(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｆｃ領域を有する糖タンパク質を含んでなる組成物の提供。【解決手段】組成物中の糖タンパク質の５１−１００％が、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含み、該Ｆｃ領域が天然配列のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含み、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを含む成熟コア炭水化物構造を有する糖タンパク質よりも、該糖タンパク質がより良好な親和性でＦｃγＲＩＩＩを結合するか、又はより効率良く抗体依存性媒介細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有する糖タンパク質を含んでなる組成物。好ましい糖タンパク質は、抗体又はイムノアドヘシンである。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物中の糖タンパク質の５１−１００％が、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含み、該Ｆｃ領域が天然配列のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含み、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを含む成熟コア炭水化物構造を有する糖タンパク質よりも、該糖タンパク質がより良好な親和性でＦｃγＲＩＩＩを結合するか、又はより効率良く抗体依存性媒介細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有する糖タンパク質を含んでなる組成物。
【請求項２】
Ｆｃ領域が、Ｆｃ領域残基についてのＥＵ番号付けを使用したアミノ酸位置２５６、２９０、２９８、３１２、３２６、３３０、３３３、３３４、３６０、３７８又は４３０の何れか１つ又は複数にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の組成物。 
【請求項３】
Ｆｃ領域が、位置２９８、３３３及び３３４における２つ又は３つの残基にアミノ酸置換を含む、請求項２に記載の組成物。 
【請求項４】
Ｆｃ領域が、位置２９８、３３３及び３３４にアミノ酸置換を含む、請求項３に記載の組成物。 
【請求項５】
位置２９８、３３３及び３３４での置換残基がアラニンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
組成物中の糖タンパク質の８０−１００％が、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む、請求項１から５のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項７】
糖タンパク質に抗体を含む、請求項１から６のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項８】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域を含む、請求項１から７のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項９】
抗体がキメラ、ヒト化又はヒト抗体である、請求項７又は８に記載の組成物。 
【請求項１０】
抗体がＢ細胞表面マーカー、ＥｒｂＢレセプター、腫瘍関連抗原及び血管形成因子からなる群から選択される抗原を結合する、請求項７から９のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項１１】
抗体がＣＤ２０、ＨＥＲ２、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＣＤ４０、又は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）を結合する、請求項１０に記載の組成物。 
【請求項１２】
抗体にヒト化抗−ＨＥＲ２抗体、キメラ抗−ＣＤ２０抗体及びヒト化抗−ＶＥＧＦ抗体を含む、請求項１１に記載の組成物。 
【請求項１３】
組成物中の糖タンパク質の９０−９９％が糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む、請求項１から１２のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項１４】
糖タンパク質がチャイニーズハムスター 卵巣（ＣＨＯ）細胞によって生成されている、請求項１から１３のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項１５】
ＣＨＯ細胞がＬｅｃ１３細胞である、請求項１４に記載の組成物。 
【請求項１６】
糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合するバイセクティングＮ−アセチルグリコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を本質的に有しない、請求項１から１４のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項１７】
糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合するバイセクティングＮ−アセチルグリコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する、請求項１から１４のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項１８】
糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合する１つ又は複数のガラクトース残基を有する、請求項１から１４及び１６から１７のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項１９】
糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合する１つ又は複数のガラクトース残基を本質的に有しない、請求項１から１４及び１６から１７のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項２０】
糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合する１つ又は複数のシアル酸残基を有する、請求項１から１４及び１６から１９のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項２１】
糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合する１つ又は複数のシアル酸残基を本質的に有しない、請求項１から１４及び１６から１９のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項２２】
薬学的製剤である、請求項１から２１のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項２３】
薬学的に許容される担体をさらに含んでなる、請求項２２の組成物。 
【請求項２４】
無菌である、請求項２２又は２３に記載の組成物。 
【請求項２５】
凍結乾燥された、請求項２２から２４のいずれか一に記載の組成物。 
【請求項２６】
糖タンパク質がイムノアドヘシンである、請求項１から６のいずれか一に記載の組成物。
【請求項２７】
容器； 
前記容器上のラベル；及び 
前記容器内に包含される請求項１から２６のいずれか一に記載の組成物 
を具備してなる製造品。 
【請求項２８】
容器上のラベルが、癌、自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、又は細胞ないしは組織の除去が所望される他の症状の治療に対して組成物が使用可能であることを示す、請求項２７に記載の製造品。 
【請求項２９】
処置により恩恵を受ける疾患又は疾病を有する哺乳動物を治療する際に用いるための医薬の製造における請求項１に記載の組成物の使用。 
【請求項３０】
哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の使用。 
【請求項３１】
ヒトがＦｃγＲＩＩＩ（Ｆ１５８）を発現する、請求項３０に記載の方法。 
【請求項３２】
疾患又は疾病が、癌、自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、又は細胞ないしは組織の除去が所望される他の症状からなる群から選択される、請求項２９に記載の使用。 
【請求項３３】
宿主細胞により生成される糖タンパク質の８０−１００％が、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む、請求項１から５、７から１２及び１６から２１のいずれか一に記載のＦｃ領域を含む糖タンパク質をコードする核酸を含んでなる宿主細胞。 
【請求項３４】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３３に記載の宿主細胞。 
【請求項３５】
ＣＨＯ細胞がＬｅｃ１３細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
核酸が発現されるように請求項３３から３５のいずれか一に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、糖タンパク質の製造方法。 
【請求項３７】
宿主細胞培養物から糖タンパク質を回収することを更に含んでなる、請求項３６に記載の方法。 
【請求項３８】
異種分子へ糖タンパク質をコンジュゲートさせることを更に含んでなる、請求項３７に記載の方法。 
【請求項３９】
異種分子が造影剤、細胞障害剤又は酵素である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を含む組成物に関する。より具体的には、本発明はＦｃ領域を有する糖タンパク質を含む組成物に関し、その組成物中の約８０−１００％の糖タンパク質は、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
抗体
抗体とは、特定の抗原との特異的な結合を示すタンパク質である。天然抗体は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【０００３】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を称する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５Ed. Public Health Service, アメリカ国立衛生研究所, ベゼズダ, メリーランド(1991))。
【０００４】
定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能を示す。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体又は免疫グロブリンは異なるクラスに分けられる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、各々α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。種々のヒト免疫グロブリンクラスの中で、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＭのみが補体を活性化することが知られている；そしてヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりもより効果的にＡＤＣＣを媒介する。
【０００５】
天然ＩｇＧ１構造の模式図を図１Ａに提示し、天然抗体分子の種々の部分を示した。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂと呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成し、各々が単一の抗原結合部位を持ち、残りの「Ｆｃ」断片という名称は、それが容易に結晶化する可能性を反映している。ヒトＩｇＧＦｃ領域の結晶構造は同定されている（Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370 (1981)）。ヒトＩｇＧ分子において、Ｆｃ領域はＮ−末端からＣｙｓ２２６へのパパイン切断によって生成される。Ｆｃ領域は抗体のエフェクター機能の中心である。
【０００６】
他の抗体様分子が記載されている。例えば、レセプター、リガンド又は酵素等の異種タンパク質の結合ドメインとＦｃ領域のエフェクター機能を結合させる「イムノアドヘシン」が参考文献に記載されている。例示的なそのような分子は、米国特許第５，６１０，２９７号に記載されている腫瘍壊死因子レセプター−ＩｇＧ（ＴＮＦＲ−ＩｇＧ）イムノアドヘシンである。二重特異性イムノアドヘシン及び抗体−イムノアドヘシンキメラも記載されている。Stabila, P., Nature Biotech, 16:1357(1998)には、他のＦｃ領域含有原形質膜アンカー融合タンパク質が記載されている。この参考文献中のこの融合タンパク質は、Ｆｃ領域のＮ末端と融合し、原形質膜に位置するＩＩ型膜貫通ドメインを結合させる。
【０００７】
抗体及びイムノアドヘシンは、ヒトの疾患の治療法として使用されている（Glennieら, Immunol. Today 21: 403-410(2000)；Kingら, Curr. Opin. Drug Discovery Develop 2:110-117(1999)；Vaswaniら, Ann. Allergy Asthma Immunol. 81:105-119(1998)；及びAbrahamら, Sec. Intern. Autumnal Them. Meeting on Sepsis, Deauville, France (1995)）。例えば、レセプター又はリガンドと結合し、それによってリガンドレセプター相互作用をブロックする、幾つかのこれら抗体及びイムノアドヘシンは、抗体エフェクター機序を使用せずに機能する。他は、標的細胞を死滅させるために免疫系を補強する必要があり得る（Clynesら Nature Med. 6:443-446(2000)；Clynesら, PNAS（USA)）95:652-656(1998)；及びAndersonら, Biochem. Soc. Trans. 25:705-708(1997)）。
【０００８】
抗体エフェクター機能
抗体Ｆｃ領域によって媒介されるエフェクター機能は、２つに分類することが可能である：（１）抗体が抗原に結合した後に作用するエフェクター機能（これらの機能は、補体カスケード又はＦｃレセプター（ＦｃＲ）含有細胞の参加を含む）；及び（２）抗原結合に無関係に作用するエフェクター機能（これらの機能は、循環の持続性及びトランスサイトーシス(transcytosis)により細胞障壁を横切って輸送される能力を付与する）に分けられる。Ward及びGhetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995)。
【０００９】
抗体の必要な抗原への結合は、外来抗原の内因性標的（例えばレセプター又はリガンド）に対する結合を防止することのできる中和効果を有するが、結合のみでは外来抗原を除去することはできない。外来抗原の除去及び／又は破壊が効果的とするためには、抗体に、その抗原に対するより高い親和性、及び有効なエフェクター機能を与えるべきである。
【００１０】
抗体又は抗体−抗原複合体と免疫系細胞との相互作用は、抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ) 及び補体媒介障害活性(ＣＤＣ)などを含む、様々な反応に作用する（Daeron. Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997); Ward and Ghetie, Therapeutic Immunol. 2:77-94 (1995);Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)を参照）。
【００１１】
いくつかの抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃレセプター（ＦｃＲｓ）によって媒介される。ＦｃＲｓは、イムノグロブリン  アイソタイプに対する特異性により定義される；ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターは、ＦｃγＲと、ＩｇＥに対してはＦｃεＲと、ＩｇＡに対してはＦｃαＲなどのように、呼ばれている。ＦｃγＲの３つのサブクラスは同定されており：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４），ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２），ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などである。それぞれのＦｃγＲサブクラスは、２または３つの遺伝子によってコードされており、さらに、選択的ＲＮＡスプライシングにより、複数種の転写産物が生じるため、ＦｃγＲアイソフォームには広い多様性が存在する。３つの遺伝子がコードするＦｃγＲＩサブクラス（ＦｃγＲＩＡ，ＦｃγＲＩＢ，ＦｃγＲＩＣ）は、第１染色体の長腕の１ｑ２１．１領域にクラスターとして存在している。ＦｃγＲＩＩアイソフォームをコードする遺伝子（ＦｃγＲＩＩＡ，ＦｃγＲＩＩＢ，ＦｃγＲＩＩＣ）とＦｃγＲＩＩＩをコードする２つの遺伝子（ＦｃγＲＩＩＩＡ，ＦｃγＲＩＩＩＢ）はすべて１ｑ２２領域にクラスターとして存在している。これらの異なるＦｃＲサブタイプは異なる型の細胞上で発現されている（Ravetch and Kinet, Annu.Rev.Immunol. 9:457-492 (1991)）。例えば、ヒトでは、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上にのみ見出されるが、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ある種のＴ細胞上に見出される。
【００１２】
構造的には、ＦｃγＲはすべて免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、２つ（ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩ）又は３つ（ＦｃγＲＩ）のＩｇ様ドメインからなる細胞外部分を持つＩｇＧ結合α鎖を有する。更には、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、シグナル伝達で機能するα鎖と結合している補助的タンパク質鎖（γ、ζ）を有する。レセプターは、ＩｇＧに対するその親和性によっても識別される。ＦｃγＲＩは、Ｋａ＝１０８−１０９Ｍ−１というＩｇＧに対する高い親和性を示し（Ravetchら, Ann. Rev. Immunol. 19: 275-290(2001)）、単量体ＩｇＧと結合することが可能である。対照的に、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、＜１０７Ｍ−１という単量体ＩｇＧに対する比較的より弱い親和性を示し（Ravetchら, Ann. Rev. Immunol. 19: 275-290(2001)）、よって、多量体免疫複合体とのみ効率よく相互作用する。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が含まれ、それらは、その細胞質ドメインで主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにイムノレセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにイムノレセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)の概説を参照せよ）。ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩＡのみを有し、ＦｃγＲＩＩＩＡとの抗体の結合は、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣ活性につながる。
【００１３】
いくつかのヒトＦｃγＲの対立遺伝子変異体は、ヒトの集団において見出されたきた。これらの対立遺伝子変異体型は、ヒトおよびマウスＩｇＧとの結合において相違を示すことが明らかにされ、多くの関連研究により、特異的な対立遺伝子型と臨床結果との相関が示されてきた（Lehrnbecher ら, Blood 94 (12):4220-4232 (1999)を参照されたし）。ＦｃγＲＩＩＡの２つの型、Ｒ１３１およびＨ１３１と臨床結果との相関について、多くの研究が行われてきた（Hatta ら, Genes and Immunity 1:53-60 (1999); Yap et al. Lupus 8:305-310 (1999);および Lorenz et al. European J. Immunogenetics 22:397-401 (1995)）。二つのＦｃγＲＩＩＩＡの対立遺伝子型、Ｆ158およびＶ158が、唯一現在研究が行われている（Lehrnbecher et al., supra; 及び Wu et al. J. Clin. Invest. 100(5):1059-1070 (1997)）。ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｐｈｅ１５８）アロタイプ（Shieldsら, J. Biol. Chem. 276:6591-6604(2001)；Koeneら, Blood90:1109-1114(1997)；及びWuら, J. Clin. Invest. 100: 1059-1070(1997)）よりも、ＦｃＲＩＩＩＡ（Ｖａｌ１５８）アロタイプがヒトＩｇＧと相互作用する。
【００１４】
Ｆｃレセプターの他の型とは、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）である。ＦｃＲｎは、主要組織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）と構造的に類似し、β２-マイクログロブリンと非共有結合的に結合しているα鎖で構成されている。ＦｃＲｎは、組織を横断するトランスサイトーシスを制御する可能性があるのと同時に、血液中のＩｇＧの恒常性を調節すると言われてきた（Ghetieら, Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766(2000)）。
【００１５】
ＦｃγＲについてのヒト及びマウス抗体上の結合部位は、以前に、残基２３３−２３９で構成される「低ヒンジ領域」と呼ばれる部分にマッピングされている（Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５編. Public Health Service, 米国国立衛生研究所, ベゼスダ, メリーランド（１９９１）のようなＥＵインデックス番号付け）。Woofら, Molec. Immunol. 23:319-330(1986)；Duncanら, Nature 332: 563(1988)；Canfield及びMorrison, J. Exp. Med. 173: 1483-1491(1991)；Chappelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036-9040(1991)。残基２３３−２３９、Ｐ２３８及びＳ２３９は、結合に関与している可能性があるとして引用されていた。
【００１６】
ＦｃγＲとの結合に関わっている可能性のある以前に引用された他の領域は：ヒトＦｃγＲＩについてのＧ３１６−Ｋ３３８（ヒトＩｇＧ）（配列比較のみによる；置換変異は評価されなかった）（Woofら, Molec. Immunol. 23:319-330(1986)）；ヒトＦｃγＲＩＩＩ（ペプチドに基づく）についてのＫ２７４−Ｒ３０１（ヒトＩｇＧ１））（Sarmayら, Molec. Immunol. 21:43-51(1984)）；ヒトＦｃγＲＩＩＩ（ペプチドに基づく）についてのＹ４０７−Ｒ４１６（ヒトＩｇＧ）（Gergelyら, Biochem. Soc. Trans.12: 739-743(1984)）並びにマウスＦｃγＲＩＩについてのＮ２９７及びＥ３１８（マウスＩｇＧ２ｂ）（Lundら, Molec. Immunol. 29:53-59(1992)）である。Armourら, Eur. J. Immunol. 29: 2613-2624(1999)も参照せよ。
【００１７】
ＷＯ００／４２０７２（Presta）には、ＦｃＲと結合が改良又は消滅したポリペプチド変異体が記載されている。この特許公報の内容は、参考文献として具体的に本明細書中に記載されている。Shieldsら, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)も参照せよ。
【００１８】
Ｃ１ｑ及び２つのセリンプロテアーゼ、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓは、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）経路の第１の成分である複合体Ｃ１を形成する。Ｃ１ｑは約４６０，０００の分子量を持つ６価の分子であり、６つのコラーゲン様「茎」が６つの球状頭領域に結合したチューリップのブーケのような構造を持つ。Burton及びWoof、Advances in Immunol. 51: 1-84 (1992)。補体カスケードを活性化するためには、Ｃ１ｑがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３の少なくとも２つに結合する必要があるが（共通するのはＩｇＧ４が補体を活性化しないこと）、ＩｇＭの１分子のみが抗原性標的に結合する。Ward及びGhetie、Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995)第80頁。
【００１９】
化学修飾及び結晶学的研究の結果に基づいて、Burton等 (Nature, 288: 338-344 (1980)）は、ＩｇＧ上の補助成分Ｃ１ｑはＣＨ２ドメインの少なくとも２つの（Ｃ−末端）β鎖を含むと提唱した。Burtonは後に（Molec. Immunol., 22(3): 161-206 (1985)）、アミノ酸残基３１８から３３７を含む領域が補体固定化に含まれることを示唆した。
【００２０】
Duncan及びWinter（Nature 332: 738-40 (1988)）は、部位指向性突然変異誘発を用いて、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２がＣ１ｑの結合部位を形成すると報告した。Duncan及びWinterのデータは、マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプのモルモットＣ１ｑへの結合試験から得られたものである。Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２残基のＣ１ｑの結合における役割は、これら３つの残基を含む短い合成ペプチドの補体媒介溶解を阻害する能力により確認された。類似の結果は、1997年7月15日に発行された米国特許第5,648,260号及び1997年4月29日に発行された米国特許第5,624,821号に記載されている。
【００２１】
残基Ｐｒｏ３３１は、ヒトＩｇＧサブクラスの補体媒介細胞溶解を行う能力の分析によりＣ１ｑ結合に含まれていた。ＩｇＧ４におけるＳｅｒ３３１からＰｒｏ３３１への変異は、補体を活性化する能力を付与する（Tao等, J. Exp. Med., 178: 661-667 (1993); Brekke等, Eur. J. Immunol., 24: 2542-47 (1994)）。
【００２２】
Winterグループのデータ、及びTao等及びBrekke等の論文の比較から、Ward及びGhetieは、彼らの概説記事において、Ｃ１ｑの結合には少なくとも２つの異なる領域が含まれ：一方は、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２残基を持つＣＨ２ドメインのβ鎖上にあり、他方は同じβ鎖の極近傍に位置する折り返し点（ターン）にあり、位置３３１に鍵となるアミノ酸残基を含んでいる。
【００２３】
他の報告者等は、低いヒンジ領域に位置するヒトＩｇＧ１残基Ｌｙｓ２３５、及びＧｌｙ２３７が補体固定化及び活性化において重要な役割を果たすことを示唆した。Xu等, J. Immunol. 150: 152A (要約)(1993)。1994年12月22日に発行されたWO94/29351は、ヒトＩｇＧ１のＣ１ｑとＦｃＲとの結合に必要なアミノ酸残基はＣＨ２ドメインのＮ-末端領域、即ち残基２３１から２３８に局在化することを報告している。
【００２４】
さらに、ＩｇＧのＣ１ｑに結合する及び補体を活性化する能力も、（通常はＡｓｎ２９７で固着されている）２つのＣＨ２ドメインの間に位置する炭水化物部分の存在、不存在又は修飾に依存することが報告された。Ward及びGhetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995),第81頁。
【００２５】
改良されたＦｃ領域アミノ酸配列及び増大又は減少したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異体は、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号及びＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これら特許公報の内容は、本明細書中に具体的に記載されている。Idusogieら, J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)も参照せよ。
【００２６】
免疫系補充を向上させる他の方法には、抗体の一つの腕がＩｇＧレセプターと結合する二重特異的抗体（Segalら, J. Immunol. Meth. 248:1-6(2001)；及びサイトカイン−ＩｇＧ融合タンパク質（Penichetら, J.Immunol. Meth. 248:91-101(2001)）が含まれる。
【００２７】
抗体グリコシル化
抗体を含む多くのポリペプチドは、オリゴ糖によるグリコシル化等の炭水化物部分を含む種々の翻訳後修飾に供せられる。このようなグリコシル化されたポリペプチドは、「糖タンパク質」と呼ばれている。
【００２８】
グリコシル化に影響を及ぼすことのできる幾つかの要因がある。グリコシル化が生じるにあたって、種、組織及び細胞型の全てが重要であることが示されている。更には、血清濃度などの改変した培養条件を介する細胞外環境は、グリコシル化に直接に作用する（Lifelyら, Glycobiology 5(8)：813-822(1995)）。オリゴ糖生成に関わる特定の酵素を誘導又は過剰発現することを含む特定の宿主生物体において達成されたグリコシル化パターンを改変するために、種々の方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号；米国特許第５，５１０，２６１号）。これらの案は、細胞内法に限定されるものではない（米国特許第５，２７８，２９９号）。
【００２９】
全ての抗体は、重鎖の定常領域の保存位置に炭水化物を有している。各抗体のアイソタイプは、異なる種々のＮ−結合炭水化物構造を有している。重鎖に結合した炭水化物を除いて、ヒトＩｇＧの３０％までがグリコシル化したＦａｂ領域を有する。ＩｇＧは、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に単一のＮ−結合した一対の炭水化物を有している。Ａｓｎ２９７に結合した完全に加工された炭水化物構造は、本明細書の図２に示されている。血清由来の或いはハイブリドーマ又は遺伝子操作された細胞でエキソビボにて生成されたＩｇＧに関しては、Ａｓｎ２９７に結合した炭水化物に関して異種性である。Jefferisら, Immunol. Rev. 163: 59-76(1998)；及びWrightら, Trends Biotech 15: 26-32(1997)。ヒトＩｇＧに関しては、コアオリゴ糖は、通常は異なる数の外部残基を有するＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ２ＧｌｃＮＡｃから構成される。本明細書中の図２は、成熟炭水化物へのオリゴ糖のプロセシング経路を示している。初期に合成される種であるＧｌｕ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮａｃ２は、リボゾームから出現すると抗体のＣＨ２ドメインにあるＡｓｎ２９７へ転移される。糖タンパク質が小胞体を通過して３つの末端グルコースが切り取られた後、その糖タンパク質はシスゴルジへ移動し、そこでマンノース残基がα-マンノシダーゼによって酵素除去される。プロセシングはこの地点で停止することが可能で、高マンノシル化糖タンパク質が生成される。そうでなければ、プロセシングが継続することが可能で、Ｍａｎ５ＧｌｃＮａｃ２を生成する。メディアルゴルジでのＮ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼＩの作用は、複合オリゴ糖合成における確かな段階である。メディアル及びトランスゴルジでは、オリゴ糖は、マンノース残基が切り取られ、糖残基が逐次添加される更なるプロッセッシング段階を受ける。新しく合成された糖タンパク質は、次いでゴルジから出て細胞膜へ輸送されるか又は分泌される。
【００３０】
個々のＩｇＧ中の変異は、２末端ＧｌｃＮａｃでのガラクトース及び／又はガラクトース−シアル酸の結合を介して、又は３番目のＧｌｃＮＡｃアーム（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）の結合を介して生じる。ＩｇＧのＡｓｎ２９７と連結した炭水化物が研究されてきた。炭水化物の欠如は、Ｃ１ｑ及びＦｃγＲとの結合に作用する（そして、補体活性化及びＡＤＣＣに作用する）。Leatherbarrowら, Molec. Immunol. 22: 407-415(1985)；Duncanら, Nature 332:738-740(1988)；Walkerら, Biochem. J. 259: 347-353(1989)；Doraiら, Hybridoma 10: 211-217 (1990)；及びHoran Handら, Cancer Immunol. Immunother. 35:165-174(1992)。FcRnとの結合が炭水化物の欠如に影響されない一方で（Hobbsら, Molec. Immunol. 29: 949-956(1992)；及びKimら, Eur. J. Immunol. 24:542-548(1994)）、クリアランスへの影響は不確かである（Doraiら, Hybridoma 10:211-217(1990)；Horan Handら, Cancer Immunol. Immunother. 35: 165-174(1992)；Hobbsら, Molec. Immunol. 29: 949-956(1992)；Kimら, Eur. J. Immunol.24: 542-548(1994)；Wawrzynczakら, Biochem. Soc. Trans. 17:1061-1062(1989)；及びTaoら, J. Immuno. 143:2595-2601(1989)）。炭水化物が存在するならば、糖残基の性質は、ＩｇＧエフェクター機能にも影響を与えることができる。末端ガラクトース残基の有無が機能に作用することが報告され（Wrightら, J. Immunol. 160: 3393-3402(1998)）、リュウマチ様関節炎と関連していると思われる（Parekhら, Nature 316: 452-457(1985)）。多発性骨髄腫の患者の血清から単離したヒトＩｇＧは、フコース、ガラクトース、及びバイセクティングＮ−アセチルグリコサミンの有無について両極端であることを示した（Parekhら, Nature 316: 452-457(1985)）。Rajuらは、異なる種のＩｇＧのグリコシル化における変異を記載している（Rajuら, Glycobiology 10(5): 477-486(2000)）。
