(57)【要約】【課題】耐熱性２本鎖特異的核酸分解酵素（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ；  ＤＳＮ）および該ＤＳＮを用いた核酸の切断方法を提供する。【解決手段】カニ下目（Ｂｒａｃｈｙｕｒａ）由来の２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組み換えベクター並びに該ベクターを含む形質転換体および形質導入体。該形質転換体または形質導入体を培地で培養し、培養物から２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質の製造方法。該２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を用いる核酸の切断方法および該ＤＳＮを用いるＲＮＡ検出方法、並びに前記方法に用いる試薬キット。【選択図】図５
2010081934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）の耐熱性を有する、請求項１に記載のタンパク質； 
（ａ）少なくとも約２０℃から６３℃までの範囲で２本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性、
（ｂ）６０℃で３０分間の加熱の後に、少なくとも加熱前の約８０％の２本鎖特異的核酸分解酵素活性を保持することのできる耐熱性。
【請求項３】
約５５℃から６３℃までの範囲で２本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が４２，０００〜４６，０００で、かつ等電点が４．４である請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。  
【請求項５】
Ｍｇ２＋イオンまたはＭｎ２＋イオン存在下において２本鎖特異的核酸分解酵素活性を示し、Ｃａ２＋イオンには非感受性である請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
カニ下目（Ｂｒａｃｈｙｕｒａ）に属する生物由来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
キオノエセテス（Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ）属の肝膵臓由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
キオノエセテス  オピリオ（Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ）由来である請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子；
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の遺伝子を含む組換え体ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え体ベクターを含む形質転換体または形質導入体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換体または形質導入体を培地で培養し、培養物から２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
昆虫細胞内で２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を発現させることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１３若しくは１４に記載の方法によって製造された２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を用いる核酸の切断方法。
【請求項１６】
１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡが共存する系で、１本鎖ＤＮＡよりも２本鎖ＤＮＡを優先的に分解する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解する請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
２本鎖特異的な核酸の切断方法であって、５０℃以上の条件下で反応させる請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
６０℃以上の条件下で反応させる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むＲＮＡ検出方法。
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程、
（ｉｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１０若しくは１１に記載の方法によって製造された２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質で、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
【請求項２１】
特定のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを検出するＲＮＡ検出方法であって、前記工程（ｉ）において検出対象とするＲＮＡおよび該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するプローブＤＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１３若しくは１４に記載の方法によって製造された２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質のうち少なくとも１つを含む試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性２本鎖特異的核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ：以下、ＤＳＮとも記載する）および該酵素の遺伝子に関する。また組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造することができる新規な耐熱性ＤＳＮ、および該ＤＳＮの製造方法に関する。またＢｒａｃｈｙｕｒａ（カニ下目）に属する生物由来、より詳しくはＭａｊｉｄａｅ（クモガニ科）の生物由来、またより詳しくはＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ（ズワイガニ）属由来の新規な耐熱性ＤＳＮに関する。また該ＤＳＮを用いる核酸の切断方法および該ＤＳＮを用いるＲＮＡ検出方法、並びに前記方法に用いる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでいくつかの甲殻類、特にエビおよびカニなどのＤｅｃａｐｏｄａ（十脚目）の消化腺または肝膵臓中に、ＤＮａｓｅ（ＤＮＡ分解酵素）活性を示すヌクレアーゼが見出されている。その中で、タラバガニ肝膵臓由来のヌクレアーゼは、２本鎖核酸に高度に特異的なＤＮａｓｅ活性を示す特徴的な酵素であることが明らかになり、本酵素は２本鎖特異的ヌクレアーゼ（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ；ＤＳＮ）と呼ばれた。
【０００３】
１．Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ  ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
エビおよびカニなどのＤｅｃａｐｏｄａ（十脚目）由来のヌクレアーゼは、最初にクダヒゲエビ科のＳｏｌｅｎｏｃｅｒａ  ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）から肝膵臓由来ＤＮａｓｅとして精製された（非特許文献１)。ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは、ウシ肝膵臓由来ＤＮａｓｅよりも大きな分子量（約４４ｋＤａ）を持っていた。ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは糖鎖を持たないことが確認され、その分子量が大きいのはポリペプチド鎖が長いためであると考えられた。ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは、金属イオン要求性と至適活性ｐＨはウシ膵臓由来ＤＮａｓｅとよく似ており、ＲＮａｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）活性は示さなかった。またナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは、トリプシン消化に対する耐性を持つことが示された。アミノ酸組成の解析結果から、ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは３６のＣｙｓ残基による１８のジスルフィド結合によって高度に分子内架橋されていることが示された。
【０００４】
２．Ｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
クルマエビ科Ｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）の肝膵臓からも同様な分子量のヌクレアーゼが精製され（非特許文献２）、またそのｃＤＮＡ配列が明らかにされた（非特許文献３）。クルマエビヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅ活性に加えて、低いレベルのＲＮａｓｅ活性を示した。アミノ酸配列の相同性から、クルマエビヌクレアーゼは、ウシＤＮＡ分解酵素Ｉ様タンパク質（ｂｏｖｉｎｅ  ＤＮａｓｅ−Ｉ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）よりむしろ霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼに代表されるＤＮＡ／ＲＮＡ非特異的エンドヌクレアーゼ（ＤＲＮＳＮ）のファミリーに属することが示された。クルマエビヌクレアーゼのアミノ酸配列は、４０２アミノ酸残基あり、３８１残基の成熟酵素と２１残基の推定シグナルペプチドから成る。クルマエビヌクレアーゼは、１１のＣｙｓ残基を持っており、それらのうちの１０のＣｙｓ残基が５つの分子内ジスルフィド結合を形成し、残る１つのＣｙｓ残基は、分子量５００〜７００Ｄａと推定されるチオール化合物に結合していた。Ｗａｎｇらは大腸菌中でクローンしたヌクレアーゼ遺伝子を発現させたが、発現したタンパク質はヌクレアーゼ活性を示さなかった（非特許文献３）。
【０００５】
３．Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
ヤドカリ下目、タラバガニ科Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）の肝膵臓からも同様な分子量のヌクレアーゼが精製され（非特許文献４）、またそのｃＤＮＡ配列が明らかにされた（非特許文献５）。タラバガニヌクレアーゼのアミノ酸配列は、４０７アミノ酸残基あり、３８０残基の成熟酵素と２７残基の推定シグナルペプチドから成り、クルマエビヌクレアーゼの配列と６４％の同一性を有していた。
タラバガニヌクレアーゼ配列もまたＤＲＮＳＮに共通するＮＵＣドメインを有していたが、精製酵素のキャラクタリゼーションの結果、驚くべきことに、タラバガニヌクレアーゼは２本鎖ＤＮＡ基質に強い切断選択性を示し、１本鎖ＤＮＡにはほとんど活性を示さなかった。またタラバガニヌクレアーゼはＲＮＡ基質に対してほとんど切断活性を示さず、ＤＮＡ−ＲＮＡ  ハイブリッド二重鎖においては、その中のＤＮＡ分子のみを効率良く切断した。またミスマッチを含む短い２本鎖ＤＮＡに対してほとんど切断活性を示さなかった。ここにタラバガニヌクレアーゼの特徴的な基質特異性が明らかにされ、この酵素は“ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ”（ＤＳＮ）と呼ばれた（非特許文献５、非特許文献６）。
【０００６】
Ｓｈａｇｉｎらは、タラバガニＤＳＮのｃＤＮＡをクローンし、推定シグナルペプチドを除いた成熟タラバガニＤＳＮを、Ｎ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として大腸菌中で発現させたが、組換えタンパク質は酵素活性を有しなかった（非特許文献５）。Ａｎｉｓｉｍｏｖａらは、大腸菌内で組換えＤＳＮ分子が凝集した封入体から、変性、リフォールディングおよび活性化を含む一連の手順を通じて、可溶性で酵素活性を有する組換えタラバガニＤＳＮを精製することに成功している（非特許文献７）。また、本発明者らは以前に、タラバガニＤＳＮ遺伝子を単離し、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて、シグナルペプチド配列を有する該ＤＳＮ遺伝子から、組換えタラバガニＤＳＮの発現を行った。この結果、リフォールディングの必要のない可溶性の組換えタラバガニＤＳＮを発現および精製することに成功し、得られた組換えＤＳＮは天然由来のＤＳＮと同様の２本鎖特異的ヌクレアーゼ活性を示した（非特許文献８）。
【０００７】
４．Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ＤＳＮ
コエビ下目、タラバエビ科のＰａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）の消化腺から精製されたヌクレアーゼもまた２本鎖ＤＮＡ基質に対する切断選択性を有し、１本鎖ＤＮＡはほとんど分解しないことが示された（特許文献１）。このホッコクアカエビＤＳＮは、耐熱性を有するタラバガニＤＳＮとは対照的に、至適活性温度が２５℃であり、７０℃、３０分間または９４℃、２分間の加熱で失活する易熱性の酵素である。
この易熱性を利用したホッコクアカエビＤＳＮの用途として、ＰＣＲ産物のキャリーオーバーコンタミネーションの除去方法が開示されている（特許文献１）が、ホッコクアカエビＤＳＮのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は開示されていない。
