(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー症を防ぐためにベータセクレターゼ酵素を阻害する有効な候補化合物およびそれらを基本構造とした医薬品、さらにはＡＤの発症を予防する予防薬を提供する。【解決手段】ベータセクレターゼ蛋白質の活性を阻害する新規な物質を見出すことによって、アルツハイマー症の予防薬を実用化して、新規な阻害物質として直鎖状のジアリールヘプタノイドに属する物質の中で式３に示される物質が阻害効果を有する。（式３）2010116322.tif 000009また新たに見出したベータセクレターゼ蛋白質を阻害する物質に加えて、脂肪酸および／または酸化防止剤を含有する予防薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータセクレターゼ蛋白質の酵素活性を阻害する物質であり、その物質が直鎖状のジアリールヘプタノイドに属する物質であることを特徴とするベータセクレターゼ蛋白質の阻害物質。
【請求項２】
前記直鎖状のジアリールヘプタノイドに属する物質の構造が、次の式１で表されることを特徴とする特許請求範囲第１項記載のベータセクレターゼ蛋白質の阻害物質。
【化１】
2010116322.tif 000007
【請求項３】
ベータセクレターゼ蛋白質を阻害する物質を含有する予防薬であり、当該予防薬には次の式２で表される物質に加えて、脂肪酸および／または酸化防止剤を含有することを特徴とする予防薬。
【化２】
2010116322.tif 000008
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベータセクレターゼ蛋白質（b-Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）の酵素活性を阻害する物質と、その阻害物質を主として含有する予防薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の長寿命化に伴う高齢化社会への移行に伴い、認知症患者、特にアルツハイマー症
（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ; ＡＤと略記する）患者が増加している。このＡＤ患者の増加は、我が国のような長寿命国家のみだけではなく世界的にも増加傾向にある。このためＡＤ患者に有効な治療薬あるいは治療法の開発が望まれているところである。
【０００３】
しかしＡＤ発症のメカニズム解明や治療薬の開発はさかんに行われているが、発症のメカニズムについてはまだ不明の部分が多いようである。また治療薬については、従来の低分子化合物を主体とした医薬品やワクチンを用いるものなどが開発されつつあるが、有効なものは未だ実用化されていない。
【０００４】
ＡＤ発症のメカニズムについては、ＡＤ患者の脳にはペプチドの一種であるベータアミロイド（Ａbと略記）の蓄積が非常に多く見られることから、このＡbの産生がＡＤ発症に関与していると考えられてきた。しかしこの産生されたＡb自身が神経毒として作用してＡＤの原因となるのか、あるいはＡbが産生される前段階の生化学的な反応過程においてＡＤの原因となるメカニズムが働いているのか、については明確になっていない。また最近になってＡbワクチンの臨床テストにおいては、脳内におけるＡbの蓄積量とＡＤ患者の寿命および痴呆の進行抑制との間には相関がない、という報告もされている。
【０００５】
これまでの研究から、Ａbはアミロイド前駆体蛋白質（Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ; ＡＰＰと略記)の代謝産物であることが判っている。ＡＰＰは７７０個のアミノ酸配列のＣ末端側に１回の膜貫通部位を有する膜結合蛋白質である。Ａbはこの前駆体蛋白質であるＡＰＰ から、２段階の切断を受けて生成されると考えられている。
【０００６】
すなわちＡＰＰに存在する約４３アミノ酸残基のＡbドメインのＮ末端側がＡＰＰ切断酵素の一つであるb-Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ（ベータセクレターゼ）により切断される過程と、さらにその後、Ｃ末端側が同じくＡＰＰ切断酵素の一つであるg-Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ（ガンマセクレターゼ）により切断される過程を経て産生される。従ってＡＤ発症を防ぐためには、これらのＡＰＰ切断酵素の活性を阻害する物質が有効であると考えられている。しかしこれらの酵素を阻害する有効な候補化合物およびそれらを基本構造とした医薬品、さらにはＡＤの発症を予防する予防薬は未だ実用化されていない。
【０００７】
ベータセクレターゼの活性を阻害する阻害物質を見出すためには、ベータセクレターゼを精製する必要がある。ベータセクレターゼの精製については以下の代表的な文献にその方法が記載されている。
【非特許文献１】Ｐａｔｅｌ， Ｓ． ｅｔ  ａｌ．，（２００４）． Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３４３，４０７−４１６．
