(57)【要約】【課題】tRNA依存性アミドトランスフェラーゼの活性を特異的に阻害する物質を探索するスクリーニング方法を構築すること。基質調製など酵素反応系の構築が難しいＧａｔＣＡＢの活性低下を簡便に測定し、医薬として見込まれるこの酵素特異的阻害物質を効率的にスクリーニングすること。【解決手段】大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより転写開始し、ｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子の発現を厳密に制御できるプラスミドとＧａｔＣＡＢ遺伝子を恒常的に発現させることのできるプラスミドの大腸菌共形質転換体を構築した。この大腸菌を被験菌とし、酵素活性測定に必要な基質及び酵素タンパク質を調製することなく、大腸菌の生育測定によって、ＧａｔＣＡＢの活性低下を容易に検出することが可能となった。非形質転換体への影響がなく被験菌の生育を阻害する物質をスクリーニングすることによりＧａｔＣＡＢに特異的な阻害物質を簡便に探索することが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
tRNA依存性アミドトランスフェラーゼの活性を特異的に阻害する物質を探索するスクリーニング方法に置いて、非特異的グルタミン酸（グルタミル）ｔＲＮＡ合成酵素（ＥＣ＝６．１．１．７）（以下  ｎｄＧｌｕＲＳと称する）とｔＲＮＡ依存性アミドトランスフェラーゼ（以下  ＧａｔＣＡＢＥＣ＝６．３．５．）を形質転換によって導入し、共発現させた大腸菌を被験菌とし、形質転換していない大腸菌の生育と比較して、形質転換された大腸菌が、特異的に生育が落ちる仕組みを利用した抗生物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
請求項１において、被検菌としてＥ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＴｇａｔＣＡＢ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６２２  ＡＨＵ１８５１）用いる抗生物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより転写開始し、ｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子の発現を任意に制御できるプラスミドとＧａｔＣＡＢ遺伝子を恒常的に発現させることのできるプラスミドを共形質転換した大腸菌形質転換体。
【請求項４】
ＧａｔＣＡＢを恒常的に発現させることのできるプラスミドに変異型ＧａｔＣＡＢ遺伝子をつなぎ、その活性をｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子の発現による発育の低下で測定できる大腸菌形質転換体。
【請求項５】
請求項４において、ｐＣＴｇａｔＣＡＢの代わりにｐＣＯＬＡＤｕｅｔのみを形質転換した、Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＯＬＡ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６２３  ＡＨＵ１８５２）を用いる抗生物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧａｔＣＡＢ活性測定に使用する大腸菌形質転換体の製造とこれを利用した活性測定法、及びこの大腸菌を用いた活性阻害物質のスクリーニング方法全般に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧａｔＣＡＢは、グルタミンとそれに対応するｔＲＮＡＧｌｎを結びつけるグルタミニルｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｎＲＳ）を持たない多くの細菌において、重要な役割を示す。
即ち、これらの細菌では、グルタミルｔＲＮＡ合成酵素（以下ＧｌｕＲＳ）はｔＲＮＡＧｌｕだけでなくｔＲＮＡＧｌｎをも認識し両方のｔＲＮＡにグルタミン酸を付ける。ｔＲＮＡＧｌｎに付けられたグルタミン酸はＧａｔＣＡＢにより、グルタミンに変換される。この反応によって正常なＧｌｎ‐ｔＲＮＡＧｌｎがこれらの細菌内においてタンパク合成に利用される  （非特許文献１、２，および３）。これらの細菌においてＧａｔＣＡＢの反応が阻害されると、Ｇｌｕ‐ｔＲＮＡＧｌｎが細胞内に蓄積し正常なタンパク合成が行われなくなって、その発育を阻害することが予想される。従って、多剤耐性が問題となるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＭＵ５０などの細菌においてＧａｔＣＡＢ阻害剤は、新しい標的、新しい作用機構を持った新規抗菌活性物質となりうる。
【０００３】
ＧａｔＣＡＢ酵素の選択的阻害剤をスクリーニングするには、スクリーニング系の構築が重要課題である。簡便な反応系及び低下した活性の測定系構築や、大量の基質であるＧｌｕ‐ｔＲＮＡＧｌｎ及びＡＴＰ、基質を準備するための大量な酵素ＧｌｎＲＳとｔＲＮＡＧｌｎの調製が必須となる。
【０００４】
これまで、新規抗生物質の標的とされてきたＧａｔＣＡＢの阻害物質の探索に対しては種々の方法が考えられてきた（特許文献１，２）。しかし、ドラッグデザインから生みだされた産物のＧａｔＣＡＢに対する活性阻害効果や、ＧａｔＣＡＢ変異体の活性低下を迅速簡便にかつ大量に判定できる手段がなかった。
【０００５】
