(57)【要約】【課題】超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料分離ピークのリーディングが少なく、クロマトグラム測定精度及び分取精製の生産性に優れた装置及び方法を提供する。【解決手段】超臨界流体を供給する超臨界流体供給部と、前記超臨界流体を含む移動相中へ試料溶液を注入する試料インジェクタを含む試料注入部と、カラムを含む試料分離部とを備え、超臨界流体供給部及びモディファイア供給部より送出される超臨界流体が、試料インジェクタを経てカラムへ至る流路が配された超臨界流体クロマトグラフィー装置における試料注入装置であって、前記流路において、前記試料インジェクタを迂回するバイパス流路が設置されていることを特徴とする試料注入装置。【選択図】      図２
2010101875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超臨界流体を供給する超臨界流体供給部と、前記超臨界流体を含む移動相中へ試料溶液を注入する試料インジェクタを含む試料注入部と、カラムを含む試料分離部とを備え、
超臨界流体供給部より送出される超臨界流体を含む移動相が試料インジェクタを経てカラムへ至る流路が配された超臨界流体クロマトグラフィー装置における試料注入装置であって、
前記流路において、前記試料インジェクタを迂回するバイパス流路が設置されていることを特徴とする試料注入装置。
【請求項２】
前記バイパス流路上に、該バイパス流路における移動相の流量を制御する高圧バルブを備えることを特徴とする請求項１に記載の試料注入装置。
【請求項３】
前記バイパス流路上に、該バイパス流路における移動相の流量を制御する可変式リストリクタを備えることを特徴とする請求項１に記載の試料注入装置。
【請求項４】
前記バイパス流路上に、該バイパス流路における移動相の流量を制御する温度調節器を備えることを特徴とする請求項１に記載の試料注入装置。
【請求項５】
前記バイパス流路上に、該バイパス流路へ溶媒を供給する液体インジェクタを備えることを特徴とする請求項１に記載の試料注入装置。
【請求項６】
超臨界流体を含む移動相に注入した試料溶液を、移動相流路に導通したカラムにおいて分離する超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入方法であって、
前記移動相流路の主流路と、その上下流を接続するバイパス流路とを通じてカラムへ移動相を供給する工程と、
前記バイパス流路によって迂回された主流路へ試料溶液を注入する工程と、
を含むことを特徴とする試料注入方法。
【請求項７】
前記バイパス流路において、移動相の流量を制御することを特徴とする請求項６に記載の試料注入方法。
【請求項８】
試料溶液を注入する工程において、前記バイパス流路から試料の溶出力の低い溶媒を注入することを特徴とする請求項６に記載の試料溶液供給方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入装置及び試料溶液注入方法に関し、特にそのクロマトグラム測定精度及び分取精製の生産性の改善に関する。
【背景技術】
【０００２】
二酸化炭素（ＣＯ２）等を用いた超臨界流体クロマトグラフィー(Supercritical fluid chromatography:SFC)は有機溶媒を用いる液体クロマトグラフィー(Liquid chromatography:LC)の代わりに利用できる分離精製法として注目されている。ＳＦＣは流体の粘性が低く、カラム効率を低下させることなく流速を上げて短時間で分離を行うことが可能である。特に光学異性体の分離、高分子オリゴマーの重合単位での分離で使用され、環境負荷が小さく、ランニングコストが安価、溶媒除去のための後工程も少なく酸化しやすい物質や熱に不安定な物質にも適している。
このようなＳＦＣは海外では環境保全の観点からも注目されている。
ところで、検出感度が低いサンプルのため大量注入する場合、あるいは分取を行う場合には、試料溶液を数〜数十ｍＬのオーダーでカラムに導入することもある。このような例が図１に示されている。
【０００３】
同図に示す分取ＳＦＣ装置は、超臨界流体を供給する超臨界流体供給部１２と、補助溶媒を供給するモディファイア供給部１４と、超臨界流体と補助溶媒を混合するアキュムレーター１６と、試料インジェクタ３６を含む試料注入部１８と、カラム３８を含む試料分離部２０と、検出部２２と、自動背圧調整弁２４とを備える。
そして、前記超臨界流体供給部１２は、二酸化炭素ボンベ２６と、該ボンベ２６から供給される二酸化炭素を昇圧送給するポンプ２８及び定温化する循環恒温槽３０とを備える。また、前記モディファイア供給部１４は、モディファイア溶媒容器３２と、モディファイアを昇圧送給するポンプ３４を備える。そして、各供給部１２，１４からの超臨界流体及び補助溶媒は、各ポンプ２８，３４の流量比に応じた組成比の流体となり、アキュムレーター１６で混合され、移動相として試料注入部１８に供給される。