【０００８】
５．その他のＤＳＮホモログ
タラバガニＤＳＮのアミノ酸配列と相同性のあるＤＳＮホモログが、いくつかのＤｅｃａｐｏｄａで見つかっている。Ｍｏｌｔｈａｔｈｏｎｇらはクルマエビ科Ｐｅｎａｅｕｓ
ｍｏｎｏｄｏｎ（ブラックタイガーエビ）肝膵臓からＤＳＮホモログをコードするｃＤＮＡを単離した。その予測アミノ酸配列は、クルマエビヌクレアーゼの配列と８９％の同一性を有していた（非特許文献９）。その他のＤＳＮホモログ配列として、スナガニ科Ａｍｐｈｉｕｃａ  ｃｒａｓｓｉｐｅｓ（ベニシオマネキ）由来のｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＱ８６２５４０］およびＰａｌａｅｍｏｎｉｄａｅ  ｓｐ．（テナガエビ科の一種）由来のｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＱ８６２５３８］がＧｅｎＢａｎｋ配列データベース中に見出される。タラバガニＤＳＮとその他のＤＳＮホモログを、進化系統樹的な解析から新規なヌクレアーゼのファミリーとして分類する提案もなされた（非特許文献１０）。これらのＤＳＮホモログ配列は、いずれもタンパク質の単離および酵素活性についての報告はなく、実際にヌクレアーゼ活性を有するタンパク質として翻訳されているのか否か、また翻訳産物がタラバガニＤＳＮのような２本鎖特的な核酸切断活性を有するかどうか、さらには耐熱性を有するかどうかということは、現在のところ全く不明である。
【０００９】
総括すると、Ｄｅｃａｐｏｄａ由来のＤＳＮ、ＤＳＮ様ヌクレアーゼおよびＤＳＮホモログの中で、実際に２本鎖特異的ヌクレアーゼ活性が示されているのは、Ａｎｏｍｕｒａ（ヤドカリ下目）に属するタラバガニのＤＳＮおよびＣａｒｉｄｅａ（コエビ下目）に属するホッコクアカエビのＤＳＮの２種類だけである。前者は至適活性温度が６０℃前後で耐熱性があるのに対して、後者は至適活性温度が２５℃の易熱性の酵素である。Ｂｒａｃｈｙｕｒａ（カニ下目）に属する生物由来、例えばＭａｊｉｄａｅ（クモガニ科）の生物由来、例えばＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ属由来、例えばＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）由来の、２本鎖特異的ヌクレアーゼ活性を示すＤＳＮも、耐熱性を有するＤＳＮも、これまで一切開示されていなかった。
【００１０】
Ｄｅｃａｐｏｄａ以外では、例えば昆虫Ｃｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ（ネッタイイエカ）に２本鎖特異的ヌクレアーゼ活性を示す酵素が見出されているが（非特許文献１１）、該酵素に耐熱性は確認されておらず、またその発現はメス成虫の唾液腺のみに限定されているため、本酵素を天然から単離して産業的に利用することは困難であると考えられる。
【００１１】
すなわち、タラバガニ肝膵臓由来のヌクレアーゼのみが、唯一の産業利用可能な耐熱性のＤＳＮであった。タラバガニＤＳＮは、核酸分子の切断に特徴的な選択性を持つことと、耐熱性があり高温で活性を有するという特徴から、分子生物学分野における様々な応用が示されている。例えば、ＳＮＰ解析（非特許文献５、特許文献２）、ｃＤＮＡライブラリのノーマライゼーション（非特許文献１２）、サブストラクション法（非特許文献１３）およびテロメアの１本鎖オーバーハング長の解析（非特許文献１４）などが開示されている。しかしながら、市販されているタラバガニＤＳＮ酵素試薬は、天然からの精製品であり、非常に高価である。大腸菌で発現させた組換えタラバガニＤＳＮは菌体内に不活性な封入体として蓄積し、それは可溶化およびリフォールディング等のプロセスを経た後に活性型酵素として単離できるが（非特許文献７）、その手順は多段階にわたる煩雑なものである。
【００１２】
このような背景のもと、新規な耐熱性ＤＳＮ酵素が求められていた。また組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造することができる新規な耐熱性ＤＳＮ酵素が求められていた。またＢｒａｃｈｙｕｒａ（カニ下目）に属する生物由来、例えばＭａｊｉｄａｅ（クモガニ科）の生物由来、例えばＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ属由来の新規なＤＳＮ酵素が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ９９／０７８８７
【特許文献２】ＷＯ０３／０４８３７８
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｃｈｏｕ，Ｍ．Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ, １０３６，９５−１００（１９９０）
【非特許文献２】Ｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１２０９，２０９−２１４．（１９９４）
【非特許文献３】Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３４６  Ｐｔ  ３，７９９−８０４（２０００）
【非特許文献４】Мензорова，Н．И．ら，Биохимия.５８，６８１−６９１（１９９３）（Ｍｅｎｚｏｒｏｖａ，Ｎ．Ｉ．ら，Ｂｉｏｋｈｉｍｉａ，５８，６８１-６９１（１９９３））
【非特許文献５】Ｓｈａｇｉｎ，Ｄ．Ａ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，１２，１９３５−１９４２（２００２）
【非特許文献６】Ａｎｉｓｉｍｏｖａ，Ｖ．Ｅ．ら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，９，１４（２００８）
【非特許文献７】Ａｎｉｓｉｍｏｖａ，Ｖ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ），７１，５１３−５１９（２００６）
【非特許文献８】平川雄三、大磯勲：タラバガニ由来ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅの昆虫細胞−バキュロウイルス系による発現、第１１回マリンバイオテクノロジー学会大会、Ｐ４−１（２００８年５月２４〜２５日）
【非特許文献９】Ｍｏｌｔｈａｔｈｏｎｇ  Ｓら，Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２，６１７−６２７（２００７）
【非特許文献１０】Ａｎｉｓｉｍｏｖａ，Ｖ．Ｅ．ら，Ｇｅｎｅ，４１８，４１−８（２００８）
【非特許文献１１】Ｃａｌｖｏ，Ｅ．ら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ，２０９（Ｐｔ  １４），２６５１−９（２００６）
【非特許文献１２】Ｚｈｕｌｉｄｏｖ，Ｐ．Ａ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３２，ｅ３７（２００４）
【非特許文献１３】Ｐｅｎｇ，Ｒ．Ｈ．ら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３７２，１４８−１５５（２００８）.
【非特許文献１４】Ｚｈａｏ，Ｙ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３６，ｅ１４（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、新規な耐熱性２本鎖特異的ヌクレアーゼ（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｓｅ；ＤＳＮ）遺伝子および酵素を得ることを主たる課題とした。
また組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造することができる新規な耐熱性ＤＳＮを得ること、およびその製造方法を提供することを課題とした。またＢｒａｃｈｙｕｒａ（カニ下目）に属する生物由来、より詳しくはＭａｊｉｄａｅ（クモガニ科）の生物由来、またより詳しくはＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ属由来の新規なＤＳＮ酵素を得ることを課題とした。また新規な耐熱性ＤＳＮを用いる核酸の切断方法および該ＤＳＮを用いるＲＮＡ検出方法、並びに前記方法に用いる試薬キットを提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、カニ下目に属する生物の中で、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ属の一種、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）の肝膵臓中にＤＳＮ様ポリペプチド配列をコードしているｍＲＮＡが発現していることを見出し、ズワイガニ肝膵臓由来Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ中の、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを単離し、該遺伝子が実際にＤＳＮ活性を示すことのできるタンパク質をコードしていることを明らかにした。さらに当該タンパク質が耐熱性を有することを見出し、また当該タンパク質を組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造する方法を見出して、上記課題を解決しうる発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の＜１＞〜＜２２＞に関する。
＜１＞  以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質。
＜２＞  以下の（ａ）または（ｂ）の耐熱性を有する、＜１＞に記載のタンパク質； 
（ａ）少なくとも約２０℃から６３℃までの範囲で２本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性、
（ｂ）６０℃で３０分間の加熱の後に、少なくとも加熱前の約８０％の２本鎖特異的核酸分解酵素活性を保持することのできる耐熱性。
＜３＞  約５５℃から６３℃までの範囲で２本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する＜２＞に記載のタンパク質。
＜４＞  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が４２，０００〜４６，０００で、かつ等電点が４．４である＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のタンパク質。  
＜５＞  Ｍｇ２＋イオンまたはＭｎ２＋イオン存在下において２本鎖特異的核酸分解酵素活性を示し、Ｃａ２＋イオンには非感受性である＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
＜６＞  カニ下目（Ｂｒａｃｈｙｕｒａ）に属する生物由来である、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
＜７＞  キオノエセテス（Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ）属の肝膵臓由来である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
＜８＞  キオノエセテス  オピリオ（Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ）由来である＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
＜９＞  ＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜１０＞  以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子；
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１１＞  ＜９＞または＜１０＞に記載の遺伝子を含む組換え体ベクター。
＜１２＞  ＜１１＞に記載の組換え体ベクターを含む形質転換体または形質導入体。
＜１３＞  ＜１２＞に記載の形質転換体または形質導入体を培地で培養し、培養物から２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質の製造方法。
＜１４＞  昆虫細胞内で２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を発現させることを特徴とする＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞  ＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載のタンパク質または＜１３＞若しくは＜１４＞に記載の方法によって製造された２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を用いる核酸の切断方法。
＜１６＞  １本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡが共存する系で、１本鎖ＤＮＡよりも２本鎖ＤＮＡを優先的に分解する＜１５＞に記載の方法。
＜１７＞  ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解する＜１５＞に記載の方法。
＜１８＞  ２本鎖特異的な核酸の切断方法であって、５０℃以上の条件下で反応させる＜１５＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１９＞  ６０℃以上の条件下で反応させる＜１８＞に記載の方法。
＜２０＞  以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むＲＮＡ検出方法。
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程、
