(57)【要約】【課題】中でも、タンパク質、特に、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ（商標））タンパク質を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに基づいて、高分子量（ＨＭＷ）凝集物およびその他の不純物を含有するタンパク質調製物から精製または回収する方法を提供すること。【解決手段】いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを、アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、３つ以下のクロマトグラフィーステップを含む。本発明はまた、本発明に従って精製されたＳＭＩＰ（商標）などのタンパク質およびそれを含有する医薬組成物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子量凝集物を含有するタンパク質調製物から小モジュラー免疫薬タンパク質を精製する方法であって、タンパク質調製物を、精製された小モジュラー免疫薬タンパク質が、４％未満の凝集物しか含有しないような操作条件下で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけるステップを含む方法。
【請求項２】
３つ以下のクロマトグラフィーステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
操作条件が、リン酸バッファー中で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リン酸バッファーが、エンドトキシンを含まない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
リン酸バッファーの発熱物質が除去されている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
リン酸バッファーが、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよび／またはリン酸リチウムを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
リン酸バッファーが、１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
リン酸バッファーが、１００ｍＭ〜２．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
リン酸バッファーが、２ｍＭ〜３２ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムおよび１００ｍＭ〜１．６Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
リン酸バッファーが、６．５〜８．５のｐＨを有する、請求項３から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
操作条件が、ＮａＣｌ勾配によってヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
操作条件が、ＮａＣｌ段階溶出法によってヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
操作条件が、リン酸勾配によってヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
リン酸勾配が、直線勾配である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リン酸勾配が、段階勾配である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、セラミックヒドロキシアパタイトＩ型またはＩＩ型樹脂を含有するカラムを使用する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
カラムが、セラミックヒドロキシアパタイトＩ型樹脂を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
樹脂が、直径１μｍ〜１，０００μｍである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
樹脂が、直径１０μｍ〜１００μｍである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの前にアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質調製物を精製するステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
アフィニティークロマトグラフィーが、定常免疫グロブリンドメインと結合するタンパク質吸収剤を使用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アフィニティークロマトグラフィーが、可変免疫グロブリンドメインと結合するタンパク質吸収剤を使用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質吸収剤が、ＶＨ３ドメインと結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質吸収剤が、プロテインＡを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
アフィニティークロマトグラフィーが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ｒプロテインＡ樹脂カラムを使用する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アフィニティークロマトグラフィーのステップが、Ｈｅｐｅｓ、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、アルギニン、Ｔｒｉｓ、塩化マグネシウム、ヒスチジン、尿素、イミダゾール、１つまたは複数の有機溶媒、イオン性および／または非イオン性界面活性剤を含む洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
１つまたは複数の有機溶媒が、エタノール、メタノール、プロピレングリコール、エチレングリコール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アフィニティークロマトグラフィーのステップが、Ｈｅｐｅｓ、リン酸、グリシン、グリシルグリシン、塩化マグネシウム、尿素、プロピレングリコール、エチレングリコール、１つまたは複数の有機酸および／またはアルギニンを含む溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
１つまたは複数の有機酸が、酢酸、クエン酸、ギ酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、マロン酸、フタル酸およびサリチル酸からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
溶出バッファーが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびそれらの組合せからなる群から選択される塩をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
塩が、１ｍＭ〜１Ｍの濃度である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
塩が、１ｍＭ〜５００ｍＭの濃度である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
塩が、１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
添加物を添加して、吸着剤との結合を促進するステップをさらに含む、請求項２０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質調製物を、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
タンパク質調製物を、アフィニティークロマトグラフィーの後であるが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの前に、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製するステップをさらに含む、請求項２０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
添加物を添加して、小モジュラー免疫薬タンパク質および／または不純物と陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の結合を増強するステップをさらに含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
添加物が、非イオン性有機ポリマーを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
非イオン性有機ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
陰イオン交換クロマトグラフィーの前にデプスフィルターステップをさらに含む、請求項３５から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
１つまたは複数の濾過ステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
１つまたは複数の濾過ステップが、ウイルス保持濾過ステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
１つまたは複数の濾過ステップが、限外濾過および／またはダイアフィルトレーションステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
小モジュラー免疫薬タンパク質を夾雑物からさらに分離できるように、添加物を添加して、タンパク質調製物からの１つまたは複数の夾雑物のタンパク質沈殿を誘導するステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
添加物が、非イオン性有機ポリマーを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
非イオン性有機ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
沈殿が、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に誘導され、沈殿した夾雑物を、濾過によってタンパク質調製物から除去するステップをさらに含む、請求項４４から４６に記載の方法。
【請求項４８】
精製された小モジュラー免疫薬タンパク質が、２％未満の凝集物しか含有しない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
精製された小モジュラー免疫薬タンパク質が、１％未満の凝集物しか含有しない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
タンパク質調製物が、１０％を超える高分子量凝集物を含有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
タンパク質調製物が、２０％を超える高分子量凝集物を含有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
タンパク質調製物が、３０％を超える高分子量凝集物を含有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
タンパク質調製物が、６０％を超える高分子量凝集物を含有する、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
タンパク質調製物が、３０％未満の高分子量凝集物しか含有しない、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
タンパク質調製物が、２０％未満の高分子量凝集物しか含有しない、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
タンパク質調製物が、１５％未満の高分子量凝集物しか含有しない、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
タンパク質調製物が、１０％未満の高分子量凝集物しか含有しない、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
タンパク質調製物が、５％未満の高分子量凝集物しか含有しない、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
小モジュラー免疫薬タンパク質が、ＣＤ２０と特異的に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
小モジュラー免疫薬タンパク質が、配列番号１〜５９および６７〜７６のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
タンパク質調製物を、培養細菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、細胞を含まない培地、トランスジェニック動物または植物から調製する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
タンパク質調製物が、細胞培養培地調製物である、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
培養培地調製物が、培養細胞から分泌される小モジュラー免疫薬タンパク質を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
培養細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
培養培地調製物を、大規模バイオリアクターから調製する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
タンパク質調製物が、細胞抽出物を含む、請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
タンパク質調製物を、封入体から調製する、請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
高分子量凝集物を含有するタンパク質調製物から小モジュラー免疫薬タンパク質を精製する方法であって、タンパク質調製物を、精製された小モジュラー免疫薬タンパク質が４％未満の凝集物しか含有しないような操作条件下で、（ａ）アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィー、ならびに（ｂ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけるステップを含む方法。
【請求項６９】
タンパク質調製物を、（ａ１）アフィニティークロマトグラフィー、（ａ２）イオン交換クロマトグラフィーおよび（ｂ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかける、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
タンパク質調製物を、（ａ１）陽イオン交換クロマトグラフィー、（ａ２）陰イオン交換クロマトグラフィーおよび（ｂ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかける、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
３つ以下のクロマトグラフィーステップを含む、請求項６８から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインＡクロマトグラフィーである、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７３】
イオン交換クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７４】
陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂が、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱ５０、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ａ５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＤＥＡＥ−６５０Ｍ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ、Ｃａｐｔｏ（商標）ＤＥＡＥおよびテンタクル陰イオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂が、帯電膜吸収体である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）ＱおよびＣｈｒｏｍａｓｏｒｂ（商標）からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂が、帯電モノリス支持体である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、ＣＩＭ（登録商標）−ＤＩＳＫである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
アフィニティークロマトグラフィーが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ｒプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーであり、イオン交換クロマトグラフィーが、テンタクル陰イオン交換クロマトグラフィーであり、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、Ｉ型セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
テンタクル陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）（商標）Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ（Ｓ）（商標）およびＦｒａｃｔｏｐｒｅｐ（登録商標）ＴＭＡＥ（商標）からなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
再使用のために、１つまたは複数のクロマトグラフィーカラムをストリップおよび／または再生するステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
精製された小モジュラー免疫薬タンパク質が、２％未満の凝集物しか含有しない、請求項６８から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
精製された小モジュラー免疫薬タンパク質が、１％未満の凝集物しか含有しない、請求項６８から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
タンパク質調製物が、２０％を超える高分子量凝集物を含有する、請求項６８から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
タンパク質調製物が、６０％を超える高分子量凝集物を含有する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
タンパク質調製物が、３０％未満の高分子量凝集物しか含有しない、請求項６８から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
小モジュラー免疫薬タンパク質が、ＣＤ２０と特異的に結合する、請求項６８から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
小モジュラー免疫薬タンパク質が、配列番号１〜５９および６７〜７６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法を用いて精製された小モジュラー免疫薬タンパク質。
【請求項９０】
２０％を超える高分子量凝集物を含有するタンパク質調製物からタンパク質を精製する方法であって、タンパク質調製物を、精製されたタンパク質が、４％未満の凝集物しか含有しないような操作条件下で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけるステップを含む方法。
【請求項９１】
タンパク質調製物が、６０％を超える高分子量凝集物を含有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
操作条件が、リン酸バッファー中で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムからタンパク質を溶出することを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
