(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＴＰ１Ｂ（蛋白質ホスファターゼ１Ｂ及びＰＴＰＮ１）の発現を調節する化合物、組成物および方法を提供する。【解決手段】ＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸を標的にするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んで成る。本化合物をＰＴＰ１Ｂ発現の調節で用いる方法そしてＰＴＰ１Ｂの発現に関連した病気の治療で用いる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸分子を標的にする長さが核酸塩基８から５０個分のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であって、配列識別番号：
２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６７、２６８、２６９、２７１、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８１、２８２、２８３、２８８、２９０、２９１、２９２、２９４、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０２、３０３、３０７、３１０、３１１、３１３、３１５、３１７、３１８、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４７、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６８、３６９、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７７、３７８、３８０、３８１、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、または ３８９
から成る群から選択される配列を含んで成っていてＰＴＰ１Ｂと特異的にハイブリッド形成しかつそれの発現を抑制する化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ホスフェート部分を生物学的分子にキナーゼと呼ばれる酵素の作用で結合させることであるとして定義される燐酸化過程は、細胞内シグナルが伝播される結果として最終的に細胞反応が起こる１つの過程に相当する。細胞内で蛋白質は燐酸化をセリン、トレオニンまたはチロシン残基の所で受け得るが、その燐酸化の度合は、ホスフェート部分を除去するホスファターゼの対抗する作用によって調節される。細胞内で起こる蛋白質燐酸化の大部分はセリンおよびトレオニン残基の所で起こるが、チロシンの燐酸化は発癌性形質転換および増殖因子刺激中に最も高い度合で調節される（非特許文献１）。
【０００２】
燐酸化はそのように細胞内のいたる所で起こる過程でありかつそのような経路の活性によって細胞の表現型が大きな影響を受けることから、現在では、いろいろな病気状態および／または障害はキナーゼおよびホスファターゼの異常な活性またはそれらの機能的変異のいずれかの結果であると信じられている。その結果として、最近では、チロシンキナーゼおよびチロシンホスファターゼの特徴づけにかなりの注目が集まっている。
【０００３】
ＰＴＰ１Ｂ（また蛋白質ホスファターゼ１ＢおよびＰＴＰＮ１としても知られる）は小胞体（ＥＲ）関連酵素であり、これは、ヒト胎盤の主要な蛋白質であるチロシンのホスファターゼとして初めて単離された（非特許文献２、３）。
【０００４】
インシュリン受容体が媒介するシグナリングでＰＴＰ１Ｂが必須な調節的役割を果たすことが確立された。ＰＴＰ１Ｂはインビトロおよび無傷の細胞の両方において活性化されたインシュリン受容体と相互作用して脱燐酸を起こさせ、その結果として、シグナリング経路の下方調節（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）をもたらす（非特許文献４、５）。加うるに、ＰＴＰ１Ｂはインシュリンが示す分裂誘発作用も調節する（非特許文献４）。ＰＴＰ１Ｂを過剰発現するラット脂肪細胞ではＧＬＵＴ４グルコース輸送体の転位が抑制され、このことから、ＰＴＰ１Ｂは同様にグルコース輸送の負の調節剤として関係付けられている（非特許文献６）。
【０００５】
ＰＴＰ１Ｂ遺伝子が欠如しているマウスノックアウトモデルもまたＰＴＰ１Ｂがインシュリンシグナリングの負の調節を行うことを示唆している。破壊されたＰＴＰ１Ｂ遺伝子を含有するマウスは高いインシュリン感受性を示し、インシュリン受容体の燐酸化が高く、そしてＰＴＰ１Ｂ−／−マウスはこれを高脂肪食餌下に置いても体重上昇を示さずかつインシュリン感受性を示すままであった（非特許文献７）。このような研究は、糖尿病および肥満症の治療でＰＴＰ１Ｂが治療標的になることを明らかに示している。
【０００６】
ＰＴＰ１Ｂは細胞周期中に特異的に調節され（非特許文献８）、インシュリン感受性組織の中に異なる２種類のアイソタイプとして発現し、これらはｐｒｅ−ｍＲＮＡの選択的スプライシングで生じる（非特許文献９）。その選択的にスプライシングされた生成物の比率は増殖因子、例えばインシュリンなどの影響を受けかつ試験を受けさせたいろいろな組織の中で異なることが最近示された（非特許文献１０）。このような研究において、また、そのような変異体の濃度は血漿のインシュリン濃度および体脂肪のパーセントと相互に関係しており、従って、患者が慢性的高インシュリン血症または２型糖尿病にかかっているか否かを示すバイオマーカーとして使用可能であることも確認された。
【０００７】
ＰＴＰ１Ｂが表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と結合しかつそれの基質として働くことが示された（非特許文献１１）。その上、Ａ４３１ヒト類表皮癌細胞において、ＰＴＰ１ＢはＥＧＦの添加で発生するＨ２Ｏ２の存在によって失活することも確認された。このよ
うな研究により、ＰＴＰ１Ｂは細胞の酸化状態によって負の調節を受け得ることが示され、それはしばしば腫瘍形成中には調節されなくなる（非特許文献１２）。
【０００８】
悪性卵巣癌の中でＰＴＰ１Ｂが過剰発現することが示され、そしてこのような相互関係に付随して関連した増殖因子受容体の発現が増加した（非特許文献１３）。
【０００９】
ＰＴＰ１Ｂはｎｅｕ腫瘍遺伝子によって誘発されるＮＩＨ３Ｔ３細胞における形質転換（非特許文献１４）ばかりでなくｖ−ｓｒｋ、ｖ−ｓｒｃおよびｖ−ｒａｓによって誘発されるラット３Ｙ１線維芽細胞における形質転換（非特許文献１５）およびｂｃｒ−ａｂｌによって誘発されるラット−１線維芽細胞における形質転換（非特許文献１６）を抑制することが示された。また、ＰＴＰ１ＢはＫ５６２細胞、即ち慢性的骨髄性白血病細胞系の分化をｂｃｒ−ａｂｌ腫瘍蛋白質の阻害剤のそれと同様な様式で助長することも示された。これらの研究は、慢性的骨髄性白血病の病因を制御する時にＰＴＰ１Ｂがある役割を果たす可能性があることを説明している（非特許文献１６）。
【００１０】
ＰＴＰ１Ｂは、１種以上の接着依存シグナリング成分と相互作用してインテグリン媒介ＭＡＰキナーゼ活性を抑制することでインテグリンシグナリングを負に調節する（非特許文献１７）。触媒的に不活性な形態のＰＴＰ１Ｂを用いてインテグリンシグナリングを試験するように考案された他の研究により、ＰＴＰ１Ｂはカドヘリン媒介細胞接着（非特許文献１８）ばかりでなく細胞拡散、接着斑（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）および緊張線維生成およびチロシン燐酸化（非特許文献１９）を調節することが示された。
【００１１】
ＰＴＰ１Ｂの合成または作用を抑制するように考案された治療剤には現在のところ小型分子（非特許文献２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６）およびペプチド（非特許文献２７、２８、２９）が含まれる。加うるに、ＰＴＰ１Ｂと活性化されたインシュリン受容体の結合を抑制するホスホペプチドおよび抗体がインシュリン耐性に関連した障害を治療する目的で特許文献１に開示されている。特許文献１にはまたＰＴＰ１Ｂに対するアンチセンスヌクレオチドも一般的に開示されている。
【００１２】
ＰＴＰ１Ｂ機能を有効に抑制し得る追加的作用剤が必要であると長年に渡って感じられているままであり、そして特異的遺伝子産物の発現を減少させるに有効な手段としてアンチセンス技術が登場してきている。従って、このような技術がＰＴＰ１Ｂ発現の調節に関するいろいろな治療、診断および研究用途にユニークに有用であることが分かるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＰＣＴ公開ＷＯ  ９７／３２５９５
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８、３３、１−５２
【非特許文献２】Ｔｏｎｋｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３、６７３１−６７３７
【非特許文献３】Ｔｏｎｋｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３、６７２２−６７３０
【非特許文献４】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９８、１８２、９１−９９
【非特許文献５】Ｓｅｅｌｙ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９９６、４５、１３７９−１３８５
【非特許文献６】Ｃｈｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、８０２６−８０３１
【非特許文献７】Ｅｌｃｈｅｂｌｙ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９、２８３、１５４４−１５４８
【非特許文献８】Ｓｃｈｉｅｖｅｌｌａ他、Ｃｅｌｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．、１９９３、４、２３９−２４６
【非特許文献９】ＳｈｉｆｒｉｎおよびＮｅｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９３、２６８、２５３７６−２５３８４
【非特許文献１０】ＳｅｌｌおよびＲｅｅｓｅ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．、１９９９、６６、１８９−１９２
【非特許文献１１】ＬｉｕおよびＣｈｅｒｎｏｆｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９９７、３２７、１３９−１４５
【非特許文献１２】Ｌｅｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８、２７３、１５３６６−１５３７２
【非特許文献１３】Ｗｉｅｎｅｒ他、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１９９４、１７０、１１７７−１１８３
【非特許文献１４】Ｂｒｏｗｎ−Ｓｈｉｍｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９２、５２、４７８−４８２
【非特許文献１５】Ｌｉｕ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８、２５０−２５９
【非特許文献１６】ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９８、９５、１４０９４−１４０９９
【非特許文献１７】Ｌｉｕ他、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９９８、８、１７３−１７６
【非特許文献１８】Ｂａｌｓａｍｏ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８、１４３、５２３−５３２
【非特許文献１９】Ａｒｒｅｇｕｉ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８、１４３、８６１−８７３
【非特許文献２０】Ｈａｍ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９９、９、１８５−１８６
【非特許文献２１】Ｓｋｏｒｅｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、２２４７２−２２４８０
【非特許文献２２】Ｔａｉｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９、３８、３７９３−３８０３
【非特許文献２３】Ｔａｙｌｏｒ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６、１４５７−１４６８
【非特許文献２４】Ｗａｎｇ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、３４５−３５０
【非特許文献２５】Ｗａｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９７、５４、７０３−７１１
【非特許文献２６】Ｙａｏ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６、１７９９−１８１０
【非特許文献２７】Ｃｈｅｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９、３８、３８４−３８９
【非特許文献２８】Ｄｅｓｍａｒａｉｓ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９８、３５４、２２５−２３１
【非特許文献２９】Ｒｏｌｌｅｒ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、２１４０−２１５０
【発明の概要】
【００１５】
本発明はＰＴＰ１Ｂの発現を調節する組成物および方法を提供する。特に、本発明は、選択的にスプライシングされた形態のＰＴＰ１Ｂを調節する組成物および方法を提供する。本発明は、ＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸と特異的にハイブリッド形成しかつそれを標的にするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドはＰＴＰ１Ｂの発現を調節することが分かった。
【００１６】
また、本発明のアンチセンス化合物を含んで成る薬剤および他の組成物も提供する。更に、細胞または組織におけるＰＴＰ１Ｂの発現を調節する方法も提供し、この方法は、前記細胞もしくは組織を本発明のアンチセンス化合物もしくは組成物の１種以上と接触させることを含んで成る。
【００１７】
更に、ＰＴＰ１Ｂの発現に関連した病気または状態を有するか、有すると思われるか或は有する傾向がある動物、特にヒトを治療する方法も提供し、この方法は、本発明のアンチセンス化合物もしくは組成物の１種以上を治療もしくは予防有効量で投与することによる。
【００１８】
本発明の他の面および利点を以下に行う本発明の詳細な記述の中に包含させる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な記述）
本発明では、ＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸分子が示す機能を調節し、最終的にＰＴＰ１Ｂの産生量を調節する用途でオリゴマー状のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを用いる。これを、ＰＴＰ１Ｂをコード化する１種以上の核酸と特異的にハイブリッドを形成するアンチセンス化合物を提供することで達成する。
【００２０】
本明細書で用いる如き用語「標的核酸」および「ＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸」は、ＰＴＰ１Ｂをコード化するＤＮＡ、前記ＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを包含）およびまた前記ＲＮＡから派生するｃＤＮＡを包含する。オリゴマー状の化合物とこれの標的核酸が特異的にハイブリッド形成すると前記核酸の正常な機能が妨害される。このように標的核酸と特異的にハイブリッド形成する化合物によってそれの機能が調節されることを一般に「アンチセンス」と呼ぶ。妨害されるＤＮＡの機能には複製および転写が含まれる。妨害されるＲＮＡの機能には、あらゆる生体機能、例えばＲＮＡの蛋白質翻訳部位への転位、ＲＮＡからの蛋白質の翻訳、１種以上のｍＲＮＡ種をもたらすＲＮＡのスプライシング、そしてＲＮＡが関与するか或はＲＮＡによって助長され得る触媒活性などが含まれる。そのように標的核酸の機能を妨害する全体的効果がＰＴＰ１Ｂ発現の調節である。
【００２１】
本発明の文脈において、「調節」は、遺伝子発現の増加（刺激）または減少（抑制）のいずれかを意味する。本発明の文脈では、抑制が遺伝子発現の調節の好適な形態であり、そしてｍＲＮＡが好適な標的である。
【００２２】
アンチセンスでは特定の核酸を標的にするのが好適である。本発明の文脈において、アンチセンス化合物が特定の核酸を「標的にする」過程は多段階過程である。この過程は通常は核酸配列の識別で始まり、それの機能を調節する。それは、例えば発現が個々の障害または病気の状態に関連している細胞遺伝子（またはこの遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）または感染性作用剤に由来する核酸分子であってもよい。本発明における標的はＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸分子である。この標的過程には、また、所望効果、例えば蛋白質発現の検出または調節がもたらされるようにアンチセンス相互作用を起こす前記遺伝子内の部位１種または２種以上を決定することも含まれる。本発明の文脈の範囲内で好適な遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始もしくは終
止コドンを包含する領域である。
【００２３】
本技術分野で公知のように、翻訳開始コドンは典型的に５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子内；相当するＤＮＡ分子内の５’−ＡＴＧ）であることから、翻訳開始コドンはまた「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれる。ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有する遺伝子は少数であり、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧはインビボで機能することが示されている。このように、開始アミノ酸は各場合とも典型的にメチオニン（真核生物の場合）またはホルミルメチオニン（原核生物の場合）ではあるが、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」には数多くのコドン配列が含まれ得る。また、真核生物および原核生物の遺伝子は２種以上の代替開始コドンを有していてそれらの中のいずれか１つが個々の細胞型または組織の中でか或は特別な設定の条件下で翻訳開始で優先的に利用され得ることも本技術分野で公知である。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列１種または２種以上に関係なく、ＰＴＰ１Ｂをコード化する遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳の開始にインビボで用いられるコドン１種または２種以上を指す。
【００２４】
また、遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は３種類の配列、即ち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（相当するＤＮＡ配列はそれぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）の中の１つであり得ることも本技術分野で公知である。用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（即ち５’または３’）に約２５から約５０個の連続的ヌクレオチドを包含する前記ｍＲＮＡもしくは遺伝子の部分を指す。同様に、用語「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（即ち５’または３’）に約２５から約５０個の連続的ヌクレオチドを包含する前記ｍＲＮＡもしくは遺伝子の部分を指す。
【００２５】
また、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コーディング領域」［これは翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域を指すことが本技術分野で知られている］も有効に標的になり得る領域である。他の標的領域には、翻訳されない５’領域（５’ＵＴＲ）［翻訳開始コドンから５’の方向のｍＲＮＡの部分を指すことが本技術分野で公知であり、従って、これはｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンの間のヌクレオチド、または遺伝子上の相当するヌクレオチドを包含する］、または翻訳されない３’領域（３’ＵＴＲ）［翻訳終止コドンから３’の方向のｍＲＮＡの部分を指すことが本技術分野で公知であり、従って、これはｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’末端部の間のヌクレオチド、または遺伝子上の相当するヌクレオチドを包含する］も含まれる。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’トリホスフェート結合を通してｍＲＮＡの最も５’側の残基と結合しているＮ７−メチル化グアノシン残基を含んで成る。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は５’キャップ構造自身ばかりでなく前記キャップに隣接する最初の５０個のヌクレオチドを包含すると考えられている。この５’キャップ領域もまた好適な標的領域であり得る。
【００２６】
ある種の真核生物のｍＲＮＡ転写産物は直接翻訳されるが、多くは「イントロン」（これは翻訳される前に転写物から切除される）として知られる領域を１個以上含有する。その残り（従って翻訳される）領域は「エキソン」として知られており、一緒にスプライシングされて連続的ｍＲＮＡ配列を生じる。ｍＲＮＡスプライス部位、即ちイントロン−エキソン連結部もまた好適な標的領域であり得、特に、異所のスプライシングが病気に関係しているか或は個々のｍＲＮＡスプライス産物の過剰産生が病気に関係していると推測される場合に有用である。また、転位または欠失が原因で起こる異所の融合連結部も好適な標的である。また、例えばＤＮＡまたはｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的にするアンチセンス化合物の場合にはイントロンも有効な標的領域であり、従って好適な標的領域であることも確
認した。
【００２７】
１種以上の標的部位を識別した後、その標的に充分な相補性を示す、即ち所望効果が得られるに充分なほど良好かつ充分に特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを選択する。
【００２８】
本発明の文脈において、「ハイブリッド形成」は、相補的ヌクレオシドもしくはヌクレオチド塩基の間の水素結合を意味し、これはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であり得る。例えばアデニンとチミンは水素結合の形成を通して対になる相補的核酸塩基である。本明細書で用いる如き「相補的」は、２つのヌクレオチドが正確に対になり得ることを指す。例えばあるオリゴヌクレオチドの特定位置に存在するヌクレオチドがＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の同じ位置に存在するヌクレオチドと水素結合し得るならば、そのオリゴヌクレオチドと前記ＤＮＡもしくはＲＮＡはその位置において互いに相補的であると見なす。前記オリゴヌクレオチドと前記ＤＮＡもしくはＲＮＡは、各分子の中の相当する位置が充分な数で互いに水素結合し得るヌクレオチドで占められるならば互いに相補的である。このように、「特異的にハイブリッド形成し得る」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡもしくはＲＮＡ標的の間に特定の安定な結合が生じるに充分な度合の相補性があることまたは正確な対が生じることを示す目的で用いる用語である。アンチセンス化合物の配列と特異的にハイブリッド形成し得るそれの標的核酸の配列が１００％相補的である必要はないことは本技術分野で理解されている。アンチセンス化合物と標的のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が、特異的結合が望まれる条件、即ちインビボ検定または治療処置の場合には生理学的条件およびインビトロ検定の場合には検定を実施する条件下で、結合することによって前記標的ＤＮＡもしくはＲＮＡの正常な機能が妨害されて有用性が失われかつ非標的配列に対する相補性の度合が前記アンチセンス化合物が非標的配列と非特異的に結合しないほどであるならば、そのようなアンチセンス化合物は特異的にハイブリッド形成し得る。
【００２９】
アンチセンス化合物は研究用試薬および診断薬として通常用いられる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが申し分のない特異性を伴って遺伝子発現を抑制し得るならば、通常の技術者は、しばしば、個々の遺伝子の機能を明らかにする目的でそれを使用するであろう。アンチセンス化合物は、また、例えば多種多様な生物学的経路の機能と機能の間の区別を行う目的でも用いられる。従って、アンチセンス調節は研究用途で用いられてきている。
【００３０】
本分野の技術者はまたアンチセンスの特異性および感受性を治療目的でも用いる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは動物およびヒトにおける病気状態の治療で治療部分（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）として用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトに安全かつ有効に投与されかついろいろな臨床試験が現在進行中である。このように、オリゴヌクレオチドは細胞、組織および動物、特にヒトの治療の治療管理で用いるに有用であるように構成されることができる有効な治療様式であり得ることが確認されている。
【００３１】
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはこれらの類似物のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語には、天然に存在する核酸塩基と糖のヌクレオシド間（バックボーン）共有結合で構成されているオリゴヌクレオチドばかりでなく同様な機能を果たす天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。そのような修飾もしくは置換されているオリゴヌクレオチドの方がしばしば未変性形態よりも好適である、と言うのは、それらの方が望ましい特性を有し、例えば細胞吸収が向上し、核酸標的への親和性が向上し、かつヌクレアーゼ存在下の安定性が向上するからである。
【００３２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが好適な形態のアンチセンス化合物であるが、本発明は、他のオリゴマー状のアンチセンス化合物も包含し、そのような化合物には、これらに限定するものでないが、以下に記述する如きオリゴヌクレオチド類似物が含まれる。本発明に従うアンチセンス化合物は、好適には、核酸塩基を約８から約５０個含んで成る（即ち結合したヌクレオシドを約８から約５０個含んで成る）。特に好適なアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチド、更により好適には核酸塩基を約１２から約３０個含んで成るアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本技術分野で公知なように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。このヌクレオシドの塩基部分は一般に複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の最も一般的な２種類はプリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合しているホスフェート基も更に含有するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含有するヌクレオシドの場合、そのホスフェート基は糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかと結合し得る。オリゴヌクレオチドの生成では、ホスフェート基が隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて線状の高分子量化合物を生じさせる。今度は、その線状の高分子量構造物の個々の末端部が更に結合して円形構造物を形成し得るが、しかしながら、一般的には開放された線状構造物の方が好適である。オリゴヌクレオチド構造の中のホスフェート基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成する基であると一般に呼ばれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合またはバックボーンは３’と５’のホスホジエステル結合である。
