(57)【要約】      （修正有）【課題】神経栄養因子、ならびに特に「エノビン（ｅｎｏｖｉｎ）」（ＥＶＮ）と命名された、神経栄養因子のＧＤＮＦファミリーの新規メンバーを提供する。【解決手段】新規なヒト神経栄養成長因子、「エノビン」をコードしている核酸分子、該核酸分子を含有する発現ベクター、該ベクターにより形質転換される宿主細胞、該核酸分子によってコードされている神経栄養成長因子、単離されたエノビン、エノビンの作動剤もしくは拮抗剤として働く化合物、および核酸またはエノビンタンパク質またはそれらの作動剤もしくは拮抗剤を含有する製薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１、１２、１３、１４もしくは１５に示されるスプライシングバリアントのいずれかのヌクレオチド配列を持つヒト神経栄養成長因子をコードする単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経栄養因子、ならびに特に本明細書において「エノビン（ｅｎｏｖｉｎ）」（ＥＶＮ）と命名された、神経栄養因子のＧＤＮＦファミリーの新規メンバーのクローニングおよび発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経栄養因子は、ニューロンの分化、発達および維持に関与している。これらのタンパク質は、種々のタイプのニューロン細胞の退化を防ぎ、そして生存を促進することができ、かくして神経変性疾患のための潜在的な治療剤である。グリア細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）とは構造的に異なる神経栄養因子の増えつつあるサブファミリーの最初のメンバーであった。ＧＤＮＦは、成長因子のトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）サブファミリーのメンバーであって、アミノ酸配列内に７個の高度に保存されたシステイン残基の特異的パターンを特徴とする（非特許文献１）。ＧＤＮＦは、本来は、イン・ビトロでの胚性腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存および機能を維持するその能力に基づくアッセイを用いて精製された（非特許文献２）。また、中枢（ＣＮＳ）もしくは末梢神経系（ＰＮＳ）における他のニューロン細胞タイプは、ＧＤＮＦの生存効果に応答する（非特許文献３，非特許文献４，非特許文献５，非特許文献６）。ＧＤＮＦは、不活性なプロフォームにおいて細胞によって生産され、これが、ＲＸＸＲフリン（ｆｕｒｉｎ）認識部位において特異的に切断されて活性（成熟）ＧＤＮＦを生成する（非特許文献２）。ＧＤＮＦの外因性投与は、パーキンソン病、脳の黒質におけるドーパミン作動性細胞の７０％までの損失を特徴とする普通の神経変性障害、の動物モデルにおいて強力な神経保護効果を有する（非特許文献７，非特許文献８，非特許文献９，非特許文献１０，非特許文献１１）。
【０００３】
近年、ＧＤＮＦファミリーのさらなる神経栄養因子が発見された。ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）（ＮＴＮ）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から、培養における交感ニューロンのその生存促進能に基づくアッセイを用いて順化培地より精製された（非特許文献１２）。成熟ＮＴＮタンパク質は、成熟ＧＤＮＦに５７％類似している。ペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）（ＰＳＰ）は、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いて退化プライマーＰＣＲを使用するクローニングによって発見された。成熟ＰＳＰは、成熟ＧＤＮＦ同様、培養において腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンおよび運動ニューロンの生存を促進する（非特許文献１３）。成熟ＧＤＮＦおよびＮＴＮと成熟ＰＳＰタンパク質の類似性は、ほぼ５０％である。アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）（ＡＲＴＮ）は、ＤＮＡデータベース検索によって発見され、そして培養における感覚および交感ニューロンの生存因子である（非特許文献１４）。
【０００４】
ＧＤＮＦ、ＮＴＮ、ＰＳＰおよびＡＲＴＮは、下流の細胞内シグナル伝達を実施するためにヘテロ二量体の受容体複合体を必要とする。ＧＤＮＦは、ＧＤＮＦファミリー受容体α−１（ＧＦＲα−１；ＧＦＲα命名委員会、１９９７）サブユニット、グリコシル−ホスファチジル−イノシトール（グリコシル−ＰｔｄＩｎｓ）に固定された膜タンパク質に結合する（非特許文献１５，非特許文献１６，非特許文献１７）。続いて、ＧＤＮＦ／ＧＦＲα−１複合体は、ｃＲＥＴプロトオンコジーン、膜結合チロシンキナーゼに結合し、活性化して（非特許文献１８，非特許文献１９）、ｃＲＥＴにおけるチロシン残基のリン酸化と、続く下流のシグナル伝達経路の活性化をもたらす（非特許文献２０）。リガンド結合性受容体のＧＦＲαファミリーの若干の他のメンバーが特徴付けられた（非特許文献２１，非特許文献１７，非特許文献２２，非特許文献４，非特許文献２３）。ＧＦＲα−２およびＧＦＲα−３（非特許文献２４，非特許文献２５，非特許文献２６，非特許文献
２７，非特許文献１４）は、多くの異なるグループによって同定された。ＧＦＲα−１およびＧＦＲα−２は、ほとんど全ての組織において広く発現し、そして発現は、発生的に制御されているようである（非特許文献１７，非特許文献２８）。
【０００５】
ＧＦＲα−３は、発生中もしくは成熟した中枢神経系では発現されないが、若干の発生中および成熟した末梢神経系の感覚および交感神経節では高度に発現される（非特許文献２９，非特許文献２７，非特許文献１４）。第４のファミリーメンバー、ＧＦＲα−４は、ニワトリｃＤＮＡからクローン化された。ＧＦＲα−１は、ＧＤＮＦに対する好適な受容体であり、一方ＧＦＲα−２は、ＮＴＮを優先的に結合する（非特許文献１５，非特許文献１６，非特許文献２２）。ニワトリＧＦＲα−４は、ｃＲＥＴと一緒になってＰＳＰに対する機能的受容体複合体を形成する。両ＧＦＲα−３およびｃＲＥＴを発現する細胞は、ＧＤＮＦ、ＮＴＮもしくはＰＳＰのいずれにも応答しないことが分かった（非特許文献２６，非特許文献１４）。近年、ＡＲＴが、好適なリガンド結合性受容体としてＧＦＲα−３を用いてｃＲＥＴを通してシグナルを送ることが分かった（非特許文献１４）。ＧＤＮＦが、ｃＲＥＴの存在下でＧＦＲα−２もしくはＧＦＲα−３に結合でき（非特許文献１７，非特許文献１９）、そしてＮＴＮが、低い親和力でＧＦＲα−１に結合できる（非特許文献２２）ので、神経栄養因子とＧＦＲα受容体間のクロストークが、イン・ビトロにおいて可能である。総括すれば、ＧＤＮＦ、ＮＴＮ、ＰＳＰおよびＡＲＴは、神経栄養シグナリング系の一部であり、これによって種々のリガンド結合性サブユニット（ＧＦＲα−１〜４）が、同じチロシンキナーゼサブユニット（ｃＲＥＴ）と相互作用することができる。これらのイン・ビトロの知見の生理学的関連性は、近年、遺伝子ノックアウト研究において示され、これは、ＧＤＮＦが、イン・ビボにおいてＧＦＲα−１と相互作用するのに対して、ＮＴＮは、ＧＦＲα−２に対する好適なリガンドであることを明らかに示している。
【０００６】
本発明者らは、エノビン（ＥＶＮ）、ＧＤＮＦファミリーの第４のメンバーを同定し、クローン化し、発現し、染色体上の位置を定め、そして特徴付けした。成熟ＥＶＮタンパク質の知識は、種々の機能性および非機能性ｍＲＮＡスプライシング変異体の発見とともに拡大された。さらにまた、本発明者らは、ＥＶＮの発現データ、ＧＦＲα−３への結合データ、ならびにスタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）で分化されたＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞培養における、軸索成長およびタキソール誘導神経毒性に対する保護へのＥＶＮのイン・ビトロ効果を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｉｎｇｓｌｅｙ，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ８（１９９４），１３３−１４６
【非特許文献２】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０（１９９３），１１３０−１１３２
【非特許文献３】Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６（１９９４），１０６２−１０６４
【非特許文献４】Ｂｕｊ−Ｂｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７（１９９５），７２１−７２４，
【非特許文献５】Ｍｏｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１９９５），９０９２−９０９６
【非特許文献６】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３（１９９５），３４４４−３４６
【非特許文献７】Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３（１９９５），３３９−３４１
【非特許文献８】Ｔｏｍａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３（１９９５），３３５−３３９
【非特許文献９】Ｇａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０（１９９６），２５２−２５５
【非特許文献１０】Ｃｈｏｉ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７５（１９９７），８３８−８４１
【非特許文献１１】Ｂｉｌａｎｇ−Ｂｌｅｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（１９９７），８８１８−８８２３
【非特許文献１２】Ｋｏｔｚｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８４（１９９６），４６７−４７０
【非特許文献１３】Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２０（１９９８），２４５−２５３
【非特許文献１４】Ｂａｌｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮＡｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１９９８），５８０１−５８０４
【非特許文献１５】Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８５（１９９６），１１１３−１１２４
【非特許文献１６】Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（１９９６），８０−８３
【非特許文献１７】Ｓａｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（１９９７），６２３８−６２４３
【非特許文献１８】Ｄｕｒｂｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８１（１９９６），７８９−７９３
【非特許文献１９】Ｔｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８１（１９９６），７８５−７８８
【非特許文献２０】Ｗｏｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７１（１９９６），２３６１９−２３６２２
【非特許文献２１】Ｂａｌｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １８（１９９７），７９３−８０２
【非特許文献２２】Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７（１９９７），７１７−７２１
【非特許文献２３】Ｓｕｖａｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６（１９９７），１２６７−１２７３
【非特許文献２４】Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７２（１９９７），３３１１１−３３１１７
【非特許文献２５】Ｍａｓｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｌｏｃｈｍ．  ２５１（１９９８），６２２−６３０
【非特許文献２６】Ｗｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３（１９９８），３５０２−３５０８
【非特許文献２７】Ｎａｖｅｉｌｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ  ９５（１９９８），１２９５−１３００
【非特許文献２８】Ｗｉｄｅｎｆａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １７（１９９７），８５０６−８５１９
【非特許文献２９】Ｗｉｄｅｎｆａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １０（１９９８），１５０８−１５１７
【発明の概要】
【０００８】
本出願において、新規なヒト神経栄養成長因子、「エノビン」をコードしている核酸分子、該核酸分子を含有する発現ベクター、該ベクターにより形質転換される宿主細胞、該核酸分子によってコードされている神経栄養成長因子、単離されたエノビン、エノビンの作動剤もしくは拮抗剤として働く化合物、および核酸またはエノビンタンパク質またはそれらの作動剤もしくは拮抗剤を含有する製薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】エノビンと命名された本発明による神経栄養因子の部分ｃＤＮＡ配列である。
【図２】ヒトＧＤＮＦ，ＮＴＮ，ＰＳＰおよびＥＶＮの予測される成熟タンパク質配列である。
【図３】エノビンの部分ｃＤＮＡ配列である。
【図４】ヒト・エノビンの染色体局在の図示である。
【図５】種々のヒト組織におけるエノビンの発現の図示である。
【図６】１０−６Ｍタキソールによる７２時間治療後のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の全生存のグラフによる図示および溶媒の条件に対して標準化された、この生存に及ぼすエノビンの増加用量の効果である。
【図７】溶媒の条件に対して標準化された、スタウロスポリンで分化されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の軸索成長に及ぼす４８時間にわたるエノビンの増加濃度の効果のグラフ表示である。
【図８】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図９】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１０】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１１】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１２】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１３】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１４】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１５】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１６】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１７】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１８】種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図１９】針突き（ｐｉｎ  ｐｒｉｃｋ）試験を用いるタキソール誘発の感覚欠乏に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図２０】針突き試験を用いるタキソール誘発の感覚欠乏に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図２１】エノビンのＤＮＡ配列である。
【図２２】ヒト組織における種々のエノビンスプライシング変異体の発現の示である。
【図２３】図２１のＤＮＡ配列から２つのイントロンをスプライシングアウトすることによって得られる、エノビンの長いスプライシング変異体の予測されるタンパク質配列。
【図２４】図２１のＤＮＡ配列から２つのイントロンをスプライシングアウトすることによって得られる、エノビンの別の（短い）スプライシング変異体の予測されるタンパク質配列。
【図２５】普通の疾病組織においてエノビンの発現レベルを比較するために計画された実験から得られた結果のグラフ表示である。
【図２６】パーキンソン病およびがんにおいてエノビンおよびＧＡＰＤＨの発現レベルを検出するために得られた結果のグラフ表示である。
【発明の詳細な記述】
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、図２１に示されるアミノ酸配列をもつ、本明細書においてエノビンと命名されたヒト神経栄養成長因子をコードしているか、あるいは該成長因子の機能的等価物、誘導体または生体前駆体をコードしている核酸分子が提供される。好ましくは、該核酸分子は、ＤＮＡ、そしてなおより好ましくは、ｃＤＮＡ分子である。
【００１１】
好ましくは、本発明による核酸は、図１に示される配列の位置８１〜４１９、そしてより好ましくは位置８１〜４２２の配列、そしてなおより好ましくは、図１に示される完全配列を含有する。
【００１２】
位置８１〜４１９の核酸分子は、該エノビンタンパク質の安定なプロフォーム中に存在するＲＸＸＲプロセッシング部位において、タンパク質のプロフォームのプロセッシングに続いて生じる成熟エノビンタンパク質の配列をコードしていると考えられる。
【００１３】
また、当業者には周知である高いストリンジェント条件下で、本発明による核酸配列のいずれかにハイブリダイズすることが可能なアンチセンス分子が、本発明によって提供される。
【００１４】
ここに使用されるようなハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ポリ核酸が安定である条件を指す。ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）において反映される。Ｔｍは、式：
８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ+］＋０．４１（％Ｇ＆Ｃ）
−６００／ｌ
［式中、ｌは、ヌクレオチド内でのハイブリッドの長さである］
によって近似させられる。Ｔｍは、配列相同性における１％減少毎に、ほぼ１〜１．５℃低下する。
【００１５】
有利には、本発明による核酸分子は、適当な発現ベクターを用いて宿主細胞もしくは類似するものにおいて、本発明によるヒト神経栄養成長因子を発現するために使用されてもよい。
【００１６】
本発明による発現ベクターは、ＤＮＡフラグメントの発現に影響を与えることができる調節配列、例えばプロモーター領域に操作可能に結合されたそのようなＤＮＡを発現することが可能なベクターを含む。
【００１７】
発現のために要求される調節要素は、ＲＮＡポリメラーゼを結合するプロモーター配列
およびリボソーム結合のための転写開始配列を含む。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター、および転写開始のためのシャイン・ダルガルノ配列および開始コドンＡＵＧを含んでもよい。同様に、真核生物発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種もしくは同類のプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの脱離のための終止コドンを含んでもよい。そのようなベクターは、商業的に得られても、または当該技術分野において周知の方法によって、既述の配列から構築できる。