リン酸バッファーが、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよび／またはリン酸リチウムを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
リン酸バッファーが、１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
リン酸バッファーが、１００ｍＭ〜２．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
リン酸バッファーが、２ｍＭ〜３２ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムおよび１００ｍＭ〜１．６Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
リン酸バッファーが、６．５〜８．５のｐＨを有する、請求項９２から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
タンパク質が、小モジュラー免疫薬ポリペプチドを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
小モジュラー免疫薬タンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、小モジュラー免疫薬タンパク質が、４％未満の高分子量凝集物しか含まない医薬組成物。
【請求項１００】
小モジュラー免疫薬タンパク質が、３％未満の高分子量凝集物しか含まない、請求項９９に記載の医薬組成物。
【請求項１０１】
小モジュラー免疫薬タンパク質が、２％未満の高分子量凝集物しか含まない、請求項９９に記載の医薬組成物。
【請求項１０２】
小モジュラー免疫薬タンパク質が、１％未満の高分子量凝集物しか含まない、請求項９９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２００９年３月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／１５９，３４７号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
一般に、タンパク質が、製薬用途で製造される場合には、タンパク質調製物から夾雑物が除去されなければならず、その後、それらを診断的適用、治療的適用、応用細胞生物学および機能研究において使用できる。例えば、培養細胞から収集されたタンパク質調製物は、細胞によって産生されたタンパク質の高分子量（ＨＭＷ）凝集物などの不要な成分を含有することが多い。高分子量凝集物は、投与時に補体活性化またはアナフィラキシーを引き起こすことによって、製品の安全性に悪影響を及ぼし得る。さらに、凝集物は、生成物収率の低下、ピークの広がりおよび活性の喪失を引き起こすことによって製造工程を妨げる場合がある。
【０００３】
小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ（商標））タンパク質は、抗体およびその他の治療用タンパク質と比較して、比較的新しいクラスの医薬用タンパク質に属する。したがって、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質の精製は、この型のタンパク質がよく知られていないために特に困難である。さらに、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、高い凝集傾向を有する。例えば、細胞培養物中のＨＭＷ凝集物のパーセンテージは、５０〜６０％ほど高い場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、中でも、ＨＭＷ凝集物を含有するタンパク質を精製する有効な方法を提供する。本発明は、小モジュラー免疫薬タンパク質を、３つ以下のクロマトグラフィーステップを用いて、高いパーセンテージのＨＭＷ凝集物を含有する（例えば、５０〜６０％を超える）タンパク質調製物から精製できるという発見を包含する。したがって、本発明による方法は、カラムステップの数を低減し、その結果、工程所要時間を大幅に短縮し、生成物収率を改善する。本発明は、小モジュラー免疫薬タンパク質を精製するために特に有用である。本発明の方法はまた、その他のタンパク質、特に、凝集傾向を有するタンパク質を精製するために使用することもできる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本発明は、タンパク質調製物を、精製された小モジュラー免疫薬タンパク質が４％未満（例えば、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．８％、０．６％、０．５％、０．４％、０．２％または０．１％未満）の凝集物しか含有しないような操作条件下で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけるステップを含む、高分子凝集物を含有するタンパク質調製物から小モジュラー免疫薬タンパク質を精製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、３つ以下のクロマトグラフィーステップを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、操作条件は、リン酸バッファー中で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出することを含む。いくつかの実施形態では、リン酸バッファーは、エンドトキシンを含まない。いくつかの実施形態では、リン酸バッファーの発熱物質が除去されている（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）。いくつかの実施形態では、リン酸バッファーは、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよび／またはリン酸リチウムを含む。いくつかの実施形態では、適したリン酸バッファーは、１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、適したリン酸バッファーは、１００ｍＭ〜２．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムをさらに含有する。いくつかの実施形態では、適したリン酸バッファーは、２ｍＭ〜３２ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムおよび１００ｍＭ〜１．６Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含有する。いくつかの実施形態では、適したリン酸バッファーは、６．５〜８．５のｐＨを有する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、操作条件は、ＮａＣｌ勾配によってヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出することを含む。いくつかの実施形態では、操作条件は、ＮａＣｌ段階溶出法によってヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出することを含む。いくつかの実施形態では、操作条件は、リン酸勾配（例えば、直線リン酸勾配）によってヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出することを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイトＩ型またはＩＩ型樹脂を含有するカラムを使用する。いくつかの実施形態では、カラムは、セラミックヒドロキシアパタイトＩ型樹脂を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに適した樹脂は、直径１μｍ〜１，０００μｍである。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに適した樹脂は、直径１０μｍ〜１００μｍである。
【０００９】
いくつかの実施形態では、その方法は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのステップの前にアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質調製物を精製するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーステップは、定常免疫グロブリンドメインと結合するタンパク質吸収剤を使用する。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、可変免疫グロブリンドメインと結合するタンパク質吸収剤を使用する。いくつかの実施形態では、本発明に適したタンパク質吸収剤は、ＶＨ３ドメインまたはＶＨ３と相同のドメイン（例えば、ＶＨ３ファミリーに由来するドメイン）と結合する。いくつかの実施形態では、本発明に適したタンパク質吸収剤は、プロテインＡを含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーステップは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ｒプロテインＡ樹脂カラムを使用する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、添加物（例えば、ＰＥＧおよび／またはその他の非イオン性有機ポリマー）を添加して、タンパク質吸着剤との結合を促進するステップをさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーのステップは、Ｈｅｐｅｓ、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、アルギニン、Ｔｒｉｓ、塩化マグネシウム、ヒスチジン、尿素、イミダゾール、１つまたは複数の有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、プロピレングリコール、エチレングリコール、プロパノール、イソプロパノールおよびブタノール）および／または界面活性剤（例えば、イオン性または非イオン性）を含む洗浄バッファーを用いてアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄することを含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーのステップは、Ｈｅｐｅｓ、リン酸、グリシン、グリシルグリシン、塩化マグネシウム、尿素、プロピレングリコール、エチレングリコール、１つまたは複数の有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、ギ酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、マロン酸、フタル酸およびサリチル酸）および／またはアルギニンを含む溶出バッファーを用いてアフィニティークロマトグラフィーカラムから小モジュラー免疫薬タンパク質を溶出することを含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびそれらの組合せからなる群から選択される塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、塩は、１ｍＭ〜１Ｍの濃度である。特定の実施形態では、塩は、１ｍＭ〜５００ｍＭの濃度である。特定の実施形態では、塩は、１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによってタンパク質調製物を精製するステップをさらに含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、アフィニティークロマトグラフィーの後であるが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップの前に、陰イオン交換クロマトグラフィーによってタンパク質調製物を精製するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、添加物を添加して、小モジュラー免疫薬タンパク質および／または不純物と陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の結合を増強するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、添加された添加物は、タンパク質調製物からの１つまたは複数の夾雑物または不純物の沈殿を誘導する。いくつかの実施形態では、沈殿した夾雑物を、濾過によってタンパク質調製物から除去する。いくつかの実施形態では、適した添加物は、非イオン性有機ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、セルロース、デキストラン、デンプンおよび／またはポリビニルピロリドン）である、または含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、その方法は、アフィニティーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、タンパク質調製物をデプスフィルターに適用するステップをさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、その方法は、１つまたは複数の濾過ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の濾過ステップは、ウイルス保持濾過ステップを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の濾過ステップは、限外濾過および／またはダイアフィルトレーションステップを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、タンパク質調製物は、培養細菌細胞、哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細胞を含まない培地、トランスジェニック動物または植物から調製する。いくつかの実施形態では、タンパク質調製物は、細胞培養培地調製物である。いくつかの実施形態では、培養培地調製物は、培養細胞から分泌された小モジュラー免疫薬タンパク質を含有する。特定の実施形態では、培養細胞は、ＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、培養培地調製物は、大規模バイオリアクターから調製する。いくつかの実施形態では、精製されるべきタンパク質調製物は、細胞抽出物を含有する。いくつかの実施形態では、精製されるべきタンパク質調製物は、封入体から調製する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、タンパク質調製物を、精製された小モジュラー免疫薬タンパク質が、４％未満（例えば、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．８％、０．６％、０．５％、０．４％、０．２％、０．１％未満）の凝集物しか含有しないような操作条件下で、（ａ）アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィー（例えば、１つまたは２つのイオン交換クロマトグラフィーステップ）ならびに（ｂ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけることによって、高分子凝集物を含有するタンパク質調製物から小モジュラー免疫薬タンパク質を精製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質調製物を、（ａ１）アフィニティークロマトグラフィー、（ａ２）イオン交換クロマトグラフィーおよび（ｂ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかける。いくつかの実施形態では、タンパク質調製物を、（ａ１）陽イオン交換クロマトグラフィー、（ａ２）陰イオン交換クロマトグラフィーおよび（ｂ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかける。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱ５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＤＥＡＥ−６５０Ｍ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ、Ｃａｐｔｏ（商標）ＤＥＡＥおよびテンタクル陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）（商標）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ（Ｓ）（商標）またはＦｒａｃｔｏｐｒｅｐ（登録商標）ＴＭＡＥ（商標））からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、帯電膜吸収体（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）および／またはＣｈｒｏｍａｓｏｒｂ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、帯電モノリス支持体（例えば、ＣＩＭ（登録商標）−ＤＩＳＫ）である。特定の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ｒプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーであり、イオン交換クロマトグラフィーは、テンタクル陰イオン交換クロマトグラフィーであり、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、Ｉ型セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、３つ以下のクロマトグラフィーステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１つまたは複数のクロマトグラフィーカラムを、再使用のために、ストリップおよび／または再生するステップをさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明を用いて、５％を超える（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％を超える、またはそれ以上）の高分子量凝集物を含有するタンパク質調製物を精製できる。いくつかの実施形態では、本発明を用いて、７０％未満（例えば、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％未満）の高分子量凝集物を含有するタンパク質調製物を精製できる。いくつかの実施形態では、本発明を用いて、４〜７０％（例えば、４〜６０％、４〜５０％、４〜４０％、４〜３０％、４〜２０％、４〜１５％、４〜１０％）の高分子量凝集物を含有するタンパク質調製物を精製できる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明を用いて、ＣＤ２０と特異的に結合する小モジュラー免疫薬タンパク質を精製する。いくつかの実施形態では、本発明を用いて、配列番号１〜５９および６７〜７６のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む小モジュラー免疫薬タンパク質を精製する。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、２０％を超える（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％を超える、またはそれ以上）の高分子量凝集物を含有するタンパク質調製物からタンパク質を精製するために使用され、タンパク質調製物を、精製されたタンパク質が４％未満（例えば、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．８％、０．６％、０．５％、０．４％、０．２％または０．１％未満）の凝集物しか含有しないような操作条件下で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけるステップを含む。特定の実施形態では、タンパク質調製物は、６０％を超える高分子量凝集物を含有する。
【００１９】
