(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘルペスウイルス群のメンバーであり、かつ重要な病原体であるエプスタイン・バーウイルス（EBV）感染の予防、より具体的には、EBV感染から生じる感染性単核球症を予防するためのワクチン組成物の提供。【解決手段】金属塩、例えば、アルミニウムまたはカルシウム塩を含む金属塩が水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又はリン酸カルシウム等、又は非毒性細菌リポ多糖誘導体を含むアジュバントとの組合せによるEBV膜抗原又はそれらの誘導体の使用によるワクチン組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性単核球症（IM）を予防するためのワクチンの製造における、適切なアジュバントとの組合せにあるEBV膜抗原またはそれらの誘導体の使用。
【請求項２】
11〜25歳の範囲の青年および若年成人の集団においてIMを予防するための請求項１記載の使用。
【請求項３】
EBV抗原がgp350またはそれらの誘導体である請求項１または請求項２記載の使用。
【請求項４】
gp350がgp350の均一調製品である請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
アジュバントが金属塩、例えば、アルミニウムまたはカルシウム塩を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
金属塩が水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはリン酸カルシウムから選択される請求項５記載の使用。
【請求項７】
アジュバントが非毒性細菌リポ多糖誘導体、例えば、3D−MPLをさらに含む請求項５または請求項６記載の使用。
【請求項８】
EBV gp350の均一調製品を金属塩および非毒性細菌リポ多糖誘導体と組み合わせて含有するワクチン組成物。
【請求項９】
gp350の均一調製品、水酸化アルミニウムおよび3D−MPLを含有する請求項８記載のワクチン。
【請求項１０】
gp350が、gp350／220タンパク質を発現するDNAの非スプライシング変種から調製される組換えgp350である請求項８または請求項９記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエプスタイン・バーウイルス（EBV）感染の予防、より具体的には、EBV感染から生じる感染性単核球症の予防に関する。より具体的には、本発明はEBV感染および／または感染性単核球症を予防するワクチンにおけるEBV抗原、特には、gp350として知られる糖タンパク質およびそれらの誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
EBVはヘルペスウイルス群のメンバーであり、かつ重要な病原体である。これはヒトにおける感染性単核球症（IM）、腺熱とも呼ばれる疾患を生じる。近年の報告において、合衆国における感染性単核球症に関連する直接医療経費は毎年1600万USドルにも達するものと見積もられた。さらに、この疾患は、感染性単核球症を頻繁に伴う長期間の仕事／学校の欠席に関連する相当の間接的経費を生じる。
【０００３】
このウイルスは様々な他の臨床状態にも関与し、それらの多くは悪性である。これらには、免疫抑制患者におけるBurkittリンパ腫、B細胞リンパ腫および平滑筋腫瘍、幾つかのT細胞リンパ腫、Hodgkin病、X染色体関連リンパ球増殖症候群、上咽頭癌、胃癌並びに口腔毛様白班症が含まれる。
【０００４】
西側社会においては、すべての成人の約85−90%がEBVウイルスを保菌する。発展途上国においては、感染レベルは2歳で100％に近づく。自然一次感染は幼児期に生じ、一般には無症状である。他のヘルペスウイルスと共通に、EBVは一生維持される持続性感染を確立する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発展した諸国においては、一次感染はしばしば数年遅れる。青年期（adolescence or young adulthood）の初回感染に続いて、それらの事例の約半分において臨床的感染性単核球症が発症する。合衆国単独において、毎年100,000を上回る新規事例が存在するものと見積もられる。したがって、様々なヒト癌へのウイルスの関与を無視するとしても、EBVはワクチンの重要な標的である。従来、ワクチンは存在しない。
【０００６】
EBVのワクチンに対する弱毒化ウイルス・アプローチは、ウイルスDNAが発癌性であると判明し得る可能性のため、ほとんど好ましいものではないことが見出されている。したがって、EBVワクチンの開発に対するアプローチのほとんどは、約350,000ダルトン（gp350）、約220,000ダルトン（gp220）および約85,000ダルトン（gp85）の分子量を有する少なくとも3種類の糖タンパク質からなるウイルス膜抗原に集中している。文献において、gp350およびgp220は様々な分子量範囲、例えば、gp350についてはgp340もしくはgp300、およびgp220についてはgp200を用いて参照される。ここでは、糖タンパク質をgp350およびgp220と呼び、集合的にgp350／220タンパク質と呼ぶ。
