(57)【要約】      （修正有）【課題】培養液中に産生される糖鎖化合物を分離精製する際に問題となる泡立ち、及び、固相抽出時の目詰まりを抑制させる方法を提供する。【解決手段】動物細胞の糖鎖化合物を含有する培養液（糖鎖プライマー法によって糖鎖化合物を生成させた水性媒体）に、パパイン、ブロメライン、トリプシン、サチライシン等から選択されるタンパク質分解酵素を作用させ、培養液中のタンパク質を分解することにより泡立ちを抑えた後、該糖鎖化合物を水性媒体から分離・精製する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖化合物の製造方法であって、糖鎖化合物を含有する水性媒体にタンパク質分解酵素を作用させた後に、糖鎖化合物を水性媒体から分離・精製することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
糖鎖化合物を含有する水性媒体が、糖鎖プライマー法によって糖鎖化合物を生成させた細胞培養液または培養上清である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
タンパク質分解酵素が、パパイン、ブロメライン、トリプシン、サチライシン、Ｐｆｕ  プロテアーゼＳからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
水性媒体からの糖鎖化合物の分離・回収に際し、合成吸着剤による濃縮が単独もしくは他の方法と組み合わせて用いられる、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
水性媒体からの糖鎖化合物の分離・回収に際し、液液分配クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、固相カラムカートリッジ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、およびＧＰＣから選択される少なくとも一つの方法が用いられる、請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬・医療・研究用素材などに利用される糖鎖化合物の生産方法に関する。より詳しくは、培地中に存在する糖鎖化合物を精製する際、酵素処理により、濃縮や精製する時に問題となる泡立ちの抑制を行うことにより糖鎖化合物を製造するための新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖鎖の研究は急速に進展し、産業利用開発も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等の関わりに関して新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や糖鎖と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることが明らかになってきている。
【０００３】
天然型の糖鎖において、シアル酸を含む一群のスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドは、脳内微量ガングリオシドの構造解析や機能などを解明するために、イオン交換クロマトグラフィにより、ウシの脳から分離・精製されている。また、シアル酸のない中性糖鎖であるグロボ系構造についても、機能解明が進められている。糖脂質の精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィやHPLC、HPTLCなどが行われている。（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）
糖鎖の合成方法としては、化学的に合成する方法、分解酵素による方法、糖転移酵素を用いる方法などがあるが、それぞれ、工程が煩雑であったり、収量が低かったり、使用原料が限定されるなどの欠点がある。このような中、最近、動物細胞の機能を利用した糖鎖合成技術が注目されている。
【０００４】
動物細胞の機能を利用した糖鎖合成では、糖鎖合成経路の前駆体となる糖鎖プライマーを培地中に添加することにより細胞内に取り込ませると、糖鎖伸長を受けた生成物が細胞外に分泌されるようになる（糖鎖プライマー法）。このようにして生成される糖鎖伸長物を分離・精製し、有用な糖鎖のスクリーニング、あるいは産業利用するための研究が進められている。（非特許文献１、６）。
【０００５】
しかしながら、動物細胞により伸長されて生成する糖鎖化合物は、細胞種、糖鎖プライマーのオリゴ糖部分の構造により多種多様な糖鎖化合物が複数種類混在して生成することや、糖鎖プライマーが残存することから、単一種類の糖鎖化合物を得るためには、これらの糖鎖を分離しなければならない。
【０００６】
動物細胞の機能を利用した糖鎖合成において、動物細胞により作られた糖鎖化合物を分離・精製する方法は、従来C18系固相カートリッジでの濃縮や、HPLCまたはＨＰＴＬＣを用いた分離方法が行われていた（例えば特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献４）が、最近、糖脂質や糖脂質類似化合物を合成吸着剤により濃縮する方法や液液分配クロマトグラフィを用いて分離する方法が開発されている（非特許文献６）。
【０００７】
しかしながら、大量の動物細胞の培養液を扱う場合には、泡立ちが問題となる。消泡剤を加える方法ではその除去に手間がかかることや、アルカリ条件下で加熱する場合、アルカリの添加や加熱用の設備が必要となる。
