(57)【要約】【課題】タンパク質−ポリマー結合体を迅速にかつ効率的に調製する方法を提供すること。【解決手段】本発明は、インスリン−ポリマー結合体を含む、タンパク質−ポリマー結合体を迅速にかつ効率的に調製する単一工程の方法に関する。本発明の方法によると、タンパク質と親水性のポリマーを、少なくとも１種の有機溶媒および少なくとも１種の金属キレート剤の存在下で、上記タンパク質とポリマーの結合体の形成が促進される条件下で、接触させる。そのように、本発明は、インスリンのような選択されたタンパク質とポリ（エチレングリコール）との残基ＰｈｅＢ１での位置特異的改変に関する。本発明はまた、生分解性ポリマーの結合体をカプセル化する薬学的処方物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、本明細書に全体の内容を参考として援用している、２００３年４月１１日出願の米国特許仮出願番号第６０／４６２，３６４号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、非結合体タンパク質の性質より優れた性質を有する化学的に改変されたタンパク質結合体に関する。詳細には、本発明は、非常に簡素化され、費用有効的であり、量産可能な、親水性ポリマーによりタンパク質を改変する方法に関する。より詳細には、本発明は、インスリンのような、選択されたタンパク質のポリエチレングリコールによる部位特異的改変に関する。本発明は、親水性タンパク質との部位特異的改変を有するタンパク質を包含する、生分解性ポリマーベースの薬剤送達処方物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
ＰＥＧ化インスリン誘導体を産生する種々の方法は、公知である。Ｄａｖｉｓら（米国特許第４，１７９，３３７号）は、ＰＥＧとタンパク質とのリンカーとしてトリクロロ−ｓ−トリアジン（塩化シアヌル）を用いたＰＥＧ−インスリン構築物の合成を、記述した。彼等は、大過剰（５０×）の塩化シアヌル活性化ＰＥＧ（２０００Ｄａ）をホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）中のインスリンと２時間反応させる合成スキームに従った。本発明者らは、部分的に活性な（〜５０％）ＰＥＧ−インスリン結合体（それは非免疫原性であり非抗原性である）を、産生することができた。Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒら（カナダ特許番号第１，１５６，２１７）は、上に引用したＤａｖｉｓ特許の実施例Ｘに従ったＰＥＧ−インスリン結合体の調製は、約５０％のトリ−ＰＥＧ−インスリンを含有する結合体の不均質な混合物を産生し、他の可能なＰＥＧ−インスリン誘導体の組合せ（モノ−ＰＥＧインスリンおよびジ−ＰＥＧ−インスリン）は残基ＰｈｅＢ１で置換されていなかったことを見出した。
【０００４】
Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒら（カナダ特許番号第１，１５６，２１７）は、残基ＰｈｅＢ１で特異的に改変されたＰＥＧ−インスリン結合体の合成を記述している。彼等の発明の基本は、残基ＧｌｙＡ１およびＬｙｓＢ２９の上記反応性アミンを、アルカリ条件下で、有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ピリジンなど）中で、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）基またはメチルスルホニルエチルオキシカルボニル（Ｍｓｃ）基により、保護する工程を含んでいる。（モノ−、ジ−およびトリ−）保護されたインスリンの複雑な混合物から、ＮαＡ１，ＮεＢ２９−ビス−保護されたインスリン種は、従来のクロマトグラフィー技術で単離された。単離に続いて、上記純粋なＮαＡ１，ＮεＢ２９−ビス−保護されたインスリンを、活性化（例えば、酸クロライドまたはイソシアネート）ＰＥＧ誘導体と反応させ、引き続き、ペプチド化学で通例の技術を用いて保護基を除去した。本発明者らは、ＧｌｙＡ１およびＬｙｓＢ２９のアミノ基が、アルカリ反応条件下では、ＰｈｅＢ１のアミノ基より、より反応性であったことを観察した。彼等は、それらの部位特異的ｍＰＥＧ（１５００）−Ｂ１−インスリン結合体が、ウサギの血糖レベルの低下に関して１００％インスリン効果（モル基準で計算した）を有することを決定した。
【０００５】
Ｇｅｉｇｅｒら（Ｄ．Ｂｒａｎｄｅｒｂｕｒｇ，ａｎｄ  Ａ．Ｗｏｌｌｍｅｒ（ｅｄｓ．）Ｉｎｓｕｌｉｎ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ、Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．４０９〜４１５、１９８０）およびＥｈｒａｔら（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２、５６９〜５７３、１９８３）は、Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒらにより記載された多段工程方法に類似する、保護／結合／脱保護スキームを用いて、調製された残基ＰｈｅＢ１での特異的な改変ＰＥＧ−インスリン付加物について記述している。ＧｅｉｇｅｒらおよびＥｈｒａｔらは、上記ＰＥＧ（１５００）−Ｂ１−インスリン結合体が天然のインスリンより抗原性がずっと低くそしてずっとより安定（肝臓の酵素に対して）であるということを観察した。他のＰＥＧ−インスリン調製物（Ｃａｌｉｃｅｔｉら、ＳＴＰ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ、９、１０７〜１１３、１９９９；Ｕｃｈｉｏら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、３５、２８９〜３０６、１９９９；Ｈｉｎｄｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１１、１９５〜２０１、２０００；Ｈｉｎｄｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４：５０５〜５３０、２００２）は以下のいずれかである：１）上記に概説されている基礎的３工程の保護／結合／脱保護のスキームを中心としている、２）結果が上記インスリン分子の非特異的改変になるもの、または３）最も効果的な結合体、即ち，ＰＥＧ−Ｂ１−インスリンを産生しない。
【０００６】
Ｌｉｕら（米国特許番号第６，３２３，３１１Ｂ１号）は、ＰＥＧ−Ｂ１−インスリン結合体の合成の有用な方法を記述している。この方法は、Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒの３工程の保護／結合／脱保護スキームの延長であるが、工程間の反応中間物の単離を必要としない（すなわち一回分式合成）。このように、上記インスリンは、残基ＧｌｙＡ１およびＬｙｓＢ２９で保護され、直ちにＰＥＧと反応し、引き続きいずれの種の単離の前には、脱保護される。本発明は、それらの一回分式反応で５０％までもの正しい位置異性体（即ち，ＰＥＧ−Ｂ１−インスリン）の収率を得、そして次の誘導体化にリサイクルできる未反応インスリンを３０％回収し得ることを請求している。これらの構築物の調製が、てきぱきと実行できたと仮定して、完了するまでには、少なくとも５日間はかかる。さらに本発明は、受容可能な結果を達成するために大過剰のＰＥＧ試薬を必要とする。本発明の生成物は、効果的であるが、それらの調製は、上記タンパク質が、長時間、タンパク質にとって有害な環境（高ｐＨおよび低ｐＨ）で三つの反応工程を経なければならないことを必要としている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、単一工程で、インスリンＢ鎖のＮ末端（ＰｈｅＢ１）に特異的にＰＥＧ化された高純度のインスリン誘導体の単純な調製方法を提供することにより、インスリンをＰＥＧ化する方法の従来技術の欠点を取り扱うものである。ＰｈｅＢ１でのＰＥＧ化が、もっとも可能性の少ない反応性生物であることを示している先行経験（例えば、Ｃａｌｉｃｅｔｉら、１９９９，上記）とは対照的に、本発明の方法は、ＰＥＧ化の優勢な部位になるようＰｈｅＢ１アミノ末端の相対的反応性を高めるために、ｐＨの特定の制御条件、金属イオンのキレート剤の使用および有機溶媒の添加を用いている。インスリンに与えられている多くの有益な性質（例えば、低減した免疫原性／抗原性；増加したタンパク質分解に対する安定性、化学的安定性および物理的安定性；増加した循環半減期；増加した水溶性溶解度／有機的溶解度；全生物活性）を考慮すると、残基ＰｈｅＢ１への部位特異的ＰＥＧ化を通じて、この結果を達成するために、単純であり、費用有効的であり、容易にスケールアップできる工程は当該分野では顕著な進展である。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、タンパク質−ポリマー結合体を調製する単一工程の方法の発見に基づいている。本発明はまた、親水性タンパク質との部位特異的な改変を有する生分解性ポリマーベースの薬剤送達処方物に関する。特定の実施形態では、本発明は、置換の部位が優勢的に残基ＰｈｅＢ１（上記Ｂ鎖のＮ末端）であるＰＥＧ化インスリン誘導体の単一工程の合成のための方法を提供する。そのような誘導体が、天然のインスリンより物理的に酵素的により安定であることは当該分野では周知である。さらに、上記誘導体は、インスリンより水系／有機系でより溶解性である。さらにこれらの誘導体は免疫原性がより低く、長時間の循環半減期を有していることが分かっている。
