(57)【要約】【課題】ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ、ロイコノストック・メセンテロイデス及び、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス、亜種ケフィアグラナムについて、ＰＣＲ検査によって簡便に短時間に検出・識別及び／又は定量するためのＰＣＲプライマーセット、その増幅領域ＤＮＡ、及びこれらを用いた検査方法を提供する。【解決手段】ケフィアグレイン構成乳酸菌のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子塩基配列において、他の菌株にはない検出・識別に最適な領域及びこの領域の増幅用ＰＣＲプライマーセットを設計し、これを用いて検査することで、簡便で短時間に目的の菌株を個別に検出、識別、定量する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１及び２に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット、及び配列番号３に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
【請求項２】
ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号４及び５に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット、及び配列番号６に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
【請求項３】
ケフィアグレイン構成乳酸菌である、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号７及び８に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット、及び配列番号９に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
【請求項４】
ケフィアグレイン構成乳酸菌である、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１０及び１１に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット、及び配列番号１２に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
【請求項５】
ケフィアグレイン構成乳酸菌である、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１３及び１４に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット、及び配列番号１５に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
【請求項６】
ケフィアグレイン構成乳酸菌である、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィアグラナム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１４及び１６に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット、及び配列番号１７に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜６に記載のＰＣＲプライマーセットを少なくとも１種以上含む、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、その亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のうち少なくとも１種以上の乳酸菌の検出・識別及び／又は定量用ＰＣＲ検査キット。
【請求項８】
請求項１〜６に記載のＰＣＲプライマーセットを少なくとも１種以上使用して、検体のＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅することで、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、その亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のうち少なくとも１種以上の乳酸菌を検出・識別及び／又は定量する方法。
【請求項９】
請求項７に記載のＰＣＲ検査キットを使用することを特徴とする、請求項８に記載の乳酸菌を検出・識別及び／又は定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール発酵乳であるケフィアの生産にスターターとして使用されるケフィアグレイン（乳酸菌と酵母の共生体）の構成乳酸菌の検出・識別及び／又は定量に用いるＰＣＲプライマーセット、その増幅領域ＤＮＡ、及びそれらを用いた乳酸菌の簡便な検出・識別及び／又は定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ケフィアは、長寿者の多いことで知られる旧ソビエト連邦のコーカサス地方（現在のグルジア共和国、アルメニア共和国、アゼルバイジャン共和国にまたがる地域）に古くから伝わるアルコール発酵乳であり、ケフィールとも呼ばれている。このケフィアは、一般的な乳酸発酵乳とは異なり、乳酸菌による乳酸醗酵と酵母によるアルコール発酵を同時に進めることにより、独特の風味をもつ発酵乳となる。このケフィアの生産（発酵）には、ケフィアグレインと称されるスターターを使用する。
【０００３】
