(57)【要約】      （修正有）【課題】優れたチロシナーゼ抑制能及び抗酸化能を有するため優れた皮膚美白効果を奏するのみならず、優れた生体親和性を有することで皮膚への刺激がなく、且つ長期間の保存においても優れた安定性を有することにより、皮膚美白用化粧料組成物を提供する。【解決手段】安息香酸誘導体に３ないし１２個のアミノ酸残基からなるグルタチオン類似ペプチドが結合されたペプチド誘導体。及び、前記グルタチオン類似ペプチドが結合されたペプチド誘導体を含む化粧料組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で表されるペプチド誘導体。
【化１】
2010248166.tif 000010
前記式中、
Ｒ１ないしＲ５は、それぞれ独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ、ハロ、またはアミノであり、
ｎは、１または２であり、
Ｌは、存在しないかまたは連結基であり、
Ａは、３ないし１２個のアミノ酸残基からなるグルタチオン類似ペプチドである。
【請求項２】
Ａが、下記一般式２で表されるペプチド断片を含む３ないし１２個のアミノ酸残基からなるグルタチオン類似ペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のペプチド誘導体。
【化２】
2010248166.tif 000011
前記式中、
Ｘは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＡｓｎあり、
Ｙは、Ｃｙｓであり、
Zは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｈｅである。
【請求項３】
ＸはＧｌｕであり、ＹはＣｙｓであり、ＺはＧｌｙであることを特徴とする請求項２に記載のペプチド誘導体。
【請求項４】
ＬがＬｙｓであることを特徴とする請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項５】
ｎが２であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項６】
Ｒ１ないしＲ５が、それぞれ独立して水素またはヒドロキシであることを特徴とする請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ５はいずれも水素であり、Ｒ２ないしＲ４はいずれもヒドロキシであることを特徴とする請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項８】
下記一般式３で表されるペプチド誘導体。
【化３】
2010248166.tif 000012
前記式中、
Ｌは、存在しないかまたはＬｙｓであり、
Ａは、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙである。
【請求項９】
ＬがＬｙｓであることを特徴とする請求項８に記載のペプチド誘導体。
【請求項１０】
下記一般式４で表されるペプチド誘導体。
【化４】
2010248166.tif 000013
前記式中、
Ｌは、存在しないかまたはＬｙｓであり、
Ａは、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙである。
【請求項１１】
ＬがＬｙｓであることを特徴とする請求項１０に記載のペプチド誘導体。
【請求項１２】
請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載のペプチド誘導体を含む化粧料組成物。
【請求項１３】
皮膚美白用であることを特徴とする請求項１２に記載の化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド誘導体及びそれを含む化粧料組成物に関し、より詳しくは、優れた皮膚美白効果を有し、皮膚への刺激がなく、且つ優れた安定性を有するペプチド誘導体及びそれを含む皮膚美白用化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外部環境に直接露出するもので、人体を保護し、生化学的且つ物理的な機能を持っている非常に重要な組職である。この組職は、３つの層、即ち、表皮層、真皮層、及び皮下組織から構成される。ヒトの皮膚色は、血液内の赤血球、カロチン、及びメラニンによって複合的に決められるが、人種間の皮膚色の違いやしみ、そばかすなどの色素過剰は、メラニンによる影響が大きい。皮膚の最外層である表皮層に存在するメラニンは、アミノ酸の一つであるチロシンにチロシナーゼという酵素が働き、ドーパ、ドーパキノンという化合物に変わった後、非酵素的に酸化反応して作られるものであって、紫外線を遮断することで真皮層の下の皮膚器官を保護するという有用な役割をするものでもある。
【０００３】
しかしながら、内・外的ストレスによる刺激によって生成されたメラニンは、ストレスが消えても皮膚角質化によって外部に排出される前までは消失しない安定な物質である。皮膚においてフリーラジカルの生成が多くなるか、炎症反応があるか、或いは紫外線などにさらされると、生体内でチロシナーゼなどの酵素を触媒とする重合化酸化反応が起こることでメラニンの生成が増大するようになる。特に、紫外線はメラニンの生成を増大させ、部分的に増大されたメラニンがしみなどに発展していき、外観上、望ましくない結果が生じることもある。
【０００４】
