(57)【要約】【課題】正常型遺伝子の中に少数の変異型遺伝子が含まれる検体であっても、公知の方法よりも高感度に変異型遺伝子を検出することができる、変異型遺伝子の検出方法及びそのための核酸増幅法を提供すること。【解決手段】鋳型核酸との結合親和性がプライマーよりも高く、3'側に伸長せず、正常型核酸とは相補的であるが変異型核酸とはミスマッチを含む、増幅阻害オリゴ核酸の存在下で核酸増幅法を行うと共に、アニーリング工程を、高温側から低温側に温度を降下させながら行うことにより、正常型の核酸の増幅が特異的に阻害され、変異型核酸のみが増幅され、その結果、変異型核酸を検出することが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基本型の塩基配列を有する基本型核酸と、該基本型の塩基配列中に変異部位を有する変異型核酸の混合物を鋳型核酸とし、該鋳型核酸中の一部領域を、該鋳型核酸とハイブリダイズする少なくとも１種類のプライマーの伸長反応の繰返しにより増幅する核酸増幅法であって、
前記増幅は、前記基本型核酸と前記プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する増幅阻害オリゴ核酸の存在下において行われ、該増幅阻害オリゴ核酸は、
(1) リボースの2'位の炭素原子と4'位の炭素原子がメチレン鎖を介して架橋された修飾リボースを含むリボヌクレオチドを含み、
(2)その3'末端がポリメラーゼにより伸長できないように修飾されており、かつ、
(3)前記基本型の塩基配列の部分領域及び／又は前記基本型核酸の増幅産物の部分領域と相補的な塩基配列を有するが、前記変異型の塩基配列の部分領域とはミスマッチ部位を含み、
前記鋳型核酸と前記増幅阻害オリゴ核酸及び前記プライマーとのハイブリダイゼーションを行うアニーリング工程が、前記鋳型核酸と前記増幅阻害オリゴ核酸とから成る二本鎖核酸の融解温度及び前記鋳型核酸と前記プライマーから成る二本鎖核酸の融解温度の両者を包含する温度範囲において高温側から低温側に温度を下げながら行われる、核酸増幅法。
【請求項２】
前記増幅阻害オリゴ核酸がハイブリダイズする領域と、前記プライマーがハイブリダイズする領域とが少なくとも部分的に重複している請求項１記載の核酸増幅法。
【請求項３】
前記増幅阻害オリゴ核酸がハイブリダイズした二本鎖核酸の融解温度が、前記プライマーがハイブリダイズした二本鎖核酸の融解温度よりも高い、請求項１又は２記載の核酸増幅法。
【請求項４】
前記プライマーがハイブリダイズする領域に、前記変異部位が含まれない請求項１ないし３のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項５】
前記変異部位は１個の点変異のみである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項６】
前記増幅阻害オリゴ核酸を構成する少なくとも一部のヌクレオチドが、耐ヌクレアーゼ修飾を有するものである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項７】
前記核酸増幅法が、PCR法である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項８】
前記基本型核酸の増幅産物及び前記変異型核酸の増幅産物は、これらのいずれか一方のみが切断される制限酵素部位を有する請求項１ないし７のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項９】
前記プライマーは、前記制限酵素部位を与えるミスマッチ部位を含む請求項８記載の核酸増幅法。
【請求項１０】
前記プライマーは、前記鋳型核酸とハイブリダイズしない無関係な配列から成るサイズ増大領域が5'側に付加されている請求項８又は９記載の核酸増幅法。
【請求項１１】
請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の核酸増幅法により前記鋳型核酸の一部領域を増幅した後、増幅産物を前記制限酵素で消化し、消化後の核酸断片のサイズに基づき、前記変異型核酸の増幅産物の有無を検出することを含む、前記変異型核酸の検出方法。