ケフィアグレインとは、複数の乳酸菌と酵母が共生する共生体であり、ケフィア粒又はケフィア種とも呼ばれている。形状及び色彩は、弾性のある塊であり、乳白色、半透明で、数ミリから数センチの大きさがある。またケフィアグレイン自体は、代々乳に植え継がれることで今日まで伝えられてきている。一般的なケフィアグレインは、１０種類以上もの乳酸菌と酵母で構成されており、これらが複合発酵することで多種類の微生物が有用菌として働き、ケフィアが様々な健康効果をもたらすと考えられている。また、ケフィアグレインはケフィランと呼ばれる粘性多糖類が糊のような役割をして、各乳酸菌と酵母をからめて共生体を構築していると考えられており、このケフィランにも抗腫瘍効果などの様々な有効性が報告されている。
【０００４】
ケフィアグレイン構成乳酸菌としては、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）が主なものとして例示される。この中で、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスはケフィランを産出することから、ケフィアグレインの形成に最も重要な役割がある乳酸菌であるとされている。さらにラクトバシルス・ケフィラノファシエンスは、２つの亜種、ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ケフィアグラナム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）に分類される。
【０００５】
例えば、株式会社不二家で保有するケフィアグレイン（Ｋｅｆｉｒ  ｇｒａｉｎ  Ｆ２０）には、上述の乳酸菌が全て含まれていることが培養検査等で明らかにされている。また、Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５，４９２−５０１（２００８）（非特許文献１）に報告されているケフィアグレインも、これに近い乳酸菌の構成となっている。
【０００６】
しかし、近年ケフィアが世界各国へ広がったことや、ケフィアが発酵するごとに菌叢が変化していくことなどから、現在では産地等の条件により含まれる菌の種類、数、バランスが大きく異なってきている。中には、ケフィアには元来含まれない菌を含んでいたり、上述の有用な乳酸菌の一部あるいは全部を含んでいない、というものも見受けられる。したがって、ケフィアやケフィア製造の際に使用するケフィアグレインなどに、上述の有用乳酸菌が確実に一定の菌数含まれていることを検査等により確認することが非常に重要である。
【０００７】
ケフィアグレイン構成乳酸菌の検査を行う場合、これまでの技術では、例えばラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの培養には特別な培地を必要とするのに加え、この培地を使用しても単菌培養自体の難しさがあり、コロニーが出現するまで１〜２週間と長期間を要していた（特許文献１）。そのため、多種の乳酸菌が含まれるケフィアやケフィアグレインなどから、特定のケフィアグレイン構成乳酸菌の検出や、得られた乳酸菌の菌株の識別、菌数の定量などを短時間で簡便に行うことは非常に困難であり、品質管理上などでの問題が生じていた。
【０００８】
近年、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列のＰＣＲ検査によって、ロイコノストック属の検出を行う簡便な検査法が報告されている（特許文献２）。しかし、この検出方法では、例えばラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの２つの亜種については１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が１００％一致するため、これら２つの亜種を識別することはできない。つまり、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は近縁の菌種間での配列保存領域が極めて多く、この同定方法では属などの識別は可能であっても、近縁種や亜種の識別は困難であると考えられる。
【０００９】
また、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子よりも配列多型が多いＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）の配列について、多くの細菌の遺伝子配列の急速な蓄積が行われており、この配列を利用した細菌同定法も報告されている（特許文献３、４）。しかし、特許文献３で開示の方法は、ｇｙｒＢ配列中の細菌種間で保存性の高い配列を利用しているため、特定の菌株の識別には適さない。また、特許文献４に開示の方法は、ビール混濁性に関与するラクトバシルス・ブレビスの菌株に関する方法であるが、ＰＣＲ増幅産物をさらに制限酵素処理してビール混濁性の基準株との制限酵素切断パターンを比較することでその菌株のビール混濁性を判断するのみであり、菌株の同定までを行うものではない。
【００１０】
特に、ケフィアグレイン構成乳酸菌は上述の培養の特殊性、困難性などから、簡便で検査時間が短時間ですむ検出・識別及び定量法の開発が望まれているが、上述のような従来技術ではこの課題を解決することはできなかった。
【特許文献１】特開昭６１−２５７１９７号公報
【特許文献２】特開２００３−２５５号公報
【特許文献３】特開平７−２１３２９９号公報
【特許文献４】特開２００３−２５０５５７号公報
【非特許文献１】Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５，４９２−５０１（２００８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ、ロイコノストック・メセンテロイデス及び、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス、亜種ケフィアグラナムについて、ＰＣＲ検査によって簡便に短時間に検出・識別及び／又は定量するためのＰＣＲプライマーセット、その増幅領域ＤＮＡ、及びこれらを用いた検査方法の提供を目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、上述のケフィアグレイン構成乳酸菌のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）に着目し、この遺伝子配列と他の乳酸菌の配列を比較・解析して、この遺伝子配列中の他の菌株にはない検出・識別に最適な領域及びこの領域の増幅用ＰＣＲプライマーセットを設計し、これを検査に用いることで、目的の菌の検出・識別及び定量が可能であることを見出し、本発明に至った。