【００３１】
Boydらは、脱シアル化ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈからの大半のガラクトース残基の除去が補体溶解活性を低下させる（消滅させるのではない）ことが見出されたのに対して、グリコペプチダーゼＦ消化によるＣＨＯ由来ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈからの末端シアル酸の除去が、試験したあらゆるＩｇＧ活性に作用しなかったことを見出した。他の活性は、脱ガラクトシル化によって影響を受けなかった。Boydら, Molec. Immunol. 32(17/18): 1311-1318(1995)。Kumpelら, Hum. Antibod. Hybridomas, 5(3-4): 143-151(1994)は、ヒトＩｇＧモノクローナル抗体のガラクトシル化は、Ｆｃレセプター媒介機能活性に作用することを報告している。
【００３２】
Rothmanらは、炭水化物プロセシング経路における異なる段階で作用するグリコシダーゼインヒビターによって処理したハイブリドーマから精製したモノクローナルＩｇＧのＡＤＣＣ機能について試験した。Rothmanら, Molecular Immunol. 26(12): 1113-1123(1989)。新生オリゴ糖からのグルコース残基の除去を阻害するカスタノスペルミン による処理（Kaushalら, Method. Enzymol. 230: 316-329(1994)）は、単球等の他の型のエフェクター細胞によってではなく、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するＮＫ細胞によって増大したＡＤＣＣを示した。レクチン結合分析は、カスタノスペルミン処理ＩｇＧがフコースを欠いていることを示唆した；しかしながら、カスタノスペルミン処理で生じたＩｇＧは、未処理細胞又はヒト血清から分泌されたＩｇＧには通常は見出されない、末端グルコース残基だけでなく高マンノシル化等の他の炭水化物構造を有していた（Kaushalら, Meth. Enzymol. 230:316-329(1994)；Hashimら, Immunology 63:383-388(1988)；Hashimら, Molec. Immunol. 24: 1087-1096(1987)）。
【００３３】
ＷＯ９７／３００８７には、抗体のＦｃドメインのＮ−グリコシル化部位が両触角性（biantennary）オリゴ糖で置換されているグリコシル化抗体の調製が記載されている。
【００３４】
Umanaらは、抗体のＡｓｎ２９７と結合した炭水化物コアへバイセクトＧｌｃＮＡｃの付加を触媒するβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｃＴＩＩＩ）遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へ導入した。操作されたＣＨＯ細胞によって生成されたグリコ型は、最適化されたＡＤＣＣを有すると考えられた。ＷＯ９９／５４３４２及びUmanaら, Nature Biotechnology, 17: 176-180(1999)を参照せよ。
【００３５】
ＷＯ９８／５８９６４（Rajuら）には、実質的に全てのＮ−結合オリゴ糖がＧ２オリゴ糖である抗体組成物が記載されている。Ｇ２とは、２つの末端ＧａｌとＮｅｕＡｃを有しない両触角性構造を指す。ＷＯ９９／２２７６４（Rajuら）は、ＣＨ２ドメイン中にＮ−結合Ｇ１，Ｇ０，又はＧ−１オリゴ糖を有する糖タンパク質を実質的に有しない抗体組成物に言及している。Ｇ１とは、１つのＧａｌを有し、ＮｅｕＡｃを有しない両触角性構造を指し、Ｇ０は、末端ＮｅｕＡｃ又はＧａｌｓが存在しない両触角性構造を指し、Ｇ−１とは、１つのＧｌｃＮＡｃを差し引いたコア単位を指す。
【００３６】
ＷＯ００／６１７３９は、ＮＳＯ（マウスミエローマ）細胞によって発現される抗−ｈＩＬ−５Ｒ抗体の７３％と比較して、ＹＢ２／０（ラットミエローマ）によって発現される抗−ｈＩＬ−５Ｒ抗体の４７％がα１−６フコース結合糖鎖を有していると報告している。 種々の宿主細胞によって発現されるα−ｈＩＬ−５Ｒ抗体のフコースの相対比は、ＹＢ２／０＜ＣＨＯ／ｄ＜ＮＳＯである。
【００３７】
Routierらは、ＣＨＯ−ＤＵＫ細胞で発現されたヒト化ＩｇＧ１抗体（Ｄ１．３）のグリコシル化パターンを研究した。ＣＨＯ−発現のＮ−グリカンの構造は、バイセクトＧｌｃＮＡｃ及びシアル酸を欠くが、コアフコースを有する両触角性Ｎ−グリカンであった。その構造は末端ガラクトシル化に関して異種性であり、よって、Ｇ２、Ｇ１及びＧ０と呼ばれた。Routierら，Glycoconjugate J. 14: 201-207(1997)。
【００３８】
Ｏ−結合フコースが多くのポリペプチドで見出され、結合したフコースがポリペプチドの適切な活性にとって重要であることが、以前から報告されてきた。Ｏ−フコース部分によるグリコシル化の方法が記載されているＷＯ９８／３３９２４を参照せよ。Stankovaら，J. Immunol. 135(6):3719-3728(1985)は、フコースが混合白血球培養（ＭＣＬ）誘導又はプレインキュベートエフェクター細胞の細胞障害能を顕著に高めることを見出した。Cameronら, Immunol. Lett. 11: 39-44(1985)は、α−Ｌ−フコースがマクロファージ−腫瘍細胞相互作用において重要な役割を担うと思われることを見出した。
【００３９】
向上した生物学的活性を有する抗体等の糖タンパク質を生成することが、当該分野では引き続き必要とされる。
【発明の概要】
【００４０】
本発明は、Ｆｃ領域を有する糖タンパク質の糖タンパク質組成物に関し、その組成物の糖タンパク質の約８０−１００％（そしてより好ましくは９０−９９％）が、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物を含む。このような組成物は、本明細書中で、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）との結合が１００倍向上したという驚くべきことが示されていて、それは、ヒトＩｇＧとの相互作用におけるＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）程は効果的ではない。従って、本明細書中のその組成物は、以前に記載された組成物、特にＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）を発現するヒト患者の治療のための組成物に対して優れていることが期待される。ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）は、正常で健康なアフリカ系アメリカ人及びコーカサス人におけるＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）よりも広く見られる。Lehrnbecherら, Blood 94: 4220(1999)。
【００４１】
本発明は、更に、本明細書中のグリコシル化変異と糖タンパク質Ｆｃ領域におけるアミノ酸配列修飾を組み合わせることで生じるＦｃγＲＩＩＩ結合及び／又はＡＤＣＣ機能の相乗増加を示す。向上したＡＤＣＣ活性を有するＦｃ領域アミノ酸配列を作製するために、通常は、ＡＤＣＣを媒介するために重要なＦｃＲであると考えられる、ＦｃγＲＩＩＩに関して向上した結合親和性を有するＦｃ領域変異体を設計する。例えば、親Ｆｃ領域のアミノ酸位置２５６，２９０，２９８，３１２，３２６，３３０，３３３，３３４，３６０，３７８又は４３０のうちの一つ又は複数にアミノ酸修飾（例えば置換）を導入してそのような変異体を作製することが可能である。ＦｃγＲＩＩＩに対して向上した結合親和性を有する変異体は、更にＦｃγＲＩＩに対する結合親和性が低下しており、特にＦｃγＲＩＩＢレセプターを阻害することに関する親和性が低下している可能性がある。好ましい実施態様では、Ｆｃ領域は、例えば、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ等、位置２９８，３３３及び３３４でアミノ酸置換を有している。改変されたアミノ酸配列を有するＦｃ領域は、更にＡＤＣＣを高めるグリコシル化変異体を更に含む。例えば、変異体Ｆｃ領域は、フコースを欠く成熟コア炭水化物構造へ結合している可能性がある。
【００４２】
従って、本発明は、Ｆｃ領域を有する糖タンパク質を含む組成物を提供し、その組成物中の糖タンパク質の約５１−１００％は、糖タンパク質のＦｃ領域と結合しているフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含み、そのＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、その組成物中の糖タンパク質の約８０−１００％は、フコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含み、最も好ましくは、その組成物中の糖タンパク質の約９０−９９％は、成熟コア炭水化物構造と結合したフコースを欠く。
【００４３】
例えば、糖タンパク質は、抗体又はイムノアドヘシンを含む。糖タンパク質は一般的にＦｃ領域、好ましくは、例えば、ヒトＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３又はＩｇＧ４Ｆｃ領域等のヒトＦｃ領域を含む。この糖タンパク質は、向上したＦｃγＲＩＩＩとの結合（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８））、及び成熟コア炭水化物構造と結合したフコースを有する糖タンパク質と比べて向上したＡＤＣＣを示す。
【００４４】
本発明は、糖タンパク質、場合によっては、製薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む製薬的調製物を提供する。潜在的な治療的使用のためのこの調製物は無菌であり、凍結乾燥されてもよい。
【００４５】
本明細書中で開示した糖タンパク質に関する診断的及び治療的使用が考慮される。一つの診断的応用では、本発明は、抗原を含有すると疑われる試料を糖タンパク質に曝して、糖タンパク質とその試料との結合を決定することを含む、対象である抗原の存在を確かめる方法を提供する。
【００４６】
一つの治療的応用では、本発明は、そのような治療法の恩恵を受ける疾患又は疾病を患っているか又は患いやすい哺乳動物を治療する方法を提供し、その方法には、特に組成物が製薬的調製物である本明細書中の組成物の治療的有効量を哺乳動物へ投与することが含まれる。
【００４７】
本発明は、更に、Ｆｃ領域を含む糖タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を提供し、その宿主細胞によって生成される糖タンパク質の約８０−１００％は、糖タンパク質のＦｃ領域と結合しているフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む。更には、本発明は、核酸が発現するようにこの宿主細胞を培養し、場合によっては、その宿主細胞培養（例えば、宿主細胞培養培地）から糖タンパク質を回収することを含む糖タンパク質の産生方法を提供する。
【００４８】
本発明は、更に、疾患又は疾病を治療する目的のために使用することが可能な製造品又はキット中での糖タンパク質を提供する。  
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】種々の抗体断片を作製するための天然ＩｇＧ及びその酵素消化の図示。ジスルフィド結合は、ＣＨ１及びＣＬドメインと２つのＣＨ２ドメインの間の二重線によって示されている。Ｖは可変ドメイン；Ｃは定常ドメイン；Ｌ鎖のためのＬストランド及びＨ鎖のためのＨストランド。
【図１Ｂ】血清ＩｇＧのＡｓｎ２９７と結合した完全に「加工された」又は「成熟」コア炭水化物構造（２１１０）、単鎖ガラクトース残基を有する成熟コア炭水化物構造（２１００）、並びに２つのガラクトース残基とバイセクト化ＧｌｃＮＡｃを有するコア炭水化物構造（３１２０）を概略的に示す。ＧｌｃＮＡｃ、フコース、ガラクトース及びシアル酸残基の番号は、それぞれ、この図に示す４桁番号付けシステムで表されている。
【図２】図２は、ＩｇＧのＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのオリゴ糖の付加、その後の、完全な複合両触角性（biantennary）プロセス炭水化物構造を生成するシス、メディア及びトランスゴルジでのそのプロセシングを示す。カスタノスペルミンは、初期オリゴ糖からのグルコース及びマンノース残基の除去を阻害する。
【図３】正常なフコース代謝を有するＣＨＯ細胞で発現した抗体に見出された重鎖（Ｆｃ）オリゴ糖を示す。さらなる図説文章と実施例を通して、次の命名が使用されている：「Ｈｕ４Ｄ５」は、ヒト化抗−ＨＥＲ２４Ｄ５抗体の略記、チャイニーズハムスター卵巣は、「ＣＨＯ」で略記され、１５ｃｍプレートで培養されたＣＨＯ−ＤＰ１２細胞は、「ＣＨＯ−Ｐ」と命名され、スピナーフラスコで培養されたＣＨＯ−ＤＰ１２細胞は、「ＣＨＯ−Ｓ」と命名され、ヒト胎児腎臓２９３細胞は、「ＨＥＫ２９３」と略記され、「Ｌｅｃ１３」は、イェシーバ大学 のアルバート アインシュタインメディカルカレッジ、ブロンクス、ニューヨークのPamela Stanleyから得たフコース代謝が欠失したＣＨＯ細胞株を示し、Ｆｃ領域でＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ置換を有するＨｕ４Ｄ５は、「Ｈｕ４Ｄ５−ＡＡＡ」と呼ばれ、「Ｅ２７」は、米国特許第６，１７２，２１３号に記載されている親和性成熟／ヒト化抗−ＩｇＥ抗体であり、Ｆｃ領域にＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ置換を有するＥ２７は、「Ｅ２７−ＡＡＡ」と命名され、そして末梢血単核細胞抗体依存性細胞媒介細胞障害性は、「ＰＢＭＣ ＡＤＣＣ」と略記されている。
【図４】ヒトＦｃγＲＩとのＨｕ４Ｄ５単量体の結合を示す。Ｈｕ４Ｄ５抗体は、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ−Ｐ、又はＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（２つの異なるバッチ）で発現される。
【図５】ヒトＦｃγＲＩＩＢとのＨｕ４Ｄ５二量体の結合を示す。Ｈｕ４Ｄ５抗体は、ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ１３細胞で発現した（３つの異なるバッチ）。
【図６】ヒトＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）とＨｕ４Ｄ５二量体の結合を示す。Ｈｕ４Ｄ５抗体は、ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ１３細胞で発現した（３つの異なるバッチ）。
【図７】ヒトＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）とＨｕ４Ｄ５二量体の結合を示す。Ｈｕ４Ｄ５抗体は、ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ１３細胞で発現した（３つの異なるバッチ）。
【図８】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）とＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ１３細胞（それぞれ、３つ及び２つの異なるバッチ）で発現したＨｕ４Ｄ５又はＨｕ４Ｄ５−ＡＡＡ二量体の結合を示す。
【図９】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）とＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ１３細胞（３つの異なるバッチ）で発現したＨｕ４Ｄ５二量体又はＬｅｃ１３細胞（２つの異なるバッチ）で発現したＨｕ４Ｄ５−ＡＡＡ二量体の結合を表す。
【図１０】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）と抗−ＩｇＥ（Ｅ２７）二量体の結合を示す。ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ−Ｐ細胞（２つのバッチ）又はＬｅｃ１３細胞（２つのバッチ）で発現したＥ２７は、このアッセイで試験された。
【図１１】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）と抗−ＩｇＥ（Ｅ２７）二量体の結合を示す。ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ−Ｐ細胞（２つのバッチ）又はＬｅｃ１３細胞（２つのバッチ）で発現したＥ２７は、このアッセイで試験された。
【図１２】ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）と抗−ＩｇＥ（Ｅ２７）六量体及びＥ２７−ＡＡＡの結合を例示する。抗体は、ＣＨＯ−Ｐ、Ｌｅｃ−１３又はＨＥＫ２９３細胞で発現した。
【図１３】ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）と抗−ＩｇＥ（Ｅ２７）六量体及びＥ２７−ＡＡＡの結合を例示する。抗体は、ＣＨＯ−Ｐ、Ｌｅｃ−１３又はＨＥＫ２９３細胞で発現した。
【図１４】ヒトＦｃＲｎとＣＨＯ−Ｐ、ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ−１３細胞で発現したＨｕ４Ｄ５の結合を示す。
【図１５】ヒトＣ１ｑとＨｕ４Ｄ５及び抗−ＣＤ２０（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））の結合を示す。Ｈｕ４Ｄ５は、ＣＨＯ−Ｐ又はＬｅｃ１３細胞で発現した（２つのバッチ）。ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は、ＣＨＯ−Ｐ細胞で発現した。
【図１６】ヒトＣ１ｑとＨｕ４Ｄ５又はＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）の結合を示す。この実験で使用したＨｕ４Ｄ５は、ＣＨＯ−Ｐ、Ｌｅｃ−１３（３つの異なるバッチ）又はＣＨＯ−Ｓ細胞で発現された。ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は、ＣＨＯ−Ｐ細胞で発現された。
【図１７】ＦｃγＲＩＩＩ ＶＦ供与体をを使用したＳＫＢＲ３乳腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ ３０：１）のＰＢＭＣ ＡＤＣＣを示す。ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ−１３細胞で発現したＨｕ４Ｄ５から生じたものと比較した自発的ＡＤＣＣを示す。
【図１８】他のＦｃγＲＩＩＩ ＶＦ供与体を使用したＳＫＢＲ３乳腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ ３０：１）のＰＢＭＣ ＡＤＣＣを示す。ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ−１３細胞で発現したＨｕ４Ｄ５から生じたものと比較した自発的ＡＤＣＣを示す。
【図１９】ＦｃγＲＩＩＩ ＦＦ供与体を使用したＳＫＢＲ３乳腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ ３０：１）のＰＢＭＣ ＡＤＣＣを示す。ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ−１３細胞で発現したＨｕ４Ｄ５から生じたものと比較した自発的ＡＤＣＣを示す。
【図２０】他のＦｃγＲＩＩＩ ＦＦ供与体を使用したＳＫＢＲ３乳腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ ３０：１）のＰＢＭＣ ＡＤＣＣを示す。ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ−１３細胞で発現したＨｕ４Ｄ５から生じたものと比較した自発的ＡＤＣＣを示す。
【図２１】ＦｃγＲＩＩＡ ＲＲ供与体を使用したＳＫＢＲ３乳腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ １０：１）の単球ＡＤＣＣを示す。ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ−１３細胞（２つの異なるバッチ）で発現したＨｕ４Ｄ５から生じたものと比較した自発的ＡＤＣＣを示す。
【図２２】ＦｃγＲＩＩＡ ＨＨ供与体を使用したＳＫＢＲ３乳腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ １０：１）の 単球ＡＤＣＣを示す。ＣＨＯ−Ｓ又はＬｅｃ−１３細胞で発現したＨｕ４Ｄ５から生じたものと比較した自発的ＡＤＣＣを示す。
【図２３】天然配列ＩｇＧ Ｆｃ領域のアライメントを示す。天然配列ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域配列、ｈｕｍＩｇＧ１（非−Ａ及びＡアロタイプ）（それぞれ配列番号：１及び２）、ｈｕｍＩｇＧ２（配列番号：３） 、ｈｕｍＩｇＧ３（配列番号：４）及びｈｕｍＩｇＧ４（配列番号：５）を示している。ヒトＩｇＧ１配列は、非−Ａアロタイプであり、この配列とＡアロタイプの違い（位置３５６及び３５８；ＥＵ番号付けシステム）は、以下のヒトＩｇＧ１配列に示されている。天然配列マウスＩｇＧ Ｆｃ領域配列、ｍｕｒＩｇＧ１（配列番号：６）、ｍｕｒＩｇＧ２Ａ（配列番号：７）、ｍｕｒＩｇＧ２Ｂ（配列番号：８）及びｍｕｒＩｇＧ３（配列番号：９）も示されている。
【図２４】ＣＤ５６ポジティブナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とＨｕ４Ｄ５及びＨｕ４Ｄ５−ＡＡＡの結合を示す。試験された産物は：（１）ＦＩＴＣ結合抗−ヒトＩｇＧ、（２）ＣＨＯ−ＳのＨｕ４Ｄ５、（３）Ｌｅｃ１３細胞で発現したＨｕ４Ｄ５、及び（４）Ｌｅｃ１３細胞で発現したＨｕ４Ｄ５−ＡＡＡである。
【図２５】ＦｃγＲＩＩＩ（Ｆ／Ｆ）レセプターを発現する精製ＮＫ細胞の免疫蛍光染色を表す。
【図２６】ＣＨＯ−ＳのＨｕ４Ｄ５、Ｌｅｃ１３細胞のＨｕ４Ｄ５、Ｌｅｃ１３細胞のＨｕ４Ｄ５−ＡＡＡ、及びＨＥＫ２９３のＨｕ４Ｄ５のＮＫ ＡＤＤＣ活性の比較を提供する。供与体は、ＦｃγＲＩＩＩ（Ｆ／Ｆ）である。
【図２７】異なるＦｃγＲＩＩＩ（Ｆ／Ｆ）供与体による図２６の実験をくり返す。
【図２８】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡα鎖及びγ鎖で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株との抗−ＨＥＲ２ Ｈｕ４Ｄ５単量体の結合を示す（１つのアッセイについての代表的プロット）。Ｈｕ４Ｄ５ ＣＨＯ−Ｓ、白丸；Ｈｕ４Ｄ５ Ｌｅｃ１３−Ｄ、白四角形；Ｈｕ４Ｄ５ Ｌｅｃ１３−Ｅ、白ダイヤモンド形；Ｈｕ４Ｄ５ Ｌｅｃ１３−Ｆ、白三角形 ；Ｈｕ４Ｄ５ ＨＥＫ２９３−ＡＡＡ、黒丸；Ｈｕ４Ｄ５ Ｌｅｃ１３−ＡＡＡ−Ｂ、黒四角形；Ｈｕ４Ｄ５ Ｌｅｃ１３−ＡＡＡ−Ｃ，黒ダイヤモンド形。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
本明細書及び請求の範囲を通じて、免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、ここに明示して参考として取り入れるKabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.（ Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)）に記載されたようなＥＵインデックスのものである。「KabatのようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００５１】
本発明の炭水化物部分は、オリゴ糖の記述に通常用いられる命名法を参照して記載される。この命名法を用いた炭水化物化学の概説は、Hubbardら, Ann., Rev. Biochem. 50: 555-583(1981)に見出される。この命名法は、例えば、マンノースを表すＭａｎ；２-Ｎ-アセチルグルコサミンを表すＧｌｃＮＡｃ；ガラクトースを表すＧａｌ；フコースを表すＦｕｃ；及びグルコースを表すＧｌｃを含む。シアル酸は、５-Ｎ-アセチルノイラミン酸に対するＮｅｕＮＡｃ、及び５-グリコリルノイラミン酸に対するＮｅｕＮＧｃという略式表記によって記載する。
【００５２】
「グリコシル化」という用語は、糖タンパク質へのオリゴ糖の結合（例えば、２つから約１２の単純な糖が結合した、結合した２又は複数の単純な糖を含有する炭水化物）を意味する。オリゴ糖側鎖は、典型的には、Ｎ−又はＯ−結合の何れかを介して糖タンパク質の骨格と結合する。本発明のオリゴ糖は、一般的には、Ｎ−結合オリゴ糖のようにＦｃ領域のＣＨ２ドメインと結合している。
【００５３】
「Ｎ−結合グリコシル化」とは、糖タンパク質鎖中のアスパラギン残基との炭水化物部分の結合を指す。熟練者は、例えば、ヒトＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ及びＩｇＤ ＣＨ２ドメインだけでなく各マウスＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３が、アミノ酸残基２９７にＮ−結合グリコシル化のための１つの部位を有することを認識する（Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991）。
【００５４】
「糖タンパク質」は、一つ又は複数のオリゴ糖側鎖が結合したポリペプチドを有する。
【００５５】
本明細書の目的では、「成熟コア炭水化物構造」とは、以下の式で示される両触角性オリゴ糖に典型的な次の炭水化物構造ＧｌｃＮＡｃ（フコース）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）２で通常は構成されるＦｃ領域と結合する加工されたコア炭水化物構造を指す：
2010248228.tif 000003
【００５６】
この用語は、特には、β１，２ＧｌｃＮＡｃ残基を欠くコア成熟炭水化物構造のＧ−１型を含む。しかしながら、好ましくは、このコア炭水化物構造は、両β１，２ＧｌｃＮＡｃ残基を含む。本明細書中の成熟コア炭水化物構造は、通常は、高マンノース化されていない。
【００５７】
成熟コア炭水化物構造は、通常は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７とのＮ−結合を介して、糖タンパク質のＦｃ領域と結合している。
【００５８】
「バイセクト化ＧｌｃＮＡｃ」は、成熟コア炭水化物構造のβ１，４マンノースと結合したＧｌｃＮＡｃ残基である。このバイセクト化ＧｌｃＮＡｃは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ酵素（ＧｎＴＩＩＩ）によって成熟コア炭水化物構造と酵素的に結合することが可能である。ＣＨＯ細胞は、通常はＧｎＴＩＩＩを発現しないが（Stanleyら, J.Biol.Chem.261: 13370-13378(1984)）、操作してそうするようにしてもよい（Umanaら, Nature Biotech. 17: 176-180(1999)）。
【００５９】
一つ又は複数の選択した糖類を「本来的に有しない」糖タンパク質（例えば、バイセクト化ＧｌｃＮＡｃ、一つ又は複数のガラクトース残基、又は一つ又は複数のシアル酸残基）は、組成物の糖タンパク質の約９０−１００％が成熟コア炭水化物構造と結合している選択糖類を欠くように、通常は、成熟コア炭水化物構造への選択された糖類の付加を欠く宿主細胞で生成される。
【００６０】
「グリコシダーゼ」は、アスパラギン結合（Ｎ−結合）糖タンパク質の生合成に関与する酵素である。「トリミング」酵素はオリゴ糖を取り除くもので、「トランスフェラーゼ」はオリゴ糖を付加する。グリコシダーゼの例には、グルコシダーゼＩ及びＩＩ等のトリミンググルコシダーゼ；粗面小胞体マンノシダーゼ（ｒＥＲマンノシダーゼ）、マンノシダーゼＩＡ、マンノシダーゼＩＢ及びマンノシダーゼＩＩ等のトリミングマンノシダーゼ；並びにグリコシルトランスフェラーゼ等のトランスフェラーゼ、例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、Ｇａｌ−トランスフェラーゼ、シアル酸トランスフェラーゼ及びフコトランスフェラーゼが含まれる。
【００６１】
「グリコシダーゼインヒビター」とは、一つ又は複数のグリコシダーゼによるＮ−結合オリゴ糖プロセシングを低下又は防ぐ化合物又は組成物を指す。例としては、ノジリマイシン、１−デオキシノジリマイシン（ｄＮＭ）、Ｎ−メチル−１−デオキシ−ノジリマイシン（Ｍ−ｄＮＭ）、カスタノスペルミン、ブロモコンデュリトール（bromoconduritol）、１−デオキシマンノジリマイシン（ｄＭＭ）、アウストラリン（australine）、ＭＤＬ、レンチギノシン（lentiginosine）、及びスワインソニン（Swainsonine（Sw))が含まれる。グリコシダーゼインヒビターは、Fuhrmannら, Biochim. Biophys. Acta. 825:95-110(1985)；Kaushal及びElbein, Methods in Enzym. 230:316-329(1994)；及びElbein, A. FASEB 5:3055-3063(1991)に概説されている。
【００６２】
「Ｌｅｃ１３」とは、フコース代謝欠損を示し、そのために複合炭水化物にフコースを付加する能力が消滅しているレクチン耐性チャイニーズ  ハムスター卵巣（ＣＨＯ）変異細胞株を指す。その細胞株は、Ripka及びStanley, Somatic Cell ＆ Molec. Gen. 12(1): 51-62(1986)；及びRipkaら, Arch. Biochem. Biophys. 249(2): 533-545(1986)に記載されており、イェシーバ大学 のアルバート アインシュタインメディカルカレッジ、ブロンクス、ニューヨークから入手可能である。Ｌｅｃ１３細胞は、フコース代謝にとって重要な酵素であるＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼの転写物を欠いていると考えられている。Ohyamaら, J. Biol. Chem. 273(23): 14582-14587(1988)。ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼは、後にＦＸタンパク質によってＧＤＰ−Ｌ−フコースへ転換される、ＧＤＰ−マンノース−４−ケト−６−Ｄ−デオキシマンノースをＧＤＰ−マンノースから生成する。フコシル化オリゴ糖の発現は、ＧＤＰ−Ｌ−フコース供与体基質とフコシルトランスフェラーゼに依存する。
【００６３】
「フコシルトランスフェラーゼ」は、糖タンパク質に一つ又は複数のフコースを付加する酵素である。例としては、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、ＦｕｃＴＩ、ＦｕｃＴＩＩ、ＦｕｃＴＩＩＩ、ＦｕｃＴＩＶ、ＦｕｃＴＶ，ＦｕｃＴＶＩ及びＦｕｃＴＶＩＩが含まれる。ブタ及びヒトα１，６−フコシルトランスフェラーゼは、それぞれUozumiら, J. Biol. Chem. 271:27810-27817(1996)、及びYanagidaniら, J. Biochem. 121:626-632(1997)に記載されている。
【００６４】
「シアリルトランスフェラーゼ」は、糖タンパク質に一つ又は複数のシアル酸残基を付加する酵素である。α２，３シアリルトランスフェラーゼは、成熟コア炭水化物構造に結合しているガラクトース残基にシアル酸残基を付加することができる。
【００６５】
「ガラクトトランスフェラーゼ」は、糖タンパク質に一つ又は複数のガラクトース残基を付加する酵素である。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、成熟コア炭水化物構造にガラクトース残基を付加することができる。
【００６６】
「Ｆｃ領域含有糖タンパク質」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体又はイムノアドヘシン等の糖タンパク質を指す。
【００６７】
「Ｆｃ領域」という用語は、例えば図１Ａに示されているような免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域又は変異体Ｆｃ領域であってよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６、又はＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸展すると定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、例えば図１Ａに示された２つの定常領域、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。
【００６８】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。模範的な「エフェクター機能」はＣ１ｑ結合を含む；補体依存性細胞障害性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)；ファゴサイトーシス(食作用）；細胞表層レセプターのダウンレギュレーション(例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）、など。このようなエフェクター機能は、一般的に、結合ドメイン（例えば、抗体可変領域）との結合のためにＦｃ領域を必要とし、例えば、本明細書中に開示された種々のアッセイを使用して評価することができる。
【００６９】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は図２３に示されており、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域と並んでその天然発生変異体を含む。天然配列マウスＦｃ領域は、図２３にも示されている。天然配列Ｆｃ領域の他の例には、天然配列ヒトＩｇＡ Ｆｃ領域及び天然配列ヒトＩｇＤ Ｆｃ領域が含まれる。
【００７０】
「変異体Ｆｃ領域」は、本明細書で定義された少なくとも一つの「アミノ酸修飾」によって天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較し、少なくとも一つのアミノ酸置換を有する、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１から約１０アミノ酸置換、及び好ましくは約１から約５アミノ酸置換である。ここにおける変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％配列同一性、及び最も好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する。
