(57)【要約】      （修正有）【課題】外因性タンパク質を組織特異的に発現するトランスジェニックトリ、及び該タンパク質発現を可能にする導入遺伝子の提供。【解決手段】外因性タンパク質を管状腺細胞において選択的に発現するトランスジェニックニワトリであって、該タンパク質が、該ニワトリのゲノム中に安定に組み込まれた導入遺伝子によってコードされ、該導入遺伝子が、該外因性タンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結されている、卵白タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの少なくとも一部分を含む、トランスジェニックニワトリ。【選択図】図１０Ａ
2010158245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、トランスジェニック動物およびキメラ動物におけるタンパク質発現の分野、ならびに胚性幹細胞の遺伝子操作、トランスジェニックおよび長期培養のような、可能にする技術に関する。胚性幹細胞は、外因性タンパク質の組織特異的発現を生じる導入遺伝子の挿入によることを含め、遺伝子改変をトリに導入するために特別に設計された遺伝子構築物を用いて操作される。本発明のトランスジェニックトリは、導入遺伝子によって駆動される外因性タンパク質を卵管中に発現し、そしてこのタンパク質は、卵中に多量に蓄積される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子操作された動物は、このような動物の細胞からの有益な薬学的製品の産生における途方もなく大きな前進の可能性を提供する。しかし、遺伝子操作された動物の産生は、いくつかの種についてしか克服されていない有意な技術的ハードルを含む。ある種の永続的ＤＮＡに遺伝子改変を取り込む能力は、遺伝子操作される各々の種について開発されねばならない、いくつかの別個の技術を必要とする。動物の遺伝的特徴および物理的特徴を変更する１つのアプローチは、動物の胚形態に注入した場合に動物の表現型に寄与する胚性幹細胞を使用することである。胚性幹細胞は、レシピエント胚から生まれた動物の組織に寄与し、交配したキメラによって作製されたトランスジェニック生物のゲノムに寄与する能力を有する。
【０００３】
時間および資源の多大な消費が、胚性幹細胞株、細胞のゲノムの操作、ならびにこのような操作された細胞を培養において維持することを可能にする細胞培養技術の研究および開発に捧げられた。多くの試みがなされたが、操作された胚性幹細胞の多能性を培養において維持する能力は、ほんのいくつかの種（特に、マウス）においてしか達成されていない。他の種については、タンパク質産生のためのトランスジェニックにおける遺伝子操作の見込みは、維持可能な長期の胚性幹細胞培養物がないことにより挫折した。
【０００４】
胚性幹細胞の維持可能な培養物が容易に利用可能であって、多能性を維持しながらも遺伝子操作が可能な場合、新たな技術の広範な適用が利用可能である。胚性幹細胞は、動物の永続的なＤＮＡに寄与するので、胚性幹細胞が由来する動物の生理学的特徴は、これらの細胞を胚状態のレシピエント動物中に組み込むことにより、レシピエント胚に移入され得る。このことは、以下の２つの主な利点を提供する：第１に、胚性幹細胞が由来する動物の表現型が、レシピエント胚に選択的に移入され得る。第２に、上記の通り、胚性幹細胞培養物が特に安定である場合、この細胞のゲノムは、これらの細胞が導入されるレシピエント胚中に遺伝的改変を導入するように遺伝的に改変され得る。
【０００５】
特定の場合には、これらの胚性幹細胞は、外因性タンパク質をコードする導入遺伝子を用いて操作され得る。この導入遺伝子は、有益なタンパク質の産生についての青写真として作用するＤＮＡを含み、そしてレシピエント胚へのこの幹細胞の挿入から作製される動物の組織中でのこのタンパク質の発現を可能にするに充分なコードエレメントおよび調節エレメントを含む、遺伝子構築物である。多くの場合、タンパク質の発現は、特に有益である。なぜなら、このタンパク質が、トランスジェニック動物から収集および単離され得るからである。しかし、動物の組織からの有益なタンパク質の収集は、代表的に、発現されたタンパク質の収集を容易にする特定の特異的組織に発現が制限されることを必要とする。例えば、ウシでは、乳汁中でのタンパク質の発現は、容易な収集を可能にする。乳汁中のタンパク質の発現は、ウシの乳汁を単純に収集して外因性タンパク質を分離することによる、このタンパク質の容易な収集を可能にする。ニワトリでは、卵の卵白におけるタンパク質の頑強な産生はまた、外因性タンパク質の発現のための魅力的なビヒクルを提供する。有益なタンパク質の発現がこのような様式で達成され得る場合、この動物は、他の産生方法よりも優れたタンパク質産生のためのビヒクルとして用いられ得る。従って、１つの特に魅力的な研究分野および魅力的な商業的開発分野は、選択された外因性タンパク質を、このタンパク質の単離および収集を促進する特定の組織において発現する、遺伝子操作された動物である。外因性タンパク質を、動物のうちの特に選択された細胞において産生する能力もまた、特に有益である。なぜなら、組織特異性が単に存在しないことは、この動物の全ての組織においてこのタンパク質が発現されることをもたらすからである。このような環境においては、意味ある量のこのタンパク質が、この動物から分離され得ることはありそうになく、さらに、外因性タンパク質の遍在発現は、通常、動物の全般的健康状態および健康を非常に損なうからである。
【０００６】
胚性幹細胞培養物が、導入遺伝子が胚性幹細胞のゲノムに組み込まれるのを可能にするに充分に安定であるならば、タンパク質の組織特異的発現をコードする導入遺伝子は、導入遺伝子として用いられる特定の構築物に依存したいくつかの異なる技術によって、新たなキメラ生物またはトランスジェニック生物に受け継がれ得る。ゲノム全体は、細胞ハイブリダイゼーションによって、インタクトな染色体はマイクロセルによって、染色体未満のセグメントは染色体媒介遺伝子移入によって、そしてキロベースの範囲のＤＮＡフラグメントはＤＮＡ媒介遺伝子移入によって、移入され得る（Ｋｌｏｂｕｔｃｈｅｒ，Ｌ．Ａ．およびＦ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０：５３３−５５４，１９８１）。インタクトな染色体は、マイクロセル媒介染色体移入（ＭＭＣＴ）（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｒ．Ｅ．およびＦ．Ｈ．Ｐｕｄｄｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４：３１９−３２３，１９７７）によって胚性幹細胞に移入され得る。導入遺伝子の特定の設計もまた、外因性タンパク質をコードするＤＮＡ配列の内容、発現が標的化される特定の組織、発現が生じる宿主生物、および発現されるべきタンパク質の性質を考慮しなければならないからである。インビボで通常発現されるタンパク質は、それらのサイズ、生化学的特徴、および機能が劇的に変化するので、組織特異的発現について設計された導入遺伝子は、胚性幹細胞のゲノムへの成功裏の組み込みを可能にして、宿主生物の選択された組織における成功裏の発現を確実にするいくつかのパラメーターを満たさねばならない。
【０００７】
上記の通り、胚性幹細胞における遺伝的改変が、トランスジェニック動物を作製する性能は、非常にわずかな種についてのみ実証されている。マウスについては、キメラ子孫およびトランスジェニック子孫の作製に関する、相同組換えの別個の使用、続いて胚性幹（ＥＳ）細胞への染色体移入が周知である。部位特異的相同組換えまたは遺伝子標的化の強力な技術が開発されている（Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＭ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２，１９８７を参照のこと；Ｗａｌｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２：４９−６４，１９９２によって概説される）。クローニングされたＤＮＡの挿入（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４：７６１−７６３，１９９４）、およびＣｒｅ−ｌｏｘＰシステム技術による染色体フラグメントの操作および選択（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｊ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９：３７６−３８５，１９９５；Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ，Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：７２０−７２４，１９９５；米国特許第４，９５９，３１７号；同第６，１３０，３６４号；同第６，０９１，００１号；同第５，９８５，６１４号を参照のこと）は、安定な遺伝子キメラを作製するために、マウスＥＳ細胞内への遺伝子の操作および移入のために利用可能である。哺乳動物システムにおいて有用であると証明された多くのこのような技術は、必要な細胞培養物が入手可能であって、外因性タンパク質の単離および収集を促進する特定の組織での組織特異的発現を生じる導入遺伝子が設計され得るならば、非哺乳動物胚性幹細胞に適用されるべく利用可能である。
【０００８】
組織特異的発現を可能にする導入遺伝子は複雑であり、そして導入遺伝子を胚性細胞株中に組み込むために必要な遺伝子操作は、胚性幹細胞の大規模の操作を必要とし、培養条件が遺伝子導入について最適化されなければ、幹細胞の多能性を脅かし得る。従って、導入遺伝子における使用に適切な胚性幹細胞株は、培養において安定でなければならず、かつ、多能性を維持しなければならない。ＥＳ細胞が、タンパク質発現に必要なエレメントの全てを含むに充分に大きくかつ複雑である遺伝子構築物でトランスフェクトされた場合に、さらに、この遺伝子構築物は、ＥＳ細胞中で発現されて、成功裏に形質転換された細胞の選択を可能にしなければならず、そしてＥＳ細胞は、潜在能力を維持しなければならず、そしてこの導入遺伝子は、レシピエント胚中への注入および得られる動物の形成の間、生存可能なままでなければならない。得られる動物では、この導入遺伝子は、導入遺伝子が発現されるように設計された特異的な個々の組織型において効果的に発現されなければならず、そして動物の生存率を損なうので、他の組織においては発現されるべきではない。例えば、免疫系のリンパ様エレメント由来のＤＮＡをコードする導入遺伝子は、キメラ動物またはトランスジェニック動物のＢリンパ球において発現されるように特異的に標的化され得る。特に、有益なタンパク質の発現については、この導入遺伝子は、卵管においてタンパク質を発現するように設計され得、その結果、得られるタンパク質は、卵白中に蓄積される。トリ種においては、卵管の細胞型における外因性タンパク質の組織特異的発現は、タンパク質産生のための有益な生物学的系をもたらす。
【０００９】
外因性タンパク質の産生については、トリの生物学的系は、効率的な農場養殖、迅速な成長、および経済的生産を含め、多くの利点を提供する。全世界的に、ニワトリおよび七面鳥は、ヒトの食事における主なタンパク質供給源である。さらに、トリの卵は、いくつかのタンパク質の大量合成、ならびにタンパク質産物の単離および収集の容易さの両方について、理想的な生物学的設計を提供する。しかし、トリ種への哺乳動物全体のトランスジェニック技術の適用は、失敗した。最も顕著なことには、トリ胚性癌細胞中に導入されて組織特異性を伴って発現された外因性タンパク質をコードする遺伝的改変の成熟した生存動物への伝達が、実証されていない。
【００１０】
