(57)【要約】【課題】核酸結合性担体における核酸吸着能の劣化を改善することで、安定的に或いは常に優れた効率で核酸を回収する。【解決手段】核酸結合性担体に核酸を含有する溶液を接触させて、当該核酸を当該核酸結合性担体に吸着させることで核酸を回収する方法であって、核酸を含む溶液と核酸結合性担体の接触に先立ち、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する工程を有する。【選択図】図１
2010158190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸結合性担体に核酸を含有する溶液を接触させて、当該核酸を当該核酸結合性担体に吸着させることで核酸を回収する方法であって、
核酸を含む溶液と核酸結合性担体の接触に先立ち、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する工程を有することを特徴とする核酸回収方法。
【請求項２】
上記核酸結合性担体は、酸化ケイ素を含有する物質であることを特徴とする請求項１記載の核酸回収方法。
【請求項３】
上記液体は、アルカリ溶液であることを特徴とする請求項１記載の核酸回収方法。
【請求項４】
上記液体は、有機溶剤を含有することを特徴とする請求項１記載の核酸回収方法。
【請求項５】
上記液体は２種以上の組成の異なる液体であり、これら２種以上の液体を上記核酸結合性担体に順次接触させることを特徴とする請求項１記載の核酸回収方法。
【請求項６】
上記核酸は、リボヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の核酸回収方法。
【請求項７】
上記核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露した後、核酸を含有する液体と当該核酸結合性担体とを接触させる工程と、
核酸を吸着した当該核酸結合性担体と溶離液とを接触させ、溶離液中に核酸を溶離する工程とを更に含むことを特徴とする請求項１記載の核酸回収方法。
【請求項８】
核酸結合性担体を備える抽出カラムと、
抽出カラムに溶液を投入するための分注機構と、
抽出カラムに投入した溶液を核酸結合性担体内部を通して排出するための加圧機構とを備える核酸抽出装置であって、
核酸を含む溶液と核酸結合性担体の接触に先立ち、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露することを特徴とする核酸抽出装置。
【請求項９】
上記液体を保持する容器を備え、上記分注機構が当該容器内の液体を上記抽出カラムに投入し、上記加圧機構が上記抽出カラムに投入された液体を上記核酸結合性担体内部に通して排出することを特徴とする請求項８記載の核酸抽出装置。
【請求項１０】
上記核酸結合性担体は、酸化ケイ素を含有する物質であることを特徴とする請求項８記載の核酸回収装置。
【請求項１１】
上記液体は、アルカリ溶液であることを特徴とする請求項８記載の核酸回収装置。
【請求項１２】
上記液体は、有機溶剤を含有することを特徴とする請求項８記載の核酸回収装置。
【請求項１３】
上記液体は２種以上の組成の異なる液体であり、これら２種以上の液体を上記核酸結合性担体に順次接触させることを特徴とする請求項８記載の核酸回収装置。
【請求項１４】
上記核酸は、リボヌクレオチドであることを特徴とする請求項８記載の核酸回収装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を結合した固相から核酸を溶出し、溶液中に核酸を回収する核酸回収方法及び核酸回収装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝情報を担う物質である核酸の分析は、学術研究や医療等の多岐の分野で実施されている。核酸の分析方法としては主にPCR（Polymerase Chain Reaction）等の核酸増幅技術を利用されることが多い。PCRとは核酸を塩基配列特異的に増幅する方法であり、極微量の目的遺伝子の検出や定量が可能である。PCR等の核酸分析においては生物試料等から抽出した核酸を用いるが、この核酸抽出では分析反応に対する阻害物質、例えば、分析結果に擬陽性をもたらすような外部環境に由来する核酸等を含むコンタミネーション物質の影響を排除する必要がある。
【０００３】
生物試料等から核酸を抽出する方法としては、フェノールやクロロホルム等の毒劇物を使用し、エタノール沈殿等の操作を行う従来方法があるが、近年では、非特許文献１に記載されるように、カオトロピック物質の存在下でシリカ含有物質等に核酸が結合する性質を利用する方法が主として採用されている。更に、簡便化、或は、自動化を目指して、シリカ含有物質等の核酸結合性担体には種々の改良がなされている。例えば、特許文献１では核酸結合性担体を底部に保持した円筒状部材、特許文献２ではガラスパウダーを有したカートリッジ、特許文献３では核酸結合性担体を所定の状態で保持したチップ、等の改良がなされている。