また、最近の報告では、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素（以下ＡｓｐＲＳ）、ｔＲＮＡＡｓｎとＧａｔＣＡＢは、トランスアミドソームと呼ばれる安定なＲＮＡタンパク複合体の状態で存在し、Ａｓｐ‐ｔＲＮＡＡｓｎはＧａｔＣＡＢにより速やかにＡｓｎ‐ｔＲＮＡＡｓｎへ変換することが明らかにされた  （非特許文献４）。ＧｌｕＲＳ、ｔＲＮＡｇｌｎとＧａｔＣＡＢがＡｓｐＲＳと同様にトランスアミドソームの状態で存在するかどうかまだ明らかにされていないが、このような一連の反応は、細菌細胞内の活性でみることがより実際的であり、それに合った活性の測定法が必要であった。
【０００６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでは、一種類のｎｄＧｌｕＲＳがｔＲＮＡＧｌｕだけでなくｔＲＮＡＧｌｎにグルタミン酸を付加する。このｎｄＧｌｕＲＳは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ１Ｇｌｎにグルタミン酸を付加するが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ２ＧｌｎとｔＲＮＡＧｌｕには付加しない  （非特許文献５）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子の、Ｅ．ｃｏｌｉへのクローニングの試みは当初成功しなかった。インタクトなＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子の過剰発現はＥ．ｃｏｌｉにとって致死的であった  （非特許文献６）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子の発現を制御できるベクターをＥ．ｃｏｌｉに形質転換することにより、Ｅ．ｃｏｌｉの生育の低下はグルタミン酸がｔＲＮＡ１Ｇｌｎに誤って付加した結果起こることがコロニー形成によって確認された。が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子およびＧａｔＣＡＢ遺伝子がタンパク質として発現するのを確かめた上で、ＧａｔＣＡＢがこの生育低下を相補し、ＧａｔＣＡＢ活性が低下することの影響を数値として測定をすることはされていない。（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開番号  ＷＯ９９／１８２３９
【特許文献２】特表２００１−５１９１７１
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｉｌｃｏｘら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ．  １９６８年６１巻、ページ２２９−２３６．
【非特許文献２】Ｃｕｒｎｏｗら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ．  １９９７年９４巻、ページ１１８１９−１１８２６．
【非特許文献３】Ｉｂｂａら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．  ２０００年２５巻、  ページ３１１―３１６．
【非特許文献４】Ｂａｉｌｌｙら、  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ２００７年２８巻、ページ２２８−２３９．
【非特許文献５】Ｌａｐｏｉｎｔｅら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８６年１６５巻ページ８８‐９３．
【非特許文献６】Ｐｅｌｃｈａｔら、Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８年４４巻、ページ３７８−３８１．
【非特許文献７】Ｂａｉｃｋら、  Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００４年４２巻、ページ１１１−１１６．
【非特許文献８】Ｓａｍｂｒｏｏｋら‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ’３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
解決しようとする問題点は、大量の基質調製が難しいがゆえに酵素活性測定が困難なＧａｔＣＡＢ酵素において、ＧａｔＣＡＢ活性の低下の程度を簡便に測定し、又、医薬として見込まれるこの酵素阻害物質を効率的にスクリーニングする方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、ＧａｔＣＡＢ活性の低下の測定を扱いやすい大腸菌の生育低下により測定することを可能にした。即ち、ｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子およびＧａｔＣＡＢ遺伝子を、ホストである大腸菌のＲＮＡポリメラーゼにより転写が開始されが、異なるプロモーターを持つ２つのプラスミド上に別個につなげ、形質転換した大腸菌を作成し、ｎｄＧｌｕＲＳおよびＧａｔＣＡＢの発現を確認した。一方、プラスミド上にＧａｔＣＡＢ遺伝子を持たない状態で、ｎｄＧｌｕＲＳ
のみを大腸菌に発現させると生育程度が９０％ほど減少したが、ＧａｔＣＡＢを共発現させることによりこの生育阻害を相補することを確かめた。従って、ＧａｔＣＡＢ活性が低下すると相補されなくなり、生育低下が測定される。さらに、この形質転換体と何も持たない大腸菌に対する生育阻害の程度を比較することによりＧａｔＣＡＢ特異的阻害物質のスクリーニング系を構築した。
【発明の効果】
【００１１】
