(57)【要約】【課題】  改善されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物およびその製造方法の開発。【解決手段】  本発明は、組み換えCTLA4−Igおよびその変異体を生産し得る哺乳類細胞を提供する。また本発明は、CTLA4−Igを含む組成物およびその製剤を提供する。さらに本発明は、この組み換えタンパク質を生産し得る哺乳類細胞からCTLA4−Igを大量生産するため、およびCTLA−Igを精製するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の単離した集団を含む組成物を液体培地から得る方法であって、前記培地がＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の初期集団を含み、その中で
（１）該初期集団のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は一つ以上のシアル酸残基を有し、
（２）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１個あたりのシアル酸残基の数は初期集団内で異なり、
（３）該初期集団はＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および高分子量凝集体を含み、並びに
（４）該液体培地はＭＣＰ−１を含み、前記方法は
（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を発現している哺乳類細胞の培養物から液体培地を収集する工程；
（ｂ）該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を細胞成分から分離する工程；
（ｃ）該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子をＭＣＰ−１から分離する工程；
（ｄ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体をＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量凝集体から分離する工程；並びに
（ｅ）該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を二つ以上の画分に分離する工程であって、少なくとも一つの画分のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル比は少なくとも一つの他の画分よりも大きい工程を含み、
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を同時にまたは任意の順序で実施して、前記組成物を得ることを特徴とする方法。
【請求項２】
（ａ）該組成物のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が８．０以上であり、かつサイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下であり；並びに
（ｂ）該組成物が、３ｎｇ／ｍｇ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子）以下のＭＣＰ−１量を含むことを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
（ａ）該組成物のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が５．０以上であり、かつサイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が４．０面積％以下であり；並びに
（ｂ）該組成物が、５ｐｐｍ以下のＭＣＰ−１を含むことを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項４】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する方法であって、
（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳類細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程；
（ｉｉ）該可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、溶離されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のタンパク質産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、濃縮されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のタンパク質産物をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶離および濃縮されたタンパク質産物を得る工程；並びに
（ｖ）工程（ｉｖ）のタンパク質産物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する方法であって、
（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳類細胞を含む液体培養物の細胞培養上清を得る工程；
（ｉｉ）上清を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、溶離されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のタンパク質産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、濃縮されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のタンパク質産物をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶離および濃縮されたタンパク質産物を得る工程；並びに
（ｖ）工程（ｉｖ）のタンパク質産物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する工程（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、タンパク質１モルあたり≧８．０モルのシアル酸比を有している）を含み；その中で
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、３％未満が二量体形よりも大きなＣＴＬＡ４−Ｉｇ多量体であり、および
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物は、ＭＣＰ−１≦５ｎｇ／ｍｇ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体）の特徴を有する方法。
【請求項６】
（ａ）工程（ｉｉ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２５．７面積％以下である特徴を有しており、
（ｂ）工程（ｉｉｉ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下である特徴を有しており、
（ｃ）工程（ｉｖ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下である特徴を有しており、並びに
（ｄ）工程（ｖ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．０面積％以下である特徴を有している、請求項４の方法。
【請求項７】
（ａ）工程（ｉｉｉ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＭＣＰ−１が５６００ｎｇ／ｍｌ未満である特徴を有しており、
（ｂ）工程（ｉｖ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＭＣＰ−１が３８ｎｇ／ｍｌ未満である特徴を有しており、並びに
（ｃ）工程（ｖ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＭＣＰ−１が９．５ｎｇ／ｍｌ未満である特徴を有している、請求項４の方法。
【請求項８】
（ａ）工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを、
第一級、第二級、第三級、または第四級アミン官能基を含む陰イオン交換樹脂を有するカラム；
約７５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約３６０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファー；および
約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約８５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の溶離バッファーを用いて実施し、
（ｂ）工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを、
フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を含む疎水性相互作用樹脂；および
約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約８５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の単一の洗浄バッファーを用いて実施し、
（ｃ）工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーを、
タンパク質Ａを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂；
約２５ｍＭのトリスおよび約２５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファー；および
約１００ｍＭのグリシンを含み、ｐＨが約３．５の溶離バッファーを用いて実施し、並びに
（ｄ）工程（ｖ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを、
約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１２０ｍＭのＮａＣｌ〜約１３０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファー；および
約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約２００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の溶離バッファーを用いて実施する、請求項４の方法。
【請求項９】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する方法であって、
（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳類細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程と、任意の順序の；
（ｉｉ）該可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶離された組成物を得る工程；
（ｉｉｉ）該可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶離および濃縮された組成物を得る工程；並びに
（ｉｖ）該可溶性画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶離および濃縮された組成物を得る工程を含み、その中で
該アフィニティークロマトグラフィー工程を最初に行うことを特徴とする方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーを、グアニジンまたは尿素を含む溶離バッファーを用いて実施する、請求項９の方法。
【請求項１１】
（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳類細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程；
（ｉｉ）該可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶離されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のタンパク質産物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、溶離および濃縮されたタンパク質産物を得る工程；並びに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のタンパク質産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含むさらに濃縮された組成物を得る工程を含むことを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｖ）で得られた組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定された高分子量種の割合が約２．５面積％未満であり、
細胞タンパク質の割合が約９５ｎｇ／ｍｌ未満であり、並びに
ＭＣＰ−１の割合が約５ｐｐｍ未満である特徴を有する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
（ａ）工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーを、
タンパク質Ａを含む樹脂；
約２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．５の洗浄バッファー；および
約２５０ｍＭのグリシンを含み、ｐＨが約３の溶離バッファーを用いて実施し；
（ｂ）工程（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを、
第一級、第二級、第三級、または第四級アミン官能基を含む陰イオン交換樹脂を有するカラム；
約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１３５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７の洗浄バッファー；および
約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約２００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７の溶離バッファーを用いて実施し；並びに
（ｃ）工程（ｉｖ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを、
フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を含む疎水性相互作用樹脂；および
約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１．２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含み、ｐＨが約７の洗浄バッファーを用いて実施する、請求項１１の方法。
【請求項１４】
該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が配列番号２、５、６、７、８、９または１０を有する一つ以上のポリペプチドを含む、請求項１０〜１３のいずれか一つの方法。
【請求項１５】
該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が配列番号１８を有する一つ以上のポリペプチドを含む、請求項１０〜１３のいずれか一つの方法。
【請求項１６】
該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が配列番号４、１１、１２、１３、１４、１５または１６を有する一つ以上のポリペプチドを含む、請求項１０〜１３のいずれか一つの方法。
【請求項１７】
該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が配列番号２４を有する一つ以上のポリペプチドを含む、請求項１０〜１３のいずれか一つの方法。
【請求項１８】
請求項１０〜１３のいずれか一つの方法によって得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００５年１２月２０日に出願された米国出願番号６０／７５２，２６７、２００６年１０月５日に出願された米国出願番号６０／８４９，５４３、および２００５年１２月２０日に出願された米国出願番号６０／７５２，１５０の優先権を主張し、そのすべては本明細書によって、その全体が引用される。本願はまた、２００６年１２月１９日にＰＣＴ出願された代理人整理番号(Attorney Docket Number)１０７３９で「安定なタンパク質製剤」と題する特許出願の全体も引用する。
【０００２】
本明細書に引用されたすべての特許、特許出願および公報は、本明細書によってその全体が引用される。
【０００３】
この特許開示は、著作権保護に付される資料を含む。米国特許商標庁の特許包袋(patent file)または特許記録(patent record)に記載されているので、著作権者は、誰が特許文書または特許開示を複製(facsimile reproduction)しても異存はないが、それ以外は、いずれの、およびすべての著作権を留保する(reserve)。
【０００４】
発明の背景
細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、活性化Ｔ細胞によって発現される分子である。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞補助刺激分子ＣＤ２８に類似し、両分子は、抗原掲示細胞（ＡＰＣ）上のＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）に結合する。しかしながら、ＣＴＬＡ４はＴ細胞に阻害シグナルを伝達するのに対し、ＣＤ２８は刺激性シグナルを伝達する。
【０００５】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）のリガンド結合ドメインと、免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖定常部との融合タンパク質である。この可溶性分子は、様々な抗原掲示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＢ７抗原（ＣＤ８０およびＣＤ８６）に結合し、そのため、Ｂ７−１およびＢ７−２と、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８との機能的相互作用を遮断することによって、その生理的効果を発揮する。この遮断は、Ｔ細胞活性化の抑制をもたらし、それゆえ、免疫応答の抑制をもたらす。したがって、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、組織および／または臓器移植拒絶反応の阻害方法、並びに一般には不統制な免疫応答、例えば自己免疫に関する疾患または障害の治療用途を提供しうる。例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、
抗二本鎖ＤＮＡ抗体の産生を抑制し、狼瘡になりやすいマウスの腎炎を軽減し；
タンパク尿症を軽減し、進行性腎炎を有するマウスの生存を延長し；並びに
乾癬および関節リウマチについての臨床成績を改善しうる。
【０００６】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の治療上の有用性を改善するため、例えば、Ｂ７抗原についての分子の結合活性および効力を増大させることによって、Ｔ細胞刺激の阻害剤としての分子の有効性が亢進しうる分子改変を決定することが重要である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の結合活性および効力を増大させることによって、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少ない量を患者に投与して、目的の治療効果（すなわち、低用量の投与）を達成することが可能となりうる。またＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の結合活性および効力を増大させることによって、患者に投与される用量の回数または用量の頻度を減少させて、目的の治療効果を達成しうる。
【０００７】
発明の概要
本発明は、改善された組成物およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の製造方法に関する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む改善された組成物、並びにＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子および他の組換えタンパク質の改善された生成方法（大量生産を含む）に関する。
【０００８】
単独でまたは特定の組合せもしくは順列で記載されているかどうかにかかわらず、本発明には、本明細書に記載されたいずれの要素および特徴のいずれの順列および／または組合せも含まれる。
【０００９】
細胞：本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができるクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができるクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、各細胞には３０またはそれ以上のコピーのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットが含まれる。本発明はまた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができるクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団も提供し、各細胞には３０またはそれ以上のコピーのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットが含まれ、その中で、３０またはそれ以上のコピーは各細胞のゲノム中の単一部位に組み込まれている。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができるクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、その中で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットは約１０５継代にわたって安定である。一つの態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、その全体が本明細書に引用されるKoduri R., et al. (Gene, 2001, 280:87-95)並びに米国特許番号6,800,457および6,521,419に記載されている核酸配列を含む発現カセットによってコードされている。別の態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、その全体が本明細書に引用されるKoduri R., et al. (Gene, 2001, 280:87-95)並びに米国特許番号6,800,457および6,521,419に記載されている特定の部位で、細胞集団から細胞ゲノムに組み込まれている発現カセットによってコードされている。一つの態様において、集団には、３３またはそれ以上のコピーのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットを含む細胞の亜集団が含まれ、その中で、３３またはそれ以上のコピーは、亜集団の各細胞のゲノム中の単一部位に組み込まれている。
【００１０】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができるクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、その中で、少なくとも７５％の細胞集団は、３０またはそれ以上のコピーのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットを有しており、３０またはそれ以上のコピーは、７５％の集団の各細胞のゲノム中の単一部位に組み込まれている。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができるクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、その中で、少なくとも８５％の集団は、３０またはそれ以上のコピーのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットを有しており、３０またはそれ以上のコピーは、８５％の集団の各細胞のゲノム中の単一部位に組み込まれている。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができるクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、その中で、少なくとも９５％の集団は、３０またはそれ以上のコピーのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットを有しており、３０またはそれ以上のコピーは、９５％の集団の各細胞のゲノム中の単一部位に組み込まれている。一つの態様において、培養液１リットルあたり、細胞集団は、０．５グラムまたはそれ以上のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生することができ、その中で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇのモル比が、１，０００Ｌまたはそれ以上の培養スケールで約６から約１４である、許容される糖（炭水化物）の特徴を示す。別の態様において、細胞集団は、無血清の既知組成培地に適合されている。別の態様において、細胞集団の培養液から産生されるＣＴＬＡ４−Ｉｇは、１．００±０．０５ ＡＵ ｍＬ ｃｍ-1 ｍｇ-1の吸光係数(extinction coefficient)を有する。別の態様において、細胞集団は、培養液内で成長する場合、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを産生することができ、その中で：
（ａ）約９０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基２７でメチオニンから始まる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれ；
（ｂ）約１０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基番号２６でアラニンから始まる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれ；
（ｃ）約４％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基番号３８３でリジンで終わる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれ、
（ｄ）約９６％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基番号３８２でグリシンで終わる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれ；および適宜、
（ｅ）約１％未満のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基番号２５でメチオニンから始まる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれる。
【００１１】
本発明は、クローン細胞の子孫細胞を提供し、その中で子孫細胞はＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生する。一つの態様において、子孫細胞は、少なくとも５世代にわたってクローンの親細胞を培養することで得られる。別の態様において、子孫細胞は、少なくとも１０世代にわたって、少なくとも２０世代にわたって、少なくとも４０世代にわたって、少なくとも５０世代にわたって、少なくとも７５世代にわたって、または少なくとも１００世代にわたって細胞を培養することで得られる。本発明は、クローン細胞から生じた細胞株を提供する。一つの態様において、細胞株はクローンである。本発明は：
（ａ）配列番号：１０のアミノ酸配列（アミノ酸位置２７でメチオニン、およびアミノ酸位置３８２でグリシン；図１Ａおよび１Ｂ）を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質；
（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列（アミノ酸位置２７でメチオニン、およびアミノ酸位置３８３でリジン；図１Ａおよび１Ｂ）を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質；
（ｃ）配列番号：９のアミノ酸配列（アミノ酸位置２６でアラニン、およびアミノ酸位置３８２でグリシン；図１Ａおよび１Ｂ）を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質；
（ｄ）配列番号：６のアミノ酸配列（アミノ酸位置２６でアラニン、およびアミノ酸位置３８３でリジン；図１Ａおよび１Ｂ）を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質；
（ｅ）配列番号：８のアミノ酸配列（アミノ酸位置２５でメチオニン、およびアミノ酸位置３８２でグリシン；図１Ａおよび１Ｂ）を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質；または
（ｆ）配列番号：５のアミノ酸配列（アミノ酸位置２５でメチオニン、およびアミノ酸位置３８３でリジン；図１Ａおよび１Ｂ）を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を産生することができる細胞株を提供する。別の態様において、細胞株は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を産生することができ、その中で：
（ａ）約９０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基２７でメチオニンから始まる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれ；
（ｂ）約１０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基番号２６でアラニンから始まる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれ；
（ｃ）約４％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基番号３８３でリジンで終わる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれ、
（ｄ）約９６％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基番号３８２でグリシンで終わる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれ；および適宜、
（ｅ）約１％未満のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドには、残基番号２５でメチオニンから始まる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれる。
【００１２】
一つの態様において、細胞株の培養液から産生されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、１．００±０．０５ ＡＵ ｍＬ ｃｍ-1 ｍｇ-1の吸光係数を有する。本発明は、クローン細胞株由来の細胞集団を提供する。態様において、最初の(original)クローン細胞株と比較して、細胞集団は少なくとも一つの別の遺伝子変化からなり、その中で生じた細胞集団は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができる。別の態様において、細胞集団は、親細胞と比較して、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または少なくとも２０個の別の遺伝子変化からなり、その中で生じた細胞集団は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができる。一つの態様において、遺伝子変化には、細胞ゲノム中、またはＣＴＬＡ４−Ｉｇをコードする組換え発現カセット中、少なくとも一つの非保存的な変異が含まれる。別の態様において、遺伝子変化には、細胞内に少なくとも一つの別の組換え核酸が含まれる。さらなる態様において、変化には細胞ゲノムの変異が含まれる。別の態様において、変化には、細胞ゲノムに核酸を加えるか、またはトランスフェクトした核酸(trans nucleic acid)として加えることが含まれ、それは抗アポトーシスのポリペプチドをコードする。別の態様において、抗アポトーシスのポリペプチドは、グリコシル化に関連する。別の態様において、遺伝子変化には、細胞ゲノムの少なくとも一つの変異、またはＣＴＬＡ４−Ｉｇをコードする組換え発現カセットの少なくとも一つの変異が含まれる。
【００１３】
組成物：本発明は、約６から約１８の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマー（二量体）または分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約８から約１８の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約１１から約１８の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約１２から約１８の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約１３から約１８の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約１４から約１８の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約１５から約１７の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約１６の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供し、その中で、９５％超の分子はＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーである。一つの態様において、９８％超の分子はＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーである。別の態様において、９９％超の分子はＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーである。別の態様において、９９．５％超の分子はＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーである。別の態様において、約９５％から約９９．５％の分子はＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーであり、約０．５％から約５％の分子はＣＴＬＡ４−Ｉｇテトラマーまたは高分子量種である。別の態様において、約９８．６％の分子はＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーであり、約１．２％の分子はＣＴＬＡ４−Ｉｇテトラマーまたは高分子量種であり、約０．７％未満の分子はＣＴＬＡ４−Ｉｇモノマー（単量体）である。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーからなる群を提供する。本発明はＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供し、その中で、集団にはＣＴＬＡ４−Ｉｇモノマーが実質的に含まれない。本発明はＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供し、その中で、分子の集団にはＣＴＬＡ４−Ｉｇテトラマーが実質的に含まれない。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーおよびテトラマーが実質的に含まれないＣＴＬＡ４−Ｉｇモノマー分子の集団を提供する。一つの態様において、各ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーの各モノマーは、少なくとも３個のシアル酸残基を有する。別の態様において、各ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーの各モノマーは、少なくとも３個のシアル酸残基から少なくとも８個のシアル酸残基を有する。本発明は、生成されたＣＴＬＡ４−Ｉｇテトラマー分子の集団を提供し、集団にはＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーが実質的に含まれず、適宜その中で、集団には約１００グラム超の量が含まれる。本発明は、生成されたＣＴＬＡ４−Ｉｇテトラマー分子の集団を提供し、集団にはＣＴＬＡ４−Ｉｇモノマーが実質的に含まれず、適宜その中で、集団には約１００グラム超の量が含まれる。一つの態様において、各テトラマー分子には、２対のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが含まれ、その中で、各ポリペプチドは配列番号：５〜１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有しており、ポリペプチド対の各メンバーは、他のメンバーと共有結合しており、２対のポリペプチドは互いに非共有結合している。別の態様において、各テトラマー分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６に結合することができる。さらなる態様において、各テトラマー分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマー分子と比較して、少なくとも２倍の大きさのＣＤ８０またはＣＤ８６についての結合活性を有する。別の態様において、各テトラマー分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマー分子と比較して、少なくとも２倍の大きさのＴ細胞増殖または活性化の阻害を有する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、組成物には、等電点電気泳動で決定されるように、５．１未満またはそれと等しい等電点，ｐＩを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの等電点電気泳動ゲル上で視覚化できる支配的なアイソフォーム（優勢アイソフォーム）が含まれる。一つの態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、組成物には、等電点電気泳動で決定されるように、５．８未満またはそれと等しい等電点，ｐＩを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの等電点電気泳動ゲル上で視覚化できる支配的なアイソフォームが含まれる。一つの態様において、ｐＩはノイラミニダーゼ処理の後に増大する。一つの態様において、組成物には、等電点電気泳動で決定されるように、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、４．７、４．６、または４．５未満またはそれと等しい等電点，ｐＩを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの等電点電気泳動ゲル上で視覚化できる支配的なアイソフォームが含まれる。別の態様において、少なくとも４０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、等電点電気泳動で決定されるように、約５．１未満またはそれと等しい等電点を示す。別の態様において、少なくとも７０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、等電点電気泳動で決定されるように、約５．１未満またはそれと等しい等電点を示す。別の態様において、少なくとも９０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、等電点電気泳動で決定されるように、約２．５未満またはそれと等しい等電点を示す。本発明は、約２．０±０．２から約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約４．０±０．２から約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約４．３±０．２から約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約３．３±０．２から約４．７±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、組成物の製造方法を提供し、組成物には、約２．０±０．２から約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が含まれ、該方法は：
（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の混合物を等電点電気泳動ゲル電気泳動に付し、その中で、ゲル上の一つのバンドは、特定のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を表し、および
（ｂ）組成物を製造するために、約２．０±０．２から約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を単離することを特徴とする。
【００１４】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、約１５から約３５の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、約１．７から約３．６の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、約８から約１７の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、約３．５から約８．３の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのフコースの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、約７．２から約２２の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのマンノースの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、約６から約１２の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有する。
【００１５】
本発明は：
（ａ）約１５から約３５の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；並びに
（ｂ）約６から約１２の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は：
（ａ）約１５から約３５の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約１．７から約３．６の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；並びに
（ｃ）約６から約１２の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は：
（ａ）約１５から約３５の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約１．７から約３．６の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；
（ｃ）約８から約１７の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；並びに
（ｄ）約６から約１２の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は：
（ａ）約１５から約３５の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約１．７から約３．６の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；
（ｃ）約８から約１７の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｄ）約３．５から約８．３の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのフコースの平均モル比；並びに
（ｅ）約６から約１２の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は：
（ａ）約１５から約３５の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約１．７から約３．６の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；
（ｃ）約８から約１７の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｄ）約３．５から約８．３の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたりのフコースの平均モル比；
（ｅ）約７．２から約２２の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたりのマンノースの平均モル比；並びに
（ｆ）約６から約１２の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、組成物は約９．５８９＋／−０．３のＮＧＮＡクロマトグラムピークおよび約１０．５４３＋／−０．３のＮＡＮＡクロマトグラムピークを示す。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、ＣＴＬＡ−Ｉｇ分子は、図６８に示される糖プロフィール（炭水化物プロフィール）(carbohydrate profile)を示す。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供し、その中で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、ドメインＩ〜Ｖ（例えば、Ｉ〜ＩＶ）の糖プロフィールを示し、ドメインＩには、ａ−シアル酸付加オリゴ糖（ａ−シアル化オリゴ糖、ａ−シアリル化オリゴ糖）を表すピークが含まれ、ドメインＩＩには、モノシアル酸付加オリゴ糖（モノ−シアル化オリゴ糖、モノ−シアリル化オリゴ糖）を表すピークが含まれ、ドメインＩＩＩには、ジシアル酸付加オリゴ糖（ジ−シアル化オリゴ糖、ジ−シアリル化オリゴ糖）を表すピークが含まれ、およびドメインＩＶには、トリシアル酸付加オリゴ糖（トリ−シアル化オリゴ糖、トリ−シアリル化オリゴ糖）を表すピークが含まれる。ドメインＶには、テトラシアル酸付加オリゴ糖（テトラ−シアル化オリゴ糖、テトラ−シアリル化オリゴ糖）を表すピークが含まれる。一つの態様において、ドメインＩにおける第１ピークと、ドメインＩＩにおけるメインピークとの間のＮ結合型オリゴ糖の保持時間の差は、約２２から約２８分である。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマー分子を含む組成物を提供し、その中で、少なくとも０．５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマー分子はシステイン付加(cysteinylate)されている。一つの態様において、少なくとも１．０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマー分子はシステイン付加されている。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供し、その中で、集団は図８および１０に示される質量分析プロフィールを示す。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供し、その中で、集団は図２０および２１に示されるキャピラリー電気泳動プロフィールを示す。本発明は、約６から約１８の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーの平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物を提供する。本発明は、本明細書に記載されるいずれの方法によっても得られるＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供し、その中で、該分子は、配列番号：２の１０２位のアスパラギンアミノ酸残基で、配列番号：２の１３４位のアスパラギンアミノ酸残基で、配列番号：２の２３３位のアスパラギンアミノ酸残基で、配列番号：２の１５５位のセリンアミノ酸残基で、または配列番号：２の１６５位のセリンアミノ酸残基でグリコシル化される。
【００１６】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供し、その中で、分子の集団は：
（ａ）約１５から約３５の、ＣＴＬＡ４−ＩｇダイマーまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約１．７から約３．６の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；
（ｃ）約８から約１７の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｄ）約３．５から約８．３の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたりのフコースの平均モル比；
（ｅ）約７．２から約２２の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたりのマンノースの平均モル比；
（ｆ）約６から約１２の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比；
（ｇ）約２．４±０．２から約５．０±０．２の範囲で等電点電気泳動ゲルについての可視化から決定されるｐＩ；
（ｈ）５ｐｐｍ未満またはそれと等しいＭＣＰ−１；
（ｉ）３．０％未満のテトラマー（例えば、２．５％ 高分子量種またはテトラマー、２．０％ 高分子量種またはテトラマー）；
（ｊ）０．５％未満のモノマー；
（ｋ）配列番号：２〜８のいずれとも少なくとも９５％同一のアミノ酸を有する集団のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチド；
（ｌ）その中で、集団中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子がＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することができる特徴を有する。
【００１７】
組成物：本発明は、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の有効量および医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明は、２００５年１２月２０日に出願された米国出願番号６０／７５２，１５０に記載された賦形剤を含む組成物を提供する。一つの態様において、組成物にはＣＴＬＡ４−Ｉｇが含まれる。一つの態様において、組成物にはさらに医薬的に許容される希釈剤、添加剤または担体が含まれる。別の態様において、組成物にはさらに、マルトース、リン酸二水素ナトリウム一水和物(sodium phosphate monobasic monohydrate)、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、および滅菌水が含まれる。別の態様において、組成物には、ショ糖、ポロキサマー、リン酸二水素ナトリウム一水和物、無水リン酸水素二ナトリウム(sodium phosphate dibasic anhydrous)、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、および滅菌水が含まれる。
【００１８】
製剤およびキット：本発明は、少なくとも９５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマー、および多くて５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇテトラマーを含む凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を提供する。一つの態様において、混合物には、少なくとも９８％のＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーおよびわずか２％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種もしくはテトラマーが含まれる。別の態様において、混合物には、少なくとも９９％のＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーおよびわずか１％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種もしくはテトラマーが含まれる。別の態様において、混合物には、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたり少なくとも８．０モルのシアル酸が含まれる。別の態様において、混合物には、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたり約１５．７から約３１モルのＧｌｃＮＡｃが含まれる。別の態様において、混合物には、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたり約１．６から約３．２モルのＧａｌＮＡｃが含まれる。別の態様において、混合物には、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたり約９．３から約１５．５モルのガラクトースが含まれる。一つの態様において、混合物には、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたり約３．６から約７．９モルのフコースが含まれる。一つの態様において、混合物には、ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子１モルあたり約９．７モルのマンノースが含まれる。本発明はまた：
（ａ）本発明の凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を含む容器；および
（ｂ）凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を注射用溶液へと再構成するための指示書を含む医薬キットも提供する。
【００１９】
治療方法の例：本発明は、Ｔ細胞増殖（または活性化）の阻害方法、Ｔ細胞を本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量と接触させることを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における免疫応答の阻害方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における抗原への免疫寛容の誘導方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における炎症の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする関節リウマチの治療方法を提供する。本発明は、患者における乾癬の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者におけるループスの治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者におけるアレルギーの治療または予防方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における移植片対宿主病の治療または予防方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における移植器官の拒絶の治療または予防方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における多発性硬化症の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者におけるクローン病の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者におけるＩ型糖尿病の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における炎症性腸疾患の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における卵巣炎の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における糸球体腎炎の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者におけるアレルギー性脳脊髄炎の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における重症筋無力症の治療方法、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。
【００２０】
本発明は、免疫障害の治療的および／または予防的処置のための薬物の製造において、約６から約１８の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団の使用を提供する。本発明は、関節リウマチの治療におけるその使用のための指示書と共に、包装した抗関節リウマチ薬の製造において、約６から約１８の、シアル酸残基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマーまたは分子の平均モル比を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団の使用を提供する。
【００２１】
併用療法の例：本発明は、Ｔ細胞増殖（または活性化）の阻害方法、メトトレキセートと併用してＴ細胞を本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量と接触させることを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における免疫応答の阻害方法、メトトレキセートと併用して本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、患者における抗原への免疫寛容の誘導方法、メトトレキセートと併用して本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする方法を提供する。
【００２２】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇの製造方法：本発明は、組換えタンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞（哺乳動物細胞）を増殖(expand)させ、ここで該増殖は種培養(seed culture)から液体培養（液体培養物）へ行われ、組換えタンパク質の濃度は少なくとも０．５グラム／Ｌ（培養液）であり；並びに
（ｂ）培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とする。培養液は、少なくとも１，０００Ｌ、少なくとも５，０００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、少なくとも１５，０００Ｌ、少なくとも２０，０００Ｌ、少なくとも２５，０００Ｌ、少なくとも３０，０００Ｌ、少なくとも４０，０００Ｌでありうる。一つの態様において、増殖段階（ａ）は：
（ｉ）１ｍＬあたり少なくとも約１．０×１０5個の生細胞の細胞密度が得られるように、少なくとも４回継代して無血清の既知組成培地中で細胞を培養し、その中で、各播種段階(seed stage)を１ｍＬあたり約２×１０5個で開始し、１ｍｌあたり１００〜２００万個の細胞まで行い；
（ｉｉ）少なくとも約０．５ｇ／Ｌで培養液から産生するのに十分な時間、培養液中の細胞を維持することを特徴とする。一つの態様において、タンパク質は糖タンパク質である。一つの態様において、タンパク質はＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質である。一つの態様において、哺乳類細胞は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を生ずることができるＣＨＯクローン細胞株の子孫であり、その中で、ＣＨＯ細胞はそのゲノム中に少なくとも３０コピーのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットを安定に組み込んでいる。一つの態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が３０％を下回らない時間である。別の態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が４０％を下回らない時間である。別の態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が５０％を下回らない時間である。別の態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が６０％を下回らない時間である。別の態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が７０％、８０％、９０％または９５％を下回らない時間である。
【００２３】
さらなる態様において、少なくとも４回の継代は：
（ｉ）１ｍＬあたり約１００万から約２５０万個の細胞の細胞密度に達するまで、少なくとも５０ｍＬの培養容積中で細胞を成長させ；
（ｉｉ）１ｍＬあたり約１００万から約２５０万個の細胞の細胞密度に達するまで、少なくとも１０Ｌの培養容積中で細胞を成長させ；
（ｉｉｉ）１ｍＬあたり約１００万から約２５０万個の細胞の細胞密度に達するまで、少なくとも１００Ｌの培養容積中で細胞を成長させ；および
（ｉｖ）１ｍＬあたり約１００万から約２５０万個の細胞の細胞密度に達するまで、２００Ｌの培養容積中で細胞を成長させることを特徴とする。一つの態様において、ガラクトースを無血清の既知組成培地に加える。一つの態様において、該維持は、
（ｉ）３７±２℃から３４±２℃に培養液の温度を下げ；および
（ｉｉ）３４±２℃から３２±２℃に培養液の温度を下げることを特徴とする。別の態様において、少なくとも５日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも６日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも７日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも８日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも９日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１０日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１１日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１２日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１３日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１４日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１５日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１６日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１７日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１８日間、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、１８日間まで温度を３２±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、培養液の細胞密度が、培養液１ｍＬあたり約３０×１０5から約７９×１０5個の細胞になるまで、温度を３２±２℃の範囲内に保つ。
【００２４】
本発明は、組換えタンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換えタンパク質の濃度が少なくとも０．５グラム／Ｌの培養液となるように、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞を種培養から液体培養へ増殖させ；並びに
（ｂ）培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とし、その中で、単離は、培養液がＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質またはダイマー１モルあたり約６．０モル超またはそれと等しいＮＡＮＡを含む場合のみ起こる。本発明は、組換えタンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換えタンパク質の濃度が少なくとも０．５グラム／Ｌの培養液となるように、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞を種培養から液体培養へ増殖させ；並びに
（ｂ）培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とし、その中で、単離は、培養液が１ｍＬあたり約３３×１０5から約７９×１０5個の細胞の細胞密度を有する場合のみ起こる。本発明は、組換えタンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換えタンパク質の濃度が少なくとも０．５グラム／Ｌの培養液となるように、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞を種培養から液体培養へ増殖させ；並びに
（ｂ）培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とし、その中で、単離は、培養液における細胞生存率が、約２０％、約３０％、または約３８％を下回っていない場合に起こる。本発明は、組換えタンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換えタンパク質の濃度が少なくとも０．５グラム／Ｌの培養液となるように、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞を種培養から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養へ増殖させ；並びに
（ｂ）培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とし、その中で、単離は、エンドトキシンが培養液１ｍＬあたり約７６．８ＥＵ未満またはそれと等しい場合のみ起こる。本発明は、組換えタンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換えタンパク質の濃度が少なくとも０．５グラム／Ｌの培養液となるように、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞を種培養から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養へ増殖させ；並びに
（ｂ）少なくとも１０，０００Ｌの培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とし、その中で、単離は、バイオバーデンが培養液１ｍＬあたり１コロニー形成単位未満である場合のみ起こる。本発明の培養液は、少なくとも５，０００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、少なくとも１５，０００Ｌ、少なくとも２０，０００Ｌ、少なくとも２５，０００Ｌ、少なくとも３０，０００Ｌ、少なくとも４０，０００Ｌ、少なくとも５０，０００Ｌ、少なくとも６０，０００Ｌの容積でありうる。
【００２５】
本発明は、組換えタンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換えタンパク質の濃度が少なくとも０．５グラム／Ｌの培養液となるように、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞を種培養から液体培養へ増殖させ；並びに
（ｂ）培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とし、その中で、単離は、以下の条件の少なくとも２つが満たされた場合のみ起こる：
（ｉ）培養液が、タンパク質１モルあたり約６．０モル超またはそれと等しいＮＡＮＡを含み、
（ｉｉ）培養液が、１ｍＬあたり約３３×１０5から約７９×１０5個の細胞の細胞密度を有しており、
（ｉｉｉ）培養液中の細胞生存率が、約２０％、または約３８％を下回っておらず、
（ｉｖ）培養液中のＣＴＬＡ４−Ｉｇの量が０．５ｇ／Ｌを超えている。一つの態様において、該単離は：
（ｉ）細胞培養液の上澄みを得；
（ｉｉ）上澄みを陰イオン交感クロマトグラフィーに供して、溶離（溶出）したタンパク質産物を得；
（ｉｉｉ）濃縮したタンパク質産物が得られるように、段階（ｉｉ）の溶離したタンパク質生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し；
（ｉｖ）濃縮したタンパク質産物をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶離し、濃縮したタンパク質産物を得；および
（ｖ）  （ｉｖ）の溶離し、濃縮したタンパク質産物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供することを特徴とする。別の態様において、段階（ｉｉｉ）で得られる濃縮したタンパク質産物は、いずれの高分子量の混入物(contaminant)の割合も２５重量％未満であるという特徴を有している。別の態様において、約７５ｍＭ ヘペス、および約３６０ｍＭ ＮａＣｌを含み、約８．０のｐＨを有する洗浄緩衝液（洗浄バッファー）を用いて、段階（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。別の態様において、約２５ｍＭ ヘペス、および約３２５ｍＭ ＮａＣｌを含み、約７．０のｐＨを有する溶離緩衝液を用いて、段階（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。別の態様において、約２５ｍＭ ヘペス、および約８５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、約７．０のｐＨを有する単一洗浄緩衝液を用いて、段階（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う。別の態様において、約２５ｍＭ トリス、および約２５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、約８．０のｐＨを有する洗浄緩衝液を用いて、段階（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーを行う。別の態様において、約１００ｍＭ グリシンを含み、約３．５のｐＨを有する溶離緩衝液を用いて、段階（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーを行う。別の態様において、約２５ｍＭ ヘペス、および約１２０ｍＭ ＮａＣｌから約１３０ｍＭ ＮａＣｌを含み、約８．０のｐＨを有する洗浄緩衝液を用いて、段階（ｖ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。別の態様において、約２５ｍＭ ヘペス、および約２００ｍＭ ＮａＣｌを含み、約８．０のｐＨを有する溶離緩衝液を用いて、段階（ｖ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。別の態様において、一級、二級、三級、または四級アミン官能基を有する陰イオン交換樹脂を有するカラムを用いて、段階（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。別の態様において、樹脂は四級アミン官能基を有する。別の態様において、フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を有する疎水性相互作用樹脂を用いて、段階（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う。別の態様において、官能基はフェニル官能基である。別の態様において、タンパク質Ａを含むカラムを用いて、段階（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーを行う。
【００２６】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの製造方法を提供し、該方法は、精製したＣＴＬＡ４−Ｉｇが、
（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇダイマー１ｍｇあたり約３８ｎｇのＭＣＰ−１を有しており、および
（ｂ）２．５重量％未満のＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種（例えば、テトラマー）を含むように、細胞培養液からＣＴＬＡ４−Ｉｇを精製することを特徴とする。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができる子孫細胞またはＣＨＯ細胞を増殖させ、ここで該増殖は種培養から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養へ行われ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの濃度は少なくとも０．５グラム／Ｌ（培養液）であり；並びに
（ｂ）少なくとも１０，０００Ｌの培養液からＣＴＬＡ４−Ｉｇを単離し、その中で
、クロマトグラフィーを少なくともフェニル官能基を有する疎水性相互作用樹脂を有するカラムについて行い、単離は、約２５ｍＭ ヘペス、および約８５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、約７．０のｐＨを有する単一洗浄緩衝液を用いて行われる疎水性相互作用クロマトグラフィーの段階を含むことを特徴とする。
【００２７】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子には、ベータポリペプチド分子が含まれる。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇはベータポリペプチド分子である。本発明は、ベータポリペプチド組成物もしくはベータポリペプチド分子組成物、および改良された組成物の生産方法（大量生産を含む）に関する。本発明は、ベータポリペプチド分子、ベータポリペプチド分子を含む改良された組成物、並びにベータポリペプチド分子および他の組換え糖タンパク質の改良された生産方法（大量生産を含む）に関する。
【００２８】
ベータポリペプチドおよび他の糖タンパク質の生産方法：本発明は、組換え糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換え糖タンパク質を分泌する哺乳類細胞を増殖させ、ここで該増殖は種培養から少なくとも約１０，０００Ｌの液体培養へ行われ、組換えタンパク質の濃度は少なくとも０．５ｇ／Ｌ（培養液）であり；増殖は：
（ｉ）１ｍＬあたり少なくとも約１．０×１０5個の生細胞の細胞密度が得られるように少なくとも４回継代して無血清の既知組成培地中で細胞を培養し、その中で、各播種段階を１ｍＬあたり約２×１０5個で開始し、１ｍｌあたり１００万〜２００万個の細胞になるまで行い、培養は：
（１）約１５日から約２５日間、無血清の既知組成接種培地中で細胞を培養し；次いで
（２）１ｍＬあたり少なくとも約４００万個の細胞の細胞密度に達するまで、無血清の既知組成基本培地中で細胞を培養することを特徴とし；並びに
（ｉｉ）培養液から少なくとも約０．５ｇ／Ｌの組換えタンパク質を産生するのに十分な時間、培養液中で細胞を維持することを特徴とし；並びに
（ｂ）少なくとも約１０，０００Ｌの培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とする。
【００２９】
本発明は、組換え糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換え糖タンパク質を分泌する哺乳類細胞を増殖させ、ここで該増殖は種培養から少なくとも約１０，０００Ｌの液体培養へ行われ、組換えタンパク質の濃度は少なくとも０．５ｇ／Ｌ（培養液）であり；増殖は：
（ｉ）１ｍＬあたり少なくとも約１．０×１０5個の生細胞の細胞密度が得られるように少なくとも４回継代して無血清の既知組成培地中で細胞を培養し、その中で、各播種段階を１ｍＬあたり約２×１０5個で開始し、１ｍｌあたり約１００〜２００万個の細胞まで行い；並びに
（ｉｉ）培養液から少なくとも約０．５ｇ／Ｌの組換えタンパク質を産生するのに十分な時間、培養液中で細胞を維持することを特徴とし、維持は：
（１）３７±２℃から３４±２℃に培養液の温度を下げ；および
（２）ポリアニオン性化合物を培養液に加えることを特徴とし；並びに
（ｂ）少なくとも約１０，０００Ｌの培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とする。
【００３０】
本発明は、組換え糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）組換え糖タンパク質を分泌する哺乳類細胞を増殖させ、ここで該増殖は種培養から少なくとも約１０，０００Ｌの液体培養へ行われ、組換えタンパク質の濃度は少なくとも０．５ｇ／Ｌ（培養液）であり；並びに
（ｂ）少なくとも約１０，０００Ｌの培養液から組換えタンパク質を単離することを特徴とし、単離は：
（ｉ）段階（ａ）の培養液の可溶性画分を得；
（ｉｉ）可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶離したタンパク質産物を得；
（ｉｉｉ）溶離し、濃縮したタンパク質産物が得られるように、段階（ｉｉ）の溶離したタンパク質産物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供し；並びに
（ｉｖ）濃縮したタンパク質産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、濃縮したタンパク質産物を得ることを特徴とする。
【００３１】
本発明の一つの態様において、タンパク質にはＣＴＬＡ４−Ｉｇが含まれる。別の態様において、タンパク質にはベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子が含まれる。別の態様において、タンパク質には、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６を有するベータポリペプチドが含まれる。
【００３２】
本発明の一つの態様において、少なくとも４回の継代は：
（ｉ）１ｍＬあたり約１００万から約２５０万個の細胞の細胞密度に達するまで、少なくとも５０ｍＬの培養容積中で細胞を成長させ；
（ｉｉ）１ｍＬあたり約１００万から約２５０万個の細胞の細胞密度に達するまで、少なくとも１０Ｌの培養容積中で細胞を成長させ；
（ｉｉｉ）１ｍＬあたり約１００万から約２５０万個の細胞の細胞密度に達するまで、少なくとも１００Ｌの培養容積中で細胞を成長させ；および
（ｉｖ）１ｍＬあたり約１００万から約２５０万個の細胞の細胞密度に達するまで、２００Ｌの培養容積中で細胞を成長させることを特徴とする。
【００３３】
本発明の一つの態様において、単離は：
（ｉ）段階（ａ）の培養液の可溶性画分を得；
（ｉｉ）可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶離したタンパク質産物を得；
（ｉｉｉ）溶離し、濃縮したタンパク質産物が得られるように、段階（ｉｉ）の溶離したタンパク質産物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供し；並びに
（ｉｖ）濃縮したタンパク質産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、濃縮したタンパク質産物を得ることを特徴とする。
【００３４】
一つの態様において、段階（ｉｖ）で得られる濃縮したタンパク質産物は、いずれの高分子量マルチマー（多量体）の割合も２５重量％未満であるという特徴を有している。別の態様において、約５０ｍＭ ヘペス、および約１３５ｍＭ ＮａＣｌを含み、約７のｐＨを有する洗浄緩衝液を用いて、段階（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。別の態様において、約５０ｍＭ ヘペス、および約２００ｍＭ ＮａＣｌを含み、約７のｐＨを有する溶離緩衝液を用いて、段階（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。別の態様において、約５０ｍＭ ヘペス、および約１．２Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4を含み、約７のｐＨを有する洗浄緩衝液を用いて、段階（ｉｖ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う。別の態様において、約２５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、および約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、約７．５のｐＨを有する洗浄緩衝液を用いて、段階（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーを行う。別の態様において、約２５０ｍＭ グリシンを含み、約３のｐＨを有する溶離緩衝液を用いて、段階（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーを行う。別の態様において、一級、二級、三級、または四級アミン官能基を有する陰イオン交換樹脂を有するカラムを用いて、段階（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。別の態様において、樹脂は四級アミン官能基を有する。別の態様において、フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を有する疎水性相互作用樹脂を用いて、段階（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う。別の態様において、官能基はフェニル官能基である。別の態様において、タンパク質Ａを含むカラムを用いて、段階（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーを行う。
【００３５】
別の態様において、増殖は：
（ｉ）１ｍＬあたり少なくとも約１．０×１０5個の生細胞の細胞密度が得られるように、少なくとも４回継代して無血清の既知組成培地中で細胞を培養し、その中で、各播種段階を１ｍＬあたり約２×１０5個で開始し、１ｍｌあたり１００〜２００万個の細胞まで行い；並びに
（ｉｉ）少なくとも約０．５ｇ／Ｌで培養液から組換えタンパク質を産生するのに十分な時間、培養液中の細胞を維持することを特徴とする。別の態様において、培養は：
（ｉ）約１５日から約２５日間、無血清の既知組成接種培地中で細胞を培養し；次いで
（ｉｉ）１ｍＬあたり少なくとも約４００万個の細胞の細胞密度に達するまで、無血清の既知組成基本培地中で細胞を培養することを特徴とする。
【００３６】
別の態様において、維持は：
（ｉ）３７±２℃から３４±２℃に培養液の温度を下げ；並びに
（ｉｉ）ポリアニオン性化合物を培養液に加えることを特徴とする。一つの態様において、ポリアニオン性化合物はデキストラン硫酸であり、その中で、デキストラン硫酸を約５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で培養液に加える。別の態様において、少なくとも５日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも６日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも７日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも８日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも９日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１０日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１１日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１２日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１３日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１４日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１５日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１６日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１７日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１８日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも１９日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも２０日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも２１日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも２２日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも２３日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも２４日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも２５日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも２６日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも２７日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、少なくとも２８日間、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。別の態様において、２８日間まで、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。培養液の細胞密度が、培養液１ｍＬあたり約３０×１０5から約７９×１０5個の細胞になるまで、温度を３４±２℃の範囲内に保つ。
【００３７】
一つの態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が３０％を下回らない時間である。別の態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が４０％を下回らない時間である。別の態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が５０％を下回らない時間である。別の態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が６０％を下回らない時間である。別の態様において、十分な時間は、それによって細胞の生存率が７０％、８０％、９０％または９５％を下回らない時間である。
【００３８】
一つの態様において、ガラクトースを無血清の既知組成培地に加える。別の態様において、単離は、培養液がタンパク質１モルあたり約６モル超またはそれと等しいシアル酸を含む場合に起こる。別の態様において、単離は、培養液がタンパク質１モルあたり約５．２から約７．６モルのシアル酸を含む場合に起こる。別の態様において、単離は、培養液が１ｍＬあたり約３３×１０5から約７９×１０5個の細胞の細胞密度を有する場合に起こる。別の態様において、単離は、培養液中の細胞生存率が約３７％を下回っていない場合に起こる。別の態様において、単離は、エンドトキシンが培養液１ｍＬあたり約４．８ＥＵ未満またはそれと等しい場合に起こる。別の態様において、単離は、バイオバーデンが培養液１ｍＬあたり約１未満のコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）である場合に起こる。別の態様において、単離は、以下の条件の少なくとも２つが満たされた場合に起こる：
（ｉ）培養液が、タンパク質１モルあたり約６モル超またはそれと等しいシアル酸を含み、
（ｉｉ）培養液が、１ｍＬあたり約３３×１０5から約７９×１０5個の細胞の細胞密度を有しており、
（ｉｉｉ）培養液中の細胞生存率が、約３７％を下回っておらず、
（ｉｖ）培養液中の糖タンパク質の量が０．４６ｇ／Ｌから０．７１ｇ／Ｌである。
【００３９】
一つの態様において、哺乳類細胞は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子のいずれの組合せも産生するチャイニーズハムスター卵巣クローン細胞株の子孫であり、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６が含まれ、各チャイニーズハムスター卵巣細胞は、そのゲノム中に配列番号：３を含む発現カセットの少なくとも３０コピーを安定に組み込んでいる。一つの態様において、培養液には、本発明の産生細胞株の細胞または子孫細胞が含まれる。
【００４０】
本発明は、本発明によって提供される方法で得られる配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６を含むベータポリペプチドを提供する。本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を含む組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、本発明によって提供される方法で得られる配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６が含まれる。本発明は、本発明によって提供される方法で得られるベータポリペプチドを提供する。
【００４１】
細胞：本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子をコードする核酸を含むクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞を提供する。本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を産生するクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供する。一つの態様において、ベータポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６が含まれる。本発明は、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６のアミノ酸配列をコードする発現カセットを含む核酸を含むクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞を提供する。一つの態様において、発現カセットには、配列番号：３が含まれる。本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を産生するクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、その中で、ベータポリペプチドは、２０００年６月１９日にブダペスト条約の規定の下でアメリカ培養細胞系統保存期間（ＡＴＣＣ）, 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110に寄託されたＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２１０４を有するプラスミド由来のヌクレオチド配列から発現される。
【００４２】
本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を産生するクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、各細胞には、３０またはそれ以上のコピーのベータポリペプチド発現カセットが含まれる。本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を産生するクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、各細胞には、３０またはそれ以上のコピーのベータポリペプチド発現カセットが含まれ、その中で、３０またはそれ以上のコピーは各細胞のゲノム中の単一部位に組み込まれている。本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を産生するクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、その中で、ベータポリペプチド発現カセットは約１０５継代にわたって安定である。一つの態様において、ベータポリペプチドは、細胞ゲノムに組み込まれる発現カセットでコードされる。
【００４３】
本発明は、ベータポリペプチドを産生するクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、その中で、少なくとも７５％の細胞集団は、１細胞あたり３０またはそれ以上のコピーのベータポリペプチド発現カセットを有しており、３０またはそれ以上のコピーは、７５％の集団の各細胞のゲノム中の単一部位に組み込まれる。本発明は、ベータポリペプチドを産生するクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、その中で、少なくとも８５％の細胞集団は、１細胞あたり３０またはそれ以上のコピーのベータポリペプチド発現カセットを有しており、３０またはそれ以上のコピーは、８５％の集団の各細胞のゲノム中の単一部位に組み込まれる。本発明は、ベータポリペプチドを産生するクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供し、その中で、少なくとも９５％の細胞集団は、１細胞あたり３０またはそれ以上のコピーのベータポリペプチド発現カセットを有しており、３０またはそれ以上のコピーは、９５％の集団の各細胞のゲノム中の単一部位に組み込まれる。一つの態様において、発現カセットは、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２１０４として寄託されているプラスミドに由来する。別の態様において、発現カセットには、配列番号：３の配列を有する核酸が含まれる。一つの態様において、細胞集団は、培養液１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのベータポリペプチドを産生し、その中で、ベータポリペプチドは、１，０００Ｌまたはそれ以上の培養スケールで約５．５から約８．５の、シアル酸対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子のモル比を有する。別の態様において、細胞集団は、培養液１リットルあたり少なくとも５、少なくとも１０または少なくとも２０グラムのベータポリペプチドを産生する。別の態様において、ベータポリペプチドは、１，０００Ｌまたはそれ以上の培養スケールで約５から約１０の、シアル酸対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子のモル比を有する。別の態様において、細胞集団は、無血清の既知組成培地に適合されている。別の態様において、細胞集団の培養液から産生したベータポリペプチドは、１．０±０．０５ ＡＵ ｍＬ ｃｍ-1 ｍｇ-1の吸光係数を有する。別の態様において、細胞集団は、培養液中で成長する場合、ベータポリペプチドを産生し、その中で：
（ａ）約９０％または約８０％のベータポリペプチドには、残基２７でメチオニンから始まる配列番号：４のアミノ酸配列が含まれ；
（ｂ）約１０％または約２０％のベータポリペプチドには、残基番号２６でアラニンから始まる配列番号：４のアミノ酸配列が含まれ；
（ｃ）約４％から約８％のベータポリペプチドには、残基番号３８３でリジンで終わる配列番号：４のアミノ酸配列が含まれ；
（ｄ）約９２％から約９６％のベータポリペプチドには、残基番号３８２でグリシンで終わる配列番号：４のアミノ酸配列が含まれ；および適宜、
（ｅ）約１％未満のベータポリペプチドには、残基番号２５でメチオニンから始まる配列番号：４のアミノ酸配列が含まれる。
【００４４】
本発明は、本発明の細胞集団の子孫細胞を提供し、その中で、子孫細胞はベータポリペプチドを産生する。一つの態様において、子孫細胞は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５世代にわたる細胞の培養から得られる。別の態様において、子孫細胞は、２７世代の細胞の培養から得られる。
【００４５】
本発明は、本発明によって提供されるいずれの細胞からも産生される細胞株を提供する。一つの態様において、細胞株はクローンである。一つの態様において、細胞株は：
（ａ）配列番号：１６のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２７でメチオニン、およびアミノ酸位置３８２でグリシン）を有するベータポリペプチド；
（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２７でメチオニン、およびアミノ酸位置３８３でリジン）を有するベータポリペプチド；
（ｃ）配列番号：１５のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２６でアラニン、およびアミノ酸位置３８２でグリシン）を有するベータポリペプチド；
（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２６でアラニン、およびアミノ酸位置３８３でリジン）を有するベータポリペプチド；
（ｅ）配列番号：１１のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２５でメチオニン、およびアミノ酸位置３８３でリジン）を有するベータポリペプチド；
（ｆ）配列番号：１４のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２５でメチオニン、およびアミノ酸位置３８２でグリシン）を有するベータポリペプチド；または
（ｇ）そのいずれの組合せも産生する。一つの態様において、細胞株は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を産生し、その中で：
（ａ）約９０％または約８０％のベータポリペプチドには、残基２７でメチオニンから始まる配列番号：４のアミノ酸配列が含まれ；
（ｂ）約１０％または約２０％のベータポリペプチドには、残基番号２６でアラニンから始まる配列番号：４のアミノ酸配列が含まれ；
（ｃ）約４％から約８％のベータポリペプチドには、残基番号３８３でリジンで終わる配列番号：４のアミノ酸配列が含まれ；
（ｄ）約９２％から約９６％のベータポリペプチドには、残基番号３８２でグリシンで終わる配列番号：４のアミノ酸配列が含まれ；および適宜、
（ｅ）約１％未満のベータポリペプチドには、残基番号２５でメチオニンから始まる配列番号：２のアミノ酸配列が含まれる。一つの態様において、細胞株の培養から産生されるベータポリペプチドは、１．０±０．０５ ＡＵ ｍＬ ｃｍ-1 ｍｇ-1の吸光係数を有する。
【００４６】
本発明は、本発明の細胞由来の細胞集団を提供する。一つの態様において、集団の細胞には、集団が生じた本発明の細胞と比較して、少なくとも一つの別の遺伝子変化が含まれ、その中で、細胞はベータポリペプチドを産生する。別の態様において、集団の細胞には、集団が生じた本発明の細胞と比較して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも２０個の別の遺伝子変化が含まれ、その中で、細胞はベータポリペプチドを産生する。一つの態様において、遺伝子変化には、細胞ゲノム中またはベータポリペプチドをコードする発現カセット中に、少なくとも一つの非保存的変異が含まれる。別の態様において、遺伝子変化には、細胞内に少なくとも一つの別の組換え核酸が含まれる。別の態様において、遺伝子変化には、細胞ゲノムの変異が含まれる。別の態様において、遺伝子変化には、細胞ゲノムに核酸を加えるか、またはトランスフェクトした核酸として加えることが含まれ、その中で、核酸は抗アポトーシスのポリペプチドをコードする。別の態様において、抗アポトーシスのポリペプチドはグリコシル化に関連する。別の態様において、遺伝子変化には、細胞ゲノムの、またはベータポリペプチドをコードする発現カセットの少なくとも一つの変異が含まれる。別の態様において、培養液中で成長する場合、細胞集団は：
（ａ）配列番号：１６のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２７でメチオニン、およびアミノ酸位置３８２でグリシン）を有するベータポリペプチド；
（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２７でメチオニン、およびアミノ酸位置３８３でリジン）を有するベータポリペプチド；
（ｃ）配列番号：１５のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２６でアラニン、およびアミノ酸位置３８２でグリシン）を有するベータポリペプチド；
（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２６でアラニン、およびアミノ酸位置３８３でリジン）を有するベータポリペプチド；
（ｅ）配列番号：１１のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２５でメチオニン、およびアミノ酸位置３８３でリジン）を有するベータポリペプチド；
（ｆ）配列番号：１４のアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸位置２５でメチオニン、およびアミノ酸位置３８２でグリシン）を有するベータポリペプチド；または
（ｇ）そのいずれの組合せも産生する。
【００４７】
組成物：本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子の単離した集団を提供し、その中で、各ポリペプチドには、約５から約１０の、シアル酸残基対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子の平均モル比を有する、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれる。一つの態様において、約５．５から約８．５の、シアル酸残基対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子の平均モル比。一つの態様において、約５．２から約７．６の、シアル酸残基対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子の平均モル比。本発明は、ベータポリペプチドの単離した集団を提供し、その中で、各ポリペプチドには、約６の、シアル酸残基対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子の平均モル比を有する、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれる。本発明は、ベータポリペプチドの単離した集団を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、９５％超のポリペプチドはダイマーに形成される。一つにおいて、９８％超、９９％超、または９９．５％超のポリペプチドはダイマーに形成される。別の態様において、約９５％から約９９．５％のポリペプチドはダイマーに形成され、約０．５％から約５％のポリペプチドはテトラマーまたは高分子量種に形成される。別の態様において、約９８．６％のポリペプチドはダイマーに形成され、約１．２％のポリペプチドはテトラマーまたは高分子量種に形成され、約０．７％未満のポリペプチドはモノマーである。別の態様において、約９５％のポリペプチドはダイマーに形成され、約４％のポリペプチドはテトラマーまたは高分子量種に形成され、約１％のポリペプチドはベータポリペプチドダイマーの単離した集団であり、その中で、各ポリペプチドモノマーには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれる。一つの態様において、集団には、ベータポリペプチドモノマーが実質的に含まれていない。別の態様において、集団には、ベータポリペプチドテトラマーが実質的に含まれていない。本発明は、ベータポリペプチドダイマーおよびテトラマーが実質的に含まれていないベータポリペプチドモノマーの単離した集団を提供する。一つの態様において、各ベータポリペプチドダイマーの各モノマーは、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列を含み、少なくとも２．５ シアル酸残基を有する。
【００４８】
本発明は、ベータポリペプチドの単離した集団を提供し、その中で、各ポリペプチドには、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ標準物質(standard)と比較して、Ｂ７結合アッセイにおいて約７０％から約１３０％の効力を有する配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、アッセイには表面プラズモン共鳴の測定が含まれる。本発明は、ベータポリペプチドの単離した集団を提供し、その中で、各ポリペプチドには、標準物質と比較して、ヒト細胞ＩＬ−２阻害アッセイにおいて約５０％から約１５０％の効力を有する配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれる。本発明は、ベータポリペプチドテトラマーまたは高分子量種の精製した集団を提供し、その中で、各ポリペプチドモノマーには配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、集団にはベータポリペプチドダイマーが実質的に含まれず、および適宜、集団には約１００グラム超の量が含まれる。本発明は、ベータポリペプチドテトラマーまたは高分子量種の精製した集団を提供し、その中で、各ポリペプチドモノマーには配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、集団にはベータポリペプチドモノマーが実質的に含まれず、および適宜、集団には約１００グラム超の量が含まれる。一つの態様において、各テトラマー分子には２対のベータポリペプチドが含まれ、その中で、各ポリペプチドモノマーには配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチド対の各メンバーは他のメンバーと共有結合しており、２対のポリペプチドは互いに非共有結合している。一つの態様において、各テトラマー分子はＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。一つの態様において、各テトラマー分子は、ベータポリペプチドダイマーと比較して、ＣＤ８０またはＣＤ８６について少なくとも２倍の大きさの結合活性を有しており、その中で、ダイマーの各ポリペプチドモノマーには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれる。別の態様において、各テトラマー分子は、配列番号：２の配列を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇテトラマー分子と比較して、ＣＤ８０またはＣＤ８６について少なくとも２倍の大きさの結合活性を有する。別の態様において、各テトラマー分子は、ベータポリペプチドダイマーと比較して、少なくとも２倍の大きさのＴ細胞増殖または活性化の阻害を有しており、その中で、ダイマーの各ポリペプチドモノマーには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれる。別の態様において、各テトラマー分子は、配列番号：２の配列を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇテトラマー分子と比較して、少なくとも２倍の大きさのＴ細胞増殖または活性化の阻害を有する。
【００４９】
本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、組成物には、等電点電気泳動で決定されるように、５．５未満またはそれと等しい等電点，ｐＩを有する、等電点電気泳動ゲル上で視覚化できる支配的なアイソフォームが含まれる。一つの態様において、ｐＩは、ノイラミニダーゼ処理の後に増大する。一つの態様において、少なくとも４０％のベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子は、等電点電気泳動で決定されるように、約５．３未満またはそれと等しい等電点を示す。一つの態様において、少なくとも７０％のベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子は、等電点電気泳動で決定されるように、約５．３未満またはそれと等しい等電点を示す。一つの態様において、少なくとも９０％のベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子は、等電点電気泳動で決定されるように、約５．３未満またはそれと等しい等電点を示す。本発明は、約２．０±０．２から約５．２±０．２のｐＩを有するベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子の単離した集団を提供する。本発明は、約４．５±０．２から約５．２±０．２のｐＩを有するベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子の単離した集団を提供する。本発明は、約４．７±０．２から約５．１±０．２のｐＩを有するベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子の単離した集団を提供する。本発明は、組成物の製造方法を提供し、組成物には、約２．０±０．２から約５．２±０．２のｐＩを有するベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子が含まれ、その中で、各ポリペプチドには配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、該方法は：
（ａ）ベータポリペプチドの混合物を等電点電気泳動ゲル電気泳動に付し、その中で、ゲル上の一つのバンドは、特定のｐＩを有するベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子の集団を表し、並びに
（ｂ）約２．０±０．２から約５．２±０．２のｐＩを有するベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子の集団を単離して、組成物を製造することを特徴とする。
【００５０】
本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは、約２４から約２８の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは、約２．７から約３．６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは、約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは、約６．４から約７．０の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのフコースの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは、約１４から約１６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのマンノースの平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、該分子は、約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、該分子は、約５から約１０の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約２４から約２８の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；並びに
（ｂ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、該分子は：
（ａ）約２４から約２８の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約２．７から約３．６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；並びに
（ｃ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、該分子は：
（ａ）約２４から約２８の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約２．７から約３．６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；
（ｃ）約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；並びに
（ｄ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約２４から約２８の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約２．７から約３．６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；
（ｃ）約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｄ）約６．４から約７．０の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのフコースの平均モル比；並びに
（ｅ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約２４から約２８の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約２．７から約３．６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；
（ｃ）約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｄ）約６．４から約７．０の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのフコースの平均モル比；
（ｅ）約１４から約１６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのマンノースの平均モル比；並びに
（ｆ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約８から約１７の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｂ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比；並びに
（ｃ）図８と実質的に同一の糖プロフィールの特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約８から約１７の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｂ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比；
（ｃ）図８と実質的に同一の糖プロフィール；並びに
（ｄ）約５％未満のベータポリペプチドテトラマー含有率の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；並びに
（ｂ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｂ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比；並びに
（ｃ）約５％未満のベータポリペプチドテトラマー含有率の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比；並びに
（ｂ）図８と実質的に同一の糖プロフィールの特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；並びに
（ｂ）図８と実質的に同一の糖プロフィールの特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比；並びに
（ｂ）約５％未満のベータポリペプチドテトラマーまたは高分子量種の含有率の特徴を有する。本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは：
（ａ）約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；並びに
（ｂ）約５％未満のベータポリペプチドテトラマーまたは高分子量種の含有率の特徴を有する。
【００５１】
本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子を含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは、図８と実質的に同一の糖プロフィールを示す。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは、ドメインＩ〜ＩＶの糖プロフィールを示し、ドメインＩにはａ−シアル酸付加オリゴ糖を表すピークが含まれ、ドメインＩＩにはモノシアル酸付加オリゴ糖を表すピークが含まれ、ドメインＩＩＩにはジシアル酸付加オリゴ糖を表すピークが含まれ、およびドメインＩＶにはトリシアル酸付加オリゴ糖を表すピークが含まれる。一つの態様において、ドメインＩにおける第１ピークとドメインＩＩにおけるメインピークとの間のＮ結合型オリゴ糖の保持時間の差は、約１１から約１３分である。一つの態様において、ドメインＩＩＩおよびＩＶの和には、全糖プロフィールの約２５％から約３６％が含まれる。
【００５２】
本発明は、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子を含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドモノマーには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、少なくとも約０．５％の分子はシステイン付加されている。本発明は、ベータポリペプチドの単離した集団を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、集団は図１１に示される質量分析プロフィールを示す。本発明は、ベータポリペプチドの単離した集団またはベータポリペプチド分子を提供し、その中で、各ポリペプチドには、約５．５から約８．５の、シアル酸残基対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子の平均モル比を有する配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子は、産生細胞株の細胞から産生される。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、ポリペプチドは、配列番号：４の１０２位のアスパラギンアミノ酸残基、配列番号：４の１３４位のアスパラギンアミノ酸残基、配列番号：４の２３３位のアスパラギンアミノ酸残基でグリコシル化される。本発明は、ベータポリペプチドを含む単離された組成物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、該分子は：
（ａ）約２４から約２８の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約２．７から約３．６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；
（ｃ）約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｄ）約６．４から約７．０の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのフコースの平均モル比；
（ｅ）約１４から約１６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのマンノースの平均モル比；
（ｆ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比；
（ｇ）約２．４±０．２から約５．２±０．２の範囲にある等電点電気泳動ゲル上の可視化から決定されるｐＩ；
（ｈ）５ｐｐｍ未満またはそれと等しいＭＣＰ−１；
（ｉ）５％未満のテトラマーまたは高分子量種；
（ｊ）１％未満のベータポリペプチドモノマー；並びに
（ｋ）配列番号：４、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のいずれとも少なくとも９５％同一のアミノ酸を有する集団のベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子の特徴を有しており、その中で、集団内のベータポリペプチドはＣＤ８０およびＣＤ８６と結合することができる。本発明は、ベータポリペプチドの単離した集団を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、分子の集団は：
（ａ）約２４から約２８の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比；
（ｂ）約２．７から約３．６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比；
（ｃ）約１１から約１３の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのガラクトースの平均モル比；
（ｄ）約６．４から約７．０の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのフコースの平均モル比；
（ｅ）約１４から約１６の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのマンノースの平均モル比；
（ｆ）約５．５から約８．５の、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比；
（ｇ）約２．４±０．２から約５．２±０．２の範囲にある等電点電気泳動ゲル上の可視化から決定されるｐＩ；
（ｈ）５ｐｐｍ未満またはそれと等しいＭＣＰ−１；
（ｉ）５％未満のベータポリペプチドテトラマーまたは高分子量種；
（ｊ）１％未満のモノマー；並びに
（ｋ）配列番号：４、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のいずれとも少なくとも９５％同一のアミノ酸を有する集団のベータポリペプチドの特徴を有しており、その中で、集団内のベータポリペプチド分子はＣＤ８０およびＣＤ８６；またはその医薬的な同等物と結合することができる。
【００５３】
本発明は、本発明のベータポリペプチドの有効量および医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明は、２００５年１２月２０日に出願された米国出願番号６０／７５２，１５０に記載された賦形剤を含む組成物を提供する。一つの態様において、組成物にはベータポリペプチド分子が含まれる。一つの態様において、組成物にはさらに、医薬的に許容される希釈剤、添加剤または担体が含まれる。一つの態様において、組成物にはさらに、ショ糖、リン酸二水素ナトリウム一水和物、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩酸、および滅菌水が含まれる。別の態様において、組成物には、ショ糖、ポロキサマー、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、および滅菌水が含まれる。一つの態様において、組成物は凍結乾燥されている。本発明は、本発明のベータポリペプチドの有効量、ショ糖、リン酸二水素ナトリウム一水和物、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、および塩酸を含む凍結乾燥した組成物を提供する。
【００５４】
製剤およびキット：本発明は、少なくとも９５％ ベータポリペプチドダイマー、および多くて５％ ベータポリペプチドテトラマー（高分子量種）を含む凍結乾燥したベータポリペプチド混合物を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれる。一つの態様において、混合物には、少なくとも９８％のベータポリペプチドダイマーおよびわずか２％のベータポリペプチドテトラマー（高分子量種）が含まれる。一つの態様において、混合物には、少なくとも９９％のベータポリペプチドダイマーおよびわずか１％のベータポリペプチドテトラマー（高分子量種）が含まれる。一つの態様において、混合物には、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたり少なくとも５モルのシアル酸が含まれる。一つの態様において、混合物には、ベータポリペプチドダイマー（高分子量種）１モルあたり約２４から約２８モルのＧｌｃＮＡｃが含まれる。一つの態様において、混合物には、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたり約２．７から約３．６モルのＧａｌＮＡｃが含まれる。一つの態様において、混合物には、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたり約１１から約１３モルのガラクトースが含まれる。一つの態様において、混合物には、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたり約６．４から約７．０モルのフコースが含まれる。一つの態様において、混合物には、ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子１モルあたり約１４から約１６モルのマンノースが含まれる。本発明はまた：
（ａ）本発明の凍結乾燥したベータポリペプチド混合物を含む容器、および
（ｂ）凍結乾燥したベータポリペプチド混合物を注射用溶液へと再構成するための指示書を含む医薬キットも提供する。
【００５５】
治療方法の例：Ｔ細胞増殖、活性化またはその両方の阻害方法（該方法は、Ｔ細胞を、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量と接触させることを特徴とする）。本発明は、患者における免疫応答の阻害方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における免疫障害の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における抗原に対する免疫寛容の誘導方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。該方法は、患者における炎症の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。該方法は、関節リウマチの治療方法を提供し、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における乾癬の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者におけるループスの治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者におけるアレルギーの治療または予防方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における移植片対宿主病の治療または予防方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における移植器官の拒絶の治療または予防方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における移植組織の拒絶の治療または予防方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における移植細胞の拒絶の治療または予防方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。一つの態様において、移植細胞は骨髄細胞である。別の態様において、移植細胞は島細胞である。別の態様において、移植細胞はインスリン産生膵島細胞である。本発明は、患者における多発性硬化症の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者におけるクローン病の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者におけるＩ型糖尿病の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、炎症性腸疾患 患者におけるの治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における��巣炎の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における糸球体腎炎の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者におけるアレルギー性脳脊髄炎の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における重症筋無力症の治療方法を提供し、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。
【００５６】
本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子の集団の使用を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、集団は、免疫障害の治療的および／または予防的処置のための薬物の製造において、約５から約１０の、シアル酸残基対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子の平均モル比を有する。本発明は、ベータポリペプチドまたはベータポリペプチド分子の集団の使用を提供し、その中で、各ポリペプチドには、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、または１６の配列が含まれ、集団は、関節リウマチの治療におけるその使用のための指示書と共に、包装した抗関節リウマチ薬の製造において、約５から約１０の、シアル酸残基対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子の平均モル比を有する。一つの態様において、集団は、約５．５から約８．５の、シアル酸残基対ベータポリペプチドダイマーまたはベータポリペプチド分子の平均モル比を有する。
【００５７】
併用療法の例：本発明は、Ｔ細胞増殖、活性化またはその両方の阻害方法を提供し、該方法は、メトトレキセートと併用して、Ｔ細胞を本発明のベータポリペプチド組成物の有効量と接触させることを特徴とする。本発明は、患者における免疫応答の阻害方法を提供し、該方法は、メトトレキセートと併用して、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。本発明は、患者における抗原に対する免疫寛容の誘導方法を提供し、メトトレキセートと併用して、該方法は、本発明のベータポリペプチド組成物の有効量を治療が必要な患者に投与することを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、自己免疫およびアレルギーなどの異常な免疫増殖性および免疫反応性の現象に関連する障害を含めた様々な障害を治療するために用いることができる。本発明は、たとえば特定のグリコシル化修飾、特定の炭水化物プロフィールもしくは特徴、特定の多量体構造、および／または特定の結合力の強度を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物を提供する。やはりＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、その使用および方法について記載している、本明細書中に参考としてその全体を組み込む文献には、米国特許第５，４３４，１３１号；第５，８５１，７９５号；第５，８８５，７９６号；第５，８８５，５７９号；および第７，０９４，８７４号が含まれる。
【００５９】
本発明はまた、本明細書中に提供する大量産生および培養方法によって大量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生することができる細胞系も提供する。本発明の１つの特定の細胞系は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が特定のグリコシル化および炭水化物プロフィールを有するように、それを大量産生するために用いることができるクローン細胞系である。ＡＴＣＣ寄託番号６８６２９号を有する異種および非クローン細胞集団と比較して（参考としてその全体で本明細書中に組み込まれている米国特許第５，４３４，１３１号参照）、本発明のクローン細胞系は、より一貫したまたはより均一なグリコシル化または炭水化物プロフィールを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を分泌することができる。さらに、ＡＴＣＣ寄託番号６８６２９号を有する異種および非クローン細胞集団と比較して、本発明のクローン細胞系は、本クローン細胞系は高コピー数のＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットが細胞のゲノム中の単一の部位内に組み込まれているように選択されていることが部分的な原因で、より大量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を分泌することができる。
【００６０】
本発明は、ＣＴＬＡ−４結合ドメインのＢ７結合領域中に２つのアミノ酸置換、すなわち（ｉ）配列番号２の位置２９アラニンをチロシンで置換（Ａ２９Ｙ）すること、および（ｉｉ）配列番号２の位置１０４のリシンをグルタミン酸で置換すること（Ｌ１０４Ｅ）を行うことによって、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（配列番号２）の結合力および力価を増加できるという発見を提供する。本発明は、「βポリペプチド分子」と呼ばれるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の亜属を提供し、これは、Ｂ７結合活性を有しており、免疫グロブリン定常領域またはその一部分に連結した配列番号２４のアミノ酸配列（Ａ２９ＹおよびＬ１０４Ｅの突然変異を有するＣＴＬＡ４細胞外ドメイン）を含み得るβポリペプチドを含む。
［配列番号２４］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
［配列番号１８］−ＣＴＬＡ４細胞外ドメイン
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
【００６１】
用語
【００６２】
本明細書中で使用する用語「クローン」とは、単一の細胞から増大させた細胞集団をいう。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を発現することができるクローン細胞系またはクローン細胞集団に関して、クローン細胞系または集団は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子をコードしている発現ベクターで形質移入した細胞の集団から単離した単一の細胞から増大させる。形質移入した細胞の集団は異種集団であることができる。クローン細胞系または集団は、集団中のすべての細胞が単一の形質移入に由来するという意味で、同種であるとみなすことができる。
【００６３】
本明細書中で使用する用語「Ｂ７−１」とはＣＤ８０をいい；用語「Ｂ７−２」とはＣＤ８６をいい；用語「Ｂ７」とは、Ｂ７−１およびＢ７−２（ＣＤ８０およびＣＤ８６）の両方またはどちらかをいう。用語「Ｂ７−１−Ｉｇ」または「Ｂ７−１Ｉｇ」とはＣＤ８０−Ｉｇをいい；用語「Ｂ７−２−Ｉｇ」または「Ｂ７−２Ｉｇ」とはＣＤ８６−Ｉｇをいう。
【００６４】
本明細書中で使用する用語「ＣＴＬＡ４−Ｉｇ」または「ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子」または「ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子」または「ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質」または「ＣＴＬＡ４Ｉｇタンパク質」は、互換性があるように使用し、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインと免疫グロブリン定常領域またはその一部分とを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを少なくとも含むタンパク質分子をいう。一部の実施形態では、たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドは、少なくとも配列番号１８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインおよび免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、野生型、または突然変異体もしくは修飾体であることができる。突然変異ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドは、突然変異ＣＴＬＡ４細胞外ドメインを含むＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドである。突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は突然変異ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを少なくとも含む。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインおよび免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、ヒトまたはマウスを含めた哺乳動物のものであることができる。一部の実施形態では、突然変異ＣＴＬＡ４細胞外ドメインは、図１または配列番号１８に示すＣＴＬＡ４細胞外ドメインと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有することができる。一部の実施形態では、突然変異免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、図１に示す免疫グロブリン（ｇ）定常領域と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有することができる。ポリペプチドは、さらなるタンパク質ドメインをさらに含むことができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドの単量体をいうことができ、また、二量体、四量体、および六量体等（または他の高分子量種）などのポリペプチドの多量体をいうこともできる。また、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と結合することができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子には、「βポリペプチド分子」、たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇなどの突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子が含まれる。たとえば、ＣＴＬＡ４−ＩｇはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含み、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇはβポリペプチド分子を含む（突然変異ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の例）。
【００６５】
本明細書中で使用する用語「ＣＴＬＡ４細胞外ドメイン」とは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）および／またはＢ７−２（ＣＤ８６）と結合する、配列番号１８に示すアミノ酸配列の全体または一部分を含むタンパク質ドメインをいう。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインは、配列番号１８に示すアミノ酸と同一である配列番号２のアミノ酸２７〜１５０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。配列番号２のアミノ酸１５１は接合アミノ酸である。
【００６６】
本明細書中で使用する用語「βポリペプチド」とは、（１）位置２９のアミノ酸がチロシンに突然変異しており、位置１０４のアミノ酸がグルタミン酸に突然変異しており、所望により様々な追加の突然変異を有する配列番号１８のアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常領域またはその一部分とを含み；（２）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と結合することができる突然変異ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドをいう。一部の実施形態では、たとえば、βポリペプチドは、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２４に示す）を少なくとも含む。βポリペプチドの非限定的な例には、ベラタセプトならびに配列番号４および１１〜１６が含まれる。特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、野生型、突然変異体もしくは修飾体であることができる。特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、ヒトまたはマウスを含めた哺乳動物のものであることができる。βポリペプチドのさらなる非限定的な例には、免疫グロブリン定常領域またはその一部分中に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むβポリペプチド（たとえば、配列番号４のシステイン１２０の置換）、および配列番号１８のアミノ酸位置２５、３０、９３、９６、１０３または１０５の１つまたは複数でさらなる突然変異を含むβポリペプチドが含まれる。βポリペプチド分子はβポリペプチドを含む。βポリペプチド分子とは、βポリペプチドの単量体ならびに二量体、四量体および六量体等のβポリペプチドの多量体などをいうことができる。たとえば、ベラタセプトはβポリペプチド分子を含む。βポリペプチド分子は、参考としてその全体で本明細書中に組み込まれている、２００６年１０月５日出願の米国仮出願第６０／８４９，５４３号にさらに記載されている。
【００６７】
本明細書中で使用する用語「グルタメート」および「グルタミン酸」は互換性があるように使用する。
【００６８】
本明細書中で使用する用語「二量体」とは、連結または結合した２個のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドまたは単量体からなる、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子をいう。二量体の単量体間の連結は、非共有結合もしくは相互作用、共有結合もしくは相互作用、または両方であることができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の例を図４に示す。２つの同一の単量体からなるＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、ホモ二量体である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇホモ二量体には、配列がわずかに異なり得る２つの単量体を含む分子も包含される。ホモ二量体には、結合した単量体が実質的に同じ配列である二量体が包含される。ホモ二量体を構成する単量体は、相当の構造的相同性を共有する。たとえば、配列の差異は、単量体のＮ末端プロセシング修飾によるものであり得る。
【００６９】
本明細書中で使用する「保存的突然変異」とは、あるアミノ酸を同じクラスの別のアミノ酸で置換する核酸配列の変化をいう（たとえば、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなど、ある無極性アミノ酸を別の無極性アミノ酸で置換すること；またはリシンをアルギニンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、もしくはアスパラギンをグルタミンで置換することなど、ある極性アミノ酸を別の極性アミノ酸で置換すること）。
【００７０】
本明細書中で使用する「非保存的突然変異」とは、あるアミノ酸を異なるクラスのアミノ酸で置換する核酸配列の変化をいう（たとえば、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなどのある塩基性アミノ酸をアスパラギン酸またはグルタミン酸などの酸性アミノ酸で置換すること）。たとえば、アミノ酸は、アミノ酸の大きさ、荷電、極性、反応性または他の同様の特徴に基づいて、別のアミノ酸と生化学的に相違することができる。
【００７１】
本明細書中で使用する「単離した」とは、そのネイティブ環境から取り出し、分子が天然に存在する環境とは異なる環境にある分子、または物質（たとえばタンパク質）が、生じる組成物、混合物、もしくは構成成分のコレクション中に存在する主な種（たとえばタンパク質種）であるように（たとえば、モル濃度に基づいて、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）その環境の他の構成成分から部分的にもしくは完全に回収もしくは分離された物質（たとえばタンパク質）をいう。たとえば、調製物は、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４または９５％を超える単離したＣＴＬＡ４−Ｉｇからなり得る。「単離した」とは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子と分子が天然に存在する環境由来の他のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子との混合物を排除しない。「単離した」とは、細胞培養物、バッチ培養物、またはバイオリアクターなどのその環境から回収したＣＴＬＡ４−Ｉｇと組み合わせた医薬上許容される賦形剤を排除しない。本明細書中で使用する「単離すること」とは、単離したＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を得るためにプロセスまたは方法を実施することをいう。
【００７２】
本明細書中で使用する用語「可溶性ＣＴＬＡ４」とは、インビボで循環することができる分子または細胞膜に結合していないＣＴＬＡ４を意味する。たとえば、可溶性ＣＴＬＡ４には、Ｉｇに連結したＣＴＬＡ４の細胞外領域を含めたＣＴＬＡ４−Ｉｇが含まれることができる。
【００７３】
本明細書中で使用する用語「細胞培養物の可溶性画分」とは、細胞、細胞膜および核などの細胞培養物の不溶性、粒子状もしくは固形の構成成分以外の、またはそれを実質的に含まない、細胞培養物の液体部分をいう。可溶性画分は、たとえば、細胞培養物の遠心分離後に生じる上清、または細胞培養物の濾過後に生じる濾液であり得る。
【００７４】
本明細書中で使用する用語「発現カセット」とは、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列と作動可能に連結された５’制御領域（たとえばプロモーター）を少なくとも有し、かつ所望により非翻訳３’終止領域（たとえば、ストップコドンおよびポリアデニル化配列）を有する核酸をいう。適切な条件下では、発現カセットによってコードされているポリペプチドを発現カセットによって産生させる。また、発現カセットは、発現カセットを宿主細胞のゲノム中の特異的部位内に組み込むことを標的とする、１つまたは複数のヌクレオチド配列も有し得る（たとえば、Koduri et al., (2001) Gene 280:87-95参照）。たとえば、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１０４号として寄託されているプラスミドに由来するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇポリペプチド発現カセットは、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇをコードしている発現カセットの一例である。
【００７５】
本明細書中で使用する用語「実質的に精製した」とは、その天然の環境から取り出した（たとえば単離した）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の選択した集団を含む組成物をいい、細胞物質または培地などのそれが天然で関連している他の構成成分を少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％含まない。たとえば、組換えによって産生したＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質分子に関しては、用語「実質的に精製した」とは、タンパク質分子が目的の配列番号２のポリペプチドまたは配列番号２の突然変異ポリペプチドではないタンパク質分子を少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％含まないように産生環境から取り出した、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質分子を含む組成物をいうこともできる。「実質的に精製した」とは、他のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子（四量体など）とのＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子（二量体など）の混合物を排除しない。「実質的に精製した」とは、そのネイティブ環境から取り出したＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子と組み合わせた医薬上許容される賦形剤または担体を排除しない。
【００７６】
本明細書中で使用する用語「大スケールプロセス」とは、用語「工業スケールプロセス」と互換性があるように使用する。用語「培養容器」は、「バイオリアクター」、「反応器」および「タンク」と互換性があるように使用する。
【００７７】
「液体培養物」とは、支持体上で増殖させた、または液体栄養培地中で懸濁させて増殖させた細胞（たとえば、細菌、植物、昆虫、酵母、または動物細胞）をいう。
【００７８】
「種培養物」とは、より大容量の培地に接種するために増殖させた細胞培養物をいう。種培養物を用いて、培養物中で増殖させる細胞（たとえば懸濁液中で増殖させる細胞）の数を増大させるために、より大容量の培地に接種することができる。
【００７９】
本明細書中で使用する「培養」とは、１個または複数個の細胞をインビトロで、定義または調整された条件下で増殖させることをいう。定義することができる培養条件の例には、温度、気体の混合、時間、および培地の配合が含まれる。
【００８０】
本明細書中で使用する「増大」とは、培養物中により多数の細胞を得ることを目的として１個または複数個の細胞をインビトロで培養することをいう。
【００８１】
本明細書中で使用する「集団」とは、１つもしくは複数の測定可能もしくは検出可能な特性が存在することまたは存在しないことによって特徴づけられた、２つ以上の分子（「分子の集団」）または細胞（「細胞の集団」）の群をいう。同種集団では、集団中の分子または細胞は、同一または実質的に同一の特性によって特徴づけられている（たとえばクローン細胞系の細胞）。異種集団では、集団中の分子または細胞は、同一または実質的に同一である少なくとも１つの特性によって特徴づけられており、細胞または分子も同一でない特性を示し得る（たとえば、実質的に類似の平均シアル酸含有率を有するが、類似していないマンノース含有率を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団）。
【００８２】
本明細書中で使用する「高分子量凝集体」とは「高分子量種」と互換性があるように使用し、少なくとも３つのＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子をいう。たとえば、高分子量凝集体は、四量体、五量体または六量体であり得る。
【００８３】
「パーセント（％）収率」とは、実収率を理論収率で割り算し、その値に１００を掛けた値をいう。実収率は重量グラムまたはモル（たとえばモル収率）として得ることができる。理論収率は理想的または数学計算した収率として得ることができる。
【００８４】
本明細書中で使用する「ＭＣＰ−１の量」とは、（１）一定量の単独のＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１、特にハムスターＭＣＰ−１）、または（２）一定量のＭＣＰ−１を含めた「ＭＣＰ−１様」タンパク質と、ＭＣＰ−１に相同的なタンパク質、ＭＣＰ−１の断片、および／もしくはＭＣＰ−１に相同的なタンパク質の断片とを合わせた量（たとえば、前述の事例のそれぞれにおいて、ＭＣＰ−１を検出するための抗体（たとえばポリクローナルＥＬＩＳＡ）アッセイと交叉反応性を有し得る）をいう。ＭＣＰ−１の量の範囲に関して下限を提供していない場合は、ＭＣＰ−１（ならびに／またはＭＣＰ−１に相同的なタンパク質、ＭＣＰ−１の断片、および／もしくはＭＣＰ−１に相同的なタンパク質の断片）が存在しないことも企図される。
【００８５】
本明細書中で使用する「グリコシル化の含有率」とは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子に似た糖タンパク質などのタンパク質分子と共有結合した一定量のＮ結合型またはＯ結合型糖残基をいう。
【００８６】
本明細書中で使用する用語「シアル酸対タンパク質のモル比」とは、タンパク質（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子）または二量体１モルあたりのシアル酸分子のモル数として計算して求める。
【００８７】
本明細書中で使用する用語「糖タンパク質」とは、１つまたは複数の糖残基の含めた１つまたは複数の炭水化物の付加によって修飾されたタンパク質をいう。
【００８８】
本明細書中で使用する用語「シアリル化」とは、シアル酸残基を、糖タンパク質を含めたタンパク質に付加することをいう。
【００８９】
本明細書中で使用する用語「糖タンパク質アイソフォーム」とは、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、ゲル電気泳動または混合物中の様々なタンパク質をその分子量、荷電、および／もしくは他の特徴によって識別するための他の適切な方法によって決定された、炭水化物およびシアル酸の含有率によって特徴づけられた分子をいう。たとえば、ＩＥＦゲルで観察されるそれぞれの明確なバンドが特定の等電点（ｐＩ）を有し、したがって同じ正味荷電を有する分子を表す。糖タンパク質アイソフォームは、ＩＥＦゲル上に観察される明確なバンドであることができ、それぞれのバンドが特定のｐＩを有する分子の集団であることができる。
【００９０】
「免疫寛容」とは、ある人が通常応答性である特定の抗原または抗原の群に対する非応答状態をいう（たとえば、Ｔ細胞がもはや抗原に応答しなくなる状態）。
【００９１】
「力価」とは、リガンド濃度の関数としての応答の尺度をいう。たとえば、アゴニストの力価は、最大効果の半量を生じるリガンドの濃度（ＥＣ50）として定量する。力価の非限定的な薬理学的定義には親和性および有効性の要素が含まれ、有効性とは、結合した後に薬物が応答を誘起する能力である。力価は親和性に関連するが、力価および親和性は薬物作用の異なる尺度である。
【００９２】
本明細書中で使用する「医薬上許容される担体」とは、薬理学的に活性のある薬剤のためのビヒクルをいう。担体は、薬剤の機能を終わらせることなく活性剤の標的部位へのデリバリーを行うことを容易にする。担体の適切な形態の非限定的な例には、液剤、クリーム、ゲル、ゲル乳剤、ゼリー、ペースト、ローション、膏薬、スプレー、軟膏、散剤、固形混合物、エアロゾル、乳剤（たとえば、油中水または水中油）、ゲル水溶液、水溶液、懸濁液、リニメント、チンキ剤、および局所投与に適したパッチが含まれる。
【００９３】
本明細書中で使用する語句「医薬上許容される組成物」（または「医薬組成物」）とは、人間などへの医薬投与が許容される組成物をいう。このような組成物には、任意の活性剤（または複数の活性剤）に加えて、医薬投与に許容されるレベルを超えないレベルで不純物である物質を含めてもよく（そのようなレベルには、そのような不純物が存在しないことが含まれる）、また、投与を容易にするために医薬上許容される賦形剤、ビヒクル、担体および他の不活性成分を含めて、たとえば、そのような組成物を配合することができる。たとえば、医薬上許容されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物には、ＭＣＰ−１またはＤＮＡを、それらの物質がヒトへの投与に許容されるレベルである限りは、含めることができる。
【００９４】
「薬物物質」とは、医薬組成物中に含まれる活性医薬成分である。用語「薬物物質」には、溶液および／または緩衝形態中の活性医薬成分が含まれる。「薬物製品」とは、医薬投与のために配合された薬物物質を含む医薬組成物である。薬物物質および／または薬物製品に言及し得る本明細書中の実施例および他の箇所に含まれるアッセイ目的には、アッセイを行い得る例示的な薬物物質および薬物製品は以下のとおりである。
【００９５】
配列番号２、５、６、７、８、９、１０または１８を含むＣＴＬＡ４Ｉｇ分子の例示的な薬物物質は、緩衝水溶液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）中、５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質である。
【００９６】
配列番号２、５、６、７、８、９、１０または１８を含むＣＴＬＡ４Ｉｇ分子の例示的な薬物製品は、２５０ｍｇの凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質、５００ｍｇのマルトース、１７．２ｍｇの一塩基性リン酸ナトリウム、および１４．６ｍｇの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜８．０；または
緩衝水溶液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）中に２５ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質である。
凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質（２５０ｍｇ／バイアル）薬物製品の組成
2010116402.tif 000002
配列番号４、１１、１２、１３、１４、１５、１６または２４を含むＣＴＬＡ４Ｉｇ分子の例示的な薬物製品：
凍結乾燥したＣＬＴＡ４A29YL104E−Ｉｇの１００ｍｇ／バイアルの薬物製品の組成
2010116402.tif 000003
【００９７】
本明細書中で使用する用語「培地」および「細胞培地」および「フィード培地」および「発酵培地」とは、細胞、特に哺乳動物細胞を増殖または維持するために用いる栄養液をいう。限定せずに、これらの溶液は通常、以下の分類の１つまたは複数からの少なくとも１つの構成成分を提供する：（１）通常はグルコースなどの炭水化物の形態のエネルギー源；（２）すべての必須アミノ酸、ならびに通常は基本の２０種のアミノ酸およびシステイン；（３）ビタミンおよび／または低濃度で必要な他の有機化合物；（４）遊離脂肪酸または脂質、たとえばリノール酸；（５）微量元素（微量元素とは、典型的には非常に低い濃度、通常はマイクロモル濃度の範囲で必要な、無機化合物または天然に存在する要素として定義される）。栄養液には、以下の分類のうちの任意のものからの１つまたは複数の構成成分を随意で添加することができる：（１）血清、インスリン、トランスフェリン、および表皮成長因子などのホルモンおよび他の成長因子；（２）塩、たとえば、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびリン酸塩；（３）ＨＥＰＥＳなどのバッファー；（４）アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチンなどのヌクレオシドおよび塩基；（５）タンパク質および組織加水分解物、たとえば、精製ゼラチン、植物材料、または動物副産物から得ることができるペプトンまたはペプトン混合物；（６）ゲンタマイシンなどの抗生物質；（７）細胞保護剤、たとえばプルロニックポリオール；（８）ガラクトース。
【００９８】
本明細書中で使用する用語「接種」とは、培養を開始するために細胞を培地に加えることをいう。
【００９９】
本明細書中で使用する用語、細胞培養の「増殖期」とは、細胞が主に迅速に分裂する指数関数的な細胞増殖の期間（たとえば対数期）をいう。この期間中、生細胞密度の増加速度は任意の他の時点よりも高い。
【０１００】
本明細書中で使用する用語、細胞培養の「産生期」とは、細胞増殖が静止している、またはほぼ一定レベルに保たれている期間をいう。生細胞密度は所定の期間にわたってほぼ一定にとどまる。対数細胞増殖は終わっており、タンパク質産生が産生期の主な活動である。タンパク質産生の持続を支援するために、および所望の糖タンパク質生成物を得るために、この時点で一般的に培地を補充する。
【０１０１】
本明細書中で使用する用語「発現」または「発現する」とは、細胞内で起こる転写および翻訳をいうために用いる。宿主細胞中の遺伝子産物の発現レベルは、細胞中に存在するｍＲＮＡに対応する量もしくは細胞によって産生される遺伝子産物によってコードされているタンパク質の量、または両方に基づいて決定することができる。
【０１０２】
本明細書中で使用する「グリコシル化」とは、ポリペプチド鎖内の特異的部位でタンパク質に複合オリゴ糖構造を付加することをいう。タンパク質のグリコシル化および続く付加した炭水化物プロセシングは、タンパク質の折り畳みおよび構造、タンパク質半減期を含めたタンパク質安定性、ならびにタンパク質の機能的特性に影響を与えることができる。タンパク質のグリコシル化は、修飾が起こる配列の状況によって２つのクラス、すなわちＯ結合型グリコシル化およびＮ結合型グリコシル化に分類することができる。Ｏ結合型多糖類は、ヒドロキシル基、通常はセリンまたはスレオニン残基のどちらかのヒドロキシル基に連結している。Ｏ−グリカンはすべてのセリンおよびスレオニン残基には付加されない。Ｏ結合型オリゴ糖は通常一または二分岐である、すなわち、これらは１つまたは最大２つの分枝鎖（アンテナ）を含み、１つずつ付加される１〜４種類の異なる糖残基を含む。Ｎ結合型多糖類は、アスパラギンのアミド窒素に付着している。２つのトリペプチド配列の一方、すなわちアスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のどちらかの一部であるアスパラギンのみが、グリコシル化の標的である。Ｎ結合型オリゴ糖は、一分岐、二分岐、三分岐、四分岐と呼ばれる１〜４つの分枝鎖を有することができる。Ｎ結合型およびＯ結合型オリゴ糖の構造およびそれら中に見つかる糖残基は異なる。その違いにもかかわらず、Ｎ結合型およびＯ結合型多糖の双方のそれぞれの分枝鎖上の末端残基をシアル酸分子によって修飾することができ、これはシアル酸キャッピングと呼ばれる修飾である。シアル酸とは、独特な９個の炭素の単糖ファミリーの一般名であり、他のオリゴ糖と連結することができる。２つのファミリーメンバーは、Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮＡＮＡと略記されるＮ−アセチルノイラミン酸、およびＮｅｕ５ＧｃまたはＮＧＮＡと略記されるＮ−グリコリルノイラミン酸である。ヒトにおけるシアル酸の最も一般的な形態はＮＡＮＡである。Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子中に存在する主なシアル酸種である。しかし、微量であるが検出可能なレベルのＮグリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）もＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子中に存在することに留意されたい。さらに、本明細書中に記載の方法を用いてＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのどちらのシアル酸モル数も決定することができ、したがって、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのどちらのレベルも、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子について決定および報告されている。Ｎ結合型およびＯ結合型オリゴ糖は異なる数の分枝鎖を有し、これにより、シアル酸分子が付着することができる位置が異なる数で提供される。Ｎ結合型オリゴ糖は４つまでのシアル酸の付着位置を提供することができ、一方で、Ｏ結合型オリゴ糖はシアル酸の付着に２つの部位を提供することができる。
【０１０３】
本明細書中で使用する用語「大スケールプロセス」は、用語「工業スケールプロセス」と互換性があるように使用することができる。さらに、用語「培養容器」は、「バイオリアクター」、「反応器」および「タンク」と互換性があるように使用することができる。
【０１０４】
本明細書中で使用する語句「使用溶液」とは、方法で用いる溶液をいう。使用溶液の非限定的な例にはバッファーが含まれる。
【０１０５】
本明細書中で使用する「基準物質」とは、方法中で標準として用いる物質をいう。たとえば、基準物質を、実験試料を比較する標準として用いることができる。
【０１０６】
物質の量の範囲に関して下限を提供していない場合は、そのような物質が存在しないことも企図される。
【０１０７】
細胞培養物に関して本明細書中で使用する言及した温度は、バイオリアクターの温度を制御する装置の温度設定をいう。もちろん、液体培養物自体の温度は、バイオリアクターの温度を制御する装置で設定した温度となる。インキュベータ内の棚上で維持する細胞培養物を指す場合は、温度とはインキュベータの棚温度を指す。
【０１０８】
本発明の非限定的な実施形態
【０１０９】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物およびＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇなどの突然変異ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物を提供する。本発明は、特定量の細菌内毒素、汚染微生物数、特定の範囲内のｐＩ（もしくは特定の範囲のｐＩ内の特定のＩＥＦバンド）、特定量の単量体（単鎖）、二量体もしくは高分子量種（四量体など）、特定のトリプシンペプチドプロフィール、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の主要なバンドのある組、特定のＤＮＡ含有率、特定の最大値を超えない量のＭＣＰ−１、特定の最大値を超えない量の細胞タンパク質、特定の最大値を超えない量のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、特定の最大値を超えない量のタンパク質Ａ、特定のＮ結合型炭水化物プロフィール、特定のアミノ単糖組成物（ＧｌｃＮａｃ、ＧａｌＮＡｃ）、特定の中性単糖組成物（ガラクトース、フコース、マンノース）、特定量のＢ７結合、ＩＬ−２阻害細胞アッセイにおける特定量の活性、および／または特定のシアル酸組成（ＮＡＮＡ、ＮＧＮＡ）などの特定の特徴を有する組成物を提供し、それぞれの場合で、前記特定量は範囲または複数の範囲であることができる。本発明は、前述の特徴の任意の１つ、または前述の特徴の複数を有する組成物から、前述の特徴のすべてを任意かつすべての可能な順列または組合せが含まれるものまでを提供する。本発明には、単離もしくは実質的に精製した形態、または単離していないもしくは実質的に精製していない形態の、本発明の組成物すべてが含まれる。本発明は、医薬組成物である組成物を提供する。
【０１１０】
一態様では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の単離した集団を含む組成物を液体培地から得る方法であって、前記培地がＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の初期集団を含み、（１）初期集団のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が１つまたは複数のシアル酸残基を有し、（２）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１個あたりのシアル酸残基の数が初期集団内で異なり、（３）初期集団がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および高分子量凝集体を含み、前記方法は（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を発現している哺乳動物細胞の培養物から液体培地を収集する工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を細胞成分から分離する工程と；（ｃ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体をＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量凝集体から分離する工程と；（ｄ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を２つ以上の画分に分離する工程であって、少なくとも１つの画分のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル比は少なくとも１つの他の画分よりも大きい工程とを含み、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を同時にまたは任意の順序で実施して、前記組成物を得る方法を対象とする。
【０１１１】
本発明の方法の一実施形態では、工程（ａ）の収集は、液体培養物の可溶性画分を得ることを含む。別の実施形態では、本方法の工程（ｃ）および（ｄ）は、カラムクロマトグラフィーを使用して異なるシアル酸含有率を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の画分を得ることを含む。さらに別の実施形態では、本方法は、カラムクロマトグラフィーを使用して、組成物中のＭＣＰ−１の含有率を低下させることをさらに含む。
【０１１２】
本発明の方法の一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、配列番号２、５、６、７、８、９、または１０を有する１つまたは複数のポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、配列番号４、１１、１２、１３、１４、１５または１６を有する１つまたは複数のポリペプチドを含む。
【０１１３】
本発明の方法の一部の実施形態では、より大きなシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル比を有する（ｄ）の画分は約８〜約１４のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比を示す。具体的な実施形態では、平均モル比は約８〜約１１、約８〜約１０、または約８〜約９である。
【０１１４】
本発明は、（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を産生する哺乳動物細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程と；（ｉｉ）可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶出された組成物を得る工程と；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の組成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮された組成物を得る工程と；（ｉｖ）（ｉｉｉ）の組成物をアフィニティークロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含むさらに濃縮された組成物を得る工程と；（ｖ）（ｉｖ）の組成物を陰イオン交換クロマトグラフィー供する工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を単離する方法を提供する。一実施形態では、工程（ｉｉ）で得られた組成物は、（ａ）ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子１モルあたりのＮＡＮＡが平均６．０〜１０．１モルであり；（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２５．７面積％以下であることによって特徴づけられている。別の実施形態では、工程（ｉｉｉ）で得られた組成物は、（ａ）ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子１モルあたりのＮＡＮＡが平均６．８〜１１．４モルであり；（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下であることによって特徴づけられている。さらなる実施形態では、工程（ｉｖ）で得られた組成物は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＮＡＮＡが平均８．０〜１１．０モルであり；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下であることによって特徴づけられている。別の実施形態では、工程（ｖ）で得られた組成物は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＮＡＮＡが平均８．０〜１１．９モルであり；（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出（ＳＰＤ）によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．０面積％以下であることによって特徴づけられている。一実施形態では、ＳＰＤの一例はＡ２８０ｎｍのものであることができる。
【０１１５】
本発明はまた、（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳動物細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程と、任意の順序の、（ｉｉ）可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程と；（ｉｉｉ）可溶性画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程と；（ｉｖ）可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程と；（ｖ）可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物を単離する方法も提供する。別の態様では、本発明は、（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳動物細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程と；（ｉｉ）可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶出された組成物を得る工程と；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のタンパク質生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮された組成物を得る工程と；（ｉｖ）（ｉｉｉ）のタンパク質生成物をアフィニティークロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含むさらに濃縮された組成物を得る工程と；（ｖ）（ｉｖ）のタンパク質生成物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する方法を提供する。
【０１１６】
一実施形態では、本方法の工程（ｉｉ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物は、（ａ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子の平均モル比が６．０〜１０．１であり、（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下であることによって特徴づけられている。別の実施形態では、本方法の工程（ｉｉｉ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物は、（ａ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が約２．５面積％未満であり、（ｂ）細胞タンパク質が約９５ｎｇ／ｍｌ未満であり、（ｃ）ＭＣＰ−１が約５ｐｐｍ未満であることによって特徴づけられている。さらなる実施形態では、本方法の工程（ｉｉｉ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物は、（ａ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が６．８〜１１．４であり、（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下であることによって特徴づけられている。さらなる実施形態では、本方法の工程（ｉｖ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物は、（ａ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が８．０〜１１．０であり、（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下であることによって特徴づけられている。さらに別の実施形態では、本発明の工程（ｉｉｉ）で得られた組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５％面積％未満であることによって特徴づけられている。さらに別の実施形態では、本方法の工程（ｖ）のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含むタンパク質組成物は、（ａ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が８．０〜１１．９であり、（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．０面積％以下であることによって特徴づけられている。