【０００４】
【非特許文献１】J.Clin.Microbiol.,28(3),495-503 (1990)
【特許文献１】特許第2936111号
【特許文献２】特許第3045922号
【特許文献４】特許第3619514号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の特許文献１〜３に記載される方法は、簡便化、或は、自動化の点では種々の改良がなされているが、性能の安定化に関する考慮は必ずしも十分ではなかった。すなわち、核酸を吸着する核酸結合性担体には、核酸吸着能にばらつきがあったり、経時的に核酸吸着能が低下するといった問題があった。例えば、核酸結合性担体を通常の室内環境に放置した場合、核酸結合性能が低下するといった問題があった。
【０００６】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、核酸結合性担体における核酸吸着能の劣化を改善することで、安定的に或いは常に優れた効率で核酸を回収することができる核酸回収方法及び核酸回収装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、核酸結合性担体における核酸吸着能の低下は核酸結合性担体の表面性状の変化に起因することが初めて明らかになった。また、核酸結合性担体に核酸を吸着する前に、核酸結合性担体の表面性状を改善することによって核酸吸着能の劣化を改善できることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を包含する。
本発明に係る核酸回収方法は、核酸結合性担体に核酸を含有する溶液を接触させて、当該核酸を当該核酸結合性担体に吸着させることで核酸を回収する方法であって、核酸を含む溶液と核酸結合性担体の接触に先立ち、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する工程を有するものである。
【０００９】
本発明に係る核酸回収方法において、上記核酸結合性担体としては、酸化ケイ素を含有する物質を挙げることができる。また、上記液体としては、アルカリ溶液や有機溶剤を挙ることができる。また、上記液体としては、２種以上の組成の異なる液体を使用して、これら２種以上の液体を上記核酸結合性担体に順次接触させるものであっても良い。上記核酸としては、リボヌクレオチドを挙げることができる。
【００１０】
また、本発明に係る核酸回収方法は、上記核酸結合性担体に対して液体若しくは高温高圧ガスを接触させた後、核酸を含有する液体と当該核酸結合性担体とを接触させる工程と、核酸を吸着した当該核酸結合性担体と溶離液とを接触させ、溶離液中に核酸を溶離する工程とを更に含むものであってもよい。
【００１１】
一方、本発明に係る核酸回収装置は、核酸結合性担体を備える抽出カラムと、抽出カラムに溶液を投入するための分注機構と、抽出カラムに投入した溶液を核酸結合性担体内部を通して排出するための加圧機構とを備える核酸抽出装置であって、核酸を含む溶液と核酸結合性担体の接触に先立ち、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露するものである。
【００１２】
また、本発明に係る核酸回収装置は、上記液体を保持する容器を備える構成であってもよい。この場合、本発明に係る核酸回収装置では、上記分注機構が当該容器内の液体を上記抽出カラムに投入し、上記加圧機構が上記抽出カラムに投入された液体を上記核酸結合性担体内部に通して排出することで、上記核酸結合性担体に液体を接触させることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、核酸結合性担体における核酸吸着能の低下を改善することができ、核酸結合性担体を用いた核酸吸着効率を安定化することができる。したがって、本発明に係る核酸回収方法及び核酸回収装置によれば、核酸結合性担体の保存状態や保存期間等に影響されず、核酸結合性担体における核酸吸着能を安定的に発揮し、核酸を回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を図面を参照して詳細に説明する。
本発明に係る核酸回収方法では、先ず、核酸結合性担体に対して核酸を吸着させる工程に先立って、当該核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する方法である。言い換えると、本発明に係る核酸回収方法は、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する工程と、当該工程の後に核酸結合性担体に対して核酸を吸着させる工程を含む方法である。
