(57)【要約】【課題】目的とする液体試料が微量でも基板上の所定箇所に安定して保持でき、該液体試料中の光シグナルを簡便且つ高精度に検出できる光シグナルの検出方法、及び該検出方法を利用して、光シグナルをリアルタイムで検出できる核酸増幅方法の提供。【解決手段】基板１の表面１１に設けられた親水性領域１１１に液体試料１０を保持し、液体試料１０よりも比重が小さく、液体試料１０とは混和しない被覆液１５で、保持された液体試料１０を被覆し、基板１に対向させて基板４を配置して、基板１及び４間で液体試料１０を挟持し、液体試料１０中の光シグナルをリアルタイムに検出する。液体試料１０として核酸増幅を行う反応液を挟持して核酸増幅反応を行い、反応液中の増幅核酸に由来する光シグナル、又は増幅核酸を標識する標識物質に由来する光シグナルを検出して、反応液中の核酸増幅量を定量する。【選択図】図６
2010158201.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上の液体試料中の光シグナルを検出する方法であって、
第一の基板の表面に設けられた親水性領域に液体試料を保持し、
前記液体試料よりも比重が小さく、前記液体試料とは混和しない被覆液で、保持された前記液体試料を被覆し、
前記第一の基板に対向させて第二の基板を配置して、該第一及び第二の基板間で前記液体試料を挟持し、
挟持した前記液体試料中の光シグナルをリアルタイムに検出することを特徴とする光シグナルの検出方法。
【請求項２】
前記第一の基板の表面には、第一親水性領域と、該第一親水性領域周縁部を包囲する第一撥水性領域とが設けられ、前記第一親水性領域に前記液体試料を保持することを特徴とする請求項１に記載の光シグナルの検出方法。
【請求項３】
前記第一の基板の表面には、さらに、前記第一撥水性領域の外側周縁部を包囲する第二親水性領域と、該第二親水性領域の外側周縁部を包囲する第二撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項２に記載の光シグナルの検出方法。
【請求項４】
前記第二の基板の表面には、前記第一の基板と同じパターンの親水性領域が設けられ、前記液体試料が、互いに位置合わせされた前記第一及び第二の基板の親水性領域間で挟持されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の光シグナルの検出方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の光シグナルの検出方法を利用する核酸増幅方法であって、
前記液体試料として核酸増幅を行う反応液を挟持して核酸増幅反応を行い、前記反応液中の増幅核酸に由来する光シグナル、又は増幅核酸を標識する標識物質に由来する光シグナルを検出して、前記反応液中の核酸増幅量を定量することを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項６】
核酸増幅サイクル一回あたりに、一回以上光シグナルを検出することを特徴とする請求項５に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
逆転写反応後に前記核酸増幅反応を行うことを特徴とする請求項５又は６に記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
細胞を前記第一の基板の表面に分取し、分取した前記細胞の少なくとも一部が前記親水性領域に位置することを確認し、前記親水性領域において核酸増幅反応に必要な液体に前記細胞を浸漬させて得られた液体を前記反応液として使用することを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
鋳型核酸を前記第一の基板の親水性領域に配置し、核酸増幅反応に必要な液体を前記親水性領域に分注して得られた液体を前記反応液として使用することを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上に保持された液体試料中の光シグナルの検出方法、及び該検出方法を利用する核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学分野において、ＤＮＡやＲＮＡの検出を活用した診断が注目を集めている。また、農業分野においても、遺伝子組み換え作物の品種判定に、ＤＮＡ鑑定が活用されている。このような診断や品種判定は、血液、組織、細胞等のヒト由来の試料や、作物由来の試料中における、標的とするＤＮＡ又はＲＮＡの有無、あるいは塩基配列の違い（変異等）を検出することで行われるが、試料中の標的とするＤＮＡやＲＮＡは、微量である場合が多い。そこで、このような診断や品種判定に先立って、試料中に含まれるこれらＤＮＡやＲＮＡを増幅することが必要となる。
【０００３】
これに対して、試料中の標的ＤＮＡを特異的に増幅する方法として、各種の核酸増幅反応が提案されている。特にポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）法による核酸増幅反応は、バイオテクノロジー分野における基本技術として確立されている。標的がＲＮＡである場合には、逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を行ってから、ＰＣＲを行う方法（ＲＴ−ＰＣＲ法）が適用される。
【０００４】
ＰＣＲ法では、鋳型ＤＮＡ、プライマー、基質、耐熱性ポリメラーゼなどを混合して反応液を調製し、その温度を所定の３通り又は２通りに順次設定して、これを１５〜４０回程度繰り返すことで、目的とするＤＮＡの増幅産物が多量に得られる。
ＲＴ−ＰＣＲ法では、試料中のＲＮＡを高温で変性させた後、逆転写酵素を使用して、恒温でＲＮＡを一旦ＤＮＡに逆転写した後、ＰＣＲ法を適用することで、同様にＤＮＡの増幅産物が多量に得られる。
そして、従来のＰＣＲでは、反応容器としてマイクロチューブを使用し、その中に試料やＰＣＲプライマー等、増幅反応に必要な成分を含む反応液を入れて、このマイクロチューブ内の反応液を所定の温度に設定する方法が採用されてきた。しかし、マイクロチューブを使用するために、反応液として相応の量が必要であり、試料が微量である場合には、上記のような診断や品種判定を行えないという問題点があった。
これに対して、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を、基板上で保持した反応液中で行う方法が開示されている（特許文献１〜３参照）。
【０００５】
特許文献１では、表面にくぼみや溝等が設けられたガラス板等を使用し、これらくぼみや溝等が設けられた表面を開放するようになっているＰＣＲ槽を使用して、核酸増幅反応を行う方法が開示されている。
特許文献２では、ガラス板からなる第一層とシリコンゴムからなる第二層が積層され、第二層には第一層との接触面側に微細な溝加工が施されて、第一層と第二層との間で空隙部が形成された基板を使用し、その空隙部で核酸増幅を行う方法が開示されている。この方法によれば、前記空隙部の容積が小さいので、反応液量が少なくて済み、ごく少量の試料でも核酸増幅を行うことができる。