【０１１７】
別の態様では、本発明はまた、（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳動物細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程と、任意の順序の、（ｉｉ）可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程と；（ｉｉｉ）可溶性画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程と；（ｉｖ）可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程と；（ｖ）可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程とを含み、工程（ｉｉｉ）で得られた組成物が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種の割合が約２．５面積％未満であり、細胞タンパク質の割合が９５ｎｇ／ｍｌ未満であり、ＭＣＰ−１の割合が約５ｐｐｍ未満であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物を単離する方法も提供する。
【０１１８】
さらに別の態様では、本発明は、（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳動物細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程と、任意の順序の、（ｉｉ）可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程と；（ｉｉｉ）可溶性画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程と；（ｉｖ）可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程と；（ｖ）可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮かつ溶出された組成物を得る工程とを含み、工程（ｉｉｉ）で得られた組成物が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種の割合が約２．５面積％未満であり、細胞タンパク質の割合が９５ｎｇ／ｍｌ未満であり、ＭＣＰ−１の割合が約５ｐｐｍ未満であり、ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８．０〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物を単離する方法を提供する。
【０１１９】
一実施形態では、本方法の工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約７５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約３６０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファーを用いて実施する。別の実施形態では、本発明の工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約８５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の溶出バッファーを用いて実施する。さらなる実施形態では、本方法の工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約８５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の単一の洗浄バッファーを用いて実施する。さらなる実施形態では、本方法の工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーは、約２５ｍＭのトリスおよび約２５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファーを用いて実施する。さらに別の実施形態では、本方法の工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーは、約１００ｍＭのグリシンを含み、ｐＨが約３．５の溶出バッファーを用いて実施する。さらに別の実施形態では、本方法の工程（ｖ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１２０ｍＭのＮａＣｌ〜約１３０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファーを用いて実施する。さらに別の実施形態では、本方法の工程（ｖ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約２００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の溶出バッファーを用いて実施する。さらに別の実施形態では、本方法の工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、第一級、第二級、第三級、または第四級アミン官能基を含む陰イオン交換樹脂を有するカラムを用いて実施する。具体的な実施形態では、樹脂は第四級アミン官能基を含む。さらに別の実施形態では、本方法の工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を含む疎水性相互作用樹脂を用いて実施する。具体的な実施形態では、官能基はフェニル官能基を含む。さらに別の実施形態では、本方法の工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を用いて実施する。
【０１２０】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を液体細胞培養物から精製することを含み、精製したＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物が、（ａ）１ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子あたりに医薬上許容される量のＭＣＰ−１と、（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定して２．５面積％未満のＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を調製する方法を提供する。一実施形態では、医薬上許容されるＭＣＰ−１の量は約４０〜約０．５ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む。別の実施形態では、医薬上許容されるＭＣＰ−１の量は約３５〜約０．５ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む。さらなる実施形態では、医薬上許容されるＭＣＰ−１の量は約１０〜約０．５ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む。さらなる実施形態では、本方法の工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーは、溶出されたタンパク質生成物中のＭＣＰ−１を減少させることができる樹脂を含むカラムを用いて実施する。さらに別の実施形態では、本方法の工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、疎水性相互作用樹脂を用いて実施し、樹脂は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体をＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種から分離すること；（ｂ）溶出されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸含有率を増加させること；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）両方を行う能力を有する。さらに別の実施形態では、工程（ｉｉ）もしくは工程（ｉｖ）の陰イオン交換クロマトグラフィー、または両方は、陰イオン交換樹脂を用いて実施し、樹脂は、（ａ）溶出された組成物のＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量凝集体の含有率を減少させること；（ｂ）溶出された組成物のシアル酸含有率を増加させること；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）両方を行う能力を有する。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳動物細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程と、任意の順序の；（ｉｉ）可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶出された組成物を得る工程と；（ｉｉｉ）可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶出かつ濃縮された組成物を得る工程と；（ｉｖ）可溶性画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶出かつ濃縮された組成物を得る工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する方法を提供する。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー工程を最初に行う。別の実施形態では、本方法の工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａを含む樹脂を用いて実施する。さらなる実施形態では、工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーは、グアニジンを含む溶出バッファーを用いて実施する。さらなる実施形態では、工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーは、尿素を含む溶出バッファーを用いて実施する。さらに別の実施形態では、工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーによりＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶出された組成物中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の増加がもたらされる。
【０１２２】
さらに別の態様では、本発明は、（ｉ）収集した液体の可溶性画分を得る工程と；（ｉｉ）可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶出された組成物を得る工程と；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の組成物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶出かつ濃縮された組成物を得る工程と；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の組成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含むさらに濃縮された組成物を得る工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を哺乳動物細胞培養物から収集した液体から単離し、細胞がＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する方法を提供する。一実施形態では、本方法の工程（ｉｖ）で得られた組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定された高分子量種の割合が約２．５面積％未満であり、細胞タンパク質の割合が約９５ｎｇ／ｍｌ未満であり、ＭＣＰ−１の割合が約５ｐｐｍ未満であることによって特徴づけられている。別の実施形態では、工程（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１３５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７の洗浄バッファーを用いて実施する。さらなる実施形態では、工程（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約２００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７の溶出バッファーを用いて実施する。具体的な実施形態では、工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を含む疎水性相互作用樹脂を用いて実施する。さらなる実施形態では、工程（ｉｖ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１．２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含み、ｐＨが約７の洗浄バッファーを用いて実施する。さらに別の実施形態では、工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーは、約２５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4および約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．５の洗浄バッファーを用いて実施する。さらに別の実施形態では、工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーは、約２５０ｍＭのグリシンを含み、ｐＨが約３の溶出バッファーを用いて実施する。別の実施形態では、工程（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、第一級、第二級、第三級、または第四級アミン官能基を含む陰イオン交換樹脂を有するカラムを用いて実施する。具体的な実施形態では、樹脂は第四級アミン官能基を含む。
【０１２３】
一実施形態では、工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を含む疎水性相互作用樹脂を用いて実施する。一実施形態では、官能基はフェニル官能基を含む。一実施形態では、工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａを含む樹脂を用いて実施する。本発明は、本発明の方法のいずれかによって得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、配列番号２、５、６、７、８、９または１０を有する１つまたは複数のポリペプチドを含む。一実施形態では、組成物は、配列番号４、１１、１２、１３、１４、１５または１６を有する１つまたは複数のポリペプチドを含む。本発明は、配列番号１７の核酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現プラスミドを提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の平均モル比が約５．５〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５．５〜約９．５である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。
【０１２４】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５〜約１０である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。
【０１２５】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１２である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１１である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約７〜約１２である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。
【０１２６】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約７〜約１１である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１２〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。
【０１２７】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１３〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１４〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約１７である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。
【０１２８】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１６である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１０である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。一実施形態では、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１２である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．５以下である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。
【０１２９】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮＧＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約０．５〜約１．５である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮＧＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．０〜約１．５である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。
【０１３０】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。
【０１３１】
本発明は、分子のそれぞれのポリペプチドが配列番号１１、１２、１３、１４、１５または１６の配列を含み、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約５．５〜約９．５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのシアル酸のモル比を酸加水分解およびＨＰＬＣによって決定する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、配列番号２、５、６、７、８、９または１０を有する１つまたは複数のポリペプチドを含む。
【０１３２】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、配列番号４、１１、１２、１３、１４、１５または１６を有する１つまたは複数のポリペプチドを含む。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の９５％以上がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む実質的に精製した組成物を提供する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の９８％以上がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体である。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の９９％以上がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体である。
【０１３３】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の９９．５％以上がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体である。一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の約９５％〜約９９．５％がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり、分子の約０．５面積％〜約５面積％がＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種である。一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定された分子の約９８．６％がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり、分子の約１．２面積％がＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種であり、分子の約０．７面積％未満がＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体である。一実施形態では、分子の０．３％未満が５個以上のＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を含む多量体である。本発明は、本質的にＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体からなる組成物を提供する。本発明は、集団がＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を実質的に含まない、本質的にＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子からなる組成物を提供する。本発明は、集団がＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種を実質的に含まない、本質的にＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子からなる組成物を提供する。本発明は、本質的にＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体からなり、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および高分子量種を実質的に含まない組成物を提供する。一実施形態では、それぞれのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体のそれぞれの単量体は、少なくとも３個のシアル酸基を有する。一実施形態では、それぞれのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体のそれぞれの単量体は、少なくとも２．５個のシアル酸基を有する。一実施形態では、それぞれのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体のそれぞれの単量体は、少なくとも３個のシアル酸基〜少なくとも８個のシアル酸基を有する。
【０１３４】
一実施形態では、それぞれのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体のそれぞれの単量体は、少なくとも２．５個のシアル酸基〜少なくとも５個のシアル酸基を有する。一実施形態では、それぞれの二量体は、２個のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドは配列番号５〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、組成物は、配列番号２、５、６、７、８、９または１０を有する１つまたは複数のポリペプチドを含む。一実施形態では、組成物は、配列番号４、１１、１２、１３、１４、１５または１６を有する１つまたは複数のポリペプチドを含む。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含む単離した組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含む単離した組成物を提供する。一実施形態では、組成物は約１００グラムを超える量として存在する。一実施形態では、それぞれの四量体は、２対のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドは配列番号５〜１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、それぞれの四量体は、２対のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドは配列番号１１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、それぞれの四量体は、ＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。本発明は、ＭＣＰ−１を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む医薬上許容される組成物を提供する。本発明は、約２５ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む医薬上許容される組成物を提供する。一実施形態では、組成物は１０ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１を含む。一実施形態では、組成物は約０．２ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−１〜約１０ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−１を含む。一実施形態では、本発明は、（ａ）約０．２ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−１〜約１０ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−１および（ｂ）２５ｎｇ／ｍｌを超えないＣＨＯタンパク質または１０ｎｇ／ｍｌを超えないＣＨＯタンパク質を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む医薬上許容される組成物を提供する。一実施形態では、組成物は約２０ｐｇ／ｍｌを超えないＤＮＡを含む。
【０１３５】
本発明は、約１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で対象に投与した場合にＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、曲線下面積（ＡＵＣ）、約４４４００μｇ．ｈ／ｍｌ；分布容量、約０．０９Ｌ／ｋｇ；ピーク濃度（Ｃｍａｘ）、約２９２μｇ／ｍｌ；クリアランス速度、約０．２３ｍｌ／ｈ／ｋｇを示すことができる、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。本発明は、等電点電気泳動によって決定して５．１±０．２以下の等電点、すなわちｐＩを有する、等電点電気泳動ゲル上で可視化可能なＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の優勢アイソフォームを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。一実施形態では、組成物の平均ｐＩはノイラミニダーゼ処理後に増加する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少なくとも４０％が、等電点電気泳動によって決定して約５．１±０．２以下の等電点を示す。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少なくとも７０％が、等電点電気泳動によって決定して約５．１±０．２以下の等電点を示す。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少なくとも９０％が、等電点電気泳動によって決定して約５．１±０．２以下の等電点を示す。本発明は、約３．０±０．２〜約５．０±０．２のｐＩを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。本発明は、約４．３±０．２〜約５．０±０．２のｐＩを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。
【０１３６】
本発明は、約３．３±０．２〜約４．７±０．２のｐＩを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。一実施形態では、組成物は実質的に精製されている。本発明は、約３．０±０．２〜約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を調製する方法であって、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の混合物を等電点ゲル電気泳動に供する工程であって、ゲル上の単一のバンドが特定のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を表す工程と、（ｂ）約３．０±０．２〜約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を単離して組成物を調製する工程とを含む方法を提供する。本発明は、等電点電気泳動によって決定して５．５±０．２以下の等電点、すなわちｐＩを有する、等電点電気泳動ゲル上で可視化可能な優勢アイソフォームを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。一実施形態では、組成物の平均ｐＩはノイラミニダーゼ処理後に増加する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少なくとも４０％が、等電点電気泳動によって決定して約５．３±０．２以下の等電点を示す。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少なくとも７０％が、等電点電気泳動によって決定して約５．３±０．２以下の等電点を示す。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少なくとも９０％が、等電点電気泳動によって決定して約５．３±０．２以下の等電点を示す。本発明は、約３．０±０．２〜約５．２±０．２のｐＩを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。
【０１３７】
本発明は、約４．５±０．２〜約５．２±０．２のｐＩを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。本発明は、約４．７±０．２〜約５．１±０．２のｐＩを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。一実施形態では、組成物は実質的に精製されている。
【０１３８】
本発明は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の混合物を等電点ゲル電気泳動に供する工程であって、ゲル上の単一のバンドが特定のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を表す工程と、（ｂ）約３．０±０．２〜約５．２±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を単離して組成物を調製する工程とを含む、約２．０±０．２〜約５．２±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を調製する方法を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１７〜約２８であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１７〜約２５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約３５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０１３９】
本発明は、分子のそれぞれのポリペプチドが配列番号１１、１２、１３、１４、１５または１６の配列を含み、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２４〜約２８であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．７〜約３．６であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、分子のそれぞれのポリペプチドが配列番号１１、１２、１３、１４、１５または１６の配列を含み、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２．７〜約３．６であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０１４０】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、分子のそれぞれのポリペプチドが配列番号１１、１２、１３、１４、１５または１６の配列を含み、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１３であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約３．５〜約８．３であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０１４１】
本発明は、分子のそれぞれのポリペプチドが配列番号１１、１２、１３、１４、１５または１６の配列を含み、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６．４〜約７．０であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約７．７〜約２２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、分子のそれぞれのポリペプチドが配列番号１１、１２、１３、１４、１５または１６の配列を含み、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１４〜約１６であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０１４２】
一実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル比をキャピラリー電気泳動によって決定する。一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル比をキャピラリー電気泳動によって決定する。一実施形態では、ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル比をキャピラリー電気泳動によって決定する。
【０１４３】
一実施形態では、フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル比をキャピラリー電気泳動によって決定する。一実施形態では、マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル比をキャピラリー電気泳動によって決定する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が１つまたは複数の炭水化物と分子との酵素的結合によって得られる。本発明は、分子が、インビトロで酵素的に分子と結合した炭水化物残基を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約３．５〜約８．３であり；（ｅ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約３．５〜約８．３であり；（ｅ）マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約７．２〜約２２であり；（ｆ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２４〜約２８であり；（ｂ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５．５〜約９．５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２４〜約２８であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２．７〜約３．６であり；（ｃ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５．５〜約９．５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２４〜約２８であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２．７〜約３．６であり；（ｃ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１３であり；（ｄ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５．５〜約９．５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２４〜約２８であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２．７〜約３．６であり；（ｃ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１３であり；（ｄ）フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６．４〜約７．０であり；（ｅ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５．５〜約９．５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２４〜約２８であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２．７〜約３．６であり；（ｃ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１３であり；（ｄ）フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６．４〜約７．０であり；（ｅ）マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の平均モル比が約１４〜約１６であり；（ｆ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の平均モル比が約５．５〜約９．５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０１４４】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、配列番号２もしくは４の位置１０２のアスパラギンアミノ酸残基、配列番号２もしくは４の位置１３４のアスパラギンアミノ酸残基、配列番号２もしくは４の位置２３３のアスパラギンアミノ酸残基、配列番号２もしくは４の位置１５５のセリンアミノ酸残基、または配列番号２もしくは４の位置１６５のセリンアミノ酸残基でグリコシル化されている、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子がグリコシル化されており、グリコシル化の全質量の少なくとも約２％がＯ結合型グリコシル化である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０１４５】
本発明は、約９．６±０．３のＮＧＮＡクロマトグラムピークおよび約１０．５±０．３のＮＡＮＡクロマトグラムピークを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が図６８と実質的に同じ炭水化物プロフィールを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ−Ｉｇ分子が図６８に示す炭水化物プロフィールを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子がドメインＩ〜ＩＶの炭水化物プロフィールを示し、ドメインＩがａ−シアル化オリゴ糖を表すピークを含み、ドメインＩＩがモノ−シアル化オリゴ糖を表すピークを含み、ドメインＩＩＩがジ−シアル化オリゴ糖を表すピークを含み、ドメインＩＶがトリ−シアル化オリゴ糖を表すピークを含み、ドメインＶがテトラ−シアル化オリゴ糖を表すピークを含み、プロフィールとは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇから放出されるオリゴ糖のクロマトグラムである、本質的にＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子からなる組成物を提供する。一実施形態では、ドメインＩ中の最初のピークとドメインＩＩ中の主要ピークとの間のＮ結合型オリゴ糖の保持時間の差は約１０〜約１２分である。一実施形態では、ドメインＩ中の最初のピークとドメインＩＩ中の主要ピークとの間のＮ結合型オリゴ糖の保持時間の差は約１１〜約１３分である。一実施形態では、ドメインＩＩＩおよびＩＶのグリコシル化は、ＨＰＡＥＣによって測定して約２５％〜約３６％のＮ結合型グリコシル化を含む。一実施形態では、ドメインＩのグリコシル化は、ＨＰＡＥＣによって測定して約２４．５％〜約３５．２％のＮ結合型グリコシル化を含む。一実施形態では、ドメインＩＩのグリコシル化は、ＨＰＡＥＣによって測定して約２６．３％〜約３４．１％のＮ結合型グリコシル化を含む。一実施形態では、ドメインＩＩＩのグリコシル化は、ＨＰＡＥＣによって測定して約２１．９％〜約３１．５％のＮ結合型グリコシル化を含む。一実施形態では、ドメインＩＶおよびドメインＶのグリコシル化は、ＨＰＡＥＣによって測定して約７．９％〜約１８．６％のＮ結合型グリコシル化を含む。
【０１４６】
一実施形態では、（ａ）ドメインＩが少なくとも約３１の面積％を示すか；（ｂ）ドメインＩＩが少なくとも約３３の面積％を示すか；（ｃ）ドメインＩＩＩが少なくとも約２４の面積％を示すか；（ｉｖ）ドメインＩＶが少なくとも約９．４の面積％を示すか；（ｖ）ドメインＶが少なくとも約６７の面積％を示すか；または、面積はＣＴＬＡ４−Ｉｇから放出されるオリゴ糖のクロマトグラムから測定する。
【０１４７】
一実施形態では、（ａ）ドメインＩが少なくとも約５個のピークを示すか；（ｂ）ドメインＩＩが少なくとも約５個のピークを示すか；（ｃ）ドメインＩＩＩが少なくとも約５個のピークを示すか；（ｄ）ドメインＩＶが少なくとも約６個のピークを示すか；または（ｅ）ドメインＶが少なくとも約６個のピークを示し、ピークはクロマトグラム上に示される。第１のピークの最小面積が約４．５％であり、最大面積が約１１．２％であり、第２のピークの最小面積が約８．７％であり、最大が約１１．８％である、少なくとも２つのピークをドメインＩが示す組成物。
【０１４８】
一実施形態では、ドメインＩＩＩおよびＩＶは、ＨＰＡＥＣによって測定して約２５％〜約３６％の面積％を示す。一実施形態では、ドメインＩは、ＨＰＡＥＣによって測定して約２４．５％〜約３５．２％の面積％を示す。一実施形態では、ドメインＩＩは、ＨＰＡＥＣによって測定して約２６．３％〜約３４．１％の面積％を示す。一実施形態では、ドメインＩＩＩは、ＨＰＡＥＣによって測定して約２１．９％〜約３１．５％の面積％を示す。一実施形態では、ドメインＩＶは、ＨＰＡＥＣによって測定して約７．９％〜約１８．６％の面積％を示す。
【０１４９】
本発明は、（ａ）ポリペプチドの約８０％が二分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｂ）ポリペプチドの約１４％が三分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｃ）ポリペプチドの約６％が四分岐のＮ結合型グリコシル化を有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含む組成物を提供する。一実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化を、パルスアンペロメトリック検出を備えた高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＥＡＣ−ＰＡＤ）によって決定する。本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｂ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、
【０１５０】
（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｂ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であり；（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種の面積％が約３％未満であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｂ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であり；（ｃ）ＮＧＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．５以下であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０１５１】
本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｂ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であり；（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量凝集体の含有率が約３面積％未満であり；（ｄ）炭水化物プロフィールが図６８と実質的に同じであることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｂ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であり；（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量凝集体の含有率が約３面積％未満であり；（ｄ）ＨＰＡＥＣによって決定されるドメインＩＩＩ、ＩＶおよびＶ中のグリコシル化の含有率が少なくとも約２９．８％〜約５０．１％のＮ結合型グリコシル化であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｂ）ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であり；（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が約３面積％未満であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、分子は、ＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１２であることによってさらに特徴づけられている。
【０１５２】
一実施形態では、分子は、（ａ）約８０％の二分岐のＮ結合型グリコシル化；（ｂ）約１４％の三分岐のＮ結合型グリコシル化；および（ｃ）約６％の四分岐のＮ結合型グリコシル化によってさらに特徴づけられている。一実施形態では、分子は、（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸位置２７のメチオニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸位置２７のメチオニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）；（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸位置２６のアラニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）；ならびに（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸位置２６のアラニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）の１つまたは複数の任意の組合せをさらに含む。一実施形態では、（ａ）分子の約９０％が、残基２７のメチオニンから始まる配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｂ）分子の約１０％が、残基番号２６のアラニンから始まる配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｃ）分子の約４％が、残基番号３８３のリシンで終わる配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｄ）分子の約９６％が、残基番号３８２のグリシンで終わる配列番号２のアミノ酸配列を含む。本発明は、（ａ）ポリペプチドの約８０％が二分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｂ）ポリペプチドの約１４％が三分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｃ）ポリペプチドの約６％が四分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｄ）ＮＧＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が１．５以下である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ポリペプチドの約８０％が二分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｂ）ポリペプチドの約１４％が三分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｃ）ポリペプチドの約６％が四分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｄ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約３５である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ポリペプチドの約８０％が二分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｂ）ポリペプチドの約１４％が三分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｃ）ポリペプチドの約６％が四分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｄ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．７〜約３．６である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１３であり；（ｂ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５．５〜約９．５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０１５３】
本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１３であり；（ｂ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５．５〜約９．５であり；（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が約５面積％未満であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１３であり、
【０１５４】
（ｂ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５．５〜約９．５であり；（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種の含有率が約５面積％未満であり；（ｄ）炭水化物プロフィールが図６８と実質的に同じであることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１３であり；（ｂ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が５．５〜約９．５であり；（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種の含有率が約５面積％未満であり；（ｄ）ＨＰＡＥＣによって決定されるドメインＩＩＩ、ＩＶおよびＶ中のグリコシル化の含有率が少なくとも約２９．８％〜約５０．１％のＮ結合型グリコシル化であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０１５５】
本発明は、（ａ）ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１１〜約１３であり；（ｂ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５．５〜約９．５であり；（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種の含有率が約５面積％未満であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、分子は、（ａ）約８０％の二分岐のＮ結合型グリコシル化；（ｂ）約１４％の三分岐のＮ結合型グリコシル化；および（ｃ）約６％の四分岐のＮ結合型グリコシル化によってさらに特徴づけられている。別の実施形態では、分子は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸位置２７のメチオニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸位置２７のメチオニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）；（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸位置２６のアラニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）；ならびに（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸位置２６のアラニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）の１つまたは複数の任意の組合せをさらに含む。別の実施形態では、（ａ）分子の約９０％が、残基２７のメチオニンから始まる配列番号４のアミノ酸配列を含み；（ｂ）分子の約１０％が、残基番号２６のアラニンから始まる配列番号４のアミノ酸配列を含み；（ｃ）分子の約４％が、残基番号３８３のリシンで終わる配列番号４のアミノ酸配列を含み；（ｄ）分子の約９６％が、残基番号３８２のグリシンで終わる配列番号４のアミノ酸配列を含む。本発明は、（ａ）ポリペプチドの約８０％が二分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｂ）ポリペプチドの約１４％が三分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｃ）ポリペプチドの約６％が四分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｄ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約２４〜約２８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明は、（ａ）ポリペプチドの約８０％が二分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｂ）ポリペプチドの約１４％が三分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｃ）ポリペプチドの約６％が四分岐のＮ結合型グリコシル化を有し；（ｄ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約２．７〜約３．６である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含む組成物を提供する。別の実施形態では、組成物は実質的に精製した組成物である。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の約２．５％以下が酸化されている、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の約２．０％以下が脱アミド化されている、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体分子の少なくとも０．５％がシステイン化されている、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体分子の少なくとも１．０％がシステイン化されている。本発明は、集団が図６４、６５または６７と実質的に同じ質量分析プロフィールを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、集団が図４８と実質的に同じキャピラリー電気泳動プロフィールを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０１５６】
本発明は、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ガルカトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約３．５〜約８．３であり；（ｅ）マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約７．２〜約２２であり；（ｆ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であり；（ｇ）等電点電気泳動ゲル上での可視化によって決定されたｐＩが約２．４±０．２〜約５．０±０．２の範囲であり；（ｈ）ＭＣＰ−１が３ｐｐｍ以下であり；（ｉ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定された高分子量種が２．５面積％未満であり；（ｊ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定された単量体が０．５面積％未満であり；（ｋ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが配列番号５〜１０のいずれかと少なくとも９５％同一のアミノ酸を有し；（ｌ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子がＣＤ８０およびＣＤ８６と結合することができることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、分子の集団が、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ガルカトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約３．５〜約８．３であり；（ｅ）マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約７．２〜約２２であり；（ｆ）シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１２であり；（ｇ）等電点電気泳動ゲル上での可視化によって決定されたｐＩが約３．４±０．２〜約５．０±０．２の範囲であり；（ｈ）ＭＣＰ−１が５ｐｐｍ以下であり；（ｉ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定された高分子量種が２．５面積％未満であり；（ｊ）サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定された単量体が０．５面積％未満であり；（ｋ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが配列番号５〜１０のいずれかと少なくとも９５％同一のアミノ酸を有し；（ｌ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子がＣＤ８０およびＣＤ８６と結合することができることによって特徴づけられているＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物；またはその医薬的な等価物を提供する。
【０１５７】
本発明は、免疫原性の発生率が７．４％以下である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。一実施形態では、免疫原性の発生率は約２．１％〜約７．４％である。一実施形態では、免疫原性の発生率は３．７％以下である。一実施形態では、免疫原性の発生率は３．０％以下である。一実施形態では、免疫原性の発生率は約２．８％〜約３．０％である。本発明は、組成物をヒトに投与した後、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子と結合する抗体の産生が、ヒトにおいて７．４％以下の発生率で起こる、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。一実施形態では、発生率は約２．１％〜約７．４％である。一実施形態では、発生率は３．７％以下である。一実施形態では、発生率は３．０％以下である。一実施形態では、発生率は約２．８％〜約３．０％である。本発明は、組成物をヒトに投与した後、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＣＴＬＡ４部分と結合する抗体の産生が、ヒトにおいて４．９％以下の発生率で起こる、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。一実施形態では、発生率は約０．５％〜約４．９％である。一実施形態では、発生率は１．２％以下である。一実施形態では、発生率は１．０％以下である。一実施形態では、発生率は約０．９％〜約１．０％である。一実施形態では、発生率を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定する。一実施形態では、発生率を電気化学発光アッセイ（ＥＣＬ）で測定する。
【０１５８】
本発明は、組成物をヒトに投与した後、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を中和する抗体の産生が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＣＴＬＡ４部分と結合する抗体を有するヒトの７５％以下の発生率で起こる、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む単離した組成物を提供する。一実施形態では、発生率は４０〜７５％である。一実施形態では、発生率は４０％以下である。一実施形態では、発生率を細胞に基づいたルシフェラーゼレポーターアッセイで測定する。
【０１５９】
本発明は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、液体培養物が、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたり約６．０モル以上のＮＡＮＡを示した場合に、単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法を提供する。本方法は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、液体培養物が、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたり約５．２〜約７．６モルのシアル酸を示した場合に、単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法も提供する。本方法は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、液体培養物が液体培養物１ｍＬあたり約３３×１０5個の生細胞〜液体培養物１ｍＬあたり約７９×１０5個の細胞の細胞密度を有する場合に単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法も提供する。本発明はまた、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、液体培養物中の細胞生存度が約３８％を下回らない場合に単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法も提供する。本発明はまた、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、液体培養物中の細胞生存度が約３７％を下回らない場合に単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法も提供する。本方法は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、液体培養物のアリコートを評価することによって決定された内毒素が液体培養物の約７６．８ＥＵ／ｍＬ以下である場合に単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法も提供する。本方法は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、液体培養物のアリコートを評価することによって決定された内毒素が液体培養物の約４．８ＥＵ／ｍＬ以下である場合に単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法も提供する。本発明はまた、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、液体培養物のアリコートを評価することによって決定された汚染微生物数が液体培養物１ｍＬあたり１コロニー形成単位未満である場合にのみ単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法も提供する。本発明はまた、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、以下の条件、すなわち（ｉ）液体培養物がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体もしくはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたり約６．０モル以上のＮＡＮＡを含むこと；（ｉｉ）液体培養物が、液体培養物１ｍＬあたり約３３×１０5個の生細胞〜液体培養物１ｍＬあたり約７９×１０5個の生細胞の細胞密度を有すること；（ｉｉｉ）液体培養物中の細胞生存度が約３８％を下回らないこと；または（ｉｖ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率が液体培養物１リットルあたり約０．５グラムを超えるＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質であること［ただし、（ｉ）のＮＡＮＡ濃度および（ｉｖ）の収率は、液体培養物のアリコートを評価することによって決定すること］のうちの少なくとも２つが満たされている場合にのみ単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法も提供する。本発明はまた、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、液体培養物のアリコートを評価することによって決定してＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率で産生されるまで行う工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、以下の条件、すなわち（ｉ）液体培養物がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体もしくはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたり約５．２〜約７．６モルのシアル酸を含むこと；（ｉｉ）液体培養物中の細胞生存度が約３７％を下回らないこと；または（ｉｉｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の収率が液体培養物１リットルあたり約０．５グラムを超えるＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質であること［ただし、（ｉ）のシアル酸含有率および（ｉｉｉ）の収率は、液体培養物のアリコートを評価することによって決定する］のうちの少なくとも２つが満たされている場合にのみ単離を行う工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生する方法も提供する。
【０１６０】
配列：
配列番号１［ＣＴＬＡ４−Ｉｇヌクレオチド配列、図１参照］
配列番号２［ＣＴＬＡ４−Ｉｇアミノ酸配列、図１参照］
配列番号３［ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇヌクレオチド配列は、図２に示す核酸配列のヌクレオチド７９〜１１４９を含む］
配列番号２３は図２に示す完全ヌクレオチド配列である。このヌクレオチド配列には、プロ配列のコード配列が含まれる。
配列番号４［ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇアミノ酸配列、図３、プロ配列なし］
配列番号５［配列番号２のアミノ酸２５〜３８３］
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号６［配列番号２のアミノ酸２６〜３８３］
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号７［配列番号２のアミノ酸２７〜３８３］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号８［配列番号２のアミノ酸２５〜３８２］
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号９［配列番号２のアミノ酸２６〜３８２］
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号１０［配列番号２のアミノ酸２７〜３８２］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号１１［配列番号４のアミノ酸２５〜３８３］
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１２［配列番号４のアミノ酸２６〜３８３］
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１３［配列番号４のアミノ酸２７〜３８３］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１４［配列番号４のアミノ酸２５〜３８２］
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号１５［配列番号４のアミノ酸２６〜３８２］
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号１６［配列番号４のアミノ酸２７〜３８２］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号１７
配列番号１８［ＣＴＬＡ４細胞外ドメイン配列］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
配列番号１９
5'-AGAAAAGGGGCTGGAGAGATGGCTCAGTGGTTAAGAGCA-3'
配列番号２０〜２２
配列番号２０−5'-GTACTCAGG
配列番号２１−AGTCAGAGAC
配列番号２２−CGGCAGATCTCTGTGAGTTTGAGGCCAGCCTGGTCTACAAAGCAAGTT-3'
【０１６１】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇの単量体および多量体
【０１６２】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号１を含む発現カセットを有する細胞系を提供する（図１Ａ）。そのような発現カセットは、ＣＨＯ細胞を含めた哺乳動物細胞中で発現させた場合、発現カセットから産生されたタンパク質が、（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、もしくは（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、または所望により（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、もしくは（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３の残基のアミノ酸配列（図１Ａ）を有することができるような、ＮおよびＣ末端変異体の産生をもたらすことができる。これらのタンパク質は、本明細書中で「配列番号２の単量体」、または「配列番号２の配列を有する」単量体と呼ぶことができる。これらの配列番号２の単量体は、二量体の組合せに、たとえば、（ｉ）と（ｉ）；（ｉ）と（ｉｉ）；（ｉ）と（ｉｉｉ）；（ｉ）と（ｉｖ）；（ｉ）と（ｖ）；（ｉ）と（ｖｉ）；（ｉｉ）と（ｉｉ）；（ｉｉ）と（ｉｉｉ）；（ｉｉ）と（ｉｖ）；（ｉｉ）と（ｖ）；（ｉｉ）と（ｖｉ）；（ｉｉｉ）と（ｉｉｉ）；（ｉｉｉ）と（ｉｖ）；（ｉｉｉ）と（ｖ）；（ｉｉｉ）と（ｖｉ）；（ｉｖ）と（ｉｖ）；（ｉｖ）と（ｖ）；（ｉｖ）と（ｖｉ）；（ｖ）と（ｖ）；（ｖ）と（ｖｉ）；および（ｖｉ）と（ｖｉ）が含まれることができるように、二量体化することができる。これらの様々な二量体の組合せは、互いに会合して四量体ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を形成することもできる。これらの単量体、二量体、四量体、および他の多量体は、本明細書中で「配列番号２のタンパク質」または「配列番号２の配列を有する」タンパク質と呼ぶことができる。細胞系は翻訳後すぐにこれらの変異体を産生することができるが、変異体は、より典型的には細胞内での翻訳後の活動の産物であることができる。細胞系は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子も分泌する。アバタセプトとは、配列番号２のタンパク質をいう。
【０１６３】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子には、たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または他の多量体が含まれることができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、少なくともＣＴＬＡ４の細胞外ドメインおよび免疫グロブリン定常領域と融合したタンパク質を含むことができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、たとえば、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインおよび免疫グロブリン定常領域の配列に関して、野生型配列または突然変異配列を含むことができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇの単量体は単独で、または二量体、四量体もしくは他の多量体として、グリコシル化されていることができる。
【０１６４】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも特定の割合の二量体または他の多量体分子を有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。たとえば、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体が９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％を超える、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。一実施形態では、本発明は、約９５％〜約９９．５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および約０．５％〜約５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団は、約９８％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体、約１．５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体および約０．５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を含む。
【０１６５】
一実施形態では、本発明は、集団がＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子を実質的に含まないとは、１％、０．５％、または０．１％未満の単量体を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団をいうことができる。
【０１６６】
一実施形態では、本発明は、集団が、四量体、六量体等（たとえば高分子量種）などの二量体よりも大きいＣＴＬＡ４−Ｉｇ多量体を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。二量体よりも大きいＣＴＬＡ４−Ｉｇ多量体分子を実質的に含まないとは、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満の二量体よりも大きいＣＴＬＡ４−Ｉｇ多量体（たとえば高分子量種）を有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団をいうことができる。
【０１６７】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子は、たとえば、（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、もしくは（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、または所望により（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、もしくは（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３のアミノ酸配列を有することができる。配列番号１の核酸配列を含む発現カセットをＣＨＯ細胞中で発現させた場合、発現された主な単量体はメチオニンのＮ末端アミノ酸残基を有し（配列番号２の残基２７）これは野生型ヒトＣＴＬＡ４のＮ末端アミノ酸残基に対応する。しかし、配列番号１にはオンコスタチンＭシグナル配列のコード配列も含まれるので（配列番号１のヌクレオチド１１〜８８）、配列番号１から発現されたタンパク質はオンコスタチンＭシグナル配列を含む。シグナル配列は、細胞質からのタンパク質輸出、または細胞からの分泌のプロセス中に発現されたタンパク質から切断される。しかし、切断は、配列番号２のアミノ酸残基２６と２７の間の切断（残基２７のＮ末端をもたらす）と対照的に、配列番号２のアミノ酸残基２５と２６の間の切断（残基２６のＮ末端、すなわち「Ａｌａ変異体」をもたらす）、または配列番号２のアミノ酸残基２４と２５の間（残基２５のＮ末端、すなわち「Ｍｅｔ−Ａｌａ変異体」をもたらす）などのＮ末端変異をもたらすことができる。たとえば、Ｍｅｔ−Ａｌａ変異体はＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の混合物中に約１％で存在することができ、Ａｌａ変異体はＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の混合物中に約８〜１０％で存在することができる。さらに、配列番号１から発現されたタンパク質は、不完全プロセシングによるＣ末端変異を有することができる。主なＣ末端は、配列番号２の残基３８２のグリシンである。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の混合物中では、Ｃ末端にリシンを有する単量体（配列番号２の残基３８３）が、たとえば約４〜５％で存在することができる。
【０１６８】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、以下の配列番号５のアミノ酸配列を有する（これは配列番号２のアミノ酸２５〜３８３と同一である）：
［配列番号５］
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
【０１６９】
別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、以下の配列番号６のアミノ酸配列を有する（これは配列番号２のアミノ酸２６〜３８３と同一である）：
［配列番号６］
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
【０１７０】
別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、以下の配列番号７のアミノ酸配列を有する（これは配列番号２のアミノ酸２７〜３８３と同一である）：
［配列番号７］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
【０１７１】
別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、以下の配列番号８のアミノ酸配列を有する（これは配列番号２のアミノ酸２５〜３８２と同一である）：
［配列番号８］
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG;
【０１７２】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、以下の配列番号９のアミノ酸配列を有する（これは配列番号２のアミノ酸２６〜３８２と同一である）：
［配列番号９］
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG;
【０１７３】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、以下の配列番号１０のアミノ酸配列を有する（これは配列番号２のアミノ酸２７〜３８２と同一である）：
［配列番号１０］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
【０１７４】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子は、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含むことができる。一実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸２７〜１５１をコードしている配列番号１のヌクレオチド８９〜４６３のヌクレオチド配列を含むことができる。別の実施形態では、細胞外ドメインは、ヒトＣＴＬＡ４の突然変異配列を含むことができる。別の実施形態では、細胞外ドメインは、保存的アミノ酸変化が行われるように、配列番号１のヌクレオチド８９〜４６３へのヌクレオチド変化を含むことができる。別の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号１のヌクレオチド８９〜４６３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１７５】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子は、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含むことができる。この定常領域は、定常領域の一部分であることができ；この定常領域は野生型配列または突然変異配列を有することができる。定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤまたはＩｇＥ由来であることができる。定常領域は、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖由来であることができる。定常領域がＩｇＧ、ＩｇＤ、またはＩｇＡ分子由来である場合は、定常領域は、以下の定常領域ドメイン、すなわちＣL、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３の１つまたは複数を含むことができる。定常領域がＩｇＭまたはＩｇＥ由来である場合は、定常領域は、以下の定常領域ドメイン、すなわちＣL、ＣH１、ＣH２、ＣH３、またはＣH４の１つまたは複数を含むことができる。一実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥ由来の１つまたは複数の定常領域ドメインを含むことができる。
【０１７６】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体は２つの単量体からなり、それぞれの単量体は同一または異なるアミノ酸配列を有することができ、配列は、（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３のアミノ酸配列であることができる。そのようなＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体は、配列番号２の位置１４６のシステインアミノ酸残基を介してヒトＣＴＬＡ４配列の細胞外ドメインによって二量体化することができる。
【０１７７】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、ＩｇＭまたはＩｇＡ定常領域ドメインとＪ鎖タンパク質との相互作用によって多量体化することができる。ＩｇＭおよびＩｇＡは通常、追加のポリペプチド鎖であるＪ鎖と会合した多量体として産生される。五量体ＩｇＭでは、単量体は、ジスルフィド結合によって、ＣＨ３ドメインで互いに架橋結合されており、ＣＨ４ドメインでＪ鎖と架橋結合されている。また、ＩｇＭも、Ｊ鎖を欠く六量体を形成することができ、多量体化は、それぞれに対するジスルフィド結合によって達成される。二量体ＩｇＡでは、単量体は、そのＣＨ３ドメインを介してＪ鎖とジスルフィド結合を有するが、互いに対しては有さない。したがって、一実施形態では、本発明は、Ｉｇ部分がＩｇＭ定常領域もしくはその一部分またはＩｇＡ定常領域もしくはその一部分を含む、二量体、五量体、および六量体を含めたＣＴＬＡ４−Ｉｇ多量体を提供する。ＩｇＭまたはＩｇＡに基づいたそのようなＣＴＬＡ４−Ｉｇ多量体には、Ｊ鎖が含まれることができる。
【０１７８】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子（ＣＴＬＡ４  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｉ１３２５３号）は、修飾されたヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号１のヌクレオチド４６４〜５０８；配列番号２のアミノ酸１５２〜１６６）を含み、配列番号２のアミノ酸残基１５６、１６２、および１６５のセリンが、野生型配列中に存在するシステインから遺伝子操作されている。
【０１７９】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子は、修飾されたヒトＩｇＧ１  ＣＨ２領域および野生型ＣＨ３領域を含む（修飾されたヒトＩｇＧ１  ＣH２ドメインは配列番号１のヌクレオチド５０９〜８３８および配列番号２のアミノ酸１６７〜２７６を有し；ヒトＩｇＧ１  ＣH３ドメインは配列番号１のヌクレオチド８３９〜１１５９および配列番号２のアミノ酸２７７〜３８３を有する）。
【０１８０】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団は、そのそれぞれが参考としてその全体で本明細書中に組み込まれている、２００２／０１８２２１１Ａ１号の図７、８、または９のいずれか１つまたは複数、米国特許出願第２００３００８３２４６号および同第２００４００２２７８７号に示されている配列を有する単量体を含む。
【０１８１】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを２対または２つの二量体含み、それぞれのポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の１つを有する：（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３。ポリペプチド対または二量体のそれぞれのメンバーは他方のメンバーと共有結合しており、２対のポリペプチドが互いに非共有結合的に会合して四量体を形成している。そのような四量体分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。別の実施形態では、そのような四量体分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体（その単量体は上記アミノ酸配列の１つを有する）のＣＤ８０またはＣＤ８６に対する結合力よりも少なくとも２倍高い結合力で、ＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。別の実施形態では、そのような四量体分子は、野生型ＣＴＬＡ４のＣＤ８０またはＣＤ８６に対する結合親和性または結合力よりも少なくとも２倍高い結合力で、ＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。そのようなより高い結合力は、免疫障害および下に記載する他の疾患の治療、ならびに組織および／または実質臓器の移植片拒絶の阻害において、より高い有効性に貢献することができる。さらに、より高いまたは向上した結合力は、より高い薬物力価をもたらすことができる。たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含む治療組成物はより高い結合力を有するので、したがって、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を有する同じ量の治療組成物よりも高い力価を有する。別の実施形態では、そのような四量体分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体（その単量体は上記アミノ酸配列の１つを有する）と比較して、Ｔ細胞増殖に対して少なくとも２倍高い阻害を有することができる。別の実施形態では、そのような四量体分子は、野生型ＣＴＬＡ４分子と比較して、Ｔ細胞増殖に対して少なくとも２倍高い阻害を有することができる。
【０１８２】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの単量体、二量体、および多量体
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇとは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの修飾された形態である（図１Ａ；配列番号１〜２）。修飾は、図２に示すように、２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）をもたらす点変異からなる（図３のアミノ酸位置５５および１３０に対応；配列番号４）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇと比較して、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ（たとえば配列番号５〜１０）は、約２倍高い結合力でＣＤ８０（Ｂ７−１）と結合し、約４倍高い結合力でＣＤ８６（Ｂ７−２）と結合する。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、およびナチュラルキラー細胞による標的細胞のＣＤ２８依存性の死滅の阻害において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇよりも約１０倍有効である。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、Ｂ７−１に媒介されるＴ細胞増殖の中程度の阻害を引き起こすが、Ｂ７−２に媒介されるＴ細胞増殖の遮断においてＣＴＬＡ４−Ｉｇよりも顕著に強力である。力価の増加はＢ７−２だけを遮断するのか、Ｂ７−１およびＢ７−２をどちらも遮断するのかにかかわらず匹敵し、これは、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの免疫調節活性の増強が、Ｂ７−２を遮断する力価の増強に起因する可能性が高いことを示唆している。
【０１８３】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇとは、修飾されたヒトＣＴＬＡ−４の機能的結合ドメインおよびＩｇＧ１クラスのヒト免疫グロブリンのＦｃドメインからなる、遺伝子操作した融合タンパク質である（図３Ａ〜Ｂ）。２つのアミノ酸置換をＣＴＬＡ−４ドメインのＢ７結合領域中に行って（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を作製する。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体は、２つのグリコシル化されたＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ鎖からなる。これは、鎖間ジスルフィド結合によって連結された共有結合性の二量体として存在する。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の分子モデルを図４に示す。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、マトリックス支援レーザー脱離−イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって決定された平均質量が約９１，８００Ｄａである。
【０１８４】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号３を含む発現カセットを有する細胞系を提供する。そのような発現カセットは、哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞中で発現させた場合、発現カセットから産生されたポリペプチドが、（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２；（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、もしくは（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、または所望により（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、もしくは（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３の残基のアミノ酸配列を有することができるような、ＮおよびＣ末端変異体の産生をもたらすことができる。これらのポリペプチドは、本明細書中で「配列番号４の単量体」、または「配列番号４の配列」を有する単量体と呼ぶことができる。
【０１８５】
これらの配列番号４の単量体は、たとえば、（ｉ）と（ｉ）；（ｉ）と（ｉｉ）；（ｉ）と（ｉｉｉ）；（ｉ）と（ｉｖ）；（ｉ）と（ｖ）；（ｉ）と（ｖｉ）；（ｉｉ）と（ｉｉ）；（ｉｉ）と（ｉｉｉ）；（ｉｉ）と（ｉｖ）；（ｉｉ）と（ｖ）；（ｉｉ）と（ｖｉ）；（ｉｉｉ）と（ｉｉｉ）；（ｉｉｉ）と（ｉｖ）；（ｉｉｉ）と（ｖ）；（ｉｉｉ）と（ｖｉ）；（ｉｖ）と（ｉｖ）；（ｉｖ）と（ｖ）；（ｉｖ）と（ｖｉ）；（ｖ）と（ｖ）；（ｖ）と（ｖｉ）；および、（ｖｉ）と（ｖｉ）が含まれることができるように、二量体化することができる。これらの様々な二量体の組合せは、互いに会合して四量体ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を形成することもできる。これらの単量体、二量体、テラマー、および他の多量体は、本明細書中で「配列番号４のポリペプチド」または「配列番号４の配列」を有するポリペプチドと呼ぶことができる。細胞系は翻訳後すぐにこれらの変異体を産生することができるが、変異体は、より典型的には細胞内での翻訳後の活動の産物であることができる。二量体は、一緒に共有結合しているか、一緒に非共有結合しているか、または両方行うことができる。本発明は、共有結合した二量体から本質的になる組成物を提供する。たとえば、本発明は、少なくとも５０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体が、共有結合した単量体からなる組成物を提供する。本発明はまた、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体が、共有結合した単量体からなる組成物も提供する。本発明はまた、分子が主に二量体であり、二量体が主に共有結合によって形成される、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物も提供する。たとえば、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の大多数が共有結合している組成物を提供する。組成物中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の一部分が非共有結合している可能性もある。
【０１８６】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子には、たとえば、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または他の多量体が含まれることができる。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、少なくとも修飾されたＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（配列番号１８）および免疫グロブリン定常領域と融合したタンパク質を含むことができる。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、たとえば、修飾されたＣＴＬＡ４細胞外ドメインおよび免疫グロブリン定常領域の配列に関して、突然変異配列を有することができる。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの単量体は単独で、または二量体、四量体または他の多量体として、グリコシル化されていることができる。
【０１８７】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも特定の割合の二量体または他の多量体分子を有する、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。たとえば、本発明は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体が９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％を超える、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。一実施形態では、本発明は、約９５％〜約９９．５％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体および約０．５％〜約５％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ四量体を含む、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、約９５％〜約９９．５％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体、約０．５％〜約２．５％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体、および約０．５％〜約５％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ四量体を含む、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団は、約９６％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体、約２．５％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ四量体、および約０．５％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体を含む。
【０１８８】
一実施形態では、本発明は、集団がＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体を実質的に含まないとは、１％、０．５％、または０．１％未満の単量体を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団をいうことができる。
【０１８９】
別の実施形態では、本発明は、集団が、四量体、六量体などの二量体よりも大きいＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ多量体を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。二量体よりも大きいＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ多量体を実質的に含まないとは、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満の二量体よりも大きいＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ多量体を有する、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団をいうことができる。
【０１９０】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体は、たとえば、（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、もしくは（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、または所望により（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、または（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３のアミノ酸配列を有することができる。配列番号３または２３の核酸配列を含む発現カセットをＣＨＯ細胞中で発現させた場合、発現された主な単量体はメチオニンのＮ末端アミノ酸残基を有し（配列番号４の残基２７）、これはヒトＣＴＬＡ４のＮ末端アミノ酸残基に対応する。しかし、配列番号２３にはオンコスタチンＭシグナル配列のコード配列も含まれるので（配列番号２３のヌクレオチド１１〜８８）、配列番号２３から発現されたタンパク質はオンコスタチンＭシグナル配列を含む。
【０１９１】
シグナル配列は、細胞質からのタンパク質輸出、または細胞からの分泌のプロセス中に発現されたタンパク質から切断される。しかし、切断は、配列番号４のアミノ酸残基２６と２７の間の切断（アミノ酸位置２７のＭｅｔ残基から始まるＮ末端をもたらす）と対照的に、配列番号４のアミノ酸残基２５と２６の間の切断（残基２６のＮ末端、すなわち「Ａｌａ変異体」をもたらす）、または配列番号４のアミノ酸残基２４と２５の間（残基２５のＮ末端、すなわち「Ｍｅｔ−Ａｌａ変異体」をもたらす）などのＮ末端変異体をもたらすことができる。たとえば、Ｍｅｔ−Ａｌａ変異体はＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の混合物中に約１％で存在することができ、Ａｌａ変異体はＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の混合物中に約１０〜２０％で存在することができる。
【０１９２】
さらに、配列番号３を含む核酸から発現されたタンパク質は、不完全プロセシングによるＣ末端変異を有することができる。主なＣ末端は配列番号４の残基３８２のグリシンである。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の混合物中では、Ｃ末端にリシンを有する単量体（配列番号４の残基３８３）が、たとえば約４〜８％で存在することができる。
【０１９３】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、以下の配列番号１１のアミノ酸配列を含む（これは配列番号４のアミノ酸２５〜３８３と同一である）：
［配列番号１１］
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
【０１９４】
別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、以下の配列番号１２のアミノ酸配列を含む（これは配列番号４のアミノ酸２６〜３８３と同一である）：
［配列番号１２］
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
【０１９５】
さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、以下の配列番号１３のアミノ酸配列を含む（これは配列番号４のアミノ酸２７〜３８３と同一である）：
［配列番号１３］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
【０１９６】
別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、以下の配列番号１４のアミノ酸配列を含む（これは配列番号４のアミノ酸２５〜３８２と同一である）：
［配列番号１４］
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
【０１９７】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、以下の配列番号１５のアミノ酸配列を有する（これは配列番号４のアミノ酸２６〜３８２と同一である）：
［配列番号１５］
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
【０１９８】
さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、以下の配列番号１６のアミノ酸配列を有する（これは配列番号４のアミノ酸２７〜３８２と同一である）：
［配列番号１６］
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
【０１９９】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体は、２つのアミノ酸置換がＣＴＬＡ−４ドメイン内に行われている（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含むことができる（図５）。一実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号４のアミノ酸２７〜１５１をコードしている配列番号２３のヌクレオチド８９〜４６３のヌクレオチド配列を含むことができる。別の実施形態では、細胞外ドメインは、ヒトＣＴＬＡ４の突然変異配列を含むことができる（配列番号４のアミノ酸２７〜１５１中に１箇所、２箇所、および３箇所の部位突然変異）。別の実施形態では、細胞外ドメインは、保存的アミノ酸変化が行われるように、配列番号２３のヌクレオチド８９〜４６３へのヌクレオチド変化を含むことができる。さらなる実施形態では、細胞外ドメインは、非保存的アミノ酸変化が行われるように、配列番号２３のヌクレオチド８９〜４６３へのヌクレオチド変化を含むことができる。別の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号２３のヌクレオチド８９〜４６３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。
【０２００】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体は、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含むことができる。この定常領域は、定常領域の一部分であることができる。この定常領域は、野生型配列または突然変異配列を有することもできる。定常領域は、ヒトＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＭ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＤまたはＩｇＥ由来であることができる。定常領域は、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖由来であることができる。定常領域がＩｇＧ、ＩｇＤ、またはＩｇＡ分子由来である場合は、定常領域は、以下の定常領域ドメイン、すなわちＣL、ＣH１、ヒンジ、ＣH２、またはＣH３の１つまたは複数を含むことができる。定常領域がＩｇＭまたはＩｇＥ由来である場合は、定常領域は、以下の定常領域ドメイン、すなわちＣL、ＣH１、ＣH２、ＣH３、またはＣH４の１つまたは複数を含むことができる。一実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥ由来の１つまたは複数の定常領域ドメインを含むことができる。
【０２０１】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体は２つの単量体からなり、それぞれの単量体は同一または異なるアミノ酸配列を有することができ、配列は、（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３のアミノ酸配列であることができる。そのようなＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体は、配列番号４の位置１４６システインアミノ酸残基（または図５の位置１２０のシステインアミノ酸残基）を介してヒトＣＴＬＡ４配列の細胞外ドメインによって二量体化することができる。
【０２０２】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、ＩｇＭまたはＩｇＡ定常領域ドメインとＪ鎖タンパク質との相互作用によって多量体化することができる。ＩｇＭおよびＩｇＡは通常、追加のポリペプチド鎖であるＪ鎖と会合した多量体として産生される。五量体ＩｇＭでは、単量体は、ジスルフィド結合によって、ＣH３ドメインで互いに架橋結合されており、ＣH４ドメインでＪ鎖と架橋結合されている。また、ＩｇＭも、Ｊ鎖を欠く六量体を形成することができ、多量体化は、それぞれに対するジスルフィド結合によって達成される。二量体ＩｇＡでは、単量体は、そのＣH３ドメインを介してＪ鎖とジスルフィド結合を有するが、互いに対しては有さない。したがって、一実施形態では、本発明は、Ｉｇ部分がＩｇＭ定常領域もしくはその一部分またはＩｇＡ定常領域もしくはその一部分を含む、二量体、五量体、および六量体を含めたＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ多量体を提供する。ＩｇＭまたはＩｇＡに基づいたそのようなＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ多量体には、Ｊ鎖が含まれることができる。
【０２０３】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体は、修飾されたヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号２３のヌクレオチド４６４〜５０８；配列番号４のアミノ酸１５２〜１６６）を含み、配列番号４の位置１５６、１６２、および１６５のセリン残基が、野生型配列中に存在するシステイン残基から遺伝子操作されている。
【０２０４】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体は、修飾されたヒトＩｇＧ１  ＣＨ２領域および野生型ＣＨ３領域を含む（修飾されたヒトＩｇＧ１  ＣH２ドメインは配列番号１のヌクレオチド５０９〜８３８および配列番号２のアミノ酸１６７〜２７６を有し；ヒトＩｇＧ１  ＣH３ドメインは配列番号１のヌクレオチド８３９〜１１５９および配列番号２のアミノ酸２７７〜３８３を有する）。
【０２０５】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団は、そのそれぞれが参考としてその全体で本明細書中に組み込まれている、米国特許出願第２００２／００３９５７７号、同第２００３／０００７９６８号、同第２００４／００２２７８７号、同第２００５／００１９８５９号および同第２００５／００８４９３３号、ならびに米国特許第７，０９４，８７４号に示されている配列を有する単量体を含む。
【０２０６】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ四量体は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を２対または２つの二量体含み、それぞれのポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の１つを有する：（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３。ポリペプチド対または二量体のそれぞれのメンバーは他方のメンバーと共有結合しており、２対のポリペプチドが互いに非共有結合的に会合して四量体を形成している。そのような四量体分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。別の実施形態では、そのような四量体分子は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体（その単量体は上記アミノ酸配列の１つを有する）のＣＤ８０またはＣＤ８６に対する結合力よりも少なくとも２倍高い結合力で、ＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。
【０２０７】
そのようなより高い結合力は、免疫障害および下に記載する他の疾患の治療、ならびに組織および／または実質臓器の移植片拒絶の阻害において、より高い有効性に貢献することができる。さらに、より高いまたは向上した結合力は、より高い薬物力価をもたらすことができる。たとえば、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ四量体を含む治療組成物はより高い結合力を有するので、したがって、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体を有する同じ量の治療組成物よりも高い力価を有する。別の実施形態では、そのような四量体分子は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体（その単量体は上記アミノ酸配列の１つを有する）と比較して、Ｔ細胞増殖に対して少なくとも２倍高い阻害を有することができる。別の実施形態では、そのような四量体分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体分子と比較して、Ｔ細胞増殖に対して少なくとも２倍高い阻害を有することができる。
【０２０８】
ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の特徴づけ
【０２０９】
Ｔ細胞増殖は、当分野で知られている標準のアッセイを用いて測定することができる。たとえば、Ｔ細胞増殖を評価する最も一般的な１つは、抗原または作用性抗体を介して、Ｔ細胞をＴＣＲに対して刺激して、たとえば、増殖Ｔ細胞中におけるトリチウム標識したチミジン（3Ｈ−ＴｄＲ）の取り込み、または増殖Ｔ細胞によって培養物へと放出されるサイトカインの量を測定することである。これにより、Ｔ細胞を活性化または増殖させた際のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の阻害効果を測定することができる。
【０２１０】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の親和性とは、分子の、ＣＤ８０、ＣＤ８６、もしくはＣＤ８０Ｉｇを含めた単一リガンド、またはＣＤ８６Ｉｇ融合タンパク質に対する結合の強度である。ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇのリガンドに対する親和性は、たとえば、表面プラズモン技術に基づいた結合相互作用分析（ＢＩＡ）を用いることによって測定することができる。結合強度を測定する以外にも、会合および解離速度定数などの結合力学の実時間での決定を可能にする。表面マトリックスを共有結合させた、薄い金属フィルムでコーティングしたスライドガラスからなるセンサーチップを、相互作用剤の１つ、すなわち、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ、またはリガンドの１つでコーティングする。他の相互作用剤を含む溶液をその表面の上に流す。連続光線を表面の反対側に向け、その反射角度を測定する。ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇがリガンドと結合する際、光線の共鳴角度が変化する（これは、これがセンサーの反応性の側に近い培地の屈折率に依存し、それは立ち代って培地中に溶けた物質の濃度に直接相関するからである）。続いて、これをコンピュータによって補助して分析する。
【０２１１】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ結合実験は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＧ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）上での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行うことができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇを第一級アミン基によってＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上のカルボキシメチル化デキストランマトリックスと共有結合させ、それによりＣＴＬＡ４−Ｉｇをセンサーチップに固定することができる。あるいは、抗定常領域抗体を用いて、Ｉｇ断片を介してＣＴＬＡ４−Ｉｇをセンサー表面に間接的に固定することができる。その後、リガンドをチップに加えて、リガンドと結合するＣＴＬＡ４−Ｉｇを結合する。親和性の測定は、たとえば、参考としてその全体で本明細書中に組み込まれているvan der Merwe, P. et al., J. Exp. Med. (1997) 185 (3):393-404に記載のように行うことができる。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ結合実験は、上述の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて行うことができる（図６；実施例２１参照）。
【０２１２】
ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の結合力も測定することができる。結合力とは、２つの分子または細胞が複数の部位で互いに結合する強度の総計として定義することができる。結合力は、分子上の一部位とそのリガンドとの結合の強度である親和性とは異なる。理論に縛られずに、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子のより高い結合力は、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子によるＴ細胞の増殖および活性化に対する阻害の力価の増加をもたらすことができる。結合力は、たとえば、２種類の固相アッセイ、すなわちａ）競合的阻害アッセイ、およびｂ）溶出アッセイによって測定することができる。これらのどちらにおいても、リガンドを固体支持体に付着させる。競合的阻害アッセイでは、その後、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を溶液中の固定濃度で、様々な濃度の遊離リガンドと共に加え、固相結合を５０％阻害するリガンド量を決定する。必要なリガンドが少ないほど、結合力が強い。溶出アッセイでは、リガンドを溶液に加える。平衡状態を得た後、カオトロープまたは変性剤（たとえばイソチオシアネート、尿素、もしくはジエチルアミン）を様々な濃度で加えて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ／リガンドの相互作用またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ／リガンドの相互作用を乱す。その後、溶出に抵抗するＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの量をＥＬＩＳＡで決定する。結合力が高いほど、特定の量のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを溶出させるためにより多くのカオトロピック剤が必要である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの異種混合物の相対的結合力を結合力指標（ＡＩ）として表すことができ、これは、結合したＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の５０％を溶出させるために必要な溶出剤の濃度に等しい。データの精密分析は、様々な溶出剤の濃度で溶出されたＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの割合を決定することによって行うことができる。
【０２１３】
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、プロセスを用いて、ＨＩＣ精製工程で溶出されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種の量を減少させることができる（実施例１５参照）。したがって、ＨＩＣカラムのクリーニングピークはＣＴＬＡ４−ＩｇＨＭＷ種が濃縮されている。たとえば、調製用単一または直列カラムＳＥＣ  ＨＰＬＣを用いて、二量体、四量体および多量体部分集合をＨＩＣクリーニングピーク物質から精製することができる。一実施形態では、精製された構成成分は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体、四量体、および六量体である。ＨＩＣクリーニングピーク中に存在するＣＴＬＡ４−Ｉｇの高分子量構成成分の特徴づけは、静的および動的光散乱法技術によって実施することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）プロセス工程追跡で採取した試料により、様々なサンプリング点で二量体、四量体、および多量体の存在が明らかとなった。六量体種は、「クリーニングピークの開始」および「クリーニングピーク最大ＯＤ」に対応する試料中でのみ検出することができる。十量体種は「クリーニングピーク最大ＯＤ」中でのみ検出された。モル質量および流体力学半径形成は、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出と組み合わせた多角度光散乱（ＭＡＬＳ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して分画によって決定することができる。
【０２１４】
細胞系から産生させたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子に関して、ＳＥＣは、タンパク質Ａの溶出液が多量体、四量体、および二量体の構成成分の混合物であることを示している。調製用直列ＳＥＣカラム上でのこの混合物の分画により、多量の多量体、四量体および二量体種の単離が可能となる。単離した画分のＳＥＣ分析におけるそれぞれの構成成分の面積％回収率により、それぞれの画分について９３〜９８％の均一性がもたらされる。一態様では、個々の構成成分の精製により、ＣＴＬＡ４−ＩｇＨＭＷ物質の構成成分とＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の構成成分との物理化学的特性の比較が可能となる。図７は、動的光散乱法検出（ＤＳＬ）を用いたＳＥＣおよびＳＥＣ上の保持時間によって決定された、ＣＴＬＡ４−ＩｇＨＩＣクリーニングピークの多量体、四量体、および二量体画分に対応する見かけ上の分子量を示す。一実施形態では、ＨＩＣクリーニングピークから精製した構成成分の生体特異的結合活性は、ＢＩＡｃｏｒｅに基づいた固定Ｂ７−１Ｉｇ結合アッセイによって決定された結合活性に匹敵する。別の態様では、ＨＩＣクリーニングピークから単離した構成成分のシアル酸モル比は４．９〜７．６の範囲であり、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または二量体（ＨＩＣクリーニングピーク中でない）のシアル酸モル比は８〜１０の範囲である。ＩＥＦゲルによる分析により、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の移動と比較してＨＩＣクリーニングピークから精製したＣＴＬＡ４−Ｉｇアイソフォームの移動度が減少していることが示された。これは、ＣＴＬＡ４−ＩｇＨＩＣクリーニングピーク画分で観察されるシアル酸モル比がより低いことと一貫している（図８）。
【０２１５】
細胞培養条件の選択は、組換えタンパク質生成物の単鎖（すなわち単量体）および高分子量種（すなわち、二量体、四量体など）の形成に影響を与えることができる。また、それだけには限定されないが培地組成を含めた増殖条件も、単鎖の形成およびシステイン化に影響を与えることができる要素である。これは、ジスルフィド結合の減少をもたらす薬剤の存在の結果である可能性が高い。システインを直接、またはシステイン含有培地を、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを分泌する細胞に添加することにより、単鎖および高分子量種の迅速な形成をもたらすことができる。この速度は加えたシステインの量に正比例する。別の実施形態では、遊離スルフヒドリルと反応する化合物であるヨードアセトアミドを添加することで、ジスルフィド結合に依存するＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの高分子量種の形成が遮断される。
【０２１６】
たとえば、ヨードアセトアミドに感受性および非感受性の高分子量経路は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ中で高分子量種が形成されることができる２つの主要かつ明確に異なる機構を強調する。高い塩濃度（０．５Ｍ）をＣＴＬＡ４−Ｉｇ溶液に添加することにより、持続的かつ迅速な速度の高分子量形成がもたらされる。ＥＤＴＡ、ＣｏｎＡｃｉｄＳｏｌ  ＩＩ、およびイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）は、単鎖形成を中程度に増加させる（実施例５参照）。
【０２１７】
特定の実施形態では、本発明は、高分子量ＣＴＬＡ４−Ｉｇの集団を作製する方法を提供する、主にＣＴＬＡ４−Ｉｇの単量体または二量体を含む混合物に、混合物の塩濃度が約０．３、０．４、０．４５、０．５、または０．６Ｍを超えるように、高塩を添加する。一実施形態では、そのような方法により、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体分子を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇの集団を含む混合物が作製される。
【０２１８】
一実施形態では、本発明は、Ｃｙｓ146がシステイン化されているように修飾を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単鎖種の集団を提供する（実施例４参照）。システイン化とは、ポリペプチド鎖内のシステインがジスルフィド結合を介した別のシステインの付着によって修飾されている、翻訳後修飾である。タンパク質のシステイン化は、ＭＨＣクラスＩ制限ウイルス決定因子の免疫原性および抗原性を含めたタンパク質生物活性の改変に関係づけられている。一実施形態では、本発明は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、９０、または９５％のシステイン化単鎖ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明の別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの集団は、約１％を超えないＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子を有し、または別の実施形態、０．６％未満のＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を有する。
【０２１９】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜約Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７であり、Ｙは約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８である。他の実施形態では、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜約Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約４．０、４．５、５．０、５．５または６．０であり、Ｙは約８．０、８．５、９．０、９．５、または１０．０である。他の実施形態では、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜約Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５または９．０であり、Ｙは約１１．０、１１．５、１２．０、１２．５または１３．０である。他の実施形態では、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約６〜約１４、約７〜約１３、約８〜約１２、または約９〜約１１である。他の実施形態では、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約５〜約９、約５．５〜約９．５、約６〜約９、約６〜約１０、または約７〜約１０である。他の実施形態では、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、５以上、または８以上である。特定の実施形態では、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である。
【０２２０】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が２．５以下、２．０以下、１．５以下、１．０以下、または０．５以下である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０２２１】
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の９３．０面積％以上、９３．５面積％以上、９４．０面積％以上、９４．５面積％以上、９５．０面積％以上、９５．５面積％以上、９６．０面積％以上、９６．５面積％以上、または９７．０面積％以上がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の９５．０面積％以上がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり、４．０面積％以下が高分子量種であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む。一部の実施形態では、組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の９５．０面積％以上がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり、５．０面積％以下が高分子量種であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む。
【０２２２】
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の２．０面積％以下、１．５面積％以下、１．０面積％以下、または０．５面積％以下がＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体（すなわち単鎖）である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０２２３】
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の５．０面積％以下、４．５面積％以下、４．０面積％以下、３．５面積％以下、３．０面積％以下、２．５面積％以下、２．０面積％以下、１．５面積％以下、１．０面積％以下、または０．５面積％以下がＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種（たとえば四量体）である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、特にＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む濃縮組成物に関与するものでは（たとえば皮下投与用の組成物など）、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって決定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の１０面積％以下、９面積％以下、８面積％以下、７面積％以下、６面積％以下がＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種である。
【０２２４】
本発明は、組成物が５０ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３８ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下または１ｐｐｍ以下の量のＭＣＰ−１またはＭＣＰ−１様物質を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、組成物が５０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、４０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３８ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、５ｎｇ／ｍｇ以下、４ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または１ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子でＭＣＰ−１またはＭＣＰ−１様物質を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、前記組成物が医薬上許容される組成物である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子および一定量のＭＣＰ−１（ＭＣＰ−１が存在しない場合を含む）を含む組成物を提供する。
【０２２５】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約６〜約１９である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜約Ｙであり、Ｘは約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８であり、Ｙは約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９である。他の実施形態では、ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０．０であり、Ｙは約１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、または１６．０である。他の実施形態では、ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜約Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約６．０、６．５、７．０、７．５または８．０であり、Ｙは約１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、または１９．０である。他の実施形態では、ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約７〜約１５、約８〜約１４、約９〜約１３、約１０〜約１２である。他の実施形態では、ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約７〜約１８、約８〜約１７、約９〜約１７、約９〜約１６、または約１０〜約１５である。他の実施形態では、ガラクトース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は８以上である。
【０２２６】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のフコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約０．５〜約１２である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜約Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５または４．５であり、Ｙは約７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０または１０．５である。他の実施形態では、フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約２．９、３．１、３．３、３．５、３．７、３．９、または４．１であり、Ｙは約７．９、８．１、８．３、８．５、８．７、８．９、または９．１である。他の実施形態では、フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約１．０、１．５、１．７、１．９、２．１、２．３または２．５であり、Ｙは約８．７、８．９、９．１、９．３、９．６、９．９、１０．１、１０．３または１０．５である。他の実施形態では、フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約約３．３〜約８．５、約３．５〜約８．３、約３．７〜約８．１、約３．９〜約７．９である。他の実施形態では、フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約１．５〜約９．５、約１．７〜約９．３、約１．９〜約９．１、または約２．１〜約８．９である。他の実施形態では、フコース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は１．７以上である。
【０２２７】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のマンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約５〜約２５である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、シアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜約Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１であり、Ｙは約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４である。他の実施形態では、マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約６．５、７．０、７．５、７．７、７．９、８．１、８．３、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５または１２．０であり、Ｙは約１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３、２３．５または２４．０である。他の実施形態では、マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜Ｙ（ＸおよびＹを含む）、Ｘは約８、８．５、９．０、９．５、１０．０または１１．０であり、Ｙは約１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５または２０．０である。他の実施形態では、マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約約６〜約２３、約７〜約２２、約７．７〜約２２、約８〜約２１、約９〜約２０、約１０〜約１９、約１１〜約１９、および約１１〜約１７である。他の実施形態では、マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約８〜約１９、約９〜約１８、約１０〜約１７、または約１１〜約１６である。他の実施形態では、マンノース対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は７以上である。
【０２２８】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の５．０面積％以下、４．５面積％以下、４．０面積％以下、３．５面積％以下、３．０面積％以下、２．５面積％以下、２．０面積％以下、１．５面積％以下、１．０面積％以下、または０．５面積％以下が酸化した種である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の５．０面積％以下、４．５面積％以下、４．０面積％以下、３．５面積％以下、３．０面積％以下、２．５面積％以下、２．０面積％以下、１．５面積％以下、１．０面積％以下、または０．５面積％以下が脱アミド化した種である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の３．５面積％以下が酸化した種であり、２．５面積％以下が脱アミド化した種であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む。
【０２２９】
本発明は、組成物が細菌内毒素ＬＡＬを０．７ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、０．６ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、０．５ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、０．４２ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、０．４ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、０．３５ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、０．３ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、０．２５ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、０．２０ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、０．１５ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、または０．０５ＥＵ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子で含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０２３０】
本発明は、組成物が汚染微生物数を２ＣＦＵ／１０ｍＬ以下、１．５ＣＦＵ／１０ｍＬ以下、１ＣＦＵ／１０ｍＬ以下、または０．５ＣＦＵ／１０ｍＬ以下で含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０２３１】
本発明は、組成物がＤＮＡを２５ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２０ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１５ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１０ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、５．０ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、４．０ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３．５ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３．０ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２．５ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１．５ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１．０ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、または０．５ｐｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、または０．２０ｐｇ／ｍｌ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子で含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０２３２】
本発明は、組成物が細胞タンパク質（たとえばＣＨＯタンパク質すなわちＣＨＯＰ）を２００ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１５０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１２５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１００ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、９０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、８０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、７０ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、６０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、５０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、４０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、または５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子で含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、組成物が細胞タンパク質を２００ｐｐｍ以下、１５０ｐｐｍ以下、１２５ｐｐｍ以下、１００ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、または５ｐｐｍ以下で含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０２３３】
本発明は、組成物がＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（たとえばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を４．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、または０．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子で含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、組成物がＴｒｉｔｏｎ−Ｘを４．０ｐｐｍ以下、３．５ｐｐｍ以下、３．０ｐｐｍ以下、２．５ｐｐｍ以下、２．０ｐｐｍ以下、１．５ｐｐｍ以下、１．０ｐｐｍ以下、または０．５ｐｐｍ以下で含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０２３４】
本発明は、組成物がタンパク質Ａを８．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、７．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、７．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、６．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、６．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、５．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、５．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、４．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、４．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、３．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、２．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、１．０ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、または０．５ｎｇ／ｍｇ以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子で含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、組成物がタンパク質Ａを８．０ｐｐｍ以下、７．５ｐｐｍ以下、７．０ｐｐｍ以下、６．５ｐｐｍ以下、６．０ｐｐｍ以下、５．５ｐｐｍ以下、５．０ｐｐｍ以下、４．５ｐｐｍ以下、４．０ｐｐｍ以下、３．５ｐｐｍ以下、３．０ｐｐｍ以下、２．５ｐｐｍ以下、２．０ｐｐｍ以下、１．５ｐｐｍ以下、１．０ｐｐｍ以下、または０．５ｐｐｍ以下で含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０２３５】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約１０〜約４０である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜約Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは１０〜３９の任意の整数であり、Ｙは１１〜４０の任意の整数である。他の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約１２、１４、１４、１５、１６または１７であり、Ｙは約３２、３３、３４、３５、３６または３７である。他の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約１２〜約３５、約１３〜約３５、約１４〜約３５、約１５〜約３５である。
【０２３６】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が約０．５〜約７．０である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜約Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０であり、Ｙは３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、６．０、７．０または８．０である。他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約Ｘ〜Ｙ（ＸおよびＹを含む）であり、Ｘは約０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０であり、Ｙは約３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１または４．２である。他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約０．７〜約４．１、約０．８〜約４．０、約０．９〜約３．９、または約１．０〜約３．８、または約１．１〜約３．７である。他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比は、約１．６〜約３．７、約１．７〜約３．６、約１．８〜約３．５、または約１．９〜約３．４である。
【０２３７】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物が等電点電気泳動ゲル（ＩＥＦゲル）で決定されたｐＩ範囲で以下のバンド、すなわち、約４．３〜約５．６のｐＩ範囲に約１０〜約２２個のバンド；約４．３〜約５．３のｐＩ範囲に約９０％〜約１１０％の累積バンド強度、および約４．５〜約５．２のｐＩ範囲に約３個の主要なバンドを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、約４．３〜約５．６の範囲のバンドは、約５〜約３０個、約６〜約２９個、約７〜約２８個、約８〜約２７個、約９〜約２６個、約１０〜約２５個、約１１〜約２４個、約１２〜約２３個、約１３〜約２２個、約１４〜約２１個、約１５〜約２０個、約１６〜約１９個、約１７〜約２０個、約１８〜約１９個である。
【０２３８】
グリコシル化されたＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの分子ならびにその集団
【０２３９】
限定せずに、グリコシル化とは、ポリペプチド鎖内の特異的部位でタンパク質に複合オリゴ糖構造を付加することをいうことができる。タンパク質のグリコシル化および続く付加した炭水化物プロセシングは、タンパク質の折り畳みおよび構造、タンパク質半減期を含めたタンパク質安定性、ならびにタンパク質の機能的特性に影響を与えることができる。タンパク質のグリコシル化は、修飾が起こる配列の状況によって２つのクラス、すなわちＯ結合型グリコシル化およびＮ結合型グリコシル化に分類することができる。Ｏ結合型多糖類は、ヒドロキシル基、通常はセリンまたはスレオニン残基のどちらかのヒドロキシル基に連結している。Ｏ−グリカンはすべてのセリンおよびスレオニン残基には付加されない。Ｏ結合型オリゴ糖は通常一または二分岐である、すなわち、これらは１つまたは最大２つの分枝鎖（アンテナ）を含み、１つずつ付加される１〜４種類の異なる糖残基を含む。
【０２４０】
Ｎ結合型多糖類は、アスパラギンのアミド窒素に付着している。２つのトリペプチド配列の一方、すなわちアスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のどちらかの一部であるアスパラギンのみが、グリコシル化の標的である。Ｎ結合型オリゴ糖は、一分岐、二分岐、三分岐、四分岐と呼ばれる１〜４つの分枝鎖を有することができる。Ｎ結合型およびＯ結合型オリゴ糖の構造およびそれら中に見つかる糖残基は異なる。その違いにもかかわらず、Ｎ結合型およびＯ結合型多糖の双方のそれぞれの分枝鎖上の末端残基をシアル酸分子によって修飾することができ、これはシアル酸キャッピングと呼ばれる修飾である。シアル酸とは、独特な９個の炭素の単糖ファミリーの一般名であり、他のオリゴ糖と連結することができる。２つのファミリーメンバーは、Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮＡＮＡと略記されるＮ−アセチルノイラミン酸、およびＮｅｕ５ＧｃまたはＮＧＮＡと略記されるＮ−グリコリルノイラミン酸である。
【０２４１】
ヒトにおけるシアル酸の最も一般的な形態はＮＡＮＡである。Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子中に存在する主なシアル酸種である。しかし、微量であるが検出可能なレベルのＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）もＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子中に存在することに留意されたい。さらに、本明細書中に記載の方法を用いてＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのどちらのシアル酸モル数も決定することができ、したがって、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのどちらのレベルも、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子について決定および報告されている。Ｎ結合型およびＯ結合型オリゴ糖は異なる数の分枝鎖を有し、これにより、シアル酸分子が付着することができる位置が異なる数で提供される。Ｎ結合型オリゴ糖は４つまでのシアル酸の付着位置を提供することができ、一方で、Ｏ結合型オリゴ糖はシアル酸の付着に２つの部位を提供することができる。
【０２４２】
その多くが組換えＤＮＡ技術の方法によって産生されたグリコシル化されたタンパク質（糖タンパク質）は、診断剤および治療剤として非常に興味がもたれている。細胞表面および分泌悦タンパク質となる運命にある多くの真核膜貫通タンパク質は、翻訳後修飾されてＮ結合型およびＯ結合型炭水化物基を取り込む。Ｎ結合型オリゴ糖は、ペプチドモチーフＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であることができる）の一部である場合はアスパラギン残基に付着している。Ｏ結合型オリゴ糖はセリンまたはスレオニン残基に付着している。Ｎ結合型およびＯ結合型オリゴ糖、ならびにそれぞれ中に見つかる糖残基の構造は異なることができる。両方に共通して見つかる糖の一種は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ；本明細書中でシアル酸と呼ぶ）である。通常、シアル酸は、Ｎ結合型およびＯ結合型オリゴ糖の両方の末端残基である。糖タンパク質は、その負荷電が原因で、酸性特性を示すことができる。
【０２４３】
グリコシル化されたタンパク質は、タンパク質折り畳みの増強、細胞の分別および細胞内輸送の調節、タンパク質凝集の予防、細胞−細胞接着の媒介、およびタンパク質分解に対する耐性の増加において役割を果たすことを意図する。真核生物では、グリコシル化の性質および程度は、受容体に媒介されるエンドサイトーシスおよびクリアランスに関与するプロセスによる糖タンパク質治療学の循環半減期および生物活性に著しい影響を与えることができる。受容体に媒介される系は、オリゴ糖の様々な糖構成成分を認識することによって血清糖タンパク質を除去することにおいて、主要な役割を果たすと考えられている。糖タンパク質の末端シアル酸基は、吸収、半減期、および血清クリアランスに影響を与えることができる。したがって、グリコシル化されたタンパク質の末端シアル酸構成成分を維持する糖タンパク質産生戦略は、タンパク質の生体利用度および血清半減期をより良好に増加させることができる。組換え糖タンパク質合成、特に様々な産生戦略における培地組成および温度シフトの影響に関して、いくつかの産生プロセスパラメータが調査されている。
【０２４４】
（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、または（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３の残基のアミノ酸を有する単量体からなるＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体は、約７８，０００〜約７９，０００ダルトンの推定理論ＭＷを有することができる。しかし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって得られたこのような二量体のＭＷは約９１，０００ダルトンである。この約１３，０００〜１４，０００ダルトンのＭＷの差異は、少なくとも部分的にグリコシル化に原因があり、これは、一実施形態ではこの特定のＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子質量の約１５％を占める。上記で特定した単量体は、配列番号２の残基１０２、１３４、および２３３のアスパラギンで起こることがペプチドマッピングによって確認されている３つのＮ結合型グリコシル化部位を有する。アスパラギンによって連結されている炭水化物分子は、酵素ペプチド−ＮグリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）を用いて選択的に切断することができる。一例では、配列番号２の２７〜３８３を有する単量体をＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理することにより、約８０，２００ダルトンのＭＷを有する種がもたらされた。この単量体の理論ＭＷは約８０，２００であるので、この処理により、不明の１，４００ダルトン（８０，２００−７８，８００＝１，４００）はＯ結合型グリコシル化が原因である可能性があることが示唆された。グリコシル化部位となる潜在性を有する数々のセリンおよびスレオニン残基が存在するが、２つのＯ結合部位のみ、すなわち配列番号２のＳｅｒ155およびＳｅｒ165が同定されている。一実施形態では、これら２つの部位に付着している主なグリカンはＨｅｘＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＮｅｕＡｃである。
【０２４５】
たとえば、図９は、配列番号２からの配列（すなわち、以下の配列のうちの１つを有する単量体：（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、または（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３）を有する単量体からなるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子上におけるＮ結合型およびＯ結合型炭水化物の構造の全体像を表し、一実施形態では、示した炭水化物特徴を有するこのような分子は、実施例１４〜１５に記載し、図１０にも示した産生方法に従った本発明の細胞系またはその子孫によって産生する。それぞれの部位について記載した主要な構造は、直交技法に基づいている（本明細書参照）。それぞれの構造について、これらの実験中に観察されたその構造の推定割合を記載する。これらの割合は、直交技法からの最良推定を表す。
【０２４６】
（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、または（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３の残基のアミノ酸配列を有する単量体からなるＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体は、約７８，０００〜約７９，０００ダルトンの推定理論ＭＷを有することができる。しかし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって得られたこのような二量体のＭＷは約９１，５００ダルトンである。この約１２，０００〜１３，０００ダルトンのＭＷの差異は、少なくとも部分的にグリコシル化に原因がある。上記で特定した単量体は、配列番号４の残基１０２、１３４、および２３３のアスパラギンで起こることがペプチドマッピングによって確認されている３つのＮ結合型グリコシル化部位を有する（図４のＮ７６、Ｎ１０８、およびＮ２０７）。アスパラギンによって連結されている炭水化物分子は、酵素ペプチド−ＮグリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）を用いて選択的に切断することができる。グリコシル化部位となる潜在性を有する数々のセリンおよびスレオニン残基が存在するが、３つのＯ結合部位のみ、すなわち配列番号４のＳｅｒ１４９、Ｓｅｒ１５５、およびＳｅｒ１６５が同定されている（実施例２２の表２５参照）。一実施形態では、これらの部位に付着している主なグリカンはＨｅｘＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＮｅｕＡｃである。
【０２４７】
特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、本発明の培養方法によって産生することができる糖タンパク質である。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質は、分子の約１５％（ｗ／ｗ）を表すオリゴ糖によって修飾されている。これらのオリゴ糖は、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質の薬物動態学（ＰＫ）パラメータに重要な役割を果たすことができる。さらに、様々なオリゴ糖プロフィールがタンパク質の安定性および分解に影響を与えることができる。たとえば、Ｏ結合型オリゴ糖は、免疫グロブリン定常領域のヒンジ領域での自己融解を妨げることによってＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の安定性を増強し得る。
【０２４８】
ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団のオリゴ糖分布は、細胞培養およびプロセスの複雑さが原因で、性質が不均一な場合がある。不均一性はグリコシル化部位が完全に占有または非占有されていること、および任意の特異的部位に多くの異なるオリゴ糖構造を存在させることができることが原因で存在することができ、これは、シアル酸修飾パターンの変動をさらに示すことができる。
【０２４９】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の第一級シアル酸部分はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ、ＮＡＮＡ）であり、第二級シアル酸部分はＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）である。シアル酸および複合シアル酸含有構造の荷電性質によりＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇそれぞれの複数のアイソフォームが生じることができ、そのようなアイソフォームは等電点電気泳動（ＩＥＦ）プロフィールで明らかにすることができる。たとえば、ＣＴＬＡ４−ＩｇのＩＥＦプロフィールには図１１および実施例３を参照されたい。さらに、ＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇのＩＥＦプロフィールには図１２および実施例２２を参照されたい。
【０２５０】
一実施形態では、本発明は、優勢のＣＴＬＡ４−Ｉｇアイソフォームが５．１または５．０以下の等電点（ｐＩ）を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供し、これは、たとえばＩＥＦによって決定することができる。別の実施形態では、優勢のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇアイソフォームが５．５以下の等電点（ｐＩ）を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供し、これは、たとえばＩＥＦによって決定することができる（図１２）。
【０２５１】
一実施形態では、本発明は、約４．２〜約５．７のｐＩ、約４．２５〜約５．５、約４．３〜約５．３、または約４．５〜約５．２を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、約４．４５〜約５．３０のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、約４．３〜約５．１のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。特定の実施形態では、本発明は、約４．４５〜約５．０のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。一実施形態では、本発明は、ＩＥＦによって決定して集団内の分子の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が約５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４．４．３、４．２、４．１、４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、または２．１以下の等電点を示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する（これらの値は±０．２の標準偏差を有することができる）。一実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団をＩＥＦゲル電気泳動に供し（ゲル上の単一のバンドが特定のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の部分集団を表す）、バンドをゲルから切り取ることによって特定のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の部分集団を単離し、続いて切り取ったゲルバンドからタンパク質を精製することを含む、約４．４５〜約５．３０、または約４．４５〜約５．１、または約４．４５〜約５．０のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を調製する方法を提供する。
【０２５２】
さらなる実施形態では、本発明は、約４．５〜約５．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、約４．７〜約５．１のｐＩを有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、約２．０〜約５．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。一実施形態では、本発明は、ＩＥＦによって決定して集団内の分子の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が約５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４．４．３、４．２、４．１、４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、または３．０以下の等電点を示す、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する（これらの値は±０．２の標準偏差を有することができる）。一実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団をＩＥＦゲル電気泳動に供し（ゲル上の単一のバンドが特定のｐＩを有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の部分集団を表す）、バンドをゲルから切り取ることによって特定のｐＩを有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の部分集団を単離し、続いて切り取ったゲルバンドからタンパク質を精製することを含む、約４．５〜約５．２；約４．７〜約５．１；約２．０〜約５．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を調製する方法を提供する。
【０２５３】
特定の実施形態では、本発明は、シアル酸基のモル数対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル数の平均モル比が約６〜約３２、約８〜約３２、約１１〜約３０、約１２〜約２０、約１３〜約１９、約１４〜約１８、約１５〜約１７、約６〜約１６、約８〜約１６、約８〜約１４、約８〜約１２である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２５４】
一部の実施形態では、≦２５ｐｐｍ〜≦１０ｎｇ／ｍｇの最大の許容可能なＣＨＯ宿主細胞タンパク質が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物を特徴づける。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物は、≦２．５ｐｇ／ｍｇ〜≦１．０ｐｇ／ｍｇのレベルの宿主細胞ＤＮＡによって特徴づけられている。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物は、≦１．０ｎｇ／ｍｇまたは≦１．０ｐｐｍのレベルのＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって特徴づけられている。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度は、Ｗａｔｅｒｓ  ＯＡＳＩＳ−ＨＬＢ固相抽出を用いてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を抽出し、次いで水で洗浄して残留タンパク質を除去することによって、決定することができる。結合したＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、アセトニトリルを用いた溶出によって除去する。アセトニトリル溶出液は、ＳＡＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ５μｍカラムおよびアセトニトリル：水（８０：２０）からなる移動相を用いた逆相クロマトグラフィーによって分析する。検出は２２５ｎｍでのＵＶ吸光度による。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物は、≦２．５面積％の酸化および≦２．０面積％の脱アミド化によって特徴づけられている。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物は、≦３．０面積％の酸化および≦２．５面積％の脱アミド化によって特徴づけられている。トリプシンペプチドマッピング方法を用いて酸化および脱アミド化を定量した。％酸化のデータは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質中のＭｅｔ８５からメチオニンスルホキシドへの酸化の面積％を定量するＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマッピングアッセイを用いることによって決定した。本方法の％酸化は、Ｍｅｔ８５を含む残基８４〜９３からなるＴ６トリプシンペプチド、およびＭｅｔ（Ｏ）８５を含む対応する酸化されたトリプシンペプチドであるＴ６ｏｘについて、ＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップ中のＵＶピーク面積を測定することによって得られる。Ｍｅｔ８５からＭｅｔ（Ｏ）８５への酸化の面積％は、Ｔ６ｏｘピークの面積％に正比例する：％酸化＝１００＊ＡＴ６ｏｘ／（ＡＴ６ｏｘ＋ＡＴ６）、ＡＴ６＝Ｔ６トリプシンペプチドのピーク面積、（８４〜９３）、ＡＴ６ｏｘ＝Ｔ６ｏｘトリプシンペプチドのピーク面積、Ｍｅｔ（Ｏ）８５（８４〜９３）。酸化および脱アミド化の面積％を定量するＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマッピングアッセイを用いることによって得られた％脱アミド化のデータは、Ａｓｎ２９４を含む残基２８１〜３０２からなるＴ２６トリプシンペプチド、およびｉｓｏＡｓｐ２９４を含む対応する脱アミド化されたトリプシンペプチドであるＴ２６ｄｅａｍ１について、ＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップ中のＵＶピーク面積を測定することによって得られる。したがって、Ａｓｎ２９４からｉｓｏＡｓｐ２９４への脱アミド化の面積％は、Ｔ２６ｄｅａｍ１ピークの面積％に正比例する：ＡＴ２６＝Ｔ２６のピーク面積、（２８１〜３０２）、ＡＴ２６ｄｅａｍ１＝Ｔ２６ｄｅａｍ１のピーク面積、ｉｓｏＡｓｐ２９４（２８１〜３０２）。ＡＴ２６ｄｅａｍ２＝Ｔ２６ｄｅａｍ２のピーク面積、Ａｓｐ２９９（２８１〜３０２）。ＡＴ２６ｄｅａｍ３＝Ｔ２６ｄｅａｍ３のピーク面積、Ａｓｐ２９４（２８１〜３���２）。ＡＴ２６ｄｅａｍ４＝Ｔ２６ｄｅａｍ４のピーク面積、Ａｓｕ２９４（２８１〜３０２）。
【０２５５】
別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物は、１５〜３５モルのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）：ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質１モル、または１．７〜３．６モルのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）：ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質１モルによって特徴づけられている。アミノ単糖は、酸加水分解によるタンパク質の放出後にキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって定量する。放出されたアミノ単糖は、その検出および定量を容易にするために再アセチル化し、アミノピレントリスルホン酸（ＡＰＴＳ）で蛍光標識する。内部標準として役立たせるためにＮ−アセチルマンノサミンを試料およびアミノ単糖標準に加える。内部標準を用いて試料中のアミノ単糖のピーク面積を正規化し、標準中のそのそれぞれの正規化したアミノ単糖のピーク面積と比較することによって定量する。その後、それぞれの単糖のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子に対するモル比を計算する。