【００１５】
なお、以下の説明において、「核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する」ことを「核酸結合性担体を洗浄する」或いは「核酸結合性担体の洗浄工程を行う」と称する。
【００１６】
ここで、核酸結合性担体としては、ガラス、珪藻土等のシリカを含有するものであれば使用できる。或いは、核酸結合性担体としては、アセチルセルロース等の有機物や磁気ビーズ等の従来公知の物質を挙げることができる。これらの物質を微粒子状や多孔性膜状に加工して固相を形成することができる。特に、核酸結合性担体としては、上述した洗浄工程によって核酸吸着能を大幅に回復できることからシリカ含有物質であることが好ましい。
【００１７】
洗浄に使用する液体（以下、洗浄液と称する場合もある）としては、核酸結合性担体に対して核酸結合能回復作用を有する組成であれば特に限定されない。洗浄液の好適な例としては、純水に加えて、塩酸水溶液、水酸化ナトリウム水溶液等のイオン性水溶液、キシレン等の有機溶媒、及びこれらの混合液等を挙げることができる。これらの洗浄液は、核酸結合性担体に残存したとしても、後述する次工程に悪影響を及ぼすことがないため好ましい。
【００１８】
上述した洗浄液を用いて核酸結合性担体を洗浄する際には、特に限定されないが、核酸結合性担体に上記洗浄液を接触させれば良い。上記洗浄液を核酸結合性担体に接触させることによって、核酸結合性担体の表面性状が変化して核酸吸着能が回復することとなる。より具体的には、例えば、核酸結合性担体を保存すると、保存環境中に含まれるガス成分が表面に吸着する場合があり、これに起因して核酸吸着能が劣化する場合がある。上述した洗浄液と核酸結合性担体とを接触させることによって、例えば、核酸結合性担体の表面に吸着したガス成分を除去することができ、核酸吸着能を回復することができる。
【００１９】
また、核酸結合性担体と上記洗浄液とを接触させる際には、核酸結合性担体を収容したカラムに上記洗浄液を通液させてもよい。例えば、多孔膜状の核酸結合性担体を使用する場合には、多孔膜状の核酸結合性担体を中空状の配管内部に固定した器具を用いる。なお、多孔膜状の核酸結合性担体は、配管内部において一対の固相保持部材で挟み込むようにして固定することもできる。このとき、一対の固相保持部材は、例えば、多孔性ポリプロピレン粒子焼結体から形成することができる。この器具を使用する場合、配管の一方端部を開口端とし、他方端部をポンプ装置に連結し、当該ポンプ装置を駆動することにより一方端部から溶液を吸引及び吐出することができる。これによって、多孔膜状の核酸結合性担体に上記洗浄液を接触させることができる。なお、器具内部に吸引した溶液は、遠心力を利用して吐出することもできる。
【００２０】
一方、洗浄工程としては、上述した洗浄液を核酸結合性担体に接触させる手法に限定されず、オートクレーブ等を用いて、核酸結合性担体を高温高圧条件下に曝露する処理であってもよい。核酸結合性担体を高温高圧条件下に曝露することによって、核酸結合性担体の表面性状が変化して核酸吸着能が回復することとなる。高温高圧条件とは、核酸結合性担体における核酸吸着能を回復できる条件であれば特に限定されない。より具体的に、温度条件としては４５〜１３５℃が好ましく、１０５〜１２１℃がより好ましく、１２１℃が最も好ましい。また、圧力条件としては、１×１０５〜２．５×１０５Paが好ましく、２×１０５Paが最も好ましい。
【００２１】
以上のように洗浄を行った後の核酸結合性担体に対して、核酸を含有する試料を接触させることにより当該核酸を核酸結合性担体に吸着させることができる。ここで、核酸を含有する試料としては、例えば、全血、血漿、血清、尿、大便、唾液、喀痰、精液等の体液、動植物の組織や細胞、微生物、細菌、ウイルス等及びそれらの懸濁物、或いは溶解物が使用できる。核酸を核酸結合性担体に吸着させる際には、核酸の吸着を促進するいわゆる結合試薬を使用することが好ましい。結合試薬としては、核酸含有試料中の核酸を遊離化し、且つ核酸と核酸結合性担体との結合を促進し得るものであれば特に限定されず使用することができる。例えば、結合試薬としては、各種のカオトロピック塩が使用できる。カオトロピック塩としては、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等を使用できる。また、核酸の遊離化を促進する為に界面活性剤やタンパク質分解酵素等が使用できる。界面活性剤としては非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン、オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン、ソルビタンモノラウレート等が使用できる。また、核酸含有試料に内在、或いは外部環境に由来する核酸分解酵素を不活性化する為に、2-メルカプトエタノールやジチオトレイトール等の還元剤やエチレンジアミン四酢酸塩等の金属キレート剤が使用できる。また、核酸の遊離化を促進するために、加温、攪拌、ホモジナイズ、超音波等の処理を併用することができる。また、核酸と核酸結合性担体との結合を促進するために、有機溶媒を使用できる。有機溶媒としては水溶性有機溶媒が好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、乳酸エチル等が使用できる。