【００１３】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１及び２に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号１）とＲ−プライマー（配列番号２）のセット）、及び配列番号３に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（２）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号４及び５に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号４）とＲ−プライマー（配列番号５）のセット）、及び配列番号６に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（３）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号７及び８に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号７）とＲ−プライマー（配列番号８）のセット）、及び配列番号９に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（４）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１０及び１１に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号１０）とＲ−プライマー（配列番号１１）のセット）、及び配列番号１２に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（５）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１３及び１４に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号１３）とＲ−プライマー（配列番号１４）のセット）、及び配列番号１５に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（６）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィアグラナム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１４及び１６に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号１６）とＲ−プライマー（配列番号１４）のセット）、及び配列番号１７に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（７）（１）〜（６）に記載のＰＣＲプライマーセット（ＰＣＲ用のＦ−プライマーとＲ−プライマーのセット）を少なくとも１種以上含む、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、その亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のうち少なくとも１種以上の乳酸菌の検出・識別及び／又は定量用ＰＣＲ検査キット。
（８）（１）〜（６）に記載のＰＣＲプライマーセット（ＰＣＲ用のＦ−プライマーとＲ−プライマーのセット）を少なくとも１種以上使用して、検体のＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅することで、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、その亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のうち少なくとも１種以上の乳酸菌を検出・識別及び／又は定量する方法。
（９）（７）に記載のＰＣＲ検査キットを使用することを特徴とする、（８）に記載の乳酸菌を検出・識別及び／又は定量する方法。
【００１４】
つまり、本発明においては、配列番号１〜１７及び図１、図２で示される、各乳酸菌株が固有に持つｇｙｒＢ部分塩基配列及びこれらを特異的に増幅するＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマーとＲ−プライマーのセット）、このプライマーセットを１種以上含むＰＣＲ検査キット、及びこれらを使用した乳酸菌のＰＣＲ検査方法を提供している。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ケフィアグレイン構成乳酸菌であるラクトバシルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ、ロイコノストック・メセンテロイデス及び、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス、亜種ケフィアグラナムについて、ＰＣＲ検査によって直接、簡便に短時間に検出・識別することが可能となる。また、これらのプライマーセットをリアルタイムＰＣＲ検査に用いることで目的菌株の定量も行うことができ、検出・識別だけでなく、菌数確認、菌数管理などが可能であるため、上記乳酸菌の品質管理等に非常に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明では、まずケフィアグレイン構成乳酸菌の中で、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ、ロイコノストック・メセンテロイデス及び、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス、亜種ケフィアグラナムを検出・識別標的菌株とした。