試料は通常、有機溶媒等の液体に溶解された試料溶液の状態で供給され、試料インジェクタ３６のサンプルループに満たされる。その後、試料インジェクタの高圧バルブを切り換えることにより、サンプルループが移動相の流路内に導入され、結果として前記試料溶液が流路内に導入される。このとき、試料溶液が配管内を満たし、移動相流路に試料バンドを形成する。これにより、その後、試料溶液は前記試料バンドとしてカラムトップに到達するため、カラムトップにおける試料溶液濃度は必然的に極めて高くなる。
【０００４】
すなわち、上記のような従来システムの場合、カラムにおいて、本来は各ポンプ２８，３４の流量比に応じた組成比の流体で試料の展開が行なわれるべきところ、溶出力の強い試料溶液の溶媒濃度が高くなるため、一部試料の保持時間が短くなる。ゆえに、カラムから溶出するピークはリーディングし、ピークの立ち上がりから、立下がりまでの時間が長くなってしまうことがあった。このようなリーディングは、導入する試料溶液が増えるにしたがって顕著となり、同一絶対量の試料を、少量の溶媒に溶解させて導入した場合には分離したピークが得られるものの、同試料を多量の溶媒に溶解させて導入するとピークが不分離となってしまう場合があった。
したがって、カラムに導入時における移動相に対する試料溶液の濃度を調整し、ピークの立ち上がり及び立下がり時間を短くすることは、ＳＦＣにおける測定精度の向上に繋がるものとして、その解決手段が検討されてきた。また、分取精製の観点においても、前記リーディングが解消すれば高濃度の回収物が得られることとなり、別途条件を調整して分離時間を短縮すれば、生産性を劇的に向上させることが可能となる。さらに、試料成分を高濃度で回収することができれば、その後の蒸散、濃縮等の工程を大幅に短縮することも可能となる。
【０００５】
このような問題を解決する手段として、例えば、サンプルを注入する注入器（シリンジポンプ）を補助溶媒のポンプラインに接続し、サンプルの溶解溶媒の影響を極力少なくする方法が開示されている（特許文献１）。しかしながら、この方法は、補助溶媒の流量が低いと、試料の導入に時間がかかってしまうため、結果的にピークが広がってしまい、分取時間を大きくとらなければならなかった。
また、特許文献２には、試料導入ポンプを別途設け、試料を注入する方法が開示されている。この方法によれば、圧力変動を伴わずに試料溶解溶媒を補助溶媒に代えて移動相に供給することができるため、分離に悪影響を与える移動相の組成比変化を防ぐことができる。一般的に補助溶媒比率は０．１〜１．０％程度と主たる移動相に対して相当に低いため、主たる移動相を送液するポンプに対して、流量の少ない安価なポンプを試料導入用に用いることも可能ではあるが、リーディングが十分に抑制された測定を行なうには高価な高速高耐圧ポンプを設置しなければならず、性能の高いＳＦＣシステムの構築には多大なコストを要するものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許番号６，５７６，１２５号公報
【特許文献２】特開２００６−６４５６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこれらの問題に鑑みてなされたものであり、超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料分離ピークのリーディングが少なく、クロマトグラフ測定精度及び分取精製の生産性に優れた超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入装置及び試料注入方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために本発明者等が鋭意検討を行なった結果、超臨界流体供給部から供給される超臨界流体と、モディファイア供給部から供給される補助溶媒（モディフィア）とを混合して移動相とし、移動相がカラムトップに至るまでの流路において、該流路の上流から下流にバイパス流路を設置し、バイパス流路に移動相を流しながら主流路より試料溶液を注入することによって、カラムトップにおける試料溶液濃度を低下せしめ、延いては分離ピークのリーディングの抑制が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明にかかる試料注入装置は、超臨界流体を供給する超臨界流体供給部と、前記超臨界流体を含む移動相中へ試料溶液を注入する試料インジェクタを含む試料注入部と、カラムを含む試料分離部とを備え、
超臨界流体供給部より送出される超臨界流体を含む移動相が試料インジェクタを経てカラムへ至る流路が配された超臨界流体クロマトグラフィー装置における試料注入装置であって、
前記流路において、前記試料インジェクタを迂回するバイパス流路が設置されていることを特徴とする。
前記装置において、前記バイパス流路上に、該バイパス流路における移動相の流量を制御する高圧バルブを備えることが好適である。
前記装置において、前記バイパス流路上に、該バイパス流路における移動相の流量を制御する可変式リストリクタを備えることが好適である。
前記装置において、前記バイパス流路上に、該バイパス流路における移動相の流量を制御する温度調節器を備えることが好適である。
