(57)【要約】  【課題】  免疫疾患等の疾病の治療、予防に有効で安全なソルガム抽出物を含む生理活性物を提供する。  【解決手段】  ホワイト・ソルガムを、有機溶媒を含む抽出溶媒に浸漬して得られた抽出物は、図１に示すように、ＩｇＥ産生抑制活性を有する。前記有機溶媒としては、例えば、メタノールとクロロホルムとの混合溶媒があげられる。前記ソルガム抽出物は、この他に、インターフェロンγ産生促進活性、脱顆粒抑制活性、アレルギー抑制活性、免疫調整活性を有する。前記ソルガム抽出物を含む本発明の生理活性物は、飲食品、サプリメント、医薬品等に適用可能である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソルガム抽出物を含む生理活性物であって、
前記ソルガム抽出物が、ソルガムの一部または全部を、有機溶媒を含む抽出溶媒で抽出した抽出物であることを特徴とする生理活性物。
【請求項２】
前記抽出溶媒が、アルコール、ヘキサン、酢酸エチルおよびクロロホルムからなる群から選択された少なくとも一つの有機溶媒を含む、請求項１記載の生理活性物。
【請求項３】
前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２記載の生理活性物。
【請求項４】
前記抽出溶媒が、メタノール、エタノール、ヘキサンおよびクロロホルムからなる群から選択された少なくとも一つの有機溶媒を含む、請求項１記載の生理活性物。
【請求項５】
前記抽出溶媒が、少なくともメタノールとクロロホルムとを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の生理活性物。
【請求項６】
前記抽出溶媒におけるメタノール（Ｘ）とクロロホルム（Ｙ）との含有割合（Ｘ：Ｙ）が、１：１〜１：５の範囲である、請求項５記載の生理活性物。
【請求項７】
前記ソルガムが、ホワイト・ソルガムである、請求項１から６のいずれか一項に記載の生理活性物。
【請求項８】
前記ソルガムの一部が、外皮である、請求項１から７のいずれか一項に記載の生理活性物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の生理活性物を含むアレルギー抑制活性剤。
【請求項１０】
前記生理活性物が、ソルガム外皮の抽出物を含む、請求項９記載のアレルギー抑制活性剤。
【請求項１１】
前記アレルギー抑制活性が、ＩｇＥ産生の抑制活性、ＩＦＮ−γ産生の促進活性
および脱顆粒抑制活性からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項９または１０記載のアレルギー抑制活性剤。
【請求項１２】
前記脱顆粒抑制活性が、好塩基球の脱顆粒抑制活性である請求項１１記載のアレルギー抑制活性剤。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の生理活性物を含む免疫調整剤。
【請求項１４】
前記生理活性物が、ソルガム外皮の抽出物を含む、請求項１３記載の免疫調整剤。
【請求項１５】
前記免疫調整活性が、ＩｇＥ産生の抑制活性、ＩＦＮ−γ産生の促進活性および脱顆粒抑制活性からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１３または１４記載の免疫調整剤。
【請求項１６】
前記脱顆粒抑制活性が、好塩基球の脱顆粒抑制活性である請求項１５記載の免疫調整剤。
【請求項１７】
請求項１から８のいずれか一項に記載の生理活性物、請求項９から１２のいずれか一項に記載のアレルギー抑制活性剤、および、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の免疫調整剤からなる群から選択された少なくとも一つを含む飲食品。
【請求項１８】
請求項１から８のいずれか一項に記載の生理活性物、請求項９から１２のいずれか一項に記載のアレルギー抑制活性剤、および、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の免疫調整剤からなる群から選択された少なくとも一つを含むサプリメント。
【請求項１９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の生理活性物、請求項９から１２のいずれか一項に記載のアレルギー抑制活性剤、および、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の免疫調整剤からなる群から選択された少なくとも一つを含む医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソルガムの抽出物を含む生理活性物、それを含むアレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメントおよび医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ソルガムは、イネ科モロコシ属に属し、アメリカ、インド、中国、メキシコ、ナイジェリア等の国々で生産量が多い穀物種である。ソルガムは、グレイン・ソルガム、スイート・ソルガム、ブルーム・ソルガムおよびグラス・ソルガムの４種類に大別される。最近、小麦アレルギー対策のための穀物として、グルテンを含まない品種ホワイト・ソルガムが注目されている。ホワイト・ソルガムは、グレイン・ソルガムの一種であり、グルテンを含まないという特性の他に、必須アミノ酸を含み、ミネラル、ビタミンＢ群、食物繊維および不飽和脂肪酸が豊富であるという特性を有する。このような特性に鑑み、ホワイト・ソルガムを利用した食品の開発が行われている。ホワイト・ソルガムを利用した食品としては、例えば、パフスナック菓子（特許文献１）、麺類（特許文献２）、発泡性飲料（特許文献３）およびシロップ（特許文献４）等がある。
