(57)【要約】【課題】セルロース系、リグノセルロース系バイオマス資源の糖化液を発酵してエタノールを生産できるグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌を創製し、バイオエタノールの省エネルギー型高効率転換プロセスを構築する。【解決手段】エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のホスホマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子を相同組換え法によるダブルクロスオーバーによって染色体上のレバンスクラーゼ遺伝子内に組み込み、かつ、エシェリヒア・コリ由来のキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターに結合させてなる組換えＤＮＡを導入してなるザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、および当該ザイモモナス・モビリスを固定化した系でセルロース系バイオマス資源の糖化液を連続的に発酵させるエタノールの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のホスホマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子を相同組換え法によるダブルクロスオーバーによって染色体上のレバンスクラーゼ遺伝子内に組み込み、かつ、エシェリヒア・コリ由来のキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターに結合させてなる組換えＤＮＡを導入したザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）であるグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌。
【請求項２】
レバンスクラーゼ高産生株を宿主株とする請求項１記載の発酵性菌。
【請求項３】
宿主株がザイモモナス・モビリス  ZMcs（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４１）である請求項２記載の発酵性菌。
【請求項４】
ザイモモナス・モビリス  ZM mx42（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４２）である請求項３記載の発酵性菌。
【請求項５】
セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマス資源の糖化液を、固定化担体に固定化した請求項１記載のグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌と接触させて発酵させ、得られる発酵液からエタノールを回収することを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項６】
発酵性菌が、ザイモモナス・モビリス  ZM mx42（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４２）である請求項５記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
バイオマス資源が木質系バイオマス資源である請求項５記載のエタノールの製造方法。
【請求項８】
固定化した発酵性菌を充填したリアクターに、糖化液を連続的に導入して発酵性菌と接触させ、発酵液を連続的に収集し、エタノールを回収する請求項５記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌およびそれを用いるセルロース系やリグノセルロース系バイオマスからのバイオエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国において、森林間伐材、建築廃材、稲藁・籾殻、および古紙・廃紙などの未利用バイオマス資源、すなわちセルロース系産業（一般）廃棄物の排出量は年間５千万トンにも達している。これらバイオマスのエネルギー源としての利用は、地球規模でのＣＯ２バランスを崩さないことから「カーボンニュートラル」とされ、温室効果ガス削減に貢献するエネルギー資源として大いに期待されている。このような事情の下、未利用のセルロース系やリグノセルロース系バイオマス資源からバイオ燃料としてエタノールを製造し、製造したバイオエタノールをガソリン添加用含酸素化合物や化成品合成原料として、さらには地域の熱源および電力源として利用することが提案、研究されている。
しかし、セルロース系やリグノセルロース系バイオマス資源を直接分解・発酵してエタノールを生産する発酵菌は自然界に存在しない。そのために、代謝工学（メタボリック・エンジニアリング）技術と細胞表層提示技術を用いてセルロースおよびヘミセルロースの酸処理糖化液に混在するセルロース部分分解物（セロオリゴ糖）、キシロース、マンノースを同時にエタノールに発酵転換できる発酵菌を創製するとともに、育種発酵菌を触媒素子とした連続発酵装置を組み込んだ革新的な省エネルギー型高効率転換プロセスの構築が期待されている。
本発明者らは、先に、ペントースを資化することができないザイモバクター（Zymobactor）属の微生物に、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼから選ばれる少なくとも１種の酵素をコードする外来遺伝子を導入することにより、ペントースからエタノールを生産できる形質転換微生物の創製に成功した（特許文献１）。また、マンノースを含有する原料からのエタノールの効率的な生産のために、ホスホマンノースイソメラーゼをコードする外来遺伝子をザイモモナス（Zymomonas）属細菌の染色体に組み込み、安定したマンノース発酵性を付与した組換え微生物の創製にも成功した（特許文献２）。
【特許文献１】特開２００５−２６１４２１号公報
【特許文献２】特開２００７−１４３０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、草本系はもとより、特に木質系のセルロース系、リグノセルロース系バイオマス資源からの糖化液中に存在するセロオリゴ糖、キシロース、マンノースを同時にエタノールに発酵転換してエタノールを生産できるグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌を創製し、実用に適したバイオエタノールの革新的な省エネルギー型高効率転換プロセスの構築を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ザイモモナス属の細菌は、テキーラの醸造菌として知られており、伝統的な醸造用酵母と比較してエタノール発酵速度と生産性が３倍〜５倍も優れており、単位菌体当たりのエタノール生産性も酵母に比べて優れている。しかしながら、ザイモモナス属の細菌は、セルロース系やリグノセルロース系バイオマス資源の糖化液中に存在するマルトースやキシロースをエタノールに発酵することはできない。
本発明者らは、ザイモモナス属の優れたエタノール生産性に着目し、上記の本発明者らの特許文献１および２に記載の技術を応用することによって、グルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌を創製することができ、上記目的が達成できると考え、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のホスホマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子を相同組換え法によるダブルクロスオーバーによって染色体上のレバンスクラーゼ遺伝子内に組み込み、かつ、エシェリヒア・コリ由来のキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターに結合させてなる組換えＤＮＡを導入したザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）であるグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌、