【００１８】
かくして、発現ベクターは、組み換えＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物、例えばプラスミド、ファージ、組み換えウイルス、または適当な宿主細胞中への導入によってＤＮＡもしくはＲＮＡフラグメントの発現をもたらす他のベクターを指す。適当な発現ベクターは当業者には周知であり、そして真核細胞および／または原核細胞において複製可能であるもの、およびエピソームのまま残るもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものを含む。
【００１９】
本発明による核酸にハイブリダイズすることが可能なアンチセンス分子は、プローブもしくは薬物として、または製薬組成物において使用されてもよい。
【００２０】
本発明による核酸分子は、アンチセンスＲＮＡの作成用に提供するために、アンチセンス方向において既述のベクター中に挿入されてもよい。アンチセンスＲＮＡもしくは他のアンチセンス核酸は、合成手段によって作成されてもよい。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、本発明による発現ベクターにより形質転換、トランスフェクションもしくは感染された宿主細胞を含み、この細胞は、好ましくは、真核細胞、そしてより好ましくは哺乳類細胞を含む。
【００２２】
該細胞の続いての形質転換、そして形質転換された細胞の続いての選択のために、適当な発現ベクター中へのクローン化されたＤＮＡの組み入れは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓにおいて提供されるように、当業者には周知である。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、本発明による核酸分子のヌクレオチド少なくとも１５、好ましくはヌクレオチド１５〜５０をもつ核酸分子を含む。
【００２４】
これらの配列は、有利には、プローブまたは複製を開始するべきプライマーまたは類似のものとして使用されてもよい。そのような核酸分子は、当該技術分野において周知の技術により、例えば組み換えもしくは合成手段によって作成されてもよい。また、それらは、本発明による核酸の存在を検出するための診断キットもしくは用具もしくは類似のものにおいて使用されてもよい。これらの試験は、一般に、プローブをハイブリダイズする条件下でサンプルと接触させ、そしてプローブとサンプル中のいずれかの核酸間でのいずれか二重らせん形成の存在を検出することを含む。
【００２５】
本発明によれば、これらのプローブは、固形支持体に固定されてもよい。好ましくは、それらは、多数のプローブが、単一の生物サンプルに同時にハイブリダイズできるようにアレイ上に存在している。プローブは、アレイ上に点在させるか、またはアレイ上でインサイチューで合成することができる。（Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９６「高密度オリゴヌクレオチド・アレイ中へのハイブリダイゼーションによる発現モニタリング」、参照）。単一のアレイは、別々の配置において１００，５００または１，０００個以上もの
異なるプローブを含有できる。
【００２６】
また、本発明による核酸分子は、例えば、ＰＣＲクローニング機序を用いるような組み換えもしくは合成手段を使用して作成されてもよく、この機序は、一般に、クローン化されることが望まれる遺伝子の領域に対して約１０〜５０ヌクレオチドであってもよい１対のプライマーを作成し、そのプライマーをヒト細胞からのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を遂行し、増幅された領域もしくはフラグメントを単離し、そして増幅されたＤＮＡを回収することを伴う。一般に、ここで定義されるような技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌにより既述されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９）。
【００２７】
本発明による核酸もしくはオリゴヌクレオチドは、指示標識を担持してもよい。適当な標識は、放射性同位元素、例えば32Ｐもしくは35Ｓ、酵素標識もしくは他のタンパク質標識、例えばビオチンもしくは蛍光マーカーを含む。そのような標識は、本発明の核酸もしくはオリゴヌクレオチドに付加されてもよく、そしてそれ自体既知の技術を用いて検出されてもよい。
【００２８】
有利には、ヒト対立遺伝子変異体もしくは本発明によるＤＮＡ分子の多型性は、例えば、例えば種々の集団からの個体の範囲から、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーをプローブすることによって同定されてもよい。さらにまた、本発明による核酸およびプローブは、当該技術分野において周知の技術、例えばサンガージデオキシチェーンターミネーション法を用いて、患者からのゲノムＤＮＡを配列決定するために使用されてもよく、この方法は、有利には、本発明による成長因子に関連するある障害に対する患者の何らかの素質を確認できる。
【００２９】
さらに、本発明によるヒト神経栄養因子エノビンを発現することが可能な導入遺伝子を含有しているトランスジェニック細胞、組織もしくは生物体が、本発明によって提供される。
【００３０】
本明細書において使用されるところの用語「発現の可能な導入遺伝子」は、本発明による神経栄養因子の同じ機能および／または活性をもつ神経栄養因子の発現に導くすべての適当な核酸配列を意味する。導入遺伝子は、例えば、染色体中もしくは染色体外の状態で組み込まれた、ヒト細胞から単離されたゲノム核酸またはｃＤＮＡを含む合成核酸を含んでもよい。
【００３１】
好ましくは、導入遺伝子は、ベクターが該神経栄養因子をコードしている核酸分子、または該核酸分子の機能的フラグメントを含む、本発明によるベクターを含有する。該核酸の「機能的フラグメント」は、該神経栄養因子またはその機能的等価物をコードしている遺伝子もしくはｃＤＮＡのフラグメントを意味するととらえるべきであり、このフラグメントは、発現されて本発明による機能的神経栄養成長因子を生産することが可能である。かくして、例えば、対応する受容体と相互作用する特異的アミノ酸残基に対応する本発明による神経栄養成長因子のフラグメントは、また、本発明の一部を形成し、そしてこれらのフラグメントは、本発明による成長因子の対応する受容体を活性化する作動体として機能するために役立って、細胞へのその成長促進および生存維持効果を誘起できる。また、本発明のこの態様は、本発明による核酸の差別的にスプライシングされたイソ型および転写開始物（ｓｔａｒｔｓ）を含む。
【００３２】
本発明によれば、定義された核酸は、同一の核酸のみならず、また、特に同類アミノ酸置換における退化コードによる同義コドン（同じアミノ酸残基を指定する異なるコドン）
をもたらす塩基における置換を含む何らかの小さい塩基変異を含む。用語「核酸分子」は、また、関連する塩基変異を与えるいかなる一本鎖配列にも相補的な配列を含む。
【００３３】
さらなる態様によれば、本発明は、本明細書において定義されるような核酸分子によってコードされている、単離されたヒト神経栄養成長因子を提供する。好ましくは、成長因子は、図１のアミノ酸配列のアミノ酸配列位置２７〜１３９またはそれらの機能的等価物、誘導体もしくは生体前駆体を含有する。
【００３４】
本明細書において定義されるような「機能的等価物」は、成長因子エノビンに関連する成長性および機能性のすべてを表す成長因子を意味するととらえられるべきである。本明細書において定義されるようなエノビンの「誘導体」は、ポリペプチドにおけるある種のアミノ酸が変更もしくは欠失されるか、または他のアミノ酸によって置換され、そしてポリペプチドがエノビンの生物活性を保持し、そして／またはポリペプチドが、チャレンジ抗原として本発明によるエノビンを使用して生じた抗体と反応できる、ポリペプチドを含むことを意図している。
【００３５】
融合タンパク質およびフラグメントを含む、エノビンのハイブリッドおよび改変型は、本発明の範囲内に包含される。ハイブリッドおよび改変型は、本発明によれば、例えば、ある種のアミノ酸が、例えば、改変が、なおもエノビンの生物活性を保持しているタンパク質をもたらす点突然変異によるような、若干の改変もしくは置換にかけられた場合を含む。特定の核酸配列は、エノビンに同じか実質的に同じ性質を表す成長因子を生産するように、当業者によって改変することができる。
【００３６】
当該技術分野において周知のように、多くのタンパク質は、タンパク質のＮ末端における（プレ）シグナル配列をもってイン・ビボで生産される。さらにまた、そのようなタンパク質は、成熟タンパク質への安定な前駆体を表すさらなるプロ配列を含有してもよい。そのようなプレおよびプロ配列は、生物活性のためには一般に必要ではない。本発明によるエノビン分子は、図２１に示される完全な長さの配列のみならず、また、位置２７〜１３９も含み、これは、このタイプの成長因子に存在するＲＸＸＲタンパク質分解プロセッシング部位に続き、そしてエノビンの成熟配列を表すと考えられる。
【００３７】
本発明により定義されたタンパク質、ポリペプチドもしくはアミノ酸配列は、同一アミノ酸配列のみならず、また、同類アミノ酸置換（その側鎖に関連するアミノ酸による置換）を含む天然のアミノ酸配列とは異なる小さいアミノ酸変異に加えてそれらの異性体も含む。また、天然のアミノ酸から変化しているが、天然に存在する配列によってコードされるポリペプチドと免疫学的に同一または類似であるポリペプチドをもたらすアミノ酸配列も含まれる。
【００３８】
本発明によるタンパク質もしくはポリペプチドは、該タンパク質もしくはポリペプチドと実質的に相同である天然に存在する対立遺伝子変異体を含む、そのような配列の変異体をさらに含む。本文脈において、実質的な相同性は、本発明による核酸分子によってコードされるタンパク質もしくはポリペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、９０％もしくは９５％のアミノ酸相同性をもつ配列と見なされる。
【００３９】
本発明による宿主細胞によって発現される神経栄養成長因子は、また、本発明内に包含される。
【００４０】
さらに、本発明は、アンチセンス技術の使用によって、本発明による神経栄養成長因子をイン・ビボで抑制することに対向される。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を調節するために使用でき、この
両方法は、ＤＮＡもしくはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟タンパク質をコードしているＤＮＡ配列の一部が、長さ１０〜５０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに使用できる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計される（三重らせん−Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）；それによる転写の阻止およびエノビンの生産、参照）。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン・ビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてエノビンへのｍＲＮＡ分子の翻訳を遮断する。
【００４１】
従来同定されたＧＤＮＦファミリーの成長因子と本明細書に既述される成長因子間の配列類似性のために、エノビンは、また、細胞の生存および成長を促進し、そして該神経栄養因子の機能および発現における欠陥からもたらされる障害を治療することができると考えられる。
【００４２】
したがって、本発明による核酸分子もしくは神経栄養因子は、有利には、該障害の症候を軽減させるのに十分な濃度における本発明による核酸分子もしくは成長因子量を、患者に投与することによって該患者における神経障害を治療または予防するために使用されてもよい。かくして、本発明の核酸分子は、ニューロン細胞の維持および生存を促進するため、そしてパーキンソン病、アルツハイマー病、末梢神経病、筋委縮性側索硬化症、末梢および中枢神経傷害もしくは損傷および神経毒曝露を含む神経細胞障害もしくは神経変性症状を治療するために使用されてもよい。
【００４３】
本発明による神経栄養成長因子は、有利には、ニューロン細胞もしくは細胞集団、特に、アポトーシスを受けるべく誘導されたそれらのニューロン細胞もしくは細胞集団に、神経栄養もしくは神経保護効果を与えることが観察された。したがって、本発明による核酸もしくはエノビン成長因子それ自体は、本明細書に記述される神経障害の症候を軽減または予防するのに十分な濃度における該核酸分子もしくはエノビン量を、それらを必要とする患者に投与することによって、神経変性障害、例えば卒中、ハンチントン病、末梢神経病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、末梢神経傷害もしくは損傷、神経毒曝露、多発性内分泌新形成、家族性ヒルシュスプルング病、プリオン関連疾患、クロイツフェルド・ヤコブ病を治療することに、さらに使用されてもよい。
【００４４】
その上、そして下記実施例においてより詳細に記述されるが、エノビンは、誘発された感覚欠乏の回復を速めることが分かっていて、このことは、これらの障害の症候を軽減または予防するのに十分な濃度においてそれを必要とする患者に投与することによって、末梢もしくは中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ／炎症疾患ならびにコンダクタンス障害を治療または緩和するための候補薬として、エノビンを同定する。
【００４５】
上記神経障害を治療するその外の方法は、本発明によるヒト神経栄養成長因子を発現する患者細胞、例えば本明細書に記述されるトランスジェニック細胞中に移植することを含む。
【００４６】
また、本発明による核酸分子および神経栄養成長因子は、製薬組成物中に、そのための製薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤もしくは添加物と一緒に含有されてもよい。
【００４７】
本発明の神経栄養因子に対する抗体は、有利には、当該技術分野において既知である技術によって作成されてもよい。例えば、ポリクローナル抗体は、成長因子もしくはそのエピトープを宿主動物、例えばマウスに接種し、そして免疫血清を回収することのよって作
成されてもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｒ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５−４９７によって記述されるような既知技術にしたがって作成されてもよい。
【００４８】
本発明による抗体は、有利には、本発明による成長因子の存在を検出する方法において使用されてもよく、この方法は、抗体をサンプルと反応させ、そして該抗体に結合されるいずれかのタンパク質を同定することを含む。また、本発明による抗体を含む該方法を遂行するキット、および該サンプルと抗体を反応させる手段が提供される。
【００４９】
また、上記の抗体および該抗体と該サンプルを反応させるための手段を含む、サンプルにおいて本発明による神経栄養成長因子の存在を検出するためのキットもしくは器具が、本発明によって提供される。
【００５０】
本発明の神経栄養因子と相互作用するタンパク質、例えばそれは対応する細胞受容体であるが、それは、分子生物学者には周知である二ハイブリッドベクター系を用いてタンパク質−タンパク質相互作用を研究することによって同定されてもよい（Ｆｉｅｌｄｓ  ＆
Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５  １９８９）。この技術は、リポーター遺伝子を活性化する転写因子のイン・ビボでの機能的再構築に基づいている。より特別には、その技術は、ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインをもつ転写因子によって制御されるプロモーターの調節下にリポーター遺伝子を含有するＤＮＡ構築物を提供し、本発明による核酸配列のフラグメントもしくは全部の第１の融合物をコードしている第１のハイブリッドＤＮＡ配列および転写因子の該ＤＮＡ結合ドメインか該活性化ドメインのいずれかを宿主細胞において発現し、第１の融合物に組み入れられていない転写因子のＤＮＡ結合ドメインもしくは活性化ドメインと一緒に、研究されるべき推定上の結合タンパク質をコードしている少なくとも１つの第２のハイブリッドＤＮＡ配列、例えばライブラリーまたは類するものを宿主において発現すること；宿主細胞におけるいずれかリポーター遺伝子産物の存在を検出することによって、本発明によるタンパク質と研究されるべきタンパク質のいずれかの結合を検出すること；場合によっては結合タンパク質をコードしている第２のハイブリッドＤＮＡ配列を単離すること；を含む。
【００５１】
そのような技術の例は、酵母におけるＧＡＬ４タンパク質を利用する。ＧＡＬ４は、酵母におけるガラクトース代謝の転写アクチベーターであり、そしてガラクトース代謝遺伝子ならびにタンパク質結合ドメインの上流にアクチベーターに結合するための別のドメインをもつ。ヌクレオチドベクターが構築されてもよく、これらの１つは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードしているヌクレオチド残基を含有する。これらの結合ドメイン残基は、既知のタンパク質をコードする配列、例えば本発明による核酸に融合されてもよい。他のベクターは、ＧＡＬ４のタンパク質結合ドメインをコードしている残基を含有する。これらの残基は、試験タンパク質、好ましくは問題の脊椎動物のシグナル伝達経路からの試験タンパク質をコードしている残基に結合される。本発明による核酸によってコードされる神経栄養因子と試験されるべきタンパク質との間の相互作用は、ベクターが形質転換されたＧＡＬ４転写欠失酵母細胞におけるリポーター分子の転写活性化をもたらす。好ましくは、β−ガラクトシダーゼのようなリポーター分子は、酵母ガラクトース代謝遺伝子の転写の回復により活性化される。
【００５２】
エノビンについての受容体は、ＧＦＲα３として本発明者らによって同定された。したがって、アッセイは、エノビンの作動もしくは拮抗化合物を同定するために作成されてもよい。また、このアッセイは、他の神経栄養成長因子とそれらの対応する受容体を組み合わせて使用されてもよい。同定された化合物は、パーキンソン病、アルツハイマー病のような障害、拡張したポリグルタミン配列に関連するニューロン障害、例えばハンチントン病、末梢神経病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、末梢神
経傷害もしくは損傷、神経毒曝露、多発性内分泌新形成および家族性ヒルシュスプルング病、プリオン関連疾患、クロイツフェルド・ヤコブ病、卒中、事実上末梢もしくは中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ／炎症疾患ならびにコンダクタンス障害を治療または予防するために、該神経障害を予防または治療するのに十分な濃度における該作動剤もしくは拮抗剤量を個体に投与することによって、使用されてもよい。また、そのような化合物は、製薬組成物中に、そのための製薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤もしくは添加物と一緒に含有されてもよい。
【００５３】
成長因子（例えばエノビンのような）の作動剤もしくは拮抗剤は、１つの実施態様では、適当な受容体およびｃＲＥＴを発現する細胞、組織もしくは生物体を、成長因子の存在下で候補化合物と接触させ、そして該細胞、組織もしくは生物体におけるＲＥＴ活性化レベルを、該候補化合物と接触されなかった対照と比較することによって同定されてもよい。
【００５４】
本発明の別の実施態様は、神経栄養成長因子の作動剤もしくは拮抗剤を同定する方法を含み、該方法は、該成長因子の適当な受容体およびｃＲＥＴを発現する細胞組織もしくは生物体を、該成長因子の存在下で候補化合物と接触させ、該適当な受容体が成分であるシグナル伝達経路におけるシグナリングキナーゼの活性化のレベルを、リポーター分子に共役される該シグナルキナーゼに特異的な抗体の添加に続いて、該化合物と接触されなかった細胞、組織もしくは生物体と比較されて測定することを含む。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、増強された蠕動腸運動に仲介される胃腸障害もしくは症状を治療するための薬物の製造における、本発明による拮抗剤として同定された化合物の使用を含む。
