(57)【要約】【課題】より簡単な構成で、セクショニング分解能を変更できるようにする。【解決手段】光源２２からの照明光が試料１３に照射されると、試料１３からは観察光が発現し、この観察光は、結像光学系５１を通って光検出器５２で検出される。光検出器５２は、観察面１３ｓと略共役な位置に配置されているので、観察面１３ｓ近傍の近傍領域からの観察光と、近傍領域の周辺の周辺領域からの観察光とを個々に検出できる。画像処理部５４は、近傍領域からの観察光の検出結果から近傍画像を生成し、周辺領域からの観察光の検出結果から周辺画像を生成する。パーソナルコンピュータ１２は、近傍画像および周辺画像から、それらの画像とはセクショニング分解能の異なる観察画像を演算処理により生成する。本発明は、共焦点顕微鏡に適用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象の試料の観察面に照明光を集光する照明光学系と、
前記照明光学系に含まれ、前記観察面上で前記照明光を走査させるスキャナと、
前記試料からの観察光を集光する結像光学系と、
前記試料における前記照明光の集光位置と略共役な位置に配置され、前記観察光を検出する光検出手段と、
前記光検出手段による検出結果に基づいて、前記試料における前記集光位置の近傍領域からの前記観察光に基づく第１の画像データと、前記試料における前記近傍領域の周辺領域からの前記観察光に基づく第２の画像データとを生成する画像生成手段と、
前記第１の画像データおよび前記第２の画像データに基づいて、前記第１の画像データおよび前記第２の画像データとはセクショニング分解能が異なる第３の画像データを生成する演算手段と
を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記照明光学系を構成し、前記照明光を、前記照明光の進行方向と垂直な方向に所定の間隔で並ぶ複数の光束に分離する分離手段をさらに備える
ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記光検出手段は、前記光検出手段に設けられた前記観察光の受光面における所定の領域に入射した前記観察光を、前記近傍領域からの前記観察光として検出し、前記受光面における前記所定の領域を囲む領域に入射した前記観察光を、前記周辺領域からの前記観察光として検出する
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、より簡単な構成でセクショニング分解能を変更できるようにした共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、観察対象の試料に照明光を照射し、これにより試料から発現した観察光のうち、その試料と略共役な位置にあるピンホールを通過した光束を光検出器で検出することで、試料の２次元の画像を得る共焦点顕微鏡が知られている。共焦点顕微鏡ではピンホールを設けることで、試料における、照射される照明光の進行方向と略同じ方向に薄い部位の層のみからの観察光だけを検出し、その部位の画像を得ることができる。
【０００３】
特に、観察対象となる試料の厚み方向の観察範囲、より詳細には、試料の厚み方向の観察範囲の調節能力はセクショニング分解能と呼ばれており、試料の厚み方向の観察範囲の厚みが薄いほど、よりセクショニング分解能は高いとされる。例えば共焦点顕微鏡では、ピンホールの開口をより小さくするほど、観察光の検出対象となる試料の厚み方向の観察範囲がより薄くなるので、セクショニング分解能は高くなる。
【０００４】
また、従来の共焦点顕微鏡には、試料からの観察光を開口径の小さなピンホールを通過させると同時に、そのピンホールを通過できなかった観察光を反射して、より大きな開口径のピンホールを通過させることで、セクショニング分解能を変化させるものもある（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