【請求項１２】
前記検出は、前記制限酵素で消化した増幅産物を電気泳動にかけ、分離されたバンドを検出することにより行われる請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基本型の塩基配列を有する核酸と、該基本型の塩基配列に変異を有する変異型核酸との混合物中の前記変異型核酸の検出方法及びそのための核酸増幅法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の疾患等を診断するための遺伝子検査において、正常型遺伝子の中に混入している変異型遺伝子を検出する必要がしばしばある。例えば、膵臓癌等の癌においては、K-ras遺伝子のcodon 12の単点突然変異が発癌に寄与していることが知られているので、組織中のK-ras codon 12の異常型を検出することにより癌の診断を行うことが可能である。しかしながら、組織中の癌細胞が少数であり、他の大多数の細胞が正常細胞である場合には、該組織から抽出したDNA検体は、野生型遺伝子中に少数の変異型遺伝子を含むものとなる。
【０００３】
正常型遺伝子中に含まれる変異型遺伝子を簡便に検出する方法としては、例えば、制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism、RFLP)を利用した方法、特に、PCRにより検体遺伝子を増幅した後にRFLPを行うPCR-RFLPが知られている（例えば特許文献１）。すなわち、正常型遺伝子及び変異型遺伝子の増幅産物のいずれか一方のみが制限酵素部位を有する増幅産物をその制限酵素で消化し、消化物を電気泳動にかけ、分離されるバンドのサイズに基づき、変異型遺伝子を検出する方法である。遺伝子をそのまま増幅した場合にこのような制限酵素部位が存在しない場合には、このような制限酵素部位が生じるようにプライマーの配列を設定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２１８９９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来のPCR-RFLP等の公知の方法では、正常型遺伝子が圧倒的に多数を占め、変異型遺伝子の割合が非常に少ない検体の場合には、変異型遺伝子を検出することが困難であり、すなわち、検出感度が必ずしも満足できない。
【０００６】
従って、本発明の目的は、正常型遺伝子の中に少数の変異型遺伝子が含まれる検体であっても、公知の方法よりも高感度に変異型遺伝子を検出することができる、変異型遺伝子の検出方法及びそのための核酸増幅法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、鋳型核酸との結合親和性がプライマーよりも高く、3'側に伸長せず、正常型核酸とは相補的であるが変異型核酸とはミスマッチを含む、増幅阻害オリゴ核酸の存在下で核酸増幅法を行うと共に、アニーリング工程を、高温側から低温側に温度を降下させながら行うことにより、正常型の核酸の増幅が特異的に阻害され、変異型核酸のみが増幅され、その結果、変異型核酸を検出することが可能となることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、基本型の塩基配列を有する基本型核酸と、該基本型の塩基配列中に変異部位を有する変異型核酸の混合物を鋳型核酸とし、該鋳型核酸中の一部領域を、該鋳型核酸とハイブリダイズする少なくとも１種類のプライマーの伸長反応の繰返しにより増幅する核酸増幅法であって、
前記増幅は、前記基本型核酸と前記プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する増幅阻害オリゴ核酸の存在下において行われ、該増幅阻害オリゴ核酸は、
(1) リボースの2'位の炭素原子と4'位の炭素原子がメチレン鎖を介して架橋された修飾リボースを含むリボヌクレオチドを含み、
(2)その3'末端がポリメラーゼにより伸長できないように修飾されており、かつ、
(3)前記基本型の塩基配列の部分領域及び／又は前記基本型核酸の増幅産物の部分領域と相補的な塩基配列を有するが、前記変異型の塩基配列の部分領域とはミスマッチ部位を含み、