【００１７】
そして、これらの菌株のＰＣＲ検査での検出・識別のため、配列多型が多いｇｙｒＢ遺伝子に着目し、公共の遺伝子配列データベースを解析した。しかし、データベースに蓄積されていたのはロイコノストック・メセンテロイデスのｇｙｒＢ遺伝子配列のみであったため、ＰＣＲ法を利用して他の菌株のｇｙｒＢ遺伝子を全て取得し、全長塩基配列を決定した。
【００１８】
これらのｇｙｒＢ遺伝子配列情報と、近縁種でありｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列が公知である様々な乳酸菌の配列情報を比較して、上述のケフィアを構成する乳酸菌株を検出・識別するのに最適であると思われる増幅領域ＤＮＡ、及びこの領域のみを増幅するＰＣＲプライマーセットを設計した。これらの設計に際しては、通常のＰＣＲ検査に適用可能な領域及びプライマーであること、目的の菌株の目的領域のみを増幅、検出し、他の菌株では増幅反応を行わないプライマーであること、増幅後のＤＮＡ（ＰＣＲ産物）について制限酵素処理やシークエンス等の特別な操作を必要としない増幅領域であること、定量検査として有効なリアルタイムＰＣＲ検査にも適用可能な１００ｂｐ前後の長さの増幅領域であること、などを主な設計基準とした。
【００１９】
上記手法により設計されたのが、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスについては配列番号１で示されるＦ−プライマー、配列番号２で示されるＲ−プライマー、配列番号３で示される増幅領域ＤＮＡ（９８ｂｐ）、ラクトバシルス・ケフィーリについては配列番号４で示されるＦ−プライマー、配列番号５で示されるＲ−プライマー、配列番号６で示される増幅領域ＤＮＡ（１１７ｂｐ）、ラクトバシルス・パラケフィーリについては配列番号７で示されるＦ−プライマー、配列番号８で示されるＲ−プライマー、配列番号９で示される増幅領域ＤＮＡ（１１８ｂｐ）、ロイコノストック・メセンテロイデスについては配列番号１０で示されるＦ−プライマー、配列番号１１で示されるＲ−プライマー、配列番号１２で示される増幅領域ＤＮＡ（１４９ｂｐ）、亜種ケフィラノファシエンスについては配列番号１３で示されるＦ−プライマー、配列番号１４で示されるＲ−プライマー、配列番号１５で示される増幅領域ＤＮＡ（１２１ｂｐ）、亜種ケフィアグラナムについては配列番号１６で示されるＦ−プライマー、配列番号１４で示されるＲ−プライマー（亜種ケフィラノファシエンスのＲ−プライマーと同一）、配列番号１７で示される増幅領域ＤＮＡ（１２４ｂｐ）である。これらは図１、図２にも示されている。
【００２０】
ＰＣＲ検査の検体としては、乳酸菌培養液、ケフィア、ケフィアグレインなどから定法により調製したＤＮＡを用いることができるほか、乳酸菌培養液、ケフィア、ケフィアグレインなどをそのまま検体として使用することも可能である。また、ケフィア以外の加工食品等から定法により調製したＤＮＡや、その加工食品等をそのまま検体として用いることも可能であり、その加工食品等の中の上記乳酸菌の有無の検出等にも利用可能である。
【００２１】
ＰＣＲ検査としては、定法のＰＣＲ試薬及びＰＣＲ検査機器を使用することができる。また、標的となる増幅領域ＤＮＡが短いためリアルタイムＰＣＲ法にも適用が可能であり、これらで通常用いられる試薬及び検査機器も使用することができる。反応条件についても定法を用いることができ、例えば、通常のＰＣＲ反応において、９５℃１０分の熱変性反応後、９５℃１５秒−６５℃１分の２ステップを３０サイクル反応し、最後に６５℃１０分伸長反応を行った後低温でホールドする条件などを用いることができる。この反応条件は、検体などの特性等により温度、時間を適宜増減させてもよく、反応サイクル数も適宜増減させてよい。例えば、ラクトバシルス・ケフィーリ及びラクトバシルス・パラケフィーリ増幅反応について、９５℃１５秒−６８℃１分の２ステップを３０サイクル反応し、最後に６８℃１０分伸長反応を行う条件としてもよく、亜種ケフィラノファシエンス増幅反応について、９６℃１５秒−７２℃３０秒の２ステップを２５サイクル反応し、最後に７２℃１０分伸長反応を行う条件としてもよく、亜種ケフィアグラナム増幅反応について、９６℃１５秒−７０℃３０秒の２ステップを２５サイクル反応し、最後に７０℃１０分伸長反応を行う条件としてもよい。このＰＣＲ反応条件の調整は、ＰＣＲに関する基本的な知識を有していれば、検体等に応じてすることは容易に行えるため、特に限定されるものではない。
【００２２】
また、ＰＣＲ検査に際して、ＰＣＲ反応に使用するＰＣＲ試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、単体のデオキシリボヌクレオチドミックス、バッファー、ＭｇＣｌ２溶液等）の一部又は全部と上述のＰＣＲプライマーセットを１種含んだＰＣＲ検査キットとして使用することができる。増幅領域のサイズが異なるものや、蛍光ラベル標識等の条件があえば、２種以上のＰＣＲプライマーセットを含むＰＣＲ検査キットを使用して、同時に複数菌種の検査をすることも可能である。
【００２３】
ＰＣＲ検査によって得られた増幅産物は、定法のＰＣＲ産物を確認する方法で行うことができる。例えば、通常のＰＣＲ法での増幅産物については、アガロースゲル等にＰＣＲ反応サンプル及び所定のサイズマーカーをアプライして一定時間ゲル電気泳動を行い、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド等の染色液で染色した後、ＵＶ照射などで増幅の有無及び断片サイズを確認することができる。なお、本発明のプライマーセットは菌種に特異的に反応するため、ＰＣＲ検査によって得られた増幅産物の制限酵素処理やシークエンス等の特別な確認操作は必要なく、これらを行うことはない。また、リアルタイムＰＣＲについては、通常は検査機器に常時検査結果（定量データ）が示されるため、ＰＣＲ反応後の増幅産物の確認操作自体を必要としない。
【００２４】
