(57)【要約】【課題】  本発明は、放射性標識を使用することなく、高感度で簡便にＡＣＣの活性を測定するための新規な測定方法、及びそれ用いた被検物質のＡＣＣ活性をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】  本発明は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成するＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、次いで当該過酸化水素を定量することを特徴とするアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法、及びそれを用いたＡＣＣ活性をスクリーニングする方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成するＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、次いで当該過酸化水素を定量することを特徴とするアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法。
【請求項２】
ピルビン酸オキシダーゼを用いる酵素反応が、リン酸の存在下で行われるものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リン酸が、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成したリン酸である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
過酸化水素を定量する方法が、パーオキシダーゼを用いた蛍光試薬を用いる方法である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
蛍光試薬が、アンプレックスレッドであり、パーオキシダーゼとの酵素反応によるレゾルフィンの生成量を測定するものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法が、ワンポットで行われる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが、そのサブタイプである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法が、被検物質を含有した測定系で行われる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを含有していることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の測定方法を行うための検査キット。
【請求項１０】
被検物質を含有する測定系において請求項１〜８のいずれかに記載のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法を行って、当該被検物質のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに対する活性を測定することにより、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに対する活性をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに対する活性の測定が、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性阻害を測定する方法である請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法に関し、より詳細には、本発明は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成するＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、次いで当該過酸化水素を定量することを特徴とするアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）は、次に示す反応式により、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換すると同時に、ＡＴＰからＡＤＰ及びリン酸に変化させる酵素である。
ビオチン酵素＋ＨＣＯ３−＋ＡＴＰ  →  −ＣＯ２−ビオチン酵素＋ＡＤＰ＋リン酸
−ＣＯ２−ビオチン酵素＋アセチル−ＣｏＡ  →  ビオチン酵素＋マロニル−ＣｏＡ
全体としては次の反応式となる。
ＨＣＯ３−＋ＡＴＰ＋アセチル−ＣｏＡ  →  ＡＤＰ＋リン酸＋マロニル−ＣｏＡ
【０００３】
ＡＣＣの産物であるマロニル−ＣｏＡは、脂肪酸の生合成及び炭素鎖延長による長鎖脂肪酸合成における前駆体であり、ＡＣＣは脂肪酸の生合成の律速酵素と考えられている。また、細胞内にＡＣＣの産物であるマロニル−ＣｏＡが大量に存在する場合、カルニチンパルミチン酸転移酵素Ｉ（ＣＰＴ−Ｉ）を阻害して脂肪酸のミトコンドリアへの輸送が阻害され、脂肪酸酸化が抑制される。ＡＣＣを欠損したマウスは脂肪酸の酸化が高レベルになり、体脂肪と体重の低下が見られることより、ＡＣＣの阻害剤は抗肥満薬の候補となると考えられている（特許文献１及び２参照）。また、ＡＣＣを活性化させて細胞内に大量のマロニル−ＣｏＡを生成させることにより、細胞内のＣｏＡを低下させ癌細胞を死滅させることも報告されている（特許文献３参照）。
【０００４】
