(57)【要約】【課題】親水性の薬剤等の活性成分であっても、上記高分子ミセルの内部に効率良く、安定に封入することができる手法を提供し、ひいてはこの手法により得られる活性成分封入高分子ミセルを提供すること。【解決手段】活性成分封入高分子ミセルは、親水性領域と疎水性領域を有するブロックコポリマーから形成され、該親水性領域が外側、該疎水性領域が内側に配置された高分子ミセルであって前記疎水性領域を有する高分子ミセルの内部に、イオン性基を有する活性成分と、該イオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有する化合物から成る溶出抑制剤とが封入されている。【選択図】図１
2010116382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性領域と疎水性領域を有するブロックコポリマーから形成され、該親水性領域が外側、該疎水性領域が内側に配置された高分子ミセルであって前記疎水性領域を有する高分子ミセルの内部に、イオン性基を有する活性成分と、該イオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有する化合物から成る溶出抑制剤とが封入された、活性成分封入高分子ミセル。
【請求項２】
前記溶出抑制剤が、前記活性成分よりも疎水性である請求項１記載の活性成分封入高分子ミセル。
【請求項３】
前記活性成分及び前記溶出抑制剤が有する前記イオン性基が、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、硫酸基から成る群より選ばれる少なくとも１種の陰イオン性基並びに第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、第４級アンモニウム基から成る群より選ばれる少なくとも１種の陽イオン性基である請求項１又は２記載の活性成分封入高分子ミセル。
【請求項４】
前記活性成分のイオン性基がカルボキシル基又はアミノ基であり、前記溶出抑制剤のイオン性基がアミノ基又はカルボキシル基である請求項３記載の活性成分封入高分子ミセル。
【請求項５】
前記溶出抑制剤が、炭素数６以上のアルキル基を有するアルキルアミンである請求項４記載の活性成分封入高分子ミセル。
【請求項６】
前記活性成分が医薬である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の活性成分封入高分子ミセル。
【請求項７】
前記活性成分がレチノイドである請求項６記載の活性成分封入高分子ミセル。
【請求項８】
前記活性成分が4-[(5, 6, 7, 8-テトラヒドロ-5, 5, 8, 8-テトラメチル-2-ナフチル)カルバモイル] 安息香酸である請求項７記載の活性成分封入高分子ミセル。
【請求項９】
前記溶出抑制剤が医薬又は医薬添加物である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の活性成分封入高分子ミセル。
【請求項１０】
親水性領域と疎水性領域を有するブロックコポリマーから形成され、該親水性領域が外側、該疎水性領域が内側に配置された高分子ミセルであって前記疎水性領域を有する高分子ミセルの内部に、イオン性基を有する活性成分を封入する際に、該活性成分を、該イオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有する化合物から成る溶出抑制剤と共に封入することを含む、高分子ミセルに封入される活性成分の溶出抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬等の活性成分を封入高分子ミセル及び該活性成分が高分子ミセルから溶出することを抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤を、リポソームや高分子ミセル等の内部に封入して生体内の目的の臓器や組織に送達するドラッグデリバリーシステムが知られている。本願発明者らは、これまでに、親水性領域と疎水性領域を有するブロックコポリマーから形成され、該親水性領域が外側、該疎水性領域が内側に配置された高分子ミセルであって前記疎水性領域を有する高分子ミセルの内部に、薬剤や造影剤を封入して、生体内の所望の臓器や組織に送達する手法を開発してきた（特許文献１並びに非特許文献１及び２）。薬剤や造影剤を封入した高分子ミセルは、血中での安定性が比較的高く、粒径が小さいために癌組織に特異的に送達される等の優れた利点を有する。
【０００３】
【特許文献１】特開2008-222804号公報
【非特許文献１】M. Yokoyama, T. Okano, Y. Sakurai, S. Fukushima, K. Okamoto, and K. Kataoka, Selective delivery of adriamycin to a solid tumor using a polymeric micelle carrier system, J. Drug Targeting, 7(3), 171186 (1999)
【非特許文献２】Kumi Kawano, Masato Watanabe, Tatsuhiro Yamamoto, Masayuki Yokoyama, Praneet Opanasopit, Teruo Okano, and Yoshie Maitani, Enhanced antitumor effect of camptothecin loaded in long-circulating polymeric micelles,J. Controlled Release, 112, 329 332 (2006)
【非特許文献３】Kagechika, H., Novel synthetic retinoids and separation of the pleiotropic retinoidal activities. Curr Medicinal Chem. 2002; 9: 591608.
【非特許文献４】Altucci, L., et al., RAR and RXR modulation in cancer and metabolic disease. Nat Rev Drug Discov. 2007; 6(10): 793810.
【非特許文献５】Ezawa, S., et al., A synthetic retinoid, TAC-101 (4-[3,5-bis (trimethylsilyl) benzamido] benzoic acid), plus cisplatin: potential new therapy for ovarian clear cell adenocarcinoma. Gynecol Oncol. 2008;108(3): 627631.
【非特許文献６】Yokoyama, M., et al., Bioconjugate Chem. 1992; 3: 295301.
【非特許文献７】Opanasopit, P., et al., Pharm. Res. 2004; 21: 20012008.