【０２５６】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物は、以下のＮ結合型オリゴ糖プロフィールの明細によって特徴づけられている：
2010116402.tif 000004
【０２５７】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物は、組成物が以下の比を有する中性単糖によって特徴づけられている：
【０２５８】
ガラクトース：８．０〜１７モル：ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質１モル
【０２５９】
フコース：３．５〜８．３モル：ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質１モル
【０２６０】
マンノース：７．７〜２２モル：ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質１モル、または
【０２６１】
ガラクトース：９．０〜１７モル：ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質１モル
【０２６２】
マンノース：１１〜１９モル：ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質１モル。
2010116402.tif 000005
【０２６３】
別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ組成物の単糖モル比範囲は以下のとおりである：約１０〜２０モルのマンノース／タンパク質１モル；約４．２〜７．０モルのフコース／タンパク質１モル；および約９．２〜１７モルのガラクトース／タンパク質１モル。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ組成物は、約５．０〜１０．０モルのＮＡＮＡ／タンパク質１モルのＮＡＮＡモル比によって特徴づけられている。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ組成物は、＜１．５モルのＮＧＮＡ／タンパク質１モルのＮＧＮＡモル比によって特徴づけられている。一部の実施形態では、シアル酸のモル比の％偏差は≦１５％または≦２０％または≦３０％である。
【０２６４】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団は、それぞれが少なくとも３個のシアル酸基を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を含むことができる。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団は、それぞれが３〜８個のシアル酸基を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を含む。
【０２６５】
一実施形態では、本発明は、集団内の分子の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が約５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４．４．３、４．２、４．１、４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、または３．０以下の等電点を示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２６６】
一部の実施形態では、本発明は、ＮＡＮＡのモル数対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または二量体のモル数の平均モル比が約６〜約１６、約６〜約１４、約６〜約１２、約８〜約１２、約８〜約１４、約８〜約１６である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２６７】
他の実施形態では、本発明は、ＮＧＮＡのモル数対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または二量体のモル数の平均モル比が約２、１．８、１．６、１．５、１．４、１．０、０．８、または０．５以下である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２６８】
特定の実施形態では、本発明は、シアル酸基のモル数対ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子または二量体のモル数の平均モル比が約５．５〜約８．５である、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、シアル酸基のモル数対ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子または二量体のモル数の平均モル比が約５〜約１０である、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２６９】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団は、それぞれが少なくとも２．５個のシアル酸基を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体を含むことができる。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団は、それぞれが２．５〜５個のシアル酸基を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体を含む。
【０２７０】
他の実施形態では、本発明は、集団のアミノ単糖および／または中性単糖および／またはシアル酸のモル数対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または二量体のモル数の平均モル比によって識別される、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。特定の実施形態では、本発明は、集団のアミノ単糖および／または中性単糖および／またはシアル酸のモル数対ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子または二量体のモル数の平均モル比によって識別される、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。アミノ単糖にはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）およびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が含まれる。中性単糖にはマンノース、フコース、およびガラクトースが含まれる。シアル酸にはＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）およびＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）が含まれる。
【０２７１】
一実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃのモル数の平均モル比が約１０〜約４０、約１５〜約３５、約１５〜約２５、または約１５〜約２０であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、集団内の分子の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧｌｃＮＡｃのモル数の平均モル比が約４０、３８、３５、３０、２５、２０、１８、または１５以下であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２７２】
別の実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃのモル数の平均モル比が約１．５〜約８．５、約１．７〜約３．０、約１．７〜約４．０、約１．７〜約５．０、約１．７〜約６．０、約１．７〜約７．０、約１．７〜約８．０、または約１．７〜約８．３であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、集団内の分子の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのＧａｌＮＡｃのモル数の平均モル比が約８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４．０、３．８、３．６、３．５、３．０、２．５、２．０、１．７、または１．５以下であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２７３】
さらなる実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのガラクトースのモル数の平均モル比が約７．５〜約２０．０、約８．０〜約１９．０、約８〜約１８．０、約８．０〜約１７．０、約８．５〜約１７．０、または約９．０〜約１７．０であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、集団内の分子の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのガラクトースのモル数の平均モル比が約２０．０、１９．０、１８．０、１７．０、１６．０、１５．０、１４．０、１３．０、１２．０、１１．０、１０．０、９．０、８．５、８．０または７．５以下であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２７４】
さらなる実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのフコースのモル数の平均モル比が約３〜約８．５、約３．５〜約８．５、約３．５〜約８．３、約３．５〜約８．０、約３．５〜約７．５、または約３．５〜約７．０であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、集団内の分子の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのフコースのモル数の平均モル比が約８．５、８．３、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．２、または３．０以下であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２７５】
さらなる実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたりのマンノースのモル数の平均モル比が約７〜約２３、約７．５〜約２３、約７．７〜約２３、約７．７〜約２２．５、約７．７〜約２２、約７．７〜約２０、約７．７〜約１８、約７．７〜約１６、約８．０〜約１６．０、約９．０〜約１７．０、約１０〜約１９．０、または約１１〜約１９．０であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、集団内の分子の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子もしくは二量体１モルあたりまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルに対するのマンノースのモル数平均モル数が約２３、２２．５、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９．５、９、８．５、８、７．７、７．５、７．３または７以下であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０２７６】
一実施形態では、本発明は、生物活性を保持したままで血清からのクリアランスが低下することにより生じるまたはそれによって実証されるものなど、曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定される曝露の増加などのＰＫ値の増加を示す、グリコシル化されたＣＴＬＡ４−Ｉｇの集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、生物活性を保持したままで血清からのクリアランスが低下することによって実証される、薬物動態学（ＰＫ）値の増加を示すグリコシル化されたＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの集団を提供する。
【０２７７】
一部の実施形態では、本発明は、さらなるグリコシル化部位を有する可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の類似体を提供する。他の実施形態では、本発明は、さらなるグリコシル化部位を有する可溶性ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の類似体を提供する。さらなるグリコシル化部位は、シアル化されていることができるさらなる炭水化物構造の付着点を提供する。シアル酸含有率の増加は、ＰＫ値の増加および／または糖タンパク質安定性の増加をもたらすことができる。より高いシアル酸含有率が有益である。本発明のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子のさらなる実施形態を生じるために、さらなるシアル酸を付加させるために酵素を用いるインビトロの精製後方法を行うことができる。
【０２７８】
本発明の実施形態には、本明細書中に開示した任意の１つの範囲が、本明細書中に開示した任意の１つまたは複数の範囲と組み合わせて含まれる。本発明の実施形態には、本明細書中に開示した任意の１つのＣＴＬＡ４−Ｉｇの特徴または特性が、本明細書中に開示した任意の１つまたは複数のＣＴＬＡ４−Ｉｇの特徴または特性と組み合わせて含まれる。
【０２７９】
ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質を分析および単離する方法
【０２８０】
本明細書中に記載の以下の方法を用いて、それだけには限定されないが、集団のアミノ単糖および／または中性単糖および／またはシアル酸のモル数のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの分子または二量体１モルあたりの平均モル比を含めた様々な糖プロフィールに基づいて、特定のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を識別、同定、または単離することができる。
【０２８１】
培養細胞から分泌された糖タンパク質を培地または上清から単離することができる。細胞によって産生された糖タンパク質を、所望に応じて、全細胞培養期間の終わりに、当分野で知られており実施されている、または本明細書中に記載の単離および精製方法を用いて、採取、回収、単離、および／または精製もしくは実質的に精製する。一実施形態では、細胞によって発現されるが細胞によって分泌されない本発明の糖タンパク質も、たとえば、細胞溶解液を作製して糖タンパク質を単離すること、および／または以下にさらに記載する当分野で知られており実施されている方法を用いることによって、細胞から回収することができる。
【０２８２】
本発明の細胞培養プロセスによって産生された糖タンパク質は、炭水化物分析の様々な技術によって分析することができる複合炭水化物を含む。たとえば、当分野で周知のレクチンブロッティングなどの技術により、末端マンノース、またはガラクトースなどの他の糖の割合が明らかになる。一、二、三、または四分岐のオリゴ糖がシアル酸で終止することは、無水ヒドラジンまたは酵素的方法を用いたタンパク質からの糖の放出、およびイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または当分野で知られている他の方法によるオリゴ糖の分画によって、確認することができる。
【０２８３】
２種類の主なグリコシド結合、すなわちＮ結合型およびＯ結合型が糖タンパク質中に見つかる。Ｎ−グリコシル化は、グリカンとアスパラギン残基のアミド窒素との共有結合によって作製される。Ｏ−グリコシド結合は、セリン、スレオニン、ヒドロキシリシンまたはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基とグリカンとの共有結合によって作製される。糖タンパク質の炭水化物部分は、宿主−病原体相互作用、血清からのクリアランスおよび様々な組織の標的化を含めた数々の分子認識現象に関与している。ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子に関して、炭水化物部分は、少なくとも、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子とＣＤ８０もしくはＣＤ８６との結合、またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子とＣＤ８０もしくはＣＤ８６との結合に影響を与えることができる。
【０２８４】
炭水化物構造は、典型的には発現されたタンパク質上でＮ結合型またはＯ結合型炭水化物として存在する。Ｎ結合型およびＯ結合型炭水化物は、主にその核構造が異なる。Ｎ結合型グリコシル化とは、炭水化物部分がＧｌｃＮＡｃを介してペプチド鎖中のアスパラギン残基に付着することをいう。一実施形態では、Ｎ結合型炭水化物はすべて共通のＭａｎ１−６（Ｍａｎ１−３）Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃ−ＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒ核構造を含み、この核構造中、Ｒはアスパラギン残基を表す。生じたタンパク質のペプチド配列はアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システインを含み、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である。
【０２８５】
対照的に、Ｏ結合型炭水化物は、スレオニンまたはセリンのヒドロキシル基に付着したＧａｌＮＡｃを含む共通の核構造によって特徴づけられている。Ｎ結合型およびＯ結合型炭水化物のうち、最も重要なのは複合Ｎ結合型およびＯ結合型炭水化物である。そのような複合炭水化物はいくつかの分岐構造を含む。一、二、三、および四分岐構造は、末端シアル酸の付加に重要である。そのような外鎖構造は、タンパク質生成物の炭水化物を含む特定の糖および結合の追加の部位を提供する。
【０２８６】
治療的糖タンパク質はしばしば、組換えＤＮＡ細胞培養技術を用いて産生する。細胞培養物中のタンパク質のグリコシル化分布は、ｐＨ、細胞密度、栄養素の濃度、および代謝物の濃度の変動によって影響を受ける場合がある。環境効果に対するグリカン分布の感受性が原因で、再現可能な産物が製造されることを確実にするために、産物の開発および産生中にグリカン分布を注意深く監視することが必要となる。
【０２８７】
治療的使用のための組換え由来の糖タンパク質の開発により、その炭水化物構造の特徴づけおよびプロファイリングを行う方法の要求が高まっている。ネイティブタンパク質と比較するための組換えタンパク質の最初の特徴づけを行って、存在するオリゴ糖構造を同定し、オリゴ糖組成の一貫性を監視し、細胞培養物または産生プロセスの変更の結果生じる可能性がある変化を評価し、かつ様々な細胞系中での発現の結果生じるグリコシル化の変化を同定するために、オリゴ糖マッピングが用いられている。
【０２８８】
炭水化物構造的の分布を評価するために様々な技術が利用可能である。これらには、広範囲の検出技術と組み合わせたゲル濾過、クロマトグラフィーおよび電気泳動分離美術が含まれる。試料の量が限られている場合は、検出を向上させるために、糖タンパク質をしばしば２−アミノ安息香酸および２−アミノピリジンなどの蛍光試薬で誘導体化する。しかし、誘導体化および誘導体の精製は時間がかかる場合がある。試料の大きさが問題でない場合は、炭水化物構造的の分布の直接評価が可能である。
【０２８９】
糖タンパク質のオリゴ糖含有率の分析
【０２９０】
特定の糖タンパク質は、炭水化物の不均一性を示すことができる。不均一性はいくつかのレベルで見られる場合があり、グリコシル化部位は完全に占有されている状態から占有されていない状態まで変動することができ、任意の特異的部位を多くの異なるオリゴ糖構造が占めていることができ、それぞれの構造はＮＡＮＡまたはＮＧＮＡなどのシアル酸分子によって修飾されていることができる。
【０２９１】
本発明のタンパク質の炭水化物含有率は、本明細書中の実施例中に記載した方法を含めた当分野で知られている方法によって分析することができる。グリコシル化分析のためにいくつかの方法が当分野で知られており、本発明のコンテキストで有用である。これらの方法は、産生されたペプチドに付着したオリゴ糖が何であるかおよびその組成に関する情報を提供する。本発明に関連して有用な炭水化物分析の方法には、それだけには限定されないが、レクチンクロマトグラフィー；荷電に基づいてオリゴ糖を分離するために高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィーを用いるパルスアンペロメトリック検出と組み合わせた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）；ＮＭＲ；質量分析；ＨＰＬＣ；多孔性黒鉛化炭素（ＧＰＣ）クロマトグラフィーが含まれる。
【０２９２】
オリゴ糖を放出させる方法が知られている。これらの方法には、１）一般的にペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ／エンド−α−ガラクトシダーゼを用いて行われる酵素的方法；２）厳しいアルカリ環境を用いて主にＯ結合型構造を放出させるβ−排除方法；ならびに３）無水ヒドラジンを用いてＮ結合型およびＯ結合型オリゴ糖をどちらも放出させる化学的方法が含まれる。分析方法は以下の工程を含むことができる：１．試料を脱イオン水に対して透析してすべてのバッファー塩を除去し、次いで凍結乾燥を行う工程。２．無水ヒドラジンを用いてインタクトのオリゴ糖鎖を放出させる工程。３．インタクトのオリゴ糖鎖を無水メタノールＨＣｌで処理して個々の単糖をＯ−メチル誘導体として遊離させる工程。４．任意の第一級アミノ基をＮ−アセチル化する工程。５．ペル−Ｏ−トリメチルシリルメチルグリコシドを得るために誘導体化する工程。６．ＣＰ−ＳＩＬ８カラム上のキャピラリーガス−液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）によってこれらの誘導体を分離する工程。７．既知の標準と比較したＧＬＣおよび質量分析からの保持時間によって個々のグリコシド誘導体を同定する工程。８．内部標準（１３−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース）を用いてＦＩＤによって個々の誘導体を定量する工程。
【０２９３】
中性およびアミノ糖の存在は、パルスアンペロメトリック検出と組み合わせた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ炭水化物システム；Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）を用いることによって決定することができる。たとえば、糖を、２０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸中、１００℃、６時間での加水分解によって放出させることができる。その後、加水分解物を凍結乾燥によってまたはＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて乾燥させる。その後、残渣を１％の酢酸ナトリウム三水和物溶液に溶かし、ＨＰＬＣ−ＡＳ６カラムで分析する（Anumula et al., 1991, Anal. Biochem., 195:269-280に記載のように）。
【０２９４】
あるいは、免疫ブロット炭水化物分析を行うことができる。この手順では、Haselbeck et al. (1993, Glycoconjugate J., 7:63)に記載の酸化的免疫ブロット手順に基づいた市販のグリカン検出系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて、タンパク質に結合した炭水化物を検出する。製造者に推奨される染色プロトコルを次いで行うが、ただし、タンパク質をニトロセルロース膜の代わりにポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、遮断バッファーは１０ｍＭのトリスバッファー中に５％のウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４（０．９％の塩化ナトリウムを含む）を含む。検出は、アルカリ性リン酸コンジュゲートと連結した抗ジゴキシゲニン抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ホスファターゼ基質を用いてトリス緩衝生理食塩水中に１：１０００の希釈液、塩化４−ニトロブルーテトラゾリウム、０．０３％（ｗ／ｖ）ならびに１００ｍＭのトリスバッファー中に５−ブロモ−４クロロ−３−インドリル−ホスフェート０．０３％（ｗ／ｖ）、ｐＨ９．５（１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび５０ｍＭの塩化マグネシウムを含む）を用いて実施する。炭水化物を含むタンパク質バンドは、通常約１０〜１５分間で可視化される。
【０２９５】
タンパク質と会合した炭水化物は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦを用いた消化によっても切断することができる。この手順によれば、残渣を、０．１８％のＳＤＳ、１８ｍＭのβ−メルカプトエタノール、９０ｍＭのリン酸、３．６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．６を含む１４μＬのバッファーに懸濁させ、１００℃で３分間加熱する。室温まで冷却した後、反応混合物を２つのほぼ同量の部分に分割する。それ以上処理しない一方の部分は、対照として役割を果たす。他方の部分は約１％のＮＰ−４０洗剤に調節し、次いで０．２単位のペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を加える。どちらの部分も３７℃で２時間温め、その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する。
【０２９６】
糖タンパク質のグリカンマッピングは次第に受け入れられている。本明細書中に記載の方法は、グリカンの種類、シアリル化の程度および炭水化物の非還元末端の分枝鎖の数に関して、オリゴ糖の迅速な特徴づけを可能にする。したがって、特定の実施形態では、本発明は、特定のオリゴ糖プロフィールによって特徴づけられているＣＴＬＡ４−Ｉｇの集団を提供する。オリゴ糖プロファイリングは、典型的には、オリゴ糖のクロマトグラフィー分離、次いで検出および相対定量によって行う。クロマトグラフィープロファイリングの代替方法は、オンライン脱塩後のＥＳＩインフュージョンによるオリゴ糖の直接分析である。
【０２９７】
ＰＧＣによるオリゴ糖プロファイリングを用いて、Ｎ結合型オリゴ糖をＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子から特徴づけることができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子（配列番号２）から同定されたオリゴ糖の構造クラスは３１個存在し、これにはＯ−アセチル化したシアル酸基を含む構造クラスも含まれる。構造クラスの立証はＭＳ／ＭＳおよび陽性イオンモードのＭＳを使用することによって達成される。構造クラスの相対定量は、２０６ｎｍでのＵＶ追跡を積分することによって可能である。個々のＮ結合部位からの部分集団プロフィールの比較が知られており、Ｎ結合部位間で顕著な集団差異が明らかとなっている。ＰＧＣを用いたオリゴ糖プロファイリングは、ＨＰＡＥＣなどのより伝統的なプロファイリング方法に代わる便利かつ情報に富んだ代替方法を提供する。
【０２９８】
配列番号２の単量体を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子中のＮ結合型構造
【０２９９】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ多量体または二量体上には鎖１本あたり（すなわち単量体１個あたり）３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在し、単量体は配列番号２の配列、たとえば、（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、または（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３を有する。部位によるグリコシル化の変異は、タンパク質のトリプシン消化からのＮ結合型グリカンを含むペプチド断片を単離することによって分析する。タンパク質上のＮ結合型グリコシル化部位はＡｓｎ102、Ａｓｎ134およびＡｓｎ233に位置し、それぞれトリプシン断片５、７、および１４に含まれる。単離したペプチド断片からのＮ結合型オリゴ糖の酵素的放出、次いで放出されたオリゴ糖のＰＧＣプロファイリングにより、図１３に示すプロフィールがもたらされる。Ａｓｎ233（トリプシン断片１４、Ｔ１４）から放出されたグリカンのプロフィールから、このオリゴ糖集団がアシアロ構造に富むことが明らかである（構造はシアル酸を有さない）。Ａｓｎ102およびＡｓｎ134（Ｔ５およびＴ７）で付着したグリカンからのオリゴ糖プロフィールは、大量のシアル化された構造を含む。
【０３００】
糖タンパク質から放出された単離したオリゴ糖を多孔性黒鉛化炭素ＬＣ／ＵＶ／ＭＳシステムに直接注入する。図１４および１５は、酸性および塩基性添加剤を含むアセトニトリル勾配によって作製した典型的なＰＧＣプロフィールのＴＩＣおよびＵＶクロマトグラムを示す。ほとんどの場合、単一のクロマトグラフィーピークからの質量スペクトルは単一のオリゴ糖の質量ピークを含む。ＴＦＡを含む溶出プロフィールから３０個のオリゴ糖構造クラスが同定される。ＮＨ4ＯＨを含む溶出プロフィールからは１６個のオリゴ糖構造クラスしか同定されない。それぞれの構造クラス内には、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）の代わりにＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）の置換を含む変異構造および様々な度合のシアル酸アセチル化が存在する。オリゴ糖クラスのイオン計数の比較からは定性的情報しか得られないが、４つのドメインのそれぞれ内の主要な構造クラスがＰ２１００、Ｐ２１１１、Ｐ２１２２、およびＰ３１３３であることは明らかである。これは、２０６ｎｍでのＵＶ追跡から得られた積分値と一貫している。さらなる構造的立証は、陽イオン質量スペクトルから得ることができる。陽イオンモードのイオン化は、オリゴ糖源の主にグリコシド結合での断片化を促進する。陰イオン質量スペクトルによって決定されたオリゴ糖の分離が良好であるので、陽イオンモードからの断片化スペクトルは陽イオンＭＳ／ＭＳスペクトルを模倣する。ドメインＩＩＩ（ジ−シアル化構造）は顕著な量のＯ−アセチル化した構造Ｐ２１２２−Ａｃを含む。陽イオンｍ／ｓデータは、構造上のシアル酸の１つのＯ−アセチル化を支持する。シアル酸残基の最も一般的なＯ−アセチル化部位は、Ｃ−７およびＣ−９位置のものである（Shi WX, Chammas R., Varki A., J. Biol. Chem. 271 (1996) 15130-15188）。生理的な細胞外ｐＨでは、Ｃ−７でのＯ−アセチルエステルはＣ−９へと自発的に遊走する。したがって、最も可能性の高いＯ−アセチル化部位はＣ−９である。
【０３０１】
Ｎ結合型オリゴ糖含有率の分析：分析技術は、カラムクロマトグラフィーによるＮ結合型オリゴ糖の切断および単離を含むことができ、非限定的な実施形態ではＨｙｐｅｒｃａｒｂカラムを用いる。Ｈｙｐｅｒｃａｒｂクロマトグラフィーに供したグリカンを単離し、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって分析することができ、この分析により特定の糖タンパク質を修飾する炭水化物の種類が決定される。Ｎ結合型オリゴ糖の分析的特徴づけは、多孔性黒鉛化炭素（ＰＧＣ）を用いた液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によっても達成することができる。炭水化物分析には、炭水化物構造を含むペプチドを決定するためのトリプシン、Ａｓｐ−Ｎ、およびトリプシン／キモトリプシンペプチドマッピングが含まれることもできる。
【０３０２】
Ｎ結合型オリゴ糖構造は、一連の直交型質量分析およびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ技術を用いて分析することができる（実施例参照）。これらの技術には、いくつかのエンドペプチダーゼ切断、次いでＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析が含まれる。配列番号２からの配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体に関して、Ｎ結合型グリコシル化の３つの主要な部位はＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳエレクトロスプレーイオン化を用いて特徴づけ、それぞれのＮ結合部位での主要な構造を決定した。これらのデータを図９に要約する。Ｎ結合型オリゴ糖にはＡｓｎ102、Ａｓｎ134、およびＡｓｎ233での少なくとも３つの主要な付着点が存在する。さらに、Ａｓｎ233は、約８０％の場合でシアル酸基の存在が含まれない、Ｎ結合型構造の集団を含むことが見出された。
【０３０３】
糖ペプチドのＬＣ／ＭＳ、オリゴ糖のＬＣ／ＭＳ、およびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって決定されたＣＴＬＡ４−ＩｇのＮ結合型オリゴ糖構造：Ｎ結合型炭水化物は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのコンセンサス配列モチーフと会合している。この配列は、以下の配列のうちの１つを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体鎖上に３回現れる：（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３。コンセンサス配列モチーフは、配列番号２中にＡｓｎ102Ｌｅｕ103Ｔｈｒ104；Ａｓｎ134Ｇｌｙ135Ｔｈｒ136；およびＡｓｎ233Ｓｅｒ234Ｔｈｒ235で現れる。コンセンサス配列に基づいて、二量体分子１個あたり６個の、以下の単量体配列のうちの任意の１つまたは２つからなるＮ結合型炭水化物部位が存在する：（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３。
【０３０４】
Ｎ結合型炭水化物は、３つの一般的な種類、すなわち、高マンノース、ハイブリッドおよび／または複合体からなることができる。糖ペプチドを分析するためのＬＣ／ＭＳ技術が開発されている。単量体のトリプシンタンパク質内分解的切断（（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３の配列の１つを有する）は、Ｎ結合型グリコシル化を含む３つのペプチドをもたらす。３つのＮ結合部位すべてを炭水化物構造が占めている。配列番号２のアミノ酸６５〜１０９に対応するトリプシン断片Ｔ５は、Ａｓｎ102上にグリコシル化を含む。配列番号２のアミノ酸１２０〜１５４に対応するトリプシン断片Ｔ７は、Ａｓｎ134上にグリコシル化を含む。配列番号２のアミノ酸２２９〜２３７に対応するトリプシン断片Ｔ１４は、Ａｓｎ233上にグリコシル化を含む。
【０３０５】
それぞれの部位上のグリコシル化の具体的な種類を決定するために、タンパク質消化のスケールを増加し、Ｔ５、Ｔ７、およびＴ１４ペプチドを分離、次いで採取することによって、それぞれの特異的部位から炭水化物を得た。目的のトリプシンペプチドピークをＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理し、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム上のＬＣ／ＭＳによる分析用に処理した。結果により、それぞれの部位で複合二、三、および四分岐構造の異種集団が示された。これらは図１３に見ることができ、クロマトグラフィーにより糖が５つのドメイン、すなわち、アシアロ、モノ−シアロ、ジ−シアロ、トリ−シアロ、およびテトラ−シアロ構造（それぞれドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶと呼ぶ）に分離された。Ａｓｎ102（Ｔ５）炭水化物のクロマトグラム（図１３パネルＡ）は、この部位での一連のモノ−およびジ−シアロ構造を例示する。Ａｓｎ134（Ｔ７）のクロマトグラム（図１３パネルＢ）は、２つの主なジ−シアロ構造をモノ−シアロ構造の集団と共に例示する。Ａｓｎ233（Ｔ１４）のクロマトグラム（図１３パネルＣ）はわずかなシアリル化を例示する。Ｎ結合型炭水化物部位のそれぞれについて、ＭＳスペクトルおよび対応する構造をそれぞれのクロマトグラムの主要なピークについて示す（図１３、パネルＥ、Ｆ、Ｈ参照）。図１３、パネルＤでは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの全Ｎ結合型炭水化物プロフィールをクロマトグラム中に示す。選択したピークの質量および構造を表１に示す。オリゴ糖ＬＣ／ＭＳデータは、ペプチドマップの詳細分析によって支援した。Ａｓｎ102（Ｔ５ペプチド）が最も高い度合の炭水化物不均一性を有し、二分岐の非シアル化構造から四分岐のテトラ−シアル化構造までの範囲であった。Ａｓｎ134（Ｔ７ペプチド）は主に二分岐構造を含む。この部位はＡｓｎ102部位よりもはるかに少ない不均一性を含む。Ａｓｎ233（Ｔ１４ペプチド）部位はわずかなシアリル化を含む。第３の分析技術であるＨＰＡＥＣ−ＰＡＤも、２つの直交型ＬＣ／ＭＳの発見を支援するために用いた。
【表１】
2010116402.tif 000006
*アシアロ種はＴＦＡ付加物として検出される。
【０３０６】
全Ｎ結合型炭水化物の集団を、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを用いて分析した。この方法によって得られたデータを表２および３に示す。表２では、アシアロ対トリ−シアロドメインの相対面積％をそれぞれの部位内に記載した（配列番号２のＡｓｎ102、Ａｓｎ134、およびＡｓｎ233）。表３では、オリゴ糖ドメインの面積％をオリゴ糖の集団全体の分率として示した。
【表２】
2010116402.tif 000007
【表３】
2010116402.tif 000008
完全なグリコシル化を仮定する。
【０３０７】
糖ペプチドのＬＣ／ＭＳ、オリゴ糖のＬＣ／ＭＳ、およびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって決定されたＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子のＮ結合型オリゴ糖構造：Ｎ結合型炭水化物は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのコンセンサス配列モチーフと会合している。この配列は、以下の配列のうちの１つを有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体鎖上に３回現れる：（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３。コンセンサス配列モチーフは、配列番号４中にＡｓｎ102Ｌｅｕ103Ｔｈｒ104；Ａｓｎ134Ｇｌｙ135Ｔｈｒ136；およびＡｓｎ233Ｓｅｒ234Ｔｈｒ235で現れる。コンセンサス配列に基づいて、二量体分子１個あたり６個の、以下の単量体配列のうちの任意の１つまたは２つからなるＮ結合型炭水化物部位が存在する：（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３。
【０３０８】
Ｎ結合型炭水化物は、３つの一般的な種類、すなわち、高マンノース、ハイブリッドおよび／または複合体からなることができる。糖ペプチドを分析するためのＬＣ／ＭＳ技術が開発されている。単量体のトリプシンタンパク質内分解的切断（（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３の配列の１つを有する）は、Ｎ結合型グリコシル化を含む３つのペプチドをもたらす（実施例２２の表２５参照）。３つのＮ結合部位すべてを炭水化物構造が占めている。配列番号４のアミノ酸６５〜１０９に対応するトリプシン断片Ｔ５は、Ａｓｎ102上にグリコシル化を含む。配列番号４のアミノ酸１２０〜１５４に対応するトリプシン断片Ｔ７は、Ａｓｎ134上にグリコシル化を含む。配列番号４のアミノ酸２２９〜２３７に対応するトリプシン断片Ｔ１４は、Ａｓｎ233上にグリコシル化を含む（実施例２２の表２５参照）。
【０３０９】
それぞれの部位上のグリコシル化の具体的な種類を決定するために、タンパク質消化のスケールを増加し、Ｔ５、Ｔ７、およびＴ１４ペプチドを分離、次いで採取することによって、それぞれの特異的部位から炭水化物を得た。目的のトリプシンペプチドピークをＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理し、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム上のＬＣ／ＭＳによる分析用に処理した。結果により、それぞれの部位で複合二、三、および四分岐構造の異種集団が示された。これらは図１６に見ることができ、クロマトグラフィーにより糖が４つのドメイン、すなわち、アシアロ、モノ−シアロ、ジ−シアロ、およびトリ−シアロ構造（それぞれドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶと呼ぶ）に分離された。分析し、グリコシル化された分子間、またはグリコシル化された分子を含む集団もしくは組成物間で比較することができる炭水化物プロフィールの特徴には、ピーク面積％、ドメイン面積％、谷間距離、またはピーク間距離が含まれる。
【０３１０】
ＣＴＬＡ４−ＩｇのＮ結合型オリゴ糖のＬＣ／ＭＳ特徴づけ
【０３１１】
ＬＣ／ＭＳ多孔性黒鉛化炭素（ＰＧＣ）クロマトグラフィーとは、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を超えるいくつかの利点を提供することができる、Ｎ結合型オリゴ糖をプロファイリングする方法である。これらの利点の一部には、消化混合物からの直接プロファイリングにより試料の損失および分解が最小限となること；直接ＭＳ界面によりオリゴ糖の迅速に特徴づけおよび分析する方法が提供されること；ＰＧＣクロマトグラフィーによる分解能の増加によりドメイン間の比較およびより細かいドメイン内分析がどちらも可能になることが、含まれる。
【０３１２】
ＬＣ／ＭＳ  ＰＧＣ方法は、グリカンの種類、ならびに炭水化物の非還元末端上のシアリル化および分枝鎖の程度を決定することに関して、オリゴ糖の迅速なプロファイリングおよび特徴づけを可能にする。その後、負イオンモードＭＳスペクトルにより最小限のオリゴ糖断片化で解釈が簡単なデータが生じ、陽性モードのイオン化は構造クラスの立証を可能にする。ここで記載した方法は、誘導体化を行う必要なしに、糖タンパク質の全消化混合物、および事前に単離したオリゴ糖試料に適用することができる。用いたクロマトグラフィー移動相は、より詳細な特徴づけのためのさらなる操作なしで、プリファイリングからのピークの採取および濃縮乾固を可能にする。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ  Ｎ結合型オリゴ糖を特徴づけるためにこの方法を用いる。ＬＣ／ＭＳ  ＰＧＣ方法を用いて、３１個の明確なオリゴ糖クラスを、配列番号２からの配列、たとえば、配列番号５、６、７、８、９、または１０を有する単量体からなるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子で同定することができる。
【０３１３】
高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）は、誘導体化を行う必要なしに糖タンパク質から放出されたオリゴ糖のプロファイリングを行うために大規模に用いられてきた。ＨＰＡＥＣの高分解能ならびに分離が存在する糖残基の種類、結合の種類およびグリカンの大きさによって影響を受けることが、この技術が広範に用いられる理由である。分離の重要因子は荷電であり、高荷電のオリゴ糖は低荷電のグリカンよりも後に溶出される。クロマトグラフィープロフィールはしばしば、グリカン上の荷電種、典型的にはシアル酸残基の数によって定義されたドメインへと分割される（図１７）。
【０３１４】
未知のオリゴ糖の構造についてさらなる情報を得るために、ＨＰＡＥＣピークを採取し、脱塩し、ＭＳおよび／またはＮＭＲによって特徴づけることができる。オリゴ糖分布のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイリングに関する１つの考慮すべき事項は、検出モード特有のばらつきである。電気化学的細胞老化および電極表面汚損はプロフィールのばらつきをもたらす。パルスアンペロメトリック検出を備えたＨＰＡＥＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いた場合に、オリゴ糖の構造およびシアリル化の度合が検出細胞間のばらつきをもたらす場合があることも報告されている。このばらつきは、プロセス変化の効果を評価するまたはバッチ間の一貫性を決定するために用いる定量および相対定量の結果に影響を与える場合がある。その速度および特異性により、質量分析（ＭＳ）が、糖タンパク質のオリゴ糖プロファイリングを評価するための技術として人気を得ている。ＭＳプロフィールはアノマー立体配置または分枝鎖パターンを直接決定するために用いることはできないが、ＭＳデータを用いて構造クラスを同定し、糖型の分布の定性的変化を検出することができる。
【０３１５】
酵素的に放出させたＮ結合型オリゴ糖の多孔性黒鉛化炭素（ＰＧＣ）クロマトグラフィープロファイリング方法では、酵素消化混合物から直接または単離したオリゴ糖から、Ｎ結合型オリゴ糖のプロファイリングおよび特徴づけを行うために、紫外線（ＵＶ）および質量分析（ＭＳ）検出をどちらも用いる。この方法を用いて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質から放出されたオリゴ糖のプロファイリングおよび特徴づけを行うことができる。ＬＣ／ＭＳ  ＰＧＣ方法により、産生プロセスから生じるオリゴ糖分布の一貫性、およびプロセスの改変から生じるオリゴ糖分布の任意の変化を評価することができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮ結合型オリゴ糖のクロマトグラフィー微量分析では、酵素的に放出させたＮ結合型オリゴ糖をＰＧＣカラムによって、シアリル化が増えていき、大きさが増えていく順序で容易に分離することができる。存在する構造の範囲およびそれぞれの構造クラスの相対量は、ＭＳおよびＵＶ分析組合せによって決定する（実施例３）。
【０３１６】
ＬＣ／ＭＳ  ＰＧＣ方法を最適化するために、質量分析条件の最適化が有用な場合がある。最適化には、オリゴ糖検出に対する溶媒組成およびＭＳイオン化パラメータの効果を評価するための、一組の表面マッピング実験が含まれることができる。評価のための溶媒組成パラメータは、アセトニトリルの割合（容量による）ならびに溶出液添加物（トリフルオロ酢酸および水酸化アンモニウム）を含む。評価のために評価したＭＳイオン化パラメータには、エレクトロスプレー源の脱溶媒和温度、キャピラリー電位およびコーン電位の設定が含まれる。
【０３１７】
イオン化パラメータはシグナル応答において顕著な役割を果たすことができる。表面マッピングの決定から生じるモデルを用いて、クロマトグラフィー決定中のイオン化パラメータを設定した。脱溶媒和温度およびコーン電位をどちらも高い値にした場合は、より大きな応答がもたらされた。キャピラリー電位の最適値は溶出液の添加物に応じて変化し、ＴＦＡを含む溶媒系はわずかに高い最適キャピラリー電位を有する。最も大きな効果を有する因子はアセトニトリルの容量％であり、より高いアセトニトリル含有率がより大きな応答をもたらす。
【０３１８】
多孔性黒鉛化炭素クロマトグラフィー
【０３１９】
多孔性黒鉛化炭素（ＰＧＣ）は、オリゴ糖の固相抽出脱塩に用いられてきた。また、ＰＧＣは、酸性および塩基性の溶出条件のどちらの下でのオリゴ糖分離においても、有効なクロマトグラフィー媒体としても知られている。配列番号２からの単量体配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子から酵素的に放出させたオリゴ糖の酸性および塩基性プロファイリングをどちらも行うためのクロマトグラフィー条件が開発されている。それぞれの条件は、ＵＶおよびＭＳ検出のどちらにも適合性がある。インフュージョン実験で観察されたように、酸性溶出条件は塩基性条件よりも高いＭＳ感度をもたらす。酸性条件下で溶出させ、ＴＦＡ付加物として検出された中性オリゴ糖のＭＳ応答は、塩基性条件下で溶出させた対応するピークの強度の５〜９倍である。シグナル応答の差異は、酸性オリゴ糖ではこれほど劇的ではなく、モノシアル化されたグリカンで平均３倍のシグナル応答であり、ジ−シアル化グリカンで同等のシグナル応答である。ＮＨ4ＯＨで溶出させたクロマトグラム（図１５Ａ〜Ｂ）と比較して、ＴＦＡで溶出させたクロマトグラム（図１４Ａ〜Ｂ）においてピークの数が増加していることは、オリゴ糖のアノマーの分離の結果である。ＴＦＡ勾配から溶出させた個々のピークの採取および濃縮により、再注入の際に単一のピークが同一質量の２つのピークへと分裂することがもたらされる。ＰＧＣカラムからのオリゴ糖の塩基性溶出により、より単純なプロフィールがもたらされる（図１５Ａ〜Ｂ）。塩基性溶出条件は完全なアノマー分離をもたらさないが、顕著なピークの広幅化が観察される。ピークの分解能は、カラム温度を上げてアノマーの相互交換を加速することによって増大することができる（Itoh S., et al., J. Chromatogr. A. 2002 968(1-2), 89-100）。しかし、検出されたオリゴ糖の感度（イオン計数）は、酸性溶出条件よりも低いままである。酢酸アンモニウムなどの塩を添加することで感度を増加できることが報告されている。（Churms SC, J. Chromatogr. A. 500 (1990) 555-583.）
【０３２０】
酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸アンモニウムまたはギ酸アンモニウムの添加は応答の増加をもたらすが、非対称のピークの広幅化ももたらす。生じるピークの広幅化および加えた塩とＵＶ検出との潜在的な干渉により、塩の添加は魅力的でない選択肢となった。アノマー分離を排除する代替手順は、オリゴ糖を対応するアルジトールへと還元することである。
【０３２１】
より高い感度およびクロマトグラフィー分解能により、酸性溶出条件がオリゴ糖プロファイリングに有利となる。特定のプロファイリング系は、２つの二位置の６ポート弁を介してＨｙｐｅｒｃａｒｂ  ５μＭカラム（１００×４．６ｍｍ）と連結したＬｕｎａ  Ｃ１８カラムからなる。Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムは、ＵＶ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６  ＰＤＡ）に、標準のＥＳＩプローブを備えたＱ−ＴｏＦ  Ｍｉｃｒｏ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）と直列で連結されている。適切なスイッチコントロールを介して、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムを単独で用いて事前に精製したＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料のプロファイリングを行うことができるか、または、消化混合物をＨｙｐｅｒｃａｒｂカラムと直列のＬｕｎａ  Ｃ１８に直接注入することによって消化混合物のプロファイリングを行うことができる。典型的には、プロフィールは１０〜２０ｎｍｏｌｅｓのタンパク質から放出されたＮ結合型オリゴ糖から得られる。
【０３２２】
特定の実施形態では、本発明は、代表的なピークを有するクロマトグラムのうちの任意の１つまたは複数に従ったクロマトグラムを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。配列番号２からの配列を有する単量体を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の代表的なオリゴ糖プロフィールクロマトグラムを図１３、図１４Ａ〜Ｂ、図１５Ａ〜Ｂ（ＰＧＣ）、図１７（ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤ）、および図１８Ａ〜Ｂに示す。これらのクロマトグラフィープロフィールはどちらも、後に溶出されるドメインでシアリル化の度合が増加しているオリゴ糖構造を含む、４つの明確なドメインに分割することができる。ＰＧＣクロマトグラフィー系は、質量検出器との直接界面を可能にする。質量分解能および信号対雑音比は、低い割合で存在するオリゴ糖にも許容されるものであった。個々のオリゴ糖構造のクロマトグラフィー分解能は、ＨＰＡＥＣよりもＰＧＣクロマトグラフィー分離でより高いように見える。
【０３２３】
ＨＰＡＥＣ方法からのピークの採取には脱塩が必要であり、用いた高ｐＨにより、ピークの正確な構造的同定と干渉し得る剥離反応の可能性が導入される。ＰＧＣクロマトグラフィーで用いたクロマトグラフィー条件は塩を含まないので、溶出されたオリゴ糖ピークを最小限の操作で採取および濃縮することができる。これにより、溶出させたピークを採取および濃縮すること、次いで採取したオリゴ糖をＨＰＡＥＣ系に注入することが可能となる。採取したオリゴ糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ系に再注入することにより、ＨＰＡＥＣプロフィール中に存在するピークの一部の構造的割当てが可能となる（図１７）。陰イオン交換カラムでの不完全なピーク分解能が原因で、単離したピークのすべてをＨＰＡＥＣプロフィールにマッピングすることができなかった。
【０３２４】
消化混合物の直接注入により生じたプロフィールおよび同じタンパク質試料からの単離したオリゴ糖のプロフィールは同一ではない。直接注入により生じたプロフィール（図１８Ａ〜Ｂ）は異なるアノマー比を有し、これは、採取されたオリゴ糖の濃度がアノマー化の増加をもたらしていることを示唆している。より重要なことに、直接注入により生じたプロフィールは、テトラ−シアル化構造に対応するピークを含む。この構造は採取および単離したオリゴ糖のプロフィールでは同定されていない。アッセイ時間の短縮に加えて、消化混合物から直接プロファイリングを行うことにより、採取および濃縮中のグリカン分解を回避することによってオリゴ糖分布をより正確に表すことができる。
【０３２５】
相対定量
【０３２６】
インフュージョン試料で行った表面マッピングにより、アセトニトリルの容量％が溶出されるオリゴ糖のイオン化効率に顕著な影響を与えることが示されている。シグナル強度が移動相中のアセトニトリル含有率に依存することで、ＭＳによるオリゴ糖の相対定量が溶出ピークの保持時間に依存性となる。カラム条件の変化はＰＧＣカラムでの溶出時間に影響を与えることができる。このため、イオンクロマトグラム溶出プロフィールから一貫した相対定量を得るのは困難であろう。２０６ｎｍでのＵＶ追跡は、イオン追跡と同程度までは溶媒組成によって影響を受けないはずである。ＵＶ追跡を用いて相対定量を行い、イオン追跡は特徴づけおよび定性的比較にのみ用いた。単一の糖タンパク質ロットから単離したオリゴ糖の反復注入により、定量した４つのオリゴ糖ドメインのそれぞれについて４％未満の％相対標準偏差（％ＲＳＤ）がもたらされた。
【０３２７】
配列番号２の単量体を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子中のＯ結合型構造
【０３２８】
Ｎ結合型炭水化物に加えて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子はＯ結合型炭水化物を含むことができる。Ｏ結合型オリゴ糖構造は、一連の直交型質量分析技術を用いて分析することができる。これらの技術には、いくつかのエンドペプチダーゼ切断、次いでＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析が含まれる。
【０３２９】
配列番号５、６、７、８、９または１０からの配列を有する単量体から形成されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子に関して、Ｏ結合型グリコシル化の２つの主要な部位を、正確な質量エレクトロスプレーイオン化を用いて特徴づけ、それぞれのＯ結合部位での主要な構造を決定した。これらのデータを図９に要約する。３つの主要なＯ結合型構造が存在し、データは一貫している：（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1；（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）2；（ＧａｌＮＡｃ）1（ＧｌｃＮａｃ）1（Ｇａｌ）2（ＮｅｕＡｃ）2。それぞれの構造は、それぞれの部位で異なる量で観察される。これらの量は相対定量的であり、複数の分析から得られたデータを表す。Ｏ結合型オリゴ糖は相当量のシアル酸をＣＴＬＡ４−Ｉｇに提供する。鎖１本あたり２つの主要なＯ結合型オリゴ糖付着点が存在する。Ｏ結合型オリゴ糖発生の第１部位はＳｅｒ165であり、約９５％の確率で占有されている。Ｏ結合型オリゴ糖発生の第２部位はＳｅｒ155/156であり、２５％の確率で占有されている。本明細書中に提示する直交データは、そのようなＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子上に存在する主な炭水化物構造の概要を提供し、図９に要約されている。
【０３３０】
一般に、Ｏ結合型炭水化物は、Ｎ結合型炭水化物中に存在するよりもはるかに多い構造の不均一性を有する。さらに、Ｏ結合型の結合にはコンセンサス配列が存在しない。したがって、Ｏ結合型オリゴ糖の構造的特徴づけで用いるために一連の直交型技術、すなわちＬＣ／ＭＳインタクト分析およびＬＣ／ＭＳ糖ペプチド分析が開発された。
【０３３１】
エドマン分解およびＭＡＬＤＩに基づいて、Ｏ結合部位がＳｅｒ165であることが報告された（配列番号２に関して）。Ｓｅｒ165グリコシル化の存在の直接データを得るために、Ｔ９ペプチドにｂ’およびｙ’’イオンシリーズを用いたＭＳ／ＭＳ配列決定を行った（表４および表５参照）。表４は、４つの異なるグリコシル化状態のＴ９ペプチドのイオンシリーズを示す。４つの状態すべてで、ｂ’イオンシリーズ、ｂ１．．．ｂ６イオンは一致している。しかし、ｂ’イオンシリーズ、ｂ７．．．ｂ最大は、ｂ７での異なるグリコシル化状態によって異なっている（Ｓｅｒ165）。確認として、対応するｙ’’イオンシリーズを報告した。４つのｙ’’イオンシリーズすべてで、ｙ１．．．ｙ１９イオンは完全に一致している。しかし、ｙ’’イオンシリーズ、ｙ２０．．．ｙ最大は、ｙ２０での異なるグリコシル化状態によって異なっている（Ｓｅｒ139）。ｂ’およびｙ’’イオンシリーズは、一緒になって、Ｓｅｒ139がＴ９ペプチド上の主なＯ結合型グリコシル化の部位であるというエドマン配列決定の暗示を支持している。Ｔ９とは、いくつかのセリンおよびスレオニン残基を含むペプチドである。
【０３３２】
表４は、（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1のＯ結合型ラダーを有するまたは有さないＴ９ペプチドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳのｂ’およびｙ’’イオンを表す。ｂ’イオンシリーズはすべてのスペクトルでｂ７まで同一であり、その後は、スペクトルはそれぞれのシリーズの上部に示したＯ結合型炭水化物構造により異なる。ｙ’イオンシリーズはすべてのスペクトルでｙ１９まで同一であり、その後は、スペクトルはそれぞれのシリーズの上部に示したＯ結合型炭水化物構造により異なる。
【表４】
2010116402.tif 000009
【表５】
2010116402.tif 000010
【０３３３】
Ｓｅｒ165でのＯ結合型炭水化物構造は、３つの主要な種の異種集団を表す。図１９では、Ｔ９糖ペプチドが逆重畳積分したスペクトルで観察される。２６８９．２ａｍｕでベースピークが存在し、これはこのペプチドの理論質量である２６８９．１１ａｍｕと一致する。スペクトルは、３つの主要なＯ結合型構造を例示する。スペクトルは、Ｏ結合型構造（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1と一貫した、糖ラダーを有するベースペプチドを例示する。スペクトルの拡大した太字部分は１０倍拡大しており、（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）2および（ＧａｌＮＡｃ）1（ＧｌｃＮＡｃ）1（Ｇａｌ）2（ＮｅｕＡｃ）2と一貫した、２つの追加のＯ結合型構造を同定している。
【０３３４】
質量分析を用いて、それぞれのＯ結合型種の相対存在量を評価した。図１９では、（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1グリカンは、（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）2グリカンと１０：１比で、（ＧａｌＮＡｃ）1（ＧｌｃＮＡｃ）1（Ｇａｌ）2（ＮｅｕＡｃ）2グリカンと３０：１比で観察された。したがって、一実施形態では、本発明は、１０：１比の（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1グリカン対（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）2グリカンを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、３０：１比の（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1グリカン対（ＧａｌＮＡｃ）1（ＧｌｃＮＡｃ）1（Ｇａｌ）2（ＮｅｕＡｃ）2グリカンを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む集団を提供する。（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）2グリカンは、（ＨｅｘＮＡｃ）2（Ｇａｌ）2（ＮｅｕＡｃ）2グリカンと２０：１の比で観察される。別の実施形態では、本発明は、２０：１比の（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）2グリカン対（ＨｅｘＮＡｃ）2（Ｇａｌ）2（ＮｅｕＡｃ）2グリカンを有する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、本段落中の前記比のすべてを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。さらに、陰イオンエレクトロスプレースペクトルにより、これら３つの主な構造が確認され；それぞれの相対存在量を図９に示す。
【０３３５】
配列番号２の単量体を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子に関して、Ｓｅｒ165部位に加えて、第２のＯ結合部位がＳｅｒ155またはＳｅｒ156で観察される。この部位は、Ｓｅｒ155/156と呼ばれる。Ｓｅｒ155/156を含むＤ８ペプチドをＡｓｐＮ消化から作製し、これは配列番号２のアミノ酸１５０〜１５６に対応する。ペプチドを分離し、ＬＣ／ＭＳによって検出する。Ｄ８  Ｏ結合型糖ペプチドのスペクトル（示さず）は、理論質量７９０．８ａｍｕと一致する７９０．２ａｍｕのベースピークを示す。スペクトルは、ペプチドイオンおよび構造と一貫した一連のイオン、（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1を例示する。ペプチドは主に非グリコシル化されており；グリコシル化された（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1種は約２２％ピーク面積を構成する。
【０３３６】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単鎖のＯ結合型オリゴ糖構造は、一連の直交型質量分析技術を用いて特徴づけた。これらの技術には、エンドペプチダーゼ切断およびそれぞれのＯ結合部位での主な構造を決定するためにエレクトロスプレーイオン化を用いた２つの主なＯ結合型グリコシル化の部位のＬＣ／ＭＳ分析が含まれる。これらのデータを図２０に要約する。４つの主なＯ結合型構造、すなわち、（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1；（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）2；（ＨｅｘＮＡｃ）2（Ｇａｌ）2（ＮｅｕＡｃ）2；（ＨｅｘＮＡｃ）2（Ｇａｌ）2，（ＮｅｕＡｃ）3が存在することができる。これらの構造は、それぞれの部位について異なる量で検出される。９５％を超えるＣＴＬＡ４−Ｉｇ単鎖が少なくとも（ＨｅｘＮＡｃ）2（Ｇａｌ）2（ＮｅｕＡｃ）2を有する。
【０３３７】
Ｏ結合型炭水化物を確認し、より優勢でない構造を探すために、別のアッセイが開発された。この技術では、トリプシンおよびキモトリプシンの同時消化を利用して、ＭＳ／ＭＳによってＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬ（配列番号２のアミノ酸１５９〜１７１）であることが確認されたペプチドを生じる。このペプチドにより、１個のモノシアル化、２個のジ−シアル化および１個のトリ−シアル化されたＯ結合型種の同定が可能となった。トリ−シアル化種には決定的な構造が解明されていないが、２つの可能性が提案されており、それらは、３つのシアル酸を有する核２の構造または２つの異なるアミノ酸残基上に存在する２つの核１の構造を含むペプチドである。
【０３３８】
相補的技術、ＭＳによるインタクト分析を用いて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の異種Ｏ結合型グリコシル化の存在を確認した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ単鎖をＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理してＮ結合型オリゴ糖を除去した。その後、質量分析装置によって分子を検出し、対応するイオンの逆重畳積分を行ってスペクトルとした。単鎖物質では、主なグリカン組成は（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｈｅｘ）２（ＮｅｕＡｃ）２であり、参照は主に（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｈｅｘ）１（ＮｅｕＡｃ）１である。グリコシル化の組成は、ＬＣ／ＭＳペプチド分析で観察されたものと一致している。Ｏ結合型グリコシル化パターンの変化に加えて、第２の主要な修飾が観察された。単鎖非還元種と還元ＣＴＬＡ４Ｉｇ標準との間で１１３±４ｕの質量シフトが観察される。１１３±４ｕの質量シフトは、ＤＴＴを用いた還元の際に消失した。二量体物質では、生じたイオンエンベロープの逆重畳積分を行ってスペクトルとし（示さず）、これは７９９４４ａｍｕで主要なピークを有し、これは２（ＧａｌＮＡｃ）1（Ｇａｌ）1（ＮｅｕＡｃ）1構造の存在に対応する。次に大きな８０６００ａｍｕのピークは、３つのＯ結合型構造または最大で一分枝鎖状のＯ結合型構造の組合せに対応する。３番目に大きなピークは、４つのＯ結合型構造または最大で二分枝鎖状のＯ結合型構造の組合せのどちらかに対応する。
【０３３９】
シアル酸含有率の決定
【０３４０】
糖タンパク質の特徴づけの別の態様は、シアル酸の決定である。シアル酸含有率は、糖タンパク質に特徴的な指標であることができる。本発明の糖タンパク質のシアル酸含有率は慣用の方法によって評価することができる。たとえば、シアル酸は、少なくとも３つ組の試料を用いて、直接比色方法（Yao et al., 1989, Anal. Biochem., 179:332-335）によって別々に決定することができる。シアル酸決定の別の方法は、Warren et al., 1959, J. Biol. Chem., 234:1971-1975に記載のように、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）の使用を含む。さらに別の方法は、H. K. Ogawa et al., 1993, J. Chromatography, 612:145-149に記載などのように、高速クロマトグラフィーを含む。
【０３４１】
一実施形態では、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）およびＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）の量を決定する一方法は、目的の糖タンパク質の酸加水分解処理によるものである（たとえば、実施例３参照）。この方法では、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡを酸加水分解によってタンパク質から切断する。一実施形態では、糖タンパク質を、その精製に適した方法によって実質的に精製する。放出されたＮＡＮＡおよびＮＧＮＡをＲｅｚｅｘ単糖ＲＨＭカラム上のＨＰＬＣによって分離し、ＵＶ吸光（２０６ｎｍ）によって検出する。同時に流すＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ標準の応答係数に基づいて、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡを定量する。結果は、タンパク質に対するＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのそれぞれのモル比（ＭＲ）として報告することができる。
【０３４２】
シアル酸含有率を測定する酸加水分解方法の目的は、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ試料中のタンパク質に対する全シアル酸（ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ）の量を測定することである（モル比）。しかし、これらのシアル酸モル比には、結合および遊離のＮＡＮＡおよびＮＧＮＡがどちらも含まれることに留意することが重要である。モル比の結果は、加水分解したＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ試料対加水分解していないＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ標準からのＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのピーク面積の比較に基づいて得られる。ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡの加水分解した標準も用いることができる。
【０３４３】
たとえば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子についてモル比を得た。加水分解なしでは、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ標準のクロマトグラム中の目的のピークは単一のピークとして現れる。ＮＡＮＡ標準およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料を加水分解した場合、生じるクロマトグラムはＮＡＮＡを主要なピークとして示し、小さな肩のピークがすぐに続く（主要なピーク面積の＜１０％；「分解ＮＡＮＡ」と呼ぶ）；加水分解を行ったおよび行わなかった同濃度のＮＡＮＡ標準は、分解物を含めて非常に近いピーク面積をもたらした。分解ＮＧＮＡ種については、クロマトグラム中に明らかに見えるピークは存在しないが、加水分解したＮＧＮＡ標準中のＮＧＮＡピークの面積計数は、約８〜９％低下することが見られた。質量分析（ＭＳ）実験により、「ＮＡＮＡ分解物」は、加水分解したＮＡＮＡ標準および加水分解したＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料のどちらにおいても、ＮＡＮＡからの１８ダルトン（水）の損失から生じることが実証された。したがって、本方法には、加水分解したＣＴＬＡ４−Ｉｇ中のＮＡＮＡピークの積分に小さな肩のピークが適切に含まれる。また、ＭＳ実験により、ＮＧＮＡは、加水分解の際に１８ダルトンを損失して分解したことも実証された。ＮＧＮＡ分解物はＮＡＮＡおよびＮＡＮＡ分解物の間で溶出されたので、ＵＶによって検出されなかった。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質では、ＮＧＮＡ含有率はＮＡＮＡ含有率の約５％であり、その結果、ＮＧＮＡ分解物の同時溶出によりＮＡＮＡピーク面積の０．５％未満の変化が引き起こされ、これは、ＮＡＮＡピーク面積のばらつきの範囲内である。この方法では、ＮＧＮＡの結果に分解ＮＧＮＡの面積を含めることができない；したがって、ＮＧＮＡの結果は＜１０％低くあることができ、これも、本方法のばらつきの範囲内である。
【０３４４】
ＮＧＮＡはＮＡＮＡよりも免疫原性であると考えられているので、低いモル比のＮＧＮＡを含む組換え治療剤が臨床的に好まれる。本発明の一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団中のシアル酸の優勢はＮＧＮＡではなくＮＡＮＡであり、この集団中、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または二量体１モルあたりのシアル酸のモル数のモル比は約５〜約１８である。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団中のシアル酸の優勢なＮＧＮＡではなくＮＡＮＡであり、この集団中、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子または二量体１モルあたりのシアル酸のモル数のモル比は約５．５〜約８．５である。
【０３４５】
ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ発現カセット
【０３４６】
本発明は、一実施形態では発現カセットである、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子をコードしている核酸を提供する。本発明はまた、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子をコードしている核酸も提供する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子をコードしている核酸は発現カセット内に含まれている。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子をコードしている核酸は、配列番号１７のヌクレオチド配列を有するプラスミドに由来する発現カセット内に含まれている。さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子をコードしている核酸は発現カセット内に含まれている。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子をコードしている核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１０４号として寄託されているプラスミドに由来する発現カセット内に含まれている。
【０３４７】
本発明の核酸は、天然のプロモーターもしくはその誘導体または完全に異種のプロモーターから発現させることができる、発現カセットなどの発現可能な形態の目的のｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ様、ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸分子であることができる。あるいは、目的の核酸はアンチセンスＲＮＡをコードすることができる。目的の核酸はタンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質などの糖タンパク質）をコードすることができ、イントロンを含んでいても含んでいなくてもよい。
【０３４８】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４活性を有するペプチドをコードしている核酸は、Ｔ細胞ゲノムＤＮＡまたは活性Ｔリンパ球中に存在するｍＲＮＡから得ることができる。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇをコードしている核酸も、Ｔ細胞ゲノムＤＮＡまたは活性Ｔリンパ球中に存在するｍＲＮＡから得ることができる。本発明の別の実施形態では、目的のタンパク質、たとえばＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇをコードしている遺伝子は、ゲノムライブラリまたはｃＤＮＡのどちらかから、当業者が実施する標準のプロトコルに従ってクローニングすることができる。たとえばＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇをコードしているｃＤＮＡは、全ｍＲＮＡを適切な細胞系から単離することによって得ることができる。当分野で知られている方法を用いて、二本鎖ｃＤＮＡを全ｍＲＮＡから調製することができ、続いて適切なバクテリオファージベクターまたはプラスミド内に挿入することができる。遺伝子は、当分野で十分に確立されているＰＣＲ技術を用いてクローニングすることもできる。一実施形態では、ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇをコードしている遺伝子は、本発明によって提供されるヌクレオチド配列情報に従ってＰＣＲを介してクローニングすることができる。
【０３４９】
別の実施形態では、ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇのｃＤＮＡを含むＤＮＡベクターは、ＰＣＲ反応の鋳型として働くことができ、目的の領域を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、その領域を包含する単離したＤＮＡ断片を得ることができる。本発明の特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４のｃＤＮＡ中で標的とされた目的領域は、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含めたＣＴＬＡ４の細胞外ドメインであることができる。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇのｃＤＮＡ中で標的とされた目的領域は、配列番号２のアミノ酸位置５５および１３０でアミノ酸変化を有するＣＴＬＡ４の細胞外ドメインであることができ（たとえば配列番号１８参照）、これには上述のアミノ酸変化を保有するヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインが含まれる。
【０３５０】
本発明のコンテキストで融合タンパク質を発現させるために、一実施形態のキメラ遺伝子融合（たとえば、ＣＴＬＡ４−免疫グロブリン（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）融合タンパク質またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ融合タンパク質コードしている遺伝子）には、キメラ遺伝子が転写および翻訳された際に、新しく合成された融合タンパク質の分泌を指示するシグナル配列をコードしている、ヌクレオチド配列が含まれる。一実施形態では、ネイティブＣＴＬＡ４シグナル配列（たとえば、Harper, K., et al. 1991, J. Immunol. 147,1037-1044に記載のヒトＣＴＬＡ４シグナル配列）を用いることができる。本発明の代替実施形態では、異種シグナル配列を用いてＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの分泌を指示することができる（たとえば、オンコスタチン−Ｍシグナル配列（Malik N., et al., 1989, Mol Cell Biol 9(7), 2847-2853）または免疫グロブリンシグナル配列）。当業者は、ＣＴＬＡ４をコードしている核酸配列の５’末端でシグナル配列のインフレームライゲーションを行うことなどの標準の組換えＤＮＡ技術によって、シグナル配列に対応するヌクレオチド配列をキメラ遺伝子融合体内に挿入できることを理解されよう。
【０３５１】
ブダペスト条約の規定の下、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０に、１９９１年５月３１日に寄託されている。これにはＡＴＣＣ寄託番号６８６２９号が割り当てられている。さらに、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇに対応するアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む発現プラスミドは、ブダペスト条約の規定の下、２０００年６月１９日にＡＴＣＣに寄託されている。寄託したプラスミドにはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１０４号が割り当てられている。寄託したプラスミドは、ｐＤ１６  ＬＥＡ２９ＹおよびｐＤ１６  Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙとも呼ぶ。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、そのすべてが参考として本出願中にその全体で組み込まれている、米国特許第７，０９４，８７４号ならびに同時係属中の米国特許出願第０９／５７９，９２７号、第６０／２８７，５７６号、および第６０／２１４，０６５号、ならびに国際特許公開ＷＯ０１／９２３３３７Ａ２号にさらに記載されている。
【０３５２】
本発明の発現ベクターを用いて、真核（たとえば、酵母、哺乳動物、もしくは昆虫細胞）または原核のどちらかの細胞の形質移入を行って、ベクターのヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子などの融合タンパク質）を産生させることができる。当業者は、原核生物中での所望のタンパク質生成物の発現は、ほとんどの場合、イー・コリ中で、構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて実施することを理解されよう。一部のイー・コリ発現ベクター（当分野で融合ベクターとしても知られている）は、いくつかのアミノ酸残基を、通常は発現された組換えタンパク質のＮ末端に付加するように設計されている。前記融合ベクターは、３つの機能、すなわち、１）所望の組換えタンパク質の溶解度を増加させること；２）目的の組換えタンパク質の発現を増加させること；および３）親和性精製においてリガンドとして働くことによって組換えタンパク質の精製を補助することを果たすことができる。融合発現ベクターの一部の例には、それだけには限定されないが、ａ）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを所望のタンパク質と融合するｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．、オーストラリア、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）；ｂ）６ｘ−Ｈｉｓを目的の組換えタンパク質と融合するｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  Ａ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）；ならびにｃ）マルトースＥ結合タンパク質を標的組換えタンパク質と融合するｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）が含まれる。
【０３５３】
本発明のプロセスおよび方法に従った培養に適した細胞は、プラスミドなどの導入した発現ベクター（構築体）を保有することができる。発現ベクター構築体は、形質移入、リポフェクション、形質転換、注入、電気穿孔、または感染によって導入することができる。発現ベクターは、培養プロセス中で発現および産生させるタンパク質をコードしているコード配列、またはその一部分を含むことができる。そのような発現ベクターには、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な構成成分が含まれることができる。産生されるタンパク質およびポリペプチドをコードしている配列、ならびに適切な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクターは、当業者に周知かつ当業者に実施される方法を用いて作製することができる。これらの方法には、J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.およびF. M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載されているインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換えが含まれる。
【０３５４】
ベクターを保有する細胞に耐性を与えるために、選択マーカーを、細胞のゲノム内に安定して組み込まれている組換え発現ベクター（たとえばプラスミド）中で用いることができる。これにより、適切な選択培地中でそれらを選択することが可能となる。それだけには限定されないが、それぞれｈｇｐｒｔ−、ｔｋ−、またはａｐｒｔ−細胞で用いることができる、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ＴＫ）、（Wigler et al., 1977, Cell, 11:223）、（Szybalska and Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）、（Lowy et al., 1980, Cell, 22:817）遺伝子を含めた、いくつかの選択系を用いることができる。
【０３５５】
発現ベクター内に含めることができるマーカー遺伝子の以下の非限定的な例も、代謝拮抗剤耐性を選択する根拠として用いることができる：ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072）；メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357；およびO'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527）；ハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Santerre et al., 1984, Gene, 30:147）；ならびにアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Clinical Pharmacy, 12:488-505；Wu and Wu, 1991, Biotherapy, 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596；Mulligan, 1993, Science, 260:926-932；Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191-21；May, 1993, TIB Tech, 11 (5):155-215）。当分野で一般的に知られている組換えＤＮＡ技術をルーチン的に適用して、所望の組換え細胞クローンを選ぶことができる。そのような技術は、たとえば、参考として本明細書中にその全体で組み込まれているAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapin et al., 1981. J. Mol. Biol., 150:1に記載されている。
【０３５６】
発現されたタンパク質分子の発現レベルは、発現ベクターの増幅によって増加することができる（総説には、Bebbington and Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, New York, 1987を参照）。目的のタンパク質を発現している発現ベクター系中のマーカーが増幅可能な場合は、宿主細胞の培地中に存在する阻害剤のレベルの増加により、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅した領域はタンパク質をコードしている遺伝子に関連しているので、タンパク質の産生も同時に増加する（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3:257）。選択マーカーのグルタミン合成酵素（ＧＳ）またはジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードしている核酸配列を保有するベクターは、それぞれ薬物のメチオニンスルホキシミンまたはメトトレキサートの存在下で増幅することができる。そのようなベクターの利点は、それぞれグルタミン合成酵素陰性およびジヒドロ葉酸還元酵素陰性である細胞系、たとえば、ネズミ骨髄腫細胞系、ＮＳＯおよびチャイニーズハムスター卵巣、ＣＨＯ、細胞系ＤＧ４４が利用可能であることである。
【０３５７】
本発明の一実施形態では、可溶性ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ融合タンパク質分子をコードしている核酸配列を、真核宿主中で外来配列を発現させるために設計された発現ベクター内に挿入できる。ベクターの制御要素は、使用に選択した真核宿主に応じて変化することができる。可溶性ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを真核宿主細胞中で発現させるために用いるベクターには、タンパク質の発現を最適化するためのエンハンサー配列が含まれることができる。
【０３５８】
哺乳動物細胞（ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞など）は、発現ベクターを適切な宿主細胞内に導入することによって、発現ベクター（たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ融合タンパク質をコードしている遺伝子を含むもの）を保有することができる。したがって、本発明は、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む発現ベクターを包含し、当分野で知られている方法によってそのような発現ベクターを内部に導入することができる宿主細胞を包含する。本明細書中に記載のように、本発明の発現ベクターには、宿主細胞中でヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で少なくとも１つの調節配列と連結した、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が含まれることができる。当業者には、調節配列は周知であり、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Dieg, Calif. (1990)に記載のように、適切な宿主細胞中で目的のタンパク質の発現を指示するように選択することができる。調節配列は、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および他の発現調節要素を含むことができる。当業者は、発現ベクターの設計は、形質移入する宿主細胞の選択ならびに／または発現させる所望のタンパク質の種類および／もしくは量などの要素に依存する場合があることを、理解されよう。
【０３５９】
クローニングおよび発現プラスミド（たとえば、ｐｃＳＤおよびｐｉＬＮ）は、実施例１１に記載のように構築する。本発明の一実施形態では、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ−からの単離したＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３ベクター主鎖とライゲーションし、発現ベクターｐｃＳＤを作製する。ベクターｐｃＳＤは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、次いで多重クローニング部位（ＭＣＳ）；ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列；選択および増幅のためのマウスｄｈｆｒ  ｃＤＮＡ配列；アンピシリン耐性遺伝子；ならびにエシェリキア・コリの選択および維持のためのｐＵＣ複製起点の特長からなる。実施例１１のヒトＣＴＬＡ４受容体の細胞外ドメインの断片に対応するアミノ酸配列の一部分をコードしているｃＤＮＡを含むベクターｐｉＬＮを構築し、第１のアミノ酸配列をコードしているｃＤＮＡは、発現されたＣＴＬＡ４タンパク質の溶解度を変化させることによってＣＴＬＡ４受容体遺伝子の発現を可能にするＩｇＣ領域に対応する、第２のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡと結合している（ＣＴＬＡ４の細胞外部分およびＩｇＧ１の定常領域に対応する残基については、図１および図１の簡単な説明を参照）。一実施形態では、オンコスタチンＭシグナルペプチド配列は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列と融合していることができ、これは続いて、図１に既に記載のように、Ｉｇドメイン（たとえばヒトＩｇＣγ1ドメイン）に対応する第２のアミノ酸配列と融合している。オンコスタチンＭシグナル配列は、ＣＴＬＡ４遺伝子（たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇ）タンパク質生成物の可溶形の産生を可能にする。
【０３６０】
ＣＴＬＡ４−免疫グロブリン融合タンパク質をコードしている遺伝子を含むｐｃＳＤ発現ベクターを構築するために、当分野で知られている方法（たとえば制限部位サブクローニング）を用いることができる。本発明の一実施形態の出発物質は、実施例１１に記載のクローニングベクターｐｉＬＮからの消化かつ切除したＤＮＡ断片であることができる。別の実施形態では、前記ベクターからの切除したＤＮＡ断片は、オンコスタチンＭシグナル配列およびＣＴＬ４Ｉｇ融合タンパク質のアミノ酸配列を含み、前記ＤＮＡ断片は消化したｐｃＳＤベクターとライゲーションしている。オンコスタチンＭ−ＣＴＬＡ４−ＩｇＤＮＡ断片は、ＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列を含むカセットとの間に挿入することができる。これにより、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子産物が、ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇと命名したプラスミド中のＣＭＶプロモーターの制御下に置かれる（図２１；配列番号１７）。
【０３６１】
さらに、クローニングおよび発現プラスミド（たとえばｐＤ１６ＬＥＡ２９Ｙ）は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎプラスミドｐｃＤＮＡ３に由来することができる。ベクターｐＤ１６ＬＥＡ２９Ｙ（図２２）は、ｐｃＤＮＡ３からのネオマイシン耐性遺伝子がエンハンサーなし（弱化）ＳＶ４０プロモーターの制御下にあるネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子で置き換えられていること；ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇをコードしている遺伝子がＣＭＶプロモーターから発現され、ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン遺伝子に由来すること；目的の遺伝子の発現カセットが転写終止配列に隣接している、すなわち、プロモーターの５’側およびポリＡ部位の３’側にあること；ベクターが２つの明確な制限部位ポリリンカーを含み、一方は目的の遺伝子をクローニングするためのプロモーターの３’側にあり、他方は形質移入前にベクターを直鎖化するためのプロモーターの５’側にあること；ベクターがアンピシリン耐性遺伝子およびイー・コリ中のプラスミド増殖のためのＣｏｌＥ１複製起点を含むこと；ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ配列（配列番号３）がオンコスタチンＭシグナルペプチドの後にあり、ベクターｐＤ１６ＬＥＡ２９Ｙとして知られている発現ベクター中でアセンブルされることの特長を含む。
【０３６２】
ヒトＣＴＬＡ４受容体の細胞外ドメインの断片に対応するアミノ酸配列に一部分をコードしているｃＤＮＡを含むベクターを構築し（配列番号２）、位置５５のアミノ酸Ａｌａはアミノ酸Ｔｙｒによって置き換えられており、位置１３０のアミノ酸Ｌｅｕはアミノ酸Ｇｌｕによって置き換えられている（図３）。これらのアミノ酸変化を、配列番号４を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇアミノ酸配列に示す。第１のアミノ酸配列（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇをコードしている配列）をコードしているｃＤＮＡは、配列番号３を有する発現されたＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇタンパク質の溶解度を変化させることによってＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ受容体遺伝子の発現を可能にするＩｇＣ領域に対応する、第２のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡと結合している（修飾されたＣＴＬＡ４の細胞外部分およびＩｇＧ１の定常領域に対応する残基については、図３および図３の簡単な説明を参照）。
【０３６３】
一実施形態では、オンコスタチンＭシグナルペプチド配列は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列と融合していることができ、これは続いて、図３に既に記載のように、Ｉｇドメイン（たとえばヒトＩｇＣγ1ドメイン）に対応する第２のアミノ酸配列と融合している。オンコスタチンＭシグナル配列は、ＣＴＬＡ４遺伝子（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）タンパク質生成物の可溶形の産生を可能にする。
【０３６４】
細胞系を作製するための安定した形質移入
【０３６５】
目的のタンパク質（たとえば、融合構築体、糖タンパク質など）をコードしているＤＮＡを含むベクターを適切な宿主細胞（たとえば細菌細胞）中に導入し形質転換して、大量のクローニングしたＤＮＡを産生することができる。形質転換用の細菌細胞の一部の非限定的な例には、細菌細胞系イー・コリ株ＤＨ５αまたはＭＣ１０６１／ｐ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）が含まれ、これは、当分野で実施される標準の手順を用いて形質転換させることができ、その後、コロニーを適切なプラスミド発現についてスクリーニングすることができる。
【０３６６】
哺乳動物細胞などの真核細胞用の発現ベクターには、哺乳動物細胞に適合性のあるプロモーターおよび制御配列が含まれることができる。本発明の一実施形態では、これらの調節要素は、たとえば、ｐｃＳＤもしくはｐＤ１６ＬＥＡ２９Ｙベクター中に見つかるＣＭＶプロモーター、またはｐｉＬＮベクター中に位置するトリ肉腫ウイルス（ＡＳＶ）であることができる。他の一般的に用いられる初期および後期プロモーターには、それだけには限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のもの（Fiers, et al., 1973, Nature 273:113）、またはウシパピローマ、ポリオーマ、およびアデノウイルス２ウイルスに由来するものなどの他のウイルスプロモーターが含まれる。当分野で知られている他のものに加えて、調節可能なプロモーター、ｈＭＴＩＩ（Karin, et al., 1982, Nature 299:797-802）を用いることもできる。培養昆虫細胞（たとえばＳＦ９細胞）中での組換えタンパク質の発現のための、利用可能な一部のバキュロウイルスベクターには、ｐＶＬシリーズ（Lucklow, V. A., and Summers, M. D., 1989, Virology 170:31-39）およびｐＡｃシリーズ（Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）が含まれる。また、当業者は、エンハンサー領域（非コードＤＮＡ領域中、プロモーター領域の上流または下流に見つかる配列）も発現の最適化に重要であることも理解されよう。必要な場合、たとえばプラスミドＤＮＡの導入に原核宿主を利用する場合、ウイルス源由来の複製起点を用いることができる。しかし、染色体の組み込みは、真核生物におけるＤＮＡ複製の共通の機構である。
【０３６７】
本発明の一実施形態では、所望のタンパク質（たとえば、融合タンパク質、糖タンパク質など）を発現させるために哺乳動物宿主細胞（ＣＨＯ細胞など）を用いるが、他の真核生物も宿主として用い得る。出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエの実験室株（パン酵母またはビール酵母としても知られる）、および分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベなどの他の酵母株を用いることができる。目的のタンパク質（たとえば、融合構築体、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ等の糖タンパク質など）をコードしているＤＮＡを保有する酵母ベクターは、Broach, Meth. Enz. 101:307 (1983)の２μ複製起点、または酵母に適合性のある他の複製起点（たとえば、Stinchcomb et al., 1979, Nature 282:39；Tschempe et al., 1980, Gene 10:157；およびClarke et al., 1983, Meth. Enz. 101:300）を利用することができる。酵母ベクター内に含まれる調節要素は、糖分解酵素を合成するためのプロモーターであることができる（Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149；Holland et al., 1978, Biochemistry 17:4900）。
【０３６８】
当業者は、増殖条件により前記調節可能な遺伝子の転写を調節することができる他のプロモーターも利用することができ、これには、イソチトクロームＣ、アルコール脱水素酵素２、マルトースおよびガラクトース利用を担う酵素、酸ホスファターゼ、および窒素代謝に関連する分解酵素の非限定的な例が含まれることができる。哺乳動物発現系と同様、ここでも酵母発現ベクター中にターミネーター配列がコード配列の３’末端にあることが望ましく、３’非翻訳領域中、酵母由来の遺伝子中のオープンリーディングフレームに続いて見つかる。酵母内（たとえばエス・セレビシエ内）での組換えタンパク質発現に適した酵母ベクターの一部の非限定的な例には、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123）、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari, et al., 1987, Embo J. 6:229-234）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、および酵母ベクターのｐＲＳファミリーに属するものが含まれる。
【０３６９】
その後、上述のように得た、目的のタンパク質（たとえば、融合構築体、糖タンパク質など）をコードしているＤＮＡを含むクローン、たとえば細菌クローンを、所望の産物を発現させるために哺乳動物細胞などの適切な宿主細胞内に形質移入し得る。形質移入技術は、前記宿主細胞に適した当分野で確立されている標準の技術を用いて実施し、形質移入技術は用いる宿主細胞に依存する。たとえば、哺乳動物細胞の形質移入は、リポフェクション、プロトプラスト融合、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介の形質移入、ＣａＰＯ4共沈殿、電気穿孔、直接微量注入、ならびに、擦過、直接取り込み、浸透圧もしくはスクロースショック、リゾチーム融合もしくは赤血球融合、赤血球に媒介される技術などによる間接微量注入、および／または宿主細胞を電流に供することを含むことができる当分野で知られている他の方法を用いて達成することができる。遺伝情報を宿主細胞内に導入する他の技術が開発されていくので、上述の形質移入方法のリストは完全であるとみなされない。
【０３７０】
多細胞生物に由来する真核宿主細胞（たとえば哺乳動物由来）中での目的のタンパク質（たとえば、融合構築体、糖タンパク質など）をコードしているＤＮＡの発現を、本発明のコンテキストで特に利用する（Tissue Cultures, Academic Press, Cruz and Patterson, Eds. (1973)）。多細胞生物に由来する宿主細胞はイントロンをスプライシングして切り出す能力を有するので、ゲノムＤＮＡ断片を発現させるために直接用いることができる。既に述べたように、有用な宿主細胞系には、それだけには限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞が含まれる。本発明では、目的のタンパク質（たとえば、融合構築体、糖タンパク質など）を安定して発現する細胞系を用いる。一実施形態では、哺乳動物細胞系（ＣＨＯ細胞系など）を、目的の糖タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクター（たとえば、ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ｐＤ１６ＬＥＡ２９Ｙなど）を用いて、（たとえば電気穿孔によって）形質移入する。一実施形態では、目的の糖タンパク質は、配列番号１のヌクレオチド配列の一部分によってコードされている配列番号２に含まれるアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質（または複数のタンパク質）を含めたＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質であることができる。別の実施形態では、目的の糖タンパク質は、配列番号２３のヌクレオチド配列の一部分によってコードされている配列番号４に含まれるアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを含めたＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇであることができる。
【０３７１】
ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇなどの組換えタンパク質は、哺乳動物細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、もしくはＮＳ０細胞）、昆虫細胞（たとえばバキュロウイルスベクターを用いて）、または酵母細胞などの真核宿主細胞中で発現させることができる。当業者は、本発明のコンテキスト中で既に記載したものなどの他の適切な宿主細胞を用いることができる。一実施形態では、組換え融合タンパク質（ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇなどの）の発現に原核ではなく真核を用いる。ＣＨＯ細胞などの真核細胞中でのヒトＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇなどの真核組換えタンパク質の発現は、部分的および／または完全なグリコシル化、ならびに鎖内または鎖間ジスルフィド結合の形成をもたらすことができる。所望のタンパク質の一過性増幅および発現には、目的のタンパク質（たとえば、融合構築体、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ等の糖タンパク質など）をコードしているＤＮＡを保有するベクターは、当分野で知られている形質移入方法によって真核細胞内にデリバリーを行うが、細胞のゲノム内に組み込まれない。形質移入した遺伝子の発現は１６〜９６時間以内に測定することができる。哺乳動物細胞（ＣＯＳ細胞など）をｐＣＤＭ８などのベクターと併せて用いて、所望のタンパク質を一過的に発現させることができる（Gluzman, Y., 1981, Cell 23:175-182；Seed, B., 1987, Nature 329:840）。
【０３７２】
哺乳動物細胞が安定して形質移入されるために、細胞の小画分がＤＮＡをそのゲノム内に組み込むことができ、組み込みの成功は利用する発現ベクターおよび形質移入方法に依存する場合があることは、当分野で理解されている。所望のタンパク質の安定した増幅および発現、目的のタンパク質（たとえば、融合構築体、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ等の糖タンパク質など）をコードしているＤＮＡを保有するベクターを真核細胞（哺乳動物細胞など）のゲノム内に安定して組み込ませ、その結果、形質移入した遺伝子の安定した発現がもたらされる。目的のタンパク質をコードしている遺伝子を安定して発現するクローンを同定および選択するために、選択マーカー（たとえば抗生物質に対する耐性）をコードしている遺伝子を、目的の遺伝子と共に宿主細胞内に導入することができる。当業者によって用いられる選択マーカーは、Ｇ４１８およびハイグロマイシンなどの薬物に対する耐性を与えるものであることができる。選択マーカーをコードしている遺伝子は、別のプラスミド上で宿主細胞内に導入するか、または目的の遺伝子と同じプラスミド上で導入することができる。目的の遺伝子を含む細胞は、薬物選択によって同定することができ、選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は前記薬物の存在下で生存し、一方で選択マーカー遺伝子が組み込まれなかった細胞は死滅する。その後、生存細胞を、所望のタンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）の産生についてスクリーニングすることができる。
【０３７３】
既に記載のように、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子の発現が欠損したＣＨＯ細胞は、ヌクレオシドを添加した場合にのみ生存することができる。前記細胞がｄｈｆｒ遺伝子を保有するＤＮＡベクターで安定して形質移入されている場合、細胞は必要なヌクレオシドを産生することができる。ｄｈｆｒを選択マーカーとして用いることによって、当業者は、代謝拮抗剤メトトレキサートの存在下で、ｄｈｆｒおよび形質移入した目的の遺伝子（たとえば、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）の遺伝子増幅が容易に起こることを理解されよう。本発明の一実施形態では、ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞などの哺乳動物細胞を、ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇ（実施例１１〜１３）またはｐＤ１６ＬＥＡ２９Ｙなどの発現ベクターで形質移入して、安定して増幅させることができ、かつ所望のタンパク質生成物（それぞれＣＴＬＡ４−ＩｇまたはβｐＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇポリペプチド）を安定して発現することができる細胞の集団を作製する。別の実施形態では、ｄｈｆｒ−陰性細胞系ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を安定した形質移入に用いることができる。本発明の別の実施形態では、形質移入は電気穿孔によって起こることができる。
【０３７４】
当分野で容易に実施されているように、形質移入した哺乳動物細胞（たとえばｄｈｆｒ−陰性ＣＨＯ細胞）は、血清を含む非選択培地中で形質移入後１〜２日間維持する。その後、細胞をトリプシンで処理し、選択圧（たとえばメトトレキサートなどの薬物）の存在下で血清含有培地中に再度プレートする。細胞を選択的血清含有培地で２〜３週間、細片および死細胞を排除するために選択培地を頻繁に変えながら、明確なコロニーを見ることができるまで培養する。その後、個々のコロニーをトリプシン処理して、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降などの当分野で確立されている方法によって高レベルの所望のタンパク質（たとえば、融合構築体、糖タンパク質など）を発現する産生株を同定するために、選択培地の存在下でさらに増殖および増幅させるためにマルチウェルプレートに入れることができる。本発明の一実施形態では、上述の方法は、目的の組換えタンパク質（たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質）を発現する安定した細胞系を確立するために、ｄｈｆｒ−陰性ＣＨＯ細胞（たとえばＤＧ４４細胞）の形質移入に実施した（たとえば実施例１２〜１３参照）。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを発現する安定した細胞系を確立した（実施例２３参照）。
【０３７５】
本発明の安定したＣＨＯ系は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質分子を、（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３の配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体として、安定して発現する。この細胞系は、配列番号２の異なる単量体配列を有することができる多量体（二量体、四量体など）として存在することができるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を分泌することができる。この細胞系内に組み込まれている発現カセットは配列番号１を含み、ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇ内に含まれる。
【０３７６】
本発明はまた、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを安定して発現する安定したＣＨＯ系も提供する。一実施形態では、細胞系は、（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３の配列を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体を発現する。別の実施形態では、細胞系は、配列番号４の異なる単量体配列を有することができる多量体（二量体、四量体など）として存在することができるＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を分泌することができる。この細胞系内に組み込まれている発現カセットは配列番号３を含み、ｐＤ１６ＬＥＡ２９Ｙ内に含まれる。
【０３７７】
細胞のクローン集団を作製するためのサブクローニング
【０３７８】
所望のタンパク質（たとえば、融合構築体、糖タンパク質など）の産生株であると同定された細胞を細胞培養物から単離し、続いて、培地が血清を含むことができる、産生に等価な条件下で増幅する。それだけには限定されないが軟寒天クローニングなどの当分野で知られているサブクローニング方法を用いることができる。その後、得られた安定した組換え細胞クローンを血清および動物製品を含まない条件下でさらに増殖させることができる。本発明によれば、所望のタンパク質生成物（たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）を発現する安定した細胞クローンは、組換えた最初の細胞クローンを血清含有培地中で培養した後に得られた細胞培養物から組換え細胞クローンを得て、細胞を血清および動物製品を含まない培地に再度適応させることによって獲得する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現する細胞クローンを、血清および動物製品を含まない培地中で少なくとも５０世代にわたって培養し続けることができる。本発明の別の実施形態では、細胞クローンは、上述のように少なくとも７５世代にわたって培養し続けることができる。本発明によれば、細胞クローンは、血清および動物製品を含まない培地中で少なくとも１００世代にわたって培養し続けることができる。
【０３７９】
さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを発現する細胞クローンは、血清および動物製品を含まない培地中で少なくとも２７世代にわたって培養し続けることができる。別の実施形態では、細胞クローンは、上述のように少なくとも７５世代にわたって培養し続けることができる。さらに、細胞クローンは、血清および動物製品を含まない培地中で少なくとも１００世代にわたって培養し続けることができる。
【０３８０】
一実施形態では、本発明は、配列番号２の単量体を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する細胞系を提供し、細胞系は１００世代を超えて安定であり、細胞系の安定性は、（１）１００世代目での倍加時間が約２４．５±２．６時間未満であること；（２）１００世代目での細胞生存度が９５％を超えること、（３）５Ｌバイオリアクター内でのＣＴＬＡ４−Ｉｇの産生力価が１００世代目で１．６９ｍｇ／ｍＬを超えること；（４）１０５世代目でのタンパク質に対するシアル酸のモル比が約９．３〜約１１．０であることを含む。
【０３８１】
本発明の安定した組換え細胞クローンは単離した形態で存在し、単離は当分野で実施される方法（たとえば、軟寒天クローニングまたは限界希釈クローニングなど）に従って行うことができる。本発明では、安定した組換え細胞クローンは、目的の組換えタンパク質（たとえば、融合構築体、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ等の糖タンパク質など）をコードしているＤＮＡ配列を含む、懸濁液中または接着して増殖することができる組換え哺乳動物細胞（たとえばＣＨＯ細胞）に由来する。本発明の細胞系によって発現される組換えタンパク質は、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇなどの治療的糖タンパク質であることができる。本発明によれば、真核細胞（哺乳動物ＣＨＯ細胞、ＤＧ４４細胞、またはｄｈｆｒ−陰性ＣＨＯ細胞など）に由来し、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇなどの組換え糖タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含み、数世代にわたって組換え糖タンパク質を安定して発現することができる、安定した組換え細胞クローンが有用である。
【０３８２】
本発明の一実施形態では、目的のタンパク質（たとえば、融合構築体、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ等の糖タンパク質など）を安定して発現する哺乳動物宿主細胞の集団を、血清および動物製品を含まない条件下で、安定して形質移入した細胞を増幅することによって得る。本発明によれば、その後、組換え細胞クローンは、たとえば、無血清かつ動物製品を含まない培養培地中で少なくとも１０５世代にわたって安定していることを特徴とすることができる。
【０３８３】
本発明の一実施形態では、細胞のクローン集団はＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する。このＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団の具体的な特徴の一部を以下の表６に示す。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団には、少なくとも、それぞれが以下の配列のうちの１つを有することができる２つの単量体分子を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体分子が含まれていることができる：（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号２の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号２の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号２の２７〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号２の２５〜３８３。したがって、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団には、主にホモ二量体またはヘテロ二量体が含まれていることができる。集団には、ホモ二量体およびヘテロ二量体がどちらも含まれていることができる。一実施形態では、本発明は、表６に示す特徴を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団またはその医薬的均等物を提供する。本明細書中で使用する医薬的均等物とは、分子の集団が、ＦＤＡなどの政府機関に了解された、患者の治療において最初の集団（標準集団）と等価な安全性および有効性のプロフィールを有するものである。たとえば、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇの集団は、表６に示す特徴を有することができる。別の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団は、表６に示す特徴またはその均等物を、単独でまたはその任意の組合せもしくは順列で有することができる。
【０３８４】
別の実施形態では、目的のクローンは、発現された組換え産物およびその生化学的特徴に従って特徴づけることもできる（たとえば特定の消光係数値を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ）。消光係数値（吸光率値（ａs）とも呼ばれる）は、理論的または実験的に導き出すことができる。２８０ｎｍでは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの吸光率値（ａs）は、以下に詳述するMach, et al. (Analytical Biochemistry, Vol. 200, pp. 74-80, 1992)の方法を用いて、１．０１ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1であると決定された。
方程式１を用いてモル吸光率（ε）を決定した。
方程式１：ε＝［（ジスルフィド結合の数×１３４）＋（トリプトファン残基の数×５，５４０）＋（チロシン残基の数×１，４８０）］
ＣＴＬＡ４−Ｉｇは９個のジスルフィド結合、８個のトリプトファン残基および３２個のチロシン残基を有し、方程式２に示すように９２，８８６Ｍ-1ｃｍ-1のモル吸光率（ε）が得られた。
方程式２：ε＝（９×１３４）＋（８×５，５４０）＋（３２×１，４８０）］＝９２，８８６Ｍ-1ｃｍ-1
吸光率定数（ａs）は、モル吸光率（ε）を分子量で割ることによって計算し、分子量は方程式３に示すようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって決定した。
方程式３：ａs＝ε／分子量＝９２，８８６Ｍ-1ｃｍ-1／９２，２７８Ｄａ＝１．０１ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1
【０３８５】
２つのロットのＣＴＬＡ４−Ｉｇ（配列番号２を含む）物質の、理論的に導き出した吸光率値と実験的に決定した吸光率値の比較を、アミノ酸分析を用いて実施した。実験的に決定した吸光率定数の平均は１．００±０．０５ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1である。実験値により、理論値の１．０１ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1が実験による決定の誤差範囲内にあることが確認された。したがって、一実施形態では、本発明は、約１．００±０．０５ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1の吸光率値または消光係数を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する細胞系を提供する。
【０３８６】
本発明によれば、目的の組換えクローンは、目的のタンパク質（たとえば、融合構築体、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ等の糖タンパク質など）をコードしているＤＮＡ配列が宿主細胞ゲノム内に組み込まれている部位の数に従って特徴づけることもできる。当業者は、標準のサザンハイブリダイゼーション技術によりそのような分析が可能となることを理解されよう。本発明の一実施形態では、本発明の組換え細胞クローンから調製したゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限消化のそれぞれで約１．２ｋｂの単一のハイブリッド形成断片が検出され、これは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子の予測した大きさと一貫している（サザンハイブリッド；図２３）。図は、プラスミドに単一の組み込み部位があること、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子中にサザンハイブリダイゼーション分析によって検出可能な挿入または欠失が存在しないことと一貫している。
【０３８７】
一実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生することができるＣＨＯ細胞集団を提供し、集団のそれぞれの細胞がＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質をコードしている核酸を少なくとも３０コピー含み、３０以上のコピーが直列で細胞のゲノム中の単一の部位に組み込まれており、細胞の集団はクローンである。他の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生することができるＣＨＯ細胞集団は、集団中の細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％がＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質をコードしている核酸を少なくとも３０コピー含む集団を含む。
【０３８８】
別の実施形態では、本発明は、図１０または実施例１４による条件下で培養した場合に、配列番号２からなるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を、産生段階で細胞培養物１リットルあたり少なくとも１．０、１．３、１．６、１．８、２．０、または２．５グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の一定量で産生する細胞系を提供する。
【０３８９】
本発明によれば、懸濁培養で増殖させた場合に、培養上清中に分泌される分子の集団を産生することができる、所望のタンパク質（たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質）を発現する哺乳動物細胞系（たとえばｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞系）を作製する。この分子の集団は、たとえば、表６に記載の以下の特徴の１つもしくは複数またはすべてを有することができる。
【表６】
2010116402.tif 000011
【０３９０】
表６によれば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の％、ＨＭＷ種（たとえば四量体などのＣＴＬＡ４−Ｉｇ多量体）の％、およびＬＭＷ種（たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体）の％は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団に対するものである。表６に記載の糖のモル数およびシアル酸のモル数は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または二量体のモル数に対するものである。表６に見られるＢ７結合の％は、既に記載したＢＩＡｃｏｒｅ装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行ったＣＴＬＡ４−Ｉｇ結合実験に言及し、割合は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ対照に対するＢ７結合との比較である。
【０３９１】
一実施形態では、哺乳動物細胞系（ｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞系など）は、表６の特徴属性１〜５を示すＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を作製する。本発明の別の実施形態では、哺乳動物細胞系は、表６の特徴属性１〜１０を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を作製する。他の実施形態では、哺乳動物細胞系は、表６の特徴属性１〜１５を示すＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を作製する。さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ上の遊離スルフヒドリル基の量は、１分子あたり約≦０．２０個の遊離チオールである。
【０３９２】
形質移入した哺乳動物細胞（たとえばｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞）の集団によって分泌された所望のタンパク質（たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質）を含む細胞培養上清を精製する際、分子の集団はさらなる特徴を有することができる。表６に記載した特徴に加えて、この分子の集団は、たとえば、以下の特徴、すなわち、ｐＨ範囲が約７．０〜８．０であること；ヒト細胞のＩＬ−２活性を５０〜１５０％阻害する能力；単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）が精製した最終産物中に≦５ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子で存在すること；精製した最終産物中に存在するＤＮＡの濃度が≦２．５ｐｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であること；ＣＨＯ宿主細胞タンパク質が精製した最終産物中に≦５０ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体で存在すること；精製した最終産物中に存在するＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が≦１．０ｐｐｍであること；タンパク質Ａの量が≦５ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であること；精製した最終産物中の細菌内毒素の量が≦０．３ＥＵ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であること；精製した最終産物中の汚染微生物の量が≦３．０ＣＦＵ／１０ｍｌであることの、１つもしくは複数またはすべてを有することができる。
【０３９３】
一実施形態では、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）は精製した最終産物中に≦３ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子で存在し；精製した最終産物中に存在するＤＮＡの濃度は≦１．０ｐｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり；精製した最終産物中に存在するＣＨＯ宿主細胞タンパク質は≦１０ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり；タンパク質Ａの量は≦１ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり；精製した最終産物中の細菌内毒素の量は≦０．１５ＥＵ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり；精製した最終産物中の汚染微生物の量は≦１．０ＣＦＵ／１０ｍｌであり；ｐＨ範囲は約７．２〜７．８である。特定の実施形態では、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）は精製した最終産物中に≦１ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子で存在する。さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子はヒト細胞のＩＬ−２活性を６０〜１４０％阻害する。
【０３９４】
本発明の別の実施形態では、細胞のクローン集団はＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を産生する。このＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団の具体的な特徴の一部を表７に記載する。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団には、少なくとも、それぞれが以下の配列のうちの１つを有することができる２つの単量体分子を含む、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体分子が含まれていることができる：（ｉ）配列番号４の２６〜３８３、（ｉｉ）配列番号４の２６〜３８２、（ｉｉｉ）配列番号４の２７〜３８３、（ｉｖ）配列番号４の２７〜３８２、（ｖ）配列番号４の２５〜３８２、および（ｖｉ）配列番号４の２５〜３８３。したがって、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団には、主にホモ二量体もしくはヘテロ二量体、またはその任意の混合物が含まれていることができる。一実施形態では、本発明は、表７に示す特徴を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団またはその医薬的均等物を提供する。本明細書中で使用する医薬的均等物とは、分子の集団が、ＦＤＡなどの政府機関に了解された、患者の治療において最初の集団（標準集団）と等価な安全性および有効性のプロフィールを有するものである。たとえば、本発明のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの集団は、表７に示す特徴を有することができる。別の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団は、表７に示す特徴またはその均等物を、単独でまたはその任意の組合せもしくは順列で有することができる。
【０３９５】
一実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を産生することができるＣＨＯ細胞集団を提供し、集団のそれぞれの細胞がＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇタンパク質をコードしている核酸を少なくとも３０コピー含み、３０以上のコピーが直列で細胞のゲノム中の単一の部位に組み込まれており、細胞の集団はクローンである。他の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を産生することができるＣＨＯ細胞集団は、集団中の細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％がＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇをコードしている核酸を少なくとも３０コピー含む集団を含む。
【０３９６】
別の実施形態では、本発明は、図２４または実施例１９〜２０による条件下で培養した場合に、配列番号４からなるＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を、産生段階で細胞培養物１リットルあたり少なくとも２２、２２．５、２３、２７．５、または２８グラムのＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の一定量で産生する細胞系を提供する。
【０３９７】
本発明によれば、懸濁培養で増殖させた場合に、培養上清中に分泌される分子の集団を産生することができる、所望のタンパク質（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）を発現する哺乳動物細胞系（たとえばｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞系）を作製する。この分子の集団は、たとえば、表７に記載の以下の特徴の１つもしくは複数またはすべてを有することができる。
【０３９８】
【表７】
2010116402.tif 000012
【０３９９】
表７によれば、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体の％、ＨＭＷ種（たとえば四量体などのＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ多量体）の％、およびＬＭＷ種（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体）の％は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団に対するものである。表７に記載の糖のモル数およびシアル酸のモル数は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子または二量体のモル数に対するものである。表７に見られるＢ７結合の％は、既に記載したＢＩＡｃｏｒｅ装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行ったＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ結合実験に言及し、割合は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ対照に対するＢ７結合との比較である。
【０４００】
一実施形態では、哺乳動物細胞系（ｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞系など）は、表７の特徴属性１〜５を示すＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を作製する。本発明の別の実施形態では、哺乳動物細胞系は、表７の特徴属性１〜１０を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を作製する。他の実施形態では、哺乳動物細胞系は、表７の特徴属性１〜１３を示すＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を作製する。
【０４０１】
形質移入した哺乳動物細胞（たとえばｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞）の集団によって分泌された所望のタンパク質（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）を含む細胞培養上清を精製する際、分子の集団はさらなる特徴を有することができる。表７に記載した特徴に加えて、この分子の集団は、たとえば、以下の特徴、すなわち、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）が精製した最終産物中に≦５ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体で存在すること；精製した最終産物中に存在するＤＮＡの濃度が≦２．５ｐｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体であること；および精製した最終産物中に存在するＣＨＯ宿主細胞タンパク質が≦５０ｎｇ／ｍｇのＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体であることの、１つもしくは複数またはすべてを有することができる。
【０４０２】
細胞系の一般的培養
【０４０３】
本発明によれば、当業者に慣用に知られているように哺乳動物細胞を培養して糖タンパク質を含めた所望のタンパク質を産生する。目的の糖タンパク質を発現する哺乳動物細胞は、十分な条件下でグリコシル化に最も適切な翻訳後修飾がインビボで起こるような適切な酵素を発現すべきである、または発現するように操作すべきである。酵素には、Ｎ結合型オリゴ糖についてHubbard and Ivatt, Ann. Rev. Biochem., 50:555-583(1981)に記載されているものなど、Ｎ結合型およびＯ結合型炭水化物の付加および完成に必要なものが含まれる。酵素には、所望により、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、α−グルコシダーゼＩ、α−グルコシダーゼＩＩ、ＥＲα（１，２）マンノシダーゼ、ゴルジα−マンノシダーゼＩ(Golgi alpha-mannodase I)、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、ゴルジα−マンノダーゼＩＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、α（１，６）フコシルトランスフェラーゼ、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ、および適切なシアリルトランスフェラーゼが含まれる。
【０４０４】
アポトーシス（プログラム細胞死）の遅延は、細胞培養プロセス中に細胞生存度を高める効果を有する場合がある。アポトーシスの低下、ひいては特定の細胞の寿命の増加により、細胞培養からのタンパク質産生が増加する場合がある。細胞のアポトーシス事象は、細胞（哺乳動物細胞、昆虫細胞、または酵母細胞など）内にアポトーシス経路の正確な時点で細胞のアポトーシスを阻害する１つまたは複数の抗アポトーシスタンパク質を導入することによって、阻害することができる。アポトーシスを阻害する別の方法は、細胞内のミトコンドリアからのプロアポトーシス分子の放出を阻害することである。カスパーゼ−９の優勢−陰性形態などの当分野で知られているプロアポトーシスタンパク質の変異体を、細胞のアポトーシスの阻害剤として用いることができる。プログラム細胞死を遅延させるために、このような変異タンパク質を細胞内に導入することができる。細胞のアポトーシスの阻害は、立ち代って、特定の細胞がタンパク質を産生する期間を延長し、その結果、特定の細胞による所望のタンパク質の産生が全体的に増加する。カスパーゼ阻害剤（アポトーシスのＸ連鎖阻害剤（ＸＩＡＰ）もしくはその変異体など）または抗アポトーシス遺伝子（たとえば、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘLもしくはその変異体）をコードしているいくつかの遺伝子を、遺伝子操作した哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞など）内に形質移入することができる（Sauerwald, T. et al., 2003, Biotechnol Bioeng. 81:329-340；Sauerwald, T. et al., 2002, Biotechnol Bioeng. 77:704-716；Mastrangelo, A., et al., 2000, Biotechnol Bioeng. 67:544-564；Kim, N., et al., 2002, J Biotechnol. 95:237-248；Figueroa, B., et al., 2001, Biotechnol Bioeng. 73:211-222）。
【０４０５】
一実施形態では、組換えタンパク質を産生する哺乳動物細胞を、抗アポトーシス遺伝子（ｂｃｌ−２など）を含むベクターで形質移入することができる。別の実施形態では、組換え哺乳動物細胞を、カスパーゼ阻害剤をコードしている遺伝子、もしくは上述のプロアポトーシス分子の変異体をコードしている遺伝子、抗アポトーシス活性を有することが当業者に知られているタンパク質をコードしている遺伝子、またはそれらの任意の組合せを含むプラスミドで形質移入することができる。
【０４０６】
別の実施形態では、所望の組換えタンパク質（治療的タンパク質など）の全体的な生成物品質（たとえばグリコシル化の増強）を増強することができる。組換えタンパク質のグリコシル化を増加させるためには、哺乳動物細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞など）を、タンパク質のグリコシル化に関与している１つまたは複数の酵素（α２，３−シアリルトランスフェラーゼ、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼなど）をコードしている核酸で形質移入することができる（Weikert et al., 1999, Nature Biotechnol 17:1116-21）。一実施形態では、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードしているプラスミドを、目的のタンパク質を発現する哺乳動物細胞内に導入することができる。別の実施形態では、α２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードしているプラスミドを、目的のタンパク質を発現する哺乳動物細胞内に導入することができる。
【０４０７】
培養する宿主細胞に関して様々な培養パラメータを用いることができる。哺乳動物細胞の適切な培養条件は当分野で周知であるか（Cleveland et al., J. Immunol. Methods, 56: 221-234 (1983)）、または当業者が決定することができ（たとえば、Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. (Oxford University Press: New York, 1992)参照）、選択した特定の宿主細胞に応じて変化する。
【０４０８】
限定せずに、細胞培地（接種培地、フィード培地、基本培地など）とは、細胞用の、特に哺乳動物細胞を増殖および／または維持するために用いる栄養液をいうことができる。これらの溶液は通常、以下の分類の１つまたは複数からの少なくとも１つの構成成分を提供する：（１）通常はグルコースなどの炭水化物の形態のエネルギー源；（２）すべての必須アミノ酸、ならびに通常は基本の２０種のアミノ酸およびシステイン；（３）ビタミンおよび／または低濃度で必要な他の有機化合物；（４）遊離脂肪酸または脂質、たとえばリノール酸；（５）微量元素（微量元素とは、典型的には非常に低い濃度、通常はマイクロモル濃度の範囲で必要な、無機化合物または天然に存在する要素として定義される）。栄養液には、以下の分類のうちの任意のものからの１つまたは複数の構成成分を随意で添加することができる：（１）血清、インスリン、トランスフェリン、および表皮成長因子などのホルモンおよび他の成長因子；（２）塩、たとえば、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびリン酸塩；（３）ＨＥＰＥＳなどのバッファー；（４）アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチンなどのヌクレオシドおよび塩基；（５）タンパク質および組織加水分解物、たとえば、精製ゼラチン、植物材料、または動物副産物から得ることができるペプトンまたはペプトン混合物；（６）ゲンタマイシンなどの抗生物質；（７）細胞保護剤、たとえばプルロニックポリオール；（８）ガラクトース。基本培地の例は、細胞増殖基本培地であることができる。接種培地の例は、接種細胞増殖基本培地であることができる。フィード培地の例は、産生バイオリアクターフィード培地であることができる。
【０４０９】
市販の培地を利用することができ、たとえば、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）；ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ）；ＨｙＣｌｏｎｅ細胞培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、ユタ州Ｌｏｇａｎ）；ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）；および特定の細胞種用に配合された既知組成（ＣＤ）培地、たとえば、ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）が含まれる。これらの培地の任意のものに、必要に応じて、必要または所望に応じた適切な濃度または量の任意選択の構成成分を含めた、事前に定義された添加構成成分または成分を添加することができる。本発明で用いることができる哺乳動物細胞培養物は、培養する特定の細胞に適した培地中で調製する。一実施形態では、細胞培地は、任意の哺乳動物源由来の血清（たとえばウシ胎児血清（ＦＢＳ））を一般に含まない、前述のものの１つであることができる。本発明の別の実施形態では、哺乳動物細胞培養物は、表１５に指定した追加の構成成分を添加した市販の既知組成（ＣＤ）−ＣＨＯ培地中で増殖させることができる。さらなる実施形態では、哺乳動物細胞培養物は、表２０または２１に指定した追加の構成成分を添加したＣＤ−ＣＨＯ培地中で増殖させることができる。
【０４１０】
本発明の方法には、数々の細胞種の培養が含まれる。本発明の一実施形態では、細胞は動物または哺乳動物である。別の実施形態では、細胞は大量の所望のタンパク質を発現および分泌することができる。本発明の別の実施形態では、細胞は大量の目的の糖タンパク質を発現して培地中に分泌することができる。動物または哺乳動物細胞はまた、目的のタンパク質を発現および分泌するように分子修飾されていることもできる。宿主細胞によって産生されたタンパク質は、宿主細胞に内在性または同種であることができる。また、タンパク質は宿主細胞に異種（たとえば外来）であることもでき、目的のタンパク質をコードしている遺伝情報は、当分野で標準の方法によって（たとえば、電気穿孔、形質移入などによって）宿主細胞内に導入する。一実施形態では、哺乳動物糖タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって産生されて培地中に分泌されることができる。
【０４１１】
一部の実施形態では、本発明は、実施例１４に記載し、図１０に示した大量産生方法を含めた本明細書中に記載の産生方法によって産生した、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。このプロセスは、高分子量（ＨＭＷ）のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の産生をもたらすことができる（たとえば、実施例１４および１５参照）。別の実施形態では、実施例１９および２０に記載し、図２４に示した大量産生方法などの本明細書中に記載の産生方法によって産生した、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団を提供する。このプロセスは、高分子量（ＨＭＷ）のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の産生をもたらすことができる（たとえば、実施例１９および２０参照）。一部の実施形態では、ＨＭＷ種は、既知組成（ＣＤ）−ＣＨＯ１発酵プロセスを含めた産生方法によって産生された分子または二量体の約１５〜２５％であることができる。他の実施形態では、本発明は、ＣＤ−ＣＨＯ１発酵プロセスによって産生したＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇＨＭＷ構成成分の単離、精製および特徴づけを行う方法を提供する。ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇＨＭＷ構成成分は、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体よりも大きな分子量を有する多量体（すなわち、四量体、六量体など）である。
【０４１２】
後に単離および／または精製する大量の目的の糖タンパク質を保有し、発現し、培地中に分泌することができる動物または哺乳動物宿主細胞には、それだけには限定されないが、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１号）、ＤＧ４４（Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet, 12:555-556；Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909；およびＷＯ０１／９２３３７Ａ２）、ジヒドロ葉酸還元酵素陰性ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−、Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216）、ならびにｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号）などのチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；ＳＶ４０によって形質転換させたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１号）；ヒト胎児腎細胞（たとえば、２９３細胞、または懸濁培養中での増殖用にサブクローニングした２９３細胞、Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０号）；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０号）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７号；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１号）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２号）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４号）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５号）；ヒト肝細胞癌細胞（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＢ８０６５号）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−５１号）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４２号）；ＴＲＩ細胞（Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68）；ＭＣＲ５細胞；ＦＳ４細胞が含まれる。本発明の一態様では、ＣＨＯ細胞、特にＣＨＯ／ｄｈｆｒ−およびＣＨＯ  ＤＧ４４細胞が利用される。
【０４１３】
本発明の方法によって産生することができる哺乳動物糖タンパク質の例には、それだけには限定されないが、融合タンパク質またはキメラタンパク質を含めた、サイトカイン、サイトカイン受容体、成長因子（たとえば、ＥＧＦ、ＨＥＲ−２、ＦＧＦ−α、ＦＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＮＧＦ、ＮＧＦ−β）；成長因子受容体が含まれる。他の例には、それだけには限定されないが、成長ホルモン（たとえば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン）；インスリン（たとえば、インスリンＡ鎖およびインスリンＢ鎖）、プロインスリン；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；コロニー刺激因子（たとえば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）；インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１からＩＬ−１２）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）；インターフェロン（たとえば、ＩＦＮ−α、β、またはγ）；腫瘍壊死因子（たとえば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）およびその受容体、ＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−２；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；トロンビン；脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）；凝固因子（たとえば、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、フォンウィルブランド因子など）；抗凝固因子；組織プラスミノーゲン活性化剤（ＴＰＡ）、たとえば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型ＴＰＡ；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；カルシトニン；ＣＤタンパク質（たとえば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１９など）；ＣＴＬＡタンパク質（たとえばＣＴＬＡ４）；Ｔ細胞およびＢ細胞受容体タンパク質；骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ、たとえば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３など）；神経栄養因子、たとえば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン、たとえば３〜６；レニン；リウマチ因子；ＲＡＮＴＥＳ；アルブミン；リラキシン；マクロファージ阻害タンパク質（たとえば、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２）；ウイルス性タンパク質または抗原；表面膜タンパク質；イオンチャネルタンパク質；酵素；調節タンパク質；抗体；免疫調節タンパク質（たとえば、ＨＬＡ、ＭＨＣ、Ｂ７ファミリー）；ホーミング受容体；輸送タンパク質；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；Ｇ−タンパク質共役型受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）；神経修飾タンパク質；アルツハイマー病関連のタンパク質およびペプチド（たとえば、Ａ−β）、ならびに当分野で知られている他のものが含まれる。本発明の方法によって産生することができる適切なタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドには、それだけには限定されないが、前述のタンパク質およびポリペプチドの任意のものの融合タンパク質、ポリペプチド、キメラタンパク質、ならびに断片もしくは部分、または突然変異体、変異体、もしくは類似体が含まれる。
【０４１４】
本発明の方法を用いて、配列番号５、６、７、８、９、または１０の変異体であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生することもできる。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、残基５５（Ａ５５Ｙ）および１３０（Ｌ１３０Ｅ）に１つまたは複数の変化を有する単量体を含むことができる（言及した残基は配列番号２のものである）。参考としてその全体で本明細書中に組み込まれている米国特許出願公開第２００２／０１８２２１１Ａ１号に記載のＣＴＬＡ４−Ｉｇの変異体および突然変異体の説明を参照されたい。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体は、ＣＴＬＡ−４領域内に突然変異を有する、もしくはＩｇ領域に突然変異を有する、それらの任意の組合せを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含むことができる。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体分子は、配列番号５、６、７、８、９または１０と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体分子はＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。別の実施形態では、変異体は二量体を形成することができる。さらなる実施形態では、変異体は、非突然変異したＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団によって示されるものと類似の炭水化物プロフィールを示す。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体分子は、配列番号２中に存在するものと同じ潜在的なＮ結合型およびＯ結合型グリコシル化部位を有する。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体分子は、配列番号２中に存在するものと同じＮ結合型およびＯ結合型グリコシル化部位を有し、さらなるグリコシル化部位を有する。突然変異には、それだけには限定されないが、ヌクレオチドの欠失、挿入、付加；アミノ酸の欠失、置換、付加；核酸のフレームシフトが含まれることができ；置換は、非保存的置換（たとえば、グリシンがトリプトファンで置換）または保存的置換（たとえば、ロイシンでイソロイシンを置換）のどちらかであることができる。
【０４１５】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体分子には、それだけには限定されないが、ＣＴＬＡ４−Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（配列番号２に従った残基の番号付けを用いて、ＣＴＬＡ４−Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは本明細書中ではＣＴＬＡ４−Ｌ１３０ＥＡ５５ＹＩｇと呼ばれる）、ならびに、米国特許出願第０９／８６５，３２１号（米国特許出願公開第２００２／０１８２２１１号）、第６０／２１４，０６５号および第６０／２８７，５７６号；ＷＯ０１／９２３３７Ａ２；米国特許第６，０９０，９１４号、第５，８４４，０９５号および第５，７７３，２５３号；R. J. Peach et al., 1994, J Exp Med, 180:2049-2058に記載のＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体分子が含まれる。一実施形態では、本方法で産生したＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異タンパク質をコードしている発現ベクターを含む細胞から分泌させることができる。
【０４１６】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体であるＬ１３０ＥＡ５５Ｙｉｇは、構造がＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子に類似の遺伝子操作した融合タンパク質である。Ｌ１３０ＥＡ５５Ｙ−Ｉｇは、修飾されたヒトＣＴＬＡ−４の機能的細胞外結合ドメインおよびＩｇＧ１クラスのヒト免疫グロブリンのＦｃドメインを有する。２つのアミノ酸修飾、すなわち、配列番号２の位置１３０に対応する、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ変異体の位置１０４のロイシンからグルタミン酸（Ｌ１０４Ｅ）、および配列番号２の位置５５に対応する、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ変異体の位置２９のアラニンからチロシン（Ａ２９Ｙ）を、ＣＴＬＡ−４ドメインのＢ７結合領域に行って、Ｌ１３０ＥＡ５５Ｙを作製した。Ｌ１３０ＥＡ５５Ｙ−Ｉｇは、それぞれ約４５，７００ダルトンの２つの相同的なグリコシル化されたポリペプチド鎖を有することができ、これらは鎖間ジスルフィド結合および非共有相互作用によって結合されている。Ｌ１３０ＥＡ５５Ｙ−ＩｇをコードしているＤＮＡは、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−ＩｇをコードしているＤＮＡとして、ブダペスト条約の規定の下、２０００年６月２０日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託した。これは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１０４号が与えられている。Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇ（本出願ではＬ１３０ＥＡ５５Ｙ−Ｉｇに対応）は、そのすべてが参考として本出願中にその全体で組み込まれている、同時係属中の米国特許出願第０９／５７９，９２７号、同第６０／２８７，５７６号および同第６０／２１４，０６５号、ならびに同第０９／８６５，３２１号およびＷＯ／０１／９２３３３７Ａ２にさらに記載されている。
【０４１７】
組換えタンパク質Ｌ１３０ＥＡ５５Ｙ−Ｉｇは、配列番号２のアミノ酸位置５５でＡｌａを有し、アミノ酸位置１３０でＬｅｕを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体と比較して２つのアミノ酸（アミノ酸位置５５のＴｙｒおよびアミノ酸位置１３０のＧｌｕ）でのみ異なり、かつこれら２つの突然変異はＮ結合型またはＯ結合型グリコシル化に影響を与えないので、Ｌ１３０ＥＡ５５Ｙ−Ｉｇを含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体分子の集団は、野生型ＣＴＬＡ４−Ｉｇを含む集団と同じプロフィールまたは非常に類似したグリコシル化プロフィールを有し得る。さらに、組換えタンパク質Ｌ１３０ＥＡ５５Ｙ−Ｉｇは、配列番号２のアミノ酸位置５５でＡｌａを有し、アミノ酸位置１３０でＬｅｕを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体と比較して２つのアミノ酸（アミノ酸位置５５のＴｙｒおよびアミノ酸位置１３０のＧｌｕ）でのみ異なるので、本発明の本方法は、表６に記載のものに類似の特徴属性を有するＬ１３０ＥＡ５５Ｙ−Ｉｇが産生できるはずである。
【０４１８】
本発明の方法を用いて、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、または１６の変異体であるＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を産生することもできる。一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、配列番号３中に１つまたは複数の変化を有する単量体を含むことができる。たとえば、他のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の説明は、参考としてその全体で本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第２００２／００３９５７７号、同第２００３／０００７９６８号、同第２００４／００２２７８７号、同第２００５／００１９８５９号、および同第２００５／００８４９３３号、ならびに米国特許第７，０９４，８８７４号に記載されている。
【０４１９】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、ＣＴＬＡ−４領域（配列番号１８）内に１つまたは複数の突然変異を含む、もしくはＩｇ領域内に１つの突然変異を含む、またはそれらの任意の組合せを含む。他の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、または１６と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを含む。さらなる実施形態では、上述のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子はＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは二量体を形成することができる。さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、非突然変異したＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団によって示されるものと類似の炭水化物プロフィールを示す。さらに他の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、配列番号４中に存在するものと同じ潜在的なＮ結合型およびＯ結合型グリコシル化部位を有する。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、配列番号４中に存在するものと同じＮ結合型およびＯ結合型グリコシル化部位を有し、さらなるグリコシル化部位を有する。突然変異には、それだけには限定されないが、ヌクレオチドの欠失、挿入、付加；アミノ酸の欠失、置換、付加；核酸のフレームシフトが含まれることができ；置換は、非保存的置換（たとえば、グリシンがトリプトファンで置換）または保存的置換（たとえば、ロイシンでイソロイシンを置換）のどちらかであることができる。
【０４２０】
本発明の一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体分子の集団は、所望のタンパク質（たとえばＬ１３０ＥＡ５５Ｙ−Ｉｇタンパク質など）をコードしている遺伝子を発現する、本発明の大量産生方法に従って懸濁液中で増殖させた、哺乳動物細胞（たとえばｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞）によって産生させることができる。本発明によれば、哺乳動物細胞によって産生させた組換えＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異タンパク質は、本明細書中に記載の収集パラメータに従って回収することができる。他の実施形態では、哺乳動物細胞によって産生させた組換えＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異タンパク質は、本発明に記載の精製スキームに従って精製することができる（実施例１５）。
【０４２１】
本発明の一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団は、所望のタンパク質（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）をコードしている遺伝子を発現する、本発明の大量産生方法に従って懸濁液中で増殖させた、哺乳動物細胞（たとえばｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞）によって産生させることができる。本発明によれば、哺乳動物細胞によって産生させた組換えＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、本明細書中に記載の収集パラメータに従って回収することができる。他の実施形態では、哺乳動物細胞によって産生させた組換えＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、本発明に記載の精製スキームに従って精製することができる（実施例１９〜２０）。
【０４２２】
細胞培養の種類および一般培養プロセス
【０４２３】
目的のタンパク質、たとえば糖タンパク質、融合タンパク質などは、所望のタンパク質生成物を発現する細胞を様々な細胞培養条件下で増殖させることによって産生させることができる。当業者は、タンパク質を産生するための細胞培養および培養の実行には、それだけには限定されないが、３つの一般的な種類、すなわち、連続培養、バッチ培養、流加培養が存在することを理解されよう。連続培養プロセスでは、新鮮な培地の補充（たとえばフィード培地）を、培養期間中、古い培地を除去しながら細胞に供給する。連続培養中に産生された産物は、たとえば、毎日または連続的に収集することもできる。細胞が生存している限りは、かつ環境および培養条件が維持されている限りは、連続培養プロセスにおいて所望する限り細胞の培養を保つことができる。
【０４２４】
バッチ培養プロセスでは、細胞を最初に培地中で培養し、この培養培地は、交換も除去も補充もしない。細胞には、培養の実行中またはそれの終了前に新しい培地を「供給」せず、したがって、栄養素が消耗されるまで培養が続く。培養の実行の最後にタンパク質組成物を収集する。
【０４２５】
流加培養プロセスには、実行中、培地に１日に１回もしくは複数回（または連続的に）、新鮮な培地を補充することによって、培養の実行時間を増加することができる。このプロセスでは、培養期間中、細胞に新鮮な培地、すなわち「フィード培地」を補充する。流加培養には、たとえば、毎日、２日毎、隔日など；１日１回より多く、または１日１回より少なくなど、既に記載した様々な供給スケジュールが含まれることができる。流加培養では、フィード培地を連続的に供給することもできる。その後、培養／産生の実行の終わりに、目的のタンパク質生成物を収集する。
【０４２６】
哺乳動物宿主細胞によって産生される糖タンパク質を含めたタンパク質の小または大スケール産生の細胞培養系は、本発明のコンテキスト内で有用である。当業者は、実験室スケールの培養方法では、組織培養皿、スピナーフラスコ、およびＴ−フラスコが典型的に用いられることを理解されよう。より大きなスケール（たとえば、５００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、２０，０００Ｌなど）の培養に用いることができるプロセスには、それだけには限定されないが、中空繊維バイオリアクター、流動床バイオリアクター、攪拌タンクバイオリアクター系、またはローラーボトル培養物が含まれる。最後の２つのプロセスは、マイクロキャリアを用いてまたは用いずに利用することができる。
【０４２７】
系は、バッチ、フィードバッチ、または連続モードで運用することができる。産生スケールの培養には、攪拌タンクバイオリアクターが、その柔軟性の故、好まれる系である。これらの反応器は、気泡スパージを備えた機械的攪拌またはインペラーによって細胞を懸濁に保つ。攪拌タンクバイオリアクターは、大量産生スケールの容量（たとえば２０，０００リットル）までスケールアップすることができ、異なるフィードモードで運用することができる。これらの系は、細胞増殖のための大きな表面積、代謝廃棄物、酸素、および栄養素の効率的な移送、ならびに反応器での連続攪拌または構成成分の混合によって細胞が底に沈むことを防止することによって反応器全体にわたって均一な環境を維持することを提供する。所望の糖タンパク質の産生には、本発明は、攪拌タンクバイオリアクター内に維持する、Ｄ−ガラクトースを含むフィード培地を毎日供給する、大スケールのフィードバッチ細胞培養物を具体化する。別の実施形態では、フィードバッチ細胞培養物は、適切な濃度のグルコースおよびグルタミンなどのタンパク質のグリコシル化に重要な限界細胞培養栄養素を含むフィード培地を毎日供給する、攪拌タンクバイオリアクター内で維持することもできる（Chee et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 89:164-177）。
【０４２８】
目的のタンパク質を産生する培養物の細胞は、特定の哺乳動物宿主細胞および企図する特定の産生計画に最も適した任意のスキームまたはルーチンに従って増殖させることができる。細胞培養条件は、細胞培養の増殖期における哺乳動物宿主細胞の集団の増大または増殖が、そのような増大および増殖のために最大にした一定期間の間増強されるように、開発することができる。細胞培養の増殖期は、細胞が主に迅速に分裂する指数関数的な細胞増殖の期間（たとえば対数期）を含む。この期間の間、生細胞密度の増加速度は任意の他の時点よりも高い。
【０４２９】
また、細胞培養条件は、細胞培養の産生期中の一定期間、タンパク質産生が増強されるように開発することができる。細胞培養の産生期は、細胞増殖が静止している、またはほぼ一定レベルに保たれている期間を含む。生細胞密度は所定の期間にわたってほぼ一定にとどまる。対数細胞増殖は終わっており、タンパク質産生が産生期の主な活動である。タンパク質産生の持続を支援するために、および所望の糖タンパク質生成物を得るために、この時点で一般的に培地を補充する。
【０４３０】
温度、ｐＨ、溶解酸素（ＤＯ2）などの培養条件は、当業者には理解される、哺乳動物宿主細胞の培養に用いられるものである。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞の培養に適切な温度範囲は３０〜４０℃であり、一実施形態では約３７℃である。ｐＨは、一般に、酸または塩基のどちらかを用いて約６．５〜７．５のレベルに調節する。適切なＤＯ2は空気飽和の５〜９０％である。これらの培養条件は、所望のタンパク質または糖タンパク質生成物を産生する哺乳動物細胞の培養を促進するために用いることができる。
【０４３１】
哺乳動物宿主細胞集団は、増殖期の培養で増大および増殖させることができ、場合によっては保管から外した細胞を、増殖および高生存度の促進に許容される培養培地に接種する。その後、新鮮な培養培地を宿主細胞培養物に加えることによって細胞を適切な期間、産生期に維持することができる。産生期中、タンパク質産生を増強するために細胞を様々な温度シフトに供することができる。複数温度シフトの培養プロセスは、２００３年１２月１８日出願の米国特許出願第１０／７４２，５６４号、および２００３年１２月１８日出願の米国特許出願第１０／７４０，６４５号に記載されている。これら出願の内容は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。本発明では、細胞培養プロセスを含む２つ以上の温度シフトは、プロセスまたは産生の実行の終わりまで培養物中で生存する生細胞の数の増加をもたらすことができる。培養の産生期中、より多くの細胞数が生存することは、より大量のタンパク質または糖タンパク質生成物が産生される結果となる場合があり、プロセスの終わりのタンパク質生成物の量が増加する。
【０４３２】
本発明の特定の態様は、細胞に目的の糖タンパク質を産生させるためにＤ−ガラクトースを含む、毎日供給するまたは表１４、１５に記載のフィード培地を供給する、フィードバッチの大スケール（たとえば、５００Ｌ、５０００Ｌ、１００００Ｌなど）の哺乳動物細胞培養物を具体化する。本実施形態で産生されるタンパク質の品質を上げるために、２つ以上の温度シフトを培養期間中に用いて、タンパク質の産生期を、温度シフトを用いない場合、または１つの温度シフトのみを用いる場合を超えて延長することができる。別の実施形態では、本発明は、細胞に目的の糖タンパク質（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）を産生させるためにＤ−ガラクトースを含む、表２２に記載のフィード培地を１日に１回または複数回を供給する、フィードバッチの大スケール（たとえば、５００Ｌ、５０００Ｌ、１００００Ｌなど）の哺乳動物細胞培養物を伴う。また、糖タンパク質の品質を上げるために、１回または複数回の温度シフトを培養期間中に用いて、タンパク質産生期を、温度シフトを用いない場合を超えて延長することもできる。あるいは、硫酸デキストランを培養物に加え、同時に温度シフトを行うことができる。
【０４３３】
バイオリアクターでの組換えタンパク質の大量産生
【０４３４】
