(57)【要約】【課題】  微小流量を分離媒体に送液するための送液方法、及び送液装置を提供すること。【解決の手段】  送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値と、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値とを計測し、（１）前記送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値に、１未満の任意の流量比率を乗じた、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流すべき液体の計算流量値と、前記分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値とが一致するよう、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御する、または、（２）前記分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値に、１を超える任意の流量比率を乗じた、送液手段と分岐手段との間に流すべき液体の計算流量値と、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量の計測値が一致するよう、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値を制御する、微小流量送液方法、及び前記方法を利用した送液装置を用いることで、前記課題を解決した。【選択図】  図６
2010101630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
送液手段によって液体を流し、分岐手段を用いて、分離媒体側の流路及び廃棄側の流路とに分岐させることで、微小流量の液体を分離媒体に流す微小流量送液装置であって、
送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値を任意のサンプリング間隔で計測する第一の流量計と、
分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値を第一の流量計と同じまたは異なるサンプリング間隔で計測する第二の流量計と、
分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を必要に応じて制御する流量制御手段と、
第一及び第二の流量計で計測された流量値に基づいて、送液手段と分岐手段との間の流路、分離媒体側の流路、及び廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御するための信号を送る演算手段とを備え、
前記演算手段は
（１−１）第一の流量計で計測された流量値を入力値として、当該流量値に１未満の任意の値を乗じて、第二の流量計で計測されるべき流量値を計算し、
（１−２）第二の流量計で計測された流量値を入力値として、前記計算流量値と比較し、両方の流量値を一致させるように、前記流量制御手段を制御する、
または、
（２−１）第二の流量計で計測された流量値を入力値として、当該流量値に１を超える任意の値を乗じて、第一の流量計で計測されるべき流量値を計算し、
（２−２）第一の流量計で計測された流量値を入力値として、前記計算流量値と比較し、両方の流量値を一致させるように、前記送液手段を制御する、
ことを特徴とする、前記装置。
【請求項２】
前記第一及び第二の流量計が、熱式流量計であることを特徴とする、請求項１に記載の微小流量送液装置。
【請求項３】
廃棄側の流路に前記第二の流量計及び前記流量制御手段を設置していることを特徴とする、請求項１から２に記載の微小流量送液装置。
【請求項４】
前記演算手段には、各サンプリング間隔で計測した時間における、
（１）第一及び第二の流量計で計測された流量値、
（２）第一または第二の流量計で計測されるべき流量の計算値、
（３）流量制御手段または送液手段で制御すべき流量値、
（４）流量制御手段または送液手段の制御に関する情報、
を記録するための記録手段を備えていることを特徴とする、請求項１から３に記載の微小流量送液装置。
【請求項５】
送液手段を用いて液体を流し、分岐手段を用いて分離媒体側の流路及び廃棄側の流路とに分岐させることで、微小流量の液体を分離媒体に流す微小流量送液方法であって、
送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値と、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値を計測し、
（１−１）前記送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値に、１未満の任意の値を乗じて、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流すべき液体の流量値を計算し、
（１−２）前記計算流量値と、前記分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値とが一致するように、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御する、
または
（２−１）前記分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量に、１を超える任意の値を乗じて、送液手段と分岐手段との間に流すべき液体の流量値を計算し、
（２−２）前記計算流量値と、前記送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値とが一致するように、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量を制御する、
ことを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値に１未満の任意の値を乗じた計算値で制御される流量が、廃棄側の流路に流れる液体の流量であることを特徴とする、請求項５に記載の微小流量送液方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
毎分数百ｎＬから数十μＬといった微小流量を流すための装置、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎分数百ｎＬから数十μＬといった微小流量を流すことができる装置は存在するものの、多くの欠点を有する。液体クロマトグラフィでよく知られるストローク機構を有するポンプは、前記微小流量を安定的に流すことは期待できない。別法として、シリンジ式ポンプは、前記微小流量においても比較的安定的に流すことができるものの、シリンジ容量が有限であり、かつ、連続的な使用が困難で各バッチ間に差異が生じやすいといった課題がある。
【０００３】
古典的な微小流量を流すための方法として、スプリット法（スタティックスプリット法）が知られている。目的の流量の数十倍から数百倍の流量を流し、分離媒体（７）の前で分岐手段（１３）を用いて分岐し、その数十分の一から数百分の一を分離媒体側（Ａ側流路）に流し、残りの大部分を廃棄側（Ｂ側流路）に流す方法である（図１参照）。本法ではＡ側流路とＢ側流路の圧力比により分岐比率が決まる。定常状態では微小流量を流すことができるが、Ａ側流路とＢ側流路の圧力比が外乱により変化した場合、分岐比率が変化し、目的の微小流量も変化してしまう欠点がある（特許文献１及び２）。
【０００４】
スタティックスプリット法の欠点を解決するために提案されたのが、アクティブスプリット法である（特許文献３）。本法（図２参照）は、Ａ側流路またはＢ側流路に熱式流量計（５ａ）を配置し、流量が一定になるよう可動式のオリフィスバルブ（流量制御装置）（５ｂ）で制御するものである。分離媒体（７）の下流側には目的成分の検出や捕獲するための機器を配置することが多いため、図２の装置のようにＢ側流路に熱式流量計（５ａ）を配置するのが一般的である。本法は、分離媒体や各配管の物理的な詰まりなどによる外乱が発生しても、スタティックスプリット法と比較し、Ａ側流路に流れる微小流量への影響は少ない。しかしながら、アクティブスプリット法にもいくつかの課題がある。
【０００５】
第一の課題として、Ｂ側流路の流量を一定にする制御を行なうため、分岐前の流量が変化した場合、その変化分はすべて目的流路であるＡ側流路の流量変化となる。
【０００６】
