(57)【要約】【課題】含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分の新規用途を開発する。【解決手段】３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを有効成分として含有することを特徴とする皮膚老化防止・予防剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを有効成分として含有することを特徴とする皮膚老化防止・予防剤。
【請求項２】
前記皮膚老化が、紫外線による、しわの増加、皮膚の肥厚、皮膚の弾力性低下または色素沈着である、請求項１に記載の皮膚老化防止・予防剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の皮膚老化防止・予防剤を含む香粧品。
【請求項４】
前記香粧品が、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、化粧用下地、ファンデーションおよびボディーローションからなる群から選択される、請求項３に記載の香粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、含蜜糖に含まれる３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを有効成分とする皮膚老化防止・予防剤ならびに該防止・予防剤を含む香粧品に関する。
より詳細には、本発明は、含蜜糖に含まれ波長２７２ｎｍの紫外線に対して極大吸収を示す３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを有効成分として含有する皮膚の老化防止・予防剤に関する。
また、本発明は、上記の皮膚老化防止・予防剤を含む皮膚老化防止用香粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
含蜜糖または含蜜糖から製造される黒砂糖に含まれる、非甘味性の色素成分エキスの製造方法は、黒砂糖または粗糖の水溶液の、活性炭カラムクロマトグラフィーによる製造方法（非特許文献１）、またはポリスチレン系樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２などのような非極性吸着剤を用い、甘味が無くなるまで水で溶出し、次いで２０〜３０％のエタノール水溶液で溶出するカラムクロマトグラフィーによる製造方法が報告されている（特許文献１および２）。
【０００３】
さらに、有機溶媒を用いずに黒砂糖の水溶液を、水を溶離剤とする強酸性型イオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィーにより精製するフェニルグルコシド誘導体含有画分の分離方法も報告されている（特許文献３）。
【０００４】
また、上記のフェニルグルコシド誘導体の主成分が、３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドまたは３,４,６−トリメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドであることについては報告されている（例えば、非特許文献１）。
また、上記の色素成分エキスが血清中の中性脂肪およびインスリンの増加抑制作用を有することも既に明らかとなっている（例えば、非特許文献１）。
【０００５】
さらに、上記色素成分エキスが抗アレルギー作用を有し、動脈硬化の予防改善ができ（例えば、特許文献１）、また皮膚賦活・美白作用などの効果を有することも報告されている（例えば、特許文献２）。
【０００６】
また、上記色素成分エキスが、肥満改善および予防作用を有することも明らかとなっている（特許文献４）。
【０００７】
一方、地上約１０ｋｍ〜５０ｋｍの上部成層圏に存在するオゾン層は、比較的短波長の紫外線Ｂ（ＵＶＢ）、すなわち波長２８０ｎｍ〜３１５ｎｍのＵＶＢを吸収することが知られている。
しかしながら、近年、従来クーラーなどの冷媒として用いられていたフロンガスが、上記のオゾン層を破壊し、南極ではオゾンホールも観測され、地表における上記のＵＶＢの線量の増加による健康に対する影響が心配されている。
【０００８】
また、しわおよび色素沈着などの皮膚老化症状は、太陽光に曝露されていない皮膚と、曝露した皮膚とを比較すると、太陽光に曝露した皮膚には、早期にしわの発生や色素沈着を生じているため光老化と称されている。
【０００９】
より具体的には、紫外線を浴びすぎると、急性の症状として日焼け、紫外線角膜炎（雪目）、免疫機能低下が生じるといわれている。
また、慢性の症状としては、皮膚に関しては、しわ（菱形皮膚）、しみや日光黒子、良性腫瘍、前癌症（日光角化症、悪性黒子）、皮膚癌などを生じ易くなり、目に関しては、白内障や翼状片を生じ易くなるといわれている。
【００１０】
実際に、有害紫外線量の増加により皮膚癌や白内障に罹患し易くなり、今日では、世界中で皮膚癌や白内障の患者が増加し、日本でもこれらの疾患の罹患率が７倍に増えているとも言われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開昭５７−８８１０７
【特許文献２】特許昭５９−４８８０９
【特許文献３】特開２００８−１７４４８８
【特許文献４】特開２００８−２２２６５６
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】木村ら、和漢医学雑誌、Ｖｏｌ１、第１号、１９８４、１７８〜１７９
