(57)【要約】【課題】簡便に、短時間でかつ廉価にシミ改善効果および美白効果を有する有効成分をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】メラノサイトの増殖および／または活性化を抑制してシミ改善効果または美白効果を有する有効成分のスクリーニング方法であって、メラノサイトを被験成分と接触させ、メラノサイトのチロシナーゼ活性および細胞活性を測定する工程を含み、前記メラノサイトに複数のメラノサイト活性化因子を添加してメラノサイトを刺激を与え増殖および／または活性化を促進する、スクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノサイトの増殖および／または活性化を抑制することによりシミ改善効果及び／または美白効果を発揮する有効成分のスクリーニング方法であって、メラノサイトを被験成分と接触させ、メラノサイトのチロシナーゼ活性および細胞活性を測定し、チロシナーゼ活性を減少させる被験成分を前記有効成分として選定する工程を含み、前記メラノサイトに複数のメラノサイト活性化因子を添加してメラノサイトに刺激を与え増殖および／または活性化を促進する、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記メラノサイト活性化因子がエンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）からなる群から選ばれる、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
各メラノサイト活性化因子の添加量が１０×１０-6ｍｏｌ／ｍ3以下である、請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記メラノサイト活性化因子を少なくとも３種以上用いる、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記メラノサイト活性化因子を少なくとも５種以上用いる、請求項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記メラノサイトにケラチノサイトを共存させる、請求項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シミ改善効果及び／または美白効果を発揮する有効成分のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
局所的なメラノサイトの増殖および／または活性化の亢進によるメラニン色素の生成や局所的な沈着によって、ヒト等の脊椎動物の皮膚が黒化したり、いわゆるシミが皮膚に生じる。このメラノサイトの増殖、活性化に関わる因子（以下、「メラノサイト活性化因子」という）については多くの研究がなされている。例えば、エンドセリン−１（以下「ＥＴ−１」ともいう）、幹細胞増殖因子（以下「ＳＣＦ」ともいう）、メラノサイト刺激ホルモン（以下「α−ＭＳＨ」ともいう）、ヒスタミン、プロスタグランジンＥ2（以下「ＰＧＥ2」ともいう）などのメラノサイト活性化因子が知られている。
【０００３】
これら因子はメラノサイトの細胞膜表面に存在する受容体に結合し、細胞内の情報伝達経路を活性化し、メラノサイトの増殖および／または活性化を誘導する。例えば、ＥＴ−１はプロテインカイネース経路を活性化し、ＳＣＦはチロシンカイネース経路を活性化し、α−ＭＳＨ、ヒスタミンおよびＰＧＥ2はアデニルサイクラーゼ経路を活性化することが知られている。
【０００４】
従来より、シミ改善効果または美白効果を謳う様々な化粧料が使用されている。このような化粧料にはメラノサイトの増殖および／または活性化を抑制する有効成分が含まれている。このメラノサイトの増殖および／または活性化を抑制する有効成分の探索のために、増殖および／または活性化したメラノサイトに対する抑制作用を有する素材のスクリーニング方法が開発されている（例えば、特許文献１〜６参照）。
【特許文献１】特開２００７−２０９２０８号公報
【特許文献２】特開２００６−５６９０２号公報
【特許文献３】特開２００４−１９１１０６号公報
【特許文献４】特開２００３−１９４８０９号公報
【特許文献５】特開２００１−５６３３１号公報
【特許文献６】特開平７−１６７８６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
皮膚の黒化およびシミの発生のメカニズムに関して、前記情報伝達経路がそれぞれ単独で皮膚を黒化させたりシミを発生させるのではなく、それぞれの情報伝達経路が互いに関連しあってメラノサイトの増殖および／または活性化を制御することで皮膚が黒化したりシミが発生する。言い換えると、実際のメラノサイトは、メラノサイトの増殖、活性化に関わる複数のメラノサイト活性化因子により活性化され、細胞内の複数の情報伝達経路が互いに作用し合ってシミが発生したり、肌が黒化すると考えられる。
【０００６】
前記特許文献に記載のスクリーニング方法では、１種類のメラノサイト活性化因子をメラノサイトと共存させ、活性化したメラノサイトに対する抑制作用を有する素材を探索するものである。したがって、複数のメラノサイト活性化因子が関係する実際のメラノサイトとはかけ離れた系でのスクリーニング方法と言わざるを得ない。また、これらのメラノサイト活性化因子に対する有効素材のスクリーニングを各因子に対して別個に行うと、多大な時間とコストを要する。