多くの場合、胚性幹細胞に遺伝的改変を導入するために必要な技術、遺伝的構築物が導入された特定の細胞改変を選択するための改変された胚性幹細胞のスクリーニングは、胚内への注入のためにＥＳ細胞を操作してトランスジェニックニワトリを作製する能力は、これらの工程の全てを実施するために少なくとも数週間を必要とする。遺伝子導入において有用な胚性幹細胞については、胚内への注入までの期間全体について、多能性状態が保持されなければならず、そしてＥＳ細胞は、得られる動物において外因性タンパク質の有意義な量を発現するために必要な程度まで、レシピエント胚内に組み込まれなければならない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、外因性タンパク質の非特異的発現および組織特異的発現を示す、トランスジェニックトリおよびキメラトリ、外因性タンパク質発現を可能にする導入遺伝子構築物、外因性タンパク質の単離された組成物、ならびに関連する方法を包含する。本発明は、長期胚性幹細胞培養物由来のキメラトリおよびトランスジェニックトリを作製するために、長期のトリＥＳ細胞培養物および特異的技術を用い、ここで、ＥＳ細胞のゲノムは、外因性タンパク質を発現する、安定に組み込まれた導入遺伝子を有し、その結果、このＥＳ細胞の子孫は、この導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子構築物は、ＥＳ細胞のＤＮＡを改変して、外因性タンパク質の組織特異的発現を促進する。以下に記載の手順により、宿主トリ胚と組み合わされた場合、これらの改変されたＥＳ細胞は、この導入遺伝子を、得られる動物の特異的に選択された体細胞組織中に組み込んでいるキメラトリを産生する。これらのキメラトリまたはトランスジェニックトリは、ＥＳ細胞由来の表現型を示し、そして全ての組織にまたがって、または選択された組織において、外来タンパク質を発現する。好ましくは、特異的発現パターンは、他の組織を実質的に除いて、発現をある組織または組織型に焦点を合わせて、このタンパク質の濃縮および収集を容易にする。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
外因性タンパク質を管状腺細胞において選択的に発現するトランスジェニックニワトリであって、該タンパク質が、該ニワトリのゲノム中に安定に組み込まれた導入遺伝子導入遺伝子によってコードされ、該導入遺伝子が、該外因性タンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結されている、卵白タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの少なくとも一部分を含む、トランスジェニックニワトリ。
（項目２）
前記外因性タンパク質をコードするＤＮＡの３’末端に隣接する、卵白タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの少なくとも第２の部分をさらに含む、項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目３）
前記外因性タンパク質が、モノクローナル抗体である、項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目４）
前記モノクローナル抗体が、ヒト重鎖を含む、項目３に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目５）
前記モノクローナル抗体が、アイソタイプＩｇＧである、項目４に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目６）
前記卵白タンパク質が、オボアルブミンである、項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目７）
前記卵白タンパク質が、オボトランスフェリン、オボムコイド、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、オボインヒビター、シスタチン、オボ糖タンパク質、オボフラボタンパク質、オボマクログロブリン、およびアビジンからなる群より選択される、項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目８）
前記導入遺伝子のサイズが、１５ｋｂよりも大きい、項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目９）
卵白中にヒトタンパク質を含むニワトリ卵であって、該ヒトタンパク質が、トランスジェニックニワトリのゲノムに安定に組み込まれた導入遺伝子によってコードされる、ニワトリ卵。
（項目１０）
前記ヒトタンパク質が、モノクローナル抗体である、項目９に記載の卵。
本発明はまた、多量の外来ＤＮＡを組み込むように遺伝子改変されて、レシピエント胚の体細胞組織および生殖系列に寄与する、ニワトリ胚性幹細胞の長期培養物を含む組成物を包含する。本発明はまた、卵管組織中に外因性タンパク質を発現し、その結果、外因性タンパク質が、卵白中に濃縮される、トランスジェニックニワトリを包含する。１つの好ましい実施形態では、この外因性タンパク質は、胚性幹細胞および子孫のゲノム中に組み込まれた導入遺伝子構築物によってコードされるモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体配列は、卵管における発現のために特異的に構築されて、組織特異的発現を促進する適切なプロモーターおよび調節配列を含む、導入遺伝子内に含まれる。外因性タンパク質を発現するトランスジェニックトリまたはキメラトリの実施形態では、本発明は、この動物およびタンパク質（例えば、卵白、外因性タンパク質を含むアルブミン）に特異的な組成物を含む。これらの実施形態の全てについて、本発明のこの構築物、動物および外因性タンパク質を用いる方法もまた含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ニワトリＥＳ細胞の特徴的な形態を示し、ここで、小さな細胞は、細胞質がほとんどなくおよび顕著な核小体を伴って、単層で増殖する。
【図２】図２は、ニワトリＥＳ細胞のインビトロでの特性、特に、抗体ＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１との反応、ならびにアルカリホスファターゼの発現を示す。
【図３】図３は、１８９日間培養されたニワトリＥＳ細胞の核型である。これらの細胞は二倍体であり、３８対の常染色体及び一対のＺ染色体を保有する。
【図４】図４は、２つのＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋヒヨコ、およびＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ  ＥＳ細胞を白色レグホンレシピエント胚に注入することによって形成された２つのキメラである。これらのキメラおよびＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋｓは区別ができず、このことは、メラノサイト系列へのＥＳ細胞の寄与が大規模であることを示す。
【図５】図５は、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ  ＥＳ細胞を白色レグホンレシピエントへと注入することにより作製されたキメラである。左のパネルにおける一対のキメラは、メラノサイト系列に対する、より小さな寄与を示し、一方、左のパネルにおける対は、より大規模の寄与を示す。
【図６】図６は、ＥＳ細胞のトランスフェクションに用いられるｐＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ  プラスミド構築物の図である。
【図７】図７は、ｐＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ  構築物でトランスフェクトされ、ピューロマイシンの存在下で増殖させたニワトリＥＳ細胞を示す。上のパネルは、蛍光を示すために写真撮影される；下のパネルは、位相差顕微鏡法によって観察された同じ視野である。
【図８】図８は、トランスフェクトされていないニワトリＥＳ細胞（上のパネル）、およびｐＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ構築物でトランスフェクトされてピューロマイシンの存在下で増殖させたニワトリＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析である。この分析は、トランスフェクトされた細胞の実質的に全てが、導入遺伝子を発現することを示す。
【図９】図９は、ｐＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ構築物でトランスフェクトされたＥＳ細胞のサザン分析である。ＢａｍＨ１、ＥｃｏＲ１およびこの２つのエンドヌクレアーゼの組み合わせによって消化されたＤＮＡの組み合わせにおけるプローブ位置の相違は、この導入遺伝子が、細胞株ＴＢ０１およびＴＢ０９において異なる位置でゲノム中に組み込まれたことを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、ニワトリの卵管の管状腺細胞における組織特異的発現および組織特異的発現を確認する生理学的証拠を提供する導入遺伝子構築物である。図１０Ａは、Ｏｖ７．５ＭＡｂｄｎｓと称される導入遺伝子の図である（上のパネル）；（Ｂ）モノクローナル抗体についてのコードＤＮＡと組み合わされた、宿主オボアルブミンプロモーター由来のＤＮＡ配列を含む、組織特異的発現の導入遺伝子の、図表による提示。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、ニワトリの卵管の管状腺細胞における組織特異的発現および組織特異的発現を確認する生理学的証拠を提供する導入遺伝子構築物である。図１０Ｂは、他の細胞型以外の管状腺細胞において選択的な、モノクローナル抗体の発現を示す、組織特異的発現の導入遺伝子を含むキメラニワトリの膨大部の切片である。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、ニワトリの卵管の管状腺細胞における組織特異的発現および組織特異的発現を確認する生理学的証拠を提供する導入遺伝子構築物である。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、キメラの脳組織、腸組織、膵臓組織および筋肉組織を除いて、卵管におけるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の両方の発現を示す、ＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、ニワトリの卵管の管状腺細胞における組織特異的発現および組織特異的発現を確認する生理学的証拠を提供する導入遺伝子構築物である。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、キメラの脳組織、腸組織、膵臓組織および筋肉組織を除いて、卵管におけるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の両方の発現を示す、ＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【図１１】図１１は、ＢＡＣ−ＡでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞のゲノムＰＣＲ分析である。
【図１２】図１２は、ＣＸ／ＧＦＰ／ＰｕｒｏでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞を用いて作製されたキメラのサザン分析である。
【図１３】図１３は、ＣＸ／ＧＦＰ／ＰｕｒｏでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞を用いて作製されたキメラニワトリの、蛍光下での写真（左パネル）および白色光下での写真（右パネル）である。緑色蛍光は、眼およびくちばしにおいて観察され得、このトランスフェクトされたＥＳ細胞が、これらの組織に寄与したことを確認する。
【図１４】図１４は、ＣＸ／ＧＦＰ／ＰｕｒｏでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞を用いて作製されたキメラニワトリの、蛍光下での写真である。口腔前庭、脚部および足における緑色蛍光は、トランスフェクトされたＥＳ細胞が、これらの組織に寄与したことを確認する。