【非特許文献２】木村ら、薬学雑誌、１０２(７)、１９８２、６６６〜６６９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、従来、産業廃棄物として廃棄されていた含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分の新規利用方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、鋭意努力研究を重ねた結果、驚くべきことに、含蜜糖に含まれる３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを含む画分が、皮膚老化防止に対し有効であることを見出して本発明を完成した。
したがって、本発明によれば、３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを有効成分として含有することを特徴とする皮膚老化防止剤が提供される。
また、本発明によれば、３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを有効成分として含有することを特徴とする皮膚老化防止剤を含む香粧品が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、上白糖の製造工程で従来廃棄物とされていた含蜜糖が含有する非甘味水溶性画分の主成分であるフェニルグルコシド誘導体含有着色成分を、皮膚老化防止に安全に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを含む画分の背部局所塗布が、長期ＵＶＢ照射したメラニン保有無毛マウスの皮膚の厚さ（ａ）および皮膚の弾力性（ｂ）に与える影響を示す図である。  各値は、５匹のマウスの平均値±標準誤差で示す。＊は、賦形剤塗布群（ＵＶＢ照射マウス（対照））との有意差（ｐ＜０.０５）を示す。
【図２】長期ＵＶＢ照射により誘導される皮膚のしわおよび３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを含む画分の背部局所塗布が与える影響を示す写真である。
【図３】（ａ）ヘマトキシリン‐エオジン（ＨＥ）、（ｂ）アザンおよび（ｃ）フォンタナ・マッソンで染色した正常マウス、賦形剤のみを背部に塗布し長期ＵＶＢ照射したマウス（賦形剤塗布群、対照）、および３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを含む画分の１％または３％水溶液またはエタノール−ポリプロピレングリコール（賦形剤）溶液（７：３、ｖ／ｖ、１００ｍｌ中）を背部塗布したＵＶＢ照射マウス（１％または３％被験試料塗布群）の背部皮膚組織の光学顕微鏡写真である。
【図４】正常マウス、賦形剤塗布群、および１％または３％被験試料塗布群の皮膚血管の写真である。
【図５】長期ＵＶＢ照射したメラニン保有無毛マウスの皮膚において、１％または３％被験試料塗布群における、ＭＭＰ‐９前駆体、ＭＭＰ‐２前駆体、およびＭＭＰ‐２の発現へ与える影響を示す図である。  各値は、マウス５匹の平均値±標準誤差で示す。＊は、ＵＶＢ照射マウス（対照）との有意差（ｐ＜０.０５）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明によれば、皮膚老化防止作用を有する３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドまたは３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを主成分として含む画分もしくはその乾燥末が提供される。
【００１８】
また、本発明によれば、前記皮膚老化防止が、紫外線による、しわの増加防止、皮膚の肥厚防止、皮膚の弾力性低下防止または色素沈着防止である皮膚老化防止剤が提供される。
【００１９】
また、本発明によれば、前記香粧品が、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、化粧用下地、ファンデーションおよびボディーローションからなる群から選択される香粧品が提供される。
なお、本発明による皮膚老化防止剤は、上記の香粧品に０.１重量％〜２０重量％、好ましくは、０.５重量％〜１０重量％の範囲で添加できる。
【００２０】
本発明において用いられる用語「含蜜糖」とは、サトウキビまたは砂糖大根などの原料の搾り汁をそのまま煮詰めたものを意味し、黒砂糖、上記の原料から得られる粗製蔗糖、粗製蔗糖エキス、その乾固物または原料糖（粗糖）のいずれをも意味する。
【００２１】
また、本発明において用いられる３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを主成分として含む含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分は、前記の特許文献１、２または非特許文献１に記載の水およびアルコールで溶出するカラムクロマトグラフィー法、あるいは以下の製造例１に記載の強酸性イオン交換樹脂を用い水で溶出するカラムクロマトグラフィー法（特許文献３）のいずれかに従って得られる。
しかしながら、本発明による皮膚老化防止剤の用途が香粧品であるという観点から、有機溶媒を全く使用しない以下の製造例１に記載の方法が最も好ましい。
【００２２】
したがって、本発明において用いられる用語、含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分または該画分を含む皮膚老化防止剤とは、含蜜糖から分離した非甘味水溶性画分に含有される、３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドの含有画分、該画分の減圧濃縮物および濃縮乾固物（乾燥末）またはそれらから単離された３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドまたはブラックオリゴもしくはブラックオリゴール（商標：オリエント・ハーブ株式会社）のいずれをも意味する。