【非特許文献２】Ｌｉｎ，Ｘ． ｅｔ  ａｌ．， （２０００）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７，１４５６−１４６０．
【非特許文献３】Ｓａｒｄａｎｄ，Ｖ． ｅｔ  ａｌ．，（２００４）． Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． ３４， １９０−１９６．    またベータセクレターゼの阻害剤については以下の代表的な例がある。
【特許文献１】ＰＣＴ ＷＯ ０１／０００６６５  Ａ３
【特許文献２】ＰＣＴ ＷＯ ０１／００６６３  Ａ２      ＡＤ発症患者に特徴的に見出されているＡbの産生は不可逆反応であるため、ＡＤの発症と病状も不可逆的に進行するものと考えられる。すなわち産生されたＡbはひとたび生成されれば、出発物質であるＡＰＰの分子に再構築されて戻ることができない。このことよりＡＤは発症を早期に抑えて、予防することが重要であると考えられる。いったんＡＤが発症してしまえば、進行を遅らせることができたとしても根本的な治療とはならず、長い年月をかけてＡＤの病状が進行してしまうものと思われる。このようなＡＤの発病を未然に予防するための予防薬あるいは医薬品についても未だ実用化されていないのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする問題点は、ＡＤ発症を防ぐためのベータセクレターゼ酵素を阻害する有効な候補化合物およびそれらを基本構造とした医薬品、さらにはＡＤの発症を予防する予防薬が実現できていない点である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以上のような技術とその課題を解決するために本発明はなされたものであり、以下詳細にその内容を説明する。
【００１０】
ＡＰＰとベータセクレターゼは共に膜貫通型蛋白質であるが、本発明者らはＡＤの発症の初期段階では、ＡＰＰあるいはベータセクレターゼが膜組織（細胞膜）から露出あるいは脱離してＡＰＰが切断酵素であるベータセクレターゼに攻撃されやすくなっているものと考えている。すなわち、ＡＰＰ分子内のＡbドメインは通常は細胞膜に保護されており、ベータセクレターゼには攻撃されにくい構造となっている。しかし加齢と共に細胞膜を構成する動物性脂質が減少するのに伴い、ＡＰＰ分子内のＡbドメインが露出してしまうこと、および／または遊離したベータセクレターゼの攻撃を受けやすくなるものと考えられる。
【００１１】
このことよりＡＤ発症の予防としては、第一にＡＰＰ分子内のＡbドメインを保護している細胞膜に存在する動物性脂質、あるいはベータセクレターゼのＣ末端側にある膜結合部位周辺に存在する動物性脂質を十分に供給すること、そして第二にたとえＡbドメインが露出してしまった場合でも、Ａbドメインが切断されないようＡＰＰ切断酵素であるベータセクレターゼを阻害する物質を供給すること、が重要であると考えられる。よって本発明者は、始めにＡＤの発症原因となると考えられているＡＰＰの切断酵素であるベータセクレターゼに着目し、この酵素活性阻害物質を食用される植物の天然物の中から見出すことを試みた。
【発明の効果】
【００１２】
本発明者は食用に供される各種植物から天然物成分を抽出・精製し、ベータセクレターゼの酵素阻害活性を詳細に評価した結果、式１に表される直鎖状のジアリールヘプタノイドとして分類される天然物由来の成分が阻害活性を有することを見出した。
【００１３】
【化３】
2010116322.tif 000002
【００１４】
この式１に示される天然物成分は一般にはクルクミンと称されているが、このうち酵素阻害活性を有するものは式１で表されるクルクミン-Ａのみであることを初めて見出した。一方、類似の骨格構造を有する式２で表されるクルクミン-Ｂと、式３で表されるクルクミン-Ｃは置換基がわずかに異なるのみであるが、酵素阻害活性を全く示さなかった。
【００１５】
【化４】
2010116322.tif 000003
【００１６】
【化５】
2010116322.tif 000004
【００１７】
従って、式１の化学式で表されるクルクミン-ＡのみがＡＤの予防薬として有効であることが示唆された。
【００１８】
本発明者らが見出したクルクミン-Ａは植物であるウコンあるいはターメリックを原料とするが、同一の化学構造と阻害活性を有するものであれば、天然物由来だけでなく、化学合成品であっても良い。また式１で示される天然物成分の化学構造に類似したものとして式４および式５で表される天然物由来のジアリールヘプタノイドであるヤクチノンＡやヤクチノンＢも効果である。
【００１９】
【化６】
2010116322.tif 000005
【００２０】
【化７】
2010116322.tif 000006
【００２１】
一般的にはクルクミン-Ａは植物であるウコンあるいはターメリックを原料として、以下のようにして抽出・精製される。
【００２２】