【０００９】
本発明の顕著な利点は、上記反応が望ましくない副反応（例えば、脱アミド化、トランスアミド化、酸化等）が無視し得る中性に近い条件で起きることである。別の利点は、比較的少量のポリマー（例えば，ＰＥＧ試薬）の使用、従って、コストの低減化である。上記の結果できたタンパク質−ポリマー結合体（例えば、ＰＥＧ化インスリン）は、例えばヒトの治療において、それ自身使用し得るかまたは、米国特許出願第２００２／０１５５１５８号に開示されているような徐放性送達媒体にカプセル化し得る。
【００１０】
従って、一つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種の有機溶媒および少なくとも１種の金属キレート剤の存在下で、上記タンパク質とポリマーの結合体が生成する条件下で、インスリンタンパク質と親水性ポリマーとを接触させ、タンパク質−ポリマーの結合体を調製する方法を提供する。そこで、上記結合体は、カラムクロマトグラフィーのような種々の標準的技術で単離され得る。
【００１１】
本発明の特定の実施形態では、親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化グリセリンおよびそれらの線状誘導体、分岐誘導体およびアミノ反応性誘導体からなる群より選択される。適切なアミノ反応性誘導体としては、例えば、アルデヒド、ＰＥＧカルボン酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、ＰＮＰ炭酸塩およびベンゾトリアゾール末端親水性ポリマー誘導体が挙げられる。典型的には、親水性ポリマーおよびインスリンタンパク質は、モル濃度比、約１０：１〜１：１で存在する。
【００１２】
本発明で使用される適切な有機溶媒としては、限定しないが、例えば、エタノール、メタノール，ＤＭＳＯ、ジオキサン、ＤＭＦおよびＮＭＰなどの水と混和可能な有機溶媒を含む、種々の公知の溶媒が挙げられる。典型的には、上記有機溶媒は、濃度が約０．１〜１０％で存在する。
【００１３】
本発明で使用される適切な金属キレート剤としては、限定されないが、多価（例えば２価）金属イオンキレート剤、例えばＥＤＴＡ、デフェロキサミン（ＤＥＦ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む種々の公知の化合物が挙げられる。一般的に、上記キレート剤は、濃度が約０．１〜１０ｍＭで存在する。
【００１４】
本発明の特定の実施形態では、上記インスリンタンパク質と親水性ポリマー（例えば，ＰＥＧ）を水溶液中で、タンパク質濃度が約０．１〜５重量％で、接触させる（即ち反応させまたは、結合させる）。本発明の別の実施形態では、上記インスリンタンパク質および親水性ポリマーを、水溶液中ｐＨが約５．０〜７．５、好ましくは約７．０で接触させる。これは、インスリン−ポリマー結合体の上記正しい位置異性体の５０％までの収率という結果を生じる。別の特定の実施形態では、上記親水性ポリマーとインスリンタンパク質を約４℃〜５０℃、好ましくは約１５℃〜２５℃の温度で接触させる。
【００１５】
一度生成されると、上記タンパク質−ポリマー結合体は、望ましくない副反応性生物および未反応インスリンタンパク質から分離される。これは、クロマトグラフィーのような種々の公知の技術を用いて達成され得る。特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーが用いられる。
【００１６】
さらに別の実施形態では、本発明の方法には、上記結合生成物を単離する工程に先立ってインスリンタンパク質と親水性のポリマーとの反応（即ち結合）をクエンチする工程が、さらに含まれる。特定の実施形態では、これは、上記反応のｐＨを約１〜４までに低下させることにより達成される。
【００１７】
本発明の方法により産生される特定のタンパク質−ポリマー結合体は、例えば、インスリン−ポリマー結合体、好ましくは、インスリン−ＰＥＧ結合体（ＰＥＧ化インスリン）を包含する。これは、配列番号１で示される上記配列を有するヒトインスリンおよび関連ファミリーメンバーのような任意のインスリンもしくはインスリン関連タンパク質を包含し得る。特定の実施形態では、上記インスリンは、残基ＧｌｙＡ１もしくはＬｙｓＢ２９での反応がそれ程なく、残基ＰｈｅＢ１で特異的に反応（ＰＥＧ化）する。結果としてできるＰＥＧ化インスリンは、当該分野で周知の任意の適切な処方物で治療的に投与され得る。特定の実施形態では、上記結合体は、例えば、投与の前に生分解性ポリマーで上記結合体をカプセル化することによる徐放性処方物で投与される。
【００１８】
本発明は、さらに以下を提供する。
（項目１）
タンパク質−ポリマー結合体を調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）インスリンタンパク質を、少なくとも１種の有機溶媒および少なくとも１種の金属キレート剤の存在下、該タンパク質と該ポリマーの結合体の形成を促進する条件下で、親水性ポリマーと接触させる工程；および
（ｂ）該結合体を単離する工程
を包含する、方法。
（項目２）
前記インスリンタンパク質が、ヒトインスリンを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化グリセリンならびにそれらの線状、分岐およびアミノ反応性誘導体からなる群より選択される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記アミノ反応性誘導体が、アルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ＰＮＰ炭酸塩およびベンゾトリアゾール（ｂｅｎｚｏｔｒｉｚｏｌｅ）末端親水性ポリマーからなる群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記親水性ポリマーおよびインスリンタンパク質が、モル比で約１０：１〜１：１で接触させられる、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記有機溶媒が、エタノール、メタノール，ＤＭＳＯ、ジオキサン、ＤＭＦおよびＮＭＰからなる群より選択される、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記有機溶媒が、約０．１〜１０％の濃度で存在する、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記インスリンタンパク質および親水性ポリマーが、約０．１〜５．０％のタンパク質濃度で接触させられる、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記インスリンタンパク質および親水性ポリマーが、ｐＨが約５．０〜７．５で接触させられる、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記キレート剤が、多価金属イオンキレート剤、ＥＤＴＡ、デフェロキサミン（ＤＥＦ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）からなる群より選択される、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記キレート剤が、約０．１〜１０ｍＭの濃度で存在する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記インスリンタンパク質および親水性ポリマーが、約４〜５０℃の温度で接触させられる、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記方法が、前記結合体を単離する前に、該結合体の形成をクエンチする工程をさらに含む、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記クエンチングが、該ｐＨを約１〜４に低下させることにより達成される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記単離が、クロマトグラフィーにより達成される、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記結合体を、生分解性ポリマーでカプセル化する工程をさらに含む、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