この発明の効果は、3種のタンパク質が複合体として、続けて反応を行うＧａｔＣＡＢにおいて、その酵素活性の低下を大腸菌の発育すなわち吸光度の低下として測定できることにある。この酵素活性測定系では、大量の酵素ｎｄＧｌｕＲＳや、ＧａｔＣＡＢをタンパク質として発現させる必要がない。従って、ＧａｔＣＡＢの変異体の活性を見たいとき、タンパク質としてそれぞれを精製することなく、活性低下変異体を選び出すことができる。吸光度を見る簡便な方法なので、ＧａｔＣＡＢのみをターゲットとした阻害物質のスクリーニングにおいて一度に多くのサンプルの取り扱いが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は構築したｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳのベクターマップである。（実施例１）
【図２】図２は構築したｐＣＴｇａｔＣＡＢのベクターマップである。（実施例１）
【図３】図３は非形質転換体、ｎｄＧｌｕＲＳのみ発現した大腸菌とｎｄＧｌｕＲＳ及びＧａｔＣＡＢを共発現した３種の大腸菌の発現タンパク質を螢光発色とウエスタンブロットにより確認した結果を示した。（実施例１）
【図４】図４は上記３種の大腸菌の生育を、吸光度とコロニー形成数により示した物である。（実施例１）
【図５】図５は上記３種の大腸菌を９６穴プレートで３反復ずつ培養し、吸光度を１５分ごとに測定、記録したものである。（実施例３）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
共発現のための２つのベクターとして、それらの発現タンパク質が大腸菌の発育低下を引き起こす。これを利用するためには、ｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子の転写を厳密に制御し、ＧａｔＣＡＢ遺伝子は恒常的に転写され、共通なＲＮＡポリメラーゼにより転写が開始され、異なる複製起点と抗生物質耐性及び異なるプロモーターを持ち、かつコピー数も同様である２種のプラスミドであることがのぞましい。また、大腸菌の発育測定は、連続的に吸光度を記録できる機器を使用すると、発育低下の様子が判明しやすい。
【実施例１】
【００１４】
供試菌株、および発現用ベクターの構築
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１０ＧｏｌｄはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ, Ｃａｌｉｆ.）から、Ｔｏｐ１０は  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐ. （Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ）より購入し、発現ベクターの構築に使用した。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ50より取得したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｎｄＧｌｕＲＳ遺伝子全配列をＰＣＲにより増幅した。この断片をｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）のＮｃｏＩ／ＸｂａＩサイトへつなぎ構築したベクターをｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳとした（図１）。同様に増幅したＧａｔＣＡＢオペロンは、ＧａｔＢ遺伝子のＣ末端にルミオペプチドタグ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）遺伝子配列を融合させ、まずｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ サイトにつなげクローニングした。さらに、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａのｔｒｃプロモーター・ターミネーターと共にルミオぺプチドタグのつながったＧａｔＣＡＢオペロンをｐＣＯＬＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩサイトにつなぎ、ｐＣＴｇａｔＣＡＢを構築した（図２）。
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）およびＴ４−ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）をＰＣＲおよびライゲーション反応に用いた。そのほかの標準的な遺伝子操作は非特許文献８を参考にした。
【００１５】
形質転換
前述のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＴｏｐ１０を共発現の宿主とし、エレクトロポーレーション法により先ずｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳを形質転換した。さらに得られたＥ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０/ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳからエレクトロポーレーション用コンピテントセルを調製し、ｐＣＴｇａｔＣＡＢを形質転換してＥ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＴｇａｔＣＡＢ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６２２  ＡＨＵ１８５１）を得た。またｐＣＴｇａｔＣＡＢの代わりにｐＣＯＬＡＤｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のみを形質転換し、Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＯＬＡ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６２３  ＡＨＵ１８５２）を得た。
