(57)【要約】      （修正有）【課題】抗癌剤又は抗炎症剤として有用なｐｒｏ−ＰＨＢＰの活性化を特異的に抑制する化合物の提供。【解決手段】既知化合物ライブラリーサンプルおよび市販化合物を探索源とし、Ｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化阻害物質の新規スクリーニングを行った結果得られた、下記式で示される化合物、タンニン酸やシアニジンなどのポリフェノール構造を有する化合物、オキシテトラサイクリンなどから選択される化合物を有効成分として含む、医薬組成物。2010209055.tif 000028【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化４】
2010209055.tif 000017
2010209055.tif 000018
2010209055.tif 000019
2010209055.tif 000020
2010209055.tif 000021
で示される化合物を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項２】
抗癌剤又は抗炎症剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前駆体型血漿ヒアルロナン結合タンパク質の活性化に関連する疾患の治療剤である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
下記式：
【化５】
2010209055.tif 000022
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2010209055.tif 000024
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で示される化合物を含む、前駆体型血漿ヒアルロナン結合タンパク質の活性化阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、医薬組成物および前駆体型血漿ヒアルロナン結合タンパク質の活性化阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  癌細胞はその悪性化に伴って、周囲の組織へと浸潤し、さらには他の臓器へと転移して二次腫瘍を形成する。この浸潤・転移の過程は非常に複雑であり様々な因子がその制御に関わるが、このうち基底膜や血管壁の分解は浸潤・転移の過程の中でも重要なステップである。このステップにおいて中心的な役割を果たすのが、血漿中に存在する一連のセリンプロテアーゼやそのインヒビターであり、中でも組織線溶にはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）が重要な役割を担っている。【０００３】  ｕ−ＰＡによって生じたプラスミンは細胞外マトリックスを直接の基質とするマトリックスメタロプロテアーゼ前駆体（ｐｒｏ−ＭＭＰｓ）を活性化し、このことによって組織線溶が生じる［非特許文献１］。これら一連のプロテアーゼ活性と癌の浸潤・転移能との関わりについてはこれまで多くの報告がなされており［非特許文献２］、これらの酵素活性、あるいはそのレセプターとの相互作用を阻害することによる転移阻害剤の研究が行われている。ｕ−ＰＡは多くのセリンプロテアーゼがそうであるように、血中では酵素活性を持たない前駆体型として存在し、何らかの要因によって活性化し線溶反応を引き起こす。近年、ｕ−ＰＡの活性化の引き金となる酵素として、血漿中からプロウロキナーゼ活性化能を有する新規セリンプロテアーゼが発見された。【０００４】  ＰＨＢＰ（ｐｌａｓｍａ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、１９９４年に三浦らによって、ヒアルロン酸に特異的に結合するタンパク質として血漿中から発見された［非特許文献３］。ＰＨＢＰは主として肝臓で翻訳されたのち、Ｎ末端のシグナルペプチドが切断され、酵素活性を持たない前駆体型ｐｒｏ−ＰＨＢＰとして血中に分泌される［非特許文献４］。Ｐｒｏ−ＰＨＢＰは、３つのＥＧＦ様ドメインと、１つのクリングルドメイン、さらにセリンプロテアーゼ様ドメインを有する、５３７アミノ酸残基からなる分子量７０ｋＤａの一本鎖型の前駆体である［非特許文献５］。正常血中ではこの前駆体型のみが存在し、活性型ＰＨＢＰはマウスの肝障害時、あるいは肝切除の場合にのみ検出されている［非特許文献６］。【０００５】  ＰＨＢＰの生理的な役割は未だ不明な点が多いが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてフィブリン、フィブロネクチンの切断［非特許文献６］やｐｒｏ−ｕ−ＰＡをｕ−ＰＡへと変換するプロウロキナーゼ活性化能を有することが報告されており［非特許文献７］、さらに、ＰＨＢＰの細胞表面の局在に伴い、線溶が促進されることも明らかにされている。【０００６】  また、ＰＨＢＰには、Ｍａｒｂｕｒｇ症と名付けられた５１１番目のアミノ酸がＧからＥに置換された遺伝子多型が報告されており、このアミノ酸置換をもつ患者では、ＰＨＢＰ依存性のｕ−ＰＡ活性が正常と比較して５０−８０％減少しており、ｕ−ＰＡ依存性のプラスミン生成量の減少も見られる［非特許文献８］。