【０００７】
別にスプライスされた単一遺伝子はgp350／220タンパク質をコードし、gp350およびgp220 mRNA 転写体の産生を生じる。この遺伝子は2種類の発現産生物、gp350およびgp220タンパク質を産生する。gp350／220 DNA配列の読み取り枠は2721bpであり、読み取り枠全体はgp350の907アミノ酸をコードする（Kieffに発行された米国特許第4,707,358号、1987を参照）。この読み取り枠のスプライスされたものは2130塩基をカバーし、gp220タンパク質、710アミノ酸配列を翻訳する。
【０００８】
これらのタンパク質の組換え産生は、しばしば、産生されるgp350およびgp220タンパク質の混合物を生じる。EBV gp350/220タンパク質の修飾体、例えば、膜スパンニング配列を欠くga350／220遺伝子の組換えトランケート構築体も当該技術分野において公知である。そのような構築体は依然としてgp350およびgp220の2種類の混合物を産生するが、膜スパンニング領域の欠損はそれらのタンパク質の分泌を可能にする。
【０００９】
gp350/220の部分的に精製された調製品が早くも70年代に記載されているが、それらの特徴付けは不十分なままであり、すべてが免疫原性であるわけではなかった（Boone CW et al, J Nati Cancer fast (1973) 50:841）。その後、抗原的に活性のgp350タンパク質の高度に精製された調製品が非変性および組換え源から得られている（Morgan AJ, North JR and Epstein MA. Purification and properties of the gp340 component ofEpstein-Barr Virus membrane antigen in an immunogenic form. J. Gen. Virol. (1983) 64: 455-460；Thorley-Lawson D and Poodry CA. Identification and isolation of the main component (gp350-gp220) of Epstein-Barr Virus responsible for generating neutralizing antibodies in vivo. J. Virol. (1982) 43: 730-736；Emini EA, Schleif WA, Armstrong ME, Silberklang M, et al Virol (1988) 166:387-393；Madej M, Conway MJ, Morgan AJ et al Vaccine (1992) 10:777-782）。しかしながら、gp350／220を精製するためのこれらの精製法の多くは商業ワクチンの製造には適合しない（例えば、純度の不足、不十分な収率）。
【００１０】
EP 0 769 056はEBV gp350/220 DNA配列の非スプライシング変種を記載し、これは均一な組換えgp350の産生、すなわち、gp220とは独立した組換えgp350の産生を可能にする。これはgp350遺伝子におけるRNAスプライス部位シグナルの幾らかもしくはすべての除去および適切な宿主細胞におけるその遺伝子の発現によって達成される。好ましくは、しかしながら絶対条件ではないが、EBV抗原は有意のgp220が存在しない均一なgp350である。
【００１１】
幾つかの刊行物がEBVワクチン開発の合理性および方策をレビューした。Arrand（1992）は、The Cancer Journal, 5 (4) "Prospects for a Vaccine against Epstein-Barr virus" においてモデル系における最近の結果は将来有望であると言明した。Arrandは臨床使用に移るEBVワクチンの見通しについて楽観的であった。しかしながら、それから10年、実現に近づいているEBVワクチンはどこにも存在しない。刊行された文献のコンセンサスは、ウイルスの蔓延およびそれが関与する疾患の数のため、EBVがワクチン化の挑戦を妨げているというものであると思われる。
【００１２】
Arrandのような数名の著者をEBVワクチンの可能性の示唆に導いている前臨床モデルはKhanna et al (1999) Immunol Rev 170, 49-64によってレビューされた。EBV感染について幾つかの霊長類および／または齧歯類モデルが存在する。異なるEBVワクチンの防御効力がそれらの幾つかにおいて評価されており、成功のレベルは様々である。これに関するほとんどの研究はコットン・トップ・タマリン（cotton-top tamarin）（Saguinus oedipus oedipus）に集中しており、ここでは複数のB細胞リンパ腫が高力価EBVの接種の後に発症する。ヨザル（Aotus trivirgatus）はEBV誘導リンパ腫に感受性であり、それに対して一般のマーモセット（Callithrix jaccus）はEBV接種の後にリンパ球数の一時的な増加を生じる。口腔内でのEBVの脱落も一般のマーモセットにおいて観察することができる（Cox et al (1996) J Gen Virol 77, 1173-1180）。利用可能なマウスモデルはEBV血清陽性ドナーに由来する末梢血単核細胞をSCIDマウスに注射することからなり、これはB細胞リンパ腫の発症を生じる。
