(57)【要約】【課題】コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子励起の蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察する。【解決手段】極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源４と、レーザ光源４から射出された極短パルスレーザ光を２つの光路６，７に分岐するビームスプリッタ５と、極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する周波数分散装置９と、２つの光路６，７を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、パルスレーザ光の周波数を高周波数側に変換するフォトニッククリスタルファイバ１０と、２つの光路６，７を導光されてきたパルスレーザ光を合波するレーザコンバイナ８と、合波されたパルスレーザ光を標本Ａに照射する集光レンズ１３とを備えるレーザ顕微鏡装置１を採用する。【選択図】図１
2010096667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光を２つの光路に分岐する分岐手段と、
前記レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する周波数分散調節手段と、
前記２つの光路のいずれか一方に設けられ、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、パルスレーザ光の周波数を高周波数側に変換する周波数変換手段と、
前記２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、
該合波手段により合波されたパルスレーザ光を前記標本に照射する照射手段と
を備えるレーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記周波数変換手段が、パルスレーザ光の周波数を高周波数側および低周波数側の両方に変換し、
パルスレーザ光の周波数を高周波数側または低周波数側のいずれかに切り替える周波数切替手段を備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記周波数切替手段が、
所定の波長域の極短パルスレーザ光を通過させる複数のフィルタと、
該複数のフィルタから標本中の分子の特定の振動周波数に応じたフィルタを選択するフィルタ選択手段と
を備える請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項４】
前記レーザ光源により射出される極短パルスレーザ光の波長が９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲である請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項５】
前記２つの光路の少なくとも一方に、前記標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することができるパルスタイミング調節手段を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項６】
前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバである請求項１から請求項５のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項７】
前記２つの光路に、パルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段が設けられている請求項１から請求項６のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標本中の分子の特定の振動を利用し、分子からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、この散乱光を検出することで標本の観察を行うコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡は、標本の分子の特定の振動を利用しているため、蛍光顕微鏡のように、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がない。また、利用する振動を変更することで観察する分子を変更することができる。
【０００３】
従来、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の光源には、比較的狭い周波数スペクトル帯域を有した２つの異なる周波数を有するピコ秒パルスレーザが用いられている。このような顕微鏡によれば、これら２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が、標本の分子の特定の振動周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が分子の特定の振動周波数に共鳴し、強いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が発生する。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、照射した２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数よりも高い周波数を有する（つまり短い波長を有する）。したがって、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光だけを分光的に選択して検出することで標本の分子の観察を行うことができる。
【０００４】
また、フェムト秒パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍に広がる極めて狭い空間において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、鮮明な蛍光画像を得ることができる多光子励起型のレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５２０６１２号公報
【特許文献２】特開２００２−２４３６４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡において、標本の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させるためには、周波数帯域が狭い（または、パルス幅が比較的広い）ピコ秒パルスレーザ光を用いるのが良い。なぜならば、周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いてしまうことで、２つのパルスレーザ光の周波数差の中に、分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分も生じてしまうからである。それら分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分は、分子の特定の振動に共鳴したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に寄与しない。結果として、２つのパルスレーザ光のエネルギーを、分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために効率的に利用できなくなってしまう。
【０００７】