（ｉｉ）＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質または＜１０＞若しくは＜１１＞に記載の方法によって製造された２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質で、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
＜２１＞  特定のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを検出するＲＮＡ検出方法であって、前記工程（ｉ）において検出対象とするＲＮＡおよび該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するプローブＤＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる、＜２０＞に記載の方法。
＜２２＞  ＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載のタンパク質または＜１３＞若しくは＜１４＞に記載の方法によって製造された２本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質のうち少なくとも１つを含む試薬キット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、ＤＳＮ活性を有し、少なくとも約２０℃から６３℃までの範囲で高い活性を示し、好ましくは約５５℃から６３℃までの範囲で特に高い活性を示し、特に好ましくは約６０℃で至適活性を示すことのできる耐熱性、または６０℃で３０分間の加熱の後に、少なくとも加熱前の約８０％の活性を保持することのできる耐熱性、好ましくは約９０％の活性を保持することのできる耐熱性を有する新規なＤＳＮ（以下、本発明のＤＳＮとも記載する）、当該耐熱性ＤＳＮをコードする遺伝子、当該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、当該組換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体、および当該耐熱性ＤＳＮの製造方法が提供される。また本発明により、当該耐熱性ＤＳＮを用いる核酸の切断方法および該ＤＳＮを用いるＲＮＡ検出方法、並びに前記方法に用いる試薬キットが提供される。本発明の耐熱性ＤＳＮは、核酸分子の分析、検出、分解、合成および改変などを含む様々な検査技術、診断技術並びに遺伝子工学技術に利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ズワイガニＤＳＮ遺伝子の部分配列および全長配列のクローニングの概要を示した図である。
【図２】ズワイガニＤＳＮと、クルマエビＤＮａｓｅおよびタラバガニＤＳＮのアミノ酸配列の比較を示すマルチプルアライメントの図である。
【図３】ズワイガニＤＳＮの精製過程の各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図である。
【図４】ズワイガニＤＳＮの精製における、プロテイナーゼ  Ｋ処理および熱処理の効果を示した図である。
【図５】ズワイガニＤＳＮの２本鎖特異的核酸切断活性を示す図である。
【図６】ズワイガニＤＳＮの熱処理後の残存活性を示した図である。
【図７】ズワイガニＤＳＮの至適活性温度を示す図である。
【図８】ズワイガニＤＳＮの金属イオン要求性を示す図である。
【図９】ズワイガニＤＳＮの１本鎖ＤＮＡ分解に対する反応温度の影響を示す図である。
【図１０】２本鎖ＤＮＡ共存条件下におけるズワイガニＤＳＮの１本鎖ＤＮＡ分解に対する反応温度の影響を示す図である。
【図１１】ズワイガニＤＳＮのＲＮＡ分解活性を示す図である。
【図１２】ズワイガニＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解活性を示す図である。
【図１３】ズワイガニＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解を表す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明においてＤＳＮ（２本鎖特異的核酸分解酵素）とは、ＤＳＮ活性（２本鎖特異的核酸分解酵素活性）を示す能力を有する酵素のことをいい、該ＤＳＮ活性とは、２本鎖核酸中に存在するデオキシリボ核酸を優先的に切断または分解する活性のことをいう。該２本鎖核酸には、ＤＮＡ−ＤＮＡ２本鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖および部分的な１本鎖構造と部分的な２本鎖構造を有する核酸分子の中の２本鎖部分が含まれる。該部分的な１本鎖構造とは、例えば、塩基のミスマッチ、バルジ構造、ループ構造、フラップ構造および偽Ｙ構造（ｐｓｅｕｄｏ−Ｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）などが含まれる。
【００２１】
ＤＳＮ活性の１つの例は、１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡが共存する系で、１本鎖ＤＮＡよりも２本鎖ＤＮＡを優先的に分解する活性である。また別のＤＳＮ活性の１つの例は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解する活性である。また別のＤＳＮ活性の１つの例は、完全な塩基対を形成している２本鎖核酸およびミスマッチを含む２本鎖核酸が存在する系で、完全な塩基対を形成している２本鎖核酸部分を優先的に分解する活性である。
【００２２】
ＤＳＮ活性は、例えばＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）で測定可能である。また、ＤＳＮ活性は、例えば、核酸を基質として精製酵素を３７℃で３０分間反応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、基質のバンドの有無および濃淡を比較することによっても検出可能である。
【００２３】
本発明の耐熱性ＤＳＮは、少なくとも約２０℃から約６３℃の範囲で高い活性を示し、好ましくは約５５℃から約６３℃の範囲で特に高い活性を示し、特に好ましくは約６０℃で至適活性を示すことのできる耐熱性を有する。ここで、該活性とはＤＳＮ活性をいう。例えば、本願実施例で示されるウシ胸腺由来のＤＮＡを用いた活性測定方法により精製酵素の活性を測定した場合に、約２０℃から約６３℃の範囲で８００Ｕ／ｍｌ〜７３０００Ｕ／ｍｌのＤＮＡ分解活性を示すことが好ましく、約５５℃から約６３℃の範囲で４６０００Ｕ／ｍｌ〜７３０００Ｕ／ｍｌのＤＮＡ分解活性を示すことがより好ましく、約６０℃で６３０００Ｕ／ｍｌ〜７３０００Ｕ／ｍｌのＤＮＡ分解活性を示すことが特に好ましい。また本発明の酵素が有する耐熱性の別の側面は、少なくとも加熱前の約８０％の活性、好ましくは約９０％の活性を保持することのできる耐熱性である。
【００２４】
本発明の耐熱性ＤＳＮは、前記のごとく約５５℃から約６３℃の範囲で特に高い活性を示すことができるが、本明細書の実施例に具体例を示したように、たとえ低温（例えば２５℃）でも十分な活性を示すことができる。すなわち本発明の耐熱性ＤＳＮは、低温から高温（約６３℃）までの幅広い温度範囲で使用することができる。また６３℃より高い温度であっても、経時的な酵素の失活を問題としないような場合ならば、本酵素の活性が完全に消失しない範囲の高温（例えば８０℃を越えない温度であって、例えば７０℃）で使用することもできる。
【００２５】
本発明の耐熱性ＤＳＮは、Ｂｒａｃｈｙｕｒａ（カニ下目）に属する生物由来、より詳しくはＭａｊｉｄａｅ（クモガニ科）の生物由来、またより詳しくはＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ（キオノエセテス）属由来のＤＳＮである。Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ属由来のＤＳＮは、例えば、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ａｎｇｕｌａｔｕｓ（トゲズワイガニ）、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｂａｉｒｄｉ（オオズワイガニ）、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（ベニズワイガニ）、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）およびＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｔａｎｎｅｒｉ（ミゾズワイガニ）由来のＤＳＮが挙げられ、好ましくはＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓおよびＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ由来のＤＳＮが挙げられ、より好ましくはＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ由来のＤＳＮが挙げられる。なおＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏは日本標準和名のズワイガニの他に、別名「マツバガニ」および「エチゼンガニ」並びにその他の地域名で呼ばれることもある。
【００２６】
本発明の耐熱性ＤＳＮの好ましい形態の１つは、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ由来のＤＳＮのアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列を有するＤＳＮである。ここでＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ由来のＤＳＮのアミノ酸配列は、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列である。本発明の耐熱性ＤＳＮのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は、４２，０００〜４６，０００であることが好ましい。また、本発明の耐熱性ＤＳＮの等電点は４．４であることが好ましい。
【００２７】
さらにまた、本発明の耐熱性ＤＳＮは、Ｍｎ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオン存在下において好適なＤＳＮ活性を示し、Ｃａ２＋イオンには非感受性であることが好ましい。例えば、本願実施例で示されるウシ胸腺由来のＤＮＡを用いた活性測定方法により精製酵素の活性を測定した場合に、Ｍｎ２＋イオンを使用した場合は、１ｍＭ〜４ｍＭの範囲で７５％〜１００％の相対活性を示し、Ｍｇ２＋イオンを使用した場合は、７ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で７０％〜１００％の相対活性を示すことが好ましい。また、Ｃａ２＋イオンを使用した場合は、０〜１００ｍＭの範囲で、金属イオンを添加しない場合と同様に、ほとんど活性を示さないことが好ましい。
【００２８】
ここで、１若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列とは、基準とする配列と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をいう。
【００２９】
本発明の耐熱性ＤＳＮの好ましい形態の１つは、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ属の肝膵臓から精製された酵素であり、例えばＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ肝膵臓から精製された酵素である。Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏがその肝膵臓中に耐熱性ＤＳＮを発現しているという本発明の開示に基づき、当業者はＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ属生物の肝膵臓から、一般的な生化学的方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、濃縮および透析等を単独または適宜組み合わせて用いることにより、本発明の耐熱性ＤＳＮを単離精製することができる。また、当業者は開示された類似の肝膵臓由来酵素の精製方法、例えば、ナミクダヒゲエビ肝膵臓からのＤＮａｓｅの精製方法（非特許文献１）およびタラバガニ肝膵臓からのＤＳＮの精製方法（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）、並びにこれらに準ずる方法およびこれらを改変した方法によって精製することもできる。
【００３０】
本発明の耐熱性ＤＳＮは、前記のごとく天然の生体由来材料から、単離および精製してもよいが、本発明の耐熱性ＤＳＮをコードする遺伝子を用いて、組換えタンパク質として調製してもよい。
【００３１】
本発明の耐熱性ＤＳＮをコードする遺伝子は、本明細書の配列番号１または配列番号２０に記載の塩基配列に基づき、当業者に公知のクローニング手法等によって調製される。
例えば、該遺伝子は、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ肝膵臓由来のＴｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡとして調製することができる。また、例えば、該遺伝子は開示された配列に基づき本明細書の実施例３に記載の方法によって調製される。
【００３２】
また、前記の耐熱性ＤＳＮのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも、本発明の耐熱性ＤＳＮをコードする遺伝子に含まれる。また、該ＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤＳＮ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。また、配列番号１に記載の耐熱性ＤＳＮをコードする塩基配列を有するＤＮＡにおいて１若しくは複数個の塩基が付加、欠損若しくは置換された塩基配列であって、かつ耐熱性ＤＳＮをコードする塩基配列を有するＤＮＡも、本発明の遺伝子に含まれる。ここで、１若しくは複数個の塩基が付加、欠損若しくは置換された塩基配列とは、基準とする配列と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の塩基配列同一性を有する塩基配列をいう。