例えば図２の装置の場合、Ｂ側流路の流量値（Ｆｂ）を熱式流量計（５ａ）により任意のサンプリング間隔で計測し、その値が一定になるように流量制御装置（５ｂ）で制御する。この値と分岐前の流量（Ｆｍ）との差がＡ側流路に送液される（Ｆａ）。その流量変化を図３に示す。
【０００７】
Ｆａ＝Ｆｍ−Ｆｂ
Ｆａ：Ａ側流路の流量（微小流量）
Ｆｂ：Ｂ側流路の流量値（大流量）
Ｆｍ：分岐前の流量
ここで使用される熱式流量計（５ａ）は高精度であるため、分岐前の流量（Ｆｍ）が変動してもＢ側流路を一定に保つことができる（図３（ａ））。よって、分岐前の流量（Ｆｍ）が変動した場合、その偏差の殆どがＡ側流路の流量（Ｆａ）に影響する（図３（ｂ））。たとえば、分岐前の流量（Ｆｍ）毎分５０μＬ、Ｂ側流路の流量（Ｆｂ）を毎分４９μＬで制御した場合、理論的にはＡ側流路の流量（Ｆａ）は、毎分１μＬとなる。分岐前の流量（Ｆｍ）が毎分±０．２μＬ変動した場合、Ｂ側流路の流量（Ｆｂ）は毎分４９μＬで制御されるため、Ａ側流路の流量（Ｆａ）は毎分０．８から１．２μＬで変動し、±２０％の誤差が生じてしまう。
【０００８】
第二の課題として、流す液体の比熱が変化する場合（液体クロマトグラフィで使用される溶媒グラジエントなどの手法）、熱式流量計の応答が変化する。例えば、水で校正を行なった熱式流量計でアセトニトリルを使用した場合、同じ流量でありながら応答出力は水の場合の約３０％である。よって、前記熱式流量計を用いたアクティブスプリット法による微小流量を流す方法において、水に続きアセトニトリルを流した場合、送液量が一定であると前記熱式流量計の応答出力が減少するため、応答出力を一定にするにはＢ側流路の流量が増加させる必要があり、結果的にＡ側流路の流量が減少する。そのため、アクティブスプリット法により微小流量を流すのは更に困難となる。
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−３０９１３５号公報
【特許文献２】特表２００４−５０６８９６号公報
【特許文献３】特開２００６−２７６０２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
分析装置において、毎分数百ｎＬから数十μＬといった微小流量を分離媒体へ流すための微小流量送液手段、及び送液方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
第一の発明は、送液手段によって液体を流し、分岐手段を用いて、分離媒体側の流路及び廃棄側の流路とに分岐させることで、微小流量の液体を分離媒体に流す微小流量送液装置であって、
送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値を任意のサンプリング間隔で計測する第一の流量計と、
分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値を第一の流量計と同じまたは異なるサンプリング間隔で計測する第二の流量計と、
分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を必要に応じて制御する流量制御手段と、
第一及び第二の流量計で計測された流量値に基づいて、送液手段と分岐手段との間の流路、分離媒体側の流路、及び廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御するための信号を送る演算手段とを備え、
前記演算手段は
（１−１）第一の流量計で計測された流量値を入力値として、当該流量値に１未満の任意の値を乗じて、第二の流量計で計測されるべき流量値を計算し、
（１−２）第二の流量計で計測された流量値を入力値として、前記計算流量値と比較し、両方の流量値を一致させるように、前記流量制御手段を制御する、
または、
（２−１）第二の流量計で計測された流量値を入力値として、当該流量値に１を超える任意の値を乗じて、第一の流量計で計測されるべき流量値を計算し、
（２−２）第一の流量計で計測された流量値を入力値として、前記計算流量値と比較し、両方の流量値を一致させるように、前記送液手段を制御する、
ことを特徴とする、前記装置である。
【００１２】
第二の発明は、前記第一及び第二の流量計が、熱式流量計であることを特徴とする、第一に発明に記載の微小流量送液装置である。
【００１３】
第三の発明は、廃棄側の流路に前記第二の流量計及び前記流量制御手段を設置していることを特徴とする、第一から第二の発明に記載の微小流量送液装置である。
【００１４】
第四の発明は、前記演算手段には、各サンプリング間隔で計測した時間における、
（１）第一及び第二の流量計で計測された流量値、
（２）第一または第二の流量計で計測されるべき流量の計算値、
（３）流量制御手段または送液手段で制御すべき流量値、
（４）流量制御手段または送液手段の制御に関する情報、
を記録するための記録手段を備えていることを特徴とする、第一から第三の発明に記載の微小流量送液装置である。
【００１５】
第五の発明は、送液手段を用いて液体を流し、分岐手段を用いて分離媒体側の流路及び廃棄側の流路とに分岐させることで、微小流量の液体を分離媒体に流す微小流量送液方法であって、
送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値と、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値を計測し、
（１−１）前記送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値に、１未満の任意の値を乗じて、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流すべき液体の流量値を計算し、
（１−２）前記計算流量値と、前記分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値とが一致するように、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御する、
または
（２−１）前記分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量に、１を超える任意の値を乗じて、送液手段と分岐手段との間に流すべき液体の流量値を計算し、
（２−２）前記計算流量値と、前記送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値とが一致するように、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量を制御する、
ことを特徴とする、前記方法である。
【００１６】
第六の発明は、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値に１未満の任意の値を乗じた計算値で制御される流量が、廃棄側の流路に流れる液体の流量であることを特徴とする、第五の発明に記載の微小流量送液方法である。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値と、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値を計測し、
計測した送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値に、１未満の任意の流量比率を乗じた流量値を計算し、前記計算流量値と、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量の計測値とが一致するよう、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御する、
または、
計測した分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値に、１を超える任意の流量比率を乗じた流量値を計算し、前記計算流量値と、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量の計測値とが一致するよう、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量を制御することで、
一定の微小流量の液体を分離媒体側の流路に流すことを特徴としている。
【００１９】
本発明の微小流量送液方法における流量値の計測方法としては、液体の流量が計測可能な装置を用いるのであれば限定されないが、特に微小流量の液体を高精度に計測可能な熱式流量計を用いて計測するのが好ましい。