特定の実施形態では、操作条件は、リン酸バッファー中で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムからタンパク質を溶出することを含む。いくつかの実施形態では、リン酸バッファーは、エンドトキシンを含まない。いくつかの実施形態では、リン酸バッファーの発熱物質が除去されている。いくつかの実施形態では、リン酸バッファーは、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよび／またはリン酸リチウムを含む。いくつかの実施形態では、リン酸バッファーは、１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、リン酸バッファーは、１００ｍＭ〜２．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムをさらに含む。特定の実施形態では、リン酸バッファーは、２ｍＭ〜３２ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムおよび１００ｍＭ〜１．６Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、リン酸バッファーは、６．５〜８．５のｐＨを有する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、精製されるべきタンパク質は、小モジュラー免疫薬ポリペプチドを含む。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載される方法を用いて精製された小モジュラー免疫薬タンパク質をさらに提供する。さらに、本発明は、小モジュラー免疫薬タンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供し、小モジュラー免疫薬タンパク質は、４％未満（例えば、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．８％、０．６％、０．５％、０．４％、０．２％または０．１％）の凝集物しか含まない。
【００２２】
本出願では、「または」の使用は、特に断りのない限り、「および／または」を意味する。本出願で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのこの用語の変形は、その他の添加物、成分、整数またはステップを排除することを意図しない。本出願で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、同等なものとして使用される。約（ａｂｏｕｔ）／約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）を伴って、または伴わずに本出願において使用される任意の数字は、関連技術分野の当業者に理解される任意の正常変動を対象にすることを意味する。
【００２３】
本発明のその他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲において明らかである。しかし、詳細な説明、図面および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すものの、限定ではなく単に例示として示すに過ぎないことを理解すべきである。本発明の範囲内の種々の変法および改変は、当業者には明らかとなろう。
【００２４】
図面は、単に例示目的のためのものに過ぎず限定のためではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】抗ＣＤ２０小モジュラー免疫薬タンパク質の例示的構造を表す図である。
【図２】溶液中にあり得るＳＭＩＰ（商標）分子の例示的立体配置を示す図である。
【図３−１】種々のドメイン交換機構が、ＳＭＩＰ（商標）分子の高分子量凝集物、例えば、三量体、四量体またはマルチマーの形成につながり得ることを示す図である。
【図３−２】種々のドメイン交換機構が、ＳＭＩＰ（商標）分子の高分子量凝集物、例えば、三量体、四量体またはマルチマーの形成につながり得ることを示す図である。
【図３−３】種々のドメイン交換機構が、ＳＭＩＰ（商標）分子の高分子量凝集物、例えば、三量体、四量体またはマルチマーの形成につながり得ることを示す図である。
【図４】例示的細胞培養および収集手順を示す模式図を表す図である。
【図５】１２〜１４日の培養期間にかけての、２種の異なるＣＨＯ細胞クローンによって産生されたＴＲＵ−０１５の生産用バイオリアクターの例示的な１日力価測定値（μｇ／ｍＬ）を表す図である。ピーク力価値は、１２日から１４日の生産用バイオリアクター増殖の間に得た。ピーク力価値は、１５００〜３０００μｇ／ｍＬの範囲であった。
【図６】バッチ結合機構を用いるハイスループットスクリーニングの例示的設計を表す図である。
【図７】プロテインＡカラム操作およびハイスループットスクリーニングモデルの例示的設計を表す図である。
【図８】例示的プロテインＡハイスループットスクリーニング結果を表す図である。
【図９】（Ａ）セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーについての、ハイスループットスクリーニングにおいて試験した例示的変数の要約を示す図である。（Ｂ）種々の濃度のリン酸およびＮａＣｌをｃＨＡ精製の間に用いた場合の、ＨＭＷ化合物パーセントを示す例示的結果プロットを示す図である。（Ｃ）約１０のＫｐ（または１のｌｏｇ  Ｋｐ）を示す例示的ＨＭＷ対Ｌｏｇ  Ｋｐプロットを示す図であり、ＨＭＷ化合物のほとんどはサンプルから除去されている。
【図１０】ｃＨＡクロマトグラフィーステップを開発するための、ｃＨＡカラムおよびＮａＣｌ勾配溶出を用いる例示的代替スクリーニングを表す図である。
【図１１】例示的な代表的なｃＨＡクロマトグラムを表す図である。
【図１２】例示的ＴＲＵ−０１５精製工程を表す図である。
【図１３】ＣＥＸによるものとの、ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるＨＭＷ凝集物量の減少の例示的比較を表す図である。
【図１４】ＣＥＸ樹脂のタンパク質産物結合特性を示す例示的結果を表す図である。
【図１５】２５対７５ｍｇ／ｍＬｒのローディングチャレンジを用いたＣＥＸピークを示す例示的結果を表す図である。
【図１６】ＡＥＸカラムを用いたＨＭＷの有効な除去を示す例示的結果を表す図である。集められたプールは８８％純粋であり、「単量体」ＳＭＩＰ（商標）タンパク質の＞９５％収率であった。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、中でも、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに基づいて、ＨＭＷ凝集物およびその他の不純物を含有するタンパク質調製物から、タンパク質、特に、小モジュラー免疫薬タンパク質を精製または回収する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを、アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ウイルス性夾雑物をさらに除去するため、タンパク質を濃縮するため、および／またはバッファー交換のために１つまたは複数の濾過ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、３つ以下のクロマトグラフィーステップ（例えば、２つのクロマトグラフィーステップまたは３つのクロマトグラフィーステップ）しか有さない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、３つ以下の濾過ステップ（例えば、２つの濾過ステップ、３つの濾過ステップ）を有する。
【００２７】
実施例の節に記載のとおり、本発明者らは、タンパク質調製物からのＨＭＷ凝集物およびその他の不純物（例えば、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、ウイルスおよびその他の夾雑物）の効率的な除去を可能にする、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーの適した操作条件を発見した。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ凝集物のパーセンテージを、出発調製物中の２０％（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％またはそれ以上）から、精製されたタンパク質生成物中の４％未満（例えば、３．５％、３．０％、２．５％、２．０％、１．５％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、０．１％未満）に低減できる。いくつかの実施形態では、出発調製物中のＨＭＷ凝集物を、少なくとも約５倍または少なくとも約１０倍または少なくとも約２０倍または少なくとも約３０倍または少なくとも約４０倍または少なくとも約５０倍または少なくとも約６０倍または少なくとも約７０倍または少なくとも約８０倍または少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍低減できる。それに加えて、またはその代わりに、精製されたタンパク質中のその他の混入（例えば、ＨＣＰ）のパーセンテージは、約１０，０００ｐｐｍ以下または約５０００ｐｐｍ以下または約２５００ｐｐｍ以下または約４００ｐｐｍ以下または約３６０ｐｐｍ以下または約３２０ｐｐｍ以下または約２８０ｐｐｍ以下または約２４０ｐｐｍ以下または約２００ｐｐｍ以下または約１６０ｐｐｍ以下または約１４０ｐｐｍ以下または約１２０ｐｐｍ以下または約１００ｐｐｍ以下または約８０ｐｐｍ以下または約６０ｐｐｍ以下または約４０ｐｐｍ以下または約３０ｐｐｍ以下または約２０ｐｐｍ以下または約１０ｐｐｍ以下である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明による方法は、注目するタンパク質の少なくとも５０％の回収（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、少なくとも２０％生成物収率（例えば、少なくとも２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％または５０％）を提供する。
【００２９】
本発明の種々の態様は、以下の節で詳細に記載されている。節の使用は、本発明を制限するものではない。各節は、本発明の任意の態様に適用してよい。本出願では、「または」の使用は、特に断りのない限り、「および／または」を意味する。
【００３０】
定義
本発明がより容易に理解されるように、まず、特定の用語を定義する。以下の用語およびその他の用語のためにさらなる定義は、本明細書を通じて示される。
【００３１】
吸収剤：吸収剤は、クロマトグラフィーを実施するために使用される、固相支持体に固定された少なくとも１種の分子またはそれ自体が固体である少なくとも１種の分子である。
【００３２】
アフィニティークロマトグラフィー：アフィニティークロマトグラフィーは、等電点、疎水性または大きさなどの分子の一般的な特性というよりも、生体分子間の特異的な、可逆性の相互作用、例えば、プロテインＡの、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分と結合する能力を利用して、クロマトグラフィーによる分離を達成するクロマトグラフィーである。実際には、アフィニティークロマトグラフィーは、固相支持体に固定されたプロテインＡなどの吸収剤を使用して、程度の差はあるが吸収剤と堅固に結合する分子をクロマトグラフィーによって分離することを含む。その全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：３５７〜３７９中、Ｏｓｔｒｏｖｅ（１９９０年）参照のこと。
【００３３】
約（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）：本明細書において、注目する１つまたは複数の値に適用される、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」とは、記載された参照値と同様である値を指す。特定の実施形態では、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」とは、特に断りのない限り、または文脈から明らかでない限り、記載された参照値のいずれの方向でも（より大きいまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の範囲内に入る値の範囲を指す（このような数が、あり得る値の１００％を超える場合は除く）。
【００３４】
結合−溶出様式：用語「結合−溶出様式」（「結合様式」ともいわれる）とは、調製物中に含まれる少なくとも１種の生成物が、クロマトグラフィーの樹脂または媒体と結合する生成物調製分離技術を指す。この様式で結合している生成物は、溶出相の間に溶出される。
【００３５】
クロマトグラフィー：クロマトグラフィーは、種々の分子を程度の差はあるが強く吸収または保持する吸収剤を介した混合物の透過による、互いからの混合物中の化学的に異なる分子の分離である。吸収剤に最も弱く吸収される、または保持される分子は、より強く吸収または保持されるものが放出されない条件下で吸収剤から放出される。
【００３６】
定常免疫グロブリンドメイン：定常抗体免疫グロブリンドメインは、ヒトまたは動物起源のＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメインと同一または実質的に同様である免疫グロブリンドメインである。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．  Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、２０９、２１０〜２１８頁（１９８９年）中、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ａ  Ｈａｓｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄｏｎａｌｄ  Ｃａｐｒａ、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ参照のこと。ＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインまたはＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインと実質的に同様である免疫グロブリンドメインはまた、抗体のＦＣ部分と呼ばれる。
【００３７】
夾雑物または不純物：夾雑物または不純物とは、任意の外来の、または好ましくない分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは精製されている注目するタンパク質以外の、精製されている注目するタンパク質のサンプル中に同様に存在するタンパク質などの生体高分子を指す。不純物として、例えば、凝集したタンパク質、高分子量種、低分子量種および断片ならびに脱アミド種などのタンパク質変異体、精製されているタンパク質を分泌する宿主細胞に由来するその他のタンパク質（宿主細胞タンパク質）、先の精製ステップの間にサンプル中に浸出し得るアフィニティークロマトグラフィーに使用される吸収剤の一部であるタンパク質、例えば、プロテインＡ、内毒素、およびウイルスが挙げられる。
【００３８】
フロースルー様式：用語「フロースルー様式」とは、通常、調製物中に含まれる少なくとも１種の生成物が、クロマトグラフィーの樹脂または媒体を通って流れ、一方で少なくとも１種の可能性ある夾雑物または不純物がクロマトグラフィーの樹脂または媒体と結合することが意図される生成物調製分離技術を指す。いくつかの実施形態では、フロースルー様式は、生成物が樹脂と弱く結合できながら、少なくとも１種の可能性ある夾雑物または不純物が、クロマトグラフィーの樹脂または媒体と、より優先的に結合する弱分配性クロマトグラフィー（ＷＰＣ）である。通常、ＷＰＣは、従来のフロースルー様式においてよりも高い分配係数であるが、結合および溶出様式より低い分配係数で操作する。弱い分配では、大きなロードチャレンジおよびロード相後に適用される短い洗浄を用いて、高い回収率が達成され得る。
【００３９】
宿主細胞タンパク質：宿主細胞タンパク質は、宿主細胞の天然に存在するゲノムによってコードされるタンパク質であり、これに、精製されるべきタンパク質をコードするＤＮＡが導入される。宿主細胞タンパク質は、精製されるべきタンパク質の夾雑物であり得、そのレベルは、精製によって低減され得る。宿主細胞タンパク質は、中でも、ゲル電気泳動および染色および／またはＥＬＩＳＡアッセイをはじめとする任意の適した方法によってアッセイできる。
【００４０】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとは、吸収剤としてセラミックヒドロキシアパタイトを用いるクロマトグラフィーである。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：３２９〜３３９頁中の、Ｍａｒｉｎａ  Ｊ．  Ｇｏｒｂｕｎｏｆｆ（１９９０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎｓ参照のこと。
【００４１】
ロード：用語「ロード」とは、清澄化された細胞培養物もしくは発酵コンディショニング培地のいずれかに由来する生成物、またはクロマトグラフィーステップに由来する部分精製された中間体を含有する任意のロード物質を指す。用語「ロード液」とは、本発明の操作条件下で媒体に通すための、ロード物質を含有する液体を指す。
【００４２】
「ロードチャレンジ」（ＬＣ）：用語「ロードチャレンジ」とは、樹脂の単位容積あたりの生成物の質量の単位で測定された、クロマトグラフィーステップのロードサイクルにおいてカラムにロードされた、またはバッチ結合において樹脂に適用された生成物の全質量を指す。
【００４３】
プロテインＡ：プロテインＡは、抗体のＦＣ部分または可変ドメインと結合する、ブドウ球菌の細胞壁中で最初に発見されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、プロテインＡは、ＶＨ３ファミリー由来のドメイン（例えば、ＩｇＧ抗体のＶＨ３ドメイン）と結合する。本発明の目的上、「プロテインＡ」は、ブドウ球菌のプロテインＡと同一であるか、または実質的に同様である任意のタンパク質、例えば、市販のおよび／または組換え型のプロテインＡである。本発明の目的上、実質的類似性を調べる目的のプロテインＡの生物活性は、ＩｇＧ抗体のＦＣ部分または可変ドメイン（例えば、ＶＨ３）と結合する能力である。
【００４４】
プロテインＧ：プロテインＧは、抗体（例えば、ＩｇＧ）のＦＣ部分または可変ドメインと結合する、連鎖球菌の細胞壁において最初に発見されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、プロテインＧは、ＶＨ３ファミリー由来のドメイン（例えば、ＩｇＧ抗体のＶＨ３ドメイン）と結合する。本発明の目的上、「プロテインＧ」は、連鎖球菌のプロテインＧと同一であるか、または実質的に同様である任意のタンパク質、例えば、市販のおよび／または組換え型のプロテインＧである。本発明の目的上、実質的類似性を調べる目的のプロテインＧの生物活性は、ＩｇＧ抗体のＦＣ部分または可変ドメイン（例えば、ＶＨ３）と結合する能力である。
【００４５】
プロテインＬＧ：プロテインＬＧは、プロテインＧ（上記の定義を参照のこと）およびプロテインＬの両方の部分を含む、ＩｇＧ抗体と結合する組換え融合タンパク質である。プロテインＬは、ペプトストレプトコッカスの細胞壁から最初に単離された。プロテインＬＧは、プロテインＬおよびＧ両方に由来するＩｇＧ結合ドメインを含む。その全体が本明細書に組み込まれる、Ｖｏｌａら（１９９４年）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４〜２５：２７〜３６。本発明の目的上、「プロテインＬＧ」は、プロテインＬＧと同一であるか、または実質的に同様である任意のタンパク質、例えば、市販のおよび／または組換え型のプロテインＬＧである。本発明の目的上、実質的類似性を調べる目的のプロテインＬＧの生物活性は、ＩｇＧ抗体と結合する能力である。
【００４６】
精製する：タンパク質を精製することとは、タンパク質のサンプル中に存在し得る、外来の、または好ましくない要素、特に、タンパク質またはＤＮＡなどの生体高分子の量を低減することを意味する。外来のタンパク質の存在は、ゲル電気泳動および染色ならびに／またはＥＬＩＳＡアッセイをはじめとする任意の適当な方法によってアッセイできる。ＤＮＡの存在は、ゲル電気泳動および染色ならびに／またはポリメラーゼ連鎖反応を使用するアッセイをはじめとする任意の適当な方法によってアッセイできる。
【００４７】
可変抗体免疫グロブリンドメイン：可変抗体免疫グロブリンドメインとは、ヒトまたは動物起源のＶＬまたはＶＨドメインと同一であるか、または実質的の同様である、免疫グロブリンドメインである。本発明の目的上、実質的類似性を調べる目的の可変抗体免疫グロブリンドメインの生物活性は、抗原結合である。いくつかの実施形態では、可変抗体免疫グロブリンドメインは、ＶＨ３ドメインである。ＶＨ３ドメインとは、本明細書において、ＶＨ３自体、またはＶＨ３ドメインに対して相同性を有する任意のドメインを指す。
【００４８】
小モジュラー免疫薬タンパク質
本明細書において、小モジュラー免疫薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ（商標））タンパク質とは、以下の融合ドメイン：結合ドメイン、免疫グロブリンヒンジ領域またはそれらに由来するドメインならびに免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域またはそれに由来するドメインおよび免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域またはそれに由来するドメインであり得るエフェクタードメインのうち１種以上を含有するタンパク質を指す。ＳＭＩＰ（商標）タンパク質治療薬は、単一特異性（すなわち、それらは単一の抗原標的を認識し、結合して、生物活性を開始する）であることが好ましい。本発明はまた、多重特異的および／または多価分子、例えば、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質を組み込み、分子のＳＭＩＰ（商標）タンパク質部分のＣ末端に位置するさらなる結合ドメインも有するＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）治療薬に関する。ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）治療薬の結合ドメインは各々、異なる標的と結合することが好ましい。本発明に適した小モジュラー免疫薬のドメインは、ヒト遺伝子配列、任意のその他の天然または人工供給源の産物であるポリペプチド、例えば、遺伝子操作された、および／または突然変異したポリペプチドであるか、それらに由来する。小モジュラー免疫薬はまた、結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質としても知られる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、小モジュラー免疫薬に適したヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＡ、ＩｇＥなどといった免疫グロブリンに由来する。例えば、ヒンジ領域は、０、１または２個のシステイン残基のいずれかを有する変異株ＩｇＧ１ヒンジ領域ポリペプチドであり得る。
