(57)【要約】      （修正有）【課題】短時間かつ簡易的にクロロゲン酸類含有水溶液中のクロロゲン酸類を精密に定量化でき、再現性良く定量化できる方法を提供する。【解決手段】クロロゲン酸類含有水溶液を疎水性吸着剤で処理した後に、紫外線吸光光度法にて測定を行う。疎水性吸着剤がアルキル基修飾シリカゲル吸着剤であり、アルキル基修飾シリカゲル吸着剤が、オクタデシル基修飾シリカゲル、オクチル基修飾シリカゲル、及びシクロヘキシル基修飾シリカゲルからなる群から選ばれる少なくとも１種である。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロゲン酸類含有水溶液を疎水性吸着剤で処理した後に、紫外線吸光光度法にて測定を行う、クロロゲン酸類の分析方法。
【請求項２】
疎水性吸着剤がアルキル基修飾シリカゲル吸着剤である、請求項１記載のクロロゲン酸類の分析方法。
【請求項３】
アルキル基修飾シリカゲル吸着剤が、オクタデシル基修飾シリカゲル、オクチル基修飾シリカゲル、及びシクロヘキシル基修飾シリカゲルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項２記載のクロロゲン酸類の分析方法。
【請求項４】
クロロゲン酸類含有水溶液を酸性にした後に疎水性吸着剤処理を行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載のクロロゲン酸類の分析方法。
【請求項５】
クロロゲン酸類含有水溶液がコーヒー抽出液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のクロロゲン酸類の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロロゲン酸類の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒーは単に嗜好品としてだけではなく、多くの機能性、生理学的効果を有することから、その機能性成分としてクロロゲン酸類が注目されている。クロロゲン酸類の機能としては抗酸化性、抗変異原性、発ガン抑制、活性酸素消去能などが知られている。
また、コーヒー等の食品に含まれているクロロゲン酸、カフェ酸、フェルラ酸等が優れた血圧降下作用を示すことが報告されている。また最近においては、クロロゲン酸類による体脂肪抑制も報告されている。
一方、コーヒー飲料中のクロロゲン酸類の管理における定量法については、紫外線吸収（ＵＶ）検出器を備えた高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）を用いた方法が報告されている（特許文献１〜３）。
【特許文献１】特開２００５−１３７２６９号公報
【特許文献２】特開２００７−３１３９２号公報
【特許文献３】特開２００７−５４０６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＨＰＬＣ法は測定精度が高いが、含有成分をカラムで分離して測定するという特性より、分析に長時間を必要とする。このため、即時の判定が求められる製造現場における工程管理等においては適用が難しく、また、装置の維持管理が煩雑という問題がある。
一方、試料をそのまま分析する方法として紫外線吸光光度法（ＵＶ法）があるが、混合物のまま分析を行うために、定量精度が低く、試料による値のバラツキが大きいという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、紫外線吸光光度法においても精度の高い定量を可能とするために試料の前処理について検討を行い、その結果、疎水性の吸着剤で前処理を行うことにより、分析目的物であるクロロゲン酸類を試料中に保持したまま、クロロゲン酸類と重複した吸収スペクトルを有する夾雑物を分離除去できることを見出した。
即ち、本発明は、クロロゲン酸類含有水溶液を疎水性吸着剤で処理した後に紫外線吸光光度法にて測定を行う、クロロゲン酸類の分析方法に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、短時間かつ簡易的にクロロゲン酸類含有水溶液中のクロロゲン酸類を精密に定量化でき、再現性良く定量化できる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明のクロロゲン酸類とは、モノカフェオイルキナ酸及びフェルラキナ酸を指す。モノカフェオイルキナ酸には、３−カフェオイルキナ酸、４−カフェオイルキナ酸、及び５−カフェオイルキナ酸という異性体が存在し、フェルラキナ酸には、３−フェルラキナ酸、４−フェルラキナ酸及び５−フェルラキナ酸という異性体が存在する。
【０００７】
本発明の分析方法は、クロロゲン酸類を含有する水溶液に広く適用することができる。