これらのＰＣＲプライマーセットによりＰＣＲ産物が確認された検体には、該プライマーセットが特異的に検出する菌株が存在していることがわかり、リアルタイムＰＣＲ検査によれば当該菌数の確認も可能である。また、分離培養等によって得られた特定の乳酸菌についても、これらのプライマーセットを用いて検査することにより菌株を識別することができる。これらの検査に要する時間は数時間であり、長くとも検査開始から６時間以内には検査結果が判明する。これにより、複数の乳酸菌で構成されるケフィア、ケフィアグレインから、培養検査と比較して、非常に短時間で直接的に簡便に上述の菌株を個別に検出、識別、定量することができる。また、ケフィア以外の加工食品等の検体についても、上述の菌株の含有の判別が即座に可能となり、発酵乳等の食品の品質管理など産業上非常に有効である。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１：ＰＣＲ検査に用いる検体ゲノムＤＮＡの調製）
検査に用いた検出・識別標的菌株（８株）及び標的菌株以外の乳酸菌（７株）については表１に示した。菌株名に記載されるＪＣＭおよびＮＢＲＣは、菌株分譲機関を示している。菌株名にＪＣＭと記載されているものは、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室より入手し、菌株名にＮＢＲＣと記載されているものは、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門から入手した。また、菌株名の最後に「Ｔ」とつくものは、Ｔｙｐｅ  Ｓｔｒａｉｎ（基準株）であることを示している。
【００２７】
【表１】
2010081889.tif 000002
【００２８】
これら１５株の菌よりゲノムＤＮＡを調製した。方法は、５ｍｌのＭＲＳ液体培地（ＯＸＯＩＤ社製品）に各供試菌を植菌し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製品）を用いて嫌気条件下３０℃で２〜１０日間培養を行った。充分培養がされたところで、これらの培養液２ｍｌからＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製品）を用いて抽出したものを各菌のＤＮＡ溶液として使用した。
【００２９】
（実施例２：ＰＣＲプライマーの設計及び作製）
検出・識別標的菌株のｇｙｒＢ遺伝子配列情報とｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列が公知である様々な乳酸菌の配列情報を比較し、通常のＰＣＲ検査に適用可能な領域及びプライマーであること、目的の菌株の目的領域のみを増幅、検出し、目的の菌株の他の領域や他の菌株では増幅反応を行わないプライマーであること、増幅後のＤＮＡについて特別な操作を必要としないこと、リアルタイムＰＣＲ検査にも適用可能な１００ｂｐ前後の長さの増幅領域であることを設計基準として、各標的菌株の特異的プライマーセット（図１）及び増幅領域（図２）を設計した。
上述の設計した各菌株を特異的に検出するためのプライマーは、全て定法に従い、単体のデオキシリボヌクレオチドからＤＮＡ合成を行って作製した。
【００３０】
（実施例３：ＰＣＲ反応液の調製及びＰＣＲ増幅反応）
各プライマーセットにつき、表２及び表３に示す組成でＰＣＲ反応液を調製した。
【００３１】
【表２】
2010081889.tif 000003
【００３２】
【表３】
2010081889.tif 000004
【００３３】
ＰＣＲ増幅反応はＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品）を用いて、各プライマーセットにつき以下の条件で行った。
【００３４】
ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス及びロイコノストック・メセンテロイデス検出用プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅反応は、９５℃１０分間熱変性後、９５℃１５秒−６５℃１分の２ステップを３０サイクル反応し、最後に６５℃１０分間伸長反応を行った後低温でホールドした。
【００３５】
ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ検出用プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅反応は、９５℃１０分間熱変性後、９５℃１５秒−６８℃１分の２ステップを３０サイクル反応し、最後に６８℃１０分間伸長反応を行った後低温でホールドした。
【００３６】
ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス検出用プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅反応は、９５℃１０分間熱変性後、９６℃１５秒−７２℃３０秒の２ステップを２５サイクル反応し、最後に７２℃１０分間伸長反応を行った後低温でホールドした。
【００３７】
ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム検出用プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅反応は、９５℃１０分間熱変性後、９６℃１５秒−７０℃３０秒の２ステップを２５サイクル反応し、最後に７０℃１０分間伸長反応を行った後低温でホールドした。
【００３８】
ＰＣＲ増幅産物の検出はゲル電気泳動によって行った。各ＰＣＲ増幅反応後の反応液に６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ（ニッポンジーン社製品）２μｌを加え撹拌した後、６μｌを１×ＴＡＥ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて作製した３．５％のＮｕＳｉｅｖｅ  ３：１  Ａｇａｒｏｓｅゲル（Ｌｏｎｚａ社製品）にアプライした。またＤＮＡサイズマーカーには５０ｂｐ  ＤＮＡ  ラダー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）を使用した。ＤＮＡのバンドは、エチジウムブロマイド溶液で約２０分間染色後、紫外線照射して確認した。