一方、多光子励起型のレーザ顕微鏡においては、蛍光の励起効率をより高め、かつ、標本に与えるダメージをより軽減して観察を行うことを目的として、周波数帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）フェムト秒レーザ光が使用され、加えて、フーリエ限界パルスに近い状態で使用される。上記理由から、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡と多光子励起型のレーザ顕微鏡の両観察方法は、使用するパルスレーザ光の仕様が相違するため、同一の顕微鏡装置によって達成することが困難である。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察および多光子蛍光観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光を２つの光路に分岐する分岐手段と、前記レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する周波数分散調節手段と、前記２つの光路のいずれか一方に設けられ、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、パルスレーザ光の周波数を高周波数側に変換する周波数変換手段と、前記２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、該合波手段により合波されたパルスレーザ光を前記標本に照射する照射手段とを備えるレーザ顕微鏡装置を採用する。
【００１０】
本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、１台のレーザ光源から射出されたフェムト秒パルスレーザ光のような極短パルスレーザ光が、分岐手段により２つの光路に分岐され、周波数分散調節手段によってその周波数分散量が調節される。極短パルスレーザ光に所定の周波数分散量を与えた２つのパルスレーザ光を合波手段により合波し、合波されたパルスレーザ光を照射手段により標本に照射することで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察を行うことができる。また、一方の光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を極短パルスレーザ光のままで標本に照射することで、多光子蛍光観察を行うことができる。
【００１１】
ここで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察時には、周波数変換手段により、２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、一方の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数が高周波数側に変換される。これにより、周波数が高周波数側に変換されたパルスレーザ光をポンプ光、周波数が変換されていないパルスレーザ光をストークス光として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。また、周波数分散調節手段により、２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数分散量を等しくすることで、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光の周波数差を一定にすることができる。これにより、２つのパルスレーザ光のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。
【００１２】
また、多光子蛍光観察時には、周波数分散調節手段により、標本面上において略フーリエ限界パルスに近づくように一方の光路を導光される極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節することで、多光子励起光効果を効率的に発生させることが可能となる。
【００１３】
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記周波数変換手段が、パルスレーザ光の周波数を高周波数側および低周波数側の両方に変換し、パルスレーザ光の周波数を高周波数側または低周波数側のいずれかに切り替える周波数切替手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、周波数変換手段によって、パルスレーザ光の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれにも変換し、周波数切替手段によって、高周波数側または低周波数側のいずれかに切り替えることで、発生させるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の周波数の範囲を拡張することができる。これにより、様々な振動周波数を有する標本中の分子を観察することが可能となる。
【００１４】
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記周波数切替手段が、所定の波長域（つまり周波数域）の極短パルスレーザ光を通過させる複数のフィルタと、該複数のフィルタから標本中の分子の特定の振動周波数に応じたフィルタを選択するフィルタ選択手段とを備えることとしてもよい。
フィルタ選択手段により、標本中の分子の特定の振動周波数、すなわち、発生させるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の周波数に応じたフィルタを選択することで、パルスレーザ光の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれに変換するかを容易に切り替えることができ、発生させるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の周波数の範囲を拡張することができる。
【００１５】
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記レーザ光源により射出される極短パルスレーザ光の波長が９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲であることとしてもよい。
近年、多光子励起型のレーザ顕微鏡において、標本を標識するための蛍光物質としてｅＧＦＰ（enhanced Green Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）といった蛍光タンパクが使用される。これらの蛍光タンパクを効率よく励起できる励起波長は１０００ｎｍ付近である。また、１０００ｎｍ付近の波長を有する観察光は、生体内での光散乱の影響も少ないため、特に生体の深部観察に適している。したがって、レーザ光源により射出される極短パルスレーザ光の波長を９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲とすることで、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光タンパクを効率よく励起して多光子蛍光観察を行うことができる。
【００１６】
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記２つの光路の少なくとも一方に、前記標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することができるパルスタイミング調節手段を備えることとしてもよい。