クロロゲン酸類を含有する水溶液としては、コーヒー抽出液等の各種植物抽出液の他、クロロゲン酸類添加飲料やクロロゲン酸類添加食品が挙げられるが、特にコーヒー抽出液に対して適用するのが好ましい。
【０００８】
コーヒー抽出液を得るためのコーヒー豆の種類は特に限定されないが、例えばブラジル、コロンビア、タンザニア、モカ、キリマンジェロ、マンデリン、ブルーマウンテン等が挙げられる。コーヒー豆種としては、アラビカ種、ロブスタ種などがある。コーヒー豆は１種でもよいし、複数種をブレンドして用いてもよい。
コーヒー豆を焙煎する方法としては直火式又は熱風式、半熱風式があり、回転ドラムを有している形式が例示される。焙煎温度は通常１００〜３００℃、更に好ましくは１５０〜２５０℃である。風味の観点より焙煎後１時間以内に０〜１００℃まで冷却することが好ましく、更に好ましくは１０〜６０℃である。
【０００９】
コーヒー抽出液は、コーヒー豆を水又は有機溶媒にて抽出することで得られる。コーヒー豆は生豆でもよく、焙煎したものでもよい。いかなる焙煎度のコーヒー豆の抽出液についても適用できるが、深煎り豆の抽出液においてはＵＶ法における分析値のバラツキが大きくなりやすいため、本発明の方法を適用することが好ましい。コーヒー豆の焙煎度はＬ値で規定することができ、Ｌ値が１４〜３５の豆の抽出液を含むものに適用するのが好ましく、Ｌ値が１４〜２５の豆の抽出液を含むものに適用するのがより好ましく、Ｌ値が１６〜２０の豆の抽出液を含むものに適用するのがさらに好ましい。ここでＬ値は色差計で測定することで求めることができる。
抽出方法は、ボイリング式、エスプレッソ式、サイホン式、ドリップ式（ペーパー、ネル等）等が挙げられる。
【００１０】
コーヒー抽出液の濃度は、そのまま飲用できる濃度のものから濃縮タイプまで様々であるが、分析に際して適宜希釈することができるので、特に規定されない。また、製造工程の一部に活性炭処理を行って製造されたコーヒー抽出液も含まれる。
【００１１】
本発明の分析方法は紫外線吸収を測定するため、糖類や脂肪、蛋白質等の影響を受けにくい。このため、コーヒー抽出液に、糖類や脂肪、蛋白質等を添加したコーヒー飲料、例えばブラックコーヒー、砂糖入りコーヒー、ミルクコーヒー等に対しても適用することができる。また、ソリュブルコーヒー（いわゆるインスタントコーヒー）についても、適宜希釈してコーヒー飲料とすることで測定することができる。また、活性炭処理を行って製造されたコーヒー抽出液を用いたコーヒー飲料についても適用することができる。
【００１２】
測定に際しては、クロロゲン酸類含有水溶液を調製する。試料がクロロゲン酸類を含有する固体の場合は、水に分散又は溶解することによりクロロゲン酸類含有水溶液を調製する。不溶性分を除去するために、適宜濾過を施すことが好ましい。
測定に供するクロロゲン酸類含有水溶液中のクロロゲン酸類濃度は、吸光度が濃度に対して直線性を有し、十分な精度が得られるようにすればよい。吸光光路長が短い測定セルを用いれば高濃度の水溶液を分析することができ、吸光光路長が長い測定セルを用いれば低濃度の水溶液を分析することができる。標準的には０．０１〜１０ｍｇ／１００ｇに調整することが好ましく、０．０２〜５ｍｇ／１００ｇがより好ましい。
【００１３】
測定に供するクロロゲン酸類含有水溶液は、酸性溶液であることがクロロゲン酸類の安定性の観点より好ましい。クロロゲン酸類含有水溶液のｐＨは２〜５が好ましい。このためクロロゲン酸類含有水溶液には、クエン酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、酢酸水溶液、又は酢酸緩衝溶液を添加することが好ましく、酢酸水溶液又は酢酸緩衝溶液を用いることがより好ましい。また、前述のクロロゲン酸類濃度に調整する際に、上記の酸水溶液や緩衝溶液を用いることが好ましい。
【００１４】
本発明の分析方法は、クロロゲン酸類含有水溶液を疎水性吸着剤で処理を行う。疎水性吸着剤は、逆相吸着剤又は非極性吸着剤とも呼ばれる。
疎水性吸着剤としては、アルキル基修飾シリカゲル、フェニル基修飾シリカゲル、シアノ基修飾シリカゲル、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体等が挙げられ、アルキル基修飾シリカゲルが好ましい。
アルキル基修飾シリカゲルとしては、オクタデシル基修飾シリカゲル、オクチル基修飾シリカゲル、エチル基修飾シリカゲル、シクロヘキシル基修飾シリカゲル等が挙げられ、オクタデシル基修飾シリカゲル、オクチル基修飾シリカゲル、及びシクロヘキシル基修飾シリカゲルが特に好ましい。
【００１５】
疎水性吸着剤による処理は、クロロゲン酸類含有水溶液を吸着剤に接触させることで行う。
疎水性吸着剤は、粉末状、粒状のものを用いることができ、水溶液に分散し、分離することでも処理できるが、カートリッジ型のものを用いれば通液を行うことで処理ができ、分離操作が不要なことから簡便に処理を行うことができる。
