(57)【要約】【課題】エフェクターの生体膜を通した移送を容易にすることができるアミノ酸配列を提供することを課題とする。【解決手段】上記課題は、多量体トランスポーターペプチドを提供することによって、解決された。この多量体トランスポーターペプチドは、［Ｐ］ｖ−［スペーサー］ｘ−コア−［リンカー］ｙ−［レポーター］ｚの式を有し、ここでＰは、（ＸｍＲＸｏＲＸｎ）、（ＸｍＲＲＲＸｎ）、（ＸｍＲＲＸＲＸｎ）および（ＸｍＲＸＲＲＸｎ）からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を含むトランスポーターペプチド、Ｘは非塩基性アミノ酸、ｍは０〜１４の整数、ｎはｍとは独立に０と１４との間の整数、ｏはｍおよびｎとは独立に０と５との間の整数、ｖは２〜８の整数、ｘ、ｙおよびｚは独立に０または１、各Ｐは同じでも異なっていてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載のトランスポーターペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は分子生物学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
対象物質を外部培地から細胞内、特に細胞核へ効率的に移入することを可能にする技術
は、バイオテクノロジーの分野において極めて重要である。このような技術は、タンパク
質もしくはペプチド産生、遺伝子発現の調節、細胞内シグナル伝達チャネルの解析、およ
び細胞（もしくは細胞核）内への種々多様な物質の移送効果の解析に有用であり得る。現
在利用できる技術は、移入用ベクターに対し、生物活性のある物質を宿主細胞の細胞質（
もしくは核）内に移入させて、宿主ゲノムに影響を与えずに、またはこの活性物質の生物
学的性質を変えずに処理することができないことにより制約を受ける場合が多い。
【０００３】
以前は、高分子活性物質の細胞内への導入は、この移送すべき物質のサイズおよび生化
学的性質によって制約されていた。しかしながら、最近、トランスポーターペプチドもし
くはタンパク質を用いることにより、この分野に進歩がもたらされた。例えば、Ｓｃｈｗ
ａｒｚｅとその共同研究者は、複合ペプチドもしくはタンパク質を組織の細胞内へ、およ
び血液−脳関門を通過させて移送させることができるＨＩＶ、ＴＡＴ４８−５７由来１０
マーのペプチドについて報告している（非特許文献１参照）。この複合ペプチドもしくは
タンパク質は、エンドサイトーシスを伴わないタンパク質導入プロセスにより細胞に吸収
されるものと考えられている。この発見により、生物医学研究および患者体内への薬物の
直接的な送達に新しい方法論の突破口が開かれた。しかしながら、この方法の１つの重要
な制限は、これらのタイプのトランスポーターに細胞特異性がないことである。従って、
標的としない正常な組織との相互作用により有害な副作用が生じるため、こうした非特異
的トランスポーターペプチドの多くは、有用性に制限がある。このような制限は、糖尿病
などの慢性疾患の処置において特に問題となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  285：1573（1999）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
薬物および治療剤をペプチド移送を介して細胞内に送達するための、種々の細胞型を特
異的に標的とするための効率的で安全な組成物および方法は、当該分野でなお求められて
いる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、生体膜を通過して移行することができるトランスポーターペプチドを提供す
る。また、本発明は、エフェクターに対し生体膜を通過させて移行させるこのようなトラ
ンスポーターペプチドを使用する方法に関する。このトランスポーターペプチドは単体も
しくは多量体であり得る。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
式Ｉ、
［Ｐ］ｖ−［スペーサー］ｘ−コア−［リンカー］ｙ−［レポーター］ｚ    （Ｉ）
による多量体トランスポーターペプチドであって：
ここで、Ｐは
ａ）（ＸｍＲＸｏＲＸｎ）、
ｂ）（ＸｍＲＲＲＸｎ）、
ｃ）（ＸｍＲＲＸＲＸｎ）および
ｄ）（ＸｍＲＸＲＲＸｎ）
からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を含むトランスポーターペプチ
ドであり、
Ｘは非塩基性アミノ酸であり、
ｍは０〜１４の整数であり、
ｎはｍとは独立に０と１４との間の整数であり、
ｏはｍおよびｎとは独立に０と５との間の整数であり、
ｖは２〜８の整数であり、
ｘ、ｙおよびｚは独立に０または１であり、
各Ｐは同じでも異なっていてもよく、該トランスポーターペプチドは生体膜を通過して移
行し得る、トランスポーターペプチド。
（項目２）
項目１に記載のトランスポーターペプチドであって、少なくとも１つのＰがアミノ酸
配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒを有する、トランスポーターペプチド。
（項目３）
項目１に記載のトランスポーターペプチドであって、各Ｐが配列番号１〜３４からな
る群から選ばれる、トランスポーターペプチド。
（項目４）
項目１に記載のトランスポーターペプチドであって、ｖが２、４、６および８からな
る群から選ばれる、トランスポーターペプチド。
（項目５）
項目４に記載のトランスポーターペプチドであって、ｖが４である、トランスポータ
ーペプチド。
（項目６）
項目４に記載のトランスポーターペプチドであって、ｖが８である、トランスポータ
ーペプチド。
（項目７）
項目１に記載のトランスポーターペプチドであって、前記スペーサーがスクシンイミ
ジル−ポリエチレングリコールである、トランスポーターペプチド。
（項目８）
項目１に記載のトランスポーターペプチドであって、前記コアがＣ４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（
ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、Ｃ−ＧＧＧ−［Ｋ（Ｃ）］３−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ
−Ｓ）−アミド、（ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ）４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）−アミド
および（ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ）８−Ｋ４Ｋ２Ｋ−Ｋ（ＧＧＧ）−アミドからなる群から選
ばれる、トランスポーターペプチド。
（項目９）
エフェクターと結合体化されている項目１に記載のトランスポーターペプチドを含む
、トランスポーターユニット。
（項目１０）
式ＩＩ：
（［Ｐ］ｖ−［スペーサー］ｘ−コア−［リンカー］ｙ−［レポーター］ｚ）・Ｅ    
（ＩＩ）
のトランスポーターユニットであって：
ここで、Ｅはエフェクターであり、
Ｐは
ｅ）（ＸｍＲＸｏＲＸｎ）、
ｆ）（ＸｍＲＲＲＸｎ）、
ｇ）（ＸｍＲＲＸＲＸｎ）および
ｈ）（ＸｍＲＸＲＲＸｎ）
からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を含むトランスポーターペプチド
であり、
Ｘは非塩基性アミノ酸であり、
ｍは０〜１４の整数であり、
ｎはｍとは独立に０と１４との間の整数であり、
ｏはｍおよびｎとは独立に０と５との間の整数であり、
ｖは２〜８の整数であり、
ｘ、ｙおよびｚは独立に０もしくは１であり、
各Ｐは同じでも異なっていてもよいものとし、ならびに該トランスポーターペプチドは生
体膜を通過して移行し得る、トランスポーターユニット。
（項目１１）
項目１０に記載のトランスポーターユニットであって、少なくとも１つのＰがアミノ
酸配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒを有する、トランスポーターユニット。
（項目１２）
項目１０に記載のトランスポーターユニットであって、各Ｐが配列番号１〜３４から
なる群から選ばれる、トランスポーターユニット。
（項目１３）
項目１０に記載のトランスポーターユニットであって、ｖが２、４、６および８から
なる群から選ばれる、トランスポーターユニット。
（項目１４）
項目１３に記載のトランスポーターユニットであって、ｖが４である、トランスポー
ターユニット。
（項目１５）
項目１３に記載のトランスポーターユニットであって、ｖが８である、トランスポー
ターユニット。
（項目１６）
項目１０のトランスポーターユニットであって、該コアがＣ４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃ
ｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、Ｃ−ＧＧＧ−［Ｋ（Ｃ）］３−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）
−アミド、（ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ）４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）−アミドおよび
（ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ）８−Ｋ４Ｋ２Ｋ−Ｋ（ＧＧＧ）−アミドからなる群から選ばれる
、トランスポーターユニット。
（項目１７）
項目１０に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターが前記リン
カーに共有結合により融合されている、トランスポーターユニット。
（項目１８）
項目１０に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターが核酸、ペ
プチドおよび薬学的に活性な薬剤からなる群から選ばれる、トランスポーターユニット。
（項目１９）
項目１８に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターが核酸であ
る、トランスポーターユニット。
（項目２０）
項目１９に記載のトランスポーターユニットであって、前記核酸がＤＮＡである、ト
ランスポーターユニット。
（項目２１）
項目１９に記載のトランスポーターユニットであって、前記核酸がＲＮＡである、ト
ランスポーターユニット。
（項目２２）
項目１８に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターがペプチド
である、トランスポーターユニット。
（項目２３）
項目１８に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターが薬学的に
活性な薬剤である、トランスポーターユニット。
（項目２４）
項目２３に記載のトランスポーターユニットであって、前記薬学的に活性な薬剤が、
毒素、抗生物質、抗病原体剤、抗原、抗体断片、免疫調節剤、酵素および治療剤からなる
群から選ばれる、トランスポーターユニット。
（項目２５）
項目１０に記載のトランスポーターユニットであって、各ペプチドが５０アミノ酸長
未満である、トランスポーターユニット。
（項目２６）
項目１０に記載のトランスポーターユニットであって、各ペプチドが２５アミノ酸長
未満である、トランスポーターユニット。
（項目２７）
項目１０に記載のトランスポーターユニットであって、各ペプチドが１５アミノ酸長
未満である、トランスポーターユニット。
（項目２８）
項目１０に記載のトランスポーターユニットであって、移行が膵Ｂ細胞、肝細胞、結
腸細胞、筋肉細胞および肺細胞からなる群から選ばれる組織内へ行われる、トランスポー
ターユニット。
（項目２９）
項目１２に記載のトランスポーターユニットを膵β細胞の膜を通過させて移行させる
方法であって、少なくとも１種のトランスポーターペプチドが配列番号１〜６からなる群
から選ばれる、方法。
（項目３０）
項目２９に記載の方法であって、少なくとも１種のトランスポーターペプチドが配列
番号１である、方法。
（項目３１）
項目１２に記載のトランスポーターユニットを肝細胞の膜を通過させて移行させる方
法であって、少なくとも１種のペプチドが配列番号７〜１０からなる群から選ばれる、方
法。
（項目３２）
項目１２に記載のトランスポーターユニットを結腸細胞の膜を通過させて移行させる
方法であって、少なくとも１種のペプチドが配列番号１１である、方法。
（項目３３）
項目１２に記載のトランスポーターユニットを筋肉細胞の膜を通過させて移行させる
方法であって、少なくとも１種のペプチドが配列番号１２〜２０からなる群から選ばれる
方法。
（項目３４）
項目１２に記載のトランスポーターユニットを肺細胞の膜を通過させて移行させる方
法であって、少なくとも１種のペプチドが配列番号２１〜３４からなる群から選ばれる方
法。
（項目３５）
治療的もしくは予防的に有効な量の項目１０に記載のトランスポーターユニット、お
よび薬学的受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３６）
項目１に記載の該トランスポーターペプチドとエフェクターとの間で移行可能な結合
体を生成する方法であって、該エフェクターを該トランスポーターペプチドに結合させて
トランスポーターペプチド−エフェクター結合体を形成することを含む方法。
（項目３７）
エフェクターを真核細胞の細胞質および核の中へ移行させる方法であって、
該エフェクターを項目１に記載のトランスポーターペプチドに結合させてトランスポ
ーターペプチド−エフェクター結合体を形成する工程、および
該トランスポーターペプチド−エフェクター結合体を該細胞に導入する工程
を包含する、方法。
（項目３８）
項目３７に記載の方法であって、該導入工程が、前記トランスポーターペプチド−エ
フェクター結合体の存在下で細胞培養物をインキュベートすることにより、または前記ト
ランスポーターペプチド−エフェクター結合体を前記細胞内に注入することにより達成さ
れる方法。
（項目３９）
項目３７に記載の方法であって、該真核細胞がヒト細胞である、方法。
（項目４０）
項目３７に記載の方法であって、該真核細胞がβ細胞である、方法。
（項目４１）
真核細胞内のエフェクターの細胞内濃度を増大させる方法であって、
該エフェクターを項目１に記載のトランスポーターペプチドに結合させてトランスポ
ーターペプチド−エフェクター結合体を形成する工程、および
該真核細胞の活性な代謝を促進する条件の下、該トランスポーターペプチド−エフェク
ター結合体の存在下で該細胞をインキュベートする工程
を包含する、方法。
（項目４２）
項目４１に記載の方法であって、前記真核細胞がヒト細胞である、方法。
（項目４３）
１つ以上の容器に項目３５に記載の治療的もしくは予防的に有効な量の該薬学的組成
物を含む、キット。
（項目４４）
疾患を処置または予防する方法であって、そのような処置または予防が所望されている
被験体に対し、項目３５に記載の薬学的組成物を該被験体の該疾患を処置または予防す
るのに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
（項目４５）
項目４４に記載の方法であって、該疾患が、糖尿病、結腸癌、呼吸器疾患、神経変性
障害、心臓麻痺、およびウイルス感染症からなる群から選ばれる、方法。
（項目４６）
多量体トランスポーターペプチドであって、各トランスポーターペプチドのアミノ酸配
列が配列番号１〜３４からなる群から選ばれる、トランスポーターペプチド。
【０００７】
一局面として、本発明は、（ＸｍＲＸｏＲＸｎ）、（ＸｍＲＲＲＸｎ）、（ＸｍＲＲＸ
ＲＸｎ）および（ＸｍＲＸＲＲＸｎ）から選ばれ、Ｘが非塩基性アミノ酸であり、ｍが０
〜１４の整数であり、ｎがｍとは独立に０と１４との間の整数であり、ｏがｍおよびｎと
は独立に０と５との間の整数である少なくとも１種のアミノ酸を有するトランスポーター
ペプチドであって、生体膜を通過して移行することができるトランスポーターペプチドを
含む。
【０００８】
一実施形態として、本発明は、アミノ酸配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒを有するトランスポーター
ペプチドを提供する。他の実施形態として、本発明は、配列番号１−３４のうちの任意の
１つのアミノ酸配列を有するトランスポーターペプチドを提供する。種々の別の実施形態
として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素のリガンド由来のもので
ある。さらに他の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵
素の切断部位から得られるものである。
【０００９】
別の局面として、本発明は、各単量体トランスポーターペプチドが（ＸｍＲＸｏＲＸｎ
）、（ＸｍＲＲＲＸｎ）、（ＸｍＲＲＸＲＸｎ）および（ＸｍＲＸＲＲＸｎ）から選ばれ
、Ｘが非塩基性アミノ酸であり、ｍが０〜１４の整数であり、ｎがｍとは独立に０と１４
との間の整数であり、ｏがｍおよびｎとは独立に０と５との間の整数であり、生体膜を通
過して移行することができる２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくはそれ以
