(57)【要約】【課題】VifによるAPOBEC3G分解活性を抑制することで、APOBEC3Gによるウイルスの複製を阻害する効果を有する医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を第１有効成分として含有する医薬組成物を提供する。（ａ）は、Ｈｓｐ７０と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸であり、（ｂ）は、（ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなりＶｉｆによるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解を阻害する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を第１有効成分として含有する医薬組成物。
（ａ）Ｈｓｐ７０と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなりＶｉｆによるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解を阻害する活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列を含有する核酸
【請求項２】
前記第１有効成分に加え、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を第２有効成分として併せて含有する請求項１に記載の医薬組成物。
（ｃ）ＡＰＯＢＥＣ３Ｇと同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸
【請求項３】
前記核酸が発現ベクターである請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記第１有効成分に加え、以下の（ｅ）及び（ｆ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を第２有効成分として併せて含有する請求項１〜３いずれか一項に記載の医薬組成物。
（ｅ）ＡＰＯＢＥＣ３Ｇと同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ）前記（ｅ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を有するポリペプチド
【請求項５】
前記第１有効成分が、以下の（ｇ）及び（ｈ）からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４いずれか一項に記載の医薬組成物。
（ｇ）Ｈｓｐ７０と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｈ）前記（ｇ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＶｉｆによるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解を阻害する活性を有するポリペプチド
【請求項６】
請求項１〜５いずれか一項に記載の医薬組成物を含有するウイルス感染症の治療・予防薬。
【請求項７】
前記ウイルス感染症がＨＩＶ感染症である、請求項６に記載の治療・予防薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスが有するタンパク質であるVifによるAPOBEC3G分解を阻害することで、ウイルス感染症の治療又は予防に用いられる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
HIV（ヒト免疫不全ウイルス、Human Immuno Deficiency
Virus）はヒトのＴ細胞やマクロファージに感染、増殖し、免疫細胞を減少させることでAIDS（後天性免疫不全症候群、Acquired Immune Deficiency
Syndrome）を引き起こす。これまで、HIVの増殖を抑える医薬が多数開発されてきた（特許文献１〜４参照）。
【０００３】
APOBEC3Gはヒトが有するタンパク質である。APOBEC3Gは、APOBECスーパーファミリーに属し、シチジン脱アミノ化酵素として働く。ウイルス粒子内に取り込まれたAPOBEC3GはHIVなどのレトロウイルスのRNAが逆転写される際、ウイルスマイナス鎖DNAにおけるシチジン（C）をウラシル（U）とする変異を多数導入する。これによりプラス鎖のＤＮＡ中にグリシン（G）からアデニン（A）への高頻度変異が引き起こされ、ウイルスの増殖が阻害される（非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、HIV-１に代表されるレトロウイルス等はVif（Viral Infectivity Factor）というタンパク質を有している。VifはAPOBEC3Gのウイルス増殖阻害効果の抑制に関与していることが知られている。VifはAPOBEC3Gを標的として結合する。Vifと結合したAPOBEC3Gは分解されるため、VifはAPOBEC3Gのウイルス粒子中への取り込みを特異的に阻害し、ウイルスの複製を助けている（非特許文献２参照）。
【０００５】
本発明者らは、Hsp70の存在下でAPOBEC3Gのウイルス粒子への取り込み量が増加することを発見し、報告した（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１６３０４７号公報
【特許文献２】特開２００５−２４７７６３号公報
【特許文献３】特開平１０−３２４７００号公報
【特許文献４】特開平０６−１２８２８８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mangeat,B., Turelli, P., Caron, G., Friedli, M., Perrin, L. & Trono, D. “Broadantiretroviral defence by human A3G through lethal editing of nascent reversetranscripts.” Nature. 424, 99-103 (2003).
【非特許文献２】Marin, M., Rose, K.M.,Kozak, S.L. & Kabat, D. “HIV-1 Vif protein binds the editing enzyme A3G andinduces its degradation.” Nat. Med. 9, 1398-1403 (2003).
