(57)【要約】【課題】電気泳動によって分離した分子を、精度よく、且つ、透過することによる損失がなく均一に転写することができる転写用媒体、電気泳動兼転写用積層体および電気泳動兼転写用チップを提供すること。【解決手段】接着層４を介して転写用媒体１と半透膜２を積層した転写用積層体５を用いることによって、電気泳動支持体中で分離したサンプルを、転写用積層体を透過して損失することなく、効率よく転写させる。また本発明は、電気泳動支持体と前記転写用積層体とを一体形成し電気泳動兼転写用積層体とする。さらに本発明は、前記電気泳動兼転写用積層体を用いた電気泳動兼転写用チップを提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写用媒体と半透膜とを備えてなることを特徴とする転写用積層体。
【請求項２】
前記転写用積層体を構成する転写用媒体は、ポリカーボネート、ポリフッ化ビニリデン、ニトロセルロース、セルロース混合エステル、ポリオレフィンのいずれかを主成分とすることを特徴とする請求項１に記載の転写用積層体。
【請求項３】
前記転写用積層体を構成する半透膜は、セロファン、アセチルセルロース、ポリアクリロニトリル、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリアミド、ポリエステル系ポリマーアロイのいずれかを主成分とすることを特徴とする請求項１または２に記載の転写用積層体。
【請求項４】
前記転写用積層体を構成する転写用媒体と半透膜との間に接着層を介していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の転写用積層体。
【請求項５】
電気泳動支持体と請求項１〜４のいずれかに記載の転写用積層体とが一体形成された電気泳動兼転写用積層体。
【請求項６】
請求項５に記載の電気泳動兼転写用積層体を包含することを特徴とする電気泳動兼転写用チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写用積層体、電気泳動兼転写用積層体および電気泳動兼転写用チップに関するものであり、より詳細には、転写用媒体と半透膜とを備えてなる転写用積層体、電気泳動支持体と転写用媒体とが一体形成された電気泳動兼転写用積層体および該電気泳動兼転写用積層体を用いた電気泳動兼転写用チップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動植物の組織や細胞から抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体高分子をサイズ、性状等の違いに基づいて電気泳動ゲル中に分離する電気泳動技術は、ライフサイエンス分野において非常に重要な技術である。特にタンパク質を電気泳動によって分離する場合、タンパク質の分子量の違いに基づくＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法および等電点の違いに基づく等電点電気泳動法を組み合わせた二次元電気泳動法が広く用いられている。
【０００３】
また、電気泳動技術を用いて分離した生体高分子をさらに分析する場合、分離した生体高分子を電気泳動ゲルから転写膜に転写し、転写膜上においてハイブリダイゼーション、抗原抗体反応等を利用した遺伝子工学的または免疫化学的分析が行われている。電気泳動後、電気泳動ゲル中に分離された生体高分子を転写膜に転写するために、電気泳動後のゲルを電気泳動装置から取り出し、取り出したゲル上に転写膜を貼り合わせた後、ゲルと転写膜とを共に転写装置に取り付けてゲル中の分子を転写膜に吸着させる。特許文献１には、生体分子を検出および分析するための方法および装置が開示されている。
【特許文献１】特表２００４−５１８９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記の転写において、電気泳動支持体中で分離した生体高分子のうち、分子量の低いものほど電気泳動支持体から転写膜へと移動しやすく、反対に、分子量の高いものは転写膜への移動に時間がかかる。そのため、分子量の高い生体分子を充分に転写させるために転写を長時間かけて行うと、一旦吸着された分子量の低い生体分子の一部が転写膜を通り抜けてしまう。よって、分離した生体高分子を損失することなく、且つ、一律に効率よく転写させることが非常に難しい。ゆえに、従来の構成においては、印加電圧や転写時間を固定するなど、転写の諸条件を一定にしなければならず、ゲル上に分離した各分子を精度よく、均一に転写膜に転写することが困難であった。
【０００５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、電気泳動によって分離した分子を、精度よく、且つ、透過することによる損失がなく均一に転写することができる転写用媒体、電気泳動兼転写用積層体および電気泳動兼転写用チップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１に記載の発明は、転写用媒体と半透膜とを備えてなることを特徴とする転写用積層体である。