【０００３】
従来のホワイト・ソルガムの利用方法は、その栄養特性に着目したものが多かったが、ホワイト・ソルガムの性能を十分に引き出す技術が開発されたとはいえない。一方、免疫疾患等の疾病において、安全で有効な医薬品、食品の開発が求められている。このような背景から、近年、水含有溶媒によるソルガム抽出物について、免疫疾患等の疾病に対する有効性が研究されている(特許文献５)。しかしながら、ホワイト・ソルガムを含む各種ソルガムについては、さらに、その性能を引き出す技術の開発が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１３５５３０号公報
【特許文献２】特開２００４−３３７０９５号公報
【特許文献３】特開２００５−４００４５号公報
【特許文献４】特開２００５−３２３５５５号公報
【特許文献５】特開２００７−２５４３３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、免疫疾患等の疾病の治療、予防に有効で安全なソルガム抽出物を含む生理活性物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の生理活性物は、ソルガム抽出物を含む生理活性物であって、前記ソルガム抽出物が、ソルガムの一部または全部を、有機溶媒を含む抽出溶媒で抽出した抽出物であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の生理活性物は、有機溶媒を含む抽出溶媒によるソルガム抽出物を含むことによって、例えば、ＩｇＥの産生抑制活性、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生促進活性、脱顆粒抑制活性、アレルギー抑制活性または免疫調整活性を有する。また、ソルガムは、長年食品として利用されているため、その安全性にも優れる。このため、本発明の生理活性物は、例えば、アレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメント、医薬品等に適用でき、免疫疾患の予防や改善に有効である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明の実施例１および２の生理活性物について、ＩｇＥ産生ヒト骨髄腫細胞株におけるＩｇＥ産生抑制効果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例２の生理活性物について、熱安定性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例２の生理活性物について、抗体産生に対する効果を示すグラフであり、（Ａ）は、血中ＩｇＥ量への効果を示すグラフであり。（Ｂ）は、血中ＩｇＧ量への効果を示すグラフであり、（Ｃ）は、血中ＩｇＡ量への効果を示すグラフであり、（Ｄ）は、血中ＩｇＭ量への効果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例２の生理活性物について、血中ＯＶＡ特異的抗体の産生に対する効果を示すグラフであり、（Ａ）は、血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量への効果を示すグラフであり、（Ｂ）は、血中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ量への効果を示すグラフであり、血中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ量への効果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例２の生理活性物について、ＩＦＮ−γ産生に対する効果を示すグラフであり、（Ａ）は、血中ＩＦＮ−γ量への効果を示すグラフであり、（Ｂ）は、脾臓リンパ球のＩＦＮ−γ産生量への効果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例２の生理活性物について、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の脱顆粒抑制活性を示すグラフである。
【図７】図７は、比較例１および本発明の実施例１、３および４の生理活性物について、ＩｇＥ産生ヒト骨髄腫細胞株におけるＩｇＥ産生抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の生理活性物は、前述のように、ソルガム抽出物を含む生理活性物であって、前記ソルガム抽出物が、ソルガムの一部または全部を、有機溶媒を含む抽出溶媒で抽出した抽出物であることを特徴とする。
【００１０】
本発明において、前記ソルガムは、特に制限されず、ホワイト・ソルガム、グレイン・ソルガム、スイート・ソルガム、ブルーム・ソルガム、グラス・ソルガム等があげられ、中でもホワイト・ソルガムが好ましい。
【００１１】
本発明において、前記ソルガム抽出物の調製に使用するソルガムは、例えば、ソルガム全体でもよいし、ソルガムの一部でもよい。前記ソルガムの一部とは、例えば、ふすま、外皮、内皮、ふすまを除いた部分、外皮を除いた部分、内皮を除いた部分等があげられる。
【００１２】