【００７１】
「相同性」とは、アミノ酸配列変異体において、最大のパーセント相同性を達成するために、必要ならば間隙を導入して、配列を整列させた後に同一である残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは本技術分野においてよく知られているものである。そのようなコンピュータープログラムの一つは、ジェネンテック社により著作された「Align2」で、1991年12月10日にアメリカ合衆国著作権庁、Washington, DC 20559に利用者資料を付して提出されている。
【００７２】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」）及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化ＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＩＭ）を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)に概説されている）。本明細書中のＦｃレセプターには、アミノ酸位置１３１によって決定されるヒトＦｃγＲＩＩの２つの天然発生アロタイプであるＦｃγＲＩＩ（Ｈ１３１）及びＦｃγＲＩＩ（Ｒ１３１）（Clarkら, J. Immunol. 143: 1731-1734(1989)）、及びヒトFcγＲＩＩＩＡの天然発生アロタイプが含まれる。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡは、位置４８（Ｌｅｕ，Ｈｉｓ又はＡｒｇ）及び位置１５８（Ｖａｌ又はＰｈｅ）での天然発生アロタイプを有する。ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）アロタイプは、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）アロタイプよりもヒトＩｇＧと相互作用する（Shieldsら, J. Biol. Chem. 276:6591-6604(2001)）；Koeneら, Blood 90: 1109-1114(1997)；及びWuら, J. Clin. Invest. 100:1059-1070(1997)）。ＦｃＲは、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34(1994)；及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)に概説されている。将来において同定されるべきものに含まれる他のＦｃＲは、本明細書中の用語「ＦｃＲ」に含まれている。この用語は、胎児へ母性ＩｇＧの転移を担う新生児レセプターであるＦｃＲｎも含まれる（Guyerら, J. Immunol. 117:587(1976)及びKimら, J. Immunol. 24: 249(1994)）。
【００７３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ＦｃＲを発現する非特異的細胞傷害細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いてその標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を言う。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、その一方で単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。
【００７４】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つ又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液又はＰＢＭＣから単離してもよい。
【００７５】
「ヒンジ領域」は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０の伸展として一般に定義されている(Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985))。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１と並べることができる。
【００７６】
Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域」は、通常はヒンジ領域のＣ末端に隣接する残基の伸展として定義される、即ち、Ｆｃ領域の残基２３３から２３９である。
【００７７】
本発明の「ＣＨ２ドメイン」は、本明細書中では、通常はＡｓｎ２９７で少なくとも１つのＮ−結合オリゴ糖の結合部位を有するＣＨ２ドメインを記載するために使用されている。それが、少なくともヒトＩｇＧ ＣＨ２ドメインのＮ−結合オリゴ糖を有するＣＨ２ドメインを有するか、又は修飾されて有するという点で、本発明の糖タンパク質の特徴である。ＣＨ２ドメインは、好ましくはヒトＩｇＧ１のＣＨγ２ドメインである。免疫グロブリン重鎖の残基を番号付けするためのＥＵインデックスを使用すると、ヒトＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、通常は、Ｆｃ領域の約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで伸長する。
【００７８】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインまでの残基Ｃ末端のストレッチを含む（即ち、ＩｇＧの約アミノ酸残基３４１から約アミノ酸残基４４７）。
【００７９】
用語「アミノ酸類」及び「アミノ酸」とは、Ｄ及びＬ立体異性体の双方のすべての天然発生アルファアミノ酸、及びそれらの類似体及び誘導体を意味する。類似体とは、アミノ酸の原子を、通常は類似の特性を有する異なるアミノ酸で置換することと定義される。誘導体とは、それに他の分子又は原子が結合したアミノ酸だと定義される。例えば、誘導体には、アミノ酸のアセチル化、カルボキシ基のアミノ化、又は２つのシステイン分子の硫黄残基の酸化によるシステインの形成が含まれる。
【００８０】
本明細書中で使用されているように、「ポリペプチド」とは、通常は、約１０より多いアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を意味する。ポリペプチドは、それが発現される宿主細胞にとって相同的であるか、又は好ましくは、外来性であり、それは異種性であり、即ち、ＣＨＯ細胞で生成されるキメラ、ヒト化又はヒト抗体等のように、使用される宿主細胞にとって外来である。
【００８１】
用語「抗体」は最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特性抗体）、そして、所望される生物活性を示している限りは抗体断片を包含する。
【００８２】
本発明の目的のために定義された「抗体断片」は、通常は、無傷の抗体の抗原結合又は可変領域、又は抗体のＦｃ領域を含む無傷の抗体の一部分を含む。抗体断片の例には、直鎖抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異的抗体が含まれる。
【００８３】
ここで用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらには、概して異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来型（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示すものであって、ある特定の方法による抗体の産生を必要とすることを意味するためのものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256: 495 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）によって作成してもよい。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352: 624-628 (1991)及び Marks等, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
【００８４】
ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、それらの抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である（米国特許第4,816,567号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。
【００８５】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの超可変領域の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(供与体抗体)の超可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、供与抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。さらなる詳細は、Jonesら, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmannら, Nature 332, 323-329(1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００８６】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のものに相当するアミノ酸配列を有するもの、および／または本明細書に記載されているようなヒト抗体を作成するための技術の何れかを用いて作成されたものである。ヒト抗体のこのような定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は考慮されない。ヒト抗体は、様々な従来技術を使用して生成することができる。一実施態様では、ファージライブラリがヒト抗体を発現する場合、そのようなファージライブラリからヒト抗体を選択する（Vaughanら, Nature Biotechnology, 14:309-314, (1996); Sheets他 PNAS(USA), 95:6157-6162,(1998); HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227:381, (1991); Marksら, J. Mol. Biol., 222:581, (1991)）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が特異的にまたは完全に非活性化されているマウスに導入することにより生成することができる。実験によりヒト抗体の産生が確認されており、それは遺伝子の再編成、構築、および抗体のレパートリーを含め、すべての面でヒトに見られる抗体産生に非常に類似している。この方法は、例えば、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、および以下の科学文献に開示されている：Marksら, Bio/Technology, 10: 779-783, (1992); Lonbergら, Nature, 368: 856-859, (1994); Morrison, Nature, 368:812-13, (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology, 14: 845-51, (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826, (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93, (1995)。あるいは、ヒト抗体は、標的となる抗原を志向する抗体を産生するＢリンパ球（このようなＢリンパ球は個体から回収できるか、またはインビボで免疫することができる）の不死化により調製することもできる。 例えば、Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, (1985); Boerner他, J. Immunol., 147 (1):86-95, (1991); および米国特許第5,750,373号を参照のこと。
【００８７】
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８８】
ここで使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、異種性「接着」タンパク質(例えば、レセプター、リガンド又は酵素)の「結合ドメイン」を免疫グロブリン定常ドメインと組み合わせた抗体様分子を示す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）以外の所望の結合特異性を持つ接着アミノ酸配列（即ち、異種性）及び免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含んでなる。
【００８９】
ここで使用される「リガンド結合ドメイン」という用語は、対応する未変性のレセプターの定性的リガンド結合能を少なくとも保持している任意の未変性の細胞表面レセプター又はその任意の領域又は誘導体を意味する。特定の実施態様では、レセプターは免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーに対して相同である細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドからのものである。他のレセプターは、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないが、それにもかかわらずこの定義により特にカバーされるものであり、サイトカインに対するレセプター、特にチロシンキナーゼ活性を持つレセプター(レセプターチロシンキナーゼ)、造血素及び神経成長因子レセプタースーパーファミリーのメンバー、及び細胞接着分子、例えば(Ｅ-、Ｌ-及びＰ-)セレクチンである。
【００９０】
「レセプター結合ドメイン」という用語は、細胞接着分子を含む、レセプターに対する任意の未変性のリガンド、又は対応する未変性のリガンドの定性的なレセプター結合能を少なくとも保持するそのような未変性のリガンドの任意の領域又は誘導体を示すために使用される。この定義は、なかでも、上述のレセプターに対するリガンド由来の結合配列を特に含む。
【００９１】
「抗体-イムノアドヘシンキメラ」は、(ここに定義した)抗体の少なくとも一つの結合ドメインを少なくとも一つの(本出願において定義した)イムノアドヘシンと組み合わせた分子を含む。抗体-イムノアドヘシンキメラの例は、Berg等, PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991)及びChamow等, J. Immunol. 153:4268 (1994)に記載された二重特異的ＣＤ４-ＩｇＧキメラである。
【００９２】
本明細書中で使用する用語「製剤」は、その環境の成分として同定及び分離及び／又は回収された組成物又は糖タンパク質を定義するのに用いられる。その環境の混入物成分は、望まれない又は意図していないグリコフォーム等の糖タンパク質又は組成物ついての診断又は治療用途を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含みうる。本発明の製剤は、これらの汚染物質を実質的に含まない。好ましい実施態様では、糖タンパク質製剤は、（１）ローリー法で測定したときに９５重量％以上、より好ましくは９９重量％以上の抗体まで、（２）スピニングカップ配列器を用いてＮ-末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元条件又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで精製される。
【００９３】
本明細書中の目的のための「製薬的製剤」とは、哺乳動物、特にヒトへの投与に適用され適切なものである。従って、その組成物は、哺乳動物の疾患又は疾病の治療に使用することができる。更には、治療用途を妨害し得る混入物がそれから分離されるように、組成物中の活性な成分である糖タンパク質は、１つ又は複数の精製又は単離工程に供せられた。一般的に、製薬的製剤は、その例が以下に記載されている、治療用糖タンパク質及び製薬的に許容される担体又は希釈剤を含む。製剤は、通常は無菌、そして凍結乾燥してもよい。
【００９４】
本明細書中の目的にための「親糖タンパク質」とは、フコースが成熟コア炭水化物構造と結合していることを除いて、本発明の糖タンパク質変異体と同じアミノ酸配列及びコア炭水化物構造を有する糖タンパク質である。例えば、約５０−１００％の親糖タンパク質又は親糖タンパク質の約７０−１００％を含む組成物中には、それに結合したフコースを有する成熟コア炭水化物構造が含まれる。
【００９５】
親糖タンパク質よりも「より高い親和性」でＦｃＲと結合する糖タンパク質変異体は、結合アッセイでの糖タンパク質変異体の量及び親糖タンパク質が本質的に同じ場合に、親糖タンパク質よりも実質的により高い結合親和性で上記のＦｃＲの何れか１つ又は複数と結合するものである。例えば、向上したＦｃＲ結合親和性を有する糖タンパク質変異体は、本明細書中の実施例に開示したようにＦｃＲ結合親和性が決定される場合に、約５倍から約１０００倍、例えば、親糖タンパク質と比較してＦｃＲ結合親和性が約１０倍から約５００倍の向上を示す可能性がある。
【００９６】
親ポリペプチド「よりも効果的に、ヒトエフェクター細胞の存在において抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する」糖タンパク質変異体は、アッセイで使用する糖タンパク質変異体と親糖タンパク質の量が本質的に同じ場合に、ＡＤＣＣ媒介がインビトロとインビボで実質的により効果的であるものである。一般的に、そのような糖タンパク質変異体は、本明細書中で開示されるインビトロＡＤＣＣを使用して同定されるが、例えば動物モデル等でのＡＤＣＣ活性を同定するための他のアッセイ又は方法が検討されている。好ましい糖タンパク質変異体は、親、例えば本明細書中で開示されたインビトロアッセイにおいて、約１．５倍から約１００倍、例えば約２倍から約５０倍もＡＤＣＣを媒介することにおいてより効果的である。
【００９７】
「アミノ酸修飾」とは、前もって決定されたアミノ酸配列のアミノ酸配列の変化を意味する。例示的な修飾には、アミノ酸置換、挿入及び／又は欠損が含まれる。本明細書中での好ましいアミノ酸修飾は置換である。
【００９８】
例えばＦｃ領域等、特定の位置での「アミノ酸修飾」とは、特定の残基の置換又は欠損、又は特定の残基に近接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を意味する。挿入による「近接」した特定の残基とは、その１つ又は２つの残基内で挿入することを意味する。その挿入とは、特定の残基に対してＮ−末端又はＣ−末端であってよい。
【００９９】
「アミノ酸置換」とは、すでに決定されているアミノ酸配列に存在する少なくとも１アミノ酸残基を他の異なる「置換」アミノ酸残基で置き換えることを指す。置換残基もしくは残基群は、「天然に存在するアミノ酸残基」（即ち、遺伝コードでコードされるもの）で良く、アラニン（Ala）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される。好ましくは、置換はシステインではない。ここでのアミノ酸置換の定義には、一又はそれ以上の非天然型アミノ残基の置換も含める。「非天然型アミノ酸残基」とは、上述した天然アミノ酸残基以外の残基で、ポリペプチド鎖においてアミノ酸残基（群）に隣接して共有結合し得るものを指す。非天然型アミノ酸の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびその他Ellman et al. Meth,Enzym. 202:301-336 (1991)に記載されているようなアミノ酸類似体が含まれる。非天然型アミノ酸残基を産生するためには、Noren et al. Science 244:182 (1989)およびEllamn et al. 上掲の方法を利用することができる。要するに、これらの方法はＲＮＡインビトロにおける転写、翻訳に先立って非天然型アミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡ化学的活性化する方法である。
【０１００】
「アミノ酸挿入」とは、すでに決定されているアミノ酸配列の中に少なくとも１つアミノ酸を取り込ませることである。挿入は通常１または２のアミノ酸残基の挿入により構成されるが、本出願においては、より長い「ペプチド挿入」、例えば、約３から５、さらには約１０アミノ酸残基の挿入を考慮する。挿入された残基（群）は、上述した天然存在もしくは非天然存在である。
【０１０１】
「アミノ酸欠失」とは既に決定されているアミノ酸配列から少なくとも１アミノ酸を除去することを意味する。
【０１０２】
「Ｃ１ｑ」は免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは二つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓと共に、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)経路の最初の成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは、例えばQuidel, San Diego, CAから商業的に購入可能である。
【０１０３】
「治療」とは、治癒的処置、及び予防的療法又は防止的療法の両方を指す。治療を必要とする対象には、既に障害を受けているもの並びに障害を予防されるべきものが含まれる。
【０１０４】
本明細書での「疾病」または「疾患」とは、糖タンパク質による治療が有益であるあらゆる症状である。これには、哺乳動物を問題となっている疾患に罹りやすくする病理的症状を含む、慢性及び急性疾病又は疾患が含まれる。１つの実施態様では、疾病は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾病、感染又は不必要な組織又は細胞の除去が所望される甲状腺腫等の他の症状である。本明細書において治療されるのが好ましい疾患又は疾病は、癌又は自己免疫疾患である。
【０１０５】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか又は表す。癌の例は、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定な例としては、扁平上皮癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓又は腎癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌、並びに頭及び頸癌を含む。
【０１０６】
本明細書中の「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、低級／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中級／濾胞性ＮＨＬ、中級びまん性ＮＨＬ、高級免疫芽細胞性ＮＨＬ、高級リンパ芽球性ＮＨＬ、高級小非分割細胞ＮＨＬ、バルキー疾患ＮＨＬ、外套細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、及びワルデンストロームマクログロブリン血症を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；急性リンパ芽球白血病(ＡＬＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を含むリンパ腫；そして他の血液悪性腫瘍を含む。このような悪性腫瘍は、ＣＤ２０等のＢ細胞表面マーカーに対する抗体によって治療することが可能である。
【０１０７】
「ホルモン非依存性」癌とは、その増殖が、癌の細胞によって発現するレセプターと結合するホルモンの存在に依存しないものである。そのような癌は、腫瘍又はその近傍でのホルモン濃度を低下させる薬学的又は外科的戦略を施すと臨床的な退行はない。ホルモン非依存性癌の例には、アンドロゲン非依存性前立腺癌、エストロゲン非依存性乳癌、子宮内膜癌及び卵巣癌が含まれる。このような癌は、ホルモン依存性腫瘍のように発症し、ホルモン感受性段階からホルモン抵抗性腫瘍へ進行し、その後は抗ホルモン治療が続く。
【０１０８】
本明細書中の「自己免疫疾患」とは、個人の自身の組織から生じる、また該組織に対する非悪性疾患又は障害のことである。自己免疫疾患又は障害の例には、これらに限るものではないが、炎症反応、例えば乾癬及び皮膚炎(例えばアトピー性皮膚炎)を含む炎症性皮膚病；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患(例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎)に関連した反応；呼吸困難症候群(成人性呼吸困難症候群；ＡＲＤＳを含む)；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギーによる病状、例えば湿疹及び喘息及びＴ細胞の浸潤に関連した他の病状及び慢性炎症反応；アテローム性動脈硬化症；白血球付着欠損症；リウマチ様関節炎；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)；真性糖尿病(例えば、Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性真性糖尿病)；多発性硬化症；レーノー症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；ショルゲン(Sjorgen)症候群；若年発症糖尿病；及び結核に典型的に見出されるＴリンパ球及びサイトカインにより媒介される急性及び遅延高血圧に関連した免疫反応、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽種症及び血管炎；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出に関連した疾患；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症疾病；多臓器傷害症候群；溶血性貧血(限定するものではないが、クリオグロブリン血症又はクームズ陽性貧血を含む)；重症筋無力症；抗原-抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランベルト-イートン筋無力症症候群；類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；stiff-man症候群；ベーチット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)又は自己免疫血小板減少病等が含まれる。
【０１０９】
「炎症性疾患」とは、炎症を起こす病理的段階、典型的には好中球走化性によって生じる。そのような疾患の例には、炎症性皮膚疾患が含まれ、それには、乾癬及びアトピー性皮膚炎；全身性硬化症；炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）に関連する反応；手術組織再潅流傷害、心筋不全等の心筋虚血症状、心不全、心臓手術後の潅流及び経皮経管冠動脈形成後の潅流、発作、及び腹部大動脈瘤を含む虚血潅流疾患；発作後の脳水腫；頭蓋外傷；血液量減少性ショック；呼吸停止；成人呼吸窮迫症候群；急性肺障害；ベーチェット病；皮膚筋炎；多発性筋炎；多発性硬化症；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；骨関節炎；ルーブス腎炎；リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、血管炎等の自己免疫疾患；白血球漏出を含む疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性疾患、敗血症又は心的外傷の後の多臓器傷害；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；糸球体腎炎を含む抗原−抗体複合媒介疾患；敗血症；サルコイドーシス；組織／臓器移植への免疫病理学的応答；胸膜炎、肺胞炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、及び嚢胞性線維症等を含む肺の炎症が含まれる。好ましい症状には、急性肺傷害、成人呼吸窮迫症候群、虚血性潅流（外科組織潅流傷害、心筋虚血症、及び急性心筋不全が含まれる）、血液量減少性ショック、喘息、細菌性肺炎及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患が含まれる。自己免疫疾患は、炎症性疾患と重複し、逆も同様である。
【０１１０】
外来抗原に対する「免疫応答のブロッキング」とは、少なくとも外来抗原に曝すことで結果として生じる少なくとも１つの免疫媒介応答を減少又は防ぐことを意味する。例えば、即ち、哺乳動物の抗原に対する抗体の生成を防ぐか又は減じることによって、外来抗原への体液性応答を鈍らせることができる。場合によっては、更に、イデオタイプを抑制してもよい；アロ抗体で覆われた細胞の除去を和らげ；及び／又は抗原提示細胞の欠乏を通してアロ抗原提示に作用する。
【０１１１】
「外来抗原」とは、それに曝されている哺乳動物にとって内因性又は天然のものではない分子又は分子群を意味する。外来抗原は、免疫応答、例えば、哺乳動物での体液性及び／又はＴ細胞媒介応答を誘発することが可能である。一般的に、外来抗原は、それに反して抗体の産生を誘発する。本明細書中で検討される外来抗原の例としては、免疫原性療法剤、例えば、抗体等のタンパク質、特に非ヒトアミノ酸残基（例えば、げっ歯類、キメラ／ヒト化、及び初回刺激した抗体）を含む抗体；毒素（随意的に、抗体等の標的分子と複合化し、その標的化分子も免疫原性であってもよい）；レトロウイルス及びアデノウイルス等の遺伝子治療ウイルスベクター；移植片；病原菌（例えば、細菌及びウイルス）；血液型の違いなどのアロ抗原（即ち、同じ種の他のメンバーではないが、同じメンバーで生じる抗原）、ヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）、血小板抗原、移植した臓器で発現する抗原、血液成分、妊娠（Ｒｈ）、及び血友病因子（例えば、ＶＩＩＩ及びＩＸ因子）を含む。
【０１１２】
本明細書における目的での「腫瘍関連抗原」とは、正常な細胞に比べて腫瘍細胞でのより高い発現によって特徴付けられる抗原である。具体的な例としては、ＥｒｂＢレセプター、Ｂ細胞表面マーカー、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３及びＧＭ２が含まれる（Ragupathi G., Cancer Immunol. Immunother. 43: 152(1996)）；ＣＤ５２（Ginaldiら, Leukemia Resarch 22:: 185(1998)；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；及びＭＡＧＥ（Kirkinら, ＡＰＭＩＳ 106:665 (1998)）。
【０１１３】
本明細書中の「血管形成因子」とは、血管形成を刺激する分子である。例としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性又は酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）を含む。
【０１１４】
ここで使用される場合、「ＥｒｂＢレセプター」は、ＥｒｂＢレセプターファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４レセプター及び将来同定されるこのファミリーの他のメンバーを含む。ＥｒｂＢレセプターは、一般にはＥｒｂＢリガンドに結合しうる胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化され得る幾つかのチロシンキナーゼ残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。
【０１１５】
「ＥｒｂＢ１」、「上皮成長因子レセプター」及び「ＥＧＦＲ」という用語は、ここでは互換的に使用され、Carpenter等, （Ann. Rev. Biochem. 56:881-914(1987)）に開示されているようなＥＧＦＲを意味し、その天然変異体（例えば、Humphrey等, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4207-4211(1990)に記載されているような欠失変異体ＥＧＦＲ）を含む。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を意味する。
【０１１６】
「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」という表現はここでは互換的に使用され、例えば、Semba等, (Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:6497-6501(1985))及びYamamoto等, (Nature 319:230-234(1986))(Genebank受託番号 Ｘ０３３６３)に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質を意味する。
【０１１７】
ＨＥＲ２と結合する抗体の例には、参考文献として本明細書中に取り入れられていて米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されているｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８を含む、４Ｄ５、７Ｃ２、７Ｆ３及び２Ｃ４並びにそのヒト化変異体；及びＷＯ０１／００２４５に記載されているヒト化２Ｃ４変異体第５６０，５６１，５６２，５６８，５６９，５７０，５７１，５７４，又は５６８６９が含まれる。７Ｃ２及び７Ｆ３、そしてそのヒト変異体は、ＷＯ９８／１７７９７に記載されている。好ましい抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、又はヒト化２Ｃ４変異体５７４の重及び軽鎖可変領域を含む。
【０１１８】
「Trastuzumab」（HERCEPTIN（登録商標））はＨＥＲ２の細胞外ドメインと細胞ベースアッセイで高親和性（Ｋｄ＝５ｎＭ）によって結合する組み換えＤＮＡ由来ヒト化抗体である。この抗体は、米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載の変異体ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の重及び軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗体である。この抗体は、ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞によって生成される。
【０１１９】
「ＥｒｂＢ３」及び「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号及び第５，４８０，９６８号、並びにKrausら, PNAS(USA) 86: 9193-9197(1989)に開示されたレセプターポリペプチドに相当する。
【０１２０】