【非特許文献８】Lavasanifar, A., et al., J. Control. Release 2001; 77: 155160.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記した公知の高分子ミセルの内部に薬剤を封入する場合、高分子ミセルの内側は疎水性になっているので、封入される薬剤の疎水性が十分に高い場合には、封入の効率が高く（十分な量の薬剤が封入可能）、高分子ミセル内に薬剤が安定に保持される。しかしながら、封入される薬剤の疎水性が十分に高くない場合には、高分子ミセルの内部に所望の量の薬剤を封入することが容易ではなく、封入できたとしても、血液のような水系媒体中では、内部の薬剤が高分子ミセルから溶出し易く、血中安定性が満足できないという問題がある。
【０００５】
従って、本発明の目的は、親水性の薬剤等の活性成分であっても、上記高分子ミセルの内部に効率良く、安定に封入することができる手法を提供し、ひいてはこの手法により得られる活性成分封入高分子ミセルを提供することである。さらに、本発明の目的は、該手法を利用した、上記高分子ミセルに封入される活性成分の溶出抑制方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、活性成分がイオン性基を有する場合には、該イオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有する化合物から成る溶出抑制剤を該活性成分と共に封入することにより、活性成分が親水性の場合であっても効率良く、安定に高分子ミセル内に封入可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、親水性領域と疎水性領域を有するブロックコポリマーから形成され、該親水性領域が外側、該疎水性領域が内側に配置された高分子ミセルであって前記疎水性領域を有する高分子ミセルの内部に、イオン性基を有する活性成分と、該イオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有する化合物から成る溶出抑制剤とが封入された、活性成分封入高分子ミセルを提供する。また、本発明は、親水性領域と疎水性領域を有するブロックコポリマーから形成され、該親水性領域が外側、該疎水性領域が内側に配置された高分子ミセルであって前記疎水性領域を有する高分子ミセルの内部に、イオン性基を有する活性成分を封入する際に、該活性成分を、該イオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有する化合物から成る溶出抑制剤と共に封入することを含む、高分子ミセルに封入される活性成分の溶出抑制方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、高分子ミセル内に封入する活性成分がイオン性基を有する場合には、たとえ該活性成分が親水性であっても、高分子ミセル内に効率良く、安定に封入できる。有用な薬剤は、比較的親水性のものが少なくない。本発明によれば、このような有用な種々の親水性薬剤を生体内の所望の臓器や組織に送達することが可能になり、従って、本発明により、これまでにない有用な薬剤送達系が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の高分子ミセルは、親水性領域と疎水性領域を有するブロックコポリマーから形成され、前記親水性領域が外側、前記疎水性領域が内側に配置された高分子ミセルである。このような高分子ミセル自体及びその製造方法は、本願共同発明者らが研究し、公知になっている（例えば、特許文献１、非特許文献１及び非特許文献２）。なお、上記高分子ミセルにおいて、「親水性領域」及び「疎水性領域」とは、両者の親水性が、水中で親水性領域を外側、疎水性領域を内側にしたミセルが形成される程度に異なった各領域を意味するものである。
【００１０】
親水性領域を構成する構造の好ましい例としては、ポリエチレングリコール、ポリ（ビニルアルコール）及びポリ（ビニルピロリドン）等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。親水性領域の末端（疎水性領域と反対側、すなわち、ブロックコポリマーの親水性領域側の末端）は、水素、低級（炭素数１〜６、以下同じ））アルキル基、低級ヒドロキシアルキル基、低級アルキルアミノ基等が好ましいがこれらに限定されるものではない。親水性領域の分子量は、２０００〜２万程度が好ましく、４０００〜１４０００程度がさらに好ましい。
【００１１】
疎水性領域を構成する構造の好ましい例としては、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アクリル酸）及びポリ（メタクリル酸）等の遊離のカルボキシル基の一部又は全部に疎水性基を共有結合したものを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのカルボキシル基含有単位は、１種類でもよいし、複数種類のものが組み合わされていてもよい。疎水性領域に用いることができるアスパラギン酸やグルタミン酸は、１単位中に２個のカルボキシル基を有しており、どちらのカルボキシル基を主鎖のペプチド結合に供したものでもよく、異なるカルボキシル基を主鎖のペプチド結合に供したもののコポリマーとなっていてもよい（下記実施例参照）。また、上記疎水性基としては、例えば、ベンジル基、フェニル基、ナフチル基等のような芳香環を含む基を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。疎水性領域中のカルボキシル基のうち、疎水性基が結合されているものの割合は、好ましくは20mol%〜100mol%程度である。疎水性領域の末端（親水性領域と反対側、すなわち、ブロックコポリマーの疎水性領域側の末端）は、水素、低級アルキル基、水酸基、低級アルキルオキシ、フェニル低級アルキル、フェニル低級アルキルオキシ、低級アルキルフェニル、低級アルキルフェニルオキシ、低級アルコキシカルボニル、フェニル低級アルコキシカルボニル、低級アルキルアミノカルボニル及びフェニル低級アルキルアミノカルボニル基等が好ましいがこれらに限定されるものではない。また、疎水性領域中に含まれる遊離の及び前記疎水性基が結合したカルボキシル基の数（重合単位が上記したアスパラギン酸、グルタミン酸、（メタ）アクリル酸のように、重合した状態で１個の遊離のカルボキシル基を有する場合には、その単位の重合度）は、通常、１０〜２００個、好ましくは１０〜６０個程度である。