特許文献３では、撥水膜をコートした基板上にオイルなどの液体層を形成し、その液体層中にインクジェット技術などで微量液滴（液量４０ｐｌ程度）を打ち込むことで、微量液滴を基板上で蒸発を抑制しながら保持する技術が開示されている。この方法によれば、微量液滴中の光シグナルを容易に検出でき、さらにＰＣＲなども行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−８３９６５号公報
【特許文献２】特開２００６−１１５７４１号公報
【特許文献３】特許第３１２０４５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１及び２に記載の方法では、基板に使用するガラスの加工が複雑であるという問題点があった。また、特許文献１及び２に記載の方法では、核酸増幅時に光シグナルをリアルタイムに検出できないという問題点があった。さらに、特許文献1に記載の方法では、核酸増幅時に細胞から核酸を抽出する際に、基板上の所定箇所への細胞の配置及び配置箇所の確認が困難であるという問題点があった。
一方、特許文献３に記載の方法では、微量液滴の打ち込みは手作業では行うことができず、インクジェット技術が必要で操作が煩雑になるという問題点があった。また、予め基板上に細胞を配置して乾燥させたり、鋳型ＤＮＡを分注して乾燥させてから、さらに反応に必要な液体を分注する場合には、オイル中に細胞や鋳型ＤＮＡが流出してしまう可能性があり、さらに、細胞や鋳型ＤＮＡが配置箇所から移動してしまう可能性があるという問題点があった。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、目的とする液体試料が微量でも基板上の所定箇所に安定して保持でき、該液体試料中の光シグナルを簡便且つ高精度に検出できる光シグナルの検出方法、及び該検出方法を利用して、光シグナルをリアルタイムで検出できる核酸増幅方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、基板上の液体試料中の光シグナルを検出する方法であって、
第一の基板の表面に設けられた親水性領域に液体試料を保持し、前記液体試料よりも比重が小さく、前記液体試料とは混和しない被覆液で、保持された前記液体試料を被覆し、前記第一の基板に対向させて第二の基板を配置して、該第一及び第二の基板間で前記液体試料を挟持し、挟持した前記液体試料中の光シグナルをリアルタイムに検出することを特徴とする光シグナルの検出方法である。
請求項２に記載の発明は、前記第一の基板の表面には、第一親水性領域と、該第一親水性領域周縁部を包囲する第一撥水性領域とが設けられ、前記第一親水性領域に前記液体試料を保持することを特徴とする請求項１に記載の光シグナルの検出方法である。
請求項３に記載の発明は、前記第一の基板の表面には、さらに、前記第一撥水性領域の外側周縁部を包囲する第二親水性領域と、該第二親水性領域の外側周縁部を包囲する第二撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項２に記載の光シグナルの検出方法である。
請求項４に記載の発明は、前記第二の基板の表面には、前記第一の基板と同じパターンの親水性領域が設けられ、前記液体試料が、互いに位置合わせされた前記第一及び第二の基板の親水性領域間で挟持されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の光シグナルの検出方法である。
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の光シグナルの検出方法を利用する核酸増幅方法であって、前記液体試料として核酸増幅を行う反応液を挟持して核酸増幅反応を行い、前記反応液中の増幅核酸に由来する光シグナル、又は増幅核酸を標識する標識物質に由来する光シグナルを検出して、前記反応液中の核酸増幅量を定量することを特徴とする核酸増幅方法である。
請求項６に記載の発明は、核酸増幅サイクル一回あたりに、一回以上光シグナルを検出することを特徴とする請求項５に記載の核酸増幅方法である。
請求項７に記載の発明は、逆転写反応後に前記核酸増幅反応を行うことを特徴とする請求項５又は６に記載の核酸増幅方法である。
請求項８に記載の発明は、細胞を前記第一の基板の表面に分取し、分取した前記細胞の少なくとも一部が前記親水性領域に位置することを確認し、前記親水性領域において核酸増幅反応に必要な液体に前記細胞を浸漬させて得られた液体を前記反応液として使用することを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅方法である。
請求項９に記載の発明は、鋳型核酸を前記第一の基板の親水性領域に配置し、核酸増幅反応に必要な液体を前記親水性領域に分注して得られた液体を前記反応液として使用することを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、目的とする液体試料が微量でも基板上の所定箇所に安定して保持でき、液体試料中の光シグナルを簡便且つ高精度に検出できる。また、光シグナルをリアルタイムで検出しながら核酸を増幅できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明における、表面に親水性領域が設けられた基板を例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線における断面図である。
【図２】本発明における、表面に親水性領域が設けられた基板の他の例を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における断面図である。
【図３】本発明における、アダプターを設けた第一の基板を例示する斜視図である。
【図４】本発明における、アダプターを設けた第一の基板の他の例を示す斜視図である。
【図５】本発明における、アダプターを設けた第一の基板の他の例を示す斜視図である。
【図６】本発明において、第一及び第二の基板間で液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。
【図７】本発明の他の実施形態において、第一及び第二の基板間で液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。
【図８】本発明のさらに他の実施形態において、第一及び第二の基板間で液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。
【図９】本発明のさらに他の実施形態において、第一及び第二の基板間で液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。
【図１０】本発明のさらに他の実施形態において、第一及び第二の基板間で液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。
【図１１】本発明のさらに他の実施形態において、第一及び第二の基板間で液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。
【図１２】実施例１における蛍光シグナルの検出結果を示すグラフである。
