(57)【要約】【課題】  ＥＳ細胞やＡＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多分化能を有する未分化細胞を未分化の状態で培養するための、合成高分子を用いた足場材料を提供する。【解決手段】  未分化細胞を未分化の状態で培養するための足場材料であって、ハイドロゲルからなり、ＥＳ細胞や成体幹細胞、ｉＰＳ細胞等の未分化細胞を未分化の状態で培養することができる材料である。本発明によれば、ウイルス感染や異種細胞との接触等の問題を生ずることなく、未分化細胞に酸素と栄養を十分かつ効率的に補給することができ、ハイドロゲル上で未分化細胞を未分化の状態で培養することができる。【選択図】  図１
2010158180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化細胞を未分化の状態で培養するための足場材料であって、ハイドロゲルからなる前記足場材料。
【請求項２】
前記ハイドロゲルが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スチレンスルホン酸またはそのスルホン酸基に金属もしくは塩基が付加された塩をモノマー単位として含むハイドロゲル、ジメチルアクリルアミドをモノマー単位として含むハイドロゲル、ビニルアルコールをモノマー単位として含むハイドロゲルまたは２種以上の前記モノマー単位を含むハイドロゲルよりなる群から選ばれるハイドロゲルである、請求項１に記載の足場材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞や成体幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞等の多分化能を有する未分化細胞を未分化の状態で培養するための足場材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）や成体幹細胞（Ａｄｕｌｔ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＡＳ細胞）、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞）等の未分化細胞を分離する技術、生物組織細胞への分化誘導に関する技術、生物組織や組織再生用足場をラピッド・プロトタイピングするためのバイオプリンティング技術、或いはより複雑な細胞を再生するための生体材料足場材料等の開発により、未分化細胞から生物組織を作製することが可能となっている。これら未分化細胞は分化万能性や多能性等の多分化能を有する細胞であるため、特にヒト未分化細胞の再生医療分野や組織工学分野への応用がさらに期待されており、一部では臨床試験や早期商業化がなされている。
【０００３】
そこで、近年では、未分化細胞から組織細胞への分化を制御する研究が盛んに行われている。例えば、マウスＥＳ細胞は、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ；ＬＩＦ）存在下、マウス胎児線維芽細胞（Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）等のフィーダ細胞上で共培養することにより、未分化性を維持することができることが確認されている（非特許文献１）。また、ヒトＥＳ細胞については、例えば、ｂＦＧＦ (Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ)とヘパリンとの存在下、未分化性を維持することができることが確認されている（非特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、ヒトＥＳ細胞やヒトＡＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞等は自発的に分化しやすい細胞であり、多分化能の状態を保ったままの継代が難しいため、これら未分化細胞を再生医療分野や組織工学分野で用いるためには、未分化の状態で大量に培養する技術が必要であるが、これを行うことのできる最適な培養法は未だ確立されていない。
【０００５】
一方、本発明者等は、独自に開発したハイドロゲルを応用して、様々な再生医療材料や組織工学材料の創作を行っている。例えば、特開２００６−４２７９５号公報には、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム（ＮａＳＳ）や２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム（ＮａＡＭＰＳ）をモノマー単位とする合成高分子を含有する細胞培養用基材が開示されており（特許文献１）、特開２００７−３０７３００号公報には、ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＳＳ）ゲルまたはポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＡＭＰＳ）ゲルである人工血管用材料が開示されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−４２７９５号公報
【特許文献２】特開２００７−３０７３００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Smith A.G. et al., Nature 336: 688-90（1988）
【非特許文献２】Miho K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(36), 13409-13414（2008）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１および特許文献２に開示された細胞培養用基材や人工血管材料に基づいては、未分化細胞を未分化の状態で培養することができる足場材料を確立することはできず、最適な培養法が求められている。
【０００９】
本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、ＥＳ細胞やＡＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多分化能を有する未分化細胞を未分化の状態で培養するための、合成高分子を用いた足場材料を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る足場材料は、未分化細胞を未分化の状態で培養するための足場材料であって、ハイドロゲルからなる。
【００１１】
また、本発明の好適な態様は、前記ハイドロゲルが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、ｐ−スチレンスルホン酸（ＳＳ）またはそのスルホン酸基に金属もしくは塩基が付加された塩をモノマー単位として含むハイドロゲル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）をモノマー単位として含むハイドロゲル、ビニルアルコール（ＶＡ）をモノマー単位として含むハイドロゲルまたは２種以上の前記モノマー単位を含むハイドロゲルよりなる群から選ばれるハイドロゲルである、前記足場材料である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ウイルス感染や異種細胞との接触等の問題を生ずることなく、未分化細胞に酸素と栄養を十分かつ効率的に補給することができ、ハイドロゲル上で未分化細胞を未分化の状態で培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】架橋密度が０．５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養２４時間、４８時間、７２時間、左下から右へ順に培養９６時間、１２０時間）を示す写真図である。