【００５０】
小モジュラー免疫薬タンパク質に適した結合ドメインは、同族生体分子、例えば、抗原、受容体（例えば、ＣＤ２０）または２種以上の分子の複合体または集合体または凝集物を特異的に認識し、結合する能力を有する任意のポリペプチドであり得る。
【００５１】
結合ドメインは、注目する抗原またはその他の所望の標的構造と特異的に結合できるという条件で、少なくとも１種の免疫グロブリン可変領域ポリペプチド、例えば、重鎖または軽鎖Ｖ領域のすべてまたは一部または断片を含み得る。その他の実施形態では、結合ドメインは、少なくとも１種の免疫グロブリン軽鎖Ｖ領域のすべてまたは一部および少なくとも１種の免疫グロブリン重鎖Ｖ領域のすべてまたは一部を含む場合があり、Ｖ領域と融合しているリンカーをさらに含む、一本鎖免疫グロブリン由来Ｆｖ生成物を含み得る。
【００５２】
本発明は、種々の小モジュラー免疫薬に適用してよい。例示的小モジュラー免疫薬は、受容体またはその他のタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３４、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体などのＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー、ＬＦＡ−１、Ｍｏｌ、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、増殖因子、例えば、ＶＥＧＦなどの細胞接着分子、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、プロテインＣ、ＥＧＦＲ、ＲＡＧＥ、Ｐ４０、Ｄｋｋ１、ＮＯＴＣＨ１、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−４およびＩＬ−２２などを標的とし得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明を利用して、ＣＤ２０を特異的に認識する小モジュラー免疫薬を精製する。ＣＤ２０と特異的に結合する例示的小モジュラー免疫薬タンパク質が、図１に示されている。図１に示されるように、抗ＣＤ２０  ＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、通常、３つの別個のドメイン：（１）アミノ酸リンカー（例えば、１５−アミノ酸リンカーによって連結されている可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）断片を含有するキメラ（マウス／ヒト）ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、１５アミノ酸リンカー）、（２）改変ヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）ヒンジドメインおよび（３）ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどのＩｇＧエフェクタードメインからなる組換えホモ二量体融合タンパク質である。
【００５４】
通常、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合された共有結合ホモ二量体（ＣＤ）と予測される、２つの明確に結合しているホモ二量体の形、および分子内ジスルフィド結合を有さないホモ二量体の形（解離可能な二量体、ＤＤ）で存在し得る。解離可能な二量体は、通常、十分に活性である。通常、二量体は、約１０６，０００ダルトンという理論上の分子量を有する。ＳＭＩＰ（商標）タンパク質はまた、多価複合体を形成し得る。
【００５５】
一般に、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、糖タンパク質として存在する。例えば、図１に示されるように、抗ＣＤ２０  ＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、オリゴ糖を用いて、各タンパク質鎖のＣＨ２ドメイン中のＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列（例えば、３２７ＮＳＴ）で修飾され得る（図１参照のこと）。ＳＭＩＰ（商標）タンパク質はまた、コア−フコシル化アシアロ−アガラクト−二分岐Ｎ結合型オリゴ糖（Ｇ０Ｆ）、各鎖（Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ）上のＣＯＯＨ末端Ｇｌｙ４７６およびＮＨ２末端ピログルタミン酸を含み得る。２種の微量のグリコフォーム、Ｇ１Ｆ／Ｇ０ＦおよびＧ１Ｆ／Ｇ１Ｆならびにその他の予測される痕跡レベルのＮ結合型グリコフォームも存在し得る。さらに、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質のヒンジ領域には、低レベルのコア１Ｏ−グリカン修飾も観察される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質の等電点（ｐＩまたはＩＥＰ）は、約７．０〜９．０の範囲（例えば、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８）である。
【００５７】
本発明を用いて、本明細書に記載されるような種々の形態（例えば、単量体ポリペプチド、ホモ二量体、解離可能な二量体または多価複合体）のＳＭＩＰ（商標）タンパク質を精製できる。本発明を用いて、種々の修飾ＳＭＩＰ（商標）タンパク質、例えば、ヒト化ＳＭＩＰ（商標）またはキメラＳＭＩＰ（商標）タンパク質を精製できる。本明細書において、用語「ヒト化ＳＭＩＰ（商標）タンパク質」とは、少なくとも１種のヒト化免疫グロブリン領域（例えば、ヒト化免疫グロブリン可変または定常領域）を含むＳＭＩＰ（商標）タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ヒト化ＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来する可変フレームワーク領域（例えば、完全ヒトＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４）を含みながら、標的特異的な１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、２つのＣＤＲまたは３つのＣＤＲ）を維持するヒト化可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、１つまたは複数のヒトまたはヒト化定常領域（例えば、ヒト免疫グロブリンＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）を含む。用語「ヒト免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する」または「実質的にヒト」とは、比較目的で、ヒト免疫グロブリンまたは抗体アミノ配列に対してアラインされた場合に、その領域が、ヒトフレームワークまたは定常領域配列と、少なくとも８０〜９０％、好ましくは、９０〜９５％、より好ましくは、９５〜９９％の同一性（すなわち、局所配列同一性）を共有し、例えば、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖配列置換、逆突然変異などが可能となることを意味する。本明細書において、用語「キメラＳＭＩＰ（商標）タンパク質」とは、その可変領域が、第１の種に由来し、その定常領域が、第２の種に由来するＳＭＩＰ（商標）タンパク質を指す。キメラＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、例えば、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから遺伝子工学によって構築できる。ヒト化およびキメラＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開番号ＷＯ２００８／１５６７１３においてさらに記載されている。
【００５８】
また、本発明を用いて、エフェクター機能を変更する、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの改変されたグリコシル化パターンおよび／または突然変異を含むＳＭＩＰ（商標）タンパク質を精製できる。いくつかの実施形態では、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、受容体結合の親和性に影響を及ぼす、ヒンジ結合領域中の隣接する、または近接する部位に突然変異を含み得る。さらに、本発明を用いて、小モジュラー免疫薬ポリペプチドまたはその一部を含む融合タンパク質を精製できる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明を用いて、配列番号１〜７６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＳＭＩＰ（商標）タンパク質（例示的ＳＭＩＰ（商標）配列の節を参照のこと）またはその変異体を精製できる。いくつかの実施形態では、本発明を用いて、配列番号１〜５９またはその変異体のいずれか１つのアミノ酸配列を有する可変ドメインを含有するＳＭＩＰ（商標）タンパク質を精製できる。いくつかの実施形態では、本発明を用いて、配列番号１〜５９またはその変異体のいずれか１つのアミノ酸配列を有する可変ドメイン、配列番号６０〜６４またはその変異体のいずれか１つのアミノ酸配列を有するヒンジ領域および／または配列番号６５もしくは６６またはその変異体のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常領域を含有するＳＭＩＰ（商標）タンパク質を精製できる。いくつかの実施形態では、本発明を用いて、配列番号６７〜７６またはその変異体のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＳＭＩＰ（商標）タンパク質を精製できる。
【００６０】
本明細書において、親配列の変異体は、それだけには限らないが、親配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、アミノ酸配列を含む。２種のアミノ酸配列の同一性パーセントは、目視検査および数学的計算によって求めることができ、または、より好ましくは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７頁）またはその他の同等のコンピュータプログラムなどのコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって比較を行う。「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメータとして、（１）ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、３５３〜３５８頁（１９７９年）によって記載される、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓの重み付けアミノ酸比較マトリックス（（１９８６年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５頁）またはその他の同等の比較マトリックス、（２）各ギャップに対して３０のペナルティーおよびアミノ酸配列の各ギャップ中の各記号に対して１のさらなるペナルティー、（３）末端ギャップに対するペナルティーなし、および（４）長いギャップに対する最大ペナルティーなしが挙げられる。配列比較の当業者によって使用されるその他のプログラムを使用することもできる。
【００６１】
さらなる小モジュラー免疫薬は、例えば、ＵＳ特許公報第２００３０１３３９３９号、同２００３０１１８５９２号、同２００４００５８４４５号、同２００５０１３６０４９号、同２００５０１７５６１４号、同２００５０１８０９７０号、同２００５０１８６２１６号、同２００５０２０２０１２号、同２００５０２０２０２３号、同２００５０２０２０２８号、同２００５０２０２５３４号、同２００５０２３８６４６号および同２００８０２１３２７３号；国際特許公報ＷＯ０２／０５６９１０、ＷＯ２００５／０３７９８９およびＷＯ２００５／０１７１４８にさらに記載されており、それらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
タンパク質凝集
どんな理論にも拘束されるものではないが、ドメイン交換が、タンパク質凝集機序であり得ると考えられる。ドメイン交換は、区別して構築されたタンパク質のサブセクション（ドメイン）が、別の単量体のものと物理的に交換し、二量体またはより高次のオリゴマーを生成する場合に生じる。ドメイン交換したタンパク質では、各ドメインは、交換していない単量体におけるその構造と同等の、天然様の全体的な構造を維持する。複数のドメインを含有するフォールディングされたタンパク質が、低ｐＨ、高温または剪断力によってストレスを受けると、部分的にフォールディングされた、または「開いた」コンホメーション（解離しているがフォールディングしているドメインを特徴とする）が誘導され得る。いくつかの「開いた」分子は、フォールディングしているドメインの簡単な再結合によってその天然の構造に再フォールディングする。いくつかの場合には（通常、高いタンパク質濃度に有利に働く）、ドメイン再結合が、２つの隣接する分子間で生じ、その結果、ドメイン交換された二量体が生じる。このような分子間交換が、伝播し、大きな凝集物につながり得る。通常、ドメイン交換しているタンパク質は、天然様ドメインフォールディングおよびドメイン間接触を有する、非共有結合で（しかし安定に）結合している分子である。このような場合には、マルチマータンパク質は、普通は、分子間に存在する、極めて同様のドメイン間境界によってまとまる。
【００６３】
ＳＭＩＰ（商標）タンパク質は、精製工程の前には、相当量（例えば、２０〜６０％）のＨＭＷタンパク質（凝集物）を含有する。過剰のＨＭＷ含量は、ＳＭＩＰ（商標）の分子構造によるものであり得る。図１に示されるように、通常のＳＭＩＰ（商標）二量体分子は、ヒトＩｇＧｌ  Ｆｃドメインと融合している、フレキシブルリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号７７））によって接続されているＶＨおよびＶＬドメインを含む２つの同一の一本鎖−Ｆｖ領域を含有する（図１）。どんな理論にも拘束されるものではないが、ＳＭＩＰ（商標）分子は、各サブユニット中のフレキシブルリンカーのために、アンフォールディング（Ｆｖの開いたコンホメーション）およびその後のドメイン交換、結果として生じるタンパク質凝集に対してより感受性が高いものであり得る。
【００６４】
低温電子顕微鏡を使用する研究によれば、ＳＭＩＰ（商標）分子は、溶液中で、例えば、緻密型、混合型、伸展型、またはダイアボディー様の立体配置で存在し得る（図２）。どんな理論にも拘束されるものではないが、伸展した、または開いた鎖を有するＳＭＩＰ（商標）分子の中には、フォールディングしているドメインの簡単な再結合によって、その天然構造へ再フォールディングしようとし得るものもあると考えられる。図３Ａに示されるように、ドメイン再結合が、２つの隣接するＳＭＩＰ（商標）分子間で生じ、その結果、ドメイン交換した二量体が生じ得る。このような分子間交換が伝播し、大きな凝集物、例えば、三量体、四量体またはマルチマーにつながり得る（図３Ｂおよび３Ｃ参照のこと）。
【００６５】
タンパク質調製物
本明細書に記載される方法とともに使用されるタンパク質調製物は、任意のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質発現系から得ることができる。本発明に適したタンパク質調製物の例示的供給源として、それだけには限らないが、注目するタンパク質を発現する組換え細胞株を培養することから、あるいは、例えば、生成物産生細胞、細菌、真菌細胞、昆虫細胞、トランスジェニック植物もしくは植物細胞、トランスジェニック動物もしくは動物細胞の細胞抽出物または動物の血清、腹水、ハイブリドーマもしくは骨髄腫上清から得られるコンディショニング培養培地が挙げられる。適した細菌細胞として、それだけには限らないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。適した大腸菌株の例として、以下が挙げられる：ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９および外来ＤＮＡを切断できない任意の大腸菌株。使用してよい適した真菌宿主細胞として、それだけには限らないが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞が挙げられる。適した昆虫細胞として、それだけには限らないが、Ｓ２  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞、Ｄ．Ｍｅｌ−２細胞、ＳＦ９、ＳＦ２１、Ｈｉｇｈ−５（商標）、Ｍｉｍｉｃ（商標）−ＳＦ９、ＭＧ１およびＫＣ１細胞が挙げられる。適した例示的組換え細胞株として、それだけには限らないが、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株、ヒト網膜芽細胞（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｓ）（ＰＥＲ．Ｃ６）、サル腎臓細胞、ヒト胚性腎株（２９３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳房腫瘍細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【００６６】
注目するタンパク質は、当技術分野で公知の種々のベクター（例えば、ウイルスベクター）を使用して発現させることができ、細胞は、当技術分野で公知の種々の条件下（例えば、フェドバッチ）で培養することができる。タンパク質を製造するために細胞を遺伝子操作する種々の方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ａｕｓａｂｅｌら編（１９９０年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照のこと。
【００６７】
ＳＭＩＰ（商標）タンパク質を発現する細胞は、当技術分野で公知の種々の細胞培養培地で培養してよい。例示的細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＨａｍのＦ−１０、ＨａｍのＦ−１２、Ｆ−１２Ｋ、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ａｍｅｓ’、ＢＧＪｂ、Ｃｌｉｃｋ’ｓ、ＣＭＲＬ−１０６６、Ｆｉｓｃｈｅｒｓ、ＧＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｌ−１５、ＭｃＣｏｙの５Ａ改変、ＮＣＴＣ、ＳｗｉｋのＳ−７７、Ｗａｙｍｏｕｔｈ、ＷｉｌｌｉａｍのＭｅｄｉｕｍ  Ｅをベースとするものであり得る。適した細胞培養培地は、血清を含まないものであり得る。いくつかの実施形態では、適した細胞培養培地は、血清／培養培地添加剤、例えば、それだけには限らないが、ウシ胎児血清、新生仔ウシ血清、仔ウシ血清および成体ウシ血清、ニワトリ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヒト血清、血清代替品またはウシ胚性液を含み得る。適した細胞培養培地は、栄養補助剤および／または抗生物質、例えば、それだけには限らないが、Ｌ−グルタミン溶液、Ｌ−アルバニ（Ａｌｂａｎｙ）−Ｌ−グルタミン溶液、非必須アミノ酸溶液、ペニシリン、ストレプトマイシンをさらに含み得る。
【００６８】