【００３３】
本発明で用いるに有用な好適なアンチセンス化合物の具体例には、修飾を受けたバックボーンまたは天然には存在しないヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書で定義するように、修飾を受けたバックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーンの中に燐原子を含有するオリゴヌクレオチドおよびバックボーンの中に燐原子を持たないオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書の目的で、時には本技術分野で言及されているように、ヌクレオシド間バックボーンの中に燐原子を持たないように修飾を受けたオリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオシドであると見なすことができる。
【００３４】
好適な修飾を受けたオリゴヌクレオチドバックボーンには、例えばホスホロチオエート、キラリティーを持つホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホロトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラリティーを持つホスホネートを包含）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを包含）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、そして通常の３’−５’結合、これの２’−５’結合類似物、および極性が逆の結合（ヌクレオシド単位の隣接する対の結合が３’−５’から５’−３’になっているか或は２’−５’から５’−２’になっている）を有するボラノホスフェートなどが含まれる。また、いろいろな塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
【００３５】
この上に示した燐含有結合を生じさせることを教示している代表的な米国特許には、これらに限定するものでないが、米国特許第３,６８７,８０８；４,４６９,８６３；４,４
７６,３０１；５,０２３,２４３；５,１７７,１９６；５,１８８,８９７；５,２６４,４
２３；５,２７６,０１９；５,２７８,３０２；５,２８６,７１７；５,３２１,１３１；５,３９９,６７６；５,４０５,９３９；５,４５３,４９６；５,４５５,２３３；５,４６６,６７７；５,４７６,９２５；５,５１９,１２６；５,５３６,８２１；５,５４１,３０６；５,５５０,１１１；５,５６３,２５３；５,５７１,７９９；５,５８７,３６１；および 
５,６２５,０５０号が含まれ、それらの中の特定の特許は本出願と共通所有であり、これらの各々は引用することによって本明細書に組み入れられる。
【００３６】
燐原子を含有しない好適な修飾を受けたオリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１種以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって生じたバックボーンを有する。それらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）、シロキサンバックボーン、スルフィド、スルホキサイドおよびスルホンバックボーン、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン、メチレン、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン、アルケン含有バックボーン、スルファメートバックボーン、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン、スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン、アミドバックボーン、そして混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有するバックボーンを有するそれらが含まれる。
【００３７】
上述したオリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許には、これらに限定するものでないが、米国特許第５,０３４,５０６；５,１６６,３１５；５,１８５,４４４；５,２１４,１３４；５,２１６,１４１；５,２３５,０３３；５,２６４,５６２；５,
２６４,５６４；５,４０５,９３８；５,４３４,２５７；５,４６６,６７７；５,４７０,
９６７；５,４８９,６７７；５,５４１,３０７；５,５６１,２２５；５,５９６,０８６；５,６０２,２４０；５,６１０,２８９；５,６０２,２４０；５,６０８,０４６；５,６１
０,２８９；５,６１８,７０４；５,６２３,０７０；５,６６３,３１２；５,６３３,３６
０；５,６７７,４３７；および ５,６７７,４３９号が含まれ、それらの中の特定の特許
は本出願と共通所有であり、これらの各々は引用することによって本明細書に組み入れられる。
【００３８】
他の好適なオリゴヌクレオチド類似物では、糖結合とヌクレオシド間結合、即ちヌクレオチド単位のバックボーンの両方が新規な基に置き換わっている。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリッド形成の目的で保持させる。そのようなある種のオリゴマー状化合物、即ち優れたハイブリッド形成特性を有することを確かめたオリゴヌクレオチド類似物をペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ぶ。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンがアミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンに置き換わっている。その核酸塩基は保持されたままであり、前記バックボーンのアミド部分が有するアザ窒素原子に直接もしくは間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許には、これらに限定するものでないが、米国特許第５，５３９，０８２号、５，７１４，３３１号および５，７１９，２６２号が含まれ、これらの各々は引用することによって本明細書に組み入れられる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示をＮｉｅｌｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７−１５００に見ることができる。
【００３９】
本発明の最も好適な態様は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子バックボーン、特にこの上に示した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［この場合の天然のホスホジエステルバックボーンは−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、およびこの上に示した米国特許第５，６０２，２４０号のアミドバックボーンを有するオリゴヌクレオシドである。また、この上に示した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドも好適である。
【００４０】
また、置換されている糖部分を１つ以上含有するようにオリゴヌクレオチドに修飾を受
けさせることも可能である。好適なオリゴヌクレオチドは、２’位に下記の中の１つを含んで成るオリゴヌクレオチドである：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換されているか或は置換されていないＣ１からＣ１０のアルキルまたはＣ２からＣ１０のアルケニルおよびアルキニルであってもよい）。特にＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ここで、ｎおよびｍは１から約１０である）が好適である。他の好適なオリゴヌクレオチドは２’位に下記の中の１つを含んで成るオリゴヌクレオチドである：Ｃ１からＣ１０の低級アルキル、置換されている低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基（ＲＮＡ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）、レポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、オリゴヌクレオチドの薬物速度論的特性を向上させる基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させる基、そして同様な特性を有する他の置換基。好適な修飾には、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、また２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる］（Ｍａｒｔｉｎ他、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４）、即ちアルコキシアルコキシ基が含まれる。好適なさらなる修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基［また２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる（本明細書の以下に示す実施例に記述する如き）］、そして２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ［本技術分野ではまた２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる］、即ち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２（また本明細書の以下に示す実施例にも記述）が含まれる。
【００４１】
他の好適な修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。また、オリゴヌクレオチドの他の位置に同様な修飾を受けさせることも可能であり、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合したオリゴヌクレオチドの中の糖の３’位、または５’末端ヌクレオチドの５’位に同様な修飾を受けさせることができる。オリゴヌクレオチドにまたペントフラノシル糖の代わりに糖類似物、例えばシクロブチル部分などを持たせることも可能である。そのような修飾を受けさせた糖構造物の調製を教示している代表的な米国特許には、これらに限定するものでないが、米国特許第４,９８１,９５７；５,１１８,８００；５,３１９,０８０；５,３５９,０４４；５,３９３,８７８；５,４
４６,１３７；５,４６６,７８６；５,５１４,７８５；５,５１９,１３４；５,５６７,８
１１；５,５７６,４２７；５,５９１,７２２；５,５９７,９０９；５,６１０,３００；５,６２７,０５３；５,６３９,８７３；５,６４６,２６５；５,６５８,８７３；５,６７０,６３３；および ５,７００,９２０号が含まれ、それらの中の特定の特許は本出願と共通
所有であり、これらの各々は引用することによって全体が本明細書に組み入れられる。
【００４２】
また、オリゴヌクレオチドに含まれる核酸塩基（本技術分野ではしばしば簡単に「塩基」とも呼ばれる）に修飾または置換を受けさせることも可能である。本明細書で用いる如き「未修飾」または「天然」の核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、そしてピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾を受けた核酸塩基には、他の合成もしくは天然の核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、
２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（疑似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロ−メチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザグアニン、そして３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されている核酸塩基、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８−８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されている核酸塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ他、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３に開示されている核酸塩基、そしてＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９−３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編集、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３に開示されている核酸塩基が含まれる。これらの核酸塩基の中の特定の核酸塩基は本発明のオリゴマー状化合物が示す結合親和力を向上させるに特に有用である。それらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、そしてＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを包含）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシン置換は核酸デュプレックス安定性を０．６−１．２℃上昇させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編集、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒａｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９３、２７６−２７８頁）、現在のところ好適な塩基置換であり、それを２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせるのが更により特に好適である。
【００４３】
この上に示した修飾を受けた核酸塩基ばかりでなく他の修飾を受けた核酸塩基の中の特定の核酸塩基の調製を教示している代表的な米国特許には、これらに限定するものでないが、この上に示した米国特許第３，６８７，８０８号ばかりでなく、米国特許第４,８４
５,２０５；５,１３０,３０２；５,１３４,０６６；５,１７５,２７３；５,３６７,０６
６；５,４３２,２７２；５,４５７,１８７；５,４５９,２５５；５,４８４,９０８；５,
５０２,１７７；５,５２５,７１１；５,５５２,５４０；５,５８７,４６９；５,５９４,
１２１；５,５９６,０９１；５,６１４,６１７；および ５,６８１,９４１号（これらの
中の特定の特許は本出願と共通所有であり、これらの各々は引用することによって本明細書に組み入れられる）、そして米国特許第５，７５０，６９２号（これは本出願と共通所有であり、これもまた引用することによって本明細書に組み入れられる）が含まれる。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドに受けさせる別の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞吸収を向上させる１種以上の部分または接合体をオリゴヌクレオチドに化学的に結合させることが含まれる。そのような部分には、これらに限定するものでないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３−６５５６）、コリックアシッド（ｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４、４、１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ他、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．１９９３、３、２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３−５３８）、脂肪鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏ
ａｒａｓ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９１、１０、１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、１９９３、７５、４９−５４）、燐脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ他、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノカルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３−９３７）が含まれる。
【００４５】
そのようなオリゴヌクレオチド接合体の調製を教示している代表的な米国特許には、これらに限定するものでないが、米国特許第４,８２８,９７９；４,９４８,８８２；５,２
１８,１０５；５,５２５,４６５；５,５４１,３１３；５,５４５,７３０；５,５５２,５
３８；５,５７８,７１７；５,５８０,７３１；５,５８０,７３１；５,５９１,５８４；５,１０９,１２４；５,１１８,８０２；５,１３８,０４５；５,４１４,０７７；５,４８６,６０３；５,５１２,４３９；５,５７８,７１８；５,６０８,０４６；４,５８７,０４４；４,６０５,７３５；４,６６７,０２５；４,７６２,７７９；４,７８９,７３７；４,８２
４,９４１；４,８３５,２６３；４,８７６,３３５；４,９０４,５８２；４,９５８,０１
３；５,０８２,８３０；５,１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,０８２,８３０；５,
１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,２４５,０２２；５,２５４,４６９；５,２５８,
５０６；５,２６２,５３６；５,２７２,２５０；５,２９２,８７３；５,３１７,０９８；５,３７１,２４１；５,３９１,７２３；５,４１６,２０３；５,４５１,４６３；５,５１
０,４７５；５,５１２,６６７；５,５１４,７８５；５,５６５,５５２；５,５６７,８１
０；５,５７４,１４２；５,５８５,４８１；５,５８７,３７１；５,５９５,７２６；５,
５９７,６９６；５,５９９,９２３；５,５９９,９２８ および ５,６８８,９４１号（こ
れらの中の特定の特許は本出願と共通所有であり、これらの各々は引用することによって本明細書に組み入れられる）が含まれる。
【００４６】
所定化合物の中のあらゆる位置に修飾を均一に受けさせる必要はなく、実際、上述した修飾の２種以上を単一の化合物の中に組み込んでもよいか或はオリゴヌクレオチドの中のただ１つのヌクレオシドの所に修飾を組み込むことさえ可能である。本発明はまたキメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明の文脈において、「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、化学的に異なる領域を２つ以上含有していて各々が少なくとも１種の単量体単位、即ちオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドで構成されているアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、典型的に、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼによる劣化に対して向上した耐性を示し、細胞吸収が向上しそして／または標的核酸への結合親和力が向上するようにオリゴヌクレオチドが修飾を受けている領域を少なくとも１つ含有する。そのようなオリゴヌクレオチドの追加的領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂させ得る酵素の基質として働き得る領域である。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡストランドを開裂させる細胞エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮアーゼＨを活性化させると結果としてＲＮＡ標的の開裂がもたらされ、それによって、オリゴヌクレオチドが示す遺伝子発現抑制の効率が大きく向上する。その結果として、キメラオリゴヌクレオチドを用いる時、より短いオリゴヌクレオチドを用いたとしても、同じ標的領域とハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキオリゴヌクレ
オチドに比較して相当する結果をしばしば得ることができる。ＲＮＡ標的の開裂はゲル電気泳動法そして必要ならば本分野で公知の関連した核酸ハイブリッド形成技術を用いて常規通り検出可能である。
【００４７】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、この上に記述した如き２種以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド類似物の複合構造物として生成可能である。そのような化合物を本技術分野ではまたハイブリッドまたはギャップマー（ｇａｐｍｅｒｓ）とも呼んでいる。そのようなハイブリッド構造物の調製を教示している代表的な米国特許には、これらに限定するものでないが、米国特許第５,０１３,８３０；５,１４９,７９７；５,２２０,００７；５,２５６,７７５；５,３６６,８７８；５,４０３,７１１；５,４９１,１３３；５,５６５,３５０；５,
６２３,０６５；５,６５２,３５５；５,６５２,３５６；および ５,７００,９２２号（これらの中の特定の特許は本出願と共通所有であり、これらの各々は引用することによって全体が本明細書に組み入れられる）が含まれる。
【００４８】
本発明に従って用いるアンチセンス化合物の製造は良く知られている固相合成技術を用いて便利に常規通り実施可能である。そのような合成で用いるに適した装置をいくつかの売り主が販売しており、そのような売り主には、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が含まれる。そのような合成では本技術分野で公知の他の任意手段を追加的または別法として用いることも可能である。オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートおよびアルキル置換誘導体などの調製でも同様な技術が用いられることは良く知られている。
【００４９】
本発明のアンチセンス化合物はインビトロで合成した化合物であり、これには、生物学的源のアンチセンス組成物もアンチセンス分子のインビボ合成に向けて考案された遺伝的ベクター構築物も含まれない。本発明の化合物の取り上げ、分布および／または吸収を助長する目的で、これをまた他の分子、分子構造物または化合物の混合物、例えばリポソーム、受容体標的分子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、経口、直腸、局所または他の調剤と一緒に混合するか、それらでカプセル封じするか、それらと接合させるか、或は他の様式で一緒にしてもよい。そのような取り上げ、分布および／または吸収を補助する調剤の調製を教示している代表的な米国特許には、これらに限定するものでないが、米国特許第５,１０８,９２１；５,３５４,８４４；５,４１６,０１６；５,４５９,１２７；５,５２１,２９１；５,５４３,１５８；５,５４７,９３２；５,５
８３,０２０；５,５９１,７２１；４,４２６,３３０；４,５３４,８９９；５,０１３,５
５６；５,１０８,９２１；５,２１３,８０４；５,２２７,１７０；５,２６４,２２１；５,３５６,６３３；５,３９５,６１９；５,４１６,０１６；５,４１７,９７８；５,４６２,８５４；５,４６９,８５４；５,５１２,２９５；５,５２７,５２８；５,５３４,２５９；５,５４３,１５２；５,５５６,９４８；５,５８０,５７５；および ５,５９５,７５６号
（これらは各々引用することによって本明細書に組み入れられる）が含まれる。
【００５０】
本発明のアンチセンス化合物には、如何なる薬学的に受け入れられる塩、エステル、前記エステルの塩、またはヒトを包含する動物に投与された時点で生物学的に活性な代謝産物もしくはこれの残基を生じ（直接または間接的に）得る他の如何なる化合物も含まれる。従って、本開示からまた例えば本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に受け入れられる塩、前記プロドラッグの薬学的に受け入れられる塩および他の生体内等価物（ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）も引き出される。
【００５１】
用語「プロドラッグ」は、不活性な形態で調製されていて体またはこれの細胞の中で内因性酵素または他の化学品および／または条件の作用によって活性形態（即ち薬剤）に変化する治療剤を指す。本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンの調製では
、特に、１９９３年１２月９日付けで公開されたＧｏｓｓｅｌｉｎ他のＷＯ  ９３／２４５１０またはＩｍｂａｃｈ他のＷＯ  ９４／２６７６４に開示された方法に従って、それをＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として生じさせる。
【００５２】
用語「薬学的に受け入れられる塩」は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に受け入れられる塩、即ち親化合物の所望生物学的活性を保持していて望まれない毒物学的影響を与えない塩を指す。
【００５３】
金属またはアミン、例えばアルカリおよびアルカリ土類金属などまたは有機アミンを用いて薬学的に受け入れられる塩基付加塩を生じさせる。カチオンとして用いる金属の例はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適切なアミンの例はＮ，Ｎ’−ジベンジル−エチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインである（例えばＢｅｒｇｅ他、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．、１９７７、６６、１−１９を参照）。前記酸性化合物の塩基付加塩の調製では、その遊離酸形態を塩が生じるに充分な量の所望塩基に通常様式で接触させることで調製を行う。その塩形態を酸に接触させそして遊離酸を通常様式で単離することで、その遊離酸形態を再生させてもよい。この遊離酸形態とこれらの個々の塩形態は特定の物性、例えば極性溶媒中の溶解度などの点でいくらか異なるが、他の点では、そのような塩は本発明の目的にとって個々の遊離酸に相当する。本明細書で用いる如き「薬学的付加塩」には、本発明の組成物に含める成分の中の一成分の酸形態の薬学的に受け入れられる塩が含まれる。それらにはアミンの有機もしくは無機酸塩が含まれる。好適な酸塩は塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩および燐酸塩である。他の適切な薬学的に受け入れられる塩は本分野の技術者に良く知られており、それには、いろいろな無機および有機酸、例えば無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸または燐酸など、有機カルボン酸、スルホン酸、スルホもしくはホスホアシッド（ｓｕｌｆｏ  ｏｒ  ｐｈｏｓｐｈｏ  ａｃｉｄ）またはＮ置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、こはく酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、しゅう酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボニックアシッド（ｅｍｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ニコチン酸またはイソニコチン酸など、そしてアミノ酸、例えば現実に蛋白質の合成に関与する２０種類のアルファ−アミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸など、およびまたフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−もしくは３−ホスホグリセレート、グルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの生成を伴う）、または他の酸性有機化合物、例えばアスコルビン酸などの塩基塩が含まれる。化合物の薬学的に受け入れられる塩の調製をまた薬学的に受け入れられるカチオンを用いて行うことも可能である。適切な薬学的に受け入れられるカチオンは本分野の技術者に良く知られており、それにはアルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四級アンモニウムカチオンが含まれる。また、炭酸塩または水素炭酸塩も可能である。
【００５４】