本発明は、真核細胞の慣用の攪拌タンクバイオリアクターによる培養方法、特にそのような細胞によって発現される所望のタンパク質生成物を大スケールまたは工業的な量で産生させるための方法を提供する（たとえば２００００Ｌの細胞培養容量）。培養プロセスは、懸濁液中で増殖させる真核細胞のフィードバッチ培養プロセスであり、培養上清の収集を伴い、目的のタンパク質を発現する真核細胞、たとえば哺乳動物細胞が所望のタンパク質生成物を培地中に分泌する。
【０４３５】
哺乳動物細胞の大スケール培養方法、特にそのような細胞によって発現される大量の所望のタンパク質生成物を産生させるための方法を、本発明で具体化する。この方法は、
（ｉ）細胞を、無血清培地を含む種培養容器（たとえばＴ−１７５フラスコ）に接種し、種培養物（たとえば、より大きな容量を接種するために用いる開始培養物）を少なくとも細胞が最小限の交差接種密度に達するまで増殖させる工程であって、密度は、細胞が続く培養容量で十分に増殖するために必要な、事前に決定した値である工程と；
（ｉｉ）培養物を増大させるために、増殖した種培養物を、動物由来の構成成分を欠く培地を含むより大きな培養容器（たとえば、ローラーボトルまたは細胞バッグ）に移す工程と；
（ｉｉｉ）細胞培養物をさらに増殖させるために、増大させた種培養物を、無血清培地を含む大スケール培養容器に移す工程と；
（ｉｖ）大スケール培養物を、動物由来の構成成分を欠く培地中で、少なくとも前記細胞が標的密度に達成するまでまたは特定の生化学的特徴を示すまで維持する工程と
を含む工程によって実施することができる。
【０４３６】
一部の実施形態では、この方法は、（ｉｖ）培地を収集し、その培地を新鮮な培地で交換する工程を含むことができる。
【０４３７】
他の実施形態では、哺乳動物細胞の大スケール培養方法は、
（ｉ）細胞を、無血清培地（たとえば接種培地）を含む種培養容器（たとえばＴ−１７５フラスコ）に接種し、種培養物（たとえば、より大きな容量を接種するために用いる開始培養物）を少なくとも細胞が最小限の交差接種密度に達するまで増殖させる工程であって、密度は、細胞が続く培養容量で十分に増殖するために必要な、事前に決定した値である工程と；
（ｉｉ）培養物を増大させるために、増殖した種培養物を、動物由来の構成成分を欠く培地（たとえば接種培地）を含むより大きな培養容器（たとえば、ローラーボトルまたは細胞バッグ）に移す工程と；
（ｉｉｉ）細胞培養物をさらに増殖させるために、増大した種培養物を、無血清培地（たとえば基本培地）を含む大スケール培養容器（１０００Ｌバイオリアクターなど）に移す工程と；
（ｉｖ）大スケール培養物を、動物由来の構成成分を欠く培地（たとえばフィード培地）中で、少なくとも前記細胞が標的密度に達成するまでまたは特定の生化学的特徴を示すまで維持する工程と
を含む工程によって実施することができる。
【０４３８】
本発明の一部の実施形態では、この方法は、
（ｖ）培地を収集し、消費した培地を新鮮な培地で交換する工程
を含むことができる。
【０４３９】
本発明は、大スケール量の所望のタンパク質生成物を産生するための動物由来の構成成分を欠く培地の任意の配合物中の任意の細胞種に適用可能であり、ａ）マイクロキャリアプロセスもしくはｂ）懸濁細胞プロセスの２つプロセス、またはその変形のいずれかを利用することができる。細胞、たとえば哺乳動物細胞の培養では、どちらかのプロセスを利用することができ、２つの明確な期、増殖期および産生期で運用する。本発明の別の実施形態では、動物由来の構成成分（一部の非限定的な例はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはＦＢＳである）を含む培地の任意の配合物も、上述のような大スケールタンパク質の量の産生に用いることができる。
【０４４０】
当業者は、マイクロキャリアプロセスは標準のマイクロキャリアプロセスまたは灌流マイクロキャリアプロセスには限定されず、また、細胞がマクロ多孔性担体上に付着および／または固定されている細胞培養に用いることができることを、理解されよう。標準のマイクロキャリアプロセスでは、細胞を、無血清培地を含む種培養容器内に接種し、細胞が最低播種密度に達するまで増殖させる。続いて、増殖した種培養物を、無血清培地およびマイクロキャリアを含む大スケール培養容器に移す。この増殖期では、たとえば、マクロ多孔性担体を用いたプロセスの場合では担体内に遊走する細胞によって、担体が完全にコロニー形成されるまで、細胞をマイクロキャリア上で増殖させる。
【０４４１】
培地の交換は、マイクロキャリアが培養容器の底に沈んだ際に行うことができ、タンク容量の事前に決定した割合を除去し、タンク容量の対応する割合の新鮮な培地を容器に加える。その後、マイクロキャリアを培養培地に再懸濁させる。当業者は、培地の除去および交換のプロセスを、事前に決定した間隔、たとえば２４時間毎に繰り返すことができ、交換する培地の量は細胞密度に依存し、典型的にはタンク容量の２５％〜８０％であることができることを、理解されよう。タンク内のタンク培地の６０〜９５％を、細胞密度がタンパク質の発現に適した事前に決定した値に達した際に、２４時間毎に変えることができる。当業者はしばしば、産生期にわたっても前述の培地交換％の値を用いる。
【０４４２】
産生期中、培地は、マイクロキャリアをタンクの底に沈めさせ、タンク容量の選択した％を除去し、タンク容量の対応する％、たとえば前述に記載のように６０〜９５％の新鮮な培養培地を容器に加えることによって交換することができる。その後、マイクロキャリアを培養培地に再懸濁させ、培地の除去および交換プロセスを毎日繰り返すことができる。
【０４４３】
マイクロキャリア灌流プロセスは標準のマイクロキャリアプロセスに似ており、これも増殖／増大期および産生期で運用する。２つのプロセスの主な違いは、培地を変えるのに用いる方法である。標準のマイクロキャリアプロセスでは、定義された量のタンク容量、たとえば全タンク容量の６０〜９５％を一度に変えるが、灌流プロセスでは、培地を連続的に加える。本質的に、培地が容器から出ることを可能にするがマイクロキャリアをタンク内に保持する分離装置（または灌流装置）を用いることによってマイクロキャリアを容器内に保ちながら、タンク容量の一定％の培地を、事前に決定した時間をかけて徐々に変える。このプロセスの増殖期は、徐々に培地を交換する以外は標準のマイクロキャリアプロセスに記載のとおりである。
【０４４４】
懸濁細胞プロセスの２つの非限定的なオプションには、懸濁細胞灌流プロセスおよび懸濁細胞バッチプロセスが含まれる。灌流プロセスでは、培養培地中の細胞を担体に固定せずに自由に懸濁させ、マイクロキャリアプロセスと同様、２つの明確な期（たとえば、増殖期および産生期）で運用することができる。懸濁細胞灌流プロセスの増殖期中、細胞を、無血清培地を含む種培養容器内に接種し、標的交差接種密度に達するまで増殖させる。その後、増殖した種培養物を、培養動物由来の構成成分を欠く培地を含む大スケール培養容器に移すことができる、タンパク質の発現に適した事前に決定した細胞密度の値に達するまで増殖させる。新鮮な培地を用いた培養容器の連続灌流を行って培地交換プロセスを実施する。
【０４４５】
懸濁細胞バッチプロセスでは、細胞培養は、ａ）単純バッチプロセスまたはｂ）フィードバッチプロセスの非限定的な様式によって実施することができる。単純バッチプロセスでは、細胞を動物由来の構成成分を欠く培地を含む種培養容器に接種し、細胞が事前に決定した交差接種密度に達するまで増殖させる。続いて、増殖した種培養物を、無血清培地を含む大スケール培養容器に移し、培地中の栄養素が消耗されるまで培養容器を稼動する。フィードバッチプロセスでは、栄養素の濃縮溶液（たとえばフィード培地）をタンクに供給することにより、この培養プロセスの培地の栄養素供給を延長することができ、したがってプロセス時間が延長され、最終的には培養容器内の所望のタンパク質の産生の増加がもたらされる。フィード培地を加える方法は様々であることができる。培地は、単一のパルスボーラス（１日１回、２回、３回など）として加えるか、または２４時間の期間にわたって徐々に供給することができる。この供給により、細胞が大スケール培養容器内で増殖することが可能となり、実行の終わりにどの栄養素も消耗されてしまう前に、分泌された目的のタンパク質生成物を含んでいることができる培地を収集することが可能となる。容器の内容物をすべて除去する代わりに、当業者は、タンク容量の一部のみ（約８０％であることができる）を除去する。
【０４４６】
フィードバッチプロセスの任意選択の態様は、温度シフトの使用である。このプロセスでは、産生期中に運用温度として用いる温度は、増殖期中に用いる温度よりも低い。フィードバッチプロセス、たとえば本発明で用いるプロセスの前記温度範囲は、使用する特定の細胞系の増殖に適した温度での最初の増殖期、次いで事前に決定した細胞密度での運用温度の低下からなることができる。
【０４４７】
一実施形態では、大スケール流加培養プロセスのプロセスは、（ｉ）細胞を、無血清培地を含む種培養容器（たとえばＴ−１７５フラスコ）に接種し、増殖に適した温度で、細胞が少なくとも事前に決定した交差接種密度に達するまで種培養物を増殖させる工程と；（ｉｉ）培養物を適した温度で増大させるために、増殖した種培養物を、動物由来の構成成分を欠く培地を含むより大きな培養容器（たとえば、ローラーボトルまたは細胞バッグ）に移す工程と；（ｉｉｉ）細胞培養物を適切な温度でさらに増殖させるために、増大した種培養物を、無血清培地を含む大スケール培養容器に移す工程と；（ｉｖ）大スケール培養物をタンパク質の発現に適した下げた温度で、新鮮なフィード培地で毎日交換しながら、少なくとも前記細胞が標的密度に達するまでまたは臨界期間の間、動物由来の構成成分を欠く培地中に維持する工程とを含む。
【０４４８】
（ｉｖ）の新鮮なフィード培地で交換する工程は、事前に決定した容量、たとえばタンク容量の８０％を除去し、同じ容量の新鮮なフィード培地で交換することを伴うことができる。
【０４４９】
さらなる実施形態では、大スケール流加培養プロセスのプロセスは、（ｉ）細胞を、無血清培地を含む種培養容器（たとえばＴ−１７５フラスコ）に接種し、増殖に適した温度で、細胞が少なくとも事前に決定した交差接種密度に達するまで種培養物を増殖させる工程と；（ｉｉ）培養物を適した適切な温度で増大させるために、増殖した種培養物を、動物由来の構成成分を欠く培地を含むより大きな培養容器（たとえば、ローラーボトルまたは細胞バッグ）に移す工程と；（ｉｉｉ）細胞培養物を適切な温度でさらに増殖させるために、増大した種培養物を、無血清培地を含む大スケール培養容器（たとえば１０００Ｌバイオリアクター）に移す工程と；（ｉｖ）大スケール培養物をタンパク質の発現に適した下げた温度で、新鮮なフィード培地で毎日交換しながら、少なくとも前記細胞が標的密度に達するまでまたは臨界期間の間、動物由来の構成成分を欠く培地中に維持する工程とを含む。
【０４５０】
（ｉｖ）の新鮮なフィード培地で交換する工程は、事前に決定した容量、たとえばタンク容量の約８０％を除去し、同じ容量の新鮮なフィード培地で交換することを伴うことができる。
【０４５１】
本発明の一実施形態では、フィードバッチプロセスで培養する細胞は、所望のタンパク質生成物を発現する哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞である。哺乳動物細胞を、無血清培地、たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地を含む種培養容器（たとえばＴ−１７５フラスコ）内に接種し（実施例１３）、増殖に適した温度で、たとえば約３５〜３９℃で３〜４日間、細胞が事前に決定した交差接種密度に達するまで増殖させる（たとえば、≧６．０×１０6個の生細胞を有する、または最終培養物生存度≧８０％であるまで）。その後、適切な温度（たとえば約３５〜３９℃）で約３〜４日間増大させるために、増殖した種培養物を、動物由来の構成成分を欠く培地を含む大きな培養容器（たとえばローラーボトル）に移す。細胞培養物を、無血清培地、たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地を含むより大きな培養容器（たとえば、２０Ｌの細胞バッグ、１００Ｌの細胞バッグなど）中で、増殖に適した温度、たとえば約３５〜３９℃で３〜４日間、細胞が標的播種密度に達するまでさらに増大させる（たとえば、≧１〜２×１０6個の生細胞／ｍｌを有する、または最終培養物生存度≧８０％であるまで）。一実施形態では、接種剤の増大は、最低４継代を含む。本発明の別の実施形態では、接種剤の増大は２０継代を越えない。
【０４５２】
その後、増大させた種培養物を用いて無血清培地（たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地）を含む大スケール培養タンク（たとえば、１０００Ｌ、４０００Ｌのバイオリアクターなど）に接種して、細胞培養物を適切な温度、たとえば約３５〜３９℃で３〜６日間、細胞が標的播種密度に達するまで、さらに増殖させることができる（たとえば、≧１〜２×１０6個の生細胞／ｍｌを有する、または最終細胞培養物生存度≧８０％であるまで）。続いて、大スケール培養物（たとえば、バイオリアクター中に１０，０００Ｌ、１５，０００Ｌ、２０，０００Ｌの培養物など）を、タンパク質の発現および分泌されたタンパク質生成物の産生に適した増殖温度よりも低い温度（たとえば３３〜３５℃またはその近辺で３〜４日間、および３１〜３３℃またはその近辺で６〜８日間）で無血清培地中に維持し、培地はフィード培地（たとえばｅＲＤＦ培地、実施例１４）である。フィード培地は新鮮なフィード培地で毎日交換し、タンクを新鮮なフィード培地で交換することは、事前に決定した容量、たとえばタンク容量の８０％を除去し、タンクを同じ容量の新鮮なフィード培地で置き換えることを伴う。商業用スケールの培養は、前記細胞が、それだけには限定されないが、時間の長さ、標的細胞密度、または生化学的タンパク質特徴（既に記載したＮＡＮＡのモル比など）であることができる産生パラメータの標的値に達するまで維持し、生細胞密度は３．０〜８．０×１０6個の細胞／ｍｌであることができ；ＮＡＮＡのモル比は≧６．０であることができ；最終細胞培養物生存度は≧３０％であることができ；最終タンパク質生成物力価は≧０．５ｇ／Ｌであることができる。
【０４５３】
本発明の特定の実施形態では、フィードバッチプロセスで培養する細胞は、所望のタンパク質生成物（たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子）を発現する哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞を、無血清培地を含む種培養容器（たとえばＴ−１７５フラスコ）内に接種し、たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地、増殖に適した温度、たとえば約３７℃で３〜４日間、細胞が事前に決定した交差接種密度に達するまで増殖させる（たとえば、≧１０．０×１０6個の生細胞を有する、または最終培養物生存度≧８４％であるまで）。その後、適切な温度（約３７℃）で約４日間増大させるために、増殖した種培養物を、動物由来の構成成分を欠く培地を含む大きな培養容器（たとえばローラーボトル）に移す。細胞培養物を、無血清培地、たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地を含むより大きな培養容器（たとえば、２０Ｌの細胞バッグ、１００Ｌの細胞バッグなど）中で、４日間、増殖に適した温度で（たとえば約３７℃で）、細胞が標的播種密度に達するまでさらに増大させる（たとえば、≧１〜２×１０6個の生細胞／ｍｌを有する、または最終培養物生存度≧９１％であるまで）。接種剤の増大は、最低７継代を含むことができる。
【０４５４】
その後、細胞培養物を適切な温度、たとえば約３７℃で５〜６日間、細胞が標的播種密度に達するまでさらに増殖させるために、増大させた種培養物を用いて、無血清培地（たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地）を含む大スケール培養タンク（たとえば４０００Ｌバイオリアクターなど）に接種する（たとえば、≧１〜２×１０6個の生細胞／ｍｌを有する、または最終細胞培養物生存度≧８６％であるまで）。続いて、商業用スケールの培養物（たとえばバイオリアクター中に２０，０００Ｌの培養物）を、タンパク質の発現および分泌されたタンパク質生成物（たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇ）の産生に適した増殖温度よりも低い温度で無血清培地中に維持し、培地はフィード培地（たとえばｅＲＤＦ培地）である。商業用スケールの培養物を最初に約３７℃から約３４℃まで４日間下げ、その後、温度を約３４℃から約３２℃まで８日間下げることによって第２の温度シフトに供する。フィード培地は新鮮なフィード培地で毎日交換し、バイオリアクタータンク内のフィード培地を交換することは、事前に決定した容量、たとえばタンク容量の８０％を除去し、同じ容量の新鮮なフィード培地で交換することを伴う。商業用スケールは、前記ＣＨＯ細胞および／または分泌されたタンパク質生成物が、生細胞密度４．０〜７．０×１０6個の細胞／ｍｌ；ＮＡＮＡのモル比≧８．０；最終細胞培養物生存度≧３８％；および最終タンパク質生成物力価≧０．６ｇ／Ｌの非限定的な産生パラメータの標的値に達するまで維持する。
【０４５５】
本発明の別の実施形態では、フィードバッチプロセスで培養する細胞は、所望のタンパク質生成物を発現する哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞である。哺乳動物細胞を、無血清培地、たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地を含む種培養容器（たとえばＴ−１７５フラスコ）内に接種し（実施例１９）、増殖に適した温度、たとえば約３５℃〜約３９℃で約３〜４日間；または約３６℃〜約３８℃で約４日間まで、細胞が事前に決定した交差接種密度に達するまで増殖させる（たとえば、１．５×１０6以上の細胞密度を有する、または最終培養物生存度が約８０％以上であるまで）。その後、適切な温度（たとえば、約３５℃〜約３９℃、または約３６℃〜約３８℃）で約３〜４日間または約４日間まで増大させるために、増殖した種培養物を、動物由来の構成成分を欠く培地を含む大きな培養容器（たとえばローラーボトル）に移す。細胞培養物を、無血清培地、たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地を含むより大きな培養容器（たとえば、２０Ｌの細胞バッグ、１００Ｌの細胞バッグなど）中、増殖に適した温度、たとえば約３５℃〜約３９℃、または約３６℃〜約３８℃で、約３〜４日間または約４日間まで、細胞が標的播種密度に達するまでさらに増大させる（たとえば、少なくとも約１．５×１０6個の生細胞／ｍｌを有する、または最終培養物生存度が８０％以上であるまで）。一実施形態では、接種剤の増大は、最低４継代を含む。本発明の別の実施形態では、接種剤の増大は２０継代を越えない。一部の実施形態では、ＣＤ−ＣＨＯ培地はＣＤ−ＣＨＯ接種培地である。
【０４５６】
その後、細胞培養物を適切な温度、たとえば約３５℃〜約３９℃、または約３６℃〜約３８℃で約３〜約６日間、または約４〜約５日間、または約４．７日間、または約１１３時間以下、細胞が標的播種密度に達するまで、さらに増殖させるために、増大させた種培養物を用いて、無血清培地（たとえば、ＣＤ−ＣＨＯ接種培地および／またはＣＤ−ＣＨＯ基本培地などのＣＤ−ＣＨＯ培地）を含む大スケール培養タンク（たとえば、１０００Ｌ、４０００Ｌのバイオリアクターなど）に接種することができる（たとえば、約２．３×１０6個の生細胞／ｍｌを有する、または最終細胞培養物生存度が少なくとも約８８％であるまで）。
【０４５７】
続いて、商業用スケールの培養物（たとえば、バイオリアクター中に１０，０００Ｌ、１５，０００Ｌ、２０，０００Ｌ、３０，０００Ｌの培養物など）を、タンパク質の発現および分泌されたタンパク質生成物の産生に適した約３５℃〜約３９℃の温度で約３〜約６日間、または約４〜約５日間、無血清培地中に維持し、培地はフィード培地である（たとえば、ｅＲＤＦ培地、実施例１９）。あるいは、以下および参考としてその全体で本明細書中に組み込まれている米国特許出願公開番号２００５／００１９８５９号に記載のように、ポリアニオン化合物（たとえば硫酸デキストランなど）を、無血清培地中に維持している培養物に加えることができ、培地はフィード培地である（たとえば、ｅＲＤＦ培地、実施例１９）。培養物を、同時に、単一工程の温度低下（たとえば、３２℃もしくはその近辺〜３６℃またはその近辺で約３〜約１４日間、または約１０〜約１３日間、または約２３４〜約３０４時間）に供することができる。
【０４５８】
本発明の一実施形態では、培養物を、同時に、複数工程の温度低下（たとえば、３３℃またはその近辺〜３５℃またはその近辺で約３〜６日間、および３１℃またはその近辺〜３３℃またはその近辺で約６〜８日間）に供することもできる。上述の処理したものは、タンパク質の発現および分泌されたタンパク質生成物の産生に適している。
【０４５９】
上述の例のフィード培地は、毎日（１日１回、２回、３回など）または数日毎に、新鮮なフィード培地で交換することができる。タンクを新鮮なフィード培地で交換することは、事前に決定した容量、たとえばタンク容量の８０％を除去し、タンクを同じ容量の新鮮なフィード培地で置き換えることを伴う。商業用スケールの培養は、前記細胞が、それだけには限定されないが、時間の長さ、標的細胞密度、または生化学的タンパク質特徴（既に記載したＮＡＮＡのモル比など）であることができる産生パラメータの標的値に達するまで維持し、生細胞密度は３．０〜８．０×１０6個の細胞／ｍｌであることができ；ＮＡＮＡのモル比は≧５．０、または約６、または約５．２〜約７．６であることができ；最終細胞培養物生存度は約３０％以上または約３７％以上であることができ；最終タンパク質生成物力価は約０．４６〜約０．７１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ以上、または２０ｇ／Ｌ以上であることができる。
【０４６０】
本発明に従って、ポリアニオン化合物を遅れて加えることを含む細胞培養プロセスを提供する。このプロセスは、接種後の時点（たとえば、培養プロセスの増殖期中または産生期中）でポリアニオン化合物を細胞培養物に加えることを含む。ポリアニオン化合物を遅れて加えることにより、細胞生存度の増加が達成される。一実施形態では、本発明は、目的のタンパク質を発現する宿主細胞を培養し、接種後の時点でポリアニオン化合物を細胞培養物に加えることを含む細胞培養プロセスを対象とする。
【０４６１】
ポリアニオン化合物には、それだけには限定されないが、硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから入手可能）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ヘパラン硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、マンナン硫酸、コンドロイチン硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、デルマタン硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ケラタン硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ポリ（硫酸ビニル）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、κ−カラゲナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、およびスラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）が含まれる。化合物は、記載した購入源から容易に入手可能であるか、または当業者に知られている手段によって容易に獲得可能である。これらの化合物は、しばしば、それだけには限定されないがナトリウム塩を含めた塩の形態で入手可能であるが、非塩形態でも用い得る。ポリアニオン化合物には、それだけには限定されないがナトリウム塩などの塩形態を含めた、そのすべての形態が含まれる。
【０４６２】
本発明のポリアニオン化合物の特に有用な非限定的な例には、ポリ硫酸化化合物、すなわち、硫酸デキストラン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、マンナン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ポリ（硫酸ビニル）、κ−カラゲナン、およびスラミンが含まれる。一実施形態では、ポリアニオン化合物は硫酸デキストランである。硫酸デキストランは５，０００〜５００，０００Ｄａの平均分子量を有し得る。本発明の別の実施形態では、５，０００Ｄａの分子量を有する硫酸デキストランを用いる。
【０４６３】
本発明の方法によれば、ポリアニオン化合物を細胞培養物に、指定した細胞培養期間中（たとえば、増殖期または産生期中などの接種後の時点）、１回、２回、３回、または任意の回数加え得る。１つまたは複数のポリアニオン化合物を組み合わせて用い得る。たとえば、ポリアニオン化合物の任意の単一添加には、１つまたは複数の他のポリアニオン化合物の添加が含まれ得る。同様に、ポリアニオン化合物の複数の添加が存在する場合、異なるポリアニオン化合物を異なる時点の添加で加え得る。ポリアニオン化合物を含めたさらなる化合物および物質を、指定した期間中またはそれ以外の時に、ポリアニオン化合物を加える前、それと同時に、またはその後に培養物に加え得る。特定の実施形態では、単一の、たとえば１回のポリアニオン化合物の添加が存在する。別の実施形態では、１つのポリアニオン化合物を加える。
【０４６４】
ポリアニオン化合物は、任意の手段によって細胞培養物に加え得る。ポリアニオン化合物を加える手段には、それだけには限定されないが、水に溶かして、培地に溶かして、フィード培地に溶かして、適切な培地に溶かして、およびそれが得られた形態で加える手段が含まれる。具体的には、ポリアニオン化合物は水に溶かして加える。本発明に従って、培養物中の濃度が適切なレベルになるまでポリアニオン化合物を加える。非限定的な例として、ポリアニオン化合物を１〜１０００ｍｇ／Ｌ、１〜２００ｍｇ／Ｌ、１〜１００ｍｇ／Ｌ、または２５〜７５ｍｇ／Ｌｎ濃度まで加える。細胞培養物に加えるポリアニオン化合物の特に有用な濃度には、それだけには限定されないが、約２５〜２００ｍｇ／Ｌ；約２５〜１００ｍｇ／Ｌ；および約５０〜１００ｍｇ／Ｌが含まれる。本発明の一実施形態では、培養物に加えるポリアニオン化合物の濃度は約５０ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、培養物に加えるポリアニオン化合物の濃度は約１００ｍｇ／Ｌである。
【０４６５】
本発明の方法は、培養はポリアニオン化合物を加えた後に任意の期間実行し得ることを提供する。培養実行時間は、回収可能なタンパク質の量および品質、ならびに、目的のタンパク質の回収率を悪化させる、細胞溶解から生じる上清中の汚染細胞種（たとえば、タンパク質およびＤＮＡ）のレベルなどの関連する要素に基づいて当業者が決定し得る。細胞培養プロセスの一部の実施形態では、ポリアニオン化合物を接種後の時点（たとえば、細胞培養プロセスの増殖期中または細胞培養プロセスの産生期）で加える。ポリアニオン化合物は、増殖期の終わりまたはその近辺中の接種後の時点で加える。具体的には、ポリアニオン化合物は、産生期中、たとえば、産生期の始まりの接種後の時点で加える。
【０４６６】
本発明の特定の実施形態では、フィードバッチプロセスで培養する細胞は、所望のタンパク質生成物（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子）を発現する哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞を、無血清培地、たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地（ＣＤ−ＣＨＯ接種培地など）を含む種培養容器（たとえばＴ−１７５フラスコ）内に接種し、増殖に適した温度、たとえば約３７℃で約３〜４日間、細胞が事前に決定した交差接種密度に達するまで増殖させる（たとえば、≧１．５×１０6個の生細胞を有する、または最終培養物生存度≧８０％であるまで）。その後、適切な温度（約３７℃）で約４日間増大させるために、増殖した種培養物を動物由来の構成成分を欠く培地を含む大きな培養容器（たとえばローラーボトル）に移す。細胞培養物を、無血清培地、たとえばＣＤ−ＣＨＯ培地（ＣＤ−ＣＨＯ接種培地など）を含むより大きな培養容器（たとえば、２０Ｌの細胞バッグ、１００Ｌの細胞バッグなど）中で、約４日間、増殖に適した温度で（たとえば約３７℃で）、細胞が標的播種密度に達するまでさらに増大させる（たとえば、≧１．５×１０6個の生細胞を有する、または最終培養物生存度≧８０％であるまで）。接種剤の増大は、最低７継代を含むことができる。
【０４６７】
その後、細胞培養物を適切な温度、たとえば約３７℃で約５〜６日間、細胞が標的播種密度に達するまでさらに増殖させるために、増大させた種培養物を用いて、無血清培地（たとえば、ＣＤ−ＣＨＯ基本培地などのＣＤ−ＣＨＯ培地）を含む大スケール培養タンク（たとえば、１０００Ｌ、４０００Ｌのバイオリアクターなど）に接種する（たとえば、約２．３×１０6個の生細胞／ｍｌを有する、または最終細胞培養物生存度≧８８％である）。続いて、商業用スケールの培養物（たとえばバイオリアクター中に１０，０００Ｌ、１５，００００Ｌ、または２０，０００Ｌの培養物など）を無血清培地中で、タンパク質の発現および分泌されたタンパク質生成物（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）の産生に適した、増殖温度よりも低い温度で維持し、培地はフィード培地である（たとえばｅＲＤＦ培地）。
【０４６８】
商業用スケールの培養物を、たとえば、約３７℃から約３４℃まで約４日間下げる。温度を下げた際にポリアニオン化合物を同時に培養物に加え得る。あるいは、商業用スケールの培養物を約３５℃〜３７℃から約３２℃〜３６℃まで約１２日間下げ、温度が下がるにつれてポリアニオン化合物を培養物に同時に加える。
【０４６９】
上述の例のフィード培地は、毎日（１日１回、２回、３回など）または数日毎に、新鮮なフィード培地で交換することができる。タンクを新鮮なフィード培地で交換することは、事前に決定した容量、たとえばタンク容量の８０％を除去し、タンクを同じ容量の新鮮なフィード培地で置き換えることを伴う。一実施形態では、フィード培地は、約２〜３日間毎日、たとえばグルコース濃度が１ｇ／Ｌまで下がるまで加える。別の実施形態では、フィード培地は、８時間毎に、たとえばグルコース濃度が１ｇ／Ｌに達した場合に加える。商業用スケールは、前記ＣＨＯ細胞および／または分泌されたタンパク質生成物が、ＮＡＮＡのモル比約６．０、または約５．２〜約７．６；最終細胞培養物生存度≧３７％；および最終タンパク質生成物力価約０．４６〜約０．７１ｇ／Ｌの非限定的な産生パラメータの標的値に達するまで維持する。
【０４７０】
本発明の一実施形態では、培養する細胞は、それだけには限定されないが、ＣＨＯ（たとえばＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１号）、ＨＥＫ２９３（たとえばＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３号；Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）、ＣＯＳ−１（たとえばＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０号）、ＤＧ４４（ＣＨＯ細胞系）（Cell, 33: 405, 1983およびSomatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986）、ならびにベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系を含めた、哺乳動物細胞または確立された哺乳動物細胞系であることができる。他の有用な非限定的な例は、骨髄腫、３Ｔ３細胞、ナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、および骨髄腫と他の細胞との融合物である。一部の実施形態では、細胞は、たとえば、それが由来する細胞種とは異なる範囲の、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素（たとえば、プロペプチドなどのプロセシング酵素またはグリコシルトランスフェラーゼおよび／もしくはグリコシダーゼなどのグリコシル化酵素）を発現する細胞などの、突然変異または組換え細胞であることができる。本発明特定の一態様では、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を特に利用する。
【０４７１】
細胞培養物の増大に用いる培養容器は、それだけには限定されないが、エルレンマイヤーフラスコ、Ｔ−１７５フラスコ、ローラーボトル、および細胞バッグであることができる。大スケール培養容器は、たとえば、容器の底から空気を導入する手段によって攪拌を得るエアリフト反応器、または慣用のインペラーの型の手段によって攪拌を得る慣用の攪拌タンク反応器（ＣＳＴＲ）であることができる。指定した限界内で調整するパラメータには、とりわけ、温度、ｐＨ、および溶解酸素圧（ＤＯＴ）が存在する。この系の温度制御媒体は水であり、必要に応じて加熱または冷却することができる。水は、細胞培地に浸けたパイプコイルまたは容器を取り巻くジャケットを通すことができる。ｐＨは、たとえば、必要な場合に細胞培地に塩基を加えることによって、またはヘッドスペースの気体中のＣＯ2濃度を変化させることによって調節することができる。ＤＯＴは、純粋な酸素もしくは空気またはその混合物をスパージすることによって維持することができる。
【０４７２】
したがって、本発明は、少なくとも２つの工程、すなわち、（ａ）組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞を、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで増大させる工程（すなわち、哺乳動物細胞が通常発現または過剰発現しないタンパク質であり、組換えタンパク質は、細胞または細胞の親に形質移入した発現ベクターまたは構築体によって細胞内で発現される）と、（ｂ）少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から組換えタンパク質を単離する工程とを含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、タンパク質を液体培養物から精製する前に組換えタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも０．５グラムの濃度で産生されるように、用いることができる。別の実施形態では、本発明による方法は、タンパク質を液体培養物から精製する前に組換えタンパク質が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．４６〜約０．７１グラムの濃度で産生されるように、用いることができる。
【０４７３】
一実施形態では、増大工程は、（ｉ）少なくとも約１．０×１０5個の生細胞／ｍＬの細胞密度を得るために、細胞を無血清培地中で少なくとも４継代培養する工程と、（ｉｉ）組換えタンパク質の少なくとも約０．５を産生するのに十分な期間、細胞の培養を維持する工程とを含むことができる。一実施形態では、継代の数は３６継代を超えない。別の実施形態では、組換えタンパク質をコードしている核酸のコピー数、細胞生存度、および倍加時間に関して細胞が世代にわたって安定している場合、継代の数は３６継代を超えることができる。
【０４７４】
少なくとも約０．５〜約１．３ｇ／Ｌの組換えタンパク質を産生させるために十分な時間は、細胞生存度が５％、１０％、２５％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％を下回らない限り、かつ／または細胞の世代数が５０、７５、１００、１０５、もしくは１２５世代を超えない限りは、任意の長さの時間であることができる。維持工程は、培養物の温度を最初に３７±２℃から３４±２℃まで下げ、後に３４±２℃から３２±２℃まで下げるなどの温度シフト工程を含むことができる。３２±２℃の温度は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、３０、５０、または１００日間維持することができる。３２±２℃の温度は、少なくとも２０、５０、７５、または１００細胞世代維持することができる。３２±２℃の温度は、培養物の細胞密度が液体培養物１ｍＬあたり約３０〜約１００×１０5個の細胞となるまで維持することができる。
【０４７５】
他の実施形態では、本発明は、（ａ）組換えタンパク質の濃度が液体培養物１Ｌあたり少なくとも０．５グラムであるように、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞を増大させる工程と；（ｂ）液体培養物が、（ｉ）タンパク質１モルあたり（この場合は糖タンパク質）約６．０モル以上のＮＡＮＡを含み；（ｉｉ）約３３〜約７９×１０5個の細胞／ｍＬの細胞密度を有し；（ｉｉｉ）液体培養物中の細胞生存度が３８％を下回らないもしくは約３８％以上であり；（ｉｖ）内毒素が液体培養物の約７６．８ＥＵ／ｍＬ以下であり；かつ／または（ｖ）汚染微生物数が液体培養物１ｍＬあたり１コロニー形成単位未満である場合に、少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から組換えタンパク質を単離する工程とを少なくとも含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。
【０４７６】
さらなる実施形態では、増大工程は、（ｉ）少なくとも約１．０×１０6個の生細胞／ｍＬの細胞密度を得るために細胞を無血清培地中で少なくとも４継代培養する工程と、（ｉｉ）液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．４６〜約０．７１グラムの組換えタンパク質を産生するのに十分な期間、細胞の培養を維持する工程とを含むことができる。一実施形態では、継代の数は３６継代を超えない。別の実施形態では、組換えタンパク質をコードしている核酸のコピー数、細胞生存度、および倍加時間に関して細胞が世代にわたって安定している場合、継代の数は３６継代を超えることができる。
【０４７７】
約０．４６〜約０．７１ｇ／Ｌの組換えタンパク質を産生させるために十分な時間は、細胞生存度が５％、１０％、２５％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％を下回らない限り、かつ／または細胞の世代数が２７、５０、７５、１００、１０５、または１２５世代を超えない限りは、任意の長さの時間であることができる。維持工程は、培養物の温度を最初に３７±２℃から３４±２℃まで下げるなどの温度シフト工程を含むことができる。３４±２℃の温度は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、３０、５０、または１００日間維持することができる。あるいは、維持工程は、培養物の温度を３７±２℃から３４±２℃まで下げるなどの温度シフト工程であることができる。
【０４７８】
ポリアニオン化合物は、温度低下が始まったら培養物に加えることができる。培養物に加えるポリアニオン化合物の濃度は、約１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１２．５ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、７５０ｍｇ／Ｌ、または１０００ｍｇ／Ｌであることができる。３２±２℃の温度は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、３０、５０、または１００日間維持することができる。３４±２℃の温度は、少なくとも２０、２７、５０、７５、または１００細胞世代維持することができる。
【０４７９】
さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）組換えタンパク質の濃度が液体培養物１リットルあたり少なくとも約０．４６〜約０．７１グラムであるように、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで、組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞を増大させる工程と；（ｂ）液体培養物が、（ｉ）タンパク質１モルあたり（この場合は糖タンパク質）約６モルのＮＡＮＡを含み；（ｉｉ）液体培養物中の細胞生存度が約３７％を下回らず；（ｉｉｉ）内毒素が液体培養物の約４．８ＥＵ／ｍＬ以下であり；かつ／または（ｉｖ）汚染微生物数が液体培養物１ｍＬあたり１コロニー形成単位未満である場合に、少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物の培養物から組換えタンパク質を単離する工程とを少なくとも含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。
【０４８０】
本発明のこれらの方法によって産生した組換えタンパク質は、分泌されたタンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、ホルモン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質、またはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇタンパク質であることができる。一実施形態では、哺乳動物細胞は、本発明によって提供される細胞の子孫またはサブクローンである。別の実施形態では、哺乳動物細胞は、本発明の細胞系に由来する細胞の子孫またはサブクローンである。さらなる実施形態では、哺乳動物細胞は、配列番号１を含む発現カセットで形質移入した細胞からのクローン集団である。特定の実施形態では、配列番号３を含む発現カセットで形質移入した細胞からのクローン集団である。
【０４８１】
培養物から組換えタンパク質を精製する一般的技術
【０４８２】
細胞培養プロセスのタンパク質産生期に次いで、目的のタンパク質、たとえば糖タンパク質を、当業者に理解される技術を用いて、細胞培地から回収する。具体的には、目的のタンパク質は培地から分泌されたポリペプチドとして回収するが、宿主細胞溶解液から回収することもできる。細胞細片および粒子状物質を除去するために培地または溶解物を最初に遠心分離する。続いて、所望のタンパク質を汚染物質のＤＮＡ、可溶性タンパク質、およびポリペプチドから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫安塩析；エタノール沈降；免疫親和性カラムまたはイオン交換カラム上での分画；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＱＡＥもしくはＤＥＡＥなどの陰イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；たとえばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５（商標）カラムを用いたゲル濾過；およびＩｇＧなどの汚染物質を除去するためのタンパク質Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムの、当分野でよく確立された非限定的な精製手順を用いて精製する。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤、またはプロテアーゼ阻害剤カクテル混合物の添加も、精製中にタンパク質分解を阻害するために有用である場合がある。当業者は、目的のタンパク質、たとえば糖タンパク質に適した精製方法は、組換え細胞培養物中での発現の際に起こるタンパク質の特徴の変化のために、変更を要する場合があることを、理解されよう。
【０４８３】
糖タンパク質の炭水化物基を選択する精製技術および方法も、本発明のコンテキスト内で有用性である。たとえば、そのような技術には、どの炭水化物について選択を行うかに応じてより塩基性またはより酸性の画分が採取される、ＨＰＬＣまたは陽イオンもしくは陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。また、そのような技術の使用は、汚染物質を同時に除去する結果にもなり得る。
【０４８４】
本発明では、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ融合タンパク質を産生することができるＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ特異的培地中で懸濁液として、事前に決定した細胞密度まで増殖させる。無血清発現培地中に懸濁液中で増殖させたＣＨＯ細胞は、続いてＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を産生し、これらはＣＨＯ細胞によって培地中に分泌される。細胞懸濁液は遠心分離によって清澄にすることができ、その後、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を清澄にした培養上清から標準の精製技術によって分離することができる。より高い純度および均一性のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを得るための適切な精製手順の非限定的な例は、個別にまたは組み合わせて、セファロース上のアフィニティークロマトグラフィー；陰イオン交換カラム（ＡＥＣ）上の分画；および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。
【０４８５】
一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または他のタンパク質（糖タンパク質を含む）を本明細書中に記載の産生方法から単離することは、（ｉ）細胞培養上清を得る工程と；（ｉｉ）上清を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、溶出タンパク質生成物を得る工程と；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶出タンパク質生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、濃縮されたタンパク質生成物を得る工程と；（ｉｖ）濃縮されたタンパク質生成物をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶出かつ濃縮されたタンパク質生成物を得る工程と；（ｖ）（ｉｖ）の溶出かつ濃縮されたタンパク質生成物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程とを、少なくとも含むことができる。工程（ｉｉｉ）で得られた濃縮されたタンパク質生成物は、たとえば、任意のＨＭＷタンパク質または汚染物質の割合が５、１０、１５または２５％未満であることを特徴とすることができる。工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、たとえば、約２５〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約３００〜９００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０〜８．０の洗浄バッファーを用いることによって実施することができる。工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、たとえば、ｐＨ約７．０を有し、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約８５０ｍＭのＮａＣｌを含む単一の洗浄バッファー；またはｐＨ約８．０を有し、約２５ｍＭのトリスおよび約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む洗浄バッファーを用いることによって実施することができる。工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーは、たとえば、ｐＨ約３．５を有し、約１００ｍＭのグリシンを含む溶出バッファーを用いることによって実施することができる。工程（ｖ）のアフィニティークロマトグラフィーは、たとえば、ｐＨ約８．０を有し、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１２０ｍＭのＮａＣｌ〜約１３０ｍＭのＮａＣｌを含む洗浄バッファー、またはｐＨ約８．０を有し、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約２００ｍＭのＮａＣｌを含む洗浄バッファーを用いることによって実施することができる。工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、第一級、第二級、第三級、または第四級アミン官能基を有する陰イオン交換樹脂を有するカラムを用いて実施することができる。工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用カラムは、フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を有する疎水性相互作用樹脂を用いて実施することができる。
【０４８６】
他の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子または他のタンパク質（糖タンパク質を含む）を本明細書中に記載の産生方法から単離することは、（ｉ）細胞培養上清を得る工程と；（ｉｉ）上清をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶出タンパク質生成物を得る工程と；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶出タンパク質生成物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、濃縮されたタンパク質生成物を得る工程と；（ｉｖ）濃縮されたタンパク質生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、高分子量（ＨＭＷ）タンパク質複合体が減少した溶出かつ濃縮されたタンパク質生成物を得る工程とを少なくとも含むことができる。工程（ｉｖ）で得られた濃縮されたタンパク質生成物は、たとえば、任意のＨＭＷタンパク質または汚染物質の割合が５、１０、１５または２５％未満であることを特徴とすることができる。工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーは、たとえば、ｐＨ約３．０を有し、約２５０ｍＭのグリシンを含む溶出バッファーを用いることによって実施することができる。工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーは、たとえば、ｐＨ約７．５を有し、約２５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4および約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む洗浄バッファーを用いることによって実施することができる。工程（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、たとえば、約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１３５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の洗浄バッファーを用いることによって実施することができる。工程（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、たとえば、約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約２００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の溶出バッファーを用いることによって実施することができる。工程（ｉｖ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、たとえば、ｐＨ約７．０を有し、約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１．２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む洗浄バッファーを用いることによって実施することができる。工程（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、第一級、第二級、第三級、または第四級アミン官能基を有する陰イオン交換樹脂を有するカラムを用いて実施することができる。工程（ｉｖ）の疎水性相互作用カラムは、フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を有する疎水性相互作用樹脂を用いて実施することができる。
【０４８７】
一実施形態では、本発明は、精製したＣＴＬＡ４−Ｉｇが単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を実質的に含まないように、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を液体細胞培養物から精製する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、０．５ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１、１ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１、２ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１、３ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１、４ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１、５ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１、６ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１、７ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１、８ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１、９ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１または１０ｐｐｍを超えないＭＣＰ−１を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の医薬上許容される組成物を提供する。別の実施形態では、組成物中、ＭＣＰ−１の量は、精製したＣＴＬＡ４−Ｉｇの重量の１％、０．５％、または０．１％を超えることができない。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物はＭＣＰ−１を実質的に含まず、ＱＦＦ溶出液中には５０、４５、４０、３８、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｎｇ／ｍＬ未満のＭＣＰ−１しか存在しない。別の実施形態では、本発明は、精製したＣＴＬＡ４−ＩｇがＭＣＰ−１を実質的に含まず、２．５％未満のＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含むように、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を液体細胞培養物から精製する方法を提供する。
【０４８８】
組成物中の単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の量は、ＥＬＩＳＡ方法を用いて定量することができる。コーティング抗体はヤギ抗マウスＭＣＰ−１ＩｇＧ抗体である。二次抗体はウサギ抗ラットＭＣＰ−１ＩｇＧ抗体である。検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体および基質ＴＭＢを用いて達成する。西洋ワサビペルオキシダーゼ試薬は、捕捉されたタンパク質の量に比例して発色する比色反応を生じる。ＥＬＩＳＡでは、物質の検量線に対してＭＣＰ−１レベルを定量する。一実施形態では、ＭＣＰ−１を組成物中で定量し、ＭＣＰ−１レベルは０〜０．０９７ｎｇ／ｍｇおよび０．０１４  ０．１５４ｎｇ／ｍｇの範囲であった。
【０４８９】
別の実施形態では、本発明は、精製したＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇが単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を実質的に含まないように、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を液体細胞培養物から精製する方法を提供する。一実施形態では、ＭＣＰ−１の量は、精製したＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの重量の１％、０．５％、または０．１％を超えることができない。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇはＭＣＰ−１を実質的に含まず、ＨＩＣ溶出液中には５０、４５、４０、３８、３５、または３０ｎｇ／ｍＬ未満のＭＣＰ−１しか存在しない。さらなる実施形態では、本発明は、精製したＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇがＭＣＰ−１を実質的に含まず、２．５％未満のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ四量体を含むように、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を液体細胞培養物から精製する方法を提供する。
【０４９０】
細胞培養および精製からの糖タンパク質の回収
【０４９１】
本発明は、糖タンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ）を不純な細胞培養上清、目的の糖タンパク質（ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇなど）を含むタンパク質プールおよび望ましくない汚染物質から分離するための一連の工程を記載する。不純な細胞培養上清は、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質を精製するための出発物質として用いることができる。
【０４９２】
本発明の一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質および望ましくない汚染物質を含む不純な細胞培養上清を陰イオン交換培地に施用する。不純な細胞培養上清中に存在するＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質は陰イオン交換培地と結合する。その後、陰イオン交換培地を洗浄して、任意の未結合の物質を陰イオン交換培地から除去する。未結合の物質を除去した後にＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質を溶出させ、溶出液を採取する。
【０４９３】
本発明の一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質および望ましくない汚染物質を含む不純な細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー培地に施用する。不純な細胞培養上清中に存在するＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質はアフィニティークロマトグラフィー培地と結合する。その後、アフィニティークロマトグラフィー培地を洗浄して、任意の未結合の物質を陰イオン交換培地から除去する。未結合の物質を除去した後にＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質を溶出させ、溶出液を採取する。
【０４９４】
本発明の特定の実施形態では、たとえばＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）を用いて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質を収集物質から分離する、かつバルク汚染物質を減少させる。このカラムは、哺乳動物細胞培養物からのＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質の精製の初期工程として、収集した細胞培地の分画に用いることができる。別の実施形態では、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィー、たとえばＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、アフィニティークロマトグラフィー精製工程後に用いることができる。陰イオン交換カラムの非常に高い流動特性により、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質がカラムに結合するように条件を調節することによって、続くＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＨＩＣなどのクロマトグラフィー工程の前に、大容量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質または収集した細胞培地を容易に濃縮することが可能となる。ｐＨ約ｐＨ５〜９、具体的には約８の洗浄バッファーには、７５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび３６０ｍＭのＮａＣｌの濃度が有用である。典型的には、ｐＨ約ｐＨ５〜８、具体的には約７の溶出バッファーには、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび３２５ｍＭのＮａＣｌの濃度が有用である。
【０４９５】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質を収集した培養培地から分離するために適切な樹脂は、固定アミン官能基を有するものであった。第四級アンモニウムリガンドが高空隙率の架橋結合したアガロースと結合している第四級アミン官能基樹脂、たとえばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂上のものが最も有用である。また、第三級ジエチルアミノエチルリガンドが高空隙率の架橋結合したアガロースと結合している第一級、第二級および第三級アミン官能基樹脂、たとえばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂上のものも、有用である。
【０４９６】
本発明の別の実施形態では、陰イオン交換培地からのＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質含有溶出液を採取し、その後、疎水性相互作用樹脂と接触させる。以下に記載のように、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質含有容量をＨＩＣカラムに通し、その後、さらに精製することができる採取したプールを、陰イオン交換樹脂と結合させる。
【０４９７】
ＨＩＣは、所望のＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質二量体を哺乳動物細胞培養物由来の高分子量物質および他のタンパク質不純物から分離するために有用である。たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現しているＣＨＯ細胞培養物はＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質の高分子量凝集体を含む。また、ＣＨＯ細胞タンパク質不純物も哺乳動物細胞培地中に見つかる。これらの望ましくない生成物は患者において望ましくない抗原性応答を生じて、生成物の品質または活性の不良の一因となる可能性がある。ＨＩＣは、疎水性変異体、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質二量体をＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質ＨＭＷ複合体およびＣＨＯタンパク質不純物から、後者の生成物がＨＩＣ樹脂と結合すること、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質二量体をカラムに通すことによって、有効に分離する。したがって、これらの種を実質的に含まず、陰イオン交換クロマトグラフィーなどの別のクロマトグラフィー工程に特に適したＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質プールを得ることができる。ＨＩＣで用いるためのＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質混合物源は、哺乳動物細胞培養物、たとえばＣＨＯ細胞培養物である。具体的には、既に記載したように、培養物を少なくとも１つの事前の精製工程に供することができる。
【０４９８】
本発明の別の実施形態では、ＨＩＣ方法は、他の糖タンパク質（たとえばＣＴＬＡ４−ＩｇＨＭＷ複合体）のプールを採取するために変更することができる。ＨＭＷ凝集体は、ＨＩＣ樹脂（たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体などを含むもの）と結合することができる。これらのＨＭＷ複合体はより高い結合力を有し、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体単独よりもインビボでより効率的に結合する。したがって、当業者は、ＣＴＬＡ４−ＩｇのプールをＨＩＣから溶出させることによって、ＣＴＬＡ４−ＩｇＨＭＷ凝集体のプールを得ることができる。
【０４９９】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質形態を分離するために最も有用なＨＩＣ樹脂は、固定フェニル官能基を有するものである。フェニル−ＨＩＣ樹脂のうち、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ（高置換）が最も有用である。ＴｏｓｏＨａａｓのＰｈｅｎｙｌ  ＴｏｙｏｐｅａｒｌおよびＴＳＫ  Ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷが、用いることができる他のフェニル−ＨＩＣ樹脂の非限定的な例である。他のＨＩＣ官能基には、それだけには限定されないが、プロピル、オクチル、アルコキシル、ブチル、およびイソアミル部分が含まれる。
【０５００】
たとえば、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）プロセスを用いて、ＨＩＣ精製工程で溶出されるＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ高分子量種の量を減少させることができる（実施例１５および実施例２０参照）。したがって、ＨＩＣカラムからのクリーニングピークにはＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇＨＭＷ種が濃縮されている。
【０５０１】
ＨＩＣ精製工程からのＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質を含む未結合の画分をアフィニティークロマトグラフィーなどのさらなる精製方法に供することができ、その後、生じる溶出液を陰イオン交換培地に施用することができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質は陰イオン交換樹脂と結合し、続いてこれを洗浄して未結合のタンパク質を除去することができる。未結合のタンパク質が除去された後、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質を第２の陰イオン交換樹脂から溶出させる。溶出液を採取し、さらに濃縮することができる。
【０５０２】
本発明の別の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー、たとえばｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質をさらに濃縮し、次いでさらに陰イオン交換クロマトグラフィー工程、たとえばＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行うことができる。アフィニティークロマトグラフィー工程は、ＣＨＯタンパク質および単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１、ケモカイン）不純物のレベルを低下させることもできる。アフィニティークロマトグラフィーは、精製する目的分子、たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質が何らかのマトリックスまたは樹脂上に固定したリガンドと特異的かつ可逆的に結合する、吸着分離を含む。親和性精製カラムの一部の非限定的な例には、レクチン；親和性タグ（たとえば、ＧＳＴカラムもしくは６Ｘ−Ｈｉｓカラム）；ストレプトアビジン；ヘパリン；または抗体（たとえば、タンパク質Ａカラムもしくはタンパク質Ｇカラム）が含まれる。具体的には、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質の結合にタンパク質Ａ樹脂を利用する。ｐＨ約５〜９、より有効には約８の洗浄バッファーには、２５ｍＭのトリスおよび２５０ｍＭのＮａＣｌの濃度が有用である。ｐＨ約２〜５、より有効には約３．５の溶出バッファーには、１００ｍＭのグリシンの濃度が有用である。その後、アフィニティークロマトグラフィー溶出液を中和し、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに載せることができ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗが最も有用である。
【０５０３】
前述の回収／最初の精製工程後の生成物中のタンパク質Ａ、ＤＮＡ、および所望しないＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質種のレベルをさらに下げるために、別のイオン交換工程を精製手順に組み込むことができる。本発明では、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム、またはやはりＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムなどの市販のイオン交換カラムを用いることができる。本明細書中で決定したように、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質を収集した培養培地から分離するために最も適切な樹脂は、固定アミン官能基を有するものであった。他の有用な基は、第四級アンモニウムリガンドが高空隙率の架橋結合したアガロースと結合している第四級アミン官能基樹脂、たとえばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム中のものである。また、第三級ジエチルアミノエチルリガンドが高空隙率の架橋結合したアガロースと結合している第一級、第二級および第三級アミン官能基樹脂、たとえばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム中のものも、有用である。本発明の特定の実施形態では、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムなどの強力な陰イオン交換体を利用するカラムを利用する。
【０５０４】
本発明の一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質溶出液を、陰イオン交換カラム、たとえばＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに載せる。カラムを洗浄し、続いてＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質を陰イオン交換カラムから溶出させる。ｐＨ約５〜９、一実施形態ではｐＨ８の洗浄バッファーには、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１００〜１４０ｍＭのＮａＣｌの濃度が有用である。ｐＨ約５〜９、または別の実施形態ではｐＨ８の溶出バッファーには、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２００ｍＭのＮａＣｌの濃度が有用である。陰イオン交換培地から溶出させたＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質を、ダイアフィルトレーションまたは当業者に知られている他の適切な方法によって回収、濃縮、洗浄して、最終の精製ＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質生成物が得られる。本発明のプロセスに従って調製したＣＴＬＡ４−Ｉｇ糖タンパク質生成物は高純度であり、たとえば≧９５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体を含み、≦５％のＣＴＬＡ４−ＩｇＨＭＷ生成物を含み、かつ≦１％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を含む。
【０５０５】
この精製方法は、哺乳動物細胞系の細胞培地中に潜在的に存在し得るウイルスおよび／またはレトロウイルスを失活させるおよび／または除去するさらなる工程を、さらに含むことができる。著しい数のウイルスクリアランス工程が利用可能であり、それだけには限定されないが、尿素もしくはグアニジンなどのカオトロープを用いた処理、洗剤、さらなる限外濾過／ダイアフィルトレーション工程、イオン交換もしくはサイズ排除クロマトグラフィーなどの慣用の分離、極度のｐＨ、熱、プロテアーゼ、有機溶媒またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【０５０６】
本発明の別の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー、たとえばＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質を捕捉し、次いでさらに陰イオン交換クロマトグラフィー工程、たとえばＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行うことができる。アフィニティークロマトグラフィー工程は、ＣＨＯタンパク質および単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１、ケモカイン）不純物のレベルを低下させることもできる。アフィニティークロマトグラフィーは、精製する目的分子、たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質が何らかのマトリックスまたは樹脂上に固定したリガンドと特異的かつ可逆的に結合する、吸着分離を含む。親和性精製カラムの一部の非限定的な例には、レクチン；親和性タグ（たとえば、ＧＳＴカラムもしくは６Ｘ−Ｈｉｓカラム）；ストレプトアビジン；ヘパリン；または抗体（たとえば、タンパク質Ａカラムもしくはタンパク質Ｇカラム）が含まれる。具体的には、本発明は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質の結合にタンパク質Ａ樹脂を利用する。ｐＨ約５〜９、より有効には約約７．５の洗浄バッファーには、２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、および２５０ｍＭのＮａＣｌの濃度が有用である。ｐＨ約２〜５、より有効には約約３．５の溶出バッファーには、１００〜３００ｍＭのグリシンの濃度が有用である。その後、アフィニティークロマトグラフィー溶出液を中和し、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに載せることができ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗが最も有用である。
【０５０７】
前述の回収／最初の精製工程後の生成物中のタンパク質Ａ、ＤＮＡ、および所望しないＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質種のレベルをさらに下げるために、イオン交換工程を精製手順に組み込むことができる。本発明では、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、またはやはりＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムなどの市販のイオン交換カラムを用いることができる。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質を分離するために最も適切な樹脂は、固定アミン官能基を有するものである。他の有用な基は、第四級アンモニウムリガンドが高空隙率の架橋結合したアガロースと結合している第四級アミン官能基樹脂、たとえばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム中のものである。また、第三級ジエチルアミノエチルリガンドが高空隙率の架橋結合したアガロースと結合している第一級、第二級および第三級アミン官能基樹脂、たとえばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム中のものも、有用である。本発明の特定の実施形態では、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムなどの強力な陰イオン交換体を利用するカラムを利用する。
【０５０８】
本発明の一実施形態では、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質溶出液を、陰イオン交換カラム、たとえばＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに載せる。カラムを洗浄し、続いてＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質を陰イオン交換カラムから溶出させる。ｐＨ約５〜９、一実施形態ではｐＨ７の洗浄バッファーには、２５〜５５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１００〜１４０ｍＭのＮａＣｌの濃度が有用である。ｐＨ約５〜９、または別の実施形態ではｐＨ７の溶出バッファーには、２５〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２００ｍＭのＮａＣｌの濃度が有用である。
【０５０９】
本発明の別の実施形態では、陰イオン交換培地からのＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質含有溶出液を採取し、その後、疎水性相互作用樹脂と接触させる。ＨＩＣは、所望のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質二量体を哺乳動物細胞培養物由来の高分子量物質および他のタンパク質不純物から分離するために有用である。たとえば、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを発現しているＣＨＯ細胞培養物はＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質の高分子量凝集体を含む。また、ＣＨＯ細胞タンパク質不純物も哺乳動物細胞培地中に見つかる。これらの望ましくない生成物は患者において望ましくない抗原性応答を生じて、生成物の品質または活性の不良の一因となる可能性がある。
【０５１０】
ＨＩＣは、疎水性変異体、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質二量体をＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質ＨＭＷ複合体およびＣＨＯタンパク質不純物から、後者の生成物がＨＩＣ樹脂と結合すること、およびＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質二量体をカラムに通すことによって、有効に分離する。したがって、これらの種を実質的に含まないＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質プールを得ることができる。ＨＩＣで用いるためのＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質混合物源は、哺乳動物細胞培養物、たとえばＣＨＯ細胞培養物である。具体的には、既に記載したように、培養物を少なくとも１つの事前の精製工程に供することができる。
【０５１１】
本発明の別の実施形態では、ＨＩＣ方法は、他の糖タンパク質（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇＨＭＷ複合体）のプールを採取するために変更することができる。ＨＭＷ凝集体は、ＨＩＣ樹脂（たとえばＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ四量体などを含むもの）と結合することができる。これらのＨＭＷ複合体はより高い結合力を有し、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体単独よりもインビボでより効率的に結合する。したがって、当業者は、ＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇのプールをＨＩＣから溶出させることによって、ＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇＨＭＷ凝集体のプールを得ることができる。
【０５１２】
ＨＩＣ培地から溶出させたＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質を、ダイアフィルトレーションまたは当業者に知られている他の適切な方法によって回収、濃縮、洗浄して、最終の精製ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質生成物が得られる。本発明のプロセスに従って調製したＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質生成物は高純度であり、たとえば≧９５％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ二量体を含み、≦５％のＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇＨＭＷ生成物を含み、かつ≦１％のＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ単量体を含む。
【０５１３】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ糖タンパク質形態を分離するために最も有用なＨＩＣ樹脂は、固定フェニル官能基を有するものである。フェニル−ＨＩＣ樹脂のうち、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ（高置換）が最も有用である。ＴｏｓｏＨａａｓのＰｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ培地およびＴＳＫ  Ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷが、用いることができる他のフェニル−ＨＩＣ樹脂の非限定的な例である。他のＨＩＣ官能基には、それだけには限定されないが、プロピル、オクチル、アルコキシル、ブチル、およびイソアミル部分が含まれる。
【０５１４】
この精製方法は、哺乳動物細胞系の細胞培地中に潜在的に存在し得るウイルスおよび／またはレトロウイルスを失活させるおよび／または除去するさらなる工程を、さらに含むことができる。著しい数のウイルスクリアランス工程が利用可能であり、それだけには限定されないが、尿素もしくはグアニジンなどのカオトロープを用いた処理、洗剤、さらなる限外濾過／ダイアフィルトレーション工程、イオン交換もしくはサイズ排除クロマトグラフィーなどの慣用の分離、極度のｐＨ、熱、プロテアーゼ、有機溶媒またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【０５１５】
一態様では、濃縮し、ダイアフィルトレーション工程に供した精製ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を２ＬのＢｉｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）ボトル、５０Ｌのバイオプロセスバッグまたは任意の他の適切な容器に満たすことができる。そのような容器中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、凍結前に約６０日間、２°〜８℃で貯蔵することができる。精製したＣＴＬＡ４−Ｉｇを２°〜８℃で延長して貯蔵した場合、ＣＬＴＡ４−Ｉｇ四量体の割合の増加がもたらされ得る。したがって、長期貯蔵には、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は貯蔵前に約−７０℃で凍結し、約−４０℃の温度で貯蔵することができる。凍結温度は約−５０℃から約−９０℃で変動することができる。凍結時間は変動することができ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む容器の容量、冷凍庫内に入れる容器の数に大きく依存する。たとえば、一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は２ＬのＢｉｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）ボトル中にある。４本未満の２ＬのＢｉｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）ボトルを冷凍庫内に入れる場合、約１４〜少なくとも１８時間の凍結時間を要し得る。少なくとも４本のボトルを入れる場合、約１８〜少なくとも２４時間の凍結時間を要し得る。凍結したＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を有する容器は、約−３５℃〜約−５５℃の温度で貯蔵する。
【０５１６】
約−３５℃〜約−５５℃の温度の貯蔵時間は変動することができ、１８時間ほどの短い時間であることができる。凍結したＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、調整した様式で解凍することができる。凍結したＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の解凍は調整されており、インキュベータ内、約２０℃〜約２４℃の温度で行うことができる。解凍工程の期間は、インキュベータへの負荷に依存し、４本未満の２ＬのＢｉｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）ボトルを入れる場合は、約２４時間未満の解凍時間を要し得る。４本の２ＬのＢｉｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）ボトルを入れる場合は、約１８時間を要し得る。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む解凍した溶液は、潜在的な濃度勾配を回避するために混合することができる。したがって、解凍は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを含む容器の振盪を可能にする、温度調整されたインキュベータ内で行うことができる。振盪速度は約４０〜約８０ｒｐｍであることができる。解凍したＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、さらに５〜１０分間、約３ｒｐｍの回転速度でさらに混合することができる。解凍したＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを含む医薬組成物の生産中、２°〜８℃で貯蔵し、分けて、凍結乾燥することができる。
【０５１７】
本発明はさらに、大スケールで産生する治療的糖タンパク質の他の非限定的な例の精製に適用することができる。本発明のプロセスは、哺乳動物細胞培養物中に複数のグリコシル化された変異体を有する他の糖タンパク質の産生に適用可能である場合がある。当業者は、例示した方法を様々な糖タンパク質の産生に適応させる過程で変更が必要となる可能性があることを理解されよう。
【０５１８】
配合物およびキット
【０５１９】
本発明はまた、凍結乾燥した混合物としての記載した任意のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子も提供する。凍結乾燥するＣＴＬＡ４−Ｉｇを含む配合物は、（１）他の組換えタンパク質または小分子（免疫抑制剤など）を含めた追加の活性成分（または複数の追加の活性成分）、（２）賦形剤（または複数の賦形剤）および（３）溶媒（または複数の溶媒）の３つの基本構成成分をさらに含む。賦形剤には、良好な凍結乾燥したケーク特性を提供するため（充填剤）、ならびにタンパク質の凍結乾燥保護および／または凍結保護を提供するため（「安定化剤」）、ｐＨを維持するため（緩衝化剤）、生物活性（タンパク質安定性などの活性成分安定性を含む）の実質的な保持が維持されるような貯蔵中のタンパク質の適切なコンホメーションを提供するための、医薬上許容される試薬が含まれる。賦形剤に関して、配合物の例には、緩衝化剤（もしくは複数の緩衝化剤）、充填剤（もしくは複数の充填剤）、タンパク質安定化剤（もしくは複数のタンパク質安定化剤）および抗菌剤（もしくは複数の抗菌剤）の１つまたは複数が含まれることができる。糖またはポリオールを、溶液中ならびに凍結解凍および凍結乾燥中の非特異的なタンパク質安定化剤として用いることができる。ポリマーを、溶液中ならびに凍結解凍および凍結乾燥中にタンパク質を安定化させるために用いることができる。１つの人気のあるポリマーは血清アルブミンであり、これは凍結保護剤および凍結乾燥保護剤のどちらとしても用いられている。一実施形態では、本発明は、アルブミンを含まない配合物を提供する。様々な塩を充填剤として用いることができる。例示的な塩充填剤には、たとえば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2が含まれる。特定のアミノ酸を凍結保護剤および／または凍結乾燥保護剤および／または充填剤として用いることができる。用いることができるアミノ酸には、それだけには限定されないが、グリシン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸ナトリウム、アラニン、アルギニンおよび塩酸リシンが含まれる。広いｐＨ範囲をカバーする多くの緩衝化剤が、配合物での選択に利用可能である。緩衝化剤には、たとえば、酢酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジン、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、ジエタノールアミンおよびトリスが含まれる。緩衝化剤には、凍結乾燥前に溶液のｐＨを許容される範囲に維持する薬剤が包含される。配合物は、参考としてその全体で本明細書中に組み込まれている、２００５年１２月２０日出願の米国特許出願第６０／７５２，１５０号に既に記載されている。
【０５２０】
一実施形態では、本発明は、少なくとも９０％、９５％、９９％、または９９．５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体を含む、凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を提供する。一実施形態では、本発明は、少なくとも９０％、９５％、９９％、または９９．５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体を含み、５％、４％、３％、２％、または１％を超えないＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含む、凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも９０％、９５％、９９％、または９９．５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体、および５％、４％、３％、２％、または１％を超えないＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含み、２％、１．５％、１．０％、０．８％、０．５％、または０．３％を超えないＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を含む、凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたり少なくとも８．０モルのシアル酸を含む、凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡＩｇ分子もしくは二量体１モルあたり約１５〜約３５モルのＧｌｃＮａｃ；ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体もしくはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたり約１〜約５モルのＧａｌＮａｃ；ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体もしくはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたり約５モル〜約２０モルのガラクトース；ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体もしくはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたり約２〜約１０モルのフコース；および／またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体もしくはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１モルあたり約５〜１５モルのマンノースを含む、凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を提供する。
【０５２１】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ薬物物質は、２５ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１０ｍＭの塩化ナトリウムのバッファー、ｐＨ〜７．５中に約２５ｍｇ／ｍＬ（２２．５〜２７．５ｍｇ／ｍＬ）の濃度の水溶液として利用可能である。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、水溶液中で高分子量種を形成する傾向にある。したがって、薬物製品中で形成され得る高分子量種のレベルを最小限にするために、凍結乾燥した生成物を開発した。マルトース、スクロース、および塩酸Ｌ−アルギニン等のアミノ酸などの様々な賦形剤を、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの凍結乾燥中の潜在的な凍結乾燥保護剤としてスクリーニングした。スクロースが最も有効な凍結乾燥保護剤であることが見出された。スクロース対タンパク質の比を増加することによりタンパク質の安定性が向上したことが、さらに観察された。凍結乾燥するタンパク質溶液には２：１のスクロース：タンパク質比（重量：重量）を選択した。凍結乾燥した薬物製品は十分な安定性および満足できる構成挙動を有する。
【０５２２】
治療方法
【０５２３】
本発明によれば、Ｔ細胞とＢ７陽性細胞との相互作用によって媒介される疾患は、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの医薬上許容される配合物を受けることによって治療することができる。遺伝子操作された哺乳動物細胞系（たとえば、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−ＩｇをコードしているＤＮＡを保有するｄｈｆｒ−陰性チャイニーズハムスター卵巣細胞系）によって分泌されたＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、特定のグリコシル化プロフィールを有する分子の集団であることができる。本明細書中に記載したように、特定のグリコシル化プロフィールは、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子がＴ細胞の活性化および／または増殖に対してより大きな阻害をもたらすことができるように、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に対するＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの結合に影響を与えることができる。本明細書中に記載したように、特定のグリコシル化プロフィールは、細胞系および産生方法によって影響を受けることができる。したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明は、それだけには限定されないが、一般に任意のＴ細胞依存性リンパ球増殖性疾患または障害および任意のＴ細胞依存性自己免疫疾患または障害、より具体的には；Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、良性リンパ性脈管炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片移植拒絶に関連する免疫障害、乾癬、炎症、アレルギー、卵巣炎、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、脳脊髄炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、クローン病、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、原発性粘液水腫、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、関節リウマチ、インスリン依存性真性糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、多発性硬化症、交感性眼炎、自己免疫ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性作用肝炎、潰瘍性大腸炎、強皮症、多発性筋炎、および混合結合組織病を含めた、Ｔ細胞関連の疾患または障害を治療するための、細胞系によって本明細書中に記載の産生方法中で産生されたＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を提供する。
【０５２４】
本発明は、Ｔ細胞の増殖または活性化を阻害する方法、対象においてまたはインビトロで免疫応答を阻害する方法、および対象において免疫障害を治療するまたは対象において抗原に対する免疫寛容を誘発させる方法における、開示した任意のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の使用を提供する。免疫寛容とは、特定の抗原に対するリンパ組織の特異的な非反応性が発生する免疫学的応答の一種であり、寛容が存在しない場合には、抗原は免疫応答を誘発させることができる。一実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子および組成物を用いて、寛容を誘発させ、拒絶の可能性を低下させるために、移植を受けた対象を治療することができる。別の実施形態では、移植は、器官移植、組織移植または細胞移植である。別の実施形態では、細胞移植は骨髄細胞または島細胞を含む。
【０５２５】
本発明は、上述の任意の疾患または障害を治療するための医薬品の製造における、開示した任意のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の使用を提供する。本発明はまた、上述の疾患または障害を治療するための別の薬剤と同時投与する、開示した任意のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の使用も提供する。本発明のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、対象に、たとえば、静脈内、皮下、および／または吸入によって投与することができる。静脈内または皮下投与に適用可能なＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ配合物は、参考としてその全体で本明細書中に組み込まれている、２００５年１２月２０日出願の米国特許出願第６０／７５２，１５０号に記載されている。ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ配合物には、リポソームがＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子を標的細胞または組織にデリバリーすることができる、リポソーム系配合物が含まれることもできる。また、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ遺伝子発現カセットを含むウイルスベクターを投与することによっても、標的細胞または組織にデリバリーすることができる。ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の集団の投与および用量は、すべて本明細書中にその全体で参考として組み込まれている、米国特許出願公開第２００３００８３２４６号および同第２００４００２２７８７号、ならびに２００５年４月６日出願の係属中の米国特許出願第６０／６６８，７７４号に記載されている。
【０５２６】
本明細書中に記載のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子は、それだけには限定されないが、液体の液剤または懸濁液、錠剤、丸薬、散剤、坐薬、高分子マイクロカプセルまたは微小胞、リポソーム、および注射用または輸液用の液剤が含まれる様々な剤形であり得る。形態は投与様式および治療応用に依存する。本発明の分子に有効な投与様式および用量レジメンは、疾患の重篤度および経過、対象の健康および治療に対する応答、ならびに治療する医師の判断に依存する。したがって、分子の用量は個々の対象に応じて判定すべきである。ｍｇ／ｍ2の表面積に基づいた、様々な大きさおよび種の動物ならびにヒトにおける用量の相互関係は、Freireich, E. J., et al. (Quantitative Comparison of Toxicity of Anticancer Agents in Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man. Cancer Chemother, Rep., 50, No.4, 219-244, May 1966)に記載されている。阻害応答を増大させるために、用量レジメンの調節を行い得る。
【０５２７】
用量は、状況に応じて、分割して毎日投与するか、または用量を比例的に減少させ得る。たとえば、いくつかの分割した用量を毎日もしくは月１回投与してもよく、または特定の治療状況に示されるように、用量を比例的に減少させ得る。一実施形態では、投与は、月１回、年４回、１日１回、１日２回日、約１０時間毎、約６時間毎、約４時間毎、約２時間毎、約１時間毎である。本発明の実施によれば、対象を治療するための有効量は、対象の体重１ｋｇあたり約０．１〜約１０ｍｇであり得る。また、有効量は、対象の体重１ｋｇあたり約１〜約１０ｍｇの一定量であり得る。また、本発明のＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、インビボの臨床応用を有する。これらは、免疫不全の一部の状態の診断または予後診断におけるＢ７陽性細胞の計数、白血病およびリンパ腫の表現型決定、ならびに臓器移植後の免疫学的変化の監視に用いることができる。
【０５２８】
本明細書中に記載の組成物のデリバリーは、注射、経口デリバリー、スプレーまたは他の特定の分散系の吸入、皮下注射、静脈内デリバリー、局所的デリバリー、坐薬、眼球デリバリー、経鼻または経口デリバリーによって達成し得る。組成物は、リポソームまたは他の膜様デリバリービヒクル中にカプセル封入することによってデリバリーすることができる。組成物は、事前に組成物で処理し、その後対象に輸液する血液または他の流体によってデリバリーすることができる。
【０５２９】
配列表
配列番号１７は、ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４Ｉｇをコードしているヌクレオチド配列である。
2010116402.tif 000013
2010116402.tif 000014
2010116402.tif 000015
【０５３０】
配列番号１８は、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
【０５３１】
さらなる非限定的な実施形態
【０５３２】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができるクローンのチャイニーズハムスター卵巣細胞集団を提供する。一実施形態では、細胞集団は、液体培養物１リットルあたり０．５グラム以上を超えるＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生することができ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、１，０００Ｌ以上の培養スケールで約６〜約１４のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体のモル比を示す。一実施形態では、細胞集団は無血清の既知組成培地に適応している。別の実施形態では、細胞集団の培養物から産生させたＣＴＬＡ４−Ｉｇは１．００±０．０５ＡＵｍＬｃｍ-1ｍｇ-1の消光係数を有する。さらなる実施形態では、細胞集団は、培養で増殖させた場合に、（ａ）約９０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基２７のメチオニンから始まる配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｂ）約１０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基番号２６のアラニンから始まる配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｃ）約４％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基番号３８３のリシンで終わる配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｄ）約９６％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基番号３８２のグリシンで終わる配列番号２のアミノ酸配列を含み；所望により、（ｅ）約１％未満のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基番号２５のメチオニンから始まる配列番号２のアミノ酸配列を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを産生することができる。
【０５３３】
本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生する、上述の細胞の子孫細胞を提供する。一実施形態では、子孫細胞は、細胞を少なくとも５世代にわたって培養することで得る。別の実施形態では、子孫細胞は、細胞を少なくとも１０世代にわたって培養することで得る。別の実施形態では、子孫細胞は、細胞を少なくとも２０世代にわたって培養することで得る。別の実施形態では，子孫細胞は、細胞を少なくとも４０世代にわたって培養することで得る。別の実施形態では、子孫細胞は、細胞を少なくとも５０世代にわたって培養することで得る。別の実施形態では、子孫細胞は、細胞を少なくとも７５世代にわたって培養することで得る。別の実施形態では、子孫細胞は、細胞を少なくとも１００世代にわたって培養することで得る。
【０５３４】
本発明は、任意の上述の細胞から作製した細胞系を提供する。一実施形態では、細胞系はクローンである。別の実施形態では、細胞系は、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２７のメチオニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２７のメチオニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）；（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２６のアラニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２６のアラニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）；（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２５のメチオニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）；または（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２５のメチオニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）を産生することができる。
【０５３５】
別の実施形態では、細胞系は、（ａ）約９０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基２７のメチオニンから始まる配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｂ）約１０％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基番号２６のアラニンから始まる配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｃ）約４％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基番号３８３のリシンで終わる配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｄ）約９６％のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基番号３８２のグリシンで終わる配列番号２のアミノ酸配列を含み；所望により、（ｅ）約１％未満のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが、残基番号２５のメチオニンから始まる配列番号２のアミノ酸配列を含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を産生することができる。
【０５３６】
一実施形態では、細胞系を培養することから産生するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、１．００±０．０５ＡＵｍＬｃｍ−１ｍｇ−１の消光係数を有する。一実施形態では、本発明は、本発明の細胞に由来する細胞集団を提供する。一実施形態では、細胞集団は、最初に形質移入した細胞と比較して少なくとも１つの追加の遺伝子変化からなり、誘導した細胞集団はＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができる。他の実施形態では、細胞集団は、最初に形質移入した細胞と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６個の追加の遺伝子変化からなり、誘導した細胞集団はＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができる。一実施形態では、遺伝子変化は、細胞ゲノムまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇをコードしている組換え発現カセット中に少なくとも１つの非保存的突然変異を含む。
【０５３７】
一実施形態では、遺伝子変化は、細胞内に少なくとも１つの追加の組換え核酸を含む。一実施形態では、変化は細胞ゲノムの突然変異を含む。一実施形態では、変化は、細胞ゲノムへの、または抗アポトーシスポリペプチドをコードするトランス核酸としての、核酸の付加を含む。一実施形態では、抗アポトーシスポリペプチドはグリコシル化に関連する。
【０５３８】
一実施形態では、遺伝子変化は、細胞ゲノムまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇをコードしている組換え発現カセットの少なくとも１つ突然変異を含む。一実施形態では、細胞集団は、培養で増殖させた場合に、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２７のメチオニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２７のメチオニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）；（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２６のアラニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２６のアラニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）；（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２５のメチオニンおよびアミノ酸位置３８３のリシン）；または（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２のアミノ酸位置２５のメチオニンおよびアミノ酸位置３８２のグリシン）を産生することができる。
【０５３９】
本発明は、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約６〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約８〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約１１〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約１２〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約１３〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約１４〜約１８である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約１５〜約１７である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約１６である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。
【０５４０】
本発明は、９５％を超える分子がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体である、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。一実施形態では、９８％を超える分子がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体である。一実施形態では、９９％を超える分子がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体である。一実施形態では、９９．５％を超える分子がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体である。一実施形態では、約９５％〜約９９．５％の分子がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり、分子の約０．５％〜約５％がＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体である。一実施形態では、約９８．６％の分子がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体であり、約１．２％の分子がＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体であり、約０．７％未満の分子がＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体である。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体からなる集団を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および四量体を実質的に含まない、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体分子の集団を提供する。一実施形態では、それぞれのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体のそれぞれの単量体が少なくとも３個のシアル酸基を有する。
【０５４１】
一実施形態では、それぞれのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体のそれぞれの単量体は少なくとも３個のシアル酸基〜少なくとも８個のシアル酸基を有する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体を実質的に含まず、所望により約１００グラムを超える量が含まれる、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体分子の精製した集団を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体を実質的に含まない、所望により約１００グラムを超える量が含まれる、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体分子の精製した集団を提供する。一実施形態では、それぞれの四量体分子は２対のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドは配列番号３〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ポリペプチド対のそれぞれのメンバーは他方のメンバーと共有結合しており、２対のポリペプチドは互いに非共有的に会合している。一実施形態では、それぞれの四量体分子はＣＤ８０またはＣＤ８６と結合することができる。一実施形態では、それぞれの四量体分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体分子と比較して、少なくとも２倍高いＣＤ８０またはＣＤ８６に対する結合力を有する。一実施形態では、それぞれの四量体分子は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体分子と比較して、少なくとも２倍高いＴ細胞の増殖または活性化の阻害を有する。
【０５４２】
本発明は、等電点電気泳動によって決定して５．１以下の等電点、すなわちｐＩを有し、等電点電気泳動ゲル上で可視化可能なＣＴＬＡ４−Ｉｇの優勢アイソフォームを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、ｐＩはノイラミニダーゼ処理後に増加する。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少なくとも４０％が、等電点電気泳動によって決定して約５．１以下の等電点を示す。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少なくとも７０％が、等電点電気泳動によって決定して約５．１以下の等電点を示す。一実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の少なくとも９０％が、等電点電気泳動によって決定して約２．５以下の等電点を示す。本発明は、約２．０±０．２〜約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約４．３±０．２〜約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、約３．３±０．２〜約４．７±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の混合物を等電点ゲル電気泳動に供する工程であって、ゲル上の単一のバンドが特定のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を表す工程と、（ｂ）約２．０±０．２〜約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を単離して組成物を調製する工程とを含む、約２．０±０．２〜約５．０±０．２のｐＩを有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を調製する方法を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約１７〜約２５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約１５〜約３５であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比が約１．７〜約３．６であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのガルカトースの平均モル比が約８〜約１７であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのフコースの平均モル比が約３．５〜約８．３であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのマンノースの平均モル比が約７．２〜約２２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＣＴＬＡ���−Ｉｇ二量体１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのガルカトースの平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのガルカトースの平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのフコースの平均モル比が約３．５〜約８．３であり；（ｅ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのガルカトースの平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのフコースの平均モル比が約３．５〜約８．３であり；（ｅ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのマンノースの平均モル比が約７．２〜約２２であり；（ｆ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約６〜約１２であることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。
【０５４３】
本発明は、約９．５８９＋／−０．３のＮＧＮＡクロマトグラムピークおよび約１０．５４３＋／−０．３のＮＡＮＡクロマトグラムピークを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ−Ｉｇ分子が図７に示す炭水化物プロフィールを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子がドメインＩ〜ＩＶの炭水化物プロフィールを示し、ドメインＩがａ−シアル化オリゴ糖を表すピークを含み、ドメインＩＩがモノ−シアル化オリゴ糖を表すピークを含み、ドメインＩＩＩがジ−シアル化オリゴ糖を表すピークを含み、ドメインＩＶがトリ−シアル化オリゴ糖を表すピークを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、ドメインＩ中の最初のピークとドメインＩＩ中の主要ピークとの間のＮ結合型オリゴ糖の保持時間の差が約２２〜約２８分である。本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体分子の少なくとも０．５％がシステイン化されている、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体分子を含む組成物を提供する。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体分子の少なくとも１．０％がシステイン化されている。本発明は、図８および１０に示す質量分析プロフィールを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、図２０および２１に示すキャピラリー電気泳動プロフィールを示す、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約６〜約１８であり、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体を市販の細胞系の細胞から産生させる、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の組成物を提供する。本発明は、本発明の任意の方法によって得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物を提供する。本発明は、分子が配列番号２の位置１０２のアスパラギンアミノ酸残基、配列番号２の位置１３４のアスパラギンアミノ酸残基、配列番号２の位置２３３のアスパラギンアミノ酸残基、配列番号２の位置１５５のセリンアミノ酸残基、または配列番号２の位置１６５のセリンアミノ酸残基でグリコシル化されている、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのガルカトースの平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのフコースの平均モル比が約３．５〜約８．３であり；（ｅ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのマンノースの平均モル比が約７．２〜約２２であり；（ｆ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約６〜約１２であり；（ｇ）等電点電気泳動ゲル上での可視化によって決定されたｐＩが約２．４±０．２〜約５．０±０．２の範囲であり；（ｈ）ＭＣＰ−１が５ｐｐｍ以下であり；（ｉ）四量体が２．５％未満であり；（ｊ）単量体が０．５％未満であり；（ｋ）集団のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが配列番号２〜８のいずれかと少なくとも９５％同一のアミノ酸を有し；（ｌ）集団内のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子がＣＤ８０およびＣＤ８６と結合できることによって特徴づけられ��、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を提供する。本発明は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧｌｃＮＡｃの平均モル比が約１５〜約３５であり；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのＧａｌＮＡｃの平均モル比が約１．７〜約３．６であり；（ｃ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのガルカトースの平均モル比が約８〜約１７であり；（ｄ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのフコースの平均モル比が約３．５〜約８．３であり；（ｅ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのマンノースの平均モル比が約７．２〜約２２であり；（ｆ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたりのシアル酸の平均モル比が約６〜約１２であり；（ｇ）等電点電気泳動ゲル上での可視化によって決定されたｐＩが約２．４±０．２〜約５．０±０．２の範囲であり；（ｈ）ＭＣＰ−１が５ｐｐｍ以下であり；（ｉ）四量体が２．５％未満であり；（ｊ）単量体が０．５％未満であり；（ｋ）集団のＣＴＬＡ４−Ｉｇポリペプチドが配列番号２〜８のいずれかと少なくとも９５％同一のアミノ酸を有し；（ｌ）集団内のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子がＣＤ８０およびＣＤ８６と結合できることによって特徴づけられた、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団、またはその医薬的な等価物を提供する。本発明は、有効量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子および医薬上許容される担体を含む組成物を提供する。本発明は、一定量のマルトース一水和物をさらに含む、有効量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、医薬上許容される希釈剤、アジュバントまたは担体をさらに含む。一実施形態では、組成物は、マルトース、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、および滅菌水をさらに含む。一実施形態では、組成物は、スクロース、ポロキサマー、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、二塩基性リン酸ナトリウム無水物、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、および滅菌水をさらに含む。
【０５４４】
本発明は、少なくとも９５％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体、および５％を超えないＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含む、凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を提供する。一実施形態では、混合物は、少なくとも９８％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および２％を超えないＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含む。一実施形態では、混合物は、少なくとも９９％のＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および１％を超えないＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含む。一実施形態では、混合物は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたり少なくとも８．０モルのシアル酸を含む。一実施形態では、混合物は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたり約１５．７〜約３１モルのＧｌｃＮＡｃを含む。一実施形態では、混合物は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたり約１．６〜約３．２モルのＧａｌＮＡｃを含む。一実施形態では、混合物は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたり約９．３〜約１５．５モルのガラクトースを含む。一実施形態では、混合物は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたり約３．６〜約７．９モルのフコースを含む。一実施形態では、混合物は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１モルあたり約９．７モルのマンノースを含む。本発明は、（ａ）請求項１に記載の凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を含む容器；および（ｂ）凍結乾燥したＣＴＬＡ４−Ｉｇ混合物を注射用溶液へと再構成するための指示書を含む医薬キットを提供する。
【０５４５】
本発明は、Ｔ細胞を有効量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物と接触させることを含む、Ｔ細胞の増殖（または活性化）を阻害する方法を提供する。本発明は、それを必要としている対象に有効量の組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を阻害する方法を提供する。本発明は、疾患または障害を治療するために対象に本発明の組成物を一定量で投与することによる、対象において抗原に対する免疫寛容を誘発させる方法、対象において炎症を治療する方法、関節リウマチを治療する方法、対象において乾癬を治療する方法、対象においてループスを治療する方法、対象においてアレルギーを治療または予防する方法、対象において移植片対宿主病を治療または予防する方法、対象において移植器官の拒絶を治療または予防する方法、対象において多発性硬化症を治療する方法、対象においてＩ型糖尿病を治療する方法、対象において炎症性腸疾患を治療する方法、対象において卵巣炎を治療する方法、対象において糸球体腎炎を治療する方法、対象においてアレルギー性脳脊髄炎を治療する方法、または対象において重症筋無力症を治療する方法を提供する。組成物は医薬上許容される担体と組み合わせ得る。本発明は、免疫障害の治療的および／または予防的処置を行うための医薬品の製造における、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約６〜約１８であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団の使用を提供する。本発明は、抗関節リウマチ剤と、それと一緒に梱包したそれを関節リウマチの治療で使用するための指示書の製造における、シアル酸基対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の平均モル比が約６〜約１８であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団の使用を提供する。本発明は、Ｔ細胞を、有効量の本発明の組成物と、メトトレキサートと組み合わせて接触させることを含む、Ｔ細胞の増殖（または活性化）を阻害する方法を提供する。本発明は、それを必要としている対象に、有効量の本発明の組成物を、メトトレキサートと組み合わせて投与することを含む、対象において免疫応答を阻害する方法を提供する。本発明は、それを必要としている対象に、有効量の請求項１から６４のいずれかに記載の組成物を、メトトレキサートと組み合わせて投与することを含む、対象において抗原に対する免疫寛容を誘発させる方法を提供する。本発明は、（ａ）組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞を増大させる工程であって、増大が種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物までであり、組換えタンパク質の濃度が液体培養物１Ｌあたり少なくとも０．５グラムである工程と；（ｂ）少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から組換えタンパク質を単離する工程とを含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。一実施形態では、工程（ａ）の増大は、（ｉ）少なくとも約１．０×１０5個の生細胞／ｍＬの細胞密度を得るために細胞を無血清の既知組成培地中で少なくとも４継代培養する工程であって、それぞれの播種段階は約２×１０5／ｍｌで開始し、１〜２００万個の細胞／ｍｌまで到達する工程と；（ｉｉ）培養物から少なくとも約０．５ｇ／Ｌを産生するのに十分な期間、細胞の培養を維持する工程とを含む。一実施形態では、タンパク質は糖タンパク質である。一実施形態では、タンパク質はＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質である。一実施形態では、哺乳動物細胞は子孫細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞はＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質産生することができるＣＨＯクローン細胞系の子孫であり、ＣＨＯ細胞には少なくとも３０コピーのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットをそのゲノム内に安定して組み込まれている。一実施形態では、十分な時間とは、細胞の生存度が３０％未満まで下がらない時間である。一実施形態では、十分な時間とは、細胞の生存度が４０％未満まで下がらない時間である。一実施形態では、十分な時間とは、細胞の生存度が５０％未満まで下がらない時間である。一実施形態では、十分な時間とは、細胞の生存度が６０％未満まで下がらない時間である。一実施形態では、十分な時間とは、細胞の生存度が７０％、または８０％または９０％または９５％未満まで下がらない時間である。一実施形態では、少なくとも４継代は、（ｉ）細胞密度が約１００万〜約２５０万個の細胞／ｍｌに達するまで、細胞を少なくとも５０ｍＬの培養容量で増殖させること、（ｉｉ）細胞密度が約１００万〜約２５０万個の細胞／ｍｌに達するまで、細胞を少なくとも１０Ｌの培養容量で増殖させること；（ｉｉｉ）細胞密度が約１００万〜約２５０万個の細胞／ｍｌに達するまで、細胞を少なくとも１００Ｌの培養容量で増殖させること；および（ｉｖ）細胞密度が約１００万〜約２５０万個の細胞／ｍｌに達するまで、細胞を２００Ｌの培養容量で増殖させることを含む。一実施形態では、ガラクトースを無血清の既知組成培地に加える。一実施形態では、維持は、（ｉ）培養物の温度を３７±２℃から３４±２℃まで下げること；および（ｉｉ）培養物の温度を３４±２℃から３２±２℃まで下げることを含む。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも５日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも６日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも７日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも８日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも９日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも１０日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも１１日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも１２日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも１３日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも１４日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも１５日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも１６日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも１７日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で少なくとも１８日間保つ。一実施形態では、温度を３２±２℃の範囲内で１８日間まで保つ。一実施形態では、培養物の細胞密度が液体培養物１ｍＬあたり約３０×１０5〜約７９×１０5個の細胞となるまで温度を３２±２℃の範囲内で保つ。本発明は、（ａ）組換えタンパク質の濃度が液体培養物１Ｌあたり少なくとも０．５グラムであるように、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで組換えタ��パク質を分泌する哺乳動物細胞を増大させる工程と；（ｂ）液体培養物がタンパク質１モルあたり約６．０モル以上のＮＡＮＡを含む場合にのみ、少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から組換えタンパク質を単離する工程とを含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。本発明は、（ａ）組換えタンパク質の濃度が液体培養物１Ｌあたり少なくとも０．５グラムであるように、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞を増大させる工程と；（ｂ）液体培養物の細胞密度が約３３×１０5〜約７９×１０5個の細胞／ｍＬである場合にのみ、少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から組換えタンパク質を単離する工程とを含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。
【０５４６】
本発明は、（ａ）組換えタンパク質の濃度が液体培養物１Ｌあたり少なくとも０．５グラムであるように、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞を増大させる工程と；（ｂ）液体培養物中の細胞生存度が約２０％、または約３０％、または約３８％未満まで下がっていない場合に、少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から組換えタンパク質を単離する工程とを含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。本発明は、（ａ）組換えタンパク質の濃度が液体培養物１Ｌあたり少なくとも０．５グラムであるように、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞を増大させる工程と；（ｂ）内毒素が液体培養物の約７６．８ＥＵ／ｍＬ以下である場合にのみ、少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から組換えタンパク質を単離する工程とを含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。本発明は、（ａ）組換えタンパク質の濃度が液体培養物１Ｌあたり少なくとも０．５グラムであるように、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞を増大させる工程と；（ｂ）汚染微生物数が液体培養物１ｍＬあたり１コロニー形成単位未満である場合にのみ、少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から組換えタンパク質を単離する工程とを含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。本発明は、（ａ）組換えタンパク質の濃度が液体培養物１Ｌあたり少なくとも０．５グラムであるように、種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物まで組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞を増大させる工程と；（ｂ）少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から組換えタンパク質を単離する工程であって、以下の条件、すなわち（ｉ）液体培養物がタンパク質１モルあたり約６．０モル以上のＮＡＮＡを含むこと、（ｉｉ）液体培養物の細胞密度が約３３×１０5〜約７９×１０5個の細胞／ｍＬであること、（ｉｉｉ）液体培養物中の細胞生存度が約２０％、もしくは約３８％未満まで下がらないこと、または（ｉｖ）培養物中のＣＴＬＡ４−Ｉｇの量が０．５ｇ／Ｌを超えることのうち少なくとも２つが満たされている場合にのみ単離を行う工程とを含む、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。一実施形態では、単離は、（ｉ）細胞培養上清を得る工程と；（ｉｉ）上清を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、溶出タンパク質生成物を得る工程と；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶出タンパク質生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、濃縮されたタンパク質生成物を得る工程と；（ｉｖ）濃縮されたタンパク質生成物をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶出かつ濃縮されたタンパク質生成物を得る工程と；（ｖ）（ｉｖ）の溶出かつ濃縮されたタンパク質生成物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程とを含む。一実施形態では、工程（ｉｉｉ）で得られた濃縮されたタンパク質生成物は、任意の高分子量多量体の割合が２５重量％未満であることを特徴とする。一実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約７５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約３６０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファーを用いて実施する。一実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約３２５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の溶出バッファーを用いて実施する。一実施形態では、工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約８５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の単一の洗浄バッファーを用いて実施する。一実施形態では、工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーは、約２５ｍＭのトリスおよび約２５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファーを用いて実施する。一実施形態では、工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーは、約１００ｍＭのグリシンを含み、ｐＨが約３．５の溶出バッファーを用いて実施する。一実施形態では、工程（ｖ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１２０ｍＭのＮａＣｌ〜約１３０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファーを用いて実施する。一実施形態では、工程（ｖ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約２００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の溶出バッファーを用いて実施する。一実施形態では、工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーは、第一級、第二級、第三級、または第四級アミン官能基を有する陰イオン交換樹脂を有するカラムを用いて実施する。一実施形態では、樹脂は第四級アミン官能基を有する。一実施形態では、工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を有する疎水性相互作用樹脂を用いて実施する。一実施形態では、官能基はフェニル官能基である。一実施形態では、工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａを含むカラムを用いて実施する。一実施形態では、精製したＣＴＬＡ４−Ｉｇが（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体１ｍｇあたり約３８ｎｇのＭＣＰ−１を有し、（ｂ）２．５重量％未満のＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体を含むように、液体細胞培養物からＣＴＬＡ４−Ｉｇを調製することを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを調製する方法。一実施形態では、液体細胞培養物は、本発明の細胞または子孫細胞を含む。本発明は、（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生することができる任意の市販の細胞系またはＣＨＯ細胞の子孫細胞を増大させる工程であって、増大は種培養物から少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物までであり、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの濃度は液体培養物１Ｌあたり少なくとも０．５グラムである工程と；（ｂ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇを少なくとも１０，０００Ｌの液体培養物から単離する工程であって、クロマトグラフィーは少なくとも１つのフェニル官能基を有する疎水性相互作用樹脂を用いたカラム上であり、単離は、約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約８５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の単一の洗浄バッファーを用いて実施する疎水性相互作用クロマトグラフィーの工程を含む工程とを含む、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを産生する方法を提供する。
【発明の実施例】
【０５４７】
以下、本発明に対する理解をさらに深められるように多数の実施例を示す。下記の実施例は、本発明の典型的な製造および実施方法を説明するものである。しかしながら、これらの実施例は、説明を目的としているに過ぎず、本発明の範囲は実施例に開示された実施態様に限定されるわけではないため、代替的方法を用いて同様の結果を得ることも可能である。
【０５４８】
下記実施例は、配列番号２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のうちの１つまたはそれ以上の配列を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子について説明している。これらの実施例は、限定を意図したものではなく、当業者であれば、実施例を、他のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子、他の糖タンパク質、およびＩｇ−スーパーファミリータンパク質の一部に関連しているかまたはそれらを含む他のタンパク質に拡大または適合させ得ることは容易に理解できるはずである。
【０５４９】
以下の表は、ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇに関する実施例を示す。
2010116402.tif 000016
2010116402.tif 000017
【０５５０】
略語：
１５Ｎ  １５ナノメートル
Ａ280  ２８０ｎｍでの吸光度
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ 細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４免疫グロブリン；ＣＴＬＡ−４ Ｉｇ
ＡＰＩ  医薬有効成分
ＡＵ  吸光度単位
Ｂ７  ＣＴＬＡ−４受容体リガンド
ｃｆｕ  コロニー形成単位
ＣＨＯ  チャイニーズハムスター卵巣
ＣＨＯＰ  チャイニーズハムスター卵巣宿主細胞タンパク質
ＣＶ  カラム容量
薬剤物質充填  薬剤物質濃縮／ダイアフィルトレーションおよび充填段階
ＥＬＩＳＡ  酵素結合イムノソルベント検定法
ＥＵ  内毒素単位
Ｆｃ  抗体の定常域
ＧａｌＮＡｃ  Ｎ−アセチル−ガラクトサミン
ＧｌｃＮＡｃ  Ｎ−アセチル−グルコサミン
ＨＥＰＥＳ  ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸
ＨＩＣ  疎水性相互作用クロマトグラフィー；フェニルセファロース（Sepharose、登録商標）高流速（Fast Flow）
ＨＭＷ  高分子量
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ＩｇＧ１  クラスＧ１の免疫グロブリン
ＩＰＣ  製造過程の対照
ＬＡＬ  カブトガニアメーバ様細胞ライゼート
ＭＢＲ（ｓ）  マスター・バッチ・レコード（複数も可）
ＭＣＰ−１  単球走化性タンパク質１
ＭＴＸ  メトトレキセート
ＭＷ  分子量
Ｎ／Ａ  適用不可
ＮＡＮＡ  Ｎ−アセチルノイラミン酸；シアル酸；ＳＡ
ＮＭＷＣ  名目分子量カットオフ
ＯＤ  光学密度
ＰＡＲ  検証許容範囲
Planova  ウイルス除去フィルター、孔サイズ１５ｎｍ
ＰＰ（ｓ）  製造パラメーター（複数も可）
ＰＱ  性能適格性評価
ｐｓｉ  重量ポンド毎平方インチ
ｐｓｉｄ  重量ポンド毎平方インチ、差圧
ｐｓｉｇ  重量ポンド毎平方インチ；ゲージ圧
ＱＦＦ  Ｑ Sepharose（登録商標、セファロース）高流速
ＱＸＬ  Ｑ  セファロース高結合容量（Extreme Load）
ｒＰＡ  組換えプロテインＡセファロース高流速
ＳＡ  シアル酸；Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＮＡＮＡ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＯＰ  標準操作手順
Ｔｒｉｓ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
トリトンＸ−１００  ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール；ポリエチレングリコールｔｅｒｔ-オクチルフェニルエーテル
ＵＦ  限外濾過
ＵＶ  紫外線
ｖ／ｖ  体積／体積
ＶＦ  ウイルス濾過；ナノメートル濾過
ＶＩ  ウイルス不活化
【０５５１】
実施例１：プラスミドｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−ＩｇにおけるＣＴＬＡ４−Ｉｇコーディング配列の確認
【０５５２】
ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇに存在するＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子の注釈した核酸配列およびＣＴＬＡ４−Ｉｇの対応する推定アミノ酸配列を図１に示す。ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇ核酸を、ＣＨＯ細胞へトランスフェクションすることにより、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を発現し得る安定したトランスフェクタントを作製した（実施例１２参照）。トランスフェクタントをスクリーニングにかけ、ある一定のトランスフェクタントをサブクローニングまたは増大させることにより、クローンセルラインを作製した。
【０５５３】
ＤＮＡ配列データの解析により、プラスミド構築中に形成された連結点が設計どおりであること、およびポリメラーゼ連鎖反応で使用した合成オリゴヌクレオチドプライマーによりＣＴＬＡ４−Ｉｇ配列の上流に正確なオンコスタチンＭシグナル配列が作製されていることを確認した。融合タンパク質のヒンジ領域ではシステインからセリンへの所望の改変（配列番号２の１５６、１６２および１６５位）を確認した。図１ではこれらのアミノ酸残基をアステリスク付きの太字で示している。また、配列番号２の１７４位におけるプロリンからセリンへのさらなるアミノ酸改変も検出された。この改変は、ポリメラーゼ連鎖反応によるＩｇＧ1 ｃＤＮＡ合成中に導入された。また、このアミノ酸残基も図１においてアステリスク付きの太字で示している。
【０５５４】
ＤＮＡ配列データ解析により、ヒトＣＴＬＡ４およびヒトＩｇＧ1定常域の公開されたヌクレオチド配列と比較したとき、さらに１つの差異が同定された。ＣＴＬＡ４コーディング領域のアミノ酸１１０でのコドンは、ＧＣＣ（アラニン）ではなくＡＣＣ（トレオニン）として同定された。
実施例２：ＣＴＬＡ４−Ｉｇ製剤
【０５５５】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ注射用組成物、２５０ｍｇ／バイアルは、静脈内（ＩＶ）投与用滅菌非発熱性凍結乾燥物である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の集団を、１５ｃｃＩ型フリント管系ガラスバイアルに詰める。各バイアルに２０ｍｍ Daikyo グレイブチルＤ−２１−７−Ｓ／Ｂ２−ＴＲフルオロ樹脂コーティングストッパーで栓をし、２０ｍｍアルミニウム、白色フリップ-オフシールで密閉する。
【０５５６】
各１回量バイアルは、注射用滅菌水、ＵＳＰで構成され、使用時に０.９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰでさらに希釈されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物２５０ｍｇを含む。ＣＴＬＡ４−Ｉｇの注射用組成物、２５０ｍｇ／バイアル、および各成分の機能を下表に列挙する。
2010116402.tif 000018
bこれらの成分はＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物溶液中に存在する
【０５５７】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物は、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液および５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７.５）中に約５０ｍｇ／ｍＬのＣＴＬＡ４−Ｉｇを含む。初期展開中に、ｐＨ、緩衝液タイプ、緩衝液濃度および塩化ナトリウム濃度の関数としてのＣＴＬＡ４−Ｉｇの物理的および化学的安定性の評価に基づいて、この緩衝系を選択した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ溶液の安定性を５〜９のｐＨ範囲で調べた。結果は、高分子量種の形成はｐＨ依存的であり、最大安定性のｐＨ範囲は７と８の間であることを示した。別の測定で、緩衝液タイプおよび濃度の影響を調べたところ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物はｐＨ８のリン酸ナトリウムまたはトリス緩衝液中で同等に安定していることが見出された。さらに、濃度１０〜１００ｍＭ間の緩衝液濃度は、２°〜８℃でのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の安定性に全く影響を及ぼさなかった。同様に、濃度３０〜５００ｍＭ間の塩化ナトリウムの存在は、２〜８℃で貯蔵したＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の溶解状態安定性に全く影響を及ぼさなかった。
【０５５８】
これらの結果に基づき、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液および５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７.５）中１０ｍｇ／ｍＬのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物を５０ｍｇ／バイアル強度での処方用に選択した。後で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ濃度を、同緩衝液組成物中５０ｍｇ／ｍＬに変えると、２００〜２５０ｍｇ／バイアル強度でのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物が生成され得た。
【０５５９】
注射用ＣＴＬＡ４−Ｉｇを、リン酸ナトリウム緩衝液および塩化ナトリウムに加え、マルトースを用いて処方する。この製品で使用する賦形剤の機能を上表に列挙する。
【０５６０】
無機塩、例えば塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウム緩衝液成分の存在により、冷凍系のガラス転移温度（Ｔｇ’）は低下した。さらに、ｐＨ７.５でin situで形成される二塩基性リン酸ナトリウムは、冷凍中に結晶化が起こり易いため、冷凍液の微環境ｐＨが低下する。これらの理由に基づいて、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウム緩衝液の最小量を選択することにより、凍結乾燥過程に対するそれらの影響を最小限にとどめた。マルトースは、凍結乾燥中および後続の薬剤製品の貯蔵時にそれぞれ低温および冷凍保護剤として作用する安定剤として添加される。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ注射用組成物、２５０ｍｇ／バイアルは、抗微生物保存剤を含まない滅菌１回量バイアルである。
実施例３：ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物の炭水化物含有量分析
【０５６１】
本方法の目的は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ Ｎ−結合型オリゴ糖のクロマトグラフィープロフィールを提供することである。この手順を用いることにより、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料中におけるＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）およびＮ−グリコシルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）対タンパク質のモル比が得られる（結合＋遊離の合計）。ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡは、シアル酸の２形態である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質に対するグリコシル化は、Ｎ−結合型オリゴ糖を含む。例えば、これらのオリゴ糖は、２２時間にわたる ペプチド−Ｎ−グリカナーゼ Ｆでの酵素的加水分解により遊離され得る。電気化学的検出法を用いる高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィーを用いて、遊離オリゴ糖をプロファイリングする。Ｎ−結合型オリゴ糖に関する炭水化物プロフィールを、パルスドアンペロメトリー検出器を用いた高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いて評価した。これらのプロフィールを確認し、ＭＳと共に多孔質グラファイトカーボン（ＰＧＣ）クロマトグラフィーを用いて構造情報を得た。両技術および結果をこの項で記載する。この手順は配列番号：のＣＴＬＡ４−Ｉｇについて典型的なものである。
【０５６２】
Ｎ−結合型オリゴ糖単離：ＣＴＬＡ４−Ｉｇからのアスパラギン結合（Ｎ−結合型）オリゴ糖の開裂を、ペプチド−Ｎ−グリカナーゼＦを用いる酵素加水分解により実施した。脱グリコシル化を行うため、まずＣＴＬＡ４−Ｉｇを還元し、変性させた；０.５％ＳＤＳおよび１％ベータ−メルカプトエタノールを含む５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液１７６μＬ中１〜２ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇを、１００℃で２分間加熱し、次いで周囲温度に放冷した。冷却混合物に、１６μＬの１０％ＮＰ−４０を添加した。試料を十分に混合し、４０μＬのペプチド−Ｎ−グリカナーゼ Ｆ（５００００Ｕ／ｍＬ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中）を添加した。試料を十分に混合し、３８℃で２４時間インキュベーションした。１.０ｍＬ／分の流速で Thermo HyperCarb カラム（４.６×１００ｍｍ；５μＬ）と連結した Phenomenex Luna Ｃ１８カラム（４.６×１５０ｍｍ；５μＬ）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、酵素放出オリゴ糖（グリカン）を精製した；単離に使用したクロマトグラフは、Waters ２９９６検出器を備えた Waters Alliance ２６９５であった。まず、カラムを０.０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により平衡させた。試料の注入後、アセトニトリルの勾配を開始し、１５分で１２％アセトニトリル中０.０５％ＴＦＡの溶媒組成物で終結させた。次いで、グリカンを６０％アセトニトリル中０.０５％ＴＦＡへの段階勾配により HyperCarb カラムから溶離した。２０６ｎｍでのＵＶ吸光度により観察しながら、グリカンを集め、真空中で濃縮乾固した。後続の注入前に、Luna Ｃ１８カラムを、４０％アセトニトリル、４０％イソプロパノール、２０％水中の０.０５％ＴＦＡにより洗浄した。
【０５６３】
ＮＡＮＡ保存液（Ｎ−アセチルノイラミン酸）（１ｍｇ／ｍＬ）の調製。要点：秤量前、ＮＡＮＡ標準液を室温まで温めておく。それを怠ると、標準液中での水分凝縮が起こる。所望の量が得られる程度の期間開口し、次いで瓶を固く再密閉し、冷凍庫に戻し、乾燥剤と共に貯蔵する。３〜１０ｍｇ間のＮ−アセチルノイラミン酸を正確に秤量する。０.１ｍｇ単位まで記録する。秤量用ペーパー／ボートを用いて秤量する場合、適切な大きさの容器に移す。十分な量のＨＰＬＣグレードの水を加えることにより、１ｍｇ／ｍＬ溶液の濃縮液を得る。溶解するまで撹拌棒または渦状に撹拌することにより混合する。ポリプロピレン管中で３ヶ月までの間２〜８℃で貯蔵する。
【０５６４】
ＮＧＮＡ保存液（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）（１ｍｇ／ｍＬ）の調製。要点：秤量前、ＮＧＮＡ標準を室温まで温めておく。それを怠ると、保存液中での水分凝縮が起こる。所望の量が得られる程度の期間開口し、次いで瓶を固く再密閉し、冷凍庫に戻し、乾燥剤と共に貯蔵する。３〜１０ｍｇ（０.１ｍｇ単位まで記録）間のＮ−グリコリルノイラミン酸を正確に秤量する。０.１ｍｇ単位まで記録する。秤量用ペーパー／ボートを用いて秤量する場合、適切な大きさの容器に移す。適切な量のＨＰＬＣグレードの水を加えることにより、１ｍｇ／ｍＬ溶液の標的濃縮液を得る。溶解するまで撹拌棒または渦状に撹拌することにより混合する。ポリプロピレン管中で３ヶ月までの間２〜８℃で貯蔵する。
【０５６５】
システム適合溶液。１ｍｇ／ｍＬのＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ保存液各々０.０５０ｍＬを、適切な容器に入れたＨＰＬＣグレードの水０.９００ｍＬに加える。撹拌することにより混合する。３ヶ月までの期間２〜８℃で貯蔵する。Ｎ−アセチルノイラミン酸使用液（Ｎ−アセチルノイラミン酸作業溶液）(N-Acetyl Neuraminic Acid working solution)（０.０５０ｍｇ／ｍＬ）。１ｍｇ／ｍＬのＮＡＮＡ保存液０.０５０ｍＬを正確に測定し、０.９５０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水に加える。撹拌することにより混合する。使用時にデュプリケイトで製造する。Ｎ−グリコリルノイラミン酸使用液（０.０５０ｍｇ／ｍＬ）。０.０５０ｍＬの１ｍｇ／ｍＬのＮＧＮＡ保存液を正確に測定し、０.９５０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水に加える。撹拌することにより混合する。使用時にデュプリケイトで製造する。
【０５６６】
試料および加水分解ブランクの製造。試験成績書（ＣＯＡ）からＣＴＬＡ４−Ｉｇ材料についてのタンパク質濃度を入手する。１.５ｍＬ微量遠心分離管にＨＰＬＣグレードの水０.１９０ｍＬを加えることにより、加水分解ブランクの単一試料を製造する。ＨＰＬＣグレードの水を用いて試料およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準物質の１ｍｇ／ｍＬ溶液をデュプリケイトで製造する。撹拌することにより混合する。
【０５６７】
試料、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準物質および加水分解ブランクの加水分解。１.５ｍＬ微量遠心分離管中で基準物質および試料のデュプリケイト調製物に対して加水分解を行う。注：ヒートブロックへ完全に適合する微量遠心分離管を使用することが重要である。０.０１０ｍＬの１ＭのＨ２ＳＯ４を、０.１９０ｍＬの試料およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準物質の１ｍｇ／ｍＬ希釈液、および加水分解ブランクに加える。撹拌することにより混合し、蓋ロックまたはテープにより蓋を固く締める。８０℃±２℃ヒートブロックに１時間±２分間微量遠心分離管を置く。インキュベーション後、ヒートブロックから管を除去し、微量遠心分離機中に管を置き、回転させて試料を管の底部へ追いやる。加水分解溶液をアリコートに分けてオートサンプルバイアル中へ入れ、オートサンプラーに入れて注入する。
【０５６８】
器具条件。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムの製造。以下の条件を設定する。０.６ｍＬ／分の流速および４０℃の温度で少なくとも１時間カラムを平衡状態にする。
2010116402.tif 000019
【０５６９】
システム適合性。器具ブランクとしての移動相の注入により分析を開始し、均一かつ安定しているべきシステムベースラインを評価する。ベースラインが均一かつ安定したものではない場合、追加のブランク注入をするべきである。注：ベースラインのシフトは、０.２５ＡＵを超えるべきではない。システム適合溶液の注入を６回反復実施する。分離度（Ｒ）および理論段（Ｎ）を計算する。
第１システム適合注入を用いることにより、以下の等式を用いて理論段数（Ｎ）を計算する：
2010116402.tif 000020
式中：
Ｎ＝理論段数
ｔ＝ＮＡＮＡピークの保持時間、分
Ｗ＝ベースラインでのＮＡＮＡピーク幅、分
【０５７０】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準物質および試料中におけるＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのモル数を計算する。ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ標準を、各作業の開始および終了時に注入する。ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡの繰り返し注入についての面積数を平均化する。以下の等式でこの面積を用いる：
2010116402.tif 000021
Ｘ＝７.３.１の項で計算した使用液中のＮＡＮＡまたはＮＧＮＡのモル数
Ｙ＝各調製物に関するアバタセプト基準物質または試料中のＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの面積数（注：ＮＡＮＡについて統合する際のピークについては７.２項および図３参照）
Ｚ＝使用液中における反復ＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの平均面積
【０５７１】
一実施態様において、ＮＧＮＡおよびＮＡＮＡピーク間の分離度は１.３より大でなくてはならない。理論段数は４０００またはそれより大でなくてはならない。ＮＡＮＡピークの面積数のＲＳＤ％として評価されるシステム適合注入再現性は３％またはそれ以下でなくてはならない。理論段数は４０００またはそれより大でなくてはならない。ＮＡＮＡピークの面積数のＲＳＤ％として評価されるシステム適合注入再現性は３％またはそれ以下でなくてはならない。
【０５７２】
パルスドアンペロメトリー検出器を用いた高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）によるＮ−結合型オリゴ糖プロファイリング：単離オリゴ糖のＨＰＡＥＣについては、Dionex CarboPack ＰＡ１（４×２５０ｍｍ）アニオン交換カラムおよび Dionex CarboPack ガードカラムを用いる Waters 464 電気化学的検出器を備えた Waters Alliance から成るクロマトグラフィーシステムで実施した。２００ｍＭ水酸化ナトリウム中の酢酸ナトリウム勾配（酢酸ナトリウム濃度を、注入時の０ｍＭから６０分後の２２５ｍＭまで増加させる）を用いてオリゴ糖試料を溶離した。電気化学的検出器を、パルス電位差Ｅ１＝０.０５Ｖ（ｔ１＝０.４秒）、Ｓ＝０.７５Ｖ（ｔ2＝０.２秒）、Ｅ３＝−０.１５Ｖ（ｔ3＝０.４秒）によるパルス方式で稼動させた。検出セルは、金作用電極、ステンレス鋼カウンター電極および銀／塩化銀参照電極により構成された。
【０５７３】
本方法では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料中のタンパク質から放出されたＮ−結合型オリゴ糖のＨＰＡＥＣ（高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー）オリゴ糖プロフィールを測定する手順について説明する。本方法の目的は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の種々の組成物間における比較分析に使用され得るＣＴＬＡ４−Ｉｇ薬剤物質Ｎ−結合型オリゴ糖のクロマトグラフィープロフィールを提供することである。ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質におけるグリコシル化は、Ｎ−結合型オリゴ糖を含む。これらのオリゴ糖は、２２時間にわたるＰＮＧａｓｅ Ｆ（ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ）による酵素加水分解により遊離される。電気化学的検出法を用いる高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィーを用いて、遊離オリゴ糖をプロファイリングする。
2010116402.tif 000022
【０５７４】
薬剤物質のオリゴ糖プロフィールを、基準物質の同時実施試料に対して評価する。参照標準液（参照標準）(reference standard)における同一ピークからの選択されたドメインおよびピークの偏差値パーセントとして結果を記録する。
【０５７５】
アニオン交換クロマトグラフィーによるオリゴ糖プロフィールについてのクロマトグラフィー条件
2010116402.tif 000023
注：約２時間、または注入を行う前にベースラインが安定するまで、分析流速で初期移動相によりカラムおよび検出器を平衡状態にする。
2010116402.tif 000024
【０５７６】
ＨＰＡＥＣオリゴ糖炭水化物プロファイリング用の移動相の製造
【０５７７】
ＨＰＡＥＣ溶離液１：５００ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）。４００ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を含む５００ｍＬメスシリンダーへ２０.５１±０.０５ｇの酢酸ナトリウム（無水）を秤量して注ぐ。ＨＰＬＣグレードの水で容量を５００ｍＬにし、プラスチック製セロロジカルピペットを用いて完全混合するまで５分間撹拌する。溶液を０.２μｍナイロンフィルターで濾過する。１Ｌの溶離液びんへ移す。びんのキャップを緩く締め、２０分間ヘリウムを噴霧する。キャップを固く締め、ヘリウムでびんを加圧する。３週間までの間ヘリウム下室温で溶液を貯蔵する。
【０５７８】
ＨＰＡＥＣ溶離液２：４００ｍＭの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）。１Ｌのメスシリンダーを用いて、９６０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を計量し、清潔な１Ｌの溶離液びんに移す。セロロジカルプラスチックピペットを用いて、４０.０ｍＬの１０Ｎ ＮａＯＨを直接溶離液びんに添加し、溶離液を撹拌することにより混合する。びんのキャップを緩く締め、ヘリウムを２０分間噴霧する。キャップを固く締め、ヘリウムでびんを加圧する。３週間までの間ヘリウム下室温で溶液を貯蔵する。
【０５７９】
ＨＰＡＥＣ溶離液３：ＨＰＬＣグレードの水。約１ＬのＨＰＬＣグレードの水で１Ｌの溶離液びんを満たす。溶離液びんをシステムに配置し、キャップを緩く締め、約２０分間噴霧する。キャップを固く締め、ヘリウムで加圧する。３週間までの間ヘリウム下室温で溶液を貯蔵する。
【０５８０】
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０.０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ＝７.５。
ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ        ６.９ｇ
ＮａＮ3                    ０.２ｇ
Ｈ2Ｏ                      １.０リットル最終容量
【０５８１】
６.９ｇ±０.１ｇのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏおよび０.２ｇのＮａＮ3を秤量し、マグネチックスターラーで連続混合しながら１Ｌ試薬びん中の８００ｍＬのＨＰＬＣ用Ｈ2Ｏに溶かす。ｐＨ計を用いて、１０ＭのＮａＯＨで溶液のｐＨを７.５に調節する。１Ｌメスシリンダーを用いて最終容量を１.０リットルにする。溶液を６ヶ月までの間室温で貯蔵する。
【０５８２】
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ＝７.５）中のＰＮＧase Ｆ酵素使用原液（ＰＮＧase Ｆ酵素希釈標準保存液）(PNGase F Enzyme Working Stock)
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
０.０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ＝７.５               １.８ｍＬ
キット、カタログ番号Ｐ０７０４ＬからのＰＮＧase  Ｆ  ０.２ｍＬ
【０５８３】
１.８ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.５）をピペットで１.８ｍＬ凍結保存バイアルに注ぐ。キットからの０.２ｍＬのＰＮＧase Ｆを添加し、十分に混合する。溶液を６ヶ月までの間−２０℃またはそれ未満で貯蔵する。冷凍前に溶液をアリコートに分け得る。
【０５８４】
外部システム適合性標準。スタキオース保存液（１.２５ｍｇ／ｍＬ）。０.１２５ｇのスタキオースを薬包紙で秤量する。分析天秤を用いて、１００ｍＬ計量フラスコに移す。ＨＰＬＣグレードの水で印まで満たし、十分に混合する。２ｍＬ分量のアリコートに分けて Nalgene 凍結保存バイアルに入れる。溶液を６ヶ月までの間−２０℃またはそれ未満で貯蔵する。
【０５８５】
スタキオースシステム適合性標準（１２.５μｇ／ｍＬ）。１ｍＬの１.２５ｍｇ／ｍＬ保存液を１００ｍＬ計量フラスコにピペットで入れる。ＨＰＬＣグレードの水で印まで満たし、十分に混合する。２００μＬ分量のアリコートを０.６５ｍＬ微量遠心管に入れる。適切なラベルを貼った貯蔵箱に管を入れる。システム適合溶液を６ヶ月までの間−２０℃またはそれ未満で貯蔵する。
【０５８６】
標準および試料調製
【０５８７】