【図１３】比較例１における蛍光シグナルの検出結果を示すグラフである。
【図１４】実施例１及び比較例１における蛍光シグナルの検出結果から算出したＣｔ値を示すグラフである。
【図１５】実施例２における蛍光シグナルの検出結果を示すグラフである。
【図１６】実施例３における光シグナルの検出結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照しながら、本発明について詳しく説明する。
＜光シグナルの検出方法＞
本発明に係る光シグナルの検出方法は、基板上の液体試料中の光シグナルを検出する方法であって、第一の基板の表面に設けられた親水性領域に液体試料を保持し、前記液体試料よりも比重が小さく、前記液体試料とは混和しない被覆液で、保持された前記液体試料を被覆し、前記第一の基板に対向させて第二の基板を配置して、該第一及び第二の基板間で前記液体試料を挟持し、挟持した前記液体試料中の光シグナルをリアルタイムに検出することを特徴とする。ここで、「リアルタイムに検出する」とは、「所望のタイミングで検出する」ことを指す。
【００１３】
本発明においては、まず、第一の基板の表面に設けられた親水性領域に液体試料を保持する。ここで、「親水性領域に液体試料を保持する」とは、液体試料を、その少なくとも一部が親水性領域内に位置するように保持することを指す。そして本発明においては、液体試料を、その全量が親水性領域内に位置するように保持することが好ましい。このようにすることで、液体試料の基板表面における移動が抑制されて、液体試料を安定して基板上で保持できる。
【００１４】
液体試料としては、目的に応じて所望のものを使用できる。なかでも好ましいものは、水溶液等の親水性の液体試料である。該親水性の液体試料としては、好ましいものとして核酸を含む試料が例示でき、より好ましいものとして、核酸増幅反応を行う反応液が例示できる。
【００１５】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド等いずれでも良い。そして、核酸増幅反応は特に限定されず、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する）法等、公知のいずれの方法でも良い。
【００１６】
反応液中の核酸は、例えば、増幅反応で得られた増幅核酸、増幅反応時に鋳型となる核酸、増幅核酸の原料となる核酸、プライマー等である。すなわち、反応液としては、酵素などの増幅反応に必要な各成分を含有する増幅反応開始前の反応液や、増幅反応中の反応液が例示できる。これら反応液は、通常水溶液である。
【００１７】
核酸増幅をＰＣＲ法で行う場合、鋳型となる核酸としてＤＮＡを使用しても良いし、鋳型となる核酸としてＲＮＡを使用して、逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）反応を行ってから核酸増幅反応を行っても良い（ＲＴ−ＰＣＲ）。
【００１８】
液体試料として核酸増幅反応を行う反応液を使用する場合、該反応液は公知の手法を適用して種々準備できる。
例えば、第一の基板の親水性領域に、予め調製済みの反応液を配置しても良いし、前記親水性領域で反応液を調製して直ちに核酸増幅を行っても良い。
前記親水性領域で反応液を調製する場合、例えば、予め調製済みの鋳型核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を前記親水性領域に配置し、ここへ核酸増幅反応に必要な液体を分注して得られた鋳型核酸を含む液体を反応液としても良い。あるいは第一の基板の表面に細胞を分取し、分取した前記細胞の少なくとも一部が前記親水性領域に位置することを確認し、前記親水性領域に、核酸増幅反応に必要な液体を分注して前記細胞を浸漬させて得られた核酸を含む液体を反応液としても良い。この場合、基板を使用することで、細胞の分取及び位置確認は極めて容易となる。
これらの方法では、核酸の分解を抑制するために、核酸増幅反応に必要な液体を分注する前の鋳型となる核酸あるいは細胞を乾燥させても良い。
【００１９】
液体試料中の光シグナルは、光学的に検出可能なシグナルであれば特に限定されず、本発明の光シグナルの検出方法を適用する対象に応じて、任意に選択できる。
前記光シグナルとしては、例えば、液体試料として前記反応液を使用する場合には、反応液中の核酸、又は該核酸を標識する標識物質などに由来する光シグナルが例示できる。ここで「核酸を標識する標識物質」とは、核酸に共有結合している標識物質、又は核酸と共有結合せずに相互作用する標識物質のことを指す。この場合の光シグナルは、反応液中の核酸や標識物質などが、励起光の照射等により励起された結果発するものである。
また、発光を伴う反応を行い、この時の光シグナルを検出するようにしても良い。発光を伴う反応としては、種々の酵素反応が例示でき、例えば、ルシフェラーゼ存在下でのＡＴＰとルシフェリンとの反応が挙げられる。例えば、ＡＴＰは、ＡＴＰスルフリラーゼ等の酵素を使用してピロリン酸（ＰＰｉ）から得られ、ピロリン酸は核酸増幅時に生成されるので、ルシフェラーゼを使用する上記反応により、核酸増幅反応を追跡できる。
本発明においては、挟持した反応液中で核酸増幅反応行い、該反応液中の光シグナルをリアルタイムに検出して核酸増幅量を定量することにより、核酸増幅量をリアルタイムに確認できる。
【００２０】
前記標識物質としては、好ましいものとして蛍光物質が例示できる。
そして、該蛍光物質としては、公知の如何なるものも使用でき特に限定されない。具体的には、フルオレセイン、ローダミン（ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ等）、アクリフラビン、アレクサ（アレクサ６４７等）、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）等が例示できる。
例えば、サイバーグリーンＩ（ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ）は、二重らせん構造を形成している核酸と特異的にインターカレートし、その結果、青色光（波長４８８ｎｍ）を吸収し、緑色光(波長５２２ｎｍ)の蛍光を発することが知られている。したがって、サイバーグリーンＩを含む反応液を増幅反応に供して核酸を増幅すると、増幅された核酸の二重らせんにサイバーグリーンＩがインターカレートするので、励起光を照射すると蛍光を発し、この時の蛍光強度は、増幅された核酸の量に比例する。
【００２１】
標識物質は一種を単独で用いても良いし、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率等は、目的に応じて適宜選択し得る。
また、増幅核酸に導入する標識物質の量も、目的に応じて適宜選択し得る。
【００２２】
液体試料の量は、目的に応じて適宜設定すれば良い。本発明の光シグナルの検出方法は、特に液体試料が微量である場合に、優れた効果を発揮する。このような液体試料の量は、好ましくは０．５〜１０μｌ、より好ましくは１〜３μｌである。下限値以上とすることにより、光シグナルを容易に検出でき、上限値以下とすることにより、一度に多数の液体試料を検出に供することができると共に、試薬の使用量を低減できるので、光シグナルを高効率かつ低コストで検出できる。