前記鋳型核酸と前記増幅阻害オリゴ核酸及び前記プライマーとのハイブリダイゼーションを行うアニーリング工程が、前記鋳型核酸と前記増幅阻害オリゴ核酸とから成る二本鎖核酸の融解温度及び前記鋳型核酸と前記プライマーから成る二本鎖核酸の融解温度の両者を包含する温度範囲において高温側から低温側に温度を下げながら行われる、核酸増幅法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の核酸増幅法によれば、正常型遺伝子の中に少数の変異型遺伝子が含まれる検体であっても、高感度に変異型遺伝子を検出することができる。従って、本発明は、癌等の各種疾患の遺伝子検査に貢献するものであり、とりわけ、変異型遺伝子の比率が低い、早期の疾患の診断に貢献するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の核酸増幅法は、基本的には、オリゴヌクレオチドプライマーを用いる、PCR(polymerase chain reaction)法等の周知の核酸増幅法により行うことができる。オリゴヌクレオチドプライマーを用いる核酸増幅法としては、PCR法の他に、LCR(ligase chain reaction)法、SDA (strand displacement amplification)法やRNAを増幅するTMA (transcription mediated amplification)法等が広く知られており、これらを実施するキットが市販されているので、市販のキットを用いて容易に行うことができる。これらの周知の核酸増幅法は、オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型核酸とハイブリダイズさせ、該オリゴヌクレオチドプライマーの伸長反応を利用して増幅するものであるので、後述する、本発明の方法を適用することが可能なものである。以下の説明では、最も広く用いられているPCR法を基礎とする方法を主として説明するが、他の核酸増幅法でも同じ原理により本発明の方法が適用可能であることは明らかである。
【００１１】
本発明の核酸増幅法に供される検体は、基本型の塩基配列を有する基本型核酸と、該基本型の塩基配列中に変異部位を有する変異型核酸の混合物を含む。ここで、「基本型核酸」は、検体中に、変異型核酸より多く含まれる核酸であり、各種疾患の遺伝子検査においては多くの場合「正常型遺伝子」に該当するが、必ずしも「基本型」が正常型である必要はない。検体中に含まれる、２種類の核酸の数が同程度の場合には、任意の一方を「基本型」と考えることができる。
【００１２】
「変異型核酸」は、基本型核酸の塩基配列とほぼ同じ塩基配列を有するが、少なくとも１箇所の変異部位を持つ塩基配列を有する。変異部位は、複数箇所でもよいが、本発明の方法は、高感度に変異型核酸を検出可能であるので、変異部位が点変異１箇所のみの場合（一塩基多型(SNP)の場合等）に特に威力を発揮するので好ましい。
【００１３】
本発明の核酸増幅法は、上記基本型核酸の増幅を特異的に阻害する増幅阻害オリゴ核酸の存在下で、核酸増幅法を行うことを重要な特徴としている。増幅阻害オリゴ核酸は、
(1) リボースの2'位の炭素原子と4'位の炭素原子がメチレン鎖を介して架橋された修飾リボースを含むリボヌクレオチドを含み、
(2)その3'末端がポリメラーゼにより伸長できないように修飾されており、かつ、
(3)前記基本型の塩基配列の部分領域及び／又は前記基本型核酸の増幅産物の部分領域と相補的な塩基配列を有するが、前記変異型の塩基配列の部分領域とはミスマッチ部位を含むものである。以下、これらについて説明する。
【００１４】
リボースの2'位の炭素原子と4'位の炭素原子がメチレン鎖を介して架橋された修飾リボースを含む修飾リボヌクレオチドは、LNA(Locked Nucleic Acid（登録商標）)として市販されており、このような修飾リボヌクレオチドを含むオリゴ核酸は市販の該修飾リボヌクレオチドを用いて、通常のDNA合成法により容易に合成することができる。また、該修飾リボヌクレオチドを含み、特定の塩基配列を有するオリゴ核酸の合成を受託しているサービスも利用可能である。