【００１３】
11kワクシニアプロモーターの下でgp220／350を発現する生組換えワクシニア株を用い、最低限の成功を主張するヒト治験が1995年に報告された。この構築体はEBV陽性およびワクシニアウイルスにさらされた成人、EBV陽性、ワクシニアにさらされていない若年者、並びに小児おけるEBVおよびワクシニアウイルス未経験乳児において試験された（Gu et al (1995) Dev Biol Stand. Basel, Karger, 84, 171-177）。しかしながら、EBV関連疾患の研究はなされておらず、乳児および小児を冒さないIMに関して推論を導くことはできなかった。
【００１４】
EBV膜抗原を適切なアジュバントとの組合せで含むサブユニットワクチンを用いるヒトワクチン接種治験において驚くべき結果が見出されている。このワクチンは青年および若年成人の集団においてIMの予防に有効である。これらの結果は期待も予想もされなかった。
【００１５】
前述のEBV感染の実験モデルには、感染性単核球症（IM）の特定の症状、例えば、強度の疲労、リンパ節症、発熱を観察できるものはなかった。さらに、IMワクチンの考え得る防御メカニズムは粘膜抗体の誘導および（ヒトにおいて感染が最初に生じる）口−咽頭から末梢血へのEBVの蔓延の遮断に関連する。そのようなウイルスの蔓延を遮断するワクチンの能力を評価することができる、非経口（最も頻繁には腹腔内）抗原投与および／または口−喉頭におけるウイルスの持続の監視を用いる、報告されている動物モデルは存在しない。さらに、文献に記載される1つのヒト実験は感染性単核球症に関連していなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第1の側面において、本発明は、感染性単核球症（IM）を予防するためのワクチンの製造における、適切なアジュバントとの組合せにあるEBV膜抗原またはそれらの誘導体の使用を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、特には、IMに対して最も感受性の年齢範囲である11〜25歳の年齢範囲にある青年および若年成人の集団において有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
好ましくは、EBV抗原はgp350もしくはgp220またはそれらの誘導体である。誘導体にはgp350／220のトランケート型、ペプチドおよび他の修飾体、例えば、ここに開示されるものまたは当該技術分野において公知のものが含まれる。そのような誘導体には、EBV中和抗体によって認識され、および／またはヒトCD21（別名、CR2）に結合する、gp350または220の直線配列の少なくとも5個の連続するアミノ酸を有するペプチドが含まれる。好ましい誘導体は、gp350／220の残基21−24または25−27の少なくとも1つを含む。
【００１９】
本発明における使用に特に好ましいものはgp350の均一調製品であり、これはgp220が混入していないか、または実質的に混入していないgp350の調製品を意味する。そのような調製品は、例えば、EP 0 769 056に記載されるような組換えgp350の産生によって得ることができる。
【００２０】
本発明における使用に適するアジュバントには、無機塩、例えば、アルミニウムまたはカルシウム塩、特には水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムが含まれる。
【００２１】
好ましくは、アジュバントは非毒性細菌リポ多糖誘導体、例えば、3 De-O-アシル化モノホスホリルリピッドA（3D−MPL）をさらに含む。
【００２２】
別の側面において、本発明は、EBV gp350の均一調製品、無機塩、例えば、アルミニウムまたはカルシウム塩および非毒性細菌リポ多糖誘導体、例えば、3D−MPLを含有するワクチン組成物を提供する。
【００２３】
本発明のこの側面による特に好ましいワクチンは、gp350の均一調製品を水酸化アルミニウムおよび3D−MPLとの組合せで含有する。
【００２４】
最も好ましくは、gp350は、EP 0 769 056に記載されるもののようなgp350／220タンパク質を発現するDNAの非スプライシング変種から調製される組換えgp350である。
【００２５】
別の好ましいアジュバントは、Quillaja Saponaria Molinaの樹皮から誘導されるHPLC精製非毒性画分であるQS21のようなサポニンを含む。任意に、これを3D−MPLと、任意に担体と共に、混合することができる。
【００２６】
QS21の生成方法は米国特許第5,057,540号に開示されている。
【００２７】
QS21を含有する比反応原性アジュバント処方はWO 96/33739に記載されている。そのようなQS21およびコレステロールを含有する処方は、抗原と共に処方するとき、成功したTH1刺激性アジュバントであることが示されている。したがって、本発明はQS21およびコレステロールの組合せを含むアジュバントを用いることができる。
【００２８】