（２）レバンスクラーゼ高産生株を宿主株とする上記（１）記載の発酵性菌、
（３）宿主株がザイモモナス・モビリス  ZMcs（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４１）である上記（２）記載の発酵性菌、
（４）ザイモモナス・モビリス  ZM mx42（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４２）である上記（３）記載の発酵性菌、
（５）セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマス資源の糖化液を、固定化担体に固定化した請求項１記載のグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌と接触させて発酵させ、得られる発酵液からエタノールを回収することを特徴とするエタノールの製造方法、
（６）発酵性菌が、ザイモモナス・モビリス  ZM mx42（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４２）である上記（５）記載のエタノールの製造方法、
（７）バイオマス資源が木質系バイオマス資源である上記（５）記載のエタノールの製造方法、
（８）固定化した発酵性菌を充填したリアクターに、糖化液を連続的に導入して発酵性菌と接触させ、発酵液を連続的に収集し、エタノールを回収する上記（５）記載のエタノールの製造方法等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
木質系および草本系のバイオマス資源の酸処理糖化液からの効率のよいエタノール生産においては、糖化液中に混在するセルロースやヘミセルロースに由来する、グルコース、マンノース、キシロースの並行発酵性の付与が重要であるが、ザイモモナス・モビリスは、強力なグルコース発酵性を示すものの、マンノースやキシロースの発酵性を示さない。
【０００７】
マンノース発酵性について、ザイモモナス・モビリスは、マンノースの代謝に不可欠なマンノースキナーゼとホスホマンノースイソメラーゼ、特にホスホマンノースイソメラーゼの発現が不十分であるので、本発明に従って、エシェリヒア・コリ由来のホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（manA）を導入して発現させることにより、マンノース発酵性を付与でき、染色体への組み込みにより安定なマンノース発酵性が付与できる。また、細菌におけるキシロース代謝には、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼと、ペントースリン酸経路の主要酵素であるトランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼの４つの酵素が必要であるが、ザイモモナス・モビリスはキシロースイソメラーゼとキシルロキナーゼを欠損しており、キシロースを利用できない。そこで、本発明に従って、エシェリヒア・コリ由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子(xylA)、キシルロースキナーゼ遺伝子(xylB)、トランスアルドラーゼ遺伝子(tal)、トランスケトラーゼ遺伝子(tktA)を導入することで、ザイモモナス・モビリスにキシロース発酵性を付与することができる。かくして、manA遺伝子とキシロース代謝酵素系遺伝子の導入により、ザイモモナス・モビリスにグルコース・キシロース・マンノースの３種の糖質の発酵性を付与することができる。
【０００８】
このようにして創製されたグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌を固定化担体上に固定化し、バイオエタノール連続製造リアクターを構成し、バイオマス資源の糖化液を連続的にリアクターに導入し、発酵性菌と接触させることにより、効率よくエタノール発酵が行なえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
宿主株
本発明に従ってマンノース発酵性を付与するザイモモナス・モビリス宿主としては、通常、エタノール生産に使用されるザイモモナス・モビリスでよいが、キシロース発酵性を高める点で、後に述べる、野性型株よりもレバンスクラーゼを大量に生産する自然突然変異により生じたレバンスクラーゼ高生産株が好ましい。
【００１０】
マンノース発酵性付与
マンノース発酵性付与のために使用するホスホマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子（manA）は、マンノース分解能を有する供与体微生物であるエシェリヒア・コリから得ることができる。
供与体微生物のホスホマンノースイソメラーゼをコードするＤＮＡを分離、精製した後、種々の方法で切断して得られるＤＮＡ断片を調製する。さらに同様にして得られるベクターＤＮＡ断片とを、例えばＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを形成する。ＤＮＡの分離、精製、ＤＮＡ断片の調製、ＤＮＡリガーゼによる結合等は、市販のＤＮＡ抽出キットなどを用い、当該分野で公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）3rd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）に記載の方法などに従って行なうことができる。
【００１１】
染色体への組み込みは、公知の相同組換え法によるダブルクロスオーバーによって行うことができる。すなわち、ザイモモナス・モビリスの染色体上の標的遺伝子として、レバンスクラーセ遺伝子をクローニングした後、試験管内でクローン化した該染色体標的遺伝子の中にホスホマンノースイソメラーゼをコードする外来遺伝子を挿入し、この外来遺伝子の上流と下流に標的遺伝子の一部が連結されたＤＮＡを調製し、これをザイモモナス・モビリスの染色体上の標的遺伝子内に組み込む。例えば、図１に示すごとく、ザイモモナス・モビリスの染色体ＤＮＡ上には、レバンスクラーゼ遺伝子（以下Ｅ２と称する）とインベルターゼ遺伝子(以下、Ｅ３と称する)が配位しており、この二つの酵素はザイモモナス・モビリスの細胞表層に提示され、スクロースを基質としてフルクトースを遊離し、転移反応を触媒してレバンを形成する。そのＥ２部位をターゲットにして、相同組換え法を用いたダブルクロスオーバーによりホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子組み込み、Ｅ２を欠損させる。その結果、レバンを形成するフルクトースからエタノールの生産が可能となり、一方では、ベクター導入株とは違い、導入した遺伝子の安定性が増し、マーカー等の薬剤の必要性がなくなる。
【００１２】
キシロース発酵性付与のための組み換えベクター構築
キシロース分解能を有する微生物として、エシェリヒア・コリをＤＮＡ供与体として用い、それからキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードするＤＮＡを分離、精製した後、種々の方法で切断することにより、該酵素をコードするＤＮＡ断片を調製する。このＤＮＡ断片を適当なベクターＤＮＡ断片と、例えばＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、キシロースイソメラーゼ遺伝子、キシルロキナーゼ遺伝子、トランスアルドラーゼ遺伝子およびトランスケトラーゼ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを形成する。