また、上記の皮膚老化防止剤は、医薬的に受容な公知の賦形剤を含んでいてもよい。
【００２３】
なお、本発明に用いられる３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドは以下の性状を示す。
（１）  上記濃縮乾固末は黄褐色のやや吸湿性の粉末で、水、アルコールに可溶、ヘキサン石油エーテル、エーテルに不溶である：
（２）  上記濃縮乾固末の１％水溶液はｐＨ約７.５を示す：
（３）  赤外線吸収スペクトルνmax（ヌジョール；ｃｍ-1）：３３００、１５９０、１０２０および７２０：
【００２４】
（４）  紫外線吸収スペクトルλmax（ｎｍ）（水）：２７２、３２０：
（５）  上記の濃縮乾固末の５％水溶液２〜３滴を沸騰フェーリング試液５ｍＬに加えると赤色沈殿を生じる。また、本品の５％水溶液に塩化第二鉄試液を加えても陰性である：さらに、５％水溶液にゼラチン試液を加えても沈殿を生じない：
【００２５】
（６）  薄層クロマトグラフィー：
上記の濃縮乾固末１０ｍｇを水１ｍＬに溶解し、以下に記載の条件下、日本薬局法一般試験法薄層クロマトグラフ法により試験するときＲｆ約０.６〜０.８５の間に単一の顕著な紅色スポットを発現する。
担体：シリカゲル６０Ｆ254（メルク社、厚さ０.２５ｍｍ）：
試料添付量：１０μＬ：
展開溶媒：クロロホルム：メタノール：水（６５：３５：１０）の下層：
展開距離：１０ｃｍ：
検出：ｐ−アニスアルデヒド試液を噴霧後１０５℃で５分間加熱：
【００２６】
（７）  濃縮乾固末からの３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドの結晶化：
上記の濃縮乾固末をイソプロビルアルコールから再結晶すると、融点１５４〜１５６℃の白色結晶性粉末が得られる。
上記結晶性粉末を上記（６）に記載の条件下に薄層クロマトグラフィーに付すと、Ｒｆ０.８に赤色の顕著なスポットを発現した。
【００２７】
上記結晶性粉末の元素分析、質量分析および1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）を測定したところ、３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドのデータと完全に一致し、上記結晶性粉末が３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドであることを確認した。
【００２８】
また、上記結晶性粉末のＨＰＬＣ分析（カラム：Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP 80A (250 mm×4.6 mm)、移動相：0.1％リン酸水溶液；アセトニトリル＝95％；5％、検出波長：282 nm）を行ったところ、純度９６％以上であることが判明した。
【００２９】
本発明者は、含蜜糖が含有する非甘味水溶性画分を、メラニン色素を有する無毛マウスの背部に、１９週間毎日塗布し、かつ１９週間の長期に亘り紫外線Ｂ（ＵＶＢ）を照射した無毛マウスの皮膚を観察した。その結果、含蜜糖が含有する非甘味水溶性画分の塗布が、ＵＶＢ照射による、無毛マウスの皮膚の厚さの増加および皮膚の弾力性の低下を抑制することを見出した。
【００３０】
また、本発明者は、上記の非甘味水溶性画分の塗布が、皮膚におけるＵＶＢ照射により誘発されるしわおよびメラニン色素の沈着の形成を予防できることを見出した。
また、本発明者は、上記の非甘味水溶性画分の塗布が、長期に亘る慢性的なＵＶＢ照射による皮膚血管の直径および長さの増大も予防できることを見出した。
【００３１】
さらに、本発明者は、上記の非甘味水溶性画分の塗布が、ＵＶＢ照射マウスの皮膚におけるマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）および血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）の発現増加を抑制できることを見出し、本発明を完成させた。
したがって、含蜜糖の非甘味水溶性画分の局所塗布によるＵＶＢ照射皮膚の老化予防は、長期ＵＶＢ照射により誘発されたＭＭＰ−２およびＶＥＧＦの発現抑制によるものと思われる。
【００３２】
よって、本発明による組成物は、紫外線による皮膚老化防止の有効成分として香粧品、すなわち、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、化粧用下地、ファンデーション、ボディーローションおよび入浴剤などに好適に添加できる。
【００３３】
上記の香粧品の添加剤としては、当業者に公知の添加剤を用いることができる。
また、上記の香粧品に用いられる香料としては、例えば、フトモモ葉エキス、酢酸カリオフィレン、ヘリオトロピン、ユーカリ油、ローズ水、ラベンダー油またはハッカ油等が挙げられるが、これらの香料から製品に応じて適宜選択し、その適量を添加することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明による皮膚老化防止の有効成分としての含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を含む組成物について、実施例により具体的に説明するが、以下の実施例および試験例は、本発明を説明するためのものであり、本発明をなんら限定するものではない。
また、特に記載がない溶媒および試薬は、和光純薬工業株式会社またはナカライテスク株式会社から購入した。
【００３５】
統計分析