オリゴヌクレオチドの場合の薬学的に受け入れられる塩の好適な例には、これらに限定するものでないが、（ａ）カチオン、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミンおよびスペルミジンなどを用いて生じさせた塩、（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸、硝酸などを用いて生じさせた酸付加塩、（ｃ）有機酸、例えば酢酸、しゅう酸、酒石酸、こはく酸、マレイ
ン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などを用いて生じさせた塩、そして（ｄ）元素状アニオン、例えば塩素、臭素およびヨウ素などを用いて生じさせた塩が含まれる。
【００５５】
本発明のアンチセンス化合物は診断薬、治療薬、予防薬および研究用試薬およびキットとして使用可能である。治療薬の場合、ＰＴＰ１Ｂ発現の調節によって治療可能な病気もしくは障害を有すると思われる動物、好適にはヒトに本発明に従うアンチセンス化合物を投与することで治療を行う。適切な薬学的に受け入れられる希釈剤もしくは担体にアンチセンス化合物を有効量で添加することで本発明の化合物を薬剤組成物の状態で用いてもよい。本発明のアンチセンス化合物の使用および方法はまた予防にも有用であり、例えば感染、炎症または腫瘍の形成などを予防または遅らせる目的などでも使用可能である。
【００５６】
本発明のアンチセンス化合物はＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸とハイブリッドを形成し、それによって、このことを利用してサンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）および他の検定を容易に構築することができることから、本発明のアンチセンス化合物は研究および診断で用いるに有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸が起こすハイブリッド形成は本技術分野で公知の手段を用いて検出可能である。そのような手段には、ある酵素を本オリゴヌクレオチドと接合させること、本オリゴヌクレオチドに放射線標識を付けること、または他の適切な如何なる検出手段も含まれ得る。また、あるサンプルに入っているＰＴＰ１Ｂの濃度を検出する目的でそのような検出手段を用いたキットを調製することも可能である。
【００５７】
本発明は、また、本発明のアンチセンス化合物を含有させた薬剤組成物および調剤も包含する。本発明の薬剤組成物は、望まれる治療が局所であるか或は全身であるかそして治療を受けさせる領域に応じていろいろな様式で投与可能である。投与は局所［眼および粘膜（膣および直腸搬送を包含）を包含］、肺［例えば粉末またはエーロゾルの吸入もしくは通気（噴霧器によるそれらを包含）による］、気管内、鼻内、表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与には静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入、または頭蓋内、例えば鞘内または脳室内投与などが含まれる。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を少なくとも１つ伴うオリゴヌクレオチドは特に経口投与で用いるに有用であると考えている。
【００５８】
局所投与用薬剤組成物および調剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴、座薬、スプレー、液体および粉末が含まれ得る。通常の薬剤担体、水性、粉末状または油状基材、増粘剤などが必要であり得るか或は望ましい可能性がある。また、被覆を受けさせたコンドーム、グローブなども有用であり得る。
【００５９】
経口投与用組成物および調剤には、粉末または顆粒、水または非水性媒体に入っている懸濁液または溶液、カプセル、袋または錠剤が含まれる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい可能性がある。
【００６０】
非経口、鞘内または脳室内投与用の組成物および調剤には、無菌水溶液（これにはまた緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤、例えば、これらに限定するものでないが、浸透強化剤、担体化合物、そして他の薬学的に受け入れられる担体または賦形剤などが入っていてもよい）が含まれ得る。
【００６１】
本発明の製薬学的組成物には、これらに限定するものでないが、溶液、乳液、およびリポソーム含有調剤が含まれる。いろいろな成分を用いてそのような組成物を生じさせるこ
とができ、そのような成分には、これらに限定するものでないが、前以て生じさせておいた液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体が含まれる。
【００６２】
本発明の薬剤組成物を便利には単位投薬形態で存在させてもよく、これの調製は薬剤産業で良く知られている通常技術に従って実施可能である。そのような技術は、本活性材料と薬剤担体１種または２種以上または賦形剤１種または２種以上と一緒にする段階を包含する。一般的には、本活性材料と液状担体もしくは微細固体状担体または両方と均一または密に一緒にした後、必要ならば、その生成物の成形を行うことでそのような調剤を生じさせる。
【００６３】
本発明の組成物は可能ないろいろな投薬形態、例えばこれらに限定するものでないが、錠剤、カプセル、液状シロップ、軟質ゲル、座薬および浣腸などのいずれに調合されてもよい。本発明の組成物をまた水性、非水性または混合媒体に入っている懸濁液として調合することも可能である。水性懸濁液に更にこの懸濁液の粘度を高くする物質を入れてもよく、そのような物質には、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランなどが含まれる。このような懸濁液にまた安定剤を入れることも可能である。
【００６４】
本発明の１つの態様では、本薬剤組成物を発泡体として調合して用いることができる。製薬学的発泡体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏａｍｓ）には、これらに限定するものでないが、エマルジョン、ミクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームなどの如き調剤が含まれる。そのような調剤は基本的には現実に同様であるが、成分および最終生成物の粘ちょう度の点で多様である。そのような組成物および調剤の調製は薬剤および調合技術分野の技術者に一般に良く知られており、本発明の組成物の処方に適用可能である。
【００６５】
エマルジョン：本発明の組成物はエマルジョンとして調製および調合可能である。エマルジョンは典型的に直径が一般に０．１μｍ以上の液滴の形態のある液体が別の液体の中に分散している不均一な系である（Ｉｄｓｏｎ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、１９９頁；Ｒｏｓｏｆｆ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２４５頁；Ｂｌｏｃｋ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第２巻、３３５頁；Ｈｉｇｕｃｈｉ他、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８５、３０１頁）。エマルジョンはしばしば互いに密に混ざり合って分散している２種類の混和しない液相で構成されている２相系である。エマルジョンは一般に油中水（ｗ／ｏ）または水中油（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水相が微細な液滴としてバルクな（ｂｕｌｋ）油相の中に微細分散している時、結果として生じる組成物は油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。別法として、油相が微細な液滴としてバルクな水相の中に微細分散している時、結果として生じる組成物は水中油（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンにそのような分散相に加えて追加的成分を入れることも可能であり、かつ水相または油相のいずれかに入っている溶液またはそれ自身として個別相として存在し得る活性薬剤を入れることも可能である。また、製薬学的賦形剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）、例えば乳化剤、安定剤、色素および抗酸化剤なども必要に応じてエマルジョンの中に存在させることも可能である。製薬学的エマルジョンは、また、例えば油中水中
油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のように、３相以上の相で構成されている多相エマルジョン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）であってもよい。そのような複雑な調剤ではしばしば単に２相のエマルジョンでは得られない特定の利点が得られる。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さい水滴を封じ込めている多相エマルジョンはｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、連続油の中に安定に存在する水滴の中に油滴が封じ込められている系はｏ／ｗ／ｏエマルジョンである。
【００６６】
エマルジョンは熱力学安定性をほとんどか或は全く持たないことを特徴とする。しばしば、このエマルジョンに含まれている分散もしくは不連続相は乳化剤または調剤の粘度によって外部もしくは連続相の中に良好に分散していてそのような形態に維持されている。このエマルジョンに含まれている相のどちらかはエマルジョン型の軟膏ベースおよびクリームの場合のように半固体または固体であってもよい。エマルジョンを安定にする他の手段は乳化剤の使用を伴い、それがエマルジョンに含まれているいずれかの相の中に入り込むようにしてもよい。乳化剤は幅広い意味で下記の４種類に分類分け可能である：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基材（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂａｓｅｓ）および微分散固体［Ｉｄｓｏｎ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、１９９頁］。
【００６７】
合成界面活性剤（また表面活性剤としても知られる）はエマルジョンの処方で幅広く用いられており、文献［Ｒｉｅｇｅｒ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２８５頁；Ｉｄｓｏｎ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、１９８８、第１巻、１９９頁］の中で論評されている。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含んで成る。界面活性剤が示す疎水性に対する親水性の比率は親水／親油均衡（ＨＬＢ）と呼ばれており、これは調剤を調製する時に界面活性剤を分類分けして選択する時の価値有る道具である。界面活性剤は親水性基の性質を基にして下記のいろいろな種類に分類分け可能である：非イオン性、アニオン性、カチオン性および両性［Ｒｉｅｇｅｒ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２８５頁］。
【００６８】
エマルジョン調剤で用いられる天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアカシアが含まれる。吸収基材、例えば無水ラノリンおよび親水性ワセリンなどは親水性特性を有し、その結果として、それらは水を吸い込んでｗ／ｏエマルジョンを形成し得るが、それらの半固体粘ちょう度を保持している。また、微細固体も特に界面活性剤と組み合わせて良好な乳化剤として粘性のある調剤の中で用いられる。それらには極性のある無機固体、例えば重金属の水酸化物、膨潤しない粘土、例えばベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モントモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウムなど、顔料および非極性固体、例えば炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどが含まれる。
【００６９】
エマルジョン調剤にはまた多種多様な非乳化性材料も入っており、それらはエマルジョンの特性に寄与する。それらには脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、浸潤薬、親水性コロイド、防腐剤および抗酸化剤が含まれる［Ｂｌｏｃｋ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニ
ューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、３３５頁；Ｉｄｓｏｎ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、１９９頁］。
【００７０】
親水性コロイドまたはヒドロコロイドには、天然に存在するゴムおよび合成重合体、例えば多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーゴム、カラヤゴムおよびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）および合成重合体［例えばカルボマー（ｃａｒｂｏｍｅｒｓ）、セルロースエーテルおよびカルボキシビニル重合体］が含まれる。それらは水の中に分散または膨潤してコロイド溶液を形成し、これは、分散相液滴の回りに強力な界面膜を形成しかつ外部相の粘度を高くすることでエマルジョンを安定にする。
【００７１】
エマルジョンにはしばしばいろいろな材料、例えば炭水化物、蛋白質、ステロールおよびホスファチド（これらは微生物の増殖を容易に支援し得る）が入っていることから、そのような調剤にはしばしば防腐剤が添加される。エマルジョン調剤に入れて通常用いられる防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸が含まれる。また、エマルジョン調剤の劣化を防止する目的で一般に抗酸化剤もそのような調剤に添加される。用いられる抗酸化剤はフリーラジカル捕捉剤、例えばトコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなど、または還元剤、例えばアスコルビン酸および異性重亜硫酸ナトリウムなど、そして抗酸化剤相乗剤、例えばクエン酸、酒石酸およびレシチンなどであり得る。
【００７２】
皮膚科学的、経口および非経口経路によるエマルジョン調剤の投与およびそれらの製造方法が文献の中で論評されている［Ｉｄｓｏｎ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、１９９頁］。経口搬送用エマルジョン調剤は処方が容易なことと吸収および生利用性の観点の効率が理由で非常に幅広く用いられている［Ｒｏｓｏｆｆ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２４５頁；Ｉｄｓｏｎ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、１９９頁］。鉱油が基になった下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調剤がとりわけｏ／ｗエマルジョンとして通常経口投与される材料である。
【００７３】
本発明の１つの態様では、オリゴヌクレオチドと核酸の組成物をミクロエマルジョンとして調合する。ミクロエマルジョンは水と油と両親媒剤の系として定義可能であり、これは光学的に等方性で熱力学に安定な単一の液状溶液である［Ｒｏｓｏｆｆ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２４５頁］。ミクロエマルジョンは、典型的に、油を最初に水性界面活性剤溶液の中に分散させた後に４番目の成分、一般的には中間的鎖長のアルコールを透明な系が生じるに充分な量で添加することで生じさせた系である。従って、ミクロエマルジョンは、また、混和しない２種類の液体が表面活性分子の界面膜で安定化を受けている熱力学に安定で等方的に透明な分散液であるとして記述されている［ＬｅｕｎｇおよびＳｈａｈ、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．編集
、１９８９、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１８５−２１５頁」。ミクロエマルジョンの調製は一般に３種類から５種類の成分（これには油、水、界面活性剤、共界面活性剤および電解質が含まれる）を組み合わせることで行われる。このミクロエマルジョンの種類が油中水（ｗ／ｏ）型であるか或は水中油（ｏ／ｗ）型であるかは用いられた油および界面活性剤の特性および界面活性剤分子が有する極性頭および炭化水素尾の構造および幾何学的パッキングに依存する。［Ｓｃｏｔｔ、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８５、２７１頁］。
【００７４】
相ダイアグラム（ｐｈａｓｅ  ｄｉａｇｒａｍｓ）を用いた現象学的アプローチが広範に研究されてきており、どのようにすればミクロエマルジョンを生じさせることができるかに関する総括的な知識が本分野の技術者にもたらされた［Ｒｏｓｏｆｆ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２４５頁；Ｂｌｏｃｋ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、３３５頁］。ミクロエマルジョンは通常のエマルジョンに比較して自然発生的に生じた熱力学的に安定な液滴の構成の中に水に不溶な薬剤を溶解させることができると言った利点を与える。
【００７５】
ミクロエマルジョンの調製で用いられる界面活性剤には、これらに限定するものでないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセスキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が含まれ、これらは単独または共界面活性剤と一緒に用いられる。共界面活性剤、通常は短鎖のアルコール、例えばエタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールなどは、界面活性剤分子の間に空隙空間部が生じることから界面活性剤膜の中に入り込む結果として無秩序な膜を作り出すことによって界面の流動性を高くする働きをする。しかしながら、共界面活性剤を用いないでミクロエマルジョンを生じさせることも可能であり、かつアルコールを含まない自己乳化性ミクロエマルジョン系も本技術分野で公知である。その水相は、典型的に、これらに限定するものでないが、薬剤、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコール誘導体の水溶液、水などであり得る。油相には、これらに限定するものでないが、Ｃａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中程度の鎖長（Ｃ８−Ｃ１２）のモノ、ジおよびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコンオイルなどの如き材料が含まれ得る。
【００７６】
ミクロエマルジョンは特に薬剤を溶解させかつ薬剤の吸収を向上させると言った観点から興味が持たれる。脂質が基になったミクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）を用いて薬剤（ペプチドを包含）の経口生利用性を向上させることが提案された［Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ他、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、１１、１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ、Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９３、１３、２０５］。ミクロエマルジョンは薬剤の溶解性を向上させ、薬剤を酵素による加水分解から保護し、膜流動性および透過性が界面
活性剤によって誘発されて変化することが理由で薬剤の吸収を向上させる可能性があり、調製が容易であり、固体状投薬形態に比べて経口投与が容易であり、臨床的効力を向上させ、そして毒性を低くすると言った利点を与える［Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ他、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、１１、１３８５；Ｈｏ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９６、８５、１３８−１４３］。ミクロエマルジョンは、しばしば、これらの成分を周囲温度で一緒にすると自然発生的に生じ得る。このことは熱に不安定な薬剤、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを処方する時に特に有利であり得る。ミクロエマルジョンはまた化粧用途および薬剤用途の両方の活性成分を経皮搬送する時にも有効であった。本発明のミクロエマルジョン組成物および調剤はオリゴヌクレオチドおよび核酸が胃腸管から全身に吸収される度合を向上させるに役立つばかりでなくオリゴヌクレオチドおよび核酸が胃腸管、膣、頬空洞部および他の投与領域の中で局所的に細胞によって吸収される度合を向上させることは予想外であった。
【００７７】
また、本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の処方特性を向上させかつそれらの吸収性を向上させる目的で、本発明のミクロエマルジョンに追加的成分および添加剤、例えばソルビタンのモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ  ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透向上剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）などを含有させることも可能である。本発明のミクロエマルジョンで用いる浸透向上剤は、下記の５種類の幅広い分類：界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、およびキレート剤でも界面活性剤でもないものの中の１つに属するとして分類分け可能である［Ｌｅｅ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁］。これらの種類の各々はこの上で考察したそれである。
【００７８】
リポソーム：薬剤の処方で試験して用いたミクロエマルジョン以外に数多くの組織化された界面活性剤構造物（ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）が存在する。それらには単層、ミセル、２層およびベシクルが含まれる。ベシクル、例えばリポソームなどは薬剤搬送の観点でそれらが与える特異性および作用持続性が理由で多大な興味を集めている。本発明で用いる如き用語「リポソーム」は、球形の２層または２層以上の状態で配列している両親媒性脂質で構成されているベシクルを意味する。
【００７９】
リポソームは、親油性材料で構成されている膜と水性内部を有する単層もしくは多層ベシクルである。前記水性部分に搬送すべき組成物を含有させる。カチオン性リポソームは細胞壁に融合し得ると言った利点を有する。非カチオン性のリポソームは、同様な効率で細胞壁と融合する能力は持たないが、インビボでマクロファージによって吸収される。
【００８０】
脂質ベシクルが哺乳動物の無傷の皮膚を通り抜けるようにするには、各々が５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細な孔を適切な経皮勾配（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）の影響下で通り抜けるようにすべきである。従って、非常に変形し易くかつそのような微細な孔を通り抜け得るリポソームの使用が望ましい。
【００８１】
リポソームのさらなる利点には下記が含まれる：天然の燐脂質を用いて得たリポソームは生適合性で生分解性であり、リポソームに幅広い範囲の水溶性および脂質溶解性薬剤を取り込ませることができ、リポソームはこれの内部の部屋の中にカプセル封じされている薬剤を代謝および劣化から保護し得る［Ｒｏｓｏｆｆ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編集）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２４５頁］。リポソーム調剤を調製する時の重要な考慮は脂質表面の帯電、ベシクルの大きさおよびリポソームの水性体積である。
【００８２】
リポソームは活性材料を作用部位に移送および搬送するに有用である。リポソームの膜
は構造的に生物学的膜に類似していることから、リポソームを組織に付着させると、そのリポソームは細胞膜に併合され始める。このリポソームと細胞の併合が進行するにつれて、リポソームの内容物が出て細胞の中に入って、その細胞の中で活性剤が作用を示すようになり得る。
【００８３】
リポソーム調剤はいろいろな薬剤の搬送様式として広範な調査の焦点であった。局所投与に関して、リポソームは他の調剤に比べていくつかの利点を与えると言った証拠が現れてきている。そのような利点には、投薬された薬剤が高い度合で全身に吸収されることに関連して副作用が低いこと、投与された薬剤が所望標的の所に蓄積する度合が高いこと、そして幅広く多様な薬剤（親水性および疎水性の両方）を皮膚に投与することが可能になることが含まれる。
【００８４】
リポソームを用いて作用剤（高分子量のＤＮＡを包含）を皮膚に搬送することができることを詳細に示している報告がいくつか存在する。皮膚に投与された化合物には鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量のＤＮＡが含まれる。大部分の用途で結果として行われたのは上表皮を標的にしたものであった。
【００８５】
リポソームは幅広く２種類に分類分けされる。カチオン性リポソームは正に帯電しているリポソームであり、これは負に帯電しているＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する。この正に帯電しているＤＮＡ／リポソーム複合体は負に帯電している細胞表面と結合して、エンドソームの中に入り込む。そのエンドソームの中のｐＨは酸性であることから、そのリポソームは崩壊し、その結果として、その内容物が放出されて細胞の細胞質の中に入り込む［Ｗａｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８７、１４７、９８０−９８５］。
【００８６】
ｐＨに敏感であるか或は負に帯電しているリポソームはＤＮＡと複合体を形成しないでＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡの帯電と脂質の帯電は両方とも類似していることから、複合体の生成が起こるよりも反発が起こる。それにも拘らず、そのようなリポソームの水性内部の中にＤＮＡがいくらか捕捉される。ｐＨに敏感なリポソームを用いてチミジンキナーゼ遺伝子をコード化するＤＮＡを培養物の中の細胞単層に搬送することが行われた。その標的細胞の中で外因性遺伝子が発現することが検出された［Ｚｈｏｕ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９２、１９、２６９−２７４］。
【００８７】
１つの主要な種類のリポソーム組成物は、天然由来のホスファチジルコリンではない燐脂質を含有する組成物である。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を用いると中性のリポソーム組成物が生じ得る。一般に、ジミリストイルホスファチジルコリンを用いるとアニオン性リポソーム組成物が生じるが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を用いると主にアニオン性の融合性リポソームが生じる。例えば、大豆のホスファチジルコリン（ＰＣ）および卵のＰＣなどの如きＰＣを用いると別の種類のリポソーム組成物が生じる。燐脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物を用いると別の種類が生じる。
【００８８】
いくつかの研究でリポソーム型薬剤調剤（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）を皮膚に局所搬送することが評価された。インターフェロンを含有させておいたリポソームをモルモットの皮膚に塗布すると結果として皮膚のヘルペスただれの軽減がもたらされたが、インターフェロンを別の手段（例えば溶液または乳液として）で搬送しても有効でなかった［Ｗｅｉｎｅｒ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９２、２、４０５−４１０］。更に、追加的試験で、インターフェロンをリポソーム調剤の一部として投与した時の効力と水系を用いてインターフェロンを投
与した場合の試験が行われ、その結論は、リポソーム型調剤の方が水系投与よりも優れていると言った結論であった［ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ他、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓａｒｃｈ、１９９２、１８、２５９−２６５］。