本発明を利用して、粗タンパク質調製物を精製できる。例えば、本発明を使用して、培養細胞から分泌されたタンパク質を含有するコンディショニング培養培地からタンパク質を直接精製できる。コンディショニング培養培地は、小規模培養物（例えば、振盪フラスコ、ウェーブバッグ）から、または播種用バイオリアクターまたは生産用バイオリアクター（例えば、２５０Ｌ、６００Ｌ、２５００Ｌまたは６０００Ｌバイオリアクター）から得ることができる。いくつかの実施形態では、本発明を利用して、タンパク質含有細胞から調製した粗細胞溶解物から、細胞内に発現されたタンパク質を精製できる。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、注目するタンパク質を含有する血清、乳またはその他の液体から、タンパク質を精製できる。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、クロマトグラフィーカラムからの溶出液もしくはフロースルーなどの部分精製した調製物または貯蔵工程もしくは製剤工程から得られる中間タンパク質調製物から、タンパク質を精製できる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明を使用して、封入体（例えば、細菌細胞、ウイルス細胞、植物細胞または任意のその他の型の封入体）中に発現されているタンパク質を精製できる。封入体中に発現されるタンパク質は、凝集物を形成し、これが精製にとって難題をもたらす。したがって、本発明は、封入体中に発現されるタンパク質を精製することにとって特に有用であり得る。封入体から得られるタンパク質の精製には、通常、まず、細菌またはその他の型の細胞から封入体を抽出すること、続いて、精製された封入体を可溶化することが必要である。種々の封入体抽出法および可溶化法が、当技術分野で周知であり、本発明において使用できる。例えば、中でも、強力な変性剤（例えば、尿素および塩酸グアニジン）、ｐＨおよび／または温度の変更、物理的破壊、例えば、音波処理など）を使用して、封入体を抽出および／または可溶化できる。封入体抽出および／または可溶化工程は、ミスフォールディングされたタンパク質につながり得る。いくつかの実施形態では、封入体抽出物を、本発明のクロマトグラフィーカラムに直接ロードしてよい。いくつかの実施形態では、封入体から抽出されたタンパク質を、まず再フォールディング工程に、その後、本明細書に記載されるクロマトグラフィーステップにかける。いくつかの実施形態では、再フォールディング工程は、フォールディングバッファーへのタンパク質の透析または希釈を含み得る。種々のフォールディングバッファーは、当技術分野で周知であり、本発明において使用してよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明を使用して、種々の不純物、例えば、それだけには限らないが、凝集したタンパク質、例えば、高分子量種、低分子量種および断片ならびに脱アミド種、精製されるべきタンパク質を分泌する宿主細胞に由来するその他のタンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、細胞培養培地に由来する成分、先の精製ステップの間にサンプル中に浸出するアフィニティークロマトグラフィーに使用される吸収剤の一部である分子、例えば、プロテインＡおよびプロテインＧ、エンドトキシン、核酸、ウイルスまたは前記のもののいずれかの断片などの望ましくないタンパク質変異体を含有する調製物からタンパク質を精製できる。
【００７１】
本発明は、ＨＭＷ凝集物を除去するために特に有用である。いくつかの実施形態では、出発タンパク質調製物は、少なくとも４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のＨＭＷ凝集物を含み得る。いくつかの実施形態では、出発タンパク質調製物は、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満のＨＭＷ凝集物を含み得る。いくつかの実施形態では、出発調製物は、上記のパーセンテージの組合せ（例えば、約４〜９５％、５〜７０％、１０〜６０％、４〜３０％、４〜２５％、４〜２０％、４〜１５％、４〜１０％および上記で同定されたパーセンテージの任意の組合せ）の範囲でＨＭＷ凝集物を含み得る。本明細書において、用語「高分子量（ＨＭＷ）凝集物」とは、少なくとも２つのタンパク質単量体の結合を指す。本発明の目的上、単量体とは、注目するタンパク質の任意の生物学的に活性な形態の単一の単位を指す。例えば、小モジュラー免疫薬タンパク質の単量体は、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質の単量体ポリペプチドまたはホモ二量体もしくは解離可能な二量体もしくは多価複合体の単位であり得る。結合は、共有結合、非共有結合、ジスルフィド、非還元性架橋またはその他の機序によるものであり得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、適当なタンパク質調製物を、収集処理によって得ることができる。実施例において論じられるように、コンディショニング培地は、生産用バイオリアクターから遠心分離（例えば、ディスクスタック遠心分離（ＤＳＣ）による）によって収集することができる。遠心分離ステップは、細胞および細胞片を分泌タンパク質（例えば、ＳＭＩＰ（商標））を含有するコンディショニング培地から分離できる。いくつかの実施形態では、ＤＳＣ後、内容物をパッド濾過装置に適用し、次いで、濾液容器またはバッグ中に濾過してもよい。いくつかの実施形態では、Ｈｅｐｅｓ／ＥＤＴＡバッファー溶液を、濾過された濃縮プールに加え、ＤＳＣおよびアフィニティークロマトグラフィーステップの間の工程間保持期間の間の酸性種の生成を低減することができる。さらに、ＥＤＴＡまたはイミダゾールなどのプロテアーゼ阻害剤を加えて、メタロプロテアーゼ活性、特定のセリンプロテアーゼまたはその他のプロテアーゼ活性を阻害してもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質調製物に、約０．００１μＭ〜約１００ｍＭの量の適したプロテアーゼ阻害薬を加えてもよい。プロテアーゼ阻害薬は、タンパク質調製物に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの前および／またはその間に加えてもよい。プロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ）を加えることはまた、プロテインＡ浸出を低減し得る。温度およびｐＨなどのその他の条件を調整してプロテインＡ浸出を低減してもよい。プロテインＡ浸出を低減するための方法および条件は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００５００３８２３１号に詳細に記載されている。
【００７３】
精製方法
本発明の精製方法は、１以上のクロマトグラフィーステップ（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の精製法は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明の精製法は、アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーと組み合わせたヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、膜濾過ステップ（例えば、限外濾過、ダイアフィルトレーションおよび／または最終濾過）をさらに含む。例示的精製工程は、実施例の節に詳細に記載されている。
【００７４】
アフィニティークロマトグラフィー
アフィニティークロマトグラフィーステップの主な目的として、出発調製物（例えば、中でも、細胞を含まないコンディショニング培地、細胞溶解物、封入体抽出物）からの生成物捕獲および工程由来不純物（例えば、宿主細胞ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質、培地成分および外来物質）からの注目するタンパク質の分離が挙げられる。
【００７５】
したがって、本発明に適したアフィニティークロマトグラフィーは、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質と結合できる吸収剤を使用することを含む。例えば、適した吸収剤は、定常抗体免疫グロブリンドメインと結合するタンパク質であり得る。適した吸収剤は、プロテインＧ、プロテインＬＧまたはプロテインＡであり得る。いくつかの実施形態では、適した吸収剤は、可変抗体免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨ３ドメインまたはＶＨ３ドメインと相同なドメイン）と結合するタンパク質である。吸収剤は、任意の適した固相支持体、例えば、アガロース、セファロース、シリカ、コロジオン炭、砂および任意のその他の適した材料に添加することができる。このような物質は、当技術分野で周知である。任意の適した方法を使用して、吸収剤を固相支持体に添加することができる。タンパク質を、適した固相支持体に添加するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２：３５７〜３７１頁中、Ｏｓｔｒｏｖｅ（１９９０年）参照のこと。
【００７６】
いくつかの実施形態では、適したアフィニティークロマトグラフィーステップは、プロテインＡクロマトグラフィーカラムまたはプロテインＧクロマトグラフィーカラムを使用し得る。プロテインＡクロマトグラフィーカラムは、例えば、ＰＲＯＳＥＰ−Ａ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｕ．Ｋ．）、プロテインＡセファロースＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）６５０ＭプロテインＡ（ＴｏｓｏＨａｓｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）であり得る。
【００７７】
タンパク質調製物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する前に、ｐＨ、イオン強度および温度などのパラメータを調整すること、いくつかの例では、種々の種類の物質の添加が望ましい場合がある。したがって、溶液（例えば、ｐＨ、イオン強度などを調整するための、または界面活性剤の導入のためのバッファー）で洗浄することによって、アフィニティークロマトグラフィーカラムの平衡化を実施し、タンパク質生成物の結合および精製に適した特徴をもたらすことは任意選択のステップである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、プロテインＡカラムは、塩、例えば、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭリン酸ナトリウム、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶液を使用して平衡化され得る。平衡バッファーのｐＨは、約６．０〜約８．０の範囲であり得る。一実施形態では、平衡バッファーのｐＨは、約７．５である。平衡バッファーはまた、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含有し得る。別の実施形態では、バッファーは、約２０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含有し得る。
【００７９】
タンパク質調製物がロードされた後、洗浄溶液を使用して結合しているカラムを洗浄してもよい。適した洗浄溶液は、塩（例えば、Ｈｅｐｅｓ、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム）、アルギニン、ヒスチジン、Ｔｒｉｓおよび／またはその他の成分を含有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に適した洗浄溶液は、アルギニンまたはアルギニン誘導体を含有し得る。適したアルギニン誘導体は、それだけには限らないが、アセチルアルギニン、アグマチン、アルギン酸、Ｎ−α−ブチロイル−Ｌ−アルギニンまたはＮ−α−ピバロイルアルギニンであり得る。洗浄溶液中のアルギニンまたはアルギニン誘導体の適した濃度は、約０．１Ｍから約２．０Ｍの間（例えば、０．１Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍまたは２．０Ｍ）または約０．５Ｍから約１．０Ｍの間（例えば、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍまたは１．０Ｍ）である。アフィニティークロマトグラフィーにおけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の使用は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２００８／００６４８６０号に記載されている。いくつかの実施形態では、本発明に適した洗浄溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含有し得る。いくつかの実施形態では、適した洗浄溶液は、カオトロピック試薬（例えば、尿素、ナトリウムチオシネート（ｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）および／または塩酸グアニジン）を含有し得る。いくつかの実施形態では、適した洗浄溶液は、疎水性モディファイヤー（例えば、エタノール、メタノール、プロピレングリコール、エチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、プロパノール、ブタノールおよびイソプロパノールをはじめとする有機溶媒）を含有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に適した洗浄溶液は、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤および／またはイオン性界面活性剤）を含有し得る。
【００８０】
洗浄溶液のｐＨは、通常、約４．５から約８．０の間、例えば、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０である。いくつかの場合では、洗浄溶液のｐＨは、５．０より高く、約８．０未満、例えば、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０である。洗浄溶液は、２０ｍＭから５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（例えば、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭまたは５０ｍＭ）を含有し得る。
【００８１】
生成物は、溶出バッファーによって、洗浄されたカラム、例えば、プロテインＡカラムから溶出され得る。通常、適した溶出バッファーは、Ｈｅｐｅｓ、リン酸、グリシン、グリシルグリシン、１つまたは複数の有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、ギ酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、マロン酸、フタル酸、サリチル酸）、および／またはアルギニンを含有し得る。適した溶出バッファーは、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、カルシウム塩、および／またはマグネシウム塩）をさらに含有し得る。適した塩濃度は、０ｍＭ〜１Ｍの範囲（例えば、０ｍＭ〜５００ｍＭ、０ｍＭ〜１００ｍＭ、０ｍＭ〜５０ｍＭ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、適した溶出バッファーは、約１５ｍＭ〜約１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する。いくつかの実施形態では、溶出バッファー中のＮａＣｌ濃度は、４レベル（例えば、０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭおよび５０ｍＭ）であり得る。その他の実施形態では、溶出バッファーは、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭアルギニンまたはアルギニン誘導体を含有し得る。さらなる実施形態では、溶出バッファーは、２０ｍＭ〜２００ｍＭのグリシンを含有し得る。溶出バッファーはまた、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭのＨＥＰＥＳを含有し得る。溶出バッファーはまた、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭの酢酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、クエン酸（例えば、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭのクエン酸）を含有し得る。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、グリシルグリシン（例えば、約１０〜５０ｍＭ、約５０〜１００ｍＭまたは約１００〜２００ｍＭ）を含有し得る。いくつかの実施形態では、適した溶出バッファーは、カオトロピック試薬（例えば、尿素、ナトリウムチオシネート（ｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）および／または塩酸グアニジン）を含有し得る。いくつかの実施形態では、適した溶出バッファーは、アルキルグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ヘキサエチレングリコール）を含有し得る。溶出バッファーのｐＨは、約２．５〜約４．０の範囲であり得る。一実施形態では、溶出バッファーのｐＨは、約３．０である。
【００８２】
アフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出物は、中和バッファーによって中和してもよい。適した中和バッファーは、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓおよび／またはイミダゾールを含有し得る。
【００８３】
溶出後、アフィニティークロマトグラフィーカラムは、清浄化、すなわち、タンパク質の溶出後にストリップおよび／または再生してもよい。この手順は、通常、固相の表面上の不純物の蓄積を最小化し、かつ／または微生物での生成物の汚染を避けるためにマトリックスを安定化するよう定期的に実施する。ストリップおよび／または再生されたカラムは、繰り返し使用してよい。
【００８４】
バッファー成分は、当業者の知識によって調整できる。サンプルバッファー組成範囲は、以下の実施例に提供されている。バッファーまたはステップのすべてが必ずしも必要ではなく、単に例示のために提供される。実施例に記載されるハイスループットスクリーニングを用いて、プロテインＡカラムクロマトグラフィーのためのバッファー条件を効率的に最適化してもよい。
【００８５】
イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーステップの主な目的として、工程由来不純物（例えば、浸出したプロテインＡ、宿主細胞ＤＮＡおよび／またはタンパク質、外来物質）ならびにＨＭＷ凝集物などの生成物関連不純物の除去が挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、本発明のアフィニティークロマトグラフィーと併用する。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーの代わりに、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換および／または陰イオン交換クロマトグラフィー）を使用してもよい。
【００８７】
