(57)【要約】【課題】効率的に製造することができる新規なカフェ酸フェネチルエステルの製造方法を提供する。【解決手段】カフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、水、カフェ酸、及びフェネチルアルコールの存在下でクロロゲン酸エステラーゼを０．０５〜１０Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、カフェ酸、及びフェネチルアルコールの存在下でクロロゲン酸エステラーゼを０．０５〜１０Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させることを特徴とするカフェ酸フェネチルエステルの製造方法。
【請求項２】
前記クロロゲン酸エステラーゼは、０．２〜８Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させることを特徴とする請求項１に記載のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法。
【請求項３】
さらに、前記クロロゲン酸エステラーゼによる反応後に、シリカ系樹脂、芳香族系合成吸着剤、及び脂肪族エステル系合成吸着剤から選ばれる少なくとも一種に接触させることにより、カフェ酸フェネチルエステルを吸着させる処理、次に溶出用溶媒を用いてカフェ酸フェネチルエステルを溶出させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備えることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法。
【請求項４】
さらに、前記クロロゲン酸エステラーゼによる反応後に反応液を遠心分離又は静置することにより水層とフェネチルアルコール層とに分離する処理、次に得られた前記水層にカフェ酸及びフェネチルアルコールを配合することにより再度酵素反応させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備えることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロロゲン酸エステラーゼを特定量使用することにより、効率的な反応を行うことができるカフェ酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、プロポリスに含有される微量成分としてカフェ酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）が知られている。カフェ酸フェネチルエステルは、抗酸化作用、抗炎症作用及び抗癌作用の他、抗ウイルス作用等を有していることが知られている（特許文献１参照）。
【０００３】
従来より、カフェ酸フェネチルエステルの製造方法としては、天然物中から抽出する方法、及び化学的・酵素的に合成する方法が知られている。化学的に合成する方法としては、カフェ酸とフェネチルアルコールを酸触媒下で高温で反応させる方法が知られている（特許文献２参照）。また、カフェ酸を塩化チオニルを用いて塩素化した後、フェネチルアルコールと反応させて合成する方法が知られている（特許文献３参照）。また、酵素を用いた合成方法としては、カフェ酸とフェネチルアルコールの存在下でクロロゲン酸エステラーゼ（約０．０１６５Ｕ／ｍＬ）を作用させて合成する方法が知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−９１４４６号公報
【特許文献２】特許第３１５５３２５号公報
【特許文献３】特表平１０−５０１２１６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】N. Kishimoto et.al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 68: 198-202
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、天然物から抽出する方法は、天然物中の存在量が微量であるためカフェ酸フェネチルエステルの入手効率が非常に悪いという問題があった。また、特許文献２，３に開示される化学的に合成する方法は、合成反応後に酸触媒又は塩素化剤を除去する必要があり、カフェ酸フェネチルエステルを効率的に得ることができないという問題があった。また、非特許文献１に開示されるカフェ酸フェネチルエステルの合成方法は、反応率及び収率が非常に悪く、効率的にカフェ酸フェネチルエステルを得ることができないという問題があった。
【０００７】
本発明者らは、カフェ酸フェネチルエステルの製造方法を新たに模索した。その結果、原料としてカフェ酸とフェネチルアルコールの存在下で特定量のクロロゲン酸エステラーゼを作用させることにより効率的に製造されることを発見するに至った。
【０００８】
本発明の目的とするところは、効率的に製造することができる新規なカフェ酸フェネチルエステルの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、請求項１に記載の発明のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、水、カフェ酸、及びフェネチルアルコールの存在下でクロロゲン酸エステラーゼを０．０５〜１０Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させることを特徴とする。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、前記クロロゲン酸エステラーゼは、０．２〜８Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させることを特徴とする。