このような理由から、メラニン生成抑制剤としてハイドロキノン、コウジ酸、アルブチン、グルタチオン、ビタミンＣ（ascorbic acid）などが化粧品の原料に用いられてきたが、満足のいく美白効果が得られず、また原料自体が不安定であることから皮膚刺激が強かったため、その利用が非常に制限的であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上記のような従来技術の問題点を克服するために鋭意研究を重ねた結果、安息香酸誘導体にグルタチオン類似ペプチドが結合された本発明によるペプチド誘導体が、皮膚刺激が低いながらもメラニンの生成を抑制することができる優れたチロシナーゼ抑制能を有するのみならず、長期間の保存においても優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、優れたチロシナーゼ抑制能及び抗酸化能を有するのみならず、皮膚への刺激がなく、且つ長期間の保存においても優れた安定性を有するペプチド誘導体を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、上記ペプチド誘導体を含む皮膚美白用化粧料組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一観点において、本発明は、機能性化粧品原料に用いることができる下記一般式１で表される新規なペプチド誘導体に関する。
【化１】
2010248166.tif 000002
上記式中、
Ｒ１ないしＲ５は、それぞれ独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ、ハロ、またはアミノ、好ましくは、水素またはヒドロキシであり、
ｎは、１または２、好ましくは、２であり、
Ｌは、存在しないかまたは連結基、好ましくは、Ｌｙｓであり、
Ａは、３ないし１２個のアミノ酸残基からなるグルタチオン類似ペプチドである。
【０００９】
好ましくは、Ａは、下記一般式２で表されるペプチド断片を含む３ないし１２個のアミノ酸残基からなるグルタチオン類似ペプチドである。
【化２】
2010248166.tif 000003
上記式中、
Ｘは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＡｓｎ、好ましくは、Ｇｌｕであり、
Ｙは、Ｃｙｓであり、
Zは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｈｅ、好ましくは、Ｇｌｙである。
【００１０】
他の観点において、本発明は、下記一般式３で表されるペプチド誘導体に関する。
【化３】
2010248166.tif 000004
上記式中、
Ｌは、存在しないかまたはＬｙｓ、好ましくは、Ｌｙｓであり、
Ａは、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙである。
【００１１】
また他の観点において、本発明は、下記一般式４で表されるペプチド誘導体に関する。
【化４】
2010248166.tif 000005
上記式中、
Ｌは、存在しないかまたはＬｙｓ、好ましくは、Ｌｙｓであり、
Ａは、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙである。
【００１２】
本明細書においてＣ１〜Ｃ６のアルキル基は、炭素数１〜６個からなる直鎖状または分岐状炭化水素を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、i−プロピル、ｎ−ブチルなどが含まれるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００１３】
Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基は、炭素数１〜６個からなる直鎖状または分岐状アルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロパンオキシなどが含まれるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００１４】
本明細書においてペプチドを名付ける一般的な規則は、具体的に指示された例外事項がない限り、３文字または１文字アミノ酸コードの適用を基礎とする。言い換えれば、アミノ酸構造の中心部を３文字コード（例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ）で表示し、３文字コードの前に「Ｄ−」を付することでＤ−立体形態（例えば、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｙｓ）であることを具体的に指示しない限り、Ｌ−立体形態であると仮定する。
【００１５】
ペプチドを構成するアミノ酸残基は、天然または非天然アミノ酸残基のいずれも可能である。
【００１６】
本発明によるペプチド誘導体は、目的とするペプチドを合成した後、安息香酸誘導体と結合反応させて製造することができる。
【００１７】
上記目的とするペプチドは、生体内のタンパク質を抽出した後、タンパク質分解酵素による処理を施すことで低分子量化するか、遺伝子組換とタンパク質発現システムを用いて製造することもでき、好ましくは、ペプチド合成器などを用いた化学合成方法により製造することもできる。
【００１８】
本発明によるペプチド誘導体は、例えば、
（１）通常の固相ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＰＰＳ）によりＮＨ２−保護されたペプチド−レジンを収得するステップと、
（２）収得されたＮＨ２−保護されたペプチド−レジンを安息香酸誘導体と反応させるステップ、及び
（３）レジンを除去するステップと、を実施して製造することができる。
【００１９】