前記抽出溶媒は、前記有機溶媒を含んでいればよい。前記抽出溶媒は、例えば、水系溶媒の含有量が低いことが好ましく、具体的には、前記水系溶媒の含有量は、例えば、２０体積％以下であり、好ましくは、１０体積％以下であり、好ましくは検出限界以下であり、特に好ましくは有機溶媒のみからなることが好ましい。前記水系溶媒としては、例えば、水、リン酸緩衝液等の各種緩衝液があげられる。
【００１３】
前記有機溶媒としては、例えば、アルコール、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム等があげられる。前記アルコールとしては、特に制限されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等があげられ、好ましくは、エタノール、メタノールであり、より好ましくはエタノールである。前記抽出溶媒において、前記有機溶媒は一種類でもよいし、二種類以上でもよい。また、前記抽出溶媒がアルコールを含有する場合、アルコールは一種類でもよいし二種類以上でもよい。
【００１４】
前記抽出溶媒が、二種類以上の有機溶媒を含む場合、有機溶媒の組み合わせは特に制限されないが、例えば、アルコールとクロロホルムとの組み合わせが好ましく、より好ましくは、メタノールとクロロホルムとの組み合わせである。
【００１５】
前記抽出溶媒におけるアルコールの添加割合は、特に制限されないが、例えば、５０ｖ／ｖ％以下の範囲であり、好ましくは、２０〜５０ｖ／ｖ％の範囲である。また、前記抽出溶媒における添加溶媒の割合は、特に制限されないが、例えば、８０ｖ／ｖ％以下の範囲であり、好ましくは、５０〜８０ｖ／ｖ％の範囲である。前記抽出溶媒において、前記アルコール（Ｘ）と前記添加溶媒（Ｙ）との添加割合（Ｘ：Ｙ）は、特に制限されないが、１：１〜１：５の範囲であり、好ましくは１：１〜１：２の範囲である。具体例として、メタノールとクロロホルムとの添加割合も、例えば、同様の範囲である。
【００１６】
前記ソルガム抽出物は、例えば、前記抽出溶媒を用いて製造することができる。具体的には、例えば、ソルガムの全部または一部（ソルガム原料ともいう）を前記抽出溶媒に浸漬することで調製できる。前記抽出溶媒に対するソルガムの添加割合は、特に制限されないが、例えば、抽出溶媒１００ｍＬに対して、ソルガム原料１００ｇ以下の範囲が好ましく、より好ましくは２０〜５０ｇの範囲である。抽出条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、２０〜４０℃の範囲が好ましく、より好ましくは２５〜３０℃の範囲であり、処理時間は、例えば、２〜７２時間の範囲が好ましく、より好ましくは１５〜３０時間の範囲である。抽出は、ソルガム原料を浸漬した前記抽出溶媒を撹拌することが好ましい。
【００１７】
抽出処理後、前記ソルガム原料を浸漬した前記抽出溶媒を、そのままソルガム抽出物として使用してもよいが、例えば、遠心やろ過等の分離処理によって、前記抽出溶媒から固形画分（不溶性画分）を除去し、液体画分（溶性画分）をソルガム抽出物として回収することが好ましい。また、前記ソルガム抽出物は、例えば、さらに、濃縮処理、希釈処理、脱色処理、脱臭処理、加熱処理、酵素処理等の処理を施してもよい。
【００１８】
つぎに、本発明のアレルギー抑制活性剤は、本発明の生理活性物を含むことを特徴とする。前記生理活性物は、前述のソルガム抽出物を含んでいればよいが、例えば、ソルガム外皮の抽出物を含むことが好ましい。
【００１９】
また、前記アレルギー抑制活性は、例えば、ＩｇＥ（ＩｇＥ抗体）の産生抑制活性である。前記生理活性物中の前記ＩｇＥ産生抑制因子は、例えば、４０〜６０℃の温度での加熱処理でも完全に失活しない、脂質が関与する非タンパク質物質である。また、前記アレルギー抑制活性は、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生促進活性である。さらに、前記アレルギー抑制活性は、例えば、脱顆粒抑制活性であり、具体的には、顆粒産生細胞の脱顆粒抑制活性である。前記顆粒産生細胞としては、特に制限されないが、例えば、好塩基球、好酸球、好中球、単球、マスト細胞、腸管クロム親和性様細胞（ＥＣＬ細胞）、ヒスタミン神経細胞等があげられる。前記顆粒に含まれる物質としては、特に制限されないが、例えば、ヒスタミン、キマーゼ、ヘパリン、走化性因子、プロスタグランジン、ロイコトリエン等のアレルギーに関与する物質があげられる。
【００２０】
アレルギー症状は、例えば、好塩基球や肥満細胞の細胞表面上に存在する免疫グロブリン（ＩｇＥ）のレセプターへの結合により誘起される脱顆粒が原因で、引き起こされることが知られている。また、Ｂ細胞によるＩｇＥ産生は、例えば、ＩＦＮ−γにより抑制されることが知られている。本発明の生理活性物は、ＩＦＮ−γの産生を促進し、ＩｇＥの産生を抑制し、または脱顆粒を抑制することから、アレルギー抑制活性剤として使用できる。
【００２１】
本発明の免疫調整剤は、本発明の生理活性物を含むことを特徴とする。本発明の免疫調整剤における免疫調整活性としては、例えば、ＩｇＥの産生抑制活性、ＩＦＮ−γの産生促進活性、脱顆粒抑制活性等があげられる。前記脱顆粒抑制活性は、具体的には、顆粒産生細胞の脱顆粒抑制活性である。前記顆粒産生細胞としては、特に制限されないが、例えば、前述の細胞等があげられる。前記顆粒に含まれる物質としては、特に制限されないが、例えば、前述のアレルギーに関与する物質があげられる。
【００２２】