このように、ＡＣＣは脂肪酸の代謝や分解をコントロールする重要な役割を持ち、サブタイプとしてＡＣＣ１及びＡＣＣ２が知られている。ＡＣＣ１は、肝臓や脂肪組織に多く発現し、主に脂質合成に関わる組織に存在する。ＡＣＣ２は、心臓や骨格筋に多く発現し、主に脂肪酸のβ酸化に関わる組織に存在する。
ＡＣＣ１やＡＣＣ２の阻害により、マロニル−ＣｏＡレベルが低下することにより、肝臓などの脂肪組織における長鎖脂肪酸合成が抑制され、骨格筋などにおける脂肪酸β酸化が亢進され、脂肪酸の利用の増加が促される。
したがって、ＡＣＣ１又はＡＣＣ２の活性を阻害するＡＣＣ阻害剤は、メタボリックシンドローム、高脂血症、肥満症、高血圧症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症と関連する心血管疾患などの予防及び治療に極めて有用であると考えられている。また、ＡＣＣの活性促進剤は、抗癌剤への利用も検討されている（特許文献３参照）。
【０００５】
このために、ＡＣＣの活性を測定するための多数の測定系が提案されてきている。提案されている測定系としては、（１）放射能標識体を用いる方法、（２）リン酸を測定する方法、（３）ＡＤＰを測定する方法、及び（４）マロニルＣｏＡを測定する方法などが報告されている。
放射能標識体を用いる方法としては、炭素１４で標識された炭酸塩を用いて生成したマロニルＣｏＡの放射能を測定することによりＡＣＣの活性測定を測定する方法がある（非特許文献１参照）。また、炭素１４で放射能標識したアセチルＣｏＡを用いて生成するマロニルＣｏＡの放射能を測定する方法（特許文献１参照）、生成したマロニルＣｏＡを、さらに脂肪酸合成酵素を用いて生成したパルミチン酸を測定することによりＡＣＣの活性測定を測定する方法がある（特許文献４参照）。
これらの方法は、放射能標識体を用いることにより、感度の高い測定が可能ではあるが、特殊な施設でないと測定できないことや、廃棄物に対しても環境汚染の問題が生じるなどの大きな問題がある。
リン酸を測定する方法としては、マラカイドグリーン試薬を用いて生成したリン酸を測定することによりＡＣＣの活性測定を行う方法（特許文献２参照）や、生成したリン酸をマルトースホスホリラーゼ、グルコースオキシダーゼ、パーオキシダーゼをもちいてレゾルフィンの生成量を測定することにより、ＡＣＣの活性測定を行う方法（非特許文献２参照）がある。この方法は放射性化合物を使用しないメリットはある。しかし、ＡＣＣ阻害剤のスクリーニングを行う方法として、リン酸を測定するよりもＡＤＰを測定した方がＡＣＣに対してより選択性が高いことが報告されており（非特許文献２参照）、測定感度に大きな問題があった。
【０００６】
ＡＤＰを測定する方法としては、生成したＡＤＰと蛍光標識したＡＤＰ抗体（Alexa-633）とを抗原抗体反応により結合させると、みかけ上の分子量が大きくなり、蛍光偏光が増大する。この蛍光偏光を測定することによりＡＣＣの活性測定を行う方法（非特許文献２参照）がある。この方法は、前記したリン酸を測定する方法に比べれば感度は高いが、ＡＤＰ抗体の特性としてＡＴＰが約１００分の１の交叉性を持つため、ＡＤＰの生成量が少ない場合には測定誤差が大きくなるだけでなく、特殊な蛍光偏光測定装置が必要とされるので、簡便な測定方法ではない。また、次の反応式（１）〜（３）により、生成したＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ（下記反応式（２）参照）、乳酸脱水素酵素を用いて（下記反応式（３）参照）ＮＡＤＨの減少量を測定することにより、ＡＣＣの活性測定を行う方法（非特許文献３参照）がある。
ＨＣＯ３−  ＋  ＡＴＰ  ＋  アセチル−ＣｏＡ  
→  ＡＤＰ  ＋  リン酸  ＋  マロニル−ＣｏＡ  （１）
ホスホエノールピルベート  ＋  ＡＤＰ  →  ピルベート  ＋  ＡＴＰ  （２）
ピルベート  ＋  ＮＡＤＨ  ＋  Ｈ＋  →  乳酸  ＋  ＮＡＤ＋        （３）
ＮＡＤＨは３４０ｎｍに吸収があり、これがＮＡＤ＋に変化することにより吸収が減少するため、３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。この方法は放射性化合物を使用しないメリットはあるが、測定感度が低い。
マロニルＣｏＡを測定する方法としては、下記の反応式（１）、（４）、及び（５）により、まず反応式（１）で生成したマロニルＣｏＡを脂肪酸合成酵素により脂肪酸とＣｏＡにする（下記反応式（４）参照）。次いで、ＣｏＡを蛍光試薬（ＣＰＭ）により測定することによりＡＣＣの活性測定を行う方法（非特許文献４参照）がある。
ＨＣＯ３−  ＋  ＡＴＰ  ＋  アセチル−ＣｏＡ  
→  ＡＤＰ  ＋  リン酸  ＋  マロニル−ＣｏＡ  （１）
マロニル−ＣｏＡ  ＋  アセチル−ＣｏＡ  ＋  ＡＴＰ  ＋  ＮＡＤＰＨ
→  パルミチン酸  ＋  ＡＤＰ  ＋  ＮＡＤＨ  ＋  ＣｏＡ  （４）
ＣｏＡ  ＋  ＣＰＭ    →  ＣｏＡ−ＣＰＭ                          （５）
ＣｏＡ−ＣＰＭは励起波長４０５ｎｍで励起され、５３０ｎｍの蛍光を発する。
この方法は、脂肪酸合成酵素が市販されていないので、動物臓器又は酵素発現細胞から精製して使用しなければならず、汎用性に乏しい。また、脂肪酸合成酵素に対する影響についても考慮する必要があると思われる。
【０００７】
このように、ＡＣＣの阻害活性の測定方法の殆どの場合は、感度の点から放射能標識した化合物を用いた方法によっているが、実施場所が限定されることや環境汚染の点などから放射能を用いない方法が望まれる。