【００２０】
本発明の微小流量送液方法において、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御する場合は、液体の流量を計測した流路と同じ流路に流れる液体の流量を制御（例えば、流量を計測する流路が分離媒体側の流路の場合、分離媒体側の流路の流量を制御）してもよいし、液体の流量を計測した流路と異なる流路を流れる液体の流量を制御（例えば、流量を計測する流路が分離媒体側の流路の場合、廃棄側の流路の流量を制御）してもよいが、制御の容易性から前者の制御が好ましい。
【００２１】
本発明の微小流量送液方法における、流量制御手段を用いた、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量制御方法としては、以下の方法があげられる。
［１］流量を制御する流路上にバルブを設置し、流量を制御する方法。
［２］分岐手段中にバルブを設置し、流量を制御する方法。
このうち、［１］または［２］の方法におけるバルブとしては、流量制御に通常用いられるゲートバルブ（仕切弁）、グローブバルブ（玉形弁）、バタフライバルブ、ダイヤフラムバルブを例示できるが、容易に微小流量の制御が可能なオリフィス板を利用したバルブを用いるのが好ましい。また、オリフィス板を利用したバルブを用いた流量制御では、
［３］オリフィス板が全開の状態から制御を開始し、その状態からオリフィス板を狭める制御、
［４］オリフィス板が中間開度の状態から制御を開始し、その状態からオリフィス板を広げる、または狭める制御、
いずれの制御を行なってもよい。［３］の制御は、流量を開始時の流量から増加させる制御を行なう場合、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量制御を行なう必要があるものの、オリフィス板で制御できる流量の範囲を、［４］の制御と比較し広くすることができる。一方［４］の制御は、オリフィス板で制御できる流量の範囲は［３］の制御と比較し狭いものの、流量を開始時の流量から増加させる制御を行なう場合でも、オリフィス板を広げる制御で対応できる。
【００２２】
本発明の微小流量送液方法における、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量制御方法としては、送液手段で流す液体の流量を制御する方法があげられる。
【００２３】
本発明の微小流量制御方法では、以下の［１］または［２］のいずれかの制御を行なう方法でもよいし、必要に応じて［１］と［２］の制御を切り替える方法であってもよい。
［１］分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御
［２］送液手段と分岐手段との間の流路に流れる液体の流量を制御
後者の微小流量制御方法を採用した場合には、分離媒体側または廃液側の流路に流れる液体の計測流量値と、計算流量値との間に大きな違いがあり、分離媒体側または廃液側の流路に設置した流量制御装置では流量の制御ができなくなった場合（例えば、オリフィスバルブが全開となった場合）でも、送液手段で流す液体の流量制御に切り替えることで、分離媒体側または廃液側の流路に流れる液体の流量を制御することができる。
【００２４】
分離媒体側流路に設置される分離媒体としては、微小試料を分析・分取する目的に合致したものであればよく、微小試料を分析・分取するための液体クロマトグラフ用カラム、キャピラリー電気泳動用カラム、電気泳動などの分析用マイクロプレート、分取用マイクロプレートを例示することができる。また、分取した試料を別の試薬と反応させるマイクロリアクターの構成要素としても、本発明の送液方法を採用できる。
【００２５】
本発明の微小流量送液方法を用いた送液装置の一態様を図４に示す。送液ポンプ（２）により溶離液（１）を一定流量で送液する。送液された溶離液（１）は第一の熱式流量計（４）を通過した後、分岐ブロック（１３）により分離媒体側（以下、Ａ側流路とする）と廃棄側（以下、Ｂ側流路とする）に分岐される。Ａ側流路には液体の流れる順に、第二の熱式流量計（５ａ）、流量制御装置（５ｂ）、試料注入装置（６）、分析カラム（７）、検出器（９）が配置されている。Ｂ側流路に流れた液体はそのまま廃液（１１）となる。なお、第一の熱式流量計（４）と第二の熱式流量計（５ａ）は接近して設置している。また、図４には記載されていないが、Ｂ側流路には必要に応じて抵抗管といった圧力調整手段を設置してもよい。
【００２６】
ポンプ（２）により送液された溶離液（１）の流量値を第一の熱式流量計（４）により、Ａ側流路に流れる溶離液の流量値を第二の熱式流量計（５ａ）により、それぞれ任意のサンプリング間隔で計測し、その値を演算機（１４）に入力後、前記演算機（１４）で、前記計測流量値のうち、第一の熱式流量計（４）で計測された流量値に１未満の任意の流量比率を乗じることでＡ側流路に流すべき流量を計算する。そして、前記計算流量値と、第二の熱式流量計（５ａ）で計測された流量値と比較し、両方の流量値が一致するよう、流量制御装置（５ｂ）の流量を制御する信号を前記演算機（１４）から送ることで、Ａ側流路に流れる溶離液の流量制御を行なう。これにより、Ａ側流路は毎分数百ｎＬから数十μＬといった微小流量が流れ、Ｂ側流路には分岐前の流量とＡ側流路の流量の差分が流れる。演算機（１４）は単独で存在してもよいし、第一の熱式流量計（４）または第二の熱式流量計（５ａ）に含まれてもよい。なお、前記演算機（１４）には前記制御を行なうためのプログラムが備えられており、さらに
（１）第一及び第二の熱式流量計で計測された流量値、
（２）第二の熱式流量計で計測されるべき流量の計算値、
（３）流量制御装置で制御すべき流量値、
（４）流量制御装置の制御に関する情報、
を記録するための記録手段を備えているのが、前記制御を効率的に行なう点で好ましい。
【００２７】
図４に示す、Ａ側流路に第二の熱式流量計（５ａ）を設置した送液手段では、分析カラム（７）の前に、少なくとも数百μＬ程度の内部容量を有する第二の熱式流量計（５ａ）及び流量制御装置（５ｂ）が設置されている。毎分数百ｎＬから数十μＬの微小流量が流れるＡ側流路に対し、第二の熱式流量計（５ａ）及び流量制御装置（５ｂ）の有する内部容量が大きいため、特に毎分数百ｎＬと極めて微小な流量をＡ側流路に流す場合、第一の熱式流量計（４）を流れた溶離液が流量制御装置（５ｂ）出口に設置された分析カラム（７）に到達するには相当の時間を要し（Ａ側流路の流量が毎分５００ｎＬで、前記流量計及び制御装置の有する内部容量が５００μＬの場合、溶離液が前記流量計及び制御装置の通過するのに計算上１０００分を要する）、分析カラム（７）へ到達する時間に遅れが生じる。
【００２８】
分離媒体に流れる液体の組成が変化しない系（例えば、アイソクラティック法での溶出、カラム洗浄、緩衝液置換）の場合は、事前に送液手段に溶離液を流すことで、分析カラム（７）へ到達する時間が遅れる問題は解消できる。また、第一の熱式流量計（４）と第二の熱式流量計（５ａ）は接近して設置しているため、第二の熱式流量計へ到達する時間の遅れは無視できる。
【００２９】
一方、液体の組成が経時的に変化する系（例えば、溶媒グラジエント法での溶出）では、分離カラムへの到達時間の遅れがそのまま組成変化への応答の遅れに繋がるため、第二の熱式流量計（５ａ）と流量制御装置（５ｂ）で流量を制御しても、分析カラム（７）に所望の流量及び組成の溶離液を送液するのは困難である。
【００３０】
本発明の微小流量送液方法を用いた送液装置の別の態様を図５に示す。
【００３１】
図４の装置との違いは、Ａ側流路の配置が液体の流れる順に、試料注入装置（６）、分析カラム（７）、検出器（９）、第二の熱式流量計（５ａ）、流量制御装置（５ｂ）となっていることである。なお、図５には記載されていないが、Ｂ側流路には必要に応じて抵抗管といった圧力調整手段を設置してもよい。図５の装置も、図４の時と同様、Ａ側流路には毎分数百ｎＬから数十μＬといった微小流量を作り出すことができる。
【００３２】
分離媒体に流れる液体の組成が変化しない系（例えば、アイソクラティック法での溶出、カラム洗浄、緩衝液置換）の場合は、図４の装置と同様、事前に送液手段に溶離液を流すことで、分離カラムへ到達する時間が遅れる問題は解消できる。また、第一の熱式流量計（４）と第二の熱式流量計（５ａ）との間には内部容量を有する分析カラム（７）が設置されているが、事前に送液手段に溶離液を流すことで、第二の熱式流量計へ到達する時間が遅れる問題も解消できる。
【００３３】