基準物質調製。１ｍｇの凍結乾燥 RapiGest SFを含むバイアルに、０.０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７.５を含む６２５μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を加える。０.６５ｍＬのエッペンドルフ管に、RapiGest SF 含有緩衝液１２０μＬを加える。４０μＬの基準物質（〜５０ｍｇ／ｍＬ）を加える。最終 RapiGest SF 濃度は０.１２％ｗ／ｖとするべきである。４０μＬのＰＮＧase Ｆ使用原液を加え、十分に混合し、試料をスピンダウンし、２２±２時間３８±２℃で置いておく（水浴または Alliance オートサンプラー区画）。試料を Microcon ＹＭ−１０遠心式フィルター中へピペットで移し、３０分間１３０００ｇでの遠心分離にかける。フィルター中に２００μＬのＨＰＬＣグレードの水を注ぎ、１３０００ｇでさらに３０分間遠心分離することにより濾液中ですすぐ。濾液を合わせ、１５秒間撹拌し、試料を１０秒間遠心分離にかける。ピペットを用いて、生成した溶液（〜３８０μＬ）をＨＰＬＣ全回収オートサンプラーバイアル（アイテム１.１５）へ移す。
【０５８８】
試料調製。０.６５ｍＬエッペンドルフ管に、RapiGest SF 含有緩衝液１２０μＬを加える。４０μＬのタンパク質試料（この容量は、１〜２ｍｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇと同等であるとみなすべきである）を加える。最終 RapiGest SF 濃度は０.１２％ｗ／ｖとするべきである。４０μＬのＰＮＧase Ｆ使用原液を加え、１０秒間撹拌することにより十分に混合する。試料をスピンダウンし、２２±２時間３８±２℃で置いておく（水浴または Alliance オートサンプラー区画）。試料をマイクロコンＹＭ−１０遠心式フィルターへピペットで移し入れ、３０分間１３０００ｇでの遠心分離にかける。フィルター中に２００μＬのＨＰＬＣグレードの水を注ぎ、１３０００ｇでさらに３０分間遠心分離することにより濾液中へすすぐ。濾液を合わせ、１５秒間撹拌し、試料を１０秒間遠心分離にかける。生成した溶液（〜３８０μＬ）を全回収ＨＰＬＣオートサンプラーバイアル（アイテム１.１５）へ移す。
【０５８９】
システム適合性
【０５９０】
電気化学的検出器セル安定化。３０μＬの外部スタキオースシステム適合標準（１２.５μｇ／ｍＬ）を注入する。確実に、スタキオースについてのピーク高が８００ｎＡまたはそれ以上であるようにする。確実に、セルからの過剰の電気ノイズが無く、ベースラインが均一であるようにする。典型的なシステム適合性クロマトグラムを図２に示す。スタキオース感度またはベースラインが許容され得ない場合、緩衝液組成物を検査し、電極を洗浄するかまたは電極を取り替える。過剰のノイズが存在する場合、セルを検査して、確実に気泡が全て除去されているようにする。セルを再び安定させ、スタキオース標準を再注入する。
【０５９１】
理論段（Ｎ）。下式を用いて、スタキオースピークに基づく理論段数（Ｎ）を測定する。Empower データ解析システムを通してこれを行うか、または手技でも実施し得る。
Ｎ＝１６（ｔ／Ｗ）2、式中：
ｔ：  注入時点から最大高でのピーク溶離時まで測定された保持時間
Ｗ：両側からベースラインへの延長によるピークの幅
Ｎ  ６０００またはそれより大でなくてはならない。段数が６０００未満である場合、実施勾配を調節するか、カラムを取り替える。
【０５９２】
テーリング係数（Ｔ）。下式を用いて、スタキオースピークに基づきカラムテーリング係数（Ｔ）を測定する。Empower データ解析システムを通してこれを行うか、または手技でも実施し得る。Ｔ＝（Ｗ0.05／２ｆ）、式中：
Ｗ0.05：高さ５％でのピーク幅（０.０５時間）
ｆ：  Ｗ0.05でのピークの端からピークの軸までの測定値（幅）
Ｔは１.２またはそれ以下でなくてはならない。テーリング係数が１.２より大きい場合、示された要領で緩衝液組成物を確認するか、カラムを取り替えるか、またはカラムを洗浄し、システム適合標準を再注入する。
【０５９３】
スタキオースシステム適合標準保持時間の確認。保持時間はシステムにより異なる。スタキオースシステム適合標準液は、１８.５±２.０分の保持時間を呈するべきである。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ標準物質。試料注入前に注入した第１群（ブラケット）の基準物質からの炭水化物プロフィールを観察する。炭水化物プロフィールは、当然図１に示されたものと類似している。絶対保持時間はシステム依存的である。確実に、ドメイン１における第１ピーク（ピーク１Ａ）およびドメインIIIにおける主要ピーク（ピーク３）間の保持時間の差異が２２分〜２８分であるようにする。ピーク形状が図１で得られたものと類似していない場合、適切な行動（例、器具機能の確認、カラムの清掃、緩衝液の確認／取替え、カラムの取替え）をとり、再評価する。以下の手順を用いて、カラムを清掃し得る：セルを閉じ、５分間８０％溶離液１、２０％溶離液２、次いで１０分間５０％溶離液１、５０％溶離液２でカラムを洗浄する。開始条件でカラムおよびセル（セルを開ける）を再び平衡させ、再評価する。
【０５９４】
注入順序
以下のとおり、単離オリゴ糖の注入順序を設定する：
スタキオース標準液（３０μＬ）
基準物質（６０μＬ）
試料（複数も可）（６０μＬ）
基準物質（６０μＬ）
基準物質注入群間で使用する試料は５またはそれ以下であることを薦める。
【０５９５】
データ分析
【０５９６】
クロマトグラムを処理する。Empower で基準物質および試料についてのクロマトグラムを処理する。ピーク形状およびベースラインが図７６に示したものと類似するように統合パラメーターを設定し、統合の線を手技で設ける必要があり得る。示された相対ドメイン面積および相対ピーク面積について計算を実施する。繰り返し注入を行った場合、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質および各試料についてのこれらのパラメーターに関する平均値を測定する。基準物質については、全繰り返し測定の平均に関して各繰り返し測定に関するドメインＩ、II、III、ピーク１Ａおよび１Ｂについて相対偏差値を測定する。
【０５９７】
試料のプロフィールと基準物質のプロフィールの比較。視覚的比較。試料および基準物質の両方が同数のドメインおよび１次ピークを有するか否かを測定する。１次ピークは、図７６で標識したピーク（ピーク１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２、３および４）である。相対的定量比較。試料の相対面積（ドメインＩ、II、およびIIIおよびピーク１Ａ、および１Ｂ；繰り返し注入を試料から行った場合、それらの平均値を使用する）とＣＴＬＡ４−Ｉｇ注入群からの平均相対面積を比較する。平均ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質値からのこれらの面積の相対差異を測定する。計算−ドメイン面積％（相対ドメイン面積）。基準物質および試料に関するプロフィールのドメインについてドメイン面積％を計算する。ドメイン面積のパターンについては図７６を参照。図７６における実施例にしたがって、以下の情報および式を用いることにより、ドメインパーセント比を計算する（保持時間はシステム依存的であり、図７６で結果を反映している）：
ドメインＩ：おおよその保持時間１８〜２４分でのピーク面積の和（ピーク１Ａ〜１Ｅ）
ドメインII  ：２６〜３８分でのピークの和
ドメインIII  ：３９〜５０分でのピークの和
ドメインIV  : ５１〜６４分でのピークの和
ドメインＶ  ：６５〜７５分でのピークの和
注：ドメインについての保持時間ウインドウは、日々のクロマトグラフィー性能の変動に応じてシフトする。それに応じて時間を調節する。
2010116402.tif 000025
また、ドメインＩ〜IIIについても、基準物質注入群での平均値、および繰り返し注入実施の場合は試料での平均値を計算する。
【０５９８】
ピーク面積％（相対ピーク面積）。基準物質および試料に関するプロフィールのピーク１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび３についてのピーク面積％を計算する。ピーク面積のパターンについては図１参照。保持時間はシステムに左右される。以下の情報および式を用いることにより、ピークパーセント比を計算する：
2010116402.tif 000026
【０５９９】
ピーク１Ａおよび１Ｂの各々についても、基準物質注入群での平均値、および繰り返し注入実施の場合は試料での平均値を計算する。平均基準物質値からの差異パーセントの計算。下式を用いて、基準物質の場合と比べた試料のドメインＩ〜III、ピーク１Ａおよび１Ｂの平均相対面積における差異パーセントを計算する。
【０６００】
差異％＝｜ＲＭ−Ｓ｜／ＲＭ×１００
式中：
ＲＭ＝基準物質に関する興味の対象である平均相対面積値
Ｓ＝試料に関する興味の対象である平均相対面積値
｜  ｜＝絶対値
【０６０１】
模範値（模範的値）(exemplary value)。測定が許容できるものであるためには、模範値は条件を満たすものでなくてはならず、試料に直接関連する注入は全てうまく行われなければならない。さらに、基準物質注入群の各々について、ドメインＩ、II およびIIIに関するドメイン面積％およびピーク１Ａおよび１Ｂのピーク面積％は、それらの平均値の１５％以内でなくてはならない。
【０６０２】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる分析：Ｎ−結合型オリゴ糖をＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子から開裂し、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。オリゴ糖は、存在するシアル酸の量に基づき４ドメインに溶出する。ドメインを、オリゴ糖標準物質の移動に基づいて確立し、ＭＳにより確認した。ドメインＩは非シアル化（asialylated）のものを表す。ドメインII、IIIおよび IVは、それぞれモノ−、ジ−およびトリ−シアル化されたものを表す。３つのＮ−結合型部位でのオリゴ糖の構造を特性確認するため、ペプチドＴ５、Ｔ７およびＴ１４を個々に単離した（これらのペプチドの同一性については表５９参照）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇのトリプシン消化を用い、これら３ペプチドに対応するピークを手技的に集めることにより、これを実施した。
【０６０３】
単離したペプチドを、ＰＮＧase Ｆで処理することにより、オリゴ糖を放出させ、それに続いてそれらを精製し、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。ペプチドＴ５は、その極度の疎水性故に精製が困難であるため、良好なプロフィールを生じなかった。開裂されたオリゴ糖の量は、トリプシン消化後の逆相クロマトグラフィー段階からのこのペプチドの収率が低いことから低レベルである。
【表８】
2010116402.tif 000027
2010116402.tif 000028
ＮＤ  検出されず
ＮＥ  トリプシン消化から予測されず（これらの質量は消化物、非特異的開裂から予測されなかった）
ａ  トリプシンペプチドＴ５、Ｔ７およびＴ１４は、Ｎ−結合型グリコシル化を有する。列挙した質量は、グリコシル化を伴わないペプチドのものである。
ｂ  トリプシンペプチドＴ８およびＴ９は、Ｏ−結合グリコシル化を有する。列挙した質量は、グリコシル化を伴わないペプチドのものである。
ｃ  グリコシル化ペプチドの異なる糖形態に対応する幾つかの異なる質量が観察された。
【０６０４】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび３ペプチドからの全Ｎ−結合型炭水化物についてのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロフィールを図５５Ａ〜Ｄに示す。パネルＡは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮ−結合型オリゴ糖プロフィールを示し、パネルＢ、ＣおよびＤは、それぞれＴ５、Ｔ７およびＴ１４のプロフィールを示す。ペプチドの各々について注入したオリゴ糖の量は、製造工程故によって異なる。ペプチドＴ５で検出されたオリゴ糖の大多数は、モノ−およびジ−シアル化オリゴ糖により構成される。Ｔ７のプロフィールは、主としてモノ−、ジ−グリカン類を含み、一部はａ−およびトリ−シアル化グリカン類を含む。ごく少量のトリ−シアル化構造がＴ５から検出され得る。ペプチドＴ１４は、主として非シアル化オリゴ糖および少量のモノ−およびジ−シアル化オリゴ糖により構成される。
【０６０５】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより得られる結果からは、部位特異的Ｎ−結合型グリコシル化に関する情報が得られる。ＣＴＬＡ４−ＩｇのＣＴＬＡ４領域からのＮ−結合型オリゴ糖は、ＣＴＬＡ４−ＩｇのＦｃ領域からのものより高い比率でシアル化糖類を含む。
【０６０６】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇのトリプシン、Ａｓｐ−Ｎ、およびトリプシン／キモトリプシンペプチドマッピング：
ＣＴＬＡ４−Ｉｇを、６Ｍグアニジンおよび５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８.０）中で変性させ、還元した。５０℃で２０分間インキュベーションした後、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を加えて１０ｍＭの最終濃度にし、遊離チオールをアルキル化し、インキュベーションを暗所において５０℃でさらに２０分間続行した。還元およびアルキル化混合物を、脱塩カラム（Amersham NAP-5）にローディングし、次いで５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８または５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.５）で空隙容量中へ溶離した。脱塩後、還元／アルキル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇを２種の異なるプロテアーゼ：トリプシンおよびＡｓｐ−Ｎを用いて消化した。トリプシン＋キモトリプシン消化については、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは還元もアルキル化もされない。
【０６０７】
トリプシン消化については、シークエンスグレードのトリプシン（Roche、２％、ｗ／ｗ、酵素／タンパク質）を加え、３７℃で４時間インキュベーションした。Ａｓｐ−Ｎ消化については、シークエンスグレードのＡｓｐ−Ｎ（Roche、４％、ｗ／ｗ、酵素／タンパク質）を加え、３７℃で１６時間インキュベーションした。トリプシン／キモトリプシン消化については、シークエンスグレードのトリプシン（Promega、４％、ｗ／ｗ、酵素／タンパク質）を加え、３７℃で４時間インキュベーションし、次いでａ−キモトリプシンを加え（Sigma、４％、ｗ／ｗ、酵素／タンパク質）、３７℃で１６時間インキュベーションした。消化後全試料を冷凍庫に入れた。
【０６０８】
生成したペプチド混合物を、０.１２０ｍＬ／分で、Waters Alliance ＨＰＬＣ ワークステーションにおける Waters Atlantis（登録商標）Ｍ ｄＣ１８カラム（２.１×２５０ｍｍ）からの勾配溶離により分離した。カラムを、マススペクトル収集用のイオンスプレーソースを備えた Waters Micromass Q-Tof micro（登録商標）Ｍ質量分析計に直接連結した。ペプチド混合物も、同ＨＰＬＣワークステーションを用いて、０.７ｍＬ／分で、Varian Polaris C18 カラム（４.６×２５０ｍｍ）で分離した。カラムを溶媒Ａ（水中０.０２％ＴＦＡ）で平衡させ、溶媒Ｂ（水中９５％アセトニトリル／０.０２％ＴＦＡ）の濃度を高めることによりペプチドを溶離した。ポスト-カラムスプリッターのバルブを用いて、流れの１５％を、プラスＴＯＦモード（ｍ／ｚ１００〜２０００）で稼動させている Q-Tof ワークステーションへ指向させた。使用した典型的なイオンスプレー電圧は３０００Ｖであった。
【０６０９】
ＭＳによるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分析：ＣＴＬＡ４−Ｉｇを、１００ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で０.７ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。ＰＮＧase（New England Biolabs）を、１００ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で３０倍希釈することにより、１７Ｕ／μＬの最終濃度とした。等容量（各々６０μＬ）の希釈精製発酵試料および希釈グリコシダーゼ溶液を混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。
【０６１０】
生成した脱グリコシル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（２μｇ）を、ポリマーベースの（ポリスチレンおよびポリＮ−ビニル−２−ピロリジノンのコポリマー）Waters Oasis（登録商標）逆相抽出カートリッジカラム（２.１×２０ｍｍ）にローディングした。充填したカラムを流速０.２ｍＬ／分で５分間、５％溶媒Ｂ（溶媒Ａ：水中１％蟻酸、溶媒Ｂ：アセトニトリル中１％蟻酸）で洗浄することにより脱塩し、溶離液の流れを変えて排出した。５分経過した時点で、急速勾配（１０分で５％溶媒Ｂから９５％溶媒Ｂ）により、カラムからのＣＴＬＡ４−Ｉｇの溶離を開始させた。次いで、流路を分岐後、溶離液を、４５μＬ／分で質量分析計（Waters Micromass Q-Tof micro（登録商標）Ｍ）へ注いだ（使用したクロマトグラフィーシステムは、Waters ２９９６検出器を備えた Waters Alliance ２６９５であった）。
【０６１１】
Q-Tof micro（登録商標）Ｍについてのキャピラリー電圧を３ｋＶに、試料コーン電圧を４０Ｖに設定した。０.９秒ごとのスキャンを１スキャンに平均化した。スキャン間隔は０.１秒であった。Q-Tof 分析装置は、ｍ／ｚ８００〜２５００を走査する。半最大ピーク高より高い部分に対応するスペクトル（ＴＩＣクロマトグラムで）を、Waters MassLynx（登録商標）Ｍソフトウェアにより合わせる。合わせたスペクトルを、Waters MaxEnt１デコンボルーションにかけた。分離度を１Ｄａ／チャンネルに設定し、均一ガウスダメージモデルを選択し、半高での幅を０.５〜１Ｄａに設定した。左ピークおよび右ピークについての最小強度比率を両方とも５０％に設定した。
【０６１２】
多孔質グラファイトカーボン（ＰＧＣ）を用いた液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によるＮ−結合型オリゴ糖分析：単離したオリゴ糖を、Waters ２９９６フォトダイオードアレイ検出器を備えたWaters Alliance ２６９５ＨＰＬＣシステムを用いて多孔質グラファイトカラム（Thermo Hypercarb；４.６×１００ｍｍ）で分離した。０.０５％ＴＦＡ中のアセトニトリルの比率を増大させる２段階勾配を用いて、オリゴ糖分離を遂行した。勾配の第１段階では、アセトニトリルパーセンテージは、注入時点での９.６％から８０分時点での２４％の範囲であった。勾配の第２段階では、アセトニトリルパーセンテージは、８０分時点での２４％から１１０分時点での６０％の範囲であった。終始０.２ｍＬ／分の流速を使用した。溶出の流れを２０６ｎｍでのＵＶ検出により観察し、質量同定用 Waters MicroMass Q-Tof micro（登録商標）Ｍを用いる質量分析法により分析した。
【０６１３】
ＬＣ／ＭＳ ＰＧＣ方法による炭水化物分析：タンパク質の脱グリコシル化によるオリゴ糖単離を、ＰＮＧase Ｆ（New England Biolabs、ベバリー、マサチューセッツ）を用いる酵素加水分解により実施した。脱グリコシル化については、０.１５％（ｗ／ｖ）Rapigest ＳＦ（Waters Corporation）を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１６０μＬ中１〜２ｍｇの糖タンパク質を、２分間１００℃で加熱することにより変性させた。冷却した溶液を混合し、４０μＬのＰＮＧase Ｆ（５００００Ｕ／ｍＬ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５中）を加えた。試料を撹拌後、３８℃で２４時間インキュベーションした。酵素放出されたオリゴ糖を高速液体クロマトグラフィーにより精製した。逆相液体クロマトグラフィーを、１.０ｍＬ／分の流速で、Thermo HyperCarb ５μＬ（４.６×１００ｍｍ、Phenomenex、トランス、カリフォルニア）と連結した Phenomenex Luna ５μＬ Ｃ１８カラム（４.６×１５０ｍｍ、Phenomenex、トランス、カリフォルニア）で実施した。注入前に、カラムを０.０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡させた。試料注入後（１５０μＬの消化物混合物）、アセトニトリル勾配を開始し、１５分後１２％アセトニトリル中０.０５％ＴＦＡの溶媒組成物で終結した。次いで、６０％アセトニトリル中０.０５％ＴＦＡで洗浄することにより、グリカンを HyperCarb カラムから溶離した。２０６ｎｍでのＵＶ吸光度によりグリカンが検出された。Hypercarb 洗浄液から溶離したピークを集め、減圧下で濃縮乾固した。後続の注入前、Luna Ｃ１８カラムを、４０％アセトニトリル、４０％イソプロパノール、２０％水中の０.０５％ＴＦＡにより洗浄した。
【０６１４】
ＰＧＣによる単離オリゴ糖のプロファイリング
【０６１５】
単離オリゴ糖のＰＧＣクロマトグラフィーに使用するシステムは、Hypercarb カラム（２.１×１００ｍｍ）を用いる Waters ２９９６フォトダイオードアレイ検出器を備えた Waters Allianceにより構成された。アセトニトリル勾配を用いてオリゴ糖試料を溶離した。
【０６１６】
酸性移動相溶離：０.０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中でのアセトニトリル勾配。アセトニトリルを増加させる２段階勾配を、オリゴ糖のクロマトグラフィー分離に用いた。アセトニトリル容量パーセンテージを注入時の９.６％から８０分時点での２４％に増加させる初回直線勾配の後、アセトニトリル容量パーセンテージを８０分時点での２４％から１１０分時点での６０％（アセトニトリル）に増加させる第２勾配を続ける。勾配全体を通して０.１５ｍｌ／分の流速を用いた。溶出の流れを２０６ｎｍで Waters ＵＶ検出器により観測し、質量同定用 MicroMass Q-Tof Micro により分析した。ＥＳＩプローブに関するイオン化パラメーターを以下のとおり設定した：キャピラリー電圧＝３ｋＶ、コーン電圧＝４５Ｖ、ソース温度８０℃、および脱溶媒和温度１７５℃。
【０６１７】
塩基性移動相溶離：０.４％水酸化アンモニウム（ＮＨ4ＯＨ）中のアセトニトリル勾配を、オリゴ糖のクロマトグラフィー分離に用いた。０.１５ｍＬ／分の流速で注入時での１０.４％から１５０分後での２８％にアセトニトリル容量パーセンテージを増加させる直線勾配を用いてプロフィールを作製した。溶出の流れを２０６ｎｍで Waters ＵＶ検出器により観測し、質量同定用 MicroMass Q-Tof Micro により分析した。ＥＳＩプローブについてのイオン化パラメーターを以下のとおり設定した：キャピラリー電圧＝３ｋＶ、コーン電圧＝４５Ｖ、ソース温度８０℃、および脱溶媒和温度１７５℃。
【０６１８】
ＰＧＣによるオリゴ糖消化物混合物の直接プロファイリング：オリゴ糖消化物混合物のＰＧＣクロマトグラフィーに使用したシステムは、Luna C18 および Hypercarb 多孔質グラファイトカラム（４.６×１００ｍｍ、Thermo）の両方を備えた Waters Allianceにより構成された。このシステムを、Waters ２９９６フォトダイオードアレイ検出器およびQ-ToF Micro（Micromass）とインターフェースで連結した。タンパク質の脱グリコシル化を、ＰＮＧase Ｆを用いる酵素加水分解により実施した。脱グリコシル化については、０.１５重量％ Rapigest ＳＦ（Waters Corporation）を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１６０μＬ中の１〜２ｍｇの糖タンパク質を、２分間１００℃で加熱することにより変性させた。冷却した溶液を十分に混合し、４０μＬのＰＮＧase Ｆ（５００００Ｕ／ｍＬ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５中）を加えた。試料を混合し、次いで３８℃で２４時間インキュベーションした。酵素放出されたオリゴ糖を、高速液体クロマトグラフィーによりプロファイリングした。逆相液体クロマトグラフィーを、１.０ｍＬ／分の流速で、Thermo HyperCarb ５μＬ（４.６×１００ｍｍ）と連結した Phenomenex Luna ５μＬ Ｃ１８カラム（４.６×１５０ｍｍ）で実施した。カラムを０.０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡させた。試料注入後（１５０μＬの消化物混合物）、アセトニトリル勾配を開始し、１１分後９％アセトニトリル中０.０５％ＴＦＡの溶媒組成物で終結した。カラムスイッチを用いて Hypercarb カラムを分離し、次いで、グリカンを、アセトニトリルパーセンテージを増加させる直線勾配で HyperCarb カラムから溶離した。注入時での９％から１６０分後での３６％へとアセトニトリル容量パーセンテージを増加させる初回勾配を用いた。第２の勾配では、アセトニトリル容量パーセンテージを１６０分時点での３６％から１７０分時点での６０％（アセトニトリル）へと増加させた。溶離勾配全体を通して０.１５ｍＬ／分の流速を使用した。２０６ｎｍでのＵＶ吸光度、および４００〜３０００ｍ／ｚの質量範囲をＭＳ走査することによりグリカンが検出された。ＭＳパラメーターを以下の値に設定した：キャピラリー３ｋＶ、コーン４５Ｖ。後続の注入前、Luna Ｃ１８カラムを、４０％アセトニトリル、４０％イソプロパノール、２０％水中の０.０５％ＴＦＡにより洗浄した。
【０６１９】
多孔質グラファイトカーボンクロマトグラフィーによる分析：ドメインＩ〜ＩＶのオリゴ糖の構造を、多孔質グラファイトカーボンクロマトグラフィー（ＰＧＣ）／ＭＳにより調べた。Ｎ−結合型オリゴ糖をＣＴＬＡ４−Ｉｇから単離し、上記ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤの項で記載した要領で精製した。Hypercarb（ＰＧＣ）カラムを用いて、ＵＶ検出器、次いでＱ−ＴＯＦ ＥＳＩ／ＭＳを用いてオリゴ糖を分析した。ＰＮＧase Ｆ消化によりＣＴＬＡ４−ＩＧから放出されたＮ−結合型オリゴ糖についてのＰＧＣプロフィールを図５６に示す。溶離の順序は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで観察されたものと同じである。得られた構造を表６０に示す。
【０６２０】
表６０に示したオリゴ糖の命名について以下に示す：
2010116402.tif 000029
【０６２１】
灰色がかった領域は、Ｎ−結合型オリゴ糖コア構造を示しており、ＰはＰＮＧase Ｆ消化を表し、後続のディジットは、それぞれマンノース（丸）、フコース（下向きの三角）、ガラクトース（右向きの三角）およびシアル酸残基（星）の番号をそれぞれ記載している。Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は四角で表されている。
【表９】
2010116402.tif 000030
2010116402.tif 000031
【０６２２】
ドメインＩでは、３つの非シアル化オリゴ糖（構造Ｐ２１００、Ｐ２１１０、Ｐ２１２０）に対応する、６つのピークが同定された。予測構造および実測質量間における１１３ダルトンの質量差は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）付加物の検出に起因する。Ｐ２１００に対応する、１４６３の同一質量による異なるピークは、それらが異なるアノマーだと思われることを示している。
【０６２３】
ドメインIIでは、各々１個のシアル酸残基を含む（Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮＡＮＡ）、３種の２分枝および３分枝オリゴ糖（それぞれ構造Ｐ２１１１、Ｐ２１２１およびＰ３１３１）に対応する６つのピークが同定された。
【０６２４】
ドメインIIIでは、各々２個のシアル酸残基を含む（ＮＡＮＡ）、３種の２分枝、３分枝および４分枝オリゴ糖（それぞれ構造Ｐ２１２２、Ｐ３１３２およびＰ４１４２）に対応する６つのピークが同定された。
【０６２５】
ドメインIVでは、各々３個のシアル酸残基を含む（ＮＡＮＡ）、２種の３分枝および４分枝オリゴ糖（それぞれ構造Ｐ３１３３およびＰ４１３３）に対応する２つのピークが同定された。
【０６２６】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の酸加水分解処理によるシアル酸モル数対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または２量体モル数のモル比の測定（図２５および２６参照）：この方法では、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡを、酸加水分解によりタンパク質から開裂する。放出されたＮＡＮＡおよびＮＧＮＡを、Rezex Monosaccharide RHM カラムでのＨＰＬＣにより分離し、ＵＶ吸光度（２０６ｎｍ）により検出する。ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡを、同時泳動のＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ標準液の応答係数に基づいて定量する。試験結果を、タンパク質に対するＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのそれぞれのモル比（ＭＲ）として記録する。この検定は、シアル酸の結合および未結合のモル総数を測定する。
【０６２７】
検定で使用する試薬、器具およびクロマトグラフィー条件：１Ｍの硫酸Ｈ2ＳＯ4（保存液）および５ｍＭのＨ2ＳＯ4移動相泳動用緩衝液；１ｍｇ／ｍｌのＮＡＮＡ標準液；１ｍｇ／ｍｌのＮＧＮＡ標準液。Alliance クロマトグラフィーシステム−オートサンプラーを組み込んだ Waters Corporation ２６９５ Separations Module；Rezex 単糖ＲＨＭカラム−８マイクロメートル、７.８×３００ｍｍ、Phenomenex、７.８×５０ｍｍガードカラム、Phenomenex を装備；検出器−Waters Corporation ９９６フォトダイオードアレイ検出器またはWaters Corporation ２４８７ ２波長吸光度検出器。クロマトグラフィーパラメーター：流速--０.６００ｍＬ／分；移動相--５ｍＭ Ｈ2ＳＯ4；注入容量--５マイクロＬ；標的濃度--１ｍｇ／ｍｌ；泳動時間--２５分；カラム温度--４０℃；オートサンプラー温度--４℃；波長--２０６ｎｍ；保持時間ＮＡＮＡ（システム依存的）−１０..８分（＋または−１分）、保持時間ＮＧＮＡ（システム依存的）−９.８分（＋または−１分）。
【０６２８】
システム適合性標準：適切な容器中の９００μＬのＨ2Ｏに、１ｍｇ／ｍＬのＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ各々５０μＬを加える。３ヶ月までの間４℃で貯蔵する；Ｎ−アセチルノイラミン酸使用標準（０.０５ｍｇ／ｍＬ）；Ｎ−グリコリルノイラミン酸使用標準（０.０５ｍｇ／ｍＬ）。
【０６２９】
試料およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ標準物質の加水分解：試料およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ標準物質を、加水分解用にＨ2Ｏ中１ｍｇ／ｍＬに希釈する。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ標準物質を、１ｍｇ／ｍＬ希釈試料およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ１９０μＬに１０μＬの１Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えることにより加水分解する。加水分解を１.５ｍＬ微量遠心分離管においてデュプリケイトで実施する。蓋ロックまたはテープで蓋を確実に締める。管を撹拌混合し、１時間８０℃のヒートブロックに置く。インキュベーション後、管をヒートブロックから除去し、３分間室温で冷まし、遠心管中に入れ、高速スピンすることにより試料を管の底部に集める。管から、５０μＬ分量の加水分解溶液のアリコートを取り分けて試料バイアルに分配し、冷却したオートサンプラーに入れて注入する。１.５ｍＬ微量遠心分離管中で１０μＬの１Ｍ Ｈ2ＳＯ4を１９０μＬの水に加えることにより、加水分解ブランクを単一調製物として製造する。ブランクを試料と同様に処理する。
【０６３０】
システム適合性：システム適合性を調べるため、システム適合性標準の注入液（各々５μＬ）で６回繰り返し注入を実施し、次いで加水分解ブランク（５μＬ）の１回注入を行った。最後のシステム適合性標準注入液を用いて、許容され得る値が１.３よりも高い分離度（Ｒ）、および許容され得る理論段数が少なくとも４０００でなくてはならない理論段（Ｎ）をそれぞれ計算した。最後のシステム適合性の５回繰り返し測定を用いて、ＮＡＮＡカウントの再現性を計算し、加水分解ブランクを評価した。
【０６３１】
分離度：最後のシステム適合性標準液注入を用いて、次の等式によりピーク分離度を計算した：Ｒ＝２（Ｔ２−Ｔ１）／（Ｗ２＋Ｗ１）［式中、Ｒは分離度であり、Ｔ２はＮＡＮＡピーク（ピーク２）の保持時間であり、Ｔ１はＮＧＮＡピーク（ピーク１）の保持時間であり、Ｗ２はピーク２の両端へ引いた接線のベースラインでの幅であり、Ｗ１はピーク１の両端へ引いた接線のベースラインでの幅である］。図２５は、典型的システム適合性注入を示す。
【０６３２】
理論段（Ｎ）：最後のシステム適合性標準注入を用いて、理論段数（Ｎ）を次の等式により計算した：Ｎ＝１６（ＲＴ2／Ｗ）（式中、Ｎは理論段数であり、ＲＴはＮＡＮＡピークの保持時間（分）であり、ＷはＮＡＮＡピークの両端へ引いた接線のベースラインでの幅である）。
【０６３３】
システム適合性標準の最後５回の注入を用いて、ＮＡＮＡに関する平均面積数およびそれらの標準偏差を計算した。相対標準偏差は３％またはそれ未満であった。加水分解ブランクは、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡの保持時間をもつ重要なピークを含んでいなかった。
【０６３４】
注入順序：ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ使用標準を各々１回注入し、次いで加水分解ＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料物質（デュプリケイト試料）、次いで加水分解ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質の注入を行った。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ泳動を完了させた後、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ使用標準を各々１回注入した。
【０６３５】
使用標準液で注入されたＮＡＮＡまたはＮＧＮＡのモル数を測定するため、以下の等式を用いる：ＮＡＮＡまたはＮＧＮＡのモル＝（Ｃ）（Ｐ）（Ｉ）／ＭＷ［式中、Ｃは、使用標準液中のＮＡＮＡおよびＮＧＮＡの濃度であり、Ｐは標準液の純度であり、Ｉは注入容量であり、ＭＷは分子量である（ＮＡＮＡについては３０９.２ｇ／モル、およびＮＧＮＡについては３２５.３ｇ／モル）］。
【０６３６】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料中のＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのモル数を測定するため、以下の等式を用いる：試料中のＮＡＮＡまたはＮＧＮＡのモル＝（Ｘ）（Ｙ）／Ｚ（式中、ＸはＮＡＮＡおよびＮＧＮＡの使用標準液でのモル数であり、ＹはＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料中のＮＡＮＡおよびＮＧＮＡの平均数であり、Ｚは使用標準液中におけるデュプリケイトのＮＡＮＡおよびＮＧＮＡの平均面積である）。標準液のデュプリケイト注入から、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ標準の面積数についてのＲＳＤは１０％未満でなくてはならない。
【０６３７】
各試料中の注入量を測定するため、以下の等式を用いる：タンパク質モル数＝（Ｃ）（Ｄ）（Ｉ）／ＭＷ［式中、ＣはＣＴＬＡ４−Ｉｇ２量体の濃度（ｇ／ｍｌ）（ＵＶ分析から得られた）であり、Ｄは加水分解用の希釈率（０.９５）であり、Ｉは注入容量（０.００５ｍｌ）であり、ＭＷは、質量分析法で測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ２量体の分子量である（９２４３９ｇ／モル）］。
【０６３８】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質に対するＮＡＮＡまたはＮＧＮＡのモル比（ＭＲ）を次の等式により計算する：ＭＲ＝Ａ／Ｂ（式中、ＡはＮＡＮＡまたはＮＧＮＡのモル数であり、ＢはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または２量体のモル数である）
【０６３９】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質に対するシアル酸、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡのモル比（ＭＲ）を次の等式により計算する：ＭＲ＝（Ａ＋Ｂ）／Ｃ（式中、ＡはＮＡＮＡのモル数であり、ＢはＮＧＮＡのモル数であり、ＣはＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子または２量体のモル数である）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ標準物質のデュプリケイトは、ＮＡＮＡについてのモル比において１０％未満のＲＳＤを示さなくてはならない。
【０６４０】
シアル酸含有量の加水分解測定方法により測定した応答の直線性：ＮＡＮＡ応答は、０.５μｇ／ｍＬ（〜０.１％名目ＮＡＮＡ標準＝ＮＡＮＡ〜ＱＬ）〜９８.７μｇ／ｍＬ（−２００％名目ＮＡＮＡ標準）の範囲におけるＮＡＮＡ標準濃度に関して線形であることが立証された。ＮＧＮＡ応答は、５.０μｇ／ｍＬ（−１０％名目ＮＧＮＡ標準）〜８２.０μｇ／ｍＬ（−１６０％名目ＮＧＮＡ標準）の範囲におけるＮＧＮＡ標準濃度に対して線形であることが立証された。
【０６４１】
加水分解ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質からのＮＡＮＡの応答は、０.２５ｍｇ／ｍＬ（２５％名目ＣＴＬＡ４−Ｉｇ充填量）〜２.０ｍｇ／ｍＬ ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（２００％名目ＣＴＬＡ４−Ｉｇ充填量）の範囲におけるタンパク質濃度に関して線形である。加水分解ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質からのＮＧＮＡの応答は、０.２５ｍｇ／ｍＬ（２５％名目ＣＴＬＡ４−Ｉｇ充填量）〜２.０ｍｇ／ｍＬ ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（２００％名目ＣＴＬＡ４−Ｉｇ充填量）の範囲におけるタンパク質濃度に対して線形である。
【０６４２】
シアル酸含有量の加水分解測定方法の真度：ＮＡＮＡまたはＮＧＮＡ標準液でスパイクしたＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質（１ｍｇ／ｍＬ）について正確さを立証した。
【０６４３】
シアル酸含有量の加水分解測定方法の精度：確認実験により、器具の精度（ＲＳＤ％＜３％）、試料調製についての併行精度（ＲＳＤ％＜４％）および種々の試料調製物、相異なる日数、種々の器具および相異なる分析者全体に及ぶ再現精度（ＮＡＮＡについてＲＳＤ％＜６％、ＮＧＮＡについてＲＳＤ＜１２％）が立証された。ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡモル比は、それぞれ報告された結果の１０％〜２０％の範囲内で正確であるとみなされた。
【０６４４】
シアル酸含有量の加水分解測定方法に範囲：この検定法に関する試験範囲は、０.４９ｍｇ／ｍＬ〜３.８７ｍｇ／ｍＬのＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質であることが示された。
【０６４５】
シアル酸含有量の加水分解測定方法の検出限界（ＤＬ）：フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ；ＨＰＬＣシステム１）を用いたＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ標準に関する個々のＤＬ値は、それぞれ０.４６４μｇ／ｍＬおよび０.４０２μｇ／ｍＬであった。２波長検出器（ＨＰＬＣシステム２）を用いたＮＡＮＡおよびＮＧＮＡに関する個々のＤＬ値は、それぞれ０.１３１μｇ／ｍＬおよび０.１１１μｇ／ｍＬであった。最低感度の検出器の使用に基づいた両シアル酸類についての方法ＤＬは、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡについて０.５μｇ／ｍＬであった。
【０６４６】
シアル酸含有量の加水分解測定方法の定量限界（ＱＬ）：フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ；ＨＰＬＣシステム１）を用いたＮＡＮＡおよびＮＧＮＡ標準に関する個々のＱＬ値は、それぞれ１.６８μｇ／ｍＬおよび１.５２μｇ／ｍＬであった。２波長検出器（ＨＰＬＣシステム２）を用いたＮＡＮＡおよびＮＧＮＡに関するＱＬ値は、それぞれ０.４８μｇ／ｍＬおよび０.４１μｇ／ｍＬであった。最低感度の検出器の使用に基づいた両シアル酸類についての方法ＱＬは、ＮＡＮＡおよびＮＧＮＡについて１.７μｇ／ｍＬであった。
【０６４７】
堅牢性／頑健性：本方法は、試料の４８時間冷蔵保存溶液安定性、異なるカラムの使用、異なるＮＡＮＡおよびＮＧＮＡロットの使用および±５％濃度改変を伴う移動相の使用に関して頑健であることが立証された。
【０６４８】
ＩＥＦゲル電気泳動：ノイラミニダーゼ処理によるシアル酸除去の前および後に、糖タンパク質のｐＩを測定し得る。ノイラミニダーゼ処理後のｐＩの増加は、糖タンパク質におけるシアル酸の存在を示す。ＩＥＦゲルを用いることにより、等電点、ＣＴＬＡ４−Ｉｇのイソ型の数を測定し得る。ＩＥＦゲル電気泳動に適切なシステムは、Multiphore II 電気泳動システム、およびｐＨ４.０〜６.５のＩＥＦゲル（Amersham Biosciences）である。陽極性緩衝液は次の組成を有する：０.５Ｍリン酸中０.１Ｍのグルタミン酸。陰極性緩衝液は次の組成を有する：０.１Ｍベータ−アラニン。ＩＥＦゲルを、電圧が３００Ｖ以上に達するまで、一定電力（２５ワット）および電流（２５ミリアンペア）下で前もって集束させておく。適切な濃度のＩＥＦキャリブレーション標準および試料をローディングし、２.５時間最大２０００Ｖで一定電力（２５ワット）および電流（ミリアンペア）下においてゲルを泳動させた。ＩＥＦゲルを固定し、クーマシーブルー染色した後、タンパク質バンドをデンシトメーターにより可視化する。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ２量体調製物の典型的ＩＥＦゲルを図１１に示す。
実施例４：ＣＴＬＡ４−Ｉｇの１本鎖（単量体）の単離および特性確認
【０６４９】
天然１本鎖ＣＴＬＡ４−Ｉｇの製造：本発明方法により製造されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ組換えタンパク質の試料を、タンデムで２本の２１.５×３００ｍｍ TSK Gel（登録商標）Ｇ３０００ＳＷXL分取カラム（Tosoh Bioscience、モントゴメリー、ペンシルベニア）での２６９５ Alliance ＨＰＬＣ（Waters、ミルフォード、マサチューセッツ）を用いる非変性ＳＥＣにより分離した。〜５０ｍｇ／ｍＬの試料の３０注入液（各々１.０ｍＬ）を、１.０ｍＬ／分の流速で０.２ＭのＮａＨ2ＰＯ4、０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.０から成る移動相を用いる無勾配条件下で分離した。Waters ２９９６PDA 検出器を用いて２８０ｎｍの吸光度で試料を観察した。Waters Millennium ４.０（登録商標）および Empower Pro（著作権）ソフトウェアを用いて分析を行った。Foxy ２００自動フラクションコレクターで９０〜１５０分間フラクション（各々１.０ｍＬ）を集めた。フラクション１６〜３９（１０５ｍＬで開始し、１２９ｍＬで終わる）をプールし、カットオフ３５００ＭＷの Centricon 濃縮装置で濃縮した。
【０６５０】
AKTAexplorer（登録商標）（Amersham Biosciences）で移動相として２００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、６.０Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ６.０）を用いる、２.０ｍＬ／分の無勾配流速での HiLoad ２６／６０ Superdex ２００ Prep グレードカラム（Amersham Biosciences、ピスキャタウェイ、ニュージャージー）を用いた変性条件下、試料（〜４ｍｇ／ｍＬで２.０ｍＬ）をさらにクロマトグラフィーにかけた。フラクション１２〜１６を集め、プールし、HiPrep ２６／１０脱塩カラム（Amersham Biosciences）を用いて２００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６.０）中へ緩衝液交換を行い、最後に濃縮した。
【０６５１】
誘導１本鎖ＣＴＬＡ４−Ｉｇの製造：本発明方法により製造されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ組換えタンパク質の変性、還元およびアルキル化により、誘導１本鎖ＣＴＬＡ４−Ｉｇを製造した。グアニジン塩酸塩（０.６８４ｇ）を秤量して１.５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離管に入れ、５１２μＬの２００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６.０を加え、グアニジン塩酸塩が完全に溶解するまで撹拌した。２３９μＬのＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質（濃度：５０ｍｇ／ｍＬ）を上記管に加えることにより、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組換えタンパク質を変性させ、撹拌することにより、６.０Ｍグアニジン塩酸塩中〜１０.０ｍｇ／ｍＬのＣＴＬＡ４−Ｉｇ最終濃度とした。１.０ＭのＤＴＴ２.６μＬを加え、３７℃で９０分間インキュベーションすることにより、変性タンパク質を還元した。次いで、試料混合物中へ０.０４７ｇのヨードアセトアミドを加え、撹拌し、暗所で６０分間、３７℃でインキュベーションすることにより還元タンパク質をアルキル化した。試料（各注入について〜４.０ｍｇ／ｍＬで２.０ｍＬ）を、AKTAexplorer（登録商標）で２００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、６.０Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ６.０）を用いる、２.０ｍＬ／分の無勾配流速での HiLoad ２６／６０ Superdex ２００ Prep グレードカラムを用いた変性条件下でクロマトグラフィーにかけた。生成した１本鎖フラクション（９〜１２）を集め、プールし、HiPrep ２６／１０脱塩カラムにおいて２００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６.０）中へ緩衝液交換を行い、濃縮した。
【０６５２】
天然（ナイーブ）および誘導１本鎖ＣＴＬＡ４−ＩｇのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法：１本鎖試料（２０μＬ）を脱塩し、C4 ZipTips（Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ）で濃縮し、次いでシナピン酸で飽和させた０.１％ＴＦＡ含有の８０％アセトニトリル２０μＬで溶離した。混合物（１.０μＬ）をＭＡＬＤＩ試料プレートのウェルにスポットし、質量分析計に置く前に風乾した。窒素レーザー（３３７ｎｍ）を用いる OmniFlex 質量分析計（Bruker Daltonics、マサチューセッツ）でＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを得た。２０ｋＶの加速電圧および２００ｎｓの遅延時間を用いる遅延型抽出による反射式陽イオンモードで試料を分析した。合計２５０の単ショットスペクトルを各試料について集めた。トリプシノーゲン（２３９８２ｍ／ｚ）、プロテインＡ（４４６１３ｍ／ｚ）およびウシアルブミン（６６４３１ｍ／ｚ）の混合物を用いて外部キャリブレーションを行った。
【０６５３】
変性（グアニジンＨＣｌ）サイズ排除クロマトグラフィーを用いる１本鎖分析：試験期間中異なる時点で集めた細胞培養物からのＣＴＬＡ４−Ｉｇ上清をＨＰＬＣ分析用に調製する。０.６５ｍＬエッペンドルフ遠心分離管中で０.１１４ｇグアニジン塩酸塩（Mallinckrodt Baker Inc.）を秤量し、１２５μＬの経時ＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料を加え、撹拌してグアニジンＨＣｌを完全溶解させることにより、試料を調製する。直後に、１.８μＬの２５０ｍＭヨードアセトアミドを加え、混合し、３７℃で３０分間インキュベーションする。
【０６５４】
タンデムTSK-GEL（登録商標）Ｇ３０００ＳＷXLサイズ排除カラム（７.８ｍｍ内径×３０ｃｍ）を TSK カラムガード（SWXL、６.０ｍｍ内径×４.０ｃｍ）と共に、２９９６フォトダイオードアレイ検出器を備えた Waters ２６９５分離モジュールで実施する１本鎖ＳＥＣ分析に使用する。移動相として２００ｍＭリン酸ナトリウム、６.０Ｍグアニジン塩酸塩ｐＨ６.０で平衡させたカラムへ各試料２５μＬを注入する。タンパク質を流速０.５ｍＬ／分でカラムにおいて分離し、得られたクロマトグラムを６０分ウィンドウにわたって集める。個々のピーク（単量体、１本鎖など）の集積および定量を、Empower Pro ソフトウェアを用いて実施する。確実にＨＰＬＣシステムを正しく作動させるため、試料注入の前および後に、注入を移動相、タンパク質試料緩衝液、システム適合性標準液、および現ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質で行う。システム適合性標準クロマトグラムにおけるピーク分離度および段数を計算する。
【０６５５】
ＬＣ／ＭＳペプチド解析によるＣＴＬＡ４−Ｉｇ１本鎖のシステイニル化の分析：ＣＴＬＡ４−Ｉｇを変性させ、６Ｍグアニジンおよび５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）中で還元した。５０℃で２０分のインキュベーション後、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を加えて１０ｍＭの最終濃度とし、遊離チオールをアルキル化し、暗所中５０℃でインキュベーションをさらに２０分間続行した。還元およびアルキル化混合物を、脱塩カラム（Amersham、ＮＡＰ−５）に充填し、次いで５０ｍＭトリス、１０ｍＭのＣａＣｌ、ｐＨ８.０または５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５で溶媒容量中へ溶離した。脱塩後、還元／アルキル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇを、２種の相異なるプロテアーゼ：トリプシンまたはＡｓｐ−Ｎを用いて消化した。またＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質については、還元およびアルキル化せずにトリプシン／キモトリプシンで消化した。
【０６５６】
トリプシン消化については、シークエンスグレードのトリプシン（Promega、２％、ｗ／ｗ、酵素／タンパク質）を加え、混合物を３７℃で４時間インキュベーションした。Ａｓｐ−Ｎ消化については、シークエンスグレードのＡｓｐ−Ｎ（Roche、２％、ｗ／ｗ、酵素／タンパク質）を加え、混合物を３７℃で１６時間インキュベーションした。トリプシン／キモトリプシン消化については、シークエンスグレードのトリプシン（Promega、４％、ｗ／ｗ、酵素／タンパク質）を加え、混合物を３７℃で４時間インキュベーションし、次いでａ−キモトリプシンを加え（Sigma、４％、ｗ／ｗ、酵素／タンパク質）、混合物を３７℃で１６時間インキュベーションした。消化後試料を全て冷凍（−２０℃）した。
【０６５７】
生成したペプチド混合物を０.１２ｍＬ／分で、Waters Alliance ＨＰＬＣ ワークステーションにおける Waters Atlantis（登録商標）Ｍ ｄＣ１８カラム（２.１×２５０ｍｍ）からの勾配溶離により分離した。カラムを、マススペクトル収集用のイオンスプレーソースを備えた Waters Micromass Q-Tof micro（登録商標）Ｍ質量分析計に直接連結した。ペプチド混合物も、同ＨＰＬＣワークステーションを用いて、０.７０ｍＬ／分で、Varian Polaris C18 カラム（４.６×２５０ｍｍ）で分離した。カラムを溶媒Ａ（水中０.０２％ＴＦＡ）で平衡させ、溶媒Ｂ（水中９５％アセトニトリル／０.０２％ＴＦＡ）の濃度を高めることによりペプチドを溶離した。ポスト-カラムスプリッターのバルブを用いて、流れの１５％を、プラスＴＯＦ（飛行時間）モード（ｍ／ｚ１００〜２０００）で稼動させている Q-Tof ワークステーションへ指向させた。使用した典型的なイオンスプレー電圧は３０００Ｖであった。
【０６５８】
還元時の１１３±４ｕの減損は、共有結合的ジスルフィド修飾がタンパク質に加えられていることを示唆している。システイニル化について予測されるシフトは１１９.１４ｕである。しかしながら、１１１.１４ｕの実際の質量減損は、１本鎖物質の還元時に予測されている。１１９.４ｕの減損はシステインの除去によるものであり、８ｕの増加は、８個の鎖内システイン（配列番号２のＣｙｓ47,74,92,118,197,157,303,361）の還元時における８プロトンの付加によるものである。すなわち、無傷の質量に対する追加の１１３±４ｕは、システインアミノ酸によるシステイニル化に対応する。鎖間ジスルフィド結合は、無傷ＭＡＬＤＩデータに基づいた１本鎖物質には存在しないため、最も修飾されていると思われるシステインはＣｙｓ146である。ＬＣ／ＭＳペプチド分析を用いて、Ｃｙｓ146を含むペプチドを調べると、還元および非還元物質は、１本鎖物質とは異なる保持時間および質量を示すことがわかる。システイニル化を確認するため、Ｃｙｓ146を含む１本鎖ペプチドを集め、ＭＡＬＤＩを用いて分析した。
【０６５９】
集めたＣｙｓ146含有ピークは、１７８７.４８ｕの質量を有し、Ｃｙｓ146のシステイニル化を伴うペプチドについて予測された質量１７８７.５１ｕと一致している（図２７、パネルＡ）。このペプチドは、還元された後、システインの喪失である１１９.１４ｕの予測される減損と一致する１１９.１１ｕを減損している（図２７、パネルＢ）。次いで、この物質をヨードアセトアミドでさらに操作することにより、５７.０３ｕの予測される質量増加と一致する５６.９９ｕのシフトがもたらされる（図２７、パネルＣ）。
実施例５：単量体または多量体ＣＴＬＡ４−Ｉｇ形成の操作
【０６６０】
１本鎖形成に対する培地および培地成分のアゴニスト効果：１本鎖形成について種々の培地および培地成分のアゴニスト作用を測定する。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を３７℃で様々な培地および個々の培地構成成分と６０時間にわたってインキュベーションし、タンデムカラム変性ＳＥＣにより１本鎖形成について分析し得る。１本鎖形成についての圧倒的なアゴニスト応答は、１０ｍＭシステインを調製緩衝液に添加したときに見出される。１本鎖形成の急速な上昇があり、システイン添加の約６時間後にピークに達する。この応答は、残り５６時間にわたって徐々に減少する。さらに、＋３０％のｇａｌ飼料は、１本鎖形成の徐々にではあるが、依然として比較的速い増加に影響を及ぼした。＋３０％ｇａｌ飼料は、ガラクトースおよび１１７Ｅの組成物である。この混合物を毎日添加し、細胞に供給した。この実験では、システインは、１１７Ｅとは関係なく人為的に大量で導入されたが、１１７Ｅ成分のうちのどれが１本鎖形成に関与し得るのかを測定する必要がある。
【０６６１】
１１７Ｅおよび他の培地の特定成分を、６０時間にわたってＣＴＬＡ４−Ｉｇとインキュベーションし、タンデムカラム変性ＳＥＣにより１本鎖形成について分析した。この培地に関する研究は、可能なジスルフィド還元成分および／または阻害剤にほぼ集中しており、鎖間ジスルフィドが存在しないことを示す以前の実験に基づいた１本鎖情報に影響を及ぼすことになる。ジスルフィドに対してある程度の還元作用を有することが知られている１１７Ｅの構成成分を試験した：リポ酸、シスチン、システイン、メチオニンおよびグルタチオン。また、システインを調製緩衝液に添加したとき、１本鎖形成についての圧倒的なアゴニスト応答が見出される。１本鎖形成の急速な応答が生じ、システイン添加のほぼ６時間後にピークに達する。この応答は、残り５６時間にわたって徐々に減少する。主たる１本鎖形成は、システイン含有培地：システイン、イーストレートおよび発酵培地により行われる。他の硫黄含有成分、例えばメチオニン、およびグルタチオンは、１本鎖形成に全くまたはほとんど影響を及ぼさない。塩化アンモニウムの影響は全く観察されない。
【０６６２】
したがって、本発明は、タンパク質、すなわち２量体および１本鎖形態で存在し得るタンパク質の１本鎖：２量体形態の比率を提供する方法であって、（１）上記タンパク質を発現する細胞を培養するための液体細胞培養培地を供給および／または維持（例えば段階（２）の間）し、ただし、２量体形成を還元または阻害し得る薬剤の濃度を、上記比率を提供するように選択するものとし、次いで（２）細胞を培養してタンパク質を発現させる段階を含む方法を包含する。液体細胞培養培地においてかかる薬剤（例えばシステイン）を添加および／またはその濃度を高めると、上記タンパク質の１本鎖：２量体形態の比率が高くなり、液体細胞培養培地中で上記薬剤（例えばシステイン）を除去、減少または排除すると、上記タンパク質の１本鎖：２量体形態の比率は低くなる。
【０６６３】
本方法の一実施態様では、上記タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合の形成を通じて２量体を形成させ得る糖タンパク質、例えば本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子である。
【０６６４】
高分子量形成に対する高（濃度）塩のアゴニスト作用：精製過程中、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを、様々な期間高塩濃度に暴露する。高塩濃度の影響を、高分子量形成について測定する。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（〜５０ｍｇ／ｍＬ）を、５００ｎＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６.０の存在下３７℃でインキュベーションする。高濃度のリン酸ナトリウムではアゴニスト作用が存在し、高分子量形態、主として４量体では、１００時間にわたって持続的で急速な増加が観察される。
【０６６５】
したがって、本発明は、タンパク質、すなわち凝集体および２量体形態で存在し得るタンパク質の凝集体：２量体形態の比率を上記タンパク質の処理（例えば精製）期間中低下させる方法であって、非凝集性塩溶液である１種またはそれ以上の液体の使用を含む方法を包含する。「非凝集性塩溶液」とは、高濃度の塩を含む同一液体と比べて、凝集体形成における促進性が低い濃度の上記塩が溶解した液体をいう。
【０６６６】
本方法の一実施態様では、上記タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合の形成を通じて２量体を形成させ得る糖タンパク質、例えば本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子である。
【０６６７】
１本鎖形成に対するアンタゴニスト作用：以前のモデリング実験は、システイン含有成分の添加による１本鎖形成に対する多大かつ急速な影響を立証した。システインは、遊離スルフヒドリルを含むアミノ酸である。スルフヒドリルが１本鎖の形成に含まれる場合、拮抗性化合物の使用によりそれを遮断するべきである。かかる一化合物がヨードアセトアミドである。ヨードアセトアミドは、急速な形で遊離スルフヒドリルと反応して、不可逆的チオエーテル結合を形成する水溶性化合物である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇを３７℃で様々な培地、システインおよびヨードアセトアミドと６０時間にわたってインキュベーションし、タンデムカラム変性ＳＥＣにより１本鎖形成およびタンデムカラム非変性ＳＥＣによりＨＭＷについて分析する。ヨードアセトアミドは１本鎖形成を遮断するだけでなく、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物および高塩の両方における凝集体形成についても遮断する。ヨードアセトアミドは、低シアル酸単量体における凝集体形成については遮断しない。しかしながら、低シアル酸物質で形成される凝集体の量は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物で形成される量と同等である。
【０６６８】
モデルにより、これまで十分には解明されていなかった機構に対する理解が深められた。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ製造過程における凝集体形成の少なくとも２つの主要経路が確認されたと思われる。第一経路では、大量の凝集体が生じ、遊離スルフヒドリルシステインが１本鎖物質の形成についてのアゴニストとして作用する。システインのアゴニスト作用は、ヨードアセトアミドの添加により遮断され得る。驚くべきことに、ヨードアセトアミドは、１本鎖形成および高分子量形成の両方に関するアンタゴニストである。ただし、上記プロセスは、下流精製中における発酵と比べて多量のシアル酸を含む組成物を生成するように設計されているものとする。凝集体をそれほど生じない第二経路では、少量のシアル酸を含む副物質（subspecies）が、１本鎖または凝集体の形成についてヨードアセトアミドによる影響を受けることはない。
【０６６９】
したがって、本発明は、タンパク質、すなわち２量体および１本鎖形態で存在し得るタンパク質の１本鎖：２量体形態の比率を減少させる方法であって、（１）上記タンパク質を発現する細胞を培養するための液体細胞培養培地を供給および／または維持（例えば段階（２）の間）し、ただし、上記培地は１本鎖形成に対する拮抗作用物質（例えばヨードアセトアミド）を含むものとし、次いで（２）細胞を培養してタンパク質を発現させる段階を含む方法を包含する。
【０６７０】
また本発明は、タンパク質、すなわち凝集体および２量体形態で存在し得るタンパク質の凝集体：２量体形態の比率を減少させる方法であって、（１）上記タンパク質を発現する細胞を培養するための液体細胞培養培地を供給および／または維持（例えば段階（２）の間）し、ただし、上記培地は凝集鎖形成および／または１本鎖形成に対する拮抗作用物質（例えばヨードアセトアミド）を含むものとし、次いで（２）細胞を培養してタンパク質を発現させる段階を含む方法を包含する。
【０６７１】
本方法の一実施態様では、上記タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合の形成を通じて２量体を形成させ得る糖タンパク質、例えば本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子である。
【０６７２】
これらのデータに基づき、凝集体形成への少なくとも２つの経路がＣＴＬＡ４−Ｉｇで誘導されていることを想像するのは難しくない。主要経路では、１本鎖が、未だ完全には解明されていない機構を通して凝集体の形成に関与している。１本鎖形成とは関係の無い第２の副経路は、凝集体の形成に関与している。これらの経路は、クロマトグラフィーにより分離され得る少なくとも３形態の高分子量物質が存在する理由を説明するのに役立ち得る。これらはモデルであるため、実際の影響（あるとすれば）およびその影響の大きさを測定するために、実際の発酵過程中に試験しなければならない。このデータに基づいて、現発酵過程およびシステインを欠く発酵について試験する際に熟慮するべきである。
実施例６：ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および四量体
【０６７３】
Ｂ７−１ ＩｇへのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および四量体結合
【０６７４】
本発明は、Ｂ７−１ ＩｇへのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および四量体結合の評価方法を提供する。物理特性（例、拡散係数、分子量、結合価）および器具作動パラメーター（例、流速、チップ密度）は、Biacore 検定結果に影響を及ぼし得る。質量転移制限下では、四量体の結合速度は、同一モル濃度の場合二量体よりも約２０％遅い。特定流速の場合、四量体分子は二量体ほど効率良くマトリックスを貫通しない可能性がある。高密度Ｂ７−１ Ｉｇ固定化チップ下において、四量体および二量体の競合的結合は、同等の阻害曲線を呈する。これは、四量体（４）対二量体（２）の理論的価がＢ７−１ Ｉｇへの結合に全く影響しないことを示している。四量体のモル濃度は、二量体標準曲線に基づいて算出され得る。この方法を用いることにより、Ｂ７−１ Ｉｇへの四量体の結合は、二量体と比べた場合同等の用量依存的応答を有することが見出された。
【０６７５】
四量体および二量体の結合能の比較は、標準および試料の製造に使用する測定ユニットにより影響される。四量体および二量体試料は、２０００ｎｇ／ｍＬの濃度で比較され得る。質量（ｎｇ／ｍＬ）に基づくと、各物質は、同一物質の標準曲線を用いたとき約１００％の結合能を示す。しかしながら、四量体の結合能は、二量体標準曲線で測定したときには半減しており、二量体の結合能は四量体標準曲線で測定したときの２倍を超えていた。Biacore 装置は、質量に基づいて分子間相互作用を検出するため、同一濃度（ｎｇ／ｍＬ）の四量体および二量体からのシグナル共鳴単位（ＲＵ）は当然同一である。検出システムは質量の関数であるが、分子間相互作用はモルに基づいて行われる。したがって、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体およびＶＴＬＡ４−Ｉｇ四量体のモル濃度は、２０００ｎｇ／ｍＬでそれぞれ２１.６ｎＭおよび１０.８ｎＭである。モル濃度を用いると、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体試料は両方とも、二量体標準曲線に基づいた同等の結合能を示す。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体標準曲線での同一モル濃度方法を用いると、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体試料は、四量体試料と比べて結合能のさらなる３０％増加を示す。この観察結果は、所定の開始結合速度について高い理論濃度をもたらす、高濃度での四量体標準曲線の傾きの減少に起因する。この観察結果についての一つの説明は、質量転移の影響である。
【０６７６】
質量転移制限実験は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体の開始結合速度が、同数の分子についてＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体よりも約２０％遅い（すなわち、四量体の結合速度は０.８の係数により二量体との差異を示す）ことを示している。観察されたこの差異は、２物質の分子量およびチップ表面への分子の拡散に対するその影響によるものである。分子の拡散係数は、分子量の立方根に可逆的に比例している。拡散係数が低いということは、分子の動きが遅いことを示す。各分子量に基づくと、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体の理論拡散係数は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の係数の０.８倍であり、または逆に言えば二量体の同係数は、四量体の１.２５倍である。実験データは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体が、モル濃度を用いてＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体標準曲線から計算された１３３％の能力を示すこの観察結果と一致する。高密度チップでの質量転移制限は、低い流速および低い被分析試料濃度では影響が大きい。流速が増すと、二量体は、四量体よりも速い開始結合速度を示す。したがって、四量体の高い分子量および低い拡散係数が、二量体と比べた場合の開始結合速度差異の一因となっている。
【０６７７】
Ｂ７１ ＩｇへのＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体および二量体の競合的結合は、四量体および二量体が質量転移制限条件下では類似した結合価を示すことを実証している。最初に二量体または四量体と結合させたＢ７−１ Ｉｇチップへの追加四量体の影響は、低い結合ポテンシャルを示す。追加二量体は最初にＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体と結合させたＢ７−１ Ｉｇチップに結合し得るため、この観察結果は結合部位利用能の制限によるものではない。マトリックスへの貫通の制限は、観察された四量体結合の減少の説明となり得る。
【０６７８】
分子が Biacore で結合する際の性質は、結果の解釈に影響を及ぼす。四量体および二量体分子は、質量転移制限条件下ではそれらの分子サイズが異なるため、異なる速度で拡散する。さらに、高密度チップの表面での立体障害は、マトリックスへの後続分子の貫通に影響を及ぼす。
【０６７９】
Biacore で濃度分析を実施するとき、物理特性、例えば分子量、拡散係数、および各物質の結合性を考慮に入れる必要がある。興味の対象である被分析試料との比較に使用する標準物質は、同一材料から成るべきである。しかしながら、分子サイズが考慮されるモル基準で標準および試料の両方が表される場合でも、四量体は依然として二量体標準に対して分析され得る。提示されたデータは、Ｂ７−１ ＩｇへのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体の結合が同等であることを示している。
【０６８０】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および四量体は両方とも、類似した会合速度（ｋon）を示す。しかしながら、四量体は、結合部位数の増加ゆえに結合活性に起因すると考えられる遅い解離速度（ｋoff）を示す。
【０６８１】
２タンパク質、例えばリガンドおよび受容体間の結合速度分析は、最大結合能力（Ｒmax）が５０〜１５０ＲＵの範囲になるように、約６００〜８００ＲＵの低密度のリガンドで固定化したチップを用いて Biacore で実施され得る。低密度チップの目的は、結合活性および質量輸送の影響を最小限にすることである。個々の結合部位の解離が行われるとき利用可能なリガンドが極めて接近しているため多価被分析試料がチップ表面に結合した状態である場合、結合活性が観察される。チップ表面およびバルク溶液間における被分析試料濃度に著しい差異があるとき、質量輸送が観察される。
【０６８２】
一具体例では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、単一鎖間ジスルフィド結合により結合された２本の１本鎖分子から成る二量体であり、Ｂ７分子に関する２個の結合部位を含む。別の具体例では、光散乱、ＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認されたところによると、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体の形成は、潜在的に結合部位をもつ分子をもたらす。精製単量体および二量体の結合速度を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体物質と統計比較する。ｋon速度に有意差は無い（ｐ値＞０.０５）。四量体のｋoff速度は、二量体のｋoff速度と著しく異なる。ＨＩＣクリーニングピークから精製された二量体のｋoff速度は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体物質のｋoff速度とはあまり異ならない。したがって、四量体は二量体よりゆっくりと解離することから、結合活性の影響は１分子あたりの結合部位の数の増加に起因することがわかる。
【０６８３】
四量体は、折りたたまれておらず、グアニジン処理により二量体に解離され得る。このグアニジン処理ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体を分析したところ、結果は、その結合速度特性が生理学的条件下で形成されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の場合と類似していることを示す。この観察結果は、観察された二量体および四量体間のｋoff速度差異が、分子の結合価および結合活性が結合速度論においてある一定の役割を演じる特異的 Biacore 方法独特の性質と関連しているという仮説を裏付けるものである。
【０６８４】
ＨＩＣクリーニングピークからのＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質のアフィニティー精製：
【０６８５】
プロテインＡ−Sepharose アフィニティークロマトグラフィー：５００ｍＬのＨＩＣクリーニングピークを、０.２２ミクロンの１Ｌフィルターシステム（Corning、コーニング、ニューヨーク、パート番号４３０５１７）で濾過し、ｐＨ７.４のリン酸緩衝食塩水（Sigma、セントルイス、ミズーリ、Ｐ−４４１７）で予め平衡させておいた、ｒProtein Ａ−Sepharose カラム（５ｃｍ×１５ｃｍ）に充填した。カラムを７００ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７.４で洗浄し、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３.５で溶離した。収集している間０.５ｍＬの２.０Ｍトリス、ｐＨ１０を収集管に添加することにより、各５０ｍＬのフラクションを中和した。フラクションを２８０ｎｍ吸光度で検定し、プールし、Centriprep ＹＭ−３カートリッジ（Millipore Corporation、ベッドフォード、マサチューセッツ、パート番号４２０３）を用いて濃縮した。精製タンパク質溶液を−７０℃で貯蔵した。
【０６８６】
ＰＲＯＳＥＰ−ｒＡ（組換えプロテインＡ）アフィニティークロマトグラフィー：５００ｍＬのＨＩＣクリーニングピークを、０.２２ミクロンの１Ｌフィルターシステム（Corning、コーニング、ニューヨーク、パート番号４３０５１７）で濾過し、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ８.０の２５ｍＭトリスで予め平衡させておいた、PROSEP-rA High Capacity（Millipore Corporation、ベッドフォード、マサチューセッツ）カラム（２５ｍｍ×２８ｃｍ）に流速２５ｍＬ／分で充填した。Waters ２７６７試料マネージャーおよびWaters ２９９６フォトダイオードアレイ検出器を備えた Waters PrepLC システムをこのクロマトグラフィーに使用した。カラムを３０分間２５ｍＬ／分の流速で２５平衡緩衝液により洗浄し、２５ｍＬ／分の流速で３０分間、１００ｍＭ酢酸溶液、ｐＨ３.０で溶離した。前もって管に加えておいた５０μｌの２.０Ｍトリス、ｐＨ１０において収集することにより溶離中各１０ｍＬのフラクションを中和した。２８０ｎｍの高い吸光度を有するフラクションをプールし、Centriprep ＹＭ−３カートリッジ（Millipore Corporation、ベッドフォード、マサチューセッツ、パート番号４２０３）を用いて濃縮した。精製タンパク質溶液を−７０℃で貯蔵した。
【０６８７】
サイズ排除クロマトグラフィー：Waters ２９９６フォトダイオードアレイ検出器（ミルフォード、マサチューセッツ）、および Millennium32バージョン３.２０またはEmpower ソフトウェアにより制御される Foxy ２００フラクションコレクターを備えた Waters Alliance ２６９５分離モジュールでサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。タンデム TOSOH BIOSCIENCE（モントゴメリー、ペンシルベニア）TSK G３０００ ＳＷ（２１.５ｍｍ×３００ｍｍ）およびタンデムＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷｘＬ（７.８ｍｍ×３００ｍｍ）カラムを、分取および分析的ＳＥＣにそれぞれ使用した。溶離したタンパク質を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度により観察した。
【０６８８】
二量体、四量体および多量体の分取的単離をプロテインＡ精製ＨＩＣクリーニングピーク物質のＳＥＣにより行った。プロテインＡ溶離液の１３試料（各々〜１０ｍｇ）を、１ｍＬ／分の流速で０.９％塩化ナトリウムを含む１００ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７.０の移動相を用いることにより分取タンデムＳＥＣカラムに注入した。フラクションを１３注入液の各々について９０〜１６０分間毎分収集した。単一注入液についての泳動時間は１８０分であった。
【０６８９】
各フラクションをタンデムカラム分析的サイズ排除ＨＰＬＣにより調べた。フラクション１３〜１５（多量体を含む）、フラクション２２および２３（四量体を含む）およびフラクション４３〜４９（二量体を含む）をプールした。精製した多量体、四量体および二量体フラクションを、動的光散乱検出（ＤＳＬ）による分析用２カラムＳＥＣで調べた。
【０６９０】
ＨＩＣクリーニングピークのＣＴＬＡ４−Ｉｇ成分および精製成分の固定化Ｂ７−１ Ｉｇへの生物特異的（biospecific）結合分析：ＣＴＬＡ４−Ｉｇの固定化Ｂ７−１ Ｉｇ（ＣＭ５カラム上）への生物特異的結合を、ＳＰＲベースのBIAcore Ｃバイオセンサー（BIAcore、AB、ピスキャタウェイ、ニュージャージー）を用いて測定した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質を用いて、標準曲線を作成した。Ｂ７−１ Ｉｇを、活性化ＣＭ５センサーチップ上に５０００〜１００００共鳴単位（ＲＵ）の密度で固定させた。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準標準液、品質対照（品質コントロール）(quality control)、および試料を、Ｂ７−１ Ｉｇセンサーチップ表面全体に２０μＬ／分の流速で注入することにより、センサーグラムを作成した。固定化Ｂ７−１ ＩｇへのＣＴＬＡ４−Ｉｇの開始結合速度（ＲＵ／ｓ）を、高密度Ｂ７−１ Ｉｇ表面での拡散制限条件下で測定したところ、これは試料中のＣＴＬＡ４−Ｉｇの活性濃度と直接相関関係を示した。標準、品質対照試料および未知試料濃度を、１２５〜８０００ｎｇ／ｍＬの名目範囲でＲＵ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ濃度をプロットすることにより作成した標準曲線から補外した。最終結果を結合パーセント（未知試料の平均濃度／試料／２０００）×１００として表した。
【０６９１】
モル質量および流体力学的半径の測定：ＳＥＣ分離をＴＳＫ３０００ ＳＷＸＬカラムおよび対応するガードカラムにより実施した。移動相は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、８５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.０により構成され、０.８ｍＬ／分での溶離用に無勾配条件を使用した。ＨＰＬＣ分析を周囲温度で実施し、試料を分析中４℃に維持した。モル質量測定は、１５の異なる散乱角度を用いるWyatt Dawn ＥＯＳを組み込むことにより、各物質に関する光散乱の角度変化を測定した。Zimm プロット形式をモル質量測定に用い、各物質の薄片をモル質量について平均化した。絶対モル質量を計算するのに使用する示差屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）値は、ａ）および Optilab ＤＳＰ 干渉計（ＲＩ）を用いて得られた０.１８９であった。フローセルに対し約９０°の角度で設置した光子相関装置 QELS 検出装置と直線に並べて流体力学的半径（Ｒｈ）測定を実施した。並進拡散定数をこのシグナルから測定し、アインシュタイン-ストークス関係を用いてＲhを計算する。Wyatt Technology からの Astra ソフトウェアバージョン４.９０を用いて、データ解析を実施した。
【０６９２】
二量体および四量体物質に関する分子量および流体力学的半径の値は、それぞれ８６〜９１ｋＤａおよび１７２〜１９９ｋＤａであることが見出された。クリーニングピーク試料は、分子量により六量体および十量体に対応するさらなるＨＭＷ物質を含むことが観察された。二量体物質に関する流体力学的半径の範囲は、３.８〜４.７ｎｍである。異種四量体物質の流体力学的半径の範囲は５.７ｎｍ〜６.２−６.３ｎｍであった。
【０６９３】
表面プラスモン共鳴を用いたＢ７−１ ＩｇへのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および四量体の結合：濃度分析：Ｂ７−１ Ｉｇに対する様々なＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質の濃度分析を、わずかな修正を加えたメソッド７４４１−４2にしたがって、Biacore ３０００装置（Biacore、ピスキャタウェイ、ニュージャージー）で実施した。修正は以下の内容を含む：Biacore CではなくBiacore ３０００を使用した。流速は、２０μＬ／分ではなく１０μＬ／分であった。試料を１５秒とは異なり６０秒間注入した。センサーチップ表面を、３０μＬ／分で１００ｍＭのＮａＣｌを含む、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４.０（再生緩衝液）の３回の短い３０秒（１５μＬ）パルス、次いで水の１回３０秒パルスにより再生した。
【０６９４】
ＣＭセンサーチップを、６０００〜１２０００共鳴単位（ＲＵ）の目標密度に向けて、酢酸緩衝液、ｐＨ５.０中２０μｇ／ｍＬの濃度でＢ７−１ Ｉｇにより固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中でＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質を６２.５〜８０００ｎｇ／ｍＬ（０.６７５〜８６.３ｎＭ）の濃度に、二量体を１２５〜１６０００ｎｇ／ｍＬ（０.６７５〜８６.３ｎＭ）の濃度に系列希釈することにより、標準液を調製した。単量体または二量体から成る試験試料を、〜２０００ｎｇ／ｍＬの目標濃度に希釈し、Biacoreで分析した。BIAevaluationソフトウェア（バージョン４.０.１）によりＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質（＞９８％単量体）または精製二量体の標準曲線を用いて濃度を測定した。Biacore で測定した濃度をＡ２８０ｎｍにより測定した濃度で割ったパーセンテージとして結合能を計算する。
【０６９５】
所定の表面への分子の結合速度は濃度の関数であり、未知濃度の測定を可能にする。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体は、濃度（ｎｇ／ｍＬ）の関数としてＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体と比べると高い結合速度を呈する。
【０６９６】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および四量体の結合能を表７にまとめる。ｎｇ／ｍＬに基づき、二量体試料の結合能を二量体標準曲線から計算したところ、９９.５％であることがわかった。また、これと同等の四量体試料の濃度は４７.２％である。逆に、二量体試料の結合能を、四量体標準曲線から計算したところ、２６６％であることが見出され、これと同等の四量体試料の濃度は１０３％である。しかしながら、二量体および四量体をモル濃度（ｎＭ）として表すとき、両物質の結合能は類似している。二量体標準曲線から計算した二量体および四量体試料の結合能は、それぞれ９９.４％および９４.３％である。四量体標準曲線では、それはそれぞれ１３３％および１０３％である。二量体および四量体の標準曲線は、モル濃度に基づくと類似している。
2010116402.tif 000032
【０６９７】
結合価：ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体（２５〜１６００ｎＭ）または四量体（２５〜４００ｎＭ）をＢ７−１ Ｉｇと様々なモル比で３分間予め混合した後、３０μＬの混合物を、９３９２ＲＵの密度で固定化したＢ７−１ Ｉｇチップ全体に１０μＬ／分の流速で注入した。再生緩衝液の３回３０秒パルス、次いで水の１回３０秒パルスによる各注入後チップは再生された。各注入の最後に得られたＲＵを比較した。
【０６９８】
理論的には、二量体分子の結合価は２である。各１本鎖は１個の結合部位から成る。四量体分子は、２個の二量体分子から成るため、その結合価は４である。二量体および四量体の見かけ上の結合価を測定するため、競合検定法を設計し、Biacore ３００で実施した。実験では、被分析試料をＢ７−１ Ｉｇと様々なモル比で３分間予め混合した後、混合物をＢ７−１ Ｉｇチップ（９３９２ＲＵ）へ１分間１０μＬ／分の流速で注入した。表１０は、モル量を増加させたＢ７−１ Ｉｇにより競合的に阻害された二量体または四量体のパーセンテージを示す。１.２５（Ｂ７−１ Ｉｇ）対１（二量体または四量体）のモル比では、９６.１％での単量体および８４.９％での二量体による競合的阻害において著しい差異が観察された。しかしながら、二量体および四量体が類似した阻害曲線を呈することから、結合価はほぼ等しいことが示唆されている。さらに、二量体および四量体は、低密度チップを用いると両方とも類似した阻害プロフィールを示した。
2010116402.tif 000033
【０６９９】
Ｂ７−１Ｉｇチップの飽和：まずＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体または四量体（２００、１０００または８０００ｎｇ／ｍＬ）を、高密度Ｂ７−１Ｉｇチップ（６７３８ＲＵ）全体に１０μＬ／分で１分間注入し、次いで単量体または二量体（２００、１０００または８０００ｎｇ／ｍＬ）の一連の７回１分注入を行った。再生緩衝液の４回２５μＬ注入、次いで水の２５μＬ注入による各条件の後、チップは再生された。各注入の最後に得られたＲＵを比較した。
【０７００】
表面再生をせずに二量体または四量体で予めコーティングしておいたＢ７−１Ｉｇ表面全体に二量体または四量体を繰り返し注入した。四量体との最初の結合により、二量体の後続注入による結合が妨げられることはないが、しかしながら、追加の四量体注入は、二量体注入と比較して結合速度の著しい減少をもたらした。二量体との最初の結合、それに続く二量体の注入により、結合は飽和に向かって増加する。それに続いて二量体プレコーティングチップへ四量体を注入すると、結合の緩やかな減少が見られることから、チップから分子が解離し、マトリックスへ四量体が貫通していないことがわかる。２００ｎｇ／ｍＬまたは８０００ｎｇ／ｍＬのＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を最初に注入しても類似した結果が観察される。
【０７０１】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ四量体はＢ７−１Ｉｇ受容体への高い結合活性を有する：精製カラム、例えばＨＩＣおよびＱＦＦカラムのクリーニングピークの廃棄部分を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質を、精製し、それらの結合速度を Biacoreで分析した。
【０７０２】
ＨＩＣクリーニングピークからのＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質：ＨＩＣカラムをＣＴＬＡ４−Ｉｇプロセスで使用することにより、高分子量物質、例えばＤＮＡを除去する。ＨＩＣカラムからのクリーニングピークからのＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質は、後続の精製および速度分析に使用され得る。ＨＩＣクリーニングピークをプロテインＡカラムに通すことにより、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質を全て捕獲し、存在し得る他の不純物を除去した。全ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質（すなわち、二量体、四量体、六量体、多量体）の混合物から成るプロテインＡカラムからの溶離液は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体標準と同等である見かけ上のｋonおよびｋoff速度を示した。２−カラムＳＥＣによるプロテインＡ溶離液の分離により、表１１にまとめたｋonおよびｋoff速度を有する、３種のＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質：二量体、四量体および六量体／多量体が生じた。ＨＩＣクリーニングピークからの精製二量体のシアル酸含有率は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体と比べて低かった。
【０７０３】
表１１では、７５〜２００ｎＭの試料濃度をＢ７−１Ｉｇチップ（６９４ＲＵ）で試験した。ＨＩＣクリーニングピークから精製したＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準と比べて低い結合性を示した。分解される四量体は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準と同等のｋonおよびｋof速度をもたらした。
2010116402.tif 000034
【０７０４】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体標準の７観察結果および精製二量体および四量体の１４観察結果に基づいたスチューデントのｔ検定を用いて、データの統計分析を実施した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体標準と精製二量体または四量体を比べても、ｋon速度に差異は無かった。しかしながら、基準液を精製四量体と比較したとき、ｋoff速度およびＫDは統計的に有意であった（表１２）。精製四量体を精製二量体と比較すると、ｋonおよびｋoff速度およびＫDは両方とも統計的に異なっていた。データを二量体および四量体にグループ分けしたが、試料を分類すると（すなわち、前端、後方など）、個々にそれらの結合速度論に影響を及ぼし得る僅かに異なる特性を有し得ることが当然指摘される。二量体については、ｋonおよびｋoff速度は、平均するとそれぞれ３.３±１.０×１０5Ｍ-１ｓ-1および８.８±３.５×１０-３ｓ-1であった。四量体のｋonおよびｋoff速度はそれぞれ２.６±０.８×１０5Ｍ-１ｓ-1および３.１±１.４×１０-３ｓ-1であった。
【０７０５】
表１２では、二量体（ｎ＝１４）および四量体（ｎ＝１４）およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体標準（ｎ＝７）を分析した。
2010116402.tif 000035
【０７０６】
ＱＦＦクリーニングピークからのＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質：ＱＦＦカラムは、生成物からの残留不純物の除去には最も使用されない精製カラムである。２−カラムＳＥＣ方法を用いて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質をＱＦＦカラムのクリーニングピークから単離し、Biacore ３０００で分析した。データは、この「ＱＦＦクリーニングピーク」試料の結合速度論は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体標準と類似していることを示した。さらに、ＱＦＦクリーニングピークから精製された二量体および四量体は両方とも、組成物から精製したものと比べた場合類似した結合速度論をもたらした。さらに、精製単量体フラクションのシアル酸含有率は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体標準よりも大きかった。
【０７０７】
グアニジン処理（四量体の二量体化）：四量体を、グアニジン処理により二量体に変換し、次いでリン酸緩衝液へ透析すると、分析的ＳＥＣにより二量体として存在することが確認され得る。ＨＩＣクリーニングピークからの「二量体化」四量体の速度論分析は、そのｋonおよびｋoff速度がＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の場合と類似していることを示した。
実施例７：ＭＳエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によるインタクト分析
【０７０８】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇを、１００ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８により最終濃度０.７ｍｇ／ｍＬに希釈した。PNGase F（New England Biolabs）を、１００ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で３０倍に希釈して、最終濃度１７単位／μＬとした。等量（各６０μＬ）の希釈試料および希釈グリコシダーゼ溶液を混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。
【０７０９】
生成した脱グリコシル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（２μＬ）を、Waters Oasis（登録商標）逆相抽出カートリッジカラム（２.１×２０ｍｍ）に充填した。充填したカラムを流速０.２ｍＬ／分で５分間、５％溶媒Ｂ（溶媒Ａ：水中１％蟻酸、溶媒Ｂ：アセトニトリル中１％蟻酸）で洗浄することにより脱塩し、溶離液の流れを変えて排出した。５分経過した時点で、急速勾配（１０分で５％溶媒Ｂから９５％溶媒Ｂ）により、カラムからのＣＴＬＡ４−Ｉｇの溶離を開始させた。次いで、流路を分岐後、溶離液を、４５μＬ／分で質量分析計（Waters Micromass Q-Tof micro（登録商標）Ｍ）へ注いだ（使用したクロマトグラフィーシステムは、Waters ２９９６検出器を備えた Waters Alliance ２６９５であった）。
【０７１０】
Q-Tof micro（登録商標）Ｍについてのキャピラリー電圧を３ｋＶに、試料コーン電圧を４０Ｖに設定した。０.９秒ごとのスキャンを１スキャンに平均化した。スキャン間隔は０.１秒であった。Q-Tof 分析装置は、ｍ／ｚ８００〜２５００を走査する。半最大ピーク高より高い部分に対応するスペクトル（ＴＩＣクロマトグラムで）を、Waters MassLynx（登録商標）Ｍソフトウェアにより合わせた。合わせたスペクトルを、Waters MaxEnt１デコンボルーションにかけた。分離度を１Ｄａ／チャンネルに設定し、均一ガウスダメージモデルを選択し、半高での幅を０.５〜１Ｄａに設定した。左ピークおよび右ピークについての最小強度比率を両方とも５０％に設定した。
実施例８：マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）
【０７１１】
窒素レーザー（３３７ｎｍ）を用いる OmniFlex（登録商標）（Bruker Daltonics、マサチューセッツ）でＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを得た。タンパク質試料を脱塩せずに使用するか、またはＣ4 ZipTip（登録商標）ピペット先端形態（Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ）で固相抽出を用いて脱塩した。ピペット先端をアセトニトリル−水（１：１ｖ／ｖ）で湿らし、使用前０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により平衡させた。次に、ピペットから試料１０μＬを３回吸引および放出することにより、ピペット先端部に充填した。充填した試料を１０μＬの０.１％ＴＦＡで３回洗浄した。脱塩タンパク質試料を、アセトニトリル対水（１：１ｖ／ｖ）１０μＬによりピペットから溶出させた。１μＬ試料（脱塩または緩衝液含有）を１μＬのマトリックス溶液と混合し、１μＬの混合物をステンレス鋼標的上に滴下することによりスポットした。マトリックス溶液は、０.１％ＴＦＡ含有の１：１水対アセトニトリル（ｖ／ｖ）中のシナピン酸飽和溶液であった。混合物をＭＡＬＤＩ試料プレートにスポットし、質量分析計に置く前に風乾した。２０ｋＶの加速電圧および２００ナノ秒の遅延時間を用いる遅延型抽出による直線型陽イオンモードで全タンパク質試料を分析した。合計４００の単ショットスペクトルを各試料から集積した。トリプシノーゲン（２３９８２ｍ／ｚ）、プロテインＡ（４４６１３ｍ／ｚ）およびウシアルブミン（６６４３１ｍ／ｚ）を含む標準タンパク質の混合物を用いて外部キャリブレーションを行った。
【０７１２】
ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
【０７１３】
ペプチド混合物を逆相クロマトグラフィーにより分離し、クロマトグラフィーピークからのフラクションを集め、蒸発乾固した。試料を５０μＬの２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.５中で再構成した。ＤＴＴを加えて５ｍＭの最終濃度とし、フラクションを５０℃で２０分間インキュベーションした。還元後、１０ｍＭの最終濃度となるようにＩＡＭを添加し、暗所中５０℃でさらに２０分間インキュベーションした。
【０７１４】
窒素レーザー（３３７ｎｍ）を用いる OmniFlex（Bruker Daltonics、マサチューセッツ）でＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを得た。１μＬの試料を１μＬのマトリックス溶液と混合することにより、試料を調製した。マトリックス溶液は、０.１％ＴＦＡ含有の１：１水対アセトニトリル中のａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸飽和溶液であった。混合物をＭＡＬＤＩ試料プレートのウェルにスポットし、質量分析計に置く前に風乾した。２０ｋＶの加速電圧および２００ナノ秒の遅延時間を用いる遅延型抽出による反射式陽イオンモードで全ペプチドを分析した。合計１００の単ショットスペクトルを各試料から集積した。アンギオテンシンII（１０４６.５４ｍ／ｚ）、アンギオテンシンＩ（１２９６.６８ｍ／ｚ）、物質Ｐ（１３４７.７４ｍ／ｚ）、ボンベシン（１６１９.８２ｍ／ｚ）、ＡＣＴＨクリップ１〜１７（２０９３.０９ｍ／ｚ）、ＡＣＴＨクリップ１８〜３９（２４６５.２０ｍ／ｚ）およびソマトスタチン（３１４７.４７ｍ／ｚ）を含む標準ペプチドの混合物を用いて外部キャリブレーションを行った。
実施例９：ＣＴＬＡ４−Ｉｇ１本鎖および多量体物質に対する培地および培地構成成分の影響の分析
【０７１５】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの低シアル酸サブフラクション、高シアル酸サブフラクション、単量体前端、および単量体物質を調製し、精製する。これらの試料を、０〜少なくとも６０時間の期間にわたって１本鎖および高分子量形成に対する培地および培地構成成分の影響を測定するように設計された一連のモデリング実験で使用する。調製緩衝液、ヨードアセトアミド、リン酸ナトリウム、塩化アンモニウム、基礎培地、発酵ブロス、培地１７７ｅ、培地濃縮酸溶液Ｉ、培地濃縮酸溶液II、インスリン、ＥＤＴＡ、システイン、リポ酸、グルタチオン、メチオニン、およびイーストレートを単独および組み合わせた場合の影響を試験する。
実施例１０：サイズによるＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の分析
【０７１６】
変性条件を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法は、異なるサイズのタンパク質物質の定量に使用され得る。一態様では、非変性条件を用いるタンデムＳＥＣ方法も、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ１本鎖物質の定量に使用され得る。１本鎖ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、鎖間ジスルフィド架橋を欠く物質であり得る。精製過程中に単離される１本鎖ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質を、天然１本鎖ＣＴＬＡ４−Ｉｇと称す。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の還元およびアルキル化により製造される精製１本鎖を、誘導１本鎖と称す。天然および誘導１本鎖ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、同じ特性を有する。
【０７１７】
材料：
一塩基性リン酸カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）ＡＣＳグレード
水酸化カリウム（ＫＯＨ）４５％ｗ／ｗ溶液ＡＣＳグレード
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）ＡＣＳグレード
液量調節可能シングルピペッター、１００＿Ｌ
ライニン（Rainin）、（カタログ番号Ｐ−１００）
水（Ｈ2Ｏ）ＨＰＬＣグレード
２.０ｍＬクライオバイアル Nalgene、（カタログ番号５０００−００２０）
濃塩酸（ＨＣｌ）Fisher（カタログ番号Ａ１４４−２１２）
水酸化ナトリウム、（ＮａＯＨ）１０Ｎ溶液
J.T.Baker（カタログ番号５６７４−０２）
１０００ｍＬフィルターユニット０.２２ｍｍ Corning、（カタログ番号４３０５１７）
ポリプロピレン１５ｍＬ試験管 Falcon、（カタログ番号３５２０９７）
アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）ＡＣＳグレード
一塩基性リン酸ナトリウム、一水和物（ＮａＨ２ＰＯ４／Ｈ２Ｏ）
水酸化カリウム（ＫＯＨ）ペレット
器具および条件
ＨＰＬＣシステム Waters ２６９５分離モジュール
カラム Toso Haas ５μTSK ３０００SWXL、３００ｍｍ×７.８ｍｍ内径（パート番号０８５４１）
ガードカラム Toso Haas ５μＴＳＫ ３０００ ＳＷＸＬ、４０ｍｍ×６.０ｍｍ内径（パート番号０８５４３）
検出器 Waters ２４８７ ２波長検出器  波長２８０ｎｍ  流速１ｍＬ／分
統合システム Empower
注入量 ２０μＬ
検定目標濃度 １０ｍｇ／ｍＬ
移動相０.２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ６.８、ＫＯＨ含有
検定泳動時間２０分
カラム温度  周囲温度
試料温度  ４℃
保持時間  単量体８.７分±１.０分、ＨＭＷ物質７.５分±１.０分
存在するとすれば、ＭＷ物質は単量体ピーク後に溶離する。
試薬
４Ｎ  水酸化カリウム（４Ｎ ＫＯＨ）（１００ｍＬ）
下記製法の一つを使用：
４０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水およびＫＯＨの４５％ｗ／ｗ溶液１１.６ｍＬを、１００ｍＬメスフラスコに加える。ＨＰＬＣグレードの水で容量を１００ｍＬにする。
１００ｍＬメスフラスコに、８０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を加え、２２.４グラムのＫＯＨペレットを秤量して入れ、完全溶解するまで機械的に攪拌する。ＨＰＬＣグレードの水で容量を１００ｍＬにする。
２５０ｍＬガラス試薬瓶に溶液を注入する。転回させることにより十分に混合する。１年間までの期間室温で貯蔵する。
移動相（０.２Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ６.８）
２７.２グラムのＫＨ2ＰＯ4および９.０グラムのＮａＣｌを秤量して１０００ｍＬビーカーに入れる。
マグネチックスターラーでの連続混合を用いて、固体を８００ｍＬのＨＰＬＣグレードの水に溶かす。
ｐＨ計を用いて、４ＮのＫＯＨ溶液により溶液のｐＨを６.８に調節する。ｐＨが６.８を超える場合、濃ＨＣｌでそれを調節する。
１０００ｍＬメスシリンダーを用いて、最終容量を１リットルにする。溶液を０.２２μｍフィルターユニットにより濾過する。
１０００ｍＬのガラス製試薬瓶へ移し入れ、５＋／−１分間真空脱気しながら超音波処理する。使用前に脱気する。
１ヶ月までの期間、室温で貯蔵する。
２Ｎ水酸化ナトリウム（２Ｎ ＮａＯＨ）
２０ｍＬの１０Ｎ ＮａＯＨを１００ｍＬのガラス製メスシリンダーに移し入れる。
ＨＰＬＣグレードの水で容量を１００ｍＬにする。
２５０ｍＬガラス製試薬瓶に溶液を移し入れる。転回させることにより十分に混合する。１年間までの期間室温で貯蔵する。
３.４５グラムのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏおよび２.９２グラムのＮａＣｌを秤量し、撹拌棒で混合することにより、９００ｍＬのＨＰＬＣグレードの水に溶かす。ｐＨ計を用いて、溶液のｐＨを２Ｎ ＮａＯＨにより７.４に調節する。ｐＨが７.４を超える場合、それを濃ＨＣｌにより調節する。
１０００ｍＬのメスシリンダーを用いて最終容量を１リットルにする。溶液を０.２２μｍフィルターユニットにより濾過する。
２〜８℃で６ヶ月までの期間貯蔵する。
カラム貯蔵緩衝液（０.０５％ｗ／ｖＮａＮ3、水中）
５０±５ｍｇのアジ化ナトリウムを秤量し、それを１０００ｍＬのビーカーにマグネチックスターラーで添加する。
５００ｍＬのＨＰＬＣグレードの水をビーカーに加え、完全に溶解するまで撹拌する。
容量を水により１Ｌにする。溶液を０.２２μｍフィルターユニットにより濾過し、１０００ｍＬのＨＰＬＣ試薬瓶に注入する。
６ヶ月までの期間室温で貯蔵する。
高分子量物質およびシステム適合性標準の製造
【０７１８】
加熱〜非加熱ＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準物質の３倍希釈液および１５％〜３０％高分子量物質面積パーセント量を製造する。１５ｍＬのFalcon 試験管で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ希釈緩衝液を用いて１０.０±１.０ｍｇ／ｍＬで約３ｍＬの基準物質を調製する。ＣＴＬＡ４−Ｉｇの出発濃度はＣＯＡからである。その値から１０.０±１.０ｍｇ／ｍＬ希釈を行う。２.０ｍＬクライオバイアル中で製造した１.０ｍＬの希釈基準物質を、１ｍＬピペッターを用いて移し入れ、それを４５±２分間６７±２℃の水浴中で加熱する。上記バイアルで製造した加熱基準物質を１５ｍＬ試験管へ１ｍＬピペッターで移し入れる。試験管の１ｍＬ容量の内容物を、合計１０回静かにピペットを上下に操作して移し入れる。これがシステム適合性標準である。貯蔵条件：１５０μＬアリコートのシステム適合性標準を２.０ｍＬクライオバイアル中で調製し、１年までの期間−８０±５℃で貯蔵する。出発濃度の基準物質を得、その値から１０.０±１.０ｍｇ／ｍＬ希釈を行う。最小限の１００μｌの基準物質および適量の希釈緩衝液を用いることにより、最終濃度を１０.０±１.０ｍｇ／ｍＬとする。希釈については以下の等式を用いる：
2010116402.tif 000036
【０７１９】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ薬剤物質については、最少量の１００μＬアリコートの試料および適量の希釈緩衝液を用いて、タンパク質濃度から１０.０±１.０ｍｇ／ｍＬの希釈を行い、１０.０±１.０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にする。希釈については以下の等式を用いる：
2010116402.tif 000037
【０７２０】
１０.０±１.０ｍｇ／ｍＬに希釈後、試料は２４時間までの間２°〜８℃で貯蔵され得る。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ薬品については、最少量の２００μＬアリコートの試料および適量の希釈緩衝液を用いて、タンパク質濃度から１０.０±１.０ｍｇ／ｍＬの希釈を行い、１０.０±１.０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にする。希釈については、次の等式を用いる：
2010116402.tif 000038
【０７２１】
移動相を１個の溶媒レザーバーに、ＨＰＬＣグレードの水を別のレザーバーに入れる。泳動前に超音波処理し、真空脱気する。検出器をつけ、作動前に１５分間暖気する。新しいかまたは現用のカラムを分析に使用する前、カラムをＨＰＬＣグレードの水で少なくとも２０分間洗い流し、次いで移動相緩衝液で少なくとも２０分間平衡させる。１.０ｍＬ／分の流速を用いる。システム適合性標準の１５０μＬアリコートを解凍し、それをオートサンプラーバイアルに添加し、オートサンプラーにバイアルを配置する。２０μＬの標準液を条件下で注入する。
【０７２２】
約７.５分で溶離する高分子量物質のパーセンテージを、下式にしたがって測定する（下式では、単量体は実際には二量体をいう）：
2010116402.tif 000039
式中：
Ａ＝高分子量物質のピーク面積
Ｂ＝単量体のピーク面積
【０７２３】
高分子量物質の面積パーセントは１５％未満であるべきではない。それが１５％未満である場合、追加の濃縮高分子量物質を上記システム適合性標準に加える。分離度（Ｒ）を測定し、保持時間を評価する。２０μＬのシステム適合性標準を注入する。下記等式を用いて、高分子量物質（保持時間約７.５分）および単量体ピーク（保持時間約８.７分）間の分離度を計算する（下式では、「単量体」は実際には二量体をいう）：
2010116402.tif 000040
式中：
ｔ1＝高分子物質の保持時間
ｔ2＝単量体の保持時間
Ｗ1＝高分子量物質のピーク幅
Ｗ2＝単量体のピーク幅
【０７２４】
ピークの両端から比較的直線的にベースラインへ延長した後、ピーク幅をピーク基部で測定する（分で）。保持時間およびピーク幅を同じユニットで測定する。一実施態様では、（Ｒ）は１.２以上でなくてはならず、ピークについての保持時間は８.７±１.０分であるべきである。
理論段数測定（Ｎ）
システム適合性標準クロマトグラムから、下記等式にしたがって理論段数（Ｎ）を計算することにより、カラムの効率を測定する：
2010116402.tif 000041
式中、
ｔ＝単量体の保持時間（分）
ｗ＝ピークの両端からベースラインへ延長することにより得られた単量体のベースラインでの幅（分）。
【０７２５】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質の合計６回の注入を行う。１０ｍｇ／ｍＬ基準物質を２００μＬ分量に分けてオートサンプラーバイアルに入れ、バイアルをオートサンプラーに設置し、６回注入する。クロマトグラムを処理し、各クロマトグラフに関して二量体ピーク面積を計算する。６クロマトグラフからの二量体ピーク面積を合計し、以下の等式にしたがって平均、標準偏差およびＲＳＤ％を計算する：
2010116402.tif 000042
式中、
Ｘ1,2,3...＝一連のデータにおける模範値
ｎx＝一連の値（ｘ）
５.４.４.２ 以下の要領で標準偏差を計算する：
2010116402.tif 000043
式中、
ｎ＝一連のデータにおける値（ｘ）の数
ｘ＝一連のデータにおける一つの値
５.４.４.３ 以下の要領で相対標準偏差（ＲＳＤ）％を計算する：
2010116402.tif 000044
注入順序の例：
2010116402.tif 000045
ピークの統合
【０７２６】
５.５〜１１.８分までのクロマトグラムにおける全ピーク面積を統合する。クロマトグラムのベースラインを拡大することにより、確実に全ＬＭＷおよびＨＭＷ物質の総面積が統合値に含まれるようにする。対照におけるピークに対応する試料中のピークについては無視する。包含容量ピーク（１１.８〜１３.５分）および後のピークはこの計算では考慮されない。しかしながら、包含容量での面積が総面積の０.１％またはそれより大きい場合には注目するべきである。二量体ピークは８.７±１.０分で溶離し、高分子量物質ピークは７.５±１.０分で溶離し、低分子量物質（例、存在するとすれば単量体）は二量体ピーク後に溶離する。全ピーク面積の０.１％を超える面積で２８０ｎｍ吸光度を有する高分子量物質、二量体または低分子量物質以外のピークがあれば、それらにも注目するべきである。以下の要領で面積パーセンテージを計算する（この実施例における「アバタセプト単量体」とは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体をいう）：
2010116402.tif 000046
単量体面積％＝１００−（ＨＭＷ面積％＋ＬＭＷ面積％）
式中：
Ａ＝アバタセプト単量体ピーク面積
Ｂ＝保持時間がアバタセプト単量体より少ない全ピークの総面積
Ｃ＝保持時間がアバタセプト単量体ピーク（包含容量を除く）より多い全ピークの総面積
【０７２７】
６.０×４０ｍｍガードカラムを用いて連続して設置した２本の７.８×３００ｍｍ ＴＳＫ Gel G3000SWXL（登録商標）カラム（Tosoh Biosep、モントゴメリー、ペンシルベニア）でのWater's Alliance（登録商標）２６９５（ミルフォード、マサチューセッツ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより試料を分離した。各精製試料２５マイクロリットルを注入し、１.０ｍＬ／分で０.１ＭのＮａ2ＨＰＯ4、０.１ＭのＮａ2ＳＯ4、ｐＨ６.８を用いた無勾配条件下で分離した。９９６ＰＤＡ（フォトダイオードアレイ）検出器（Waters、ミルフォード、マサチューセッツ）を用いて２８０ｎｍで試料を検出し、Millennium 4.0（登録商標）クロマトグラフィーソフトウェア（Waters、ミルフォード、マサチューセッツ）を用いて解析した。
【０７２８】
変性分析的タンデムサイズ排除クロマトグラフィーからの天然および誘導１本鎖物質の重ねたクロマトグラムは、それぞれ２７.９６±０.０２および２７.９９±０.０２の平均保持時間（６回繰り返し測定）を示す。天然１本鎖についての平均ピーク面積は、４９５５２５.０±９５８９.６であり、誘導１本鎖については４６３３１１.８±７９９７.２であることが見出された（表１３）。天然および誘導１本鎖物質の重ねたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、約１５０００質量単位のベースライン幅をもつ非常に広いピークを有する。これは、両試料におけるグリコシル化の不均一性に起因するものと予測される。各質量スペクトルにおける１本鎖ピークの頂点を用いて、平均質量を計算した。天然および誘導ＣＴＬＡ４−Ｉｇ１本鎖の平均質量は、６繰り返し測定の分析結果に基づくとそれぞれ４５６９４.４２６±２９７.７３５および４５３３３.０８６±２６４.７７８質量単位である（表１４）。天然１本鎖では、配列番号２のＣｙｓ146のところに余分のシステイン（残基質量１０３ダルトン）があり、誘導１本鎖は、アセチル基（質量５８ダルトン）を付加するアルキル化により１個の鎖間ジスルフィド架橋を選択的に還元した結果であるため、天然１本鎖質量は、誘導１本鎖質量より高いと予測される。
【０７２９】
これらのデータは、天然および誘導物質が、タンデム変性ＳＥＣクロマトグラフィーおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により均等内容の結果をもたらすことを示している。これらの結果は、天然および誘導ＣＴＬＡ４−Ｉｇ１本鎖物質間の同等性を立証している。
2010116402.tif 000047
2010116402.tif 000048
【０７３０】
ポリペプチド鎖内におけるシステインの存在により、分子内または分子間で二量体または多量体タンパク質複合体の形成を誘導し得るジスルフィド結合が形成され得る。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、二量体として存在し、前記二量体は、以下の配列のいずれか一つを有する２個の単量体が各鎖上のＣ146間における１個のジスルフィド結合により連結された形で構成される：（ｉ）配列番号２の２６〜３８３、（ii）配列番号２の２６〜３８２、（iii）配列番号２の２７〜３８３、（iv）配列番号２の２６〜３８２、（ｖ）配列番号２の２５〜３８２、および（vi）配列番号２の２５〜３８３。このジスルフィド結合の還元により、非共有結合的静電引力により連結される２個の均等タンパク質鎖が形成され得る。静電引力を圧倒するか、またはそれより影響力が大きい変性条件下におくと、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇは完全に解離して、約４６ｋＤａの２個の同一タンパク質構造を生じ得る。形成された構造は、１本鎖または単量体と称される。１本鎖の存在は、変性条件下で実施されるタンデムカラムサイズ排除クロマトグラフィーにより観測され得る。
【０７３１】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の部分集団は、Ｃｙｓ146上に修飾を含む。主要集団に存在するジスルフィド結合は、遊離システインアミノ酸に変換される（システイニル化と称す）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体は、主として約９２０００の分子量をもつタンパク質である。それは、１個の鎖間ジスルフィド結合および非共有結合的相互作用により連結された２本のグリコシル化ポリペプチド鎖（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ「二量体」とも称す）により構成される。精製タンパク質は、不均一集団として存在し、修飾、例えばＮ−およびＣ−末端にグリコシル化および変異を含む。
【０７３２】
鎖間ジスルフィド結合連鎖を欠くＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の異なる集団が存在する。この非共有結合的連結集団は、サイズ排除クロマトグラフィーにより生成された前端二量体ピーク内に存在する。前端二量体は、鎖間ジスルフィド結合を欠くことが見出された。鎖間ジスルフィド結合を欠くＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質は、Ｃｙｓ146がシステイニル化により修飾されており、その修飾は、ＥＳＩ−ＭＳインタクトデータに基づくと９９％を超える割合の１本鎖物質で起こる。Ｃｙｓ146システイニル化およびＯ−結合炭水化物の濃厚化は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ１本鎖物質における２つの主要な修飾である。前端二量体を変性サイズ排除クロマトグラフィーにかけると、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ１本鎖ピークが単離される。固相抽出（ＳＰＥ）を実施および実施せずに、精製前端単量体物質を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇと比較し、ＭＡＬＤＩで分析した。精製前端単量体は、２種の優勢な物質を含む：主たる物質はＳＰＥ処理については４７００５ｕまたは非処理については４６８９７ｕ、小さい方の物質はＳＰＥ処理については９５０７０ｕまたは非処理については９６１７２ｕ。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質もまた、２種の優勢な物質を含む：主たる物質はＳＰＥ処理については９１５１８ｕまたは非処理については９１１４３ｕ、小さい方の物質はＳＰＥ処理については４５６６０ｕまたは非処理については４６０１４ｕ。
2010116402.tif 000049
【０７３３】
一具体例では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物は、二量体、高ＭＷ物質、および低ＭＷ物質（例、単量体、１本鎖）のサイズ均一性（ＨＰＬＣ）分析によると以下の特性を有する。
≧９７.０％二量体
≦２.０％ＨＭＷ物質
≦０.５％ＬＭＷ物質（例、単量体、１本鎖）
別の具体例では、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物は以下の特有な量の各物質を有する：
≧９５.５％二量体
≦３.０％ＨＭＷ物質
≦０.５％ＬＭＷ物質（例、単量体、１本鎖）
2010116402.tif 000050
【０７３４】
プロセスＣＤ−ＣＨＯ１を用いて製造した薬剤物質について、単量体パーセントは９８.４〜９９.８％の範囲であり、平均値は９９.４％であった。ＨＭＷ物質のパーセンテージは０.２〜１.６％の範囲で変動した。平均値は０.６％であり、ＣＶは４５.７％であった。９５％許容区間は、二量体については９８.７％以上およびＨＭＷ物質については１.３％以下であった。バッチのＨＭＷ物質パーセントは、０.４％の最小値から２.１％の最大値の範囲で変動した。ＨＭＷ物質平均パーセントは０.８％であり、ＣＶ％は４０％であった。どの場合も、ＬＭＷまたは単量体物質は検出限界（ＤＬ＝０.１％）未満であった。プロセスＣＤ−ＣＨＯ１により製造されたＣＴＬＡ４−Ｉｇについての９５％許容区間（母集団の９９面積％についての適用範囲を提供する）は、ＨＭＷ物質についてはそれぞれ１.３以下および１.８以下であった。プロセスＣＤ−ＣＨＯ１からの薬剤物質における二量体についての９５％許容区間は、それぞれ９８.７％および９６.５％であった。
ＣＴＬＡ４−Ｉｇについて合わせたデータの要約
2010116402.tif 000051
【０７３５】
上表は、ＨＭＷ物質のパーセントが０.２〜２.１％の範囲であり、平均は０.６％であったことを示す。二量体は９４.８％〜９９.８％の範囲であり、平均値は９９.３％および精度は０.３％であった。二量体に関する部位間、部位内変動および全部位での変動は、０.３〜０.５％の範囲内であった。ＨＭＷについての部位間変動は２６.４％であった。部位内および全部位変動は、ＨＭＷ物質パーセントについてはそれぞれ４４.２および５１.４％であった。二量体（９７.３％）およびＨＭＷ物質（１.８％）についての９５％許容区間は明細の範囲内であった。
実施例１１：ベクター構築
【０７３６】
ｐｃＳＤ発現ベクターの構築：発現ベクター、ｐｃＳＤを、図２８に示した要領で市販のｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア）から構築した。制限エンドヌクレアーゼＮａｅＩでの消化によりネオマイシン耐性遺伝子カセットをプラスミドｐｃＤＮＡ３から除去した。制限エンドヌクレアーゼＮａｅＩは平滑末端を形成する。ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、３.８２１ｋｂのｐｃＤＮＡ３ベクターバックボーンをゲルから精製した。マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする遺伝子およびＳＶ４０プロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕIIおよびＢａｍＨ Ｉでのプラスミドの消化によりプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒから単離した。ｄｈｆｒ遺伝子カセットに対応する１.９３ｋｂフラグメントを分離し、アガロースゲル電気泳動により精製した。ＢａｍＨ Ｉ消化により生成された３−プライム陥没末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて満たし、平滑末端を形成させた。この単離フラグメントを、平滑末端３.８ｋｂのｐｃＤＮＡ３ベクターバックボーンに連結することにより、発現ベクターｐｃＳＤを作製した。この発現ベクターは、以下の特徴を有する：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、次いで多重クローニング部位、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列、選択および増幅を目的とするマウスｄｈｆｒ ｃＤＮＡ配列、およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）における選択および維持を目的とするアンピシリン耐性遺伝子およびｐＵＣ複製起点。
【０７３７】
ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現ベクターの構築：ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質をコード化する配列を含む１.２キロ塩基（ｋｂ）のＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩでの消化によりプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＴＬＡ４−Ｉｇから単離した。１.２ｋｂのＨｉｎｄIII／ＸｂａＩフラグメントを、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩで予め消化しておいたベクターｐｉＬＮに連結した。ｐｉＬＮ−ｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇと命名した、生成したプラスミド構築物を図２１に示す。ｐｉＬＮ−ｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇプラスミドを、最終発現ベクターｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇの構築で使用されるＣＴＬＡ４−Ｉｇコーディング配列の供給源として使用した。
【０７３８】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子発現用の最終ベクターを図２９に示す要領で構築した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を含む１.２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、２段階制限消化手順によりプラスミドｐｉＬＮ−ｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇから単離した。プラスミドｐｉＬＮ−ｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇをまず制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化した。生成した３−プライム陥没末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント処理により満たした。次いで、プラスミドを制限酵素ＸｂａＩで消化することにより、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を含む１.２ｋｂフラグメントを放出させた。このフラグメントを精製し、ｐｃＳＤの制限消化から単離したＥｃｏＲ ＶおよびＸｂａＩフラグメントに連結した。ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩ制限部位は、ＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含むカセット間のｐｃＳＤの多重クローニング部位に配置される。これによってＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子フラグメントをＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。このプラスミドは、ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇと命名され、配列番号１を含む。
実施例１２：ＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現ベクターのトランスフェクションにより安定したセルラインを得る
【０７３９】
この実施例および実施例１３では、個々のクローンが選択および増殖された細胞の新たにトランスフェクションされた集団について記載しており、そのため増殖されたクローンは、受入番号ＣＲＬ−１０７６２としてＡＴＣＣに寄託された細胞とは異なっている。ＣＴＬＡ４−Ｉｇに対応するアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ（ＡＴＣＣ受入番号６８６２９を有するＤＮＡ）を含む発現ベクターをもつ以前のＣＨＯセルラインは、米国特許第５４３４１３１号で報告されている。簡単に述べると、ＡＴＣＣ受入番号６８６２９で寄託されたｃＤＮＡを含む発現プラスミド（例えば、ｐＣＤＭ８）を、標準手順を用いてリポフェクチンによりｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞へトランスフェクションすることにより、安定してＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するセルラインを得た。培地中におけるＢ７結合活性についてＢ７陽性ＣＨＯセルラインを免疫染色の使用でスクリーニングすることにより、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現する安定したトランスフェクタントを得た。トランスフェクション細胞のこの不均一集団を、チャイニーズハムスター卵巣セルライン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−２４と命名し、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１０７６２として１９９１年５月３１日にブダペスト条約のもとＡＴＣＣに寄託した。
【０７４０】
チャイニーズハムスター卵巣セルライン、ＤＧ４４は、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子の欠失を含む。発現プラスミドｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇは、１コピーのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）を含む。ＤＧ４４ゲノムへのプラスミドｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇの挿入により、ｄｈｆｒ欠失が機能的に補完された。この機能的補完は、メトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下におけるトランスフェクタントの選択およびｄｈｆｒおよび近接遺伝子の増幅に使用され得る。
【０７４１】
図２９に示した要領により、ｐｃＳＤｈｕＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現プラスミドでセルラインＤＧ４４をトランスフェクションすることにより、ヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇ分泌性セルライン１Ｄ５を構築した。当業界で公知の標準的手順を用いて電気穿孔によりプラスミドＤＮＡをＤＧ４４細胞へ導入した。５％（ｖ／ｖ）透析胎児ウシ血清を補った最小必須培地（ＭＥＭ；JRH Biosciences,Inc.、カンサス）を用いて、トランスフェクタントを選択した。サンドイッチＥＬＩＳＡ方法を用いて、トランスフェクタントからの培養上清を、ヒトＩｇＧ産生についてスクリーニングした。Ｆｃ−特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧを捕獲抗体として用いた。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、ヒトＩｇＧを検出した。高レベルのヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を発現するトランスフェクタントをさらなる増幅用に選択した。
【０７４２】
ＭＴＸを１００ｎＭの最終濃度で培養培地へ添加することにより、選択されたトランスフェクタントの遺伝子増幅を実施した。ＭＴＸは、ジヒドロ葉酸レダクターゼの競合的阻害剤として作用する葉酸類似体である。培地へのＭＴＸの添加により、多コピーのｄｈｆｒ遺伝子を含むトランスフェクタントが選択され得、ジヒドロ葉酸レダクターゼのレベルが上昇した。ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡ方法を用いて、多コピーの隣接ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を含むトランスフェクタントも同定した。１Ｄ５と命名したＣＴＬＡ４−Ｉｇ産生クローンを、一部実施例１３で記載した、さらなる展開用に選択した。
実施例１３：安定したトランスフェクション細胞のサブクローニング
【０７４３】
セルライン１Ｄ５を軟寒天クローニングにかけた。ＥＬＩＳＡ方法を用いて、軟寒天クローニングから誘導されたサブクローンをヒトＩｇＧ産生について分析した。選択されたサブクローンをＣＴＬＡ４−Ｉｇ産生および成長特性について評価した。１Ｄ５−１００Ａ１と命名した先導サブクローンを選択した。
【０７４４】
１Ｄ５−１００Ａ１セルラインを、動物由来の原材料を含むＤＥ培地（JRH Biosciences,Inc.、カンサス）からＣＤ−ＣＨＯと命名した化学的に特定された培地に適合させた（表１５）。ＣＤ−ＣＨＯ培地は、カリフォルニア、カールスバッドのInvitrogen Corporation により製造された専売の動物成分不含有培地である。
2010116402.tif 000052
【０７４５】
標準組織培養プロトコルにしたがって、セルライン１Ｄ５−１００Ａ１を、ＤＥ培地中で培養および継代した。次いで、細胞を、５０％ＤＥ培地および５０％ＣＤ−ＣＨＯ培地から成る培地へ移した。この培地で数回継代後、細胞を、１００％ＣＤ−ＣＨＯ培地含有のＴ−フラスコへ移した。細胞を１００％ＣＤ−ＣＨＯ培地中で数継代増殖させた。次いで、適合した細胞を制限希釈によりクローニングにかけた。
【０７４６】
ＣＤ−ＣＨＯ適合化１Ｄ５−１００Ａ１セルラインからの細胞を、血清不含有培地を用いた制限希釈によりクローン化した。１Ｄ５−１００Ａ１細胞を、１細胞／ウェルの目標で補足ＭＣＤＢ培地を含む９６ウェルのマイクロタイタープレートへ播種した。ＭＣＤＢは、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ）販売の化学的に特定された培地処方物である。ＭＣＤＢ培地に４ｍＭのグルタミン、５００μｇ／ｍＬの組換えヒトインスリン、１００ｎＭのＭＴＸおよび１０％条件培地を補った。条件培地は、ＭＣＤＢ培地で増殖させたＣＤ−ＣＨＯ適合化１Ｄ５−１００Ａ１セルラインの培養物からのフィルター滅菌上清であった。
【０７４７】
単コロニーを含むウェルを同定し、ＥＬＩＳＡ方法を用いてクローンをＣＴＬＡ４−Ｉｇ産生について評価した。選択されたクローンを９６ウェルのマイクロタイタープレートから６ウェルの培養プレートへ増殖させた。さらに培養物を２５ｃｍ2Ｔ−フラスコ、次いでローラーボトルへ増殖させた。
【０７４８】
ローラーボトル培養物を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ力価、ＣＴＬＡ４−Ｉｇシアル酸含有率および成長について評価した。３つのクローンを、バイオリアクターでのさらなる評価およびさらなる特性確認用に選択した。−８０℃で貯蔵したクローンセルライン１Ｄ５−１００Ａ１.１７の冷凍バイアル研究保存液を用いて細胞バンクを作製した。
実施例１４：フィード-バッチ法によるバイオリアクターでのＣＴＬＡ４−Ｉｇの製造
【０７４９】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現する懸濁哺乳類細胞の商業規模培養：この実施例では、懸濁培養ｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞からの、配列番号２単量体を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の製造について記載する。この実施例で記載した方法は、限定するわけではないが、分泌タンパク質、例えばサイトカインおよび他のホルモン、Ｉｇスーパーファミリーの構成員であるか、またはＩｇスーパーファミリータンパク質の一部分を構成する分泌タンパク質、およびＣＨＯ細胞で発現されるタンパク質全般を含む、他の組換えタンパク質の製造にも適合化および拡大され得る。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ培養段階についての工程フローチャートを図１０に示す。
【０７５０】
培養フラスコ（例えば、Ｔ−１７５およびエルレンマイヤーフラスコ）、ローラーボトル、および細胞（培養）バッグを、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ培養工程の接種材料増大段階に使用して、冷凍バイアルからの細胞を連続増殖させることにより、２００００−Ｌバイオリアクターに接種するのに十分な数の生存しうる細胞を供給した。
【０７５１】
単一バイアルの細胞を、液体窒素貯蔵冷凍庫の気相から取り出し、３７℃の水浴中で解凍した。バイアルの内容物全体を、滅菌１５ｍＬ円錐型遠心分離管に無菌状態で移した。ＣＤ−ＣＨＯ培地を加えて、最終容量を１０ｍＬにする。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを１０ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ細胞培養培地に再懸濁した。再懸濁した細胞を、１０ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地を含むＴ−１７５フラスコに移した。Ｔ−１７５フラスコ中における培養物の生細胞密度および生存能パーセントを測定する。≧８４％というこの段階での生存能パーセント基準を確立した。ＣＤ−ＣＨＯ培地をＴ−１７５フラスコに添加することにより、１.７〜２.６×１０5細胞／ｍＬの目標生細胞密度を達成する。
【０７５２】
Ｔ−１７５フラスコを、６％二酸化炭素の雰囲気中３７℃で最大４日間インキュベーションすることにより、≧６×１０6生細胞という目標最終細胞数を達成する。Ｔ−１７５フラスコ段階後、図１０に示したとおり、培養物を一連の振とうフラスコ、１−Ｌおよび２−Ｌローラーボトルを用いて増大させる。各継代では、細胞を２.０×１０5生細胞／ｍＬの目標密度で播種し、培養物について最終培養細胞生存能が８０％以上となるように目標を定めた。培養物を、３７℃で６％二酸化炭素の雰囲気中最大４日間、ＣＤ−ＣＨＯ培地中でインキュベーションする。
【０７５３】
培養物の増大を一連の細胞（培養）バッグ（２０−Ｌ、１００−Ｌおよび２００−Ｌ）で行うことにより、さらには１０００−Ｌバイオリアクターに接種する。２−Ｌローラーボトル接種材料増大段階からの細胞培養材料をプールし、２.０×１０5生細胞／ｍＬの目標播種密度で２０−Ｌ細胞培養バッグに接種する。１.０〜２.０×１０6細胞／ｍＬの２−Ｌローラーボトル接種材料増大段階での最終生細胞密度および８０％以上の最小細胞生存能パーセントという条件を確立した。接種時、２０−Ｌ細胞バッグ培養物を、６％二酸化炭素の雰囲気中３７℃で最大４日間、ＣＤ−ＣＨＯ培地中でインキュベーションする。各後続継代（１００−Ｌおよび２００−Ｌ細胞バッグ）について、細胞を２.０×１０5生細胞／ｍＬの目標密度で播種し、培養物について最終培養細胞生存能が８０％以上となるように目標を定めた。培養物を、６％二酸化炭素の雰囲気中３７℃で最大４日間、ＣＤ−ＣＨＯ培地中でインキュベーションする。１.０〜２.０×１０6細胞／ｍＬの２０−Ｌ、１００−Ｌおよび２００−Ｌ細胞バッグ接種材料増大段階での最終生細胞密度についての模範値および８０％以上の最小細胞生存能パーセントを確立した。これらの模範値により、確実に１０００−Ｌバイオリアクターへ接種するのに十分な数の生細胞が使用されることになる。
【０７５４】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ製造過程の１０００−Ｌおよび４０００−Ｌシードバイオリアクター接種材料増大段階の目的は、２００００−Ｌの生産型バイオリアクターに接種するのに十分な数の生細胞を供給することである。
【０７５５】
ＣＤ−ＣＨＯ細胞培養培地を用いて、シードバイオリアクターをバッチ方式で操作する。温度、ｐＨ、溶解酸素、圧力、振動、空気、酸素および二酸化炭素についての気流速度を、分散制御システム（ＤＣＳ）により制御し、シードバイオリアクターにおける培養物の最適な増殖条件を提供させる。シードバイオリアクターを３７℃で作動させる。生細胞密度、生存能パーセントおよび代謝物濃度の測定用に、培養試料をシードバイオリアクターから取り出す。
【０７５６】
１０００−Ｌシードバイオリアクターに、１.０〜３.０×１０5生細胞／ｍＬの目標初回生細胞密度となるように２００−Ｌ細胞バッグ増大段階からの接種材料を接種する。培養物を３７℃で最大５日間、ＣＤ−ＣＨＯ培地でインキュベーションする。１０００−Ｌシードバイオリアクター接種材料増大段階での最終生細胞密度についての模範値は、１.０〜２.０×１０6細胞／ｍＬであり、最小細胞生存能パーセントは８０％以上である。
【０７５７】
４０００−Ｌシードバイオリアクターに、１.０〜３.０×１０5生細胞／ｍＬの目標初回生細胞密度となるように１０００−Ｌシードバイオリアクター増大段階からの接種材料を接種する。培養物を３７℃で最大６日間、ＣＤ−ＣＨＯ培地中でインキュベーションする。４０００−Ｌシードバイオリアクター接種材料増大段階での最終生細胞密度についての模範値は、１.０〜２.０×１０6細胞／ｍＬであり、最小細胞生存能パーセントは８０％以上である。これらの模範値により、確実に２００００−Ｌ生産型バイオリアクターへ接種するのに十分な数の生細胞が使用されることになる。
【０７５８】
２００００−Ｌシードバイオリアクターに、１.０〜１.８×１０5生細胞／ｍＬの目標初回生細胞密度となるように４０００−Ｌシードバイオリアクター増大段階からの接種材料を接種する。培養物を３７℃で最大６日間、ＣＤ−ＣＨＯ培地中でインキュベーションする。２００００−Ｌシードバイオリアクター接種材料増大段階での最終生細胞密度についての模範値は、１.０〜２.０×１０6細胞／ｍＬであり、最小細胞生存能パーセントは８０％以上である。これらの模範値により、確実に２００００−Ｌ生産型バイオリアクターで生産段階を開始する前に十分な数の生細胞が使用されることになる。
【０７５９】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇの商業規模生産：２００００−Ｌ生産型バイオリアクターで行われる本発明の製造段階では、大量かつ高品質のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質が生産され、２段階温度シフトを有する培養過程が含まれる。ＣＤ−ＣＨＯ培地中３７℃で最大６日間インキュベーション（上記と同様）した２００００Ｌ培養物を、６日目（対数成長期の最後）に３７℃から３４℃までの温度シフト（Ｔ−シフト）にかける。３７℃から３４℃への温度シフトの１２時間後、ＣＤ−ＣＨＯ培地に修飾ｅＲＤＦ飼料培地（Invitrogen Corp.、カールスバッド、カリフォルニア、表１６、１７）を補足し、この飼料を生産用リアクターに毎日ボーラス（１％ｗ／ｗ）として供給する。
2010116402.tif 000053
2010116402.tif 000054
2010116402.tif 000055
【０７６０】
ｅＲＤＦ飼料培地を毎日補充するＣＤ−ＣＨＯ培地中で、２００００Ｌ培養物を３４℃で最大４日間インキュベーションする。１０日目、２００００Ｌ培養物を２回目の３４℃から３２℃へのＴ−シフトにかける。生産型バイオリアクター中の２００００Ｌ生産培養物を、最大８日間３２℃で維持した。１８日目、培養試料を以下の模範値について分析した：２００００−Ｌシードバイオリアクター製造段階での生細胞密度は３.０〜８.０×１０6細胞／ｍＬである；最小細胞生存能パーセントは３８％以上である；最終シアル酸モル比（他の箇所で記載）は６以上である；そして最終ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質生成物力価は０.５〜１.３ｇ／Ｌである。これらの模範値により、確実に十分な品質および量のタンパク質製品が組換えＣＨＯセルラインにより生産され、そして２００００−Ｌ哺乳類細胞培養物を採取する準備ができていることになる。
【０７６１】
製造段階におけるバイオリアクター中の培養物には、次の要領で改変ｅＲＤＦ培地を用いて日常のボーラス飼料を与える（表１６、１７）：初回温度シフト（３７℃から３４℃）の１２時間後に開始し、最小限１％培養容量を給餌培地として添加した；グルコースレベルが３ｇ／Ｌ未満に落ちた場合、計算した量を添加することにより、グルコースレベルを３ｇ／Ｌに戻す。
【０７６２】
製造段階は、２００００Ｌ規模で持続期間は１８日であった。サンプルを毎日生産型バイオリアクターから分析用に採取した。例えば、細胞計数に使用する試料を、トリパンブルー（Sigma、セントルイス、ミズーリ）で染色した。血球計を用いて細胞数および細胞生存能の測定を実施することにより、顕微鏡下で生存可能な染色細胞を計数した。代謝物の分析については、追加の試料アリコートを２０分間２０００ｒｐｍ（４℃）での遠心分離にかけて、細胞を沈降させた。当業界で常用されている技術およびプロトコルを用いて、上清をタンパク質力価、シアル酸、グルコース、ラクテート、グルタミン、グルタメート、ｐＨ、ｐＯ2、ｐＣＯ2、アンモニア、およびＬＤＨについて分析した。
実施例１５：組換えＣＴＬＡ４−Ｉｇの精製
【０７６３】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ精製のためのＱＸＬアニオン交換クロマトグラフィー：ＣＴＬＡ４−Ｉｇ製造におけるアニオン交換クロマトグラフィー段階では、Ｑセファロース高結合容量（ＱＸＬ）アニオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いる。この樹脂は、ウィスコンシン、ウォーケシャのGE Healthcare（元 Amersham Biosciences）により供給される。ＱＸＬクロマトグラフィー工程では、さらなる下流プロセッシングを行うための採取工程からの製造過程物質からのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体を捕捉および濃縮する。
【０７６４】
１.０〜２.０ｍ内径カラムに、約６４３Ｌ〜１０１８Ｌの体積に相当する、１７〜３０ｃｍの高さまでＱＸＬ樹脂を充填する。充填カラムの理論段（ＨＥＴＰ）および非対称性（Ａs）と同等になる高さを測定することにより、カラムを使用に適したものにする。０.０２〜０.０８ｃｍのＨＥＴＰおよび０.８〜１.２のＡsをＱＸＬカラムの適格化に使用する。
【０７６５】
周囲温度でＱＸＬカラム操作を実施する。澄明な細胞培養ブロスを平衡させたＱＸＬカラムに充填する。９９.４Ｌ／分の最大流速を用いてＱＸＬクロマトグラフィー工程を実施する。カラム引入圧を３５ｐｓｉｇ未満に維持する。ＱＸＬカラムについての最大ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質充填量は、樹脂１リットルにつき２８グラムのＣＴＬＡ４−Ｉｇである。
【０７６６】
ＱＸＬクロマトグラフィーカラムをまず１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で無菌化する。２〜４カラム容量（ＣＶ）の１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いて無菌化を実施する。カラム流出液の伝導性が１６９±３３ｍＳ／ｃｍに等しくなると無菌化は完了であり、カラムを６０〜１２０分間保っておく。
【０７６７】
無菌化工程後、カラムを７５ｍＭのＨＥＰＥＳ、３６０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８.０緩衝液で平衡状態にする。最小限３ＣＶの平衡緩衝液がカラムを通過し、流出液のｐＨが８.０±０.２であり、流出液の伝導性が１３.４±１.０ｍＳ／ｃｍになると、平衡に達したことになる。
【０７６８】
採取操作工程からの製造過程物質を、ＱＸＬカラムに充填する。カラムを最小限１０ＣＶの洗浄緩衝液（７５ｍＭのＨＥＰＥＳ、３６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０）で洗浄し、洗浄工程の最後にカラム流出液の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）を測定する。次いで、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、３２５ｍＭのＮａＣｌまたは８５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.０緩衝液によりカラムからＣＴＬＡ４−Ｉｇを溶離する。Ａ280が洗浄工程の最後の吸光度単位（ＡＵ）値を越えて０.０２ＡＵ以上まで増加したとき、溶離液の流れを収集容器に向ける。溶離ピークのトレーリングエッジのＡ280が１.０ＡＵ以下の値に減少するまで溶離液を集める。
【０７６９】
シアル酸モル数対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質モル数のモル比が８以上であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体生成物を集めると、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量物質のプールは２５.７％以下の割合で存在する。次いで、四量体を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量物質をさらに精製することにより、本明細書記載の処理方法における単独物質として使用し得る。
【０７７０】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ精製用のフェニルセファロースＦＦ ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程では、フェニルセファロース高流速樹脂（ウィスコンシン、ウォーケシャのGE Healthcare（元 Amersham Biosciences））を使用する。ＨＩＣ工程により、ＱＸＬ生成物プールに存在するＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量物質のレベルは低下する。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体は、ＨＩＣ工程に使用されるローディング条件下ではＨＩＣ樹脂に結合しない。
【０７７１】
１.０〜２.０ｍ内径カラムに、約６８０Ｌ〜８５２Ｌの体積に相当する、１８〜２２ｃｍの高さまでフェニルセファロース高流速樹脂を充填する。充填したカラムのＨＥＴＰおよびＡsを測定することにより、カラムを使用に関して適格化する。０.０２〜０.０８ｃｍのＨＥＴＰおよび０.８〜１.２のＡsをＨＩＣカラムの適格化に使用する。
【０７７２】
周囲温度でＨＩＣカラム操作を実施する。ＱＸＬカラム工程からの溶離液プールを、それ以上処理せずに平衡ＨＩＣカラムに充填する。６５.４Ｌ／分の最大流速および１３ｐｓｉｇ以下の引入圧でＨＩＣ工程を実施する。ＨＩＣカラムに適用される最大ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質充填量は、樹脂１リットルにつき１０.０ｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質である。多サイクルのＨＩＣ工程が、ＱＸＬ溶離液プール存在するＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の量に基づいて使用され得る。
【０７７３】
ＨＩＣカラムをまず１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で無菌化する。２〜４ＣＶの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液がカラムを通過したとき、無菌化は完了である。次いで、カラムを６０〜１２０分間保っておくことにより、無菌化を確実にする。
【０７７４】
無菌化工程後、カラムを７５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２.５５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７.０緩衝液で平衡状態にする。最小限３ＣＶの平衡緩衝液がカラムを通過し、流出液のｐＨが７.０±０.３であり、伝導性が７１.５〜７５.５ｍＳ／ｃｍになると、平衡に達したことになる。
【０７７５】
ＱＸＬ工程からの溶離液を、平衡ＨＩＣカラムに適用する。次いで、流出液のＡ280が０.８〜１.０ＡＵに減少するまで、カラムをチェイス平衡緩衝液で洗浄する。ＨＩＣ工程の各サイクルからのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質含有流出液を、０.２μｍ酢酸セルロースフィルターを通して一般的なステンレス鋼収集容器中へ濾過する。このＨＩＣ生成物プールを２°〜８℃で収集容器に保つ。収集容器中での最大保管期間は３日である。
【０７７６】
シアル酸モル数対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質モル数のモル比が８以上であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体生成物を集めると、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量物質のプールは２.５％以下の割合で存在する。
【０７７７】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ精製のための組換えプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー：下流ＣＴＬＡ４−Ｉｇ製造工程で使用する組換えプロテインＡセファロース高流速アフィニティー樹脂（ｒＰＡ）を、GE Healthcare（ウィスコンシン、ウォーケシャ（元 Amersham Biosciences））から入手する。ｒＰＡカラムクロマトグラフィー工程では、さらにＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を精製する。この工程で、ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質、例えば単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を除去する。
【０７７８】
８０〜１４０ｃｍ内径カラムに、約３３９Ｌ〜３７２Ｌの容量に相当する、１８〜２５ｃｍの高さまでｒＰＡ樹脂を充填する。充填したカラムのＨＥＴＰおよびＡsを測定することにより、カラムを使用に関して適格化する。０.０２〜０.０８ｃｍのＨＥＴＰおよび０.８〜１.２のＡsをカラムの適格化に使用する。樹脂寿命試験で確立されたｒＰＡ樹脂についての最大使用回数は６０である。
【０７７９】
周囲温度でｒＰＡカラム操作を実施する。ウイルス不活化生成物プールを、平衡ｒＰＡカラムに充填する。２６.７Ｌ／分の最大流速および１３ｐｓｉｇ以下の引入圧でｒＰＡ工程を実施する。ｒＰＡカラムに適用される最大ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質充填量は、樹脂１リットルにつき２５ｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質である。
【０７８０】
ｒＰＡカラムを２５ｍＭのトリス、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０緩衝液で平衡状態にする。最小限３ＣＶの平衡緩衝液がカラムを通過し、流出液のｐＨおよび伝導性の値がそれぞれ７.８〜８.２および２３.０〜２７.０ｍＳ／ｃｍであるとき、平衡に達したことになる。
【０７８１】
ウイルス不活化工程生成物プールを、平衡ｒＰＡカラムに適用する。ｒＰＡクロマトグラフィー工程は２回の洗浄工程を含む。最小限５ＣＶの２５ｍＭトリス、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０.５％Triton X-100、ｐＨ８.０緩衝液を用いて、第一洗浄工程を実施し、ｒＰＡカラムから弱結合物質を除去する。２５ｍＭのトリス、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０緩衝液を用いて、第二洗浄工程を実施する。第二洗浄工程では、最小限５ＣＶを用いることにより、残留したTriton X-100をｒＰＡカラムから除去する。
【０７８２】
１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３.５緩衝液によりｒＰＡクロマトグラフィーカラムからＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を溶離する。Ａ280がベースラインを越えて０.２ＡＵ以上まで増加したとき、溶離液の流れを収集容器に向ける。カラム流出液を０.２μｍ酢酸セルロースフィルターにより濾過し、アジテーターを備えた収集容器に集める。溶離ピークのトレーリングエッジのＡ280が０.２ＡＵ以下の値に減少するまで溶離液を集める。溶離液プールのｐＨを、２ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８.０緩衝液によりｐＨ７.５±０.２に調節する。ｒＰＡクロマトグラフィー工程生成物プールを最大３日間２°〜８℃に保つ。
【０７８３】
シアル酸モル数対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質モル数のモル比が８以上であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体生成物を集める。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量物質のプールは２.５％以下の割合で存在し、ＭＣＰ−１のプールは３８ｎｇ／ｍＬ以下の割合で存在する。
【０７８４】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ精製のためのＱＦＦアニオン交換クロマトグラフィー：下流ＣＴＬＡ４−Ｉｇ製造工程におけるアニオン交換クロマトグラフィー工程では、Ｑセファロース高流速（ＱＦＦ）アニオン交換クロマトグラフィー樹脂（GE Healthcare、ウィスコンシン、ウォーケシャ（元 Amersham Biosciences））を使用する。ＱＦＦクロマトグラフィー工程の目的は、残留プロテインＡレベルを低下させ、ウイルス濾過工程生成物プールから宿主細胞ＤＮＡをさらに減少させることである。また、ＱＦＦカラム工程を用いることにより、ＱＦＦクロマトグラフィー工程生成物プールのシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質モル比を制御し、製造過程ＣＴＬＡ４−Ｉｇ ＨＭＷ物質レベルをさらに制御する。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ ＨＭＷ物質の低減化に関する主たる製造過程制御ポイントはＨＩＣ工程である。
【０７８５】
６０〜１４０ｃｍ内径カラムに、約５３６Ｌ〜６６７Ｌの容量に相当する、２８〜３５ｃｍの高さまでＱＦＦ樹脂を充填する。充填したカラムのＨＥＴＰおよびＡsを測定することにより、カラムを使用に関して適格化する。０.０２〜０.０８ｃｍのＨＥＴＰおよび０.８〜１.２のＡsをカラムの適格化に使用する。
【０７８６】
周囲温度でＱＦＦカラム操作を実施する。ウイルス濾過工程生成物プールを、平衡させたＱＦＦカラムに充填する。３８.７Ｌ／分の最大流速および３５ｐｓｉｇ以下の引入圧でＱＦＦ工程を実施する。ＱＦＦカラムに適用される最大ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質充填量は、樹脂１リットルにつき２５ｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質である。
【０７８７】
ＱＦＦクロマトグラフィーカラムをまず１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で無菌化する。２〜４ＣＶの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いて、無菌化を実施する。カラム流出液の伝導性が１３６〜２０２ｍＳ／ｃｍに等しくなったとき、無菌化は完了であり、カラムを６０〜１２０分間その状態で保つ。
【０７８８】
無菌化工程後、カラムを２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８.０緩衝液で平衡状態にする。最小限４ＣＶの平衡緩衝液がカラムを通過し、流出液のｐＨが７.７〜８.３であり、伝導性が１０.５〜１２.９ｍＳ／ｃｍになると、平衡に達したことになる。
【０７８９】
バイオプロセス用バッグに含まれるウイルス濾過工程生成物プールを、滅菌ステンレス鋼収集容器に移す。
【０７９０】
ウイルス濾過工程生成物プールを、平衡ＱＦＦカラムに適用する。ＱＦＦクロマトグラフィー工程は２回の洗浄工程を含む。最小限５.０ＣＶの２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０緩衝液を用いて、第一洗浄工程を実施する。最小限５.０ＣＶの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０緩衝液を用いて、第二洗浄工程を実施する。
【０７９１】
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０緩衝液を用いて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体をＱＦＦクロマトグラフィーカラムから溶離する。流出液のＡ280が増加し始めたとき、溶離液採取を開始する。溶離中、カラム流出液を０.２μｍ酢酸セルロースフィルターに通してステンレス鋼収集容器中へ濾過する。溶離ピークのトレーリングエッジのＡ280がベースラインを超えて０.２ＡＵ以下に減少するまで溶離液を集める。次いで、収集容器を２°〜８℃に冷却する。２°〜８℃でのＱＦＦクロマトグラフィー工程生成物プールについての最大保持期間は３日間である。
【０７９２】
シアル酸モル数対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質モル数のモル比が８以上であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体生成物を集める。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量物質のプールは２.５％以下の割合で存在し、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ低分子量物質（例えばＣＴＬＡ４−Ｉｇ単量体）のプールは０.５％以下の割合で存在し、ＭＣＰ−１のプールは９.５ｎｇ／ｍＬ以下の割合で存在する。
【０７９３】
Pall Filtron TFF システムを、下流ＣＴＬＡ４−Ｉｇ製造過程の濃縮およびダイアフィルトレーション工程で使用する。この工程の目的は、ＱＦＦクロマトグラフィー工程生成物プールを４５〜５５ｇ／Ｌに濃縮し、ＱＦＦクロマトグラフィー工程で使用する溶離緩衝液をＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物に使用する最終緩衝液と交換することである。濃縮ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質生成物プールを、０.２μｍポリビニリデンフルオリドフィルターに通し、５０−Ｌバイオプロセス用バッグへ移す。
【０７９４】
実施例１６：アミノ単糖のＣＴＬＡ４−Ｉｇモル比測定
【０７９５】
この実施例は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ試料中におけるアミノ単糖（Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン）対タンパク質のモル比を得る方法を提供する。
【０７９６】
器具：キャピラリー電気泳動システム Beckman P/ACE MDQ CE システム；検出器 Beckman レーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）検出システム（P/ACE MDQ と結合）；非コーティングキャピラリー（内径２５μｍ；光学密度３６０μｍ）、全長２７〜３１ｃｍで P/ACE MDQ または５５１０PolyMicro Technologies、カタログ番号ＴＳＰ０２５３７５に適応させる；Maxi-Mix ミキサー Thermolyne、（ＶＷＲカタログ番号５８８１０−１８５）
【０７９７】
試薬：
加水分解溶液（４Ｎ ＨＣｌ水溶液）
１６０ｍＬの６Ｎ ＨＣｌおよび８０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を、２５０ｍＬガラス瓶に加える。
十分に撹拌混合する。
６ヶ月までの間、２〜８℃で貯蔵する。
誘導体化溶液Ｉ（０.１ＭのＡＰＴＳ水溶液）
１９２μＬのＨＰＬＣグレードの水を、ガラス製バイアル中の１０ｍｇのＡＰＴＳに添加する。
バイアルを５〜１０秒間撹拌することにより、ＡＰＴＳを完全に溶解させる。
１年までの間、−２０℃で貯蔵する。
誘導体化溶液II（１Ｍの酢酸および０.２５ＭのＮａＢＨ3ＣＮ）
０.４ｍＬの遠心管中で２０μＬの酢酸を３２０μＬのＨＰＬＣグレードの水で希釈（１７倍希釈）することにより、１Ｍ酢酸溶液を調製する。
２.０±０.５ｍｇのＮａＢＨ3ＣＮを秤量して凍結保存バイアルに入れる。
下式を用いて、適切な容量の１Ｍ酢酸溶液を加えることにより、０.２５ＭのＮａＢＨ3ＣＮを調製する。容量（μＬ）＝１０3×（ｍｇでのＮａＢＨ3ＣＮの重量）／（６２.８４ｇ／ｍｏｌ×０.２５ｍｏｌ／Ｌ）
【０７９８】
・水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）については、デシケーター中において暗所で貯蔵するべきである。・後続手順による当初の試薬瓶の開口の繰り返しを避けるために、試薬を貯蔵用の一連の２.０ｍＬクライオバイアルに小分けすることが推奨される。・１.０ｇ±０.２ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを秤量して２.０ｍＬクライオバイアルに入れる。この方法で当初の瓶から水素化シアノホウ素ナトリウムの全含有量をアリコートに分ける・堅固に蓋を絞め、試薬名、ロット番号および６ヶ月有効期限の日付を記した通し番号の（１、２、３など）ラベルを貼付する。・湿気を避けるため、バイアルをパラフィルムで密閉するべきである。・同一クライオバイアルからは３回のみ誘導体化溶液II用に水素化シアノホウ素ナトリウムを秤量する。このことおよびクライオバイアル連続番号を研究室のワークシートに書きとめておく。・クライオバイアルを繰り返し開口した後、またはその特定ロットの水素化シアノホウ素ナトリウムを使用した場合、ＣＥプロフィールで試薬ピークが観察されるか、またはラベル表示が判りにくくなり得る。これが結果に影響する場合、使用されているクライオバイアルを廃棄し、次の連続番号のクライオバイアルまたは新しいロットの水素化シアノホウ素ナトリウムから試薬を秤量する。
再アセチル化緩衝液（２５ｍＭの重炭酸ナトリウム、ｐＨ９.５）
０.２１０±０.０２ｇの重炭酸ナトリウムを秤量し、清潔な１００ｍＬガラス製ビーカーへ入れる。
９０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を加え、塩が完全に溶解されるまで撹拌プレートで混合する。
ｐＨを１０ＮのＮａＯＨにより９.５±０.１に調節する。
ＨＰＬＣグレード水を加えることにより、最終容量１００ｍＬにする。溶液を濾過（工程１.２６）し、３ヶ月までの間室温で貯蔵する。
泳動緩衝液（６０±５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９.２５）
１.２１±０.０２ｇの四ホウ酸ナトリウムを秤量し、１００ｍＬの清潔なガラス製ビーカーに入れる。
９０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を加え、塩が完全に溶解されるまで撹拌プレートで混合する。
１０ＮのＮａＯＨでｐＨを９.２５±０.１０に調節する。
ＨＰＬＣグレードの水を加えることにより、６０±５ｍＭの最終濃度にするため最終容量１００ｍＬにする。
５５ｍＭ溶液については、１.１１ｇ（±０.０２）の四ホウ酸ナトリウムを秤量し、溶解および滴定に関する上記の指示に従う。
６５ｍＭ溶液については、１.３１ｇ（±０.０２）の四ホウ酸ナトリウムを秤量し、溶解および滴定に関する上記の指示に従う。
３ヶ月までの期間室温で貯蔵する。ピーク分離を実施する場合（Ｒ値＜１.０）、新鮮な緩衝液を調製する。
選択：１２０ｍＬの超純水を８０ｍＬの１５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液に加えることにより、四ホウ酸緩衝液（MicroSolv）を６０ｍＭ（±５ｍＭ）の最終濃度に希釈する。１０ＮのＮａＯＨで滴定することにより、溶液ｐＨを９.２５（±０.１）にする。
５５ｍＭ四ホウ酸溶液については、６６ｍＬの１５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム緩衝液を１１４ｍＬの超純水で希釈する。上記要領で滴定する。
６５ｍＭ四ホウ酸溶液については、７８ｍＬの１５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム緩衝液を１０２ｍＬの超純水で希釈する。上記要領で滴定する。
室温で最大３ヶ月間貯蔵する。ピーク分離を実施する場合（Ｒ値＜１.０）、新鮮な緩衝液を調製する。
キャピラリーすすぎ液
Ｎ ＮａＯＨ溶液
９ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を含む１５ｍＬ目盛り付きプラスチック管に１０ＮのＮａＯＨ溶液１ｍＬを加える。５〜１０秒間撹拌することにより、十分混合する。
溶液を６ヶ月までの期間室温で貯蔵する。
Ｎ  ＨＣｌ溶液：
５ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を含む１５ｍＬ目盛り付きプラスチック管に６ＮのＨＣｌ溶液１ｍＬを加える。５〜１０秒間撹拌することにより、十分混合する。
溶液を６ヶ月までの期間室温で貯蔵する。
３.６.３  ８０％メタノール溶液：
２ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を含む１５ｍＬ目盛り付きプラスチック管にＨＰＬＣグレードのメタノール８ｍＬを加える。５〜１０秒間撹拌することにより、十分混合する。
溶液を６ヶ月までの期間室温で貯蔵する。
単糖標準保存液
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）
５±１ｍｇのＧａｌＮＡｃを正確に秤量して、２.０ｍＬ凍結保存バイアルに入れる。
１ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を加えて、溶解するまで撹拌することにより十分に混合する。
溶液の正確な濃度（ｍｇ／ｍＬ）を記録する。
Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ）
５±１ｍｇのＧｌｃＮＡｃを正確に秤量して、２.０ｍＬ凍結保存バイアルに入れる。
１ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を加えて、溶解するまで撹拌することにより十分に混合する。
溶液の正確な濃度（ｍｇ／ｍＬ）を記録する。
Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）
５±１ｍｇのＭａｎＮＡｃを正確に秤量して、２.０ｍＬ凍結保存バイアルに入れる。
１ｍＬのＨＰＬＣグレードの水を加えて、溶解するまで撹拌することにより十分に混合する。
溶液の正確な濃度（ｍｇ／ｍＬ）を記録する。
１年までの期間、単糖標準保存液を−２０℃で貯蔵する。
単糖使用液Ｉ：内部標準使用液
１９８０μＬのＨＰＬＣグレードの水を既に含む２ｍＬ凍結保存バイアル中に２０μＬのＭａｎＮＡｃ保存液を加えることにより、ＭａｎＮＡｃの保存液をＨＰＬＣグレード水で１００倍希釈する。約５〜１０秒間撹拌する。
６ヶ月までの期間、内部標準使用液を２〜８℃で貯蔵する。
単糖使用液II：アミノ混合標準使用液
１９６０μＬのＨＰＬＣグレードの水を含む２.０ｍＬ凍結保存バイアルに、２０μＬのＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃの保存液をそれぞれ加える。約５〜１０秒間撹拌する。
６ヶ月までの期間、アミノ混合標準使用液を２〜８℃で貯蔵する。
試料および基準物質溶液。
冷凍したタンパク質試料を２〜８℃で解凍し、転回させて緩やかに混合する。
試料および基準物質を両方ともＨＰＬＣグレードの水で約１.０ｍｇ／ｍＬに希釈する。濃度を有効数字３桁まで書き留めておく。
【０７９９】
ＣＥ実施条件
泳動緩衝液（工程２.５）６０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９.２５
キャピラリーカートリッジ温度２５℃
電圧２５〜３０ｋＶ、プラスモード
検出器条件ＬＩＦ検出器、励起：４８８ｎｍ、放射：５２０ｎｍ。
試料注入圧注入モード、０.５ＰＳＩで２０ｓ
泳動時間１０分間
試料貯蔵１０℃
【０８００】
手順
注：１０μＬピペッターおよびマイクロチップを用いて、１０μＬ試料容量を移し、適切なサイズのピペッターで他の試薬を移す（工程２.１０〜２.１４の範囲参照）。
加水分解
０.６５ｍＬ遠心管に、１０μＬのＭａｎＮＡｃ使用液および２００μＬの４Ｎ加水分解溶液（工程３.１）を添加する。これをシステムブランクとして使用する。
０.６５ｍＬ遠心管に、１０μＬのＭａｎＮＡｃ使用液および１０μＬのアミノ混合標準溶液（工程３.９）を加える。さらに２００μＬの４Ｎ加水分解溶液を添加する。これを定量およびシステム適合性についての単糖標準として使用する。デュプリケイトで調製する。
０.６５ｍＬ遠心管に、１０μＬのＭａｎＮＡｃ使用液および１０μＬのＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準物質溶液（約１ｍｇ／ｍＬ）を加える。
さらに２００μＬの４ＮのＨＣｌ溶液を添加する。デュプリケイトで調製する。
０.６５ｍＬ遠心管に、１０μＬのＭａｎＮＡｃ使用液および１０μＬの試料溶液（約１ｍｇ／ｍＬ）を加える。さらに２００μＬの４ＮのＨＣｌ溶液を添加する。デュプリケイトで調製する。
試料を約１０秒間撹拌し、約５〜１０秒間遠心分離にかける。９６本立てバイアルラックに試料を置き、６時間９５℃のオーブンでインキュベーションする。
加水分解後、加水分解試料を−２０℃で１０分間放冷する。
凝縮体が管の底部に集められるまで（高速で５〜１０秒）加水分解試料を短時間遠心分離にかける。試料を SpeedVac で蒸発乾固する。
注： SpeedVac 加熱を止め、蒸発速度を「低」に設定する。
各試料を１００μＬのＨＰＬＣグレードの水で再構成し、１０〜１５秒間撹拌する。試料をSpeedVacで蒸発乾固する。
注： SpeedVac 加熱を止め、蒸発速度を「低」に設定する。
再アセチル化
各試料を１０μＬのＭ６再アセチル化緩衝液で再構成し、５〜１０秒間撹拌することにより、十分混合する。４μＬのＭ３再アセチル化試薬を各管に加える。約５〜１０秒間撹拌する。氷上で３０分間インキュベーションする。
注： 再アセチル化緩衝液（Ｍ６）および試薬（Ｍ３）は、２５ｍＭの内部製造のＮａＨＣＯ3（２０μＬ添加）および無水酢酸（４μＬ添加）によりそれぞれ置き換えられ得る。
試料を SpeedVac で蒸発乾固する。
注： SpeedVac 加熱を止め、蒸発速度を「低」に設定する。
各試料を１００μＬのＨＰＬＣグレードの水で再構成し、１０〜１５秒間撹拌する。試料を SpeedVac で蒸発乾固する。
注： SpeedVac 加熱を止め、蒸発速度を「低」に設定する。
誘導体化
微量遠心機をオーブンに入れ、５５℃のオーブン温度に対して平衡させる。
各試料を１０μＬの誘導体化溶液Ｉ（０.１ＭのＡＰＴＳ溶液、工程３.２）で再構成する。約５〜１０秒間撹拌する。
５μＬの誘導体化溶液II（１ＭのＨＡｃおよび０.２５ＭのＮａＢＨ3ＣＮ、工程３.３）を加える。約５〜１０秒間撹拌し、遠心分離にかける。
予め暖めておいた遠心機に試料バイアルを迅速にローディングし、遠心機を５５℃オーブンに戻す。２０００ｒｐｍで遠心分離しながら、３時間インキュベーションする。これにより、バイアル表面での溶媒の凝結を防ぐ。
器具の準備
新しいキャピラリーを設置し、以下の工程を用いて高圧モード（８０ＰＳＩ）ですすぐ：
１ＮのＮａＯＨで２０分間
ＨＰＬＣグレード水で１０分間
６０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム緩衝液で１０分間
操作
各操作前、洗浄／すすぎ連続工程を実施して、キャピラリーをすすぐ。
次いで、システム適合性標準（単糖標準）試験を実施して、システムが適切であることを確認する。
１ＮのＮａＯＨを用いると、販売元によってはキャピラリーの内側が腐食することもあり、実施期間全体を通して移動時間の変動が誘発され得る。これが原因で最終ピーク（ＧｌｃＮＡｃ）の移動時間が１０.０分を超える場合、工程２のすすぎについて１ＮのＮａＯＨの代りに０.１ＮのＮａＯＨまたはＨＰＬＣグレードの水を使用することが必要な場合もあり得る。
均等内容のキャピラリーおよび上記洗浄手順を使用しても十分ではないときに、最終ピーク（ＧｌｃＮＡｃ）の移動時間を模範値である１０.０分以内に収めるためには８０％メタノールおよび／または１ＮのＨＣｌの使用が必要な場合もあり得る。
注入用調製
誘導体化後、試料を室温に放冷する。凝縮体が管の底部に集められるまで、約１０秒間室温で遠心分離する。
８５μＬのＨＰＬＣグレード水を各管に加え、各試料の最終容量を１００μＬにする。５〜１０秒間撹拌する。
１０μＬの試料を各管からＣＥマイクロバイアルへ移し、１９０μＬのＨＰＬＣグレード水を各管に加える。５〜１０秒間撹拌する。
すすぎ工程および注入順序：
注：４回のどの注入についても、ＣＥ泳動緩衝液を新たに調製したＣＥ泳動緩衝液と交換する（イオン枯渇作用のため）。４０ｐｓｉでキャピラリーをすすぐ。
2010116402.tif 000056
2010116402.tif 000057
【０８０１】
システム適合性
注：特に断らなければ、システム適合性標準の初回注入を用いて、システム適合性の値を測定する。
初回システム適合性の電気泳動図は、当然図８１に示したものと類似しており、図中、ピーク１はＧａｌＮＡｃであり、ピーク２はＭａｎＮＡｃであり、ピーク３はＧｌｃＮＡｃである。
注： Beckman PACE MDO 以外のＣＥ器具を使用するとき、分離キャピラリーを保持するカートリッジの形態も変わるため、キャピラリーの長さは本方法で具体的に示したものとは異なり得る。その結果、被分析試料移動時間およびピーク強度の変化が誘発される。
２つの近隣ピーク間の分離度を、以下の等式に従って器具により初回システム適合性標準について計算する：
2010116402.tif 000058
式中：
Ｒ＝分離度
ｔ2、ｔ1＝それぞれ、２つの近隣ピークの移動時間
Ｗ1、Ｗ2＝それぞれ、２つの近隣ピークのベースラインでのピーク幅
【０８０２】
Ｒ値は１.０以上でなくてはならない。Ｒが１.０未満である場合、キャピラリーを洗浄／すすぎ連続工程ですすぐ。それでも問題が解決されない場合、古い緩衝液を新たに調製した泳動緩衝液と交換するか、またはキャピラリーを交換する。最後のシステム適合性注入については、次式を用いて、最後のピーク（ＧｌｃＮＡｃ）のテーリング係数はＩ.４より小でなくてはならない：
Ｔ＝Ｗ0.05／２ｆ
式中：
Ｔ＝テーリング係数
Ｗ0.05＝高さの５％でのピークの幅
ｆ＝最大ピークでのピーク前端の幅
Ｔが１.４以上である場合、キャピラリーを洗浄／すすぎ連続工程ですすぐ。それでも問題が解決されない場合、古い緩衝液を新たに調製した泳動緩衝液と交換するか、またはキャピラリーを交換する。
繰り返し注入により、以下の模範値が示される：
・ＧｌｃＮＡｃ対ＭａＮＡｃのピーク面積比：ＲＳＤ≦１０％（工程7.１で計算）
・ＧｌｃＮＡｃの移動時間は１０.０分以下であるべき
・プロフィールは図８１と均等内容であるべきで、３ピークが観察され、内部標準（ＭａｎＮＡｃ）は２番ピークである。