【００１３】
供与体からのＤＮＡの分離、精製は、それ自体既知の方法、例えば、斉藤・三浦らの方法(Biochem.Biophys.Acta,Vol.72,619 〜629,1963)やその変法、さらには市販のＤＮＡ 抽出キットなどを用いる方法などにより行うことができる。
得られる供与体微生物のＤＮＡを制限酵素などにより分解し、蔗糖密度勾配法により１kbp未満のＤＮＡ断片を除いたものを、供与体ＤＮＡ断片として用いることができる。このときに用いる制限酵素は特に限定はなく、また、上記の酵素法以外にも超音波処理や物理的剪断力などを用いてＤＮＡを切断することも可能である。その際、例えば、クレノーフラグメントやＤＮＡポリメラーゼ、マングビーンヌクレアーゼなどの酵素で供与体ＤＮＡ断片の末端を処理しておくと、後のベクターＤＮＡとの結合効率が上がり好ましい。さらに、供与体微生物のＤＮＡやその断片をテンプレートとしてＰＣＲ増幅したものについても、そのままあるいは上記の処理を行うことにより供与体ＤＮＡ断片として使用することができる。
【００１４】
ベクターＤＮＡ断片としては、特に限定するものではないが、シャトルベクターpZA22等が好適に使用できる。
得られるベクターＤＮＡ断片は、上記の供与体ＤＮＡ断片との結合反応に先立ち、アルカリ性フォスファターゼ処理することができる。これにより、該断片と供与体ＤＮＡ断片との結合効率が向上する。さらに、ＰＣＲ増幅により供与体ＤＮＡ断片を調製する場合には、予め増幅断片の両末端にEcoRIなどの制限酵素部位付与プライマーを用い、その制限酵素切断したＤＮＡ断片と同じ制限酵素で切断したベクター断片を用いると、結合効率を上げることができる。供与体ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との結合反応は、公知のＤＮＡリガーゼを使用する方法等の常法を用いて行うことができ、例えば、供与体ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とをアニーリングした後、生体外で適当なＤＮＡリガーゼの作用により組換えＤＮＡを作成することができる。また、必要に応じて、アニーリングした後、宿主微生物に導入し、生体内のＤＮＡ修復能を利用して組換えＤＮＡにすることもできる。
【００１５】
グルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌の創製
キシロースイソメラーゼ遺伝子、キシルロキナーゼ遺伝子、トランスアルドラーゼ遺伝子およびトランスケトラーゼ遺伝子を含有する組換えＤＮＡベクターを、上記で得られたマンノース発酵性を付与したザイモモナス・モビリスに導入する。
組み換えＤＮＡベクターを導入する方法は、特に制限されないが、エレクトロポレーションなどの電気的刺激を利用する方法による組換えＤＮＡの導入が好適である。
組換えＤＮＡベクター導入株をキシロース平板培地上で培養し、形成したコロニーを、キシロースおよびマンノースを炭素源とした液体培地で培養し、その生育を観察し、キシロースとマンノースのいずれの炭素源においても高い生育を示した形質転換株を選択することにより、所望のグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌が得られる。
【００１６】
バイオマス資源からの糖化液の連続発酵リアクターの構築
本発明の発酵性菌は、木質系、草本系いずれのバイオマス資源の糖化液からのエタノール製造にも使用できるが、その高いエタノール生産性から、木質系バイオマス資源の糖化液からのエタノール生産に好適に使用できる。
例えば、原料となる木質を化学的あるいは物理的に処理することにより加水分解して糖化液を調製し、これを発酵原料とする。この木質糖化液には、木質の構成成分であるセルロースとヘミセルロースに由来するグルコース、キシロース、およびマンノースが混在する。
従来は、木質糖化液に対して伝統的な醸造菌として利用される酵母を用いてバイオエタノールを回分式あるいは連続式にて発酵・製造していた。この製造法では、木質糖化液中に含まれるキシロースやマンノース（約２０％）はバイオエタノールに変換できない。そのために、木質糖化液からのバイオエタノール回収はグルコース成分（約５０％）のみ限定され、バイオエタノールのコスト上昇の一要因なっていた。
本発明では、上記発酵性菌を使用し、これを固定化担体に固定化、充填したリアクターに木質糖化液を連続的に供給して、当該発酵性菌と接触させることにより高速度、且つ高回収でバイオエタノールを製造することができる。これにより、従来の方法に比較してキシロースとマンノース量に相当する約２０％のバイオエタノールの回収と低コスト化を達成することが可能となる。
【００１７】
固定化担体への固定化は、それ自体既知の方法によって行うことができ、例えば、包括法、物理的吸着法、共有結合法等が挙げられる。
担体としては、中空状、凹凸状、多孔質状等の形態で単位体積当たりの表面積が大きいもの或いは水を吸収して膨潤するものであって、流動性を持ち、容易に反応系から流出しない粒径および比重を有するものが好適であり、担体形状としては、例えば、板状体、繊維状体、円筒などの特殊形状体、スポンジ状体、粒・塊状体、立方体状などいずれでもよいが、中でも、流動性と充分な表面積を確保しやすい微小な粒状体が好ましい。担体素材としては、微生物や酵素などの担体材料として従来から用いられている各種の有機・無機材料を用いることができ、例えば、粒状活性炭、破砕活性炭、木炭、ゼオライト、雲母、砂粒等の無機材料；光硬化性樹脂、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリプロピレン、寒天、アルギン酸、カラギーナン、セルロース、デキストラン、アガロース、イオン交換樹脂等の樹脂材料；シリカゲル等の多孔質セラミックス；アンスラサイト；ケイソウ土；樹脂材料に活性炭等を混入したものなどが挙げられ、これらはそれぞれ単独でもしくは２種以上組合せて用いることができる。
【００１８】
上記固定化担体は、通常、バイオリアクター内に充填されて用いられる。発酵に用いられるバイオリアクターとしては、その形式の違いから、完全混合槽型、充填層型、膜型、流動層型、横型等のリアクターが挙げられる。このようなバイオリアクターを用いると、連続発酵が可能となり、微生物等の投入・回収が不要となるので好適である。
【００１９】
上記のアルコール発酵の際には、微生物の種々の栄養源を必要に応じて糖液中に配合することができ、例えば、窒素源として酵母エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カツオエキスなどを使用することができる。
以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（manA）の組込み
（１）エシェリヒア・コリ（E. coli)由来のホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（manA）のクローニング
公知のザイモモナス・モビリス（Zm. mobilis）由来グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子配列（J. Bacteriol. Vol.169 (12), 5653-5662, 1987）、公知のE. coli由来のmanAの塩基配列（Gene 32 (1-2), 41-48 (1984)）に基づいて設計した表１に示す合成オリゴヌクレオチドの組み合わせにより、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。