また、被覆液の量は、液体試料の露出部位を被覆できる範囲で選択すれば良いが、液体試料の量に応じて、第一及び第二の基板間で高い安定性で液体試料を挟持できる範囲内で選択することが好ましい。このような好ましい被覆液の量を、対応する液体試料の量と共に表１に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
第一及び第二の基板の材質は特に限定されないが、第一又は第二の基板を介して、反応液中に励起光を照射したり、光シグナルを検出する場合、当該基板は透光性の材質からなるものとする。ここで、透光性の材質とは、光の透過率が高く且つ自家蛍光の少ない材質を指し、具体的にはガラス類や透明な樹脂類が例示できる。なかでも好ましいものとしては、水板ガラス、白板ガラス、ハーフホワイトガラス等のガラス類が例示できる。本発明においては、第一及び第二の基板の材質がいずれも透光性であることが好ましい。
【００２５】
基板は、表面及び裏面が平滑なものが好ましい。ここで、基板の表面とは、後記する試料保持部が設けられている側の基板の面を指し、基板の裏面とは、前記表面とは反対側の基板の面を指す。
基板の大きさは特に限定されず、例えば表面及び裏面の大きさは、目的に応じて適宜選択し得る。また、基板の厚さも目的に応じて適宜選択し得るが、強度も考慮して取り扱いのし易さという観点からは、０．９〜１．１ｍｍであることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、次いで、保持された前記液体試料を被覆液で被覆する。これにより、液体試料の露出部位が被覆されて、溶媒成分の蒸発が抑制される。
被覆液は、前記液体試料よりも比重が小さく、前記液体試料とは混和しないものである。ここで「液体試料と混和しない」とは、液体試料と混合した際に、少なくとも混合比が極端に大きいか又は小さい場合を除いて、単一層を形成しないことを指す。したがって、液体試料が水溶液等の親水性であれば、被覆液は親油性である。
被覆液は、液体試料が水溶液である場合に、主溶媒である水の蒸発を抑制し、液体試料の加熱時における耐熱性を持たせるという目的から、沸点が１００℃以上であることが好ましい。
被覆液としては、上記のような物性を有するものであれば如何なるものも使用し得るが、好ましい市販品として、各種ミネラルオイルが例示できる。
【００２７】
以下、基板の具体例を挙げながら、より詳細に説明する。
図１は、本発明における、表面に親水性領域が設けられた基板を例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線における断面図である。なお、図１（ａ）においては、Ｉ−Ｉ線と重なる試料保持部でのみ、液体試料１０を保持した状態を示している。
ここに示す基板１は、第一及び第二基板のいずれにも使用し得るものである。基板１の表面１１には、親水性領域１１１と、該親水性領域１１１の周縁部を包囲する撥水性領域１１２とが設けられている。親水性領域１１１は、液体試料１０を保持するための試料保持部であり、液体試料１０が上記反応液である場合には、試料保持部は、核酸増幅反応を行う部位でもある。
親水性領域１１１の数は、４×１２で合計４８である。
【００２８】
親水性領域１１１及び撥水性領域１１２は、平面状であることが好ましい。そして、親水性領域１１１の外形は、ここに示すように略円形状であることが好ましいが、その他の形状でも良く、目的に応じて選択すれば良い。また、ここに示すように、表面１１上の親水性領域１１１を除く全面に、撥水性領域１１２が設けられていることが好ましいが、撥水性領域１１２の外形はその他の形状でも良く、目的に応じて選択すれば良い。
【００２９】
親水性領域１１１一つあたりの面積は、液体試料１０の量等に応じて適宜設定すれば良く、特に限定されない。例えば、ここで示すように親水性領域１１１が略円形状であり、液体試料１０の量が上記範囲内である場合には、その直径Ｄ１１１は０．５ｍｍ〜６ｍｍであることが好ましい。またこの時、隣り合う親水性領域１１１の中心間の距離Ｌ１１１は、前記Ｄ１１１に応じて設定すれば良いが、３〜１４ｍｍであることが好ましい。
撥水性領域１１２の面積は、基板１の大きさや試料保持部の数を考慮して、適宜設定すれば良い。
【００３０】
基板１では、液体試料１０が親水性領域１１１で安定して保持される。その結果、液体試料１０を被覆する被覆液１５も安定して保持される。そして、撥水性領域１１２により、液体試料１０の基板１上での移動を抑制する一層高い効果が得られる。撥水性領域１１２は必ずしも設ける必要性はないが、上記のような理由から設けることが好ましい。
【００３１】
親水性領域の配置形態は、ここに示すものに限定されず、目的に応じて設定すれば良い。例えば、親水性領域の数は、液体試料の数や基板の大きさを考慮して設定すれば良い。また、親水性領域は、ここに示すように、直交する二方向に一定の間隔をおいて設けても良いが、間隔はすべて一定でなくても良いし、直交する二方向以外に設けても良い。また、ここに示すように、親水性領域はすべて同等の面積でも良いし、一部又は全部が異なる面積でも良い。
また、基板は、親水性領域及び撥水性領域が、ここに示したように、基板表面だけに設けられていても良いが、基板の厚さ方向全体に渡って親水性又は撥水性とされていても良い。これは、以下に示す基板においても同様である。
【００３２】
図２は、本発明における、表面に親水性領域が設けられた基板の他の例を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における断面図である。なお、図２（ａ）においては、ＩＩ−ＩＩ線と重なる試料保持部でのみ、液体試料１０を保持した状態を示している。なお、図２において、図１に示した構成と同様のものには、図１における符号と同じ符号を付して、その詳細な説明は省略する。これは、その他の図面においても同様である。
【００３３】
ここに示す基板２も、第一及び第二基板のいずれにも使用し得るものである。基板２の表面２１には、第一親水性領域２１１と、該第一親水性領域２１１の周縁部を包囲する第一撥水性領域２１２とが設けられ、さらに該第一撥水性領域２１２の外側周縁部を包囲する第二親水性領域２１３と、該第二親水性領域２１３の外側周縁部を包囲する第二撥水性領域２１４とが設けられている。すなわち、親水性領域及び撥水性領域として、いずれも二つのパターンが存在する点が上記基板１と異なり、それ以外の点は基板１と同様である。
【００３４】
基板２では、第一親水性領域２１１により、液体試料１０を安定して保持できる。そして、第一撥水性領域２１２により、液体試料１０の基板２上での移動を抑制する一層高い効果が得られる。さらに、第二親水性領域２１３により、被覆液１５を一層安定して保持できる。そして、第二撥水性領域２１４により、被覆液１５の基板２上での移動を抑制するさらに高い効果が得られる。
【００３５】
基板２において、第一親水性領域２１１は、基板１における親水性領域１１１と同様である。また、第二親水性領域２１３は、その外形が異なること以外は、基板１における親水性領域１１１と同様である。