請求項２に記載の発明は、前記転写用積層体を構成する転写用媒体は、ポリカーボネート、ポリフッ化ビニリデン、ニトロセルロース、セルロース混合エステル、ポリオレフィンのいずれかを主成分とすることを特徴とする請求項１に記載の転写用積層体である。
請求項３に記載の発明は、前記転写用積層体を構成する半透膜は、セロファン、アセチルセルロース、ポリアクリロニトリル、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリアミド、ポリエステル系ポリマーアロイのいずれかを主成分とすることを特徴とする請求項１または２に記載の転写用積層体である。
請求項４に記載の発明は、前記転写用積層体を構成する転写用媒体と半透膜との間に接着層を介していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の転写用積層体である。
請求項５に記載の発明は、電気泳動支持体と請求項１〜４のいずれかに記載の転写用積層体とが一体形成された電気泳動兼転写用積層体である。
請求項６に記載の発明は、請求項５に記載の電気泳動兼転写用積層体を包含することを特徴とする電気泳動兼転写用チップである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、転写用積層体は転写用媒体と半透膜が積層されているため、電気泳動支持体中で分離した被分離物質を転写用積層体に転写するときに、透過して損失することなく、分離パターンを維持したまま、精度よく、均一に写し取ることができる。また、電気泳動支持体と当該転写用積層体とを一体形成させる場合、被分離物質の分離パターンを精度よく、均一に転写することが可能である。また、電気泳動後の電気泳動支持体に転写用積層体を貼り合わせる必要もなく、さらに、電気泳動装置から電気泳動支持体を取り出し、転写用積層体と貼り合わせるときに生じうるズレや気泡混入等の不具合を回避することも可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
（転写用積層体）
図１に示すように、本発明に係る転写用積層体３は、転写用媒体１と半透膜２とを備えている。本発明に係る転写用媒体１は、電気泳動支持体中に分離された被分離物質を、転写、吸着させるために用いられる。また、図２に示すように、転写用積層体５を構成する転写用媒体１と半透膜２は接着層４によって密着させてもよく、転写工程において被分離物質が多孔質膜を透過して損失することがないため、十分に、均一に転写される。
【０００９】
また、本発明に係る転写用積層体を構成する転写用媒体および半透膜は、電気泳動支持体と略同一形状であり、面積が略同一であることが好ましい。また、転写用積層体の厚さは、それぞれ転写用または電気泳動用に常用されている一般的な厚さ範囲から逸脱しない範囲内であればよく、転写用積層体と電気泳動支持体とを備えた電気泳動兼転写用積層体の厚さは、従来の方法または装置を用いて電気泳動および転写可能な厚さ範囲から逸脱しない範囲内であればよい。
【００１０】
（転写用媒体）
本発明に係る転写用積層体が備える転写用媒体としては、ポリカーボネート膜、ポリフッ化ビニリデン膜、ニトロセルロース膜、セルロース混合エステル膜、ポリオレフィン膜等が好適である。これらは、均質な孔を有する多孔質膜で、電気泳動によって分離したサンプルを、分離パターンを維持したまま透過させて電気泳動支持体から精度よく吸着して固定することが可能な薄膜である。また、上記の転写用媒体を含む転写用積層体を電気泳動支持体と一体化させた場合に、電気泳動による被分離物質の分離を妨げない。なお、これらの膜は、例えば、一般にろ過膜として用いられているような膜を商業的に入手したものであってもよい。
【００１１】
また、上記の転写用媒体のうち、ポリカーボネート膜もしくはポリオレフィン膜を用いるのが好ましい。そのいずれかの膜上に電気泳動支持体溶液を充填、重合させて、電気泳動もしくは転写後に分離することが可能であるため、そのいずれかを用いることにより、転写用積層体を電気泳動支持体と一体形成させることが可能になる。
【００１２】
さらに、それらのうち、ポリカーボネート膜を用いるのがより好ましい。ポリカーボネート膜は、乾燥状態、あるいは、水系溶媒で湿潤させた状態で設置可能であるだけでなく、膜を湿潤させる水系溶媒の吸水により、膜の体積変化がほとんどなく歪みが生じにくいので、転写用積層体の構成成分として用いるのにより好適である。
【００１３】
（半透膜）
本発明に係る転写用積層体の一構成成分である半透膜は、セロファン、アセチルセルロース、ポリアクリロニトリル、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリアミド、ポリエステル系ポリマーアロイから選択されることが好ましい。そのなかでも特に、親水性であるセロファンを用いるのが好適である。半透膜はタンパク質やＤＮＡなどの高分子を透過しないので、半透膜を転写用媒体に積層させた転写用積層体を用いることにより、転写でのタンパク質の透過を防止することが可能になる。
【００１４】
（接着層）