上の単量体トランスポーターペプチドを含む多量体トランスポーターペプチドを含む。多
量体トランスポーターペプチド内の個々の単量体トランスポーターペプチドは同一もしく
は異なるものであり得る。
【００１０】
別の実施形態として、本発明は、アミノ酸配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒを有する多量体トランス
ポーターペプチドを提供する。他の実施形態として、本発明は、配列番号１−３４のうち
の任意の１つのアミノ酸配列を有する多量体トランスポーターペプチドを提供する。種々
の他の実施形態として、この多量体トランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素の
リガンド由来のものである。さらに別の実施形態として、この多量体トランスポーターペ
プチドは、タンパク質転換酵素の切断部位から得られるものである。
【００１１】
一部の実施形態として、この多量体トランスポーターペプチドは、スペーサー部分およ
びリンカー部分を含む。好ましくは、このスペーサー部分およびリンカー部分は、可動性
、両親媒性、非免疫原性、およびタンパク質分解酵素に対し非感受性である。このリンカ
ーは、例えば、ポリエチレングリコールであり得る。
【００１２】
他の実施形態として、この単量体もしくは重合体トランスポーターペプチドは、レポー
ター基を含むことができる。本明細書に用いている「レポーター基」とは、検出可能な任
意の基である。非限定的な例としては、放射性同位体、蛍光性部分、リン光性部分、化学
発光性部分、および量子ドットが挙げられる。その他のレポーター基としては、ビオチン
、シンテイン、ヒスチジン、赤血球凝集素、ｍｙｃもしくはフラッグ・タグが挙げられる
。
【００１３】
一部の実施形態として、本発明のトランスポーターペプチドは、式Ｉ：
［Ｐ］ｖ−［スペーサー］ｘ−コア−［リンカー］ｙ−［レポーター］ｚ    （Ｉ）
によって表され、式中、Ｐは前述のコンセンサスモチーフ（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｍｏｔ
ｉｆ）（ＸｍＲＸｏＲＸｎ）、（ＸｍＲＲＲＸｎ）、（ＸｍＲＲＸＲＸｎ）および（Ｘｍ
ＲＸＲＲＸｎ）に包含されるペプチドである。例えば、このペプチドは、配列Ｘ１−Ｘ２
−Ｘ３−Ｘ４を含むことができ、式中、Ｘ１およびＸ４はＲもしくはＫであり得、Ｘ１お
よびＸ４は任意のアミノ酸であり得る。一実施形態として、本発明は、アミノ酸配列Ｒ−
Ｘ−Ｘ−Ｒを有する少なくとも１種のペプチドを含む多量体トランスポーターを提供する
。他の実施形態として、本発明は、配列番号１−３４のうちの任意の１つのアミノ酸配列
を有する少なくとも１種のペプチドを含む多量体トランスポーターを提供する。種々の実
施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素のリガンド由来の
ものである。さらに他の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質
転換酵素の切断部位から得られるものである。ｖによって表される所与のトランスポータ
ー内のペプチド数は、整数とする。単量体トランスポーターでは、ｖは１である。多量体
トランスポーターでは、ｖは２〜８以上の整数とする。任意の所与の多量体結合体におい
て、それぞれのペプチドは互いに同じであっても異なっていてもよい。
【００１４】
単量体のトランスポーター構築物では、コアは存在していてもしていなくてもよいもの
とする。
【００１５】
ペプチドとコアとの間のスペーサーは存在していてもしていなくてもよく、従って、ｘ
は０または１である。好ましいスペーサーは可動性、両親媒性、非免疫原性、およびタン
パク質分解酵素に対し非感受性であり、例えば、スクシンイミジル−ＰＥＧ（ｓｕｃｃ−
ｐｅｇ）などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００１６】
本明細書に用いている「コア」とは、リンカー、スペーサーおよびレポーター基の接続
ポイントとなる構造体である。また、コアは多量体トランスポーター内のペプチド間を結
合する役割を果たす。一部の実施形態として、このコアを分枝型とすることによって多く
のペプチドを同一トランスポーターユニット内で結合させることができる。通常、コアに
対し結合に利用可能な多くの官能性を持たせることによって、この多量体構築物の種々の
異なる部分（ペプチド、ならびに存在する場合にはスペーサー、リンカーおよびレポータ
ー）をこのコアと融合させて１つの分子を形成させることができる。企図しているコア部
分としては、以下に詳細を説明するポリリジン（Ｋ）が挙げられ、また、リンカーの組み
込まれた構造のものも挙げられる。コアを選択することにより、所与の結合体内に存在す
るペプチドの数が決まる。代表的なコアとしては、Ｃ４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ
−Ｓ）−アミド、Ｃ−ＧＧＧ−［Ｋ（Ｃ）］３−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、
（ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ）４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）−アミドおよび（ＮＨ２Ｏ
ＣＨ２ＣＯ）８−Ｋ４Ｋ２Ｋ−Ｋ（ＧＧＧ）−アミドが挙げられる。
【００１７】
多量体のトランスポーター構築物では、リンカーおよびレポーター基は存在していても
していなくてもよく、従って、ｙおよびｚは、式Ｉにおいて独立に１もしくは０である。
【００１８】
本明細書に用いている「トランスポーターペプチド」とは、物質が生体膜を通過して移
行するのを容易にするペプチドである。特に明記しない限り、または用いる文脈において
不正確でない限り、トランスポーターペプチドを意味するものは単量体もしくは多量体の
トランスポーターペプチドを包含する。
【００１９】
一部の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、１つ以上のエフェクターと
融合させる。「エフェクター」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、または薬学
的に活性な薬剤、例えば、毒素、抗生物質、抗病原体剤（ａｎｔｉｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ
ａｇｅｎｔ）、抗原、抗体、抗体断片、免疫調節剤、酵素もしくは治療剤などを含む任
意の適切な分子であり得る。２つ以上のエフェクターが存在する場合、これらのエフェク
ターは同一もしくは異なるものであり得る。
【００２０】
「融合」もしくは「融合した」という用語は、何らかの第３の分子よりも互いを好む２
種以上の分子をもたらすような特定の相互作用全てを含むものである。これには、共有結
合、イオン結合、疎水性結合、水素結合などの作用が含まれるが、溶媒選択性などの非特
異的結合は含まれない。
【００２１】
本発明の多量体結合体は、式（ＩＩ）：
（［Ｐ］ｖ−［スペーサー］ｘ−コア−［リンカー］ｙ−［レポーター］ｚ）・Ｅ    
（ＩＩ）
によって表すことができ、式中、Ｐ、コア、スペーサー、リンカー、レポーター、ｖ、ｘ
、ｙおよびｚは前記の通りであり、Ｅはエフェクターである。共有結合により融合させた
結合体では、化学の法則通りに、エフェクターはコア、もしくはリンカー、またはこれら
の両方に結合させることができる。
【００２２】
本明細書に用いている「結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」もしくは「結合体化（ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｉｏｎ）」とは、エフェクターと単量体もしくは多量体トランスポーターペプ
チドとの間の物理的な結合を可能にするあらゆるタイプの相互作用のことを意味する。こ
の結合の性質は、共有もしくは非共有結合であり得るが、その結合は、細胞移行の前もし
くは移行中に結合体が解離しないように十分強力なものである必要がある。結合体化は、
当業者に公知の任意の化学的、生化学的、酵素的もしくは遺伝子的カップリング法を用い
て達成することができる。目的のエフェクターは、トランスポーターペプチドのＮ末端も
しくはＣ末端にカップリングまたは融合させることができる。一部の実施形態として、こ
のエフェクターは、リンカー基に、もしくは直接コアに、またはレポーター基にカップリ
ングあるいは融合させる。
【００２３】
種々の実施形態として、単量体および／または多量体トランスポーターペプチドは、長
さをアミノ酸長として５０個未満、２５個未満もしくは１５個未満であり得る。
【００２４】
さらなる実施形態として、移行は膵Ｂ細胞、肝細胞、大腸細胞、筋肉細胞および／また
は肺細胞内で行われる。
【００２５】
別の実施形態として、本発明は、トランスポーターペプチドを生体膜を通過させて移行
させる方法を含む。例えば、配列番号１−６の配列のうちの１種以上を含む単量体もしく
は多量体ペプチドは膵Ｂ細胞の膜を通過させて移行させることができ、配列番号７−１０
の配列のうちの１種以上を含む単量体もしくは多量体ペプチドは肝細胞の膜を通過させて
移行させることができ、配列番号１１のペプチドうちの１種以上を含む単量体もしくは多
量体ペプチドは大腸細胞の膜を通過させて移行させることができ、配列番号１２−２０の
配列のうちの１種以上を含む単量体もしくは多量体ペプチドは筋肉細胞の膜を通過させて
移行させることができ、および配列番号２１−３４の配列のうちの１種以上を含む単量体
もしくは多量体ペプチドは肺細胞の膜を通過させて移行させることができる。
【００２６】
なおさらなる実施形態として、本発明は、１種以上のエフェクターに結合させた単量体
もしくは多量体トランスポーターペプチドであるトランスポーターユニットを含む。種々
の他の実施形態として、このエフェクターは核酸、ペプチドもしくは薬学的に活性な薬剤
であり得る。
【００２７】
さらに別の実施形態として、本発明は、トランスポーターペプチドと１種以上のエフェ
クターとの間で移行可能な単量体もしくは多量体結合体を作製し、従ってトランスポータ
ーペプチド−エフェクター結合体を形成する方法を含む。
【００２８】
別の実施形態として、本発明は、エフェクターを単量体もしくは多量体トランスポータ
ーペプチドに結合させて真核細胞内に導入することによる、真核細胞の細胞質および／ま
たは核内に１種以上のエフェクターを移行させる方法を含む。例えば、このトランスポー
ターペプチド−エフェクター結合体は、この結合体の存在下で培養細胞をインキュベート
することにより、またはこの結合体を細胞内に注入することにより細胞内に導入すること
ができる。
【００２９】
種々の他の実施形態として、本発明は、エフェクターを単量体もしくは多量体のトラン
スポーターペプチドに結合させ、細胞の活性状態の代謝を亢進させる条件の下、この細胞
の存在下にインキュベートすることによる、真核細胞におけるエフェクターの細胞内濃度
を上昇させる方法を含む。本発明の好ましい実施形態は、この真核細胞としてヒト細胞を
使用することを含む。
【００３０】
さらなる実施形態として、本発明は、治療的もしくは予防的に有効な量の単量体もしく
は多量体トランスポーターユニット、および薬学的に受容可能な担体を含む薬学的組成物
を含む。
【００３１】
好ましい「薬学的組成物」としては、ａ）希釈剤、例えば、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マ
ンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）滑沢剤、例えば、
シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩および／または
ポリエチレングリコール；また、錠剤用としてｃ）結合剤、例えば、ケイ酸マグネシウム
・アルミニウム、でんぷん糊、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン；必要に応じてｄ）崩壊
剤、例えば、でんぷん、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩もしくは発泡性混合物
；ならびに／あるいはｅ）吸収剤、着色剤、矯味矯臭剤および甘味剤とともに有効成分を
含む錠剤およびゼラチンカプセル剤が挙げられる。注射用組成物は、好ましくは等張水溶
液もしくは懸濁液であり、坐剤は脂肪性乳濁液もしくは懸濁液から調製するのが有利であ
る。これらの組成物は、滅菌することができ、および／または保存剤、安定化剤、湿潤剤
または乳化剤などのアジュバント、溶解促進剤、浸透圧調節塩および／または緩衝液を含
むことができる。また、さらに、これらは他の治療上有用な物質を含むこともできる。こ
れらの組成物は、それぞれ、従来の混和、顆粒化またはコーティング法によって調製され
、有効成分を約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％含有する。
【００３２】
なおさらなる実施形態として、本発明は、１個以上の容器が本発明の薬学的組成物を治
療的もしくは予防的有効量で含有するキットを含む。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、疾患の処置もしくは予防を必要とする被験体に対し、疾患を
処置もしくは予防するのに十分な量の薬学的組成物を投与することにより、その疾患を処
置もしくは予防する方法を含む。処置対象の疾患としては、例えば、糖尿病、大腸癌、呼
吸器疾患、神経変性障害、心臓麻痺、および／またはウイルス感染症が挙げられ得る。
【００３４】
別の局面として、本発明は、特定の細胞型に対してファージ・ライブラリをスクリーニ
ングした後、どの細胞がファージを取り込んだかを評価する、トランスポーターペプチド
用ファージ・ライブラリのスクリーニング方法を含む。
【００３５】
別の実施形態として、この方法は、取り込まれたファージのＤＮＡを同定し、これから
発現されるペプチドを推定することを含む。
【００３６】
なおさらなる実施形態として、この方法は、ファージ・ライブラリを少なくとも３サイ
クルにわたって選択するスクリーニング工程を含む。
【００３７】
さらに別の実施形態として、本発明は、ペプチドの多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）デ
ィスプレイを有するファージを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１はオキシム１〜３の構造を示す。コアの分枝Ｌｙｓ残基のαおよびεアミノ基は、ＲＲＴＫペプチドのＮ末端でアシル化（スペーサがあってもなくてもよい）されている。スペーサーと共に、レポータ・タグＦＩＴＣが各構築体のコアに導入されている。
【図２】図２はオキシム４〜６の構造を示す。コアの分枝Ｌｙｓ残基のαおよびεアミノ基は、ＲＲＴＫペプチドのＮ末端でスペーサーを有してアシル化されている。スペーサーと共に、レポータ・タグのビオチンが各構築体のコアに導入されている。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、薬物および治療剤を細胞内へ送達するための、種々の細胞型を特異的に標的
とするペプチドトランスポーターならびにペプチド移送システムを提供する。当該分野で
公知の既存の移送システムには、これらが非効率的で、宿主ゲノムに影響を与え、活性物
質（例えば、エフェクタ）の生物学的性質を変え、標的細胞を殺傷し、あるいは（例えば
、ウイルス性結合体を使用することにより）極めて高いリスクを生じるためヒト対象には
使用できないので、制約がある場合が多い。本発明のペプチド移送システムでは、治療剤
となり得るものを細胞内へ送達するためにプロタンパク質転換酵素およびその特異的なリ
ガンドを用いることによって当該分野で公知のトランスポーターシステムの限界を克服し
ている。本発明のシステムでは、宿主のゲノムに影響を与えず、その他の点でも、非侵襲
性である、変化を受けていない生物活性物質が効率的に送達される。
【００４０】
受容体媒介性のエンドサイトーシスは、細胞内への治療剤の送達を狙った実験系におい
て広く利用されてきた。ＫａｔｏおよびＳｕｇｉｙａｍａ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ
．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ．Ｓｙｓｔ．１４：２８７（１９９７）。従って、細胞特異
的なエンドサイトーシス受容体を首尾良く標的にすることによって、ペプチドを細胞型特
異的に送達することができる。プロタンパク質転換酵素は、受容体媒介性エンドサイトー
シスにより取り込まれる細胞表面受容体の一例である。こうしたタンパク質は、ペプチド
ホルモン、神経ペプチドその他の多くのタンパク質の前駆体をその生物活性のある形に転
換する役割を果たしていることが明らかにされている。プロタンパク質転換酵素ファミリ
ーの切断部位にはコンセンサス配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒが含まれている。発現および局在性に
関する情報は、プロタンパク質転換酵素は細胞外のリガンドを細胞内空間に移送すること
を示す。
【００４１】
例えば、哺乳類のプロタンパク質転換酵素は、その組織分布に基づいて３グループに分