まず、Zm. mobilisの野生株(IFO13756）のクロモゾームＤＮＡ（Chr. DNA）を鋳型として１次ＰＣＲを行い、gapプロモーターを増幅させた。同様に、E. coli K12株のChr. DNAを鋳型とし、manAを増幅させた。次に、２つのＰＣＲ産物を用いてヘテロ二本鎖を形成し、２次ＰＣＲを行い、gap-manA断片を構築して、ベクターpUC118のHincIIサイトにライゲーションさせ、E. coli JM109株へ形質転換した。
挿入断片のシークエンスを行った結果、データベースに登録されているmanAの塩基配列と一致したことからpUC118-manAとした。
図２にこのクローニング操作をまとめる。
【００２１】
［表１］
manAプライマー
manA(1)（配列番号１）：CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCG
manA(2)（配列番号２）：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCAA
manA(3)（配列番号３）：TTGCACTGAGTTAATGAGTTTTTGCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG
manA(4)（配列番号４）: CGCGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACGCGCTA
【００２２】
（２）染色体組込み用ベクターpUZE2d’-manAの構築
染色体組込み用ベクターをＥ２部位をターゲットにして行った構築図を図３に示す。
ベクターpUZE2d（４．８ kb）をNdeI処理、平滑化、ついでＢＡＰP処理してＤＮＡを切出した。また、pUC118-manA（４．８ kb）からPgap-manA（１．５ kb)をBamHIとEcoRIで消化し、平滑化し、manA断片を切出した。その後ライゲーション・ハイ（Ligation high）とＴ４リガーゼを用いて4℃、16℃で一晩ライゲーションさせ、ヒート・ショック（Heat shock）法によりE. coli JM109の形質転換を行い、プラスミド抽出を行った。その抽出したプラスミドから、公知のZn. mobilisゲノムＥ２配列（Biosci. Biotech. Biochem., 59(2), 289-293 (1995) DNAのAccession number D17524 (DDBJ, EMBL))に基づいて設計した表２に示すmanA(1)およびmanA(4)プライマーを用いて１．５ kbpのmanA断片をＰＣＲにより確認した。さらに、EcoRVとKpnIで消化したところ、Ｅ２遺伝子と順方向であることを示す４．８ kbp、１．５ kbp断片であることを示す５．３ kbp断片のバンドを検出した。このとから、これをプラスミドpUZE2d’-manAとした。
【００２３】
［表２］
E2プライマー
E2(1)  （配列番号５）:ACTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGTTGAATAAAGCAGGCATTGCAGA
E2(2)  （配列番号６）:GCTCTAGATCATTATTTATTCAATAAAGACAGGGC
E2(3)  （配列番号７）:AGCAAATAATTTCTGGGATTTCCGC
E2(4)  （配列番号８）:AGGCCGCTCCGTCTGG
【００２４】
（３）Zm. mobilis染色体ＤＮＡへのmanAの組込み確認
Zm. mobilis IFO13756が自然突然変異によりレバンスクラーゼを大量に生産するようになった株（以下、ZM ms株と称する）を宿主株として選択し、高濃度のプラスミド溶液を用いたエレクトロポレーション法により形質転換を行った。次に、３回の継代培養を行い２％マンノース−ＲＭプレートに塗布した。その後３日から約２週間培養を続け、生育した大きなコロニーを任意に選び出し、２％マンノース−ＲＭ液体培地に接種した。生育した菌体懸濁液を集菌し、一度滅菌MilliQ水で洗浄後、１ｍＬの滅菌MilliＱ水に懸濁してＤＮＡ抽出用サンプルとした。その抽出液５０μＬの内１μＬからmanAプライマーmanA(1)、manA(4)およびE2プライマーE2(1)、E2(2)によるＰＣＲ増幅を行った。その結果、manAプライマーによる増幅では、manA断片（1.5 kbp）が、また、E2プライマーによる増幅では２．８ kbpにバンドが検出された。これは、Ｅ２（１．３ kbp）にmanA（１．５ kbp）を組込んだ断片の２．８ kbpに合致することから、染色体ＤＮＡ上のＥ２部位にmanAが挿入されたことが裏付けられた。
ZM ms株は、平成１９年８月１３日から、茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４１の下で寄託してある。
【実施例２】
【００２５】
キシロース並行発酵性の付与
E. coli由来のキシロース代謝系酵素遺伝子をZm. mobilisに導入するために、まず、E. coli内でベクターpUC118を用いてxylA、xylB、tal、tktAの遺伝子をクローニング後、E. coliとZm. mobilisのシャトルベクター、pZA22に挿入して組換えプラスミドpZA22-xtを構築した。次いで、manAを染色体に組み込むことによりマンノース発酵性を付与したZm. mobilisにpZA22-xtを導入して、グルコース、キシロースおよびマンノースの並行発酵性を付与した。
（１）pUC118-xylABの構築
E.coliのゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いてクローニングした。また、導入した４種の酵素遺伝子をZm. mobilis細胞内で発現させるために、Zm. mobilis細胞内で大量発現が報告されているグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素の発現を制御するプロモーター遺伝子（GAP promoter）を利用した。
E. coli由来キシロースイソメラーゼ遺伝子とキシルロキナーゼ遺伝子はＰＣＲによりクローニングした。すなわち、Zm. mobilis由来グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター遺伝子の下流にE. coli由来キシロースイソメラーゼ遺伝子とキシルロキナーゼ遺伝子をタンデムに連結し、かつ、そのＤＮＡ断片の両末端にクローニングのためのEcoRI制限酵素切断部位を付与したＤＮＡ断片を調製するために、公知のZm. mobilis由来グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素遺伝子配列（J. Bacteriol. Vol.169 (12), 5653-5662, 1987）と公知のE. coli由来キシロースイソメラーゼ遺伝子とキシルロキナーゼ遺伝子の塩基配列（Appl. Environ. Microbiol., Vol.47 (1), 15-21, 1984）に基づき、表３に示す４種のＰＣＲプライマーを設計した。
【００２６】
［表３］
XYLプライマー
XYL1  （配列番号９）：CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCG
XYL2  （配列番号１０）：TACTGGAATAAATGGTCTTCGTTATGCAAGCCTATTTTGACCAGCCTCGAT
XYL3  （配列番号１１）：ATCGACTGGTCAAAATAGGCTTGCATAACGAAGACCATTTATTCCAGTA
XYL4  （配列番号１２）: CGGAATTCATGCATAGTTGCCAAAAGTTGCTGTCA
【００２７】