【００５６】
本発明のアッセイにおいて同定された化合物は、有利には、胃腸運動を増進するために使用されてもよく、したがって妨げられ、または傷害された胃腸通過に関連する症状を治療することに有用であろう。
【００５７】
したがって、そのような化合物は、妨げられ、または傷害された胃排出に関連する症状を患っているか、あるいはより一般的に、妨げられ、または傷害された胃腸通過に関連する症状を患っている、ヒトを含む温血動物を治療することに有用であろう。その結果、治療方法は、例えば胃食道逆流、消化不良、軽症胃アトニー、術後腸閉塞症および腸偽閉鎖症のような症状から患者を救護するために提供される。
【００５８】
消化不良は、消化機能の障害であり、これは、１次的な胃腸機能障害、特に筋緊張力の増加に関連する胃腸機能障害の症候として、または他の障害、例えば虫垂炎、胆嚢障害もしくは栄養失調症による併発症として起きる。消化不良症候は、例えば、食欲欠乏、満腹感、初期飽満、悪心、嘔吐および鼓腸である。
【００５９】
軽症胃アトニーは、胃における異常によるか、または糖尿病、進行性全身性硬化症、食欲不良および萎縮性筋硬直症のような疾病の合併症としてもたらされる。
【００６０】
術後腸閉塞症は、術後の筋緊張力の分裂による腸における閉塞もしくは運動性障害である。
【００６１】
腸偽閉塞症は、便秘、疝痛性痛みおよび嘔吐を特徴とする症状であるが、物理的閉塞の証拠はない。
【００６２】
かくして、本発明の化合物は、症状の実原因を取り除くためにも、また症状の徴候を緩
和するためにも使用することができる。
【００６３】
その上、結腸における運動活性の促進物質であるある種の化合物は、障害された運動性、例えば小腸および大腸自体か、または遅延した胃の排出と組み合わされての減退した蠕動に関連した症候を患っている患者における腸通過を正常化するか改善するために有用であろう。
【００６４】
本発明の化合物の結腸運動への利用に関して、腸系の運動障害、例えば便秘、偽閉塞症、腸アトニー、術後腸アトニー、感応性腸症候群（ＩＢＳ）および薬物誘発の通過遅延を患っているヒトを含む、温血動物を治療する方法が提供される。
【００６５】
また、本発明のアッセイにより拮抗剤として同定された化合物は、腸における増強した蠕動運動からもたらされる胃腸症状、例えば下痢（分泌性下痢、細菌誘発性下痢、胆汁性下痢、旅行者の下痢および心理的下痢）、クローン病、痙攣性結腸、感応性腸症候群（ＩＢＳ）、下痢優勢の感応性腸胃腸過敏症の治療もしくは予防において有効な用途をもつであろう。
【００６６】
本発明の化合物の利用に関して、本発明は、また、胃腸症状、例えば感応性腸症候群（ＩＢＳ）、特にＩＢＳの下痢症状を患っているヒトを含む、温血動物を治療する方法を提供することが続く。その結果、治療方法は、感応性腸症候群（ＩＢＳ）、下痢優勢の感応性腸症候群、腸過敏症のような症状を患っている患者を救護するため、そして胃腸過敏症に関連する疼痛の軽減のために提供される。
【００６７】
また、本化合物は、他の胃腸障害、例えば上部消化管運動に関連した障害において、ならびに嘔吐および細胞毒性薬物や放射能に誘発される嘔吐を治療する鎮吐薬として、有力な用途をもつであろう。
【００６８】
炎症性腸疾患は、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病および類するものを含む。
【００６９】
また、本発明のさらなる態様は、障害の症候を緩和もしくは軽減するのに十分な濃度において、本発明によるアンチセンス分子もしくはその拮抗剤量を患者に投与することによる、本発明によるエノビンの発現によって仲介される該障害の治療方法を含む。
【００７０】
また、エノビンの不活性化もしくは発現を抑制することによって仲介される障害は、有利には、障害の症候を軽減もしくは予防するのに十分な濃度において、エノビンの作動剤として同定された化合物の量を個体に投与することによって治療されてもよい。
【００７１】
さらなる態様では、本発明は、ヒト神経栄養成長因子エノビンに関連する疾病の治療のための製薬製剤を作成する方法を提供し、該方法は、本発明によるエノビンの作動剤もしくは拮抗剤として同定される候補化合物を選択し、該化合物のバルク量を製造し、そして製造された化合物を製薬的に許容しうるキャリヤーにおいて製剤化することを含む。
【００７２】
以下の実施例からより詳細に見られるように、エノビンは、タキソール誘導感覚欠乏を軽減することに有効であった。したがって、エノビンは、事実上末梢および中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リウマチ病ならびにコンダクタンス障害において可能性のある役割を演じるであろうし、そして経皮、局所、局部中心点（ｌｏｃａｌ  ｃｅｎｔｒａｌ）（例えば硬膜外、夾膜内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、ＩＣＶ、集網内、ニューロン内）、経口、肛門および全身適用後の感覚行程において変調的役割を演じることができる。したがって，エノビンによって仲介される他の症状に関しても本明細書に記述されるような同じ方式において、これらの症状は、該障害の症候を緩和もしくは予防するために
十分な濃度において、本発明により適当であるような、アンチセンス分子、核酸、エノビンタンパク質、製薬組成物、または作動剤もしくは拮抗剤として同定された化合物のいずれかを投与することによって緩和もしくは予防さえできるであろう。
【００７３】
本発明の治療もしくは製薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、夾膜内もしくは脳内を含む当該技術分野において既知のすべての適当な経路によって、またはエクス・ビボ治療処方における細胞への投与によって投与することができる。投与は、注射によるように急速にでも、または遅い注入もしくは徐放製剤の投与による長時間にわたってもよい。中枢神経系における組織を治療するためには、投与は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中への注射もしくは注入によってもよい。
【００７４】
また、エノビンは、所望の製薬的もしくは薬力学性質を提供する薬剤と結合されても共役されてもよい。例えば、当該技術分野における既知のいずれかの物質と結合されて、トランスフェリン受容体に対する抗体のように、血液−脳バリヤーを横切る浸透もしくは輸送を促進することができ、そして静脈内注射によって投与できる。
【００７５】
本発明によるエノビン、アンチセンス分子または実際にエノビンの作動剤もしくは拮抗剤として同定された化合物は、製薬組成物の形態において使用されてもよく、これは、当該技術分野において周知の操作にしたがって製造できる。好適な組成物は、製薬的に許容しうる媒質もしくは希釈剤もしくは添加物、例えば生理食塩水を含有する。また、他の製薬的に許容しうるキャリヤーは、無毒な塩類、滅菌水もしくは類するものが使用されてもよい。また、適当なバッファーは、凍結乾燥させ、そして保存された組成物を、後の投与のために滅菌水の添加によって再調製するまで無菌状態で存在してもよい。固形もしくは半固形の生物学的に適合しうるマトリックス中へのエノビンの組み入れが実施されてもよく、これは、治療を要する組織中に移植できる。
【００７６】
また、キャリヤーは、ｐＨ、張性、粘度、滅菌性、凍結乾燥性、溶解度もしくはそれに類するような他の条件を修飾するために、他の製薬的に許容しうる添加物を含有してもよい。また、投与後、持続もしくは遅延放出させる製薬的に許容しうる添加物が含有されてもよい。
【００７７】
本発明によるエノビンタンパク質もしくは核酸分子もしくは化合物は、経口的に投与されてもよい。この実施態様では、それらは、当業者には周知である固形製剤中に適当なキャリヤーとともに封入および合体されてもよい。
【００７８】
当業者には周知であるように、一定の用量処方が、使用されるべき特定の投与経路に応じて、患者の体表面積もしくは占められる体空間の容積にしたがって計算されてもよい。しかしながら、実際に投与される組成物の量は、治療されるべき障害に付随する環境、例えば症候の重篤度、投与される組成物、個々の患者の年齢、体重および応答、および選択された投与経路に基づいて、医療実務者によって決定されるであろう。
【００７９】
本発明は、純粋に例示である次の実施例によって、そしてここに添付する図面の引用によって、より明白に理解されるであろう：
【００８０】
図１：エノビンと命名された本発明による神経栄養因子の部分ｃＤＮＡ配列である。共通配列は、種々のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡにおいてプライマーＰＮＨｓｐ３およびＰＮＨａｐｌを用いるＰＣＲ増幅、それに続くクローニングおよび得られた配列の配列解析と比較によって得られた。予期される１文字コードアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の上に示される。ヌクレオチド残基数は、ＤＮＡ配列の右に示され、一方アミノ酸残基数は、翻訳されたタンパク質配列の右に示される。プロドメインに対する推定ＲＸＸＲ切断部位は、
太い下線で指示される。成熟タンパク質の推定の始まりは、矢印によって指示される。ＴＧＦ−βファミリーの全メンバーの７個の保存システイン残基特性は、太く指示される。潜在性Ｎ−グリコシル化部位は、二重の下線である、
【００８１】
図２：ヒトＧＤＮＦ，ＮＴＮ，ＰＳＰおよびＥＶＮの予測される成熟タンパク質配列である。配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントプログラムを用いて整列された。すべて３種のタンパク質間に保存されるアミノ酸残基は、黒い範囲に含まれる。２〜３種の配列間に保存される残基は、灰色で塗られている。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの７個の保存システイン残基特性は、配列の上に星印によって指示される。アミノ酸残基は、右に数が示される。ダッシュは、整列を最適化するために配列中に導入されたギャップを示す、
【００８２】
図３：エノビンの部分ｃＤＮＡ配列である。共通配列は、種々のｃＤＮＡにおけるＰＣＲ増幅（プライマーＰＮＨｓｐ１およびＰＮＨａｐｌを用いるプライマーＰＣＲ、およびプライマーＰＮＨｓｐ２およびＰＮＨａｐ２を用いるネストＰＣＲ）、それに続くクローニングおよび得られた配列の配列解析と比較によって得られた。ヌクレオチド３０〜２８４（読み枠Ａ）の翻訳された１文字コードアミノ酸配列は、配列の上に示され、そして右に数が示される（Ａ１〜Ａ８５）。この読み枠は、推定のＡＴＧ翻訳開始コドンを含有する。ヌクレオチド３３４〜８１０（読み枠Ｂ）の翻訳された１文字コードアミノ酸配列は、配列の上に示され、そして右に数が示される（Ｂ１〜Ｂ１５９）。この読み枠は、ＧＤＮＦ，ＮＴＮおよびＰＳＰとの相同領域を含有する。ヌクレオチド残基数は、ＤＮＡ配列の右に示される。プロドメインに対する推定ＲＸＸＲ切断部位は、太い下線で指示される。成熟タンパク質の推定の始まりは、矢印によって指示される。ＴＧＦ−βファミリーの全メンバーの７個の保存システイン残基特性は、太く指示される。潜在性Ｎ−グリコシル化部位は、二重の下線である、
【００８３】
図４：ヒト・エノビンの染色体局在の図示である。（Ａ）エノビンについてのＦＩＳＨマッピング結果の図。各ドットは、ヒト染色体１、領域ｐ３１．３−ｐ３２において検出される二重ＦＩＳＨシグナルを表す。（Ｂ）エノビンのＦＩＳＨマッピングの例。左図は、染色体１におけるＦＩＳＨシグナルを示す。右図は、染色体１を同定するための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールにより染色された同じ有糸分裂図を示す、
【００８４】
図５：種々のヒト組織におけるエノビンの発現の図示である。（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）エノビンの組織発現のノザンブロット解析。種々のヒト組織におけるエノビンｍＲＮＡの発現が、ヒト・ポリ（Ａ）リッチＲＮＡのブロットを解析するために、エノビンのコーディング領域の一部（成熟エノビンタンパク質をコードしている領域を含む）に対応するプローブを用いて検査された。（Ａ）多組織ノザン（ＭＴＮ）ブロット；（Ｂ）ＭＴＮブロットＩＩ）胎児性ＭＴＮブロットＩＩ。パネル（Ｄ）は、同じエノビンｃＤＮＡフラグメントによりプローブされたヒトＲＮＡマスターブロットのオートラジオグラフィーを示す。パネル（Ｅ）は、（Ｄ）からのＲＮＡマスターブロットにおけるヒト組織ｍＲＮＡサンプルの位置、
【００８５】
図６：１０−６Ｍタキソールによる７２時間治療後のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の全生存のグラフによる図示および溶媒の条件に対して標準化された、この生存に及ぼすエノビンの増加用量の効果である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、タキソールの適用前に２５ｎＭスタウロスポリンにより５日間分化された。データは、ｓｉｘｔｕｐｌａｔｅにおける２つの独立した実験からのものである。平均値および標準偏差が示される、
【００８６】
図７：溶媒の条件に対して標準化された、スタウロスポリンで分化されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の軸索成長に及ぼす４８時間にわたるエノビンの増加濃度の効果のグラフ表示であ
る。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、４８時間の実験を始める前に２５ｎＭスタウロスポリンにより２５日間分化される。ポジティブ対照として、２５ｎＭスタウロスポリンの分化効果が示される。軸索の長さは少なくとも５０００細胞において算出される。データは、２並列において実施された実施から提供される。平均値および標準偏差が示される、
【００８７】
図８〜１８：種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【００８８】
図１９：針突き（ｐｉｎ  ｐｒｉｃｋ）試験を用いるタキソール誘発の感覚欠乏に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。タキソール後にエノビンの２つの異なる用量（２３もしくは１３０μｇ／ｍｌ；ｎ＝１０ラット／群）か、または媒質／食塩水（ｎ＝２０ラット）かいずれかにより処置されたラットの経時的な平均（±１ＳＥＭ）累積スコアが与えられる。エノビンもしくは食塩水／媒質は、右後足の足底下（ｓｕｂｐｌａｎｔａｒ）域中に容量７５μｌにおいて注射された。
【００８９】
図２０：針突き試験を用いるタキソール誘発の感覚欠乏に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。タキソール後にエノビンの２つの異なる用量（２３もしくは１３０μｇ／ｍｌ；ｎ＝１０ラット／群）か、または媒質／食塩水（ｎ＝２０ラット）かいずれかにより処置されたラットの経時的な平均（±１ＳＥＭ）累積スコアが与えられる。エノビンもしくは食塩水／媒質は、右後足の足底下域中に容量７５μｌにおいて注射された。
【００９０】
図２１：エノビンのＤＮＡ配列である。共通配列は、ヒト前頭皮質ｃＤＮＡおよびヒト・ゲノムＤＮＡにおいてプライマーＰＮＨｓｐ５およびＰＮＨａｐｌを用いるＰＣＲによる増幅、それに続くクローニング、得られた配列の配列解析と比較によって得られた。予期されるアミノ酸配列は、翻訳後に機能的エノビンタンパク質を生じる唯一スプライシング変異体についてＤＮＡ配列の上に示される。ヌクレオチド残基数は、ＤＮＡ配列の左に示され、一方アミノ酸残基数は、翻訳されたタンパク質配列の右に示される。配列決定されたｃＤＮＡフラグメントのゲノム配列との比較によって検出される５’および３’スプライシング部位が、それぞれ左もしくは右に曲がった縦線によって指示され、そして連続的に数字を付けられる。プロドメインに対する推定ＲＸＸＲフリン切断部位は、太い下線で指示される。成熟タンパク質の推定の始まりは、矢印によって指示される。ＴＧＦ−βファミリーの全メンバーの７個の保存システイン残基特性は、太く指示される。潜在性Ｎ−結合グリコシル化部位は、二重の下線である。５’および３’スプライシング部位が、数字を付けられ、そして円で囲まれている。
【００９１】
図２２：ヒト組織における種々のエノビンスプライシング変異体の発現の示である。（Ａ）種々のヒト組織由来のＲＮＡにおいてエノビン特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ、それに続くクローニング、およびＰＣＲ生成物の配列解析によって同定されたエノビンスプライシング変異体の概要図。上部の線はスケール（ｂｐ）を示す。第２の線はエノビンゲノム配列を表す。翻訳開始および終止コドンの位置、配列をコードしている成熟エノビンの開始の位置および５’および３’スプライシング部位（図２１参照）の位置が指示される。図の右部分は、１００ｂｐＤＮＡラダーとともに卵巣および前頭皮質ＲＮＡにおけるＲＴ−ＰＣＲによって得られたＰＣＲ生成物を示す。種々のｍＲＮＡ変異体の位置は、それらのサイズ（開始から終止コドンまで）とともに指示される。翻訳されたタンパク質は、左手側に示される。ボックスはｃＤＮＡにおいて表される領域を描く。破線はスプライシングアウトされたゲノムＤＮＡを表す。斜線領域は、成熟エノビン・コーディング配列を表す。点線は成熟エノビン・コーディング配列の始めを印す。機能的エノビンタンパク質を得ることが可能な２つの転写物が、左手側における星印によって指示される。（Ｂ）主スプライシング変異体の組織分布。写真は、種々のヒトｃＤＮＡにおいてエノビン特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって得られたＰＣＲフラグメントを示す。４個の主スプライシング変異体（Ａ〜Ｄ）が、左手側における矢印によって指示される。
サイズは、ゲルにおいてサイズ参照として使用された１００ｂｐＤＮＡラダーに基づいて右手側に指示される。
【００９２】
図２３：図２１のＤＮＡ配列から２つのイントロンをスプライシングアウトすることによって得られる、エノビンの長いスプライシング変異体の予測されるタンパク質配列。スプライシング部位５’−１および３’−１は、第１のイントロンを除去するために使用され、そしてスプライシング部位５’−２および３’−３は、第２のイントロンを除去するために使用される。これは、先に示された２２８アミノ酸残基タンパク質をコードしている読み枠をもつｃＤＮＡ配列をもたらす。
【００９３】
図２４：図２１のＤＮＡ配列から２つのイントロンをスプライシングアウトすることによって得られる、エノビンの別の（短い）スプライシング変異体の予測されるタンパク質配列。スプライシング部位５’−１および３’−２は、第１のイントロンを除去するために使用され、そしてスプライシング部位５’−２および３’−３は、第２のイントロンを除去するために使用される。これは、先に示された２２０アミノ酸残基タンパク質をコードしている読み枠をもつｃＤＮＡ配列をもららす。このタンパク質配列は、図２３の配列と比較して８アミノ酸残基を失っている。
【００９４】
図２５：普通の疾病組織においてエノビンの発現レベルを比較するために計画された実験から得られた結果のグラフ表示である。エノビンおよびＧＡＰＤＨ発現は、多発性硬化症およびアルツハイマー病に関して、脳組織において表される。
【００９５】
図２６：パーキンソン病およびがんにおいてエノビンおよびＧＡＰＤＨの発現レベルを検出するために得られた結果のグラフ表示である。
【００９６】
寄託
エノビンをコードしているＤＮＡ配列を含有しているプラスミドＥＶＮｍａｔ／ｐＲＳＥＴＢは、１９９７年４月２８日のブダペスト条約の約定に従って、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ−Ｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｌｌｅｃｔｉｅ（ＬＭＢＰ）Ｂ９０００，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍにおけるザ・ベルジアン・コオーディネーテッド・コレクションズ・オブ・ミクロ−ビオロジー（ｔｈｅ  Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｅ）（ＢＣＣＭ）に、受託番号ＬＭＢＰ３９３１の下、１９９９年５月６日に寄託された。