液体の組成が経時的に変化する系（例えば、溶媒グラジエント法での溶出）では、図４の時と同様、分析カラム（７）への到達時間の遅れがそのまま組成変化への応答の遅れに繋がるが、第一の熱式流量計（４）と分析カラム（７）とが接近して設置している場合は、分析カラム（７）へ到達する時間が遅れる問題は無視できる。しかしながら、第一の熱式流量計（４）と第二の熱式流量計（５ａ）との間には、内部容量を有する分析カラム（７）が設置されているため、第二の熱式流量計へ到達する時間が遅れる問題、つまり組成変化への応答が遅れる問題が無視できなくなる。また、分離した目的成分の分画（捕集）装置、及び質量分析装置といった他の分析装置を第二の熱式流量計（５ａ）及び流量制御装置（５ｂ）の後に設置した場合、第二の熱式流量計（５ａ）及び流量制御装置（５ｂ）に少なくとも数百μＬ程度の内部容量を有しているため、当該分取装置及び他の分析装置に所望の流量及び組成の溶離液を送液するのはさらに困難となる。なお、分画（捕集）装置、及び他の分析装置を分析カラム（７）と第二の熱式流量計（５ａ）の間に設置した場合は当該分取装置及び他の分析装置へ到達する時間が遅れる問題は解消できるが、第一の熱式流量計（４）と第二の熱式流量計（５ａ）との間の距離がさらに離れるため、第二の熱式流量計へ到達する時間にさらに大きな遅れが発生する。
【００３４】
本発明の微小流量送液方法を用いた送液装置の好ましい態様を図６に示す。
【００３５】
図４の装置との違いは、第二の熱式流量計（５ａ）、流量制御装置（５ｂ）がＢ側流路に配置されており、Ａ側流路には液体の流れる順に、試料注入装置（６）、分析カラム（７）及び検出器（９）が配置されていることである。なお、第一の熱式流量計（４）と第二の熱式流量計（５ａ）は接近して設置している。また、図６には記載されていないが、Ｂ側流路には必要に応じて抵抗管といった圧力調整手段を設置してもよい。
【００３６】
ポンプ（２）により送液された溶離液（１）の流量値を第一の熱式流量計（４）により、Ｂ側流路に流れる溶離液の流量値を第二の熱式流量計（５ａ）により、それぞれリアルタイムで計測し、その値を演算機（１４）に入力後、前記演算機（１４）で、前記計測流量値のうち、第一の熱式流量計（５ａ）で計測された流量値に１未満の任意の流量比率を乗じることでＢ側流路に流すべき流量を計算する。そして、前記計算流量値と、第二の熱式流量計（５ａ）で計測された流量値と比較し、両方の流量値が一致するよう、流量制御装置（５ｂ）の流量を制御する信号を前記演算機（１４）から送ることで、Ｂ側流路に流れる溶離液の流量をリアルタイムで制御を行なう。これにより、Ａ側流路には分岐前の流量とＢ側流路の流量の差分が流れる。
【００３７】
図６の微小流量送液装置の場合、第二の熱式流量計（５ａ）及び流量制御装置（５ｂ）といった内部容量が少なくとも数百μＬ程度有する装置が、流量の多い廃棄側流路（Ｂ側流路）に設置されている。そのため、Ａ側流路に設置の分析カラム（７）へ到達する時間が遅れる問題は解消できる。また、第一の熱式流量計（４）と第二の熱式流量計（５ａ）は接近して設置しているため、第二の熱式流量計（５ａ）へ到達する時間が遅れる問題も解消できる。さらに、液体の組成が経時的に変化する系（例えば、溶媒グラジエント法での溶出）においても、Ｂ側流路に流れる流量に対し、第二の熱式流量計（５ａ）及び流量制御装置（５ｂ）の有する内部容量に差がないため、溶離液の組成変化の遅れの問題も解消できる。そのため、液体の組成が経時的に変化しない系／する系を問わず、所望の流量及び組成の溶離液を分析カラム（７）に流すことができる。
【００３８】
図６の微小流量送液装置における送液方法では、分岐前の流量値（送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値）（Ｆｍ）を任意のサンプリング間隔で計測し、その流量値に、ある一定の流量比率を乗じて、Ｂ側流路の流量制御値とし制御を行なう。その流量変化を図７に示す。
【００３９】
Ｆｂ＝Ｆｍ・Ｓ
Ｆａ＝Ｆｍ−Ｆｂ
Ｆａ：Ａ側流路の流量（微小流量）
Ｆｂ：Ｂ側流路の流量値（大流量）
Ｆｍ：分岐前の流量値
Ｓ：流量比率
図６の微小流量送液手段における送液方法では、分岐前の流量値（Ｆｍ）を任意のサンプリング間隔で計測できるように第一の熱式流量計（４）が設置されている。分岐前の流量値（Ｆｍ）を任意のサンプリング間隔で計測し、その値に１未満の一定の流量比率（Ｓ）を乗じて、Ｂ側流路の制御流量値として与える。そのため、分岐前の流量値（Ｆｍ）が変動した場合であっても、Ｂ側流路の流量値（Ｆｂ）は分岐前の流量値（Ｆｍ）に前記流量比率（Ｓ）を乗じた値で制御され（図７（ａ））、Ａ側流路の流量（Ｆａ）はその差分となる。よって、Ａ側流路の流量（Ｆａ）の変動は、流量の絶対値で制御する従来のアクティブスプリット法（図３（ｂ））による微小流量送液方法と比較し小さくなる（図７（ｂ））。たとえば、図６の装置で、分岐前の流量（Ｆｍ）を毎分５０μＬ、分岐比率を（Ｓ）を０．９８とした場合、Ｂ側流路の計算流量値（Ｆｂ）は毎分４９μＬ、Ａ側流路の流量（Ｆａ）は、毎分１μＬとなる。分岐前の流量値（Ｆｍ）が毎分±０．２μＬ変動した場合、Ｂ側流路の流量値（Ｆｂ）は毎分４８．８０から４９．１２μＬで変動する。Ａ側流路の流量（Ｆａ）は毎分０．９９６から１．００４μＬで変動し、毎分０．００８μＬ（±０．４％）の誤差で収まる。一方、同様な条件（分岐前の流量：毎分５０μＬ、Ｂ側流路の流量：毎分４９μＬ、流量値変動：毎分±０．２μＬ）で従来のアクティブスプリット法（図２）による微小流量送液方法では、Ａ側流路の流量変動は毎分０．４μＬ（±２０％）の変動となる。
【００４０】
溶離液の組成が経時的に変化する溶媒グラジエント溶出法のような場合、従来のアクティブスプリット法では微小流量を流すのは更に困難となる。
【００４１】
熱式流量計は使用する溶離液にて事前に補正されているため、異なる溶離液を流した場合、その値は実際の値と乖離する。熱式流量計の出力は下式のように使用する溶離液の比熱により変化する。
【００４２】
Ｖｓｉｇｎａｌ＝ｋ・Ｃｐ・Φ
Ｖｓｉｇｎａｌ＝出力流量値
ｋ＝補正係数
Ｃｐ＝比熱
Φ＝実際の流量
図８に、水で補正を行なった熱式流量計を使用し、水１００％からアセトニトリル１００％までのグラジエントを行なった場合の熱式流量計の出力の変化を示す。水の比熱は１．００Ｃａｌ／（ｇ・ｄｅｇ）、アセトニトリルの比熱：０．３０４Ｃａｌ／（ｇ・ｄｅｇ）である。水で補正を行なった熱式流量計を使用した場合、水を毎分１．００ｍＬで送液すると、熱式流量計は毎分１．００ｍＬの出力値となる。しかし、溶離液としてアセトニトリルを毎分１．００ｍＬで送液すると、熱式流量計は毎分０．３０４ｍＬの出力値となる。つまり、溶媒グラジエント溶出法で水１００％からアセトニトリル１００％までのグラジエントを行なった場合、実際の流量は一定であるにもかかわらず、熱式流量計の出力は経時的に小さくなる。このような特性があるため、従来のアクティブスプリット法による微小流量送液方法では不都合が生じる。溶媒グラジエント溶出法で、水１００％からアセトニトリル１００％まで溶離液の組成変化が伴う場合を例に、従来のアクティブスプリット法（図２）による微小流量送液方法と、図６に示す本発明の微小流量送液方法との違いを説明する。
【００４３】
まず、従来のアクティブスプリット法による微小流量送液方法では次のようになる（図９参照）。分岐前の流量（Ｆｍ）毎分５０μＬ、Ｂ側流路の流量（Ｆｂ）を毎分４９μＬで制御した場合、最初水１００％であることから、Ａ側流路の流量（Ｆａ）は、その差分の毎分１μＬとなる（図９（ａ））。徐々にアセトニトリルの割合が増加していくと、Ｂ側流路の実流量は殆ど変化しないにもかかわらず、熱式流量計の応答は小さくなることから、Ｂ側流路の流量を増やす方向に制御され、一定の値（毎分４９μＬ）を保つ（図９（ａ））。アセトニトリル１００％ではＢ側流路の目標制御流量の値は２２９％増加し、計算上、毎分１６１μＬとなる。Ａ側流路の流量（Ｆａ）は、その差分の毎分−１１２μＬとなってしまい、制御できなくなる（図９（ｂ））。
【００４４】
図６に示す本発明の微小流量送液方法では、同様な条件の場合、次のようになる（図１０参照）。
【００４５】