【非特許文献３】杉山隆一、羽生勇一郎、長沼晴樹、高久洋、「APOBEC3GとHsp70の相互作用によるHIV-1ウイルス粒子形成への影響」  第５５回日本ウイルス学会学術集会  プログラム・抄録集、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
VifのAPOBEC3G分解活性を抑制することができれば、APOBEC3Gの作用を有効利用してHIV-1等ウイルスの複製を阻害することができる。したがって、VifによるAPOBEC3G分解を阻害する物質は、HIV等ウイルスの感染症の治療又は予防に用いられる医薬組成物に応用することができると考えられる。しかしながら、そのような機能を持つ物質は報告されていない。また、本発明者らの報告（非特許文献３）においても、Hsp70の機能の特定には至っておらず、医薬組成物として利用するには不十分であった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、Hsp70の機能を解析した結果、Hsp70とVifとが相互作用し、VifのAPOBEC3G分解能を抑制することを見出し、以下の発明に到達した。すなわち、本発明の医薬組成物は、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を第１有効成分として含有する。（ａ）は、Hsp70と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸であり、（ｂ）は、（ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなりVifによるAPOBEC3G分解を阻害する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸である。
【００１０】
本発明の医薬組成物を投与すると、第１有効成分である核酸が、導入された細胞内で発現してポリペプチドを生成し、このポリペプチドがVifと結合することでAPOBEC3G分解を防ぐため、APOBEC3Gがウイルスの増殖を阻害することができる。
【００１１】
ここで、上記の、（ａ）Hsp70と同一のアミノ酸配列は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列であってもよい。配列番号：１は、Hsp70（Heat Shock 70kDa Protein）（Accession Number: NP-
005336）の全アミノ酸配列を示している。
【００１２】
また、本発明の医薬組成物は、第１有効成分に加え、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を第２有効成分として併せて含有するものであってもよい。（ｃ）は、APOBEC3Gと同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸であり、（ｄ）は、（ｃ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなりAPOBEC3G活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸である。
【００１３】
本発明の医薬組成物は第１の有効成分がVifの活性を阻害するため、第２の有効成分の核酸が細胞内で発現することで細胞内のAPOBEC3G活性を高め、ウイルス増殖を効果的に抑えることができる。
【００１４】
また、本発明の医薬組成物は、第１有効成分又は第２有効成分として含む核酸が発現ベクターであってもよい。発現ベクターであれば、細胞内での核酸の発現を効率的に誘導することができる。
【００１５】
また、本発明の医薬組成物は、第１有効成分に加え、以下の（ｅ）及び（ｆ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を第２有効成分として併せて含有してもよい。（ｅ）は、APOBEC3Gと同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、（ｆ）は、（ｅ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなりAPOBEC3G活性を有するポリペプチドである。
【００１６】
また、本発明の医薬組成物の第１有効成分は、以下の（ｇ）及び（ｈ）からなる群から選ばれる少なくとも１種でもよい。（ｇ）は、Hsp70と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、（ｈ）は、（ｇ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、VifによるAPOBEC3G分解を阻害する活性を有するポリペプチドである。
【００１７】
本発明の医薬組成物が、第１有効成分又は第２有効成分をポリペプチドとして含有することで、核酸の転写・翻訳の過程を経ずに本発明の効果を発揮することが可能である。
【００１８】
さらに、本発明は上記の医薬組成物を含有するウイルス感染症の治療・予防薬、特にHIV感染症の治療・予防薬を含む。