前記装置において、前記バイパス流路上に、該バイパス流路へ溶媒を供給する液体インジェクタを備えることが好適である。
【００１０】
また、本発明にかかる試料注入方法は、超臨界流体を含む移動相に注入した試料溶液を、移動相流路に導通したカラムにおいて分離する超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入方法であって、
前記移動相流路の主流路と、その上下流を接続するバイパス流路とを通じてカラムへ移動相を供給する工程と、
前記バイパス流路によって迂回された主流路へ試料溶液を注入する工程と、
を含むことを特徴とする。
前記方法は、前記バイパス流路において、移動相の流量を制御することが好適である。
前記方法は、試料溶液を注入する工程において、前記バイパス流路から試料の溶出力の低い溶媒を注入することが好適である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、設置が容易で、且つ安価な構成によって超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料分離ピークのリーディングを低減し、その測定精度及び分取精製の生産性を著しく改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】一般的な超臨界流体クロマトグラフィー装置を示す図である。
【図２】本発明にかかる試料注入装置を備えた超臨界流体クロマトグラフィー装置を例示する図である。
【図３】本発明にかかる試料注入装置において、試料溶液が注入される段階を模式的に示した図である。
【図４】本発明における前記流路抵抗調整手段を示す図である。
【図５】従来技術及び本発明における配管中の試料溶媒の模式図である。
【図６】実施例１及び比較例１におけるクロマトグラフ測定結果を示した図である。
【図７】比較例２におけるクロマトグラム測定結果を示した図である。
【図８】比較例４にかかる試料導入用ポンプを備えた超臨界流体クロマトグラフィー装置を示す図である。
【図９】比較例４におけるクロマトグラム測定結果を示した図である。
【図１０】比較例５におけるクロマトグラム測定結果を示した図である。
【図１１】比較例６におけるクロマトグラム測定結果を示した図である。
【図１２】比較例７におけるクロマトグラム測定結果を示した図である。
【図１３】実施例２及び比較例２におけるクロマトグラム測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明にかかる試料注入装置は、超臨界流体を供給する超臨界流体供給部と、補助溶媒を供給するモディファイア供給部と、試料インジェクタを含む試料注入部と、カラムを含む試料分離部を備えた一般的な超臨界流体クロマトグラフィー装置において、超臨界流体供給部より送出される超臨界流体が、試料インジェクタを経てカラムへ至る流路に設置される。前記流路は、試料インジェクタが設置された主流路と、試料インジェクタを迂回するように主流路の上下流を接続するバイパス流路とを有する。
本発明にかかる装置への試料注入に際しては、前記主流路及びバイパス流路の両方を通じてカラムへ移動相を供給し続けながら、主流路に設置された試料インジェクタから試料溶液を注入することが好ましい。
【００１４】
本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置における試料注入装置の構成を具体的に説明する。
本発明にかかる試料注入装置を備えた超臨界流体クロマトグラフィー装置の構成例を図２に示す。同図に示す超臨界流体クロマトグラフィー装置は、超臨界流体を供給する超臨界流体供給部１２と、補助溶媒を供給するモディファイア供給部１４と、超臨界流体と補助溶媒を混合するアキュムレーター１６と、試料インジェクタ３６を含む試料注入部１８と、カラム３８を含む試料分離部２０と、検出部２２と、自動背圧調整弁２４とを備える。
そして、前記超臨界流体供給部１２は、二酸化炭素ボンベ２６と、該ボンベ２６から供給される二酸化炭素を昇圧送給するポンプ２８及び定温化する循環恒温槽３０とを備える。また、前記モディファイア供給部１４は、モディファイア溶媒容器３２と、モディファイアを昇圧送給するポンプ３４を備える。そして、各供給部１２，１４からの超臨界流体及び補助溶媒は、各ポンプ２８，３４の流量比に応じた組成比の流体となり、アキュムレーター１６で混合され、移動相として試料注入部１８に供給される。試料注入部１８において、前記移動相流路は主流路及び、該主流路の上下流を接続するバイパス流路４０によって構成され、主流路に試料を注入するための試料インジェクタ３６が設置されている。
【００１５】
本発明において試料は、有機溶媒等の液体に溶解された試料溶液の状態で供給され、試料インジェクタ３６のサンプルループに満たされる。その後、試料インジェクタ３６の高圧バルブを切り換えることにより、サンプルループが移動相の流路内に導入され、結果として前記試料溶液が流路内に導入される。