そして、第一撥水性領域２１２及び第二撥水性領域２１４は、外形が異なること以外は、基板１における撥水性領域１１２と同様である。
【００３６】
第一撥水性領域２１２及び第二親水性領域２１３の外形はリング状であるが、その他の形状でも良い。ただしリング状とすることで、液体試料１０及び被覆液１５を安定して保持する高い効果が得られる。
また、第二撥水性領域２１４は、ここに示すように、表面２１上の第二親水性領域２１３の外側全面に設けられていることが好ましいが、外形はリング状等、その他の形状でも良く、目的に応じて選択すれば良い。
【００３７】
第一親水性領域２１１、第一撥水性領域２１２及び第二親水性領域２１３は、同心状に設けられていることが好ましい。
【００３８】
第一親水性領域２１１の直径Ｄ２１１は、基板１における親水性領域１１１の直径Ｄ１１１と同様である。また、隣り合う第一親水性領域２１１の中心間の距離Ｌ２１１は、基板１におけるＬ１１１と同様である。
第一撥水性領域２１２の幅Ｗ２１２及び第二親水性領域２１３の幅Ｗ２１３は、液体試料１０や被覆液１５の量等に応じて適宜設定すれば良く、特に限定されない。例えば、液体試料１０及び被覆液１５の量が上記範囲内である場合には、０．２ｍｍ〜３ｍｍであることが好ましい。
第二撥水性領域２１４の面積は、基板２の大きさや試料保持部の数を考慮して、適宜設定すれば良い。
【００３９】
親水性領域及び撥水性領域を有する基板は、公知の方法で作製できる。具体的には、基板表面に親水処理及び撥水処理を施す方法、親水性基板表面に撥水処理を施す方法が例示できる。
親水処理としては、水酸基、アミノ基又はカルボキシ基等の親水性の官能基を基板表面に導入するものが例示できる。撥水処理としては、アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基又はアルケニルオキシ基等の低極性の官能基や、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されたアルキル基又はアルコキシ基等の疎水性の官能基を基板表面に導入するものが例示できる。
このような、親水性領域及び撥水性領域を有する基板としては市販品を使用しても良く、例えば、基板２と同様のものであれば、Ａｄｖａｌｙｔｉｘ製のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ（登録商標）が好適である。
【００４０】
本発明においては、次いで、前記第一の基板に対向させて第二の基板を配置して、該第一及び第二の基板間で前記液体試料を挟持する。これにより液体試料は、第一及び第二の基板間でこれらの表面に接触した状態で保持されると共に、これらの表面に接触していない部位は、被覆液で被覆された状態となる。そして液体試料は、第一の基板上においては、親水性領域で保持されるので、第一の基板上における移動が抑制され、第一及び第二の基板間で安定して挟持される。
【００４１】
第二の基板は、その表面が、第一の基板の親水性領域が設けられた面と対向するように配置する。そのためには、例えば、支持手段で支持しながら第二の基板の配置位置を調整するようにしても良いし、第一の基板の対向面（親水性領域が設けられた面）及び／又は第二の基板の対向面（第一の基板の親水性領域設けられた面と対向する面）に、第二の基板を対向配置させるためのアダプターを設けて、このアダプターを介して第二の基板を配置しても良い。本発明においては、操作を簡略化できる点から、上記のアダプターを使用して、第二の基板を対向配置することが好ましい。
【００４２】
前記アダプターは、第一及び第二の基板の表面間の距離を、所定の範囲に維持できるものであれば、如何なる形態でも良い。
例えば、第一及び第二の基板の表面に、それぞれ互いに嵌合可能な突起物を設けて、アダプターとする方法が例示できる。この場合、突起物は、基板表面に接着剤等で固定することが好ましい。
また、第一及び第二の基板のいずれか一方又は両方の表面に、単に突起物を設けてアダプターとする方法も例示できる。図３は、このようなアダプターを設けた基板を例示する斜視図である。
【００４３】
図３において、基板２は第一の基板であり、図２で説明したものである。基板２の試料保持部には、被覆液１５で被覆された液体試料１０が保持されている。
そして、基板２の表面２１のうち、長手方向両端部近傍には、一対の四角柱状のアダプター３，３が、その一側面を第二撥水性領域２１４への設置面として設けられている。アダプター３の前記設置面とは反対側の面は、第二の基板（図示略）との接触面となる。
【００４４】
アダプター３の材質は、液体試料１０中の光シグナルの検出を妨げないものであれば、目的に応じて任意に選択できるが、自家蛍光が無いものや透光性のものが好ましい。ここで、透光性の材質とは、第一及び第二の基板で説明したものと同様である。また、液体試料１０として核酸増幅反応を行う反応液を使用する場合には、該反応液を加熱する際の温度に対して耐熱性を有するものが好ましい。このような観点から、具体的な材質として、各種プラスチックやゴム等の樹脂類が例示できる。
【００４５】
図３に示すように、試料保持部を真上に向けて基板２を配置する場合には、アダプター３は、基板２に固定化されていても良いし、固定化されることなく載置されているだけでも良いが、液体試料１０を一層安定して保持するためには、固定化されていることが好ましい。試料保持部を真上以外の方向に向けて基板２を配置する場合には、アダプター３は、基板２に固定化されていることが好ましい。アダプター３を基板２に固定化するためには、接着剤等を使用すれば良い。
【００４６】
アダプター３の厚さＴ３は、少なくとも、アダプターを介して配置した第二の基板の、第一の基板に対する対向面が、基板２上の被覆液１５と接触する厚さとする。すなわち、Ｔ３は、基板２上に保持された液体試料１０を被覆する被覆液１５の高さよりも小さい値とし、液体試料１０及び被覆液１５の量に応じて調節する。このようなＴ３の好ましい範囲を、対応する液体試料１０及び被覆液１５の量と共に表２に示す。
【００４７】
【表２】
2010158201.tif 000004
【００４８】
アダプター３の設置面の幅Ｗ３及び長手方向の長さＬ３は、第一及び第二の基板間で安定するように適宜調整すれば良い。
【００４９】
図３では、アダプター３が、基板２の長手方向両端部近傍に設けられているものについて説明したが、アダプターの設置箇所は、これに限定されず適宜調整できる。
例えば、図４に例示するように、基板２の表面２１のうち、短手方向両端部近傍に、一対のアダプター３’，３’が設けられていても良い。ここに示すアダプター３’は、長手方向の長さが異なる点以外は、図３に示すアダプター３と同様である。
さらに、例えば図５に例示するように、基板２の表面２１において周縁部に沿って、アダプター３及び３’が連設されていても良い。
【００５０】
基板に固定化又は載置するアダプターは、ここに示すものに限定されず、適宜選択できる。例えば、アダプター３及び３’は、四角柱状以外の形状でも良く、細長形状であれば、その他の角柱状、円柱状等としても良いし、ブロック状等、細長形状以外の形状としても良い。ただし、第一及び第二の基板とは、面接触する形状であることが好ましい。また、アダプターの数も二つや四つに限定されず、任意に選択できる。そして、例えば、図５に示すアダプター３及び３’をすべて一体化させたものなど、枠状としても良い。