【発明の効果】
【００１９】
本発明における医薬組成物は、VifのAPOBEC3G分解活性を阻害することで、APOBEC3Gの作用によりウイルスの複製を阻害することができる。したがって、本発明における医薬組成物は、ウイルス感染症の治療又は予防に用いることができる。また、本発明の医薬組成物が含有するHsp70はヒトが有するタンパク質であるため、投薬による副作用が少ないことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】VifとHsp70が相互作用していることを示すウエスタンブロットの結果の図である。
【図２】第１有効成分であり、ヒトHsp70のアミノ酸配列をコードするDNAを含む発現ベクター（pFLAG-Hsp70）の模式図である。
【図３】第１有効成分（pFLAG-Hsp70）が構築されたことを確認する電気泳動の結果の図である。
【図４】第１有効成分（pFLAG-Hsp70）によりHsp70が発現したことを確認するウエスタンブロットの結果の図である。
【図５】第１有効成分（pFLAG-Hsp70）によりVifによるAPOBEC3Gの分解能が阻害されたことを示したウエスタンブロットの結果の図である。
【図６】第１有効成分（pFLAG-Hsp70）及び第２有効成分（pcDNA-APOBEC3G）を含有する本発明の医薬組成物により、HIV-1の感染細胞が減少したことを示すMAGIアッセイの結果の図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の医薬組成物の好ましい一実施形態を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトリンパ好性ウイルス、C型肝炎ウイルス等、Vifを有するウイルスの感染症の治療又は予防に用いることができる。
【００２３】
本発明において、ポリペプチドとは、アミノ酸同士がアミド結合により連なったことで形成される高分子化合物である。一般に、分子量の大きなポリペプチドはタンパク質と呼称されるが、本明細書においては、ポリペプチドはタンパク質をも含むものとする。
【００２４】
アミノ酸とは、アミノ基とカルボキシル基との両方の官能基を持つ有機化合物であり、ポリペプチドの構成単位である。生体由来のタンパク質は、20種類のアミノ酸から構成されるが、本発明において用いられるポリペプチドは、上記20種類以外のアミノ酸を構成単位として含むものであっても構わない。また、生体由来のアミノ酸はD体であるが、上記ポリペプチドはL体のアミノ酸を構成単位として含むものであっても構わない。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を第１有効成分として含有する。（ａ）は、Hsp70と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸であり、（ｂ）は（ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなりVifによるAPOBEC3G分解を阻害する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有する核酸である。
【００２６】
Hsp70は分子量70 kDaの熱ショックタンパク質の一種である。Hsp70は、N末端側が44kDのATP結合領域、C末端側が27kDの基質結合領域により構成されている。Hsp70は、タンパク質のフォールディングの補助をはじめとして、細胞内でさまざまな機能を有している。本発明におけるHsp70はヒト由来のものであることが好ましい。ヒトが有するHsp70と、本発明の医薬組成物の含有するポリペプチドが高い相同性を有していれば、副作用が少ないことが期待されるためである。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、第１有効成分である核酸が投与された細胞内で、Vifと結合する活性を有するポリペプチドを生成する。このポリペプチドとウイルス由来のVifとが相互作用し、Vifによるヒト細胞内のAPOBEC3Gの分解を阻害する。したがって、ヒト細胞内のAPOBEC3Gがウイルスの複製を阻害し、ウイルス感染症の治療又は予防が実現される。
【００２８】
ここで、「VifによるAPOBEC3G分解を阻害する活性を有する」とは、Hsp70が有するAPOBEC3G分解阻害活性と同程度又はそれ以上のAPOBEC3G分解阻害活性を有することをいう。APOBEC3G分解阻害活性は、ウエスタンブロット等の公知の方法で測定することができる。
【００２９】
また、VifによるAPOBEC3G分解を阻害する活性を有するポリペプチドは、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。配列番号：１は、Hsp70（Heat Shock 70kDa Protein）（Accession Number: NP-
005336）の全アミノ酸配列を示す。
【００３０】