免疫疾患の発症は、一般に、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）と２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）とのバランス異常に密接に関連することが知られている。例えば、アレルギーの発症において重要な役割を担う免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の産生は、つぎのようなメカニズムで調節される。すなわち、Ｔｈ２細胞が分泌したサイトカインは、Ｂ細胞に作用し、ＩｇＥ産生の促進に働く。その一方で、Ｔｈ１細胞の分泌するＩＦＮ−γは、Ｔｈ２細胞の働きを抑える作用を有し、ＩｇＥ産生を抑制する。このように、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とが、互いに作用することにより、ＩｇＥ産生が調節されている。そして、免疫疾患は、Ｔｈ２細胞の機能亢進により、このＴｈ１細胞とＴｈ２細胞とのバランス（いわゆる、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス）が崩れた状態と考えられている。本発明の生理活性物は、ＩｇＥの産生を抑制し且つＩＦＮ−γの産生を促進することから、前記Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整できるため、免疫調整剤として使用できる。
【００２３】
本発明の飲食品は、本発明の生理活性物、本発明のアレルギー抑制活性剤、および、本発明の免疫調整剤からなる群から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とする。本発明において、飲食品とは、例えば、飲料、食品を含み、前記食品とは、例えば、一般食品、保健機能食品を含む。前記一般食品としては、特に限定されないが、例えば、穀物加工食品、野菜加工食品、果物加工食品、食肉加工食品、水産物加工食品、乳製品、健康食品等があげられる。また、前記保健機能食品は、一般に機能性食品とも称される。前記保健機能食品としては、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品等があげられる。本発明の飲食品は、例えば、さらに、種々の食品素材、助剤、安定化剤等を含んでもよい。
【００２４】
本発明のサプリメントは、本発明の生理活性物、本発明のアレルギー抑制活性剤、および、本発明の免疫調整剤からなる群から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とする。本発明において、前記サプリメントとは、前述の保健機能食品を含む。前記サプリメントの剤形としては、特に制限されないが、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤等があげられる。また、前記サプリメントは、例えば、さらに、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、吸収促進剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤等の各種添加剤等を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明の医薬品は、本発明の生理活性物、本発明のアレルギー抑制活性剤、および、本発明の免疫調整剤からなる群から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とする。本発明において、前記医薬品とは、例えば、医薬部外品も含む。前記医薬品の剤形としては、特に制限されないが、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤等があげられる。また、前記医薬品は、例えば、さらに、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、吸収促進剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤等の各種添加剤等を含んでいてもよい。
【００２６】
本発明の生理活性物、アレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメントおよび医薬品の形態は、特に制限されず、例えば、液状、ゾル状、ゲル状、固体状、粒状、粉末状等の各種形態をとることができる。また、本発明のアレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメントおよび医薬品は、必要に応じて、薬学的若しくは食品安全上許容される各種添加剤を含んでもよい。
【００２７】
つぎに、本発明は、ＩｇＥの産生抑制方法、ＩＦＮ−γの産生促進方法、脱顆粒抑制方法、アレルギーの抑制方法または免疫調整方法であって、本発明の生理活性物、アレルギー抑制活性剤、免疫調整剤または医薬品を投与する工程を含むことを特徴とする。投与対象としては、特に制限されず、ヒト、ヒトを除くマウス等の哺乳類等があげられる。また、細胞や組織に対して、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与してもよい。
【実施例】
【００２８】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例によってなんら限定されない。
【００２９】
以下のようにして、実施例１および２の生理活性物を調製した。
【００３０】
（実施例１）