一次ＰＣＲとして、Zm. mobilis菌体から調製したゲノムＤＮＡをテンプレートにプライマーXYL1とXYL3を用いて、プロモーターとキシロースイソメラーゼ遺伝子のN末部位を含む約３００bp ＤＮＡ断片を増幅した。一方、E. coliゲノムＤＮＡをテンプレートにプライマーXYL2とXYL4を用いて、プロモーター遺伝子の一部とキシロースイソメラーゼ遺伝子とキシルロキナーゼ遺伝子を含む約３．０kbp ＤＮＡ断片を増幅した。次に、プロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断片とキシロースイソメラーゼ遺伝子とキシルロキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を混合して９４℃で２０分間加熱後、３７℃で１５分間保持することによりヘテロデュープレックスを形成させた後、TaqDNAポリメラーゼ存在下、７２℃で３分間反応させた。この反応液に、プライマーXYL1とプライマーXYL4を添加して二次ＰＣＲを行い、Gapプロモーター遺伝子、キシロースイソメラーゼ遺伝子、キシルロキナーゼ遺伝子の順に連結した約３．２kbp ＤＮＡ断片を増幅させた。このDNA断片の両末端を平滑化反応後、E. coli用ベクタープラスミドＤＮＡ、pUC118のHincII制限酵素切断片と混合してT4リガーゼにより連結させて組換えプラスミドＤＮＡを作製した。作製した組換えプラスミドを用いてE. coli JM109を常法に従い形質転換した後、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド、２０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むＬＢ平板培地（１％ Bacto Tripton、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布して、コロニーを形成させた。白色コロニーを形成した形質転換株から抽出した組換えプラスミドをpUC118-xylABとした。
図４にこの操作をまとめる。
【００２８】
（２）pUC118-taltktAの構築
E. coliゲノムＤＮＡ上ではトランスアルドラーゼ遺伝子とトランスケトラーゼ遺伝子はオペロンを構成せず、お互いに離れた位置に配座している。そのため、トランスアルドラーゼとトランスケトラーゼを個々にクローニングした後に、Zm. mobilis由来GAPプロモーター制御下になるように連結した。そのため、公知のZm. mobilis由来エノラーゼ酵素遺伝子配列と公知のE. coli由来トランスアルドラーゼ遺伝子（Nucleic Acids Res., Vol.20, 3305-3308, 1992）に基づき、表４に示す４種のＰＣＲプライマーを設計した。
【００２９】
［表４］
TALプライマー
TAL1  （配列番号１３）：CGGAATTCTCGAGCTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAA
TAL2  （配列番号１４）：AAGATTTTAAGAAAGGTTTCGATATGACGGACAAATTGACCTCCCTTCGT
TAL3  （配列番号１５）：ACGAAGGGAGGTCAATTTGTCCGTCATATCGAAACCTTTCTTAAAATCTT
TAL4  （配列番号１６）：CATTTTGACTACCAGATCTAGATTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC
【００３０】
一次ＰＣＲとして、Zm. mobilis菌体から調製したゲノムＤＮＡをテンプレートにプライマーTAL1とTAL3を用いて、プロモーターとトランスアルドラーゼ遺伝子のN末部位を含み、そのプロモーター遺伝子上流末端にXhoI制限酵素切断部位を付加した約３００bp ＤＮＡ断片を増幅した。一方、E. coliゲノムＤＮＡをテンプレートにプライマーTAL2とTAL4を用いて、プロモーター遺伝子の一部とトランスアルドラーゼ遺伝子を含み、そのトランスアルドラーゼ遺伝子のＣ末端にXbaI制限酵素切断部位を付加した約１．２kbp ＤＮＡ断片を増幅した。次に、プロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断片とトランスアルドラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を混合して９４℃で２０分間加熱後、３７℃で１５分間保持することによりヘテロデュープレックスを形成させた後、TaqDNAポリメラーゼ存在下、７２℃で３分間反応させた。この反応液に、プライマーTAL1とプライマーTAL4を添加して二次ＰＣＲを行い、Enoプロモーター遺伝子とトランスアルドラーゼ遺伝子の順に連結した約１．３kbpＤＮＡ断片を増幅させた。このＤＮＡ断片の両末端を平滑化反応後、大腸菌用ベクタープラスミドＤＮＡ、pUC118のHincII制限酵素切断片と混合してT4リガーゼにより連結させて組換えプラスミドDNAを作製した。作製した組換えプラスミドを用いてE. coli JM109を常法に従い形質転換した後、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド、２０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むＬＢ平板培地（１％ Bacto Tripton、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布して、コロニーを形成させた。白色コロニーを形成した形質転換株から抽出した組換えプラスミドをpUC118-talとした。
図５にこの操作をまとめる。
【００３１】
次に、トランスケトラーゼ遺伝子のPCRによる増幅を行った。公知のトランズケトラーゼ遺伝子の塩基配列（J. Bacteriol., Vol.174, 1707-1708, 1992）に基づき、表５に示す２種のプライマーを合成した。
【００３２】
［表５］
TKTプライマー
TKT1  （配列番号１７）：CGGAATTCTCGAGCTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAA
TKT2  （配列番号１８）：CGGCATGCCTCGAGGCAAACGGACATTATCAAGGTAATAAAAAAGGTCGC
【００３３】
一次ＰＣＲとして、E. coliの菌体から調製したゲノムＤＮＡをテンプレートにプライマーTKT1とTKT2を用いて、トランスケトラーゼ遺伝子のN末端上流にXbaI制限酵素切断部位とそのC末端下流にXhoI制限酵素切断部位を付与した約２．１kbpＤＮＡ断片を増幅させた。このＤＮＡ断片の両末端を平滑化反応後、E. coli用ベクタープラスミドＤＮＡ、pUC118のHincII制限酵素切断片と混合してT4リガーゼにより連結させて組換えプラスミドＤＮＡを作製した。作製した組換えプラスミドを用いてE. coli JM109を常法に従い形質転換した後、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド、２０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むＬＢ平板培地（１％ Bacto Tripton、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布して、コロニーを形成させた。白色コロニーを形成した形質転換株から抽出した組換えプラスミドをpUC118-tktとした。
図６にこの操作をまとめる。
【００３４】