図２に示すように、本発明に係る転写用積層体を構成する転写用媒体と半透膜との間に接着層４を介することにより、転写用積層体が強固になる。なお、接着層は、転写を阻害しないものであればいずれの接着剤でも差し支えないが、転写用積層体がバッファーに浸漬されるため、親水性のものが好ましい。水溶性の接着剤であるポリビニルアルコールは、乾燥させることにより固化し、そのことにより接着効果が生じる。なお、転写用積層体中に接着層４が存在することにより、転写時の導電ならびに溶媒の透過を妨げない。
【００１５】
（電気泳動兼転写用積層体）
図３に示すように、本発明に係る転写用積層体５を、電気泳動支持体６と積層することにより電気泳動兼転写用積層体７が形成される。転写用積層体５を構成する転写用媒体において、ポリカーボネート膜あるいはポリオレフィン膜を用いれば、予め転写用積層体を設置したゲルカセットに電気泳動支持体溶液を充填することにより一体形成させることが可能で、また、電気泳動ならびに転写実施後に転写用積層体を電気泳動支持体から容易に分離することも可能になる。なお、電気泳動支持体を形成させた後に転写用積層体を設置してもよく、これに限定されない。
【００１６】
本発明に係る電気泳動兼転写用積層体は、転写用積層体および電気泳動支持体を備えているので、被分離物質の電気泳動による分離から転写までを連続して行うことができる。すなわち本発明に係る電気泳動兼転写用積層体は電気泳動および転写用途に用いられるものであり、電気泳動用の支持体でもあり、転写用の媒体でもある。したがって、本発明に係る電気泳動兼転写用積層体を、転写用積層体一体型電気泳動支持体または電気泳動支持体一体型転写用積層体と称することもできる。
【００１７】
（被分離物質）
本発明に係る電気泳動兼転写用積層体を用いて分離される被分離物質は、電気泳動および転写することによって分析すべき物質であり、サンプルと称することもある。被分離物質として、生物材料（例えば、生物個体、体液、細胞株、組織培養物、または組織断片）からの調製物を好適に用いることが可能であり、特にタンパク質サンプル、ＤＮＡサンプルおよびＲＮＡサンプルを好適に用いることが可能である。これらのサンプルは、予め蛍光試料等によって染色（蛍光染色または蛍光標識）されていてもよい。
【００１８】
（電気泳動支持体）
本発明に係る電気泳動兼転写用積層体が備える電気泳動支持体は、被分離物質を支持体中において電気泳動することによって、被分離物質のサイズ、性状等の違いに基づいて分離するものであり、単に支持体と称することもある。電気泳動支持体は、支持体中を被分離物質が移動できるように、重合体分子が複雑な網目構造を形成してなるゲルであるため、単にゲルまたは電気泳動ゲルと称することもある。ゲルを構成する主材料としてポリアクリルアミドまたはアガロースのように、従来から一般に電気泳動に用いられるゲル材料を好適に使用可能である。
【００１９】
（電気泳動兼転写用ゲルチップの構成）
本発明の電気泳動兼転写用積層体を備えた電気泳動兼転写用ゲルチップの構成を図４に示す。図１または図２に示すようにして作成した転写用積層体３ないし５を準備し、ゲルカセット基板（電気泳動ゲルカセット８）上に載置し、もう一方の電気泳動ゲルカセット８により蓋をしてゲルカセット基板８と前記蓋とを密着させる。次に電気泳動ゲルカセット８中の転写用積層体３ないし５上にゲル溶液を充填し、ゲル溶液を重合させて電気泳動支持体６を形成し、電気泳動兼転写用チップ９を作成する。なお、電気泳動支持体を形成させた後に転写用積層体３ないし５を積層してもよく、これに限定されない。
【００２０】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されない。
【００２２】
〔１．材料および方法〕
（１−１．転写用媒体、半透膜および接着層）
転写用媒体として孔径が０．４μｍのポリカーボネート膜（商品名Isopore Membrane Filter（Millipore 社製））を、半透膜としてセロファン（TOHO社製）を用いた。チップに設置させるため、各々 ５×６ cm の大きさに切断した。接着層として、ポリビニルアルコール（完全けん化型、分子量２，０００（和光純薬工業(株)）を用いた。詳細には、ポリビニルアルコールの固形粉末を、沸騰させた蒸留水に攪拌しながら溶解させて、２重量％の溶液を調製し、それを接着層として用いた。
【００２３】
（１−２．転写用積層体の作成）
上記１−１の転写用媒体ならびに半透膜を用いて転写用積層体を作成した。詳細には、半透膜を２％ポリビニルアルコール水溶液からなる接着層に、半透膜の片面あるいは全体を浸漬させたものを転写用媒体に重ね合わせて密着させ、乾燥機にて８０℃で３０分程度乾燥させた。
【００２４】
（１−３．電気泳動ゲルおよび電気泳動兼転写用チップの調製）
上記１−２の転写用積層体を、ゲルを形成するための領域が ５×６ cmのプラスチック製容器の基板面に載置し、容器に蓋をして超音波溶着装置にて基板と蓋とを溶着した。ゲル形成領域の下端部を封止した後上端部よりポリアクリルアミドゲル溶液を充填し、静置してゲルを重合させた。
【００２５】