インスリン−ＰＥＧ結合体の調製方法であって、以下の工程：
（ａ）インスリンを、少なくとも１種の有機溶媒および少なくとも１種の金属キレート剤の存在下、該インスリンとＰＥＧとの結合体の形成を促進する条件下で、ＰＥＧと接触させる工程；および
（ｂ）該結合体を単離する工程
を包含する、方法。
（項目１９）
前記インスリンが、ヒトインスリンを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ＰＥＧが、アルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ＰＮＰ炭酸塩およびベンゾトリアゾール末端親水性ポリマーからなる群より選択されるアミノ反応性ＰＥＧ誘導体を含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＰＥＧおよびインスリンが、モル比で約１０：１〜１：１で接触させられる、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記ＰＥＧおよびインスリンが、約０．１〜５．０％のタンパク質濃度で接触させられる、項目１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記ＰＥＧおよびインスリンが、ｐＨが約５．０〜７．５で接触させられる、項目１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記方法が、前記結合体を単離する前に、該結合体の形成をクエンチする工程をさらに含む、項目１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記クエンチングが、該ｐＨを約１〜４に低下させることにより達成される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記単離が、イオン交換クロマトグラフィーにより達成される、項目１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記結合体を、生分解性ポリマーでカプセル化する工程をさらに含む、項目１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
本発明の他の実施形態は、以下の詳細な説明および実施例から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、正常ラットに静脈内注入を行なった後のＰＥＧ−インスリン結合体のインビボ薬力学に対する部位置換の効果（図１Ａ）またはポリマー分子量の効果（図１Ｂ）を示すグラフである。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ポリマー連結の同じ部位で異なる分子量のインスリン−ＰＥＧ結合体（図２Ａ）および同分子量のＰＥＧＦでポリマー連結の部位が異なるインスリン−ＰＥＧ結合体（図２Ｂ）の、物理的凝集に起因する可溶性インスリンの損失を示すグラフである。
【図３】図３は、２種のｍＰＥＧ（５０００Ｄａ）−インスリン位置異性体の化学的安定性を示すグラフである。
【図４】図４は、ＰＧＬＡミクロスフェアからのＦ５０００（ＰＥＧ−インスリン）のインビトロ累積放出を示すグラフである。
【図５】図５は、糖尿病ラットへ皮下投与後のＦ５０００（ＰＥＧ−インスリン）ミクロスフェアのインビボ薬力学を示すグラフである。
【図６】図６は、糖尿病ラットへ皮下投与後のＦ５０００（ＰＥＧ−インスリン）ミクロスフェアのインビボ薬物動態を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（詳細な説明）
本発明は、タンパク質−ポリマー結合体を迅速におよび効率的に調製する単一工程の方法に関する。本方法は、少なくとも１種の有機溶媒および少なくとも１種の金属キレート剤の存在下で、中性近辺の条件下で、タンパク質と親水性ポリマーを反応させる工程を包含する。本発明の特定のタンパク質−ポリマー結合体は、最小量のＰＥＧ試薬および温和な条件を用いて、アミノ末端ＰｈｅＢ１にＰＥＧ化されたインスリンを包含する。先行技術は、ＰｈｅＢ１が、立体的に嵩高い高分子試薬に対して、通常、インスリンの最も反応性が低いアミノ基であることを示している（例えば、Ｃａｌｉｃｅｔｉら、１９９９、上記）にもかかわらず、驚くべきことに、本発明の方法は、ＰｈｅＢ１が、親水性ポリマーによる改変で利用可能な最も反応性の高い基になるような条件を作り出す。これは、ＰｈｅＢ１でＰＥＧ化されたインスリンが最高収率の生成物であり、かつ他の結合体および未反応インスリンから分離され得る単純な単一工程の反応を可能にする。後者は、望まれる場合、さらなる結合のためにリサイクルされ得る。ＰｈｅＢ１でＰＥＧ化されたインスリン結合体は、血糖制御で測定されるように、完全な活性を保持し、かつ上記タンパク質の天然構造が保存されている。
【００２１】
（親水性ポリマー）
用語「親水性ポリマー」は、限定しないが、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化グリセリンならびに類似のポリマーを含む、如何なる水溶性線状ポリマー、分岐ポリマー、グラフト（ｆｏｒｋｅｄ）ポリマー、分岐−グラフトポリマー、デンドリマー状ポリマー、多枝（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍｅｄ）ポリマーまたは星型ポリマーをいう。好ましくは、上記ポリマーの分子量は、約５００ダルトン〜約５００００ダルトンの範囲である。本発明で使用する親水性ポリマーは、典型的には、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、リン酸またはヒドロキシル基を介して、関心の生理活性分子との連結に組込まれる、少なくとも一つの反応性基を有する。ポリエチレングリコールのような本発明で使用される親水性ポリマーは、メトキシ基で一端が保護され、そして他の一端が生理活性分子の活性基への容易な結合のために活性化される標準的プロトコールに従って、調製され得る。例えば、米国特許番号第６，１１３，９０６号は、タンパク質のアミノ基との反応のために、「Ｕ型」（即ち、分岐）型形態のポリエチレングリコールにコハク酸コハク酸イミド反応性基または炭酸コハク酸イミド反応性基の使用を記載している。米国特許番号５，６５０，２３４号は、安定なウレタン結合を形成するためのタンパク質のアミノ基との反応に、ポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール炭酸塩誘導体、２−ヒドロキシピリミジン炭酸塩誘導体およびＮ−ヒドロキシ−２−ピロリジノン炭酸塩誘導体の使用を記載している。米国特許番号第５，６７２，６６２号は、安定なアミド結合を形成するためのタンパク質のアミノ基との反応のために、プロピオン酸および酪酸置換ポリエチレングリコールのコハク酸イミドエステルの使用を記載している。米国特許番号第５，４４６，０９０号は、タンパク質のスルフヒドリル基と安定なチオエーテル結合を形成するために、ポリエチレングリコールのビニル−スルホン誘導体の使用を記載している。米国特許番号第５，８８０，２５５号は、単純で、安定な２級アミン結合を形成するために、タンパク質のアミノ基との反応のためにポリエチレングリコールのトレシル（２，２，２，−トリフルオロエタンスルホニル誘導体の使用を記載している。米国特許番号第５，２５２，７１４号は、安定な２級アミン結合を生じるタンパク質のアミノ基との反応のため、ポリエチレングリコールのプロピオンアルデヒド誘導体の使用を記載している。そのような親水性ポリマーの生理活性分子への連結から生じる結合は、安定または不安定（即ち可逆的）に意図的に設計され得る。さらに本発明で使用される親水性ポリマーは、生理活性分子の活性基への結合を容易にする利用可能な二つの類似な（例えば、ホモ二官能性）、または類似しない（ヘテロ官能性）官能基を用いる標準的なプロトコールに従って調製され得る。例えば、ＷＯ１２６６９２Ａ１は、タンパク質の改変のために、ヘテロ二官能性のポリエチレングリコール誘導体の使用を記載している。これらの特許の全体的な内容は、本明細書に参考として援用されている。