【００９７】
材料および方法
材料
ネイティブＴａｑポリメラーゼ、アンピシリン、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）および使用される全制限酵素は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。１０ｍＭｄＮＴＰ混合物は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ（Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。Ｑｉａｇｅｎ  プラスミド・ミニ−もしくはミディ−ＤＮＡ精製キット、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ＭｉｎｉｐｒｅｐキットおよびＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットは、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ｃＤＮＡライブラリー、ＭａｒａｔｈｏｎTm  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡキット、ヒト多組織ｃＤＮＡ（ＭＴＣTM）パネルＩおよびＩＩ多組織ノザンブロット、およびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得られた。全ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９６００サイクラー（ｐｅｒｋ
ｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）において行われた。ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地は、トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌおよびＮａＣｌ  １０ｇ／ｌからなる。２ｘＹＴ／アンピシリンプレートは、トリプトン１６ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌおよびアンピシリン１００ｍｇ／ｌからなる。
【００９８】
データベース相同性検索および配列比較
完全なヒト・グリア細胞系誘導の神経栄養因子（ＧＤＮＦ；受託番号Ｑ９９７４８）、クウィリー（ｑｕｅｒｙ）配列としてのニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）（ＮＴＮ；受託番号Ｐ３９９０５）およびペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）（ＰＳＰ；受託番号ＡＦ０４０９６２）ｃＤＮＡ誘導のタンパク質配列を使用して、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５（１９９０），４０３−４１０）検索が、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋヒト発現配列ｔａｇ（ＥＳＴ）およびゲノムデータベースの毎日最新のものにおいて遂行された。
【００９９】
追加のＢＬＡＳＴ検索は、受託番号ＡＣ００５０３８をもつゲノム配列およびＧｅｎＢａｎｋデータベースに存在する数種のＥＳＴを用いて遂行され、そしてこのゲノム配列に対して見られる相同性が検出された。
【０１００】
ＧＤＮＦファミリーのメンバー間の同一性パーセントおよび類似性パーセントは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ配列解析ソフトウエアーパッケージ、バージョン８．０，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて配列の対毎の比較で算出された。ＤＮＡもしくはタンパク質配列の整列は、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントプログラム（ＥＭＢＬ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により実施された。
【０１０１】
ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチド合成およびＤＮＡ配列決定
すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から整えられた。インサート特異的配列決定プライマー（１５−および１６量体）およびＰＣＲ反応に使用するためのプライマーは、手作業で計画された。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ−２０もしくは−１００陰イオン交換またはＱｉａｑｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において調製され、そしてカラムからＴＥバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ（ナトリウム塩），ｐＨ８．０）３０μｌ中に回収された。
【０１０２】
配列決定反応は、ＡＢＩプリズムＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ配列決定キットを用いて両鎖において実施され、そしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７７ＸＬシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＡＢＩ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）において行われた。ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒTMソフトウェアーは、配列組み立ておよび手編集のために使用された（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）。
【０１０３】
新規なＧＤＮＦ同族体のクローニング
翻訳タンパク質配列が成熟ＮＴＮおよびＰＳＰに相同であった、ＥＭＢＬ受託番号ＡＣ００５０３８のヌクレオチド６７４１１〜６８３４３にわたるＤＮＡ領域が、ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用された。使用された種々のプライマーが表１に示される。
【０１０４】
【表１】
2010158241.tif 000002
【０１０５】
プライマーＰＮＨｓｐ３およびＰＮＨａｐ１は，種々のヒト組織（胎児脳、全胎児、前立腺もしくは肺Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙTMｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、前頭皮質、海馬および小脳ｃＤＮＡ）から得られたｃＤＮＡに基づき、およびヒトゲノムＤＮＡに基づく５０２ｂｐのフラグメントを増幅するために使用された。ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースからのゲノム配列（ａｃｃ．ｎｏ．ＡＣ００５０３８）に基づいて、増幅されるべきフラグメントは、Ｇ＋Ｃ含量７６％をもつと予測された。したがって、増幅は、ＧＣリッチＤＮＡ配列の増幅のために標準化されたＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて実施された。ＰＣＲ反応は、１ｘＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応バッファー、０．２ｍＭｄＮＴＰ、１ＭＧＣ−ＭＥＬＴTM，プライマーＰＮＨｓｐ３およびＰＮＨａｐ１  ２００ｎＭ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合物１μｌおよびｃＤＮＡ１〜５μｌまたはゲノムＤＮＡ０．５μｇを含有する全容量５０μｌにおいて遂行された。サンプルは５分間９５℃に加熱され、そしてサイクリングは、３５サイクルの間９５℃で４５秒、５８℃で１分そして７２℃で４０秒間実施されたが、最終段階は７２℃で７分であった。サンプルは、最後に、Ａ−オーバーハングを付加するために、ネイティブＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕによって処理された。ＰＣＲ生成物は、１ｘＴＡＥバッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ（ナトリウム塩），ｐＨ８．３）における１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにおいて解析された。期待されたサイズ（４９５ｂｐ）のＰＣＲフラグメントが、ゲルから切り取られ、そしてＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットにより精製された。ＰＣＲフラグメントは、それらの同一性を確認するために配列決定され、そして製造者の指示にしたがって、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキットを用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローン化された。精製フラグメント約２０ｎｇが、全容量５μｌ中にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター１μｌと合わされた。反応物は、室温（２０℃）で５分間インキュベートされた。反応物２μｌは、ヒートショック・トランスフォーメーションを用いてＴＯＰ１ＯＦ’受容細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ）中にトランスフォームされ、そしてブルー・ホワイトスクリーニングのために１０ｍＭＩＰＴＧおよび２％（ｗ／ｖ）Ｘ−ｇａｌを補足された２ｘＹＴ／アンピシリンプレート上に平板塗布された。一夜増殖後ホワイトコロニーが、プレートから採取され、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを補足されたＬＢ培地５ｍｌ中で増殖され、そしてプラスミドＤＮＡがＱｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて調製された。期待されるサイズのインサートの存在は、ＥｃｏＲＩによる制限消化によって確認された。若干のポジティブクローンのプラスミドインサートが配列決定され、そして得られた配列がＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントプログラムを用いて比較された。
【０１０６】
新規ＧＤＮＦ同族体についての付加的なコーディング配列を得るために、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ配列（ａｃｃ．ｎｏ．ＡＣ００５０３８）に基づいて、９３１ｂｐの期待されるサイズをもつフラグメントが、プライマーＰＮＨｓｐ１およびＰＮＨａｐ１を用いてＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ反応は、１ｘＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応バッファー、０．２ｍＭｄＮＴＰ、１ＭＧＣ−ＭＥＬＴTM，プライマーＰＮＨｓｐ３およびＰＮＨａｐ１  ２００ｎＭ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合物１μｌ、および小脳、前脳皮質もしくは海馬からのｃＤＮＡ５μｌまたはゲノムＤＮＡ０．５μｇを含有する全容量５０μｌにおいて遂行された。サンプルは５分間９５℃に加熱され、そしてサイクリングは、３５サイクルの間９５℃で４５秒、５８℃で１分そして７２℃で１分３０秒間実施されたが、最終段階は７２℃で７分であった。ＰＣＲ生成物は、１ｘＴＡＥバッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ（ナトリウム塩），ｐＨ８．３）における１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにおいて解析された。
【０１０７】
第２回の増幅は、ネストプライマー（ＰＮＨｓｐ２およびＰＮＨａｐ２）を用いて行われた。第１回の増幅反応の１μｌが、１ｘＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応バッファー、０．２ｍＭｄＮＴＰ、１ＭＧＣ−ＭＥＬＴTM，プライマーＰＮＨｓｐ２およびＰＮＨａｐ２  ２００ｎＭおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合物を含有する全容量５０μｌにおいて使用された。サンプルは５分間９５℃に加熱され、そしてサイクリングは、３５サイクルの間９５℃で４５秒、５８℃で１分そして７２℃で１分３０秒間実施されたが、最終段階は７２℃で７分であった。サンプルは、１ｘＴＡＥバッファーにおける１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにおいて解析された。期待されたサイズ（８７０ｂｐ）のＰＣＲフラグメントが、ゲルから切り取られ、そしてＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットにより精製された。ＰＣＲフラグメントは、それらの同一性を確認するために配列決定され、そして製造者の指示にしたがって、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローン化された。精製フラグメント約２０ｎｇが、全容量５μｌ中にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター１μｌと合わされた。反応物は、室温（２０℃）で５分間インキュベートされた。反応物２μｌは、ヒートショック・トランスフォーメーションを用いてＴＯＰ１ＯＦ’受容細胞中にトランスフォームされ、そしてブルー・ホワイトスクリーニングのために１０ｍＭＩＰＴＧおよび２％（ｗ／ｖ）Ｘ−ｇａｌを補足された２ｘＹＴ／アンピシリンプレート上に平板塗布された。一夜増殖後ホワイトコロニーが、プレートから採取され、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを補足されたＬＢ培地５ｍｌ中で増殖され、そしてプラスミドＤＮＡがＱｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて調製された。期待されるサイズのインサートの存在は、ＥｃｏＲＩによる制限消化によって確認された。若干のポジティブクローンのプラスミドインサートが配列決定され、そして配列がＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントプログラムを用いて比較された。
【０１０８】
ＲＴ−ＰＣＲ解析によるエノビン遺伝子発現の解析
オリゴヌクレオチドプライマーＰＮＨｓｐ３およびＰＮＨａｐ１（表１参照）が，エノビンからの５０２ｂｐフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅のために使用された。６種の異なる保管遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに標準化されたヒト多組織ｃＤＮＡ（ＭＴＣTM）パネルにおいて遂行された。エノビン特異的プライマーによるＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ５μｌ、１ｘＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応バッファー、０．２ｍＭｄＮＴＰ、１ＭＧＣ−ＭＥＬＴTM，プライマーＰＮＨｓｐ３およびＰＮＨａｐ１  ４００ｎＭ、およびＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合物１μｌを含有する全容量５０μｌにおいて遂行された。サンプルは３０秒間９５℃に加熱され、そしてサイクリングは、３５サイクルの間９５℃で３０秒および６８℃で３０秒間であった。サンプルは、１ｘＴＡＥバッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ（ナトリウム塩），ｐＨ８．３）における１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにおいて解析され、そして臭化エチジウム染色されたゲ
ルの像が、Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ  ＩＩ  Ｖｉｄｅｏシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて得られた。
【０１０９】
ヒト・ニュールツリンおよびペルセフィンタンパク質配列を用いる、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースの毎日最新の類似性検索が、エノビン（ＥＶＮ）と呼ばれた、神経栄養因子ＧＤＮＦ、ＮＴＮおよびＰＳＰに類似の推定新規タンパク質をコードしているゲノムＤＮＡ配列を得た。エノビンをコードしている領域を取り囲むゲノムＤＮＡ配列を用いる、さらなるデータベース相同性検索は、種々の組織（前立腺上皮［受託番号ＡＡ５３３５１２（ＩＤ１３２２９５２）］、肺がん腫［受託番号ＡＡ９３１６３７］および上皮小体腫瘍［受託番号ＡＡ８４４０７２］）から得られる数種の発現される配列ｔａｇ（ＥＳＴ）クローンをもたらした。これらのクローンは、ＧＤＮＦ、ＰＳＰもしくはＮＴＮと相同性をもつ領域の外側のＤＮＡ配列を含有しているが、エノビンｍＲＮＡが正常および腫瘍組織において発現されることを確認した。
【０１１０】
ゲノム配列に基づくプライマー（ＰＮＨｓｐ３およびＰＮＨａｐ１）を用いる最初のＰＣＲ増幅は、胎児、胎児脳、前立腺、前頭皮質、海馬、小脳ｃＤＮＡから、そしてゲノムＤＮＡからほぼ５００ｂｐのフラグメントを生成したが、肺ｃＤＮＡからは生成しなかった。これらのフラグメントのクローニングおよび配列解析は、４７４ｂｐのＤＮＡ配列をもたらし、これは、タンパク質のトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）ファミリー（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ，１９９４）の全メンバーの７個の保存システイン残基特性を含む１３９アミノ酸残基の予測されたタンパク質残基に翻訳された（図１）。また、配列は、プロドメインの切断のためのＲＸＸＲモチーフ（ＲＡＡＲ、アミノ酸位置２３〜２６）（Ｂａｒｒ，Ｃｅｌｌ  ６６（１９９１），１−３）を含有した。類似の切断部位は、プロドメイン配列における比較しうる位置において、ＧＤＮＦ、ＮＴＮおよびＰＳＰタンパク質配列中にも存在している。エノビンのプロドメインの切断が、イン・ビボでこの部位において起きると仮定すると、成熟ＥＶＮタンパク質配列は、１１３アミノ酸残基（図１において残基２７〜１３９）を含有し、そして計算される分子質量１１９６５Ｄａおよび等電点１１．８をもつ。成熟配列には１個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位が存在する（アミノ酸位置１２１−１２３におけるＮＳＴ）。さらに、既知の神経栄養因子ＧＤＮＦ、ＮＴＮおよびＰＳＰの成熟型間に保存されるいくつかの領域が、また、エノビンにおいても存在している（図２）。表２は、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムによる、ＧＤＮＦファミリーメンバーの成熟タンパク質配列の比較結果を総括している。同一性パーセントおよび類似性パーセントが示される。この比較において使用されたＧＤＮＦ、ＮＴＮ、ＰＳＰおよびＥＶＮ成熟配列は、ＲＸＸＲ切断部位に続く最初のアミノ酸残基において始まる。
【０１１１】
【表２】
2010158241.tif 000003
【０１１２】
これらの比較から、成熟エノビンタンパク質が、ＧＤＮＦよりもペルセフィンおよびニュールツリンに、より密接に関連していることが明らかである。
【０１１３】
ゲノムＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ配列（ａｃｃ．ｎｏ．ＡＣ００５０３８）に基づくプライマーを用いる、前頭皮質ｃＤＮＡからのエノビンＤＮＡ配列の、より大きいフラグメントの増幅、クローニングおよび配列解析が、８１９ｂｐの配列をもたらした。この配列は、ヌクレオチド位置３０−３２おける推定ＡＴＧ開始コドンを含有し、そしてヌクレオチド位置２８５−２８７における終止コドンまで広がる読み枠（図３における読み枠Ａ）をもたらす。この領域の翻訳タンパク質配列は、データベースにおけるいずれの既知タンパク質とも類似性も示さない。第２の読み枠（図３における読み枠Ｂ）におけるｃＤＮＡ配列の翻訳は、１５９アミノ酸残基の推定タンパク質配列をもたらす。この配列は、ＲＸＸＲ切断部位（位置Ｂ４３〜Ｂ４６；ヌクレオチド位置４６０−４７１）、および成熟エノビン配列（位置Ｂ４７〜Ｂ１５９；ヌクレオチド位置４７２−８１０）に対応する配列を含有する。ＲＸＸＲ切断部位および成熟エノビンコーディング配列を含む読み枠は、ヌクレオチド位置３３４（フレーム内終止コドンによって先行される）から位置８１１−８１３における終止コドンまで広がっている。ペルセフィン（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）との類似性では、本発明者らは、スプライシングされないイントロンが、ＥＶＮ遺伝子からの主要ｍＲＮＡ転写物中に存在すると仮定している。ＧＤＮＦおよびＮＴＮもまた、それぞれのプロドメインコーディング領域中にイントロンをもっている（Ｍａｔｓｕｓｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２０３（１９９７），１４９−１５７，Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４４（１９９７））。
【０１１４】
エノビンの種々のｍＲＮＡ転写物の存在を評価するために、ＲＴ−ＰＣＲ実験が、エノビン・コーディング配列の５’末端、可能性のある上流ＡＴＧ開始コドンのまさに５’に位置するプライマー（プライマーＰＮＨｓｐ５［５’−ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ
ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  Ｇ−３’］およびネストプライマーＰＮＨｓｐ６［５’−ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＴＧＧ−３’］、ならびに３’末端に位置するプライマー（プライマーＰＮＨａｐ１およびネストプライマーＰＮＨａｐ２［表１参照］を用いて遂行された。実験は、ヒト多組織ｃＤＮＡパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＭＴＣパネルＩおよびＩＩ），胎児心臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびヒト小脳、海馬もしくは前頭皮質から得られたｃＤＮＡ（Ｍａｓｕｒｅ  ｅｔ
ａｌ．，１９９８）において遂行された。１次ＰＣＲ反応は、ＧＣリッチ条件下でプライマーＰＮＨｓｐ５およびＰＮＨａｐ１を用いて（Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ＰＣＲキ
ット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、既述のように３０サイクル（９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−１分）の間遂行された。ネストＰＣＲ反応は、同じ条件下でプライマーＰＮＨｓｐ６およびＰＮＨａｐ２を用いて３０サイクルの間遂行された。得られるＰＣＲ生成物は、１．５％アガロースゲルにおいて解析され、そしてサイズは±３５０ｂｐ〜±８００ｂｐにわたった。いくつかのバンドがゲルから精製され、そしてＰＣＲフラグメントが直接配列決定された。また、若干の精製ＰＣＲ生成物が、また、ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化され、次いで配列決定された。
【０１１５】
配列解析は、エノビン配列を含有する種々のｍＲＮＡ分子の存在を確認した。得られたフラグメント配列は、ゲノムエノビン配列と比較された。これにより、ゲノム配列におけるいくつかの可能な５’および３’スプライシング部位を同定することができた（図２１）。すべてのこれらのスプライシング部位は、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位に対する共通配列に対応した（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ，ｐ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．Ｂ．＆Ｈａｒｒｉｓ，Ｎ．Ｌ．（１９９０））ｓｐｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｂｒａｎｃｈ  ｐｏｉｎｔ  ｓｉｔｅｓ，ａｎｄ  ｅｘｏｎｓ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ
ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３，２５２−２７８）。同定された種々のエノビンスプライシング変異体およびそれらの種々のヒト組織における存在が図２２に総括される。５種の配列決定された転写物のわずか２種が、ＡＴＧ開始コドンからの翻訳により機能的なエノビンタンパク質を生成する。これらの２種の転写物は、それぞれ４７および３９アミノ酸残基の予想シグナルペプチドをもつアミノ酸２２８もしくは２２０個のタンパク質をコードしている。これら２種の変異体の予想されるタンパク質配列は、図２３（長い変異体）および図２４（短い変異体）に示される。長い変異体は、場所５’−１および３’−１における第１のイントロンを、そして５’−２および３’−３における第２のイントロンをスプライシングアウトすることによって図２１のＤＮＡ配列から得られると推定できる。読み枠の翻訳によって、図２３の予測されたタンパク質配列が得られる。より短い変異体は、場所５’−１および３’−２における第１のイントロンを、そして５’−２および３’−３における第２のイントロンをスプライシングアウトすることによって図２１のＤＮＡ配列から得られると推定できる。読み枠の翻訳によって、図２４の予測されたタンパク質配列が得られる。
【０１１６】
最も長い転写物は、図２２Ｂにおけるバンドの強さによって判定されるようにほとんどの組織において最も豊富にそんざいすると思われる。より短い転写物は、ＧＤＮＦ，ＮＴＮおよびＰＳＰと相同な成熟エノビンアミノ酸配列を失っている翻訳タンパク質を生成するフレームシフトをもたらす。２種の最小の転写物は、７個の高度に保存されたシステイン残基の２個を含む、成熟コーディング配列の一部を失ってさえいる。図２２Ｂは、種々のヒト組織における主なスプライシング変異体の分布を示す。機能的なエノビンｍＲＮＡは、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、結腸、小腸、抹消血液白血球、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、胎盤および胎児心臓を含む、試験されたほとんど全ての組織において発現される。若干のヒト組織（例えば小脳、海馬）では、非機能的な転写物のみが、ＰＣＲによって増幅することができた。本発明者らの知識にとって、そのような程度までの非機能的なｍＲＮＡ転写物の出現は、以前には既述されていなかった。この発見の生物学的意義は、研究されるべく残されている。種々の組織におけるＮＴＮおよびＰＳＰの発現は完全には特徴付けられていないけれども、それらの発現レベルは、非常に低く、そしてある種の組織に、より限定された発現であると思われる（非特許文献１２，人っ子文献１３）。
【０１１７】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるエノビンの組み換え発現
エノビン発現プラスミドの構築
４１４ｂｐＰＣＲフラグメントが、プライマーＰＮＨｓｐ４およびＰＮＨａｐ２（表１）を用いてヒトゲノムＤＮＡから増幅され、ＴＡ−クローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローン化された。インサートの配列は、配列解析によって確認された。エノビン共通配列をもつインサートを含有する１つのクローン（クローン３６）が、続く発現プラスミドの構築のために使用された。２種のプラスミドが、それらの５’末端において適当な制限部位を含有するように設計された。正プライマーＰＮＨｅｘｐ−ｓｐ１（５’−ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  Ａ−３’）は、ＢａｍＨＩ制限部位（下線）を含有し、そして逆プライマーＰＮＨｅｘｐ−ａｐ１（５’−ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  Ｇ−３’）は、ＸｈｏＩ制限部位（また下線）を含有した。これらのプライマーを使用して、成熟エノビンをコードしている３４３ｂｐフラグメント（図１における位置８１〜４２２）が、クローン３６から増幅された。ＰＣＲ反応は、１ｘＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応バッファー、０．２ｍＭｄＮＴＰ、１ＭＧＣ−ＭＥＬＴTM，プライマーＰＮＨｅｘｐ−ｓｐ１およびＰＮＨｅｘｐ−ａｐ１  ２００ｎＭ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合物１μｌ、およびクローン３６からのプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを含有する全容量５０μｌにおいて遂行された。サンプルは５分間９４℃に加熱され、そしてサイクリングは、２５サイクルの間９４℃で４５秒、５８℃で１分そして７２℃で３０秒間実施されたが、最終段階は７２℃で７分であった。得られる５０μｌ生成物は、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製され、そしてＤＮＡは３０μｌに溶出された。この精製生成物２５μｌが、次に、１ｘバッファーＢ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中ＢａｍＨＩ  １０ＵおよびＸｈｏＩ  １０Ｕを含む反応液３０μｌにおいて３７℃で１時間消化された。１ｘＴＡＥバッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ（ナトリウム塩），ｐＨ８．３）における１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにおける電気泳動の後、期待される３５３ｂｐバンドが、ゲルから切除され、そしてＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製された。得られるフラグメントは、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより線状にされたベクターｐＲＳＥＴ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結された。得られるプラスミド構築物のインサート（ｈＥＶＮｍａｔ／ｐＲＳＥＴＢ）は、完全配列解析によって確認された。得られる構築物は、成熟エノビンコーディング配列にフレーム内融合されたＮＨ２末端６ｘＨｉｓ−ｔａｇを含む推定分子質量１５７０４Ｄａをもつ１４６アミノ酸タンパク質をコードしている。かくして、得られるタンパク質のＮＨ２末端アミノ酸配列は、
【０１１８】
【化１】
2010158241.tif 000004
【０１１９】
ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．コリ細胞におけるエノビンの発現
エノビンタンパク質の組み換え生産は、本質的に、Ｃｒｅｅｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）によるニュールツリンに関する記述のように改変して遂行された。組み換えエノビンタンパク質の生産のために、プラスミドｈＥＶＮｍａｔ／ｐＲＳＥＴＢが、Ｅ．コリ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にトランスフォームされ、そして２ｘＹＴ／アンピシリン培地（トリプトン１６ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌおよびアンピシリン１００ｍｇ／ｌ）において、発現を誘導するために最終濃度０．２ｍＭまでＩＰＴＧを添加する前に、ＯＤ６００約０．５まで３０℃（２２５ｒｐｍ）または３７℃（３００ｒｐｍ）において増殖された。３時間の誘導時間に続いて、細胞ペレットが遠心によって回収され、リン酸バッファー食塩水で洗浄され、遠心され、そして凍結保存された。精製および再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）では、細胞ペレットは、音波処理バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，３００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭ２−メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤（ＣｏｍｐｌｅｔｅTMプロテアーゼ阻害剤反応
混液タブレット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，５０ｍｌバッファー当たり１タブレット）および細胞ペレット５００ｍｇ当たりリゾチーム１ｍｇ）中に再懸濁された。細胞が音波処理によって破壊され、そして封入体が遠心によって回収された。封入体は、バッファーＡ（８Ｍ尿素、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，２００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭ２−メルカプトエタノール）に溶解され、そして３７℃で３０分間インキュベートされ、その後Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ニッケルニトリロ三酢酸、Ｑｉａｇｅｎ）に添加された。３７℃で４０分振盪後、サンプルがバッファーＡで１回洗浄され、そして５ｍｌＮｉ−ＮＴＡカラム上に負荷された。カラムは、連続して１０カラム容量のバッファーＡ、１０カラム容量のｐＨ７．２のバッファーＡおよび１０カラム容量のｐＨ７．２＋１０ｍＭイミダゾールのバッファーＡで洗浄された。エノビンは、カラムから、４カラム容量のｐＨ７．２＋２００ｍＭイミダゾールのバッファーＡにおいて溶出された。
【０１２０】
エノビン再生は、各段階において減量する尿素（６Ｍ−４Ｍ−３Ｍ−２Ｍ−１Ｍ−０．５Ｍ−０Ｍ尿素）を含有する再生バッファー（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、３μＭシステイン、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％グリセロール、０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）中、４℃において段階的な一夜透析によって遂行された。精製タンパク質は一定量づつ分けられ、−２０℃で保存され、そしてさらに機能アッセイに使用された。
【０１２１】
エノビン遺伝子の染色体局在
エノビン遺伝子の３．３ｋｂフラグメントが、ＥＭＢＬ受託番号ＡＣ００５０３８の配列において設計されたプライマーＥＶＮ（７）−ｓｐ１（５’−ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＴＧＴ
ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＣＣ−３’）およびＰＮＨａｐ１（５’−ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  Ｇ−３’）を用いて小脳ｃＤＮＡから増殖された。ＰＣＲ反応は、１ｘＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ
ＰＣＲ反応バッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、０．５ｍＭｄＮＴＰ、１ＭＧＣ−ＭＥＬＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），プライマーＥＶＮ（７）−ｓｐ１およびＰＮＨａｐ１  ４００ｎＭおよび小脳ｃＤＮＡ１μｌを含有する全容量５０μｌにおいて遂行された。最初９４℃で２分間後、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が添加され、そしてサイクリングは、１０サイクルの間９４℃で１０秒、５８℃で３０秒そして６８℃で３分間実施された。次いで、さらなるサイクルは、各サイクル２０秒づつ６８℃で伸長時間を増加しつつ遂行された。最終６８℃で７分が、また含まれた。得られる３．３ｋｂフラグメントは、０．８％アガロース／ＴＡＥゲルにおける電気泳動後精製され、そしてＴＡ−クローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローン化された。１つのクローンの３．３ｋｂインサートの完全配列解析は、得られたｃＤＮＡ配列が、ＥＭＢＬデータベース中のゲノム配列（受託番号ＡＣ００５０３８）に対応することを確認した。小脳ｃＤＮＡから得られたｃＤＮＡにおいて、イントロンはスプライシングアウトされなかった。
【０１２２】
染色体マッピング研究は、本質的に既述の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて実施された（Ｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１９９２），９５０９−９５１３，Ｈｅｎｇ  ＆  Ｔｓｕｉ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １０２（１９９３），３２５−３３１）。ヒト・リンパ球が、３７℃で６８〜７２時間培養された後、細胞集団における細胞周期を同調させるために５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）０．１８ｍｇ／ｍｌにより処理した。同調された細胞は洗浄され、そして３７℃で６時間再培養された。細胞が収穫され、そして低張処理、固定および風乾を含む標準操作を用いて、スライドが調製された。エノビンについての３．３ｋｂプローブがビオチン化され、そしてＦＩＳＨ検出に使用された。スライドは、５５℃で１時間乾かされ、ＲＮａｓｅで処理され、そして２ｘＮａＣｌ／Ｃｉ
ｔ（２０ｘＮａＣｌ／Ｃｉｔは３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸二ナトリウム、ｐＨ７．０である）中７０％ホルムアルデヒド中で７０℃２分間変性され、続いて、エタノールで脱水された。プローブは、変性染色体スライドに装填する前に変性された。一夜ハイブリダイゼーションの後、スライドが洗浄され、そしてＦＩＳＨシグナルおよび４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール・バンディングパターンが、写真フィルム上に別々に記録され、そして染色体バンドによるＦＩＳＨマッピングデータの割り当てが、ＦＩＳＨシグナルを４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドールで縞模様にされた染色体と重ね合わせることによって達成された（同上：Ｈｅｎｇ  ＆  Ｔｓｕｉ，１９９３）。使用された条件下で、ハイブリダイゼーション効率は、このプローブでは約７２％であった（１００個のチェックされた有糸分裂図中で、それらの７２個が、１対の染色体においてシグナルを示した）。４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール・バンディングが、特定の染色体を同定するために使用されたので、プローブからのシグナルと染色体１の短い腕との間の割り当てが得られた。さらに、詳細な位置は１０枚の写真からの総括に基づいて決定された（図４Ａ）。使用された条件下のＦＩＳＨ検出によって選ばれるさらなる座はなく、したがって、本発明者らは、エノビンがヒト染色体１、領域ｐ３１．３−ｐ３２に位置すると結論する。マッピング結果の例は図４Ｂに提示される。
