(57)【要約】【課題】細胞内細菌性感染もしくは寄生生物性感染、またはウイルスのような感染因子に起因する疾患（例えば、肝炎）を処置または予防するための治療剤を提供する。【解決手段】本発明は、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を投与する工程、そしてさらに抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果免疫応答が生成される工程を包含する、細胞内感染を処置するための方法が提供される。【選択図】図１３
2010116417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬の製造に使用するための、細胞内病原体から得られた抗原の少なくとも１つの免疫原性部分をコードするポリヌクレオチドを含むベクター構築物の使用であって、該医薬は、該抗原の少なくとも１つの該免疫原性部分を含むタンパク質を有するプライミング剤として使用するための医薬であり、該ベクター構築物は、追加免疫剤として使用されて、該細胞内病原体に対する免疫応答を誘発し、該ベクター構築物含有医薬は、複数回投与され、そのような投与の各々は、前回の投与から数週間の間隔をおかれる、使用。
【請求項２】
医薬の製造に使用するための、細胞内病原体から得られた抗原の少なくとも１つの免疫原性部分を含むタンパク質の使用であって、該医薬は、該抗原の少なくとも１つの該免疫原性部分をコードするポリヌクレオチドを有する追加免疫剤として使用するための医薬であり、該タンパク質は、プライミング剤として使用されて、該細胞内病原体に対する免疫応答を誘発し、該ベクター構築物含有医薬は、複数回投与され、そのような投与の各々は、前回の投与から数週間の間隔をおかれる、使用。
【請求項３】
前記細胞内病原体がウイルスであり、そして前記抗原がウイルス抗原である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記ウイルス抗原が、肝炎、ネコ免疫不全ウイルス、およびHIVからなる群から選択されるウイルスから得られる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記細胞内病原体が寄生生物である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項６】
前記ベクター構築物が、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびパルボウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ベクター構築物が、ＤＮＡベクター、および真核生物層化ベクター開始系からなる群から選択される核酸発現ベクターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
追加免疫剤としての細胞内病原体から得られた抗原の少なくとも１つの免疫原性部分を含むタンパク質とともに、プライマーとして使用するための組成物であって、該組成物は、該抗原の該免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物、および薬学的受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、組成物。
【請求項９】
免疫調節補因子をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞内病原体がウイルスであり、そして前記抗原がウイルス抗原である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ウイルス抗原が、肝炎、ネコ免疫不全ウイルス、およびHIVからなる群より選択されるウイルスから得られる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原が、Ｂ型肝炎抗原である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｂ型肝炎抗原が、HBeAg、HBcAg、およびHBsAgからなる群より選択される請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原がＣ型肝炎抗原である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｃ型抗原は、コア抗原Ｃ、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4、およびNS5からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞内病原体が寄生生物である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ベクター構築物が、組換えレトロウイルスによって運ばれる、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、広範な種々の細胞内疾患（例えば、ウイルス疾患、寄生生物疾患、および特定の細菌性疾患を含む）を処置するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
現代医学の出現によって、多くの疾患が、今や、広範な種々の医薬で処置され得る。それにもかかわらず、感染性疾患は、発展途上国において、免疫システムが損なわれた個体において、そして適切な処置がない特定の疾患について深刻な関心事である。
【０００３】
発展途上国において、不十分な衛生および適切な衛生設備の欠如は、感染性疾患を促進する環境を提供する。適切な衛生設備を有する国でさえ、感染性因子の定常的な猛威が、標準以下のレベルまで免疫系防御にストレスをかけ得、従って、これは疾患の進展を可能にし得る。
【０００４】
これらの疾患のいくつかに対して防御するために、ワクチンは利用可能であるけれど、ワクチン接種は、感染後におけるあまりにも遅い時期における送達またはワクチンに対して免疫応答を増大させる患者の不能のような因子に起因して常に適しているわけではない。このような疾患の１つは、肝炎（これは、主に肝臓に影響する全身的な疾患である）である。簡略には、この疾患は、最初の症状の発症（例えば、食欲不振、悪心、嘔吐、疲労、倦怠、関節痛、筋肉痛、および頭痛）、続く黄疸の発症によって分類される。この疾患はまた、アミノトランスフェラーゼASTおよびALTの上昇した血清レベルによって特徴づけられ得る。血清におけるこれらの酵素の定量は、肝臓損傷の程度を示す。
【０００５】
肝炎に関連するウイルス因子の５つの一般的な分類が存在する：Ａ型肝炎ウイルス（HAV）；Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）；２つの型の非Ａ非Ｂ（NANB）因子、一方は血液媒介性（Ｃ型肝炎）および他方は腸伝播性（Ｅ型肝炎）；ならびにHBV関連デルタ因子（Ｄ型肝炎）。
【０００６】
肝炎の２つの一般的な臨床的分類（急性肝炎および慢性肝炎）が存在する。急性肝炎の症状は無症候性かつ非顕在性のものから胎児感染のものにまでに及ぶ。この疾患は、無症状性かつ持続性であり得るか、または肝硬変を有する慢性の肝疾患まで、いくつかの場合では、肝臓癌まで迅速に進行する。アメリカ合衆国における成人白人の急性Ｂ型肝炎感染は、約５％〜10％の場合で慢性Ｂ型肝炎まで進行する。残りの場合では、約65％が無症状性である。極東の場合において、感染は、通常、出生時であり、そして50％〜90％は慢性状態に進行する。進行の異なる割合は、宿主の遺伝的差異よりもむしろ感染年齢に関連するようである。アメリカ合衆国において、ハイリスクの群（例えば、内科医、薬物常用者、および腎臓透析患者）におけるより高い割合を伴って、人口の約0.2％が慢性的に感染している。台湾、香港、およびシンガポールのような国では、人口における肝炎感染を有するレベルは、10％程度の高さであり得る。
【０００７】
アメリカ合衆国において、慢性肝炎を有する患者の約20％が肝不全で死亡し、そしてさらに５％がＢ型肝炎に関連する癌を発症する。極東の場合において、人口の大きな割合がHBVに感染し、そして長期の慢性感染（20〜40年）後、これらの約25％が、肝細胞癌を発症する。
【０００８】
Ａ型肝炎およびＢ型肝炎の両方についての血清学的試験の開発の後、研究者らは、肝炎様症状を有し、そして感染性疾患と一致するインキュベーション期間および伝播様式を有するが、Ａ型肝炎感染またはＢ型肝炎感染の血清学的証拠を有さない他の患者を同定した。ほぼ15年後、原因因子がRNAウイルスとして同定された。このウイルス（「Ｃ型肝炎」と命名された）は、HBV、レトロウイルス、または他の肝炎ウイルスとのホモロジーを有さない。
【０００９】
Ｃ型肝炎（HCV）は、世界中で、輸血後および散発性非Ａ非Ｂ（NANB）型肝炎の主な原因であるようであり、そして慢性肝臓疾患の発症に主な役割をはたす。これは、肝細胞癌（非特許文献１、非特許文献２）を含む。毎年、輸血を受けた３百万人の内、約150,000人が急性Ｃ型肝炎を発症する（非特許文献３）。さらに、急性Ｃ型肝炎を発症する人の内、少なくとも半分が慢性Ｃ型肝炎を発症する。
【００１０】
最近まで、治療が、急性Ｂ型肝炎もしくは慢性Ｂ型肝炎または急性Ｃ型肝炎もしくは慢性Ｃ型肝炎の処置に有効であると判明せず、そして肝炎に感染した患者は、一般に、その疾患に対してその治療単位を行わなけれなばならない。ほとんどの抗ウイルス薬物（例えば、アシクロビル）ならびにコルチコステロイドの使用を介する免疫系を増強する試みは、効果的でないことが判明している（非特許文献４）。いくらかの抗ウイルス活性は、アデノシンアラビノシドで観察されている（非特許文献５）が、この薬物と関連する毒性の副作用がこのような処置を容認し難いものにしている。
【００１１】
慢性Ｂ型肝炎感染および慢性Ｃ型肝炎感染に対していくらかの利益を提供した１つの処置は、組換えαインターフェロンの使用である（非特許文献６;非特許文献７）。しかし、Ｂ型肝炎感染を有する患者について、被感染者の約35％のみがこのような処置に反応し、そして出生時感染において約10％のみが処置に応答した。Ｃ型肝炎感染について、このような治療を利用する明らかな短期間の成功にもかかわらず、処置の終結の６ヶ月後で、治療に応答した患者の半分が再発した。さらに、αインターフェロン治療に伴うさらなる困難さは、この成分が、しばしば、感受性の患者に対して低減した薬用量を必要とする毒性の副作用（例えば、悪心および流感様症状）を有することである。
【００１２】
従って、当該分野で、細胞内細菌性感染もしくは寄生生物性感染、またはウイルスのような感染因子に起因する疾患（例えば、肝炎）を処置または予防するための治療剤に対する必要性が存在する。本発明は、このような治療剤を提供し、そして他の関連する利点をさらに提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Kuoら、Science  244:362-364,  1989
【非特許文献２】Chooら、British  Medical  Bulletin  46(2):423-441,  1990
【非特許文献３】Davisら、New  Eng.  J.  Med.  321(22):1501-1506,  1989
【非特許文献４】Alter,  「Viral  hepatitis  and  liver  disease」,  Zuckerman（編）、New  York:  Alan  R.  Liss,  537〜42頁、1988
【非特許文献５】Jacynaら、British  Med.  Bull.  46：368-382、1990
【非特許文献６】Davisら、New  Eng.  J.  Med.  321(22):1501-1506,  1989
【非特許文献７】Perrilloら、New  Eng.  J.  Med.  323:295-301,  1990
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
簡略にいうと、本発明は、細胞内細菌性感染、寄生生物性感染、ウイルス性感染を処置する方法に関する。このような細胞内感染の代表的な例には、細菌感染（例えば、レジオネラ、結核、およびクラジミア感染症）、寄生生物性感染（例えば、リッケチア、リーシュマニア、またはマラリア）、ならびにHBV、HCV、HSV、HIV、およびFIVのようなウイルス感染が挙げられる。
【００１５】
本発明の１つの局面において、温血動物内の細胞内感染を処置するための方法が提供される。この方法は、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程、そしてさらに抗原上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果免疫応答が生成される、工程を包含する。特定の実施態様において、免疫調節補因子もまた投与され得る。さらに、以下により詳細に議論されるように、タンパク質はベクター構築物の投与の前に、同時に、またはその後のいずれかで投与され得る。
【００１６】
本発明の特定の実施態様において、細胞内病原体はウイルスであり、そして抗原はウイルス抗原である。ウイルス抗原の代表的な例は、肝炎、ネコ免疫不全ウイルス、およびHIVからなる群から選択されるウイルスから得られるウイルス抗原を含む。特定の実施態様において、抗原はＢ型肝炎抗原（例えば、HBeAg、HBcAg、およびHBsAg（例えば、Ｓ、プレ-S1、またはプレ-S2））、ORF5、ORF6、HBV  pol抗原）、またはＣ型肝炎抗原（例えば、コア抗原Ｃ、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4、およびNS5）である。関連する実施態様において、いくつかの抗原が、組み合わせられ得る（例えば、HBeAgおよびHBcAg）。他の実施態様において、細胞内病原体は寄生生物である。
【００１７】
本発明の関連する局面において、ポリタンパク質抗原の免疫原性部分の発現を指向するか、またはこの抗原を免疫調節補因子と共に同時発現するベクター構築物が提供される。さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤との組み合わせでこれらの組換えウイルスを含む薬学的組成物が提供される。
【００１８】
さらなる実施態様において、ベクター構築物は、組換えレトロウイルス、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはパルボウイルスによって運ばれる。あるいは、ベクター構築物は、核酸発現ベクター（例えば、DNAベクターまたは真核生物層化ベクター開始系（eukaryotic  layered  vector  initiation  system））であり得る。ベクター構築物、または関連する免疫原性部分をコードする核酸は、例えば、トランスフェクション法（例えば、リポフェクション、直接DNA注入、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、リポソーム、CaPO4、もしくはDNAリガンド）によって直接的に、または間接的に（例えば、細胞の選択された集団へのエクソビボ）患者に投与され得る。
【００１９】
本発明はまた、組成物（例えば、種々のアジュバントを含む）を提供する。１つの局面において、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物、上記抗原の免疫原性部分を含むタンパク質、および必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物が提供される。特定の実施態様において、このような組成物は、免疫調節補因子をさらに含み得る。上記のように、細胞内病原体は、例えば、ウイルス、寄生生物、細菌であり得る。ウイルス抗原の代表的な例は、肝炎、ネコ免疫不全ウイルス、およびHIVからなる群から選択されるウイルスから得られるウイルス抗原を含む。特定の実施態様において、抗原はＢ型肝炎抗原（例えば、HBeAg、HBcAg、およびHBsAg）またはＣ型肝炎抗原（例えば、コア抗原Ｃ、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4、およびNS5）である。
【００２０】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面への参照において明らかである。
【００２１】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
１．温血動物内の細胞内感染を処置するための方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程；および
（ｂ）該抗原の該免疫原性部分を含むタンパク質を該温血動物に投与し、その結果免疫応答が生成される工程、
を包含する、方法。
２．免疫調節補因子を投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
３．上記タンパク質が、上記ベクター構築物の投与の前に投与される、項目１に記載の方法。
４．上記細胞内病原体が、ウイルスであり、そして上記抗原がウイルス抗原である、項目１に記載の方法。
５．上記ウイルス抗原が、肝炎、ネコ免疫不全ウイルス、およびHIVからなる群より選択されるウイルスから得られる、項目３に記載の方法。
６．上記抗原が、Ｂ型肝炎抗原である、項目５に記載の方法。
７．上記Ｂ型肝炎抗原が、HBeAg、HBcAg、およびHBsAgからなる群より選択される、項目６に記載の方法。
８．上記抗原がＣ型肝炎抗原である、項目５に記載の方法。
９．上記Ｃ型抗原が、コア抗原Ｃ、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4、およびNS5からなる群より選択される、項目８に記載の方法。
１０．上記細胞内病原体が、寄生生物である、項目１に記載の方法。
１１．上記ベクター構築物が、組換えレトロウイルスによって運ばれる、項目１に記載の方法。
１２．上記ベクター構築物が、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルス、および、パルボウイルスからなる群より選択される組換えウイルスによって運ばれる、項目１に記載の方法。
１３．上記ベクター構築物が、核酸発現ベクター、または真核生物層化ベクター開始系である、項目１に記載の方法。
１４．細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物、該抗原の該免疫原性部分を含むタンパク質、および薬学的受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、組成物。
１５．免疫調節補因子をさらに含む、項目１４に記載の組成物。
１６．上記細胞内病原体がウイルスであり、そして上記抗原がウイルス抗原である、項目１４に記載の組成物。
１７．上記ウイルス抗原が、肝炎、ネコ免疫不全ウイルス、およびHIVからなる群より選択されるウイルスから得られる、項目１６に記載の組成物。
１８．上記抗原が、Ｂ型肝炎抗原である、項目１６に記載の組成物。
１９．上記Ｂ型肝炎抗原が、HBeAg、HBcAg、およびHBsAgからなる群より選択される項目１８に記載の組成物。
２０．上記抗原がＣ型肝炎抗原である、項目１６に記載の組成物。
２１．上記Ｃ型抗原は、コア抗原Ｃ、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4、およびNS5からなる群より選択される、項目２０に記載の組成物。
２２．上記細胞内病原体が寄生性物である、項目１４に記載の組成物。
２３．上記ベクター構築物が、組換えレトロウイルスによって運ばれる、項目１に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ATCC  45020からのＢ型肝炎配列の回収を概説する概略図である。
【図２】図２は、HBV（adw）プレコア／コアのヌクレオチド配列（配列番号56）およびpAM6（ATCC  95020）クローン由来の不正確な配列（配列番号57）の領域のヌクレオチド配列の図表である。
【図３】図３は、pAM6（ATCC  45020）由来のHBプレコア／コア配列における変異を訂正するために利用したプロトコールの概略図である。
【図４】図４は、SK+HBe-c由来の訂正されたヌクレオチド配列を示す、DNA配列決定ゲルである。
【図５】図５は、以下のレトロウイルスで形質導入したマウス細胞株、BC10Me、B1/6,  L-M(TK-)、EA2Kb、およびレトロウイルスで形質導入したヒトＴ細胞株JA2/Kb由来のHBVeタンパク質およびHBVコアタンパク質のELISAで決定した発現のレベルを示す表である。
【図６】図６は、レトロウイルスで形質導入したBC10MEおよびB1/6細胞によって分泌されたp17kD  HBV  e  タンパク質およびp23kDプレコア中間体タンパク質の免疫沈降／発現を示すウェスタンブロットである。このブロットはまた、レトロウイルスで形質導入したBC10ME細胞由来の細胞溶解物におけるp21  HBVコアタンパク質の発現を示す。
【図７】図７は、処方したHB  Fコア/neoRベクターを注射したC3H  He  CRマウスにおけるHBVコア抗原に対する抗体応答の誘導を示す表である。
【図８】図８は、HBVコアおよびB7タンパク質の両方を発現するベクター構築物KT-HBVコア/B7の模式図である。
【図９】図９は、HBVコア処方HB  Fコア/neoRベクターのi.m.投与後のC3H  HeマウスにおけるHBVコア抗原およびHBV  e  抗原に対するCTL応答の誘導を示すグラフである。
【図１０】図10は、C3H/He  CRマウスにおけるHBVコア抗原に対するCTL応答がMHCクラスＩ制限性であることを示すグラフである。
【図１１】図11（パネルＡおよびパネルＢ）は、C3H/He  CRマウスにおけるHBVコア抗原に対するCTL応答がCD4-CD8+細胞であることを示す１対のグラフである。
【図１２】図12は、処方したHB  Fコア/neoRベクターを注射したC3H/He  CRマウスにおけるHBVコア抗原およびHBV  e抗原に対する抗体応答のイソ型を示す表である。
【図１３】図13は、処方したHB  Fコア/neoRベクターの筋肉内注射後のアカゲザルマカクにおけるHBVコア抗原およびHBV  e抗原に対するCTLの応答の誘導を示すグラフである。
【図１４】図14（パネルＡおよびパネルＢ）は、アカゲザルマカクにおけるHBVコア抗原に対するCTL応答がCD4-CD8+細胞であることを示す１対のグラフである。
【図１５】図15（パネルＡ、Ｂ、およびＣ）は、CFA(a)、２×100μl（HBc[3A4]  (b)、または２×100μl  Hbc/neo[6A3]における後ろ足パッドへの10μg  rHBcAgのs.c注射によるHBc/eAgＴ細胞プライミング効率の比較を示す。３匹マウスの群をプライムし（レトロウイルスベクターで免疫化したマウスを５日後に追加免疫した）、そして９日〜11日後に屠殺した。排出LNを採取し、そして単一の懸濁液を、示される抗原の非存在下または存在化で96時間培養した。値を、抗原を伴う１分当たりのカウント（CPM）から抗原を伴わないウェルの平均CPMを引いた∂CPMとして示す。
【図１６Ａ】図16は、HBe[5A2]レトロウイルスベクターで免疫化後のB10およびB10.S  LN  ならびに脾臓Ｔ細胞のrHBcAgに対する増殖応答（パネルａおよびｂ）ならびにサイトカイン応答（パネルｃ）を示す。マウスをプライムし、そして図15の解説に示したように後ろ足パッドに追加免疫した。増殖を96時間目で測定し、サイトカインmRNAを48時間培養物から抽出した。値を∂CPMで示す。
【図１６Ｂ】図16は、HBe[5A2]レトロウイルスベクターで免疫化後のB10およびB10.S  LN  ならびに脾臓Ｔ細胞のrHBcAgに対する増殖応答（パネルａおよびｂ）ならびにサイトカイン応答（パネルｃ）を示す。マウスをプライムし、そして図15の解説に示したように後ろ足パッドに追加免疫した。増殖を96時間目で測定し、サイトカインmRNAを48時間培養物から抽出した。値を∂CPMで示す。
【図１６Ｃ】図16は、HBe[5A2]レトロウイルスベクターで免疫化後のB10およびB10.S  LN  ならびに脾臓Ｔ細胞のrHBcAgに対する増殖応答（パネルａおよびｂ）ならびにサイトカイン応答（パネルｃ）を示す。マウスをプライムし、そして図15の解説に示したように後ろ足パッドに追加免疫した。増殖を96時間目で測定し、サイトカインmRNAを48時間培養物から抽出した。値を∂CPMで示す。
【図１７】図17は、HBc[3A4]（パネルａ）、HBe  [5A2]（パネルｂ）、およびHBc/neo  [6A3]（パネルｃ）レトロウイルスでの免疫化後のB10マウスにおける抗体応答は、HBc/eAgの残基129〜140に対応する合成Th細胞部位での先のプライミングによって増強され得る。２匹〜３匹のマウスの群を、レトロベクター免疫化の９〜11日前に不完全フロイントのアジュバンド中の100μgのペプチドでプライムし、そしてその後６週間毎週プライムした。コントロールとして、レトロベクター免疫化のみを受けただけの同数のマウスを供給した。各値を２〜３匹のマウスの群の終点力価の平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明を記載する前に、以下に使用される特定の用語を最初に定義することは本発明の理解に有用であり得る。以下に引用される全ての参考文献は、それらの全体で本明細書によって参考として援用される。
【００２４】
本発明において利用される「免疫原性タンパク質」は、適切な条件下で免疫応答（すなわち、細胞媒介性または体液性）を引き起こし得るそれぞれの抗原の部分をいう。「部分」は可変性の大きさであり得るが、好ましくは少なくとも９のアミノ酸長であり、そして抗原全体を含み得る。免疫原性（例えば、細胞媒介性免疫応答）を決定するために利用され得る代表的なアッセイは、以下ならびに実施例15Aiにより詳細に記載される。細胞媒介性免疫応答は、主要組織適合性複合体（「MHC」）クラスＩ提示、MHCクラスII提示、または両方を介して媒介され得る。
【００２５】
「免疫調節補因子」は、免疫応答に関与する１つ以上の細胞によって生成される場合、または細胞に外来的に添加される場合、補因子の非存在下で生じる免疫応答とは質または強さにおいて異なる免疫応答を引き起こす因子をいう。応答の質または強さは、当業者に公知の種々のアッセイによって測定され得る。これには、例えば、細胞増殖（例えば、3Hチミジン取り込み）を測定するインビトロアッセイ、およびインビトロサイトカインアッセイ（例えば、51Cr放出を測定する）（Warnerら、AIDS  Res.  and  Human  Retroviruses  7:645-655,  1991を参照のこと）が挙げられる。免疫調節補因子は、インビボおよびエキソビトロの両方で活性であり得る。このような補因子の代表的な例は、サイトカイン（例えば、インターロイキン２、４、６、および12（とりわけ）、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、GM-CSF、G-CSF、および腫瘍壊死因子（TNF）を含む。他の免疫調節補因子は、例えば、CD3、ICAM-1、ICAM-2、LFA-1、LFA-3、MHCクラスＩ分子、MHCクラスII分子、B7、β2-ミクログロブリン、シャペロン、またはそれらのアナログを含む。
【００２６】
「ベクター構築物」は、目的の配列（単数もしくは複数）または遺伝子（単数もしくは複数）の発現を指向し得る集合体をいう。ベクター構築物は、プロモーターエレメントを含まなければならず、そして好ましくはポリアデニル化を指向するシグナルを含む。さらに、ベクター構築物は、転写される場合、目的の配列（単数もしくは複数）または遺伝子（単数もしくは複数）に作動可能に連結され、そして翻訳開始配列として作用する配列を含まなければならない。好ましくは、ベクター構築物はまた、選択マーカー（例えば、Neo、SV2  Neo、TK、ハイグロマシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ、またはDHFR）、および１つ以上の制限部位、および翻訳終結配列を含む。さらに、ベクター構築物がレトロウイルス中に配置される場合、ベクター構築物は、使用されるレトロウイルスに適切なパッケージングシグナルおよび長末端反復（LTR）（これらが既に存在しない場合）を含まなければならない。
【００２７】
「レトロウイルスベクター構築物」は、本発明の好ましい実施態様において、目的の配列（単数もしくは複数）または遺伝子（単数もしくは複数）の発現を指向し得る集合体をいう。好ましくは、レトロベクター構築物は、5'LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、１つ以上の異種配列、第２の鎖のDNA合成起点、および3'LTRを含む。広範な種々の異種配列は、ベクター構築物において含まれ得る。これには、例えば、タンパク質（例えば、細胞傷害性タンパク質、疾患関連抗原、免疫付属分子、もしくは置換タンパク質）をコードする配列、または分子自身として（例えば、リボザイムもしくはアンチセンス配列として）有用な配列が挙げられる。あるいは、異種配列はまた、単に、「スタッファー」または「フィラー（filler）」配列であり得る。これは、RNAゲノムを含むウイルス粒子の産生を可能にするに十分な大きさである。好ましくは、異種配列は、長さが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８kbである。
【００２８】
レトロベクター構築物はまた、転写プロモーター／エンハンサーもしくは部位決定エレメント（単数もしくは複数）、またはオルタナティブスプライシング、核RNA輸送、メッセンジャーの翻訳後修飾、もしくはタンパク質の転写後修飾のような手段によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含み得る。必要に応じて、レトロベクター構築物は、選択マーカー（例えば、Neo、TK、ハイグロマイシン、フェロマイシン、ヒスチジノール、またはDHFR）、ならびに１つ以上の特異的制限部位および翻訳終結配列を含み得る。
【００２９】
「核酸配列ベクター」は、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る集合体をいう。核酸発現ベクターは、転写される場合、目的の配列（単数もしくは複数）または遺伝子（単数もしくは複数）に作動可能に連結されたプロモーター、ならびにポリアデニル化配列を含まなければならない。
【００３０】
本発明の特定の実施態様において、本明細書中に記載される核酸発現ベクターは、プラスミド構築物内に含まれ得る。核酸発現ベクターの成分に加えて、プラスミド構築物はまた、細菌性の複製起点、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物が１本鎖DNAとして存在することを可能にするシグナル（例えば、M13複製起点）、複数クローニング部位、および「哺乳動物」複製起点（例えば、SV40複製起点またはアデノウイルス複製起点）を含み得る。
【００３１】
上記のように、本発明は、温血動物における細胞内感染を処置するための方法および組成物に関し、この方法は、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程、そしてさらに抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果免疫応答が生成される、工程を包含する。簡略には、外来病原体を認識し、そしてこれらに対して防御する能力は、免疫系の機能の中核をなす。この系は、免疫認識を介して、「非自己」（外来）から「自己」を区別し得、これは防御機構が宿主組織ではなく、浸入した存在に向けられることを確実にするに不可欠である。以下により詳細に記載される方法は、強力なクラスＩ制限性の防御的かつ、治療的CTL応答、ならびに体液性応答を誘導する、有効な手段を提供する。
【００３２】
細胞内疾患
上記のように、本発明の１つの局面において、温血動物における細胞内感染を処置するための方法が提供され、この方法は、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程、そしてさらに抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果免疫応答が生成される、工程を包含する。このような細胞内疾患の代表的な例は、細胞内細菌性感染、寄生生物感染、およびウイルス感染を含む。
【００３３】
本発明の１つの局面において、上記の方法は、細菌性疾患（例えば、放線菌疾患（例えば、結核、クラジミア感染症）を含む）を処置または予防するために利用され得る。適切な放線菌抗原の代表的な例には、フィブロネクチン結合抗原複合体（Ag85）由来のMycobacteria  tuberculosis抗原を含む（例えば、Launoisら、Infection  and  Immnity  62(9):3679-3687,  1994を参照のこと）。フィブロネクチン結合複合体の特に好ましい免疫原性部分は、アミノ酸41〜80および241〜295を含み、これは強力かつ無差別のＴ細胞刺激特性を有する。当業者によって理解されるべきであるように、M.  tuberculosis複合体（例えば、M.  bovisおよびM.  bovis  BCG）内のこのような抗原は、疾患の処置のために利用され得るが、他の関連する放線菌（例えば、M.  leprae）内のこのような抗原においても同様である。
【００３４】