【０００８】
また、固相カートリッジや合成吸着剤を用いた濃縮（固相抽出法）によって糖鎖化合物の分離・精製を行う場合には、固相カートリッジや合成吸着剤を充填したカラム等の目詰まりも問題となる。
【特許文献１】特開２０００−２４７９９２
【非特許文献１】M. C. Z. Kasuyaら、Carbohydrate Research 329 (2000) 755-763
【非特許文献２】Johannes Muthing, Method in Enzymology, Vol312, Part B, 45-64
【非特許文献３】Stephan Ladisch and Ruixiang Li, Method in Enzymology, Vol312, Part B, 135-145
【非特許文献４】Robert K. Yu and Toshio Ariga, Methods in Enzymology, Vol312, Part B, 115-134
【非特許文献５】Y. Hirabayashiら、J. Biol. Chem., 265 (1990), 8144-8151
【非特許文献６】T. Katoら、J. Chromatogr. A 1178 (2008), 154-159
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、動物細胞の培養液中に生産された化合物を抽出・精製する場合において簡便に泡立ちを抑え、特に抽出操作を固相で行う場合、目詰まりを低減できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、動物細胞の培養液中に、タンパク質分解酵素を添加することにより泡立ちを抑える方法を見出し、本発明を完成するに到った。即ち、本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであり、以下発明を包含する。
[１]  糖鎖化合物の製造方法であって、糖鎖化合物を含有する水性媒体にタンパク質分解酵素を作用させた後に、糖鎖化合物を水性媒体から分離・精製することを特徴とする製造方法。
[２]  糖鎖化合物を含有する水性媒体が、糖鎖プライマー法によって糖鎖化合物を生成させた細胞培養液または培養上清である、[１]記載の製造方法。
[３]  タンパク質分解酵素が、パパイン、ブロメライン、トリプシン、サチライシン、Ｐｆｕ  プロテアーゼＳからなる群より選択される少なくとも一種である、[１]記載の製造方法。
[４]  水性媒体からの糖鎖化合物の分離・回収に際し、合成吸着剤による濃縮が単独もしくは他の方法と組み合わせて用いられる、[１]記載の製造方法。
[５]  水性媒体からの糖鎖化合物の分離・回収に際し、液液分配クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、固相カラムカートリッジ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、およびＧＰＣから選択される少なくとも一つの方法が用いられる、[１]記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
以上のように、本発明を適用することによって、これまで動物細胞の培養液から化合物を抽出する際、泡立つことによりに濃縮操作等で作業性が悪かったが、タンパク質分解酵素によりタンパク質を分解させることにより、大量の動物細胞の培養液からの抽出、精製が容易になる。特に、固相抽出時の目詰まりを大幅に低減することが可能となる。  よって、糖鎖プライマー法で得られる糖鎖化合物等のような動物細胞によって産生される化合物の大量精製が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１３】
本発明は、糖鎖化合物の製造方法であって、糖鎖化合物を含有する水性媒体にタンパク質分解酵素を作用させた後に、糖鎖化合物を水性媒体から分離・回収する工程を含む方法である。
【００１４】
糖鎖化合物を含有する水性媒体としては、水、緩衝液、培養培地等の水性媒体中に、糖鎖、糖脂質、糖鎖伸長プライマー法により得られる糖鎖伸長物等を含むものであれば、特に制限されない。例えば、生体組織や細胞のホモジネート、抽出液、糖鎖プライマー伸長法によって糖鎖化合物（糖鎖伸長物）が蓄積された細胞培養液／培養上清等が挙げられる。なかでも、糖鎖プライマー伸長法によって糖鎖化合物（糖鎖伸長物）が蓄積された細胞培養液／培養上清が好ましい。
【００１５】
また、細胞による糖鎖プライマー伸長法による糖鎖合成において、細胞培養物は、好ましくは動物細胞を糖鎖化合物が得られるような条件にて培養することで得られる。動物細胞は特に限定されず、所望の糖鎖化合物の種類に応じて様々な動物細胞が用いられ得る。動物細胞の例としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、特にB１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞などが好適に用いられ得る。培養は、通常の培養条件に従って行う
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間でＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培養培地で前培養した後、糖鎖プライマーを添加した培地に置換して更に培養を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。