【００１２】
親水性領域と疎水性領域は、直接結合されていてもよいが、リンカーを介して結合していてもよい。このようなリンカーとして、-O-、-NH-、-OCO-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-COO-、-CONH-、-(CH2)n-（nは１〜６の整数）、-R1-(CH2)n-（nは１〜６の整数、R1は-O-、-NH-、-OCO-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-COO-、-CONH-）、-(CH2)n-R2-（nは１〜６の整数、R2は-O-、-NH-、-OCO-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-COO-、-CONH-）、-R1-(CH2)n-R2-（nは１〜６の整数、R1及びR2は互いに独立に-O-、-NH-、-OCO-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-COO-、-CONH-）を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明の活性成分封入高分子ミセルは、ミセルの内部に薬剤等の活性成分を含む。ミセル内に封入される活性成分は、イオン性基を有するものである。ここで、「イオン性基」とは、水中で少なくとも一部が電離し得る基を意味し、好ましい例として、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、硫酸基から成る群より選ばれる少なくとも１種の陰イオン性基並びに第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、第４級アンモニウム基から成る群より選ばれる少なくとも１種の陽イオン性基を挙げることができる。
【００１４】
活性成分としては、上記イオン性基を有し、生体内における送達が望まれる化合物であれば限定されず、通常、医薬や造影剤等の診断剤である。活性成分の好ましい例として、レチノイド類、アドリアマイシン、ダウノマイシンなどのアントラサイクリン系、ACNU,シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ，ブレオマイシン、ビンブラスチン・ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド系等の抗がん剤；メソトレキセート等の代謝拮抗剤（メソトレキセートは抗がん剤でもある）；タモキシフェン等のホルモン剤；、インドメタシン等の抗炎症剤；アザセトロン等の制吐剤；アシクロビル・アマンタジン等の抗ウイルス剤；アストロマイシン・セフニジル等の抗生物質；アセトアミノフェン・サリチル酸ナトリウム等の解熱鎮痛剤；ノルエピネフリン等の血圧上昇剤等の医薬を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。レチノイド類は、天然のものでも合成されたものでもよい。
【００１５】
イオン性基を有する合成レチノイド類としては、種々のものが公知であり、例えば、非特許文献３〜５に記載されている。本発明において好ましく用いることができるイオン性基を有する合成レチノイド類の具体例として以下のものを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１６】
Ａｍ８０  （非特許文献３）
4-[(5, 6, 7, 8-テトラヒドロ-5, 5, 8, 8-テトラメチル-2-ナフチル)カルバモイル] 安息香酸
【００１７】
【化１】
2010116382.tif 000003
【００１８】
ＬＥ５４０（非特許文献３）
4-(13H-10,11,12,13-テトラヒドロ-10,10,13,13,15-ペンタメチルジナフト[2,3-b][1,2-e]-1,4-ジアゼピン-7-イル)安息香酸
【００１９】
【化２】
2010116382.tif 000004
【００２０】
AGN195183 （非特許文献４）
4-(4-クロロ-3-ヒドロキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-カルボキシアミド)-2,6-ジフルオロ安息香酸
【００２１】
【化３】
2010116382.tif 000005
【００２２】
LGD1550 （非特許文献４）
(2E,4E,6E)-7-(3,5-ジ-tert-ブチルフェニル)-3-メチルオクタ-2,4,6-トリエン酸
【００２３】
【化４】
2010116382.tif 000006
【００２４】
R667 （非特許文献４）
(E)-4-(2-(3-((1H-ピラゾール-1-イル)メチル)-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-イル)ビニル)安息香酸
【００２５】
【化５】
2010116382.tif 000007
【００２６】
Bexarotene（非特許文献４）
4-(1-(3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-イル)ビニル)安息香酸
【００２７】
【化６】
2010116382.tif 000008
【００２８】
UAB-30 （非特許文献４）