【０００７】
本発明は、簡便に、短時間でかつ廉価にシミ改善効果および／または美白効果を発揮する有効成分をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、メラノサイトの増殖、活性化に関わるメラノサイト活性化因子の複数を組み合わせて用いることにより非常に低濃度で安定的にメラノサイトが活性化することを見出した。また、複数のメラノサイト活性化因子で刺激したメラノサイトに対して、各種メラノサイト活性化因子の阻害剤単独を作用させても有効素材として評価可能であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００９】
本発明は、メラノサイトの増殖および／または活性化を抑制することによりシミ改善効果及び／または美白効果を発揮する有効成分のスクリーニング方法であって、メラノサイトを被験成分と接触させ、メラノサイトのチロシナーゼ活性および細胞活性を測定し、チロシナーゼ活性を減少させる被験成分を前記有効成分として選定する工程を含み、前記メラノサイトに複数のメラノサイト活性化因子を添加してメラノサイトに刺激を与え増殖および／または活性化を促進する、スクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、簡便に、短時間でかつ廉価にシミ改善効果および／または美白効果を発揮する有効成分をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のスクリーニング方法は、メラノサイトの増殖および／または活性化を抑制することによりシミ改善効果および／または美白効果を発揮する有効成分のスクリーニング方法であって、メラノサイトを被験成分と接触させ、メラノサイトのチロシナーゼ活性および細胞活性を測定し、チロシナーゼ活性を減少させる被験成分を前記有効成分として選定する工程を含み、前記メラノサイトに複数のメラノサイト活性化因子を添加してメラノサイトに刺激を与え増殖および／または活性化を促進することを特徴とする。メラノサイトに複数のメラノサイト活性化因子を添加することで、実際のシミ部位のメラノサイトと類似な状態を再現することができる。
【００１２】
本発明における「メラノサイト」とは、メラニンを産出する色素細胞である。哺乳類において、メラノサイトは表皮基底層および毛根に多く存在し、真皮、消化管などの上皮にも少数存在する。本発明に用いることができるメラノサイトは特に制限はないが、ヒト、マウスなどの哺乳類由来のメラノサイトであることが好ましい。
【００１３】
本発明における「シミ改善効果」とは、慢性的なシミの色調を薄くしたり、大きさを小さくすることにより目立たなくすることをいう。また、「美白効果」とは、日焼け等によるシミを防ぐ作用のことをいい、具体的には例えば、紫外線を肌に照射すること等によるメラニン色素の沈着を抑制する作用などを指す。これらは、活性化されたメラノサイトに対するチロシナーゼ活性の低下作用、またはメラニン生成量の低下作用も含まれる。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法において、チロシナーゼ活性および細胞活性を測定する。これらチロシナーゼ活性および細胞活性と、シミ改善効果及び美白効果の関連性について説明する。
複数のメラノサイト活性化因子を添加することにより、メラノサイトのチロシナーゼ活性の上昇と、細胞増殖による細胞数の増加が起こる。被験物質を添加してチロシナーゼ活性および細胞増殖が抑制された場合、当該被験物質をシミ改善効果を発揮する有効成分としてスクリーニングすることができる。また、メラノサイト活性化因子を添加せずに培養したメラノサイトと比較して細胞活性が低下した場合、当該被験物質は細胞毒性として作用したと判断することができる。
さらに、紫外線による色素沈着の形成にも、メラノサイト活性化因子が関与している。したがって、チロシナーゼ活性および細胞増殖が抑制された場合、美白効果を発揮する有効成分としてもスクリーニングすることができる。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法において、メラノサイトを複数のメラノサイト活性化因子で刺激し、メラノサイトの増殖および／または活性化を促進する。本発明に用いられるメラノサイト活性化因子としては特に制限はないが、ＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、ヒスタミンおよびＰＧＥ2であることが好ましい。
また、本発明において、好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも５種のメラノサイト活性化因子を用いてメラノサイトを刺激する。さらに、ＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、ヒスタミンおよびＰＧＥ2の各１種でメラノサイトを刺激するのが好ましい。
【００１６】
本発明に用いられるメラノサイト活性化因子は通常の方法により調製することができる。また、市販のものを用いることもできる。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法におけるメラノサイトの刺激は、メラノサイトに被験細胞を接触させる前、同時、または後のいずれであってもよい。
【００１８】