分岐前の流量（Ｆｍ）毎分５０μＬ、Ｂ側流路への流量比率を０．９８として制御した場合、最初は水１００％であるので、Ｂ側流路の計算流量値（Ｆｂ）は、分岐前の流量（Ｆｍ）毎分５０μＬに０．９８を乗じた、毎分４９μＬとなり（図１０（ａ））、Ａ側流路の流量（Ｆａ）は、その差分の毎分１μＬとなる。徐々にアセトニトリルの割合が増加していくと、実際の流量は殆ど変化しないにもかかわらず、第一の熱式流量計および第二の熱式流量計の応答が同じ割合で減少していく（図１０（ａ））。アセトニトリル１００％では分岐前の第一の熱式流量計の出力流量値は毎分１５μＬ（５０×０．３０）となり、計算上、Ｂ側流路の目標制御流量の値は分岐前の流量値（Ｆｍ）毎分１５μＬに０．９８を乗じた、毎分１４．７μＬとなる。Ａ側流路の流量（Ｆａ）は計算上、その差分の毎分０．３μＬとなる（図１０（ｂ））。しかしながら、実際には、熱式流量計の出力値は７０％減少するものの、実流量は殆ど変化していないため、アセトニトリル１００％でもＢ側流路の流量（Ｆｂ）は、分岐前の流量（Ｆｍ）毎分５０μＬに０．９８を乗じた毎分４９μＬ、Ａ側流路の流量（Ｆａ）は、その差分の毎分１μＬとなる。
【００４６】
なお、図６の微小流量送液方法では、流量比率（Ｓ）が大きくなるほど（１に近づくほど）、流量誤差における、従来のアクティブスプリット法（図２）による微小流量送液方法に対する優位性が高まるため好ましく、分岐比率が０．７（Ａ側流路：Ｂ側流路＝３０：７０）から０．９９９（Ａ側流路：Ｂ側流路＝１：１０００）の範囲が特に好ましい。
【発明の効果】
【００４７】
本発明の微小流量送液方法は、
送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値と、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値を計測し、
（１−１）前記送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値に、１未満の任意の値を乗じて、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流すべき液体の流量値を計算し、
（１−２）前記計算流量値と、前記分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値とが一致するように、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御する、
または、
（２−１）前記分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値に、１を超える任意の値を乗じて、送液手段と分岐手段との間に流すべき液体の流量値を計算し、
（２−２）前記計算流量値と、前記送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量値とが一致するように、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量を制御する、
ことで、一定の微小流量を分離媒体に流すことを特徴としている。このため、送液手段側の問題（例えば、ポンプの脈動）で送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量が変動した場合でも、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量の絶対値のみで制御する従来のアクティブスプリット法と比較し、流量の変動を抑えることができるため、一定の微小流量の液体を精度良く分離媒体側の流路に送液することができる。
【００４８】
本発明の微小流量送液方法は流量比率で制御しているため、分離媒体側の流路へ流す流量が微小であるほど、流量の絶対値で制御する従来のアクティブスプリット法に対する、流量精度における優位性が高い。特に、送液手段と分岐手段との間に流れる液体の流量に対する、廃棄側の流路に流れる液体の流量の割合が１に近い値、具体的には０．７（分離媒体側：廃棄側＝３０：７０）から０．９９９（分離媒体側：廃棄側＝１：１０００）の範囲にすることで、従来のアクティブスプリット法に対する優位性が高まる。
【００４９】
本発明の微小流量送液方法を採用した装置、具体的には、送液手段と分離手段との間に流れる液体の流量値を任意のサンプリング間隔で計測する第一の流量計と、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量値を第一の流量計と同じまたは異なるサンプリング間隔で計測する第二の流量計と、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流路を必要に応じて制御する流量制御手段と、第一及び第二の流量計で計測された流量値に基づいて、送液手段と分岐手段との間の流路、分離媒体側の流路、及び廃棄側の流路に流れる液体の流量を制御するための信号を送る演算手段とを備えており、前記演算手段が
（３−１）第一の流量計で計測された流量値を入力値として、当該流量値に１未満の任意の値を乗じて、第二の流量計で計測されるべき流量値を計算し、
（３−２）第二の流量計で計測された流量値を入力値として、前記計算流量値と比較し、両方の流量値を一致させるように、前記流量制御手段を制御する、
または
（４−１）第二の流量計で計測された流量値を入力値として、当該流量値に１を超える任意の値を乗じて、第一の流量計で計測されるべき流量値を計算し、
（４−２）第一の流量計で計測された流量値を入力値として、前記計算流量値と比較し、両方の流量値を一致させるように、前記送液手段を制御する、
手段である、微小流量送液装置は、流路に流れる液体の組成変動にともない比熱が変動し、それに応じて熱式流量計の示す流量値が変動したとしても、分離媒体側の流路へ流す流量を流量比で制御しているため、分離媒体側の流路または廃棄側の流路に流れる液体の流量を、熱式流量計の示す流量の絶対値で制御する従来のアクティブスプリット法と比較し、実際の流量変動を抑えることができるため、一定の微小流量の液体を高い精度で分離媒体側の流路に流し続けることができる。
【００５０】
前記装置において、第二の熱式流量計及び流量制御装置を、分離媒体側の流路、廃棄側の流路、いずれの流路にも設置しても、分離媒体に流れる液体の組成が変化しない系（例えば、アイソクラティック法での溶出、カラム洗浄、緩衝液置換）では、従来のアクティブスプリット法と比較し微小流量制御に優れた送液装置を提供することができる。
【００５１】
また、前記装置において、分離媒体に流れる液体の組成が経時的に変化する系（例えば、溶媒グラジエント系）での分析、前記分析で分離した目的成分の分画（捕集）及び他の分析装置を用いた分析に適用する場合には、第二の熱式流量計及び流量制御装置を、分離媒体及び前記分取・分析装置の入口側に設置すると、分離媒体側の流路に流れる流量（毎分数百ｎＬから数十μＬ）に対する、第二の熱式流量計及び流量制御装置の有する内部容量（数百μＬ）が大きく、液体の組成または試料到達時間に大きな遅延が生じる。そのため、前記分析に対して本発明を適用する場合は、第二の熱式流量計及び流量制御装置を、分離媒体及び前記分取・分析装置の出口側、または廃棄側の流路に設置するのが好ましい。
【００５２】
特に、第二の熱式流量計及び流量制御装置がともに廃棄側の流路に設置した場合は、第一の熱式流量計、第二の熱式流量計及び流量制御装置を接近して設置することが可能なため、応答の遅延がなく、かつ、分離媒体に流れる液体の組成が変化しない系での分析、分離媒体に流れる液体の組成が経時的に変化する系での分析、前記分析で分離した目的成分の分画（捕集）及び他の分析装置を用いた分析、いずれの分析においても一定の微小流量制御が可能な装置を提供することができる。
【実施例】
【００５３】
以下実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５４】
実施例１  アイソクラティック溶出法における送液方法の比較
熱式流量計に流れる液体の組成変化のないアイソクラティック溶出法で流量毎分数十μＬの条件で分析を行なった場合における、従来のアクティブスプリット法による微小流量送液方法と、本発明の微小流量送液方法との比較を行なった。
【００５５】
（Ａ）従来のアクティブスプリット法による微小流量送液方法
従来のアクティブスプリット法による微小流量送液装置のシステム構成を図２に示す。送液ポンプ（２）により溶離液（１）を一定流量で送液し、送液された溶離液（１）は分岐ブロック（１３）によりＡ側流路とＢ側流路に分岐される。Ａ側流路は分析に使用される流路であり、試料注入装置（６）、分析カラム（７）及びカラム恒温槽（８）、検出器（９）が配置されている。Ｂ側流路には熱式流量計（５ａ）、流量制御装置（５ｂ）が配置されている。Ａ側流路は毎分数百ｎＬから数十μＬといった微小流量が流れる流路である。Ｂ側流路は残りの大部分が流れる流路である。
【００５６】