ここでの用語「ＥｒｂＢ４」及び「ＨＥＲ４」は、例えば、欧州特許出願５９９，２７４；Plowmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750(1993)；及びPlowmanら, Nature 366: 473-475(1993)に開示されたレセプターポリペプチドに相当し、例えば１９９９年４月２２日公開のＷＯ９９／１９４８８に開示されているような、そのアイソフォームを含む。
【０１２１】
本明細書中の「Ｂ細胞表面マーカー」は、Ｂ細胞の表面と結合する抗体によって標的とされることが可能なＢ細胞の表面上に発現する抗原である。例示的なＢ細胞表面マーカーは、ＣＤ１０，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２１，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ２４，ＣＤ４０，ＣＤ３７，ＣＤ５３，ＣＤ７２，ＣＤ７３，ＣＤ７４，ＣＤｗ７５，ＣＤｗ７６，ＣＤ７７，ＣＤｗ７８，ＣＤ７９ａ，ＣＤ７９ｂ，ＣＤ８０，ＣＤ８１，ＣＤ８２，ＣＤ８３，ＣＤｗ８４，ＣＤ８５及びＣＤ８６リンパ球表面マーカーを含む。特に対象とするＢ細胞表面マーカーは、哺乳動物の他の非Ｂ細胞組織と比べて優先的にＢ細胞上に発現し、前駆体Ｂ細胞と成熟Ｂ細胞の双方で発現し得る。１つの実施態様では、そのマーカーは、ＣＤ２０又はＣＤ１９のように、幹細胞段階からプラズマ細胞への終末分化の直前の時点までの系列の分化の間の全体にわたってＢ細胞に見出されるものである。ここで好ましいＢ細胞表面マーカーはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ４０である。
【０１２２】
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系器官の９０％以上のＢ細胞の表面で見出される３５ｋＤａまでの非グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る。ＣＤ２０は正常なＢ細胞と悪性のＢ細胞の双方に存在する。文献中でのＣＤ２０の他の名称には「Ｂリンパ球制限抗原」及び「Ｂｐ３５」が含まれる。ＣＤ２０抗原は、例えばClark等, PNAS(USA)82：1766(1985)に記載されている。
【０１２３】
ＣＤ２０抗原に結合する抗体の例には、今は「リツキシマブ(Rituximab)（「ＲＩＴＵＸＡＮ(登録商標)」）と呼ばれている「Ｃ２Ｂ８」（ここに出典明示により取り込まれる米国特許第５，７３６，１３７号）；「Ｙ２Ｂ８」と命名されたイットリウム-[９０]-標識２Ｂ８マウス抗体（ここに出典明示により取り込まれる米国特許第５，７３６，１３７号）；「１３１Ｉ-Ｂ１」抗体（ＢＥＸＸＡＲ（商品名）を産生するために１３１Ｉで標識されていてもよいマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」（ここに出典明示により取り込まれる米国特許第５，５９５，７２１号）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Press等, Blood 69(2):584-591 (1987)）；「キメラ２Ｈ７」抗体（ここに出典明示により取り込まれる米国特許第５，６７７，１８０号）；及び国際白血球タイピングワークショップから入手できるモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２（Valentine等, In: Leukocyte Typing III (McMichael編, p.440, Oxford University Press (1987)）が含まれる。
【０１２４】
本明細書中の用語「リツキシマブ(Rituximab)」又は「ＲＩＴＵＸＡＮ(登録商標)」とは、ＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を意味し、米国特許第５，７３６，１３７号で「Ｃ２Ｂ８」と命名され、本明細書中で参考文献として明白に取り入れられている。この抗体は、ＩｇＧ１カッパ免疫グロブリンであって、マウス軽鎖及び重鎖可変領域配列とヒト定常領域配列を有する。リツキシマブは、およそ８．０ｎＭのＣＤ２０抗原に対する結合親和性を有する。リツキシマブは、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞によって生成される。
【０１２５】
用語「哺乳動物」は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含み、哺乳動物類として分類される任意の動物を含む。本発明の好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【０１２６】
本明細書で使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、細胞（例えば、癌細胞）の成長を阻害する化合物又は組成物を指す。よって、成長阻害剤とは、S期における細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(S期以外の場所において)、例えばG1停止及びM期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なM期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。G1を停止させるこれらの薬剤、例えばDNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びara-CがS期停止へ波及する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【０１２７】
「成長阻害性」抗体の例には、抗原と結合し、その抗原を発現する細胞の成長を阻害するものである。好ましい成長阻害性抗−ＨＥＲ２抗体は、２０％より高く、好ましくは、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で５０％より高く（例えば、約５０％〜約１００％）で細胞培養でのＳＫ−ＢＲ−３乳腫瘍細胞の成長を阻害し、この場合、成長阻害は、抗体へのＳＫ−ＢＲ−３細胞の曝露の６日後に確かめられる（１９９７年１０月１４日に発行の米国特許第５，６７７，１７１号を参照せよ）。好ましい成長阻害抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８である。
【０１２８】
「細胞死を誘導する」抗体は、生存可能な細胞を生育不能にするものである。ここでの細胞とは、抗体が結合する抗原を発現するものである。インビトロ細胞死は、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性障害（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を識別するために、補体及び免疫エフェクター細胞の無い状態で確かめてもよい。従って、細胞死に関するアッセイは、熱不活性化血清（すなわち、補体の無い）を用いて、免疫エフェクター細胞が無い状態でおこなってもよい。抗体が細胞死を誘導するか否かを確かめるために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Mooreら. Cytotechnology 17: 1-11(1995)）又は７ＡＡＤの取り込みによって評価した膜整合性の損失を、未処理細胞と関連して評価することができる。好ましい細胞死を誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞でのＰＩ取り込みでアッセイ、ＰＩ取り込みを誘導するものである。
【０１２９】
「アポトーシスを誘導する」抗体とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞（アポトーシス体と呼ばれる）によって確かめられるプログラム化された細胞死を誘導するものである。細胞は、抗体が結合する抗原を発現する。好ましくは、この細胞は腫瘍細胞である。アポトーシスに関連する細胞の現象を評価するのに利用可能な種々の方法がある。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）トランスロケーションは、アネキシン結合によって評価することができる；ＤＮＡ断片化は、ＤＮＡラダー化を通して評価することができる；そして、ＤＮＡ断片化をともなう核／クロマチン濃縮は、低２倍体細胞でのあらゆる増加によって評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞を使用したアネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比較して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、そして最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘導を引き起こすものである。
【０１３０】
「治療的有効量」という用語は、哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な薬剤の量を指す。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は癌に関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。ある程度、薬剤は、現存の癌細胞の成長を妨げ及び／又は殺すことが可能で、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、効力は、例えば病状の進行時間(ＴＴＰ)の評価、及び／又は応答速度(ＲＲ)の決定を評価することにより測定される
【０１３１】
「抗原発現癌」とは、抗-抗原抗体がそれに結合して癌について治療効果を有する程に、その細胞の表面に十分な量の抗原を有するものである。
【０１３２】
レセプターの「過度の活性化によって特徴付けられる」癌とは、癌細胞でのレセプター活性化の程度が同じ組織型の非癌性細胞のレセプターの活性化レベルを顕著に超えるものである。そのような過度の活性化は、癌細胞のレセプターを活性化するのに利用可能なレセプターの過剰発現及び／又は正常なレベルより高いリガンドから生じる。そのような過度の活性化は、癌細胞の悪性段階にを生じるか、及び／又はそれを引き起こす。ある実施態様では、癌を診断又は予後アッセイに供して、レセプターのそのような過度の活性化を引き起こす、レセプターの増幅及び／又は過剰発現が起こっているのかを確かめる。或いは更に、癌を診断又は予後アッセイに供し、リガンドの増幅及び／又は過剰発現が、レセプターの過度の活性化の原因となる癌において起こっているのかを確かめることができる。そのような癌のサブセットでは、レセプターの過度の活性化は、自己分泌刺激経路から生じる。
【０１３３】
レセプターを「過剰発現する」癌とは、同じ細胞型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面にＨＥＲ２等の顕著により高いレベルのレセプターを有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅によって又は転写又は翻訳の増加によって起こり得る。レセプターの過剰発現は、細胞の表面に存在するレセプタータンパク質の増加したレベルを評価することによる診断的又は予後的アッセイで確かめることができる（例えば、免疫組織化学アッセイによる；ＩＨＣ）。或いは、又は更には、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開の国際公開９８／４５４７９を参照せよ）、サザンブロッティング又はリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）等のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法によって、細胞内のレセプター-コード化核酸のレベルを測定することができる。血清等の体液中の隠れた抗原（例えば、細胞外ドメイン）を測定することによって、レセプターの過剰発現を研究してもよい（また、例えば、１９９０年６月１２日に発行の米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開の国際公開９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行の米国特許第５，４０１，６３８号；及びSiasら. J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990)を参照せよ）。前出のアッセイは別として、種々のインビボアッセイが熟練者にとって利用可能である。例えば、患者の体内の細胞を、検出可能な標識、例えば放射活性同位体で状況に応じて標識した抗体へ曝してもよく、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は前もって抗体に曝した患者から取得した生検を分析することによって、抗体の患者の細胞への結合を評価することができる。
【０１３４】
リガンドを「過剰発現する」癌とは、同じ細胞型の非癌性細胞と比較して、顕著により高いレベルのリガンドを産するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅によって又は転写又は翻訳の増加によって起こり得る。リガンドの過剰発現は、患者、例えば腫瘍生検のリガンド（又はそれをコードする核酸）のレベルを評価することによって、又はＩＨＣ、ＦＩＳＨ、サザンブロット、ＰＣＲ又はインビボアッセイ等の上述の種々の診断アッセイによって診断的に測定することが可能である。
【０１３５】
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32およびLuの放射性同位体）、化学療法剤、毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素、又は小分子毒素、それらの断片及び／又は変異体を含む。
【０１３６】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン（calicheamicin）、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル(５−ＦＵ）のような抗−代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)等のピリミジン類似体； カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；オキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリニック酸（podophyllinic acid）；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２'';-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（タキソール（TAXOL）(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, プリンストン, ニュージャージー州）、及びドセタキセル（タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, アントニー, フランス）；クロランブシル；ゲンシタビン；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(VP-16）；イフォスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン（novantrone）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターRFS2000；ジフルオロメチロールニチン(DMFO)；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン(capecitabine)；及び上記のあらゆる製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義に含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗−ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、アロマターゼ阻害４(５)-イミダゾール類、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストーン(onapristone)、トレミフェン(Fareston）；及びフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープリン(leuprolide)、及びゴセレリン等の抗エストロゲン類；そして上記のあらゆる製薬的に許容可能な塩類、酸又は誘導体である。
【０１３７】
本明細書で使用されているように、用語「ＥＧＦＲ標的剤」とは、ＥＧＦＲと結合し、随意的にＥＧＦＲ活性化を阻害する治療剤を指す。このような薬剤の例には、ＥＧＦＲと結合する抗体と小分子が含まれる。ＥＧＦＲと結合する抗体の例には、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６）、ＭＡｂ ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、ＭＡｂ ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Mendelsohnらを参照せよ）及びその変異体、例えば、キメラ化２２５（Ｃ２２５）及び再形態化ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０，Imclone Systems Inc.）；II型変異体ＥＧＦＲと結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されているＥＧＦＲと結合するヒト化及びキメラ抗体；及びＥＧＦＲと結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３，Abgenix）が含まれる。抗−ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害剤と複合化し、それによって免疫複合体を生成することが可能である（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２，Merck Patent GmbHを参照せよ）。ＥＧＦＲと結合する小分子の例には、ＺＤ１８３９（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（Astra Zeneca）、ＣＰ−３５８７７４又はＯＳＩ−７７４（ＴＡＲＣＥＶＡ（商品名））（Genentech）及びＡＧ１４７８が含まれる。
【０１３８】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのような形質転換成長因子(ＴＧＦ)；インシュリン様成長因子-I及び-II；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン-α、-β、及び-γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ−１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ−１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β等の腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【０１３９】
この出願で使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物に比べて、癌細胞に対する細胞障害性が低く、より活性な親形態に、酵素的に活性化又は転換され得る製薬的に活性な物質の先駆体又は誘導体形態を称する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast(1986)及びStella等,「Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」, Directed Drug Delivery, Borchardt等,(編), pp.247-267, Humana Press(1985)を参照。 限定するものではないが、本発明のプロドラッグには、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグが含まれる。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、上記の化学療法剤が含まれる。
【０１４０】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（例えば、ここで開示されている糖タンパク質組成物及び、状況に応じて、化学療法剤）の送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列されている。
【０１４１】
「パッケージ挿入物」という用語は効能、用法、用量、投与、禁忌及び／又はかかる治療製品の使用に関する警告についての情報を含む、治療製品の市販用パッケージに通常含まれるインストラクションを意味するために使用される。
【０１４２】
「単離された」核酸分子とは、少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離された核酸分子であって、通常は、ポリペプチド核酸の天然源と存在している。単離された核酸分子は、自然で見出された場合とは異なる形態又は周囲環境にある。よって、単離された核酸は、天然の細胞で存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体上の位置に存在し、普通にポリペプチドを発現している細胞内に含まれる核酸分子を含む。
【０１４３】
「制御配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えば、プロモーター、状況に応じてはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０１４４】
他の核酸配列へ機能的関係で配された場合、核酸は「作用可能に連結」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に加わるプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡと作用可能に連結している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるならば、コード化配列と作用可能に連結している；又は、リボゾーム結合部位は、翻訳を促進するように位置されているならば、コード化配列と作用可能に連結している。一般的に、「作用可能に連結した」とは、連結したDNA配列は近接し、分泌リーダーの場合には、近接し、リーディングフェーズにある。しかしながら、エンハンサーは連続である必要はない。連結は、従来の制限部位でのライゲーションによって完成する。そのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、従来の技術によって利用される。
【０１４５】
ここで用いられているように、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」という表現は交換可能に用いられ、全てのそのような表示には子孫が含まれる。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語句には、トランスファーの数に関わらず、それから誘導された一次被験細胞及び培養を含む。また、故意又は不慮の変異のために、全ての子孫がＤＮＡ内容物について正確には同一でないことがあり得る。当初の形質転換細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が含まれる。識別可能な表示が意図された場合、それは状況から明かである。
【０１４６】
ＩＩ．発明を実行するためのモード
本明細書の発明は、組成物中の約８０−１００％の糖タンパク質が糖タンパク質のＦｃ領域と結合しているフコースを欠く成熟コア炭水化物を含む、Ｆｃ領域含有糖タンパク質の実質的に均一な調製物を作製する方法に関する。本明細書中の好ましい実施形態では、タンパク質は抗体又はイムノアドヘシンである。例えば、糖タンパク質は、（ａ）宿主細胞内発現されたタンパク質のフコシル化する能力が低下（又は不能である）ようフコース代謝を欠くよう操作された宿主細胞又は変異宿主細胞の使用によって；（ｂ）フコシル化を防ぐか又は低下させる条件下で細胞を培養すること；（ｃ）フコースの翻訳後の除去（例えば、フコシダーゼ酵素によって）；（ｄ）所望される炭水化物の翻訳後付加、例えば、非グリコシル化糖タンパク質の組み換え発現後；（ｅ）フコシル化していない産物を選択するような糖タンパク質の精製によって調製することが可能である。本発明は、これら例示的方法（ａ）−（ｅ）の２つ又はそれより多い方法を組み合わせることを検討する。
【０１４７】
もっとも好ましくは、所望される糖タンパク質をコードする核酸は、そこで発現されるタンパク質をフコシル化する能力が低下（又は不能）している宿主細胞で発現される。好ましくは、その宿主細胞はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、例えばＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞、又は生成される糖タンパク質が実質的にフコシル化されないように改良されている例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＤＵＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ−ＤＰ１２又はＣＨＯ−ＤＧ４４ ＣＨＯ宿主細胞である。従って、細胞は、フコシルトランスフェラーゼ酵素に関して改良された発現又は活性を示すであろうし、或いは、Ｎ−結合オリゴ糖にフコースを付加することに関わっている他の酵素又は基質は、宿主細胞では活性が減少している及び／又はレベルが低下しているであろう。
【０１４８】
コア炭水化物構造は成熟しており、従って、成熟炭水化物のプロセシングを阻害又は妨害するカスタノスペルミン等の阻害剤の使用は、概して避けるべきである。本発明の１つの好ましい実施態様によると、糖タンパク質を産生する組み換え宿主細胞から回収した組成物中の糖タンパク質の約８０−１００％は、糖タンパク質のＦｃ領域と結合しているフコースを欠くコア炭水化物構造を有し、本明細書において後に「フコースフリー糖タンパク質組成物」とされている。ここでの「回収した」ことによってとは、フコースフリー糖タンパク質を濃縮する精製段階にその物質を供することなしに、宿主細胞培養から直接に物質を得ることである。
【０１４９】
しかしながら、本発明では、レクチン基質を使用して所望する組成物からフコース含有糖タンパク質を除く精製等の種々の技術によって、フコースフリー糖タンパク質の量を濃縮することは検討する。
【０１５０】
当然のことながら、種々のバッチで組み換え的に作られた糖タンパク質のフコースフリー糖タンパク質の量が変化するであろう。例えば、下記の実施例では、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３細胞によって発現した糖タンパク質と結合しているフコースを有しない全オリゴ糖の％は、８８％−９５％の範囲である。
【０１５１】
好ましくは、組成物中の糖タンパク質の約９０−９９％は、糖タンパク質のＦｃ領域と結合しているフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む。
【０１５２】
炭水化物構造の種々の型は、組成物中に存在し得る。例えば、糖タンパク質と結合している炭水化物は、以下の式によって表される：
2010248228.tif 000004
Ｍはマンノース。
ＧＮはＧｌｃＮＡｃ。
Ｘ１は、バイセクト化ＧｌｃＮＡｃと随意的に結合した付加的単糖類を有する、任意のバイセクト化ＧｌｃＮＡｃ残基。
Ｘ２は、好ましいＧｌｃＮＡｃ残基である。
Ｘ３は、任意のＧａｌ残基で、１つのＧａｌ残基は各ＧＮアームと結合することができる。
Ｘ４は、任意の末端シアル酸残基で、１つ又は２つのシアル酸残基が結合することができる。
【０１５３】
本明細書中のフコースフリー糖タンパク質組成物は、その組成物中の糖タンパク質の殆ど（例えば、約５０−１００％、又は約７０−１００％）は成熟コア炭水化物構造（本明細書中でこの後は「フコースフ含有糖タンパク質組成物」と結合しているフコースを有するが、同じ糖タンパク質の組成物と比較して、１つ又は複数のＦｃγＲＩＩＩレセプターとの結合が向上していことを示す。例えば、本明細書中のフコースフリー糖タンパク質組成物は、フコース含有糖タンパク質組成物と比較すると、ＦｃγＲＩＩＩ（Ｆ１５８）等のＦｃγＲＩＩＩとの結合が１００−１０００倍向上したことを示す可能性がある。この点において、Ｆ１５８アロタイプは、Ｖ１５８よりもヒトＩｇＧとの相互作用において効率が低く、これは、特にＦｃγＲＩＩＩ（Ｆ１５８）を発現する患者では、治療の見込みに顕著な有利性を提供すると考えられる。更には、本明細書中のフコースフリー糖タンパク質組成物は、その対応物であるフコース含有糖タンパク質組成物と比較して、より高いＡＤＣＣ活性、例えば、約２−２０倍向上したＡＤＣＣ活性を示す。
【０１５４】
フコースフリー成熟コア炭水化物構造の他に、さらなるオリゴ糖がコア炭水化物構造と結合し得る。例えば、バイセクト化ＧｌｃＮＡｃは結合又は結合しない可能性がある。例としては、宿主細胞はＧｎＴＩＩＩ酵素を欠くであろうし、よって、糖タンパク質は本質的にバイセクト化ＧｌｃＮＡｃがない。場合によっては、糖タンパク質は、バイセクト化ＧｌｃＮＡｃを付加する宿主細胞（例えば、Ｙ０宿主又は操作されたＣＨＯ細胞）で発現する。１つ又は複数（通常は１つ又は２つ）のガラクトース残基もコア炭水化物構造と結合し得る。最終的には、１つ又は複数の末端シアル酸残基（通常は１つ又は２つ）は、例えば、ガラクトース残基との結合によってコア炭水化物構造と結合し得る。
【０１５５】
本明細書中の組成物は、好ましい実施例では、調製されて、治療的用途を目的とされている。従って、好ましい組成物は、糖タンパク質を含む製薬的調製物であり、以下に例示されているような製薬的に許容される担体又は希釈剤である。このような調製物は、通常は無菌であり、凍結乾燥されてもよい。
【０１５６】
本発明の好ましい実施態様では、糖タンパク質は抗体であり、抗体を作製するための例示的方法は、以下の章により詳しく記載されている。しかしながら、糖タンパク質は、例えばイムノアドヘシン等のＦｃ領域を含む他のどんな糖タンパク質でもあり得る。イムノアドヘシンを作製する方法は、下記により詳しく述べられている。
【０１５７】
Ａ．変異体Ｆｃ領域配列
本発明の１つの実施態様では、糖タンパク質変異体は、天然配列のものとは異なるアミノ酸配列を有する変異体Ｆｃ領域をさらに含む。一般的に、必須ではないが、変異体Ｆｃ領域は複数のアミノ酸置換を有する場合には、同じクラスのアミノ酸置換が組み合わされて所望される結果が達成される。種々のクラスのアミノ酸置換が、以下の表に記載されている。
2010248228.tif 000005
【０１５８】
アミノ酸置換の他に、本発明では、改良されたエフェクター機能を有するＦｃ領域変異体を作製するために、親Ｆｃ領域アミノ酸配列の他の修飾を検討する。
【０１５９】
例えば、ＦｃＲとの結合を低下させるために、Ｆｃ領域の１つ又は複数のアミノ酸残基を欠失させることができる。一般的には、そのようなＦｃ領域変異体を作製するために、ＦｃＲ結合に作用すると本明細書で同定された１つ又は複数のＦｃ領域残基を欠失させる。一般的に、本発明のこの実施態様によって、たった１つ〜約１０のＦｃ領域残基が欠失する。１つ又は複数のアミノ酸欠失を含む本明細書中のＦｃ領域は、好ましくは、親Ｆｃ領域又は天然配列ヒトＦｃ領域の少なくとも約８０％、及び好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％を保持する。
【０１６０】
アミノ酸挿入Ｆｃ領域変異体を作製することも可能であり、その変異体は改変されたエフェクター効果を有する。例えば、ＦｃＲとの結合に影響することが、本発明において同定された一又は複数のＦｃ領域の位置に隣接して少なくとも１のアミノ酸残基（例えば、１または２のアミノ酸残基、一般には多くても１０残基）を導入することが可能である。「隣接」とは、ここで同定されたＦｃ領域残基と１ないし２アミノ酸残基以内を意味する。そのようなＦｃ領域の変異体は、向上もしくは減少したＦｃＲ結合能および/もしくはＡＤＣＣ活性を示す可能性がある。そのような挿入型変異体を作製するために、ＦｃＲの結合領域（例えば、注目しているＦｃＲの細胞外領域）を含んだポリペプチドとの共結晶化構造や、改善したＦｃＲ結合能を有するＦｃ領域の変異体を合理的に構築するため、アミノ酸残基（群）が挿入されたＦｃ領域（例えば、Deisenhofer, Biochemistry 20(9):2361-2370 (1981);およびBurmeister et al., Nature 342:379-383 (1994)を参照のこと）を評価することもあり得る。そのような挿入は、一般に、Ｆｃ領域の二次構造上（例えば、βストランドのような）にではなく、Ｆｃ領域のループ構造上に行われる。
【０１６１】
親Ｆｃ領域に適切なアミノ酸配列修飾を導入することにより、（ａ）ヒトエフェクター細胞の存在下で抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をより効果的に媒介する、および/もしくは（ｂ）親ポリペプチドよりも、より強い親和性でＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）と結合するような、Ｆｃ領域の変異体を作出することができる。そのようなＦｃ領域の変異体は、一般に、少なくとも一アミノ酸修飾をＦｃ領域に含むであろう。併用されたアミノ酸修飾は、特に好ましいと考えられる。例えば、ここでのＦｃ領域の変異体は、２，３，４，５個所等の様々な置換、例えば、ここで同定された特異的なＦｃ領域の位置を含み得る。
【０１６２】
好ましくは、親ポリペプチドＦｃ領域はヒトＦｃ領域である、例えば、ヒトＩｇＧ１（Ａおよび非Ａ  アロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のＦｃ領域。そのような配列は、図２３に示してある。
【０１６３】
向上したＡＤＣＣ活性を有するＦｃ領域を作製するために、親ポリペプチドは従来から存在するＡＤＣＣ活性を有するのが好ましく、例えば、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ３のＦｃ領域を含む。一実施態様において、改善されたＡＤＣＣ活性を有する変異体は、本質的に、天然配列のＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３のＦｃ領域と変異体の抗原結合領域を有する抗体よりも効果的なＡＤＣＣを引き起こす。好ましくは、変異体は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２９８、３３３、および３３４の位置において２もしくは３残基置換を含む、もしくはそのような置換残基により本来的に構成される。最も好ましくは、２９８、３３３、３３４の位置の残基が（例えば、アラニン残基に）置換される場合である。さらに、改善されたＡＤＣＣ活性を持つＦｃ領域の変異体を産生するためには、一般に、ＦｃγＲＩＩＩ（ＡＤＣＣを引き起こすのに重要なＦｃＲであると考えられている）に対する改善された結合親和性を持つＦｃ領域の変異体を設計し得るだろう。例えば、そのような変異体を作製するために、一又は複数のアミノ酸位置２５６、２９０、２９８、３１２、３２６、３３０、３３３、３３４、３６０、３７８、および４３０において、親Ｆｃ領域にアミノ酸の修飾（例えば、置換）を導入することが可能である。さらに、ＦｃγＲＩＩＩに対して改善された結合親和性を持つ変異体は、ＦｃγＲＩＩ、とりわけ、阻害性ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対して、低下した結合親和性を有するかもしれない。