メラノサイトに添加する複数のメラノサイト活性化因子の添加量について特に制限はないが、反応系における終濃度がそれぞれ１０×１０-6ｍｏｌ／ｍ3以下が好ましく、１０×１０-9〜１０×１０-6ｍｏｌ／ｍ3がより好ましく、１０×１０-8〜１０×１０-7ｍｏｌ／ｍ3がさらに好ましい。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法は以下のように実施することができる。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００２０】
（メラノサイトの採取、培養）
本発明に用いるメラノサイトとして、メラノサイトを含む表皮細胞を生体から通常の方法で採取することができる。採取した、メラノサイトを含む表皮細胞を適当な培地を用いて培養する。あるいは、市販されているメラノサイトを用いることもできる。培養条件に特に制限はないが、３５〜３９℃で２４〜１８０時間培養することが好ましい。
【００２１】
（メラノサイトの活性化）
メラノサイトに、ＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、ヒスタミンおよびＰＧＥ2等から選ばれる、複数のメラノサイト活性化因子を添加し刺激を与え、メラノサイトの増殖および／または活性化を促進する。メラノサイト活性化因子の好ましい添加量は前述の通りである。
【００２２】
（被験成分の添加）
メラノサイトを含む培地に被験成分（メラノサイト活性化因子阻害剤）を添加する。被験成分の添加量に特に制限はないが、培地における終濃度で１０×１０-7〜１０×１０-3ｍｏｌ／ｍ3または０．０００１〜１質量％が好ましく、１０×１０-7〜１０×１０-4ｍｏｌ／ｍ3または０．００１〜０．５質量％がより好ましい。
本発明のスクリーニング方法に用いることのできる被検物質としては、特に制限はなく、低分子化合物、天然有機化合物、各種ペプチド等を挙げることができる。また、植物、動物または海洋生物由来の天然成分または抽出物を被験物質として用いることもできる。
【００２３】
（メラノサイトのインキュベーション）
その後、培地交換を行いながら、メラノサイトを適当な条件でインキュベーションする。インキュベーション条件に特に制限はないが、３５〜３９℃で２４〜１８０時間培養することが好ましい。
【００２４】
（チロシナーゼ活性および細胞活性の測定）
培養後、メラノサイトのチロシナーゼ活性および細胞活性を測定する。その結果、チロシナーゼ活性を減少させる被験成分をシミ改善効果および美白効果を有する有効成分として選定することができる。
【００２５】
本発明における「細胞活性」とは細胞増殖活性や呼吸活性を意味する。細胞活性の測定方法については特に制限はなく、通常の方法により測定することができるが、alamar  Blue法、ＷＳＴ法、ＭＴＴ法またはＢｒｄＵ法により測定することが好ましく、具体的には以下のように測定することがより好ましい。
メラノサイトを培養後、各測定方法のプロトコルに従い試薬類を添加後、所定の時間培養を行う。その後所定の測定方法、測定機器により細胞活性、細胞増殖能を測定する。
【００２６】
また、「チロシナーゼ」とは、チロシンを酸化してメラニンを生ずる酵素である。チロシナーゼ活性の測定方法については特に制限はなく、通常の方法により測定することができるが、メラニン定量法、チロシナーゼ活性測定法またはドーパオキシターゼ活性測定法により測定することが好ましく、具体的には以下のように測定することがより好ましい。
メラノサイトを培養後、各測定方法のプロトコルに従い、試薬類を添加後、所定の時間培養を行う。その後所定の測定方法、測定機器によりメラニン量、チロシナーゼ活性、ドーパオキシターゼ活性を測定する。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法においては、ケラチノサイトをメラノサイトと共存させることができる。さらには、ケラチノサイトとメラノサイト共培養して得られる皮膚モデルなどを用いることができる。
「ケラチノサイト」とは、外界に直接暴露する上皮組織の上皮細胞のうち、角質化能力を持つ細胞をいう。本発明に用いることができるケラチノサイトは特に制限はないが、ヒト、マウスなどの哺乳類由来のケラチノサイトであることが好ましい。本発明に用いることができるケラチノサイトは通常の方法により調製することができる。また、市販のものを用いることもできる。
【００２８】
本発明のスクリーニング方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことが好ましいが、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することもできる。
【００２９】
また、本発明のスクリーニング方法で選定された有効成分を外用剤組成物に用いることが出来る。
その際、外用剤組成物における前記有効成分の含有量は特に制限はないが、組成物の
０．０００１〜１０質量％であることが好ましく、０．００１〜５質量％であることがより好ましい。
【００３０】