【００２２】
一つの実施形態では、上記親水性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、化学式ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈを有する線状または分岐の中性ポリエーテルをいう。ＰＥＧは水および多くの有機溶媒（例えば、ジクロロメタン、エタノール、トルエン、アセトンおよびクロロホルム）に非常に溶解性があり、種々のサイズ（分子量）および機能的構築物（例えば、アミノ−、カルボキシル−およびスルフヒドリル−末端）で容易に入手できる。ＰＥＧは、毒性がないことが分かっており、そして薬物（非経口剤、局所剤、坐薬、鼻スプレー）、食品および化粧品としてＦＤＡにより認可されている。溶液中では，ＰＥＧは高度に水和されたポリマーで、各モノマー（エチレンオキシド単位）は、３分子の水と結合し得る。さらに、ＰＥＧは、水和水分子とより緩やかに結合している、７つの分子層の構造に影響を与える能力を有すると考えられている。水中での単一表面結合鎖の動きの分子シミュレーションは、上記ポリマーが、大きな程度の分節の自由度を提示することを示している。このように上記ポリマーは、水性環境中では、大きな流体力学的な容量を占めていると考えられている。これらの結果は、何故ＰＥＧがその存在から他のポリマー（天然および合成）を排除するのに著しく効果的であるかを説明するのに役立っている。上記の他のポリマーの排除は、ＰＥＧがタンパク質を拒絶し、他の合成ポリマーと二相系を形成する主たる推進力であり、このポリマーを非免疫原性および非抗原性にする。ＰＥＧが、タンパク質に共有結合的に連結する場合、それは典型的に、ポリマーの有利な特徴の多くを、結果として生じる結合体に、伝達する。上記の多くの有利な性質により、ＰＥＧはタンパク質の改変に非常に適している。
【００２３】
本明細書で用いられているように、用語「ＰＥＧ」は、ＰＥＧ（「ＰＥＧ試薬」）のアミノ反応性誘導体を含む、如何なるＰＥＧポリマーをも包含する。タンパク質結合のための種々のＰＥＧ試薬は公知である。典型的なＰＥＧ試薬は、一つの末端がエーテル結合（例えばＯ−メチル）を有し、かつ他の末端が反応性基で官能基化されている線状ＰＥＧポリマーである。他のＰＥＧ試薬は、タンパク質への結合が、再び非反応性末端および反応性官能基の組合せによる、分岐またはデンドリマー状である。あるいは、類似もしくは非類似の反応性官能基の組合せを有するホモ−もしくはヘテロ−二官能性ＰＥＧ試薬は、タンパク質へ結合するために使用され得る。ＰＥＧ試薬の例としては、限定されないが、アルデヒド、Ｎ−ヒドロキコハク酸イミジルカルボネート、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルプロピオネート、ｐ−ニトロフェニルカルボネート、またはベンゾトリアゾールカルボネート末端種またはＰＥＧの他のアミノ反応性活性化種が挙げられる。
【００２４】
上記ＰＥＧポリマーは、例えば、５００ダルトンから５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有し得る。上記反応性官能基は、リンカー基によりＰＥＧ鎖から分離され得る。必要に応じて、上記ポリマーは、上記ＰＥＧとリンカーとの間に分解性の内部結合を有する。従って、本発明の一つの実施形態では、ＰＥＧポリマーの反応性基は、タンパク質求核剤との反応のために親電子的に活性化され得る。親電子基の例としては、ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルカルボネート、トレシルおよびアルデヒド官能基である。これらの官能基を有するＰＥＧ試薬は、タンパク質のアミノ基への共有的に結合を形成するように反応する。タンパク質アミノ基へのＰＥＧ結合のための好ましいＰＥＧ試薬は、プロピオン酸リンカーｍＰＥＧ−ＳＰＡのｍＰＥＧコハク酸イミド活性エステルである。別の好ましいＰＥＧ試薬は、モノメトキシＰＥＧ−アルデヒド（ｍＰＥＧ−Ａｌｄ）である。
【００２５】
（インスリン−ポリマー結合体）
インスリン処方物の非経口的投与は、７５年以上前のインスリンの発見以来、依然としてインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の処置に用いられる第一治療法である。現在の治療法を不適切にしている要因の多くは、上記インスリン分子に固有の本質的な欠点である。詳細には、インスリンは、弱い物理的安定性および化学的安定性、タンパク質分解の受け易さ、免疫原性および抗原性ならびに比較的短い血漿中半減期を含む、タンパク質製剤に典型的な多くの問題に直面する。
【００２６】
タンパク質ＰＥＧ化は組換えヒトタンパク質の治療効率を改善するのに使用されてきている。ほとんどの非経口的に投与されるタンパク質は、細網内皮系（ＲＥＳ）、腎臓、脾臓および肝臓により、身体から早く消失する。さらに、ろ過率は分子サイズ、電荷および問題のタンパク質の特異的なレセプターの存在に依存する。ＰＥＧのタンパク質への連結は、その分子サイズ、電荷およびレセプター結合能に影響を及ぼし、結合体の全体としての消失率を減少させるのに役立つ。
【００２７】
さらに、酵素によるタンパク質の代謝は、治療用タンパク質の生物学的活性の早い損失につながる。タンパク質分解攻撃を受けやすい上記タンパク質のドメインを、立体的に遮蔽することにより、ＰＥＧは、生物学的に不活性にするタンパク質の分解を、減少させる。
【００２８】
さらに、組換えヒトタンパク質でさえも、繰返し使用の後に免疫反応を、誘発する。上記治療用タンパク質の免疫原性決定基／抗原性決定基を立体的に覆い隠すことにより、ＰＥＧ−連結は、通常非免疫原性および非抗原性の結合体になる。従って、全体として、ＰＥＧ化による非経口的タンパク質の特質の変化の結果、血漿中の半減期およびタンパク質分解の抵抗性を増加させ、生じたＰＥＧ−タンパク質構築物の免疫原性および抗原性を減少させる。
【００２９】
（インスリンタンパク質）
本明細書で使用される用語「インスリンタンパク質」は、任意の天然に存在するもしくは組換えインスリンタンパク質または、例えば、残基ＰｈｅＢ１で結合され得る関連タンパク質をいう。従って、本発明に使用されるインスリンタンパク質としては、例えば、インスリンアナログ、インスリンホモログおよびインスリン誘導体が挙げられる。任意の適切な種、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス、ヒツジまたはサルからのインスリンが、用いられ得る。好ましい実施形態において、インスリンはヒトインスリンである。
【００３０】
ヒトインスリンは周知のタンパク質であり、限定されないが、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣｏｍｐａｎｙおよびＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋを含む、多くの業者から市販品で容易に入手可能である。天然に存在するヒトインスリンは、分子量およそ５，５００ダルトンを有し、およそ５１アミノ酸を含むタンパク質である。製造業者により、上記インスリンは、重量ベースではわずかに異なる活性を有し得るが、単位で規定されたインスリンの活性は標準である。種々の程度の生物学的活性を有するインスリンは、市販で入手可能である。例えば、低い作用形態、中程度の作用形態および即効性の作用形態のインスリンを購入することは可能である。インスリンと類似した作用を有するかまたはインスリンレセプターを増加させる非インスリン血糖低下剤としては、限定されないが、スルホニル尿素（例えば、グリベンクラミド、グリクラジド、グリピジド、グリブリド（ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）、クロルプロパミド、トリブタミド、トラザミド、アセトヘキサミドおよびグリモプリド（ｇｌｉｍｏｐｒｉｄｅ））；チアゾリジンジオン（例えば、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびプログリタゾン（ｐｌｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）；αーグルコシダーゼインヒビター（例えば、アカルボースおよびミグリトール）；並びに第３世代インスリン放出剤（例えば、ＫＡＤ  １２２０、エトキソミール（ｅｔｏｘｏｍｉｒ）およびレパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ））が挙げられる。
