有利な効果が奏され得る。尚、各ウェルに隆起部が６つ形成された態様としては、図１０（ａ）および（ｂ）に示すような態様も考えられる。この態様は、図９における「隆起部」と「ＰＣＲ反応液の収容部」とを相互に入れ替えたものに相当しており、もたらされる機能・効果などは図９の場合と同様である。また、後述で触れるが、このような６つの隆起部の上面を円周方向および／または中央方向（放射方向）に沿って傾斜するように設けることによって、マイクロビーズをウェル内部へと容易に導くことができる。
【００４３】
（液溜まりを備えた形態）
隆起部に隣接して“液溜まり”が設けられた態様を図１１（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様では、“半島”に相当する部分は、図面において符号２５ａで示される領域であって、“液溜まり”は図面において符号３０ｂ’で示される領域である。かかる態様では、マイクロビーズの周囲に比較的多量のＰＣＲ反応液を収容することができる。したがって、隆起部に隣接して“液溜まり”が設けられた態様は、マイクロビーズ１個当たりに多くのＰＣＲ反応液を必要とする核酸増幅に特に適した態様であるといえる。
【００４４】
（中央方向に傾斜した半島を備えた形態）
「ウェルの中央に向かって傾斜している隆起部」が設けられた態様を図１２に示す。図示する態様は、“半島”が６つ形成されている態様であり、特に、各々の隆起部２５が、ウェル中央に向かって低くなるテーパー面を有していることを特徴としている。つまり、隆起部の高さが、ウェル周縁部分からウェル中央に向かって徐々に低くなっている。かかる態様では、マイクロビーズがウェル周縁領域に供された際、重力沈降などに起因して隆起部の上面を滑り落ちるようにマイクロビーズが移動し得るため、マイクロビーズがウェルの内部へと収容され易い。つまり、図１２に示すような隆起部を有する態様では、マイクロビーズの収容率が向上することが期待される。水平面に対する隆起部（上面）の傾斜角度は、好ましくは約１０°以上であり、より好ましくは約２０°以上であり、更に好ましくは約３０°以上である（尚、傾斜角度０°では、隆起部が傾斜しておらず、隆起部の上面が水平となっている状態を指している）。かかる傾斜角度の上限値としては特に制限は無いが、ウェル中央部の隆起部が機能できる範囲で、ウェルの周縁形状、ウェル深さ等の関係から適宜に選択される（尚、上限値は９０°を超えない数値となり得る）。例えば、傾斜角度の上限値としては、一旦収容されたマイクロビーズがウェルから飛び出さないように保持される観点で言えば４５°程度であることが好ましい。
【００４５】
（円周方向に傾斜した半島を備えた形態）
ウェルの円周方向に沿って傾斜している隆起部が設けられた態様を図１３に示す。図示する態様は、“半島”が６つ形成されている態様であり、特に、各々の隆起部２５が、円周方向（ウェルの中央を円中心した場合の円周方向）に沿って低くなるテーパー面を有していることを特徴としている。つまり、隆起部の上面２５Ａが、水平面に対して一定の方向に傾いた傾斜面を成している点で特徴を有している。かかる態様では、マイクロビーズがウェル周縁領域に供された際、重力沈降などに起因して隆起部の上面を滑り落ちるようにマイクロビーズが移動し得るため、マイクロビーズがウェルの内部へと収容され易い。つまり、図１３に示すような隆起部を有する態様では、マイクロビーズの収容率が向上することが期待される。水平面に対する傾斜面の角度は、好ましくは約１０°以上であり、より好ましくは約２０°以上であり、更に好ましくは約３０°以上である（尚、傾斜角度０°では、隆起部が傾斜しておらず、隆起部の上面が水平となっている状態を指している）。かかる傾斜面の角度の上限値としては特に制限は無いが、ウェル中央部の隆起部が機能できる範囲で、ウェルの周縁形状、ウェル深さ等の関係から適宜に選択される（尚、上限値は９０°を超えない数値となり得る）。例えば、傾斜面の角度の上限値としては、一旦収容されたマイクロビーズがウェルから飛び出さないように保持される観点で言えば４５°程度であることが好ましい。
【００４６】
（階段状の半島を備えた形態）
ウェルにおいて複数の隆起部の高さが段階状に異なる態様を図１４に示す。図示する態様は、“半島”が６つ形成されている態様であり、特に、円周方向に沿って設けられている複数の隆起部２５の高さが段階状に順次変化するようになっている。つまり、図示するように、各ウェルでは、円周方向に沿って順次変化するように隆起部の各々の高さがそれぞれ異なっている。かかる態様では、マイクロビーズがウェル周縁領域に供された際、重力沈降などに起因して“段階状の隆起部の上面”を滑り落ちるようにマイクロビーズが移動し得るため、マイクロビーズがウェル内へと収容され易い。つまり、図１４に示すような隆起部を有する態様では、マイクロビーズの収容率が向上することが期待される。段階状に順次変化する高さ（即ち、「ある隆起部の高さ」と「隣接する隆起部の高さ」との差）の下限は、マイクロビーズの直径寸法Ｄとした場合、概ね０．０５Ｄ以上が好ましい。その高さの差が０．０５Ｄ以下になると、マイクロビーズが段差に沿って順次移動しにくくなる。一方、段階状に順次変化する高さ（即ち、「ある隆起部の高さ」と「隣接する隆起部の高さ」との差）の上限は、隆起部の数ｎにより制限され、その値はＤ／ｎとなる。段階状に順次変化する高さが、Ｄ／ｎ以上となると、段階状に順次変化する隆起部の中で一番低い部分の高さが０となってしまい、隆起部の機能をはたさなくなる。
【００４７】
（螺旋状の半島を備えた形態）
螺旋形状の隆起部が設けられた態様を図１５（ａ）および（ｂ）に示す。図示する態様では、隆起部２５が渦巻き状に設けられており、隆起部の高さが周縁部分から中央へと向かうにつれて徐々に低くなっている。このように、隆起部の形態は、必ずしも直線状に延在する態様に限定されるものでなく、曲線状に延在する態様であってもよい。図１５（ａ）および（ｂ）に示す態様では、マイクロビーズがウェル周縁領域に供された際、重力沈降に起因して“螺旋形状の隆起部の上面”を滑り落ちるようにマイクロビーズが移動し得るため、マイクロビーズがウェル内へと収容され易い。つまり、図１５（ａ）および（ｂ）に示すような隆起部を有するウェルの態様では、マイクロビーズの収容率が向上することが期待される。
【００４８】
（ピラーを２つ備えた形態）
各ウェルに“ピラー状（柱状）”の隆起部が２つ形成された態様を図１６（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様は、図３に示すようなリング形状の隆起部に対して切欠き部分Ｐを更に１つ多く設けたものに相当する。図示するように、相互に対称的な位置関係となるように２つの隆起部２５ａ,２５ｂが設けられており、２つの隆起部が“収容されたマイクロビーズ”を取り囲むようになっている。かかる態様では、図３（ａ）および（ｂ）に示す態様と比べると、マイクロビーズの周囲に収容されたＰＣＲ反応液がより自由に往来できるようになっている。
【００４９】
（ピラーを３つ備えた形態）
各ウェルに“ピラー状（柱状）”の隆起部が３つ形成された態様を図１７（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様は、図３に示すようなリング形状の隆起部に対して切欠き部分Ｐを更に２つ多く設けたものに相当する。図示するように、相互に点対称な位置関係となるように３つの隆起部２５ａ,２５ｂ，２５ｃが設けられており、３つの隆起部が“収容されたマイクロビーズ”を取り囲むようになっている。かかる態様では、図３に示す態様と比べると、マイクロビーズの周囲に収容されたＰＣＲ反応液がより自由に往来できるようになっているといえる。