試料を試験する前に上記の模範値を満たしていないものがある場合、例えばＧｌｃＮＡｃの移動時間が１０.０分より長い場合、まず電圧を高める。次に、ピーク面積比が１０％より大である場合、新たにＣＥ緩衝液を調製してそのｐＨを確実なものにするか、またはキャピラリーを交換する。器具を調整した後、システム適合性注入を繰り返す。ピークプロフィールを分析したときに、ＭａｎＮａｃのピーク高が著しく減少している場合、ＬＩＦモジュールへの光ファイバーケーブルの取付けが正常であることを確認する。
内部標準および単糖標準成分のピーク面積比を比較することにより、単糖標準ＲＳＤパーセントを測定する。各単糖成分に関するピーク面積を、各単糖標準注入に関する内部標準のピーク面積で割る。２つの一括標準に関するＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃについてのＲＳＤパーセントを計算する。ＲＳＤは１０％以下であるべきである。この平均した模範値を満たしていない場合、上記と同様キャピラリーをすすぐか交換するべきである。
【０８０３】
計算
内部標準（ＭａｎＮＡｃ）に対するＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃのピーク面積比を計算する。この計算法を、上記の模範値を満たすように初めの４システム適合性標準の繰り返し注入時に使用し、試料（複数も可）の前および後に注入したシステム適合性標準群の全てについて同計算法を実施する。
ピーク面積比＝各単糖成分（ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ）に関するピーク面積を、各システム適合性標準注入に関する内部標準（ＭａｎＮＡｃ）のピーク面積で割る。
2010116402.tif 000059
システム適合性標準におけるＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃに関するピーク面積比の平均を計算する。また、標準偏差（ＳＤ）および相対標準偏差パーセント（ＲＳＤ％）も計算する。
模範値：ＧｌｃＮＡｃのピーク面積比に関するＲＳＤ≦１０％。
試料（複数も可）の前および後に注入した２システム適合性標準群：ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃのピーク面積比についてのＲＤＳパーセント≦１０％。この平均した模範値が満たされていない場合（ＲＳＤ＞１０％）、キャピラリーを上記すすぎ手順で再びすすぐ必要があり、試料および単糖標準群を再び電気泳動にかける必要がある。それでも平均した模範値が満たされていない場合、キャピラリーを交換し、すすぐ。試料および単糖標準群を再び電気泳動にかける。
2010116402.tif 000060
式中：
ｎ＝試料における測定数
ｘ＝個々の測定値
2010116402.tif 000061
【０８０４】
ＧａｌＮＡｃ／タンパク質のモル比の計算：
2010116402.tif 000062
式中：
ＲGalNAc＝ＧａｌＮＡｃ対タンパク質のモル比
ＡGalNAc＝試料におけるＧａｌＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）
ＡManNAc＝試料におけるＭａｎＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）
ＡManNAc0＝単糖標準におけるＭａｎＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）平均
ＡGalNAc0＝単糖標準におけるＧａｌＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）平均
ＶGalNAc0＝加水分解に使用する単糖使用液に含まれるＧａｌＮＡｃの容量（μＬ）
ＣGalNAc0＝加水分解に使用する単糖使用液に含まれるＧａｌＮＡｃの濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｖｐ＝加水分解に使用するタンパク質試料の容量（μＬ）
Ｃｐ＝加水分解に使用するタンパク質試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
ＭＷAbatacept＝試験成績書（ＣＯＡ）によるアバタセプト基準物質の分子量
ＭＷGlcNAc＝ＧａｌＮＡｃの分子量（２２１.２ダルトン）
【０８０５】
標準群（ブラケット）
【０８０６】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ物質および試料のモル比を計算するとき、８システム適合性標準群を全て使用する。この等式に入れるピーク面積の平均を出す。これを最初の３試料に使用するものとする。全ての他の試料のモル比計算については、常に次の４単糖標準群および先の４単糖標準群の平均ピーク面積を使用する。
【０８０７】
ＧｌｃＮＡｃ／タンパク質のモル比の計算：
2010116402.tif 000063
式中：
ＲGlcNAc＝ＧｌｃＮＡｃ対タンパク質のモル比
ＡGlcNAc＝試料におけるＧｌｃＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）
ＡManNAc＝試料におけるＭａｎＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）
ＡManNAc0＝単糖標準におけるＭａｎＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）平均
ＡGlcNAc0＝単糖標準におけるＧｌｃＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）平均
ＶGlcNAc0＝加水分解に使用する単糖使用液に含まれるＧｌｃＮＡｃの容量（μＬ）
ＣGlcNAc0＝加水分解に使用する単糖使用液に含まれるＧｌｃＮＡｃの濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｖｐ＝加水分解に使用するタンパク質試料の容量（μＬ）
Ｃｐ＝加水分解に使用するタンパク質試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
【０８０８】
ＭＷCTLA4-Ig＝ＣＴＬＡ４−Ｉｇ基準物質の分子量
【０８０９】
ＭＷGlcNAc＝ＧｌｃＮＡｃの分子量（２２１.２ダルトン）
【０８１０】
模範値。２つのアミノシステム適合性標準群ピーク面積比に関するＲＳＤパーセントは１０％を超えるべきではない。基準物質におけるアミノ単糖に関する平均モル比は、直接下表で具体的に示した範囲内とするべきである。各成分については、４つの結果（デュプリケイト調製品のデュプリケイト注入）に関するＲＳＤ％は＜／２５％でなくてはならない。
2010116402.tif 000064
【０８１１】
実施例１７：キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によるアミノ単糖類（ＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃ）のモル比の測定
【０８１２】
一実施態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物は、タンパク質１モルにつき約１５〜３５モルのＧｌｃＮＡｃおよび約１.７〜３.６モルのＧａｌＮａｃを有するという特性を有する。以下の実施例では、これらのモル比の測定方法について記載する。
【０８１３】
試薬：加水分解溶液（４ＮのＨＣｌ）；誘導体化溶液Ｉ（０.１Ｍの８−アミノ−１,３,６，トリスルホン酸、三ナトリウム塩（ＡＰＴＳ）水溶液）；誘導体化溶液II（０.２５ＭのＮａＢＨ3ＣＮ、１Ｍ酢酸中）；再アセチル化緩衝液（２５ｍＭの重炭酸ナトリウム、ｐＨ９.５）；泳動緩衝液（６０±５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９.２５）；キャピラリーすすぎ液（１ＮのＮａＯＨ；１ＮのＨＣｌ；８０％メタノール）；５ｍｇ／ｍｌ濃度のＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃおよびＭａｎＮＡｃの単糖標準保存液；単糖使用液Ｉ；内部標準使用液は、ＭａｎＮＡｃ保存液の１００倍希釈液である；単糖使用液II；アミノ混合標準使用液、ＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃ保存液の１００倍希釈液。
【０８１４】
器具：ＣＥシステムは、Beckman Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ ＣＥシステムである；検出器：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱと連結したBeckmanレーザー誘導（ＬＩＦ）検出システム；非コーティングキャピラリー（内径２５μｍ、光学密度３６０μｍ）全長２７〜３１ｃｍでＰ／ＡＣＥ ＭＤＱに適応。
キャピラリー電気泳動実施条件：泳動緩衝液（６０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９.２５）；キャピラリーカートリッジ温度：２５℃；電圧：２５〜３０ｋＶ、プラスモード；検出器条件：ＬＩＦ検出器、励起４８８ｎｍ、放射５２０ｎｍ；試料注入：加圧注入モード、０.５ＰＳＩで２０秒；泳動時間：１０分；試料貯蔵：１０℃。
【０８１５】
加水分解：１０μＬのＭａｎＮＡｃ使用液および２００μＬの４ＮのＨＣｌを混合し、システムブランクを作製した。ＭａｎＮＡｃ使用液１０μＬおよびアミノ混合標準溶液１０μＬを、２００μＬの４ＮのＨＣｌと混合することにより、単糖標準を調製した。１０μＬのＭａｎＮＡｃ使用液および１０μＬのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体（約１ｍｇ／ｍｌ）を２００μＬの４ＮのＨＣｌと混合し、試験試料を作製した。管を全て１０秒間撹拌し、１０秒間遠心分離にかけ、次いで９５℃で６時間インキュベーションした。加水分解工程後、試料を−２０℃で１０分間放冷した。試料を SpeedVac で１０秒間スピンさせ、蒸発乾固した。
【０８１６】
再アセチル化：加水分解および乾燥した試料を、１００μＬのＨＰＬＣグレードの水で再構成した。再構成した試料を、１０μＬのＭ６再−Ｎ−アセチル化緩衝液（Glyko）および４μＬのＭ３再アセチル化試薬（Glyko）を添加し、次いで混合し氷上でインキュベーション（３０分）することにより再アセチル化した。試料をSpeedVac で１０秒間スピンさせ、蒸発乾固した。
【０８１７】
誘導体化：再構成試料（１００μＬのＨＰＬＣグレード水）を、５５℃で平衡させ、次に１０μＬの誘導体化溶液Ｉを添加し、短時間混合し、５μＬの誘導体化溶液IIを加えた。試料を予め暖めておいた遠心機にローディングし、２０００ｒｐｍで遠心分離しながら５５℃で３時間インキュベーションした。
【０８１８】
ＣＥ注入：誘導体化後の試料の最終容量を、ＨＰＬＣグレード水の添加により１００μＬにし、１０μＬの試料を、１９０μＬのＨＰＬＣグレード水と共にＣＥマイクロバイアルに移した。試料注入前、ＣＥカートリッジをＨＰＬＣグレード水で十分にすすぎ（実施時間１〜３分）、次いで泳動緩衝液ですすぎ、平衡させた（実施時間５分）。初回すすぎ後、単糖標準および分析試料を、ＣＥカートリッジにおいて注入した（実施時間１０分）。各標準または試験試料の注入実施後、ＣＥカートリッジを、ＨＰＬＣグレード水および泳動緩衝液ですすぎ、平衡させた。システム適合性の電気泳動図は当然図３０と類似している。
【０８１９】
計算：内部標準ＭａｎＮＡｃに対するＧａｌＮＡｃおよびＧＬＣＮＡｃのピーク面積比を計算する。
ピーク面積比＝単糖ピーク面積（ＧａｌＮＡｃまたはＧｌｃＮＡｃ）／ＭａｎＮＡｃピーク面積
式中、ピーク面積比についての相対標準偏差（ＲＳＤ）は１０％またはそれ未満である。
単糖（例えばＧａｌＮＡｃ）対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の比の計算：
比GalNAc＝（ＡGalNAc×ＡManNAc0×ＶGalNAc0×ＣGalNAc0×ＭＷCTLA4-Ig二量体）／（ＡManNAc×ＡGalNAc0×Ｖｐ×Ｃｐ×ＭＷGalNAc）
比GalNAc＝ＧａｌＮＡｃ対タンパク質のモル比
ＡGalNAc＝ＧａｌＮＡｃ試料におけるピーク面積（μＶ・秒）
ＡManNAc＝ＭａｎＮＡｃ試料におけるピーク面積（μＶ・秒）
ＡManNAc0＝単糖標準におけるＭａｎＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）平均
ＡGalNAc0＝単糖標準におけるＧａｌＮＡｃのピーク面積（μＶ・秒）平均
ＶGalNAc0＝加水分解に使用する単糖使用液に含まれるＧａｌＮＡｃの容量（μＬ）
ＣGalNAc0＝加水分解に使用する単糖使用液に含まれるＧａｌＮＡｃの濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｖｐ＝加水分解に使用するタンパク質試料の容量（μＬ）
Ｃｐ＝加水分解に使用するタンパク質試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
ＭＷCTLA4-Ig＝ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の分子量
ＭＷGalNAc＝２２１.２ダルトン
2010116402.tif 000065
実施例１８：キャピラリー電気泳動（ＣＥ）による中性単糖類（マンノース、フコースおよびガラクトース）のモル比の測定
【０８２０】
試薬：加水分解溶液（２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））；誘導体化溶液Ｉ（０.１Ｍの８−アミノ−１,３,６，トリスルホン酸、三ナトリウム塩（ＡＰＴＳ）水溶液）；誘導体化溶液II（０.２５ＭのＮａＢＨ3ＣＮ、１Ｍ酢酸中）；泳動緩衝液（６０±５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９.２５）；キャピラリーすすぎ液（１ＮのＮａＯＨ；１ＮのＨＣｌ；８０％メタノール）；５ｍｇ／ｍｌ濃度のマンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）およびキシロース（Ｘｙｌ）の単糖標準保存液；単糖使用液Ｉ；内部標準使用液は、Ｘｙｌ保存液の１００倍希釈液である；単糖使用液II；中性混合標準使用液、Ｍａｎ、ＦｕｃおよびＧａｌ保存液の１００倍希釈液。
【０８２１】
器具：ＣＥシステムは、Beckman Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ ＣＥシステムである；検出器：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱと連結したBeckmanレーザー誘導（ＬＩＦ）検出システム；非コーティングキャピラリー（内径２５μｍ、光学密度３６０μｍ）全長２７〜３１ｃｍでＰ／ＡＣＥ ＭＤＱに適応。
【０８２２】
キャピラリー電気泳動実施条件：泳動緩衝液（６０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９.２５）；キャピラリーカートリッジ温度：２５℃；電圧：２５〜３０ｋＶ、プラスモード；検出器条件：ＬＩＦ検出器、励起４８８ｎｍ、放射５２０ｎｍ；試料注入：加圧注入モード、０.５ＰＳＩで２０秒；泳動時間：１０分；試料貯蔵：１０℃。
【０８２３】
加水分解：１０μＬのキシロース使用液および２００μＬの２ＭのＴＦＡを混合し、システムブランクを作製した。キシロース使用液１０μＬおよび中性混合標準溶液１０μＬを、２００μＬの２ＭのＴＦＡと混合することにより、単糖標準を調製した。１０μＬのキシロース使用液および１０μＬのＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体（約１ｍｇ／ｍｌ）を２００μＬの２ＭのＴＦＡと混合し、試験試料を作製した。管を全て１０秒間撹拌し、１０秒間遠心分離にかけ、次いで９５℃で６時間インキュベーションした。加水分解工程後、試料を−２０℃で１０分間放冷した。試料を SpeedVac で１０秒間スピンさせ、蒸発乾固した。
【０８２４】
誘導体化：試料を１００μＬのＨＰＬＣグレードの水で再構成し、５５℃で平衡させ、次に１０μＬの誘導体化溶液Ｉを添加し、短時間混合し、５μＬの誘導体化溶液IIを加えた。試料を予め暖めておいた遠心機にローディングし、２０００ｒｐｍで遠心分離しながら５５℃で３時間インキュベーションした。
【０８２５】
ＣＥ注入：誘導体化後の試料の最終容量を、ＨＰＬＣグレードの水の添加により１００μＬにし、１０μＬの試料を、１９０μＬのＨＰＬＣグレードの水と共にＣＥマイクロバイアルに移した。試料注入前、ＣＥカートリッジをＨＰＬＣグレードの水で十分にすすぎ（実施時間１〜３分）、次いで泳動緩衝液ですすぎ、平衡状態にした（実施時間５分）。初回すすぎ後、単糖標準および分析試料を、ＣＥカートリッジにおいて注入した（実施時間１０分）。各標準または試験試料の注入実施後、ＣＥカートリッジを、ＨＰＬＣグレードの水および泳動緩衝液ですすぎ、平衡させた。システム適合性の電気泳動図は当然図３０と類似している。
【０８２６】
計算：内部標準キシロースに対するＭａｎ、ＧａｌおよびＦｕｃのピーク面積比を計算する。
ピーク面積比＝単糖ピーク面積（Ｇａｌ、ＦｕｃまたはＭａｎ）／キシロースピーク面積
式中、ピーク面積比についての相対標準偏差（ＲＳＤ）は１０％またはそれ未満である。
単糖（例えばＭａｎ）対ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の比の計算：
比Man＝（ＡMan×ＡXyl0×ＶMan0×ＣMan0×ＭＷCTLA4-Ig二量体）／（ＡXyl×ＡMan0×Ｖｐ×Ｃｐ×ＭＷMan）
比Man＝Ｍａｎ対タンパク質のモル比
ＡMsn＝試料中のＭａｎにおけるピーク面積（μＶ・秒）
ＡXyl＝試料中のＸｙｌにおけるピーク面積（μＶ・秒）
ＡXyl0＝単糖標準におけるＸｙｌのピーク面積（μＶ・秒）平均
ＡMan0＝単糖標準におけるＭａｎのピーク面積（μＶ・秒）平均
ＶMan0＝加水分解に使用する単糖使用液に含まれるマンノースの容量（μＬ）
ＣMan0＝加水分解に使用する単糖使用液に含まれるマンノースの濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｖｐ＝加水分解に使用するタンパク質試料の容量（μＬ）
Ｃｐ＝加水分解に使用するタンパク質試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
ＭＷCTLA4-Ig＝ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体の分子量
ＭＷMan＝１８０.２ダルトン
2010116402.tif 000066
実施例１９：ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇの製造
【０８２７】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、遺伝子操作を加えた融合タンパク質であり、修飾ヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇの機能性結合ドメインおよびＩｇＧ１クラスのヒト免疫グロブリンのＦｃドメインにより構成される。ＣＴＬＡ４−ＩｇドメインのＢ７結合領域に２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）を導入することにより、この分子を作製した。この分子は、各々３５７アミノ酸を有する２本のグリコシル化ポリペプチド鎖から成る。これは、鎖内ジスルフィド結合を介して連結された共有結合二量体として存在する。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、マトリックス支援レーザー脱離−イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を用いた測定によると約９１８００Ｄａの平均質量を有する。
【０８２８】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの修飾形態である。この修飾は、２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）をもたらす点突然変異により構成される。ＣＴＬＡ４−Ｉｇに対し、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、〜２倍高い結合力でＣＤ８０（Ｂ７−１）と結合し、〜４倍高い結合力でＣＤ８６（Ｂ７−２）と結合する。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生およびナチュラルキラー細胞による標的細胞のＣＤ２８依存的致死作用の阻害ではアバタセプトと比べてその約１０倍有効である。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇは、Ｂ７−１介在Ｔ細胞増殖の緩い阻害を誘発するが、Ｂ７−２介在Ｔ細胞増殖の遮断では著しく強力である。この実施例では、配列番号４を含むＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ分子の製法を記載する。この実施例記載の方法は、限定するわけではないが、分泌タンパク質、例えばサイトカインおよび他のホルモン、Ｉｇスーパーファミリーの構成員であるか、またはＩｇスーパーファミリータンパク質の一部分を含む分泌タンパク質、およびＣＨＯ細胞で発現されるタンパク質全般を含む他の組換えタンパク質の製造についても適合化および拡大され得る。
【０８２９】
ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ培養工程についての製造過程フローチャートを図２４に示す。ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇを、使用容量が約４０００Ｌである５０００−Ｌ生産バイオリアクターで製造する。１バッチの薬剤物質を、細胞バンクからの単一バイアルから誘導した単一生産型バイオリアクターから製造する。この製造過程は、接種材料の増大、生産細胞培養および下流精製から成る３段階を含む。動物成分不含有培地を用いて、接種材料増大段階を誘導する。また、Ｄ−ガラクトースの使用は例外として動物成分不含有培地で生産細胞培養段階を実施する。
【０８３０】
細胞培養培地。適切なサイズの清潔な培地容器で全培地を調製し、滅菌濾過する。接種材料増大に使用する培地の組成を下表に示す。
2010116402.tif 000067
【０８３１】
2010116402.tif 000068
【０８３２】
接種材料の増大
【０８３３】
細胞バンクからの凍結バイアルを制御温度で解凍し、遠心分離にかけることにより、低温保護培地を除去する。細胞を接種材料培地に再懸濁し、Ｔ−フラスコ中で回収する。解凍後の最小細胞生存能８０％が模範値である。Ｔ−フラスコでのインキュベーション工程中、温度および二酸化炭素を制御する。１.０×１０7細胞の生菌数が得られるまで、Ｔ−フラスコをインキュベーションし、内容物を振とうフラスコに移す。一連の振とうフラスコを通じて培養物を増大させ、必要とされる接種材料容量を達成する。振とうフラスコ継代についての播種密度範囲は、１.０〜３.０×１０5生菌／ｍＬである。振とうフラスコインキュベーション工程中、温度、二酸化炭素、および振とう速度を制御する。１.５〜３.０×１０6細胞／ｍＬの生菌密度範囲に到達したとき、振とうフラスコ培養物を滅菌接種材料移入容器にプールする。最終振とうフラスコ接種材料増大工程からの約２０リットルを、１４０−Ｌシードバイオリアクターに移すことにより、０.２〜１.０×１０6生細胞／ｍＬの初期細胞密度範囲に到達させる。
【０８３４】
シードバイオリアクター操作
【０８３５】
使用容量が約９０リットルである１４０−Ｌシードバイオリアクターをバッチ方式で稼動させる。分散制御システム（ＤＣＳ）を用いて、１４０−Ｌシードリアクター中の温度、ｐＨ、圧力および溶解酸素濃度を監視および制御する。１４０−Ｌシードバイオリアクターから毎日試料を採取し、細胞成長を観察する。１４０−Ｌシードバイオリアクターの播種密度範囲は、０.２〜１.０×１０6生細胞／ｍＬである。１４０−Ｌシードバイオリアクター培養物を用いて、生細胞密度が１.５×１０6細胞／ｍＬ以上に達したとき、１１００−Ｌシードバイオリアクターに接種する。１４０−Ｌシードバイオリアクター工程の持続期間は約３日である。１１００−Ｌシードバイオリアクターにおけるこの初期目標生細胞密度は、０.４〜１.５×１０6生細胞／ｍＬである。
【０８３６】
１１００−Ｌシードバイオリアクターは、２６０リットルの初期培養容量を含む。１１００−Ｌシードバイオリアクターをバッチ方式で稼動させる。ＤＣＳを用いて、１１００−Ｌシードリアクター中の温度、ｐＨ、圧力および溶解酸素濃度を監視および制御する。生細胞密度が１.５×１０6細胞／ｍＬ以上に達したとき、培養物の容量を基礎培地により９００リットルまで増量する。１１００−Ｌシードバイオリアクターから毎日試料を採取し、細胞成長を観察する。１１００−Ｌシードバイオリアクター培養物を用いて、生細胞密度が２.０×１０6細胞／ｍＬ以上に達したとき、５０００−Ｌ生産型バイオリアクターに接種する。１１００−Ｌシードバイオリアクター工程の持続期間は約４日である。５０００−Ｌ生産型バイオリアクターにおけるこの初期目標生細胞密度は、０.４〜１.５×１０6生細胞／ｍＬである。
【０８３７】
生産型バイオリアクター操作
【０８３８】
５０００−Ｌ生産型バイオリアクターは、３０００リットルの初期培養容量を含む。５０００−Ｌ生産型バイオリアクターをフィード-バッチ方式で作動させ、温度、ｐＨ、圧力、および溶解酸素濃度をＤＣＳにより監視および制御する。約７２時間経過時、硫酸デキストランのボーラスを培養物に添加する。生産型バイオリアクターの作動中、１４４±８時間の時点で培養温度設定値を３７°から３４℃にシフトさせる。温度シフトおよび硫酸デキストラン添加を実行することにより、５０００−Ｌ生産型バイオリアクター工程における高い細胞生存能の持続時間を長くする。試料をバイオリアクターから採取して、細胞の成長および生存能、グルコース、ラクテートおよびアンモニア濃度を監視する。また、ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇ濃度およびシアル酸対ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇタンパク質モル比についても試料を試験する。飼料培地をバイオリアクターに添加することにより、所望のグルコース濃度を維持する。生産型バイオリアクターについての主たる収穫基準は、シアル酸対ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇタンパク質モル比である。６以上の目標シアル酸対ＣＴＬＡ４A29YL104E−Ｉｇタンパク質モル比で生産型バイオリアクターの収穫を行う。５０００−Ｌ生産型バイオリアクター工程の持続期間は約１４日間である。５０００−Ｌ生産型バイオリアクターの収穫容量は約４０００リットルである。
【０８３９】
細胞除去および生成物濃縮
【０８４０】
０.６５μｍの膜を用いたタンジェンシャルフロー精密濾過により、細胞を培養ブロスから除去する。３０ｋＤａ名目分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）膜を用いるタンジェンシャルフロー限外濾過により、精密濾過透過液を濃縮する。精密濾過および限外濾過工程中、膜間圧力差および流速を制御する。次いで、一連のメンブランフィルターに濃縮液を通し、最終濾過では０.２μｍ使い捨てフィルターに通す。０.５Ｍトリス溶液の添加により濃縮液のｐＨを８.０に調節する。精密濾過および限外濾過フィルターは多用される。精密濾過フィルターを、次亜塩素酸ナトリウムおよび TritonＸ−１００で掃除し、リン酸中で貯蔵する。限外濾過フィルターを次亜塩素酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムで掃除し、次いで水酸化ナトリウム中で貯蔵する。
【０８４１】
実施例20：組み換えCTLA4A29YL104E−Igの精製
実施例20−A：CTLA4A29YL104E−Igの精製工程の一例を以下の流れ図において示し、精製工程の説明をこの実施例により提供する。
2010116402.tif 000069
【０８４２】
ウイルス不活性化
浄化、濃縮した採集物質のpHを、0.5M Tris溶液の添加により8.0に調整する。潜在的な迷入ウイルス物質を、最終濃度0.5％(v/v)になるよう20％Triton X−100を添加することにより不活性化する。Triton X−100で処理したタンパク質溶液を2時間以上混合する。
【０８４３】
アフィニティークロマトグラフィー
MabSelectプロテインA樹脂のカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー(以前にAmersham Biosciencesとして知られたGE Healthcare)を用いて、ウイルス不活性化段階から得た工程内(in-process)物質由来のCTLA4A29YL104E−Igタンパク質を捕捉し、不純物の大部分からベラタセプト(belatacept)タンパク質を分離する。
【０８４４】
MabSelectプロテインAカラムを25mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.5緩衝液で平衡化する。アフィニティー樹脂の動的結合能力は、350cm/時の直線速度で、樹脂1リットル当たりCTLA4A29YL104E−Igタンパク質25gである。157Lカラムベッドは、約3.9kgのCTLA4A29YL104E−Igタンパク質を結合することができる。
【０８４５】
Triton X−100−処理工程内物質を、MabSelectプロテインAカラムに適用し、そのカラムを最小3カラム容量(CV)の平衡化緩衝液で洗浄して、わずかに残留した不純物を除去する。これらの不純物には、サイトカイン単球走化性タンパク質−1(MCP−1)およびTriton X−100が含まれる。次いで、CTLA4A29YL104E−Igタンパク質を250mMグリシン、pH3.0緩衝液を有するカラムから溶離させた。CTLA4A29YL104E−Igタンパク質は、約2〜3CVの溶離緩衝液において狭いピークとして溶出し、pHを急激に上昇させてそれによりベラタセプト高分子量種の生成を最小にするために2M HEPES(pH7.5)緩衝液を有するタンク中に集める。
【０８４６】
陰イオン交換クロマトグラフィー
Q−Sepharose Fast Flow(QFF)樹脂(GE Healthcare)を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーを、よりシアル化度の高い種のCTLA4A29YL104E−Igタンパク質の量を主に増やすために使用する。MabSelectプロテインAカラムから得た、pH調整したベラタセプト生産物プールを、QFFカラムに適用する前に注入用水(WFI)で約2倍に希釈する。
【０８４７】
QFFカラムを、50mM HEPES、50mM NaCl、pH7.0緩衝液で平衡化する。pHおよび電気伝導度を調節したMabSelectプロテインA段階生産物プールをQFFカラムに適用し、カラムを最小3CVの平衡化緩衝液で洗浄して、弱く結合した不純物を除去する。次いで、このカラムを50mM HEPES、140mM NaCl、pH7.0緩衝液で洗浄して、シアル酸含量が低いCTLA4A29YL104E−Igタンパク質種を除去する。続いて、CTLA4A29YL104E−Igプロテインのシアル化度のより高い種を、5CV以下の50mM HEPES、200mM NaCl、pH7.0緩衝液を用いるカラムから溶出させる。
【０８４８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
Toyopearl Phenyl 650M樹脂(Tosoh Biosciences)を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を、QFFクロマトグラフィー段階から得た生産物プール中のCTLA4A29YL104E−Ig HMW種の量を主に低下させるために用いる。HICカラムにかける前に、QFFクロマトグラフィー段階生産物プールを、50mM HEPES、pH7.0緩衝液および50mM HEPES、3.6M硫酸アンモニウム、pH7.0緩衝液を用いて希釈し、約135mS/cmの電気伝導度およびQFF生産物プール中1g/L以下のCTLA4A29YL104E−Ig濃度が達成される。
【０８４９】
HICカラムを、50mM HEPES、1.2M硫酸アンモニウム、pH7.0緩衝液で平衡化する。濃度および電気伝導度調節したCTLA4A29YL104E−Ig QFFクロマトグラフィー段階生産物プールを該カラムにかける。カラムは、次いで50mM HEPES、1.2M硫酸アンモニウム、pH7.0緩衝液で洗浄して、弱く結合した不純物を除去する。CTLA4A29YL104E−Igタンパク質は、50mM HEPES、0.55M硫酸アンモニウム、pH7.0緩衝液を用いるHICカラムから溶出させる。
【０８５０】
ウイルス濾過
HIC段階から得たCTLA4A29YL104E−Ig生産物プールの濃縮およびダイアフィルトレーションを、限外濾過(UF)により達成する。UF段階は、30−kDa NMWCO膜および25mM NaH2PO4、10mM NaCl、pH7.5緩衝液を使用する。UF段階に続いて、15−nm Planova膜(Asahi Kasei)を用いるウイルス濾過段階を行う。次いで、CTLA4A29YL104E−Igタンパク質生産物プールを、30−kDa NMWCO膜を用いるUFによりタンパク質濃度25g/Lに調節する。
【０８５１】
カラム浄化および保存
MabSelectプロテインAクロマトグラフィーカラムを0.1 N NaOH溶液で浄化し、25mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.5緩衝液を用いて洗浄して、pHを低下させ、次いで20％エタノール中、2℃〜8℃で保存する。QFFクロマトグラフィーカラムを1 N NaOH溶液で浄化して、0.1N NaOH溶液中、室温で保存する。HICカラムを0.1N NaOH溶液で浄化し、20％エタノールで洗浄して、20％エタノール中、室温で保存する。
【０８５２】
実施例20−B：このような精製法のさらに別の例は以下の通りである：
ウイルス不活性化
浄化し、濃縮した採集物質のpHを、0.5M Tris溶液の添加により8.0に調節する。潜在的迷入ウイルス物質を、最終濃度0.5％(v/v)になるよう20％Triton X−100を添加することにより不活性化する。Triton X−100で処理したタンパク質溶液を2時間以上混合する。
【０８５３】
CTLA4A29YL104E−Ig精製のためのプロテインAアフィニティークロマトグラフィー：MabSelectプロテインA樹脂のカラム(以前にAmersham Biosciencesとして知られたGE Healthcare)を使用するアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ウイルス不活性化段階から得た工程内物質由来のCTLA4A29YL104E−Igを捕捉し、不純物の大部分からCTLA4A29YL104E−Igを分離する。
【０８５４】
内径140cmのカラムにMabSelect PrA樹脂を18〜25cmの高さ(約339〜372Lの容量を表す)まで充填する。充填カラムのHETPおよびAsを測定することによりカラムの使用のための適格性が判断される。カラム適格性のために0.02〜0.08cmのHETPおよび0.8〜1.2のAsが用いられる。
【０８５５】
MabSelect PrAカラム操作は、周囲温度で行う。ウイルス不活性化生産物プールを平衡化MabSelect PrAカラム上に負荷する。MabSelect PrA段階は、最大流速26.7L/分および操作圧力13psig以下で操作する。MabSelect PrAカラムに適用される最大CTLA4A29YL104E−Igタンパク質負荷は、直線速度350cm/時で樹脂1リットル当たりのCTLA4A29YL104E−Igタンパク質25gである。カラムベッドは、約3.9kgのCTLA4A29YL104E−Igタンパク質を結合し得る。
【０８５６】
MabSelect PrAカラムを、25mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.5緩衝液で平衡化する。平衡化は、最小3CVの平衡化緩衝液がカラムを通過し、流出液のpHおよび電気伝導度の値が各々7.3〜7.7および14.5〜17.5mS/cmになったときに完了する。
【０８５７】
Triton X−100−処理工程内物質を平衡化MabSelect PrAカラムに適用する。カラムを最小3CVの25mM NaH2PO4、150mM NaCl、0.5％Triton X−100、pH7.5緩衝液で洗浄して、弱く残留した不純物をMabSelect PrAカラムから除去する。これらの不純物には、サイトカイン単球走化性タンパク質−1(MCP−1)およびTriton X−100が含まれる。続く洗浄段階を、25mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.5緩衝液を用いて行い、残存したTriton X−100をMabSelect PrAカラムから除去する。
【０８５８】
CTLA4A29YL104E−Igを、250mMグリシン、pH3.0緩衝液を用いたMabSelect PrAクロマトグラフィーカラムから溶出させる。A280がベースラインより上に0.2AU以上に上昇した時に溶出液を回収容器へ移す。カラム流出液を、0.2μm酢酸セルロースフィルターで濾過して、攪拌装置を備えた回収容器に入れる。溶出ピークの立ち下りのA280が0.2AU以下の値に低下するまで、溶出液を回収する。CTLA4A29YL104E−Igは、約2〜3CVの溶離緩衝液において狭いピークとして溶出する。pHを急激に上昇させてそれによりCTLA4A29YL104E−Ig高分子量(HMW)種の生成を最小にするために、溶出プールのpHを2M HEPES、pH7.5緩衝液でpH7.5±0.2に調節する。MabSelect PrAクロマトグラフィー段階生産物プールを周囲温度で最大5日間保持する。生産物プールを保存のために冷却してもよく；CTLA4A29YL104E−Igの安定性プロファイルは5℃および22℃で同じであった。生産物は5日間まで保存してもよい。
【０８５９】
シアル酸モルのCTLA4A29YL104E−Igタンパク質のモルに対するモル比が約6、または約5.2〜約7.6であるCTLA4A29YL104E−Ig二量体生産物を集める。
【０８６０】
CTLA4A29YL104E−Ig精製に対するQFF陰イオン交換クロマトグラフィー：Q−Sepharose Fast Flow(QFF)樹脂(GE Healthcare)を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーを、よりシアル化度の高い種のCTLA4A29YL104E−Igの量を主に増やし、同時に残存するプロテインＡレベルを低下させるために使用する。MabSelectプロテインAカラムから得た、pH調整したCTLA4A29YL104E−Ig生産物プールを、QFFカラムに適用する前に注入用水(WFI)で約2倍に希釈する。
【０８６１】
内径80cmのカラムにQFF樹脂を27〜35cmの高さ(約136〜176Lの容量を表す)まで充填する。充填カラムのHETPおよびAsを測定することによりカラムの使用のための適格性が判断される。カラムの適格性のために0.02〜0.08cmのHETPおよび0.8〜1.2の非対称性(asymmetry)Asが用いられる。
【０８６２】
QFFカラム操作は、周囲温度で行う。QFFカラムを50mM HEPES、50mM NaCl、pH7.0緩衝液で平衡化する。pHおよび電気伝導度が調節されたMabSelectプロテインA段階生産物プールをQFFカラムに適用する。QFF段階を最大流速16.4L/分(196cm/h)および最大操作圧力35psiで操作する。
【０８６３】
カラムを、使用の前後に1N NaOH溶液で浄化する。最小2カラム容量の水酸化ナトリウム溶液をカラムに通す。次いで、カラムを60〜120分間、静止保持する。溶液およびカラム流出液についての許容し得る電気伝導度範囲は、136〜202mS/cmである。
【０８６４】
カラムを最小5カラム容量の50mM HEPES、50mM塩化ナトリウム、pH7.0緩衝液で平衡化する。この緩衝液に対するpHおよび電気伝導度範囲は各々6.8〜7.2および5.0〜7.0mS/cmである。これらの範囲は、カラムが平衡化されているか否かを測定するためにも用いる。
【０８６５】
pHおよび電気伝導度が調節されたMabSelectプロテインA段階生産物プールをQFFカラムに適用し、このカラムを最小3CVの平衡化緩衝液で洗浄して、弱く結合した不純物を除去する。次いで、カラムを50mM HEPES、135mM NaCl、pH7.0緩衝液で洗浄して、シアル酸含量が低いCTLA4A29YL104E−Ig種を除去する。
【０８６６】
よりシアル化度の高いCTLA4A29YL104E−Igの種は、50mM HEPES、200mM NaCl、pH7.0緩衝液を用いるQFFクロマトグラフィーカラムから溶出する。溶出物回収は、溶離緩衝液をカラムに最初に適用した時に開始する。溶出中、カラム流出液を0.2μmフィルターで濾過して回収容器に入れる。溶出ピークの立ち下りの吸光度がベースラインより上に0.2AU以下に低下するまで、溶出液を回収する。CTLA4A29YL104E−Igは、5CV以下の50mM HEPES、200mM NaCl、pH7.0緩衝液を用いるカラムから溶出する。次いで、回収容器を2℃〜８℃に冷却する。2〜８℃でのQFFクロマトグラフィー段階生産物プールの最大保持時間は、3日間である。
【０８６７】
シアル酸モルのCTLA4A29YL104E−Igタンパク質モルに対するモル比が約6、または約5.2〜約7.6であるCTLA4A29YL104E−Ig二量体生産物を集める。
【０８６８】
CTLA4A29YL104E−Ig精製のためのPhenyl Sepharose FF HIC：Toyopearl Phenyl 650M樹脂(Tosoh Biosciences)を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を、QFFクロマトグラフィー段階から得た生産物プール中のCTLA4A29YL104E−IgのHMW種量を主に低下させるために使用する。
【０８６９】
内径100cmのカラムにPhenyl Sepharose Phenyl 650M樹脂を18〜25cmの高さ(約141〜173Lの容量を表す)まで充填する。充填カラムのHETPおよびAsを測定することによりカラムの使用のための適格性を判断する。HICカラムの適格性のために0.02〜0.08cmのHETPおよび0.8〜1.2のAsが用いられる。
【０８７０】
HICカラム操作は、周囲温度で行う。HICカラムに適用する前に、QFFクロマトグラフィー段階生産物プールを、50mM HEPES、pH7.0緩衝液および50mM HEPES、3.6M硫酸アンモニウム、pH7.0緩衝液を用いて希釈し、QFF生産物プール中で約135mS/cmの電気伝導度および1g/L以下のCTLA4A29YL104E−Ig濃度を達成する。HIC段階は、最大流速22.7L/分(173cm/h)および最大操作圧力45psig以下で操作する。QXL溶出物プールに存在するCTLA4A29YL104E−Igの量に基づいてHIC段階の多サイクルを用いることができる。
【０８７１】
HICカラムをまず1N水酸化ナトリウム溶液で浄化する。浄化は、2〜4CVの1N水酸化ナトリウム溶液がカラムを通過した時に完了する。次いで、浄化を確実にするためにカラムを60〜120分保持する。
【０８７２】
浄化段階後、HICカラムを50mM HEPES、1.2M硫酸アンモニウム、pH7.0緩衝液で平衡化する。平衡化は、最小3CVの平衡化緩衝液がカラムを通過し、流出液のpHが7.0±0.3、電気伝導度が約135mS/cmとなった時に平衡化は完了する。
【０８７３】
濃度および電気伝導度を調節したCTLA4A29YL104E−IgのQFFクロマトグラフィー段階生産物プールをカラムに適用する。次いで、カラムを50mM HEPES、1.2M硫酸アンモニウム、pH7.0緩衝液で洗浄して、弱く結合した不純物を除去する。CTLA4A29YL104E−Igを50mM HEPES、0.55M硫酸アンモニウム、pH7.0緩衝液を用いるHICカラムから溶出させる。このHIC生産物プールを回収容器中、2℃〜8℃で保持する。回収容器における最大保持時間は3日間である。
【０８７４】
シアル酸モルのCTLA4A29YL104E−Igタンパク質モルに対するモル比が約6、または約5.2〜約7.6であるCTLA4A29YL104E−Ig二量体生産物；CTLA4A29YL104E−Ig高分子量物質のプールは2.5％以下で存在し；CTLA4A29YL104E−Ig低分子量物質(例えば、CTLA4A29YL104E−Ig単量体)のプールは0.5％以下で存在し；そしてMCP−1のプールは9.5ng/mL以下で存在する。
【０８７５】
ウイルス濾過  HIC段階から得たCTLA4A29YL104E−Ig生産物プールの濃縮およびダイアフィルトレーションを、限外濾過(UF)により達成する。UF段階は、30−kDa NMWCO膜および25mM NaH2PO4、10mM NaCl、pH7.5緩衝液を使用する。UF段階に続いて、15−nm Planova膜(Asahi Kasei)を用いるウイルス濾過段階を行う。次いで、CTLA4A29YL104E−Ig生産物プールを、30−kDa NMWCO膜を用いるUFによりタンパク質濃度25g/Lに調節する。
【０８７６】
下流CTLA4A29YL104E−Ig生産工程の濃縮およびダイアフィルトレーション段階においてPall Filtron TFF系を用いる。この段階の目的は、HICクロマトグラフィー段階生産物プールを45〜55g/Lに濃縮し、HICクロマトグラフィー段階で用いられる溶離緩衝液をCTLA4A29YL104E−Ig組成物に用いられる最終緩衝液と交換することである。濃縮されたCTLA4A29YL104E−Ig生産物プールを0.2μmポリフッ化ビニリデン膜を通して、50−Lバイオプロセスバッグ中に移す。
【０８７７】
実施例21：生物活性−表面プラズモン共鳴によるCTLA4A29YL104E−IgのB7Ig共受容体への生体特異的結合の測定
表面プラズモン共鳴(B7結合)
この方法は、代表的なB7共受容体へのCTLA4A29YL104E−Igの結合を表面プラズモン共鳴により測定するものである。B7Igは、活性化CM5センサーチップの表面に、第一級アミノ基を介して高密度で固定化される。CTLA4A29YL104E−Ig物質、品質管理物、およびサンプルを0.125〜8ng/mLの濃度に希釈し、B7Ig表面上に注入し、結合センサーグラムを得る。固定化されたB7IgへのCTLA4A29YL104E−Ig結合の初速度(勾配)を、物質移動(拡散)律速条件下、このB7Ig表面上で測定する。1秒当たりの共鳴単位(RU/s)での最初の結合速度は、活性濃度と直接相関している。サンプルの結合速度を、CTLA4A29YL104E−Ig物質の結合速度を濃度に対してプロットしている参照標準曲線を用いて活性濃度に変換する。最終結果は、CTLA4A29YL104E−Ig物質と比較したサンプルの結合パーセントとしてどちらも表す。
【０８７８】
CTLA4A29YL104E−IgにおけるヒトIgG1 Fc領域の存在を、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて検出した。SPRは、リアルタイムでの生体特異的相互作用の測定を可能にする。ヒトIgGのFc領域に特異的な抗体フラグメント(ヤギF(ab')2抗ヒトIgG Fc)を共有結合によりセンサーチップの表面上に固定した。CTLA4A29YL104E−Igサンプルの結合は、この表面上で得られる応答を、非修飾センサーチップ表面と比較して測定することにより検出した。工程B物質、工程C物質および共混合物(Co-mixture)に結合した共鳴単位における結果は、図6および表23に示すように比較される。
2010116402.tif 000070
【０８７９】
ヒト細胞IL2阻害アッセイ
この方法は、抗CD3およびB細胞で刺激したときの、CTLA4A29YL104E−IgによるT細胞からのIL-2産生の阻害に基づく。IL-2プロモーターの制御下の、ルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションしたJurkat T細胞を、様々な濃度のCTLA4A29YL104E−Igの存在下にDaudi B細胞および抗CD3で共刺激する。この共刺激は、IL−2プロモーターを活性化し、順にルシフェラーゼタンパク質を産生する。得られた発光シグナルをルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定する。このシステムにおいて、CTLA4A29YL104E−Igは、ルシフェラーゼ活性の用量依存性の低下をもたらす。
【０８８０】
工程Bロット000929−278、工程Cロット224818−2004−007および共混合物ロット55128−162についての結果は、表24に示すように比較することができる。EC50値、勾配係数および漸近線上限および下限は、3つ全てのサンプルについて１標準偏差内で類似している。これは、工程Ｃ由来および工程Ｂ由来のCTLA4A29YL104E−Igが、インビトロ効力アッセイにおいて同等に作用することを示している。
2010116402.tif 000071
【０８８１】
材料：
−センサーチップCM5、Biacore認定等級(カタログNo. BR−1000−13)
−HBS−EP緩衝液BIA認定10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005％v/v
−界面活性剤P20 Biacore(カタログNo. BR−1001−88)
−アミンカップリングキットBIA認定115mg N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、750mg 1−エチル−3−(3 ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)、10.5mLエタノールアミンHCl Biacore(カタログNo. BR−1000−50)
−PC互換性コンピューターBiacoreを伴うBiacore C機器(カタログNo. BR−1100−51)
−Biacore C機器と共に提供されるBiacore C制御ソフトウェアBiacore、バージョン1.0.1
【０８８２】
アミンカップリングキットBIA認定：このキットは115mg NHS、750mg EDCおよび10.5mLエタノールアミンを有する各々１バイアルを有している。各バイアルを、製造者の使用説明に従い準備する。NHSおよびEDC溶液を、適当な大きさでキャップを有する個々のプラスチック/ガラスバイアル中に200μL容量に等分する。これら溶液は、−20℃で保存した場合に2ヶ月間安定である。エタノールアミンを適当な大きさでキャップを有する個々のプラスチック/ガラスバイアル中に200μL容量に等分する。この溶液は、製造者の使用説明に従い−2〜8℃で保存し、安定である。
【０８８３】
フローセルへの良好な結合を確実にするために、フローセルは１週間または286注入の間(いずれか早い方)、使用されるであろう。新しいフローセルは各週の初めに固定化されるであろう。サンプル試験のための調製におけるB7.1 Igの固定化。注記：全ての溶液を分析のために7mmBiacoreチューブ中に200μLずつ等分する。B7.1 Igを含有する1バイアルを周囲温度で解凍する。B7.1 Igを10mM酢酸塩pH5.0緩衝液(1.7)を用いて希釈し、3000〜9000共鳴単位(RU)の表面質量を達成する。EDCおよびNHSの各々１バイアル(200μL)を周囲温度に解凍する。エタノールアミンHClを冷蔵庫から取り出し、室温に暖める。Biacoreソフトウェアから：「Immobilization Wizard」から選択される、公開された計画「B7 Ig Immobilization」を開く。公開ファイル「B7 Immob.blw」を開く。ウィザードにより進み、「Next」をクリックすることにより選択を確認または変更する。「User Information」のうち、フローセルを選択し、「Notebook」タブにおいて実験情報を与える。試薬およびリガンドバイアルを、概説されるようにサンプルラックに入れる。使用説明書を見直す。テンプレート・ファイルをB7 Immob BIOQC＃Date Initials Chip＃Flow cell＃.blwとして保存する。「Start」をクリックすることにより固定化を開始する。結果ファイルをB7 Immob BIOQC＃Date Initial chip＃flow cell＃.blrとして保存する。アッセイが終了したら、ウィザードの結果およびセンサーグラムを印刷する。
【０８８４】
実施例22：CTLA4A29YL104E−Ig組成物の炭水化物含量分析、トリプシンペプチド・マッピングおよびIEF
トリプシン消化ペプチド・マッピング
【０８８５】
このトリプシン消化法において、CTLA4A29YL104E−Igサンプルをグアニジン−HClを用いて変性させ、DTTおよびIAAを用いて還元およびアルキル化する。サンプルをNAP−5カラムを用いて脱塩し、トリプシンで消化する。消化混合物を逆相(C18)クロマトグラフィーにより分離し、ピークをUV吸光度により215nmで検出する。
【０８８６】
試薬：移動相A溶液(水中0.02％トリフルオロ酢酸(TFA)(v/v))；移動相B溶液(95％ACN(アセトニトリル)および5％水中0.02％TFA(v/v))；アルキル化剤(200mMヨードアセトアミド(IAA))；希釈緩衝液(100mM Tris、25mM NaCl、pH8.0)；変性化緩衝液(8Mグアニジン、50mM TRIS、pH8.0)；消化緩衝液(50mM TRIS、10mM CaCl2、pH8.0)；還元剤(100mM DTT)。
【０８８７】
装置：(同等の装置を用いてもよい)NAP−5カラム(Amersham、cat.＃17−0853−02)；HPLCカラムヒーター；カラムヒーターおよびUV検出器を備えたWater's Alliance HPLCシステム。
【０８８８】
【表１０】
2010116402.tif 000072
【表１１】
2010116402.tif 000073
【０８８９】
還元およびアルキル化：サンプル(例えば、CTLA4A29YL104E−Igなど)を水の添加により10mg/mlに希釈して、最終容量100μL(1mg)にした。560μLの変性化緩衝液および35μLの還元剤(100mM DTT)を100μLのサンプルに加え、混合し、微小遠心管中で3秒間遠沈させた。次いでサンプルを50℃で20分±2分間インキュベートした。次いで35μLのアルキル化剤(200mM IAA)を各サンプルに加え、再び混合し、そして微小遠心管中で3秒間遠沈させた。次いでサンプルをアルホイルで覆い、50℃で20±2分間インキュベートした。3カラム容量(約7〜8mL)の消化緩衝液を注ぐことによりNAP−5カラムが平衡化された後に、500μLの還元およびアルキル化された混合物をNAP−5カラム上に注ぎ、液体をカラムから流出させた。次いで1mLの消化緩衝液を用いてカラムからサンプルを溶離させることにより、サンプルをNAP−5カラムから集めた。
【０８９０】
消化：サンプルを、20μLのトリプシン(0.5μg/μL)を用いて38℃の水浴中、4時間(±0.5時間)消化した。消化が完了したら、サンプルを2.5μLのTFAで酸性にした。次いでサンプルを、以降の分析のためにオートサンプラー・バイアルに入れた。
【０８９１】
装置による方法：装置による方法を以下に示す：
2010116402.tif 000074
【０８９２】
最初の注入の前に、カラムを100％移動相A緩衝液で25分間平衡化した。カラム温度を37℃に、オートサンプラーの温度を4℃に維持しながら、UV吸光度を215nmでモニターした。最初のシステム適合性標準の前に移動相A緩衝液ブランクを流し、その後に各サンプル1回の50μL注入を行った。参考物質の1注入で、各6サンプルの注入を一くくりにすべきである。
【０８９３】
理論段数：理論段数として評価されるカラム効率は、以下の方程式に従い、保持時間とピーク幅を使用して定量的に測定することができる：
2010116402.tif 000075
[式中：
「w」は、比較的直線状の両側をベースラインに外挿することにより計測されるベースラインでのピーク幅であり、「t」は注入時間からピーク最大値の溶出時間まで計測されたピークの保持時間である。
【０８９４】
N＜50000なら、カラムを再度平衡化する。
【０８９５】
分離能：2ピーク間の分離能(R)の測定、例えば、図32に示されるピークT2およびピークT12の間の分離能は、以下の方程式を使用して決定することができる：
2010116402.tif 000076
[式中、t1、t2＝フラグメントピークT2およびピークT12各々の保持時間
w1、w2＝保持時間が各々t1およびt2であるピークのベースラインでの、接線により規定されたピーク幅。]
【０８９６】
R＜1.5であるなら、カラムを再度平衡化すべきであり、問題が持続するならそのカラムを交換すべきである。
【０８９７】
図32および表25は、CTLA4A29YL104E−Igのトリプシン消化から得たペプチドフラグメントを示す。約50分でペプチドT7およびT9を示す領域は、不完全なサンプルの消化を反映することがあり、ピークは日によって異なる特性を示し得る；しかし、１溶出内で全てのサンプルは比較可能性を示す。
表25：CTLA4A29YL104E−Igのトリプシンペプチドフラグメント
【表１２】
2010116402.tif 000077
【表１３】
2010116402.tif 000078
【表１４】
2010116402.tif 000079
a N−結合炭水化物を有するペプチド
b O−結合炭水化物を有するペプチド
c T5、T7、T9およびT14の質量は、炭水化物部分を含まない質量である。
d 糖化ペプチドに対応する多くの質量が観察された。
【０８９８】
等電点電気泳動法(アイソエレクトリックフォーカシング)
等電点電気泳動法(IEF)を用いて、製剤原料および製剤両方におけるCTLA4A29YL104E−Igの様々なイソフォームの等電点(pI)を評価する。この方法では、Pharmacia Biotech Ampholine(登録商標)PAGプレート(pH勾配4.0〜6.5)およびMultiphore II Flatbed電気泳動システムを使用する。サンプル(例えば、CTLA4A29YL104E−Igなど)をMilli−Q水中に希釈し、サンプル・アプリケーション・ストリップを用いてゲル上に負荷する。このゲルを、100mM β−アラニンに浸した陰極ストリップおよび100mMグルタミン酸/500mMリン酸に浸した陽極ストリップを用いて、電圧を上昇させながら2.5時間フォーカシングする。フォーカシング後、このゲルをスルホサリチル酸/トリクロロ酢酸を用いて固定化し、次いでクマシーブルー染色システムを用いて染色する。染色後に、湿ったゲルを、レーザーを用いた濃度計により4096レベルまでの光学密度分解能を有する空間分解能50または100μmでスキャンして、デジタル画像ファイルにする。CTLA4A29YL104E−Igは、pI4.5〜5.5の範囲の10〜15バンドにフォーカシングされる。
【０８９９】
図12に示すように、ゲル(pH4.0〜6.5)上での天然のCTLA4A29YL104E−Igの等電点電気泳動法により、工程Cロット224818−2004−007、工程Bロット000929−287および共混合物ロット55128−162について、4.6〜5.5のpI範囲で同様のバンドパターンが生じる。この方法により、同じIEFゲル上で分析した場合に、工程BおよびCの物質が同等であることが示される。
【０９００】
等電点電気泳動標準物質は、バックグラウンドと容易に識別されるはずである(図12を参照)。
タンパク質標準                 pI
レンチルレクチン              8.65
8.45
ウマ・ミオグロビン            7.35
6.85
コンアルブミン                5.90
ラクトグロブリン              5.20
大豆トリプシンインヒビター    4.55
アミログルコシダーゼ          3.50
【０９０１】
CTLA4A29YL104E−Igは、約4.5〜約5.5のpI範囲を有する多数のバンド(＞10)として同定される(図32)。
【０９０２】
CTLA4A29YL104E−Igは、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA4)の修飾されたリガンド結合ドメインおよびヒトIgG1重鎖の定常領域からなる、第二世代のCTLA4−Ig融合糖タンパク質である。この新規分子は、免疫抑制剤としての治療適用性を有している。CTLA4A29YL104E−Igは、等電点電気泳動法(IEF)により分離され得る多数の電荷イソフォームを含んでいる。IEF法を用いて、CTLA4A29YL104E−Igの製剤原料および製剤両方の分析のためのIEF法が開発されてきた。この方法は、Ampholine(登録商標)PAGプレート(pH4.0〜6.5)Multiphore II平面電気泳動システムにおいてCTLA4A29YL104E−Igを分析するために使用される。CTLA4A29YL104E−Ig製剤原料、製剤および標準物質をMilli−Q水中に希釈し、ゲル上に直接負荷する。このゲルを、100mM β−アラニンに浸した陰極ストリップおよび100mMグルタミン酸/500mMリン酸に浸した陽極ストリップを用いて、電圧を上昇させながら2.5時間フォーカシングする。フォーカシング後、ゲルを固定化し、クマシーブルーで染色する。染色したゲルを、レーザーによる濃度測定法によりスキャンして、ゲルバンドの半定量分析をデジタル画像ファイル上で行う。
【０９０３】
材料：
2010116402.tif 000080
装置：
2010116402.tif 000081
【０９０４】
試薬調製：
陽極緩衝液溶液(100mL)：0.5Mリン酸中0.1Mグルタミン酸；3.4mL 85％リン酸；1.47±0.02gグルタミン酸；Milli−Q水。グルタミン酸を50mLのMilli−Q水に加える。85％リン酸を十分量加えて100mLにして、攪拌混合する。6ヶ月の使用期限を指定して、4℃で保存する。
【０９０５】
陰極緩衝液溶液(100mL)：0.1M β−アラニン、0.9±0.02g β−アラニン、Milli−Q水。十分量の試薬をMilli−Q水で100mLにして、攪拌混合する。6ヶ月の使用期限を指定して、4℃で保存する。
【０９０６】
固定液(2000mL)：12％トリクロロ酢酸中の3.5％5−スルホサリチル酸、240±5.0gトリクロロ酢酸、70±2.0g 5−スルホサリチル酸、Milli−Q水。試薬および十分量のMilli−Q水を合わせて2000mLにする。3ヶ月の使用期限を指定して、室温で保存する。
【０９０７】
装置およびゲル調製。Multiphore II電気泳動ユニットの冷却プラットフォームをMulti−Temp循環恒温槽に接続し、温度を10℃に設定する。循環槽を10±2℃に到達させる。ゲルを冷蔵庫から取り出す。ハサミを用いて、ゲル/ゲル支持体に切り込まないよう確認しながら包みの4辺全てに沿って注意深く切断する。約1.0mLのMilli−Q水を冷却プラットフォームの一端に加える。水がゲルの端全体を移動するように、ゲル/ゲル支持体の一端を水中に入れる。気泡の生成を避けながら、ゲルを冷却プラットフォームにわたるよう注意深く取り付ける。透明フィルムをゲル表面からとり除く。各電極ストリップを約3.0mLの適当な電極溶液(直下の表)に浸す。電極ストリップをゲルの上端および下端から約10mmに取り付ける。陰極ストリップを冷却プラットフォーム上の(−)マークの最も近くに、陽極ストリップを(＋)マークの最も近くに置く。電極ストリップを取り付けたら、ゲル支持体との接触を避けながら、ストリップをゲルに適合するよう切断する。
【０９０８】
電極溶液および電気泳動パラメーターの設定
2010116402.tif 000082
【０９０９】
サンプルアプリケーション・ピースを陰極ストリップの約10mm上に取り付ける。直前の表に定義した電気泳動パラメーターを用いて、電圧が300Vに達するまでゲルをプレフォーカシングする。
【０９１０】
IEF pIマーカーおよび染色対照調製。IEF pIマーカーを100μLのMilli−Q水を用いて再構成する。炭酸脱水酵素II染色対照を1000μL Milli−Q水で再構成して、1.0mg/mL保存溶液を作る。10μLの保存溶液(1.0mg/mL)を90μL Milli−Q水に加えて、最終負荷濃度を0.10mg/mLにする。
【０９１１】
サンプル調製。CTLA4A29YL104E−Ig参考物質およびサンプルを2mg/mLの濃度に希釈する。例：CTLA4A29YL104E−Igサンプルが25mg/mLの濃度を有しているなら、以下に示す希釈を用いて、2mg/mLの最終負荷濃度を調製する：
10μL(25mg/mL)＋115μL Milli−Q水＝2mg/mL
注：サンプル濃度が≦2.0mg/mLであるなら、サンプルを希釈せずに負荷する。
【０９１２】
ゲル負荷。泳動パターンに基づきサンプル同定が容易になるようゲルに負荷する。ゲルに対称になるよう負荷しない。IEF pIマーカー、染色対照、CTLA4A29YL104E−Ig参考物質およびCTLA4A29YL104E−Igサンプルは直下の表にまとめた通りである。全てのサンプルをサンプルアプリケーション・ピース上に負荷する。
【０９１３】
ゲル負荷パターン
2010116402.tif 000083
* レーン1におけるIEF pIマーカーの負荷は、ゲルの方向性を規定するために必要である。2レーン内で負荷パターンを開始し、追加的サンプルについて負荷パターンを繰り返す。IEF pIマーカーは、少なくとも10レーン毎に負荷しなければならない(例：MRS1S2S3S4S5S6RM；M−マーカー−；R−参考物質、Sx−サンプル)。
【０９１４】
ゲル処理。電極ホルダーをMultiphor IIユニット上に置き、電極をゲル上の電極ストリップの中心とそろえる。電極ホルダーの2つの電極をベースユニットに接続し、安全カバーを適所に置く。粘着テープを使用して、安全カバーの穴をふさぎ、ゲルが乾燥するのを防ぐ。電極を電源装置に接続する。電気泳動を適当な電圧、電流および電力で行う。電気泳動が完了したら、電源を切り、安全カバーおよび電極ホルダーを取り外す。電極ストリップおよびサンプルアプリケーション・ピースをゲルから注意深く取り出す。ゲルおよびゲル支持体全体を冷却板から取り出して、200mL固定溶液を有する280×180×40mm Pyrex(登録商標)皿中に入れる。その皿をプラスチックラップで覆い、室温で最小20分間オービタル・シェーカー上に置く。NOTE：ゲルは最大1時間染色すべきである。固定化が完了したら、ゲルを約200mLのMilli−Q水で5分ずつ3回洗浄する。GelCode Blue染色試薬溶液は、ボトルを数回転倒させることにより混合する。均一な試薬サンプルを用いることを確実にするために、分注前に染色試薬を混合することは重要である。約200mLの染色試薬を皿に加える。皿をプラスチックラップで覆い、室温で18〜20時間オービタル・シェーカー上に置いて、最適なバンド展開を達成する。染色が完了したら、染色試薬を約200mLのMilli−Q水で置き換えることにより、ゲルを洗浄する。最適な結果を得るために、1〜2時間で最小3回、水の交換を行う。
【０９１５】
ゲルスキャンニングおよび分析。直前の表において規定されるスキャンパラメーターを用いてゲルをスキャンする。ゲルの分析は、スキャンされた画像ファイル上で行う。
【０９１６】
ゲルスキャンニングおよび分析パラメーター
2010116402.tif 000084
注：表3は、ゲル画像分析のための通常の指標を概説する。各バンドの検出パラメーターの適当な調整に関する詳細情報についてImageQuant TL(v2003.03)マニュアルおよび画面上の指示を参照。
【０９１７】
ImageQuantTLにおける＜1D Gel Analysis(1Dゲル分析)＞からゲル画像ファイル(スキャンされた原データ)を開く。ツールバー上の＜Contrast(コントラスト)＞まで進み、＜Image Histogram (画像ヒストグラム)＞パラメーターを、全てのバンドがはっきりと見えるまで下げる。＜Lane Creation(レーン作成)＞を選択し、＜Manual(マニュアル)＞を選んで、分析すべき＜Number of Lanes(レーン数)＞を設定する。＜Lane ％ Width(レーン幅％)＞を100％まで調節して、ゲルレーンを覆う。必要ならば単一のレーンを適当にそろえる。＜Rolling Ball＞法を用いてバックグラウンドを差し引く。これは、IEFゲルの画像分析に決定的ではない。表3に列挙した初期＜Minimum Slope(最小勾配)＞、＜Noise Reduction (ノイズ低減)＞、および＜％ Maximum Peak(最大ピーク％)＞設定を用いてバンドを検出する。これらの値の調節は、バンドを正確に同定するのに必要である。見逃されたバンドおよび誤認されたあらゆるバンドを手動で補正する。pH/pI 4.0〜6.5のゲルについて、System Suitability Section(システム適合性セクション)に列挙されたラベル化マーカー由来の標準pIマーカーを用いてバンドpI値を計算する。較正と正規化段階を行わない。さらに計算およびレポート作成のために、Measurements Window(測定ウィンドウ)内に含まれるデータをエクセルシートに転送する。結果報告用の定量分析を行うために、エクセルデータを有効な集計表に取り込む。
【０９１８】
システム適合性。等電点電気泳動標準(pIマーカー)は、スキャンされたゲル画像の目視検査により、バックグラウンドから容易に識別され、示されるゆがみは限定的でなくてはならない(pIマーカー列挙のために直下の表を参照)。
【０９１９】
等電点電気泳動標準
2010116402.tif 000085
【０９２０】
注：ゲルのpH/pI範囲は4.0〜6.5であるから、等電点電気泳動標準の全てはゲル上に現れないであろう。3.50、4.55、5.20および5.85でのpIマーカーは、ゲル上で同定され、ラベルされるべきである。
【０９２１】
CTLA4A29YL104E−Ig参考物質および被験物質のバンドパターンは、スキャンされたゲル画像の目視検査により、示されるゆがみは限定的でなくてはならない。一致したゲル染色が示されるように、炭酸脱水酵素II(pI5.4)の染色対照を低レベルのタンパク質の負荷(1.0μg)で用いる。バンドは、スキャンされたゲル画像の目視検査により、バックグラウンドと容易に識別されねばならない。CTLA4A29YL104E−Ig参考物質は、pI範囲4.5〜5.6内でバンド強度≧1.0％を有する8〜15バンドを有していなければならない。pI範囲4.5〜5.6内でのCTLA4A29YL104E−Ig参考物質バンドは、累積強度百分率≧95％を有していなければならない。
【０９２２】
データ計算。以下の計算式を用いて、参考物質と比較したCTLA4A29YL104E−Igサンプルの累積強度百分率の計算を行う：
【０９２３】
2010116402.tif 000086
【０９２４】
例：サンプルが95％のバンド強度％(pI4.5〜5.6)を有し、参考物質が100％のバンド強度(pI 4.5〜5.6)を有するなら、累積強度％は95％となるであろう。
【０９２５】
ある態様において、CTLA4A29YL104E−Ig物質は、4.5〜5.6のpI範囲内で相対的バンド強度＞1.0％を有するバンドを有するであろう。CTLA4A29YL104E−Ig物質は4.5〜5.6のpI範囲内でCTLA4A29YL104E−Ig参考物質のものと比較した累積強度％を有する。
【０９２６】
実施例23：トランスフェクションおよび細胞株の生成
エレクトロポレーションの前に、発現ベクターpD16LEA29Yは、BstBI酵素を用いて線状化し、適合性の4bpオーバーハングを作成した。線状化ベクターおよびせん断ニシン精子キャリアDNA(担体として)をエタノールと共沈殿し、PF CHO培地(JRH Biosciences)中に無菌的に再懸濁して、DG44細胞中にエレクトロポレーションした。
【０９２７】
エレクトロポレーション後、細胞を非選択培地中で回復させた。次いで細胞を、500ng/mLのrecombulin(Gibco)、4mM L−グルタミン(Gibco)およびメトトレキサート(ICN)を含有したPF CHOの選択培地において、96穴プレート中に播種した。
【０９２８】
以下に示すように培養に添加するメトトレキサート(MTX)濃度を進行させて、このプレート培養(plating)から得たCTLA4A29YL104E−Ig産生細胞株を発現増幅のために選択した：
20nM→50nM→100nM→250nM→500nM→1μM MTX
【０９２９】
CTLA4A29YL104E−Ig発現プラスミド全体を細胞ゲノムに組み込む。
【０９３０】
産生細胞株選択
性能の最も良い、増幅された、元になる(master)ウェルの細胞株を2回限界希釈クローニングした後に、最終産生細胞株GF1.1.9を単離した。細胞株GF1.1.9は、増殖パターン、力価および他のクローンから生産された物質に比べて高分子量成分の量が低下し、シアル酸含量がより高い生産物に基づいて選択した。
【０９３１】
実施例24：CTLA4A29YL104E−Igの遺伝子特性化
ゲノム安定性の検討
細胞バンクから得た細胞から単離したDNAおよびRNAを用いて、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション分析、およびCTLA4A29YL104E−Ig暗号配列に対するcDNAの配列決定を行った。これらの結果をCTLA4A29YL104E−Igから得た結果と比較した。
【０９３２】
ノーザンハイブリダイゼーション分析、およびcDNA配列の配列決定の推定を以下に示す。
【０９３３】
ノーザンハイブリダイゼーション分析
細胞バンクから得た細胞を播種した培養物を拡大して、ノーザンハイブリダイゼーション分析用にRNAを単離するために用いた。調製した培養物は、CTLA4A29YL104E−Ig生産工程において用いられるインビトロ細胞齢を約27代超えた細胞を表す。全RNAをCTLA4A29YL104E−Ig細胞バンクから得た細胞および拡大されたCTLA4A29YL104E−Ig細胞由来の細胞から抽出した。親CHO細胞株由来の全RNAを用いる対照もこれらの実験において用いた。約5μgの全RNAを、変性条件下でアガロースゲル電気泳動に供した。ゲル中のRNAを、ナイロン膜上にブロットし、CTLA4A29YL104E−Ig遺伝子を含有する32P−ラベル化1.2kb HindIII/XbaI DNAフラグメントとハイブリダイズした。プローブのために用いた1.2kb HindIII/XbaI DNAフラグメントは、プラスミドpD16LEA29Yから単離した。
【０９３４】
CTLA4A29YL104E−Ig遺伝子プローブにハイブリダイズした約1.7キロベースのmRNA種を、図33に示すように細胞バンク由来の全RNAサンプルにおいて検出した。図33に示されるパネルAおよびパネルBは、エチジウムブロマイド染色されたアガロースゲルおよび対応するオートラジオグラムを各々表す。
【０９３５】
これらの結果は、CTLA4A29YL104E−Igをコードしている唯一の転写物がCTLA4A29YL104E−Ig拡大細胞バンク由来の培養物中に発現されることを示す。さらに、細胞バンクを用いて得られた結果に比較して、これらのサンプルにおいてCTLA4A29YL104E−Ig mRNA転写物中にいかなる検出可能な変化も観察されなかった。
【０９３６】
実施例25：サイズ排除クロマトグラフィー
CTLA4A29YL104E−Ig成分を分析するために、保護カラムを備えた7.8mm×300mm TosoHaas TSK−3000 SWXLカラムを用いて280nmでの検出を行うサイズ排除法が開発されている。CTLA4A29YL104E−Igを、単量体(一本鎖)、二量体または高分子量種(例えば、四量体)を含む生産物均一性について評価する。この方法は、名目濃度約10mg/mLで良好な精度(＜2％)を示し、約0.5〜15mg/mLから直線状(r2＝0.999)である。DL(検出限界)は、約2.26Φg/mLであり、QL(定量限界)は約7.53Φg/mLである。これらの可溶性CTLA4−Ig分子は、免疫抑制剤としての治療への応用可能性を有する、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA4)のリガンド結合ドメインおよびヒトIgG1重鎖の定常領域からなる融合タンパク質である。これらの化合物は、様々な抗原提示細胞(APC)の表面上のB7抗原(CD80およびCD86)への結合を通してそれらの生理学的効果を及ぼし、それによりB7.1およびB7.2のT細胞表面上のCD28との機能的相互作用を阻害する。この阻害は、T細胞活性化の抑制、ゆえに免疫応答の抑制をもたらす。LEA29YはCTLA4Igと2アミノ酸残基、Leu104−gluおよびAla29−Tryで異なるのみであるが、この分子は、B7.1およびB7.2抗原に対する親和性が著しく異なる。LEA29Yは、親CTLA4Igと比較して、ヒト型のB7.2(CD86)に対して5〜10倍高い親和性を示し、ヒトB7.1(CD80)に対して同様の親和性を示す。
【０９３７】
保護カラムを備えたTSK−3000 SWXLカラム(7.8mm×300mm)によるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて280nmで検出することにより、CTLA4A29YL104E−Ig製剤原料を均一性について分析する。CTLA4A29YL104E−Ig二量体、高分子量(HMW)および低分子量(LMW)種が識別される。
【０９３８】
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて、CTLA4A29YL104E−Igを生産物均一性について評価する。図34A〜Cは、工程B、工程Cおよび共混合物ロットについてのCTLA4A29YL104E−IgのSECクロマトグラムを示す。CTLA4A29YL104E−IgのSECにより、工程Cの物質は99.8面積パーセントが二量体、0.2面積パーセントがHMW種で、LMW種は検出不可能であることが示される。これらの結果は、工程Bの物質(二量体97.4面積パーセント、HMW 2.6面積パーセント、およびLMW＜DL)と同程度である。
【０９３９】
試薬：4N KOH(100mL)；システム適合性標準(HPLC等級水に溶解した分子量マーカー)；移動相流出緩衝液(0.2M KH2PO4、0.9％NaCl、pH6.8)；4N NaOH；希釈緩衝液(25mM NaH2PO4−H2O、10mM NaCl、pH7.5)。
【０９４０】
装置および条件−同等の器具で置き換えてもよい：
2010116402.tif 000087
【０９４１】
標準およびサンプル(10mg/ml)を、ラベル化オートサンプラーバイアル中で50ml容量として調製した。サンプルは、重複して調製した。
【０９４２】
計算
分離能(R)測定および保持時間評価：20mLのシステム適合性標準を注入して、該標準を用いて得られたクロマトグラムの2ピーク(例えば、1つのピーク、ピーク1、保持時間約8.5分、および第二のピーク、ピーク2、保持時間約10分)間の分離能を以下の式を用いて計算する：
2010116402.tif 000088
式中：
t1＝ピーク1の保持時間
t2＝ピーク2の保持時間
W1＝ピーク1のピーク幅
W2＝ピーク2のピーク幅
2010116402.tif 000089
＝2.12
【０９４３】
ピーク幅は、比較的直線の両側をベースラインに外挿後の、ピークのベースでの幅(分)に等しい。保持時間およびピーク幅は、同じ単位で計測される。
【０９４４】
Rは、≧1.3でなくてはならず、ピークの保持時間は約8.5±0.5分となるべきである。
【０９４５】
理論段数の測定：システム適合性標準のクロマトグラムから、カラム効率は、以下の計算式に従う理論段数の計算により、測定することができる：
2010116402.tif 000090
式中：
(t)は、ピーク2の保持時間(分)である。
(w)は、図１に見られるように、ピークの両側をベースラインに外挿することにより得られたピーク2のベースラインでの幅(分)である。
【０９４６】
Nは≧2500でなくてはならない。
【０９４７】
ピークの積分：クロマトグラムにおけるピーク面積を積分した(例えば、図34A−C)。CTLA4A29YL104E−Ig二量体ピークは約8.5分で、高分子量種ピークは約7.4分である。
【０９４８】
範囲パーセントは、以下の計算式に従い計算することができる：
二量体の面積％＝
100−(高分子量種の面積％＋低分子量種の面積％)
2010116402.tif 000091
2010116402.tif 000092
式中：
A＝CTLA4A29YL104E−Ig二量体ピーク面積
B＝CTLA4A29YL104E−Ig二量体より小さい保持時間を有する全てのピークの全面積
C＝CTLA4A29YL104E−Ig二量体ピークより大きい保持時間を有する全てのピークの合計面積(封入(inclusion)容量を除く)。
【０９４９】
全面積カウントの％RSD(封入容量を除く)を測定する。全面積カウントの％RSDは、2％以下でなくてはならない。面積が＜2707面積カウントであるなら、＃DL(検出限界)(約2.26μg/mL)として結果を報告する。面積カウントが2707〜9014であるなら、＃QL(定量限界)(約7.53μg/mL)として報告する。面積カウントが≧9014であるなら、小数第一位までのパーセントとして結果を報告する。
【０９５０】
実施例26：SDS−PAGEおよびジスルフィド結合
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
CTLA4A29YL104E−Ig分析のためのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)法を、純度試験として用いる。サンプルを、ジチオスレイトール(DTT)の存在下(還元)または非存在下(非還元)に、Tris−HCl(pH6.8)、SDS、ショ糖、およびブロモフェノール・ブルー・サンプル緩衝液中に調製する。サンプルを80℃水浴に2分間入れ、プレキャスト、勾配(4〜20％)ポリアクリルアミドSDSゲル中で、Tris−グリシンSDS泳動用緩衝液を用いて電気泳動する。電気泳動後、ゲルを固定化し、クマシーブルーまたは銀染色システムを用いて染色する。非還元CTLA4A29YL104E−Igは、約104kDの見かけのおよその分子量を有する1つの大きなバンドとして観察される。CTLA4A29YL104E−Igは、約53kDの見かけのおよその分子量を有する1つの主なバンドとして観察される。
【０９５１】
工程Bロット000929−278、工程Cロット224818−2004−007および共混合物ロット551218−162のサンプルを、還元および非還元の両条件下に4〜20％勾配SDS-PAGEゲルを用いる電気泳動により分離した。図35および図36に示すように、ゲルをクマシーまたは銀染色のどちらかで別々に染色した。非還元CTLA4A29YL104E−IgのSDS−PAGEにより、無傷の単量体を表す約104kDaの主バンドが示された。より小さい3つのバンドは、電子的複製物上で見るのは容易でないが、約200、65および53kDaでも観察された。CTLA4A29YL104E−Igの還元サンプルは、一本鎖形を表す約53kDaでの主バンド、および約150kDaで小さいバンドを示す。この比較により、3つの試験物質は同じゲル上で分析した時に同等であることが示される。
【０９５２】
ジスルフィド結合
ロット224818−2004−007を用いて工程Cの製剤原料についてジスルフィド結合を特性化した。CTLA4A29YL104E−Igの各鎖は、9個のシステインを含んでいる。これらはCys21、Cys48、Cys66、Cys92、Cys120、Cys171、Cys231、Cys277およびCys335である。還元および非還元CTLA4A29YL104E−Igの両方のオンラインLC/MS/MSによるペプチド・マッピングを用いて、CTLA4A29YL104E−Igにおける分子内および分子間ジスルフィド結合の部位を同定した。非還元CTLA4A29YL104E−Igのペプチド・マッピングから得たペプチドのリストを、予想および実測MWと共に表27に示す。
【０９５３】
非還元ペプチドマップにおけるある種のピークの消失および還元ペプチドマップにおける新しいピークの出現は、3つのジスルフィド結合されたペプチドの証拠を与えた：Cys21−Cys92、Cys171−Cys231およびCys277−Cys335のジスルフィド結合に対応するT2−T6、T11−T17およびT25−T30。ペプチドT5およびT7は、比較的高い分子量を有しており、N−結合炭水化物を含むが、このことはジスルフィド結合の位置特定を難しくしている。より短く、炭水化物を含まないペプチドを得るために、CTLA4A29YL104E−Igをトリプシンおよびキモトリプシンの混合物で消化した。さらにキモトリプシンによる切断を行った結果、T7は35−アミノ酸ペプチドから15−アミノ酸ペプチドへと短くなり、これをT7'−T7'(N−結合炭水化物が除去されている)と称した。ジスルフィド結合したペプチドT7'−T7'は、非還元マップにおいて見出される(図37を参照)。T7'−T7'上でのMS/MSにより、その配列およびCys120−Cys120での鎖間ジスルフィド結合が確認された。
【０９５４】
表27  非還元条件下でCTLA4A29YL104E−Igのトリプシン消化から得たジスルフィド結合ペプチドのペプチド配列およびMW
【表１５】
2010116402.tif 000093
ａペプチドT5およびT7-T7は、ジスルフィド結合の位置特定を困難にするＮ−結合グリコシル化の不均一性のために数個の質量を生じさせる。
【０９５５】
また、トリプシンおよびキモトリプシン混合物での処理により、トリプシンのみによるCTLA4A29YL104E−Igの加水分解で観察された他のジスルフィド結合ペプチドのより短い変化体に対応する、フラグメントが生成した。これらを表28に示す。
表28  消化(トリプシンおよびキモトリプシン)によるCTLA4A29YL104E−Igのジスルフィド結合ペプチドのペプチド配列およびMW
【表１６】
2010116402.tif 000094
【０９５６】
トリプシンおよびキモトリプシン混合物でのCTLA4A29YL104E−Igの消化は、T7−T7におけるジスルフィド対合を達成し、トリプシンのみでの消化により見られるジスルフィド結合を確認した。しかし、この酵素混合物は、同じく糖ペプチドであるペプチドT5に対していかなる効果も有していなかった。N−結合炭水化物をT5から除去するために、図38に示すように、CTLA4A29YL104E−Igをトリプシンおよびエラスターゼ混合物で消化した。この酵素混合物は、T5を4つの異なる部位で加水分解し、表29に示すように(T5'−T5'')と称される、より短いペプチドを生じた。この得られたペプチドは、予測質量1259Daを有し、Cys46−Cys66に対応するジスルフィド結合を有していた。トリプシンおよびエラスターゼ混合物による非還元CTLA4A29YL104E−Igの加水分解から得たペプチドマッププロファイルを、図38に示し、ペプチドT5'−T5''の配列を表29に示す。
表29：トリプシンおよびエラスターゼ混合物でのCTLA4A29YL104E−Igの消化により得たペプチドT5'−T5''のペプチド配列およびMW
【表１７】
2010116402.tif 000095
【０９５７】
この結果は、CTLA4A29YL104E−Igが4つの分子内ジスルフィド結合をCys21−Cys92(T2−T6)、Cys48−Cys66(単一ペプチドT5に対応)、Cys171−Cys231(T11−T17)およびCys277−Cys335(T25−T30)の位置に有し、1つの鎖間ジスルフィド結合をCys120−Cys120(T7−T7)の位置に有することを示している。データは、全部で18個のシステイン残基を説明していた。いかなる誤対合も観察されなかった。
【０９５８】
実施例27：CTLA4A29YL104E−Ig製剤
注射用CTLA4A29YL104E−Ig、100mg/バイアルは、無菌性の非発熱性凍結乾燥品である。製剤の組成を表30に示す。これは、灰色のブチル栓で蓋をし、アルミニウムシールで密封したＩ型ガラスバイアルに入れた、白からオフホワイトの完全またはフラグメント化ケーキである。この製品には、バイアル、針および注射器のホールドアップを計算に入れた10％の過剰充填が含まれている。
【０９５９】
投与前に、注射用CTLA4A29YL104E−Ig、100mg/バイアルを4.2mLの注射用滅菌水(Sterile Water for Injection, USP)を用いて構成し、25mg/mLの濃度を得る。これをさらに5％注射用デキストロース(5％ Dextrose Injection, USP)または0.9％注射用塩化ナトリウム(0.9％ Sodium Chloride Injection, USP)で1mg/mLの低濃度に希釈することができる。構成され、希釈された溶液は、透明、無色および目視検査により粒子状物質が本質的に含まれていない。
【０９６０】
2010116402.tif 000096
ａ 各バイアルは再構成溶液のバイアル、針および注射器のホールドアップを計算に入れた10％の過剰充填を含む。
ｂ 凍結乾燥中に除去
【０９６１】
凍結乾燥されるべき凍結溶液のガラス転移温度は−28.9℃であることが測定された。凍結乾燥の検討は、生産物の品質を妥協することなく、第一の乾燥中に許容される最も高い可能な棚温度を決定するために様々な棚温度で行った。これらの検討に基づいて、−20℃の棚温度を、CTLA4A29YL104E−Igの凍結乾燥中、第一乾燥段階のために選択した。凍結乾燥サイクルの最後に、バイアルに減圧下で栓をする。
【０９６２】
生産工程には、凍結乾燥機チャンバーにおける凍結乾燥のためのバルク溶液(適当な賦形剤と共に)を有するバイアルの凍結、次いで温度および圧力制御下での凍結水の昇華が含まれる。チャンバーにおける温度および圧力条件は、生産物品質を妥協することなく、効率的に昇華させるために最適化される。
【０９６３】
様々な製品接触表面との溶液の適合性および包装材を検討した。溶液は、ステンレススチール316L、シリコンチューブ、AcrodiscTM、HT Tuffryn(ポリスルホン)、Millipore PVDF(フッ化ポリビニレン)フィルター膜および選択された容器密封システムと適合性であることが見出された。
【０９６４】
注射用CTLA4A29YL104E−Ig、100mg/バイアルを、15cc Ｉ型フリントチューブガラスバイアルに入れ、20mm DaikyoグレーブチルD−21−7−S/B2−TRフルオロ樹脂被覆栓で蓋をし、20mmアルミニウム・フリップオフ・シールで密封した。
【０９６５】
注射用CTLA4A29YL104E−Igのためのバイアル選択は、効率的な凍結乾燥を確実にするために、5.5mLの充填容量に基づいて行い、20mm DaikyoグレーブチルD−21−7−S/B2−TRフルオロ樹脂被覆栓の選択は、適合性データに基づいて行った。
【０９６６】
長時間使用の適合性の検討を行った。注射用CTLA4A29YL104E−Ig 100mg/mLは、無菌水で注射用に25mg/mLに構成された場合、周囲室温で15℃〜25℃(華氏59〜77度)および室内光で24時間保存してよい。構成された溶液は、さらに0.9％注射用塩化ナトリウム(生理食塩水(Normal Saline/NS))または5％注射用デキストロース(D5W)を用いて1mg/mlまたは10mg/mLのどちらかに希釈され、PVCまたはIntra Via非PVCバッグ中、周囲温度15℃〜25℃(華氏59〜77度)、室内光で保存された場合に、24時間の間、効力の損失または高分子量種の増加がないことが示された。希釈された溶液は、投与前に0.2μmまたは1.2μm混合セルロース/アセテート・フィルターで濾過しなければならない。希釈された溶液は、0.2μmおよび1.2μm混合セルロース/アセテート・フィルターと適合性である。
【０９６７】
生産物は、シリコンと非適合性である。それは、シリコンと相互作用して、目に見える粒子を形成する。ゆえに、シリコン化シリンジなどのシリコン処理表面との接触は避けるべきである。
【０９６８】
実施例28：CTLA4−Ig生産工程
CTLA4−Igは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を用いた大規模細胞培養における分泌タンパク質として生産される。CTLA4−Ig生産工程は、一連のフラスコおよびシード(seed)・バイオリアクター接種物拡大段階を用いて開始される。最終シード・バイオリアクターの内容物を用いて、5000−L生産バイオリアクターに接種する。5000−L生産バイオリアクターから得た細胞培養採集物を浄化し、精密濾過および限外濾過により濃縮する。下流プロセシングのための調製において、細胞を含まない採集物質をpHおよび電気伝導度について調節する。CTLA4−Igは、一連のクロマトグラフィーおよび濾過段階を用いて精製する。下流CTLA4−Ig生産工程には、2つの陰イオン交換クロマトグラフィー段階、1つの疎水性相互作用クロマトグラフィー段階、および1つのアフィニティークロマトグラフィー段階が含まれる。これらの段階の目的は、CTLA4−Igタンパク質を精製し、高分子量CTLA4−Ig物質を除去してCTLA4−Ig製剤原料のシアル酸含量を制御することである。下流プロセシング段階には、ウイルス不活性化段階、および可能性ある迷入ウイルス物質を取り除くための濾過段階も含まれる。精製したCTLA4−Ig製剤原料を2−Lポリカーボネートボトルに充填し、標的温度−40℃で保存する前に標的温度−70℃で凍結した。凍結した製剤原料を解凍する。
【０９６９】
N−アセチルノイラミン酸(NANA)は、CTLA4−Ig製剤原料中に存在する主なシアル酸種である。この章を通してシアル酸への言及は、特にこの種を指している。低レベルのN−グリコリルノイラミン酸(NGNA)もCTLA4−Ig製剤原料中に存在する。NANAおよびNGNAの両レベルは、最終CTLA4−Ig製剤原料について測定される。CTLA4−Ig生産工程のための工程流れ図を以下に示す。
【表１８】
2010116402.tif 000097
【０９７０】
CTLA4−Igは、およその作業容量が4300Lである5000−L生産バイオリアクター中で生産される。1バッチのCTLA4−Ig製剤原料は、細胞バンクから得た1個のバイアル由来の１つの生産バイオリアクターから製造される。上流の細胞培養生産工程は、細胞バンクから得た１個の細胞バイアルを用いて開始される。バイアルを解凍し、全内容物を用いて細胞培養増殖培地を有するT−フラスコに播種する。次いで、細胞を一連のスピナーフラスコ中で拡大する。最終スピナーフラスコ接種物拡大段階から得たフラスコを用いて、140−Lシード・バイオリアクターに播種する。この140−Lシード・バイオリアクターは約100Lの作業容量を有している。140−Lシード・バイオリアクターの内容物を用いて、1100−Lシード・バイオリアクターに播種する。この1100−Lシード・バイオリアクターは約600Lの作業容量を有している。1100−Lシード・バイオリアクターの内容物を用いて、5000−L生産バイオリアクターに播種する。この細胞を5000−L生産バイオリアクターにおいて約14日間培養する。生産バイオリアクター段階に続いて、１つのバイオリアクター由来の細胞培養ブロスをさらに処理するために採集容器に移す。接線流精密濾過(MF)ユニットを用いて、分泌されたCTLA4−Igタンパク質を宿主細胞および細胞破砕物から分離する。CTLA4−Igタンパク質−含有MF濾液を、次いで限外濾過(UF)により濃縮し、最初のクロマトグラフィー段階のための調製においてpHおよび電気伝導度について調節する。
【０９７１】
CTLA4−Ig製剤原料の精製および下流プロセシング段階は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、ウイルス不活性化、アフィニティークロマトグラフィー、接線流UF濃縮およびダイアフィルトレーション、ウイルス濾過、第二の陰イオン交換クロマトグラフィーおよびUF濃縮およびダイアフィルトレーションからなる。HIC段階は、処理されるCTLA4−Igの量に応じて、CTLA4−Igの１バッチ当たり多数のサイクルを使用する。多数のHIC段階サイクルから得た工程内物質を、続くウイルス不活性化段階のためにプールする。異なるロット由来の工程内物質はプールしない。多数のウイルスフィルターを、CTLA4−Igの1つのロットを処理するために平行して用いてもよい。ウイルス濾過に続いて、さらに処理するために濾液をプールする。
【０９７２】
CTLA4−Igの各ロットを0.2μmフィルターで濾過して2−Lポリカーボネート(PC)ボトルに入れ、2〜8℃で一時的に保存する。CTLA4−Igの2−L PCボトルを−70℃の標的温度で凍結し、次いで−40℃の標的温度で保存する。製剤原料のボトルをインキュベーター中、22〜24℃で解凍し、出荷前に2〜8℃に冷却する。
【０９７３】
生産
CTLA4−Igは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を用いる大規模細胞培養物中で生産される。CTLA4−Ig上流生産工程は、細胞バンク由来の凍結バイアルの解凍で開始される。培養物をT−フラスコ、次いで一連のスピナーフラスコ培養中で増殖させる。これらの培養物を140−Lシード・バイオリアクターに移す。140−Lシード・バイオリアクターから得た培養物を1100−Lシード・バイオリアクターに移す。1100−Lシード・バイオリアクターから得た培養物を用いて、5000−L生産バイオリアクターに播種する。生産バイオリアクターを、標的シアル酸のCTLA4−Igタンパク質に対するモル比に主に基づいて採集する。細胞培養採集物を、精密濾過(MF)および限外濾過(UF)の組み合わせを用いて浄化、濃縮する。最後に、濃縮した細胞不含採集物質を、下流プロセシングのための調製において、特定の電気伝導度およびpHを達成するよう調節する。
【０９７４】
細胞培養およびフィード培地調製
固体および液体培地成分の重さを量り、計測する。2つの細胞培養培地をこの工程で用いる。培地127−Gを、T−フラスコ、スピナーフラスコ、シード・バイオリアクターおよび生産バイオリアクター段階において用いる。培地117−Eを、生産バイオリアクター段階におけるフィード培地として用いる。培地127−Gの組成を、直下の表に示す。
【０９７５】
成分                        濃度
CD-CHO 25×酸可溶物Ｉ            40.0mL/L
CD-CHO 25×酸可溶物II             40.0mL/L
CD-CHO 25×塩Ｉ                  40.0mL/L
CD-CHO 25×塩II                   40.0mL/L
L-グルタミン                       0.585g/L
r-ヒトインスリン(10mg/mL溶液)      0.1ｍL/L
メトトレキサート(20mM溶液)          5μL/L
重炭酸ナトリウム                    2.22g/L
注射用水                          必要に応じて
1N HCl溶液                       pH調製のために0〜5ｍL/L
10N NaOH溶液                    pH調製のために0〜10ｍL/L
【０９７６】
培地117−Eの組成を以下に示す。
成分                        濃度
e-RDF-1培地                       16.47g/kg
デキストロース                     30.29g/kg
D-ガラクトース                    12.38g/kg
L-グルタミン                       4.02g/kg
r-ヒトインスリン(10mg/mL溶液)      0.98ｍL/L
TCイーストレート(Yeastolate)         4.90g/kg
注射用水                          必要に応じて
1N HCl溶液                        pH調製のために0〜5ｍL/L
10N NaOH溶液                     pH調製のために0〜2ｍL/L
【０９７７】
e−RDF−1培地の組成を以下に示す：
成分                      濃度(mg/L)
硫酸銅5H2O                    0.0008
硫酸第一鉄7H2O                0.220
硫酸マグネシウム(MgSO4)       66.20
硫酸亜鉛7H2O                  0.230
ピルビン酸ナトリウム          110.0
DL-リポ酸チオクト             0.050
リノール酸                     0.021
L-アラニン                     6.68
L-アルギニン                 581.44
L-アスパラギン                94.59
L-アスパラギン酸              39.93
L-シスチン2HCl               105.38
L-グルタミン酸                39.7
グリシン                      42.8
L-ヒスチジンHCl-H2O           75.47
L-イソロイシン               157.40
L-ロイシン                   165.30
L-リシンHCl                  197.26
L-メチオニン                  49.24
L-フェニルアラニン            74.30
L-プロリン                    55.3
L-ヒドロキシプロリン          31.5
L-セリン                      85.10
L-トレオニン                 110.8
L-トリプトファン              18.40
L-チロシン2Na2H2O            108.10
L-バリン                      108.9
パラアミノ安息香酸             0.51
ビタミンB12                    0.339
ビオチン                       1.00
D-Caパントテン酸塩             1.29      
【０９７８】
表(続き)：
成分                    濃度(mg/L)
塩化コリン                    12.29
葉酸                           1.96
i-イノシトール                46.84
ナイアシンアミド               1.47
ピリドキサールHCl              1.00
ピリドキシンHCl                0.420
リボフラビン                   0.21
チアミンHCl                    1.59
プトレシン2HCl                 0.020    
【０９７９】
工程においてT−フラスコおよびスピナーフラスコ中で用いられる127−G細胞培養培地を、混合用攪拌機および容量測定のためのガラス窓を備えた培地容器において調製する。T−フラスコおよびスピナーフラスコ接種物拡大段階において用いる培地127−Gのバッチサイズは75Lである。培地127−Gは、注射用水(Water For Injection, WFI)を用いて調製する。固体および液体培地成分をWFIに加える。各成分の添加後、必要とされる時間の間に培地を混合する。WFIを加えて、培地を最終バッチ容量75Lにする。サンプルを最終培地調製物から取り、サンプルのグルコース濃度、pH、および浸透圧を測定して、その培地が規定された許容基準を満たすことを確認する。培地を0.2μmフィルターで濾過して、滅菌ポリエチレン・テレフタラート・グリコール(PETG)ボトルに分注する。T−フラスコおよびスピナーフラスコ接種物拡大段階のために調製した培地127−Gを2〜8℃で最大42日間保存する。140−Lおよび1100−Lシード・バイオリアクター段階のための培地127−Gを、混合用攪拌機を備えた容器中に調製する。140−Lシード・バイオリアクター段階において用いる培地127−Gのバッチサイズは120Lである。140−Lシード・バイオリアクター用培地の調製に用いる容器は、容量計測のための目盛り付きガラス窓を備えている。1100−Lシード・バイオリアクター段階において用いる培地127−Gのバッチサイズは600kgである。1100−Lシード・バイオリアクター用の培地の調製に用いる容器は、重量測定のための差圧伝送器を備えている。
【０９８０】
培地127−Gの必要容量を、連続した0.2μmおよび0.1μmフィルターを通して140−Lおよび1100−Lシード・バイオリアクターに移す。140−Lおよび1100−Lシード・バイオリアクター段階のために調製した培地127−Gを、37℃で最大48時間保持してもよい。培地を4℃でさらに84時間保持してもよい。
【０９８１】
5000−L生産バイオリアクター段階において用いる127−Gおよび117−E細胞培養培地の調製
5000−L生産バイオリアクター段階のための培地127−Gは、攪拌機および重量測定のための差圧伝送器を備えた培地調製容器中で調製する。5000−L生産バイオリアクター段階において用いる培地127−Gのバッチサイズは2900kgである。培地127−Gの必要容量を、連続した0.2μmおよび0.1μmフィルターを通して5000−L生産バイオリアクターに移す。5000−L生産バイオリアクター段階のために調製した培地127−Gを37℃で最大48時間保持してもよい。この培地を4℃でさらに84時間保持してもよい。
【０９８２】
フィード培地117−Eは、混合のための攪拌機および重量測定のための差圧伝送器を備えた培地調製容器において調製する。5000−L生産バイオリアクター段階において用いる培地117−Eのバッチサイズは、1800kgである。培地117−Eの成分を、培地調製容器中のWFIの特定重量に加える。各成分の添加後の必要時間でこの培地を混合する。WFIを加えて、培地を特定の最終重量にする。サンプルを最終培地調製物から取り出し、培地が規定された許容基準を満たすことを確認するためにサンプルのグルコース濃度、pHおよび浸透圧を測定する。必要容量の培地117−Eは、連続した0.2μmおよび0.1μmフィルターを通してフィード培地含有タンクに移す。5000−L生産バイオリアクター段階のために調製した培地117−Eは37℃で最大2日間保持してもよい。培地を4℃でさらに4日間保持してもよい。
【０９８３】
T−フラスコおよびスピナーフラスコ接種物拡大段階における接種物拡大段階
CTLA4−Ig生産工程のT−フラスコおよびスピナーフラスコ接種物拡大段階の目的は、細胞バンクのバイアル由来の細胞を連続的に増殖させて、140−Lシード・バイオリアクターに接種するための十分な数の生存細胞を得ることである。細胞バンクから得た1個のバイアルを液体窒素保存冷凍庫の気相から取り出し、水浴中37℃で解凍する。バイアルの全内容物を滅菌円錐形遠心管15−mLに無菌的に移す。培地127−Gを加えて最終容量を10mLにする。細胞懸濁物を遠心分離し、上清を捨てて、細胞ペレットを10mLの127−G細胞培養培地中に再懸濁する。再懸濁した細胞を、10mLの127−G培地を含有するT−175フラスコに移す。T−175フラスコ中の培養物の生存細胞密度および生存率パーセントを測定する。この段階での生存率パーセント≧84％が達成された。培地127−GをT−175フラスコに加えて、標的生存細胞密度2.1×105細胞/mLを達成する。
【０９８４】
T−175フラスコを、6％二酸化炭素の雰囲気下、37℃で最大4日間インキュベートして、標的最終細胞数1.80×107生存細胞を達成する。T−175フラスコ段階に続いて、培養物を0.25−L、1−Lおよび3−Lの一連のスピナーフラスコ段階を用いて拡大する。各継代時に、細胞を標的密度2.0×105生存細胞/mLで播種する。スピナーフラスコ培養物を6％二酸化炭素下、37℃でインキュベートする。
【０９８５】
最終3−Lスピナーフラスコ接種物拡大段階から得た細胞培養物質を、滅菌した20−L接種物移動容器中にプールする。3−Lスピナーフラスコ接種物拡大段階での最終生存細胞密度1.0〜2.0×106細胞/mLおよび細胞生存率最小パーセント≧80％が達成された。これらの例示的値は、十分な数の生存細胞が140−Lシード・バイオリアクターの播種に用いられることを確実にする。最終3−Lスピナーフラスコ接種物拡大段階から得た全容量12L〜18Lのプール細胞培養物を用いて、140−Lシード・バイオリアクターに播種する。
【０９８６】
140−Lおよび1100−Lシード・バイオリアクター接種物拡大段階
CTLA4−Ig生産工程の140−Lおよび1100−Lシード・バイオリアクター接種物拡大段階の目的は、5000−L生産バイオリアクターに播種するための十分な数の生存細胞をもたらすことである。シード・バイオリアクターは、細胞培養培地127−Gを用いるバッチ様式で操作される。温度、pH、溶存酸素、圧力、空気のための攪拌および気体流速度、酸素、および二酸化炭素は、分散制御システム(DCS)により制御され、シード・バイオリアクター中の培養物の最適増殖のための条件が与えられる。シード・バイオリアクターは、37℃で操作する。サンプルは、シード・バイオリアクターから取り出し、生存細胞密度、生存率パーセントおよび代謝物の濃度を測定する。
【０９８７】
140−Lシード・バイオリアクターに、3−Lスピナーフラスコ接種物拡大段階から得たプールされた接種物を用いて播種し、標的初期生存細胞密度2.0×105細胞/mLを得る。1100−Lシード・バイオリアクター接種物拡大段階で最終生存細胞密度1.0〜2.5×106細胞/mLおよび細胞生存率最小パーセント≧80％が達成された。これらの許容基準は、十分な数の生存細胞が5000−L生産バイオリアクターに播種するために用いられることを確保するものである。1100−Lシード・バイオリアクターから得た細胞培養物を5000−L生産バイオリアクターに移して、標的初期生存細胞密度1.5×105細胞/mLを達成する。
【０９８８】
生産バイオリアクター段階
5000−L生産バイオリアクター段階の目的は、生存細胞の数を拡大し、CTLA4−Igタンパク質を生産させることである。生産バイオリアクター段階の期間は約14日間である。1100−Lシード・バイオリアクターから得た接種物を、細胞培養培地127−G含有5000−L生産バイオリアクターに接種する。生産バイオリアクターは、流加培養法で操作される。温度、pH、溶存酸素、圧力、空気のための攪拌および気体流速度、酸素、および二酸化炭素は、DCSにより制御され、生産バイオリアクター中の最適な培養物の増殖およびCTLA4−Igタンパク質の生産のための条件が与えられる。
【０９８９】
5000−L生産バイオリアクター段階の間、細胞増殖およびCTLA4−Ig生産を最適にするために、3段階温度制御戦略を用いる。生産バイオリアクターの最初のインキュベーション温度を、37℃に制御して、最適な細胞増殖を達成させる。生産バイオリアクター中で生存細胞密度4.0×106細胞/mLが達成されたとき、または播種時から144時間のいずれか先に到達した時に、温度を34℃に低下させる。温度を240時間で32℃に低下させ、採集するまで32℃に維持する。毎日のサンプルは、5000−L生産バイオリアクターから得て、細胞増殖、細胞生存率、代謝物濃度、CTLA4−Ig力価およびCTLA4−Igタンパク質に対するシアル酸のモル比をモニターする。
【０９９０】
生産バイオリアクターへの培地117−Eのフィーディングは、播種時から12〜24時間で開始する。培養物容量に対して1％(v/v)のフィード培地の到達目標を達成するよう117−E培地を毎日加えるか、またはグルコース濃度を3g/Lにするよう十分な容量のフィード培地117−Eを加える。このフィーディング戦略は、十分なレベルのグルコースおよび他の栄養素を培養物に与えて、生産バイオリアクター段階の間のCTLA4−Igタンパク質の生産を支持するものである。
【０９９１】
培地117−EにD−ガラクトースを補って、CTLA4−Igタンパク質のグリコシル化の増大を促進させる。ガラクトース補充の結果、CTLA4−Igタンパク質の末端シアル酸含量が増大する。シアル酸のCTLA4−Igタンパク質に対するモル比は、CTLA4−Ig生産工程において重要な採集基準である。
【０９９２】
また、生産バイオリアクター中の溶存酸素および攪拌速度を制御するために、3−段階戦略を用いる。初期攪拌速度30rpmにより、物理的状態の均一性が確保され、5000−L生産バイオリアクター内の細胞の沈殿が防止される。初期溶存酸素の設定値40％は、生産バイオリアクター中の培養物の増殖を支持する十分なレベルの溶存酸素の利用可能性を確保する。溶存酸素および攪拌速度の設定値は、播種時から96時間で各々50％および40rpmに上昇させる。播種時から120時間で、溶存酸素および攪拌速度のための設定値は、さらに各々60％および50rpmに上昇させる。この戦略は、生産バイオリアクター段階の間、細胞培養物を維持するために十分なレベルの溶存酸素を確保する。CTLA4−Igタンパク質の力価は、生産バイオリアクター段階の過程で増大する。この段階の過程を通して培養物生存率をモニターする。シアル酸のCTLA4−Igタンパク質に対するモル比を、播種後6日から採集時まで毎日2回モニターする。シアル酸のCTLA4−Igタンパク質に対するモル比は、播種時から約8日目で約10でピークに達し、次いで生産バイオリアクター段階の残りの時間、徐々に低下する。生産バイオリアクターの主な採集基準はシアル酸のCTLA4−Igタンパク質に対するモル比である。生産バイオリアクターは、標的シアル酸のCTLA4−Igタンパク質に対するモル比8.0で採集する。
【０９９３】
さらに、最小細胞生存率値38％が、培養物の採集物について達成された。これらの採集基準は、CTLA4−Ig製剤原料への下流プロセシングのための工程内採集物質の一貫性を確保する。播種拡大開始からCTLA4−Ig上流生産プロセスにおける生産バイオリアクターの採集を通した細胞世代数の合計は約38世代である。該工程において用いられる細胞株は、細胞株安定性の検討において105世代の間安定であることが示された。
【０９９４】
採集操作段階
採集操作段階の目的は、採集物質から細胞および細胞破砕物を取り出して、さらに下流プロセシングのためにCLTA4−Igタンパク質を含有する工程内ストリーム(stream)を濃縮することである。MFおよびUFシステムを採集物質の処理の前に浄化する。MFおよびUFシステムを、過酢酸溶液でフラッシュする。次いで、MFおよびUFシステムを漂白溶液および水酸化ナトリウム溶液で各々処理する。最後に、未透過物(retentate)および透過物中の電気伝導度≦3μS/cmが達成されるまで、MFおよびUFシステムをWFIでフラッシュする。5000−L生産バイオリアクターから得た細胞培養ブロスを採集容器に移す。0.65μmポリフッ化ビニリデン膜を有する接線流MFを用いて、CLTA4−Igタンパク質を含む工程内採集物質から細胞および細胞破砕物を除去する。細胞を含まないMF透過物を透過物容器中に集める。細胞を含まないMF透過物を、30キロダルトン(kDa)の名目分子量カットオフを有するポリエーテルスルホン膜を用いる接線流UFにより同時に濃縮する。UF透過物を、MF工程段階のためのダイアフィルトレーションの媒体として用いる。0.1Nリン酸溶液をMFシステムの保存に用いる。0.1N水酸化ナトリウム溶液をUFシステムの保存に用いる。MFおよびUF操作中、温度、透過物および非透過物の流速および膜間圧をモニターし、制御する。流速は、濾過スキッド上に存在するインライン流量計により測定する。センサーを用いて、圧力および温度を測定する。MF非透過物の流速163〜235L/分およびMF膜間圧≦3.8psigが達成された。これらの値は、採集操作段階の性能における一貫性を確保するものである。
【０９９５】
採集操作における最終段階は、浄化、濃縮された工程内採集物質のpHおよび電気伝導度の調節である。最初の下流クロマトグラフィープロセシング段階の間、CLTA4−Igタンパク質を捕捉するために、濃縮された工程内採集物質のpHおよび電気伝導度を調節する。pHを、2M Tris溶液添加により8.0に調節し、WFIの添加により濃縮透過物の電気伝導度を10mS/cmに低下させる。次いで、濃縮および調節された工程内採集物質を、0.2μmディスポーザブルフィルターを有する3つの平行したそして1つの連続したフィルターハウジングで濾過し、下流精製領域におけるサージタンクに移す。
【０９９６】
【表１９】
2010116402.tif 000098
【表２０】
2010116402.tif 000099
【表２１】
2010116402.tif 000100
【０９９７】
実施例29− CTLA4−Ig精製工程
実施例28に記載の採集操作段階から得た、最終のpH−および電気伝導度が調節された物質は、まず陰イオン交換クロマトグラフィー段階を用いて処理する。次いで、この最初の陰イオン交換クロマトグラフィー段階から得た生産物プールを、疎水性相互作用クロマトグラフィー段階を用いて処理する。次いで、CTLA4−Ig含有物質をTriton X−100で処理して、可能性ある迷入ウイルス物質を不活性化する。Triton X−100処理物質を組み換えプロテインAアフィニティークロマトグラフィー段階を用いて処理する。組み換えプロテインAクロマトグラフィー段階から得た生産物プールを濃縮して、ダイアフィルトレーションする。次いで、可能性ある迷入ウイルス物質除去のためのウイルス濾過段階を行う。濾液を、さらに第二の陰イオン交換クロマトグラフィー段階を用いて精製する。最後に、精製したCTLA4−Igタンパク質を濃縮してダイアフィルトレーションして、最終製剤原料緩衝液に入れる。
【０９９８】
CTLA4−Igは、ヒト細胞傷害性Tリンパ球抗原−4の機能性結合ドメインとIgG1クラスのヒトモノクローナル免疫グロブリンのFcドメインからなる遺伝子組み換えの融合タンパク質である。CTLA4−Ig二量体は、1個のジスルフィド結合により各々共有結合している約46kDaの2つの相同グリコシル化ポリペプチド鎖からなる。CTLA4−Ig生産工程の下流段階のための工程流れ図を示す。CTLA4−Igは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を用いる5000−L生産バイオリアクター中で生産される。下流CTLA4−Ig生産工程におけるクロマトグラフィーおよび濾過段階は、周囲温度で行う。処理段階の間、工程内物質を2〜8℃で保存する。下流工程は、採集操作段階からの工程内採集物質の受け入れから開始する。この物質を最初にQ Sepharose(登録商標) Extreme Load(QXL)樹脂を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーカラムで処理する。QXLカラムはCLTA4−Igタンパク質を採集物質から捕捉するよう機能する。QXLカラム捕捉段階は、さらなる下流プロセシングのために容量の縮小も達成する。
【０９９９】
QXL生産物プールは、Phenyl Sepharose Fast Flow樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)カラムを通す。この段階の間、CLTA4−Ig高分子量(HMW)物質およびチャイニーズハムスター卵巣宿主細胞タンパク質(CHOP)をカラムに結合させる。CLTA4−Ig二量体タンパク質は、HIC樹脂に結合せず、カラムを通過する。HIC段階に続いて、Triton(登録商標)X−100界面活性剤を用いたウイルス不活性化(VI)を行い、可能性ある迷入ウイルス物質を不活性化する。次の段階は、組み換えプロテインA Sepharose Fast Flow(rPA)樹脂アフィニティーカラムを使用するものである。このクロマトグラフィー段階において、CHOPおよび単球走化性タンパク質1(MCP−1)のレベルは低下する。rPA段階は、ウイルス排除段階であると定義される。アフィニティークロマトグラフィー段階の後に、CLTA4−Igタンパク質を濃縮し、30kDa限外濾過(UF)膜を用いて透析し、Planova(登録商標)15nmフィルターを通して処理し、可能性ある迷入物質を除去する。ウイルス濾過(VF)段階が完了したら、CLTA4−Igタンパク質を第二の陰イオン交換カラム(Q Sepharose Fast Flow(QFF)樹脂を使用)で処理する。QFFクロマトグラフィー段階は、残存する組み換えプロテインAおよびDNAレベルを低下させる。QFF段階は、ウイルス排除段階であると定義される。最後に、CLTA4−Igタンパク質を濃縮し、ダイアフィルトレ−ション(25mMリン酸ナトリウム、50mM NaCl、pH7.5溶液に対して30kDa UF膜を使用)する。次いで、CLTA4−Ig製剤原料を、最終充填段階の前に0.2μmフィルターで濾過する。
【１０００】
【表２２】
2010116402.tif 000101
【１００１】
工程関連の不純物CHOP、MCP−1、残存する組み換えプロテインA、DNAおよびTriton X−100を、CTLA4−Ig生産工程の特定の下流プロセシング段階で減少させる。処理限界を有するPPは、各不純物のための主な工程内制御ポイントで確立されている3。生産物プールCHOPおよびMCP−1をrPAクロマトグラフィー段階のためのPPとして同定する。生産物プールの残存組み換えプロテインAリガンド、DNAおよびTriton X−100をQFFクロマトグラフィー段階のためのPPとして同定する。インスリンの既知の構造およびクロマトグラフィー保持に基づいて、HIC、rPAおよびQFF段階は、相互作用の直交モード(orthogonal modes)に基づきインスリンの有意なクリアランスを与えるはずである。さらに、分子量5.8kDaを有するインスリンは、採集および下流工程における3つの30kDa濃縮/ダイアフィルトレーション段階により除去されるべきである。rPA段階は、メトトレキサート(MTX)の＞3.0 log10クリアランスを与える。さらに、分子量0.455kDaを有するMTXは、採集および下流工程における3つの30kDa濃縮/ダイアフィルトレーション段階により除去すべきである。インスリンおよびMTXは発酵培地に一定量が加えられ、下流プロセシングの前の5000−L発酵工程の間、細胞代謝の関数として消費される。下流工程において多数の点でインスリンおよびMTXを測定する。これらの各点でのインスリンおよびMTXレベルは、完了した過去の実行の定量レベルより低かった。
【１００２】
緩衝液：緩衝液調製の目的は、例示的な値、処理限界およびアラート限界に適合する下流プロセシング緩衝液を製造することである。一貫した緩衝液品質は、再現性あるクロマトグラフィー性能を確保するために不可欠である。CTLA4−Ig工程CD−CHO1の下流段階は、17の緩衝液および溶液を必要とする。緩衝液および溶液は、調製されて1ロット内で特定のプロセシング段階のために使用される。CTLA4−Ig工程内物質と接触する緩衝液は、重要な工程緩衝液であると考えられる。生産物−接触緩衝液には、平衡化、洗浄、溶離および生産物プール調整緩衝液が含まれる。洗浄および浄化段階、およびクロマトグラフィー・スキッドにおける紫外吸光(UV)検出器の機能試験において用いる緩衝液および溶液は、広い指定範囲を有する。これらの緩衝液および溶液が広い指定範囲を有し、生産物の接触がないために、これらの緩衝液および溶液にはいかなるPPも指定されていない。10の生産物−接触緩衝液のために規定されたPPおよび対応する例示的な値を要約する。これらの緩衝液についての最大保持時間限界は3日であり、これは緩衝液溶液保持の検討9から得られ、緩衝液安定性の検討により支持されている。また生産物−接触緩衝液は、対応するアラート限界を有する指定PPを有している。これらの緩衝液についてのPPおよび対応するアラート限界を示す。CTLA4−Ig工程内物質と接触しない緩衝液および溶液は、アラートまたは処理限界を有する指定PPを有しており、それらを示す。非生産物−接触緩衝液および溶液はエンドトキシンに対して試験しないが、なぜならそれらは浄化溶液またはクロマトグラフィー樹脂洗浄緩衝液または溶液であって、その後にカラム浄化段階が存在するからである。
【１００３】
Q Sepharose Extreme Load陰イオン交換クロマトグラフィー段階
陰イオン交換クロマトグラフィーは、GE Healthcare(旧Amersham Biosciences)から得たQXL樹脂を用いて行う。1.0m内径カラムにQXL樹脂を17〜24cmの高さ(133〜188Lの容量を表す)まで充填する。カラムは、充填カラムの理論段(HETP)に相当する高さおよび非対称性(As)を測定することにより使用に適格とされる。HETP0.02〜0.08cmおよびAs0.8〜1.2は、QXLカラムの適格性のために必要である。QXLカラムは、CTLA4−Igタンパク質を工程内採集物質から捕捉するよう機能する。QXL捕捉段階は、さらなる下流プロセシングのために容量縮小も行う。QXLカラム操作は周囲温度で行う。浄化された細胞培養ブロスを平衡化QXLカラム上に充填する。QXLクロマトグラフィー段階は、最大流速28L/分を用いて行う。カラム入口圧力を35psig未満に維持する。QXLカラムに対する最大のアバタセプトタンパク質負荷は、樹脂1リットル当たりアバタセプト28グラムである。25mM HEPES、100mM NaCl、pH8.0緩衝液で平衡化することにより、カラムを調製する。カラム平衡化後、採集物質をカラム上に負荷し、流出物のUV吸収を280nmで連続的にモニターする。負荷適用後、カラムを25mM HEPES、120mM NaCl、pH8.0緩衝液で洗浄する。CTLA4−Igタンパク質を、25mM HEPES、850mM NaCl、pH7.0緩衝液を用いてカラムから溶離させる。直下の表は、Q Sepharose Extreme Loadクロマトグラフィー段階のための工程パラメーターを示す。
【１００４】
2010116402.tif 000102
【１００５】
採集物保持時間は、確立されたアラート限界を有する工程一貫性を保証する。プレ濾過生産物プールのバイオバーデン・パラメーターは、一時的なアラートおよび処理限界が各々＜10cfu/mLおよび＜100cfu/mLに指定されている。処理限界により規定されている6つのQXL PPは、カラム高さ、流速、洗浄緩衝液電気伝導度、溶出ピーク端光学密度(OD)、段階収率(step yield)および負荷バイオバーデンである。カラム高さの範囲は、採集物質から生産物を捕捉するために十分な樹脂容量を得るよう確立された。このパラメーターに対する処理限界は、データから確立された。流速は、クロマトグラフィー段階の一貫性および性能を確保するために重要な因子である。それは、最大処理限界を有するPPとしてQXL段階のために規定される。洗浄緩衝液の電気伝導度は、弱く結合した不純物をQXL樹脂から除去するよう確立される。規模縮小範囲決定試験により、このパラメーターがQXL段階の一貫性の維持に重要な因子であることが確定された。溶出ピーク末端ODは、生産物プールにおけるCTLA4−Ig HMW物質のレベルを最小にするために規定される。CTLA4−Ig HMW物質は、溶出ピークの終端で溶出する。段階収率の処理限界は、QXL段階についての工程一貫性を確保する。流速、溶出ピーク末端ODおよび段階収率PPについての処理限界が確立された。負荷バイオバーデンは、処理限界＜1cfu/mLに指定される。12のQXL PPは、示すようなアラート限界により規定される。
【１００６】
工程における緩衝液のpHおよび電気伝導度値をモニターする。調製時にpHおよび電気伝導度の例示的な値に適合しない緩衝液を排除して、その緩衝液ロットを捨てる。QXL段階のために、平衡化緩衝液の電気伝導度およびpH、洗浄緩衝液のpH、および溶離緩衝液の電気伝導度およびpHを規定する。カラム入口圧力は、結合−および−溶離クロマトグラフィー段階の間の一貫性を確保する。QXL段階は、最大圧力限界35psigで行う。製造者の仕様書に従い、QXL樹脂の圧縮を予防するために圧力限界35psigを用いる。生産物プールの電気伝導度は、アラート限界を有するPPである。QXL生産物プールにおけるCTLA4−Ig HMW物質およびCHOPがその後のHICカラムに効率的に結合することを確実にするために、生産物プールの電気伝導度はアラート限界が指定される。アラート限界58.5〜69.1mS/cmが確立された。肯定の一貫性を確保するために、生産物プール力価、シアル酸(SA) N−アセチルノイラミン酸(NANA)モル比、CTLA4−Ig HMW物質およびCHOPは、アラート限界が指定される。生産物プールの力価およびSAアラート限界が確立された。
【１００７】
採集操作段階から得た工程内物質をQXLカラム上に負荷する。カラムを最小10CVの洗浄緩衝液(25mM HEPES、120mM NaCl、pH8.0)で洗浄し、カラム溶出液の280nm(A280)での吸光度を洗浄段階の終わりに測定する。次いで、25mM HEPES、850mM NaCl、pH7.0緩衝液を用いてアバタセプトをカラムから溶離させる。A280が洗浄段階終了時の吸光度単位(AU)値の上方≧0.02AUに上昇したときに、溶出液を回収容器に移し替えた。溶出ピークの後縁のA280が≦1.0AUの値に低下するまで溶出液を集める。溶出液回収容器に溶離緩衝液を直接加えて、溶出液の標的重量600±10kgを達成する。溶出液回収容器中の攪拌速度30±5rpmを用いて、内容物の十分な混合を確保する。混合時間≧5分の後に、回収容器の内容物を0.2μm酢酸セルロースフィルターで濾過して、保持容器に直接入れる。さらに50kgの溶離緩衝液を回収容器に加え、次いで0.2μm酢酸セルロースフィルターで濾過して同じ保持容器に入れる。保持容器の内容物を2〜8℃で72時間まで保存する。
【１００８】
表5  Q Sepharose Extreme Loadクロマトグラフィー段階のための工程パラメーター
2010116402.tif 000103
【１００９】
Phenyl Sepharose Fast Flow疎水性相互作用クロマトグラフィー段階
HIC段階の主な目的は、QXL生産物プールに存在するCTLA4−Ig高分子量種(例えば、四量体)のレベルを低下させることである。CTLA4−Ig四量体は、HIC段階に用いる負荷条件下でHIC樹脂に結合しない。
【１０１０】
HIC段階は、Phenyl Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)を用いて行う。このHICカラムはCTLA4−Ig HMW物質およびCHOPに結合し、ゆえにCTLA4−Igタンパク質流におけるそれらの濃度を低下させる。HICカラムは、25mM HEPES、850mM NaCl、pH7.0緩衝液を用いた平衡化により調製する。QXL段階から得たCTLA4−Ig生産物プールを平衡化カラムに適用する。負荷適用後、25mM HEPES、850mM NaCl、pH7.0緩衝液をカラムに適用する。CTLA4−Igを貫流(flowthrough)およびカラム追跡分画においてカラムから回収する。HICカラムは、QXL生産物プールにおけるCTLA4−Igの全質量に依存してCTLA4−Igの1個のロットを処理するために多サイクルで操作する。サイクルおよびロットの間でカラムを浄化して清浄にする。
【１０１１】
HIC負荷バイオバーデンPPをアラートおよび処理限界により規定する。HIC負荷バイオバーデンPPは、一時的なアラートおよび処理限界が各々＜10cfu/mLおよび＜100cfu/mLに指定されている。カラムに対して規定された5つのHIC値は、カラムの高さ、流速、追跡終了OD、段階収率および負荷保持時間である。カラムの高さは、1ロット当たり1、2または3サイクルでQXLカラムから得た溶出プールを処理するために十分な樹脂容量を得るよう決定された。このパラメーターに対する処理限界は、データから確立された。流速は、クロマトグラフィー段階の一貫性および性能を確保するために重要な因子である。それは、最大処理限界を有する工程パラメーターとしてHIC段階のために規定される。追跡終了ODは、生産物プールにおけるCTLA4−Ig HMW物質のレベルを最小にするよう規定される。CTLA4−Ig HMW物質は、生産物ピークの終わりに溶出する。工程段階収率は、HIC段階のための工程一貫性を確保する。流速、追跡終了ODおよび段階収率PPに対する処理限界は、確立された。負荷保持時間に対する処理限界は、工程の一貫性を確保する。負荷保持時間PPについての処理限界≦5日は、生産物容器保持時間の検討および生化学的安定性の検討により支持されている。9つのHIC PPは、示すようにアラート限界により規定されている。下流工程における緩衝液のpHおよび電気伝導度パラメーターは、アラート限界を有するPPとして同定される。調製時にpHおよび電気伝導度の例示的な値に適合しない緩衝液を排除し、その緩衝液ロットを廃棄する。HIC段階のために、平衡化/追跡緩衝液の電気伝導度およびpHは、アラート限界を有するPPとして規定される。
【１０１２】
カラム入口圧力は、クロマトグラフィー段階の間の一貫性を確保する。HIC段階は、最大圧力限界13psigで行う。製造者の仕様書に従い、HIC樹脂の圧縮を予防するために圧力限界13psigを用いる。生産物プール力価およびSAアラート限界は、工程一貫性を確保し、PARレポート12において確立された。生産物プールDNA、CHOPおよびMCP−1は、続くrPA段階におけるそれらの除去の定量化を容易にするためにこの段階でアラート限界が指定される。
【１０１３】
表7  Phenyl Sepharose Fast Flow疎水性相互作用クロマトグラフィー段階のための工程パラメーター
2010116402.tif 000104
【１０１４】
表7  Phenyl Sepharose Fast Flow疎水性相互作用クロマトグラフィー段階のための工程パラメーター(続き)
2010116402.tif 000105
【１０１５】
ウイルス不活性化段階：HIC段階から得た生産物プール中の潜在的迷入ウイルス物質の不活性化は、最終濃度0.5％(v/v)までの20％Triton X−100の添加により達成される。次の段階に進む前に、界面活性剤処理された溶液を混合し、22±3℃で1〜4時間保持する。VI段階のために規定された5つのPPを示す。20％Triton X−100添加パラメーターの上限は3.8％である。ウイルス不活性化段階のための工程パラメーターを示す直下の表を参照。
【１０１６】
2010116402.tif 000106
【１０１７】
表9  ウイルス不活性化段階のための工程パラメーター
2010116402.tif 000107
【１０１８】
組み換えプロテインA Sepharose Fast Flowアフィニティー段階
GE Healthcareから得た固定化rPA樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行う。rPAクロマトグラフィー段階は、CHOP、MCP−1および潜在的迷入ウイルス物質のレベルを低下させることにより、さらにCTLA4−Igタンパク質を精製する。アフィニティークロマトグラフィーカラムを25mM Tris、250mM NaCl、pH8.0緩衝液で平衡化する。カラムの平衡化後、VI段階から得た、Triton X−100処理された物質をアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する。カラムを最初に25mM Tris、250mM NaCl、0.5％Triton X−100、pH8.0緩衝液で洗浄し、次いで25mM Tris、250mM NaCl、pH8.0緩衝液を用いて第二の洗浄を行う。CTLA4−Igタンパク質を、100mMグリシン、pH3.5緩衝液を用いてカラムから溶出させる。アフィニティーカラムから得た生産物プールのpHを、2M HEPES、pH8.0緩衝液を用いて7.5±0.2に調整する。rPA段階のために規定される4つのPPを表10に示す。rPAクロマトグラフィー段階はウイルス除去段階として同定され、ゆえに、カラムベッド高さは例示的な値21〜25cmを有する新しいPPとして確立された。生産物プールCHOPおよび生産物プールMCP−1は、rPA段階のためのPPとして既に同定された。これらの不純物を処理限界を有するPPとして再規定した。組み換えプロテインA Sepharose Fast Flowクロマトグラフィー段階のための工程パラメーターを示す直下の表を参照。
【１０１９】
2010116402.tif 000108
【１０２０】
rPA段階のための3つのPPをアラートおよび処理限界の両方により規定し、示す。負荷保持時間は、PARレポートにおいて確立されたアラート限界を有する工程一貫性を確保する。負荷保持時間のための処理限界は工程一貫性を確保する。負荷保持時間PPに対する処理限界≦48時間は、生産物容器保持時間の検討および生化学的安定性の検討により支持される。範囲決定試験により、溶離緩衝液pHは、rPA生産物プールにおけるCTLA4−Ig HMW物質のレベルに影響を与える重要な因子として同定された。溶離緩衝液pHに対するアラート限界が確立された。溶離緩衝液pHに対する処理限界は、規模縮小範囲決定試験から確立された。rPA負荷バイオバーデンPPは、各々、一時的なアラートおよび処理限界＜10cfu/mLおよび＜100cfu/mLとして指定された。
【１０２１】
処理限界により規定された7つのrPA PPは、カラム入口圧力、流速、段階収率、生産物プール初期pH、生産物プールHMW、生産物プールCHOPおよび生産物プールMCP−1である。製造者の仕様書に従い、rPA樹脂の圧縮を予防するために圧力限界≦13psigを用いる。流速は、クロマトグラフィー段階の一貫性および性能を確保するために重要な因子である。これは、最大処理限界を有するPPとしてrPA段階のために規定される。段階収率および生産物プール初期pHについての処理限界は、rPA段階のための工程一貫性を確保する。流速および生産物プール初期pHについての処理限界は確立された。ピーク溶出中のCTLA4−Ig HMW物質の可能な形成は、このパラメーターについての処理限界≦2.5％の規定を必要とする。処理限界範囲66〜108％は、rPA樹脂の1個のロットから得た平均±3標準偏差のデータを用いて確立された。この範囲は、樹脂の寿命試験において観察された段階収率と合致する。工程関連の不純物CHOPおよびMCP−1は、rPA段階についてのPPとして以前に同定されている。このレポートにおいて、これらの不純物は、処理限界を有するPPとして再規定された。生産物プールのCHOPおよびMCP−1は、これらの工程関連不純物の制御を確保するために、例示的な値を有するCQAsとして規定された。12個のrPA PPは、示すようにアラート限界により規定される。下流工程における緩衝液のpHおよび電気伝導度パラメーターは、アラート限界を有するPPとして同定される。調製時にpHおよび電気伝導度の例示的な値に適合しない緩衝液を排除し、その緩衝液ロットを廃棄する。rPA段階のために、平衡化/洗浄2緩衝液の電気伝導度およびpH、洗浄1緩衝液の電気伝導度およびpHおよび溶離緩衝液の電気伝導度は、アラート限界を有するPPとして規定される。
表11  組み換えプロテインA Fast Flowクロマトグラフィー段階のための工程パラメーター
2010116402.tif 000109
【１０２２】
表11  組み換えプロテインA Fast Flowクロマトグラフィー段階のための工程パラメーター(続き)
2010116402.tif 000110
【１０２３】
濃縮/ダイアフィルトレーションおよびウイルス濾過段階
rPAカラムからの溶出時に、生産物プールを濃縮して、CTLA4−Ig濃縮の限界内の標的容量を達成する。次いでこの濃縮物を、30kDa名目分子量カットオフ(NMWC)膜によるUFシステムを用いる、25mM HEPES、100mM NaCl、pH8.0緩衝液を使用するダイアフィルトレーションにかける。ダイアフィルトレーション後に、フィルター列を用いて、潜在的迷入ウイルス粒子を除去する。フィルター列は、0.2μmフィルター、0.1μmフィルターおよび15nm膜フィルター(Planova 15Nフィルター)からなる。VF段階(0.2μm、0.1μmおよび15nm)において用いるフィルターは、使い捨てのフィルターである。UF後のCTLA4−Ig濃度の範囲およびPlanova差圧の上限は、これらの条件を用いた、示されたウイルス除去に基づいて上昇した。ウイルス濾過段階のための工程パラメーターを示す下の表を参照。
【１０２４】
2010116402.tif 000111
【１０２５】
表13  ウイルス濾過段階のための工程パラメーター
2010116402.tif 000112
【１０２６】
Q Sepharose Fast Flow陰イオン交換クロマトグラフィー段階
QFFクロマトグラフィー段階の目的は、残存プロテインAレベルを低下させ、ウイルス濾過段階生産物プール由来の宿主細胞DNAのさらなる減少をもたらすことである。QFFカラム段階も用いて、QFFクロマトグラフィー段階生産物プールのシアル酸のCTLA4−Ig分子またはタンパク質に対するモル比を制御し、さらにHMW物質レベルを制御する。また、QFF陰イオン交換クロマトグラフィー段階は、残存する組み換えプロテインA、宿主細胞DNA、Triton X−100および潜在的迷入ウイルス物質を除去することができる。
【１０２７】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、GE Healthcareから得たQFF樹脂を用いて行う。QFFカラムを25mM HEPES、100mM NaCl、pH8.0緩衝液で平衡化する。カラム平衡化後、Planovaの濾液をQFFカラムに適用する。カラムをまず、25mM HEPES、120mM NaCl、pH8.0緩衝液で洗浄し、次いで第二の洗浄を25mM HEPES、130mM NaCl、pH8.0緩衝液を用いて行う。CTLA4−Igタンパク質は、25mM HEPES、200mM NaCl、pH8.0緩衝液を用いてカラムから溶出する。
【１０２８】
2010116402.tif 000113
【１０２９】
QFF負荷バイオバーデン値は、各々＜10cfu/mLまたは＜100cfu/mLである。処理限界により規定される12のQFF PPは、流速、洗浄2緩衝液電気伝導度、溶離緩衝液電気伝導度、負荷保持時間、段階収率、およびQFF生産物プール中のl残存プロテインA、DNA、Triton X−100、SA、HMW、CHOPおよびMCP−1のレベルである。流速は、クロマトグラフィー段階の一貫性および性能の確保において考慮すべき因子である。これはQFF段階のために、PARレポートにおいて確立された最大処理限界を有する工程パラメーターとして規定される。洗浄2および溶離緩衝液の電気伝導度値は処理限界を有するPPであるが、なぜならそれらは段階収率および生産物品質の決定に重要であるからである。これらのパラメーターのための処理限界は、規模縮小QFF範囲試験中に決定された。負荷保持時間についての処理限界は、工程一貫性を確実にする。負荷保持時間PPについて処理限界≦5日は、生産物容器保持時間試験および生化学的安定性試験により支持される。段階収率は、QFF段階のための工程一貫性を確保する。品質パラメーター、生産物プールSA、HMW、CHOPおよびMCP−1は、最終クロマトグラフィー段階において厳しく制御されねばならない。段階収率、およびQFF生産物プールにおけるSA、CHOPおよびMCP−1のレベルの処理限界は確立された。工程関連の不純物である残存プロテインA、DNAおよびTriton X−100は、既にQFF段階のためのPPとして同定された。これらの不純物は、処理限界を有するPPとして再規定された。残存プロテインA、DNAおよびTriton X−100は、工程関連の不純物の制御を確実にするために、例示的な値を有するCQAとして規定される。この例において、生産物プールHMWについての処理限界は≦2.5から≦2.0％に修正された。
【１０３０】
下流工程における緩衝液のpHおよび電気伝導度パラメーターは、アラート限界を有するPPとして同定される。調製時にpHおよび電気伝導度の例示的な値に適合しない緩衝液を排除し、その緩衝液ロットを廃棄する。QFF段階のために、平衡化緩衝液の電気伝導度およびpH、洗浄1緩衝液の電気伝導度およびpH、洗浄2緩衝液のpH、および溶離緩衝液のpHは、アラート限界を有するPPとして規定される。これらの限界は確立された。カラム入口圧力は、結合−および−溶出クロマトグラフィー段階の間の一貫性を確保する。QFF段階は、製造者の仕様書に従い、最大圧力限界35psigで行う。洗浄1緩衝液容量、洗浄2緩衝液容量、生産物プール力価および生産物プール容量は、工程一貫性を確保するためにアラート限界12が指定される。
表15  Qセファロース高速(Q Sepharose Fast Flow)クロマトグラフィー段階のための工程パラメーター
2010116402.tif 000114
【１０３１】
表15  Qセファロース高速クロマトグラフィー段階のための工程パラメーター(続き)
2010116402.tif 000115
【１０３２】
濃縮/ダイアフィルトレーションおよび充填段階。QFF 陰イオン交換クロマトグラフィー段階から得た生産物プールを濃縮して、30kDa NMWC膜によるUFシステムを用いる25mMリン酸ナトリウム、50mM NaCl、pH7.5緩衝液を使用するダイアフィルトレーションにかける。ダイアフィルトレーションされた濃縮物を、0.2μmフィルターで濾過して、滅菌容器に入れ、2〜8℃で保存する。製剤原料は、必要なら−70℃で凍結させて、−40℃で保存してもよい。濃縮/ダイアフィルトレーションおよび充填段階のために規定された1個のPPを示す。製剤原料濃縮/ダイアフィルトレーションおよび充填段階のための工程パラメーターを示す、直下の表を参照。
【１０３３】
2010116402.tif 000116
【１０３４】
UF II生産物プールバイオバーデンPPを、各々一時的なアラートおよび処理限界＜10cfu/mLおよび＜50cfu/mLに指定する。濃縮/ダイアフィルトレーションおよび充填段階のための処理限界により規定された6つのPPは、示すようにダイアフィルトレーション容量、濾液の電気伝導度およびpH、段階収率、負荷保持時間、および工程収率である。ダイアフィルトレーション容量の下限は、充填段階前の最終製剤原料緩衝液へのCTLA4−Igタンパク質の完全な緩衝液交換を確保するために確立された。濾液電気伝導度および濾液pHは、さらに一貫性ある製剤原料製剤化を確保する。段階収率は、濃縮/ダイアフィルトレーションおよび充填段階のための工程一貫性を確保する。ダイアフィルトレーション容量、濾液伝導度およびpH、および段階収率のための処理限界は、確立された。負荷保持時間についての処理限界は、工程一貫性を確保する。UF II負荷保持時間≦5日は、生産物容器保持時間試験および生化学的安定性試験により支持される。工程収率の処理限界20〜62％が推奨された。2つのPPは、示すようにその段階についての工程一貫性を確保するためにアラート限界により規定される。
【１０３５】
表17  製剤原料濃縮/ダイアフィルトレーションおよび充填段階のための工程パラメーター
2010116402.tif 000117
【１０３６】
実施例30：製剤原料最終充填段階
CTLA4−Igの濃縮およびダイアフィルトレーションII段階の完了後に、CTLA4−Ig製剤原料を、300−Lバイオプロセスバッグから予め滅菌された2−Lおよび10−LBiotainer PCボトル中に、クラス100の環境内で充填する。
【１０３７】
各ボトルの外側を70％イソプロパノール溶液で殺菌する。各ボトルのキャップの周りからシールを取り除き、充填前にボトルの風袋を計測する。バッチ記録において計算を記録して、確実に充填重量が2−Lボトルに対して500グラム〜1950グラムで、10−Lボトルに対して7500グラム〜10200グラムになるようにした。蠕動ポンプを用いて製剤原料を、使い捨て0.45/0.2μmフィルターおよびフィリング・ベル(filling bell)を通してBiotainerボトル中に分注する。ボトルにキャップをして、指定のトルク設定までキャップを締める。各充填ボトルのキャップにテープでシールをし、このテープに頭文字と日付を付ける。各ボトルに、識別情報ならびに充填日、ロット内の充填ボトルの連番およびオペレーターのイニシャルをラベルする。
【１０３８】
充填工程中、空気および表面微生物のモニタリングおよび粒子計測を行う。製剤原料サンプルを充填操作中に得る。エンドトキシン試験のために最初のボトルの充填前に1つのサンプルを得る。エンドトキシン試験のためにさらなるサンプルを、充填工程の間および最後に得る。充填工程中に、サンプル製剤原料放出試験のためのサンプルを得る。
【１０３９】
実施例31：免疫原性の試験
CTLA4−Igは、ヒト免疫グロブリン(Ig)G1の修飾Fc(ヒンジ、CH2およびCH3ドメイン)部分に連結したヒト細胞傷害性Tリンパ球−関連抗原4(CTLA−4)の細胞外ドメインからなる可溶性融合タンパク質である。これは完全なT細胞活性化に用いられるCD80/CD86：CD28共刺激シグナルを選択的に調節する、関節リウマチ(RA)治療のために承認された新しいクラスの薬物における最初のものである。RAにおいては、主要組織適合性複合体を介して未知の抗原が提示され、共刺激シグナルの存在下に自己反応性T細胞を活性化することが前提となる。続いて、活性化されたT細胞は下流免疫細胞を集めて活性化し、炎症および関節破壊をもたらす細胞性プロセスを組織化し永続させる(Choy and Panayi(2001) N Engl J Med, 344(12)：907−916)。
【１０４０】
組み換え生物学的治療薬、例えばCTLA4−Igは、免疫原性であり得、ゆえに抗体反応を引き出す可能性を有する。生物学的薬物に対する免疫原性は理論的に、安全性、有効性および薬物動態に影響を及ぼし得る。生物学的治療の抗体介在性クリアランスは、薬物レベルの低下をもたらし、結果として有効性を低下させ得る。また抗体反応は、薬物がその薬理学的標的に結合するのを妨げる可能性があり、これも有効性を低下させるであろう。これは、用量の経時的な段階的増大−いわゆる「用量クリープ(creep)」に対する必要性を導き得る。用量クリープは、RA治療における抗TNF抗体、インフリキシマブの使用の延長を伴うことが報告されており(Anderson(2005) Semin Arthritis Rheum, 34(5 Suppl1)：19−22)、これはある種の患者において臨床効果の低下を導く抗インフリキシマブ抗体の結果であるとして最近示されている(Haraoui et al., (2006) J Rheumatol, 33(1)：31−36)。
【１０４１】
ここで、抗CTLA4−Igおよび抗CTLA−4抗体の生成、およびCTLA4−Ig治療の有効性および安全性に対するそれらの可能な効果が検討された。CTLA4−Igは、選択的共刺激調節物質としてのその活性および非臨床モデルにおいて観察される応答に基づいて、自身に対する免疫応答を阻害するようであるから、免疫原性のレベルに対する1〜2用量の欠如および治療の中断の効果も検討された。最後に、血清反応陽性サンプルを、抗体活性の中和のために試験した。
【１０４２】
材料および方法
評価された試験
RAを有する患者においてCTLA4−Igが免疫原性の応答を引き起こすか否かを決定するために、抗体反応を、メトトレキサート(MTX)または抗TNF治療への反応が不十分であった患者を含む2,237人のRA患者における6つのDBおよび4つのOL試験期間からなる多数のIIおよびIII相臨床試験にわたって評価した。また1つの試験(IIa相)は、単剤治療としてのRA治療に対するCTLA4−Igを評価した(表40)。サンプルを、試験前、治療を通して、ならびにCTLA4−Igのクリアランスのための時間を与えるため最終投与後56および/または85日目に総合的に評価した。
【１０４３】
【表２３】
2010116402.tif 000118
【表２４】
2010116402.tif 000119
【表２５】
2010116402.tif 000120
RA＝関節リウマチ；MTX＝メトトレキサート；DB＝二重盲検法；TNF＝腫瘍壊死因子；DMARD＝疾患修飾性抗リウマチ薬；ETAN＝エタネルセプト；OL＝非盲検；PK＝薬物動力学的
*OL、非対照期間における被験者は、DB、プラセボ対照試験期間を終了したものの部分集合である。
【１０４４】
事前に指定した注入周囲の有害事象(AE)、全体的AEおよび重篤AE(SAE)、および中止の発生率とタイプを、CTLA4−IgまたはCTLA−4に対する陽性抗体反応を発現した患者において調べた。また、有効性に対する免疫原性の影響を、陽性抗体反応を有する患者における米国リウマチ学会(ACR)20および健康状態質問票(Health Assessment Questionnaire)回答を評価することにより調べた。
【１０４５】
免疫原性アッセイ
基本的なアッセイ形式：特にRA群においては、ヒト血清中のCTLA4−IgのFc部分に対して向けられた交差反応性が高く、既に存在するので、2つの直接−形式の酵素免疫吸着法(ELISA)を用いて、抗体反応を評価した。抗CTLA4−Igアッセイにより、分子の全ての部分に対する抗体反応が測定されたが、感受性は低かった。抗CTLA−4アッセイにより、CTLA−4部分のみ(Ig領域を除く)に対する抗体反応が測定され、これにより与えられた感受性は高かった。両アッセイを、終点力価(EPT)形式(アッセイA)またはスクリーニング形式(アッセイB)のどちらかで用いた。
【１０４６】
アッセイA形式：II相二重盲検臨床免疫原性アッセイ法
II相RA試験中に用いられる抗CTLA4−Igアッセイおよび抗CTLA−4アッセイは、アッセイAと総称した。アッセイAにおいて、CTLA4−IgまたはCTLA−4を96穴マイクロタイタープレート上に吸着させ、次いでこれを試験血清(3倍連続希釈、1：10で開始)と共にインキュベートした。アルカリホスファターゼとコンジュゲート化した抗ヒト抗体カクテル(Southern Biotech、Birmingham、US)を用いて、結合した抗体を検出し、p−ニトロフェニルホスフェート(PNPP)基質を用いて視覚化した。いかなるヒト抗CTLA4−Ig抗体または陽性対照血清も入手可能でなかったので、これらのアッセイは、カニクイザルにおいて得られたCTLA4−Ig−特異的抗血清を用いて有効なものとした。各アッセイから得た結果をEPT値として表した。患者は、彼/彼女のEPTが、個々の投与前(1日目)EPTと比較して、2またはそれ以上の連続希釈分(≧9倍)上昇したなら、セロコンバージョンしたと考えられた。
【１０４７】
アッセイB形式：III相およびII相非盲検臨床免疫原性アッセイ法
III相試験、および2年II相OL期のために、抗CTLA4−Igおよび抗CTLA−4アッセイの両方を修飾して、非特異的バックグラウンドを低下させて、感受性を上昇させ、陽性決定方法を変更し、これをアッセイBと総称した。さらにこれらのアッセイは、カニクイザル抗血清から精製したCTLA4−Ig−特異的抗体を用いて有効なものとした。各ELISAのために、CTLA4−Ig(0.25μg/mL)またはCTLA−4(0.5μg/mL)でコーティングした96穴マイクロタイタープレートを1：400希釈した試験血清と共に22±5℃(抗CTLA4−Ig)で2時間、1：25希釈した試験血清と共に32〜40℃(抗CTLA−4)で2時間インキュベートした。第一のインキュベーション後、結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート化抗ヒト抗体カクテル、次いでテトラメチルベンジジン基質を用いて検出した。
【１０４８】
抗CTLA4−Igアッセイに対する結果を、投与後サンプルのOD値を同じプレート上で分析された対応する投与前サンプルOD値で割ることにより計算されたポスト/プレ比として表現した。陽性は、プラセボ処置したRA患者のサンプルを用いて確立されたカットオフ値を基にした。この比の値がカットオフより小さいなら、サンプルは陰性であるとみなされ、力価値＜400として報告された。このカットオフを超えるいかなる値も条件的に陽性であるとみなされた。
【１０４９】
抗CTLA−4アッセイに対する結果を、平均患者血清サンプルのODを同じプレート上の陰性対照の平均ODで割ることにより計算した「比1」値として表現した。陽性は、陰性対照としてプラセボ処置したRA患者から得たプール血清を用いて確立された値を基にした。値が特定のカットオフより小さいなら、サンプルは、陰性であるとみなされ、力価値＜25として報告した。このカットオフを超えるいかなる値も条件的に陽性であるとみなされた。
【１０５０】
確認分析
各アッセイ(抗CTLA4−Igおよび抗CTLA−4)および各アッセイ形式(アッセイAおよびB)において同定された条件的に陽性であるサンプルを、イムノデプレション(immunodepletion)アッセイにおいて評価し、反応の特異性を測定した。抗CTLA4−Ig陽性サンプルを約40μg/mLのCTLA4−Ig(分子のCTLA−4部分)、他の非関連Ig融合タンパク質(CD40Ig)または非関連タンパク質(オボアルブミン)のいずれかと共に予めインキュベートし、抗CTLA4−Ig反応性が向けられている可能性のある分子領域(CTLA−4、Igまたは結合領域)を同定した。抗CTLA−4陽性サンプルを、同様にCTLA4−Ig、CTLA−4部分またはオボアルブミンのいずれかと共に予めインキュベートして、抗CTLA−4反応性の特異性を確認した。事前インキュベーションに次いで、全てのサンプルを、上記の同じ元のアッセイ形式において再度分析した。事前インキュベーションの結果、未処理サンプルと比較して事前インキュベーションを行ったサンプルの≧30％のOD低下が生じたサンプルは、確認された陽性であるとみなされた。確認されたら、サンプルを滴定して、特定のアッセイのカットオフに等しい比の値をもたらす血清希釈を同定し、この値をEPTとして報告した。
【１０５１】
中和−抗体活性評価
CTLA−4に対する薬物特異的抗体を有する患者サンプルの、CTLA4−Ig活性を阻害または中和(CD80/86への結合を阻害)する(T細胞表面上のCD80/86へのその結合を妨げることによる)能力を評価するために、バイオアッセイを行った。インターロイキン(IL)−2プロモーター制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現している安定なJurkat T細胞形質転換体に、抗CD3抗体の存在下でDaudi B細胞を用いて共刺激した。Jurkat T細胞上のCD28と、抗CD3抗体と組み合わせたDaudi B細胞上のCD80/86の間の相互作用により仲介されるこの共刺激は、IL−2プロモーターを活性化し、ルシフェラーゼ遺伝子の転写の増大をもたらし、ゆえにルシフェラーゼタンパク質の発現を増大させる。発光シグナルを、ルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定する。CTLA4−IgはCD80/86：CD28相互作用を阻害するので、CTLA4−Igの細胞混合物への添加はこのIL−2プロモーター活性化を阻害し、発光を低下させるが、中和抗体との事前インキュベーションは、共刺激相互作用を回復させ、発光の増大をもたらすであろう。
【１０５２】
1：25の投与後血清反応陽性の血清の存在下のバイオアッセイにおいて0.1、0.25または0.5μg/mLの濃度でCTLA4−Ig反応を測定し、その対応する1日目のサンプル存在下の反応と統計学的に比較することにより、CTLA4−Ig中和抗体活性を評価した。バイオアッセイにおいてCTLA4−Ig−中和活性を有する抗ヒトCTLA−4マウスモノクローナル抗体(11D4)を、各分析実行における陽性対照として用いた。バイオアッセイ試験法に固有の限界のために、CTLA4−Igの存在レベル≦1μg/mLを有する投与後サンプルのみを評価することができたが、これはより高い薬物レベルは中和反応に干渉し、さらなるサンプル希釈はアッセイの感受性を低下させることになるからであった。
【１０５３】
薬物動力学的評価
陽性免疫応答が確認されたII相/III相試験のDB期から得た患者由来の血清サンプルデートについて母集団薬物動態(POPPK)解析を行った。有効なPOPPKモデルを個々の患者血清濃度データに適用し、個々のPKパラメーター値の最大事後ベイズ推定値を得た。これらの患者についてのクリアランス、容量推定値、定常状態曲線下面積(AUC)値、および投与後体内の薬物の最低濃度(Cmin)値の分布を、免疫応答を発現しなかった同じ試験由来の患者の大きなデータセットにおけるこれらの値の分布と比較した。
【１０５４】
結果
抗CTLA4−Igおよび抗CTLA−4反応の発生率
計2,237人の患者は、プレ−およびポスト−ベースライン血清サンプルの両方を有しており、評価のために適格であった。これらの、62(2.8％)人の患者は、アッセイAまたはBを用いて測定したときに、抗CTLA4−Igまたは抗CTLA−4反応の証拠を有していた(図39)。いかなる患者も、CTLA4−IgのFcおよびCTLA−4ドメインの両方に免疫応答を示さなかった。3人の患者は、結合領域への応答性を有していた。より感受性の高いアッセイBを用いたときに、CTLA4−Igに対する抗体反応が、1,990人の患者のうち60人で検出された(3.0％)(図39)。
【１０５５】
III相試験(n＝1,764)において評価された患者のうち、203人はDBまたはOL期の間にCTLA4−Ig治療を中止したか、または続くOL試験期間に入らず、治療の中止後56および/または85日目に血清を集めた。203人の患者のうち、15人(7.4％)はCTLA4−Ig(分子全体；n＝5、2.5％)またはCTLA−4(n＝10、4.9％；表42)のどちらかに免疫陽性反応を有していた。III相DB期を終了し、OL治療へと継続した残りの1,561人のRA患者のうち、40人(2.6％)はDBまたはOL期の間に陽性抗体反応を有していた(33人(2.1％)はCTLA4−Igに対して、7人(0.4％)はCTLA−4に対して)。興味深いことに、単剤治療としてのTLA4−IgのIIa相試験において、いかなる患者もCTLA4−Igまたは分子のCTLA−4部分に対してセロコンバージョンしなかったが；感受性の比較的低いアッセイA形式を用いた。
【１０５６】
計191人の患者は、DBおよびOL期間への参加の間にCTLA4−Ig投与がない期間が30日を超えていた。これらの、3人(1.6％)の患者は、OL期の間にCTLA4−Igに対する陽性抗体反応を有し、1人(0.5％)の患者はCTLA−4に対する陽性抗体反応を有していた(表41)。さらに、試験薬物の1〜2投薬を欠落し、試験中のいずれかの時点で再開した587人のRA患者から得た血清を分析した。これらの患者のうち、15人(2.6％)は、CTLA4−Igに対する陽性抗体反応を示し、7人(1.2％)はCTLA−4に対する陽性抗体反応を有していた(表41)。
【１０５７】
表41  CTLA4−Igの使用を中断した血清反応陽性患者数(％)
2010116402.tif 000121
CTLA−4＝細胞傷害性Tリンパ球関連抗原−4；DB＝二重盲検法；OL＝非盲検
【１０５８】
併用メトトレキサートの免疫原性に対する効果
計2451人の患者はMTXを併用し、493人の患者は併用しなかった。全体として、CTLA-Igに対して陽性抗体反応を有する患者のパーセントは、MTX併用または非併用であっても概して同様であった(2.3％対1.4％)(表42)。
【１０５９】
表42  メトトレキサート併用または非併用の、抗CTLA4−Igまたは抗CTLA−4反応を有する患者数(％)
2010116402.tif 000122
CTLA−4＝細胞傷害性Tリンパ球関連抗原−4
【１０６０】
CTLA4−Igの安全性および有効性に対する免疫原性の影響
全ての陽性患者についてのAE、SAE、注入周囲AEの率を評価し、免疫原性と安全性の間のいかなる関係も観察されなかった。同様に、免疫原性と有効性の間のいかなる関係も示されなかったが；セロコンバージョンした患者数が限られているために、これらのデータの解釈は、限定的である。
【１０６１】
抗CTLA−4抗体の中和活性
20人の患者から得た24の血清サンプルは、抗CTLA−4抗体スクリーニングアッセイにおいて抗CTLA−4反応性について陽性であることが確認された。これらのうち、14サンプル(13人の患者から集めた)は、中和バイオアッセイにおける評価のための例示的な値(≦1μg/mL CTLA4−Ig)に合致していた。これらの13サンプルのうち、1つは投与後56日目に陽性であって、10は85日目に陽性であった。14サンプル(8人の患者から得た)のうち9つは、中和抗体活性を示した。1人の患者の敗血症をのぞいて、医学的に重大ないかなるAEも、これらの8人の患者において治療関連または関連の可能性があると考えられるセロコンバージョンの時点またはその頃に、これらの患者において報告されなかった。非常に多くの数のサンプルが中和抗体の評価に適していた時期である、試験中断後の時期(中断後56日および85日目)、有効性データは集められなかった。このようにして、有効性に対する中和抗体の効果を評価することはできなかった。
【１０６２】
薬物動力学的評価
II相/III相試験のDB期中、陽性抗体反応を有していた32人の患者のうち31人について薬物動力学的パラメーターを推定した。PK分析のための血清サンプルは、陽性免疫応答が記録された日に必ずしも集められたのではない。DB試験期から得た患者データの母集団PKモデル化により、31人の免疫陽性患者において予測されたPKパラメーターは陽性免疫応答を有していない患者のより大きな群(n＝386)におけるものと比較され得ることが示唆された。セロコンバージョンが記録されたDB期中の試験日におけるトラフ血清濃度は、1.16〜24.21μg/mLの範囲であって、大多数の血清濃度は5〜20μg/mLの間であった。セロコンバージョンは、血清トラフレベルに影響を与えないようであった。免疫原性の状態による、クリアランスおよび中心コンパートメント容量の分布を図40に示す。
【１０６３】
MSD電気化学発光測定法。薬物存在下での(薬物耐性)結合免疫原性アッセイの感受性および抗体検出能力およびを上昇させることを目指して、Meso−Scale Discovery(MSD)技術を用いることによりCTLA4−Igに対する抗薬物抗体をモニターするために新世代の免疫原性アッセイが開発されている。この新しい技術は、マイクロプレートの電極表面で生じる電気化学的刺激により発光するラベルを用いる。MSD形式は、ELISA形式と比較して薬物の存在下で抗体を検出する能力が増大し、感受性が上昇していることが示されている。この溶液−相技術は、ラベルされた薬物が血清中の薬物とより効率的に競合することを可能にし、より大きなダイナミックレンジ、ノイズに対するシグナル比を有し、ELISA形式よりも増大した表面能力を有している。分子のCTLA4部分または分子全体を捕捉試薬として使用する現在のELISAとは異なり、新しいアッセイは、アビジン被覆MSDプレートへの添加前に患者サンプルとインキュベートさせるビオチン化およびルテニウムラベル化CTLA4−Ig分子を用いる架橋アッセイである。ルテニウム標識により発光する電気化学発光シグナルをMSD装置を用いて測定する。有効なアッセイのカットポイントに基づいた陽性サンプルは、陽性を確認し、CTLA4−Ig分子のどの部分に免疫原性の反応が向けられているかを示すために、MSDアッセイにおいてCTLA4−Ig、CTLA4−TまたはCD40Igのいずれかを用いたイムノデプレッションによりさらに評価され、終点力価が規定される。
【１０６４】
実施例32：サルにおける薬物動力学的パラメーター
1群当たり6匹の雌性カニクイザルに、CD−CHO1工程から生産されたCTLA4−Igの1回の静脈内10−mg/kg投与を行った。6匹の雌性サルからなる対照群には、生理食塩水(1ml/kg)を与えた。CTLA4−Igの生物活性を評価するために、全てのサルに、投与前30分以内に10mg/動物のT細胞依存性抗原キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を筋肉内注射により免疫した。
【１０６５】
処置後6週間、動物を観察した。薬物動力学的プロファイルを測定して比較するために、血液サンプルを、各々、投与前；投与後3分および30分；1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、および48時間；および4日、8日、11日、15日、22日、29日、36日、および43日目に得た。薬物動力学的レポートにおいて、これらの試験日は各々0日、1日、2日、3日、7日、10日、14日、21日、28日、35日および42日に対応する。血清サンプルを、ELISA法によりCTLA4−Igについて分析した。比較可能な血液サンプルを、同じ日に対照動物から集め、適当な場合には、抗KLH抗体反応を評価するために用いた。CTLA4−Ig−特異的抗体の形成の評価を、試験前およびその後毎週CTLA4−Ig−処理動物から得た血清について行った。KLH−特異的抗体の形成を、免疫前およびその後およそ毎週、免疫後4週間の間、全ての動物から得た血清サンプルについて測定した。評価のためのさらに例示的な値には、生存、臨床的兆候、身体診察(神経学的、呼吸数および聴診による評価を含む)、体重、体温、および摂餌量が含まれた。
【１０６６】
試験前および45日目に臨床病理学的評価を行った。全ての動物は、試験終了後に保存のために戻された。
【１０６７】
表43  本発明の工程から生産されたCTLA4−Igの薬物動力学的パラメーター
【表２６】
2010116402.tif 000123
【１０６８】
薬物−特異的抗体反応は、CD−CHO1工程物質で処理した6匹のサルのうち3匹において29日以降に生じた(表43；図41)。CD−CHO1工程物質で処置したサルにおいて血中尿素窒素(BUN)のわずかな上昇(20％)および血清カリウムの減少(14％)は、生理学的または毒性学的に重要なものではなく、これは値が従来の制御範囲のわずかに外側にあるだけで、BUNについては血清クレアチニンの付随する上昇が存在しなかったからである。臨床病理学的パラメーターにおいていかなる他の変化も示されなかった。KLH抗体反応(対照反応ピークの≧94％)の顕著な抑制が、CD−CHO1工程物質を投与したサルで観察された。免疫原性は、CTLA4−Ig血清レベルが29日以降に約1μg/mLの免疫抑制レベルより低くなるまで、著しく遅延した。
【１０６９】
臨床病理学。投与前(−13日)および最後の薬物動力学的採血後(45日)に絶食動物の大腿静脈から血液サンプルを集めた。試験前(−13日)18時間、および最後の薬物動力学的サンプリング(45日)の後に集めた尿について尿検査を行った。以下の分析パラメーターを測定した：血液学：ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数、平均赤血球容積平均、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度、網状赤血球数、総白血球数および白血球分画、血小板数の測定、および末梢血塗抹標本における細胞形態学の評価を行った。凝固：プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、および血漿フィブリノーゲンを測定した。血液生化学検査：尿素窒素、クレアチニン、グルコース、総コレステロール、総タンパク、アルブミン、グロブリン、アルブミン/グロブリン比、アラニン・アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、トリグリセリド、ガンマ・グルタミルトランスフェラーゼ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、クロリド、およびリンを測定した。尿検査：量、比重、pH、色および外観を検査し、グルコース、タンパク質、ケトン、ビリルビン、潜血、およびウロビリノーゲンの定性的測定を行った。尿沈渣は、顕微鏡により検査した。
【１０７０】
特異的抗体反応。同程度の強度の薬物−特異的抗体反応が、CD−CHO1工程物質で処置した6匹のサルのうち3匹において29日目以降に生じた。予想されたように、該工程物質による免疫原性は、CTLA4−Ig血清レベルが29日以降に約1μg/mLの免疫抑制レベルより低くなるまで、著しく遅延した。CD−CHO1工程物質を与えたサルについての平均CTLA4−Ig−特異的抗体反応は36日に陽性になり、43日目(評価した最終時点)にピークとなった。CD−CHO1工程物質を与えた個々のサルにおける抗体力価のピークは、23〜10,448の範囲であった。
【１０７１】
実施例33：カラム上での分離
アフィニティークロマトグラフィー樹脂を通した分離工程は、有用であり、哺乳類細胞において生産される全てのIgG−Fcをベースとする組み換え分子に適用可能である。カオトロピック薬剤を使用して、高分子量タンパク質または物質を分解させることができる。分離は、このようなあらゆるタンパク質に対してカラム上で行うことができる。この実施例は、例示的な物質(すなわち、CTLA4−Ig)に対して分離工程を行う方法を与える。
【１０７２】
生産バイオリアクターにおいて生産されるCTLA4−Ig高分子量(HMW)物質を、溶液中(バッチ様式)、またはアフィニティークロマトグラフィー段階(カラム上での様式)との組み合わせのどちらかでカオトロピック薬剤を使用することにより機能的CTLA4−Ig二量体に部分的に変換することができる。この工程を「分離(disaggregation)」と称する。分離されたCTLA4−Ig物質の分析的特性化試験に基づいて、分離された物質は、分離工程に供されなかった対照物質と生化学的に同等であると思われる。
【１０７３】
本発明のCTLA4−Ig分子を生産する醗酵工程において、得られたCTLA4−Igタンパク質の約20〜25％は、HMW物質(すなわち、凝集体)の形態であり得る。ゆえに、この物質の一部を機能的二量体として回収することは、工程全体の収率を＞10％上昇させる可能性を有している。
【１０７４】
バッチ様式分離工程
適度な濃度のカオトロピック薬剤、例えば塩酸グアニジンまたは尿素を用いた処理、次いで分子がその天然の立体配座をとるのを助ける低塩リフォールディング緩衝液への急速な希釈による分離が、バッチ様式(溶液中)で示されている。
【１０７５】
プロテインA(樹脂はMabSelectを使用)を用いて精製したCTLA4−Igを、これらのバッチ実験のための出発物質として用いるために、最終濃度約4〜5mg/mlに調整した。次いで、これを容量比1：1で2倍濃縮カオトロピック緩衝液と接触させて、最終カオトロピック薬剤の濃度1〜3M(塩酸グアニジンについて)および2〜7M(尿素について)を達成させた。塩酸グアニジン濃度＞2Mおよび尿素濃度≧4Mは、CTLA4−Ig HMW物質の分離を生じさせるのに有効であった。これらの実験に用いた移動相は、pH範囲が6.5〜7.0のリン酸緩衝液系であった。分離反応を50mM Tris、25mM NaCl、pH8.5からなるリフォールディング緩衝液中への急速な希釈(容量比1：5で)によりクエンチした。バッチ分離実験において、HMW物質の50〜60％がCTLA4−Ig二量体に、＞95％段階収率で変換される。分離段階後に観察されたHMW物質のレベルの低下を図42に示す。
【１０７６】
カラム上での分離工程
バッチ分離工程のスケールアップ中の、可能性あるタンクおよび混合の限界を克服するために、プロテインA捕捉段階とこの分離段階を組み合わせる工程を評価した。この工程には、プロテインA段階のためにカオトロピック溶液を溶離緩衝液として使用し、次いで溶出プールをリフォールディング/希釈緩衝液中に回収することが含まれる。
【１０７７】
分離効率における同様の性能が、バッチおよびカラム上での工程を用いて観察された。カラム上での分離工程は、処理段階数を低下させるための明らかな利点を有するであろう。カラム上での分離段階を用いるプロテインA段階のための実験の詳細を以下の表に要約する。使用樹脂：MAbSelect(GE Healthcareから得た)；カラムベッド高さ：20〜25cm
2010116402.tif 000124
【１０７８】
下流工程への組み込みの実現可能性
サンプルの3−カラム精製列を実行し、カラム上でのプロテインA分離段階を使用して、および使用せずに最終工程物質を得た。2つの精製列から得たクロマトグラフィー段階収率を表44に示す。
【１０７９】
表44  分離有りおよび分離なしの3カラム工程についてのクロマトグラフィーによる収率
2010116402.tif 000125
【１０８０】
サンプルの3カラム工程への分離段階の組み込みの結果、工程収率が約10％改善された。2つの工程列から得た生産物プールを分析して、得られたCTLA4−Ig物質の生化学的同等性を評価した。
【１０８１】
2つの生産物プールのMALDI−TOFによるN−グリカン分析を図43に示す。この分析に基づいて、物質は同等であると思われる。このMALDI−TOFの結果は、HPLC−ベースのN−グリカンアッセイ法を用いて確認された。HPLC分析は、対照および分離最終工程物質の間で、二分岐のシアル酸ピークにおいて＜1.7％の差異を示した。
【１０８２】
また、2つの生産物プールについてトリプシンペプチド・マッピングを行い、精製物質に存在する脱アミド化および酸化ペプチドのパーセントを定量した。結果(表45に要約)により、2つのサンプルについての脱アミノ化および酸化レベルが同等であることが示された。
表45  ペプチドマップ結果
2010116402.tif 000126
【１０８３】
さらに、B7−結合アッセイの結果は、対照およびカラム上分離物質に対して、各々101％および98％であった。
【１０８４】
IgG−Fcベースの組み換え分子、例えば哺乳類細胞により生産される分子を分離させる方法は、凝集形態にある該分子を含む組成物を、カオトロピック薬剤(例えば、塩酸グアニジンまたは尿素)と該凝集分子の少なくとも一部分を分離させるのに十分な量および時間、接触させ、場合により、次いで分子の該分離部分をリフォールディング剤および/またはクエンチ剤と接触させる(例えば、該分子が天然の立体配座をとるのを助けるための低塩リフォールディング緩衝液中への急速な希釈による)段階を含む。カオトロピック薬剤との接触は、例えば、バッチ、半−バッチまたは連続様式で、ならびに、例えば、溶液中(例えばバッチ様式で)、またはクロマトグラフィー段階と組み合わせて、例えばアフィニティークロマトグラフィー段階中に(カラム上での様式)行うことができる。
【１０８５】
カラム上での精製、例えばプロテインA捕捉段階を、上述の分離法と組み合わせた工程は、全体の工程の効率性を上昇させることができ、本発明の他の態様である。ゆえに、本発明は、IgG−Fcベースの組み換え分子、例えば哺乳類動物により生産される分子を分離する方法であって、凝集形態にある該分子を含む組成物を、カオトロピック薬剤(例えば、塩酸グアニジンまたは尿素)と該凝集分子の少なくとも一部分を分離させるのに十分な量および時間接触させ、該接触はクロマトグラフィーカラム上で行う、例えば、該カオトロピック薬剤を該カラム溶出のための溶液(例えば、プロテインAカラムのための溶離緩衝液)中で用い、場合により、次いで分子の該分離部分をリフォールディング剤および/またはクエンチ剤と接触させる(例えば、該分子が天然の立体配座をとるのを助けるための低塩リフォールディング緩衝液中への急速な希釈による)段階を含む方法を包含する。
【１０８６】
該カオトロピック薬剤と接触させるべき組成物は、IgG−Fcベースの組み換え分子を凝集形態で含むものに加えて、凝集形態以外の形態(例えば、一本鎖型または二量体)にある該分子を含み得る。
【１０８７】
例示的なIgG−Fcベースの分子は、本発明のCTLA4−Ig分子などの糖タンパク質を含み得る。
【１０８８】
実施例34：薬物動態
活性な関節リウマチを有し、メトトレキサートを使用している被験者に静脈投与されるCTLA4−Igの2つの異なる用量の安全性および臨床効果を評価するための2B相、多施設、無作為、二重盲検、プラセボ対照試験：この試験において、被験者に、2用量のCTLA4−Ig(2および10mg/kg)またはプラセボをMTXと組み合わせて与えた。CTLA4−Igは、本発明の工程に従い生産し、個々のバイアル(200mgのCTLA4−Igを含む)に供給した。CTLA4−Igを、被験者に1日目、15日目、および30日目、およびその後1年間30日毎にIV投与した。多用量PKを、部位−特異的PK副試験に登録された患者から60日目〜90日目の投与間隔の間に得た血清濃度対時間データから得た。PK副試験における被験者について、血液サンプルを60日目の投与前に集め、PKプロファイルは、60日目の30分(CTLA4−Ig注入の終了時に対応)に開始し、注入開始後4時間、およびその後90日目まで毎週行った。合計90人の被験者はPK副試験への参加が登録された。しかし、60〜90日目の投与間隔の間の完全なPKプロファイルは、29人の被験者(15人の被験者には2mg/kgを投与；14人の被験者には10mg/kgを投与)から得た。
【１０８９】
PKパラメーターの要約を表46に示す。この試験から得た結果により、CmaxおよびAUC(TAU)(TAU＝30日)の両方は、用量に比例した様式で上昇することが示された。1：5の比で増大する名目用量に対して、Cmaxの相乗平均は1：5.2の比で上昇し、AUC(TAU)の相乗平均 は1：5.0の比で上昇した。さらに、T−HALF、CLT、およびVss値は、用量に非依存性のようであった。これらのRA被験者において、平均T−HALF、CLT、およびVss値は、各々およそ13日、約0.2mL/h/kg、および約0.07L/kgであった。小さなVssは、CTLA4−Igが主に細胞外液の容量に限定されていることを示す。最初の注入の2週間および4週間後、その後1ヶ月に1回の投薬の投与計画に基づいて、CTLA4−Igの定常状態条件に、毎月投与の3回目で達した。さらに、投与計画の結果として、血清濃度は処置の最初の2ヶ月間、定常状態トラフ濃度を超えるものであった。60日、90日および180日目のトラフ(Cmin)値の比較は、CTLA4−Igが続く毎月の投薬を蓄積しないようであることを示していた。2および10mg/kg CTLA4−Igの毎月のIV投与を受けた全ての被験者に対する平均Cmin定常値の範囲は、各々4.4〜6.7μg/mLおよび22.0〜28.7μg/mLであった。
【１０９０】
表46  関節リウマチ被験者における多数PK試験の概要
2010116402.tif 000127
【１０９１】
RA患者において、多回静脈内注入の後に、CTLA4−Igの薬物動態は、2mg/kg〜10mg/kgの用量範囲にわたり、CmaxおよびAUCの比例した増大を示した。10mg/kgで、血清濃度は、60日目までに平均(範囲)トラフ濃度24(1−66)mcg/mLを有する定常状態に達したようであった。RA患者において、毎月の間隔で10mg/kgを用いた連続的な繰り返し治療によって、CTLA4−Igの全身的蓄積は生じなかった。
【１０９２】
RA患者における母集団薬物動力学的分析により、体重の増加に伴い、CTLA4−Igクリアランスがより高くなる傾向が存在することが明らかになった。年齢および性別(体重に対して補正した場合)は、クリアランスに影響を与えなかった。併用メトトレキサート(MTX)、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)、コルチコステロイド、およびTNF阻害薬はCTLA4−Igクリアランスに影響を与えなかった。
【１０９３】
実施例35：CEによるマンノース、フコースおよびガラクトースのモル比の測定
キャピラリー電気泳動法は、LEA2 CTLA4A29YL104E−Ig中の中性単糖類含量の定量分析のために開発された。マンノース、フコース、およびガラクトースを含む中性単糖類は、高温条件での酸加水分解(2Mトリフルオロ酢酸、95℃で6時間)によりCTLA4A29YL104E−Igサンプルから放出される。次いで放出された中性単糖類を、触媒としての酢酸、および還元試薬としてのNaBH3CNの存在下に、アミノピレントリスルホン酸(APTS)で蛍光ラベルする(67mM APTS、330mM HAc、83mM NaBH3CN、55℃で3時間)。キシロースを各サンプルに加え、内部標準とする。内部標準に対する各中性単糖類のピーク面積の比を定量に使用する。
【１０９４】
試薬：加水分解溶液(2Mトリフルオロ酢酸(TFA))；誘導体化溶液I(0.1M 8−アミノ−1,3,6、トリスルホン酸、3ナトリウム塩(APTS)水溶液)；誘導体化溶液II(1M酢酸中0.25M NaBH3CN)；流出緩衝液(60±5mM四ホウ素ナトリウム、pH9.25)；キャピラリーリンス溶液(1N NaOH；1N HCl；80％メタノール)；10mg/ml濃度のマンノース(Man)、フコース(Fuc)、ガラクトース(Gal)およびキシロース(Xyl)の単糖類標準保存溶液；単糖類作業溶液I：内部標準作業溶液はXyl保存溶液の100倍希釈物である；単糖類作業溶液II：中性混合標準作業溶液、Man、FucおよびGal保存溶液の100倍希釈物。
【１０９５】