【００３３】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハートおよび１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００３４】
また、生物由来材料から耐熱性ＤＳＮ遺伝子を調製する方法の他に、確定した耐熱性ＤＳＮの塩基配列情報を基に、有機合成法および酵素合成法並びにそれらを適宜組み合わせた方法により、直接的に所望する耐熱性ＤＳＮ遺伝子を合成することもできる。
【００３５】
本発明の組換え体ＤＮＡは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐＱＥ（ＱＩＡＧＥＮ社製）およびｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０およびｐＴＰ５等）および酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４およびＹＣｐ５０等）などが挙げられる。ファージＤＮＡとしては、例えば、λファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルスおよびワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター並びにバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３６】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、例えば、精製された本発明の遺伝子を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。ベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーおよびリボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。本発明の遺伝子には、後で本発明の耐熱性ＤＳＮの精製および検出を容易にするために、または発現した耐熱性ＤＳＮが細胞内で不溶化してしまうのを防ぐために、ＧＳＴタグおよびヒスチジンタグなどのタグ配列等をコードする配列を付加してもよい（例えば、Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．,Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６０，５２３−５３３，２００３）。
【００３７】
本発明の形質転換体および形質導入体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで用いる宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ等）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）およびリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ等）などに属する細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等の酵母、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞等の動物細胞並びにヨトウガ細胞（Ｓｆ９およびＳｆ２１等）およびカイコ細胞（ＢｍＮ４等）などの昆虫細胞が挙げられる。
【００３８】
本発明の形質転換体および形質導入体が得られたならば、その培養物から本発明の耐熱性ＤＳＮを採取するには、当業者が通常行う酵素採取手段を用いることができる。本発明の耐熱性ＤＳＮが菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することにより当該酵素を抽出できる。例えば、常法により菌体または細胞を超音波破砕処理および磨砕処理などする方法、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて該酵素を抽出する方法、並びにトルエン等の存在下で振盪または放置して自己消化を行なわせ該酵素を菌体または細胞外に排出させるなどの方法で菌体内または細胞内から該酵素を抽出することができる。
【００３９】
前記のごとくして得られた本発明の耐熱性ＤＳＮを含む調製物から、さらに本発明の耐熱性ＤＳＮを精製し、精製酵素標品を得る場合には、当業者がタンパク質の単離精製に用いる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー等を単独または適宜組み合わせて用いることにより、前記酵素溶液から本発明の耐熱性ＤＳＮを単離精製することができる。
【００４０】
本発明の耐熱性ＤＳＮに、ＧＳＴタグおよびヒスチジンタグなどのタグ配列等を付加して発現させた場合、このような付加配列は、当該酵素の精製途中または精製後に、当業者が通常行う適当な酵素処理等によって取り除いてもよいし、付加配列によって本発明の耐熱性ＤＳＮの活性が損なわれない場合はそのままでもよい。
【００４１】
ナミクダヒゲエビ肝膵臓由来ＤＮａｓｅおよびウシ膵臓由来ＤＮａｓｅはトリプシン消化に対する耐性を示し（非特許文献１）、タラバガニ肝膵臓由来ＤＳＮはプロテイナーゼＫ消化に対する耐性を示すことが知られていた（非特許文献６）。一方、本発明者らは、本発明のＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ属由来耐熱性ＤＳＮが、プロテイナーゼＫ消化に対して耐性を示すことを見出した。本開示により、当業者は、プロテイナーゼＫによって目的外のタンパク質の大部分を消化せしめ、所望する本発明の耐熱性ＤＳＮは分解されないような条件で処理することによって、本発明の酵素の精製を簡便に行うことが可能である。そのような精製手順を含む本発明の耐熱性ＤＳＮの製造方法の好ましい実施形態の１つの例を、本明細書の実施例においてより詳しく具体的に説明する。
【００４２】
本発明の耐熱性ＤＳＮは、開示したアミノ酸配列から理解できるように、高度にシステイン残基を有しており、このことから分子内に複数のジスルフィド架橋が形成されることが推察される。一般的に、高度な分子内ジスルフィドネットワークを有するタンパク質は、大腸菌などの原核生物を宿主として成功裏に組換えタンパク質を得るのが困難な場合がしばしばあることは、当業者の知るところである。大腸菌内で発現させた目的タンパク質が、不溶化した封入体として得られる場合には、封入体の可溶化およびリフォールディング等の手順を経て、可溶性で酵素活性のある目的タンパク質を再生することができる（例えば、非特許文献７）。
【００４３】
本発明の耐熱性ＤＳＮを組換えタンパク質として調製する方法の好ましい実施形態の１つの例は、真核生物細胞内で目的タンパク質を発現させる方法であり、好ましい１つの例は昆虫細胞内で目的タンパク質を発現させる方法であり、例えば、組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞内で目的タンパク質を発現させるバキュロウイルス−昆虫細胞組換えタンパク質発現系（例えば、Ｓｈｕｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．らの文献、“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９５年およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．らの文献、“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９４年）を用いる方法が挙げられる。バキュロウイルス−昆虫細胞組換えタンパク質発現系を用いる本発明の耐熱性ＤＳＮの製造方法の好ましい実施形態の１つの例を、本明細書の実施例においてより詳しく具体的に説明する。
【００４４】
本発明の耐熱性ＤＳＮを用いることで、当該酵素を用いた核酸の切断方法が提供される。当該方法によれば、２本鎖特異的に核酸を切断することができる。より詳しくは、当該方法によれば、１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡが共存する系で、１本鎖ＤＮＡよりも２本鎖ＤＮＡを優先的に分解することができる。また、当該方法によれば、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解することができる。本発明の耐熱性ＤＳＮを用いて２本鎖特異的に核酸を切断する場合、４０℃以上、好ましくは５０℃以上、より好ましくは６０℃以上の条件下で反応を行うことが好ましい。また、７０℃以下、好ましくは６５℃以下の条件下で反応を行うことが好ましい。
【００４５】
本発明の耐熱性ＤＳＮを用いる核酸の切断方法における、反応液組成および反応条件は、当業者が目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本明細書の実施例に記載の反応液組成および反応条件並びにそれらを改変したものが使用できるが、これらに限定されるものではない。上述のごとく、本発明の耐熱性ＤＳＮは約５５℃から約６３℃の範囲で特に高い活性を示すことができるが、使用できる反応温度はこの範囲に限られるものではない。
【００４６】
本発明の耐熱性ＤＳＮは、低温（例えば２５℃（実施例参照））でも十分な活性を示すことができる。また、時間の経過に伴う酵素の失活を問題としないような使用目的の場合は、本酵素の活性が完全に消失しない範囲の高温（例えば８０℃を越えない温度であって、例えば７０℃）で使用することもできる。すなわち、本発明の耐熱性ＤＳＮは、低温から高温までの幅広い温度範囲で活性を示すことができるので、当業者は目的に応じて様々な温度条件下で使用することができる。例えば、本発明の耐熱性ＤＳＮを、一定温度条件下、ある範囲の温度変化が伴う条件下、および所定のまたはプログラムされた温度サイクリング条件下などで使用して、本発明の核酸の切断方法を実施することができる。
【００４７】
本発明の耐熱性ＤＳＮを用いることで、以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むＲＮＡ検出方法が提供される；
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程、
（ｉｉ）本発明の耐熱性ＤＳＮで、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
工程（ｉ）において、検出対象とするＲＮＡおよび該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するプローブＤＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させることにより、特定のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを検出することができる。
【００４８】
以下、各工程について説明する。
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程
この工程は、ＲＮＡと該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとのハイブリッド鎖を形成させる工程である。ここで「ハイブリッド」とは、ＲＮＡとＤＮＡとの相補的結合の結果物をいう。ＲＮＡとしては、全体が天然型のＲＮＡである場合のほか、ＲＮＡをその一部に含む核酸および非天然型のヌクレオチドを含むＲＮＡなどが挙げられる。また、本発明の方法によればＲＮＡの断片も検出可能である。
【００４９】
ＲＮＡは溶液中に存在していてもよく、固体状態であってもよい。また、例えば、ＤＮＡチップまたはＤＮＡアレイと呼ばれる固相担体上に相補的結合により固定されている状態でもよい。溶液の場合には、溶媒としては水または緩衝液が好ましく、水の他に水と混和しうる溶媒を適宜混合して用いるのが好ましい。水と混和して用いる溶媒の例としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリルおよびスルホランなどが挙げられる。固体状態の場合には、検出対象となるＲＮＡは他の物質と混合状態であってもよく、複数種のＲＮＡの混合物であってもよい。
【００５０】
固相担体上にＲＮＡが固定されている場合、該固相担体としては、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレンおよびポリメチルメタクリレート等のポリマー並びにシリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕物、不織布、減紙、短繊維およびメンブレンフィルター等の多孔質物質が拳げられる。また、固相担体はビーズ状になったものおよびアクリルアミドゲルのようにゲル状のものであってもよい。また、ＲＮＡが単に固相担体上に物理的に密着されていてもよく、固相担体上から一部固相担体内に浸透した形態であってもよい。また、ＲＮＡが完全に固相担体に浸透した形態であってもよく、共有結合で化学的に固相担体に結合されていてもよい。
【００５１】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させるＤＮＡとしては、例えば、化学的に合成したＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素などによって酵素学的に合成したＤＮＡ並びに生物由来試料から抽出またはクローン化したＤＮＡが挙げられる。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させるＤＮＡは、特定のＲＮＡのヌクレオチド配列を検出する場合、該ＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブＤＮＡであることが好ましい。また、該プローブＤＮＡは標識物質を結合するものであることが好ましい。標識物質としては、例えば、クエンチャー（例えば、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＴＡＭＲＡ（登録商標）およびＭＧＢなど）およびレポーター色素（例えば、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＥＴおよびＨＥＸなど）等の蛍光色素、ビオチン並びに放射性同位体元素が挙げられる。また他の標識の例としては、直接は検出できないが標識物質と特異的に結合する物質（例えばアビジンなど）との反応によって間接的に検出可能となるような物質、例えば、ハプテンおよび抗体などが挙げられる。当該ＤＮＡは、１５〜３００ヌクレオチド、好ましくは１５〜６０ヌクレオチドを含有することが好ましい。