種々の陰イオン性または陽イオン性置換基をマトリックスと結合し、クロマトグラフィーのための陰イオン性または陽イオン性支持体を形成してもよい。陰イオン交換置換基として、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチルアクリルアミド（ＴＭＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）および第四級アミン（Ｑ）基が挙げられる。陽イオン交換置換基として、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）が挙げられる。ポリエチレンイミン官能基を有するイオン交換樹脂、例えば、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱ５０は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能である。固定された組換えプロテインＡ官能基を有する交換樹脂、例えば、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ａ５０は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能である。セルロースイオン交換樹脂、例えば、ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２およびＣＭ−５２は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．  Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．から入手可能である。Ｓｅｐｈａｄｅｘベースのイオン交換体および架橋イオン交換体も知られている。例えば、ＣＡＰＴＯ  Ｑ、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−およびＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−およびＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（例えば、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦおよびＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ）およびＳｅｐｈａｒｏｓｅはすべて、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．  Ｆｕｒｔｈｅｒから入手可能であり、ＤＥＡＥおよびＣＭ誘導体化エチレングリコール−メタクリレート共重合体の両方、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ−６５０ＳまたはＭ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＧＩＧＡＣＡＰ  Ｑ−６５０およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＧＩＧＡＣＡＰ  ＣＭ−６５０は、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから入手可能である。また、本発明に従って、イオン交換モノリスクロマトグラフィー支持体、例えば、ＣＩＭ（登録商標）−ＤＩＳＫを使用してもよく、Ｂｉａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｕｓｔｒｉａから入手可能である。イオン交換膜吸着体、例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）ＱおよびＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．、Ｆｒａｎｃｅ）およびＣｈｒｏｍａｓｏｒｂ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）も本発明に従って使用してよい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、陰イオン交換カラムを使用する。イオン交換カラムは、まず、高塩バッファー、次いで、低塩バッファーを用いて平衡化し、その後、タンパク質と接触させる。通常、ＳＭＩＰ（商標）は、カラムと弱くしか結合せず、これによって、生成物の大部分が流れ、一方で、負の電荷を有する不純物、例えば、宿主細胞ＤＮＡおよびＨＣＰは強力に結合し、保持されることが可能となる。次いで、カラムを平衡バッファーで洗浄し、樹脂に弱く結合されたさらなる生成物を収集する。生成物をカラムから除去した後で、高塩バッファーを使用して不純物をストリップすることができる。樹脂は再生、衛生化し、次いで、エタノール溶液中に保存できる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーに使用される樹脂の不純物容量および寿命を増大するために、イオン交換クロマトグラフィーの前に吸着性デプスフィルターを使用することが望ましい。例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ（Ｍ）樹脂は、合成メタクリレートポリマー塩基を有する強力な陰イオン交換体である。絡み合ったポリマー集塊物から形成される孔は、約８００オングストロームの大きさを有する。ポリマー中のエーテル結合のために、表面は強い親水性である。長い、直鎖のポリマー鎖が、機能的リガンドを保有する。これらのポリマー鎖は、テンタクルとして知られている。すべてのテンタクルは、メタクリレート主鎖のヒドロキシル基に共有結合によって結合されている。さらなるテンタクル樹脂、例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｓ）およびＦｒａｃｔｏｐｒｅｐ（登録商標）ＴＭＡＥも、本発明に従って使用してよい。吸着性デプスプレフィルターの使用によって、ＴＭＡＥカラムをタンパク質ロード中の不純物（例えば、ＰｒｏＡピークプール）から保護してもよい。これらの不純物が、ＴＭＡＥカラムの結合部位を使い果たし、またはブロックし、不純物に対する樹脂能を低下させる可能性がある。これらの不純物は、例えば、吸着性デプスフィルターを通すプレ濾過またはタンパク質の沈殿によって低減できる。
【００９０】
溶出後、イオン交換クロマトグラフィーカラムは、清浄化してもよく、すなわち、タンパク質の溶出後、ストリップおよび／または再生してもよい。この手順は、通常、固相の表面上の不純物の蓄積を最小化し、かつ／または微生物での生成物の汚染の可能性を低減するために定期的に実施する。いくつかの実施形態では、イオン交換カラムは、１０ｍＭ〜２Ｍ  ＮａＯＨの濃度を用いるＮａＯＨ溶液での処理によって再生する。ストリップかつ／または再生されたカラムは、繰り返し使用してよい。
【００９１】
上記のように、いくつかの実施形態では、デプス濾過を使用して、タンパク質調製物中の不純物を低減してもよい。いくつかの実施形態では、デプス濾過媒体は、セルロースファイバー、珪藻土および陽イオン性樹脂結合剤からなる高度に多孔性のフィルターである。デプスフィルターは、セルロースファイバーを通す篩い分けによって、珪藻土への疎水性吸着によって、および陽イオン結合剤へのイオン性吸着によって不純物を除去できる。デプスフィルターは、例えば、０．５ｃｍ、１ｃｍ、１．５ｃｍ、２．０ｃｍの厚さであり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、タンパク質調製物に１つまたは複数の添加物を加え、沈殿を誘導し、かつ／またはイオン交換カラムへのプロテイン吸着を増強することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質沈殿は、不純物の量を低減するための添加物によって誘導できる。種々のタンパク質沈殿法が、当技術分野で公知であり、本発明において使用できる。例えば、タンパク質は、塩析（例えば、中性塩を使用する）によって沈殿させることができる。いくつかの実施形態では、タンパク質を有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール）の添加によって沈殿させることができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、非イオン性有機ポリマーを使用して、表面とのタンパク質結合および／またはタンパク質沈殿を促進することができる。種々の非イオン性有機ポリマーは、市販されており、本発明において使用してよい。例として、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、セルロース、デキストラン、デンプンおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。いくつかの実施形態では、添加物としてＰＥＧを使用する。本発明において、種々の分子量を有するＰＥＧを使用してよい。適したＰＥＧは、例えば、約１００〜約２０，０００ダルトンの平均ポリマー分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、適したＰＥＧは、２００〜１２，０００、４００〜２０，０００、４００〜１０００、２００〜１０００、４００〜２０００、１０００〜５０００、８００〜８，０００、１０００〜１０，０００、２，０００〜１２，０００ダルトンの間の平均重量を有し得る。いくつかの実施形態では、例示的ＰＥＧは、例えば、２００、４００、８００、１０００、２，０００、４，０００、６，０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１４，０００、１６，０００、１８，０００、２０，０００ダルトンなどの平均分子量を有するＰＥＧを含む。ＰＥＧは、種々の濃度で添加できる。低分子量ＰＥＧには、高分子量ＰＥＧと同様の効果を達成するために、通常、高濃度が必要となる。例示的な適したＰＥＧ濃度は、０〜２５％（例えば、０〜６％、０〜９％、０〜１２％、０〜１５％、０〜１８％、０〜２０％、３〜９％、３〜１５％、６〜１２％、６〜２０％または６〜２５％の範囲であり得る）。ＰＥＧまたはその他の有機ポリマーは、直鎖ポリマーであっても、分岐ポリマーであってもよい。
【００９４】
ＰＥＧの結合または沈殿効果は、通常、タンパク質の分子量に応じて変わると考えられる。通常、ＰＥＧ効果は、大きなタンパク質に対してより大きい。例えば、通常、大きなタンパク質（例えば、ＨＭＷ凝集物）ならびにウイルスの結合を増強するためには、単量体タンパク質またはＬＭＷ不純物の結合の増強の同量の結果をもたらすために必要とされるＰＥＧの濃度と比較して、低濃度の所与の分子量のＰＥＧが使用される。したがって、凝集物、複合体およびその他の大分子夾雑物の保持は、通常、それらが由来する凝集していない形態のタンパク質よりも大きな程度に増強される。したがって、ＰＥＧまたはその他の非イオン性ポリマー改変は、弱分配性クロマトグラフィーによる、不純物、特に、弱結合性ＨＭＷ凝集物の除去の増強にとって特に有用である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、陰イオン交換クロマトグラフィーの前であるが、アフィニティークロマトグラフィーステップの後に添加してもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、タンパク質沈殿のための非イオン性有機ポリマーの使用は、タンパク質変性を低減または排除するのに、ならびに界面活性剤およびその他の不純物を除去するのに役立ち得る。いくつかの実施形態では、添加物（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、生成物を濃縮することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、沈殿物は、遠心分離、濾過または当技術分野で公知のその他の分離法によって分離できる。いくつかの実施形態では、沈殿は、ＨＭＷ凝集物などの夾雑物を含有する。いくつかの実施形態では、夾雑物含有沈殿を除去すること（例えば、濾過によって）が望ましい。いくつかの実施形態では、ＳＭＩＰ（商標）は沈殿中に存在する。いくつかの実施形態では、ＳＭＩＰ（商標）含有沈殿を再懸濁バッファーに溶解することが望ましい。いくつかの実施形態では、再懸濁バッファーは、イオン交換カラムへの直接ローディングに適したｐＨおよび／または伝導率を有する。
【００９７】
実施例に記載されるハイスループットスクリーニングを用いて、イオン交換クロマトグラフィーのためのバッファー条件を効率的に最適化してもよい。
【００９８】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
セラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）ステップの主な目的は、高分子量（ＨＭＷ）凝集物、浸出したプロテインＡ、沈殿または吸収剤への結合を促進するために使用される添加物（例えば、ポリエチレングリコール）および宿主細胞由来不純物、例えば、ＤＮＡおよびＨＣＰの除去である。ほぼ中性のｐＨおよび低イオン強度のリン酸で帯電しているｃＨＡ樹脂を使用して、単量体タンパク質生成物（例えば、ＳＭＩＰ（商標））およびＨＭＷ凝集物の両方を結合することができる。ＨＭＷ凝集物は、単量体よりもｃＨＡ樹脂とより堅固に結合するので、弱酸性〜弱塩基性ｐＨの適したイオン強度を有する溶出バッファーを使用して単量体を選択的に溶出することができる。ＨＭＷ凝集物は、中性ｐＨのさらに高イオン強度および高リン酸濃度のバッファーを使用して、樹脂から、続いて、洗浄除去することができる。実施例に記載のとおり、本発明者らは、タンパク質調製物からＨＭＷ凝集物を効率的に除去するｃＨＡ操作条件を開発した。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ凝集物のパーセンテージを、ロード物質中、５％を超える（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％）から精製タンパク質生成物中、４％未満（例えば、３．５％、３．０％、２．５％、２．０％、１．５％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、０．１％未満）に低減できる。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ凝集物は、ｃＨＡクロマトグラフィー後に少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍低減され得る。
【００９９】
１．ヒドロキシアパタイト樹脂
種々のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂は市販されており、本発明に使用してよい。例えば、ヒドロキシアパタイトは、結晶形態であり得る。いくつかの実施形態では、本発明に適したヒドロキシアパタイトは、凝集して粒子を形成し、高温で安定な多孔性セラミック塊に焼結するものであり得る。ヒドロキシアパタイトの粒径は広く変わり得るが、通常の粒径は、直径１μｍ〜１，０００μｍの範囲であり、１０μｍ〜１００μｍ（例えば、２０μｍ、４０μｍ、６０μｍまたは８０μｍ）であり得る。
【０１００】
ｃＨＡカラムの調製において、いくつかのクロマトグラフィー樹脂を使用してもよく、Ｉ型およびＩＩ型ヒドロキシアパタイトが最も広く用いられる。Ｉ型は、高いタンパク質結合能および産生タンパク質に対してより良好な能力を有する。Ｉ型は、小モジュラー免疫薬タンパク質の精製に特に適している。しかし、ＩＩ型は、低いタンパク質結合能しか有さないものの、核酸と特定のタンパク質の良好な解離を有する。ＩＩ型物質はまた、アルブミンに対して極めて低い親和性しか有さず、多数の種およびクラスの免疫グロブリンの精製に特に適している。特定のヒドロキシアパタイトの型の選択は、当業者によって決定できる。
【０１０１】
本発明は、容器に入っていない、カラムまたは連続アニュアルクロマトグラフ（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｎｎｕａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）中に詰められたヒドロキシアパタイト樹脂とともに使用してもよい。本発明の一実施形態では、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂を、カラムに詰める。カラム寸法の選択は、当業者によって決定できる。いくつかの実施形態では、小規模精製には、少なくとも０．５ｃｍのカラム直径および約２０ｃｍの床高さを使用してよい。いくつかの実施形態では、約３５ｃｍ〜約６０ｃｍのカラム直径を使用してよい。いくつかの実施形態では、６０ｃｍ〜８５ｃｍのカラム直径を使用してよい。いくつかの実施形態では、ｐＨ９．０の２００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４溶液中のセラミックヒドロキシアパタイト樹脂のスラリーを使用して、約４ｃｍ／分の一定流速で、または重力を用いてカラムを充填してもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイト樹脂は、清浄化、すなわち、タンパク質の溶出後にストリップおよび／または再生してもよい。ストリップおよび／または再生されたカラムは、繰り返し使用してよい。
【０１０３】
２．操作バッファーおよび条件
ヒドロキシアパタイト樹脂を、ロード物質と接触する前に、ｐＨ、イオン強度および温度などのパラメータを調整すること、いくつかの例では、種々の種類の物質の添加が重要である。したがって、ヒドロキシアパタイトマトリックスを溶液（例えば、ｐＨ、イオン強度などを調整するための、または界面活性剤の導入のためのバッファー）を用いて洗浄することによってヒドロキシアパタイトマトリックスの平衡化を実施し、注目するタンパク質（例えば、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質）の精製に必要な特徴をもたらすことが最適ステップである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトマトリックスは、弱塩基性〜弱酸性のｐＨの０．０１〜２．０Ｍ  ＮａＣｌを含有する溶液を使用して平衡化してもよい。いくつかの実施形態では、平衡バッファーは、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよび／またはリン酸リチウムを含有し得る。例えば、平衡バッファーは、１〜２０ｍＭのリン酸ナトリウム（例えば、１〜１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２〜５ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭのリン酸ナトリウムまたは５ｍＭのリン酸ナトリウム）を含有し得る。平衡バッファーは、０．０１〜０．２Ｍ  ＮａＣｌ（例えば、０．０２５〜０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５〜０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５〜０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  ＮａＣｌまたは０．１Ｍ  ＮａＣｌ）を含有し得る。ロードバッファーのｐＨは、６．２〜８．０（例えば、６．６〜７．７、６．５〜７．５、６．８、７．０、７．１、７．２または７．３）の範囲であり得る。平衡バッファーはまた、０〜２００ｍＭのアルギニン（例えば、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭのアルギニン、１４０ｍＭ、１６０または１８０ｍＭのアルギニン）を含有し得る。平衡バッファーは、０〜２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（例えば、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１４０ｍＭ、１６０ｍＭ、１８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を含有し得る。２以上の平衡化ステップを実施してもよい。
【０１０５】
種々のタンパク質調製物を、ロード物質（例えば、アフィニティークロマトグラフィーからのピークプール、イオン交換クロマトグラフィーからのフロースルーまたは原料調製物）として使用してよい。いくつかの実施形態では、ロードは、適当なローディングバッファーにバッファー交換してよい。例えば、タンパク質調製物は、弱酸性〜弱塩基性ｐＨの０．２〜２．５Ｍ  ＮａＣｌを含有するローディングバッファーにバッファー交換してよい。例えば、ローディングバッファーは、１〜２０ｍＭリン酸ナトリウム（例えば、２〜８ｍＭリン酸ナトリウム、３〜７ｍＭリン酸ナトリウムまたは５ｍＭリン酸ナトリウム）を含有し得る。ローディングバッファーは、０．０１〜０．２Ｍ  ＮａＣｌ（例えば、０．０２５〜０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５〜０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５〜０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  ＮａＣｌまたは０．１Ｍ  ＮａＣｌ）を含有し得る。ローディングバッファーのｐＨは、６．４〜７．６（例えば、６．５〜７．０または６．６〜７．２）の範囲であり得る。
【０１０６】
ローディングは、タンパク質調製物を固相マトリックスを含有する充填床カラム、流動床／膨張床（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ）に適用すること、および／または特定の時間の間、固相マトリックスが溶液と混合される簡単なバッチ操作において、タンパク質調製物をヒドロキシアパタイト樹脂と混合することによって実施してよい。
【０１０７】
ローディング後、ヒドロキシアパタイト樹脂を、洗浄バッファー（例えば、リン酸バッファー）を用いて洗浄し、ゆるく結合している不純物を除去してもよい。使用してよい洗浄バッファーは、ヒドロキシアパタイト樹脂の性質に応じて変わり、当業者によって決定できる。
【０１０８】
結合している生成物は、任意選択の洗浄手順後にカラムから溶出され得る。カラムからＳＭＩＰ（商標）タンパク質の単量体を効率的に溶出するために、本発明は、弱酸性〜弱塩基性ｐＨの高イオン強度リン酸バッファーを使用する。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよび／またはリン酸リチウムを含有し得る。例えば、適した溶出バッファーは、１〜１００ｍＭリン酸ナトリウム（例えば、２〜５０ｍＭ、２〜４０ｍＭ、２〜３５ｍＭ、２〜３２ｍＭ、２〜３０ｍＭ、４〜３５ｍＭ、４〜２０ｍＭ、１０〜４０ｍＭ、１０〜３５ｍＭ、４〜１０ｍＭまたは２〜６ｍＭリン酸ナトリウム）を含有し得る。いくつかの実施形態では、適した溶出バッファーは、２ｍＭ、３ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭまたは６０ｍＭリン酸ナトリウムを含有し得る。
【０１０９】
適した溶出バッファーはまた、０．０１〜２．５Ｍ  ＮａＣｌ（例えば、０．１〜２．５Ｍ、０．１〜２．０Ｍ、０．１〜１．６Ｍ、０．１〜１．２Ｍ、０．１〜１．０Ｍ、０．１〜０．８Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．２〜２．５Ｍ、０．２〜１．５Ｍ、０．２〜１．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２〜１．０Ｍ、０．２〜０．８Ｍ、０．３〜１．１Ｍまたは０．２〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を含有し得る。いくつかの実施形態では、適した溶出バッファーは、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍまたは２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を含有する。