【図１５】図１５は、ＣＸ／ＧＦＰ／ＰｕｒｏでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞を用いて作製されたキメラニワトリの、蛍光下での写真（左パネル）および白色光下での写真（左パネル）である。出現する始原翼羽毛の骨および羽毛髄質中の細胞における緑色蛍光が観察され得、トランスフェクトされたＥＳ細胞が、これらの組織に寄与したことを確認する。
【図１６】図１６は、ＣＸ／ＧＦＰ／ＰｕｒｏでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞を用いて作製されたキメラニワトリの、蛍光下での写真（左パネル）および白色光下での写真（左パネル）である。緑色蛍光は、腸組織および胸部筋肉において観察され得、トランスフェクトされたＥＳ細胞が、これらの組織に寄与したことを確認する。
【図１７】図１７は、ＣＸ／ＧＦＰ／ＰｕｒｏでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞を用いて作製されたキメラニワトリの、蛍光下での写真（左パネル）および白色光下での写真（左パネル）である。緑色蛍光は、脚部筋肉において観察され得、トランスフェクトされたＥＳ細胞がこれらの組織に寄与し得ることを確認する。
【図１８】図１８は、ＣＸ／ＧＦＰ／ＰｕｒｏでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞を用いて作製されたキメラニワトリの、蛍光下での写真（左パネル）および白色光下での写真（左パネル）である。緑色蛍光は、膵臓において観察され得、ＥＳ細胞がこの組織に寄与したことを確認する。
【図１９】図１９は、皮膚およびとさかの組織における蛍光レベルをスコア付けすることにより導かれるキメラ現象の評価と、孵化時のヒヨコの黒色色素沈着の程度をスコア付けすることによって導かれるキメラ現象の評価との間の相関を示す。
【図２０】図２０は、ＣＸ／ＧＦＰ／ＰｕｒｏでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞を用いて作製されたキメラ胚の尿膜の、蛍光下での写真（左パネル）および白色光下での写真（左パネル）である。緑色蛍光は、尿膜において観察され得、ＥＳ細胞がこの組織に寄与したことを確認する。
【図２１】図２１は、トランスフェクトされていない細胞を用いて作製されたキメラ（コントロール）、ＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏでトランスフェクトされ、羽毛色素沈着によって５％を超えるドナー由来細胞を含むと評価されたＥＳ細胞を用いて作製されたキメラ、ＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏでトランスフェクトされ、羽毛色素沈着によって５％を超えて１０％未満のドナー由来細胞を含むと評価されたＥＳ細胞を用いて作製されたキメラ、ＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏでトランスフェクトされ、羽毛色素沈着によって１０％を超えて３０％未満のドナー由来細胞を含むと評価されたＥＳ細胞を用いて作製されたキメラ、ＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏでトランスフェクトされ、羽毛色素沈着によって３０％を超えて７５％未満のドナー由来細胞を含むと評価されたＥＳ細胞を用いて作製されたキメラ、ＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏでトランスフェクトされ、羽毛色素沈着によって７５％を超えてドナー由来細胞を含むと評価されたＥＳ細胞を用いて作製されたキメラ、からのＦＡＣＳデータ、からのＦＡＣＳデータのまとめである。肝臓、脳および筋肉からの細胞を、本文において記載の通りに調製した。自己蛍光の閾値よりも上で検出された蛍光細胞の平均数を左に示す；Ｍ２閾値（これは、自己蛍光閾値よりも１桁高い）よりも上で検出された蛍光細胞の平均数を、右のパネルに示す。
【図２２】図２２は、トランスフェクトされていないＥＳ細胞を用いて作製されたキメラ（上のパネル）およびＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏでトランスフェクトされた細胞を用いて作製されたキメラ（下のパネル）の脳から調製された細胞のＦＡＣＳ分析の例である。トランスフェクトされた細胞を用いて作製された胚由来の実質的に全ての細胞は、コントロールトリ由来の細胞の蛍光よりも高いレベルの蛍光を提示し、このことは、キメラの脳組織に対するドナーＥＳ細胞の寄与が大規模であることを示す。
【図２３】図２３は、ＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏでトランスフェクトされた細胞を用いて作製されたキメラ（下のパネル）の脚部の筋肉から調製された細胞のＦＡＣＳ分析の例である。このキメラの右足は、裸眼で緑色であった。このことは、この組織に対する実質的寄与を示す。蛍光脚部筋肉からの細胞の調製物は、蛍光を発する細胞を主に含むことがＦＡＣＳ分析により示された（下のパネル）。このキメラの左脚部は、色は正常であり、これらの細胞の調製物は、蛍光を発しない細胞を含むことがＦＡＣＳ分析により示された。これらのデータは、同じ動物内での組織のキメラ現象が、ドナーＥＳ細胞による異なる寄与を受け得ることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明に従って、ニワトリＥＳ細胞株は、大きな核を含み、顕著な核小体を含む、Ｘ期胚（図１）から誘導される。これらの細胞は、長期の培養後の形態学により、ニワトリ胚性幹（ｃＥＳ）細胞であること、およびレシピエント胚中に注入された場合にキメラを生じることが確認されている。さらに、このＥＳ細胞は、大量の羽毛キメラ現象によって決定したところ、体細胞組織への高度の寄与を可能にする。なおさらに、これらの胚性幹細胞は、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを保有する導入遺伝子でトランスフェクトされることが実証されている。このＥＳ細胞は、この導入遺伝子を安定に組み込み、そしてこの導入遺伝子を発現して、形質転換細胞の選択を可能にする。これらの形質転換細胞は、キメラを形成し得、ここで、この導入遺伝子によってコードされる外因性タンパク質は、キメラのうちの選択された組織中に存在する。このキメラ由来の細胞は、この導入遺伝子によってコードされる外因性タンパク質を発現する。特に好ましい実施形態では、この導入遺伝子によってコードされる外因性タンパク質は、この導入遺伝子によってコードされるタンパク質に従って、特定の組織または組織型において発現される。胚性幹細胞の子孫は、レシピエント胚へのＥＳ細胞の導入およびキメラの形成後、非ＥＳ細胞表現型へと分化する、ＥＳ細胞誘導体である。トランスジェニックニワトリは、トランスジェニックＥＳ細胞由来細胞が生殖系列中に組み込まれた場合、ゲノム中に安定に組み込まれた導入遺伝子を保有するニワトリＥＳ細胞から作製されたキメラの子孫である。
【００１４】
体細胞組織における導入遺伝子の広範な発現は、胚体外組織および体細胞組織における発現によって実証される。トランスジェニック動物の卵のタンパク質内容物の分析は、導入遺伝子から得られ、かつ本発明の技術を用いた、導入遺伝子によってコードされる外因性タンパク質の卵白における選択的発現を実証する。組織特異的発現は、１つの器官、組織または細胞型に実質的に制限される発現によって実証される。
【実施例】
【００１５】
（実施例１−ニワトリ胚性幹細胞（ｃＥＳ細胞）の誘導）
ニワトリＥＳ細胞を、２つの交配のうちの１つから誘導した：Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ×Ｂａｒｒｅｄ  ＲｏｃｋまたはＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ×Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｒｅｄ。これらの交配物を、ｃＥＳ細胞の開発可能性を試験する場合の羽毛マーカーを得るように選択した。このｃＥＳ細胞を、白色レグホン胚（これは、優性の白色遺伝子座においてホモ接合性優性である）中に注入する。これらのＥＳ細胞の注入から得たキメラニワトリは、ｃＥＳ細胞由来の黒色の羽毛およびレシピエント胚由来の白色の羽毛を提示する。
【００１６】
ｃＥＳ細胞培養物の最初の確立を、米国特許第５，５６５，４７９号に記載のプロトコルに従って開始した。Ｘ期に、この胚は、約４０，０００〜６０，０００個の細胞からなり、卵黄の表面に位置する、小さな丸い盤である。この胚を回収するために、紙のリングを卵黄の膜上に置き、胚を真ん中に露出させる。卵黄膜をこのリングの周囲で切断し、次いでこれを卵黄から持ち上げる。リングの腹側に結合した胚は、顕微鏡下に配置され、そして透明な領域が細い輪を用いて不透明領域から単離される。
【００１７】
【表１】
2010158245.tif 000003
胚を、単細胞懸濁物へと機械的に分散させ、有糸分裂が不活化されたＳＴＯ細胞のコンフルエントなフィーダー層上に３×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種する。ｃＥＳ培養培地は、１０％  ＦＣＳ、１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ；２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルベート、１×ヌクレオシド（複数）、１×非必須アミノ酸および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールが補充されたＤＭＥＭ（２０％新鮮培地および８０％馴化培地）からなる。使用前に、ＤＭＥＭ培地は、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ（ＢＲＬ）細胞において馴化される。手短に述べると、ＢＲＬ細胞がコンフルエンシーになるまで増殖したあと、５％血清を含むＤＭＥＭを添加し、そして３日間馴化する。この培地を除去し、そして新たな培地バッチを３日間馴化し、そしてこれを繰り返す。３つのバッチを合わせ、そしてこれを用いてｃＥＳ培地を作製する。ニワトリＥＳ細胞は、胚盤葉細胞の播種後３〜７日後に可視になる。これらのｃＥＳ細胞は、ｍＥＳ細胞に形態学的に類似であった；これらの細胞は、大きな核および顕著な核小体を有して小さかった（図１を参照のこと）。
【００１８】
ｃＥＳ細胞の増殖特徴は、ｍＥＳ細胞とは異なる。ｍＥＳ細胞は、平滑な縁部を有する堅い丸いコロニーで増殖し、個々の細胞を区別することが困難である。ニワトリＥＳ細胞は、明確に可視の個々の細胞を有する単一層コロニーにおいて増殖した。堅いコロニーはしばしば、ｃＥＳ培養における分化の最初の徴候である。
【００１９】
培養において誘導された細胞の多能性マーカーについて試験するために、これらの細胞を固定し、そしてＳＳＥＡ−１  １（Ｓｏｌｔｅｒ，Ｄ．およびＢ．Ｂ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：５５６５−５５６９，１９７８）、ＥＭＡ−１（これは、マウスおよびニワトリにおける始原生殖細胞上のエピトープを認識する）（Ｈａｈｎｅｌ，Ａ．Ｃ．およびＥ．Ｍ．Ｅｄｄｙ，Ｇａｍｅｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：２５−３４，１９８６）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（これもまた、多能性細胞によって発現される）で染色した。これらの試験の結果（これを図２に示す）は、ニワトリＥＳ細胞が、アルカリホスファターゼを発現し、そして抗原がＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１によって認識されることを実証する。