前記試料溶液注入時において、超臨界流体供給部１２より供給される超臨界流体と、モディファイア供給部１４より供給される補助溶媒は、アキュムレーター１６において混合された移動相として、試料インジェクタ３６が設置された主流路と、バイパス流路４０の両方に供給される。この構成により、主流路のサンプルループ内の試料溶液と、バイパス流路に供給される移動相（超臨界流体及び補助溶媒）の混合流体がカラム３８へ導入され、カラムトップにおける試料溶液の濃度を下げることができる。よって、試料を溶解する溶媒によるピークのリーディングを防ぎ、ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間を短縮し、試料分取の生産性を著しく向上することが可能となる。
カラム３８によって分離された試料成分は、背圧調整弁２４から溶出され、これをフラクションコレクタ等で収集することにより分取することができる。
【００１６】
次に、本発明にかかる試料注入装置における試料溶液の注入方法について説明する。
図３は、図２に示す本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置の本発明に相当する試料注入部１８において、試料溶液が注入される段階を模式的に表したものである。
図３（ａ）は、アキュムレーター１６を経た移動相が主流路及びバイパス流路４０を通ってカラムへ流れる様子を示している。図中の矢印は移動相の流れる方向、斜線は移動相を表す。
図３（ｂ）は、（ａ）に試料溶液を注入した直後の様子を示している。すなわち、試料インジェクタ３６のサンプルループ内の試料溶液が移動相に供給されると、流路内が試料溶液で満たされ、図中に黒く示す試料バンドが形成される。従来の装置では、試料溶液がこのようなバンド状態でカラムトップへ導入されるため、試料を溶解している溶媒の影響を大きく受け、測定時にリーディングが生じることがあった。
一方、本発明にかかる装置においては、図３（ｃ）に示すように、試料バンドがバイパス流路４０の合流点に至ると、該バイパス流路より流入する移動相と試料溶液が混合され、両者が共にカラムへ導入されることになるため、カラムトップにおける試料溶液の濃度が従来に比べ大幅に低減される。このような機序に基づき、本発明にかかる試料注入装置によって、試料を溶解している溶媒に起因するリーディングを抑制することが可能となる。
【００１７】
また、本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置における試料注入装置は、前記バイパス流路４０に移動相の流路抵抗調整手段を設置し、バイパス流路から主流路の試料溶液に合流する移動相の流量を制御することもできる。バイパス流路における移動相流量を制御した分、主流量の流量が変化するため、カラムへ供給される移動相の流量は一定となる。また、本手段によって、主流路に供給される試料溶液に対する移動相の流量を調節することができるため、クロマトグラム測定条件、試料及びその溶媒の種類や量等に応じた濃度の試料溶液をカラムへ導入することが可能となる。
本発明における前記流路抵抗調整手段としては、例えば図４（ａ）〜（ｃ）に示す構造を挙げることができる。
なお、図４は、図２の試料注入部１８において、試料インジェクタ３６を備えた主流路を迂回するバイパス流路４０上に、（ａ）〜（ｃ）の各流路抵抗調整手段を設置したことを示している。
【００１８】
図４（ａ）は、１  ｉｎ  ６  ｏｕｔ高圧バルブ４２を、バイパス流路４０に２台向き合わせて設置し、流路抵抗の異なる配管６本を各高圧バルブの６つのｏｕｔポートにそれぞれ接続したものである。すなわち、各高圧バルブのｉｎポートは、バイパス流路に接続されている。このように設置された２台の高圧バルブ４２は、それぞれ付属のモーターにより６つのバルブ位置を切り換えることが可能であり、２台を同期して作用させることで流路抵抗の異なる６つの流路を自動選択することができる。すなわち、流路抵抗の異なる６つの流路を選択することにより、バイパス流路４０から主流路に流入する移動相の流量として、実施するクロマトグラム測定に適した条件を決定することができる。
【００１９】
図４（ｂ）は、バイパス流路４０内に流路抵抗調整手段として、可変式リストリクタ４４を設置したものである。アキュムレーター１６において混合され、バイパス流路４０に供給された移動相は、可変式リストリクタの絞り弁開度によって調整された流量で試料溶液が導入された主流路へ供給される。このような可変式リストリクタとしては、流路抵抗の調整をより容易とする点から、特に自動可変式の絞り弁の適用が好ましい。
【００２０】
図４（ｃ）は、バイパス流路４０に流路抵抗調整手段として、温度調節器４６を設置したものである。超臨界流体クロマトグラフィーにおいては、移動相として超臨界流体が大きな比率を占めている。超臨界流体は、温度により粘性が大きく変化する性質を有しているため、この粘性変化を流路抵抗として利用することができる。このような温度調節器としては、特にヒーターを用い、加温に伴う流体粘性の変化度合いを調整することによって流路抵抗を制御することが好ましい。
【００２１】