本発明の別の局面において、上記の方法はクラジミア感染症のような細菌性疾患を処置または予防するために利用され得る。簡略には、Chlamydia  trachomatis  servars  Ａ、Ｂ，およびＣは、トラコーマの原因因子であり、予防可能な失明の世界の主要な原因である。適切な抗原の例は、クラジミアの主要な外膜タンパク質（「MOMP」;  Westbayら、Infect.  Immun.  63:1391-1393,  1995;  SuおよびCaldwell,  Vaccine  11:1159-1166,  1993；AllenおよびStephens,  Eur.  J.  Immunol.  23:1169-1172,  1993；SuおよびCaldwell,  J.  Exp.  Med.  175:227035,  1992；Suら、J.  Exp.  Med.  172:203-212,  1990；およびGuagliardiら、Infect.  Immun  57:1561-1567,  1989）を含む。
【００３５】
本発明の別の局面において、上記の方法は、例えば、マラリアのような寄生生物性感染を処置または予防するために利用され得る。適切な抗原の例は、Plasmodium  falciparumのcircumsporozoiteタンパク質を含む。
【００３６】
本発明の他の局面において、温血動物におけるウイルス感染を処置するための方法が提供され、この方法は、ウイルス由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程、そしてさらに抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果免疫応答が生成される工程を包含する。このようなウイルスの代表的な例は、HIVおよび肝炎を含む。
【００３７】
HIVについて、特に好ましい抗原は、HIV  gag遺伝子およびenv遺伝子を含む。適切な免疫原性部分は、関連するエピトープの合成および広範な種々の技術を利用する分析によって容易に同定され得る（Mancaら  Eur.  J.  Immunol.  25:1217-1223,  1995；Sarobeら、J.  Acquir.  Immune.  Defic.  Syndr.  7:635-40,  1994；Shiraiら、J.  Immunol.  152:549-56,  1994；Mancaら、Int.  Immunol.  5:1109-1117,  1993；Ahlersら、J.  Immunol.  150:5647-65,  1993；KunduおよびMerigan、Aids  6:643-9,  1992；Lasarteら、Cell  immunol.  141:211-8,  1992；およびHosmalinら、J.  Immunol.  146:1667-73,  1991）。
【００３８】
本発明の他の局面において、温血動物内の肝炎感染を処置および／または予防するための方法が提供され、この方法は、肝炎由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程、そしてさらに抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果免疫応答が生成される工程を包含する。本発明の好ましい実施態様において、肝炎ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスである。
【００３９】
簡略には、Ｂ型肝炎ゲノムは、約3.2kb長の環状DNAから構成され、そして十分に特徴づけられている（Tiollaisら、Science  213:406-411,  1981；Tiollaisら、Nature  317:489-495,  1985；およびGanemおよびVarmus,  Ann.  Rev.  Biochem.  56:651-693,  1987；EP  0  278,940、EP  0  241,021、WO  88/10301、および米国特許第4,696,898号および同第5,024,938号もまた参照のこと）（これらは、本明細書によって参考として援用される）。Ｂ型肝炎ウイルスには、いくつかの異なる抗原を示す。これは、とりわけ、３つのHB「Ｓ」抗原（HBsAg）、HBc抗原（HBcAg）、HBe抗原（HBeAg）、およびHBx抗原（HBxAg）（Blumら、「The  Molecular  Biology  of  Hepatitis  B  Virus」TIG  5(5):154-158,  1989を参照のこと）を含む。簡略には、HBeAgは、P22プレコア中間体のタンパク質分解性切断から生じ、そして細胞から分泌される。HbeAgは17kDaタンパク質として血清において見出される。HBcAgは、183アミノ酸のタンパク質であり、そしてHBxAgは、サブタイプに依存して、145アミノ酸〜154アミノ酸のタンパク質である。
【００４０】
動物細胞において合成されるHbsAgはグリコシル化され、アセンブリされ、そして細胞上清中へ分泌される（Tiollaisら、Nature  317:489-495,  1985）。３つの異なるenvタンパク質が、HBVゲノムのＳ領域によってコードされる。これは３つの翻訳開始コドンを含む（Heermanら、J.  Virol  52:396-402,  1984；  Tiollaisら、Nature  317:489-495,  1985）。ラージenvタンパク質、中間envタンパク質、および主要なenvタンパク質は、第１のATG、第２のATG、第３のATGで翻訳を開始し、そして合成はORFの末端まで進行する。このORFのプレS1、プレS2、およびＳ遺伝子セグメントは、それぞれ、第１のATGと第２のATGとの間、第２のATGと第３のATGとの間、および第３のATGとORFの末端との間に位置する。３つのセグメントは、それぞれ、119、55、または226アミノ酸をコードする。プレS2産物はpHSAに結合し得る（Machidaら、Gastroenterology  86:910-918,  1984;  Michelら、  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  82:7708-7712,  1985；Pertsingら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  82:3440-3444.  1985）。肝細胞は、HSAに対する受容体を発現するので、pHSAが中間体受容体として作用し、中間Ｓタンパク質および肝細胞に結合する（これはウイルス付着を生じる）ことが示唆される（Michelら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81:7708-7712,  1985）。主要なenvタンパク質およびラージenvタンパク質は、Ｓ領域（gp27、gp42）の部位において非グリコシル化（p24、p39）されているか、またはグリコシル化されているかのいずれかである。中間envタンパク質は、プレS2領域（gp33）内の部位でグリコシル化されていて、そしてさらにＳ領域においてグリコシル化（gp36）され得る。
【００４１】
当業者に明らかであるように、上記の抗原の種々の免疫原性部分は、本明細書中で記載されるベクター構築物の１つによって投与される場合、免疫応答を表すために組み合わせら得る。さらに、HBVのＳオープンリーディンフレームについての、異なる地理学的領域において見出される大きな免疫学的可変性に起因して、抗原の特定の組み合わせが、特定の地理学的領域においての投与について好ましくあり得る。簡略には、全てのヒトＢ型肝炎ウイルスＳサンプルに見出されるエピトープは、決定基「ａ」として規定される。しかし、相互に排他的なサブタイプ決定基はまた、２次元二重免疫拡散法（Ouchterlony,  Progr.  Allergy  5:1,  1958）によって同定された。これらの決定基は、「ｄ」または「ｙ」および「ｗ」または「ｒ」と命名された（LeBouvier,  J.  Infect.  123:671,  1971；Bancroftら、J.  Immunol.  109:842,  1972；Courouceら、Bibl.  Haematol.  42:1-158,  1976）。免疫学的可変性は、以下のアミノ酸変化を生じるＢ型肝炎ウイルスＳオープンリーディングフレームの２つの領域における単一のヌクレオオチド置換に起因する：（１）Ｂ型肝炎ウイルスＳオープンリーディングフレームにおけるリジン-122のアルギニンへの交換は、ｄからｙへのサブタイプシフトを引き起こし、そして（２）アルギニン-160のリジンへの交換はサブタイプｒからｗへのシフトを引き起こす。アフリカ黒人において、サブタイプaywが優性であるが、アメリカ合衆国および北ヨーロッパでは、サブタイプadw2がより多い（Molecular  Biology  of  the  Hepatitis  B  Virus,  McLachlan（編）、CRC  Press,  1991）。当業者に明らかであるように、投与の地理学的領域において優性である特定のＢ型肝炎ウイルスサブタイプに適切である、投与のためのベクターを構築することが一般に好ましい。特定の領域のサブタイプは、２次元二重免疫拡散法によって、または好ましくはその領域内の個体から単離されたHBVウイルスのＳオープンリーディングフレームを配列決定することによって決定され得る。
【００４２】
pol（「HBV  pol」）、ORF  5、およびORF  6抗原はまた、HBVによって提示される。簡略には、HBVのポリメラーゼオープンリーディングフレームは、感染した肝臓におけるビリオンおよびコア様粒子に見出される逆転写活性をコードする。ポリメラーゼタンパク質は、少なくとも２つのドメインからなる：逆転写をプライムするタンパク質をコードするアミノ末端ドメイン、および逆転写酵素およびRNase  H活性をコードするカルボキシル末端ドメイン。HBV  polの免疫学的部分は、以下に記載されるベクター構築物を利用し、本明細書中に記載の方法（例えば、以下ならびに実施例15Aiおよび16）を利用して決定され得、そして温血動物内で免疫応答を生成するために投与され得る。同様に、ORF  5およびORF  6のような他のHBV抗原、（Millerら、Hepatology  9:322-327,  1989）は、本明細書中に記載されるベクター構築物を利用して発現され得る。ORF  5およびORF  6を利用するベクター構築物の代表的な例は、以下の実施例5Iおよび5Jに記載される。
【００４３】
Ｂ型肝炎ウイルスをコードする分子的にクローン化されたゲノムは、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC,  Rockville,  Maryland）を含む種々の供給原から得られ得る。例えば、ATCC  No.45020は、pBR322（Moriartyら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  78:2606-2610,  1981）のBamHI部位にＢ型肝炎の全ゲノムDNA（精製したDane粒子から抽出した）（Blumら、TIG  5(5):154-159,  1989の図３を参照のこと）を含む（実施例2Aに記載されるように、そして図２に示されるように、修正可能な間違いが、ATCC  No.45020の配列に存在することに留意のこと）。
【００４４】
上記のように、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分がベクター構築物中に組み込まれる。ベクター構築物中に組み込まれる免疫原性部分（単数または複数）は種々の長さであり得るが、一般に、その部分は少なくとも９アミノ酸長であることが好ましく、そして全抗原を含み得る。特定の配列の免疫原性は、しばしば、予測することが困難であるが、Ｔ細胞エピトープはFalkら（Nature  351:290,  1991）によって記載されるHLA  A2.1モチーフを利用して予想され得る。この分析から、ペプチドが合成され得、そしてインビトロ細胞傷害性アッセイ（例えば、実施例15Aiにおいて記載されるアッセイ）において標的として使用され得る。しかし、他のアッセイもまた利用され得る。これは、例えば、新たに導入したベクターに対する抗体の存在を検出するELISA、ならびにＴヘルパー細胞について試験するアッセイ（例えば、γインターフェロンアッセイ、IL-2産生アッセイ、および増殖アッセイ（実施例15Bおよび15C））を含む。
【００４５】
免疫原性部分はまた、他の方法によって選択され得る。例えば、HLA  A2.1/Kbトランスジェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識についてのモデルとして有用であることが示されている。簡略には、インフルエンザおよびＢ型肝炎ウイルス系において、マウスＴ細胞レセプターレパトリーは、ヒトＴ細胞によって認識される同じ抗原性決定基を認識する。両方の系において、HLA  A2.1/Kbトランスジェニックマウスにおいて生成されるCTL応答は、HLA  A2.1ハプロタイプのヒトCTLによって認識されるエピトープと同一のエピトープに実質的に向けられる（Vitielloら、J.  Exp.  Med.  173:1007-1015,  1991；Vitielloら、Abstract  of  Molecular  Biology  of  Hepatitis  B  Virus  Symposia,  1992）。
【００４６】
ベクター構築物への取り込みのために特に好ましい免疫原性部分は、以下の実施例5A、5B、および5Gでそれぞれより詳細に記載されるHBeAg、HBcAg、およびHBsAgを含む。Ｂ型肝炎ウイルスのさらなる免疫原性部分は、例えば、以下の部位を含む種々の位置でコード配列を短縮することによって得られ得る：Bst  UI、Ssp  I、Ppu  M1、およびMsp  I（Valenzuelaら、Nature  280:815-19,  1979;  Valenzuelaら、Animal  Virus  Genetics:  ICN/UCLA  Symp.  Mol.  Cell  Biol.,  1980,  B.N.  FieldsおよびR.  Jaenisch（編）、57-70頁、New  York:  Academic）。
【００４７】
なお他の好ましい免疫優性Ｔ細胞エピトープは、コア分子中のaa  50-69（PHHTALRQAILCWGELMTLA;  配列番号84)を含み、急性HBV感染および異なるHLAハプロタイプの95％の患者によって認識され、そしてコア抗原のペプチド１〜20（MDIDPYKEFGATVELLSFLP;  配列番号85）および117-131（EYLVSFGVWIRTPPA;  配列番号86）はまた、Ｔ細胞増殖を誘導し得る。
【００４８】
適切な免疫原性部分を決定するさらなる方法および方法もまた、以下により詳細に記載される（Ferrariら、J.  Clin.  Invest.  88:214-222,  1991もまた参照のこと）。
【００４９】
本発明の別の局面において、Ｃ型肝炎感染を処置するための方法が提供される。この方法は、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向させるベクター構築物を温血動物に投与する工程、およびまた免疫応答を生じるように抗原の前述の免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与する工程を包含する。簡単には、上記のように、Ｃ型肝炎（非Ａ、非Ｂ（NANB）肝炎）は、輸血後に発症する肝炎の症例の90％より多くを占める一般的な疾患である（Chooら、Science  244:359-362,  1989）。NANB肝炎に関するほとんどの情報は、チンパンジー伝染研究に由来していた。これらの研究は、NANB肝炎がほとんどのヒト感染において、ほんの102〜103CID/ml（チンパンジー感染性用量/ml）の力価で存在したことを示した。さらに、この疾患は、実験的に感染したチンパンジーの肝細胞内にはっきりとした膜状の細管の出現を引き起こすことが見出された。この「細管形成」(tubule  forming）因子は、その後Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）と名付けられた。
【００５０】
HCVのゲノムRNAは、9379ヌクレオチドの配列を有することが最近になって決定されている（Chooら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:2451-2455,  1991;  Chooら、Brit.  Med.  Bull.  46(2):423-441,  1990;  Okamotoら、J.  Gen.  Vir.  72:2697-2704,  1991;  Genbank  Accession  No.  M67463,  Intelligenetics  (Mountain  View,  California)もまた参照のこと)。この配列は、3011アミノ酸のポリタンパク質前駆体を発現する。これは、フラビウイルスファミリーのタンパク質に対する有意な相同性を有する。ポリタンパク質前駆体は、切断されて、Ｃ（ヌクレオキャプシドタンパク質）E1、E2/NS1、および非構造タンパク質NS2、NS3、NS4、およびNS5を含むいくつかの異なるウイルスタンパク質を生じる（Houghtonら、Hepatology  14:381-388,  1991）。
【００５１】
上記のように、本発明の１つの実施態様において、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分は、ベクター構築物中に組み込まれる。Ｃ型肝炎の好ましい免疫原性部分は、ＣおよびNS3-NS4領域内で見出され得る。なぜなら、これらの領域は、種々の型のＣ型肝炎ウイルス間で最も保存されているからである（Houghtonら、Hepatology  14:381-388,  1991）。特に好ましい免疫原性部分は、種々の方法によって決定され得る。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスについて上記のように、ポリタンパク質の免疫原性部分の同定は、アミノ酸配列に基づいて予想され得る。簡単には、当業者に公知の種々のコンピュータープログラムがCTLエピトープを予想するために利用され得る。例えば、HLA  A2.1ハプロタイプについてのCTLエピトープは、Falkら（Nature  351:290,  1991）によって記載されるHLA  A2.1モチーフを利用することが予想され得る。この分析から、ペプチドは、合成され、そして実施例15Aに記載されるようなインビトロ細胞傷害性アッセイにおける標的として使用される。
【００５２】
好ましい免疫原性部分はまた、以下の様式で選択され得る。簡単には、HCVの患者からの血液サンプルが、個々のHCVポリタンパク質領域（例えば、HCVコア、E1、E2/SNI、およびNS2-NS5領域）に対する抗体を用いて、患者血清中にどの抗原性フラグメントが存在するかを決定するために分析される。一時的な寛解を得るためにαインターフェロンで処置した患者において、いくつかの抗原性決定基が消失し、そして抗原に対する内因性の抗体によって取って代わられる。このような抗原は、本発明の状況内で免疫原性部分として有用である（Hayataら、Hepatology  13:1022-1028,  1991;  Davisら、N.  Eng.  J.  Med.  321:  1501-1506,  1989;  Chooら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:2451-2455,  1991もまた参照のこと）。
【００５３】
抗原の多数の特定の免疫原性部分は、本明細書中に、広範な種々の細胞内疾患の処置および/または予防のために提供されてきたが、本発明はそのように限定されるべきではないことに注意すべきである。特に、さらなる追加的な免疫原性部分は、種々の方法によって決定され得る。例えば、上記のように、好ましい免疫原性部分は、アミノ酸配列に基づいて予想され得る。簡単には、当業者に公知の種々のコンピュータープログラムは、CTLエピトープを予想するために利用され得る。例えば、HLA  A2.1ハプロタイプのCTLエピトープは、Falkら（Nature  351:290,  1991）によって記載されるHLA  A2.1モチーフを利用することよって予想され得る。
【００５４】
この分析から、ペプチドは、合成され、そしてCTLエピトープを同定するために使用される。次に、これらのペプチドは、急性のＢ型肝炎感染を有する個体において、またはHLA  A2.1もしくはHLA  A2.1/Kbトランスジェニックマウスにおいて試験される。急性Ｂ型肝炎感染を有する個体からのエフェクター細胞は、インビトロで形質導入された自己LCL（実施例11  Aiii）で刺激され、そしてペプチドでコートされた自己LCLにおいて試験される。クロム放出アッセイは、ペプチドが最終濃度１〜100μg/mlで、非形質導入Na251CrO4標識LCLに、エフェクター細胞とともに添加されることを除き、実施例15Aivにおいて記載されるように行われる。反応物は、４〜６時間インキュベートされ、そして標準的なクロミウム放出アッセイが実施例12Aiに記載されるように行われる。
【００５５】
HLA  A2.1またはHLA  A2.1/Kbトランスジェニックマウスからのエフェクター細胞を収集し、そしてCTLアッセイを実施例15Aiiに記載されるように行う。ペプチドは、最終濃度１〜10μg/mlで、非形質導入Na251CrO4標識ELA  A2/Kb細胞に添加する。これらのペプチドでコートされた細胞は、CTLアッセイにおいて標的として使用される。
【００５６】
免疫原性部分を予想するために同様に利用され得る別の方法は、どの部分がマウスにおいてCTLを誘導する特性を有するかをレトロウイルスベクターを利用して決定することである（Warnerら、AIDS  Res.  and  Human  Retroviruses  7:645-655,  1991を参照のこと)。Warnerらに記載されるように、マウスにおけるCTL誘導は、細胞性免疫原性をヒトにおいて予想するために利用され得る。好ましい免疫原性部分はまた、ポリタンパク質抗原またはペプチドのどのフラグメントが、対応する遺伝子のベクター形質導入の後に,フラグメントを発現する標的細胞（例えば、自己EBV形質転換リンパ球）の自己患者リンパ球によって溶解を誘導することが可能であるかを決定することにより導き出され得る（実施例16）。
【００５７】
本発明において利用される場合、免疫原性部分はまた、それらをより抗原性にするために改変されている抗原を含むことが理解されるべきである。免疫原を改変するために適切な方法の代表的な例には、以下が含まれる：Ｔヘルパーエピトープに対応するアミノ酸配列を付加すること；疎水性残基を付加することによって細胞の取り込みを促進すること；粒子状の構造を形成すること；またはこれらの任意の組み合わせ（一般には、Hart,  op.  cit.,  Milichら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:1610-1614,  1988;  Willis,  Nature  340:  323-324,  1989;  Griffithsら、J.  Virol.  65:  450-456,  1991を参照のこと）。さらに、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質の単量体の非粒子形態は、ベクター構築物の投与前に、CTLのためにＴヘルプをプライムするために利用され得る。これは、実施例14Aiに示される。
【００５８】
一旦、免疫原性部分が選択されると、それが非腫瘍原性であることを確実にすることもまた一般に好ましい。これは、例えば、短縮、点変異、成熟前停止コドンの付加、またはリン酸化部位の変更を含む種々の方法によって達成され得る。抗原またはその改変形態はまた、上記の方法を利用して腫瘍原性について試験され得る。
【００５９】
上記のように、１つより多くの免疫原性部分が、ベクター構築物中に組み込まれ得る。例えば、ベクター構築物は、（別々に、または１つの構築物としてのいずれかで）HBcAg、HBeAg、HBsAgs、HBxAgの全てまたは免疫原性部分、ならびに以下に議論されるHCV抗原の免疫原性部分を発現し得る。
【００６０】
タンパク質
上記の抗原の免疫原性部分は、多くの公知の様式で、産生され得る（EllisおよびGerety,  J.  Med.  Virol.  31:54-58,  1990）。これらの様式には、化学合成（Bergotら、Applied  Biosystems  Peptide  Synthesizer  User  Bulletin  No.  16,  1986,  Applied  Biosystems,  Foster  City,  California）、ならびに組換え系（例えば、昆虫由来のバキュロウイルス系（Doerfler,  Current  Topics  in  Immunology  131:51-68,  1986）、哺乳動物由来の系（例えば、CHO細胞）（Bermanら、J.  Virol.  63:3489-3498,  1989)、酵母由来の系（McAleerら、Nature  307:178-180）、および原核生物の系（Burrelら、Nature  279:43-47,  1979））におけるDNA発現が含まれる。
【００６１】
次いで、タンパク質またはペプチドは、従来の手段により精製され得、そして細胞媒介性応答（クラスIおよびクラスII応答を含む）を誘導するために、多くの方法によって送達され得る。これらの方法は、例えば、以下のような種々の型のアジュバントの使用を含む：ISCOMS（Morein,  Immunology  Letters  25:281-284,  1990;  Takahashiら、Nature  344:873-875m,  1990)、リポソーム（Gergoriadisら、Vaccine  5:  145-151,  1987)、脂質結合（Deresら、Nature  342:561-564,  1989)、自己細胞上でのペプチドのコーティング（Staerzら、Nature  329:449-451,  1987)、ピノソーム（Mooreら、Cell,  54:777-785,  1988)、ミョウバン、完全もしくは不完全フロイントアジュバント（Hartら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:9448-9452,  1991)、または種々の他の有用なアジュバント（例えば、AllisonおよびByars,  Vaccines  87:56-59,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  1987）であって有効な非経口投与を可能にするもの（Litvinら、Advances  in  AIDS  Vaccine  Development,  Fifth  Annual  Meeting  of  the  National  Vaccine  Development  Groups  for  AIDS,  1992年８月30日）。
【００６２】
あるいは、上記の免疫原性部分に対応するタンパク質またはペプチドは、腸溶カプセルにおいて（Channockら、J.  Amer.  Med.  Assoc.  195:445-452,  1966）か、または他の適切なキャリア（例えば、胃腸放出のためのポリ(DL-ラクチド-co-グリコレート）スフィア（Eldridgeら、Proceedings  of  the  International  Conference  on  Advances  in  AIDS  Vaccine  Development,  DAIDS,  NIAID、米国厚生省  1991））において免疫応答を誘発するための経口投与のためにカプセル化され得る。
【００６３】
免疫調節補因子
さらに、ベクター構築物はまた、αインターフェロン（Finterら、Drugs  42(5):  749-765,  1991;米国特許4,892,743;  米国特許第4,966,843号；WO  85/02862;  Nagataら、Nature  284:  316-320,  1980;  Famillettiら、Methods  in  Enz.  78:387-394,  1981;  Twuら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  86:  2046-2050,  1989;  Faktorら、Oncogene  5:867-872,  1990)、βインターフェロン（Seifら、J.  Virol.  65:  664-671,  1991)、γインターフェロン（Radfordら、The  American  Society  of  Hepatology  20082015,  1991;  Watanabeら、PNAS  86:  9456-9460,  1989;  Gansbacherら、Cancer  Research  50:  7820-7825,  1990;  Maioら、Can.  Immunol.  Immunother.  30:34-42,  1989;米国特許第4,762,791号；米国特許第4,727,138号)、G-CSF（米国特許第4,999,291号および同第4,810,643号)、GM-CSF（WO  85/04188)、TNF（Jayaramanら、J.  Immunolgy  144:942-951,  1990)、インターロイキン２（IL-2）(Karupiahら、J.  Immunology  144:290-298,  1990;  Weberら、J.  Exp.  Med.  166:1716-1733,  1987;  Gansbacherら、J.  Exp.  Med.  172:1217-1224,  1990;  米国特許第4,738,927号）、IL-4（Tepperら、Cell  57:503-512,  1989;  Golumbekら、Science  254:713-716,  1991；米国特許第5,017,691号)、IL-6（Brakenhofら、J.  Immunol.  139:4116-4121,  1987;  WO  90/06370)、ICAM-I(Altmanら、Nature  338:512-514,  1989)、ICAM-2、LFA-1、LFA-3、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、β２-ミクログロビン、シャペロン、CD3、B7、MHC連結トランスポータータンパク質、またはそのアナログ（Powisら、Nature  354:528-531,  1991）のような免疫調節補因子を同時発現し得る。
【００６４】
どの免疫調節補因子をベクター構築物内に含ませるかの選択は、補因子の公知の治療効果に基づき得るか、または実験的に決定し得る。例えば、慢性のＢ型肝炎感染において、αインターフェロンは、患者の免疫学的欠損を補うのに有効であり、それにより疾患からの回復を補助することが見出されている。あるいは、適切な免疫調節補因子が、実験的に決定され得る。簡単には、血液サンプルが、まず肝疾患の患者から採取される。末梢血リンパ球（PBL）は、肝炎抗原の免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物および免疫調節補因子で形質導入された自己またはHLA適合細胞（例えば、EBV形質転換細胞）でインビトロで再刺激される。次いで、これらの刺激されたPBLは、HLA適合形質導入細胞を標的として使用するCTLアッセイにおけるエフェクターとして使用される。HLA適合刺激因子および抗原のみをコードするベクターで形質導入される標的細胞を使用して行われる同じアッセイにおいて観察されるものに対するCTL応答における増大は、有用な免疫調節補因子を示す。本発明の１つの実施態様において、免疫調節補因子γインターフェロンは、特に好ましい。
【００６５】
免疫調節補因子の別の例は、B7同時刺激因子である。簡単には、Ｔ細胞の全機能活性の活性化は、２つのシグナルを必要とする。１つのシグナルは、抗原特異的Ｔ細胞レセプターの、主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合するペプチドとの相互作用によって提供される。そして、第二のシグナルは、同時刺激と呼ばれ、抗原提示細胞によってＴ細胞に送達される。第二のシグナルは、Ｔ細胞によるインターロイキン２（IL-2）産生に必要とされ、そして抗原提示細胞上のB7分子のＴリンパ球上のCD28およびCTLA-4レセプターとの相互作用に関与するようである（Linsleyら、J.  Exp.  Med.  173:721-730,  1991a、およびJ.  Exp.  Med.  174:561-570,  1991）。本発明の１つの実施態様において、B7は、細胞中に導入され、CD8+Ｔ細胞をプライムする効率的な抗原提示細胞を生成し得る。これらのCD8+Ｔ細胞は、B7を発現しない細胞を殺傷し得る。なぜなら、同時刺激は、もはやさらなるCTL機能には必要ではないからである。同時刺激B7因子および、例えば、免疫原性HBVコアタンパク質の両方を発現するベクターは、本明細書中に記載される方法を利用して作製され得る。これらのベクターで形質導入された細胞は、より効率的な抗原提示細胞になる。HBVコア特異的CTL応答は、完全に活性化されたCD8+Ｔ細胞から同時刺激リガンドB7を介して増大される。特に好ましい実施態様は、実施例6Ciおよび6Ciiに示される。
【００６６】