目的とするペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に官能基が存在する場合には、上記ステップ（１）において上記官能基が保護されたアミノ酸を用いてペプチドを合成することができ、上記官能基に結合された保護基はステップ（３）において除去される。
【００２０】
官能基が保護されたアミノ酸を用いた本発明によるペプチド誘導体の製造過程の一具体例を、下記の反応式１で簡略に表した。
（反応式１）
2010248166.tif 000006
【００２１】
また、官能基が保護されたアミノ酸を用いた本発明によるペプチド誘導体の製造過程の他の具体例を下記の反応式２で簡略に表した。
（反応式２）
2010248166.tif 000007
【００２２】
本発明は、また他の観点において、本発明によるペプチド誘導体を含む化粧料組成物、特に皮膚美白用化粧料組成物に関する。
【００２３】
本発明によるペプチド誘導体は、メラニンの生成に関与するチロシナーゼ酵素の抑制能による美白効果を有する。さらに、本発明によるペプチド誘導体は、抗酸化能をも有するため、皮膚美白用化粧料組成物に有効に用いることができる。
【００２４】
本発明の化粧料組成物は、本発明によるペプチド誘導体を有効成分として、好ましくは、０．００１〜１０．０重量％の範囲で含む。なお、有効成分の含量は、その使用目的に応じて適宜決められていてよい。
【００２５】
本発明の化粧料組成物は、有効成分として、本発明によるペプチド誘導体の他、化粧料組成物に通常に用いられる成分、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の助剤、及び担体を含む。
【００２６】
本発明の化粧料組成物は、当業界において通常に用いられるあらゆる剤形に製剤化することができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、パウダー、スプレーなどに製剤化することができる。
【００２７】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などを用いればよい。
【００２８】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミドパウダーなどを用いればよく、特に、スプレーである場合には、さらに、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進剤を含んでいてよい。
【００２９】
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤、例えば、水、エチルアルコール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステルなどを用いればよい。
【００３０】
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エチルアルコールまたはプロピレングリコールのような液相の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルまたはポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天（ａｇａｒ）、トラカントなどを用いればよい。
【００３１】
本発明の化粧料組成物は、スキン、ローション、クリーム、パック、色調化粧品、ハンドクリーム、ツーウェイケーキ、フェイスパウダー、コンパクト、メーキャップベース、スキンカバー、アイシャドー、リップスティック、リップグロス、リップフィックス、アイブローペンシルなどの化粧品に適用することができる。
【発明の効果】
【００３２】
安息香酸誘導体にグルタチオン類似ペプチドが結合された本発明によるペプチド誘導体は、優れたチロシナーゼ抑制能及び抗酸化能を有するため優れた美白効果を奏するのみならず、優れた生体親和性を有することで皮膚への刺激がなく、且つ長期間の保存においても優れた安定性を有するという効果がある。
【００３３】
特に、安息香酸誘導体にグルタチオン類似ペプチドが連結基を介して結合された本発明によるペプチド誘導体は、安息香酸誘導体にグルタチオン類似ペプチドが連結基を介さずに直接結合されたペプチド誘導体よりも優れたチロシナーゼ抑制能を有する。
【００３４】
したがって、本発明のペプチド誘導体は、機能性化粧品原料として化粧料組成物、特に皮膚美白用化粧料組成物に有効に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明することにする。なお、これら実施例は単に本発明を説明するためのものであるに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例に局限されないことは当業者にとって自明である。
【実施例】
【００３６】
実施例１：ガロイル−テトラペプチド（リシル−グルタミル−システイニル−グリシン）の製造
１.１：ＮＨ２−保護されたペプチド−レジンの合成
ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｆｍｏｃ）をアミノ酸の保護基として用い、通常の固相ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＰＰＳ）によって合成し、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ：ＨＯＢｔ）とＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ,Ｎ'−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ：ＤＣＣ）を活性化剤として用いてアミノ酸残基を延長した［参考文献：Wang C. Chan, Perter D. White,‘Fmoc solid phase peptide synthesis', Oxford]。