アミノ酸配列の改変又は変異は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるし、人為的に行うこともできる。上記ポリペプチドには、このような改変、変異の原因や手段などを問わず、VifによるAPOBEC3G分解を阻害する活性を有する全ての改変ペプチドが包含される。アミノ酸の人為的な置換は、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／ 又は両親媒性における類似性に基づき行うことができる。例えば、負電荷の酸性アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正電荷の塩基性アミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ、また同様の親水価をもつ無電荷の中性アミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【００３１】
アミノ酸の「欠失、置換若しくは付加」の程度及びそれらの位置は、改変された又は変異したアミノ酸配列からなるポリペプチドが、例えば配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同程度又はそれ以上の作用を有するものであれば、特に制限されない。
【００３２】
上記ポリペプチドの有するアミノ基やカルボキシル基は、アミノ基のアセチル化、アセチル化、メチル化、カルボキシル基のアミド化など、化学修飾を施したものであってもよい。さらに、アミノ酸配列を改変してジスルフィド結合を形成したり、N末端のアミノ酸とC末端のアミノ酸の間でアミド結合を形成して環状の構造としたりしてもよい。これらの処理を行うことで、ポリペプチドの安定化を図ることができる。
【００３３】
また、本発明において用いられる核酸とは、ヌクレオチドがリン酸エステル結合で連なった有機化合物をいい、DNAやRNAが代表的である。核酸は、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）チミン（T）、ウラシル（U）の塩基の配列によりポリペプチドをコードする。また、本発明は該核酸に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記ポリペプチドを発現することが可能な核酸も、上記ポリペプチドをコードする核酸として包含する。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、50℃でハイブリダイズし、50℃での0.1％SDSを含む1×SSCによる洗浄処理によっても脱離しない条件等を挙げることができる。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、有効成分である核酸を発現ベクターとして含有することができる。発現ベクターとは外来の遺伝子を細胞に導入する、いわば遺伝子の運び屋である。本発明では発現ベクターとして、ウイルスベクターやプラスミドベクター、人工染色体ベクター等、公知の発現ベクターを用いることができる。ある種のウイルスベクターを用いた場合は、外来の遺伝子を染色体に組み込むことも可能であるため、細胞内における持続的な発現が期待される。これら発現ベクターは、公知の方法を用いて外来の遺伝子を宿主に導入することが可能である。
【００３５】
発現ベクターがプラスミドベクターであった場合には、宿主の細胞内で、転写、翻訳という過程を経てポリペプチドを生成する。一方、上記発現ベクターがウイルスベクターであった場合には、ウイルスベクターが宿主に感染することで、ベクターの有する核酸からポリペプチドを生成する。ウイルスベクターは、ウイルスの複製系を利用して遺伝子を導入するものであり、その導入法はウイルスの種類に応じてさまざまである。例えば、ウイルスベクターの有するDNAが宿主の染色体に組み込まれるもの、ウイルスベクターがRNAと逆転写酵素を有し、宿主の細胞内でRNAがDNAとなって宿主の染色体に組み込まれるもの、ウイルスベクターの有するRNAが細胞質で複製されて翻訳されるもの、等がある。
【００３６】
本発明の医薬組成物が含有する発現ベクターは、上記ポリペプチドをコードする核酸を、既存の骨格ベクターの特定部位に挿入して構築される。また、発現ベクターは、特定部位に挿入された核酸の転写を誘導するプロモーター配列を有する。
【００３７】
発現ベクターとして用いられるウイルスベクターとしては、具体的にはアデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス、バキュロウイルス、レンチウイルス及びこれらウイルスについて遺伝子組換え技術により無毒化処理や弱毒化処理を施したウイルス等を利用したものが挙げられる。
【００３８】
また、ウイルスベクターは水疱性口内炎ウイルス由来のVSVG（Vesicular  Stomatitis Virus Glycoprotein）、狂犬病ウイルス由来のRVG（Rabies  Virus Glycoprotein）等の糖タンパク質を外殻に有するように組み換えたものであってもよい。これらの糖タンパク質は細胞膜を形成するリン脂質と結合するため、ウイルスベクターによる遺伝子導入効率を高めることができる。