本発明の１つの局面において、１つ以上の免疫調節補因子が、ベクター構築物中に含められ、そしてそれによって同時発現され（るかまたは別々に投与され）、TH1とTH2媒介性応答との間のバランスをシフトさせる。簡単には、そのサイトカイン分泌パターンに基づいて、Ｔヘルパー細胞が２つの相互に排他的なセット（Ｔヘルパー１（TH1)またはＴヘルパー２（TH2)として知られる）に分割される。TH1細胞は、IL-2、IL-12、IL-15、γ-IFN、およびTNFβを分泌し、Ｂ細胞が分化するのを助け、そしてIgG2aを分泌し、そしてCTLが増殖するのを助ける。TH2細胞は、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、およびIL-10を分泌し、そしてＢ細胞が分化するのを助け、そしてIgEまたはIgG1を分泌する。本発明の特に好ましい実施態様において、TH1とTH2との間のバランスをシフトさせることが望ましい。以下により詳細に記載されるように、これは、TH1サイトカイン遺伝子（例えば、IL-2、IL-12、IL-15、γ-IFN、またはTNFβ遺伝子）を、（本明細書中に記載されるＢ型肝炎抗原またはＣ型肝炎抗原をコードする１つ以上の遺伝子とともに）標的細胞中に導入し、そしてそれによりTH1媒介性CTL応答に対する免疫応答をシフトすることによって達成され得る。特に好ましい実施態様は、実施例6Eに示される。
【００６７】
上記の免疫調節補因子をコードする分子は、種々の供給源から得られ得る。例えば、これらの配列を含むプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC,  Rockville,  Maryland)のような寄託機関から入手可能であるか、またはBritish  Bio-technology  Limited  (Cowley,  Oxford  England）のような商業的供給源から入手可能である。代表的な例には、BBG  12（127アミノ酸の成熟タンパク質をコードするGM-CSF遺伝子を含む）、BBG6（γインターフェロンをコードする配列を含む）、ATCC番号39656（TNFをコードする配列を含む）、ATCC番号20663（αインターフェロンをコードする配列を含む）、ATCC番号31902、31902、および39517（βインターフェロンをコードする配列を含む）、ATCC番号39405、39452、39516、39626、および39673（インターロイキン２をコードする配列を含む）、ATCC番号57592（インターロイキン４をコードする配列を含む）、およびATCC番号67153（インターロイキン６をコードする配列を含む）が含まれる。
【００６８】
同様に、免疫調節補因子をコードする配列は、これらの補因子をコードする配列を発現または含有する細胞から容易に得られ得る。簡単には、１つの実施態様において、プライマーは、所望の配列のいずれかの側で調製される。これは、続いて、PCRによって増幅される（米国特許第4,683,202号、米国特許第4,683,195号、および米国特許第4,800,159号を参照のこと）（PCR  Technology:  Principle  and  Applications  for  DNA  Amplification,  Erlich（編）、Stockton  Press,  1989もまた参照のこと）。特に、二本鎖DNAは、熱安定性Taqポリメラーゼ、配列特異的DNAプライマー、ATP、CTP、GTP、およびTTPの存在下で加熱することによって変性される。二本鎖DNAは、合成が完了したときに産生される。このサイクルは、多数回反復され得、所望のDNAの階乗増幅を生じる。
【００６９】
免疫調節補因子をコードする配列はまた、例えば、Applied  Biosystems  Inc.  DNA合成機（例えば、ABI  DNA合成機モデル392（Foster  City,  California））で合成され得る。このような配列はまた、相補的末端を介して一緒に連結され得、その後PCR増幅されて（Vent  polymerase,  New  England  Biomedical,  Beverly,  Massachusetts）、長い二本鎖DNA分子を形成し得る（Foguetら、Biotechniques  13:674-675,  1992)。
【００７０】
本発明の別の実施態様において、ベクター構築物は、別の因子の存在下で致死的である（となる）遺伝子を発現するために調製され得る。例えば、HSV-1チミジンキナーゼ遺伝子を発現する細胞は、ガンシクロビルに対して感受性になるが、正常細胞は影響されない。従って、ベクター構築物は、単純ヘルペスウイルス（HSV-1）チミジンキナーゼ遺伝子のような遺伝子を発現するために調製され得る（一般には、WO95/14091を参照のこと）。従って、治療遺伝子がベクター構築物の投与後に患者において発現される時間の長さは、ガンシクロビルの投与によって制限され得る。代表的なベクター構築物は、以下の実施例5Kにより詳細に記載される。
【００７１】
ベクター構築物
一旦、免疫原性部分（および、所望であれば、免疫調節補因子）が選択されると、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、その発現を指向するベクター構築物中に置かれる。一般に、このようなベクターは、これらの遺伝子のみをコードし、選択マーカーをコードしない。特定の抗原および免疫調節補因子をコードし、そしてその発現を導くベクターは、当業者によって容易に構築され得る。適切なベクターの代表的な例には、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、および広範な種々の他のウイルス性および非ウイルス性ベクターが含まれる。
【００７２】
１．レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの構築
本発明の１つの局面において、目的の抗原の選択された免疫原性部分を有するかまたは発現するように構築されたレトロウイルスベクター構築物が提供される。多くのレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルが、本発明の状況内で利用され得る。このような遺伝子送達ビヒクルは、例えば、以下を含む：
【００７３】
【数１】
2010116417.tif 000003
本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、広範な種々のレトロウイルス（例えば、Ｂ、Ｃ、およびＤ型レトロウイルス、ならびにスプマウイルス（spumavirus）およびレンチウイルスを含む）から容易に構築され得る（RNA  Tumor  Viruses、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  1985を参照のこと)。簡単には、ウイルスは、しばしば、電子顕微鏡下で観察されるその形態にしたがって分類される。「Ｂ」型レトロウイルスは、偏心性のコアを有するようであり、一方「Ｃ」型レトロウイルスは、中心のコアを有する。Ｄ型レトロウイルスは、Ｂ型レトロウイルスとＣ型レトロウイルスの中間の形態を有する。適切なレトロウイルスの代表的な例には、以下の図17A、B、およびCに示すもの（第2〜7頁のRNA腫瘍ウイルスを参照のこと）、ならびに種々の異種栄養性レトロウイルス（例えば、NZB-X1、NXB-X2、およびNZB9-1（O'Neillら、J.  Vir.  53:100-106,  1985を参照のこと)）、およびポリトロピック（polytropic）レトロウイルス(例えば、MCFおよびMCF-MLV（Kellyら、J.Vir.  45(1):291-298,  1983を参照のこと)）が含まれる。このようなレトロウイルスは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ATCC」;  Rockville,  Maryland）のような寄託機関またはコレクションから容易に得られ得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
【００７４】
本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの調製または構築のために特に好ましいレトロウイルスは、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘導（Mink-Cell  Focus-Inducing）ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスには、4070Aおよび1504A（HartleyおよびRowe,  J.  Virol.  19:19-25,  1976)、Abelson（ATCC番号VR-999)、Friend（ATCC番号VR-245)、Graffi、Gross（ATCC番号VR-590)、Kirsten、Harvey肉腫ウイルス、およびRauscher（ATCC番号VR-998)、ならびにモロニーマウス白血病ウイルス（ATCC番号VR-190）が含まれる。特に好ましいラウス肉腫ウイルスには、Bratislava、Bryan高力価（例えば、ATCC番号VR-334、VR-657、VR-726、VR-659、およびVR-728）、Bryan標準、Carr-Zilber、Engelbreth-Holm、Harris、Prague（例えば、ATCC番号VR-772および45033）、ならびにSchmidt-Ruppin（例えば、ATCC番号VR-724、VR-725、VR-354）が含まれる。
【００７５】
任意の上記のレトロウイルスは、本明細書中に提供される開示および標準的な組換え技術（例えば、Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  1989;  Kunkle,  PNAS  82:488,  1985）を考慮すると、レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルをアセンブリまたは構築するために容易に利用され得る。さらに、本発明の特定の実施態様において、レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、本発明の１つの実施態様において、レトロベクターLTRはマウス肉腫ウイルスに、tRNA結合部位はラウス肉腫ウイルスに、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに、そして第二鎖合成の起点はトリ白血病ウイルスに由来し得る。
【００７６】
本発明の１つの局面において、5'LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、１つ以上の異種配列、第二鎖DNA合成の起点、および3'  LTRを含むレトロベクター構築物が提供される。ここで、ベクター構築物は、gag/polまたはenvコード配列を欠失する。簡単には、長末端反復配列（「LTR」）は、３つのエレメントに分割され、U5、R、およびU3と命名される。これらのエレメントは、レトロウイルスの生物学的活性を担う種々のシグナル（例えば、U3内に配置されるプロモーターおよびエンハンサーエレメントを含む）を含む。LTRは、ゲノムのいずれかの末端での、その正確な重複のためにプロウイルスにおいて容易に同定され得る。本明細書中で利用される場合、5'LTRは、ベクターのDNA形態の逆転写および組み込みを可能にする5'プロモーターエレメントおよび十分なLTR配列を含むことが理解されるべきである。3'LTRは、ポリアデニル化シグナル、ならびにベクターのDNA形態の逆転写および組み込みを可能にするのに十分なLTR配列を含むことが理解されるべきである。
【００７７】
tRNA結合部位および第二鎖DNA合成の起点はまた、レトロウイルスが生物学的に活性であるために重要であり、そして当業者によって容易に同定され得る。例えば、レトロウイルスtRNAは、ワトソン-クリック塩基対合によってtRNA結合部位に結合し、そしてレトロウイルスゲノムによってウイルス粒子中に運ばれる。次いで、tRNAは、逆転写酵素によるDNA合成のプライマーとして利用される。tRNA結合部位は、5'  LTRから直ぐ下流のその位置に基づいて容易に同定され得る。同様に、第二鎖DNA合成の起点は、その名称が意味するように、レトロウイルスの第二鎖DNA合成に重要である。この領域は、ポリプリントラクトとしても言及されるが、3'  LTRの直ぐ上流に位置する。
【００７８】
5'および3'  LTR、tRNA結合部位、および第二鎖DNA合成の起点に加えて、本明細書中に提供される特定の好ましいレトロベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、ならびに１つ以上の異種配列を含み、これらの各々が以下により詳細に議論される。
【００７９】
本発明の１つの局面において、gag/polおよびenvコード配列の両方を欠失するレトロベクター構築物が提供される。本明細書中で利用される場合、句「gag/polまたはenvコード配列を欠失する」は、レトロベクターが、gag/polまたはenv遺伝子に、特にレトロベクター構築物のためのパッケージング細胞株を構築するために使用されるgag/polまたはenv発現カセットに見出される少なくとも20、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも10、そして最も好ましくは少なくとも８の連続するヌクレオチドを含まないことを意味すると理解されるべきである。
【００８０】
本発明の他の局面において、5'  LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖DNA合成の起点、および3'  LTRを含むレトロベクター構築物が提供される。ここで、レトロベクター構築物は、5'  LTRの上流のレトロウイルス核酸配列を含まない。本発明の状況内で利用される場合、句「5'  LTRの上流のレトロウイルス核酸配列を含まない」は、レトロベクターが、レトロウイルスにおいて、そしてより詳細にはレトロベクター構築物に相同であるレトロウイルスにおいて見出される少なくとも20、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも10、そして最も好ましくは少なくとも８の連続するヌクレオチドを含まないことを意味すると理解されるべきである。好ましい実施態様において、レトロベクター構築物は、5'  LTRの上流のenvコード配列を含まない。
【００８１】
本発明のさらなる局面において、5'  LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖DNA合成の起点、および3'  LTRを含むレトロベクター構築物が提供される。ここで、レトロベクター構築物は、3'  LTRの下流のレトロウイルスパッケージングシグナル配列を含まない。本明細書中で使用される場合、用語「パッケージングシグナル配列」は、RNAゲノムのパッケージングを可能にするのに十分な配列を意味すると理解されるべきである。
【００８２】
上記のレトロベクター構築物との使用のために適切なパッケージング細胞株は、容易に調製され得（米国特許第08/437,465号を参照のこと；米国特許第07/800,921号もまた参照のこと）、そして組換えベクター粒子の産生のためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株または「VCL」をも呼ばれる）を作製するために使用され得る。
【００８３】
２．アルファウイルスベクター
本発明の他の実施態様において、アルファウイルスベクター、または真核生物層化ベクター開始系が、目的の抗原の免疫原性部分を温血動物に送達するために使用され得る。このようなベクターの代表的な例は、米国特許出願第08/405,827号および同第08/628,594号に記載される。
【００８４】
代表的な目的のみのために、Sindbisウイルス（これは、Togavirusファミリーのアルファウイルス属の原型メンバーである）が議論される。簡単には、Sindbisウイルスのセグメント化されていないゲノムRNA（49S  RNA）は、長さが約11,703ヌクレオチドであり、5'キャップおよび3'ポリアデニル化テールを含み、そして陽性の極性を示す。感染性のエンベロープ化Sindbisウイルスは、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質の細胞質中でのウイルスゲノムRNA上へのアセンブリ、およびウイルスコード糖タンパク質で包埋される細胞膜を通しての発芽によって産生される。ウイルスの細胞への進入は、クラスリンコートピットを介するエンドサイトーシス、ウイルス膜のエンドソームでの融合、ヌクレオキャプシドの放出、およびウイルスゲノムの非コート化による。ウイルス複製の間に、ゲノム49S  RNAは、相補ネガティブ鎖の合成のための鋳型として作用する。このネガティブ鎖は、次いで、ゲノムRNAおよび内部的に開始される26SサブゲノムRNAの鋳型として作用する。Sindbisウイルス非構造タンパク質は、ゲノムRNAから翻訳され、一方構造タンパク質は、サブゲノム26S  RNAから翻訳される。全てのウイルス遺伝子は、ポリタンパク質として発現され、そして翻訳後タンパク質切断によって個々のタンパク質にプロセスされる。非構造コード領域内にパッケージング配列残基は存在し、それゆえ、ゲノム49S  RNAのみが、ビリオンにパッケージングされる。
【００８５】
いくつかの異なるSindbisベクター系が構築され得、そして本発明において使用され得る。このような系の代表的な例には、米国特許第5,091,309号および同第5,217,879号に記載されるものが含まれる。
【００８６】
本発明における使用のための特定の代表的なアルファウイルスベクターは、米国特許第08/405,827号において記載されるものが含まれる。簡単には、１つの実施態様において、Sindbisウイルスの転写を開始し得る5'配列、Sindbis非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ウイルス結合領域、およびSindbis  RNAポリメラーゼ認識配列を含むSindbisベクター構築物が提供される。他の実施態様において、ウイルス結合領域は、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が低減されるように改変されている。別の実施態様において、Sindbisウイルスの転写を開始し得る5'配列、Sindbis非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が防止されるように不活化されている第一のウイルス結合領域、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が低減されるように改変されている第二のウイルス結合領域、およびSindbis  RNAポリメラーゼ認識配列を含むSindbisベクター構築物が提供される。なお別の実施態様において、cDNAからのウイルスRNAの合成を開始し得る5'プロモーターおよび転写終結を制御する3'配列に加えて、上記のベクター構築物を含むSindbis  cDNAベクター構築物が提供される。
【００８７】
なおさらなる実施態様において、上記のベクター構築物は、  Sindbis構造タンパク質をベクター構築物中に含まず、選択された異種配列は、ウイルス結合領域から下流に位置され得；第二のウイルス結合領域を有する上記のベクター構築物中で、選択された異種配列は、異種配列が下流に位置される第二のウイルス結合領域から下流に位置され得、ベクター構築物は、ウイルス結合領域と上記異種配列との間に位置するポリリンカーを含み得、そして好ましくはポリリンカーは、野生型Sindbisウイルス制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含まない。
【００８８】
上記のSindbisベクター構築物、および多くの類似のベクター構築物は、本質的に米国特許第08/198,450号（本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されるように容易に調製され得る。
【００８９】
３．他のウイルス遺伝子送達ビヒクル
レトロウイルスベクターおよびアルファウイルスベクターに加えて、多くの他のウイルスベクター系はまた、本発明の状況内で利用され得る。このような遺伝子送達ビヒクルの代表的な例には、ポリオウイルス（Evansら、Nature  339:385-388,  1989;およびSabin,  J.  Biol.  Standardization  1:115-118,  1973）；ライノウイルス；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルス）（Fisher-Hochら、PNAS  86:317-321,  1989;  Flexnerら、Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.  569:86-103,  1989;  Flexnerら、Vaccine  8:17-21,  1990;  米国特許第4,603,112号、同第4,769,330号、および同第5,017,487号；WO  89/01973）；SV40(Mulliganら、Nature  277:108-114,  1979）；インフルエンザウイルス（Luytjesら、Cell  59:1107-1113,  1989;  McMichealら、N.  Eng.  J.  Med.  309:13-17,  1983;およびYapら、Nature  273:238-239,  1978);  アデノウイルス（Berkner,  Biotechniques  6:616-627,  1988;  Rosenfeldら、Science  252:431-434,  1991;  WO93/9191;  Kollsら、PNAS  91(1):215-219,  1994;  Kass-Eislerら、PNAS  90(24):11498-502,  1993;  Guzmanら、Circulation  88(6):2838-48,  1993;  Guzmanら、Cir.  Re.  73(6):1202-1207,  1993;  Zabnerら、Cell  75(2):207-216,  1993;  Liら、Hum.  Gene  Ther.  4(4):403-409,  1993;  Caillaudら、Eur.  J.  Neurosci.  5(10):1287-1291,  1993;  Vincentら、Nat.  Genet.5(2):130-134,  1993;  Jaffeら、Nat.  Genet.  1(5):372-378,  1992;およびLevreroら、Gene  101(2):195-202,  1991);アデノウイルス随伴ウイルスのようなパルボウイルス（Samulskiら、J.  Vir.  63:3822-3828,  1989;  Mendelsonら、Virol.  166:154-165,  1988;  PA  7/222,684;  Flotteら、PNAS  90(22):10613-10617,  1993);  ヘルペス（Kit,  Adv.  Exp.  Med.  Biol.  215:219-236,  1989;  米国特許第5,288,641号）；SV40;  HIV（Poznansky,  J.  Virol.  65:532-536,  1991);  麻疹（EP  0  440,219);  アストロウイルス（Munroe  S.S.ら、J.  Vir.  67:3611-3614,  1993);  およびコロナウイルス、ならびに他のウイルス系（例えば、EP  0,440,219；WO  92/06693;  米国特許第5,166,057号）が含まれる。さらに、ウイルスキャリアは、同種の、非病原性（欠損）の、複製可能なウイルス（例えば、Overbaughら、Science  239:906-910,  1988）であり得、そしてそれにも関わらず、CTLを含む細胞性免疫応答を誘導し得る。１つの特定の好ましい実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、真核生物層化ベクター開始系であり得る（米国特許第08/404,796号または同第08/405,827号を参照のこと）。
【００９０】
4.非ウイルス遺伝子送達ビヒクル
上記のウイルスベースベクターに加えて、多数の非ウイルス遺伝子送達ビヒクルが、本発明の状況内で同様に利用され得る。このような遺伝子送達ビヒクルの代表例としては、核酸発現ベクターの直接的送達、裸のDNA単独(WO  90/11092)、殺されたアデノウイルスに連結されるかまたは連結されないポリカチオン濃縮DNA(Curielら,  Hum.Gene  Ther.  3:147-154,  1992)、上記の高親和性ペアを有するかまたは有さないリガンドに連結されたDNAリガンド(Wuら,  J.  of  Biol.Chem  264:16985-16987,  1989)、および特定の真核生物細胞（例えば、プロデューサー細胞-米国特許第07/800,921号、および第08/437,465号を参照のこと）が挙げられる。
【００９１】
投与
上記のように、本発明は温血動物内で細胞内感染を処置するための方法を提供し、それには温血動物に、細胞内病原体に由来する少なくとも１つの免疫原部分の発現を導くベクター構築物を投与し、そしてまた温血動物へ上述の抗原の免疫原部分を含むタンパク質を投与する工程を含み、その結果免疫応答が生成される。簡単には、ベクター構築物を投与する方法は、インビボでの送達、またはエキソビボでの送達のいずれかを導くことによって容易に達成され得る。適切な方法の代表例としては、例えば、皮内（「i.d.」）、頭蓋内（「i.c.」）、腹腔内（「i.p.」）、くも膜下内（「i.t.」）、静脈内（「i.v.」）、皮下（「s.c.」）、筋肉内（「i.m」）が挙げられる。他の方法としては、例えば、種々の物理的方法（例えば、リポフェクション(Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.  USA  84:7413-7417,  1989)；直接DNA注入（Acsadiら,  Nature  352;815-818,  1991)；微粒子銃（Williamsら,  PNAS  88:2726-2730,  1991)；リポソーム(Wangら,  PNAS  84;7851-7855,  1987)；CaPO4(Dubenskyら,  PNAS  81:7529-7533,  1984)；DNAリガンド（Wuら,  J.Biol.Chem.  264:16985-16987,  1989)；またはさらに核酸の直接投与（Curielら,  Human  Gene  and  Therapy  3:147-154,  1992)）による細胞のトランスフェクションが挙げられる。
【００９２】
本発明の特定の好ましい実施態様において、目的の抗原（単数または複数）の免疫原部分を含むタンパク質は、ベクター構築物の投与前に投与される。簡単には、下記により詳細に記載されるように、インビボで存在する抗原の量は、高レベルのThプライミングを引き出すには不十分でり得る。従って、特定の実施態様において、抗原の合成免疫原部分は、ベクター構築物（例えば、レトロウイルスベクター）の投与の前にThプライミングを増強するために投与され得る。
【００９３】
本発明の特定の好ましい実施態様において、温血動物（例えば、ヒト）からの血液は、動物中に存在するTヘルパー応答のレベルを決定するためにアッセイされる。この様なアッセイを達成するための代表的な方法は、Maruyamaら,  J.Clinical  Invest  91:2586-2595,1993、Maruyamaら,  Gastro  105:1141-1151,  1993に、より詳細に記載されている。
【００９４】
組成物
本発明の好ましい実施態様において、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原部分の発現を導くベクター構築物、その抗原の免疫原部分を含むタンパク質、および必要に応じて薬学的受容可能なキャリアまたｈ希釈剤を含む組成物が提供される。上記のように、広範な種々のベクター構築物が、例えば組み換えレトロウイルス、またはパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアルファウイルスからなる群より選択される組み換えウイルスを含む本発明の状況において利用され得る。
【００９５】
そのような組成物は、液体溶液としてか、または投与前に溶液に懸濁される固体形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかで調製され得る。さらに、組成物は、注射、経口投与、または直腸投与のいずれかのために適切なキャリアまたは希釈剤を用いて調製され得る。一般的に、ベクター構築物が組み換えウイルスである場合、ウイルスは、処方の前に、0.25％〜25％の範囲で、そして好ましくは約５％〜20％の範囲の濃度で調製される。次いで、組成物の調製後、組換えウイルスは、用量あたり約１μgの材料、そして同時精製夾雑物としてこの量の約10倍の材料（10μg)で構成される。好ましくは、組成物は、下記のように、処方される水性溶液の0.1〜1.0mlにおいて調製される。
【００９６】
本発明の特定の実施態様において、本明細書中で提供される組成物は、アジュバントとともに処方され得る。適切なアジュバントの代表例は、MF-59、水酸化アルミニウム（「Alumn」）、MAP(Multiple  Antigen  Peptides)などが含まれる。
【００９７】
薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに非毒性である。注射可能な溶液のキャリアまたは希釈剤の代表例は、水、好ましくは生理学的pHで緩衝化される等張性生理食塩水溶液（リン酸緩衝化生理食塩水またはTris緩衝化生理食塩水のような）、マンニトール、ブドウ糖、グリセロール、およびエタノール、ならびにヒト血清アルブミンのようなポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。特に好ましい組成物は、10mg/ml  マンニトール、1mg/ml  HSA、20mM  Tris,  pH  7.2、および150mM  NaClにおいてベクターまたは組み換えベクターを含む。この場合、組換えウイルスは、材料の約１μgを示すので、１％未満の高分子量材料、および全体材料（水を含む）の1/100,000未満であり得る。この組成物は、-70℃で少なくとも６ヶ月間安定である。組成物はまた、静脈内(i.v.)または皮下(s.c.)へ注射され得るが、一般的には筋肉内(i.m.)に注射されることが好ましい。通常使用される個々の用量は、107〜109c.f.u.(HT1080細胞で力価測定されたネオマイシン耐性のコロニー形成単位）である。これらは、１〜４週間の間隔で、最初は３または４の用量で投与される。追加抗原注射は、６〜12ヶ月後、そしてその後は毎年、１または２の用量で与えられ得る。
【００９８】
経口処方物はまた、セルロース、ラクトース、マンニトール、ポリ(DL-ラクチド-co-グリコール酸）スフェア、および／またはデンプンのような炭水化物のようなキャリアまたは希釈剤とともに用いられ得る。組成物は、例えば、錠剤、ゲルカプセル、ピル、溶液、または懸濁液の形態で服用され得、そしてさらに持続放出のために処方され得る。直腸投与について、坐薬の調製は、ポリアルキレングルコース、またはトリグリセリドのような伝統的なキャリアとともに達成され得る。
【００９９】
上記のように、ベクター構築物は、肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原部分に加えて、免疫調節補因子を直接発現し得る。しかし、ベクター構築物がサイトカインである免疫調節補因子を発現しない場合、このサイトカインは上記の組成物を含み得るか、または上記組成物と別々に（同時または引き続いて）投与され得る。簡単には、このような実施態様において、免疫調節補因子は、好ましくは標準的プロトコールおよびThe  Physician's  Desk  Referenceに指示されるような投与量に従って投与される。例えば、αインターフェロンは、２〜４ヶ月間100万〜500万単位／kg体重の投薬量で、IL-2は、２〜12週間10,000〜100,000単位／kg体重で、１〜３回／日の投薬量で投与され得る。γインターフェロンは、150,000〜1,500,000単位、２〜３回／週で、１〜12週間の投薬量で投与され得る。
【０１００】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されない。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
HBV  E/コア配列の単離
Ｂ型肝炎ウイルスの完全なプレコア／コアコード領域を含む1.8Kb  BamHIフラグメントをプラスミドpAM6(ATCC番号45020)から得、そしてKS  II+(Stratagene,  La  Jolla,  California)のBamHI部位へ連結する。このプラスミドを、KSII+  HBpc/cと称する（図１）。XhoIリンカーを、KSII+  HBpc/c中のプレコア／コアのStuI部位へ（ヌクレオチド配列1704で）付加し、次いでHincIIで（ヌクレオチド配列2592で)切断する。得られた877塩基対のXhoI-HincIIプレコア／コアフラグメントを、SKII+のXhoI/HincII部位へクローン化する。このプラスミドを、SK+HBeと称する（図１）。
【０１０２】
実施例２
PCRを用いた配列の調製
Ａ．PCRを用いたHBV  e/コア配列の部位特異的変異誘発