本発明における使用に適するさらなるアジュバントには免疫調節性オリゴヌクレオチド、例えば、WO 96/02555に開示されるような非メチル化CpG配列が含まれる。
【００２９】
上述のもののような異なるアジュバントの組合せもここで説明されるワクチン組成物における使用について考慮される。例えば、既述のように、QS21を3D−MPLと共に処方することができる。QS21：3D−MPLの比は典型的には1：10〜10：1のオーダーであり；好ましくは1：5〜5：1、しばしば実質的に1：1である。最適相乗作用に好ましい範囲は、2.5：1〜1：1 3D−MPL：QS21である。
【００３０】
好ましくは、本発明によるワクチン組成物中には担体も存在する。担体は水中油エマルジョン、または無機塩、例えば、カルシウムもしくはアルミニウム塩、例えば、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウムであり得る。
【００３１】
好ましい水中油エマルジョンは代謝性油、例えば、スクアレン、アルファトコフェロールまたはTween80を含む。加えて、水中油エマルジョンはspan 85および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含むことができる。
【００３２】
ヒト投与に典型的には、QS21および3D−MPLはワクチン中に用量当たり1μg−200μgの範囲、例えば、10−100μg、好ましくは10μg−50μg存在する。典型的には、水中油エマルジョンは2〜10％のスクアレン、2〜10％のアルファトコフェロールおよび0.3〜3％のtween 80を含有する。好ましくは、スクアレン：アルファトコフェロールの比は、これがより安定なエマルジョンを提供するため、1以下である。Span 85も1％のレベルで存在することができる。幾つかの場合においては、本発明のワクチンが安定化剤をさらに含有することが有利であり得る。
【００３３】
非毒性水中油エマルジョンは、好ましくは、非毒性油、例えば、スクアランまたはスクアレン、乳化剤、例えば、Tween80を水性担体中に含有する。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であり得る。
【００３４】
QS21、3D−MPLおよびトコフェロールを水中油エマルジョン中に含む特に強力なアジュバントはWO 95/17210に開示されている。
【００３５】
腸内細菌リポ多糖（LPS）は、アジュバントにおけるその使用はその毒性効果によって削減されているものの、免疫系の強力な刺激因子である。還元末端グルコサミンからの核炭水化物基およびリン酸塩の除去によって生成されるLPSの非毒性誘導体、モノホスホリルリピッドA（MPL）がRibiら（1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins. Plenum Publ. Corp., NY, p407-419）によって記載されており、以下の構造を有する：
【化１】
2010209080.tif 000002
【００３６】
MPLのさらなる解毒体は二糖主鎖の3位からアシル鎖を除去する結果生じ、3−O−脱アシル化モノホスホリルリピッドA（3D−MPL）と呼ばれる。これはGB 2122204Bにおいて教示される方法によって生成および調製することができ、この参考文献はジホスホリルリピッドAおよびそれらの3−O−脱アシル化体の調製も開示する。3D−MPLの好ましい形態は直径が0.2μm未満の小粒子サイズを有するエマルジョンの形態であり、その製造方法はWO 94/21292に開示されている。好ましくは、3D−MPLの粒子は（欧州特許第0 689 454号に記載されるように）0.22ミクロン膜を通して無菌濾過するのに十分な小ささである。
【００３７】
そのようなLPSの誘導体の例は以下に説明される。
【００３８】
本発明において処方しようとする細菌リポ多糖誘導アジュバントは細菌源から精製および処理することができ、または、その代わりに、合成物であってもよい。例えば、精製モノホスホリルリピッドAはRibiら 1986（前出）に記載されており、サルモネラ種から誘導される3−O−脱アシル化モノホスホリルおよびジホスホリルリピッドAはGB 2220211およびUS 4912094に記載されている。他の精製および合成リポ多糖が記載されている（US 6,005,099およびEP 0 729 473 Bl；Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy.Immunol., 79(4):392-6；Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6並びにEP 0 549 074 Bl）。特に好ましい細菌リポ多糖アジュバントは3D−MPL並びにUS 6,005,099およびEP 0 729 473 B1に記載されるβ（1−6）グルコサミン二糖である。
【００３９】
したがって、本発明において用いることができるLPS誘導体はLPSまたはMPLまたは3D−MPLに構造が類似する免疫刺激因子である。本発明の別の側面においては、LPS誘導体は、上記MPLの構造の下位部分であるアシル化単糖であり得る。
【００４０】
CpGと組み合わせるのに好ましい二糖アジュバントは以下の式を有する精製または合成リピッドAである：