【００５０】
（ピラーを４つ備えた形態）
各ウェルに“ピラー状（柱状）”の隆起部が４つ形成された態様を図１８（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様は、図３に示すようなリング形状の隆起部に対して切欠き部分Ｐを更に３つ多く設けたものに相当する。図示するように、相互に点対称な位置関係となるように４つの隆起部２５ａ,２５ｂ，２５ｃ，２５ｄが設けられており、４つの隆起部が“収容されたマイクロビーズ”を取り囲むようになっている。かかる態様では、図３に示す態様と比べると、マイクロビーズの周囲に収容されたＰＣＲ反応液がより自由に往来できるようになっている。
【００５１】
（中央方向に傾斜したピラーを備えた形態）
「ウェルの中央に向かって傾斜しているピラー状の隆起部」が設けられた態様を図１９に示す。図示する態様は、“ピラー”が４つ形成されている態様であるが、特に、各々の“ピラー”が、ウェルの中央に向かって低くなるテーパー面を有していることを特徴としている。つまり、隆起部２５の高さは、ウェル周縁部分からウェル中央へと向かって徐々に低くなっている。かかる態様では、マイクロビーズがウェルの周縁領域に供された際、重力沈降などに起因して隆起部の上面を滑り落ちるようにマイクロビーズが移動し得るため、マイクロビーズがウェル内へと収容され易い。つまり、図１９に示すような隆起部を有する態様では、マイクロビーズの収容率が向上することが期待される。水平面に対する隆起部（上面）の傾斜角度は、好ましくは約１０°以上であり、より好ましくは約２０°以上であり、更に好ましくは約３０°以上である（尚、傾斜角度０°では、隆起部が傾斜しておらず、隆起部の上面が水平となっている状態を指している）。かかる傾斜角度の上限値としては特に制限は無いが、ウェル中央部の隆起部が機能できる範囲で、ウェルの周縁形状、ウェル深さ等の関係から適宜に選択される（尚、上限値は９０°を超えない数値となり得る）。例えば、傾斜角度の上限値としては、一旦収容されたマイクロビーズがウェルから飛び出さないように保持される観点で言えば４５°程度であることが好ましい。
【００５２】
（円周方向に傾斜したピラーを備えた形態）
ウェルの円周方向に沿って傾斜しているピラー状の隆起部が設けられた態様を図２０に示す。図示する態様は、“ピラー”が４つ形成されている態様であるが、特に、各々の“ピラー”が、ウェルの円周方向に沿って低くなるテーパー面を有していることを特徴としている。つまり、隆起部の上面２５Ａは、水平面に対して一定の方向に傾いた傾斜面を成している。かかる態様では、マイクロビーズがウェルの周縁領域に供された際、重力沈降などに起因して隆起部の上面を滑り落ちるようにマイクロビーズが移動し得るために、マイクロビーズがウェル内へと収容され易くなっている。つまり、図２０に示すような隆起部を有する態様では、マイクロビーズの収容率が向上することが期待される。水平面に対する傾斜面の角度は、好ましくは約１０°以上であり、より好ましくは約２０°以上であり、更に好ましくは約３０°以上である（尚、傾斜角度０°では、隆起部が傾斜しておらず、隆起部の上面が水平となっている状態を指している）。かかる傾斜面の角度の上限値としては特に制限は無いが、ウェル中央部の隆起部が機能できる範囲で、ウェルの周縁形状、ウェル深さ等の関係から適宜に選択される（尚、上限値は９０°を超えない数値となり得る）。例えば、傾斜面の角度の上限値としては、一旦収容されたマイクロビーズがウェルから飛び出さないように保持される観点で言えば４５°程度であることが好ましい。    
【００５３】
（階段状のピラーを備えた形態）
ウェルにおいて複数のピラー状隆起部の高さが段階状に異なる態様を図２１に示す。図示する態様は、“ピラー”が４つ形成されている態様であるが、特に、円周方向に沿って設けられた複数の“ピラー”の高さが段階状に順次変化するようになっている。つまり、図示するように、各ウェルでは、円周方向に沿って順次変化するように隆起部の各々の高さがそれぞれ異なっている。かかる態様では、マイクロビーズがウェルの周縁領域に供された際、重力沈降などに起因して“段階状の隆起部の上面”を滑り落ちるようにマイクロビーズが移動し得るため、マイクロビーズがウェル内へと収容され易い。つまり、図２１に示すような隆起部を有する態様では、マイクロビーズの収容率が向上することが期待される。段階状に順次変化する高さ（即ち、「ある隆起部の高さ」と「隣接する隆起部の高さ」との差）の下限は、マイクロビーズの直径寸法Ｄとした場合、概ね０．０５Ｄ以上が好ましい。その高さの差が０．０５Ｄ以下になると、マイクロビーズが段差に沿って順次移動しにくくなる。一方、段階状に順次変化する高さ（即ち、「ある隆起部の高さ」と「隣接する隆起部の高さ」との差）の上限は、隆起部の数ｎにより制限され、その値はＤ／ｎとなる。段階状に順次変化する高さが、Ｄ／ｎ以上となると、段階状に順次変化する隆起部の中で一番低い部分の高さが０となってしまい、隆起部の機能をはたさなくなる。
【００５４】
（螺旋状のピラーを備えた形態）
螺旋形状の“ピラー”が設けられた態様を図２２（ａ）および（ｂ）に示す。図示する態様では、“ピラー”が渦巻き状に設けられており、隆起部の高さが周縁部分から中央へと向かうにつれて徐々に低くなっている。かかる態様では、マイクロビーズがウェルの周縁領域に供された際、重力沈降などに起因して“螺旋形状の隆起部２５の上面”を滑り落ちるようにマイクロビーズが移動し得るため、マイクロビーズがウェル内へと収容され易い。つまり、図２２に示すような隆起部を有するウェルの態様では、マイクロビーズの収容率が向上することが期待される。
【００５５】
（円柱形状のピラーを備えた形態）
各ウェルに円柱形状の“ピラー”が４つ形成された態様を図２３（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様は、図１８に示した４つの隆起部の形状をそれぞれ円柱形状にしたものに相当する。図示するように、相互に点対称な位置関係となるように４つの隆起部２５ａ〜２５ｄが設けられており、４つの隆起部が“収容されたマイクロビーズ”を取り囲むようになっている。かかる態様では、図１８に示した態様と比べると、マイクロビーズの周囲に収容された液体がより自由に往来できるようになっているといえる。
【００５６】
（“島状”の隆起部を備えた形態−変更例１）
各ウェルに“島状”の隆起部が３つ形成された態様を図２４（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様の隆起部は、“ピラー”の場合と同様にウェル周縁部分から離隔した形態を有しているものの、“ピラー”ほどの幾何学的形状・角張った形状を有しておらず、その表面全体が滑らかになっている。かかる態様では、「隆起部」と「ウェル周縁部分」との間に形成された間隙Ｃの寸法が、螺旋方向に沿うようにウェル周縁部分から中央へと向かうにつれて、徐々に広くなっている。例えば、図示するように、間隙Ｃの寸法Ｇａ〜Ｇｆについて、ＧａよりＧｂの方が大きく、また、ＧｂよりＧｃの方が大きくなっている（以下、同様）。かかる態様においては、供されたマイクロビーズは、中央へと向かうにつれて徐々に広くなる間隙Ｃに沿って外側からウェル中央へと誘導されることになり得る。つまり、マイクロビーズがウェルの中央部へと容易に導かれるので、マイクロビーズの収容が促進されるといった有利な効果が奏され得る。