さらに、本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置おいては、上記した移動相の流路抵抗調整手段のほかに、バイパス流路４０から移動相中へ別途溶媒を注入し、これを試料溶液とともにカラムへ導入することによって、試料溶液による測定への影響を抑えることもできる。
図４（ｄ）は、主流路における試料インジェクタ３６とは別に、バイパス流路４０上に液体インジェクタ４８を設置した装置を示している。本発明において、主流路に設置した試料インジェクタ３６は、試料溶液注入用として使用するものであるが、バイパス流路４０に設置した液体インジェクタ４８は、試料の溶出力が弱い溶媒を導入するために設置されたものである。
例えば、液体インジェクタ４８のサンプルループを、試料インジェクタ３６のサンプルループの２倍とし、そのループ内には測定試料の溶出力が弱い溶媒を充填しておく。液体インジェクタ４８のサンプルループ内の溶媒の１／４が移動相へ流れ出すタイミングで、主流路の試料インジェクタ３６を作動させ、試料溶液の導入を開始する。すると、試料インジェクタ３６のサンプルループの試料溶液が全て移動相へ流れ出すタイミングは、液体インジェクタ４８のサンプルループ内の溶媒の３／４が流出したタイミングとなり、それ以降は液体インジェクタ４８のサンプルループ内の溶媒の１／４が、カラムへ向けて流れ出すことになる。すなわち、試料インジェクタ３６より注入された試料溶液の前後及び注入中に溶出力の弱い溶媒が一緒にカラムへ導入されることとなり、カラムトップにおける試料を溶解している溶媒によるリーディングが抑制される。
【００２２】
また、本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入方法は、超臨界流体を含む移動相に注入した試料溶液を、移動相流路に導通したカラムにおいて分離する超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入方法であって、前記移動相流路の主流路と、その上下流を接続するバイパス流路とを通じてカラムへ移動相を供給する工程と、前記バイパス流路によって迂回された主流路へ試料溶液を注入する工程とを含むものである。
本方法の具体例としては、例えば、前述の本発明にかかる試料注入装置における試料溶液の注入方法を挙げることができる。すなわち、本方法は、図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、バイパス流路４０によって迂回された主流路、すなわち、試料インジェクタ３６に相当する部分に試料溶液を注入することを意図している。そして、前記試料溶液の注入工程においては、移動相が主流路とこれをバイパス流路の両方に供給されていることが好ましい。このような試料注入方法とすることによって、試料注入前、試料注入中、試料注入後の全てに亘り、主流路及びバイパス流路を通じて移動相を一定の流量でカラムへ送り続けることができ（図３（ａ）〜（ｃ））、クロマトグラム測定におけるリーディングの原因である試料バンドの形成を抑制することができる。また、移動相に補助溶媒を添加する場合においても、移動相中の超臨界流体と補助溶媒の組成比を、試料注入前、試料注入中、試料注入後に亘って一定に維持することができる。
【００２３】
本発明にかかる試料注入方法においては、前記バイパス流路において、移動相の流量を制御することが好適である。流量の制御は、例えば、図４の（ａ）〜（ｃ）に示すような流路抵抗調整手段をバイパス流路上に備えることによって為すことができる。バイパス流路において移動相の流量を制御することにより、カラムへ導入される試料溶液の濃度を調整し、より適切な分離条件でクロマトグラム測定を行なうことができる。
【００２４】
また、本発明にかかる試料注入方法において、バイパス流路から移動相へ試料の溶出が弱い溶媒を注入することが好適である。前記溶媒の注入は、例えば、図４の（ｄ）に示すような、液体インジェクタ４８の設置により行なうことができる。特に、主流路における試料溶液の注入時に、バイパス流路から試料の溶出力が弱い溶媒を別途注入することにより、試料溶液に起因するリーディングが抑制される。
【００２５】
本発明において試料溶液とは、カラムにおいて分離する試料が適当な溶媒に溶解／分散されたものを示す。本発明において使用する溶媒の種類に制限はないが、一般に、メタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、水等を好適に用いることができる。
また、本発明において、試料溶液を注入する手段としては、液体クロマトグラフィーにおいて一般的に使用されるループインジェクタを用いることが好ましい。
【００２６】
なお、ＨＰＬＣの場合、移動相に液体を使用するため、測定試料は予め移動相に溶解／分散させて系内へ注入することができる。このような場合、試料溶解溶媒と移動相の試料成分の溶出力は同等となるため、カラムにおける試料成分のバンド幅は、試料の注入量のみに依存することとなる。
