(57)【要約】【課題】３光子励起による蛍光を抑制しつつ、２光子励起蛍光の観察を精度よく行うことができるレーザ顕微鏡を提供する。【解決手段】パルスレーザ光Ｌを射出するレーザ光源２と、レーザ光源２からのパルスレーザ光Ｌを試料Ａに照射する一方、試料Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ８と、対物レンズ８により集光された蛍光を検出する検出器１３ａ，１３ｂと、パルスレーザ光Ｌのパルス幅の調整が指示された場合に、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を検出器１３ａ，１３ｂにより検出される蛍光の強度が最大となる最小パルス幅よりも大きく設定する分散補償光学系１７とを備えるレーザ顕微鏡１を採用する。【選択図】図１
2010160264.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源からのパルスレーザ光を標本に照射する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された蛍光を検出する検出手段と、
前記パルスレーザ光のパルス幅の調整を指示する調整指示手段と、
該調整指示手段により前記パルスレーザ光のパルス幅の調整が指示された場合に、前記パルスレーザ光のパルス幅を前記検出手段により検出される蛍光の強度が最大となる最小パルス幅よりも大きく設定するパルス幅調整手段とを備えるレーザ顕微鏡。
【請求項２】
前記対物レンズにより集光された蛍光を２光子励起蛍光と３光子励起蛍光とに分岐する分岐手段を備え、
前記検出手段が、前記分岐手段により分岐された２光子励起蛍光を検出する２光子蛍光検出部と、前記分岐手段により分岐された３光子励起蛍光を検出する３光子蛍光検出部とを有する請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記パルス幅調整手段は、前記３光子蛍光検出部により検出された３光子励起蛍光の強度の変化率の絶対値が所定の閾値以下となるように、前記パルスレーザ光のパルス幅を調整する請求項２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記パルス幅調整手段は、前記２光子蛍光検出部により検出された２光子励起蛍光の強度の変化率の絶対値が所定の閾値以上となるように、前記パルスレーザ光のパルス幅を調整する請求項２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記パルス幅調整手段は、前記２光子蛍光検出部により検出された２光子励起蛍光の強度に対する前記３光子蛍光検出部により検出された３光子励起蛍光の強度の比率が所定の閾値以下となるように、前記パルスレーザ光のパルス幅を調整する請求項２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項６】
前記パルス幅調整手段を操作する操作部と、
前記２光子蛍光検出部により検出された２光子励起蛍光および前記３光子蛍光検出部により検出された３光子励起蛍光から、それぞれの画像を生成する画像生成部と、
該画像生成部により生成された画像を表示する表示部とを備える請求項２から請求項５のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光源を有するレーザ顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、パルスレーザ光を励起光として、標本において発生した蛍光を観察するレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１から３参照）。このようなレーザ顕微鏡によれば、特に生体試料の観察において高い空間分解能を得ることができる。また、生体組織での透過率の高い近赤外の波長のパルスを励起光として用いることで、試料への低侵襲性の実現と標本深部の観察も可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表平５−５０３１４９号公報
【特許文献２】特開２００６−１０６００４号公報
【特許文献３】特開２００７−１２７５２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１から３に開示されている技術によれば、２光子励起観察を行う際に、意図しない３光子励起による蛍光が生じて生体標本へダメージを与えてしまう。ここで、２光子励起の励起効率と３光子励起の励起効率に関わる励起光の特性パラメータは共通であるため、無闇に３光子励起効率を低下させるように励起光の調整を行うと、本来観察したい２光子励起蛍光の観察精度も低下してしまうという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、３光子励起による蛍光を抑制しつつ、２光子励起蛍光の観察を精度よく行うことができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源からのパルスレーザ光を標本に照射する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を検出する検出手段と、前記パルスレーザ光のパルス幅の調整を指示する調整指示手段と、該調整指示手段により前記パルスレーザ光のパルス幅の調整が指示された場合に、前記パルスレーザ光のパルス幅を前記検出手段により検出される蛍光の強度が最大となる最小パルス幅よりも大きく設定するパルス幅調整手段とを備えるレーザ顕微鏡を採用する。
【０００７】
本発明によれば、調整指示手段によりパルスレーザ光のパルス幅の調整が指示された場合に、パルス幅調整手段によりパルスレーザ光のパルス幅が蛍光の強度が最大となる最小パルス幅よりも大きく設定されるので、標本からの３光子励起蛍光の強度を小さくして、標本へのダメージを低減することができる。この際、観察に適した２光子励起蛍光の強度を確保するようにパルスレーザ光のパルス幅を設定することで、３光子励起蛍光による標本へのダメージを抑制しつつ、２光子励起蛍光による標本の観察を精度良く行うことが可能となる。