【００５２】
（ｉｉ）本発明の耐熱性ＤＳＮで、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程
この工程は、本発明耐熱性ＤＳＮを用いて２本鎖特異的に核酸を切断することにより、工程（ｉ）で形成された１本のＲＮＡ鎖および１本のＤＮＡ鎖からなるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程である。工程（ｉｉ）は、２５℃以上、好ましくは３５℃以上の条件下で反応を行うことが好ましい。また、９０℃以下、好ましくは８０℃以下の条件下で反応を行うことが好ましい。
【００５３】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
この工程は、工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程である。ＤＮＡの分解は、例えば、次の方法により検出することができる。工程（ｉ）においてＤＮＡの５’末端をレポーターの蛍光色素、３’末端をクエンチャーの蛍光色素で標識したプローブＤＮＡを用いてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる。その後、本発明の耐熱性ＤＳＮでＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中にＤＮＡを分解することにより、プローブＤＮＡに結合しているリポーターの蛍光色素とクエンチャーの蛍光色素が離れ離れになり、リポーターの蛍光色素が検出されるようになる。すなわち、検体中にＲＮＡが存在すれば、リポーターの蛍光色素が検出される。また、例えば、平板ゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動およびマススペクトル分析などの当業者に公知の様々な核酸の分析手法によっても検出が可能である。例えば、本発明のＤＳＮ酵素を添加する場合と添加しない場合との電気泳動パターンを比較することによりＤＮＡの分解を検出することも可能である。
【００５４】
本発明の耐熱性ＤＳＮを含んでなる試薬キットも本発明の範囲に包含される。本試薬キットは、標識物質、緩衝液および塩など、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。当該試薬キットは、本発明の２本鎖特異的な核酸の切断方法およびＲＮＡの検出方法に使用可能である。
【００５５】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。なお本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
ズワイガニ肝膵臓由来ｃＤＮＡの調製
我々は、ズワイガニの肝膵臓中にＤＳＮが発現していることを見出し、その遺伝子を単離および同定する目的で、まず以下の方法で肝膵臓由来１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを調製した。
【００５７】
（１）ズワイガニからの肝膵臓の採取
鳥取県の網代港で水揚げされた活ズワイガニを購入し、解剖して肝膵臓を採取した。採取した肝膵臓、約１００ｍｇを直ちに１．２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に浸漬し、４℃で１６時間保存した。浸漬した肝膵臓をピンセットで取り出し、新しいエッペンドルフチューブに入れ、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５８】
（２）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
−８０℃で保存したズワイガニの肝膵臓から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。３０ｍｇの肝膵臓から、６０μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡが得られた。
【００５９】
（３）１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの作製
以下に示す逆転写反応により、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。反応は３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添付の試薬を使用して行った。ズワイガニ肝膵臓から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ、１μｌのプライマーＡＰ（配列番号１６）（１０μＭ）および、１０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを混合し、７０℃で１０分間熱処理を行い、その後氷上で急冷した。熱処理後の混合液（１２μｌ）に、反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液(１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ)を２μｌ添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が２．５ｍＭ、そしてＤＴＴが１０ｍＭとなるようにそれぞれ添加し、４２℃で２分間インキュベートした。逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  Ｒｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを２００Ｕ添加して反応液（全量２０ μｌ）を調製した。反応液を４２℃で５０分間インキュベート後、７０℃で１５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。反応液を氷上で冷却して、ＲＮａｓｅＨ  ２．０Ｕを添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。この溶液を１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ溶液とした。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。
【実施例２】
【００６０】
ズワイガニＤＳＮ遺伝子の塩基配列の決定
実施例１の方法で調製したズワイガニ肝膵臓由来１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として用い、まずＤＳＮ遺伝子の内部配列を取得した後、得られた内部配列を元に３’領域配列を決定し、次に５’配列領域を決定し、最終的にズワイガニＤＳＮ遺伝子の全長ｃＤＮＡの塩基配列決定に至った（配列番号２０）。図１はズワイガニＤＳＮ遺伝子の部分配列および全長配列のクローニングの概要を示すもので、用いたプライマーの位置の模式図とそれぞれのＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動像を示した（レーンＭ；ＤＮＡサイズマーカー、レーン６；プライマーＧＳＰ６−２およびＡＵＡＰによるＰＣＲ増幅産物、レーンＩ；プライマーＭｉ１およびＭｉ２によるＰＣＲ増幅産物、レーン３’；プライマーＭ３Ｒ２およびＡＵＡＰによるＰＣＲ増幅産物、レーン５’；プライマーＭ５Ｒ２およびＡＵＡＰによるＰＣＲ増幅産物、レーンＦ；プライマーＭＷＦ１およびＭＷＲ１のＰＣＲ増幅産物）。
【００６１】
（１）ズワイガニＤＳＮ遺伝子の内部配列の取得
種々の甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間でよく保存されている領域を参考にして、プライマーＭＧＳＰ６（配列番号３）、ＭＧＳＰ６−２（配列番号４）、Ｍｉ１（配列番号５）、Ｍｉ２（配列番号６）を作製した。
以下のＰＣＲによって、ズワイガニＤＳＮ遺伝子の内部配列を増幅した。１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液(１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ)を５μｌ添加した。プライマーとして、ＭＧＳＰ６（配列番号３）およびＡＵＡＰ（配列番号１４）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ａ〉を得た。
【００６２】
次に、増幅産物〈Ａ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈し、この希釈液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。希釈液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、ＭＧＳＰ６−２（配列番号４）およびＡＵＡＰ（配列番号１４）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ｂ〉を得た。
【００６３】
増幅産物〈Ｂ〉を、アガロースゲル電気泳動を行い、バンドの確認をしたところ、特異的な増幅産物は観察されなかった（図１（ａ）レーン６）。そこで、増幅産物〈Ｂ〉を鋳型としてさらにＰＣＲを行った。増幅産物〈Ｂ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈した。この希釈液  ２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液(１０×ＫＯＤ−ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ)を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｍｉ１（配列番号５）およびＭｉ２（配列番号６）をそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動したところ、約２５０  ｂｐの位置にバンドが観察された（図１（ｂ）レーンＩ）。このバンドを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。得られた増幅産物を常法に従って、ｐＵＣ１８ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてズワイガニＤＳＮ遺伝子の内部配列を決定した。
【００６４】
（２）ズワイガニＤＳＮ遺伝子３’領域配列の取得
取得したズワイガニＤＳＮ遺伝子の内部配列をもとにプライマーＭ３Ｒ１（配列番号７）、Ｍ３Ｒ２（配列番号８）を作製した。以下のＰＣＲによって、ズワイガニＤＳＮ遺伝子の３’領域配列を増幅した。１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液(１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ)を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｍ３Ｒ１（配列番号７）およびＡＵＡＰ（配列番号１４）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ｃ〉を得た。
【００６５】
次に、増幅産物〈Ｃ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈し、この希釈液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。希釈液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｍ３Ｒ２（配列番号８）およびＡＵＡＰ（配列番号１４）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約６００ｂｐのＰＣＲ増幅産物（図１（ｃ）レーン３’）を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水１０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。
【００６６】
得られた産物をＭｉｇｈｔｙ  ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、当該キットに添付のｐＭＤ２０−Ｔベクターへ挿入した。本操作の手順は、当該キットに付属の仕様書に従った。得られた組換え体ＤＮＡ中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてズワイガニＤＳＮ遺伝子３’領域の塩基配列を決定した。
【００６７】
（３）ズワイガニＤＳＮ遺伝子５’領域配列の取得
以下に示す５’ＲＡＣＥ法により、ズワイガニＤＳＮ遺伝子５’領域の塩基配列を解読した。反応は５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Iｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添付の試薬を用いて行った。取得したズワイガニＤＳＮ遺伝子の内部配列をもとに、Ｍ５ＲＴ（配列番号９）、Ｍ５Ｒ１（配列番号１０）、Ｍ５Ｒ２（配列番号１１）を作製した。