ホワイト・ソルガムの外皮粉末２５ｇを、メタノール１００ｍＬに懸濁し、２５℃で１５時間撹拌した後、不溶物を遠心により除去した。回収した可溶性画分から、エバポレーターを用いてメタノールを除去し、メタノール抽出物を得た。前記メタノール抽出物全量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２ｍＬに溶解し、本例の生理活性物を調製した。
【００３１】
（実施例２）
メタノールに代えて、クロロホルムおよびメタノールを２：１の体積比で混合した混合溶媒を使用した以外は、実施例１と同様にして生理活性物を調製した。
【００３２】
調製した実施例１および２の生理活性物を用いて、以下の各種確認実験を行った。
【００３３】
＜ＩｇＥ産生ヒト骨髄腫細胞株のＩｇＥ産生抑制＞
実施例１および２の生理活性物について、ＩｇＥ産生ヒト骨髄腫細胞株のＩｇＥ産生への影響を確認した。まず、下記表に示す組成の培地に、前記生理活性物をそれぞれ添加した。実施例１の前記生理活性物は、前記培地における最終濃度が、０．００００２、０．０００１３、０．０００７７、０．００４６、０．０２８、０．１７および１ｖ／ｖ％となるように添加し、実施例２の前記生理活性物は、前記培地における最終濃度が、０．００００１１、０．００００６４、０．０００３９、０．００２３、０．０１４、０．０８３および０．５ｖ／ｖ％となるように添加した。前記生理活性物を添加した前記培地に懸濁したＩｇＥ産生ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−１９６）を播種して、３７℃で２４時間培養した。細胞は、前記培地１ｍＬあたり、約５×１０４個となるように播種した。培養後、各培養液中に分泌されたＩｇＥ量を酵素抗体法により測定した。なお、前記酵素抗体法において、吸光度の測定波長は、４１５ｎｍとした。また、コントロールとして、前記生理活性物に代えて、ＤＭＳＯのみを添加した培地を用いて、同様に、分泌されたＩｇＥ量の測定を行った。
【００３４】
（培地の組成）
成分                            濃度        
ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）        １７．７ｇ／Ｌ
インスリン                          １０μｇ/ｍＬ
トランスフェリン                    ２０μｇ/ｍＬ
エタノールアミン                    ２０μｍｏｌ／Ｌ
亜セレン酸ナトリウム                ２５ｎｍｏｌ／Ｌ
【００３５】
図１のグラフに、前記ＩｇＥ産生量の測定結果を示す。同図において、横軸は、前記生理活性物の添加濃度であり、縦軸は、ＩｇＥ産生量（ｎｇ／ｍＬ）である。同図において、白丸（○）のプロットは、実施例１の結果を示し、白四角（□）のプロットは、実施例２の結果を示し、白三角（△）のプロットは、前記コントロールの結果を示す。同図に示すように、コントロール（△）と比較して、実施例１（○）および実施例２（□）は、低いＩｇＥ産生量を示したことから、各実施例の生理活性物が、ＩｇＥ産生抑制能を有することが確認できた。特に、メタノールとクロロホルムとの混合溶媒で抽出した実施例２の生理活性物は、メタノールのみで抽出した実施例１の生理活性物よりも低い添加量で、同程度のＩｇＥ産生抑制を実現できた。具体的には、ＩｇＥ産生量を約１０ｎｇ／ｍＬに抑制する際の生理活性物の添加濃度は、実施例１が０．０３ｖ／ｖ％であり、実施例２が、０．０００４ｖ／ｖ％であることから、実施例２の生理活性物は、実施例１の生理活性物の約７５倍以上のＩｇＥ産生抑制活性を有しているといえる。また、このような有機溶媒により抽出できることから、本発明の生理活性物における活性成分は、脂質が関連する非タンパク質物質と考えられる。
【００３６】
以上の結果から、有機溶媒を含有する抽出溶媒で抽出した本発明の生理活性物は、ＩｇＥ産生抑制によるアレルギー抑制活性を有することがわかった。また、特に、メタノール等のアルコールの他にクロロホルムを含む抽出溶媒で抽出した生理活性物は、さらに優れたＩｇＥ産生抑制活性を有し、ひいては、さらに優れたアレルギー抑制活性を有することがわかった。
【００３７】
＜生理活性物の熱安定性＞
実施例２の生理活性物について、加熱処理によるＩｇＥ産生抑制効果への影響を確認した。実施例２の生理活性物を、３７、６０、８０、１００および１２０℃の温度で１５分間加熱処理した。そして、前記基本培地に、実施例２の非加熱の生理活性物または前記加熱処理後の生理活性物を、それぞれ最終濃度が０．００２ｖ／ｖ％となるように添加した。これらの培地を用いたこと以外は、前述と同様にして、培養液中に分泌されたＩｇＥ量を測定した。
【００３８】
図２のグラフに、前記ＩｇＥ産生量の測定結果を示す。同図において、横軸は、前記加熱処理温度（℃）であり、縦軸は、ＩｇＥ産生量（ｎｇ／ｍＬ）である。また、同図において、白丸（○）のプロットは、実施例２の前記加熱処理後の生理活性物の結果を示し、白四角（□）のプロットは、実施例２の前記非加熱の生理活性物の結果を示し、白三角（△）のプロットは、前記コントロールの結果を示す。同図に示すように、実施例２の生理活性物は、加熱処理温度が６０℃以下ではＩｇＥ産生抑制活性が維持され、８０℃および１００℃では前記活性が消失し、１２０℃では前記活性が回復した。
【００３９】
＜血中ＩｇＥの産生抑制＞