【０００８】
上記発明において、前記対物レンズにより集光された蛍光を２光子励起蛍光と３光子励起蛍光とに分岐する分岐手段を備え、前記検出手段が、前記分岐手段により分岐された２光子励起蛍光を検出する２光子蛍光検出部と、前記分岐手段により分岐された３光子励起蛍光を検出する３光子蛍光検出部とを有することとしてもよい。
【０００９】
このようにすることで、標本において発生した２光子励起蛍光と３光子励起蛍光とを別個に且つ同時に検出することができ、パルスレーザ光のパルス幅の調整時間を短縮して標本へのダメージを低減することができる。
【００１０】
上記発明において、前記パルス幅調整手段は、前記３光子蛍光検出部により検出された３光子励起蛍光の強度の変化率の絶対値が所定の閾値以下となるように、前記パルスレーザ光のパルス幅を調整することとしてもよい。
【００１１】
３光子励起蛍光の強度は、励起光であるパルスレーザ光のパルス幅の２乗に反比例する。したがって、パルス幅調整手段により３光子励起蛍光の強度の変化率の絶対値を所定の閾値以下とすることで、３光子励起蛍光の強度が急激に上昇しないようにパルスレーザ光のパルス幅を調整することができ、３光子励起蛍光による標本へのダメージを抑制することが可能となる。
【００１２】
上記発明において、前記パルス幅調整手段は、前記２光子蛍光検出部により検出された２光子励起蛍光の強度の変化率の絶対値が所定の閾値以上となるように、前記パルスレーザ光のパルス幅を調整することとしてもよい。
【００１３】
２光子励起蛍光の強度は、励起光であるパルスレーザ光のパルス幅に反比例する。したがって、パルス幅調整手段により２光子励起蛍光の強度の変化率の絶対値を所定の閾値以上とすることで、２光子励起蛍光の強度を飛躍的に向上させるようにパルスレーザ光のパルス幅を調整することができ、２光子励起蛍光による観察精度を向上することが可能となる。
【００１４】
上記発明において、前記パルス幅調整手段は、前記２光子蛍光検出部により検出された２光子励起蛍光の強度に対する前記３光子蛍光検出部により検出された３光子励起蛍光の強度の比率が所定の閾値以下となるように、前記パルスレーザ光のパルス幅を調整することとしてもよい。
【００１５】
このようにすることで、パルス幅調整手段により２光子励起蛍光の強度と３光子励起蛍光の強度とのバランスに基づいてパルスレーザ光のパルス幅を調整することができ、観察に適した２光子励起蛍光の強度を確保しつつ、３光子励起蛍光の上昇を抑制することができる。これにより、３光子励起蛍光による標本へのダメージを抑制しつつ、２光子励起蛍光による標本の観察を精度良く行うことが可能となる。
【００１６】
上記発明において、前記パルス幅調整手段を操作する操作部と、前記２光子蛍光検出部により検出された２光子励起蛍光および前記３光子蛍光検出部により検出された３光子励起蛍光から、それぞれの画像を生成する画像生成部と、該画像生成部により生成された画像を表示する表示部とを備えることとしてもよい。
【００１７】
このようにすることで、画像生成部により２光子励起蛍光の画像および３光子励起蛍光の画像を生成し、これら画像を表示部に表示することができ、これら画像を確認しながら操作部によりパルス幅調整手段を操作することで、各画像が所望の強度となるようにパルスレーザ光のパルス幅の調整を行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、３光子励起による蛍光を抑制しつつ、２光子励起蛍光の観察を精度よく行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１の分散補正光学系の概略構成図である。
【図３】図１の分散補正光学系の動作を説明する図であり、（ａ）は光路長を短くした場合、（ｂ）は光路長を長くした場合である。
【図４】図１のレーザ顕微鏡の作用を説明する図である。
【図５】パルス幅の調節方法を説明する図であり、（ａ）は２光子＞３光子の場合、（ｂ）は２光子＜３光子の場合、（ｃ）は各蛍光の強度を規格化した場合である。
【図６】第１の変形例に係るレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図７】第２の変形例に係る分散調節系の概略構成図である。
【図８】第４の変形例に係るレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図９】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図１０】図９のレーザ顕微鏡の作用を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態のレーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、パルスレーザ光Ｌを射出するレーザ光源２と、試料Ａにパルスレーザ光Ｌを照射して、得られる蛍光Ｆを観察する蛍光顕微鏡本体３と、この顕微鏡本体３にレーザ光源２から発せられたパルスレーザ光Ｌを導入する導入光学系４とを備えている。
【００２１】
蛍光顕微鏡本体３は、ガルバノミラー５と、瞳投影レンズ６と、結像レンズ７と、対物レンズ８と、励起ダイクロイックミラー（分岐手段）９と、集光レンズ１０と、バリアフィルタ１１と、蛍光分岐ダイクロイックミラー１２と、検出器（検出手段）１３ａ，１３ｂとを備えている。図中の符号１４はミラー、符号１５はバンドパスフィルタ、符号１６は集光レンズを示している。
【００２２】
ガルバノミラー５は導入光学系４から入射されてくるパルスレーザ光Ｌを２次元的に走査するようになっている。
瞳投影レンズ６は、ガルバノミラー５により走査されたパルスレーザ光Ｌを集光して中間像を結像させるようになっている。
【００２３】
結像レンズ７は、瞳投影レンズ６により中間像を結像したパルスレーザ光Ｌを集光して平行光に変換するようになっている。
対物レンズ８は、結像レンズ７により平行光に変換されたパルスレーザ光Ｌを集光して試料Ａに結像させ、また試料Ａにおいて蛍光物質が励起されることにより発せられた蛍光Ｆを集光するようになっている。
【００２４】