以下に示す逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。ズワイガニ肝膵臓から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ、２．５μｌのプライマーＭ５ＲＴ（配列番号９）（１μＭ）および、１２．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを混合し、７０℃で１０分間インキュベート後、氷上で急冷した。熱処理後の混合液（１５．５μｌ）に、反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液(１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ)を２μｌ添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．４ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が２．５ｍＭ、そしてＤＴＴが１０ｍＭとなるようにそれぞれ添加し、４２℃で１分間インキュベートした。逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ  Ｒｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを２００Ｕ添加して、反応液（全量２５ μｌ）を調製した。反応液を４２℃で５０分間インキュベート後、７０℃で１５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。この反応液に、ＲＮａｓｅ  ｍｉｘ  １μｌを添加し３７℃で３０分間インキュベート後、該キットに添付のＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．カラムを用いて合成したｃＤＮＡを精製し、滅菌超純水５０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該キットに付属の仕様書に従った。
【００６８】
次に、ＴｄＴ−ｔａｉｌｉｎｇ反応を行った。Ｏｌｉｇｏ−ｄＣ付加酵素として、該キットに付属のＴｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）を使用した。Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ精製ｃＤＮＡ  １０μｌ、反応緩衝液として、５倍濃度の緩衝液（５×ｔａｉｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ、ｄＣＴＰは終濃度が０．２ｍＭになるように添加して、混合液（全量２４μｌ）を調製した。この混合液を９４℃で３分間インキュベートし、氷上で急冷した。ＴｄＴを１μｌ添加して反応液（全量２５μｌ）を調製し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、６５℃で１０分間インキュベートして、ＴｄＴを不活性化した。この溶液をｄＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡ溶液とした。
【００６９】
以下のＰＣＲによって、ズワイガニＤＳＮ遺伝子の５’領域の配列を増幅した。ｄＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡ  ５μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液(１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ)を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｍ５Ｒ１（配列番号１０）およびＡＡＰ（配列番号１５）をそれぞれ終濃度０．４μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ｄ〉を得た。
【００７０】
次に、増幅産物〈Ｄ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈し、この希釈液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。希釈液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液(１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ)を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｍ５Ｒ２（配列番号１１）およびＡＵＡＰ（配列番号１４）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約７００ｂｐのＰＣＲ増幅産物（図１（ｄ）レーン５’）を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水１０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。
【００７１】
得られた産物をＭｉｇｈｔｙ  ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、該キットに添付のｐＭＤ２０−Ｔベクターへ挿入した。本操作の手順は、当該キットに付属の仕様書に従った。得られた組換え体ＤＮＡ中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてズワイガニＤＳＮ遺伝子５’領域の塩基配列を決定した。このようにして最終的にズワイガニＤＳＮ遺伝子の全長ｍＲＮＡの塩基配列（配列番号２０）が得られた。該配列は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする配列番号１のＤＳＮ遺伝子を有していた。
【実施例３】
【００７２】
ズワイガニＤＳＮ全長遺伝子のクローニング
実施例２によってズワイガニＤＳＮのｍＲＮＡの塩基配列からｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２０）を決定した我々は、この配列に基づきプライマーＭＷＦ１（配列番号１２）およびＭＷＲ１（配列番号１３）を設計し、これによってズワイガニＤＳＮ全長遺伝子（配列番号１）をクローンした。全長遺伝子の電気泳動像は図１（ｅ）に示した。
逆転写およびＰＣＲ反応は、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いて行った。まず以下に示す逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。ズワイガニ肝膵臓から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ、５μｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー（配列番号１７）（１０μＭ）および、６．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを混合し、６５℃で５分間熱処理を行い、その後氷上で急冷した。熱処理後の混合液（１２μｌ）に、反応緩衝液として、５倍濃度の緩衝液(５×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ  )を４μｌ添加した。ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓを２μｌ、逆転写酵素としてＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡社製）を１μｌ、それぞれ添加して反応液（全量２０μｌ）を調製した。反応液を４２℃で６０分間インキュベート後、８５℃で５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。この溶液を逆転写ｃＤＮＡ溶液とした。
【００７３】
この逆転写ｃＤＮＡ  ２μｌを鋳型として、反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液(１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ)を５μｌ添加した。プライマーＭＷＦ１（配列番号１２）およびＭＷＲ１（配列番号１３）をそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約１３００ｂｐのＰＣＲ増幅産物（図１（ｅ）レーンＦ）を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。得られた増幅産物を常法に従って、ｐＵＣ１８ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ中（以下ｐＵＣ１８  ＺＤＳＮと呼ぶ）の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてズワイガニＤＳＮ全長遺伝子をクローンし、その全配列を確認した。
【００７４】
単離されたズワイガニＤＳＮ  ｃＤＮＡのコード領域は、１２１５塩基からなる配列であり（配列番号１）、４０４アミノ酸の配列からなるポリペプチドをコードしていた（配列番号２）。ズワイガニＤＳＮは、クルマエビＤＮａｓｅ（非特許文献３）に対して塩基配列レベルで６４％、アミノ酸配列レベルで５９％の同一性を示し、タラバガニＤＳＮ（非特許文献８）に対しては、塩基配列レベルで６６％、アミノ酸配列レベルで６１％の同一性を示した。
【００７５】
ズワイガニＤＳＮと、クルマエビＤＮａｓｅおよびタラバガニＤＳＮのアミノ酸配列の比較を示すマルチプルアライメントを図２に示した。図２中、ＫｕｒｕｍａはクルマエビＤＮａｓｅ、ＴａｒａｂａはタラバガニＤＳＮ、ＺｕｗａｉはズワイガニＤＳＮのアミノ酸配列を示す。３つの配列の間で一致するアミノ酸を四角で囲んで示した。シグナルペプチド切断部位を縦二重線（‖）で示した。シグナルペプチド切断部位は、ズワイガニＤＳＮとタラバガニＤＳＮについてはＳｉｇｎａｌＰ  ３．０  ソフトウェア（Ｂｅｎｄｔｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０，７８３−９５，２００４年）による予測切断部位であり、クルマエビＤＮａｓｅについてはＷａｎｇらの実験によって明らかにされた切断部位（非特許文献３）である。ＤＮＡ／ＲＮＡ非特異的エンドヌクレアーゼファミリーのＮＵＣ保存ドメインの活性部位に相当する位置のアミノ酸残基を丸印（○）で示した。配列中のＣｙｓ残基を灰色で示した。ズワイガニＤＳＮはＮ末端から２３アミノ酸の推定シグナル配列を有しており、全長ポリペプチドの計算分子量は４４．３ｋＤａ、予測等電点は４．４、予測成熟ポリペプチドの計算分子量は４１．８ｋＤａ、予測等電点は４．４であった。ズワイガニＤＳＮには、タラバガニＤＳＮとの間で保存された位置にある１０のＣｙｓ残基と、さらに付加的な２つのＣｙｓ残基があり、合計１２のＣｙｓ残基を有していた。
【実施例４】
【００７６】
組換えズワイガニＤＳＮの発現および精製
実施例３によって単離されたズワイガニＤＳＮ  ｃＤＮＡを用い、バキュロウイルス−昆虫細胞系による組換えＤＳＮ酵素の発現と精製を行った。
【００７７】
（１）組換えバキュロウイルスの作製
以下に示すＰＣＲにより、ズワイガニＤＳＮ  ｃＤＮＡを増幅させた。ズワイガニＤＳＮ  ｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するために、プライマーＭＥＰＦ（配列番号１８）およびＭＥＰＲ−Ｈｉｓ（配列番号１９）を作製した。ズワイガニＤＳＮをＣ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として発現させるために、ＭＥＰＲ−Ｈｉｓ（配列番号１９）の５’末端側に、６×ヒスチジンをコードする塩基配列を付加した。
【００７８】
実施例３で作製したｐＵＣ１８  ＺＤＳＮ  ６ｎｇを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液(１０×ＫＯＤ−ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ)を５μｌ添加した。プライマーとして、ＭＥＰＦ（配列番号１８）およびＭＥＰＲ−Ｈｉｓ（配列番号１９）をそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、約１２５０ｂｐの位置にバンドが確認された。このＰＣＲ増幅産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌超純水５０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。精製した増幅産物を、ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）およびＢａｍＨＩ（ニッポンジーン社製）を用いて消化後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。制限酵素で消化した増幅産物を常法に従って、ｐＶＬ１３９３ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ（以下ｐＶＬ１３９３  ＺＤＳＮ−Ｈｉｓと呼ぶ）中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読し、配列番号１と一致することを確認した。
【００７９】
作製したｐＶＬ１３９３  ＺＤＳＮ−Ｈｉｓ  ２μｇ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（Ｏｒｂｉｇｅｎ社製）０．５μｇおよび無血清培地Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を混合して溶液Ａ（全量５０μｌ）を調製した。また、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ  ４５μｌとセルフェクチン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５μｌを混合して溶液Bを調製した。溶液Ａと溶液Ｂを混合して溶液Ｃを調製し、室温で３０分間静地した。φ６０ｍｍ  ｄｉｓｈに０．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量４ｍｌ）で準備したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に溶液Ｃを添加し、２８℃で６時間インキュベートした。培地のみを除去し、新しいＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ  ３ｍｌを添加して、２８℃で５日間インキュベートした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を１ｓｔ  組換えウイルス液とした。次に、組換えウイルスの感染力価を増加させるために、以下の操作を行った。１ｓｔ組換えウイルス液５００μｌを、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１５ｍｌ）で組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、２８℃で５日間インキュベートした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を２ｎｄ組換えウイルス液とした。次に、作製した２ｎｄ組換えウイルス液  １ｍｌを、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量５０ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に添加し、２８℃で振とうしながら、４日間インキュベーションした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を３ｒｄ組換えウイルス液とした。