13% アクリルアミド、375 mM トリス塩酸・pH 8.8、0.1% 過硫酸アンモニウム、0.1% テトラメチルエチレンジアミンを含むポリアクリルアミドゲル溶液を用いた。29.2% アクリルアミド-0.8% メチレンビスアクリルアミド混合溶液を添加して、ポリアクリルアミドゲル中のアクリルアミドの最終濃度が 13% になるように調製した。
【００２６】
（１−４．サンプル）
電気泳動および転写するサンプルとして、着色分子量マーカーであるSeeBlue Pre-Stained Standard（Invitrogen 社製）を用いた。
【００２７】
（１−５．電気泳動）
上記１−３において調製した電気泳動兼転写用チップのゲルのウエルにサンプルと 1% アガロースを混合したものをのせて SDS-PAGE に供した。電気泳動バッファーとして、25 mM トリス、192 mM グリシンおよび 0.1% SDS を含む陰極バッファーと、150 mM トリス塩酸・pH 8.8 を含む陽極バッファーとを用いた。サンプルをのせた電気泳動兼転写用チップを４℃において約５分固めた後電気泳動装置に装着した後、装置のバッファー槽に上記バッファーを各 5 ml添加し、定電流 20 mAにおいて３０分間電気泳動を行った。
【００２８】
（１−６．転写）
電気泳動終了後、チップを電気泳動装置から取り出した後、さらにチップから一体形成された転写用積層体および電気泳動ゲルを取り出す。取り出した転写用積層体と電気泳動ゲルとを iBlot Transfer Stacks, Mini（Invitrogen 社製）に装着した後、iBlot Gel Transfer Device（Invitrogen 社製）に装着し、プロトコールに従って定電圧 20 V において６分間通電させてゲルに展開されたサンプルを転写用積層体に転写した。
【００２９】
〔２．結果〕
本発明に係る転写用積層体を含む電気泳動兼転写用チップを用いて、電気泳動および転写を実施した。
【００３０】
ポリアクリルアミドゲルおよび転写用積層体を設置した電気泳動兼転写用積層体を用いて、着色分子量マーカーを試料に供して電気泳動ならびに転写を行った。結果を図５および図６に示す。図５および図６は、電気泳動を行い、さらに転写した後の電気泳動ゲル（図５および図６中（ａ））と転写用積層体（図５および図６中（ｂ））およびiBlot のニトロセルロース膜（図５および図６中（ｃ））を示している。なお、図５は対照実験で、図５中（ｂ）では転写用積層体の代わりに、半透膜を積層していないポリカーボネート膜のみを用いた。
【００３１】
図６で、半透膜を転写用媒体に接着層を介して積層することにより、電気泳動での着色分子量マーカーの移動を損ねることなく、また、転写操作でタンパク質が透過することなく、分離パターンを維持したまま転写用積層体に転写された（図６中（ｂ））。なお、セロファンを積層していないポリカーボネート膜を用いて電気泳動ならびに転写を行うと、着色分子量マーカーは転写用積層体に殆ど吸着せずに透過してしまい（図５中（ｂ））、ｉＢｌｏｔに設置されているニトロセルロース膜に吸着されていた（図５中（ｃ））。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明を用いれば、電気泳動で分離された生体試料を、分離パターンを維持したまま、損失することなく、効率よく、均一に転写することが可能である。また、電気泳動支持体と転写用積層体とを一体形成させることにより、電気泳動による分子の分離から、分離した分子の転写までの工程をより簡便に行うことが可能であり、電気泳動および転写を連続して行い得るような装置に適用することが可能になる。さらに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体高分子の研究をより発展させることによって、特に医学、生物学、化学分野の産業の発展に貢献し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の転写用積層体の構成を示す図である。
【図２】図２は、本発明の、接着層を介した転写用積層体の構成を示す図である。
【図３】図３は、本発明の電気泳動兼転写用積層体の構成を示す図である。
【図４】図４は、本発明の電気泳動兼転写用積層体を備えた電気泳動兼転写用チップの構成を示す図である。
【図５】図５は、対照実験として、電気泳動兼転写用チップを用いてサンプルを電気泳動後に転写した結果を示す図である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態に係る電気泳動兼転写用チップを用いてサンプルを電気泳動後に転写した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００３４】
１  転写用媒体
２  半透膜
３  転写用積層体
４  接着層
５  接着層介在転写用積層体
６  電気泳動ゲル（電気泳動支持体）
７  電気泳動兼転写用積層体
８  電気泳動ゲルカセット
９  電気泳動兼転写用チップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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