【００２２】
核酸結合性担体を備える抽出デバイスの一例として、抽出カラムの模式図を図１に示す。抽出カラムは、図１に示すように、溶液を投入する開口部21、加圧機構を接続する接続部22及び溶液を排出する為の開口部23を備え、配管内部に核酸結合性担体24を保持部材25により固定化したものである。図１に示す核酸結合性担体24としては、例えば、ガラス、シリカ、ケイソウ土等、或いは、アセチルセルロース等を含有する固相であり、連続する複数の通液孔を有して通液可能であり、通液の際に溶液との十分な接触効率を得られるように、微細且つ緊密なフィルター状の構造であるものが使用できる。保持部材25は、核酸結合性担体24の形状や設置位置を維持することができ、且つ、連続する複数の通液孔を有し通液可能である部材が使用でき、例えばプリプロピレン粒子の焼結体等が使用できる。
【００２３】
溶液を投入した抽出カラム内部を加圧し、溶液を核酸結合性担体24の内部を通して排出する為の加圧機構を図２に示す。加圧機構は、抽出カラム内部を加圧する為のシリンジ31及びプランジャ32と、プランジャ32を上下駆動するためのプランジャ駆動用モーター33と、シリンジ31とプランジャ駆動用モーター33を上下駆動させるためのシリンジ駆動用モーター34と、シリンジ31と抽出カラム35との間に配されたシール部材36と、抽出カラム保持スタンド37と、廃液受容器38と、廃液受容器保持スタンド39とから構成されている。この加圧機構においては、先ず、プランジャ32とシリンジ31を上方へ移動させ、抽出カラム35と廃液受容器38をそれぞれ抽出カラム保持スタンド37及び廃液受容器保持スタンド39に設置する。次に、この加圧機構においては、抽出カラム35内部に上述した溶液を投入し、シリンジ31を下方へ移動させ、シール部材36を介してシリンジ31と抽出カラム35を密着させる。次に、この加圧機構においては、プランジャ32を下方へ移動させ、抽出カラム35内部を加圧し、抽出カラム35内部の溶液を核酸結合性担体の内部を通して廃液受容器38に排出する。
【００２４】
なお、図１に示した抽出カラム及び図２に示した加圧機構は、上述した洗浄液を核酸結合性担体に接触させる際にも同様に使用することができる。また、核酸結合性担体に核酸を吸着させた後には、例えば、以下のように第一洗浄工程、第二洗浄工程及び溶出工程が実施される。
【００２５】
第一洗浄液としては、核酸と核酸結合性担体の結合を維持して、タンパク質等の非特異的な結合物を除去し得るものであり、結合液において用いることができるカオトロピック塩、界面活性剤、還元剤、金属キレート剤、有機溶媒等を含む溶液が使用できる。第二洗浄液としては、核酸と核酸結合性担体との結合を維持して、第一洗浄液で除去しきれなかった非特異的な結合物と第一洗浄液の残留成分を除去し、且つ、次工程の溶出液に持ち越されて後段の分析反応を阻害しない水準まで除去可能なものであり、エタノールやアセトン等の揮発性を有する有機溶媒等を含有する溶液が使用できる。第二洗浄液の残液を除去する方法としては、抽出カラムの核酸結合性担体部分を加温して乾燥させる方法等が使用できる。
【００２６】
溶出液としては、核酸を核酸結合性担体から溶離し、且つ、後段の分析反応を阻害する成分を含有しないものであり、核酸分解酵素を含有しない純水、或いは低塩濃度緩衝液等が使用できる。尚、核酸の溶離を促進する為に溶出液を加温することができる。抽出後の核酸を対象とする後段の分析反応としては、PCR（；Polymerase Chain Reaction）、RT-PCR（；Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）、LCR（；Ligase Chain Reaction）、SDA（；Strand Displacement Amplification）、NASBA（；Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）、TMA（；Transcription-Mediated Amplification）、 LAMP（；Loop-mediated isothermal amplification）、ICAN（；Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）等の核酸増幅、逆転写反応、核酸伸長反応、制限酵素等の酵素反応、或いは電気泳動等の核酸分析が適用できる。