【００８０】
（２）組換えズワイガニＤＳＮの発現および精製
以下の手順に従い組換えズワイガニＤＳＮの発現および精製を行った。作製した３ｒｄ組換えウイルス  １ｍｌを、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１００ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、２８℃で振とうしながら、４日間インキュベーションした。同様の条件で、さらに２本の該フラスコ（計３００ｍｌ）で感染を行った。ウイルス感染培養液（全量３００ｍｌ）を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２％  ＮＰ４０）２０ｍｌに懸濁し、氷上で１時間静地した。この懸濁液を、超音波破砕処理した後、７，０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清にプロテイナーゼＫ（タカラバイオ社製）を終濃度２０μｇ/ｍｌになるように添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、上清中に含まれる昆虫細胞およびバキュロウイルス由来のタンパク質を分解した。この処理液を７，０００×ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清から、ＴＡＬＯＮ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ（クローンテック社製）を用いて、ズワイガニＤＳＮを精製した。このとき緩衝液として、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）をＴＡＬＯＮの洗浄に使用し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を溶出に使用した。得られた溶出画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。この結果を図３に示す。図３中、各レーンは次のサンプルを示す：レーンＭ；分子量マーカー、レーン１；細胞破砕上清、レーン２；細胞破砕沈殿、レーン３；プロテイナーゼＫ処理上清、レーン４；プロテイナーゼＫ処理沈殿、レーン５；ＴＡＬＯＮ非吸着画分、レーン６；ＴＡＬＯＮ洗浄画分１、レーン７；ＴＡＬＯＮ洗浄画分２、レーン８；イミダゾール溶出画分。この結果、ズワイガニＤＳＮの予測分子量に一致する単一のタンパク質バンドが観察されることを確認した（図３レーン８、ズワイガニＤＳＮと考えられるバンドを矢印で示した）。以上のような精製操作により、３００ｍｌのウイルス感染培養液から、約５０μｇの高純度酵素が得られた。
【００８１】
（３）プロテイナーゼＫ処理および熱処理のズワイガニＤＳＮの精製純度に及ぼす効果
ズワイガニＤＳＮの精製純度に及ぼすプロテイナーゼＫ処理および熱処理の効果を調査した。以下の手順に従って、精製純度を比較した。実施例４（１）で作製した２ｎｄ組換えウイルス  １ｍｌを、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量５０ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したｅｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞に添加し、２８℃で振とうしながら、４日間インキュベーションした。ウイルス感染培養液（全量５０ｍｌ）を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２％  ＮＰ４０）４ｍｌに懸濁し、氷上で１時間静地した。この懸濁液を、超音波破砕処理した後、７，０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清を２ｍｌずつ別の容器に回収した。１つの容器に、プロテイナーゼＫ（タカラバイオ社製）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で３０分間インキュベート後、６０℃で１５分間処理した。この処理液を１５，０００×ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を回収した（処理上清）。もう一方の容器は、これらの処理を行わなかった（未処理上清）。処理上清および未処理上清それぞれから、ＴＡＬＯＮ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ（クローンテック社製）を用いて、ズワイガニＤＳＮを精製した。このとき緩衝液として、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）をＴＡＬＯＮの洗浄に使用し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を溶出に使用した。
【００８２】
得られた各溶出画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。この結果を図４に示した。図４中、各レーンに添加したサンプルは以下の通りである：レーンＭ；分子量マーカー、レーン１；プロテイナーゼ  Ｋ処理および熱処理を行わなかった場合の溶出画分（１０μｌ）、レーン２；プロテイナーゼ Ｋ処理および熱処理を行った場合の溶出画分（１０μｌ）。レーン１では、矢印で示した位置にズワイガニＤＳＮの予測分子量と一致するバンドは観察されたが、これ以外のバンドが多数存在した。一方、レーン２では、ほぼ単一の該ＤＳＮと考えられるバンドが観察された。また、各溶出画分に存在する該ＤＳＮに相当するバンドの濃淡は、レーン１とレーン２で同等であることが観察された。つまり、プロテイナーゼＫ処理および熱処理は、ズワイガニＤＳＮの精製収量に影響を及ぼさないと考えられる。このことは、該処理により、昆虫細胞およびバキュロウイルス由来のタンパク質は、分解または沈殿するが、ズワイガニＤＳＮは分解または沈殿しないことを示唆している。よって、該処理は、昆虫細胞−バキュロウイルス系を用いて発現させたズワイガニＤＳＮの精製ステップとして有効である。また実施例４（２）で示したＤＳＮの精製方法は、不溶化した封入体を可溶化およびリフォールディングするといった手順を必要とせず、プロテイナーゼ  Ｋ処理と、アフィニティ精製による２ステップでズワイガニＤＳＮを簡便かつ高純度に取得可能な方法である。
【実施例５】
【００８３】
ズワイガニＤＳＮの２本鎖特異的核酸切断活性
（１）ズワイガニＤＳＮのＤＮＡ分解活性
実施例４で取得したズワイガニＤＳＮ精製酵素のＤＮＡ分解活性を測定した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ、Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。反応基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ/ｍｌになるように添加して調製した。調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、２５℃で平衡化した。精製酵素１０μｌを添加し、すばやく攪拌した後に、波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素活性を１Ｕとした。この結果、精製酵素の活性は１３１３Ｕ／ｍｌであることが示された。
【００８４】
（２）ズワイガニＤＳＮの２本鎖特異的核酸切断活性
ズワイガニＤＳＮの２本鎖特異的切断活性を評価した。２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を、１本鎖ＤＮＡ基質としてＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  (ｐＨ８．０)、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、λＤＮＡとＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを、終濃度がそれぞれ２１μｇ/ｍｌと１０μｇ/ｍｌになるように添加して調製した。また、基質ＤＮＡをそれぞれ単独で添加した基質溶液も調製した。基質溶液９μｌにズワイガニＤＳＮ精製酵素  １μｌ（０．５Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、実施例４の緩衝液Ｂを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロールとして調製した。調製した反応液を６０℃で３分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。その電気泳動像を図５に示した。図５中、レーンＭはλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、酵素を含むサンプルがレーン１〜３（Ｚｕｗａｉ  ＤＳＮ＋）、酵素を含まないサンプルがレーン４〜６（Ｚｕｗａｉ  ＤＳＮ  −）であり、各レーン番号の上に反応液中に添加した基質ＤＮＡを示した（Ｍ１３、λ、およびＭ１３＋λ）。また図５中、白抜き矢印はλＤＮＡ、黒矢印はＭ１３  ＤＮＡの、それぞれ無傷の分子量の位置を示す。
【００８５】
この結果、酵素を添加した反応液（Ｚｕｗａｉ  ＤＳＮ＋；図５  レーン１、２、３）では、２本鎖ＤＮＡ基質であるλＤＮＡ（白抜き矢印）のみが分解され、１本鎖ＤＮＡ基質であるＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（黒矢印）は分解されなかった。一方、酵素の代わりに緩衝液Ｂを添加した場合（Ｚｕｗａｉ  ＤＳＮ−；図５  レーン４、５、６）では、両方の基質が分解されなかった。このことから、ズワイガニＤＳＮは１本鎖ＤＮＡにはほとんど作用せず、２本鎖ＤＮＡのみを特異的に分解することが示された。
【実施例６】
【００８６】
ズワイガニＤＳＮの耐熱性
（１）熱処理後の残存活性
ズワイガニＤＳＮの熱安定性を以下の方法で評価した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。反応基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ/ｍｌになるように添加して調製した。
調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、２５℃で平衡化した。実施例４で得られたズワイガニＤＳＮ精製酵素を、５０℃、６０℃、６３℃、７０℃、８０℃の各温度で、５、１０、１５、２０、３０分間インキュベーションした後、そのうちの１０μｌを反応基質溶液に添加し、すばやく攪拌した。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。
【００８７】
熱処理前の活性に対する、熱処理後の相対活性（％）の変化を図６に示した。この結果、５０℃および６０℃で処理した酵素は、３０分経過後でも、熱処理前の８０％より高い活性を保持していた。６３℃で処理した酵素は、１０分経過後に熱処理前の８０％より低い活性となった。７０℃で処理した酵素は、１５分経過後に熱処理前の約４０%まで活性が減少し、３０分経過後に約１０%まで減少した。８０℃で処理した酵素は、５分後には活性が消失した。この結果は、ズワイガニＤＳＮが、少なくとも６０℃までの温度では、３０分間の加熱に耐えて８０％より高い活性を保持できる耐熱性を有することを示す。
【００８８】
（２）至適活性温度
ズワイガニＤＳＮの様々な温度におけるＤＮＡ分解活性を以下の方法で評価した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。反応基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。
調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、２０℃〜７０℃の範囲の各活性測定温度で平衡化した。活性測定には、溶液の蒸発を防ぐために蓋付きの石英セルを使用した。波長２６０ｎｍの吸光度の値が安定した後、実施例４で取得したズワイガニＤＳＮ精製酵素を１０μｌ添加し、すばやく攪拌した。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。
測定結果を図７に示した。図７は、各温度において（ａ）測定された活性（Ｕ／ｍｌ）および（ｂ）相対活性（％）のグラフを示す。この結果から、ズワイガニＤＳＮが、少なくとも約２０℃（７８９Ｕ／ｍｌ）から６３℃（５０２５０Ｕ／ｍｌ）までの範囲で高い活性を示し、その至適活性温度は約６０℃であり、約５５℃から６３℃までの範囲で最大活性の７０％以上の活性を示すことが分かった。
【実施例７】
【００８９】
ズワイガニＤＳＮの金属イオン要求性
ズワイガニＤＳＮの金属イオン要求性を以下の方法で評価した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。反応基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２をそれぞれ、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、１００ｍＭ添加し、この溶液にウシ胸腺由来のＤＮＡ が終濃度４０μg/ｍｌになるように添加して調製した。
【００９０】