【図２】架橋密度が２ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図３】架橋密度が１５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図４】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．１のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図５】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．３のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図６】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図７】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．８のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図８】架橋密度が２ｍｏｌ％ＰＮａＳＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養２４時間、４８時間、７２時間、左下から右へ順に培養９６時間、１２０時間）を示す写真図である。
【図９】架橋密度が４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図１０】架橋密度が１５ｍｏｌ％ＰＮａＳＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図１１】架橋密度が１ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、左下から右へ順に培養９６時間、１２０時間）を示す写真図である。
【図１２】架橋密度が２ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左から右へ順に培養７２時間、１２０時間）を示す写真図である。
【図１３】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦｂ値が０．０５のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図１４】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦｂ値が０．１のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図１５】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦｂ値が０．２のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図１６】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦｂ値が０．５のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞コロニーの形態（左上から右へ順に培養４８時間、７２時間、９６時間、左下から右へ順に培養１２０時間、１６８時間）を示す写真図である。
【図１７】各ディスクの弾性率および膨潤度を示した図である。
【図１８】ＰＮａＡＭＰＳディスクにおける架橋密度と９６時間培養後のＥＳ細胞コロニーの数との関係を示した図である。
【図１９】５ｗｔ％ＰＶＡディスクにおけるマウスＥＳ細胞の形態（培養１２０時間）を示す写真図である。
【図２０】１０ｗｔ％ＰＶＡディスクにおけるマウスＥＳ細胞の形態（培養１２０時間）を示す写真図である。
【図２１】比較例であるＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞の形態（培養２４時間）を示す写真図である。
【図２２】比較例であるＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞の形態（培養４８時間）を示す写真図である。
【図２３】比較例であるＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞の形態（培養７２時間）を示す写真図である。
【図２４】比較例であるＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞の形態（培養９６時間）を示す写真図である。
【図２５】比較例であるＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞の形態（培養１２０時間）を示す写真図である。
【図２６】架橋密度が０．５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態（培養１２０時間）を示す写真図である。
【図２７】架橋密度が４ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態（培養１２０時間）を示す写真図である。
【図２８】架橋密度が１０ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態（培養１２０時間）を示す写真図である。
【図２９】架橋密度が１５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態（培養１２０時間）を示す写真図である。
【図３０】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．５のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態を示す写真図である。
【図３１】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態を示す写真図である。
【図３２】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．８のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態を示す写真図である。
【図３３】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦｂ値が０．２のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態を示す写真図である。
【図３４】架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦｂ値が０．５のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態を示す写真図である。
【図３５】比較例であるＰＳディスクにおけるマウスＥＳ細胞をＡＬＰ染色した状態を示す写真図である。
【図３６】各ディスク上のマウスＥＳ細胞コロニーのうちＡＬＰ陽性を呈したコロニーの割合を示す図である。
【図３７】各ディスク上のマウスＥＳ細胞の未分化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。
【図３８】各ディスク上のマウスＥＳ細胞の外胚葉系分化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。
【図３９】各ディスク上のマウスＥＳ細胞の内胚葉系分化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。
【図４０】各ディスク上のマウスＥＳ細胞の中胚葉系分化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。
【図４１】各ディスク上のマウスＥＳ細胞の表面に結合した抗ＳＳＥＡ−１抗体の平均蛍光値を示すグラフである。図中、黒いバーはＬＩＦを含む培地で培養したＥＳ細胞における平均蛍光値を、斜線のバーはＬＩＦを含まない培地で培養したＥＳ細胞における平均蛍光値をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に係る足場材料について詳細に説明する。本発明に係る足場材料は、ハイドロゲルからなり、ＥＳ細胞や成体幹細胞、ｉＰＳ細胞等の未分化細胞を未分化の状態で培養することができる材料である。
【００１５】
本発明における「未分化細胞」とは、動物由来の分化万能性や多能性等の多分化能を有する細胞を意味する。分化万能性を有する未分化細胞としては、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を挙げることができ、多能性を有する細胞としては、例えば、ＡＳ細胞を挙げることができる。また、動物由来であれば特に限定されないが、哺乳類由来が好ましく、霊長目由来がより好ましく、ヒト由来がさらに好ましい。ここで、「未分化の状態」とは、視覚的には未分化細胞のコロニーが存在する状態をいうが、例えば、後述するアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色反応を呈する状態や未分化細胞特有の遺伝子または抗原を発現する状態をいう。すなわち、未分化の状態であるか否かの判断は、当業者が通常選択可能な手法によりすることができる。