(2E,4E,6Z,8E)-8-(3,4-ジヒドロナフタレン-1(2H)-イリデン)-3,7-ジメチルオクタ-2,4,6-トリエン酸
【００２９】
【化７】
2010116382.tif 000009
【００３０】
AGN194310（非特許文献４）
4-((4-(4-エチルフェニル)-2,2-ジメチル-2H-チオクロメン-6-イル)エチニル)安息香酸
【００３１】
【化８】
2010116382.tif 000010
【００３２】
Adapalene（非特許文献４）
6-(3-(1-アダマンチル)-4-メトキシルフェニル)ナフタレン-2-カルボン酸
【００３３】
【化９】
2010116382.tif 000011
【００３４】
TAC-101
4-[3,5-ビス(トリメチルシリル) ベンズアミド]安息香酸
【００３５】
【化１０】
2010116382.tif 000012
【００３６】
上記活性成分は、単独の成分でもよいし、複数種類の成分を組み合わせて用いることもできる。
【００３７】
本発明の活性成分封入高分子ミセルは、さらに、ミセル内部に溶出抑制剤を含む。溶出抑制剤は、ミセル内部に封入される上記活性成分が有するイオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有する化合物である。活性成分が陰イオン性基を有する場合には、溶出抑制剤は陽イオン性基を有し、活性成分が陽イオン性基を有する場合には、溶出抑制剤は陰イオン性基を有する。活性成分が陰イオン性基と陽イオン性基の両方を有する場合には、溶出抑制剤は、陰イオン性基と陽イオン性基の少なくともいずれか一方を有すればよいが、活性成分封入高分子ミセルの使用条件下においてより強く電離するイオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有することが好ましい。陰イオン性基及び陽イオン性基の好ましい具体例は、上記した活性成分が有するイオン性基の好ましい例と同様である。特に、活性成分のイオン性基がカルボキシル基又はアミノ基（第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、第４級アンモニウム基、以下、特に断りがない限り同様）であり、溶出抑制剤のイオン性基がアミノ基又はカルボキシル基である場合が好ましい。溶出抑制剤は、1種類の化合物でもあってもよいし、複数種類の化合物を組み合わせて用いることもできる。
【００３８】
溶出抑制剤の疎水性が、封入される活性成分よりも高い場合には、溶出抑制効果がさらに高まるので好ましい。すなわち、溶出抑制剤は、そのイオン性基が活性成分のイオン性基をイオンコンプレックスを形成することでミセルの疎水性内核に親和性が高くなることによって、溶出が抑制されると考えられるが、溶出抑制剤が活性成分よりも疎水性が高ければ、疎水性である高分子ミセル内部との親和性が高くなり、活性成分の高分子ミセルからの溶出がより一層抑制されると考えられる。実際、下記実施例において具体的に示されるとおり、同一の活性成分を同一のブロックコポリマーから成る高分子ミセルに封入し、アルキル基の鎖長を変えることにより疎水性を変化させた複数種類のジメルアルキルアミンを溶出抑制剤として用いた例では、ジメチルアルキルアミンのアルキル基の長さが長くなるほど、すなわち、溶出抑制剤の疎水性が大きくなるほど、活性成分の溶出がより抑制された。換言すれば、溶出抑制剤の疎水性を調節することにより、活性成分の溶出速度を調節することが可能である。
【００３９】
活性成分と溶出抑制剤の疎水性の大小は、水又は緩衝液に対する溶解度（正確には使用環境（血液等）における溶解度であるが、血液等の体液は水系なので、例外的な場合を除き、水又は緩衝液に対する溶解度でほぼ近似可能）を比較することにより知ることができる。すなわち、好ましくは、溶出抑制剤としては、封入する活性成分よりも水又は緩衝液に対する溶解度が大きな化合物を用いることが好ましい。なお、溶解度は、使用温度（ヒトに投与する場合にはヒトの体温である３７℃）における溶解度を比較するのが適切であるが、常温（２５℃）における溶解度の比較でほぼ近似可能である。
【００４０】
疎水性の溶出抑制剤の好ましい例としては、上記したイオン性基に炭素数６以上のアルキル基が少なくとも１個結合しているものを挙げることができる。例えば、炭素数６以上のアルキル基を有するアルキルアミン（第１級アミン〜第４級アミンのいずれでもよい）を挙げることができる。後述の実施例ではN,N-ジメチルアルキルアミンを用いている。このようなアルキル基含有化合物は、アルキル基の鎖長を長くすることにより疎水性を増大させることが可能であるので、封入する活性成分よりも疎水性の大きな化合物を容易に合成することができる。また、アルキル基の長さを適宜設定することにより、活性成分の溶出速度を調節することが可能である。
【００４１】
溶出抑制剤としては医薬又は医薬添加剤を用いることもできる。すなわち、活性成分のみならず、溶出抑制剤も医薬又は医薬添加剤とすることができる。イオン性基を有する医薬や医薬添加物は種々のものが公知であり、これらの中から、活性成分のイオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有し、好ましくは活性成分よりも疎水性である医薬又は医薬添加剤を選択して溶出抑制剤として用いることができる。
【００４２】
溶出抑制剤として用いることができる、イオン性基を有する医薬又は医薬添加剤の例として以下のものを挙げることができる。
【００４３】
塩酸メプリルカイン
無痛化剤、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射
【００４４】
【化１１】
2010116382.tif 000013
【００４５】
塩酸グルコサミン 
緩衝剤、経口投与
【００４６】
【化１２】
2010116382.tif 000014
【００４７】
ラウリルジアミノエチルグリシンナトリウム液
崩壊補助剤、経口投与
【００４８】
【化１３】