【化２】
2010209080.tif 000003
【００４１】
ここで、R2はHまたはP03H2であり得；R3はアシル鎖またはβ−ヒドロキシミリストイルまたは以下の式を有する3−アシルオキシアシル残基であり得： 
【化３】
2010209080.tif 000004
【００４２】
ここで、
【化４】
2010209080.tif 000005
【００４３】
並びにXおよびYは0から約20までの値を有する。
【００４４】
サポニンは：Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)において教示される。サポニンは植物および海洋動物界に広く分布するステロイドもしくはトリテルペングリコシドである。サポニンは水中でのコロイド溶液（これは振盪によって泡立つ）の形成について、およびコレステロールの沈殿について注目される。サポニンが細胞膜近くに位置するとき、それらは膜内に細孔様構造を創出し、それが膜を破裂させる。赤血球の溶血がこの現象の例であり、これが、すべてではないが、サポニンの一つの特性である。
【００４５】
サポニンは全身投与のためのワクチンにおけるアジュバントとして公知である。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血活性は当該技術分野において広範囲に研究されている（Lacaille-Dubois and Wagner、前出）。例えば、（南アメリカ樹木Quillaja Saponaria Molinaの樹皮から誘導される）Quil Aおよびそれらの画分はUS 5,057,540および"Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55；およびEP 0 362 279 B1に記載されている。Quil Aの画分を含有する、免疫刺激複合体（ISCOMS）と呼ばれる粒子構造は溶血性であり、ワクチンの製造において用いられている（Morein, B., EP 0 109 942 Bl；WO 96/11711；WO 96/33739）。溶血性サポニンQS21およびQS17（Quil AのHPLC精製画分）は強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの生成方法は米国特許第5,057,540号およびEP 0 362 279 B1に開示されている。全身ワクチン接種の研究において用いられている他のサポニンには、他の植物種、例えば、GypsophilaおよびSaponariaから誘導されるものが含まれる（Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992）。
【００４６】
本発明のワクチンは免疫防御量の抗原を含み、通常の技術によって調製することができる。
【００４７】
ワクチン調製は、Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, 1995に一般的に記載されている。New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978。リポソーム内への封入は、例えば、Fullerton、米国特許第4,235,877号によって記載されている。巨大分子へのタンパク質の結合は、例えば、Likhite、米国特許第4,372,945号およびArmorら、米国特許第4,474,757号によって開示される。
【００４８】
各々のワクチン投与におけるタンパク質の量は典型的な被ワクチン接種者における重大な有害副作用なしに免疫保防御応答を誘導する量として選択される。この文脈における免疫防御は必ずしも感染に対する完全な防御を意味するものではない；ウイルスに関与する疾患、すなわち、感染性単核球症に対する防御を意味する。抗原の量はどの特定免疫原が用いられるかに応じて変化する。一般には、各々の用量が1〜l000μgのタンパク質、好ましくは2〜100μg、最も好ましくは10〜50μgを含むことが期待される。特定のワクチンに最適な量は被験者における抗体力価および他の応答の観察を含む標準的な研究によって確認される。最初のワクチン接種に続いて、被験者は約4週間で追加接種を受けることができる。
【実施例】
【００４９】
実施例1
材料および方法
研究集団
この第1の研究は、ベルギーのLiege大学で、EBV感染の血清学的マーカーについて陽性または陰性のいずれかであり、したがって、それぞれEBV感染および感染性単核球症の危険性がなく、または危険性がある、18〜25歳の67名の健常ボランティアにおいて行われた。研究センターからの現地倫理委員会認可および各被験者の文書化されたインフォームドコンセントは得た。子供を出産する年齢の女性は研究の最初の7ヶ月の間適切に避妊することに同意した。
【００５０】
排除基準は研究参加の時点での急性疾患の臨床的徴候、感染性単核球症の病歴、主要な先天的欠陥もしくは深刻な慢性病、副腎皮質ステロイドを含む免疫抑制剤でのあらゆる慢性的な治療、あらゆる免疫抑制もしくは免疫不全状態、慢性的なアルコール中毒および／または静脈内薬物乱用のあらゆる履歴、ワクチン成分に対する感受性のあらゆる履歴、あらゆる他の臨床治験における同時参加、妊娠もしくは授乳、あらゆる他のワクチンの同時投与、研究の間もしくは第1ワクチン投与に先立つ3ヶ月以内の免疫グロブリンの投与が含まれていた。