【００１６】
また、本発明において「足場材料」は、「足場基材」、「スキャフォールド」、「スカフォールド」、「培養（用）基板」、「培養（用）基材」、「培養（用）担体」、或いは「固定（用）装置」と交換可能に用いられる。
【００１７】
本発明における重合体は、高分子が化学結合によって網目状構造をとり、網目に多量の水を保有しているという特徴を有する、いわゆるハイドロゲルであればよいが、好ましくは、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、ｐ−スチレンスルホン酸（ＳＳ）またはそのスルホン酸基に金属もしくは塩基が付加された塩をモノマー単位として含むハイドロゲル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）をモノマー単位として含むハイドロゲル、ビニルアルコールをモノマー単位として含むハイドロゲルまたは２種以上の前記モノマー単位を含むハイドロゲルよりなる群から選ばれるハイドロゲルである。
【００１８】
本発明において好ましいハイドロゲルの一つは、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）またはそのスルホン酸基に金属もしくは塩基が付加された塩をモノマー単位として含むハイドロゲルである。このようなゲルとしては、例えば、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）（ＰＡＭＰＳ）ゲルや、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩）ゲル、これらハイドロゲルが第１のポリマーであってその架橋網目構造に第２のポリマーが侵入した構造を有するハイドロゲル等を挙げることができるが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム（ＮａＡＭＰＳ）をモノマー単位として含んでいることが好ましく、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＡＭＰＳ）ゲルがより好ましい。
【００１９】
ここで、ＮａＡＭＰＳは以下の構造式I（化１）で示すことができる、マイナス電荷を有するモノマーであり、ＰＮａＡＭＰＳは以下の構造式II（化２）で示すことができる、マイナス電荷を有するポリマーである。
【化１】
2010158180.tif 000003
【化２】
2010158180.tif 000004
【００２０】
本発明において好ましいハイドロゲルのもう一つは、ｐ−スチレンスルホン酸（ＳＳ）またはそのスルホン酸基に金属もしくは塩基が付加された塩をモノマー単位として含むハイドロゲルである。このようなゲルとしては、例えば、ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸）（ＰＳＳ）ゲルや、ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸アルカリ金属塩）ゲル、これらハイドロゲルが第１のポリマーであってその架橋網目構造に第２のポリマーが侵入した構造を有するハイドロゲル等を挙げることができるが、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム（ＮａＳＳ）をモノマー単位として含んでいることが好ましく、ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＳＳ）ゲルがより好ましい。
【００２１】
ここで、ＮａＳＳは、以下の構造式III（化３）で示すことができる、マイナス電荷を有するモノマーであり、ＰＮａＳＳは以下の構造式IV（化４）で示すことができる、マイナス電荷を有するポリマーである。
【化３】
2010158180.tif 000005
【化４】
2010158180.tif 000006
【００２２】
本発明において好ましいハイドロゲルの別の一つは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）をモノマー単位として含むハイドロゲルである。このようなゲルとしては、例えば、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）ゲルやＰＤＭＡＡｍが第１のポリマーであってその架橋網目構造に第２のポリマーが侵入した構造を有するハイドロゲル等を挙げることができるが、ＰＤＭＡＡｍが好ましい。
【００２３】
ここで、ＤＭＡＡｍは以下の構造式V（化５）で示すことができる、中性モノマーであり、ＰＤＭＡＡｍは以下の構造式VI（化６）で示すことができる、中性ポリマーである。
【化５】
2010158180.tif 000007
【化６】
2010158180.tif 000008
【００２４】
ＰＮａＡＭＰＳゲル、ＰＮａＳＳおよびＰＤＭＡＡｍは、周知或いは公知の方法によって調製することができるが、例えば、Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｍ．等の方法（Chen Y. M., Shiraishi N., Satokawa H., Kakugo K., Narita T., Gong J. P., Osada Y., Yamamoto K., Ando J., Biomaterials 26：4588-4596（2005）） に従い、それぞれのモノマー溶液であるＮａＡＭＰＳ溶液、ＮａＳＳ溶液またはＤＭＡＡｍ溶液に適当なＵＶ開始剤と架橋剤とを加え、ラジカル重合させることによって調製することができる。これらＵＶ開始剤および架橋剤は、ＰＮａＡＭＰＳゲルが調製できれば特に限定されないが、例えば、ＵＶ開始剤として２−Ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃａｃｉｄを利用することができ、また、架橋剤としてＮ，Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ (ＭＢＡＡ)を利用することができる。また、ラジカル重合反応の条件は適宜選択することができ、例えば、前記Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｍ．等の方法における反応条件に従うことができる。具体的には、反応温度を２０℃〜３０℃、反応時間を６〜１０時間、前記ＵＶ開始剤の添加量を０．１ｍｏｌ％、架橋剤の添加量を２ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％の各範囲から適宜選択することができる。なお、ラジカル重合反応を行うに際し、不活性化ガスを用いたバブリング等によってＮａＡＭＰＳ溶液、ＮａＳＳ溶液またはＤＭＡＡｍ溶液の溶存酸素を不活性化ガスに置換することが好ましい。
【００２５】
本発明において好ましいハイドロゲルのもう一つは、ビニルアルコール（ＣＨ２ＣＨ−ＯＨ；ＶＡ）をモノマー単位として含むハイドロゲルであり、より好ましくはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である。ＰＶＡは、酢酸ビニルを重合して得たポリ酢酸ビニルを加水分解（けん化）する方法その他の周知或いは公知の方法によって調製することができる。
【００２６】
また、本発明のハイドロゲルは、前記２種以上のモノマー単位を含むハイドロゲルであってもよい。このようなゲルとしては、例えば、ＰＡＭＰＳ、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩）、ＰＳＳまたはポリ（ｐ−スチレンスルホン酸アルカリ金属塩）が第１のポリマーであってその架橋網目構造に第２のポリマーであるＰＤＭＡＡｍが侵入した構造を有するハイドロゲル等を挙げることができる。なお、このようなハイドロゲルは、例えば、本発明者等による発明に係る特願２００６−３５０５２６に記載されており、この内容は本明細書に包含される。
【００２７】
本発明に係る足場材料は、調製するハイドロゲルの形態を平板状または円盤状の薄膜とすることが好ましく、例えば、適当な間隔を空けた２枚のガラス板の間にモノマー溶液を充填してラジカル重合を行わせる等の方法によって、平板状または円盤状の薄膜に調製することができる。また薄膜の厚みは適宜決定することができるが、０．１ｍｍ〜１０ｍｍとするのが好ましく、０．２ｍｍ〜５ｍｍとするのがより好ましく、０．５ｍｍ〜３ｍｍとするのがさらに好ましい。
【００２８】