ウコンあるいはターメリックを切断後、粉砕器で粉砕処理し、数百ミクロン以下の粉末にする。この粉末原料１０ｇ当たり５００ｍLのメタノールを加えて１２時間浸とうし、その後６,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清の抽出液を回収する。回収した抽出液はデイスクフイルター（０．４５ミクロン径）でろ過処理を行う。サンプルの分離には高分離シリカ系カラムを用いた高速液体クロマトグラフーにより行う。ウコンあるいはターメリックを原料としてクルクミンをＨＰＬＣで分析すると、通常3種類のクルクミン（Ａ，Ｂ，Ｃ）がそれぞれ分離した３本のピークとして得られる。このうち、目的とするクルクミン-Ａは溶出ピークのうちの中央のピーク成分として観測される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明者らはベータセクレターゼを得るために、独自の方法によって精製を行った。すなわち、第２図に示されるアミノ配列部分に相当する塩基配列を人工合成し、さらにこれを発現ベクターであるｐＥＴ-３０ａ にサブクローニングして発現系を構築した。この発現ベクターを用いてコンピテントセルである大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３） を形質転換することによって大腸菌の発現系を得ることができた。このような大腸菌を発現系として作製されるベータセクレターゼは不溶性画分として回収されるため、精製に際しては高濃度の尿素を含む水溶液を用いて可溶化した後、リフオールデイング（蛋白質の巻き戻し）を行った。リフオールデイング後のベータセクレターゼはプロ体（不活性型）であるため、Ｎｉアフイニテイカラムクロマトグラフィーによる粗精製後に活性化処理を行った。
【００２４】
活性化処理後のベータセクレターゼは、引き続いて陰イオン交換カラムクロマログラフーとゲルろ過カラムクロマログラフーによる精製を行った。図３に本発明者が精製したベータセクレターゼの１２．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【００２５】
精製されたベータセクレターゼの酵素活性の測定は以下のようにして行った。精製後のベータセクレターゼ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＤＴＴのバッフアに溶解）に等量の１００％グリセロールを加えて希釈する。このサンプルに基質を添加し、さらに最終濃度が４０ｍＭとなるよう酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を加え、３７℃で反応を行う。反応後の各成分はＨＰＬＣ−ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳによって分離および質量分析を行う。
【００２６】
図２に酵素活性の測定結果の一例を示す。ここでは１００ｎＭのベータセクレターゼと１０５mＭ の基質１を３７℃で６時間反応させて、生成物２と３を産生している。ベータセクレターゼはアスパラギン酸プロテアーゼであり、基質１がアミノ酸配列中のＬｅｕ−Ａｓｐ間を切断していることがわかる。また精製されたベータセクレターゼを用いた酵素阻害活性の測定では、図１に示した各精製サンプルをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１００ｍＭのストック溶液を調整し、上述の酵素活性の評価用サンプルに逐次添加して酵素活性を測定する。    
【００２７】
図３にクルクミン-Ａ の酵素阻害活性の評価結果を示す。この結果からベータセクレターゼに対するクルクミン-ＡのＩＣ５０は１．５ｍＭ であった。一方、クルクミン-Ｂおよびクルクミン-Ｃは分子構造がわずかに異なるのみであるが阻害活性を全く示さないことが判明した。
【００２８】
本発明者はＡＤ発症のメカニズムに基づき、ＡＤを予防するための予防薬として以下の組成を有するものが有効であることを初めて見出した。すなわち、本発明者が見出したベータセクレターゼの酵素阻害剤として有効なクルクミン-Ａに加えて、脂肪酸および／または酸化防止剤を含有することを特徴としている。これらの組成のうち脂肪酸は細胞膜の構成成分として機能するものである。細胞膜を構成する脂質が加齢あるいは食生活の偏り等により減少することで膜結合型蛋白質の結合部位の露出あるいは離脱が起こると考えられるため、これら脂質の構築成分となる脂肪酸を摂取することが有効である。
【００２９】
この脂肪酸としては、ガンマーリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサン酸、エイコサペンタエン酸、共役リノレン酸、共役リノール酸などが挙げられる。また中鎖脂肪酸トリグリセロイド等の食用油脂類も有効である。また上記脂肪酸のほかに機能性脂質として、イソプレノイド、リン脂質、長鎖アルコール等も有効である。
【００３０】
本発明の予防薬の他の成分である酸化防止剤は脂質の酸化による劣化を防止するために主に用いられ、脂溶性ビタミンであるビタミンＡ，Ｄ，Ｅ，Ｋなどが効果的である。
【００３１】
本発明の予防薬の作製に際しては、上記の各物質を適量混合して調整する必要がある。本発明においては、クルクミン-Ａ，脂肪酸および酸化防止剤の混合比は１：１〜１００００:１〜１００００であるのが好ましく、より好ましくは１:１０〜１００:１〜１００である。しかし、効能や用途に応じてこの組成比を変更することも可能である。
【００３２】