測定条件は分析カラム（７）として、内径０．３ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒径３μｍのＯＤＳカラム（ＧＬサイエンス社製）、溶離液（１）として、アセトニトリル／水（４０／６０）を使用した。ポンプ（２）としては東ソー社製のＣＣＰＭを一部改良して使用した。ポンプ（２）の流量を毎分５０μＬに設定し送液を行ない、熱式流量計（５ａ）、流量制御装置（５ｂ）でＢ側流路の流量値が毎分４７．７μＬで一定になるように制御し、分析を行なうＡ側流路には上記の差分である毎分２．３μＬ流れるように制御を行なった。
【００５７】
測定試料としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ブチルの４種を混合したものを用いた。
【００５８】
（Ｂ）本発明の微小流量送液方法
本発明の微小流量送液装置のシステム構成を図６に示す。送液ポンプ（２）により溶離液（１）を一定流量で送液する。送液された溶離液（１）は第一の熱式流量計（４）を通過した後、分岐ブロック（１３）によりＡ側流路とＢ側流路に分岐される。Ａ側流路は分析に使用される流路であり、試料注入装置（６）、分析カラム（７）及びカラム恒温槽（８）、検出器（９）が配置されている。Ｂ側流路には第二の熱式流量計（５ａ）、流量制御装置（５ｂ）が配置されている。Ａ側流路は毎分数百ｎＬから数十μＬといった微小流量が流れる流路である。Ｂ側流路は残りの大部分が流れる流路である。
【００５９】
測定条件は分析カラム（７）として、内径０．３ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒径３μｍのＯＤＳカラム（東ソー社製）、溶離液として、アセトニトリル／水（３０／７０）を使用した。ポンプ（２）としては東ソー社製のＣＣＰＭを一部改良して使用した。ポンプ（２）の流量は毎分５０μＬに設定し送液を行なった。溶離液は第一の熱式流量計（４）で流量値を計測し、その値（流量値）に流量比率（０．９４４）を乗じた値を演算機（１４）で計算する。そして、前記演算機（１４）より、前記計算流量値と、第二の熱式流量計（５ａ）の流量値とを一致させる制御信号を流量制御装置（５ｂ）に送り、Ｂ側流路の流量値が毎分（第一の熱式流量計の流量値×０．９４４）μＬになるように、分析を行なうＡ側流路には上記の差分である（第一の熱式流量計の流量値×０．０５６）μＬになるように制御を行なった。
【００６０】
測定試料としては、（Ａ）の装置の時と同じ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ブチルの４種を混合したものを用いた。
【００６１】
（Ｃ）結果
図１１は、（Ａ）のシステム構成（図２）における、Ｂ側流路に配置された熱式流量計（５ａ）からの信号を示した図である。図１１に示すように、熱式流量計（５ａ）の信号は非常に安定しており、Ｂ側流路の流量が正確に一定に保たれていることがわかる。図１１の状態におけるクロマトグラム（ｎ＝２０）を図１２に、各ピークの溶出時間のＣｖ（％）をまとめた結果を図１５（ａ）にそれぞれ示す。Ｂ側流路の流量が正確に一定に保たれているにも関わらず、溶出時間の再現性はＣｖ（％）で１から４％と悪い。これは、送液ポンプの実送液量が、温度や溶離液中気泡の影響等により、毎分±数百ｎＬのオーダで変動していることが原因である。送液ポンプ（２）の実際の送液量が、変動しているなか、Ｂ側流路の流量が一定に保たれているため、送液ポンプ（２）に起因する毎分±数百ｎＬのオーダの変動が分析に使用するＡ側流路の実際の流量に直接加算あるいは減算され、大きな流量変動になっているためである。
【００６２】
図１３（ａ）は（Ｂ）のシステム構成（図６）における、第一の熱式流量計（４）からの信号、図１３（ｂ）は第二の熱式流量計（５ａ）の信号をそれぞれ示す。図１３（ｃ）は第一の熱式流量計（４）からの信号から第二の熱式流量計（５ａ）の信号を差し引いた値、つまり分析に使用するＡ側流路の流量変化を示した図である。
【００６３】
図１３（ａ）に示すように、第一の熱式流量計（４）の信号は一見安定しているようにも見られるが、毎分±数百ｎＬのオーダで変動している。Ｂ側流路の流量は第一熱式流量計（４）の流量値に分岐比率を乗じた値になるように制御しているため、前記実流量の変動と同期して、Ｂ側流路の流量（図１３（ｂ））も毎分±数百ｎＬのオーダで変動しており、正しくフィードバック制御が行なわれていることが示されている。そのため、分岐前の流量の変動をキャンセルでき、第一の熱式流量計（４）からの信号（図１３（ａ））から第二の熱式流量計（５ａ）からの信号（図１３（ｂ））の差は（Ａ）のシステム構成（図２）と比較し非常に安定している（図１３（ｃ））。
【００６４】
図１３の状態における、クロマトグラム（ｎ＝２０）を図１４に、各ピークの溶出時間のＣｖ（％）を図１５（ｂ）にそれぞれ示す。（Ｂ）のシステム構成（図６）を用いることにより、分析に使用するＡ側流路の実際の流量を一定に保つことが可能となり、その結果、溶出時間の再現性はＣｖ（％）で０．５から１％と、（Ａ）のシステム構成（図２）を用いたとき（図１５（ａ））と比較し大幅に改善された。
【００６５】
実施例２  溶媒グラジエント溶出法における送液方法の比較
熱式流量計に流れる液体の組成が経時的に変化する溶媒グラジエント溶出法で、流量毎分数十μＬの条件で分析を行なった場合における、従来のアクティブスプリット法による微小流量送液方法と、本発明の微小流量送液方法との比較を示す。
【００６６】
（Ａ）従来のアクティブスプリット法による微小流量送液方法
従来のアクティブスプリット法による微小流量送液装置のシステム構成を図１６に示す。送液ポンプＡ（２）により溶離液Ａ（１）を、送液ポンプＢ（１６）により溶離液Ｂ（１５）を送液する。送液ポンプＡ（２）、送液ポンプＢ（１６）の各流量を変化させ溶媒グラジエントを行なう（送液ポンプＡ（２）と送液ポンプＢ（１６）との流量の和は一定）。送液された溶離液（１、１５）は、分岐ブロック（１３）によりＡ側流路とＢ側流路に分岐される。Ａ側流路は分析に使用される流路であり、試料注入装置（６）、分析カラム（７）及びカラム恒温槽（８）、検出器（９）が配置されている。Ｂ側流路には熱式流量計（５ａ）、流量制御装置（５ｂ）が配置されている。Ａ側流路は毎分数十μＬから毎分数百ｎＬといった微小流量が流れる流路である。Ｂ側流路は残りの大部分が流れる流路である。
【００６７】
測定条件は分析カラム（７）として、内径１ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒径３μｍのＯＤＳカラム（東ソー社製）、溶離液（１、１５）として、Ａ：アセトニトリル／水（２０／８０）、Ｂ：アセトニトリル／水（７０／３０）を使用した。ポンプ（２、１６）としては東ソー社製のＣＣＰＭを一部改良して使用した。グラジエントは３０分間で溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％まで変化するグラジエントを行なった。ポンプ（２、１６）の総流量を毎分２００μＬに設定し、熱式流量計（５ａ）、流量制御装置（５ｂ）でＢ側流路の流量値が毎分１７６．５μＬで一定になるように制御し、分析を行なうＡ側流路には上記の差分である毎分２３．５μＬ流れるように制御を行なった。
【００６８】
測定試料としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ブチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヘキシル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヘプチルの６種を混合したものを用いた。
【００６９】
（Ｂ）本発明の微小流量送液方法
本発明のアクティブスプリット法による微小流量送液装置のシステム構成を図１７に示す。送液ポンプＡ（２）により溶離液Ａ（１）を、送液ポンプＢ（１６）により溶離液Ｂ（１５）を送液する。送液ポンプＡ（２）、送液ポンプＢ（１６）の各流量を変化させ溶媒グラジエントを行なう（送液ポンプＡ（２）と送液ポンプＢ（１６）との流量の和は一定）。送液された溶離液（１、１５）は第一の熱式流量計（４）を通過した後、分岐ブロック（１３）によりＡ側流路とＢ側流路に分岐される。Ａ側流路は分析に使用される流路であり、試料注入装置（６）、分析カラム（７）及びカラム恒温槽（８）、検出器（９）が配置されている。Ｂ側流路には第二の熱式流量計（５ａ）、流量制御装置（５ｂ）が配置されている。Ａ側流路は毎分数十μＬから毎分数百ｎＬといった微小流量が流れる流路である。Ｂ側流路は残りの大部分が流れる流路である。
【００７０】