【００１５】
前記修飾リボヌクレオチドを含む修飾オリゴ核酸は、その相補的なDNAやRNAとの結合親和性が、同じ塩基配列を有するDNA-DNA間の結合親和性よりも高いことを有利な特徴としており、前記修飾オリゴ核酸をプライマーやプローブとして用いることにより、その配列特異性を高めることができ、また、同じ配列特異性を達成するために必要なサイズ（塩基数）を小さくすることができるという利点があり、近年広く用いられつつある。
【００１６】
本発明の核酸増幅法に用いる増幅阻害オリゴ核酸は、上記した修飾リボヌクレオチドを含むものである。なお、オリゴ核酸の全部を上記修飾リボヌクレオチドにする必要はなく、オリゴ核酸を構成するヌクレオチドのうち、１個〜２個おきの間隔で前記修飾リボヌクレオチドを配置することが配列特異性を高める上で効果的である。
【００１７】
前記増幅阻害オリゴ核酸は、ポリメラーゼによる3'側への伸長ができないように修飾されている。これにより、増幅阻害オリゴ核酸がプライマーとして働いて不所望の増幅が起きる可能性が排除される。3'側への伸長を防止する修飾はこの分野において周知であり、例えば、3'末端のリン酸化により達成することができる。3'末端のリン酸化方法は周知であり、例えば、文献Applied Biosystem, User Bulletin, 86 (1994).に記載されている。3'末端のリン酸化の他に、ddNTP(ダイデオキシヌクレオチド、ddCTP,ddATP,ddGTP,ddTTP)を用いる方法（文献：Single nucleotide polymorphism analysis based on minisequencing coupled with a fluorescence microsphere technology.  Li ZP, Kambara H.  J Nanosci Nanotechnol. 2005 Aug;5(8):1256-60.）やｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴなどを用いる方法（文献：5'-,3'-inverted thymidine-modified antisense oligodeoxynucleotide targeting midkine. Its design and application for cancer therapy.Takei Y, Kadomatsu K, Itoh H, Sato W, Nakazawa K, Kubota S, Muramatsu T.J Biol Chem. 2002 Jun 28;277(26):23800-6.）を利用することもできる。これらの方法もそれ自体周知である。
【００１８】
前記増幅阻害オリゴ核酸は、前記基本型の塩基配列の部分領域及び／又は前記基本型核酸の増幅産物の部分領域と相補的な塩基配列を有するが、前記変異型の塩基配列の部分領域とはミスマッチ部位を含む。ここで、「相補的」とは、二本鎖核酸のいずれか一方の鎖と相補的という意味であり、配列表に記載されるセンス鎖同士を比較すれば、配列が同一となる。なお、増幅阻害オリゴ核酸は、通常、前記基本型核酸の部分領域及び基本型核酸を鋳型とする増幅産物と相補的であるが、後述するように、増幅産物中に、意図的に制限酵素部位を含ませるために、ミスマッチ部位を有するプライマーを用いて増幅を行なった場合には、増幅産物の塩基配列は、最初の鋳型となる基本型の塩基配列とは異なったものになる。この場合には、増幅阻害オリゴ核酸は、最初の鋳型となる基本型の塩基配列及び増幅産物の塩基配列のいずれか一方と相補的な塩基配列を有する。増幅産物は、PCRの２サイクル目以降は、鋳型として機能するので、増幅阻害オリゴ核酸が、この鋳型と相補的な塩基配列を有する場合でも増幅を有効に阻害することができる。また、上記の通り、増幅阻害オリゴヌクレオチドは、変異型の塩基配列の部分領域とはミスマッチ部位を有する。換言すれば、増幅阻害オリゴヌクレオチドは、変異型の塩基配列の変異部位を含む領域とハイブリダイズするように設定される。これにより、増幅阻害オリゴ核酸は、主として基本型核酸とのみハイブリダイズする。
【００１９】