また、本発明のスクリーニング方法で選定された有効成分を含む外用剤組成物は、その使用形態において薬用皮膚外用剤と化粧料に大別することができるが、特にシミ改善用化粧料、美白用化粧料などの皮膚化粧料として用いるのが好ましい。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法で選定された有効成分を含む外用剤組成物を皮膚化粧料として使用する場合は、複数のメラノサイト活性化因子により刺激されたメラノサイトの、増殖および／または活性化を抑制する有効成分の他に、化粧料成分として一般に使用されている成分（油分、界面活性剤、保湿剤、しわ改善剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等）を任意に組合せて含有させることができる。
皮膚化粧料の形態としては、種々の形態、例えば油中水型又は水中油型の乳化化粧料、クリーム、化粧乳液、化粧水、油性化粧料、口紅、ファンデーション、入浴剤、皮膚洗浄剤、爪手入れ剤等が挙げられる。
【００３２】
薬用皮膚外用剤としては、例えば各種軟膏剤を挙げることができる。軟膏剤としては、油性基剤をベースとするもの、水中油型又は油中水型の乳化系基剤をベースとするもののいずれであってもよい。油性基剤としては、例えば植物油、動物油、合成油、脂肪酸及び天然又は合成のグリセライド等が挙げられる。薬用皮膚外用剤には、複数のメラノサイト活性化因子により刺激されたメラノサイトの、増殖および／または活性化を抑制する有効成分の他に、例えば鎮痛消炎剤、鎮痒剤、殺菌消毒剤、収斂剤、皮膚軟化剤、ホルモン剤等を必要に応じて使用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
（試験例１）
９６穴プレートにヒト表皮由来メラノサイトの分散液１００μｌを５×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human  Melanocyte  Growth  Supplement）（いずれもＣａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  社）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、表１に示すように、各種メラノサイト活性化因子ＥＴ−１（Ｓｉｇｍａ社製）、ＳＣＦ（Ｓｉｇｍａ社製）、α−ＭＳＨ（Ｓｉｇｍａ社製）、ヒスタミン（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＧＥ2（Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。最終的に、培地量は２００μｌ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。３日後に培地１００μｌを除去後、新たな培地（前記活性化因子含有）１００μｌを添加し、更に４日間培養した。
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）  ３ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液）          ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清）                ０．５体積％
ハイドロコーチゾン                    ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン                            ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン                      ５μｇ／ｍｌ
ヘパリン                              ５μｇ／ｍｌ
【００３５】
【表１】
2010081913.tif 000002
【００３６】
培養終了後、メラノサイトをＣａ２＋およびＭｇ２＋を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を２０μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、０℃、３時間で細胞を可溶化し、チロシナーゼ抽出溶液として酵素活性測定（ドーパオキシターゼ活性測定）に用いた。
【００３７】
ドーパオキシターゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Ｗｉｎｄｅｒ  Ａ．Ｊ．，Ｈａｒｒｉｓ  Ｈ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８，３１７−３２６，１９９１参照）を参考に、以下のように行った。
可溶化した細胞溶液（前記チロシナーゼ抽出溶液）の各ｗｅｌｌに、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン  ヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ  Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μｌ、それぞれ加え、３７℃３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。その結果を図１に示す。
【００３８】
その結果、複数のメラノサイト活性化因子を組み合わせて添加することにより、ドーパオキシターゼ活性が増加することを確認した。中でもＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、ヒスタミン、ＰＧＥ2すべてを添加した場合が、最もドーパオキシターゼ活性が増加することを確認した。