類することができる。１つのクラスのフューリン（Ｆｕｒｉｎ）、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／
ＰＣ６およびＬＰＣＩＰＣ７／ＰＣ８／ＳＰＣ７は広範囲の組織および細胞株において発
現される。第２のクラスの神経内分泌特異的転換酵素ＰＣ２およびＰＣ１／ＰＣ３の発現
は、膵島、下垂体、副腎髄質および多くの脳領域などの内分泌組織に限定されている。さ
らに、第３のクラスのＰＣ４の発現は、精巣の精子形成細胞に高度に制限されている。神
経内分泌特異的転換酵素は、主として分泌顆粒内に局在している。また、ＰＣ５／ＰＣ６
Ａも、分泌顆粒に局在していると報告されている。さらに、間接的な証拠ではあるが、一
部のプロタンパク質転換酵素分子は細胞表面に存在することが示唆されており、フューリ
ンはＴＧＮと細胞表面との間を循環することが明らかにされている。Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐ
ｏｕｌｓｅｎ、ＢＭＪ．３１６：１２２１（１９９８）を参照されたい。
【００４２】
天然リガンドの働きをするように見えるペプチドリガンドは、ファージ・ディスプレイ
法によって同定される場合が多い。効率的な受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導する
ペプチド配列の単離は、ファージ・ディスプレイ法を用いることによって向上する。Ｉｖ
ａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１４４８：４５０、ｐ４
６３（１９９９）を参照されたい。ファージ・ディスプレイ・ライブラリは、細胞受容体
に対する天然リガンドの修飾体を含む変異体分子（Ｃａｂｉｂｂｏら、Ｇｅｎｅ  １６７
：４１（１９９５））および短鎖ペプチド（Ｚｗｉｃｋら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．９：４２７（１９９８））の膨大な供給源となる極めて強力なツールで
ある。また、ライブラリを直接注射したマウスにおいて、脳および腎臓に１３倍の選択性
を示すペプチド配列が首尾良く単離されている。ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌ
ａｈｔｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４（１９９６）ならびにＰａｓｑｕａｌｉｎｉ、
Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １：４２３（１９９６）を参照さ
れたい。
【００４３】
時として、この方法により得られたリガンドは、短鎖ペプチド分子内の立体構造の自由
度が高く接触残基数が少ないため、低親和性（マイクロモル程度）となることがある。ペ
プチドリガンドの結合親和性を改善する１つの方法は、低親和性ペプチドのいくつかのコ
ピーを単一の多量体分子の形に結合させることである。この多量体リガンドの親和力（お
よび生物活性）は、単量体リガンドに対して大きく向上させることができる。一部の実施
形態として、多量体構築物は、オキシム化学を用いて、構築ブロックとしての細胞を標的
とするペプチドから作製する。例えば、このペプチドは、特定の細胞（例えば、膵β細胞
）に特異的に結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスを介してこの細胞による取り込み
を誘発させることができるペプチドリガンドを選択するファージ・ディスプレイ実験から
得ることができる。
【００４４】
例えば、単量体としてのＩｇＭは低親和性タンパク質であるが、５量体の形をとると、
細菌もしくはウイルスの表面に存在する反復性抗原決定基に対する親和力が大きく向上す
る。Ｒｏｉｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂｌａｃ
ｋｗｅｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ），ｐ６５−８４（１９９１）を参照されたい。
【００４５】
同様に、組換えＤＮＡ技術により作製されるタンパク質であるこのペンタボディでは、
１０５倍の向上がみられる。Ａｌｅｘｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ  ９４：１６６３−１６６８（１９９７）。ファージ・ライブラリから得られるポ
リペプチドの低親和性はペンタボディの５量体構造によって補われ、その標的に対する高
い親和力が得られる。
【００４６】
また、最近、Ｒｏｓｅは同様な分子を「ケモボディ（ｃｈｅｍｏｂｏｄｙ）」と名付け
た。ＲｏｓｅおよびＶｉｚｚａｖｏｎａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：７０３
４−７０３８（１９９９）を参照されたい。このケモボディは、相補性構造に非共有結合
することにより抗体分子の働きを模倣することができるペプチドサブユニットの複数のコ
ピーを提示する合成分子である。その結合ペプチドのアミノ酸配列は、ファージ・ライブ
ラリ法により同定され、サブユニット自体そのものは、オキシム化学によって構築された
。また、同時に２つ以上のペプチドサブユニットによって標的に結合することができるよ
うに、適切なスペーサーおよびリンカーもこのケモボディに導入された。Ｒｏｓｅは、可
動性リンカーを有するインフルエンザ・ウイルスのファージ由来ペプチドのコピーを４個
有するモデルケモボディを作製した。
【００４７】
特定の細胞型を選択的に標的とする低分子トランスポーターペプチドは、大きなファー
ジ・ディスプレイ・ライブラリから得て、単量体もしくは多量体トランスポーター分子と
して用いることができる。ファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて得られるような
低分子ペプチド担体の有利な点としては、高品質、高純度、低免疫原性であり、生体の全
ての細胞に極めて効率的に送達することを可能にすることが挙げられる。Ｓｃｈｗａｒｚ
ｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５７３（１９９９）。従って、ペプチド担体では、種
々の高分子を効率的に送達するためのリポソーム、ウイルスなどの従来のトランスポータ
ーを改良することができる可能性がある。例えば、Ｍａｈａｔｏら、Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａ
ｒｇｅｔ．４：３３７（１９９７）、およびＭａｈａｔｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅ
ｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ．Ｓｙｓｔ．１４：１３３  ４：３３７（１９９７）を参
照されたい。
【００４８】
本明細書に記載したトランスポーターペプチドは、種々の疾患の治療に用いられ、この
ような疾患としては、糖尿病が挙げられるが、これに限定されるものではない。正常な生
物体（では、インスリン分泌により正常血糖が維持されるようにβ細胞集団は厳格に制御
されている。β細胞集団は、乳児もしくは成熟生物体の要求に反応して、特に、特定の生
理的および生理病理学的状態への反応として調節されている。β細胞集団の適切性は、基
本的にβ細胞の死と再生との動的バランスによって達成されている。このバランスは、未
熟β細胞の分化および既存のインスリン分泌細胞の増殖によって達成されている。Ｓｃｈ
ａｒｆｍａｎｎおよびＣｚｅｒｎｉｃｈｏｗ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．２２：２
２３（１９９６）ならびにＢｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ
．Ｒｅｓ．４９：９１（１９９４）を参照されたい。Ｉ型糖尿病におけるβ細胞集団の障
害されたバランスは、膵β細胞を標的にする免疫系の特異的攻撃により惹起される過程で
あるβ細胞破壊の促進によって生じる。従って、β細胞破壊の速度を抑制もしくは低下さ
せると、糖尿病が安定化されるばかりではなく、島が再生されてβ細胞集団の機能不全を
是正することも可能となる。
【００４９】
Ｉ型糖尿病の実験モデルにおいてβ細胞の喪失速度を低下させるのに用いられる効力の
あるツールとして数種の化合物を確立した。これらのペプチドの多くは本質的にペプチジ
ルであり、従ってペプチド担体に容易に結合する。本明細書に記載したこれらのペプチド
は、治療用「積み荷（ｃａｒｇｏ）」のデザイン、即ち、治療剤（「エフェクタ」）を担
体（単量体もしくは多量体「トランスポーターペプチド」）とカップリングさせるための
基剤となる。
【００５０】
本発明の移送システムの１つの実施形態は、Ｉ型糖尿病の治療のためにβ細胞の細胞内
メカニズムを標的にしたものである。Ｉ型糖尿病の症状は、免疫系の分泌による膵β細胞
の破壊に続発するものである。Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，ＢＭＪ  ３１６：１２
２１（１９９８）を参照されたい。ヒトおよび齧歯類における結論的なデータは、サイト
カインのインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、マクロファージおよびＴ細胞により
分泌されるＴＮＦαおよびＩＮＦγと共に、β細胞の機能不全および破壊ならびにＩ型糖
尿病をもたらす最終的な転帰の原因となる主要な成分であることを示す。Ｍａｎｄｒｕｐ
−Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３９：１００５（１９９６）、Ｎｅｒｕ
ｐら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １１  Ｓｕｐｐｌ  １：１６（１９８８）、ならび
にＭａｕｒｉｃｉｏおよびＭａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：
１５３７（１９９８）を参照されたい。これらの分泌サイトカインは、膵β細胞において
シグナル伝達およびエフェクター分子の高度に複雑なネットワークに関与している。この
シグナル伝達は、細胞の挙動を改変し、細胞の運命に決定的な影響力を与える。これまで
に蓄積された証拠から、この調節性細胞内ネットワークは新規な治療方法の開発のための
有望な標的となることが分かる。Ｉｗａｈａｓｈｉら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ  
Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：４５（１９９８）、Ｓｊｏｈｏｌｍ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ．Ｄ
ｉｆｆｅｒ．５：４６１（１９９８）、Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．
１０：２９３（１９９７）、Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：１２
２３（１９９９）、Ｂｌｅｉｃｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１４３１（
１９９９）、Ｗｅｌｓｈら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５：１６９（１９９９）、およびＣｈｅｎ
ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：５６２（２０００）を参照されたい。細胞内サイトカイン
・シグナル伝達の処理および形成に関与するこれらの分子はそれぞれ、トランスポーター
−薬物設計の標的とすることができる。
【００５１】
β細胞内でＩＬ−１βによって動員される最も重要なシグナル伝達分子としては、セラ
ミド、プロスタグランジン、熱ショックタンパク質、誘導性ＮＯシンターゼ酵素（ｉＮＯ
Ｓ）、転写因子ＮＦ−κＢ（Ｔｏｒｇｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６０
８４（１９９８）参照）、ならびに３種のＭＡＰキナーゼＥＲＫ１／２、ｐ３８およびＪ
ＮＫがある。これらの分子の多くは、β細胞の生残および機能の改善をもたらした既存の
阻害剤によるブロックの標的である。ｉＮＯＳノックアウト（ＫＯ）マウスはＩＬ−１β
の細胞毒性に対して抵抗性であり（Ｆｌｏｄｓｔｒｏｍら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：７
０６（１９９９）参照）、ｉＮＯＳ作用のブロッカーはＮＯの細胞毒性の種々の側面を抑
制する（Ｓｊｏｈｏｌｍ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．５：４６１（１９９８
）に概説されている）。島および細胞株による研究は、Ｃａ２＋チャネルのブロッカーお
よびカスパーゼ阻害剤は齧歯類のβ細胞死を防止することを示す。Ｗａｎｇら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：１２００（１９９９）、およびＹａｍａｄａら、Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ  ４８：４７８（１９９９）を参照されたい。ｐ３８阻害剤は、グルコース賦活
性インスリン放出のＩＬ−１β媒介性阻害を減弱させる。Ｌａｒｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７３：１５２９４（１９９８）を参照されたい。アンチセンスＧＡＤトラ
ンスジェニックＮＯＤマウスにおいてＧＡＤの発現をβ細胞特異的に抑制すると、自己免
疫性糖尿病が阻止された。Ｙｏｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１１８３（１９９９）
を参照されたい。膵β細胞株においてｂｃｌ−２、ＩＬ−１ＲａおよびＪＢＤ（ｃ−Ｊｕ
ｎ  Ｎ末端キナーゼＪＮＫの優性阻害因子）を発現させると、細胞はアポトーシスに抵抗
性となった。Ｂｏｎｎｙら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：７７−８２（２０００）、Ｉｗａ
ｈａｓｈｉら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３９：５３０（１９９６）、Ｄｕｐｒａｚら
、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１１６０（１９９９）、およびＧｉａｎｎｏｕｋａｋｉｓら
、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：１７３０（１９９９）を参照されたい。以上のデータを総合
すると、特定の手段により細胞内事象を操作することはＩ型糖尿病の治療にかなり有望で
あることを示す。
【００５２】
疾病治療の１つの主要な課題は、生物学的に重要な分子をインビボで有効な細胞透過性
の生物活性化合物に変換することである。Ｇｉｂｂｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１９６
９（２０００）を参照されたい。例えば、β細胞の喪失を防止するための最も有望なツー
ルは、多くの高分子タンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈら、Ｄｉ
ａｂｅｔｅｓ  ４８：１２２３（１９９９）参照）、ドミナントネガティブ型のＭｙＤ８
８、ＴＲＡＦ、ＦＡＤＤもしくはＩＲＡＫ（Ｂｕｒｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７３：１２２０３（１９９８）、およびＳｔｅｐｈｅｎｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ  １４０：３２１９（１９９９）参照）などのサイトカイン・シグナル伝達の阻害因子
、または現在インビボで組織および膵β細胞を含む細胞型に送達させることができないＪ
ＮＫ阻害剤ＪＢＤ２８０（Ａｍｍｅｎｄｒｕｐら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１４６８−
１４７６（２０００）参照）である。
【００５３】
最近の研究は、高分子タンパク質を、細胞および器官に容易に送達させることができる
低分子生物活性化合物に変換する試みの前進を示す。Ｈａｗｉｇｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：８９（１９９９）を参照されたい。これらの方法には基本
的に２つの条件が必要とされる：即ち、１）細胞内に効率的に送達させたい分子に特定の
トランスポーターもしくはその化学的修飾体を結合させること（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ
ｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５７３（１９９９）、Ｂｒｕｇｉｄｏｕら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：６８５（１９９５）、Ｏｅｈ
ｌｋｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４１４：１２７（１９９８）
およびＴｅｒｓｋｉｋｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４
：１６６３（１９９７）に報告されている効率的な短鎖ペプチドトランスポーターを参照
されたい）；２）トランスポーターに低分子ペプチド配列を結合させることができるよう
に、タンパク質の活性部分を狭小化する必要があること。手短に言えば、概してこれらの
条件では、元のタンパク質の不可欠な生物学的性質を保ちながら細胞内に入ることができ
る３〜３０アミノ酸長の二連（ｂｉ−ｐａｒｔｉｔｅ）ペプチドが設定される。癌研究の
場合のように（Ｇｉｂｂｓ、Ｏｌｉｆｆ、Ｃｅｌｌ  ７９：１９３（１９９４）参照）、
β細胞には操作することによりサイトカイン誘発性アポトーシスからβ細胞を保護するこ
とができる多数の細胞内事象があり、こうした操作は薬剤設計の有望な標的となると考え
られる。
【００５４】
受容体媒介性エンドサイトーシスは、細胞内への治療剤の送達を狙った実験系において
広く利用されている。Ｋａｔｏ、Ｓｕｇｉｙａｍａ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒ
ｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ．Ｓｙｓｔ．１４：２８７（１９９７）を参照されたい。エンドサ
イトーシス作用は、ＩｇＧ  Ｆｃ、ソマトスタチン、インスリン、ＩＧＦ−ＩおよびＩＩ
、トランスフェリン、ＥＧＦ、ＧＬＰ−１、ＶＬＤＬもしくはインテグリン受容体を含む
多くの受容体について報告されている共通的性質である。Ｈｏｆｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．
Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ．１１１：６３（１９９９）、Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５３：Ｓ６３（１９８９）
、Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５７１３（１９９０）、Ｓｍｉｔｈ
およびＪａｒｅｔｔ、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：６１３（１９８８）、Ｓｏｌｅｒら
、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２７：５９５（１９９０）、Ｗｉｄｍａｎｎら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０：２０３（１９９５）、Ｙｏｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７４：１１６４（１９９９）、およびＭｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ
．７７：７５９（１９９７）を参照されたい。エンドサイトーシスを媒介する細胞型特異
的受容体についても報告されている。Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４４８：４６３（１９９９）を参照されたい。
【００５５】
強い実験的バックグラウンドは、膵β細胞を選択的に標的にするトランスポーターペプ
チドが大きなファージ・ディスプレイ・ライブラリから得られることも考えられることを
示しているが、そのような試みについては報告されていない。ファージ・ディスプレイ・
ライブラリを用いて得られるような低分子ペプチド担体の利点は数多くあり、例えば、化
学合成による作製が容易であること、高品質、高純度、低免疫原性であること、および生
物体の全ての細胞に極めて効率的に送達することが可能であることが挙げられる。Ｓｃｈ
ｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５７３（１９９９）を参照されたい。従って
、本発明のペプチド担体には、多くの高分子の効率的な送達において、リポソームもしく
はウイルスなどの従来のトランスポーターよりもうまく機能する可能性がある。例えば、
Ｍａｈａｔｏら、Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  ４：３３７（１９９７）およびＭａｈａ
ｔｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ．Ｓｙｓｔ．１４：１
３３（１９９７）を参照されたい。
【００５６】
ファージ・ペプチド・ライブラリは、従来より、線維状ファージＭ１３の誘導体として
構築されている。ペプチド・ライブラリは、このペプチドモチーフの１〜５個のコピーを
提示するキャプシドのマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩに融合される。Ｚｗｉｃｋら、
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４２７（１９９８）を参照されたい。
あるいは、メジャーコートタンパク質ｐＶＩＩＩを用いることによって高価（ｈｉｇｈ−
ｖａｌｅｎｔ）提示（ｄｉｓｐｌａｙ）が達成される。しかしながら、これらのタイプの
ライブラリは、受容体媒介性エンドサイトーシスペプチド配列の単離のために最適化され
ていない。高い内部移行効率を有する担体を回収することに関連して考慮すべき事柄は以
下の通りである：１）ペプチドの１価もしくは低価（ｌｏｗ−ｖａｌｅｎｔ）提示は、線
維状ファージのような大きな構造体を効率的に取り込ませるには基本的に不十分であるが
、多価提示では効率的取り込みが可能となること（Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４４８：４５０（１９９９）参照）；および２）受容
体結合リガンドが内部移行が、原形質膜の特定領域における細胞表面受容体の濃縮、続く
クラスリン被覆小胞の形成に関連すること（Ｄａｍｋｅ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８９：
４８（１９９６））。
【００５７】
Ｍ１３誘導体のサイズは大きく（１〜１．５μｍ）（Ｚａｃｈｅｒら、Ｇｅｎｅ  ９：
１２７（１９８０）参照）、古典的なクラスリン被覆ピットの通常サイズ（１５０ｎＭ）
を上回る。クラスリン被覆ピットは、膜表面の約２％を占める原形質膜上の陥入構造体で
ある。この特殊な構造は、インスリン、ＥＧＦなどの細胞外タンパク質もしくはペプチド
を１０〜５０％／分という極めて速い速度で除去する高度に効率的な受容体媒介性内部移
行プロセスを指向する。Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７７：７５９
（１９９７）を参照されたい。従って、従来のＭ１３ファージでは、こうした特殊で高度
に効率的な構造による受容体媒介性内部移行が行われるとは考えられない。
【００５８】
従って、報告されている試みでは、ペプチド担持ファージが高い内部移行率を示すペプ
チドは得られていない。これまで、こうした研究から、特定の細胞型に特異的なコンセン
サス取り込みモチーフは出現していない。
【００５９】
一部の局面として、本明細書に開示した本発明は、ペプチド担持エフェクターの取り込
みを促進するトランスポーターペプチドの同定に関する。一旦このペプチド配列が決まる
と、このペプチドをエフェクター分子に結合させることによりエフェクター分子を生体膜
を通過させて移送させる。例えば、ファージ・ディスプレイ・パニングにより膵インスリ
ン分泌β細胞を標的にする一連のペプチドを単離した。こうした細胞を標的にするペプチ
ドを構築ブロックとする単量体もしくは多量体構築物を合成した。これらの構築物は、治
療剤を特異的に送達して糖尿病をコントロールするように設計した新規化学物質である。
【００６０】
本発明のトランスポーターペプチドは式Ｉで表すことができる：
［Ｐ］ｖ−［スペーサー］ｘ−コア−［リンカー］ｙ−［レポーター］ｚ    （Ｉ）
式中、Ｐは前述のコンセンサス配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｍｏｔｉｆ）（ＸｍＲＸｏＲ
Ｘｎ）、（ＸｍＲＲＲＸｎ）、（ＸｍＲＲＸＲＸｎ）および（ＸｍＲＸＲＲＸｎ）に包含
されるペプチドである。例えば、このペプチドは、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４を含むこ
とができ、式中、Ｘ１およびＸ４はＲもしくはＫとすることができ、Ｘ１およびＸ４は任
意のアミノ酸とすることができる。一実施形態として、本発明は、アミノ酸配列Ｒ−Ｘ−
Ｘ−Ｒを有する少なくとも１種のペプチドを含む多量体トランスポーターを提供する。別
の実施形態として、本発明は、配列番号１−３４のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有
する少なくとも１種のペプチドを含む多量体トランスポーターを提供する。種々の別の実
施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素のリガンド由来の
ものである。さらに別の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質
転換酵素の切断部位から得られるものである。ｖによって表される所与のトランスポータ
ー内のペプチド数は、整数とする。単量体トランスポーターでは、ｖは１である。多量体
トランスポーターでは、ｖは２〜８またはそれ以上の整数とする。任意の所与の多量体結
合体において、それぞれのペプチドは互いに同じか、異なるものとすることができる。
【００６１】
ペプチドとコアとの間のスペーサーは存在していてもしていなくてもよく、従って、ｘ
は１または０である。好ましいスペーサーは可動性、両親媒性、非免疫原性、およびタン
パク質分解酵素に対し非感受性であり、例えば、スクシンイミジル−ポリエチレングリコ
ール（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００６２】
本明細書に用いている「コア」とは、多量体トランスポーターペプチド内のペプチド間
を結合する役割を果たす構造体である。また、コアは、リンカー、スペーサーおよびレポ
ーター基の接続ポイントとなる。通常、コアに対し結合に利用可能な多くの機能性を持た
せることによって、この多量体構築物の種々の異なる部分（ペプチド、および存在する場
合にはスペーサー、リンカーおよびレポーター）をこのコアと融合させて１つの分子を形
成させることができる。企図しているコア部分としては、以下に詳細を説明するポリリジ
ン（Ｋ）が挙げられ、また、リンカーの組み込まれた構造のものも挙げられる。コアを選
択することにより、所与の結合体内に存在するペプチドの数が決まる。代表的なコアとし
ては、Ｃ４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、Ｃ−ＧＧＧ−［Ｋ（Ｃ）］
３−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、（ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ）４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（ｓ
ｕｃｃ−ｐｅｇ）−アミドおよび（ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ）８−Ｋ４Ｋ２Ｋ−Ｋ（ＧＧＧ）
−アミドが挙げられる。単量体トランスポーターペプチドでは、コアは存在していてもし
ていなくてもよい。
【００６３】
このトランスポーター構築物では、リンカーおよびレポーター基は存在していてもして
いなくてもよく、従って、ｙおよびｚは、式Ｉにおいて独立に１もしくは０である。
【００６４】
本明細書に用いている「トランスポーターペプチド」とは、物質が生体膜を通過して移
行するのを促進するペプチドである。特に明記しない限り、または用いる文脈において不
正確でない限り、トランスポーターペプチドを意味するものは単量体もしくは多量体のト
ランスポーターペプチドを包含する。
【００６５】
トランスポーターペプチドは、物質が細胞の生体膜を横切って、特にその細胞質もしく
は核内へ通過または移行するのを容易にするペプチドである。移行の検出は、例えば、Ｐ
ＣＴ出願第ＷＯ９７／０２８４０号に記載されている細胞透過アッセイ（ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を含む種々の方法によって行うことができる
。一般に、細胞透過アッセイは、ａ）培養細胞を、移行させるペプチドとインキュベート
し、ｂ）この細胞を固定して透過処理し、およびｃ）細胞内のペプチドの有無を検出する
ことによって実施する。検出工程は、固定、透過処理した細胞をこのペプチドに対する標
識抗体とインキュベートした後、ペプチドと標識抗体との免疫反応を検出することによっ
て行うことができる。あるいは、検出可能な標識ペプチドを用い、細胞コンパートメント
内の標識の有無を直接検出することによっても、検出を行うことができる。この標識は、
例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、色素、または検出可能な任意の標識とすることが
できる。例えば、ｄｅ  Ｊｏｎｇら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：２０８１（１９９９
）およびＢｒｅｅｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：６５８（１９９９）を参
照されたい。
【００６６】
さらに、本発明は、トランスポーターペプチドをエフェクターにカップリングもしくは
融合させた結合体である移送ユニット、もしくは結合体を含む。本明細書に用いている「
カップリングさせた」とは、エフェクターと前記ペプチドとの物理的な結合を可能にする
任意のタイプの相互作用のことを意味する。この結合の性質は、共有もしくは非共有結合
とすることができるが、その結合は、細胞移行の前もしくは移行中にこのベクターが解離
しないように十分強力なものである必要がある。カップリングは、当業者に既知の任意の
化学的、生化学的、酵素的もしくは遺伝子的カップリング法を用いて達成することができ
る。対象とするエフェクターは、このペプチド・ベクターのＮ末端もしくはＣ末端にカッ
プリングさせることができる。
【００６７】
「融合した」もしくは「融合」または「結合する」あるいは「相互作用する」という用
語は、２種以上の分子同士が何らかの第３の分子に対するよりも高い選択性を示すような
特定の相互作用全てを含むものであり、これらには、共有結合、イオン結合、疎水性結合
、水素結合などの作用が含まれるが、溶媒選択性などの非特異的結合は含まれない。
【００６８】
一部の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、１つ以上のエフェクターと
カップリングもしくは融合させる。このカップリングは、直接的なもの、もしくはコアを
介したものとすることができる。「エフェクター」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペ
プチド、または薬学的に活性な薬剤、例えば、毒素、抗生物質、抗病原体剤（ａｎｔｉｐ
ａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗原、抗体、抗体断片、免疫調節剤、酵素もしくは
治療剤などを含む任意の適切な分子とすることができる。２つ以上のエフェクターが存在
する場合、これらのエフェクターは同一もしくは異なるものとすることができる。エフェ
クターとは、例えば、生物学、医薬、診断、トレーシングもしくは食品加工の対象になる
任意の分子または化合物のことを意味する。エフェクターは、種々の由来の核酸、特にヒ
ト、ウイルス、動物、真核もしくは原核生物、植物または合成由来等の核酸（リボ核酸、
デオキシリボ核酸）で構成することができる。対象とする核酸は、例えば、単純な微量ヌ
クレオチドからゲノム断片もしくはゲノム全体に至る種々のサイズのものとすることがで
きる。同様に、これはウイルスゲノムもしくはプラスミドとすることができる。あるいは
、対象とするエフェクターは、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、アポリポタンパ
ク質、成長因子、抗原、抗体などのタンパク質とすることもできる。さらに、このエフェ
クターは、例えば、毒素、治療剤、もしくは抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生
生物剤などの抗病原体剤のような薬学的に活性な物質とすることができる。この対象とす
るエフェクターは、それ自体そのままで活性があるものとすることができ、またはインサ
イチュでペプチドもしくは別の物質または環境条件により活性化されるものとすることが
できる。
【００６９】
本発明のトランスポーターペプチド結合体は、式（ＩＩ）：
（［Ｐ］ｖ−［スペーサー］ｘ−コア−［リンカー］ｙ−［レポーター］ｚ）・Ｅ    
（ＩＩ）
によって表すことができ、式中、Ｐ、コア、スペーサー、リンカー、レポーター、ｖ、ｘ
、ｙおよびｚは前記の通りであり、Ｅはエフェクターである。共有結合により融合させた
結合体では、化学の法則通りに、エフェクターはコア、もしくはリンカー、またはこれら