2010116382.tif 000015
【００４９】
塩化ベンゼトニウム
安定化剤、分散剤、防腐剤、保存剤、
静脈内注射、筋肉内注射、眼科用剤
【００５０】
【化１４】
2010116382.tif 000016
【００５１】
ニコチン酸アミド
安定化剤、等張化剤、溶解補助剤、経口投与、
静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射
【００５２】
【化１５】
2010116382.tif 000017
【００５３】
L-ヒスチジン
安定化剤、静脈内注射
【００５４】
【化１６】
2010116382.tif 000018
【００５５】
リドカイン
薬理活性あり；麻酔薬、無痛化剤、溶剤、溶解剤、溶解補助剤、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射
【００５６】
【化１７】
2010116382.tif 000019
【００５７】
マレイン酸クロルフェニラミン
薬理活性あり；抗ヒスタミン剤
【００５８】
【化１８】
2010116382.tif 000020
【００５９】
塩酸プロカインアミド
薬理活性あり；ナトリウムチャネル遮断剤
【００６０】
【化１９】
2010116382.tif 000021
【００６１】
活性成分と溶出抑制剤の混合比率は、活性成分のイオン性基と溶出抑制剤のイオン性基が過不足なく、イオン対を形成する量にした場合に溶出抑制効果が最も高くなる。従って、添加する溶出抑制剤の量によっても活性成分の溶出速度を調節することができる。溶出抑制剤の添加量は、そのイオン性基の数が、通常、封入される活性成分のイオン性基の数の1/10倍〜１０倍程度、好ましくは1/2倍〜２倍程度となる量である。ただし、これは、高分子ミセルを構成するブロックコポリマーがイオン性基を有していない場合であり、後述の実施例で記載する高分子ミセルのように、疎水性領域を構成するアスパラギン酸のようなカルボン酸のカルボキシル基がミセルの内側に存在する場合等には、活性成分とイオン対を形成する量に加え、ブロックコポリマーのイオン性基とイオン対を形成するのに必要な量だけ溶出抑制剤を添加した場合に溶出抑制効果が最も高くなる。すなわち、ブロックコポリマー自体がイオン性基を有する場合には、溶出抑制剤の添加量は、そのイオン性基の数が、通常、封入される活性成分のイオン性基の数とブロックコポリマーのイオン性基の数の合計数の1/10倍〜１０倍程度、好ましくは1/2倍〜２倍程度となる量である。
【００６２】
活性成分封入高分子ミセルの粒径（直径）は、通常、3nm〜1000nm程度、好ましくは10nm〜300nm程度である。高分子ミセルの粒径は、ブロックコポリマーの分子量を調整することにより調整することができる。高分子ミセルを調製後、市販の高圧乳化装置等を用いてフィルターを通すことにより、整粒することもできる。
【００６３】
本発明の活性成分封入高分子ミセルは、活性成分、溶出抑制剤及びブロックコポリマーを水系媒体中で撹拌することにより調製することができる。すなわち、溶出抑制剤を添加することを除き、例えば非特許文献２や非特許文献３等に記載されている公知の方法により調製することができる。すなわち、活性成分、溶出抑制剤及びブロックコポリマーを含む水系媒体中で高分子ミセルを形成させることにより、高分子ミセルを得ることができる。なお、ここで「水系媒体」とは水を主成分とする均一な液体の媒体であり、通常、水や緩衝液等である。高分子ミセルは、単にこの水溶液を撹拌することにより形成することもでき、水を徐々に蒸発させてブロックコポリマー濃度を高めて高分子ミセルを形成させる溶媒蒸発法等により形成することができる。あるいは、テトラヒドロフランのような水と自由に混じり合う有機溶媒中に活性成分、溶出抑制剤及びブロックコポリマーを溶解した溶液を調製し、この溶媒を徐々に蒸発させてブロックコポリマー濃度を高めて高分子ミセルを形成させながら乾燥し、次いで水を加えて超音波を照射する方法によっても調製することができる（下記実施例参照）。高分子ミセルを形成させる際の溶液中のブロックコポリマー濃度は、通常、0.05重量％〜30重量％程度、好ましくは0. 5重量％〜10重量％程度である。高分子ミセルの形成は、室温下で行なうことができる。また、溶液中の活性成分の濃度は、通常、ブロックコポリマーの１重量％〜３０重量％程度、好ましくは５重量％〜２０重量％程度である。溶出抑制剤の添加量は、活性成分との混合比率が上記した範囲になる量である。
【００６４】
使用時には、活性成分封入高分子ミセルを水性媒体中に懸濁した懸濁液を、該活性成分の投与経路で投与する。投与経路は、活性成分を投与する際に採用される経路であり、通常、経口投与又は組織若しくは臓器への直接注射、静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与、経腸投与等の非経口投与である。投与量は、通常、高分子ミセルに封入されている活性成分について定められている所定の投与量でよいが、必要により又は所望により適宜増減してもよい。
【００６５】
上記の通り、イオン性基を有する活性成分と共に溶出抑制剤を高分子ミセル内に封入するすることにより、該活性成分のミセルからの溶出を抑制することができるので、本発明は、上記高分子ミセルの内部に、イオン性基を有する活性成分を封入する際に、該活性成分を、該イオン性基と反対の極性を有するイオン性基を有する化合物から成る溶出抑制剤と共に封入することを含む、高分子ミセルに封入される活性成分の溶出抑制方法をも提供するものである。
【００６６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６７】
ブロックコポリマーの製造例１
下記式１で示すブロックコポリマーを非特許文献６記載の方法により製造した。
【００６８】
【化２０】
2010116382.tif 000022
式１
【００６９】