【０１１０】
適した溶出バッファーのｐＨは、６．４〜８．５（例えば、６．４〜８．０、６．４〜７．８、６．５〜７．７または６．５〜７．３）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、適した溶出バッファーのｐＨは、６．４、６．５、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４または８．５）であり得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、連続または段階的勾配での、結合している生成物のカラムからの溶出に、変更した塩濃度を含有する溶出バッファーを使用してもよい。
【０１１２】
例示的バッファーおよび操作条件は、実施例の節に記載されている。実施例に記載される、ハイスループットスクリーニングまたは代替スクリーニング（例えば、勾配溶出スクリーニング）を使用して、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのバッファーおよび操作条件を効率的に最適化することができる。
【０１１３】
通常、本発明には、結合様式ｃＨＡクロマトグラフィーを用いる。あるいは、またはさらに、フロースルー様式を使用してもよい。フロースルー様式では、タンパク質調製物は、通常、本明細書に記載される適したロードバッファーにバッファー交換される。次いで、タンパク質調製物が、ヒドロキシアパタイトカラムを通って流れることが可能になる一方で、ＨＭＷ凝集物などの不純物がカラムと結合することが可能となる。続いて、カラムを洗浄し、さらなる精製タンパク質がカラムを通って流れることを可能にしてもよい。
【０１１４】
組合せ結合／フロースルー様式では、タンパク質調製物が、ヒドロキシアパタイトカラムを通って流れることが可能となり、タンパク質単量体およびＨＭＷ凝集物の両方がまず結合する。しかし、ローディングを続けるにつれ、流入ＨＭＷ凝集物は、タンパク質単量体よりも堅固に結合することができ、ひいては、結合している単量体と置き換わる。結果として、置換された単量体は、カラムを通って流れる。続いて、カラムを洗浄し、さらなる置換された単量体がカラムが通って流れることを可能にしてもよい。
【０１１５】
上記で具体的に論じられた塩およびバッファーに加えて、クロマトグラフィーおよびローディングは、種々のバッファーおよび／または塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、フッ化物、酢酸、リン酸、クエン酸および／またはＴｒｉｓバッファーで起り得る。このようなバッファーの具体的な例として以下が挙げられる：Ｔｒｉｓ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、フッ化ナトリウム物、フッ化カリウム、フッ化アンモニウム、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムまたは酢酸アンモニウム。実施例に記載されるハイスループットスクリーニングを使用して、ｃＨＡクロマトグラフィーのバッファーを効率的に最適化できる。
【０１１６】
さらに、本明細書に記載される種々のバッファーおよび溶液を使用して、確実にエンドトキシンおよび／または外毒素を含まないようにできる。特に、精製されたタンパク質調製物が製薬および／または臨床目的で使用されることが意図される場合には、エンドトキシンおよび／または外毒素を含まないバッファーを使用することが望ましい場合がある。バッファーまたは溶液から内毒素および／または外毒素を除去する種々の方法は、当技術分野で公知であり、本発明において使用できる。例えば、バッファーおよび溶液から発熱物質を除去できる。発熱物質除去は、中でも、例えば、酸ベースの加水分解、酸化、熱、水酸化ナトリウムによって達成され得る。
【０１１７】
さらなる濾過ステップ
膜濾過ステップを使用して、外来のウイルス性およびその他の夾雑物を低減、濃縮および／またはバッファー交換することができる。種々のウイルス保持フィルター、例えば、それだけには限らないが、中でも、Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎウイルス保持濾過（ＶＲＦ）およびＰｌａｎｏｖａ  ３５Ｎウイルス保持濾過（ＶＲＦ）を本発明において使用してよい。種々の限外濾過および／またはダイアフィルトレーションスキッド（例えば、分子量カットオフ１０ｋＤａ）を使用して、工程の流れを濃縮および／または製剤バッファーにバッファー交換できる。最終原薬を、例えば、使い捨て０．２ｐｍフィルターを通して、任意の外来微生物夾雑物および特定の物質を除去できる。
【０１１８】
精製ＳＭＩＰ（商標）タンパク質を含有する医薬組成物
本明細書に記載される精製タンパク質調製物は、製薬学的用途のために製剤できる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、４％未満（例えば、３．５％、３．０％、２．５％、２．０％、１．５％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２、０．１％未満）のＨＭＷ凝集物を含む精製されたＳＭＩＰ（商標）タンパク質を含有し得る。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、精製ＳＭＩＰ（商標）タンパク質を含有し得、タンパク質の７０％を超える（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％を超える）ものが、生物学的に活性な単量体の形態で存在する。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体を含有し得る。このような薬学的に許容できる担体は、医薬品投与と適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被膜、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むよう意図される。医薬上活性な物質のための、このような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物中におけるその使用が考慮される。栄養補助剤的に活性な化合物（本発明によって同定される、かつ／または当技術分野で公知の）はまた、薬学／微生物学の技術分野で周知の任意の方法によって組成物中に組み込むことができる。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するよう製剤される。投与のために使用される溶液または懸濁液は、当技術分野で周知の公知の成分、中でも、例えば、注射水、生理食塩水、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくはその他の合成溶剤などの滅菌希釈液、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンなどの抗菌薬、アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、酢酸、クエン酸もしくはリン酸などのバッファーならびに塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの張力の調整のための薬剤ならびに／または塩酸もしくは水酸化ナトリウムなどの酸もしくは塩基を含み得る。
【０１２１】
投与に適した本発明の製剤は、当技術分野で公知の任意の形態であり得る。例えば、経口投与のための適した製剤として、中でも、カプセル剤、ゼラチンカプセル剤、サシェ剤、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、散剤、顆粒剤、水性液または非水性液中の溶液または懸濁液または水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンであり得る。治療薬はまた、ボーラス、舐剤またはペースト剤の形態で投与してよい。別の実施例として、注射使用に適した製剤は、滅菌注射溶液または分散物の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物および滅菌散剤を含む。静脈内投与には、適した担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）が挙げられる。関節内投与に適した製剤は、微晶質の形態、例えば、水性微晶質懸濁液の形態であり得る治療薬の滅菌水性調製物の形態であり得る。リポソーム製剤または生分解性ポリマーシステムを使用して、関節内および眼部投与の両方のための治療薬を提示してもよい。眼の治療をはじめとする局所投与に適した製剤として、リニメント剤、ローション剤、ゲル剤、塗布剤、水中油型または油中水エマルジョン、例えば、クリーム、軟膏もしくはペースト、または溶液もしくは懸濁液、例えば、液滴などの液体または半液体の調製物が挙げられる。喘息のためなどの吸入治療には、スプレー缶、噴霧器またはアトマイザで分配される散剤（自己推進性またはスプレー製剤）の吸入を使用してもよい。このような製剤は、散剤吸入装置からの肺投与のための細かく粉砕された散剤の形態または自己推進性散剤分配製剤であり得る。
【０１２２】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。
【０１２３】
本発明によれば、精製されたタンパク質調製物を含む医薬組成物を、任意の経路によって哺乳類宿主に投与してよい。したがって、必要に応じて、投与は、経口または非経口、例えば、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与であり得る。
【０１２４】
このように一般的に記載された本発明は、例示として提供され、本発明を限定しようとするものではない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１２５】
【実施例１】
【０１２６】
細胞培養および収集
抗ＣＤ２０  ＳＭＩＰ（商標）タンパク質ＴＲＵ−０１５を、懸濁培養で増殖させた組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を使用して製造した。ＴＲＵ−０１５の製造のための例示的細胞培養および収集方法は、図４に示されている。本明細書に記載されるすべての細胞培養ステップについて、ステップに添加される液体は、添加に先立って少なくとも１回、０．２μｍフィルターを通して濾過した。このようなフィルターを通過することができない消泡剤懸濁液は、添加前にオートクレーブ処理した。細胞を含有する培養ブロスは、ステップの間に濾過しなかった。
【０１２７】
ＴＲＵ−０１５を発現するＣＨＯ細胞株を含有する細胞のバイアルを、解凍し、予加温した、選択圧のための０．４５μＭメトトレキサートを含む振盪フラスコ培地を入れた培養フラスコに移した。
【０１２８】
フラスコおよびウェーブバッグにおける細胞培養拡大および維持
細胞培養物を、まず、バッチリフィード法（ｂａｔｃｈ−ｒｅｆｅｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を使用してディスポーザブル振盪フラスコ（最大作業容量１Ｌ）において拡大した。各培養フラスコを、バッチリフィードサイクルの間、制御温度およびＣＯ２雰囲気下で撹拌しながらインキュベートした。サイクルの最後に、培養物のすべてまたは一部を、１個以上のその他の振盪フラスコに移し（または、ウェーブバッグに対して十分な数の細胞がある場合には、以下を参照のこと）、振盪フラスコ培地で、予め定義された標的初期細胞密度に希釈した。リフィーディング後、各希釈培養物をインキュベーターに戻し、そこで、別のバッチリフィードサイクルの間、撹拌した。最終的なフェドバッチ培養のステップまでの使用したすべての細胞培養培地は、選択圧を維持するためにメトトレキサートを場合により含んでいた。
【０１２９】
振盪フラスコ中での増殖によって、十分な数の細胞が得られると、培養拡大は、ウェーブバッグにおいて継続した。増殖サイクルおよびインキュベーター条件は、ウェーブバッグが振盪される代わりに揺り動かされる点を除いて、フラスコについてと同様とした。ウェーブバッグ培地は、振盪フラスコ培地と同様とした。
【０１３０】
振盪フラスコおよびウェーブバッグ培養は、解凍から特定の最大世代数まで、必要な限りこの様式で継続した。通常、ウェーブバッグにおいて十分な数の細胞が得られるとすぐ、シードトレインバイオリアクターに播種し、少なくとも１つのウェーブバッグをシードトレインバイオリアクターのバックアップとして維持した。
【０１３１】
シードトレインバイオリアクターにおける細胞培養拡大および維持
シードトレインバイオリアクターにおいて播種物拡大を継続した。バイオリアクターに播種用バイオリアクター培地を加え、生理食塩水中、消泡剤のオートクレーブした懸濁液を補充した。ウェーブバッグから得た播種培養物を、予め定義された標的細胞密度に加え、各バッチリフィード継代を開始した。培養物を、継代の間中、制御された条件下で撹拌しながら維持し、その後、一部を採取し、次のバイオリアクターに播種するために使用するか、必要でない場合には、廃棄した。温度は３７℃またはその付近で制御し、溶存酸素（ＤＯ２）は、散布された０．２μｍの濾過した空気、酸素または両方のガスのブレンドを使用して制御し、ｐＨは、炭酸塩溶液（塩基性滴定剤）を使用して制御した。
【０１３２】
その後のシードトレインバイオリアクターバッチ−リフィード継代各々は、先行するサイクルから得た培養物の一部を保持し、播種用バイオリアクター培地で希釈し、消泡剤懸濁液を添加して開始した。シードトレインバイオリアクターおよびウェーブバッグは、両方とも必要に応じて、互いにバックアップとして役立つよう、複数の生産用バイオリアクターバッチに播種物を提供するよう、バッチリフィード操作で維持した。十分な数の細胞が得られるとすぐ、生産用バイオリアクターに播種した。
【０１３３】
生産用バイオリアクター
ＴＲＵ−０１５を含有するコンディショニング培地を、１０〜１５日間持続する最終的なフェドバッチ工程を使用して生産用バイオリアクターにおいて作製した。シードトレインバイオリアクターから得た播種培養物を、生産用バイオリアクター中の最初の生産培地に加えた。消泡剤懸濁液を加えた。得られた培養物を、バッチの間中、制御された条件下で撹拌しながら維持した。播種の約４日後、温度設定を３７℃から３１℃に変えた。生産細胞培養工程の間中、ＤＯ２は、散布された０．２μｍの濾過した空気、酸素またはブレンドを使用して制御し、ｐＨは、炭酸塩溶液（塩基性滴定剤）を使用して制御した。フェドバッチの間に、濃縮されたフィード培地溶液も加えた。播種後１０から１５日の間に、生産用バイオリアクター培養物の全容積を収集した。収集日は、スケジュールの考慮および／または培養生存力の考慮に基づいて選択した。
【０１３４】
図５は、１４日の培養期間にかけて２種の異なるＣＨＯ細胞クローンによって産生されたＴＲＵ−０１５の生産用バイオリアクターの例示的１日力価測定値（μｇ／ｍｌ）を示す。ピーク力価値は、１２から１４日の生産用バイオリアクター増殖の間に得た。ピーク力価値の範囲は、１５００〜３０００μｇ／ｍｌであった。
【０１３５】
ディスクスタック遠心分離（ＤＳＣ）による収集
生産用バイオリアクターからのコンディショニング培地は、ディスクスタック型遠心機によって収集し、清澄化コンディショニング培地（ＣＣＭ）を得た。ＤＳＣステップの１つの目的は、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質を含有するコンディショニング培地からＣＨＯ細胞および細胞片を分離することであった。バイオリアクター容器の内容物を、圧力によってＤＳＣ、次いで、パッド濾過装置、次いで、０．２μｍフィルターを通して、濾液容器またはバッグ中へ送った。収集処理が完了した後で、ＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡバッファー溶液を、濾過された遠心分離物プール中にスパイクした。このスパイクの１つの目的は、ＤＳＣとその後のステップの間の工程間保持期間の間の酸性種の生成を低減することであった。ＥＤＴＡも、プロテアーゼ活性を阻害し、プロテインＡ浸出を低減し得る。ＤＳＣステップは、室温で操作した。
【実施例２】
【０１３６】
クロマトグラフィー条件のハイスループットスクリーニング
ハイスループットスクリーニングを用いて、精製工程のための最適条件を開発した。クロマトグラフィー選択肢の初期ハイスループットスクリーニングによって、操作ウィンドウの迅速な同定が可能となる。データベースに対するハイスループットスクリーニング結果の比較によって、さらに、操作条件が狭まる。ハイスループットスクリーニングは、カラム実施の数および必要とされる工程間物質を最小化し、並行した開発努力を可能にする。
【０１３７】
プロテインＡクロマトグラフィー
プロテインＡクロマトグラフィーステップの主な目的として、細胞を含まない清澄化コンディショニング培地からの生成物捕獲および工程由来不純物（例えば、宿主細胞ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質［ＨＣＰ］、培地成分および外来物質）からのＴＲＵ−０１５の分離が挙げられる。
【０１３８】
ハイスループットスクリーニングを実施して、プロテインＡカラム条件を最適化し、生成物捕獲、不純物除去を増大し、溶出液沈殿を最小化した。バッチ結合機構を用いるハイスループットスクリーニングの例示的設計が、図６に示されており、プロテインＡカラム操作の例示およびハイスループットスクリーニングモデルが図７に示されている。示されるように、賦形剤洗浄、溶出および中和条件の種々の組合せをスクリーニングした。特に、スクリーニングは、洗浄賦形剤として、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、アルギニンおよびＴｒｉｓ、溶出バッファーとして、ＨＥＰＥＳ、酢酸およびグリシン、中和バッファーとして、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳおよびイミダゾールのレベル、および溶出における塩化ナトリウム濃度レベル（例えば、０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭおよび５０ｍＭ）を少なくとも変更した。
【０１３９】
スクリーニングには、９６ウェルを含有し、各ウェルが異なる条件を有するフィルタープレートを使用した。各ウェルは、約５０μｌの樹脂および３００μｌの液体を含んでいた。樹脂および液体を、Ｔｅｃａｎ  Ｒｏｂｏｔ（Ｔｅｃａｎ  ＵＳ、Ｉｎｃ．  ４０２２  Ｓｔｉｒｒｕｐ  Ｃｒｅｅｋ  Ｄｒｉｖｅ  Ｓｕｉｔｅ  ３１０  Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ  ２７７０３、ＵＳＡ）を使用して、約２０分間混合し、プレートを遠心分離して、上清を収集した。各ウェルからの上清を分析し、生成物の回収率、単量体および凝集物の量および宿主細胞タンパク質の存在を調べた。例えば、Ａ２８０でのＵＶ吸光度を使用して、全タンパク質濃度を調べた。濁度は、Ａ３２０の吸光度によって測定した。単量体および凝集物の量は、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定した。宿主細胞タンパク質は、ＥＬＩＳＡによって特性決定した。
【０１４０】
例示的プロテインＡハイスループットスクリーニング結果は、図８に示されている。この実験において同定された１つの例示的な好都合な条件は、カルシウム洗浄、塩化ナトリウムを伴う酢酸溶出およびＨＥＰＥＳ中和を含んでいた（図８参照のこと）。
【０１４１】
イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーの主な目的として、工程由来不純物（例えば、浸出したプロテインＡ、宿主細胞ＤＮＡおよびタンパク質ならびに外来物質）ならびに高分子量（ＨＭＷ）種などの生成物関連不純物の除去が挙げられる。同様に、ハイスループットスクリーニングを使用して、不純物を除去するための陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）条件および陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）の可能性ある操作条件を同定した。試験した例示的変数が、表１に示されている。
【０１４２】
【表１】
2010209068.tif 000003
【０１４３】
セラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）クロマトグラフィー
セラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）クロマトグラフィーの主な目的として、高分子量（ＨＭＷ）凝集物、浸出したプロテインＡならびにＤＮＡおよびＨＣＰなどの宿主細胞由来不純物の除去が挙げられる。
【０１４４】
また、ハイスループットスクリーニングを実施して、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの操作条件を最適化した。スクリーニングは、少なくともｐＨ、塩濃度およびリン酸濃度を変更した。例示的変数が図９に示されている。ＨＭＷ凝集物の除去に関する例示的結果が、図９に示されている。
【実施例３】
【０１４５】
ｃＨＡクロマトグラフィーステップの開発
ハイスループットスクリーニングによって、カラム精製スキームにおける適した単量体回収およびＨＭＷ凝集物除去条件を定性的に予測することができた。例えば、ハイスループットスクリーニングによって、ｃＨＡクロマトグラフィーステップは、ＨＭＷ凝集物の除去において有効であることが同定された。ＨＭＷ凝集物を除去するのに適した塩またはバッファー条件のおよその範囲も予測された（図９参照のこと）。代替スクリーニングを使用して、ハイスループットスクリーニングによって同定された条件をさらに精密にしてもよい。