【００２０】
ｃＥＳ細胞は上記のプロトコルを用いた後に可視であるが、このような培養物は、数週間よりも長く維持できない。培養条件におけるいくつかの改変を、以下で議論の通りに開始し、このことにより、１９の細胞株誘導物（表１）がもたらされ、これらのうちの１４個を、レシピエント胚中への注入によるそれらの発生可能性について試験した。羽毛色素沈着によって決定したところ、１４個の細胞株のうちの１１個が、レシピエント胚に寄与した（以下の表２を参照のこと）。このプロトコルは、胚性幹細胞表現型を発現する多能性細胞の持続培養物を生じる。任意の時点で、この細胞を冷凍保存し得、そして傷つけられたレシピエント胚内に注入された場合、体細胞組織に実質的に寄与する可能性を有する（以下の実施例３および実施例５を参照のこと）。
【００２１】
【表２】
2010158245.tif 000004
マウスについてと同様、トリ胚性幹細胞（これは時々、胚性生殖細胞と呼ばれる）を、ＳＴＯ、ＳＴＯ−ｓｎ１および容易に入手可能な他のものを含めた種々のフィーダー層上で誘導する。これらのフィーダー細胞によって産生される白血病阻害因子（ＬＩＦ）、および帯磁ウシ血清の添加は、ＥＳ細胞を未分化状態に維持することに寄与する。本発明の好ましい実施形態では、ニワトリＥＳ細胞培養を、ＳＴＯフィーダー層上で開始する。ＳＴＯ細胞を、コンフルエンシーになるまで増殖させ、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンで３〜４時間処理し、洗浄し、トリプシン処理し、そしてゼラチンコートディッシュ上に４×１０４細胞／ｃｍ２にて播種する。ｃＥＳ細胞は、ＳＴＯ細胞のフィーダーがまばらである場合、より迅速に増殖するようである。ＳＴＯフィーダー細胞濃度を１０３と１０５との間まで、好ましくは１０４細胞／ｃｍ２未満まで低下させることにより、ｃＥＳ細胞の誘導体化および増殖を促進する。しかし、ニワトリ胚線維芽細胞およびマウス初代線維芽細胞をフィーダーとして用いた場合、ｃＥＳ細胞は誘導されなかった。また。以前に確立されたｃＥＳ細胞をこれらのフィーダー上にプレーティングした場合、これらの全ては、１週間以内に分化した。
【００２２】
ｃＥＳ細胞を、フィーダーなしで、合成挿入物（例えば、ポリマー膜（Ｃｏｓｔａｒ，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ型）上で増殖させることは、ＥＳ細胞を注入した場合のフィーダー細胞によるレシピエント胚汚染を回避する。表３および表４が示すように、ＳＴＯフィーダーの代わりに挿入物上で培養することは、ｃＥＳ細胞の誘導体化を容易にし、そして挿入物は、最初の誘導体化のために用いられ得る。しかし、挿入物上で最初に迅速に増殖させた後、ＥＳ細胞の有糸分裂活性は、４〜６週間の培養後、低下する。培養を長期化するために、これらの細胞は、ＳＴＯ細胞のフィーダーに移入されなければならない。
【００２３】
【表３】
2010158245.tif 000005
【００２４】
【表４】
2010158245.tif 000006
表３および表４におけるデータは、ニワトリの胚性フィーダー細胞およびマウス初代胎仔線維芽細胞が、ｃＥＳ細胞の誘導体化も培養も支持しないことを示す。ＳＴＯ細胞のフィーダーは、誘導体化および増殖を支持するが、１０３と１０５との間の限定された濃度、好ましくは、本発明の実施形態では、１０４未満または約１０４細胞／ｃｍ２の濃度のＳＴＯ細胞が存在する場合にのみ、支持する。濃密なＳＴＯフィーダー層は、ｃＥＳ細胞の増殖を損ない、一方、指定された濃度のＳＴＯ細胞は、ＥＳ細胞の増殖に必要な因子を提供する。これらの細胞が長期の培養期間にわたって保持され、胚性幹細胞表現型を発現し続け、そしてインビボにおいて非胚性幹細胞表現型へと分化する場合、これらは、「ＥＳ細胞子孫」と呼ばれる。
【００２５】
ｃＥＳ細胞培養物培地は、８０％馴化培地から構成され、好ましくは、ｃＥＳ細胞の誘導体化および増殖に必要な因子を含む特定のＢＲＬ馴化培地を含む。５０％の濃度において、ｃＥＳ細胞の増殖は、８０％馴化培地においてほど信頼性はない。馴化培地の百分率が５０％未満まで低下した場合、分化細胞の増加によって証明されるように、ｃＥＳ細胞の増殖は影響を受け、そして３０％以下の濃度では、ｃＥＳ細胞は、１週間以内に分化する。ｃＥＳ細胞の誘導体化および維持に必要であることが見出されたこの馴化培地は、ｍＥＳを維持しないが、それらの分化を引き起こす。
【００２６】
胎仔ウシ血清は、本発明によるＥＳ細胞培地の好ましい成分であり、そしてｃＥＳ細胞を未分化状態に保つ因子を含む。しかし、血清もまた、分化を誘導する因子を含むことが公知である。市販の血清ロットは、ＥＳ細胞を未分化状態に保つ可能性について、使用者によって慣用的に試験される。ｃＥＳ細胞培養物に使用される血清は、マウスＥＳ細胞培養物に使用される血清とは異なることが公知である。例えば、細胞毒およびヘモグロビン濃度が低く、マウスＥＳ細胞を未分化上体に維持することが公知の、マウスＥＳ細胞の培養のために用いられる血清は、ニワトリＥＳ細胞の持続増殖を支持しない。
【００２７】
それゆえ、ニワトリＥＳ細胞について用いられるべき血清は、マウスＥＳ細胞について試験されて、培地成分としての適切さが決定されるべきでなく、その代わり、ニワトリＥＳ細胞について評価されるべきである。そうするために、ニワトリＥＳ細胞培養物を２つに分け、そして各々新たな血清バッチを試験するために用いる。試験した新たなバッチは、経験的に試験された場合、ニワトリＥＳ細胞の増殖を明らかに支持しなければならない。
【００２８】
ニワトリ染色体展開物は、マウスとは異なる特別の評価技術を必要とする。なぜなら、複雑な核型は、１０本の巨大染色体、６６本の小さな染色体、及び一対の性染色体（優性においてはＺＺ、そして雌性においてはＺＷ）からなるからである。図３に示す本発明の長期ｃＥＳ細胞を、培養１８９日後に分析し、２回冷凍保存した。図３に言及すると、これらは、１０本の巨大染色体；２本のＺ染色体および６６本の小さな染色体を有する、正常な核型を示した。
【００２９】
ニワトリＥＳ細胞を、培地中で１０％  ＤＭＳＯにおいて凍結保存する。いくつかの細胞株の解凍およびレシピエント胚へのこれらの細胞株の注入の後、体細胞キメラが得られる。このことは、これらのｃＥＳ細胞が、凍結保存プロセスの間、それらの発生能力を保持することを示す。
【００３０】
（実施例２−レシピエント胚へのニワトリ胚性幹細胞の注入）
新鮮に置かれた卵中の胚への接近を可能にするために、殻は、半ズボンをはいた状態に（ｂｒｅｅｃｈ）されなければならず、このことは、２１日間の孵化期間の最後における孵化率の低下を回避不可能にもたらす。慣例は、卵の側の小さな穴（直径１０ｍｍ未満）を切断し、これを通して胚を操作し、そしてテープ、ガラスカバースリップ、殻の膜または殻の小片で再度シールした。実施することは比較的簡単であるが、この「窓開け」方法は、７０％と１００％との間の胚の死亡を引き起こした。胚への改善された接近、ならびに増大した生存および孵化能力は、２つの異なる殻および方法（Ｃａｌｌｅｂａｕｔから適応される）（（Ｃａｌｌｅｂａｕｔ，Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ  ６０：７２３−７２５，１９８１）および（Ｒｏｗｌｅｔｔ，Ｋ．およびＫ．Ｓｉｍｋｉｓｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１４３：５２９−５３６，１９８９）、これは、この技術に関して、本明細書中に参考として援用される）を用いた孵化のためのインキュベーションのために、この胚を代理卵殻に移植する場合に達成され得、平均孵化率は、約４１％（２３〜７０％の範囲）であり、４６９個のｃＥＳ細胞注入胚から１９１匹のヒヨコが孵化する。
【００３１】
レシピエント胚内へのドナーＥＳ細胞の注射後の胚のインキュベーションは、以下に記載の通り、システムＡおよびシステムＢを含む、２つの部分に分けられ得る：
システムＡは、最初の３日間の産卵後発生を包含する。レシピエント胚を含む、繁殖能力のある卵は、３〜５グラムより重い卵と一致する。３２ｍｍの直径の窓を、指定された極で切断し、内容物を除去し、そして卵黄上のレシピエント胚を、周囲の卵白とともに、代理殻内に慎重に移す。
【００３２】
細胞を、２ミクロンフィルターを取り付けたマウスアスピレータに接続した無菌の細くテーパ状になったガラスピペット中に吸い込む。ピペットの開口部は、直径が５０〜１２０ミクロンであり得、そして３０°のスパイクしたベベルを有し得る。この胚は、低倍率下で青色光を用いて可視化される。ニワトリＥＳ細胞をトリプシン処理して、単細胞懸濁物にし、そして約２，０００と２６，０００との間の細胞、好ましくは約２０，０００細胞を胚に注入する。この細胞を胚の下または上のいずれかの空間、すなわち、胚下腔または透明領域および卵黄周囲層（卵黄膜）の頂部表面に［Ｒｏｂ：好ましくは、生殖腔下に］穏やかに放出する。新鮮な繁殖能力のある卵から収集された過剰な卵白を添加し、そして殻をサランラッププラスチックフィルムでシールする。
【００３３】
システムＢは、３日目から孵化までの期間を含む。インキュベーション３日目に、胚は、ほぼ１７段階（Ｈ  ＆  Ｈ）に達した。水は、卵白から胚下腔に輸送されており、卵黄が拡大して非常に脆弱になるようになる。システムＡの殻の内容物は、元の卵よりも３０〜３５グラム重い第２の代理殻（通常、七面鳥の卵）へと、非常に注意深く移される。ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加して細菌汚染を防止し、そして平らな極における３８〜４２ｍｍの窓を、プラスチックフィルムでシールする。このより大きな殻は、人工的な空隙を可能にする。インキュベーション１８日目〜１９日目に、これらの胚培養物を、密接な観察のために、卓上用孵卵器に移す。肺への通気が確立されるにつれて、穴は、プラスチックフィルムにおいて定期的に作製されて、周囲の空気が間隙に入るのが可能になる。孵化の約６〜１２時間前に、フィルムを小さなペトリ皿に置き換え、このペトリ皿は、孵化の間にヒヨコによって容易に押しのけられ得る。
【００３４】
インキュベーションについては、従来の温度（３７．５℃〜３８℃）および相対湿度（５０％〜６０％）が、代理殻における胚について維持されるが、定期的に卵を揺り動かすこと（これは通常、毎時であり、９０度である）は、良好な生存を確実にするために改変される。システムＡでは、揺り動かしは、４〜５分間ごとに９０°である；システムＢでは、これは、４０〜４５分毎に４０°〜６０°である。両方の系では、揺り動かしの速度は、１分間あたり１５°〜２０°に維持される。
【００３５】
キメラに対するｃＥＳ細胞の寄与は、レシピエント胚が、ｃＥＳ細胞の注入の前に以下によって調製される場合、改善される：（１）６６０ラドのガンマ照射への曝露によって照射される、（２）約１０００の細胞を胚の中心から機械的に除去することによって改変される、または上記の（１）および（２）の組み合わせ。表５を言及すると、体細胞組織に対するｃＥＳ細胞の寄与は、レシピエント胚の中心から細胞を除去することまたは照射への曝露のいずれかによってレシピエント胚が傷つけられた場合に実質的に増加した。レシピエント胚が、細胞照射と細胞の機械的除去との組み合わせによって傷つけられた場合、ＥＳ細胞の寄与はさらに増加したが、ｃＥＳ細胞は、より長期にわたって培養された。得られたキメラヒヨコのいくつかは、純粋なＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋヒヨコと区別できない（図４）。表５におけるデータが示す通り、キメラ現象の割合および１つの胚あたりのキメラ現象程度は、レシピエント胚を傷つけた後に増加した。
【００３６】
【表５】
2010158245.tif 000007
レシピエント胚は、Ｘ期よりも実質的に若く、そしてまた、ＥＳ細胞をドナーとして用いてキメラを生成するために用いられ得る。初期段階のレシピエント胚は、オキシトシンを雌鶏に注入して、早産での産卵を誘導することにより回収され、そして繁殖能力のある卵がＶＩＩ期〜ＩＸ期に回収される。
【００３７】
あるいは、卵管の有頭領域からの胚の回収は、約４〜２５０の細胞からなるＩ期〜ＶＩ期の胚への接触を提供し、潜在的レシピエント胚としての全ての胚段階からのキメラの発生を可能にする。