【００１１】
請求項３に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、さらに、前記クロロゲン酸エステラーゼによる反応後に、シリカ系樹脂、芳香族系合成吸着剤、及び脂肪族エステル系合成吸着剤から選ばれる少なくとも一種に接触させることにより、カフェ酸フェネチルエステルを吸着させる処理、次に溶出用溶媒を用いてカフェ酸フェネチルエステルを溶出させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備えることを特徴とする。
【００１２】
請求項４に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、さらに、前記クロロゲン酸エステラーゼによる反応後に反応液を遠心分離又は静置することにより水層とフェネチルアルコール層とに分離する処理、次に得られた前記水層にカフェ酸及びフェネチルアルコールを配合することにより再度酵素反応させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、カフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】クロロゲン酸エステラーゼの酵素量（Ｕ／ｍＬ）と反応率（％）との関係を示す図。
【図２】酵素反応により得られたＣＡＰＥの粉末のクロマトグラムを示す。
【図３】ＣＡＰＥの標準品のクロマトグラムを示す。
【図４】酵素反応により得られたＣＡＰＥの粉末の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図５】ＣＡＰＥの標準品の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図６】アルカリ処理前のコーヒー豆エキスのクロマトグラム。
【図７】アルカリ処理後のコーヒー豆エキスのクロマトグラム。
【図８】酵素反応後のコーヒー豆エキスのクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法を具体化した実施形態を説明する。
本発明のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法は、原料としてカフェ酸とフェネチルアルコール、酵素として所定量のクロロゲン酸エステラーゼ、及び溶媒として水を用い、それらの存在下で酵素反応させる工程からなる。カフェ酸フェネチルエステルは、カフェ酸とフェネチルアルコールとがクロロゲン酸エステラーゼによってエステル化させることにより合成される。
【００１６】
本実施形態においてカフェ酸は、クロロゲン酸エステラーゼの基質として使用される。カフェ酸の配合形態としては、生合成品、化学合成品、天然素材からの精製品を適用することができる。精製方法としては、公知のクロマトグラフィーを用いて実施することができる。また、カフェ酸を含有する天然素材又はその抽出物（エキス）を原料として使用してもよい。カフェ酸を含有する天然素材としては、例えばコーヒー豆が挙げられる。コーヒー豆の種類としては、特に限定されないが、例えば、アラビカ種、カネフォーラ種ロブスタ、コニロン又はリベリカ種、及びそれらの雑種が挙げられる。コーヒー豆は、生豆の状態でもカフェ酸が含まれるが、コーヒー豆中に含有されるクロロゲン酸を熱によりカフェ酸へ分解させるために焙煎又は熱処理するのが好ましい。更に、焙煎又は熱処理したコーヒー豆を公知の方法に従って抽出後、アルカリ処理によって、クロロゲン酸を完全にカフェ酸へ分解させることがより好ましい。カフェ酸を含有する天然素材のエキスは、蒸気抽出や水（熱水）抽出、アルコール抽出、及び含水アルコール抽出等の公知の方法に従って抽出されることにより得られる。
【００１７】
フェネチルアルコールは、酵素によるエステル化反応の基質として利用される。フェネチルアルコールの配合形態としては、生合成品、化学合成品、天然素材から抽出された粗抽出品又は精製品を使用してもよく、フェネチルアルコールを含有する天然素材を原料として適用してもよい。フェネチルアルコールの水溶性を高めるために、水溶性の高いアルコールや有機溶媒、乳化剤等を酵素の変性が起こらない程度に加えてもよい。
【００１８】
クロロゲン酸エステラーゼは、基質としてのカフェ酸及びフェネチルアルコールを用いてエステル化反応を行うために配合される。クロロゲン酸エステラーゼは、麹菌等の糸状菌、酵母、細菌等の微生物が生産するものが一般的に用いられるが、酵素処理の効率が特に高いために、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、ボトリティス（Botrytis）属が生産するクロロゲン酸エステラーゼが好ましい。クロロゲン酸エステラーゼは、市販品を使用することができ、市販品としては例えばキッコーマン社製（Aspergillus japonicus由来）を挙げることができる。クロロゲン酸エステラーゼは、主としてクロロゲン酸をカフェ酸とキナ酸（キニン酸）に加水分解する反応を触媒する酵素であるが、クロロゲン酸エステラーゼの酵素量を調節することにより、またフェネチルアルコール等の基質の配合により、逆反応としてエステル化反応を進行させることができる。