一方、ＳＦＣに用いられる移動相は通常、常温、大気圧下では気体であり、試料を移動相に溶解／分散させておくことができない。そのため、一般的に、試料を溶解／分散させる溶媒として、使用する移動相（超臨界流体）と相溶性のある有機溶媒が用いられている。しかし、このような場合、試料溶解溶媒と移動相の試料成分の溶出力に差異が生じ、これが試料成分のバンド幅に影響をもたらすこととなる。
【００２７】
クロマトグラフィーにおけるピーク幅を広げる要因としては、試料溶液の注入量、カラムへの過剰な負荷（オーバーロード）などが挙げられるが、前記した試料溶解溶媒と移動相の溶出力もまた大きな要因である。
溶媒の溶出力は、溶媒の特性に対する試料成分、固定相、移動相の関係によって表され、ＨＰＬＣにおいては、例えば溶媒の溶解パラメータδ、溶媒和パラメータ、水素結合形成能力などが用いられる。
ＳＦＣの場合は、移動相の密度が前記溶出力の重要なパラメータとなる。超臨界流体の密度は、圧力や温度の調節によって気体から液体に近い状態にまで変化させることが可能ではあるが、基本的に液体よりも低い（表１：気体、液体、超臨界流体の密度の比較）。そのため、ほとんどの場合では、試料を溶解／分散する有機溶媒の方が、超臨界流体の移動相よりも溶出力が高くなる。
したがって、ＳＦＣでは、移動相よりも溶出力の高い溶媒に溶解／分散された試料がカラム上端部で該溶媒と共に速く移動し、ピーク幅を広げてしまう傾向があった。特に、分取クロマトグラフィーのように試料溶液を大量に注入する条件では、ピークのブロードニングが生じやすくなり、分離に多大な影響が及ぶ。
このような問題に対し、本発明においては、移動相を送液しながらインラインで試料溶液を移動相（超臨界流体）へ注入し、カラムトップにおける試料溶液濃度を低下せしめたのである。
なお、既に述べたように、ＨＰＬＣにおいては、試料を溶解／分散する溶媒の種類や組成比の調整によりピークのブロードニングを抑えることが可能である。したがって、本発明にかかる方法は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）に適用することが特に好ましい。
【００２８】
【表１】
2010101875.tif 000003
【００２９】
図５は、ＳＦＣ系の配管内における試料溶液（Ｓａｍｐｌｅ）と移動相（超臨界流体（ＣＯ２）及び補助溶媒）の組成比を模式的に示した図である。図中の矢印は試料溶液及び移動相の流動方向を示す。
図５の（ａ）〜（ｃ）は従来の超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料溶液導入後の配管内の組成比である。
（ａ）は、移動相の流動する配管内に通常の試料インジェクタから試料溶液を注入した際の様子を表している。すなわち、注入された試料溶液は配管内にバンドを形成する。試料溶液は該バンド状態のままカラムへ至るため、試料溶液流入時のカラムトップにおける試料溶液の濃度は高くなり、試料成分の分離測定に支障をきたしてしまう。
【００３０】
（ｂ）は、サンプルを注入する注入器（シリンジポンプ）を補助溶媒のポンプラインに接続し、サンプルの溶解溶媒の影響を極力少なくした方法（米国特許番号６，５７６，１２５号公報）を適用した際の様子を表している。前記方法では、注入された試料溶媒が補助溶媒と同一の流速でカラムに到達する。試料注入に必要な時間は、補助溶媒の流量に依存する。補助溶媒の流量は、全体の流量に比べて非常に低いため、試料注入に必要な時間は極端に長い。したがって、注入時間を短くするためには補助溶媒流量を高くする必要があるが、そうすると系における補助溶媒の組成比が変化し、カラムの分離条件が大きく変わってしまう。すなわち、この方法では試料注入時間と分離条件が相互に作用するため、配管における試料溶液及び移動相の組成比の調整により分離ピーク形状を改善する場合、調整における自由度は大幅に制限されてしまう。
なお、この方法では、試料注入時にのみ補助溶媒の流量を高くすることも考えられるが、高圧高流量のポンプを要する上、通常の高圧ポンプ性能を考慮すれば、注入時間を大幅に短縮することは困難である。
【００３１】
（ｃ）は、試料導入ポンプを別途設け、試料を注入する方法（特開２００６−６４５６６号公報）を適用した際の様子を表している。この方法も前記と同様、補助溶媒側流路に試料溶液を注入するものであるため、配管内の組成比は（ｂ）と同じ模式図となる。なお、この方法においても、前記理由から試料注入時のみ補助溶媒／試料溶液導入ポンプの流量を高くすることは難しい。
【００３２】
（ｄ）は、本発明の方法を適用した際の配管内の様子である。すなわち、移動相中に試料溶液が導入された主流路側の組成と、移動相を流通するバイパス側の組成が合流し、図５の（ｄ）−１に示す組成が形成される。（ｄ）−２は、（ｄ）−１の補助溶媒を合わせて表した実組成比を表している。同図に示すように、本発明では、主流路側においてもバイパス側においても流量の調整を必要としないため、試料溶液の注入に高圧高流量ポンプを用いることなく測定に好適な組成比を達成することができる。
【実施例】
【００３３】
以下に、本発明の実施例を挙げるが、これらは本発明を限定するものではない。
＜実施例１＞