【００３１】
上記インスリン分子は、二つのポリペプチド鎖、Ａ鎖およびＢ鎖からなる。ヒトインスリンの上記アミノ酸配列は、本明細書中の配列番号１として提供される。上記Ａ鎖は、２１個のアミノ酸（Ａ１〜Ａ２１と表示する）から構成され、そしてより長いＢ鎖は、３０個のアミノ酸（Ｂ１〜Ｂ３０）から構成される。これらの二つの鎖は、残基Ａ７とＢ７との間ならびにＡ２０とＢ１９との間の二つの鎖間のジスルフィド結合により一緒に保持されているが、別の鎖内ジスルフィド結合は、残基Ａ６およびＡ１１を結合している。インスリンの３次元構造への安定化をさせるのに役立つ、上記の二つの鎖のアミノ酸残基間でまた、多数の非共有結合性相互作用が存在する。
【００３２】
改変（例えばＰＥＧによる）のための利用可能な３つの反応性アミノ基があり、即ち、それらは、Ａ鎖Ｎ末端およびＢ鎖Ｎ末端（それぞれＡ１およびＢ１）に位置し、ならびにＢ鎖Ｃ末端（Ｂ２９）に隣接するリジンに位置する。
【００３３】
インスリンタンパク質はまた、インスリン様成長因子（ＩおよびＩＩ）のような関連タンパク質および成長ホルモンおよびプロラクチンファミリー由来のタンパク質も含む。
【００３４】
（インスリンタンパク質の親水性ポリマーへの結合）
本発明に従って、上記インスリンタンパク質および親水性ポリマーを少なくとも１種の有機溶媒および少なくとも１種の金属キレート剤の存在下で、上記タンパク質とポリマーの結合体の形成が促進される条件下で、接触させる（即ち、反応または結合させる）。特定の実施形態では、上記インスリンタンパク質は、最小量のＰＥＧ試薬とゆるやかな条件を用いて、ＰｈｅＢ１アミノ末端でＰＥＧ化される。ＰｈｅＢ１アミノ基は、通常インスリンの３つの利用可能なアミノ官能基の中で反応性が最も低い（Ｃａｌｉｃｅｔｉら、１９９９、上記）。本発明において、条件はＰｈｅＢ１アミノ基をＰＥＧ試薬に対して最も反応性にすること見出した。これらの反応条件は、このようにＰｈｅＢ１での単一ＰＥＧ化を優性の反応生成物として産生する。
【００３５】
本発明の特定の実施形態では、上記インスリンタンパク質および親水性ポリマーを、水溶液中で約０．１〜５％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．５〜１．５％でのタンパク質濃度で、ｐＨを５．０〜７．５の範囲、好ましくはｐＨ６．５〜７．２に調整して、接触させる。上記ｐＨは、緩衝塩の包含、有機酸／塩基の添加または通常の無機酸／塩基の添加により制御され得る。上記水溶液は、少なくとも１種の水に混和可能な有機溶媒をさらに包含し、それはエタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、ジオキサン、ＤＭＦ、ＮＭＰなどを含む群から選択され得る。別の局面では、上記有機溶媒、好ましくはジオキサンは、濃度（ｖ／ｖ）が０〜２５％、好ましくは２〜２０％、さらに好ましくは、５〜１５％で含まれる。
本発明で用いられる適切な金属キレート剤としては、種々の公知のキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ｔｒａｎｓ−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、グルタミン酸およびアスパラギン酸のようなアミノポリカルボン酸；ならびに、例えば、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチルグリシン（ｂｉｃｉｎｅ）、およびＮ−（トリヒドロキシメチルメチルグリシン（ｔｒｉｃｉｎｅ）のようなヒドロキシアミノカルボン酸；ならびにグリシルグリシンのようなＮ−置換グリシンが挙げられる。他の適切なキレート剤としては、２−（２−アミノ−２−オキソエチル（ｏｘｏｃｔｈｙｌ）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）およびデフェロキサミン（ＤＥＦ）が挙げられる。本発明の方法で用いられる適切なキレート剤としては、例えば、溶液中で利用可能な酸素と反応することを不可能にする金属イオンへ結合し、それにより上記タンパク質と自由に反応および分解するＯＨラジカルの発生を、最小限にするまたは防止するキレート剤が挙げられる。そのようなキレート剤は、キレート剤の保護なしで処方されたタンパク質の分解を減少させ得、または防止し得る。
【００３６】
本発明で用いられるキレート剤は、塩の形態で、例えば前述のキレート剤のカルボキシル基または他の酸性の官能基で存在し得る。そのような塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび他の弱く結合する金属イオンで形成される塩が挙げられる。当該分野で公知のように、上記塩の性質および中和されるべき電荷数は、存在するカルボキシル基の数および安定化キレート剤が供給されるｐＨに依存する。当該分野で公知のように、キレート剤は、特定の標的イオンと結合する強度は変化する。一般に、重金属イオンは、類似した電荷をもつ低い分子量の対応物よりも、より強く結合する。
本発明の方法で用いられるキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび当該分野で公知の他の多価カチオンキレート剤から選択され得る。本発明の方法に従って、金属キレート剤、好ましくはＥＤＴＡが、濃度が０．１〜１０ｍＭ、好ましくは１〜５ｍＭ、より好ましくは、１〜３ｍＭで存在する。
【００３７】
本発明で使用される適切な親水性ポリマーとしては種々の公知のポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびそれらの線状、分岐およびアミノ反応性誘導体が挙げられる。本発明の一つの局面では、上記アミノ反応性誘導体は、アルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ＰＮＰ炭酸塩およびベンゾトリアゾール末端親水性ポリマー誘導体からなる群より選択される。本発明の特定の実施形態では、親水性ポリマー、例えばＰＥＧ試薬、好ましくはＰＥＧのコハク酸イミドエステル、より好ましくは、ｍＰＥＧ−ＳＰＡを、インスリンとモル比（ＰＥＧ：インスリン）を約１０：１〜１：１、好ましくは３：１〜１．２：１、より好ましくは１．７：１〜１．５：１で、接触させる。別の特定の実施形態では、親水性ポリマーとインスリンタンパク質を温度が約４℃〜５０℃、好ましくは約１５℃〜２５℃で接触させる。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、上記結合体を単離する前に、上記結合反応をクエンチする工程を、さらに含む。これは、例えばｐＨを約１〜４、好ましくは約２〜３、より好ましくは２．４〜２．６に低下させることにより達成され得る。上記結合体の単離はイオン交換（例えば、カチオン交換）クロマトグラフィーなどの標準的な技術を用いて達成され得、所望の結合体は収集され、濃縮され、脱塩されそして乾燥され得る。
【００３９】
（徐放性送達処方物での生理活性結合体薬剤の利用）
ＰＥＧ化インスリンタンパク質のような生理活性結合体薬剤は、生分解性ポリマーベースの薬物送達処方物で、有利にカプセル化され得る。ＰＥＧ化生理活性剤は、対応する非ＰＥＧ化生理活性剤より高濃度で、薬物送達処方物にカプセル化される。生分解性ポリマー薬物送達処方物からのＰＥＧ化生理活性剤の放出は、対応する非ＰＥＧ化の生理活性剤より急速ではないことを示している。生分解性ポリマーの薬物送達処方物の中でのＰＥＧ化生理活性剤の物理的安定性および化学的安定性はより大きく、かつ抗原性および免疫原性は対応する非ＰＥＧ化生理活性剤よりも低い。
【００４０】
この応用のための生分解性ポリマーとしては、限定されないが、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（エステル）とポリ（エーテル）の共重合体、ポリ（乳酸）とポリ（エチレングリコール）の共重合体などが挙げられる。
【００４１】
従って、本発明のタンパク質−ポリマー（例えば、ＰＥＧ化インスリン）の結合体は、生分解性ポリマーの薬物送達処方物、例えばポリ（ｄ，ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェアに有利に取り込まれ得る。これは、非結合タンパク質と比較して、上記タンパク質結合体の高いカプセル化を達成し、かつまたバーストを減少させる（最初の２４時間にわたる放出）。さらに、ＰＥＧのような親水性のポリマーとの結合は、その結合体を特定の有機溶媒に溶解させ、ＰＬＧＡミクロスフェアの形成を単純化する。
【実施例】
【００４２】
Ｉ．一工程法による部位特異的ＰＥＧインスリンの調製および性質決定
（実施例１）