すなわち、片末端メトキシ基および片末端アミノ基のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量５，２００、７．０ｇ）とβ−ベンジル  Ｌ−アスパルテート  Ｎ−カルボン酸無水物（９．１ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１５ｍＬ）とジクロロメタン（１５０ｍＬ）の混合溶媒中、窒素雰囲気下、３５℃で１７時間撹拌した後、反応混合物をジエチルエーテル（１．５Ｌ）中に滴下混合して沈殿物を生じさせた。沈殿物を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、次いで減圧乾燥してＰＥＧ鎖とポリ（β−ベンジル  Ｌ−アスパルテート）（ＰＢＬＡ）鎖からなるブロックコポリマー（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ、１３．４ｇ）を得た。ＰＥＧ鎖のメチレンプロトンとＰＢＬＡ鎖ベンジル基のメチレンプロトンの１Ｈ−ＮＭＲ測定により、ＰＢＬＡ鎖の分子量は約４，９００（すなわち式１でｎ＝１１７、ｍ＝２４）と決定された。
【００７０】
また、同様の方法によりＰＥＧ鎖およびＰＢＬＡ鎖の分子量がそれぞれ約５，２００および約５，７００（すなわち式１でｎ＝１１７、ｍ＝２８）のＰＥＧ−ＰＢＬＡを得た。
【００７１】
ブロックコポリマーの製造例２
基本的に上記と同様にして、下記式２で示されるブロックコポリマーを製造した。
【００７２】
【化２１】
2010116382.tif 000023
式２
ここで、ＲはＨまたはベンジル基（Ｂｚｌ）。また、ａ：ｂ比は約１：３、ＲがＨの単位とベンジル基の単位はランダムに配列している。
【００７３】
すなわち、上記ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（式１でｎ＝１１７、ｍ＝２８、１０．０ｇ）を水酸化ナトリウム水溶液（０．５Ｍ、１５０ｍＬ）中、室温で２０分間激しく撹拌した後、塩酸（６Ｍ、４２．５ｍＬ）を加えて酸性化した。反応混合物をスペクトラポアー（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）６透析膜（分画分子量１，０００）を使用して蒸留水に対して一夜透析し、次いで透析バッグ中の溶液を凍結乾燥してベンジルエステルが加水分解されたブロックコポリマー［上記式２でＲ＝Ｈ、以下、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）］（７．２５ｇ）を得た。ベンジルエステルの加水分解は１Ｈ−ＮＭＲ測定により確認した。この操作ではポリアスパラギン酸（Ｐ（Ａｓｐ））鎖の一部も加水分解され、得られたブロックコポリマーのＰ（Ａｓｐ）鎖の分子量は約２，８００（すなわち式２でｎ＝１１７、ｍ＝２４）であった。
【００７４】
また、文献（Saudek, V., et al., Biopolymers 1981; 20: 16151623.）に記載されているとおり、この操作に伴うＰ（Ａｓｐ）鎖のβ−アミド化が１Ｈ−ＮＭＲ測定により確認された。
【００７５】
ブロックコポリマーの製造例３
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）のベンジルエステル化を非特許文献７記載の方法に従い行った。すなわち、前記ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）（式２でＲ＝Ｈ、ｎ＝１１７、ｍ＝２４、０．５０ｇ）をＤＭＦ（５．０ｍＬ）に溶解し、臭化ベンジル次いでエステル化反応活性化剤として１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）を加えて窒素雰囲気下、５０℃で１６時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍＬ）中に滴下混合し、沈殿物を生じさせた。沈殿物を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄して減圧乾燥した後、ＤＭＦに溶解してＤＢＵと等モル量の塩酸（６Ｍ）を加えた。この溶液をスペクトラポアー（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）６透析膜（分画分子量１，０００）を使用して蒸留水に対して一夜透析し、次いで透析バッグ中の溶液を凍結乾燥して、Ｐ（Ａｓｐ）鎖が部分的にベンジルエステル化されたブロックコポリマー［上記式２でＲ＝ＨまたはＢｚｌ、以下、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ（Ｂｚｌ）ｘ）。ここでｘはＰ（Ａｓｐ）鎖に対するベンジル基の修飾率（％）を示す］を得た。ＰＥＧ鎖のメチレンプロトンとベンジル基のメチレンプロトンの１Ｈ−ＮＭＲ測定からベンジル修飾率を決定した。反応に使用した臭化ベンジルおよびＤＢＵの量、ならびに得られたＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ（Ｂｚｌ）ｘ）のベンジル修飾率を表１に示す。
【００７６】
【表１】
2010116382.tif 000024
【００７７】
高分子ミセルの製造
高分子ミセルの製造は非特許文献８記載の方法に従って行った。すなわち、ブロックコポリマー（２０ｍｇ）をガラス容器中でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２．５ｍＬ）に溶解した後、窒素気流下、４０℃で加熱撹拌してＴＨＦを留去してブロックコポリマーの薄膜を得た。次いでガラス容器に蒸留水（４．０ｍＬ）を加えてプローブ型超音波照射装置にて超音波照射を行い、高分子ミセル溶液を得た。この溶液を遠心分離処理し（３，９００ｒｐｍ、１０分間）、次いで孔径０．２２μｍの膜で濾過して異物を除去した。
【００７８】