また、以下の試験例における全ての値は、平均値±標準誤差として示した。データは、一元分散分析（one-way ANOVA）で解析し、平均値間の差は、デュネット検定（Dunnet's test）またはターキー−クレイマー多元比較検定（Turkey-Kramer's multiple test）により解析した。ｐ＜０.０５で有意差とみなした。
【００３６】
製造例１
粗糖末１ｋｇを脱イオン水２.５Ｌに溶解し、不溶物をろ別し、粗糖の水溶液を得た。この水溶液を、常法に従って、１７Ｌのナトリウム型陽イオン交換樹脂（三菱化学製、ＵＢＫ５３０）を脱イオン水に分散して充填したカラムの上部に注ぎ込み、該樹脂に吸着させた。
次いで、室温で、８５Ｌのイオン交換水を用い、流速８Ｌ/時の速度で上記のカラムから溶出させ蔗糖を溶離した。
【００３７】
蔗糖の溶離後に、カラムからの溶出液が着色し始めた時点で、４Ｌずつ分画し、フラクション１〜２０を得た。各フラクションを糖度計（アタゴ社製MASTE）で計測し、糖度プリックスが値０で、かつ甘味を呈さず、最大紫外線吸収波長２７２nmで吸光度１.０以上を示したフラクション８〜１６を合せ、この溶出液を６０℃で減圧濃縮した。さらに残留物を６０℃で真空下に濃縮乾固し、乾燥して３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを主成分とする画分の乾燥末５ｇを０.５％収率で得た。
【００３８】
この画分をイソプロピルアルコールから再結晶することにより、容易に、３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドの白色結晶性粉末（ｍ.ｐ.１５４〜１５６℃）を得た。
【００３９】
上記の製造例１で得られた３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを主成分として含む含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分（乾燥粉末）を以下の実施例および試験例において用いた。
すなわち、含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分１ｇまたは３ｇを、水またはエタノール−ポリプロピレングリコール混合物（７：３、ｖ／ｖ、１００ｍｌ中）に溶解し、含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分の１％および３％溶液（以下、１％被験試料および３％被験試料という）をそれぞれ試料として調製し、以下の試験例で用いた。
また、対照には、エタノール−ポリプロピレングリコール混合物（７：３）（以下、賦形剤という）を用いた。
【００４０】
動物
雄性無毛Ｈｏｓ：ＨＲＭマウス（メラニン保有無毛マウス）（５週齢）を、株式会社星野試験動物飼育所（埼玉県）から購入し、実験前に、温度を２５±１℃および相対湿度を６０％に制御した飼育室内のゲージで１週間飼育し、標準実験食と水を自由に接種させた。
なお、ＨＲＭマウスは、ＵＶＢ非照射群（以下、通常ともいう）と、ＵＶＢ照射群として含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分の１％溶液（１％被験試料）塗布群、３％溶液（３％被験試料）塗布群および賦形剤塗布群との４群に、各５匹のＨＲＭマウスを用いた。
【００４１】
各マウスの背部に、含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分の１％溶液または３％溶液（１％または３％被験試料）、各５０μｌまたは賦形剤５０μｌを、それぞれ１９週間毎日塗布した。
【００４２】
試験例１
紫外線Ｂ（ＵＶＢ）照射（曝露）により誘導されたしわの測定
ＵＶＢ照射により誘導された皮膚の厚さ、弾力性およびしわへの含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分の影響を調べるために、この研究では、ＵＶＢランプ（１５Ｗ型、ＵＶ最大波長３１２ｎｍ；ＵＶ強度１００μＷ／ｃｍ2、家田貿易株式会社）を用いた。
【００４３】
ＵＶ照射時間は、各マウスの背部に照射するＵＶＢエネルギーを制御するために調節した。マウスあたりの最小紅斑線量（ＭＥＤ）の値は、約３６ｍＪ／ｃｍ2であった。
したがって、第１週目のＵＶＢ線量を３６ｍＪ／ｃｍ2に調整し、その後第２〜４週目は５４ｍＪ／ｃｍ2に、第５〜７週目は７２ｍＪ／ｃｍ2、第８〜１０週目は１０８ｍＪ／ｃｍ2、第１１〜１３週目は１４４ｍＪ／ｃｍ2、第１４〜１６週目は１６８ｍＪ／ｃｍ2、第１７〜１９週目は１８０ｍＪ／ｃｍ2まで、ＵＶＢ線量を漸次増加した。
【００４４】
ＵＶＢ照射の頻度は、１週間あたり３回（月曜日、水曜日および金曜日）とした。
この試験において、初回ＵＶＢ照射後第７週目ぐらいから、被験マウスの背部に、肉眼でしわが観察され始めた。
ＵＶＢ照射後の皮膚の厚さおよび弾力性は、それぞれクイックミニキャリパ（株式会社ミツトヨ、神奈川県）およびデジマチックキャリパ（株式会社ミツトヨ、神奈川県）を用いて毎週測定した。
【００４５】
ＵＶＢ照射後のしわの形成を評価するために、８および１１週目に、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を被験マウスの腹腔内に注射して麻酔し、ＵＶＢ照射した背部（しわの形成部位）を写真撮影した。
【００４６】
上記の各マウスの写真に基づき、しわの形成程度を、Ｂｉｓｓｅｔらの方法（Bissett et al., "An animal model of solar-aged skin: Histological, physical, and visible changes in UV-irradiated hairless mouse skin", Photochem. Photobiol., 46: 367-378, 1987）を改変した、以下の評価基準に従って評価した：