ＮαＢ１−メトキシポリ（エチレングリコール）−インスリン結合体の調製
１グラム（１７２μモル）のインスリン（Ｚｎ２＋−インスリン、Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．）を、室温で１００ｍＬの２ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液に溶解し、希塩酸を用いて、その溶液のｐＨａｐｐを７に調整した。別の容器に、１．４ｇ（インスリンに対して１．６モル当量）の活性化ＰＥＧ誘導体［モノメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオン酸コハク酸イミド、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．］を、室温で１０ｍＬのジオキサンに溶解した。上記ｍＰＥＧ−ＳＰＡ溶液を、上記インスリン溶液に直接注入で加え、そしてその反応を室温で２時間進行させた。上記反応を、ＨＣｌ（ｐＨａｐｐ２．５）で酸性化してクエンチし、そしてその混合物を０．０２％重炭酸アンモニウムに対して限外ろ過［ＹＭ３（３０００ＭＷＣＯ）膜を取り付けたＡｍｉｃｏｎ  ８２００  限外ろ過装置］した。その後、その反応混合物を、１Ｍ  酢酸／７Ｍ  尿素／０．０１Ｍ  ＮａＣｌに対して限外ろ過し、精製前に１０ｍＬまでに濃縮した。上記ｍＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリン誘導体を、他の反応副生成物（ｍＰＥＧ−ＧｌｙＡ１−インスリン、ｍＰＥＧ−ＬｙｓＢ２９−インスリン、ジ−ｍＰＥＧ−インスリン、およびトリ−ｍＰＥＧ−インスリン）から、ＳＰ  セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カチオン交換カラムを取り付けたＦＰＬＣシステムを用いて、単離した。上記カラムを、５ｍＬ／分の流速で、１Ｍ  酢酸／０．０４Ｍ  ＮａＣｌ含有７Ｍ  尿素で平衡化し、上記結合タンパク質をＮａＣｌ−グラジェント（０．０４Ｍ〜０．１２Ｍ）を用いて、８０分にわたって溶出した。２８０ｎｍで検出された主要なピークに対応する上記溶出液を収集し、そしていかなる低分子量の不純物をも除去するために０．０２％  ＮＨ４ＨＣＯ３に対して限外ろ過し、その後凍結乾燥をして性質決定の前に−２０℃で保存した。
【００４３】
ＰｈｅＢ１のアミノ基に連結した、より低分子量の線状ポリマー（即ちｍＰＥＧ−ＳＰＡ、Ｍｒ＝２０００Ｄａ）を有する１種の結合体、および２種のより高分子量の分岐ポリマー（即ち、ｍＰＥＧ２−ＳＰＡ、Ｍｒ＝１０，０００Ｄａ）を有する結合体を調製するのにもこの方法を用い、そしてこれらの２種の異なる結合体の性質決定もまた、以下に概説する技術に従って行なった。この結果は、この方法が、ＰｈｅＢ１に連結されたポリマー構造のみ（即ち、線状もしくは分岐）またはサイズのみ（即ち、分子量）が異なる種々様々のＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリン結合体を首尾良く調製するのに用い得る。
【００４４】
（実施例２）
結合体純度のＦＰＬＣ／ＨＰＬＣによる評価
ｍＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンの純度を、流速１．０ｍＬ／分を用いた以外は、上述の単離手順で用いた条件と同一の条件下で、分析用カチオン交換カラム（ＭｏｎｏＳ  ５／５、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、分析した。直交技術（逆相ＨＰＬＣ）もまた、上記結合体の最終純度を証明するのに用いた。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ  システムに、Ｗａｔｅｒｓ  ９９６光ダイオード配列検出器（ＰＤＡ）およびＳｙｍｍｅｔｒｙ３００（Ｃ１８、５μｍ  粒子サイズ、４．６×２５０ｍｍ）逆相カラムを取り付けた。流動層Ａは、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）ＭｉｌｌｉＱ  品質水からなり、そして流動層Ｂはまた、０．１％ＴＦＡを含有する、９５／５ＡＣＮ（アセトニトリル）／Ｈ２Ｏからなった。１５分にわたって、３０〜６０％Ｂの直線グラジェントを用いて、化合物の溶出を２７６ｎｍの検出で、進めた。上記ｍＰＥＧ−インスリンの純度は、９５％を超えた。
【００４５】
（実施例３）
結合体同一性のＮ末端タンパク質配列決定（エドマン分解）による確認
上記エドマン分解反応は、ＰＥＧに共有結合したＮ末端アミノ基では進まないということを承知の上で、ＰＥＧ結合部位を決定するために、Ｎ末端タンパク質配列分析を用いた。全ての試料を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７７Ａタンパク質配列分析器（Ｐａｓａｄｅｎａ、Ｃａ）を用いて、３回の分解サイクルで分析した。Ｎ末端アミノ酸モル比が［ＧｌｙＡ１／ＰｈｅＢ１］≒１の場合は、残基ＬｙｓＢ２９（または無し）への結合を暗示し、［ＧｌｙＡ１／ＰｈｅＢ１］≒０の場合は、残基ＧｌｙＡ１への結合を暗示し、［ＧｌｙＡ１／ＰｈｅＢ１］≒３０の場合はＰｈｅＢ１への結合を暗示する。この結果は、置換の部位が約９５％ＰｈｅＢ１であることを確証した。
【００４６】
（実施例４）
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）による結合体分子量の同定
この分析の性質決定技術を、分析中にＰＥＧ−インスリン結合体が分解する原因にならないような意味を持つ「軟イオン化」であるので、選択した。上記機器の出力は、各試料の質量／電荷比の定量的な尺度を提供する；従って、インスリンに連結しているＰＥＧ鎖の数を、上記結合体の分子量と未改変のインスリンの分子量との全体的な差から容易に決定することができる。全ての試料を、直線モードで操作したＰｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ＤＥＲＰ  ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分析計にかけ、陽イオンをモニターした。全ての試料の上記マトリックスは、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸であり、窒素レーザの３３７ｎｍ線を最終スペクトルのために平均して少なくとも６４ショットで用いた。モノマーのインスリンは５８０７．２Ｄａの計算分子量を有し、結合反応に用いたｍＰＥＧ（５０００）−ＳＰＡの数平均分子量は、５１２９Ｄａであった。上記ｍＰＥＧ（５０００）−インスリンの質量スペクトルは、一つのみのｍＰＥＧ鎖がインスリンに連結しているという結論と一致した。さらに、個々のイオンピークは、一貫して４４Ｄａ（エチレンオキシドモノマー単位の分子量）ごとに異なっていた。これらの結果、調製した結合体の全てにおいて、一つのみのｍＰＥＧ鎖がインスリンに連結して、そしてそれらの多分散性が、もっぱらＰＥＧ固有の多分散性に、起因するものであることを確証した。
【００４７】
（実施例５）
インスリンＢ１アミノ末端へのＰＥＧの結合における２級アミンの形成
Ｆ５０００ＰＥＧ−インスリンを上記タンパク質と末端にアルデヒド基を有する活性化ｍＰＥＧとを反応させて調製した。この反応は、シフ塩基中間体を経由して進行し、引き続いて上記ポリマーとタンパク質間の安定な２級アミン結合を形成するようシアノトリヒドロホウ酸ナトリウムで還元する。上記反応を以下のようにして行なった：２ｍＭ  ＥＤＴＡ／２５ｍＭ  リン酸緩衝液を作り、ｐＨをリン酸で６．０に調整した。５．５ｍｇ／ｍＬ（全容量２ｍＬ）のインスリンを４４０μｌのジオキサンを加えたリン酸緩衝液に溶解した。一度、インスリンを２ｍＬの１０ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３水溶液に加え、その後５倍モルの過剰のｍＰＥＧ（５０００）−アルデヒド（乾燥粉末として、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）を加える。結局、上記反応混合物は、およそ１２．５ｍＭ  リン酸（ｐＨ６）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％ジオキサン、５ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３、２．５ｍｇ／ｍＬ  インスリンおよび１０ｍｇ／ｍＬ  ｍＰＥＧ−アルデヒドを含有していた。上記反応を一晩進行させ、翌日、そのｐＨが約５．５であることが分かった。上記反応を、酢酸の添加により、約ｐＨ２にクエンチした。小アリコートをＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。主要な反応種を以下のように決定した：約７０％の上記反応生成物は、モノ−ＰＥＧ化物（室温で１２．５分）、約１０％の未反応インスリン（室温で９．８分）および９％のジ−ＰＥＧ化インスリン（室温１３．８分）が残っていた。上記モノ−ＰＥＧ化分画を溜めて０．０２％ＮＨ４ＨＣＯ３に対して透析し、そして凍結乾燥した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、インスリンへ１つのＰＥＧ−５０００鎖の付加に対応する単一分子質量を示した。エドマン分解分析では、約９５％のモノ−ＰＥＧ化種が残基ＰｈｅＢ１で置換され、残りのモノ−ＰＥＧ化種（〜５％）は殆ど残基ＧｌｙＡ１で置換されている。何故なら、ここで用いた反応条件下ではＬｙｓＢ２９のアミノ基は９９．９９％プロトン化されている（従って反応性無い）からである。