【００５１】
ここでは、基板２にアダプターを設けた例について説明したが、アダプターを設ける基板の種類は、本発明に適用できるものである限り、特に限定されない。
また、ここでは、第一の基板にアダプターを設けた例について説明したが、第二の基板にアダプターを設けても良く、第一及び第二の基板の両方にアダプターを設けても良い。第二の基板へのアダプターの設置形態は、第一の基板の場合と同様である。本発明においては、アダプターは、第一及び第二の基板のいずれか一方に設けられていれば、十分な効果が得られる。
【００５２】
次に、対向配置された第一及び第二の基板間で、液体試料が挟持されている様子の断面図を図６に例示する。図６において、基板１は、図１に示したものと同じであり、第一の基板である。そして、基板１に対向して配置された基板４は、第二の基板であり、その対向面である表面４１全面には、撥水性領域４１２が設けられている。
【００５３】
液体試料１０は、概ね基板１上の親水性領域１１１と、基板４上の撥水性領域４１２との間で挟持され、さらに、これら基板に接触していない部位は、被覆液１５で被覆されている。このように、液体試料１０は、基板１及び４並びに被覆液１５により、露出箇所無く挟持されているので、加熱条件下でも溶媒成分の蒸発が抑制される。また、被覆液も、基板１及び４で挟持されることにより、蒸発が抑制される。
一方、被覆液１５は、概ね基板１上の撥水性領域１１２と、基板４上の撥水性領域４１２との間に位置している。
そして、液体試料１０及び被覆液１５は、基板１により移動が抑制され、安定して挟持される。
また、液体試料１０及び被覆液１５の厚みＴ１０は、基板１及び４（第一及び第二の基板）間の距離で決定され、すべての試料保持部においてほぼ一定となっていることが好ましい。
【００５４】
図７は、他の実施形態における、液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。本実施形態は、第一の基板が基板１ではなく、図２に示した基板２である点が、図６に示す実施形態とは異なる。
ここでは、液体試料１０は、概ね基板２上の第一親水性領域２１１と、基板４上の撥水性領域４１２との間で挟持され、さらに、これら基板に接触していない部位は、被覆液１５で被覆されており、図６の場合と同様に、液体試料１０は、溶媒成分の蒸発が抑制される。
一方、被覆液１５は、概ね基板２上の第二親水性領域２１３を含む領域と、基板４上の撥水性領域４１２との間に位置している。
そして、液体試料１０及び被覆液１５は、基板２により移動が抑制され、安定して挟持される。
【００５５】
図６及び７では、第二の基板として、表面全面に撥水性領域が設けられた基板を使用した場合について説明したが、表面全面に親水性領域が設けられた基板を使用しても、同様に液体試料を挟持できる。図８は、第一の基板として基板１を、第二の基板として、表面５１全面に親水性領域５１１が設けられた基板５を使用した場合の、液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。本実施形態は、第二の基板が基板４ではなく、前記基板５である点が、図６に示す実施形態とは異なる。そして、液体試料１０及び被覆液１５は、図６に示す実施形態の場合と同様に挟持される。
【００５６】
図９は、第一の基板として基板２を、第二の基板として、前記基板５を使用した場合の、液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。本実施形態は、第二の基板が基板４ではなく、前記基板５である点が、図７に示す実施形態とは異なる。そして、液体試料１０及び被覆液１５は、図７に示す実施形態の場合と同様に挟持される。
【００５７】
なお、図６及び７では、基板４として表面４１のみが撥水性領域４１２となっているものを、図８及び９では、基板５として表面５１のみが親水性領域５１１となっているものをそれぞれ示したが、基板の厚さ方向全体に渡って撥水性又は親水性とされていても良い。
【００５８】
本発明においては、第一及び第二の基板として、同じパターンの親水性領域が設けられものを使用し、これら基板の親水性領域を互いに位置合わせして配置することにより、一層安定して液体試料を挟持できる。そして、第一及び第二の基板として、同じ種類のものを使用することが特に好ましい。ここで、親水性領域を互いに位置合わせするとは、第一及び第二の基板の表面（又は裏面）を真上から見た時に、これら基板を、その親水性領域がほぼ一致するように配置することを指す。
【００５９】
図１０は、第一及び第二の基板として、共に基板１を使用した場合の、液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。
本実施形態では、液体試料１０及び被覆液１５は、図６に示す実施形態の場合と同様に挟持されるが、二つの基板で移動が抑制されるので、一層安定して挟持される。
【００６０】
図１１は、第一及び第二の基板として、共に基板２を使用した場合の、液体試料が挟持されている様子を例示する断面図である。
本実施形態では、液体試料１０及び被覆液１５は、図７に示す実施形態の場合と同様に挟持されるが、二つの基板で移動が抑制されるので、一層安定して挟持される。
【００６１】
本発明においては、必ずしも、図６〜１１に示すように、液体試料が第二の基板の表面に接触している必要性はないが、接触している方が液体試料を一層安定して挟持できる。
また、同様の理由で、第一の基板は上に向けて配置することが好ましく、真上に向けて配置することが特に好ましい。
【００６２】
本発明においては、親水性領域が設けられた第一の基板と、第二の基板を使用することにより、液体試料及び被覆液の基板上での移動が抑制される。また、液体試料及び被覆液の厚さは、第一及び第二の基板間の距離で決定され、常に一定であり、移動が抑制されることで、形状も一定となる。このように、液体試料や被覆液は安定して挟持されるので、近傍のものとの接触や混合も抑制される。
これに対して、第一の基板に親水性領域が設けられていない場合には、液体試料は第一の基板と直接接触せずに、被覆液を介して接触し易く、この場合、光シグナルの検出精度が低下することがある。また、第二の基板を配置しない場合には、液体試料や被覆液の上部は略球状となり、被覆液によってレンズ効果が生じることがある。
【００６３】
また、本発明においては、液体試料及び被覆液はスポット状であり、これらの第一の基板上への配置も、特別な装置を使用することなく容易に行うことができる。また、特許第３１２０４５３号公報に記載のように、オイル層中に微量液滴を打ち込む方法等とは異なり、液体試料がオイル中に移動したりすることも無い。
【００６４】
本発明においては、次いで、挟持した前記液体試料中の光シグナルをリアルタイムに検出する。検出する光シグナルは、先に説明した通りである。