処理温度は特に限定されず、０〜１００℃で行うことができるが、１０〜８０℃が好ましく、１５〜６０℃がより好ましく、１５〜３５℃が特に好ましい。
疎水性吸着剤の使用量は、含有される夾雑物の量により適宜調整すればよいが、クロロゲン酸類に対し、１０００〜５００００質量倍が好ましく、２０００〜２００００質量倍がより好ましい。あるいは、上記濃度に調整したクロロゲン酸類含有水溶液に対し、０．０５〜０．５質量倍の疎水性吸着剤を使用してもよい。
【００１６】
分析装置は、紫外−可視分光光度計を用いる。試料を入れるセルの大きさは、一般に１０ｍｍ角のものが用いられるが、クロロゲン酸類含有量に応じて適宜選択することができる。吸着剤処理後に試料が分散系である場合は、セルの間隙が狭いものを用いることで、光の散乱を低減させ、分析精度を向上させることができる。
【００１７】
測定は、クロロゲン酸類の吸光度を測定するが、他のアルカロイド等の妨害を防ぐため、吸収波長として３００〜３８０ｎｍを選択することが好ましく、３１０〜３４０ｎｍを選択することがより好ましく、３２５ｎｍを選択することが特に好ましい。
純度の高いクロロゲン酸化合物を標準試料とし、検量線法を用いることでクロロゲン酸類の定量を行うことができる。得られた値に希釈倍率を掛けることにより、原試料中のクロロゲン酸類濃度を決定することができる。
【実施例】
【００１８】
（コーヒー液の調製）
調製例１
Ｌ３４／Ｌ１６．５焙煎混合コーヒー豆（Ｌ３４／Ｌ１６．５＝５５〜７０／４５〜３０（重量比））に対して６倍量のイオン交換水（９５℃）で抽出し、コーヒー抽出液を得た。上記コーヒー抽出液をイオン交換水にて希釈し、各希釈液について、活性炭（白鷺ＷＨ２Ｃ）を６０分間接触させた後、濾過し、ＨＰＬＣによるクロロゲン酸類濃度が１７８．８〜２８０．３ｍｇ／１００ｇである活性炭処理コーヒー抽出液１０種を調製した（以下、これらを「Ｌ３４／Ｌ１６．５コーヒー液」という）。
調製例２
Ｌ３４／Ｌ１６．５焙煎混合コーヒー豆に代えてＬ２２焙煎コーヒー豆を用い、調製例１と同様にして、ＨＰＬＣによるクロロゲン酸類濃度が１８４．１〜２１７．８ｍｇ／１００ｇである活性炭処理コーヒー抽出液１８種を調製した（以下、これらを「Ｌ２２コーヒー液」という）。
調製例３
Ｌ３４／Ｌ１６．５焙煎混合コーヒー豆に代えてＬ１６．５焙煎コーヒー豆を用い、調製例１と同様にして、ＨＰＬＣによるクロロゲン酸類濃度が４３．５〜７６．８ｍｇ／１００ｇである活性炭処理コーヒー抽出液１８種を調製した（以下、これらを「Ｌ１６．５コーヒー液」という）。
【００１９】
（高速液体クロマトグラフィー装置及び分析条件）
分析精度の比較を行うために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を行った。
【００２０】
使用した装置：
ＵＶ−ＶＩＳ検出器：Ｌ−２４２０（（株）日立ハイテクノロジーズ）
カラムオーブン：Ｌ−２３００（（株）日立ハイテクノロジーズ）
ポンプ：Ｌ−２１３０（（株）日立ハイテクノロジーズ）
オートサンプラー：Ｌ−２２００（（株）日立ハイテクノロジーズ）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、粒子径３μｍ（インタクト（株））。
【００２１】
分析条件：
サンプル注入量：１０μＬ
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ−ＶＩＳ検出器設定波長：３２５ｎｍ
カラムオーブン設定温度：３５℃
溶離液Ａ：０．０５Ｍ  酢酸、０．１ｍＭ  １−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム、５（Ｖ／Ｖ）％アセトニトリル溶液
溶離液Ｂ：アセトニトリル
【００２２】
濃度勾配条件
時間        溶離液Ａ        溶離液Ｂ
０．０分        １００％            ０％
１０．０分        １００％            ０％
１５．０分          ９５％            ５％
２０．０分          ９５％            ５％
２２．０分          ９２％            ８％
５０．０分          ９２％            ８％
５２．０分          １０％          ９０％
６０．０分          １０％          ９０％
６０．１分        １００％            ０％
７０．０分        １００％            ０％
【００２３】
ＨＰＬＣでは、試料１ｇを精秤後、溶離液Ａにて１０ｍＬにメスアップし、メンブレンフィルター（ＧＬクロマトディスク２５Ａ，孔径０．４５μｍ，ジーエルサイエンス（株））にて濾過後、分析に供した。