【００３７】
具体的に、ガラス反応器においてアミノ基がＦｍｏｃで保護されたグリシンレジン（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）０．０４ｇを、溶媒であるＮ−メチル−２−ピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ：ＮＭＰ）３ｍｌで２０分間膨張させた後、溶媒を除去し、２０％ピペリジン３ｍｌで２回処理を施してＦｍｏｃを除去した。Ｆｍｏｃが除去されたグリシンレジンをジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ：ＤＣＭ）で２回、ＮＭＰで２回処理を施し、ＨＯＢｔ−ＤＣＣで活性化されたシステイン溶液と室温下に約２時間反応させた。このような過程においてグルタミンとリジンとを連続して反応させて収得したＮＨ２−保護されたペプチド（リシル−グルタミル−システイニル−グリシン）−レジンをＤＣＭで２回、ＮＭＰで２回、ＤＣＭで２回洗浄した後、完全に乾燥させた。
【００３８】
１.２：ガロイル−テトラペプチドの合成
上記のようにして合成されたＮＨ２−保護されたペプチド（リシル−グルタミル−システイニル−グリシン）−レジンに２０％ピペリジン／ＮＭＰ溶液を加えてアミノ基に結合されたＦｍｏｃを除去し、ＮＭＰとＤＣＭで洗浄した後、没食子酸（gallic acid, Ｌａｎｃａｓｔｅｒ社製）５当量と室温下に一晩結合反応させた。反応が終了した後、ＮＭＰとＤＣＭで数回洗浄してから乾燥させた。
【００３９】
乾燥されたガロイル−テトラペプチド−レジンを、トリフルオロ酢酸：フェノール：チオアニソール：水：エタンジチオール（８２．５：５：５：５：２．５（ｖ／ｖ））の混合溶液で室温下に２〜３時間反応させ、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に存在する官能基の保護基であるｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びトリチル（トリフェニルメチル）を除去し、レジンからガロイル−テトラペプチドを分離させた後、冷たいジエチルエーテルで上記ペプチドを沈殿させた。
【００４０】
収得したガロイル−テトラペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸が含まれた水とアセトニトリルを溶媒とした逆相高性能液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｃｏｌｕｍｎ：Ｇｅｍｉｎｉ、Ｃ１８ １１０Ａ ２５０×２１．２ｍｍ）によって精製した。
収率：７１％
【００４１】
実施例２：ジガロイル−テトラペプチド（リシル−グルタミル−システイニル−グリシン）の製造
２.１：ＮＨ２−保護されたペプチド−レジンの合成
上記実施例１と同様な方法によりＮＨ２−保護されたペプチド（リシル−グルタミル−システイニル−グリシン）−レジンを合成した。
【００４２】
２.２：ジガロイル−テトラペプチドの合成
上記のようにして合成されたＮＨ２−保護されたペプチド（リシル−グルタミル−システイニル−グリシン）−レジンに２０％ピペリジン／ＮＭＰ溶液を加えてアミノ基に結合されたＦｍｏｃを除去し、ＮＭＰとＤＣＭで洗浄した後、没食子酸１０当量と室温下に一晩結合反応させた。反応が終了した後、ＮＭＰとＤＣＭで数回洗浄してから乾燥させた。
【００４３】
乾燥されたジガロイル−テトラペプチド−レジンをトリフルオロ酢酸：フェノール：チオアニソール：水：エタンジチオール（８２．５：５：５：５：２．５（ｖ／ｖ））の混合溶液で室温下に２〜３時間反応させ、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に存在する官能基の保護基であるｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びトリチル（トリフェニルメチル）を除去し、レジンからジガロイル−テトラペプチドを分離させた後、冷たいジエチルエーテルで上記ペプチドを沈殿させた。
【００４４】
収得したジガロイル−テトラペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸が含まれた水とアセトニトリルを溶媒とした逆相高性能液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｃｏｌｕｍｎ：Ｇｅｍｉｎｉ、Ｃ１８ １１０Ａ ２５０×２１.２ｍｍ）によって精製した。
収率：６２％
ＨＰＬＣ純度：＞９８％
分子量：７３９．７（Ｍ＋＋Ｎａ：７６０．５、Ｍ＋＋Ｋ：７７６．４）
【００４５】
実施例３：ガロイル−トリペプチド（グルタミル−システイニル−グリシン）の製造
３.１：ＮＨ２−保護されたペプチド−レジンの合成
上記実施例１と同様な方法によりＮＨ２−保護されたペプチド（グルタミル−システイニル−グリシン）−レジンを合成した。
【００４６】
３.２：ガロイル−トリペプチドの合成
上記のようにして合成されたＮＨ２−保護されたペプチド（グルタミル−システイニル−グリシン）−レジンに２０％ピペリジン／ＮＭＰ溶液を加えてアミノ基に結合されたＦｍｏｃを除去し、ＮＭＰとＤＣＭで洗浄した後、没食子酸５当量と室温下に一晩結合反応させた。反応が終了した後、ＮＭＰとＤＣＭで数回洗浄してから乾燥させた。