【００１６】
共発現と発現の確認
形質転換体Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＴｇａｔＣＡＢを５０μｇ／ｍｌカナマイシン、５０μｇ／ｍｌカルベニシリン、０．２％アラビノースを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養した。
上記培養液の溶解バッファー溶解産物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動後Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い製品に添付のプロトコルに従って行ったウエスタンブロットによりｎｄＧｌｕＲＳの発現を確認した。ＧａｔＣＡＢの発現は添付のマニュアルに従って行ったＬｕｍｉｏＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による蛍光発色により確認した（図３）。
【００１７】
共発現状態での大腸菌の生育曲線  
非形質転換体Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０、ｎｄＧｌｕＲＳのみを発現させたＥ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＯＬＡ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６２３  ＡＨＵ１８５２）および共発現させたＥ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＴｇａｔＣＡＢ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６２２  ＡＨＵ１８５１）の発育を時間の経過と共に６００ｎｍの吸光度とコロニー形成単位により測定した（図４）。
【００１８】
この結果、ｎｄＧｌｕＲＳのみを発現させて起こる大腸菌の生育の低下は、ＧａｔＣＡＢタンパク質を共発現させることにより相補することが確かめられた。
【００１９】
大腸菌細胞の生残率
生細胞を緑に、死細胞を赤に染め分けるＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
Ｋｉｔｓを用い、上記３種の大腸菌細胞を染色し、顕微鏡下で比較し、生残数を計測したところｎｄＧｌｕＲＳによる生育阻害がＧａｔＣＡＢにより相補されていることが視覚的にも明らかになった。
【実施例２】
【００２０】
既にｔＲＮＡ結合能の低下をゲルシフトアッセイにより確かめている変異型ＧａｔＣＡＢ遺伝子をつなげたＥ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＴｇａｔＣＡＢＭを上記と同様に共発現し、この生育を計測した結果、野生型ＧａｔＣＡＢ遺伝子を共発現させた大腸菌に比べ生育が低下し、ＧａｔＣＡＢを発現させないものと同様の生育曲線を示した。
【実施例３】
【００２１】
Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＴｇａｔＣＡＢ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６２３  ＡＨＵ１８５２）を試験菌とし、Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＢＡＤｎｄｇｌｕＲＳ／ｐＣＯＬＡ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１６２２  ＡＨＵ１８５１）と非形質転換体Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０と共に、ハイスループットスクリーニング目指し、９６穴プレート１５０μｌの培養液中、３０℃で培養し、１５分間隔で１２時間６５０ｎｍの吸光度を測定した。実施例１と同様、ｎｄＧｌｕＲＳのみを発現させて起こる大腸菌の生育の低下は、ＧａｔＣＡＢタンパク質を共発現させることにより相補することが確かめられた（図５)。
これらの培養液にＧａｔＣＡＢ活性阻害が期待される物質を加え、生育を見ることにより
ＧａｔＣＡＢ活性のみを阻害し、非形質転換体Ｔｏｐ１０には影響を与えない特異的阻害剤のスクリーニングが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明により、迅速に効率よくＧａｔＣＡＢ活性低下を測定することができる。一次スクリーニングとしてハイスループットスクリーニング系への利用も可能である。なお、ＧａｔＣＡＢ阻害物質は多剤耐性菌に対する新規抗生物質として見込まれる。
【符号の説明】
【００２３】
ＰＢＡＤ，Ｐｔｒｃ    プロモーター名
ＡｍｐＲ、ＫｍＲ            耐性遺伝子
―    非形質転換体（誘導なし）
ＲＳ  ｎｄＧｌｕＲＳ発現大腸菌
Ｃｏ  ｎｄＧｌｕＲＳおよびＧａｔＣＡＢ共発現大腸菌
ｐＢＲ３２２ｏｒｉ、ＣｏｌＡｏｒｉ  各プラスミド複製開始点遺伝子
Ａ６００、Ａ６５０  波長６００ｎｍ、６５０ｎｍにおける吸光度
ＣＦＵ  コロニー形成単位
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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