クロロゲン酸エステラーゼは、反応溶液中において０．０５Ｕｎｉｔ／ｍＬ（０．８３３ｎｋａｔ／ｍＬ）以上、好ましくは０．２Ｕｎｉｔ／ｍＬ（３．３３ｎｋａｔ／ｍＬ）以上、より好ましくは１Ｕｎｉｔ／ｍＬ（１６．７ｎｋａｔ／ｍＬ）以上の酵素量で反応させる。酵素量が０．０５Ｕｎｉｔ／ｍＬ未満であると反応効率が低下し、カフェ酸フェネチルエステルの収率が低下する。クロロゲン酸エステラーゼの配合量の上限は、反応溶液中において１０Ｕｎｉｔ／ｍＬ（１６７ｎｋａｔ／ｍＬ）以下、好ましくは８Ｕｎｉｔ／ｍＬ（１３３ｎｋａｔ／ｍＬ）以下、より好ましくは７．２Ｕｎｉｔ／ｍＬ（１２０ｎｋａｔ／ｍＬ）以下の酵素量で反応させる。酵素量が１０Ｕｎｉｔ／ｍＬを超えるとそれ以上の反応促進又は収率の増加効果は得られず、製造コストの上昇を招くおそれがある。尚、クロロゲン酸エステラーゼの酵素量１Ｕｎｉｔとは、３０℃で最も化学反応が進む酸性度（ｐＨ６．５）で毎分１μｍｏｌのクロロゲン酸を加水分解することができる酵素量を示す。
【００１９】
酵素処理は、カフェ酸及びフェネチルアルコールを溶媒である水に混合して反応溶液を調製した後、該反応溶液に酵素を作用させる処理である。尚、カフェ酸、フェネチルアルコール及び水とを混合して反応溶液を調製してもよいし、フェネチルアルコールに水を加えてフェネチルアルコール・水混合液を調製した後、該フェネチルアルコール・水混合液にカフェ酸を添加して反応溶液を調製してもよい。また、カフェ酸が含有される天然素材のエキスにフェネチルアルコールを配合して反応溶液を調製してもよい。この酵素処理では、所定条件下において酵素によりカフェ酸とフェネチルアルコールとのエステル化反応が行われ、カフェ酸フェネチルエステルが生成される。反応溶液中におけるカフェ酸の濃度は、好ましくは０．０２〜１Ｍ、より好ましくは０．１〜０．５Ｍ、さらに好ましくは０．２〜０．３Ｍである。カフェ酸の濃度が０．０２Ｍ未満の場合は、反応率は良いが、ＣＡＰＥの収量が少なく効率が悪い。また、カフェ酸の濃度が１Ｍを超える場合は、反応液への分散性が悪いため、反応率が低下するおそれがあり反応の効率が悪い。反応溶液中におけるカフェ酸及びフェネチルアルコールの配合比は、特に限定されず、カフェ酸の配合量に対し、フェネチルアルコールを過剰量配合すればよい。例えば、カフェ酸１モルに対し、好ましくは１〜２００モル、より好ましくは５〜５０モル、さらに好ましくは８〜１５モルである。
【００２０】
酵素処理は、前記反応溶液に酵素を直接添加して静置又は撹拌することにより行う。酵素と基質が接触しやすい点で、撹拌した方が好ましい。また、酵素処理の効率が高く、反応溶液と酵素との分離が容易な方法として、担体に固定化された酵素と反応溶液とを接触させることにより行ってもよい。担体に固定化された酵素と反応溶液との接触は、反応溶液中に前記担体を分散させる等により行われる。また、酵素反応を後述するクロマトグラフィー担体の存在下で行ってもよい。その場合、生成したカフェ酸フェネチルエステルがクロマトグラフィー担体に吸着されるため、化学平衡によりクロマトグラフィー担体に吸着していない酵素及び未反応基質より新たなカフェ酸フェネチルエステルが連続的に合成される。かかる連続的な合成により、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。
【００２１】
酵素処理の条件は、目的とする収率等に応じ、適宜設定することができる。反応ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ４〜５である。ｐＨ変化を少なくするために、緩衝液、例えばクエン酸緩衝液等を用いても良い。反応温度は、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは３５〜４５℃である。反応温度が３０℃未満の場合、酵素活性が低く反応が遅くなり、逆に６０℃を超える場合、酵素が失活するおそれがある。反応時間は、上記反応ｐＨ及び反応温度により適宜設定され得るが、好ましくは１２〜１２０時間、より好ましく２４〜９６時間である。反応時間が１２時間未満の場合、十分な量の反応生成物が得られない場合がある。逆に反応時間が１２０時間を超える場合、それ以上の反応生成物が得られず、効率が悪い。
【００２２】
クロロゲン酸エステラーゼによる反応後は、反応後の溶液をそのままカフェ酸フェネチルエステル含有組成物として各種用途に適用してもよいが、未反応の基質等の不純物を除くために、分離・精製処理することが好ましい。分離・精製処理としては、公知のクロマトグラフィーを用いて、生成したカフェ酸フェネチルエステルを分離・精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えばカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び薄層クロマトグラフィーが挙げられる。クロマトグラフィーに用いられる担体としては、例えばシリカ系樹脂、及び合成吸着剤が挙げられる。シリカ系樹脂としては、例えばオクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）、フェニルシリル化シリカゲル、及びオクチルシリル化シリカゲル等が挙げられる。これらの中で、カフェ酸フェネチルエステルを効率よく分離することができるＯＤＳが好ましく適用される。