(57)【要約】【課題】本発明の課題は、副作用が少なく、安全性の高い関節リウマチの予防・治療剤を提供することにある。【解決手段】アポリポタンパク質Ａ−IIは高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要な構成タンパク質の一種であるが、そのアポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分として含有する非経口投与用医薬組成物が安全且つ効果的に関節リウマチの予防・治療剤として使用することができることが判明した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分として含有する関節リウマチの予防・治療薬。
【請求項２】
注射薬である請求項１記載の関節リウマチの予防・治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分として含有する関節リウマチの予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ(Rheumatoid arthritis)は、原因不明の多発性関節炎を主体とする進行性疾患と定義されている。原因は未だに明らかにされていないが、遺伝的素因があり、たとえば微生物の感染、ストレス、手術、妊娠などといった外的環境因子をきっかけに、免疫異常反応によって起こる自己免疫疾患と考えられている。同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患であり、寛解と増悪を繰り返しながら慢性に進行する。この疾患は無治療で放置すると関節の破壊と変形を来し、やがて運動機能障害を呈し、ときには生命をも脅かす恐れもある。
【０００３】
関節リウマチは、なんらかの原因により、関節腔の内面を覆っている滑膜細胞が増殖し、関節の血管が増加し、血管内から関節滑膜組織にリンパ球、マクロファージなどの白血球が遊走する結果、関節局所で免疫応答が起こり、さらにリンパ球やマクロファージが産生するサイトカインの作用により炎症反応がひきおこされ、軟骨・骨の破壊へと病状が進行する。
【０００４】
関節リウマチの患者は、わが国では９０万人程度存在し、全ての年齢に発生するが、とりわけ女性に多く（男女比１：３）、４０歳代が発生のピークである。最近では６５歳以上の高齢者の発症も増加の傾向にある。
【０００５】
症状は全身症状（微熱、倦怠感、食欲不振、体重減少など）に加え、関節症状として朝のこわばり（滑膜が腫れ、関節液がたまり、関節の動きが緩慢になる状態）、腫脹及び関節痛を認める。大半の症例は左右対称性に手指や手首、足などの小さな関節から膝や股、肘などの大きな関節へと進み、次第に関節の変形を呈する。レントゲン検査では、骨吸収像や骨びらん像、関節裂隙の狭小化、のう胞状陰影、変形などの所見を認める。患者の約２０％は一過性に発症し軽快するが、残りの患者の病態は進行性に経過する。中には、関節外症状として眼症状（上強膜炎・強膜炎など）、肺疾患（胸膜炎・間質性肺炎など）、心疾患（心膜炎など）、腎疾患（ＩｇＡ腎症など）を合併する事があり、早期の治療が望まれる。
【０００６】
診断はアメリカリウマチ学会のＲＡ分類基準（１９８７年）に基づき７つの項目の内、４項目以上あてはまれば関節リウマチと診断される。
（１）朝のこわばりが少なくとも１時間以上続く。
（２）３関節領域以上の腫脹がる。
（３）手関節またはＰＩＰ関節（第２関節）、ＭＰ関節（第３関節）領域に腫脹がある。
（尚、これらの（１）〜（３）の項目は６週間以上続くことが条件である。）
（４）対称性関節腫脹がある。
（５）手・指のレントゲン所見で変形が認められる。
（６）皮下結節（しこり）が認められる。
（７）リウマトイド因子が陽性である。
しかし、この診断基準は早期のリウマチの診断および治療には不向きである。
【０００７】
関節リウマチは早期に診断し、早期に治療を開始すれば、進行を阻止するだけでなく、予後も良い。そこで、日本リウマチ学会（１９９４年）では早期のリウマチ診断基準として、下記の６項目の内３項目以上あてはまれば早期リウマチと診断することを提唱している。
（１）３関節以上の圧痛または運動時痛
（２）２関節以上の腫れ
（３）朝のこわばり
（４）リウマチ結節
（５）採血での炎症反応陽性
（６）採血でのリウマチ因子
【０００８】
また、近年において関節リウマチの新たな自己抗体として抗環状シトルリン化ペプチド抗体（抗ＣＣＰ抗体）が注目されている。初診時において抗ＣＣＰ抗体が陽性であれば、関節リウマチ分類基準を満たさない関節炎症例を追跡調査することにより、後に関節リウマチと診断される可能性が高く、従来のリウマトイド因子より関節リウマチの診断予測に優れていることが明らかになった。
【０００９】