【００２７】
以上に説明したように、本発明によれば、核酸結合性担体における核酸吸着能が劣化としたとしても、当該核酸吸着能を回復することができる。したがって、核酸結合性担体に核酸を吸着する工程に先立って上述した洗浄工程を行うことによって、安定的に或いは常に優れた効率で核酸を回収することができる。
【００２８】
なお、上述した洗浄工程と核酸吸着工程との間隔は、特に限定されないが、洗浄工程の終了後、３日以内が好ましく、１日以内がより好ましく、４時間以内が最も好ましい。洗浄工程の終了後１日を過ぎてから核酸吸着工程を行う場合、核酸結合性担体が再度劣化する虞がある。なお、洗浄工程の終了後、核酸結合性担体を吸着ガス等の除去した環境下に密閉して保存できる場合には、核酸結合性担体における核酸吸着能を高く維持でききるため、上記期間を過ぎてから核酸吸着工程を行ってもよい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を用いて本発明に係る核酸回収方法及び核酸回収装置を説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３０】
先ず、本実施例において使用した試料、試薬、核酸抽出器具、核酸抽出方法、核酸定量方法及び核酸分析方法について順に説明する。
1.試料
マウスの肝臓から精製したtotal RNAを血清に添加した擬似試料（100ng/ 200μl）
【００３１】
2.試薬
洗浄液
超純水、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、Tris(pH8.0)緩衝液及びMES(pH4.0)緩衝液から一つを選択して使用した。
【００３２】
結合試薬
6M グアニジン塩酸塩
100mM MES 
25mM EDTA・2Na
20%(v/v) ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル
【００３３】
第一洗浄液
2.5M グアニジンチオシアン酸塩
100mM MES 
25mM EDTA・2Na
1%(v/v) ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル
【００３４】
第二洗浄液
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
80%(v/v) EtOH
【００３５】
溶出液
10mM Tris-HCl （pH 8.0）
【００３６】
3.核酸抽出器具
上述した図１に示す抽出カラムにおいて、抽出カラムの内部容量を2ml、抽出カラムの材質をポリプロピレン、核酸含有核酸結合性担体を平均粒子保持径0.7μmのガラス繊維濾紙、保持部材を平均粒子保持径約100μmのプポリプロピレン粒子焼結体としたものを使用した。
【００３７】
4.核酸抽出方法
図１に示した抽出カラム及び図２に示した加圧機構を用いた核酸抽出方法は以下の通りである。
（1）加圧機構に抽出カラムと廃液受容器を設置する。
（2）洗浄液1mLを抽出カラムに投入する。
（3）加圧ユニットを起動する。
（4）シリンジが下方へ駆動され、シール材を介して抽出カラムに密着する。
（5）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
【００３８】
（6）洗浄液を全量抽出カラム底部より吐出する。
（7）一定時間経過後、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（8）(2)〜(7)を再度実行する
（9）200μl試料と800μl結合液の混合液を抽出カラムに投入する。
（10）加圧機構を起動する。
【００３９】
（11）シリンジが下方へ駆動され、シール材を介して抽出カラムに密着させられる。
（12）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
（13）混合液液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（14）プランジャが上方へ駆動される。
（15）1200μl第一洗浄液を抽出カラムに投入する。
【００４０】
（16）シリンジが下方へ駆動され、シール材を介して抽出カラムに密着させられる。
（17）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
（18）洗浄液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（19）プランジャが上方へ駆動される。