【００５７】
（“島状”の隆起部を備えた形態−変更例２）
各ウェルに“島状”の隆起部が４つ形成された態様を図２５（ａ）および（ｂ）に示す。かかる態様でも、図２４に示す態様と同様、「隆起部」と「ウェル周縁部分」との間に形成された間隙Ｃの寸法が、螺旋方向に沿うようにウェル周縁部分からウェル中央へと向かうにつれて、徐々に広くなっている。例えば、図示するように、間隙Ｃの寸法Ｇａ〜Ｇｆについて、ＧａよりＧｂの方が大きく、また、ＧｂよりＧｃの方が大きくなっている（以下、同様）。かかる態様でも、マイクロビーズが、中央へと向かうにつれて徐々に広くなる間隙Ｃに沿って外側からウェル内部へと誘導されることになり得る。つまり、マイクロビーズがウェルの中央部へと容易に導かれるので、マイクロビーズの収容が促進されるといった有利な効果が奏され得る。
【００５８】
（“島状”の隆起部を備えた形態−変更例３）
“島状”隆起部のその他の変更例を図２６〜図２８に示す。図示する“島状”の隆起部は、その有する効果の点では図２４および２５に示すものと同様であるものの、形状の点で相違がある。図２４および２５に示す隆起部２５は、あくまでもウェル周縁部分から離隔した形状を有しているものの、図２６〜図２８に示す隆起部２５は、その端部がウェル周縁部分と一体化している。かかる点で形状が異なるものの、図２６〜図２８に示す隆起部であっても、隆起部とウェル周縁部分との間に形成された間隙の寸法が、螺旋方向に沿うようにウェルの周縁部分から中央へと向かうにつれて、徐々に広くなっている点に留意されたい。つまり、マイクロビーズは、中央へと向かうにつれて徐々に広くなる間隙に沿って外側からウェル内部へと誘導され得る。
【００５９】
尚、図２６〜図２８に示すような島状の隆起部の場合、ウェルに形成される間隙（即ち“溝”）が外周部で連結していないものの、かかる間隙は上方に向かって広がるテーパー形状を有しているので、ウェル内のＰＣＲ反応液の移動は比較的容易となっている。
【００６０】
《各ウェルにおけるＰＣＲ反応液の容量》
ウェルプレートでは、ウェルの各々がマイクロビーズの直径寸法Ｄよりも大きい幅寸法および深さ寸法を有している。従って、ウェルにマイクロビーズが収容されたとしてもウェル内にＰＣＲ反応液をある程度収容することができる。ここで、本発明では、各ウェルの内部に１個のマイクロビーズとＰＣＲ反応液とを収容させることになるが、各ウェルでは、マイクロビーズの体積（Ｖｍ）に対するＰＣＲ反応液の体積（Ｖｐ）の割合（Ｖｐ／Ｖｍ）が好ましくは３〜１００、より好ましくは９〜３０、更に好ましくは１０〜３０となっている（一例を挙げるとすると、Ｖｐ／Ｖｍは８〜１０である）。換言すれば、各ウェルにマイクロビーズが１個ずつ収容されるにも拘わらず、その各ウェルにはある程度多くの量のＰＣＲ反応液が収容されることになるといえる。これについて詳述する。
【００６１】
（従来技術におけるＰＣＲ反応液の容量）−円柱形状ウェル
従来技術で見られるような円柱形状のウェル３０’を図２９（ａ）および（ｂ）に示す。ウェルに供されるマクロビーズ６０の直径をＤとする場合、図示するウェル直径寸法が２Ｄとなると、ウェル内にマイクロビーズは２つ入ってしまうことになる。そこでウェルの直径寸法をＤ以上かつ２Ｄ以下とすれば、ウェル内にマイクロビーズが２個収容されることはない。しかしながら、ここで、ウェルが実際には立体的な形状であることを考慮しなければならない。マイクロビーズの体積が半分以上ウェルに収容された状態では、マイクロビーズが容器から再び出ることは難しい（図３０参照）。このため２個目のマイクロビーズがウェル内に半分以上収容された状態を“不可”と見なせば、ウェルの直径は１．８６６Ｄ以下でなければならないことになる。かかる算出根拠は以下に示す。
【００６２】
「１．８６６Ｄ以下」の算出根拠について
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【００６３】
ここで、考えられる最小の円柱形状ウェルというのは、マイクロビーズの直径Ｄと同じ長さ寸法の底面直径および高さを有する円柱形状のウェル（即ち、図２９（ａ）および（ｂ）に示すようなウェル）である。かかる円柱形状ウェルの体積は、Ｄ３π／４である。この場合、収容されるマイクロビーズ（直径Ｄ）の体積Ｄ３π／６を考慮に入れると、ＰＣＲ反応液の容量は、ウェル体積とマイクロビーズ体積との差となるので（Ｄ３π／４−Ｄ３π／６）となる。つまり、マイクロビーズを１つ収容する場合に想定される最小のＰＣＲ反応液量は（Ｄ３π／４−Ｄ３π／６）であるといえる（以下では「最小液量」とも称す）。
【００６４】
図２９（ａ）および（ｂ）に示すような円柱形状のウェルの直径を、上記にて算出した１．８６６Ｄとした場合（即ち、マイクロビーズが２つ収容されないことを担保する最大径を想定した場合）、ＰＣＲ液量は、“（（１．８６６Ｄ）２・Ｄ・π−Ｄ３π／６）”となる（ここで凹部の深さは従来どおりＤとする）。上記の同じ深さの最小液量（Ｄ３π／４−Ｄ３π／６）とすれば、“（（１．８６６Ｄ）２・Ｄ・π−Ｄ３π／６）／（Ｄ３π／４−Ｄ３π／６）”となり８．４倍程度にしかならない。これは、従来技術の円柱形状ウェルでは、ＰＣＲ液量を確保しつつ１個のマイクロビーズしか入らないようにしたものは、ＰＣＲ液量が上記の最小液量の８．４倍程度しか有さないことを意味している。
【００６５】
（従来技術におけるＰＣＲ反応液の容量）−四角柱形状ウェル
従来技術で見られるような四角柱状のウェル３０’’を図３１（ａ）および（ｂ）に示す。ウェルに供されるマイクロビーズ６０の直径をＤとする場合、図示するウェル直径寸法が２Ｄとなると、ウェル内にマイクロビーズは２つ入ってしまうことになる。そこでウェルの１辺の長さをＤ以上かつ２Ｄ以下とすれば、ウェル内にマイクロビーズが２個収容されることはない。しかしながら、上述の「円柱形状ウェル」の場合と同様、ウェルが実際には立体的な形状であることを考慮しなければならない。マイクロビーズの体積が半分以上ウェルに収容された状態では、マイクロビーズが容器から再び出ることは難しい（図３２参照）。このため２個目のマイクロビーズがウェル内に半分以上収容された状態を“不可”と見なせば、ウェルの１辺の長さは、マイクロビーズの直径Ｄに対して１．６１Ｄ以下でなければならないことになる（算出過程は上述の「円柱形状ウェル」の場合と同様となり得るので重複を避けるために省略する）。
【００６６】
ここで、考えられる最小の四角柱形状ウェルというのは、マイクロビーズの直径Ｄと同じ長さ寸法の底面幅および高さを有する四角柱形状ウェル（即ち、図３１（ａ）および（ｂ）に示すようなウェル）である。かかる四角柱形状ウェルの体積は、Ｄ３である。この場合、収容されるマイクロビーズ（直径Ｄ）の体積Ｄ３π／６を考慮に入れると、ウェルに収容されるＰＣＲ反応液量は（Ｄ３−Ｄ３π／６）となる。つまり、マイクロビーズを１つ収容する場合に想定される最小のＰＣＲ反応液量は（Ｄ３−Ｄ３π／６）であるといえる。
【００６７】