【００３９】
また、本発明の医薬組成物が含有する第１有効成分は、ポリペプチドであってもよい。本発明の医薬組成物を投与し、有効成分であるポリペプチドが細胞内に到達することで、転写、翻訳という過程を経ることなく、本発明の効果を発揮することができる。本発明に用いるポリペプチドは、有機合成や遺伝子工学的手法等の公知の方法を用いて生産することができる。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、VifによるAPOBEC3G分解を阻害する活性を有するポリペプチド又はそれをコードする核酸である第１有効成分に加えて、APOBEC3Gと同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド、APOBEC3Gと同一のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、APOBEC3GによるHIVの増殖を阻害する活性を有するポリペプチド、又はこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列をコードする核酸を第２有効成分として含有してもよい。また、第２有効成分が核酸であった場合には、核酸を発現ベクターとして含有してもよい。第１有効成分によるVifのAPOBEC3G分解阻害活性、及び内在のAPOBEC3Gのウイルス増殖阻害活性に加えて、第２有効成分がさらにAPOBEC3Gによるウイルス増殖阻害活性を付与するため、本発明の効果を増強することができる。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、ウイルス治療・予防薬に含有される。ウイルス治療・予防薬は経口又は非経口により患者に対し投与することができる。非経口投与とは、具体的には、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、骨髄腔内投与、経粘膜投与、門脈内投与などを挙げることができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与形態、症状等により適時選定することができる。本発明は、HIVやHCV等のVifを有するウイルスの感染症治療に用いることができる。
【実施例】
【００４２】
次に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１：Hsp70とVifとの相互作用の検証
まず、ヒト由来Hsp70のポリペプチドが、Vifと相互作用することを検証した。DNAベクターにVifをコードするDNAを挿入したpcDNA-Vif ORF（pcDNA3.1はInvitrogen社の製品）、HIV-1のDNAクローンであるpNL4-3、及びpNL4-3からVifの領域を取り除いたpNL4-3Δvifの3種の発現ベクターを作成し、ヒト腎臓由来の培養細胞である293T細胞に形質導入を行った。
【００４４】
293T細胞にLipofectamin 2000（Invitrogen社）及びOpti-MEM I（Invitrogen社）を用いて形質導入を行って、さらに細胞を培養した。培養後、界面活性剤を含有した緩衝液で処理し、遠心、上清を回収した。回収した上清について、抗Vif抗体及び抗Hsp70抗体を用いてウエスタンブロットを行い、Vif及びHsp70を検出した。図１左に示すように、Vifの発現がpcDNA-Vif ORFを導入した細胞とpcNL4-3を導入した細胞でみられ、Hsp70の発現がすべての細胞でみられていることを確認した。
【００４５】
つづいて、前記の上清について、抗Hsp70抗体で免疫沈降を行い、抗Vif抗体でウエスタンブロットを行った。図１右に示すように、pcDNA-Vif ORFを形質導入した細胞に含まれていたHsp70と、pNL4-3を形質導入した細胞に含まれていたHsp70とについて、それぞれVifの共存が確認されたことから、VifとHsp70とが結合していたことが明らかとなった。
【００４６】
実施例２：Hsp70発現ベクターの作成
293T細胞から全RNAを抽出し、これを鋳型としてRT-PCRを行い、ヒトHsp70のアミノ酸配列をコードするDNAを取得した。これをEcoRI及びBamHIで消化し、アガロース電気泳動後、ゲルからDNAを抽出してインサートとした。骨格ベクターにはpFLAG-CMV（登録商標：シグマ―アルドリッチ・コーポレイション）を用いて、公知の方法により、発現ベクターを構築した。図２に示すようにヒトHsp70のアミノ酸配列をコードするDNAを組み込んだ発現ベクター（pFLAG-Hsp70）であり、第１有効成分として本発明の医薬組成物に含有される。
【００４７】
構築した発現ベクターをNae Iで消化し、消化したものと消化していないものとをそれぞれ電気泳動し、発現ベクターの構築を確認した。図３に示すように適切な位置にフラグメントが検出されたことから、第１有効成分（pFLAG-Hsp70）の生成が確認された。
【００４８】