プラスミドKSII+  HBpc/c中のプレコア／コア遺伝子を配列決定して、プレコア／コアコード領域が正しいか否かを決定する。この配列は、コドン84および85で２つの連続的なインフレームでのTAG終止コドンを生じるコドン79でのフレームシフトを生じる単一の塩基対欠失を有することが見出された（図２）。この欠失は、プラスミドSK+HBe中のプレコア／コアコーディング領域のPCRオーバーラップ伸長によって補正される(Hoら,  Gene  77:51-59,  1989)。４つのオリゴヌクレオチドプライマーを、正確な欠失を行う３つのPCR反応のために使用する。
【０１０３】
最初の反応はテンプレートとしておよび２つのプライマーとしてプラスミドKSII+HB  pc/cを利用する。センスプライマー配列は、adw株のヌクレオチド配列1855〜1827に対応し、そして5'末端で２つのXhoI制限部位を含む。ヌクレオチド配列のナンバリングは、Genbank(Intelligenics,  Inc.,  Mountain  View,  California)から入手した。
（配列番号１）
5'-3':  CTC  GAG  CTC  GAG  GCA  CCA  GCA  CCA  TGC  AAC  TTT  TT
第２のプライマー配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのadw株のアンチセンスヌクレオチド配列2158〜2130に対応し、そしてコドン79、84、および85を含む。
（配列番号２）
5'-3':CTA  CTA  GAT  CCC  TAG  ATG  CTG  GAT  CTT  CC
第２の反応はまた、テンプレートとしてプラスミドKS  II+HB  pc/cおよび２つのプライマーを利用する。センスプライマーは、adw株のヌクレオチド配列2130〜2158に対応し、そしてコドン79、84、および85を含む。
（配列番号３）
5'-3':GGA  AGA  TCC  AGC  ATC  TAG  GGA  TCT  AGT  AG
第２のプライマーはSK+プラスミドポリリンカー由来のアンチセンスヌクレオチド配列に対応し、HBVプレコア／コアコーディング領域の終止コドンの135bp下流のClaI部位を含む。
（配列番号4）
5'-3':GGG  CGA  TAT  CAA  GCT  TAT  CGA  TAC  CG
第３の反応はまた、第１および第２のPCR反応の２つのプライマーおよび産物を利用する。センスプライマーはadw株のヌクレオチド配列５〜27に対応し、そして5'末端に２つのXhoI制限部位を含む。
（配列番号１）
5'-3':  CTC  GAG  CTC  GAG  GCA  CCA  GCA  CCA  TGC  AAC  TTT  TT
第２のプライマー配列は、SK+プラスミドポリリンカーのアンチセンスヌクレオチド配列に対応し、HBVプレコア／コアコーディング領域の終止コドンの135bp下流のClaI部位を含む。
（配列番号4）
5'-3':GGG  CGA  TAT  CAA  GCT  TAT  CGA  TAC  CG
第１のPCR反応は、アンチセンス鎖における欠失を補正し、そして第２の反応は、センス鎖における欠失を補正する。PCR反応１および２は、コドン79において生じるCCからCCAへの変異、およびコドン81におけるTCAからTCTへの塩基対置換を補正する（図２を参照のこと）。プライマー１は、HBV  eコーディング領域のATGコドンの10bp上流の２つの連続するXhoI部位を含み、そしてプライマー４はHBVプレコア／コアコーディング領域の終止コドンの135bp下流のClaI部位を含む。第１および第２のPCR反応の産物を第３のPCR反応において伸長して、正しい配列を有する完全なHBVプレコア／コアコーディング領域を作製する（図３）。
【０１０４】
PCR反応を、以下のサイクル条件を用いて行う：サンプルをまず94℃で2分間加熱する。融解工程といわれるこの工程は、合成のために二本鎖DNAを一本鎖に分離する。次いで、サンプルを56℃で30秒間加熱する。アニーリング工程といわれるこの工程は、プライマーが第１の工程において作製された一本鎖DNAへのアニールするのを可能にする。次いで、サンプルを72℃で30秒加熱する。伸長工程といわれるこの工程は、第１の工程で作製された一本鎖DNAの相補鎖を合成する。第二の融解工程を、94℃30秒で行い、続いて56℃で30秒アニーリング工程を行い、続いて72℃30秒で伸長工程を行う。次いでこの手順を35サイクル繰り返し、所望のDNA産物の増幅を生じる。
【０１０５】
PCR反応産物をゲル電気泳動で精製し、そしてNA45濾紙(Schleicher  and  Schuell,  Keene,  New  Hampshier)上へ移す。所望の787bp  DNAフラグメントを、400μlの高塩濃度緩衝液(1.5M  NaCl、20mM  Tris,  pH  8.0、および0.1mM  EDTA)において65℃で30分間インキュベートすることによってNA45濾紙から溶出する。溶出の後、500μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1)を溶液へ添加する。混合物をボルテックスし、次いでBrinkmann  Eppendorf遠心機(5415L)において14,000rpmで5分間遠心分離する。所望のDNAフラグメントを含む水相を、1.5mlの微量遠心管に移し、1.0mlの100％  EtOHを添加する。溶液を、ドライアイス上で５分間インキュベートし、次いで10,000rpmで20分間遠心分離する。上清をデカントし、そして沈殿を500μlの70％EtOHで洗浄する。沈殿を、Savant  Speed-Vacコンセントレーターにおいて真空下の10,000rpmでの遠心分離によって乾燥し、次いで10μlの脱イオンH2Oに再懸濁する。１μlのPCR産物を、1.5％アガロースゲル電気泳動によって分析する。787  XhoI-ClaIプレコア／コアPCR増幅フラグメントをSK+プラスミドのXhoI-ClaI部位へクローン化する。このプラスミドを、SK+HBe-cと称する。E.coli(DH5α、Bethesda  Research  Labs,  Gaithersburg,  Maryland)をSK+HBe-cプラスミドで形質転換し、増殖してプラスミドDNAを作製する。次いで、本質的にBirnboimら(Nuc.  Acid  Res.  7:1513,  1979;  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Sambrookら（編）,  Cold  Spring  Harbor  Press,  1989)もまた参照のこと）に記載のように、プラスミドを単離し、そして精製する。SK+HBe-cプラスミドを分析して、プレコア／コア遺伝子の配列を確認する（図４）。
【０１０６】
Ｂ．HBVコア配列の単離
プラスミドSK+HBeにおける１塩基対欠失を、実施例2Aに記載のように、PCRオーバーラップ伸長法によって補正する。４つのオリゴヌクレオチドプライマーをPCR反応実施のために用いて、変異を補正する。
【０１０７】
第１の反応は、テンプレートとしてのプラスミドKSII+HBpc/cおよび２つのプライマーを利用する。センスプライマーは、SK+HBeプラスミドのT-7プロモーターについてのヌクレオチド配列に対応する。
（配列番号５）
5'-3':AAT  ACG  ACT  CAC  TAT  AGG  G
第２のプライマーは、adw株のアンチセンス配列2158〜2130に対応し、そしてコドン79、84、および85を含む。
（配列番号２）
5'-3':CTA  CTA  GAT  CCC  TAG  ATG  CTG  GAT  CTT  CC
第２の反応は、テンプレートとしてのプラスミドKSII+HB  pc/cおよび２つのプライマーを利用する。アンチセンスプライマーは、SK+HBeプラスミドに存在するT-3プロモーターについてのヌクレオチド配列に対応する。
（配列番号６）
5'-3':ATT  AAC  CCT  CAC  TAA  AG
第２のプライマーは、adw株のセンスヌクレオチド配列2130〜2158に対応し、そしてコドン79、84、および85を含む。
（配列番号３）
5'-3':GGA  AGA  TCC  AGC  ATC  TAG  GGA  TCT  AGT  AG
第３の反応は、２つのプライマーならびに第１および第２のPCR反応の産物を利用する。アンチセンスプライマーは、SK+HBeプラスミドに存在するT-3プロモーターについてのヌクレオチド配列に対応する。
（配列番号６）
5'-3':ATT  AAC  CCT  CAC  TAA  AG
第２のプライマーは、SK+HBeプラスミドに存在するT-7プロモーターのセンス配列に対応する。
（配列番号７）
5'-3':AAT  ACG  ACT  CAC  TAT  AGG  G
第３の反応からのPCR産物は、HBVプレコア／コアコーディング領域について正しい配列を生じる。
【０１０８】
HBVコアコーディング領域を単離するために、プライマーを、コアコーディング領域のATG開始コドンの上流にXhoI部位を導入し、そしてHBVプレコア／コア領域の29アミノ酸リーダー配列を除去するように設計する。第４の反応において、HBVコアコーディング領域を、第３の反応からのPCR産物および以下の２つのプローブを用いて作製する。
【０１０９】
センスプライマーは、adw株のヌクレオチド配列1885〜1905に対応し、そして5'末端で２つのXhoI部位を含む。
（配列番号８）
5'-3':CCT  CGA  GCT  CGA  GCT  TGG  GTG  GCT  TTG  GGG  CAT  G
第２のプライマーは、SK+HBeプラスミドに存在するT-3プロモーターについてのアンチセンスヌクレオチド配列に対応する。第４のPCR反応からの約600bp  PCR産物は、HBVコアコーディング領域、ならびに5'末端に新規のXhoI制限部位、および3'末端にSK+HBeプラスミドのマルチクローニング部位に存在するClaI制限部位を含む。
（配列番号９）
5'-3':ATT  ACC  CCT  CAC  TAA  AG
第４のPCR反応の後、溶液を新しい1.5ml微量遠心管に移す。15μlの３M酢酸ナトリウムをこの溶液へ添加し、次いで500μlのクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1)を添加する。混合物をボルテックスし、次いで14,000rpmで５分間遠心分離する。水相を新しい微量遠心管に移し、そして1.0ml  100％EtOHを添加する。この溶液を、-20℃で4.5時間インキュベートし、次いで10,000rpmで20分間遠心分離する。上清をデカントし、そして沈殿を500μlの70％EtOHで洗浄する。ペレットを真空下の10,000rpmでの遠心分離によって乾燥し、次いで10μlの脱イオンH2Oに再懸濁する。１μlのPCR産物を、1.5％アガロースゲルにおける電気泳動によって分析する。
【０１１０】
Ｃ．HCVコア配列の単離
血清の200μlサンプルを、慢性非Ａ非Ｂ肝炎を有する患者から入手し、ウイルスRNAをCristianoら,  Hepatology  14:51-55,  1991の手順によって調製する。200μlの血清を、4.2Mイソチオシアン酸グアニジン(Fluka  Chemical  Corp.,  St.Louis,  Missouri)、0.5％ラウリルサルコシン酸(sarkosate)ナトリウム、および25mM  Tris  HCL,  pH8.0を含む550μlの抽出緩衝液と混合し、そしてフェノール：クロロホルム(1:1)で１度、およびクロロホルムで１度抽出する。水相を、等量のイソプロピルアルコールおよび14,000rpmで５分間の遠心分離で沈殿させる。ウイルスRNAを含む得られた沈殿を70％エタノールで洗浄し、そして200μlのRNaseを含まない脱イオンH2Oに再懸濁する。４μlのRNasin(40,000U/ml)(Promega  Corp.,  Madison,  Wisconsin)を混合物に添加する。この混合物はHCV  RNAを含み、そして以下の逆転写反応のテンプレートである。cDNA  CYCLEキット(Invitrogen,  San  Diego,  California)を用いて、全長第１鎖cDNAを、単離されたウイルスmRNAから作製する。７μlの上記の逆転写反応物（100ngの全長第１鎖cDNA)を、10μlの10×PCR緩衝液（バイアルC16)、２μlの25mM  dNTP（バイアルC11)、5％のDMSO、４UのTaq  DNAポリメラーゼ（Cetus,  Los  Angeles,  California)、および２lMの各２つのプライマーを含む全量100μlの反応混合物中でPCRによって増幅する。
【０１１１】
センスプライマーは、ヌクレオチド配列316〜335に対応し、そしてC型肝炎ウイルスコアオープンリーディングフレームの5'領域のヌクレオチド配列であり、そしてATG開始コドンを含む。
【０１１２】
（配列番号10）
5'-3'：GTA  GAC  CGT  GCA  TCA  TGA  GC
第２のプライマーは、C型肝炎ウイルスエンベロープオープンリーディングフレームに存在するアンチセンスヌクレオチド配列1172〜1153に対応する。
【０１１３】
（配列番号11）
5'-3'：ATA  GCG  GAA  CAG  AGA  GCA  GC
反応混合物を、PCR  Gene  AMP  System  9600（Perkin-Elmer,  Cetus,  Los  Angeles,  California）に配置する。PCRプログラムは、反応容器の温度を、最初95℃で１分間、次いで60℃で２分間、そして最後は72℃にて２分間で、調節する。このサイクルを、40回くり返す。40回目のサイクルの後、最終サイクルを、反応容器を95℃で１分間、次いで67℃で２分間、そして最後は72℃にて７分間で、調節する。
【０１１４】
第１のPCR反応において、ATG開始コドンから上流の、5'領域からHCV  E1オープンリーディングフレームの始まりまでのHCVコアオープンリーディングフレームを、増幅する。ヌクレオチドナンバリング配列は、HCV-J株に従う（Katoら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  87：9524-9528,  1990）。
【０１１５】
第１のPCR反応からの産物を、第２のPCR反応で増幅する。第２のPCR増幅を、ヌクレオチド配列329〜367に対応する（およびC型肝炎ウイルスコアオープンリーディングフレームの5'末端のヌクレオチド配列である）センスプライマーを用いて行う。センスプライマーの5'末端は、２つの連続したXho  I制限部位を含む。このプライマーはまた、翻訳開始の適切な規則を確実にするために、イニシエーターATG開始コドンの領域に導入される多数のヌクレオチド変化を含む（Kozak,  Mol.  Biol.  196：947-950,  1987）。
【０１１６】
（配列番号12）
5'-3'：CTC  GAG  CTC  GAG  CCA  CCA  TGA  GCA  CAA  ATC  CTA  AAC  CTC  AAA  GAA  AAA  CCA  AAC  G
アンチセンスプライマーを、HCVコア遺伝子とインフレームで２つの連続した終止コドンを含むように設計する。プライマーの5'末端は、２つの連続したHind  III制限部位を含む。このプライマーは、ヌクレオチド配列902〜860に対応し、そしてC型肝炎ウイルスコアとE1オープンリーディングフレームとの間の結合点である。
【０１１７】
（配列番号13）
5'-3'：GC  AAG  CTT  AAG  CTT  CTA  TCA  AGC  GGA  AGC  TGG  GAT  GGT  CAA  ACA  AGA  CAG  CAA  AGC  TAA  GAG
次いで、TA  Cloning  Kit（Invitrogen,  San  Diago,  Calfornia）を用いて、第２の反応からの570bpのPCR増幅産物をpCR  IIベクター（Invitrogen,  San  Diego,  California）に連結し、そして凍結したコンピテントE.  coli細胞に形質転換する。DNA配列決定による確認の後、この構築物を、pCR  II  Xh-H  HCVコアと称す。
【０１１８】
第１のPCR反応からの産物をまた、三次PCR反応において増幅する。センスプライマーの5'末端は、２つの連続したHind  III制限部位を含む。このプライマーはまた、翻訳開始のKozak規則を確認するために、ヌクレオチド変化を含み、そしてHCV-J配列のヌクレオチド配列329〜367に対応する（およびC型肝炎ウイルスコアオープンリーディングフレームの5'末端のヌクレオチド配列である）。
【０１１９】
（配列番号14）
5'-3'：AAG  CTT  AAG  CTT  CCA  CCA  TGA  GCA  CAA  ATC  CTA  AAC  CTC  AAA  GAA  AAA  CCA  AAC  G
アンチセンスプライマーを、HCVコア遺伝子とインフレームで２つの終止コドン、およびプライマーの5'末端に２つの連続したXho  I制限部位を含むように設計する。このプライマーは、アンチセンスヌクレオチド配列902〜860に対応し、そしてC型肝炎ウイルスコアとE1リーディングフレームとの間の結合点である。
【０１２０】
（配列番号15）
5'-3'：GC  CTC  GAG  CTC  GAG  CTA  TCA  AGA  GGA  AGC  TGG  GAT  GGT  CAA  ACA  AGA  CAG  CAA  AGC  TAA  GAG
上記のように、第３の反応からの570bp  PCR増幅産物を、pCR  IIベクターに連結する。DNA配列決定による確認の後、この構築物を、pCR  II  H-Xh  HCVコアと称する。
【０１２１】
D．HCV  NS3/NS4配列の単離
C型肝炎ウイルスNS3/NS4配列を、慢性非Ａ、非Ｂ型肝炎に罹患した患者から得た200μlの血清から、実施例2Cに記載されるように単離する。ウイルスRNAを、CDNA  CYCLE  Kit（Invitrogen,  San  Diego,  California）により逆転写し、そしてPCRにより増幅する。第１のPCR反応において、HCV  NS3/NS4オープンリーディングフレームを増幅する。
【０１２２】
第１のPCR増幅を、２つのプライマーで行う。センスプライマーは、C型肝炎ウイルスNS2オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列3088〜3106に対応する。
【０１２３】
（配列番号16）
5'-3'：GTG  CAT  GCA  TGT  TAG  TGC  G
第２のプライマーは、C型肝炎ウイルスNS5オープンリーディングフレームのアンチセンスヌクレオチド配列6530-6511に対応する。
【０１２４】
（配列番号17）
5'-3'：CGT  GGT  GTA  TGC  GTT  GAT  GG
第１のPCR反応からの産物を、第２のPCR反応において増幅する。センスプライマーの5'末端は、２つの連続したXho  I制限部位を含む。このプライマーはまた、翻訳開始のためのKozak規則を確認するために、ヌクレオチド変化を含み、そしてHCV-J配列のNS3オープンリーディングフレームの5'領域のヌクレオチド配列3348〜3385に対応する。
【０１２５】
（配列番号18）
5'-3'：C  CTC  GAG  CTC  GAG  CCA  CCA  TGG  GGA  AGG  AGA  TAC  TTC  TAG  GAC  CGG  CCG  ATA  GTT  TTG  G
このプライマーは、HCV-J配列のNS4オープンリーディングフレームの3'領域のヌクレオチド配列6368〜6328に対応する。このプライマーは、HCV  NS4  NS4遺伝子をインフレームでの２つの連続した終止コドン、ならびにその5'末端に２つの連続したHind  III部位を含む。
【０１２６】
（配列番号19）
5'-3'：GC  AAG  CTT  AAG  CTT  CTA  TCA  GCG  TTG  GCA  TGA  CAG  GAA  AGG  GAG  TCC  CGG  TAA  CCG  CGG  C
第２のPCR反応からの3020bp  PCR産物を、pCR  IIプラスミドに連結し、DNA配列決定によって確認し、そしてpCR  II  Xh-H  HCV  NS3/NS4と称する。
【０１２７】
E．免疫調節補因子IL-2の増幅
Jurkat細胞を、T75フラスコ中で、158mlの最終容量まで、１×106細胞/mlで再懸濁した。植物性凝集素（PHA；Sigma,  St.  Louis,  MO）を、１％の全容量まで添加し（1.58ml全量）、37℃、５％CO2で、一晩インキュベートする。次の日に、細胞を３つの50mlの遠心チューブ（Corning,  Corning,  NY）に採取する。３つのペレットを、50mlのPBS中で合わせ、3,000rpmで5分間遠心分離し、そして上清をデカントする。この手順をくり返す。Poly  A+  mRNAを、Micro-Fast  Track  mRNA  Isolation  Kit、バージョン1.2（Invitrogen,  San  Diego,  California）を用いて単離する。この単離したインタクトなmRNAを、テンプレートとして使用し、以下のプライマーを用いてcDNA  CYCLEキットによって全長の一次鎖cDNAを生成する。
【０１２８】
このオリゴヌクレオチドは、IL-2  mRNAの終止コドンの25塩基対下流のアンチセンスヌクレオチド配列に対応する。
【０１２９】
（配列番号20）
5'-3'：ATA  AAT  AGA  AGG  CCT  GAT  ATG
逆転写反応からの産物を、２つの別々の反応で増幅する。第１のPCR増幅を、ATG開始コドンの３bp上流に対応するセンスプライマーを用いて行う。このプライマーは、その5'末端にHind  III部位を含み、およびATG開始コドンを含むIL-2オープンリーディングフレームの5'領域を含む。
【０１３０】
（配列番号21）
5'-3'：GCA  AGC  TTA  CAA  TGT  ACA  GGA  TGC  AAC  TCC  TGT  CT
アンチセンスプライマーは、IL-2オープンリーディングフレームの3'領域に相補的であり、TGA終止コドンの３bp下流から始まる。このプライマーは、プライマーの5'末端にXho  I部位を含む。
【０１３１】
（配列番号22）
5'-3'：GAC  TCG  AGT  TAT  CAA  GTC  AGT  GTT  GAG  ATG  ATG  CT
第１のPCR反応からの467bpのPCR産物を、pCR  IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そしてpCR  II  H-Xh  IL-2と称する。
【０１３２】
逆転写反応からの産物を、第２のPCR反応で増幅する。第２のPCR増幅を、ATG開始コドンの３bp上流に対応するセンスプライマーを用いて行う。このプライマーは、5'末端にXho  I部位、およびATG開始コドンを含むIL-2オープンリーディングフレームの5'領域を含む。
【０１３３】
（配列番号23）
5'-3'：GCC  TCG  AGA  CAA  TGT  ACA  GGA  TGC  AAC  TCC  TGT  CT
アンチセンスプライマーは、IL-2オープンリーディングフレームの3'領域に相補的であり、そしてTGA終止コドンの３bp下流から始まる。このプライマーは、プライマーの5'末端にApa  I部位を含む。
【０１３４】
（配列番号24）
5'-3'：GAG  GGC  CCT  TAT  CAA  GTC  AGT  GTT  GAG  ATG  ATG  CT
第２のPCR反応からの467bpのPCR産物を、pCR  IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そして凍結したコンピテントE.  coli細胞に形質転換する。このベクター構築物を、pCR  II  Xh-A  IL-2と称する。
【０１３５】
F．免疫調節補因子B7の増幅
Raji細胞を、５つのT75フラスコ中で、全容量158mlまで、１×106細胞/mlで再懸濁し、そして37℃、５％CO2で一晩インキュベートする。次の日に、細胞を３つの50ml遠心チューブに採取する。細胞ペレットを、50mlのPBS中で合わせ、2,000rpmで10分間遠心分離し、そして上清をデカントする。この手順をくり返す。Poly  A+  mRNAを、実施例E2に記載されるように単離する。単離したインタクトなmRNAをテンプレートとして使用し、cDNA  CYCLEキットを用いて全長の一次鎖cDNAを生成し、続いて２つの別々のPCR増幅反応を、プライマーとして１μgのオリゴdT（バイアルC5）を用いることを除いて、本質的に実施例2Eに記載されるように行う。ヌクレオチドナンバリングシステムは、Freemanら（J.  Immunol.  143：2714-2722,  1989）から得られる。
【０１３６】
第１のPCR増幅を、２つのプライマーを用いて行う。センスプライマーは、B7のヌクレオチド配列315〜353に対応する。このプライマーは、ATG開始コドンを含むB7オープンリーディングフレームの5'領域を含み、および5'末端に２つのHind  III制限部位を有する。
【０１３７】
（配列番号25）
5'-3'：GG  AAG  CTT  AAG  CTT  GCC  ATG  GGC  CAC  ACA  CGG  AGG  CAG  GGA  ACA  TCA  CCA  TCC
第２のプライマーは、B7のアンチセンスヌクレオチド配列1187〜1149に対応する。このプライマーは、TAA終止コドンで終結するB7オープンリーディングフレームの3'領域に相補的であり、そして5'末端に２つのXho  I制限部位を含む。
【０１３８】
（配列番号26）
5'-3'：C  CTC  GAG  CTC  GAG  CTG  TTA  TAC  AGG  GCG  TAC  ACT  TTC  CCT  TCT  CAA  TCT  CTC
第１のPCR反応からの868bp  PCR産物を、pCR  IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そして凍結したコンピテントE.  coli細胞に形質転換する。このベクター構築物を、PCR  II  H-Xh-B7と称し、そしてDNA配列決定により確認する。
【０１３９】
第２のPCR増幅を、２つのプライマーを用いて行う。センスプライマーは、B7のヌクレオチド配列315〜353に対応する。このプライマーは、ATG開始コドンを含むB7オープンリーディングフレームの5'領域を含み、そしてその5'末端に２つのXho  I部位を有する。
【０１４０】
（配列番号27）
5'-3'：C  CTC  GAG  CTC  GAG  GCC  ATG  GGC  CAC  ACA  CGG  AGG  CAG  GGA  ACA  TCA  CCA  TCC
第２のプライマーは、B7のアンチセンスヌクレオチド配列1187〜1149に対応する。このプライマーは、TAA終止コドンで終結するB7オープンリーディングフレームの3'領域に相補的であり、そして5'末端に２つのApa  I制限部位を含む。
【０１４１】
（配列番号28）
5'-3'：C  GGG  CCC  GGG  CCC  CTG  TTA  TAC  AGG  GCG  TAC  ACT  TTC  CCT  TCT  CAA  TCT  CTC
第２のPCR反応からの868bpのPCR産物を、pCR  IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そして凍結したコンピテントE.  coli細胞に形質転換する。このベクター構築物をpCR  II  Xh-A-B7と称し、そしてDNA配列決定により確認する。
【０１４２】
G．免疫調節補因子GM-CSFの合成
GM-CSFの合成を、FoguetおよびLubbert（Biotechniques  13：674-675,  1992）のプロトコルに従って行う。簡単には、10の重なったオリゴヌクレオチド、53〜106のヌクレオチド長を合成する。第１のオリゴヌクレオチドは、5'末端に２つのHind  III部位を含むヌクレオチド配列番号29〜86の、ヒトGM-CSFのセンス配列である。
【０１４３】
（配列番号29）
5'-3'：GCA  AGC  TTA  AGC  TTG  AGG  ATG  TGG  CTG  CAG  AGC  CTG  CTG  CTC  TTG  GGC  ACT  GTG  GCC  TGC  AGC  ATC  TCT  GCA
第２のオリゴヌクレオチド配列は、5'末端に２つのXho  I部位を含むヌクレオチド配列番号29〜86の、ヒトGM-CSFのセンス配列である。
【０１４４】
（配列番号47）
5'-3'：GC  CTC  GAG  CTC  GAG  GAG  GAT  GTG  GCT  GCA  GAG  CCT  GCT  GCT  CTT  GGG  CAC  TGT  GGC  CTG  CAG  CAT  CTC  TGC  A
第３のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列番号145〜70の、ヒトGM-CSFのアンチセンス配列である。
【０１４５】
（配列番号30）
5'-3'：TCC  TGG  ATG  GCA  TTC  ACA  TGC  TCC  CAG  GGC  TGC  GTG  CTG  GGG  CTG  GGC  GAG  CGG  GCG  GGT  GCA  GAG  ATG  CTG  CAG
第４のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号131〜191の、ヒトGM-CSFのセンス配列である。
【０１４６】
（配列番号31）
5'-3'：GAA  TGC  CAT  CCA  GGA  GGC  CCG  GCG  TCT  CCT  GAA  CCT  GAG  TAG  AGA  CAC  TGC  TGC  TGA  GAT  G
第５のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号282〜176の、ヒトGM-CSFのアンチセンス配列である。
【０１４７】
（配列番号32）
5'-3'：CTT  GTA  CAG  CTC  CAG  GCG  GGT  CTG  TAG  GCA  GGT  CGG  CTC  CTG  GAG  GTC  AAA  CAT  TTC  TGA  GAT  GAC  TTC  TAC  TGT  TTC  ATT  CAT  CTC  AGC  AGC  AGT
第６のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号265〜346の、ヒトGM-CSFのセンス配列である。
【０１４８】
（配列番号33）
5'-3'：CCT  GGA  GCT  GTA  CAA  GCA  GGG  CCT  GCG  GGG  CAG  CCT  CAC  CAA  GCT  CAA  GGG  CCC  CTT  GAC  CAT  GAT  GGC  CAG  CCA  CTA  CAA  GCA  GCA  CTG
第７のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号389〜331の、ヒトGM-CSFのアンチセンス配列である。
【０１４９】
（配列番号34）
5'-3'：GGT  GAT  AAT  CTG  GGT  TGC  ACA  GGA  AGT  TTC  CGG  GGT  TGG  AGG  GCA  GTG  CTG  CTT  GTA  G
第８のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号372〜431の、ヒトGM-CSFのセンス配列である。
【０１５０】
（配列番号35）
5'-3'：CAA  CCC  AGA  TTA  TCA  CCT  TTG  AAA  GTT  TCA  AAG  AGA  ACC  TGA  AGG  ACT  TTC  TGC  TTG  TC
第９のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号520〜416の、ヒトGM-CSFのアンチセンス配列であり、そして5'末端に２つのXho  I制限部位を含む。
【０１５１】
（配列番号36）
5'-3'：GC  CTC  GAG  CTC  GAG  GTC  TCA  CTC  CTG  GAC  TGG  CTC  CCA  GCA  GTC  AAA  GGG  GAT  GAC  AAG  CAG  AAA  GTC  C
第10のオリゴヌクレオチドは、5'末端にXho  I制限部位の代わりに２つのXba  I制限部位を含むことを除いて、オリゴヌクレオチド番号９と同一である。
【０１５２】
（配列番号37）
5'-3'：GC  TCT  AGA  TCT  AGA  GTC  TCA  CTC  CTG  GAC  TGG  CTC  CCA  GCA  GTC  AAA  GGG  GAT  GAC  AAG  CAG  AAA  GTC  C
配列番号29、36、37、および47のオリゴヌクレオチドを除く全てのオリゴヌクレオチドを、リン酸化する。連結を、８pmolの各オリゴヌクレオチドと7.5μlの10×  Sequenase  Buffer（US  Biochemical,  Cleveland,  Ohio）とを、滅菌蒸留脱イオンH2Oで75μlの最終容量まで混和することによって行う。反応を70℃で５分間、続いて48℃で５分間加熱する。２μlのdNTPミックス（2.5mMの各dNTP）および10U  Sequenaseを添加し、そして37℃で30分間インキュベートする。Sequenaseを不活性化するために、連結反応物を70℃で10分間加熱する（Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  F.M.  Asubelら、8.2.8-8.2.13,  1988）。