乾燥されたガロイル−トリペプチド−レジンをトリフルオロ酢酸：フェノール：チオアニソール：水：エタンジチオール（８２．５：５：５：５：２．５（ｖ／ｖ））の混合溶液で室温下に２〜３時間反応させ、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に存在する官能基の保護基であるｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びトリチル（トリフェニルメチル）を除去し、レジンからガロイル−トリペプチドを分離させた後、冷たいジエチルエーテルで上記ペプチドを沈殿させた。
収得したガロイル−トリペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸が含まれた水とアセトニトリルを溶媒として逆相高性能液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｃｏｌｕｍｎ：Ｇｅｍｉｎｉ、Ｃ１８ １１０Ａ ２５０×２１.２ｍｍ）して精製した。
収率：６９％
【００４７】
比較例１：ガロイル−トリペプチド（チロシル−ヒスチジル−チロシン）の製造
上記実施例１と同様な方法により表題化合物を製造した。
収率：７６％
【００４８】
比較例２：ジガロイル−テトラペプチド（リシル−チロシル−ヒスチジル−チロシン）の製造
上記実施例２と同様な方法により表題化合物を製造した。
収率：７１％
【００４９】
比較例３：ガロイル−デカペプチド（チロシル−グリシル−グリシル−フェニルアラニル−ルシル−アルギニル−リシル−チロシル−プロリル−リジン）の製造
上記実施例１と同様な方法により表題化合物を製造した。
収率：５９％
【００５０】
実験例１：チロシナーゼ活性抑制効果の実験
試料のチロシナーゼ活性抑制効果を公知の方法を用いて測定した［参考文献：Pomerantz S.H., J. Biochem., 24：161−168, 1966]。
【００５１】
試料を最終濃度が１００μΜになるように９６−ウェルプレートに入れ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ；ｐＨ６．８）２２０ｕｌ、１．５ｍＭのＬ−チロシン溶液４０ｕｌを入れてから、マッシュルーム由来のチロシナーゼ（１,５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社製）２０ｕｌを添加して３７℃で２０分間反応させた後、０．２ｍｌを取って９６−ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用いて４９０ｎｍで吸光度を測定してチロシナーゼに対する阻害率を測定した。
【００５２】
チロシナーゼの活性抑制能の度合いは、純水を使用した対照群の吸光度を基準にして下記の計算式１による百分率で算出した。
（計算式１）
チロシナーゼ抑制能（％）＝１００−（各試料の反応吸光度／対照群の反応吸光度×１００）
【００５３】
その結果を下記の表１に表した。
【００５４】
【表１】
2010248166.tif 000008
【００５５】
上記表１から、没食子酸にグルタチオン類似ペプチドが結合された本発明によるペプチド誘導体は、没食子酸に比べ、チロシナーゼ抑制能が顕著に増加する他、没食子酸に抗酸化能に優れていると知られた大豆タンパク質来由のペプチドが結合されたペプチド誘導体（比較例１及び２）またはニューロペプチドが結合されたペプチド誘導体（比較例３）よりも顕著に優れたチロシナーゼ抑制能を有することを確認することができた。また、没食子酸にリジンを介してグルタチオン類似ペプチドが連結された場合、直接結合された場合よりもチロシナーゼ抑制能が増加することが分かった。
【００５６】
実験例２：フリーラジカル消去効果実験（抗酸化能実験）
上記実施例１及び２においてそれぞれ製造されたガロイル−テトラペプチド及びジガロイル−テトラペプチドのフリーラジカル消去効果を、通常のＤＰＰＨ法により測定した。
【００５７】
陽性対照群として、代表的な抗酸化剤であるビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、上記本発明によるガロイル−テトラペプチド及びジガロイル−テトラペプチドをエチルアルコール中においてフリーラジカルを発生させる１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（１,１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ：ＤＰＰＨ、Ｓｉｇｍａ社製）と一定の割合で混合して、生成されたフリーラジカルの量がどの程度減少したかを確認した。具体的に、エチルアルコール０.４ｍｌに、精製水に溶かした上記ペプチド誘導体溶液０．１ｍｌと０．１ｍＭのＤＰＰＨ 溶液０．５ｍｌを添加して、最終濃度が１０、５０、１００μＭになるようにした。１０秒間強くボルテックスさせてから冷暗所で３０分間放置した後、ＥＬＩＳＡ法を用いて５１７ｎｍで吸光度を測定した。
【００５８】
抗酸化能（フリーラジカル消去効果）の度合いは、純水を使用した対照群の吸光度を基準にして下記の計算式２による百分率で算出した。
（計算式２）
フリーラジカル消去効果（％）＝１００−（各試料の反応吸光度／対照群の反応吸光度×１００）
【００５９】
その結果を下記の表２に表した。
【００６０】
【表２】
2010248166.tif 000009
【００６１】
上記表２から分かるように、上記実施例１及び２においてそれぞれ製造されたガロイル−テトラペプチド及びジガロイル−テトラペプチドは、ビタミンＣよりも優れたフリーラジカル消去効果を奏した。したがって、本発明のペプチド誘導体が、優れた抗酸化効果を有する物質であることを確認することができた。