ここで高分子ミセルの製造に使用したブロックコポリマーを下記表２に示す。これらのブロックコポリマーの構造は式１又は式２においてｎ＝１１７、ｍ＝２４であり、ベンジル修飾率が３３％から１００％の範囲にある。
【００７９】
【表２】
2010116382.tif 000025
【００８０】
高分子ミセルへの合成レチノイドの封入
上記高分子ミセル製造において、ブロックコポリマーのＴＨＦ溶液中に合成レチノイドを加え、以降は同じ操作を行うことにより合成レチノイド封入高分子ミセルを調製した。  ここで高分子ミセルに封入した合成レチノイドは、上記Ａｍ８０又は上記ＬＥ５４０であった。
【００８１】
すなわち、合成レチノイドの添加量はブロックコポリマーの１０％（重量比）とし、高分子ミセル中への封入量は逆相ＨＰＬＣにて決定した。逆相ＨＰＬＣ測定はＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ逆相クロマトグラフィーカラム（１５０ｍｍ長，４．６ｍｍ径）を使用して行った。移動相はＡｍ８０について５％酢酸−メタノール（容積比１：２）、ＬＥ５４０について５％酢酸−メタノール（容積比１：９）を使用した。検出はＡｍ８０について２９０ｎｍ、ＬＥ５４０について３５６ｎｍのＵＶ吸収測定にて行った。
【００８２】
上記表２に示す４種のブロックコポリマーで構成される高分子ミセル中へのＡｍ８０およびＬＥ５４０の封入量は添加量の７５％以上であった。なお、Ａｍ８０およびＬＥ５４０は水に対して難容性であり、高分子ミセル中に封入されなかった場合は上記製造工程の遠心分離および濾過操作により系中から除去される。
【００８３】
高分子ミセルへの溶出抑制剤の同時封入
上記高分子ミセルへのＡｍ８０の封入工程において、ブロックコポリマーおよびＡｍ８０のＴＨＦ溶液中に溶出抑制剤を加え、以降は同じ操作を行うことにより高分子ミセル中にＡｍ８０と溶出抑制剤を同時封入した。溶出抑制剤の組成については以下に記載の放出性試験の実施例に詳細を述べる。
【００８４】
放出性試験の方法
合成レチノイドの高分子ミセル中からの放出性は透析法により評価した。すなわち、上記記載の方法で製造した合成レチノイド封入高分子ミセルの水溶液（１．０ｍＬ）をスペクトラポアー（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）６透析膜（分画分子量１，０００）中に注ぎ、１００倍量（容積比）のダルベッコりん酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に対して透析した。所定時間経過後に外部透析液（０．１ｍＬ）を分取して凍結乾燥し、合成レチノイドをメタノール（０．１ｍＬ）にて抽出して逆相ＨＰＬＣによる定量を行った。試験は各条件につき３回繰り返して再現性を確認した。以下に記載の放出性試験の実施例では合成レチノイドの放出率を３回の試験の平均値で示し、誤差を標準偏差で示した。
【００８５】
放出性試験１；溶出抑制剤による効果
放出性試験の実施例について以下に述べる。ここでは溶出抑制剤の疎水性がＡｍ８０の放出挙動に与える影響について評価した。高分子ミセルは表２中に示すブロックコポリマー１にて製造し、Ａｍ８０および溶出抑制剤を封入した。
【００８６】
溶出抑制剤は下記式３で示すＮ，Ｎ−ジメチルアルキルアミン類（すなわちＲ＝ｎ−ヘキシルであるＮ，Ｎ−ジメチルヘキシルアミン（ＤＭＨＡ）、Ｒ＝ｎ−ドデシルであるＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン（ＤＭＤＡ）、およびＲ＝ｎ−オクタデシルであるＮ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアミン（ＤＭＯＡ））である。溶出抑制剤の添加量はＡｍ８０に対して等モル量とした。
【００８７】
【化２２】
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式３
（ここでＲはＣ６Ｈ１３（ｎ−ヘキシル）、Ｃ１２Ｈ２５（ｎ−ドデシル）、またはＣ１８Ｈ３７（ｎ−オクタデシル）である）
【００８８】
放出性試験の結果を図１に示す。比較例として、溶出抑制剤を封入していない場合の高分子ミセルからのＡｍ８０の放出率も図１に示す。なお、図１中、添加した溶出抑制剤は○；ＤＭＨＡ、◇；ＤＭＤＡ、および△；ＤＭＯＡ。また、■；添加物なしの系の結果を示す。
【００８９】
図１から、溶出抑制剤の添加はＡｍ８０の徐放化に寄与することが明らかであり、この徐放化に与える効果はＤＭＯＡが最も大きく、次いでＤＭＤＡであり、ＤＭＨＡは効果が小さい。すなわち添加物のアルキル鎖が長い、言い換えると疎水性が大きいほどＡｍ８０の放出速度を小さくできる。この結果はＡｍ８０の放出速度が同時封入する溶出抑制剤の種類で制御できることを示す。
【００９０】
放出性試験２；ブロックコポリマーの構造による影響
溶出抑制剤の添加によるＡｍ８０の徐放化に与えるブロックコポリマーの構造の影響について評価した。高分子ミセルは表２中に示す４種のブロックコポリマーにて製造し、Ａｍ８０およびＤＭＤＡを封入した。ＤＭＤＡの添加量はＡｍ８０およびブロックコポリマーの非ベンジル修飾アスパラギン酸残基と等モル量とした。それぞれのブロックコポリマーより構成される高分子ミセルからのＡｍ８０の放出率を図２に示す。比較例として、溶出抑制剤を封入していない場合の高分子ミセルからのＡｍ８０の放出率も図２に示す。なお、図２中、Ａｍ８０およびＤＭＤＡを封入した高分子ミセルを構成するブロックコポリマーは、○；１、◇；２、△；３、および□；４である。また、ＤＭＤＡを添加しなかった系について●；１、◆；２、▲；３、および■；４で示した。
【００９１】
図２に示されるように、Ａｍ８０の放出速度はブロックコポリマーの構造に依らずＤＭＤＡの同時封入により低下した。具体的には、封入されたＡｍ８０の６０％が放出されるために要した時間は８時間以内から２４時間以上に延長した。この結果は、本方法による高分子ミセルからの封入化合物の放出挙動の制御がブロックコポリマーの特定の構造に依存しないことを示す。