【００４８】
ＩＩ．部位特異的ＰＥＧ−インスリン結合体の代替的調製法
（実施例６）
従来の多工程法を用いて、Ｂ鎖アミノ末端（Ｆ５０００）へ結合したＰＥＧ−５０００
組換えヒトインスリン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．）をジ−ｂｏｃ保護化中間体を用いて、ＰｈｅＢ１位にＰＥＧ化した。ジ−ＮαＡ１、ＮεＢ２９−ｔ−ｂｏｃ−インスリン（ジ−ｂｏｃ−インスリン）を、Ｌｉｕら。１９９７（Ｌｉｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８（５）：６６４〜６７２、１９９７）に従って合成した。上記ｍＰＥＧ（５０００）−ＰｈｅＢ１−インスリン結合体をＨｉｎｄｓら、２０００、上記のプロトコールに従って調製した。
【００４９】
ＦＰＬＣで単離された上記所望の分画は、逆相ＨＰＬＣおよびイオン交換ＦＰＬＣのクロマトグラフのピーク面積を基礎にして９８％を越える純度であった。上記精製した生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析およびアミノ酸配列分析でさらに性質決定を行ない、上記Ｂ鎖アミノ末端ＰｈｅＢ１で、モノ置換ＰＥＧであることが分かった。この方法で調製および精製された上記ｍＰＥＧ（５０００）−ＰｈｅＢ１−インスリン結合体（Ｆ５０００）は、本発明のより単純で、より時間のかからない方法により作られた同じ結合体（実施例１）と等価であった。
【００５０】
（実施例７）
Ｂ鎖Ｌｙｓ２９に結合したＰＥＧ−５０００（Ｋ５０００）
組換えヒトインスリン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．）を、Ｈｉｎｄｓら、２０００、上記の方法により、Ｂ鎖のＬｙｓ２９に特異的にＰＥＧ化した。上記所望のＦＰＬＣ分画は、逆相ＨＰＬＣおよびイオン交換ＦＰＬＣのクロマトグラフのピーク面積を基礎にして、純度が９８％を超えた。その精製された生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析およびアミノ酸配列分析でさらに性質決定を行い、そしてＢ鎖末端から２番目のアミノ酸ＬｙｓＢ２９で、モノ置換されていることを示した。この同じ方法をまた使用して、ＬｙｓＢ２９に連結した１種の低分子量の線状ポリマー（即ち、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、Ｍｒ＝２０００Ｄａ）および２種のより高分子量の分岐ポリマー（即ち、ｍＰＥＧ２−ＳＰＡ、Ｍｒ＝１０，０００または２０，０００Ｄａ）を調製し、そして上記に概説した技術に従って、これらの３種の異なる結合体の性質決定を行なった。この結果は、この方法が、ＬｙｓＢ２９に連結されたポリマー構造のみ（即ち、線状もしくは分岐）またはサイズのみ（即ち、分子量）が異なる種々様々のＰＥＧ−ＬｙｓＢ２９−インスリン結合体を、首尾良く調製するのに用い得る。
【００５１】
ＩＩＩ．部位特異的ＰＥＧ−インスリンの性質決定
コンホメーション、活性および安定性
（実施例８）
部位特異的ＰＥＧ化後のインスリンコンホメーション保持性の評価
遠紫外範囲の円偏光二色性分光法を用いてインスリンのコンホメーションを調べた。通常、以下の二つの負の極小の強度を評価する：水性環境中でのインスリンのコンホメーションの分析において２０８ｎｍ（α−ヘリックス）および２２３ｎｍ（β−シーツ）。２０８ｎｍの遠紫外のＣＤ−帯は、主として残基Ｂ１０〜Ｂ１９、Ａ２〜Ａ６およびＡ１３〜Ａ１９から形成されるα−ヘリックスに起因し、一方、β−構造は、２２３ｎｍの遠紫外ＣＤ−帯の主たる成分である。上記試料に特徴的なＣＤスペクトルは、残基ＰｈｅＢ１またはＬｙｓＢ２９のいずれかへのインスリンへのｍＰＥＧの連結は、Ｚｎ２＋−インスリンと比較して、上記結合体の全体的なコンホメーション（２次）を変化させない事を確認した。
【００５２】
（実施例９）
ＰＥＧ−インスリン結合体の薬力学
インスリン薬力学に対するＰＥＧ化の効果を調査した。これらの研究は、市販で入手可能なインスリン処方物（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ、Ｌｉｌｌｙ）と比較して、置換部位の異なるＰＥＧ−インスリン（位置異性体）またはＰＥＧの分子量が異なるＰＥＧ−インスリンを含有する結合体処方物のインビボの生物学的活性（血清グルコースを低下させる能力）を評価するために実施した。絶食したＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにＦ５０００、Ｋ２０００、Ｋ５０００、Ｋ１００００またはＨｕｍｕｌｉｎＲ（登録商標）を静脈内に投与した後、血中グルコースレベルを測定した。０．３ＩＵ／ｋｇ（タンパク質濃度を基礎にし、そしてＰＥＧの重量を適切に補正して；２５ＩＵ／ｍｇタンパク質と仮定する）を通常の生理食塩水に溶解し、尾静脈注射により投与した；１群Ｎ＝６。試験試料の注射前および注射後６時間の期間、間隔をおいて採血を行なった。血清を標準的な操作方法で単離し、グルコースレベルをＡｃｃｕｃｈｅｃｋ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）グルコースメータを用いて測定した。
【００５３】
図１Ａおよび図１Ｂに示す結果は、Ｆ５０００、Ｋ２０００およびＫ５０００は、正常ヒトインスリンと等価の用量で、正常ラットのグルコースレベルを抑制するのに、全て効果的である。興味深いことには、上記Ｋ１００００結合体は、他の試験試料と同じ程度にはグルコースレベルを減少しなかったが、結合体の作用の持続時間は、６時間を越えて観察された。このように、上記Ｋ１００００結合体は、糖尿病患者に長時間のグルコース抑制を提供し、従前の基本のインスリン懸濁剤の可溶性代替物として、開発され得る。
【００５４】
（実施例１０）
代表的なＰＥＧ−インスリン結合体の物理的安定性
加速振動試験法を用いて７種のＰＥＧ−インスリン結合体（Ｆ２０００、Ｆ５０００、Ｆ１００００、Ｋ２０００、Ｋ５０００、Ｋ１００００およびＫ２００００）および亜鉛インスリンの物理的安定性を調査した。この試験は加速法でインスリン調製物の物理的安定性の正確な測定を提供する文献に、通常記載されている。このアッセイのために、上記タンパク質（結合体）の水溶液を４部（１ｍｇ／ｍＬ、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．３，０．０２％アジ化ナトリウム）調製し、３７℃で水平振動（１００／分の振動数）させた。試料を所定の時間に取り出し、ろ過し（不溶性凝集体の除去のため）、そして溶液中に残っているタンパク質（結合体）分画を、定量化するためにＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。図２は、各インスリン誘導体に関して、時間の関数として可溶性タンパク質の減少を示している。
【００５５】
これらのデータは著しく高い（３６〜４０倍）物理的安定性を有するＰｈｅＢ１アミノ基で置換されたインスリン誘導体およびＬｙｓＢ２９−インスリンが、天然のペプチドより、いくらかより安定（４〜８倍）であった以前の報告を補強するものである。以前の研究では、ＰｈｅＢ１−インスリンの繊維形成に対する増加した抵抗性は二つの相補的な効果によるものであることを示している。第一の効果は、ｍＰＥＧ結合によりＢ鎖Ｎ末端を立体特異的に遮断することであり、それがこの表面がインスリンの繊維形成に必要とされる疎水性相互作用に関与するのを防止する。ＰｈｅＢ１−インスリンの増加した物理的安定性に貢献する第二の効果は、元々非特異的であり、立体的であり、そしてポリマー分子量に比例的に増加する。上記ＬｙｓＢ２９−インスリンの全てが、天然のペプチドに比較して、増加した物理的安定性を示すが、ポリマー分子量が１０ｋＤａを超えるまでは、ＰｈｅＢ１で置換された上記結合体と同じ程度ではない。これは、繊維形成反応におけるＬｙｓＢ２９の関与の欠如により説明され得、繊維形成に関与する分子間相互作用の非特異的立体障害に起因する安定化効果を伴う。