【００５１】
ワクチン
ワクチンはGlaxoSmithKhne Biologicals（Rixensart、ベルギー）によって処方された。単用量バイアル中のgp350ワクチンの各0.5ml用量は、0.5mgの水酸化アルミニウム（Al（OH）3）に吸着されているか、または0.5mgの水酸化アルミニウムおよび50μgの3D−MPLと共に処方されている、50μgのgp350を含んでいた。gp350はチャイニーズハムスター卵巣細胞において培養培地中で発現するトランケート型産生物として、および（EP 769 056, Jackmanらに記載されるような）gp220イソ型が存在しないgp350の産生を可能にする突然変異形態において産生された。接着性産生細胞株の培養はウシ胎児血清の存在下で行った。その後、Jackmanらによって記載される方法に従ってgp350を培養上清から精製した。
【００５２】
研究設計
研究は、2種類のワクチン処方を0−1−6ヶ月スケジュールに従って投与する二重盲験、無作為化研究であった。被験者は第7日まで各ワクチン投与後にダイアリーカードに誘起された、および誘起されていない徴候および症状を記録し、第28日まで有害事例について被験者を追跡調査した。抗gp350抗体力価に加えて抗EBV抗体（非ワクチン抗原に対する抗体、EBV感染のマーカー）を決定するため、血液サンプルを第0、1、2、6および7月に抜き取った。追加の来院を第3年に計画した。その前の来院以来3年間にわたる感染性単核球症の発症について被験者にインタビューし、抗gp350免疫性およびEBV感染状態を決定するために血液サンプルを抜き取った。
【００５３】
免疫学的試験
すべてのサンプルは盲験方式で分析した。抗gp350抗体はGlaxoSmitbKline Biologicalsで開発されたELISAを用いて決定した。抗EBV（非ワクチン抗原）抗体はウイルスカプシド抗原に特異的な市販のELISAキットを用いて決定し、免疫蛍光アッセイによって確認した。ELISAと免疫蛍光との不一致は再試験および免疫蛍光およびELISAアッセイ（抗−VCA、−EA、−EBNA、−p107）のパネルを用いる外部研究所（Swedish Institute for Infectious Disease Control、ストックホルム、スウェーデン）でのさらなるEBV試験によって解決した。血清の中和力価は、EBVによる新鮮なヒトBリンパ球の不死化を阻害するそれらの能力によって測定した。同様に、EBV特異的細胞介在免疫性を、EBV感染による不死化を阻害する患者リンパ球の能力によって評価した（増殖阻害アッセイ）。
【００５４】
統計法：
ワクチン接種されたEBV血清陰性被験者における症例の発生率を同様の年齢の非ワクチン接種血清陰性被験者における予想発生率と比較するのに二項検定を用いた。算出はUnistat Statistical Package（Unistat Ltd、英国）を用いて行った。
【００５５】
結果および考察
EBV感染症例
gp350／Alumまたはgp350／Alum＋3D−MPLおよびgp350処方のいずれかをワクチン接種され、第7月でEBV感染のマーカーについて血清陰性であった合計17名の被験者が第3年来院に参加した。彼らのうちの9名はAlum処方されたワクチンを接種され、8名はAlum＋3D−MPL処方であった。彼ら全員を2回の研究来院の間の3年間にわたるEBV感染について評価した。結果を下記表1に示す。
【表１】
2010209080.tif 000006
【００５６】
合計で、17名のワクチン接種被験者のうちの4名が3年にわたる期間でEBVに感染した。より正確には、636月×被験者の合計追跡調査で4症例の割合が観察された。すべてのワクチン接種被験者は第7月にgp350抗体を投与されており、したがって、これらのデータは抗gp350免疫の誘導にもかかわらずEBV感染がワクチン接種被験者において生じることを示す。
【００５７】
非ワクチン接種EBV血清陰性若年青年の集団におけるEBV感染の年間攻撃率は少なくとも12％に達することが報告されている（Evans and Niederman, Epstein-Barr virus, in Viral Infections of Humans, epidemiology and control. 1991: pp 265-292. Plenum medical book companyによる論評)。この攻撃率のより正確な見積もりを得るため、ベルギーにおいて、この臨床試験に参加している同じ大学集団の間で、血清疫学的研究も行った。17〜46歳の被験者から800を超える血清サンプルを得、それらのEBV血清学的状態を抗VCA ELISA試験および免疫蛍光法によって決定した。次に、そのデータをコンピュータ処理し、EBV血清陰性被験者の割合を年齢に従ってモデリングした。一定比率の血清陰性青年／若年成人におけるEBV感染を仮定し、したがって、このデータに一致するように指数関数的回帰曲線を算出した。以下の式が得られた：
y＝161.14e−0.1269x
y＝x歳での血清陰性被験者のパーセンテージ、およびx＝年表示の年齢。この式は、我々の危険性のある青年／若年成人の集団におけるEBV感染の推定年間攻撃率の算出を可能にし、それは11.9％に等しいことが見出され、12％に近似された。