この共焦点顕微鏡では、ピンホールを通過した観察光のそれぞれを光検出器で検出することにより、セクショニング分解能の異なる複数の画像が生成され、さらにそれらの画像を用いた演算処理により、目的とするセクショニング分解能の画像が得られる。したがって、このような共焦点顕微鏡によれば、演算処理により、簡単にセクショニング分解能を変更することができる（例えば、特許文献２等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２７４５９１号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０１０６９７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら上述した技術では、共焦点顕微鏡に、複数のピンホールを有し、観察光を分離する部材や、観察光が通過するピンホールごとに光検出器を設ける必要があるため、共焦点顕微鏡の構成が煩雑になってしまう。
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より簡単な構成で、共焦点顕微鏡のセクショニング分解能を変更できるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の共焦点顕微鏡は、観察対象の試料の観察面に照明光を集光する照明光学系と、前記照明光学系に含まれ、前記観察面上で前記照明光を走査させるスキャナと、前記試料からの観察光を集光する結像光学系と、前記試料における前記照明光の集光位置と略共役な位置に配置され、前記観察光を検出する光検出手段と、前記光検出手段による検出結果に基づいて、前記試料における前記集光位置の近傍領域からの前記観察光に基づく第１の画像データと、前記試料における前記近傍領域の周辺領域からの前記観察光に基づく第２の画像データとを生成する画像生成手段と、前記第１の画像データおよび前記第２の画像データに基づいて、前記第１の画像データおよび前記第２の画像データとはセクショニング分解能が異なる第３の画像データを生成する演算手段とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、より簡単な構成で、セクショニング分解能を変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明を適用した共焦点観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】照明光による走査について説明する図である。
【図３】光検出器の受光面において、試料の各部位からの観察光が入射する領域について説明する図である。
【図４】光検出器の受光面の各領域に入射する、試料の部位からの観察光について説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。
【００１３】
図１は、本発明を適用した共焦点観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。この共焦点観察システムは、共焦点顕微鏡１１およびパーソナルコンピュータ１２から構成され、共焦点観察システムにより試料１３の共焦点観察が行われる。
【００１４】
観察対象の試料１３は、共焦点顕微鏡１１のステージ２１上に載置され、試料１３には、光源２２から出射し、共焦点顕微鏡１１の照明光学系２３により導かれた照明光が照射される。
【００１５】
すなわち、光源２２には光ファイバ３１が接続されており、光源２２から光ファイバ３１に入射した照明光は、光ファイバ３１によりコリメートレンズ３２に導かれる。そして、光ファイバ３１からコリメートレンズ３２に入射した照明光は、コリメートレンズ３２により平行光とされ、さらにシリンドリカルレンズ３３により図中、奥行き方向に収斂されたライン状の光に変換されてマイクロレンズアレイ３４に入射する。
【００１６】
また、マイクロレンズアレイ３４は、図中、縦方向に並べられた複数のレンズからなり、マイクロレンズアレイ３４に入射した照明光は、それらのレンズにより、照明光の進行方向と垂直な方向、つまり図中、縦方向に並ぶ複数の光束に分離される。すなわち、マイクロレンズアレイ３４を構成する各レンズは、入射した照明光を集光してレンズ３５に入射させる。
【００１７】