図３１（ａ）および（ｂ）に示すような四角柱形状のウェルの１辺の長さを、上記にて算出した１．６１Ｄとした場合（即ち、マイクロビーズが２つ収容されないことを担保する最大径を想定した場合）、ＰＣＲ反応液量は、一辺が（１．６１Ｄ）の正方形を底面とした、高さＤの立方体、つまり（１．６１Ｄ）２・Ｄからマイクロビーズ分の体積“Ｄ３π／６”を引いた値になる。これは（２．５９２１Ｄ３−Ｄ３π／６）であり、上記の最小液量（Ｄ３−Ｄ３π／６）で割れば、４．３倍程度の容量にしかならない。これは、従来技術の四角柱形状ウェルでは、ＰＣＲ反応液量を確保しつつ１個のマイクロビーズしか入らないようにしたものは、ＰＣＲ反応液量が上記の最小液量の４．３倍程度の容量しか有さないことを意味している。
【００６８】
（本発明における各ウェルでのＰＣＲ反応液量）−図２に示す態様のウェル
図２（ａ）および（ｂ）に示す態様の“隆起部”の寸法につき、長さ寸法ｍをＤとし、幅寸法ｎを０．２Ｄとした場合（ウェルの直径寸法：２Ｄ）、収容されるマイクロビーズ（直径Ｄ）の体積Ｄ３π／６を考慮すると、ＰＣＲ反応液量は、ウェルの体積（Ｄ３π）から、マイクロビーズの体積（Ｄ３π／６）および隆起部の体積約０．２Ｄ３を引いた値となる（隆起部の円弧部分の体積は微小なので考慮しない）。つまり、ＰＣＲ反応液量は上記最小液量の式で除する事で“（（Ｄ３π）−（Ｄ３π／６）−（０．２Ｄ３））／（（Ｄ３π／４−Ｄ３π／６））”となり、従って、ＰＣＲ反応液量は、上記の最小液量（Ｄ３π／４−Ｄ３π／６）の９．２倍となる。
ここで、仮に図２に示す形状をＤ＝２５μｍとすれば、ウェルの深さを２５μｍとすれば、
最小液量（Ｄ３π／４−Ｄ３π／６）は、１２２７１．８−８１８１．２＝４０９０．６
ウェルの体積（Ｄ３π）＝４９０８７．４
マイクロビーズの体積（Ｄ３π／６）＝８１８１．２
隆起部の体積約（０．２Ｄ３）＝３１２５
となり、４９０８７．４−（８１８１．２＋３１２５）＝３７７８１．２
となって、３７７８１．２÷４０９０．６＝９．２倍となる。
【００６９】
（本発明における各ウェルでのＰＣＲ反応液量）−図３に示す態様のウェル
図３（ａ）および（ｂ）に示す態様の“隆起部”の寸法につき、外径２Ｄおよび内径１．２Ｄとし、切欠き部Ｐの幅寸法ｋを０．４Ｄとした場合（ウェルの直径寸法：３．６Ｄ）、収容されるマイクロビーズ（直径Ｄ）の体積Ｄ３π／６を考慮して計算すると、
ウェル体積：（３．６Ｄ）２/４・π・Ｄから、
隆起部外径体積：（２Ｄ）２/４・π・Ｄを引き、
隆起部内径体積：（１．２Ｄ）２/４・π・Ｄを足し、
切欠き部Ｐの体積≒０．４Ｄ・（２Ｄ−１．２Ｄ）／２・Ｄを足し、
収容されるマイクロビーズ（直径Ｄ）の体積：Ｄ３π／６を引いた値となる。
このＰＣＲ反応液量は、約７．８１Ｄ３となり、最小液量（Ｄ３π／４−Ｄ３π／６）＝０．２６Ｄ３の約３０倍となる。
【００７０】
（本発明における各ウェルでのＰＣＲ反応液量）−図５に示す態様のウェル
図５（ａ）および（ｂ）に示す態様の“隆起部”の寸法につき、横寸法ｑ＝１．６Ｄ、平均縦寸法ｒ＝０．５Ｄ、高さ寸法ｓ＝Ｄとした場合（ウェルの幅寸法：２．７Ｄ）、収容されるマイクロビーズ（直径Ｄ）の体積Ｄ３π／６を考慮すると、ＰＣＲ反応液量は最小液量の約１６倍となる。
たとえば、Ｄを２５μｍ、ウェルの深さ２５μｍとして計算すると、
ウェルの全体積≒９９５００μｍ３
隆起部≒８２００μｍ３  ×３個分＝２４６００μｍ３
収容されるマイクロビーズ（直径Ｄ）の体積Ｄ３π／６≒８１８１．２μｍ３
最小液量（Ｄ３π／４−Ｄ３π／６）≒４０９０．６μｍ３
となるため、
{（９９５００）−（２４６００）−（８１８１．２）}／４０９０．６＝１６．３
となり、最小液量の約１６倍となる。
【００７１】
以上を纏めて説明すると次のようになる。隆起部とマイクロビーズの収容空間とを除いたウェルの内部空間はＰＣＲ反応液の収容空間となるが、本発明においては、この収容空間の体積Ｖｂがある程度大きくなっており、従来のウェル（マイクロビーズを１個収容できるウェル）で想定される最小体積よりも９倍〜３０倍程度大きくなっている。具体的には、球形状のマイクロビーズの直径Ｄと同じ長さ寸法の底面直径および高さを有する円柱空間に対して、「ＰＣＲ反応液」と「直径Ｄを有する球形状のマイクロビーズ」とを収容した際に想定されるＰＣＲ反応液の体積を最小収容体積Ｖｂ’とすると、「本発明におけるＰＣＲ反応液の収容空間体積Ｖｂ」が最小収容体積Ｖｂ’の９倍〜３０倍となっている。
【００７２】
《本発明の核酸増幅方法》
次に、本発明の核酸増幅方法について、各工程（ｉ）〜（ｉｖ）ごとに詳述する。
【００７３】
まず、工程（ｉ）では、複数のウェルを備えたウェルプレートであって、各ウェルにおいてウェル底面からウェル開口部へと延在する隆起部が少なくとも１つ形成されているウェルプレートを用意する（例えば図３３（ａ）参照）。
【００７４】
かかるウェルプレートは、まず、その形状が模された「レジスト原盤」なるものから「スタンパ」を製作し、その後、かかるスタンパを鋳型（金型）として用いた射出成形を行うことによって製造できる。かかる一連の製造工程を経時的に説明する。
【００７５】
（レジスト原盤の作製）
鋳型の製作に用いる“レジスト原盤”を製造する。まず、“レジスト原盤”の原型となる基板を用意する。用意する基板は、その表面が平坦かつ平滑であれば、どのような種類のものであってよい。例えば、表面が平滑であって鏡面状に研磨されており、表面に熱酸化膜が形成されたシリコンウエハを用いることができる。また、石英から成る基板を用いてもよい。
【００７６】
次いで、かかる基板の表面にレジストを形成する。レジストを形成した後、レジスト上にマスクを配して露光を行う。例えば、図３４（ａ）に示すようなパターンの穴が規則正しく設けられたクロムマスク（図３４（ａ）に示すマスクは“３つの島状隆起部”を形成する場合に用いるマスク）を配して、密着露光を行う。露光は、マスクによる一括露光に限定されるものでなく、直接レーザや電子線により露光を行ってもよい。更には、ＬＩＧＡ （Lithographie  Galvanoformung  Abformung）プロセスのように、シンクロトロン放射光を使用してもよい。
【００７７】
尚、高さ寸法が変化する隆起部あるいは傾斜面を有する隆起部などを形成する場合、即ち、ウェル内の深さ方向に変化を有する隆起部を形成する場合では、マスクの階調を自由に変えることが可能な多階調フォトマスクを使用してよい。かかる多階調フォトマスクとしてはグレイトーンマスクおよび／またはハーフトーンマスクを用いることができる。グレイトーンマスクは、露光機の解像度以下のスリットを作り、そのスリット部が光の一部を遮り、中間露光を実現する。一方、ハーフトーンマスクは“半透過”の膜を利用することで中間露光を実現する。いずれも、１回の露光で「露光部分」「中間露光部分」「未露光部分」の３つの露光レベルを実現し、現像後に厚さが異なる微細構造物を得ることができる。
【００７８】
露光を行った後、現像処理を行う。例えば、露光された基板をＴＭＡＨ(テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド)溶液に浸し現像を行ってよい。かかる現像によって、ウェルパターンが模された「原盤」が得られる（得られた「原盤」は、レジストによりパターン作製して得られたものなので、“レジスト原盤”と称すことができる）。
【００７９】
（スタンパの作製）
次いで、「レジスト原盤」から「スタンパ」を作製する。具体的には、レジスト原盤に対してスパッタやめっき処理を行って、原盤パターンの反転パターンを有するスタンパを作製する。例えば、原盤に対してＮｉスパッタ膜を導電膜として形成し、スルファミン酸ニッケルめっきを行ってスタンパを作製できる。導電膜の形成をスパッタによって行うことに限定されず、無電解めっきやＣＶＤ (Chemical Vapor Deposition)などを用いて行ってもよい。