【００５８】
12パーセントのEBV感染の年間攻撃率は血清陰性非ワクチン接種被験者における100月×被験者の追跡調査当たり1予想感染症例に相当する。研究番号1のワクチン接種被験者において観察された症例の割合（4／636月×被験者）と非ワクチン接種被検種において予想される割合（1／100月×被験者）との間に有意の差は見られなかった。したがって、このデータは、gp350／Alumまたはgp350／Alum＋3D−MPLのいずれかをワクチン接種した我々の研究集団におけるEBV感染に対する防御の欠如を示唆する。
【００５９】
感染性単核球症症例
上述のように、第7月にEBV感染のマーカーについて血清陰性であった、gp350／Alumまたはgp350／Alum＋3D−MPLのいずれかをワクチン接種された合計で17名の被験者が第3年来院に参加した。彼らのうちの1名のみが感染性単核球症に一致する症状を報告した（第38月に、1週間〜1ヶ月の範囲の持続期間の発熱、倦怠感／疲労感、咽頭炎、リンパ肥大）。しかしながら、その被験者の免疫学的プロフィールはEBV関連感染性単核球症の発症を裏付けることはなかった（ウイルスカプシド抗原IgGおよびIgM ELISA陰性、EBV免疫蛍光陰性、gp350 ELISA陰性、EBV中和陰性並びにEBV細胞介在免疫性陰性）。したがって、17名の被験者は3年の期間にわたってEBV感染から生じる感染性単核球症を発症していないものと結論付けられた。より正確には、636被験者×月の合計追跡調査に対して感染性単核球症の症例は検出されなかった。
【００６０】
非ワクチン接種EBV血清陰性若年成人の集団において感染性単核球症の年間攻撃率を定める研究はほとんど行われていない。入手可能な疫学的データ（Evans and Niederman, 1993；およびD. Crawfordの私信）からは、7パーセントの感染性単核球症の年間発生率を感受性被験者の集団において予想することができる。しかしながら、この公開データは合衆国および英国においてのみ実施された調査から得られたものである。次に、ベルギーにおけるこの疾患の発生率を評価するため、遡及的疫学的調査を開始した。質問表を3つの異なる集団に配布した（GlaxoSmithKline Biologicalsの職員、Liege大学獣医学部の学生およびフランス語を話すブリュッセルの学校の選択されたクラス）。3597の回答が得られた。これらは13〜66歳（平均27.9歳）の被験者に相当し、男性の女性に対する比は0.82であった。彼らのほぼ1／5は感染性単核球症の病歴を報告した。血清陰性被験者におけるこの疾患の対応する発生率を決定するため、上述の血清疫学的研究から算出された式を用いた。16〜25歳の各年齢について、その年齢以上の被験者からの回答数を（式から得られる）その年齢の血清陰性被験者パーセンテージで乗することにより血清陰性被験者の推定数を得た。次に、その年齢で報告された感染性単核球症症例のパーセンテージを算出した。全体として、16〜25歳で、血清陰性被験者における感染性単核球症の算出年間発生率は調査したベルギー人集団において9.2パーセントに達することが見出された。これらの症例の約10％はエプスタイン・バー感染というよりもサイトメガロウイルスに関連するものと考えることができ、したがって、EBV関連感染性単核球症の8パーセントの年間発生率が研究番号1に参加する者に匹敵する非ワクチン接種集団において生じるものと予想することができる。
【００６１】
疾患の8パーセントの年間発生率は非ワクチン接種被験者における150月×被験者の追跡調査当たり1予想感染性単核球症症例に相当する。ワクチン接種被験者において観察された症例の割合（0／17被験者）と非ワクチン接種被験者において予想される数（1／150月×被験者、これは我々の治験においては4症例に相当する）との差は統計的有意（p＜0.12）に比較的近かった。したがって、このデータは、感染性単核球症に対して防御するワクチンの効力を示唆する。実施例2（下記参照）との組合せにおいて、そのようにすることで統計解析を行うより巨大でより現実的な集団サンプルが生じるが、これらの結果は統計的に有意であることが見出される。
【００６２】
実施例2
材料および方法
研究集団
第2研究は2つのセンター、Liege大学およびLouvainのカトリック大学において、全員がEBV感染の血清学的マーカーについて陰性であり、したがって、EBV感染および感染性単核球症の危険性がある、18−45歳の81名の健常ボランティアにおいて行った。各々の被験者に対する地域倫理委員会の認可および文書化されたインフォームドコンセントは得た。子供を出産する年齢の女性は研究の持続期間適切な避妊を用いることに同意した。
【００６３】
排除基準は研究参加の時点での急性疾患の臨床的徴候、感染性単核球症の病歴、主要な先天的欠陥もしくは深刻な慢性病、副腎皮質ステロイドを含む免疫抑制剤でのあらゆる慢性的な治療、あらゆる免疫抑制もしくは免疫不全状態、慢性的なアルコール中毒および／または静脈内薬物乱用の履歴、ワクチン成分に対する感受性のあらゆる履歴、あらゆる他の臨床治験における同時参加、妊娠もしくは授乳、あらゆる他のワクチンの同時投与、研究の間もしくは第1ワクチン投与に先立つ3ヶ月以内の免疫グロブリンの投与が含まれていた。