前述のように調製したハイドロゲルは、そのままヒトＥＳ細胞やヒトＡＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の未分化細胞の培養に供することができるが、未分化細胞の培養に適当な緩衝液中または細胞培養液中でハイドロゲルを膨潤させ、ゲル中の溶媒を交換することが好ましい。好適な緩衝液としては、実施例で使用される４−（−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液やウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ゼラチン水溶液の他、ＰＢＳ等を挙げることができる。また、好適な細胞培養液の種類及び組成は、未分化細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
また、個々の成分の正確な組成に従った既知組成培地を使用してもよく、そのような培地として、例えば、ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ (Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ)、ＲＰＭＩ１６４０ 、ＡＩＭ−Ｖ、ＡＤＣ、ＬＰＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、Ｈａｍ’ｓＦ１２、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＢＧＪ、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｌ−１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ−１５）、ＭｃＣｏｙ５Ａ、Ｍ１９９、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等を挙げることができる。さらに、必要に応じて、公知の構成の培地成分や、アール平衡塩溶液、ハンクス平衡塩溶液、ダルベッコＰＢＳ、スピナー塩溶液等の公知の平衡塩類組成成分、種々の細胞増殖因子、抗生物質、ビタミン類、ホルモン類、ｐＨ調整剤、血清、その他生物由来成分等を加えることができる。
【００３０】
なお、未分化細胞の培養に際し、ＵＶ滅菌やオートクレーブ滅菌等によりハイドロゲルを滅菌しておくことが好ましい。
【００３１】
前述のように調製したハイドロゲル上での未分化細胞の培養は、適当な容器に置いたハイドロゲルに適当な個数の未分化細胞を含む細胞懸濁液を加えることで行うことができる。例えば、ハイドロゲル単位面積（ｃｍ２）当たり１×１０４〜１×１０６個の未分化細胞を播種し、標準的な未分化細胞の培養条件下にハイドロゲルを置くことで行うことができる。例えば、培養条件は、２０℃ 〜 ４０℃の培養温度、１％ 〜１０％のＣＯ２雰囲気、２４時間〜１６８時間の培養時間から適宜選択することができる。
【００３２】
本発明においては、未分化の状態であるか否かの判断を、細胞の形態観察やアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色法によって行っている。細胞の形態観察は、培養ディスク上の細胞の形態を適当な倍率の顕微鏡を用いて観察し、コロニーの崩れや分化した細胞の存在を確認するものである。また、ＡＬＰ染色法は、培養ディスク上の細胞に基質としてリン酸エステル塩とジアゾニウム塩を含む反応溶液を添加することにより、細胞膜状に存在するアルカリフォスファターゼによってリン酸エステル塩が加水分解され、さらにジアゾニウム塩とカップリング反応することによりアゾ色素が生じ、ＡＬＰ活性部位に色素が沈殿する。こうして染色されたコロニー数を計測することにより、細胞のＡＬＰ活性を定量化することが可能となり、これにより細胞の未分化度合いを定量することができる。
【００３３】
ＡＬＰ染色は、適宜ＡＬＰ染色液を調製して行ってもよく、市販のキットを用いて行ってもよい。このような市販のキットとしては、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社）、Ｎｅｗ Ｆｕｃｈｓｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ社）、ＳｔｅｍＴＡＧ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｒｏｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）等を挙げることができる。
【００３４】
また、未分化の状態であるか否かの判断は、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて未分化マーカー遺伝子を含む細胞分化マーカー遺伝子の発現量を定量することにより行ってもよい。
【００３５】
ＲＴ−ＰＣＲは、通常の実験書の記載に従って行うことができ、そのような実験書として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、２００１年版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を挙げることができる。
【００３６】
また、ＲＴ−ＰＣＲはｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後に行ってもよく、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出せずに行う、いわゆるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ってもよい。前者の場合、ＲＮＡの抽出には、例えば、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）、ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）、Ｃｏｎｃｅｒｔ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｒｅｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）等を用いることができ、ＲＴ−ＰＣＲ法には、例えば、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＬＵＳ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｒｏｃｈｅ社)、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ (タカラバイオ社)、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ 、ＰＬＡＴＩＵＭ ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ（いずれもＧｉｂｃｏ社)、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００、同７９００（いずれもＡＢＩ社）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。一方、後者の場合、例えば、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ II（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）、ＣｅｌｌＡｍｐ Ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ（タカラバイオ社）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）等を用いることができる。
【００３７】
さらに、未分化の状態であるか否かの判断は、胚性幹細胞の未分化マーカーＳＳＥＡ−１抗原の発現を、抗ＳＳＥＡ−１抗体（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２（１１４），１９９８）染色とフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；ＦＣＭ）とを用いて確認することにより行ってもよい。
【００３８】
なお、フローサイトメトリーはフローサイトメーターやフローサイトメトリーシステムを用いて行うことができ、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社やＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社等の各種フローサイトメーターやフローサイトメトリーシステムを挙げることができる。