励起ダイクロイックミラー９は、対物レンズ８により集光された蛍光Ｆをパルスレーザ光Ｌから分岐するようになっている。
集光レンズ１０は、励起ダイクロイックミラー９により分岐された蛍光Ｆを集光するようになっている。
バリアフィルタ１１は、集光レンズ１０により集光された蛍光Ｆにおけるパルスレーザ光Ｌ成分を除去するようになっている。
【００２５】
蛍光分岐ダイクロイックミラー１２は、バリアフィルタ１１を通過した蛍光Ｆを波長毎に分岐するようになっている。
検出器１３ａ，１３ｂは、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier tube）であり、蛍光分岐ダイクロイックミラー１２により波長毎に分岐された蛍光Ｆをそれぞれ検出するようになっている。
【００２６】
導入光学系４は、パルスレーザ光Ｌのパルス時間幅を調節する分散補償光学系（パルス幅調整手段）１７と、パルスレーザ光Ｌの光軸および角度を変更可能にするアライメント調節装置１８と、蛍光顕微鏡本体３に入射されるパルスレーザＬのビーム径を調節するビーム整形光学系２０と、アライメント調節装置１８とビーム整形光学系２０との間に配置された音響光学装置１９と、パルスレーザＬのビーム径を調節する顕微鏡入射補正装置２１とを備えている。
【００２７】
アライメント調節装置１８は、分散補償光学系１７によりパルス時間幅が調節されたパルスレーザ光Ｌをミラーに入射させ、そのミラーの位置と角度を調節することでパルスレーザ光Ｌの光軸および角度を変更可能にするようになっている。
音響光学装置１９は、例えばＡＯＭ（Acoustic Optical Modulator）であり、パルスレーザ光Ｌのオンオフあるいは強度変調を行うようになっている。
【００２８】
ビーム整形光学系２０は、パルスレーザ光Ｌの光束を絞り、音響光学装置１９の結晶の有効範囲内に漏れなく入射させるためのビームエキスパンダである。
顕微鏡入射補正装置２１は、対物レンズに入射する光束径を調節し、対物レンズ８の瞳径とあわせることで、光子の空間的な密度を高くするための調節機構である。また、顕微鏡入射補正装置２１は、音響光学装置１９から出射されたパルスレーザ光Ｌが、顕微鏡本体３の対物レンズ８の瞳位置に瞳径と同等の光束径で入射されるように、出射されるパルスレーザ光Ｌの光束形およびビームダイバージェンスを調節するビームエキスパンダである。
【００２９】
ここで、試料Ａにおける２光子励起効果や３光子励起効果などの多光子励起効果を得られる確率は、励起したい所望の位置における光子の空間的、時間的な密度が高いほど確率が高くなる。そこで、光子の時間的な密度を高くする手段として、励起光源には瞬間的な光子密度が非常に高いパルス時間幅が１００ｆｓ程度の極短パルスレーザを射出するレーザ光源２を用いている。
【００３０】
また、光子の空間的な密度を高くするためには、試料Ａに入射する励起光を対物レンズ８により微小領域に集光させることで実現している。集光点での光の密度を高くするには、できるだけ小さな点に集光する必要がある。パルスレーザ光Ｌは、対物レンズ８に入射する光束径が対物レンズ８の瞳径と同じときに、最も小さく集光することができる。
【００３１】
一方、励起光として用いる超短パルスレーザ光は、非常に狭い波長スペクトル幅を持つ一般的なレーザ光源と異なり、ある程度広い波長スペクトルを持つ。ここで、光が屈折率媒体を通過する際の速度は、その光の波長に依存し、長波長の光ほど速く、短波長の光ほど遅く進む。そのため、パルスレーザ光Ｌが光源から試料Ａまでに存在する光学素子を通過する際に、このパルスに含まれる短波長の成分は長波長の成分に比べて時間的に遅れが生じる。以降では、この遅れを群速度分散と呼ぶ。
【００３２】
この群速度分散の影響で、光源ではパルス幅が１００ｆｓ程度であった光が、試料Ａのところでは２００ｆｓ以上のパルス幅に広がってしまう。パルスの時間幅が広がると、光子の時間的な密度は小さくなるので、多光子励起効果の励起効率は低下してしまう。そこで、予め長波長の成分が短波長の成分より時間的に遅れた状態に調節しておけば、光学素子を通過した際の群速度分散で、試料Ａの点においてはちょうど短波長成分と長波長成分が時間的に一致し、狭いパルス幅をもつパルス光を試料Ａに照射することが可能となる。
【００３３】
分散補償光学系１７は、レーザ光源２から入射されてくるパルスレーザ光Ｌを通過させることにより負の群速度分散を付与し、パルスレーザ光Ｌのパルス時間幅を調節するようになっている。分散補正光学系１７は、図２に示されるように、２つのプリズム２２、２３と、ミラー２４により構成されており、２つのプリズム間隔を変化させることで、パルスレーザ光Ｌに与える群速度分散を調節できるようになっている。
【００３４】
具体的には、分散補正光学系１７は、パルスレーザ光Ｌに対して、レーザ光源２から試料Ａまでの光学系で生じる群速度分散と同じだけ、逆方向に群速度分散を予め与える。これにより、試料Ａにおいてパルスレーザ光Ｌのパルス幅が広がってしまうことを防止し、光子の時間的密度を高くすることができる。
【００３５】
分散補正光学系１７は、試料Ａや対物レンズ等の光学系の変更を図示しない入力装置（調整指示手段）により入力することで動作する。また、試料Ａや対物レンズ等の光学系の変更をセンサ等により検出し、その検出結果に基づいて分散補正光学系１７を動作させることとしてもよい。
【００３６】
上記のように構成された分散補正光学系１７の作用について、図３（ａ）および図３（ｂ）を用いて説明する。
プリズム２２に入射したパルス光Ｌは、波長ごとに分散し、その後プリズム２３に入射する。プリズム２３では、パルス光Ｌのうち長波長成分（図において鎖線で表記）が通過する光路長が、短波長成分（図において実線で表記）が通過する光路長よりも長くなる。プリズム２３を出たパルス光はミラー２４で反射し、同じ光路を戻る。
【００３７】
ここで、屈折率の高い媒体中では、光の速度は空気中よりも遅くなるので、プリズム２３を通過するときに長波長が通過する光路長が、短波長が通過する光路長より長くなる。したがって、分散補正光学系１７を動作させることにより、長波長成分を時間的に予め遅らせたパルスレーザ光を生成することが可能となる。
【００３８】