【００８９】
非イオン性のリポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含んで成る系にもまた薬剤を皮膚に搬送する時の有用性を測定する試験を受けさせた。ＮｏｖａｓｏｍｅＪ  Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅＪ  ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含んで成る非イオン性リポソーム型調剤を用いてシクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮に搬送することも行われた。結果としてそのような非イオン性のリポソーム系はシクロスポリン−Ａを皮膚のいろいろな層に付着させるのを容易にするに有効であることが示された［Ｈｕ他、Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、１９９４、４、６、４６６］。
【００９０】
リポソームにはまた「立体的に安定な」リポソームも含まれ、その用語を本明細書で用いる場合、これは、リポソームの中に取り込まれた時に結果としてそれの循環寿命（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ）を向上させる１種以上の特殊な脂質を含んで成るリポソームを指す（そのような特殊な脂質を含有させていないリポソームに比較して）。立体的に安定なリポソームの例は、（Ａ）リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が１種以上の糖脂質、例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１などを含んで成るリポソームであるか、或は（Ｂ）１種以上の親水性重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などを用いて誘導されたリポソームである。如何なる特別な理論でも範囲を限定することを望むものでないが、本技術分野では、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ誘導脂質を含有する立体的に安定なリポソームにおいてそのような立体的に安定なリポソームが向上した循環半減期を有するのはそれが網内皮細胞系（ＲＥＳ）の細胞の中に吸収される度合が低いことによると考えられている［Ａｌｌｅｎ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８７、２２３、４２；Ｗｕ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、３７６５］。１種以上の糖脂質を含んで成るいろいろなリポソームが本技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ他［Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８７、５０７、６４］はモノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールがリポソームの血液半減期を向上させる能力を有することを報告した。そのような発見をＧａｂｉｚｏｎ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８８、８５、６９４９］が明瞭に詳しく説明した。米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ  ８８／０４９２４［両方ともＡｌｌｅｎ他］に、（１）スフィンゴミエリンと（２）ガングリオシドＧＭ１もしくはガラクトセレブロシドの硫酸エステルを含んで成るリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂ他）にスフィンゴミエリンを含んで成るリポソームが開示されている。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含んで成るリポソームがＷＯ  ９７／１３４９９（Ｌｉｍ他）に開示されている。
【００９１】
１種以上の親水性重合体を用いて誘導された脂質を含んで成るいろいろなリポソームおよびそれらの製造方法は本技術分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏ他［Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、１９８０、５３、２７７８］は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性洗浄剤である２Ｃ１２１５Ｇを含んで成るリポソームを記述した。Ｉｌｌｕｍ他［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９８４、１６７、７９］は、ポリスチレン粒子を高分子量のグリコールで親水性被覆すると結果としてそれの血液半減期が有意に向上することを示した。合成燐脂質にポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボキシル基を結合させてそれに修飾を受けさせることをＳｅａｒｓが記述している［米国特許第４，４２６，３３０号および４，５３４，８９９号］。Ｋｌｉｂａｎｏｖ他［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２６８、２３５］は、ＰＥＧもしくはＰＥＧステアレートを用いて誘導されたホス
ファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含んで成るリポソームはそれの血液循環半減期が有意に向上することを示す実験を記述した。Ｂｌｕｍｅ他［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１９９０、１０２９、９１］は、そのような観察を他のＰＥＧ誘導燐脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧを組み合わせることで生じさせたＤＳＰＥ−ＰＥＧなどに拡張した。外側表面に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームがＦｉｓｈｅｒ他のヨーロッパ特許番号ＥＰ  ０  ４４５  １３１  Ｂ１およびＷＯ  ９０／０４３８４に記述されている。ＰＥＧを用いて誘導されたＰＥを１−２０モルパーセント含有するリポソーム組成物およびそれの使用方法をＷｏｏｄｌｅ他［米国特許第５，０１３，５５６号および５，３５６，６３３号］およびＭａｒｔｉｎ他［米国特許第５，２１３，８０４号およびヨーロッパ特許番号ＥＰ  ０  ４９６  ８１３  Ｂ１］が記述している。他のいろいろな脂質−重合体接合体を含んで成るリポソームがＷＯ  ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２［両方ともＭａｒｔｉｎ他］およびＷＯ  ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙ他）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含んで成るリポソームがＷＯ  ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉ他）に記述されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉ他）および５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａ他）にＰＥＧ含有リポソームが記述されており、それの表面に官能部分を用いた誘導化を更に受けさせてもよい。
【００９２】
本技術分野で公知の核酸含有リポソームの数は限られている。Ｔｈｉｅｒｒｙ他のＷＯ
９６／４００６２には高分子量の核酸をリポソームの中にカプセル封じする方法が開示されている。Ｔａｇａｗａ他の米国特許第５，２６４，２２１号には、蛋白質と結合したリポソームが開示されており、かつそのようなリポソームの内容物にはアンチセンスＲＮＡが含まれ得ると主張されている。Ｒａｈｍａｎ他の米国特許第５，６６５，７１０号には、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームの中にカプセル封じする特定の方法が記述されている。Ｌｏｖｅ他のＷＯ  ９７／０４７８７にｒａｆ遺伝子を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んで成るリポソームが開示されている。
【００９３】
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅｓ）が更に別な種類のリポソームであり、これは非常に変形し得る脂質凝集物であり、これは薬剤搬送用媒体の魅力的な候補品である。トランスファーソームは脂質滴として記述可能であり、これらは非常に変形し得ることから、前記滴より小さい孔の中を容易に通り抜ける。トランスファーソームはこれらが用いられる環境に適合し、例えばこれらは自己最適化を行い（皮膚の中の孔の形状に適合し）、自己修復し、しばしば断片化を起こすことなく標的に到達しかつしばしば自己充填を行う（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）。トランスファーソームを形成させる時、標準的なリポソーム組成物に表面縁活性化剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）、通常は界面活性剤を添加することができる。トランスファーソームは血清アルブミンを皮膚に搬送する目的で用いられてきた。トランスファーソームを媒介して血清アルブミンを搬送した時に得られる効果は血清アルブミンを入れた溶液を皮下注射した時の効果と同等であることが示された。
【００９４】
界面活性剤はエマルジョン（ミクロエマルジョンを包含）およびリポソームなどの如き調剤で幅広い用途を有する。天然および合成両方の多種多様な界面活性剤を分類分けしそしてそれらの特性に等級を付ける最も一般的な方法は、親水／親油均衡（ＨＬＢ）を用いる方法である。親水性基（また「頭」としても知られる）の性質を用いると、調剤で用いられるいろいろな界面活性剤を分類分けする最も有効な手段を得ることができる［Ｒｉｅｇｅｒ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、１９８８、２８５頁］。
【００９５】
界面活性剤の分子がイオン化しない場合、これは非イオン性界面活性剤として分類分けされる。非イオン性界面活性剤は薬剤および化粧品で幅広く用いられていて、幅広い範囲
のｐＨ値に渡って使用可能である。それらが示すＨＬＢ値は一般にそれらの構造に応じて２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、非イオン性エステル、例えばエチレングリコールのエステル、プロピレングリコールのエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンのエステル、スクロースのエステルおよびエトキシル化エステル（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｅｓｔｅｒｓ）などが含まれる。また、非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば脂肪アルコールのエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロック重合体もそのような種類に含まれる。このようなポリオキシエチレン界面活性剤が非イオン性界面活性剤の種類の最も一般的な員である。
【００９６】
界面活性剤分子を水に溶解または分散させた時にそれが負の電荷を持つ場合、そのような界面活性剤はアニオン性として分類分けされる。アニオン性界面活性剤には、カルボン酸塩、例えば石鹸など、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなど、スルホン酸塩、例えばアルキルベンゼンスルホン酸塩など、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、および燐酸塩が含まれる。アニオン性界面活性剤の種類の最も重要な員は硫酸アルキルおよび石鹸である。
【００９７】
界面活性剤分子を水に溶解もしくは分散させた時にそれが正電荷を持つ場合、そのような界面活性剤はカチオン性として分類分けされる。カチオン性界面活性剤には第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩がこの種類の最も用いられる員である。
【００９８】
界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれも持つ能力を有する場合、そのような界面活性剤は両性として分類分けされる。両性界面活性剤にはアクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが含まれる。
【００９９】
界面活性剤を薬剤製品、調剤およびエマルジョンで用いることは論評されている［Ｒｉｅｇｅｒ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、１９８８、２８５頁］。
【０１００】
浸透向上剤：本発明では、１つの態様において、核酸、特にオリゴヌクレオチドを動物の皮膚に効率良く搬送する目的でいろいろな浸透向上剤を用いる。大部分の薬剤はイオン化形態および非イオン化形態の両方で溶液の中に存在する。しかしながら、細胞膜を容易に通り抜けるのは一般に脂質可溶性もしくは親油性薬剤のみである。通り抜けさせるべき膜を浸透向上剤で処理しておくと非親油性薬剤でさえ細胞膜を通り抜けることができることを見いだした。浸透向上剤は非親油性薬剤が細胞膜を通り抜けて拡散するのを補助することに加えて親油性薬剤の透過性も向上させる。
【０１０１】
浸透向上剤は下記の５種類の幅広い分類、即ち界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、およびキレート剤でも界面活性剤でもないものの中の１つに属するとして分類分け可能である［Ｌｅｅ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁］。上述した種類の浸透補助剤の各々を以下により詳細に記述する。
【０１０２】
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解した時にその溶液の表面張力を低くするか或はその水溶液と別の液体の間の界面張力を低くする結果としてオリゴヌクレオチドが粘膜を通して吸収される度合を向上させる化学構成要素である。そのような浸透向上剤には、胆汁塩および脂肪酸に加えて、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチ
レン−２０−セチルエーテル［Ｌｅｅ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁］およびパーフルオロケミカルエマルジョン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）、例えばＦＣ−４３など［Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８８、４０、２５２］が含まれる。
【０１０３】
脂肪酸：浸透向上剤として働くいろいろな脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロールの１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、そしてそれらのモノ−およびジグリセリド（即ちオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレートなど）が含まれる［Ｌｅｅ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９２、４４、６５１−６５４］。
【０１０４】
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂肪溶解性ビタミンの分散および吸収の助長が含まれる［Ｂｒｕｎｔｏｎ、３８章「Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第９版、Ｈａｒｄｍａｎ他編集、ＭａＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク、１９９６、９３４−９３５頁］。いろいろな天然の胆汁塩およびこれらの合成誘導体が浸透向上剤として働く。従って、用語「胆汁塩」には、胆汁の天然に存在する成分のいずれも含まれるばかりでなくそれらの合成誘導体のいずれも含まれる。本発明の胆汁塩には、例えばコール酸（またはこれの薬学的に受け入れられるナトリウム塩、即ちコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる［Ｌｅｅ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁；Ｓｗｉｎｙａｒｄ、３９章「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、７８２−７８３頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ
Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９２、２６３、２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９０、７９、５７９−５８３］。
【０１０５】
キレート剤：本発明に関連して用いる如きキレート剤は、金属イオンと錯体を形成することでそれを溶液から除去する結果としてオリゴヌクレオチドが粘膜を通して吸収される度合を向上させる化合物であるとして定義可能である。キレート剤を本発明で浸透向上剤として用いることに関して、それらはまたＤＮアーゼ阻害剤としても働くと言った追加的
利点が得られる、と言うのは、特徴付けが成された大部分のＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用で二価の金属を必要とし、従ってキレート剤によって阻害されるからである［Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９９３、６１８、３１５−３３９］。本発明のキレート剤には、これらに限定するものでないが、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩およびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９およびベータ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれる［Ｌｅｅ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｂｕｕｒ他、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．、１９９０、１４、４３−５１］。
【０１０６】
キレート剤でも界面活性剤でもないもの：キレート剤でも界面活性剤でもない浸透向上用化合物を本明細書で用いる場合、これは、キレート剤としても界面活性剤としても有意な活性を示さないがそれにも拘らずオリゴヌクレオチドが消化粘膜（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｍｕｃｏｓａ）を通して吸収される度合を向上させる化合物であるとして定義可能である［Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３］。この種類の浸透向上剤には、例えば不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体［Ｌｅｅ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁］および非ステロイド系抗炎症剤、例えばジクロフェナックナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン［Ｙａｍａｓｈｉｔａ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８７、３９、６２１−６２６］が含まれる。
【０１０７】
また、オリゴヌクレオチドが細胞レベルで吸収される度合を向上させる作用剤を本発明の薬剤および他の組成物に添加することも可能である。また、例えばカチオン性脂質、例えばリポフェクチン［Ｊｕｎｉｃｈｉ他、米国特許第５，７０５，１８８号］、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えばポリリジン［Ｌｏｌｌｏ他、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９７／３０７３１］などもオリゴヌクレオチドの細胞吸収を向上させることが知られている。
【０１０８】
投与した核酸の浸透を向上させる他の作用剤を用いることも可能であり、それらにはグリコール、例えばエチレングリコールおよびプロピレングリコールなど、ピロール、例えば２−ピロールなど、アゾン、およびテルペン、例えばリモネンおよびメントンなどが含まれる。
【０１０９】
担体：本発明の特定の組成物では、また、担体化合物を調剤の中に混合する。本明細書で用いる如き「担体化合物」または「担体」は、例えば生物学的活性のある核酸を劣化させるか或はそれが循環から除去されるのを助長することなどで生物学的活性核酸の生利用性を低下させるインビボ過程で核酸として認識されはするが不活性である（即ち本質的に生物学的活性を持たない）核酸もしくは核酸類似物を指し得る。核酸を担体化合物と一緒に典型的には後者の物質を過剰量で用いて一緒に投与すると、結果として、肝臓、腎臓または他の循環外貯蔵場所（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ）の中で核酸が回収される量が実質的に少なくなる可能性があり、これは、恐らくは、その担体化合物と核酸が共通の受容体に関して競合することによるものであろう。例えば、部分的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と一緒に投与すると肝組織の中で回収されるそれの量が少なくなり得る［Ｍｉｙ
ａｏ他、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、１９９５、５、１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ他、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、１９９６、６、１７７−１８３］。
【０１１０】
賦形剤：「製薬学的担体」または「賦形剤」は、担体化合物とは対照的に、薬学的に受け入れられる溶媒、懸濁剤、または１種以上の核酸を動物に搬送するに適した他のいずれかの薬理学的に不活性な媒体である。そのような賦形剤は液体または固体であってもよく、核酸および所定製薬学的組成物の他の成分と一緒にした時に所望のバルク（ｂｕｌｋ）、粘ちょう度などを与えるように、思い描いた投与様式に伴って選択される。典型的な製薬学的担体には、これらに限定するものでないが、結合剤（例えば前以てゼラチン状にしておいたトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填材（例えばラクトースおよび他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたは燐酸水素カルシウムなど）；滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属のステアリン酸塩、水添植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれる。
【０１１１】
また、非腸管外投与の場合に用いるに適した薬学的に受け入れられる有機もしくは無機賦形剤（核酸と有害に反応しない）を用いて本発明の組成物を調合することも可能である。適切な薬学的に受け入れられる担体には、これらに限定するものでないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性のあるパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれる。
【０１１２】
核酸の局所投与に適した調剤には、核酸の無菌および非無菌水溶液、普通の溶媒、例えばアルコールなど中の非水性溶液、または液状もしくは固体状の油基材中の溶液が含まれ得る。これらの溶液にまた緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤を入れることも可能である。非腸管外投与で用いるに適していて核酸と有害に反応しない薬学的に受け入れられる有機もしくは無機賦形剤を用いることができる。
【０１１３】
適切な薬学的に受け入れられる賦形剤には、これらに限定するものでないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性のあるパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれる。
【０１１４】
他の成分：本発明の組成物に追加的に薬剤組成物に通常見られる他の付随的成分も本技術分野で確立された使用濃度で含有させることも可能である。従って、本組成物に例えば適合し得る薬学的に活性な追加的材料、例えばかゆみ止め、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤などを入れてもよく、或は本発明の組成物のいろいろな投薬形態を物理的に調製する時に用いるに有用な追加的材料、例えば色素、風味剤、防腐剤、抗酸化剤、不透明化剤、増粘剤および安定剤などを入れることも可能である。しかしながら、そのような材料を添加する場合には、それらが本発明の組成物に含める成分の生物学的活性を不必要に妨害しないようにすべきである。本調剤に殺菌を受けさせてもよく、望まれるならば、それを本調剤の核酸１種または２種以上と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、緩衝剤、着色剤、風味剤および／または芳香族物質などと混合してもよい。
【０１１５】
水性懸濁液の粘度を高くする物質（例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソ
ルビトールおよび／またはデキストランなど包含）を水性懸濁液に入れてもよい。この懸濁液にまた安定剤を入れることも可能である。
【０１１６】
本発明の特定態様では、（ａ）１種以上のアンチセンス化合物と（ｂ）アンチセンス機構でない機構で機能する他の１種以上の化学治療剤を含有させた薬剤組成物を提供する。そのような化学治療剤の例には、これらに限定するものでないが、抗癌薬、例えばダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトマイシン、窒素マスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウロジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルキシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が含まれる。一般的には、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ
Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１５版、Ｂｅｒｋｏｗ他編集、１９８７、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、１２０６−１２２８頁を参照のこと。本発明の組成物にまた抗炎症薬（これらに限定するものでないが、非ステロイド系抗炎症薬およびコルチコステロイドが含まれる）および抗ウイルス薬（これらに限定するものでないが、リビヴィリン、ヴィラダビン、アシクロヴィルおよびガンシクロヴィルが含まれる）を混合することも可能である。一般的には、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１５版、Ｂｅｒｋｏｗ他編集、１９８７、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．のそれぞれ２４９９−２５０６および４６−４９頁を参照のこと。また、アンチセンス化学治療剤でない他の治療剤も本発明の範囲内である。化合物を２種以上組み合わせる時にはそれらを一緒または逐次的に用いてもよい。
【０１１７】
別の関連態様では、本発明の組成物に１番目の核酸を標的にする１種以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドと２番目の核酸標的を標的にする１種以上の追加的アンチセンス化合物を含有させてもよい。本技術分野ではアンチセンス化合物のいろいろな例が知られている。２種以上の化合物を組み合わせる場合にはそれらを一緒または逐次的に用いてもよい。
【０１１８】
治療用組成物の処方そしてその後のそれらの投与は本技術分野の技術の範囲内であると考えている。投薬は治療を受けさせる病気の状態のひどさおよび反応に依存し、治療期間は数日間から数カ月間であるか、或は治癒されるか或は病気の状態が軽減されるまでである。最適な投薬スケジュールは患者の体の中に蓄積した薬剤を測定することで計算可能である。通常の技術者は最適な投薬量、投薬方法および反復率を容易に決定することができるであろう。最適な投薬量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変わり得るが、一般的には、インビトロおよびインビボ動物モデルで効果があると測定されたＥＣ５０を基にして推測可能である。投薬量は一般に体重１ｋｇ当たり０．０１ｕｇから１００ｇであり、これの投与は日、週、月または年に１回以上、または２から２０年毎に１回であってもよい。本技術分野の通常の技術者は、体液または組織の中に当該薬剤が滞留する時間および濃度を測定することを基にして投薬の反復率を容易に推測することができるであろう。治療が成功裏に成された後、その患者が病気状態を再発しないように維持療法を受けさせるのが望ましい可能性があり、その場合には本オリゴヌクレオチドを維持投薬量、即ち体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇの範囲の量で日に１回以上から２０年毎に１回の割合で投与する。