増幅阻害オリゴ核酸がハイブリダイズする領域と、前記プライマーがハイブリダイズする領域とが少なくとも部分的に重複していることが好ましい。これにより、増幅阻害オリゴ核酸が、鋳型となる相補鎖とハイブリダイズした場合に、さらに後述のプライマーがハイブリダイズして増幅が起きる可能性がさらに低減される。重複するように増幅阻害オリゴ核酸を設定する場合、重複部分の長さは、１塩基以上、増幅阻害オリゴ核酸の全長であり、１０塩基以上、増幅阻害オリゴ核酸の全長マイナス３塩基程度が好ましい。なお、PCRの場合、１対のプライマーが用いられるが、増幅阻害オリゴ核酸は、いずれか一方のプライマーと重複するものであればよい。下記実施例では、PCRのセンスプライマーと重複するものを用いている。
【００２０】
増幅阻害オリゴ核酸がハイブリダイズした二本鎖核酸の融解温度(Tm)が、前記プライマーがハイブリダイズした二本鎖核酸のTmよりも高いことが好ましい。後述のように、本発明の核酸増幅法では、温度を降下させながらアニーリング工程を行なうが、増幅阻害オリゴ核酸がハイブリダイズした二本鎖核酸のTmが、プライマーがハイブリダイズした二本鎖核酸のTmよりも高い場合には、プライマーよりも先に増幅阻害オリゴ核酸が鋳型にハイブリダイズするので、プライマーが鋳型にハイブリダイズする可能性がより低減される。
【００２１】
増幅阻害オリゴ核酸は、ヌクレアーゼによる分解を受けにくくするために、耐ヌクレアーゼ修飾を受けたヌクレオチドを含んでいてもよい。「耐ヌクレアーゼ修飾」とは、ヌクレアーゼによる分解を天然のDNAよりも受けにくくする修飾のことを意味し、このような修飾自体は周知である。耐ヌクレアーゼ修飾の例としては、ホスホロチオエート化（本明細書において「Ｓ化」と呼ぶことがある)、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化等を挙げることができる。これらのうち、Ｓ化が好ましい。Ｓ化は、隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を構成するリン原子に結合している２個の非架橋酸素原子のうちの１個をイオウ原子に変換することを意味する。任意の隣接するヌクレオチド間の結合をＳ化する手法自体は周知であり、また、Ｓ化オリゴヌクレオチドは商業的にも合成されているのでそれらの市販品を用いることもできる。増幅阻害オリゴ核酸を構成する全ヌクレオチドに耐ヌクレアーゼ修飾を施してもよいが、一部のヌクレオチドにだけ耐ヌクレアーゼ修飾を施してもよい。
【００２２】
増幅阻害オリゴ核酸は、DNAプライマーよりも配列特異性が高いので、通常のDNAプライマーよりも短くてよく、特に、仮に検体中に存在する他の何らかの核酸とハイブリダイズした場合でも、その核酸の増幅を阻害するだけであるので特に問題は生じない。従って、増幅阻害オリゴ核酸のサイズは、１２塩基以上程度でよく、好ましくは１５塩基以上である。一方、増幅阻害オリゴ核酸の長さがあまりに長くなると、変異型核酸とハイブリダイズする可能性が生じてくるので好ましくなく、従って、増幅阻害オリゴ核酸のサイズは、２５塩基以下が好ましく、さらに２０塩基以下が好ましい。なお、増幅阻害オリゴ核酸は、基本型核酸の増幅を阻害するものであるので、本発明で規定する上記要件を満足するものであれば、単独でも用いることができるし、２種以上を混合して用いることもできる。例えば、下記実施例３では、基本型の塩基配列と相補的な増幅阻害オリゴ核酸と、増幅産物の塩基配列と相補的な増幅阻害オリゴ核酸の混合物を用いている。
【００２３】
増幅に用いられるプライマーは、通常の核酸増幅法に用いられるプライマーと同様でよい。なお、基本型核酸の増幅は、上記した増幅阻害オリゴ核酸により特異的に阻害されるので、プライマーは、変異部位を含む領域とハイブリダイズする必要はなく、変異部位を含まない領域に設定することが可能である。なお、プライマーのサイズは、常法と同様でよく、通常、１８塩基以上、５０塩基以下、好ましくは２０塩基以上３５塩基以下である。なお、プライマーが、後述するサイズ増大領域を含む場合には、上記したプライマーのサイズは、サイズ増大領域以外の領域のサイズである。
【００２４】