の両方に結合させることができる。単量体トランスポーターペプチド結合体（ｖ＝１）で
は、コアは存在してもしていなくてもよい。
【００７０】
本明細書に用いている「薬学的に活性な物質」とは、ヒトもしくは動物の生物体に投与
したときに、検出可能な薬理学的および／または生理学的効果を誘起する化学物質もしく
は化合物のことを意味する。本明細書に用いている「治療剤」とは、ヒトもしくは動物の
生物体に投与したときに、目的とする薬理学的および／または生理学的効果を誘起する化
学物質もしくは化合物のことを意味する。
【００７１】
本発明によるトランスポーターペプチドは、その透過能がこれにカップリングさせる対
象物質（エフェクター）の性質とは事実上無関係であるという事実に特徴がある。
【００７２】
また、本発明は、対象物質を細胞もしくは細胞の核内に導入する方法を含む。この方法
は、細胞内への効率的な透過を可能にするのに十分な量のトランスポーターペプチド−エ
フェクター結合体もしくはトランスポーターユニットと細胞とを接触させることを含む。
一般に、本方法は、この結合体をインビボまたはインビトロで取り込ませるために用いる
ことができる。例えば、この結合体は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで与え
ることができる。さらに、本発明によるトランスポーターペプチドは、カップリングさせ
た物質に生物活性を持たせることを可能にすることができる。従って、トランスポーター
ペプチドはカップリングさせたエフェクターの生物活性を増強させることができる。イン
ビトロによる方法では、エフェクターをトランスポーターとカップリングさせ、得られた
結合体を、細胞代謝の活性化を可能にする温度で細胞とインキュベートする。場合によっ
ては、このトランスポーター−エフェクター結合体を特定の細胞に注入する。この結合体
を細胞内に導入する他の任意の方法を用いることもできることは当業者によって認められ
よう。
【００７３】
また、以上のペプチド−エフェクター結合体のほかに、本発明は、薬学的に受容可能な
塩基もしくは酸付加塩、水和物、エステル、溶媒和物、プロドラッグ、代謝体、立体異性
体もしくはこれらの混合物を提供する。また、本発明は、薬学的に受容可能な担体、希釈
剤もしくは賦形剤と共に、ペプチド−エフェクター結合体を含む薬学的組成物を含む。
【００７４】
「薬学的に受容可能な塩」という用語に包含される塩とは、一般に、この遊離塩基と適
切な有機もしくは無機酸とを反応させて本明細書に開示した化合物の「薬学的に受容可能
な酸付加塩」を作製することにより調製する本発明の化合物の毒性のない塩のことを意味
する。こうした化合物は、この遊離塩基の生物学的効果および性質を保持するものである
。このような塩の代表例は、酢酸塩、アムソン酸塩（４，４−ジアミノスチルベン−２，
２’−ジスルホネート）、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゾネート、重炭酸塩、重硫酸塩、
酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム塩、カンシル酸塩、炭酸
塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラリエート（ｃｌａｖｕｌａｒｉａｔｅ）、二塩化水素
化物、エデト酸塩、エディシレート、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプ
ト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキサフルオロリ
ン酸塩、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシ
ナフトエート、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、
リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル塩、メチル硝酸塩、
メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミン・アンモニウ
ム塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトエート、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩
、パモン酸塩（１，１−メチレン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトエート、エンボネ
ート）、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロン酸塩
、プロピオン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性
酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリキュレート、スラメート、タンニン酸塩、酒石
酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド、および吉草酸塩などの水溶性なら
びに非水溶性塩である。
【００７５】
本発明の方法によれば、ヒト患者に対し、薬理学的に有効な量のペプチドもしくは結合
体を投与することができる。「薬理学的に有効な量」という用語は、研究者もしくは臨床
家によって求められている組織、器官系、動物もしくはヒトの生物学的または医学的反応
を誘起する薬物もしくは薬学的組成物（エフェクター）の量のことを意味する。
【００７６】
また、本発明は、対象エフェクターを細胞もしくは細胞核内に導入するのに適した薬学
的組成物を含む。この組成物は、内服に適したものであることが好ましく、有効量の本発
明の薬理学的に活性な化合物を単独、もしくは１種以上の薬学的に受容可能な担体との組
合せで含む。この化合物は、毒性があるとしても極めて少ないという点で、特に有用であ
る。
【００７７】
好ましい薬学的組成物は、ａ）希釈剤、例えば、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール
、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、滑
石、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩および／またはポリエチレン
グリコール；錠剤用としてｃ）カップリング剤、例えば、ケイ酸マグネシウム・アルミニ
ウム、でんぷん糊、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン；必要に応じてｄ）崩壊剤、例えば
、でんぷん、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩もしくは発泡性混合物；および／
またはｅ）吸収剤、着色剤、矯味矯臭剤および甘味剤とともに有効成分を含む錠剤ならび
にゼラチンカプセル剤である。注射用組成物は、好ましくは等張水溶液もしくは懸濁液で
あり、坐剤は脂肪性乳濁液もしくは懸濁液から調製するのが有利である。これらの組成物
は、滅菌することができ、および／または保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤などの
佐剤、溶解促進剤、浸透圧調節塩および／または緩衝液を含むことができる。また、さら
に、これらは別の治療上有用な物質を含むことができる。これらの組成物は、それぞれ、
従来の混和、顆粒化またはコーティング法によって調製することができ、有効成分を約０
．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％含有する。
【００７８】
本明細書に開示した活性化合物および塩の投与は、一般に認められている治療剤の投与
方法のうちの任意の方法によることができる。これらの方法としては、経口、鼻腔内、非
経口、経皮、皮下もしくは局所性投与様式などの全身性または局所投与が挙げられる。
【００７９】
目的とする投与様式に応じて、この組成物は、例えば、好ましくは単位投与量の注射用
剤、錠剤、坐剤、丸剤、徐放性カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤などのような固体もしく
は半固体または液状の投与形態とすることができる。この組成物は、有効量の活性化合物
もしくはその薬学的に受容可能な塩を含むことになり、また、さらに、薬学において通例
用いられている任意の従来の薬学的賦形剤および他の治療薬もしくは薬学的組成物、担体
、アジュバント、希釈剤なども含むことができる。
【００８０】
固体組成物の賦形剤としては、医薬用品質のマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリ
ン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、蔗糖、炭
酸マグネシウムなどを用いることができる。また、上記の活性化合物は、例えば、プロピ
レングリコールなどのポリアルキレングリコールを担体とする坐剤として製剤化すること
ができる。
【００８１】
液体、特に注射用組成物は、例えば、溶解、分散などにより調製することができる。活
性化合物は、例えば、水、生理食塩液、ブドウ糖水溶液、グリセロール、エタノールなど
の医薬用純品溶媒に溶解もしくは混合することにより、注射用溶液もしくは懸濁液を作製
する。
【００８２】
また、投与することになる薬学的組成物は、必要に応じて、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝
剤、および例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンのような他の物質
などの毒性のない補助剤を少量含むことができる。
【００８３】
一般に、非経口注射用剤は、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射もしくは注入により投与
する。注射用剤は、溶液もしくは懸濁液、または液に溶かした後、注射するのに適した固
体形態のような通常の形態として調製することができる。
【００８４】
非経口投与の１つの方法として、本明細書に引用により組み込まれている米国特許第３
，７１０，７９５号に記載の方法に従い、投与量の一定のレベルが維持されるのを確実な
ものにする徐放性もしくは持続放出性製剤の埋め込み法を用いる。
【００８５】
本発明の化合物は、錠剤、カプセル剤（各々が徐放性および持続放出性製剤を含む）、
丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような
経口剤形として投与することができる。また、同様に、この化合物は、医薬分野の当業者
に周知の形態により静脈内（急速および点滴の両方）、腹腔内、皮下もしくは筋肉内形態
で投与することができる。
【００８６】
この化合物の用法・用量は、患者の体型、種類、年齢、体重、性別および病状；治療対
象の症状の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用する特定の化合物も
しくはその塩を含む種々の要素に基づいて選択する。当該分野の医師もしくは獣医師であ
れば、症状の進行を防止し、遅らせ、または止めるのに必要とされる薬剤の有効量を容易
に決定し、処方することができる。
【００８７】
本発明の経口用量は、適応となる効果に用いる場合、有効成分を０．５、１．０、２．
５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５０
０．０もしくは１０００．０ｍｇ含有する分割錠の形態で提供し得る。
【００８８】
本発明の化合物は、１日１回の用量として投与することができ、あるいは１日当たりの
総投与量を１日２回もしくは３回または４回の分割用量として投与することができる。さ
らに、本発明に好ましい化合物は、適切な鼻腔内投与用器具（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｖ
ｅｈｉｃｌｅ）の局所使用による鼻腔内投与、もしくは当業者に周知の形態の経皮投与用
皮膚パッチ剤による経皮投与を行うことができる。経皮送達システムの形態で投与する場
合には、勿論、適量投与（ｄｏｓａｇｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は用法・用量
全体を通して間欠的ではなく連続的なものとなる。その他の好ましい局所用製剤としては
、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアロゾル・スプレー剤およびゲル剤が挙げられ
、これらの場合、有効成分の濃度は０．１％〜１５％ｗ／ｗまたはｗ／ｖの範囲となろう
。
【００８９】
本明細書に詳細に述べた化合物は、有効成分を構成することができ、通常、対象とする
投与形態、即ち、経口用としての錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに対
して適切に選ばれ、従来の調剤慣行に合った適切な薬学的希釈剤、賦形剤もしくは担体（
本明細書ではこれらを総称して「担体」物質と呼ぶ）と混合して投与する。
【００９０】
例えば、錠剤もしくはカプセル剤として経口投与する場合、有効薬物成分は、エタノー
ル、グリセロール、水などの経口用で毒性がなく薬学的に受容可能な不活性担体と混合す
ることができる。さらに、所望もしくは必要に応じて、この混合物に適切な結合剤、滑沢
剤、崩壊剤および着色剤を混和することもできる。好適な結合剤としては、でんぷん、ゼ
ラチン、グルコースもしくはベータ乳糖のような天然糖、コーン甘味剤、アカシア、トラ
ガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成ゴム、カルボキシメチル
セルロース、ポリエチレングリコール、ろうなどが挙げられる。こうした剤形に用いる滑
沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシ
ウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤
としては、でんぷん、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタン・ガムなどが
挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
また、本発明の化合物は、小単層小胞、大単層小胞および多重層小胞などのリポソーム
送達システムの形で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリル
アミンもしくはホスファチジルコリンを含有する種々のリン脂質から形成することができ
る。一部の実施形態として、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されているようにし
て、脂質成分の膜を薬剤の水溶液で水和させて、薬剤を内包する脂質層を形成する。
【００９２】
また、本発明の化合物は、標的を定めることができる薬物担体としての可溶性ポリマー
とカップリングさせることもできる。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリド
ン、ピラン・コポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポ
リヒドロキシエチルアスパンアミドフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｓｐａｎａｍ
ｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、もしくはパルミトイル残基で置換したポリエチレンオキシドポリ
リジンを挙げることができる。さらに、本発明の化合物は、薬剤の放出を制御するのに有
用なクラスの生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロ
キシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアク
リレート、およびヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロックコポリマーとカップリング
させることができる。
【００９３】
上記薬学的組成物はいずれも、活性化合物、特に有効成分としての式Ｉの化合物を０．
１〜９９％、好ましくは１〜７０％含有することができる。
【００９４】
（その他の実施形態）
本発明の１つ以上の実施形態についてその詳細を前記の添付明細書において説明した。
本発明の特定の実施形態についての前記詳細な説明から、生体膜を通過させて移行させる
ための独自の方法および組成物が開示されたことが明瞭に理解されよう。本明細書では特
定の実施形態についてその詳細を説明したが、これは単に例示を目的として例として説明
したものであり、以下に添付した特許請求の範囲に対して限定しているものではない。特
に、この特許請求の範囲に定義したような本発明の精神および範囲から逸脱することなく
、本発明に対し、種々の置換、変更および変形を行うことができることは、本発明者によ
り企図されている。例えば、特定のタイプの細胞、または移行させるべき特定のエフェク
ターの選択については、本明細書に開示した実施形態を知った当業者には日常的な事柄で
あると考えられる。
【００９５】