光シグナルは、基板の表面に対して略垂直な方向から検出することが好ましい。例えば、図６に示す実施形態の場合には、基板１の裏面１２側又は基板４の裏面４２側から検出することが好ましい。例えば、液体試料が核酸増幅を行う反応液であり、基板上で核酸増幅反応を行う場合には、サーマルサイクラーや、ヒーティングブロック等の温度調節手段に基板１を設置することが必要である。この場合、基板１の裏面１２を、前記温度調節手段に接触させることが好ましく、基板４の裏面４２側から光シグナルを検出することが好ましい。
図７に示す実施形態の場合にも同様であり、基板１の裏面１２側に代わり、基板２の裏面２２側から検出すること以外は、図６の場合と同様に光シグナルを検出すれば良い。
そして、図８に示す実施形態の場合には、基板４の裏面４２側に代わり、基板５の裏面５２側から検出すること以外は、図６の場合と同様に光シグナルを検出すれば良い。
以下、図９〜１１に示すその他の実施形態の場合も同様である。
光シグナルは、その種類に応じて、顕微鏡等の検出手段を使用して検出すれば良い。
【００６５】
液体試料として、核酸増幅を行う反応液を使用し、基板上で核酸増幅反応を行う場合には、核酸増幅サイクル一回あたりに、一回以上光シグナルを検出することが好ましい。このようにすることで、核酸増幅量をリアルタイムに定量でき、種々の有用な情報を取得できる。
【００６６】
本発明の光シグナルの検出方法によれば、液体試料の基板上での移動が抑制されるので、光シグナルを煩雑な操作を伴うことなく簡便に検出できる。また、液体試料の厚さ及び形状が一定であり、液体試料や被覆液同士の接触や混合も抑制され、液体試料及び被覆液の蒸発も抑制されるので、光シグナルを高精度に検出できる。さらに被覆液の蒸発が抑制されることで、装置の維持管理も簡略化できる。
【００６７】
＜核酸増幅方法＞
本発明に係る核酸増幅方法は、上記本発明の光シグナルの検出方法を利用する核酸増幅方法であって、前記液体試料として核酸増幅を行う反応液を挟持して核酸増幅反応を行い、前記反応液中の増幅核酸に由来する光シグナル、又は増幅核酸を標識する標識物質に由来する光シグナルを検出して、前記反応液中の核酸増幅量を定量することを特徴とする。
かかる核酸増幅方法については、上記の光シグナルの検出方法のところであわせて説明したので、ここでの説明は省略する。
【００６８】
本発明の核酸増幅方法によれば、反応液中の光シグナルを簡便且つ高精度に検出できるので、核酸増幅量を簡便且つ高精度に定量できる。特にリアルタイムＰＣＲへの適用に好適である。
【実施例】
【００６９】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（反応液の調製）
以下に示すプライマー、プローブ、鋳型ＤＮＡ及び試薬を使用し、鋳型ＤＮＡの濃度がそれぞれ２０００ｐｇ／μｌ、５００ｐｇ／μｌ、 １２５ｐｇ／μｌ、３１．２５ｐｇ／μｌ、０ｐｇ／μｌ（ネガティブコントロール）となるように、核酸増幅を行う反応液を調製した。
プライマー；ヒトβ−グロビン（最終濃度；０．３μＭ、配列番号１に示す塩基配列のフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列のリバースプライマー）
プローブ；ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ（配列番号３に示す塩基配列の５’−末端にＦＡＭ、３’−末端にＴＡＭＲＡがそれぞれ結合したもの）
鋳型ＤＮＡ；ＰＳＣＤＡ０２０５（財団法人ヒューマンサイエンス製）
試薬；２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
【００７０】
（反応液の保持）
次いで、第一の基板として、図２における基板２と同様の構成を有するＡｄｖａｌｙｔｉｘ製のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ（登録商標）を使用し、その５箇所の第一親水性領域に前記反応液を１μｌずつアプライし、さらに反応液をそれぞれ５μｌのオイルで被覆した。そして、図３に示すアダプターを介して、第二の基板としてスライドガラスを設置して、図７に示すように前記反応液を挟持した。
【００７１】
（核酸増幅反応）
次いで、以下に示す温度条件で基板を加熱及び冷却して、反応液中でリアルタイムＰＣＲを行った。
・ＰＣＲの温度条件
９５℃／１０分  →  （９５℃／１５秒  →  ６０℃／１分）×４０サイクル
なお、加熱、冷却時の温度変化の速度は、それぞれ１℃／秒、−１℃／秒とした。
反応液中の蛍光シグナルは、第二の基板上に設置した蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス社製）を使用して、各サイクルの６０℃の時に、３秒間露光することで検出し、検出した蛍光シグナルは、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）を使用して解析した。蛍光シグナルの検出結果を図１２に示す。また、これらの検出結果から、Ｃｔ値を算出した。算出結果を図１４に示す。なお、図１４中、グラフの横軸の「鋳型ＤＮＡ量」とは、鋳型ＤＮＡ濃度の対数値のことである。
【００７２】
［比較例１］
第二の基板を使用しなかったこと以外は、実施例１と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。蛍光シグナルの検出結果を図１３に示す。また、Ｃｔ値の算出結果を図１４に示す。
【００７３】
図１２及び１３から明らかなように、同じ鋳型ＤＮＡの濃度同士で比較した場合、実施例１の方が比較例１よりも、蛍光シグナルの検出値が大きかった。さらに、図１４から明らかなように、同じ鋳型ＤＮＡの濃度同士で比較した場合、実施例１の方が比較例１よりもＣｔ値が小さかった。これらの結果から、実施例１の方が比較例１よりも検出感度が高いことが確認された。
【００７４】
［実施例２］
（反応液の調製）
ヒト細胞中のＸ染色体上の遺伝子であるＸｉｓｔ、及びＹ染色体上の遺伝子であるＳＲＹを標的遺伝子としてＰＣＲを行うために、以下に示すプローブ及び試薬を使用して反応液プレミックスを調製した。
プローブ；ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ（Ｘｉｓｔに対してＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ、ＳＲＹに対してＶＩＣ−ＴＡＭＲＡ）
試薬；２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
【００７５】
次いで、ヒト女性細胞であるＮＣＣ−ＳｔＣ−Ｋ１４０細胞の培養液、及びヒト男性細胞であるＭＫＮ７４細胞の培養液を採取し、細胞計測板を試用してそれぞれ細胞数を計測し、どちらの培養液も細胞数が５×１０３個／ｍｌとなるように希釈した。
次いで、第一の基板として、図２における基板２と同様の構成を有するＡｄｖａｌｙｔｉｘ製のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ（登録商標）を使用し、その２４箇所の第一親水性領域に、希釈した培養液を１μｌずつアプライし、顕微鏡（ＩＸ８１、オリンパス社製）で細胞数を確認した。
次いで、細胞を乾燥させ、細胞が５個計測されたスポットに、前記反応液プレミックスを１μｌずつアプライして反応液を調製し、さらに反応液をそれぞれ５μｌのオイルで被覆した。そして、図３に示すアダプターを介して、第二の基板としてスライドガラスを設置して、図７に示すように前記反応液を挟持した。