【０１１９】
本発明を本発明の特定の好適な態様に従って具体的に記述してきたが、以下の実施例は本発明を単に説明する目的で示すものであり、本発明を限定することを意図するものでない。
【０１２０】
実施例
【実施例１】
【０１２１】
オリゴヌクレオチド合成用ヌクレオシドホスホルアミダイト  デオキシおよび２’−アルコキシアミダイト
２’−デオキシおよび２’−メトキシベータ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトを商業源（例えばＣｈｅｍｇｅｎｅｓ、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡまたはＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）から購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイト（ａｍｉｄｉｔｅｓ）を米国特許第５，５０６，３５１号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして調製する。２’−アルコキシアミダイトを用いて合成したオリゴヌクレオチドでは、テトラゾールおよび塩基をパルス搬送（ｐｕｌｓｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）した後の待機段階（ｗａｉｔ  ｓｔｅｐ）を長くして３６０秒にすることを除いて未修飾オリゴヌクレオチド用標準的サイクルを利用した。
【０１２２】
公開された方法（Ｓａｎｇｈｖｉ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、２１、３１９７−３２０３）に従い、市販のホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡまたはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）を用いて、５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを合成した。
２’−フルオロアミダイト
（ａ）２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
２’−フルオロオリゴヌクレオチドの合成を以前に記述されたようにして行った［Ｋａｗａｓａｋｉ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９３、３６、８３１−８４１および米国特許第５，６７０，６３３号（引用することによって本明細書に組み入れられる）］。簡単に述べると、市販の９−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発材料として用いそして文献の手順に修飾を受けさせた手順（この手順では、２’−アルファ−フルオロ原子を２’−ベータ−トリチル基のＳＮ２−置換で導入する）を用いて、保護されたヌクレオシドであるＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを合成した。このように、Ｎ６−ベンゾイル−９−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンに選択的保護を３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として中程度の収率で受けさせた。標準的方法を用いて前記ＴＨＰおよびＮ６−ベンゾイル基の脱保護を達成し、そして標準的な方法を用いて５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイト中間体を得た。
（ｂ）２’−フルオロデオキシグアノシン
テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）で保護されている９−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発材料として用いそしてそれを中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンに変化させることを通して、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成を達成した。前記ＴＰＤＳ基の脱保護の後にヒドロキシル基をＴＨＰで保護することでジイソブチリルジ−ＴＨＰで保護されたアラビノフラノシルグアニンを得た。その粗生成物に選択的Ｏ−脱アシル化およびトリフレーション（ｔｒｉｆｌａｔｉｏｎ）を受けさせた後、フッ化物による処理を受けさせ、次にＴＨＰ基の脱保護を行った。標準的方法を用いて５’−ＤＭＴ−および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイトを得た。
（ｃ）２’−フルオロウリジン
文献の手順に修飾を受けさせた手順を用いて２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成を達成したが、この手順では、２，２’−アンヒドロ−１−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルに７０％のフッ化水素−ピリジンを用いた処理を受けさせた。標準的手順を用いて５’−ＤＭＴおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。
（ｄ）２’−フルオロデオキシシチジン
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンにアミノ化を受けさせた後に選択的保護を受
けさせてＮ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得ることを通して、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンの合成を行った。標準的手順を用いて５’−ＤＭＴ−および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイトを得た。
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト
２’−Ｏ−メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトの調製を下記のようにか或は別法としてＭａｒｔｉｎ，Ｐ．、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４の方法に従って行う。
（ａ）２，２’−アンヒドロ［１−（ベータ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン
５−メチルウリジン（リボシルチミン、Ｙａｍａｓａ、銚子、日本から商業的に入手可能）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ、０．４２０Ｍ）および重炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。この混合物を撹拌しつつ還流にまで加熱しながら発生する二酸化炭素ガスを制御様式で放出させた。１時間後、若干暗色の溶液に濃縮を減圧下で受けさせた。その結果として得たシロップをジエチルエーテル（２．５Ｌ）に撹拌しながら注ぎ込んだ。生成物がゴムを形成した。エーテルを傾斜法で除去した後、その残留物を最小量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解させた。その溶液を新鮮なエーテル（２．５Ｌ）に注ぎ込むと堅いゴムが生じた。そのエーテルを傾斜法で除去した後、そのゴムを真空オーブンで乾燥（１ｍｍＨｇ下６０℃で２４時間）させることで固体を得た後、これを粉砕して明黄褐色の粉末にした（５７ｇ、粗収率８５％）。そのＮＭＲスペクトルはその構造に一致しており、フェノールがこれのナトリウム塩として混入していた（約５％）。この材料をさらなる反応でそのまま用いた［または、酢酸エチル中のメタノールの勾配（１０−２５％）を用いたカラムクロマトグラフィーで更に精製することで融点が２２２−４℃の白色固体を得ることができる］。
（ｂ）２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２Ｌのステンレス鋼製圧力槽に２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ、０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を入れた後、それを前以て１６０℃に加熱しておいたオイルバスの中に入れた。前記槽を１５５−１６℃に４８時間加熱した後、それを開けて、溶液を蒸発乾固させた後、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と一緒にすり潰した。その残留物を熱アセトン（１Ｌ）に入れて懸濁させた。不溶な塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄した後、その濾液に蒸発を受けさせた。その残留物（２８０ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解させた後、蒸発させた。Ｅｔ３ＮＨを０．５％含有させておいたＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）をシリカゲルカラム（３ｋｇ）に充填した。前記残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）に溶解させた後、それを前記カラムに充填する前に、シリカ（１５０ｇ）に吸着させておいた。前記充填用溶媒（ｐａｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｖｅｎｔ）を用いて生成物を溶離させることで生成物を１６０ｇ（６３％）得た。低純度の画分を再処理することで追加的材料を得た。
（ｃ）２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と一緒に蒸発させた後、その乾燥させた残留物をピリジン（１．３Ｌ）に溶解させた。最初の一定分量のジメトキシトリチルクロライド（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を加えた後、その混合物を室温で１時間撹拌した。２番目の一定分量のジメトキシトリチルクロライド（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を加えた後、その反応物を更に１時間撹拌した。次に、メタノール（１７０ｍＬ）を添加して反応を停止させた。ＨＰＬＣは生成物が約７０％存在することを示していた。溶媒を蒸発させた後、ＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）を用いたすり潰しを行った。その残留物をＣＨＣｌ３（１．５Ｌ）に溶解させた後、２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３および２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。その有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した後、蒸発させた。残留物を２７５ｇ得た。その残留物を３．５ｋｇのシリカゲルカラムにかけて、Ｅｔ３ＮＨを０．５％含有させて
おいたＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）を充填して溶離を起こさせることで精製を行った。高純度を画分に蒸発を受けさせることで生成物を１６４ｇ得た。低純度の画分から追加的に約２０ｇ得ることで全体収量が１８３ｇ（５７％）になった。
（ｄ）３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦと１８８ｍＬのピリジンから生じさせた３：１の混合物を７５０ｍＬ）および無水酢酸（２４．３８ｍＬ、０．２５８Ｍ）を一緒にして室温で２４時間撹拌した。ＴＬＣ用サンプルに最初にＭｅＯＨを添加してクエンチさせ、反応をＴＬＣで監視した。ＴＬＣで判断して反応が完了した時点でＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加えた後、その混合物に蒸発を３５℃で受けさせた。その残留物をＣＨＣｌ３（８００ｍＬ）に溶解させた後、２ｘ２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウムおよび２ｘ２００の飽和ＮａＣｌで抽出した。その水層に逆抽出を２００ｍＬのＣＨＣｌ３を用いて受けさせた。その有機物を一緒にして硫酸ナトリウムで乾燥させた後、蒸発させることで残留物を１２２ｇ得た（生成物を約９０％）。その残留物を３．５ｋｇのシリカゲルカラムにかけてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶離させることで精製を行った。高純度生成物画分に蒸発を受けさせることで９６ｇ（８４％）得た。その後の画分から追加的に１．５ｇ回収した。
（ｅ）３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解させることで１番目の溶液を調製してとって置いた。トリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）に入れることで生じさせた溶液にトリエチルアミン（１８９ｍＬ、１．４４Ｍ）を加え、−５℃に冷却しそして塔頂撹拌機を用いて０．５時間撹拌した。この溶液を０−１０℃に維持しつつ撹拌しながらこれにＰＯＣｌ３を３０分かけて滴下した後、その結果として得た混合物を更に２時間撹拌した。この後者の溶液に前記１番目の溶液を４５分かけて滴下した。その結果として得た反応混合物を冷室に入れて一晩貯蔵した。この反応混合物から塩を濾過した後、その溶液に蒸発を受けさせた。その残留物をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解させた後、不溶固体を濾過で除去した。その濾液を１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ３そして２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、蒸発させた。その残留物をＥｔＯＡｃと一緒にすり潰すことで表題の化合物を得た。
（ｆ）２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）をジオキサン（５００ｍＬ）とＮＨ４ＯＨ（３０ｍＬ）に入れることで生じさせた溶液を室温で２時間撹拌した。このジオキサン溶液に蒸発を受けさせた後、その残留物にＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）を用いた共沸を受けさせた。その残留物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解させた後、２リットルのステンレス鋼製圧力槽に移した。ＮＨ３ガスで飽和状態にしておいたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加えた後、前記槽を１００℃に２時間加熱した（ＴＬＣで変換が完了したことが分かった）。前記槽の内容物に蒸発乾固を受けさせた後、その残留物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解させて飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。その有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を蒸発させることで、表題の化合物を８５ｇ（９５％）得た。
（ｇ）Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解させた後、撹拌しながら無水安息香酸（３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を加えた。撹拌を３時間行った後、ＴＬＣで反応がほぼ９５％完了したことが分かった。溶媒を蒸発させた後、その残留物にＭｅＯＨ（２００ｍ
Ｌ）を用いた共沸を受けさせた。その残留物をＣＨＣｌ３（７００ｍＬ）に溶解させて、飽和ＮａＨＣＯ３（２ｘ３００ｍＬ）そして飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた後、蒸発させることで残留物（９６ｇ）を得た。その残留物を１．５ｋｇのシリカカラムを用いたクロマトグラフィーにかけてＥｔ３ＮＨを０．５％含有させておいたＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶離用溶媒として用いた。高純度の生成物画分に蒸発を受けさせることで表題の化合物を９０ｇ（９０％）得た。
（ｈ）Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）をＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）に溶解させた。撹拌を窒素雰囲気下で行いながらテトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ）を加えた。その結果として得た混合物を室温で２０時間撹拌した（ＴＬＣで反応が９５％完了したことが分かった）。この反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１ｘ３００ｍＬ）そして飽和ＮａＣｌ（３ｘ２００ｍＬ）で抽出した。その水性洗浄液にＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）による逆抽出を受けさせ、その抽出液を一緒にし、ＭｇＳＯ４で乾燥させた後、濃縮した。その得た残留物を１．５ｋｇのシリカカラムを用いたクロマトグラフィーにかけてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶離用溶媒として用いた。高純度画分を一緒にすることで表題の化合物を９０．６ｇ（８７％）得た。
２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
（ａ）２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［本技術分野ではまた２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる］を下記のパラグラフに記述する如く調製する。環外アミン（ｅｘｏｃｙｃｌｉｃ  ａｍｉｎｅｓ）に保護をアデノシンおよびシチジンの場合にはベンゾイル部分で受けさせそしてグアノシンの場合にはイソブチリルで受けさせることを除いて、アデノシン、シチジンおよびグアノシンヌクレオシドアミダイトの調製をチミジン（５−メチルウリジン）と同様に行う。
（ｂ）５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン
乾燥ピリジン（５００ｍｌ）をアルゴン雰囲気下周囲温度で機械的に撹拌しながらこれにＯ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．、Ｖａｒｅｓｅ、イタリア、１００．０ｇ、０．４１６ミリモル）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ｇ、０．０１３当量、０．００５４ミリモル）を溶解させた。ｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ、１１９．０ｍＬ、１．１当量、０．４５８ミリモル）を一度に加えた。この反応物を周囲温度で１６時間撹拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ  ０．２２、酢酸エチル）で反応が完了したことが分かった。その溶液に濃縮を減圧下で受けさせることで濃密な油を得た。これをジクロロメタン（１Ｌ）と飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ１  Ｌ）と食塩水（１Ｌ）の間で分離させた。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で濃縮することで濃密な油を得た。この油を酢酸エチルとエチルエーテルが１：１の混合物（６００ｍＬ）に溶解させた後、その溶液を−１０℃に冷却した。その結果として生じた結晶性生成物を濾過で集め、エチルエーテル（３ｘ２００ｍＬ）で洗浄した後、乾燥（４０℃、１ｍｍＨｇ、２４時間）させることで、白色固体を１４９ｇ（７４．８％）得た。ＴＬＣおよびＮＭＲは高純度生成物に一致していた。
（ｃ）５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２Ｌのステンレス鋼製非撹拌型圧力反応槽にテトラヒドロフラン中のボラン（１．０Ｍ、２．０当量、６２２ｍＬ）を入れた。フュームフード（ｆｕｍｅ  ｈｏｏｄ）内で撹拌を手で行いながら最初にエチレングリコール（３５０ｍＬ、過剰量）を水素ガスの発生が
静まるまで注意深く加えた。撹拌を手で行いながら５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ、０．３１１モル）および重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ、０．００３当量）を加えた。その反応槽を密封してオイルバスで１６０℃の内部温度に到達するまで加熱した後、１６時間保持した（圧力＜１００ｐｓｉｇ）。この反応槽を周囲条件になるまで冷却して開けた。ＴＬＣ（所望生成物のＲｆは０．６７でありそしてａｒａ−Ｔ副生成物である酢酸エチルのＲｆは０．８２である）で生成物をもたらす変換率が約７０％であることが分かった。副生成物が追加的に生じないようにする目的で反応を停止させ、エチレングリコールを除去する目的でより極端な条件を用いて減圧（１０から１ｍｍＨｇ）下の濃縮を温水浴（４０−１００℃）中で行った［別法として、低沸点の溶媒を出て行かせた後、残存する溶液を酢酸エチルと水の間で分離させてもよい。生成物は有機相の中に入るであろう］。その残留物をカラムクロマトグラフィー（２ｋｇのシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサンが１：１から４：１に至る勾配）で精製した。適切な画分を一緒にし、それにストリッピングを受けさせ（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）た後、それを乾燥させることで生成物を脆い白色発泡体として得たが（８４ｇ、５０％）、これには出発材料（１７．４ｇ）および再使用可能な高純度の出発材料（２０ｇ）が混入していた。回収した低純度の出発材料である出発材料を基にした収率は５８％であった。ＴＬＣおよびＮＭＲは純度が９９％の生成物に一致していた。
（ｄ）２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ、３６．９８ミリモル）とトリフェニルホスフィン（１１．６３ｇ、４４．３６ミリモル）とＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ｇ、４４．３６ミリモル）を混合した。次に、Ｐ２Ｏ５を用いてそれを高真空下４０℃で２日間乾燥させた。この反応混合物をアルゴンでフラッシュ洗浄した後、乾燥ＴＨＦ（３６９．８ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ、しっかりと密封されたボトル）を加えることで透明な溶液を得た。この反応混合物にジエチル−アゾジカルボキシレート（６．９８ｍＬ、４４．３６ミリモル）を滴下した。この滴下速度を結果として生じる暗赤色の色が次の滴を添加する前にちょうど消失するように維持する。添加終了後の反応物を４時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサンが６０：４０）でその時までに反応が完了していたことが分かった。溶媒を真空下で蒸発させた。得た残留物をフラッシュカラムの上に置いて酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶離させることで、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色発泡体として得た（２１．８１９ｇ、８６％）。
（ｅ）５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ、４．５ミリモル）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ｍＬ）に溶解させた後、−１０℃から０℃でメチルヒドラジン（３００ｍＬ、４．６４ミリモル）を滴下した。１時間後、その混合物を濾過し、その濾液を氷冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、有機相を一緒にして水そして食塩水で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶液に濃縮を受けさせることで２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得た後、これをＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）に溶解させた。これにホルムアルデヒド（２０％水溶液、重量／重量１．１当量）を加えた後、その結果として得た混合物を１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物をクロマトグラフィーにかけることで５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白色発泡体として得た（１．９５ｇ、７８％）
（ｆ）５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン
乾燥ＭｅＯＨ中１Ｍのｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）溶液（３０．６ｍＬ）に５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシ
ミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ、３．１２ミリモル）を溶解させた。この溶液に不活性雰囲気下１０℃でシアノホウ水素化ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ミリモル）を加えた。この反応混合物を１０℃で１０分間撹拌した。その後、反応槽を氷浴から取り出し、撹拌を室温で２時間行いながら反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の５％のＭｅＯＨ）で監視した。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％、１０ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、蒸発乾固させた。残留物をＭｅＯＨ中１ＭのＰＰＴＳ溶液（３０．６ｍＬ）に溶解させた。ホルムアルデヒド（２０％重量／重量、３０ｍＬ、３．３７ミリモル）を加えた後、この反応混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物を氷浴に入れて１０℃に冷却し、シアノホウ水素化ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ミリモル）を加えた後、この反応混合物を１０℃で１０分間撹拌した。１０分後、この反応混合物を氷浴から取り出して室温で２時間撹拌した。この反応混合物に５％のＮａＨＣＯ３溶液（２５ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル（２ｘ２５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、蒸発乾固させた。得た残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけてＣＨ２Ｃｌ２中５％のＭｅＯＨで溶離させて精製することで、５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを白色発泡体として得た（１４．６ｇ、８０％）。
（ｇ）２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
三フッ化水素酸トリエチルアミン（３．９１ｍＬ、２４．０ミリモル）を乾燥ＴＨＦとトリエチルアミン（１．６７ｍＬ、１２ミリモル、乾燥、ＫＯＨ上に保存）に溶解させた。次に、このトリエチルアミン−２ＨＦの混合物に５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１．４０ｇ、２．４ミリモル）を加えた後、室温で２４時間撹拌した。反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の５％のＭｅＯＨ）で監視した。溶媒を真空下で除去した後、その残留物をフラッシュカラムの上に置いてＣＨ２Ｃｌ２中１０％のＭｅＯＨで溶離させることで、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジンを得た（７６６ｍｇ、９２．５％）。