合成吸着剤としては、例えば芳香族系合成吸着剤及び脂肪族エステル系合成吸着剤が挙げられる。合成吸着剤の中でも、カフェ酸フェネチルエステルを効率よく分離することができる芳香族系合成吸着剤のスチレン系合成吸着剤が好ましく適用される。スチレン系合成吸着剤の市販品としては、例えばデュオライトＳシリーズ、アンバーライトＸＡＤシリーズ（いずれもローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ２０、セパビーズＳＰ２０７、セパビーズＳＰ７００、セパビーズＳＰ８２５（いずれも三菱化学社製）等が挙げられる。これらの担体は１種類のみ適用してもよく、又は２種以上を組み合わせて適用してもよい。これらの中でもカフェ酸フェネチルエステルの分離効率がより高いスチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤であるダイヤイオンＨＰ２０が好ましく適用される。
【００２３】
上記各種クロマトグラフィーの使用方法としては、公知の方法を適宜採用することができる。例えば、酵素反応後の溶液を各種クロマトグラフィーの担体に接触させることによりカフェ酸フェネチルエステルを吸着させる吸着工程、次に洗浄用溶媒を用いて担体を洗浄する工程、次に溶出用溶媒を用いて担体からカフェ酸フェネチルエステルを溶出させる溶出工程からなる。クロマトグラフィーを用いた分離・精製処理は１回のみならず２回以上繰り返すことによりカフェ酸フェネチルエステルの純度を高めてもよい。洗浄用溶媒及び溶出用溶媒としては、水及び有機溶媒、例えばアルコール（エタノール、メタノール等）、アセトン、ヘキサン、クロロホルム、グリセリン、氷酢酸が挙げられる。溶媒はこれらの中から担体の種類、分離条件等に応じて適宜一種又は二種以上組み合わせて適用される。
【００２４】
反応溶液に酵素を作用させた後は、該酵素を失活又は反応溶液から取除いてもよいが、製造コストの低減のために以下の方法を用いてクロロゲン酸エステラーゼを再利用することが好ましい。まず、クロロゲン酸エステラーゼによる反応後に反応液を遠心分離又は静置することにより水層とフェネチルアルコール層とに分離する処理が行われる。遠心分離の条件は特に限定されないが、好ましくは１０００〜３０００ｒｐｍで５〜２０分の条件で行われる。また、静置の場合、静置の時間は一晩（約１２時間）以上が好ましい。分離後の水層には、クロロゲン酸エステラーゼが分配され、フェネチルアルコール層には、カフェ酸フェネチルエステル、並びに未反応のカフェ酸及びフェネチルアルコールが分配される。したがって、水層のみを取り出し、新規にカフェ酸及びフェネチルアルコールを配合することにより再度酵素反応させることができる。このクロロゲン酸エステラーゼが含有される水層の再利用は、２回以上繰り返してもよい。尚、分離後のフェネチルアルコール層は、既に溶媒としての水及び酵素が分離されているため、その後のクロマトグラフィーを用いたカフェ酸フェネチルエステルの分離・精製処理工程に好ましく適用することができる。また、担体に固定化された酵素を使用した場合は、公知の方法により担体を回収し、酵素を再利用できる。
【００２５】
カフェ酸フェネチルエステルの分離及び精製工程後の溶液は、そのままの状態でカフェ酸フェネチルエステルとして利用してもよく、真空乾燥及び凍結乾燥等の公知の乾燥処理を行うことにより、粉末化して使用してもよい。カフェ酸フェネチルエステルは、抗酸化作用、抗炎症作用、抗癌作用、及び抗ウイルス作用等を目的とした飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の用途に利用することができる。
【００２６】
本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法は、原料としてカフェ酸とフェネチルアルコール、及び溶媒として水の存在下で酵素としてクロロゲン酸エステラーゼを０．０５〜１０Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させることを特徴とする。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを効率的に製造することができる。また、化学合成に比べて複雑な製造工程を要することなく容易に製造することができる。
【００２７】
（２）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、好ましくはクロロゲン酸エステラーゼは０．２〜８Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させる。したがって、カフェ酸フェネチルエステルをより効率的に製造することができる。
【００２８】
（３）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、好ましくは、さらに分離・精製処理される。分離・精製処理は、まず、酵素反応後にシリカ系樹脂、芳香族系合成吸着剤、及び脂肪族エステル系合成吸着剤から選ばれる少なくとも一種に接触させることにより、カフェ酸フェネチルエステルを吸着させる処理、次に溶出用溶媒を用いてカフェ酸フェネチルエステルを溶出させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備える。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを未反応原料から容易に分離・精製することができ、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。