本発明の核酸増幅法では、アニーリング工程が、前記鋳型核酸と前記増幅阻害オリゴ核酸とから成る二本鎖核酸の融解温度及び前記鋳型核酸と前記プライマーから成る二本鎖核酸の融解温度の両者を包含する温度範囲において高温側から低温側に温度を下げながら行われる。すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーを用いる核酸増幅法では、プライマーと鋳型とをハイブリダイズさせる、アニーリング工程と呼ばれる工程を含むが、このアニーリング工程を、上記の通り、温度を降下させながら行なう。これにより、増幅阻害オリゴ核酸及びプライマーの両者が、鋳型となる核酸と最もよくハイブリダイズする温度条件を達成することができ、増幅阻害オリゴ核酸による基本型核酸の増幅阻害と、プライマーによる変異型核酸の増幅がより確実に確保される。核酸増幅法をＰＣＲにより行なう場合、通常、変性温度（多くの場合９４℃前後）から、伸長温度（多くの場合７２℃前後）よりも１０℃以上低い温度、好ましくは４５℃〜５５℃程度まで温度を降下させながら行なうことにより、上記した両Tm温度を通過することが確保される。アニーリング工程の長さは特に限定されないが、通常１分間〜５分間程度、好ましくは２分間〜４分間程度である。また、温度の降下は、増幅阻害オリゴ核酸とプライマーのハイブリダイゼーションを確保するために、アニーリング工程の時間内でできるだけゆっくりと行なうことが好ましく、アニーリング工程の全体を実質的に等速度で降下させることが好ましい。
【００２５】
上記した増幅阻害オリゴ核酸の存在下で核酸増幅法を行なうこと、及び上記した温度条件でアニーリング工程を行なうこと以外は、通常の核酸増幅法と同様にして行なうことができる。すなわち、PCRの場合、鋳型核酸、一対のプライマー及び上記増幅阻害オリゴ核酸並びに耐熱性DNAポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング及び伸長の各工程の温度サイクルを繰り返すことにより行なうことができる。反応液中の増幅阻害オリゴ核酸の濃度は、特に限定されないが、通常、5nM〜50000nM程度、好ましくは250nM〜5000nM程度である。また、プライマーの濃度は、通常の条件でよく、通常、5nM〜50000nM程度、好ましくは50nM〜1000nM程度である。また、アニーリング工程は上記の通りであり、変性工程及び伸長工程は通常と同じでよく、変性工程は、通常、80℃〜100℃程度で0.1秒間〜120秒間程度、伸長工程は、通常、20℃〜80℃程度で1秒間〜180秒間程度行なわれる。
【００２６】
本発明の核酸増幅法では、基本型核酸は、増幅阻害オリゴ核酸がハイブリダイズすることにより増幅が阻害され、一方、変異型核酸には増幅阻害オリゴ核酸がハイブリダイズしないので、増幅が阻害されない。このため、大多数の基本型核酸中に少数の変異型核酸が含まれる場合であっても、変異型核酸の増幅が効率的に起きるので、増幅の有無に基づき、変異型核酸の検出を行なうことができる。また、PCRとして、周知のリアルタイム検出PCRを採用することなどにより、変異型核酸の定量を行なうことも可能である。なお、定量は、必然的に検出を伴うので、本発明でいう「検出」には定量も包含される。
【００２７】
変異型核酸の検出は、それ自体周知のRFLPによっても行なうことができる。すなわち、上記変異部位に起因して、基本型核酸の増幅産物及び変異型核酸の増幅産物のいずれか一方のみに制限酵素部位が生じる場合には、増幅産物を制限酵素で消化し、消化物をゲル電気泳動にかけ、分離されたバンドのサイズを調べることにより、変異型核酸を検出することができる。天然の配列では、このような制限酵素部位が存在しない場合には、このような制限酵素部位を与えるように設計した、ミスマッチ部位を有するプライマー（制限酵素プライマー）を用いて増幅を行なうこともできる（下記実施例参照）。このような制限酵素プライマーを用いて、RFLPに利用可能な制限酵素部位を作り出す手法自体は周知である。
【００２８】