これにより、標本中の分子の特定の振動周波数に一致させるように２つのパルスレーザ光のタイミングを調整することができる。これにより、分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させることが可能となる。また、２つのパルスレーザ光の時間的タイミングを調節し、２つのパルスレーザ光の周波数差を標本中の別の分子の振動の周波数に応じて任意に調整することも可能である。
【００１７】
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバであることとしてもよい。
周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有する極短パルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調整することが可能となる。
【００１８】
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記２つの光路に、パルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段が設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、光量調節手段を作動させて、各光路を導光されるパルスレーザ光の光量を調節し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および／または多光子蛍光を発生させる際の光量バランスを図ることができるとともに、最適な画像で観察を行うことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図１から図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体３とを備えている。
【００２１】
レーザ光源装置２は、９００ｎｍから１１００ｎｍの波長を有するフェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ（分岐手段）５と、ビームスプリッタ５により分岐された２つのフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路６，７と、２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を合波するレーザコンバイナ（合波手段）８とを備えている。
【００２２】
第１の光路６には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節可能な周波数分散装置（周波数分散調節手段）９が設けられている。
周波数分散装置９は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路６上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散装置９を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記一対のプリズムの代わりに一対の回折格子（図示略）を用いてもよい。
【００２３】
また、周波数分散装置９は、周波数分散装置９を通過したパルスレーザ光Ｌ１’が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくような分散量を設定することができるようになっている。これにより、レーザ光源４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によってフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのフェムト秒パルスレーザ光が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができるようになっている。
【００２４】
第２の光路７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２を通過させるフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１０と、フォトニッククリスタルファイバ１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を調節する光路調節装置（パルスタイミング調節手段）１１とが設けられている。
【００２５】
フォトニッククリスタルファイバ１０は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を高周波数側に変更または拡大してパルスレーザ光Ｌ２’を生成し、光路６，７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。
【００２６】
光路調節装置１１は、例えば、ミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２’の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光Ｌ２’のパルスの時間的タイミングを調整することができる。
【００２７】
顕微鏡本体３は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置２から出射されたパルスレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１２およびレンズ群２０と、スキャナ１２により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａ面に集光する集光レンズ（照射手段）１３と、標本Ａにおいて発生し、集光レンズ１３によって集光された蛍光を検出する第１の光検出器１４と、標本Ａを透過する方向に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を集光する集光レンズ１５と、集光レンズ１５により集光されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する第２の光検出器１６とを備えている。
【００２８】
図中、符号１７はダイクロイックミラー、符号１８はステージ、符号１９はミラーである。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５により集光され第２の検出器１６で検出されてもよい。また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は集光レンズ１３により集光され第１の検出器１４で検出されてもよい。
【００２９】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。
【００３０】
第１の光路６に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、第１の光路６上に配置されている周波数分散装置９を通過させられることにより、初期の周波数分散量を与えられる。一方、第２の光路７に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１９によって偏向された後、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過させられることにより、第１の光路６のフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが高周波数側に変更または拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’）となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２’にはフォトニッククリスタルファイバ１０を通過することにより所定の周波数分散が与えられる。