しかし、マラカイドグリーン試薬などを使用してリン酸を測定する方法、ＡＤＰを測定するためにＬＤＨを用いたＵＶ法などの方法は測定感度が低いため多量の酵素が必要であるだけでなく、信頼性に乏しい。また、ＡＣＣ阻害剤のスクリーニングを行う方法としては、リン酸を測定するよりもＡＤＰを測定した方がＡＣＣに対してより選択性が高いことも報告されているが、感度よく簡便に測定できる方法は知られていなかった。
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１７９６２１号公報
【特許文献２】特開２００６−１３１５５９号公報
【特許文献３】特表２００３−５１６９３８号公報
【特許文献４】米国特許明細書第７，３８４，７５７号
【非特許文献１】Harwood H. J., Petras S. F., et al., J. Biol. Chem. (2003) 278, 37099-37111
【非特許文献２】Liu Y., Zalameda L., et al., Assay and drug development technologies  (2007) 5, 225-235
【非特許文献３】Weatherly S. C., Volrath S. L. et al., Biochem J. (2004) 380, 105-110
【非特許文献４】Chung C. C., Ohwaki K., et al., Assay and Drug Development Technology  (2008) 6, 361-374
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、放射性標識を使用することなく、高感度で簡便にＡＣＣの活性の測定のための新規な測定方法を提供する。また、本発明は、当該測定方法を用いた被検物質のＡＣＣ活性をスクリーニングする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害剤などの探索を行うために、高感度で実用性の高いＡＣＣ活性の測定方法の開発を行ってきた。放射性化合物を使用しないＡＣＣ活性の測定方法としては、この酵素反応で生成するマロニル−ＣｏＡやリン酸を測定する方法などが知られているが、いずれも感度の点で満足できるものではなかった。また、ＡＤＰを測定する方法も知られていたが、誤差が大きく感度も十分ではなく、満足できるものではなかった。そこで、本発明者らは、鋭意検討してきた結果、ＡＤＰを蛍光法により測定する方法により高感度でＡＣＣ活性が測定できる新規な方法を見出した。
【００１１】
即ち、本発明は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成するＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、次いで当該過酸化水素を定量することを特徴とするアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法に関する。
また、本発明は、このための測定用キット、及びこの方法を用いたスクリーニング方法に関する。
【００１２】
本発明をさらに詳細に説明すれば以下のとおりとなる。
（１）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の活性を測定する方法において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成するＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、次いで当該過酸化水素を定量することを特徴とするアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法。
（２）ピルビン酸オキシダーゼを用いる酵素反応が、リン酸の存在下で行われるものである前記（１）に記載の方法。
（３）リン酸が、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成したリン酸である前記（２）に記載の方法。
（４）過酸化水素を定量する方法が、パーオキシダーゼを用いた蛍光試薬を用いる方法である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）蛍光試薬が、アンプレックスレッドであり、パーオキシダーゼとの酵素反応によるレゾルフィンの生成量を測定するものである前記（４）に記載の方法。
（６）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法が、ワンポットで行われる前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが、そのサブタイプである前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法が、被検物質を含有した測定系で行われる前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを含有していることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれかに記載の測定方法を行うための検査キット。
（１０）被検物質を含有する測定系において前記（１）〜（８）のいずれかに記載のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法を行って、当該被検物質のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに対する活性を測定することにより、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに対する活性をスクリーニングする方法。