また、RFLPを行なう場合には、特に、上記した制限酵素プライマーを用いて増幅を行なう場合には、少なくともいずれか一方のプライマー（制限酵素プライマーを用いる場合には制限酵素プライマー）の5'末端に鋳型核酸とハイブリダイズしない無関係な配列から成るサイズ増大領域が付加されていてもよい。これにより、制限酵素で切断された断片の長さを大きくすることができ、電気泳動でより明確にバンドを検出することができる。
【００２９】
本発明は、上記した本発明の核酸増幅法を行なった後、上記したRFLPを行なうことを含む、上記変異型核酸の検出方法をも提供するものである。
【００３０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１及び２、比較例１及び２
野生型K-ras遺伝子中に変異型K-ras遺伝子を含む遺伝子混合物の増幅
本発明の方法を適用したPCR-RFLPに基づき、K-ras codon 12点突然変異の検出を行った。K-ras codon 12点突然変異は、野生型のK-ras codon 12のggtがgttに変異したものであり、膵癌、大腸癌、肺癌等で高率に出現する点突然変異である。なお、野生型のK-ras遺伝子の部分領域が本発明で言う「基本型核酸」、変異型のK-ras遺伝子の部分領域が本発明で言う「変異型核酸」に該当する。本実施例で増幅した領域の塩基配列を図１及び配列番号１に示す。図１中、大文字で記載されている領域がエクソン、小文字で記載されている領域がイントロンである。なお、図１及び配列番号１に示す配列は、野生型遺伝子の配列であり、変異型遺伝子では、配列番号１中の24nt〜26ntのggtがgttに点突然変異している。
【００３２】
図１及び配列番号１に示す配列を有する領域を含む領域を通常のPCRで増幅後、第２段の増幅に本発明の方法を適用した。以下、本発明の方法を適用した第２段の増幅について説明する。用いたフォワード側プライマーの塩基配列（配列番号２）は、次の通りである。
5'-gtaaaacgacggccag-ataaacttgtggtagttggagccg-3'
3'末端から２番目の下線を引いたcは、K-ras遺伝子の部分領域の増幅産物に制限酵素MspIの切断部位を与えるために導入したミスマッチ部位である。このフォワード側プライマーを用いた場合、変異型遺伝子の部分領域の増幅産物には、MspI部位が存在しないが、野生型遺伝子の部分領域の増幅産物にはMspI部位が存在することになるので、RFLPにより変異型遺伝子の検出が可能になる。上記フォワード側プライマーの中央付近のハイフンよりも上流の領域は、K-ras遺伝子とは全く無関係な配列を有し、鋳型とは全くハイブリダイズしない。これは上記したサイズ増大領域であり、MspIにより切断される部位よりも上流の断片のサイズを大きくして電気泳動分離後にこの断片のバンドを検出し易くするものである。また、PCRに用いたリバース側プライマーの塩基配列は、配列番号３に示す通りであり、上記したフォワード側プライマーとこのリバース側プライマーを用いたPCRにより、図１及び配列番号１に示す領域が増幅される（ただし、実際に主として増幅される配列は上記の変異部位を含む変異型のK-ras遺伝子の部分領域である）。
【００３３】
増幅阻害オリゴ核酸としては、図２に示す、AIN-1（配列番号４）、AIN-2（配列番号５）又はAIN-3（配列番号６）を用いた。これらのうち、AIN-2は、野生型遺伝子の部分領域と相補的（配列表ではセンス鎖のみを記載するので同一配列）であり、変異型遺伝子の部分領域とはミスマッチ部位を有するので、本発明で規定する増幅阻害オリゴ核酸に該当する（実施例２）。AIN-1は、野生型遺伝子とはミスマッチ部位を有するが、これは、制限酵素プライマーに意図的に導入されている、MspI部位を導入するための変異であり、増幅産物とは相補的であり、変異型遺伝子の部分領域とはミスマッチ部位を有するので、AIN-1も本発明で規定する増幅阻害オリゴ核酸に該当する（実施例１）。一方、AIN-3は、その10ntがcになっており、野生型遺伝子ともミスマッチ部位を有するので、本発明で規定する増幅阻害オリゴ核酸には該当しない（比較例１）。また、増幅阻害オリゴ核酸として、AIN-1とAIN-2との等量混合物も用いた（実施例３）。各増幅阻害オリゴ核酸を構成するオリゴヌクレオチドは、１個〜２個おきにLNA（登録商標）となっており、具体的には、例えば、AIN-1の配列は