【００７６】
（核酸増幅反応）
次いで、実施例１と同様に、リアルタイムＰＣＲを行った。蛍光シグナルの検出結果を図１５に示す。また、これらの検出結果から、Ｃｔ値を算出した。算出結果を表３に示す。
【００７７】
【表３】
2010158201.tif 000005
【００７８】
ＸｉｓｔはＸ染色体上にある遺伝子、ＳＲＹはＹ染色体上に存在する遺伝子である。そして、ＭＫＮ７４細胞中にはＸｉｓｔとＳＲＹが１つずつ存在するが、ＭＫＮ７４細胞からの増幅核酸では、図１５に示すように、これらの遺伝子についてはほぼ同じ増幅曲線が得られ、ＸｉｓｔとＳＲＹが１コピーずつ存在することを示す結果が得られた。
一方、ＮＣＣ−ＳｔＣ−Ｋ１４０細胞中にはＹ染色体がなく、Ｘｉｓｔが２つ存在するが、ＮＣＣ−ＳｔＣ−Ｋ１４０細胞からの増幅核酸では、図１５に示すように、ＳＲＹが存在せず、ＭＫＮ７４細胞の場合に対してＸｉｓｔが２倍であり（Ｃｔ値で約1サイクルの違い）、Ｘｉｓｔが２コピー存在することを示す結果が得られた。
以上より、細胞を使用して核酸増幅でき、高精度に光シグナルを検出できることが確認された。
【００７９】
［実施例３］
（反応液の調製）
表４に示す組成の混合液を調製した。この混合液は、２５℃でｐＨ８．８であった。そして、この混合液１８．６μｌに、濃度が０．４ｎｇ／μｌである配列番号１０の塩基配列の鋳型ＤＮＡ溶液１μｌ、及びＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（８Ｕ／μｌ  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製））０．４μｌを加えて、反応液を調製した。さらにコントロールとして、前記混合液１８．６μｌに０．４ｎｇ／μｌの鋳型ＤＮＡ溶液を１μｌ加え、ＤＮＡポリメラーゼを加えないものを調製した。
【００８０】
【表４】
2010158201.tif 000006
【００８１】
（反応液の保持）
次いで、第一の基板として、図２における基板２と同様の構成を有するＡｄｖａｌｙｔｉｘ製のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ（登録商標）を使用し、その２箇所の第一親水性領域に、前記反応液を１μｌずつアプライし、さらに反応液をそれぞれ５μｌのオイルで被覆した。そして、図３に示すアダプターを介して、第二の基板としてスライドガラスを設置して、図７に示すように前記反応液を挟持した。前記コントロールも同様に挟持した。
【００８２】
（核酸増幅反応）
次いで、５０℃に保持したヒーティングブロックで基板を加熱し、リアルタイムで光シグナルを検出しながら、核酸増幅反応を行った。
本実施例では、核酸増幅の際に生成されるピロリン酸（ＰＰｉ）が、ＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰへ変換され、このＡＴＰとルシフェリンがルシフェラーゼによって反応する際に発光するが、この時の光シグナルを検出した。光シグナルは、第二の基板上に設置した蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス社製）を使用して、１０秒間露光し、１分おきに４０分間検出した。検出した光シグナルは、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）を使用して解析した。前記コントロールも同様に光シグナルの検出に供した。光シグナルの検出結果を図１６に示す。図１６中、グラフの横軸は、核酸増幅反応開始後の時間を表し、グラフの縦軸は光シグナル検出値を表す。
【００８３】
図１６から明らかなように、反応液の光シグナルの検出値は、初期には減少したが、その後時間の経過と共に増加に転じ、再度減少した。一方、コントロールでは、時間の経過と共に光シグナルの検出値は、減少するだけであった。反応液では、最終的に光シグナルの検出値がコントロールよりも小さくなったが、これはルシフェラーゼがピロリン酸により阻害されたことを示していると推測される。
さらに、前記反応液及びコントロールを核酸増幅に供した後、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、反応液からは増幅核酸が検出されたが、コントロールからは増幅核酸は検出されなかった。
以上より、ルシフェラーゼを使用する化学発光による光シグナルの検出も、本発明において好適であることが確認された。
【００８４】
［実施例４］
第一の基板として、図１に示す基板１を使用し、図６に示すように反応液を挟持したこと以外は、実施例１と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。その結果、実施例１と同様の結果が得られた。
【００８５】
［実施例５］
第二の基板として、表面全面が撥水性である基板を使用し、図９に示すように反応液を挟持したこと以外は、実施例１と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。その結果、実施例１と同様の結果が得られた。
【００８６】
［実施例６］
第二の基板として、表面全面が撥水性である基板を使用し、図８に示すように反応液を挟持したこと以外は、実施例４と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。その結果、実施例４と同様の結果が得られた。
【００８７】
［実施例７］
第二の基板として、第一の基板と同様のＡｄｖａｌｙｔｉｘ製のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ（登録商標）を使用し、図１１に示すように反応液を挟持したこと以外は、実施例１と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。その結果、実施例１と同様の結果が得られた。
【００８８】
［実施例８］
第二の基板として、第一の基板と同様の基板１を使用し、図１０に示すように反応液を挟持したこと以外は、実施例４と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。その結果、実施例４と同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の微量成分の検出に利用可能であり、特に医学分野における遺伝子診断や、農業分野におけるＤＮＡ鑑定等への適用に好適である。
【符号の説明】
【００９０】
１，２，４，５・・・基板、１０・・・液体試料、１１，２１・・・基板表面、１５・・・被覆液、１１１・・・親水性領域、２１１・・・第一親水性領域、２１２・・・第一撥水性領域、２１３・・・第二親水性領域、２１４・・・第二撥水性領域、４１２・・・撥水性領域、５１１・・・親水性領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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