（１１）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに対する活性の測定が、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性阻害を測定する方法である前記（１０）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、生成したＡＤＰをピルビン酸キナーゼ、及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、これを定量する、例えば、パーオキシダーゼを用いてレゾルフィンの生成量を測定することにより、ＡＣＣの活性測定を行うことにより、放射性化合物を全く使用することなく、極めて高感度で、かつ簡便に測定することができる方法を提供する。本発明の方法は、高感度で、高信頼性で、かつ放射性物質による環境汚染も無い安全な方法である。また、本発明のこの方法を使用することにより、簡便で大量に各種の物質のＡＣＣ活性を測定することができ、被検物質をスクリーニングする方法として極めて優れている。さらに、本発明の方法は、ＡＣＣのサブタイプであるＡＣＣ１及びＡＣＣ２のいずれに対しても適用可能であり、いずれのサブタイプも使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の方法におけるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）［ＥＣ  ６．４．１．２．］としては、ＡＣＣ１（ＡＣＣ-α、ＡＣＡＣ、ＡＣＡＣＡ、ｔｇｆとしても知られている）と、ＡＣＣ２（ＡＣＣ-β、ＡＣＡＣＢ、ＡＣＣＢ、ＨＡＣＣ２７５としても知られている）のいずれのサブタイプであってもよい。また、その由来は特に制限されないが、入手の容易さや信頼性の観点からヒト又はラット由来のものが好ましい。
本発明の方法におけるピルビン酸キナーゼ［ＥＣ  ２．７．１．４０．］としては、哺乳動物の筋肉や心筋などの解糖組織に多く存在するＭ型、肝臓に主として存在するＬ型、脾臓に存在するＳ型、胎生組織に存在するＡ型（又はＫ型）があり、そのいずれでもよいが、好ましくはホスホエノールピルビン酸に親和性が高い活性型が挙げられる。この酵素の安定化のために、グリセロール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、フルクトース−１，６−ビスリン酸などを併用してもよい。
本発明の方法におけるピルビン酸オキシダーゼ［ＥＣ  １．２．３．３．］も、いずれのものでも使用できるが、大腸菌から純化されている市販のものが簡便で好ましい。使用に当たっては、比活性を上げるために脂質や界面活性剤を適宜添加して使用してもよい。
【００１５】
本発明における過酸化水素を定量する方法としては、公知の各種の方法を適用することができる。簡便で好ましい方法としては、蛍光試薬を使用した蛍光測定法が挙げられる。好ましい方法としては、例えば、パーオキシダーゼを用いてレゾルフィンの生成量を蛍光により測定する方法が挙げられる。レゾルフィンは励起波長５６０ｎｍで、５９０ｎｍの蛍光を発する。
本発明の方法は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の公知の反応条件下で行うことができる。例えば、ＡＣＣを含有するＡＣＣ溶液、好ましくは脂質を含有しないＢＳＡ、クエン酸カリウム、及びＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液に、被検物質の溶液（ＤＭＳＯ、及びＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液が好ましい。）を加え、３７℃付近で２０〜６０分間、好ましくは約３０分間プレインキュベーションした後、アセチル−ＣｏＡ、ＡＴＰ、及びＮａＨＣＯ３を含有する基質溶液（ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、ＭｇＣｌ２を含むものが好ましい。）を加えて、３７℃付近で３０分〜２時間、好ましくは約１時間反応させることにより行うことができる。
本発明のピルビン酸キナーゼによる反応は、前記したアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の反応生成物を用いて、これにホスホエノールピルビン酸を加えて、３７℃付近で３０分〜２時間、好ましくは約１時間反応させることにより行うことができる。本発明のピルビン酸キナーゼによる反応は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）による反応と同時に行うこともできる。この場合には、ＡＣＣをプレインキュベーションした後にＡＣＣの基質溶液と同時にピルビン酸キナーゼ及びホスホエノールピルビン酸を加えて、３７℃付近で３０分〜２時間、好ましくは約１時間反応させることにより行うことができる。
【００１６】
本発明のピルビン酸オキシダーゼによる反応は、前記したアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）及びピルビン酸キナーゼの反応生成物を用いて、３７℃付近で３分〜３０分、好ましくは３〜１０分、より好ましくは約５分間反応させることにより行うことができる。ピルビン酸オキシダーゼによる反応の際に、蛍光試薬及びパーオキシダーゼ、例えばＨＲＰ(horseradish peroxidase)を同時に加えておくことにより、同時に酸化反応を行うこともできる。