（20）1200μl第二洗浄液を抽出カラムに投入する。
【００４１】
（21）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
（22）洗浄液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（23）プランジャが上方へ駆動される。
（24）再度、1200μl第二洗浄液を抽出カラムに投入する。
（25）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
【００４２】
（26）洗浄液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（27）プランジャが上方へ駆動される。
（28）廃液受容器を取り外して廃棄し、精製液受容器を設置する。
（29）110μl溶出液を抽出カラムに投入する。
（30）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積2ml空気相が1mlに圧縮される。
（31）洗浄液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
【００４３】
以上の（1）〜（31）のプロトコルにより精製液受容器に約100μl溶出液を得た。
【００４４】
5.核酸定量方法
抽出後の核酸の定量は、蛍光色素であるRiboGreenを使用し、添付の手順書に従って行った。なお、ここで、添加時のtotal RNA量を100%として回収RNA量から抽出率を算出した。
【００４５】
6.結果
結果を図３に示す。この結果から、環境中に放置した抽出カラムでは抽出率が著しく低下すること及び洗浄工程を追加することにより抽出効率が改善することが明らかとなった。また、図３に示した結果から、洗浄工程で使用する洗浄液の種類に応じて核酸吸着能の改善効果に差が生じること、特に水酸化イオンを含む溶液により洗浄が効果的であることが明らかとなった。
【００４６】
〔実施例１〕
本実施例では、核酸結合性担体としてガラス繊維ろ紙を使用し、核酸結合性担体の経時的劣化を検証した。具体的には、核酸結合性担体を１ヵ月間放置した後、１２１℃６０分のオートクレーブ処理条件の有無、またオートクレーブ処理の後からの経過日数（２日、５日及び８日）による、核酸吸着能の変化を検証した。
【００４７】
結果を図４に示す。図４の結果から、核酸結合性担体は、経時的に核酸吸着能が劣化すること及び核酸吸着能は高温高圧条件下に曝露することによって回復できることが明らかとなった。
【００４８】
〔実施例２〕
本実施例では、洗浄液を有機溶媒とした以外は実施例１と同様にして、試料に含まれる核酸の回収実験を行った。本実施例において有機溶媒としては、テトラヒドロフラン（THF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、γ-ブチル、ジメチルホルムアミド（DMF）、メチダチオン（DMTP）、テトラメチル尿素（TMU）、ジメチルアセトアミド（DMAc）及びジメチルオレチレンウレア（DMEU）を使用した。
【００４９】
結果を図５に示す。図５に示した結果から、核酸吸着能が劣化した核酸結合性担体に有機溶媒を接触させることによって、核酸結合性担体における核酸吸着能を回復できることが明らかとなった。
【００５０】
〔実施例３〕
本実施例では、洗浄液を有機溶媒とイオン性化合物とを含む混合液とした以外は実施例１と同様にして、試料に含まれる核酸の回収実験を行った。本実施例において、洗浄液としては、0.1mol/L塩化ナトリウムとDMEUとの混合液、及び0.1mol/L水酸化ナトリウムとDMEUとの混合液を使用した。
【００５１】
結果を図６に示す。図６に示した結果から、有機溶媒とイオン性化合物とを含む混合液を洗浄液として使用した場合でも、核酸吸着能を回復できることが明らかとなった。特に、水酸化イオンを含有する混合液を使用した場合には、核酸吸着能の回復度合いがより優れていることが明らかとなった。
【００５２】
〔実施例４〕
本実施例では、核酸結合性担体に吸着した物質を、洗浄前後において比較検討した。具体的には、先ず、実施例１で使用した抽出カラムを開封状態で実験室中に1日放置した。その後、所定の洗浄液を用いて、実施例1の手順(1)から(8)を実施した。そして、抽出カラムを分解し、核酸結合性担体を取り出してGC-MSにて分析を行った。本実施例において、洗浄液としては、0.1mol/L水酸化ナトリウム溶液、DMEU溶液、0.1mol/L水酸化ナトリウムとDMEUとの混合液を使用した。
【００５３】
結果を図７に示す。図７に示した結果から、核酸結合性担体に吸着した物質が洗浄により除去されていることが明らかとなった。また、この結果から、核酸結合性担体の核酸吸着能の回復が、核酸結合性担体に吸着した物質の除去に起因することが明らかとなった。