ここで、図３（ａ）のように、２つのプリズム間隔が小さい場合には、プリズム２３をパルス光が通過する際の、長波長成分が通過する光路長と短波長成分が通過する光路長との差が少ない。一方、図３（ｂ）のように、２つのプリズム間隔が大きい場合には、プリズム２３を通過する際の長波長成分が通過する光路長と短波長成分が通過する光路長との差が大きい。このように、プリズム間隔を調節することで、パルス光Ｌに予め加える分散補正量を調節することができる。
【００３９】
励起光として用いるパルスレーザ光Ｌの波長と、レーザ光源２から試料Ａまでの光学素子の構成によって、調節する分散補正量は異なるが、このようにプリズム間隔を調節することで、試料Ａでのパルス幅の広がりがなくなる様に調節して、多光子励起効果の励起効率を上げることが可能である。なお、プリズム間隔を変えた場合には、パルスレーザ光Ｌの光軸も動くので、元と同じ光軸になるようにプリズム２２，２３とミラー２４を図２に示す矢印のように揺動させて、それらの角度を調節する必要がある。
【００４０】
上記のように分散量補正されたパルスレーザ光Ｌは、顕微鏡本体３に入射して、ガルバノミラー５によって２次元的に走査され、あるいは、所定の照射位置に位置決めされる。そして、パルスレーザ光Ｌは、瞳投影レンズ６、結像レンズ７および対物レンズ８を介して、試料Ａの所定の照射位置に集光される。このように試料Ａに集光させたパルスレーザ光Ｌのビームウエスト位置において、多光子励起効果が発生する。
【００４１】
多光子励起効果には、２つの光子を同時に吸収することで励起されて蛍光を発する２光子励起蛍光や、３つの光子を同時に吸収することで励起されて蛍光を発する３光子励起蛍光や、あるいはｎ個（ｎ＞３）の光子を同時に吸収することで励起されて蛍光を発するｎ光子励起蛍光といった現象がふくまれ、これらを総じて多光子励起蛍光とよぶ。
【００４２】
試料Ａで発生した多光子励起蛍光Ｆは、対物レンズ８によって集光され、励起ダイクロイックミラー９によってパルスレーザ光Ｌから分岐させられて、ミラー１４、集光レンズ１０およびバリアフィルタ１１を透過した後に、蛍光分岐ダイクロイックミラー１２によって波長ごとに分岐させられて検出器１３ａ，１３ｂにより検出される。
【００４３】
ところで、多光子励起蛍光の蛍光波長は、パルスレーザ光Ｌの波長をλ、励起のために吸収した光子数をｎとすると、おおよそλ／ｎより若干長い波長となることが知られている。したがって、試料Ａから発生した多光子励起蛍光に、２光子励起蛍光と、３光子以上の光子の同時吸収で励起される蛍光が混じっている場合には、それぞれの蛍光の波長は異なるものとなる。
【００４４】
例えば、パルスレーザ光Ｌの波長を７２０ｎｍとして、試料Ａに適用した蛍光試薬を２光子励起で励起したときの２光子励起蛍光を観察する場合、試薬の種類にもよるが、その２光子励起蛍光の蛍光波長は４００ｎｍ〜５００ｎｍであることが多い。
【００４５】
一方で、試料Ａの細胞組織のある特定の分子自身が、パルスレーザ光Ｌの光子を３つ同時に吸収して励起状態となり、３光子励起蛍光を蛍光波長３００ｎｍ〜４００ｎｍで発生する自家蛍光が起こることがあることが知られている。このような３光子励起蛍光が起こることは、研究対象として関心が持たれている一方で、標本への意図しない変化やダメージともなっており、試料からの２光子励起蛍光だけを観察したいという目的においては、３光子励起蛍光は極力発生させないようにすることが好ましい。
【００４６】
この場合において、蛍光分岐ダイクロイックミラー１２に、２光子励起蛍光の波長は透過する一方、３光子励起蛍光の波長は反射する光学特性を持つものを用いることで、標本からの蛍光Ｆのうち、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光は励起分岐ダイクロイックミラー１２で分岐されて、それぞれ別々に２つの検出器１３ａ，１３ｂで検出し、２光子励起蛍光の蛍光強度と３光子励起蛍光の蛍光強度を独立して同時に測定することができる。
【００４７】
あるいは、スキャナ５によりパルスレーザＬを２次元的に走査すれば、２光子励起蛍光の蛍光画像と３光子励起蛍光の蛍光画像を別々に同時に取得することができる。
このようにすることで、標本からの２光子励起蛍光の観察をしながらも、本来意図していない３光子励起蛍光がどの程度発生しているかも測定することができる。
【００４８】
ここで、２光子励起効果の励起効率Ｉ２と３光子励起効果の励起効率Ｉ３は、それぞれ以下の式で表されることが分かっている。
Ｉ２＝Ｑσ２ＣＰａｖｅ２／ＦｐＴｐ・・・（１）
Ｉ３＝Ｑσ３ＣＰａｖｅ３／（ＦｐＴｐ）２・・・（２）
【００４９】
上記の式において、Ｑは標本に依存する発光の量子収率（％）、σ２は２光子の吸収断面積（cm4s2photon-1molecule-1）、σ３は３光子の吸収断面積（cm6s2photon-1molecule-1）、Ｃは標本に依存する分子数密度（molecule-3）、Ｐａｖｅはレーザ光および装置の透過率に依存するLaserのAverage Power、Ｆｐはレーザ光に依存するパルスの繰返し周波数（Ｈｚ）、Ｔｐはレーザ光、装置の分散量、分散補正量に依存するパルス幅（ｓｅｃ）を表している。
【００５０】
２光子励起効果の励起効率Ｉ２は、（１）式に示されるように、Average Powerの２乗に比例し、パルス幅に反比例する。一方、３光子励起効果の励起効率Ｉ３は、（２）式に示されるように、Average Powerの３乗に比例し、パルス幅の２乗に反比例する。
これによれば、２光子励起効果と３光子励起効果の励起効率は、ともに、励起パルス光のパルス幅Ｔｐが小さいほど効率がよく、また、励起パルス光の平均強度Ｐａｖｅが大きいほど効率がよく、また、励起パルス光の繰り返し周波数Ｆｐが小さいほど効率が良いことが分かる。
【００５１】
なお、一般的には、多光子励起蛍光を観察する場合には、パルス幅Ｔｐはその装置構成で可能な限り最小となるよう最適化した状態に調整して、励起効率が大きくなるようにして観察することが多い。パルス平均強度については、励起効率だけを見れば強い方がよいが、生体資料へのダメージを考慮すると弱い方が望ましいので、標本や観察の種類によりその設定は様々である。
【００５２】