装置：CEシステムはBeckman P/ACE MDQ CE sytemであり；検出器：P/ACE MDQと連結したBeckmanレーザー誘導(LIF)検出システム；P/ACE MDQに適応させるための非被覆キャピラリー(内径25μm、外径360μm)、全長27−31cm。
【１０９６】
キャピラリー電気泳動泳動条件：泳動緩衝液(60mM四ホウ素ナトリウム、pH9.25)；キャピラリーカートリッジ温度：25℃；電圧：25〜30kV、正(positive)モード；検出器条件：LIF検出器、488nmでの励起、520mでの発光；サンプル注入：圧力注入様式、0.5PSIで20s；泳動時間：10分；サンプル保存：10℃。
【１０９７】
加水分解：10μLのキシロース作業溶液および200μLの2M TFAを混合して、システム・ブランクを作成した。10μLのキシロース作業溶液および10μLの中性混合標準溶液を200μLの2M TFAと混合して、単糖類標準を作成した。10μLのキシロース作業溶液および10μLのサンプル(例えば、CTLA4A29YL104E−Ig、約1mg/ml)を200μLの2M TFAと混合して、試験サンプルを作成した。全ての試験管を10秒間ボルテックスにかけ、10秒間遠心分離し、次いで95℃で6時間インキュベートした。加水分解段階後、サンプルを−20℃に10分間置いて、冷却した。サンプルを10秒間沈降させ、SpeedVac中で蒸発乾固した。
【１０９８】
誘導体化：サンプルを10μLの誘導体化溶液Iを用いて再構成した。サンプルを軽く混合し、5μLの誘導体化溶液IIを加えた。サンプルを、予め暖めた遠心分離機中に負荷し、2000rpmで遠心分離しながら55℃で3時間インキュベートした。
【１０９９】
CE注入：誘導体化後のサンプル最終容量を、HPLC等級の水の添加により100μLにして、10μLのサンプルを190μL HPLC等級の水を用いてCEマイクロバイアルに移した。サンプル注入前に、CEカートリッジをHPLC等級の水で広範囲にリンスし(泳動時間1〜3分)、次いで泳動緩衝液を用いて平衡化のためのリンスをした(泳動時間5分)。最初のリンス後、単糖類標準および分析用サンプルを、CEカートリッジに注入した(泳動時間15分)。各標準またはテストサンプルの注入泳動後、CEカートリッジを、HPLC等級の水および泳動緩衝液でリンスし、平衡化した(表51)。システム適合性のエレクトロフェログラムは、図45と同様であるはずであり、図中、ピーク1はマンノースであり；ピーク2はキシロースであり；ピーク3はフコースであり；そしてピーク4はガラクトースである。
【１１００】
表51  装置の方法
2010116402.tif 000128
【１１０１】
システム適合性：
システム適合性のエレクトロフェログラムは、図45に示すものと同様であり得、ピーク1はマンノースであり；ピーク2はキシロースであり；ピーク3はフコースであり；そしてピーク4はガラクトースである。
【１１０２】
Beckman MDQシステム以外のCE装置を使用する場合には、キャピラリーの長さは、この方法で指定されるものとは異なる可能性がある。これは、分析物の移動時間、ならびにピーク強度の変動の原因となるであろう。しかし、単糖類分析物のピークパターンは同じに留まるはずである。
【１１０３】
最初のシステム適合性(System Suitability)標準について2つの隣接ピークの間の分離を、以下の式に従い計算することができる：
R＝2(t2−t1)/(W1＋W2)
(式中、
R：分離能
t2、t1：2つの隣接ピーク各々の移動時間
W1、W2：2つの隣接ピーク各々のベースラインでのピーク幅)。
【１１０４】
R値は、≧1.0でなければならない。R＜1.0なら、キャピラリーを洗浄/リンスの連続によりリンスする。問題が存続するなら、古い緩衝液を、新しく調製した泳動緩衝液と取り替えるか、またはキャピラリーを取り替える。
【１１０５】
最後のシステム適合性注入について、最後のピーク(ガラクトース)は、以下の式を用いてテーリング係数＜1.4を有していなければならない：
T＝W0.05/2f
式中：T：テーリング係数
W0.05：高さの5％でのピーク幅
f：最大ピークでのピーク前部の幅。
【１１０６】
T≧1.4であるなら、キャピラリーを洗浄/リンスの連続によりリンスし；問題が存続するなら、古い緩衝液を、新しく調製した泳動緩衝液と取り替えるか、またはキャピラリーを取り替える。ガラクトースとキシロースのピーク面積比は、RSD≦10％を有していなければならない。ガラクトースの移動時間は≦15.0分である必要がある。エレクトロフェログラムのプロファイルは、図45と同等であるはずである。
【１１０７】
単糖類標準物のRSDパーセントは、各単糖類成分のピーク面積を各単糖類標準物注入に対する内部標準のピーク面積で割ることを通じて、内部標準と単糖類標準成分のピーク面積比を比較することにより測定することができる。RSDパーセントを、マンノース、フコース、およびガラクトースについて計算することができる。RSDは≦10％であるべきである。
【１１０８】
タンパク質に対する中性単糖類のモル比の測定
タンパク質に対する各中性単糖類のモル比を測定するために、内部標準キシロースに比較した中性単糖類(例えば、Man、GalおよびFuc)のピーク面積比を、以下に示す式に従い計算することができる。例えば、ピーク面積比は、キシロースのピーク面積で割った単糖類ピーク面積(Gal、FucまたはMan)に等しく、ここでピーク面積比に対する相対標準偏差(RSD)は、10％と等しいかまたはそれより小さい。次の式を使用して、以下に示すものを計算することができる：
マンノース/タンパク質のモル比について：
2010116402.tif 000129
[式中、
Rman：マンノース対タンパク質のモル比
Aman：サンプル中のマンノースのピーク面積(μV.sec)
Axyl：サンプル中のキシロースのピーク面積(μV.sec)
Axyl0：単糖類標準物中のキシロースのピーク面積(μV.sec)平均
Aman0：単糖類標準物中のマンノースのピーク面積(μV.sec)平均
Vman0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるマンノースの容量(μL)
Cman0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるマンノースの濃度(mg/mL)
Vp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの容量(μL)
Cp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの濃度(mg/mL)
MWLEA29Y：LEA29Y(またはCTLA4A29YL104E−Ig)の分子量(91,232Da)
マンノースのMW：180.2ダルトン]。
【１１０９】
フコース/タンパク質のモル比について：
2010116402.tif 000130
[式中、
Rfc：フコース対タンパク質のモル比
Afuc：サンプル中フコースのピーク面積(μV.sec)
Axyl：サンプル中キシロースのピーク面積(μV.sec)
Axyl0：単糖類標準物中のキシロースピーク面積(μV.sec)平均
Afuc0：単糖類標準物中フコースのピーク面積平均(μV.sec)
Vfuc0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるフコースの容量(μL)
Cfuc0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるフコースの濃度(mg/mL)
Vp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの容量(μL)
Cp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの濃度(mg/mL)
MWLEA29Y：LEA29Y(またはCTLA4A29YL104E−Ig)の分子量(91,232Da)
フコースのMW：164.2ダルトン]。
【１１１０】
ガラクトース/タンパク質のモル比について：
2010116402.tif 000131
[式中、
Rgal：ガラクトース対タンパク質のモル比
Agal：サンプル中のガラクトースのピーク面積(μV.sec)
Axyl：サンプル中のキシロースのピーク面積(μV.sec)
Axyl0：単糖類標準物中のキシロースのピーク面積(μV.sec)平均
Agal0：単糖類標準物中のガラクトースのピーク面積(μV.sec)平均
Vgal0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるガラクトースの容量(μL)
Cgal0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるガラクトースの濃度(mg/mL)
Vp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの容量(μL)
Cp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの濃度(mg/mL)
MWLEA29Y：LEA29Y(またはCTLA4A29YL104E−Ig)の分子量(91,232Da)
ガラクトースのMW：180.2ダルトン]。
【１１１１】
表52：CTLA4A29YL104E−Igタンパク質に対する単糖類の平均モル比
2010116402.tif 000132
【１１１２】
実施例36：CEによるGalNAcおよびGlcNAcのモル比の測定
キャピラリー電気泳動法は、CTLA4A29YL104E−Igにおけるアミノ単糖類、6N−結合グリコシル化部位および少なくとも1つのO−結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質含量の定量分析のために開発された。N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)およびN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)を含むアミノ単糖類は、高温条件での酸加水分解(4N HCl、95℃で6時間)によりCTLA4A29YL104E−Igサンプルから放出される。放出されたアミノ単糖類を無水酢酸と氷上で30分間インキュベートすることにより、再アセチル化段階を行う。次いでそれらを触媒としての酢酸、および還元試薬としてのNaBH3CNの存在下に、アミノピレントリスルホン酸(APTS)で蛍光ラベルする(67mM APTS、330mM HAc、83mM NaBH3CN、55℃で3時間)。N−アセチルマンノサミンを各サンプルに加え、内部標準とする。内部標準に対する各アミノ単糖類のピーク面積の比を定量に使用する。
【１１１３】
試薬：加水分解溶液(4N HCl)；誘導体化溶液I(0.1M 8−アミノ−1,3,6,トリスルホン酸、3ナトリウム塩(APTS)水溶液)；誘導体化溶液II(1M酢酸中、0.25M NaBH3CN)；再アセチル化緩衝液(25mM重炭酸ナトリウム、pH9.5)；泳動緩衝液(60±5mM四ホウ素ナトリウム、pH9.25)；キャピラリーリンス溶液(1N NaOH；1N HCl；80％メタノール)；10mg/ml濃度のGalNAc、GlcNAcおよびManNAcの単糖類標準保存溶液；単糖類作業溶液I：内部標準作業溶液はManNAc保存溶液の100倍希釈物である；単糖類作業溶液II：アミノ混合標準作業溶液、GalNAcおよびGlcNAc保存溶液の100倍希釈物。
【１１１４】
装置：CEシステムはBeckman P/ACE MDQ CEシステムであり；検出器：P/ACE MDQと連結したBeckmanレーザー誘導(LIF)検出システム。
【１１１５】
キャピラリー電気泳動泳動条件：泳動緩衝液(60mM四ホウ素ナトリウム、pH9.25)；キャピラリーカートリッジ温度：25℃；電圧：25〜30kV、正(positive)モード；検出器条件：LIF検出器、488nmでの励起、520mでの発光；サンプル注入：圧力注入様式、0.5PSIで20s；泳動時間：10分；サンプル保存：10℃。
【１１１６】
加水分解：10μLのManNAc作業溶液および200μLの4N HClを混合して、システム・ブランクを作成した。10μLのManNAc作業溶液および10μLのアミノ混合標準溶液を200μLの4N HClと混合して、単糖類標準を作成した。10μLのManNAc作業溶液および10μLのサンプル(例えば、CTLA4A29YL104E−Igサンプルなど；約1mg/ml)を200μLの4N HClと混合して、テストサンプルを作成した。全ての試験管を10秒間ボルテックスにかけ、10秒間遠心分離し、次いで95℃で6時間インキュベートした。加水分解段階後、サンプルを−20℃に10分間置いて、冷却した。サンプルを10秒間沈降させ、SpeedVac中で蒸発乾固した。
【１１１７】
再アセチル化：加水分解し、乾燥したサンプルを20μLの再アセチル化緩衝液および4μLの無水酢酸で再構成し、次いで混合および氷上でインキュベートした(30分間)。サンプルを10秒間沈降させ、SpeedVac中で蒸発乾固した。サンプルを各々100μlのHPLC等級水で再構成し、SpeedVac中で蒸発乾固した。
【１１１８】
誘導体化：再構成したサンプル(10μLの誘導体化溶液I HPLC)に、5μLの誘導体化溶液IIを加えた。混合後、サンプルを、予め暖めた遠心分離機中に負荷し、2000rpmで遠心分離しながら55℃で3時間インキュベートした。
【１１１９】
CE注入：誘導体化後のサンプル最終容量を、HPLC等級の水の添加により100μLにして、10μLのサンプルを190μL HPLC等級の水を用いてCEマイクロバイアルに移した。サンプル注入前に、CEカートリッジをHPLC等級の水で広範囲にリンスし(泳動時間1〜3分)、次いで泳動緩衝液を用いて平衡化のためのリンスをした(泳動時間5分)。最初のリンス後、単糖類標準および分析用サンプルを、CEカートリッジに注入した(泳動時間10分)。各標準またはテストサンプルの注入泳動後、CEカートリッジを、HPLC等級の水および泳動緩衝液でリンスし、平衡化した。システム適合性のエレクトロフェログラムは、図46と同様となるはずであり、図中、ピーク1はGalNAcであり；ピーク2はManNAcであり；ピーク3はGlcNAcである。
【１１２０】
表53  装置の方法
2010116402.tif 000133
【１１２１】
システム適合性：
システム適合性のエレクトロフェログラムは、図46に示すものと同様であり得、ピーク1はGalNAcであり；ピーク2はManNAcであり；そしてピーク3はGlcNAcである。
【１１２２】
Beckman MDQシステム以外のCE装置を使用する場合には、キャピラリーの長さは、この方法で指定されるものとは異なる可能性がある。これは、分析物の移動時間、ならびにピーク強度の変動の原因となるであろう。しかし、単糖類分析物のピークパターンは同じに留まるはずである。
【１１２３】
最初のシステム適合性標準について2つの隣接ピーク間の分離を、以下の式に従い計算することができる：
R＝2(t2−t1)/(W1＋W2)
(式中、
R：分離能
t2、t1：2つの隣接ピーク各々の移動時間
W1、W2：2つの隣接ピーク各々のベースラインでのピーク幅)。
【１１２４】
R値は、≧1.0でなければならない。R＜1.0なら、キャピラリーを洗浄/リンスの連続によりリンスする。問題が存続するなら、古い緩衝液を、新しく調製した泳動緩衝液と取り替えるか、またはキャピラリーを取り替える。
【１１２５】
最後のシステム適合性注入について、最後のピーク(GlcNAc)は、以下の式を用いてテーリング係数＜1.4を有していなければならない：
T＝W0.05/2f
式中：T：テーリング係数
W0.05：高さの5％でのピーク幅
f：ピーク最大でのピーク前部の幅。
【１１２６】
T≧1.4であるなら、キャピラリーを洗浄/リンスの連続によりリンスし；問題が存続するなら、古い緩衝液を、新しく調製した泳動緩衝液と取り替えるか、またはキャピラリーを取り替える。GlcNAcとManNAcのピーク面積比は、RSD≦10％を有していなければならない。GlcNAcの移動時間は≦10.0分である必要がある。エレクトロフェログラムのプロファイルは、図46と同等であるはずである。
【１１２７】
単糖類標準物のRSDパーセントは、各単糖類成分のピーク面積を各単糖類標準物注入のための内部標準のピーク面積で割ることを通じて、内部標準と単糖類標準成分のピーク面積比を比較することにより測定することができる。RSDパーセントを、GalNAcおよびGlcNAcについて計算することができる。RSDは≦10％であるべきである。
【１１２８】
タンパク質に対するアミノ単糖類のモル比の測定
内部標準ManNAcに比較したアミノ単糖類(例えば、GalNAcおよびGlcNAc)のピーク面積比を、タンパク質に対する各アミノ単糖類のモル比を測定するための以下に示す式に従い計算することができる。例えば、ピーク面積比は、ManNAcのピーク面積で割った単糖類ピーク面積(GalNAcおよびGlcNAc)に等しく、ここでピーク面積比に対する相対標準偏差(RSD)は、10％と等しいかまたはそれより小さい。次の式を使用して、以下に示すものを計算することができる：
GalNAc/タンパク質のモル比について：
2010116402.tif 000134
[式中、
RGalNAc：GalNAc対タンパク質のモル比
AGalNAc：サンプル中のGalNAcのピーク面積(μV.sec)
AManNAc：サンプル中のManNAcのピーク面積(μV.sec)
AManNAc0：単糖類標準物中のManNAcのピーク面積(μV.sec)平均
AGalNAc0：単糖類標準物中のGalNAcのピーク面積(μV.sec)平均
VGalNAc0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるGalNAcの容量(μL)
CGalNAc0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるGalNAcの濃度(mg/mL)
Vp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの容量(μL)
Cp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの濃度(mg/mL)
MWLEA29Y：LEA29Y(またはCTLA4A29YL104E−Ig)の分子量(91,232Da)
GalNAcのMW：221.2ダルトン。
【１１２９】
GlcNAc/タンパク質のモル比について：
2010116402.tif 000135
[式中、
RGlcNAc：GlcNAc対タンパク質のモル比
AGlcNAc：サンプル中のGlcNAcのピーク面積(μV.sec)
AManNAc：サンプル中のManNAcのピーク面積(μV.sec)
AManNAc0：単糖類標準物中のManNAcのピーク面積(μV.sec)平均
AGlcNAc0：単糖類標準物中のGlcNAcのピーク面積(μV.sec)平均
VGlcNAc0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるGlcNAcの容量(μL)
CGlcNAc0：加水分解に使用される単糖類作業溶液中に含まれるGlcNAcの濃度(mg/mL)
Vp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの容量(μL)
Cp：加水分解に使用されるタンパク質サンプルの濃度(mg/mL)
MWLEA29Y：LEA29Y(またはCTLA4A29YL104E−Ig)の分子量(91,232Da)
GlcNAcのMW：221.2ダルトン。
【１１３０】
表54：CTLA4A29YL104E−Igタンパク質モルに対する単糖類モルの平均モル比
2010116402.tif 000136
【１１３１】
実施例37：高性能陰イオン交換クロマトグラフィーによるCTLA4A29YL104E−IgのN−結合オリゴ糖炭水化物プロファイリング
糖タンパク質上に存在する炭水化物構造は、それらの機能およびインビボでのクリアランスに影響を及ぼし得る。ゆえに、組み換え生産された糖タンパク質バッチの炭水化物の構造的一致性をモニターすることは重要である。ここでは、CTLA4A29YL104E−Ig上に存在するN−結合(アスパラギン−結合)炭水化物をモニターする。この方法において、オリゴ糖をPNGase F(ペプチド：N−Glycosidase F)を用いた酵素消化により開裂し、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)により分離し、そして電気化学的検出(統合アンペロメトリー)によりモニターする。得られたクロマトグラムは、N−結合炭水化物プロファイルであり、ここでCTLA4A29YL104E−Igサンプルのプロファイルはそれと同様のはずである。
【１１３２】
逆相および黒鉛炭素HPLCによるオリゴ糖単離のための移動相用試薬：溶離液1(HPLC等級水中0.05％トリフルオロ酢酸(TFA))；溶離液2：(60％アセトニトリル(ACN)、40％HPLC水(60：40、ACN：H2O)中0.05％TFA；溶離液3：(40％アセトニトリル、40％イソプロパノール(IPA)、20％HPLC水(40：40：20、ACN：IPA：H2O)中0.05％TFA)。
【１１３３】
HPAECオリゴ糖炭水化物プロファイリングのための移動層の調製用試薬：溶離液1：500mM酢酸ナトリウム(NaOAc)；溶離液2：400mM 水酸化ナトリウム(NaOH)；Milli−Q水；4M 水酸化ナトリウム(約4M NaOH)；50mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.02％アジ化ナトリウム、pH＝7.5；50mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.02％アジ化ナトリウム、pH＝7.5中PNGase F酵素作業保存液；スタキオース保存溶液(1.25mg/mL)；スタキオースシステム適合性標準(12.5μg/mL)。
【１１３４】
装置および条件−(等価な装置を代用してもよい)
装置：
2010116402.tif 000137
【１１３５】
サンプル調製：1.7mLエッペンドルフチューブに、0.02％アジ化ナトリウム、pH7を含む80μLの50mMリン酸ナトリウム緩衝液および80μLのサンプル(合計2mgのCTLA4A29YL104E−Igのために約25μg/μLなど)を加え、次いで16μLの10倍変性緩衝液(5％SDS、10％β−メルカプトエタノール)を加えた。サンプルを十分混合し、続いて2分間沸騰させてタンパク質を変性させた。バイアルを室温に冷却し、次いで16μLのNP40(10％)および40μLのPNGase F作業用保存液を加え、続いて混合した。サンプルを37℃で24±2時間インキュベートした後に、それらをHPLCオートサンプラーバイアル中に移し、HPLC装置への注入に備えた。
【１１３６】
【表２７】
2010116402.tif 000138
【１１３７】
【表２８】
2010116402.tif 000139
【表２９】
2010116402.tif 000140
【１１３８】
CTLA4A29YL104E−Igサンプルは、図47のクロマトグラムにおいて示される炭水化物プロファイルを有し得る。図47において同定される各ドメインの保持時間は、およそ次の通りとなるはずである：
ドメインI(ピーク1A、1B、1C、1Dおよび1E)：10〜17分
ドメインII：21〜29分
ドメインIII：33〜43分
ドメインIV：48〜56分
【１１３９】
保持時間はシステムに依存しており、スタキオースとして同様にシフトするはずである。
【１１４０】
計算
理論段(N)：理論段数(N)を、以下の式を用いてスタキオースのピークに基づき測定することができる。これは、Millenniumデータ分析システムにより行うか、または手作業で行ってもよい。
N＝16(t/W)2
[式中：
t：注入時から最大高さのピーク溶出時間まで測定された保持時間。
W：両側をベースラインに外挿することによるピーク幅]。
【１１４１】
Nは≧6000でなければならない。段数が6000より小さいなら、カラムを取り替えるべきである。
【１１４２】
テーリング係数(T)：以下の式を用いて、スタキオースピークに基づきカラムテーリング係数(T)を計算することができる。これは、Millenniumデータ分析システムにより行うか、または手作業で行ってもよい。
T＝(W0.05/2f)
[式中：
W0.05：高さの5％(0.05h)でのピーク幅
f：W0.05でのピークの前端から最大高さのピーク中央までの測定値(幅)
【１１４３】
Tは≦1.2でなければならない。テーリング係数が1.2より大きいなら、緩衝液組成を評価すべきであり、カラムを取り替えるかまたは洗浄すべきである。
【１１４４】
ドメイン面積％：
ドメインI：保持時間約10〜15分での合計ピーク面積(ピーク1A−1E；例えば、図47)
ドメインII：21〜27分のピーク合計
ドメインIII：34〜40分のピーク合計
ドメインIV：45〜56分のピーク面積
2010116402.tif 000141
【１１４５】
主ピーク面積のパーセント：5つの主ピークの各々のピーク面積％を、以下のものについて下記の式を用いて計算することができる：ピーク1A、1B、1C、2(2つの非分解種)、3(2つの非分解種)、および4。
2010116402.tif 000142
【１１４６】
実施例38：製剤原料および製剤中のCTLA4A29YL104E−Igのキャピラリー電気泳動による同定
CTLA4A29YL104E−Igは、免疫抑制活性を有する水溶性糖タンパク質である。非被覆融合シリカキャピラリーを用いるキャピラリー電気泳動法を使用してCTLA4A29YL104E−Igを同定した。サンプル(例えば、CTLA4A29YL104E−Igなど)を70℃で5分間加熱し、次いで214nmに設定したUV検出により直ちに分析して、同定を確認する。
【１１４７】
さらに、CTLA4A29YL104E−IgおよびCTLA4−Ig物質の1：1 混合物を混合し、注入して、2つのタンパク質が分離され、識別され得ることを確認した。この方法は、サンプルに対してCTLA4A29YL104E−Ig物質の移動時間を比較することによりCTLA4A29YL104E−IgとCTLA4−Igを識別することができる。
【１１４８】
装置(同等の装置で置き換えてもよい)：
2010116402.tif 000143
【１１４９】
試薬および溶液：泳動緩衝液(14.4mMホウ酸ナトリウム；17.3mMドデシル硫酸ナトリウム；2.0％アセトニトリル)；リン酸希釈緩衝液(22.3mMリン酸ナトリウム、二塩基性；4.2mMリン酸ナトリウム、一塩基性；53.4mM塩化ナトリウム)；ホウ酸希釈緩衝液(83.5mM NaBO2、pH9.6)；参考またはサンプル作業溶液(リン酸塩希釈緩衝液中10±1mg/mLサンプル)；参考またはサンプル注入溶液(10.0μLサンプル＋ 50μLのホウ酸希釈緩衝液)；サンプル1：1 CTLA4−Ig−CTLA4A29YL104E−Ig混合溶液(10.0μL CTLA4−Igサンプル＋10.0μL CTLA4A29YL104E−Igサンプル＋50μLのホウ酸希釈緩衝液)；注入溶液。
【１１５０】
泳動条件：
2010116402.tif 000144
*  全長：キャピラリー入口から出口まで
** 有効長：キャピラリー入口から検出ウィンドウまで
【１１５１】
主ピークのCTLA4−Igサンプル移動時間は、約11.0±0.4分である。主ピークのCTLA4A29YL104E−Igサンプル移動時間は約12.0±0.4分である。各サンプル間の主ピーク移動時間は、少なくとも0.6分離れているはずである(図48)。
【１１５２】
実施例39：CTLA4A29YL104E−IgにおけるN−アセチルノイラミン酸およびN−グリコリルノイラミン酸含量測定のための加水分解およびHPLC分析
組み換えタンパク質におけるシアリル化の程度は、薬物動態およびクリアランス速度に影響を及ぼし得る。CTLA4A29YL104E−Igは、N−およびO−結合炭水化物部位を有する組み換えタンパク質である。これらの部位を占めるグリカンは、シアリル化の様々な度合いを有している。そのシアリル化の構造的不均一性に加えて、個々のシアル酸含量はロット毎に変化し得る。ゆえに、タンパク質に対するシアル酸比の全体的な測定が得られる。
【１１５３】
CTLA4A29YL104E−Igに存在するN−アセチルノイラミン酸(NANA)およびN−グリコリルノイラミン酸(NGNA)含量を調べた。シアル酸を酸加水分解によりタンパク質から遊離させ、次いでDMBで蛍光ラベルする。ラベル化シアル酸をRP−HPLC C−18カラム上で分離し、同時に泳動するシアル酸標準の応答係数から定量する。データ分析および報告値(NANAまたはNGNAのタンパク質に対するモル比として)を、この実施例の方法内に明記する。この実施例は、CTLA4A29YL104E−Ig中に存在するN−アセチルノイラミン酸(NANA)およびN−グリコリルノイラミン酸(NGNA)の量を測定するために用いられる方法について記載する。シアル酸を酸加水分解によりタンパク質から遊離させる。遊離したNANAおよびNGNAを、次いで、1,2,−ジアミノ−4,5−メチルオキシベンゼン(DMB)で蛍光ラベルする。ラベル化シアル酸を、RP−HPLC C−18カラム上で分離し、蛍光検出(Ex＝373nm、Em＝448nm)により検出する。NANAおよびNGNAを、同時に泳動するNANAおよびNGNA標準の応答係数に基づいて定量する。試験結果を、各々、タンパク質に対するNANAおよびNGNAのモル比(MR)として報告する。
【１１５４】
試薬および溶液：1.0M H2SO4；50mM H2SO4；蛍光標識試薬(18mMヒドロ亜硫酸ナトリウム(Na2S2O4)、7％2−メルカプトエタノール、7mM 1,2−ジアミノ−4,5−メチレン−ジオキシベンゼン二塩酸塩(DMB))；移動相移動緩衝液A(20％メタノール)；移動相移動緩衝液B(70％メタノール)；N−アセチルノイラミン酸標準溶液(1mg/mL)；N−グリコリルノイラミン酸標準溶液(1mg/mL)；システム適合性標準(900μLの水中の50μLのNANAまたはNGNA溶液)；サンプル溶液(例えば、2mg/mlのCTLA4A29YL104E−Igなど)；NANA作業用保存標準溶液(保存液を希釈して50μg/mLにする)；NGNA作業用保存標準溶液(保存液を希釈して50μg/mLにする)。
【１１５５】
加水分解：20μLの各NANA標準、NGNA標準、CTLA4A29YL104E−Igおよびシステム適合性標準溶液を、別々の1.5mL遠心分離管に等量ずつ入れ、200μLの50mM硫酸溶液を各バイアルに加えた。内容物を静かに混合し、80℃で1時間±5分インキュベートした。加水分解が完了したら、サンプルをすばやく遠心分離した。
【１１５６】
蛍光ラベル化：蛍光標識試薬(200μL)を、各サンプルに加え、十分混合した。次いで、サンプルを暗所にて、80℃で45±5インキュベートし、続いて冷却した。
【１１５７】
装置およびクロマトグラフィー条件(同等の装置で置き換えてもよい)：
2010116402.tif 000145
HPLCシステム：Waters 2690/2695分離モジュールまたは同等物
蛍光検出器：Waters 2475マルチ波長蛍光検出器または同等物
データ収集：Waters Millennium 32またはEmpower
カラム：Luna 5μ、C18、100A、150×4.6mm、Phenomenex、(カタログNo. 00F−4252−E0)
デジタル・ヒートブロックWVR、(カタログNo. 13259−056)または同等物。
ミニ遠心分離機WVR、(モデルNo. C−1200)または同等物。
移動相A：10％(v/v)MeOH/90％水
移動相B：70％(v/v)MeOH/30％水
流速：1mL/分
注入容量：10μL
実行時間：30分
カラム温度：室温
励起波長：373nm
発光波長：448nm
ゲイン：1
溶離勾配：
2010116402.tif 000146
【１１５８】
シアル酸標準物調製(約5mM)。N−アセチルノイラミン酸(NANA、MW＝309.3)標準(約5mM)。N−アセチルノイラミン酸の154.5±1.0mgを正確に秤量し、100mLの容量フラスコに入れる。DI水を用いて溶解し、適量でその容量にして、よく混合する。等量ずつの溶液を2mLの低温バイアルに入れる。
2010116402.tif 000147
【１１５９】
P＝NANAの純度−供給メーカーのCOAによる(例えば、99％＝0.99)。
【１１６０】
N−グリコリルノイラミン酸(NGNA、MW＝325.7)標準(約0.25mM)。N−グリコリルノイラミン酸の8.0±1.0mgを正確に秤量して、100mL容量フラスコに入れる。DI水を用いて溶解し、適量でその容量にして、よく混合する。等量ずつの溶液を2mLの低温バイアルに入れる。
2010116402.tif 000148
【１１６１】
P＝NGNAの純度−供給メーカーのCOAによる(例えば、99％＝0.99)。等量ずつのシアル酸標準物は、−20℃で6ヶ月まで保存することができる。
【１１６２】
シアル酸標準混合物調製。システム適合性および定量化のためのシアル酸標準混合物(50μM NANA、1μM NGNA)。1mLの5mM NANA、400μLの0.25mM NGNAを100mL容量フラスコに加える。DI水を適量用いてその容量にして、よく混合する。等量ずつのシアル酸標準混合物を2mLの低温バイアルに入れる。等量ずつのシアル酸標準混合物は、−20℃で6ヶ月まで保存することができる。
【１１６３】
サンプルおよび参考物質調製。凍結したタンパク質サンプルを2〜8℃で解凍し、よく混合する。サンプルおよび参考物質の両方を希釈して、約0.5mg/mLのCTLA4A29YL104E−Igにする(例えば、タンパク質濃度＝25.0mg/ml、50.0μLのタンパク質を2450μLの水に加える)。粒子状物質を除去するために、希釈した試験サンプルおよび参考物質を10,000rpmで5分間遠心分離する。
【１１６４】
加水分解。ブランク：2.0mL遠心分離管に、50μLのDI水および200μLの50mM硫酸を加える。これをブランクとして使用する。システムの適合性および定量化のためのシアル酸標準物。2.0mL遠心分離管に、50μLのシアル酸標準混合物および200μLの50mM硫酸を加える。二重に調製する。Std1およびStd2として示す。参考物質：2.0mL遠心分離管に、50μLの希釈したCTLA4A29YL104E−Ig参考物質(約0.5mg/mL)、および200μLの50mM硫酸を加える。二重に調製し、RM1およびRM2として示す。試験サンプル：2.0mL遠心分離管に、50μLの希釈したCTLA4A29YL104E−Ig製剤原料(約0.5mg/mL)、および200μLの50mM硫酸を加える。二重に調製する。S1−1、S1−2；S2−1、S2−2；S3−1、S3−2等として示す。サンプルを約5秒間ボルテックスにかけ、約5〜10秒間遠心分離する。サンプルを加熱ブロック中に置き、80℃±5℃で1時間±5分インキュベートする。加水分解されたサンプルを室温に冷却する。加水分解されたサンプルを短時間遠心分離して、試験管内への凝縮を進めた(高速で約10秒間)。
【１１６５】
誘導体化。加熱ブロックを80℃±5℃に予熱する。200μLの蛍光標識試薬を各々の加水分解されたサンプルに加える。約5秒間ボルテックスにかけ、約10秒間遠心分離する。サンプルを80℃±5℃加熱ブロックに40±5分間置く。ラベル化溶液は感光性であるので、加熱ブロックにアルミホイルで蓋をする。誘導体化したサンプルを室温に冷却する。サンプルをボルテックスにかけ、約10秒間遠心分離して、試験管内への凝縮を進めた。
【１１６６】
注入のための調製。分析前にカラムを移動相で確実に平衡化させる。十分なサンプル(100〜200μL)を各遠心分離管から挿入部が制限されているオートサンプラーバイアル中に移す。〱苣뎃菣ꮃ돦ꖅ臣龁苣꺁胩뢸臣ꪂ菣袃苣뎃菣ꦃ菣ꂲ跨꾁믤许臣骀苣ꞁ臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㤴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 匠摴誁苣뎁瑓㉤臣膀苣ꊂ菣뢅꣦隺럦袐뫦늶臣뾪ꏨꦉ臣芁苣鮼䵒誁苣뎁䵒꾁꿥ꞅ苣뎃菣ꮃ臣龁苣꺁ꫨ붣觧ꞁ臣誂볯鶁臣ꚁ꾁苣뎃菣ꮃ돦ꖅ臣芁苣芀鳦鶈臣㒮臣⢤苣뎃菣ꮃ㈣臣袂臣㎳꺁苣ꊂ菣뢅꣦隺匨摴⤱돦ꖅ臣膀苣릂菣ꂃ臩袐胦꺁鯧蒚臣龁苣ꮁ뷤ꢔ臣貂苣ꞁ臣趂臣芀苣뎃菣ꮃ㌣匨摴⤱臣袂臣떂菣鞃菣⎫⠴瑓㉤꺁ꢳ藥꾁胣袨껧꺁臣膂臣뾽铧閁苣讂臣芁苣蚁胣閁苣ꪁ苣떂菣鞃菣ꢳ藥꺁臣膂臣膀苣벃菣떂菣鞃菣벃단랍鲀㘱苣낹苣钿臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ胣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ苣뎃菣ꮃ臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣膀鯥㒳ꮁꓧ馁苣궃菣袃苣ꦃ菣ꢁ郥颧臣ꪁ苣꾁臣ꞁ臣讂胣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺匨摴⤱臣肜裥꺁돦ꖅ臣龁苣ꮁ胣亁乇誁苣뎁䅎䅎臣ꒁ臣ꚁ臣單偓裥ꊛ菨⢽⥒臣膀觢ㆧ㔮臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦⢖瑓ㅤ꺁ꒁ臣ꢳ藥꾁胣ꖻ룤ꮁꓧ馁뻤몤髧ꪁ胥銂뫦龁臣节臣ꞁ臣辁臣꾁臣覂臣蒁볯亚乁ꮁ臣蒁臣꺁菣벃苣ꊝꧧ꺁卒꾁胣ꚉ薼臣ꪁ臣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣芀䝎䅎臣ꒁ臣ꚁ臣钃菣꾂鷩趩臣劮䑓臣膀觢ㆦ薼臣ꪁ臣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣芀䝎䅎菣벃苣꺁꟧開駦鎖臣膀ㄱ㌮뇂⸲蚈臣뚺蟥閁苣ꪁ臣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣芀䅎䅎菣벃苣꺁꟧開駦鎖臣ㆯ⸶숰㊱㔮裥ꮁ뫦몇臣貂臣辁臣꾁臣覂臣蒁胣㒂臣꺁꣦隺觧ꢳ藥꺁菣벃苣ꊝꧧ꺁卒⡄瑓ㅤ胣떂菣鞃菣⎫⤳臣袂臣⢳瑓㉤胣떂菣鞃菣⎫⤴臣ꚉ〱볯ꞁ臣辁臣꾁臣覂臣蒁胣ꎀ뛧ꦉ臣肸详鞁臣ꢅ臣꺁꣦隺觧ꢳ藥꺁菣벃苣ꊝꧧ꺁卒꾁胣ꚉ㔱볯ꞁ臣辁臣꾁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†偈䍌苣릂菣ꂃ臣뾪ꏨ骼苣ꦃ菣銂㠹볯ꦷꇨ늶誁苣뎁薼럧鶡뛦䊲苣ꢔ臣ꚁ洱⽌裥ꞁ㔱裥鎖맥ꆡ賥鞁臣芀〱볎꺁鯨覅菣馃菣閁苣龁苣릂菣ꂃ臩袐胦뚺뛦銂苣릂菣ꂃ臣ꢳ藥鞁臣芀곦蒁臣膀菣벃苣꺁裥ꊛ菨誁苣뎁郧隫껦낕苣膀믤许臣込苣ꢔ臣ꚁ꣨鞮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰〵⼼㹡⼼䥄㹖嬊볥궸볯劚볯蚈鯩붃戼㹲吊鶼銈苣ꪃ苣ꪃ菣躃苣ꦃ菣뎃藩꺁뿤膌駦鎖蚈㰩牢ਾ㉔볯亝裢ꊂ苣膃菣躃苣ꦃ菣뎃藩꺁뿤膌駦鎖蚈㰩牢ਾㅗ볯亝裢낂菣뎂菣ꮃ菣ꒂ菣龃菣뢅臣馃菣릂菣ꒂ菣ꞁ臣钃菣꾂맥⢅裥⦆戼㹲圊���鶼䅎䅎臣馃菣릂菣ꒂ菣ꞁ臣钃菣꾂맥⢅裥⦆㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 蚈鯩붃胥꾁⸱ꞁ臣辁臣꾁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†郧隫껦낕臣膀믤许臣込苣ꢔ臣ꚁ꣨鞮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂볯㲚牢ਾ鶼㘱吨⼲㉗㰩畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯灵㰾牢ਾ込룤骼戼㹲上볯蚐ꯨ떮闦㲰牢ਾ㉔볯亝裢ꊂ苣膃菣躃苣ꦃ菣뎃藩꺁뿤膌駦鎖蚈㰩牢ਾ㉗볯亝裢ꊂ苣膃菣躃苣ꦃ菣뎃藩꺁菣벃苣ꦃ苣뎃臣꺁菣벃苣薹蚈਩⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†郧隫껦낕臣㊯〰ꞁ臣辁臣꾁臣覂臣蒁胣䎂䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒ꂊ냦蚈꟨鞃菣閃苣ꒂ菣꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣뎛㤴臣貐꟦ꮁ臣讂臣骁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 떂菣鞃菣銂胣蚀鯧䢸䱐⡃偒裢䢒䱐⥃臣袂苣膀믤许臣蚠뫥ꞁ裥邞臣龁볯亚乁誁苣뎁䝎䅎꣦隺苣肜裥ꮁ돦ꖅ臣膀곦蒁臣떂菣鞃菣銂돦ꖅ臣龁薿ꛨꪁ苣낁뫤趇臣⦫设臣낁胣䎁䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒ꪁ臣⦩胣떂菣鞃菣蚈黦貾胣ꮂ菣ꂃ苣뮧该뢛銂铧蒁臣ウ㔮䱭蚈臣㊧蚈雩鞴뗦鞁臣芀뿥膦臣覂臣膀苣ꦃ菣銂胩ꮁ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꊂ菣뢅丨乁뺁臣꾁䝎䅎꺁苣뎃菣꾂돨ꮁ꿥馁苣ꊃ菣钯䴨⥒臣겸껥㲚牢ਾ†苣ꊂ菣뢅臣뾂菣醃苣ꪳ臣뺯臣讂菣ꮃ꿦銂楍汬湥楮浵臣龁臣䖯灭睯牥苣閃菣Ꚃ苣ꊂ臣袂苣袨껧馁苣鎁臣貁臣趁苣芀戼㹲貸蟩芿闦骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㔱㰱愯㰾䐯噉ਾ込룤膀戼㹲嘊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾潲整湩⼼畳㹢볯ꂊ臣龁苣뎃菣꾂돨鶿귥뚺뛦꺁껥辇츨沼膀戼㹲嘊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰眾瑡牥⼼畳㹢볯ꂊ臣龁냦꺁껥辇츨沼㰩牢ਾ苣뎃菣꾂돨鲽ꗦ뚺뛦⢲諥뒰裥ꎧ臣뾽铧鞁臣뾂菣醃苣ꪳ꺁뿦ꚺ츨䶼骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㔱㰲愯㰾䐯噉ਾ込룤膀戼㹲䌊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾潲整湩⼼畳㹢볯뾂菣醃苣ꪳ뷤궥뫦늶臣莿뫥⢦볎⥍胣㲁牢ਾ㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁〸⼼畳㹢볯뾂菣醃苣ꪳ뿤颭뫦늶臣䆮猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾〸⼼畳㹢뿦ꚺ洨⽧汭膀戼㹲䴊⁗猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䌾䱔㑁㉁夹ㅌ㐰ⵅ杉⼼畳㹢鶼呃䅌䄴㤲䱙〱䔴裢䦒꺁裥邭蟩膀ㄹ㌲䐲芀戼㹲뾂菣醃苣ꪳ뷤궥뫦늶룤꺁苣ꊂ菣뢅뿦ꚺ츨䶼骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㔱㰳愯㰾䐯噉ਾ込룤膀戼㹲䌊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰甾歮潮湷⼼畳㹢볯ꪜ鿧떂菣鞃菣궸臣랂苣ꮃ藩⢸䅎䅎臣龁臣亯乇⥁臣莿뫥㲦牢ਾ㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢瑳㱤猯扵鶼꣦隺觧궸臣랂苣ꮃ藩⢸䅎䅎臣龁臣亯乇⥁臣莿뫥⢦볎���戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰甾⼼畳㹢볯ꪜ鿧떂菣鞃菣궸臣랂苣ꮃ藩⢸䅎䅎臣龁臣亯乇⥁臣钃菣꾂鷩趩戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰猾摴⼼畳㹢볯馨뫦ꦉ룤꺁苣ꊂ菣뢅丨乁뺁臣꾁䝎䅎꺁菣벃苣ꊝꧧ㲍牢ਾ苣뎃菣꾂돨ꮁ꿥馁苣랂苣ꮃ藩⢸䅎䅎臣龁臣亯乇⥁臣ꊃ菣钯䴨刮⤮볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㐵⼼㹡⼼䥄㹖뾂菣醃苣ꪳ臣뺯臣讂苣ꊂ菣뢅臣袐꣨ꊃ菣钯吨䅓꺁꣨鞮볯㲚牢ਾ協鶼䅎䅎菣ꮃ꿦讼䝎䅎菣ꮃ꿦ઔ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†ꒁ臣肸详鞁臣亟乁馨뫦ꦉ臣ꊝꧧꮂ苣뎃菣ꮁ臣蒁臣꺁鯧뺯꣦隺臥꺷臣鲼〱볯ꢁ臣讂臣趁臣芁苣芀ꒁ臣肸详鞁臣亟乇馨뫦ꦉ臣ꊝꧧꮂ苣뎃菣ꮁ臣蒁臣꺁鯧뺯꣦隺臥꺷臣鲼〱볯ꢁ臣讂臣趁臣芁苣芀ꒁ臣겋ꯧ鞁臣ꂊ냦蚈꟨ꦉ臣ꊝꧧꮂ苣뎃菣ꮁ臣蒁臣꺁鯧뺯꣦隺臥꺷臣鲼〱볯ꢁ臣讂臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 ㄠ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣䎁䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒궸臣랂苣ꮃ藩꺁맥螝菣ꮃ꿦꾁胣뒛룤꺁ꇨꮁ觧骮臣讂꿧늛蛥ꮁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣㲂牢ਾ呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉觧ꪳ臣ꊃ菣钯꿧늛戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㔱㰵愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†ꒁ臣떂菣鞃菣뾪ꏨꦉ臣ꒁ臣ꚁ胣芏胨ꦉ돨誁苣뎁苣뎃菣ꮃ룤꺁苣ꊂ菣뢅臣ꊃ菣钯臣辁럥ꒀ볯꾁胣ꚉ㔱볯膀觢㊦薼胣ꚉ㔲볯膀觢㎦薼臣龁臣ꚉ㔳볯ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤㒋骼呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣ꒁ臣ꚁ臣ꒂ菣鎃菣궃듧麃臣몟臣辁菣ꒂ苣ꊂ菣뮂苣㲤牢ਾ†내菨꾁胣뮴胦隌臣袂臣鶁苣ꮁ뛧辁ꋥ隮臣龁苣ꮁꒁ臣랂苣誃菣銂뿥膦臣馁苣芀鳦鶈臣랂苣誃菣꾁胣鞊軥骃菣膃菣ꢁ䍔銈䑃螤郥鎽臣뢛뫤鲽铧ꮁ苣誂뻥覂苣讂胣견뫤꺁藥몈뿦랂苣誃菣꾁胣咁듧麃룤꺁䑃㠲臣鞊軥邏ꓧ내菨誸臣䊮뾂菣醃苣ꪳ臣鎖臣뢛뫤鲽铧ꮁ苣誂铧颁苣芀臣貂苣꺁ꒁ臣랂苣誃菣銂迥醁臣膀내菨꾁苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣芁苣ꒂ菣뾂菣궃苣궂菣㊳䤨銈⤲苣蚈돦馁苣芀䱉裢㊒臣뺔蟥ꮁ苣誂胣내菨꺁듦Ꞁ賥誁苣뎁ꋥ隮臣躰臣貂苣芀臣龁迥뚺胦膀藥ꮖ諦뚈胦隌郥ꦉ臣芁苣䎋䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒꾁胣鞊軥邏ꓧ내菨誸臣䊮뾂菣醃苣ꪳ臣邵郥鞁胣蚂臣ꮁ䑃㠲臣꺁ꧦ붃髧뢛뫤鲽铧銂飩뎮臣膀䱉㈭铧龔臣薿ꛨꪁ藥몈뿦랂苣誃菣銂諦뚈臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁雦閳臣誁臣ꚁ胣䦁銈鞃菣ꊃ菣���뾂菣꺁裥ꆾ룤ꮁ臣讂胣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂臩鶼귥ꞁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣龁畊歲瑡吠듧麃苣膀諦䎗㍄臣颭鳥许臣䒧畡楤䈠듧麃苣ꢔ臣ꚁ藥몈뿦馁苣芀藥몈뿦꾁胣䦁銈鞃菣ꊃ菣뾂菣銂듦Ꞁ賥鞁胣ꆬ臣ꞁ菣랂菣Ꞃ菣벃苣뾂菣醃苣ꪳ苣ꎔ铧馁苣芀뻥覂苣龁駧覅苣낂菣ꮃ苣膀菣랂菣Ꞃ菣벃苣ꊂ菣뮂苣뮳苣ꢔ臣ꚁ룦骮臣讂胣鎁臣랂苣蚃菣ꮁ臣蒁臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣膀菣랂菣Ꞃ菣벃苣뮴胦꺁铧辇뻤颭胦꺁룦醰苣节臣覂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣릖돦꾁胣䦁ⵌꎔ铧ꮁ뿥膦臣놅裥肿苣낂菣ꮃ臣躸臣讂呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣릊諥銂ꫨ릁苣节臣ꞁ臣讂胣꾏뫦Ꞁ呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣颭鳥꾁胣咁듧麃臣鞊軥邏ꓧ내菨꺁雩꺁苣낂菣ꪃ菣낂苣ꢦ臣讂胣鎁臣랂苣誃菣貁臣蒁臣覂胣䦁銈꾁铧龔臣貂臣膀苣袁臣咫듧麃臣꾂菣벃菣Ꞁꋥ隮苣ꢦ臣讂胣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂臩鶼귥銂鳦馁苣馃苣뾂菣꾁胣䦁銈鞃菣ꊃ菣뾂菣銂铧蒁臣떉ꏨ鞁臣芀곦蒁臣䪧牵慫⁴내菨銂胣鎁臣ꪃ菣벃苣벃菣꾂苣벃臣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣鞁臣芀駩Ꞁ苣궃菣뎃胣䪁牵慫⹴䅃苣뢁諦鞁胣鎁臣릖돦ꮁ臣蒁臣뾽铧鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ臣꾁胣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣閁苣龁내菨⢞畊歲瑡䌮⥁苣鞊䑃誁苣뎁내菨⢞慄摵⥩臣몈뿦馁苣鎁臣貁郥뺁苣讂胣䊂듧麃臣袂苣节臣覂臣貂苣놅裥肿臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣뮷諥ꮁ苣誂飩뎮臣貂苣芀畊歲瑡䌮誁苣뎁慄摵내菨銂㘹ꧧ膀駧늉胣趸胩躘胣뎹뫥鞃菣벃菣꺁苣Ꞃ菣궸臣궒꣧鞁胣낕臣讂뿦ꚺ臣䎮䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒꺁귥ꢜ룤ꮁ諦䎗㍄臣몈뿦馁苣芀㜳蓢ꞁ㘱胣㊜芙雩꺁苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣貾胣Ꚃ苣ꮃ苣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂듦Ꞁ臣ꒁ臣ꚁ苣莃苣ꒂ臣讂胣䎂䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒ꮁ苣讂藥몈뿦꺁飩뎮臣膀菣랂菣Ꞃ菣벃苣뮴胦꺁铧辇뻤颭髧ꪁ룦醰臣鞁臣讦苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雨骼慄摵내菨릟ꓩ릟鳥⢰偒䥍ㄠ㐶궸胣ㆁ薼苣랂菨邅ꇨ薸胣ㆁ볯䶅䵅菣ꮃ菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ鮼畊歲瑡䌮내菨릟ꓩ릟鳥⢰偒䥍ㄠ㐶궸胣ㆁ薼믤Ꚃ苣股룦膀薼䕍钃菣鎃菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀〴츰枼洯꺁苣Ꞃ菣蚃苣랂菣⦳볯邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ鿥난䐨畡楤듧麃鿥誤鿥난룤キ㈮볎⽧䱭臣鞊䑃鞊뷤誁苣뎁薼菣讃苣ꪃ菣銈苣袃菣鞃菣麃苣랂菣뚺뛦⦲볯ꊂ菣뮂苣랂苣蚃菣讁���鞾臣䊟楲桧銈汇ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂뫦늶倨潲敭慧胣ꮂ苣궃苣⎰䔠㘲〲芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 薣뷧骼楎潫膀楄灡潨⁴〲‰湉敶瑲摥ꇩ꺾迩鮼慐正牡⁤潔䍰畯瑮丠员藧ꚺ꣨鮼敔慣⁮敇敮楳늶뷤较菣覃菣벃볯䎛畯瑬牥嘠銈敃汬듧麃꣨낕駥鮼祚慭歲删灡摩汐瑡銈㘹胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㘵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 鲽ꗦ뚺뛦꺁ꫨ붣볯邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ鿥난룤꺁洳꺁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉뫦늶㔨〰渰⽧䱭਩⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†慄摵내菨릟ꓩ릟鳥芀〳洰꺁偒䥍ㄠ㐶銂䰱䌠牯楮杮菣ꎂ菣뾂菣ꚃ菣莃菣ꮁ諥袁苣芀곦蒁臣膀〱洰꺁苣랂菨邅ꇨ薸臣袂臣ㆳ洰꺁䕍钃菣鎃菣뢅菣袃菣Ꚃ菣銂諥袁苣芀跥蚈臣努䵐⁉㘱〴苣ꂊ臣ꚁꪃ菣袃菣銂뷤邈臣讂胣뺿臩鞁胣㒁蓢ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 䨠牵慫⹴䅃듧麃鿥誤鿥난胣㎂〰䱭臣劮䵐⁉㘱〴苣㆒⁌潃湲湩閃苣ꮃ苣벃菣讃菣袃臣ꂊ臣讂胣ꆬ臣ꞁ胣ㆁ〰䱭臣钻苣랂ꇨ薸胣ㆁ洰꺁䕍钃菣鎃菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀臣袂臣㢳䱭臣뢂苣趃菣ꎂ苣뎃苣㖒洰⽧䱭臣ꂊ臣讂肜뗧莿뫥꾁〴츰枼洯⥌胣膍裥ꪁ偒䥍ㄠ㐶銂諥袁臣ㆦ菣莃菣ꮃ苣鲽裦馁苣芀뿦躁臣膀莄臣ㆧ菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꒂ苣ꊂ菣뮂苣릟鳥芀〱洰꺁慄摵내菨릟ꓩ릟鳥⢰⸲⤱苣㆒〰䱭鿥난菣袃菣ꮁ諥袁苣芀곦蒁臣膀諦䎗㍄諦鎽苣を㈮볎⽧䱭뿦ꚺ臣ꞁ諥袁胣鶁臣ꚁ洱꺁菣讃苣ꪃ菣銈苣袃菣鞃菣麃苣랂菣뚺뛦⢲⸱ㄱ銂諥袁苣芀믨銀臣袂苣誁臣蒂臣ꮁ럦袐臣膀껥ꦸ臣㢧駦鎖苣薶臣骁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 䈠楲桧銈汇ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂뫦늶胣랂苣蚃菣⢠⸱ㄲꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣ꊂ菣뮂苣ꦷꇨ늶苣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂鿥ꪳ臣ꂊ臣膀믨銀럦袐臣袂苣膀뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀ꧨ겖臣膀芙雩ꖻ蛥ꮁ뷤ꢔ臣讂臣뺁臣꾁裢㊒莄臣膀臩覅臣ꚁ놀雩뺁臣鶿귥馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 내菨ꪠ臣궶賦芀듧麃꣨낕駥銂铧蒁臣袨룦ꮁ苣誂胣䪁牵慫⹴䅃臣袂臣䒳畡楤듧麃ꃦ꺁룤릖臣ꒁ臣ꚁ洱鎽臣誂臣내菨낕苣겸껥馁苣芀듧麃臣ㆯ韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾⼼畳㹰胣㆜㔮韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰듧麃洯꺁雩ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀㈱韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰畊歲瑡䌮내菨誁苣뎁㈱韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰慄摵내菨銂蓧貏臩莿裥ꊛ껧궸臣랷郥馁苣芀듧麃苣蒴㈱쌵林臣ㆧ蚈雩膀껥ꦸ臣ꂁ뿥蚈鯩馁苣芀臣���臣讂듧麃鯩誡苣讦臣ꪁ臣ꪁ苣뺁臣股룦ꢔ菣骃菣袃苣ꢔ臣ꚁ맧誂뿨鞁ꧧ蒂臣ꮁ菣骃菣蚃苣뎃苣馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣내菨銂洹꺁慄摵내菨릟ꓩ릟鳥⢰⸲⤱룤ꮁ跥蚈臣趆蟦膿臣ꚁ胣莿뫥銂⸲쌷쎗㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵내菨⾞䱭臣馁苣芀듧麃뿦ꚺ苣膀듧麃꣨낕駥ꮁ臣蒁臣내菨銂꣨낕臣讂臣ꢁ臣袂苣鲤꣨馁苣芀臣꺁蛥뢇뿦鞁臣내菨銂㘹ꧧ鞃菣벃菣⢈⸱⤳臣Ꚃ苣ꮃ룤ꮁ胣ㆁ苣Ꞃ菣鎽臣誂㔷䱭ㄨ苣Ꞃ菣鎽臣誂〲ⰰ〰내菨⦞臣궒꣧馁苣芀臣꺁菣것菣袃苣ꒂ菣궂菣馃菣뾂菣⢼㜳蓢膀佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢薼胣誁苣뎁맦ꚺ㔸볯꺁꣨骮胥⦤臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀臣꺁雩ꮁ꣦隺胣膓돨ꆮ郧ꦉ臣袂臣떂菣鞃菣銂ꫨ붣臣讂胣馨뫦膀鏥ꪳ껧蚐觧誁苣뎁苣뎃菣ꮃ誁苣뎁꺁臣膂臣趐鯧莿뫥꺁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣뾪ꏨ芀꣦隺鯦骷臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣膀〵〰杮洯꺁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉觧ꪳ뷤궥뫦늶洳銂菣ꒂ苣ꊂ菣뮂苣릟鳥⢰⸲⤳룤ꮁꫨ붣臣讂胣膓돨ꆮ郧늛럧ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣龁苣ꮁ胣㖁〰渰⽧䱭臣䎮䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒ꦉ돨鲽ꗦ뚺뛦㎲䱭苣邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ鿥난㈨㌮궸臣뾪ꏨ馁苣芀苣뎃菣ꮃ鯦骷臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣膀ꒁ臣䎮䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒떂菣鞃菣鲽ꗦ뚺뛦꺁郥薀洳銂菣ꒂ苣ꊂ菣뮂苣릟鳥⢰⸲⤳룤㖭〰渰⽧䱭臣뾪ꏨ馁苣芀䌨䱔㑁㉁夹ㅌ㐰銈杉苣뎃菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ臣袂臣꺁뿦ꚺ苣뾽铧鞁臣膀릂鯦骷苣뾪ꏨ鞁臣节苣辁胣겸껥閁苣龁뿦ꚺ臣ꦈ铧꾏菨ꞁ臣讂臣趁臣膀⸵ꮁ꣨覼臣袂臣ꮁ꿦뮴胦ꒀ苣꺿귦鞁臣节苣蒁芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 㠠苧늛럧銂胣馨뫦膀鏥ꪳ껧蚐觧誁苣뎁苣뎃菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ胣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣醁苣肜뗧莿뫥ꮁ臣蒁臣꺁믤许臣ꢡ㔵臣몤臣袂臣ꮁ胣䎁䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒銂〵〰胣㊁〰胣ㆁ〰胣㖁膀㔲胣ㆁ膀膀臣袂臣コㄮ杮洯꺁뿦ꚺ臣뾪ꏨ鞁胣鞃菣벃菣뢁臣㊮胥貸蟩貾臣膀㔲〰胣ㆁ〰胣㖁膀㔲胣ㆁ⸲膀膀⸲膀臣袂臣コ〮渵⽧䱭臣莿뫥ꮁ臣ꎁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꢡ㔵†꣦隺鯦骷苣鞾苣龁苣ꮁ뷤ꢔ臣貂苣貸蟩㲈牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㜵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ㈠臣꺁菣것菣袃菣莃菣銂뷤ꢔ臣ꚁ苣袂臣芀菣뎃菣ꂃ菣것菣袃菣莃菣꾁胣궨껥ꮁ뛦鎽菣뎃菣ꦃ菣꺁뷤ꢔ苣薿ꛨꢁ臣讂胣蚠뫥颻臣覂苣龁菣것菣袃菣莃菣꾁胣ꎚ軦鞁臣覸臣肸뗧���ꮁ臣ꎁ臣誁苣膀胩骶臣蚠뫥颻臣覂苣龁菣ꒂ苣Ꚃ菣ꞁ럦ꂊ臣貂臣ꮢ꣩ꦉ돨ꮁ臣蒁臣꺁鯦骷臣蒐苧銂鳦鞁臣蒁苣芀菣뎃菣ꂃ菣것菣袃菣莃菣ꮁ臣蒁臣꾁胣㞁층䲼臣蒐뫦늶㐨㠮銂胣ꖻ룤꺁菣것菣袃菣莃菣ꮁꓧ馁苣蚁臣내菨⢞⸴⤵苣ꮐ苣鞃菣벃菣꺁臩鎽臣Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣蚠뫥颻臣覂苣龁菣것菣袃菣莃菣ꮁ臣蒁臣꾁胣㞁층䲼臣蒐뫦늶㐨㠮銂믤许臣鞃菣벃菣麃菣鞃臣몤臣袂臣ꮁ듧麃㐨㔮銂郥肂ꒁ臣鞃菣벃菣꺁臩鎽臣Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†菣것菣袃臣咫灯敓污裢䆒ㄨ㈮⤲臣랂菣ꮃ臣讂胣鶁臣랂菣ꮃ臣鞁臣讁苣ꢁ껥趽뷧ꮁ臣讂臣銂ꋧ趪臣讂胣목냦鎖髩貁臣ꎁ臣꾁臣覂臣蒁胣鞃菣벃菣銂苣뎃苣ꖃ菣벃苣벃臣膀㜳蓢膀佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢薼胣誁苣뎁맦ꚺ㔸볯ꮁ꣨骮臣ꚁ㘱胣㊜芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鞃菣벃菣誁苣뎁牂杩瑨裢䞒潬菣랂菣Ꞃ菣벃苣뚺뛦⢲⸲⤴苣薣뷧ꦸ뫥ꮁ맥ꆡ賥馁苣芀㔱츰䲼臣䊮楲桧銈汇ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂뫦늶苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ郥芙臣ꂊ臣ꚁ胣랷郥馁苣芀럦袐鯧貾臣鞃菣벃菣銂潔䍰畯瑮丠员臣꺽臣膀髦肉臣ㆧ蚈雩뎹ꇨ隌臣讂胣몙藥랂苣誃菣銂潔䍰畯瑮丠员臣誁臣ꚁꚂ苣ꮃ뷥龁苣ㆊ꟧꺁苣뎃菣낂菣벃苣ꞃ菣銂铧蒁臣膀臣龁臣뾽铧馁苣ꞅ뫥袨臣릉껥꺁黥ꮁ뿥颁臣겸껥馁苣芀潔䍰畯瑮丠员臣覂臣몇諥銂꣨늌臣讂胣蚠뫥颻臣覂苣龁菣것菣袃菣莃菣銂뷤ꢔ臣讂ꃥ袐臣꾁胣㊁臣꺁菣것菣袃臣궪臣随苣貂苣ꞁ臣趂臣芀鳦鶈臣鞃菣벃菣⢈黥뒛꾁胣䆁Ꚃ苣ꮃ苣ꚷ룤銧臣鞁臣궪臣随苣貂苣ꞁ臣趂臣芀곧貺臣鞃菣벃菣⢈胩趽꾁胣䆁Ꚃ苣ꮃ苣뎏룤銧臣鞁臣궪臣随苣貂苣ꞁ臣趂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ臣ꦃ菣肃菣鞃菣벃菣麃菣鞃꣨骮볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㠵⼼㹡⼼䥄㹖匊湴骼苣Ꞃ菣궸鳦芵뿦ꚺ㔲〰胣゜〮渵⽧䱭臣馨뫦ꦉ戼㹲儊骼苣Ꞃ菣궸鳦芵뿦ꚺ㔲〰胣゜〮渵⽧䱭臣膓돨ꆮ郧ꦉ戼㹲匊灭膀浓㉰볯Ꚃ苣ꮃ룤肜뗧莿뫥㊦〵鲀⸰㔰杮洯꺁苣뎃菣ꮃ鲀ਲ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꒂ苣ꊂ菣뮂苣꺁ꃩ辺믤醁苣貂臣鞃菣벃菣麃菣鞃꣨骮볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㤵⼼㹡⼼䥄㹖匊湴骼苣Ꞃ菣궸鳦芵뿦ꚺ㔲〰胣゜〮渵⽧䱭臣馨뫦ꦉ戼㹲儊骼苣Ꞃ菣궸鳦芵뿦ꚺ㔲〰胣゜〮渵⽧䱭臣膓돨ꆮ郧ꦉ戼㹲匊灭膀浓㉰볯Ꚃ苣ꮃ룤肜뗧莿뫥㊦〵鲀⸰㔰杮洯꺁苣뎃菣ꮃ鲀ਲ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†㘹ꧧ鞃菣벃菣꺁Ꚃ苣ꮃ뷥龁苣㊊〰〬〰듧麃苣ꂊ臣膀㜳蓢膀佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰���⼼畳㹢薼胣誁苣뎁맦ꚺ㔸볯ꞁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀㈱韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰畊歲瑡䌮내菨誁苣뎁㈱韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰慄摵내菨銂蓧貏臩莿裥ꊛ껧궸臣랷郥鞁臣芀듧麃苣蒴㈱쌵林胣꒮룦ꞁ〱裥鎖臩莿裥ꊛ臣膀臣讁臣讂듧麃鯩誡苣讦臣ꪁ臣ꪁ苣뺁臣股룦ꢔ菣骃菣袃苣ꢔ臣ꚁ맧誂뿨鞁ꧧ蒂臣ꮁ菣骃菣蚃苣뎃苣馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣㦁䱭臣䒮畡楤듧麃鿥誤鿥난룤ꮁ跥蚈臣趆蟦膿臣ꚁ胣莿뫥銂⸲쌷㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵내菨⾞䱭臣馁苣芀ꇨ㖨讁苣꺁郥뚺뛦㞲층䲼苣膀듧麃苣ꮐ苣㊀臣꺁菣것菣袃臣ꦁ뷥ꪁ苣Ꞃ菣ꮁ諥袁苣芀菣것菣袃臣咫灯敓污裢䆒臣랂菣ꮃ臣膀㜳蓢膀佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢薼胣誁苣뎁맦ꚺ㔸볯ꞁ㘱胣㊜芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣鞃菣벃菣誁苣뎁牂杩瑨裢䞒潬菣랂菣Ꞃ菣벃苣뚺뛦銂ꏨ꺽룦ꚺ臣뎹ꇨ隌臣龁뻥ꮁ胣ㆁ〵볎꺁牂杩瑨裢䞒潬菣랂菣Ꞃ菣벃苣뚺뛦銂郥Ꚃ苣ꮃ臣貐駦ꮁ諥袁臣膀럦袐臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣랷郥뒛뻥ꮁ菣것菣袃苣咒灯潃湵⁴塎ꮁ뷧趁胣鞚触ꞁ〱裥鎖맥ꆡ賥馁苣芀곦蒁臣膀駧覅苣낂菣ꮃ苣咒灯潃湵⁴塎ꮁ臣蒁臣Ꚃ苣ꮃ뷥龁苣ㆊ꟧꺁苣뎃菣낂菣벃苣ꞃ菣銂铧蒁臣膀臣龁臣뾽铧馁苣ꞅ뫥袨臣릉껥꺁黥ꮁ뿥颁臣겸껥鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 吠灯潃湵⁴塎讁苣꺁蟥鮊苣風賩鞁胣馨뫦蚈黦鞃菣낂菣ꂃ룤ꮁꫨ뾁迥誂胣鶁臣ꚁ菣벃苣銂胣鶁苣覂臣뺯闦銂迥讂臣ꢁ臣袂苣覤迦鞁臣⢟뫥꾁〱芀郥ꚩ꣩ꦉ臣覂臣覤迦螃菣뾂苣膀믤许臣込臣몤臣袂臣ꮁ胣㒁菣ꦃ菣벃苣벃臣궃苣릂菣ꎂ菣꾂菣螃菣ꮁ臩袐臣鮁臣骼戼㹲込骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘱㰰愯㰾䐯噉ਾ込룤骼戼㹲䄊臣膀鯦骷臣肜ꯩꢃ菣ꦃ菣벃臣芁苣膀꾁胣늛럧꺁鳦躽菩鞃菣袃菣ꞁ臣誂胣䊁臣膀若趁뿤낕臣芁苣膀臣鞁臣䎦臣䆯臣䒨臣뎹鷥ꮁ귧鞁臣릊黦銂铧颁臣鮁苣莿뫥ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†㱒畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯灵놵꣨辇胣誁苣뎁룤ꦁ郥ꚺ銈ꓦ骮苣膀郥ꚩ꣩ꦉ臣ꒁ臣ꚁ꣨鞮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣뺁臣膀꣦隺觧ꪳ臣钯볨鞁臣ꮢ꣩ꦉ돨꺁鳦辰胥膀鳦Ꞥ胥誁苣뎁若趁臣钯苣袨껧馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣覂臣膀꿦ꮁ꿥馁苣ꆿꃩ몌雩銂껧몇臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†迥莀觧놔鷦꺁菣벃苣ꢁ뗧뾁郥辂臣龁胣뾪臣龁臣ꚩ꣩ꦉ臣覂뻥龁菣벃苣ꮁ讀臣込苣ꦁ郥閁臣讂臣ꢁ臣袂苣膀郥薀臣薠鯧꺁꿦뮴胦銂룦骮臣龁胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶���琮晩ꃂ〰㄰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖嬊볥궸볯㲚牢ਾ膀誁苣뎁醃菣ꆃ菣뾂菣꾁胣芏胨誁苣뎁ꧨ鎨觧꺁룤릖臣놅胩ꞁ臣誂胣䎁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰刾⼼畳㹢臣膀迥莀觧醃菣ꆃ菣뾂菣膀㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱁猯扵꾁ꧨ鎨觧醃菣ꆃ菣뾂菣膀臣鞁臣䎦猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰刾⼼畳㹢䌯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾⼼畳㹢臣钯臣膀꿦뮴胦ꞁ臣讂胣誸믤趁雦鞭臣䦮臣膀賦몤ꓥ낕臣芁苣芀菣벃苣貁ꫨ릁臣蒁ꧨ鎨觧놔鷦ꞁ臣讂臣覂臣貂臣ㆯ臣覭臣辁꣨骮臣貂胣螃菣뾂臣馨뫦ꦉ铧ꖝ臣芁苣ꪁ苣ら臣覭臣辁꣨骮臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 蒐ꧨ鎨觧꺁꿦뮴胦꾁胣醃菣뮂菣袃迦鞮臣꺽臣鮏臣覂苣膀ꧨ钯듦Ꞁ臣鞃菣낂菣ꂃ臣覂臣몇諥ꢁ臣ꚁ룤袁苣貂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 誁苣鶁臣莿뫥ꞁ뻥覂苣龁꿦뮴胦ꒀ臣뾪闦骼戼㹲 떂菣鞃菣鞏臣随苣ꢁ귦몢臣뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ苣鞾苣鎁臣ꮁ駦鎖럥貁臣讂臣膂臣膀苣뎃菣ꮃ苣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣誁苣鶁臣莿뫥ꞁꧨ鎨臣膀귦몢臣莿뫥貁뇦骮臣貂苣ꢁ臣ꮁ뗧鲞苣뾪闦鞁臣节苣蒁胣鎁臣뾪闦꾁胣ꖻ룤ꮁꓧ馁볥㊏苣ꢔ臣膀룦骮臣龁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉苣뎃菣ꮃ뿦ꚺ臣뺯臣讂胣ꊂ菣뮂苣讧裦꺁臣膂臣ꢔ臣龁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉뿦ꚺ臣钯苣膀苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ룦骮臣貂臣钯듦Ꞁ臣鮎臣ꚁꇨ蚁胣㲂牢ਾ볥㊏볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㈶⼼㹡⼼䥄㹖设볯㲚牢ਾ苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ苣뎃菣꾂돨莿뫥㊦洵⽧䱭臣떂菣鞃菣銂ꧨ鎨臣龁胣㲂牢ਾ룦骮臣貂臣钯듦Ꞁ臣ㆯ㔰볯ꞁ臣ꎁ臣芀戼㹲겸껥閁苣龁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉뿦ꚺ臣膀㔲㔮杭洯ꢁ뇦骮臣貂臣芀戼㹲놠釥馁臣趁꿦뮴胦鶼ㄨ㔰韃㔲⼩㔲㔮볯㆝㌰볯અ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†꣦隺觧骼蟥鮊臣貂臣馨뫦ꦉ臣䖮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥꾁胣㖁胣㎜渵⽧䱭臣ꪁ苣릁臣ꞁ臣讂胣㊂〵渰⽧䱭臣エ〮渵⽧䱭뿦ꚺ臣馨뫦ꦉ雩꺁럥낕蒯鯥⦲臣꞉〴〬〰苣Ꚃ菣袃銧䌨卐ꢁ臣讂臣趁臣芁苣芀迥莀觧ꮁ臣蒁臣꺁銈뫤鞹胥꾁胣め㤮袂苣Ꞥ臣辁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ㦨臣誁臣讂ꧨ鎨觧꺁꿦뮴胦ꒀ臣膀迥莀꣦隺觧꺁㔲胣㆜㔷볯ꞁ臣辁臣꾁臣覂臣膀臣貂臣ꊂ菣뮂苣꺁꿧늛臣芁苣芀꿦뮴胦ꒀ臣鎁臣蒯鯥꺁ꓥꮁ臣讂臣覂胣鎁臣蒯鯥薆臣ꖅ苣袂臣ꮁ苣뎃菣ꮃ苣貸蟩馁苣讁臣龁臣莿룧鞁胣떂菣鞃菣銂蛥ꚺ裥邞臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣���醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 䐠畡楤䈠듧麃ꃦ骼戼㹲 鮾뗧邺볯䒚畡楤듧麃臣膀呁䍃臣覂뻥龁胣莅臣ꪁ苣꾲铨ꦉ洨獡整⁲慢歮꾁胣㚁邃苣ꊂ菣讁苣讧裦閁苣龁胣鲽ꗦꢔ단떔觧꾁胣莅臣ꪁ苣꾲铨ꦉ菣ꒂ苣ꮃ臣覂胣㒁뛧ꎻ뻥ꮁ뷤邈臣龁ꢳ볯馶믤ィ臣ꎧ蟥ꢁꛨꪁ臣膀곦蒁臣붿諥꺁馶믤銂胣鲽ꗦꢔ단떔觧龔裦趉臣財臣龁芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 릟鳥骼慄摵내菨銂偒䥍ㄠ㐶릟鳥⢰䕈䕐誁苣뎁銈苣ꮃ苣龃菣ꮐ鳦膀〱볯Ꚃ苣躃藥股룦誁苣뎁薼菣ꮃ菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ뿨ꂊꮁ臣蒁臣鞢껦閁臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃苣ꖃ菣벃苣벃鷦뚻볯내菨銂胩鞰볥咏裢閃菣릂苣ꮁ臣蒁臣膀㜳蓢膀佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢薼胣誁苣뎁맦ꚺ〷胣㦜薼臣궶賦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꎧ蟥鞃菣袃苣벃菣骼듧麃臣邃苣ꊂ菣銂뛦鎽ꫧꂴ蛥趇뫥讁苣随苣몇臣膀㜳蓢뒰뗦궸臣ꎧ蟥馁苣芀蛥릮觧銂〱䱭臣릟鳥ꢁ럦袐臣讂胣내菨銂꣨낕臣膀곦蒁臣ㆧ㔲韃ꞁ〱裥鎖臣ꂁ뿥蚈鯩ꮁ苣誂鯩膂苣芀臩莿裥ꊛ뻥膀룤薸苣꒙軥鞁胣내菨銂雦꺮臣릟鳥ꮁ쌳㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰵猯灵龔귥내菨⾞䱭臣뢇뿦馁苣芀듧麃臣鎁臣芙苧ꞁ뛧ꎻꢁ껥ꦾ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꋥ隮觧Ꞁ볯鎁臣내菨ꪠ臣뢇뿦ꦉ룤ꞁꋥ隮臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†뛧ꎻ鿥誤볯馶믤鎖臣㖌韦袂苣랕臣ꪁ苣ꪁ臣袂臣膀룤놀雩ꮁ麛臣馶믤ꮁ苣誂鿥誤觧銂뛧膌臣讂胣내菨銂胣낖껩ꪁ鿥난苣覜臣讂胩鞰볥咏裢閃菣릂苣ꮁ臣蒁臣膀⸰쌵㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰵猯灵鲀쌲㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰵猯灵龔귥내菨⾞䱭臣馶믤馁苣芀듧麃臣膀⸱쌵㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵내菨⾞䱭苣薶臣讂꿥ꚺ臣钁臣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣芀듧麃臣膀菣ꪃ菣뎃菣ꮃ菣鎟觨銂铧蒁臣閩뻤ꮁ苣誂〸볯銂뛨袁臣颭鳥鞁臣蒁苣릁臣ꞁ臣讂胣馶믤貾臣膀韦颻臣袂臣馶믤낕苣咒裢閃菣릂苣誸臣ꦃ菣ꮃ臣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†胥ꂊ駦鎖볯趀諥芙雩꾁㠱胣㊜芙雩꺁꿧늛臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 馶믤邙闧骼뷤궥铧꾲铨ꦉ臣覂뻥龁듧麃苣膀菣ꒂ苣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣ꢔ臣讂觥ꮁ麛뛧ꎻ臣릁臣ꞁ臣讂胣馁臣辂臣내菨꾁뛧ꎻ뺁臣꾁臣貂믤誸臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣내菨꾁胣㊁馶믤꺁雩꺁臣릟ꓩꦉ룤ꮁ귥骶臣鮁苣릁臣ꞁ臣讂胣鶁臣芙苧ꞁ胣낖臣蒁뷤궥铧邃苣ꊂ菣銂꟨趇臣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†蟥���邵菣궃菣뎂菣ꮃ볯내菨銂苣ꪃ苣邃苣ꊂ菣ꮁ臣蒁臣膀鲀〱韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰듧麃洯ꞁ蟥邵臣讂胣趇뗧鶿귨릟鳥꾁胣貮藥릟鳥ꮁ薼瘨瘯䐩卍銂뿨ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣뾪ꏨ馁苣芀듧麃苣膀뛦鎽ꫧꂴ룦ꚺ蒴㤱莄ꮁ臩馁苣뺁臣膀莄蚈臣龀뫥ꞁ蟥邵臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†畊歲瑡䌮⁁내菨ꪠ볯㲚牢ਾ†뻤ꚵ뫦骼畊歲瑡吠듧麃苣䎒䱔㑁裢䦒蚈귥銂苣벃菣馁苣鞃菣릂菣覃臣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣鞁臣芀뷤궥铧꾲铨ꦉ臣膀藥ꢁ臣讂단떔觧邃苣ꊂ菣讁苣膀馶믤貾臣鲽裦鞁臣⢟돦骼뛧ꎻ꾁꟨趇臣讦臣鞁胣ꆬ臣ꞁ뿨ꂊ臣㊮뛧ꎻ苣膀뷤궥铧꾲铨ꦉ铧邈觥ꮁꇨꎁ臣⦟胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†鿥난볯䪚牵慫⁴䅃듧麃苣劒䵐⁉㘱〴鿥난䠨偅卅臣袂臣䲳裢낂菣뾂菣뎃郥覜胣ㆁ薼믤Ꚃ苣股룦誁苣뎁薼菣ꮃ菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ뿨ꂊ胣誁苣뎁苣Ꞃ菣蚃苣랂菣⢳㑇㠱ꇧ뢅ꇥ⦩苣肜뗧莿뫥㒦〰볎⽧䱭臣붿諥⦠臣誁臣ꚁꋥ隮臣鮁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꒂ菣궂菣馃菣뾂菣ꆝ믤骼듧麃苣骀냦込銈菣ꦃ苣뎂臣誁臣ꚁ胣㎁莄胣䎁㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵㔾볯膀臣袂臣뾹뫥㞦鲀〹볯ꞁ뛧膌臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†꟨趇菣궃菣뎂菣ꮃ볯내菨꺁菣ꒂ苣ꮃ苣늶뷤銪듧랆蟥ꮺ臣覂迥誂蟥鞁胣㎁莄냦뒵룤ꞁ꟨趇臣讂胣薆껥ꦉ苣㆒洰꺁鿥난臣랷郥馁苣芀듧麃苣袨闦鞁胣ꆬ臣ꞁ㈱쌵林臣ㆧ蚈雩꺁臩莿裥ꊛ臣袂苣蚛苣讂胣ꂁ뿥蚈鯩貾胣誸룦銂駩뮎臣膀듧麃苣낖껩ꪁ鿥난臣㎫韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾⼼畳㹰铧颭듧麃洯ꞁ蟦膿臣讂胣내菨꾁臣꺁駦릂臣馶믤ィ臣骮뻧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 鞢껦릉胦骼臣꺁듧麃ꃦ꾁蟦膿觧궸臣鞢껦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 馶믤릟ꓩ骼뛧ꎻ雩貁ꖗ苣誂闩辁臣覂臣蒁苣蚁胣肸胩鎖臣㊫鯥꺁뛧ꎻ臣袂苣릟ꓩꦉ苣궶賦馁苣芀듧麃苣膀雦꺮臣릟鳥銂鳦馁苣骀냦込銈菣ꦃ苣뎂臣誁臣ꚁ胣め㔮胣㊜韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾⼼畳㹰铧颭듧麃洯ꮁ뛧ꎻ臣讂胣내菨꾁胣ㆁ㔮韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰듧麃洯銂뛨袁苣蚯뫥ꮁ臩鞁臣꾁臣覂臣蒁胣내菨꾁胣袃菣醃菣隃菣벃鿦늉苣ꢔ臣龁ꧨꆾ臣袂苣㢊薼苣薶臣ꚁ귥ꢜ臣ꚁ臣ꪁ臣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣芀뛧ꎻ뻥ꮁ胣ꖗ믤誁苣뎁뛧ꎻ闦銂銈菣ꦃ苣뎂룤ꮁ菣馃菣馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 趀諥芙雩骼胥ꂊ駦鎖臣ㆯ鲀㘲駦鎖臣蒯鯥ꮁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†뛧ꎻ駩貕볯���鲽ꗦꢔ단떔觧讁苣鞾臣내菨銂胣邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ铧蒁苣趉臣㎫鯥馶믤馁臣趁臣芁苣膀臣ꪁ苣ꆁ듧麃臣馶믤㎣臣龁臣鶁苣ꖻ룤ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀듧麃臣膀〲뛧ꎻ臣鎖臣뾁鿥誤觧궸臣颭뛧閁臣讂臣趁臣芁苣芀臣꺁駦릂臣膀雦鞁臣鲽ꗦꢔ菣ꒂ苣ꮃ苣ꎧ蟥馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 趇뗧鞃菣袃苣벃菣骼듧麃苣꾂菣ꪂ菣ꒂ苣ꮃ臣誁臣ꚁ胣㖁胣㆜쌰㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵내菨⾞䱭臣趇뗧馁苣芀蟥邵뿤랭鿥난苣膀껥ꢅ鿥난臣㖫볯⢅⽶⥶䵄体苣붿諥馁苣鎁臣ꮁ苣誂ꫨ붣臣讂胣내菨銂胣늶뷤銪듧ꦸ뫥⢦듧ㆄ〹蓢⦃臣钁臣讂臣ꞁ胣ㆁ蓢⾃裥꺁胩ꚺ臣趇뗧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设ㄴ볯ꢡ鷩鞃菣몂菣뎃藥뒳䈨䅉潣敲ꮁ苣讂㝂ㄮ裢䦒鞏껥鎽臣꺁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣龔뷤릉闧蒚뗧袐臣겸껥㲚牢ਾ†㝂ㄮ杉迥릮뷤뢁臣䎮䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒떂菣鞃菣꺁鯧뺯髧邵郥銂胣䊁䅉潣敲ꏨ꺽苣ꢔ臣龁ꇨꊝ菣ꦃ苣ꊃ菣놅돩ꮁ苣誂룦骮臣龁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣膀偁내菨鲆苣뎃菣꾂돨䊪⸷놔鷦꺁㝂ㄮ杉藥ꮖ苣궃菣ꪃ菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ臣邵郥馁苣芀㝂ㄮ杉迥릮뷤銂胣뮴胦隌苣뎃苣벃菣莃菣꺁ꇨꊝ룤ꮁꯩ蚯뫥ꮁ鯥骮賥鞁臣貾臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉觧ꪳ胣膓돨ꆮ郧ꦉ胣誁苣뎁苣뎃菣ꮃ苣膀뗧袐苣뎃苣벃苣ꦃ菣銂뻥讂臣膂臣貸蟩馁苣芀鯥骮賥閁苣龁㝂ㄮ杉ꇨꊝ臣꺁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣肜裥꺁뗧袐胩ꚺ뺋藩⦍邵郥鞁臣놅돩颍뷤⢍啒銂胣ꦉ돨뮧该⢕详ꎕ设胩ꆝ믤许胣鎁臣颫꿥ꚺ㝂ㄮ杉ꇨꊝ룤ꞁ룦骮臣讂胣ㆂ꟧鎽臣誂臣놅돩颍뷤⢍啒猯ꮁ臣醁苣肜裥꺁뗧袐胩ꚺ臣膀铧鎽듦Ꞁ뿦ꚺ臣뒛軦뢛雩鞁臣蒁苣芀苣뎃菣ꮃ臣邵郥龀뫥꾁胣䎁䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒ꦉ돨꺁뗧袐胩ꚺ苣膀뿦ꚺ臣뺯臣ꚁ菣궃菣袃臣ꚁ臣讂迥莀꣦隺鯦骷苣ꢔ臣ꚁ胣뮴胦莿뫥뢁臣袨껧馁苣芀鳦芵뗧鲞臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉觧ꪳ臣钯볨鞁臣떂菣鞃菣꺁뗧袐菣벃苣뎃菣ꮁ苣誂胣뺁臣꾁뿦ꚺ臣鞁臣ꢡ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雨骼苣龃菣ꮂ菣鞃菣뎃苣궂菣袃䥂趪껥⢚苣莃菣꾁胣蒐胣ㆅ菣ꒂ苣ꮃ臣ㆮ㔱杭丠裢銃菣궃苣랂苣꾂苣뎃苣龃菣⢉䡎⥓胣㞁〵杭丠裢ꢂ菣ꮃ裢互銈㌨裢뢂菣膃菣⦫䔨䍄膀臣袂臣ꢂ苣躃菣ꮃ苣龃菣銂郥肂���蛥龔럧鶡뛦⢲〱䵭苣ꢂ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀〱洰⁍慎汃胣炁㑈〮鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 薣뷧骼䍐뫤鮏胦뎂菣钃菣벃苣벃苣覜臣讂䥂捁牯⁥薣뷧⢮䥂捁牯⡥苣뾂菣낂潎‮剂裢㆒〱銈ㄵ⤩볯䊛慩潣敲䌠裥ꆾ苣閃菣Ꚃ苣ꊂ胣邃菣뢂菣뎃⸱⸰鮼䥂捁牯閩뻤붂菣袃苣Ꞃ苣₢⸱鮼䥂捁牯㥥뒩菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃讞䥂捁牯⡥苣뾂菣낂潎‮剂裢㆒〰銈㌰鮼䥂捁牯㥥뒩菣ꒂ苣궃菣것菣袃潆汩鞃菣벃菣뮃苣벃菣벃ꮂ苣궃苣亰⹯䈠銈〱㔰裢㞒⤸胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘱㰳愯㰾䐯噉ਾ㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 邝雦㲙牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㐶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雨㲬牢ਾ†苣龃菣ꮂ菣鞃菣뎃苣궂菣袃䥂趪껥芀臣꺁苣莃菣꾁胣蒐胣ㆅ菣ꒂ苣ꮃ臣ㆮ㔱杭丠裢銃菣궃苣랂苣꾂苣뎃苣龃菣膀㔷洰⁧銈苣膃菣銈❎裢⢒銈苣ꆃ菣ꮃ誁苣뎁苣뾂菣벃菣ꊂ菣뎃苣ꮐ苣芀郥뚺뛦銂ꏨꂀ胨꺁賦몤臣鎾臣覭裥鞁胣ꖻ룤ꮁꓧ馁苣蚁臣鶿귥馁苣骼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ㄠ⸱洵⽧汭丠裢銃菣궃苣랂苣꾂苣뎃苣龃菣⢉䡎⥓臣覭蟩骁臣銂裢㊒莄臣鶿귥馁苣芀臣꺁蟥邵臣龁귧辇觧꾁胣뾪ꏨꖗ臣覂뚃鳦ꞁ鳦邙臣螈苣讂胣㞂洵⽧汭ㄠ裢ꢂ菣ꮃ裢㎒裢⢒銈苣ꆃ菣ꮃ苣龃菣鞃菣钃菣⦫苣ꮃ菣뢂苣龃菣ꦡ藩ꦡ䔨䍄꺁귧辇觧銂裢㊒莄臣鶿귥馁苣芀臣꺁蟥邵臣龁귧辇觧꾁胣뾪ꏨꖗ臣覂뚃鳦ꞁ鳦邙臣螈苣讂胣ㆂ〮ꢂ苣躃菣ꮃ苣龃菣銈䍈⁬䡰⸸꺁귧辇觧銂裢㊒莄臣鶿귥馁苣芀臣꺁蟥邵臣龁귧辇觧꾁胣뾪ꏨꖗ臣覂뚃鳦ꞁ鳦邙臣螈苣讂胣趆铧ꦷꇨ늶ㄨ洰꾂苣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣ㆁ〰䵭丠䍡膀䡰⸴⤰胣ㆂ㔮뇂⸰朱苣ꢂ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣誁苣뎁⸲숹ケㄮ⁧慎汃苣蚈黦蒚臣辇苣蚈臣讂胣㖂〰䱭䴠汩楬裢冒냦ꮁ諥袁胣ㆁ⁎䍈銂铧蒁臣炦銂⸴ꮁꫨ뒕臣讂胣뚺뛦銂⸰㈲볎閃苣ꮃ苣벃臣뺿臩鞁胣ꆬ臣ꞁ〵洰銂귧蚈臣ꚁ㔴䱭㔯洰蚆賩ꆮ룤ꮁ藥貂苣芀뫦늶臣膀鲀莄臣鶿귥鞁臣ꢁ臣ꮁꫨ붣韦讁苣㚉菣袜臣龜駩貁裥貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 薣뷧㲮牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㔶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 뮂菣떂菣膃菣鞃臣뾪ꏨ₽낖臣蒁苣뎃苣벃菣莃菣䎗㕍苣薣뷧꺁ꓦ몇駥ꚃ菣莃菣誸臣ꮂ苣莃菣鶃菣袃臣뾌藥馁苣芀䥂捁牯⁥较菣覃菣莃苣ꮁ꣨覼臣袂臣ꮁ胣䢁卂裢䖒ꦷꇨ늶苣ꢔ臣ꚁ胣랂苣蚃菣꺁뫦馂苣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 릖돦꺁ꧦ붃臣龁苣꺁䥂捁牯⁥薣뷧꺁鏦鲽†䥂捁牯⁥薣���銂胣銺迦Ꞁ䍐苣뎃菣ꖃ菣뾂菣讁苣膀楍牣獯景⁴楗摮睯낒ꋥ许臣䊫䅉潣敲䌠裥ꆾ苣閃菣Ꚃ苣ꊂ苣ꢔ臣ꚁ裥ꆾ臣讂胣䊂䅉潣敲䌠ꏨ꺽臣뾽铧誁苣뎁菣뎃菣誃菣릂臣龁苣ꮁ胣鲽ꗦ螌ꓧ뢛胣侌数慲楴湯漠⁦䥂捁牯⁥⁃湉瑳畲敭瑮䈨䅉潣敲䌠ꏨ꺽臣趓뷤⦜胣誁苣뎁胣䎌污扩慲楴湯愠摮䴠楡瑮湥湡散漠⁦䥂捁牯⁥⁃湉瑳畲敭瑮䈨䅉潣敲䌠ꏨ꺽臣莼귦誁苣뎁菣뎃菣誃菣릂趀苣芏藧芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 䈠⸷䤱꺁鯥骮賥閳戼㹲 䈠⸷䤱꺁ꫨ붣볯䊚⸷䤱銂郥肂菣ꒂ苣ꮃ苣㊒⸲숵㖱蓢ꞁ꟨趇臣膀〳〰裢㦒〰到銂鯥骮賥馁苣莿뫥ꮁ胣貸蟩늶臣鞁臣ㆦ洰ꊅ藩炸㕈〮럧鶡뛦銂铧蒁臣貸蟩鞁臣芀䑅膀䡎誁苣뎁苣뾂菣벃菣ꊂ菣뎃臣邃苣ꊂ菣銂胣風볨꺁苣蚁臣ꊂ菣뎃苣莃菣ꪃ菣낂苣莃菣讁苣蒐胣ꎧ蟥鞁臣芀곦蒁臣膀ꧨ겖臣袂臣ꪃ苣뎃菣邃苣ꊂ菣銂胣䊁䅉潣敲菣궃苣ꦃ菣ꮁ苣誂賦몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ苣뎃菣ꮃ菣莃苣ꮁ藥貂胣䊁䅉潣敲ꏨ꺽賦몤鯦ꮁ뻥蒁鯥骮賥銂雩讧臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉꣦隺鯦骷臣鲽裦㲐牢ਾ†꣦隺臣袂臣떂菣鞃菣⢫뻤袁臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣ꦁ銂껥ꦸ臣ꎧ蟥鞁臣芀꣦隺鯦骷苣鞾苣龁苣ꮁ뷤ꢔ臣讂꣦隺觧銂胣馨뫦늛럧꺁꣦蒚뿦ꚺ㈨〵胣㖁〰胣ㆁ〰膀〲〰胣㒁〰膀臣袂臣㢳〰渰⽧䱭ꮁ룥袇臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†뿦ꚺ臣㊌洵⽧䱭臣芁苣馨뫦떂菣鞃菣⢫呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉觧ꪳ뿤颭觧ꪁ臣⦩臣貸蟩꺁臣膂臣膀믤许臣貸蟩銂ꇨ蚁臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣芁苣蚁볯㲚牢ਾ⹩†††††††㈠츰䲼苣㦒〸볎⁌䉈銈偅臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀⼱〵㔨〰볎⽧䱭ꮁ룥袇臣讂胣㲂牢ਾ楩‮†††††††〳볎꺁〵츰枼洯銂〹츸䲼䠠卂裢䖒ꮁ諥袁苣鎁臣ꮁ苣誂胣ㆁ츶枼洯ꮁ룥袇臣讂胣㲂牢ਾ楩⹩†††††††⼱떮髩⢎〵츰䲼臣趉룥袇觧讼〵츰䲼䠠卂裢䖒⥐臣ꎀ뛧貸蟩鞁臣膀㔲渰⽧䱭臣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ㈠臣꺁该超胥貁뻥覂苣讂臣芁苣蚁뫤趇돦ꖅ臣膀郥馨뫦銂裥邞臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†鏥ꪳ껧蚐苣뎃菣ꮃ†呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉臣膓돨ꆮ郧⢆䍑떂菣鞃菣銂胣㎁臣꺁꣦蒚뿦ꚺ菣馃菣㞫〵胣㊁〵膀臣袂臣㖳〰渰⽧䱭臣䢧卂裢䖒ꦷꇨ늶룤ꮁꫨ붣臣膀洷鞃菣릂菣莃苣邃苣ꊂ菣궸臣㊫〰볎覭蟩骁臣銈〸蓢ꞁ蟥邵臣讂胣冂떂菣鞃菣궸臣䎮䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒莿뫥꾁胣鎁臣릖돦銂铧蒁臣㎦臣꺁诧讫臣龁뿦ꚺ裥邞껥鎨臣誁臣ꚁ룦骮臣讂胣���껥鎨臣誁臣ꚁ胣ꢅ臣꺁䍑苣뎃菣ꮃ돦ꖅ臣膀꣨릮臣趁苣膀郥꺛뿦ꚺ臣슮㊱薼臣鲤蟥ꞁ臣辁臣꾁臣覂臣蒁胣ꦁꃦꢁ臣貂臣趇뗧冐떂菣鞃菣꾁胣뾪ꏨ貾떃鳦ꞁ鳦邙臣螈苣讂胣龮꣩ꖗ臣膀ꒁ臣冮떂菣鞃菣꺁臣ꆁ郥薀ꒁ臣邃苣ꊂ菣銂껥ꦸ臣ꎧ蟥馁苣芀䍑苣뎃菣ꮃ苣릖돦꺁鏦鲽苣ꒂ菣ꮁ꣨覼臣袂臣ꮁ苣뎃菣ꮃ菣莃苣趽뷧ꮁ藥貂胣蒐䍑苣覸蟩ꢳ藥ꞁ裥邞臣讂胣芁苣蒁臣膀䍑苣蚈黦ꖗ臣낖껩ꮁꫨ붣臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉ꧨ鎨苣뎃菣ꮃ†呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉苣뎃菣ꮃ苣ꊂ菣뮂苣꺁꿧늛蛥꺁뿦ꚺ㜨〵胣㖜〰渰⽧䱭ꮁ룥袇臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀韦ꖟ臣誁苣鶁臣䎮䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒莿뫥銂鳦馁苣떂菣鞃菣銂꣦蒚뿦ꚺ〲〰杮洯ꮁ룥袇臣릁臣ꞁ臣讂胣떂菣鞃菣銂껥ꦸ臣ꎧ蟥貾胣鶁苣覂苣馨髧莿뫥㊦〰渰⽧䱭臣䢫卂裢䖒ꦷꇨ늶苣ꢔ臣ꚁ룥袇臣讂胣떂菣鞃菣貸蟩ꦉ苣蚈黦꺁臣膂臣䊫䅉潣敲ꫨ骮菣ꪃ菣궃菣것菣ꚩ꣩ꆮ臣龁臣㦯뒩菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃룤ꮁꫨ붣臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ꖻ룤ꮁꓧ馁苣꺁臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉ꧨ鎨苣뎃菣ꮃ臣貸蟩꺁臣膂臣设臣芁苣骼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 떂菣鞃菣銂껥ꦸ臣ꎧ蟥貾胣䎁䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒떂菣鞃菣銂苣莃苣ꒂ臣蒯鯥薆臣莿뫥⢦뻤袁臣膀㔷鲀〵〰杮洯⥌臣貸蟩鞁臣芀韦ꖟ臣誁苣鶁臣䎮䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒莿뫥銂鳦馁苣떂菣鞃菣銂胣䢁卂裢䖒ꦷꇨ늶苣ꢔ臣ꚁ䥂捁牯趪껥鶃菣鞃菣钃菣뎃ꧨ鎨껧뺁臣꾁㘹ꧧ麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣궸臣馨髧莿뫥㊦〰渰⽧䱭臣貸蟩馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤ꮁꓧ馁苣꺁臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉苣뎃菣ꮃ莿뫥鶼㔲〮杭洯⥌臣貸蟩꺁뻤ꞁ臣讂볯㲚牢ਾ⹩†††††††㈠츰䲼苣㦒〸볎⁌䉈銈偅臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀⼱〵㔨〰볎⽧䱭ꮁ룥袇戼㹲椊⹩†††††††㌠츰䲼臣㖮〰볎⽧䱭苣㞒〲볎⁌䉈銈偅臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀⼱㔲㈨츰枼洯⥌臣貸蟩㲈牢ਾ楩⹩†††††††〱츰䲼臣㊮츰枼洯銂〹츰䲼䠠卂裢䖒ꮁ諥袁苣鎁臣ꮁ苣誂胣ㆁㄯ⠰츲枼洯⥌臣貸蟩ઈ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†郥貸蟩ꦉ苣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁꧧ蒂臣ꪁ胩ꚺ臣㊧胣㒜꟧鎖臣醁苣芀苣뎃菣ꮃ苣覸蟩⢍뿤颭苣뎃菣ꮃ뫦늶臣覂뻥龁ꒁ臣겋ꯧ鞁臣貸蟩ꦉꮁꫨ붣臣膀郥貸蟩ꦉ苣㆒돦ꖅ臣蚈黦���馁苣芀苣뎃菣ꮃ苣覸蟩⢍뿤颭苣뎃菣ꮃ뫦늶臣覂뻥龁ꒁ臣겋ꯧ鞁臣貸蟩ꦉꮁꫨ붣臣膀郥貸蟩ꦉ苣㆒돦ꖅ臣蚈黦鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 䈠䅉潣敲䌠苣閃菣Ꚃ苣ꊂ苣ꢔ臣龁裥邞臣讖꟥骼䥂捁牯⁥뚈뻥붂菣袃苣Ꞃ苣銂雩趁胣䚁汩銆牐橯捥銆畐汢獩敨銆ㄸ㐶裢㊒蛢䎒湯散瑮慲楴湯䄠慮祬楳⁳楗慺摲苣뢁諦鞁胣貀敎瑸胣銂苣ꪃ菣꾂臣ꚁ胣財臣릁臣蚈黦ꮁ臩鎽臣겅雩蚃菣鞃菣벃菣膀뻤袁臣膀胣䎌䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒⁧慓灭敬䌠湯散瑮慲楴湯䄠慮祬楳⹳戠睬胣銂臩麊臣讂胣袨铧鞁臣蚈黦꺁臣膂臣떂菣鞃菣꺁鳦Ꞥ闦銂藥鮊臣讂胣鎁臣떂菣鞃菣낕臣꾁胣螤ꏨꦉ臣ꮐ臣貂苣꺁臣膀뻤袁臣膀떂菣鞃菣銂룤趇臣蚈黦馁苣龁苣ꮁ臣膀㐲臣蒁臣낕苣ꖅ諥馁臣趁臣芁苣芀㝂ㄮ杉菣겂菣覃臣몛껥隌臣貂臣蒁苣閃菣벃苣ꮃㄨ裢㒒銂臩麊臣讂胣貀敎瑸胣銂苣ꪃ菣꾂臣ꚁ胣떂菣鞃菣䦫膀룥袇뿤낕胣誁苣뎁ꓨ붣臣낕苣ꖅ諥馁苣芀胣二硥趀苣꾂菣莃苣鞁臣膀菣ꒂ苣ꮃ臣趽뷧銂菣Ꞃ菣꾂臣讂胣鎁臣芙苧ꞁ胣邃苣ꊂ菣꺁뷤꺽苣肉鳦꺁藩꺽臣開臣馁臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣貀敎瑸胣銂苣ꪃ菣꾂臣ꚁ胣貀牐灥牡瑡潩⁮潦⁲湁污獹獩胣릂苣ꪃ菣뎃룤꺁苣莃苣ꒂ臣龁苣꺁꣨骮臣袂臣뢁諦銂ꋧ趪臣讂胣貀敎瑸胣銂苣ꪃ菣꾂臣ꚁ胣许雦뢁苣꾂菣벃菣馁苣芀꣦隺胣冁膀蛥龔뫦늶胣誁苣뎁ꧨ鎨苣뎃菣ꮃ苣ꦁ뷥ꪁ뷤꺽臣꺽臣芀胣厌慴瑲胣銂苣ꪃ菣꾂臣ꚁ胣蚈黦銂雩讧臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†菣벃苣閩뻤芀䥂捁牯⁥붂菣袃苣Ꞃ苣銂雩讧臣膀뻥覂苣龁䥂捁牯⁥楦敬⨪⸪汢銂雩辁胣ꆬ臣ꞁ胣貀楗慺摲删獥汵獴胣銂胣嚌敩趀菣讃菣벃臣覂臩麊臣ꚁ胣螃菣뾂苣閩뻤馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 䈠⸷䤱ꢡ鷩ꮁ臣蒁臣꺁뻤몤髧ꒀ戼㹲 뮴胦隌菣궃菣뮂菣誸臣몛껥隌臣貂臣䊟⸷䤱꺁돨辇苣膀啒놅돩颍뷤⦍臣鞁臣ꢡ臣龁胣ꢡ鷩ꪳ蟩꾁胣肜臩ꪁ苣莃苣ꒂ臣Ꞁ菨꺁臣膂臣㎫〰鲀〹〰啒臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣ꢡ鷩ꪳ蟩貁臣꺁뻤몤髧ꒀ臣袐苣ꪁ臣ꪁ苣膀듦Ꞁ賥芙雩⢓䑅⽃䡎ꢳ藥⦥臣龁臣䊯⸷䤱莿뫥꺁ꫨ뒕苣財臣膀믤꺁菣궃菣뮂菣銂鯥骮賥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 馃菣릂菣ꒂ菣覤该ꮁ臣蒁臣꺁뻤몤髧ꒀ戼㹲 蒐껥붖臣馃菣릂菣ꒂ菣覤该銂胣ꪃ苣뎃菣꺁鯥骮賥ꢡ鷩ꪳ蟩ꮁ꿦莼臣龁郥떂苣꾂菣鎖臣馃菣릂菣ꒂ菣꺁ꓥ隌菣벃苣뎃菣⢈胣뚵꿥趏뿥ꒀ胣⦍臣鞁臣袨껧鞁臣芀껥財臣芁苣蚂苣㊋苣ꒂ苣ꮃ雩꺁鳦节ꓥ趁臣醃菣뮂菣袃ꓥ隌臣ꚉ⸵薼臣ꪁ臣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣���뻤袁臣骼苣ꒂ苣ꮃ〲臣馃菣릂菣ꒂ菣鶼㌱〵到膀苣ꒂ苣ꮃ㌲臣馃菣릂菣ꒂ菣鶼㌱㔶到膀臣袂臣䊳⸷䤱ꢡ鷩蚯뫥鶼〶〰啒臣芁苣ꪁ苣膀菣벃苣ꦃ苣뎃ꓥ開볯⢝㌱㔶銈㌱〵⤰㘯〰쌰㆗〰볯㊝㔮볯ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†꣦隺觧ꮁ臣蒁臣꺁뻤몤髧ꒀ戼㹲 设ꓧ蒚胥銂胣㖁〰杮洯ꖻ룤꺁꣦隺鯦骷뿦ꚺ臣ꦁ铧馁苣芀꣦隺鯦骷苣몱껥馁苣龁苣ꮁ铧蒁苣蒐꣦隺觧莿뫥ꞁ臣蒐该超胥ꞁ臣ꒀ臣覤该芿闦⢰볯䎅⥖臣膀뇂〱볯ꖻ蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣蒐꣦隺觧莿뫥ꞁ臣뎹鷥鞮蟥莿뫥ꒀ渨⽧䱭꾁꣦蒚趐鯧⦮胥꺁㔱볯ꖻ蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣鞮蟥莿뫥ꢁ꣦蒚趐鯧莿뫥⦦臣鎖臣꺷苣膀꣦蒚趐鯧⦮뿦ꚺ臣늉臣ꚁ胣ㆁ〰苣鮎臣讂胣设臣낁胣馨뫦ꦉ〵渰⽧䱭臣膀䥂捁牯⁥鞮蟥莿뫥꾁ㄵ渰⽧䱭臣芁苣芀臥꺷胥薼臣膀곦꺁苣蚁臣袨껧閁苣讂臣芁苣蚁볯⢚ㄵ渰⽧䱭裢㖒〰杮洯⥌㔯〰杮洯썌㆗〰볯鶼⸲薼胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†䍑苣뎃菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ臣设ꓧ蒚胥骼郥冄떂菣鞃菣馨髧莿뫥ꮁ臣蒁臣㎦蟩ꮁ꣨鞮臣貂臣莿뫥ꒀ臣薼噃臣슯ㆱ薼믤薆臣ꪁ臣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣芀䍑苣뎃菣ꮃ臣邵黦꾁胣㦁臣꺁䍑룦骮臣蚁臣醰臣辁臣节ꒁ臣ꒁ臣ꚁ臣蒐胣꺁꣦蒚胥꺁뇂㔱볯ꖻ蛥ꞁ臣辁臣꾁臣覂臣蒁胣㊂〵渰⽧䱭菣馃菣ꞁ臣肜裥誁苣뎁鳦貾臣冮ꢳ藥꺁雩꺁该超胥꺁럥꾁胣슁㖱〮볯ꖻ蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣设臣낁胣肜裥꺁该超胥貁〱㌮㘶啒猯臣芁臣ꚁ胣肜뻥꺁该超胥貁〱㈮〳啒猯臣芁苣ꪁ苣膀臣꺁럥꺁菣벃苣뎃菣꾁곦꺁胩誂臣ꪁ苣蚁볯㲚牢ਾㄨ⸰㘳銈〱㈮〳⼩〱㌮㘶韃〱薼볯㆝㌮볯અ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨苣뎃菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ臣设ꓧ蒚胥㲤牢ਾ†郥蚃苣袃苣뎃菣ꮃ꣦蒚뿦ꚺ臣ꒁ臣ꚁ뻥龁趇臣龮룦ꒀ臣薼噃臣膀〲볯ꖻ蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣떂菣鞃菣ꮁ臣蒁臣꺁该超胥꾁胣鎁臣릖돦꺁꿧늛蛥ꮁ臣醁苣낁臣覂臣蒁볯膓돨ꆮ郧떂菣鞃菣ㆫ臣꺁맥螝该超觢떂菣鞃菣꺁맥螝该超觢膓돨ꆮ郧떂菣鞃菣㎫臣뎹鷥뺋藩芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 떂菣鞃菣邵黦꺁꣨鞮戼㹲 䌠䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒ꦉ돨ꮁ꿦莼臣龁ꧨ鎨苣뎃菣ꮃ臣邵郥醃菣뮂菣袃苣겸껥馁苣龁苣ꮁ胣蒐ꧨ鎨苣뎃菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ臣莿뫥ꒀ苣馨뫦늛럧讁苣溉⽧䱭臣袨껧馁苣芀䥂捁牯薣뷧꺁敒畳瑬⁳楗慺摲臣袂苣膀郥떂菣鞃菣ꮁ臣蒁臣ꖅ諥鞁臣貸蟩ꂛ귥ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ鷩貸蟩떂菣鞃菣궸臣䎮䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒莿뫥貁杭洯ꞁ꣨鞮臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 邵郥醃菣뮂菣���臣겸껥骼ꧨ鎨臣貂臣蒐苣뎃菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ꣨鞮臣貂臣뎹鷥莿뫥ꒀ臣ㆫ〰苣讁臣ꚁ胣㊁〸浮䄨猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾〸⼼畳㹢ꞁ룦骮臣龁郥覅뫥ꮁ苣誂뇦骮臣龁苣뎃菣ꮃ臣놠釥閁苣龁苣뎃菣꾂돨莿뫥ꞁ觥讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ꆬ臣ꞁ胣鶁臣ꒀ苣膀꣦隺苣뎃菣ꮃ臣钯볨鞁臣邵郥醃菣뮂菣袃臣鞁臣鮛跦钺藥鞁臣뒕闦ꮁꃥ誑臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣设臣낁胣떂菣鞃菣銂룥袇鯥邭㈱㔬〰떂菣鞃菣뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ듧㊄洵⽧䱭ꮁ苣誂룥袇臣龁胣떂菣鞃菣꺁趇돦ꖅ臣覂뻥龁껧몇맥螝呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈杉뿦ꚺ臣㊯⸵洳⽧䱭臣芁苣芀苣뎃菣ꮃ臣䆮猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾〸⼼畳㹢臣膀㐲㈮杭洯ꞁ臣讂胣馨뫦떂菣鞃菣ꢁ꿦莼臣龁껧몇뗧袐菣벃苣뎃菣꾁胣ꆬ臣骀苣ꞁ臣誂뻥讂볯㊚⸵洳⽧䱭볯㊏⸴洲⽧䱭韃〱薼볯㆝㐰㔮㔴볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 䌠䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢䦒몛껥隌苣ꎂ苣벃菣蚃菣鞃菣벃菣㲈牢ਾ†鯥骮賥ꢳ藥醃菣ꆃ菣뾂菣㲼牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㘶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖몛껥隌ꃥ誑臣膦苧㲹牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㜶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㈴볯䎚䱔㑁䤭꺁苧뒰賥ꦉ裥邞菣벃苣ꢁ雨ꦉ该讅菣벃苣ꢁ臣鎖臣뢛雩㲢牢ਾ†呃䅌ⴴ杉룤꺁苧뒰賥ꦉ꟦ꂀ臣䎯䱔㑁䤭뮲駧蒵裦ꦉ臣겖觧開藦袼䭐볯ꮁ臣蒁臣趇ꛨꪁ뷥늉苣鲞臣馁胣鎁苣覂臣궂냦隌觧讧胩銂觧뒾臣醁苣龁苣ꮁ臣辁臣讁臣릖돦貁雩몙臣貂臣蒁苣芀곦꺁뫤ꒁ臣蚈黦醃菣ꆃ菣뾂菣貁苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ臣袂臣뢛雩鞁臣蒁苣骼苣ꊂ菣뢅볯予乁覼꿥䎾䱔㑁䤭뾂菣醃苣ꪳ臣钯臣覂臣ꮁ苧뒰賥ꦉ菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣覂臣覃菣ꒂ菣䦳䥉臣袂臣䦳꺁菣벃苣뎃菣벃苣芀곧覸臣醃菣ꆃ菣뾂菣袼跥隳裥邞臣覂臣겂菣꾂菣벃苣뺯菣뎃菣벃苣꺁꿦覼苣袂臣뢛雩馁苣ꢁ胦辂苣讂胣设臣낁胣鎁苣覂臣醃菣ꆃ菣뾂菣꺁飦내臣许꣨ꞁ臣誂臣讂볯㲚牢ਾ䅎䅎볯䎚䱔㑁䤭뾂菣醃苣ꪳ꿦ₔ꞉⸸㰰牢ਾ苧뒰賥ꦉ菣궃菣ꆂ苣ꮃ†菣ꆃ苣뎃䥉誁苣뎁噉†觢㊧┵볯릖돦䦕볯㲉牢ਾ苣ꦃ苣袃菣릂볯麃菣躃菣릂꿦ₔ꞉⸰㔶㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 䌠䱔㑁䤭몙藩鞃菣뮂苣ꮁ臣醁苣趇ꛨꪁ껦躚臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ飦風臣貂苣릉뻥銂郥肂鳦芵铧邈觧꺁迥辇볯鮊뻤覼苣肜ꓥꮁ臣讂鯥躏菣ꦃ菣벃苣벃臣뢁諦ꞁ臣誂臣讂볯ꢡ芏藧覼胣醃菣ꆃ菣뾂菣꺁룤ꒁ볯予乁骼苣뎃菣꾂돨钯볯꾁鯥躏菣ꦃ菣벃苣벃臣肸臣ꢁ臣ꚁ铧蒁苣꺁臣���膍裥龀苣讁臣ꎭꋧꞁ臣讂胣亂乁뺯呃䅌ⴴ杉苣뎃菣꾂돨꺁듧㢄〮臣蒁臣馨髧ꊃ菣钯臣袂臣ꚁ胣몢껥ꮁ臣ꢁ苣ꦁ臣麛迥ꦉ臣麼⸷꺁䅎䅎꿦銂鳦馁苣鎁臣ꮁ臣讂胣骶臣ꚁ胣뺲ꏨ궸臣랼賥ꮁ苣誂䅎䅎꿦麼⸹꺁呃䅌ⴴ杉裥邭苣龔裦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 䌠䱔㑁䤭꾁臣辁臣讁臣亮ꎀ뗧誁苣뎁ⵏ胩邵苣ꪃ苣랂菣隌菩趽苣覜臣讂돧뾂菣醃苣ꪳ臣芁苣芀ⵎ胩邵苧뒰賥ꦉ꟦ꂀ臣뢅黥蒚臣꾁ⴲ臣龁臣㎯ꚧ꟨ꞁ胣貮藥ꮁ苣ꊂ菣ꮃ賥閁苣ꚁ臣讂ꃥ袐胣ꮜꯧ꾁苧뒰賥ꦉ䅎䅎䜭污䜭捬䅎ꞁ臣讂胣뮁臣鎂臣꺁裥邭臣ꢃ裥蒚臣랂苣ꪃ菣隌臣貂臣蒁苣ꮁ臣躁臣膀鳦꾫臣䞌污臣龁臣䞯捬䅎꺁臣辁臣讁臣궂냦隌觧階苣ꮐ苣芀鳦꾫苣ꊂ菣뢅볯予乁覼껦몟臣ꪁ臣ꢁ胣股뗦讁苣꺁鯦늜胩ꚺꋥꞤ臣ꒁ臣貁苣鎁臣ꮁ臣讂胣겜껥붖뻤ꮁ臣蒁臣膀鳦꾫苣ꦃ苣袃菣릂臣ꖀ胩ꪁ苣ꪃ苣ꦃ菣릂臣覂臣蒁臣覂臣꺁뿤랭苣邏뻤馁苣鎁臣銂飦覂臣ꮁ臣讂菣벃苣銂ꓧ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꪃ苣랂菣隌苣閩뻤馁苣龁苣ꮁ铧蒁苣견룤꺁菣ꦃ菣벃苣벃臣亯乁骼呃䅌ⴴ杉苣뎃菣꾂돨ꊃ菣钯臣芁苣芀苣ꮃ䭐ꧨ鎨臣膀䅎䅎꿦貁⸶꺁呃䅌ⴴ杉裥邭苣ꢔ臣ꚁ꣨릮臣貂苣꾂菣ꊂ菣뎃苣貁뻥覂苣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣떂菣ꞁꧨ鎨臣龁菣궃苣릂⁙呃䅌ⴴ杉鷦首臣견룤궃菣袃볯妈菣궃苣릂臣覂뻥龁呃䅌ⴴ杉뗧邈觧覼臣亯乁钯⸷銂鳦鞁臣蒁臣芀ꧩ辁臣趁臣ꢁ臣膀臣貂臣亯乁钯⸶꺁呃䅌ⴴ杉鷦首臣貺胥龀臣銎蟥馁苣鎁臣貁裥躘臣龁胣貺臣꺁ꧨ首臣颍돧蚈黦銂ꓦ躨臣ꚁ胣墁菣궃苣릂鷦首臣䎯ⵄ䡃鞃菣뮂苣邝雦袂苣节鳦辄臣骤臣꺁苣ꦃ苣袃菣릂苣覜臣讂臣ꢁ臣躘苣讁臣ꪁ臣龁胣벣雦궸臣겂菣꾂菣벃苣銂郥肂菣궃苣릂臣讖駧閁苣龁볯䎈ⵄ䡃ㅏ볯芀臣꺁菣궃苣릂臣袂苣龔裦鞁臣䎟䱔㑁䤭꾁鞃菣뮂苣邝雦袂苣节ꯩ蒁菣馃菣꺁苣ꦃ苣袃菣릂臣袂臣랂苣ꮃ藩꺁룤릖苣覜臣ꚁ臣龁胣䎂ⵄ䡃ㅏ菣궃苣릂臣覂臣邝雦꺁裥邞臣袂臣傳螃菣뾂臣ꒁ臣ꚁ믤许臣風볨鞁胣鞃菣뮂苣妹臣袂臣鞃菣뮂苣墹鷦首臣钯볨馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖蚈黦閳㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 궂냦隌觧鞃菣閃苣ꒂ菣ꊂ菣뮂苣꾁藥궂냦隌觧讧胩꺁藩ꂴ髧꒙軥誁苣뎁苣讃苣뎃뫤鮏苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ臣袂苣鶁苣覂臣蚈鯩讁苣ꪁ苣芀苧뒰賥ꦉ菣벃苣꾁룤ꮁ郥讧胩ꮁ臣醁苣랂苣ꮃ藩议鿥꺁闦ꮁ鿥ꖁ臣㒍臣龁臣㖯臣꺁鯩ꎛ볯貀菣ꆃ苣뎃胣覼臣蚈臣貂苣芀菣ꆃ苣뎃꾁臣ꢁ苣ꦁ苣ꊂ菣ꮃ賥閁苣ꚁ臣覂臣膀菣ꆃ���뎃䥉臣ꊃ菣랂苣ꪃ菣隌臣貂臣誁苣膀菣ꆃ苣뎃䥉꾁苣랂苣ꪃ菣隌臣貂臣誁苣膀菣ꆃ苣뎃噉臣袃菣랂苣ꪃ菣隌臣貂臣誁苣膀臣ꒁ菣ꆃ苣뎃꾁菣袃菣랂苣ꪃ菣隌臣貂臣蒁苣芀郥钃菣꾂臣龁臣覃菣ꒂ菣许臣ꊝꧧ銂苣ꢁ苣膀臣릁臣꺁菣벃苣许臣袐꣨ꊝꧧ꺁菣벃苣뎃菣벃苣ꢁ臣ꚁꃥ誑臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ苣膀苣ꮃ臣ㆫ洰⽧杫臣䎮䱔㑁䤭銂룤趇ꓨꞁ돦蒰臣膀곦蒁臣㊧ꖗ雩꺁ꇨ薸뿦ꚺ臣躽룤銂뿨ꆷ臣讂臣ꢁ臣袂苣节臣膂臣芀苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ臣貀鯦骷룤ꊝꧧ趀臣ꪁ苣ꆁ啁꺁룦骮胥ꮁ雩ꎀ臣ꚁ臣讂胣䆂䍕臣꾂菣ꊂ菣뎃苣ꮁ雩ꎀ臣膀苣誂ꯩ蒁苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ臣颫臣뮁臣䆩䍕臣辰臣辁胣꾂菣ꊂ菣뎃苣龀뫥貁뷤蒁臣ꦁ啁ꒀ臣Ꞥ臣辁臣讂胣ꒀ臣颫臣뮁臣䎩䱔㑁䤭꺁苣ꪃ苣ꦃ菣릂臣薁臣鎁臣ꮁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†鯥㖳꾁胣몓매開觧뾂菣醃苣ꪳ臣讦苣貂苣骤臣꺁ⵎ胩邵苧뒰賥ꦉ꟦ꂀ臣蒁臣ꒁ臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀臣릁臣꺁軩꾁ꒁ臣䞮捬䅎誁苣뎁ꒁ臣麃菣躃菣릂껦몟苣ꮐ苣놅胩꺁룤뢠꟦ꂀ苣覜臣ꚁ臣讂胣鎁臣궸ꃦ讁苣膀裢䞒捬䅎銈慇銈䅎䅎胣銈汇乣捁裢䞒污胣뺁臣꾁裢䞒捬䅎꺁ꒁ臣讧胩꺁ꒁ臣覂臣讂讁苣㒉臣꺁軩貁볤뎁臣蒁苣袼鯥㖳膀꟦ꂀ볯ㆈ볯膀볯㊈볯膀臣袂臣袼覼볯芀鳦꾫苣ꊂ菣뢅볯予乁覼臣뾂菣醃苣ꪳ臣股뗦讁苣꺁苣ꪃ苣ꦃ菣릂苣躽룤閁臣讂軥ꂛ臣꺻껥馁苣ꢁ胣亂乁钯臣貐臣뺁臣ꞁ臣讂臣节臣讁苣覂臣袼ꇨ㖨銈鯥㖳鲀㈵臣鶁苣麁苣ꚩ雦䎙䱔㑁䤭⁧ㅓ臣袂臣䎳䱔㑁䤭⁧⴨ 慇覼胣떂菣傫ꚩ꣩ꞁ呃䅌ⴴ杉臣꾂菣ꊂ菣뎃苣龀뫥貁胥鞢臣龁볯ꢡ㘵볯鎁臣꾁ꧩ趁臣芁臣龁胣낕臣讂鿥난룤ꞁꫨ붣臣龁ꧨ首雩ꞁꛨ龯臣貂臣肸臣꺁럥꾁苣ꦃ苣袃菣릂꿥뾂菣醃苣ꪳ臣ꊃ菣钯臣膀臣貂臣鞃菣뮂苣妹苣誂苣鞃菣뮂苣墹臣뾪ꏨ鞁臣ꚩ雦꺁雦貁鳦辄臣颫臣ꎁ臣袼呃䅌ⴴ杉볯芀臣貂臣꾂菣ꊂ菣뎃苣龀뫥貁룤ꮁ鳦꾫汇乣捁껦몟臣袂臣ꚁ뇦骮臣貂胣ꮜꯧ겂菣꾂菣벃苣꾁臣辁苣讁臣鶿귨銂迦鮾臣讂臣ꢁ苣몤铥馁苣节臣ꞁ臣ꎁ臣芀呃䅌ⴴ杉臣겂菣꾂菣랂菣隌苣颫苣讂臣膂臣膀鞃菣뮂苣꺁ꧨ首臣겂菣꾂菣벃苣銂諥袁臣芀雦鞁臣鞃菣뮂苣袼䑃䌭佈鮼鯥㖳鲀㈵臣䎮䱔㑁䤭⁧㉓볯꾁菣ꒂ苣ꪃ苣꾂苣벃룤꺁呃䅌ⴴ杉臣겂菣꾂菣벃苣誁苣뎁䅎䅎룤릖臣ꊃ菣钯苣覜蓦ꮁꋥꞤ臣鮁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 閁苣ꪁ苣떂菣傫ꚩ꣩銂껥붖臣龁胣鎁苣覂臣㎯臣꺁闧ꪁ苣鞃菣뮂苣袼菣궃苣릂膀菣궃苣릂膀臣袂臣䎳ⵄ䡃���菣궃苣릂볯뎛ㄵ胣㖜꺁臣貂臣貂呃䅌ⴴ杉匠膀呃䅌ⴴ杉⠠⤭䜠污胣誁苣뎁呃䅌ⴴ杉匠覼臣袂臣ꚁ铧邈臣龁呃䅌ⴴ杉铧邈觧銂郥鎂臣蒁臣芀諥袁臣膀䅎䅎꿦貁鷩뢸臣躽臣䎄䱔㑁䤭袼닧붣触蚠臣誁臣讂듦蒵껦躚臣覂鯥躏볯뎛㈶迥ꞅ볯銂ꧨ鎨臣龁胣鎁苣뺁臣ꮁꧨ鎨臣龁ꧨ首臣릁臣꺁裥邞臣袂臣傳螃菣뾂苣ꢡ㘵臣몤臣ꚁ臣讂胣肜苣肜뿨꺁䭐ꧨ鎨볯ꢡ㘵볯ꮁ臣蒁臣膀믥랕臣龁菣궃苣릂몙藩讁믨讁苣龔裦鞁臣䎟䱔㑁䤭袼呃䅌ⴴ杉匠覼苣閩뻤鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 뎛ㄵ臣膀ꒁ臣ꚩ꣩ꮁ臣醁苣ꚩ雦馁臣ꚁ臣亮乁钯臣떂菣傫⁋啁ꒀ臣꺁雩꺁鯧ꊖ苣몤臣ꚁ臣讂胣如菣궃苣릂볯뎛ㄵ臣䎮䱔㑁䤭⁧⴨ 慇芏藧覼臣袂臣䎳ⵄ䡃ㅏ菣궃苣릂볯뎛ㄵ臣䎮䱔㑁䤭⁧㉓볯ꮁ苣ꎁ臣뾪ꏨ鞁臣ꚩ雦꾁臣貂苣꺁菣ꦃ菣벃苣벃雩ꞁ볥蒁鯧ꊖ苣몤臣膀䅎䅎꿦꾁呃䅌䤴꺁苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ臣鞑臣蒁뷥뾟苣覜臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣鎁苣覂臣릂臣ꒁ臣ꚁ臣뺂郥骷臣蚈黦꾁胣亁乁鶼ꞁ胣妁볯䎈䱔㑁䤭⁧⴨ 慇覼臣龁臣䎯ⵄ䡃ㅏ볯䎈䱔㑁䤭⁧㉓볯鞃菣뮂苣ꮁ苣ꎁ臣뾪ꏨ鞁臣䎟䱔㑁䤭꾁菣궃苣릂邝雦䎙䱔㑁䤭⁧ㅓ볯ꢁ臣벁郥颁胩ꚺ臣銎蟥閁苣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣亂乁钯苣㢒臣许臣讂臣膀苣ꮃ䭐ꧨ鎨臣䆮䍕臣蒴㔲躽룤馁苣貁胣钯苣㆒ꮁ룤銁苣ꢁ啁꾁듧㊄┵ꋥꞤ臣讂胣如볯䎈䱔㑁䤭⁧⴨ 慇覼臣袂臣䎳ⵄ䡃ㅏ볯䎈䱔㑁䤭⁧㉓볯鞃菣뮂苣ꮁ雩鞁臣亦乁ꢁ啁ꢁ臣鎖臣꾁볥蒁鯧ꊖ臣芁苣貁胣亁乁钯臣㦌臣䎮ⵄ䡃ㅏ鷦首볯䎈䱔㑁䤭⁧㉓볯ꢁ郥颁苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ苣몤臣墙鷦首볯䎈䱔㑁䤭⁧ㅓ볯꺁䅎䅎볯㞝臣芁苣鎁臣ꮁ闧辄臣讂臣ꢁ臣趇ꛨꞁ臣讂胣鞁臣貁臣ꚁ胣亁乁钯臣䎯䱔㑁䤭꺁苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ苣몱껥馁苣꾔룤꺁軥ꂛ臣꾁臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾꇨ㖨⸶†呃䅌ⴴ杉臣궂냦隌觧閩뻤芀ⵍ꾁呃䅌ⴴ杉鷦首苣릖돦㆕苣ꢔ臣ꚁ裥邞臣龁臣ꢁ苣몤臣膀ⵍ꾁呃䅌ⴴ杉鷦首苣辂臣讁臣낕臣讂雦閳銂铧蒁臣蚈黦鞁臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀胣傌趀臣몙藩隃菣릂臣覂臣뾂菣醃苣ꪳ뺲ꏨꚩ雦ꞁ臣讂鷦首苣몤臣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㠶⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㤶⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰〷⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 节臣肸臣꺁苣ꮃ䭐ꧨ鎨볯ꢡ㘵볯銂껥붖臣ꚁ胣㎁臣꺁闧ꪁ苣鞃菣뮂苣袼菣궃苣릂膀菣궃苣릂膀臣袂臣䎳ⵄ䡃ㅏ菣궃苣릂볯ꮁ苣ꎁ臣龔裦鞁臣䎟䱔㑁杉臣꾂菣ꊂ菣뎃苣龀뫥���銂꿦莼臣龁胣ꂊ臣ꚁ胣亁乁钯臣麝룥ꮁ뷤蒁呃䅌䤴袼닧붣触蚠臣誁臣讂듦蒵껦躚臣覂鯥躏볯傈覼볯銂ꧨ鎨臣ꮐ苣龁胣㖂䰰臣龁臣㖯〰䰰臣骁苣讁臣邃苣ꪂ菣ꊂ苣뾂菣궸臣䎧ⵄ䡃鞃菣뮂苣ꮁ苣ꎁ臣뾪ꏨ鞁臣䎟䱔㑁杉臣墯菣궃苣릂鷦首臣醿臣亄乁ꊃ菣钯苣覜臣膀䭐ꧨ鎨臣誁臣ꚁ胣蒁臣貂苣鞃菣뮂苣墹胥꺁듧認裥꺁啁ꒀ苣覜臣ꚁ臣龁胣䎂ⵄ䡃ㅏ菣궃苣릂臣袂臣ꚁ铧邈臣龁呃䅌䤴꾁菣궃苣릂邝雦袂苣节ꯩ蒁䅎䅎꿦袼⸹뺯⸶覼臣袂臣蒴〳颫臣䆄䍕胥銂鳦鞁胣꾂菣ꊂ菣뎃苣龀뫥貁臩蒁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣랂苣ꪃ菣隌臣袂臣겂菣꾂菣랂菣隌臣讨뫥貁뷤蒁듦蒵鷦首볯予乁鶼⸲覼臣麝룥ꮁ胩蒂臣ꮁ軦몇臣貂臣袼菣궃苣릂邝雦ꮁ臣蒁臣䆦䍕볯㊝㌳‷牨츭枼洯뺯㔱㔷覼胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†苣蚁룤ꒁ臣떂菣傫ꚩ꣩袼ꇨ㖨覼臣膀〵〰꺁菣ꒂ苣ꪃ苣꾂苣벃룤䎭ⵄ䡃ㅏ菣궃苣릂臣袂苣뾪ꏨ鞁胣낕臣讂韦ꮁ鯥躏臣龁呃䅌䤴銂꿦莼臣龁胣몙藩讁믨궸胣亁乁钯臣뢅黥蒚臣꾁臣벁곧㢬韦ꮁ鳦Ꞥ臣ꪁ苣膀臣꺁뻥邾胣ꮁ뷤许臣讂胣貺臣꺁臩ꊻ臣覂胣肸껥辇苣견㈱胣ㆁ膀臣袂臣ㆳꖗ臣随苣몇臣膀닧붣臣龁胣뺲ꏨ貾胣亁乁钯臣㢯㠮臣覂〱〮臣蒯鯥ꞁ臣ꎁ臣芀곧ㆬ誁苣뎁㐱韦꺁ꧨ首볯予乁鶼臣貂臣貂⸹誁苣뎁〱〮볯꾁菣궃苣릂邝雦袂苣节〲胣㎜┰ꯩ蒁啁ꒀ苣覜臣ꚁ臣龁胣견㘱韦꺁ꧨ首볯予乁鶼⸸覼臣鞃菣뮂苣墹鷦首臣뮁臣覭臣蒁啁ꒀ苣覜臣ꚁ臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†呃䅌ⴴ杉臣낂菣뎂苣ꮃ賥銂ꧨꆾ臣讂臣膂臣节臣肸臣꺁裥邞触떮臣궂냦隌觧鞃菣閃苣ꒂ菣ꞁ臣讂胣ꢅⵎ胩邵苧뒰賥ꦉ꟦ꂀ苣떅듧蒚臣꒙軥鞁胣ꊂ菣ꪂ菣꒺迦䢛䱐ꞁ裥ꊛ臣讂胣骤闦꺁菣벃苣貁铧颁胣鎁苣覂臣㒯臣龁臣㖯臣꺁菣ꆃ苣뎃臣蚈臣貂苣袼鯥㖳鲀㈶迥ꞅ볯芀菣ꆃ苣뎃誁苣뎁䥉臣Ꞥ菩蚈臣랂苣ꪃ菣隌臣貂臣蒁臣蒁꟦ꂀ臣膀菣躃苣ꊂ菣ꮃ賥閁苣龁꟦ꂀ臣膀룤릖胣覃菣ꒂ菣䦳䥉臣袂臣䦳誁苣뎁꾁ꓥꢃ裥貁苣誁苣뎁菣ꪃ臣袂臣蚃菣ꦃ苣ꊂ菣ꮃ賥閁苣龁꟦ꂀ臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 鞃菣뮂苣墹鷦首苣ꮐ苣ꚩ雦꺁臣릁臣ꞁ胣覃菣ꒂ菣䦳䥉臣袂臣䦳ꮁ臣醁苣ꢅ菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣醃菣뮂菣蚃菣뢂臣䆯䍕臣袂臣뢛雩馁苣鎁臣貁뗧鎨髧ꮁꛨ龯臣貂臣袼鯥㖳覼胣鎁苣覂臣覃菣ꒂ菣ꮁ臣醁苣讧胩꺁臣ꢁ苣ꦁ臣貮藥ꮁ苣ꊂ菣ꮃ賥誁苣뎁苣ꦃ苣袃苣ꮃ賥閁苣ꚁ臣讂臣袺菦閁苣讂胣䶂ㄭ뻧讁苣꺁菣벃苣銂铧蒁臣膀菣ꆃ苣뎃䥉誁苣뎁噉臣蒴㤲ꢁ臣蚁菣벃苣뎃菣벃苣꾁菣궃苣릂邝雦ꢁ郥颁苣ꪃ苣���ꦃ菣릂胩ꚺ苣覜臣讂臣骁臣芁苣芀雦閳讁苣꺁菣ꆃ苣뎃䥉誁苣뎁噉臣螃菣뾂臣릖돦㆕臣鞾臣螃菣뾂苣誂苣뢅黥蒚臣蒴┴뷤蒁볯㊈┱꿥㊾┵볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 ꂊ臣ꚁ胣ꚩ雦꺁臣릁臣ꞁ菣ꆃ苣뎃誁苣뎁䥉臣誁臣讂藥鞃菣閃苣ꒂ菣꺁菣벃苣뎃菣벃苣꾁啁ꢁ苣辁鯧ꊖ臣讂臣ꢁ臣뎦꿥閁苣龁볯뎛㜵볯芀臣貂苣꺁菣ꆃ苣뎃臣誁臣讂꟦ꂀ臣뮁臣鎂臣꾁룤ꮁ苣ꊂ菣ꮃ賥閁苣ꚁ臣ꪁ臣讧胩誁苣뎁菣躃苣ꊂ菣ꮃ賥閁苣龁꟦ꂀ臣芁苣ꢁ뫤뎃臣貂苣芀鯥㖳꾁胣꾂菣ꊂ菣뎃苣龀뫥꾁胣覃菣ꒂ菣䦳臣袂臣䦳꺁菣벃苣뎃菣벃苣貁뷤蒁ꧨ首臣꾁胣覃菣ꒂ菣䦳臣袂臣䦳꺁菣벃苣뎃菣벃苣貁ꯩ蒁ꧨ首苣誂苣颫臣ꎁ臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀菣ꆃ苣뎃誁苣뎁䥉臣낂菣뎂苣ꮃ賥꺁뷤许臣膀菣ꆃ苣뎃䥉誁苣뎁噉臣誁臣ꚁ苣ꪃ苣랂菣隌臣貂臣骃菣膃菣꺁귥ꢜ臣誁臣覂臣颫臣ꎁ臣蒁苣鎁臣ꮁ鯧ꊖ臣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†呃䅌䤴꺁苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ苣袺룦馁苣龁苣ꮁ苣ꊂ菣뢅臣뾂菣醃苣ꪳ臣뺯臣讂菣ꮃ꿦貁볤놵髧ꮁ铧蒁苣貂臣趁臣貁胣떂菣傫ꚩ꣩ꮁ臣蒁臣낕臣讂駧떅鿥난臣꾁䅎䅎꿦꾁郥颁臣芁苣貁胣꾂菣ꊂ菣뎃苣龀뫥꾁闧ꪁ苣蚈귥貁뻥覂苣ꚁ臣讂胣꾂菣ꊂ菣뎃苣龀뫥銂뫤겸臣讂臣膂臣袂苣袂臣讉껦銂雩몙臣讂臣膂臣膀믤꺁뫤蒵臣蚈黦螃菣뾂볯颍돧蚈黦誁苣뎁苧뒰賥ꦉ菣궃菣ꆂ苣ꮃ볯銂ꧨꆾ臣膀苣ꮃ䭐菣벃苣ꢁ꿦莼臣龁胣肜苣袺룦蒚臣蚈黦醃菣ꆃ菣뾂菣꾁呃䅌䤴꺁苣ꦃ苣袃苣ꮃ賥꺁꣧ꚺ臣芁臣龁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꺁裥邞臣낁苣ꒁ臣銂룦覂臣龁苣ꮁ胣겂菣꾂菣벃苣꺁菣ꮃ꿦銂菣뎃菣벃苣꺁菣ꮃ꿦ꮁꛨ隺賥鞁臣芀뻥覂苣龁慇㩬慍钯臣ꚩ雦꺁臣릁臣ꞁ苣ꮃ䭐ꧨ鎨臣覂臣䆮䍕뗧鲞臣袂臣뢛雩鞁臣蒁臣芀臣꺁뗧鲞臣膀呃䅌䤴꺁苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ臣뮸臣蚈귥誸臣늜蟥鞁臣ꮜꯧ䞯捬䅎议鿥꺁闦ꮁ苣ꎁ臣몱臣讂菣螃菣ꢁ룤뒇臣ꚁ臣讂胣鎁臣ꊃ菣ꮃ臣ꎭ臣醁苣낁胣겂菣꾂菣랂菣隌臣讨뫥꾁苣ꊂ菣ꮃ賥袂苣节苣ꪃ苣ꦃ菣릂胩ꚺ苣袂臣袺룦馁苣꾁臣ꞁ臣讂胣겖觧開藦ꮁ苣讂꿦莼迥붃胦銂ꋧ龮臣馁苣龁苣ꮁ볯墈菣궃苣릂臣覂臣邝雦꺁啁♃瑧㜻┵볯膀慇㩬慍♮瑧〻㘮ꢁ臣蚁苣ꦃ苣袃菣릂臣麃菣躃菣릂臣钯臣ꒁ臣ꚁ臣辦ꃦ貁닧붣呃䅌ⴴ杉軥겖菣ꮃ苣袼䑂覼臣龁苣ꮁ軦ꢥ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 夠菣궃苣릂臣龁臣䎯ⵄ䡃ㅏ菣궃苣릂臣袂臣ꚁꫨ붣臣龁鷦首臣醁苣蚈黦馁苣뒠郥膀䅎䅎꿥뾂菣醃苣ꪳ臣ꊃ菣钯臣꾂菣ꊂ菣���뎃苣龀뫥銂귦몢臣袺룦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣讁臣膀臣꺁雩ꎀ胦꾁鞃菣뮂苣ꞁꫨ붣臣龁鷦首臣꾁臩ꢔ臣貂臣蒁胣墂菣궃苣릂鷦首臣钯볨꾏菨ꮁ臣讂臣膂臣膀鞃菣뮂苣뺁臣꾁䑃䌭佈鞃菣뮂苣ꮁ苣ꎁ臣뾪ꏨ鞁臣䎟䱔㑁䤭꾁䅎䅎꿦貁颍뷤颫臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣袼䅎䅎볯㦝臣䎮ⵄ䡃ㅏ臣亯乁鶼꺁鞃菣뮂苣邝雦ꢁ꿦莼迥붃臣芁苣覼胣랂苣ꮃ藩ꊂ菣뮂苣꾁귦몢臣膀触膦駦鎖臣薿胩ꞁ臣讂臣膂胣몙藩讁믨궸臣䎮䱔㑁杉臣膓돨銂菣讃苣벃臣讂臣膂臣붣胩躁꣧꺁裥邞菣벃菣ꢁ臣ꚁ鳦ꢔ臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 钯볨꾏菨ꪁ雨ꦉ该讅볯䆈䍕朦㭴鿥隺臣㞮┵볯銂뛧膌臣讂臣膂臣膀䅎䅎朦㭴ꢁ臣蚁ꛨ베臣뺲ꏨ䊽卄臣龁苣ꮁ軦ꢥ臣貂苣芀臣꺁胥꾁駧떅臩ꊻ苣麛迥馁苣龁苣꺁ꛥ鎽臣馨髧ꞁ苣芁苣芀닧붣菣궃苣릂臣랂苣ꮃ藩钯苣醰臣辁臣节颍뷤颫苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣膂胣麛迥馨髧銂䅎䅎볯㢝臣궨껥馁苣鎁臣ꞁ냥ꪁ臣ꢁ苣亂乁鶼꺁껥鮚臣麛迥ꒀ臣몢껥ꮁ臣讂臣鶀苣貂苣芀닧붣菣궃苣릂臣鎁臣ꒀ苣醰臣辁臣节䅎䅎볯㦝臣颫苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣貂臣鞃菣뮂苣墹鷦首臣钯볨꾏菨ꞁ胣趉뿨꺁䑂꺁軦ꢥ鳦辰ꛨ베苣誂苣膍裥ꮁꯩ蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꆃ苣뎃䥉誁苣뎁噉룤꺁鷩趩菣벃苣뎃菣銂啁ꢁ꿦莼臣讂ꃥ袐胣궂냦隌觧鞃菣閃苣ꒂ菣节菣궃苣릂邝雦誁苣뎁菣궃苣릂邝雦꺁룤릖臣떂菣傫ꚩ꣩꺁뗧鲞苣袂臣袺룦鞁臣芀菣ꆃ苣뎃䥉誁苣뎁噉臣뮁臣鎂臣貁껥ꢅ臣랂苣ꪃ菣隌臣袂臣겂菣꾂菣랂菣隌臣貂臣궂냦隌觧讧胩讁苣ꪁ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 䄠䍕胥膀䅎䅎胥膀慇ꒀ胣ꪁ苣뎁臣覃菣ꒂ菣䦳誁苣뎁噉臣䆮䍕郥袨臣ꢅ菣벃苣뎃菣벃苣꺁雩꺁鯧ꊖ苣몤臣袂臣膀ꇨ㖨꺁菣벃苣銂臣覂臣邏ꓧ馁苣鎁臣貁臣趁苣芀룤風迥ꞅ볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㈷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 誸臣鎁臣ꢡ臣膀뗧邈觧꺁菣ꆃ苣뎃䥉袼臣袂臣䦳覼臣袐꣨ꢁ䭐뗧鲞臣꺁雩ꮁ鯧ꊖ臣芁苣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀菣ꆃ苣뎃䥉誁苣뎁噉臣袂臣嚳臣䆮䍕臣亯乁誁苣뎁慇꺁呃䅌ⴴ杉苣뎃菣꾂돨꺁菣ꮃ闦ꮁ꿥馁苣ꊃ菣钯臣뒛軦ꊖ胩鞁臣蒁苣芀臣龁臣ꎁ臣膀鳦몙飦꾁胣鶁苣覂臣궂냦隌觧鞃菣閃苣ꒂ菣貁㠱臣覂듧㎄‷啁╃臣覃菣ꒂ菣䦳誁苣뎁噉臣袐꣨膀臣龁臣覃菣ꒂ菣䦳䥉胣䦁誁苣뎁꺁郥袨苣ꮐ苣鎁臣銂觧뒾臣馁苣蒵裦ꦉ苣邏뻤馁苣芀룤ꒁ臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀菣ꆃ苣뎃䥉胣䦁誁苣뎁꺁郥袨臣蒴㤱臣覂듧㎄膀듧㊄讁苣蒴㔳胣蒴ㄲ臣覂듧���膀듧㊄讁苣蒴㌳胣蒴㌲臣覂듧㎄膀듧㊄讁苣蒴ㄳ胣蒴㔲臣覂듧㎄膀듧㊄讁苣蒴㤲胣蒴㜲臣覂듧㊄‸啁╃臣芁苣芀룤ꒁ臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦몙飦꾁胣覃菣ꒂ菣䦳䥉臣袐꣨ㆈ숹㒱臣䆮䍕銂鳦鞁볯覃菣ꒂ菣䦳貁郥袨숷㒱臣䆮䍕銂鳦馁苣鎁臣銂觧뒾臣馁苣䎋䱔㑁䤭蒵裦ꦉ苣邏뻤馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㌴볯䎚䱔㑁䤭꺁菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣麃菣钃菣낂戼㹲 ꊽ돨뮧藥鞁臣膃菣ꒂ菣벃苣较菣릂苣벃跥ꎷ볯䎈佈볯내菨놔鷦䎥䱔㑁䤭꾁裥邭돨辇듧㦄㔲〰菣ꮃ菣뎃臣隳苣뎃菣꾂돨ꞁ臣讂胣骃菣膃菣麃菣钃菣낂臣뾂菣醃苣ꪳ臣肸곦讧胩꺁郥肸胦銂ꫨ릁苣龁苣꺁蓦ꚺ臣颫臣릖돦ꞁ臣誂胣뮿꣨貾뿤뺣苣鲤蟥馁苣鮚臣覜铧ꞁ臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ苣낂苣讃苣뎃䠭汃苣ꢔ臣ꚁꓥꞀ臣膀苩莅臣膀呄誁苣뎁䅉銂铧蒁臣ꊂ菣궂菣隌臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ苣互偁㔭苣ꦃ菣銂铧蒁臣놄ꇥ鞁胣袶賥랷郥ꦉ苣蚀鯧袼ㅃ覼苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ臣蚈黦馁苣芀菣벃苣鲤蟥銂ㄲ渵꺁噕郥躏臣袂苣財臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雨骼꟧開鯧䆸뫦늶볯뒰룤꺁⸰㈰袃菣閃菣ꪂ菣ꊅ藩袼䙔覼볯皈瘯볯覼볯뮧该뢛뚺뛦袼㔹䄥乃볯ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ볯誁苣뎁┵냦궸臣ギ〮┲䙔⡁⽶覼볯鮼苣ꮃ苣ꮃ賥ꒉ볯㊈〰䵭菣벃菣ꊂ苣袃苣龃菣袼䅉覼볯鮼룥袇럧鶡뛦袼〱洰袃菣릂胣㊁洵⁍慎汃胣炁㡈〮볯鮼ꓥꞀ럧鶡뛦袼䴸苣ꊂ菣뢂菣膀〵䵭菣ꪃ苣膀䡰⸸覼볯袶賥ꦷꇨ늶볯㖈洰袃菣릂胣ㆁ洰⁍慃汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢胣炁㡈〮볯鮼苩莅觥袼〱洰⁍呄覼胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†ꧦꢙ볯袼귧ꆾ臣龩駥銂铧蒁臣节苣蒁볯争偁㔭苣ꦃ菣袼流牥桳浡胣掁瑡‮‣㜱〭㔸ⴳ㈰볯鮼偈䍌苣ꦃ菣銃菣뾂菣鮼苣ꦃ菣銃菣뾂菣誁苣뎁噕ꓦ몇駥銂若袁臣垟瑡牥猧䄠汬慩据⁥偈䍌苣릂菣ꂃ胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†苩莅臣袂臣ꊂ菣궂菣隌볯ꚩ雦袼뻤袁臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉胣馨뫦ꪁ臣覼苣뒰苣ꂊ臣ꚁ洱⽧汭臣貸蟩鞁胣肜뗧辇〱츰䲼볯ㆈ杭볯ꢁ臣龁胣覤胦ꦷꇨ늶볯㖈〶볎覼臣袂臣蒂藥ꒉ볯ㆈ〰䵭䐠呔胣㎁층䲼볯銂ꧨ首볯ㆈ〰볎覼臣ꂊ臣膀럦袐臣膀菣ꒂ苣궃臩莿駥ꞁ銧雩ꂁ뿥蚈鯩鞁臣芀곦蒁臣ꚩ雦銂〵蓢ꞁ〲뇂蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣ꊂ菣궂菣隌觥袼〲洰⁍䅉膀㔳볎覼苣蒐ꧨ首臣ꂊ臣膀ꧨ首苣趆뫥랷郥鞁胣麃苣꾂菣ꂁ뿥ꢙ臣㎧꟧鎖臩莿닦趙臣龁胣骶臣ꚁꧨ首苣㖒莄胣鞚触ꞁ〲뇂蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣亂偁㔭苣ꦃ菣ꮁ苣ꦃ菣꺁趀蟩袼듧㞄胣㢜䱭볯꺁뛦隌럧鶡뛦銂뗦鞁臣뎹ꇨ隌臣龁뻥膀苩莅臣���苣ꮃ苣ꮃ賥鞁臣랷郥ꦉ볯㖈〰볎覼苣互偁㔭苣ꦃ菣ꮁ諥袁胣ꮂ菣ꂃ苣骀臣ꚁ뗦몇臣鮁臣芀곦蒁臣膀뛦隌럧鶡뛦袼洱覼臣ꚩ雦銂苣ꦃ菣讁苣뚺蟥馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣ꚩ雦銂䅎ⵐꮂ菣ꂃ臣覂鯥躏臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†뛦隌볯ꚩ雦銂菣ꪃ菣랂菣袼⸰층枼츯䲼胣㊁츰䲼볯ꮁ苣誂胣㎁莄臣뒰뗦궸臣㒧駦鎖볯슈ケ㔮駦鎖볯袶賥鞁臣芀뛦隌껥蚺뻥膀ꧨ首苣咒䅆볯㊈㔮볎覼臣뢅胦隌臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣ꚩ雦銂臣꺁뻥꺁裥邞铧꺁苣벃菣떂菣鞃菣벃菣ꒂ苣ꮃ臣ꖅ苣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†ꧦꢙ뷤ꢔ돦骼ꧦꢙ뷤ꢔ돦銂믤许臣몤臣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜱㰳愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꦃ菣銂鳦鶈臣ꢳ藥趉臣ㆫ〰뮧该뢛ꦷꇨ늶臣㊧蚈雩뎹ꇨ隌臣龁胣ꮂ菣ꂃ룦ꚺ苣㎒莄胣ꪂ菣袃苣뎃菣ꦃ菣ꦸ뫥銂莄臣궶賦鞁臣貁苣膀噕郥躏苣㊒㔱浮臣ꊃ菣뾂菣鞁臣芀꟧開鯧䆸럧鶡뛦꺁菣ꦃ菣꾂苣肜裥꺁苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦꺁觥ꮁ껥財臣膀臣꺁뻥蒐ꧨ首〵볎銂麛돦ꖅ臣龁胣몟뫦ꦉ돨꺁돦ꖅ臣ꚩ雦ꢳ藥㚥鯥钁臣ꮁ菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣릁臣ꞁ臣讂胣䎂䱔㑁䤭ꚩ雦꺁臣膂臣骃菣膃菣麃菣鞃苣궃菣袃苣ꦃ菣銂鯥㖳ꮁꓧ馁胣鶈鳦誁苣뎁菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂鿥隺觧ꪳ苣궃菣袃苣ꦃ菣鎖臣钃菣꾂㉔胣咁膀ㅔ膀臣袂臣咳㤱볯뎛㌵臣袂臣ꢡ㜵볯꺁뿤膌駦鎖臣誁臣讂럥꾁뇂⸰蚈臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ꇨ㖨⸷†菣ꪃ菣랂菣ꞁ뛦隌臣龁呃䅌ⴴ杉臣蚐ꯨ蒚臣袺菦閁苣讂雦螉⼼㹵戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜱㰴愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†郧隫껦낕볯蚐ꯨ떮闦ꞁꧨꆾ臣龁苣ꦃ菣꺁鳦릊胦銂胣许꣨꺁볥ꮁ뻥蒁菣벃苣꺁뿤膌駦鎖臣袂臣薹苣ꢔ臣ꚁ껥辇髧ꮁ룦骮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㔷⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲貀趀臣钯볨蒚鯧骷臣뒁菩銂菣벃苣ꦃ苣뎃臣隤賦馁苣鎁臣ꮁ苣誂룦骮臣龁胣馃菣릂菣ꒂ菣ꮁ臣醁苣钃菣꾂맥ꞁ臣誂胣貀趀臣ꢳ藥芙臣覂菣벃苣肜ꯩ릂臣뚺蟥芙臣ꞁ苣겸껥鞁臣钃菣꾂臣鶿賦芙雩ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†♎瑬㔻〰〰臣뒠郥膀苣ꦃ菣銂蛥ꚺ맥ꆡ賥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 蚈꟨붃볯㊚臣꺁菣벃苣膀뻤袁臣膀鯥㖳ꮁꓧ馁菣벃苣咯〳臣钃菣꾂ㅔꢁ臣鎖臣蚈꟨붃볯劈볯꾁룤風臣込苣ꢔ臣ꚁ苣ꢁ苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㘷⼼㹡⼼䥄㹖���込룤骼戼㹲琊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ⼼畳㹢胣璁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢㴠鶁苣麁苣궖觧钃菣꾂㍔誁苣뎁菣벃苣咯㈱臣鶿賦芙雩㲓牢ਾ㱷畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵膀㱷畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵‾‽臣貂臣貂뿤膌駦鎖㱴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵誁苣뎁㱴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵꺁菣벃苣꺁菣벃苣ꦃ苣뎃臣誁臣讂軦骷臣袂苣辦껥鞁臣钃菣꾂맥芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 删氦㭴⸱꺁ꃥ袐胣ꮂ菣ꂃ苣趆뫥뎹ꇨ隌臣릁臣ꞁ臣誂胣辕ꇩ貁뛧辁ꃥ袐臣꾁胣ꮂ菣ꂃ苣꒺迦馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 ꆨ꿧蒚胥骼ꧨ鎨鏥誁苣뎁鿥隺觧ꪳ臣钃菣꾂㍔胣咁㔱胣誁苣뎁ㅔ꺁鯧뺯菣벃苣ꊝꧧ鎖臣꺷臣ꚉ〱〮ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣钃菣꾂臣뢛꿥钃菣꾂鷩趩臣膀菣벃苣咯꺁菣벃苣ꊝꧧ꺁菣벃苣뎃菣벃苣ꞁꇨ馁菣벃苣ꊝꧧꢁ껥ꦾ臣貂苣芀ꧨ鎨鏥誁苣뎁裥龜苣릂菣ꂃ臩袐胦몟뫦꺁鯧뺯菣벃苣ꊝꧧ鎖臣꺷苣ꖻ룤ꮁꓧ馁臣誁苣ꮁ뻥讂胣뢛꿥钃菣꾂鷩趩볯劈猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰匾㱘猯扵覼苣许꣨꺁볥銂铧蒁臣ꚩ꣩膓臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣誁臣讂菣벃苣咯膀ㅔ膀臣袂臣咳㤱臣貂臣貂臣ꒁ臣ꚁ꣨鞮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂볯㲚牢ਾ㱒畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢塓⼼畳㹢㴠⠠獁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰堾⼼畳㹢䄯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰匾㰲猯扵⤾ㄪ〰戼㹲込룤骼戼㹲刊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰匾㱘猯扵‾‽苣궃菣袃苣ꦃ菣ꮁ臣醁苣钃菣꾂꺁鯧뺯菣벃苣ꊝꧧ㲍牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢塓⼼畳㹢㴠ꚩ雦궸臣钃菣꾂꺁鷩趩戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰匾㰲猯扵‾‽ꧨ首룤꺁菣벃苣咯꺁鷩趩胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†郥颧臣膀鯧뺯菣벃苣ꊝꧧ袼㱒畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢塒⼼畳㹢볯銂꣦隺臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣誁臣讂菣벃苣咯膀ㅔ膀臣袂臣咳㤱臣貂臣貂臣ꒁ臣ꚁ꣨鞮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣骶臣ꚁ胣ꚩ雦誁苣뎁꣦隺臣誁臣讂鯧뺯菣벃苣ꊝꧧ鎖臣꺷볯䒈覼苣许꣨꺁볥銂铧蒁臣袨껧馁苣鎁臣貁臣趁苣骼戼㹲䐊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰堾⼼畳㹢㴠嬠刨猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰匾㱘猯扵‾‭㱒畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢塒⼼畳㹢⼩⠠㱒畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢塒⼼畳㹢崩ㄪ〰ਮ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首臣鶁臣隻臣钃菣꾂臣ㆌ臣芁苣뒠郥膀菣벃苣咯ㄱ臣钯臣ꚁ臣鶁臣钃菣꾂臣뢛꿥钃菣꾂ꯩ銂룤風臣込苣ꢔ臣ꚁ苣ꢁ苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂볯㲚牢ਾ鯧뺯菣벃苣颫㱒畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱔猯扵‾‽���猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾⼼畳㹢䠯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰱猯扵⤾ㄪ〰†込룤㲭牢ਾ㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱔猯扵‾‽뿤膌駦鎖蚈臣钃菣꾂臣颫臣㲕牢ਾ㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ㄱ⼼畳㹢㴠꾂菣麃菣낂菣ꂃ룤ꞁ鳦节ꯩ蒁菣벃苣ꞁ臣讂菣벃苣咯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰱猯扵꺁ꯩ閁㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 肸臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣낖臣蒁菣벃苣꺁鯧뺯菣벃苣颫臣ꚉ⸵┰臣뒠郥膀菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣䎯䱔㑁䤭馨뫦꺁菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣肸蟨馁苣ꢁ胨袁苣貂苣芀雦鞁臣钃菣꾂臣뢛꿥钃菣꾂ꯩ貁朦㭴⸵┰臣뒠郥膀菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣䎯䱔㑁䤭馨뫦ꦉ돨꺁菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣肸蟨鞁臣蒁臣莀臣覂苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†藩隌菣벃苣뎃菣螃菣뾂苣膀苣뎃菣꾂돨궸臣䶮瑥㔸臣ꆃ菣ꪂ菣뎃苣ꮃ菣궂苣覃臣꺁藩隌鷩趩菣벃苣뎃菣銂껥辇臣讂胣劁ⵐ偈䍌菣ꪃ菣랂菣麃菣钃菣낂苣莃苣ꒂ苣ꢔ臣ꚁ뻥龁胣鎁臣릖돦꺁藩隌菣벃苣뎃菣꾁胣䶁瑥㔸苣ꮐ苣议鿥㢺鲀㌹臣覂臣讂㙔菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣膀臣袂臣뺯뿥馁苣䶋瑥伨㠩銂郥肂藩隌菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣膀㙔硯臣劮ⵐ偈䍌菣ꪃ菣랂菣麃菣鞃臣誁臣讂噕菣벃苣ꊝꧧ銂룦骮臣讂臣ꢁ臣袂苣鞾苣芀敍㡴꺁敍⡴⥏㔸臣꺁藩隌鷩趩菣벃苣뎃菣꾁㙔硯菣벃苣꺁鷩趩菣벃苣뎃菣ꮁ꿦设臣讂볯㲚牢ਾ藩隌菣벃苣뎃菣₈‽〱‰‪㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㙔硯⼼畳㹢 䄨猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾漶㱸猯扵‾‫㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㙔⼼畳㹢㰩牢ਾ볥궸胣㲁牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㙔⼼畳㹢㴠吠袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃볯㢈鲀㌹볯꺁菣벃苣ꊝꧧ㲍牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㙔硯⼼畳㹢㴠吠漶袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃胣䶁瑥伨㰩畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔸⼼畳㹰볯㢈鲀㌹볯꺁菣벃苣ꊝꧧઍ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†蓨ꊂ菣覃菣벃苣뎃菣螃菣뾂苣膀苣莃苣ꒂ臣誁臣讂蓨ꊂ菣覃臣뢅賥ꊝꧧ醃菣뮂菣袃苣骮蟩馁苣膀偒䠭䱐袃菣鞃苣뎃菣莃菣뎃苣ꊂ菣뮂苣銂铧蒁臣鞾胣鎁臣놄苣龃菣醃菣뮂菣袃臣膀獁㉮㐹苣ꮐ苣议鿥㊺ㄸ胣㎜㈰苣ꮐ苣咀㘲菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣膀臣袂臣뺯뿥馁苣榋潳獁㉰㐹苣ꮐ苣놄苣龃菣袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃胣咁㘲敤浡꺁偒䠭䱐袃菣鞃苣뎃菣莃菣ꮁ臣醁苣喋钃菣꾂鷩趩苣겸껥馁苣鎁臣ꮁ苣誂뻥讂胣䆂湳㤲꺁獩䅯湳㤲뢁臣놄苣龃菣ꊝꧧ醃菣뮂菣袃臣咯㘲敤浡钃菣꾂臣ꊝꧧ醃菣뮂菣袃臣钯뻤馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜱㰷愯㰾䐯噉ਾ볥궸胣㲁牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉔㰶猯扵‾‽㉔袼㠲ⴱ〳覼臣钃菣꾂���趩戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾㘲敤浡㰱猯扵‾‽㉔搶慥ㅭ胣榁潳獁㱰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤲㰴猯灵袼㠲鲀〳覼臣钃菣꾂鷩趩戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾㘲敤浡㰲猯扵‾‽㉔搶慥㉭胣䆁灳猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㤹⼼畳㹰볯㊈ㄸ胣㎜㈰볯꺁菣벃苣ꊝꧧ㲍牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉔搶慥㍭⼼畳㹢㴠吠㘲敤浡膀獁㱰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤲㰴猯灵袼㠲鲀〳覼臣钃菣꾂鷩趩戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾㘲敤浡㰴猯扵‾‽㉔搶慥㑭胣䆁畳猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㐹⼼畳㹰볯㊈ㄸ胣㎜㈰볯꺁菣벃苣ꊝꧧઍ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤㒋骼鯩鞰賥ꚭ髧鲤蟥銂铧蒁臣颫胦붃苣讃苣뎃뫤鮏苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ臣袂苣䎋䱔㑁䤭⁧ⵎ胩邵苣ꪃ苣隳苧뒰賥ꦉ菣궃菣ꆂ苣ꪃ菣낂戼㹲 隳苣뎃菣꾂돨誸臣궂냦隌觧讧胩꾁臣貂苣꺁ꧦ붃臣袂臣ꒂ菣鎃菣ꞁ臣꾂菣ꊂ菣뎃苣ꮁ뷥뾟苣誁苣벁臣蚁苣芀臣龁臣ꎁ臣膀뗧鮏臣ꮁ苣ꎁ臣龔裦鞁臣隳苣뎃菣꾂돨꺁菣莃菣꺁苧뒰賥ꦉ臣讧胩蒚룤ꮲ胦銂菣讃苣벃臣讂臣ꢁ臣趇ꛨꞁ臣讂胣䎂䱔㑁䤭꾁ⵎ胩邵臣袂臣侳ꎀ뗧袼苣ꪃ菣ⶳ胩邵볯ꆸ雦꺁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽苣ꮐ苣蒵迦袁苣뎃菣꾂돨ꞁ臣讂胣鎁臣ꞁ胣䎁䱔㑁䤭誸臣亮ꎀ뗧袼苣릂菣ꦃ苣뎃ꎀ뗧覼苧뒰賥ꦉ苣ꊃ菣뾂菣馁苣芀臣꺁雦閳臣誁臣ꚁ胣ꪂ菣뒂돧銂乐ꊂ菣벂袼菣鞃菣覃为낂菣뎂苣肃菣벂覼臣꺁藩ꂴ뛦隌臣袂苣螈雦鞁胣ꆬ臣ꞁꮂ菣ꂃ苣릂菣ꂃ臣꺁胩뢛偈䍌臣袂苣颍鯩鞁胣颫胦붃苣讃苣뎃뫤鮏苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ볯䢈䅐䍅볯ꮁ苣誂裥ꊛ臣膀鯩鞰賥ꚭ髧鲤蟥袼뗧袐苣뎃菣궃菣袃菣벃볯ꞁ菣讃苣벃臣讂胣龔裦鞁臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣亯ꎀ뗧궂냦隌觧鞃菣閃苣ꒂ菣ꞁ胣鎁臣ꞁ呃䅌ⴴ杉ꧨ首臣鞃菣閃苣ꒂ菣꾁臣꺁苣蚁臣节臣ꮁꇩ벼臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁雦閳臣膀呃䅌ⴴ杉ꧨ首臣覂铦몇臣貂臣亟ꎀ뗧ꪂ菣뒂돧꺁偈䕁ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣ꒂ菣銂ꧨꆾ臣讂臣膂臣讉ꃩ銂꣨覼臣讂胣鎁臣릖돦꺁鯧蒚臣膀꿦莼裥邞臣龁苣ꮁ铧蒁臣讂呃䅌ⴴ杉軥겖ⵎ胩邵苣ꪃ苣隳臣꾂菣麃菣낂菣閃苣鞃菣閃苣ꒂ菣銂迦鮾臣讂臣ꢁ臣芁苣芀呃䅌ⴴ杉룤꺁苣ꪃ苣랂菣隌臣亯ꎀ뗧ꪂ菣뒂돧銂郥肂胣鎁苣覂臣ꪂ菣뒂돧꾁乐ꊂ菣벂ꞁ臣㊮芙雩讁臣ꚁ臣떅듧ꂊ냦蚈꟨ꮁ苣誂臩ꊛ臣貂苣芀臩ꊛ苣ꪃ苣隳臣뮛냦隌귥蒚ꓦ몇苣ꢔ臣ꚁ臣颫䡰苣讃苣뎃뫤鮏苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ臣袂苣鞃菣閃苣ꒂ菣뎃苣馁苣芀軥겖臣ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣ꒂ菣銂鿥隺觧ꪳ臣뺏鳥龮ꇨ궸臣ꚩ雦ꮁ꿥���臣閩뻤馁苣芀뗧鲞苣뢁諦鞁臣覃菣ꒂ菣誁苣뎁菣벃苣꺁迥ꞅ꣦隺臣誁臣讂郥颁菣벃苣讁苣꺁臥꺷菣벃苣뎃菣ꢁ臣ꚁꃥ誑臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㠷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 邝雦芀觧ꮁ飦風臣貂臣蒁臣躁苣膀귧ꆾ臣邝雦銂믤辂苣ꮁ铧蒁臣节苣蒁胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㤷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 龩駥誁苣뎁鷦뚻胣릉臣躘꣨閁苣ꪁ臣讁臣誂胣覭뻤꺁ꧦꢙ苣ꎻ苣誂臣ꢔ臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 龩駥骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠱㰰愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†苣讃苣뎃뫤鮏苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ臣袂苣ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣ꒂ菣꺁臣膂臣꾂菣麃菣낂菣閃苣ꆝ믤㲶牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖ꢳ볯ꢳ藥銂ꇨ蚁觥ꮁ胣鶈鳦뮧该뢛苣ꢔ臣膀裥邞뗦龀臣蒴芙雩膀臣龁臣馃菣릂菣ꒂ菣貁껥骮臣讂臣ꞁ苣ꦃ菣銂맥ꆡ賥馁苣鎁臣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠱㰲愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†鯩떥苣ꪃ菣讃菣낂볯垈瑡牥⁳㐲㔶볯芀ꓦ몇駥麃菣ꖃ苣ꮃ臣꾂菣벃菣뎃苣꺁ꫨ躘臣鎾臣芀鯩떥ꇨꊝ苣ꢣ臣龁苣ꮁ菣궃菣뮂菣궂菣袃臣ꮐ臣貂苣肃苣ꊂ菣뎃菣릂菣ꪃ菣銂铧蒁苣芀ꃧꢣ臣袂臣ꚁ꣨릮臣貂苣邵黦貁뻥覂苣ꪁ臣뒠郥膀鯩떥苣낖臣蒁菣궃菣뮂菣궂菣袃臣ꎻ臣讂胣낖臣蒁苣骃菣떂菣袼〵볎覼苣ꢔ臣ꚁ菣궃菣뮂菣銂蛥龔臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ겖胣ꢳ볯ꢃ雩꺁触蚠臣鎾臣膀臣릁臣꺁ꧨ겖ꫨ붣觧ꮁ菣馃菣뎃苣鞁胣風賩馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 䠠䅐䍅苣ꪃ苣隳苧뒰賥ꦉ菣궃菣ꆂ苣ꪃ菣낂臣龁苣ꮁ꟧開鯧銂ꫨ붣臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†偈䕁뚺鯩ꒉ骼〵洰ꊅ藩誃菣ꪃ苣ꂃ볯予佡捁볯芀蓧뒰藩뢅菣袃菣Ꚃ菣袼〲㔮숱ケ〮朵볯銂偈䍌귧骴臣뒰볯㒈〰䱭볯銂郥肂〵洰ꆃ苣랂菣뎃菣벃臣꒧蟩馁苣芀偈䍌귧骴臣뒰臣㖧〰䱭臣鞁胣鞃菣릂菣ꎂ菣꾂ꏨꆃ苣钃菣莃菣銂铧蒁臣貮藥ꮁ럦袐臣讂臣ꞁ蚈雩릒详馁苣芀뫦늶苣を㈮볎誃苣궃菣閃苣ꮃ苣벃苣骀臣ꚁ苣躁臣讂胣ㆂ뚺鯩ꒉ菣袃菣ꮁ꟧馁胣鲃菣ꮃ臣떁臣銂럧辁雩膂胣颃菣Ꚃ菣ꞁ〲裥鎖苣醃菣뢂臣讂胣떁臣銂臣ꒁ臣視苣膀菣袃菣銂菣ꪃ苣ꂃ臣ꂊ鳥馁苣芀뫦늶苣颃菣Ꚃ菣낛鯥鞰룤膀껥ꦸ臣㎧胩鎖臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†偈䕁뚺鯩ꒉ骼〴洰뒰藩隌菣袃菣���菣袼慎䡏볯芀䰱菣릂苣ꪃ菣肃菣銂铧蒁胣䢁䱐覭듧꺁냦袼㘹洰覼苣辇臣ꚁ䰱뫦ꊛ觥鲃菣ꮃ臣뮧臣芀菣ꦃ苣蚃苣莃苣붣菣릂菣骃菣袃苣ꢔ臣膀〱⁎慎䡏볯㒈⸰洰覼苣뚺鯩ꒉ菣袃菣ꮁ鯧ꖎ諥袁胣麛韦ꮁ苣誂뫦ꊛ觥銂럦袐臣讂胣鲃菣ꮃ臣떁臣銂럧辁雩膂胣颃菣Ꚃ菣ꞁ〲裥鎖苣醃菣뢂臣讂胣떁臣銂臣ꒁ臣視苣膀菣袃菣銂菣ꪃ苣ꂃ臣ꂊ鳥馁苣芀뫦늶苣颃菣Ꚃ菣낛鯥鞰룤膀껥ꦸ臣㎧胩鎖臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†偈䕁뚺鯩ꒉ骼偈䍌귧骴臣뒰胣ㆂ뚺鯩ꒉ菣袃菣ꮁ偈䍌귧骴臣뒰볯蒴䰱볯銂藥ꮡ臣讂胣뚺鯩ꒉ菣袃菣銂苣릂菣ꂃ룤ꮁ뷧趁胣떁臣銂럧辁雩膂胣蒴〲裥鎖苣醃菣뢂臣讂胣떁臣銂臣ꒁ臣視苣膀菣袃菣銂菣ꪃ苣ꂃ臣ꂊ鳥馁苣芀뫦늶苣颃菣Ꚃ菣낛鯥鞰룤膀껥ꦸ臣㎧胩鎖臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†〵䵭菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦膀⸰㈰ꊂ苣隌菣袃菣Ꚃ菣膀䡰㴠㜠㔮胣ꊂ苣隌菣袃菣Ꚃ菣袼慎㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵覼臣뢐藥袼鳦銯볯誁苣뎁髧骆臣꺁軦ꚧ볯몈뿦Ꞁ볯銂臩醁苣袂臣ꢳ蓦鞁臣随苣놉臣릁臣ꞁ臣讂胣鶁臣隻臣膦뇦ꮁ臣蒁臣꾁卍卄苣벃菣銂迥ꞅ臣貂臣蒁胣亂乡猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢꟧辇뻥膀ꓥ꒧臣芁苣뒠触銂跥蚈臣薸軦馁臣趁臣芁苣芀戼㹲上䡡猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢佐猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢菣䢻猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢⁏㘠㤮㱧牢ਾ慎㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵‾〠㈮㱧牢ਾ㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾†鳦芵蟩㆏〮菣莃菣ꮃ㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 丠䡡猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢佐猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢菣䢻猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢袼⸶朹뇂⸰朱볯誁苣뎁慎㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵袼⸰朲볯銂꟧辇臣膀䰱ꧨ겖菣袃菣궸臣䢮䱐覭듧꺁냦袼〸洰覼臣膀ꏧ鞰鋦貋귥ꞁ胩骶鋦貋臣ꪁ臣覂뫦ꎧ臣讂胣炂겸껥ꢙ苣ꢔ臣膀〱⁍慎䡏臣뚺뛦꺁䡰苣㞒㔮臣뾪꿧馁苣芀䰱菣릂苣ꪃ菣肃菣銂铧蒁胣肜뗧辇苣㆒〮菣莃菣ꮃ臣馁苣芀뫦늶苣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀〵䵭菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦膀⸰㈰ꊂ苣隌菣袃菣Ꚃ菣膀䡰㴠㜠㔮룤꺁乐ꊂ菣벂떅듧貸蟩馨뫦鶿귥늶胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†〵䵭菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦㲲牢ਾ⸰㈰ꊂ苣隌菣袃菣Ꚃ菣膀䡰㴠㜠㔮†⸱洸㱌牢ਾ苣莃菣膀苣뾂菣낂潎‮ぐ〷䰴臣覂臣傮䝎苣벃苣䚼†⸰洲ੌ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†〵䵭菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦膀⸰㈰ꊂ苣隌菣袃菣Ꚃ���膀䡰⸷袼⸱洸覼苣㆒㠮䱭뷤ꦸ菣ꒂ苣ꮃ룤ꮁ菣骃菣袃臣ꂊ臣讂胣궂菣袃臣覂臣傮䝎苣벃苣䚼볯よ㈮䱭볯銂諥袁胣膍裥ꮁ럦袐臣讂胣뚺뛦銂㈭莄믤许臣㚧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣뚺뛦銂蟥邵觥ꮁ裥ꢳ臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 隤菩랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺胣릂苣궂苣벃苣鶿귥뚺뛦袼⸱㔲杭洯覼볯릂苣궂苣벃苣袼⸰㈱朵볯銂꟧辇듧誸臣辇苣芀裥邞铧ꦤ꟧銂铧蒁胣ㆁ〰䱭菣릂菣ꦃ苣뎂臣뮧臣芀偈䍌귧骴臣뒰苣馨럧뺁臣ꂊ臣膀跥蚈臣랷郥馁苣芀慎杬湥꾂菣ꒂ苣邃苣ꊂ菣궸臣㊫䱭臣ꒁ裥ꢳ臣讂胣뚺뛦銂㈭莄믤许臣㚧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†苣뾂苣ꪂ菣릂苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦袼㈱㔮볎⽧䱭볯骼⸱㔲杭洯鶿귥뚺뛦袼洱覼苣㆒〰䱭菣릂菣ꦃ苣뎂臣钃菣莃菣ꞁ諥袁苣芀偈䍌귧骴臣뒰苣馨럧뺁臣ꂊ臣膀跥蚈臣랷郥馁苣芀⸰㔶䱭菣ꒂ苣궃臩莿껧ꮁ〲츰䲼臣ꒁ裥ꢳ臣讂胣ꂁ뿥ꆮ苣ꦁ뷥ꮁ菣馃菣뎃苣鞁臣놮臣ꖅ苣讂胣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ뫦늶苣ⶒ〲蓢ꖻ룤ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖馨뫦誁苣뎁ꧨ首ꫨ붣㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 몟뫦ꦉ돨뾪ꏨ芀蟥邵매ꖇ慒楰敇瑳匠袼洱覼苣ꮐ苣邃苣ꊂ菣ꮁ胣め〮┲苣뢂賥亖銂郥肂〵䵭菣뎃藩亸ꦷꇨ늶胣炁㝈㔮볯㚈㔲볎覼苣ꂊ臣讂胣ꢳ볯肸胩꺁ꧨ首蛥ꞁ臣馁臣ꚁ臣ꚩ雦ꮁ꿥鞁跥肸菣벃菣꺁慒楰敇瑳匠ꮐ鳦ꦷꇨ늶苣ꢔ臣讂臣趁臣芁苣芀臣辁臣讁臣邃苣ꊂ菣꺁慒楰敇瑳匠銂蛥讧裦鞁胣랷郥鞁臣膀跥蚈臣辇苣邏뻤鞁臣节苣蒁胣も㘮洵ꢂ菣骃菣覃菣閃菣ꖃ菣隃臣劫灡䝩獥⁴䙓郥覜럧鶡뛦袼㈱츰䲼볯銂諥袁苣芀鿥隺觧ꪳ볯蒴〵杭洯膀〴볎覼苣ꂊ臣讂胣肜뗧劂灡䝩獥⁴䙓뿦ꚺ臣クㄮ┲眠瘯臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣傂䝎苣벃苣䚼룥袇꣦隺뿤颭뛦袼〴볎覼苣ꂊ臣膀跥蚈臣랷郥鞁胣ꚩ雦銂臩莿닦趙臣膀㠳뇂莄臣㊧숲㊱駦鎖铦꺽臣讂볯뒰뗦뺁臣꾁汁楬湡散苣벃菣떂菣鞃菣벃껥覼胣ꚩ雦銂菣ꒂ苣궃苣뎃䵙ㄭꂁ뿥趂臩ꢙ臣钃菣莃菣ꞁ諥袁胣ㆁⰳ〰朰臣㎧蚈雩ꂁ뿥馁苣芀偈䍌냦袼〲츰䲼볯銂苣躁駥ꮁ藥貂胣ㆁⰳ〰朰臣閁苣ꮁ〳裥鎖臩莿臣讂臣ꢁ臣袂苣膀苣늶룤ꮁ듦蒁뻨肂胣袐苣鮁臣趂뛦銂㔱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀ꧨ首苣㆒銧雩ꂁ뿥馁苣芀菣骃菣袃苣ꢔ臣ꚁ胣鞾苣貂臣뚺뛦袼듧㎄〸볎覼苣䢒䱐袃菣뾂菣ꪃ苣邃菣ꪂ菣袃苣뎃菣ꦃ菣邃苣ꊂ菣ꮁ꟧馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首ꫨ붣볯゚㘮洵ꢂ菣骃菣覃菣閃菣ꖃ菣隃臣劫灡䝩獥⁴䙓郥覜럧鶡뛦袼㈱츰䲼볯銂諥袁苣芀苣뎃菣꾂돨ꚩ雦袼〴볎膀臣꺁蟩꾁呃䅌ⴴ杉���臣覂洲꺁雩ꢁ귧鞁臣馁臣趁臣芁苣覼苣ꂊ臣讂胣肜뗧劂灡䝩獥⁴䙓뿦ꚺ臣クㄮ┲眠瘯臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣傂䝎苣벃苣䚼룥袇꣦隺뿤颭뛦袼〴볎覼苣ꂊ臣膀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ跥蚈臣랷郥馁苣芀ꧨ首苣ꂁ뿥袲駩鞁胣㎁숸㊱蓢ꞁ㈲뇂芙雩뺔뷧馁苣袼냦뒵臣龁臣䆯汬慩据ꪂ菣袃苣뎃菣ꦃ菣꒮볯芀ꧨ首苣麃苣꾂菣뎂菣妳ⵍ〱臩莿苣躁駥ꮁ菣骃菣袃臣ꂊ臣膀㌱〬〰ꞁ〳裥鎖臩莿臣讂胣䢂䱐뒰볯㊈〰볎覼苣趂臩ꢙ臣ꖅ苣膀㌱〬〰ꞁ臣覂臣㎫蚈雩ꂁ뿥馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣趂뛦궸臣鞴臣벾苣芀郥辂臣龁苣늶苣㆒銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣ꚩ雦銂〱꟧鎖臩莿臣讂胣鞾苣貂臣뚺뛦袼듧㎄〸볎覼苣袃菣뾂菣ꪃ苣邃菣䢪䱐ꪂ菣袃苣뎃菣ꦃ菣邃苣ꊂ菣ꮁ꟧馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†鯩鞰賥ꚭ髧鲤蟥ꢙ苣ꮃ껥骮賥骼ꓥꢃ苣뾂苣ꪂ菣릂苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦袼㈱㔮볎⽧䱭胣㎁츰䲼볯銂돦ꖅ臣讂胣릂苣궂苣벃苣꺁菣벃苣颫苣몢껥ꮁ觢㢧〰䅮臣馁苣芀ꋧ龮臣뮂菣讁苣꺁臩낉臣뮛냦蒚菣ꒂ苣貁臣辁胣馃菣릂菣ꒂ菣貁맥ꚝ臣芁苣袂臣ꮁ臣讂胣릂苣궂苣벃苣龄뫥뺁臣꾁菣벃苣ꦃ苣뎃臣놨껥閁苣ꪁ臣뒠郥膀럧鶡뛦蒵裦銂菣Ꞃ菣꾂臣讂臣膀鯩떥苣꾂菣벃菣뎃苣馁苣讁胣뺁臣꾁鯩떥苣꒺迦馁苣芀臩낉臣躃苣몂臣芁苣뒠郥膀苣ꮃ苣膃苣莃苣鞁臣馁臣ꚁ臣鞰돦銂ꋧ龮臣꒙軥馁苣芀苣ꮃ苣趆껥骮賥鞁胣릂苣궂苣벃苣馨뫦銂蛥ꢳ藥馁苣芀闥財臣骶臣뒠郥ꮁ臣膀믤꺁臩鎽臣財该銂迥讂臣膀臣龁臣겲믤薀臣ꎀ뗧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 蚐ꯨ떮볯予볯骼郧隫껦낕볯予볯銂苣뾂苣ꪂ菣릂菣벃苣ꮁ鿥ꖁ臣许꣨꺁볥銂铧蒁臣节臣膂苣芀臣貂臣䖯灭睯牥菣벃苣ꎧ黦랂苣蚃菣ꮁ苣誂ꇨ蚁臣膀臣龁臣讉该ꞁꇨꎁ臣节苣蒁胣㲂牢ਾ⁎‽㘱⠠⁴ ⥗猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹰㰠牢ਾ볥궸볯㲚牢ਾ骼돦ꖅ駦讁苣钃菣꾂鳦颫苧꺁뫦몇駦뺁臣ꞁ룦骮臣龁뿤膌駦鎖戼㹲圊볯ꆸ뻨꺁菣벃苣ꦃ苣뎃臣ꞁ臣隤賦ꮁ苣讂菣벃苣薹胣㲂牢ਾ꾁觢㚧〰ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣떮闦貁〶〰鳦肺臣芁苣뒠郥膀뫦몇该超苣뾪꿧馁苣讁胣뺁臣꾁苣ꦃ菣銂뫤鮏臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†菣벃菣뎃苣芿闦袼覼볯ꮂ菣ꂃ菣벃菣뎃苣芿闦袼覼苣릂苣궂苣벃苣钃菣꾂臣몟臣趁룤風臣込苣ꢔ臣ꚁ苣ꢁ苣讂胣鎁苣꾁䵅佐䕗螃菣뾂꟨邞苣릂菣ꂃ臣袂苣財臣讁胣뺁臣꾁触開臣財臣ꚁ苣袂臣芀戼㹲吊㴠⠠㱗畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⸰㔰⼼畳㹢⼠㈠⥦戼㹲込룤骼戼㹲圊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰〾〮㰵猯扵���┵臣颫臣袼⸰㔰覼臣钃菣꾂맥㲅牢ਾ骼㱗畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⸰㔰⼼畳㹢臣钃菣꾂觥꾫臣覂菣벃苣꺁ꃩ릂臣ꞁ臣겸껥ꒀ볯薹볯ઉ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†꾁觢ㆦ㈮臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀菣벃菣뎃苣芿闦貁⸱袂苣节ꓥ趁臣뒠郥膀럧鶡뛦蒵裦銂菣Ꞃ菣꾂臣讂臣膀苣ꦃ菣銂뫤鮏臣讂臣膀臣龁臣ꮂ菣ꂃ苣鞴뗦鞁胣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺苣趆돦ꖅ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†苣뾂苣ꪂ菣릂苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦鶿賦芙雩鲤꣨骼뿤膌駦鎖臣랂苣蚃菣鶾귥Ꞁ臣芁苣芀苣뾂苣ꪂ菣릂苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦꾁㠱㔮뇂⸳蚈臣鶿賦芙雩銂ꓧ馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 䌠䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨銈ꧨ首돦ꖅ觥ꮁ돦ꖅ臣龁곧肸臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣몟뫦ꦉ돨讁苣꺁苧뒰賥ꦉ菣궃菣ꆂ苣ꮃ苣뎦꿥馁苣芀苧뒰賥ꦉ菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣뎛㠶臣몤臣节臣ꢁꇩ벼臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣뚵꿥鶿賦芙雩꾁苣릂菣ꂃ뻤颭胦ꞁ臣讂胣覃菣ꒂ菣䦳臣肜裥꺁菣벃苣袼菣벃苣ㆯ覼臣覃菣ꒂ菣䦳䥉臣뮸菣벃苣袼菣벃苣㎯볯ꢁ臣鎖臣鶿賦芙雩꺁럥貁ꋧ龮臣㊫蚈臣覂㠲裥꺁雩ꢁ臣讂苣蚁臣馁苣芀菣벃苣꺁뷥貁鯥㚳ꞁ뻥覂苣龁苣꺁臣麡볤ꞁ臣蒁ꃥ袐胣ꦁ뷥ꪁꇨ開苣随苣袼뻤袁臣膀ꧦꢙ臣龩菨銂菣Ꞃ菣꾂臣讂胣ꮂ菣ꂃ苣鞴뗦馁苣膀럧鶡뛦銂菣Ꞃ菣꾂꒺迦馁苣膀苣ꦃ菣銂뫤鮏臣讂볯膀蛥閩뻤馁苣芀믤许臣릖돦銂铧蒁臣ꮂ菣ꂃ苣鞴뗦鞁臣节苣蒁볯뮂菣銂臩궖臣膀苣ꦃ菣銂뫦ꊛ觥ㆤ㠠┰胣뚺鯩ꒉ′〲ꞁ蚈雩ꢁ胣骶臣ꚁ뫦ꊛ觥ㆤ㔠┰胣뚺鯩ꒉ′〵ꞁ〱裥鎖듦蒵臣讂胣ꮂ菣ꂃ臣袂臣뮂菣袼苣ꮃ苣ꒁ臣蒁臣覼苣鶈鳦ꆝ믤ꞁ蛥ꚺ맥ꆡ賥鞁胣趆ꧨꆾ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ돦ꖅ苣벃苣뎃苣હ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†跥ꊛ苣ꪃ苣隳臣ꢳ藥랂菣놂菣릂苣许꣨꺁臣誁苣ꮁ꣨骮臣讂볯㲚牢ਾ苣뾂苣ꪂ菣릂꣦隺볯㎈츰䲼볯㲉牢ਾ鿥隺觧ꪳ볯㚈츰䲼볯㲉牢ਾꧨ首볯㚈츰䲼볯㲉牢ਾ鿥隺觧ꪳ볯㚈츰䲼볯ઉ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂鿥隺觧ꪳ돦ꖅ臣鎖臣蚈黦馁苣ꚩ雦꾁ꒁ믤许臣馁苣鎁臣貁軦ꢥ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 螃菣뾂꟨邞볯꾂菣麃菣낂菣ꂃ苣ꂊ럥馁苣芀䵅佐䕗궸臣몟뫦ꦉ돨誁苣뎁ꧨ首臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ苣ꂊ럥馁苣芀菣벃苣꺁뷥誁苣뎁菣벃苣ꦃ苣뎃臣뎛㠶臣몤臣节臣ꮁꇩ벼臣讂苣蚁胣趩裥醃菣ꆃ菣뾂菣銂꣨骮臣膀ꧧ蚈菣ꒂ菣꾁触開臣궨뷧馁苣薿ꛨ貁臣讂臣ꢁ苣芁苣芀鯧뺯菣ꆃ苣뎃鷩趩臣袂臣뢛꿥钃���꾂鷩趩臣ꒁ臣ꚁ꣨鞮苣財臣袼鯥㚳꺁냧颍臣겪飦ꮁ郥뺁苣讂ꇨ誁苣뎁臣꺁껥붖뻤꺁鳦貾臣ꢡ苣芏藧閁苣龁臣覼胣趇ꓨꢳ藥銂ꇨꎁ臣뒠郥膀鿥隺觧ꪳ臣袂臣蒐ꧨ首臣鎁苣覂臣醃菣ꆃ菣뾂菣ꮁ臣蒁臣뎹鷥ꒀ苣节臣膂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 몟뫦ꦉ돨ꮁ臣蒁臣膀菣ꆃ苣뎃膀䥉胣䦁䥉胣钃菣꾂䄱臣袂臣ㆳ꺁郥趇ꓨ겸껥꺁鯧뺯臥꺷苣膀臣릁臣꺁蟩螤룦骮臣뎹鷥ꮁ雩鞁臣节臣膂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖ꚩ雦꺁菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣몟뫦ꦉ돨鞃菣閃苣ꒂ菣ꢁ臣钯볨ઃ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†鯧隦꿦莼†ꧨ首臣袂臣몟뫦ꦉ돨꺁룤릖臣貐臣낕臣覃菣ꒂ菣誁苣뎁룤ꪁ菣벃苣銂鳦馁苣讁臣蚁臣銂ꫨ릁苣芀룤ꪁ菣벃苣꾁鯥㚳꺁ꫨ躘룤ꞁ釥趐臣龁菣벃苣袼菣벃苣ㆯ膀䈱胣ㆁ膀䐱胣㊁胣㎁臣袂臣㒳볯ꞁ臣讂胣뢛꿥骮蟩钯볨₃ꚩ雦꺁鯧뺯鷩趩볯覃菣ꒂ菣䦳胣䦁膀䥉膀臣覂臣ꮁ菣벃苣ㆯ誁苣뎁䈱볯ꚩ雦꺁蟩螤돦ꖅ苣鞁臣뒠郥꾁胣鶁臣뎹鷥ꒀ苣ꢔ臣讂볯銂菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂鿥隺觧ꪳ돦ꖅ臣覂臣뎹鷥뢛꿥ꊝꧧꢁ꿦莼臣讂胣鎁苣覂臣ꊝꧧ꺁鿥隺觧ꪳ맥螝胥讁苣꺁鯧뺯럥銂苣ꢁ苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†꣨鞮胣覃菣ꒂ菣ꊝꧧ▍볯뢛꿥覃菣ꒂ菣ꊝꧧ覼볯몟뫦ꦉ돨誁苣뎁ꧨ首臣ꒁ臣ꚁ菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣覃菣ꒂ菣꺁菣ꆃ苣뎃鷩趩銂꣨鞮臣讂胣覃菣ꒂ菣ꊝꧧ꺁菣뾂菣뎃臣ꒁ臣ꚁ臣뎛㠶苣芏藧閁苣龁臣芀鯥㚳꺁뻤ꮁ뻥蒁胣ꖻ룤꺁菦놠臣袂臣込苣ꢔ臣ꚁ菣ꆃ苣뎃菣벃苣뎃菣钯苣袨껧馁苣袼뿤膌駦鎖臣랂苣蚃菣鶾귥Ꞁ臣膀鯥㚳꺁뗧鲞苣趏飦馁苣骼戼㹲覃菣ꒂ菣䦳볯醿볤鶿賦芙雩㆓鲀㐲裥꺁菣벃苣ꊝꧧ꺁郥袨볯钃菣꾂䄱胣㆜覼戼㹲覃菣ꒂ菣䦳骼㘲胣㎜蚈臣钃菣꾂臣袐꣨㲈牢ਾ菣ꆃ苣뎃䥉骼㤳胣㖜蚈臣钃菣꾂臣袐꣨㲈牢ਾ菣ꆃ苣뎃噉볯㖚鲀㐶裥꺁菣벃苣꺁郥袨戼㹲覃菣ꒂ菣嚳볯㚚鲀㔷裥꺁菣벃苣꺁郥袨㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꢳ볯覃菣ꒂ菣꺁뿤膌駦鎖苣ꎂ菣覃苣꾁꿦ꖗ臣꾂菣麃菣낂菣閃苣Ꞁ菨꺁臣覂臣趁臣鲿臣ꚁ苣閃菣馁苣鎁臣ꮁ臣讂胣鶁苣ꮁ뿥颁臣芙雩銂ꫨ肯臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㌸⼼㹡⼼䥄㹖趇ꓨꢳ藥銂臣龁ꃥ袐臣膀菣ꆃ苣뎃鲀䥉ꮁ臣蒁臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣몟뫦ꦉ돨ꢳ藥膀臣覂臣ꮁꧨ首臣뎹鷥ꒀ苣袨껧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 钃菣꾂鷩趩袼鯧뺯菣벃苣ꊝꧧ覼胣몟뫦ꦉ돨誁苣뎁ꧨ首臣ꒁ臣ꚁ菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣钃菣꾂䄱胣ㆁ膀䌱胣誁苣뎁꺁菣벃苣ꊝꧧ▍苣���袨껧馁苣芀菣벃苣ꊝꧧ꺁菣뾂菣뎃臣ꒁ臣ꚁ臣뎛㠶苣芏藧閁苣龁臣鮼뿤膌駦鎖臣랂苣蚃菣鶾귥Ꞁ臣芁苣芀믤许臣薃ꃥ誁苣뎁볥銂铧蒁臣钃菣꾂菣벃苣뎃菣钯苣袨껧馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠱㰴愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†蟩螤돦ꖅ苣鞁臣뒠郥꾁胣钃菣꾂䄱臣袂臣ㆳ꺁臣貂臣貂臣ꒁ臣ꚁ菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂鿥隺觧ꪳ돦ꖅ胣ꪁ苣뎁臣ꚩ雦꺁맥螝胥节꣨鞮臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鿥隺觧ꪳ맥螝胥讁苣꺁럥醃菣뮂菣袃臣袨껧芀믤许臣込苣ꢔ臣ꚁ胣몟뫦ꦉ돨ꢁ꿦莼臣ꚁ臣ꚩ雦꺁맥螝鯧뺯鷩趩臣誁臣讂럥醃菣뮂菣袃苣袨껧馁苣芀戼㹲꺷‥‽剼⁍‭籓⼠删썍㆗〰戼㹲込룤骼戼㹲刊⁍‽鿥隺觧ꪳ臣뺯뇨ꢁ臣讂맥螝鯧뺯鷩趩胥㲤牢ਾ⁓‽ꧨ首臣뺯뇨ꢁ臣讂맥螝鯧뺯鷩趩胥㲤牢ਾ⁼†簠㴠뚵꿥ꒀ㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 邵黦骼뗧鲞苣覃菣ꒂ菣䦳胣覃菣ꒂ菣䦳膀菣ꆃ苣뎃䥉胣钃菣꾂䄱臣袂臣钃菣꾂䈱臣ꒁ臣ꚁ鿥隺觧ꪳ臣覂臣꺷菣벃苣뎃菣袨껧ꒀ臣놠釥馁苣芀鿥隺觧ꪳ臣袂臣ꚩ雦꺁룤릖臣ꒁ臣ꚁ뗧袐臣龁믤ꢡ髧꾂菣麃菣낂菣ꂃ苣ꮐ苣芀ꧨ首臣袂臣몟뫦ꦉ돨꺁룤릖臣ꒁ臣ꚁ菣ꆃ苣뎃鲀䥉膀臣覂臣ꮁ菣벃苣ㆯ誁苣뎁䈱臣뢛꿥ꊝꧧ醃菣뮂菣蚃菣뢂苣㆒蚈臣ㆮ菣벃苣뎃菣뺁臣ꮐ苣袼菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂돦ꖅ臣뎹鷥覼胣ꂊ臣ꚁ胣隃菣놂菣蚃苣뎃苣몟뫦ꦉ돨ꢳ藥꺁臣貂臣貂臣ꒁ臣ꚁ胣覃菣ꒂ菣䦳胣䦁誁苣뎁䥉꺁菣ꆃ苣뎃鷩趩ꪁ苣뎁臣钃菣꾂䄱臣袂臣ㆳ꺁菣벃苣ꊝꧧ▍臣鶁苣覂臣뎹鷥ꒀ臣ㆮ┵믤薆臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†鯥㖳鲀㈶胣㚁膀㘷臣袂臣㢳鲀㐸臣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁ⵎ胩邵苣ꪃ苣隳菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣覂뻥龁菣벃苣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀鯥㚳꾁藥讞髧ꪁⵎ胩邵苣ꪃ苣隳菣궃菣ꆂ苣ꮃ볯궃菣袃맥螝臣㖮ꖻ蛥꺁菣ꆃ苣뎃膀䥉胣䦁䥉胣䦁誁苣뎁膀臣覂臣ꮁ菣벃苣ㆯ誁苣뎁䈱볯銂ꓧ鞁臣蒁苣芀菣벃苣ㆯ膀䈱臣袂臣ㆳ꾁ぇ胣䞁誁苣뎁㉇臣ꊂ苣ꊂ菣亭ꎀ뗧ꪂ菣뒂돧讧胩銂ꓧ鞁臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 뎛㠶臣䎯䱔㑁䤭蒵裦ꦉ臣뢅黥蒚ⵎ胩邵苧뒰賥ꦉ菣궃菣ꆂ苣ꮃ苣몤臣ꚁ臣讂胣ꖻ룤꺁ꇨ꾁呃䅌ⴴ杉臣亮ꎀ뗧ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣ꒂ菣꺁菣벃苣銂ꇨꮁ臣ꚁꓧ馁苣꺁臣芁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠱㰵愯㰾䐯噉ਾ믤许臣ꢡ臣䎯䱔㑁䤭꺁ꛨ龯꿧늛苣몤臣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㘸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㔴볯���菣鎃菣궃臣꺁呃䅌ⴴ杉臣내菨邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ戼㹲 吠듧麃臣뮴胦隌臣袂臣鶁臣貾臣鞢껦꺁臣膂臣㊫臣꺁苣낂菣ꮃ苣薿ꛨꢁ臣讂胣견룤꺁苣낂菣ꮃ臣鞊軥骃菣膃菣ꢁ䍔ⵒ䑃螤郥鎽臣꺁鯧銺뷤ꢔ臣袂臣ꚁ迦鮾臣貂苣芀곧貺臣놅裥肿苣낂菣ꮃ臣咯듧麃룤꺁䑃㠲臣鞊軥邏ꓧ내菨誸臣䊮뾂菣醃苣ꪳ臣꺁雩꺁鯧銺뷤ꢔ臣袂臣ꚁ铧颁苣芀臣貂苣㊉臣꺁苣낂菣ꮃ苣鞏臣随臣龁뻥膀내菨꾁苣ꒂ菣ꮂ苣뎃胣ꒂ菣뾂菣궃苣궂菣㊳볯䦈ⵌ覼苣蚈돦馁苣芀䱉㈭臣뺔蟥꾁듧麃臣뮴胦隌臣袂臣鞢껦ꮁ臣ꪁ臣讂胣꾏뫦Ꞁ藥ꮖ諦뚈賥袐觧ꞁ臣讂呃䅌ⴴ杉臣鞊軥邏ꓧ내菨誸臣䊮뾂菣醃苣ꪳ臣节뗧袐臣膀臣龁臣ꎁ臣䎦㉄ꢁ臣龩菨蒚鯧銺뷤ꢔ苣뮘귦鞁胣䦁ⵌꎔ铧ꮁ뿥膦臣놅裥肿苣낂菣ꮃ苣늘귦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣릖돦ꮁ臣蒁臣膀䱉㈭菣궃菣벃苣벃臣뚈뻥许臣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂臩鶼귥銂뷥ꪳ꟧ꖅ臣龁苣ꎃ菣ꮂ菣袃내菨銂胣鞊䑃颭鳥许臣肃苣螃苣䊣듧麃臣놅裥肿臣讂胣놅裥肿臣䦯ⵌ鞃菣ꊃ菣뾂菣銂듦Ꞁ賥鞁胣鎁苣꾁곦蒁臣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂苣뎃菣꾂돨銂铧龔臣讂胣鞾苣貂臣몙藥랂苣誃菣銂菣랂菣Ꞃ菣벃苣ꊂ菣뮂苣랂苣蚃菣銂铧蒁臣겸껥馁苣芀臣꺁苣릂菣ꂃ臣誁臣ꚁ胣䎁䱔㑁䤭꾁菣랂菣Ꞃ菣벃苣뮴胦꺁铧辇뻤颭髧躽룤銂볥趁뗨鎁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣릖돦꾁䱉㈭铧龔臣薿ꛨꪁ藥몈뿦랂苣誃菣ꮁ꿥馁苣䎋䱔㑁䤭꺁諥鲞苣뾪臣讂胣꾏뫦Ꞁ呃䅌ⴴ杉臣颭鳥꾁내菨ꢁ諦龎迦몤듧麃臣꺁雩꺁苣낂菣ꮃ볤钁苣늘귦馁苣芀臣꺁苣낂菣ꮃ臣鞁臣꾁胣䦁ⵌ꾁铧龔臣貂臣膀臣龁臣ꎁ臣咦듧麃臣꾂菣벃菣鞢껦銂飩ꊭ臣讂胣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂臩鶼귥銂볤蚁菣꾂苣벃苣䦒ⵌ鞃菣ꊃ菣뾂菣銂铧蒁臣鲽裦鞁臣芀곦蒁臣膀苣ꎃ菣ꮂ菣袃내菨ꮁ臣꺁菣鶃菣뾂菣馃苣뾂菣銂뷥ꪳ꟧ꖅ臣龁胣붙胦꾂菣벃菣ꞁ臣讂苣ꎃ菣ꮂ菣袃䅃苣뢁諦鞁胣鎁臣릖돦ꞁ铧蒁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ臣膀諦䎗㍄苣ꊽ돨뮧藥鞁臣咟듧麃볯뢂菣벃苣莃菣䎈覼臣袂臣䊳듧麃볯肃苣螃苣覼苣몈뿦馁苣鎁臣銂郥肂胣䊂듧麃臣袂臣ꚁ迦鮾臣貂苣놅裥肿臣膀呃䅌ⴴ杉臣뮷諥ꮁ苣ꎁ臣뮘껥閁苣讂胣뢂菣벃苣莃菣䎈誁苣뎁菣Ꚃ菣ꎂ듧麃苣㦒뒩駧늉룤辀飦뎹뫥鞃菣벃菣꺁苣Ꞃ菣ꮁ鋦꺨臣膀闧ꪁ苣莿뫥꺁呃䅌ⴴ杉귥ꢜ룤膀諦䎗㍄臣몈뿦馁苣芀㜳蓢ꞁ㘱臣覂〲駦鎖臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃뻥膀苣Ꞃ菣銂菣랂菣Ꞃ菣벃苣뮴胦ꮁ臣蒁臣ꊂ菣뮂苣馁苣芀呃䅌ⴴ杉臣袂苣���裥肿臣뮘껥꾁菣랂菣Ꞃ菣벃苣뮴胦꺁铧辇뻤颭髧躽룤ꢁ臣ꚁꛨ覂苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ겖볯肃苣螃苣내菨릟鳥袼偒䥍ㄠ㐶궸臣ㆮ┰苣랂菨钻ꇨ薸胣ㆁ‥䕍钃菣鎃菣뢅菣袃菣Ꚃ菣覼볯뢂菣벃苣莃菣䎈내菨릟鳥袼偒䥍ㄠ㐶궸〱Ꚃ苣股룦膀┱䴠䵅菣ꮃ菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣㒁〰볎⽧䱭苣Ꞃ菣蚃苣랂菣覼볯邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ鿥난볯肃苣螃苣내菨릟鳥궸⸰츲枼洯鞊䑃鞊뷤誁苣뎁┱菣讃苣ꪃ菣ⶳ苣袃菣鞃菣麃苣랂菣뚺뛦覼볯ꊂ菣뮂苣랂苣蚃菣讁苣꺁牂杩瑨䜭潬䰠捵晩牥獡⁥潓畬楴湯볯傈潲敭慧胣ꮂ苣궃苣⎰䔠㘲〲볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 龩駥骼菣뎂菣膀楄灡潨⁴〲銀ꯧ閡뻥ꆏ볯傛捡慫摲吠灯潃湵⁴塎⁔界業潮敭整鮼敔慣⁮敇敮楳⁳楌畱摩䠠湡汤牥볯䎛畯瑬牥嘠⵩敃汬䌠汥⁬潃湵整鮼祚慭歲删灡摩汐瑡ⵥ㘹胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ触蚠臣閃菣벃菣ꎃ菣袃볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㜸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖鲽ꗦ뚺뛦꺁ꫨ붣볯邃苣ꪂ苣莃苣ꒂ鿥난룤꺁呃䅌ⴴ杉뫦늶볯㖈〰渰⽧䱭胣㎁䱭볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 鞃菣벃菣ꮁ趀룥袇臣龁뻥膀呃䅌ⴴ杉㔠膀膀膀⸰膀⸰㔲胣めㄮ胣め〮膀臣袂臣コ〮㄰볎⽧䱭臣ꊂ菣뮂苣肜뗧莿뫥꺁臣膂臣膀룤風臣ꢡ㠵臣몤臣ꢁ臣誂〱膀膀膀膀⸰膀⸰膀⸰膀臣袂臣コ〮㈰볎⽧䱭臣馨뫦膀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ胣誁苣뎁ꧨ首臣ꒁ臣ꚁ릂鯦骷苣뾪ꏨ鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖ꢡ㠵‮馨뫦늛럧꺁臣膂臣貸蟩늶戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠱㰸愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†㘹ꧧ鞃菣벃菣꺁苣Ꞃ菣钁臣ꮁ〲ⰰ〰내菨銂諥袁胣㎁莄胣㖁䌥㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵膀臣袂臣뾹뫥㢦┵臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ㆂ쌲㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵뢂菣벃苣莃菣䎈내菨誁苣뎁㈱韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰菣Ꚃ菣ꎂ듧麃苣薻迨ꂁ뿥ꆮ룤ꞁ럦袐臣龁胣내菨銂듧ㆄ㔲韃膀껥ꦸ臣ㆧ蚈雩ꂁ뿥鞁胣肃苣螃苣내菨릟鳥袼洹覼臣ꆃ苣钃菣莃菣ꞁ苣ꎁ臣誂菣骃菣蚃苣뎃苣銂맧誂뿨鞁臣내菨誡臣讦臣ꪁ臣ꪁ苣뺁臣膍裥趆蟦膿臣膀⸲쌷㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵내菨⾞䱭臣莿뫥ꢁ臣龁胣ꢡ㠵臣蒐뫦늶㜨층䲼볯銂胣내菨銂郥肂菣것菣袃臣ꦁ뷥ꪁ苣Ꞃ菣ꮁ諥袁臣芀곦蒁臣膀菣것菣袃苣咒灯敓污䄭臣蚯냥鞁胣㎁莄胣㖁䌥㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵膀臣袂臣뾹뫥㢦┵臣ㆧ讁苣㊉芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣鞃菣벃菣誁苣뎁牂杩瑨䜭潬菣랂菣Ꞃ菣벃苣뚺뛦銂ꧦꢙ룦ꚺ臣뎹ꇨ隌臣���牂杩瑨䜭潬菣랂菣Ꞃ菣벃苣뚺뛦袼㔱츰䲼볯銂郥Ꚃ苣ꮃ臣貐駦ꮁ諥袁胣랷郥鞁臣芀곦蒁臣膀菣것菣袃苣랷郥貾臣ꂁ臣ꮁ潔䍰畯瑮丠员臣ꖅ苣膀髦肉臣ㆧ蚈雩뎹ꇨ隌臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣몙藥랂苣誃菣銂潔䍰畯瑮丠员룤膀苣Ꞃ菣躯臣ㆫ꟧鎖臣趩裥銂铧蒁臣膀臣龁臣ꦁ껥ꢔ臣讂觧骮臣讞臣ꮃ菣躃菣벃苣벃臣뺯臣ꚁ룦骮臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†潔䍰畯瑮丠员臣覂臣몇諥銂꣨늌臣膀꣦隺꟨邞菣궃苣ꦃ菣ꮁꫨ뾁뻨뾁胣螃菣뾂苣鶁苣覂臣뺯闦袼뫥㆕覼苣随苣鎁臣ꮁ苣誂ꓥ鮏臣龁胣蒐ꧨ鎨鏥讁苣꺁ꓥ鮏菣벃苣銂胣ꖻ룤꺁볥ꮁꓧ馁臣誁苣膀ⴴ菣ꦃ菣벃苣벃菣뢂苣蚃苣莃苣ꊃ菣ꮃ臣芁臣꾁苣龁볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㤸⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲䄊臣늛럧꺁룤꺁菣ꦃ菣벃臣芁苣膀꾁鯦骷臣许臣鞃菣袃菣ꞁ臣誂胣䊁臣뺂臣芿闦ꞁ臣誂胣䎁臣䆯臣袂臣䒳臣뎹鷥ꮁ귧鞁臣릊黦銂铧颁苣莿뫥ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†㱒畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯灵놵꣨辇胣誁苣뎁뷥ꚁ臣뺁苣꺁곦芦ⵆꓦ骮苣蒐ꧨ鎨鏥ꮁ臣蒁臣袨껧馁苣鎁臣貁臣趁苣芀ꧨ鎨鏥꺁鳦辰胣肜ꓥ誁苣뎁若趁臣馨뫦ꦉ돨ꮁ꿥馁苣钯苣袨껧馁苣鎁臣节臣趁苣芀諥袁臣膀꿦꺁뿤베賥鎖苣袨껧馁苣鎁臣节臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 蒐ꧨ鎨鏥꺁鯧뺯諥鮊苣膀꿥ꆱꧨ鎨鏥讁苣꺁菣벃苣銂鿥隺鏥讁苣꺁菣벃苣ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ룤ꒁ臣込苣芁臣꾁苣讂臣ꢁ臣袂苣閩뻤鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤱㰰愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ膀誁苣뎁醃菣ꆃ菣뾂菣꾁鿥隺臣袂臣ꚩ꣩膓臣ꆸ雦ꮁ藥骀臣膀㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱒猯扵꾁鿥隺菣ꦃ菣벃苣벃臣芁苣膀㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱁猯扵꾁ꧨ鎨鏥醃菣ꆃ菣뾂菣ꞁ臣誂胣䎁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰刾⼼畳㹢䌯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾⼼畳㹢꿦꾁鯧뺯諥鮊臣芁苣芀룤颻臣螖귥䦗臣螌꣦覤闦ꞁ臣讂胣鎁苣꾁胣螃菣뾂臣뺯뇨ꚩ꣩膓臣覂臣节臣ꞁ臣讂ꃥ袐臣꾁ꢁ꣨骮臣貂胣螃菣뾂臣䎌䱔㑁䤭ꦉ돨讁苣꺁苣꺁臣芁苣뒠郥ꮁ臣ク臣궨껥閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†郥ꚩ꣩膓臣뢛꿥릊諥銂菣벃苣뎃菣벃苣꺁냥ꚺ臣뢛臣鮏臣膀鯧뺯諥鮊苣鞃菣낂菣ꂃ臣覂臣몇諥ꢁ臣ꚁ뻥龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†볥㎏臣袂臣㒳苣ꢔ臣ꚁ胣鶁苣麁苣蚈黦鞁臣㢟뗧꺁菣벃苣鶁苣麁苣讁苣꺁蟥鮊臣㢮臣꺁鯧뺯諥鮊뗧鲞苣뎹鷥鞁胣馨뫦辁럥銂꣨鞮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣뎹鷥꺁뗧鲞���肜苣醿臣뒕闦ꮁ룤膂臣貀鯧뺯諥鮊菣벃苣뎃菣趀臣鞁臣놠釥馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤱㰱愯㰾䐯噉ਾ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤱㰲愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ꾁諥鮊룦骮臣낕臣芁苣㲊牢ਾ⁸‽胥薀臣겸껥ꒀ臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 芦껧莿뫥ꞁ뻥龁鯧뺯諥鮊胥꺁ꫨ肯볯ꚩ雦鞏臣随苣讁苣ꎭꋧꪁ苣뎃菣꾂돨莿뫥銂뻥讂臣ꞁ臣芙雩ꮁ臣貂臣芁苣龁苣膀ꧨ首苣ꊂ菣뮂苣궸臣芦껧莿뫥ꞁꧨ鎨臣膀뗧鲞苣ꎭꋧꪁ뿦ꚺ苣骮蟩鞁臣芙苧ꞁꫨ肯臣ꚁ苣袂臣芀臣꺁ꫨ肯臣膀룤風臣込銂铧蒁臣財臣膀臣鎁臣ꊂ菣뮂苣궸臣节臣膂臣뢛꿥릊諥ꮁ胣ꊂ菣뮂苣銂꣨骮臣讂臣膂臣ꢔ臣龁呃䅌ⴴ杉뿦ꚺ臣骮蟩鞁臣䎟䱔㑁䤭ꚩ雦莿뫥꺁꿦銂매骁苣芀戼㹲込骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤱㰳愯㰾䐯噉ਾ뻤骼戼㹲ꚩ雦銂苣莃苣ꒂ룤ꮁ苣뎃菣꾂돨莿뫥㊦洵⽧䱭臣ꚩ꣩鞁臣芀戼㹲节臣膂臣뢛꿥鞊諥꾁〱┵臣芁臣龁胣㲂牢ਾ껥辇臣龁呃䅌ⴴ杉뿦ꚺ臣㊯⸵洵⽧䱭臣ꪁ臣龁胣㲂牢ਾꃥ誑迥붃臣뢛꿥릊諥ₛ‽ㄨ㔰⨠㈠⤵㈯⸵‵‽〱┳㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ꣩膓臣뢛꿥릊諥ꒀ臣芏藧馨뫦꺁㔲臣覂㜱┵臣鎖臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣骁胣鎁苣꾁苣莃苣ꒂ臣蒯鯥ꞁ臣讂胣뢛꿥릊諥꺁胥貁臣꺁꿧늛ꓥꞁ臣讂ꃥ袐胣ꚩ雦銂臣꺁꿧늛蛥ꢁ臣讂臣膂臣貸蟩뺁臣꾁뿦꺸臣ꚁ胣趆裥邞臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㘴볯侚ꎀ뗧ꪂ菣뒂돧꺁꟦ꂀ髧릉뻥ꖁ臣㲑牢ਾ†呃䅌ⴴ杉臣侮ꎀ뗧낂菣뎂苣ꮃ賥銂菣鞃菣覃菣莃菣뎃苣ꢁ뛧辁卅ⵉ卍䴯膀臣袂臣䶳䱁䥄吭䙏臣袂苣릉뻥ꖁ臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ菣鞃菣覃菣莃菣뎃苣誁苣뎁卅ⵉ卍䴯ꮁ苣讂㡔臣袂臣咳꺁裥邞㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 传ꎀ뗧隳菣鞃菣覃㡔臣袂臣咳銂觧뒾臣醁苣龁苣ꮁ胣䚁湩楮慧⁮潉⁮牔灡돨辇裥邞꣨銂铧蒁臣꺁苣뎃菣ꒂ菣䖳䥓䴭⽓卍臣袂苣袃菣鞃苣뎃뛦隌돦꺁铦覤触開黥銂껥붖臣龁볯骃菣膃菣貐룤Ꞁ臣ꒁ臣ꚁ臣ꢡ㤵迥ꞅ볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 뎛㌶臣䎯䱔㑁䤭꺁菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣麃菣鞃苣몤臣膀㡔臣뚺ꫥ趉菩꺁鳦貾臣뚺蟥鞁胣咁꾁㉔꺁苨ꮁ뫦몇臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†菣鞃菣覃㡔臣ꢅ돨辇苣骃苣袃菣銂鯥㚳ꮁꓧ鞁胣鎁臣ꞁ㌴⸶꺁菣벃苣꾁룤ꆾ臣麝뿤뺣菣鞃菣覃㡔臣袺菦䶳ꮁ꿥鲿臣膀〱㈹㈮臣钃菣꾂臣肸뻤꺁苣ꪃ苣랂菣隌㡔臣䶮ꮁ꿥鲿臣讂胣뮸ꛨ钃菣꾂臣뺯뿥馁苣ꪳ蟩ꢁ臣꺁꟦ꂀ볯咈ⴸ效乸���䠭硥中略捁볯銂ꇨ㚨ꮁꓧ馁胣㲂牢ਾꇨ㚨⸱戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤱㰴愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†菣鞃菣覃㥔臣ꢅ돨辇苣骃苣袃菣銂鯥㚳ꮁꓧ鞁胣鎁臣ꞁ돧骃菣膃菣꺁뫤ꆾ臣袂臣覸뻤꺁苣ꪂ菣貁迧貂胣趸鷥肸臣낂菣뎂菣ꦂ菣ꂃ臣蒯鯥ꮁ꿥鲿臣ꚁ臣讂胣ㆂㄱ⸵꺁룤膦菣벃苣꾁效乸捁䠭硥中略捁臣낂菣뎂苣ꮃ賥閁苣龁룤ꆾ臣咮꺁坍臣뺯뿥鞁臣蒁苣芀㈱㌱〮臣袂臣ㆳ㌳⸴꺁菣벃苣꾁臣貂臣貂效乸捁丨略捁⴩效⵸敎䅵膀臣袂臣⢳效乸捁䠭硥中略捁㰩畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵ꞁ苣ꪃ苣랂菣隌臣貂臣覸뻤꺁㥔臣蚈귥辇臣뺯뿥鞁臣蒁苣袼ꇨ㚨覼胣뮸臣ꪁ苣낂菣뎂菣ꦂ菣ꂃ臣ꊃ菣랂苣ꪃ菣隌㥔䠭硥䅎ⵣ效⵸敎䅵ꞁ臣讂臣膀믤꺁苣ꪃ苣閃苣벃菣꾁臣讂臣ꮁ냥辇臣颭鳥馁苣芀戼㹲ꢡ㈶㰮牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㔹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 传ꎀ뗧ꢃ뷤銂ꫨ릁苣龁苣ꮁ胣䎁䱔㑁䤭꺁菣鞃菣覃菣莃菣뎃苣銂껥붖뻤㒋臣趉뿨鞁臣ꢁ臣誂臣財臣膀裥뮔㡔㤭볯袃菣鞃苣뎃臣袂苣趸껥ꢅ臣袶賥꺁臣膂볯銂鯥躏臣膀苣覃菣뎃藩鞈뇦骮臣讁臣龁胣超裥몱껥螃菣뾂臣膀곧肸釥龜臣誁臣ꚁ胣厁牥臣ꂊ臣ꚁ臣貂믤隤臣钃菣꾂臣뺏苣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣龁胣鎁臣钃菣꾂臣鶿賦芙雩꾁꣦隺苣龃菣뢅臣蒁臣貂臣节룤뒇臣骁胣咁꺁趽臣厮牥볯厈牥ㄠ㤲볯貁뿤뺣臣貂胣侁낂菣ꮂ菣銂郥肂臣ꢁ苣몤铥鞁臣蒁苣芀敓誁苣뎁臣貂믤隤臣ꆸ雦꺁敓꺁蟥뺏臣膀敓貁菩蚈髧ꮁ뿤뺣臣貂臣蒁苣鎁臣銂ꓧ馁苣꺁臣芁苣芀臣貂臣咯꺁卍菣벃苣ꢁ苣肸蟨鞁臣蒁苣芀藩鞈뇦骮껥鎨臣膀㥔臣侮ꎀ뗧ꢃ뷤貁敓⁲㌱ꞁ臣讂臣ꢁ苣躘苣讁臣鞁臣蒁苣芀뗧隫臣鞁臣膀뫤ꒁ臣侮ꎀ뗧낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤꾁苣龃菣뢅껦몟苣ꪃ菣ㆳ㤲臣袂臣뮂菣뎃㌱ꢁ郥骮臣貂臣芀뫤ꒁ臣ꢃ뷤ꮁ뗧袐臣ꚁ臣讂룤ꪁ苣ꪃ苣뎃臣䢯硥䅎ⵣ效⵸敎䅵ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ㥔菣鞃菣覃臣䶮䱁䥄吭䙏裥邞㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 骃菣膃菣咉꺁䅍䑌ⵉ佔蚈黦꾁胣蒁臣ꒁ臣꺁苣ꪃ苣閃苣벃菣꺁귥ꢜ苣몤臣ꚁ臣讂볯뎛㘶볯芀坍㈠㤶⸰꺁菣벃苣꾁㥔雦螉臣肸蟨鞁臣蒁苣芀坍㈠㤸⸳꺁菣벃苣꾁㥔菣ꦃ苣䢹硥䅎ꮁ鯧ꊖ臣ꚁ臣讂胣䶂⁗〳㔵㜮臣钃菣꾂臣咯鞃菣릂效乸捁䠭硥臣뢛雩鞁臣蒁苣芀坍㌠㐳⸵꺁菣벃苣꾁㥔菣ꦃ苣䢹硥䅎ⵣ效⵸䅎䅎苣몤臣ꚁ臣讂胣颍돧蚈黦ꮁ鿥ꖁ臣膀㥔룤ꮁ苣ꦃ苣袃菣릂臣袂臣亳ꊂ苣膃菣겂菣꾂菣떂菣뎃臣鲤蟥閁苣膀臣龁臣ꎁ臣咦ꮁ臣醁苣뮸ꛨꪁⵏ胩邵꣧꾁慇乬捁䜭污中乁ꢁ軦骮臣���苣芀菣鞃菣覃㡔臣䶮䱁䥄吭䙏裥邞臣麛迥螎臣躽臣龁苣龮雦鞁臣讁臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤㒋骼呃䅌ⴴ杉臣誁臣讂藩隌臣袂臣놄苣龃菣覤闧鎽戼㹲 뢅賥誁苣뎁蓨ꊂ菣覃臣骃菣膃菣誁苣뎁苣뎃菣꾂돨꺁藥骀臣龔裦ꦉꓥ낕뷤ꞁ臣讂胣鎁苣覂臣몙藩膀鯥躏내菨薸뻦膀닧붣胣龎雨⾬ꏨꒉ뿤颭胣誁苣뎁ꧨ首裥邞룤ꮁ뗨鎁苣蚁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 뾂菣醃苣ꪳ臣뢅賥꾁藥讞髧ꮁ臣肸臣뺁臣꾁ꓨ낕臣뢅듧龎귥꺁苣뎃菣꾂돨뢁臣隌귥蒚믤ꂊ臣袂臣ꚁ觧뒾臣醁苣貂苣芀臣辁臣讁臣ꊂ菣躃藩膀敍膀祃膀牔膀楈誁苣뎁牔꾁믤꺁ꓥ뚄苣龃菣뢅臣钯臣ꚁ藩隌苣鞏臣蒂臣蒁胣뢅賥ꮁ꿥馁苣龄迥Ꞁ臣肜苣颫臣ꊂ菣躃藩꾁菣膃苣讃菣ꞁ臣讂胣鎁苣뺁臣ꮁꋧ趪臣貂臣蒁苣뾂菣醃苣ꪳ藩隌臣Ꞥ菩蚈臣ꆃ菣ꪂ菣뎃臣릂菣鮃苣랂菣覤闧鎽臣꺁藩隌臣芁臣龁胣뾂菣醃苣ꪳ臣誁臣讂藩隌臣蒁臣ꒁ臣꺁闧ꪁ苣ꆃ苣讃苣ꂃ臣袂臣ꚁ뗨鎁苣蚁苣芀藩隌臣肸裨蒚菣ꮂ菣몂菣꾁藥뢁臣鶛鳩뺁臣꾁臩뮧蟩麱꟨銪臣覂뗨鎁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 놄苣龃菣꾁苣뎃菣꾂돨讁苣争㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵貁ꓥ辂苣讂臣ꢁ臣膀苣꾂苣뎃苣龃菣궸雩鎽苣龔臣膀臣貂臣ꂊ냦蚈꟨銂뗨鎁臣蚁苣芀苣꾂苣뎃苣龃菣궸雩鎽臣ꪦ菣鞃菣覃臣ㆮ男臣ꪳ蟩鮸냥銂볥趁뗨鎁臣芀뛧辁諥뒰裥ꎧ臣ㆯ甸臣ꪳ蟩鞢諥銂볥趁뗨鎁臣芀苣꾂苣뎃苣龃菣궸雩鎽臣颍鯩꾁냦Ꞁ鷦뚻룤ꞁ룤覮껥ꞁ臣讂臣膂鯩鞁臣芀臣龁臣ꎁ臣膀蓨ꊂ菣覃臣뢅黥蒚臣꾁由臣ꪳ蟩鞢諥ꢁ臣ꚁꓦ몇迥붃臣芁苣芀苣릂菣ꦃ苣뎃臣놄苣龃菣꾁苣릂菣ꦃ苣뎃藩뺁臣꾁苣붂苣릂菣ꦃ苣뎃藩꺁臣骁苣讁苣龔臣讂胣놄苣龃菣꺁胩ꚺ臣놽鿩銂臣袂臣馁菣ꦃ菣벃苣벃臣꾁䡰胣ꦸ뫥膀뫦銪ꫨ뮛軧膀苣ꪂ菣랼뫥膀룤ꆬ藩鞈胣肱菩鶃菣骃菣膃菣超뫥膀臣袂臣覸곦讧胩貁郥뺁苣讂胣骃菣膃菣階臣誁臣讂獁ꮁ髩ꖎ臣讂苣龃菣뢅껦몟臣놄苣龃菣龀뫥ꮁ뷥뾟苣誁苣벁臣芀苣뎃菣꾂돨超裥ꮁ臣醁苣䆋湳臣骶臣䞏祬臣袂臣厳牥臣놄苣龃菣ꮁ꿥馁苣龄迥Ꞁ苣颫苣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖邝雦ꢁ雦閳㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖ꚩ雦骼呃䅌ⴴ杉꣦隺㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 䌠䱔㑁䤭꺁菣ꪃ菣랂菣⾳獁⵰⽎菣ꪃ菣랂菣誁苣뎁苣ꊃ菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣麃菣钃菣낂볯뾂菣醃苣ꪳ苣㚒낂苣讃苣뎃臣袂臣㖳䵭苣膃苣릂菣ꒂ菣벃菣袼呄覼苣ꮐ苣㖀洰袃菣릂럧鶡���袼䡰⸸覼룤ꞁꓥꞀ臣膀苩莅臣龁胣㖂莄臣㊧蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁뻥膀菣벃菣ꊂ苣袃苣龃菣袼䅉覼苣ꂊ臣ꚁ鳦芵뿦ꚺ〱䵭臣鞁胣ꚩ雦銂〵蓢꺁髦肉臣閁苣ꮁ〲裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀苩莅臣膀苣ꮃ苣ꮃ賥鞁臣랷郥ꦉ苣互偁㔭苣ꦃ菣ꮁ냥ꖅ臣膀곦蒁臣㖧洰袃菣릂胣ㆁ洰⁍慃汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢胣炁㡈〮臣뚺蟥鞁臣芀藩鞈뇦骮귧骴臣袃菣鞃苣뎃볯㊈‥⽷膀藩ꂴ볯뾂菣醃苣ꪳ볯銂諥袁胣㎁莄臣㒧駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀獁⵰袶賥꺁ꃥ袐胣超裥몱껥覭듧꺁獁⵰袼┴眠眯胣떅듧骼苣뎃菣꾂돨覼苣ꂊ臣膀ꧨ首苣㎒莄臣ㆧ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꪃ菣랂菣誁苣뎁苣ꊃ菣ꪃ菣랂菣袶賥꺁ꃥ袐胣뾂菣醃苣ꪳ苣㖒洰ꪃ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣ꦷꇨ늶胣炁㝈㔮臣ꖅ苣龁胣超裥몱껥覭듧꺁菣ꪃ菣랂菣袼┴眠眯胣떅듧骼苣뎃菣꾂돨覼苣ꂊ臣膀ꧨ首苣㎒莄臣㒧駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀苣ꊃ菣ꪃ菣랂菣袼┴眠眯胣떅듧骼苣뎃菣꾂돨覼苣ꂊ臣膀ꧨ首苣㎒莄臣ㆧ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꚩ雦銂뛦隌뻥ⶌ〲蓢ꞁ뿤颭臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†菣鞃菣覃럦袐觧銂慗整獲䄠汬慩据⁥偈䍌圠牯獫慴楴湯볯垈瑡牥膀楍晬牯膀䅍볯誸臣䆮汴湡楴⁳ㅃ‸苣ꦃ菣袼⸲쌱㊗〵浭볯讁苣らㄮ〲䱭蚈臣뺋藩뚺蟥ꮁ苣誂裥ꊛ臣龁胣ꮂ菣ꂃ苣ꢂ菣꾂菣궃苣鞃菣벃苣ꪂ菣隌苣鞃菣벃뻤ꚵ뫦銂ꏨ馂臣龁ⵑ潔⁦業牣袼慗整獲胣䶁汩潦摲胣䶁覼臣뒛軦ꖎ뛧鞁胣ꪳ蟩릂菣꾂菣ꮃ苣躏鯩鞁臣芀獁⵰骃菣膃菣麃菣钃菣낂臣뒠郥膀郥颁偈䍌菣벃苣릂菣벃苣ꞃ菣銂铧蒁胣嚁牡慩⁮ㅃꮂ菣ꂃ볯㒈㘮韃㔲洰覼臣覂⸰洷⽌裥ꞁ菣鞃菣覃럦袐觧銂裥ꊛ臣龁胣ꮂ菣ꂃ苣뚺ꫥ䆒볯뒰룤キ〮┲吠䅆볯ꞁ맥ꆡ賥鞁胣骃菣膃菣銂뫦銪袼냦궸㔹ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ〯〮┲吠䅆볯꺁볦鞢뿦ꚺ臣뚺蟥鞁臣芀菣릂菣ꮂ菣ꂃ苣鞃菣莃苣벃볥銂铧蒁臣膀뗦貂臣ㆮ┵苣冒吭景洠捩潲臣颪냥鞁臣芀ꧦꢙ苣鶃苣蚃苣隃菣벃菣袼⽭⁺〱ⴰ〲〰볯ꞁ껥財臣龁胣궂菣钃菣ꪃ菣뮛鳥銂〳〰ꮁ꣨骮臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†菣鞃菣覃臣䶮⽓卍裥邞볯蚀鯧꾂菣麃菣낂菣閃苣讁苣꺁裥뮔苣蚛苣膀ⵑ潔⁦業牣ꮁ〲볎⽌裥꺁뗦龀臣ꢳ藥鞁臣芀胥薀臣骃菣膃菣ꮁ꿥鞁臣肜臩隌臣龁ꇨ膪苣趃菣꺂菣袼㔲臣覂㈴噥臣蒯鯥覼苣ꢔ臣ꚁ胣䶁⽓卍苣骃苣袃菣銂뻥龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ뗧鲞戼㹲 