測定条件は分析カラム（７）として、内径１ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒径３μｍのＯＤＳカラム（東ソー社製）、溶離液（１、１５）として、Ａ：アセトニトリル／水（２０／８０）、Ｂ：アセトニトリル／水（７０／３０）を使用した。ポンプ（２、１６）としては東ソー社製のＣＣＰＭを一部改良して使用した。グラジエントは３０分間で溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％まで変化するグラジエントを行なった。溶離液は第一の熱式流量計（４）で流量値を計測し、その値（流量値）に流量比率（０．８８３）を乗じた値を演算機（１４）で計算する。そして、前記演算機（１４）より、前記計算値と、第二の熱式流量計（５ａ）の流量値とを一致させる制御信号を流量制御装置（５ｂ）に送り、Ｂ側流路の流量値が毎分（第一の熱式流量計の流量値×０．８８３）μＬになるように、分析を行なうＡ側流路には上記の差分である（第一の熱式流量計の流量値×０．１１７）μＬになるように制御を行なった。
【００７１】
測定試料としては（Ａ）のシステム構成（図１６）を用いたときと同じ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ブチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヘキシル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヘプチルの６種を混合したものを用いた。
【００７２】
（Ｃ）結果
図１８に（Ａ）（Ｂ）両システム構成（図１６、図１７）を用いたときの、クロマトグラムの結果を示す。図１８のうち、ａが（Ａ）のシステム構成（図１６）を用いたときの、ｂが（Ｂ）のシステム構成（図１７）を用いたときの結果である。（Ｂ）のシステム構成（図１７）を用いたときは６種全てのピークが確認でき、良好にグラジエントが行なわれていることがわかる（図１８ｂ）。一方、（Ａ）のシステム構成（図１６）を用いたときでは極端に溶出が遅れ、８０分でも３種のピークしか確認できなかった（図１８ａ）。図１８ａの結果から、（Ａ）のシステム構成（図１６）を用いたときでは分析の途中から流量が極端に低下していることがわかる。
【００７３】
この時のカラム圧力変化を図１９に、第一の熱式流量計（４）の出力値（分岐前の流量）を図２０に、第二の熱式流量計（５ａ）の出力値（Ｂ側流路の流量）を図２１にそれぞれ示す（それぞれ、図中のａが（Ａ）のシステム構成（図１６）を用いたとき、ｂが（Ｂ）のシステム構成（図１７）を用いたときの結果である）。
【００７４】
（Ａ）（Ｂ）両システム構成（図１６、図１７）を用いたときも、グラジエントの進行と共に、第一の熱式流量計（４）の出力値（分岐前の流量）は直線的に低下していく（図２０）。これは、実際の流量は変化していないが、溶媒の比熱は変化するため熱式流量計の応答が変化していることに由来する。
【００７５】
（Ａ）のシステム構成（図１６）を用いたときは、第二の熱式流量計（５ａ）の出力値（Ｂ側流路の流量）が一定になるように制御を行なうため、グラジエント開始後しばらくは一定の値になるが、１３分以降は値の低下が見られ、正しく制御されていないことが分かる（図２１ａ）。
【００７６】
一方、（Ｂ）のシステム構成（図１７）を用いたときは、第一の熱式流量計（４）で実流量値を計測し、その値（実流量値）に分岐比率を乗じた計算流量値と、第二の熱式流量計（５ａ）の流量値とを一致させる制御を行なっているため、第二の熱式流量計（５ａ）の出力流量値（Ｂ側流路の流量）は、第一の熱式流量計（４）の出力流量値（分岐前の流量）の低下と同期して低下していく（図２１ｂ）。
【００７７】
第一の熱式流量計（４）の出力流量値と第二の熱式流量計（５ａ）の出力流量値の差、つまり分析に使用されるＡ側流路の流量を図２２に示す。ａは（Ａ）のシステム構成（図１６）を用いたときの流量、ｂは（Ｂ）のシステム構成（図１７）を用いたときの流量、ｃは比熱の変化（理論値）の変化を示している。なお、ｃの比熱は、ボイドの影響を考慮し、２分の遅れをもたしている。
【００７８】
（Ａ）のシステム構成（図１６）を用いたとき（図２２ａ）は、グラジエント開始後、約２分から急激に低下し約１３分以降は全く流れていないことが分かる。一方、（Ｂ）のシステム構成（図１７）を用いたとき（図２２ｂ）は、グラジエント開始時、毎分約２７μＬであったものが徐々に低下して行き、３０分後毎分約１７μＬになっている。
【００７９】
（Ｂ）のシステム構成（図１７）を用いたとき（図２２ｂ）でも計算上の流量が低下しているのは、比熱の変化により熱式流量計の応答が変化しているためである。図２０の第一の熱式流量計（４）の出力流量値と第二の熱式流量計（５ａ）の出力流量値の差を比熱で除すると実際の流量が算出できる。図２３は除算後のＡ側流路の流量である。このように、本発明の微小流量送液方法を用いた場合、グラジエント実行中、毎分約３０μＬでほぼ一定の流量が得られていることが分かる。
【００８０】
（Ｂ）のシステム構成（図１７）を用いたときでの再現性を図２４から２６に示す。図２４はクロマトグラム（ｎ＝１０）、図２５は溶出時間の変化（ｎ＝１０）、図２６は溶出時間の再現性を示す。（ｎ＝１０×２）。このように各ピークの溶出時間の再現性はＣｖ（％）で０．１から０．５％と良好な値が得られており（図２６）、本発明の流量制御方法を用いることでＡ側流路に微小流量を精度良く送液可能であることが示唆される。
【００８１】
実施例３  本発明の微小流量送液方法を用いたキャピラリィ電気泳動装置
実施例１及び２では、ポンプにより液体を送液する液体クロマトグラフィに本発明を適用した例を示したが、キャピラリィ電気泳動に対しても同様な送液方法を適用することができる。図２７にその構成を示す。送液ポンプ（２）の代わりに電解液Ａ（２０）を配し、導管を挿入する。Ａ側流路の廃液およびＢ側流路の廃液配管を電解液Ｂ（２１）に挿入する。電解液Ａ（２０）と電解液Ｂ（２１）にそれぞれ電極（２２）（２３）を挿入し、電源（１８）に接続することで、液流が発生し、キャピラリィ電気泳動を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】基本的なスプリット法（スタティックスプリット法）で微小流量を送液したときの流路図（アイソクラティック法）。長鎖線はＡ側流路、長破線はＢ側流路を示す。
【図２】従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときの流路図（アイソクラティック法）。長鎖線はＡ側流路、長破線はＢ側流路を示す。
【図３】従来のアクティブスプリット法における、溶離液組成が変化しない場合（アイソクラティック溶出法）の流量制御を示したグラフ。横軸は時間、縦軸は流量を表す。（ａ）は分岐前およびＢ側流路の流量の変化を示したグラフであり、実線は分岐前の流量、塗りつぶした領域はＢ側流路の熱式流量計／流量制御装置の制御値を示す。（ｂ）はＡ側流路の流量の変化を示したグラフであり、塗りつぶした領域はＡ側流路の流量を示す。
【図４】本発明の微小流量送液方法において、第二の熱式流量計（５ａ）及び流量制御装置（５ｂ）を、Ａ側流路の試料注入装置（６）の前に配置した場合の流路図。長鎖線はＡ側流路、長破線はＢ側流路を示す。
【図５】本発明の微小流量送液方法において、第二の熱式流量計（５ａ）及び流量制御装置（５ｂ）を、Ａ側流路の検出器（９）の後に配置した場合の流路図。長鎖線はＡ側流路、長破線はＢ側流路を示す。
【図６】本発明の微小流量送液方法において、第二の熱式流量計（５ａ）及び流量制御装置（５ｂ）を、Ｂ側流路に配置した場合の流路図（アイソクラティック法）。長鎖線はＡ側流路、長破線はＢ側流路を示す。
【図７】本発明の微小流量送液方法における、溶離液組成が変化しない場合（アイソクラティック溶出法）の流量制御を示したグラフ。横軸は時間、縦軸は流量を表す。（ａ）は、分岐前およびＢ側流路の流量の変化を示したグラフであり、実線は分岐前の流量、塗りつぶした領域はＢ側流路の熱式流量計／流量制御装置の制御値を示す。（ｂ）は、Ａ側流路の流量の変化を示したグラフであり、塗りつぶした領域はＡ側流路の流量を示す。
【図８】水で補正を行なった熱式流量計を使用し、水１００％からアセトニトリル１００％までのグラジエントを行なった場合の熱式流量計の出力変化。横軸はアセトニトリルの濃度、左縦軸は流量、右縦軸は比熱を表す。破線は実際の流量、塗りつぶした領域は熱式流量計が指示する流量値をそれぞれ示す。