さらにＭａｒｂｕｒｇ症が動脈硬化の進行に関与していること、Ｍａｒｂｕｒｇ症患者の頚動脈血管壁にＰＨＢＰが高発現していることも報告されている［非特許文献９］。これらの知見はＰＨＢＰが線溶系の最上流に位置し、血栓の溶解反応や炎症反応、癌の浸潤・転移の際に生じる一連の組織線溶にも関わる重要なタンパク質の一つであることを示している。【０００７】  Ｐｒｏ−ＰＨＢＰからＰＨＢＰへの変換を触媒する酵素の存在は、現在までに報告されておらず、自己活性化によって変換されると考えられている［非特許文献１０，１１］。自己触媒作用によりＡｒｇ２９０−Ｉｌｅ２９１の間が切断され、活性型２本鎖分子（３つのＥＧＦドメインとクリングルドメインを含む５０ｋＤａの重鎖：Ｐｈｅ１−Ａｒｇ２９０およびセリンプロテアーゼドメインを含む２７ｋＤａの軽鎖：Ｉｌｅ２９１−Ｐｈｅ５３７）が生じ、さらなる自己開裂によって、失活型４本鎖分子となる。その後もさらなる自己開裂によって断片化が進行する［非特許文献５］。【０００８】  ＰＨＢＰの活性化機構は、凝固系因子  Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩに類似しており、その自己開裂は、ポリ−Ｌ−リジンやヘパリン、デキストラン硫酸といった電荷物質によって促進される［非特許文献５，１０］。また生体内ポリアミンの一つであるスペルミジンによっても、活性化が促進されることが明らかとされた。【０００９】  しかし、これらの活性化促進因子がどのようなメカニズムで（ｐｒｏ−）ＰＨＢＰに結合し作用を及ぼしているのかは不明であり、前述したようにｐｒｏ−ＰＨＢＰの活性化機構、およびその生理的役割は不明な点が多い。また活性型二本鎖ＰＨＢＰの阻害剤としては、内因性阻害因子としてＣ−１インヒビターやａ２−アンチプラスミンが報告されており、また一般的なセリンプロテアーゼ阻害剤によって阻害されるが［非特許文献１１］、これらはいずれもＰＨＢＰ特異的なものではなく、また前駆体型ｐｒｏ−ＰＨＢＰに対する特異性も有していない。【００１０】
【化１】
2010209055.tif 000002
【００１１】  図中、ｕＰＡは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターであり、ｕＰＡＲは、ｕＰＡレセプターであり、ＰＬＧは、プラスミノーゲンであり、ＰＭは、プラスミンである。【００１２】  従来、ｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化阻害剤としては、サーファクチンを始めとした環状リポペプチドなど十数種の化合物が知られている。［特許文献１］しかしこれらの化合物はその阻害活性が低いこと、阻害作用の特異性が低いなど問題点があり、ｐｒｏ−ＰＨＢＰの活性化を特異的に抑制する、より優れた活性をもつ化合物の開発が望まれていた。
【非特許文献１】Ｗｅｒｂ，Ｚ．（１９９７）．ＥＣＭ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ：ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｃｏｌｏｇｙ．Ｃｅｌｌ  ９１，４３９−４２
【非特許文献２】Ｐｅｐｐｅｒ，Ｍ．Ｓ．（２００１）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｐｌａｓｍｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  ｔｈｒｏｍｂ  ｖａｓｃ  ｂｉｏｌ．２１，１１０４−１１１７
【非特許文献３】Ｃｈｏｉ−Ｍｉｕｒａ，Ｎ．Ｈ．Ｔｏｂｅ，Ｔ．Ｓｕｍｉｙａ，Ｊ．Ｎａｋａｎｏ，Ｙ．Ｓａｎｏ，Ｙ．Ｍａｚｄａ，Ｔ．  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．（１９９６）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＨＢＰ）ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ：ｉｔ  ｈａｓ  ｔｈｒｅｅ  ＥＧＦ，ａ  ｋｒｉｎｇｌｅ  ａｎｄ  ａ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ，ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９，１１５７−１１６５
【非特許文献４】Ｃｈｏｉ−Ｍｉｕｒａ，Ｎ．Ｈ．Ｙｏｄａ，Ｍ．Ｓａｉｔｏ，Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．（２００１）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４，１４０−１４３
【非特許文献５】Ｃｈｏｉ−Ｍｉｕｒａ，Ｎ．Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．Ｙｏｄａ，Ｍ．Ｓａｉｔｏ，Ｋ．Ｍａｚｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．（２００１）．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４，４４８−４５２