図２に示す構成の超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、クロマトグラム測定を行なった。バイパス流路４０は、試料インジェクタ３６の上流及び下流にＴジョイントを設け、配管で接続したものとした。二酸化炭素ポンプ２８による二酸化炭素流量を４５ｍＬ／ｍｉｎ、モディファイアポンプ３４による補助溶媒（メタノール）流量を５ｍＬ／ｍｉｎとしてそれぞれ送液し、該組成比の移動相が等分配比で試料インジェクタ３６とバイパス流路４０それぞれに流れるように、バイパス管を選択・設置した。前記移動相送液状態で、インジェクタ３６より試料溶液１０００μＬを注入した。その後、通常の動作により、試料についてクロマトグラム測定を行なった。結果を図６に示す。
なお、試料溶液は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル１．５ｍｇ／ｍＬメタノール溶液を使用した。カラム３８は、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍの充填カラムであり、充填剤はシリカを用いた。
図６（ａ）は、実施例１の測定結果および下記比較例１の測定結果を重ねて示したグラフであり、図６（ｂ）は（ａ）のピーク立ち上がり、立ち下がり部分を拡大したものである。図６に示すとおり、バイパス流路を備えた本発明にかかる装置を用いることにより、バイパスを備えない装置を用いた比較例１に比して、ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間が１．６分から１．２５分と約２２％短縮された。
したがって、本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置は、容易且つ安価な構成によってクロマトグラムにおけるリーディングを抑制することができ、測定精度及び分離能において優れたものであることが明らかである。
【００３４】
＜比較例１＞
図１に示す一般的な超臨界流体クロマトグラフィー装置、すなわち、バイパス流路を備えない装置を用いた以外は実施例１と同様の条件で操作及びクロマトグラム測定を行なった。
【００３５】
＜比較例２＞
図１に示す一般的な超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、クロマトグラム測定を行なった。二酸化炭素ポンプ２８による二酸化炭素流量を６０ｍＬ／ｍｉｎ、モディファイアポンプ３４による補助溶媒（メタノール）流量を５ｍＬ／ｍｉｎとしてそれぞれ送液し、該組成比の移動相によりシステム内が満たされた状態でインジェクタ３６より試料溶液１０００μＬを注入した。その後、通常の操作により、試料についてクロマトグラム測定を行なった。結果を図７に示す。
なお、試料溶液は、カフェイン０．３ｍｇ／ｍＬメタノール溶液を使用した。カラム３８は、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍの充填カラムであり、充填剤はシリカを用いた。
図７に示すとおり、一般的な超臨界クロマトグラフィー装置を用いて測定したクロマトグラムは、ピークトップに対して前方にピークが広がるピークリーディングが顕著に現れた。このときのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの時間は４５秒であった。
【００３６】
＜比較例３＞
比較例２において、試料注入３０秒前からモディファイアポンプ３４の流量を０．１ｍL／ｍｉｎに減少させ、カラム３８内を低モディファイア溶媒濃度の状態とした以外は同様に操作及びクロマトグラム測定を行なった。
比較例３の測定結果は、比較例２とほぼ同じであり、改善は認められなかった。
したがって、カラム内を低モディファイアの試料が保持され易い条件としても、リーディングは緩和されないことが明らかとなった。
【００３７】
＜比較例４＞
図８に示す構成の超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、クロマトグラム測定を行なった。前記装置は、図１のインジェクタ３６に代えて試料導入用ポンプ５０の流出口をＴジョイント５２によってカラム上流流路へ接続したものである。すなわち、試料溶液５４は試料導入用ポンプ５０に吸い上げられ、その流出口から移動相で満たされた流路へと導入される。具体的には、上記比較例２と同様の試料溶液を試料導入用ポンプ流量４ｍL／ｍｉｎとして１５秒間送液することにより、１０００μＬの試料溶液が流路へ導入された。二酸化炭素ポンプ２８及びモディファイアポンプ３４による二酸化炭素及び補助溶媒（メタノール）の流量はそれぞれ６０ｍＬ／ｍｉｎ、５ｍＬ／ｍｉｎとした。結果を図９に示す。このときのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの時間は、５８秒であった。
【００３８】
＜比較例５＞
比較例４において、試料導入用ポンプ流量を８ｍＬ／ｍｉｎとして７．５秒間送液し、１０００μＬの試料溶液を流路へ導入した以外は同様に操作及びクロマトグラム測定を行なった。結果を図１０に示す。このときのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの時間は４７秒であった。