これらパルス幅Ｔｐ、平均強度Ｐａｖｅ、繰り返し周波数Ｆｐを変化させたときの励起効率の変化の傾向は、２光子励起効果と３光子励起効果の場合では異なる。具体的には、パルス幅Ｔｐ、平均強度Ｐａｖｅ、繰り返し周波数ＦｐをそれぞれΔＴｐ、ΔＰａｖｅ、ΔＦｐだけ変化させたときの、２光子励起効率と３光子励起効率の変化量は以下のようになる。
【００５３】
ΔＴｐ・・・（２光子変化量：３光子変化量）＝（∝１／ΔＴｐ：∝１／ΔＴｐ２）
ΔＰａｖｅ・・・（２光子変化量：３光子変化量）＝（∝ΔＰａｖｅ２：∝ΔＰａｖｅ３）
ΔＦｐ・・・（２光子変化量：３光子変化量）＝（∝１／ΔＦｐ：∝１／ΔＦｐ２）
【００５４】
これによれば、例えば、パルス幅がその装置構成で可能な最小のパルス幅からΔＴｐだけ大きくなるようにした場合には、図４に示されるように、２光子励起効果の効率はΔＴｐに反比例して減衰するが、３光子励起効果の効率はΔＴｐ２に反比例して減衰することになり、同じ変化量に対して３光子励起効果の方が２光子励起効果よりも大きく減衰する。平均強度、繰り返し周波数についても同様で、２光子励起効果よりも３光子励起効果の方が同じ変化に対しても大きく変化する。
【００５５】
ここで、従来のレーザ顕微鏡におけるパルス幅の調整方法は、試料Ａに集光したパルスレーザ光Ｌのビームウエストにおけるパルス幅Ｔｐが極力小さくなるように調節するものであった。そのため、２光子励起効果の励起効率は最適化されるが、同時に３光子励起効果の励起効率も最適化してしまい、意図しない３光子励起効果も起こりやすくなっていた。
【００５６】
これに対して本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、分散補償光学系１７を動作させてパルス幅Ｔｐを広げる方向に変化させるか、あるいは、パルス光Ｌの平均強度Ｐａｖｅが小さくなるようにすることで、３光子励起効果の励起効率は２光子励起効果の励起効率よりも大きく減衰させることができる。ただし、パルス幅Ｔｐ、平均強度Ｐａｖｅのわずかな変化に対してこれらの励起効率は大きく変化するので、肝心の２光子励起効果の効率まで大きく減衰させてしまうことがないようにするためには、パルス幅Ｔｐ、平均強度Ｐａｖｅの調節は精度よく微調整できるものであることが好ましい。
【００５７】
３光子励起抑制のため、パルスレーザ光Ｌの平均強度Ｐａｖｅを落とす方法では、試料に入射するパルスレーザＬの絶対的な光子数が減少することになり、試料の不透明性のため試料深部まで到達する光子数も試料表面から深部へ行くほど減少してしまい、結果として、２光子励起観察のメリットである試料深部での観察精度も低下してしまうことになる。
【００５８】
一方で、パルス幅Ｔｐを広げる方法では、試料に入射するパルスレーザＬの絶対的な光子数は変えずに、時間的な光子密度のみを変化させているので、２光子励起可能な深部到達性は損ねることがない。よって、３光子励起効果抑制のためには、平均強度Ｐａｖｅを下げる調節よりも、パルス幅Ｔｐを広げる調節を行うほうが好ましい。
【００５９】
したがって、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１では、パルス幅Ｔｐを分散補正光学系１７により調節して、３光子励起効果の発生を抑制させる方法を取ることにする。つまり、パルスレーザ光Ｌの波長ごとに最適に調節されたプリズム２２、２３間の距離間隔を、その最適状態から意図的に間隔を変化させる調節をすることで、パルス幅Ｔｐを連続的に少しずつ広げることができる。
【００６０】
具体的には、分散補正光学系１７は、図示しない入力装置によりパルスレーザ光Ｌのパルス幅Ｔｐの調整が指示された場合に、パルスレーザ光Ｌのパルス幅Ｔｐを、検出器１３ａ，１３ｂにより検出される蛍光の強度が最大となる最小パルス幅よりも大きく設定する。
【００６１】
このようにしてパルス幅Ｔｐを広げることにより、試料Ａで発生している３光子励起効果は２光子励起効果よりも大きく減衰する。結果として、測定すべき試料Ａでの２光子励起蛍光も減衰してしまうが、意図しない３光子励起蛍光の発生は２光子励起蛍光よりもさらに大きく減衰させることができる。
【００６２】
上記のパルス幅Ｔｐの調節方法について、図５（ａ）から図５（ｃ）に示す具体例を用いて説明する。各図において、横軸はパルスレーザ光Ｌのパルス幅、縦軸は検出器１３ａ，１３ｂにより検出された２光子励起蛍光と３光子励起蛍光の強度を表している。
図５（ａ）は２光子励起蛍光の強度が３光子励起蛍光の強度よりも大きい場合、図５（ｂ）は２光子励起蛍光の強度が３光子励起蛍光の強度よりも小さい場合を示している。図５（ｃ）は、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光のそれぞれの最大強度を１として規格化した場合を示している。
【００６３】
図５（ｃ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を広げることにより、３光子励起蛍光は２光子励起蛍光よりも大きく減衰する。
したがって、分散補正光学系１７は、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を変化させて、３光子励起蛍光の強度の変化率の絶対値、すなわち、３光子励起蛍光の強度を示す二次関数の接線の傾きの絶対値が、所定の閾値以下となるようにパルスレーザ光Ｌのパルス幅を調整する。
【００６４】
具体的には、例えば、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を、検出器１３ａまたは検出器１３ｂにより検出された蛍光が最大となる最小パルス幅の２倍から３倍となるように設定することで、３光子励起蛍光の強度が急激に上昇しないようにパルスレーザ光Ｌのパルス幅を調整することができ、３光子励起蛍光による試料Ａへのダメージを抑制することが可能となる。
【００６５】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、２光子励起蛍光と同時に３光子励起蛍光の蛍光強度も測定できるので、２光子励起蛍光の蛍光強度を測定しながら、その強度が観察に十分な強度を保った範囲内で、上記のパルス幅を広げる調節を行うことできる。これにより、２光子励起蛍光の観察を行いながら、３光子励起蛍光の発生は極力抑制することができ、３光子励起蛍光による試料Ａへのダメージを抑制しつつ、２光子励起蛍光による試料Ａの観察を精度良く行うことが可能となる。また、実際に３光子励起蛍光がどの程度抑制されたかを確認することができる。