【０１５３】
１μlの連結混合物を、Ventポリメラーゼ（New  England  Biolabs,  Beverly,  Massachusetts）、およびプライマーとして２つのオリゴヌクレオチド配列番号29および36とともに、PCR反応で使用する。PCR産物をpCR  IIベクター中に連結し、そして凍結したコンピテントE.  coli細胞中に形質転換する。この構築物をpCR  II  H-Xh  GM-CSFと称し、そしてDNA配列決定により確認する。
【０１５４】
１μlの連結混合物を、Ventポリメラーゼとともに、プライマーとして２つのオリゴヌクレオチド配列番号47および37を用いて、第２のPCR反応で使用した。PCR産物をpCR  IIベクター中に連結し、そして凍結したコンピテントE.  coli細胞中に形質転換する。この構築物をpCR  II  Xh-Xb  GM-CSFと称し、そしてDNA配列決定により確認する。
【０１５５】
H．HBV  Pre-S2オープンリーディングフレームの単離
Pre-S2オープンリーディングフレーム（Ｓを含む）を、２つのプライマー、およびテンプレートとしてpAM  6プラスミド（ATCC番号45020）を用いて、PCR増幅する。センスプライマーは、B型肝炎ウイルスのadw株のヌクレオチド3178〜31に対応し、そしてPre-S2オープンリーディングフレームの5'領域およびATG開始コドンを含む。このプライマーの5'末端は、２つの連続したXho  I制限部位を含む。
【０１５６】
（配列番号48）
5'-3'：GC  CTC  GAG  CTC  GAG  GTC  ATC  CTC  AGG  CCA  TGC  AGT  GGA  ATT  CCA  CTG  CCT  TGC  ACC  AAG  CTC  TGC  AGG
第２のプライマーは、アンチセンスヌクレオチド配列907〜859に対応し、そしてPre-S2オープンリーディングフレームの3'領域に相補的である。このプライマーの5'末端は、２つのCla  I部位を含む。
【０１５７】
（配列番号49）
5'-3'：GC  ATC  GAT  ATC  GAT  GTT  CCC  CAA  CTT  CCA  ATT  ATG  TAG  CCC  ATG  AAG  TTT  AGG  GAA  TAA  CCC  C
957bpのPCR産物をpCR  IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そしてpCR  II  HB-Pre-S2と称する。
【０１５８】
Ｉ．HBVポリメラーゼオープンリーディングフレームの単離
PCR増幅を、２つのプライマー、およびテンプレートとしてpAM  6プラスミド（ATCC  40202）を用いて行う。センスプライマーはB型肝炎ウイルスのadw株のヌクレオチド2309〜2370に対応し、そして翻訳のためにKozak規則を確認するためのヌクレオチド変化を有するポリメラーゼオープンリーディングフレームの5'領域を含む。このプライマーの5'末端は、２つの連続したXho  I制限部位を含む。
【０１５９】
（配列番号50）
5'-3'：GC  CTC  GAG  CTC  GAG  ACC  ATG  CCC  CTA  TCT  TAT  CAA  CAC  TTC  CGG  AAA  CTA  CTG  TTG  TTA  GAC  GAC  GGG  ACC  GAG  GCA  GG
第２のプライマーは、アンチセンスヌクレオチド配列1645〜1594に対応し、そしてポリメラーゼオープンリーディングフレームの3'領域に相補的であり、そしてTGA終止コドンを含む。このプライマーの5'末端は、２つのCla  I部位を含む。
【０１６０】
（配列番号51）
5'-3'：GC  ATC  GAT  ATC  GAT  GGG  CAG  GAT  CTG  ATG  GGC  GTT  CAC  GGT  GGT  CGC  CAT  GCA  ACG  TGC  AGA  GGT  G
2564bpのPCR産物を、pCR  IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そしてpCR  II  HB-polと称する。
【０１６１】
Ｊ．HBV  ORF5オープンリーディングフレームの単離
PCR増幅を、２つのプライマー、およびテンプレートとしてpAM  6プラスミド（ATCC  45020）を用いて行う。センスプライマーはB型肝炎ウイルスのadw株のヌクレオチド1432〜1482に対応し、そして翻訳のためにKozak規則を確認するためのヌクレオチド変化を有するORF5オープンリーディングフレームの5'領域を含む。このプライマーの5'末端は、２つの連続したXho  I制限部位を含む。
【０１６２】
（配列番号52）
5'-3'：GC  CTC  GAG  CTC  GAG  ACC  ATG  TCC  CGT  CGG  CGC  TGA  ATC  CCG  CGG  ACG  ACC  CCT  CTC  GGG  GCC  GCT  TGG  GAC
第２のプライマーは、アンチセンスヌクレオチド配列1697〜1648に対応し、そして5'末端に２つのCla  I部位を含む。このプライマーは、ORF5オープンリーディングフレームの3'領域に相補的であり、そしてTAA終止コドンを含む。
【０１６３】
（配列番号53）
5'-3'：GC  ATC  GAT  ATC  GAT  GGT  CGG  TCG  TTG  ACA  TTG  CTG  GGA  GTC  CAA  GAG  TCC  TCT  TAT  GTA  AGA  CC
293bpのPCR産物をpCR  IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そしてpCR  II  HB-ORF5と称する。
【０１６４】
Ｋ．HBV  ORF  6オープンリーディングフレームの単離
PCR増幅を、２つのプライマー、およびテンプレートとしてpAM6プラスミド（ATCC  45020）を用いて行う。センスプライマーはB型肝炎ウイルスのadw株のヌクレオチド1844〜1788に対応し、そして翻訳のためにKozak規則を確認するためのヌクレオチドの変化を有するORF  6オープンリーディングフレームの5'領域を含む。このプライマーの5'末端は、２つの連続したXho  I制限部位を含む。
【０１６５】
（配列番号54）
5'-3'：GC  CTC  GAG  CTC  GAG  ACC  ATG  ATT  AGG  CAG  AGG  TGA  AAA  AGT  TGC  ATG  GTG  CTG  GTG  CGC  AGA  CCA  ATT  TAT  GCC
第２のプライマーはアンチセンスヌクレオチド配列1188〜1240に対応し、そして5'末端に２つのCla  I部位を含む。このプライマーは、ORF6オープンリーディングフレームの3'領域に相補的であり、そしてTAA終止コドンを含む。
【０１６６】
（配列番号55）
5'-3'：GC  ATC  GAT  ATC  GAT  GCT  GAC  GCA  ACC  CCC  ACT  GGC  TGG  GGC  TTA  GCC  ATA  GGC  CAT  CAG  CGC  ATG  CG
687  bpのPCR産物をpCR  IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そしてpCR  II  HB-ORF  6と称する。
【０１６７】
Ｌ．EMC  IRESの単離
脳心筋炎ウイルス由来のIRESを、pCITE-2a(+)プラスミド（Novagen,  Madison,  WI)から、２つのプライマーを用いて、PCRによって増幅する。Acc  I制限エンドヌクレアーゼ部位を含むセンスプライマーのヌクレオチド配列は以下である：
（配列番号58）
【０１６８】
【数２】
2010116417.tif 000004
Cla  I制限エンドヌクレアーゼ部位を含むアンチセンスプライマーのヌクレオチド配列は以下である：
（配列番号59）
【０１６９】
【数３】
2010116417.tif 000005
この500塩基対のPCR生成物を、1.5％アガロースゲルを通す電気泳動によって精製し、そして実施例5Bに記載のようにGene  Clean  II  (Bio  101,  Vista,  CA)によって精製する。
【０１７０】
Ｍ．IL-12  p40サブユニットの単離
正常な非感染ヒト末梢血単核球(PBMC)を、Staphylococcal  aureasを用いて活性化する。刺激したPBMC由来のRNAを抽出し、そしてIL-12  p40サブユニットヌクレオチド配列を、実施例2Cに記載のようにPCRによって増幅する。
【０１７１】
センスプライマーは、IL-12のオープンリーディングフレームのp40サブユニットの5'領域におけるヌクレオチドに対応し、そしてさらに5'末端にBgl  II制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。このプライマーのヌクレオチド配列は以下である：
（配列番号60）
【０１７２】
【数４】
2010116417.tif 000006
第２のセンスプライマーは、IL-12のオープンリーディングフレームのp40サブユニットのアンチセンス配列3'領域に対応し、そしてさらに5'末端にHpa  I制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。このプライマーのヌクレオチド配列は以下である：
（配列番号61）
【０１７３】
【数５】
2010116417.tif 000007
このPCR反応の生成物は、IL-12のp40サブユニットをコードするBgl  II-Hpa  I  1140  bpのフラグメントである。
【０１７４】
Ｎ．IL-12  p35サブユニットの単離
正常な非感染PBMCを、Staphylococcal  aureasを用いて活性化する。刺激したPBMC由来のRNAを抽出し、そしてIL-12  p35サブユニットヌクレオチド配列を、実施例2Cに記載のようにPCRによって増幅する。センスプライマーは、IL-12のオープンリーディングフレームのp35サブユニットの5'領域におけるヌクレオチドに対応する。このプライマーのヌクレオチド配列は以下である：
（配列番号62）
【０１７５】
【数６】
2010116417.tif 000008
第２のセンスプライマーは、IL-12のオープンリーディングフレームのp35サブユニットのアンチセンス配列3'領域に対応する。このプライマーのヌクレオチド配列は以下である：
（配列番号63）
【０１７６】
【数７】
2010116417.tif 000009
次いで、TAクローニングキット(Invitrogen,  San  Diego,  CA)を用いて、PCR増幅生成物を、PCR  IIベクター（Invitrogen,  San  Diego,  CA)中に連結し、そして凍結したコンピテントE.  coli細胞中に形質転換する。DNA配列決定による検証後、この構築物をPCR  II  p35と命名する。
【０１７７】
Ｏ．F  HBコア/neoRを産生するための部位特異的変異誘発
HBVコアとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子との間に融合を有する構築物を生成するために、PCRオーバーラップ伸長を用いた。ここでHBコアの終止コドンを欠失させ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのオープンリーディングフレームの11番目のアミノ酸と、フレーム中で融合させている。KT-HBcプラスミドを鋳型として使用し、加えて４つのオリゴヌクレオチドプライマーを、誘導HBコア-neoR構築物を生成するように実施する３つのPCR反応のために使用する。
【０１７８】
第１の反応は２つのプライマーを利用する。センスプライマー配列は、HBコア遺伝子の5'末端でのXho  I制限部位に対応する。
（配列番号79）
【０１７９】
【数８】
2010116417.tif 000010
第２のプライマー配列は、アンチセンスヌクレオチド配列2457〜2441、およびコドン11〜17をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の23塩基対に対応する。
（配列番号80）
【０１８０】
【数９】
2010116417.tif 000011
第２の反応はまた、鋳型としてのKT-HBcプラスミドおよび２つのプライマーを利用する。センスプライマーは、ヌクレオチド配列2440〜2457、およびコドン11〜17をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の23塩基対に対応する。
（配列番号81）
【０１８１】
【数１０】
2010116417.tif 000012
第２のプライマーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のアンチセンスヌクレオチド配列に対応する。
（配列番号82）
【０１８２】
【数１１】
2010116417.tif 000013
第１および第２のPCR反応の生成物を、第３の反応において伸長し、F  HBコア-neoR構築物を生成する。２つのプライマーをまた、第３の反応において利用する。センスプライマーは、HBコア遺伝子の5'末端でのXho  I制限部位に対応する。
（配列番号79)
【０１８３】
【数１２】
2010116417.tif 000014
第２のプライマー配列は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のアンチセンスヌクレオチド配列に対応する。
（配列番号82)
【０１８４】
【数１３】
2010116417.tif 000015
第３の反応からのPCR生成物は、融合HBコア/neoR構築物を生成する。PCR反応後、溶液を新しい1.5mlの微量遠沈管に移す。50マイクロリットルの３Ｍ酢酸ナトリウム、続いて500μlのクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）を、この溶液に添加する。混合物をボルテックスし、次いで14,000rpmにて５分間遠心分離する。水相を新しい微量遠心管に移し、1.0ml  100％  EtOHを添加する。この溶液を-20℃にて4.5時間インキュベートし、次いで10,000rpmにて20分間遠心分離する。上清をデカントし、そしてペレットを500μlの70％  EtOHでリンスする。ペレットを、減圧下10,000rpmでの遠心分離によって乾燥させ、次いで10μlの脱イオン化H2O中に再懸濁する。１マイクロリットルのPCR生成物を、1.0％アガロースゲル中での電気泳動によって分析する。
【０１８５】
このPCR生成物（約1.05kb長）を、Xho  IおよびPst  I制限エンドヌクレアーゼで消化し、1.0％アガロースゲルを通して電気泳動し、そしてDNAをGeneclean  II  (Bio  101,  Vista,  California)によってゲル切片から精製する。このXho  I-Pst  I  PCR生成物を、pBluescript  KS+II（Stratgene,  La  Jolla,  Califormia)のそれぞれの部位中に挿入する。この構築物を、KSII+  Xh-Pst  HB  Fコア-neoRと命名し、そしてDNA配列決定によって検証する。
【０１８６】
実施例３
Ａ．HBV  X  抗原の単離
Ｂ型肝炎ウイルスＸオープンリーディングフレームを含む642bpのNco  I-Taq  Iフラグメントを、pAM6プラスミド（adw)(ATCC  45020)から得、クレノウフラグメントによって平滑末端化し、そしてSK+（Stratagene,  La  Jolla,  California)のHinc  II部位中に連結する。
【０１８７】
E.  coli（DH5α、Bethesda  Research  Labs,  Gaithersburg,  Maryland)を、連結反応で形質転換し、そして増殖させる。次いで、ミニプレップDNAを、Birnboimら（Nuc.  Acid  Res.  7:  1513,  1979;  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Sambrookら（編）、Cold  Spring  Harbor  Press,  1989）によって本質的に記載されるように単離し、そして精製する。
【０１８８】
このフラグメントは、いずれの方向でも挿入され得るので、SK+マルチクローニング部位において、Xho  IおよびCla  I部位に関してセンス方向を有するクローンを選択する。より詳細には、ミニプレップDNAを診断用制限酵素Bam  HIで消化する。正しい方向の挿入物は、3.0Kbおよび0.6Kbのサイズの２つのフラグメントを生成する。不正確な方向の挿入物は、3.6KBおよび0.74Kbの２つのフラグメントを生成する。正確な方向のクローンを選択し、そしてSK-X  Agと命名する。
【０１８９】
Ｂ．HBV  X抗原の短縮化
短縮型Ｘ抗原を生成するために、TAGを、Nhe  I（ナンセンスコドン）リンカー（NEB#1060,  New  England  BioLabs,  Beverly,  Massachusetts）を介して挿入する。このリンカーは、３つすべてのリーディングフレームにおけるナンセンスコドンを提供する。
【０１９０】
SK-XAgを、プラスミドを線状化するStu  Iで切断する（ヌクレオチド1704)。第１に、Nhe  I（ナンセンスコドン）リンカーを、最初に以下の反応においてリン酸化する。OD260  1.0のリンカーを、100μl  TE（10mM  Tris-HCl  (pH7.6)、１mM  EDTA）中に溶解する。１マイクロリットルのリンカー（1.0〜2.0)を、１μlの10×緩衝液（0.66M  Tris-HCl  (pH7.6),  10mM  ATP,  10mM  スペルミジン、0.1M  MgCl2、150mM  DTT,  ２mg/ml  BSA）、６μlのH2O、および２ＵのT4  DNAキナーゼと混合し、そして37℃にて１時間インキュベートする。次いで、この反応混合物を、10単位のT4  DNAリガーゼを有する10μlの上記の緩衝液中で、0.4μgの線状化SK  XAgプラスミド（実施例3A)に添加する。反応を22℃にて６時間インキュベートし、そして１μlの0.5M  EDTAを用いて停止する。次いで、反応物をフェノール：クロロホルム（１：１の比）で抽出し、そしてDNAをエタノールで沈殿させる。DNAを、室温にて５分間、14,000rpmでの遠心分離によって回収する。次いで、ペレットを乾燥させ、そして90μlのTE（10mM  Tris-HCl  (pH7.6),  １mM  EDTA)中に溶解する。10マイクロリットルの10×NeB2緩衝液（New  England  Biolabs,  Beverly,  Massachusetts)をDNAに添加し、次いで20ＵのNhe  Iで消化する。プラスミドを、1.0％アガロースゲルによって過剰のリンカーから精製し、そしてGeneclean  II  (Bio  101,  Vista,  California)によって単離する。
【０１９１】
DNAを自己連結し、そしてコンピテントE.  coli上に形質転換する。次いで、診断用制限部位Nhe  Iの存在についてスクリーニングし；これらのクローンは短縮型Ｘ遺伝子を含む。クローンを選択し、そしてSK-TXAgと命名する。
【０１９２】
実施例４
ベクター構築物バックボーンの調製
Ａ．レトロウイルスバックボーンKT-3の調製
N2ベクター由来のgag配列を含むモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV)5'長末端反復(LTR)  EcoR  I-EcoR  Iフラグメント(Armentanoら、J.  Vir.  61:  1647-1650,  1987;  Eglitasら、Science  230:  1395-1398,  1985)を、プラスミドSK+（Stratagene,  La  Jolla,  Califormia）中に連結する。得られる構築物をN2R5と命名する。N2R5構築物を、部位特異的インビトロ変異原性によって変異させ、ATG開始コドンを、gag発現を妨げるATTに変換する。この変異誘発したフラグメントは、200bp長であり、そしてPst  I制限部位に隣接する。Pst  I-Pst  I変異フラグメントを、SK+プラスミドから精製し、そしてプラスミドpCU31中のN2  MoMLV  5'  LTRのPst  I部位中に挿入し、非変異の200bpのフラグメントと置換する。プラスミドpCU31を、pUC19（Stratagene,  La  Jolla,  California)から誘導し、ここでさらなる制限部位Xho  I、Bgl  II、BssH  II、およびNco  Iを、ポリリンカーのEcoR  I部位とSac  I部位との間に挿入する。この構築物を、pCU31/N2R5gMと命名する。
【０１９３】
N2由来の1.0KbのMoMLV  3'LTR  EcoR  I-EcoR  Iフラグメントを、N2R3-と命名した構築物を生じるプラスミドSK+中にクローン化する。1.0KbのCla  I-Hind  IIIフラグメントを、この構築物から精製する。
【０１９４】
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するSV40初期プロモーターを含む、pAFVXMレトロウイルスベクター（Krieglerら、Cell  38:  483,  1984;  St.  Louisら、PNAS  85:  3150-3154,  1988）由来のCla  I-Cla  I優性選択マーカー遺伝子フラグメントを、SK+プラスミド中にクローン化する。この構築物を、SK+  SV2-neoと命名する。1.3KbのCla  I-BstB  I遺伝子フラグメントを、SK+  SV2-neoプラスミドから精製する。
【０１９５】
KT-3レトロウイルスベクターを、３つの部分の連結によって構築する。ここで、目的の遺伝子を含むXho  I-Cla  Iフラグメント、および1.0KbのMoMLV3'  LTR  Cla  I-Hind  IIIフラグメントを、pUC31/N2R5gMプラスミドのXho  I-Hind  III部位中に挿入する。次いで、pAFVXMレトロウイルスベクター由来の1.3KbのCla  I-BstB  I  neo遺伝子フラグメントを、このプラスミドのCla  I部位中にセンス方向で挿入する。
【０１９６】
Ｂ．レトロウイルスバックボーンKT-1の調製
KT-1レトロウイルスバックボーンベクターを、優性選択マーカー遺伝子neoを発現ベクター中に挿入しないことを除いて、本質的に実施例4AのKT-3について記載されるように構築する。詳細には、３つの部分の連結において、目的の遺伝子を含むXho  I-Cla  Iフラグメント、および1.0KbのMoMLV  3'LTR  Cla  I-Hind  IIIフラグメントを、pUC31/N2R5gMプラスミドのXho  I-Hind  III部位中に挿入する。
【０１９７】
Ｃ．レトロウイルスバックボーンJMR-2の調製
JMR-2ベクターは、脳心筋炎ウイルスIRES（Novagen,  Madison,  WI）の5'末端に隣接するKT-3のXho  I部位にてXho  I、Bam  HI、Srf  I、およびNot  I制限エンドヌクレアーゼを含むポリリンカー、ならびに脳心筋炎IRESの3'末端に隣接するCla  I、Bgl  II、Age  I、Hpa  I、Mlu  I、およびSal  I制限エンドヌクレアーゼを含むポリリンカーを有するKT-3レトロベクターを含む。
【０１９８】
手短には、LMR-2ベクターを、実施例3Bにおいて記載されるように、KT-3バックボーンのXho  I制限エンドヌクレアーゼ部位にてXho  I、Bam  HI、Srf  I、Not  I、  Cla  I、およびSal  I制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカーを挿入することによって調製する。この構築物を、KT3-L1と命名し、そしてDNA配列決定によって検証する。センス鎖およびアンチセンス鎖を、DNA合成の標準的な方法によって合成する。センス鎖配列は以下である：
（配列番号64）
【０１９９】
【数１４】
2010116417.tif 000016
アンチセンス鎖配列は以下である：
（配列番号65）
【０２００】
【数１５】
2010116417.tif 000017
これらのオリゴヌクレオチドを37℃にてアニールし、5'突出部を生成する。次いで、これらの二本鎖リンカーを、37℃でアニールし、そして連結することにより、Xho  I消化KT-3バックボーンの互換突出部にハイブリダイズする。
【０２０１】
脳心筋ウイルス由来のIRESを、PCR増幅生成物（実施例2C)のAcc  IおよびCla  I制限エンドヌクレアーゼでの消化によって切断し、そしてKT3-L1のCla  I部位中に連結し、そしてKT3-L1-IRESと命名する。IRESの正しい方向を、AvrIIエンドヌクレアーゼ消化を用いる分析後に決定する。次いで、Cla  I、Bgl  II、Age  I、Hpa  I、Mlu  I、およびSal  I制限エンドヌクレアーゼを含むマルチクローニング部位を、KT3-L1-IRESのCla  I-Sal  I部位中に挿入する。得られたベクターをIMR-2と命名する。センス鎖およびアンチセンス鎖を、DNA合成の標準的な方法によって合成する。センス鎖配列は以下である：
（配列番号66）
【０２０２】
【数１６】
2010116417.tif 000018
アンチセンス鎖配列は以下である：
（配列番号83)
【０２０３】
【数１７】
2010116417.tif 000019
これらのオリゴヌクレオチドを37℃にてアニールし、5'突出を生成する。次いで、これらの二本鎖リンカーを、37℃でのアニーリング、続く連結によって、Cla  I-Sal  I消化KT3-L1-IRESバックボーンの互換突出にハイブリダイズさせる。
【０２０４】
Ｄ．CMV発現ベクターの調製
プラスミドpSCV6（米国特許番号第07/800,921号において記載）を利用して、pCMV-HBcを生成する。手短には、pSCV6プラスミドは、CMV  IEプロモーター、続いて、目的の遺伝子の挿入を可能にし、そしてSV40ポリＡシグナルで終わるポリリンカー部位を有するpBluescript  SK-バックボーン（Stratagene,  La  Jolla,  California）から誘導される。
【０２０５】
Ｅ．アデノウイルスバックボーンの調製
アデノウイルスバックボーンpAdM1プラスミドを、Quantum  Biotechnologies  (Montreal,  Canada)から誘導する。Ad5Δ  E1Δ  E3プラスミド（Gluzmanら、Eucaryotic  Viral  Vectors,  187-192頁、Cold  Spring  Harbor,  1982）もまた、Quantum  Biotechnologiesから誘導する。
【０２０６】
実施例５
ウイルスベクターおよび発現ベクターの構築
Ａ．Ｂ型肝炎ウイルスレトロウイルスベクターの構築
次いで、SK+HBe-c（実施例2A)由来の787bpのXho  I-Cla  Iフラグメントを、KT-3レトロウイルスベクターバックボーンのXho  IおよびCla  I部位中に連結する。この構築物をKT-HBe-cと命名する。
【０２０７】
Ｂ．Ｂ型肝炎ウイルスコアレトロウイルスベクターの構築
実施例2B由来のPCR生成物（約600bp長）を、Xho  IおよびCla  I制限エンドヌクレアーゼで消化し、1.5％アガロースゲルを通して電気泳動し、そしてDNAを、Geneclean  II  (Bio  101,  Vista,  California)によってゲル切片から精製する。このXho  I-Cla  I  HBVコアPCR生成物を、KT-3レトロウイルスベクターバックボーンのXho  IおよびCla  I部位中に挿入する。構築物を、KT-HBcと命名する。
【０２０８】
KT-HBc由来のHBVコアフラグメント（Xho  I-Cla  I)を、pBluescript  KS+  II（Stratagene,  La  Jolla,  California)のそれぞれの部位中に挿入する。この構築物を、KS+  II  HBcと命名し、そしてDNA配列決定によって検証する。
【０２０９】
Ｃ．Ｃ型肝炎ウイルスコアレトロウイルスベクターの構築
実施例2C由来のpCR  II  Xh-H  HCV  コア由来のXho  I-Hind  IIIフラグメントを、pSP72のそれぞれの部位に挿入する。この構築物を、pSP72  Xh-H  HCcと命名する。次いで、pSP72  Xh-H  HCc由来のXho  I-Cla  Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボーン中に挿入する。この構築物をKT-HCcと命名する。
【０２１０】
Ｄ．Ｃ型肝炎ウイルスNS3/NS4レトロウイルスベクターの構築
実施例2DからのpCR  II  Xh-H  HCV  NS3/NS4由来のXho  I-Hind  IIIフラグメントを、pSP72のそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をpSP72  Xh-H  HCV  NS3/NS4と命名する。次いで、pSP72  Xh-H  HCV  NS3/NS4由来のXho  I-Cla  Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボーン中に挿入する。この構築物をKT-HCV  NS3/NS4と命名する。
【０２１１】
Ｅ．Ｂ型肝炎ウイルスＸレトロウイルスベクターの構築
SK-X  Ag由来のXho  I-Cla  Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT-HB-Xと命名する。
【０２１２】
Ｆ．Ｂ型肝炎ウイルス短縮型Ｘレトロウイルスベクターの構築
SK-TX  Ag由来のXho  I-Cla  Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT  HB-TXと命名する。
【０２１３】
Ｇ．Ｂ型肝炎ウイルスPre-S2レトロウイルスベクターの構築
実施例2HからのpCR  II  HB-Pre-S2由来のXho  I-Cla  Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT  HB-Pre-S2と命名する。
【０２１４】
Ｈ．Ｂ型肝炎ウイルスポリメラーゼレトロウイルスベクターの構築
実施例2IからのpCR  II  HB-pol由来のXho  I-Cla  Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT  HB-polと命名する。
【０２１５】
Ｉ．Ｂ型肝炎ウイルスORF  5レトロウイルスベクターの構築
実施例2JからのpCR  II  HB-ORF5由来のXho  I-Cla  Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT  HB-ORF  5と命名する。
【０２１６】
Ｊ．Ｂ型肝炎ウイルスORF  6レトロウイルスベクターの構築
実施例2KからのpCR  II  HB-ORF6由来のXho  I-Cla  Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT  HB-ORF  6と命名する。
【０２１７】
Ｋ．Ｂ型肝炎ウイルスe/チミジンキナーゼレトロウイルスベクターの構築
KT-HBe-c（実施例5A)由来のXho  I〜Cla  I  HBV  eを、KT-1/HBe-cと命名されたベクターを生じるKT-1レトロウイルスベクターバックボーン（実施例4B)のXho  I/Cla  I部位中に連結する。チミジンキナーゼプロモーターによって駆動されるHSV-1チミジンキナーゼ遺伝子を含む2.0Kb  Kb  Cla  I/Cla  Iフラグメントを、pSP72-TK/Claから誘導し、そしてセンス方向でKT-1/HBe-cのCla  I/Cla  I部位中に連結する。方向を、Sma  I消化によって決定する。この構築物をKT-HBe-TKと命名する。
【０２１８】
pSP72-TK/Claを以下のように誘導する。HSV-1チミジンキナーゼプロモーターおよび遺伝子を含むフラグメントを、PrTKΔAから、Xho  IおよびBam  HI消化によって切り出す（PrTKΔAは、PCT  WO  91/02805の実施例４に記載されている）。このフラグメントを、実施例2Aに記載されるようにNA45紙を用いて１％アガロースゲルから単離し、そしてpSP7プラスミドのXho  IおよびBam  HI部位中に挿入する。このプラスミドをpSP72-TKと命名する。pSP72TKを、実施例3Bに記載されるように、Xho  Iを用いて線状化し、クレノウを用いて平滑末端化し、そしてCla  Iリンカー（New  England  BioLabs,  Beverly,  Massachusetts）を用いて連結する。このプラスミドを、自己連結し、そしてコンピテントE.  coli上に形質転換する。クローンを選択し、そしてpSP72-TK/Claと命名する。
【０２１９】
Ｌ．  Ｂ型肝炎ウイルスコア／チミジンキナーゼレトロウイルスベクターの構築