マイクロレンズアレイ３４により集光された照明光の各光束は、レンズ３５により平行光とされ、ガルバノスキャナ３６、瞳投影レンズ３７、第２対物レンズ３８、ダイクロイックミラー３９、および対物レンズ４０を通って試料１３に照射される。このとき、ガルバノスキャナ３６は、図示せぬミラーを回動させて、試料１３の観察面１３ｓ上で照明光を走査させる。具体的には、図中、奥行き方向および横方向への照明光の走査が行われる。
【００１８】
このように、光源２２からの照明光は、光ファイバ３１乃至対物レンズ４０からなる照明光学系２３により試料１３に導かれて、試料１３の観察面１３ｓに集光される。
【００１９】
また、試料１３に照明光が照射されると、試料１３からは観察光としての蛍光が発現し、この観察光（蛍光）は、結像光学系５１により光検出器５２に導かれる。結像光学系５１は、対物レンズ４０、ダイクロイックミラー３９、および第２対物レンズ５３から構成され、結像光学系５１は照明光学系２３と共通の光学系を有している。
【００２０】
すなわち、試料１３からの観察光は対物レンズ４０を通ってダイクロイックミラー３９に入射し、ダイクロイックミラー３９において反射されて第２対物レンズ５３に入射する。ここで、ダイクロイックミラー３９は、第２対物レンズ３８からの照明光をそのまま透過するとともに、対物レンズ４０からの観察光を反射することで、照明光と観察光とを分離している。
【００２１】
また、ダイクロイックミラー３９からの観察光は、第２対物レンズ５３によって、光検出器５２の図示せぬ受光面上に集光される。光検出器５２の受光面は、試料１３における照明光の集光位置、つまり観察面１３ｓと略共役な位置に配置されている。
【００２２】
光検出器５２は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Devices）などからなり、試料１３からの観察光のうちの、試料１３における照明光の集光位置近傍の近傍領域からの観察光と、試料１３における近傍領域の周辺の周辺領域からの観察光とを検出する。
【００２３】
ここで、近傍領域とは、照明光が集光される観察面１３ｓを含む、試料１３の厚み方向の薄い観察範囲の領域をいう。また、周辺領域は、観察面１３ｓを中心とした試料１３における、近傍領域に図中、上側に隣接する薄い層の領域と、近傍領域に図中、下側に隣接する薄い層の領域とからなる。なお、以下、試料１３における図中、縦方向を、試料１３の厚み方向とも称する。
【００２４】
光検出器５２は、近傍領域からの観察光と周辺領域からの観察光とを、それぞれ受光して光電変換することにより、それらの観察光の検出を行い、光電変換により得られた電気信号を観察光の検出結果として画像処理部５４に供給する。この電気信号の値は、受光された観察光の光量、つまり観察光の輝度を示している。
【００２５】
画像処理部５４は、光検出器５２から供給された電気信号に基づいて、互いにセクショニング分解能の異なる近傍画像データおよび周辺画像データを生成し、パーソナルコンピュータ１２に供給する。
【００２６】
すなわち、画像処理部５４は、近傍領域からの観察光により得られた電気信号に基づいて、試料１３の近傍領域の画像の画像データである近傍画像データを生成する。同様に、画像処理部５４は、周辺領域からの観察光により得られた電気信号に基づいて、試料１３の周辺領域の画像の画像データである周辺画像データを生成する。なお、以下、近傍画像データに基づく画像を近傍画像とも称し、周辺画像データに基づく画像を周辺画像とも称することとする。
【００２７】
パーソナルコンピュータ１２は、画像処理部５４から供給された近傍画像データおよび周辺画像データに基づいて、近傍画像データおよび周辺画像データとは異なるセクショニング分解能の観察画像データを生成し、観察画像データに基づく観察画像を表示する。
【００２８】
観察画像データのセクショニング分解能、つまり観察画像に表示される試料１３の部位は、観察面１３ｓを中心とし、試料１３における近傍領域および周辺領域からなる領域よりも、試料１３の厚み方向に薄い層の領域とされる。また、セクショニング分解能は、パーソナルコンピュータ１２により、適宜、変更される。したがって、観察画像に表示される試料１３の部位の厚み方向の厚さは、近傍領域の厚さよりも薄い場合がある。