【０１２３】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）における遺伝子マップデータから、エノビン配列（ＥＭＢＬ受託番号ＡＣ００５０３８）を含有するゲノムクローンは、染色体１において、マーカーＤ１Ｓ２８４３とＤ１Ｓ４１７間に位置すると推定できる。これは、染色体１、領域ｐ３１．３−ｐ３２．３に対応し、ＦＩＳＨ解析によって得られたデータを確定する。
【０１２４】
ノザンブロットおよびドットブロット解析によって決定されるエノビンの組織分布
種々のヒト組織から得られたポリ（Ａ）−リッチＲＮＡを含有するノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；ＭＴＮTMブロット、ＭＴＮTMブロットＩＩおよび胎児ＭＴＮTMブロットＩＩ）が、製造者の指示にしたがって、（α−32Ｐ−ｄＣＴＰランダムプライミング標識（ＨｉｇｈＰｒｉｍｅキット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）された８９７ｂｐエノビンフラグメントとハイブリダイズされた。このフラグメントは、前頭皮質ｃＤＮＡにおいてプライマーＰＮＨｓｐ１およびＰＮＨａｐ１を用いるＰＣＲ増幅、続くベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中へのクローニングによって得られた。フラグメントは、終止コドンまでのエノビン配列８９７ｂｐを含有し、そして成熟エノビンタンパク質の完全コーディング配列を含む。
【０１２５】
エノビンｍＲＮＡは、約４．５ｋｂの主転写物として検出された（図５Ａ−Ｃ）。エノビンｍＲＮＡは、組織の範囲内、もっとも著しくは心臓、骨格筋、膵臓および前立腺において発現される。若干の比較的小サイズの転写物は、例えば胎盤（４ｋｂ，２．４ｋｂおよび１．６ｋｂ）および前立腺（４ｋｂおよび１．６ｋｂ）に存在している。胎児組織では、顕著な２．４ｋｂ転写物は、肝臓に、そしてより少ない程度で肺に存在している。また、他の転写物は、胎児腎臓、肝臓、肺および脳に存在している。
【０１２６】
さらにまた、種々のヒト組織および発生段階からのポリ（Ａ）リッチＲＮＡを含有するＲＮＡマスターブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、８９７ｂｐエノビンプローブとハイブリダイズされた。このブロットを作成するために使用されたポリ（Ａ）リッチＲＮＡサンプルは、製造者による８種の異なる保管遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに標準化された。エノビンｍＲＮＡは、偏在的に発現されるが、もっとも高いレベルは、前立腺、下垂体、気管、胎盤、胎児肺、膵臓および腎臓において明白であった（図５Ｄ＋Ｅ）。
【０１２７】
ＧＦＲα−ＩｇＧ−Ｆｃ融合ベクターの構築
シグナルペプチドおよびＧＰＩ固定に関与するＣＯＯＨ−末端疎水性領域をコードしている配列を除いてＧＦＲα−１、ＧＦＲα−２およびＧＦＲα−３（アミノ酸２７〜４２７、２０〜４３１および２８〜３７１をそれぞれコードしている）のｃＤＮＡ領域が、発現ベクターＳｉｇｎａｌ  ｐＩｇ  ｐｌｕｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ）中にインフレームにクローン化された。これらの構築物から発現される得られるタンパク質は、１７アミノ酸ＮＨ2−末端ＣＤ３３シグナルペプチド、ＧＦＲαタンパク質領域および２４３アミノ酸ＣＯＯＨ−末端ヒトＩｇＧ1−Ｆｃ融合ドメインを含有する。ＣＨＯ細胞は、ＧＦＲα融合構築物によりトランスフェクションされ、そして安定にトランスフェクションされた細胞が、Ｇ４１８  ５００μｇを用いて選択された。永久クローンは、抗Ｆｃ抗体を用いて選択された。ＧＦＲα融合タンパク質の精製では、細胞が血清不含培地で増殖され、そして培地が３日後毎に回収された。培地は遠心され、そしてプロテインＡカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に適用された。結合タンパク質は、０．１Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ３．０で溶出され、そして１ＭＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８．４中に回収された。タンパク質濃度は、吸光係数１．５を用いて２８０ｎｍにおける吸光度によって評価された。これらの精製された可溶性ＧＦＲα−１〜−３Ｆｃ融合タンパク質は、続いての結合研究のために使用された。
【０１２８】
表面プラズモン共鳴解析
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）実験は、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置を用いて２５℃において行われた。解析は、固定化リガンドとしてのエノビンおよびＮＧＦにより遂行された。ＦＩセンサーチップのカルボキシル化マトリックスが、最初に、４００ｍＭＮ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドおよび１００ｍＭＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドの１：１混合液により１０分間活性化された。次いで、組み換えエノビンおよびＮＧＦが、１０ｍＭ酢酸バッファー，ｐＨ４．５において流速５μｌ／ｍｉｎで活性化された表面上に適用された。占有されなかった反応基は、１Ｍエタノールアミン塩酸塩で不活性化された。結合実験では、可溶性ＧＦＲα１−３−Ｆｃが、ＨＥＰＥＳバッファー食塩水（１５０ｍＭＮａＣｌ，３．５ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％Ｐ−２０、１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）中濃度１０〜１００ｎＭにおいて、流速１０μｌ／ｍｉｎで流下された。会合が３分間モニターされ、そして１分間解離され、続いて、５ｍＭＮａＯＨにより再生された。解離は、ＨＥＰＥＳバッファー食塩水を流下することによって開始された。ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウエアー，３．０が、会合速度（Ｋa）、解離速度（Ｋd）および平衡解離定数（ｋp，Ｋd／Ｋaとして算出される）を計算するために使用された。
【０１２９】
結果
ＳＰＲが、固定化エノビンへの可溶性ＧＦＲα１−３の結合を測定するために使用された。エノビンの特異的結合は、可溶性ＧＦＲα３によってのみ検出できた。ＧＦＲα１およびＧＦＲα２は、固定化エノビンには結合しなかった。観察されたＧＦＲα３の結合は特異的であり、したがってＮＧＦへの結合は存在しなかった。別の対照実験では、固定化ＮＧＦへのＴｒｋＡ−Ｆｃ（ＮＧＦ受容体）の特異的結合は、固定化エノビンへの結合なしに検出された。
【０１３０】
ＧＦＲαの異なる３濃度を用いて得られた結合曲線から、次の表３に示される定数が引き出された。これらの結果は、ＧＦＲα３が特異的にエノビンに結合することを例証している。
【０１３１】
【表３】
2010158241.tif 000005
【０１３２】
ＧＤＮＦ，ＮＴＮおよびＰＳＰの全ては、種々のタイプのニューロン細胞の維持および生存を促進するので、エノビンが、神経細胞および多分他の細胞タイプにも類似の生物学的効果を有することが期待される。したがって、エノビンタンパク質が、一般に、パーキンソン病、アルツハイマー病、末梢神経病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、末梢神経傷害もしくは損傷および神経毒曝露を含む、神経障害の治療において有用であろうということが想起される。
【０１３３】
また、エノビンは、種々の面の神経保護において有用であろう。種々のニューロン細胞集団の生存および本発明者らのＳＨＳＹ５Ｙ細胞モデルで観察された軸索伸長に及ぼすその効果を考慮すると、本発明者らは、この化合物が、神経保護および神経再生適用をもつであろうと提案する。
【０１３４】
このことは、次の観察に基づいている。タキソールは、ＮＧＦで分化されるＰＣ１２ラット褐色細胞腫においてニューロンアポトーシスを誘発する（Ｎｕｙｄｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，提出）。したがって、タキソール誘発細胞障害は、ＤＮＡフラグメント化、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ標識およびｂｃｌ−２保護によってモニターされるようなニューロンアポトーシスの特徴を有する。したがって、延長として、タキソールが分化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるアポトーシスを誘発することが推定できる。エノビンは、この細胞死を減少できることが、ここに示され、したがって一般にニューロンアポトーシスを逆流させるであろう。
【０１３５】
したがって、本化合物は、アポトーシスが観察される次の神経変性症状、卒中（Ｈａｋｉｍ  １９９８）、パーキンソン病（Ｍａｒｓｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＡｎｎＮｅｕｒｌ．１９９８  Ｓｅｐ;４４（３Ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ１８９−９６）、アルツハイマー病（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８  Ｄｅｃ；８７（４）：７３１−９）、ハンチントン病（Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌ．１９９７  Ｊｕｌ；７（３）：９７９−１００２）、神経傷害（Ｓｍｉｒｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１９９８  Ｊｕｌ；３６（１）：６４−８０）、末梢神経病（Ｓｒｉｎｉｖｉｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｊＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．１９９８  Ｏｃｔ１；１０２（７）：１４５４−６２）において役立つであろう。
【０１３６】
最後の臨床適応の例のように、本発明者らは、この神経栄養因子は、実際に、タキソール誘発細胞障害に対して、分化されたＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞を保護することを示した。
【０１３７】
生存率測定の方法
細胞生存率は、０．０２ｍＭフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ，Ｓｉｇｍａ）を補足したＤＭＥＭ（３７℃）中、２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ，Ｓｉｇｍａ）１ｍｇ／ｍｌ溶液の１００μｌを、各ウェルに添加することによって決定された。次いで、プレートは、３７℃で２．５時間インキュベートされた。光学密度は、標準として６５０ｎ
ｍを用いて、４５０ｎｍにおいて読まれた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）。ＸＴＴアッセイは、テトラゾリウム塩ＸＴＴの赤色ホルマザン生成物への転化に基づいている。この反応は、ミトコンドリア酵素によって遂行される。
【０１３８】
ニューロン分化の方法
１．ヒト神経芽細胞腫ＳＨＳＹ５Ｙ細胞における分化
ＳＨＳＹ５Ｙ細胞が、２５ｎＭスタウロスポリンにより５日間分化される。エノビンの効果は、実験開始後７２時間目に測定される。（引用文献  Ｊａｌａｖａ  ｅｔ  ａｌ．”プロテインキナーゼ阻害剤スタウロスポリンは、ａ，ｂ，ｚ  ＰＫＣ独立経路を通してＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞において成熟ニューロン表現型を誘発する”Ｊｏｕｒｎ  ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １５５，３０１−３１２（１９９３））。
【０１３９】
２．軸索伸長の測定。
ニューロンの形態学的変化が、次にように自動的に定量された。簡単に言えば、適当な時間において、グルタルアルデヒドが、培地に直接添加され、そして室温で３０分間放置された。これは、その時点における細胞の形態が、実際の状況を反映することを確認した。細胞は、Ｉｎｄｙワークステーション（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＵＳＡ）によって作動されるＭａｒｚｈａｕｓｅｒスキャニングステージを備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、透過光方式により観察された。影像は、ＭＸ５ビデオカメラ（ＨＣＳ）を用いて撮影された。約３０００細胞が、像の８ｘ８四角格子を形成している６４の整列された像において評価された。像の正確な整列は、軸索が、１つの像視野から次まで続くことを確認した。ポリクローナルｔａｕ抗体によって標識された軸索伸長の自動検出は、曲線構造の無偏向検出器（Ｓｔｅｇｅｒ  １９９８）を用いて遂行された。解析ソフトウエアーは、全細胞体面積、細胞体数および全軸索長を自動的に算出した。
【０１４０】
種々の細胞タイプへのエノビンの影響を検討するために、２つのアッセイ、ＤＮＡ合成アッセイと走化性アッセイが行われた。
【０１４１】
ＤＮＡ合成アッセイ
ヒト皮膚繊維芽細胞（３９ＳＫ）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）、ヒト軟骨細胞およびラット骨芽細胞を含む細胞が、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（３９−ＳＫ、ＨＳＭＣ、ラット骨芽細胞）または合成培地（骨芽細胞およびＨＵＶＥＣ）において５％ＣＯ2および９５％空気を含む３７℃において維持された。ＤＮＡ合成アッセイでは、細胞が、９６穴組織培養プレートにおいて、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に５０００細胞／ウェルの密度で接種され、そして２４時間培養された。次いで、培地は、種々の濃度のエノビンおよび０．１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（３９−ＳＫ、骨芽細胞、ＨＳＭＣ、軟骨細胞のため）または種々の濃度のエノビンおよび０．５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（ＨＵＶＥＣのため）により置換され、そして細胞は２４時間培養された。続いて、培地は、５％ＦＢＳおよび０．１μＣｉの［3Ｈ］−チミジンを含有するＤＭＥＭ１００μｌで置換された。２時間のパルスラベルに続いて、細胞は、室温で１時間メタノール／酢酸（３：１，ｖｏｌ／ｖｏｌ）により固定された。固定細胞は８０％メタノールで２回洗浄された。細胞は０．０５％トリプシン（１００μｌ／ウェル）において３０分間、そして０．５％ＳＤＳ（１００μｌ／ウェル）においてさらに３０分間可溶化された。細胞溶解物の一定量（１８０μｌ）がシンチレーション混液２ｍｌと合わせられ、そして細胞溶解物の放射能が液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  １４０９）を用いて測定された。
【０１４２】
走化性アッセイ
細胞は「ＤＮＡ合成アッセイ」において記述されたように維持された。エノビンの走化
活性は、１２穴改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバー（ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｈａｎｄｌｅｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍ．Ａ．，Ｂｏｌｉｓ，Ｓ．，Ｍｉｌｗａｙ，Ｖ．Ｅ．，Ｈｅｒｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｃ．，（１９８６），「培養ウシ関節間軟骨における血清およびインシュリン様成長因子−Ｉによるプロテオグリカン生合成の促進」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０：４２３−４３０）を用いて分析された。細胞は、０．０５％トリプシンおよび０．５ｍＭＥＤＴＡを用いてトリプシン処理され、そしてＤＭＥＭ中に再懸濁された。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの下部ウェルに、種々の濃度のエノビンを含有する培地の一定分量１５０μｌが添加された。タイプＩコラーゲン０．１ｍｇ／ｍｌでコーティングされたポリカーボネートメンブラン（８μｍ）が、下部ウェルの上に置かれ、続いて上部ウェルを組み立てた。上部ウェルには、細胞（７０，０００細胞／ｍｌ）の一定量１００μｌが添加された。６時間の培養時間後、装置が解体された。メンブランの上に残っている細胞が除去された。メンブランは、１０％ホルムアルデヒドにより１５分間固定され、続いてＧｉｌｌのストレングス  ヘモトキシリン（ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）によって染色された。細胞が顕微鏡下（２５０ｘ倍率）でカウントされ、そして各ウェルの５区域からの平均細胞数が使用された。各実験は少なくとも４回繰り返された。結果は対照（０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ）の倍数として表された。
【０１４３】
図８〜１８における結果によって具体的に説明されるように、エノビンは、使用された各細胞タイプの増殖、または前述のようにＨＵＶＥＣ細胞の遊走（図１４）には効果をもたなかった。ＳＨ−ＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞にはエノビンの効果があった。このことは、ニューロン細胞に及ぼすエノビンの選択的効果を例証した。
【０１４４】
両ＧＤＮＦおよびＮＴＮは、リガンド結合サブユニット、ＧＦＲα−１かＧＦＲα−２のいずれか、およびシグナリングサブユニット、ｃＲＥＴタンパク質チロシンキナーゼからなるシグナリング複合体を経てシグナルを送ることが分かった。エノビンは、ｃＲＥＴもしくはその他のシグナリングパートナーと組み合わされたＧＦＲ結合パートナー（ＧＦＲα−１、ＧＦＲα−２、近年特定されたオーファン受容体ＧＦＲα−３または他のまだ特定されてないＧＦＲαファミリーのメンバーのいずれか）からなる類似のシグナリング複合体を経てその生物学的効果を発揮することが期待される。事実、本発明者らのデータは、エノビンがＧＦＲα−３に特異的に結合できることを示している。
【０１４５】
ヒトでは、ＧＤＮＦもしくはｃＲＥＴにおける生殖系突然変異が、多発性内分泌新形成および家族性ヒルシュスプルング病（ＨＳＣＲ）を含むいくつかの疾病表現型を起こすことができる（Ｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｎｇｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６７（１９９６），３７７−３７８）。両疾病は、乳児における先天性腸閉塞のもっとも共通する原因であるヒルシュスプルング病とともに、消化管運動性欠乏と関連される。興味あることに、ＧＤＮＦおよびｃＲＥＴノックアウトマウスは、腎発育不全および腸無神経節症（ａｇａｎｇｌｉｏｎｏｓｉｓ）と類似の病理を顕著に現す（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（１９９６），７０−７３；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（１９９６），７６−７９；Ｐｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（１９９６），７３−７６）。エノビンは、消化管もしくは腎臓の類似の障害に関与することができるか、あるいはそれは、偏在的に発現されるので、身体における他の末梢器官の発達に重要であるかもしれない。