実施例２の生理活性物について、マウスの血中ＩｇＥ量への影響を測定した。まず、前記実施例２の生理活性物について、未希釈サンプル（×１）と、ＤＭＳＯで１０倍希釈した１０倍希釈サンプル（×１０）および１００倍希釈した１００倍希釈サンプル（×１００）とを準備した。他方、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、各群３頭となるように、未希釈（×１）群、１０倍希釈（×１０）群、１００倍希釈（×１００）群、コントロール群およびネガティブコントロール群の５群に分けた。未希釈群、１０倍希釈群および１００倍希釈群には、それぞれ、前述のサンプル（×１、×１０および×１００）２５μＬを、毎日経口投与した。経口投与開始から９日目および２３日目、オボアルブミン（ＯＶＡ）を腹腔投与して免疫した。２回目（前記２３日目）の免疫から５日目（経口投与開始から２８日目）に各マウスを解剖し、その血液、脾臓および腸を採取した。そして、前記血液について、血中総ＩｇＥ量、総ＩｇＧ量、総ＩｇＡ量および総ＩｇＭ量を、酵素抗体法により測定した。また、採取した前記脾臓の脾臓重量および脾臓細胞数、ならびに前記腸のパイエル板細胞数および腸間膜リンパ球数を測定した。なお、前記コントロール群は、ＤＭＳＯ２５μＬを投与し、前記ネガティブコントロール群は、生理活性物およびＤＭＳＯのいずれも投与しなかった以外は、同様にして、測定を行った。
【００４０】
図３（Ａ）のグラフに、前記血中総ＩｇＥ量の測定結果を示し、同図（Ｂ）のグラフに、前記血中総ＩｇＧ量の測定結果を示し、同図（Ｃ）のグラフに、前記血中総ＩｇＡ量の測定結果を示し、同図（Ｄ）のグラフに、前記血中総ＩｇＭ量の測定結果を示す。図３の各図において、各バーは、左から順に、前記コントロール群、未希釈（×１）群、１０倍希釈（×１０）群、１００倍希釈（×１００）群、およびネガティブコントロール群の結果である。同図（Ａ）に示すように、前記各サンプル（×１、×１０および×１００）の投与により、血中総ＩｇＥ量は、有意に低下した。これに対して、同図（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、前記各サンプル（×１、×１０および×１００）の投与により、血中総ＩｇＧ量、総ＩｇＡ量および総ＩｇＭ量に、有意な変化はなかった。すなわち、各実施例の生理活性物は、血中の免疫グロブリンのうち、ＩｇＥのみを低減させ、アレルギー抑制活性を有することが示された。また、血中のＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ量が変化しなかったことから、各実施例の生理活性物は、アレルギー以外の免疫応答に影響しないことが示された。
【００４１】
一般に、脾臓、パイエル板および腸間膜リンパ節については、以下のことが知られている。すなわち、これらはそれぞれ免疫組織であり、中でも、パイエル板および腸間膜リンパ節は小腸に存在し、消化管から侵入する微生物等の異物に対する防御を担っている。そして、これらの免疫組織の活性の低下は、例えば、感染症に対する抵抗力の低下を招く。各実施例の生理活性物によれば、前記脾臓重量、脾臓細胞数およびパイエル板細胞数については、投与による影響は観察されず、腸間膜リンパ球数については、投与による有意な増加が確認された。この結果から、各実施例の生理活性物は、アレルギーに関与するＩｇＥ産生を抑制するが、それ以外の免疫応答には抑制的には作用せず、感染症等に対する生体防御能を低下させないことが示唆された。
【００４２】
＜血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生抑制＞
前述と同様にして、前記実施例２の生理活性物の各サンプル（×１、×１０および×１００）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに経口投与し、免疫後の血液を採取した。そして、酵素抗体法により、採取した前記血液の血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、ＩｇＧ量およびＩｇＡ量を測定した。
【００４３】
図４（Ａ）のグラフに、前記血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定結果を示し、同図（Ｂ）のグラフに、前記血中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ量の測定における吸光度の測定結果を示し、同図（Ｃ）のグラフに、前記血中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ量の測定における吸光度の測定結果を示す。図４の各図において、各バーは、左から順に、前記コントロール群、未希釈（×１）群、１０倍希釈（×１０）群および１００倍希釈（×１００）群の結果である。同図（Ａ）に示すように、前記各サンプル（×１、×１０および×１００）の投与により、血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量は減少した。特に、１０倍希釈（×１０）群において、血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量は、有意に低下した。これに対して、同図（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、前記各サンプルの投与により、血中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ量およびＩｇＡ量に、有意な変化はなかった。これらの結果から、各実施例の生理活性物は、ＩｇＥ産生細胞に対して抑制的に働いて、ＩｇＥのみを低減させ、他のクラスの抗体を産生する免疫細胞には影響しないことが示唆された。このため、各実施例の生理活性物は、アレルギー応答特異的な免疫抑制活性を有することが示唆された。