関節リウマチの治療は薬物療法が主体であるが、症状によっては、リハビリテーションや手術療法が検討される。薬物療法としては、抗炎症剤と抗リウマチ剤療法が主体である。抗炎症剤は痛みを軽減する目的で使用され、非ステロイド系抗炎症剤とステロイド剤とがある。抗リウマチ剤は病状の進行を抑える目的で使用され、免疫調整剤と免疫抑制剤とがある。一般的に効果出現までに２〜３ヶ月間を要し、関節リウマチは寛解と増悪を繰り返すが、完治が極めて困難な病気であるので、これらの薬を症例に応じて慎重に適応することになる。
【００１０】
関節リウマチの治療に使用されている主な薬物として、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）及び副腎皮質ステロイド薬がある。
【００１１】
ＮＳＡＩＤは、鎮痛効果は速やかに現れるが、抗炎症作用は１〜２週間後に発現する。ＮＳＡＩＤには炎症の程度を軽減させる作用はあっても、リウマチ性炎症の進行を阻止する作用及び関節破壊を防止する作用はなく、副作用としての消化管障害等が出現するなど問題点を有している。
【００１２】
ＤＭＡＲＤは、関節リウマチの免疫異常を是正することによりリウマチ性炎症を鎮静化させて、寛解導入を目的とする薬物の総称である。ＤＭＡＲＤは一般に遅効性であるが、効果が発現すると長期間に亘って持続する。ＤＭＡＲＤには鎮痛効果がなく、投与開始時は速効性のＮＳＡＩＤや副腎皮質ステロイド薬等を併用する。一方、問題点として、まれに骨髄抑制、腎炎、間質性肺炎などの重篤な副作用の出現や至適用量に個人差があることである。
【００１３】
副腎皮質ステロイド薬はリウマチ性炎症を迅速かつ確実に抑制し、短期間ではあるものの、関節リウマチ患者のＱＯＬを著しく改善するが、長期連用による効果の減弱、離脱困難、関節破壊の進行阻止不能、さらに感染症の誘発、副腎機能不全、消化管障害、骨粗鬆症などの重篤な副作用の出現などの弊害も多い。
【００１４】
最近では、炎症性サイトカインの作用を抑える事によって関節リウマチの進行を抑制する生物学的製剤（ＩＬ−１阻害薬ＩＬ−６阻害薬、ＴＮＦ阻害薬など）が開発され、今後の治療に大きな期待がもたれている。しかしその一方で、肺炎、結核、ニューモシスチス肺炎などの感染症をはじめとする重篤な副作用も臨床上問題となっている。
【００１５】
関節リウマチ治療剤としては、ウリナスタチンを含有する治療剤が提案されている（特許文献１）が、実用化には至っていない。
また、クトロンアミド誘導体とリポタンパク質を含有する組成物が自己免疫疾患やガンの治療剤として提案されている（特許文献２）。この文献によればリポタンパク質はクトロンアミド誘導体を濃縮する物質として用いられ、その結果としてクロトンアミド誘導体の用量減少を可能にし、副作用を軽減するという。そして実施例においては、リポタンパク質の一種である高密度リポタンパク質（３０〜３５％のアポＡ−Iと１０〜１５％のアポＡ−IIを含む）を０．２ｍＬ／ｋｇ、および０．４ｍＬ／ｋｇをラットに単独投与し、この量では、急性アレルギー性脳脊髄炎も移植拒絶反応もその阻止効果は全くなく、リポタンパク質単独での自己免疫疾患やガン治療の効果は何ら示されていない。
【特許文献１】特公平６−７８２４３号公報
【特許文献２】特開平９−１８８６５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
前述の状況のもと、関節リウマチを予知し、速やかに治療を開始することにより関節リウマチの進行を抑制し、進行した後であっても副作用を生じる可能性が低い関節リウマチの治療剤の開発が切に望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、血液中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の一成分であるアポリポタンパク質Ａ−IIの生体に及ぼす効果、影響について種々研究を重ねてきたが、このアポリポタンパク質Ａ−IIが偶然にも単独で関節リウマチの予防・治療に有効で、かつ副作用の少ない薬剤となりうることを突き止めた。この知見をもとに更に研究を重ねて、本発明を完成した。
すなわち本発明は、アポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分として含有する関節リウマチの予防・治療剤である。
【００１８】
本発明の有効成分であるアポリポタンパク質Ａ−IIはＨＤＬの主要な構成タンパク質の一種であり、アポリポタンパク質Ａ−Iに次ぎ、アポリポ蛋白の約２０％を占めている。
その分子性状としては、分子量約８，７００である７７残基のポリペプチドがホモダイマーを形成していることがよく知られているが、その生理的意義については未だに明確にはなっていない。特に脂質代謝の観点からヒトでの遺伝性アポリポタンパク質Ａ−II欠損ホモ接合体において臨床症状やリポタンパク代謝に明確な異常が認められておらず、少なくとも脂質代謝において重要な役割は見出されていない。
【００１９】
本発明に用いられるアポリポタンパク質Ａ−IIは、ヒトの血漿から、例えばゲル電気泳動で単一バンドを示す程度に精製することができ、精製法や原材料を特に限定する必要はない。