したがって、試料の導入をポンプを用いて行なうことにより、ピークの緩慢な立ち上がりは改善された。しかしながら、一方で比較例４、５のいずれにおいてもピークの頂点に飽和が認められた。これは、試料導入用ポンプの流量が低く、試料のカラム導入に時間がかかったためと考えられる。
以上の結果から、試料導入にポンプを使用することにより、リーディングの緩和は可能であるが、ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間を短縮するには、短時間での試料導入を要することが明らかである。したがって、このような試料導入には高速送液が可能な高圧高流量ポンプが必須であり、その設置にかかるコストを考慮してもポンプの使用は非効率的であると考えられた。
【００３９】
＜比較例６＞
図８に示す構成の超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、クロマトグラム測定を行なった。二酸化炭素ポンプ２８による二酸化炭素流量を６０ｍＬ／ｍｉｎ、モディファイアポンプ３４による補助溶媒（メタノール）流量を５ｍＬ／ｍｉｎとしてそれぞれ送液し、試料溶液導入３０秒前からモディファイアポンプ３４の流量を０．１ｍL／ｍｉｎに減少させた。試料溶液の導入は、試料導入用ポンプ５０の流量を８ｍL／ｍｉｎとして７．５秒間送液することにより、１０００μＬを流路へ導入した。試料溶液の構成は比較例２と同様のものとした。結果を図１１に示す。
【００４０】
＜比較例７＞
比較例６において、図８の試料導入用ポンプ５０の流量を１６ｍＬ／ｍｉｎとして３．８秒間送液し、１０００μＬの試料溶液を流路へ導入した以外は同様に操作及びクロマトグラム測定を行なった。結果を図１２に示す。
ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間は、図１１において４３秒であり、図１２において４１秒であった。したがって、試料導入用ポンプによる試料溶液供給と、カラム内低モディファイア条件を併用することで、リーディング及びピークの飽和状態は他の比較例に比べて改善されたが、依然として試料導入用ポンプとして高圧高流量ポンプが必要であることは明白であり、またモディファイア組成比プログラムが必要となるため、さらに試料供給が煩雑となることが分かった。
【００４１】
以上の結果から、比較例の試料導入方法では充分満足な結果が得られないことが明らかになった。
＜実施例２＞
図２に示す超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、比較例２と同一の分離条件、分離システムにおいて本発明を適用した。すなわち、二酸化炭素ポンプ２８による二酸化炭素流量を６０ｍＬ／ｍｉｎ、モディファイアポンプ３４による補助溶媒（メタノール）流量を５ｍＬ／ｍｉｎとしてそれぞれ送液し、該組成比の移動相が等分配比で試料インジェクタ３６とバイパス流路４０それぞれに流れるように、バイパス管を選択・設置した。前記移動相送液状態で、インジェクタ３６より試料溶液としてカフェイン０．３ｍｇ／ｍＬメタノール溶液１０００μＬを注入した。カラム３８は、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍの充填カラムであり、充填剤はシリカを用いた。
図１３は、実施例２及び比較例２の測定結果を重ねて示したグラフである。図１３に示すとおり、バイパス流路を備えることによって、高圧高流量のポンプを使用しなくとも、ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間は４５秒から３６秒と大幅に短縮した。
これらの結果から、本発明にかかる試料注入装置は、ピークのリーディングを大幅に抑制し、且つ、高圧高流量ポンプにより高流量で短時間に試料導入を行なったものに相当する効果を有することが明らかである。
【符号の説明】
【００４２】
１２        超臨界流体供給部
１４        モディファイア供給部
１６        アキュムレーター
１８        試料注入部
２０        試料分離部
２２        検出部
２４        自動背圧調整弁
２６        二酸化炭素ボンベ
２８        二酸化炭素ポンプ
３０        循環恒温槽
３２        モディファイア溶媒容器
３４        モディファイアポンプ
３６        試料インジェクタ
３８        カラム
４０        バイパス流路
４２        高圧バルブ
４４        可変式リストリクタ
４６        温度調節器
４８        液体インジェクタ
５０        試料導入用ポンプ
５２        Ｔジョイント
５４        試料溶液
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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