【００９２】
放出性試験３
溶出抑制剤の添加によるＡｍ８０の徐放化に与える溶出抑制剤の添加量の影響について評価した。高分子ミセルは表２中に示すブロックコポリマー１にて製造し、Ａｍ８０およびＤＭＤＡを封入した。ＤＭＤＡの添加量はＡｍ８０に対し１から７．４倍（モル当量）の範囲とした。放出性試験の結果を図３に示す。なお、図３中、ＤＭＤＡの添加量はＡｍ８０に対して○；１、◇；２．７、△；５．４、および□；７．４（モル当量）であった。
【００９３】
Ａｍ８０の放出速度制御におけるＤＭＤＡ添加量の効果はブロックコポリマー１よりなる高分子ミセルの系では小さい。この結果はＤＭＤＡの添加によるＡｍ８０の徐放化において、Ａｍ８０とのイオン対形成に必要な量より過剰に添加した場合は効果は顕著に増加しないことを示す。
【００９４】
同様に、表２中に示すブロックコポリマー３にて製造した高分子ミセルに、Ａｍ８０およびＤＭＤＡを封入した。ＤＭＤＡの添加量はＡｍ８０に対し１から１０．７倍（モル当量）の範囲とした。放出性試験の結果を図４に示す。なお、図４中、ＤＭＤＡの添加量はＡｍ８０に対して○；１、◇；５．４、および△；１０．７（モル当量）であった。
【００９５】
Ａｍ８０の放出速度制御におけるＤＭＤＡ添加量の効果はブロックコポリマー３よりなる高分子ミセルの系では大きい。すなわち、Ａｍ８０の徐放化にはＡｍ８０に対して５．４モル当量以上のＤＭＤＡが必要であった。これはＤＭＤＡがブロックコポリマー３の非ベンジル修飾アスパラギン酸残基のカルボキシル基ともイオン対を形成できるためである。すべてのＡｍ８０がＤＭＤＡとイオン対を形成するためには非ベンジル修飾アスパラギン酸残基と等モル量のＤＭＤＡを添加する必要がある。Ａｍ８０およびブロックコポリマー３の非ベンジル修飾アスパラギン酸残基と等モル量のＤＭＤＡは、Ａｍ８０に対して５．４モル当量に相当し、これ以上のＤＭＤＡ添加によりＡｍ８０の徐放化が達成された。この結果は、ブロックコポリマーが溶出抑制剤とイオン対を形成可能な場合は相当分の添加物を追加することで放出制御が効果的となることを示す。
【００９６】
放出性試験５；ＬＥ５４０の放出挙動
別の合成レチノイドとしてＬＥ５４０の放出挙動について評価した。高分子ミセルは表２中に示す４種のブロックコポリマーにて製造し、ＬＥ５４０を封入した。それぞれの高分子ミセルからのＬＥ５４０の放出率を図５に示す。なお、図５中、ＬＥ５４０を封入した高分子ミセルを構成するブロックコポリマーは○；１、◇；２、△；３、および□；４である。
【００９７】
ＬＥ５４０は図５結果から明らかであるように、高分子ミセルからの放出速度が極めて小さい。しかし異なる条件において放出が加速される場合、あるいはより長期間の徐放化が求められる場合は、溶出抑制剤による放出挙動の制御の対象化合物として除外されるものではない。
【００９８】
なお、上記各実施例で用いた活性成分や溶出抑制剤の溶解度を次のようにして測定した。
１．各試料をTHFに溶解して濃度1.0 mg/mLの溶液を調製。
２．ガラス容器内にてTHFを窒素気流にて留去し、試料を乾燥。
３．水またはダルベッコりん酸緩衝液（D-PBS、pH 7.4）1.0 mLを加え、磁気撹拌装置にて試料を溶解。撹拌条件は22.5℃で1.5時間。この条件では試料は飽和し、完全には溶解しない。
４．遠心分離（10000 G、20分間、室温）次いで濾過処理（孔径0.22μm）にて得られた水相に含有される試料濃度を逆相HPLCにて決定。
なお、D-PBS中での溶解度は、後述する放出試験をD-PBS中で行ったことから、併せて測定した。結果を下記表３に示す。
【００９９】
【表３】
2010116382.tif 000027
【０１００】
また、上記のように作製した各ミセルの粒径を濃度1.0 mg/mLのミセル溶液を大塚電子製DLS-7000動的光散乱測定装置にて測定した。結果を下記表４に示す。
【０１０１】
【表４】
2010116382.tif 000028
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】本発明の実施例で作製した、本発明の活性成分封入高分子ミセル及び溶出抑制剤を添加していない比較例の活性成分封入高分子ミセルからの活性成分（Ａｍ８０）の放出性試験の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例で作製した、ベンジル修飾率の異なるブロックコポリマーを用いて作製した本発明の活性成分封入高分子ミセル及び溶出抑制剤を添加していない比較例の活性成分封入高分子ミセルからの活性成分（Ａｍ８０）の放出性試験の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例で作製した、異なる量の溶出抑制剤を封入した、ブロックコポリマーの側鎖に遊離のカルボキシル基が存在しないブロックコポリマーを用いて作製した本発明の活性成分封入高分子ミセル及び溶出抑制剤を添加していない比較例の活性成分封入高分子ミセルからの活性成分（Ａｍ８０）の放出性試験の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例で作製した、異なる量の溶出抑制剤を封入した、ブロックコポリマーの側鎖に遊離のカルボキシル基が存在するブロックコポリマーを用いて作製した本発明の活性成分封入高分子ミセル及び溶出抑制剤を添加していない比較例の活性成分封入高分子ミセルからの活性成分（Ａｍ８０）の放出性試験の結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例で作製した、本発明の活性成分封入高分子ミセル及び溶出抑制剤を添加していない比較例の活性成分封入高分子ミセルからの活性成分（ＬＥ５４０）の放出性試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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