次に、GAPプロモーター遺伝子とトランスアルドラーゼ遺伝子とトランスケトラーゼ遺伝子が連結したＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを作製した。すなわち、組換えプラスミドpUC118-talを、そのトランスアルドラーゼ遺伝子のＣ末端下流域に存在するXbaI制限酵素切断部位とSphI制限酵素制限酵素切断部位により切断したＤＮＡ断片と組換えプラスミドpUC118-tktをXbaIとSphIにより切断して調製したトランスケトラーゼ遺伝子を含む約２．１kbpＤＮＡ断片を混合してT4リガーゼにより連結させて組換えプラスミドＤＮＡを作製した。作製した組換えプラスミドを用いてE. coli JM109を常法に従い形質転換した後、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ平板培地（１％ Bacto Tripton、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布して、コロニーを形成させた。コロニーを形成した形質転換株から抽出した組換えプラスミドにEnoプロモーター遺伝子、トランスアルドラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子が、この順番でタンデムに連結したことを確認して、pUC118-tal+tktとした。
図７にこの操作をまとめる。
【００３５】
（３）pZA22-xyの構築
４種のキシロース代謝系酵素遺伝子をZm. mobilisに導入して発現させるために、これら遺伝子をシャトルベクターに挿入して組換えプラスミドを作製した。組換えプラスミドpUC118-taltktをXhoI制限酵素を用いて切断することにより、Enoプロモーター遺伝子、トランスアルドラーゼ遺伝子、およびトランスケトラーゼ遺伝子含む約３．３kbpＤＮＡ断片を調製した。この断片と制限酵素SalIにより切断したシャトルベクターpZA22と混合してT4リガーゼにより連結させて組換えプラスミドを作製した。作製した組換えプラスミドを用いてE. coli JM109を常法に従い形質転換した後、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ平板培地（１％ Bacto Tripton、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布して、コロニーを形成させた。コロニーを形成した形質転換株から抽出した組換えプラスミドに、Enoプロモーター、トランスアルドラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子が、この順番で連結していることを確認した。一方、pUC118-xylAxylBをEcoRI制限酵素によりGapプロモーター遺伝子、キシロースイソメラーゼ遺伝子、およびキシルロキナーゼ遺伝子を含む約３．４kbpＤＮＡ断片を切り出し、その両切断末端を平滑化して調製した。次に、調製したＤＮＡ断片をトランスアルドラーゼ遺伝子とトランスケトラーゼ遺伝子を挿入して作製したpZA22組換えプラスミドをEcoRV制限酵素により切断したもの混合してT4リガーゼにより連結させて組換えプラスミドＤＮＡを作製した。作製した組換えプラスミドを用いてE. coli JM109を常法に従い形質転換した後、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ平板培地（１％ Bacto Tripton、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布して、コロニーを形成させた。コロニーを形成した形質転換株から抽出した組換えプラスミドに、GAPプロモーター、キシロースイソメラーゼ遺伝子、キシルロキナーゼ遺伝子、Enoプロモーター、トランスアルドラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子が、この順番で連結していることを確認して、pZA22-xtとした。
図８にこの操作をまとめる。
【００３６】
（４）Zm. mobilisへのキシロース発酵性の付与
xylABとtaltktA遺伝子をプラスミドpZA22にタンデムに挿入した組換えプラスミドpZA22-xtを用いてキシロース発酵性株の育種を検討した。
操作は組換えプラスミドpZA22-xtを用いて、Zm. mobilis IFO13756に常法に従い形質転換を行い、形質転換株をグルコース−ＲＭ平板培地（２％グルコース、１．０％酵母エキス、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、１．５％寒天、１００μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、ｐＨ６．０）に塗布して選択した。コロニーを形成した形質転換株をキシロース−ＲＭ培地（２％キシロース、１．０％酵母エキス、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、１００μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、ｐＨ６．０）に植菌して、キシロースを炭素源とした生育とエタノール発酵性を検討した。しかし、形質転換株はキシロース−ＲＭ培地において微弱な生育に留まり、エタノール発酵性を示さなかった。そこで、上記ZM msを宿主株として選択し、pZA22-xtを形質転換してZM ms[pZA22-xt]株を得た。グルコース−ＲＭ平板培地に生育したZM ms[pZA22-xt]株をキシロース−ＲＭ培地に植菌して、キシロースを炭素源とした生育とエタノール発酵性を検討した。その結果、ZM ms[pZA22-xt]株はキシロースを炭素源としての生育が認められた。
ZM ms[pZA22-xt]株の４％キシロース培地での発酵性試験を実施した。比較対象として、野生株にpZA22-xtを導入した株（ZM [pZA22-xt]）の発酵性試験を実施した。ZM ms[pZA22-xt]株では、４％キシロースを４８時間で完全に利用して、理論収率のエタノールを生産した。一方、ZM [pZA22-xt]株では、微弱な生育に伴う一部のキシロース分解は認められたが、エタノール生成は全く認められなかった（図９）。
【実施例３】
【００３７】
グルコース・マンノース・キシロース並行発酵性の付与
Zm. mobilisの染色体ＤＮＡにmanAを組み込み、マンノースとグルコースの並行発酵性の付与に成功したことから、次に、キシロースの並行発酵性付与を検討した。
（１）E. coli由来キシロース代謝系酵素遺伝子とマンノース代謝系酵素遺伝子の共存株の構築
上記実施例１で得られた、manA を染色体に組み込んだZM ms[E2:manA]のコンピテントセルを調製してpZA22-xtで形質転換を行った（図１０）。形質転換株はキシロース平板培地上でコロニー形成として選択した。次に、得られたコロニーをキシロース、マンノースを炭素源とした液体培地での生育を観察した。キシロースとマンノースのいずれの炭素源においても高い生育を示した形質転換株を発酵性試験に用いることとした。
【００３８】
（２）育種株におけるキシロース代謝系酵素遺伝子とマンノース代謝系酵素遺伝子の発現
発酵性試験用いる共存株におけるキシロース代謝系酵素遺伝子とマンノース代謝系酵素遺伝子の発現を検討した。Zm. mobilis野生株では内因性のフルクトキナーゼ活性は認められたが、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびホスホマンノースイソメラーゼの酵素活性は認められなかった。しかし、ZM ms[E2::manA]株ではホスホマンノースイソメラーゼの活性が、またZm ms [pZA22-xt]では導入したキシロース代謝系酵素遺伝子の発現指標としたキシルコキナーゼとトランスアルドラーゼの活性発現が、さらに共発現株ではキシロース代謝系酵素遺伝子とmanAの遺伝子の発現を確認するとともに、これら遺伝子の発現レベルが大腸菌に比べて高いことも確認できた。すなわち、導入した遺伝子が安定して、効率よく発現していることが明らかになった。
導入した遺伝子の発現を確認した結果を表６示す。
【００３９】