【非特許文献６】Ｃｈｏｉ−Ｍｉｕｒａ，Ｎ．Ｈ．Ｏｔｓｕｙａｍａ，Ｋ．Ｓａｎｏ，Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．（２００１）．Ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｐｌａｓｍａ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４，８９２−８９６
【非特許文献７】Ｒｏｍｉｓｈ，Ｊ．Ｖｅｒｍｏｈｌｅｎ，Ｓ．Ｆｅｕｓｓｎｅｒ，Ａ．Ｓｔｏｈｒ，Ｈ．Ａ．（１９９９），Ｔｈｅ  ＦＶＩＩ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．２９，２９２−２９９
【非特許文献８】Ｒｏｍｉｓｈ，Ｊ．Ｆｅｕｓｓｎｅｒ，Ａ．Ｎｅｒｌｉｃｈ，Ｃ．Ｓｔｏｅｈｒ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｅｉｍｅｒ，Ｔ．（２００２）．Ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｉ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＦＳＡＰ）．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇ．Ｆｉｂｌ．１３，４３３−４４１
【非特許文献９】Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｊ．Ｗｅｂｂ，Ｋ．Ｅ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｈｕｍｐｈｉｅｓ，Ｓ．Ｅ．（２００４）．Ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｇ５１１Ｅ（Ｍｕｒｂｕｒｇ）ｖａｒｉａｎｔ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｓｋ
【非特許文献１０】Ｅｔｓｃｈｅｉｄ，Ｍ．Ｈｕｎｆｅｌｄ，Ａ．Ｋｏｎｉｇ，Ｈ．Ｓｅｉｔｚ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄｏｄｔ，Ｊ．（２０００）．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏＰＨＢＳＰ，ｔｈｅ  ｚｙｍｏｇｅｎ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｓｍａ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｂｙ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８１，１２２３−１２３１
【非特許文献１１】Ｃｈｏｉ−Ｍｉｕｒａ，Ｎ．Ｈ．Ｓａｉｔｏ，Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．Ｙｏｄａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．（２００１）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４，２２１−２２５
【特許文献１】特開２００８−２０１６９９  医薬組成物
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】  本発明者は、上記課題を解決するために鋭意努力した結果、本発明の化合物が、前駆体型ｐｒｏ−ＰＨＢＰの活性化を従来知られていた化合物よりも強く阻害し、かつ活性型ＰＨＢＰには影響しないことを見出し、本発明を完成させた。【００１４】  したがって、本発明は、下記：
下記式：
【化２】
2010209055.tif 000003
2010209055.tif 000004
2010209055.tif 000005
2010209055.tif 000006
2010209055.tif 000007
2010209055.tif 000008
で示される化合物を有効成分として含む、医薬組成物、
抗癌剤又は抗炎症剤である、上記（１）〜（２４）に記載の医薬組成物、
前駆体型の血漿ヒアルロナン結合タンパク質の活性化に関連する疾患の治療剤である、上記（１）〜（２４）に記載の医薬組成物、及び
下記式：
【化３】
2010209055.tif 000009
2010209055.tif 000010
2010209055.tif 000011
2010209055.tif 000012
2010209055.tif 000013
2010209055.tif 000014