【００５６】
（実施例１１）
代表的ＰＥＧ−インスリン結合体の化学的安定性
インスリン（またはインスリンアナログ）は、水溶液中で多くの化学分解反応を受けることはよく実証されている。例えば、インスリンＡ鎖のＣ末端のアスパラギンは、酸性条件下では、環化中間体により促進される脱アミド化機構により分解する。この高い反応性環化中間体はまた、アミノ転移反応機構を介して、異なるインスリン分子からのＮ末端アミノ基の一つと反応して分解し得る。
【００５７】
上記インスリン結合体、Ｆ５０００およびＫ５０００を３７℃で、０．０２％アジ化ナトリウムＰＢＳ中で水平振動でインキュベートした。所定の時間に（０、６、１２、２８および３６日）、個々の試料を取り出し、その後、脱アミド化の程度を決定するためにＲＰ−ＨＰＬＣにより、そして共有結合の２量化の程度を決定するためにサイズ排除（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーで分析した。
ＩＶ．ＰＥＧ−インスリン生分解性ポリマー徐放送達処方物の調製、性質決定および薬物動態
（実施例１２）
ＰＬＧＡミクロスフェアでのＰＥＧ−インスリンのカプセル化
ＰＥＧ−インスリンＦ５０００（５０ｍｇ）を、１ｍｌの塩化メチレンに溶解した。上記溶液を１５０ｍｇのＰＬＧＡ４５：５５（ｌａｃ：ｇｌｙ）、酸末端基を持つ０．１５ｄｌ／ｇＩＶを有する１ｍｌ容量の塩化メチレンに添加した。上記塩化メチレン溶液を、１５ｍｌの遠心チューブ中の１％ポリ（ビニルアルコール）を含む５ｍｌの水に添加し、そしてボルテックスミキサーでエマルジョンを作った。上記エマルジョンを０．３％のポリ（ビニルアルコール）を含む１００ｍｌの水に添加し、塩化メチレンを蒸発させるために３時間攪拌した。上記硬化ミクロスフェアを、Ｗｈａｔｍａｎ１番のろ紙で真空ろ過し、そして乾燥した。
【００５８】
（実施例１３）
ＰＥＧ−インスリンＰＬＧＡミクロスフェアの性質決定
上記ＰＥＧ−インスリンミクロスフェアの表面形態および粒子サイズ分布を、それぞれ、走査型電子顕微鏡およびレーザ光散乱粒子サイズ分析で調査した。ポリマーミクロスフェア内にカプセル化されたＰＥＧ−インスリン結合体の量を定量化するために、分析用逆相ＨＰＬＣを用いた。ＨＰＬＣ分析に先立って、測定した量のミクロスフェアを、ある容量のアセトニトリルに溶解し、そしてポリマーを沈殿させ、水溶液中へ上記結合体を抽出するために、等容量の０．１％ＴＦＡ水溶液を添加した。Ｋ２０００、Ｋ５０００、Ｋ１００００、Ｋ２００００およびＦ５０００−Ａもまたこの方法を用いてカプセル化した。これらの試験の結果を表１に集めたが、そこには全ミクロスフェア中のＰＥＧ−インスリン含量％（ｗ／ｗ）、および（カプセル化されたＰＥＧインスリン重量／最初に添加されたＰＥＧ−インスリン重量）として定義されたカプセル化効率を挙げている。２８．３％と相対的に高い薬物含量および１００％までのカプセル化効率を達成し、上記生成物を、必要とされる減少した全用量により、臨床的に有用になり、かつ出発物質の低い損失で商業的にも魅力的にした。さらに、ミクロスフェアは、乳酸とグリコール酸の比率（５０：５０および７２：２５）、分子量（６．５〜２４ｋＤａ）、固有粘度（０．０９〜０．２７ｄＬ／ｇ）、または末端エステル基（メチルおよびラウリル）を変えたポリマーと広い範囲の薬物負荷（５〜３５重量％）を用いて調製した。
【００５９】
【表１】
2010248241.tif 000002
（実施例１４）
動物実験で用いられたＰＥＧ−インスリンミクロスフェア処方物のインビトロ放出
１５ｍｇのＦ５０００ＰＥＧ−インスリンミクロスフェア（１４．１％薬物含量、ＰＬＧＡ  ４５：５５；０．１５ｄｌ／ｇＩＶ、酸末端基）を１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、０．０２％アジ化ナトリウムおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）に懸濁し、３７℃でインキュベートした。上記上清を、間隔的に取り出し、放出されるＰＥＧ−インスリンをＲＰ  ＨＰＬＣで分析した。上記緩衝液を、新鮮なＰＢＳで置換し、そのインキュベーションを続けた。データをインキュベーション時間の関数として累積放出量を分析した（図４）。最初の日は、１．０％未満の上記ＰＥＧ−インスリンの放出で、１８日以内で、９５％を超える量が放出される。約２週間を越える低い「バースト」放出、高い全放出量および持続期間は、徐放インスリン処方物の非常に所望の特徴である。
異なる生分解性ポリマーおよびＦ５０００とを用い、ならびにＫ５０００ＰＥＧ−インスリンおよびＦ５０００−Ａ結合体もまた、用いる実施例１２の方法で作った他の調製物もまた、１日放出値が０〜７．５％の間で、持続放出期間も６０日までもあった。
【００６０】
（実施例１５）
Ｆ５０００ＰＥＧ−インスリンＰＬＧＡミクロスフェアのインビボ薬力学および薬物動態ＰＬＧＡ４５：５５、０．１５ｄｌ／ｇＩＶ、酸末端基（１４．１％核負荷）から構成されるミクロスフェア中のＦ５０００ＰＥＧ−インスリンを、糖尿病ラットでグルコース抑制およびＦ５０００薬物動態の試験をした。雄性ＳＤラット（〜２５０ｇ）に、等張クエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．５）に溶解した４０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、試験試料投与する１日前に皮下投与をして糖尿病にした（Ｊｕｎｏｄ，Ａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、４８：２１２９〜２１３９、１９６９）。動物を２．５％滅菌カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）または生理食塩水（陰性コントロール）に懸濁したＰＥＧ−インスリンミクロスフェア（〜１１ｍｇ／ラット、体重１ｋｇあたり３ｍｇインスリン当量に相当する）で処置し、そして血清単離、引き続くグルコース（ＰＤ）およびＦ５０００（ＰＫ）レベルの分析のために所定の間隔で採血した。図５および６は、１３日の期間の血清グルコースレベルおよび血清ＰＥＧ−インスリンレベルを示す（データは平均値±標準誤差）。図５は、予想したとおり、実験の間中、血中グルコースレベルがコントロールの糖尿病ラットに対して１００％以上（測定誤差内）を示す。ＰＥＧ−インスリンミクロスフェア処置糖尿病ラットに関しては、血中グルコ−スレベルは、３日後未処置レベルの６０％より低いレベルに低下し、さらに７日間、抑制が持続している。
【００６１】
図６は、ＰＥＧ−インスリンの無視し得る初期バースト放出（Ｃｍａｘ＝０．６２ｎｇ／ｍｌ）が、ミクロスフェア注入後すぐに（１時間）検出されたことを示している。それから注入後２４時間、処置群のＰＥＧ−インスリンレベルは、２日を超えて、着実に治療レベル（約１〜３．５ｎｇ／ｍｌ）まで上がり、約７日間持続し、一方、上記陰性コントロール群のＦ５０００血清レベルは、ずっと検出限界未満であった。これらのデータは、一緒に考えると、結合体の生物学的活性は、ミクロスフェア製造工程で保持され、そしてミクロスフェア注入に続く一週間の放出の間、維持されたことを示している。重要なことは、類似した量の初期ＰＥＧ−インスリンバースト放出が、インビトロ（図４、第１日＜０．５％放出）およびインビボ（図６、ＡＵＣ０〜１ｄ／ＡＵＣ０〜１３ｄ＝０．７％実験）で見出されたことである。さらに、図５および６に示されているデータの評価は、薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）相関がこの実施例で存在することを示唆している。
【００６２】
（等価物）
当業者は、本明細書に記載している本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を単なる慣用的実験を用いて、認識または確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含され、網羅されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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