【００８０】
上記めっき処理に用いるめっき液としては、応力の少ないスルファミン酸ニッケルめっき液を使用し、これにｐＨ緩衝用の硼酸および陽極Ｎｉの溶解を促進する塩化Ｎｉを添加してもよい。また、めっき液のｐＨ調整にスルファミン酸を用い、常にｐＨ３．８〜４．２の範囲になるようにしてもよい。めっき液の温度は例えば５０℃であってよい。更に、めっき液は常時濾過に付してもよい。
【００８１】
スタンパ材質としては、Ｎｉに限定されるわけでなく、Ａｇ、Ａｕ、Ｂｉ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｉｎ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｒｕ、Ｓｎおよび／またはＺｎ等の金属を用いてもよい。つまり、そのような金属を用いてめっき処理を行ってよい。また、Ａｇ、Ａｕ、Ｂｉ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｉｎ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｒｕ、ＳｎまたはＺｎのいずれかの金属を主体とした合金めっきやＰＴＦＥ（ポリテトラフロロエチレン）などを分散させてスタンパ材質に取り込むことによって、ロール状あるいは平面板の金属製鋳型を作製できる。更には、硬度や潤滑性、粘り強さを向上させるために、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｓｍ、Ｗ、Ｓｂ、Ｍｏ、Ｐ、Ｂおよび／またはＳなどをスタンパ材質として積極的に含ませてもよい。
【００８２】
（ウェルプレートの射出成形）
次いで、スタンパを鋳型として用いた射出成形を行うことによってウェルプレートを製造する。具体的には、金属製スタンパの外形を加工し、それを成形機に取り付けた上で射出成形を実施する。成形樹脂としては、種々の樹脂を用いることができる。例えば、シクロオレフィン樹脂を用いることができる。このような射出成形によって、ウェルプレートが最終的に得られることになる（図３４（ｂ）には、ウェルプレートの全体形状を示す。特に図３４（ｂ）ではハッチングで示した“ウェル形成領域”を理解することができる）。尚、成形樹脂としては、シクロオレフィン樹脂に限らず、ＰＣ（ポリカーボネート樹脂）、ＰＰ（ポリプロピレン樹脂）、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリビニルエーテル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミン等を用いてもよい。更には、ＵＶ硬化樹脂やＰＤＭＳ樹脂(polydimethylsiloxane)を用いてもよい。
【００８３】
尚、必ずしも射出成形に限定されるものでなく、ホットエンボスによりスタンパのパターンを転写してもよい。更には、基板の材質をＳｉあるいは石英に代表されるようなガラスとし、パターン露光後にウエットエッチングやドライエッチングで処理して直接ウェルを作製してもよい。また、ウエットエッチングやドライエッチングの代わりにサンドブラストや微細な機械加工などを行うことによってもウェルを作製できる。射出成形では離型時の抵抗を考慮して、いわゆる「抜き勾配」を鋳型に設ける必要があり得るものの、ウェルを直接的に作製する場合では、そのような「抜き勾配」を考慮することなく隆起部を形成できる点で有利である。
【００８４】
このように、ウェルプレートは、射出成形やインプリント等の大量生産手段を活用できるので、低コストの量産が可能となっている。
【００８５】
工程（ｉ）に引き続いて工程（ｉｉ）を実施する。つまり、「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズの分散液」をウェルプレートに供する。これにより、マイクロビーズをウェルの各々に１個ずつ収容させる。
【００８６】
まず、「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」を調製する。かかる調製では、原料粒子となるマイクロビーズの表面に対して、例えば、カルボキシル基やアビジンが表面に固定させておく、これによって、アミノ基またはビオチンを有するプライマーを結合することができるようになる。固定化に用いるマイクロビーズとしては、上述したように、例えば、ジルコニア、イットリウム添加ジルコニア、酸化鉄、またはアルミナ等の材質から成る粒子であってよい（以下では「固定化に用いるマイクロビーズ」を「原料粒子」とも称す）。かかる原料粒子は、球状、楕円状、米粒状、針状または板状などの各種形状を有し得る。ここでいう「球状」とは、アスペクト比（種々の方向で測定した場合の最大長さと最小長さとの比）が１．０〜１．２の範囲にある形状を指し、「楕円状」とは、アスペクト比が１．２〜１．５の範囲（但し、１．２を含まない）にある形状を指している。また、「米粒状」とは、その名の通り、“米粒”のような形状を意味しており、一般的には、球状のように粒子の長さが全方向で揃っている形状を指し、特に、全体としてサイズ的に異方性のない形状を指している。ウェルへの収容が促進される観点でいうと、原料粒子は球形状を有していることが好ましい。原料粒子の平均サイズＤは、例えば、好ましくは１μｍ〜５ｍｍ程度、より好ましくは２μｍ〜１００μｍ程度である。ここで、「原料粒子のサイズ」またはそれから得られる「表面処理が施されたマイクロビーズのサイズ」とは、粒子またはビーズのあらゆる方向における長さのうち最大となる長さを実質的に意味している。そして、「平均粒子サイズ」または「平均ビーズ・サイズ」とは、粒子またはビーズの透過型電子顕微鏡写真または光学顕微鏡写真に基づいて例えば３００個の粒子またはビーズのサイズを測定し、その数平均として算出した粒子サイズまたはビーズ・サイズを実質的に意味している。
【００８７】
尚、原料粒子は、表面処理が施されて親水性を有していることが好ましい。親水性を施すために、ＵＶ処理、ＵＶオゾン処理、プラズマ処理、親水性有機物コート、親水性基コート処理または金属薄膜コート処理を行ってもよい。
【００８８】
本発明では、原料粒子は粉末状態であって、複数個の原料粒子として用いられ得るが、その各々の原料粒子に対して、上述のような「プライマーが固定可能な表面処理」が施されることになる。尚、本発明では、プライマーとしては、センスプライマ−およびアンチセンスプライマ−を用いることができる。
【００８９】
「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」は、後にプライマーが固定化されることになるが、予めプライマーを固定化しておいてもよい。即ち、工程（ｉｉ）における「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」として「プライマーが表面に予め固定化されたマイクロビーズ」を用いてもよい。
【００９０】