KT-HBc（実施例5B）由来のXhoI〜ClaI  HBVコアフラグメントをKT-1レトロウイルスベクター骨格（実施例4B）のXhoI/ClaI部位へ連結して、KT-1/HBcと命名されるベクターを生じる。チミジンキナーゼプロモーターにより駆動されるHSV-1チミジンキナーゼ遺伝子を含む2.0kb  ClaI/ClaIフラグメントを、pSP72-TK/Claから得、そしてKT-1/HBcのClaI/ClaI部位へセンス方向に連結した。この構築物をKT-HBc/TKと命名する。
【０２２０】
Ｍ．Ｂ型肝炎ウイルスコアCMV発現ベクターの構築
HBVコアフラグメントを、構築物KT-HBc（実施例5B）からこのプラスミドのXhoIおよびClaI制限酵素での消化、および実施例2Aに記載されるようにNA45ペーパーを用いた１％アガロースゲルからの単離により得た。フラグメントをクレノウで平滑末端化し、そしてプラスミドpSC6のSmaI部位に連結する。HBコア遺伝子の方向を、EcoRI/SSpIの二重消化により決定する。このプラスミドをpCMV-HBcと命名する。E.coli（DH5α、Bethesta  Research  Labs,  Gaitheriburg,  Maryland）をpCMV-HBcプラスミドで形質転換し、そして増殖させてプラスミドDNAを生成する。次いで、このプラスミドDNAを、本質的にBrimboimら（Nuc.Acid  Res.  7:1513、1979；「Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、」Sambrookら（編）、Cold  Spring  Harbor  Press,1989もまた参照のこと）に記載される塩化セシウムバンド化およびエタノール沈澱により精製する。DNAを0.9％滅菌リン酸緩衝化生理食塩水中に、2mg/mlの最終濃度で再懸濁する。
【０２２１】
Ｎ．Ｂ型肝炎ウイルスeアデノウイルスウイルスベクターの構築
XhoI〜ClaI  HBVeフラグメントを、実施例2Aに記載されるようにXhoIおよびClaI制限酵素によるプラスミドの消化ならびに１％アガロースゲルおよびNA45ペーパー上での単離により、KT-HBe-cから得る（実施例5A）。フラグメントをクレノウフラグメントで平滑末端化する。アデノウイルスベクターバックボーンであるpAdM1プラスミドを、BamHIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化する。平滑末端化HBVeフラグメントをpAdM1プラスミドの平滑末端化BamHI部位に連結する。HBVe遺伝子の方向は、EcoRI/SspO二重消化により決定する。このプラスミドをpAdM1-HBeと命名する。
【０２２２】
Ｏ．HB  Fコア/neoRレトロウイルスベクターの構築
３つのフラグメントをHB  Fコア/neoRレトロウイルスの構築のために精製する。第一に、KT-HBc（実施例５に由来する）をClaI、PstI、およびHindIIIで消化し、そしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および３’LTRを含む1.6kb  Pst-HindIIIフラグメントを単離する。第二に、KSII+  Xh-Pst  HB  Fコア/neoR（実施例２）、1.05kbのXhoI-PstIフラグメントを単離する。第三に、KT-HBcから、ベクターバックボーンを含む4.3kb  XhoI-HindIIIフラグメントを単離する。３つの部分の連結において、HB  Fコア/neoRフラグメントを含むXhoI-PstIフラグメントおよびPstI-HindIII  neo/3'LTRフラグメントを、KT-HBcのXhoI-HindIII部位に挿入する。このベクター構築物を、KT-HB  Fcore/neoRと命名する。
【０２２３】
実施例６
多価レトロウイルスベクターの構築
Ａ．Ｂ型肝炎e/GM-CSFレトロウイルスベクターの構築
ｉ．BIP  IRESを伴う多価レトロウイルスベクター
pGEM  5Z+BIP  5'（Peter  Sarnow,University  of  Colorado,  Health  Sciences  Center,  Denver,  ヒトイムノグロブリン重鎖結合タンパク質）をSacIおよびSphIで消化する。250bpのBIPフラグメントを1.5％のアガロースゲル電気泳動で単離し、そしてpSO72のそれぞれの部位にサブクローニングする。ベクター構築物をpSP72  BIPと命名する。
【０２２４】
HindIII-XhoI  GM-CSFフラグメントを、実施例２ＧのpCR  II  H-XhGM0CSFから切り出し、pSP72  BIPのHindIII-XhoI部位にサブクローニングする。この構築物を、pSP72  BIP-GM-CSFと命名する。
【０２２５】
構築物pSP72  BIP  GM-CSFを、XhoI部位で切断して、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてClaIで切断する。KT-1バックボーンを、ClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoI制限エンドヌクレアーゼで切断する。これらの３つの部分の連結において、SK+HBe-c、実施例２由来のXhoI-ClaIフラグメント、およびClaI平滑末端化XhoI  BIP-GM-CSFフラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI平滑末端化ClaI部位に連結する。この構築物を、KT-HBe-c/BIP-GM-CSFと命名する。
【０２２６】
ii．CMVプロモーターを伴う多価レトロウイルスベクター
4.7kb  CMV  EnvR  Pst-RIフラグメントをpAF/CMV/EnvR（米国特許出願第07/395,932号）から単離し、そしてpUC18のPstIおよびEcoRI部位に挿入する。この構築物をpUC18  CMV  EnvRと命名する。
【０２２７】
HIV-I  IIIB  CARを、pAF/CMV/EnvRからのSau3AフラグメントとしてpBluesriptII  KS+（Stratagene,  La  Jolla,  California）のBamHI部位にサブクローニングして、pBluescriptII  KS+/CARを生成する。CARフラグメントをpBluescript  II  KS+/CARからXbaI-ClaIフラグメントとして切り出す。XhoI-XbaI  HIV-I  IIIBgag/polフラグメントをSK+gag/pol  SDΔ（米国特許出願第07/395,932号）から切り出す。CMVプロモーターを含むプラスミドバックボーンを、pUC18  CMV/EnvRから、XhoIおよびClaIで切り出す。３つの部分の連結において、XhoI-XbaI  HIV  IIIB  gag-polフラグメントおよびXbaI-ClaI  CARフラグメントを、pUC18  CMV/EnvRバックボーンのXhoI-ClaI部位に挿入しpUC18  CMVgag/pol/CARを生成する。
【０２２８】
pUC18  CMV-gag/pol/CAR由来のCMV  IEプロモーターを含むHindIII-XhoIフラグメントをpCDNAIIIのそれぞれの部位にサブクローニングする。この構築物を、pCDNA  II  CMVと命名する。
【０２２９】
XhoI-XbaI  GM-CSF  PCR産物を、実施例2GのpCRII  Xh-Xb  FM-CSFからサブクローニングし、そしてpCDNA  II-CMVのそれぞれの部位に挿入する。この構築物をpCDNA  II  CMV-GM-CSFと命名する。
【０２３０】
pcdna  ii  cmv  GM-CSF構築物を、Xba  I部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてHindIIIで切断する。KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。３つの部分の連結において、SK+HBe-c（実施例2A）からのXhoI-HindIIIフラグメントおよびHindIII平滑末端化XbaI  CMV-GM-CSFフラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構築物を、KT-HBe-c/CMV/GM/CSFと命名する。
【０２３１】
Ｂ．Ｃ型肝炎コア/IL-2レトロウイルスベクターの構築
i．IRESをともなう多価レトロウイルスベクター
HindIII-XhoI  IL-2配列を、実施例2EのpCR  II  H-Xh  IL-2から切り出し、そしてpSP72  BIPのHindIII-XhoI部位にサブクローニングする。この構築物をpSP72  BIP  IL-2と命名する。XhoI-HindIIIＣ型肝炎ウイルスコア配列（実施例2C）をpCRII  Xh-H  HCV  C  coreから切り出し、そしてpSP72のそれぞれの部位にサブクローニングする。この構築物を、pSP72  Xh-H  HCV  coreと命名する。
【０２３２】
構築物pSP72  BIP-IL2を、XhoI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてEcoRIで切断する。XhoI-EcoRI  HCV  coreフラグメントをpSP72  Xh-H  HCV  coreから単離する。KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。３つの部分の連結において、XhoI-EcoRI  HCVcoreフラグメントおよびEcoRI平滑末端化XhoI  BIP-IL2フラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構築物を、KT-HCV  core/BIP-IL2と命名する。
【０２３３】
ii．CMVプロモーターをともなう多価レトロウイルスベクター
XhoI-Apa  I  IL-2フラグメントを、実施例2EのpCR  II  Xh-A  IL-2から切り出し、そしてpCDNA  II-CMVプロモーターのそれぞれの部位にサブクローニングする。この構築物をpCDNA  II  CMV-IL-2と命名する。
【０２３４】
KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。構築物pCDNA  II  CMV-IL-2を、ApaI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑末端化し、そしてHindIII制限エンドヌクレアーゼで切断する。３つの部分の連結において、実施例2CからのpCRII  Xh-H  HCV  core由来のXhoI-HindIII  HCV  coreフラグメントおよびHindIII平滑末端化ApaI  CMV-IL2フラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構築物を、KT-HCV  core/CMV  IL-2と命名する。
【０２３５】
Ｃ．Ｂ型肝炎コア/B7レトロウイルスベクターの構築
i．IRESをともなう多価レトロウイルスベクター
HindIII-XhoI  B7配列を、実施例2FのpCR  II  H-Xh  B7から切り出し、そしてpSP72  BIPのHindIII-XhoI部位にサブクローニングした。この構築物をpSP72  H-Xh  BIP-B7と命名する。
【０２３６】
構築物pSP72  H-Xh  BIP-B7をXhoI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてClaIで切断する。XhoI-ClaI  HBV  coreフラグメントをKX+IIHBc（実施例5B）から単離する。KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。３つの部分の連結において、XhoI-ClaI  HBV  coreフラグメントおよびClaI平滑末端化XhoI  BIP-B7フラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構築物を、KT-HBV  core/BIP-B7と命名する（実施例７を参照のこと）。
【０２３７】
ii．  CMVプロモーターをともなう多価レトロウイルスベクター
XhoI-ApaI  B7配列を、実施例2FのpCR  II  Xh-A  B7から切り出し、そしてpCDNA  II-CMVプロモーターのそれぞれの部位にサブクローニングする。この構築物をpCDNA  II  CMV-B7と命名する。
【０２３８】
KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。構築物pCDNA  II  CMV-B7を、ApaI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑末端化し、そしてHindIII制限エンドヌクレアーゼで切断する。３つの部分の連結において、KSII+HBc由来のXhoI-HindIII  HBV  coreフラグメントおよびHindIII平滑末端化ApaI  CMV-IL2フラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構築物を、KT-HBc/CMV  B7と命名する。
【０２３９】
Ｄ．Ｂ型肝炎e/Ｃ型肝炎コアレトロウイルスベクターの構築
i．  BIP  IRESをともなう多価レトロウイルスベクター
HindIII-XhoI  HCV  core  PCR産物を、pCR  II  H-Xh  HCV  core（実施例2C）にサブクローニングし、そしてpSP72  BIPのそれぞれの部位に挿入する。この構築物をpSP72  H-Xh  BIP-HCV  coreと命名する。
【０２４０】
構築物pSP72  BIP-HCVをXhoI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてClaIで切断した。KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。３つの部分の連結において、SK+HBe-c（実施例2A）由来のXhoI-ClaI  HBVeフラグメントおよびClaI平滑末端化XhoI  BIP  HCVコアフラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構築物を、KT-HBV/BIP-HCVと命名する。
【０２４１】
ii．  CMVプロモーターをともなう多価レトロウイルスベクター
pSP72  Xh-H  HCV  core(実施例6Bi)由来のXhoI-XbaI  HCV  coreフラグメントを、pCDNA  II-CMVプラスミドのそれぞれの部位に挿入する。この構築物をpCDNA  II  CMV  HCV  coreと命名する。
【０２４２】
構築物pCDNA  II  CMV  HCVを、XbaI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑末端化し、そしてHindIII制限エンドヌクレアーゼで切断する。KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。３つの部分の連結において、SK+HBe-c(実施例2A)由来のXhoI-HindIII  HBV  e配列、HindIII平滑末端化XbaI  CMV  HCV  coreフラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構築物を、KT-HBVe/CMV  HCV  コアと命名する。
【０２４３】
Ｅ．Ｂ型肝炎ウイルスコア/IL-12レトロウイルスベクターの構築
XhoI-NotI  HBV  coreフラグメントをKS  II+  HBc（実施例5B）から単離し、そしてJMR-2のXhoI-NotI部位にサブクローニングする。この構築物をJMR-2  Hbcと命名する。
【０２４４】
次いで、BglII-HpaI  p40  PCRフラグメントをJMR-2HBcのそれぞれの部位にサブクローニングする。この構築物をJMR-2  HBc/p40と命名する。
【０２４５】
次いで、XhoI-NsiI  p35フラグメントをpCRII  p35から切り出し、そしてpCDA  II-CMV（実施例6Ai）のそれぞれの部位にサブクローニングする。この構築物をpCDNA  II  CMV-p35と命名する。
【０２４６】
pCDNA  II  CMV-p35をNsiIで切り出し、T4DNAポリメラーゼ（New  England  Biolabs,  Beverly,  MA）で平滑末端化する。NsiI平滑末端化CMV  p35フラグメントを、JMR-2  HBc/p40のSalI-平滑末端化部位に連結する。制限消化物を使用して、一つのフラグメントのみが正しい方向に挿入されていることを確認する。このレトロベクター構築物をJMR-2  HBc/p40/CMV-p35と命名する。
【０２４７】
実施例７
組換えレトロウイルスベクターの生成
Ａ．２個のパッケージング細胞株を介するプロデューサー細胞株の生成
HX細胞（WO  92/05266）を、１日目に、５×105細胞／10cm組織培養ディッシュで、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および10％仔ウシ血清（FBS）とともに播種する。２日目に、培地をトランスフェクションの４時間前に、５mlの新鮮な培地と置換する。標準的なリン酸カルシウム−DNA共沈澱を、400llの総容積中に40.0μl  2.5M  CaCl2、10μgのプラスミドDNA、および脱イオンH2Oを混合して実施する。400マイクロリットルのDNA-CaCl2溶液を、400μlの沈澱緩衝液（50mM  HEPES-NaOH、pH7.1、0.25M  NaClおよび1.5mM  Na2HPO4-NaH2PO4）に定常的に振盪させながら滴下する。この混合液を室温で10分間インキュベートする。得られた細かい沈澱を、細胞の培養培地に添加する。細胞をDNA沈殿物とともに一晩37℃でインキュベートする。３日目に、培地を吸い出し、そして新鮮な培地を添加する。４日目にウイルスを含む上清を取り出し、0.45μフィルターを通して通過させ、そしてこれを使用してDAパッケージング細胞株、マウス線維芽細胞に感染させるか、または−80℃で保存する。
【０２４８】
DA(WO  92/05266）細胞を、１日目に、５×105細胞／10cm組織培養ディッシュで、10ml  DMEMおよび10％  FBS、４μg/mlポリブレン（Sigma,St.Louis,  Missouri）中に播種する。２日目に、3.0ml、1.0ml、および0.2mlの新鮮に回収したDX培地を含むウイルスを細胞に添加する。細胞を、ウイルスとともに一晩37℃でインキュベートする。３日目に、培地を除去し、そして800μg/ml  G418を含む1.0ml  DMEM、10%  FBSをプレートに添加する。ベクターで形質導入され、そしてneo選択可能マーカーを含む細胞のみが生存する。G418耐性プールを１週間かけて生成する。このプールを記載されるように（実施例12A）発現について試験する。細胞のプールを、プレートからの細胞を除去することおよび細胞懸濁液を計数すること、細胞懸濁液を10細胞/mlにまで希釈すること、および96ウェルプレート（Corning,  Corning,  NY）の各ウェルに0.1ml（１細胞/ウェル）を添加することにより希釈クローン化する。細胞を37度で14日間、10％CO2でインキュベートする。24クローンを選択し、そして24ウェルプレート、６ウェルプレート、次いで10cmプレートにまで増殖し、この時点でクローンを発現についてアッセイし、そして上清を回収し、そしてウイルス力価についてアッセイする。
【０２４９】
パッケージング細胞株HX(WO  92/05266）を、HX上清からのDA細胞の形質導入について記載されるのと同様の様式で、DAベクタープロデューサ細胞株から生成されるベクターで形質導入する。
【０２５０】
DA(WO  92/05266）細胞の多価ベクター（neo選択マーカーを欠いている）での形質導入のために、上記の感染手順を使用する。しかし、G418を３日目に細胞に添加することに代えて、細胞を上記で説明した限界希釈によりクローニングする。50クローンを発現のために上記のように増殖させ、そして力価を実施例８に記載のようにアッセイする。
【０２５１】
Ｂ．１個のパッケージング細胞株を介するプロデューサー細胞株の生成
DA(WO  92/05266）細胞を、１日目に、５×105細胞／10cm組織培養ディッシュで、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および10％の放射線照射（最低2.5メガラド）仔ウシ血清（FBS）とともに播種する。２日目に、培地をトランスフェクションの４時間前に、5.0mlの新鮮な培地と置換する。標準的なリン酸カルシウム−DNA共沈澱を、400llの総容積中に60.0μl  2.0M  CaCl2、10μgのMLP-GプラスミドDNA、10μgのKT-HBe-cまたはKT-HBcレトロウイルスベクタープラスミドおよび脱イオン水を混合して実施する。400マイクロリットルのDNA-CaCl2溶液を、400μlの２×沈澱緩衝液（50mM  HEPES-NaOH、pH7.1、0.25M  NaClおよび1.5mM  Na2HPO4-NaH2PO4）に定常的に振盪させながら滴下する。この混合液を室温で10分間インキュベートする。得られた細かい沈澱を、前日にプレートしたDA細胞の培養培地に添加する。細胞をDNA沈殿物とともに一晩37℃でインキュベートする。３日目に、培地を吸い出し、そして新鮮な培地を添加する。４日目にＧ偽型ウイルスを含む上清を取り出し、0.45μフィルターを通して通過させ、そしてこれを使用してDAパッケージング細胞株感染させる。
【０２５２】
DA(WO  92/05266）細胞を、１日目に、５×105細胞／10cm組織培養ディッシュで、10ml  DMEMおよび10％  FBS、４μg/mlポリブレン（Sigma,St.Louis,  Missouri）中に播種する。２日目に、2.0ml、1.0ml、および0.5mlの新鮮に回収した上清を含むＧ偽型ウイルスを細胞に添加する。細胞を、ウイルスとともに一晩37℃でインキュベートする。３日目に、培地を除去し、そして800μg/ml  G418を含む1.0ml  DMEM、10%  放射線照射FBSをプレートに添加する。ベクターで形質導入され、そしてneo選択可能マーカーを含む細胞のみが生存する。G418耐性プールを１〜２週間の期間をかけて生成する。このプールを、実施例12Aに記載されるように、発現について試験する。細胞のプールを、プレートからの細胞を取り出すこと、細胞懸濁液を計数すること、細胞懸濁液を10細胞/mlにまで希釈すること、および96ウェルプレート（Corning,  Corning,  NY）の各ウェルに0.1ml（１細胞/ウェル）を添加することにより希釈クローン化する。細胞を37℃で２週間、10％CO2でインキュベートする。24クローンを選択し、そして24ウェルプレート、次いで６ウェルプレート、最後に10cmプレートにまで増殖し、この時点でクローンを発現についてアッセイし、そして上清を回収し、そしてウイルス力価についてアッセイする。
【０２５３】
実施例８
レトロウイルスベクターの力価測定
Ａ．選択マーカーとともなうベクターの力価測定
個々のクローンの力価をHT1080細胞（ATCC  CCL  121）の感染により決定する。１日目に、５×105  HT1080細胞を、６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、3.0ml  DMEM、10  ％  FBSおよび４μg/mlポリブレン中に播種する。２日目に、各クローンからの上清を10倍で連続希釈し、そしてこれを使用して1.0mlアリコート中のHT1080細胞に感染させる。培地を新鮮なDMEM,10%  FBS培地と置換し、そして細胞をベクターとともに一晩、37℃、10％CO2でインキュベートする。３日目に、形質導入された細胞の選択は、新鮮な800μｇ/mlのG418を含むDMEM、10％FBS培地で置換することにより実施する。細胞を37℃、10％  CO2で14日間インキュベートし、この時点で、G418耐性コロニーを各希釈で計数して各クローンのウイルス力価をコロニー形成単位/ml(cfu/ml）として決定する。
【０２５４】
これらの手順を用いて、HBV  coreおよびHBV  eプロデューサー細胞株の力価が以下であることが示され得る：
DAcore-6A3  3×106cfu/ml
DAcore-10  1×106cfu/ml
DAHBe  4-7  3×106cfu/ml
Ｂ．多価ベクターの力価測定
i．終末点希釈
多価ベクターは、ネオマイシン遺伝子のような選択マーカーを含んでいないので、別のベクター滴定方法を以下に詳細に記載する。手短には、1.0mlのベクター上清を５倍に希釈して10-9mlの最終希釈度にする。次いで、１ミリリットルの各希釈物を使用して、５×105  HT1080細胞(ATCC  No.  CCL  121)を、本質的に、実施例7Bで記載されるように、形質導入する。しかし、G418を添加することに代えて、DNAを各ディッシュから７日後に、Willis（J.Biol.Chem.259:7842-7859、1984）に記載されるように、抽出する。HBV  e/coreをPCRにより、Genset（Paris,  France）から得られる以下のプライマを用いて増幅する。
【０２５５】
HBV  e/coreについてのPCR増幅を、adwクローンのヌクレオチド配列1865〜1889に対応するセンスプライマーを用いて実施する。
（配列番号38）
【０２５６】
【数１８】
2010116417.tif 000020
このプライマーは、adwクローンのアンチセンスヌクレオチド配列2430〜2409に対応する。
【０２５７】
（配列番号39）
【０２５８】
【数１９】
2010116417.tif 000021
これは、所望のPCR産物の存在を確認するために使用されるプローブ配列であり、そしてＢ型肝炎ウイルスのadw株のヌクレオチド配列1926〜1907に対応する。
【０２５９】
（配列番号40）
【０２６０】
【数２０】
2010116417.tif 000022
Ｃ型肝炎コアのPCR増幅は、HCV-Jクローンのヌクレオチド配列328〜342に対応するセンスプライマーを用いて行われる。
【０２６１】
（配列番号41）
【０２６２】
【数２１】
2010116417.tif 000023
このプライマーは、HCV-Jクローンのアンチセンスヌクレオチド配列907〜892に対応する。
【０２６３】
（配列番号42）
【０２６４】
【数２２】
2010116417.tif 000024
これは、所望の564bp  PCR産物の存在を確認するために使用されるプローブ配列であり、そしてHCV-Jクローンのヌクレオチド配列674〜693に対応する。
【０２６５】
（配列番号43）
【０２６６】
【数２３】
2010116417.tif 000025
Ｃ型肝炎NS3/NS4のPCR増幅は、HCV-Jクローンのヌクレオチド配列4876〜4896に対応するセンスプライマーを用いて行われる。
【０２６７】
（配列番号44）
【０２６８】
【数２４】
2010116417.tif 000026
このプライマーは、HCV-Jクローンのアンチセンスヌクレオチド配列6321〜6302に対応する。
【０２６９】
（配列番号45）
【０２７０】
【数２５】
2010116417.tif 000027
これは、所望の1426bp  PCR産物の存在を確認するために使用されるプローブ配列であり、そしてHCV-Jクローンのヌクレオチド配列5618〜5637に対応する。
（配列番号46）
【０２７１】
【数２６】
2010116417.tif 000028
PCR産物は、適切な32P標識プローブを用いてサザンブロット分析によって分析される（Sambrookら、Molecular  Cloning,  a  Laboratory  Manual,  第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Cold  Spring  Harbor,  NY,  1989）。シグナルは、低希釈物の全てにおいて予想され、そして高希釈物で徐々に減少する。シグナルが目に見える最後の希釈物は、ベクターの感染性U/mlを産生する。
【０２７２】
ii.PCRによるレトロベクターの力価測定
PCRはまた、選択マーカーを含まないベクターの力価を測定するために利用され得る。手短には、1.0mlのベクター上清を用いて、６ウェルプレート中の5×10
5のHT1080細胞を形質導入する。形質導入された細胞をコンフルエンシーまで増殖させ、そして細胞を計数する。細胞の濃度は、5×105細胞/mlに調整される。細胞を、3000rpmで５分間、室温で遠心分離する。上清を廃棄し、そして細胞を１mlのRIPA緩衝液（10mM  Tris,  pH  7.4,  1％  NP40,  0.1％  SDS,  150mM  NaCl）で溶解させる。細胞を再懸濁し、そしてエッペンドルフチューブに移す。細胞を、微量遠心管において最大速度で、室温で10秒間遠心分離する。上清を廃棄し、そして10μlのプロテイナーゼＫ(10mg/ml  Stratagene,  La  Jolla,  CA)を細胞に添加する。この混合物を60分間37℃でインキュベートする。TE（10mM  Tris,  pH  7.6,  1mM  EDTA）をインキュベートした細胞に、1×107の核/mlの最終濃度で添加する。この溶液を100℃で10分間煮沸する。
【０２７３】
標準曲線を、１プロウイルスコピーのベクターを含むHT1080細胞のクローンを用いて作製する。このポジティブコントロールのDNAを、以下のポジティブ:ネガティブコントロール比：100:1、3:1、1:1、1:3、および1:100でネガティブコントロールDNA（HT1080）と混合する。約2.5μlのサンプルDNAを反応容器に配置する。約30μlのH2O、５μlの10×PCR緩衝液、４μl  MgCl2（各々25mM）、プライマーDNA（100ng/μlに分注）を含む５μlプライマー混合物、および0.25μl  Amplitaq（Cetus,  Los  Angeles,  CA）を、サンプルDNAを含有する各々の反応容器に添加する。この混合物に1.0μl  α32P  dCTPを添加する。この混合物を混合し、そして47.5μlをPCR反応のために分注する。PCRプログラムを、94℃２分間で開始し、続いて26サイクルの94℃30秒間、続いて１サイクルの64℃30秒間、および最終サイクルの72℃30秒間で行う。次いで、PCR混合物を４℃に冷却する。
【０２７４】
約10μlのPCR混合物を、25％グリセロール、75％  TEおよびブロモフェノールブルーを含有する10μlのゲルローディング緩衝液と混合し、そして１％アガロースゲルにロードする。電気泳動を、130ボルト30分間で１×TBE（0.045M  Trisホウ酸、0.001M  EDTA、pH  8.0）泳動緩衝液において行う。電気泳動の後、記載されるように（Sambrookら、(編)、Cold  Spring  Harbor  Press,  1989）、DNAをDuralon-UV（Stratagene,  San  Diego,  CA）に移した。Duralon-UV膜を、トランスファー装置から取り出し、Saran  Wrapに包み、そしてシグナルをAmbis  phosphorimager（Ambis,  San  Diego,  CA）を用いて定量する。各サンプルの力価値を、上記の標準曲線と比較して決定し、そしてポジティブコントロールの％として示す。
【０２７５】
実施例９
複製コンピテントレトロウイルスの検出
伸展したS+L-アッセイは、複製コンピテント、感染性ウイルスが、目的の細胞株の上清に存在するかどうかを決定する。アッセイは、感染性レトロウイルスが指示細胞株MiCl1（ATCC  CCL  64.1）に病巣を産生するという経験的観察に基づく。MiCl1細胞株は、マウス肉腫ウイルス（MSV）での形質導入によりMvILuミンク細胞株（ATCC  CCL  64）に由来する。これは、MSVゲノムの存在を示す肉腫を形成するが（S+）、複製コンピテントウイルスの非存在を示す白血病を引き起こさない（L-）、マウス肉腫プロウイルスを含有する非プロデューサー、非形質転換、復帰変異体クローンである。MiCl1細胞の複製コンピテントレトロウイルスでの感染は、MSVゲノムを「活性化」して、病巣形成を生じる「形質転換」を引き起こす。
【０２７６】
複製コンピテントレトロウイルスの存在を試験するために上清を細胞株から取り出し、そしていかなる細胞をも除去するために0.45μフィルターを通過させる。１日目に、Mv1Lu細胞を、２mL  DMEM、10％  FBSおよび８μg/mlポリブレン中に６ウェルプレートのウェルあたり1×105細胞（１試験サンプルあたり１ウェル）で播種する。Mv1Lu細胞を、別の６ウェルプレートに、同じ様式でポジティブおよびネガティブコントロールについてプレーティングする。細胞を37℃、10％CO2で一晩インキュベートする。２日目に、1.0mlの試験上清をMv1Lu細胞に添加する。ネガティブコントロールプレートを、1.0mlの培地とともにインキュベートする。ポジティブコントロールは、MAウイルス(Millerら、Molec.  and  Cell.  Biol.  5:431-437,  1985)の３つの希釈物（1.0ml培地中に各々200病巣形成ユニット、(ffu)、20ffuおよび２ffu）からなる。これを、ポジティブコントロールウェル中の細胞に添加する。細胞を一晩インキュベートする。３日目に、培地を吸引し、3.0mlの新鮮なDMEMおよび10％  FBSを細胞に添加する。細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、そして６日目と10日目に1:10に分け、任意の複製コンピテントレトロウイルスを増幅する。13日目に、Mv1Lu細胞における培地を吸引し、そして2.0ml  DMEMおよび10％  FBSを細胞に添加する。さらに、MiCl1細胞を、2.0mlのDMEM、10％  FBSおよび８μg/mlポリブレン中にウェルあたり1×105細胞で播種する。14日目に、Mv1Lu細胞からの上清をMiCl1細胞の対応するウェルに移し、そして37℃、10％  CO2で一晩インキュベートする。15日目、培地を吸引し、そして3.0mlの新鮮なDMEMおよび10％  FBSを細胞に添加する。21日目に、細胞を、細胞の単層上の病巣形成（単層一面にはびこり、接着したままである、クラスター形成した、屈折性細胞）について10×羃乗で顕微鏡下で検査する。MiCl1細胞上に病巣が現れた場合、試験物を複製コンピテントレトロウイルスで汚染していると決定する。