【００３１】
ここで、パルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量と、パルスレーザ光Ｌ２’の周波数分散量とが相違する場合、図２（ａ）に示されるように、時間軸上においてパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分布の傾きが相違する。この場合、２つの光路６，７を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’は時間軸上の各時刻において異なり、一定に保たれない。この状態においては、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを、標本Ａ中の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に効率よく利用することができない。
【００３２】
そこで、周波数分散装置９を作動させて、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える分散量が、第２の光路７のフォトニッククリスタルファイバ１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’に与えられる分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節する。すなわち、図２（ａ）の矢印Ｐ１に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。
【００３３】
また、２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のパルスの時間的タイミングによっては、図２（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しない場合がある。そこで、本実施形態においては、光路調節装置１１を作動させて、第２の光路７を通過するパルスレーザ光Ｌ２’を時間軸方向に遅延させる。すなわち、図２（ｂ）に矢印Ｐ２で示されるように、パルスレーザ光Ｌ２’の時間的なパルスタイミングを調節する。これにより、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。
【００３４】
以上のように周波数分散装置９および光路調節装置１１を作動させることで、図３に示されるように、レーザコンバイナ８に到達する２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分散量と周波数差Ω’が調節される。その後、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’は、レーザコンバイナ８によって合波され、パルスレーザ光Ｌ３となる。
【００３５】
このように合波されたパルスレーザ光Ｌ３は、顕微鏡本体３に入射させられ、スキャナ１２によって２次元的に走査された後、レンズ群２０と集光レンズ１３を介して標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ３が集光された各位置において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
【００３６】
標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、標本Ａを挟んで集光レンズ１３とは反対側に配置された集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ３の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第２の光検出器１６により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００３７】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、フェムト秒レーザ光を出射するレーザ光源４を用いて、フォトニッククリスタルファイバ１０により周波数が高周波数側に変換されたパルスレーザ光Ｌ２’をポンプ光、周波数が変換されていないパルスレーザ光Ｌ１’をストークス光として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
【００３８】
また、２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、時間軸上の各時刻において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることで、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを効率的に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に利用することができる。このように発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を時間積算することにより、明るいコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００３９】
また、光路調節装置１１により、２つの光路６，７を通過してレーザコンバイナ８に入射されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の時間的なタイミングを調節することで、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、標本Ａの分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。これにより、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差Ω’を任意に調整することができるため、標本Ａ中の別の分子の振動周波数に一致させることも可能となる。
【００４０】
また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ１０を使用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
また、パルスタイミング調節手段として、ミラー（リフレクタ）を有する光路調節装置１１を採用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
【００４１】
なお、レーザコンバイナ８以降の光学系により、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分散量が変化した場合や時間的なパルスタイミングが変化した場合は、標本Ａ面上において再度、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致するように、周波数分散量と時間的なパルスタイミングを調節してもよい。
【００４２】
また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出されてもよい。
【００４３】
次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、多光子励起型の蛍光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