【００３８】
（実施例３−ニワトリ胚性幹細胞（ｃＥＳ）からの体細胞キメラ）
本発明のｃＥＳ細胞の多能性を実証するために、ｃＥＳ細胞を、白色レグホンレシピエント胚中に注入する。１回目の実験において、２８の実験において、合計１４個の細胞株を、Ｘ期レシピエント胚に注入する（表２を参照のこと）。このｃＥＳ細胞は、４日間と１０６日間との間、培養して増殖されており、いくつかの株は、冷凍保存されている。ニワトリＥＳ細胞を、軽くトリプシン処理して、ｃＥＳ細胞の小さな塊を得て、そして２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中に再懸濁する。２０００〜５０００の間の細胞を含む３μｌ〜５μｌの細胞懸濁物を、レシピエント胚の胚芽下腔に注入する。羽毛を発生した全ての胚を分析し、そして２４パーセントの胚（８３／３４７）が、羽毛の色によって、キメラであると決定される。羽毛キメラは、１１／１４の細胞株から得られる。キメラ現象の程度は、１％〜９５％に変動し、平均程度は、２５．９％（ＳＤ＝２０．４）である。
【００３９】
表２は、細胞株内および細胞株間で実施した実験での、体細胞キメラ現象における分散を例示する。キメラに対するＥＳ細胞の寄与例を、図４および図５に示す。図４では、２匹のヒヨコがキメラであり、２匹がＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋｓである；これらのヒヨコの間に表現型の差が存在せず、キメラに対するＥＳ細胞の寄与が（特に、外胚葉由来の系統において）大きいことが明らかである。図５では、左側のキメラは、ＥＳ細胞からの比較的低いレベルの寄与を有し、一方、右では、中間の寄与を有する。
【００４０】
（実施例４−リポフェクションおよびエレクトロポレーションによるｃＥＳ細胞のトランスフェクション）
表６を言及すると、トランスフェクトされるウェルのサイズと適合した適切な量のＤＮＡを、血清も抗生物質も含まない培地中に希釈する。適切な体積のＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、そしてＤＮＡと混合し、そして反応を５〜１０分間にわたって生じさせる。この培地を除去し、そしてトランスフェクトされるべきウェルを、Ｃａ／Ｍｇを含まない塩溶液で洗浄する。適切な体積の培地（これは、血清および抗生物質を含み得る）を、ＤＮＡ／トランスフェクト混合物に添加する。これらのプレートを３７℃において２〜３時間インキュベートする。インキュベーションが完了した場合、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを、細胞を１〜２回洗浄することによって除去し、そして新たな培養培地を添加する。
【００４１】
【表６】
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ペトリパルサーを用いて、３５ｍｍの直径のウェルにおいて、プレートに付着したｃＥＳ細胞をエレクトロポレーションする。この培地を除去し、そしてウェルを、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない塩溶液で洗浄する。１ｍｌのエレクトロポレーション溶液をこのウェルに添加する。ＤＮＡを添加し、そしてこの培地を穏やかに混合する。このペトリパルサーを、ウェルの底に下げ、そして電流を送達する（電圧は好ましくは１００〜５００Ｖ／ｃｍで変動し、そしてパルス長は１２〜１６ｍ秒であり得る）。このペトリパルサーを除去し、そしてエレクトロポレーションしたウェルを、室温にて１０分間静置させる。１０分後、２ｍｌの培地を添加し、そしてこれらの皿をインキュベーターに戻す。
【００４２】
懸濁状態の細胞をトランスフェクトするために、培地を除去し、そして細胞をＣａ／Ｍｇを含まない塩溶液で洗浄する。ＥＤＴＡを含むトリプシン（Ｔｒｙｓｐｉｎ）を添加して、単細胞懸濁物を得る。細胞を洗浄し、遠心分離し、そして補正用エレクトロポレーション緩衝溶液（例えば、ＰＢＳ）中に再懸濁する。このＥＳ細胞懸濁物を無菌のキュベット中に配置し、そしてＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌの最低濃度）をこの細胞懸濁物に添加し、そして上下にピペッティングすることによって混合する。エレクトロポレーションしてＲＴにて１０分間沈降させた細胞をキュベットから取り出し、そして予め調製したウェル／ディッシュに分配する。細胞をインキュベーター中に配置し、そしてエレクトロポレーションの２４〜４８時間後に、一過性トランスフェクションについて評価する。抗生物質耐性細胞の選択はまた、ピューロマイシンのような抗生物質を培養培地中に含めることによって開始され得る。
【００４３】
好ましい実施形態では、トランスフェクトされた細胞を選択するために必要とされるピューロマイシンの濃度は、滴定殺傷曲線として算出される。ニワトリ胚性幹細胞についての滴定殺傷曲線を、培養中の細胞を、０．０〜１．０μｇ／ｍｌに変動するピューロマイシン濃度に１０日間（表７）曝露し、そして０．０〜２００μｇ／ｍｌに変動するネオマイシン濃度に曝露することにより、確立する。培地を２日毎に変更し、そして新たなピューロマイシンまたはネオマイシンを添加する。０．３ｇ／ｍｌの濃度のピューロマイシンに曝露した場合、ＥＳ細胞は、６日間の期間にわたって新たなピューロマイシンを３回交換した後に、全てのウェルに存在しなかった（表７を参照のこと）。０．３〜１．０ｇ／ｍｌのピューロマイシン濃度を、トランスフェクトされた培養物の選択に用いる。４０μｇ／ｍｌを超えるネオマイシン濃度は、全てのｃＥＳ細胞を７日間以内に除去した（表８）。
【００４４】
１０日間の選択後、ｃＥＳ細胞コロニーが生存可能であり、さらなる増大のために拾われ得る。
【００４５】
【表７】
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【００４６】
【表８】
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トランスフェクトされたニワトリＥＳ細胞の選択およびキメラにおけるそれらの同定は、この導入遺伝子が、培養中のこの細胞に選択優位性（例えば、この培地中のピューロマイシンに対する耐性）を付与すること、およびこれが、ＥＳ細胞由来のキメラにおいてこの細胞中に同定可能な遺伝子産物を産生することを必要とする。これは、ｐＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏを用いて達成され得、ｐＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏは、ｃＥＳ細胞においてピューロマイシンに対する耐性を提供し、キメラにおける全てではないにしろ大部分のドナー由来細胞中に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を産生する。
【００４７】
図６を言及すると、ＰＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ（図６）を、最終的なｐＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏプラスミドを作製する前に２つの中間体を含む３つのクローニング工程において生成した。工程１では、ＰＧＫ駆動ピューロマイシン耐性遺伝子カセット（１．５Ｋｂ）を、Ａｓｃ  Ｉ消化により、ｐＫＯ  ＳｅｌｅｃｔＰｕｒｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から遊離させた。次いで、このフラグメントを平滑末端化し、そしてＫｐｎ  Ｉリンカーを添加した。得られたフラグメント（ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ）を、ｐＭＩＥＭ（Ｊｉｍ  Ｐｅｔｉｔｔｅ（ＮＣＳＵ）から無料提供、ＬａｃＺ発現ｐＭＩＷＺ由来のＧＦＰ発現バージョン、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．２９：１８１−１８６（１９９０）を参照のこと）の対応するＫｐｎ  Ｉ部位に挿入して、最初の中間体（ｐＧＦＰ／Ｐｕｒｏ）を生成した。このＰＧＫ−Ｐｕｒｏカセットは、ＧＦＰと同じ転写方向にあった（ＢａｍＨ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉでの消化によって決定した）。工程２では、ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ発現カセット（２．５Ｋｂ）を、ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉでの二重消化によってｐＧＦＰ／Ｐｕｒｏから遊離させた。得られたフラグメントを、ｐＵＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ部位に挿入した。これは、５’独特の部位である、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｐｓｔ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを含む。得られたプラスミドｐＵＣ１８／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏを、ＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉでの三重消化によって確認した。第３の工程では、３８４ｂｐのＣＭＶ−ＩＥエンハンサーを含むＣｘプロモーター、１．３ｋｂのニワトリβ−アクチンプロモーターおよび第１イントロン部分を、Ｓａｌ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉでの消化によってｐＣＸ−ＥＧＦＰ（Ｍａｓａｈｉｔｏ，Ｉ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７５：１２５−１２８，１９９５）から遊離させた。３’ＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｕｌｌ）−ＸｍｎＩ−ＢａｍＨ  Ｉリンカーをこのフラグメントに結合させ、そしてこれを、ｐＵＣ１８／ＧＦＰ／ＰｕｒｏのＳａｌ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉ部位に挿入した。このプラスミドｐＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ（図６）を、ＢａｍＨ  ＩおよびＰｓｔ  Ｉでの二重消化によって確認した。ｐＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ  ＤＮＡは、ｃＥＳ細胞へのトランスフェクションのために、Ｓｃａ  Ｉ消化によって直鎖状にされ得る。
【００４８】
上記の手順を用いたＥＳ細胞のトランスフェクションおよび選択は、０．５μｇのピューロマイシンの存在下で増殖する細胞集団を産生した。これらの細胞は、従来の蛍光顕微鏡法によって調べた場合、緑色蛍光を示した（図７を参照のこと）。ＥＳ細胞の調製物を、蛍光活性化細胞選別によって調べる場合、本質的に全ての細胞が、導入遺伝子を保有して発現することが明らかである（図８を参照のこと）。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩまたは両方の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化された、トランスフェクトされたＥＳ細胞株ＴＢ０１およびＴＢ０９からのＤＮＡのサザン分析は、種々のサイズのＤＮＡフラグメント中での導入遺伝子を示し、この導入遺伝子が、ゲノム中に組み込まれたという証拠を提供した（図９を参照のこと）。
【００４９】