【００４４】
＜ＩＦＮ−γの産生促進＞
前述と同様にして、前記実施例２の生理活性物の各サンプル（×１および×１０）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに経口投与し、免疫後の血液および脾臓を採取した。そして、酵素抗体法により、採取した前記血液の血中ＩＦＮ−γ量、および脾臓リンパ球のＩＦＮ−γ産生量を測定した。
【００４５】
図５（Ａ）のグラフに、前記血中ＩＦＮ−γ量の測定結果を示し、図５（Ｂ）のグラフに、前記脾臓リンパ球のＩＦＮ−γ産生量の測定結果を示す。図５の各図において、各バーは、左から順に、前記コントロール、前記各サンプル（×１および×１０）の投与の結果である。同図（Ａ）のグラフに示すように、前記各サンプル（×１および×１０）の投与により、前記血中ＩＦＮ−γ量は有意に増加した。また、同図（Ｂ）に示すように、前記各サンプル（×１および×１０）の投与により、前記脾臓リンパ球のＩＦＮ−γ産生量は増加した。すなわち、本発明の生理活性物は、Ｔｈ１細胞の機能亢進に作用し、ＩＦＮ−γ産生を促進させることが示された。また、本発明の生理活性物は、前述のようにＩｇＥ産生を抑制し、かつＩＦＮ−γ産生を促進することから、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整可能である。さらに、本発明の生理活性物は、前記Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの調整により、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の体内バランスを細胞性免疫応答優勢に傾けることで、アレルギーを抑制可能である。
【００４６】
＜脱顆粒抑制活性＞
前記実施例２の生理活性物について、β−ヘキソサミニダーゼ活性を指標として、ラット好塩基球ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の脱顆粒への影響を測定した。
【００４７】
（各種溶液の調製）
まず、前記実施例２の生理活性物の各サンプル（×１および×１０）を、それぞれさらに、１倍タイロード緩衝液（１×Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）で２００倍希釈し、２００倍希釈サンプル（×２００）と２０００倍希釈サンプル（×２０００）とを調製した。また、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、前記タイロード緩衝液で２００倍希釈し、コントロール液を調製した。ＤＮＰ−ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を前記タイロード緩衝液で４０００倍に希釈し、抗原液を調製した。Ａｎｔｉ  ＤＮＰ−ＩｇＥ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で１００００倍に希釈し、抗体液を調製した。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を前記タイロード緩衝液で１０００倍に希釈し、界面活性剤液を調製した。ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを、３．３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように１００ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸緩衝液を用いて希釈し、基質液を調製した。
【００４８】
（β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定）
２４穴プレートに、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２．５×１０５細胞／ウェルずつ播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて一晩培養した。培地を吸引除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、各ウェルに前記抗体液を５００μＬずつ添加して、２時間培養した。培養後、前記抗体液を除去し、前記タイロード緩衝液で各ウェルを２回洗浄した。洗浄後、各ウェルに前記各サンプル２．５μＬを添加し、１０分間インキュベートした。さらに、各ウェルに前記抗原液１０μＬを添加して混合し、３０分間インキュベートした。インキュベート後、前記プレートを１０分間氷冷し、培養上清を回収した。前記上清回収後の各ウェルに前記界面活性剤液を添加し、氷冷下で細胞を超音波破砕し、細胞破砕液を回収した。９６穴プレートの各ウェルに、回収した培養上清５０μＬまたは細胞破砕液５０μＬを加え、３７℃で５分間プレインキュベートした。そして、前記基質液を、前記各ウェルに１００μＬずつ添加し、撹拌後、３７℃で２５分間反応させ、つづいて、２ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン緩衝液を、各ウェルに１００μＬずつ添加して、反応を停止させた。各反応液について、測定波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（ｎ＝４）。得られた吸光度を下記式に代入し、β−ヘキソサミニダーゼ放出率（％）を算出した。また、コントロールとして、前記各サンプルに代えて、前記コントロール液を用いた以外は、前述と同様に反応させて、吸光度を測定し（ｎ＝４）、β−ヘキソサミニダーゼ放出率（％）を算出した。ブランクとして、前記抗体液に代えて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、前記各サンプルに代えて、前記タイロード緩衝液を用いた以外は、前述と同様に反応させて、吸光度を測定し（ｎ＝４）、β−ヘキソサミニダーゼ放出率（％）を算出した。