［表６］
2010158170.tif 000002
注１）XK：キシルロキナーゼ、１Ｕ＝１分間にＮＡＤＨ１μmol減少させる酵素活性
TA        ：トランスアルドラーゼ、１Ｕ＝１分間にＮＡＤＨ１μmol減少させる酵素活性
PMI：ホスホマンノースイソメラーゼ、１Ｕ＝１分間にＮＡＤＰＨ１μmol生産する酵素活性
【００４０】
（３）３種混合糖での発酵性試験（バッチ発酵条件下）
染色体にmanAを、プラスミドとしてxylA、xylB、tal、tktAを導入した育種株の発酵性を評価した。図１１ａおよび図１１ｂに示すように、２％のグルコース、キシロースまたはマンノースを単一炭素源した場合では、グルコースの発酵速度に比べて若干の低下は認められるものの、キシロースとマンノースの速やかな消費に伴う生育と理論収率のエタノール生産を示した。また、グルコース混在でのキシロースやマンノースにおいても速やかなエタノール生産性を示した。グルコース、キシロース、およびマンノース混在下での糖消費においては、グルコース消費が進行した後に、キシロース、マンノースの順に消費され、理論収率のエタノール生成が認められた。
以上のように、酸処理糖化液に含まれる主要な糖質であるグルコース、キシロース、マンノースを効率よくエタノールに変換できるZm. mobilisの育種に成功した。
育種株は、ZM mx42と命名し、平成１９年８月１３日から、茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４２の下で寄託してある。
【実施例４】
【００４１】
廃木材酸処理糖化液の発酵性試験（バッチ発酵条件下）
育種株（ZM ms42 [sucZE2::manA, pZA22-xt]）の廃木材酸処理糖化液に対する発酵性試験を実施した。廃木材酸処理糖化液は常法(Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 98-100, 899-907, 2002)に従い調製された、建築廃材の濃硫酸処理糖化液を用いた。酸処理糖化液の１容量に対して２倍濃度のＲＭ培地（Ｃ源２％、酵母エキス１％、ＫＨ２ＰＯ４０．２％、ｐＨ６．０〜６．５）を１容量添加した場合、あるいは酸処理糖化液の９容量に対して１０倍濃度のＲＭ培地を１容量添加した場合の発酵性試験をおこなった。結果を図１２ａおよび図１２ｂに示した。図１２ａではグルコール、マンノース、キシロースは消費され、理論収率に近いエタノールを生産した。また、酸処理糖化液の原液に近い場合においても図１２ｂに示すように、ZM ms[pZA22-xt]が３種の糖を速やかに発酵して高収率のエタノールを生産した。
【実施例５】
【００４２】
バイオエタノール製造リアクター
（１）付着固定化増殖菌体とリアクターの調製
付着固定化増殖菌体の調製とそれを充填した発酵用リアクターの調製を以下に示す。
（ａ）酸処理糖化液培地の調製
１）酸処理糖化液（約ｐＨ１．０）をＣａＣＯ３によって、ｐＨ５．５付近まで中和させた。
２）中和した酸処理糖化液は吸引ろ過によって、沈殿を取り除き４℃で保存した。
３）酸処理糖化液を８０℃で１日以上、低温殺菌し、同時に余分な沈殿を沈降させた。
４）連続発酵試験、発酵性試験の培地に用いるため、２倍、２．５倍、１０倍のＣ源を加えていないＲＭ培地およびＴ培地を調製し、低温殺菌した酸処理糖化液と混ぜ、生成する沈殿を遠心分離（２５℃、８０００ｒｐｍ、６０分）して取り除いた。
Ｔ培地は、Ｃ源２％、酵母エキス１％、ＫＨ２ＰＯ４１％、（ＮＨ４）２ＳＯ４０，２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０５％（ｐＨ６．０）の組成を有する培地である。
（ｂ）付着固定化増殖菌体の調製
１）大量培養する際に、適当な糖の入った５００ｍｌＲＭ培地（Ｔ培地）に表７に示す担体を加えてオートクレーブした。
【００４３】
［表７］
2010158170.tif 000003
２）室温まで冷却した後、これに植菌し３０℃、２日間以上静置培養した。この時、菌体が付着した担体を固定化菌体として用いた。
（ｄ）リアクターを用いた連続発酵試験
カラムに７０％の固定化増殖菌体を充填し、上昇法で流動槽型リアクターを用いた。
図１３および表８にリアクターの模式図と連続発酵の条件を示す。
［表８］
2010158170.tif 000004
【００４４】
（ｃ）発酵液の分析方法
糖およびエタノール
経時的にサンプリングしたリアクターからの溶出液に含まれるエタノールの生産、糖成分の減少を分析した。この時、カラム抽出液１ｍｌは遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、１５分）を行い、ＨＰＬＣによって分析を行った。
ＨＰＬＣ分析条件を以下に示した。
条件１
使用カラム：BIO-RAD  Aminex  HPX-87P
流量      ：０．４ｍｌ／分
カラム温度：８０℃
抽出液    ：脱気蒸留水
サンプル量：５μｌ
条件２
使用カラム：Shodex  SUGAR  KS-801
流量      ：０．５ｍｌ／分
カラム温度：５０℃
抽出液    ：脱気蒸留水
サンプル量：５μｌ
エタノールの収率は次に示す反応式から求めた。
グルコース＋ＡＤＰ＋Ｐi→２エタノール＋２ＣＯ２＋ＡＴＰ
３キシロース＋３ＡＤＰ＋３Ｐi→５エタノール＋５ＣＯ２＋３ＡＴＰ
理論エタノール収量＝０．５１％エタノール／％グルコースまたはキシロース
【実施例６】
【００４５】
廃木材酸処理糖化液の連続発酵
（１）モデル酸処理糖化液の連続発酵
実施例５に記載したような組換えザイモモナスの固定化増殖菌体を充填したリアクターを用い、グルコース、マンノースおよびキシロースが混在するモデル糖液からのエタノール連続発酵を評価した。先ず、ZM ms42 [sucZE2::manA,pza22-xyl]を充填したリアクターでの連続発酵性試験を、６％グルコース＋２％マンノース＋２％キシロースモデル糖液、３０℃、ｐＨ６．５、Ｄ＝０．２／時で検討した結果、図１４に示すごとく、グルコースおよびマンノースの完全な消費に伴う理論収率のエタノール生産が観察された。しかし、発酵液中にはキシロースが残糖として認められ、３種の糖質の連続並行発酵が困難であることが明らかになった。そこで、キシロース発酵性低下の原因を究明したところ、発酵液のｐＨがキシロース発酵性に影響を与えることが明らかになった。図１５には、育種株による糖発酵性と発酵液初発ｐＨの相関を観察した結果を示す。ZM ms42 [sucZE2::manA,pza22-xyl]では、グルコースとマンノースの発酵においては初発ｐＨの影響は認められないが、キシロースの発酵性には糖液の初発ｐＨが著しく影響を与え、ｐＨ５以下ではキシロース発酵性の低下が明らかになった。これらの結果は、混合糖液の連続発酵においてｐＨコントロールが必要であることを示唆している。
【００４６】
（２）廃木材酸処理糖化液の連続発酵
希釈・酸処理糖化液の連続エタノール生産：
付着固定化法によるZM ms42 [sucZE2::manA,pza22-xyl]の固定化増殖菌体の調製を方法で上記したように行い、カラム（内径２５mm、長さ１３０mm）に気泡が入らないように充填後、１：１酸処理糖化液ＲＭ培地（ｐＨ６．５）を上記の方法で調整し、これを用いて流量１６ｍｌ／時、Ｄ＝０．２５／時、３０℃の恒温槽で連続発酵を行った。結果を図１６のａに示す。
この結果より、残糖は始めの頃はマンノースが残っていたが、最終的には残糖はほとんど無く、エタノール平均濃度は１．９７％、収率８８．７９％、エタノール生成速度５．１８ｇ／ｌ・時となった。このことから、理論収量に近いエタノールの生産がされた。
そこで、糖濃度を上昇させ、その他は同様に連続発酵試験を行った。図１６の結果ｂから、残糖は無く、エタノール平均濃度は２．４５％、収率９６．１６％、エタノール生成速度６．２４ｇ／ｌ・時となった。このことから、理論収量のエタノールが生産された。
【００４７】
（３）酸処理糖化液の連続エタノール生産