【００２９】
（４）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、好ましくは、さらに酵素反応後に反応液を遠心分離又は静置することにより水層とフェネチルアルコール層とに分離する処理、次に得られた前記水層にカフェ酸及びフェネチルアルコールを配合することにより再度酵素反応させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備える。反応後にクロロゲン酸エステラーゼを含有する水層を再利用することでカフェ酸フェネチルエステルを連続的に合成することができ、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。また、クロロゲン酸エステラーゼを再利用するため、製造コストを抑制することができる。
【００３０】
（５）本実施形態において、カフェ酸の原料として天然素材由来のエキスを使用することができる。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを生体に適用する場合は、その安全性を高めることができる。また、生体に不要な成分を除去する必要がなく製造効率をより向上させることができる。
【００３１】
（６）本実施形態において、カフェ酸の原料としてコーヒー豆エキスを使用することができる。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを安価に製造することができる。
（７）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、酵素反応は好ましくは反応温度３０〜６０℃、反応時間１２〜１２０時間の条件下で作用させる。したがって、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率をより向上させることができる。
【００３２】
（８）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、クロロゲン酸エステラーゼの酵素反応をクロマトグラフィー担体、例えばシリカ系樹脂、芳香族系合成吸着剤、及び脂肪族エステル系合成吸着剤の存在下で行ってもよい。生成したカフェ酸フェネチルエステルがクロマトグラフィー担体に吸着されるため、化学平衡によりクロマトグラフィー担体に吸着していない酵素及び未反応基質よって新たなカフェ酸フェネチルエステルが連続的に合成される。したがって、カフェ酸フェネチルエステルの反応液からの分離・精製が容易になるのみならず、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。
【００３３】
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・カフェ酸フェネチルエステルは、ヒトに適用される飲食品、医薬品、及び化粧品のみならず、家畜等の飼養動物に対する医薬品等に適用してもよい。
【実施例】
【００３４】
以下に試験例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜試験例１：酵素量と反応率との関係＞
基質としてカフェ酸及びフェネチルアルコール、酵素としてクロロゲン酸エステラーゼを用いた場合、酵素量と反応生成物であるカフェ酸フェネチルエステルの収率との関係について試験した。
【００３５】
蒸留水１０ｍＬにフェネチルアルコール（２−フェニルエタノール、ナカライテスク株式会社製）およびカフェ酸（カフェイン酸、３，４−ジヒドロキシケイ皮酸、東京化成工業株式会社製）を表１の各試料ごとに記した量を添加してよく混合した。この溶液に、キッコーマン株式会社製のクロロゲン酸エステラーゼ（製品コード６０７５６、２４．１Ｕｎｉｔ／ｇ、ブドウ糖９３％およびエステラーゼ７％を含む）を表１に記した量を添加し、最後に容量が２０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液の一部を下記測定条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。
【００３６】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＡＧ１２０（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、資生堂社製）
移動相：Ａ，水（０．１％トリフルオロ酢酸含有）、Ｂ，メタノール（０．１％トリフルオロ酢酸含有）
グラジエント：移動相Ａ４０％，移動相Ｂ６０％（０分）→移動相Ａ０％，移動相Ｂ１００％（１５分）→移動相Ａ０％，移動相Ｂ１００％（５分）
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：ＵＶ３２５ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ  ９９６フォトダイオード）
カラム温度：４０℃
高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、カフェ酸及びＣＡＰＥの標準品（シグマ社製）とそれぞれ対比させることにより、カフェ酸及びＣＡＰＥのピークを同定し、それぞれのピーク面積を求めた。下記式１により、反応条件ごとの反応率を求めた。結果を表１，図１（カフェ酸０．２１Ｍ及びフェネチルアルコール２．５Ｍの場合）に示す。