この場合には、周波数分散装置９を作動させることにより、図４（ａ）に矢印Ｐ３に示すように、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を調節する。具体的には、図４（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’が標本Ａ面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を設定する。このように設定されたパルスレーザ光Ｌ１’を集光レンズ１３により標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起効果を効率よく発生させ、明るい蛍光を得ることができる。
【００４４】
標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１３によって集光された後、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ１’の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第１の光検出器１４により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出されてもよい。
【００４５】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、レーザ光源４を用いて多光子蛍光観察を行うことができる。
ここで、標本Ａに照射されるパルスレーザ光Ｌ１’は、レーザ光源４から射出される極短パルスレーザ光と同じ波長（９００ｎｍから１１００ｎｍ）を有している。したがって、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、１０００ｎｍ付近の波長を有する光により励起されるｅＧＦＰ（enhanced Green Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）等の蛍光タンパクを効率よく励起して多光子蛍光観察を行うことができる。また、１０００ｎｍ付近の波長を有する観察光は、生体内での光散乱の影響も少ないため、特に生体の深部観察を良好に行うことができる。
【００４６】
なお、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出されてもよい。
また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、ＳＨＧ光（第二高調波光）観察も行うことができる。
【００４７】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびＳＨＧ光観察を切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１により、３種類の観察を効率よく行うことができ、マルチモーダルな観察を達成することができる。
【００４８】
ここで、顕微鏡の空間分解能は、励起光であるパルスレーザ光を集光レンズを用いて標本中の観察焦点面に絞り込んだ際の焦点スポットサイズよって決まり、そのサイズが小さいほど空間分解能が高くなることが知られている。
また、観察焦点面内方向および観察焦点面に垂直な方向（つまり光軸方向）の空間分解能は波長に比例することが知られている。すなわち、相対的に波長が短いパルスレーザ光は、相対的に波長が長いパルスレーザ光に比べて、集光レンズを用いて標本中の観察焦点面に絞り込んだ際の焦点スポットサイズが小さく、結果として、高い空間分解能を実現することができる。
したがって、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、レーザ光源４から射出する極短パルスレーザ光（パルスレーザ光Ｌ１’）をストークス光とし、フォトニッククリスタルファイバ１０により高周波数側（短波長側）に変換したパルスレーザ光Ｌ２’をポンプ光とすることで、レーザ光源４から射出する極短パルスレーザ光（パルスレーザ光Ｌ１’）をポンプ光とし、フォトニッククリスタルファイバ１０により低周波数側（長波長側）に変換したパルスレーザ光Ｌ２’をストークス光とする場合に比べて、パルスレーザ光Ｌ２’を集光レンズで標本中の観察焦点面に絞り込んだ際の焦点スポットサイズが小さくなる。このため、ストークス光としてレーザ光源４から出射する極短パルスレーザ光の波長は９００ｎｍから１１００ｎｍと長くした場合でも、該波長域の極短パルスレーザ光をポンプ光として用いる場合に比べて空間分解能を高く保つことが可能となる。
【００４９】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、主に図５から図８を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１が第１の実施形態と異なる点は、パルスレーザ光の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれに変換するかを切り替える点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置５１について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００５０】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１は、図５に示されるように、レーザ光源装置５２と、レーザ光源装置５２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体５３とを備えている。
【００５１】
レーザ光源装置５２は、９００ｎｍから１１００ｎｍの波長を有するフェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ（分岐手段）５と、ビームスプリッタ５により分岐された２つのフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路６，７と、２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を合波するレーザコンバイナ（合波手段）８とを備えている。
【００５２】
第２の光路７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２を通過させるフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）６０が設けられている。
フォトニッククリスタルファイバ６０は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を高周波数側または低周波数側に変更または拡大してパルスレーザ光Ｌ２’を生成し、光路６，７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。
【００５３】
レーザコンバイナ８は、透過率特性の異なる２つのフィルタ６２ａ，６２ｂを有するフィルタターレット６１（周波数切替手段）と、反射率特性の異なる２つのダイクロックミラー６４ａ，６４ｂを有する合波ミラーターレット６３とを備えている。
フィルタターレット６１は、透過率特性の異なる２つのフィルタ６２ａ，６２ｂを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって２つのフィルタ６２ａ，６２ｂのいずれか一方にパルスレーザ光Ｌ２’を通過させるようになっている。
【００５４】