蛍光測定は公知の各種の方法で行うことができる。レゾルフィンを測定する場合には、例えば、モレキュラーデバイス社製Spectra Max Gemini EMにより励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定することができる。
本発明の方法は、
（１）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）による反応、
（２）ピルビン酸キナーゼによる反応、
（３）ピルビン酸オキシダーゼによる反応、及び、
（４）過酸化水素による反応、
の４段階の反応であるが、これらの反応を同じ反応容器内でワンポットで行うことができる。また、前記したように、（１）の反応と（２）の反応を同時に行い、（３）の反応と（４）の反応を同じ反応容器内で同時に行うこともできる。
【００１７】
本発明の方法をより詳細に説明するが、以下の説明は本発明を説明するためのものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。
ＡＣＣ阻害剤として公知のＣＰ−６４０１８６（Ｒ体）を使用して試験を行った。ＣＰ−６４０１８６は、非特許文献１やStructure, Vol. 12, 1683-1691(2004)に記載されている化合物であり、次の式、
【００１８】
【化１】
2010081894.tif 000002
【００１９】
で表される化合物である。
また、これらの試験におけるＡＣＣの１ｍＵは、１分間に１ミリモルのＮＡＤＨからＮＡＤに変化する量、即ち１分間に１ミリモルのＡＤＰを遊離する量とした。
試験に用いたＡＣＣ１は、蔗糖負荷した６匹のラット肝臓より細胞質画分を分離し、単量体アビジンを結合させたアフィニティーカラムにより精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、分子量２６５Ｋにほぼ単一バンドとして検出された。
試験に用いたＡＣＣ２は、ラットの心臓より細胞質画分を分離し、単量体アビジンを結合させたアフィニティーカラムにより精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、分子量２８０Ｋに染色バンドが確認された。
【００２０】
比較のために非特許文献２に記載のＡＤＰ測定法（以下、ＵＶ法と略称することがある。）を行った。
まず、ＵＶ法によりＡＣＣ阻害活性を測定するために、ＡＣＣ１を用いて酵素量の設定を行った。０〜５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液を用いて３７℃で１時間反応後、３４０ｎｍで測定した結果を図１に示した。図１の横軸はＡＣＣ１の量（ｍＵ／ｗｅｌｌ）であり、縦軸は３４０ｎｍにおける吸収量を示す。
この結果、０〜２．５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を用いた場合には、ほぼ直線的に減少し、それ以上のＡＣＣ１では一定の値を示した。この結果より、最大反応量の約８０％であるＡＣＣ量２ｍＵ／ｗｅｌｌを用いることにした。
【００２１】
次に、本発明の方法（以下、蛍光法と略称することがある。）によりＡＣＣ阻害活性を測定するために、ＡＣＣ１を用いて酵素量の設定を行った。０〜１ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液を用いて３７℃で１時間反応した。ピルビン酸測定試薬５０μｌを加え３７℃で５分間反応後、励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した結果を図２に示した。図２の横軸はＡＣＣ１の量（ｍＵ／ｗｅｌｌ）であり、縦軸は５９０ｎｍにおける蛍光強度を示す。
この結果、０〜０．２５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を用いた場合には、ほぼ直線的に増加し、それ以上のＡＣＣ１では緩やかな増加を示した。この結果より、使用するＡＣＣ量は０．２ｍＵ／ｗｅｌｌとした。
【００２２】
次に、ＵＶ法と蛍光法によるＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ阻害活性を比較した。
ＵＶ法によるＣＰ−６４０１８６の活性測定は、２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液を用いて３７℃で１時間反応した。蛍光法によるＣＰ−６４０１８６の活性測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液を用いて３７℃で１時間反応した。ＣＰ−６４０１８６を添加しない場合のＡＣＣ活性を１００％とした時の各濃度における活性（％）を図３に示した。図３の横軸はＣＰ−６４０１８６の量（μＭ）であり、縦軸は酵素活性の残存率（％）を示す。
この結果、ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ阻害活性をＵＶ法で測定した場合と蛍光法で測定した場合とで比較すると、殆ど同じ阻害曲線となることがわかった。この試験においては、ＵＶ法ではＡＣＣ量が２ｍＵ／ｗｅｌｌであり、本発明の蛍光法ではＡＣＣ量が０．２ｍＵ／ｗｅｌｌであることから、蛍光法はＵＶ法に比較して約１０分の１量のＡＣＣで阻害活性を測定することができることがわかる。
【００２３】
次に、ＣＰ−６４０１８６によるＡＣＣ１とＡＣＣ２の阻害活性の比較を行った。
ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１活性の測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのラット肝臓由来ＡＣＣ１を用い本発明の蛍光法により測定した。ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ２活性測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのラット心臓由来ＡＣＣ２を用い本発明の蛍光法により測定した。
ＣＰ−６４０１８６を添加しない場合のＡＣＣ活性を１００％とした時の各濃度における活性（％）を図４に示した。図４の横軸はＣＰ−６４０１８６の量（μＭ）であり、縦軸は酵素活性の残存率（％）を示す。
この結果、ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１とＡＣＣ２阻害活性を比較すると、殆ど同じ阻害曲線を描くことがわかった。
【００２４】
これらの結果から、本発明の蛍光法によるＡＣＣ活性の測定では、従来のＵＶ法（非特許文献２参照）に比較して使用する酵素量が約１０分の１とすることができ、極めて高感度での測定が可能となり、本発明の測定法はＡＣＣ阻害薬のスクリーニングを行う場合に有用であると考えられる。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法は、前記してきた本発明の測定方法に準じて、
（１）ＡＣＣ溶液に被検物質溶液を加え、必要によりプレインキュベーションを行った      後、基質溶液を加えて反応させる工程、
（２）次いで、ピルビン酸キナーゼによる反応を行う工程、
（３）ピルビン酸オキシダーゼによる反応を行う工程、
（４）過酸化水素による反応を行う工程、及び、
（５）過酸化水素による定量を行う工程、
からなる。これらの工程のうち（１）〜（４）の反応は、同じ反応容器内でワンポットで行うことができる。また、前記したように、（１）の反応と（２）の反応を同時に行い、（３）の反応と（４）の反応を同じ反応容器内で同時に行うこともできる。
本発明のスクリーニング方法により、被検物質のＡＣＣに対する活性（阻害活性又は亢進活性）を簡便に高感度で行うことができ、メタボリックシンドローム、高脂血症、肥満症、高血圧症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症と関連する心血管疾患などの予防及び治療に極めて有用なＡＣＣ阻害剤や、抗癌剤として期待されているＡＣＣ活性化剤などを、高信頼性で大量に迅速にスクリーニングすることができる。
【００２６】
また、本発明は、本発明の方法を行うための測定キットを提供するものである。本発明の測定キットは、本発明の測定方法に使用するためのピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを含有していることを特徴とする検査キットである。本発明の検査キットは、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼのほかに、ＡＣＣを含有することが好ましく、これらの酵素は緩衝液などの溶液状態としておくこともできる。さらに、必要に応じて、ピルビン酸キナーゼの基質物質、蛍光試薬、ＨＲＰ(horseradish peroxidase)などのパーオキシダーゼ、及びこれらの溶液とするための溶媒（緩衝液）などを含有していてもよい。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
１）ＡＣＣ１の調製
ＳＤラット（雄性１５０−２００ｇ）６匹を２日間絶食させた後、高糖食（high sucrose diet (AIN76A)）で３日間飼育した。エーテル麻酔後肝臓を摘出し、冷却したＰＢＳ  １０００ｍｌで洗浄した。ホモジネート緩衝液（５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む溶液）５００ｍｌ、及びシグマ社製のプロテアーゼ阻害混合物（protease inhibitor cocktail）５ｍｌを加え、ワーリングブレンダーで１分間、４℃でホモジナイズした。３％ＰＥＧに調製後、２０，０００×ｇ、１５分間４℃で遠心した。上清を５％ＰＥＧに調製後、２０，０００×ｇ、２０分間４℃で遠心した。沈殿物をカラム緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び５％グリセリンを含む溶液）３０ｍｌに溶解した。プロメガ社製のアビジンカラム（SoftLink soft release avidin resin）５ｍｌに吸着させた。カラム緩衝液３００ｍｌを用いて洗浄した。溶出液（２ｍＭビオチンを添加したカラム緩衝液）３０ｍｌを用いてＡＣＣを溶出した。活性画分を膜ろ過装置−Ｕｌｔｒａ−４（分子量画分３０，０００）を用いて濃縮後−８０℃で保存した。
【００２９】
２）ＡＣＣ２の調製
正常食で飼育したＳＤラット（雄性１５０−２００ｇ）１０２匹をエーテル麻酔した。心臓を摘出後冷却したＰＢＳ  １，０００ｍｌで洗浄した。ホモジネート緩衝液（２２５ｍＭマンニトール、７５ｍＭショ糖、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液）６００ｍｌ及びシグマ社製のプロテアーゼ阻害混合物（protease inhibitor cocktail）５ｍｌを加え、ワーリングブレンダーで１分間、４℃でホモジナイズした。１，２００×ｇ、１０分間４℃で遠心後上清を更に１２，０００×ｇ、１０分間４℃で遠心した。上清に硫安を加えて５０％飽和に調製した。１２，０００×ｇ、１０分間４℃で遠心して沈殿物を回収した。沈殿物をカラム緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び５％グリセリンを含む溶液）８０ｍｌに溶解した。透析チューブに入れて５００ｍｌのカラム緩衝液で１時間透析した。この操作を５回繰り返して硫安を除去した。プロメガ社製のアビジンカラム（SoftLink soft release avidin resin）５ｍｌに吸着させた。カラム緩衝液３００ｍｌを用いて洗浄した。溶出液（２ｍＭビオチンを添加したカラム緩衝液）３０ｍｌを用いてＡＣＣを溶出した。活性画分を膜ろ過装置−Ｕｌｔｒａ−４（分子量画分３０，０００）を用いて濃縮後−８０℃で保存した。