このＣＸ／ＧＦＰ／Ｐｕｒｏ構築物は、少なくとも４．５ｋｂの導入遺伝子が、キメラニワトリ中に挿入され得ることを実証する。本明細書中に記載されるｃＥＳ細胞を用いて、ニワトリＥＳ細胞は、異なるかまたはより大きな構築物を用いてトランスフェクトされ得る。この導入遺伝子の設計に依存して、外因性タンパク質をコードするＤＮＡは、得られるキメラ動物またはトランスジェニック動物の体細胞（すなわち、内胚葉、中胚葉、外胚葉、および胚体外組織）において広範に検出され得、そして顕著なレベルの外因性タンパク質を選択された組織のみにおいて発現するように設計され得る。このタンパク質は、組織特異的導入遺伝子構築物中に含まれるＤＮＡによってコードされる。この導入遺伝子構築物は、宿主生物のゲノム由来の遺伝子エレメントから構成され得、そして選択された組織におけるタンパク質の既知の発現（または発現パターン）に基づいて選択され得る。特定の組織における発現については、選択される組織において通常発現される、そして通常高度に発現される、タンパク質をコードする遺伝子を選択し、そしてこの遺伝子由来の調節エレメントを、この外因性タンパク質の発現を駆動するために選択する。この外因性タンパク質についてのＤＮＡコード配列、他の調節エレメント、選択マーカーなどと合わせた場合、この導入遺伝子は、選択された組織においてこの外因性タンパク質の優先的発現を生じる。特定の組織型における優先的発現は、非選択組織と比較して、選択された組織において３〜４桁の大きさ分大きな発現と規定され得る。
【００５０】
トランスジェニックトリにおける組織特異的タンパク質発現について、組織特異的発現は、好ましくは、膨大部、峡部、卵殻腺部または卵管漏斗部を含め、卵管の一領域に指向される。タンパク質発現についての個々の組織の選択は、発現されるべきタンパク質の型に依存する。この膨大部は、卵白の主なタンパク質を発現する管状腺細胞を含み、一方、この峡は、殻膜を発現する細胞を含む。可溶性タンパク質の発現は好ましくは、卵白タンパク質（好ましくは、オボアルブミンであるが、オボトランスフェリン、オボムコイド、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、オボインヒビター、シスタチン、オボ糖タンパク質、オボフラボタンパク質、オボマクログロブリン、およびアビジンが挙げられる）を発現する遺伝子由来の（通常はプロモーターを含む）調節配列を選択することにより、卵管の膨大部の管状腺細胞に指向される。管状腺細胞における選択的発現は、上皮細胞における発現を排除するために、以下に実証され、そして２つの細胞型の間での選択性を区別するために、優先的発現と命名される。
【００５１】
以下の実施例では、外因性免疫グロブリン遺伝子座とともにプロモーターを含む内因性卵白調節配列を含む導入遺伝子を構築して、卵管の管状腺細胞における組織特異的抗体発現を生じる。次いで、このようにして発現された抗体分子は、トランスジェニックニワトリの卵白中に蓄積される。この実施形態では、任意の再配置された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体は、卵管の膨大部分の管状腺細胞を含む組織において特異的に発現され、そして卵の卵白から単離され得る。モノクローナル抗体をコードする再配置された免疫グロブリン遺伝子は、他の組織における発現を実質的に除いて、卵管において優先的に発現されるが、他の組織における発現は、検出可能なレベルより上で存在し得る。
【００５２】
この実施形態では、オボアルブミン調節配列の制御下のこのモノクローナル抗体カセットは、少なくとも３．４ｋｂ、好ましくは少なくとも約７．５ｋｂの５’調節配列から構成され、そして１５ｋｂ以上の３’調節配列を含み得る。好ましくは、この構築物は、外因性抗体コード領域の５’末端および３’末端の両方に隣接する、オボアルブミン遺伝子の領域を含むが、５’隣接領域の内因性プロモーター配列の大きく充分なセグメントは、３’隣接領域についての必要性を回避し得る。抗体の重鎖および軽鎖の両方のコード領域は、導入遺伝子において提供され、そして選択されるアイソタイプの可変領域、多様性領域、連結領域および定常領域を含む。好ましい実施形態では、この抗体は、特徴的にはヒトであり、少なくともヒト重鎖を含む、免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。また、このアイソタイプは、好ましくは、ＩｇＧであり、最も好ましくはＩｇＧ１である。
【００５３】
オボアルブミン由来モノクローナル抗体構築物についての好ましい導入遺伝子構築物を、図１０Ａに提供する。この導入遺伝子構築物を、Ｏｖ７．５と命名し、そしてこの構築物は、５’末端配列ではＭＡｂコードに、そしてコード領域の３’では１５ｋｂのプロモーター配列に隣接する、プロモーター（この特定の実施形態では、オボアルブミンプロモーター）を含む、約７．５ｋｂの卵白調節配列を有する。このコード領域は、軽鎖および重鎖の両方についての可変領域、Ｊ−Ｃイントロン配列、κ軽鎖定常領域、ＩＲＥＳ配列、ならびにγ１アイソタイプ重鎖定常領域を含む。この構築物の３’末端は、ＧＦＰ遺伝子および選択マーカー（この場合、本明細書中に記載されるＣＸプロモーターによって駆動されるピューロマイシン遺伝子）を含む。モノクローナル抗体コード領域の３’および５’の両方でのオボアルブミンプロモーター配列の長さは、例にすぎず、類似の構築物は、２５〜１００ｋｂ以上の５’配列ならびに種々の長さを３’配列に含み得る。当業者は、ＧＦＰマーカーが、生理学的標本における検出のためにのみ存在し、この導入遺伝子の有用性から逸脱することなく除去され得ることを認識する。ピューロマイシン耐性マーカーは、この導入遺伝子で成功裏に形質転換された胚性幹細胞を選択する能力を提供する任意のマーカーで置換され得る。いくつかの型の類似の選択マーカーは、当該分野で周知であり、そしてこの実施形態のピューロマイシン耐性遺伝子と本質的に交換可能に用いられ得る。
【００５４】
上記の通り、このモノクローナル抗体は、本発明の導入遺伝子構築物を用いて発現され得るいくつかの型のモノクローナル抗体産物のうちの１例にすぎない。さらに、タンパク質のクラスとしてのモノクローナル抗体は、本明細書中に記載される方法および技術に従って組織特異的様式で発現され得る多くのクラスのタンパク質産物の１例にすぎない。
【００５５】
図１０Ｂを言及すると、Ｏｖ  ７．５導入遺伝子の発現がエストロゲン注射によって誘導された２週齢のキメラの膨大部の切片は、形質転換胚性幹細胞由来の抗ダンシルモノクローナル抗体産生細胞の組織特異的発現が、ＧＦＰを発現することを示し、これは、図１０Ｂの左のパネルにおいて緑色として示され、Ｏｖ  ７．５導入遺伝子で形質転換された胚性幹細胞による寄与を確認する。図１０Ｂの左下のパネルを言及すると、このモノクローナル抗体は、管状腺細胞において赤色に染まり、一方、上皮細胞（これもまたドナー胚性幹細胞由来である）は、緑色に染まり、赤色には染まらない。染色におけるこの相違は、構築物の発現は、組織特異的であり、そして特定の組織型についての導入遺伝子の内容によって選択されることを実証する。以下の実施例は、卵管の管状腺細胞における組織特異的発現を実証するが、全ての細胞および組織型にまたがる発現の実証は、各々または任意の組織型が、導入遺伝子構築物の成分、および例えば、プロモーターまたは他の調節エレメントの対応する選択により、組織特異的発現または細胞特異的発現について選択され得ることを実証する。
【００５６】
図１０Ｂの右上のパネルでは、細胞型の全てを、ＤＡＰＩ染色によって示される。右下のパネルでは、染料を重ねて、ドナー由来の管状腺細胞のみがモノクローナル交代を発現し、一方、レシピエント由来細胞およびドナー由来上皮細胞がモノクローナル抗体を発現しないことを実証する。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、抗ダンシルモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖が、それぞれ、３または５のキメラの卵管組織においてのみ選択的に発現され、これらのキメラの脳、腸、膵臓または筋肉にいずれにおいても、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるレベルより上では発現されないことを示すＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【００５７】
ヒトＩｇＧアイソタイプモノクローナル抗体が選択的に発現され得、そして蓄積されるタンパク質が卵白であることを実証するために、合計１８のキメラ雌を、Ｏｖ７．５構築物を保有するｃＥＳ細胞を注入することにより作製した。この群からの６つのキメラを、早期エストロゲン誘導による導入遺伝子発現を試験するために用いた。残りの１２のキメラ胚を、卵収集のために性的に成熟するまで育てた。９つのキメラ雌が、１７〜２２週齢において産卵を開始し、これらのキメラのうちの１つは、時々産卵した。キメラ雌のうちの３つは、３５週齢においても卵を産卵せず、剖検時に、それらの性腺が、雄性ＥＳ細胞由来組織の存在により男性化していることが明らかであった。
【００５８】
卵を産卵する９個のキメラ由来の卵を収集し、そして代表的卵白サンプルを、硫酸アンモニウム沈澱によって調製し、そしてＥＬＩＳＡによって分析した。マイクロタイタープレートを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体でコートし、そして卵白サンプル中のヒトＩｇＧ  ＭＡｂの存在が、重鎖について特異的な標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）抗体および／または軽鎖についての標識ヤギ抗ヒトκ（κ鎖特異的）抗体によって明らかにされた。標準曲線を、精製ヒトＩｇγ１、κタンパク質を用いて確立した。ＥＬＩＳＡの感度は、０．８ｎｇ／ｍｌであった。非トランスジェニック白色レグホン雌鶏由来の卵白サンプルを、ネガティブコントロールとして用いた。ヒトＩｇＧ  ＭＡｂ蓄積は、非トランスジェニック白色レグホン雌鶏由来の卵（４個の卵）においても、６個のキメラ雌鶏由来の卵（雌鶏＃ＯＶ１１−１７由来の８個の卵、雌鶏＃ＯＶ１１−５３由来の８個の卵、雌鶏＃ＯＶ１１−７３由来の６個の卵、雌鶏＃ＯＶ１１−８８由来の６個の卵、雌鶏＃ＯＶ１２−９７由来の４個の卵、および雌鶏＃ＯＶ１３−１３由来の５個の卵）においても検出されなかった。
【００５９】
ヒトＩｇＧ  ＭＡｂ蓄積が、３つの異なるキメラ雌鶏からの卵において検出された（ＩｇＨについてのＥＬＩＳＡによって決定したところ、雌鶏＃ＯＶ１１−１３由来の卵について約１．４〜６．３ｎｇ／ｍｌ、雌鶏＃ＯＶ１１−３７由来の卵について約２．０〜２．９ｎｇ／ｍｌ、および雌鶏＃ＯＶ１１−４３由来の卵について約２．９〜１０．８ｎｇ／ｍｌ）。代表的な卵におけるヒトＩｇＧ  ＭＡｂの濃度を、表９にまとめる。ＩｇＬについてのＥＬＩＳＡによって決定された、卵中のヒトＩｇＧ  ＭＡｂの濃度は、ＩｇＨについてのＥＬＩＳＡによって決定された濃度よりも、一貫して低かった。一般に、ＩｇＬによって決定された濃度は、ＩｇＨによって決定された濃度の６０％であった（表９における第３欄と第５欄とを比較する）。この相違はまた、精製したヒトＩｇγ１、κタンパク質を用いて作製された、スパイクされたサンプルにおいて存在する。
【００６０】
【表１０】
2010158245.tif 000011
雌鶏＃ＯＶ１１−１３、＃ＯＶ１１−３７（これは、それらの卵中にヒトＩｇを蓄積した）および白色レグホン由来の血液サンプル中のヒトＩｇＧ  ＭＡｂタンパク質の濃度は、アッセイ感度（０．８ｎｇ／ｍｌ）未満であった。これらのデータは、エストロゲン誘導性キメラヒヨコにおける腸、脳、膵臓および筋肉におけるヒトＩｇ転写産物の存在を評価するためのＲＴ−ＰＣＲを用いて観察された、キメラニワトリにおけるヒトＩｇの異所発現が存在しないことと一貫している（図Ｔｉ  １０Ｃおよび１０Ｄ）。それゆえ、Ｏｖ７．５構築物は、組織特異的な、ホルモンによって誘導された、そして発生によって調節される遺伝子発現を、トランスジェニックキメラ雌鶏において送達するようである。さらに、このタンパク質は、膨大部における管状腺細胞から運び出されて、卵白中に蓄積するようである。
【００６１】
オボアルブミン由来の組織特異的タンパク質発現導入遺伝子を、以下の通りに構築した：