調製した各反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、２５℃で平衡化した。実施例４で得られたズワイガニＤＳＮ精製酵素１０μｌを反応基質溶液に添加し、すばやく攪拌した。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。測定結果を図８に示した。図８は、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２の各濃度において測定された活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。この結果は、ズワイガニＤＳＮはＭｇ２＋イオン存在下、またはＭｎ２＋イオン存在下において好適な活性を示し、一方でＣａ２＋イオンには非感受性であることを示す。
【実施例８】
【００９１】
ズワイガニＤＳＮの１本鎖ＤＮＡ分解に対する反応温度の影響
ズワイガニＤＳＮの１本鎖ＤＮＡ分解に対する反応温度の影響を評価した。１本鎖ＤＮＡ基質としてＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、Ｍ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを、終濃度が１０μｇ/ｍｌになるように添加して調製した。基質溶液９μｌにズワイガニＤＳＮ精製酵素  １μｌ（０．５Ｕ）を添加して、反応液を調製した。調製した反応液を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃の各温度で、０、１０、２０、３０分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。
【００９２】
得られた電気泳動像を図９に示す。図９中、レーンＭはλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、各レーンの上の数値は反応時間を示し、その上に反応温度を示した。また図９中、矢印はＭ１３  ＤＮＡの無傷の分子量の位置を示す。この結果、試験したいずれの温度においても、反応開始から３０分経過しても１本鎖ＤＮＡのバンドの完全な消失は認められなかった。これは、実施例５（２）において、本実施例と同量のズワイガニＤＳＮ（０．５Ｕ）が、わずか３分間の反応で２本鎖ＤＮＡ（λＤＮＡ）を完全に分解したこと（図５）と対照的であった。すなわち本実施例の結果から、図９に示すようにズワイガニＤＳＮが幅広い温度範囲において、１本鎖ＤＮＡを分解する活性が極めて低いか、分解活性を持たないこと、および本酵素が２本鎖ＤＮＡに対して非常に高い選択性を有することがわかった。さらに、ズワイガニＤＳＮが５０℃以上の温度で、より高い２本鎖核酸選択性を有し、また６０℃でさらに高い２本鎖核酸選択性を有することがわかった。
【実施例９】
【００９３】
２本鎖ＤＮＡ共存条件下におけるズワイガニＤＳＮの１本鎖ＤＮＡ分解に対する反応温度の影響
ズワイガニＤＳＮの１本鎖ＤＮＡ分解に対する反応温度の影響を、２本鎖ＤＮＡが共存する条件下で評価した。１本鎖ＤＮＡ基質としてＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を、２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、λＤＮＡとＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを、終濃度がそれぞれ２１μｇ/ｍｌと１０μｇ/ｍｌになるように添加して調製した。基質溶液９μｌにズワイガニＤＳＮ精製酵素 １μｌを添加して、反応液を調製した。調製した反応液を２５℃または６０℃の各温度で、０、３、１０、３０分間インキュベートした。
反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。
【００９４】
得られた電気泳動像を図１０に示す。図１０中、レーンＭはλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、各レーンの上の数値は反応時間を示し、その上にズワイガニＤＳＮ精製酵素の添加量を示した。また図１０中、白抜き矢印はλＤＮＡ、黒矢印はＭ１３  ＤＮＡの、それぞれ無傷の分子量の位置を示す。この結果、試験したいずれの条件においても、反応開始から３０分経過しても１本鎖ＤＮＡのバンドの完全な消失は認められなかった。一方、２本鎖ＤＮＡのバンドは、試験したいずれの条件においても、反応開始から３０分経過後には、ほぼ完全に消失した。これは、実施例５（２）において、本実施例と同量のズワイガニＤＳＮ（０．５Ｕ）が、わずか３分間の反応で２本鎖ＤＮＡ（λＤＮＡ）を完全に分解したこと（図５）と同等の結果であった。すなわち本実施例の結果から、図１０に示すように、ズワイガニＤＳＮが２５℃および６０℃の幅広い温度範囲において、１本鎖ＤＮＡを分解する活性が極めて低いか、分解活性を持たないこと、および該酵素が２本鎖ＤＮＡに対して非常に高い選択性を有することがわかった。さらに本実施例の結果から、ズワイガニＤＳＮが２５℃以上の温度で、より高い２本鎖核酸選択性を有し、また６０℃でさらに高い２本鎖核酸選択性を有することがわかった。
【実施例１０】
【００９５】
ズワイガニＤＳＮのＲＮＡ分解活性
ズワイガニＤＳＮのＲＮＡ分解活性を評価した。ＲＮＡ基質として昆虫細胞由来のＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いた。５×１０６個のＳｆ９細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。５×１０６個のＳｆ９細胞から、５．４μgのＴｏｔａｌ  ＲＮＡが得られた。２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を、ＲＮＡ基質として上記で調製した昆虫細胞由来Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いた。基質溶液は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴに、λＤＮＡとＴｏｔａｌ  ＲＮＡを、終濃度がそれぞれ１０μｇ/ｍｌと９μｇ/ｍｌになるように添加して調製した。基質溶液  ９μｌにズワイガニＤＳＮ精製酵素  １μｌ（５Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、実施例４の緩衝液Ｂを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロール、および、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＲＮａｓｅ  Ｔ１の混合液であるＲＮａｓｅ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μｌ添加したサンプルを陽性コントロールとして調製した。調製した各反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。その電気泳動像を図１０に示した。図１０中、レーンＭはλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、レーン１はＲＮａｓｅ  ｍｉｘ、レーン２はズワイガニＤＳＮ精製酵素、レーン３は実施例４の緩衝液Ｂを添加した反応液である。
【００９６】
この結果、ズワイガニＤＳＮ精製酵素を添加した反応液（図１１  レーン２）では、２本鎖ＤＮＡ基質であるλＤＮＡ（白抜き矢印）のみが分解され、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（黒矢印）は分解されなかった。一方、酵素の代わりにＲＮａｓｅ  ｍｉｘを添加した場合（図１１  レーン１）では、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（黒矢印）のみが分解され、２本鎖ＤＮＡ基質であるλ ＤＮＡ（白抜き矢印）は分解されなかった。また、酵素の代わりに緩衝液Ｂを添加した場合（図１１  レーン３）では、両方の基質が分解されなかった。この結果から、ズワイガニＤＳＮは、ＲＮＡを分解せず、２本鎖ＤＮＡを特異的に分解することが示された。
【実施例１１】
【００９７】
ズワイガニＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解活性
ズワイガニＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解活性を評価した。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を調製するために、ＲＮＡ鎖としてＰｏｌｙ  Ａ（Ｒｏｃｈｅ社製）を、ＤＮＡ鎖として５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  （Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（５’−ＦＡＭ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−Ｑ−３’）（配列番号２１）を用いた。基質溶液は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴに、Ｐｏｌｙ  ＡとＤＮＡプローブを、終濃度がそれぞれ１２．５ｎｍｏｌ/ｍｌと０．５ｎｍｏｌ/ｍｌになるように添加して調製した。別に、ＤＮＡプローブを単独で添加した基質溶液も調製した。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を調製するために、基質溶液を室温で３０分間放置し、ハイブリダイゼーションを行った。次に、該基質溶液  １９μｌにズワイガニＤＳＮ精製酵素  １μｌ（２．５Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、ＤＣＰＣ処理水を１μｌ添加したサンプルを陰性コントロールとして調製した。調製した反応液を３７℃でインキュベートし、３０秒おきに蛍光値を測定し、５０分間まで測定を行った。蛍光値の測定は、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。測定結果を図１２に示した。Ｐｏｌｙ  Ａ、ＤＮＡプローブおよびＤＳＮを添加したサンプルは、反応開始直後から急激に相対蛍光強度（ＲＦＵ）値が増加した。一方、ＤＳＮを添加していないサンプル、および、ＤＳＮとＤＮＡプローブのみを添加したサンプルのＲＦＵ値の増加量は、Ｐｏｌｙ  Ａ、ＤＮＡプローブおよびＤＳＮを添加したサンプルと比較して、顕著に少なかった。
【００９８】
この結果から、Ｐｏｌｙ  ＡとＤＮＡプローブがＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成できる条件下で、ズワイガニＤＳＮが、該ハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を分解して蛍光の増加をもたらしたことがわかった。本反応の模式図を図１３に示す。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成することのできない条件下、すなわち反応中にＲＮＡが存在しない場合は、ＤＮＡプローブは１本鎖の状態にあり、ズワイガニＤＳＮによってほんど分解されないことも示された。従って、ズワイガニＤＳＮが１本鎖ＤＮＡに対しては、ほとんど分解活性を示さず、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を特異的に分解することが示された。
【００９９】
また本実施例は、ズワイガニＤＳＮを用いて試料中のＲＮＡの存在を検出するための方法の一例を示すものである。また本実施例は、ズワイガニＤＳＮを用いて、プローブＤＮＡとＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成できるＲＮＡを特異的に検出するための方法の一例を示すものであり、すなわちプローブＤＮＡと相補的なヌクレオチド配列を有するＲＮＡを特異的に検出するための方法の一例を示すものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号３：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号４：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号５：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号６：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号７：ズワイガニＤＳＮ遺伝子内部配列を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号８：ズワイガニＤＳＮ遺伝子内部配列を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号９：ズワイガニＤＳＮ遺伝子内部配列を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号１０：ズワイガニＤＳＮ内部遺伝子配列を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号１１：ズワイガニＤＳＮ内部遺伝子配列を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号１２：配列番号２０を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号１３：配列番号２０を基にしたプライマーの塩基配列
配列番号１４：ＲＡＣＥ法に用いたアブリッジドユニバーサルアンプリフィケーションプライマーの塩基配列
配列番号１５：５’−ＲＡＣＥ法に用いたアブリッジドアンカープライマーの塩基配列
配列番号１６：３’−ＲＡＣＥ法に用いたアダプタープライマーの塩基配列
配列番号１７：オリゴヌクレオチドの配列
配列番号１８：配列番号２０のｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するためのプライマーの塩基配列
配列番号１９：配列番号２０のｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するためのプライマーの塩基配列
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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