【０１６４】
ここで示す実験は、ＣＨ２領域がＦｃＲ結合活性にとって重要であることを示唆しているため、アミノ酸修飾は、好ましくは、Ｆｃ領域のＣＨ２領域に導入される。さらに、上述技術中の教示と異なり、即時の適用においては、ヒンジ領域以外のＦｃ領域の一部に修飾を導入することも考慮する。
【０１６５】
改変されたＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合親和性もしくは結合活性を持つＩｇＧのＦｃ領域変異体を産生するための修飾に対して有用なＦｃ領域のアミノ酸位置は、２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９の一又は複数のアミノ酸位置を含む。好ましくは、そのような変異体を産生する鋳型として使用される親ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒトＩｇＧＦｃ領域を含む。３３１番目の残基が置換される場合、親Ｆｃ領域は、好ましくは、ヒト天然配列ＩｇＧ３を含まないか、あるいは３３１番目の位置に置換を含むＦｃ領域の変異体が、好ましくは、ＦｃＲの例えばＦｃγＲＩＩに対する増強された結合能を示す。
【０１６６】
ＦｃγＲに対して減少した結合能を持つＦｃ領域の変異体を産生するためには、Ｆｃ領域の２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９の一又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾を導入することができる。
【０１６７】
ＦｃγＲＩに対して減少した結合能を示す変異体は、２３８、２６５、２６９、２７０、３２７、もしくは３２９の一又は複数のアミノ酸位置においてＦｃ領域のアミノ酸修飾により構成されるものを含む。
【０１６８】
ＦｃγＲＩＩに対して減少した結合能を示す変異体は、２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８、もしくは４３９の一又は複数のアミノ酸位置においてＦｃ領域のアミノ酸修飾により構成されるものを含む。
【０１６９】
ＦｃγＲＩＩＩに対して減少した結合能を示すＦｃ領域の変異体は、２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５、もしくは４３７の一又は複数のアミノ酸位置においてＦｃ領域のアミノ酸修飾により構成されるものを含む。
【０１７０】
一又は複数のＦｃγＲｓに対して改善した結合能を示す変異体も、作製することができる。そのようなＦｃ領域の変異体は、Ｆｃ領域の一又は複数のアミノ酸位置２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２７２、２７６、２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、２９８、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２６、３３０、３３１、３３３、３３４、３３７、３４０、３６０、３７８、３９８、もしくは４３０におけるアミノ酸修飾を含む。
【０１７１】
例えば、ＦｃγＲに対して改善した結合能を示す変異体はＦｃγＲＩＩＩに対する増強した結合能を、場合によっては、ＦｃγＲＩＩに対して減少した結合能をさらに、示す可能性がある。その変異体は、例示すると、Ｆｃ領域の２９８及び／または３３３の位置にアミノ酸修飾を含む。
【０１７２】
ＦｃγＲＩＩに対して増強した結合能を示す変異体は、Ｆｃ領域２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２７２、２７６、２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２６、３３０、３３１、３３７、３４０、３７８、３９８、もしくは４３０の一又は複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾により構成されるものを含む。そのような変異体は、さらにＦｃγＲＩＩＩに対する減少した結合能を示す。例えば、それらは、２６８、２７２、２９８、３０１、３２２、もしくは３４０の一または複数のアミノ酸位置にＦｃ領域アミノ酸修飾を含む。
【０１７３】
ＦｃγＲに対する結合能を改変させることが好ましい場合、ここでは、新生児性のレセプター（ＦｃＲｎ）に対する改変された親和結合性を持つＦｃ領域の変異体についても考慮する。ＦｃＲｎに対して改善された親和性を持つＦｃ領域の変異体は、血清中においてより長い半減期を持つことが予想される。そして、投与されたポリペプチドが長い半減期で存在することが望まれるような哺乳動物を治療する方法において、例えば、慢性的な疾病もしくは疾患で、そのような分子は、有用な適用性を持つであろう。これに反して、ＦｃＲｎに対する減少した結合親和性を持つＦｃ領域の変異体は、より短い半減期を持つことが期待される。そして、そのような分子は、例えば、より短い循環時間の方が効果的又は生体内の画像診断法もしくは長時間血流中において循環していると毒性のある副作用を示すようなポリペプチドなど、哺乳動物に対して投与され得る。減少したＦｃＲｎ結合親和性を持つＦｃ領域の変異体は、胎盤を通過することは稀であろうと予想される。従って、そのような変異体は、妊娠中の女性の疾患もしくは疾病の治療において有用であろう。
【０１７４】
ＦｃＲｎに対して改変された結合親和性を持つＦｃ領域の変異体は、２３８、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、４００、４１３、４１５、４２４、４３３、４３４、４３５、４３６、４３９、もしくは４４７の一又は複数のアミノ酸位置におけるＦｃ領域アミノ酸修飾により構成されるものを含む。ＦｃＲｎに対して減少した結合能を示す変異体は、一般に、２５２、２５３、２５４、２５５、２８８、３０９、３８６、３８８、４００、４１５、４３３、４３５、４３６、４３９、もしくは４４７の一又は複数のアミノ酸位置におけるＦｃ領域アミノ酸修飾により構成され；ＦｃＲｎに対する増強した結合能を示す変異体は、通常、２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、もしくは４３４の一又は複数のアミノ酸位置におけるＦｃ領域アミノ酸修飾により構成される。
【０１７５】
前述のように調製されたポリペプチド変異体は、しばしばポリペプチドの目的とされる使用法に依存するが、さらなる修飾を施し得る。そのような修飾は、アミノ酸配列のさらなる改変（アミノ酸残基の置換、挿入および/もしくは欠失）、異種性のポリペプチドとの融合および/もしくは共有結合性の修飾が含まれる。このような「さらなる修飾」は、Ｆｃレセプター結合能および/もしくはＡＤＣＣ活性の改変に帰着するような上記開示のアミノ酸修飾に先立って、もしくは同時にもしくは引き続いて導入し得る。一実施態様においては、ここに示すＦｃ領域修飾と本出願中の「関連する技術」の項において挙げた参考文献中に開示されたＦｃ領域の置換とを併用する。
【０１７６】
場合によっては、もしくは更に、上記のアミノ酸修飾とＦｃ領域のＣ１ｑ結合能および/または補体依存性細胞毒性を変化させるような、一又は複数のさらなるアミノ酸修飾を併用することは、有効であり得る。
【０１７７】
ここで特に興味のある出発ポリペプチドは、通常はＣ１ｑに結合し、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)を示すものである。ここに記載したさらなるアミノ酸置換は、概して、出発ポリペプチドがＣ１ｑに結合し、及び／又はその補体依存性細胞毒性機能を改変する能力を変化させること、例えば、これらエフェクター機能を低下、好ましくは破壊することを担う。しかしながら、改善されたＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害性をともなう一又は複数の記載された位置での置換を含むポリペプチドがここで考えられる。例えば、出発ポリペプチドは、Ｃ１ｑに結合できず及び／又はＣＤＣを媒介することができず、及び／又はエフェクター機能を獲得するよう本明細書に記載の教唆に従って修飾され得る。更に、予め存在するＣ１ｑ結合活性を持ち、場合によってはＣＤＣを媒介する能力を更に有するポリペプチドを、これらの活性の一方又は両方が向上されるよう修飾することが可能である。
【０１７８】
改変されたＣ１ｑ結合能及び/もしくは、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)を持つＦｃ領域を産生するためには、修飾されるアミノ酸の位置は、一般に重鎖の位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３３１、３３３及び３３４から選択され、ここでＩｇＧ重鎖における残基の番号付けはKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されたようなＥＵインデックスのものである。一実施態様において、上記同定された８個の位置のうち１個のみが、改変されたＣ１ｑ結合能及び/もしくは補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)機能を持つポリペプチド変異体領域を製造するために変更されている。好ましくは、実際には２７０、３２９もしくは３２２の位置のアミノ酸残基のみが変更されている。場合によっては、上記同定された位置のうち２もしくはそれ以上の位置が修飾されている。もし、置換が併用された場合、一般に、ヒトＣ１ｑ結合能を向上させるような置換（例えば、残基位置３２６、３２７、３３３、および３３４）、もしくは、Ｃ１ｑ結合能を減少させるような置換（例えば、残基位置２７０、３２２、３２９、および３３１）、が併用される。その後の実施例においては、４つ全ての位置（例えば、２７０、３２２、３２９、および３３１）が置換され得る。好ましくは、インビトロもしくはインビボにおいて、向上されたＣ１ｑ結合能および好ましく改善されたＣＤＣ活性を持つポリペプチドを産生するために、３２６、３２７、３３３、もしくは３３４の位置における２または３もしくは全てのさらなる置換が併用され、場合によっては、他のＦｃ領域の置換を伴う。
【０１７９】
プロリンはヒトＩｇＧ'ｓの３２９位に保存される。この残基は好ましくはアラニンで置換されるが、例えばセリン、スレオニン、アスパラギン、グリシン又はバリンのような任意の他のアミノ酸での置換も考えられる。
【０１８０】
プロリンはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の３３１位に保存されるがＩｇＧ４(３３１位にはセリン残基を有する)では保存されない。残基３３１は好ましくはアラニン又は他のアミノ酸、例えばセリン(ＩｇＧ４以外のＩｇＧ領域に対して)、グリシン又はバリンにより置換される。
【０１８１】
リジン３２２はヒトＩｇＧｓにおいて保存され、この残基は好ましくはアラニン残基により置換されるが、任意の他のアミノ酸残基、例えばセリン、スレオニン、グリシン又はバリンによる置換も考えられる。
【０１８２】
Ｄ２７０はヒトＩｇＧｓにおいて保存され、この残基は、例えばアラニン、セリン、スレオニン、グリシン、バリン、又はリジンのような他のアミノ酸残基により置換されうる。  
【０１８３】
Ｋ３２６もまたヒトＩｇＧｓにおいて保存される。この残基は、限定されるものではないが、バリン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、アスパラギン酸、メチオニン、又はトリプトファンを含む他の残基により置換され得、トリプトファンが好ましい。
【０１８４】
同様に、Ｅ３３３もまたヒトＩｇＧｓにおいて保存される。Ｅ３３３は、好ましくは、より小さい側鎖容積を持つアミノ酸残基、例えばバリン、グリシン、アラニン又はセリンにより置換され、セリンが好ましい。
【０１８５】
Ｋ３３４はヒトＩｇＧｓにおいて保存され、アラニンのような他の残基又はその他の残基で置換されうる。
【０１８６】
ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３において残基３２７はアラニンである。改善されたＣ１ｑ結合を持つ変異体を生成するためには、このアラニンがグリシンのような他の残基と置換される。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４において、残基３２７はグリシンであり、これはＣ１ｑ結合を破壊するためにアラニン(又は他の残基)により置換されうる。
【０１８７】
上記に開示したように、改変されたエフェクター機能を持つＦｃ領域を構築することができる（例えば、Ｃ１ｑ結合能及び/もしくはＦｃＲ結合能を修飾したり、ＣＤＣ活性及び/もしくはＡＤＣＣ活性を変更することによる）。例えば、改善されたＣ１ｑ結合能およびＦｃγＲＩＩＩ結合能を有するＦｃ領域の変異体を；例えば、改善されたＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の両方を有する変異体、を産生することができる。場合により、エフェクター効果が軽減され、もしくは除去される事を望む場合には、減少したＣＤＣ活性および/もしくはＡＤＣＣ活性を持つＦｃ領域の変異体を設計することが可能である。他の実施態様においては、これらの活性のうち１のみを増強し、場合によっては、他の活性を減少させること、例えば、ＣＤＣ活性は減少するが、ＡＤＣＣ活性は向上するようなＦｃ領域の変異体を産生すること、及びその逆も可能である。
【０１８８】
更なるアミノ酸配列の修飾については、ポリペプチド変異体の正しい高次構造を維持することに関与しないシステイン残基を、一般にはセリンと置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することも可能である。
【０１８９】
他のタイプのアミノ酸置換はポリペプチドのグリコシル化パターンを改変するものである。これは、ポリペプチド中に見出される一又は複数の炭水化物部分を除去し、及び／又はポリペプチド中に見出されない一又は複数のグリコシル化部位を付加することによって、達成されうる。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはN-結合かＯ-結合である。Ｎ-結合はアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を意味する。Ｘがプロリン以外のアミノ酸であるアスパラギン-Ｘ-スレオニンのトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着に対する認識配列である。しかして、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が創製される。Ｏ-結合グリコシル化は、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用しうるが、糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの付着を意味する。ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が一又は複数の上述のトリペプチド配列(Ｎ-結合グリコシル化部位に対するもの)を含むようにこれを改変することにより簡便に達成される。改変は、(Ｏ-結合グリコシル化部位に対する)原ポリペプチドの配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によりまたなされる。例示的なグリコシル化変異体は重鎖の残基Ａｓｎ２９７のアミノ酸置換を有している。
【０１９０】
さらに、クラス、サブクラスあるいはＦｃ領域のアロタイプは、所望の異なるクラス、サブクラス、アロタイプにより相同性の高いアミノ酸配列を持つＦｃ領域を産生するために、一又は複数の更なるアミノ酸置換によって改変され得る。例えば、マウスのＦｃ領域は、よりヒトのＦｃ領域に相同性の高いアミノ酸配列を作製するために改変され得る；ヒト非ＡアロタイプＩｇＧ１Ｆｃ領域は、ＡアロタイプＩｇＧ１Ｆｃ領域などを得るために修飾され得る。一実施態様において、ＦｃＲ結合能および/もしくはＡＤＣＣ活性を改変するアミノ酸修飾は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに導入され、ＣＨ３ドメインは、欠失されているか、もしくは他の二量体化ドメインにより置換されている。しかしながら、好ましくは、ＣＨ３ドメインが保持されている（ここで開示されているようにエフェクター機能を変化させるようなアミノ酸修飾を除く）。
【０１９１】
殆どの場合は糖タンパク質の使用目的に依るが、上述の調製された糖タンパク質は、さらなる修飾に供することが可能である。そのような修飾には、アミノ酸配列のさらなる改変（アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失）、異種ポリペプチドとの融合及び／又は共有修飾が含まれる。
【０１９２】
他のタイプのアミノ酸置換は糖タンパク質のグリコシル化パターンを改変するものである。そのようなグリコシル化変異体は、本明細書中に記載のフコースの欠失に関するグリコシル化変異体に加えて、糖タンパク質に見出される１つ又は複数の炭水化物部分を欠失させることによって、及び／又は糖タンパク質には存在しない１つ又は複数のグリコシル化部位を付加することによって達成することが可能である。糖タンパク質のグリコシル化は、典型的にはN-結合かＯ-結合である。Ｎ-結合はアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を意味する。Ｘがプロリン以外のアミノ酸であるアスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンのトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着に対する認識配列である。しかして、糖タンパク質中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が創製される。Ｏ-結合グリコシル化は、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用しうるが、糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの付着を意味する。糖タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が一又は複数の上述のトリペプチド配列(Ｎ-結合グリコシル化部位に対するもの)を含むようにこれを改変することにより簡便に達成される。改変は、(Ｏ-結合グリコシル化部位に対する)原糖タンパク質の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によりまたなされる。
【０１９３】
Ｂ．生物学的活性のスクリーニング
糖タンパク質変異体は、出発ポリペプチドと比較した生物活性の任意の変化を評価するための一又は複数のアッセイにかけることができる。
【０１９４】
好ましくは、糖タンパク質変異体は、非変異体ポリペプチドと比較して抗原結合能を本質的に保持し、すなわち、その結合能は非変異体ポリペプチドの約１/２０程は悪くない（例えば、約1/５倍までは悪くない）。ポリペプチド変異体の結合能は、例えば蛍光標示式細胞分取(ＦＡＣＳ)分析又は放射免疫沈降(ＲＩＡ)のような技術を使用して定量することができる。
【０１９５】
ＦｃＲに結合する糖タンパク質変異体の能力もまた評価しうる。ＦｃＲがＦｃレセプター、例えばＦｃγＲＩ又はＦｃＲｎもしくはＦｃγＲＩＩＩＢ又はＦｃＲＩＩＩＡに対して高親和性である場合、モノマー糖タンパク質変異体を滴定し、標準的なＥＬＩＳＡ型式で糖タンパク質変異体に特異的に結合する抗体を使用して結合糖タンパク質変異体を測定することにより、結合を測定することができる(以下の実施例を参照されたい)。低親和性ＦｃＲｓに対する他のＦｃＲ結合アッセイは、ＷＯ００／４２０７２（Presta）及び米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号に記載されている。
【０１９６】
糖タンパク質変異体のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロにおけるＡＤＣＣアッセイは、様々なエフェクター：標的物質の比率を用いることにより実施することができる。そのようなアッセイにおいて有用な「エフェクター細胞」には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。場合によっては、或いはさらに、糖タンパク質変異体のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルで、インビボにおいて評価することが可能である。
【０１９７】
Ｃ１ｑに結合し補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)を媒介する変異体の能力を評価することができる。
【０１９８】
Ｃ１ｑ結合を定量するためには、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡを実施することができる。簡潔に言えば、コーティングバッファーに入れた糖タンパク質変異体又は出発ポリペプチド(対照)を４℃で一晩かけてアッセイプレートに塗布する。ついでプレートを洗浄し、ブロックする。洗浄に続いて、一定分量のヒトＣ１ｑを各ウェルに添加し室温で２時間インキュベートする。更なる洗浄に続いて、１００μｌのヒツジ抗−補体Ｃ１ｑペルオキシダーゼ抱合体抗体を各ウェルに添加し室温で１時間インキュベートする。プレートを再び洗浄バッファーで洗浄し、ＯＰＤ(Ｏ-フェニレンジアミンジヒドロクロリド(シグマ))を含む１００μｌの基質バッファーを各ウェルに添加してよい。黄色の出現により観察される酸化反応を３０分行わせ、１００μｌの４．５ＮのＨ２ＳＯ４の添加により停止させる。ついで(４９２−４０５)ｎｍで吸光度を読み取る。
【０１９９】
糖タンパク質変異体の例はこのアッセイで「Ｃ１ｑ結合に有意な減少」を示すものである。これは、約１００μｇ／ｍｌの糖タンパク質変異体が、非変異ＩｇＧ１のＦｃ領域を持つ１００μｇ／ｍｌの対照抗体と比較して約５０倍かそれ以上のＣ１ｑ結合の減少を示すことを意味する。最も好ましい実施態様では、糖タンパク質変異体は「Ｃｌｑを結合しない」、すなわち１００μｇ／ｍｌの糖タンパク質変異体は１００μｇ／ｍｌの対照抗体と比較して約１００倍かそれ以上のＣ１ｑ結合の減少を示す。
【０２００】
変異体の他の例は、「親ポリペプチドよりもヒトＣ１ｑに対してより良好な結合親和性を有する」ものである。そのような分子は、例えば、親ポリペプチドに比較して約２倍又はそれ以上、好ましくは約５倍又はそれ以上のヒトＣ１ｑ結合の改善を示しうる(例えばこれらの二分子に対してのＩＣ５０値で)。例えば、ヒトＣ１ｑ結合は、親ポリペプチドと比較して約２倍から約５００倍、好ましくは約２倍又は約５倍から約１０００倍改善されうる。
【０２０１】
補体の活性化を評価するために、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)アッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。簡潔に言えば、様々の濃度の糖タンパク質変異体とヒト補体がバッファーで希釈される。糖タンパク質変異体が結合する抗原を発現する細胞を〜１ｘ１０６細胞／ｍｌの密度まで希釈する。糖タンパク質変異体、希釈ヒト補体及び抗原発現細胞の混合物を平底組織培養９６ウェルプレートに添加し、３７℃と５％のＣＯ２で２時間インキュベートさせ、補体媒介細胞溶解を促進する。ついで、５０μｌのアラマーブルー(Accumed International)を各ウェルに添加して３７℃で一晩インキュベートする。５３０ｎｍでの励起と５９０ｎｍでの発光を伴う９６ウェルのフルオロメータを使用して吸光度を測定する。結果は相対蛍光単位(ＲＦＵ)で表現される。試料濃度は標準曲線から算定することができ、非変異体ポリペプチドと比較した活性パーセントが対象の糖タンパク質変異体に対して報告される。
【０２０２】
更に他の変異体の例は、「補体を活性化しない」ものである。例えば、糖タンパク質変異体の０．６μｇ／ｍｌは、非変異ＩｇＧ１のＦｃ領域を有する０．６μｇ／ｍｌの対照抗体と比較してこのアッセイで約０−１０％のＣＤＣ活性を示す。好ましくは変異体は上記のＣＤＣアッセイではＣＤＣ活性を有するとは思われない。
【０２０３】
糖タンパク質は、親ポリペプチドと比較してＣＤＣが増加した親ポリペプチド、例えば、インビトロ又はインビボで約２倍から約１００倍のＣＤＣ活性の改善を示すものに関する(比較される各分子のＩＣ５０値で)。
【０２０４】
新生児レセプター（ＦｃＲｎ）に対する改変された結合親和性を有するＦｃ領域変異体も、本明細書で検討される。ＦｃＲｎに対する向上した親和性を有するＦｃ領域変異体は、より長い血清半減期を有すると期待され、そのような分子は、例えば、慢性疾患又は疾病を治療するために投与された糖タンパク質の長い半減期が望ましい場合に、哺乳動物を治療する方法において有用な用途を有する。これに反して、減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃ領域変異体は、より短い半減期を有することが予想され、そのような分子は、短い循環時間が、例えば、インビボでの診断画像化又は長期間にわたって血流の循環に止まる際に毒性の副作用を有するポリペプチドにとって有利である場合に、例えば投与されてもよい。低下したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃ領域変異体は、胎盤を通過しそうにないと予想され、よって妊婦の疾患又は疾病の治療に使用され得る。
【０２０５】
Ｃ．抗体調製
本発明の好適な実施態様において、ここでの教唆に従って改変される糖タンパク質は抗体である。抗体を生産する技術は以下の通りである。
【０２０６】
(i)抗原の選択と調製
糖タンパク質が抗体である場合、それは対象のある抗原に対するものである。好ましくは、抗原は生物学的に重要な糖タンパク質であり、病気又は疾患に罹っている哺乳動物への抗体の投与によりその哺乳動物に治療的恩恵が生じうる。しかし、非ポリペプチド抗原に対する抗体(例えば腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号参照)もまた考えられる。
【０２０７】
抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子(例えば、レセプター)あるいはリガンド、例えば成長因子でありうる。抗原の例には、例えば、レニン；ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク；α-１-アンチトリプシン；インシュリンＡ-鎖；インシュリンＢ-鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子（ＴＦ）、及びvon Willebrands因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化剤；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(ＭＩＰ-１-α)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４のような細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原(ＣＴＬＡ)；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、又はＮＴ-６）、又はＮＧＦ-β等の神経成長因子等の神経成長因子；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の繊維芽成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、又はＴＧＦ-β５を含む、ＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ）；ｄｅｓ(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ４０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ-１、ＩＬ−２，ＩＬ−３、ＩＬ−４，ＩＬ−５、ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８、ＩＬ−９及びＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン(addressin)；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；及び上に列挙したポリペプチドの何れかの断片が含まれる。
【０２０８】
本発明により包含される抗体に対する例示的な分子標的には、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２，ＣＤ３４及びＣＤ４０；ＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー、例えばＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；前立腺幹細胞（ＰＳＣＡ）；細胞接着分子、例えばＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０.９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン、及びそのα又はβサブユニットを何れか含むαｖ／β３インテグリン(例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体)；成長因子、例えばＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、αインターフェロン（α−ＩＦＮ）；インターロイキン、例えばＩＬ−８；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ等々が含まれる。
【０２０９】
他の分子と場合によっては抱合していてもよい、可溶型抗原又はその断片を、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。レセプターのような膜貫通分子に対しては、これらの断片(例えば、レセプターの細胞外ドメイン)を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することもできる。そのような細胞は天然源(例えば、癌株化細胞)から取り出すことができ、又は膜貫通分子を発現するために組み換え法により形質転換された細胞でありうる。抗体の調製に対して有用な他の抗原とその型は当業者には明らかであろう。
【０２１０】
(ii)ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより、動物に産生される。免疫化されている種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ(ここで、ＲとＲ１は異なったアルキル基である)を使用して、関連抗原を抱合させることが有用である。
【０２１１】
動物を、例えばタンパク質又は抱合体１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性複合体、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又は抱合体を用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原の抱合体であるが、異なったタンパク質に抱合させた、及び／又は異なった架橋剤を介して抱合させた抱合体で追加免疫する。抱合体はまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０２１２】
(iii)モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４，８１６，５６７号)によって作成することができる。
【０２１３】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターもしくはマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
【０２１４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０２１５】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０２１６】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【０２１７】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。また、そのハイブリドーマ細胞は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０２１８】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【０２１９】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組換え生産は以下に更に詳細に説明する。
【０２２０】
更なる実施態様において、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は鎖シャッフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266 (1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【０２２１】
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常部のコード化配列を、相同的マウス配列の代わりに置換することにより(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることにより、修飾することができる。
【０２２２】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常部を置換し、又は抗体の１個の抗原結合部位の可変部を置換して、抗原に対する特異性を有する１個の抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０２２３】
(iv)ヒト化およびヒト抗体
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより、実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である(米国特許第４，８１６，５６７号)。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基及びことによると幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０２２４】
ヒト化抗体の作成に使用される軽鎖と重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J.Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J.Mol.Biol., 196:901 (1987))。もう一つの方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J.Immunol., 151:2623 (1993))。