本明細書および添付の特許請求の範囲では、文脈上明らかに別の意味に解すべき場合を
除き、単数形は複数の対象を含む。特に定義しない限り、本明細書に用いている科学技術
用語は全て、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されている意味と同じ意味を
有する。また、本明細書に引用されている全ての特許および刊行物は、引用により本明細
書に組み込まれている。
【００９６】
以下に示した実施例は、本発明の好ましい実施形態についてさらに十分に説明するため
のものである。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲により定義した本発明の範囲を
限定するものと決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９７】
（実施例１：内部移行ペプチドモチーフの特定）
ファージ・ペプチド・ライブラリは、古典的な方法では、線維状ファージＭ１３の誘導
体として構築される。ペプチド・ライブラリを、ペプチドモチーフの１〜５個のコピーを
提示するキャプシドのマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩに融合する。Ｚｗｉｃｋら、Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４２７−４３６（１９９８）を参照され
たい。あるいは、メジャーコートタンパク質ｐＶＩＩＩを用いることによって高価（ｈｉ
ｇｈ  ｖａｌｅｎｔ）提示が得られる。しかしながら、これらのタイプのライブラリは、
受容体媒介性エンドサイトーシスの対象となるペプチド配列の単離のために最適化されて
いない。何故なら、ペプチドの１価もしくは低価提示は、線維状ファージのような巨大な
構造体を効率的に取り込ませるには不十分であるからである。多価提示のみが効率的取り
込みを可能にする。Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
１４４８：４５０−４６２（１９９９）を参照されたい。さらに、受容体結合リガンド
の内部移行は、原形質膜の特定領域に細胞表面受容体が濃縮され、次いでクラスリン被覆
小胞が形成される必要があり（Ｄａｍｋｅ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８９：４８−５１（
１９９６）参照）、従来のＭ１３ファージでは、こうした特殊で高度に効率的な構造によ
る受容体媒介性内部移行が行われるとは考えられない。
【００９８】
Ｔ７  ４１５ファージ系およびＴ７  ４１３ｂファージ系のファージ・ディスプレイ・
ライブラリを構築した。このファージでは、減少した容量内にこの提示ペプチドが４１５
個のコピーとして生じる（キャプシドの直径は約５０ｎＭである）。従って、本発明に含
まれるのは、以下の基準を満たす新規なファージ系のファージ・ディスプレイ・ライブラ
リである：４〜５０ｍｅｒペプチドの多価提示（＞４００個のコピー／ファージ）；サイ
ズが小さい（５０ｎＭ）；内部移行したファージを効率的に回収できる；内部移行しなか
った結合ファージを除去できる；および個別ペプチド配列の数が大である（＞１０９個の
ヘプタペプチド配列を示す３×１０８個の独立クローン）。
【００９９】
このライブラリを用いて、βＴＣ−３細胞モデル内への高分子の効率的、特異的な細胞
内送達を誘導するペプチドモチーフの単離に成功した。さらに、このライブラリを５種の
異なる（非−β）細胞株に対して用い、それぞれの場合で、各細胞型に特異的なペプチド
モチーフの濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）について観察した。この方法の概括的な全体像
を以下に説明する。
【０１００】
（選択／濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）方法）
多くのインスリン分泌細胞株、齧歯類およびヒト単離島、およびＦＡＣＳにより精製し
たβ細胞に対するファージ・ディスプレイ・ライブラリをパニングし、最終的に、これを
直接動物（マウス、ラット、ブタ）に注射した後、島を抽出して内部移行したファージを
回収する。パニング方法は、ファージの添加、回収および増幅の少なくとも３サイクルか
らなる。あるいは、最も選択的なリガンドを単離するために、このライブラリを種々のイ
ンスリン非分泌細胞と共にインキュベートした後にβ細胞に対するライブラリを選択する
ことにより、他の細胞型に結合するファージを除去する。記載されるように、クロロキン
を用いてリソソームによる分解をブロックする実験を実施する。Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４４８：４５０（１９９９）を参照され
たい。
【０１０１】
（ファージ特異性の測定）
選択したファージを単離し、多くの種々の細胞および器官と共にインキュベートする。
例えば、一部の実験として、選択したファージをインスリン分泌およびインスリン非分泌
細胞および器官とインキュベートする。取り込みについては、回収されたファージ数をカ
ウントすることにより測定する。抗ファージ抗体を用いて免疫細胞化学的研究を実施する
。
【０１０２】
（ファージ由来（ｐｈａｒｇｅ−ｂｅａｒｄ）ペプチドの特徴付け）
単離ファージからのＤＮＡを配列決定し、発現されるペプチドを推定する。直接の内部
移行を誘導するペプチド、およびこれらのペプチドの変異型を化学的に合成し、Ｎ末端を
ＦＩＴＣで標識し、もしくはヨウ素化する。標識ペプチドを種々の細胞型、齧歯類および
ヒト単離島に加え、そして、マウスに直接注射する。取り込みの特異性、細胞内局在性、
クリアランスおよび安定性について評価する。Ｗｉｄｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
３１０：２０３（１９９５）を参照されたい。
【０１０３】
（生化学的アッセイ）
インスリン分泌細胞およびインスリン非分泌細胞を分析するため、特徴付けを行ったペ
プチドを３種の既知配列：ＹＶＡＤ（カスパーゼ阻害因子、配列番号３５；Ｒｏｕｑｕｅ
ｔら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１１９２（１９９６））、ＶＱＲＫＲＱＫＬＭＰ（ＮＦ
−κＢ核内局在化阻害因子（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５（
１９９５）、配列番号３６）もしくはＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（ＪＮ
Ｋ阻害因子、Ｂｏｎｎｙら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：７７−８２（２０００）、配列番
号３７）に結合させる。これらのペプチドは、化学的に合成し、インスリン分泌細胞およ
びインスリン非分泌細胞に加える。カスパーゼ、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫは、一般的活性
化剤エトポシド（Ｋｉｍら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０：４３９（２０００）
参照）もしくはアニソマイシン（Ｕｓａｍｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
５５：１８５（１９９８）参照）により活性化する。上記ペプチドによるカスパーゼ、Ｎ
Ｆ−κＢおよびＪＮＫの阻害についてはβ細胞および非β細胞を用いて検討する。以上の
実験によって、これらのペプチド担体が薬剤となり得る物質を活性のある形態で特にβ細
胞内に移送することができるかどうかが分かる。
【０１０４】
（治療剤となり得る物質のＧＬＰ−１受容体による取り込み）
ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の発現は、主として脳および膵臓に限定されている
。Ｙａｍａｔｏら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２９：５６（１９９７）を参照され
たい。この受容体は、アゴニストに結合した後、内部移行される。Ｗｉｄｍａｎｎら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０：２０３（１９９５）を参照されたい。こうした性質があるた
め、ＧＬＰ−１Ｒは膵β細胞への治療剤の選択的送達を媒介する魅力的なツールとなる。
この特性は、上に記載されるように評価される。ＧＬＰ−１Ｒを用いて集められた情報が
、例えば、高められた選択性を有する二重特異的ダイマーの設計において、補助する。
【０１０５】
（ＧＬＰ−１受容体に対する他の内部移行モチーフの特定）
ＧＬＰ−１Ｒを用いてトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞は、上記のような選択
実験の基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）となる。新規に特定したモチーフについてその特異性
およびエンドサイトーシス誘導能を評価する。
【０１０６】
（全−Ｄ−レトロ−インベルソ型（ａｌｌ−Ｄ−ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチ
ドの作製）
一部の実施形態として、上記ペプチドはレトロ−インベルソ型ペプチドとして合成する
ことができる。安定性が高く、免疫原性の少ない全Ｄ−レトロ−インベルソ型ペプチド（
Ｓｅｌａ、Ｚｉｓｍａｎ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：４４９（１９９７）参照）について、
前述の方法により、分析する。
【０１０７】
進化によって、天然のタンパク質にはほぼＬ型アミノ酸のみが存在することになった。
従って、事実上全てのタンパク質分解酵素は、隣接するＬ型アミノ酸間のペプチド結合を
切断するので、Ｄ型アミノ酸からなる人工的なタンパク質もしくはペプチドは、タンパク
質分解に対してかなり抵抗性である。この抵抗性は薬剤の設計者には魅力的であったが、
Ｌ−アミノ酸からなるタンパク質の生体系が排他的であるため、このようなタンパク質は
、鏡像異性タンパク質により形成される鏡像面と相互作用することができないということ
になる。従って、通常、全Ｄ（ａｌｌ−Ｄ）型アミノ酸タンパク質には生物効果もしくは
活性がない。
【０１０８】
線状の修飾レトロ−ペプチド構造については長い間研究されてきており（Ｇｏｏｄｍａ
ｎら、Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：１−７（
１９７９）参照）、「レトロ−アイソマー」という用語は、親ペプチドに対して配列の方
向が逆であるアイソマーを含むとされた。「レトロ−インベルソ・アイソマー」とは、配
列の方向が逆で、各アミノ酸残基の対掌性が逆であり、従って末端基相補性が生じ得ない
線状ペプチドのアイソマーのことを意味する。
【０１０９】
さらに最近、Ｊａｍｅｓｏｎらは、これら２つの性質、即ち、逆合成および対掌性の変
化を組み合わせることにより、ＣＤ４受容体のヘアピンループのアナログを設計した。Ｊ
ａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：７４４−７４６（１９９４）およびＢｒａｄｙ
ら、Ｎａｔｕｒｅ，３６８：６９２−６９３（１９９４）を参照されたい。Ｄ−鏡像異性
体と逆合成を組み合わせたことによる最終的な結果は、各アミド結合のカルボニル基とア
ミノ基とが交換されるが、各α炭素の側鎖基の位置は保存されたことである。Ｊａｍｅｓ
ｏｎらは、従来の全−Ｌ鏡像異性体の限定的なインビボ活性（タンパク質分解を受けやす
いことに起因する）とは対照的に、逆Ｄペプチドの生物活性が増大することを明らかにし
た。
【０１１０】
ヒト・クラスＩ組織適合性分子ＨＬＡ−Ａ２の非天然リガンドとして使用することがで
きる部分修飾したレトロ−インベルソ偽ペプチドが報告されている。Ｇｕｉｃｈａｒｄら
、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２０３０−２０３９（１９９６）を参照されたい。このよう
な非天然リガンドでは、安定性およびＭＨＣ結合能が増大した。
【０１１１】
レトロ−インベルソ・ペプチドを、以下のようにして配列が既知のペプチドに対して作
製する。レトロ−インベルソ・ペプチドアナログをデザインし、合成するためのモデル・
ペプチドとして、既知の配列を有するペプチド（例えば、腫瘍抗原ペプチド）を選択する
。このアナログは、Ｄ−アミノ酸を用い、このレトロ−インベルソ・ペプチド内のアミノ
酸の配列がモデルとして働く選択したペプチド内の配列と正確に逆になるように、Ｄ−ア
ミノ酸を結合させてペプチド鎖とすることにより合成する。例えば、このペプチド・モデ
ルがＡＢＣの配列を有するＬ−アミノ酸で形成されているペプチドである場合、Ｄ−アミ
ノ酸で形成されるそのレトロ−インベルソ・ペプチドアナログはＣＢＡの配列を有するこ
とになる。Ｄ−アミノ酸の鎖を合成してレトロ−インベルソ・ペプチドを作製する方法は
、当該分野で公知であり、前記文献において説明されている。
【０１１２】
天然ペプチドの場合の固有の問題が天然のタンパク質分解酵素により分解されることに
あるので、本発明のペプチドは、目的ペプチドの「レトロ−インベルソ・アイソマー」を
含むように作製することができる。従って、天然性のタンパク質分解からペプチドを保護
することにより、この特定のヘテロ２価（ｈｅｔｅｒｏｂｉｖａｌｅｎｔ）もしくはヘテ
ロ多価（ｈｅｔｅｒｏｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）化合物の有効性は増大するはずである。
【０１１３】
レトロ−インベルソを含むペプチドでは、天然のタンパク質分解酵素による分解から保
護されるため、レトロ−インベルソを含まないアナログと比べて、生物活性が増大すると
予測される。
【０１１４】
（修飾ペプチドの作製）
一部の実施形態として、このペプチドは、修飾ペプチドとして合成することができる。
この修飾ペプチドは前述の方法により分析する。
【０１１５】
アナログは、アミノ酸配列により、またはアミノ酸配列に影響を与えない修飾により、
あるいはこれらの両者により天然のペプチドと異なるものとすることができる。好ましい
アナログとしては、その配列が、単に保存的アミノ酸置換、好ましくは１、２もしくは３
置換のみ、例えば、１つのアミノ酸の同様な特徴を有する別のアミノ酸による置換（例え
ば、グリシンをバリンに、リジンをアルギニンに置換など）によって、またはペプチドの
生物活性を消失させない１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失もしくは挿入によって、
その野性型配列（すなわち、天然に生じるペプチドの相同な部分の配列）と異なるペプチ
ドが挙げられる。
【０１１６】
（普通一次配列に影響を与えない）修飾としては、インビボもしくはインビトロにおけ
るペプチドの化学的誘導体化、例えば、アセチル化もしくはカルボキシル化が挙げられる
。また、糖鎖形成の修飾、例えば、ペプチドの合成およびプロセッシング過程において、
または、例えば、糖鎖形成に影響を与える酵素、例えば、哺乳類のグリコシル化もしくは
脱グリコシル化酵素をペプチドに作用させることによる別のプロセッシング工程において
、ペプチドの糖鎖形成パターンを修飾することによるものも挙げることができる。また、
リン酸化されたアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンもしくはホスホス
レオニンを有する配列を挙げることもできる。
【０１１７】
本発明は、１つ以上のペプチド結合が、ペプチダーゼにより切断されにくい別のタイプ
の共有結合（「類似ペプチド結合」）に置換されたアナログを含む。対象に注射後のペプ
チドの蛋白性分解が問題となる場合、特定の切断されやすいペプチド結合を切断不能の類
似ペプチド結合に置換すると、得られるペプチドは安定性が増し、治療剤としてより有用
なものとなる。このような類似ペプチド結合およびこれをペプチドに組み込む方法は、当
該分野では周知である。また、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テイル（ｔｈｅ
ｙｌ）、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル
、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、
メトキシアジピル、メトキシスベリル、および２，４−ジニトロフェニルなどのアミノ末
端ブロック基も有用である。ペプチドの荷電アミノ−末端およびカルボキシ−末端をブロ
ックすると、ペプチドが疎水性細胞膜を通過して細胞内へ入るのが促進されるという別の
メリットがある。
【０１１８】
（多量体ペプチドの作製）
多量体リガンドでは、内部移行速度の増大につながる最大数桁の結合力の向上がみられ
る。Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：
１６６３（１９９７）およびＹｏｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１６４（
１９９９）を参照されたい。単一特異性ダイマーは、強い結合力を示し、二重特異性ダイ
マーでは、特異的に細胞を標的にする物質としての実用面の潜在能力を向上させることが