これらの結果により、建築廃材酸処理糖化液の連続エタノール発酵が可能であることが明らかになったことから、実用レベルでの酸処理糖化液からの連続エタノール生産を検討した。
すなわち、原液に近い濃度（１０：１）で流量１６ｍｌ／時、Ｄ＝０．２５／時、３０℃条件下での連続発酵試験結果を行った。その結果、残糖は少なく理論収量のエタノールが生産され、エタノール平均濃度は３．７３％、収率９２．２０％、エタノール生成速度１０．２７ｇ／ｌ・時となった（図１７のａ）。さらに、高速度エタノール連続発酵を検討するために、酸処理糖化液の糖濃度は同様に、流量３２ｍｌ／時、Ｄ＝０．５０／時、３０℃の恒温槽で連続発酵を行った。結果より、グルコースとキシロースは消費され、マンノースにおいても微量が残存した。エタノール平均濃度は３．８３％、収率８６．５６％、エタノール生成速度２０．８８ｇ／ｌ・時となった（図１７のｂ）。このことから、希釈率０．５０／時でも理論収量に近いエタノールを生産した。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
以上記載したごとく、本発明によれば、セルロース系、リグノセルロース系バイオマス資源の糖化液を発酵してエタノールを生産できるグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌を使用し、バイオエタノールの省エネルギー型高効率転換プロセスを構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】染色体ＤＮＡへのmanA組み込み手順を示す図。
【図２】E. coli由来のmanAのクローニング操作を示す図。
【図３】染色体ＤＮＡ組み込み用組換えプラスミドpUZE2d'-manAの構築操作を示す制限酵素地図。
【図４】pUC118-xylABの構築操作を示す制限酵素地図。
【図５】pUC118-talの構築操作を示す制限酵素地図。
【図６】pUC118-tktの構築操作を示す制限酵素地図。
【図７】pUC118-tal+tktの構築操作を示す制限酵素地図。
【図８】pZA22-xtの構築操作を示す制限酵素地図。
【図９】実施例２（４）におけるキシロース発酵性試験の結果を示すグラフ。
【図１０】グルコース・マンノース・キシロース並行発酵性の付与操作を示す図。
【図１１ａ】実施例３における育種株の発酵性試験の結果を示すグラフ。
【図１１ｂ】実施例３における育種株の発酵性試験の結果を示すグラフ。
【図１２ａ】実施例４における肺木材糖化液の発酵性試験の結果を示すグラフ。
【図１２ｂ】実施例４における肺木材糖化液の発酵性試験の結果を示すグラフ。
【図１３】実施例５における連続発酵の条件を示すリアクターの模式図。
【図１４】実施例６のモデル酸処理糖化液の連続発酵における結果を示すグラフ。
【図１５】実施例６のモデル酸処理糖化液の連続発酵における培地初発ｐＨの影響を示すグラフ。
【図１６】実施例６の廃木材酸処理糖化液の連続発酵における結果を示すグラフ。
【図１７】実施例６の酸処理糖化液の連続エタノール生産における結果を示すグラフ。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列番号１：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号２：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号３：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号４：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号５：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号６：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号７：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号８：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号９：E. coliのxylA、BをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１０：E. coliのxylA、BをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１１：E. coliのxylA、BをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１２：E. coliのxylA、BをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１３：E. coliのtalをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１４：E. coliのtalをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１５：E. coliのtalをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド
・プライマー。
配列番号１６：E. coliのtalをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１７：E. coliのtktをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１８：E. coliのtktをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月3日(2008.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）  ZMcs（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４１）を宿主株とし、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のホスホマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子を相同組換え法によるダブルクロスオーバーによって染色体上のレバンスクラーゼ遺伝子内に組み込み、かつ、エシェリヒア・コリ由来のキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターに結合させてなる組換えＤＮＡを導入したザイモモナス・モビリス  ZM mx42（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４２）であるグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌。
【請求項２】
セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマス資源の糖化液を、固定化担体に固定化した請求項１記載のグルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌と接触させて発酵させ、得られる発酵液からエタノールを回収することを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項３】
バイオマス資源が木質系バイオマス資源である請求項２記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
固定化した発酵性菌を充填したリアクターに、糖化液を連続的に導入して発酵性菌と接触させ、発酵液を連続的に収集し、エタノールを回収する請求項２記載のエタノールの製造方法。