【００６４】
ワクチン
3種類の異なるワクチン処方を研究番号2において評価した。単用量バイアル中のgp350ワクチンの各0.5ml用量は、0.5mgの水酸化アルミニウム（Al（OH）3）に吸着されている非アジュバント化の、または0.5mgの水酸化アルミニウムおよび50μgの3D−MPLと共に処方されている、50μgのgp350を含んでいた。gp350はチャイニーズハムスター卵巣細胞において培養培地中で発現するトランケート型産生物として、およびgp220イソ型が存在しないgp350の産生を可能にする突然変異形態（EP 769 056, Jackmanらを参照）において産生された。産生細胞株の培養は血清非含有培地中の懸濁液において行った。その後、gp350を培養上清から精製した。
【００６５】
研究設計
この研究は、3種類のワクチン処方を0−1−6月スケジュールに従って投与する二重盲験、無作為化研究であった。被験者は第7日まで各ワクチン投与の後にデイリーカードに誘起された、および誘起されていない徴候および症状を記録し、第28日まで有害事例について被験者を追跡調査した。抗gp350抗体力価に加えて抗EBV抗体（非ワクチン抗原に対する抗体、EBV感染のマーカー）を決定するため、第0、1、2、6および7月に血液サンプルを抜き取った。
【００６６】
免疫学的試験
すべてのサンプルは盲験方式で分析した。抗gp350抗体は自社製ELISAを用いて決定した。抗EBV（非ワクチン抗原）抗体はウイルスカプシド抗原に特異的な市販のELISAキットを用いて決定し、免疫蛍光アッセイによって確認した。血清の中和力価は、EBVによる新鮮なヒトBリンパ球の不死化を阻害するそれらの能力によって測定した。同様に、EBV特異的細胞介在免疫性は、EBV感染による不死化を阻害する被験者のリンパ球の能力によって評価した（増殖阻害アッセイ）。
【００６７】
統計的方法：
ワクチン接種EBV血清陰性被験者における症例の発生率を同様の年齢の非ワクチン接種血清陰性被験者における予想発生率と比較するのに二項検定を用いた。算出はUnistat Statistical Package（Unistat Ltd、英国）を用いて行った。
【００６８】
結果および考察：
EBV感染症例
研究番号2の7ヶ月の持続期間にわたって検出されたEBV感染症例の数を下記表2に示す。
【表２】
2010209080.tif 000007
【００６９】
第7月で、81名のワクチン接種被験者のうちの6名が抗体陽転していた。より正確には、551月×被験者の合計追跡調査について6症例の割合が観察された。これらの6感染症例のうちの5例は、第2ワクチン注射の1ヶ月を超えた後、（非アジュバント化ワクチンで免疫されている群からの）2名を除く全ての被験者でgp350に対する抗体が生じており、したがって、防御が誘導されるものと期待される時点で生じた。
【００７０】
上述のように、非ワクチン接種EBV血清陰性若年青年の集団におけるEBV感染の年間攻撃率は少なくとも12％である。これは非ワクチン接種被験者における100月×被験者の追跡調査当たり1予想感染症例に相当する。ワクチン接種被験者において観察される症例の割合（6／81被験者または6／551月×被験者）と非ワクチン被験者において予想される割合（1／100月×被験者）との間に差は見られなかった。したがって、このデータは、gp350／Alum、gp350／Alum＋3D−MPLまたはgp350単独のいずれかをワクチン接種された我々の研究集団におけるEBV感染に対する防御を支持しない。
【００７１】
感染性単核球症症例
上述のように、合計で81名の被験者にgp350／Alum、gp350／Alum＋3D−MPLまたはgp350単独のいずれかをワクチン接種した。これらの被験者のうち、治験の間に感染性単核球症と一致する症状を報告した者はいなかった。換言すると、551被験者×月の合計追跡調査で感染性単核球症の症例は検出されなかった。上述のように、ベルギーでの非ワクチン接種EBV血清陰性若年青年の集団における感染性単核球症の予想年間攻撃率は8パーセント、すなわち、非ワクチン接種被験者における150月×被験者の追跡調査当たり1感染性単核球症症例に等しい。ワクチン接種被験者において観察される症例の割合（0／81被験者）と非ワクチン接種被験者において予想される割合（1／150月×被験者＝7ヶ月にわたって81名の被験者について4症例）との差は、統計的有意（p＜0.2）に完全に到達してはいないものの、明確であった。この研究設計の統計的能力の欠如（比較的少数の被験者および短い持続期間の追跡調査）は症例の割合における差に対するいかなる統計的結論付けをも妨げた。しかしながら、それにもかかわらず、このデータは感染性単核球症に対して防御するワクチンの効力を支持するものと考えられる。
【００７２】
実施例1および2からのデータのプール
研究1および2のEBVワクチン接種被験者の結果を組み合わせることにより、合計で98名の被験者が12ヶ月の平均持続期間追跡調査を受け、彼らのうちで感染性単核球症を発症した者はいなかった。この数字は非ワクチン接種血清陰性被験者における8パーセント疾患の予想年間発生率と統計的に異なる（P＜0.02）。したがって、我々は、危険性のある青年／若年成人での感染性単核球症の予防におけるEBV gp350ワクチンの効力を結論付けることができる。