【００３９】
更に、ＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、ヒスタミン、ＰＧＥ2すべてをそれぞれ１０×１０-7mol/m3添加した場合でも、１０×１０-6mol/m3添加した場合と同等のドーパオキシターゼ活性が認められた。このことから、それぞれの因子が１０×１０-7mol/m3という低濃度でも、５種添加することにより高いドーパオキシターゼ活性が認められることを確認した。
【００４０】
これらのことから、シミ関連メラノサイト活性化因子を、複数作用させることにより、より実際のメラノサイトに近い系でシミ改善作用を有する素材をスクリーニング可能な方法を確立した。また、メラノサイト活性化因子を低濃度添加した場合であっても、実際のメラノサイトに近い系を再現することができることがわかった。
【００４１】
なお、「ドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）」とは、メラニン生合成の過程に生成する物質であり、メラニン合成の出発物質チロシンを酵素チロシナーゼが酸化しドーパが生成する。
シミ部位において、ＥＴ−１およびＳＣＦ等のメラノサイト活性化因子が正常部位よりも高い濃度で発現していることが報告されている（Kadono  S，et  al．，J．Invest．Dermatol．，2001，116，pp．571-577；Hattori  H，et  al.，J．Invest．Dermatol.，2004，125，pp．1256-1265等参照）。メラノサイト活性化因子が共存すると、メラノサイトが活性化され、ドーパオキシターゼ活性の上昇およびメラノサイトの増殖が起こり、色素が沈着しシミが形成される。したがって、高いドーパオキシターゼ活性を有する評価系が、実際のシミ部位のメラノサイトに近い系を再現していることを意味する。
【００４２】
（試験例２）
皮膚のモデルとして、メラノサイトおよびケラチノサイトを含むＭＥＬ−３００（クラボウ社製）のＡｓｉａｎ  ｄｏｎｏｒを用いた。培地はＥＰＩ−１００ＭＭ（クラボウ社製）を用い各種メラノサイト活性化因子を表２に示す濃度となるように添加して培養を行った。メラノサイト活性化因子５μＭを含むストック溶液を終濃度が１０×１０-7ｍｏｌ／ｍ3〜１０×１０-5ｍｏｌ／ｍ3となるようにＥＰＩ−１００ＭＭに添加し、以下の条件で培養した。
【００４３】
【表２】
2010081913.tif 000003
【００４４】
上記で調製したメラノサイト活性化因子入り培地５ｍＬを６穴プレートに添加し、２枚重ねたステンレスワッシャー上に皮膚モデルを下面に気泡が入らないように設置し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地交換は２〜３日ごとに３回行った。培地交換は、ｗｅｌｌ内の培地を吸引除去し、新たに調製したメラノサイト活性化因子を所定量含む培地を５ｍＬ添加後、上記の培養条件で培養を継続した。
１３日間培養終了後、培地を吸引除去し、培地で１０倍希釈したＡｌａｍａｒＢｌｕｅ溶液２ｍｌで皮膚モデルを２〜３時間培養し、培地２００μｌを９６穴プレートに移し蛍光強度（励起波長；５４４ｎｍ、蛍光波長；５９０ｎｍ）を測定した（結果は図示せず）。
ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ測定後、皮膚モデルをＰＢＳ（−）にて十分洗浄後、写真撮影を行った。その結果を図２に示す。皮膚組織をエッペンドルフチューブに移し、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄（以降、洗浄液の除去には、遠心分離後組織を沈降させ、洗浄液を除去）した。続いて、氷冷５％トリクロロ酢酸で３回洗浄、エタノール：ジエチルエーテル（３：１）で２回洗浄、ジエチルエーテルで１回洗浄した後に５０℃で２時間乾燥させた。２Ｎ水酸化ナトリウムを２００μＬ添加し、１００℃で１０分放置して組織を溶解した。室温に放冷後、溶液を９６穴プレートに１００μｌ移し、マイクロプレートリーダーにて吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。メラニン量は市販の合成メラニンで作成した検量線にて算出した（１ｍｇ／ｍｌのメラニン含有２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を２倍希釈を繰り返し７点作成した）。その結果を図３に示す。なお、図３に示す結果は、吸光度の値で示した。
図２および図３に示すように、ＥＴ−１またはα−ＭＳＨのみを１０×１０-7〜１０×１０-5ｍｏｌ/ｍ3添加した試料１−２、１−４、２−１、２−２、２−５および２−６にいては、明らかな黒化は見られなかった。ＳＣＦは１０×１０-5ｍｏｌ/ｍ3添加で、黒化が確認できた（試料２−４）。ＥＴ−１、ＳＣＦおよびα−ＭＳＨ（１０×１０-6ｍｏｌ/ｍ3）の組み合わせを検討した結果、ＥＴ−１とＳＣＦの組み合わせのみで極めて強く黒化することを確認した（試料１−５）。さらに、ＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨすべて添加した場合、更に黒化が増すことを確認した（試料１−８および試料２−８）。
【００４５】
さらに、図３に示すように、メラニン量においても前述と同様な結果であることを確認した。