できる選択性が高まると考えられる。Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ，Ｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：５３７（１９９６）を参照されたい。単量体および多量体ペプチド
（単一および多重特異性）は、ペプチドとして、あるいは例えば、柔軟性のあるペプチジ
ルまたは糖ベースの主鎖を有するペプチド類似体として合成することができる。Ｃａｒｕ
ｔｈｅｒｓ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：５３７（１９９６）、Ｚ
ｅｎｇら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２：６６（１９９６）およびＵｌｂｒｉｃｈら、Ｊ．
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６４．（１．−３．）：６３−７９．、６４：
６３（２０００）を参照されたい。
【０１１９】
（細胞内局在性）
単離した種々のペプチド配列は、種々の細胞コンパートメント（例えば、核、ミトコン
ドリア、細胞質ゾルなど）に局在し得る。これについては、標識（例えば、ヨウ素化もし
くはＦＩＴＣ標識）ペプチドを用いて調べる。この局在性情報を利用して機能性研究をデ
ザインする。例えば、細胞質ゾル内に蓄積するペプチドは、ＮＦ−κＢの核移行を阻害す
るのに好ましく、核内に移行するペプチドは、ＪＮＫを阻害するのに最も適している。一
部の実施形態として、核局在化モチーフのような配列を結合体に加えて、担体を適切な細
胞コンパートメントへ再誘導することができる。
【０１２０】
（機能性研究）
カスパーゼ、ＮＦ−κＢもしくはＪＮＫ阻害剤に結合させた、β細胞を標的とするトラ
ンスポーターペプチド（例えば、単量体もしくは多量体のＬ型もしくはＤ型エナンチオマ
ー）をβ細胞株、ＦＡＣＳ精製β細胞ならびに単離ヒトおよび齧歯類の島（ｉｓｌｅｔ）
に加える。ＩＬ−β（ＴＮＦαおよびＩＦＮγを併用）によりアポトーシスを誘発させ、
アポトーシスに対する抵抗性を調べる。
【０１２１】
（インビボ糖尿病実験）
糖尿病発症前および発症後の状態のＮＯＤマウスにエフェクタ・ペプチド（カスパーゼ
、ＮＦ−κＢもしくはＪＮＫ阻害剤に結合させたβ細胞を標的とするペプチド）を注射す
る。用量および注射頻度は、前述のようにして決定する。次いで、糖尿病の発生を測定す
る。
【０１２２】
（免疫原性に関するアッセイ）
齧歯類およびウサギを用い、ペプチドの免疫原性の潜在性について評価する。
【０１２３】
（クローニング）
特定の細胞による効率的な内部移行を誘導するペプチドモチーフについては実施例ＩＩ
ＩおよびＩＶにおいて説明する。このペプチドを用いて、確立された手順により、例えば
、ＩＮＳ−１、βＴＣ−３およびヒト島ｃＤＮＡライブラリからの同族（ｃｏｇｎａｔｅ
）受容体のクローニングならびに特徴付けを行う。Ｔｈｏｒｅｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：８６４１（１９９２）およびＶｏｌｚら、ＦＥ
ＥＳ  Ｌｅｔｔ．３７３：２３（１９９５）を参照されたい。
【０１２４】
（特徴付け）
上記のクローニングした受容体の組織分布について、インスリン分泌およびインスリン
非分泌細胞および器官のノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングにより
調べる。結合速度、クリアランスおよび内部移行の特異性についてはＣＯＳ−７細胞にこ
の受容体を一時的にトランスフェクションさせることにより調べる。対照ペプチドは、変
異配列、および例えば、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、グルカゴン、セクレチンなどの既知ペプチ
ドとする。これらの受容体に対する別の内部移行モチーフについては上記のトランスフェ
クションしたＣＯＳ−７細胞において前記ライブラリをパニングすることにより特徴付け
る。
【０１２５】
（実施例ＩＩ：トランスポーターペプチドのスクリーニング方法）
特に指定した場合を除き、溶媒および試薬は全てフルカ社（Ｆｌｕｋａ）、ブックス（
Ｂｕｃｈｓ）、スイスから入手し、分析品質以上のものとし、さらに精製することなく使
用した。アミノ酸は全てペプチド・インスティテュート社（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）（日本）から購入した。樹脂はアプライド・バイオシステムズ社（
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国；ノバビオケム社（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈ
ｅｍ）、スイスもしくはバッヘム社（Ｂａｃｈｅｍ）、スイスから入手した。水は、Ｍｉ
ｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した
。バイオアッセイにはインスリン分泌細胞株βＴＣ−３を用いた。Ｅｆｒａｔら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：９０３７−９０４１を参照されたい。
【０１２６】
（ファージの調製および濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）方法）
標準的な手順により（例えば、ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＴ７  ４１４ファー
ジもしくはＴ７  ４１３ｂファージを用い）、キャブシドの表面にランダムな１５マーエ
ピトープを提示する３×１０８個の単独（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）ファージのライブラ
リを作製した。ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７
：２２８（１９９３）を参照されたい。（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｏｔｔの上記文献に）記載さ
れるように、ファージを増幅させた後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法により
精製し、最終的に、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（１０：１ｍＭ、ＴＥ）中に１０１０個感
染性粒子／μｌの濃度で再懸濁した。培養培地中の細胞にファージ（１０１２個）を１〜
２４時間加えておいた。エンドサイトーシス小胞内でタンパク質分解を免れたファージの
単離を容易にするには、インキュベーション時間をさらに長くすることが好ましかった。
結合および内部移行を行わせた後、細胞を洗浄し、内部移行されなかったファージを、サ
ブチリシン（３ｍｇ／ｍｌ）（４４）で消化させて破壊した。充分に洗った後、２％デオ
キシコール酸塩、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するｐＨ８
．０の緩衝液で細胞を溶解させることにより、内部移行されたファージを回収した。回収
したファージは、最終的にＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ）を用いて増幅させ、
前述のようにして精製した。次いで、この選択したファージの調製物を用いて第２ラウン
ドのパニングを行った。３〜５ラウンドを順次実施することにより特定のファージ保有ペ
プチド配列を濃縮した。
【０１２７】
（免疫細胞化学および蛍光による検討）
上記の濃縮スキームによって単離した単一ファージを増幅させた後、培養培地中の細胞
に２４時間加えておいた。次いで、培地を洗い流し、細胞を冷メタノール−アセトン（１
：１）で５分間固定した。ファージ・キャプシドに対する抗体は、蛍光結合二次抗体と共
に用いた。古典的な蛍光顕微鏡による検討および共焦点顕微鏡によるアッセイを実施した
。組織は、処理の前にパラフィン包埋した。
【０１２８】
（ペプチド）
Ｃ−末端アミド基を有し、必要に応じてＦＩＴＣ標識もしくはヨウ素化したペプチドを
、古典的なＦ−ｍｏｃ化学（オースペップ社（Ａｕｓｐｅｐ）、オーストラリア）を用い
て合成した。ペプチドは全てＨＰＬＣにより精製し、質量分析法によって分析した。
【０１２９】
（生化学的検討）
種々の細胞株、例えばβＴＣ−３、ＩＮＳ−１、ＨｅＬａ、ＷｉＤｒ、ＨｅｐＧ２、Ｎ
ＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ−７などにおいて、ペプチド添加の１時間後からＪＮＫ、ＮＦ−κＢ
およびカスパーゼをエトポシド（ＶＰ−１６，Ａｌｅｘｉｓ）により１時間賦活化する。
細胞抽出物を処理して（ｃ−Ｊｕｎを基質として用いる固相ＪＮＫアッセイ（Ｂｏｎｎｙ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１６４６６（２０００）参照）により）ＪＮＫ活
性、（電気泳動移動度シフトアッセイ（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１
４２５５（１９９５）参照）により）ＮＦ−κＢの核移行および（アップステート・バイ
オケミカルス社（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から市販のキットおよび
抗体により）カスパーゼ活性を測定する。
【０１３０】
（アポトーシスの測定）
アポトーシスは、以前に報告された方法に従い、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２およびヨウ
化プロピジウムの組合せを用いて測定する。Ｂｏｎｎｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７５：１６４６６（２０００）、Ｈｏｏｒｅｎｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８
：１５６８（１９９６）を参照されたい。
【０１３１】
（島）
島は、Ｇｏｔｏｈらの方法（Ｇｏｔｏｈら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４３：
７２５（１９８７）参照）により単離する。ヒト島は、例えば、「Ｉｎｓｅｌ  Ｓｐｉｔ
ａｌ」、ベルン（Ｂｅｒｎ）、スイスから入手することができる。
【０１３２】
（マウス）
正確な投与量および注射の時間枠は、各ペプチドごとに最適化する。しかしながら、Ｊ
ＮＫＩを用いたこれまでの経験から、ペプチドの１ｍＭ  ＰＢＳ溶液１００μｌを２日お
きに注射するのが合理的な出発点であることが分かっている。
【０１３３】
（λＺＡＰ発現ライブラリ）
λＺＡＰ発現原核／真核発現ベクター中のＩＮＳ−１  ｃＤＮＡライブラリを用いてＩ
Ｂ１  ｃＤＮＡおよびＩＢ２  ｃＤＮＡをクローン化した。Ｂｏｎｎｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７３：１８４３（１９９８）およびＮｅｇｒｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６
４：３２４（２０００）参照。このライブラリは、真核ＣＭＶプロモータの制御下で、単
純なヘルパー・ファージ切り出し（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）によって容易にプラスミド・ライブラリに変換される。
【０１３４】
（実施例ＩＩＩ：ファージ・ディスプレイ・ライブラリのパニングおよび内部移行され
たペプチドモチーフの特徴付け）
β細胞を特異的に標的にして薬剤を送達させることができれば、Ｉ型糖尿病の治療に極
めて大きな影響を与えることになろう。基本的にβ細胞の機能（すなわち、インスリン分
泌）を変えないβ細胞破壊のブロッカーはすでに存在する（例えば、ＪＢＤ、ｂｅｌ−２
）。こうした分子の１つ（ＪＢＤ）を低分子ペプチドに変換しても全生物活性を保持させ
ることができることが示されている。
【０１３５】
膵β細胞株βＴＣ−３は、本明細書に記載したファージ・ディスプレイ・ライブラリを
用いてパニングした。下記の表１に示すように、選択の各サイクルにおいて、回収ファー
ジ数の選択的な濃縮が認められた。βＴＣ−３細胞を用いるパニング実験を、濃縮手順の
各工程で１０９個のファージを用いて実施した。０℃（エンドサイトーシスはみられない
）で回収されたファージ数は１００個未満であり、このことから、本明細書に記載した条
件下では、内部移行されなかった細胞外の結合ファージのバックグラウンドは極めて低い
ことが分かる。
【０１３６】
【表１】
2010024250.tif 000002
【０１３７】
βＴＣ−３細胞株における３工程のパニング後のファージ回収率を表２に示す。
【０１３８】
【表２】
2010024250.tif 000003
【０１３９】
表３に示した時間βＴＣ−３細胞とインキュベートしたファージＰ１（配列番号１）を
用い、滴定実験を実施した。また、投入／回収ファージの比率も示す。滴定実験から、最
初の投入Ｐ１ファージの１０％も回収することができることが分かった。
【０１４０】
【表３】
2010024250.tif 000004
【０１４１】
取り込みの特異性についての測定は、５種の細胞株における回収ファージ数をタイトレ
ートすることにより行った。ファージ（１０８個）を、示した細胞株と１６時間インキュ
ベートした後、表４に示したように、内部移行されたファージ数および回収されたファー
ジ数を算定した。インテグリン内部移行モチーフを提示する対照ファージは、全ての細胞
株に対して同様な回収ファージ数（１〜３×１０６個）を示した。このことから、Ｐ１（
配列番号１、表５参照）は、βＴＣ−３細胞によって、テストした他のどの細胞株より１
０，０００〜１，０００，０００倍効率的に内部移行されることが分かる。
【０１４２】
【表４】
2010024250.tif 000005
【０１４３】
次いで、ファージＰ１の提示ペプチドの配列に基づいてペプチドを合成した。ＦＩＴＣ
で標識した１０アミノ酸ランダム配列にＰ１  ５マーペプチドの配列を結合させた。対照
配列は、Ｐ１  ５マー配列を（Ａｌａ）５で置き換えた以外は同一であった。細胞にペプ
チド（１０μＭ）を１時間加え、細胞を洗い、冷メタノール−アセトン（１：１）で固定
した。βＴＣ−３細胞内のＦＩＴＣ標識Ｐ１ペプチドは可視化することができたが、他の
細胞型ではできなかった。
【０１４４】
最後のサイクルの濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）時の２０個の回収ファージの配列解析
結果を表５に示す。重要なことであるが、全ての配列は、５個のアミノ酸の同じ保存コン
センサス配列に厳密に従った。このことから、ファージの効率的な取り込みを誘導する保
存モチーフが特異的に選択／濃縮されることが示唆される。こうして得られたペプチドモ
チーフの大部分は、プロタンパク質転換酵素のコンセンサスなＲ−Ｘ−Ｘ−Ｒに従う。こ
の知見は、潜在的薬物および高分子を特定の細胞型の細胞内に送達するためのビヒクルと
してプロタンパク質転換酵素を使用する提案の根拠を成すものである。
【０１４５】
【表５−１】
2010024250.tif 000006
【０１４６】
【表５−２】
2010024250.tif 000007
【０１４７】
（実施例ＩＶ：多量体結合体）
ファージ・ライブラリから得られるリガンド・ペプチドは低親和性（マイクロモル程度
）とすることができる。その結合親和性もしくは結合力は、ペプチド分子のコピーを多量
体化することにより、例えば、ペプタボディ（ｐｅｐｔａｂｏｄｙ）を形成させることに
より向上させることができる。ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：
３８６−９０（１９９０）、Ｒｅｎｓｃｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６２３−３６２７（１９９４）、およびＡｌｅｘｅｙら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１６６３−１６６８（１９９７）を参
照されたい。ファージを用いた実験から、ファージ・ペプチドＲＲＴＫ（配列番号１、上
記参照）は受容体媒介性エンドサイトーシスを介してβＴＣ−３細胞により特異的に取り
込まれるが、その内部移行効率は低い（これはその低親和性結合（ほぼマイクロモルの程
度）に起因し得る）ことが分かった。レポーター・タグ（ＦＩＴＣまたはビオチン）と共
にこのペプチドの複数（４もしくは８個）のコピーを有する一連の多量体（図１および２
）を構築した。
【０１４８】
本発明の多量体トランスポーターペプチドは、式Ｉ：
［Ｐ］ｖ−［スペーサー］ｘ−コア−［リンカー］ｙ−［レポーター］ｚ    （Ｉ）
によって表すことができ、式中、Ｐは前述のコンセンサスモチーフ（ＸｍＲＸｏＲＸｎ）
、（ＸｍＲＲＲＸｎ）、（ＸｍＲＲＸＲＸｎ）および（ＸｍＲＸＲＲＸｎ）のトランスポ
ーターペプチドである。例えば、このペプチドは、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４を含むこ
とができ、式中、Ｘ１およびＸ４はＲもしくはＫとすることができ、Ｘ１およびＸ４は任
意のアミノ酸とすることができる。ｖによって表される所与のトランスポーターペプチド