で示される化合物を含む、前駆体型血漿ヒアルロナン結合タンパク質の活性化阻害剤に関する。【００１５】  式（１）〜式（２４）の化合物は、いずれも既知化合物であり、合成あるいは天然物から精製することで入手可能である。【００１６】  本発明で前駆体型血漿ヒアルロナン結合タンパク質の活性化に関連する疾患とは、活性型血漿ヒアルロナン結合タンパク質の存在に起因して生じる病態をいい、たとえば、癌や炎症を挙げることができる。本発明の医薬は、癌や炎症の予防剤又は治療剤として用いることができる。【００１７】  本発明の結晶の投与形態は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤又はシロップ剤等による経口投与、或いは、注射剤又は座剤等による非経口投与であり得る。更に、本発明の結晶は、粉末、溶液又は懸濁液の形態として経肺投与することもできる。これらのための製剤は賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。【００１８】  本発明の医薬組成物の使用量は症状、年齢、投与方法等によって異なるが、例えば経口投与の場合には、成人に対して１日あたり、下限として０．１ｍｇ（好ましくは、１ｍｇ、更に好ましくは、５ｍｇ）、上限として、１０００ｍｇ（好ましくは、１００ｍｇ、更に好ましくは、５０ｍｇ）を１回または数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。静脈内投与の場合には、成人に対して１日当たり、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、１００ｍｇ（好ましくは１０ｍｇ）を１回または数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
【発明の効果】
【００１９】  本発明の医薬組成物は、Ｐｒｏ−ＰＨＢＰの活性化を抑制することにより、副作用が少なく、炎症反応や癌の浸潤・転移の際の組織線溶を抑制する効果という効果を奏する。【００２０】  以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】  Ｐｒｏ−ＰＨＢＰの精製およびＰＨＢＰの調製
Ｐｒｏ−ＰＨＢＰは、Ｅｔｓｃｈｅｉｄらの方法［Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８１，１２２３−１２３１（２０００）］にしたがい、６Ｍウレア存在下において、二段階の陰イオンカラムクロマトグラフィーに付した。ビシコニン酸（ＢＣＡ）法によりタンパク定量を行った後、使用時まで−８０℃で保存し、凍結融解後は４℃で保存し一週間以内に使用した。活性型二本鎖ＰＨＢＰは、０．２ｍＭｐｒｏ−ＰＨＢＰをｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．０（２５℃），０．１５ＭＮａＣｌ，１０ｍＭＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で３７℃，２０分間インキュベーションすることにより調製した。【００２２】  Ｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化
Ｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化は、以下のいずれかの方法によって測定した。いずれも丸底９６ウェルプレートを用いて５０ｍｌのＳｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４（２５℃），７５ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＣａＣｌ２，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中、３７℃で測定した。４０５ｎｍの吸収波長を６０分、または２０分間連続的に測定し、遊離するｐ−ニトロアニリンを定量した。酵素（前駆体）、合成発色基質および評価系に添加するｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化促進因子の濃度は以下に示すとおりである。【００２３】（１）  ｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化（１段階アッセイ）：
Ｐｒｏ−ＰＨＢＰ  ５ｎＭ，スペクトロザイムＴＨ  ０．１ｍＭ，活性化促進因子としてスペルミジントリヒドロクロリド５ｍＭを添加。
（２）  ｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化（２段階アッセイ）：
Ｐｒｏ−ＰＨＢＰ  ５ｎＭ，活性化促進因子としてスペルミジントリヒドロクロリド５ｍＭを添加し、３７℃、２０分間インキュベーションを行った。プレインキュベーション後、スペクトロザイムＴＨを終濃度０．１ｍＭとなるように添加した。
（３）ＰＨＢＰのアミド分解活性：
ＰＨＢＰ  ２  ｎＭ，スペクトロザイムＴＨ  ０．１ｍＭ；
それぞれの測定はいずれもトリプリケートで行った。【００２４】  スクリーニング方法
本発明者が所有する既知化合物ライブラリーサンプルおよび市販化合物を探索源とした。上述の方法を用いて、ｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化阻害活性を測定した。【００２５】  結果
Ｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化阻害物質の新規スクリーニングを行った結果、以下に示す化合物がｐｒｏ−ＰＨＢＰ活性化阻害活性を示した。
【表１】
2010209055.tif 000015
2010209055.tif 000016