【００３９】
以下、本発明に係る足場材料について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
（１）ＰＮａＡＭＰＳゲルの調製
２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（ＮａＡＭＰＳ）、ＵＶ開始剤である０．１ｍｏｌ％の２−Ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄおよび架橋剤である４ｍｏｌ％のＮ，Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＭＢＡＡ）を含む水溶液２０ｍＬを調製し、窒素バブリングによって溶存酸素を窒素置換した。ＰＮａＡＭＰＳのモノマー濃度（架橋密度）は、０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％および１５ｍｏｌ％の６種類を用意した。
【００４１】
窒素置換後の各モノマー溶液を、１０×１０ｍｍ四方の２枚のガラス基板で１．５ｍｍのシリコンスペーサーを挟むことにより形成された鋳型に流し込んだ後、室温で６時間重合させて、架橋密度がそれぞれ０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％ル、１０ｍｏｌ％および１５ｍｏｌ％であるポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＡＭＰＳ）ゲルを得た。
【００４２】
ガラス基板から各ハイドロゲルを取り出し、１Ｌの蒸留水を一日ごと交換することにより一週間膨潤させた後、ハイドロゲルを１５．５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１４０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭの４−（−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）に一週間浸漬することにより、ハイドロゲルの溶媒交換を行った。
【００４３】
（２）Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ゲルの調製
Ｆａ（モル比）＝［ＮａＡＭＰＳモノマー濃度（架橋密度）］／［Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）モノマー濃度（架橋密度）＋ＮａＡＭＰＳモノマー濃度（架橋密度）］と定義し、このＦａ値がそれぞれ０．１、０．２、０．３、０．５、０．６および０．８であって、かつ架橋密度がいずれも４ｍｏｌ％のポリ｛（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）｝｛Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）｝ゲルを調製した。
【００４４】
具体的には、１ｍｏｌ／ＬのＮａＡＭＰＳ、ＮａＡＭＰＳに対し４ｍｏｌ％のＭＢＡＡおよびＮａＡＭＰＳに対し０．１ｍｏｌ％のα−ケトグルタル酸を含む水溶液にＵＶ（波長３６５ｎｍ）を６時間当て、架橋度４ｍｏｌ％のＰＮａＡＭＰＳを得た。
【００４５】
Ｆａ値に応じた１ｍｏｌ／ＬのＮａＡＭＰＳとＤＭＡＡｍのモノマー混合溶液、ＮａＡＭＰＳとＤＭＡＡｍモノマー混合溶液に対し４ｍｏｌ％のＭＢＡＡおよびＮａＡＭＰＳとＤＭＡＡｍモノマー混合溶液に対し０．１ｍｏｌ％のα−ケトグルタル酸を含む水溶液を調製し、窒素バブリングによって溶存酸素を窒素置換した後、１０×１０ｍｍ四方の２枚のガラス基板で１．５ｍｍのシリコンスペーサーを挟むことにより形成された鋳型に流し込み、封をした後、ＵＶ（波長３６５ｎｍ）を６時間当て、Ｆａ値がそれぞれ０．１、０．２、０．３、０．５、０．６および０．８であって、かつ架橋密度がいずれも４ｍｏｌ％のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ゲルを得た。得られたＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ゲルの溶媒交換は本実施例（１）と同様にして行った。
【００４６】
（３）ハイドロゲルディスクの調製
溶媒交換した本実施例（１）および（２）の各ハイドロゲルをシャーレに移し、１２１℃ 、２０分オートクレーブ滅菌後、各ハイドロゲルから直径１５ｍｍ、厚さ１〜３ｍｍのハイドロゲルディスク｛架橋密度がそれぞれ０．５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、１ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、２ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、４ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、１０ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクおよび１５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、ならびに架橋密度がいずれも４ｍｏｌ％であってＦａ値がそれぞれ０．１のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク、０．２のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク、０．３のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク、０．５のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク、０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクおよび０．８のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク｝を調製した。
【００４７】
（４）マウスＥＳ細胞のハイドロゲルディスク上での培養
本実施例（３）で調製したディスクを２４穴ポリスチレン（ＰＳ）ディッシュにそれぞれ置き、その上から未分化細胞培養液として２０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（ＩＢＬ）０．５ｍＬ／ウェル加え、２４時間後にこの溶液を取り除いた後、１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＭＧＺ５マウス胚幹細胞（以下、「マウスＥＳ細胞」という。）懸濁液（２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）１ｍＬ／ウェル加えた。この２４穴ＰＳディッシュを３７℃ 、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内に置き、マウスＥＳ細胞を培養した。
【００４８】
＜実施例２＞
（１）ＰＮａＳＳゲルディスクの調製
架橋密度がそれぞれ２ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％および１５ｍｏｌ％のポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＳＳ）ゲルからなる直径１５ｍｍ、厚さ１〜３ｍｍのディスクを、実施例１（１）および（３）に記載の方法に従って調製した。
【００４９】
（２）Ｐ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの調製