【００４７】
グレード０：粗いしわはない；
グレード２：浅く、粗いしわがＵＶ照射部の皮膚領域にところどころ観察される
（Ｂｉｓｓｅｔｔグレード１）；
グレード４：浅く、粗いしわがＵＶ照射部の皮膚領域全体に観察される
（Ｂｉｓｓｅｔｔグレード２）；
グレード６：深く、長いしわがＵＶ照射部の皮膚領域にいくつか観察される
（Ｂｉｓｓｅｔｔグレード３）。
【００４８】
メラニン保有無毛マウスへのＵＶＢ照射の第８週目および第１１週目におけるしわの評価結果を以下の表に示す。
【表１】
2010208958.tif 000002
【００４９】
上記の表に示す結果から、ＵＶＢ非照射群のマウスに比べ、ＵＶＢ照射群のマウスでは、明らかにしわが発生していることが判った。
しかしながら、３％被験試料、すなわち前記の含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分の３％溶液を塗布したマウスでは、ＵＶＢ照射（照射）により誘発されるしわの発生が強力に抑制されていることが判った。
【００５０】
皮膚の厚さは、２〜１９週間のＵＶＢ照射で顕著に増加したが、一方、皮膚の弾力性は、５〜１９週間のＵＶＢ照射で顕著に減少した（図１参照）。
しわの形成は、ＵＶＢ照射開始後第８および１１週目に、背部において肉眼で観察され始めた（図２参照）。
【００５１】
賦形剤処理したＵＶＢ照射マウス（対照）の皮膚の厚さとくらべて、１２〜１９週間のＵＶＢ曝露により誘導された皮膚の厚さの増加は、１％被験試料の塗布により顕著に抑制され、３％被験試料でも、７〜１９週目に皮膚の厚さの増加が抑制された（図１ａ参照）。
【００５２】
ＵＶＢ照射により誘導された皮膚の弾力性の低下は、対照マウスと比べて、５〜１９週間の１％被験試料または３％被験試料の塗布により、顕著に抑制された（図１ｂ参照）。
１１週間のＵＶＢ曝露によるしわの形成は、３％被験試料の塗布により予防された（図２参照）。
【００５３】
試験例２
紫外線Ｂ（ＵＶＢ）照射により誘導された表皮の厚さ、基質の細胞外マトリックスの厚さおよびメラニン顆粒面積の測定
第１９週目の最後のＵＶＢ照射が終了した２４時間後に、エーテル麻酔下で屠殺し、マウスのＵＶＢを照射した背部皮膚を剥離した。
この被験マウスの背部皮膚試料（約３ｃｍ2）を１０％−中性緩衝ホルムアルデヒド液で少なくとも２４時間固定した。
【００５４】
次いで、エタノール濃度を漸次増加した７０％、８０％、９５％エタノールおよび１００％エタノールを用い、この皮膚試料を漸次的に脱水し、次いでヒストクリア（アズワン株式会社、東京）で透明化した。この透明処理した背部皮膚試料を真空下でパラフィンに包埋し、常法に従って５μｍ厚さの薄片に切り、脱パラフィン化し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）、アザンおよびフォンタナ・マッソンでそれぞれ染色した。
【００５５】
試料につき３つの染色プレートから同じ断面を選択し、プレートにつき４つの異なる顕微鏡視野（×４０、×１００、×２００または×４００）で写真撮影した。
表皮の厚さ、基質の細胞外マトリックスの厚さおよびメラニン顆粒面積（メラニン陽性部位）をデジマチックキャリパー（株式会社ミツトヨ、神奈川県）および面積・線量測定機（エクスプランン‐３６０ｄＩＩ、有限会社牛方商会、東京）をそれぞれ用いて測定した。
【００５６】
以下の表に、長期ＵＶＢ照射したメラニン保有無毛マウスにおいて、含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分の、表皮の厚さおよび真皮の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の厚さおよびメラニン顆粒形成に与えた結果を示す。
【表２】
2010208958.tif 000003
【００５７】
上記の表に示す結果からも明らかなように、組織学的観察から、皮膚の表皮および真皮細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の厚さは、正常マウスと比べて、ＵＶＢ照射により顕著に増加した。
上記の結果から、ＵＶＢの長期照射により、表皮の厚さ、真皮の細胞外マトリックスの厚さおよび表皮および真皮間の基底層において、メラニン顆粒の発現に増加、すなわち、メラニン顆粒の形成面積のいずれもが増加することが判った。
【００５８】
しかしながら、１％または３％被験試料、すなわち含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分の１％溶液および３％溶液マウスの背部皮膚への塗布が、賦形剤処理したＵＶＢ照射マウス（対照）と比べて、ＵＶＢの長期照射による表皮の厚さ、真皮の細胞外マトリックスの厚さおよびメラニン顆粒の形成面積の増加を強力に抑制することが判った（図３ａおよびｂ参照）。
【００５９】
また、１％被験試料および３％被験試料の背部皮膚への塗布は、賦形剤処理したＵＶＢ照射マウス（対照）と比べて、ＵＶＢ照射により誘導されたメラニン顆粒領域の増加を顕著に減少した（図３ｃ参照）。
【００６０】
試験例３
ＵＶＢ照射皮膚における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）含有量、血管の直径および血管の長さの測定
前記の切り取った背部皮膚組織（約１００ｍｇ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７.０）で洗浄し、小片に切り、次いで、プロテアーゼ阻害剤を含む組織タンパク質抽出剤（Ｔ‐ＰＥＲ）（Pierce Co.、ロックフォード、イリノイ州、米国）２ｍｌを、皮膚組織に加え、この混合物をホモジナイズした。
【００６１】