【００２９】
ところで、共焦点顕微鏡１１では、マイクロレンズアレイ３４により照明光が複数の光束に分離されるため、試料１３の観察時には、例えば図２に示すように、試料１３の観察面１３ｓ上で照明光としての複数の光束Ｌ１１乃至光束Ｌ１４が走査される。なお、図２は、試料１３の観察面１３ｓを図１中、上側から下側方向に見た図を示している。
【００３０】
図２では、照明光としての光束Ｌ１１乃至光束Ｌ１４が図中、縦方向に所定の間隔で並べられ、観察面１３ｓに集光されている。これらの光束Ｌ１１乃至光束Ｌ１４はガルバノスキャナ３６により、図中、左右方向および上下方向に同時に走査される。これにより、観察面１３ｓの略全ての領域に照明光が照射されることになる。
【００３１】
一方、光検出器５２では、これらの光束Ｌ１１乃至光束Ｌ１４が試料１３に照射されることで試料１３から発現した複数の光束が、観察光として検出されることになる。
【００３２】
例えば、図３に示すように、光束Ｌ１１が試料１３に照射されることで試料１３から発現した光束は、光検出器５２の受光面の領域Ｒ１１および領域Ｒ１２に入射する。また、光束Ｌ１２が試料１３に照射されることで試料１３から発現した光束は、光検出器５２の受光面の領域Ｒ１３および領域Ｒ１４に入射する。なお、図３において、１つの四角形は、光検出器５２の受光面を構成する１つの画素を表している。
【００３３】
より詳細には、光束Ｌ１１が試料１３に照射されることで発現した観察光のうち、近傍領域から発現した成分は、１つの画素からなる領域Ｒ１１に入射する。同様に、光束Ｌ１２が試料１３に照射されることで発現した観察光のうち、近傍領域から発現した成分は、１つの画素からなる領域Ｒ１３に入射する。
【００３４】
また、光束Ｌ１１が試料１３に照射されることで発現した観察光のうち、周辺領域から発現した成分は、領域Ｒ１１を囲む複数の画素からなる領域Ｒ１２に入射する。さらに、光束Ｌ１２が試料１３に照射されることで発現した観察光のうち、周辺領域から発現した成分は、領域Ｒ１３を囲む複数の画素からなる領域Ｒ１４に入射する。
【００３５】
実際には、領域Ｒ１１は、図４の図中、上側に示すように、光束Ｌ１１のフォーカス成分が試料１３に照射されることで、試料１３から発現した観察光が入射する画素、つまり試料１３の近傍領域からの観察光が入射する画素（複数の画素）からなるように予め定められる。
【００３６】
また、領域Ｒ１２は、図４の図中、下側に示すように、光束Ｌ１１のデフォーカス成分が試料１３に照射されることで、試料１３から発現した観察光が入射する画素、つまり試料１３の周辺領域からの観察光が入射する画素（複数の画素）からなるように予め定められる。
【００３７】
なお、図４において、縦軸は試料１３における厚み方向の位置を示しており、横軸は試料１３の各位置から発現する観察光の輝度（光量）を示している。また、位置Ｚ０は観察面１３ｓの位置を示しており、位置Ｚ１から位置Ｚ２までの領域は近傍領域を示している。
【００３８】
図４の上側に示されるように、領域Ｒ１１に入射する観察光は、その殆どが位置Ｚ１から位置Ｚ２までの間、つまり近傍領域から発現した光となる。したがって、領域Ｒ１１を構成する画素で得られた電気信号を用いれば、試料１３の近傍領域における、光束Ｌ１１が照射される部分の情報だけを抽出することができる。
【００３９】
そこで、画像処理部５４は、領域Ｒ１１を構成する画素に入射した光が、光検出器５２により光電変換されて得られた電気信号から、光束Ｌ１１が照射された試料１３の近傍領域が表示される、近傍画像上の画素の画素値を求める。
【００４０】
同様に、画像処理部５４は、領域Ｒ１３を構成する画素に入射した光が、光検出器５２により光電変換されて得られた電気信号から、光束Ｌ１２が照射された試料１３の近傍領域が表示される、近傍画像上の画素の画素値を求める。
【００４１】
このように、画像処理部５４は、近傍領域からの観察光の受光量を示す電気信号を用い、近傍画像上の各画素の画素値を求めることにより、近傍画像データを生成する。
【００４２】