ニワトリゲノムＢＡＣライブラリー（Ｃｒｏｏｉｊｍａｎｓ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １１：３６０−３６３，２０００）、（Ｔｅｘａｓ  Ａ  ＆  Ｍ  ＢＡＣ
Ｃｅｎｔｅｒ）をスクリーニングして、オボアルブミン遺伝子座における４６Ｋｂの領域を単離する。ＭＡｂコード領域の５’側に位置する、このオボアルブミンプロモーターの異なるフラグメントを有する、２つの異なるベクターを構築した：（１）Ｏｖ７．５ＭＡｂ−ｄｎｓ：４２Ｋｂの発現ベクターは、オボアルブミン遺伝子由来の９．２Ｋｂの５’配列（７．５Ｋｂプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列を含む（図１０Ａ）。この４２ｋｂの発現ベクターは、オボアルブミン遺伝子由来の９．２ｋｂの５’配列（７．５ｋｂのプロモーターを含む）および１５．５ｋｂの３’隣接配列を含む。二シストロン性モノクローナル抗体カセットは、抗ダンシル抗体の軽鎖、ＩＲＥＳおよび重鎖をコードする。（２）Ｏｖ１５ＭＡｂ−ｄｎｓ：４９Ｋｂの発現ベクターは、オボアルブミン遺伝子由来の１６．８Ｋｂの５’配列（１５Ｋｂプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列（示さず）を含む。この４９ｋｂの発現ベクターは、オボアルブミン遺伝子由来の１６．８ｋｂの５’配列（１５ｋｂのプロモーターを含む）および１５．５ｋｂの３’隣接配列を含む。このモノクローナル抗体カセットは、両方の構築物において同一である。
【００６２】
上記のように、両方のベクターにおいて発現されるべき遺伝子は、マウス−ヒトハイブリッドの抗ダンシルモノクローナル抗体（ＭＡｂｄｎｓ）である。ＣｘＥＧＦＰ／ＣｘＰｕｒｏカセットを、最も３’側の末端にクローン化して、ｃＥＳ細胞における安定なトランスフェクションについての、ピューロマイシンを用いた選択、およびキメラでのトランスフェクトされた細胞の容易な同定を可能にする。両方の構築物を線状にし、そしてｃＥＳ細胞へのトランスフェクション前に精製する。ｃＥＳ細胞のトランスフェクションを、Ｏｖ７．５ＭＡｂｄｎｓを用いて実施し、そしてＯｖｌ５ＭＡｂを、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはペトリパルサーエレクトロポレーションのいずれかを用いて実施する。ピューロマイシンを用いた選択後、６つの耐性クローンを、分子分析のために拾う。導入遺伝子の存在を、ＭＡｂｄｎｓカセット中、ＧＦＰ遺伝子中およびＰｕｒｏ遺伝子中に位置するプライマーを用いたＰＣＲによって確認する。トランスフェクトされたＥＳ細胞を用いて、以下に詳細に記載する通り、トランスジェニックトリまたはキメラトリを作製する。
【００６３】
なお別の例では、再配置されていないヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座の一部をコードする、非常に大きな導入遺伝子は、ニワトリＥＳ細胞中にトランスフェクトされている。１３９キロベースの細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを、環状ＢＡＣ  ＤＮＡおよび直鎖状選択マーカーＤＮＡの共リポフェクションによって、ｐＣＸ−ＥＧＦＰ−ＣＸ−ｐｕｒｏ選択マーカーを用いて、ｃＥＳ細胞中に共トランスフェクトした。このＢＡＣクローンは、再配置されていない免疫グロブリン重鎖遺伝子座由来のヒトゲノムＤＮＡ挿入物を含み、そして最も３’側の可変領域（ＶＨ６−１）、全ての多様性（Ｄ）セグメント、全ての連結（Ｊ）セグメント、ＣμおよびＣγ定常領域、Ｊ−イントロンエンハンサー、およびこれらのエレメントの間の全ての介在ＤＮＡを含む。これはまた、ヒト遺伝子ＫＩＡＡ０１２５を含む。ヒト遺伝子ＫＩＡＡ０１２５は、ＶＨ６−１とＤセグメント領域との間に見出される、機能未知の非翻訳ＲＮＡをコードする遺伝子である。ｐＣＸ−ＥＧＦＰ−ＣＸ−ｐｕｒｏは、ＣＸプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターからなる）によって駆動される強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、および同じプロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドである。このプラスミドでトランスフェクトされたｃＥＳ細胞は、緑色蛍光性であり、抗生物質ピューロマイシンに対して耐性である。ピューロマイシンの存在下で増殖したトランスフェクトされたＥＳ細胞における、再配置されていないヒト重鎖遺伝子の存在を、１３９ｋｂの構築物全体に広がった導入遺伝子のＰＣＲ分析によって調べた。ＰＣＲ分析において用いたプライマー配列は、以下であった：
【００６４】
【化１】
2010158245.tif 000012
ｃＥＳ細胞を、選択マーカーｐＣＸ−ＥＧＦＰ−ＣＸ−ｐｕｒｏおよびＢＡＣ  ＣＴＤ−２００５Ｎ２で共トランスフェクトして、ＢＡＣ−Ａと命名されるｃＥＳ細胞株を得る。ゲノムＤＮＡを調製し、そしてＢＡＣクローンの長さとともにマーカーに対応する５つの異なるプライマーセットを用いてＰＣＲを実施する。これらのマーカーは、以下である：ＶＨ６−１（ヒトゲノム挿入物の［ヒト重鎖遺伝子座と比較して］５’末端から２４ｋｂ）、Ｄ１−２６（末端から８３ｋｂ）、Ｄ１−２０（末端から７３ｋｂ）、Ｃμ（末端から約１０８ｋｂ）、およびＣδ（末端から約１２０ｋｂ）。ＶＨ６−１、ＣμおよびＤ１−２６のみを示すが、全てが類似の結果を与えた。ｃＥＳ細胞サンプルからの増幅についてのコントロールとして、ニワトリβ−アクチンＰＣＲもまた行う。サンプルは、以下である：
１．ＢＡＣ−Ａ細胞；
２．ｃＥＳ細胞についてのフィーダー層として用いられるマウスＳＴＯ細胞（ネガティブコントロール）；
３．Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ胚ＤＮＡ（同じ系統、親ｃＥＳ細胞株、ネガティブコントロール）；
４．ヒトゲノムＤＮＡ（ポジティブコントロール）；
５．ｃＥＳ細胞培地（ネガティブコントロール）。
【００６５】
図１１に示す通り、導入遺伝子の全てのセグメントは、トランスフェクトされて選択されたＥＳ細胞中に存在する。
【００６６】
（実施例５−キメラにおける、トランスフェクトされたドナー由来細胞の同定）
トランスフェクトされたドナー由来細胞を、多数の方法により、キメラ中で検出する。例えば、導入遺伝子を、羽毛における黒色の色素沈着の存在によって同定される、キメラから採取した組織のサザン分析により検出する。また、ＤＮＡを、胚または鶏冠組織から収集し、そしてＢａｍＨ１、ＥｃｏＲ１またはこれらのエンドヌクレアーゼの組み合わせにより消化する。キメラにおける組織由来のＤＮＡを、サザン分析により調べた場合、ＴＢ０１（これは、キメラを作製するために用いたドナー細胞である）において見られるバンドと同一であったバンドは、ＢａｍＨ１、ＥｃｏＲ１またはこれらの２つの制限エンドヌクレアーゼのいずれかを用いた消化の後に明らかであり（図１２）、従って、キメラが、レシピエント胚中に導入されてキメラを形成するＥＳ細胞の子孫を含むという証拠を提供した。
【００６７】
組織における導入遺伝子の存在を、キメラに蛍光を照射することにより検出する。これは、この導入遺伝子が、眼およびくちばし（図１３）、口腔前庭、脚部および足（図１４）、ならびに翼における骨および羽毛髄質における細胞（図１５）において発現されることを示す。内部器官の検査は、ドナー由来のＥＳ細胞が、腸組織および胸筋（図１６）ならびに脚部の筋肉（図１７）に寄与したことを明らかにした。別のトリでは、膵臓への大規模の寄与が観察された（図１８）。これらのデータは、ＥＳ細胞の子孫が、くちばし、羽毛および皮膚を生じる外胚葉、筋肉および骨を生じる中胚葉、ならびに膵臓を生じる内胚葉に寄与するという強力な証拠を提供する。
【００６８】
蛍光によるトリの照射を用いて、トリを１〜４のスケールでスコア付けし、ここで、４は、可視の皮膚、眼およびとさかの全てが、蛍光性であることを示す。この蛍光スコアを、皮膚のいくつかの領域を、蛍光ランプを用いてスクリーニングし、そしてヒヨコを０〜４のスケールでスコア付けすることにより決定した。類似のスコアを用いて、羽毛の色素沈着によって評価されるキメラ現象の程度を評価する。羽毛キメラ現象を、孵化時のダウンと比較した、黒色ダウンの％として評価した。Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋヒヨコのダウンの約２５％は、白色である。それゆえ、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ由来ＥＳ細胞に完全に由来するキメラにおいて可能な最大スコアは、７５％である。方程式ｙ＝０．４１ｘ＋０．２５（ここで、ｙは、蛍光スコアであり、ｘは、ＥＳ細胞由来の羽毛色素沈着の程度である）によって記載されるこれらの２つの間の相関を、図１９に示す。
【００６９】
漿尿膜の検査は、ｃＥＳ細胞もまた、胚体外組織に寄与することを示した（図２０を参照のこと）。これらのデータは、ニワトリＥＳ細胞の多能性が、マウスＥＳ細胞（これは、栄養外胚葉に寄与しない）の多能性よりも大きいかもしれないことを示す。
【００７０】
キメラにおける生存組織の検査に加えて、細胞を、種々の組織から調製し、そしてＥＳ細胞由来の蛍光細胞を決定した。組織（筋肉、肝臓または脳）を、死後のニワトリから取り出し、次いでＰＢＳでリンスして、血液または他の流体を除去した。この組織の外膜を切開により除去し、そして残りのサンプルを細かく切り刻んだ。血清を含まない、ＤＭＥＭ（筋肉および肝臓）またはＬｉｅｂｏｖｉｔｚ  Ｌ１５培地（脳）のいずれか中に１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（ＩＶ型、Ｓｉｇｍａ）を含む微量遠心管に、各組織サンプルを移した。これらの管を、３７℃の水浴中で３０〜４５分間インキュベートし（これらのチューブを、１０〜１５分毎に反転して懸濁物を振盪した）、次いでこれらの組織を、使い捨てのプラスチックチップを備えた１００〜２００μｌのピペットを用いて、単細胞懸濁物中に分散させ、そして組織型に従って精製した。全ての遠心分離工程を、微量遠心管において実施した。
【００７１】
筋肉細胞懸濁物について、この懸濁物を、４０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離し、上清を除去し、そして１０％熱不活化ウマ血清を含む５００μｌのＤＭＥＭで置換した。ペレットを再懸濁し、そして管を、２６００ｒｐｍにおいてさらに６０秒間遠心分離し、次いで上清を取り出し、そして４０ミクロンのナイロンメッシュ（無菌で使い捨て用、Ｆａｌｃｏｎブランド）に通した。細胞懸濁物のサンプルを、この段階で顕微鏡によって検査して、適切な細胞形態およびフローサイトメトリーに関して充分な細胞密度を確実にした（最適未満の密度を、希釈、またはペレット化および再懸濁により訂正した）。
【００７２】
肝臓細胞懸濁物について、この懸濁物を、４０ミクロンのナイロンメッシュを通して濾過し、清浄な微量遠心管に移し、そして筋肉についての通りにペレット化した。ペレットの底に区別できる可視の層を形成する赤血球を破壊しないように注意しながら、このペレットの上の層を慎重に取り出して、完全ＤＭＥＭ（５００μｌ）を有する清浄なチューブに移す。この細胞懸濁物をこの段階で検査し、そして細胞密度を調整した。赤血球が細胞調製物中に存在した場合、これらを、溶解工程（これらの細胞を、１３０ｍＭ塩化アンモニウム、１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む１ｍｌ溶解緩衝液中で、室温にて５分間インキュベートする）を用いて除去する。
【００７３】
脳細胞懸濁物については、この懸濁物を濾過し、そして上記のとおりにペレット化した。１０％ウマ血清および６ｇ／ｌグルコースを含み、Ｐｅｒｃｏｌｌを添加して５０％溶液（約２６０〜２８０μｌ）を得た２５０μｌの完全Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚ（Ｌ−１５）培地中にこのペレットを再懸濁した。この懸濁物を、３．５ｋにて５分間遠心分離し、その後、細胞の上層を注意深く取り出して清浄な微量遠心管に入れ、そして少なくとも１ｍｌのＬ−１５培地で希釈した。この細胞を、４０００ｒｐｍにて５分間遠心分離することによりペレット化し、次いで適切な体積のＬ−１５中に再懸濁した。