【００２４】
クロロゲン酸類の保持時間（単位：分）
モノカフェオイルキナ酸：５．３、８．８、１１．６の計３点、及びフェルラキナ酸：１３．０、１９．９、２１．０の計３点。ここで求めた６種のクロロゲン酸類の面積値から５−カフェオイルキナ酸を標準物質とし、質量％を求めた。
【００２５】
＜紫外線吸光光度計及び分析条件＞
測定溶液について、紫外可視分光光度計（日立製作所製Ｕ２９１０）を用い、セル長１０ｍｍにて、３２５ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を測定した。
【００２６】
実施例１
調製例１で調製した、ＨＰＬＣによるクロロゲン酸類濃度が２３２．３ｍｇ/１００ｇである、Ｌ３４／１６．５コーヒー液を１ｇ精秤後、５０ｍＭ酢酸水溶液にて１０ｇとなるように希釈を行った（一次希釈液）。さらに、一次希釈液を２ｇ精秤後、５０ｍＭ酢酸水溶液にて４０ｇとなるように希釈を行った（二次希釈液）。二次希釈液をオクタデシル基修飾シリカゲル吸着剤（モード：逆相、品名：メガボンドエルートＣ１８、サイズ：５ｇ／２０ｍＬ、バリアン社製）に吸引下（約５０秒）、通液させ、１２ｍＬ端切り後、１８ｍＬを採液し、測定溶液とした。これらの操作は室温（２５℃）にて行った。
測定溶液を高速液体クロマトグラフィーにて分析した。チャートを図１に示す。
【００２７】
実施例２
実施例１で用いたコーヒー液の二次希釈液を、シクロヘキシル基修飾シリカゲル吸着剤（モード：逆相、品名：ＩｎｅｒｔＳｅｐ  ＣＨ、サイズ：５ｇ／２０ｍＬ、ＧＬサイエンス社製）に吸引下（約５０秒）、通液させ、１２ｍＬ端切り後、１８ｍＬを採液し、測定溶液とした。
測定溶液を高速液体クロマトグラフィーにて分析した。チャートを図２に示す。
【００２８】
実施例３
実施例１で用いたコーヒー液の二次希釈液を、オクチル基修飾シリカゲル吸着剤（モード：逆相、品名：ＩｎｅｒｔＳｅｐ  Ｃ８、サイズ：５ｇ／２０ｍＬ、ＧＬサイエンス社製）に吸引下（約５０秒）、通液させ、１２ｍＬ端切り後、１８ｍＬを採液し、測定溶液とした。
測定溶液を高速液体クロマトグラフィーにて分析した。チャートを図３に示す。
【００２９】
比較例１
実施例１で用いたコーヒー液を吸着剤処理せずに、高速液体クロマトグラフィーにて分析した。チャートを図４に示す。
【００３０】
比較例２
実施例１で用いたコーヒー液を、実施例１と同様に一次希釈及び二次希釈を行い、二次希釈液を親水性吸着剤であるシリカゲル吸着剤（モード：順相、品名：メガボンドエルートＳＩ、サイズ：５ｇ／２０ｍＬ、バリアン社製）に吸引下（約５０秒）、通液させ、１２ｍＬ端切り後、１８ｍＬを採液し、測定溶液とした。
測定溶液を高速液体クロマトグラフィーにて分析した。チャートを図５に示す。
【００３１】
図１〜３では、低極性のピークがきれいに除去されているのに対し、図４では低極性のピークが取れておらず、また、図５では、低極性のピークが残っており、クロロゲン酸類が減少していることがわかる。
【００３２】
実施例４
調製例１で調製したＬ３４／１６．５コーヒー液をそれぞれ０．７ｇ精秤後、実施例１と同様に一次希釈、二次希釈、及び前記メガボンドエルートＣ１８による吸着処理を行い、測定溶液を得た。測定溶液について、前記の通り吸光度（Ａｂｓ）を測定した。得られた吸光度より、標準試料により作成した検量線を用いてクロロゲン酸類濃度を求め、さらに希釈倍率を掛けることによりコーヒー液中のクロロゲン酸類濃度を決定した。
図６に、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対する本発明の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す。
【００３３】
比較例３
調製例１で調製したＬ３４／１６．５コーヒー液をそれぞれ０．７ｇ精秤後、実施例１と同様に一次希釈及び二次希釈を行い、吸着剤処理を行わずに測定溶液とした。測定溶液について、前記の通り吸光度（Ａｂｓ）を測定し、実施例４と同様にコーヒー液中のクロロゲン酸類濃度を決定した。
図７に、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対する本発明の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す。
【００３４】
実施例５
調製例２で調製したＬ２２コーヒー液をそれぞれ０．８ｇ精秤後、実施例１と同様に一次希釈及び二次希釈、及び前記メガボンドエルートＣ１８による吸着処理を行い、測定溶液を得た。測定溶液について、前記の通り吸光度（Ａｂｓ）を測定し、実施例４と同様にコーヒー液中のクロロゲン酸類濃度を決定した。