【００５４】
〔実施例５〕
以上の実施例１〜４によれば、核酸結合性担体に核酸を吸着する前に当該担体を洗浄することで当該担体における核酸吸着能を回復することができ、その結果、核酸の回収効率が向上することが明らかとなった。本実施例では、試料に含まれる核酸をより低濃度にした場合であっても、核酸増幅方法といった核酸分析法が実行可能であることを検証した。
【００５５】
1.試料
HBV陽性血清からの精製DNAを陰性血清に添加した擬似陽性検体（103copy / 200μl）を準備した。この試料から、実施例１に詳述した各種試薬、加圧機構及び動作プロトコルを用いてDNA抽出を実施した。
【００５６】
2.核酸分析方法
PCR
HBV 由来DNAを鋳型DNAとするPCRは、（J.Clin.Microbiol.,29(9),1804-1811(1991)）の報告に基づいて下記条件においてPCRを実施した。鋳型としては、上記1.試料で調整した溶出液10μlを使用した。
Primer 1 ：  5’ GCG GAT CCG AGT TAC TCT CGT TTT TGC  3’（配列番号１）
Primer 2 ：  5’ GCA AGC TTT CTA ACA ACA GTA GTT TCC GG  3’（配列番号２）
【００５７】
PCRにおける温度サイクル条件は、先ず94℃で5min維持し、その後94℃で1min、55℃で1min及び72℃で1minを１サイクルとして３０サイクル行い、その後、72℃で10minとした。
【００５８】
LAMP
HBV 由来DNAを鋳型DNAとするLAMPは、（Nucleic Acid Research,28(12),e63(2000)）の報告に基づいて下記条件においてLAMPを実施した。鋳型としては、上記1.試料で調整した溶出液10μlを使用した。
Primer FIP：5’ CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT CTT TGA CAA ACG GGC AAC ATA CCT T 3’（配列番号３）
Primer BIP：5’ GAT AAA ACG CCG CAG ACA CAT CCT TCC AAC CTC TTG TCC TCC AA 3’（配列番号４）
Primer F3：5’ GGT GGT TGA TGT TCC TGG A 3’（配列番号５）
Primer B3：5’ CAA AAT TCG CAG TCC CCA AC 3’（配列番号６）
【００５９】
LAMPにおける温度条件としては、先ず95℃で5min維持し、その後、氷上で3min維持し、Bst DNA Polymerase添加した後に65℃で1h維持し、その後80℃で10min維持した。
【００６０】
増幅産物の確認
0.8%アガロースゲルを用いた電気泳動を実施し、2本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素で染色し、紫外線照射下において確認した。
【００６１】
結果
電気泳動の結果から、上述したPCR及びLAMPともに良好な増幅産物が得られたことが明らかとなった。この結果から、低濃度の核酸を含む試料からであっても正常な核酸抽出が行われ、後段の分析反応への適性を有することが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】核酸結合性担体を備える抽出デバイスの一例として示す、抽出カラムの模式図である。
【図２】抽出カラムを備える加圧機構を示す模式図である。
【図３】洗浄液の種類による核酸吸着能の回復度合いを検討した結果を示す特性図である。
【図４】核酸結合性担体における核酸吸着能の経時劣化を検討した結果を示す特性図である。
【図５】洗浄液として使用した有機溶剤の種類による核酸吸着能の回復度合いを検討した結果を示す特性図である。
【図６】洗浄液として使用した混合液の種類による核酸吸着能の回復度合いを検討した結果を示す特性図である。
【図７】核酸結合性担体に吸着した物質を洗浄の前後で比較した結果を示す特性図である。
【符号の説明】
【００６３】
21・・溶液投入開口部
22・・加圧機構接続部
23・・溶液排出開口部
24・・核酸結合性固相
25・・保持部材
31・・シリンジ
32・・プランジャ
33・・プランジャ駆動用モーター
34・・シリンジ駆動用モーター
35・・抽出カラム
36・・シール部材
37・・抽出カラム保持スタンド
38・・廃液受容器
39・・廃液受容器保持スタンド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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