【０２２５】
更に、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにしてレシピエント及び移入配列からのＦＲ残基を選択し、結びつけることができ、所望の抗体の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
【０２２６】
別法として、免疫時に内因性免疫グロブリンの産生なしにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪH)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすということが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等, Nature 355:258 (1992)を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリから取り出すこともできる(Hoogenboom等, J.Mol.Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等, Nature Biotech 14:309 (1996))。
【０２２７】
(v)多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。このような分子は通常は二つの抗原を結合させるのみであるが(すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ)、三重特異性抗体のような更なる特異性を持つ抗体もここで使用される場合この表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、一方の腕が腫瘍細胞抗原に向けられ他方の腕が細胞毒性トリガー分子に向けられたもの、例えば抗−ＦｃγＲＩ／抗−ＣＤ１５、抗−ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲIII(ＣＤ１６)、抗−ＣＤ３／抗−悪性Ｂ細胞(１Ｄ１０)、抗−ＣＤ３／抗−ｐ１８５ＨＥＲ２、抗−ＣＤ３／抗−ｐ９７、抗−ＣＤ３／抗−腎臓細胞癌腫、抗−ＣＤ３／抗−ＯＶＣＡＲ-３、抗ＣＤ３／Ｌ-Ｄ１(抗−大腸ガン腫)、抗−ＣＤ３／抗−メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗ＥＧＦレセプター／抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ３／抗−ＣＡＭＡ１、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)／抗−ＣＤ３、抗−葉酸塩結合タンパク質(ＦＢＰ)／抗−ＣＤ３、抗−全癌腫随伴抗原(ＡＭＯＣ-３１)／抗−ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合する一つの腕と毒素に結合する一つの腕を持つＢｓＡｂ、例えば、抗−サポリン／抗−Ｉｄ-１、抗−ＣＤ２２／抗−サポリン、抗−ＣＤ７／抗−サポリン、抗−ＣＤ３８／抗−サポリン、抗−ＣＥＡ／抗−リシンＡ鎖、抗−インターフェロンα(ＩＦＮ-α)／抗−ハイブリドーマイディオタイプ、抗−ＣＥＡ／抗−ビンカアルカロイド；(マイトマイシンホスフェートのマイトマイシンアルコールへの転換を触媒する)抗−ＣＤ３０／抗−アルカリホスファターゼのような酵素活性化プロドラッグを転換するためのＢｓＡｂ；抗−フィブリン／抗−組織プラスミノーゲンアクチベーター(ｔＰＡ)、抗−フィブリン／抗−ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)のような線維素溶解剤として使用することができるＢｓＡｂ；抗−低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)／抗−Ｆｃレセプター(例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII又はＦｃγＲIII)のような細胞表面レセプターへ免疫複合体をターゲティングするためのＢｓＡｂ；抗−ＣＤ３／抗−単純ヘルペスウィルス(ＨＳＶ)、抗−Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗−インフルエンザ、抗−ＦｃγＲ／抗−ＨＩＶのような感染性疾患の治療に使用されるＢｓＡｂ；抗−ＣＥＡ／抗−ＥＯＴＵＢＥ、抗−ＣＥＡ／抗−ＤＰＴＡ、抗−ｐ１８５ＨＥＲ２／抗−ハプテンのようなインビトロ又はインビボでの腫瘍検出のためのＢｓＡｂ；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂ；及び抗−ウサギＩｇＧ／抗−フェリチン、抗−セイヨウワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)／抗−ホルモン、抗−ソマトスタチン／抗−サブスタンスＰ、抗−ＨＲＰ／抗−ＦＩＴＣ、抗−ＣＥＡ／抗−βガラクトシダーゼのような診断ツールとしてのＢｓＡｂが含まれる。三重特異性抗体の例には、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ４／抗−ＣＤ３７、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ５／抗−ＣＤ３７及び抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ８／抗−ＣＤ３７が含まれる。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。二重特異性抗体は、Segalら, J. Immunol. Methods 248: 1-6(2001)に概説されている。
【０２２８】
二重特異性抗体を作成する方法は当分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの該鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第WO 93/08829号及びTraunecker等,EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０２２９】
異なったアプローチ法によると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を、免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常部との融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、そして、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、作成に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又は、その比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０２３０】
このアプローチ法の好適な実施態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)で構成される。二重特異性分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を作製する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。国際公開WO 96/27011号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換される。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０２３１】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロ複合体抗体」もまた含む。例えば、ヘテロ複合体の抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的とするため(米国特許第４，６７６，９８０号)、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された(ＷＯ９１／００３６０，ＷＯ９２／２０３７３，  及びＥＰ０３０８９)。ヘテロ複合体抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０２３２】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０２３３】
（vi）多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ−ＶＤ２−(Ｘ２)ｎ−Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の１つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、あるいはＣＬドメインをさらに有する。多価抗体はＷＯ０１／００２３８及びＷＯ００／４４７８８に記載されている。
【０２３４】
（vii)親和性成熟抗体
本明細書における抗体は、親抗体の１つ又は複数の超可変領域残基の置換を含む親和性成熟抗体であってもよい（例えば、ヒト化又はヒト抗体）。一般的に、さらなる開発のために選択された結果として得られた変異体は、それが生じた親抗体と比較して生物学的特性が向上している。このような置換的変異体を作製する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟が含まれる。簡潔に言えば、幾つかの超可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。こうして生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への一価の融合物にディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とその抗原間の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
【０２３５】
（ｖｉｉｉ）免疫複合体
本発明は、細胞障害剤又は成長阻害剤等の抗癌剤と複合化した糖タンパク質を含む免疫複合体による治療にも関する。
【０２３６】
このような免疫複合体の作製において有用な化学療法剤は上述されている。
【０２３７】
抗体の複合体と１つ又は複数の小分子毒素、例えばカリーチアマイシン(calicheamicin)、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、本明細書において検討される。
【０２３８】
１つの好ましい実施態様では、本発明の糖タンパク質は、１つ又は複数のメイタンシノイド分子と複合している。
【０２３９】
糖タンパク質−メイタンシノイド複合体は、糖タンパク質又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に糖タンパク質（例えば、抗体）を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞毒性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３-４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞毒性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５，２０８，０２０号に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChariら, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイド複合体を作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。抗体とメイタンシノイドとの複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)プロピオナート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)(Carlssonら, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０２４０】
関心ある他の免疫複合体には、１つ又は複数のカリーチアマイシン分子と結合した糖タンパク質が含まれる。抗生物質のカリーチアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重ストランドＤＮＡ破壊を生じることができる。カリーチアマイシンファミリーの複合体の調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同５，７１４，５８６号、同５，７３９，１１６号、同５，７６７，２８５号、同５，７７０，７０１号、同５，７７０，７１０号、同５，７７３，００１号、同５，８７７，２９６号(全て、アメリカン サイアナミッド カンパニー(American Cyanamid Company))を参照のこと。使用可能なカリーチアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθI１(Hinmanら, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lodeら. Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したアメリカン サイアナミッドの米国特許)が含まれる。糖タンパク質が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリーチアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０２４１】
本発明の糖タンパク質と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、同５，７７０，７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン類(esperamicines)(米国特許第５，８７７，２９６号)が含まれる。
【０２４２】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開のWO９３／２１２３２号を参照のこと。
【０２４３】
本発明は、糖タンパク質と核分解活性(nucleolytic activity)を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫複合体をさらに考察する。
【０２４４】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射複合体抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。複合体が診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３を再び、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
【０２４５】
放射−又は他の標識が、公知の方法で複合体に導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりに、例えばフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。ヨードゲン法(IODOGEN method)(Frakerら(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０２４６】
糖タンパク質と細胞傷害剤の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドを複合化するためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチターゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーを使用することができる(Chariら, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５，２０８，０２０号)。
【０２４７】
別法として、糖タンパク質及び細胞傷害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、複合体の望ましい特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されているか、又は互いに隣接している複合体の２つの部分をコードするそれぞれの領域を含む。
【０２４８】
他の実施態様においては、抗体-レセプター複合体を患者に投与し、その後にキレート剤の使用による血液の循環からの未結合複合体の除去、細胞傷害剤(例えば放射性ヌクレオチド)に複合体する「リガンド」(例えばアビジン)の投与が続く腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体を複合化することができる。
【０２４９】
（ｉｘ）抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体を複合体することによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
【０２５０】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫複合体の酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
【０２５１】
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを変換させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458[1987]を参照)。抗体-アブザイム複合体は、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【０２５２】
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neubergerら, Nature 312:604-608[1984])。
【０２５３】
(x)他の糖タンパク質の修飾
本明細書では、糖タンパク質の他の修飾が検討される。例えば、糖タンパク質は種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合してもよい。また抗体は、例えばコロイド状薬剤送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)、又はマクロエマルションにおいて、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル(例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリラート)マイクロカプセル)に捕捉されている。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo A.編 (1980)に開示されている。
【０２５４】
本明細書で開示されている糖タンパク質は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同４，５４４，５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２５５】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のFab'フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Martinら，J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizonら，J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【０２５６】
（ｘｉ）例示的抗体
本発明の範囲にある好ましい抗体は、以下の抗体のアミノ酸配列を含むものである：
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体を包含する抗−ＨＥＲ２抗体(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:4285 -4289(1992)；米国特許第５，７２５，８５６号；
米国特許第５，７３６，１３７号（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））にあるキメラ抗−ＣＤ２０“Ｃ２Ｂ８”等の抗ＣＤ２０抗体、米国特許第５，７２１，１０８，Ｂ１号にある２Ｈ７抗体のキメラ又はヒト化変異体、又はTositumomab（BEXXAR（登録商標））；
抗−ＩＬ−８（St Johnら, Chest, 103: 932(1993)、及び国際公開番号ＷＯ９５／２３８６５）；
ヒト化抗−ＶＥＧＦ抗体 ｈｕＡ４．６．１ ＡＶＡＳＴＩＮ（商品名）（Kimら, Growth Factors, 7:53-64(1992)、１９９８年１０月１５日に発行の国際公開第ＷＯ９６／３００４６号、及びＷＯ９８／４５３３１号）等のヒト化及び／又は親和性成熟抗−ＶＥＧＦ抗体を含む抗−ＶＥＧＦ抗体；
抗−ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ０１／４０３０９）；
Ｓ２Ｃ６及びそのヒト化変異体（ＷＯ００／７５３４８）を含む抗−ＣＤ４０抗体；
抗−ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号、ＷＯ９８／２３７６１、Steppeら, Transplant Intl. 4:3-7(1991)、及びHourmantら, Transplantation 58: 377-380(1994)）；
抗−ＩｇＥ（Presta等, J.Immunol., 151:2623-2632 (1993)、及び国際公開第ＷＯ９５／１９１８１号；１９９８年２月３日に発行の米国特許第５，７１４，３３８号、又は１９９２年２月２５日に発行の米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日に公開のＷＯ９３／０４１７３、又は１９９９年１月１４日に公開のＷＯ９９／０１５５６、米国特許第５，７１４，３３８号）；
抗−ＣＤ１８（１９９７年４月２２日に発行の米国特許第５，６２２，７００号、又は１９９７年７月３１日に公開のＷＯ９７／２６９１２にあるような）；
抗−Ａｐｏ−２レセプター抗体（１９９８年１１月１９日に公開のＷＯ９８／５１７９３）；
ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ−１９５を含む抗−ＴＮＦ−α抗体（１９９７年９月３０日に発行の米国特許第５，６７２，３４７号、Lorenzら, J. Immunol. 156(4): 1646-1653(1996)、及びDhainautら, Crit. Care Med. 23(9): 1461-1469(1995)）；
抗−組織因子（ＴＦ）（１９９４年１１月４日に特許された欧州特許第０ ４２０ ９３７ Ｂ１）；
抗−ヒトα４-β７インテグリン（１９９８年２月１９日に公開のＷＯ９８／０６２４８）；
抗−ＥＧＦＲ（１９９６年１２月１９日に公開のＷＯ９６／４０２１０にあるようなキメラ化又はヒト化２２５抗体）；
抗−ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３（１９８５年５月７日に発行の米国特許第４，５１５，８９３号）；
抗−ＣＤ２５又は抗−ｔａｃ抗体、例えばＣＨＩ−６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標）及び（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））（１９９７年１２月２日に発行の米国特許第５，６９３，７６２号を参照せよ）；
抗−ＣＤ４抗体、例えばｃＭ−７４１２抗体（Choyら, Arthritis Rheum 39(1):52-56(1996)）；
抗−ＣＤ５２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（Riechmannら, Nature 332: 323-337(1988)）；
抗−Ｆｃレセプター抗体、例えば、Grazianoら, J. Immunol. 155(10):4996-5002(1995)にあるようなＦｃγＲＩに対するＭ２２抗体；
抗−癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、例えばｈＭＮ−１４（Sharkeyら, Cancer Res. 55(23Suppl）: 5935s-5945s(1995)；
ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３及びＣＨＬ６を含む乳上皮細胞に対する抗体（Cerianiら, Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s(1995)；及びRichmanら, Cancer Res. 55(23 Supp)：5916s-5920s(1995)）；
結腸癌腫細胞と結合する抗体、例えばＣ２４２（Littonら, Eur J. Immunol. 26(1):1-9(1996)）；
抗−ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ１３／５（Ellisら, J. Immunol. 155(2): 925-937(1995)）；
抗−ＣＤ３３抗体、例えばＨｕ Ｍ１９５（Jurcicら, Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s(1995)及びＣＭＡ−６７６又はＣＤＰ７７１；
抗−ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２又はLymphoCide（Juweidら, Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s(1995)；
抗−ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７−１Ａ（PANOREX(登録商標）；
抗−ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばabciximab又はｃ７Ｅ３ Ｆａｂ（REOPRO（登録商標））；
抗−ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ−４９３（SYNAGIS（登録商標））；
抗−ＣＭＶ抗体、例えばPROTOVIR（登録商標）；
抗−ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；
抗−肝炎抗体、例えば抗−ＨｅｐＢ抗体OSTAVIR（登録商標）；
抗−ＣＡ１２５抗体OvaRex；
抗−イデオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；
抗−αｖβ３抗体VITAXIN（登録商標）；
抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばｃｈ−Ｇ２５０；ＩＮＧ−１；
抗−ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；
抗−ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；
ＧＤ３ガングリオシドに対する抗−ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；
抗−ヒト扁平上皮癌（ＳＦ−２５）；及び
抗−ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えばＳｍａｒｔ ＩＤ１０及び抗−ＨＬＡ ＤＲ抗体 Oncolym（Ｌｙｍ−１）。
【０２５７】
本明細書おいて対象となる糖タンパク質は、好ましくは抗体であるが、本明細書に記載された方法によって修飾が可能な他のＦｃ領域含有糖タンパク質も検討される。このよな分子の例には、イムノアドヘシンがある。
【０２５８】
Ｄ．イムノアドヘシン調製
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ＥＣＤ))を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端的に融合されるが、Ｎ末端融合もまた可能である。
【０２５９】
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
【０２６０】
好適な実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のＦｃ領域のＮ末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は(ｂ)ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。
【０２６１】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
【０２６２】
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される：
(ａ)ＡＣＬ-ＡＣＬ；
(ｂ)ＡＣＨ-(ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｃ)ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,ＶＬＣＬ-ＡＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(ｄ)ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ,又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｅ)ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(ｆ)(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【０２６３】
簡潔化のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
【０２６４】
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３’末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【０２６５】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
【０２６６】
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は抹梢血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリン部分が、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【０２６７】
Ｅ．ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明はまたここに開示した糖タンパク質をコードしている単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び糖タンパク質の生産に対する組換え方法を提供する。
【０２６８】
糖タンパク質の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。糖タンパク質をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、通常の手法(例えば、糖タンパク質をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用するもの)を用いて配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
【０２６９】
(i)シグナル配列成分
本発明の糖タンパク質は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然ポリペプチドシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスファターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際特許公開第WO 90/13646号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
【０２７０】
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、ポリペプチドをコードするＤＮＡにリーディングフレームが結合される。
【０２７１】
(ii)複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
【０２７２】
(iii)選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補うか、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼである。
【０２７３】
選択スキームの一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、抗薬物性を付与し、選択工程を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸又はハイグロマイシンが使用される。
【０２７４】
哺乳動物細胞に適した選択可能なマーカーの他の例は、ポリペプチド核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
【０２７５】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。
【０２７６】
あるいは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選べるマーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照。
【０２７７】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【０２７８】
さらに、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、Ｋ.ラクティス(lactis)での組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系が報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの産業用菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【０２７９】
(iv)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常は宿主生物によって認識されるプロモーターを有し、ポリペプチド核酸と作用可能に連結している。原核生物宿主での使用に適したプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、及びｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも適している。細菌系で使用されるプロモーターも、ポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０２８０】