【０２７７】
これらの手順を用いて、HBVコアプロデューサー細胞株DA  core-1、DA  core-10、およびHBVeプロデューサー細胞株DA  HBe  4-7が、複製コンピテントレトロウイルスで汚染していないことが示され得る。
【０２７８】
実施例10
組換えアデノウイルスベクターの産生
ClaIで直線化した１μgのpAdM1-HBeを１μgのClaI切断Ad5delta  e1  delta  E3(Gluzmanら、Eucaryotic  Viral  Vectors,  pp.  187-192,  Cold  Spring  Harbor,  1982）ウイルスDNAと混合する。このDNA混合物を、0.8mlのOpti-MEM  I  Reduced  Serum  Medium  (BRL,  Gaithersburg,  Maryland)中の７μlのLipofectamine  (BRL,  Gaithersburg,  Maryland)を用いて、60mm直径の皿に5〜6×105の293細胞（ATCC  CRL  1573）にトランスフェクトする。20％  FBSを有する１mlのDMEM培地を５時間後に添加し、そして10％  FBSを有するDMEM培地を翌日に再び満たす。c.p.e.の出現（８〜10日）の後、培養物を回収し、ウイルス溶解物を２回のプラーク精製に曝す。個々のウイルスプラークを拾い上げ、そして６ウェルプレート中の293細胞（ウェルあたり1×105細胞の細胞密度で）に感染させることにより増幅する。組換え体を、Hirt手順（Hirt,  1967）によって感染細胞から抽出したウイルスDNAのサザン分析により同定する。ポジティブ同定の後に、組換えウイルスを２回のさらなるプラーク精製に曝す。力価を、Grahamら、J.Gen.Virol.  36:59-72,  1977に記載されるプラークアッセイによって測定する。ウイルスストックを、20pfu/細胞の多重度で60mm直径皿中のコンフルエント293細胞（2×106細胞）に感染させることによって調製する。全てのウイルス調製物を、CsCl密度遠心分離（GrahamおよびVan  der  Elb,  Virol.  52:456-457,  1973）により精製し、透析し、そしてすぐに使用する場合には４℃で、10mM  Tris-HCl（pH  7.4）、1mM  MgCl2中に保存し、そうでなければ10％グリセロールの添加を用いて−70℃で保存する。
【０２７９】
実施例11
ベクター構築物の細胞への導入
A.  組換えレトロウイルスベクター
i.  マウス細胞の形質導入
マウス線維芽細胞細胞株BC10ME（ATCC番号TIB85）B16およびL-M(TK-)(ATCC番号CCL  1.3)を、4500mg/Lグルコース、584mg/L  L-グルタミン（Irvine  Scientific,  Santa  Ana,  California）および10％  FBS（Gemine,  Calabasas,  California）を含有するDMEM上で増殖させる。
【０２８０】
BC10ME、B16、およびL-M(TK-)線維芽細胞細胞株を10cm皿にDMEM、10％FBSおよび４μg/ml  ポリブレン中に各々1×105でプレーティングする。各々を、約105
cfu/mlのベクター力価を有する1.0mlのレトロウイルスベクターで形質導入する。クローンを、実施例7Bに記載のようにDMEM、10％  FBSおよび800μg/ml  G418中で選択する。
【０２８１】
EL4（ATCC番号TIB  39）細胞およびEL4/A2/Kb細胞（L.  Sherman,  Scripps  Institute,  San  Diego,  California）をDAプロデューサー細胞とともに同時培養することによって形質導入する。詳細には、1.0×106のEL4細胞または1.0×106  EL4/A2/Kbを、１日目にRPMI  1640（Irvine  Scientific,  Santa  Ana,  California）、10％  FBS、および４μg/ml  ポリブレン(Sigma,  St.Louis,  Missouri)中の1×106の放射線照射した(10,000rad)DA（約105〜106のベクター力価）プロデューサー細胞に添加する。２日目に、1.0×106の放射線照射した(10,000rad)DAプロデューサー細胞を同時培養に添加する。５日目に、形質導入したEL4またはEL4/A2/KB細胞の選択を800μg/ml  G418で開始する。このプールは、実施例7Aに記載されるようにクローン化された希釈物である。
【０２８２】
多価ベクターによって形質導入したBC10ME、B16、L-M(TK-)、EL-4細胞は、G418において選択されない；それらは実施例7Aに記載のような限界希釈によってクローン化され、そして実施例12Aに記載されるように発現についてアッセイされる。
【０２８３】
ii.  マカク細胞の形質導入
末梢血単核細胞（PBMC）を、2000rpmで30分間室温でFicoll-hypaqueカラムによってスピンさせる。リンパ芽球腫細胞株（LCL）を、それぞれのＢ細胞をHerpes  papioウイルスに1:1000の細胞上清の希釈度で感染（形質転換）させることによって、各マカクについて確立する（594-S、Southwest  Institute  for  Biomedical  Research）。
【０２８４】
Herpes  papio形質転換の３〜５週後に、活発に増殖する細胞を、HBVコアまたはe抗原を発現するレトロウイルスベクターで２回形質導入する。LCLの形質導入を、4.0mlの培地および4.0μg/mlポリブレンを含有する６cmプレート中で1×106のLCL細胞と1×106の放射線照射（10,000rad）したDA/HBeまたはDA/HBコアプロデューサー細胞とを同時培養することによって達成する。培養培地は、RPMI  1640、20％熱不活化胎児ウシ血清（Hyclone,  Logan,  Utah）、5.0mMピルビン酸ナトリウム、5.0mM非必須アミノ酸および2mM  L-グルタミンからなる。37℃および５％  CO2での一晩の培養の後、LCL懸濁細胞を取り出し、そして最初の形質導入のように1×106の放射線照射(10,000rad)したDA/HBeまたはDA/HBコアプロデューサー細胞とともに同時培養する。形質転換したLCL細胞を、800μgm/ml  G418を添加することによって選択し、そして限界希釈によってクローン化する。
【０２８５】
iii.  チンパンジーおよびヒト細胞の形質導入
リンパ芽球腫細胞株（LCL）を、B95-8、EBV形質転換マモセット白血球（ATCC  CRL  1612）の３週齢培養物の上清から得られた新鮮なEpstein-Barrウイルス（EBV）でそれらのＢ細胞を感染させることによって、各患者について確立する。EBV形質転換の３週間後に、LCLをHBVコアまたはe抗原を発現するレトロウイルスベクターで形質導入する。LCLの形質導入を、4.0mlの培地および4.0μg/mlのポリブレンを含有する６cmプレート中で1.0×106  LCL細胞と1.0×106の放射線照射した(10,000rad)HXプロデューサー細胞とを同時培養することによって達成する。培養培地は、RPMI  1640、20％熱不活化胎児ウシ血清（Hyclone,  Logan,  Utah）、5.0mMピルビン酸ナトリウムおよび5.0mM非必須アミノ酸からなる。37℃および５％  CO2での一晩の同時培養の後、LCL懸濁細胞を取り出し、そして1×106の細胞を、1×106の放射線照射（10,000rad）したHXプロデューサー細胞を含有する新鮮なプレートにさらに６〜18時間、再び同時培養する。形質導入LCL細胞を、800μg/mlのG418を添加することによって選択し、そして高発現クローンを得るためにクローン化する。Jurkat  A2/Kb細胞（L.Sherman,  Scripps  Institute,  San  Diego,  California）を、本質的にLCL細胞の形質導入に記載されたように形質導入する。多価ベクターによって形質導入されたLCL、Jurkat  A2/KbおよびEL4  A2/Kb細胞は、G418においては選択されない；それらは、実施例7Aに記載されるように限界希釈によってクローン化され、そして実施例12Aに記載のように発現についてアッセイされる。
【０２８６】
Ｂ.  Ｂ型肝炎ウイルスコアCMV発現ベクターでのトランスフェクション
L-M(TK-)細胞を、１日目に、5×105細胞で、DulbeccoのModified  Eagle  Medium（DMEM）および10胎児ウシ血清（FBS）を有する10cm組織培養皿において播種する。２日目に、培地を、トランスフェクションの４時間前に5.0mlの新鮮な培地で交換する。標準的なリン酸カルシウム-DNA同時沈殿を、60μlの2.0M  CaCl2、10μgのCMV-HBcプラスミド、および脱イオン水を混合して、400IIの容積にするすることによって行う。400μlのDNA-CaCl2溶液を、等速で撹拌しながら液滴で400μlの2×沈殿緩衝液（50mM  HEPES-NaOH、pH  7.1、0.25M  NaClおよび1.5mM  Na2HPO4-NaH2PO4）に添加する。この混合物を、室温で10分間インキュベートする。得られる良好な沈殿物を、前日にプレーティングしたL-M(TK-)細胞の培養皿に添加する。細胞をDNA沈殿物とともに37℃で一晩インキュベートする。３日目に、培地を取り出し、新鮮な培地を添加する。４日目に、細胞抽出物を回収し、そして実施例12Aに記載されるように発現についてアッセイする。
【０２８７】
Ｃ.  組換えアデノウイルスベクターでの感染
35mm（直径）皿で増殖するL-M(TK-)細胞（約106細胞）の半コンフルエントな単層を、100pfu/細胞の多重度で組換えHBeアデノウイルスベクターに感染させる。37℃での吸着の１時間後、ウイルス接種材料を取り出し、そして2%  FBSを補充したDMEMを添加する。感染の30〜40時間後、明白なc.p.e.が観察される場合には、細胞抽出物を回収し、そして実施例12Aに記載されるように発現についてアッセイする。
【０２８８】
実施例12
形質導入遺伝子の発現
Ａ.  ELISA
KT-HBe-cまたはKT-HBcによって形質導入した細胞からの細胞溶解物を、1.0×107の培養細胞をPBSで洗浄し、総量600μlに細胞をPBSで再懸濁し、そしてBransonソニケーター、Model  350（Fisher,  Pittsburgh,  Pennysylvania）で30の設定で５秒間で２回超音波処理するか、または３回凍結解凍させたことによって作製する。溶解物を、10,000rpmで５分間遠心分離することによって明澄化する。
【０２８９】
細胞溶解物中のコア抗原およびプレコア抗原および培養上清の分泌されたe抗原を、Abbott  HBe,  rDNA  EIAキット（Abbott  Laboratories  Diagnostic  Division,  Chicago,  Illinois）を用いてアッセイする。細胞溶解物中のプレコア抗原および細胞上清中の分泌されたe抗原についての別の高感度なEIAアッセイをIncstar  ETI-EBキット（Incstar  Corporation,  Stillwater,  Minnesota）を用いて行う。標準曲線を、Biogen（Geneva,  Switzerland）から入手した組換えＢ型肝炎コアおよびe抗原の希釈物から産生する。
【０２９０】
これらの手順を用いて、約20〜40ng/mlのHBV  e抗原を、形質転換細胞株において発現させ、そして38〜750ng/mlのHBVコア抗原を形質導入細胞株において発現させる（図５）。
【０２９１】
Ｂ.  ウエスタンブロット分析による形質転換遺伝子の発現
タンパク質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、それらの分子量（MW）に従って分離する。次いで、タンパク質を、ゲルからIPVH  Immobilon-P膜（Millipore  Corp.,  Bedford,  Massachusetts）に移す。Hoefer  HSI  TTEトランスファー装置（Hoefer  Scientific  Instruments,  California）を用いて、ゲルから膜にタンパク質を移す。次いで、膜を、発現されたタンパク質と特異的に反応する患者血清からのポリクローナル抗体でプロービングする。結合抗体を、125I標識プロテインAを用いて検出する。これは、オートラジオグラフィーによって形質導入タンパク質を可視化する。
【０２９２】
Ｃ.  免疫沈降/ウエスタンブロット
形質導入細胞によって発現されるプレコア/コアおよびe抗原の特徴付けを、免疫沈降および続いてウエスタンブロット分析によって行う。詳細には、PD3または培養上清中の0.3〜1.0mlの細胞溶解物をG-Sepharose（Pharmacia  LKB,  Uppsala,  Sweden）に結合したポリクローナルウサギ抗Ｂ型肝炎コア抗原（DAKO  Corporation,  Carpinteria,  California）と混合し、そして一晩４℃でインキュベートする。サンプルを、20mM  Tris-HCl、pH  8.0、100mM  NaCl、10mM  EDTA中で２回洗浄し、そして0.5％β-2-メルカプトエタノールとともにサンプルローディング緩衝液中で煮沸する。タンパク質を最初に、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解し、次いでImmobilon（Millipore  Corp.,  Bedford,  Maine）に移し、そしてDAKOポリクローナルウサギ抗肝炎コア抗原、および続いて125I-プロテインAでプロービングする。
【０２９３】
これらの手順を用いて、図６から、17Kd  HB  eタンパク質が、形質導入マウス細胞によって培養上清中に分泌され、そしてp22、p23中間体Ｂ型肝炎e産物が、形質導入マウス細胞の溶解物中に主として存在することが示され得る。この図はまた、レトロウイルスで形質導入されたBC10ME細胞に由来する細胞溶解物におけるp21  HBVコアタンパク質の発現を示す。
【０２９４】
実施例13
腫瘍形成性および形質転換
Ａ．腫瘍形成性アッセイ
ヌードマウスにおける腫瘍形成は、腫瘍形成性を決定するために特に敏感な方法である。ヌードマウスは、成熟Ｔ細胞を有さず、それゆえ機能的細胞免疫系を欠き、細胞の腫瘍形成可能性を試験するのに有用なインビボモデルを提供する。正常な非腫瘍形成性細胞は、ヌードマウスに注射された場合に、制御されない増殖特性を提示しない。しかし、腫瘍形成性細胞は、増殖し、そしてヌードマウス中に腫瘍を生成する。手短には、ベクター構築物を、筋肉内および腹腔内注射によりヌードマウス中に投与する。マウスを、注射後４〜16週間の期間、腫瘍増殖を決定するために視覚的に検査する。マウスをまた、腫瘍が存在するか否かを決定するために屠殺および剖検し得る（Giovanellaら,  J.  Natl.  Cancer  Inst.  48:1531-1533,  1972;  Fureszら,  「Tumorigenicity  testing  of  cell  lines  considered  for  production  of  biological  drugs」,  Abnormal  Cells,  New  Products  and  Risk,  HoppsおよびPetricciani(編),  Tissue  Culture  Association,  1985;  Levenbookら,  J.  Biol.  Std.  13:135-141,  1985）。この試験を、Quality  Biotech  Inc.,(Camden,  New  Jersey)により行う。
【０２９５】
Ｂ．形質転換アッセイ
腫瘍形成性は、形質転換の特性と密接に関連することが示されている。形質転換を決定するために利用され得る１つのアッセイは、軟寒天中にプレートされた細胞のコロニー形成である（MacPhersonら,  Vir.  23:291-294,  1964）。手短には、正常な非形質転換細胞の１つの特性は、足場依存性増殖である。正常な非形質転換細胞は、これらが半固体寒天支持培地中にある場合は増殖を停止し、一方、形質転換細胞は、増殖を続けて軟寒天中にコロニーを形成する。
【０２９６】
ヒト線維肉腫に由来し、100％のヌードマウス中で腫瘍を生じることが知られる腫瘍性細胞株であるHT1080（ATCC  CCL  121）を、アッセイのポジティブコントロールとして用いる。ヌードマウスに腫瘍形成しない二倍体胚性ヒト肺細胞株であるWI-38（ATCC  CCL  75）を、アッセイのネガティブコントロールとして用いる。
【０２９７】
WI-38細胞株に、実施例11Aiに記載される通りにベクター構築物を用いて形質導入する。形質導入細胞株HT1080およびWI-38の各々の２連のサンプルを、寒天中で培養する。手短には、5.0mlのDMEM  17％  FBS中0.8％Bactoagar（Difco,  Detroit,  Michigan）の下層を、60mm組織培養プレート上にセットする。これに、５×10５細胞／mlの濃度で懸濁した細胞を有する同じ培地中0.3％Bactoagarの2.0mlを重層する。バックグラウンドの凝集を減らすために、各細胞株を、70lmナイロンメッシュを通して濾過した後で、寒天溶液に懸濁する。プレートを、５％  CO2の加湿雰囲気において37℃にて14日間インキュベートする。プレーティングの24時間以内に、各細胞株の代表的なプレートを、プレーティングの時点で存在する細胞凝集について調べる。13日目に、プレートを、1.0ml  INT生体染色（Sigma,  St.  Louis,  Missouri）で染色し、そして14日目にそれらを、直径150  lmのコロニーについて１mm接眼レンズ網線を用いてスキャンする。
【０２９８】
いずれかの方向で150  lm以上にわたるコロニーのみをスコアする。なぜなら、このサイズのコロニーは、全ての平面において顕微鏡下で容易に観察され得、そして非形質転換細胞は、まれにしかこのサイズのコロニーを形成しないからである。このアッセイの終わりに、各細胞株のプレーティング効率を、ｂ／ａ×100として計算した。ここで、ｂは、全てのプレートのコロニーの合計に等しく、そしてａは、プレートする細胞の総数に等しい。非形質転換細胞株は、0.001％以下のプレーティング効率を有する株である。それゆえ、形質転換した細胞株は、0.001％よりも大きなプレーティング効率を有する（Risserら,  Virol.  59:477-489,  1974）。
【０２９９】
実施例14
投与プロトコル
Ａ．マウス
ｉ．組換えタンパク質の投与
モノマーで非粒状形態のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質（D.  Milich,  Scripps  Institute,  San  Diego,  California）は、CTLのためにＴ-helpをプライミングするのに有用であり得る。６〜８週齢の雌性C3H/He  CR、HLA  A2.1、HLA  A2.1/Kbマウスを、完全フロイントアジュバント中に乳濁した10μgのモノマーHBVコアでプライミングする。２〜３週間後、マウスに、処方されたHBV  eまたはHBVコアレトロウイルスベクターのいずれかを注射する（実施例14A  iv  a）。
【０３００】
ii．Adjuvaxとの組換えタンパク質の投与
BALB/c、C57BL/6、およびC3H/Heマウスに、組換えHBV  eまたは組換えHBVコア／Adjuvaxの懸濁液を注射する。抗原-Adjuvax懸濁液を、乾燥Adjuvax粉末（Alpha-Beta  Technology,  Inc.,  Worchester,  Massachusetts）１mgあたりPBS中の抗原溶液1.0mlを添加することにより調製する。抗原Adjuvax混合物を、18ゲージの針を付けたシリンジ中に取り、そして懸濁液を針およびシリンジを通して複数（８〜10回）通過させることにより水和させる。マウスに、0.2mlの抗原-Adjuvax調製物を２回以上注射する。注射を、１〜２週間の間隔をあけて、腹腔内または筋肉内で与える。最後の注射の１〜２週間後、マウスから採血し、そして血清を、HBV  e抗原およびHBVコア抗原に特異的な抗体について試験する。同時に、脾臓を取り出し、そして脾細胞を、HBV  eまたはHBVコア抗原を発現する照射（10,000ラド）した同系細胞でインビトロで再刺激する。エフェクターを、HBV  e/コア特異的CTL活性について、標準的な51Cr放出アッセイ（実施例15Aiを参照のこと）において試験する。
【０３０１】
iii．レトロウイルス形質導入細胞の投与
６〜８週齢の雌性BALB/c、C57BL/6、C3H/Heマウス（Charles  River  Laboratories,  Charles  River,  MA）に、抗原を発現する１×10７個の照射（室温にて10,000ラド）同系細胞を腹腔内（i.p.）注射する。４回の注射を、１週間の間隔で与える。各注射の後、血清を、実施例15Bに記載されるように、抗体誘導の検出のために後眼窩出血により取り出す。最後の注射の７日後、動物を屠殺し、そして脾細胞を、実施例15Aiに記載されるようにクロム放出CTLアッセイのために取り出す。
【０３０２】
iv．ベクター構築物の投与
ａ．組換えレトロウイルスベクター
６〜８週齢の雌性BALB/c、C57BL/6、C3H/He（Charles  River  Laboratories,  Charles  River,  MA）、HLA  A2.1（V.  Engelhard,  Charlottesville,  Virginia）、またはHLA  A2.1/Kb（L.  Sherman,  Scripps  Institute,  San  Diego,  California）マウスに、0.1mlの処方HBVコア、HBV  e、またはHB  Fコア/neoＲレトロウイルスベクターを２部位に筋肉内（i.m.）注射するか、または尾の基部で皮内注射する。２回、４回、または６回の注射を、１週間の間隔で与える。各注射の後、実施例15Bに記載される通りに、抗体誘導の検出のために、血清を後眼窩出血により取り出す。最後の注射の14日後、動物を屠殺する。次いで、クロム放出CTLアッセイを、本質的に実施例15Aiに記載される通りに行う。
【０３０３】
ｂ．サイトカインを有する組換えレトロウイルスベクター
６〜８週齢の雌性C3H/He  Charles  River、HLA  A2.1、またはHLA  A2.1/Kbにまた、0.05mlの処方HBVコアレトロウイルスベクターおよび0.05mlの25,000単位のマウスγ-インターフェロン（m  γ-IFN）またはマウスIL-2のいずれかを筋肉内注射する。２〜３回の注射を、１週間の間隔で与える。最後の注射の14日後、動物を屠殺する。次いで、クロム放出CTLアッセイを、本質的に実施例15A.iに記載される通りに行う。
【０３０４】
ｃ．直接DNA投与
５〜６週齢の雌性C3H、HLA  A2.1、またはHLA  A2.1/Kｂマウスを、両方の脚の前脛骨筋中に注射する。各脚は、100μgのDNAを含有する50μlの滅菌0.9％滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.3）を、27ゲージの針およびTBシリンジで受ける。３回の注射を、３週間の間隔で与える。最後の注射の４週間後に動物を屠殺し、そして脾臓を採取する。
【０３０５】
ｄ．組換えアデノウイルスベクター
６〜８週齢の雌性C3H/He、HLA  A2.1、またはHLA  A2.1/Kbマウスに、５×10７pfuの組換えHBeアデノウイルスを静脈内または腹腔内注射する。注射の７日後、動物を、実施例15Aiに記載される通りにクロム放出CTLアッセイのために屠殺する。
【０３０６】
Ｂ．マカク
種々の齢の雄性および雌性のマカク（Primate  Research  Institute,  White  Sands,  New  Mexico）に、0.5mlの処方HB  Fコア/neoＲベクター、HBVコア、またはHBV  eレトロウイルスベクターを筋肉内（４部位）注射または首のうなじに皮内注射する。４回の注射を、14日間の間隔で与える。各注射の14日後に、血液サンプルを、実施例15Aiiiに記載される通りにクロム放出CTLアッセイのために収集する。
【０３０７】
Ｃ．チンパンジー
マウスおよびマカク系で生じたデータを用いて、Ｂ型肝炎ウイルスに慢性感染したチンパンジーにおけるベクターの投与のプロトコルを決定する。マウスおよびマカクにおけるHBV特異的CTLの誘導に基づいて、チンパンジー試験における被験体（White  Sands  Research  Center,  Alamorgordo,  NM,  Southwest  Foundation  for  Biomedical  Research,  San  Antonio,  Texas）は、４用量の処方HB  Fコア/neoＲベクターを14日間の間隔で受ける。投薬量は、各注射日に４回の0.5mlのi.m.注射で与えられる10９cfu/mlの処方HB  Fコア/neoＲベクターである。血液サンプルを、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）レベル、Ｂ型肝炎ｅ抗原に対する抗体の存在、HBV  DNAレベルを測定するため、ならびに処置の安全性および許容度を評価するために処置の間に採取する。Ｂ型肝炎ｅ抗原およびHB  e抗原に対する抗体を、実施例12Aに記載される通りにAbbott  HB  e  rDNA  EIAキットにより検出する。Ｂ型肝炎コアまたはｅ抗原に対するCTLの誘導の効力は、実施例15Aivに記載される通りに決定され得る。
【０３０８】
チンパンジーでの試験からの安全性および効力の結果に基づいて、投薬量および接種スケジュールが、ヒトでの試験における被験体へのベクターの投与のために決定される。これらの被験体を、血清ALTレベル、Ｂ型肝炎ｅ抗原の存在、Ｂ型肝炎ｅ抗原に対する抗体の存在、およびHBV  DNAレベルについて本質的に上記のようにモニターする。Ｂ型肝炎コアまたはｅ抗原に対するヒトCTLの誘導は、実施例15A  ivに記載される通りに決定される。
【０３０９】
実施例15
Ａ．細胞傷害性アッセイ
ｉ．近交系マウス
６〜８週齢の雌性Balb/C、C57Bl/6、およびC3Hマウス（Harlan  Sprague-Dawley,  Indianapolis,  Indiana）に、それぞれ、１×10７個の照射（室温にて10,000ラド）ベクター形質導入BC10ME、B16、およびL-M(TK−)細胞を１週間の間隔で２回、腹腔内（i.p.）注射する。動物を、ベクターまたは形質導入同系細胞の投与後に屠殺する。脾細胞（３×10６/ml）を採取し、そしてそれらのそれぞれの照射形質導入細胞（６×10４/ml）とともにT-25フラスコ（Corning,  Corning,  New  York）中でインビトロ培養する。培養培地は、RPMI  1640、５％熱不活化ウシ胎児血清、１mMピルビン酸ナトリウム、50μg/mlゲンタマイシン、および10−５M  b  2-メルカプトエタノール（Sigma,  St.  Louis,  Missouri）からなる。エフェクター細胞を、４〜７日後に採取し、そして種々のエフェクター：標的細胞比を用いて96ウェルマイクロタイタープレート（Corning,  Corning,  New  York）中で標準的なクロム放出アッセイにおいて試験する。標的は、HBコアまたはHBC形質導入L-M(TK−)細胞であり、一方非形質導入L-M(TK−)細胞株は、バックグラウンド溶解のコントロールとして用いる。詳細には、Na２51CrO４標識（Amersham,  Arlington  Heights,  Illinois）（100μCi,  37℃にて１時間）標的細胞（１×10４細胞／ウェル）を、エフェクター細胞と、種々のエフェクター対標的細胞比で、200llの最終容量で混合する。インキュベーションに続いて、100μlの培養培地を取り出し、そしてBeckmanガンマ分光器（Beckman,  Dallas,  Texas）において分析する。自然放出（SR）を、標的＋培地からのCPMとして決定し、そして最大放出（MR）を、標的＋１Ｍ  HClからのCPMとして決定する。標的細胞溶解の％を、以下の通りに計算する：[（エフェクター細胞＋標的CPM）−（SR）/（MR）−（SR）]×100。標的の自然放出値は、代表的にはMRの10％〜20％である。
【０３１０】
確実なCTLアッセイのために、エフェクターは、インビトロで複数回、例えば、一次インビトロ刺激の８〜12日後に刺激され得る。より詳細には、10７個のエフェクター細胞を、６×10５個の照射（10,000ラド）刺激細胞、および２×10７個の照射（3,000ラド）の「フィラー」細胞（以下に記載の通りに調製される）と10mlの「完全」RPMI培地中で混合する。（PRMIは、以下を含む：５％熱不活化ウシ胎児血清、２mM  L-グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、および５×10５M  β-メルカプトエタノール）。「フィラー」細胞を、RPMI中に再懸濁し、室温にて3,000ラドで照射したナイーブ同系マウス脾細胞から調製する。脾細胞をPRMIで洗浄し、3,000rpmで室温にて５分間遠心分離し、そしてペレットをRPMI中に再懸濁する。再懸濁した細胞を、1.0ml  Tris-塩化アンモニウム（100mlの0.17M  Trisベース（pH7.65）＋900mlの0.155M  NH4Cl；最終溶液は、7.2のpHに調整される）で、37℃にて３〜５分間処理する。次いで、二次インビトロ再刺激物を、CTLアッセイにおいて試験する５〜７日前に培養する。任意の続いての再刺激物を、上記の通りに、２〜10Ｕの組換えヒトIL-2（200Ｕ/ml、カタログ番号799068、Boehringer  Mannheim,  W.  Germany）を添加して培養する。
【０３１１】
特定の場合には、非標識非形質導入またはβ-gal/neo形質導入標的を、所定の比で標識された標的に添加することが必要であり得る。このことは、ネガティブコントロール細胞のバックグラウンド溶解を減少させる。
【０３１２】
β-gal/neo形質導入標的を、以下の通りに生成する。細菌のβ-gal遺伝子を含むプラスミドpSP65を得、そして3.1Kbのβ-gal遺伝子をXbaI-SmaIフラグメントとして単離し、そしてXbaI-SmaIで消化したpC15CAT（Anyaら,  Science  229:69-73,  1985）中に挿入する。β-gal遺伝子を、3.1KbのSalI-SmaIフラグメントとして切断し、そしてN2  IIIB  gag/protレトロウイルスベクターバックボーン中にXhoIおよび平滑化ClaI部位で挿入する。このプラスミドを、CB-β  galと称する。
【０３１３】
Ｎ２  III  B  gag/protの構築を、以下に記載する。HIV-1  gag遺伝子の主要なスプライスドナー（SD）部位を、pSLCATdelBglII（HXB2と呼ばれる、HIV-1  IIIBのクローンに由来する、gag/pol、tat、およびrevを発現するベクター）のPCRによりGTをACに変更することにより除去する。PCR変異誘発手順の間、780bpのSacI-SpeI  SD  delta  gagフラグメントを精製し得るように、SacI部位をまた、SD  delta部位の上流に作製する。1.5KbのSpeI-EcoRV  gag-prot-RTフラグメントおよび780bpのSacI-SpeI  SD  delta  gagフラグメントを、pUC18  SacI-SmaI部位に挿入する。得られる2.3KbのSacI平滑末端BamHI  SD  delta  gag-prot-RTフラグメントを、このpUC18ベクターから単離する。SK＋  gag-prot-RT発現ベクターを、３部連結により生成する。３部連結では、239bpのXhoI-SspI  5'  rev  DNAフラグメントおよび2.3KbのSacI平滑末端BamHI  SD  delta  gag-prot-RTフラグメントを、SK＋ベクターフラグメント中のXhoI-BylII  4.2Kb  rre/3'  rev中に挿入する。得られる構築物を、SK＋  gag-prot-RT/rre/revと称する。N2ベースgag-prot-RT発現ベクターを、２部連結により生成する。２部連結では、SK＋  gag-prot-RT/rre/rev由来の3.8KbのXhoI-ClaI  gag-prot-RT/rre/revフラグメントを、LTRを含むN2  IIIB  envのフラグメントのXhoI-ClaI部位に挿入する。N2  IIIB  envは、N2組換えレトロウイルス（Armentanoら,  J.Virol.  61:1647-1650,  1987;  Eglitasら,  Science  230:1395-1398,  1985）に基づく改変された5'末端を有する、pAF/Envr/SV2neoの誘導体である。