Ｆｂ（モル比）＝［ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム（ＮａＳＳ）モノマー濃度（架橋密度）］／［ＤＭＡＡｍモノマー濃度（架橋密度）＋ＮａＳＳモノマー濃度（架橋密度）］と定義し、このＦｂ値がそれぞれ０．０５、０．１、０．２および０．５であって、かつ架橋密度がいずれも４ｍｏｌ％のポリ｛（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）−（Ｎ’，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）｝｛Ｐ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）｝ゲルからなる直径１５ｍｍ、厚さ１〜３ｍｍのハイドロゲルディスク｛架橋密度がいずれも４ｍｏｌ％であってＦｂ値がそれぞれ０．０５のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク、０．１のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク、０．２のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクおよび０．５のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク｝を、実施例１（２）および（３）に記載の方法に従って調製した。
【００５０】
（３）マウスＥＳ細胞のハイドロゲルディスク上での培養
本比較例（１）および（２）で調製したそれぞれのＰＮａＳＳディスクおよびＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクを、実施例１（３）と同様にオートクレーブ滅菌し、実施例１（４）に記載の条件の下、２４穴ＰＳディッシュ内にそれぞれ置いてマウスＥＳ細胞の培養を行った。
【００５１】
＜実施例３＞
（１）ＰＤＭＡＡｍゲルディスクの調製
架橋密度がそれぞれ１ｍｏｌ％および２ｍｏｌ％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）ゲルからなる直径１５ｍｍ、厚さ１〜３ｍｍのディスクを、実施例１（１）および（３）に記載の方法に従って調製した。
【００５２】
（２）マウスＥＳ細胞のハイドロゲルディスク上での培養
本実施例（１）で調製したそれぞれのＰＤＭＡＡｍディスクを、実施例１（３）と同様にオートクレーブ滅菌し、実施例１（４）に記載の条件の下、２４穴ＰＳディッシュ内にそれぞれ置いてマウスＥＳ細胞の培養を行った。
【００５３】
＜実施例４＞
（１）ＰＶＡゲルディスクの調製
ＰＶＡ粉末（重合度２，０００、分子量約９０，０００）を５重量％と１０重量％とになるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と水の混合溶媒（ＤＭＳＯと水との重量比３：１）に９０℃で溶解したそれぞれの溶液を、実施例１の（２）と同様にしてガラスの型に流し込み、−４０℃で１６時間凍結した後に室温で解凍してゲルを形成させた。ガラス基板からそれぞれのゲルを取り出し、１Ｌの蒸留水を一日ごとに交換することによって一週間膨潤させた後、ゲルを１５．５ｍＭのＮａＨＣＯ３および１４０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭの４−（−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）に一週間浸漬して溶媒交換を行い、５％ＰＶＡゲルディスクおよび１０％ＰＶＡゲルディスクを調製した。
【００５４】
（２）マウスＥＳ細胞のハイドロゲルディスク上での培養
本実施例（１）で調製したそれぞれのＰＶＡゲルディスクを、７５％のエタノール中に浸漬、ＵＶランプを用いて一晩で滅菌し、実施例１（４）に記載の条件の下、２４穴ＰＳディッシュ内にそれぞれ置いてマウスＥＳ細胞の培養を行った。
【００５５】
＜比較例＞
２４穴ＰＳディッシュの上から直接に０．１％ゼラチンを０．４ｍＬ／ウェル加え、３７℃ 、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内に３０分間置いてゼラチンコーティングすることによりＰＳディスクを調製し、実施例１（４）に記載の条件下でマウスＥＳ細胞の培養を行い、比較例とした。
【００５６】
＜試験例１＞  マウスＥＳ細胞コロニーの形態観察
実施例１〜４の各ハイドロゲルディスクおよび比較例として調製したＰＳディスクについて、ディスク上でのマウスＥＳ細胞コロニーの形態を、位相差顕微鏡を用いて時系列に観察し、下記（１）〜（６）の結果を得た。
【００５７】
（１）ＰＮａＡＭＰＳディスク上でのマウスＥＳ細胞コロニーの形態
架橋密度が０．５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクにおいて、マウスＥＳ細胞コロニーは良好に成長し、１２０時間培養後には、はっきりした輪郭を持つコロニーが確認された（図１）。架橋密度が２ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク上では、４８時間培養後には直径約１０μｍのマウスＥＳ細胞コロニーが形成され、１６８時間培養後には直径約１５〜３５μｍにまで成長した。なお、架橋密度が２ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク上では、９６時間培養後には分化した細胞が若干観察されたものの、その後も分化した細胞は少数観察されるにとどまった（図２）。また、架橋密度が１５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク上では、４８時間培養後には直径約１０μｍのマウスＥＳ細胞コロニーが形成され、これが１６８時間培養後には直径約２５〜５５μｍにまで成長したが、７２時間培養後には分化した細胞が観察され、１２０時間培養後までにマウスＥＳ細胞コロニーの輪郭の崩れが確認され、さらに１６８時間培養後には、架橋密度が２ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク上のものと比較して、分化した細胞が多数観察された（図３）。
【００５８】
（２）Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク上でのマウスＥＳ細胞コロニーの形態
架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．１のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおいて、マウスＥＳ細胞コロニーは良好に成長し、１６８時間培養後には直径約５０μｍにまで成長した。ただし、観察されたマウスＥＳ細胞コロニーの数は時間の経過とともに減少する傾向が認められた（図４）。また、架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．３のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク上でもマウスＥＳ細胞コロニーは良好に成長するが、１２０時間培養後にマウスＥＳ細胞コロニーの輪郭の崩れが確認されはじめ、１６８時間経過後にはマウスＥＳ細胞コロニーは観察されなくなった（図５）。架橋密度がいずれも４ｍｏｌ％であってＦａ値がそれぞれ０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクおよび０．８のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクの場合においても、架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．３のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク上と同様の傾向を示した（図６および図７）。
【００５９】
（３）ＰＮａＳＳディスク上でのマウスＥＳ細胞コロニーの形態
架橋密度が２ｍｏｌ％ＰＮａＳＳディスク上では、７２時間培養後までマウスＥＳ細胞コロニーの輪郭の維持が確認された。その後、この輪郭の崩れが確認されたものの、１２０時間培養後でもマウス細胞コロニーを観察することができた（図８）。また、架橋密度が４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳディスク上では、４８時間経過後には直径約１０〜２０μｍのマウスＥＳ細胞コロニーが形成され、９６時間経過後にはマウスＥＳ細胞コロニーが直径約２５〜５５μｍにまで成長した。ただし、９６時間培養によってコロニーの輪郭に若干の崩れが観察された（図９）。架橋密度が１５ｍｏｌ％ＰＮａＳＳディスクの場合においても、これと同様の傾向を示した（図１０）。
【００６０】
（４）ＰＤＭＡＡｍディスク上でのマウスＥＳ細胞コロニーの形態
架橋密度がそれぞれ１ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍディスクおよび２ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍディスク上では、ＰＤＭＡＡｍの架橋密度に関係なくマウスＥＳ細胞コロニーの成長が観察されるが、その成長速度は７２時間培養後から遅くなりはじめ、１２０時間培養後にはほぼ成長が停止した（図１１および図１２）。