（ｈ）５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
Ｐ２Ｏ５を用いて２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ、２．１７ミリモル）を高真空下４０℃で一晩乾燥させた。次に、それを無水ピリジン（２０ｍＬ）と一緒に蒸発させた。その得た残留物をアルゴン雰囲気下でピリジン（１１ｍＬ）に溶解させた。この混合物に４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ｍｇ、２．６０ミリモル）、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（８８０ｍｇ、２．６０ミリモル）を加えた後、この反応混合物を室温で出発材料が全部消失するまで撹拌した。ピリジンを真空下で除去した後、その残留物をカラムクロマトグラフィーにかけてＣＨ２Ｃｌ２中１０％のＭｅＯＨ（ピリジンを数滴入れておいた）で溶離させることで、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジンを得た（１．１３ｇ、８０％）。
（ｉ）５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ｇ、１．６７ミリモル）をトルエン（２０ｍＬ）と一緒に蒸発させた。その残留物にＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ｇ、１．６７ミリモル）を加えた後、Ｐ２Ｏ５を用いて高真空下４０℃で一晩乾燥させた。次に、この反応混合物を無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）に溶解させた後、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトライソプロピルホスホルアミダイト（２．１２ｍＬ、６．０８ミリモル）を加えた。この反応混合物を不活性雰囲気下周囲温度で４時間撹拌した。この反応の進行をＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル  １：１）で監視した。溶媒を蒸発させた後、その残留物を
酢酸エチル（７０ｍＬ）に溶解させて５％のＮａＨＣＯ３水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、濃縮した。得た残留物をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチルを溶離剤として）にかけることで５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を発泡体として得た（１．０４ｇ、７４．９％）。
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［本技術分野ではまた２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる］を下記のパラグラフに記述する如く調製する。アデノシン、シチジンおよびチミジンのヌクレオシドアミダイトも同様に調製する。
Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］
ジアミノプリンリボシド（ｒｉｂｏｓｉｄｅ）に選択的２’−Ｏ−アルキル置換を受けさせることで２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類似物を得ることができる。ジアミノプリンリボシドを数グラムの量でＳｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ（ベルリン）から購入して、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを少量の３’−Ｏ−異性体と一緒に生じさせることができる。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを溶解させた後、アデノシンデアミナーゼで処理することで、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変化させることができる（ＭｃＧｅｅ，Ｄ．Ｐ．Ｃ．、Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．、Ｇｕｉｎｏｓｓｏ，Ｃ．Ｊ．、ＷＯ  ９４／０２５０１  Ａ１  ９４０２０３）。標準的な保護手順を用いて２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンと２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを生じさせるべきであり、それらに還元を受けさせることで、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを生じさせることができる。この上に示したように、ヒドロキシル基をＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応によってＮ−ヒドロキシフタルイミドで置換してもよく、そのようにして保護を受けさせたヌクレオシドに通常通りホスフィチル化を受けさせる（ｐｈｓｐｈｉｔｙｌａｔｅｄ）ことで、Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を生じさせることができる。
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト［本技術分野ではまた２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、即ち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２または２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとしても知られる］を下記の如く調製する。他のヌクレオシドアミダイトも同様に調製する。
２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン
ボランをテトラヒドロフランに入れることで生じさせた溶液（１Ｍ、１０ｍＬ、１０ミリモル）を１００ｍＬのボンベに入れて撹拌しながらこれに２［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ、６．６６ｇ、５０ミリモル）をゆっくり加える。固体が溶解するにつれて水素ガスが発生する。Ｏ２−，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．２ｇ、５ミリモル）および重炭酸ナトリウム（２．５ｍｇ）を加えた後、前記ボンベを密封し、オイルバスに入れて１５５℃に２６時間加熱する。このボンベを室温に冷却した後、開けた。その粗溶液に濃縮を受けさせた後、その残留物を水（２００ｍＬ）とヘキサン（２００ｍＬ）の間で分離させる。過剰量のフェノールをヘキサン層で抽出する。その水層を酢酸エチル（３ｘ２００ｍＬ）で抽出した後、その有機層を一緒にし
て水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮した。その残留物をシリカゲルカラムにかけて１：２０のメタノール／塩化メチレン（トリエチルアミンを２％入れた）を溶離剤として用いる。カラムの画分に濃縮を受けさせると無色の固体が生じ、これを集めることで表題の化合物を白色固体として得た。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン
０．５ｇ（１．３ミリモル）の２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジンを無水ピリジン（８ｍＬ）に入れて、これにトリエチルアミン（０．３６ｍＬ）およびジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴ−Ｃｌ、０．８７ｇ、２当量）を加えた後、１時間撹拌した。この反応混合物を水（２００ｍＬ）の中に注ぎ込んだ後、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ２００ｍＬ）で抽出した。そのＣＨ２Ｃｌ２層を一緒にして飽和ＮａＨＣＯ３溶液に続いて飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ３Ｎ（２０：１、体積／体積、トリエチルアミンが１％）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにかけることで、表題の化合物を得た。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン（２．１７ｇ、３ミリモル）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解させることで生じさせた溶液にジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ｇ）および２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（１．１ｍＬ、２当量）をアルゴン雰囲気下で加える。この反応混合物を一晩撹拌した後、溶媒を蒸発させる。その結果として得た残留物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて酢酸エチルを溶離剤として用いて精製することで表題の化合物を得た。
【実施例２】
【０１２３】
オリゴヌクレオチド合成
ヨウ素による酸化を伴う標準的ホスホルアミダイト化学を用いて未置換および置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）で合成する。
【０１２４】
ホスファイト結合に段階的チア化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）を受けさせる目的で標準的酸化用ボトルにアセトニトリル中０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキサイド溶液による交換を受けさせる以外はホスホジエステルオリゴヌクレオチドの場合と同様にしてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を合成する。チア化待機段階（ｔｈｉａｔｉｏｎ  ｗａｉｔ  ｓｔｅｐ）を長くして６８秒間にし、その後にキャッピング段階（ｃａｐｐｉｎｇ  ｓｔｅｐ）を設けた。ＣＰＧカラムを用いた開裂そして濃水酸化アンモニウムを５５℃で用いた脱ブロック（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）（１８時間）の後、０．５ＭのＮａＣｌ溶液にエタノールを２．５倍体積入れて沈澱を起こさせることを２回行うことでオリゴヌクレオチドを精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを米国特許第５，５０８，２７０号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして調製する。
【０１２５】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドの調製を米国特許第４，４６９，８６３号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドの調製を米国特許第５，６１０，２８９号または５，６２５，０５０号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。ホスホルアミダイトリゴヌクレオチドの調製を米国特許第５，２５６，７７６号または米国特許第５，３６６，８７８号（引用する
ことによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドの調製を公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれＷＯ  ９４／１７０９３およびＷＯ  ９４／０２４９９として公開）（引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの調製を米国特許第５，４７６，９２５号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドの調製を米国特許第５，０２３，２４３号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドの調製を米国特許第５，１３０，３０２号および米国特許第５，１７７，１９８号（両方とも引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。
【実施例３】
【０１２６】
オリゴヌクレオシド合成
メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（またＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても識別する）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（またＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても識別する）、メチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（またアミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても識別する）およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（またアミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても識別する）ばかりでなく、例えばＭＭＩとＰ＝ＯもしくはＰ＝Ｓ結合が交互に存在する混合バックボーン化合物（ｍｉｘｅｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）の調製も米国特許第５，３７８，８２５号、５，３８６，０２３号、５，４８９，６７７号、５，６０２，２４０号および５，６１０，２８９号（これらの全部は引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。
【０１２７】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタールで連結しているオリゴヌクレオシドの調製を米国特許第５，２６４，５６２号および５，２６４，５６４号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。エチレンオキサイドで連結しているオリゴヌクレオシドの調製を米国特許第５，２２３，６１８号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているようにして行う。
【実施例４】
【０１２８】
ＰＮＡの合成
Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、４、５−２３に示されているいろいろな手順の中のいずれかに従ってペプチド核酸（ＰＮＡ）の調製を行う。それらの調製をまた米国特許第５，５３９，０８２号、５，７００，９２２号および５，７１９，２６２号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に従って行うことも可能である。
【実施例５】
【０１２９】
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドには異なる数種類があり得る。それらには、連結ヌクレオシドの「ギャップ（ｇａｐ）」セグメントが連結ヌクレオシドの５’と３’「ウィング（ｗｉｎｇ）」セグメントの間に位置する１番目の種類、そして「ギャップ」セグメントがオリゴマー状化合物の３’もしくは５’末端のいずれかに位置する２番目の「開放末端（ｏｐｅｎ  ｅｎｄ）」型が含まれる。１番目の種類のオリゴヌクレオチドはまた本技術分野で「
ギャップマー（ｇａｐｍｅｒｓ）」またはギャップト（ｇａｐｐｅｄ）オリゴヌクレオチドとしても知られる。２番目の種類のオリゴヌクレオチドはまた本技術分野で「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒｓ）」または「ウィングマー（ｗｉｎｇｍｅｒｓ）」としても知られる。
［２’−Ｏ−ＭＥ］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−ＭＥ］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートと２’−デオキシホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドの合成を上述した如きＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動ＤＮＡ合成装置モデル３８０Ｂを用いて行う。前記自動合成装置を用い、ＤＮＡ部分に２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを用いかつ５’および３’ウィングに５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成する。テトラゾールおよび塩基を送り込んだ後の待機段階を長くして６００秒にしてＲＮＡでは４回繰り返しそして２’−Ｏ−メチルでは２回繰り返すと言った修飾を標準的合成サイクルに受けさせた。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から開裂させ、そしてホスフェート基に脱保護を３：１のアンモニア／エタノール中で室温において一晩受けさせた後、凍結乾燥を受けさせた。次に、あらゆる塩基に脱保護を受けさせる目的でアンモニアのメタノール溶液中の処理を室温で２４時間行った後、そのサンプルに再び凍結乾燥を受けさせた。そのペレットをＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦに入れて再懸濁させて室温に２４時間置くことで２’位に脱保護を受けさせる。次に、この反応物に１ＭのＴＥＡＡを用いたクエンチを受けさせ、そのサンプルの体積をロトバク（ｒｏｔｏｖａｃ）で１／２にまで小さくした後、それに脱塩をＧ２５サイズ排除カラムを用いて受けさせた。次に、その回収したオリゴ（ｏｌｉｇｏ）に分光光度計による分析を収率に関して受けさせかつ毛細管電気泳動法および質量分光法による分析を純度に関して受けさせた。
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［−２’−Ｏ−メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの調製をこの上に２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドで示した手順に従って行ったが、ここでは、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを用いた。
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドの調製をこの上に２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドで示した手順に従って行ったが、ここでは、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを用い、ヨウ素による酸化でキメラ構造物のウィング部分の中にホスホジエステルヌクレオチド間結合を生じさせかつ３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキサイド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いた硫化で中心のギャップにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生じさせる。
【０１３０】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドの合成を米国特許第５，６２３，０６５号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に従って行う。
【実施例６】
【０１３１】
オリゴヌクレオチドの単離
制御された孔を有するガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを開裂させ、そしてそれに脱ブロックを５５
℃の濃水酸化アンモニウム中で１８時間受けさせた後、０．５ＭのＮａＣｌに２．５倍体積のエタノールを入れることで起こさせる沈澱を２回受けさせることで精製を行った。合成したオリゴヌクレオチドに変性ゲル使用ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分析を受けさせることで、その材料は少なくとも全長の８５％であると判断した。合成で得たホスホロチオエート結合とホスホジエステル結合の相対量を定期的に３１Ｐ核磁気共鳴分光法で検査し、そしていくつかの試験では、オリゴヌクレオチドにＨＰＬＣによる精製をＣｈｉａｎｇ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６、１８１６２−１８１７１に記述されているようにして受けさせた。ＨＰＬＣによる精製を受けさせた材料を用いて得た結果はＨＰＬＣによる精製を受けさせていない材料を用いた時に得た結果と同様であった。
【実施例７】
【０１３２】
オリゴヌクレオチド合成−９６個ウエルプレートフォーマット（９６  ＷＥＬＬ  ＰＬＡＴＥ  ＦＯＲＭＡＴ）
９６個の配列を標準的９６個ウエルフォーマットの状態で同時に組み立てることが可能な自動合成装置を用いた固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホルアミダイト化学でオリゴヌクレオチドの合成を行った。ヨウ素水溶液を用いた酸化でホスホジエステルヌクレオチド間結合を生じさせた。３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキサイド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を無水アセトニトリルに入れて用いる硫化でホスホルチオエートヌクレオチド間結合を生じさせた。標準的塩基で保護されているベータ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトを商業的売り主（例えばＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡまたはＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。標準的でないヌクレオシドに関しては、それらの合成を公知文献または特許方法に従って行う。それらを塩基で保護されているベータ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして用いる。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドを支持体から開裂させ、それに脱保護を高温（５５−６０℃）の濃ＮＨ４ＯＨを用いて１２−１６時間受けさせた後、その放出された生成物を真空下で乾燥させた。次に、その乾燥させた生成物を無菌水に入れて再び懸濁させることでマスタープレートを生じさせ、その後、それを用いて、あらゆる分析および試験プレートサンプルに希釈をロボットピペッターで受けさせた。
【実施例８】
【０１３４】
オリゴヌクレオチド分析−９６個ウエルプレートフォーマット
サンプルの希釈および紫外線吸収分光測定を用いて各ウエルに入っているオリゴヌクレオチドの濃度を評価した。９６個ウエルフォーマット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＪ  ＭＤＱ）を用いて個々の産物の完全長性を毛細管電気泳動法（ＣＥ）で評価するか、或は個別に調製したサンプルの場合には、市販のＣＥ装置（例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＪ  ５０００、ＡＢＩ  ２７０）を用いて評価した。エレクトロスプレー質量分析を用いて化合物の質量分析を行うことで塩基およびバックボーンの組成を立証した。単一および多チャンネル（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｎｎｅｌ）のロボットピペッターを用いてあらゆる検定用試験プレートに希釈をマスタープレートを用いて受けさせた。プレート上の化合物の少なくとも８５％が全長の少なくとも８５％であるならばそのようなプレートは受け入れられると判断した。
【実施例９】
【０１３５】
細胞培養およびオリゴヌクレオチド処置
アンチセンス化合物が標的核酸発現に対して示す効果をいろいろな細胞型のいずれに関しても試験することができるが、その標的核酸が測定可能濃度で存在することを条件とする。これの測定は例えばＰＣＲまたはノーザンブロット分析を用いて常規通り実施可能で
ある。下記の５種類の細胞を説明の目的で示すが、標的が選択した種類の細胞の中で発現することを条件として他の種類の細胞も常規通り使用可能である。これの測定は本技術分野で常規の方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護検定またはＲＴ−ＰＣＲなどを用いて容易に実施可能である。
Ｔ−２４細胞：
ヒト転移性細胞である膀胱癌細胞系Ｔ−２４をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。Ｔ−２４細胞の培養を、常規通り、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を１０％、ペニシリンを１ｍＬ当たり１００単位およびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を１ｍＬ当たり１００ミクログラム補充しておいた完全ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の中で行った。細胞が９０％コンフルエンスに到達した時点でそれにトリプシン処理および希釈を受けさせることで常規通り継代を受けさせた。細胞をＲＴ−ＰＣＲ分析で用いる場合には、それを９６個ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）にウエル１個当たり７０００個の細胞密度で種付けした。
【０１３６】
ノーザンブロッティングまたは他の分析の場合には、細胞を１００ｍｍまたは他の標準的組織培養プレートに種付けすることも可能であり、そして培地およびオリゴヌクレオチドを適切な体積で用いて同様に処置してもよい。
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌細胞系Ａ５４９をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。Ａ５４９細胞の培養を、常規通り、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を１０％、ペニシリンを１ｍＬ当たり１００単位およびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を１ｍＬ当たり１００ミクログラム補充しておいたＤＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の中で行った。細胞が９０％コンフルエンスに到達した時点でそれにトリプシン処理および希釈を受けさせることで常規通り継代を受けさせた。
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  ＭＤ）から入手した。ＮＨＤＦ細胞を、常規通り、供給業者が推奨したように補充しておいた線維芽細胞増殖用培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  ＭＤ）の中に保持した。細胞を供給業者が推奨するように１０継代に及んで保持した。
ＨＥＫ細胞：
ヒト胎芽ケラチノサイト（ＨＥＫ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  ＭＤ）から入手した。ＨＥＫを、常規通り、供給業者が推奨するように調合したケラチノサイト増殖用培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  ＭＤ）の中に保持した。細胞を供給業者が推奨するように常規通り１０継代に及んで保持した。
ＰＣ−１２細胞：
ラットニューロン細胞系ＰＣ−１２をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。ＰＣ−１２細胞の培養を、常規通り、１０％ウマ血清＋５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を補充しておいた高グルコースのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の中で行った。細胞が９０％コンフルエンスに到達した時点でそれにトリプシン
処理および希釈を受けさせることで常規通り継代を受けさせた。細胞をＲＴ−ＰＣＲ分析で用いる場合には、それを９６個ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）にウエル１個当たり２００００個の細胞密度で種付けした。
【０１３７】
ノーザンブロッティングまたは他の分析の場合には、細胞を１００ｍｍまたは他の標準的組織培養プレートに種付けすることも可能であり、そして培地およびオリゴヌクレオチドを適切な体積で用いて同様に処置してもよい。
アンチセンス化合物を用いた処置：