図８に、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対する本発明の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す。
【００３５】
比較例４
調製例２で調製したＬ２２コーヒー液をそれぞれ０．８ｇ精秤後、実施例１と同様に一次希釈及び二次希釈を行い、吸着剤処理を行わずに測定溶液とした。測定溶液について、前記の通り吸光度（Ａｂｓ）を測定し、実施例４と同様にコーヒー液中のクロロゲン酸類濃度を決定した。
図９に、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対する本発明の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す。
【００３６】
実施例６
調製例３で調製したＬ１６．５コーヒー液をそれぞれ１ｇ精秤後、実施例１と同様に一次希釈、二次希釈、及び前記メガボンドエルートＣ１８による吸着処理を行い、測定溶液を得た。測定溶液について、前記の通り吸光度（Ａｂｓ）を測定し、実施例４と同様にコーヒー液中のクロロゲン酸類濃度を決定した。
図１０に、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対する本発明の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す。
【００３７】
比較例５
調製例３で調製したＬ１６．５コーヒー液をそれぞれ１ｇ精秤後、実施例１と同様に一次希釈及び二次希釈を行い、吸着剤処理を行わずに測定溶液とした。測定溶液について、前記の通り吸光度（Ａｂｓ）を測定し、実施例４と同様にコーヒー液中のクロロゲン酸類濃度を決定した。
図１１に、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対する本発明の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す。
【００３８】
実施例４〜６、比較例３〜５に示されるように、疎水性吸着剤処理により分析値のバラツキが処理を行わないものに比べて減少し、測定精度が向上していることが示される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１の測定溶液の高速液体クロマトグラフィーチャートである。
【図２】実施例２の測定溶液の高速液体クロマトグラフィーチャートである。
【図３】実施例３の測定溶液の高速液体クロマトグラフィーチャートである。
【図４】比較例１の測定溶液の高速液体クロマトグラフィーチャートである。
【図５】比較例２の測定溶液の高速液体クロマトグラフィーチャートである。
【図６】調製例１で調製したＬ３４／１６．５コーヒー液について、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対し、実施例４の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す図である。
【図７】調製例１で調製したＬ３４／１６．５コーヒー液について、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対し、比較例３の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す図である。
【図８】調製例２で調製したＬ２２コーヒー液について、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対し、実施例５の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す図である。
【図９】調製例２で調製したＬ２２コーヒー液について、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対し、比較例４の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す図である。
【図１０】調製例３で調製したＬ１６．５コーヒー液について、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対し、実施例６の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す図である。
【図１１】調製例３で調製したＬ１６．５コーヒー液について、ＨＰＬＣで求めたクロロゲン酸類濃度に対し、比較例５の方法により求めたクロロゲン酸類濃度をプロットした結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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