【０３１４】
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するSV40初期プロモーターから構成されるpAFVXMレトロウイルスベクター（Krieglerら,  Cell  38:483,  1984;  St.  Louisら,  PNAS  (USA)  85:3150-3154,  1988）由来のClaI-ClaI優性選択マーカー遺伝子フラグメントを、プラスミドSK＋にクローニングする。これから、1.3KbのClaI-BstBI  neo遺伝子フラグメントを、感染およびトランスフェクトされる細胞株の単離を容易にするためにN2ベースgag/prot/RT発現ベクター中にClaI部位で挿入する。このベクターを、N2  IIIB  gag/protと呼んだ。
【０３１５】
感染性レトロウイルス粒子を、実施例7Aに記載される通りに、CB-β  galプラスミドのトランスフェクションにより安定なプロデューサー細胞株の生成を通して生成する。これらの研究で利用される安定なプロデューサー細胞株は、DA細胞株（WO  92/05266）由来であり、そしてDA-b  galと称する。次いで、DA-b  galを用いて、b  gal/neoを発現するレトロウイルスベクターを生成する。C3H（H-2k）細胞株LMTK−を、実施例11Aiに記載される通りにb  gal/neoベクターで形質導入する。クローンを、b  gal発現についてスクリーニングし、そして最大に発現するクローンを、CTLアッセイにおけるネガティブ「neo」コントロールとして使用するために選択する。
【０３１６】
これらの手順を用いて、HBVコア処方ベクターのi.m.投与が、C3H/He  CRマウスにおいてHBVコアおよびHBV  e抗原に対するCTL応答を誘導することを示し得る（図９を参照のこと）。
【０３１７】
HBVコア処方ベクターのi.m.投与によりプライミングしたC3H/He  CRマウス（H2k）から得たエフェクター細胞を、HB  cAgレトロベクター形質導入LMTK細胞（H-2k）、HBcAgレトロベクター形質導入BL/6細胞（H-2b）、またはHBcAgレトロベクター形質導入BC10ME細胞（H-2d）をクロム放出アッセイにおいて標的として用いてそれらの細胞溶解活性について試験する。図10の結果は、HBcAgレトロベクターでの免疫により誘導されたエフェクターは、H-2k  MHCクラスＩに拘束されることを示す。なぜなら、エフェクターは、H-2kの状況でHBcAgを提示する標的を殺傷するが、H-2bまたはH-2dの状況でHBcAgを提示する標的は殺傷しないからである。
【０３１８】
上記の手順から、処方されたHBコアベクターを投与することにより刺激されたエフェクター細胞から、磁性ビーズに結合された抗CD4または抗CD8抗体のいずれかでの処理により、CD4細胞またはCD8細胞を枯渇させた。
【０３１９】
CD4細胞が枯渇した刺激されたエフェクター細胞を、Dynabeads（Dynal  Inc.,  Skoyen,  NO）を用いる免疫磁性分離により、以下の通りに単離する：a)再刺激された脾細胞（spenocyte）を、４℃にて30分間、モノクローナルラット抗L3T4（Collaborative  Biomedical  Products,  Becton  Dickinson  Labware,  Bedford,  ME）とともにインキュベートし、b)細胞を、10％  FCSを含有するDMEMで２回洗浄し、そして培地中に１×10７細胞/mlに再懸濁し、c)ヒツジ抗ラットIgGでコートした予備洗浄したDynabeads（Dynal  Inc.,カタログ番号M-450）約75μl/l×10７細胞/mlを、細胞に添加し、そしてCD4＋細胞を、磁気的に回収する。次いで、残りのCD4枯渇細胞を、それらの細胞溶解活性について、LMコア/neorおよびB-gal/neorをクロム放出アッセイにおいて標的として用いて試験する。
【０３２０】
CD8細胞が枯渇された刺激されたエフェクター細胞を、Dynabeads（Dynal  Inc.,  Skoyen,  NO）を用いる免疫磁性分離により、以下の通りに単離する：a)再刺激された脾細胞（spenocyte）を、４℃にて30分間、モノクローナルラット抗Lyt-2（Collaborative  Biomedical  Products,  Becton  Dickinson  Labware,  Bedford,  ME）とともにインキュベートし、b)細胞を、10％  FCSを含有するDMEMで２回洗浄し、そして培地中に１×10７細胞/mlに再懸濁し、c)ヒツジ抗ラットIgGでコートした予備洗浄したDynabeads（Dynal  Inc.,カタログ番号M-450）約75μl/l×10７細胞/mlを、細胞に添加し、そしてCD8＋細胞を、磁気的に回収する。次いで、残りのCD8枯渇細胞を、それらの細胞溶解活性について、i.m.コア/neorおよびB-gal/neorをクロム放出アッセイにおいて標的として用いて試験する。図11に示す結果は、CTLエフェクターが、CD8＋、CD4−であることを示す。
【０３２１】
ii．HLA  A2.1およびHLA  A2.1/Kbトランスジェニックマウス
動物を屠殺し、脾臓細胞（３×10６/ml）を、フラスコ（T-25、Corning、Corning、New  York）中で照射（10,000ラド）形質導入Jurkat  A2/Kb細胞またはペプチドコーティングJurkat  A2/Kb細胞（６×10４ml）と共にインビトロで培養した。クロミウム放出アッセイの残りを、実施例15Aiに記載のように実施する。ここでは標的は、形質導入したおよび形質導入していないEL4  A2/Kb細胞およびJurkat  A2/Kb細胞である。非形質導入細胞株をネガティブコントロールとして使用する。標的はまた、実施例16に記載のようなペプチドコーティングEL4  A2/Kb細胞であり得る。
【０３２２】
iii．マカクCTLアッセイ
血液サンプルを、各注射の14日後にヘパリン化チューブ中に収集する。次いで、末梢血液単核細胞（PBMC）を、Ficoll-hypaqueカラムによって、室温で30分間、2000rpmで回転させる。PBMCを、それらの自己形質導入LCLを用いて、刺激因子：エフェクター比10:1で７〜10日間インビトロで刺激する。培養培地は、５％熱不活性化ウシ胎児血清（Hyclone、Logan、Utah）、１mMピルビン酸ナトリウム、10mM  HEPES、２mM  L-グルタミン、および50μg/mlゲンタマイシンを有するRPMI1640からなる。得られた刺激CTLエフェクターを、標準的なクロミウム放出アッセイにおいて、形質導入および非形質導入自己LCLに対するCTL活性について試験する。
【０３２３】
iv．チンパンジーおよびヒトCTLアッセイ
ヒトPBMCをFicoll（Sigma、St.  Louis、Missouri）勾配遠心分離により分離する。詳細には、細胞を3,000rpmで室温で５分間遠心分離する。PBMCを、それらの自己形質導入LCL（実施例10B）を用いて刺激因子：エフェクター比10:1で10日間インビトロで再刺激する。培養培地は、予めスクリーニングしたロットの５％熱不活性化ウシ胎児血清、１mMピルビン酸ナトリウム、および50μg/mlゲンタマイシンを有するRPMI1640からなる。得られた刺激CTLエフェクターを、標準的なクロミウム放出アッセイにおいて、標的として形質導入自己LCLまたはHLA適合細胞を用いてCTL活性について試験する（実施例12Ai）。ほとんどの患者は、EBVに対する免疫性を有するので、非形質導入EBV形質転換Ｂ細胞（LCL）（ネガティブコントロールとして用いた）もまた、形質導入LCLと共にEBV特異的CTLにより、標的として認識される。EBV特異的CTLによる標識化標的細胞の殺傷に起因する高いバックグラウンドを低減させるために、未標識非形質導入LCLを標識化標的細胞に50:1の比で添加することが必要である。
【０３２４】
Ｂ．体液性免疫応答の検出
HBVコアおよびe抗原に特異的なマウスにおける体液性免疫応答を、ELISAによって検出する。ELISAプロトコルは、100μg/ウェルの組換えHBVコアおよび組換えHBV  e抗原(Biogen、Geneva、Switzerland）を96ウェルプレートをコーティングするために使用する。次いで、HBVコアまたはHBV  e抗原を発現する細胞または直接的なベクターで免疫したマウス由来の血清を抗原コーティングウェル中に系列希釈し、そして室温で１〜２時間インキュベートする。インキュベーション後、等価な力価のウサギ抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、およびIgG3の混合物をウェルに添加する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（「HRP」）結合ヤギ抗ウサギ抗血清を各ウェルに添加し、そしてサンプルを室温で１〜２時間インキュベートする。インキュベーション後、反応性を適切な基質を添加することにより可視化する。HBVコアおよびHBV  e抗原に特異的なIgG抗体を含有するウェルにおいて、発色する。
【０３２５】
これらの手順を用いて、HBVコア抗原およびHBV  e抗原に対するIgG抗体がマウスにおいて誘発され得ることが示され得る（図７）。（抗体力価を免疫前血清のCD読みとりの３倍を得るのに必要な希釈逆数として表す。）
HBVコアまたはeレトロベクターで免疫したマウスにおける体液性応答のイソ型を、以下の改変を伴って、上記のELISAアッセイによって検出する：マウス由来の血清を、ウェルを以前に記載のように組換えコアタンパク質または組換えeタンパク質のいずれかでコーティングした96ウェル力価プレートのウェルに系列希釈する。特定のイソ型を、以下のウサギ抗マウス抗血清の１つとのインキュベーションにより決定する：IgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3。このアッセイは、以前に記載のように開発される。この手順を用いて、IgG2a抗体は、処方HBVコアベクター（6A3）で免疫したC3H/He（CR）マウスにおいて優先的に誘発され、そしてIgG1抗体は、処方HBV3ベクター（5A2）で免疫したC3H/He  CR  マウスにおいて優先的に誘発されることが示され得る（図１２を参照のこと）。
【０３２６】
Ｃ．Ｔ細胞増殖
HBVコアまたはe抗原を発現する直接ベクター調製物の２つまたは３つの注射から得られる抗原誘導Ｔヘルパー活性を、インビトロで測定する。詳細には、免疫マウス由来の脾臓細胞を、HBVコアまたはe抗原を発現する細胞あるいはHBVコアまたはe抗原を発現しない細胞（ネガティブコントロールとして）と所定の比で、インビトロで再刺激する。５％FBS、1.0mMピルビン酸ナトリウム、および10−５β2-メルカプトエタノールを含有するRPMI  1640培養培地中で37℃および５％CO2で５日後、上清をIL-2活性について試験する。IL-2は、HBVコアまたはe抗原により刺激されたＴヘルパー細胞により特異的に分泌され、その活性を、CTLクローン、CTLL-2（ATCC  TIB  214）を用いて測定する。簡潔には、CTLL-2クローンは、増殖についてIL-2に依存性であり、そしてIL-2の不在下では増殖しない。CTLL-2細胞を、96ウェルプレート中で上清試験サンプルの系列希釈液に添加し、そして37℃および５％CO2で３日間インキュベートする。続いて、0.5  ICi３ＨチミジンをCTLL-2に添加する。３Ｈチミジンは、CTLL-2細胞が増殖する場合にのみ取り込まれる。一晩インキュベートした後、細胞をPHD細胞採取機（Cambridge  Technology  Inc.,  Watertown,  Massachusetts）を用いて採取し、そしてBeckmanベータカウンターにおいて計数する。サンプル中のIL-2の量を、Boehringer  Mannheim（Indianapolis,  Indiana）から得られた組換えIL-2標準物から作成した標準曲線から決定する。
【０３２７】
Ｄ．Ｔ細胞由来のサイトカインの測定
上述のように、主として、ＴＨ１およびＴＨ２と称される２つのタイプのＴリンパ球ヘルパー細胞（ＴＨ）がある。誘発されたＴＨのタイプを測定する１つの方法は、体液性免疫応答の優勢なイソ型を決定し（実施例15Bを参照のこと）、それにより生成されたＴＨ応答のタイプを間接的に決定することである。あるいは、マウス脾臓細胞由来のTH細胞集団のサイトカイン分泌パターンは、上記のようにインビトロで再刺激した。培養５〜７日後、上清を、各サイトカイン（Pharmagen、San  Diego、CA）に特異的なELISAアッセイを用いてIL-2、IFN-γ、IL-4、およびIL-10について試験する。
【０３２８】
TH誘発のタイプを定義するためのさらに別の直接的な方法は、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、インビトロで再刺激された脾臓細胞のCD4＋選択集団由来のサイトカイン分泌パターンを直接測定することである。簡単には、CD4＋Ｔ細胞集団を、以下のようにDynabeads（Dynal  Inc.,  Skoyen,  NO）を用いて免疫磁気分離により単離する：(a)再刺激された脾臓細胞を４℃で30分間、モノクローナルラット抗L3T4（Collaborative  Biomedical  Products,  Becton  Dickinson  Labware,  Bedford,  ME）と共にインキュベートし、(b)細胞を、10％FCSを含むDMEMで２回洗浄し、そして培地中１×10７細胞／mlに再懸濁し、(c)ヒツジ抗ラットIgGでコーティングした予備洗浄したDynabeads（Dynal  Inc.,  カタログ番号M-450）の約75ml/１×10７細胞/mlを細胞に添加し、そしてCD4＋細胞を磁気により回収する。フローサイトメトリーを用いてCD4＋Ｔ細胞の濃度を決定する。選択されたCD4＋集団由来のRNAをChomczynskiおよびSacchiの方法（Anal.  Biochem.  162:156,  1987）により単離する。CD4＋選択細胞を４Ｍグアニジウム緩衝液に添加し、そしてサンプルをDNase1（Promega、Madison、WI）で37℃で30分間処理する。cDNAをCD4＋選択細胞から単離した1mgのRNAから合成する。簡潔には、13ml  DEPC処理H2O中の1mgのRNAを、1ml（0.5mg/ml）オリゴdTプライマー、1mlの鳥類骨髄芽球ウイルス（AMV）逆転写酵素、および0.5mM  dNTPをRNAに添加し、そして42℃で１時間インキュベートすることによりプライムする。約20mlのプライムRNAを、50mM  Tris-HCl  (pH9.0)、50mM  KCl、2.5mM  MgCl2、0.1％(w/v)ゼラチン、0.2mM  dNTP、25pM  5'および3'オリゴヌクレオチドプライマー、および2.5U  Taqポリメラーゼ（Promega、Madison、WI）を含有する30mlのPCR反応混合物と混合する。アリコートを、DNA  Thermocycler（Perkin-Elmer  Corp.,  Norwalk,  CT）中で増幅する。40サイクルプログラムを使用する。このプログラムでは、各サイクルは、94℃で１分間の変性工程、および55℃（IL-2およびg-IFNについて）または65℃（IL-4およびIL-10）で２分間のアニーリング／伸長工程からなる。次いで、PCR産物のアリコートを２％アガロースゲル上に電気泳動する。サイトカイン特異的プライマー対（5'および3'）の配列は以下の通りである：
IL-2；
（配列番号67）
5'-3'：ACTCACCAGGATGCTCACAT
（配列番号68）
5'-3'：AGGTAATC-CATCTGTTCAGA
IL-4；
（配列番号69）
5'-3'：CTTCCCCCTCTGTTCTTCCT
（配列番号70）
5'-3'：TTCCTGTCGAGCCGT-TTCAG
IL-10；
（配列番号71）
5'-3'：ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA
（配列番号72）
5'-3'：TCTCAAGGGGCT-GGGTCAGCTATCCCA
IFN-γ；
（配列番号73）
5'-3'：AGTTATATCTTGGCTTTTCA
（配列番号74）
5'-3'：ACCGAATAA-TTAGTCAGCTT
PCR結果（IL-2がIL-2であり、IL-4がIL-4であり、IL-10がIL-10であり、そしてIFN-γがIFN-γであること）を確証するために、PCR産物を電気泳動し、そしてHybond-Nナイロン膜（Amersham  Corp.、Arlington  Heights、IL）に移す。あるいは、PCR産物をスロットブロッティングによりナイロン膜に直接適用する。PCR増幅プライマーに隣接された領域内の配列に相補的なオリゴヌクレオチドを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Boeringer  Mannheim  Biochemicals,  Indianapolis,  IN）および３２Ｐ-γATP（7000Ci/mM、ICN、Costa  Mesa,  CA）（放射性プローブとして使用）により5'末端で標識する。次いで、ブロットを、Sambrookらにより記載のように本質的に、室温で、プローブと４時間ハイブリダイズし、５分間、２×SSCおよび0.1％SDSで、次いで0.2×SSCおよび0.5％SDSで洗浄する。次いで、ブロットをＸ線フィルムに露出し、-80℃で一晩、増感スクリーンを行う。オリゴヌクレオチドプローブ（5'および3'）の配列は以下の通りである：
IL-2；
（配列番号75）
5'-3'：AGCTAAATTTAGGCACTTCCTCCAG
IL-4；
（配列番号76）
5'-3'：CTCGGTG-CTCAGAGTCTTCTGCTCT
IL-10；
（配列番号77）
5'-3'：CAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCA-
ACAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGACTTTGACATC
γ−IFN；
（配列番号78）
5'-3'：ATTTGGC-TCTGCATTATTTTTCTGT
膜を放射性プローブとハイブリダイズし、そしてAMBIS放射分析画像化システム（Automated  Microbiology  Systems  Inc.,  San  Diego,  CA）を用いて走査する。
【０３２９】
実施例１６
組換えHBVポリペプチドを用いたインビボプライミングによる、発現されたHBV抗原コードベクターに対する始原ヘルパーＴ細胞応答の増強
HBVコアおよびｅ抗原(HBc/eAg)を発現し、哺乳類宿主においてヘルパーＴ細胞をプライムする組換えレトロウイルスベクターの能力を評価した。HBcAg(「HBc(3A4)」と称する)、HBeAg(「HBe(5A2)」と称する)、およびネオマイシンホスホリルトランスフェラーゼ短縮型欠失変異体にインフレームで融合したHBcAgを含む融合タンパク質(「HBc/neo(6A3)」と称する)をコードするヌクレオチチド配列を発現するレトロウイルスベクターを、実施例５に記載のようにKT-3レトロウイルス骨格を用いて構築した。簡単に述べれば、HBc(3A4)構築物は、HBVカプシドアセンブリ中に見出される183アミノ酸HBVコアタンパク質を発現する。HBe(5A2)レトロウイルスは、天然に存在するプレタンパク質中に見出されるＮおよびＣ末端アミノ酸配列を欠いているが、９アミノ酸の分泌シグナル配列を所有するHBVｅ抗原の成熟分泌形態を発現する。HBc/neo(6A3)レトロウイルスは、ネオマイシンホスホリルトランスフェラーゼに融合した183アミノ酸のHBVカプシド抗原の発現を行う。
【０３３０】
一般に、以下で特に他であるように注記されなければ、ベクターの力価は、１×103〜１×109  cfu/mlであった。すべての筋肉内レトロウイルスベクター免疫化は100μl/筋肉であり、そしてすべての皮下またはフットパッド免疫化は50μl(フットパッドあたり)であった。これは、筋肉内投与について200μlの、そしてフットパッド投与について100μlの総容量であった。
【０３３１】
Ａ．インビボでHBVコアおよびｅ抗原でプライムされる弱い抗原特異的ヘルパーＴ細胞応答を発現するレトロウイルスベクター。
【０３３２】
１．HBc/eAg特異的抗体応答
３つのレトロウイルスベクター、3A4、5A2、および6A3によるマウスヘルパーＴ細胞応答のインビボプライミングを、B10の遺伝的背景を共有していた４〜８週齢のH-2類遺伝子性マウスを用いて調査した。簡単に述べれば、ベクター(１〜８×107  cfu)を、ゼロ、２、および４週で、マウスに直接筋肉内注射し、そして試験出血を、８週間の間、２週間毎に、後方眼窩叢から集めた。ヘルパーＴ細胞機能を、固相への抗原の吸着を0.5  μg/mlのrHBcAg(Schodelら、J.  Biol.  Chem.  268:1332、1993)および0.1μg/mlのHBeAg-9.6(Milichら、1988)を用いて行ったことを除いて、先に記載のように(Milichら、J.  Immunol.  141:3617、1988;  Milichら、J.  Immunol.  139:1223,  1987)、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて、免疫血清中で抗原特異的抗体力価を測定することにより分析した。マウスH-2ハプロタイプ(Milichら、J.  Virol.  69:2776、1995)および免疫グロブリンイソ型(Stevensら、Nature  334a;  255、1988)の、HBc/eAg応答との先に同定された相関関係は、体液性免疫に対するヘルパー細胞機能の重要性を示した。
【０３３３】
結果は以下の表１に報告される。H-2bマウスは、レトロウイルスベクター3A4および5A2を用いて接種後４〜６週で低いが検出可能なHBc/eAg抗体力価を生成したが、6A3は生成しなかった。逆にH-2kマウスは、ベクター3A4または5A2に応答して測定可能な力価を生成しなかったが、6A3を用いた接種に応答した。すべての場合で、一次抗体応答は貧弱で(力価＜１：1000)、そして二次応答は、力価は、＜１：10,000希釈以上であった。さらにインビトロレトロウイルス感染DA生産体細胞株中の発現されたHBc/eAgポリペプチドの細胞下免疫局在化は、3A4および6A3にコードされたHBV抗原が、細胞内位置に優先的に残存し、その一方HBeAgが5A2感染細胞により分泌されたことを示した。
【０３３４】
表１
HBc[3A4]、HBE[5A2]、およびHBc/neo[6A3]レトロウイルスベクターを用いた遺伝子免疫化後のB10(H-2b)およびB10.BR(H-2k)マウスにおける体液性免疫応答。力価は、非免疫化血清の平均の３倍を超える492nmでのODを与える血清の最終希釈として規定された終点力価として与えられる。各値は２〜４匹のマウスの平均終点力価を表す。
【０３３５】
【表１】
2010116417.tif 000029
２．HBc/eAg特異的Ｔ細胞増殖およびサイトカイン表現型
H-2kマウスに、rHBcAg(Schodelら、J.  Biol.  Chem.  268:1332、1993)または上記で論議されたレトロウイルスベクター3A4およば6A3の１つのいずれかをインビボ注射し、そしてHBV抗原に対する２次インビトロＴ細胞応答を評価した。より詳細には、フロイントの完全アジュバント中で乳化したrHBcAg(１〜7.6×108cfu/ml)を３〜４のC3H/Heマウスの後足フットパッド中に皮下注射した；他の群のマウスには、２×107〜1.5×108  cfuレトロウイルスベクター3A4(HBcAgを発現する)または6A3(HBcAg/neo融合タンパク質を発現する)を筋肉内投与した。レトロウイルスベクターを受けた群は、５日後に同じベクターで追加免疫された。最初の免疫化の９〜11日後、排出したリンパ節細胞を動物から集め、そして単細胞懸濁液(増殖アッセイにはウェルあたり６×105細胞、サイトカインアッセイにはウェルあたり８×105細胞)をClick培地(Clickら、Cell.  Immunol.  3:264、
1972)を用いて96ウェルプレート中で培養した。培養は、96時間の間、以下のHBV抗原の存在下または非存在下で維持した：rHBAg(Schodelら、J.  Biol.  Chem.  268:11332-7、1993)；HBeAg-7.2と呼ばれる短縮型HBcAg(Milichら、J.  Immunol.  141:3617-3624、1988)；またはp111-130、ヘルパーＴ細胞エピトープを規定するHBc/eAgアミノ酸111-130を含む合成ペプチド。
【０３３６】
Ｔ細胞増殖は、マイクロウェルに１μCi/ウェル  TdRの添加の後、培養の最終の16時間に、細胞DNA中に取り込まれた3Hチミジン(TdR；Amersham.  UK)により測定された。サイトカイン測定には、培養上清を、IL-2アッセイについては24時間後、そしてIL-4およびIFN-γアッセイについては48時間後に取り出した。IL-2は、IL-2感受性細胞株NK'Aの増殖を測定することにより定量し、そしてIL-4は、IL-4感受性細胞株CT4.Sの増殖を測定することにより定量した(Milichら、J.  Virol.  69:2776、1995；Milichら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  92:6847、1995)。IFN-γは、Pharmagen(San  Diego、CA)からのサンドイッチ酵素連結イムノアッセイを用いて測定した(Milichら、J.  Virol.  69:2776、1995;  Milichら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  92:6847、1995)。
【０３３７】
結果は図１５に提供される。簡単に述べれば、rHBcAgを用いたＴ細胞のインビボプライミングは、すべての３つのHBV抗原に対する２次インビトロＴ細胞増殖応答の能力により評価したとき、いずれのレトロウイルスベクターを用いたプライミングより効果的であった。Ｔ細胞増殖は、アッセイ培養に対して、モノクローナル抗CD4抗体(GK1.5、ATCC  TIB207)の添加によりブロックされたが、モノクローナル抗CD8抗体(2.43、ATCC  TIB210)の添加によりプロックされず、増殖するＴ細胞は、CD4+/CD8-であったことを示す。
【０３３８】
rHBcAgを用いた２次インビトロ刺激後の、5A2でプライムされたB10(H-2b)マウスからの脾臓Ｔ細胞中のサイトカイン遺伝子発現のプロフィールを、RT-PCRにより調べた。簡単に述べれば、5A2でプライムされたB10マウスからの２×106脾臓細胞を、Click培地中、５μg/ml  rHBcAgの非存在下または存在下で36時間培養した。総RNAを、細胞から、TRIzol  Reagent(GibcoBRL、Gaitherburg、MD)を用いて抽出し、そしてM-MLV逆転写酵素(GibcoBRL)およびオリゴ(dT)12-18プライマーを製造業者の指示に従って用いてcDNAに逆転写した。このcDNAを、サイトカイン特異的プライマーを用いて、製造業者の指示(Stratagene、La  Jolla、CA)に従ってTaqポリメラーゼ(Promega、Madison、WI)で増幅し、そして増幅された生成物を、PCR反応産物の電気泳動の後エチジウムブロマイド染色ゲル中で検出した。
【０３３９】
結果を図16に示す。簡単に述べれば、RT-PCRは、B10脾臓Ｔ細胞がレトロウイルスベクター5A2でインビボプライムされ、そしてrHBcAgでインビトロ再刺激されたB10脾臓細胞はサイトカインIL-2およびIL-4をコードする遺伝子を発現したことを示した。従って、5A2ベクターでプライムされたTh2細胞は、5A2が、体液性免疫についてヘルパーＴ細胞機能を誘導したという観察と一致する。(実施例１６Ａ、前述)。さらに、この結果は、5A2のrHBcAgとHBeAg生成物との間のＴ細胞レベルでの交差反応性を示す。
【０３４０】
Ｂ．5A2レトロベクターから発現された次に遭遇するHBeAgに応答するためのHBc/eAgペプチド129-140でプライムされるTヘルパー細胞
２〜３のB10(H-2ｂ)マウスの群を、HBV抗原をコードするレトロウイルスベクター(3A4、5A2、または6A3)を用いる免疫化９日前に、フロイントの不完全アジュバント中に乳化した100μgのペプチド129-140でプライムした。ペプチドでプライムされないベクター免疫化B10マウスをコントロールとして用いた。後方眼窩叢から隔週に採取された試験血液サンプルから免疫血清を分離した。免疫化のために用いたベクターによりコードされるHBV抗原に特異的な抗体を、市販のアッセイ(Sorin  Biomedica、Saluggia、Italy)を用いてELISAにより検出した。
【０３４１】
結果を図１７に示す。簡単の述べれば、３つのレトロウイルスベクターの任意を単独で用いて一回のみ免疫化したB10マウスは、抗原特異的抗体をほとんどまたは全く産生しなかった。[図６]。ベクターのみの動物とは全く対照的に、最初129-140でプライムされ、次いで3A4または5A2  HBVのいずれかの抗原をコードするレトロウイルスベクターで免疫化されたマウスは、容易に検出可能でかつ安定に維持された抗体力価を産生した。[図６]。ベクター5A2で129-140プライムされたマウスの免疫化は、最も顕著な抗体力価を促進した。これは3A4  HBV抗原の細胞内局在化に対してこのベクターの分泌HBV抗原産物の増加した生体利用性の反映である。経時的なHBeAg特異的体液性応答の安定性は、ペプチド129-140により一度マウス宿主のＴヘルパー細胞がプライムされたならば、5A2ベクターが、抗体力価を維持するに十分なレベルのHBeAgを発現したことを示す。ペプチド129-140は、それ自身、抗HBeAg抗体を惹起しなかったことが強調されるべきである。
【０３４２】
先行する記載から、本発明の特定の実施態様が、例示の目的で本明細書に記載されたが、本発明の思想および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが認識される。従って、本発明は、添付の請求項を除いては制限されない。
【０３４３】
【数２７】
2010116417.tif 000030
【数２８】
2010116417.tif 000031
【数２９】
2010116417.tif 000032
【数３０】
2010116417.tif 000033
【０３４４】
【数３１】
2010116417.tif 000034
【０３４５】
【数３２】
2010116417.tif 000035
【０３４６】
【数３３】
2010116417.tif 000036
【０３４７】
【数３４】
2010116417.tif 000037
【０３４８】
【数３５】
2010116417.tif 000038
【０３４９】
【数３６】
2010116417.tif 000039
【０３５０】
【数３７】
2010116417.tif 000040
【０３５１】
【数３８】
2010116417.tif 000041
【０３５２】
【数３９】
2010116417.tif 000042
【０３５３】
【数４０】
2010116417.tif 000043
【０３５４】
【数４１】
2010116417.tif 000044
【０３５５】
【数４２】
2010116417.tif 000045
【０３５６】
【数４３】
2010116417.tif 000046
【０３５７】
【数４４】
2010116417.tif 000047
【０３５８】
【数４５】
2010116417.tif 000048
【０３５９】
【数４６】
2010116417.tif 000049
【０３６０】
【数４７】
2010116417.tif 000050
【０３６１】
【数４８】
2010116417.tif 000051
【０３６２】
【数４９】
2010116417.tif 000052
【０３６３】
【数５０】
2010116417.tif 000053
【０３６４】
【数５１】
2010116417.tif 000054
【０３６５】
【数５２】
2010116417.tif 000055
【図１】
2010116417.tif 000056
【図２】
2010116417.tif 000057
【図３】
2010116417.tif 000058
【図５】
2010116417.tif 000059
【図７】
2010116417.tif 000060
【図８】
2010116417.tif 000061
【図９】
2010116417.tif 000062
【図１０】
2010116417.tif 000063
【図１１】
2010116417.tif 000064
【図１２】
2010116417.tif 000065
【図１３】
2010116417.tif 000066
【図１４】
2010116417.tif 000067
【図１５】
2010116417.tif 000068
【図１６Ａ】
2010116417.tif 000069
【図１６Ｂ】
2010116417.tif 000070
【図１６Ｃ】
2010116417.tif 000071
【図１７】
2010116417.tif 000072
【図４】
2010116417.tif 000073
【図６】
2010116417.tif 000074