【００３７】
式１：反応率（％）＝（ＣＡＰＥのピーク面積）／（カフェ酸のピーク面積＋ＣＡＰＥのピーク面積）×１００
【００３８】
【表１】
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図１及び表１に示されるように、クロロゲン酸エステラーゼの酵素量が高いほど、反応率も高いことが明らかになった。クロロゲン酸エステラーゼの酵素量が０．１６５Ｕ／ｍＬから反応率が急激に上昇し始め、酵素量が１．６５Ｕ／ｍＬ以上の酵素を添加すると、反応率が５０％を超えることが明らかになった（表1、試料番号１〜３、６〜８）。
【００３９】
＜試験例２：ＣＡＰＥの分離・精製処理＞
（ＣＡＰＥの合成）
蒸留水１０ｍＬにフェネチルアルコール６．１ｇ（終濃度２．５Ｍ）及びカフェ酸０．７５ｇ（終濃度０．２１Ｍ）を添加してよく混合した。この溶液にクロロゲン酸エステラーゼ６ｇ（終濃度約７．２３Ｕ／ｍＬ）を添加し、最後に容量が２０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４５℃で２４時間反応させた。反応後の溶液に、酢酸エチルを２０ｍＬ添加し、５分間激しく撹拌後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その結果、上部の酢酸エチル層と、下部の水層に分かれた。酢酸エチル層と水層の一部について、それぞれ試験例１に示す条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。
【００４０】
高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、クロロゲン酸エステラーゼ、カフェ酸、フェネチルアルコール、及びＣＡＰＥの標準品（シグマ社製）とそれぞれ対比させた。その結果、酢酸エチル層にはＣＡＰＥ、未反応のカフェ酸及びフェネチルアルコールが分配されたことが明らかになった。また、水層には、クロロゲン酸エステラーゼが分配されたことが明らかになった。以上の結果、酵素反応の結果、生成したＣＡＰＥは酢酸エチル層に分配されるが、未反応のカフェ酸及びフェネチルアルコールが混入するため、ＣＡＰＥのみを精製する場合、さらに処理工程が必要であることが明らかになった。次に、ＣＡＰＥの分離・精製処理工程においてＯＤＳカラム及びスチレン系合成吸着剤がそれぞれ適用可能か否かを以下の方法に従い検討した。
【００４１】
（ＯＤＳカラムを用いた分離・精製処理）
蒸留水２０ｍＬにフェネチルアルコール１２．２ｇ（終濃度２．５Ｍ）及びカフェ酸１．５ｇ（終濃度０．２１Ｍ）を添加してよく混合した。この溶液に、クロロゲン酸エステラーゼ６ｇ（終濃度約３．６２Ｕ／ｍＬ）を添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液に、酢酸エチルを４０ｍＬ添加し、５分間激しく撹拌後、３０分間静置した。上部の酢酸エチル層を回収し、溶媒をできる限り減圧留去させた後に、あらかじめ４０％メタノールで平衡化したＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社製）カラム（内径５．６ｃｍ×長さ３０ｃｍ）にアプライした。カラムは、４Ｌの４０％メタノールで洗浄後、２Ｌの９９．８％メタノールで溶出させた。溶出液は、溶媒を減圧留去し、１．９３ｇの粉末を得た。粉末の一部をとり、５０％メタノールに溶解し、試験例１に示す条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、ＣＡＰＥの標準品と対比することにより、得られた粉末がＣＡＰＥであることを確認した。また、未反応のカフェ酸及びフェネチルアルコールのピークは、全く検出されなかった。酵素反応により得られたＣＡＰＥの粉末及びＣＡＰＥの標準品の高速液体クロマトグラムを図２及び図３にそれぞれ示す。また、酵素反応により得られたＣＡＰＥの粉末及びＣＡＰＥの標準品の紫外線吸収スペクトルを図４及び図５にそれぞれ示す。なお、下記式２により、ＣＡＰＥの収率を求めた。その結果、本実施例のＣＡＰＥの収率は、約７８％であった。以上により、ＣＡＰＥの分離・精製処理工程においてＯＤＳカラムの適用が有効であることが確認された。
【００４２】
式２：収率（％）=（ＣＡＰＥのモル数）／（カフェ酸のモル数）×１００
（スチレン系合成吸着剤を用いた分離・精製処理）
蒸留水２０ｍＬにカフェ酸１．５ｇ（終濃度０．２１Ｍ）及びクロロゲン酸エステラーゼ６ｇ（終濃度約３．６２Ｕ／ｍＬ）を添加してよく混合した。この溶液に、フェネチルアルコール１２．２ｇ（終濃度２．５Ｍ）を添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を一晩静置したところ、その溶液は、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分かれた。フェネチルアルコール層と水層の一部について、それぞれ試験例１の測定条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、クロロゲン酸エステラーゼ、カフェ酸、フェネチルアルコール、及びＣＡＰＥの標準品とそれぞれ対比させた。その結果、フェネチルアルコール層には、フェネチルアルコール、ＣＡＰＥ、及び未反応のカフェ酸が分配されたことが明らかになった。