【００６６】
また、観察の種類や試料の種類によって、２光子励起蛍光の蛍光強度の必要量や、３光子励起蛍光をどの程度抑制する必要があるかは変わってくるが、本実施形態では、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光をそれぞれ測定しながら、それぞれの励起効率のバランスが最適になるようにパルス幅を調節することも可能である。
【００６７】
また、このように２光子励起蛍光と３光子励起蛍光の励起バランスを調整したパルスレーザ光Ｌを用いて、例えば、試料Ａに適用した試薬を２光子励起により開放する２光子励起刺激を行えば、３光子励起効果の影響を抑制した状態において、２光子励起刺激を行うことも可能である。
【００６８】
また、２つの検出器１３ａ，１３ｂを備えることで、試料Ａにおいて発生した２光子励起蛍光と３光子励起蛍光とを別個に且つ同時に検出することができ、分散補正光学系１７によるパルスレーザ光Ｌのパルス幅の調整時間を短縮して試料Ａへのダメージを低減することができる。
【００６９】
なお、分散補正光学系１７を操作する操作部（図示略）と、検出器１３ａ，１３ｂにより検出された２光子励起蛍光および３光子励起蛍光からそれぞれの画像を生成する画像生成部（図示略）と、生成された画像を表示する表示部（図示略）とを備えることとしてもよい。このようにすることで、表示部に表示された２光子励起蛍光の画像および３光子励起蛍光の画像を確認しながら、操作部により分散補正光学系１７を操作することができ、各画像が所望の強度となるようにパルスレーザ光Ｌのパルス幅の調整を行うことが可能となる。
【００７０】
また、図５（ａ）から図５（ｃ）に示す具体例において、分散補正光学系１７は、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を変化させて、２光子励起蛍光の強度の変化率の絶対値、すなわち、２光子励起蛍光の強度を示す二次関数の接線の傾きの絶対値が所定の閾値以上となるように、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を調整することとしてもよい。
このようにすることで、分散補正光学系１７により、２光子励起蛍光の強度を飛躍的に向上させるようにパルスレーザ光Ｌのパルス幅を調整することができ、２光子励起蛍光による観察精度を向上することが可能となる。
【００７１】
また、図５（ａ）から図５（ｃ）に示す具体例において、分散補正光学系１７は、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を変化させて、２光子励起蛍光の強度に対する３光子励起蛍光の強度の比率が所定の閾値以下となるように、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を調整することとしてもよい。
このようにすることで、分散補正光学系１７により２光子励起蛍光の強度と３光子励起蛍光の強度とのバランスに基づいてパルスレーザ光Ｌのパルス幅を調整することができ、観察に適した２光子励起蛍光の強度を確保しつつ、３光子励起蛍光の上昇を抑制することができる。これにより、３光子励起蛍光による試料Ａへのダメージを抑制しつつ、２光子励起蛍光による試料Ａの観察を精度良く行うことが可能となる。
【００７２】
〔第１の変形例〕
以下に、本実施形態の第１の変形例について図６を参照して説明する。
本実施形態の第１の変形例に係るレーザ顕微鏡は、図１の構成に加えて、図６に示されるように、演算装置１０１とメモリ１０２とを備えている。具体的には、演算装置（調整指示手段）１０１から分散補正光学系１７の調整を制御しながら、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光の強度変化を演算装置１０１で測定し、パルス幅Ｔｐの変化量に対する２光子励起蛍光と３光子励起蛍光のそれぞれの検出強度変化を関連づけてメモリ１０２に記録する。なお、このとき、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光の検出強度は、それぞれが最大強度となる値を１とするよう規格化した値としてメモリに格納する。
【００７３】
このようにして、メモリ１０２内に、パルス幅の調整量に対する２光子および３光子の蛍光検出強度を関連付けたテーブルを構築する。そして、次回からは逆に、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光の検出強度が、最大強度を１と規格化した値に対して所定の範囲の値になるように分散補正光学系１７を制御する。
【００７４】
具体的には、例えば、２光子励起蛍光は０．８以上、且つ、３光子励起蛍光は０．５以下と演算装置１０１に設定すると、演算装置１０１はメモリ１０２に格納されたテーブルから対応するパルス幅調整量を読み出し、分散補正光学系１７を動作させて読み出したパルス幅調整量となるように、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を制御する。
【００７５】
このようにすることで、３光子励起蛍光はなるべく抑制しながらも、２光子励起蛍光はできるだけ減衰させない状態で２光子励起蛍光観察を行いたいという目的に対し、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光の強度のバランスが所望のバランスになるように設定すれば、自動でそれが実現するように励起パルスのパルス幅を制御することが可能となる。
【００７６】
〔第２の変形例〕
上記の本実施形態ではパルス幅の調節方法として、分散補正光学系１７のプリズム間隔を調節する方法を採用したが、これに代えて、図７に示されるように、レーザ光源２とビーム整形光学系２０の間の光軸上に、例えばクサビ形のガラス板を２枚合わせた様な分散調節系２６を設置し、この２枚の重なり具合を図７に示す矢印のように調節することとしてもよい。