【０１４６】
ｃＨＡカラムおよび塩化ナトリウム勾配溶出を使用する代替スクリーニングを実施した。例示的スキームおよび結果は、図１０に示されている。
【０１４７】
ハイスループットおよび代替スクリーニングに基づく可能性ある溶出バッファーを、段階溶出様式でさらに評価した。例えば、６０％ＨＭＷ凝集物、６０００ｐｐｍ  ＨＣＰを含むプロテインＡカラムピークプールを、表２に示されるリン酸およびＮａＣｌ濃度の種々の組合せを用い、ｃＨＡカラムを使用して精製した。
【０１４８】
【表２】
2010209068.tif 000004
【０１４９】
５９％ＨＭＷおよび２９０ｐｐｍ  ＨＣＰを含む陰イオン交換クロマトグラフィープールを、表３に示されるリン酸およびＮａＣｌ濃度の種々の組合せを用いｃＨＡカラムを使用して精製した。
【０１５０】
【表３】
2010209068.tif 000005
【０１５１】
本明細書に記載される実験に基づいて開発された例示的な通常のｃＨＡクロマトグラフィーステップは、図１１に示されている。
【実施例４】
【０１５２】
ＴＲＵ−０１５の精製法
上記の実験に基づいて、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質の精製法を開発した。ＴＲＵ−０１５の例示的精製法は、図１２に示されている。この方法は、３つのクロマトグラフィーステップおよび３つの膜濾過ステップを含む。すべてのステップは、特に断りのない限り、室温で実施した。
【０１５３】
実施例１に記載されるように調製した、清澄化された細胞を含まないコンディショニング培地を、まず、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにかけた。組換えプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むＡ１７．７Ｌ（直径３０ｃｍ×高さ２５ｃｍ）を含むＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムを使用した。プロテインＡカラムは、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水を用いて平衡化し、清澄化コンディショニング培地をロードした。ロードされた樹脂を、塩化カルシウムを含有するＨｅｐｅｓバッファーで、続いて、低濃度のＨｅｐｅｓバッファーおよび塩化ナトリウムを含有する洗浄によって洗浄し、不純物のレベルをさらに低減した。結合している生成物を、低ｐＨ酢酸バッファーを用いてカラムから溶出した。
【０１５４】
生成物プールは、１８℃から２４℃で、ｐＨ≦４．１で、約１．５±０．５時間保持した。低ｐＨ保持は、エンベロープ型ウイルスを不活化するために設計された。次いで、濃Ｈｅｐｅｓバッファーを用いて溶出プールを中和した。樹脂を再生、衛生化し、次いで、エタノール溶液中で保存した。
【０１５５】
ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）カラムを、まず、高塩バッファーで、次いで、低塩バッファーを用いて平衡化した。カラムに中和したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ｒプロテインＡピークをロードした。１つまたは複数の中和したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ｒプロテインＡピークプールをＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）カラムにロードした。ＴＲＵ−０１５は、カラムと弱くしか結合せず、これによって、生成物の大部分が流れ、一方で、負の電荷を有する不純物、例えば、宿主細胞ＤＮＡおよびＨＣＰが強力に結合し、保持されることが可能となる。次いで、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）カラムを、平衡バッファーで洗浄し、樹脂に弱く結合されたさらなる生成物を収集する。生成物をＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）カラムから除去した後で、高塩バッファーを使用して不純物をストリップした。樹脂は再生、衛生化し、次いで、エタノール溶液中に保存した。
【０１５６】
ｃＨＡカラムは、まず高塩バッファー、続いて、低塩バッファーを用いて平衡化した。次いで、ＴＭＡＥフロースループールを、ｃＨＡカラムに適用した。ローディング後、カラムを低塩平衡バッファーを用いて洗浄し、高塩バッファーを使用してＴＲＵ−０１５を回収した（実施例３参照のこと）。かなり高い塩およびリン酸濃度でＨＭＷ種およびその他の不純物をカラムから除去した。カラムは再生し、次いで、水酸化ナトリウム溶液中で保存した。
【０１５７】
Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎウイルス保持濾過（ＶＲＦ）ステップによって、外来ウイルス性夾雑物の可能性を表し得るウイルス性粒子の除去による、生成物の安全性の保障のための相当なレベルのウイルスのクリアランスが提供される。使い捨てＰｌａｎｏｖａ  ２０Ｎ  ＶＲＦ装置を平衡化し、ｃＨＡ生成物プールをロードした。ＴＲＵ−０１５タンパク質を透過流中で収集した。ロードを処理した後、平衡バッファーフラッシュを用いて、系中に残っているさらなる生成物を回収した。
【０１５８】
限外濾過／ダイアフィルトレーションスキッド（分子量カットオフ１０ｋＤａ）を使用して、工程流を濃縮し、製剤バッファーにバッファー交換した。平衡化後、ロード溶液を、まず、約８倍濃縮し、次いで、製剤バッファー（例えば、２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、４％マンニトール、１％スクロース、ｐＨ６．０）を用いて少なくとも１０倍ダイアフィルトレーションした。さらなる濃縮後、製剤バッファーフラッシュを用いて系からプールを回収した。
【０１５９】
原薬を、使い捨て０．２μｍフィルターに通して、任意の可能性ある外来の微生物夾雑物および特定の物質を除去した。
【０１６０】
濾過したＴＲＵ−０１５原薬を、例えば、ステンレス鋼容器に詰め、凍結し、−５０℃±１０℃で保存した。
【０１６１】
各ステップでのカラム性能を分析して、生成物回収率および不純物除去効率を求めた。例示的結果が表４に要約されている。
【０１６２】
【表４】
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【０１６３】
表４で示されるように、ｃＨＡクロマトグラフィーステップは、ＨＭＷ凝集物のほとんどを効率的に除去した。注目する生成物の総工程回収率は、５１〜７３％の範囲であり、生成物収率は、約２３〜３２％であった。表４に示される結果は、実験室規模精製工程に基づくものとした。臨床製造工程について同等の結果が得られた。例えば、複数の臨床規模工程に基づいて、平均収率は約２８％であり、精製生成物中のＨＭＷ凝集物のパーセンテージは、約０．８％以下であった（出発物質中の５０〜６０％から低減した）。既存の工程と比較して、タンパク質発現／収集および精製収率の増大によって、生産性の８倍を超える増大がある。
【実施例５】
【０１６４】
ロード物質のパッド濾過
ロード物質は、不純物に対する能力および陰イオン交換カラムの寿命を増大するために、パッド濾過にかけてもよい。例えば、ＴＭＡＥ  Ｈｉ−ｃａｐ樹脂は、合成メタクリレートポリマー塩基を含む強力な陰イオン交換体である。絡み合ったポリマー集塊物から形成される孔は、約８００オングストロームの大きさを有する。ポリマー中のエーテル結合のために、表面は強い親水性である。テンタクルとして知られる長い、直鎖のポリマー鎖が、機能的リガンドを保有する。テンタクルは、共有結合によってメタクリレート主鎖のヒドロキシル基と結合している。不純物が、ＴＭＡＥカラムの結合表面を使い果たし、またはブロックし、能力を低下させる可能性がある。
【０１６５】
吸着性デプスプレフィルターの使用によって、ＴＭＡＥカラムなどのカラムが、ロード物質中の不純物（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＰｒｏＡピークプール）から保護され得る。デプス濾過媒体は、通常、セルロースファイバー、珪藻土および陽イオン性樹脂結合剤からなる高度に多孔性の１ｃｍの厚さのフィルターである。デプスフィルターは、セルロースファイバーを通す篩い分けによって、珪藻土への疎水性吸着によって、および陽イオン結合剤へのイオン性吸着によって不純物を除去できる。
【０１６６】
ＴＲＵ−０１５の精製の間、Ｍｉｌｌｉｓｔａｃｋ  Ａ１ＨＣ  ＰＡＤフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、ＴＭＡＥカラムへのローディングに先立ってＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＰｒｏＡピークプールから不純物を除去し、ＴＭＡＥ能を少なくとも２倍改善した。例えば、吸着性デプスフィルターＭｉｌｌｉｓｔａｃｋ  ＡＩＨＣを用いる生成物ロードのプレ濾過によって、その後のＴＭＡＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ樹脂カラムへのロードチャレンジの１００から２００ｍｇ／ｍＬへ増大が提供されることが、夾雑物の二次的ブレークスルーによって示される。ＡＩＨＣを、１時間当たり平方メートルあたり２００リットルの流束で実施し、平方メートルあたり２００リットルにロードした。
【実施例６】
【０１６７】
陽イオン交換クロマトグラフィーを用いるＳＢＩ−０８７の捕獲
この実施例は、アフィニティークロマトグラフィーの代わりにＣＥＸを使用して、効率的にＳＭＩＰ（商標）を捕獲できることを実証する。ＣＥＸを使用することは、中でも、低い捕獲費用、特定のアフィニティーカラムよりも高い可能性がある能力、ＨＭＷ低減のための固体の可能性およびｃＨＡまたは陰イオン交換ステップの除去の可能性をはじめとする種々の利益を有し得ると考えられる。
【０１６８】
この実験ではＳＢＩ−０８７を使用した。ＣＥＸのためのロード物質は、任意の適した酸を使用して酸性化してもよい。例示的酸性化条件は、表５に示されている。
【０１６９】
【表５】
2010209068.tif 000007
【０１７０】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるＨＭＷ凝集物の量の低減を、バッチ結合法を用いたＣＥＸによるものと比較した。図１３に示されるように、ＣＥＸによるＨＭＷ凝集物の除去は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）アフィニティークロマトグラフィーと同等であるか、より良好であり、このことは、ＣＥＸは、タンパク質調製物からのＨＭＷ凝集物の除去のために、アフィニティークロマトグラフィーを置換するために使用できることを示す。
【０１７１】
例示的ＣＥＸステップは、ロードおよび溶出を含む。ＣＥＸ捕獲操作条件は、ハイスループットスクリーニング法を使用して最適化した。例えば、２種のＣＥＸ樹脂、ＧｉｇａＣａｐ（登録商標）およびＣａｐｔｏ（商標）Ｓを使用した。２５ｍｇ／ｍＬｒ対７５ｍｇ／ｍＬｒのロードチャレンジを使用した。ロードｐＨ（１Ｍ酢酸で調整した）は、４．２５、４．５、４．７５または５．０であった。溶出条件は以下のとおりとした：
溶出（総ｍＭ  Ｎａ＋）：
ｐＨ５（酢酸）：１００、１２５、１５０、１７５ｍＭ
ｐＨ６．５（ＭＥＳ）：４０、６５、９０、１１５
ｐＨ８．０（Ｔｒｉｓ）：２０、４０、６０、８０
５０ｍＭバッファーと見なす
【０１７２】
室温での２時間のインキュベーションでの結合能を示す例示的結果が、図１４に示されている。また、高いまたは長いチャレンジが、溶出されたプール中のより多くのＬＭＷ種につながり得ることも観察された。２５対７５ｍｇ／ｍＬｒ  ＬＣでロードされたカラムから溶出されたＣＥＸピークを示す例示的結果が、図１５に示されている。使用した例示的ストリップ条件は、８Ｍ尿素、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６であった。ＣＥＸ樹脂は、ストリップおよび／または再利用できる。
【実施例７】
【０１７３】
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＭＷの除去
この実施例は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、ＳＭＩＰ（商標）調製物からＨＭＷ不純物を効率的に除去できるということを実証する。この実験では、ＳＢＩ−０８７を例示的ＳＭＩＰ（商標）タンパク質として使用した。
【０１７４】
陰イオン交換クロマトグラフィーステップは、表１に概説されるハイスループットスクリーニングアプローチを使用して開発した。そのスクリーニングから導いたクロマトグラフィー条件を、３７％ＨＭＷを含むプロテインＡピークプールを含有するロードを使用する例示的実施において使用した。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐの充填したカラムを、それぞれ、１００および９３ｍｇ／ｍＬのロードチャレンジへの弱分配性クロマトグラフィー様式で実施した。図１６は、ＨＭＷの例示的な有効な除去を示す。収集したプールは、８８％純粋であり、「単量体」ＳＭＩＰ（商標）の収率＞９５％であった。ロード後洗浄によって、「単量体」ＳＭＩＰ（商標）タンパク質のより多くの回収が可能となった。
【０１７５】
これらの結果は、第２のカラム（例えば、ＡＥＸ）クロマトグラフィーが、ＨＭＶの実質的な除去を達成でき、これによって、下流ｃＨＡステップの開発および実施における、より柔軟で、低い費用が可能となることを実証した。さらに、これらの結果はまた、２−カラム（例えば、プロテインＡからＡＥＸ）工程を開発し、タンパク質調製物からＨＭＷ不純物の実質的な量を除去することが実現可能であることを示す。
【０１７６】
例示的ＳＭＩＰ（商標）配列
イタリック体：リンカー配列
下線：ＣＤＲ配列
【０１７７】
【表６−１】
2010209068.tif 000008
【０１７８】
【表６−２】
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【０１７９】
【表７−１】
2010209068.tif 000010
【０１８０】
【表７−２】
2010209068.tif 000011
【０１８１】
【表７−３】
2010209068.tif 000012
【０１８２】
【表７−４】
2010209068.tif 000013
【０１８３】
【表７−５】
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【０１８４】
【表７−６】
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【０１８５】
【表７−７】
2010209068.tif 000016
【０１８６】
【表７−８】
2010209068.tif 000017
【０１８７】
【表７−９】
2010209068.tif 000018
【０１８８】
【表７−１０】
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【０１８９】
【表７−１１】
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【０１９０】
【表７−１２】
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【０１９１】
【表７−１３】
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【０１９２】
【表７−１４】
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【０１９３】
【表８−１】
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【０１９４】
【表８−２】
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【０１９５】
【表８−３】
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【０１９６】
【表８−４】
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【０１９７】
等価物
前記は、本発明の特定の非限定的な実施形態の説明であった。当業者ならば、日常の実験程度のものを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識するか、確認できるであろう。当業者には当然のことながら、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、この記載に種々の変更および改変を行うことができる。
【０１９８】
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの冠詞は、文脈から反対である、または別に明らかであると示されない限り、１種よりも１つまたは複数を意味し得る。１つまたは複数の群のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、文脈から反対である、または別に明らかであると示されない限り、群メンバーのうち１種、２種以上またはすべてが、所与の生成物または工程中に存在する、所与の生成物または工程において使用される、またはそうでなければ所与の生成物または工程と関連している場合に沿っていると考えられる。本発明は、群の正確に１種のメンバーが所与の生成物または工程中に存在する、所与の生成物または工程において使用される、またはそうでなければ所与の生成物または工程と関連している実施形態を含む。本発明はまた、群のメンバーのうち２種以上またはすべてが、所与の生成物または工程中に存在する、所与の生成物または工程において使用される、またはそうでなければ所与の生成物または工程と関連している実施形態を含む。さらに、本発明が、１以上の特許請求の範囲に由来するか、説明の関連部分に由来する、１以上の制限、要素、条項、記述用語などが別の特許請求の範囲に導入されるすべての変形、組合せおよび順列を包含することは理解されるべきである。例えば、別の特許請求の範囲に応じて変わる任意の特許請求の範囲を、同じ基本クレームに応じて変わる任意のその他の特許請求の範囲に見られる１以上の制限を含むよう改変してよい。さらに、特許請求の範囲が組成物を列挙する場合は、特に断りのない限り、または矛盾もしくは不一致が生じると当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される目的のいずれかのために組成物を使用する方法が含まれ、本明細書に開示される作製方法のいずれかに従って組成物を作製する方法または当技術分野で公知のその他の方法が含まれると理解されるべきである。さらに、本発明は、本明細書に開示される組成物を調製するための方法のいずれかに従って作製された組成物を包含する。
【０１９９】
要素が、例えば、マーカッシュ群形式で一覧として提示される場合は、要素の各サブグループも開示され、任意の要素（複数可）が群から除去されていてもよいと理解されるべきである。また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、オープンであり、さらなる要素またはステップを含むことを許可することも留意される。一般に、発明または発明の態様が、特定の要素、特徴、ステップなどを含むといわれる場合には、本発明の特定の実施形態または態様は、このような要素、特徴、ステップなどからなる、本質的に、それらからなると理解されるべきである。簡単にする目的で、それらの実施形態は、これらの言葉では具体的に示していない。したがって、１以上の要素、特徴、ステップなどを含む本発明の各実施形態について、本発明はまた、それらの要素、特徴、ステップなどからなる、または本質的にそれらからなる実施形態を提供する。
【０２００】
範囲が与えられる場合には、端点は含まれる。さらに、文脈から特に断りのない限り、または文脈および／もしくは当業者の理解から別に明らかでない限り、範囲として表現される値は、本発明の異なる実施形態において、記載された範囲内の任意の特定の値を、文脈が明確に別に示さない限り、下限の単位の１／１０まで仮定できると理解されるべきである。また、特に断りのない限り、または文脈および／または当業者の理解から別に明らかでない限り、範囲として表現される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を仮定でき、部分端点が、下限の単位の１／１０と同程度の正確さで表現されるということも理解されるべきである。
【０２０１】
さらに、本発明の任意の特定の実施形態が、任意の１つまたは複数の特許請求の範囲から明確に除外され得ることが理解されるべきである。本発明の組成物および／または方法の任意の実施形態、要素、特徴、適用または態様が、１つまたは複数の特許請求の範囲から除外され得る。簡潔さを目的として、１以上の要素、特徴、目的または態様が排除される実施形態のすべてが、本明細書に明確に示されるわけではない。
【０２０２】
参照文献の組み込み
本出願に列挙されるすべての刊行物および特許文書は、各個々の刊行物または特許文書が本明細書に組み込まれるのと同程度に、その全体が参照により組み込まれる。
【図１】
2010209068.tif 000028
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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