【００２０】
本発明に使用するヒトアポリポタンパク質Ａ−IIの製法として好ましいものは、例えばAnalytical Biochemistry 178, 301-305(1989)に記載された方法である。
まず、ヒトアポリポタンパク質Ａ−IIの原料としては、ヒトアポリポタンパク質Ａ−IIを含有するヒト血漿または誘導ヒト血漿画分が挙げられる。誘導ヒト血漿画分としては、たとえばヒト血漿コーン低温エタノール分画法で得られる画分IV−1が好適に挙げられる。
このヒトアポリポタンパク質Ａ−IIを含有するヒト血漿または誘導ヒト血漿画分を、低温、例えば１０℃以下で、緩衝液に溶解する。次いでたとえばエタノール／クロロホルム溶液を加えて混合し、遠心分離を行って下層の脂質成分を除去し、上清の蛋白質成分を回収する。回収した上清に対してエタノール溶液を添加し、遠心分離を行って沈殿する高分子の蛋白質を除去し、上清を回収する。さらに、回収した上清に対して再びエタノール溶液を添加し遠心分離を行って沈殿するヒトアポＡ−Iを除去し、ヒトアポリポタンパク質Ａ−IIが含まれる上清を回収する。ヒトアポリポタンパク質Ａ−IIが含まれる上清は、塩化ナトリウム溶液にて限外濾過処理を行い、エタノールを除く。その後リン酸緩衝液、食塩水にて限外濾過処理を行った後、適切な濃度まで濃縮する。脱脂が不十分な精製したヒトアポリポタンパク質Ａ−IIの性状が不安定な場合には、エタノール／クロロホルム溶液を加えて混合し、遠心分離を行って下層の脂質成分を除去する。上清のヒトアポリポタンパク質Ａ−IIは上記と同様な方法で限外濾過を行い、エタノールを除いて適切な濃度まで濃縮する。このような操作によって精製されたアポリポタンパク質Ａ−IIが得られる。
【００２１】
アポリポタンパク質Ａ−IIを含む製剤としては、水溶液、懸濁剤、凍結乾燥製剤等の非経口投与剤が挙げられ、これらの製剤化は、医薬上許容される添加剤（希釈剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、界面活性剤等）を適宜混合し、製剤上の常套手段により行うことができる。また凍結乾燥製剤は用時に注射用蒸留水等の溶解液に溶解して用いられる。
【００２２】
この様にして得られたヒトアポリポタンパク質Ａ−IIには、夾雑物を殆ど含まれていない。必要により塩、アミノ酸、有機酸、糖アルコール、アルブミンなどのタンパク質、ポリオールなどの好適な安定化剤と共に保存することが可能である。
【００２３】
本発明の薬剤の投与経路は、特に制限はないが、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、皮内注射等の非経口投与が好ましく、特に静脈注射が好ましい。注射剤とするには、常法に従い、精製されたアポリポタンパク質Ａ−IIの一定量を無菌条件下に注射用蒸留水と混合すればよいが、その際、緩衝剤、等張化剤、安定剤などを適量配合するのが良い。具体例としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸などが好適に用いられるが、これに限定する必要はない。
【００２４】
本発明に係る関節リウマチの予防・治療剤の投与量は、対象となる効果を発揮するのに十分な量とされるが、剤形、投与方法、１日当たりの投与回数、症状の程度、体重、年齢等によって適宜増減することができる。成人に対して静脈内投与する場合は、アポリポタンパク質Ａ−IIとして、成人一日あたり通常１０〜１，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１００〜９００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約２００〜８００ｍｇ／ｋｇである。この量を１日１回〜３回に分けて投与することができる。アポリポタンパク質Ａ−IIは水に可溶のタンパク質であるので、静脈注射剤におけるアポリポタンパク質Ａ−IIの濃度は任意に調節できる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る関節リウマチの予防・治療剤は、アポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分とし、関節リウマチに対して副作用がなく安全に且つ効果的に予防又は治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に実施例および実験例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
【００２７】
アポリポタンパク質Ａ−II含有製剤の調製