また、図４の下側に示されるように、領域Ｒ１２に入射する観察光は、その殆どが試料１３における、図中、位置Ｚ１よりも上側の領域および位置Ｚ２よりも下側の領域、つまり略周辺領域から発現した光となる。したがって、領域Ｒ１２を構成する画素で得られた電気信号を用いれば、試料１３の周辺領域における、光束Ｌ１１が照射される部分の情報だけを抽出することができる。
【００４３】
そこで、画像処理部５４は、領域Ｒ１２を構成する各画素に入射した光が、光検出器５２により光電変換されて得られた各電気信号から、光束Ｌ１１が照射された試料１３の周辺領域が表示される、周辺画像上の画素の画素値を求める。つまり、領域Ｒ１２を構成する各画素において得られた各電気信号の値の和に基づいて、周辺画像上の１つの画素の画素値が求められる。
【００４４】
同様に、画像処理部５４は、領域Ｒ１４を構成する各画素に入射した光が、光検出器５２により光電変換されて得られた各電気信号から、光束Ｌ１２が照射された試料１３の周辺領域が表示される、周辺画像上の画素の画素値を求める。
【００４５】
このように、画像処理部５４は、周辺領域からの観察光の受光量を示す電気信号を用い、周辺画像上の各画素の画素値を求めることにより、周辺画像データを生成する。
【００４６】
なお、共焦点顕微鏡１１のマイクロレンズアレイ３４は、光検出器５２の受光面の１つの画素に、試料１３からの観察光としての複数の光束が入射しないように、照明光を複数の光束に分離する。例えば、図３において、領域Ｒ１２と領域Ｒ１４とが重ならないように照明光が分離される。
【００４７】
より具体的には、観察光を構成する光束同士の間隔は、少なくとも観察光のエアリディスクの直径ＥＤの１０倍の距離以上とされることが望ましい。例えば、観察光の波長をλとし、第２対物レンズ５３の開口数をＮＡ’とすると、エアリディスクの直径ＥＤは次式（１）により求まる。
【００４８】
ＥＤ＝１．２２×（λ／ＮＡ’）      ・・・（１）
【００４９】
なお、式（１）における第２対物レンズ５３の開口数ＮＡ’は、対物レンズ４０の開口数をＮＡとし、対物レンズ４０の倍率をβとすると次式（２）により求まる。
【００５０】
ＮＡ’＝ＮＡ／β      ・・・（２）
【００５１】
このように、観察光を構成する各光束が一定の間隔で並ぶように、試料１３に照射する照明光を複数の光束に分離すると、光検出器５２において観察光の各光束を確実に検出することができる。
【００５２】
また、パーソナルコンピュータ１２は画像処理部５４で得られた近傍画像データおよび周辺画像データを用いて、目的とする所定のセクショニング分解能の観察画像データを生成する。
【００５３】
具体的には、パーソナルコンピュータ１２は、これから生成しようとする観察画像の画素を、順次、注目画素とする。そして、パーソナルコンピュータ１２は、注目画素と同じ位置にある近傍画像の画素の画素値Ｄａと、注目画素と同じ位置にある周辺画像の画素の画素値Ｄｂとから次式（３）に示す演算を行って、注目画素の画素値Ｄを求める。
【００５４】
Ｄ＝Ｄａ＋（α×Ｄｂ）      ・・・（３）
【００５５】
なお、注目画素と同じ位置にある近傍画像および周辺画像の画素とは、注目画素に表示される試料１３の部位が表示される近傍画像および周辺画像の画素をいう。より詳細には、注目画素と同じ位置にある近傍画像および周辺画像の画素は、厚み方向の位置は異なるが、照明光を構成する１つの光束が照射される試料１３の部位、つまり近傍領域および周辺領域が表示される画素とされる。
【００５６】
また、式（３）において、αはセクショニング分解能を定める変数であり、−１≦α≦１とされる。この変数αが小さいほど、セクショニング分解能は高くなり、観察対象とされる試料１３の部位の厚み方向の厚さがより薄くなる。
【００５７】
例えば、変数αが０である場合には、Ｄ＝Ｄａとなり、観察画像には試料１３の近傍領域の画像が表示される。また、変数αが１である場合には、Ｄ＝Ｄａ＋Ｄｂとなるので、観察画像には試料１３の近傍領域および周辺領域の画像が表示される。
【００５８】
したがって、変数αを０以上、かつ１以下の間で変化させれば、試料１３の厚み方向に、近傍領域の層より厚く、かつ近傍領域および周辺領域からなる領域の層より薄い、任意の厚さの試料１３の層の領域の観察画像を得ることができる。
【００５９】