【００１６】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。限定はされないが、好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：
（Ｇ１）x（Ｇ２）y（Ｇ３）z−Ｌ−Ｘ            ・・・（Ｉ）
で表される化合物が挙げられる。ここで、式中、Ｇ１、Ｇ２及びＧ３は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2）n−、−Ｓ−（ＣＨ2）n−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2）n−から選択される連結基であり、Ｘは、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ1〜Ｃ4アルキルから選択される基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、ｎは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００１７】
このような糖鎖プライマーを各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、糖鎖プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。付加される糖は、細胞により異なる。
【００１８】
本発明では、このようにして得られる糖鎖化合物を含有する水性媒体から、糖鎖化合物を分離・精製するに先立ち、前記水性媒体をタンパク質分解酵素で処理する。
【００１９】
タンパク質分解酵素としては、キモトリプシン、トリプシン、サチライシン、Pfu Protease Sなどの酵素の活性中心にセリン残基をもつセリンプロテアーゼ、ペプシン、カテプシンD、HIVプロテアーゼなどの触媒残基としてアスパラギン酸をもつ、アスパラギン酸プロテアーゼ、サーモリシンなどのメタロプロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、カスパーゼなどのシステインプロテアーゼ、などが好適に用いられ得る。
【００２０】
タンパク質分解酵素の使用量としては、通常１０ｍｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌであり、好ましくは０．１ｇ／Ｌから０．５ｇ／Ｌである。処理時のｐＨは、通常３から１２、好ましくは  ７から８であり、処理温度は、動物・植物由来のパパイン、ブロメライン、サチライシンは、通常４０から９０℃、好ましくは６０から８０℃である。細菌由来の酵素の場合は、その特性によるが、超好熱菌由来の場合、通常５０から１００℃、好ましくは６０から９５℃であり、常温菌由来の場合、通常４から５０℃、好ましくは２０から４０℃である。処理時間は通常１０分から２日、好ましくは２から１６時間である。
【００２１】
上記タンパク質分解酵素処理の後、Ｃ１８担体や合成吸着剤などを用いた固相抽出法により、糖鎖化合物を濃縮することができる。合成吸着剤としては、ダイヤイオンＨＰ２０、セパビーズ（登録商標、以下同じ）ＳＰ２０７、ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ等を挙げることができる。
【００２２】
濃縮された糖鎖化合物は、陰イオン交換カラムクロマトグラフィや高速液体クロマトグラフィなどで分離できる。また、中性糖鎖化合物、酸性糖鎖化合物は、それぞれの特性に応じた二層系の液系を使用することにより、液液分配クロマトグラフィを用いて効率的に分離精製することも可能である。
【００２３】
糖鎖プライマーは、ラクトースやＮ−アセチルグルコサミンなどをドデシル基と結合することで糖鎖プライマーとして利用できる。更に、アジド基などの官能基をアグリコン部分に導入しておけば、共有結合などで固定化することが可能である。
【００２４】
以下に、本発明の糖鎖化合物の精製方法および濃縮方法の具体例を実施例の態様で示すが、本発明はこれに限定されない。
【実施例】
【００２５】
（実施例１）
まず、触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)とアルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、糖鎖プライマー：１２アジドドデシル−βラクトシドを得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063, Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）。
【００２６】
１００ｍｍのディッシュに、細胞数２×１０6ｃｅｌｌｓのマウスメラノーマＢ１６細胞及びサルの腎臓由来であるベロ細胞をそれぞれ７ｍｌの１０％  ＦＢＳ、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）に懸濁して播き、ＣＯ2インキュベーターの中で３７℃にて４８時間、前培養を行った。
【００２７】
前培養後、終濃度５０μＭの１２−アジドドデシル−βラクトシド、１％のＩＴＳ−Ｘサプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ2インキュベーターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。糖鎖伸長反応後、培地を回収した。
【００２８】