肝炎ウイルスその他の病原微生物を可及的に除去したヒト血漿を原料とし、ヒト血漿コーン低温エタノール分画法で画分IV−1を得た。該画分IV−１の１．２ｋｇ を、２〜８℃の低温室で、１００ｍＭトリスと６Ｍ尿素を含む、ｐＨ７．８〜８．２に調整した溶液２．４Ｌに溶解した。さらに、溶解液と等量のエタノール／クロロホルム溶液（１：１）を加えて混合し、１２，０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離を行い、上清の蛋白質成分を回収した。回収した上清３．４Ｌに対して１．２倍量であるエタノール溶液４．１Ｌを添加し、１２，０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離を行い、上清６．８Ｌを回収した。さらに、回収した上清に対して０．８倍量のエタノール溶液５．４Ｌを添加し、１２，０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離を行い、ヒトアポリポタンパク質Ａ−IIが含まれる上清を回収した。ヒトアポリポタンパク質Ａ−IIが含まれる上清は、０．９％の塩化ナトリウム溶液にて限外濾過処理を行い、エタノールを除いた。その後２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、１５０ｍＭＮａＣｌにて限外濾過処理を行い濃縮した。
続いて以下の方法にて脱脂を充分に行なった。濃縮後のヒトアポリポタンパク質Ａ−II溶液量５００ｍＬと等量のエタノール／クロロホルム溶液（1：1）を加えて混合し、１２，０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離を行い、下層を除去した。上清のヒトアポリポタンパク質Ａ−IIは上記と同様な方法で限外濾過を行い、エタノールを除き、濃縮しアポリポタンパク質Ａ−II製剤とした。
アポリポタンパク質Ａ−II製剤について分析した結果を表１に示した。
【００２８】
【表１】
2010208946.tif 000002
このようにして得られた製剤は、そのまま注射液として用いることができる。
【００２９】
動物実験
関節炎惹起用抗体カクテルキット（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）を用いて重症の関節リウマチモデルマウスを作製した。すなわち８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（実験開始時体重範囲１９．７〜２３．３ｇ）に、関節炎用カクテル（タイプIIコラーゲンに特異的な４種類のモノクロナール抗体の混合品）２ｍｇ／匹（マウス）を静脈内投与し、その３日後にＬＰＳ溶液５０μg／匹（マウス）を腹腔内投与することにより、関節リウマチモデルマウスを１５匹作製した。実施例１で調製されたアポリポタンパク質Ａ−II製剤を上記関節リウマチモデルマウス７匹に、関節炎用カクテル投与日から連日１０日間５００ｍｇ／ｋｇで静脈内投与を行った（アポリポタンパク質Ａ−II投与群）。また、アポリポタンパク質Ａ−II を投与しなかった関節リウマチモデルマウス８匹（対照群）及び正常マウス８匹（正常群）を比較例とした。薬剤を初回投与（０日目）した後１０日目まで、関節炎スコア（測定日：０，２，３，４，５，６，７，８，９および１０日目）及び後肢腫脹（測定日：０，３，４，５，６，７，９および１０日目）を測定し、それぞれ平均値±標準誤差を算出した。関節炎スコアの評価法は、マウス４肢における各肢について、次基準で評価した。
０点：変化なし
１点：１指の指部にわずかな腫脹と発赤が見られた。
２点：２指以上の指部に軽度の腫脹と発赤が見られた。
３点：肢全体に明らかな腫脹と発赤が見られた。
４点：肢全体に強度の腫脹（浮腫性）と発赤が見られた。
４肢のスコアを合計（最大スコア：１６）し、関節炎スコアとした。後肢腫脹は、左右後肢の足根関節部厚を測定し、左右の平均を算出した。
結果を表２および３に示した。
【００３０】
【表２】
2010208946.tif 000003
【００３１】
【表３】
2010208946.tif 000004
【００３２】
表２に示したとおり、関節スコアにおいて最大スコア（１６）に対して、対照群は約１０を８〜１０日目に示した。表３に示したとおり、後肢腫脹は対照群の９および１０日目において約１．３倍の増加が正常群と比較して認められた。しかし対照群で認められた関節炎スコアおよび後肢腫脹の障害は、アポリポタンパク質Ａ−II投与群において関節炎スコアで５日目より、また後肢腫脹で７日目より抑制された。この実験により、アポリポタンパク質Ａ−IIは関節リウマチの進展を抑制し、症状を緩和することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
近年リウマトイド因子より関節リウマチの診断は的確に予測することができるようになり、日本では９０万人程度の関節リウマチ患者がいるといわれている。それらの患者に対し本発明の関節リウマチ予防・治療剤を適切な時期に投与することにより、関節リウマチの進展を未然に防止することができる。また、たとえ関節リウマチを進展してしまっていても、本発明の薬剤を投与することにより、その症状を緩和することができる。