真核生物についてのプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴ富化領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【０２８１】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０２８２】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ  ７３，６５７に更に記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０２８３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターから、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
【０２８４】
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をさらに含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の改良は、米国特許第４，６０１，９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０２８５】
(v)エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインシュリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５'又は３' 位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０２８６】
(vi)転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、ポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６とここに開示した発現ベクターを参照されたい。
【０２８７】
(vii)宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書に記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適した宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適した原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシラス・リシェニフォルミス（Bacillus licheniformis )(例えば、1989年4月12日に公開された ＤＤ２６６，７１０に開示されたバシリ・リシェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【０２８８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターのための適したクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【０２８９】
グリコシル化ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
【０２９０】
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【０２９１】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株［293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほか, J. Gen Virol., 36:59 (1977)］;ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞［TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)］;サルの腎細胞 (CVI ATCC CCL 70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34); バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATCC CCL51);ＴＲＩ細胞［Motherほか, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)］;ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；マウスミエローマ細胞、例えばＮＳＯ（例えば、RCB0213、Bebbingtonら, Bio/Technology 10:169(1992)）及びＳＰ２／０細胞（例えば、SP2/0-Ag14細胞、ATCC CRL 1581）；ラットミエローマ細胞、例えばYB2/0細胞（例えば、YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞、ATCC CRL 1662）；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＵＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ−ＤＰ１２又はＣＨＯ−ＤＧ４４（Urlaubら, Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555(1986)）とともに、本発明をおこなうために好ましい細胞株であり、Ｌｅｃ１３は例示的ＣＨＯ宿主細胞株である。ＤＵＸ−Ｂ１１細胞を、プレプロインシュリンのｃＤＮＡを有するｐＳＶＥＨＩＧＮｅｏで形質転換し、それによって、クローンＣＨＯ−ＤＰ１２を作製した。ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CRL 61）、ＤＵＸ−Ｂ１１（Simonsenら, PNAS(USA)80:2495-2499(1983)）、ＤＧ４４又はＣＨＯ−ＤＰ１２宿主細胞の場合は、その中で発現するタンパク質をフコシル化する能力が欠失するように改変することができる。
【０２９２】
本発明はハイブリドーマ細胞にも適用可能である。「ハイブリドーマ」なる用語は、免疫由来の不死細胞株と抗体産生細胞との融合により産生されるハイブリッド細胞株を意味する。該用語は、一般的にトリオーマ（trioma）細胞株として知られるヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株との融合と、それに続くプラズマ細胞との融合の結果生じるヘテロハイブリッド骨髄腫融合の子孫を包含する。さらに該用語は、クオドローマ（quadromas：例えばMilstein等, Nature, 537:3053 (1983)参照）等の抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞株を含むものとする。ハイブリッド細胞株は、ヒト及びマウスを含む任意の種のものであってよい。
【０２９３】
最も好ましい実施態様で、哺乳動物細胞は、対象のポリペプチドをエンコードする外因性の単離核酸で形質転換させた非ハイブリドーマ哺乳動物細胞である。「外因性核酸」又は「異種核酸」とは、細胞と異種の核酸配列、又は該細胞と同種であるがその核酸が通常見られない宿主細胞核酸内の位置にある核酸配列を意味する。
【０２９４】
(viii)宿主細胞の培養
宿主細胞を、ポリペプチド産生のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換し、そしてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望する配列をコードする遺伝子を増幅するのに適した改良された簡便な栄養培地で培養した。
【０２９５】
本発明のポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4,767,704号；同4,657,866号；同4,927,762号；4,560,655号；又は同5,122,469号；国際公開WO 90/03430；国際公開WO 87/00195；又は米国特許再発行第30,985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２９６】
すべての培養培地は、典型的には、１つ又は複数の以下の分類から少なくとも１つの成分を提供する：
１）通常はグルコース等の炭水化物の形態である、任意のエネルギー源；
２）すべての必須アミノ酸、及び通常は２０のアミノ酸にシステインを加えた基本的なセット；
３）低濃度で必要であるビタミン及び／又は他の有機化合物；
４）遊離脂肪酸；及び
５）有機化合物、又はかなりの低濃度、通常はマイクロモル範囲で典型的には必要とされる天然で生じる成分として定義される微量成分。
【０２９７】
培養培地は、好ましくは無血清、例えば、約５％未満、好ましくは１％未満、より好ましくは０〜０．１％血清、他の動物由来タンパク質である。しかし、所望されるならば、それを使用することが可能である。本発明の好ましい実施態様では、細胞培養培地は過度のアミノ酸を含む。過度に供給されるアミノ酸は、例えば、Asn、Asp、Gly、Ile、Leu, Lys, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr及びValから選択される。好ましくは、Asn、Asp、Lys, Met, Ser, 及びTrpは過度に提供される。例えば、アミノ酸、ビタミン、微量成分及び１又は２倍の範囲で欧州特許ＥＰ３０７，２４７又は米国特許第６，１８０，４０１号に特定されている他の培地成分を使用することができる。これら２つの書面は、本明細書に参考文献として取り入れられている。
【０２９８】
所望するタンパク質を発現し、特定の位置に所望する炭水化物を付加することが可能な哺乳動物細胞の培養のために、培養する宿主細胞に特に注意を払い、多くの培養条件を使用することが可能である。哺乳動物細胞に適した培養条件は、当業者に良く知られているか（Clevelandら, J. Immunol. Methods 56:221-234(1983)）、或いは熟練者によって容易に決定することが可能であり（例えば、Animal Cell Culture: A Practical Approach第２版，Rickwood, D. 及びHames, B.D.編 オックスフォード大学出版，ニューヨーク(1992)）、選択された特定の宿主細胞によって変化する。
【０２９９】
（ix）糖タンパク質精製
組換え技術を使用する場合、糖タンパク質は細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。糖タンパク質が細胞内に生成される場合、第１段階として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取り除く。Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される糖タンパク質を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。糖タンパク質が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０３００】
細胞から調製した糖タンパク質組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は糖タンパク質に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく糖タンパク質の精製に用いることができる（Lindmarkら, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Gussら, EMBO J. 5: 15671575 [1986]）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。糖タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商品名)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収される糖タンパク質に応じて利用可能である。
【０３０１】
１つの実施態様では、糖タンパク質は、レクチン基質への吸収によって（例えば、レクチンアフィニティーカラム）調製物からフコース含有糖タンパク質を除去し、それによって、フコースフリー糖タンパク質を濃縮することで精製が可能である。
【０３０２】
Ｆ．糖タンパク質の分析
本発明の方法で製造された糖タンパク質の複合炭水化物部分は、上記の糖タンパク質反応が完了したことを決定するために容易に分析することができる。オリゴ糖は、炭水化物分析の従来の技術により分析することができる。即ち、例えば、この分野で良く知られたレクチンブロット等の技術は、末端マンノース又はガラクトースなどの他の糖の比率を明らかにする。
【０３０３】
好ましくは、炭水化物は、以下の実施例１及びShieldsら, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)のようにＭＡＬＤ１−ＴＯＦ質量分析によって分析される。
【０３０４】
この分野でグリコシル化分析のための幾つかの方法が知られており、本発明の内容において有用である。このような方法は、ペプチドに結合したオリゴ糖の同一性及び組成に関する情報を提供する。本発明で有用な炭水化物分析の方法は、これらに限定されないが、レクチンクロマトグラフィー；オリゴ糖を電荷に基づいて分離するために高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ；ＮＭＲ；マススペクトル；ＨＰＬＣ；ＧＰＣ；単糖組成分析；逐次酵素消化を含む。
【０３０５】
さらに、オリゴ糖を放出する方法が知られている。これらの方法は、
１）酵素的、通常はフコシダーゼ、例えばα−Ｌ−フコシダーゼを使用してフコースを除く；
２）主にＯ-結合構造を放出するための過酷なアルカリ性環境を用いた脱離；及び
３）Ｎ-及びＯ-結合オリゴ糖の両方を放出するための無水ヒドラジンを用いた化学的方法を含む。
【０３０６】
中性及びアミノ糖は、パルスアンペロメトリック検出と組み合わせた高速アニオン交換クロマトグラフィーにより測定できる（HPAE-PAD carbohydrate System, Dionex Corp.）。例えば、糖類は１００℃での６時間の２０％（v/v）トリフルオロ酢酸中の加水分解により放出される。加水分解物は、次いで凍結乾燥又はSpeed-Vac(Savant Instruments)により乾燥させる。次いで残りを１％酢酸ナトリウム溶液に溶解し、Anumula等（Anal. Biochem. 195: 269-280 (1991)）に記載されたようにＨＰＬＣ-ＡＳ６カラムで分析する。
【０３０７】
シアル酸は、３組の試料において、Yao等, (Anal. Biochem. 179: 332-335 (1989))の直接比色法によって別々に測定できる。好ましい実施態様では、Warren, L. J. Biol. Chem. 238(8)(1959)のチオバルビツール酸（ＴＢＡ）が用いられる。
【０３０８】
あるいは、免疫ブロット炭水化物分析を実施してもよい。この方法によると、タンパク質結合炭水化物は、Haselbeck及びHosel [Haselbeck等, Glycoconjugate J., 7: 63 (1990)]に記載された酸化的免疫ブロット手法に基づく市販のグリカン検出系（Boehringer）を用いて検出される。
【０３０９】
分析方法は、抗体が付随したオリゴ糖の分析のために記載されたものを含み、例えば、Wormald等,  Biochem. 36: 1370-1380(1997); Sheeley等 Anal. Biochem. 247: 102-110(1997) 及び Cant等,  Cytotechnology 15: 223-228 (1994)並びにそれらに挙げられた参考文献に記載されている。
【０３１０】
Ｇ．製薬製剤
糖タンパク質の治療用製剤は、所定の純度を持つ糖タンパク質と、場合によっては製薬的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical sciences 16th edition, Osol, A. 編, (1980)）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製され調製される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンズアルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はTWEEN(商品名)、PLURONICS(商品名)又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０３１１】
本明細書中での製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば１以上の活性化合物も含んでよく、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものである。例えば。製剤は、さらに他の抗体又は化学療法剤を含んでもよい。そのような分子は、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
【０３１２】
また活性成分は、各々例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. 編, (1980)に開示されている。
【０３１３】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０３１４】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、糖タンパク質を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(商品名)（分解性乳酸グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間止まると、37℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物学的活性及び免疫原性における可能な変化を喪失させる。合理的な戦略は、含まれるメカニズムに応じて安定化のために考案できる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適当な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリクス組成物の開発によって達成される。
【０３１５】
製薬的組成物を凍結乾燥してもよい。凍結乾燥した抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。安定な水溶性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６Ｂ１号に記載されている。
【０３１６】
Ｈ．糖タンパク質の非治療的用途
本発明の糖タンパク質は、アフィニティ精製剤として使用することができる。このプロセスでは、糖タンパク質は、この分野で良く知られた方法を用いてセファデックス樹脂又は濾紙などの固相上に固定化される。固定化された糖タンパク質を精製すべき抗原を含有する試料と接触させ、その後支持体を適当な溶媒で洗浄し、その溶媒は、固定化糖タンパク質に結合した精製すべき抗原を除く試料中の実質的に全ての物質を除去する。最後に、支持体をグリシンバッファー、pH5.0等の他の適当な溶媒で洗浄して、抗原を糖タンパク質から放出させる。
【０３１７】
また糖タンパク質は、例えば、対象とする抗原の特定細胞、組織、又は血清における発現を検出するための診断アッセイにおいても有用である。
【０３１８】
診断的応用においては、糖タンパク質は典型的に検出可能な部分で標識される。多数の標識は利用可能であり、それらは一般的に以下の範疇にグループ分けされる：
（ａ）放射性同位体、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ等。糖タンパク質は、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen等, 編, Wiley-Interscience, New York, Pubs. (1991)に記載された技術を用いて放射性同位体で標識され、放射活性はシンチレーションカウンティングにより測定できる。
（ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン(Lissamine)、フィコエリトリン及びテキサスレッド等が使用できる。蛍光標識は、例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いて糖タンパク質に複合させることができる。蛍光発光は、フリオリメーターを使用して定量が可能である。
（ｃ）種々の酵素−基質標識が利用でき、米国特許第４，２７５，１４９号は、それらの幾つかの概説を提供している。酵素は一般に、種々の技術を用いて測定可能な色素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒し、それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させることもある。蛍光変化を定量化する技術は上述した。化学発光基質は化学反応によって電子的に励起され、次いで（例えば化学発光計を用いて）測定可能な光を放出する、または蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等を含む。酵素を抗体に複合させる技術は、O'Sullivan等, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (編J. Langone & H. Van Vunakis）Academic press, New York, 73: 147-166 (1981)に記載されている。
【０３１９】
酵素−基質の組み合わせは、例えば以下を含む：
(i)セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素、過酸化水素が染料前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３'，５，５'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））を酸化する；
(ii)アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート；
(iii)β-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ。
【０３２０】
当業者には、多くの他の酵素−基質の組み合わせが利用可能である。これらの一般的な概説は、米国特許第４，２７５，１４９号及び第４，３１８，９８０号を参照。
【０３２１】
標識は糖タンパク質に間接的に複合されるときもある。当業者は、これを達成するための種々の技術を知っているであろう。例えば、糖タンパク質にビオチンを複合し、上記３つの範疇の標識の任意のものにアビジンを複合する、又はその逆が可能である。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、よってこの間接的な方式で糖タンパク質に標識を複合させることができる。あるいは、糖タンパク質での標識の間接的複合を達成するために、糖タンパク質に小さなハプテン（例えばジゴキシン）を複合させ、上記した異なる型の標識を抗-ハプテンポリペプチド（例えば抗-ジゴキシン抗体）に複合させる。よって糖タンパク質での標識の間接的複合が達成できる。
【０３２２】
本発明の他の実施態様では、糖タンパク質を標識する必要はなく、その存在を糖タンパク質に結合する標識抗体を用いて検出することができる。
【０３２３】
本発明の糖タンパク質は任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等で用いられうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
【０３２４】
また糖タンパク質は、インビボ診断アッセイでも使用できる。一般的に、糖タンパク質は放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５Ｓ等）で標識され、抗原又はそれを発現する細胞がイムノシンチオグラフィー（immunoscintiography）によって局在化される。
【０３２５】
Ｉ．糖タンパク質のインビボ用途
本発明の糖タンパク質は、哺乳動物、例えば疾患又は障害に罹患し、糖タンパク質の投与の恩恵を受けることのできる患者の治療に使用できると考える。糖タンパク質で処置できる状態は多く、癌（例えば、糖タンパク質が腫瘍関連抗原、Ｂ細胞表面抗原、例えばＣＤ２０、ＥｒｂＢレセプター、例えばＨＥＲ２レセプター、血管形成因子、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する場合）；喘息等のアレルギー状態（抗-ＩｇＥ抗体によって）；及びＬＦＡ−１媒介疾患（例えば、糖タンパク質が抗-ＬＦＡ-１又は抗-ＩＣＡＭ-１である場合）等を含む。ＣＤ２０等のＢ細胞表面マーカーと結合する抗体の場合には、好ましい徴候は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫）、自己免疫疾患、又は外来抗原への免疫応答を阻止するためのものである（ＷＯ０１／０３７３４）。
【０３２６】
抗体がＥｒｂＢレセプターと結合するならば、疾患は、好ましくはＥｒｂＢ発現癌、例えば、ＥｒｂＢレセプターの過剰発現によって特徴付けられる良性又は悪性腫瘍である。限定されるものではないが、このような癌には、乳癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、肝臓癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌腫(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【０３２７】
本明細書における教示によると、ＡＤＣＣ活性が向上した変異体Ｆｃ領域を有する糖タンパク質を調製することが可能である。そのような分子は、異なる疾患の治療に用途が見出せる。
【０３２８】
例えば、改良されたＡＤＣＣ活性を有する糖タンパク質は、組織又は外来性の微生物を破壊もしくは除去する事が望まれるような疾患又は疾病において用いられる可能性がある。例えば、その糖タンパク質は、癌；自己免疫疾患；炎症性疾患；感染症（例えば、バクテリア、ウィルス、真菌もしくは酵母などの感染）；および組織の除去が望まれるようなその他の状態（甲状腺種のような）等、の治療に用いられるであろう。
【０３２９】
糖タンパク質は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、および局所的な免疫的抑制治療が望まれる場合には、その病巣内への与薬などを含む、あらゆる適した方法により投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下投与を含む。さらに、糖タンパク質は、特に減少させた糖タンパク質用量で、パルス注入によって適切に投与される。好ましくは、投与は注射によって、最も好ましくは、部分的には投与が簡潔か慢性的かに応じて、静脈内又は皮下注射によってなされる。
【０３３０】
疾患の予防又は治療のために、糖タンパク質の適切な用量は、治療すべき疾患の型、疾患の重篤さ及び経路、糖タンパク質投与が予防的か治療目的か、従前の治療、患者の臨床履歴及び糖タンパク質に対する反応、及び担当医師の判断に依存する。糖タンパク質は、一時に又は一連の治療を通じて適切に患者に投与される。
【０３３１】
疾患の重篤さに応じて、約１μg/kgから１５mg/kg（例えば、０．１−２０mg/kg）の糖タンパク質が、患者への候補となる初期投与であり、例えば一又は複数の別々の投与、あるいは連続注入のいずれかによる。典型的な１日の用量は、約1μg/kgから100mg/kgの範囲であるが、上記の要因に依存する。数日間以上に渡る繰り返し投与については、状態に応じて、望まれる疾患状態の抑制が起こるまで治療を続ける。しかしながら、他の用量計画も有用である場合もある。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイで容易に監視できる。本明細書における実施例は、フコース含有糖タンパク質と比較して、糖タンパク質（例えば、フコースフリー抗体）のより低い用量を投与することができることを示している。
【０３３２】
糖タンパク質組成物が処方され、用量決定(dose)され、良好な医学的実務に適合する方式で投与される。ここで考慮すべき因子は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、疾患の原因、薬剤の輸送部位、投与方法、投与計画、及び医学実務者に知られた他の因子を含む。投与すべき糖タンパク質の「治療的有効量」は、それらを考慮して決定され、疾患又は障害を予防、改善、又は治療するのに必要な最小量である。糖タンパク質は、問題とする疾患の予防又は治療に現在使用されている一又は複数の他の薬剤とともに製剤する必要はないが、場合によってはそのようにされる。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する糖タンパク質の量、疾患又は治療の型、及び上述した他の因子に依存する。これらは、一般的にはこれまでに使用されたのと同じ用量かつ投与経路で、あるいはこれまでに使用された用量の１から９９％で用いられる。
【０３３３】
治療的抗体組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。
【０３３４】
アンタゴニストとしての抗体でここに記載したように処理される癌患者は、放射線治療も受けることができる。あるいは、又はそれに加えて、化学治療薬を患者に投与してもよい。そのような化学治療薬の調製及び投薬スケジュールは、製造者の指示に従うか、熟練した実施者が経験的に決定したように用いることができる。また、これらの化学治療薬の調製及び投薬スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学治療薬はアンタゴニスト投与の前でも後でも、又はそれと同時に与えてもよい。癌の徴候については、腫瘍関連抗原に対する又は血管形成因子に対する抗体、例えばＨＥＲ２又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体等も投与するのが望ましい。あるいは、又はそれに加えて、１又はそれ以上のサイトカインを患者に同時投与してもよい。
【０３３５】
本発明はさらに、例えば癌の治療に有用な材料を含む製造物品及びキットを提供する。製造物品は、ラベルの付いた容器を具備する。好ましい容器は、例えば、ビン、バイアル、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックといった種々の材料から形成されてよい。容器は、本明細書に記載されている糖タンパク質調製物を含む組成物を有する。組成物中の活性薬は特定の糖タンパク質である。容器上のラベルは、組成物が特定の疾患又は障害の治療又は防止に用いられることを示し、上記のようなインビボのための指示を示していてもよい。
【０３３６】
本発明のキットは、上記の容器と、緩衝剤を入れた第２の容器とを具備する。さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための指示を記載したパッケージ挿入物を含む販売及び使用者の立場から望ましい他の材料を有していてもよい。
【０３３７】
本発明は、以下の実施例によってより十分に理解されるであろう。しかしながら、本発明の範囲を限定するように、それらは解釈されるべきではない。本明細書において言及されているすべての文献及び引例は、参考文献として明白に取り入れられている。
【実施例】
【０３３８】
ＩｇＧの機能におけるフコシル化オリゴ糖の役割を評価するために、Ｌｅｃ１３細胞株（Ripkaら, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545(1986)）を使用してヒトＩｇＧ１を発現させた。このＣＨＯ細胞株は、正常なＣＨＯ細胞株及びヒト血清で見出されたのと別の点で類似するオリゴ糖が付加されたＩｇＧを提供するが、フコースを付加する能力を欠いている。ヒトエフェクター細胞を使用するヒトＦｃγＲ、ヒトＣ１ｑ、ヒトＦｃＲｎ、及びＡＤＣＣとの結合を含めて、抗体エフェクター機能へのフコシル化炭水化物の作用を表するために、得られたＩｇＧ産物を使用した。
【０３３９】
実施例１
ヒトＦｃＲとの結合
安定な細胞株のためのｃＤＮＡコンストラクト：ヒト化抗−ＨＥＲ２抗体 Ｈｕ４Ｄ５の重及び軽鎖（Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285(1992)）、ヒト化された親和性成熟抗−ＩｇＥ抗体Ｅ２７（米国特許第６，１７２，２１３号）、及びキメラ抗−ＣＤ２０抗体Ｃ２Ｂ８（米国特許第５，７３６，１３７号）を、以前に記載した哺乳動物細胞発現ベクターへサブクローンした（Lucasら, Nucl. Acid. Res. 24, 1774-1779(1996)）。ピューロマイシンをＬｅｃ１３細胞等のＤＨＦＲ（＋）細胞の選択マーカーとして使用し、そのＤＨＦＲ部位を安定な細胞株のメトトレキサート増幅のために保持した。
【０３４０】
Ｌｅｃ１３及び野生型ＣＨＯ細胞のトランスフェクションと培養：ＣＨＯ細胞株Ｐｒｏ−Ｌｅｃ１３．６ａ（Ｌｅｃ１３）をイェシーバ大学 のアルバート アインシュタインメディカルカレッジのパメラ スタンレー教授から入手した。親株は、Ｐｒｏ−（プロリン栄養要求性）及びＧａｔ−（グリシン、アデノシン、チミジン栄養要求性）である。野生型抗体のために使用されるＣＨＯ−ＤＰ１２細胞株は、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損であり、インシュリン要求性が低下しているＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）の誘導体である。細胞株を、Superfect法（Qiagen，バレンシア， カリフォルニア）を使用してｃＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクト抗体を発現するＬｅｃ１３細胞の選択は、以下の成分を含有する成長培地に１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン ジヒドロクロライド（Calbiochem，サン ディエゴ， カリフォルニア）を使用しておこなった：１０％不活性化ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び１Ｘ ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補充したＬ−グルタミン、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、ゲーサーズバーグ、メリーランド）を含むMEMアルファ培地。ＣＨＯ細胞は、ＧＨＴ無しでHam's F12を含有する成長培地で同じように選択される：５％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１Ｘ ＧＨＴ（グリシン、ヒポキサンチン、チミジン）、及び１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンを補充し、ＮａＨＣＯ３を含み、グリシンを含まない低グルコースＤＭＥＭ。２〜３週間内で形成されたコロニーを、拡張とタンパク質発現のためにプールした。この細胞プールを、小バッチタンパク質発現のために３ｘ１０６細胞／１０ｃｍプレートで最初に播種した。９０−９５％の集密度に生育すると、細胞を無血清培地に移し、３−５日後に細胞上澄み液を収集し、ＦｃＩｇＧ及び無傷のＩｇＧ−ＥＬＩＳＡで試験してタンパク質発現レベルを見積もった。１０ｍｇ／Ｌ組み換えヒトインシュリン及び１ｍｇ／Ｌ微量成分を補充したＰＳ２４産生培地へ移す１日前に、Ｌｅｃ１３及びＣＨＯ細胞を、およそ８ｘ１０６細胞／１５ｃｍプレートで播種した。