細胞が８０％コンフルエンスに到達した時点でそれらにオリゴヌクレオチドを用いた処置を受けさせた。細胞を９６個ウエルプレートで増殖させる場合には、ウエルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＪ−１還元血清培地（ｒｅｄｕｃｅｄ−ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄した後、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＪ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を３．７５μｇ／ｍＬ入れておいた１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＪ−１および所望濃度のオリゴヌクレオチドで処置した。処置を４−７時間行った後、前記培地を新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチドで処置して１６−２４時間後に細胞を収穫した。
【０１３８】
用いたオリゴヌクレオチドの濃度は細胞系から細胞系で異なる。個々の細胞系に最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定する目的で、その細胞を正の対照であるオリゴヌクレオチドである範囲の濃度に渡って処置する。ヒト細胞の場合の正の対照であるオリゴヌクレオチドは、ヒトＨ−ｒａｓを標的にするＩＳＩＳ  １３９２０、即ちＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ、配列識別番号：１、ホスホロチオエートバックボーン含有２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルをアンダーラインで示す）である。マウスまたはラットの細胞の場合の正の対照であるオリゴヌクレオチドは、マウスおよびラット両方のｃ−ｒａｆを標的にするＩＳＩＳ  １５７７０、即ちＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡ、配列識別番号：２、ホスホロチオエートバックボーン含有２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルをアンダーラインで示す）である。次に、正の対照であるオリゴヌクレオチドの濃度を結果としてｃ−Ｈａ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ  １３９２０の場合）またはｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ  １５７７０の場合）のｍＲＮＡが８０％阻害される濃度にして、それを次に行う当該細胞系の実験で用いる新規なオリゴヌクレオチドの選別用濃度として用いる。８０％阻害が達成されない場合には、Ｈ−ｒａｓまたはｃ−ｒａｆのｍＲＮＡの６０％阻害をもたらす正の対照であるオリゴヌクレオチドの最低濃度を次に行う当該細胞系の実験で用いるオリゴヌクレオチド選別用濃度として用いる。６０％阻害が達成されない場合には、そのような特別な細胞系はオリゴヌクレオチド移入実験で用いるに適さないと見なす。
【実施例１０】
【０１３９】
オリゴヌクレオチドが示すＰＴＰ１Ｂ発現抑制の分析
ＰＴＰ１Ｂ発現のアンチセンス調節を本技術分野で公知のいろいろな方法で検定することができる。例えばＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡの濃度の場合、例えばノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などを用いて濃度を量化することができる。現在のところリアルタイム定量ＰＣＲが好適である。全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに関してＲＮＡ分析を実施することができる。ＲＮＡ単離方法は例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、４．１．１−４．２．９および４．５．１−４．５．３頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９３などに教示されている。ノーザンブロット分析は本技術分野で常規の分析であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、４．２．１−４．２．９頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９６などに教示されている。リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、
ＣＡから入手可能な市販のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＪ  ７７００配列検出装置を製造業者の指示に従って用いることで便利に達成可能である。定量ＰＣＲ分析を行う前に、測定すべき標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブセット（ｐｒｉｍｅｒ−ｐｒｏｂｅ  ｓｅｔｓ）にそれらがＧＡＰＤＨ増幅反応で「マルチプレックスされ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）」得るか否かの評価を受けさせる。マルチプレクシング（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）では、標的遺伝子と内部標準遺伝子であるＧＡＰＤＨの両方が単一サンプルの中で同時に増幅される。この分析では、未処置の細胞から単離したｍＲＮＡに順次希釈を受けさせる。各希釈物に増幅をＧＡＰＤＨのみにか、標準遺伝子のみ（「シングル−プレキシング（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）」）にか或は両方（マルチプレキシング）に特異的なプライマー−プローブセットの存在下で受けさせる。ＰＣＲ増幅後、シングルプレックスを受けさせたサンプルおよびマルチプレックスを受けさせたサンプルの両方からＧＡＰＤＨおよび標的ｍＲＮＡシグナルの標準曲線を希釈度の関数として作成する。前記マルチプレックスを受けさせたサンプルから作成したＧＡＰＤＨおよび標的シグナルの傾きおよび相関係数の両方がシングルプレックスを受けさせたサンプルから得たそれらの相当する値の１０％以内ならば、その標的に特異的なプライマー−プローブセットはマルチプレクサブル（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ）であると見なす。また、他のＰＣＲ方法も本技術分野で公知である。
【０１４０】
ＰＴＰ１Ｂの蛋白質の濃度は本技術分野で良く知られているいろいろな方法、例えば免疫沈澱、ウエスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡまたは蛍光活性化細胞分類分け（ＦＡＣＳ）などで量化可能である。ＰＴＰ１Ｂに向かう抗体をいろいろな源、例えばＭＳＲＳの抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＩ）などから識別して入手可能することができるか、或は通常の抗体発生方法を用いて生じさせることができる。ポリクローナル抗血清の調製方法は例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、１１．１２．１−１１．１２．９頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７などに教示されている。モノクローナル抗体の調製は例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、１１．４．１−１１．１１．５頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７などに教示されている。
【０１４１】
免疫沈澱方法は本技術分野で標準的な方法であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、１０．１６．１−１０．１６．１１頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９８などに見ることができる。ウエスタンブロット（イムノブロット）分析は本技術分野で標準的な分析であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、１０．８．１−１０．８．２１頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７などに見ることができる。酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）は本技術分野で標準的な検定であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、１１．２．１−１１．２．２２頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９１などに見ることができる。
【実施例１１】
【０１４２】
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの単離
Ｍｉｕｒａ他、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、４２、１７５８−１７６４に従ってポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの単離を行った。他のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離方法が例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、４．５．１−４．５．３頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９３などに教示されている。簡単に述べると、細胞を９６個ウエルプレートで増殖させる場合には、その細胞から増殖用培地を除去した後、各ウエルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。各ウエルに細胞溶解用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ、０．５％のｎＰ−４０、２０ｍＭのバナジル−リボヌクレオシド複合体）を６０μＬ加え、前記プレートを穏やかに撹拌した後、室温で５分間インキュベートした。５５μＬの細胞溶解物をＯｌｉｇｏ
ｄ（Ｔ）で被覆しておいた９６個ウエルプレート（ＡＧＣＴ  Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ
ＣＡ）に移した。プレートを室温で６０分間インキュベートし、２００μＬの洗浄用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ＭのＮａＣｌ）で３回洗浄した。最後の洗浄を行った後、前記プレートをペーパータオルでふくことで余分な洗浄用緩衝液を除去した後、空気で５分間乾燥させた。各ウエルに前以て７０℃に加熱しておいた溶離用緩衝液（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）を６０μＬ加え、前記プレートを９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートした後、その溶離液を新鮮な９６個ウエルプレートに移した。
【０１４３】
あらゆる溶液を適切な体積で用いて１００ｍｍまたは他の標準的プレート上で増殖させた細胞を同様に処置してもよい。
【実施例１２】
【０１４４】
全ＲＮＡの単離
Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）から購入したＲｎｅａｓｙ  ９６Ｊキットおよび緩衝液を製造業者の推奨した手順に従って用いることで全ｍＲＮＡの単離を行った。簡単に述べると、９６個ウエルプレート上で増殖させた細胞では、その細胞から増殖用培地を除去した後、各ウエルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。各ウエルに緩衝液ＲＬＴを１００μＬ加えた後、そのプレートを２０秒間激しく撹拌した。次に、各ウエルに７０％のエタノールを１００μＬ加えた後、その内容物をピペットで吸い上げて吐き出すことを３回行うことで混合を行った。次に、そのサンプルを廃棄物収集用トレーが備わっているＱＩＡＶＡＣＪ多岐管に取り付けられておりかつ真空源に取り付けられているＲＮＥＡＳＹ  ９６Ｊウエルプレートに移した。真空を１５秒間かけた。前記ＲＮＥＡＳＹ  ９６Ｊプレートの各ウエルに緩衝液ＲＷ１を１ｍＬ加えた後、真空を再び１５秒間かけた。次に、前記ＲＮＥＡＳＹ  ９６Ｊプレートの各ウエルに緩衝液ＲＰＥを１ｍＬ加えた後、真空を１５秒間かけた。次に、緩衝液ＲＰＥ洗浄を繰り返した後、真空を更に１０分間かけた。次に、前記プレートをＱＩＡＶＡＣＪ多岐管から取り外した後、ペーパータオルを用いてふくことで乾燥させた。次に、前記プレートを１．２ｍＬの収集用管が含まれている収集用管ラック（ｒａｃｋ）が取り付けられているＱＩＡＶＡＣＪ多岐管に再び取り付けた。次に、ピペットを用いて各ウエルに水を６０μＬ入れ、１分間インキュベートした後、真空を３０秒間かけることで、ＲＮＡを溶離させた。この溶離段階を追加的に水を６０μＬ用いて繰り返した。
【０１４５】
そのピペットで移す段階と溶離段階の繰り返しをＱＩＡＧＥＮ  Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ  ９６０４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて自動的に行うことも可能である。本質的に、細胞を培養プレート上で溶解させた後、前記プレートをロボットデッキに移し、そのデッキの所で、ピペットで移すこと、ＤＮアーゼ処理および溶離段階を実施する。
【実施例１３】
【０１４６】
ＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡの濃度のリアルタイム定量ＰＣＲ分析
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＪ  ７７００配列検定装置（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を製造業者の指示に従って用いるリアルタイム定量ＰＣＲでＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡの濃度の定量測定を行った。それはゲルが基になっ
ていない密封された管である蛍光検出装置であり、この装置を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の高処理量化をリアルタイムで行うことができる。リアルタイム定量ＰＣＲでは、ＰＣＲが完了した後に増幅産物を量化する標準的なＰＣＲとは対照的に、産物を蓄積させながらそれの量化を行う。前方と後方のＰＣＲプライマーの間のアニーリングを特異的に起こさせるオリゴヌクレオチドプローブ（これに２種類の蛍光色素を含有させておく）をＰＣＲ反応に含めることで前記を達成する。レポーター色素（例えばＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＩＮｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡのいずれかから入手したＪＯＥ、ＦＡＭまたはＶＩＣ）を前記プローブの５’末端に結合させかつクエンチャー色素（ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｄｙｅ）（例えばＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＩＮｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡのいずれかから入手したＴＡＭＲＡ）を前記プローブの３’末端に結合させる。前記プローブと色素が損なわれていない時には、レポーター色素の発色（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）が３’クエンチャー色素の近接によって消える。増幅中に前記プローブと標的配列のアニーリングが起こると、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性によって開裂し得る基質が作り出される。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長段階中に前記プローブがＴａｑポリメラーゼによって開裂を起こすことでレポーター色素が前記プローブの残りから放出され（従って、クエンチャー部分から放出され）、そして配列に特異的な蛍光シグナルが発生する。各サイクル毎に追加的レポーター色素分子がそれらの個々のプローブから開裂し、そしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＪ  ７７００配列検出装置に組み込まれているレーザー光学を用いて蛍光強度を規則的間隔で監視する。各検定毎に、未処置の対照サンプルを用いて順次希釈したｍＲＮＡを含めた一連の並行反応で標準曲線を作成し、この曲線を用いて、試験サンプルをアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した後の阻害パーセントを量化する。
【０１４７】
ＰＣＲ反応体をＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手した。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液を２５μＬ入れておいた９６個ウエルプレートにＰＣＲカクテル（１ｘのＴＡＱＭＡＮＪ緩衝液Ａ、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、各々が３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、各々が１００ｎＭの前方プライマー、後方プライマーおよびプローブ、２０単位のＲＮアーゼ阻害剤、１．２５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤＪ、および１２．５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素）を２５μＬ添加することでＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。インキュベーションを４８℃で３０分間行うことでＲＴ反応を実施した。ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤＪに活性化を受けさせる目的でインキュベーションを９５℃で１０分間行った後、２段階のＰＣＲプロトコル：９５℃で１５秒間（変性）に続く６０℃で１．５分間（アニーリング／伸長）を４０サイクル実施した。
【０１４８】
公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号Ｍ３１７２４、配列識別番号３として本明細書に組み入れる）を用いて、ヒトＰＴＰ１Ｂに対するプローブおよびプライマーをそれらがヒトＰＴＰ１Ｂ配列とハイブリッド形成するように設計した。ヒトＰＴＰ１Ｂ用のＰＣＲプライマーは下記：
前方プライマー：ＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＣＡＡ（配列識別番号：４）
後方プライマー：ＧＧＣＣＡＣＴＣＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣ（配列識別番号：５）
であり、そしてＰＣＲプローブはＦＡＭ−ＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＴ−ＴＡＭＲＡ（配列識別番号：６）であり、ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）はクエンチャー色素である。ヒトＧＡＰＤＨ用のＰＣＲプライマーは下記：
前方プライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列識別番号：７）
後方プライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列識別番号：８）
であり、そしてＰＣＲプローブは５’ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列識別番号：９）であり、ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）はクエンチャー色素である。
【０１４９】
公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号Ｍ３３９６２、配列識別番号１０として本明細書に組み入れる）を用いて、ラットＰＴＰ１Ｂに対するプローブおよびプライマーをそれらがラットＰＴＰ１Ｂ配列とハイブリッド形成するように設計した。ラットＰＴＰ１Ｂ用のＰＣＲプライマーは下記：
前方プライマー：ＣＧＡＧＧＧＴＧＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴ（配列識別番号：１１）後方プライマー：ＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴ（配列識別番号：１２）であり、そしてＰＣＲプローブはＦＡＭ−ＣＧＡＣＴＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＧＧＡ−ＴＡＭＲＡ（配列識別番号：１３）であり、ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）はクエンチャー色素である。ラットＧＡＰＤＨ用のＰＣＲプライマーは下記：
前方プライマー：ＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴ（配列識別番号：１４）
後方プライマー：ＣＡＣＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＧＴ（配列識別番号：１５）であり、そしてＰＣＲプローブは５’ＪＯＥ−ＴＴＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ３’（配列識別番号：１６）であり、ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）はクエンチャー色素である。
【実施例１４】
【０１５０】
ＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡの濃度のノーザンブロット分析
アンチセンス処置して１８時間後の細胞の単層を冷ＰＢＳで２回洗浄した後、１ｍＬのＲＮＡＺＯＬＪ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ「Ｂ」Ｉｎｃ．、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）に入れて溶解させた。製造業者の推奨プロトコルに従って全ＲＮＡを調製した。ＭＯＰＳ緩衝系（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）を用い、ホルムアルデヒドを１．１％入れておいた１．２％のアガロースゲルに通す電気泳動で２０ミクログラムの全ＲＮＡを分別した。ノーザン／サザントランスファー緩衝系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ「Ｂ」Ｉｎｃ．、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）を用い、毛細管トランスファーを一晩行うことで、ＲＮＡを前記ゲルからＨＹＢＯＮＤＪ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｏｉｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に移した。ＲＮＡトランスファーを紫外線による可視化で立証した。ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲＪ  ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ  ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて紫外線で架橋を起こさせることで膜を固定した後、ＱＵＩＣＫＨＹＢＪハイブリッド形成用溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用い、厳重な調節に関する製造業者の推奨を用いて覆った。
【０１５１】
ヒトＰＴＰ１Ｂの検出では、前方プライマーＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＣＡＡ（配列識別番号：４）および後方プライマーＧＧＣＣＡＣＴＣＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣ（配列識別番号：５）を用いたＰＣＲでヒトＰＴＰ１Ｂに特異的なプローブを調製した。充填率（ｌｏａｄｉｎｇ）およびトランスファー効率の変動に関する正規化を行う目的で、膜を剥がした後、ヒトグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）に関して精査した。
【０１５２】
ラットＰＴＰ１Ｂの検出では、前方プライマーＣＧＡＧＧＧＴＧＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴ（配列識別番号：１１）および後方プライマーＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴ（配列識別番号：１２）を用いたＰＣＲでラットＰＴＰ１Ｂに特異的なプローブを調製した。充填率およびトランスファー効率の変動に関する正規化を行う目的で、膜を剥がした後、ラットグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）に関して精査した。
【０１５３】
ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＪおよびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴＪソフトウエアＶ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、ハイブリッド形成した膜を可視化して量化した。データを未処置対照のＧＡＰＤＨ濃度に対して正規化した。
【実施例１５】
【０１５４】
２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いたヒトＰＴＰ１Ｂ発現のアンチセンス抑制
本発明に従い、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号Ｍ３１７２４、配列識別番号３として本明細書に組み入れる）を用いて、ヒトＰＴＰ１ＢのＲＮＡのいろいろな領域を標的にする一連のオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドを表１に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する個々の標的配列上の１番目（最も５’側）のヌクレオチド員を示す。表１に示す化合物は全部長さがヌクレオチド２０個分のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチド［これの両側（５’および３’方向）が５個のヌクレオチドの「ウィング」に隣接している］から成る中心の「ギャップ」領域を含有する。前記ウィングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。シチジン残基は全部５−メチルシチジンである。本明細書に示した他の実施例に記述した如き定量リアルタイムＰＣＲを用いて、前記化合物に分析をこれらがヒトＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡの濃度に対して示す効果に関して受けさせた。データは２回行った実験の平均である。「Ｎ．Ｄ．」が存在する場合、これは「データなし」を示す。
【０１５５】
【表１】
2010158249.tif 000002
【０１５６】
【表２】
2010158249.tif 000003
【０１５７】
【表３】
2010158249.tif 000004
【０１５８】
表１に示すように、配列識別番号
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、
３５、３６、３８、３９、４０、４２、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、
５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、
６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７８、７９、８０、８１、８３、８４、
８６、８７、８９、９０、９２、９３、９４、９５、および ９６
は、前記検定でヒトＰＴＰ１Ｂ発現を少なくとも３５％抑制することが示され、従って好適である。
【実施例１６】
【０１５９】
２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いたラットＰＴＰ１Ｂ発現のアンチセンス抑制