【実施例１】
【００３０】
本発明のＡＣＣ活性の測定は９６ｗｅｌｌマイクロプレートを用いて行った。ＡＣＣ溶液（０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ、０．７５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ(fatty acid free)、１０ｍＭ  クエン酸カリウム、及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液）２５μｌ、及びＣＰ−６４０１８６を含む溶液（０．２５％ＤＭＳＯ及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液で希釈したＣＰ−６４０１８６溶液）２５μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．６６ｍＭ  アセチル−ＣｏＡ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．４ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸、２ｍＭ  ＡＴＰ、及び２．２Ｕ／ｗｅｌｌのピルビン酸キナーゼを含む溶液）５０μｌを加え３７℃で１時間反応した。
反応後、ピルビン酸測定試薬（３００μＭ  Amplex red（Invitrogen社）、２Ｕ／ｍｌのＨＲＰ(horseradish peroxidase)、及び２Ｕ／ｍｌのピルビン酸オキシダーゼを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ５．８））５０μｌを加え、３７℃で５分間反応させた。
反応後、モレキュラーデバイス社製Spectra Max Gemini EMにより励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
なお、ＡＣＣの１ｍＵは１分間に１ミリモルのＮＡＤＨからＮＡＤに変化する量、即ち１分間に１ミリモルのＡＤＰを遊離する量とした。
【００３１】
比較例１  ＵＶ法による測定
ＵＶ法によるＡＣＣ活性の測定は９６ｗｅｌｌマイクロプレートを用いて行った。ＡＣＣ溶液（２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ、０．７５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ(fatty acid free)、１０ｍＭ  クエン酸カリウム、及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液）５０μｌ及びＣＰ−６４０１８６溶液（０．２５％ＤＭＳＯ及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液で希釈したＣＰ−６４０１８６溶液）５０μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．６６ｍＭ  アセチル−ＣｏＡ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＴＰ、２．２Ｕ／ｗｅｌｌのピルビン酸キナーゼ、及び４．６Ｕ／ｗｅｌｌのＬＤＨ(lactate dehydrogenase)を含む溶液）１００μｌを加え３７℃で１時間反応した。
反応後、モレキュラーデバイス社製Versa Maxにより波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
なお、ＡＣＣの１ｍＵは１分間に１ミリモルのＮＡＤＨからＮＡＤに変化する量、即ち１分間に１ミリモルのＡＤＰを遊離する量とした。
【実施例２】
【００３２】
本発明の蛍光法における酵素量の設定
本発明の蛍光法によりＡＣＣ阻害活性を測定するために、ＡＣＣ１を用いて酵素量の設定を行った。
０〜１ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液２５μｌ及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）２５μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液５０μｌを加え３７℃で１時間反応した。ピルビン酸測定試薬５０μｌを加え３７℃で５分間反応後、励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
結果を図２に示す。０〜０．２５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を用いた場合には、ほぼ直線的に増加し、それ以上のＡＣＣ１では緩やかな増加を示した。この結果より、使用するＡＣＣ量は０．２ｍＵ／ｗｅｌｌとした。
【００３３】
比較例２  ＵＶ法における酵素量の設定
ＵＶ法によりＡＣＣ阻害活性を測定するために、ＡＣＣ１を用いて酵素量の設定を行った。