皮膚ホモジネートを４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清中のＶＥＧＦ含有量を、ＶＥＧＦ−ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（R＆D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を用いて測定した。
【００６２】
長期ＵＶＢ照射後の血管の直径および血管の長さは、前記のエーテル麻酔下の被験マウスのＵＶＢ照射した背部皮膚を写真撮影し、その拡大写真に基づき、血管の直径および単位面積あたりの長さを実測した。
以下の表に、長期ＵＶＢ照射したメラニン保有マウスにおいて、ＶＥＧＦ含有量、皮膚血管の直径および血管の長さに与える影響を示す。
【００６３】
【表３】
2010208958.tif 000004
【００６４】
上記の表に示す結果から、皮膚のＶＥＧＦ含有量も、正常マウスと比べて、長期ＵＶＢ照射により顕著に増加したが判った。
しかしながら、３％被験試料塗布群の局所塗布により、対照マウスと比べて、ＵＶＢ照射により誘導されたＶＥＧＦ含有量の増加が顕著に抑制された。
また、ＵＶＢ照射マウスにおける血管は、正常マウスのものと比べると、太くかつ長くなったことが判った。
また、ＵＶＢ照射により誘導された血管の直径および長さの増加は、３％被験試料の局所塗布により、顕著に抑制された（図４参照）。
【００６５】
試験例４
マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の発現測定
前記の切り取った背部皮膚組織（約１００ｍｇ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７.０）で洗浄し、小片に切り、次いで、プロテアーゼ阻害剤を含む組織タンパク質抽出剤（Ｔ‐ＰＥＲ）（Pierce Co.、ロックフォード、イリノイ州、米国）２ｍｌを、皮膚組織に加え、この混合物をホモジナイズした。
【００６６】
皮膚ホモジネートを４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清中のＶＥＧＦ含有量を、ＶＥＧＦ−ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（R＆D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を用いて測定した。
上清中のＭＭＰ−２（活性型）、プロＭＭＰ−２（非活性型）、ＭＭＰ−９（活性型）およびプロＭＭＰ−９（非活性型）発現は、非還元条件下で、０.１％ゼラチン含有７.５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離した。
【００６７】
電気泳動後、電気泳動に用いたゲルを、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび２.５％トリトンＸ−１００を含有する５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）で１.５時間洗浄し、次いでこのゲルを、１０ｍＭ ＣａＣｌ2および１０μＭ ＺｎＣｌ2を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ中で、３７℃で２０時間インキュベートした。
【００６８】
このゲルを、０.２５％クマシーブリリアントブルー２５０で染色し、非染色のゼラチン分解領域を、米国のＮＩＨで開発されたイメージＪ１.３６（Image J 1.36）により定量した。
【００６９】
この研究では、１９週間ＵＶＢ照射した無毛マウスの皮膚において、ＭＭＰ‐９（活性型）の産生は検出されなかった。
【００７０】
以下の表に、１９週間ＵＶＢ照射した無毛マウスの皮膚組織におけるマトリックスメタロプロテアーゼのＭＭＰ−２（活性型）、プロＭＭＰ−２（非活性型）およびプロＭＭＰ−９（非活性型）の発現を測定した結果を示す。
【００７１】
【表４】
2010208958.tif 000005
【００７２】
上記の表に示す結果からＭＭＰ‐２（活性型）、プロＭＭＰ‐２（非活性型）およびプロＭＭＰ‐９（非活性型）の発現は、正常マウスでの発現と比べて、長期ＵＶＢ照射により増加したことが判った。
また、ＵＶＢ照射マウスにおけるプロＭＭＰ‐２およびＭＭＰ‐２の発現の増加は、３％被験試料の局所塗布により顕著に抑制されたが、１％被験試料を用いた場合では顕著な影響が認められなかった（図５参照）。
【００７３】
上記の試験例によれば、皮膚の厚さの増加、しわの形成および皮膚の弾力性の低下を含む長期ＵＶＢ照射による皮膚の老化は、ＵＶＢ照射皮膚におけるＭＭＰ‐２、ＭＭＰ‐９およびＶＥＧＦの発現増加と密接に関連していることが示唆されている。
【００７４】
したがって、本発明による組成物を用いた被験試料の塗布によるＵＶＢ照射した皮膚の老化（皮膚の厚さおよびしわ形成の増加、ならびに皮膚の弾力性の低下）の予防は、長期ＵＶＢ照射により誘導されるＭＭＰ‐２およびＶＥＧＦの発現増加の抑制によるものと思われる。
【００７５】
上記各試験例の結果は、含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を含む組成物による皮膚老化、ことに紫外線による皮膚老化の予防または防止作用の根拠となり、本発明による組成物が、ＵＶＢによる誘導される皮膚損傷に対して有益であることを示している。
【００７６】
実施例１
化粧水の調製
以下の処方：
【表５】
2010208958.tif 000006
に従って、常法により化粧水１ｋｇを調製した。
【００７７】
実施例２〜５
上記の実施例１において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例１と全く同様にして化粧水１ｋｇをそれぞれ調製した。