本発明に従い、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号Ｍ３３９６２、配列識別番号１０として本明細書に組み入れる）を用いて、ラットＰＴＰ１ＢのＲＮＡのいろいろな領域を標的にする２番目の一連のオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドを表２に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する個々の標的配列上の１番目（最も５’側）のヌクレオチド員を示す。表２に示す化合物は全部長さがヌクレオチド２０個分のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチド［これの両側（５’および３’方向）が５個のヌクレオチドの「ウィング」に隣接している］から成る中心の「ギャップ」領域を含有する。前記ウィングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。シチジン残基は全部５’−メチルシチジンである。本明細書に示した他の実施例に記述した如き定量リアルタイムＰＣＲを用いて、前記化合物に分析をこれらがラットＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡの濃度に対して示す効果に関して受けさせた。データは２回行った実験の平均である。「Ｎ．Ｄ．」が存在する場合、これは「データなし」を示す。
【０１６０】
【表４】
2010158249.tif 000005
【０１６１】
【表５】
2010158249.tif 000006
【０１６２】
【表６】
2010158249.tif 000007
【０１６３】
【表７】
2010158249.tif 000008
【０１６４】
表２に示すように、配列識別番号
９７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７７  １７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９１、１９３、１９５、１９６、１９８、２０１、２０２、２０４、２０５、２０６、２１１、２１５、２１７、２１９、２２３、２２５、２２６、２２８、２２９、２３０、２３２、２３３、２３５、２３６、２３７、２３９ および ２４０
は、前記実験でラットＰＴＰ１Ｂ発現を少なくとも３０％抑制することが示され、従って好適である。
【実施例１７】
【０１６５】
ＰＴＰ１Ｂ蛋白質濃度のウエスタンブロット分析
標準的方法を用いてウエスタンブロット分析（イムノブロット分析）を実施する。オリゴヌクレオチド処置を受けさせて１６−２０時間後に細胞を収穫し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００ｕｌ／ウエル）に入れて懸濁させ、５分間沸騰させた後、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した。ゲルを１５０Ｖで１．５時間走らせた後、ウエスタンブロッティング用膜に移した。ＰＴＰ１Ｂに向かう適切な一次抗体と一緒に前記一次抗体種に向かう放射標識もしくは蛍光標識付き二次抗体を用いる。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＪ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を用いてバンドを可視化した。
【実施例１８】
【０１６６】
血液のグルコース濃度に関するＰＴＰ１Ｂ（ＩＳＩＳ  １１３７１５）のアンチセンス抑制効果
ｄｂ／ｄｂマウスを２型糖尿病のモデルとして用いる。このマウスは高血糖症で肥満で高脂血症でインシュリン耐性を示す。そのｄｂ／ｄｂ表現型はＣ５７ＢＬＫＳバックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）上のレプチン受容体に変異が存在することによる。しかしながら、異なるマウスバックグラウンド上のレプチン遺伝子に変異が存在すると糖尿病を伴わない肥満がもたらされる可能性がある（ｏｂ／ｏｂマウス）。レプチンは脂肪が産出するホルモンであり、これは食欲を調節し、そしてレプチンが欠乏している動物またはヒトは肥満になる。ヘテロ接合ｄｂ／ｗｔマウス［リーンリタメート（ｌｅａｎ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓ）として知られる］は高血糖症／高脂血症も肥満表現型も示さず、これ
を対照として用いる。
【０１６７】
本発明に従い、ＰＴＰ１Ｂがグルコース代謝および血流遮断で果たす役割を取り扱うように設計した実験でＩＳＩＳ  １１３７１５（ＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣ、配列識別番号：１６６）を調査した。ＩＳＩＳ  １１３７１５は、本明細書に配列識別番号：３（ヒトＰＴＰ１Ｂのヌクレオチド９５１の所で始まる；Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｍ３１７２４）、配列識別番号：１０（ラットＰＴＰ１Ｂのヌクレオチド９８０の所で始まる；Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｍ３３９６２）および配列識別番号：２４１（マウスＰＴＰ１Ｂのヌクレオチド１５７０の所で始まる；Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｕ２４７００）として組み入れたヒト、ラットおよびマウスＰＴＰ１Ｂヌクレオチド配列のコード付け領域の中の配列に完全な相補性を示す。用いた対照はＩＳＩＳ  ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ、配列識別番号：２４２）（ここで、ＮはＡ、Ｇ、ＴおよびＣの混合である）である。
【０１６８】
オスのｄｂ／ｄｂマウスおよびリーン（ヘテロ接合、即ちｄｂ／ｗｔ）リタメート（時間０の時に９週令）を同じ平均血液グルコース濃度を有する合致群（ｍａｔｃｈｅｄ  ｇｒｏｕｐｓ）（ｎ＝６）に分割して、それらに食塩水、ＩＳＩＳ  ２９８４８（対照オリゴヌクレオチド）またはＩＳＩＳ  １１３７１５を週に一度腹腔内注射することで処置した。ｄｂ／ｄｂマウスに処置をＩＳＩＳ  １１３７１５を１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇの用量で用いるか或はＩＳＩＳ  ２９８４８を５０ｍｇ／ｋｇ用いて受けさせる一方、リーンリタメートには処置をＩＳＩＳ  １１３７１５を５０または１００ｍｇ／ｋｇの用量で用いるか或はＩＳＩＳ  ２９８４８を１００ｍｇ／ｋｇ用いて受けさせた。処置を４週間継続して、０、７、１４、２１および２８日目に血液のグルコース濃度を測定した。
【０１６９】
ｄｂ／ｄｂマウスでは、２８日までに血液のグルコース濃度が如何なる用量の時にも減少し、用量が１０ｍｇ／ｋｇの時には出発濃度の３００ｍｇ／ｄＬから２２５ｍｇ／ｄＬにまで減少し、用量が２５ｍｇ／ｋｇの時には１７５ｍｇ／ｄＬにまで減少し、そして用量が５０ｍｇ／ｋｇの時には１２５ｍｇ／ｄＬにまで減少した。これらの最終濃度は野生型マウスの正常な範囲（１７０ｍｇ／ｄＬ）内である。ミスマッチの対照および食塩水で処置した対照の２８日目の濃度はそれぞれ３２０ｍｇ／ｄＬおよび３７０ｍｇ／ｄＬであった。
【０１７０】
リーンリタメートの血液グルコース濃度はあらゆる処置群で試験全体に渡って一定のままであった（平均で１２０ｍｇ／ｄＬ）。このような結果は、ＩＳＩＳ  １１３７１５で処置するとｄｂ／ｄｂマウスでは血液のグルコースが減少しかつｄｂ／ｄｂマウスにもリーンリタメートマウスにもオリゴヌクレオチド処置の結果として低血糖症が誘発されることはないことを示している。
【０１７１】
同様な実験において、ｏｂ／ｏｂマウスおよびこれらのリーンリタメート（ヘテロ接合、即ちｏｂ／ｗｔ）にＩＳＩＳ  １１３７１５、ＩＳＩＳ  ２９８４８または食塩水対照を５０ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回投与して、血液のグルコース濃度を７、１４および２１日が終了した時点で測定した。ｏｂ／ｏｂマウスをＩＳＩＳ  １１３７１５で処置した時に最大の経時的血液グルコース減少がもたらされ、７日目の２２５ｍｇ／ｄＬから２１日目の９５ｍｇ／ｄＬに到達した。ｏｂ／ｏｂマウスは血漿グルコースの経時的上昇を示して３００ｍｇ／ｄＬから３２５ｍｇ／ｄＬに到達したが、対照オリゴヌクレオチドで処置すると血漿グルコースが平均で２８０ｍｇ／ｄＬから１３０ｍｇ／ｄＬにまで減少した。リーンリタメートの血漿グルコース濃度は処置群全部において変化しないままであった（平均濃度１００ｍｇ／ｄＬ）。
【実施例１９】
【０１７２】
肝臓におけるｍＲＮＡ発現に関するＰＴＰ１Ｂ（ＩＳＩＳ  １１３７１５）のアンチセンス抑制効果
オスのｄｂ／ｄｂマウスおよびリーンリタメート（時間０の時に９週令）を同じ平均血液グルコース濃度を有する合致群（ｎ＝６）に分割して、それらに食塩水、ＩＳＩＳ  ２９８４８（対照オリゴヌクレオチド）またはＩＳＩＳ  １１３７１５を週に一度腹腔内注射することで処置した。ｄｂ／ｄｂマウスに処置をＩＳＩＳ  １１３７１５を１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇの用量で用いるか或はＩＳＩＳ  ２９８４８を５０ｍｇ／ｋｇ用いて受けさせる一方、リーンリタメートには処置をＩＳＩＳ  １１３７１５を５０または１００ｍｇ／ｋｇの用量で用いるか或はＩＳＩＳ  ２９８４８を１００ｍｇ／ｋｇ用いて受けさせた。処置を４週間継続した後、マウスを屠殺して組織を集めることで、ｍＲＮＡ分析を行った。ＲＮＡ値を正規化しそして食塩水で処置した対照に対するパーセントとして表す。
【０１７３】
ＩＳＩＳ  １１３７１５が試験を行ったあらゆる用量でｄｂ／ｄｂマウスの肝臓の中のＰＴＰ１Ｂ  ｍＲＮＡの濃度を成功裏に低くし（ＰＴＰ１Ｂ  ｍＲＮＡを６０％減少させ）たが、対照オリゴヌクレオチドで処置した動物はＰＴＰ１Ｂ  ｍＲＮＡの減少を全く示さず、食塩水で処置した対照が示した濃度のままであった。リーンリタメートをＩＳＩＳ
１１３７１５で処置した時にもまた５０ｍｇ／ｋｇの用量の時にｍＲＮＡ濃度が対照の４５％にまで減少しかつ用量が１００ｍｇ／ｋｇの時には対照の２５％まで減少した。対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ  ２９８４８）を用いた時にはｍＲＮＡ濃度低下が全く示されなかった。
【実施例２０】
【０１７４】
体重に関するＰＴＰ１Ｂ（ＩＳＩＳ  １１３７１５）のアンチセンス抑制効果
オスのｄｂ／ｄｂマウスおよびリーンリタメート（時間０の時に９週令）を同じ平均血液グルコース濃度を有する合致群（ｎ＝６）に分割して、それらに食塩水、ＩＳＩＳ  ２９８４８（対照オリゴヌクレオチド）またはＩＳＩＳ  １１３７１５を週に一度腹腔内注射することで処置した。ｄｂ／ｄｂマウスに処置をＩＳＩＳ  １１３７１５を１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇの用量で用いるか或はＩＳＩＳ  ２９８４８を５０ｍｇ／ｋｇ用いて受けさせる一方、リーンリタメートには処置をＩＳＩＳ  １１３７１５を５０または１００ｍｇ／ｋｇの用量で用いるか或はＩＳＩＳ  ２９８４８を１００ｍｇ／ｋｇ用いて受けさせた。処置を４週間継続した。２８日目にマウスを屠殺して最終体重を測定した。
【０１７５】
ｏｂ／ｏｂマウスをＩＳＩＳ  １１３７１５で処置すると結果として体重が上昇し、これは用量範囲全体に渡って一様であり、動物の体重上昇の度合は平均で１１．０グラムであったが、食塩水で処置した対照の体重上昇は５．５グラムであった。対照オリゴヌクレオチドで処置した動物の体重上昇は平均で７．８グラムであった。
【０１７６】
ＩＳＩＳ  １１３７１５を５０または１００ｍｇ／ｋｇ用いてリーンリタメートを処置すると体重が３．８グラム上昇したのに比較して、食塩水対照の体重上昇は３．０グラムであった。
【０１７７】
同様な実験において、ｏｂ／ｏｂマウスおよびこれらのリーンリタメートにＩＳＩＳ  １１３７１５、ＩＳＩＳ  ２９８４８または食塩水対照を５０ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回投薬して体重を７、１４および２１日目が終了した時点で測定した。
【０１７８】
ｏｂ／ｏｂマウスをＩＳＩＳ  １１３７１５、ＩＳＩＳ  ２９８４８または食塩水対照で処置するとそれら全部の体重が２１日の時間経過に渡って同様に上昇した。７日目が終了した時点のｏｂ／ｏｂ処置群全部の平均体重は４２グラムであった。ＩＳＩＳ  １１３７１５で処置した動物の２１日目の平均体重は４８グラムであったが、ＩＳＩＳ  ２９８
４８（対照オリゴヌクレオチド）および食塩水対照群のそれぞれの平均体重は５２グラムであった。リーンリタメート全部の平均体重は時間経過開始時に２５グラムであり、そしてリーンリタメート処置群全部が体重上昇を示して２１日目に２８グラムになった。
【実施例２１】
【０１７９】
血漿インシュリン濃度に関するＰＴＰ１Ｂ（ＩＳＩＳ  １１３７１５）のアンチセンス抑制効果
オスのｄｂ／ｄｂマウス（時間０の時に９週令）を同じ平均血液グルコース濃度を有する合致群（ｎ＝６）に分割して、それらに食塩水、ＩＳＩＳ  ２９８４８（対照オリゴヌクレオチド）またはＩＳＩＳ  １１３７１５を５０ｍｇ／ｋｇの用量で週に二度腹腔内注射することで処置した。処置を３週間継続し、７、１４および２１日目に血漿インシュリン濃度を測定した。
【０１８０】
ＩＳＩＳ  １１３７１５で処置したマウスは血漿インシュリン濃度の低下を示し、７日目の１５ｎｇ／ｍＬから２１日目の７．５ｎｇ／ｍＬになった。食塩水で処置した動物では７日目の血漿インシュリン濃度が３７ｎｇ／ｍＬであり、１４日目に２５ｎｇ／ｍＬまで降下したが、再び上昇して２１日目に３３ｎｇ／ｍＬになった。対照オリゴヌクレオチドで処置したマウスもまた試験の時間経過全体に渡って血漿インシュリン濃度の低下を示し、７日目の２５ｎｇ／ｍＬから２１日目の１０ｎｇ／ｍＬになった。しかしながら、ＩＳＩＳ  １１３７１５が経時的血漿インシュリン減少で最も高い効果を示した。
【実施例２２】
【０１８１】
２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップを有する追加的キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いたヒトＰＴＰ１Ｂ発現のアンチセンス抑制
本発明に従い、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号Ｍ３１７２４、配列識別番号３として本明細書に組み入れる）およびＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号ＡＬ０３４４２９のヌクレオチド残基１−３１０００に続くＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号ＡＬ１３３２３０のヌクレオチド残基１−４５０００から誘導された連結ゲノム配列（本明細書に配列識別番号２４３として組み入れる）を用いて、ヒトＰＴＰ１ＢのＲＮＡのいろいろなゲノム領域を標的にする一連の追加的オリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドを表３に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する個々の標的配列上の１番目（最も５’側）のヌクレオチド員を示す。表３に示す化合物は全部長さがヌクレオチド２０個分のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチド［これの両側（５’および３’方向）が５個のヌクレオチドの「ウィング」に隣接している］から成る中心の「ギャップ」領域を含有する。前記ウィングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。シチジン残基は全部５−メチルシチジンである。本明細書に示した他の実施例に記述した如き定量リアルタイムＰＣＲを用いて、前記化合物に分析をこれらがヒトＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡの濃度に対して示す効果に関して受けさせた。データは２回行った実験の平均である。「Ｎ．Ｄ．」が存在する場合、これは「データなし」を示す。
【０１８２】
【表８】
2010158249.tif 000009
【０１８３】
【表９】
2010158249.tif 000010
【０１８４】
【表１０】
2010158249.tif 000011
【０１８５】
表３に示すように、配列識別番号
２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６７、２６８、２６９、２７１、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８１、２８２、２８３、２８８、２９０、２９１、２９２、２９４、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０２、３０３、３０７、３１０、３１１、３１３、３１５、３１７、および ３１８
は、前記検定でヒトＰＴＰ１Ｂ発現を少なくとも５０％抑制することが示され、従って好適である。
【実施例２３】
【０１８６】
２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップを有する追加的キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いたヒトＰＴＰ１Ｂ発現のアンチセンス抑制
本発明に従い、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号Ｍ３１７２４、配列識別番号３として本明細書に組み入れる）およびＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号ＡＬ０３４４２９のヌクレオチド残基１−３１０００に続くＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号ＡＬ１３３２３０のヌクレオチド残基１−４５０００から誘導された連結ゲノム配列（本明細書に配列識別番号２４３として組み入れる）を用いて、ヒトＰＴＰ１Ｂ  ＲＮＡの３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲのいずれかを標的にする一連の追加的オリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドを表４に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する個々の標的配列上の１番目（最も５’側）のヌクレオチド員を示す。表４に示す化合物は全部長さがヌクレオチド２０個分のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチド［これの両側（５’および３’方向）が５
個のヌクレオチドの「ウィング」に隣接している］から成る中心の「ギャップ」領域を含有する。前記ウィングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。シチジン残基は全部５−メチルシチジンである。本明細書に示した他の実施例に記述した如き定量リアルタイムＰＣＲを用いて、前記化合物に分析をこれらがヒトＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡの濃度に対して示す効果に関して受けさせた。データは２回行った実験の平均である。「Ｎ．Ｄ．」が存在する場合、これは「データなし」を示す。
【０１８７】
【表１１】
2010158249.tif 000012
【０１８８】
【表１２】
2010158249.tif 000013
【０１８９】
【表１３】
2010158249.tif 000014
【０１９０】
表４に示すように、配列識別番号
３２２，３２３，３２４，３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４７、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６８、３６９、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７７、３７８、３８０、３８１、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、および ３８９
は、前記検定でヒトＰＴＰ１Ｂ発現を少なくとも４０％抑制することが示され、従って好適である。
【実施例２４】
【０１９１】
カニクイザルの肝臓、筋肉および脂肪組織のＰＴＰ１Ｂ発現（ＩＳＩＳ  １１３７１５）のアンチセンス抑制
さらなる態様では、オスのカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）をＩＳＩＳ  １１３７１５（配列識別番号：１６６）で処置して、筋肉、脂肪および肝臓組織の中のＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡおよび蛋白質の濃度を測定した。また、血清サンプルにもインシュリン濃度に関する測定を受けさせた。
【０１９２】
オスのカニクイザルを２つの処置群、即ち対照動物（ｎ＝４；食塩水のみで処置）および処置動物（ｎ＝８；ＩＳＩＳ  １１３７１５で処置）に分割した。インシュリンおよびグルコースのベースライン値を確立する目的であらゆる動物に投薬前のグルコース耐性試験（ＧＴＴ）を２回受けさせた。処置群の動物には１、８および１５日目にＩＳＩＳ  １１３７１５をそれぞれ３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇおよび１２ｍｇ／ｋｇ皮下投与した。対照群の動物には処置を受けさせなかった。あらゆる動物にＧＴＴを５、１３および１９日目、即ち投与して４日後に受けさせた。最後に１２ｍｇ／ｋｇ投与して１０日目に処置群（ＩＳＩＳ  １１３７１５）の動物全部にＩＳＩＳ  １１３７１５を６ｍｇ／ｋｇの用量で一度に与えた。３日後、あらゆる動物を屠殺して組織を取り出すことで、ＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡおよび蛋白質の濃度を分析した。ｍＲＮＡおよび蛋白質の濃度を食塩水で処置した動物が示したそれらに対して正規化した。試験を受けさせた組織の中で、脂肪および肝臓の中のＰＴＰ１Ｂ  ｍＲＮＡの濃度が最も高い度合で減少し、それぞれ４１％および４０％減少した。筋肉の中のｍＲＮＡの濃度は１０％だけ減少した。肝臓の中の蛋白質濃度は６０％減少しそして筋肉の中の蛋白質濃度は４５％減少したが、脂肪では１０％上昇することが示された。
【０１９３】
肝臓の酵素であるＡＬＴとＡＳＴの濃度を毎週測定したが変化が見られず、このことは、オリゴヌクレオチド処置は進行毒性効果（ｏｎｇｏｉｎｇ  ｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を全く示さないことを示している。
【０１９４】
このような試験の結果は、ＩＳＩＳ  １１３７１５を用いて処置すると肝臓のＰＴＰ１ＢのｍＲＮＡおよび蛋白質が有意に減少することを示している。その上、群と群の間にも
同じ群の処置前と処置後の間にも空腹時のインシュリン濃度に全く変化が見られなかった。しかしながら、あらゆる群でインシュリン濃度が有意に低下したが空腹時のグルコース濃度は全く低下せず、このことは、ＩＳＩＳ  １１３７１５で処置するとインシュリンの効率（感受性）が向上することを示唆している。
【０１９５】
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
【０１９６】
１．  ＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸分子を標的にする長さが核酸塩基８から５０個分のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であって、配列識別番号：
２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６７、２６８、２６９、２７１、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８１、２８２、２８３、２８８、２９０、２９１、２９２、２９４、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０２、３０３、３０７、３１０、３１１、３１３、３１５、３１７、３１８、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４７、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６８、３６９、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７７、３７８、３８０、３８１、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、または ３８９
から成る群から選択される配列を含んで成っていてＰＴＰ１Ｂと特異的にハイブリッド形成しかつそれの発現を抑制する化合物。
【０１９７】
２．  前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオシド間結合を少なくとも１つ含んで成る１．記載の化合物。
【０１９８】
３．  前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である２．記載の化合物。
【０１９９】
４．  前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが修飾糖部分を少なくとも１つ含んで成る１．記載の化合物。
【０２００】
５．  前記修飾糖部分が２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である４．記載の化合物。
【０２０１】
６．  前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが修飾核酸塩基を少なくとも１つ含んで成る１．記載の化合物。
【０２０２】
７．  前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである６．記載の化合物。
【０２０３】
８．  前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである１．記載の化合物。
【０２０４】
９．  １．記載の化合物と薬学的受け入れられる担体もしくは希釈剤を含んで成る組成物。
【０２０５】
１０．  更にコロイド状の分散系も含んで成る９．記載の組成物。
【０２０６】
１１．  ＰＴＰ１Ｂをコード化する核酸分子上の活性部位の少なくとも８核酸塩基部分と特異的にハイブリッド形成する１．記載の化合物。
【０２０７】
１２．  細胞もしくは組織の中で起こるＰＴＰ１Ｂの発現を抑制する方法であって、ＰＴ
Ｐ１Ｂの発現が抑制されるように前記細胞もしくは組織を１．記載の化合物と接触させることを含んで成る方法。
【０２０８】
１３．  前記細胞もしくは組織がヒトの細胞もしくは組織である１２．記載の方法。
【０２０９】
１４．  前記細胞もしくは組織が齧歯類の細胞もしくは組織である１２．記載の方法。
【０２１０】
１５．  前記齧歯類の細胞もしくは組織がマウスの細胞もしくは組織である１４．記載の方法。
【０２１１】
１６．  前記齧歯類の細胞もしくは組織がラットの細胞もしくは組織である１４．記載の方法。
【０２１２】
１７．  前記細胞もしくは組織が肝臓、腎臓または脂肪細胞もしくは組織である１４．記載の方法。
【０２１３】
１８．  ＰＴＰ１Ｂに関連した病気または状態を有するか或は有すると思われる動物を治療する方法であって、ＰＴＰ１Ｂの発現が抑制されるように前記動物に１．記載の化合物を治療もしくは予防有効量で投与することを含んで成る方法。
【０２１４】
１９．  前記動物がヒトである１８．記載の方法。
【０２１５】
２０．  前記病気もしくは状態が代謝病もしくは状態である１８．記載の方法。
【０２１６】
２１．  前記病気もしくは状態が糖尿病である１８．記載の方法。
【０２１７】
２２．  前記病気もしくは状態が２型糖尿病である１８．記載の方法。
【０２１８】
２３．  前記病気もしくは状態が肥満症である１８．記載の方法。
【０２１９】
２４．  前記病気もしくは状態が過増殖状態である１８．記載の方法。
【０２２０】
２５．  前記過増殖状態が癌である２４．記載の方法。
【０２２１】
２６．  動物における血液グルコース濃度を低下させる方法であって、前記動物に１．記載の化合物を投与することを含んで成る方法。
【０２２２】
２７．  前記動物がヒトまたは齧歯類である２６．記載の方法。
【０２２３】
２８．  前記血液グルコース濃度が血漿グルコース濃度または血清グルコース濃度である２６．記載の方法。
【０２２４】
２９．  前記動物が糖尿病の動物である２６．記載の方法。
【０２２５】
３０．  動物におけるＰＴＰ１Ｂに関連した病気または状態の開始を防止または遅らせる方法であって、前記動物に１．記載の化合物を治療もしくは予防有効量で投与することを含んで成る方法。
【０２２６】
３１．  前記動物がヒトである３０．記載の方法。
【０２２７】
３２．  前記病気もしくは状態が代謝病もしくは状態である３０．記載の方法。
【０２２８】
３３．  前記病気もしくは状態が糖尿病である３０．記載の方法。
【０２２９】
３４．  前記病気もしくは状態が２型糖尿病である３０．記載の方法。
【０２３０】
３５．  前記病気もしくは状態が肥満症である３０．記載の方法。
【０２３１】
３６．  前記病気もしくは状態が過増殖状態である３０．記載の方法。
【０２３２】
３７．  前記過増殖状態が癌である３６．記載の方法。
【０２３３】
３８．  動物における血液グルコース濃度上昇の開始を防止または遅らせる方法であって、前記動物に１．記載の化合物を投与することを含んで成る方法。
【０２３４】
３９．  前記動物がヒトまたは齧歯類である３８．記載の方法。
【０２３５】
４０．  前記血液グルコース濃度が血漿グルコース濃度または血清グルコース濃度である３８．記載の方法。
【０２３６】
４１．  前記動物が糖尿病の動物である３８．記載の方法。
【配列表】
2010158249000001.app