「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」は、水（例えば、純水、超純水もしくは脱イオン水等の精製水または水道水等）、バッファーまたは溶剤などに分散させる。これにより、「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズの分散液」を得ることができる。かかる分散液におけるマイクロビーズの含有量は、特に制限されるわけではないが、例えば０．０１〜５０体積％程度である。尚、マイクロビーズの絶対量または個数は、全てのマイクロビーズがウェルに１個ずつ収容されるような量または個数であることが好ましく、例えば、ウェルの個数が１０万個であれば、マイクロビーズの個数も少なくとも１０万個であることが好ましく、それに応じた絶対量を有するマイクロビーズが分散液に含まれていればよい。尚、かかる分散液（より具体的には連続相）の粘度は、特に制限はなく、分散液が常温・常圧下で流動性を有していればよい。
【００９１】
「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」は、マイクロプレートに供されるが、この際、例えば、チューブ（エッペンドルフチューブ）、試験管、バイアル、フラスコまたはビーカー等の容器に仕込んだ分散液をウェル形成面に供給することになる。かかる供給に際しては、ピペットにより手動で供給してもよく、又はそれを自動化したピペッティングにより行ってもよい。マイクロビーズの“ウェルへの収容”は、マイクロビーズの自重に起因した沈降作用を利用してよいものの、必要に応じて振揺に付したり、あるいは遠心処理に付したりしてもよい。
【００９２】
工程（ｉｉ）に引き続いて工程（ｉｉｉ）および工程（ｉｖ）を実施する。つまり、ＰＣＲ反応液をウェルプレートに供給すると共に、鋳型核酸もウェルプレートに供することを行う。工程（ｉｉｉ）を実施する前においては、必要に応じて、ウェルに収容された液体（即ち、工程（ｉｉ）の分散液の連続相成分）を除去するか、あるいは、ウェル内の液体量を減じておく。このような処理を経て、各々のウェルにてマイクロビーズが１個ずつ収納されたウェルプレートが得られる（図３３（ｂ）参照）。
【００９３】
工程（ｉｉｉ）で用いるＰＣＲ反応液は、特に制限はなく、常套のＰＣＲに用いる反応液と同様であってよい。つまり、ＰＣＲ反応液は、酵素として耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、基質としてｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）、バッファーならびにその他の核酸増幅試薬などを更に含んで成る。また、工程（ｉｉ）における「プライマーが固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」として「プライマーが表面に固定化されたマイクロビーズ」を用いていない場合には、かかるＰＣＲ反応液にプライマーを含ませておいてもよい（これにより、ＰＣＲ反応液中にて“プライマーが固定化されたマイクロビーズ”が得られることになる）。更には、工程（ｉｉｉ）と工程（ｉｖ）とを実質的に同時に行う場合には、ＰＣＲ反応液に「鋳型核酸」を含ませておいてもよい。
【００９４】
ＰＣＲ反応液の含有成分は市販されており、容易に入手可能である。鋳型核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ類似体、およびＲＮＡ類似体などを挙げることができる（ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡなども含まれ、ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡなども含む）。鋳型核酸の形態は、特に限定されるものでなく、例えば１本鎖または２本鎖のいずれであってもよい。好ましい鋳型核酸の形態は２本鎖ＤＮＡである。このような鋳型核酸は、ある細胞から抽出することにより調製してよく、あるいは、市販の又は常法で調製した各種ＤＮＡライブラリーを好適に用いてもよい。尚、鋳型核酸（例えば鋳型ＤＮＡ）は、工程（ｉｉｉ）の後にウェルプレートに供する態様に限定されず、例えば、工程（ｉｉ）の後に添加しても良いし、工程（ｉｉｉ）に併せて添加しても、あるいは最後（即ち、“核酸（ＤＮＡ）の変性”／“アニーリング”／“伸長の反応”を行う前）に加えても良い。同様に、プライマーは、予めマイクロビーズに固定化しておいてもよいものの、それに限定されず、例えば、工程（ｉｉ）の後に添加しても良いし、工程（ｉｉｉ）に併せて添加しても、あるいは最後（即ち、“核酸（ＤＮＡ）の変性”／“アニーリング”／“伸長の反応”を行う前）に加えても良い。
【００９５】
ＰＣＲ反応液や鋳型核酸をウェル形成面に供給するに際しては、ピペットにより手動で供給してもよく、又はそれを自動化したピペッティングにより行ってもよい（必要に応じて振揺に付したり、あるいは遠心処理に付したりしてもよい）。
【００９６】
尚、例えば、エマルションＰＣＲを実施する場合には、酵素、プライマー、基質およびバッファーなどの水性成分に対して、油性成分および界面活性剤などを混合して、油中水型エマルジョンから成るＰＣＲ反応液を調製する。油性成分としては、例えばミネラルオイル（鉱物油）を用いてよい。かかるエマルジョンの調製には、攪拌処理、ホモジナイズ、超音波などを好ましく利用できる。このようにして得られたエマルジョンもウェル形成面に供給され、各ウェルに収容されることになる。
【００９７】
以上のような工程（ｉ）〜（ｉｖ）を経ることによって、各々のウェルにマイクロビーズ（１個）とＰＣＲ反応液とが収容されたウェルプレートを得ることができる（図３３（ｃ）参照）。次いで、かかるウェルプレートは、（１）核酸の１本鎖への変性、（２）１本鎖核酸とプライマーとのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼによる核酸の伸長反応といった３段階の反応を行うべく加熱に付される。つまり、上記（１）〜（３）が引き起こされるように３段階の温度変化にウェルプレートをさらす。かかる熱処理・温度変化は、常套のＰＣＲ法で採用されているものと同様であってよく、特に制限はない（即ち、工程（ｉｉｉ）の後に得られるウェルプレートを常套のＰＣＲ装置にかけてもよい）。例えば、９４℃２分のプレヒートの後、（１）の熱変性ステップでは９４℃３０秒、（２）のアニーリング・ステップでは５６℃１分、（３）の伸長反応ステップでは７２℃１分の熱処理に付される。このような（１）〜（３）のサイクルを繰り返し行うことによって、ＰＣＲが進行して、鋳型核酸から増幅産物を得ることができる（好ましくは、ビーズ上にプライマーが固定化されているので、かかるビーズ上にてＰＣＲが進行して増幅産物を得ることができる）。
【００９８】
《ＰＣＲキット》
本発明では、核酸増幅方法の他に、かかる核酸増幅方法を実施するためのＰＣＲキットも提供される。このＰＣＲキットは、上述したウェルプレート、マイクロビーズ（必要に応じて表面処理が施されたマイクロビーズ）およびＰＣＲ反応液を有して成るものである。更には、ＰＣＲキットに使用される「ウェルプレート」、「マイクロビーズ」および「ＰＣＲ反応液」なども本発明として含まれ得る。
【００９９】
以上、本発明の実施形態について説明してきたが、本発明はこれに限定されず、種々の改変がなされ得る。
【０１００】
例えば、本発明における工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）とを実質的に同時に行ってもよい。つまり、ウェルプレートに供給するマイクロビーズの分散液として、マイクロビーズとＰＣＲ反応液とを混合して得られる分散液を用いてよい。この場合であっても、分散体をウェルプレートに供した際、“隆起部”の働きによって各々のウェルにマイクロビーズを１個ずつ収容することができると共に、ＰＣＲ反応液を各々のウェルに収容することができる。