【０３４１】
タンパク質発現：Ｌｅｃ１３細胞及びＣＨＯ細胞を、３−５日間、無血清産生培地にとどめた。上澄み液を収集し、細胞と細片を除くために１５０ｍｌコニカルチューブでの遠心分離によって浄化した。プロテインＧクロマトグラフィー（アマシャム ファルマシア バイオテク、Piscataway、ニュージャージー）を使用する即時精製の前に、プロテアーゼインヒビターＰＭＳＦとアプロチニン（シグマ、セントルイス、ミズーリー）を添加し、その上澄み液をＭＷＣＯ３０フィルター（アミコン、ビバリー、マサチューセッツ）を使用して撹拌セルで５倍濃縮した。全タンパク質を、Centripriep-30コンセントレーター（アミコン）を使用してリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）にバッファー交換し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。タンパク質濃度を、Ａ２８０によって測定し、アミノ酸組成分析によって確かめた。平均では、Ｌｅｃ１３細胞は１５ｃｍプレートあたり１０μｇのｍＡｂを生成し、全抗体についてコントロールＣＨＯでの発現は、Ｌｅｃ１３細胞でよりも４−５倍高かった。プレートで生育させたＣＨＯ−ＤＰ１２から生成された抗体は、ＣＨＯ−Ｐと表示される。
【０３４２】
ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞も、スピナーフラスコで生育させた。細胞を６ｘ１０５細胞／ｍｌで播種し、２日間、３７℃で生育させた。３日目に、温度を３３℃へシフトさせ、ｐＨの６．５への低下による生存度が７０％へ低下するまで細胞を生育させた。スピナーフラスコで生育させたＣＨＯ−ＤＰ１２細胞由来の抗体は、ＣＨＯ−Ｓとして表示される。
【０３４３】
アスパラギン結合オリゴ糖のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析：Ｎ−結合オリゴ糖を、Papacら, Glycobiology ８，445-454(1998)の手法を使用して組み換え糖タンパク質から遊離した。要約すると、９６ウェルＰＶＤＦ−ライン マイクロタイタープレート（ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ）のウェルを、Milipore Multiscreen Vacuum manifoldを減圧しPDVF膜へ引き込んだ１００μｌメタノールで条件化した。この条件化したＰＶＤＦ膜を、３Ｘ２５０μｌの水で洗浄した。manifoldへ緩やかに減圧することによって、すべての洗浄段階の間をウェルを完全に排出させた。膜を、６Ｍ塩酸グアニジン、３６０ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８で構成される還元及びカルボキシメチル化緩衝液（ＲＣＭ）で洗浄した。糖タンパク質試料（５０μｇ）を個々のウェルに適用し、再び緩やかな減圧によってＰＶＤＦ膜から引き出し、ウェルを２Ｘ５０μｌのＲＣＭ緩衝液で洗浄した。各ウェルへ５０μｌの０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液を添加し、マイクロタイタープレートを３７℃で１時間インキュベートすることで、固定化した試料を還元した。ＤＴＴは、減圧によって除き、そのウェルは、２５０μｌの水で４回洗浄した。システイン残基は、１Ｍ ＮａＯＨで新しく調製し、ＲＣＭ緩衝液で０．１Ｍに希釈した５０μｌの０．１Ｍ ヨード酢酸（ＩＡＡ）溶液によってカルボキシメチル化した。カルボキシメチル化は、外気温度、暗闇での３０分間のインキュベーションによって完遂させた。減圧をプレートへ施してＩＡＡを除き、ウェルを２５０μｌの精製水で４回洗浄した。ＰＶＤＦ膜は、１００μｌの１％ＰＶＰ３６０（ポリビニルピロリジン ３６０，０００ＭＷ）（シグマ）溶液の添加と外気温度で１時間のインキュベーションによってブロックした。そのＰＶＰ−３６０溶液は、緩やかな減圧によって除き、ウェルを２５０μｌの水で４回洗浄した。ＰＮＧアーゼＦ（New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ）消化溶液、１０ｍMトリス酢酸、ｐＨ８．４の２５μｌの２５ユニット／ｍｌ溶液を各ウェルに添加して、消化を３７℃で３時間続けた。消化の後、試料を５００μｌのエッペンドルフチューブへ移し、２．５μｌの１．５Ｍ酢酸溶液を各試料へ添加した。酸性化した試料を外気温度で３時間インキュベートしてグリコシルアミンのオリゴ糖をヒドロキシ型へ変換した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の前に、遊離オリゴ糖を、コンパクトな反応チューブに泥状に詰め込んだ０．７ｍｌベッドのカチオン交換樹脂（水素型のＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂）（Bio-Rad、Hercules、カリフォルニア）を使用して脱塩した（US Biochemical、クリーブランド、オハイオ）。
【０３４４】
ポジティブモードにおける試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析のために、脱塩化したオリゴ糖（０．５μｌアリコート）を、１ｍｌのエタノール／１０ｍＭ塩化ナトリウム１：１（ｖ／ｖ）に２ｍｇの２，５ジヒドロキシ安息香酸を０．１ｍｇの５−メトキシサリシリック酸と溶解することで調製した、０．５μｌの２，５−ジヒドロキシ安息香酸マトリックス（ｓＤＨＢ）のステンレス標的に適用した。試料／マトリクスは、減圧によって乾燥させた。ネガティブモードでの分析のために、脱塩したＮ−結合オリゴ糖（０．５μｌアリコート）は、１：３（ｖ／ｖ）アセトニトリル／１３．３ｍＭクエン酸アンモニウム緩衝液で調製した０．５μｌの２'，４'，６'−トリヒドロキシアセトフェノンマトリックス（ＴＨＡＰ）とともにステンレス標的に適用した。試料／マトリクスを減圧乾燥し、次いで、分析の前に湿気を吸収させた。遊離オリゴ糖は、PerSeptive BioSystem Voyager-DE 質量分析計でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。質量分析計は、２０ｋＶで、リニアコンフィギュレーションのポジティブ又はネガティブモードのいずれか、そしてディレイドエクストラクションを使用して操作された。データーは、１３００のレーザーパワーを使用し、そしてシグナルからノイズまでを改良するためのデーター積み上げ法（２４０スキャン）で得られた。機器は標準オリゴ糖の混合物でキャリブレーションし、データーは、大きさを割り当てる前に１９ポイント Savitsky-Golayアルゴリズムを使用してスムーズにした。質量スペクトルデーターの統一は、Caesar 7.0 analysis software package（SciBridge Software）を使用して達成した。この結果は、以下の表に要約されている。
【０３４５】
2010248228.tif 000006
2010248228.tif 000007
2010248228.tif 000008
【０３４６】
ＩｇＧ１のＦｃγＲ及びＦｃＲｎとの結合を測定する方法（ＥＬＩＳＡ−フォーマット及び細胞ベース）は、前出（Shieldsら, J. Biol. Chem. 276: 6591-6604(2001)）及びＷＯ００／４２０７２（Presta）に記載されている。
【０３４７】
ヒトＦｃγＲＩと結合した単量体Ｌｅｃ１３−Ｈｕ４Ｄ５ ＩｇＧ１は、Ｈｕ４Ｄ５−ＣＨＯ−Ｓ及びＣＨＯ−Ｐの結合と等価である（図４；表２）。炭水化物の存在はＦｃγＲＩとの結合にとって必須であるが（Walkerら, Biochme. J. 259: 347-353(1989)）、フコース含量（Ｌｅｃ１３対ＣＨＯ）又はガラクトース含量（ＣＨＯ−Ｐ対ＣＨＯ−Ｓ）の違いにもかかわらずＩｇＧ１の等価結合は、ヒトＦｃγＲＩは、炭水化物でのこれら部分の存在に対して感受性がないことを示している。ＩｇＧのヒトＦｃγＲＩとの結合のガラクトシル化の作用は、以前に研究されており（Wright ら, J. Immunol. 160: 3393-3402(1998)）；Kumpelら, Human Antibod. Hybridomas 5:143-151(1994)；及びTsuchiyaら, J. Rheumatol. 16:285-290(1989)）、データーの概説では、ガラクトシル化がＦｃγＲＩとの結合に作用するならば、それは、希であり、アイソタイプ依存性であろうと示唆されている（Wright ら, J. Immunol. 160: 3393-3402(1998)）。
【０３４８】
ヒトＦｃγＲＩとＩｇＧ１の単量体結合とは対照的に、低親和性ヒトＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ）に関する結合アッセイは、結合の検出を誘導するために、二量体（Ｈｕ４Ｄ５、ＨｕＥ２７）又は六量体（ＨｕＥ２７）の形成を必要とする。ヒトＦｃＲＩＩＡは、位置１３１で確かめられる２つの既知の天然に発生するアロタイプを有する（Clarkら, J. Immunol. 143: 1731-1734(1989)）。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡは、位置４８（Leu, His又はArg）及び位置１５８（Val又はPhe）での天然に発生するアロタイプを有する；ＦｃγＲＩＩＩＡ（Val158)アロタイプは、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Phe158）アロタイプよりもヒトＩｇＧと相互作用する（Shieldsら, J. Biol. Chem.276: 6591-6604(2001)；Koeneら, Blood 90: 1109-1114(1997)；及びWuら, J. Clin. Invest. 100:1059-1070(1997)）。
【０３４９】
ヒトＦｃγＲＩＩＢとＬｅｃ１３−Ｈｕ４Ｄ５二量体の結合、及びＦｃγＲＩＩＡのヒトＲ１３１−多型は、ＣＨＯ−Ｈｕ４Ｄ５と比較して、それぞれ結合において１．８倍及び１．６倍の向上を示した（図５，６；表２）。対照的に、フコースの欠失は、ヒトＦｃγＲＩＩＡのＨ１３１−多型との結合に作用しなかった（図７；表２）。ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）に対して作用がないのに対して、それぞれが位置１３１にアルギニンを有するヒトＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＢの双方とフコースの無いＩｇＧ１の結合に関する同じような向上は、そのフコースが、ＦｃγＲ残基の位置１３１で直接に作用するか、又はアルギニンがＦｃγＲの位置１３１に存在する場合に、結合にわずかのネガティブな影響を与えるようにＩｇＧ１のコンフォメーションを変えるかのいずれかであることを示唆している。
【０３５０】
ＦｃγＲＩＩＩＡの両多型は、フコースを欠くＩｇＧ１との結合において顕著な向上を示した。ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）と二量体Ｌｅｃ１３−Ｈｕ４Ｄ５の結合は、ＣＨＯ−Ｈｕ４Ｄ５（図８；表２）に対して１４倍の向上を示し、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）との結合は、少なくとも１００倍の向上を示した（図９）。Ｌｅｃ１３−ＨｕＥ２７二量体も、ＦｃγＲＩＩＩＡの両多型との結合について向上を示した（図１０、１１；表２）。
【０３５１】
ヒトＦｃγＲとの結合へのヒトＩｇＧ１のタンパク質配列変異体の作用についてのこれまでの研究では、３つの抗−ＩｇＥ Ｅ２７及び３つのＩｇＥで構成される六量体複合体が使用された（Shieldsら, J. Biol. Chem. 276: 6591-6604(2001)）；よって、これらの複合体は、抗−ＩｇＥ Ｅ２７の三量体である。その研究では、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）及びＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）とのＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ−ＩｇＧ１変異体の結合の向上は、それぞれ１．５〜２倍、及び１．１倍であった；向上は最少に思えるであろうが、ＡＤＣＣへの作用は顕著であった（Shieldsら, J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001)）。現在の研究では、六量複合体であるＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ−ＩｇＧ１は、両ＦｃγＲＩＩＩＡ多型との結合において、これまでの研究と一致する値の向上を示した（図１２，１３；表２）；同じように、Ｌｅｃ１３−ＨｕＥ２７（天然ＩｇＧ１）の六量体複合体は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）に対しておよそ２倍の結合の向上を示した（表２）。二量体としてアッセイしたならば、フコースを有するＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ−ＩｇＧ１変異体は、それぞれＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）及びＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）との結合において９倍及び２０倍の向上を示した；フコースのない同じ変異体は、それぞれ２１倍及び３３倍のさらに向上した多型との結合を示した（表２）。故に、フコースの欠質は、ＦｃγＲＩＩＩＡと天然ＩｇＧ１の結合を増大させるだけでなく、ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体の結合を増加させることも可能である。従って、タンパク質及び炭水化物改変は相乗的である。
【０３５２】
ＨｕＥ２７（天然、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ−ＩｇＧ１、Ｌｅｃ−１３誘導）のすべての型に関して、より大きな複合体（ＨｕＥ２７の三量体）の結合の向上は、二量体複合体である同じｍＡｂに関して観察されたものよりもより小さかった。例えば、二量体としてのＬｅｃ１３−ＨｕＥ２７の結合は、およそ２０倍の向上を示したが、より大きな複合体についてはたった２倍の向上を示した（表２）。これは、免疫複合体の大きさが向上するにつれて、アビディティーの作用は結合を支配し得ることを示唆している。
【０３５３】
向上したＦｃγＲＩＩＩＡとフコース欠損ＩｇＧ１の結合は、ＣＨＯ細胞上のγ−鎖と同時発現したＦｃγＲＩＩＩＡ（Phe158）完全長α鎖によって確かめられた（図２８；表２）。ＥＬＩＳＡ−フォーマットでのα鎖融合タンパク質単独のように、フコース欠損は、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ−ＩｇＧ１変異体と相乗的であった。
【０３５４】
マウスＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩと天然及びフコースのないＩｇＧ１の結合も評価された。二量体としてさえのヒトＩｇＧ１は、これらレセプターと弱く結合し、フコースのないＩｇＧ１では、結合の向上は見られなかった。ＩｇＧに対する他のレセプターである新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は、ＦｃγＲと構造的に関連しておらず（Burmeisterら, Nature 372: 379-383(1994)）；Raghavanら, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 181-220 (1996)）、ＩｇＧのクリアランス速度を含む多くの生物学的プロセスに関わっていることが提案されてきた（Ghetieら, Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766(2000)）。ＦｃＲｎとフコシル化及び非フコシル化ＩｇＧ１の結合は、等価である（図１４）。アグリコシル化ＩｇＧ１と同じように、グリコシル化ＩｇＧ１がこのレセプターと結合するので、これは驚くことではない（アグリコＡｂはＦｃＲｎと結合する）。
【０３５５】
Asn-237結合炭水化物上のフコースの欠失は、ＥＬＩＳＡフォーマットアッセイで、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８及びＶ１５８多型の双方）との結合が顕著に向上する結果となった。ＦｃγＲＩＩＩＡとの結合の増大は、精製したヒトＰＢＭＣを使用したＡＤＣＣアッセイにおいて細胞障害性を高めるフコースのないＩｇＧの能力によって更に証明された。向上した細胞障害性は、より低い濃度の抗体で特に明かであり、このことは、より高い用量のフコシル化ＩｇＧのように等価の細胞死をもたらすように、ＡＤＣＣを使用する治療的抗体を、おそらくはより低い用量で与えることができることを示唆している。
【０３５６】
フコースのないＩｇＧの結合の小さな向上が、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＢに関して見出されている；ヒトＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）には違いが見出されなかった。この理論に限定されるのではないことを意味し、２つの前出のレセプターは、位置１３１にアルギニンを有し、フコシル化ＩｇＧでは、フコース残基は、ＦｃγＲＩＩの残基１３１と直接（及び明らかに、ネガティブに）に相互作用し得るか、又はＩｇＧコンフォメーションに微妙に影響するかのいずれかであり、そのことは、ネガティブな相互作用を引き起こす。ＥＬＩＳＡフォーマットアッセイでのＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＢとフコースのないＩｇＧの結合の向上は小さいが（２倍まで）、単球を使用するＡＤＣＣアッセイも、低濃度の抗体である程度の細胞障害性の増加を示した。単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢを発現し、単球の分集団のみがＦｃγＲＩＩＩＡを発現した。フコシルＩｇＧ及びフコースのないＩｇＧの双方について、ヒトＦｃγＲＩとの結合が等価であるので、ＡＤＣＣの向上は、ＦｃＲＩとの差時的相互作用に起因するものではないようである。ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１／Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１／Ｈ１３１）供与体単球の双方は、ＡＤＣＣにある程度の向上を示し（図２１、２２）、それは、（１）ＦｃγＲＩＩＡは、２つの多型の間の違いを示すのに十分な高さのレベルの発現を単球では示さないであろう、（２）ＦｃγＲＩＩＢは、支配的な結合ＦｃγＲであろう（よって、Ｒ１３１／Ｒ１３１及びＨ１３１／Ｈ１３１単球の双方に等価に作用する）、又は（３）ＦｃγＲＩＩＡを発現する単球の分集団は向上したＡＤＣＣの一因であることを、どんな理論にも限定されずに示唆している。
【０３５７】
Ｌｅｃ１３産生及びＣＨＯ産生ＩｇＧからの天然ＩｇＧで見出された炭水化物の比較では、ガラクトシル化の程度にかなりの違いが見られず、よって、この結果は、フコースの有無のみに起因させることが可能である。しかしながら、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ ＩｇＧ１変異体、Ｌｅｃ１３産生、ＨＥＫ２９３産生、及びＤＰ１２−産生ＩｇＧは、ガラクトシル化に変化を示した。しかしながら、タンパク質配列変異の組み合わせとフコースの欠失は、付加的と思われた。
【０３５８】
ヒトＩｇＧのタンパク質配列変異のこれまでの研究で、幾つかのＦｃ位置でのアラニン（及び他）置換は、ＡＤＣＣを向上させたことを示すだけでなく、ＦｃγＲとの結合を低下又は向上させることができることが見出された（Shieldsら, J. Biol. Chem. 276(9): 267-273 (2000)）。興味あることに、これらのうちの幾つかは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ複合体の結晶構造に見出された相互作用界面の近傍にはなかった（Sondermannら, Nature 406:267-2743(2000)）。例えば、この研究で使用されている３つのアラニン置換Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａのうち、Ｓ２９８のみが結晶構造においてＦｃ−ＦｃγＲＩＩＩＡの境界面にある。同じように、２つのＦｃ重鎖上のどのフコース残基の結晶構造もＦｃγＲＩＩＩＡと相互作用しない。ヒト及びげっ歯類Ｆｃ又はＩｇＧの結晶構造を調査によって、フコースがコンフォメーションを変化させ、高いＢ−因子を示すことができることが示された。このことは、移動度の程度の高さを示唆している。
【０３５９】
正常なＣＨＯ及びＨＥＫ２９３細胞は、高頻度（９７−９８％）で、ＩｇＧオリゴ糖にフコースを付加する。血清のＩｇＧは、同じように高フコシル化である。
【０３６０】
実施例２
Ｃ１ｑ及びＦｃＲｎ結合
抗体とのＣ１ｑの結合は、補体活性化の古典的な経路の第１段階である（Makrides, S.C. Pharmacol. Rev. 50:59-87(1998)）。ＩｇＧにおける炭水化物の性質は、Ｃ１ｑとの相互作用に影響を与える（Wrightら, J. Immunol. 160:3393-3402(1998)；Boydら, Molec. Immunol. 32: 1311-1318(1995)；及びTsuchiyaら, J. Rheumatol. 16: 285-290(1989)）。Ｈｕ４Ｄ５は、RITUXAN（登録商標）、抗−ＣＤ２０マウス／ヒトキメラＩｇＧ１よりも弱くヒトＣ１ｑと結合し（図１５，１６）（Idusogieら, J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)）、フコースの欠失は、ヒトC1ｑと相互作用するＨｕ４Ｄ５の能力に影響を与えなかった（図１５，１６）。同じように、フコースの存在の有無は、ＦｃＲｎとのＩｇＧ１の結合に影響を与えると思われなかった。
【０３６１】
実施例３
抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣに対するフコースの欠失の影響は、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対してＬｅｃ１３−Ｈｕ４Ｄ５ ＩｇＧ１を使用することにより評価した（Hudziakら, Mol. Cell. Biol. 1165-1172(1989)）。２つのＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８／Ｆ１５８）供与体及び２つのＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８／Ｆ１５８）供与体からのＰＢＭＣを、エフェクター：標的比３０：１でエフェクター細胞として使用した。すべての供与体について、フコースを有しないＩｇＧ１は、フコースを有するＩｇＧ１と比較してＡＤＣＣの顕著な向上を示した（図１７−２０）。特に、すべての供与体について、細胞障害性の向上は、抗体の濃度が低下するにつれて、より明らかであった。これは、六量体に見られるよりも、二量体でみられる結合のより大きな向上を反映している。即ち、フコースのない変異体は、エフェクター細胞の結合／活性化に作用するために、標的細胞の表面上により少ないｍＡｂを必要としている可能性がある。
【０３６２】
ヒト単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢを発現し、分集団のみがＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。フコースの欠失はＦｃγＲＩとの結合に影響を与えないが、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩＢとの結合の小さな影響を有していたので、２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：標的比で精製したヒト単球をエフェクター細胞として使用して、ＡＤＣＣアッセイをおこなった。単球の精製は、ＰＢＭＣの精製よりも困難であり、ＡＤＣＣアッセイは、結果としてより困難である。ＰＢＭＣ ＡＤＣＣの様に、効果はよりはっきりせず、標的細胞を死滅させる単球の能力はＰＢＭＣと比較して低下しているが、単球ＡＤＣＣは、フコースを欠くＩｇＧ１に対する細胞障害性の向上を示した（図２１−２２）。
【０３６３】
実施例４
Ｆｃ変異体抗体のＡＤＣＣ活性
以下の実験を比較した：（１）ＣＨＯ細胞で発現されたＨｕ４Ｄ５（Ｈｕ４Ｄ５ ＣＨＯ−Ｓ）、（２）Ｌｅｃ１３細胞で発現されたＨｕ４Ｄ５フコース欠失変異体（ｈｕ４Ｄ５ Ｌｅｃ１３）、（３）２９３ＨＥＫ細胞で発現されたＨｕ４Ｄ５三重アラニンＦｃドメイン置換変異体（Ｈｕ４Ｄ５ ＨＥＫ２９３−ＡＡＡ）及び（５）Ｌｅｃ１３細胞で発現されたＨｕ４Ｄ５フコース欠失三重アラニンＦｃドメイン置換変異体（Ｈｕ４Ｄ５−Ｌｅｃ１３−ＡＡＡ）。
【０３６４】
ＡＤＣＣ法：ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、マグネチックビーズ（Miltenyi Biotech, オーバーン, カリフォルニア）を使用するネガティブセレクションによって、２つの供与体の末梢血から精製された。ＩｇＧに対してより低い親和性結合表現型を発現するＦｃγＲ３（ＣＤ１６）（Ｆ／Ｆ１５８）（Shieldsら, J. Biol. Chem. 276:6591-6604(2001)）のＦ１５８型を発現するアレルについてホモ接合性となるよう、供与体は選択された。ＨＥＲ２−過剰発現ＳＫＢＲ−３乳癌腫細胞を、アッセイ培地（１％熱不活性化ウシ血清及び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ 緩衝液を含有する５０：５０ ＨａｍｓＦ１２：ＤＭＥＭ）中で２５℃、４５分間、１ｎｇ／ｍｌの各抗体で最適化し、次いで、加湿ＣＯ２インキュベーターで３７℃、５時間、１０：１から０．１５６の範囲の標的に対するエフェクター比（Ｅ：Ｔ）で、ＮＫ細胞の種々の濃度によって処理した。細胞障害性は、商業用キット（Roche Diagnostics, インディアナポリス， インディアナ）を使用する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の遊離によって測定した。
【０３６５】
ＮＫ細胞の間接免疫蛍光染色法：精製したＮＫ細胞を、染色緩衝液（リン酸緩衝化生理的食塩水、０．１％ウシ血清アルブミン、０．０１％アジ化ナトリウム）中で、４℃、３０分間、２μｇ／ｍｌの各Ｈｕ４Ｄ５変異体とインキュベートした。細胞は３回洗浄し、さらに３０分間、４℃でフィコエリトリン結合マウスｍａｂ抗ヒトＣＤ５６（ファーミンゲン，サン ディエゴ, カリフォルニア）及びＦＩＴＣ−Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）２特異的（Jackson Immunoresearch, West Grove, ペンシルベニア）とインキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳｃａｎ（商品名）フローサイトメーター（B.D. Biosciences，サンノゼ，カリフォルニア）での２色免疫蛍光染色について分析した。
【０３６６】
結論：両供与体（５３６５及び７５８０）では、フコース欠失三重アラニンＦｃ変異体でＦｃγＲＩＩＩ結合／ＡＤＣＣの相乗増加を示すＨｕ４Ｄ５−Ｌｅｃ１３型に対して、Ｈｕ４Ｄ５のＨｕ４Ｄ５−Ｌｅｃ１３−ＡＡＡ型について、２より高いＥ／Ｔ比で、ＡＤＣＣ活性の増加があった（図２６及び２７を参照のこと）。この結合の増大は、ＣＤ５６／ＣＤ１６発現ＮＫ細胞の供与体５３６５（図２４及び２５を参照のこと）におけるＮＫ細胞の間接免疫蛍光染色によって確かめられる。
【０３６７】
この発明は、その具体的な実施態様との関連で記載されているが、さらなる改良が可能であることが理解されるであろう。この応用は、一般的に、本発明の原則に沿い、本発明に関する分野内で知られているか又は習慣的に実施されている範囲内に止まる本発明からの逸脱を含み、添付した請求項に設定されたような前出の必須の特徴に適用し得る、あらゆる本発明の改良、使用、又は適用を包含するように意図されている。
【０３６８】
（実施態様）
１．  その組成物中の糖タンパク質の約８０−１００％が、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む、Ｆｃ領域を有する糖タンパク質を含んでなる組成物。
２．  糖タンパク質に抗体を含む、実施態様１の組成物。
３．  Ｆｃ領域にヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む、実施態様１の組成物。
４．  ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む、実施態様３の組成物。
５．  糖タンパク質がＦｃγＲＩＩＩと結合する、実施態様１の組成物。
６．  糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを含む成熟コア炭水化物構造を有する糖タンパク質よりも、糖タンパク質がより親和的にＦｃγＲＩＩＩと結合するか、又はより効率的に抗体依存性媒介細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する、実施態様５の組成物。
７．  抗体がキメラ、ヒト化又はヒト抗体である、実施態様２の組成物。
８．  抗体がＢ細胞表面マーカー、ＥｒｂＢレセプター、腫瘍関連抗原及び血管新生因子で構成される群から選択される抗原と結合する、実施態様２の組成物。
９．  抗体がＣＤ２０、ＨＥＲ２、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＣＤ４０、又は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）と結合する、実施態様２の組成物。
１０．抗体がヒト化抗−ＨＥＲ２抗体、キメラ抗−ＣＤ２０抗体及びヒト化抗−ＶＥＧＦ抗体を含む、実施態様９の組成物。
１１．組成物中の糖タンパク質の約９０−９９％が糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む、実施態様１の組成物。
１２．糖タンパク質がチャイニーズ  ハムスター 卵巣（ＣＨＯ）細胞によって生成されている、実施態様１の組成物。
１３．ＣＨＯ細胞がＬｅｃ１３細胞である、実施態様１２の組成物。
１４．糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合するバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を本質的に有しない、実施態様１の組成物。
１５．糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合するバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する、実施態様１の組成物。
１６．糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合する１つ又は複数のガラクトース残基を有する、実施態様１の組成物。
１７．糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合する１つ又は複数のガラクトース残基を本質的に有しない、実施態様１の組成物。
１８．糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合する１つ又は複数のシアル酸残基を有する、実施態様１の組成物。
１９．糖タンパク質が、成熟コア炭水化物構造に結合する１つ又は複数のシアル酸残基を本質的に有しない、実施態様１の組成物。
２０．製薬的製剤である、実施態様１の組成物。
２１．製薬的に許容される担体をさらに含んでなる、実施態様２０の製薬的製剤。
２２．無菌である、実施態様１の組成物。
２３．凍結乾燥された、実施態様１の組成物。
２４．糖タンパク質がイムノアドヘシンである、実施態様１の組成物。
２５．組成物中の糖タンパク質の約５１−１００％が、糖タンパク質のＦｃ領域と結合するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含み、そのＦｃ領域が天然配列Ｆｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含むＦｃ領域を有する糖タンパク質を含んでなる組成物。
２６．Ｆｃ領域が、Ｆｃ領域残基についてのＥＵ番号付けを使用したアミノ酸位置２５６，２９０，２９８，３１２，３２６，３３０，３３３，３３４，３６０，３７８又は４３０の何れか１つ又は複数にアミノ酸置換を含む、実施態様２５の組成物。
２７．Ｆｃ領域が、位置２９８，３３３，及び３３４における何れか２つ又は３つの残基にアミノ酸置換を含む、実施態様２６の組成物。
２８．Ｆｃ領域が、位置２９８，３３３及び３３４にアミノ酸置換を含む、実施態様２７の組成物。
２９．位置２９８，３３３及び３３４での置換残基がアラニンである、実施態様２８の組成物。
３０．容器；
前記容器上のラベル；及び
前記容器内に含有される実施態様１の組成物
を含んでなる製造品。
３１．容器上のラベルが、癌、自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、又は細胞又は組織の除去が所望される他の症状の治療に対して組成物が使用可能であることを示す、実施態様３０の製造品。
３２．実施態様１の組成物を哺乳動物の疾患又は疾病の治療をするのに有効量の実施態様１の組成物を投与することを含んでなる方法であって、そのような処置により恩恵を受ける哺乳動物を治療する方法。
３３．哺乳動物がヒトである、実施態様３２の方法。
３４．ヒトがＦｃγＲＩＩＩ（Ｆ１５８）を発現する、実施態様３３の方法。
３５．疾患又は疾病が、癌、自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、又は細胞又は組織の除去が所望される他の症状からなる群から選択される、実施態様３２の方法。
３６．宿主細胞により生成される糖タンパク質の約８０−１００％が、糖タンパク質のＦｃ領域と付着するフコースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む、Ｆｃ領域を含む糖タンパク質をコードする核酸を含んでなる宿主細胞。
３７．チャイニーズ  ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、実施態様３６の宿主細胞。
３８．核酸が発現するように実施態様３６の宿主細胞を培養することを含んでなる、糖タンパク質を産生するための方法。
３９．宿主細胞培養物から糖タンパク質を回収することを更に含んでなる、実施態様３８の方法。
４０．異種分子へ糖タンパク質を結合させることを更に含んでなる、実施態様３９の方法。
４１．異種分子が細胞障害剤又は酵素である、実施態様４０の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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