【００７８】
実施例６
乳液の調製
以下の処方：
【表６】
2010208958.tif 000007
に従って、常法により乳液１ｋｇを調製した。
【００７９】
実施例７〜１０
上記の実施例６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例６と全く同様にして乳液１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００８０】
実施例１１
クリームの調製
以下の処方：
【表７】
2010208958.tif 000008
に従って、常法によりクリーム１ｋｇを調製した。
【００８１】
実施例１２〜１５
上記の実施例１１において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例１１と全く同様にしてクリーム１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００８２】
実施例１６
エッセンスの調製
以下の処方：
【表８】
2010208958.tif 000009
に従って、常法によりエッセンス１ｋｇを調製した。
【００８３】
実施例１６〜２０
上記の実施例１６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例１６と全く同様にしてエッセンス１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００８４】
実施例２１
パックの調製
以下の処方：
【表９】
2010208958.tif 000010
に従って、常法によりパック１ｋｇを調製した。
【００８５】
実施例２２〜２５
上記の実施例２１において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例２１と全く同様にしてパック１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００８６】
実施例２６
クレンジングクリームの調製
以下の処方：
【表１０】
2010208958.tif 000011
に従って、常法によりクレンジングクリーム１ｋｇを調製した。
【００８７】
実施例２７〜３０
上記の実施例１６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例２６と全く同様にしてクレンジングクリーム１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００８８】
実施例３１
洗顔料の調製
以下の処方：
【表１１】
2010208958.tif 000012
に従って、常法により洗願料１ｋｇを調製した。
【００８９】
実施例３２〜３５
上記の実施例３１において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例31と全く同様にして洗顔料１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００９０】
実施例３６
化粧用下地の調製
以下の処方：
【表１２】
2010208958.tif 000013
に従って、常法により化粧用下地１ｋｇを調製した。
【００９１】
実施例３７〜４０
上記の実施例３６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例３６と全く同様にして化粧用下地１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００９２】
実施例４１
日焼け止めクリームの調製
以下の処方：
【表１３】
2010208958.tif 000014
に従って、常法により日焼け止め化粧用下地１ｋｇを調製した。
【００９３】
実施例４２〜４５
上記の実施例４１において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例４１と全く同様にして日焼け止め化粧用下地１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００９４】
実施例４６
ファンデーションの調製
以下の処方：
【表１４】
2010208958.tif 000015
に従って、常法によりファンデーション１ｋｇを調製した。
【００９５】
実施例４７〜５０
上記の実施例４６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例４６と全く同様にしてファンデーション１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００９６】
実施例５１
ボディーシャンプーの調製
以下の処方：
【表１５】
2010208958.tif 000016
に従って、常法によりボディーシャンプー１ｋｇを調製した。
【００９７】
実施例５２〜５５
上記の実施例５１において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例５１と全く同様にしてボディーシャンプー１ｋｇをそれぞれ製造した。
【００９８】
実施例５６
ボディローションの調製
以下の処方：
【表１６】
2010208958.tif 000017
に従って、常法によりボディーローション１ｋｇを調製した。
【００９９】
実施例５７〜６０
上記の実施例５６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例５６と全く同様にしてボディーローション１ｋｇをそれぞれ製造した。
【０１００】
実施例６１
全身用日焼け止め乳液
以下の処方：
【表１７】
2010208958.tif 000018