【００７７】
このようにすることで、パルスレーザ光Ｌがこれらのガラス板を通過する光路長ｄを変化させ、パルスレーザ光Ｌに意図的に群速度分散を与え、パルス幅が広がるように調節を行うことができる。これにより、ガラス板を通過する光路長ｄが長いほど、群速度分散の影響が大きくなりパルス幅を広くすることができる。
【００７８】
この場合、分散補正光学系１７のプリズム間隔を調節する方法では、プリズム間隔に加えプリズムの角度も調節する必要があるのに対し、ガラス板の重なり位置を調節するだけなので、調節が簡易である利点がある。また、分散補正光学系１７がない装置構成であっても、パルス幅の調節を行うことが可能である。
【００７９】
〔第３の変形例〕
また、３光子励起効果の発生を抑制させる方法として、パルスの平均強度を調節する方法を用いてもよい。これは、例えば、レーザ光源２と顕微鏡本体３の間のパルスレーザ光Ｌの光軸上に、ＮＤフィルタを設置することで実現できる。この方法では、ＮＤフィルタの透過率の調節により簡単に３光子励起効果の効率を調節できる。
【００８０】
〔第４の変形例〕
また、図８に示すように、３光子励起蛍光を検出する検出器２９を、試料Ａの透過側に別に設けてもよい。具体的には、試料Ａを透過したパルスレーザ光Ｌと、試料からの蛍光の混合した光をバリアフィルタ２７に通して、３光子励起蛍光の波長だけを透過させる。この３光子励起蛍光を集光レンズ２８により集光して検出器２９により検出する。
【００８１】
このような構成にすることで、試料Ａと３光子励起蛍光を検出する検出器との間の光学素子の数を少なくすることができる。また、試料Ａに近いところに検出器を設置することができる。これにより、もともと微弱な３光子励起蛍光の光学素子を透過する際のロスや、光学素子でのケラレ等による光量の低下を防止して、３光子励起蛍光の検出効率を向上することができる。
【００８２】
また、今までの例では、検出器１３ａ，１３ｂの一方は３光子励起蛍光検出ができるように、蛍光ダイクロイックミラー１２は２光子励起蛍光と３光子励起蛍光を分離する波長特性のものが設置されている。したがって、例えば光検出器１３ａ，１３ｂの両方を使って２Ｃｈの２光子励起蛍光観察を行いたい場合は、その都度、励起ダイクロイックミラー１２を所望の波長特性を持つものに入れ替える必要があった。しかし、３光子励起蛍光は透過側の検出器２９で行えば、検出器１３ａ，１３ｂの両方を２光子励起蛍光の観察に使えるため、励起ダイクロイックミラー１２を最初から２光子励起観察用のものを設置しておくことで交換の手間がなくなる利点もある。
【００８３】
〔第５の変形例〕
また、試料Ａに２光子励起蛍光を発生させる蛍光試薬のほかに、３光子励起蛍光を発生しやすい試薬を用いることで、意図的に３光子励起蛍光を誘導し、もともと微弱で検出しにくい３光子励起蛍光の励起効率を向上させ、３光子励起効果の効率の調整を行いやすくする方法をとってもよい。
【００８４】
〔第６の変形例〕
また、励起ダイクロイックミラー１２をなくして、検出器１３ａ（または検出器１３ｂ）のみを設けることとしてもよい。この場合には、バリアフィルタ１５を３光子励起蛍光波長のみ透過する特性のものを用いて３光子励起効果の励起効率調節を行った後、２光子励起蛍光波長のみを透過する特性のものと交換し、検出器１３で２光子励起蛍光の観察を行う。このような構成とすることで、必要な検出器や光学素子が少なくて済むという利点がある。
【００８５】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡について図９を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１が第１の実施形態と異なる点は、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光とが合成された蛍光を単一の検出器で検出する点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡１について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００８６】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図９に示されるように、図１の検出器１３ａ，１３ｂに代えて、単一の検出器１３を備えている。バリアフィルタ１５は２光子励起蛍光および３光子励起蛍光を透過して、検出器１３によりそれらの蛍光を分離せずに検出するようになっている。
【００８７】
ここで、前述のように、パルスレーザ光Ｌの特性を変化させたとき、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光の励起効率の変化の傾向は異なる。
例えば、パルス幅Ｔｐを変化させた場合は、パルス幅の変化に対して２光子励起蛍光は反比例で変化するが、３光子励起蛍光はパルス幅の２乗に反比例して変化する。よって、これら２光子励起蛍光と３光子励起蛍光を混合した状態で検出すると、その検出強度は反比例な変化と２乗の反比例な変化とが足し合わされたものとして検出される。
【００８８】
したがって、パルス幅を分散補正光学系１７のプリズム間隔を変えて変化させたとき、検出器１３により検出した光が、仮に２光子励起蛍光が３光子励起蛍光よりも圧倒的に支配的であれば、その検出強度はパルス幅の反比例で変化する。一方、検出器１３により検出した光に、３光子励起蛍光がある程度混在している場合には、その検出強度はパルス幅の反比例とパルス幅の２乗の反比例とが足し合わされたものとして変化する。
【００８９】
また、平均強度Ｐａｖｅを変化させた場合は、平均強度の変化に対して２光子励起蛍光は２次関数的に変化するが、３光子励起蛍光は３次関数的に変化する。よって、仮に２光子励起蛍光が３光子励起蛍光よりも圧倒的に支配的であれば、その検出強度は平均強度の変化に対して、２次関数的に変化し、３光子励起蛍光がある程度混在している場合には、その検出強度は２次関数と３次関数との足し合わせで変化する。
【００９０】