【００６１】
（５）Ｐ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク上でのマウスＥＳ細胞コロニーの形態
架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦｂ値が０．０５のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおいて、マウスＥＳ細胞コロニーは培養時間に伴って成長し、１６８時間培養後には直径約５０μｍにまで成長した。ただし、観察されたマウスＥＳ細胞コロニーの数は、時間の経過とともに減少する傾向が認められた（図１３）。架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦｂ値が０．１のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクにおいてもこれと同様の傾向を示した（図１４）。一方、架橋密度がいずれも４ｍｏｌ％であってＦｂ値がそれぞれ０．２のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクおよび０．５のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク上では、マウスＥＳ細胞コロニーは培養時間に伴って成長するが、１２０時間培養後にコロニーの輪郭の崩れが確認された（図１５および図１６）。
【００６２】
架橋密度がそれぞれ０．５ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％および１５ｍｏｌ％のＰＮａＡＭＰＳディスク、ならびに架橋密度がそれぞれ２ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％および１５ｍｏｌ％のＰＮａＳＳディスクの弾性率および膨潤度を示した表を図１７に、ＰＮａＡＭＰＳディスクにおける架橋密度と９６時間培養後のＥＳ細胞コロニーの数との関係を示したグラフを図１８に示す
【００６３】
（６）ＰＶＡディスク上でのマウスＥＳ細胞コロニーの形態
５ｗｔ％ＰＶＡゲルディスクおよび１０ｗｔ％ＰＶＡゲルディスクでは、いずれも１２０時間培養までマウスＥＳ細胞コロニーの成長が観察された（図１９および図２０）。
【００６４】
（７）ＰＳディスク上でのマウスＥＳコロニーの形態
比較例であるＰＳディスク上でのマウスＥＳ細胞コロニーの形態を、位相差顕微鏡を用いて時系列に観察した結果（写真）を図２１〜図２５に示す。２４時間培養後にＰＳディスク上に伸展した細胞が観察された。これらの細胞は培養時間とともに増殖し、７２時間培養後には大量の伸展した細胞と少量の小さい丸い細胞が観察された。さらに９６時間培養後には、小さい丸い細胞が伸展した細胞の上に重なっているような状態が観察され、１２０時間培養後にこのような状態の細胞が大量に増加した。一方、前記ハイドロゲルを用いた場合の結果と異なり、ＰＳディスク上では、培養過程中に細胞によるコロニー形成は確認できなかった。これらの結果は、ＰＳディスク上で培養した細胞の多くが分化した細胞であると推察した。
【００６５】
以上より、細胞形態の顕微鏡観察の結果によると、いずれのハイドロゲル上でも、マウスＥＳ細胞は未分化の状態でコロニーを形成し、増殖することが分かる。また、架橋密度が同じＰＮａＡＭＰＳディスクとＰＮａＳＳディスクとを比較した場合、ＰＮａＡＭＰＳディスク上ではＰＮａＳＳディスク上よりもマウスＥＳ細胞コロニーが成長し、かつ分化した細胞が少数となることが分かる。また、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクとＰＤＭＡＡｍディスクとを比較した場合、ＰＤＭＡＡｍディスク上でのマウスＥＳ細胞コロニーの数は時間の経過とともに減少する傾向にあるが、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスクを用いた場合は、そのＦａ値により、ＰＤＭＡＡｍディスクを用いた場合と比較して成長したマウスＥＳ細胞コロニーの数は減少せず、その形態が維持されることが分かる。さらに、架橋密度が異なるＰＮａＡＭＰＳディスクを互いに比較した場合、架橋密度すなわち弾性率の低いＰＮａＡＭＰＳディスク上では、弾性率の高いＰＮａＡＭＰＳディスク上よりも成長したマウスＥＳ細胞コロニーの数は多く、その形態が維持されることが分かる。
【００６６】
＜試験例２＞  マウスＥＳ細胞の未分化性確認試験（ＡＬＰ染色）
（２）ＡＬＰ染色
実施例１（３）で調製した架橋密度がそれぞれ０．５、４、１０、１５ｍｏｌ％のＰＮａＡＭＰＳディスクおよび架橋密度がいずれも４ｍｏｌ％であってＦａ値がそれぞれ０．５、０．６、０．８のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク、実施例２（２）で調製した架橋密度がいずれも４ｍｏｌ％であってＦｂ値がそれぞれ０．２、０．５のＰ（ＮａＳＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク、ならびに比較例で調製したＰＳディスクの各々のディスク上でマウスＥＳ細胞を１２０時間培養後、ＰＢＳで洗浄し、ウェル中の細胞をＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｒｏｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）のプロトコールに従ってＡＬＰ染色した。その結果（写真）を図２６〜３５に示す。また、それぞれのディスク上のマウスＥＳ細胞コロニーのうちＡＬＰ陽性を呈したコロニーの割合を示したグラフを図３６に示す。
【００６７】
以上より、架橋密度がそれぞれ０．５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、４ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、１０ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、１５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク上で１２０時間培養したマウスＥＳ細胞において、その９０％以上のコロニーがＡＬＰ陽性を呈することが分かる。また、架橋密度が０．５ｍｏｌ％のＰＮａＡＭＰＳディスクおよび架橋密度が４ｍｏｌ％であってＦａ値が０．５のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＤＭＡＡｍ）ディスク上では、ＡＬＰ陽性を呈するマウスＥＳ細胞コロニーの割合が最も高いことが分かる。
【００６８】
＜試験例３＞  ＲＴ−ＰＣＲ法による細胞分化マーカー遺伝子発現の定量
実施例１（３）で調製した、架橋密度がそれぞれ０．５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、１ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、２ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、４ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、１０ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスクおよび１５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク上で１２０時間培養したマウスＥＳ細胞から、ＴａｑＭａｎ ＧＡＰＤＨ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＡＢＩ社）のプライマーおよびＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を使用して鋳型サンプルを作製した。次いで、ＰＳディスク上のマウスＥＳ細胞の各遺伝子の発現量をコントロールとして、未分化マーカー遺伝子であるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２およびＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１（以下、「ＤＰＰＡ５」という場合がある。）、外胚葉系分化マーカー遺伝子であるＮｅｓｔｉｎおよびＯｔｘ２、内胚葉系分化マーカー遺伝子であるＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ１７、およびＮＨＦ−３βＦｏｘＡ２、中胚葉系分化マーカー遺伝子であるＢｒａｃｈｙｕｒｙについての発現量をｍＲＮＡレベルで調べるため、インターカレーターであるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ I（タカラバイオ社）の存在下、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ II（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）を用いてリアルタイムＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲにより調べた。その結果を図３７〜４０に示す。