【０１０１】
また、工程（ｉｉ）で用いるマイクロビーズにはプライマーが固定化されることを前提にしているが、必ずしもその態様に限定されるものではない。例えば、鋳型核酸をマイクロビーズに固定化し、プライマーをＰＣＲ反応液に含めてもよい（即ち、工程（ｉｉ）で用いるマイクロビーズとして「鋳型核酸が固定可能な表面処理を施したマイクロビーズ」または「鋳型核酸が固定化されたマイクロビーズ」を用いてもよい）。
【０１０２】
更に、工程（ｉ）で用意するウェルプレートには、ウェル構造の他に、溝、突起および／または流路などの構造を設けてもよい。具体例を挙げると、ウェルプレートの形態は図３５〜３７に示すような形態を有していてもよい。図３５および図３６に示す態様では、ウェル領域の外側から分散液を供給することができる。また、図３７に示す形態では、各ウェルに隣接して柱状突起がプレート面に形成されており、分散液の供給に際して、ビーズと柱状突起との衝突が生じ得るのでビーズがウェルに入って行き易いようになっている。また、各ウェルに複数の隆起部が設けられる場合、隆起部は全て同じ大きさとなっている必要はなく、それぞれ異なっていてもよい。例えば、ピラー状の隆起部について言うと、大中小の柱状の隆起部を形成し、ウェル内の液体容量を調整してもよい。また、隆起部の形態も図示した態様に限定されるわけでなく、必要に応じて自由に変更してもよい（即ち、隆起部の横幅、縦幅および高さなどは用途に応じて自由に選択可能である）。例えば、ピラー状の隆起部について言うと、その形状は自由に選択可能であって、矩形や三角形、あるいは複雑な形状で作製されていてもよい。つまり、円錘形状の隆起部も考えられる他、四角錘形状、三角錘形状、四角柱形状、三角柱形状の隆起部も考えられる。また、１つのピラー状の隆起部の太さが徐々に変化するような形態であってよく、あるいは、１つのピラー状の隆起部の太さが途中でステップ状に変化するような形態であってもよい。更には、隆起部の各面は平面状に限定されるわけでなく、先鋭状または曲面状に形成されていてもよい。例えば、半島状またはピラー状の隆起部の上面が曲面状に湾曲して形成されていてもよい。
【実施例】
【０１０３】
《ウェルプレートの作製》
本発明の工程（ｉ）で用意するウェルプレートを作製した。
【０１０４】
まず、“レジスト原盤”を作成した。具体的には、「表面が平滑であって鏡面状に研磨されていると共に、表面に熱酸化膜が形成されたシリコンウエハ基板」に対してヘキサメチルジシラザンを塗布して、１４０℃で１０分間ベークした。次いで、厚膜用のポジ型フォトレジスト（東京応化製ＰＭＥＲ  Ｐ-ＬＡ９００ＰＭ）を３０μｍの厚さでスピンコート法により塗布した。引き続いて、微細なウェルパターンが形成されているクロムマスクをレジスト上に配置して超高圧ＵＶ光により密着露光を行った。この露光に用いたＵＶ光源としては、ｇ線（４３６ｎｍ）、ｈ線（４０５ｎｍ）およびＩ線（３６５ｎｍ）を含んでいた。露光後、基板をＴＭＡＨ(テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド)３％の溶液により浸して現像を行うことによって、ウェル形状が模された「レジスト原盤」を得た。
【０１０５】
かかるレジスト原盤に対して導電膜としてＮｉスパッタ膜を形成した後、スルファミン酸ニッケルめっきを行うことによっての反転パターンスタンパ（例えば厚さ４００μｍ）を作製した。得られたスタンパを鋳型として用いることによって射出成形を行った。具体的には、金属製スタンパの外形を加工して成形機に取り付けた上で、シクロオレフィン樹脂を成形樹脂として用いて射出成形を実施した（樹脂温度：３４０℃、鋳型温度：１２５℃、射出速度：３００ｍｍ／ｓ、保持圧力：７０ＭＰａ）。かかる射出成形によって、ウェルプレート（ウェル数：約１０万個、ウェルサイズ：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）を得ることができた（図３８参照）。
【０１０６】
《ＰＣＲの実施》
上記で得られたウェルプレート（１ウェルの容量：６０ｐＬ）を用いてＰＣＲを実施した。  
【０１０７】
（比較例：ビーズ無しのＰＣＲ）
◇比較例の手法  
下記の表１に示す組成で調製したＰＣＲ反応液をセルに充填した。１ウェル６０ｐＬなので、６μＬがウェルに充填され、４μＬは余剰分として除去した。次いで、ＰＣＲの熱サイクルに付した。具体的には、９４℃２分のプレヒートの後、９４℃３０秒、５６℃１分、７２℃１分の熱変性、アニーリング、伸長反応ステップを５０サイクル実施し、最後に７２℃１０分の伸長反応に付した。
【０１０８】
［表１］
2010110262.tif 000004
【０１０９】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物を回収するために１００μＬのミリＱを滴下し、１０分間脱気後、セルを５０ｍＬ容量の遠心管に入れ、すべての水分を遠心分離によってセルから取り出し、水量の計測を行った。増幅産物は、回収した水分の一部をサンプルとし、リアルタイムＰＣＲによって、絶対定量法で測定した。
【０１１０】
◇比較例の結果
１００μＬのミリＱを滴下後、回収水分は５２μＬだった。この中に含まれる増幅産物の総量は１．１×１０８分子であることが算出された。１０分の脱気で水の蒸発は否めないが、脱気をすることにより回収率が高いことを確認した。また、ＰＣＲ後のセルをミリＱ滴下することなく、直接遠心回収すると、総量は２μＬしか回収できず、増幅産物の総量は６．０×１０７分子であったことから、水分蒸発に起因した壁への吸着によるロスと考えられた。それゆえ、回収には１００μＬのミリＱを滴下することにした。
１セルあたり１×１０５ポアなので、これを換算すると、１ポア当たり１×１０３分子となる。１ポア６０ｐＬであることを考慮すると、１．７×１０７／μＬ濃度と算出される。同じ反応条件で行った通常のチューブにおけるＰＣＲ（反応液１００μＬ）の１．８×１０１１／μＬであることを考えると、ＰＣＲ効率は良くないものの、ＰＣＲが可能であることが確認できた。
【０１１１】
（実施例：ビーズ有りのＰＣＲ）
◇実施例の手法
まず、ＰＣＲ反応液の充填に先立ち、オリゴＤＮＡ修飾ジルコニアビーズ（直径２２．６μｍ）を各ウェルに収容させた（図３９参照）。具体的には、ミリＱにビーズを加えてウェルプレート上に滴下し、ピペッティングおよびプレートを種々の方向に傾けたりすることによって行った。
【０１１２】
１ウェル体積の６０ｐＬからマイクロビーズ体積６ｐＬを差し引いた５４ｐＬに１分子ＤＮＡの割合となるように、テンプレート濃度を調整した以外は上述と同じ組成のＰＣＲ反応液を用意し、同様に５．４μＬを充填した。
【０１１３】
尚、ジルコニアビーズの原粒子としては、「表面がカルボキシル基修飾された粒子」（日立マクセル製）を用いた。かかる原粒子の表面に対し、５’末端をアミノ基修飾したオリゴＤＮＡ（配列は反応液に加えたフォワードプライマーと同一）を粒子あたり１０９分子共有結合で修飾した。かかる修飾オリゴによって、ＰＣＲ産物の相補鎖（１本鎖）をハイブリダイゼーションによって捕捉する。
【０１１４】