回収した７ｍｌの培地上清に、市販のＰｆｕ  ＰｒｏｔｅａｓｅＳ（タカラバイオ）１０μｌ、パパイン（和光純薬）1ｍｇ、ブロメライン（和光純薬）１ｍｇ、トリプシン（和光純薬）１ｍｇ、サチライシン（ＳＩＧＭＡ）１ｍｇを各々加えた。Ｐｆｕ  ＰｒｏｔｅａｓｅＳ、パパイン、ブロメライン、トリプシンを添加したものは６０℃、サチライシンを添加したものは３７℃にて１６時間インキュベートした。
【００２９】
各タンパク質分解酵素で処理した培地上清の泡立ち方を、無処理の培養液と比較した。比較は、１５ｍｌ容量の容器に培地上清を移し、２０回激しく振って１分間静置した後に残存する泡の量を調べることにより行った。結果を図１に示すが、いずれにおいても、泡立ちの抑制効果が認められた。特に効果が高かったのは、サチライシン、Ｐｆｕ  ＰｒｏｔｅａｓｅＳであった。
【００３０】
タンパク質分解酵素で処理した培地上清から、それぞれ５μｌずつサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果を図２に示すが、Ｐｆｕ  ＰｒｏｔｅａｓｅＳやトリプシンで処理した区分においては、Ｂ１６細胞、ベロ細胞のいずれの培養液においても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出されるバンドが消失していた。また、他のタンパク質分解酵素で処理した培養液についても、６２ｋＤａ程度のタンパク質のバンドが消失或いは減少していた。
【００３１】
回収した培地上清中に含まれる糖鎖化合物については、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製した。得られた全抽出物を５０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣ分析した結果を図３に示す。いずれの酵素で処理した場合においても、生産物である糖鎖伸長物の回収量には影響がなかった。
【００３２】
（実施例２）
２６枚の１００ｍｍのディッシュに、細胞数２×１０6ｃｅｌｌｓのマウスメラノーマＢ１６細胞を７ｍｌの１０％  ＦＢＳ、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）に懸濁して播き、ＣＯ2インキュベーターの中で３７℃にて４８時間、前培養を行った。
【００３３】
前培養後、終濃度５０μＭの１２−アジドドデシル−βラクトシド、１％のＩＴＳ−Ｘサプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ2インキュベーターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。糖鎖伸長反応後、ディッシュ毎に培地を回収した。
【００３４】
１３枚のディッシュについては、回収した７ｍｌの培地上清に、市販のＰｆｕ  ＰｒｏｔｅａｓｅＳ（タカラバイオ）１０μｌを加え、６０℃にて１６時間インキュベートした。
【００３５】
Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カラム（充填剤量３６０ｍｇ／ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製した。その際、酵素処理した培養液と、非処理の培養液を、それぞれ１本のカートリッジで、ディッシュ１、３、９枚分処理した。方法としては、まず、１０ｍｌのメタノールを流すことにより活性化し、１０ｍｌの水を流した後、培養液を通し、さらに１０ｍｌの水を流した後、１０ｍｌのメタノールで溶出した。その際、酵素処理しなかった培養液を、ディッシュ９枚分通液する際、目詰まりが起こり、処理に時間がかかった。溶出液の溶媒を除去した後、１枚分のディッシュのサンプルについては５０μｌ、３枚分のディッシュのサンプルについては１５０μｌ、９枚分のディッシュのサンプルについては４５０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣ分析した結果を図４に示す。その際、各サンプル５μｌをスポットした。
【００３６】
ＨＰＴＬＣの結果からデンシトグラム化を行い、各々の糖鎖伸長産物であるＧＭ３型糖鎖化合物の回収率を求めた結果を図５に示した。この結果から、タンパク質分解酵素処理することにより、精製効率が向上することがわかった。
【００３７】
以上の結果から、培養液中のタンパク質を分解することにより、固相抽出時の目詰まりを軽減し作業負担を減らし、更には培養液からの糖鎖化合物の回収率を高めることができた。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】各種タンパク質分解酵素で処理した培養液の泡立ち方を比較した結果を示す。
【図２】各種タンパク質分解酵素で処理した培養液中に存在するタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。
【図３】各種タンパク質分解酵素で処理による、培養液からの細胞によって産生された糖鎖化合物の収量への影響をＨＰＴＬＣにより調べた結果を示す。
【図４】タンパク質分解酵素で処理した培養液と非処理の培養液から固相抽出法により糖鎖化合物を回収したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果を示す。
【図５】図４で得られたＨＰＴＬＣの結果より、回収できたＧＭ３の量を比較した結果を示す。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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