さらに、293T細胞に第１有効成分（pFLAG-Hsp70）を含有する医薬組成物を導入して2日間培養し、細胞を溶解してタンパク質を回収した。回収したタンパク質について、抗FLAG抗体を用いてウエスタンブロットを行った。図４に示すようにlane-3で適切な位置にバンドが検出され、第１有効成分（pFLAG-Hsp）を含有する医薬組成物によるHsp70の発現が確認された。
【００４９】
実施例３：VifのAPOBEC3G分解の阻害効果の検証
本発明の医薬組成物による、VifのAPOBEC3G分解の阻害効果を検証した。上述の第１有効成分（pFLAG-Hsp70）に加え、APOBEC3Gと同一のアミノ酸配列をコードするDNAを含む発現ベクター（pcDNA-APOBEC3G、第２有効成分）、VifをコードするDNAを含む発現ベクター（pcDNA-Vif ORF）を、293T細胞に対し、Lipofectamin 2000（Invitrogen社）及びOpti-MEM I（Invitrogen社）を用いて形質導入を行って、２日間培養、細胞を溶解しタンパク質を回収した。さらに、APOBEC3G（図５ではAPO3Gと示す）、Hsp70、Vif（図５ではHIV-1 Vifと示す）について、それぞれに対する抗体を用いウエスタンブロットにより発現量を確認した。図５に示すように、Hsp70の非強発現下では、APOBEC3Gの検出量は少なかった。しかしながら、第１有効成分によるHsp70の発現下では、Hsp70の量に依存してAPOBEC3Gの検出量が多くなった。したがって、第１有効成分を含有する医薬組成物によりHsp70を発現させることで、VifによるAPOBEC3Gの分解を阻害できることが明らかとなった。
【００５０】
実施例４：HIV-1感染へのHsp70の影響
さらに、MAGIアッセイを用いて本発明の医薬組成物のHIV-1感染への影響を調べた。MAGIアッセイとは、HIVの感染価測定系に用いられる系である。MAGI細胞は、HIV-1のLT（Long Terminal Repeat）の下流にSV40の核移行シグナルを付け加えたβ-ガラクトシダーゼを入れた発現ユニットが組み込まれている。HIV-1が感染し、転写活性因子であるTatが発現すると、HIV-1 Promoter LTRが駆動するためβ-ガラクトシダーゼ酵素が細胞核内で発現するため、感染の有無が判定される（非特許文献４参照）。
【００５１】
非特許文献４：Kimpton, J. et al., Detection of replication-competent and pseudotyped
human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on the basis of
activation of an integrated beta-galactosidase gene. J.Virol. 66: 2232-2239 (1992)
【００５２】
第１有効成分（pFLAG-Hsp70）及び第２有効成分（pcDNA-APOBEC3G）を含有する医薬組成物を作製し、pNL4-3と同時に293T細胞に導入した。第１有効成分を形質導入した量は0μg、0.1μg、1.0μg及び2.0μgとした。導入後、293T細胞を2日間培養した後、ウイルスを含む培養上清を回収した。0.45μmフィルターを通じ、化学発光酵素免疫測定法（CELIA）によりHIVp24抗原濃度を測定した。つづいて、MAGI細胞にHIVp24が5ngとなる量のウイルスを感染させ、MAGIアッセイを行った。核が青く染まっている細胞は、HIV-1が感染したことの指標となるため、顕微鏡での観察が可能である。顕微鏡で感染細胞数をカウントすると、図６左に示すように、第１有効成分（pFLAG-Hsp70）と第２有効成分（pcDNA-APOBEC3G）を含有する医薬組成物（図６でA3G(+)と示す）を導入した場合、感染細胞数が第１有効成分（pFLAG-Hsp70）の量に依存して減少した。第１有効成分（pFLAG-Hsp70）を2.0μg含有する医薬組成物を導入した場合には、感染細胞数は80％減少した。したがって、本発明の医薬組成物により、細胞内でのAPOBEC3Gの分解が第１有効成分により阻害されることで、APOBEC3Gの作用によりHIV-1感染が阻害されたことが明らかとなった。
【００５３】
以上の結果から、本発明の医薬組成物は、細胞内でVifによるAPOBEC3G分解を阻害し、HIV等のウイルス感染症の治療又は予防効果を発揮することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の医薬組成物は、HIV、HCV等のウイルス感染症の治療又は予防に用いることができる。
【図１】
2010248179.tif 000002
【図２】
2010248179.tif 000003
【図３】
2010248179.tif 000004
【図４】
2010248179.tif 000005
【図５】
2010248179.tif 000006
【図６】
2010248179.tif 000007
【配列表】
2010248179000001.app