０〜５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液５０μｌ及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）５０μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液１００μｌを加え３７℃で１時間反応後、３４０ｎｍで測定した。
結果を図１に示す。０〜２．５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を用いた場合には、ほぼ直線的に減少し、それ以上のＡＣＣ１では一定の値を示した。この結果より、最大反応量の約８０％であるＡＣＣ量２ｍＵ／ｗｅｌｌを用いることにした。
【実施例３】
【００３４】
ＵＶ法と蛍光法によるＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ阻害活性の比較
ＵＶ法による阻害活性の測定は、２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液５０μｌ及びＣＰ−６４０１８６（０〜４０μＭ）溶液５０μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液１００μｌを加え３７℃で１時間反応後、３４０ｎｍで測定した。
本発明の蛍光法による阻害活性の測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液２５μｌ及びＣＰ−６４０１８６(０〜４００μＭ）溶液２５μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液１００μｌを加え３７℃で１時間反応した。ピルビン酸測定試薬５０μｌを加え３７℃で５分間反応後、励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
ＣＰ−６４０１８６を添加しない場合のＡＣＣ活性を１００％とした時の各濃度における活性（％）を計算した。
結果を図３に示す。ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ阻害活性をＵＶ法で測定した場合と蛍光法で測定した場合とで比較すると、殆ど同じ阻害曲線を描いた。蛍光法はＵＶ法に比較して約１０分の１量のＡＣＣで阻害活性を測定することができた。
【実施例４】
【００３５】
ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１とＡＣＣ２との阻害活性の比較
ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１阻害活性の測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液２５μｌ及びＣＰ−６４０１８６（０〜４００μＭ）溶液２５μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液１００μｌを加え３７℃で１時間反応した。ピルビン酸測定試薬５０μｌを加え３７℃で５分間反応後、励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
また、ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ２阻害活性の測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ２を含む溶液２５μｌを用い及びＣＰ−６４０１８６（０〜４０μＭ）溶液２５μｌを加えＡＣＣ１と同様に行った。
ＣＰ−６４０１８６を添加しない場合のＡＣＣ活性を１００％とした時の各濃度における活性（％）を計算した。
結果を図４に示す。この結果、ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１とＡＣＣ２阻害活性を比較すると、殆ど同じ阻害曲線を描くことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、メタボリックシンドローム、高脂血症、肥満症、高血圧症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症と関連する心血管疾患などの予防及び治療に極めて有用であると考えられているＡＣＣ阻害剤や、抗癌剤への利用も検討されているＡＣＣの活性促進剤などを、簡便で高感度で、かつ放射性物質を使用することなく安全にスクリーニングすることができる新規なＡＣＣ活性測定方法を提供するものであり、有用な新規な医薬品や食品類の開発に有用な手法となり産業上の利用可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、従来のＵＶ法における酵素量の影響を実験した結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の蛍光法における酵素量の影響を実験した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の蛍光法（白丸印）と従来のＵＶ法（黒丸印）における阻害活性を比較したグラフである。
【図４】図４は、本発明の蛍光法におけるサブタイプＡＣＣ１とＡＣＣ２における阻害活性を比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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