【００６９】
未分化マーカー遺伝子であるＮａｎｏｇの発現量は、架橋密度にかかわらずＰＮａＡＭＰＳディスク上で培養したマウスＥＳ細胞で多く、ＳＯＸ２の発現量は、架橋密度が０．５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク以外のＰＮａＡＭＰＳディスク上で培養したマウスＥＳ細胞において多いことが分かる。また、Ｏｃｔ３／４およびＤＰＰＡ５の発現量は、架橋密度が０．５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳ上で培養したマウスＥＳ細胞において最も多いが、ＰＳディスク上で培養したのとほとんど差がないことが分かる（図３７）。
【００７０】
外胚葉系分化マーカー遺伝子であるＮｅｓｔｉｎおよびＯｔｘ２の発現量については、ＰＮａＡＭＰＳディスク上で培養したマウスＥＳ細胞におけるＮｅｓｔｉｎの発現量は、架橋密度にかかわらず少なく、Ｏｔｘ２の発現量は、ＰＳディスク上で培養したのと同等またはそれ以上発現することが分かる（図３８）。
【００７１】
内胚葉系分化マーカー遺伝子であるＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ１７、およびＮＨＦ−３βＦｏｘＡ２の発現量については、いずれもＰＳディスク上で培養したマウスＥＳ細胞において多く、ＰＮａＡＭＰＳディスク上で培養したマウスＥＳ細胞において少ないことが分かる（図３９）。
【００７２】
中胚葉系分化マーカー遺伝子であるＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現量については、いずれもＰＳディスク上で培養したマウスＥＳ細胞において多く、ＰＮａＡＭＰＳディスク上で培養したマウスＥＳ細胞において少ないことが分かる（図４０）。
【００７３】
＜試験例４＞  フローサイトメトリーを用いた未分化状態の確認
実施例１〜４に記載の方法に準じて、０．５ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、２ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、１０ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳディスク、０．５ｍｏｌ％ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）（ＰＡＭＰＳ）ディスク、２ｍｏｌ％ＰＡＭＰＳディスク、２ｍｏｌ％ＰＮａＳＳディスク、４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳディスク、１５ｍｏｌ％ＰＮａＳＳディスク、５ｗｔ％ＰＶＡディスク、１０ｗｔ％ＰＶＡディスク、１ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍディスク、８ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍディスクおよび１５ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍディスクを調製した。
【００７４】
上記各ディスクについて、試験例１に示した培養を、マウスＥＳ細胞の分化を阻止する機能を有することが知られているニワトリ白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ；ＬＩＦ）を含む培地とこれを含まない培地とをそれぞれ用いて行った。
【００７５】
培養後の各ディスクに１ｍＬのＰＢＳ溶液を加えてＥＳ細胞を洗浄後、さらに５ｍＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液１ｍＬを加えた。室温で１５分間静置後、セルスクレイパーでゲルから細胞を剥がして、回収された細胞を含むＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液を調製した。この溶液５ｍＬをポリスチレン丸底チューブに移し、１３００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して、細胞を回収した。ここにＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）ラベルしたマウス抗ＳＳＥＡ−１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）５μＬを加え、氷上で１時間遮光下で細胞を静置した。この後、１％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）を含むＰＢＳ溶液１ｍＬを加え、１３００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心する洗浄を２回行った。洗浄後の細胞に１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液２００μＬを加え、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で細胞表面に結合したＦＩＴＣラベルしたマウス抗ＳＳＥＡ−１抗体の蛍光値を測定した。コントロールは、比較例のＰＳディスク上で培養した細胞を上記と同様に処理したものを用意した。前期蛍光値の平均値を図４１に示す。
【００７６】
コントロールであるＰＳディスク上のＥＳ細胞に関する平均蛍光値と比較すると、本発明であるハイドロゲルからなるディスク上のＥＳ細胞に関する平均蛍光値はいずれも高く、特にＰＶＡディスク及びＰＤＭＡＡｍディスク上のＥＳ細胞に関する平均蛍光値はコントロールの平均蛍光値の１０〜２０倍となっていた。これらの結果は、本発明であるハイドロゲルディスク上で培養されたＥＳ細胞が高い未分化性を維持していることを示すものである。
【００７７】
また、培地中にＬＩＦが存在しない場合には、マイナス電荷を有するＰＮａＡＭＰＳディスクおよびＰＮａＳＳディスク上で培養したＥＳ細胞の平均蛍光値は、培地中にＬＩＦが存在する場合の平均蛍光値より高いが、電荷が中性であるＰＶＡディスク及びＰＤＭＡＡｍディスク上で培養したＥＳ細胞の平均蛍光値は、培地中にＬＩＦが存在する場合とＬＩＦが存在しない場合でほぼ同等であった。
【００７８】
以上の実施例および試験例より、ＰＮａＡＭＰＳディスク上で培養したマウスＥＳ細胞は未分化が維持される傾向が、ＰＳディスク上で培養したマウスＥＳ細胞は内胚葉系または中胚葉系の細胞に分化する傾向がみられることが分かる。
【００７９】
以上のように、ウイルス感染や異種細胞との接触等の問題を生ずることなく、未分化細胞に酸素と栄養とを十分かつ効率的に補給することができ、ハイドロゲル上で未分化細胞を未分化の状態で培養することができる。
【００８０】
なお、本発明に係る足場材料は、前述した実施例に限定されるものではなく、適宜変更することができる。例えば、本発明に係る足場材料を分化細胞（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ）や前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の培養に用いてもよい。
【図１７】
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【図３６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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