g+ta+gt+tg+ga+gcc+gg+tg
である（右肩に+が付いているヌクレオチドがLNA（登録商標）である）。また、各増幅阻害オリゴ核酸の3'末端はリン酸化し、ポリメラーゼによる伸長ができなくした。なお、3'末端のリン酸化は、常法により、化学合成時にmodified CPGを用い合成することにより行った。
【００３４】
上記した鋳型核酸(野生型遺伝子及び変異型遺伝子の部分領域）の、フォワード側プライマー近傍の領域、制限酵素プライマー（フォワード側プライマー）、及び各増幅阻害オリゴ核酸の塩基配列を整列させたものを図２に示す。
【００３５】
１段目のPCRによる野生型遺伝子由来の増幅産物100万コピーに対し、変異型遺伝子由来の増幅産物を100万コピー、10万コピー、1万コピー、1000コピー又は100コピー添加した、核酸混合物を鋳型核酸として用い、上記した制限酵素プライマー（フォワード側プライマー）、リバース側プライマー及び増幅阻害オリゴ核酸を用いてPCRを行った。反応液中の増幅阻害オリゴ核酸の濃度（実施例３では、両増幅阻害オリゴ核酸の合計濃度）は、12000pmol/Lであり、制限酵素プライマー及びリバース側プライマーの濃度は、2000pmol/Lであった。反応液は、市販のPCRキットに添付のものを用いた。増幅は、９４℃、１０分間で変性後、(1)９４℃、１５秒間の変性工程、(2)９４℃から４５℃まで、一定の降下速度で３分間で温度を下げるアニーリング工程及び(3)７２℃で、１分間の伸長工程から成るサイクルを５サイクル行い、さらに、(1)９４℃、１５秒の変性工程、(2)９４℃から５５℃まで一定の降下速度で３分間で温度を下げるアニーリング工程及び(3)７２℃で、１分間の伸長工程から成るサイクルを３５サイクル繰り返した。また、比較のため、増幅阻害オリゴ核酸を用いることなく、他は全く同じ条件で増幅を行った（比較例２）。なお、各増幅阻害オリゴ核酸と鋳型から成る二本鎖核酸のTmは約６５℃であり、制限酵素プライマーと鋳型から成る二本鎖核酸のTmは約55℃である。
【００３６】
得られた各増幅産物を、制限酵素MspIで消化し、消化物を常法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、バンドを検出した。上記の通り、変異型遺伝子由来の増幅産物は、MspIで切断されず、野生型遺伝子由来の増幅産物はMspIで切断される。従って、生じたバンドのサイズに基づき、変異型遺伝子由来の増幅産物が含まれているかどうかを検出することができる。
【００３７】
その結果、切れたバンドと切れないバンドが同じ太さのバンドであったのは、増幅阻害オリゴ核酸を入れない場合（比較例２）、野生型:変異型=１：１であったが、実施例１〜３では、１：1/100から1:1/1000（切れていないバンドは、1:1/1000から1:1/10000まで検出）であった。また、増幅阻害オリゴ核酸中に野生型遺伝子及び変異型遺伝子とミスマッチ部位を１箇所含む比較例１では、野生型遺伝子中の部分領域の増幅阻害効果が弱く1:1/10〜1:1/100（切れないバンドは1:1/100から1:1/1000で検出）であった。
【００３８】
以上の結果、本発明によれば、増幅阻害オリゴ核酸を用いない比較例２（アニーリング工程の温度条件を除き、従来のPCR-RFLPに相当）と比べて、変異型核酸の検出感度が、100倍〜1000倍に高くなった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の実施例及び比較例で増幅した領域の塩基配列を示す図である。
【図２】本発明の実施例及び比較例で用いた、鋳型核酸(野生型K-ras遺伝子及び変異型K-ras遺伝子の部分領域）の、フォワード側プライマー近傍の領域、制限酵素プライマー（フォワード側プライマー）、及び各増幅阻害オリゴ核酸の塩基配列を整列させて示す図である。
【図１】
2010158178.tif 000002
【図２】
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【配列表】
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