【図９】従来のアクティブスプリット法による、溶離液組成が変化する場合（グラジエント溶出法）の流量制御を示したグラフ。横軸は時間、縦軸は流量を表す。（ａ）は分岐前およびＢ側流路の流量の変化を示したグラフであり、実線は熱式流量計が指示する分岐前の流量、破線は実際の流量、塗りつぶした領域はＢ側流路の熱式流量計／流量制御装置の制御値を示す。（ｂ）はＡ側流路の流量の変化を示したグラフであり、塗りつぶした領域はＡ側流路の流量を示す。
【図１０】本発明の微小流量送液方法による、溶離液組成が変化する場合（グラジエント溶出法）の流量制御を示したグラフ。横軸は時間、縦軸は流量を表す。（ａ）は分岐前およびＢ側流路の流量の変化を示したグラフであり、実線は熱式流量計が指示する分岐前の流量、破線は実際の流量、塗りつぶした領域はＢ側流路の熱式流量計／流量制御装置の制御値を示す。（ｂ）はＡ側流路の流量の変化を示したグラフであり、塗りつぶした領域はＡ側流路の流量を示す。
【図１１】従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときのＢ側流路の熱式流量計の出力値の変化。横軸は時間、縦軸は流量を表す。
【図１２】従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときのクロマトグラム結果（ｎ＝２０）。横軸は時間、縦軸は吸光度を表す。
【図１３】本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの各流路の流量変化。横軸は時間、縦軸は流量を表す。（ａ）は分岐前の流路に配置された、第一の熱式流量計の出力値の変化を示す。（ｂ）はＢ側流路に配置された、第二の熱式流量計の出力値の変化を示す。（ｃ）は分岐前の流路に配置された、第一の熱式流量計の出力値からＢ側流路に配置された、第二の熱式流量計の出力値の差を示す。
【図１４】本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときのクロマトグラム（ｎ＝２０）。横軸は時間、縦軸は吸光度を表す。
【図１５】溶出時間のＣｖ（％）を示した結果（ｎ＝１０で３バッチ測定）。（ａ）は従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときのＣｖ（％）を示す。（ｂ）は本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときのＣｖ（％）を示す。
【図１６】従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときの流路図（溶媒グラジエント溶出法）。長鎖線はＡ側流路、長破線はＢ側流路を示す。
【図１７】本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの流路図（溶媒グラジエント溶出法）。長鎖線はＡ側流路、長破線はＢ側流路を示す。
【図１８】溶媒グラジエント溶出法において、従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときと、本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときとを比較したクロマトグラム。横軸は時間、縦軸は吸光度を表す。ａは従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときの結果を示す。ｂは本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの結果を示す。
【図１９】溶媒グラジエント溶出法において、従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときと、本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときとでカラム圧力の変化を示した図。横軸は時間、縦軸はカラム圧力を表す。ａは従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときの結果を示す。ｂは本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの結果を示す。
【図２０】溶媒グラジエント溶出法において、従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときと、本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときとで、分岐前の流路に配置された、第一の熱式流量計の出力値の変化を示した図。横軸は時間、縦軸は流量（流量計の出力値）を表す。ａは従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときの結果を示す。ｂは本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの結果を示す。
【図２１】溶媒グラジエント溶出法において、従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときと、本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときとの、Ｂ側流路に配置された第二の熱式流量計の出力値の変化を示した図。横軸は時間、縦軸は流量を表す。ａは従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときの結果を示す。ｂは本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの結果を示す。
【図２２】溶媒グラジエント溶出法において、従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときと、本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときとの、分岐前の流路に配置された第一の熱式流量計の出力値から、Ｂ側流路に配置された第二の熱式流量計の出力値の差を示した図。横軸は時間、縦軸は流量を表す。ａは従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときの結果を示す。ｂは本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの結果を示す。ｃは溶離液の比熱の変化を示す（ボイドの影響を考慮し、２分の遅れをもたしている）。
【図２３】溶媒グラジエント溶出法において、従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときと、本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときとの、熱式流量計の出力値の差を比熱で除算した値を示した図。横軸は時間、縦軸は流量を表す。ａは従来のアクティブスプリット法で微小流量を送液したときの結果を示す。ｂは本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの結果を示す。
【図２４】本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときのクロマトグラム結果（ｎ＝１０）。横軸は時間、縦軸は吸光度を表す。
【図２５】本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの、溶出時間の変動を示した図（ｎ＝１０）。
【図２６】本発明の微小流量送液方法で微小流量を送液したときの、溶出時間のＣｖ（％）を示した図（ｎ＝１０で２バッチ測定）。
【図２７】本発明の微小流量送液方法をキャピラリィ電気泳動に適用した場合の流路図。長鎖線はＡ側流路、長破線はＢ側流路を示す。
【符号の説明】
【００８３】
１．溶離液Ａ
２．送液ポンプＡ
３．圧力計
４．第一の熱式流量計
５ａ．第二の熱式流量計
５ｂ．流量制御装置
６．試料注入装置
７．分析カラム
８．カラム恒温槽
９．検出器
１０．廃液Ａ
１１．廃液Ｂ
１２．フィードバック信号
１３．分岐ブロック
１４．演算機
１５．溶離液Ｂ
１６．送液ポンプＢ
１７．可変抵抗
１８．電源
１９．電気泳動分離媒体
２０．電解液Ａ
２１．電解液Ｂ
２２．電極Ａ
２３．電極Ｂ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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