また、水層にはクロロゲン酸エステラーゼが分配されたことが明らかになった。フェネチルアルコール層を回収し、溶媒をできる限り減圧留去させた後に、あらかじめ５０％エタノールで平衡化したスチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤としてのダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学株式会社製）カラム（内径３．４ｃｍ×長さ２６ｃｍ）にアプライした。０．５Ｌの５０％エタノール、０．５Ｌの６０％エタノール、及び０．５Ｌの７０％エタノールで段階的に溶出させ、それぞれ、画分１、画分２、画分３と名づけた。各画分の一部について、それぞれ試験例１の測定条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、カフェ酸、フェネチルアルコール、及びＣＡＰＥの標準品とそれぞれ対比させた。その結果、画分１には、カフェ酸及びフェネチルアルコールのピークが認められた。画分２には、フェネチルアルコールのピークのみ確認された。画分３には、ＣＡＰＥのピークのみ確認された（尚、データの添付はそれぞれ省略する）。以上の高速液体クロマトグラフィー分析結果に基づき、画分３について、溶媒を減圧留去し、１．８７ｇのＣＡＰＥ粉末を得た。なお、上記式２により、ＣＡＰＥの収率を求めた。その結果、本実施例のＣＡＰＥの収率は、約７５％であった。以上により、ＣＡＰＥの分離・精製処理工程においてスチレン系合成吸着剤の適用が有効であることが確認された。
【００４３】
＜試験例３：クロロゲン酸エステラーゼの再利用＞
クロロゲン酸エステラーゼを繰り返し酵素反応に使用することにより、より効率的なＣＡＰＥの合成が可能かを検討した。
【００４４】
（１回目の酵素反応）
蒸留水２０ｍＬにカフェ酸１．５ｇ（終濃度０．２１Ｍ）及びクロロゲン酸エステラーゼ６ｇ（終濃度約３．６２Ｕ／ｍＬ）を添加してよく混合した。この溶液に、フェネチルアルコール１２．２ｇ（終濃度２．５Ｍ）を添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離したところ、その溶液は、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分かれた。試験例１と同様に、上記測定条件での高速液体クロマトグラフィー分析の結果、フェネチルアルコール層には、フェネチルアルコール、ＣＡＰＥ及び未反応のカフェ酸が分配されたことが明らかになった。また、水層にはクロロゲン酸エステラーゼが分配されたことが明らかになった。フェネチルアルコール層を回収し、試験例２に記載される条件でダイヤイオンＨＰ２０カラムを用いた精製を行いＣＡＰＥ粉末１．８８ｇを得た（以上、１回目の酵素利用）。
【００４５】
（２回目の酵素反応）
次に、上記水層を回収し、新たにカフェ酸１．５ｇを添加してよく混合した。この溶液にフェネチルアルコール１２．２ｇを添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を上記の条件で遠心分離し、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分離させた。フェネチルアルコール層を回収し、試験例２に記載される条件でダイヤイオンＨＰ２０カラムを用いた精製を行いＣＡＰＥ粉末１．８３ｇを得た（以上、２回目の酵素利用）。
【００４６】
（３回目の酵素反応）
次に、２回目の酵素反応で得られた水層を回収し、新たにカフェ酸１．５ｇを添加してよく混合した。この溶液に、フェネチルアルコール１２．２ｇを添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を上記の条件で遠心分離し、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分離させた。フェネチルアルコール層を回収し、試験例２に記載される条件でダイヤイオンＨＰ２０カラムを用いた精製を行いＣＡＰＥ粉末１．７６ｇを得た（以上、３回目の酵素利用）。
【００４７】
（４回目の酵素反応）
次に、３回目の酵素反応で得られた水層を回収し、新たにカフェ酸１．５ｇを添加してよく混合した。この溶液に、フェネチルアルコール１２．２ｇを添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を上記の条件で遠心分離し、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分離させた。フェネチルアルコール層を回収し、試験例２に記載される条件でダイヤイオンＨＰ２０カラムを用いた精製を行いＣＡＰＥ粉末１．７１ｇを得た（以上、４回目の酵素利用）。
【００４８】
以上、酵素を再利用したときの、ＣＡＰＥの収率を上記式２により求めた。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
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クロロゲン酸エステラーゼは、上記４回の酵素反応に連続的に使用しても、高い反応率を保持しており、高い収率でＣＡＰＥを得ることができた。上記酵素の再利用を図ることにより、連続的で且つ効率的なＣＡＰＥの合成を行うことができることが確認された。
【００５０】