【００４９】
β−ヘキソサミニダーゼ放出率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００
Ａ＝培養上清を含む反応液の吸光度
Ｂ＝細胞破砕液を含む反応液の吸光度
【００５０】
図６に、前記β−ヘキソサミニダーゼ放出率の測定結果（平均）を示す。同図において、各バーは、左から順に、コントロール、サンプル（×２００）およびサンプル（×２０００）を用いた測定結果であり、縦軸は、β−ヘキソサミニダーゼ放出率（％）である。同図に示すように、サンプル（×２００）およびサンプル（×２０００）共に、コントロールと比較して、β−ヘキソサミニダーゼ放出率（％）が抑制された。また、中でも、サンプル（×２０００）は、コントロール（ＤＭＳＯ）に比べて、有意な抑制効果（ｐ＜０．０１）が認められた。このことから、サンプル（×２００）およびサンプル（×２０００）共に、脱顆粒を抑制することが示された。なお、ブランクのβ−ヘキソサミニダーゼ放出率は、１．１％であった（図示せず）。
【００５１】
このように、本発明の生理活性物は、ＩｇＥの産生を抑制し、ＩＦＮ−γの産生を促進し、脱顆粒を抑制可能である。このため、本発明の生理活性物によれば、例えば、前述の、ＩＦＮ−γ産生促進活性、ＩｇＥ産生抑制活性または脱顆粒抑制活性から、アレルギーの発症を効果的に抑制可能であり、免疫調整可能である。
【００５２】
（実施例３）
メタノールに代えて、エタノールを使用した以外は、実施例１と同様にして生理活性物を調製した。
【００５３】
（実施例４）
メタノールに代えて、ヘキサンを使用した以外は、実施例１と同様にして生理活性物を調製した。
【００５４】
（比較例１）
ホワイト・ソルガムの外皮粉末２５ｇを、リン酸緩衝液１００ｍＬに懸濁し、２５℃で１５時間撹拌した後、不溶物を遠心により除去し、リン酸緩衝液抽出物を得た。前記リン酸緩衝液抽出物を本例の生理活性物とした。
【００５５】
調製した実施例１、３、４および比較例１の生理活性物を用いて、前述と同様にして、ＩｇＥ産生ヒト骨髄腫細胞株のＩｇＥ産生抑制の確認実験を行った。実施例１の前記生理活性物（メタノール抽出物）は、前記培地における最終濃度が、１、０．３３、０．１１、０．０４および０．０１ｖ／ｖ％となるように添加し、実施例３の前記生理活性物（エタノール抽出物）は、前記培地における最終濃度が、１、０．３３、０．１１、０．０４および０．０１ｖ／ｖ％となるように添加し、実施例４の前記生理活性物（ヘキサン抽出物）は、前記培地における最終濃度が、５、１．６７、０．５６、０．１９および０．０６ｖ／ｖ％となるように添加し、比較例１の前記生理活性物（緩衝液抽出物）は、前記培地における最終濃度が、２５、８．３３、２．７８、０．９３および０．３１ｖ／ｖ％となるように添加した。
【００５６】
図７のグラフに、前記ＩｇＥ産生量の測定結果を示す。同図において、横軸は、前記生理活性物の添加濃度（ｖ／ｖ％）であり、縦軸は、ＩｇＥ産生量（ｎｇ／ｍＬ）である。同図において、白丸（○）のプロットは、実施例１の結果を示し、白四角（□）のプロットは、実施例３の結果を示し、白菱形（◇）のプロットは、実施例４の結果を示し、黒丸（●）のプロットは、比較例１の結果を示し、白三角（△）のプロットは、コントロールの結果を示す。同図に示すように、比較例１（●）と比較して、実施例１（○）および実施例３（□）および実施例４（◇）は、低いＩｇＥ産生量を示し、各実施例の生理活性物が、リン酸緩衝液による抽出物に比べて、著しく高いＩｇＥ産生抑制能を有することが確認できた。具体的には、ＩｇＥ産生量を約５ｎｇ／ｍＬに抑制する際の生理活性物の添加濃度は、比較例１が、１０ｖ／ｖ％であるのに対し、実施例１が０．４ｖ／ｖ％であり、実施例３が、０．１ｖ／ｖ％であり、実施例４が０．２ｖ／ｖ％であることから、実施例１、３および４の生理活性物は、比較例１の生理活性物の約１０〜１００倍以上のＩｇＥ産生抑制活性を有しているといえる。また、このような有機溶媒により抽出できることから、本発明の生理活性物における活性成分は、脂質が関連する非タンパク質物質と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上のように、本発明の生理活性物によれば、有機溶媒を含む抽出溶媒によるソルガム抽出物を含むことにより、例えば、ＩｇＥの産生抑制活性、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生促進活性、脱顆粒抑制活性、アレルギー抑制活性または免疫調整活性を発揮できる。また、ソルガムは、長年食品として利用されているため、その安全性にも優れる。このため、本発明の生理活性物は、アレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメント、医薬品等に適用でき、免疫疾患の予防や改善に有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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