合波ミラーターレット６３は、反射率特性の異なる２つのダイクロックミラーである合波ミラー６４ａ，６４ｂを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって２つの合波ミラー６４ａ，６４ｂのいずれか一方に、パルスレーザ光Ｌ１’を通過させるとともに、パルスレーザ光Ｌ２’’を反射させるようになっている。これにより、合波ミラーターレット６３は、パルスレーザ光Ｌ１’とパルスレーザ光Ｌ２’’とを合波するようになっている。
【００５５】
顕微鏡本体５３は、前述の第１の実施形態と同様の構成要素の他、反射率特性の異なる２つのダイクロックミラー６６ａ，６６ｂを有し、標本Ａからの光を分波する分波ミラーターレット６５と、透過率特性の異なる２つのフィルタ６８ａ，６８ｂを有するフィルタターレット６７と、透過率特性の異なる２つのフィルタ７０ａ，７０ｂを有するフィルタターレット６９とを備えている。
【００５６】
分波ミラーターレット６５は、反射率特性の異なる２つのダイクロックミラーである分波ミラー６６ａ，６６ｂを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって２つの分波ミラー６６ａ，６６ｂのいずれか一方に、パルスレーザ光Ｌ３を通過させるとともに、標本Ａからの蛍光またはコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第１の光検出器１４に向けて反射させるようになっている。
【００５７】
フィルタターレット６７は、透過率特性の異なる２つのフィルタ６８ａ，６８ｂを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって２つのフィルタ６８ａ，６８ｂのいずれか一方に標本Ａからの蛍光またはコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させるようになっている。
【００５８】
フィルタターレット６９は、透過率特性の異なる２つのフィルタ７０ａ，７０ｂを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって２つのフィルタ７０ａ，７０ｂのいずれか一方に標本Ａからの蛍光またはコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させるようになっている。
【００５９】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置５１の作用について以下に説明する。
まず、前述の第１の実施形態と同様に、第１の光路６を導光されてくるパルスレーザ光Ｌ１’をストークス光、第２の光路７を導光されてくるパルスレーザ光Ｌ２’’をポンプ光としてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させる場合について、図６（ａ）から（ｄ）を用いて説明する。なお、この場合、パルスレーザ光Ｌ１’の周波数はパルスレーザ光Ｌ２’’の周波数よりも低いため、パルスレーザ光Ｌ１’の波長λ＿Ｌ１’はパルスレーザ光Ｌ２’’の波長λ＿Ｌ２’’よりも大きくなる。
【００６０】
レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。
第１の光路６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ１は、周波数分散装置９を通過して合波ミラーターレット６３に入射される。一方、第２の光路７に分岐されたパルスレーザ光Ｌ２は、フォトニッククリスタルファイバ６０および光路調節装置１１を通過してフィルタターレット６１に入射される。
【００６１】
この際、フィルタターレット６１を作動させて一方のフィルタ６２ａを光路上に配置することにより、図６（ａ）に示すように、フォトニッククリスタルファイバ６０により周波数スペクトルが拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’）のうち、短波長側の波長成分を有するパルスレーザ光Ｌ２’’を通過させる。
【００６２】
また、合波ミラーターレット６３を作動させて一方の合波ミラー６４ａを光路上に配置することにより、図６（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’を通過させるとともに、パルスレーザ光Ｌ２’’を反射して、パルスレーザ光Ｌ１’とパルスレーザ光Ｌ２’’とを合波する。
【００６３】
また、分波ミラーターレット６５を作動させて一方の分波ミラー６６ａを光路上に配置することにより、図６（ｃ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’およびパルスレーザ光Ｌ２’’を通過させるとともに、標本Ａからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第１の光検出器１４に向けて反射する。
【００６４】
また、フィルタターレット６７を作動させて一方のフィルタ６８ａを光路上に配置することにより、図６（ｄ）に示すように、波長λ＿ｃａｒｓを有するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させる。
以上のようにすることで、パルスレーザ光Ｌ１’をストークス光、パルスレーザ光Ｌ２’’をポンプ光として発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第１の光検出器１４により検出することができる。
【００６５】
次に、第１の光路６を導光されてくるパルスレーザ光Ｌ１’をポンプ光、第２の光路７を導光されてくるパルスレーザ光Ｌ２’’をストークス光としてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させる場合について、図７（ａ）から（ｄ）を用いて説明する。なお、この場合、パルスレーザ光Ｌ１’の周波数はパルスレーザ光Ｌ２’’の周波数よりも高いため、パルスレーザ光Ｌ１’の波長λ＿Ｌ１’はパルスレーザ光Ｌ２’’の波長λ＿Ｌ２’’よりも小さくなる。
【００６６】
レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。
第１の光路６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ１は、周波数分散装置９を通過して合波ミラーターレット６３に入射される。一方、第２の光路７に分岐されたパルスレーザ光Ｌ２は、フォトニッククリスタルファイバ６０および光路調節装置１１を通過してフィルタターレット６１に入射される。
【００６７】
この際、フィルタターレット６１を作動させて他方のフィルタ６２ｂを光路上に配置することにより、図７（ａ）に示すように、フォトニッククリスタルファイバ６０により周波数スペクトルが拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’）のうち、長波長側の波長成分を有するパルスレーザ光Ｌ２’’を通過させる。
【００６８】
また、合波ミラーターレット６３を作動させて他方の合波ミラー６４ｂを光路上に配置することにより、図７（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’を通過させるとともに、パルスレーザ光Ｌ２’’を反射して、パルスレーザ光Ｌ１’とパルスレーザ光Ｌ２’’とを合波する。
【００６９】
また、分波ミラーターレット６５を作動させて他方の分波ミラー６６ｂを光路上に配置することにより、図７（ｃ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’およびパルスレーザ光Ｌ２’’を通過させるとともに、標本Ａからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第１の光検出器１４に向けて反射する。