＜試験例４：原料としてコーヒー豆エキスを用いたＣＡＰＥの製造＞
（熱アルカリ処理法によるカフェ酸含有コーヒー豆エキスの調製）
焙煎後のアラビカ種コーヒー豆（銘柄：モカ）１０ｇを粉砕後、５０％エタノール１００ｍＬを加えて２時間撹拌して抽出した。抽出液をろ過後、溶媒を留去し、８０ｍＬの水を加えて撹拌した。水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１１．９に調製し、８０℃で３時間加熱した。アルカリ処理前後の溶液の一部について、それぞれ下記測定条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。
【００５１】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＡＧ１２０（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、資生堂社製）
移動相：Ａ，水（０．１％トリフルオロ酢酸含有）、Ｂ，メタノール（０．１％トリフルオロ酢酸含有）
グラジエント：移動相Ａ９０％，移動相Ｂ１０％（０分）→移動相Ａ０％，移動相Ｂ１００％（２０分）→移動相Ａ０％，移動相Ｂ１００％（５分）
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：ＵＶ３２５ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ  ９９６フォトダイオード）
カラム温度：４０℃
高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、クロロゲン酸（東京化成工業社製）、各種カフェオイルキナ酸類（ＯＤＳカラム及びＡＣＲシリカゲルを用いて公知の方法により精製した精製品：例えば特開２００６−２１３６３６号公報等参照）、及びカフェ酸の標準品とそれぞれ対比させた。その結果、アルカリ処理前に認められたクロロゲン酸及び各種カフェオイルキナ酸類のピークが、アルカリ処理後には殆ど認められなかった。また、アルカリ処理によって、処理前には顕著でなかったカフェ酸のピークが増大した（図６，７）。
【００５２】
（ＣＡＰＥの合成）
このアルカリ処理後のコーヒー豆エキスは、塩酸を加えてｐＨ５．７に調整した。このうち５ｍＬを測り取り、フェネチルアルコールを２．１ｇ及び試験例１に記載されるクロロゲン酸エステラーゼ１．１ｇ（終濃度約３Ｕ／ｍＬ）を添加し、穏やかに撹拌しながら、４０℃で１１６時間反応させた。反応液の一部を試験例１に示す条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行い、ＣＡＰＥの生成を確認した。高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、カフェ酸及びＣＡＰＥの標準品（シグマ社製）とそれぞれ対比させることにより、カフェ酸及びＣＡＰＥのピークを同定し、それぞれのピーク面積を求めた。式１により、反応率は、７４．４％であった。アルカリ処理前のコーヒー豆エキス、アルカリ処理後のコーヒー豆エキス、及び酵素反応後のコーヒー豆エキスの高速液体クロマトグラムを図６、図７及び図８にそれぞれ示す。以上により、コーヒー豆エキスからアルカリ処理及び所定量のクロロゲン酸エステラーゼを用いた酵素反応を経て効率的にＣＡＰＥを製造することが可能であることが示された。
【００５３】
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、それらの効果とともに以下に追記する。
（ａ）前記カフェ酸は、原料として天然素材由来のエキスが用いられることを特徴とするカフェ酸フェネチルエステルの製造方法。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを生体に適用する場合は、その安全性を高めることができる。また、生体に不要な成分を除去する必要がなく製造効率をより向上させることができる。
【００５４】
（ｂ）アルカリ処理後のコーヒー豆エキスにフェネチルアルコール及びクロロゲン酸エステラーゼが配合されることにより得られたコーヒー豆エキス。したがって、安価にカフェ酸フェネチルエステルを製造することができる。
【００５５】
（ｃ）前記カフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、酵素反応時にシリカ系樹脂、芳香族系合成吸着剤、及び脂肪族エステル系合成吸着剤から選ばれる少なくとも一種のクロマトグラフィー担体に接触させることにより、生成したカフェ酸フェネチルエステルを吸着させると同時に、更に酵素反応を継続する工程、次に溶出用溶媒を用いてカフェ酸フェネチルエステルを溶出させる処理を行う工程を備えることを特徴とする。生成したカフェ酸フェネチルエステルがクロマトグラフィー担体に吸着されるため、化学平衡によりクロマトグラフィー担体に吸着していない酵素及び未反応基質より新たなカフェ酸フェネチルエステルが連続的に合成される。したがって、カフェ酸フェネチルエステルの反応液からの分離・精製が容易になるのみならず、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。
【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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