本発明の予防薬においては、上記の組成を有する混合されたもののほかに、図１に示される本発明の直鎖状のジアリールヘプタノイドとして分類される天然物由来の成分を、我々が通常食する種々の食物、菓子類、飲料、調味料、料理、食品添加剤などに添加して利用することも有効である。
【実施例１】
【００３３】
ベータセクレターゼの精製
ベータセクレターゼのクローニング部位を組み込んだ発現ベクター（ｐＥＴ−３０ａ）をＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフオームして、目的蛋白質の大量発現を行った。抗生物質としてカナマイシンを５０mｇ／ｍＬの濃度となるよう添加したＬＢ培地１Ｌに、同じくカナマイシン耐性のＬＢ培地１０ｍＬで培養した菌体を含む培養液を加え、３７℃で培養を行った。その後、６００ｎｍ の吸光度が約０．５となったところで、ＩＰＴＧを最終濃度で１ｍＭとなるよう添加して、さらに３７℃で４時間培養を継続した。培養後に遠心分離によって菌体を集め、−８０℃で保存した。
【００３４】
凍結保存された菌体１．５ｇ に破砕バッフアを１５ｍＬ加えて懸濁した後、超音波破砕を行った。その後、破砕液を遠心分離し、沈殿を回収した。回収された沈殿約０．８ｇに可溶化バッフアを２０ｍＬ加え、ホモジナイズを行った。さらに１５，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離を行い、可溶化した上清画分を回収した。さらにこの可溶化した上清画分を３０ｍＬ まで濃縮した。
【００３５】
次に上記の可溶化した上清画分のリフオールデイングを行った。リフオールに際しては、可溶化した上清画分の２０倍量となるようリフオールデイングバッフアを秤量した。その後、このリフオールデイングバッフアに上述の可溶化した上清画分を０．０００１ｍＬ／ｍｉｎ の流速でゆっくりと滴下しながら撹拌を行った。その後、リフオールデイングバッフアのｐＨ値を９．０に調整して、２４時間撹拌を行った。
【００３６】
その後リフオールデイングバッフアのｐＨ値を８．５に調整して、２４時間撹拌を行った。そして最後にリフオールデイングバッフアのｐＨ値を８．０に調整して、２４時間撹拌を行った。
【００３７】
以上のようにしてリフオールデイングを行ったサンプルを濃縮キットにより、約２ｍＬ まで濃縮し、さらに０．２ミクロンのフイルターでろ過したのち、ゲルろ過カラムクロマトグラフイーを行った。ゲルろ過カラムクロマトグラフイーで得られた画分から所望の画分を選択してまとめ、さらに濃縮キットにより約5mL まで濃縮した。以上の方法により得られた総蛋白量は約５０ｍｇ であった。
【００３８】
ゲルろ過後の濃縮されたサンプルに対して、クロストリペインを加えることによって活性化処理を行った。活性化処理の条件は、リフオールデイング後のサンプル１ｍｇ に対してクロストリペインを１ユニット（４mL）加えることとし、３７℃で１００分間反応を行った。
【００３９】
次に活性化処理後のベータセクレターゼ（活性化型）を陰イオン交換カラムクロマトグラフイーによりさらに精製を行った。活性化型ベータセクレターゼを陰イオン交換カラムに通液し、洗浄後、１００−５００ｍＭのＮａＣｌ濃度のバッフアをリニアーグラージェントで溶出させ、１００−３００ｍＭのＮａＣｌ濃度範囲の溶出画分を回収した。これらの溶出画分約３０ｍＬをまとめて、さらに濃縮キットで約２ｍＬ まで濃縮した。
【００４０】
濃縮された陰イオン交換カラムクロマトグラフイーの溶出画分は、さらにゲルろ過カラムクロマトグラフイーによって精製を行った。ゲルろ過カラムクロマトグラフイー後のピーク部の画分をまとめて回収し、最終のバッフア組成である５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＤＴＴのバッフアで透析し、さらにその後、約５ｍｇ／ｍＬまで濃縮キットで濃縮することで活性化型ベータセクレターゼ蛋白質を得た。
【実施例２】
【００４１】
ベータセクレターゼの酵素活性阻害物質を含有する予防薬の作製
ＡＤの予防薬として以下の組成から成るカプセルを作製した。カプセル１個あたり、クルクミン-Ａを１０ｍｇ、エイコサペンタエン酸を５０ｍｇ，ドコサヘキサン酸を５０ｍｇ，ビタミンＥを１００ｍｇ の比率で配合させた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
以上説明したとおり本発明の物資は、Ａbの産生を引き起こす原因となる酵素であるベータセクレターゼの活性を効果的に阻害するものであり、予防薬として有効な成分であることが明かとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明で用いられた酵素阻害活性測定用ベータセクレターゼ の精製結果を示した１２．５％アガロースゲル電気泳動の写真。
【図２】本発明で用いられるベータセクレターゼの酵素活性の測定結果を示す図 。
【図３】ベータセクレターゼに対するクルクミン-AＡの酵素阻害活性の評価結果を示す図 。
【図１】
2010116322.tif 000010
【図２】
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【図３】
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