このような検出強度の変化の傾向を利用して、図１０に示されるように、検出器１３の検出強度をパルス特性の変化量の関数として観測すれば、試料Ａにおいて２光子励起蛍光の蛍光に対して３光子励起蛍光が非常に小さい状態であるか、あるいは、３光子励起蛍光もある程度の強度を有している状態であるかを判断することができる。ここで、図１０は、パルス幅に対する２光子励起蛍光および３光子励起蛍光の検出強度の変化とフィッティング曲線とを示している。
【００９１】
パルス幅を変化させた場合には、検出強度の変化が反比例であるか、反比例と２乗の反比例の足し合わせであるか判定すればよい。一方、平均強度を変化させた場合は、検出強度が２次関数的に変化するか、２次関数と３次関数との足し合わせで変化するかを判断すればよいが、前述の第１の実施形態でも述べたように、標本深部への観察という特徴を犠牲にしないためには、パルス幅を変化させるほうが好ましい。よって、本実施形態においてもパルス幅を調節することとする。
【００９２】
このように、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光を同一検出器で同時に測定しながら、パルス幅の変化量に対する蛍光検出強度の変化をプロットし、その変化がパルス幅の変化に対し線形に変化する領域であれば、３光子励起蛍光は２光子励起蛍光と比較して無視できるほど小さいことになる。よって、パルス幅変化に対し、検出器１３の検出強度が線形に変化する領域と非線形に変化する領域の境界点になるようパルス幅を調節すれば、２光子励起蛍光の励起効率は極力確保した状態で、３光子励起蛍光の発生は抑制した状態とすることができる。
【００９３】
具体的には、分散補正光学系１７のプリズム間隔を、例えば、電動ステージ等で調節し、このステージの動作量の情報を外部の演算装置３０に入力する。また、検出器１３で検出した２光子励起蛍光＋３光子励起蛍光の検出強度も演算装置３０に入力する。演算装置３０は、入力されたステージの動作量に対し、検出器１３の検出強度を記憶する。このようにすることで、２光子励起蛍光＋３光子励起蛍光の強度を、パルスレーザ光Ｌのパルス幅を変数とする関数として扱うことができる。
【００９４】
このときに、パルス幅の変化に対して蛍光強度が線形に変化する領域と、非線形に変化する領域の境界点を演算により算出し、そのときのパルス幅となるよう分散補正光学系１７のプリズム間隔を制御して調節すれば、２光子励起蛍光の強度はなるべく確保したまま、３光子励起蛍光の発生は抑制した状態にすることができる。この状態にした後、バリアフィルタ１５を２光子励起蛍光だけ透過するものに交換すれば、検出器１３で試料Ａからの２光子励起蛍光の観察を、３光子励起蛍光の発生を抑制した状態で行うことができる。
【００９５】
なお、現実的には、図１０に示されるように、２光子励起蛍光および３光子励起蛍光の検出強度とフィッティング曲線とが離れる位置（境界点）を特定するのは難しい場合がある。この場合には、２光子励起蛍光および３光子励起蛍光の検出強度とフィッティング曲線がある閾値以上離れたところを境界と見なすような処理をしても良い。
【００９６】
〔第１の変形例〕
本実施形態の第１の変形例を以下に説明する。
なお、本実施形態ではバリアフィルタ１５に、２光子励起蛍光と３光子励起蛍光とを透過するものを用いたが、これに代えて、２光子励起蛍光だけを透過する挿脱可能なバリアフィルタとして、２光子励起蛍光の強度のみを検出することとしてもよい。
【００９７】
３光子励起蛍光の強度は非常に小さいので、パルス幅を変化させたときの２光子励起蛍光の強度の変化と、バリアフィルタ１５を用いた２光子励起蛍光＋３光子励起蛍光の強度の変化を比較することで、その差分から、３光子励起蛍光が強くなり始めるパルス幅の調節値を検出しやすくすることができる。
【００９８】
〔第２の変形例〕
また、パルス幅を変化させるために、分散補正光学系１７のプリズム間隔を調節する代わりに、図６のようなクサビ形のガラス板を合わせたものを、パルス光源２とビーム整形光学系２０の間の光軸上に設置し、ガラス板の重なり具合を調節することで、パルスに与える分散量を変化させる方法でパルス幅を調節する方法をとってもよい。この場合には、パルス幅の調節が簡易な点に加え、分散補正光学系１７が存在しない構成においても３光子励起蛍光の励起効率の調節が可能である。
【００９９】
〔第３の変形例〕
また、３光子励起蛍光の効率を抑制するために、パルス幅を変化させる代わりに、パルスの平均強度を変化させ、そのときの２光子励起蛍光＋３光子励起蛍光の変化の傾向が２次関数的か、あるいは、２次関数と３次関数とが足しあわされたものかを判定し、３光子励起蛍光が抑制された状態になるよう調節する方法をとってもよい。
【０１００】
〔第４の変形例〕
また、試料Ａに３光子励起蛍光を発生しやすい試薬を適用することで、３光子励起蛍光を検出しやすくする方法をとってもよい。この方法では、もともと微弱な３光子励起蛍光の検出精度を向上させることで、３光子励起蛍光が抑制されるようなパルスの調整を行いやすくなるという利点がある。
【符号の説明】
【０１０１】
Ａ  試料
１  レーザ顕微鏡
２  レーザ光源
３  蛍光顕微鏡本体
４  導入光学系
５  ガルバノミラー
８  対物レンズ
９  励起ダイクロイックミラー（分岐手段）
１２  蛍光分岐ダイクロイックミラー
１３，１３ａ，１３ｂ  検出器（検出手段）
１７  分散補償光学系（パルス幅調整手段）
１８  アライメント調節装置
１９  音響光学装置
２０  ビーム整形光学系
２１  顕微鏡入射補正装置
２６  分散調節系
２９  検出器（検出手段）
３０  演算装置
１０１  演算装置
１０２  メモリ
【図１】
2010160264.tif 000003
【図２】
2010160264.tif 000004
【図３】
2010160264.tif 000005
【図４】
2010160264.tif 000006
【図５】
2010160264.tif 000007
【図６】
2010160264.tif 000008
【図７】
2010160264.tif 000009
【図８】
2010160264.tif 000010
【図９】
2010160264.tif 000011
【図１０】
2010160264.tif 000012