また、変数αが−１である場合には、Ｄ＝Ｄａ−Ｄｂとなるので、観察画像は、近傍領域の情報を多く含む近傍画像から、周辺領域の情報を多く含む周辺画像を差し引いたものとなる。近傍画像と周辺画像の差分を求める演算は、近傍画像から、周辺領域の情報、つまり近傍画像上でぼけとなって現れる成分を、データのＳ／Ｎ比（Signal to Noise ratio）を保ったまま差し引くことと等価であり、よりセクショニング分解能は高くなる。すなわち、観察画像には、試料１３における近傍領域よりも厚み方向に薄い領域の画像が表示されることになる。
【００６０】
したがって、変数αを−１以上、かつ０以下の間で変化させれば、観察面１３ｓを中心とし、試料１３の厚み方向に近傍領域の層より薄い、任意の厚さの試料１３の層の領域の観察画像を得ることができる。
【００６１】
このように、目的とするセクショニング分解能に応じて変数αを変化させながら観察画像を生成すれば、近傍画像および周辺画像を用いた演算処理を行うだけで、簡単に任意のセクショニング分解能の観察画像を得ることができる。
【００６２】
つまり、光検出器５２を観察面１３ｓと略共役な位置に配置し、変数αを変化させて観察画像を生成することは、試料１３と光検出器５２との間の、観察面１３ｓと略共役な位置に設けられた仮想的なピンホールを変化させて試料１３を観察することと等価である。
【００６３】
なお、変数αの値によっては、注目画素の画素値Ｄが負の値となったり、観察画像のダイナミックレンジを超えた値となったりすることがある。そのような場合、パーソナルコンピュータ１２は、適宜、画素値Ｄを０としたり、ダイナミックレンジを超えない所定の値としたりして、注目画素の画素値を定める。
【００６４】
以上のように、共焦点顕微鏡１１によれば、光検出器５２を観察面１３ｓと略共役な位置に配置し、観察光の検出結果から近傍画像データおよび周辺画像データを生成することにより、簡単な演算処理で、試料１３の任意の厚さの領域を観察することができる。
【００６５】
すなわち、光検出器５２の受光面を観察面１３ｓと略共役な位置に配置すれば、その受光面の予め定められた特定の画素から出力される電気信号から、近傍画像データおよび周辺画像データを個々に得ることができる。これにより、得られた画像データから、簡単な演算処理で試料１３の任意の厚さの領域の観察画像を生成することができる。
【００６６】
したがって、共焦点顕微鏡１１には、複数のピンホールにより観察光を分離する部材や、観察光が通過するピンホールごとの光検出器を設ける必要がなく、より簡単な構成で、試料１３の観察時のセクショニング分解能を変更することができる。
【００６７】
しかも、共焦点顕微鏡１１では、照明光を複数の光束に分離して、それらの光束により観察面１３ｓの走査を行うため、試料１３の複数の部位の情報を同時に得ることができる。従来、共焦点顕微鏡では、照明光としての１つの光束により、いわゆるラスタスキャンと呼ばれる方法で走査を行っていたが、共焦点顕微鏡１１では複数の光束で同時に走査を行うため、ラスタスキャンを行う場合よりも、より迅速に観察画像を得ることができる。
【００６８】
また、照明光の分離時には、複数の光束が一定の間隔で並ぶように照明光が分離されるため、光検出器５２において、試料１３の複数の部位からの観察光が同じ画素に入射してしまうようなこともなく、各部位の情報を確実に抽出することができる。
【００６９】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００７０】
１１  共焦点顕微鏡，  １２  パーソナルコンピュータ，  １３  試料，  ２３  照明光学系，  ３４  マイクロレンズアレイ，  ３６  ガルバノスキャナ，  ３９  ダイクロイックミラー，  ４０  対物レンズ，  ５１  結像光学系，  ５２  光検出器，  ５３  第２対物レンズ，  ５４  画像処理部
【図１】
2010160371.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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