【００７０】
また、フィルタターレット６７を作動させて他方のフィルタ６８ｂを光路上に配置することにより、図７（ｄ）に示すように、波長λ＿ｃａｒｓを有するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させる。
以上のようにすることで、パルスレーザ光Ｌ１’をポンプ光、パルスレーザ光Ｌ２’’をストークス光として発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第１の光検出器１４により検出することができる。
【００７１】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１によれば、フォトニッククリスタルファイバ６０によって、パルスレーザ光Ｌ２の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれにも変換し、フィルタターレット６１によって、通過させるパルスレーザ光Ｌ２’’の周波数を高周波数側または低周波数側のいずれかに切り替えることで、発生させるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の周波数の範囲を拡張することができる。これにより、様々な振動周波数を有する標本Ａ中の分子を観察することが可能となる。
また、各フィルタにパルスレーザ光を通過させることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために不要な成分を除去することができ、鮮明なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００７２】
なお、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１の変形例として、図８に示すように、フィルタターレット６１，６７，６９、合波ミラーターレット６３、分波ミラーターレット６５の各回転機構を制御する制御部７１を備えることとしてもよい。このようにすることで、制御部７１により各ターレットを連動させてフィルタやミラーを切り替えることができ、パルスレーザ光Ｌ２の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれに変換するかを容易に切り替えることができる。
【００７３】
また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１５およびフィルタターレット６９を介して第２の光検出器１６により検出されてもよい。この場合、フィルタターレット６９は、上述したフィルタターレット６７と同様に動作して、透過率特性の異なる２つのフィルタ７０ａ，７０ｂのいずれか一方に標本Ａからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させる。
【００７４】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、周波数分散装置９として、プリズム対とミラーとを備えて、周波数分散量を連続的に変更可能なものを例示したが、これに代えて、周波数分散量が固定のもの、それらを複数用意し、段階的に切り替える方式のものや、第１の光路６上に挿脱されてパルスレーザ光Ｌ１’に与える分散量を切り替える方式のものを採用してもよい。
【００７５】
また、周波数分散装置９は、例えば、板厚の変化する楔状のガラス板のように所定の周波数分散特性を有する材質からなる部材（図示略）であってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に所定の周波数分散を与えることができる。また、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調整できる。また、周波数分散装置９は、所望の分散量を得るように調製された光ファイバであってもよい。
【００７６】
また、周波数分散装置９は、第２の光路７に設けられていてもよいし、両光路６，７にそれぞれ設けられていてもよい。また、周波数分散装置９がレーザ光源４とビームスプリッタ５との間に設けられていても、第２の光路７において所定の周波数分散量を与えることで、マルチモーダルな観察が可能となる。
また、少なくとも一方の光路６，７に、減光フィルタのような光量調節手段（図示略）を配置することにしてもよい。これにより、２つの光路６，７を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の光量バランスを図ることができる。
【００７７】
また、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくように設定して行われる多光子励起の蛍光観察の際には、第２の光路７をシャッタ等により制限することとしてもよい。多光子励起の蛍光観察時には第２の光路７への分岐は不要となるので、これを制限することによって、多光子蛍光画像に発生するノイズや標本Ａに与えるダメージを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）調整前、（ｂ）周波数分散量調整後をそれぞれ示している。
【図３】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光のパルスの時間的タイミング調整後の周波数の時間分布を示すグラフである。
【図４】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、多光子励起の蛍光観察時におけるパルスレーザ光の周波数分散量の（ａ）調整前、（ｂ）調節後のそれぞれの状態を示している。
【図５】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図６】図５のレーザ顕微鏡装置の各部を導光されるパルスレーザ光の波長分布を示すグラフであり、（ａ）フィルタターレット、（ｂ）合波ミラーターレット、（ｃ）分波ミラーターレット、（ｄ）フィルタターレットである。
【図７】図５のレーザ顕微鏡装置の各部を導光されるパルスレーザ光の波長分布を示すグラフであり、（ａ）フィルタターレット、（ｂ）合波ミラーターレット、（ｃ）分波ミラーターレット、（ｄ）フィルタターレットである。
【図８】図５のレーザ顕微鏡装置の変形例の全体構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００７９】
Ａ  標本
Ｌ１，Ｌ２  フェムト秒パルスレーザ光
Ｌ１’，Ｌ２’，Ｌ２’’  パルスレーザ光
Ω，Ω’  周波数（差）
１，５１  レーザ顕微鏡装置
２，５２  レーザ光源装置
３，５３  顕微鏡本体
４  レーザ光源
５  ビームスプリッタ（分岐手段）
６，７  光路
８  レーザコンバイナ（合波手段）
９  周波数分散装置（周波数分散調節手段）
１０，６０  フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
１１  パルスタイミング調節手段
１３  集光レンズ（照射手段）
６１，６７，６９  フィルタターレット
６３  合波ミラーターレット
６５  分波ミラーターレット
７１  制御部
【図１】
2010096667.tif 000003
【図２】
2010096667.tif 000004
【図３】
2010096667.tif 000005
【図４】
2010096667.tif 000006
【図５】
2010096667.tif 000007
【図６】
2010096667.tif 000008
【図７】
2010096667.tif 000009
【図８】
2010096667.tif 000010