【００３９】
各プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅産物の確認結果（電気泳動写真）を図３〜８に示す。また、各ＰＣＲ増幅結果を一覧としてまとめたものを図９に示す。
【００４０】
各図から明らかなように、本発明において設計した全てのプライマーセットは、いずれも標的とする乳酸菌株から調製したゲノムＤＮＡを検体としたときのみにＰＣＲ増幅産物が確認され、標的としていない乳酸菌株から調製したゲノムＤＮＡを検体としたときには全くＰＣＲ増幅産物が確認されなかった。特に、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種特異的プライマーセットは、それぞれ標的外の亜種を検体としたときにＰＣＲ増幅産物が確認されず、各亜種を的確に検出、識別することができた。
【００４１】
（実施例４：ケフィアグレインを検体としたＰＣＲ増幅反応）
株式会社不二家で保有しているケフィアグレイン（Ｋｅｆｉｒ  ｇｒａｉｎ  Ｆ２０）２０ｍｇから、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製品）を用いて抽出したものをＤＮＡ溶液として使用し、各プライマーセットにつき表２及び表３に示す組成でＰＣＲ反応液を調製した。これを、各プライマーセットについて実施例３と同じ条件でＰＣＲ増幅反応を行い、同じ条件でゲル電気泳動によってＰＣＲ増幅産物を確認した。
【００４２】
ＰＣＲ増幅産物の確認結果（電気泳動写真）を図１０に示す。図から明らかなように、各レーンにはそれぞれのプライマーセットの増幅領域ＤＮＡのサイズ位置に唯一のバンドが見られる。このことから、本発明において設計した全てのプライマーセットは、複数の乳酸菌種が混在しているケフィアグレインから調製したゲノムＤＮＡを検体としても、プライマーセットの標的菌株のみを確実に増幅できることが確認された。
【００４３】
したがって、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行うことで、検体中に含まれる標的のケフィアグレイン構成乳酸菌を簡便に短時間で個別に検出、識別できることが証明された。また、本発明のプライマーセットは蛍光標識等を行ってリアルタイムＰＣＲ検査に使用することも可能であるため、これらのプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ検査を行い、標的菌株の検体中の菌数を短時間で測定することも可能であることが明らかとなった。
【００４４】
本発明は要すれば、次の通りである。
本発明は、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ、ロイコノストック・メセンテロイデス及び、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス、亜種ケフィアグラナムのすくなくともひとつについて、ＰＣＲ検査によって簡便に短時間に検出・識別及び／又は定量するために使用することを特徴とする、各配列番号に示される塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット、その増幅領域ＤＮＡ、及びこれらを用いた検査方法に関するものである。
本発明によれば、ケフィアグレイン構成乳酸菌のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子塩基配列において、他の菌株にはない検出・識別に最適な領域及びこの領域の増幅用ＰＣＲプライマーセットを設計し、これを用いて検査することにより、簡便で短時間に目的の菌株を個別に検出、識別、定量することがはじめて可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ケフィアグレインを構成する各乳酸菌検出用プライマーセットの塩基配列。
【図２】ケフィアグレインを構成する各乳酸菌検出に用いるプライマーセットでの増幅領域ＤＮＡである、ジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）部分塩基配列。
【図３】ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス種特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真（図面代用写真）。
【図４】ラクトバシルス・ケフィーリ特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真（図面代用写真）。
【図５】ラクトバシルス・パラケフィーリ特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真（図面代用写真）。
【図６】ロイコノストック・メセンテロイデス特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真（図面代用写真）。
【図７】亜種ケフィラノファシエンス特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真（図面代用写真）。
【図８】亜種ケフィアグラナム特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真（図面代用写真）。
【図９】実施例３での各種プライマーセットによるＰＣＲ増幅結果一覧。
【図１０】実施例４でのＫｅｆｉｒ  ｇｒａｉｎ  Ｆ２０を検体としたときの各特異的プライマーセットでのＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真（図面代用写真）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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