比較例と同一のＰＣＲサイクル条件で反応を行い、ＰＣＲ終了後、セルを５０ｍＬ容量の遠心管に入れ、遠心分離によってビーズをセルから取り出し、ＰＣＲポリメラーゼに付属のＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（１×）で洗浄、０．１％Ｔｗｅｅｎを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。ビーズを個別に１個ずつマニュプレートによって拾い、ビーズ上に捕捉されたＰＣＲ増幅産物をリアルタイムＰＣＲで比較例と同様に定量した  。
【０１１５】
◇実施例の結果
定量の結果、ビーズ１個当たりのＤＮＡ捕捉数は１×１０２分子であり、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを表面に結合することが可能であることが確認できた。なお、比重の重いジルコニアビーズでは、同じ反応条件下でＰＣＲチューブに加えるとすべてが沈殿し、捕捉効率が落ちてしまい、全く捕捉できない粒子もあった。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明の核酸増幅方法は、ウェルプレートに設けられた複数のウェルでバラツキなくＤＮＡ断片やＲＮＡを増幅できるので、高い信頼性、高い収量が要求されるＰＣＲ法として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、本発明で用いるウェルプレートおよびウェルの態様を模式的に示した斜視図である。
【図２】図２は、半島状の隆起部の態様を模式的に示した上面図（図２（ａ））および斜視図（図２（ｂ））である。
【図３】図３は、ピラー状の隆起部の態様を模式的に示した上面図（図３（ａ））および斜視図（図３（ｂ））である。
【図４】図４は、図３に示すピラー状の隆起部の態様を断面図により模式的に示したものである。
【図５】図５は、島状の隆起部の態様を模式的に示した上面図（図５（ａ））および斜視図（図５（ｂ））である。
【図６】図６は、放射方向からずれて延在する半島状の隆起部を２つ備えた態様を模式的に示した上面図（図６（ａ））および斜視図（図６（ｂ））である。
【図７】図７は、放射方向に沿って延在する半島状の隆起部を２つ備えた態様を模式的に示した上面図（図７（ａ））および斜視図（図７（ｂ））である。
【図８】図８は、半島状の隆起部を５つ備えた態様を模式的に示した上面図（図８（ａ））および斜視図（図８（ｂ））である。
【図９】図９は、半島状の隆起部を６つ備えた態様を模式的に示した上面図（図９（ａ））および斜視図（図９（ｂ））である。
【図１０】図１０は、図９における「隆起部」と「ＰＣＲ反応液の収容部」とを相互に入れ替えることで形成された態様を模式的に示した上面図（図１０（ａ））および斜視図（図１０（ｂ））である。
【図１１】図１１は、隆起部に隣接して“液溜まり”が設けられた態様を模式的に示した上面図（図１１（ａ））および斜視図（図１１（ｂ））である。
【図１２】図１２は、ウェルの中央に向かって傾斜する半島状の隆起部の態様を模式的に示した斜視図である。
【図１３】図１３は、円周方向に沿って傾斜する半島状の隆起部の態様を模式的に示した斜視図である。
【図１４】図１４は、高さが段階状に異なる複数の半島状の隆起部の態様を模式的に示した斜視図である。
【図１５】図１５は、隆起部がウェル周縁部分から螺旋状に延在するように設けられた態様を模式的に示した上面図（図１５（ａ））および斜視図（図１５（ｂ））である。
【図１６】図１６は、ピラー状の隆起部を２つ備えた態様を模式的に示した上面図（図１６（ａ））および斜視図（図１６（ｂ））である。
【図１７】図１７は、ピラー状の隆起部を３つ備えた態様を模式的に示した上面図（図１７（ａ））および斜視図（図１７（ｂ））である。
【図１８】図１８は、ピラー状の隆起部を４つ備えた態様を模式的に示した上面図（図１８（ａ））および斜視図（図１８（ｂ））である。
【図１９】図１９は、ウェルの中央に向かって傾斜するピラー状の隆起部の態様を模式的に示した斜視図である。
【図２０】図２０は、円周方向に沿って傾斜するピラー状の隆起部の態様を模式的に示した斜視図である。
【図２１】図２１は、高さが段階状に異なる複数のピラー状の隆起部の態様を模式的に示した斜視図である。
【図２２】図２２は、ピラー状の隆起部が螺旋状に延在するように設けられた態様を模式的に示した上面図（図２２（ａ））および斜視図（図２２（ｂ））である。
【図２３】図２３は、各ウェルに円柱形状の“ピラー”を４つ備えた態様を模式的に示した上面図（図２３（ａ））および斜視図（図２３（ｂ））である。
【図２４】図２４は、“島状”の隆起部を３つ備えた態様を模式的に示した上面図（図２４（ａ））および斜視図（図２４（ｂ））である。
【図２５】図２５は、“島状”の隆起部を４つ備えた態様を模式的に示した上面図（図２５（ａ））および斜視図（図２５（ｂ））である。
【図２６】図２６は、“島状”の隆起部の変更態様例を模式的に示した斜視図である。
【図２７】図２７は、“島状”の隆起部の変更態様例を模式的に示した斜視図である。
【図２８】図２８は、“島状”の隆起部の変更態様例を模式的に示した斜視図である。
【図２９】図２９は、従来技術で見られるような円柱形状ウェルを模式的に示した上面図（図２９（ａ））および斜視図（図２９（ｂ））である。
【図３０】図３０は、円柱形状ウェルにおいて、２個のマイクロビーズが収容された状態を示しており、特に一方のビーズの半分がウェルに収納された状態を示す模式図である。
【図３１】図３１は、従来技術で見られるような四角柱形状ウェルを模式的に示した上面図（図３１（ａ））および斜視図（図３１（ｂ））である。
【図３２】図３２は、四角柱形状ウェルにおいて、２個のマイクロビーズが収容された状態を示しており、特に一方のビーズの半分がウェルに収納された状態を示す模式図である。
【図３３】本発明の各工程におけるウェルプレートの態様を模式的に示した斜視図である。
【図３４】図３４（ａ）は、レジスト上に配されるマスクのパターンの一例を模式的に示した図であり、図３４（ｂ）は、“ウェル形成領域”が表されたウェルプレートの全体形状を模式的に示した図である。
【図３５】図３５は、本発明で用いるウェルプレートの変更態様を模式的に示した図である。
【図３６】図３６は、本発明で用いるウェルプレートの変更態様を模式的に示した図である。
【図３７】図３７は、本発明で用いるウェルプレートの変更態様を模式的に示した図である。
【図３８】図３７は、本発明の実施例で作成したウェルプレートのウェル形成領域の電子顕微鏡写真（ＳＥＭ写真）である。
【図３９】図３９は、各ウェルに粒子が１個ずつ収納された結果を示した光学顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【０１１８】
２５（２５ａ〜２５ｄ）    隆起部
３０    ウェル
３０’  円柱形状のウェル
３０’’四角柱状のウェル
３０ａ  マイクロビーズの収容領域
３０ｂ  ＰＣＲ反応液の収容領域
３０ｂ’ 液溜まり部
５０    プレート状部材
６０    マイクロビーズ
７０    マスク
８０    ＰＣＲ反応液
１００    ウェルプレート
Ｄ      マイクロビーズなどの球形粒子の直径寸法
Ｐ      ピラー状の隆起部の切欠き部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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