【００７４】
ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を、キメラからの肝臓細胞、脳細胞および筋肉細胞において実施した。単細胞懸濁物を、ポリスチレンチューブ中に移し、そしてフローサイトメトリー（これについては、サンプルの特定の細胞型を検出するように動作パラメーターを設定してあり、そして励起レーザービームに応答して緑色波長の放射された光を検出するような装備がある）にローディングした。各分析において、非トランスジェニックキメラ由来の少なくとも１つの群のサンプルを、蛍光測定についてのベースラインを設定するために分析した（なぜなら、このフローサイトメーターは、各細胞からのいくつかの自己蛍光を検出するからである）。これらは、図２１において、コントロールサンプルと言及される。このフローサイトメーターによって生成されるデータは、（指定されたパラメーター内の）検出細胞の数を含んでおり、そしてその集団内での細胞の蛍光をまとめた。脳組織および筋肉組織の分析からのデータの例を、それぞれ、図２２および図２３に示す。データを、各組織型について非トランスジェニックサンプルによって設定された自己蛍光レベルよりも大きな蛍光強度を示す細胞の数（Ｍ１と命名される）について収集した。これらのデータのサブセットを、自己蛍光レベルよりも少なくとも１０倍高い蛍光強度を示す細胞（Ｍ２と命名される）について収集した。
【００７５】
脳サンプル、肝臓サンプルおよび筋肉（胸部および脚部）サンプルを、２６のニワトリから取り出し、このうちの１８は、上記の通りに、ＧＦＰ導入遺伝子を保有するトランスジェニックニワトリＥＳ細胞を、非トランスジェニック白色レグホンのレシピエント胚に注入することにより作製されたキメラであった。残りの８つのニワトリは、トランスフェクトされていないｃＥＳ細胞を非トランスジェニック白色レグホンのレシピエント胚中に注入することにより作製されたキメラであった。雄ニワトリおよび雌ニワトリは、両方の群に存在した。緑色蛍光は、トランスジェニックキメラからの脳由来細胞、肝臓由来細胞および筋肉由来細胞において検出された。蛍光強度および蛍光細胞と非蛍光細胞との比は、トリ毎に異なり、そして組織型毎に異なった。表にした結果を、図２１に示す。ドナー由来の羽毛色素沈着について、または死後分析の前にＵＶランプを用いてスクリーニングされた場合に緑色皮膚について、低いスコアが与えられたトリでは、組織サンプル中の蛍光細胞の数は、一般に低いかまたはゼロであった。これらの基準について高く（例えば、７５％を超えるドナー由来羽毛）スコア付けされたトリは、３つ全ての組織サンプル型において蛍光細胞を有することが見出され、そしてこれは、高度に蛍光性の（Ｍ２）細胞が、３つ全ての組織型に存在する唯一の群であった。３つの組織型のうち、肝臓由来の蛍光細胞の数が最も少なかった。脳由来蛍光細胞および筋肉由来蛍光細胞は、より多くの数で存在し、そしてトランスジェニックキメラ由来のより多数のサンプルにおいて存在した。このデータを、図１９にグラフとして示す。
【００７６】
このデータは、トランスジェニックｃＥＳ細胞が、レシピエントのＸ期胚中に注入された場合に、宿主中で繁殖し得、そして肝臓細胞、筋肉細胞および脳細胞へと分化し得ることを示す。肝臓、筋肉および脳は、それぞれ、内胚葉、中胚葉および外胚葉に由来する組織である；従って、ｃＥＳ細胞は、３つの主な体細胞系列へと分化し得、これから、全ての他の体細胞が誘導される。さらに、この実験は、トランスジェニックｃＥＳ由来細胞が、胚の段階を超えて持続して、若いニワトリにおいて見られ得、そして導入遺伝子が、これらの多様な細胞型において発現され続けることを示す。
【００７７】
導入遺伝子はまた、ＥＳ細胞由来のリンパ球において存在する。造血（ｈｅｍｏｐｅｏｔｉｃ）系列（これは、リンパ様系列および骨髄系列を含む）は、ＥＳ細胞由来のトランスジェニックキメラにおいて特に目的のものである。なぜなら、リンパ様系列におけるＢ細胞は、抗体を生じるからである。リンパ球は、孵化から成体までの任意の時点においてキメラニワトリから、またはキメラ胚のファブリキウス嚢から採取された血液サンプルのいずれかから調製される。嚢は、胚発生（Ｅ２０）の２０日目においてヒヨコから取り出され、そして２０ｍｌのシリンジのプランジャを用いて１０ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で鋼メッシュに強制的に通すことにより単離される。得られる組織フラグメントおよび細胞を管に収集し、そして室温において５分間インキュベートして、大きなフラグメントが沈澱するのを可能にする。細胞上清を収集し、そして細胞を計数し、次いで１５００ｇでの、４℃にて１０分間の遠心分離により収集し、そして１５ｍｌのコニカルチューブにおいて、ＨＢＳＳの１ｍｌあたり最大１×１０８細胞において再懸濁する。血液を、ヘパリン処理したシリンジを用いてキメラニワトリの翼の静脈から収集（０．５ｍｌ）し、そしてＥＤＴＡを含む真空管中に沈着させて凝集を存在させる。血液サンプルをＨＢＳＳと１：１で混合して、１５ｍｌのコニカルチューブ中に１ｍｌの最終体積を得た。この点から、血液サンプルおよび嚢サンプルを同じように処理する。Ｆｉｃｏ／Ｌｉｔｅを、細胞懸濁物の下にチューブの底に分配することにより、１ｍｌの細胞懸濁物の下に、０．７５ｍｌ  Ｆｉｃｏ／Ｌｉｔｅ−ＬＭ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号Ｉ４０６）を敷く。次いで、チューブを１５００ｇにて１５分間、４℃にて、ブレーキなしで遠心分離する。Ｆｉｃｏ／ＬｉｔｅとＨＢＳＳとの間の界面を注意深く集めて、別個の物質層に濃縮した単核細胞を収集する。この物質を新たなチューブに移し、粉砕して詰まった細胞を破壊し、次いで３ｍｌのＨＢＳＳ／２％熱不活化ウシ胎児血清と混合する。細胞を、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上型遠心分離機における１５００ｒｐｍにて、４℃にて１０分間の遠心分離によって収集し、次いでＨＢＳＳ／２％  ＦＢＳ中でさらに２回洗浄する。少量のアリコート（２５μｌ）を、予備評価のために、顕微鏡下でのドナー由来ＧＦＰ蛍光の程度の顕微鏡スライドに載せる。次いで、細胞の残りは、抗体染色または固定の準備ができている。
【００７８】
分析前に数時間よりも長期に細胞を保存するために、または顕微鏡法のためにスライド上に永続的に載せられる場合、これらを最初に、パラホルムアルデヒド中で固定する。細胞のアリコート（５０μｌ、０．５〜１×１０６細胞）を、１ｍｌの４％パラホルムアルデヒドを添加し、そして室温で１５分間インキュベートすることにより固定する。次いで、これらの細胞を、微量遠心機における５００ｇにて６分間の遠心分離、続いてＰＢＳ／２％熱不活化ウシ胎仔血清中でのこれらの細胞の再懸濁によって３回洗浄する。
【００７９】
抗体染色においては、新たなＰＢＳ／２％ＦＢＳ／０．１％アジ化ナトリウム中の０．５×１０６細胞のアリコートを、氷上で、チューブ中または９６ウェルプレートのウェル中に配置する。Ｒ−フィコエリトリンに結合体化したモノクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）をこれらの細胞に添加し、そして発蛍光団を保護するように覆われた氷上で３０分間インキュベートする。ニワトリＢリンパ球マーカーＢｕ−１を認識する抗体（０．２ｇ／１０６細胞の作業希釈において用いられる）またはニワトリＴ細胞マーカーＣＤ３を認識する抗体（０．５ｇ／１０６細胞において用いられる）を用いる。インキュベーション後、これらの細胞を、各回、５００ｇにて６分間の遠心分離、０．５ｍｌ  ＰＢＳ／２％  ＦＢＳ／０．１％アジド中への再懸濁によって３回洗浄する。最終洗浄の後、これらの細胞を、フローサイトメトリーによる分析の前に、１週間まで、０．５％パラホルムアルデヒド中で保存する。これらの細胞をフローサイトメトリーによって分析する当日に、このパラホルムアルデヒドをＰＢＳ／２％  ＦＢＳで置き換える；フェノールレッドを含まない緩衝液を、フローサイトメトリーに用いる。ＦＡＣＳ分析を、ＧＦＰ蛍光およびＲ−フィコエリトリン蛍光の両方について同時に実施して、ドナー由来である（ＧＦＰ陽性）細胞の比率の合計、これらの抗体によって染色される（Ｒ−フィコエリトリン陽性）細胞の比率（ドナー細胞およびレシピエント細胞の両方に由来する）、およびこれらの抗体でもまた染色される（ＧＦＰ、Ｒ−フィコエリトリン二重陽性）ドナー由来細胞の比率を検出する。
【００８０】
３つの異なるＥＳ細胞株を用いて作製されたキメラを、リンパ様系列に対するドナー寄与について分析し、これにより、ＣＸ−ＧＦＰマーカーの３つの異なる挿入部位が表された（表９）。孵化前から成体までの合計２７のキメラを分析した。リンパ球画分におけるドナー由来ＧＦＰ陽性細胞の比率は、ＦＡＣＳ分析により判断したところ、０％〜１０％の範囲であった（０％の動物は、この表には示されない）。末梢血リンパ球の抗体染色は、抗Ｂｕ−１抗体を用いて５％〜１７％の細胞染色をもたらし、そして抗ＣＤ３抗体を用いて７５％〜８５％の細胞染色をもたらした。抗Ｂｕ−１抗体を用いた嚢リンパ球の染色は、９０％を超える細胞の染色をもたらした。ＧＦＰ蛍光およびＢｕ−１またはＣＤ３のいずれかおよびＧＦＰについての染色を用いた二重陽性細胞が、いくつかのサンプルにおいて低頻度で観察された。
【００８１】
これらのデータは、外因性タンパク質をコードする遺伝子を含むＥＳ細胞が、孵化したヒヨコおよび成熟動物における造血系列に寄与したことを示す。
【００８２】
【表９】
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この表に列挙した８つのキメラは、ｃＥＳ細胞由来リンパ球を含むことが示された。末梢血リンパ球（またはキメラＩＧ１−２５の場合は嚢リンパ球）を、本文に記載される通りに、Ｆｉｃｏ／Ｌｉｔｅ−ＬＭを用いて調製した。次いで、リンパ球を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｂｕ−１  Ｂ細胞関連同種抗原（Ｂｕ−１）およびＴ細胞レセプター関連ＣＤ３複合体のＣＤ３メンバー（ＣＤ３）の発現について分析した。ＧＦＰ、Ｂｕ−１およびＣＤ３とラベルされたカラムにおける数字は、ＦＡＣＳ分析によってこれらのマーカーについて陽性である各サンプルにおける細胞の百分率を示す（ＧＦＰ蛍光細胞の百分率を、顕微鏡下で細胞を数えることによって決定した、ＯＶ−３６および１０８２１についてを除く）。サンプルを分析用に採取したときのキメラの齢を日数で示し、各キメラの性別を示す。「羽毛」とラベルされたカラムは、黒色のＣＥＳ細胞由来の羽毛色素沈着の評価の百分率を示し、７５は、可能な黒色の最大量である（なぜなら、純粋なＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋニワトリ自体が、約７５％黒色である羽衣を有するからである）。「緑色スコア」は、携帯型ＵＶランプを生体動物に対して輝かせることによって可視化される、動物全体における緑色蛍光全体の実質的な評価である。スケールは、０（緑色なし）〜４（最も緑色）である。このスコアを、各動物におけるｃＥＳ細胞寄与の程度全体のさらなる指標として用いる。「細胞株」は、キメラを作製するために用いられた異なるｃＥＳ細胞株の名称を示す。
【００８３】
当業者に明らかな、開示された発明の種々の改変、改善、および適用が存在し、そして本出願は、法によって許容される程度まで、このような実施形態を包含する。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の範囲全体は、このようには限定されないが、以下の特許請求の範囲に従って限定される。全ての参考文献、特許または他の刊行物は、本明細書中に特に参考として援用される。
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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