内のペプチド数は、２〜８以上の整数とする。任意の所与の多量体トランスポーターペプ
チドにおいて、それぞれのペプチドは互いに同じか、異なるものとすることができる。好
ましいペプチドとしては、例えば、表５に挙げたものがある。
【０１４９】
ペプチドとコアとの間のスペーサーは存在していてもしていなくてもよく、従って、ｘ
は１または０である。好ましいスペーサーは可動性、両親媒性、非免疫原性、およびタン
パク質分解酵素に対し非感受性であり、例えば、スクシンイミジル−ＰＥＧ（ｓｕｃｃ−
ｐｅｇ）などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１５０】
企図されるコア部分としては、表７に記載したポリリジン（Ｋ）コアが挙げられ、また
、組み込まれたリンカーを有するものも挙げられる。選択されるコアにより、所与の結合
体内に存在するペプチドの数が決まる。代表的なコアとしては、Ｃ４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（ｓｕ
ｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、Ｃ−ＧＧＧ−［Ｋ（Ｃ）］３−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ
）−アミド、（ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ）４−Ｋ２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）−アミドおよ
び（ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ）８−Ｋ４Ｋ２Ｋ−Ｋ（ＧＧＧ）−アミドが挙げられる。リンカ
ーおよびレポーター基は存在していてもしていなくてもよく、従って、ｙおよびｚは、式
Ｉにおいて独立に１もしくは０である。
【０１５１】
リンカーは存在していてもしていなくてもよい（即ち、ｙは１もしくは０である）。リ
ンカーとしては、コアをレポーターに接続する部分が挙げられ、例えば、ｓｕｃｃ−ＰＥ
ＧもしくはＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓとすることができる。
【０１５２】
レポーター基は存在していてもしていなくてもよい（ｚは１もしくは０である）。レポ
ーター基は検出可能な任意の基である。例としては、放射性同位体、蛍光性部分、リン光
性部分、化学発光性部分、および量子ドットが挙げられるが、これらに限定されるもので
はない。その他のレポーター基としては、ビオチン、シンテイン、ヒスチジン、赤血球凝
集素、ｍｙｃもしくはフラッグ・タグが挙げられる。本明細書において用いる代表的な蛍
光レポーター基はＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）である。
【０１５３】
代表的な多量体トランスポーターペプチドは図１および図２に示した。
【０１５４】
多量体トランスポーターペプチド・ユニットもしくは結合体においては、多量体トラン
スポーターペプチドを、１つ以上のエフェクターと融合させる。このエフェクターは、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、または薬学的に活性な薬剤、例えば、毒素、抗生
物質、抗病原体剤（ａｎｔｉｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗原、抗体、抗体断
片、免疫調節剤、酵素もしくは治療剤などを含む任意の適切な分子とすることができる。
２つ以上のエフェクターが存在する場合、これらのエフェクターは同一もしくは異なるも
のとすることができる。
【０１５５】
従って、本発明の多量体結合体は、式（ＩＩ）：
（［Ｐ］ｖ−［スペーサー］ｘ−コア−［リンカー］ｙ−［レポーター］ｚ）・Ｅ    
（ＩＩ）
によって表すことができ、式中、Ｐ、コア、スペーサー、リンカー、レポーター、ｖ、ｘ
、ｙおよびｚは前記の通りであり、Ｅはエフェクターである。共有結合により融合させた
結合体では、化学結合の法則通りに、エフェクターはコア、もしくはリンカー、またはこ
れらの両方に結合させることができる。
【０１５６】
（ペプチド合成）
ペプチド配列ＲＲＴＫ（Ｐ１、配列番号１）を、膵β細胞に結合させるためのペプチド
コンセンサスモチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４（ここで、Ｘ１およびＸ４はＲもしくはＫ
とすることができ、Ｘ１およびＸ４は任意のアミノ酸とすることができる）を明らかにす
るファージ・ディスプレイ実験から得た。表６に示されるように修飾したペプチドを、Ｂ
ｏｃ化学により０．５ｍｍｏｌのＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＰＡＭ樹脂を用いて手動で
合成した。イタリック体は、対応するタンパク質配列には存在しないリンカー残基および
スペースを示す。この実験に用いたいくつかのコア構造を表７に示す。合成を、Ｂｏｃ化
学により０．５ｍｍｏｌのメチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）を用いて行
った。
【０１５７】
ペプチドは全て、（５％のｐ−クレゾールの存在下に０℃で１時間）ＨＦを作用させて
樹脂から切断し、冷エーテルで沈殿させ、５０％アセトニトリルで抽出し、ろ過して凍結
乾燥した。粗製ペプチドを分取ＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩＭＳにより特性を決定した
。
【０１５８】
【表６】
2010024250.tif 000008
【０１５９】
【表７】
2010024250.tif 000009
【０１６０】
（フルオレセイン・リンカーの調製）
フルオレセイン・リンカーＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨを、オフォ
ード（Ｏｆｆｏｒｄ）の方法により調製した。Ｏｆｆｏｒｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．２８７：３４８−６９（１９９７）を参照されたい。簡単に言えば、２ｍｍｏ
ｌのＢｏｃ−アミノオキシアセチル（Ｂｏｃ−ＡＯＡ−ＯＳｕ）および１．２ｍｍｏｌの
Ｎε−（ＴＦＡ）−Ｌｙｓを３ｍｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶液に加え、Ｎ
−エチルモルホリンをｐＨ値が８〜９となるまで加えた。室温で１５時間、次いで３７℃
で１時間インキュベートした後、絶えず撹拌しながら氷酢酸を注意深く加えることによっ
てｐＨ値を３．０に下げた。生成物［Ｂｏｃ−ＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−ＯＨ］を、分
取スケールのＨＰＬＣにより単離し、次いで乾燥した。この乾燥した化合物に４ｍｌの水
、次いで０．４４ｍｌのピペリジン（最終濃度１Ｍ）を加え、これを室温で４時間インキ
ュベートした後、氷上でｐＨを３．０に調整した。次に、この混合物を０．１％のＴＦＡ
１０ｍｌで希釈した。分取ＨＰＬＣにより脱保護物質（Ｂｏｃ−ＡＯＡ−Ｌｙｓ−ＯＨ）
を単離し、再度乾燥した。この乾燥物質を３００μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）に溶かし、４０ｍｇのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を加え、
得られた混合物をＮ−エチルモルホリンでｐＨ８．０に調整した。暗所で１５時間インキ
ュベートした後、生成物を、メタノール／ＣＨ３Ｃｌ（１：１、ｖ／ｖ）で平衡させたシ
リカ・カラム［Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０（フルカ・ケミー社（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉ
ｅ）、ブックス（Ｂｕｃｈｓ）、スイス）、１．５×２０ｃｍ］を用いたクロマトグラフ
ィーにより精製した。過剰のＦＩＴＣを貫流（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分に溶出さ
せ、予測される生成物を含む第二の黄色画分をメタノール／ＣＨ３Ｃｌ（４：１、ｖ／ｖ
）で溶出させた。回転式蒸発により溶媒を除去した後、この乾燥化合物Ｂｏｃ−ＡＯＡ−
Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨを（２０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度の）ＴＦＡ中で脱保護し、室温
で４５分間置いておいた。次に、ＴＦＡの大部分を蒸発させ、凍結乾燥により乾燥を完了
させた。最終生成物［ＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨ］は、分取ＨＰＬＣにより単離
し、ＥＳＩ−ＭＳにより特性を決定した。
【０１６１】
（コアへのペプチドリガンドのアルキル化）
０．９μｍｏｌのＣｙｓ−コア・ペプチド（１．１９ｍｇ）を５０μｌのアセトニトリ
ルおよび１００μｌの水に溶かした（ペプチドは完全には溶けない）。ブロモアセチル−
ペプチドの新鮮溶液（ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液の３．６μｍｏｌ溶
液）を調製した。次いで、２つの溶液を室温の暗所で混合することによりアルキル化を開
始させた。４０分後に生成物を半分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥し、そして
特性を決定した。
【０１６２】
（過ヨウ素酸酸化）
過ヨウ素酸酸化を行うため、０．３７５μｍｏｌのペプチド（表６のペプチド３もしく
は４、または表８に挙げたアルキル化ペプチド）を４３３μｌアセトニトリルおよび１．
２６ｍｌイミダゾール緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．９５、塩化物対イオン）に溶かした。
メチオニン（１１３μｌ、２００ｍＭ）を加えた。次に、１７μｌのＮａＯ４（０．１Ｍ
水溶液）を加えて酸化を開始させた。５分後、４０μｌのエチレングリコール（５００ｍ
Ｍ水溶液）を加えることにより反応を停止させた。得られた生成物は分取ＨＰＬＣにより
精製し、質量分析法により特性を決定した。
【０１６３】
【表８】
2010024250.tif 000010
【０１６４】
（オキシム化）
次に、過ヨウ素酸酸化により得られたアルデヒドをコア３もしくは４（各コアにＡＯＡ
基を含む）、またはＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨと反応させてオキシムを形成した
。図１および２に示したオキシム１〜６をこうして作製した。また、表９に予測および実
測質量分析データを示した。図１に示されるように、オキシム１〜３については、コアの
分枝Ｌｙｓ残基を、αアミノ基とεアミノ基との両方において、スペーサーありまたはな
しで、ＲＲＴＫ（配列番号１）ペプチドのＮ末端でアシル化した。スペーサーと共に、レ
ポータ・タグＦＩＴＣを各構築体のコアに導入した。図２のオキシム４〜６では、コアの
分枝Ｌｙｓ残基を、αアミノ基とεアミノ基との両方において、スペーサーとともにＲＲ
ＴＫ（配列番号１）ペプチドのＮ末端でアシル化した。スペーサーと共に、レポータ・タ
グのビオチンを各構築体のコアに導入した。
【０１６５】
【表９】
2010024250.tif 000011
【０１６６】
ＡＯＡＬｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨでオキシム化するために、０．１２９μｍｏｌの酸化
構築物を５μｌのアセトニトリルおよび２００μｌのＮａＯＡｃ緩衝液（酢酸０．５７ｍ
ｌおよび水１００ｍｌの混合物と、酢酸ナトリウム０．８２ｇを水１００ｍｌに溶かした
溶液とをｐＨ４．０となるように混合した溶液）に溶解させた。この混合物に０．５１６
μｍｏｌのＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨ（１００μｌのアセトニトリルおよび１０
０μｌのＮａＯＡｃ緩衝液に８．８ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かしたもの）を加えた後、酢酸
を最終濃度が４％となるよう加えた。コア３もしくは４をオキシム化するために、酸化し
たペプチド３もしくは４の３．８μｍｏｌを１００μｌのアセトニトリルおよび２００μ
ｌのＮａＯＡｃ緩衝液に溶解させた。この溶液に０．４７５μｍｏｌのコア３もしくは０
．２３７μｍｏｌのコア４を加えた後、酢酸を最終濃度が４％となるよう加えた。室温で
２４時間反応させた後、生成物を半分取ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、質量分析により特性を
決定した。
【０１６７】
４本の分枝のそれぞれの末端にＲＲＴＫ（配列番号１）ペプチド（ペプチド１）のコピ
ーを有する円形のトリリジン・コア（コア１）にオキシム１（図１）を形成させた。各ペ
プチドのＮ末端を、ブロモアセチル基とチオール基との特異的な反応により生じるチオエ
ーテル結合を介して結合させた。また、このトリリジン・コアにはスクシンイミジル−Ｐ
ＥＧスペーサー、および酸化を受けてアルデヒドを形成することができるセリンを含ませ
たので、レポーター基アミノオキシアセチル−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）を、オキシム形成を介
してこのテトラマーに導入した。ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ分析により、目的生成物で
あることが示された：質量分析データ：Ｍｒ実測値４２８９．３１、Ｍｒ理論値４２８９
．０４。オキシム１は酸性および中性ｐＨで２４時間安定であった。
【０１６８】
オキシム２および３（図１）を、同様にして形成したが、オキシム３ではＲＲＴＫペプ
チド（配列番号１）とコアとの間に２ユニットのＰＥＧスペーサーを配置し、オキシム２
ではＲＲＴＫペプチド（配列番号１）のＮ末端はコア１ではなくコア２と結合させた。質
量分析データ：オキシム２：Ｍｒ実測値４４５９．４８、Ｍｒ理論値４４６０．１９；オ
キシム３：Ｍｒ実測値６７０８．２９、Ｍｒ理論値６７０８．００。
【０１６９】
オキシム４（図２）を、オキシム３と同様にして合成したが、ＦＩＴＣ基をレポーター
とするのではなく、ビオチン基をトリリジン・コアのアミド結合を介して直接結合させた
。質量分析データ：Ｍｒ実測値６１６０．０、Ｍｒ理論値６１６０．３。オキシム５はオ
キシム４と同様であったが、ＲＲＴＫ（配列番号１）残基は全てＤ型であった。質量分析
データ：Ｍｒ実測値６１５８．６、Ｍｒ理論値６１６０．３。
【０１７０】
オキシム６を、オキシム４と同様に合成したが、ＲＲＴＫ（配列番号１）ペプチドのコ
ピーを４個ではなく、８個含む。質量分析データ：Ｍｒ実測値１１６４６．１、Ｍｒ理論
値１１６４３．６。
【０１７１】
（免疫細胞化学および蛍光による検討）
前述の濃縮スキームによって単離した単一ファージを増幅させた。このファージ・ペプ
チドおよびオキシム１〜６のうちの１種を培養培地中の細胞に加え、２４時間インキュベ
ートした。次に、培地を洗い流し、細胞を冷メタノール−アセトン（１：１）で５分間固
定した。ファージ・キャプシドに対する抗体もしくはビオチン（ペプチド）に対する抗体
を、フルオレセイン結合（ファージ）もしくはテキサス・レッド標識（ペプチド）二次抗
体と共に用いた。古典的な蛍光顕微鏡による検討および共焦点顕微鏡によるアッセイを実
施した。
【０１７２】
まず、オキシム１〜３のβＴＣ−３細胞内への侵入について調べた。蛍光による検討で
は、構築ブロックとして２ユニットのＰＥＧスペースを有するＲＲＴＫペプチドの４つの
コピーを用いるテトラオキシム（樹状形）のオキシム３は、βＴＣ−３細胞表面の受容体
に明確に結合し、細胞内へ侵入可能であることが明らかになった。オキシム３が優れてい
るのは、細胞表面の受容体への結合を増強するＰＥＧスペーサーの可動性に起因し得る。
【０１７３】
次いで、オキシム３に類似のオキシム４〜６を合成し、結合親和力および侵入効率につ
いてアッセイした。ＲＲＴＫ（配列番号１）ペプチドのコピー数を、オキシム６では８個
まで増やし、Ｄ−ペプチドが高い安定性を有し、免疫原性がより低いことが実証されてい
るので（Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４４８
：４５０（１９９９）を参照）、オキシム５では上記ペプチドをＤ−エナンチオマー型に
変更した。顕微鏡による検査では、８個のペプチドコピーを有するオキシム６（オクタオ
キシム）は細胞内へ効率的に侵入することができることが明らかになった。ビオチンに対
するテキサス・レッド標識二次抗体によって、このオクタオキシムは、「空胞状」構造体
としての細胞の内側に、または細胞膜に局在することが明らかになった。従って、ペプチ
ドコピー数を最大８個まで増加させた多量体は、結合ペプチドの向上した結合活性および
移送効率を示す。
【図１】
2010024250.tif 000012
【図２】
2010024250.tif 000013
【配列表】
2010024250000001.app