【０１４６】
それらの受容体とリガンドとの相互作用は、一般に、両タンパク質における特定の残基からの特異的結合の相互作用によって達成される。タンパク質のフラグメントは、その受容体を活性化する作動剤として働いて細胞においてその成長促進および生存維持効果を惹起することができる。したがって、エノビンタンパク質配列に基づくエノビンの一部もしくは合成ペプチドは、その受容体ＧＦＲα３を調節するべき作動剤もしくは拮抗剤として
有用である。ペプチド合成もしくは組み換え技術を用いて、ＧＤＮＦ、ＮＴＮもしくはＰＳＰの一部、またはエノビンの一部をもついずれか他の神経栄養もしくは成長因子を含んでなるハイブリッド成長因子が製造されて、新しい性質をもつ新規な合成成長因子を得ることができる。
【０１４７】
２つの試行が、ラットにおいて足底下に注射後、エノビンが、ラットにおけるタキソール誘導感覚欠乏を変化できるか否かを試験するために行われた。第１の実験では、エノビンによる単回処置が、タキソール誘導感覚欠乏を逆転できるか否かが試験され、一方第２の試行では、エノビンが、タキソール誘導感覚欠乏の発生を防ぐことができるか否か試験された。
【０１４８】
タキソール誘導感覚機能障害の経時的回復
操作
オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、体重３００〜３４０グラムが使用された。動物は、食餌および任意の水により個々に飼われた。実験開始前に、動物は標準の観察ケージに入れられ、そして１５分の順応後、針突き反射が評価された。そうするためには、動物の右足の足底面が針により刺激され、そしてこの針突きに対する反応性が存在（スコア＝１）もしくは不在（スコア＝０）のいずれかで記録された。１試行内に、操作は、２度の連続刺激提示間に１分の間隔を置いて３回繰り返された；そのような針突き試験は、針突きに対する反応性の３測定値からなった。３回の針突きにおいて正常な反応を有するラットのみが、実験に含まれた。
【０１４９】
連続３日間の午前に、動物はタキソール（クレモホルおよび無水アルコールプラス水中に溶解されたパクリタキセル３ｍｇ／ｍｌ）５０μｌの足底下注射を、右後ろ足に毎日受けた。翌午前中に、針突き反射が再評価され、そして３回の刺激提示に対していかなる反応性も示さない動物が、ランダムにサブグループ（ｎ＝１０／グループ）に分けられて、媒質、食塩水またはエノビン２３もしくは１３０μｇ／ｍｌのいずれか７５μｌの右後ろ足における足底下注射を受けた。媒質および食塩水処置された動物の結果の間に差異は観察されなかったので、両グループは一緒にされた（対照グループ）。最後の処置後１、４、５および７日目に、針突き試験が、午前（８〜９ａｍ）および午後（３．３０〜４．３０ｐｍ）両方に行われた。８日目には、最終針突き試験が午前中に行われた。各動物では、針突きに対する反応性の累積スコアが経時的に測定された。全部で９回の針突き試験（各々、３回の針突き提示からなる）が最後の薬物処置後に遂行されたので、実験の全期間にわたって到達される最高スコアは２７である。
【０１５０】
結果
連続３日間のタキソールの反復足底下注射は、大部分の動物において針突き刺激に対する応答を欠如させる急性炎症反応をもたらした。食塩水もしくは媒質の足底下注射は、タキソール誘導感覚欠乏に影響を与えなかった。最初の測定では、２０の対照のうち４対照のみが、３回の針突きに対して少なくとも１回の反応を示し、最初の測定における対照の平均（±ＳＥＭ）針突きスコアは０．２５（±０．１２）であった；これは、全動物が針突きに応答したので平均スコアが３．０（±０．０）であった実験の開始時とは対照的である。測定の８日後でさえも、なお、対照における反応性は、２０ラット中１１ラットが少なくとも１回反応し、そして平均針突きスコア０．７５（±０．１８）もつように弱められた。この対照グループ内では、どのラットも全３回の刺激に対して正常な反応性を示さなかった。経時的な対照の累積針突きスコアが図１９に示される。動物は、８日間にわたって９回試験されたので、各試験において３回の針突きにより到達される最高スコアは２７である。グラフに見られるように、食塩水もしくは媒質の足底下注射は、タキソール誘導感覚欠乏を試験された期間にわたって回復できなかった。実験の最後における対照の平均全累積スコアは５．１０（±０．８７）であって；到達される最高スコアの１８．９
％であった。
【０１５１】
２３μｇ／ｍｌエノビン７５μｌの単回足底下注射は、最初の測定後少なくとも１回応答する１０ラット中４ラットをもたらし、平均針突きスコアは０．７０（±０．３３）であった。８日目には、全１０動物が、針突きに対して少なくとも１回応答し、そして正常な反応性は１０ラット中５ラットに存在した。８日目におけるこのグループの平均針突きスコアは２．２０（±０．２９）であった。対処に比較すると、測定８日目の最後の平均累積スコアは、有意に増加され（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔ，ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ，ｐ＜０．０１）、平均針突きスコア１４．５０（±１．９６）に達した（図１９）。これは、最高スコアの５３．７％であった。
【０１５２】
また、１３０μｇ／ｍｌエノビンの足底下注射によっては、対照に対して改善された効力があった。１３０μｇ／ｍｌエノビン後の最初の測定では、１０ラット中６ラットが少なくとも１回応答し、平均針突きスコアは１．１０（±０．３５）であった。８日目には、全１０動物が、少なくとも１回針突きに対して応答し、平均針突きスコアは２．６０（±０．２２）であった。３回の針突きに対する正常な反応性は１０ラット中８ラットに存在した。この実験の最後の平均累積総針突きスコアは、１７．２０（±１．９４）であった。これは、総可能スコアの６３．７％であり、そして対照グループに比べて有意に改善された（ｐ＜０．０１）。
【０１５３】
タキソール誘導感覚機能障害の経時的予防
操作
オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、体重３００〜３４０グラムが使用された。動物は、食餌および任意の水により個々に飼われた。実験開始前に、動物は標準の観察ケージに入れられ、そして１５分の順応後、針突き反射が評価された。そうするためには、動物の右足の足底面が針により刺激され、そしてこの針突きに対する反応性が存在（スコア＝１）もしくは不在（スコア＝０）のいずれかで記録された。１試行内に、操作は、２度の連続刺激提示間に１分の間隔を置いて３回繰り返された；そのような針突き試験は、針突きに対する反応性の３測定値からなった。３回の針突きにおいて正常な反応を有するラットのみが、実験に含まれた（針突きスコア＝３）。この対照測定の後、動物はランダムにサブグループ（ｎ＝１０／グループ）に分けられて、媒質、食塩水またはエノビン２３もしくは１３０μｇ／ｍｌのいずれか７５μｌの右後ろ足における足底下注射を受けた。媒質および食塩水処置された動物の結果の間に差異は観察されなかったので、両グループは一緒にされた（対照グループ）。連続３日間、動物はタキソール（クレモホルおよび脱水アルコールプラス水中に溶解されたパクリタキセル３ｍｇ／ｍｌ）５０μｌの足底下注射を右後ろ足に毎日受けた。タキソール後１、４、５および７日目に、針突き試験が、午前（８〜９ａｍ）および午後（３．３０〜４．３０ｐｍ）両方に行われた。８日目には、最終針突き試験が午前中に行われた。各動物では、針突きに対する反応性の累積スコアが経時的に測定された。全部で９回の針突き試験（各々、３回の針突き提示からなる）がタキソール処置後に遂行されたので、実験の全期間にわたって到達される最高累積スコアは２７である。
【０１５４】
結果
タキソール前の食塩水もしくは媒質の足底下注射は、針突き試験においてタキソール誘導感覚欠乏を防ぐことができなかった。タキソール後の最初の試験では、２０ラットの内８ラットが、針突きに対して少なくとも１回応答し、平均針突きスコアは０．６０（±０．１８）であった。８日目には、タキソール誘導感覚欠乏は、なお存在し、２０動物中８匹のみが応答し、そして平均スコア０．８（±０．２５）もっていた。２動物では、標準化針突き反射が存在した。また、経時的に、累積針突きスコアは減少し、平均値６．５５（±１．０８）をもたらし、これは最高スコアの２４．３％であった（図２０）。
【０１５５】
２３μｇ／ｍｌエノビンによる前処置は、針突きにおいてタキソール誘導感覚欠乏を軽減した。１日目には、１０動物中８匹が少なくとも１回応答し、そして平均針突きスコアは１．７０（±０．４０）であった。８日目には、全動物が応答し、平均スコアは２．５０（±０．２７）であった。ここでは、７動物が、すべての針突き曝露において正常な反応性を現した。経時的な累積応答に関して（図２０）、平均総スコアは、対照レベルを超えて１８．４０（±１．７３）まで有意に改善された（ｐ＜０．０１）；これは最高値の６８．１％である。
【０１５６】
比較しうる結果は、１３０μｇ／ｍｌエノビンによる前処置後に得られた。ここでは、１０動物中６匹が、最初の試験の間に応答し、平均針突きスコアは１．７０（＋０．３１）であった。８日目には、全１０動物が、少なくとも１回、針突き刺激に対して反応していて、平均スコアは２．４０（＋０．２２）であり、そして全３回の反応は、動物の半数において正常であった。累積スコアに関しては、８日目に得られた平均スコアは、１７．７０（±１．９２）であり、総スコアの６５．５％を表している。
【０１５７】
本一連の実験は、エノビンの単回足底下注射が、針突き試験によって測定されるようなタキソール誘導感覚欠乏を軽減することができることを示している。活性は、薬物が両タキソール前後に適用された場合に見られる。
【０１５８】
エノビンは、主として末梢および中枢の神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ／炎症疾患ならびにコンダクタンス障害のための可能性のある候補薬であり、そして経皮、局所、局部、中枢（例えば硬膜外、夾膜内など）および全身適用後の感覚行程における調整的役割を演じることができる。
【０１５９】
さらに、先に述べられた分野における生理病理学的変化をスクリーニングするための診断道具としてエノビンを使用することは価値あることである。
【０１６０】
正常対病変組織におけるエノビンｍＲＮＡ発現の比較
エノビンｍＲＮＡの発現は、Ｐｈａｒｍａｇｅｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍにおいて開発され、実施されている専有技術を用いて、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａｑＭａｎ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して定量的に分析された。システムは、ＰＣＲの間に配列特異的蛍光シグナルを生成する蛍光発生プローブを使用する。プローブは、結合された蛍光リポーターおよび消光染料をもつオリゴヌクレオチドであり、それは、正および逆ＰＣＲプライマーの間に位置している。インタクトである間は、リポーター蛍光の強度は、消光剤によって抑制される。プローブが複製複合体の一部を形成すると、蛍光リポーターが、Ｔａｑポリメラーゼにおける固有の５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性によって消光剤から切断される。反応中の蛍光リポーターシグナルの増強が、ＰＣＲ生成物の集積の直接測定値である。ｍＲＮＡ標的配列の出発コピー数（Ｃｎ）は、分画ＰＣＲサイクル数（Ｃｔ）を決定することによって確立され、このＣｔにおいて、ＰＣＲ生成物が最初に検出され−この点において、蛍光シグナルが閾基線を越える。各サンプルにおける標的ｍＲＮＡ量の定量は、実験的Ｃｔ値と標準曲線との比較を通して確立される。
【０１６１】
ＲＮＡ調製および品質管理
総ＲＮＡが、全組織および小分断組織から、発売者のプロトコールにしたがって、Ｔｒｉｚ−ｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて単離された。全ＲＮＡサンプルについての品質管理操作は、完全性（インタクト１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡ）の検査および高含有量（アクチン
）と低含有量（トランスフェリン受容体）転写物の存在の決定を含む。
【０１６２】
プライマー／プローブ設計
１対のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブが設計されて、エノビンからの特異配列が増幅された。
【０１６３】
【化２】
2010158241.tif 000006
【０１６４】
さらに、イントロンにまたがり、そしてヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の一部分を増幅する１対のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブが設計された。
【０１６５】
【化３】
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【０１６６】
プローブ５はフルオルＦＡＭで標識され、一方、プローブ６はフルオルＶＩＣで標識された。
【０１６７】
総ＲＮＡのＤＮアーゼ処理
試験された各組織では、総ＲＮＡ２．２μｇが、１ｘＤＮアーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）２０μｌ量中、室温で１５分間、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ２単位により消化された。反応は、２５ｍＭＥＤＴＡ溶液２μｌの添加によって停止された。次いで、サンプルは、６５℃で１０分間インキュベートされて酵素が失活された。
【０１６８】
第１鎖ｃＤＮＡ合成
試験された各組織では、総ＲＮＡ１００ｎｇが、第１鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用された。４ｍｌの容量で、５０ｎＭプライマー１および２、１ｘＰＣＲバッファーＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）および５ｍＭＭｇＣｌ2の存在下のＲＮＡが、７２℃で５分間加熱され、そして５５℃まで徐々に冷却された。すべての他の試薬の添加後、６ｍｌ反応液は、４８℃で３０分間インキュベートされ、続いて９０℃５分間の酵素失活段階が行われた。最終反応条件は、次のとおりである：１ｘＰＣＲバッファーＩＩ、５ｍＭＭｇＣｌ2、１ｍＭｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、１２．５単位ＭｕＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）。
【０１６９】
第１鎖ｃＤＮＡ生成物のＰＣＲ増幅
各サンプルについて１００ｎｇの総ＲＮＡ由来のｃＤＮＡが、両標的およびＧＡＰＤＨ転写物を同定するために、１回反応におけるＰＣＲ増幅にかけられた。標的についての最
終プライマー／プローブ濃度は、３００ｎＭプライマー１、３００ｎＭプライマー３および２００ｎＭプローブ５であり、ＧＡＰＤＨについてのそれは、２０ｎＭプライマー２、２０ｎＭプライマー４および１００ｎＭプローブ６であった。反応における他の試薬の最終濃度は、４．５％グリセロール、１ｘＴａｑＭａｎバッファーＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、６．２５ｍＭＭｇＣｌ2、４３０ＭｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、２．５単位ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄであった。ＰＣＲ増幅は、ＡＢＩ  ７７００配列検出システムにおいて、最初の酵素活性化段階９４℃１２分間で実施され、続いて、９４℃１５秒、６０℃１分（最小ランプ（ｒａｍｐ）時間）のサイクルが続いた。
【０１７０】
試験される疾病および組織
エノビンｍＲＮＡ発現が、病気の患者および正常な対照個体から由来する組織において比較された（図２５および２６）。下記の表は、検討された疾病および対応する組織を示す。各条件について、３種の疾病組織および３種の対照サンプルが分析された。
【０１７１】
【表４】
2010158241.tif 000008
【０１７２】
統計学的解析
３組織の各グループでは、平均および標準偏差が、Ｃｔ値（正規分布される）において計算され、次いで式Ｃｎ＝１０((Ct-40.007)/-3.623)に対応するＣｎ値に変換された。また、変動分析（ＡＮＯＶＡ）がＣｔ値において行われて、正常組織対疾病組織における平均エノビンｍＲＮＡ発現レベルを比較した。
【０１７３】
図２５および２６は、疾病組織対対照組織における平均エノビンｍＲＮＡコピー数（±ＳＤ；ｎ＝３）を示す。統計学的解析は、多発性硬化症をもつ患者の脳室周囲白質におけるエノビン発現レベルにおいて有意な増加を示した（ｐ＝０．０１３）。内部ＧＡＰＤＨ対照は有意な差異を示さなかった（ｐ＝０．７９）。脳室周囲白質におけるエノビン発現レベルは、正常組織では全く低い（ＧＡＰＤＨ２０００００コピーに対して平均総ＲＮＡ１００ｎｇ当たり２７０コピー）けれども、そのレベルは、多発性硬化症をもつ患者では３倍高い（８２５）。
【０１７４】
他の疾病組織のわずか１種が、正常な対照に対して有意な差異を示した：乳導管（ｂｒｅａｓｔ  ｄｕｃｔａｌ）腺ガンにおいては、エノビンｍＲＮＡ発現レベルは６倍高い（６０００対１０００；ｐ＝０．００７）が、また、ＧＡＰＤＨ対照値は、有意に増加され（１６５０００対４４０００；ｐ＝０．０３）、これは多分、ｍＲＮＡレベルにおける一般的増加を表している。
【０１７５】
結論として、本発明者らは、エノビンｍＲＮＡレベルが多発性硬化症をもつ患者の脳室
周囲白質において上方制御されることを見い出した。
【０１７６】
ＧＦＲα３／ｃＲＥＴ受容体複合体におけるエノビン擬似体のスクリーニングのためのホスホ特異抗体細胞に基づくＥＬＩＳＡの使用。
【０１７７】
また、方法は、他のニューロトロフィン受容体、例えばＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα４、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣの作動剤もしくは拮抗剤の同定のためにも使用できる。
【０１７８】
アッセイ
このアッセイを使用して、本発明者らは、神経栄養経路において活性化されるキーシグナリング・キナーゼの活性化を測定するか、またはｃＲＥＴ受容体キナーゼの活性化を測定することによって、神経栄養成長因子の作動もしくは拮抗化合物を同定することができる。活性化は、ホスホ特異抗体を用いて、リン酸化されるキナーゼもしくは受容体キナーゼ量を検出することによって測定される。本発明者らは、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ＧＦＲα１／ｃＲＥＴ、ＧＦＲα２／ｃＲＥＴ、ＧＦＲα３／ｃＲＥＴもしくはＧＦＲα４／ｃＲＥＴを一時的または継続的に発現するＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を使用できる。
【０１７９】
ｐ４２／ｐ４４ＭＡＰキナーゼ、ＰＫＢキナーゼ、ｃ−ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、ＪＮＫ／ＳＡＰＫキナーゼおよび他のキナーゼの活性化は、市販のホスホ特異抗体を用いて検出される。さらに、ｃＲＥＴ活性化は、ホスホ特異ｃＲＥＴ抗体を用いて欠失できる。
【０１８０】
使用されたプロトコールは次のとおりであった：
−９６穴において１０％ウシ血清中でＮＩＨ３Ｔ３細胞を接種し、細胞は刺激前に８０％集密にされる。
−翌日、培地を血清不含培地と置き換え、そして細胞を１８〜２４時間飢餓させる。
−飢餓後、細胞を化合物およびポジティブ対照としての神経栄養因子（神経栄養因子について１０ｎｇ／ｍｌ）により刺激する。
−ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドにより４℃で２０分間細胞を固定する。
−ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ２００μｌにより５分間３回細胞を洗浄する。
−ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ中０．６％Ｈ2Ｏ2１００μｌにより２０分間細胞を停止させる。
−ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ２００μｌにより５分間３回細胞を洗浄する。
−ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ中１０％胎児ウシ血清１００μｌにより６０分間細胞をブロックする。
−５％ＢＳＡ／／ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ５０μｌ中ホスホ特異的抗体により一夜４℃において細胞をインキュベートする。
抗体希釈は、実験的に決定されるべきであり、範囲１：１００〜１：２５０が示唆される。
−ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ２００μｌにより５分間３回細胞を洗浄する。
−５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ５０μｌ中希釈１：１００で、室温で１時間、結合される第２の抗体ＨＲＰとインキュベートする。
−ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ２００μｌにより５分間３回細胞を洗浄する。
−バッファー（Ｈ2Ｏ０．５ｌ中クエン酸Ｈ2Ｏ３．３６ｇおよびＮａ2ＨＰＯ4−２Ｈ2Ｏ）２５ｍｌ中ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）１錠を溶解し、そしてＨ2Ｏ2１２．５μｌを添加する各ウェルに５０μｌ添加し、そしてアルミニウムフォイルで覆って、シェーカー（２００ｐｐｍ）上で１５分間インキュベートする。
−Ｈ2ＳＯ4２５μｌにより反応を停止する。
−ＥＬＩＳＡリーダーにおいてＯＤ490-650を測定する。
【０１８１】
中脳ドーパミン作動性ニューロン培養
ニューロン培養
ニューロン培養は、酵素的および機械的分散によって胎児ラットの腹側中脳から調製された。組織が収集され、０．６％グルコースを含有する氷冷Ｃａ2+およびＭｇ2+不含リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳＧ）中で洗浄し、そして０．１％トリプシンを含有するＰＢＳＧとともに３７℃で３０分間インキュベートされた。細胞懸濁液が、９６穴ＮＵＮＣ組織培養プレートに密度２．５  １０5細胞／ｃｍ2で入れられた。予め、培養プレートは、ポリ−Ｌ−オルニチンおよび１０％胎児ウシ血清を含有するＣＤＭによりコーティングされた。培養物は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地、およびグルコース（０．６％）、グルタミン（２ｍＭ）、重炭酸ナトリウム（３ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ）、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、ヒト・トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プトレッシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）（６０μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）を補足されたＦ１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔの１：１混合物からなる化学合成培地（ＣＤＭ）中で維持された。
【０１８２】
神経栄養因子による処置
ニューロトロフィンは、保存物として０．５％ウシ血清アルブミンに溶解された。ニューロトロフィンは、最初のプレーティング後３時間および培養５日後に添加された。同量の０．５％ウシ血清アルブミンが、対照ウェルに添加された。
【０１８３】
高親和力ドーパミン取り込み
ドーパミン取り込みは、１０日後に測定された。取り込みでは、細胞が、グルコース（５ｍＭ）アスコルビン酸（１００ｍＭ）およびパルギリン（１００ｍＭ）を補足された前加温されたＰＢＳにより２回洗浄され、そして同じ溶液とともに１０分間プレインキュベートされた。プレインキュベーション溶液は、５０ｎＭ［3Ｈ］ＤＡを含有する同じ溶液で置換され、そしてインキュベーションは３７℃で１５分間継続された。取り込みは、氷冷ＰＢＳによる３回の急速洗浄によって停止された。蓄積された［3Ｈ］ドーパミンは、室温で３０分間、酸性化エタノールとともにインキュベートすることによって遊離された。放射能は、シンチレーション液（Ｐａｃｋａｒｄ  ｕｌｔｉｍａ  ｇｏｌｄ  ＭＶ）４ｍｌの添加後、Ｐａｃｋａｒｄシンチレーションカウンターを使用して決定された。非特異的取り込みは、２０μＭコカインを添加することによって決定された。
【０１８４】
【表５】
2010158241.tif 000009
【０１８５】
細胞は、エノビンの存在または不在下で１０日間増殖された。未処置対照は、１００％として設定された。結果は１〜５の独立した実験において得られた。
【０１８６】
略語のリスト
ＢＬＡＳＴ      Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈｔｏｏｌｂｐ            塩基対
ｃＤＮＡ        相補的ＤＮＡ
ＣＮＳ          中枢神経系
ＥＳＴ          発現配列Ｔａｇ
ＥＶＮ          エノビン
ＧＤＮＦ        グリア細胞系由来の神経栄養因子
ＧＦＲα        ＧＤＮＦファミリー受容体α
ＧＰＩ          グリコシルホスファチジルイノシトール
ＭＴＣ          多組織ｃＤＮＡ
ＮＴＮ          ニュールツリン
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＮＳ          末梢神経系
ＰＳＰ          ペルセフィン
ＲＴ−ＰＣＲ    逆転写ＰＣＲ
ＴＧＦ−β      トランスフォーミング成長因子
ＦＩＳＨ        蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
ＭＴＮ          多組織ノザン
ＮＧＦ          神経成長因子
ＳＰＲ          表面プラスモン共鳴
【０１８７】
本発明の主たる特徴または態様は次のとおりである。
【０１８８】
態様１：  エノビンと命名され、そして図１に示されるアミノ酸配列をもつヒト神経栄養成長因子をコードしているか、あるいは該成長因子の機能的等価物、誘導体または生物前駆体をコードしている、単離された核酸分子。
【０１８９】
態様２：  ＤＮＡ分子である、態様１記載の核酸分子。
【０１９０】
態様３：  ｃＤＮＡ分子である、態様１または２記載の核酸分子。
【０１９１】
態様４：  図１に示される配列の位置８１から４１９までの核酸配列をもつ、態様１〜３のいずれかに記載の核酸分子。
【０１９２】
態様５：  図２１に示される配列の位置５’−１から３’−１もしくは３’−２までか、または５’−１もしくは５’−２から３’−２もしくは３’−３まで指定されたスプライシング変異体のいずれかの配列に対応する核酸配列をもつ、態様１〜５のいずれかに記載の単離された核酸分子。
【０１９３】
態様６：  図１もしくは２１に示される核酸配列か、または高いストリンジェントな条件下でそれに結合できる配列をもつ態様１〜５のいずれかに記載の核酸分子。
【０１９４】
態様７：  高いストリンジェントな条件下で、態様１〜６のいずれかで定義された核酸分子にハイブリダイズできるアンチセンス分子。
【０１９５】
態様８：  態様１〜６のいずれかで定義された核酸分子によってコードされている単離されたヒト神経栄養成長因子。
【０１９６】
態様９：  図１に示されるアミノ酸配列の位置２７から１３９までのアミノ酸配列、または該成長因子の機能的等価物、誘導体もしくは生体前駆体を含む、態様８記載の成長因子。
【０１９７】
態様１０：  図１に示されるアミノ酸配列、または該成長因子の機能的等価物、誘導体もしくは生体前駆体を含む、態様８または９記載の成長因子。
【０１９８】
態様１１：  図２３または２４に示されるアミノ酸配列を含む、態様８記載の成長因子。
【０１９９】
態様１２：  態様２〜６のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含有する発現ベクター。
【０２００】
態様１３：  態様７記載のアンチセンス分子を含有する発現ベクター。
【０２０１】
態様１４：  リポーター分子をコードしているさらなる核酸配列を含有する態様１２または１３記載の発現ベクター。
【０２０２】
態様１５：  態様１２〜１４のいずれかに記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【０２０３】
態様１６：  細胞が真核細胞もしくは細菌細胞である、態様１５記載の宿主細胞。
【０２０４】
態様１７：  態様８〜１１のいずれかに記載のヒト神経栄養因子エノビンを発現することが可能な導入遺伝子を含有する、トランスジェニック細胞、組織もしくは生物体。
【０２０５】
態様１８：  該導入遺伝子が、態様１２〜１４のいずれかに記載のベクターを含有する、請求項１７記載のトランスジェニック細胞、組織もしくは生物体。
【０２０６】
態様１９：  態様１５〜１８のいずれかに記載の細胞によって発現される、神経栄養成長因子またはその機能的等価物、誘導体もしくは生物前駆体。
【０２０７】
態様２０：  態様１７または１８記載のトランスジェニック細胞、組織もしくは生物体によって発現される、神経栄養成長因子またはその機能的等価物、誘導体もしくは生体前駆体。
【０２０８】
態様２１：  患者における神経障害を治療または予防するための薬物の製造における、態様１〜６のいずれかに記載の核酸分子の使用。
【０２０９】
態様２２：  該神経障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、拡張したポリグルタミン配列に関連するニューロン障害、例えばハンチントン病、末梢神経病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、末梢神経傷害もしくは損傷、神経毒曝露、多発性内分泌新形成、家族性ヒルシュスプルング病、プリオン関連疾患、クロイツフェルド・ヤコブ病、卒中、事実上末梢もしくは中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ／炎症疾患ならびにコンダクタンス障害からなる群のいずれかから選ばれる、態様２１記載の使用。
【０２１０】
態様２３：  神経障害を治療または予防するための薬物の製造における、態様８〜１１
のいずれかに記載の神経栄養成長因子の使用。
【０２１１】
態様２４：  該神経障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、拡張したポリグルタミン配列に関連するニューロン障害、例えばハンチントン病；末梢神経病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、末梢神経傷害もしくは損傷または神経毒曝露、多発性内分泌新形成、家族性ヒルシュスプルング病、プリオン関連疾患、クロイツフェルド・ヤコブ病、卒中、事実上末梢もしくは中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ／炎症疾患ならびにコンダクタンス障害からなる群のいずれかから選ばれる、態様２２記載の使用。
【０２１２】
態様２５：  組成物のための製薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤もしくは添加物と一緒に、態様１〜６のいずれかに記載の核酸分子を含んでなる製薬組成物。
【０２１３】
態様２６：  組成物のための製薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤もしくは添加物と一緒に、態様８〜１１のいずれかに記載の成長因子を含んでなる製薬組成物。
【０２１４】
態様２７：  エノビンの過剰発現または過大活性によって媒介される神経障害を治療または予防するための薬物の製造における、態様７記載のアンチセンス分子の使用。
【０２１５】
態様２８：  神経障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、拡張したポリグルタミン配列に関連するニューロン障害、例えばハンチントン病、末梢神経病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、末梢神経傷害もしくは損傷、神経毒曝露、多発性内分泌新形成および家族性ヒルシュスプルング病、プリオン関連疾患、クロイツフェルド・ヤコブ病、卒中、事実上末梢もしくは中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ／炎症疾患ならびにコンダクタンス障害のいずれかの群から選ばれる、態様２７記載の使用。
【０２１６】
態様２９：  態様８〜１１のいずれかに記載の成長因子またはその抗原決定基に結合することが可能な抗体。
【０２１７】
態様３０：  方法が、態様２９記載の抗体をサンプルと反応させ、そして該抗体の成長因子とのいずれか結合を検出することを含む、該サンプル中の該成長因子の存在を検出する方法。
【０２１８】
態様３１：  該抗体がリポーター分子と複合化されている、態様３０記載の方法。
【０２１９】
態様３２：  態様２９記載の抗体および該抗体とサンプルを反応させるための手段を含んでなる、該サンプル中の神経栄養成長因子の存在を検出するためのキットまたは器具。
【０２２０】
態様３３：  ヒト神経栄養成長因子の作動剤もしくは拮抗剤を同定する方法であって、該成長因子の受容体を発現する細胞、組織もしくは生物体を、該成長因子の存在下で候補化合物と接触させ、そして該細胞、組織もしくは生物体におけるＲＥＴ活性化レベルを、該候補化合物と接触されなかった対照と比較することを含む、方法。
【０２２１】
態様３４：  神経栄養成長因子の作動剤もしくは拮抗剤を同定する方法であって、該成長因子の適当な受容体およびｃＲＥＴを発現する細胞、組織もしくは生物体を、該成長因子の存在下で候補化合物と接触させ、該適当な受容体が成分であるシグナル伝達経路におけるシグナリングキナーゼの活性化のレベルを、リポーター分子と複合化される該シグナルキナーゼに特異的な抗体の添加に続いて、該化合物と接触されなかった細胞、組織もしくは生物体と比較されて測定することを含む方法。
【０２２２】
態様３５：  該神経栄養成長因子がエノビンである、態様３３または３４記載の方法。
【０２２３】
態様３６：  該細胞、組織もしくは生物体がＮＩＨ３Ｔ３細胞である、態様３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【０２２４】
態様３７：  該受容体が、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３もしくはＧＦＲα４のいずれかである、態様３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【０２２５】
態様３８：  該抗体が、ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰキナーゼ、ＰＫＢキナーゼ、ｃ−ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、ＪＮＫ／ＳＡＰＩＣキナーゼのいずれかに特異的である、態様３４〜３７のいずれかに記載の方法。
【０２２６】
態様３９：  態様３３〜３８のいずれかの方法に記載の作動剤もしくは拮抗剤として同定された化合物。
【０２２７】
態様４０：  ヒト神経栄養成長因子の発現または活性によって仲介される障害を治療または予防するための薬物の製造における、請求項３９記載の拮抗剤として同定された化合物、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸分子、または態様８〜１１のいずれかに記載の神経栄養成長因子のいずれかの使用。
【０２２８】
態様４１：  ヒト神経栄養成長因子の不活性化によって仲介される障害を治療または予防するための薬物の製造における、態様３９記載の作動剤として同定された化合物、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸分子、または態様８〜１１のいずれかに記載の成長因子のいずれかの使用。
【０２２９】
態様４２：  妨げられ、または傷害された胃腸通過によって仲介される胃腸症状を治療するための薬物の製造における、態様３９記載の作動剤として同定された化合物、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸分子、または態様８〜１１のいずれかに記載の成長因子のいずれかの使用。
【０２３０】
態様４３：  該障害もしくは症状が、胃食道逆流、消化不良、軽症胃アトニー、術後腸閉塞症および腸偽閉鎖症、小腸もしくは大腸の減退した蠕動および／または遅延した胃排出、便秘、腸アトニー、術後腸アトニー、感応性腸症候群（ＩＢＳ）、薬物誘発の通過遅延、嘔吐、および細胞毒性薬物や放射能に誘発される嘔吐のいずれかを含む、態様４２記載の使用。
【０２３１】
態様４４：  増強された蠕動腸運動によって仲介される胃腸障害もしくは症状を治療するための薬物の製造における、態様３９記載の拮抗剤として同定された化合物、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸分子、または態様８〜１１のいずれかに記載の成長因子のいずれかの使用。
【０２３２】
態様４５：  該障害が、分泌性下痢、細菌誘発性下痢、胆汁性下痢、旅行者の下痢および心理的下痢を含む下痢、クローン病、痙攣性結腸、感応性腸症候群（ＩＢＳ）、下痢優勢の感応性腸症候群、腸過敏症、および胃腸過敏症に関連する疼痛のいずれかの軽減を含む、態様４４記載の使用。
【０２３３】
態様４６：  組成物のための製薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤もしくは添加物と一緒に、態様３９記載の化合物を含んでなる製薬組成物。
【０２３４】
態様４７：  ヒト神経栄養成長因子に関連する疾病の治療のための製薬製剤を作成する方法であって、態様３３または３４の方法にしたがって作動剤もしくは拮抗剤として同定される候補化合物を選択し、該化合物のバルク量を製造し、そして製造された化合物を製薬的に許容しうるキャリヤーにおいて製剤化することを含む、方法。
【０２３５】
態様４８：  該成長因子がエノビンである、態様４７記載の方法。
【０２３６】
態様４９：  組成物のための製薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤もしくは添加物と一緒に、態様２９記載の抗体を含んでなる製薬組成物。
【０２３７】
態様５０：  図１，２１，２３もしくは２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性をもつポリペプチドを含有する単離されたヒト神経栄養成長因子。
【０２３８】
態様５１：  ＬＭＢＰ受託番号ＬＭＢＰ３９３１の下に寄託されたプラスミドＥＶＮｍａｔ／ｐＲＳＥＴＢ。
【０２３９】
態様５２：  パーキンソン病、アルツハイマー病、拡張したポリグルタミン配列に関連するニューロン障害、例えばハンチントン病、末梢神経病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、末梢神経傷害もしくは損傷、神経毒曝露、多発性内分泌新形成、家族性ヒルシュスプルング病、プリオン関連疾患、クロイツフェルド・ヤコブ病、卒中、事実上末梢もしくは中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ／炎症疾患ならびにコンダクタンス障害からなる群のいずれかを治療するための薬物の製造における態様３９記載の化合物の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2010158241.tif 000029
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2010158241.tif 000032
【図２３】
2010158241.tif 000033
【図２４】
2010158241.tif 000034
【図２５−１】
2010158241.tif 000035
【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【配列表】
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