に従って、常法により全身用日焼け止め乳液１ｋｇを調製した。
【０１０１】
実施例６２〜６５
上記の実施例６１において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例６１と全く同様にして全身用日焼け止めクリーム１ｋｇをそれぞれ製造した。
【０１０２】
実施例６６
シャンプーの調製
以下の処方：
【表１８】
2010208958.tif 000019
に従って、常法によりシャンプー１ｋｇを調製した。
【０１０３】
実施例６７〜７０
上記の実施例６６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例６６と全く同様にしてシャンプー１ｋｇをそれぞれ製造した。
【０１０４】
実施例７１
トリートメントの調製
以下の処方：
【表１９】
2010208958.tif 000020
に従って、常法によりトリートメント１ｋｇを調製した。
【０１０５】
実施例７２〜７５
上記の実施例７１において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例７１と全く同様にしてトリートメント１ｋｇをそれぞれ製造した。
【０１０６】
実施例７６
頭髪用ローションの調製
以下の処方：
【表２０】
2010208958.tif 000021
に従って、常法により頭髪用ローション１ｋｇを調製した。
【０１０７】
実施例７７〜８０
上記の実施例７６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例７６と全く同様にして頭髪用ローション１ｋｇをそれぞれ製造した。
【０１０８】
実施例８１
頭髪用パックの調製
以下の処方：
【表２１】
2010208958.tif 000022
に従って、常法により頭髪用パック１ｋｇを調製した。
【０１０９】
実施例８２〜８５
上記の実施例８１において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例８１と全く同様にして頭髪用パック１ｋｇをそれぞれ製造した。
【０１１０】
実施例８６
ハンドクリームの調製
以下の処方：
【表２２】
2010208958.tif 000023
に従って、常法によりハンドクリーム０.５ｋｇを調製した。
【０１１１】
実施例８７〜９０
上記の実施例８６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例８６と全く同様にしてハンドクリーム１ｋｇをそれぞれ製造した。
【０１１２】
実施例９１
リップクリームの調製
以下の処方：
【表２３】
2010208958.tif 000024
に従って、常法によりリップクリーム０.５ｋｇを調製した。
【０１１３】
実施例９６
入浴剤の調製
以下の処方：
【表２４】
2010208958.tif 000025
に従って、常法により入浴剤１ｋｇを調製した。
【０１１４】
実施例９７〜１００
上記の実施例９６において含蜜糖に含まれる非甘味水溶性画分を０.５、３、５および１０重量％をそれぞれ用いたこと以外は、実施例９６と全く同様にして入浴剤１ｋｇをそれぞれ製造した。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によれば、上白糖の製造工程で従来廃棄物とされていた含蜜糖に含まれる３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを、皮膚老化防止・予防剤として安全に使用できる。
【図１】
2010208958.tif 000026
【図２】
2010208958.tif 000027
【図３】
2010208958.tif 000028
【図４】
2010208958.tif 000029
【図５】
2010208958.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月5日(2009.6.5)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドを有効成分として含有することを特徴とする、紫外線による、しわの増加、皮膚の肥厚または皮膚の弾力性低下の防止もしくは予防剤。
【請求項２】
請求項１に記載の防止または予防剤を含む香粧品。
【請求項３】
前記香粧品が、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、化粧用下地、ファンデーションおよびボディーローションからなる群から選択される、請求項２に記載の香粧品。
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月17日(2009.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドのみを有効成分として含有することを特徴とする、紫外線による、しわの増加、皮膚の肥厚または皮膚の弾力性低下の防止もしくは予防剤。
【請求項２】
請求項１に記載の防止または予防剤を含む香粧品。
【請求項３】
前記香粧品が、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、化粧用下地、ファンデーションおよびボディーローションからなる群から選択される、請求項２に記載の香粧品。
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月1日(2010.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３,４−ジメトキシフェニル−β−Ｄ−グルコシドのみを有効成分として含有することを特徴とする、紫外線による、しわの増加、皮膚の肥厚または皮膚の弾力性低下の防止もしくは予防剤。