また、試料１−５と試料２−７との比較から、ＥＴ−１とＳＣＦを組み合わせた場合、それぞれ１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3という低濃度において、それぞれ１０×１０-6ｍｏｌ/ｍ3と同程度の黒化度とメラニン量を示すことを確認した。さらに、試料１−８と試料２−８との比較から、ＥＴ−１とＳＣＦとα−ＭＳＨを１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3で組み合わせた場合より強い黒化度とメラニン量の増加を確認した。
以上の結果から、メラノサイトおよびケラチノサイトを含む皮膚モデルを用いた系では、より皮膚に近い状態が再現できる。前述のように、メラノサイト活性化因子の１種のみを用いた場合、１０-5ｍｏｌ／ｍ3という、生体内での発現量とはかけ離れた量の濃度で加えても、黒化が明確でないことは非常に驚くべき結果である。これは、単独のメラノサイト活性化因子による活性化では目視でわかるほどの黒化は起こらす、目に見える実際のシミの状態とは大きく異なることを示唆している。一方、ＥＴ−１およびＳＣＦを組み合わせて用いた場合、極めて強い黒化を示していた。これは、実際のシミにおいても、複数のメラノサイト活性化因子の相乗効果で、明確な黒化を引き起していることを示唆している。
さらに、ＥＴ−１、ＳＣＦにα−ＭＳＨを加えることにより更に黒化が促進されることから、よりシミに近い状態を再現しているものと考えられる。また、メラノサイト活性化因子の濃度をそれぞれ１０×１０-5ｍｏｌ／ｍ3に設定しても黒化が促進されていたことから、生体内ではもっと少ない量でより多種の因子が関与している可能性も示唆される。
【００４６】
（実施例）
９６穴プレートにヒト表皮細胞由来のメラノサイト１００μｌを５×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human  Melanocyte  Growth  Supplement）（いずれもＣａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、各種メラノサイト活性化因子ＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、ヒスタミン、ＰＧＥ2を、それぞれ培地中終濃度で１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3になるように添加した。
【００４７】
また、表３に示すように、各種被験成分を添加した。最終的に培地量は２００μｌ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。３日後に培地１００μｌを除去後、新たな培地（メラノサイト活性化因子および被験成分含有）１００μｌを添加し、更に４日間培養した。
【００４８】
【表３】
2010081913.tif 000004
【００４９】
培養終了後、メラノサイトをＣａ２＋およびＭｇ２＋を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を２０μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、０℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシターゼ活性の測定を行った。ドーパオキシターゼ活性の測定は、試験例１と同様に行った。
【００５０】
ＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、ヒスタミン、ＰＧＥ2すべてを１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3添加して培養したヒトメラノサイトに対する各種被験成分の影響を示した結果を図４に示す。
被験成分を添加しなかった比較例に対し、ＥＴ−１作用抑制効果が知られているカミツレエキス、ＳＣＦ作用抑制効果が知られているキキョウエキス、α−ＭＳＨ作用抑制効果が知られているクジンエキス、ヒスタミン作用抑制効果が知られているシラカバエキス、およびチロシナーゼ阻害作用が知られているアスコルビン酸２−グルコシドまたはアルブチンを添加した実施例１〜６において、吸光度が減少しており、いずれについてもドーパオキシターゼ活性抑制効果が認められた。
この結果から、本発明のスクリーニング方法により、それぞれ単独のメラノサイト活性化因子に対する抑制剤だけではなく、プロテインカイネース経路、チロシンカイネース経路およびアデニルサイクラーゼ経路など、シミの発生に関わる様々な情報伝達経路を総合的に抑制する素材も検出可能であった。このことより、本発明のスクリーニング方法によれば、シミの発生のメカニズムに作用する素材を網羅的にスクリーニングできることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】試験例１の結果を示すグラフである。
【図２】試験例２の結果を示す図面代用写真である。
【図３】試験例２の結果を示すグラフである。
【図４】実施例の結果を示すグラフである。
【図１】
2010081913.tif 000005
【図２】
2010081913.tif 000006
【図３】
2010081913.tif 000007
【図４】
2010081913.tif 000008