䌠䱔㑁䤭꺁藩隌볯䎚䱔㑁䤭꾁ꒁ臣階臣㞫臣꺁菣膃苣讃菣銂鳦鞁臣蒁苣骼敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯灵膀敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯���㸢㌵⼼畳㹰胣䶁瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰴猯灵膀敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔸⼼畳㹰胣䶁瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㤾㰷猯灵膀敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㘱㰲猯灵誁苣뎁敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌳㰸猯灵芀菣鞃菣覃菣莃菣뎃苣銂铧蒁臣膀臣貂苣꺁菩趽臣貂臣貂臣誁臣讂藩隌铧邈觧覤闧鎽苣貐껥鞁臣芀敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯灵膀敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔸⼼畳㹰臣袂臣䶳瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㈶⼼畳㹰臣뢅賥꾁菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣麃菣钃菣낂諦鎡苣ꢔ臣ꚁ郥骮臣讂볯뎛㜶鲀覼胣䶂瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾㠳⼼畳㹰臣뢅賥꾁ꓦ몇臣貂臣蒁胣䶂瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰳猯灵膀敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㐵⼼畳㹰臣龁臣䶯瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㤾㰷猯灵銂郥肂菣ꪃ菣랂菣궖觧꾁룤螝룤ꪁⵎ胩邵苧뒰賥ꦉ苣ꮐ苣Ꞥ臣蒁菣鞃菣覃臣芁苣芀臣貂苣꺁菣鞃菣覃臣貐껥誁苣뎁藩隌臣뢛꿥蒚껥辇苣財臣鎁臣貁臣趁臣蒁胣鞁臣貁臣ꚁ胣궟臣膀鷩낂菣뎂苣ꮃ賥骃菣膃菣銂铧颁苣膀ꓨ낕臣떅듧銂铧蒁臣꺁苣뎃菣꾂돨蚈꟨銂ꇨꎁ臣芀獁⵰骃菣膃菣䖉䍖䅁奔䵍乇볯㒈鲀㘵볯誁苣뎁菣ꪃ菣랂菣⾳苣ꊃ菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣䶉偙偐袼㜹ㄭ㈰볯銂铧蒁臣䶦瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰳猯灵膀敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㐵⼼畳㹰臣袂臣䶳瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㤾㰷猯灵꺁藩隌苣뾪臣讂胣ꆃ菣ꪂ菣뎃藩隌臣뢛꿥蒚껥辇苣膀諦몇苣ꪂ菣꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣钃菣꾂鷩趩菣벃苣뎃菣ꮁ苣誂꣨鞮臣讂胣뢅賥骃菣膃菣꺁鯧뺯蟩銂ꇨ㚨ꮁ꣨覼臣讂胣階ꒁ臣龁苣㞊臣꺁呃䅌ⴴ杉菣膃苣讃菣꺁臣ꆁꒁ臣뢅賥貁ꓦ몇臣貂苣芀菣벃苣䆯臣袂臣䊳臣骃菣膃菣䖉䍖䅁奔䵍乇볯㒈鲀㘵볯袼菣벃苣㎯볯꺁뢅賥讞臣芁苣芀钃菣꾂䄲臣袂臣㊳讁苣꺁菣鞃菣覃臣貐蟩ꞁ胣麝뿤뺣菣鞃菣覃돨辇臣钯臣ꚁ㘱꺁돨辇ꋥꂊ臣讦苣貂苣芀郥钃菣꾂臣낕臣讂敍ꞁ臣뢅賥銂ꓧ鞁臣蒁苣芀藩隌臣讨뫥꾁ꒁ臣ꢃ뷤ꞁ闧ꪁ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖ꢡ㌶‮䌠䱔㑁䤭ꮁ臣醁苣䶋瑥臣뢅賥㲖牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㘹⼼㹡⼼䥄㹖⨊呁뢅賥꺁꿥躸臣辰臣蒁臣膂胣䆁ㅔ藩隌臣醃菣뮂菣袃臣䎯䱔㑁䤭뢅賥꺁軦骮蟩꺁꣨鞮臣ꮐ臣貂臣蒁臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†呃䅌ⴴ杉菣膃苣讃菣뢅賥꺁藥ꢎ껥辇臣䎯䱔㑁䤭ꮁ꿥鞁臣㊦〮ꢁ꣨鞮臣貂苣芀臣貂臣膀郥ꢃ뷤꺁藩隌臣ꢅ菣벃苣뎃菣벃苣銂諥袁胣ꆃ菣ꪂ菣뎃臣辷闦膀臣ꪁ苣ꆁꞁ駩馁苣鎁臣ꮁ���ꎁ臣袨껧馁苣芀ꇨ㚨ꮁꓧ馁藩隌臣袂臣ꦤ蓧骃菣膃菣ꮁ꿥鞁臣䶦⽓卍裥邞苣財臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†㕄苣꒙臣馁臣ꚁ臣骃菣膃菣銂卍䴯銂铧蒁臣超裥몱껥馁苣芀藩隌苣龃菣뢅苣抒臣袂臣禳苣ꪂ菣랂菣벃苣薆臣ꪳ蟩꺷臣袂臣ꚁ껥辇臣讂胣뢅賥誁苣뎁ꓥ뚄ㅔ菣鞃菣覃臣䶮⽓卍苣骃苣袃菣꾁⽭⁺㐷⸱誁苣뎁㌷⸳ꮁ뫤ꆾ臣趉꟩ꒂ苣뎃苣뒼臣芀돨辇럥꾁甸볯貺뻤꺁諧讅볯ꞁ胣鎁苣꾁跨뮛諧讅臣鲣귦馁苣ꢁ㘱ꞁ臣讂胣袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃ㅔ볯ㆈ胣㆜覼臣䶯瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ⼼畳㹰껦몟苣ꮐ苣芀ꓥ뚄菣鞃菣覃臣袂臣鶁臣뢅賥颪냥鎽臣蚀鯧꾂菣麃菣낂菣閃苣ꞁ裥ꊛ臣龁菣벃苣ꦃ苣뎃臣芁苣芀ㅔ臣袂臣鶁臣颪냥鎽臣貺뻤ꒂ苣뎃臣ꒂ苣뎃苣궃菣袃苣ꦃ菣銂鯥㚳䄷胣䊜臣몤臣芀誁苣뎁ꒂ苣뎃苣ꪃ菣몂臣鶡ꫧ颪냥ꎧ鯩ꮁ臣蒁臣龔臣讂룤ꢁ臣讂苣ꪂ菣ꞁ臣讂胣禂鲀ㅹꒂ苣뎃臣貐臣꺿ꏩ誁苣뎁鷩꺿ꏩꒂ苣뎃돨辇苣覜臣讂胣뢅賥骃菣膃菣꺁㉢苣ꪂ菣꾁ꓥ뚄菣鞃菣覃臣뺯뿥馁苣抋ꒂ苣뎃苣誂苣ㆂ甶ꯩ蒁胣抂臣袂臣禳苣ꪂ菣랂菣벃苣꾁菣鞃菣覃돨辇臣놅臣ꆃ菣ꪂ菣뎃銂ㅔ菣鞃菣覃臣誁臣ꚁ뿤뺣臣貂臣ꊂ菣躃藩ꢁ臣ꚁ郥骮臣讂胣貐꟦ꮁ胣䆁ㅔ胣咁膀ㅔ膀臣袂臣䶳偙偐袼㜹胣㆜㈰볯骃菣膃菣ꮁ臣醁苣䶋瑥藩隌苣貐껥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 䌠䱔㑁䤭꺁蓨ꊂ菣覃볯䎚䱔㑁䤭꾁軩㆖臣ꮁ臣趁㔱臣ꊂ苣醃菣꺂菣銂鳦馁苣芀ꒁ臣ꊂ苣醃菣꺂菣貁ⵎ胩邵苧뒰賥ꦉ꟦ꂀ臣邵郥鞁臣蒁苣鎁臣貁鿧覂苣ꚁ臣讂胣骃菣膃菣麃菣钃菣낂苣ꢔ臣ꚁ胣隻臣ㆮ꺁獁议鿥ꞁ뗨鎁苣놄苣龃菣銂郥骮臣膀鯧뺯髧ꮁ껥辇臣龁胣䆂湳猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㘸⼼畳㹰胣䆁湳猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㔲⼼畳㹰胣䆁湳猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾ㄷ⼼畳㹰胣䆁湳猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㐹⼼畳㹰臣袂臣䆳湳猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾㐴⼼畳㹰臣놄苣龃菣銂䍌䴯袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃菣莃菣ꮁ苣ꎁ臣貐껥馁苣袼ꇨ㚨覼胣ꊂ苣醃菣꺂菣놄苣龃菣꺁鯧뺯껥辇苣붊蟥ꒂ苣뎃苣궃菣袃苣ꦃ菣꺁菣벃苣ꊝꧧ醃菣뮂菣袃臣袂苣袨껧馁苣芀蓨ꊂ菣覃菣鞃菣覃臣뢛꿥辇苣ꢡ㐶臣몤臣芀呃䅌ⴴ杉苣릂菣ꦃ苣뎃蓨ꊂ菣覃臣ꢅ軦骮蟩꾁呃䅌ⴴ杉臣뺯臣ꚁ⸰┳臣袨껧閁苣讂胣鎁苣꾁胣蒐菩趽臣놄苣龃菣꺁藥醃菣뮂菣蚃菣뢂苣ꂊ臣膀㔱臣꒙臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ꣨鞮臣讂胣ꢡ㐶臣몤臣놄苣龃菣誁苣뎁ꓥ뚄菣鞃菣覃臣뺯臣ꚁ卍䴯蚈黦銂ꇨꎁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖ꢡ㐶‮䌠䱔㑁���ꮁ臣醁苣䆋湳臣놄苣龃菣㲉牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㄰㜹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 놄苣龃菣ꊂ菣躃藩銂誁苣뎁ꒂ苣뎃苣ꪃ菣몂蛥꺁돨辇럥ꮁ苣ꎁ臣骮蟩馁苣芀뻤袁臣膀돨辇〹⸵田臣骃菣膃菣咉㔱臣ꒁ臣ꚁꒁ臣놄苣龃菣钃菣꾂臣芁苣뒠郥芀菣벃苣ㆯ臣겜鷦꺁菣벃苣꺁觥ꮁ뫦몇臣鮼菣벃苣㎯臣겜鷦꺁菣벃苣꺁뻥ꮁ뫦몇臣讂胣袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃臣袂臣鶁臣놄苣龃菣鎽臣蚀鯧ꮂ菣ꂃ臣蚈鯩鞁臣馃菣릂菣ꒂ菣ꞁ臣讂胣䶂⽓卍裥邞苣袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃臣뺯臣ꚁ껥붖臣膀蓨ꊂ菣覃菣鞃菣覃苣ꢡ㐶臣風볨馁苣芀菣벃苣ㆯ胣㎜臣貐臣禘誁苣뎁㉹苣ꪂ菣銂郥뾁胣䎁鳦꾫苣龃菣뢅臣㎌臣꺁菣벃苣馁臣ꚁ臣貐臣ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂臣膀菣벃苣ㆯ臣袂臣㎳臣覂臣禮鲀ㅹꒂ苣뎃臣钃菣꾂讁苣꺁꿥鲿臣讂苣ꪂ菣袂苣节由ꯩ蒁胣钃菣꾂꺁㉹臣禨ꢁ臣鎖臣ꪳ蟩꺷臣ㆯ㐱ꞁ胣鎁苣꾁獁议鿥ꮁ꿥鲿臣讂胣钃菣꾂誁苣뎁꺁ㄱ电臣䆯湳껦몟臣ꪳ蟩ꮁ꿦릁臣ㆦ꺁돨辇ꋥꂊ臣芁苣芀臣貂臣ꊂ苣醃菣꺂菣뢅臣龁臣ꒂ苣ꊂ苣醃菣꺂菣뢅臣뺯뿥馁苣芀郥颧臣膀ㅔ膀㉔膀㉔誁苣뎁㍔ꮁ臣醁苣놄苣龃菣銂郥骮臣膀雦螉苣ꪂ菣ꮁ苣誂뿤뺣菩趽苣貐껥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 ꊂ苣醃菣꺂菣놄苣龃菣誁苣뎁菣膃苣讃菣뢅賥銂胣䎁䱔㑁䤭꺁苣뎃菣骃菣膃菣벃苣螈雦꺁䍌䴯誁苣뎁䍌䴯⽓卍裥邞臣覂ꧨꆾ臣讂胣꺿ꏩ꾁胣꺿ꏩ骃菣膃菣ꢁ鷩꺿ꏩ骃菣膃菣ꢁ臣鎖臣ꪳ蟩ꮁ臣醁苣랂菣袃臣袂臣ꚁ郥骮臣讂胣꺿ꏩꊂ菣躃藩꾁卍䴯超裥몱껥ꮁ苣ꎁ臣貐껥馁苣芀苣骁臣ꪁ菣벃苣뎃菣벃苣꺁呃䅌ⴴ杉臣膀軩㆖臣芁臣誂ꒁ臣ꆃ菣ꪂ菣뎃藩隌臣袂臣㖳臣꺁苣릂菣ꦃ苣뎃蓨ꊂ菣覃臣讦苣貂苣芀呃䅌ⴴ杉䴠瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ⼼畳㹰胣䶁瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰳猯灵膀敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㐵⼼畳㹰胣䶁瑥猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㠾㰵猯灵膀敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㜹⼼畳㹰胣誁臣뎁敍㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㘱㰲猯灵꾁臣릁臣뢅賥閁苣龁臣ꢁ臣ꒈ飦鞁臣蒁苣芀呃䅌ⴴ杉臣覂ꫨ릁臣鎁苣覂臣뢅賥꾁臣릁臣꺁呃䅌ⴴ杉菣膃苣讃菣꺁⸲┵鳦肺臣芁苣鎁臣貁裥躘臣ꚁ臣讂胣䎂䱔㑁䤭⁧獁㱮畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㠱㰶猯灵膀獁㱮畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㈲㰵猯灵膀獁㱮畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㜲㰱猯灵膀獁㱮畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤲㰴猯灵膀臣袂臣䆳湳猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾㐴⼼畳㹰臣馁臣ꚁ냥辇臣놄苣龃菣閁苣龁臣ꢁ臣���飦鞁臣蒁苣芀呃䅌ⴴ杉臣覂ꫨ릁臣鎁苣覂臣놄苣龃菣꾁臣릁臣꺁呃䅌ⴴ杉苣릂菣ꦃ苣뎃臣ギ㔮ꪜ뫦ꞁ臣讂臣ꢁ臣ꒈ飦鞁臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㠴裢䎒䱔㑁䤭誁苣뎁呃䅌猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉臣내迨ꢂ菣覃菣궂苣뎃苣莃苣ꒂ戼㹲 肸臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣䎁䱔㑁䤭蒵裦ꦉ軥겖臣クㄮ䔵⽕杭믤许臣내迨ꢂ菣覃菣궂苣뎃苣覜臣讂胣喂偓氦㭴㔸朦㭴臣몟臣趁苣隃菣겂菣ꊂ菣벃菣颧듧麃뫦ꎧ觧袼䅌覼苣ꮃ苣궃菣袃諦鎡苣ꢔ臣ꚁ胣䎁䱔㑁䤭銂듧貏苣뎃菣袃苣랂菣꺁鳦ꆄ臣ꒁ臣ꚁ苣莃苣ꒂ臣讂胣ꊂ菣뮂苣꺁뫦馂臣袂臣ꦁ铧ꮁ臣蒁臣膀苨벜髧꺾铧ꦉ럦ꖅ苣뾁臣讂臣膂臣鲤뷤随苣놉臣ꮁ臣醁苣ꢳ蓦銂臩袮臣膀铧蒁苣蒁臣ꪁ苣릮駥뺁臣꾁臩랅苣膀臣꺁ꇨꊝ臣颭鳥鞁臣讂ꓥꖝ胦ꢂ菣覃菣궂苣뎃苣뒠ꏥ馁苣龁苣ꮁ胣ꂊ蛧뺹蟧ꢙ蛥ꞁ鳦릊胦몢ꫨ閁苣龁釥龜臣ꂊ蛧馁苣ꪁ臣꺁蟥蚐苣財臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖䰊䱁ꧨ겖볯袼獁潳楣瑡獥漠⁦慃数䌠摯‬湉⹣뺁臣꾁귧ꆾ觧覼蟥邵매ꖇ苣隃菣겂菣袼楌畭畬覼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 倠特瑯汥ꪁ臣꺁苣ꆃ菣邃꟦내菨뚺꟨ꦉ볯䲈䱁볯ꚩ雨꾁ꏨꂀ胨꺁賦몤臣鎾臣ꚁ뿤颭臣릁臣ꞁ臣讂胣趆꟦邈䅌ꚩ雨銂뚃鳦ꖻ蛥꾁蟥邵諧讅臣궶賦鞁臣节苣辁胣ꎧ蟥뺁臣꾁蟥邵苣螤闦麛ꇨ蚁臣趁臣꾁臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣袃苣랂菣馨뫦骼볯䆈獳捯慩整⁳景䌠灡⁥潃Ɽ䤠据⴮臣龁臣覭뻤ꦉ볯ꚩ꣩ꞁ铧蒁苣뺯藧馨뫦ꢂ菣覃菣궂苣뎃볯䎈䕓볯꾁뿨ꆷ迥붃臣膀迥ꞅ꣦隺苣뎃菣袃苣랂菣袼卒覼臣뺯臣ꚁ꣦隺賥閁苣ꚁ臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀蛥讧裦鞁臣蒁臣蒁苣뎃菣袃苣랂菣꺁껥ꢙ臣랆铨ꮺ臣鶿귥鞁胣蒁臣龁苣趆꟦邈臣龁苣膀闩龜鳦릊胦몢ꫨ貁臩鎽臣趏뿥Ꞁ苣몤臣ꪁ臣讁臣誂胣㊁蓢鲀莄臣ㆧꖗ臣ꞁ뛧膌臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖龔铧궃菣袃臣ꚩ꣩㲓牢ਾ†郥붣觥ꮁ臣蒁臣膀䅌閳臣龔裦ꦉ飩뎮臣龁臣鞢볥貁臣蒁臣ꢁ苣몢ꫨ馁臣趁臣芁苣芀铧ꎔ菣莃菣꺁ꧨ鎨苣膀铧ꎔ雩讧駦膀룤鎖胣誁苣뎁뗧蚺駦ꮁ臣龁苣㎋臣꺁胥薀臣颍뷤銂铧蒁臣龮雦馁苣芀臣貂苣꺁跥趽臣讀胣ꮁ껥財臣ꚁ苣袂臣膀臣龁臣蚛苣ꚁ苣袂臣芀뫦ꎧ觧꺁菣馃菣ꮁ꣨覼臣貂臣龄뫥꺁뫤趀蟩꺁千袼臣龁臣劯䕓볯銂軦꺨臣龁胣ꚩ꣩莿뫥꺁ꧨ首臣ꎻꇨ蒚駩Ꞁ铧邈觧뺯藧銂鳦릊胦ꚩ꣩꺁臣膂臣ꮐ臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀鳦芵铧邈觧⾩뫦ꎧ觧뚺뛦貁䡰⸶讁苣㢉〮臣蒯鯥薆臣ꖅ苣袂臣膀苣뎃菣���袃苣랂菣銂郥뺁臣蒁믦貏䍈膀慎䡏臣龁臣ꦁ뷥ꪁ럧鶡뛦銂铧蒁臣炦銂ꫨ肯臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁ꃥ袐臣꾁胣炁뾪꿧꺁믤辂苣ꮁ祐潲潳ꪁ臣꺁럧鶡觥銂铧蒁苣鎁臣貁鳦ꢔ臣芁苣蚁苣芀藥鎽髧뾽铧ꮁ臣蒁臣꾁ꏨꂀ胨꺁ꫨ躘苣芏藧閁苣龁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖뚺꟨ꦉ蛥讧裦꺁臣膂臣ꦷꇨꒉ臣뾽铧㲨牢ਾ†ꧨ鎨铧ꮁ铧蒁苣뚺꟨ꦉ苣趆꟦邈臣讂臣膂臣傫特獯汯볯䆈獳捯慩整⁳景䌠灡⁥潃Ɽ䤠据覼臣ꦁ臣ꦷꇨꒉ苣ꢔ臣膀뫦ꎧ觧꺁럧鶡菨銂ꋥ薹臣讂苣蚁꣨袨臣讂胣傂特獯汯臣趆꟦邈臣龁뫦ꎧ觧銂胣鶁臣鞁臣醁苣낁藩节臣辁臣ꦡ鿥ꮁ苣讂䡰ꫨ肯苣薿ꛨꢁ臣讂臣膀臣龁臣炯뾪꿧ꮁ苣誂닦놾臣讂臣ꢁ苣芁苣ꚩ雦꺁ꧨ鎨臣龁臣ꚩ雦貸蟩꺁臣膂臣ꢔ臣ꚁ苣袂臣芀ꧨ鎨ꧨ首臣랷郥馁苣ꢁ胣傁特獯汯臣趆꟦邈臣龁뫦ꎧ觧꾁菣뎃苣늉苣袑臣ꚁ胣炁貁鳦릊胦ꚩ꣩꺁臣膂臣蒯鯥薆臣芁苣鎁臣銂ꓧ馁胣鶁臣蒯鯥隤臣芁苣뒠郥ꮁ臣膀觨꾁믩뺁臣꾁듧ꢁ臣誂胣鶁臣뒠郥膀ꧨ鎨ꧨ首苣閁苣ꮁ䡰ꫨ肯臣讂뿥膦臣芁苣芀觧骮臣릖돦꾁뫦ꎧ觧趆꟦邈臣龁苣ꮁ祐潲潳꺁뷤ꢔ苣薿ꛨꢁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ뫦ꎧ觧趆꟦邈臣龁苣꺁苣ꮃ苣뎃飩뎮럧鶡뛦꺁뷤ꢔ戼㹲 ꚩ꣩ꢔ臣ꢔ臣讂뫦ꎧ觧銂蛥讧裦馁苣龁苣ꮁ汇捵獡楨汥袼獁潳楣瑡獥漠⁦慃数䌠摯‬湉⹣볯ꪁ臣꺁苣ꮃ苣뎃飩뎮럧鶡뛦銂铧蒁胣꾏菨Ꞁ臣芁苣낂菣ꮂ菣늹룦銂飩ꊭ臣讂苣蚁꣨袨臣讂胣䞂畬慣桳敩摬臣趆꟦邈臣龁뫦ꎧ觧銂胣낂菣ꮂ菣랷藥ꦉ苣ꮐ臣蚁苣ꚩ雦꺁ꧨ鎨臣龁臣ꚩ雦貸蟩꺁臣膂臣ꢔ臣ꚁ苣袂臣芀苣ꮃ苣뎃럦ꖅ臣覂臣늹룦꾁觧骮臣ꚩ꣩邝雦ꞁ臣북駩Ꞁ苣몤臣鎁臣貁臣誂胣鞁臣貁臣ꚁ汇捵獡楨汥ꞁ蛥讧裦鞁臣뚺꟨ꦉ臣뾽铧꾁맥覸苣뮘귦뺁臣꾁뷤鮸臣膀臥붙胦꺁闦銂룦覂臣鎁臣貁臣趁苣芀觧骮臣릖돦꾁뫦ꎧ觧趆꟦邈臣龁苣ꮁ汇捵獡楨汥꺁뷤ꢔ苣薿ꛨꢁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾꧨ首룥袇戼㹲 ꚩ雦궸臣ꢂ菣覃菣궂苣뎃뿦ꚺ臣것菣ꮃ苣醿臣醁苣薿ꛨ貁臣讂ꃥ袐胣ꢂ菣覃菣궂苣뎃苣ꮐ臣ꪁ臣薻迨뒰룤ꞁ臩鎽臣肸胩꺁ꧨ首룥袇뛦銂ꫨ붣臣讂胣鎁苣銂菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀ꧨ鎨臣讂郥뾪ꏨꦉ臣ギㄮ䱭苣膀苣뎃菣袃苣랂菣銂郥뺁臣蒁〱韃㔷浭苣ꦃ苣ꚩ꣩ꆮ겜臣貂臣貂臣ꂊ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ꣦隺鯦骷臣龁苣꺁苣뎃菣袃苣랂菣馨뫦뚺뛦꺁ꫨ붣戼㹲 ꢂ菣覃菣궂苣뎃臣邃苣ꊂ菣銂ꏨꂀ胨꺁賦몤臣鎾臣ꚁ苣뎃菣袃苣랂菣銂郥뺁臣蒁냦ꞁ蛥讧裦馁苣芀菣ꒂ苣ꮃ苣鲃���蚃菣꾂苣龃苣떂菣ꞁ〳裥鎖雦骶髧ꮁ뿦鞁臣랷郥馁苣芀뿦꺸뛦銂莄胣㢜蓢꺁蛥떔뫥ꞁ놀雩뺁臣鶿귥馁苣芀뷤ꢔ觥ꮁ菣ꮃ菣莃苣릂菣궂苣벃苣ꢔ臣ꚁ蚈雩ꖻ룤肿臣辁럦袐臣讂胣ꢂ菣覃菣궂苣뎃뿤颭뛦꺁뿦ꚺ苣鲤꣨馁苣龁苣ꮁ胣붣胩薀臣蚈黦벨飦뢛苣芏藧鞁胣ꖻ룤꺁뻤ꪁ臣꺁胣芵苧銂菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣讂苣蚁꣨袨臣龁룤ꎀ臣馨뫦ꢂ菣覃菣궂苣뎃룥袇뛦銂ꫨ붣臣讂볯㲚牢ਾ⸰洵⁌ㄨ〰䔰⽕䱭 ‫⸹洵⁌蓧ꢂ菣覃菣궂苣뎃냦₴‽〵啅洯㱌牢ਾ⸵洰⁌㔨䔰⽕䱭 ‫⸵洰⁌蓧ꢂ菣覃菣궂苣뎃냦₴‽㔲啅洯㱌牢ਾ⸱洰⁌㈨䔵⽕䱭 ‫⸹洰⁌蓧ꢂ菣覃菣궂苣뎃냦₴‽⸲䔵⽕䱭戼㹲ㄊ〮䱭⠠⸲䔵⽕䱭 ‫⸹洰⁌蓧ꢂ菣覃菣궂苣뎃냦₴‽⸰㔲啅洯㱌牢ਾ⸵洰⁌〨㈮䔵⽕䱭 ‫⸵洰⁌蓧ꢂ菣覃菣궂苣뎃냦₴‽⸰㈱䔵⽕䱭戼㹲㔊〮䱭⠠⸰㈱䔵⽕䱭 ‫⸵洰⁌蓧ꢂ菣覃菣궂苣뎃냦₴‽⸰㘰啅洯㱌牢ਾ⸵洰⁌〨〮䔶⽕䱭 ‫⸵洰⁌蓧ꢂ菣覃菣궂苣뎃냦₴‽⸰㌰啅洯㱌牢ਾ⸵洰⁌〨〮䔳⽕䱭 ‫⸵洰⁌蓧ꢂ菣覃菣궂苣뎃냦₴‽⸰㄰䔵⽕䱭㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 蒐룥袇뛦銂胣ꆬ臣貸蟩ꮁ胩肂觥ꮁꋧ龮臣醰臣辁臣节〳꟧鎖뿦鞁臣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀铧蒁苣貸蟩늶臣낙胦뒰꿥ꞅ苣ꮐ苣芀臣貂苣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣めㄮ㔲啅洯膀⸰㘰啅洯膀⸰㌰啅洯膀⸰㄰䔵⽕䱭뿦ꚺ볯뺁臣꾁裥꺁鯦骷볯誁苣뎁駩Ꞁ냦뺯藧꺁臣貂臣貂⸰洱銂胣ꢂ菣覃菣궂苣뎃苣ꮐ臣ꪁ臣ㆄ쌰㞗洵겂菣릂ꧨ鎨껧㊡鳦鶁苣麁苣ꮁ諥袁臣膀ꒁ臣趇ꓨ늛럧銂迦鮾臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䅌ꚩ雨뚺뛦꺁ꫨ붣戼㹲 閃菣벃苣벃臣覂蟥邵매ꖇ䅌ꚩ雨銂迥誂蟥馁胣ꢂ菣覃菣궂苣뎃苣ꮐ臣ꪁ臣뒰볯릉껥꺁雦閳臣袂苣趆꟦邈럧鶡뛦銂뷤ꢔ臣讂苣蚁賦몤臣ꪁ臣讁臣誂볯㖉〮䱭苣邃苣ꊂ菣ꮁ蓧貏髧ꮁ諥袁苣芀菣ꒂ苣ꮃ苣讗鯥뺁臣꾁鯥ꊻ臣ꚁꧨ겖苣뚺꟨馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖붙胦龔裦ꦉ꿥ꞅ臣뾪ꏨ㲽牢ਾ†臣릁臣꺁铧邈觧銂駩Ꞁ铧邈觧뺯藧ꞁꧨ鎨臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀駩Ꞁ꿥ꞅ臣뾪ꏨꮁ꿥馁苣겪飦ꮁ雩鞁臣ꦁ铧꾏菨ꪁ觧骮臣릖돦銂迥ꞅ臣讂胣겪飦貁臣蒁ꃥ袐胣뚺꟨ꦉ蓦ꚺ臣것菣ꮃ臣㊮胥꺁苣뎃菣袃苣랂菣릂菣ꒂ苣銂胣鶁臣ꚩ꣩것菣ꮃ臣龔裦ꦉ臣꺁뗧뾁郥辂臣ꞁ郥肂苣蚁胣붙胦龔裦ꦉ꿥ꞅ苣뾪ꏨ馁苣芀돦蒰铧뢒闧뒰臣龁臣颫鏥ꪳ諥ꖷ냦銂ꧨ鎨臣讂ꃥ袐胣ꚩ雦ꮁ諥袁臣ꢁ臣ꮁ苣뎃菣袃苣랂菣莿뫥貁䅌뚺뛦龄뫥꺁趀臣ꪁ苣袂臣膀蛥讧裦ꢂ菣覃菣궂苣뎃꣦隺臣貸蟩늶苣ꢔ臣讂胣设臣낁胣뚺꟨ꦉ蓦ꚺ㴠〠〮䔶⽕䱭臣뒠郥膀⸲䔵⽕䱭苣뎃菣袃苣랂菣뚺뛦ゲㄮ䱭苣ꚩ꣩���雦袼䅌뚺뛦ꮁ諥袁臣ꊽ臣覼⸱洹ꮁ諥袁胣めㄮ㔲啅洯ꢁ臣讂胣ꢂ菣覃菣궂苣뎃뫦늶臣辇臣クㄮ䱭믤许臣膀藥鎽臣貸蟩꾁骼〲믤誸臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖ꚩ꣩讉ꃩ㲆牢ਾ†⸱†䅌ꚩ雨뚺뛦袼⸰洱覼苣蒐ꧨ鎨ꧨ首菣ꖃ菣隃臣袂臣ꢂ菣覃菣궂苣뎃꣦隺菣ꖃ菣隃臣膀菣ꖃ菣隃雩ꞁ鯧銺뇦鎟臣ꪁ臣袂臣ꢳ蓦鞁臣貁苣膀蓧貏髧ꮁ裥ꎕ臣讂胣ꢳ볯议苣꺁ꧨ겖臣芁苣낁胣蒴ㄭ莄臣覂㈭莄臣閃菣벃苣벃臣ꖅ苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†⸲†铧邈觧ⶩ뫦ꎧ觧랷郥ꦉ臣랷郥ꮁ雩馁苣겪飦ꮁ臣蒁臣膀觧骮臣뚺꟨ꦉ럦颻雦뢛苣芏藧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ㌠‮蒐菣ꖃ菣隃苣㎒숷ㆱ蓢ꮁ뛧膌臣龁냦뒵臣龁臣ꂊ蛧隃菣莃苣ꪁ臣꺁苣뎃苣ꖃ菣벃菣ꎂ菣낂ꏨ꺽臣ꖅ苣讂胣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃雩讧駦鎖臣袂臣뒰뗦뺁臣꾁諥놆菣궃菣꾂臣ꦸ뫥銂꣨늌臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†⸴†郥膃菣벃菣銂臣趁럦鲁臣ꮁ〶뇂蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†⸵†苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣貾胣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃뗧蚺駦鎖苣風賩鞁胣蒐菣ꖃ菣隃苣蚂臣辁苣ㆊ〸냂迥ꊻ臣鮁臣뎦꿥馁苣芀駩Ꞁ뗧鲞臣膀돦辄럦辁迥ꊻ臣龁臣趁臣节鯥蒁臣뺁臣몛臣늂菣ꞁꓧ閁苣膀駩Ꞁ뗧鲞臣鶁臣袂臣ꪁ苣ꮃ臣ꪁ臣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀臣龁臣鶁臣貮藥Ꞁ苣궶賦鞁臣蒁닧ꂨ苣ꮃ臣龔裦ꮁ苣ꎁ臣릉뻥ꖁ臣覂苣讂胣膃菣벃菣銂돦辄럦辁触蒁胣북駩Ꞁ臣邵黦銂볥趁뗨鎁臣蚁苣꾌该銂臩醁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖閩뻤㲡牢ਾ†룤ꎀ臣趇ꓨ겸껥鶁苣麁苣ꮁ臣蒁臣붙胦邵黦銂铧颁苣肜뷤莿뫥銂뗧릂臣벑臣芀믤许臣릖돦ꮁ苣誂胣ꚩ꣩꺁뗧릂臣뺹뷤뎹鷥銂꣨鞮臣讂볯뺹뷤뎹鷥₇‽苣ꮃ賥芵苧꺁꿥낕鋥꺁胩뺯闦銂蟩螤뗧릂苣莃苣ꒂ臣낕臣꒙臣讂胣뺹뷤뎹鷥芵苧貁菣馃菣風볨꺁뫦ꎧ觧龄뫥꺁뫤趀룥袇蛥ꞁ臣誂胣붙胦龔裦ꦉ꿥ꞅ臣붙胦ꞁ臣誂胣낙胦뒰꿥ꞅ臣낙胦ꞁ臣讂臣覂臣膀ꧨ鎨臣覜諥ꞁ臣讂胣ꦃ菣ꮃ꣨覼臣뚺꟨ꦉ蓦ꚺ苣ꚩ꣩薠鯧꺁룥袇뿤낕臣ꊖ胩鞁臣붙胦뺁臣꾁駩Ꞁ뗧鲞臣钯볨馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣ꚩ꣩薠鯧궸臣龁臣ꚩ꣩薠鯧誸臣芦껧내迨ꢂ菣覃菣궂苣뎃菣馃菣銂苣ꢁ苣讂胣讀胣꺁ꯨ螖臣龁臣躘듧ꮁ臣蒁臣辦껥閁苣讂苣뎃菣袃苣랂菣꺁菣馃菣ꞁ鯥蒁苣ꮃ臣龔裦貁臣蒁ꃥ袐胣鎁臣鲤鿦膓臣ꚩ꣩꺁ꛨ花苣肺臣鞁臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖䌊䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱���⼼畳㹰䤭꺁臣膂臣릖돦ક⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁雦閳苣ꢔ臣ꚁ胣䎁䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭龎雨誁苣뎁ꏨꒉ臣ꚩ雦ꮁ臣醁苣내迨ꢂ菣覃菣궂苣뎃苣膀该鮊귥蒚꿦膿䅌閳苣ꢔ臣ꚁ껥辇臣讂胣邵黦銂귧ꆾ臣붣觥䖤⽕䱭臣袂臣䖳⽕杭臣놠釥馁苣芀戼㹲ꢔꫨ骼戼㹲䰊䱁ⴠꮂ菣袃苣讃苣ꆃ菣邃꟦내菨뚺꟨ꦉ戼㹲䌊䕓ⴠ뺯藧馨뫦ꢂ菣覃菣궂苣뎃戼㹲䔊⁕‭뇧붛뇥릖苣뎃菣袃苣랂菣颍뷤㲍牢ਾ啅洯⁧‭뇧붛뇥릖苣뎃菣袃苣랂菣颍뷤⾍菣ꪃ苣ꦃ菣㲠牢ਾ啅洯⁌‭뇧붛뇥릖苣뎃菣袃苣랂菣颍뷤⾍菣ꪃ菣莃菣ꮃ戼㹲䰊坒ⴠ䰠䱁ꧨ겖냦઴⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†苣隃菣겂菣ꊂ菣벃菣颧듧麃뫦ꎧ觧钯뿦袼祐潲整汬吭볯뮙賩蚕꣦覼볯뚺뛦芀祐潲整汬吭볯뮙賩蚕꣦覼臣袂臣傳特獯汯볯뮙賩蚕꣦覼臣邃苣ꊂ菣銂雩膰觥ꮁ〳裥鎖껥ꦸ臣ꞁ룦膂苣芀祐潲整汬吭볯뮙賩蚕꣦覼臣覂蟩麱苣벃菣銂駩뮎臣膀苣袃菣醃菣銂蓧貏髧ꮁ駩뮎臣讂胣傂特瑯汥⵬袼駧늌闥馨볯銂祐潲潳袼駧늌闥馨볯趆꟦邈럧鶡뛦袼⸵洰覼臣趆꟦邈臣讂胣鲃菣ꮃ苣蚂臣辁苣讗鯥鞁臣貮藥ꮁ뫦ꎧ臣讂臣ꞁ럦袐臣讂胣ꦷꇨ늶苣뾽铧뒛觥ꮁ蛥讧裦馁苣芀蛥讧裦鞁臣傟特瑯汥⵬袼駧늌闥馨볯꾁鲀莄臣㊧芙雩뺁臣궶賦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀껥ꢙ臣誸菩銂慐慲楦浬볯뮙賩蚕꣦覼臣蚦臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 뺯藧馨뫦ꢂ菣覃菣궂苣뎃뫦늶胣䎂䕓볯ㆈ㈮볯꺁菣ꒂ苣ꮃ苣讖냥趉臣㎫蚈雩꒮룦뺁臣ꦸ苣讂胣邃苣ꊂ菣讁苣醇뇥랂菣ꮃ苣꒙軥鞁胣릂菣莃菣벃苣ꆄ迨蒚臣꒙軥馁苣芀苣袃菣醃菣銂ꧧ鞰臣ꖅ苣讂臣ꮁ臣螂臣ꦁ跥蚈臣ꂁ臣ꢳ蓦놷臣膌臣誸臣膀臣貂臣袂苣鮸鳥뚊藦銂ꃧ讂胣뺯藧馨뫦ꢂ菣覃菣궂苣뎃볯䎈䕓볯銂剌袼⸱覼볯㖈〮䱭볯ꞁ蛥讧裦馁苣芀慐慲楦浬볯뮙賩蚕꣦覼臣蚯냥馁苣芀껥ꦸ臣ㆧ裥鎖苣㖒胣㆜蚈雩钚臣㎧鲀〶裥鎖胣肿臣辁菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣鎁苣ꞁ千꾁뷤ꢔ臣隺若貁臣趁臣蒁苣芀祐潲整汬吭볯뮙賩蚕꣦覼臣릉껥꺁菣莃菣ꮁ꿥馁苣邃苣ꊂ菣芁臣誂臣單偓䔭ꞁ臣뺯藧馨뫦ꢂ菣覃菣궂苣뎃볯䎈䕓볯릊諥銂뻥讂臣膂臣膀ꏨꂀ胨꺁裥邞꣨躘鯦銂迥ꞅ臣讂胣邃苣ꊂ菣궸臣䎮䕓臣單偓䔭⽕䱭苣袨껧馁苣芀蛥讧裦鞁臣䎟䕓臣㊯胣㢜蓢ꞁ〳韦鎖뛧膌臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鶁苣麁苣꺁뷤ꢔ뻥膀껥ꢙ苣낖臣蒁慐慲楦浬볯뮙賩蚕꣦覼臣蚯냥馁苣芀戼㹲设볯㲚牢ਾ剌袼⸵洰覼臣趆꟦邈臣龁胣㚁〬〰唠偓䔭⽕菣ꒂ苣ꮃ臣릊諥銂鳦馁苣邃苣ꊂ菣ꮁ臣蒁臣膀諥鮊臣ㆯ㈬〰唠偓䔭⽕䱭臣ꪁ苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴���楴쉦゠〰㤱㰸愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†祐潲潳瑦ㄭ袼駧늌闥馨볯붂菣袃苣Ꞃ苣꺁苣莃苣ꒂ菣ꦃ菣벃苣벃苣궨껥馁苣芀룤겈髧醃菣ꆃ菣뾂菣芀룤風臣ꢡ臣몤臣ꢁ臣誂룤겈ꧨ鎨菦놠苣隃臣醃菣ꆃ菣뾂菣銂꣨骮臣讂胣㲂牢ਾ룤겈ꧨ鎨菦놠戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤱㰹愯㰾䐯噉ਾ苣鞃苣ꞃ菣㲳牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰〰⼼㹡⼼䥄㹖膃菣벃菣늉苣鎽臣銈뻤㲋牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㄰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 馨뫦늛럧莿룧늶苣뾪ꏨ馁苣芀唴偓䔭⽕䱭臣뺯藧馨뫦ꢂ菣覃菣궂苣뎃볯䎈䕓胣㊁㈮볯貸蟩馨뫦鶿귥뚺뛦銂ꫨ붣臣讂胣릊諥㒛啅洯꺁千꺁룥袇꣦隺뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀볥㆏苣ꢔ臣ꚁ룥袇臣薿ꛨꪁ剌꺁蟩銂꣨鞮臣讂胣鶃菣릂菣것菣膃菣벃菣袼⸱覼룤ꞁ千뚺뛦袼⸲覼볯㊈츰䲼볯銂臩鎽臣辇볯込覼臣䲮坒볯ㆈ㐮볯ꮁ諥袁苣芀룥袇뛦銂〳꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣㲂牢ਾ뻤骼戼㹲릊諥㆛㈬〰啅洯꺁千뚺뛦꺁臣膂臣膀千뚺뛦袼〲볎覼苣䲒坒볯㖈㤬〸볎覼臣ꂊ臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㈰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 〠㘮䔴⽕䱭臣䎮䕓룥袇꣦隺뿤颭뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀菣ꪃ苣膃菣뎃菣ꖃ菣隃룤ꞁ唴偓䔭⽕䱭臣䎮䕓뿤颭뫦늶볯ㆈ㘬䱭볯銂剌袼⸸洴覼臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀諥鮊⸰㐶单ⵐ啅洯꺁千꺁룥袇꣦隺뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀〳꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†꣦隺뿤颭뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀菣ꪃ苣膃菣뎃菣ꖃ菣隃룤ꞁ千꺁룥袇꣦隺뫦늶臣覂⸰㈱膀⸰㘰膀⸰㌰膀⸰㄰膀⸰〰膀臣袂臣コ〮㐰啅洯꺁꣦隺뿤颭뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀룥袇뻥蒐菣ꖃ菣隃苣㎒銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀룥袇苣궂菣ꂃ苣ꖻ룤꺁ꇨꮁꓧ馁胣㲂牢ਾ꣦隺뿤颭뫦늶臣龁苣꺁룥袇苣궂菣ꂃ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〲㰳愯㰾䐯噉ਾ肜뗧貺胥貸蟩貁迥鲿菣ꖃ菣隃蛥ꞁ뗨鎁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦뾪ꏨ芀軥겖ꧨ首ꫨ붣胣ꚩ雦貸蟩늶苣を㈮洵⽧䱭臣뾪ꏨ馁苣芀룤風臣込苣ꢔ臣ꚁ룥袇臣薿ꛨꪁ剌꺁蟩銂꣨鞮臣讂胣ꚩ雦릮駥꺁鏨銂돦辄럦辁臣骁臣膀菣ꪃ苣膃菣뎃菣ꖃ菣隃룤ꞁꧨ首볯㖈츰䲼볯銂臩鎽臣辇볯许꣨꺁볥覼臣䲮坒臣ꂊ臣ꚁ胣め㈮洵⽧䱭뫦늶臣馁苣芀ꧨ首苣㎒銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀ꧨ首껥ꢙ臣誸菩銂慐慲楦浬볯뮙賩蚕꣦覼臣꒱臣蚦臣芀戼㹲设볯㲚牢ਾ뿦ꚺ㐲㜮杭洯꺁ꧨ首臣龁苣ꮁ胣ꚩ雦袼〵볎⁌‽⸰㔰䱭볯銂냦袼⸴㤸䱭볯ꮁ諥袁苣芀戼㹲込骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦���㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〲㰴愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†ꏨꒉ臣趇뗧뺹蟧ꚩ雦뾪ꏨ芀돦骼跥肸臣붣觥궃菣袃臣㎯臣꺁裥꺁ꧨ首胣馁臣辂臣貀雩讧駦趀胣貀룤鎖胣膀臣袂臣貀뗧蚺駦趀臣覂臣讂胣붣觥꺁菣ꒂ苣ꮃ苣䲒䱁ꧨ겖냦ꞁꏨ膓귨ꖈ볯傈覼믤颧鯦ꮁ뻥ꎁ臣趆꟦邈臣讂胣趆꟦邈臣龁ꧨ首苣を㈮洵⽧䱭臣貸蟩馁苣芀볥㊏苣ꢔ臣ꚁ룥袇臣薿ꛨꪁ剌꺁蟩銂꣨鞮臣讂胣ꚩ雦릮駥꺁鏨銂돦辄럦辁臣骁臣膀菣ꪃ苣膃菣뎃菣ꖃ菣隃룤ꞁꧨ首볯㖈츰䲼볯銂臩鎽臣辇볯込覼臣䲮坒臣ꂊ臣ꚁ胣め㈮洵⽧䱭뫦늶臣馁苣芀ꧨ首苣㎒銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀ꧨ首껥ꢙ臣誸菩銂慐慲楦浬볯뮙賩蚕꣦覼臣蚦臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 붣觥꺁跥芙뷤ꢔ迥붃臣ꚩ雦뾪ꏨ芀ꧨ首苣を㈮洵⽧䱭臣貸蟩馁苣芀볥㎏苣ꢔ臣ꚁ룥袇臣薿ꛨꪁ剌꺁蟩銂꣨鞮臣讂胣ꚩ雦릮駥꺁鏨銂돦辄럦辁臣骁臣膀菣ꪃ苣膃菣뎃菣ꖃ菣隃룤ꞁꧨ首볯ㆈ츰䲼볯銂臩鎽臣辇볯込覼臣䲮坒臣ꂊ臣ꚁ胣め㈮洵⽧䱭뫦늶臣馁苣芀ꧨ首苣㎒銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀ꧨ首껥ꢙ臣誸菩銂慐慲楦浬볯뮙賩蚕꣦覼臣蚦臣芀戼㹲设볯㲚牢ਾ뿦ꚺ㈱⸵洰⽧䱭臣ꚩ雦꺁臣膂臣膀ꧨ首볯ㆈ츰䲼㴠〠〮洱覼苣뒰볯㒈㤮洹覼臣ꂊ臣讂胣㲂牢ਾ볥㎏볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㔰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 붣觥꺁跥芙뷤ꢔ迥붃臣鞃菣랂菣鲃胣鞃菣랂菣鲃볯鎁苣貁藥낧ꏨꒉ苣뎃菣꾂돨莿뫥ㆦ㔲杭洯ꞁ臣ꎁ臣讁臣钁臣辁볯銂⸰㔲杭洯ꮁ룥袇臣讂胣鎁苣꾁骼〵貸蟩ꮁ귧鞁臣芀볥㎏苣ꢔ臣ꚁ룥袇臣薿ꛨꪁ剌꺁蟩銂꣨鞮臣讂胣ꚩ雦릮駥꺁鏨銂돦辄럦辁臣骁臣膀菣ꪃ苣膃菣뎃菣ꖃ菣隃룤ꞁꧨ首볯ㆈ츰䲼볯銂臩鎽臣辇볯込覼臣䲮坒臣ꂊ臣ꚁ胣め㈮洵⽧䱭귧ꆾ뫦늶臣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 붙胦뒰꿥ꞅ胣趏뿥膃菣벃菣궸臣ェ〮㈳啅洯꺁꣦隺볯ㆈ〰볎覼苣䲒坒볯ㆈ〰볎覼臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀꣦隺鯦骷臣覂駩Ꞁ꿥ꞅ苣뾪ꏨ馁苣芀戼㹲趏뿥膃菣벃菣꺁뫦馂裢设戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〲㰶愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†祐潲整汬吭볯뮙賩蚕꣦覼ꧨ겖苣ꂊ臣讂胣傂特瑯汥⵬袼駧늌闥馨볯뚺뛦袼〵볎覼苣蒐迥鲿菣ꖃ菣隃볯낙胦뺯藧膀꣦隺胣ꚩ雦膀苣醃苣꾂ꧨ首胣誁苣뎁駩Ꞁ냦뺯藧覼臣趏뻥钃菣莃苣벃臣ꂊ臣讂胣蒐菣ꖃ菣隃苣㆒胣㊜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀臣貂苣傒特獯䬠湩瑥硩ꏨ꺽臣늉苣鎽臣覂苣龁苣Ꞃ菣袼ꇨㆨ볯ꮁ賦ꖅ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ菣벃苣ꎧ���ઐ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†裥邞胣傂特卯景袼駧늌闥馨볯ⶉㄱ苣閃菣Ꚃ苣ꊂ臣馁臣ꚁ臣馨뫦膀꿥ꞅ胣誁苣뎁ꧨ首臣ꒁ臣ꚁ蟨開裥邞苣財臣膀裥邞껥蚺駦ꮁꧨ首뗧鲞苣䖒⽕䱭臣놠釥馁苣芀郥趇ꓨꚩ雦꾁ꒁ臣뎹鷥ꒀ臣놠釥閁苣讂胣趇ꓨ뺯臣膃菣벃菣꺁룤릖臣ꒀ臣傌特卯景袼駧늌闥馨볯ⶉㄱ臣鲤蟥閁苣ꪁ臣貂臣膀臣꺁菣ꖃ菣隃臣鶁臣貾臣螃菣뾂꟨邞臣覂駩隤臣貂胣邵黦꾁蛥袨껧閁苣讂胣릂菣ꒂ苣麛迥袼駩Ꞁꧨ首꿥ꞅ볯銂ꧨ首룤꺁苣뎃菣袃苣랂菣꺁蟩鞃菣릂ꧨ首臣릂菣ꒂ苣鞁臣ꢂ菣覃菣궂苣뎃臣辇볯よ〮㘱啅洯覼臣몟臣蒁臣袨껧馁苣鎁臣ꮁ臣讂㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 貸蟩鞁臣龎雨뺁臣꾁ꏨꒉꧨ首臣䖮⽕䱭胥銂啅洯ꒀ臣覤迦馁苣芀戼㹲龔菣벃苣銂啅洯ꞁ뻥膀啅洯袼苣뎃菣꾂돨覼臣놠釥馁苣芀啅洯銂啅洯ꮁꓥ鮏臣讂臣膂臣膀苣뎃菣袃苣랂菣ꒀ볯䖈⽕䱭볯銂苣뎃菣꾂돨莿뫥袼⸰㈱洵⽧䱭볯ꞁ駩馁苣芀뗧鲞苣覜諥낕귥㆗ꇦꞁꃥ誑臣讂胣㲂牢ਾ뻤骼戼㹲ꊂ菣뮂苣궸臣ギ㈮䔳⽕䱭臣ꚩ雦ꮁ臣蒁臣膀ꃥ誑迥붃臣䖪⽕杭胥꾁䔲⽕杭臣ꪁ苣袼⸱銂膡臣覜諥낕귥ꮁ룤膂苣覼胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㜰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 龎雨ꚩ雦꺁뗧鲞胣邵黦銂鳦릊闦鞭膡臣节臣膂苣芀苣莃苣ꒂ臣冮꾁⸰㈰啅洯ꞁ臣讂胣ꚩ雦貁觢ウ〮䔲⽕杭臣뒠郥膀ꃥ誑迥붃臣邵黦꾁♛瑬儻膀儨㵌⸰㈰啅洯⥧ꞁ臣讂胣붣觥ꚩ雦꺁뗧鲞胣龎雨꺁郥궃菣袃臣㎮臣꺁ꧨ首볯貀雩讧駦趀胣貀룤鎖胣膀臣袂臣貀뗧蚺駦趀볯꺁맥螝볯䖈⽕杭볯貁鳦릊闦鞭膡臣꺁ꏨꒉꧨ首臣놠釥꾏菨ꪁ뗧鲞臣芁苣芀臣讂菣莃菣꺁ꓨ낕臣ꚩ雦貁氦㭴䱑볯よ〮䔲⽕杭볯ꞁ臣讂ꃥ袐胣め〮䔲⽕杭臣ꒀ苣뎹鷥꺁꣨鞮臣ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀ꃥ誑迥붃臣邵黦꺁맥螝胥貁觢ウ〮䔲⽕杭臣뒠郥膀ꃥ誑迥붃臣邵黦꾁♛瑬儻膀儨㵌⸰㈰啅洯⥧ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ뻤骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〲㰸愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁뻤ꮁ臣蒁臣膀ꏨꒉ菣ꦃ苣벃菣銂곦꺁臣誁苣ꮁꃥ誑臣讂볯㎚啅洯膀藥낧ꏨꒉ뿦ꚺ㈱洵⽧䱭臣꺁⸰㈰啅洯ꢁ귧ꆾ胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†苣릂菣ꂃ臩袐胦芀軥겖ꧨ首臣鶃菣릂菣것菣릮駥궸胣㊁胣㢜蓢ꞁ迥醁迥讂臣趁臣芁苣芀ꧨ首苣낕臣讂껥ꢙ胣낕臣讂룦ꚺ臣鞏臣随苣ꢁ胣鶁苣覂臣ꊂ菣뮂苣ꞁ铧蒁苣鎁臣貁臣趁臣蒁胣馨뫦늛럧骮蟩꺁뿤낕볯犈猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹰볯꾁觢ェ㤮ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣犂猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹰���貁氦㭴⸰㤹臣芁苣낁胣ꊂ菣뮂苣꾁鳦릊臣꾁臣辁胣낹苣钿臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀駩Ꞁ꿥ꞅ臣ꢂ菣覃菣궂苣뎃뿦ꚺ룦骮胥꺁맥螝臣⚯瑬〻〮㈰啅洯ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣낙胦뺯藧貁觢ェ〮㈰啅洯꺁ꃥ袐胣ꊂ菣뮂苣꾁鳦릊臣꾁臣辁胣낹苣钿臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀苣醃苣꾂臣龁ꧨ首臣ꒀ臣袺菦ꒀ臣㖮鲀〲┰臣蒯鯥薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀苣醃苣꾂ꧨ首臣ꒀ臣袺菦ꒀ臣ꚉ㤴뺁臣꾁觢㊧㄰꺁ꃥ袐胣ꊂ菣뮂苣꾁鳦릊臣꾁臣辁胣낹苣钿臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀駩Ꞁ냦뺯藧꺁苣뎃菣袃苣랂菣莿뫥겸껥ꒀ臣뎹鷥꾁꣦隺鯦骷臣誁臣讂郥颁뿦ꚺ臣㖮鲀〲┰臣蒯鯥薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀駩Ꞁ냦뺯藧ꒀ臣袺菦ꒀ臣ꚉ㤴뺁臣꾁觢㊧㄰꺁ꃥ袐胣ꊂ菣뮂苣꾁鳦릊臣꾁臣辁胣낹苣钿臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀ꧨ首臣ꢂ菣覃菣궂苣뎃胥꾁苣뎃菣袃苣랂菣馨뫦늛럧꺁꿧늛蛥袼⸰〰讁苣ら〮㐶单ⵐ啅洯뺁臣꺁雩覼臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀ꧨ首臣⚌瑬〻〮㈰啅洯꺁ꃥ袐胣鎁苣覂臣ꊂ菣뮂苣꺁䱑苣誂苣躽臣膀⸵薠臣鎾臣ꚁꃥ誑臣讂胣ꚩ雦貁朦㭴⸰㘰唴偓䔭⽕䱭臣뒠郥膀ꧨ首苣ꊂ菣뮂苣꺁꿧늛蛥뺁臣閁苣ꮁ룥袇臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㤴裢䎒䱔㑁䤭꺁뻥龔觧邙闧ꚩ꣩袼뇦鎟뻥龔觧낕볯ઉ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁雦閳臣膀귥ꢜ臣讂ꗥ鞰胦龔迨낕苣ꢎ껥馁苣龁苣膀臣袂臣螌껥꺁뻥龔觧꺨苣ꮐ臣ꪁ臣龁苣꺁ꧨ鎨돦銂迦鮾臣讂胣肸臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣䎁䱔㑁䤭蒵裦ꦉ臣骱鿦꺾铧ꦉ闦꾁觢ㆦ䙃⽕〱䱭臣것菣ꮃ臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣ꚩ꣩꺁뫦馂臣袂臣ꦁ铧ꮁ臣蒁臣膀ꓦ鎽苣놉臣鮚臣ꆄ迨ꮁ雩馁苣ꢳ蓦銂臩袮臣讂胣貀ꋥ隮胣ꪁ苣ꢔꫨ꾁铧貏臣颭鳥誁苣뎁軦骮ꋥ隮臣骮뻧閁苣讂胣ꚩ꣩邵黦꺁鳦릊胦꾁룤ꮁ胣鶁苣覂苣ꦁ铧馁苣鲤뷤貁臣貂蟨鎽臣꾁ꧨ鎨鷦뚻룤ꞁ귥ꢜ臣蚁苣꺾铧ꦉ臣鞢껦銂飩뎮臣ꪁ臣鎁臣꺁ꯧ벨臣몟臣蒁臣蒁苣芀臣꺁ꯧ벨臣膀ꧨ鎨鷦首臣ꦁ뷥ꮁꫨ붣臣龁ꓦ鎽苣ꦁ뷥ꪁ铦莒뻥龔觧꺁裥꺁铧貏鿥誤觧ꞁ铦莒臣ꚁ胣꺾铧ꦉ臣ꚩ꣩邝雦궸臣颭鳥馁苣ꢁ胦辂苣讂ꃥ袐臣꾁胣ꚩ꣩貁臣貂苣꺁뻥龔觧꒾臣鞢껦銂飩뎮臣ꪁ臣鎁臣銂뿤벨臣讂臣ꢁ苣ꮐ苣릁臣ꞁ臣讂胣ꚩ꣩ꮁ铧蒁苣뮻蓦꺁菣벃苣ꦃ苣뾂菣龔裦ꦉ臣鶁臣ꢃ裥銂胣覜諥Ꞁꋧ趪臣貂臣릖돦ꮁ뻥蒁胣ꦁ蟩꺁菣讃苣ꪃ菣벃苣ꞁ蟥蚐臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖貸蟩늶臣릟鳥㲰牢ਾ†⸱†鿥난臣貸蟩늶臣뾪ꏨ芀鿥난臣袂臣貸蟩늶苣뾪ꏨ鞁臣节苣���辁胣뺁臣꾁ꏨꂀ胨节臣辁臣ꦲꏥ薀臣螌ꓧ骀苣ꮁ蛥讧裦鞁臣뒠郥ꮁ胣麡볤꺁裦蚈苣覜臣讂胣誁苣뎁节臣辁臣겜飦내鯦ꮁꓧ馁ꫨ袐돦讁苣鞾臣节臣ꮁ賥떕臣讂鿥난苣龔臣讂臣꺁鷦뚻臣膀蓨뒰鿥난苣ꢔ臣ꚁ苣袂臣芀ꫨ袐돦ꮁ苣讂鿥난臣뾪ꏨꮁ臣蒁臣膀迥뚺胦꺁鯥鎽苣뒰臣膀뿥膦臣芁苣낁諥놆臣ꪁ臣覂뫦ꎧ臣ꚁ껥ꢅ臣뚺뛦ꢁ臣膀뷤ꢔ迥붃臣ꪁ苣낁胣릟鳥궸臣肉鳦꺁䡰苣鞾苣꺁臣膍裥ꪁ蟩꺁ꇥ뢅臣龁臣뒰藩隌菣袃菣Ꚃ菣꺁뫦늶苣ꂊ臣讂胣릟鳥銂鳦릊胦몢ꫨ閁苣龁믦貏돦銂铧蒁臣ꪂ菣袃苣것菣隃蛥ꞁ믦貏臣讂胣薻迨貾胣㊁숵㊱蓢ꞁ䡰苣겸껥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖鞢껦莿胩㲲牢ਾ†覼苣벃菣꾂菣벃菣ꮁ臣醁臣릟鳥꺁郥邃菣膃苣膀郥릟鳥꺁蟩螤ꧨ鎨껥ꢙ臣ㆫ〰胥ꪜ뫦꺁뻥龔觧銂軦꺨臣膀믤许臣辦껥馁苣ꆝ믤ꮁ뻥ꎁ臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂臣ꢁ臣袂苣膀臣꺁ꋥ隮뿤늀菨鮊臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣讂胣꺾铧ꦉ臣膀呁䍃臣覂迥醁迥ꎁ臣릟ꓩꦉ臣覂麛苣誂苣骤臣馶믤릟ꓩ鞁臣节臣ꞁ臣辁臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†覼ꧨ鎨鿥난臣膀ꋥ隮臣벨详貁듧貏臣꾁㠴胣㞜芙雩ꖻ蛥膀鳧貏臣꾁ꖗ믤薆臣뺏苣貂臣꾉ꗥꞁ臣讂胣鞢껦莿胩ꚩ꣩꾁ꧨ鎨룤꺁鷦首臣ꚩ꣩릟鳥꺁뷤ꢔ臣貐駦ꮁꇨꎁ臣节苣蒁胣鞁臣鞁胣邝雦ꚩ꣩꾁胣鎁臣鞢껦莿胩ꚩ꣩貁臣뺁臣蒁臣ꪁ臣貂臣膀蓧릊臣莀臣覂苣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㤰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖辷ꗥ鞰胦貏闦뺁臣꾁苣鎃臣袂臣떅꿦꺁럧낕臣袨룦閳戼㹲 愠볯ꚩ雦뾪ꏨ芀觧骮臣릖돦ꞁ賦몤臣貂臣蒁臣躁苣膀ꧨ鎨铧꺁ꓦ鎽苣许꣨꺁臣誁苣ꮁꫨ붣臣讂胣ꦁ臣ꚩ꣩銂껥붖臣ꚁ臣讂臣ꮁ뿥颁臣膀鿥난臣袂臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃돦ꮁ雩馁苣붿諥薃ꃥ꾁믤许臣ꦁ뷥ꪁꃩ銂迥ꞅ臣貂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†覼菣ꮃ苣覲鳦誁苣뎁軥首裢ꚩ雦袼〱뺁臣꾁〱䱭볯銂믦貏菣뎃藩ꦷꇨ늶䡰⸷袼〲䱭볯ꮁ뫦ꎧ臣龁臣뢇뿦馁苣芀苣辁럦袐臣膀⸱洰銂ꒁ臣薻迨骃菣ꪃ髧鶁苣麁苣ꮁ꟧馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†楩볯ꮂ菣뮂菣ꒉ裢㊒臣꺁苣鞃苣ꮃ껦誁苣뎁臣貂苣꺁蛥릮觧銂믦貏菣뎃藩ꦷꇨ늶䡰⸷袼〲䱭볯ꮁ蓧貏髧ꮁ꟧馁胣뒰뗦袼듧㒄莄볯궸臣蒴〱裥鎖諥ꦸ臣讂胣뢇뿦늶臣螝룤ꮁ臣讂臣ꞁ뿦鞁臣꾌鯧鞁胣ㆁ〮䱭苣㊒臣꺁믦貏菣袃菣뾚臣貂臣貂臣뮧臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 椠楩볯뢇뿦늶铧ꎕ觥銈ꧨ首苣ꦃ菣ꮃ臣���ꓧꮁ뻥蒁胣貸蟩늶臣鞁臣薻迨ꪃ菣뢅럧鶡뛦炲㝈㈮苣ꢔ臣ꚁ蛥讧裦馁苣芀苣辁賦ꪛ臣膀⸱洰銂ꒁ臣薻迨骃菣ꪃ髧鶁苣麁苣ꮁ꟧馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†癩볯늶觥⾤蟦膿觥銈⸱洰銂ꒁ臣薻迨骃菣ꪃ髧鶁苣麁苣ꮁ꟧馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†覼賩ꒉ裢㒒賩袼ꇧ蒁賩ꒉ臣뺁臣薻迨뎹觩誁苣뎁매銣臣覲ꃧ馁臣趁臣芁苣覼苣薻迨ꪃ菣뢅럧鶡뛦炲㝈㈮볯㊈洰覼臣뮧臣芀賩ꒉ臣貮藥ꮁ듥誣臣龁臣뚺꟨馁苣뺁臣袂臣꾌鯧鞁胣ㆁ〮䱭苣㊒臣꺁믦貏菣袃菣뾚臣貂臣貂臣뮧臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 瘠覼苣鞃苣ꮃ껦銈㔲胥꺁苣鞃苣ꮃ껦銂믦貏菣뎃藩ꦷꇨ늶䡰⸷袼〱洰覼臣뮧臣膀냦뒵볯蒴㔴蓢覼룤ꞁ듧ㆄ蚈雩ꂊ룦鞁胣궖뛧蒚臣꾌鯧鞁臣뚺꟨馁苣芀苣辁賦ꪛ臣膀⸱洰銂ꒁ臣薻迨骃菣ꪃ髧鶁苣麁苣ꮁ꟧馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†楶覼믨辆裢薻迨릮駥궸臣膀菣莃菣ꢅ뷤讁苣随臣龁ꒁ臣ꚩ雦鶁苣麁苣讁苣蒴洵銂鯩膂胣랷郥馁苣芀臣꺁鯩膂臣ꚩ雦゙ㄮ䱭苣㆒꺁菣袃菣뾚臣貂臣貂臣뮧臣芀ꧨ首苣릟鳥ꢡ鷩ꮁ믦貏苣ꦃ苣릂菣것菣肃菣袼菣莃苣벃苣蚃苣莃苣뚊볯銂铧蒁臣ꆋ臣讂胣蒐菣것菣袃臣꾁裥꺁믦貏苣鞃菣莃菣벃苣ꢔ臣膀胣辷ꗥ鞰胦貏闦趀臣風볨꺁臣誁苣ꮁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 戠볯鲆苣躁胣랷蟩뎹鷦閳臣ꎻ苣誂臣鞁臣膀臩鎽臣覜諥Ꞁꋧ趪臣貂臣鲆苣躁ꧨ鎨돦銂铧蒁臣节苣蒁胣鎁苣꾁飩뎮觧ꪳ苣ꮐ苣龔裦ꦉ臣龁苣ꮁ觧ꮁ鳦ꢔ臣芁苣蚁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 挠볯趆ꧨ鎨胣许꣨꺁雦閳臣蒁臣貂臣ꮁ苣讂雧辂臣蒁뗧鲞苣몢ꫨ馁苣龁苣ꮁ胣肜裥꺁ꧨ首苣ꒂ苣꺁⸲趀볯肜냥覼苣ꢔ臣膀臩鎽臣貸蟩늶ꫨ肯臣ꚁ胣趆ꧨ鎨苣龮雦鞁臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ럧붥냦Ꞁ迨낕꣨겸ꧨ鎨戼㹲 ㄠ‮ꚩ꣩馁苣ꚩ雦銂꣨覼臣ꢁ臣誂臣뾪ꏨ馁苣芀郥鞃菣벃菣ꮁ胣趞꟨鞁胣蒴㔴蓢ꮁ蛥뒍臣龁믦貏協袼㔱胣㊜洰覼苣ꂊ臣讂胣蒐髧ꮁ鏨銂臣膀髧銂苣ꎁ臣誂若鲖臣龁臣麛韦鞁臣ꚩ雦銂꿥ꦤ臣랷郥鞁胣薆껥ꦉ苣꒮룦ꞁ鯥隌臣鮁苣芀菣것菣袃苣趏믨閁臣膀〳胣㎜莄臣㒧讁苣㞉芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†⸲†苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣貾胣冁敵敢⁣潃潬祮䌠畯瑮牥臣ꦁ臣ꆋꓥꢙ藥銂铧蒁臣鞃菣벃菣銂ꋥ隮臣ꒁ臣ꚁꫨ릁胣뎂菣讃菣낕苣袨闦鞁胣邝雦꺁ꛨ베臣誁臣ꚁ賦骮臣貂臣ꢁ臣誂跥趽臣몟臣趁볯ㆈ賩膀ꮂ菣뮂菣膀䱭胣낂菣���ꂃ臣ꦁ볯邵黦銂꣨鞮臣膀鷦首臣辦ꃦꮁ꿥馁苣놨껥Ꞁ苣閩뻤馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ㌠‮낂菣ꂃ鿦늉臣袂臣ꆏꓦꮁ苣讂뷥讅귥鲤鿦ꮁ苣誂듧貏럦ꖅ苣閁苣ꮁ觧뒾臣醁苣芀苣ꦃ菣낙胦貏臣袂臣낂菣ꂃ駩Ꞁ郧貏苣龔賥ꚭꧨ鎨볯뺁臣꾁믤辂苣꺁臩鎽臣貐껥讉껦覼臣鮾臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†돦骼苣궃菣벃苣袨闦馁苣뒠郥膀苣궃菣벃ꋥ隮苣ꚩ꣩궸臣邝雦讁苣릮飦ꮁ賥ꖈ臣趁苣袂臣ꮁ胣꺾铧ꦉꋥ隮苣뎦꿥馁苣龁苣꺁ꋥ랼觥ꢁ臣ꚁꇥ隌ⰲⰳⴵ菣ꪃ菣Ꞃ菣ꮃ菣袃菣뺂菣Ꚃ菣袼呔覼臣㊮뚺뛦銂駦薀铧蒁苣鎁臣貁鳦뺁臣蒁胣咂䍔臣ꆄ觨꺁藩隌苩莅賦몤雨ꞁ胣龔듧麃룤ꞁ돧銂苩莅臣讂臣ꢁ臣袂苣뒰듧隌臣貂苣ꢁ뗨늉臣覤苣誂胣鶁苣ꮁ苣誂苣궃菣벃苣놷뗨늉臣覤臣讂胣咂䍔苣ꢔ臣讂臣膂臣膀菣袃菣뾚臣㊫뚺뛦袼듧ㆄ䱭볯銂돦躁胣鞃菣벃菣銂〳胣㎜莄臣蒴芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣꺾铧ꦉ苣궃菣벃臣鞃菣벃菣誸臣隻臣邝雦讁苣꾁臣趁苣ꢁ鯧讫臣膀苣誂껥鎘臣袨闦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 䌠‮ꮂ菣誁苣뎁藩趯臣辷闦袨룦ꚩ꣩芀⸱†ꧨ鎨臣讂ꧨ首苣風볨꺁臣誁苣ꮁꫨ붣臣讂胣蒐菣것菣袃臣膀黨ꎧ臣膀듧㒄莄臣랆跥鞁臣薻迨厌䅄볯ㆈ鲀〲䱭볯銂諥袁苣芀郥뾚臣讓苣鞁胣뾚苣蚂臣辁苣뺂雦뺁臣꾁鯥讗臣ꚁꧨ首苣銯ꓥꢁ럦袐臣膀蛥릮觧銂껥ꦸ臣몛賥閁臣讂胣鞃菣벃菣銂迥ꊻ臣鮁胣㊁鲀㔲蓢ꞁ讁苣㞉韦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀볯ꢳ볯鞃菣벃菣薆臣ꮂ菣꺁裥ꎕ臣龮髩袂苣节ꯩ蒁꣨겸胥銂臣膂臣鎁臣貁臣讂臣膂胣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃룤꾁菣것菣袃苣讁臣랷臣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣芀볯ઽ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†⸲†苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣貾胣冁敵敢⁣潃潬祮䌠畯瑮牥臣ꦁ臣ꆋꓥꢙ藥銂铧蒁臣鞃菣벃菣銂ꋥ隮臣ꒁ臣ꚁꫨ릁胣뎂菣讃菣낕苣袨闦鞁胣邝雦꺁ꛨ베臣誁臣ꚁ賦骮臣貂臣ꢁ臣誂跥趽臣몟臣趁볯ㆈ賩膀ꮂ菣뮂菣膀䱭胣낂菣ꂃ臣ꦁ볯邵黦銂꣨鞮臣膀鷦首臣辦ꃦꮁ꿥馁苣놨껥Ꞁ苣閩뻤馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ㌠‮覂鳧誁苣뎁迩鲤臣袂苣ꊽ藦ꚭꓦ뮟臣袂苣龜迨랷藥銂臣覂臣릉뻥ꖁ臣讂胣ꦁ뷥ꪁꃥ袐臣꾁胣떅꿦銂铧隌귥ꚩ꣩袼臣龁臣ꎻ苣誂臣ꦁ뷥ꪁ郥骮触떮볯ꮁ뻤馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖붥臣鞁臣ꪁ臣꺾铧ꦉ臣麝귥ꢜꧨ鎨돦㲕牢ਾ†覼ꧨ首ꫨ붣裢릉껥꺁雦閳臣螌ꓧ閁苣ꪁ臣讁臣誂胣ꚩ꣩ꢔ臣ꚩ雦銂럧붥냦Ꞁ迨낕臣覂臣ꮁ苣鎃臣袂臣떅���꺁럧낕臣ꚩ雦뾪ꏨ꺁ꃩꞁ觥낿臣龁臣誁苣ꮁꫨ붣臣讂胣ꦁ臣ꚩ꣩銂껥붖臣ꚁ臣讂臣ꮁ뿥颁臣膀뿨ꂊ菦놠臣ꖻ룤꺁臩鎽臣薠苣芏藧閁苣龁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 戠볯鲆苣躁裢鞢迨閳臣ꎻ苣誂臣鞁臣膀臩鎽臣覜諥Ꞁꋧ趪臣貂臣鲆苣躁ꧨ鎨돦銂铧蒁臣节苣蒁胣鎁苣꾁飩뎮觧ꪳ苣ꮐ苣龔裦ꦉ臣龁苣ꮁ觧ꮁ鳦ꢔ臣芁苣蚁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 挠볯趆ꧨ鎨胣许꣨꺁雦閳臣蒁臣貂臣ꮁ苣讂雧辂臣蒁뗧鲞苣몢ꫨ馁苣龁苣ꮁ胣肜裥꺁ꧨ首苣ꒂ苣꺁⸲趀볯肜냥覼苣ꢔ臣膀臩鎽臣貸蟩늶ꫨ肯臣ꚁ胣趆ꧨ鎨苣龮雦鞁臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†⹂†믩늉菣覃苣莐迨誁苣뎁럧뾆迨꺁鷩颭鳥ꚩ꣩芀ꧨ首臣咫䉓苣ꂊ臣ꚁ〱洰ꢁ臣膀럦袐臣膀〳胣㎜莄臣㊧鲀㠴駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀鿥난苣鞢껦ꮁ臣蒁臣뾪臣膀苣鞁귥ꢜ臣貂臣膀軦꺨菣벃菣銂铧蒁臣肸菩銂臩麊鿥난臣뮔럧鞁胣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀믤许臣風볨馁苣릉뻥ꮁ臣蒁臣뾪臣讂볯芸단꺁郥骮苣莃菣銂胥薀臣趏뿥ꚩ꣩꺁믤辂苣ꮁ铧蒁臣节苣蒁볯骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄲ㰰愯㰾䐯噉ਾ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄲ㰱愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ꋥ隮臣뎦꿥閁苣ꪁ臣뒠郥膀臣龁臣讦苣貂苣뎂菣讃菣꺁臣骁苣节룤꺁ꇨꮁ꣨覼臣릉뻥꒾臣肸蟨鞁臣蒁ꃥ袐胣ꚩ雦꾁臣꺁뻥龔觧꺁鷩颭鳥꺁鷦뚻苣肺臣鞁臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖떂菣ꊃ菣ꦃ뇥貏臣袂臣Ꞥ藨貏臣麝귥ꢜꧨ鎨戼㹲 袐꣨ㆈ〰䱭臣䚮畬摩䰠捡潴敳䴠摥畩銂郥肂苣蚁臣ꚩ雦銂믦貏껥ꢙ臣뮧臣膀〳胣㎜莄臣㊧鲀㠴駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀苣ꎁ臣誂賦ꪛ臣膀ꋥ隮臣ꒁ臣ꚁꫨ릁苣芀볯芸단꺁郥骮苣莃菣銂胥薀臣趏뿥ꚩ꣩꺁믤辂苣ꮁ铧蒁臣节苣蒁胣覼覼苣ꮃ菣趃菣銈汆極⁤慌瑣獯⁥敍楤浵룤ꮁꋥ隮臣讦苣貂苣뒠郥骼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ㄠ‮ㄠ〮䱭菩蚈苣䚒畬摩匠汥湥瑩ⵥ祃瑳湩⁥敍楤浵臣袂臣䚳畬摩吠瑥慲桴潩慮整䴠摥畩꺁〱䱭菣ꖃ菣隃臣뮧臣膀럦袐臣膀〳胣㎜莄臣㊧鲀㠴駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ㈠‮ꖎ꣧ꮃ菣鞃苣ꢔ臣ꚁ胣ꆸ雦꺁鿥난臣覂룤ꢃ苣䊒楲汬慩瑮䜠敲湥䄠慧⁲敍楤浵胣墁汹獯ⵥ祌楳敮䐭獥硯捹潨慬整䄠慧⁲敍楤浵胣誁苣뎁楂浳瑵⁨畓晬瑩⁥杁牡䴠摥畩誸臣뮔럧馁苣芀鏨銂臣膀迥ꊻ臣鮁胣㎁鲀㔳蓢ꞁ㐲胣㒜芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣ꚁ胣ꖻ룤ꮁ꣨覼臣ꊽ藦ꚭ髧릉뻥ꮁ臣蒁臣뾪臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰���㈱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ㌠‮醖苣鞁臣뎂菣讃菣銂牔灩敬猭杵牡䤭潲⵮杁牡䴠摥畩꺁ꯩ꒱若鲖菣ꖃ菣隃臣膀臣骁雦ꊝ臣ꢡ鷩銂铧骷臣膀곦蒁臣ꢡ鷩许苣꾃苣ꒃ臣뾩裥馁苣鎁臣ꮁ苣誂꟧鞁臣膀臣覂臣讂郥骮苣財臣ꚁ苣袂臣芀〳胣㎜莄臣㊧鲀㠴駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣뾪臣讂胣ꊂ菣ꮂ菣Ꞁ볯꒵볯鲖鷩誁苣뎁藩袼믩覼ꯩ꒱菩袼郥芙臣颫뇥ꢃ臣銻觨隌苣뒼臣膀臣龁臣뒼苣ꪁ臣覼臣벨详銂ꓧ馁菣ꖃ菣隃臣ꪁ臣뒠郥膀ꧨ首臣떂菣ꊃ菣ꦃ뇥꺁鷩颭鳥ꮁ臣蒁臣꺁ꧨ鎨鷦뚻苣肺臣鞁臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 戠볯Ꞥ藨貏裢䚒畬摩䰠捡潴敳䴠摥畩궸臣鞢껦貁귥ꢜ臣讂ꃥ袐볯㆚‮ꖎ꣧ꮃ菣鞃苣ꢔ臣ꚁ룤ꢃ苣䶒捡潃歮祥䄠慧⁲敍楤浵臣뮔럧馁苣芀鏨銂臣膀迥ꊻ臣鮁胣㎁鲀㔳蓢ꞁ㐲胣㒜芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†⸲†뻥覂苣龁苣궃菣벃臣蒁臣貂苣꒵藧ꚓ觨꺁ꓥ뎦苣몤臣骁볯ꢑ鯥ꮁ닦놾臣龁菨膱룥銂볤蚁迥붃胦貁臣讂볯膀苣ꦃ菣낙胦뾡迨袼郧貏뾡迨覼臣芁苣뒠郥膀ꧨ首臣Ꞥ藨貏臣麝귥ꢜ臣ꒁ臣ꚁ臣ꚩ꣩ꆝ믤銂뫦龁臣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†⸳†苣궃菣벃臣鎁臣風볨ꮁ臩袐臣讂ꃥ袐胣鎁苣覂苣䲒癥湩ⵥ潅楳⵮敍桴汹湥⁥求敵䄠慧⁲敍楤浵臣뮧臣芀髧ꮁ鏨銂臣膀迥ꊻ臣鮁胣㎁鲀㔳蓢ꞁ㐲胣㒜芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣趏냥覅룤ꞁ觧뒾髧ꪁ蟩麱髧覅닦ꢁ胣辀臩覅룤ꞁ鷩ⶒ믩늉臣隤ꛨ꺁룤릖苣몤臣뎂菣讃菣貁臣蒁ꃥ袐胣ꚩ雦꾁ꓥ뢅迨꺁鷩颭鳥ꮁ臣蒁臣꺁ꧨ鎨鷦뚻苣肺臣鞁臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖릟鳥뾪郥閳戼㹲ㄊ‮ꪃ菣뢅럧鶡뛦炲㝈㈮戼㹲 愠볯鶿귥뚺뛦骼곧肸菣뎃藩ꮂ菣Ꚃ菣㎠⸴朰볯뒰볯뢒闧뺁臣꾁蓨ꒂ苣뎃볯ㆉ〰洰鮼냦뢅賥誃菣ꪃ苣ꂃ協ㄠ㔷䱭胣견룤ꪃ菣뢅苣ꪃ苣ꂃ볯㎈朴볯銂〱〰䱭菣릂菣ꦃ苣뎂룤꺁냦袼듧㖄〰䱭볯ꮁ뫦ꎧ臣讂胣뒰藩隌菣袃菣Ꚃ菣咠袼듧ㆄ㔷䱭볯銂諥袁臣炦㝈ㄮ胣㞜㌮臣뾪꿧鞁胣蚈蟩뺁臣뒰苣ꂊ臣ꚁ럦袐臣讂胣薻迨鞁胣뾽铧뺁臣랆铨袼鲀莄볯鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 戠볯貸蟩馨뫦뚺뛦芀뷤ꢔ臣龁苣ꮁ胣鶿귥뚺뛦銂냦ꞁ뺯〸꺁꿦ꞁ룥袇臣膀믦貏臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†⸲†協袼菣ꪃ菣膃苣벃苣붂苣銯ꓥ⾩苣ꒂ菣벃菣뮃苣벂苣뎃菣肃苣뢂苣릂菣銯ꓥ覼胣ꮂ苣ꒂ菣꺁蛨袶賥ꦉ㔱〮鮼苣ꒂ菣벃菣龃菣ꮃ臣醃菣ꒂ菣袶賥ꦉ⸵朰볯ꦡ賥誃菣ꪃ苣ꂃ⸵朰볯銯ꓥㆩ⸵朰볯뒰〱〰䱭볯薻迨貾臣炮骼⸷숳ケ㈮胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯閼胣���䐯噉ਾ†⸳†協袼菣ꪃ菣膃苣벃苣붂苣隃菣릂붂苣鎃菣뎃菣ꮂ苣ꒂ菣뮃菣ꒂ苣Ꞃ苣袃菣궃苣覼胣ꮂ苣ꒂ菣꺁蛨袶賥ꦉ㜱〮鮼苣ꒂ菣벃菣龃菣ꮃ臣醃菣ꒂ菣袶賥ꦉ⸵朰볯ꦡ賥誃菣ꪃ苣ꂃ⸵朰볯견뫤ꪃ菣뢅苣ꪃ苣ꂃ⸲朵볯螃苣릂菣궃菣릂⸲朵볯뒰〱〰䱭볯薻迨貾臣炮骼⸷숳ケ㈮볯㒛‮匠䅄볯떂菣궃菣螃苣릂菣궃菣릂꿥ꦤ볯鮼菣궂苣袃菣벃苣㒹朰볯開觧蒵맧꺁菣鞃苣뎃뛦隌觧誁苣뎁苣벂苣뎃臣떆뛦隌觧꺁귧辇럦袐觧ㆩ⸰朰볯銯ꓥㆩ⸵朰볯뒰〱〰䱭볯랷郥鞁胣꺅닦鞁臣뚺꟨馁苣鮼믦貏뻥꺁䡰볯㖚㘮뇂⸰芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 㔠‮䘠䵌볯늶諧ꦃ苣袃菣릂鿥난볯芀觧覂苣궂苣㎹〮鮼苣ꦃ菣뎃臣떆뛦隌觧㖩〮鮼菣꾂菣벃苣㖹〮鮼냦ㆴ〰洰鮼믦貏뻥膀臣趁苣ꂁ臣龀苣讁臣랆跥馁苣芀믦貏뻥꺁䡰볯㞚ㄮ뇂⸰芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖龮雦设〵裢䎒䱔㑁䤭꺁苣ꮃ귧뮛苧뮛냦뎳该蚈黦㲐牢ਾ†鳦龮雦设臣꺛髧꾁胣䎁䱔㑁䤭꺁귧뮛苧膀苣ꒂ苣閃苣벃菣꺁闦膀臣袂臣꺾냥趸鷥肸胦銂ꫨ릁苣鎁臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ鷦首戼㹲䤊䙅볨ꎭ苣莃菣袼䡰讁苣ㆉ覼胣袼流牥桳浡倠慨浲捡慩胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥ㆷⴷ㐰ㄷ〭覼戼㹲뺁臣꾁볯炈㉈㔮臣覂⸶覼胣袼流牥桳浡倠慨浲捡慩胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥ㆷⴷ㐰㈷〭覼戼㹲ꊂ菣閃苣ꦃ苣뎃䅐鞃菣벃菣늂菣骼䡰⸴讁苣㚉㔮胣袼流牥桳浡倠慨浲捡慩胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥㢷ⴰㄱ㐲㠭覼戼㹲䤊䙅ꧨ首苣鞃菣놂菣뾂菣膀볯䆈敭獲慨⁭桐牡慭楣膀苣뾂菣낂闧랏〸ㄭ㈱ⴹ㘴볯㲉牢ਾ䕉뮛ꗦ릂菣ꪃ菣鞃胣袼流牥桳浡倠慨浲捡慩胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥㢷ⴰㄱ㐰㐭覼戼㹲ꪃ菣뢅볯㢈┵볯膀볯䖈䑍胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥傷じ㤹ⴵ覼戼㹲薣뷧㲮牢ਾ畍瑬灩潨⁲䥉鯩鞰돦開苣릂菣ꂃ胣袼䕇䠠慥瑬捨牡膀苣뾂菣낂闧랏㠱ㄭ㄰ⴸ㘰볯㲉牢ਾꧨ겖臣뾪ꏨ㲽牢ਾ駩떥럧鶡뛦袼⸰䴵菣뎃藩궸臣ギㄮ낂菣뾂菣뎃藩覼볯鎁苣ꮁ뗦겼臣龁諨銂苣ꦃ菣꺁⬨뒁臣꺽臣覼戼㹲设볯㲚牢ਾ㔸ꪃ菣뢅⸳洴㱌牢ਾ苣ꮃ苣龃菣뢅⸱㜴쉧ケ〮朲戼㹲䠊䱐覭듧꺁냦㲴牢ਾ룤風臣ꚩ雨銂〱洰ꆃ苣랂菣뎃菣벃룤ꞁ郥辂臣膀偈䍌귧骴臣뒰臣ㆧ〰䱭臣鞁胣궂菣莃菣鞁胣낕鯥趏믨閁臣ꚁ럦袐臣讂胣㲂牢ਾ뫦늶苣㊒胣㢜蓢ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀戼㹲낙ꗦꦷꇨ늶볯よㄮ칍ⶲ苣ꦃ菣뎃볯袼臣貂臣뢵볦鞁臣꾊苣릂菣ꂃ臣⢮⤭臥ꮁ뷧辁볯㲉牢ਾ뻤骼戼㹲츊ⶲ苣ꦃ菣뎃⸰朹뇂⸰㈰㱧牢ਾ偈䍌귧骴臣뒰戼㹲誸꣨꺁ꧨ겖苣㆒〰䱭菣릂苣ꪃ菣肃菣궸臣袐苣鮁胣䢁䱐覭듧꺁냦ꞁ〱洰ꢁ臣膀苣ꎃ菣鞃臣膀闦麛迥ꊻ臣鮁臣랷郥馁苣芀戼㹲뚺뛦銂鲀莄臣㚧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣㲂牢ਾ鯥骮뫦늶볯ㆈ┲菣ꪃ苣궃菣ꊅ藩궸臣㎮㔮‥ⴵ苣ꮃ菣떂菣膃菣뢅볯㲉牢ਾ뻤骼戼㹲袃菣꾂菣궃藩���㐲朰뇂⸵朰戼㹲㔊릂菣鮃苣ꪃ菣ꮃ藩㞸朰뇂⸲朰戼㹲䠊䱐뒰〲〰䱭戼㹲誸꣨꺁ꧨ겖苣袐苣鮁臣㊦〰洰辇臣馁苣芀戼㹲뚺뛦銂껥ꦸ臣㎧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣㲂牢ਾ鿦늉뫦늶볯㲚牢ਾ敇䍬摯⁥求敵删慥敧瑮뫦늶苣뾽铧뒛觥ꮁ菣袃菣銂闦麛苣ꎁ臣誂迥ꊻ臣袂臣麛韦閁臣ꚁ럦袐臣讂胣㲂牢ਾ돦骼ꋧ龮臣ꚩ雨꺁鷥肸臣ꚩ雦銂铧蒁苣龁苣ꮁ胣鎟觨ꚩ雨銂돦ꖅ臣袂臣蚈闦趉臣랷郥馁苣鎁臣貁蟩膦臣芁苣芀戼㹲鎟觨뺯藧꺁ꫨ붣볯㲚牢ਾ苧뢅蓨뒰藩ꂴ䥉苣䢒䱐覭듧꺁냦ꞁ蛥讧裦鞁臣ㆦ〮杭洯鶿귥뚺뛦ꢁ臣讂胣㲂牢ਾ뿤颭뫦늶〱볎銂偈䍌귧骴臣뒰〹볎ꢁ郥辂臣ꚁ⸰〱볎⽧볎貸蟩馨뫦뚺뛦銂뻥讂胣㲂牢ਾ⸰〱볎⽧볎뚺뛦ㆲ츰䲼苣늂菣ꮁ菣벃菣馁苣袼⸱츰枼菣벃菣覼胣㲂牢ਾ触蚠戼㹲ꚩ雦貸蟩㲈牢ਾ偈䍌냦궸臣㊧츰枼ㄯ츰䲼臣ꚩ雦誁苣뎁鿥隺觧ꪳ臣뚺뛦銂ꫨ붣臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㌱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖ꢙ藥誁苣뎁苣ꮃꫨ붣戼㹲 䴠汵楴桰牯䤠뮛냦뎳该ꚃ菣莃菣꺁蛥뒍菣것菣袃苣떂菣ꊃ苣뾂菣袃苣벃苣ꖃ菣벃苣벃臣ꖎ뛧鞁胣ꦸ뫥銂〱뇂莄臣궨껥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ꢳ볯떂菣궂菣것菣뾂菣銂냥ꪁ臣ꢁ苣㊂蚈雩誸꣨꺁룦ꚺ臣낈臩閁臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†蛥떔뫥讁苣늂菣銂迥誂蟥馁胣늂菣⾫苣ꮃ铦膌뷤銂裥궖臣ꪁ臣袂臣ꮁ胣ꢂ菣馃菣벃菣꺁臥ꊝ臣뾲臣ꚁ돦辄럦辁裥궖臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†偈䍌귧骴臣뒰볯蒴⸱洰覼苣랆跥鞃菣莃菣閃苣벃菣꺁룤꾫臣ꂊ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꮃ늂菣꾔賦鎽臣肸ꯧ銂냦ꮁ藥貂苣ꢁ胣鮯껧鲽铧ꮁ苣ꎁ臣뒰臣늂菣꺁ꯧꢅ뷤ꮁ臩낁苣讂胣鞰돦貁迥誂뻨뺁苣ꪁ臣袂臣ꮁ苣ꎁ臣誂臣膀苣ꮃ苣랆跥鞃菣莃菣閃苣벃菣ꢅ뷤ꮁ럦ꂊ臣讂胣薿ꛨ貁臣貂臣䢰䱐覭듧꺁냦銂뿨ꂊ臣ꚁ苣袂臣芀戼㹲늂菣ꢡ鷩讁苣辀飦閃苣ꮃ菣銂駩뮎臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†룤ꒁ臣뮛ꗦ銂駩떥럧鶡뛦ꮁ뗦겼臣膀蛥뒍菣ꦃ菣袃菣ꦂ菣ꂃ臣⢮⤫菣벃苣ꮁ鳦节뿨蒁苣ꮃ臣꾫臣꺽臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 肸臣꺁鯩떥苣낙ꗦꦷꇨ늶臣뢵볦鞁胣랆跥鞃菣벃菣꺁⴨麃菣꾂臣肜苣醿臣늂菣꺁믤꾫臣꺽臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 뮛ꗦ릂菣ꪃ菣鞃苣覼臣龁뻥膀苣袃菣莃菣貁苣ꮃ铦膌뷤ꞁ臣ꪁ臣늂菣꺁ꯧꞁ뗧辂苣袂臣ꮁ胣낖臣蒁苣龃苣ꪃ臣莈苣ꢔ臣ꚁ臩낉裥銂돦辄럦辁裥궖臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首럦ꂊ觧銂蛥뒍菣ꦃ菣���菣ꦂ菣ꂃ臣⢮⤭菣벃苣ꮁ鳦节뿨蒁臥ꮁ볨鮁胣ꚩ雦뮷諥螉臣늂菣ꢁ臣鞁臣讁苣ꖎ꟨馁苣袂臣ꮁ臣讂胣ꢳ볯䦚䙅ꧨ首苣鞃菣놂菣뾂菣貁駩떥럧鶡뛦뢵볦릂菣ꪃ菣鞃臣ꖎ꟨鮁臣膀駩떥럧鶡뛦銂郥蒁룤銁臣膀ꋧ龮臣蒐ꧨ首臣ꖈ胣ꮁ돦開臣讂苣蚁跥蚈臣ꊛ苣ꚁ臣讂苣蚁ꋧ趪臣讂胣ꚩ雦ꊂ菣ꪃ苣벃苣벃臣릂菣隃苣ꮃ룤ꮁ臣ꎁ臣誂꣨꺽臣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†畍瑬灩潨⁲䥉菣讃菣袃臣뮛ꗦ鮃菣肃菣銂꣨꺽臣膀鯩떥苣늂菣誸臣뮛ꗦ릂菣ꪃ菣鞃臣궸뿥ꮁ臣ꎁ臣超뷧馁苣芀鯩떥菣ꮃ菣벃臣覂臣㊮臣꺁鯩떥苣馃菣릂菣讃菣袃臣ꖎ뛧鞁胣覮藥讓苣ꎭ臣蒁뷤꺽臣궨뷧馁苣芀닧肝菣벃菣銂铧蒁臣膀껥ꢅ鏨꺁귥銂ꛨ蒁胣늂菣꺁매ꖇ苣늘臣芀鯩떥苣뮛뫦ꮁ軦骶臣讂胣㲂牢ਾ苣ꮃ苣许꣨꺁臣誁苣궨껥鞁臣뮛뫦ꞁ胣뮛鳥貁觢㎧〰ꮁ臩馁苣뺁臣膀觥节臣ꚁ鯩龝臣鮁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄲ㰴愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ苣ꮃ菣벃菣ꎂ菣낂戼㹲 늂菣銂觥节臣ꚁ鯩龝臣鮁臣貾胣뮛뫦銂裥誂胣覮藥讓苣꾁臣鞁胣뮛ꗦ꺁軦骶苣螈苣膀鯩떥菣ꮃ菣벃苣䶒汵楴桰牯䤠ꚃ菣莃菣讁苣꾁臣馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首苣ꚩ雦ꊂ菣ꪃ苣벃苣벃臣릉껥꺁ꃩ辺臣궃菣覃臣讂胣鎁臣讉ꃩ꺁臣膂臣膀⴨낙ꗦꦷꇨ늶苣袃菣莃菣뒁臣蚈黦薀臣肜苣醿臣鎁臣銂ꋧ趪臣讂胣㲂牢ਾꧨ首苣뎏臣覂럥뢁菣벃菣馁苣芀臣骁胣㊁臣뺁臣꾁臣貂믤誸臣䦮䙅볨ꎭ꣦隺볯것菣뎃☱浡㭰覼胣ㆁ臣꺁鿥隺觧ꪳ볯것菣뎃覼胣ㆁ臣꺁ꧨ鎨ꧨ首ㄣ볯것菣뎃覼胣ㆁ臣꺁鿦늉꿥ꞅꫨ붣觧袼菣벃菣㖳볯膀ꒁ臣ꚩ꣩ꚩ雦⎙袼菣벃菣㚳볯膀ꒁ臣몟뫦ꦉ돨袼菣벃菣㞳볯膀臣袂臣ㆳ臣꺁䕉莼귦馨뫦袼菣벃菣㢳볯銂럦ꂊ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†ꒁ臣몟뫦ꦉ돨袼菣벃菣㦳볯膀ꒁ臣ꚩ꣩ꚩ雦⎙袼菣벃菣ㆳ覼胣ㆁ臣꺁鿦늉꿥ꞅꫨ붣觧袼菣벃菣ㆳ覼胣ㆁ臣꺁ꧨ鎨ꧨ首㐣볯것菣뎃㈱볯膀ꒁ臣몟뫦ꦉ돨袼菣벃菣ㆳ覼臣袂臣ㆳ臣꺁䕉莼귦馨뫦袼菣벃菣ㆳ覼苣뮷諥鞁臣膀곧㎬臣袂臣견꺁ꧨ首苣붿諥馁苣芀菣벃菣ㆳ讁苣㊉銂铧蒁胣ꚩ雦㎙臣袂臣㒳臣貐臣醃苣벃菣銂맧誂뿨鞁臣膀곧㖬臣袂臣견꺁ꧨ首苣뮷諥馁苣芀ꧨ首菣벃菣ꎂ菣낂菣뾂菣뎃苣ꢡꮁꓧ馁胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㔱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 뮛냦뎳该芀苣ꮃ苣궃菣覃臣讂髩膀畍瑬灩潨⁲䥉菣讃菣袃臣뮛ꗦ鮃菣肃菣銂꣨꺽臣膀鯩떥苣늂菣誸臣뮛ꗦ릂菣���菣鞃臣궸뿥ꮁ臣ꎁ臣超뷧馁苣芀鯩떥菣ꮃ菣벃臣覂臣㊮臣꺁鯩떥苣馃菣릂菣讃菣袃臣ꖎ뛧鞁胣覮藥讓苣ꎭ臣蒁뷤꺽臣궨뷧馁苣芀닧肝菣벃菣銂铧蒁臣膀껥ꢅ鏨꺁귥銂ꛨ蒁胣늂菣꺁매ꖇ苣늘臣芀鯩떥苣뮛뫦ꮁ軦骶臣讂胣ꦁ뷥ꪁ鯩Ꞝ胣뮛뗦誁苣뎁鯩鮊苣궨껥鞁胣뎳该銂꟥膂苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄲ㰶愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꮃ苣뎳该鞁臣貾胣뮛뫦銂裥誂胣覮藥讓苣꾁臣鞁胣뮛ꗦ꺁軦骶苣螈苣膀鯩떥菣ꮃ菣벃苣䶒汵楴桰牯䤠ꚃ菣莃菣讁苣꾁臣馁胣ꢳ蓦놷臣뮛ꗦ릂菣ꪃ菣鞃臣袂臣ꚩ雦ꊂ菣ꪃ苣벃苣벃苣늂菣讁苣随苣몇臣芀戼㹲ꢳ볯릂菣隃苣ꮃ苣몛껥뚺뛦ꮁ鯧ꖎ藥貂胣뮛ꗦ릂菣ꪃ菣鞃臣袂臣뮷諥螉苣늂菣讁苣꺵臣몇臣鮁苣鎁臣节臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 늂菣⾫苣ꮃ铦膌뷤銂蛥뒍菣것菣袃臣覂迥誂蟥鞁胣膍裥ꪁ蟩꺁鯥骮뫦늶苣ꮐ苣뎹髧ꮁ臣蒁臣袼껦躚⸳覼苣ꮃ苣뾹臣龁臣뺁臣궶賦馁苣芀菣ꦃ苣蚃苣莃苣ꦃ菣鞃臣蚦臣膀苣벃菣뾂菣鞃菣莃菣閃苣벃菣ꮁ뷧趁胣㊁鲀〶裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀雩讧臣袂臣芵뫤芙雩銂䕉꾃菣꾂苣벃菣ꮁ꣨늌臣讂胣㲂牢ਾ돦骼鯥骮뛦ꮁ䕉늂菣銂闩辁铦꺽臣馁臣讂臣膀鯩꒱臣讂臣ꢁ臣芁苣芀臣貂臣몛껥芙雩銂듧ㆄ駦鎖臣뚈駩馁苣鎁臣ꞁ鯥뾁臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㐊㔮†苣ꮃ鿦늉戼㹲 몛껥貾胣늂菣銂跥蚈臣辇臣䢮䱐覭듧꺁냦ꞁ쌳㖗裥鎖듦蒵臣膀苣ꮃ苣뾹臣龁臣뺁臣궶賦馁苣芀雩讧臣袂臣芵뫤芙雩銂䕉꾃菣꾂苣벃菣ꮁ꣨늌臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†뷤ꢔ觥ꮁ敇䍬摯⁥求敵匠慴湩删慥敧瑮苣랷郥鞁臣袼껦躚⸳覼뻥膀苣ꮃ苣膍裥ꪁ蟩꺁鿦늉觥ꮁ藥貂胣늂菣銂맦ꎁ臣뺁臣ꮁ뛧膌臣讂胣蚯냥릮駥薆臣ㆧ鲀㐲駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣ꚩ雨꺁鋨몙苣늘臣芀雩讧臣袂臣芵뫤芙雩銂䕉꾃菣꾂苣벃菣ꮁ꣨늌臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†鿦늉뫦늶苣䢒䱐覭듧꺁냦ꢁ뷧趁迦袁苣鎁臣ꮁ苣誂胣鎟觨鞁臣늂菣銂蓨鎟臣讂胣늂菣銂鲀芙雩讁臣ꚁ냥ꪁ臣ꢁ苣㎂鯥뒰苣鮏臣ꚁ듦蒵臣讂胣讖꟥誁苣뎁뗧蚺駦鎖苣䦒䙅菣벃苣랂菣袃臣風賩馁苣芀蓨鎟뻥膀苣ꮃ臣낵鿦ꮁ臣醁苣隺若貁臣趁臣蒁苣芀戼㹲ꢳ볯䦚䙅苣ꮃ룤꺁菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃鿦늉苣鮸苣馁臣膂臣鞴뗦꺁뿨ꂊ臣薿ꛨꮁ臣讂臣ꢁ苣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ戼㹲 覭鯩릂鯩鞰돦開꣦隺臣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣讁苣릮飦ꮁ귨ꖈ臣���貂苣릁臣ꞁ臣讂胣㒂〮臣覂⸶꺁雩꺁䥰胥뺁臣뎳该馁苣뾂菣醃苣ꪳ꣦隺臣늂菣誸臣讦苣鎁臣貁臣趁苣芀䥰臣鎁臣蒯鯥隤臣芁苣뾂菣醃苣ꪳ꣦隺臣늂菣誸臣讦苣鎁臣貁臣趁臣蒁胣㎂㔮膀⸴㔵胣㖁㈮膀臣袂臣㖳㠮꺁䥰菣벃苣벃苣貐껥鞁胣늂菣뮔菥誸臣ꦃ菣ꮃ臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㜱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 躽菣馃菣꺁苣뎃菣꾂돨궃菣螃苣뎃苣袼⸱츰枼볯ꞁ臣궂藩놄냦떅듧䦠馨뫦袼䥰⸵覼臣鎟觨뺯藧銂胣늂菣鎟觨꺁룤ꮲ胦銂迥隦賥馁苣龁苣ꮁ铧蒁苣芀臣꺁菣뎃菣꾁뗨뮟臣龁苣ꮃ铧较臣꺛ꛨ鲤鿦ꮁ苣誂菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃臣覂껥鎘臣颭裥ꞁ臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 䌠䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨꾁⸴讁苣㖉㘮臣炮蒯鯥薆臣ㆧ鲀㈲臣邃菣覃臣낕臣覂苣讂臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 䌠䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨꺁鳦节ꇩ鞑臣邃菣覃臣랼뫥꾴ꧧ醃菣뮂菣袃臣㒯㌮臣覂⸵꺁䥰꿧늛蛥ꞁ觢㦧┰臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†鿥隺觧ꪳ臣ꒁ臣ꚁ胣꺛ꛨ鲤鿦ꮁ苣誂⸴鲀⸵꺁䥰菣벃苣벃臣鎖臣蚛鷦閁苣龁ꒁ臣뮸ꛨꪁ菣뎃菣貁臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣袼룤膦臣邃菣覃菣뾂菣뎃臣ꒁ臣ꚁ臣뎛鷩芏藧覼胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ苣ꮃ뗨뮟臣袂臣ꎧ黦㲐牢ਾ†鯩鞰돦開臣袂臣鎟觨꺁뻥膀臣릁臣꺁苣ꮃ苣莿뫥袨苣ꢔ臣ꚁ뗨뮟臣讂胣뮔菥閃苣ꒂ菣銂苣뎃菣ꖃ菣뾂菣꺁菣벃苣ꮃ菣벃菣覃菣ꒂ菣⾖菣莃菣꾃菣꾂臣鶿귥鞁胣궃菣ꮂ菣ꢂ菣ꊂ菣莃菣꾃菣꾂苣讻臣ꚁ苣벃苣ꒂ菣馁苣芀뗨뮟臣龁苣ꮃ铧较臣ꎧ黦銂浉条入慵瑮吠붂菣袃苣Ꞃ苣袼菣벃苣ꞃ菣㊳〰⸳㌰볯銂铧蒁臣財臣芀뗨뮟臣袂臣ꎧ黦醃菣ꆃ菣뾂菣銂ꇨ㖨臣몤臣芀뗨뮟臣ꢃ雩꺁触蚠苣ꢔ臣ꚁꇨ蒁胣骮蟩馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄲ㰸愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ돦骼룤風臣讉ꃩ꾁苣ꮃ铧较꟨邞臣龁苣꺁鿥겜髧ꪁ껦躚苣몤臣节臣ꞁ臣讂胣ꢡ臣낵鿦醃菣ꆃ菣뾂菣銂ꛨ骮臣ꚁ臣讂胣ꢡ臣邃菣覃ꓦ몇菣ꦃ菣벃苣벃臣鶈鳦궨껥銂ꓧ鞁臣蒁苣芀苣ꮃ臣ꦉ郧蒚觧Ꞁ臣覤賥袼鿦늉놄鿦貾臣늂菣꺁迥꺸臣ꦁ볯蒂苣ꮃ臣邃菣覃臣ꊽ諧誁苣뎁꟧開臣袂苣膀菣뎃菣銂귦몢臣貐껥馁苣龁苣ꮁ菣뎃菣鲤蟥醃菣ꆃ菣뾂菣꺁ꫨ肯臣薿ꛨꮁ臣讂臣ꢁ苣芁苣芀ꓦ몇臣貂臣蒁胣뺁臣꾁ꫨ趪臣貂苣邃菣覃臣芁苣낁胣讉该ꞁꏨꎭ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨꮁꛨ骮臣讂뗨뮟菣ꦃ菣���벃苣벃苣ꢔ臣ꚁ苣ꮃ苣낵鿦馁苣芀苣ꮃ臣馁臣ꚁ臣ꎧ黦誁苣뎁ꧨꆾ臣낵鿦鞁臣뮔菥讁苣財臣芀苣ꮃ铧较菣ꆂ苣ꮃ볯낵鿦鞁臣龔菣벃苣覼苣䦒慭敧畑湡呴꺁氦㭴䐱䜠汥䄠慮祬楳♳瑧讁苣讖臣芀菣벃菣邃菣꺁氦㭴潃瑮慲瑳朦㭴苣꾂菣莃苣鞁胣⚁瑬䤻慭敧䠠獩潴牧浡朦㭴菣ꦃ菣벃苣벃苣馁臣ꚁ臣邃菣覃臣꾁臣趁苣讦臣讂苣蚁臣ꪁ苣뺁臣许臣讂胣⚂瑬䰻湡⁥牃慥楴湯朦㭴苣뢁諦鞁胣⚁瑬䴻湡慵♬瑧銂臩鎂臣ꎧ黦馁苣⚋瑬主浵敢⁲景䰠湡獥朦㭴苣궨껥馁苣芀氦㭴慌敮┠圠摩桴朦㭴苣㆒〰뺁臣뾪꿧鞁臣늂菣것菣뎃苣ꮂ菣벃臣讂胣薿ꛨ貁臣貂臣讀胣꺁菣벃菣銂臩螈臣超裥馁苣芀氦㭴潒汬湩⁧慂汬朦㭴돦銂铧蒁臣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣銂럥鞁볥辁胣ꢡꮁꓧ馁氦㭴楍楮畭⁭汓灯♥瑧膀氦㭴潎獩⁥敒畤瑣潩♮瑧膀氦㭴䴥硡浩浵倠慥♫瑧꺁裥龜꣨骮苣銂铧蒁臣邃菣覃苣鲤蟥馁苣芀귦몢臣邃菣覃苣貐껥馁苣龁苣ꮁ胣鎁苣覂臣ꒀ臣뾪꿧貁뿥膦臣芁苣芀苣릂菣ꂃ臩袐胦꺁ꃩꞁ䡰瀯㑉〮胣㚜㔮臣늂菣ꮁ臣蒁臣風볨鞁臣ꦃ菣ꮃ菣벃苣벃臣覂꣦隺䥰菣벃苣벃苣ꢔ臣ꚁ菣뎃菣炉ꒀ苣袨껧馁苣芀볨ꎭ臣袂臣辦뫦隌껦躚臣膜闧馁苣芀⸴讁苣㖉㘮臣炮蒯鯥薆臣邃菣覃闦銂闦袁苣芀臣꺁뻥꺁雦뢛賥誁苣뎁ꃥ誑臣龁苣ꮁ胣邵黦銂硅散랂菣袃臣膀苣芀鿥隺觧ꪳ臣뺯臣讂ꧨ首臣랼뫥꾴ꧧ醃菣뮂菣袃臣袨껧芀돦骼ꧨ首臣랼뫥꾴ꧧ薼臣膀菣벃菣薆臣芁苣馁臣ꚁ臣邃菣覃〱┰臣뺯臣讂胣㒁㌮胣㖜㌮臣炮蒯鯥薆臣뎳该馁苣邃菣覃臣醃菣뮂菣蚃菣뢂臣芁苣芀鿥隺觧ꪳ臣뺯臣讂ꧨ首臣랼뫥꾴ꧧ醃菣뮂菣袃臣袨껧ꮁ臣许꣨꺁볥銂铧蒁苣릁臣ꞁ臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㤱⼼㹡⼼䥄㹖ꢳ볯늂菣궃菣螃苣뎃苣醃苣벃菣銂迥ꞅ臣膀ꧨ首臣ꎚ臣몟뫦ꦉ돨銂꣨鞮臣ꢔ臣讂臣趁臣芁苣芀鿥隺觧ꪳ臣꾴ꧧꒀ臣ㆌ〰ꞁ胣ꚩ雦貁㔹꺁ꃥ袐胣ꚩ雦꺁鯧뺯菣벃苣뎃菣꾁㔹ㄯ〰ㄪ〰㴠㤠┵臣芁苣芀鿥隺臣꾴ꧧꒀ臣㦌┵臣膀ꧨ首臣ꒀ臣ㆌ〰꺁ꃥ袐胣ꚩ雦꺁鯧뺯菣벃苣뎃菣꾁〱⼰㔹ㄪ〰㴠ㄠ㔰ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ뗧鲞臣놠釥㲊牢ਾ†⸴鲀⸵꺁䥰꿧늛蛥ꞁ闦袁臣邃菣覃臣낕苣놠釥馁苣芀⸴鲀⸵꺁䥰꿧늛蛥꺁呃䅌ⴴ杉鿥隺觧ꪳ臣뺯臣讂듧趩볥ꚺ菣벃苣뎃菣銂ꃥ誑臣讂볯겜雦閳臣辦껥馁苣骮蟩蒚䕉늂菣蚈黦꺁ꃥ誑臣设臣ꒁ臣ꚁ臣뎛鷩芏藧覼胣꺛ꛨ鲤鿦ꮁ苣誂胣몟뫦ꦉ돨ꮁ꿦릁臣㒦㔮胣㖜㈮臣炮麃菣ꮂ菣꺁雩ꮁ鯩龝臣貂臣㎟臣꺁룤膦臣邃菣覃臣芁苣鎁臣銂ꋧ趪臣袼룤膦臣邃菣覃菣뾂菣뎃臣ꒁ臣ꚁ臣뎛芏藧覼胣㒁㔮胣㖜㈮臣炮麃菣ꮂ菣꺁雩ꮁꛨ龯臣���貂臣뮸ꛨꪁ菣뎃菣꺁闦銂ꃥ誑臣讂胣꺛ꛨ鲤鿦ꮁ苣誂胣몟뫦ꦉ돨ꮁ꿦릁臣㒦㔮胣㖜㈮臣炮麃菣ꮂ菣꺁雩ꮁ雦鞁臣閡釨ꪁ菣뎃菣貁臣蒁臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 릉껥꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣겜雦閳臣邵黦꾁⸴鲀⸵膀臣龁臣㒯㌮胣㖜㌮臣炮蒯鯥ꮁ菣뎃菣銂ꓧ馁臣ꢁ臣ꪁ苣膀臣鎁臣ㆧ〰臣覂㈲臣邃菣覃臣貐껥閁苣膀듧趩菣뎃菣랼뫥꾁〹胣㆜〱ꞁ臣讂胣节臣肸臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣炁蒯鯥꾁⸴鲀⸵ꞁ胣㎁臣꺁룤膦菣뎃菣貁臣讂胣节臣肸臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣炁蒯鯥꾁⸴鲀⸵ꞁ胣ㆁ讁苣㊉꺁菣뎃菣貁臣讂胣节臣肸臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣炁蒯鯥꾁⸴鲀⸵ꞁ胣꾴ꧧ邃菣覃볥ꚺ臣㦯鲀〱┵臣芁苣芀苣蚁룤ꒁ臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀䥰꿧늛臣㒯㔮胣㖜㈮臣膀ꒁ臣閡釨邃菣覃臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖龮雦设ㄵ볯䎚䱔㑁䤭꺁䑓ⵓ䅐䕇戼㹲 겜껥붖뻤꾁䑓ⵓ䅐䕇臣袂苣蒂藥誁苣뎁鷩蒂藥뚊藦ꆸ雦꺁呃䅌ⴴ杉臣ꚩ꣩銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ鷦首戼㹲袃菣릂낂菣랂菣袼牔獩䜭祬볯厉卄ꧨ首럧鶡뛦㊲韃볯䦈癮瑩潲敧膀苣뾂菣낂闧랏䍌㘲㘷볯㲉牢ਾ畎䅐䕇ꧨ首苩莅觥ㆤ쌰袼湉楶牴杯湥胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥亷ぐ〰覼戼㹲㐊胣㊜┰菣ꪃ苣ⶹ苣ꪃ苣뎃苣ꮃ裢㆒〮浭韃㈱苣Ꞃ菣袼湉楶牴杯湥胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥䖷㙃㈰㈵佂覼戼㹲袃菣릂낂菣랂菣厳卄돦開럧鶡뛦ㆲ쌰袼湉楶牴杯湥胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥䲷㉃㜶覼戼㹲䴊牡ㅫ袼駧늌闥馨볯꾃苣覃菣뎃苣ꪜ鷧늉苣뾂菣肃菣覃볯䦈癮瑩潲敧膀苣뾂菣낂闧랏䍌㘵㜷볯㲉牢ਾ敇䍬摯⁥求敵匠慴湩删慥敧瑮볯꾂菣麃苣벃菣ꮃ菣覼胣袼楐牥散胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥㊷㔴〹›〵洰膀苣뾂菣낂闧랏㐲㤵㨲㌠㔮覼戼㹲匊汩敶卲慮袼駧늌闥馨볯厉慴湩䬠瑩䤠袼諩鎟觨ꒉ볯袼楐牥散胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥㊷㘴㈱볯㲉牢ਾꧦꢙ볯㲚牢ਾ捘汥⁬畓敲潌正䴠湩⁩敃汬볯䦈癮瑩潲敧膀苣뾂菣낂闧랏䥅〰㄰볯㲉牢ਾ鯩鞰돦開铧뮛뫦袼坏⁌敓慰慲楴湯匠獹整獭胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥侷偓㌭〰볯㲉牢ਾꧨ겖볯㲚牢ਾ苣벃菣랂菣隃菣벃鿦늉觥ꢔ臣몛껥뚺뛦袼偈䍌귧骴臣뒰룤꺁〵ꆃ苣躃菣ꮃ臣袂臣㞳ꊅ藩覼戼㹲设볯㲚牢ਾ鋦貋귥銂郥肂臩鎽臣떂苣몂臣꺛鯧颻臣릮駥ꮁ볯㲚牢ਾ菣뾂菣벃菣㖫〰䱭苣ꂊ臣讂胣㲂牢ਾ藩뢅〷䱭苣ꂊ臣讂胣㲂牢ਾ偈䍌귧骴臣뒰臣辇苣㆒〰洰ꮁꫨ肯臣讂胣㲂牢ਾ껥ꦸ臣㚧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣㲂牢ਾ苣벃菣랂菣隃菣벃鿦늉觥袼敇䍬摯⁥求敵볯芀戼㹲릮駥讁苣뒛軦ꢔ臣讂胣辰臣蒁菣것苣궸胣늂菣銂ꛨ蚁臣ꮁ跥蚈臣辇胣ㆁ臣꺁菣讃苣ꮃ볯ㆈ쌰㆗挰覼臣蒴〵䱭苣ꂊ臣讂胣㲂牢ਾ鲀莄臣ㆧ맥뺁臣鶿귥馁苣芀戼㹲肊鿦늉觥몛껥뚺뛦袼偈䍌귧骴臣뒰룤꺁〳ꢂ苣躃菣ꮃ臣袂臣ㆳ┰藩뢅볯ઉ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†鋦���귥銂郥肂臩鎽臣떂苣몂臣꺛鯧颻臣릮駥ꮁ볯ꢂ苣躃菣ꮃ〳洰銂諥袁苣芀藩뢅〱洰銂諥袁苣芀偈䍌귧骴臣뒰臣辇苣㆒〰洰ꮁꫨ肯臣讂胣뚺뛦銂럦袐臣膀뫦늶苣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀苣ꮃ듦蒵뛦袼〱ꢂ苣躃菣ꮃ볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 㔠洰ꂁ뿥ꆮ臣骼苣뎃菣뎃苣벃볯肊鿦늉觥궂菣袃볯ㆉ〮䱭苣ꂊ臣讂胣肊鿦늉觥袼諩鎟觨ꒉ苣莃菣覼〵䱭苣ꂊ臣讂胣膃菣벃菣ꮁ鏨銂臣膀讁苣㖉꟧鎖럧蒂臣ꮁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ럦袐臣讂胣閱雩ꒉ룥袇꣦隺뫦늶胣뾽铧뒛觥ꮁꫨ붣臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†〵䱭臩莿껧ꮁ볯ꢂ菣较菣떂菣袼諩鎟觨ꒉ苣莃菣覼⸱洰銂諥袁苣芀뇥讖觥袼諩鎟觨ꒉ苣莃菣覼〵䱭苣ꂊ臣讂胣膃菣벃菣ꮁ鏨銂臣膀讁苣㖉꟧鎖럧蒂臣ꮁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ럦袐臣讂胣ㆂ韃菣ꪃ苣ⶹ苣ꪃ苣뎃䑓뎳该ꦷꇨ늶胣뾽铧鎽韦ꮁꫨ붣臣讂胣ꆃ苣랂菣뎃菣벃臣骼偈䍌귧骴臣뒰〹洰銂諥袁苣芀菣ꪃ苣ⶹ苣ꪃ苣뎃匭卄ㄠ쌰뎳该ꦷꇨ늶〱洰銂諥袁苣芀룤風臣ꚩ雨銂郥辂臣ꚁ菣ꦃ菣ꎂ菣ꂃ臣蚦臣膀闦麛迥ꊻ臣鮁臣랷郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 鎟觨뺯藧芀菣ꪃ菣랂菣뮘껥ꒉ볯鎟觨뺯藧覼洲銂郥肂菣ꒂ苣ꮃ臣䢫䱐覭듧꺁냦ㆴ䱭苣ꂊ臣讂胣鎁苣꾁츲枼츯䲼뿤颭뫦늶臣ꪁ苣膀㈭莄臣㚧菣袜雩覮껥ꞁ臣讂胣閽뫥节蟥邵꟨趇苣낹苣钿臣鎁臣ꮁ苣讂裥ꎧ苣늘귦馁苣龁苣ꮁ胣㖁츰䲼臣肸껥辇苣辰臣蒁菣ꖃ菣隃臣뮧臣膀㈭莄臣鶿귥馁苣芀뿤颭뫦늶㔲볎銂偈䍌귧骴臣뒰㔷볎ꮁ諥袁臣膀⸰층枼츯䲼臣뚺뛦銂뻥讂胣も㔮볎⽧볎뚺뛦㒲츰䲼苣䢒䱐覭듧꺁냦ㆴ〶볎ꮁ諥袁臣膀⸰츱枼츯䲼臣莿뫥ꢁ臣讂胣もㄮ볎⽧볎뚺뛦ㆲ츰䲼胣㊁韃牔獩汇ꚩ雦ꦷꇨ늶〵볎膀臣袂臣䢳䱐覭듧꺁냦㒴츰䲼苣龃苣궃臩莿껧ꮁ諥袁苣芀菣ꪃ菣랂菣뮘껥ꒉ鿦늉꿥ꞅ臣肜뗧莿뫥꾁⸰㄰볎⽧볎ꞁ臣讂胣뺔蟥ꮁ臣蒁臣蚈黦鞁胣꾂菣麃苣벃菣ꮃ菣ꞁ鿦늉臣龁ꧨ首苣㆒츰䲼臣龁苣ㆊ洰꺁뿦ꚺ臣궃菣覃臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣벃菣랂菣隃菣벃苣ꮃ铧ꮁ胣몟뫦ꦉ돨誁苣뎁ꧨ首苣䢒䱐覭듧꺁냦궸臣ㆧ츰枼츯䲼臣莿뫥ꮁ룥袇臣讂胣设볯㖚츰枼츯䲼鿥隺觧ꪳꧨ首뫦늶〸볎讼偈䍌귧骴臣뒰㈳츰䲼苣ꂊ臣讂胣麝苩莅ꧨ首铧ꮁ胣ㆁ츰枼츯䲼뿦ꚺ臣뚺뛦ㆲ츰䲼苣膀菣꾂菣ꂁ뿥ꆮ룤꺁쌲咗楲⵳汇ꚩ雦ꦷꇨ늶〵볎膀臣袂臣䢳䱐覭듧꺁냦㒴츰䲼臣ꂊ臣讂胣蒂藥ꚩ雦ꢔ臣膀〱볎⽧볎뚺뛦ㆲ츰䲼苣膀쌲咗楲⵳汇ꚩ雦ꦷꇨ늶〵볎膀偈䍌귧骴臣뒰〳볎膀臣袂臣ㆳ쌰蒂藥ꒉ〱볎ꮁ諥袁苣芀諩鎟觨鞁臣늂菣ꢔ臣膀〱볎⽧볎뚺뛦銂偈䍌���骴臣뒰룤ꞁ츱枼츯䲼臣閁苣ꮁ룥袇臣讂胣设볯㆚츰枼츯䲼뫦늶〴볎讼偈䍌귧骴臣뒰㘳츰䲼苣ꂊ臣讂胣麝苩莅ꧨ首铧ꮁ胣ㆁ볎⽧볎뚺뛦ㆲ츰䲼苣膀菣꾂菣ꂁ뿥ꆮ룤꺁쌲咗楲⵳汇ꚩ雦ꦷꇨ늶〵볎膀臣袂臣䢳䱐覭듧꺁냦㒴츰䲼臣ꂊ臣讂胣蒂藥ꚩ雦ꢔ臣膀츱枼츯䲼뫦늶〱볎膀쌲咗楲⵳汇ꚩ雦㖙츰䲼胣䢁䱐覭듧꺁냦㎴츰䲼胣誁苣뎁〱韃苩莅觥ㆤ츰䲼苣龃苣궃臩莿껧ꮁ諥袁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈲㰰愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꮃ苣鶁臣薌ꏨ讁苣随苣몇臣膀ꓥ뒁苣䢒䱐覭듧꺁냦ꞁ듦蒵臣ꚁ胣鶃菣ꊂ苣ꪃ菣ꊂ菣覃觧銂駩뮎臣讂胣ꢳ蓦놷臣Ꚃ苣ꮃ苣벃菣銂迥誂蟥鞁胣薿ꛨ貁臣貂臣늂菣궃菣螃苣뎃苣膃菣鞃臣Ꚃ苣ꮃ苣몢껥ꮁ臣ꎁ臣邁臣馁苣芀苣Ꞃ菣ꮁ偈䍌귧骴臣뒰苣肺臣鞁胣Ꚃ苣ꮃ臣覂냦銂駩뮎臣讂臣膂臣붻臣꾌苣芀苣Ꞃ菣鞴뗦銂臣覂臣㊫鯥낹苣钿臣芀⸵′늂菣銂䍘汥薣뷧ꮁ胣궟臣鞃菣벃菣ꊝ臣薆菩膃菣뎃菣벃臣醐臣袂臣ꮁ賦ꖅ臣讂胣늂菣銂ꒁ臣醁铧蒁苣뒠郥膀菣것苣랂苣ꦃ苣鞃菣벃菣銂迥뺯臥ꮁ賦ꖅ臣讂胣늂菣銂臣ꎁ臣誂諦鞁뻨뾁胣薆菩誁苣뎁ꓥꢃ菣ꎃ菣邃菣銂뷥邈臣讂胣薆菩膃菣뎃菣벃臣ㆫ韃菣ꪃ苣ⶹ苣ꪃ苣뎃䑓뎳该ꦷꇨ늶苣薅ꇥ馁苣芀苣貂臣ꪁ臣讁菣Ꞃ菣꾂臣膀곦蒁臣隤菩膃菣뎃菣벃臣ㆫ韃菣ꪃ苣ⶹ苣ꪃ苣뎃䑓뎳该ꦷꇨ늶苣薅ꇥ馁苣芀臣릁臣꺁苣ꮃ臣醰臣辁臣节ꒁ臣隃菣뎃苣것菣뎃臣袂臣ㆳ臣꺁裥邭蟩麃菣ꮂ菣것菣뎃苣ꮐ臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀苣벃菣랂菣隃菣벃鿦늉苣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ臣뾁鿦늉꿥ꞅ苣ꂊ臣讂胣늂菣궃菣螃苣뎃苣膃菣鞃苣ꢔ臣讂胣蒂藥誁苣뎁鷩蒂藥ꚩ雦꺁雩ꮁ냥ꪁ臣ꢁ苣ㆂ臣꺁胣隃菣뎃苣趀苣궃菣覃臣讂胣蚈귥辇菣벃苣벃臣蒂藥ꚩ雦ꢁ臣ꚁ触蚁胣鎁苣꾁苩莅觥꺁뗦몇臣袂苣麝苩莅ꧨ首臣蒂藥銂飩邁臣ꮁ뷥讫臣芀捘汥薣뷧꺁룤ꢃ苣随苣颻臣膀鯩떥苣뮛뫦ꮁ軦骶臣讂胣뮛뗦銂苣ꮃ꿦ꮁ㔲䅭臣뾪꿧鞁胣뮛鳥袼覼臣袂臣뮛諥袼覼苣肜ꓥꮁ꣨骮臣讂胣㊂臣꺁苣ꮃ苣뎳该馁苣뒠郥膀鯩膵苣㖒洰ꮁ꣨骮臣讂胣ㆂ臣꺁ꏨ꺽胣뺁臣꾁郥颁鯩邺臣袂苣螤闦꺁捘汥薣뷧ꞁꒁ臣늂菣銂돦開臣讂ꃥ袐胣뮛뗦銂ꫨ肯臣讂胣㚂숰㖱裥鎖胣뺁臣꾁럧鶡뛦꺁藥꾫臣꾏菨ꪁ돦開럨ꊛ臣醰臣辁臣节〸뮧该馁苣뺁臣뮛냦뎳该馁苣芀雩讧駦鎖臣袂臣鲁귦芙雩銂菣벃苣랂菣袃臣風賩馁苣芀苣ꮃ菣ꒂ菣ꞁ臣骁臣鎁臣ꮁ苣誂苣ꮃ苣꾔賦鞁臣蒁苣㊋臣꺁菣ꦃ苣蚃苣莃苣鞃菣벃菣銂돦辄럦辁裥ꊛ臣讂胣늂菣꺁裥ꊛ뻥膀鿦늉臣���讉ꃩꮁ뻥蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†苣벃菣랂菣隃菣벃鿦늉裢늂菣銂苣벃菣랂菣隃菣벃鯥骮뫦늶볯㖈┰菣뾂菣벃菣誁苣뎁┷藩뢅볯袼〵䱭볯궸臣ㆫ蚈雩꺽臣芀苣ꮃ苣䢒䱐覭듧꺁냦蒴〱洰ꞁ蚈雩銂麛맧誂뿨鞁胣袐꣨ㆈ蚈雩鞴뗦馁苣芀苣벃菣랂菣隃菣벃鿦늉觥銂苣ꮃ臣뒛軦ꂊ臣膀㔱臣覂㐲駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀苣벃菣랂菣隃菣벃鿦늉ꧨ겖苣䢒䱐覭듧꺁냦ㆴ〰䱭臣꺽臣鮏臣讂臣ꢁ臣袂苣膀鿦늉臣龁苣ꮃ苣놄鿦馁苣芀蓨鎟芙雩貾胣늂菣꾁뗨뮟臣隺若貁臣趁臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 늂菣낵鿦誁苣뎁꟨邞胣뮛냦뎳该誁苣뎁鿦늉臣貾胣늂菣銂뿦ꚺ꣨銂铧蒁臣낵鿦馁苣芀铧较菣ꆂ苣ꮃ苣뎂菣钃菣벃苣벃臣궃菣ꮂ菣较菣覃菣ꦃ苣隃臣袂臣⾳臣龁臣趃菣袃菣벃苣ꮁ뿤颭臣膀菣벃苣ꮃ苣ꪃ苣趃菣袃菣벃苣銂믤鞁臣ꊂ菣ꮂ苣隃臣讂胣낵鿦鞁臣늂菣뮔菥꺁꟨邞苣䦒慭敧畑湡⁴䱔苣閃菣Ꚃ苣ꊂ볯邃菣뢂菣뎃〲㌰〮覼苣ꢔ臣ꚁꇨ蚁胣낵鿦꾁菩肖臣讉ꃩ銂铧蒁臣財臣膀껥辇臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 꺛ꛨ鲤鿦ꮁ苣誂胣蒂藥䎃䱔㑁䤭꺁룤膦臣邃菣覃臣㖯ⰵ〴䐰꺁裥邭蟩麃菣ꮂ菣袼苣ꮃ苣龃菣뢅蓨뒰듧떅듧覼臣醿臣趽뷧ꮁ돦開臣讂뫥薹菣뎃菣ꢁ臣ꚁ迧貂臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤㖋銈呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉軥겖臣誁臣讂菣ꎃ苣讃菣몂菣ꂃ苣뾂菣떍럥袼䡃覼껥뮸듧麃苣뎃菣꾂돨趸듧ꦉ臣䖮䥌䅓臣袂苣骮蟩㲏牢ਾ†鳦龮雦设臣膀ꧨ鎨ꧨ首룤꺁䑃䌭佈议闧뾮룤내菨뾂菣醃苣ꪳ볯䢈偃볯꺁럦ꖅ菣馃菣銂껥辇臣讂臣膂臣膀藩ꂴ뗧袐藥ꮖ郥肝ꓦ骮돦袼䱅卉覼苣風볨馁苣芀苣떂苣鶃菣꾂菣벃菣ꮃ諦䎗⁄䡃ㅏ䠠偃䤠䝧苣뺁臣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ꮁ苣벃菣ꎂ菣낂臣讂胣䢂偃迥ꞅ꣦隺胣膓돨뎂菣袃菣벃菣膀臣袂臣䎳䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭龎雨ꚩ雦銂뗧袐苣떂苣鞊䑃䌠佈‱䍈⁐杉ꢁ藥ꮁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃苣鞴뗦鞁臣貾胣鶃菣꾂菣벃菣ꮃ苣떂苣鞊䑃䌠佈‱䍈鎃苣膃菣䦳䝧諦鎽苣ꂊ臣膀臣貂臣肜裥꺁껦躚臣閍跦閁苣龁䍈ꮁ뗧袐臣讂胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣銂듦蒵臣ꚁ胣邵郥鞁臣蒁臣蒁菣ꪃ苣궃菣誃菣鞊뷤貁臣貂臣꒙軥馁苣芀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ菣벃苣ꦃ菣ꎂ菣랂菣骃菣ꪂ苣랂菣벃苣銂諥袁胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣銂蛥ꚺ듦蒵臣ꚁ뗧袐臣���臣ꪁ臣ꖎ郥鞊뷤貁臣貂臣꒙軥馁苣芀곦蒁臣膀䵔늉듧龎苣ꂊ臣ꚁ胣钯觨趏뿥銂뗨鎁臣芀迥鲿苣ꮡ藩ꞁ臥ꊭ臣膀郥覅뫥銂㘹ꧧ麃苣꾂菣鞃菣벃菣궪臣随苣ꢙ蛥膀㔴渰ꞁ룦骮臣讂胣閍跦䢉偃臣辇臣钯뻤鞁臣몙觨馁苣芀ꧨ首뿦ꚺ苣膀⸴ㄱ杮洯讁苣㎉〰渰⽧䱭臣蒯鯥ꞁ郥覅뫥銂䍈莿뫥ꮁ꿥鞁臣鞃菣莃菣馁苣鎁臣ꮁ苣誂뷤邈臣龁꣦隺鯦骷臣몟臣蒁臣节臣膂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 膃菣ꒂ菣벃苣较菣릂苣벃跥ꎷ볯䎈佈볯내菨ꪠ볯䒈㑇覼苣䎒䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭꺁铧龔臣誁臣ꚁ铧蒁苣芀䑃䌭佈뾂菣醃苣ꪳ볯䢈偃볯ꎔ铧꺁臣膂臣膀䝄㐴듧麃臣蒵迦袁菣꾂苣벃䑰㘱苣覮껥ꮁ뷥ꪳ꟧ꖅ臣膀苣ꦃ苣袃菣릂臣袂臣ꪃ苣뎃菣ꪃ菣銂ꏨ뎶臣龁䑃䌭佈릟鳥궸臣릟ꓩ鞁臣芀臣꺁觧꺁䱅卉꺁臣膂臣鶃菣꾂菣벃菣ꮃ諦鎽苣膀䑃䌭佈‱䍈邝雦꺁뿦꺸觧ꞁ藥ꮖ賥鞁臣讃菣벃苣벃菣뎃菣붙苣떂苣ꮁ臣蒁臣鲽裦鞁臣芀苣떂苣鞊뷤銂苣閃苣讃菣ꎂ닧붣臣袼苣뎃菣꾂돨䆪볯膀곦蒁臣ꪃ菣뢅럧鶡ꏩꦡ냦궸臣辀黦鞁胣莿룧鞁臣芀苣떂苣鞊䑃䌭佈鞊뷤꺁杉뮔裥袼듧㖄洰覼苣膀ⵎ菣覃菣궂苣릂菣鮃苣꾂苣뎃苣龃菣ꢂ苣蚃菣隌귥趏뿥銂铧蒁臣鎃苣膃菣隌臣龁胣ꪜ뿤뺣苣떂苣鞊䡃ㅏ諦鎽苣ꢔ臣ꚁ㘹ꧧ麃苣꾂菣鞃菣벃菣銂苣벃菣ꎂ菣낂臣讂胣鎁苣꾁䑃䌭佈‱䍈銂跦覍臣膀菣ꪂ菣뎃賥Ꚃ苣꺂諦䎗ⵄ䡃ㅏ諦鎽臣袂苣鲤蟥閁苣讂胣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃菣벃苣ꦃ菣ꎂ菣랂菣骃菣ꪂ苣랂菣벃苣邵郥鎽臣鎃苣膃菣ꮁ뗧袐臣膀䵔늉듧龎臣꺁꿦늉迥鲿苣ꢔ臣ꚁ䑃䌭佈‱䍈銂껥辇臣讂胣ઁ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁雦閳臣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉軥겖鷦首臣뺔蟥ꚩ꣩꺁臣膂臣膀䱅卉ꮁ苣誂䑃䌭佈뾮룤내菨뾂菣醃苣ꪳ臣议闧것菣ꮃ苣骮蟩馁苣龁苣ꮁ꣨袨臣貂臣蒁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈲㰲愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†苣떂苣鞊䑃䌭佈鞊뷤銂胣鎃苣膃菣隌ꧨ겖臣鞁臣릂菣鮃苣꾂苣뎃苣龃苣ꮃ㘭鎃苣膃菣ꊂ菣覃颃苣떂菣벃菣銂郥肂菣ꪂ菣뎃賥궂菣袃苣ꢔ臣ꚁ菣ꪂ菣뎃賥馁苣芀畓晬ⵯ䡎ⵓ䍌䈭潩楴銂郥肂䥐剅䕃臣鎃苣膃菣隌ꧨ겖볯붣鏥⎁ㄲ㌳覼苣ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鞊뷤銂胣鎃苣膃菣隌ꧨ겖臣뮷믤閁苣ꚁ臣讂菣讃菣ꊂ菣꺁ꏨꂀ胨꺁軦ꢥ臣鎾臣ꚁ菣馃菣馁苣芀菣馃菣誁苣뎁뻤ꚵ臣貂苣떂苣몂軦꒙苣ꦃ菣ꞁ臣蚈鯩貾胣鎃苣膃菣随苣벾臣銂껥辇臣膀ꧨ首苣㖒츰䲼믤许臣肸껥辇臣鞁臣ⶦ〷蓢ꖻ룤���ꞁ蟥邵臣讂胣肜뗧龔裦ꦉ臣鎃苣膃菣⾳杉钯臣㊯臣覂꺁雩ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀㜭莄믤许臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鞃菣벃菣뎂菣蚃苣뎃苣芀닧붣苣떂苣鞊䑃䌭佈‱䍈⁐杉꺁苧뢅럧鶡뛦궸츸枼洯뚺뛦銂胣麃苣꾂菣鞃菣벃菣꺁苣벃菣ꎂ菣낂铧ꮁ铧蒁苣龁苣ꮁꫨ붣臣讂볯麃苣꾂菣鞃菣벃菣ㆈ黦ꮁ臣趁뫦늶㈱䱭臣薿ꛨꞁ臣讂볯芀臣꺁뫦늶〱츰䲼苣䦒浭汵湯㐠菣ꒂ苣궃菣것菣袃臣蒐苣Ꞃ菣ꮁ胣莼귦鞁臣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃苣벃苣ꢔ臣ꚁ諥袁苣芀菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃苣醃菣閃苣ꮃ菣ꞁꛨ蒁胣㒁蓢ꞁ㠱뇂芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†菣것菣袃듦蒵臣袂臣隃菣莃苣뎃苣芀菣것菣袃苣膀菣것菣袃듦蒵駥銂铧蒁臣膀듦蒵럧鶡뛦ꞁ麛듦蒵臣讂胣厂慥求捯⁫〳츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ胣莼귦鞁臣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃苣벃苣ꢔ臣ꚁ諥袁苣芀菣것菣袃苣㊒⸲숵㖱蓢ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣䎂ⵄ䡃ㅏ苣뎃菣꾂돨芏藧馨뫦誁苣뎁鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃꧨ首臣莿룧ꦉ苣膀㔱䱭鯧鮛믤趁믦貏菣ꪃ菣궃菣것菣膃菣벃菣薆臣뾪ꏨ馁苣芀鿥隺觧ꪳ臣袂臣膓돨뎂菣袃菣벃菣ꚩ雦銂敔湫癯⁡楄畬湥銂铧蒁臣貸蟩馁苣袼⸱ㄲ볯芀꣦隺뿦꺸觧꾁껥鎨뷥ꖗ臣许꣨꺁뻤ꮁꓧ馁뿦ꚺ臣뾪ꏨ馁苣骼戼㹲馨뫦늛럧ꚩ雦꺁臣膂臣貸蟩袼꿦ꖗꫨ붣臣龁苣꺁뻤覼戼㹲䌊ⵄ䡃ㅏ苣뎃菣꾂돨꺁뿤颭뛦莿뫥꾁⸵洷⽧䱭臣芁苣㲋牢ਾ룥袇骼†㘲㌮볎⁌㔨㜮杭洯⥌⬠㐠㤮㌷䱭倠䉔룥袇뛦₲‽〳볎⽧汭戼㹲貸蟩䊈볯ₚ〠㘮䱭⠠〳볎⽧䱭 ‫⸵洴貸蟩늶†〳〰杮洯㱌牢ਾ洲⁌㌨〰渰⽧䱭 ‫洴貸蟩늶†〱〰杮洯㱌牢ਾ洲⁌ㄨ〰渰⽧䱭 ‫洴貸蟩늶†㌳⸳渳⽧䱭戼㹲㈊䱭⠠㌳⸳渳⽧䱭 ‫洴貸蟩늶†ㄱ⸱渱⽧䱭戼㹲㈊䱭⠠ㄱ⸱渱⽧䱭 ‫洴貸蟩늶†㜳〮杮洯㱌牢ਾ洲⁌㌨⸷渰⽧䱭 ‫洴貸蟩늶†㈱㌮杮洯㱌牢ਾ洲⁌ㄨ⸲渳⽧䱭 ‫洴貸蟩늶†⸴ㄱ杮洯㱌牢ਾ‰‫洴貸蟩늶†渰⽧䱭㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖儊莿뫥蚈黦膀뿤颭胣誁苣뎁鳦릊鳦邙戼㹲 ㌠臣꺁闧ꪁ苣馨髧莿뫥袼㔲胣ㆁ〰胣誁苣뎁〷渰⽧䱭볯꺁鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ볯冈覼ꧨ首苣뾪ꏨ鞁胣蚈黦鎽韦ꮁ雦鞁臣ꢔ臣讂臣膀臣龁臣Ꞥ蟩ꮁꫨ붣臣ꚁ룤骮蟩銂㜭莄믤许臣趇뗧鶿귥馁苣芀蟥邵臣龁룤骮蟩銂ꒁ臣겋ꯧ꺁껥鎨臣蚈黦馁苣芀ꒁ臣冮ꚩ雦鶁苣麁苣ꮁ臣蒁臣膀ꒁ臣龮꣩讁苣꺁맥螝뗧鲞苣蚈黦벨飦뢛볯䎈䅏볯ꮁꃥ誑臣讂胣龮꣩鎽韦膀蟥邵䍑ꧨ首苣ꎧ蟥鞁胣许꣨꺁臣誁苣ꮁ裥邞臣讂胣ꎧ蟥貾胣蒐䍑ꧨ首苣궸胩ꞁ鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀蟥邵䍑ꧨ首臣覜諥龜駩꾁ꫨ붣韦꺁뻥㚌菣袜雩ꞁ臣���讂胣ꚩ雦꾁佃ꮁꃥ誑臣龁藥낧뿦ꚺ臣ꢔ臣讂胣낖臣辁ꫨ붣臣龁䍑臣覜諥龜駩꾁ꫨ붣뻥㊌芙雩ꞁ臣讂ਮ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯钼胣㲑䐯噉ਾ鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ볯冈覼ꧨ首臣貸蟩袼뻤覼戼㹲貸蟩䆈볯ₚ㈠⸶츳䲼⠠⸵洷⽧䱭 ‫⸴㜹洳貸蟩늶㴠㌠츰枼洯㱬牢ਾ㌲츳䲼⠠〳볎⽧䱭 ‫⸹㘷洷貸蟩늶㴠㜠〰杮洯⁌儨⁃⤱戼㹲ㄊ㐮洳⁌㜨〰杮洯⥌⬠㠠㔮洷貸蟩늶㴠ㄠ〰杮洯⁌儨⁃⤲戼㹲㈊㔮䱭⠠〱渰⽧䱭 ‫⸷洵貸蟩늶㴠㈠渵⽧䱭⠠䍑㌠਩⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首ꫨ붣胣龎雨ꚩ雦銂듧ㆄ⸲膀⸶㔲胣誁苣뎁⸳㈱洵⽧䱭臣貸蟩馁苣芀戼㹲貸蟩䆈볯ₚ㐠〰볎ꚩ雦ₙ蒴㔲杭洯⥌⬠㐠〰볎貸蟩늶㴠ㄠ⸲洵⽧䱭戼㹲貸蟩䊈볯ₚ㐠〰볎⁌蒴㈱㔮杭洯⥌⬠㐠〰볎貸蟩늶㴠㘠㈮洵⽧䱭戼㹲貸蟩䎈볯ₚ㐠〰볎⁌蒴⸶㔲杭洯⥌⬠㐠〰볎貸蟩늶㴠㌠ㄮ㔲杭洯ੌ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†菣것菣袃듦蒵胣鞃菣벃菣銂胣鞃菣벃菣鞴뗦ꢙ苣ꢔ臣ꚁ胣鞴뗦ꦷꇨ늶臣㎧鯥鞴뗦馁苣芀菣궃菣꾂臣膀듦蒵臣龁菣것菣袃臣Ꚃ苣ꮃ꿦ꮁ〱츰䲼臣蒐꣦隺뿦ꚺ胣ꚩ雦膀臣袂臣决ꚩ雦銂룤趇ꓨꞁ諥袁苣芀郥冄莿뫥銂뫤麛胣鞃菣벃菣芁臣誂郥袨ꒁ臣Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣ꢎꗥ閁苣讂꣨꺽臣ꒁ臣ꚁ臣膀뗧袐돦꺁菣것菣袃菣莃菣銂迥ꞅ臣貂臣蒁胣㊂⸲숵㖱蓢ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鞴뗦떮髩銂麛맧誂뿨馁胣Ꚃ苣꺂諦䎗ⵄ䡃ㅏ䠠偃菣ꪂ菣뎃苣咒步潮慶럧鶡뛦궸츲枼洯ꮁ룥袇臣讂胣뚺뛦銂룤龀臣㊧胣㒜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣Ꚃ苣ꮃ꿦ꮁ〱츰䲼諥袁苣芀㈲㔮뇂莄臣ㆧ駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀듦蒵껦躚苣㖒鯥낹苣钿臣芀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈袼䅓䠭偒볯銂敔湫癯ꦷꇨ늶룤ꞁ臩鎽臣貸蟩馁苣袼뻤骼⼱〲〬〰룥袇臣袂苣骀룥놨껥ꞁ臣讂郥覅뫥貁뻥覂苣讂볯芀䅓䠭偒룥袇뫦늶〱츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ諥袁胣㊁⸲숵㖱蓢ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣咂䉍觨ꂴ軥銂蛥떔뫥讁苣随苣몇臣膀菣것菣袃꿦ꮁ鳦躽〱䱭苣ꦁ뷥ꪁ껥ꢙ臣螃苣뎃菣馁苣芀髦肉臣꒮룦ꮁ裦馁胣鞴뗦떮髩銂麛맧誂뿨馁胣咂䉍觨ꂴ軥㆟〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣膀㈲㔮뇂莄臣蒴蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ㆂ⁎㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵匾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵‾〱츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ諥袁臣늉듧龎迥鲿苣鲁귦馁苣芀臥ꊭ뫦늶苣늉듧龎苣ꂊ臣龁臣ꢁ郥颁ꃩ辺臣鞃菣벃菣誁苣뎁苣Ꞃ菣ꮁ諥袁胣蒐苣Ꞃ菣ꞁ觨ꂴ軥ꢁ藩ꂴ臣趏뿥芙雩貁郥颁臣ꪁ苣袂臣ꮁ臣讂胣ꦁ뷥ꪁ㘹ꧧ鞃菣벃菣궪臣随苣ꢙ臣膀迥ꞅ돦랕㌶渰꺁㔴渰ꞁ郥覅뫥銂룦骮臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†菣벃苣ꎧ黦芀潓瑦慭鞃菣낂菣ꂃ菣뎃菣것菣袃胣䎌佈‱汅獩���整灭慬整瀮牰胣銂꣨骮臣ꚁ맥螝胥膀꣦隺臥꺷胣▁噃胣莿뫥袨껧ꒀ胣늛럧鎽臣꾁苣醃菣ꆃ菣뾂菣ꪁ臣銂苣ꢁ苣讂胣馨뫦늛럧芀迥ꞅ꣦隺菣벃苣銂꣦隺鯦骷臣膀醃菣ꆃ菣뾂菣늛럧鎽臣꾁苣ꊖ闦銂铧蒁臣鎽臣꾁苣讂볯㲚牢ਾ⁙‽甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⠾䄨㰠甯ⴾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾⥄ ㄨ⠫⽘幃⥂ 㰫甯䐾戼㹲込룤骼戼㹲夊㴠뢐藥ꚺ볯䆈猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾〵⼼畳㹢䄭猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾〳⼼畳㹢㰩牢ਾ⁁‽鳦辰볦醿럧ꮁ꿥鲿臣讂郥覅뫥㲦牢ਾ⁄‽鳦Ꞥ볦醿럧ꮁ꿥鲿臣讂郥覅뫥㲦牢ਾ⁃‽鳦Ꞥ臣袂臣肜냥뢼뿨骷胥꺁雩꺁뗧뺯럥꺁⼱ꮁ꿥鲿臣讂郥覅뫥袼ꓥ늛苧覼戼㹲䈊㴠늛럧꺁ꓥ늛苧ꞁ臣뺂臣㲍牢ਾ⁘‽䑃䌭佈‱䍈꺁뿦ꚺ㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 匠景浴硡菣궃苣ꦃ菣蚃菣鞃菣벃菣貀䡃ㅏ䔠楬慳琠浥汰瑡⹥灰趀臣膀꣨鞮臣龁맥螝胥銂铧蒁臣馨뫦꺁鯥낸럧꺁鯧ꊖ뿤낕볯劈猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹰볯銂뇦骮臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†꣦蒯髧ꒀ胣馨뫦膀䍑胣誁苣뎁ꧨ首臣邵黦貁믤许臣風볨馁苣ꆨ꿧蒚胥ꮁ郥뒇臣讂臣ꦁ臣讁苣뾪臣讂胣馨뫦꺁꣦蒯髧ꒀ胣馨뫦늛럧꺁鯧ꊖ뿤낕볯劈猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹰볯꾁觢ェ㤮ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣벂菣溭⽧䱭臣馨뫦莿뫥꺁맥螝菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃臣ꚉ⸰뢐藥ꚺ臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀苣궃臣袂臣决袼㈱㌮杮洯覼苣誂苣躽臣莿뫥銂駩辁胣馨뫦늛럧꺁ꒁ臣겅꟧莿뫥꺁ꒁ믤誸臣ꆝ믤㚶ㄮ㐮臣袂臣㚳ㄮ㔮臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐胣ꊂ菣뮂苣꾁蓧릊臣莀臣覂苣膀맧誂뿨閁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣벂菣誁苣뎁䱑볯ㆈ⸲渳⽧䱭볯袂苣节뷤蒁뿦ꚺ苣꒙臣膀꣦隺鯦骷苣节臣膂苣龁苣ꮁ铧蒁臣蒐꣦隺뿦ꚺ臣袨껧ꒀ볯溈⽧䱭볯꺁맥螝臣馨髧袼藥낧볯ꒀ臣㊮┰믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀苣궃臣袂臣决袼㈱㌮杮洯覼苣誂苣躽臣莿뫥銂駩辁胣蒐꣦隺뿦ꚺ臣覸蟩螤郥覅뫥꺁ꓥ開뿤낕볯█噃볯꾁〲ꪜ뫦ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣몢껥ꮁ냥ꪁ臣ꢁ苣貺臣꺁룤뒇臣讂菣벃苣鶃苣뎃菣銂꣨鞮铧ꮁ裥ꢔ迥붃臣馁苣龁苣ꮁ胣馨뫦膀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ臣袂臣ꚩ雦銂룤趇ꓨꚂ苣ꮃ臣궃菣覃臣讂胣蒐룤趇ꓨ꺁胥銂裥薀臣ꎧ黦馁苣芀꣦蒚臣覂鳦节臩蒁胥銂部ꢁ臣芀鯦骷苣趆꣨鞮臣膀꣦蒯髧ꒀ苣趆꟨邞臣讂胣㲂牢ਾ뻤骼戼㹲馨髧ꒀ볯溈⽧䱭볯₉龮髩꺁胥袼杮洯覼戼㹲㈊‵†††††††ㄠ㰲牢ਾ†††††††††㐲戼㹲 ††††††††㈠ਸ਼⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†㔲杮洯꺁꣦蒚胥讁苣肜苣ꂁ臣肸臣꺁胥꾁㈱杮洯ꞁ臣讂胣覸蟩螤룦骮胥讁苣ㆉ渲⽧䱭���ꒀ苣꒙軥馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣议苣꺁胥꺁맥螝臣ꆨ꿧蒚胥馁臣ꚁ臣ꦁ郥馁苣芀껦誂臣㊮臣꺁胥꺁맥螝臣뺁臣ꆨ꿧蒚胥ꮁ臩袐臣ꪁ臣鎁臣貁裥躘臣龁ꃥ袐胣肸臣꺁苧銂駩뮎臣膀鯦骷苣趆꣨鞮臣讂胣㲂牢ਾ뻤骼戼㹲馨髧ꒀ볯溈⽧䱭볯₉龮髩꺁胥袼杮洯覼戼㹲㈊‵†††††††㔠〮戼㹲 ††††††††㔠㔮戼㹲 ††††††††ㄠਰ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†맥螝胥꾁臣꺁胥銂駩뮎臣讂臣ꮁ臣讁苣覂臣馨髧讁苣⚉瑧㈻┰臣芁苣膀臣龁臣ꎁ臣膀룤ꒁ臣릂苣늛럧讁苣붐臣鞁胣늛럧銂蛥袨껧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 儠ꚩ雦꺁꣦蒯髧ꒀ胣冂ꚩ雦꾁껥뺁臣龁뿦ꚺ臣㚮臣꺁苣Ꞃ菣꺁뗧ꞁ臣讂胣冂ꚩ雦꺁ꒁ臣Ꚃ苣ꮃ臣醰臣辁臣节ꒁ臣冯ꚩ雦貁꣨릮臣貂苣겅꟧ꒀ臣㊮┰믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀ꒁ臣冮ꚩ雦馁臣ꚁ臣놨껥閁苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀臣貂苣꺁꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐胣ꊂ菣뮂苣銂맧誂뿨閁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨ꧨ首臣ꆨ꿧蒚胥芀苣莃苣ꒂ臣龁ꧨ鎨ꧨ首臣뢐藥ꚺ臣肜苣颫臣冄袂苣节뷤辁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ꒀ臣肜苣颫臣冄꺁胥銂뛨袁苣뒠郥꾁胣ꚩ꣩ꚩ雦꺁맥螝胥貁〷ꢁ㈱㌮杮洯ꢁ臣鎖臣ꪁ苣袂臣膀跥蚈臣貸蟩鞁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣馁臣ꚁ臣貸蟩뚺뛦꺁郥覅뫥貁苣莃苣ꒂ臣冮袂苣节뷤辁臣蒁臣躁苣膀ꒁ臣ꚩ雦貸蟩뚺뛦袼㈱㔮胣㚁㈮膀臣袂臣㎳ㄮ㔲杭洯覼臣醰臣辁臣节룤ꒁ臣놠釥꾏菨ꪁ뗧鲞臣龁苣ꮁ꣦隺鯦骷臣蒯鯥薆臣ꖅ苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀臣꺁ꃥ袐胣ꚩ꣩ꚩ雦銂氦㭴䱑臣놠釥馁苣芀䱑苣誂苣Ꞥ臣辁胣ꊂ菣뮂苣꺁꿧늛蛥ꮁ藥讂胣ꚩ雦貸蟩뚺뛦꺁룤趇ꓨ뢐藥ꚺ臣뎹鷥꾁胣㊁┰鳦肺臣䎮銂ꓧ馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦궸臣䎮ⵄ䡃ㅏ䠠偃뿦ꚺ臣袨껧誁苣뎁ꃥ誑뗧鲞胣ꚩ雦궸臣䎮ⵄ䡃ㅏ䠠偃뿦ꚺ臣袨껧芀ꧨ首뗧鲞臣뎹鷥ꮁ臩鎽臣貸蟩芿闦袼臣ꪁ苣ꆁ胣㊁胣㒁胣誁苣뎁覼苣讁臣ꚁ胣蒐룥袇뫦늶臣ꒁ臣ꚁ룥袇臣ꚁ臣ꪁ臣ꚩ雦궸臣䎮ⵄ䡃ㅏ䠠偃臣莿뫥銂杮洯ꞁ뻥讂胣ꊂ菣뮂苣꺁꿧늛蛥ꮁ藥讂룥袇뫦늶臣邵黦ꮁ臣蒁臣뎹鷥銂苣ꢁ苣讂胣邵黦銂ꃥ誑臣貂臣䎟䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ볯消⽧䱭볯ꞁ駩鞁臣䎦ⵄ䡃ㅏ䠠偃臣莿뫥銂呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉ㄠ杭臣龁苣꺁杮臣鞾苣芀戼㹲袨껧设볯㲚牢ਾꧨ首뗧鲞맥螝볯㊚㔳杮䌠ⵄ䡃ㅏ䠠偃洯⁌㴠㤠㐮杮洯㱧牢ਾ苣뎃菣꾂돨莿뫥骼㔲〮杭洯㱌牢ਾ돦骼铧邈觧ㆩ杭臣龁苣꺁䑃䌭佈‱䍈⁐杮볯溈⽧杭볯꾁灰ꮁ귧���臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㌵볯䖚䥌䅓臣袂苣䎋䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭궸臣뾂菣醃苣ꪳ것菣ꮃ臣骮蟩એ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁藩ꂴ뗧袐藥ꮖ郥肝ꓦ骮돦袼䱅卉覼臣䎯䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭ꚩ꣩ꚩ雦궸臣뾂菣醃苣ꪳ꺁럦ꖅ菣馃菣銂껥辇臣讂胣Ꚃ苣꺂諦뾂菣醃苣ꪳ銂臣骁菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃臣뎂菣蚃苣뎃苣馁苣芀苣뎃菣꾂돨䆪迥ꞅ꣦隺胣膓돨뎂菣袃菣벃菣膀鯥躏苣뎃菣궃菣ꮃ胣誁苣뎁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉ꧨ首苣邵郥Ꚃ苣꺂諦뾂菣醃苣ꪳ⁁杉ꢁ藥ꮁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃苣鞴뗦鞁臣貾胣鎃苣膃菣隌菣躃苣궃菣誃菣鞊苣떂苣뾂菣醃苣ꪳ⁁杉鞊뷤銂諥袁胣鎁苣꾁鳦鶈臣떮髩ꞁ跦覍臣貂臣뾂菣醃苣ꪳꮁ뗧袐臣讂胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣銂듦蒵臣ꚁ胣邵郥鞁臣蒁臣蒁菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤貁臣貂臣꒙軥馁苣芀곦蒁臣膀芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁뻥膀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ菣벃苣ꦃ菣ꎂ菣랂菣骃菣ꪂ苣랂菣벃苣銂諥袁苣芀菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃苣趆뫥鞴뗦鞁臣邵郥鞁臣蒁臣蒁軦袐諦鎽臣芁苣낁駩뮎臣讂胣ꆬ臣ꞁ胣咁䉍觨ꂴ軥銂諥袁臣膀꿦늉迥鲿苣략臣馁胣趏뿥銂ꇧ뢅臣鲁귦鞁胣覅귥蚯뫥銂㘹ꧧ麃苣꾂菣鞃菣벃菣궪臣随苣ꢙ蛥膀㔴渰ꞁ룦骮臣讂胣閍跦뾂菣醃苣ꪳ꺁蟩ꮁ꿦设臣ꚁ駧늉臣讂胣ꚩ雦莿뫥銂胣めㄮ㠸杮洯讁苣ㆉ渲⽧䱭臣蒯鯥ꞁ藥ꚭ꿥ꚺ苣뾂菣醃苣ꪳ莿뫥ꮁ꿥鞁臣鞃菣莃菣馁苣鎁臣ꮁ苣誂뷤邈臣龁꣦隺鯦骷臣몟臣蒁臣节臣膂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢雦閳ꛦ膦⼼㹵戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈲㰳愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†跦覍諦鎽臣袂苣鞃菣벃菣뎂菣蚃苣뎃苣芀苣벃菣ꎂ菣낂럧鶡뛦궸臣Ꚃ苣꺂諦뾂菣醃苣ꪳ鞊뷤꺁츱枼洯뚺뛦銂ꫨ붣臣膀뫦늶〱츰䲼苣䎒獯慴麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣꺁郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣㒂蓢ꞁ㠱뇂芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†菣것菣袃듦蒵臣袂臣隃菣莃苣뎃苣芀菣것菣袃苣膀菣것菣袃듦蒵駥銂铧蒁臣膀듦蒵뫦늶臣㎧鯥鞴뗦馁苣芀畓数䉲潬正볯뮙賩蚕꣦覼〲츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ諥袁苣芀菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃苣꒮룦ꞁ〶裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀迥ꞅ꣦隺臣뾪ꏨ₽芏藧馨뫦銂胣ꦁ뷥ꪁ蟩꺁苣뎃菣꾂돨䆪鿥隺觧ꪳ苣ꦁ뷥ꪁ蟩꺁藩뢅럧鶡���궸臣랷郥馁苣鎁臣ꮁ苣誂ꫨ붣臣讂胣뚺뛦銂룤龀臣㊧胣㒜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣芏藧馨뫦膀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ胣誁苣뎁鯥躏苣뎃菣궃菣ꮃꧨ首苣꒮룦ꞁ〱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣貾胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖设볯몟뫦ꦉ돨뾂菣醃苣ꪳ膀뿤颭뛦莿뫥㊦㌮杭洯㱌牢ਾ㨱〲‰ㄠ츰䲼⠠⸲洳⽧䱭 ‫㤱〹볎⁌ꊅ藩ꦷꇨ늶 ‽ㄱ〵渰⽧䱭戼㹲ㄊ㐺㤷†〱볎⁌ㄨ㔱〰杮洯⥌⬠㐠㠷츰䲼⠠藩뢅럧鶡뛦⦲㴠㈠渴⽧䱭戼㹲㈊䱭⠠㐲杮洯⥌⬠㈠䱭⠠藩뢅럧鶡뛦⦲㴠ㄠ渲⽧䱭戼㹲㈊䱭⠠㈱杮洯⥌⬠㈠䱭⠠藩뢅럧鶡뛦⦲㴠㘠杮洯㱌牢ਾ洲⁌㘨杮洯⥌⬠㈠䱭⠠藩뢅럧鶡뛦⦲㴠㌠杮洯㱌牢ਾ洲⁌㌨杮洯⥌⬠㈠䱭⠠藩뢅럧鶡뛦⦲㴠ㄠ㔮杮洯㱌牢ਾ洲⁌ㄨ㔮杮洯⥌⬠㈠䱭⠠藩뢅럧鶡뛦⦲㴠〠㜮渵⽧䱭戼㹲㈊䱭⠠⸰㔷杮洯⥌⬠㈠䱭⠠藩뢅럧鶡뛦⦲㴠〠㌮㔷杮洯㱌牢ਾ洲⁌〨㌮㔷杮洯⥌⬠㈠䱭⠠藩뢅럧鶡뛦⦲㴠〠ㄮ㠸杮洯㱌牢ਾ洰⁌‫洲⁌ꊅ藩ꦷꇨ늶 ‽渰⽧䱭㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蒐꣦隺뿦ꚺ苣覸蟩螤臣蚈黦馁苣芀ꧨ首苣邵郥閳臣風볨꺁臣誁苣ꮁ菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃룤ꮁ꣨꺽臣讂胣膓돨뎂菣袃菣벃菣ꚩ雦꺁ꫨ붣胣뾂菣醃苣ꪳ꺁鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ볯冈覼ꧨ首苣ꊅ藩ꦷꇨ늶룤膀⸰膀膀臣袂臣㖳杮洯꺁ꒁ臣馨髧莿뫥것菣ꮃ臣뾪ꏨ馁苣芀臣貂苣꾁껥鎨뷥ꖗ臣낖臣辁ꫨ붣臣讂臣膀臣龁臣Ꞥ蟩ꮁꫨ붣臣ꚁ胣㞁〵볎꺁룤骮蟩銂觢ⶦ〷蓢ꞁ蟥邵臣讂胣趇뗧冐ꚩ雦궸臣뾂菣醃苣ꪳ莿뫥銂臣꺁雦閳苣ꢔ臣ꚁꒁ臣겋ꯧ꺁苣뎃菣꾂돨䆪䔠䥌䅓껥鎨臣芁苣讁臣膂껥辇臣膀맥螝뿦ꚺ뗧鲞苣蒐䍑ꧨ首臣蚈黦벨飦뢛臣貀藥낧胣再莿뫥ꢁ臣ꚁꃥ誑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†껥鎨뷥ꖗ胣㎁臣꺁䍑ꧨ首臣鶁苣麁苣肸臣꺁菣ꒂ苣ꮃ苣꒮룦ꞁ꟨趇臣讂胣蒐䍑뿦ꚺ苣㊒鯥蚈黦馁苣袼ꒁ臣莿뫥ꮁ臣趁ꒁ臣覸蟩螤裥邞볯芀䍑ꧨ首苣邵郥閳臣風볨꺁臣誁苣ꮁ菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃룤ꮁ꣨꺽臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ鿥隺觧ꪳ苣뎃菣꾂돨䆪胣㊁㌮杭洯㱌牢ਾ㨱〲‰ㄠ츰䲼⠠⸲洳⽧䱭 ‫㤱〹볎⁌ꊅ藩ꦷꇨ늶 ‽ㄱ〵渰⽧䱭戼㹲ㄊ㐺㤷†〱볎⁌ㄨ㔱〰杮洯⥌⬠㐠㠷츰䲼⠠藩뢅럧鶡뛦⦲㴠㈠渴⽧䱭戼㹲㠊㌳㌮볎⁌㈨渴⽧䱭 ‫⸳㘱洶⁌ꊅ藩ꦷꇨ늶 ‽渵⽧䱭⠠䍑⤱戼㹲ㄊ㘮〰䱭⠠渵⽧䱭 ‫⸲洴⁌ꊅ藩ꦷꇨ늶 ‽渲⽧䱭⠠䍑⤲戼㹲ㄊ䱭⠠渲⽧䱭 ‫洳⁌ꊅ藩ꦷꇨ늶 ‽⸰渵⽧䱭⠠䍑⤳㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ꣩ꚩ雦꺁ꫨ붣胣鶃菣鞃菣钃菣뎃菣ꖃ菣隃룤ꞁ藩뢅럧鶡뛦袼䡰⸳覼苣ꢔ臣ꚁ呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉ꧨ鎨ꧨ首臣㊮㔮杭洯膀⸱㔲杭洯膀臣袂臣コ㘮㔲杭洯꺁뿦ꚺ苣뾪ꏨ馁苣���ꧨ鎨ꧨ首苣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ듧ㆄ蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁뻥膀菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃臣ꂊ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†菣것菣袃듦蒵胣鞃菣벃菣銂胣鞃菣벃菣鞴뗦ꢙ苣ꢔ臣ꚁ胣鞴뗦뚺뛦ꞁ麛듦蒵臣讂胣鞃菣벃菣鞴뗦ꢙ臣鞴뗦ꦷꇨ늶〳츰䲼臣Ꚃ苣ꮃ苣肺臣鞁胣뢵볦芙雩벂菣ꮁ꣨骮臣릁臣ꞁ臣讂胣蒐苣Ꞃ菣ꮁ〱츰䲼臣蒐迥ꞅ꣦隺胣膓돨뎂菣袃菣벃菣膀鯥躏苣뎃菣궃菣ꮃ胣誁苣뎁ꧨ鎨ꧨ首苣ꂊ臣膀釥늛룦ꚺ臣ㆧ駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀껦躚苣낹苣钿臣芀菣ꪂ菣뎃賥鞊苣뎃菣꾂돨䆪諦鎽苣咒步潮慶룥袇뛦ꞁ룥袇臣膀臣貂臣貂雦鞁臣궃菣袃臣肜臩隌臣袂苣몤臣貂苣肉鳦꺁뿦ꚺ臣馁苣芀뻤袁臣膀菣躃苣궃菣誃菣鞊苣뎃菣꾂돨䆪菣ꪂ菣뎃뗧袐뷤꺁臣膂臣ㆫ㘺ⰴ〰貸蟩銂ꇨ蒁胣궸胩ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀郥Ꚃ苣ꮃ臣ㆫ〰볎銂菣ꮃ菣膃菣뎃菣ꮃ菣骃菣뾂菣銂铧蒁臣ꂊ臣讂胣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ菣벃苣ꦃ菣ꎂ菣랂菣骃菣ꪂ苣랂菣벃苣銂敔湫癯ꦷꇨ늶苣ꢔ臣ꚁ臣貂臣貂雦鞁臣궃菣袃臣肜臩隌臣袂苣몤臣貂苣肉鳦꺁뿦ꚺ臣貸蟩馁苣芀뻤袁臣膀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ菣벃苣ꦃ菣ꎂ菣랂菣骃菣ꪂ苣랂菣벃苣꺁臣膂臣ㆫ㠺ⰰ〰貸蟩銂ꇨ蚁胣궸胩ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀郥Ꚃ苣ꮃ臣ㆫ〰볎銂諥袁胣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ〳裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀껦躚苣낹苣钿臣ꚁ麛듦蒵臣讂胣咂䉍觨ꂴ軥㆟〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣꒮룦ꞁ듧㊄裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀꣦隺鯦骷臣龁苣꺁鳦节ꯩ蒁뿦ꚺ臣覅귥蚯뫥꾁⸰㠹ꢁ⸱〴ꢁ臣鎖臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣ㆂ⁎㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵匾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵‾〱츰䲼Ꚃ苣ꮃ苣ꂊ臣ꚁ觨ꂴ軥趏뿥銂臥ꊭ臣讂胣鲁귦뚺뛦銂觨ꂴ軥銂諥袁臣꺁臣貐臣蚠뫥ꞁ菣것菣袃臣袂臣Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣膀郥Ꚃ苣ꮃ臣늉듧龎臣떅듧꺁迥鲿駦鎖臣貐臣ꮁ臣讂苣蚁臣馁苣芀臩鎽臣㦪뒩菣것菣袃ꫨ뾁迥誂駥ꞁ胣芏藧ꊳ闩㚷〳浮臣㒮〵浮臣뢐藥ꚺ苣겸껥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 螃菣뾂꟨邞胣뾂菣醃苣ꪳ⁁䱅卉꺁臣膂臣厮景浴硡菣궃苣ꦃ菣蚃菣鞃菣벃菣銂迥ꞅ臣ꚁ맥螝胥膀꣦隺臥꺷胣誁苣뎁䌥ꪁ臣銂苣ꢁ苣讂胣螃菣뾂꟨邞臣薠臣財臣龁臣릁臣꺁꣨鞮臣厯景䵴硡倠潲꺁苣뎃菣꾂돨䆪䔠䥌䅓琠浥汰瑡⹥灰銂铧蒁臣財臣鎁臣ꮁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†苣莃苣ꒂ臣龁郥몟뫦誁苣뎁ꧨ首뿦ꚺ臣ꒁ臣ꚁ뻥龁룤趇ꓨ���藥ꚺ볯䆈獢볯銂맥螝臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ⁁馨뫦꺁菣벃苣銂胣许꣨꺁볥꺁鷩ꂊ蟩꺁醃菣ꆃ菣뾂菣麛룥銂铧蒁臣ꊃ菣ꪃ菣낂臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㐲⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲䄊獢㴠뢐藥ꚺ戼㹲洊湩㴠肜냥뢼뿨骷臣뺯뿥馁苣뢐藥ꚺ戼㹲洊硡㴠肜ꓥ뢼뿨骷臣뺯뿥馁苣뢐藥ꚺ戼㹲䔊㱄畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢㴠肜ꓥ誁苣뎁鳦辰볦醿럧ꒀ臣鎖臣뚵꿥꺷臣ㆮ㈯臣뺯뿥馁苣뢐藥ꚺ戼㹲䈊㴠늛럧鎽臣꾁苣꺁ꓥ늛苧ꞁ臣뺂臣㲍牢ਾ⁃‽苣뎃菣꾂돨䆪臣莿뫥દ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†꣦蒯髧ꒀ胣馨뫦꺁꣦蒯髧ꒀ胣骮蟩邙闧袼䱑볯ꪜ뫦꺁胥꾁鯦骷臣떥胥銂ꋧ讫臣讂ꏨꦊ臣龁苣ꮁ臣讁铧蒁苣貂臣蒁臣膂胣馨뫦꺁꣦蒯髧ꒀ臣冯ꖻ룤꺁胥ꮁ臣ꚁ臣뺁苣芀꣦隺鯦骷臣骮蟩꺁뿤낕볯劈猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹰볯꾁觢ェ㤮ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀苣궃杮洯꺁꣦隺臣뎹鷥邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣꾁觢ウ〮뢐藥ꚺ臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣벂菣誁苣뎁䱑苣꒙臣膀꣦隺鯦骷苣节臣膂苣龁苣ꮁ铧蒁臣蒐꣦隺뿦ꚺ臣袨껧ꒀ볯溈⽧䱭볯꺁맥螝臣馨髧袼藥낧볯ꒀ臣ㆮ┵믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀꣦隺鯦骷臣冮꺁룤趇ꓨ뢐藥ꚺ臣뎹鷥꾁〲ꪜ뫦꺁䌥銂ꓧ閁臣醁苣낁臣覂臣膀꣦蒚臣㊮┰믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㐵裢䎒䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭궸臣䶮偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ껥辇臣龁苣꺁䱅卉ੁ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†鳦䖬䥌䅓臣䎯䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭궸臣䶮偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ臣莿뫥銂껥辇臣讂臣膂臣龮雦馁苣芀꣦隺鯦骷臣莿뫥袼⸰讁苣㊉⸵渶⽧䱭볯膀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ胣誁苣뎁ꧨ鎨ꧨ首苣ꒃ苣鞊菣Ꚃ苣䶹偃ㄭ郥肝菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃臣뮷諥鞁胣ꢑ鯥ꦸ뫥袼㈲㔮뇂莄볯ꞁ〶裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀菣것菣袃苣鞴뗦鞁胣貺곦鞊뷤袼苣떂苣鞊菣莃菣䶈偃ㄭ䤠䝧볯銂諥袁胣㊁⸲숵㖱蓢ꞁ〶裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀菣것菣袃苣鞴뗦鞁胣ꒃ苣鞊苣떂苣䦮䝧菣벃苣ꦃ菣ꎂ菣랂菣骃菣ꪂ苣랂菣벃苣銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣膀㈲㔮뇂莄臣㎧蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鞃菣벃菣銂듦蒵臣膀䵔늉듧龎苣ꂊ臣ꚁ胣钯觨趏뿥銂뗨鎁臣芀迥鲿苣㆒⁎㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵匾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵ꞁ臥ꊭ臣龁뻥膀藥ꚭ꿥ꚺ苣㦒뒩菣ꒂ苣궃菣것菣袃ꫨ뾁迥誂駥薆胣㒁〵浮臣겸껥鞁胣螃菣뾂苣㒒醃菣ꆃ菣뾂菣麛룥늛럧銂铧蒁臣ꊃ菣ꪃ菣낂臣讂胣ꆬ臣ꞁ胣䶁偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ臣莿뫥���銂郥ꚩ꣩ꚩ雦ꮁ臣蒁臣䶦偃ㄭ鿥隺觧ꪳ臣뺯臣ꚁ꣨鞮臣讂胣莿뫥銂胣馨뫦늛럧ꮁ꿥鞁臣鞾臣邵黦誁苣뎁鳦貸蟩ꚩ雦莿뫥銂駩馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣ꚩ雦㆙杭臣龁苣꺁䍍ⵐ颧苣뎃菣꾂돨꺁杮볯뺙룤蚈軧膀灰覼臣놠釥馁苣芀臣꺁雦閳臣袂苣膀ꏨꂀ臩讨胣뺲ꏨ龎雨膀臣袂臣붣觥銂郥肂듧麃鿥誤铧ꖝ铧鎽ꧨ首臣誁臣讂䍍ⵐ颧룤钴觧꺁껥辇臣꾏菨ꢁ臣讂胣䶂偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ臣膃菣ꒂ菣벃苣较菣릂苣벃跥ꎷ볯䎈佈볯내菨릟ꓩ궸臣ꎔ铧閁苣讂铧鎽ꧨ首룤ꮁ귥ꢜ臣蚁苣芀䡃내菨讁苣뺲ꏨ鞁臣䶟偃ㄭ꟦趸듧ꦉ臣邵郥馁苣㊋臣꺁菣ꪃ苣궃菣誃菣鞊뷤銂郥骮臣龁胣鞊뷤꾁菣Ꚃ苣誁苣뎁菣莃菣䶈偃ㄭ볯ꆄ郦랂볯ꮁ꿥馁苣节臣ꞁ胣蒁臣貂苣겜ꃥ誑臣몤臣貂苣䎋佈듧麃铧ꖝ臣䶮偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ臣꒺럥趏뿥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 鞃菣벃菣뎂菣蚃苣뎃苣芀苣벃菣ꎂ菣낂臣龁苣ꮁ胣ꒃ苣鞊菣Ꚃ苣䶹偃ㄭ諦鎽苣뎂菣蚃苣뎃苣ꦷꇨ늶臣㖧볎⽧䱭臣貸蟩馁苣芀菣것菣袃苣㆒〰볎⽌苣Ꞃ菣ꞁ苣벃菣ꎂ菣낂臣讂胣鞃菣벃菣銂菣것菣袃苣벃菣벃臣蚦臣膀㈲㔮뇂莄臣ㆧ讁苣ㆉ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鞃菣벃菣鞴뗦芀菣것菣袃苣膀菣것菣袃듦蒵駥銂铧蒁臣膀듦蒵뫦늶臣㎧鯥鞴뗦馁苣芀듦蒵駥꾁麛듦蒵胣㎁〰볎⽌苣Ꞃ菣膀뗦겼駦鎖苣궃臣궨껥馁臣趁臣芁苣芀臣龁臣膀菣것菣袃苣讉该ꞁ듦蒵臣ꚁ苣袂臣芀뫦늶〳츰䲼苣蒐菣것菣袃臣蒐苣Ꞃ菣ꮁ胣莼귦鞁臣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃苣벃苣ꢔ臣ꚁ諥袁苣芀苣Ꞃ菣銂苣뎃苣ꞁ믨辁賦ꎁ臣목臣鞁胣骃菣醃菣뾂苣ꮃ룤ꞁ苣ꎁ臣誂郥뒰臣鮁苣芀麛맧誂뿨馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†菣것菣袃菣궃菣궂菣낂胣뎂菣蚃苣뎃苣覮껥隌觥蚼菣궃菣꾂럧鶡뛦㎲〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣膀볨ꎭ臣龁菣ꮃ菣膃菣뎃菣ꮃ菣骃菣뾂菣銂铧蒁臣ꂊ臣讂胣鞃菣벃菣銂㈲㔮뇂莄臣ㆧ臣覂芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鞃菣벃菣鞴뗦誁苣뎁뿤颭胣鞃菣벃菣銂⸴ꞁ꣨覼臣龁臣誁苣ꮁ듦蒵뫦늶臣㎧鯥鞴뗦馁苣芀菣것菣袃臣Ꚃ苣ꮃ꿦ꮁ苣벃菣ꎂ菣낂럧鶡뛦㎲〰볎銂諥袁胣鞃菣벃菣랂菣ꦃ菣ꞁꛨ蒁胣㊁胣㢜蓢꺁髦肉臣ㆧ胩鎖臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†꣦隺臣뾪ꏨ芀䍍ⵐ颧苣뎃菣꾂돨鶿귥늶臣覂胣傁䉔룤㊭⸵渶⽧䱭뫦늶苣뾪ꏨ鞁胣鶁臣讁苣傉䉔苣貸蟩늶臣鞁臣ꢔ臣ꚁ胩骶룥袇껦躚볯ㆈ㈺볯ꞁ㈱㠮胣㚁㐮胣㎁㈮胣ㆁ㘮胣め㠮胣め㐮胣誁苣뎁渰⽧䱭臣貸蟩馁苣芀臣龁臣膀ꓥ辇臣馨뫦銂ꫨ붣臣讂臣ꢁ臣袂苣膀蟥邵꣦隺苣ꢔ臣讂臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣���껥辇臣蚈臣膀㜭莄臣覂㠭莄臣鶿귥馁苣芀蟥邵ꎧ蟥꺁맧誂뿨鞁臣뾁臣讂胣趇뗧馨뫦꾁ꒁ臣겋ꯧ꺁䱅卉蚈黦ꞁ鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ臣뺯臣ꚁꫨ骮臣讂뿥膦臣芁苣芀蟥邵꣦隺臣袂臣决꾁郥蚈黦ꞁ꣨릮臣趁苣节臣ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣㎂臣꺁꣨릮臣趁苣蚈黦貮뫤貾胣蚈黦벨飦뢛臣몙ꇨ閁苣讂胣趇뗧馨뫦꾁臣꺁藥낧뿦ꚺ臣뾽铧馁苣鎁臣ꮁ臣讂胣鎁苣覂臣뾪ꏨꖗ臣覂뚃鳦鎖鳦릊臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 鶿귥늶뿦ꚺ⸰㜹杭洯꺁䍍ⵐ몟뫦꺁臣膂臣设볯㲚牢ਾ呐궸㈵〰杮洯銂⸲洵뾪ꏨ馁苣骼戼㹲鶿귥늶㌱㐮䱭⬠貸蟩늶⸲㠴洷㱌牢ਾ覼†呐궸㔲㘮杮洯銂㘱洰뾪ꏨ馁苣骼戼㹲鶿귥늶⁡㠷洸⁌‫룥袇뛦ㆲ〶䱭戼㹲膃菣벃菣銂듧㊄胣㎜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀鲀麛苣ꎁ臣誂迥ꊻ臣鮁苣鎁臣ꮁ苣誂胣蒐뫦늶苣랷郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 膓돨뎂菣袃菣벃菣芀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ볯冈覼臣傯䉔룤ㆭ⸷渷⽧䱭胣㖁㌮杮洯膀臣袂臣ㆳ㈮杮洯꺁藥낧뿦ꚺ臣뾪ꏨ鞁臣䶟偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ臣芁苣芀ꓥ辇臣冮銂ꫨ붣臣膀룤骮蟩ꮁ裥醁胣ⶁ〷蓢讁苣ⶉ〸蓢ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀蟥邵ꎧ蟥꺁맧誂뿨鞁臣뾁臣讂胣膓돨뎂菣袃菣벃菣꾁ꒁ臣겋ꯧ꺁䱅卉蚈黦ꞁ꣦隺鯦骷臣뺯臣ꚁꫨ骮臣讂胣冂꾁郥蚈黦ꞁ꣨릮臣趁苣节臣ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣㎂臣꺁꣨릮臣趁苣蚈黦貮뫤貾胣蒐꣨릮臣趁苣冋꺁맥螝뗧鲞苣놠釥鞁胣蚈黦벨飦뢛臣몙ꇨ閁苣讂胣冂꾁臣꺁꣨鞮뿦ꚺ臣뾽铧馁苣鎁臣ꮁ臣讂胣鎁苣覂臣뾪ꏨꖗ臣覂뚃鳦鎖鳦릊臣芁苣芀뿤颭뛦莿뫥ウ㤮洷⽧䱭臣䶮偃ㄭ鿥隺臣覂蟥邵䍑룥袇뫦늶苣뾪ꏨ馁苣龁苣꺁뻤骼戼㹲愊볯傉䉔룤㖭〲渰⽧䱭苣㊒㔮䱭ꫨ붣臣讂볯㲚牢ਾ뿤颭뛦ㆲ⸳洴⁌‫룥袇뛦㊲㐮㜸䱭戼㹲戊볯₉䴠偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃꧨ首臣肜뗧貸蟩뚺뛦銂믤许臣ꢁ臣誂臣뾪ꏨ馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈲㰵愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†郥뚺뛦銂鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣ꆬ臣ꞁ鲀麛苣ꎁ臣誂迥ꊻ臣鮁苣鎁臣ꮁ苣誂럦袐臣讂胣뺁臣꾁胣冁銂裥邞뷥ꖗ臣낖臣辁ꫨ붣臣讂臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨ꧨ首胣ꚩ꣩ꚩ雦㊙〰볎銂呐㉂〰볎ꮁ諥袁胣㊁胣㒜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂臣ꢁ臣袂苣膀ꧨ鎨ꧨ首苣뾪ꏨ馁苣芀迥ꞅ꣦隺胣膓돨뎂菣袃菣벃菣袼韃覼胣誁苣뎁ꧨ鎨ꧨ首苣鞃菣벃菣ꮁ苣Ꞃ菣躯臣ㆫ〰볎膀룤趇ꓨꞁ諥袁胣㊁⸲숵㖱蓢ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂볯隤臥꺁苣Ꞃ菣꾁铧蒁臣蒁볯芀呐ꦷꇨ늶룤㊭볎⽧䱭臣莿뫥���꺁뫤ꆬ苣떂苣鞊菣莃菣䶈偃ㄭ諦鎽苣膀苣莃苣ꒂ臣ꢔ臣讂菣것菣袃臣膍裥ꪁ蟩ꞁꫨ붣臣讂胣뚺뛦銂듧㊄胣㒜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣鞴뗦銂맧誂뿨鞁臣㖦鯥鞴뗦馁苣芀뫤ꆬ諦鎽뫦늶〱츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ諥袁胣㊁⸲숵㖱蓢ꞁ〶裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀呐銂룥袇뛦ꢁ臣ꚁ铧蒁胣覸곦ꒃ苣鞊苣떂苣䢮偒뗧袐뷤뚺뛦袼뻤袁臣膀㨱〲〬〰臣貸蟩ꚺ臣龁臣ꦁ뷥ꪁ룥袇뫥覼苣뾪ꏨ馁苣芀뫦늶苣蒴鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀듦蒵苣낹苣钿臣芀剈邵郥鎽〱츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ諥袁胣㊁⸲숵㖱蓢膀髦肉臣㎧蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鞴뗦銂맧誂뿨馁胣咂䉍ㄠ〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣膀㈲㔮뇂莄胣鞚触ꞁ鲀蚈雩膀臣龁臣ꦁ뷥ꪁ觨貁駧늉臣讂臣ꞁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀丱䠠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢ㄠ〰볎銂觨ꂴ軥꺁럦ꂊ臣貐臣蚠뫥ꞁ諥袁臣膀觨ꂴ軥趏뿥銂臥ꊭ臣讂胣ꦁ뷥ꪁ㘹ꧧ鞃菣벃菣궪臣随苣ꢙ臣膀迥ꞅ돦랕㌶渰꺁㔴渰ꞁ郥覅뫥銂룦骮臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯馼胣㲑䐯噉ਾ菣벃苣ꚇ郧㲆牢ਾ†潓瑦慭袼駧늌闥馨볯붂菣袃苣Ꞃ苣銂菣궃菣뎂菣閃苣ꒂ菣䶫偃ㄭ瀮牰臣놅臣ꢔ臣膀룤込臣麝諥趇醃菣ꆃ菣뾂菣麛룥銂铧蒁臣馨뫦늛럧銂뷤邈臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㘲⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲䄊㴠肜냥뢼뿨骷臣뺯뿥馁苣뢐藥ꚺ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾〵⼼畳㹢戼㹲䐊㴠肜ꓥ뢼뿨骷臣뺯뿥馁苣뢐藥ꚺ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾〵⼼畳㹢戼㹲挊㴠肜ꓥ誁苣뎁鳦辰볦醿럧ꒀ臣鎖臣뚵꿥꺷臣ㆮ㈯臣뺯뿥馁苣莿뫥㲦牢ਾ⁂‽鯦骷臣뒛럧ꢃ裥꺁臣誁苣鶁臣뺂臣㲍牢ਾ⁸‽迥ꞅ꣦隺臣莿뫥દ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†꣦隺鯦骷胣膓돨뎂菣袃菣벃菣膀臣袂臣ꚩ꣩ꚩ雦ꮁ臣蒁臣膀菣벃苣貁꣨릮臣趁苣ꚩ雦ꮁ臣뾁뗧鲞苣놠釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 馨뫦꺁꣦蒯髧ꒀ胣冂ꪜ뫦꺁胥꾁鯦骷臣떥胥銂ꋧ讫臣讂ꏨꦊ臣龁苣ꮁ臣讁铧蒁苣貂臣蒁臣膂胣馨뫦꺁꣦蒯髧ꒀ臣冯袼⸰游⽧䱭볯ꖻ룤꺁胥ꮁ臣ꚁ臣뺁苣芀맥螝菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃볯벂菣溭⽧䱭臣馨뫦覼臣ꚉ⸰뢐藥ꚺ臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣馨뫦늛럧銂苣ꢁ苣讂臣膂臣ꢔ臣龁郥馨뫦莿뫥꺁胩鞮䍍ⵐ莿뫥袼杮洯覼臣뎹鷥꾁꣦蒚볯겅꟧覼胥꺁㔱ꖻ蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣馨뫦늛럧銂苣ꢁ苣讂臣膂臣ꢔ臣龁郥馨뫦莿뫥꺁룤趇ꓨ䆇猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾〵⼼畳㹢胥꺁ꓥ開뿤낕볯█噃볯꾁觢ㆦ┵臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀꣦隺鯦骷臣冮꺁룤趇ꓨ䆇猼扵砠汭獮樺㵰栢���㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾〵⼼畳㹢胥꺁맥螝臣ꚉ〲꺁䌥銂ꓧ閁臣醁苣낁臣覂臣膀胩鞮臣ꚁ꣦蒚볯겅꟧莿뫥膀⸰游⽧䱭볯꺁〲ꖻ蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣뎹鷥銂꣨鞮臣讂臣膂臣ꢔ臣讂룤趇ꓨ꺁郥ꒀ臣ꖈ胣ꮁ꟨邞臣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀맥螝臣覂鳦节臩蒁胥銂部ꢁ臣膀鯦骷苣趆꣨鞮臣膀꣦蒯髧ꒀ苣趆꟨邞臣讂胣议苣꺁ꒁ臣ꒀ臣뎹鷥貁臣ꂁ꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣蒁臣ꢁ臣ꒈ飦鞁臣뒠郥膀룤ꒁ臣릂苣꒙軥鞁胣늛럧銂蛥袨껧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 儠ꚩ雦꺁꣦蒯髧ꒀ胣冂ꚩ雦꾁껥뺁臣龁뿦ꚺ臣㎮臣꺁苣Ꞃ菣꺁뗧ꢁꛨ骮臣貂胣鞁臣貁臣ꚁ鳦릖돦ꮁ臣蒁臣風볨꺁ꒁ臣겅꟧莿뫥ꮁ臣蒁臣袐꣨㚈臣꺁䍑ꧨ首臣芁苣芀䍑ꧨ首臣㎮臣꺁苣Ꞃ菣꺁냥ꪁ臣ꢁ苣㊂臣꺁胩鞮뿦ꚺ臣冯ꚩ雦貁꣨릮臣貂苣袂臣ꮁ臣覂臣颁苣몱苣覂苣龁꣦蒚뿦ꚺ볯䎈䅏迥ꞅ볯꺁〲ꖻ蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣㚂臣꺁䍑ꧨ首臣醰臣辁臣节ꒁ臣놨껥閁苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣骁볯㚛臣꺁䍑ꧨ首臣㊮臣袼郥颁뿦ꚺ臣㊮臣ꞁ臣ꪁ臣覼臣놨껥閁苣ꪁ臣ꚁ苣袂臣膀㠱臣冮ꚩ雦Ꚃ苣ꮃ臣㚮臣ꖻ룤꾁臣貂臣貂臣馨髧莿뫥讁苣㊉薼苣誶臣ꚁ胩놄臣ꚁ苣袂臣芀臣貂苣꺁꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐胣ꊂ菣뮂苣銂맧誂뿨閁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨ꧨ首臣ꆨ꿧蒚胥芀䍍ⵐ莿뫥꺁맥螝꣨鞮胥꾁鳦节ꯩ蒁䍑苣誂苣躽臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀䍍ⵐ莿뫥꺁맥螝꣨鞮胥貁觢ェ㠮杮洯袼䱑볯꺁ꃥ袐臣膀룤趇ꓨ겸껥꺁䌥꾁觢㊦┰臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀臣꺁鷦뚻臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐胣ꚩ雦邵黦꾁鳦릊臣꾁臣辁胣낹苣钿臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀臣꺁鿥隺臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐胣뎹鷥䶇偃ㄭ뿦ꚺ苣ꢔ臣ꚁ鳦芵뗧鲞苣袨껧馁苣芀꣨鞮臣龁䍍ⵐ莿뫥貁氦㭴⸰游⽧䱭볯冈覼臣뒠郥膀ꧨ首臣⚯瑬儻ꢁꃥ誑臣膀胣⚌瑬〻㠮杮洯趀臣ꒀ苣肜뗧邵黦꺁꣨鞮臣ꢔ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯钼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤㖋銈呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉臣袂臣䎳䱔㑁䤭뷯ꮁ臣醁苣䎋佈䐠䅎臣骮蟩蒚菣ꪃ菣ꦃ菣벂胩階迥鲿臣袂苣鲤蟥઺⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁雦閳臣膀껥芙雩骮蟩蒚菣ꪃ菣ꦃ菣벂胩階迥鲿볯熈䍐覼苣莃苣ꒂ苣ꢔ臣ꚁ軥겖臣ꚩ雦궸臣议闧䎙佈䐠䅎苣鲤蟥馁苣龁苣ꮁ雩몙臣貂臣芀䍐꾁乄꺁럦袐觧꺁ꓨ붣臣芁苣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀觧骮臣䎮佈倠剃铧ꦉ臣ꊂ菣뮂苣궸臣蒓ꧧ馁苣龁苣膀臣貂苣鲤蟥馁苣龁苣ꮁ鯨覅駧龔菣궃菣隃苣ꢔ臣讂胣傂剃铧ꦉ臣鞢맥龀뫥꾁ꧨ首룤ꮁ귥ꢜ臣讂蟥몙乄꺁蟩ꮁ鯧ꖎ꿦���设臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†乄ꒀ臣钃苣낂菣ꂃ龃菣낂菣ꂃ臣꺁ꓥ鮏胣炂⽧䱭胥銂胣㊁〸浮臣뢐藥ꚺ臣节臣膂臣ꚩ雦꺁뿦ꚺ臣꒙臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ〵杭洯誁苣뎁楂牯汥慩据讁苣꺁ꃥ誑胥㶤〠㘮昷⽧볎꺁ꧨ首臣ꒁ臣ꚁ臣袨껧设胣떮髩ㆎ볯炚⽧䱭臣꺁ꓥ鮏‽⸰㜶杰洯芀껦躚骼杰洯뢁臣覤迦㶛⠠⸰㜶杰洯⽌〵〮杭洯⥌㴠〠〮㌱杰洯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㘵볯䎚䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭꺁䑓ⵓ䅐䕇臣袂苣蚈黦ઐ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁껥붖뻤꾁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉軥겖臣袂臣붣觥꺁듧ꚺꧨꆾ臣龁苣꺁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉臣蚈黦銂꣨覼臣讂胣䎂䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭꾁胣내菨銯胦咧菣뎃菣莐諦龎袼呃䅌覼臣꺿ꏩꪃ苣뎃菣邵郥覃菣ꒂ菣誁苣뎁菣袃杉꺁捆돎颠鿥讁苣ꪁ苣몁볤邭鏦鲽黨袐苣뎃菣꾂돨ꞁ臣讂胣䎂䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭꾁듧㦄欲慄臣蚈귥辇臣袂臣㦳欷慄볯麝苩莅볯뺁臣꾁㔵䑫袼苩莅볯꺁ꛨ讁臣꺁裥邭蟩銂鳦馁苣芀鲀〲뺋藩厍卄鶃菣ꊂ苣ꪃ菣ꊂ菣覃苣ꮃ臣꺁呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉臣뮛냦뎳该ꮁ苣誂胣颫裥邭蟩꺨볯鶇鯩ꦉ胣貺蟩鎽胣誁苣뎁ꯩꆬꓥ辇뷤覼臣覂臣뮸臣ꪁ苣颍蟩鎽꣧ꪁ苣뎁臣뮻蓦꺁뷤蚈귥辇꣧袼裥ꎧ雦螉볯貁裥ꊛ臣貂苣芀苣벃菣랂菣隃菣벃鿦늉臣龁苣ꮃ臣钯蟩낵鿦誁苣뎁浉条入慵瑮䱔볯뮙賩蚕꣦覼껥辇臣袂苣膀苣뎃菣꾂돨钴뫥꺁냥ꚺ臣鞾苣貂苣芀뗧鲞苣蒂藥誁苣뎁鷩蒂藥뚊藦ꞁ臣䎮䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭꺁듧ꚺ菣벃苣뎃菣ꞁꃥ誑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯馼胣㲑䐯噉ਾꧨ겖戼㹲 ꢳ볯馁臣ꚁ臣ꚩ雨꾁귧ꆾ臣ꎻ鯦ꦉ臣꺽臣鮏臣ꚁ苣袂臣芀쌱袃菣릂낂菣랂菣ⶳ䑓뎳该ꦷꇨ늶胣袃菣릂낂菣랂菣ⶳ䑓⁓〱韃돦開럧鶡뛦ㆲ〰䱭苣㆒菣莃菣ꮃ臣ꆃ苣랂菣뎃菣벃臣ꂊ臣讂胣䶂汩楬儭臣龁臣䢯䱐覭듧꺁냦銂臩辇諥袁臣ㆦ菣莃菣ꮃ臣馁苣芀鏨銂臣膀闦麛迥ꊻ臣鮁臣랷郥馁苣芀臣꺁ꧨ겖臣ꊂ菣뮂苣鎽韦ꮁꫨ붣臣릁臣ꞁ臣讂胣ꢳ볯薿ꛨ貁臣貂臣붿諥辇苣뾪ꏨ馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 꾂菣麃苣벃菣ꮃ菣鎟觨ꚩ雨芀敇䍬摯⁥求敵匠慴湩删慥敧瑮뫦늶苣뾽铧뒛觥ꮁ胣鲃菣ꮃ苣낕鯥蚂臣辁苣趏믨뺁臣꾁若鲖臣袂臣麛韦閁臣ꚁ럦袐臣讂胣㎂㔮꺁敇䍬摯릮駥銂触開菣뎃菣袼苣뾂菣낂闧랏㐲㤵覼臣놅臣ꢔ臣讂ꃥ袐胣鶁臣袂臣ꪁ럦袐臣릉臣���ꛨꞁ臣讂胣뚺뛦銂럦袐臣讂臣膂臣鲃菣ꮃ苣꾌鯧鞁臣꾁臣覂臣蒁胣ꢳ볯뚺뛦銂ꋧ龮臣螝룤ꮁ臣讂臣膂臣膀裥ꎕ觥ꮁ鿦늉ꧨ겖苣랷郥馁苣鎁臣貁蟩膦臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 몛껥뚺뛦骼냦궸〵ꆃ苣躃菣ꮃ㜯ꊅ藩芀ꪃ菣袃菣꺁菣릂苣ꪃ菣肃菣궸臣ꆃ苣躃菣ꮃ볯㖈〰䱭볯誁苣뎁藩뢅볯㞈洰覼苣랷郥馁苣芀楍汬⵩뒰苣ꦁ蟩ꂊ臣ꚁꪃ菣袃菣ꢁ臣膀럦袐臣讂胣몛껥뚺뛦꾁껥ꦸ臣㚧菣袜臣ꞁ껥骮臣芁苣芀돦骼鯥骮뫦늶臣鮏냦閃菣覃蛥ꞁꫨ붣臣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鿦늉苣뎃菣궃菣ꮃꫨ붣胣䶂汩楬儭냦銂铧蒁臣袃菣鞃苣뎃飩뎮觥銂蛥讧裦鞁胣㊁杭洯꺁뿤颭뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀〵볎ꮁ裥ꢳ臣膀㌭숰ㆱ莄臣㚧菣袜臣ꞁ蟥邵臣讂胣ꖻ룤꺁룥袇꣨뮔苣ꢔ臣ꚁ뿤颭苣뎃菣꾂돨뚺뛦銂룥袇꣦隺뿦ꚺ臣貸蟩馁苣芀戼㹲鶿귥뚺뛦㊲층䲼⬠䴠汩楬儭냦㞴층䲼㴠〠㔮볎⽧볎㱌牢ਾ⸰층枼츯䲼뫦늶〴볎⁌‫楍汬⵩뒰㘱츰䲼㴠ㄠ〰杮츯䲼戼㹲ꖻ룤꺁ꇨ銂铧蒁臣鎟觨뎂菣袃菣벃菣궃菣螃苣뎃苣뚺뛦銂ꫨ붣臣讂胣㲂牢ਾ鿦늉苣뎃菣궃菣ꮃ铧꺁ꧨ首ꫨ붣戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈲㰷愯㰾䐯噉ਾ鿦늉苣뎃菣궃菣ꮃꫨ붣觧ㆩ츰䲼臣궃菣螃苣뎃苣ꮁ苣誂〱渰꺁苣뎃菣꾂돨궃菣覃臣鞾苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖馨뫦誁苣뎁ꧨ首ꫨ붣戼㹲 몛껥鞃菣뮂苣膀䱇⽐䵇龎雨膀ꏨꒉ胣뺁臣꾁껥骮ꧨ首臣龁苣꺁菣벃菣ꎂ菣낂菣뾂菣뎃胣꾂菣麃苣벃菣ꮃ菣鎟觨늂菣ꢔ臣貸蟩芀ꧨ鎨鏥誁苣뎁鿥隺觧ꪳ苣㆒〮볎⽧䱭臣貸蟩馨뫦莿뫥ꮁ룥袇臣膀믤许臣ꢡ臣風볨꺁臣誁苣ꮁ胣蒂藥誁苣뎁鷩蒂藥꺁룤릖苣蚈귥辇菣벃苣벃臣놅臣궃菣覃臣讂胣㲂牢ਾ苣벃菣랂菣隃菣벃鿦늉苣ꮃ臣龁苣꺁ꧨ首룥袇臣袂臣늂菣궃菣螃苣뎃苣㲰牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㠲⼼㹡⼼䥄㹖㰊畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯灵‾菣ꦃ菣꾂㴠ㄠ韃丠ꚩ雦ꦷꇨ늶〱볎銂菣벃菣馁苣㲋牢ਾ돦骼苣릂菣ꂃ臩袐胦銂ꧨꆾ臣讂臣膂臣꺛ꛨ鲤鿦ꢔ臣낵鿦늂菣뮔菥ꮁ鿦늉苣뎃菣궃菣ꮃ菣뎃菣貁郥뺁苣讂胣늂菣놠釥꺁룤ꮲ胦銂뛧膌臣讂臣膂臣螈苣随臣龁苣ꮃ铧较臣꾁鿦늉苣뎃菣궃菣ꮃ菣뎃菣꾁臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首ꫨ붣臣袂臣뮛냦뎳该芀〱볎⽧菣벃菣꺁苣뎃菣꾂돨궃菣覃臣龁苣꺁ꧨ首룥袇胣ꖻ룤꺁雦閳臣鎾臣膀〱볎⽧〱볎궃菣覃臣龁苣꺁ꧨ首苣뾪ꏨ馁苣芀楍汬⵩뒰苣貸蟩늶臣鞁臣ꢔ臣膀ꧨ鎨ꧨ首臣袂臣몟뫦ꦉ돨銂〱杭洯⁌呃䅌䄴㤲䱙〱䔴䤭ꮁ룥袇臣讂胣袨껧꺁臣���臣芦껧莿뫥銂铧蒁臣节苣蒁胣设臣낁볯䎚䱔㑁㉁夹ㅌ㐰ⵅ杉軥겖臣ꚩ雦꺁뿦ꚺ臣㊌洵⽧䱭臣뒠郥膀㨱㔲룥袇뫦늶苣뾪ꏨ馁苣袼ꧨ首〴볎銂楍汬⵩뒰〶볎ꮁ諥袁苣覼胣许꣨꺁ꇨꮁ뻥蒁胣뮛냦뎳该ꢔ臣肜뗧ꚩ雦銂ꫨ붣臣讂胣鎁苣覂臣貸蟩뚺뛦ꢔ臣ꂁ뿥膃菣벃菣銂铧蒁苣芀戼㹲ꚩ꣩ꚩ雦꺁룥袇戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈲㰹愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†돦骼苣뎃菣꾂돨뚺뛦誁苣뎁楍汬⵩뒰臣辇苣薿ꛨꮁ뿥颁臣뾪꿧鞁胣肜뗧辇〱츰䲼臣馁苣芀돦骼ꧨ首뿦ꚺ臣⚌瑬ㄻ洰⽧䱭臣뒠郥膀鳦芵ꧨ首苣誸꣨꺁ꇨꮁ뻥ꎁ臣뾪ꏨ馁苣芀苣뎃菣꾂돨뚺뛦誁苣뎁냦꺁蟩銂ꫨ肯臣ꚁ胣늂菣誸臣뾂菣醃苣ꪳ菣벃菣銂鳦Ꞥ臣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦ꂊ蛧骼ꧨ首룥袇뫦늶臣뾪ꏨ貾胣ꂁ뿥膃菣벃菣銂雩颁胣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁臣뚺뛦銂럦袐臣讂胣ꚩ雦銂〸뇂莄臣뒰뗦궸臣㊧〮뇂⸰蚈雩袼볨ꎭ臣龁苣ꒂ菣벃苣ꢔ臣讂볯ꂊ蛧馁苣芀ꧨ首苣ꂊ蛧讁苣随苣몇臣膀껥ꦸ臣ꞁ蛥뒍臣讂胣膃菣벃菣銂闦麛迥ꊻ臣鮁臣膀菣ꖃ菣隃臣誸菩誁苣뎁臥ꢃ臣覂뿦꺸觧銂駩뮎臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†ꧦꢙ臣袂臣늂菣뾪ꏨ芀苣ꮃ苣鶁臣薌ꏨ讁苣随苣몇臣膀돦辄럦辁苣벃菣銂迥誂蟥鞁臣膀苣Ꞃ菣꺁ꏥ銂ꋧ龮臣뺁臣馁臣ꮁ臣讂胣薿ꛨ貁臣貂臣Ꚃ苣ꮃ苣늂菣궃菣螃苣뎃苣膃菣鞃臣뺁臣馁臣ꮁ臣讂臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣늂菣銂鯩鞰돦開ꏨ꺽臣膀鿧蒁苣ꦃ苣鞃菣벃菣貁蛥ꢃ菣ꎃ菣邃菣ꮁ郥辁苣蚁臣뾌藥馁苣芀苣ꮃ苣㆒臣ꂁ臣뎳该馁苣뒠郥膀菣것苣랂苣ꦃ苣릂菣벃苣벃苣趏꿥뒁臣뾌藥馁苣芀苣ꮃ苣趁臣ꆁ苣벊臣벾臣膀蛥ꢃ菣ꎃ菣邃菣銂ꓥꢃ菣ꎃ菣邃菣讁苣蚯냥馁苣芀蛥ꢃ菣ꎃ菣邃菣ꮁ쌱袃菣릂낂菣랂菣ⶳ䑓뎳该ꦷꇨ늶苣薅ꇥ馁苣芀苣貂臣ꪁ臣讁菣Ꞃ菣꾂臣膀곦蒁臣隤菩膃菣뎃菣벃臣ㆫ韃菣ꪃ苣ⶹ苣ꪃ苣뎃䑓뎳该ꦷꇨ늶苣Ꚃ苣ꮃ臣閺臣ꞁ藥ꮡ臣讂胣Ꚃ苣ꮃ苣㆒韃菣ꪃ苣ⶹ苣ꪃ苣뎃匭卄돦開럧鶡뛦ꞁ菣骃菣袃苣ꢔ臣ꚁ럧蒂臣ꮁ듦蒵臣膀껦馕臣讂苣꾂菣ꮃ苣龃菣貁臣貂臣꒙軥馁苣芀苣Ꞃ菣貁껥ꢅ臣蒾飦ꞁ胣莢闧貁臣ꎁ臣誂臣讂臣ꞁ胣Ꚃ苣ꮃ듦蒵苣낹苣钿臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦궃菣螃苣뎃苣芀苣ꮃ菣벃菣ꎂ菣낂菣莃菣銂铧蒁臣膀郥Ꚃ苣ꮃ臣ꚩ雦㆙츰䲼苣궃菣覃臣讂胣馁臣ꚁ臣隃菣뎃苣것菣뎃臣ㆫ韃鷩蒂藥ꚩ雦ꦷꇨ늶〱볎銂藥ꮡ臣讂胣鎁苣꾁苩莅觥꺁뗦몇臣袂苣麝苩莅ꧨ首臣蒂藥銂飩邁臣ꮁ뷥讫臣���膀苣ꮃ藥鎽臣開迦꺁ꇥ莿뫥銂뛧膌臣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 뮛냦뎳该芀苣ꮃ菣莃苣릂苣邃菣銂迥誂믤醁胣뮛ꗦ銂鯩邺臣ꖎ뛧馁苣芀鯩膵苣㊒洵⽁苣ꮃ臣뾪꿧鞁胣뮛鳥袼覼臣袂臣뮛諥袼覼苣肜ꓥꮁ꣨骮臣讂胣ꢳ볯뮛뫦궨껥꾁ꏨꂀꗦ薀臣ꢁ臣覤该鞁臣讂胣궨껥銂㔲䅭늂菣ꢁ臣讂苣蚁ꫨ肯臣讂胣늂菣銂〶裥鎖胣뺁臣꾁ꧨ首럧鶡뛦늉듧꺁藥꾫臣늂菣꺁뫥ꢃ臣낈臩馁苣뺁臣뮛냦뎳该馁苣芀鯩邺苣螈苣膀냥骷臣ꖎ뛧銂뗧ꆁ胣늂菣銂ꏨ꺽臣覂迥誂蟥馁胣鞃菣릂菣ꎂ菣꾂菣것菣袃苣ꢳ蓦놷臣蚈鯩馁苣芀鿦늉諦鎡铧꺁臩鎽臣몛껥뚺뛦誸臣늂菣貁믤肝臣龁菣ꦃ苣蚃苣莃苣鞃菣벃菣銂뿤膌臣讂胣늂菣銂뫦늶臣膀苣ꮃ臣鞃菣릂菣ꎂ菣꾂菣것菣袃臣覂臣骁苣讂臣ꞁ닦膂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 늂菣몛껥芀돦骼껦躚臣馁臣ꚁ껥ꦸ臣ꪂ菣鎃苣ꮃ苣Ꞃ苣ꮂ菣誸苣ꎁ臣誂賦ꪛ臣ꪁ臣覂ꇨ蚁胣ꢳ볯鎟觨꾁ꧨ겖臣뢒駧銂飩邁臣膂臣ꎁ臣誂꿥膰臣龁껥ꢙ蛥ꞁꇨ蚁胣ꢳ볯風볨꺁蟩銂铧蒁苣鎁臣貁臣趁苣貁胣馁臣ꚁ臣떮髩ꞁ苣ꮃ苣貮藥ꮁꛨ蚁臣ꢁ臣薿ꃩꞁ臣讂胣薿ꛨꪁ蟩銂뇦膂苣鮚臣늂菣誁苣뎁鿦늉菣것苣꺁苣ꒂ苣銂胨꺅臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀鯩鞰돦開뻥膀鯥骮뫦늶볯㖈┰菣뾂菣벃菣⾫┷藩뢅뫦늶볯㖉洰銂㔱裥鎖臣ꂊ臣讂胣늂菣銂듧ㆄ〰䱭臣䶮汩楬儭냦ꞁ蚈雩骁臣㎤鯥鞴뗦馁苣芀뷤ꢔ觥ꮁ苣벃菣랂菣鎟觨ꚩ雨銂럦袐臣膀쌸㆗挰꺁菣讃苣ꮃ臣㖫洰ꂊ臣讂胣Ꞥ臣蒁菣것苣銂铧蒁苣뒠郥ꮁ臣膀ꧨ겖苣붿諥馁苣薿ꛨ貁臣讂臣ꢁ苣芁苣芀菣것苣銂苣벃菣뾂菣랂苣ꒂ苣벃苣ꢔ臣ꚁ〲뇂芙雩蚂臣辁苣꾌鯧馁苣芀룤ꮲ胦銂뻥讂臣膂臣膀臣릁臣꺁苣ꮃ苣貐臣뎳该ꞁ郥颁鳦鎖鿦늉臣讂胣꾂菣麃苣벃鿦늉ꧨ겖苣䶒汩楬儭냦ㆴ〰䱭臣ꖅ苣뾛臣ꚁ蓨鎟臣讂胣놄鿦㆓駦鎖뻥膀苣ꮃ臣낵鿦꺁铧辄臣ꞁ臣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯醼胣㲑䐯噉ਾ뗨뮟臣袂臣ꎧ黦㲐牢ਾ†鯩鞰돦開臣袂臣鎟觨꺁뻥膀臣릁臣꺁苣ꮃ苣莿뫥袨苣ꢔ臣ꚁ뗨뮟臣膀浉条入慵瑮䱔볯뮙賩蚕꣦覼苣閃菣Ꚃ苣ꊂ苣ꢔ臣ꚁ꟨邞臣讂胣뮔菥閃苣ꒂ菣銂苣뎃菣ꖃ菣뾂菣꺁菣벃苣ꮃ菣벃菣覃菣ꒂ菣ꮁ뿤颭臣膀菣벃苣ꮃ苣ꪃ苣趃菣袃菣벃苣銂믤鞁臣ꊂ菣ꮂ苣隃臣讂胣낵鿦誁苣뎁꟨邞菣ꦃ菣벃苣벃苣ꖻ룤꺁ꇨꮁꓧ馁胣㲂牢ਾ苣ꮃ뗨뮟臣袂臣ꎧ黦醃菣ꆃ菣뾂菣㲼牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰〳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖ꢳ볯鎟觨⾲蓨鎟뻥꺁苣���迥꺸臣ꦁ臣膀苣ꮃ臣ꦉ郧蒚觧Ꞁ臣뢛臩뺁臣꾁苣ꮃ臣邃菣覃뷥뚊臣뢛臩ꮁ苣誂胣邃菣覃苣ꎭꋧꮁ郥骮臣讂臣膂臣肜ꓥ钃菣꾂꺁ꫨ肯臣薿ꛨꮁ臣讂臣ꢁ苣芁苣芀ꓦ몇臣貂臣蒁胣뺁臣꾁ꫨ趪臣貂苣邃菣覃臣芁苣낁胣讉该ꞁꏨꎭ臣讂胣邃菣覃ꓦ몇菣ꦃ菣벃苣벃臣뎩臣蒁菦놠臣ꒁ臣ꚁ臣膀浉条入慵呮袼㉶〰⸳㌰볯麃菣ꖃ苣ꮃ臣袂臣릂苣ꪃ菣뎃룤꺁ꫨ躘苣芏藧閁苣龁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 誸꣨꺁ꇨꮁ꣨覼臣낵鿦醃菣ꆃ菣뾂菣銂铧蒁臣늂菣銂뗨뮟臣讂胣늂菣꺁臣릁臣꺁꟨邞臣袂臣閩뻤꾁뗨뮟臣龁铧较臣覂ꇨ蚁臣趁臣芁苣芀苣ꮃ铧较菣ꆂ苣ꮃ볯낵鿦鞁臣뮔菥覼苣䦒慭敧畑湡呴붂菣袃苣Ꞃ苣꺁氦㭴䐱䜠汥䄠慮祬楳♳瑧讁苣讖臣芀菣벃菣邃菣꺁氦㭴潃瑮慲瑳朦㭴苣꾂菣莃苣鞁胣⚁瑬䤻慭敧䠠獩潴牧浡ⴠ䠠杩♨瑧醃菣ꆃ菣뾂菣銂⸰ꮁ꣨骮臣ꚁ胣馁臣ꚁ臣邃菣覃臣꾁臣趁苣讦臣讂苣蚁臣늂菣뮔菥銂ꋥ랼臣讂胣ꢳ볯鎁臣떮髩꾁臣꺁뻥꺁꟨邞臣龁苣ꮁ苣ꮃ铧较苣讦苣馁臣馁苣龁苣ꞁ胣骮蟩邵黦ꮁ뷥뾟臣ꪁ臣芀苣ꮃ菣뎃菣꺁鯧隦ꧨꆾ臣龁臣늂菣놠釥꺁鯧蒚臣鞢볥鞁臣늂菣뮔菥銂铧蒁臣蒁臣ꢁ胣⚂瑬䰻湡⁥牃慥楴湯朦㭴苣뢁諦鞁胣⚁瑬䴻湡慵♬瑧銂臩鎂臣ꎧ黦馁苣⚋瑬主浵敢⁲景䰠湡獥朦㭴苣궨껥馁苣芀氦㭴慌敮┠圠摩桴朦㭴苣㞒┵臣궨껥馁苣芀뿥膦臣芁苣낁胥薀臣것菣뎃苣ꦁ裥ꮁ藩鞈臣讂胣⚂瑬刻汯楬杮䈠污♬瑧閳苣ꢔ臣ꚁ菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃苣꺷臣閼臣芀菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃苣ꎭꋧꮁꫨ躘臣讂臣膂臣⚫瑬刻摡畩♳瑧銂〲ꮁ꣨骮臣讂胣ꢡꮁꓧ馁氦㭴楍楮畭⁭汓灯♥瑧膀氦㭴潎獩⁥敒畤瑣潩♮瑧膀臣袂臣⚳瑬┻慍楸畭⁭敐歡朦㭴臣鶈鳦궨껥銂苣ꢔ臣ꚁ菣뎃菣銂ꓦ몇臣讂胣ꎭꋧꮁ菣뎃菣銂郥骮臣讂臣膂臣膀臣貂苣꺁胥꺁ꫨ肯臣薿ꛨꢁ臣讂臣ꢁ苣芁苣芀ꓦ몇臣貂臣蒁胣뺁臣꾁ꫨ趪臣貂苣邃菣覃臣芁苣낁胣讉该ꞁꧨꆾ臣讂胣许꣨꺁裥邭蟩麃菣ꮂ菣銂铧蒁臣膀菣뎃菣蚈귥辇苣节臣膂苣芀볨ꎭ臣袂臣辦뫦隌껦躚臣膜闧馁苣芀裥邭蟩膀菣뎃菣辇胣誁苣뎁菣뎃菣▉苣ꮐ苣邵黦銂胣鶁臣貾臣螖鯦隌臣袂臣놠釥꺁臣膂臣䖫捸汥菣벃苣랂菣袃臣膀苣芀ꇨ㖨臣몤臣㆙꺁裥邭蟩馨뫦꺁臣ꆁㄱ臣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣讁苣릮飦ꮁ귨ꖈ臣趁苣ꢁ胦辂苣讂볯뎛㤷볯芀돦骼苣뎃苣ꪃ菣䊳軩袼ⰳ〵䐰覼臣袂臣ꒂ菣릂菣뎃階볯㊈㔬〰慄볯꾁ꒁ臣莺맥邃菣覃臣鞁臣뺏苣讂臣ꢁ苣芁苣膀臣龁臣ꒂ菣릂菣뎃階臣늂菣誸臣꺛ꛨꮁ苣誂ꋧ趪臣貂臣蒁臣ꢁ苣芁苣芀戼㹲ㄊ꺁裥邭蟩馨뫦銂菣벃苣馁苣㲋牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢���〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 겜껥붖뻤ꮁ臣蒁臣膀鷩蒂藥袼跥辇뷤覼臣袂臣蒂藥袼룤겜軩覼룤릖臣ꚩ꣩膓臣뮸ꛨ邃菣覃臣늂菣誸臣䎧䱔㑁㉁夹ㅌ㐰ⵅ杉鿥隺觧ꪳ臣貐臣뢛꿥趽뷧ꮁ臣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀鯥㞳芏藧芀〱渰⽧菣벃菣꺁菣ꒂ苣袃菣鞃苣뎃飩뎮觥袼ㄲ㔬〰慄볯馨뫦꺁鿦늉苣뎃菣궃菣ꮃ臣낵鿦늂菣뮔菥誸臣讦臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣袼鯥㞳膀菣벃菣ㆳ覼胣㖂ⰵ〴䐰꺁裥邭蟩麃菣ꮂ菣꺁뿨辁臣袂臣뎦꿥閁苣讂鷩蒂藥뚊藦꺁냥閁臣邃菣覃볯ㆈ鳦階볯銂駩趁胣꾂菣麃苣벃菣ꮃ菣鎟觨늂菣꺁믤辄臣隻臣邃菣覃臣뢛꿥랼뫥醃菣뮂菣袃臣몟뫦ꦉ돨ꞁ臣ꚉ┲臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣ꢳ볯뮸臣邃菣覃臣蚈귥辇臣ꢎ껥꾁胣麝귦辦裥莸臣龁苣ꎭꋧꮁ苣ꢁ苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣ꪁ臣芀苩莅鿥隺觧ꪳ臣꺛ꛨ鲤鿦ꮁ苣誂胣㖁ⰵ〴䐰꺁裥邭蟩麃菣ꮂ菣ꮁ뿨蒁뷤꺽臣뎳该馁苣ㆋ臣꺁뫥薹菣뎃菣貁ꛨ覂苣讂볯뎛㤷迥ꞅ볯芀苩莅룤膦菣뎃菣꺁듧ꚺ菣벃苣뎃菣꾁觢㦧┷臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀鷩蒂藥몟뫦ꦉ돨뮸ꛨ邃菣覃臣꺛ꛨ鲤鿦ꮁ苣誂胣㦁ⰷ〴䐰誁苣뎁ㄱⰶ〳䐰꺁裥邭蟩麃菣ꮂ菣ꮁ뿨蒁뷤꺽臣뎳该馁苣ㆋ臣꺁뫥薹菣뎃菣貁ꛨ覂苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣袼鯥㞳膀菣벃菣㊳볯芀鿥隺觧ꪳ룤膦菣뎃菣꺁듧ꚺ菣벃苣뎃菣꾁觢㦧┷臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀鷩蒂藥몟뫦ꦉ돨뮸ꛨ邃菣覃臣꺛ꛨ鲤鿦ꮁ苣誂胣㦁ⰷ〴䐰誁苣뎁ㄱⰶ〳䐰꺁裥邭蟩麃菣ꮂ菣ꮁ뿨蒁뷤꺽臣뎳该馁苣ㆋ臣꺁뫥薹菣뎃菣貁ꛨ覂苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣袼鯥㞳膀菣벃菣㊳볯芀鿥隺觧ꪳ룤膦菣뎃菣꺁듧ꚺ菣벃苣뎃菣꾁觢㦧┷臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㜵裢䎒䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭궸臣袃菣袃菣墳ㄭ〰껥辇臣龁苣꺁偈䍌돦㲕牢ਾ†偈䍌臣袂苣袃菣袃菣墳ㄭ〰苣䎒䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭꺁苣뎃菣꾂돨ꚩ雦ꮁ臣蒁臣躽臣뺙룤蚈軧袼灰覼菣馃菣ꞁ껥辇臣讂胣鎁臣릖돦꾁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꺁鯥뢛諦몇ꫥꪳ臣꺁諦몇臣膀臣꺁뻥꺁껦馕苣뎃菣꾂돨銂駩뮎臣讂臣膂臣뒰듦誁苣뎁苣뮂菣讃菣ꪃ菣ꮁ苣讂菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꺁뫦몇苣ꮐ苣芀苣뮂菣讃菣ꪃ菣뚺蟥ꦉ苣傒敨潮敭敮⁸祈数獲汩䌠ꮂ菣ꂃ臣膀苣뮂菣讃菣ꪃ菣㪫냦袼〸㈺覼臣覂臣讂꟧開鯧銂铧蒁臣꾂菣麃菣낂菣閃苣ꮁ臣醁苣芀ꓦ몇臣㊯㔲浮臣꺁噕臣袂苣芀雦閳臣ㆯ胣㊜瀲浰臣鎖臣뒛럧ꞁ胣鲤蟥邙闧꾁⸰㔲灰ꞁ臣讂胣超雧醊裥ꒉ臣꾏菨Ꞁ臣芁苣䎋䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭꾁胣내菨銯胦咧菣뎃菣���莐諦龎袼呃䅌覼臣ꪃ苣뎃菣邵郥覃菣ꒂ菣誁苣뎁菣袃杉ㅇ蟩階臣骮룥颠鿥讁苣ꪁ苣견뫤隸믤趞郥뾂菣醃苣ꪳ臣芁苣芀鷩ꒂ苣뎃胦貕鷩뮴胦ꒉ臣袃菣袃菣墳ㄭ〰苣膀呃䅌㰴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵ⴾ杉臣뺲ꏨꮁ臣醁苣Ꚃ苣ꮃ苣趸듦隌臣龁苣ꮁ铧蒁苣芀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱銂駩뮎臣ꚁ苣膀铧邈觧꺁鏥ꪳ臣袂臣辦裥꺁鯧蒚臣뾂菣醃苣ꪳ臣覂臣貕鷩뮴胦ꒉ臣议闧것菣ꮃ臣龁臣麝귥ꢜ苣몢ꯧ馁苣薿ꛨ貁臣讂胣鶁臣龁苣ꮁ胣閗럨것菣ꮃ臣袃菣袃菣墳ㄭ〰苣鲤蟥誁苣뎁껥辇迥붃臣릖돦貁雩몙臣貂臣芀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱銂苣뎃菣꾂돨讁苣厉䕐ꫥꪳ臣붊蟥鞁胣䢁䱐ꮁ苣讂裥邞臣龁苣ꮁ苣뮂菣讃菣ꪃ菣ꞁ뫦몇臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯隼胣㲑䐯噉ਾ꣦隺ꫨ붣戼㹲 隃菣뎃苣芀臣꺁雦閳臣ꖻ觥ꮁ裥邞臣膀ꓦ몇迥붃臣것菣ꮃ臣袃菣袃菣墳ㄭ〰苣ꮐ臣ꪁ臣鎁臣貁裥躘臣龁胣뮻蓦꺁ꧨ首臣龁臣芏藧馨뫦銂菣ꦃ菣꾂臣鞁臣ꢔ臣ꚁ苣袂臣芀菣ꦃ菣꾂臣袂臣ꚩ雦궸臣뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ臣麡볤ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀菣ꦃ菣꾂苣ꚩ雦ꢁ藥ꮁ裥邞臣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†뿤颭꣦隺뫦늶胣ㆂ⸰肈⸱洰꺁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱銂〱洰꺁鯧鮛믤趁껥ꢙ臣ꎭꋧꮁ꟧辇臣膀냦ꞁ裥辇臣ꞁ룥袇臣膀럦袐臣讂胣ꢳ볯袃菣袃菣墳ㄭ〰臣뒰臣蚂臣辁苣뚺꟨馁苣芀뷤ꢔ觥ꮁ껥ꢅ臣뚺꟨鞁臣蒁苣讁뫦늶苣뾪臣讂볯뢅黥蒚臣꾁㔱裥貾볯芀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꾁냦袂苣节닧Ꞁ臣颫臣膀臣龁臣ꎁ臣뚺꟨鞁臣蒁臣蒁蟩꾁냦颭鳥许臣꺛臣讦臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†룥袇꣦隺뫦늶胣袃菣袃菣墳ㄭ〰뿤颭꣦隺뫦늶苣䎒䱔㑁猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰䤭隃菣뎃苣ク㔮䱭臣ꂊ臣讂胣鲃菣蚃菣꾂苣뺁臣꾁믤꺁臩鎽臣讉껦ꞁ跥蚈臣랷郥馁苣芀臣꺁룥袇꣦隺뫦늶臣蒴瀵浰볯뺁臣꾁층枼洯⁌瑷‮潶⹬볯꺁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱銂郥肂胣ꢳ볯馨뫦뚺뛦꾁꿦ꖗ雦鞁臣뾪ꏨ馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦뾪ꏨ芀ꧨ首臣鶁臣뺁臣ꢔ臣讂胣隃菣뎃苣銂ꧨ首臣놅臣蚈黦馁臣趁臣芁苣芀꣦隺臣袂臣ꚩ雦뚺뛦讁苣꺁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꺁諦몇胣许꣨꺁諦몇껦躚臣㎯胣㖜苣뎃菣䢁꺁룦Ꞝ룤ꞁ껥붖臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†鯥뢛諦몇볯厈䕐볯銪돨꺁듦Ꞁ賥芀룦Ꞝ菣讃菣벃菣覃臣讓苣誸臣膀菣讃菣벃菣覃蛥ꢃ臣ꦃ菣꾂臣ꚩ꣩ꆮ苣ꖅ苣讂胣鎁苣覂臣貀믥蒣觧趀ꧨ鎨껧ꞁ臣讂胣讓苣ꎻ臣膀偓膃菣벃菣銂룦Ꞝ菣讃菣벃菣覃臣꺽臣膀郥厄䕐菣ꖃ菣隃臣许臣貀믥蒣���趀菣ꖃ菣隃臣芁苣鎁臣銂ꋧ趪臣讂胣ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ洱銂郥膃菣벃菣ꮁ諥袁胣ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ臣馁臣ꚁꫥꪳ뫥銂胩躁臣讂臣ꞁ菣ꖃ菣隃臣鮸鳥銂臣醁苣芀껦躚苣낹苣钿臣芀꣦隺ꚩ雦麃菣ꪃ菣꾂苣讁苣꺁偓銪돨誸臣꺁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱莿룧芀裥꺁듦Ꞁ賥厖䕐菣ꖃ菣隃臣膀룥袇꣦隺뫦늶胣ꚩ雦膀臣袂臣隃菣뎃苣鶁苣麁苣れ㔮洰銂菣骃菣袃臣ꂊ臣讂胣뚺뛦貁ꫥꪳ뫥銂껥ꢅ臣骀臩馁苣뺁臣厧䕐菣ꖃ菣隃臣鮸鳥銂臣醁苣芀껦馕苣뎃菣꾂돨꺁偓誺臣覂臣꒙軥芀냦ㆴ䱭苣蒐偓膃菣벃菣ꮁ諥袁胣뒰臣銪돨誺苣骀臩馁苣뺁臣膃菣벃菣ꮁ룦Ꞝ苣讁臣讂胣떮髩銂맧誂뿨馁胣袃菣袃菣墳ㄭ〰臣厮䕐뫥讁苣꺁뫦몇胣麃菣鮃菣ꮃ菣뢁臣鮸鳥銂裥誂胣薣뷧銂룥Ꞝ臣뮈臣芀菣讃菣벃菣覃臣讓苣膀꣦隺臣袂臣ꚩ雦厙䕐菣ꖃ菣隃苣随苣颻臣龁臣뺁臣蚂臣辁苣膌臣誸臣讂胣貀믥蒣觧趀ꧨ鎨껧銂臣覂臣颁苣ꦃ菣ꮃ臣龁ꧨ鎨껧袼꣦隺胣隃菣뎃苣膀臣袂臣ꚩ雦覼臣蒵臣ꎻ臣ꚁ胣ꖻ룤꺁껦躚臣厧䕐뫥讁苣뚺蟥鞁臣讂臣讁臣讂菣ꪃ菣뎃ⵘ〱节鯥躏臣讂胣鎁苣覂臣뚺蟥ꦉꧨ鎨껧ꞁ臣讂胣麃菣鮃菣ꮃ菣꺁鏨銂믤袁胣蒐ꧨ首胣隃菣뎃苣膀臣袂臣馨뫦厖䕐뫥꺁룤ꮁ臣貂臣貂臣뚺蟥ꦉꧨ鎨껧貁臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀苣뮂菣讃菣ꪃ菣カ㔮洰銂郥厄䕐菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣膀苣뮂菣讃菣ꪃ菣貁臣릁臣銪돨誺苣骀臩馁苣뺁臣膃菣벃菣ꮁ룦Ꞝ苣讁臣讂胣麃菣鮃菣ꮃ菣뢁臣鮸鳥銂裥誂胣讓苣膌臣誸臣ꚁ뫦몇觧ꚩ꣩ꆮ苣麛迥馁苣芀꣦隺胣ꚩ雦膀臣袂臣隃菣뎃苣꺁苣뮂菣讃菣ꪃ菣뚺蟥ꦉ苣膀苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ苣릂菣ꂃ臣ꢳ藥馁苣龁苣꺁苣벃菣떂菣鞃菣벃菣ꒂ苣ꮃ臣ꖅ苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯醼胣㲑䐯噉ਾ苣릂菣ꂃ臩袐胦㲧牢ਾ†돦ꖅ苣讖꟥馁苣趉臣ꮂ菣ꂃ랂苣蚃菣銂꟧開鯧ꞁ듧ㆄ駦鎖맥ꆡ賥馁苣芀꣦隺뫦늶臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ苣鞾苣芀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꺁뿤膌駦鎖臣㖯裢ㆀ裥ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀郧隫껦낕臣鞁臣閩뻤鞁臣ꮂ菣ꂃ臣袃菣袃菣墳ㄭ〰臣뺯臣讂諥螎臣膀룤風臣込臣袂臣ꚁ꣨鞮臣龁ꃥ袐胣⚁瑧㈻〰떮ꮂ菣ꂃ臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌲㰲愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ꾁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱钃菣꾂臣鶿賦芙雩ꞁ臣誂胣瞁臣钃菣꾂臣뒁菩銂菣벃苣ꦃ苣뎃臣隤賦鞁臣鞾臣袃菣袃菣墳ㄭ〰菣벃苣꺁菣벃苣ꦃ苣뎃臣誁臣讂맥ꞁ臣讂胣馨뫦뚺뛦꺁돦ꖅ臣醰臣辁臣节麛ꇨ蚁胣肜뻥㎌鯥꺁돦ꖅ臣ꊝꧧ芿闦꺁卒醃菣뮂菣袃臣㎯〮銂뛨袁苣릁臣ꞁ臣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖���醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 隃菣뎃苣꺁苣궃菣袃苣ꦃ菣銂꣦隺臣袂臣ꚩ雦꺁苣궃菣袃苣ꦃ菣讁苣꺷臣閼臣膀룤風臣袨껧ꮁ胩肂胣袃菣袃菣墳ㄭ〰臣莿뫥袼灰覼㴠㰠牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㌳⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌲㰴愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤㖋銈呃䅌ⴴ杉뗧邈觧䎩佈듧麃乄ꮐ蟩銂껥辇臣讂臣膂臣ꊂ菣뮂苣㲤牢ਾ†臣꺁雦閳臣膀껥芙雩骮蟩蒚菣ꪃ菣ꦃ菣벂胩階迥鲿볯熈䍐覼苣莃苣ꒂ苣ꢔ臣ꚁ呃䅌ⴴ杉軥겖臣ꚩ雦궸臣议闧䎙佈䐠䅎苣鲤蟥馁苣龁苣ꮁ雩몙臣貂臣芀䍐꾁乄랷郥ꦉ臣螤ꏨꞁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣릉껥꺁䡃⁏䍐ꎔ觧貁苣莃苣ꒂ룤ꮁ鏨趩臣讂臣膂胣鎁苣銂ꓦ몇臣讂臣膂臣趛藥몙铧鞃菣벃菣銂铧蒁苣芀䍐ꎔ觧꺁ꋥ薹胩ꚺ臣ꚩ雦궸臣颭鳥馁苣몇駧䒺䅎臣辇臣뒛軦钯뻤馁苣芀鯧蒚臣䎯䱔㑁䤭蒵裦ꦉ臣ꚩ雦궸臣䎮佈苣躃菣䒠䅎臣辇苣鲤蟥馁苣鎁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首苣膀껥辇髧鶃菣ꆃ菣벃苣ꎀ軩趏뿥蚈黦ꞁ铧鎽ꧨ首룤꺁䡃⁏乄銂ꓦ몇臣讂臣ꢁ臣袂苣蚈黦馁苣芀꣨鞮苣財臣膀뗧鲞苣㊒ꇦ꺁鳦릊闦鞭臣袂苣炊⽧杭臣颍뷤ꞁꃥ誑臣讂胣邵黦貁苣莃苣ꒂ臣骮蟩邙闧ꪜ뫦ꞁ臣讂ꃥ袐胣邵黦꾁氦㭴䱑臣놠釥鞁胣ꊂ菣뮂苣꺁䱑苣風賩馁苣芀乄ꒀ臣钃苣낂菣ꂃ龃菣낂菣ꂃ臣꺁ꓥ鮏臣芁苣芀杰洯ꒀ苣膀㠲渰꺁郥覅뫥ꞁ苣ꢁ苣龁ꧨ首臣莿뫥ꞁ駩馁苣芀苣뎃菣꾂돨莿뫥㖦洰⽧䱭臣袂臣䊳潩敲楬湡散臣覂臣놠釥ꒀ‽⸰㜶杦츯䲼臣ꚩ雦ꮁ臣蒁臣꺁꣨鞮뻤芀껦躚骼杰洯뢁臣覤迦㶛〠㘮瀷⽧䱭†껦躚骼杰洯뢁臣覤迦㶛⠠⸰㜶杰洯⽌〵〮杭洯⥌㴠〠〮㌱杰洯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㤵裢龔뷤ꚩ雦誁苣뎁呃䅌ⴴ杉뗧邈觧궸臣䶮偃ㄭ苣뎃菣꾂돨꺁껥辇㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 겜껥붖뻤꾁铧鎽ꧨ首臣袂臣䎳䱔㑁䤭꺁ꧨ首룤꺁껦馕䍍ⵐ颧苣뎃菣꾂돨銂껥辇臣讂臣膂臣ꢔ臣讂雦閳苣낿臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ鷦首볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㔳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖ꚩ雨㲬牢ਾ†菣뎃藩ꦷꇨ隌ꏩꦡ냦袼䉐膀〱䵭菣뎃藩ꦷꇨ늶胣ㆁ㜳䵭丠䍡膀⸲洷⁍䍋膀䡰⸷讁苣㞉㔮볯芀菣袃菣ꮁ꣨覼臣붣胩薀臣겪飦ꮁ뻥ꎁ臣뾪ꏨ馁苣芀跥蚈臣떂苣몂臣릮駥ꮁ胣䢁䱐覭듧꺁냦膀䉐骃菣莃菣膀臣袂臣릒详邭苣ꂊ臣讂胣릒详鞃菣벃菣誸臣骃菣莃菣誁苣뎁ꇥ貁뫦ꎧ臣讂臣ꞁ럦袐臣讂胣薿ꛨꮁ뿥颁臣뒰藩隌菣袃菣Ꚃ菣뺁臣꾁ꇥ뢅臣炧㝈㌮臣覂⸷ꮁꫨ肯臣讂胣���袂臣랷郥馁苣뺁臣릒详馁苣芀뷤蒁跦ꚁ臣ギ㈮츲涼菣ꎂ菣뾂菣薣뷧銂胩鞁臣趂臩馁苣芀뫦늶苣㊒胣㢜蓢ꞁꫨ붣韦讁苣㎉ꖗ臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†䍍ⵐ袼跥莐뗨隌胦뾂菣醃苣ꪳㄭ볯꾁跥莐臣랂껥誁苣뎁蓦鎟菩趽臣꺁该ꆓ臣誁臣ꚁ뷥늉苣鲞臣馁菣袃苣뎃菣꾂돨ꞁ臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ臣뢛郥Ꞁ臣袂臣䶳偃ㄭ臣뺯臣讂諦鎽臣꺁뫤꺷迥鲿胦ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ䍍ⵐ颧臣芁苣ꢁ胨袁苣貂苣芀䱅卉ꮁ臣蒁臣ꢔ臣龁諦鎽臣馨髧뾂菣醃苣ꪳ臣肸菩鞁臣趪귨鞁臣讁臣龁臣膂胣䶁偃ㄭ臣螈雦讞臣肊ꇨ蒚臣뮴胦ꞁ臣蒁臣节臣貂臣蒁臣膀苣莃苣ꒂ룤ꮁ迥鲿臣讂迥붃胦节臣讂胣鞁臣貁臣ꚁ胣ꊂ菣뮂苣궸臣趏뿥馁苣较菣릂苣벃䍍ⵐ꺁믤辄臣覤闧鎽苣骮蟩鞁胣ꊂ菣뮂苣貁藥랕䍍ⵐ誁苣뎁귦鞁臣ꢂ菣袃菣鞃苣ꮐ苣䶀偃ㄭ臣뮻蓦꺁ꓥ낕뷤銂ꓦ몇臣讂苣蚁臣馁苣芀菣ꪃ苣궃菣誃菣鞊뷤랷郥ꦉ苣ꢔ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀臣辁臣讁臣ꢂ菣袃菣鞃臣邏ꓧ閁苣讂迥붃胦貁ꯩ辁臣讂臣ꢁ臣馕蓦閁苣龁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 鞴뗦뚺뛦袼⸰㄰‥⽶袃苣ꒂ菣뎃〲苣ꮐ苣膀〱䵭菣뎃藩ꦷꇨ늶胣ㆁ㜳䵭丠䍡膀⸰㜲䵭䬠汃胣炁㝈㌮臣覂⸷覼胣뢒闧뺁臣꾁偈䍌귧骴臣뒰⸴䰰臣릒详邭胣傁卂賩㊠賩膀慎汃㈠⸸朸胣誁苣뎁菣ꖂ苣벃菣㊳‰⸰洴銂諥袁苣芀臣릁臣꺁蛥릮觧貁뫦ꎧ臣讂臣ꞁ苣ꎁ臣誂럦袐臣讂胣薿ꛨꮁ뿥颁臣뒰藩隌菣袃菣Ꚃ菣뺁臣꾁ꇥ뢅臣炧㝈㌮臣覂⸷ꮁꫨ肯臣讂胣㊂胣㢜蓢ꞁꫨ붣韦讁苣㎉ꖗ臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†룥袇뛦袼┱眠瘯䈠䅓胣誁苣뎁⸰㔰‥⽶袃苣ꒂ菣뎃〲苣ꮐ苣膀䉐膀䡰⸷讁苣㞉㔮볯芀볯鎁苣꾁룥ꦲ臣貸蟩ꒉ臣뾽铧ꮁ믤辂苣节臣ꞁ臣讂臣ꢁ臣馕蓦閁苣龁臣覼胣ꪃ菣뢅럧鶡賥龣ꇥ뒰⸴䰰臣릒详邭胣䊁䅓㐠朰胣誁苣뎁菣ꖂ苣벃菣㊳‰洲銂諥袁苣芀臣릁臣꺁蛥릮觧貁뫦ꎧ臣讂臣ꞁ苣ꎁ臣誂럦袐臣讂胣も㈮츲涼菣ꎂ菣뾂菣銂胩鞁臣趂臩馁苣芀鳦讖냥꺁ꃥ袐臣㊯胣㢜蓢ꞁꫨ붣韦讁苣㎉ꖗ臣ꞁ胣뺁臣꾁雩膰뻥鞼韦鎖뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†菣것菣袃苣벃菣ꎂ菣낂ꧨ겖胣ꒃ苣鞊菣Ꚃ苣䶹偃ㄭ諦鎽臣蒁臣ꒁ臣꺁菣ꒂ苣ꮃ苣붣胩薀臣겪飦ꮁ뻥蒁蛥讧裦鞁胣낕鯥蚂臣辁苣趏믨閁臣ꚁ럦袐臣膀郥辂臣讂胣肸껥辇臣蚈臣膀㈭莄臣ㆧ맥뺁臣鶿귥馁苣袼ꏨꂀ胨꺁鳦릊鳦邙苣誶臣ꪁ臣鎁臣覼胣趇뗧ꎧ蟥꺁맧誂뿨鞁苣뾁臣讂胣뺁臣꾁胣趇뗧뺹蟧ꚩ雦邃苣ꊂ菣銂㈭莄臣㚧菣袜苣誂苣랕臣鶿귥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀蛥讧裦貾胣鞊뷤銂鲀���莄臣ㆧ菣袜雩鶿귥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 貺곦ꚩ雨芀苣떂苣鞊菣莃菣䶈偃ㄭ諦鎽臣ㆮ臣꺁菣ꒂ苣ꮃ苣붣胩薀臣겪飦ꮁ뻥蒁蛥讧裦鞁胣낕鯥蚂臣辁苣趏믨閁臣ꚁ럦袐臣讂胣뚺뛦銂鲀莄臣㒧胩鎖臣ꞁ뿤颭臣讂胣뺁臣꾁胣趇뗧뺹蟧ꚩ雦邃苣ꊂ菣꾁㈭莄臣ㆧ맥袂苣节闩辁껥骮臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 覸곦ꚩ雨芀菣꺂諦Ꚃ苣꺂杉⁇䠨䰫 剈꺁臣辁臣讁臣邃苣ꊂ菣銂鯩膂胣낕鯥蚂臣辁苣趏믨閁臣ꚁ럦袐臣讂胣肸껥辇臣蚈臣膀㈭莄臣㊧맥뺁臣鶿귥馁苣袼ꏨꂀ胨꺁鳦릊鳦邙苣誶臣ꪁ臣鎁臣覼胣趇뗧ꎧ蟥꺁맧誂뿨鞁苣뾁臣讂胣蒁臣龁苣ꎧ蟥馁苣낁胣邃苣ꊂ菣꾁鲀莄臣㎧ꖗ臣ꞁ뿤颭臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†꣦隺臣뾪ꏨ芀䍍ⵐ颧苣뎃菣꾂돨鶿귥늶臣覂胣貸蟩늶룤㊭⸵渶⽧䱭뫦늶苣뾪ꏨ鞁胣鶁臣讁苣ꎀ뛧貸蟩袼趀볯떮髩ꞁ㈱㠮胣㚁㐮胣㎁㈮胣ㆁ㘮胣め㠮胣誁苣뎁⸰ꮁ룥袇臣讂胣も杮洯꺁꣦隺臣ꪜ룥袇臣貸蟩늶臣芁苣芀戼㹲鶿귥莿뫥ウ㤮洷⽧䱭臣䶮偃ㄭ鿥隺觧ꪳ苣ꢔ臣ꚁ臣馨뫦뾪ꏨ设볯㲚牢ਾ覼볯뚺뛦䆲볯貸蟩늶룤㖭〲渰⽧䱭臣㊮㔮䱭苣뾪ꏨ馁苣骼戼㹲 ††††††鶿귥늶㌱㐮䱵⬠貸蟩늶⸲㠴洷㱌牢ਾ覼볯뚺뛦䊲볯貸蟩늶룤㊭⸵渶⽧䱭臣㎮㤮䱭苣뾪ꏨ馁苣骼戼㹲鶿귥늶⁡㤱㈮䱵⬠貸蟩늶⸳㠸洱㱌牢ਾ껦誂臣馨뫦銂믤许臣辦껥馁苣辇苣ꢔ臣ꚁꫨ붣臣讂볯㲚牢ਾ†††††††††††††††††††††††††鳦芵戼㹲貸蟩馨뫦ₖ††††††††††††††††††††莿뫥㲦牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰뚺뛦₲††††辇볯消覼††††룥袇뛦袼䱭볯₉†††渨⽧䱭 †††㰠甯㰾牢ਾ㔲㘮杮洯⁌††ㄠ䱭†††††††‰†††††††㈠⸵渶⽧䱭戼㹲㈊⸵渶⽧䱭†††洱⁌††††††ㄠ䱭†††††††㈱㠮杮洯㱌牢ਾ㈱㠮杮洯⁌††ㄠ䱭†††††††洱⁌†††††††㘠㐮杮洯㱌牢ਾ⸶渴⽧䱭†††洱⁌††††††ㄠ䱭††††††††⸳渲⽧䱭戼㹲㌊㈮杮洯⁌††ㄠ䱭†††††††洱⁌†††††††ㄠ㘮杮洯㱌牢ਾ⸱渶⽧䱭†††洱⁌††††††ㄠ䱭††††††††⸰游⽧䱭戼㹲《㠮杮洯⁌††ㄠ䱭†††††††洱⁌†††††††〠㐮杮洯ੌ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†郥뚺뛦銂룤龀꣨骮臣蒴鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣ꆬ臣ꞁ鲀麛苣ꎁ臣誂迥ꊻ臣鮁苣鎁臣ꮁ苣誂럦袐臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃꧨ首臣뾪ꏨ芀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ볯冈覼ꧨ首苣貸蟩늶룤꺁䍍ⵐ颧苣뎃菣꾂돨꺁菣ꒂ苣ꮃ臣覂ꫨ붣臣讂胣㖂〲杮洯꺁뫦늶뿤颭뿦ꚺ苣뾪ꏨ鞁胣鶁苣讁苣ꆬ臣趇뗧ꢔ臣膓돨뎂菣袃菣벃菣ꚩ雦銂뷤邈臣讂볯㆚⸱渰⽧䱭胣㖁㌮杮洯���膀臣袂臣ㆳ㈮杮洯芀믤许臣ꢡ臣風볨꺁臣誁苣ꮁ룥袇臣讂胣㲂牢ਾ뿤颭뿦ꚺ⸰㜹杭洯꺁䍍ⵐ몟뫦ꦉ돨銂铧蒁臣꺁䍑ꫨ붣뻤骼戼㹲愊볯袼뫦늶覼룥袇뛦궸㈵〰杮洯꺁⸲洵銂ꫨ붣臣讂볯㲚牢ਾ†††††††뿤颭뛦ㆲ⸳甴⁌‫룥袇뛦㊲㐮㜸䱭戼㹲戊볯袼뫦늶覼룥袇뛦궸㈵渰⽧䱭臣㖮〮䱭苣뾪ꏨ馁苣骼戼㹲鶿귥늶⁡〵田⁌‫룥袇뛦㒲㔮〰䱭戼㹲挊볯䶉偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ䍑ꧨ首臣肜뗧貸蟩뚺뛦銂룤風臣ꢁ臣誂臣뾪ꏨ馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌲㰶愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†郥뚺뛦銂룤龀꣨骮臣蒴鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣ꆬ臣ꞁ鲀麛苣ꎁ臣誂迥ꊻ臣鮁苣鎁臣ꮁ苣誂럦袐臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨ꧨ首臣뾪ꏨ芀郥ꚩ꣩ꚩ雦꾁룥袇臣龁ꧨ鎨鏥讁苣ꪁ苣芀ꧨ鎨ꧨ首〲츰䲼苣貸蟩늶〲츰䲼臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣ꚩ꣩ꚩ雦銂ꫨ붣臣讂胣蒐뫦늶苣궸胩궨껥ꞁ듧㊄胣㎜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀곦蒁臣㊧胣㎜鯥蚂臣辁苣趏믨閁臣讂臣ꢁ臣袂苣랷郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 讉ꃩ芀菣것菣袃苣벃菣ꎂ菣낂胣ꒃ苣鞊菣Ꚃ苣䶹偃ㄭ諦鎽苣傒卂臣㖧볎⽧䱭臣貸蟩馁苣芀諦鎽臣储卂뫦늶臣銂룤龀꣨骮臣蒴鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣ꆬ臣ꞁ鲀麛苣ꎁ臣誂迥ꊻ臣鮁苣鎁臣ꮁ苣誂럦袐臣讂胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃苣벃苣ꢔ臣ꚁ胣鎁臣뚺뛦ㆲ〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣鞃菣벃菣銂菣것菣袃苣벃菣벃臣蚦臣膀껥ꦸ臣ㆧ讁苣ㆉ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鞃菣벃菣鞴뗦芀菣것菣袃苣膀菣것菣袃듦蒵駥銂铧蒁臣膀듦蒵뫦늶臣㎧鯥鞴뗦馁苣芀듦蒵駥銂麛듦蒵胣㎁〰볎⽌苣Ꞃ菣膀뗦겼駦鎖苣궃臣궨껥馁苣芀臣龁臣膀菣것菣袃苣讉该ꞁ듦蒵臣ꚁ苣袂臣芀듦蒵뫦늶〳츰䲼苣蒐菣것菣袃臣蒐苣Ꞃ菣ꮁ菣ꮃ菣膃菣뎃菣ꮃ菣骃菣뾂菣銂铧蒁臣ꂊ臣讂胣Ꚃ苣ꮃ苣랂菣꾂臣붻臣꾌臣ꚁꧧꮁ臣膀菣벃菣벃苣ꪂ菣誸臣蚂臣辁苣뢐냦閁臣讂胣㎂鯥낹苣钿臣芀菣것菣袃菣궃菣궂菣낂胣䎂䉓⁂〳츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ菣ꮃ菣膃菣뎃菣ꮃ菣骃菣뾂菣銂铧蒁臣ꂊ臣讂胣鞃菣벃菣銂껥ꦸ臣㚧숰ㆱ蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ꚩ雦꺁럦ꂊ胣芏藧馨뫦膀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ볯蒐뿦ꚺ蒵볯膀臣袂臣ꚩ꣩ꚩ雦銂菣것菣袃臣覸蟩螤臣ㆧ〰볎⽌苣Ꞃ菣ꂊ臣膀껥ꦸ臣蒴〶뇂〱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀ꓥ뒁臣Ꚃ苣ꮃ臣ꢔ臣ꪁ臣芀뫤ꆬ苣떂苣鞊菣莃菣䶈偃ㄭ諦鎽苣銂ꫨ붣臣讂胣貸蟩늶룤ꞁ苣떂苣鞊菣莃菣䶈偃ㄭ諦鎽뿤颭뛦銂츲枼洯뺁臣꾁臩鎽臣貸蟩ꚺ볯궃菣袃귧ꆾꧨ鎨臣龁臣䎯䅏���袂苣覼臣膀苣莃苣ꒂ臣ꢔ臣讂菣것菣袃臣膍裥ꪁ蟩ꞁꫨ붣臣讂胣뚺뛦銂룤龀臣蒴鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀菣것菣袃듦蒵苣낹苣钿臣ꚁ麛듦蒵臣讂胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃菣銂铧蒁胣貺곦鞊뷤뚺뛦ㆲ〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣膀껥ꦸ臣㚧숰ㆱ蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣貸蟩늶苣ꢔ臣ꚁ룤ꆬ菣꺂諦Ꚃ苣꺂剈邵郥鎽뫦늶볯よ㔮볎⽧䱭臣龁臣ꦁ뷥ꪁ룥袇뫥覼苣뾪ꏨ馁苣芀剈邵郥鎽苣궸胩궨껥ꞁ듧㊄胣㎜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀곦蒁臣㊧胣㎜鯥蚂臣辁苣趏믨閁臣ꚁ럦袐臣讂胣ꚩ雨趪껥꺁臣膂臣ꢃ雩厀偏臣袂苣몢ꯧ閁苣龁뿦ꚺ臣貸蟩馁苣芀菣것菣袃듦蒵苣㖒鯥낹苣钿臣芀菣ꮃ菣膃菣뎃菣ꮃ菣骃菣袃苣ꢔ臣膀剈邵郥鎽〱츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ諥袁胣꒮룦膀髦肉臣蒴〳뇂蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鞃菣벃菣鞴뗦銂麛맧誂뿨馁胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃菣銂铧蒁胣咁䉍ㄠ〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣膀釥늛룦ꚺ胣鞚触ꞁ듧㊄㔮胣㒜裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀菣ꮃ菣膃菣뎃菣ꮃ菣骃菣袃苣ꢔ臣膀⸱丰䠠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢ㄠ〰볎銂䵔꺁럦ꂊ臣貐臣蚠뫥ꞁ諥袁臣膀䵔趏뿥銂臥ꊭ臣讂胣㦂뒩菣것菣袃ꫨ뾁迥誂駥ꞁ迥ꞅ돦랕㌶渰꺁㔴渰ꞁ藥ꚭ꿥ꚺ苣겸껥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꆨ꿧蒚胥芀껥辇駩貕볯冈覼볯よ㠮杮洯覼鳦肺臣ꒀ臣늛럧꺁ꗦꒀ苣몢ꯧ馁苣鲣諥꺁臣膂臣鞁臣ꢔ臣覂苣ꪁ臣龁苣膀꣦隺臣ꆨ꿧蒚胥꾁䱑믤誸臣ꒀ臣芁臣꾁臣讂胣许꣨꺁꣨鞮苣ꢔ臣ꚁ臣뎹鷥邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣袼苣궃杮洯馨뫦覼臣ꚉ⸰뢐藥ꚺ臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌲㰷愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯墚猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㈬㌬⼼畳㹢㴠螃菣뾂뗧꺁觧骮臣ꒀ戼㹲上㴠螃菣뾂뗧ꮁ臣醁苣ꒀ臣낕㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 벂菣膀⸰誁苣뎁䱑볯よ㠮杮洯覼苣꒙臣膀꣦隺鯦骷苣节臣膂苣龁苣ꮁ铧蒁臣蒐꣦隺뿦ꚺ臣馨髧袼藥낧볯ꒀ臣ㆮ┵믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀苣궃胣め㐮臣袂臣决袼⸰游⽧䱭볯ꖻꓥ꺁胣馨뫦늛럧銂苣ꢁ苣讂臣膂臣ꢔ臣龁郥馨뫦莿뫥ꞁ臣覸蟩螤䉁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾〵⼼畳㹢胥꺁ꓥ開뿤낕볯█噃볯꾁觢ㆦ┵臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀呃䅌ⴴ杉뗧邈觧꺁ꧨ鎨ꧨ首臣뎹鷥䶇偃ㄭ뿦ꚺ꣨鞮胥꾁觢ㆦ⸱渰⽧䱭臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣뎹鷥䶇偃ㄭ뿦ꚺ꣨鞮胥貁觢ェ㠮杮洯袼苣莃苣ꒂ䱑볯ꞁ臣貂臣膀룤趇ꓨ骮蟩꺁䌥銂꣨鞮臣膀꣦蒯髧ꒀ臣ꚉ〲ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ꆨ꿧蒚胥貁臩袐臣貂臣���膀맥螝䍍ⵐ莿뫥銂灰袨껧ꮁ铧蒁苣芀䍍ⵐ莿뫥袨껧ꒀ臣ꚉ⸰游⽧䱭볯ꊂ菣뮂苣冤覼臣뒠郥膀ꧨ首苣⚒瑬儻ꢁꃥ誑臣膀胥貀氦㭴⸰游⽧䱭胣銂灰袨껧ꮁ铧蒁苣芀룤趇ꓨ骮蟩꺁䌥꾁胨꺅臣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 儠ꚩ雦꾁껥뺁臣龁뿦ꚺ臣㎮臣꺁苣Ꞃ菣꺁뗧ꢁꛨ骮臣貂胣鞁臣貁臣ꚁ鳦릖돦ꮁ臣蒁臣風볨꺁ꒁ臣겅꟧莿뫥ꮁ臣蒁臣袐꣨㚈臣꺁䍑ꧨ首臣芁苣芀䍑ꧨ首臣㎮臣꺁苣Ꞃ菣꺁냥ꪁ臣ꢁ苣㊂臣꺁뿦ꚺ臣冯ꚩ雦貁꣨릮臣貂苣袂臣ꮁ뇦膂苣貂臣겅꟧莿뫥꺁〲ꖻ蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ㆂ꺁䍑ꧨ首껥辇胥꺁냥ꪁ臣ꢁ苣ㆂ꾁臣貂臣貂臣馨髧ꒀ臣㊮薼믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㠱臣冮ꚩ雦꺁ꒁ볯貐臣莿뫥꺁ꒁ臣꾁臣蒁볯꾁臣貂臣貂臣겅꟧ꒀ臣覂〲볯銂뛨袁臣뢀蓨鞁臣节苣蒁胣㚂臣꺁䍑ꧨ首臣醰臣辁臣节ꒁ臣놨껥閁苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀ꒁ臣膀룤릖臣貐臣莿뫥ꞁ臣蒁臣ꢁ苣ꆝ믤ꮁ胣놨껥閁苣ꪁ臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 螃菣뾂ꧨꆾ胣厂景浴硡볯뮙賩蚕꣦覼苣閃菣Ꚃ苣ꊂ苣鞃菣袃苣ꮃ菣ꆂ苣ꮃ䍍ⵐ⸱灰ꢁ藥ꮁ铧蒁胣许볥꺁鷩ꂊ蟩㒍菣ꦃ菣벃苣벃鯥낸苣ꢔ臣ꚁ꣦隺鯦骷苣鲽裦馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌲㰸愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ⁁‽鳦辰볦醿럧ꮁ꿥鲿臣讂郥覅뫥㲦畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔴㰰猯扵㰾牢ਾ⁄‽鳦Ꞥ볦醿럧ꮁ꿥鲿臣讂郥覅뫥㲦畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔴㰰猯扵㰾牢ਾ⁣‽鳦Ꞥ臣袂臣肜냥뢼뿨骷胥꺁雩꺁뗧뺯럥꺁⼱ꮁ꿥鲿臣讂뿦ꚺ戼㹲戊㴠늛럧꺁鯧骷菩蚈臣誁臣袂臣꺁若趁戼㹲砊㴠芏藧馨뫦꺁뿦ꚺ㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 䴠偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ臣莿뫥꺁꣨鞮胣ꚩ꣩ꚩ雦궸臣䶮偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ臣辇苣膀潓瑦慭⁸汐瑡⁥敒摡牥匠景睴牡銂铧蒁臣袨껧鞁臣节苣蒁胣ꖻ룤꺁뻤꾁臣꺁苣蚁臣肜뗧邵黦銂ꃥ誑臣蚁苣讁苣设ꓧ馁苣芀郥ꚩ雦꺁趀룥袇觧銂苣莃苣ꒂ臣讂胣莿뫥袨껧ꒀ臣ꦁ뷥ꪁ룥袇뿤낕볯㊈볯銂臣醁臣膀鳦貸蟩꺁ꧨ鎨鏥꺁뿦ꚺ苣鞾苣芀戼㹲设볯㲚牢ਾ覼룥袇臣龁ꧨ鎨ꧨ首臣ㆯ⸰渰⽧䱭臣芁苣芀戼㹲ꪜ룥袇臣ꚩ꣩膓룤꺁䍍ⵐ颧苣뎃菣꾂돨莿뫥꾁볯㲚牢ਾ〱杮洯썌㊗㴠㈠渰⽧䱭䴠偃ㄭ戼㹲㈊볯貸蟩鞁臣ꚩ雦꺁뗧鲞臣貀氦㭴⸰游⽧䱭胣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ鳦貸蟩꺁ꧨ鎨鏥궸臣䶮偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ臣骼戼㹲貀氦㭴⸰游⽧䱭胣쎍㊗㴠貀氦㭴⸱渶⽧䱭胣䶍偃ㄭ㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦㆙杭臣龁苣꺁杮䴠偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ볯炈浰볯꺁鳦芵뗧鲞苣놠釥馁苣龁苣ꮁ胣誸臣鞾臣邵黦銂鳦貸蟩꺁ꧨ首뿦ꚺ臣꒙臣讂胣㲂牢ਾ뻤���骼戼㹲ㄊ볯ꚩ꣩ꚩ雦뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ㴠㔠洰⽧䱭戼㹲䴊偃ㄭ꟦뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ㴠㈠〰杮洯骼戼㹲㈊〰杮洯⁌䍍ⵐ‱ 〵杭洯⁌‽渴⽧杭戼㹲ꚩ雦銂瀴浰볯뺙룤蚈軧覼戼㹲ꢁꃥ誑臣讂胣㲂牢ਾ覼ꧨ鎨ꧨ首苣뎃菣꾂돨莿뫥₦‽〵杭洯㱌牢ਾ䍍ⵐ颧苣뎃菣꾂돨莿뫥₦‽胣⚌瑬ㄻ㘮杮洯趀볯㲚牢ਾ胣⚌瑬ㄻ㘮杮洯趀䍍ⵐ‱ 〵杭洯⁌‽胣⚌瑬〻〮㈳杮洯趀戼㹲ꚩ雦銂胣⚌瑬儻袼氦㭴⸰㌰瀲浰볯趀臣놠釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖龮雦设〶볯䎚䱔㑁䤭龎雨邝雦뺔蟥ꚩ꣩꺁臣膂臣䖮䥌䅓臣袂苣䎋ⵄ䡃ㅏ苣뎃菣꾂돨꺁껦馕菣馃菣骮蟩ꊂ菣뮂苣ત⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†苧뢅럧鶡뛦芀鋦貋귥銂郥肂臩鎽臣릮駥ꮁ胣䢁䱐覭듧꺁냦袼〲洰覼胣궂藩ꦷꇨ늶苣鞃苣ꮃ讀臣薆껥ꦉ苣ꂊ臣讂胣릒详鞃菣벃菣銂铧蒁胣邝雦貁뫦늶臣ꪁ苣뺁臣랷郥馁苣芀䡰꣨銂铧蒁胣薿ꛨꮁ뿥颁臣ㆦ⁎慎䡏臣龁臣䢯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢臣蒁臣貂臣ꞁ䡰苣㦒㘮臣뾪꿧馁苣芀鋦貋菣것菣袃苣ꢔ臣膀뫦늶苣肜뷤㖎裥鎖럦袐臣讂胣뚺뛦銂⸰㈲볎閃苣ꮃ苣벃苣骀臣ꚁ苣躁臣讂胣뚺뛦銂鲀莄臣㎧ꖗ臣ꞁ뿤颭臣膀菩肖臣讉ꃩꮁ苣誂菣馃菣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 鞴뗦ꦷꇨ늶볯よ〮┵瘠瘯菣ꖂ苣벃菣㊳銂郥肂䉐膀䡰⸷覼胣㒂鲃菣ꮃ臣䢮䱐覭듧꺁냦ꮁ鋦貋귥膀䉐ꂌ〲賩膀菣ꖂ苣벃菣㊳‰〲䱭苣ꂊ臣讂胣릒详鞃菣벃菣銂铧蒁胣邝雦貁뫦늶臣ꪁ苣뺁臣랷郥馁苣芀䡰꣨銂铧蒁胣薿ꛨꮁ뿥颁臣ㆦ⁎慎䡏臣龁臣ㆯ⁎䍈꺁臣骁苣讁臣炧銂⸷ꮁꫨ肯臣讂胣릒详鞃菣벃菣銂铧蒁胣뚺뛦銂鳦躽蚈雩랷郥馁苣芀뫦늶苣㊒胣㢜蓢ꞁ〳韦뺁臣鶿귥鞁胣ꢃ雩꺁触蚠臣袂苣ꦃ菣ꮃ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈芀偈䍌귧骴臣뒰볯よ㔮䱭볯銂苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈꺁菣ꒂ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣랷郥馁苣龁苣ꮁ胣邃苣ꊂ菣ꮁ鏨銂臣膀듧ㆄ銧雩蚂臣辁苣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀苣ꪃ苣궃菣ꮃ볯よ㔮䱭볯銂苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈꺁菣ꒂ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣랷郥馁苣芀뫦늶苣薸뗦ꪁ菣릂菣벃菣钃菣莃菣ꮁ郥蒁룤銁臣뚺뛦꺁胩躘胦銂菣Ꞃ菣꾂臣讂胣뚺뛦貁胩躘臣ꪁ臣貂臣膀뫦늶臣辀飦ꮁ臣讂臣ꞁ⸳⸳ꮁ苣誂럦袐臣芀⸳⸳銂맧誂뿨馁胣ꢃ雩꺁触蚠臣袂苣膀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈꺁菣莃菣꺁臣膂臣ꢔ臣讂臩鎽臣貸蟩릂苣벃菣銂뇦膂苣芀〲볎辇苣を㔮䱭臣颁鏨膃菣벃菣ꮁ裥ꢳ臣讂胣讓苣鞁胣내菨鶿귥놮臣ꖅ苣讂胣뚺뛦銂㈭莄臣㎧㔶韦뺁臣鶿귥鞁胣ꢃ雩꺁触蚠臣袂苣ꦃ菣ꮃ臣讂胣ં⼼䥄㹖���䥄㹖䐼噉邀볯隼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臥ꊭ뫦늶볯ㆈ⁎㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵匾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵覼胣鮏냦閃菣覃蛥ꞁ胣ꦁ뷥ꪁ껥ꢙ苣릒详鞃菣벃菣誸臣꺽臣芀鋦貋귥銂諥袁苣芀偈䍌귧骴臣뒰볯㒈㔸㘮䱭볯銂諥袁苣芀鋦貋菣것菣袃苣ꪂ菣ꮁ臣膀냦꺁鋦貋苣讖꟥馁苣芀뿦䢃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢볯ㆈ⸴洴覼苣蚂臣辁苣ꂊ臣讂胣뚺뛦꾁껥ꦸ臣鶿귥鞁臣㦦ꖗ雩覮껥ꞁ臣讂胣뚺뛦銂菩肖臣讉ꃩꮁ苣誂菣馃菣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 讉ꃩ芀菣것菣袃苣벃菣ꎂ菣낂胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣꺁苣벃菣ꎂ菣낂铧ꮁ铧蒁苣궂藩ꦷꇨ늶룤꺁닧붣苣떂苣鞊䑃䌠⁄䡃ㅏ諦鎽츸枼洯뚺뛦銂ꫨ붣臣讂볯麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ㆈ黦ꮁ〱䱭臣뚺뛦貁뿥膦臣芁苣覼胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃苣벃苣ꢔ臣ꚁ胣鎁臣뚺뛦ㆲ〰볎銂浉畭潬⁮麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣꺁郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣銂菣ꦃ菣ꎂ菣ꂃ臣蚦臣膀鲀莄臣ㆧ숸㊱駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鞃菣벃菣鞴뗦芀菣것菣袃苣膀菣것菣袃듦蒵駥銂铧蒁臣膀듦蒵뫦늶〳츰䲼臣㎧鯥鞴뗦馁苣芀볯뺁臣꾁胣鞃菣벃菣銂菣ꮃ菣膃菣뎃菣ꮃ菣骃菣뾂菣銂铧蒁臣讉该ꞁ듦蒵臣ꚁ苣袂臣芀볯肜뻥꺁듦蒵뻥膀菣것菣袃苣蚀臣ꮁ臣膀ꇧ蒁ꇨꊝ臣꺽臣龁菣벃菣벃苣ꪂ菣ꮁ믨鎉臣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†菣것菣袃菣궃菣궂菣낂胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃菣銂铧蒁胣厁慥求捯袼〳츰䲼볯銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣鞃菣벃菣銂껥ꦸ胣鞚触ꞁ芙雩袼뇂蚈雩覼苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀菣것菣袃苣ꊂ菣龃菣ꒂ菣ꞁ賥肂臣膀臣龁臣궂菣鎃菣莃菣节臣辁臣閼臣몇臣ꮁ藥貂臣节苣蒁胣许꣨꺁룥袇苣궂菣ꂃ臣鎾臣膀㔱䱭鯧鮛믤趁믦貏菣ꪃ菣궃菣것菣膃菣벃菣薆臣咧步潮慶䐠汩敵瑮苣ꢔ臣ꚁ臣馨뫦늛럧ꚩ雦꺁ꫨ붣胣ꢳ볯许꣨꺁룥袇苣궂菣ꂃ臣鞃菣벃菣㖈黦ꢔ臣芁苣芀苣莃苣ꒂ臣誁臣讂菣것菣袃臣낕臣뺯臣薿ꛨꮁ뿥颁臣辇苣뾪꿧馁苣芀裥邞꣨躘鯦袼佃覼臣覂䑃䌭佈뾂菣醃苣ꪳ迥ꞅ꣦隺볯劈晥匠摴볯꺁苣뎃菣꾂돨莿뫥銂뻥讂胣䎂ⵄ䡃ㅏ苣뎃菣꾂돨努晥匠摴臣㎮츰枼洯뚺뛦銂ꫨ붣臣讂胣㎂츰枼洯뚺뛦銂뻥讂臣膂臣薿ꛨꪁ䑃䌭佈뾂菣醃苣ꪳ敒⁦瑓꺁蟩銂꣨鞮臣讂胣䎂ⵄ䡃ㅏ苣뎃菣꾂돨努晥匠摴臣肜냥뮧该辇臣ㆯ츰䲼臣芁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌲㰹愯㰾䐯噉ਾ돦骼跥趽臣ꦁ郥���臣芁苣鎁臣銂ꋧ趪臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰〴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 䌠ⵄ䡃ㅏ苣뎃菣꾂돨努晥匠摴臣薿ꛨ辇苣肉鳦꺁蟩讁苣閼臣鎁臣ꮁ苣誂룥袇뛦꺁蟩銂꣨鞮臣讂胣㲂牢ਾ볥骼†肉鳦꺁蟩⦏⠭敒⁦瑓辇 ‽貸蟩늶蟩⦏戼㹲设볯ₚㄠ⸰洰⁌‭⸰㄰洲⁌‽⸹㠹洸貸蟩늶㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 䌠ⵄ䡃ㅏ苣뎃菣꾂돨努晥匠摴臣袨껧辇苣膀룥袇뛦袨껧首苣ꮐ苣ㆀ洵薻迨膃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀菣ꖃ菣隃臣讓苣鞁胣㊁胣㒜꟧鎖臣궨껥ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣议苣꺁꣦隺苣뾪ꏨ馁苣芀믤许臣ꢡ苣设臣鞁臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐲㰱愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†郥貸蟩떮髩貾胣膃菣벃菣ꮁ鏨銂臣膀鲀銧雩蚂臣辁苣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣鶁臣貾곦꺁룥袇껦躚臣늀苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 许꣨꺁룥袇苣궂菣ꂃ臣鎾臣膀㔱䱭鯧鮛믤趁믦貏菣ꪃ菣궃菣것菣膃菣벃菣薆臣咧步潮慶䐠汩敵瑮苣ꢔ臣ꚁ鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ볯冈覼뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀裥邞꣨躘鯦袼佃覼臣覂䑃䌭佈뾂菣醃苣ꪳ鿥隺觧ꪳ볯劈晥䴠瑡볯꺁苣뎃菣꾂돨莿뫥銂뻥讂胣䎂ⵄ䡃ㅏ苣뎃菣꾂돨芏藧馨뫦袼敒⁦慍覼臣㎮츰枼洯뚺뛦銂ꫨ붣臣讂胣膃菣벃菣ꮁ鏨銂臣膀鲀銧雩꺁꣨骮臣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀〷膀〱膀臣袂臣㊳渵⽧䱭臣莿뫥꺁䍑뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀룥袇苣궂菣ꂃ臣设苣ꖻ룤ꮁꓧ馁볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㈴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 蒐䍑뫦늶臣膃菣벃菣ꮁ鏨銂臣膀鲀銧雩蚂臣辁苣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ뫦늶臣ꊂ菣뮂苣鎽韦ꮁ雦鞁臣뾪ꏨ馁苣鎁臣节臣趁胣뺁臣꾁룤骮蟩ꮁ裥醁臣趇뗧馁苣鎁臣节臣趁苣芀ꒁ臣겋ꯧ꺁껥鎨臣誁臣讂ꒁ臣冮뚺뛦꺁껥鮚臣莿뫥銂껥辇臣讂胣蒐䍑뫦늶臣ꒁ臣ꚁꒁ臣龮꣩讁苣꺁뗧鲞苣뎹鷥鞁胣㎁臣꺁䍑뫦늶臣貂臣貂臣䎫䅏苣몙ꇨ馁苣芀臣貂苣꺁껥鎨髧ꮁ苣ꢁ苣龁䍑뿦ꚺ苣膀呃䅌ⴴ杉ꧨ首臣蚈黦銂ꇨ蚁髩꺁꣦蒚胥ꢁ臣ꚁ铧蒁苣鎁臣ꮁ臣讂胣冂뚺뛦銂臣邁臣뾽铧ꞁ臣讂룤骮蟩ꢁ臣ꚁ㜭莄臣鶿귥馁苣芀䍑뫦늶臣뾪ꏨ貾뚃鳦鎖鳦릊臣芁苣芀苣莃苣ꒂ뷥ꖗ臣冫뚺뛦銂뿤颭뫥讁苣随苣몇臣膀껥ꦸ臣ꎧ蟥馁苣芀뷤ꢔ觥ꮁ꟨趇臣龁䍑뫦늶苣궸胩ꞁ鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦뾪ꏨ芀裥邞臣讂郥䎄䱔㑁䤭ꚩ雦ꮁ臣蒁臣貸蟩늶룤蒴㈱㔮杭洯뚺뛦銂胣龎雨ꚩ雦㊙〵볎銂룥袇뛦㞲〵볎ꮁ諥袁苣���臣ꮁ苣誂ꫨ붣臣讂胣膃菣벃菣ꮁ鏨銂臣膀鲀銧雩蚂臣辁苣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀裥邞臣讂郥䎄䱔㑁䤭ꚩ雦ꮁ臣蒁臣㚦㈮洵⽧䱭뫦늶苣膀㈱㔮杭洯뚺뛦꺁〴銂룥袇뛦㒲〰볎銂郥肂菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣뾪ꏨ馁苣芀菣ꖃ菣隃臣讓苣鞁胣㊁胣㒜꟧鎖苣ꎁ臣誂菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣蚈黦馁苣蒐呃䅌ⴴ杉ꧨ首臣ꒁ臣ꚁ⸳㈱洵⽧䱭뫦늶苣膀⸶㔲杭洯뚺뛦꺁〴銂룥袇뛦㒲〰볎銂郥肂菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣뾪ꏨ馁苣芀菣ꖃ菣隃臣讓苣鞁胣㊁胣㒜꟧鎖苣ꎁ臣誂菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣鞴뗦떮髩銂맧誂뿨鞁臣鞃菣벃菣銂듦蒵臣讂胣Ꚃ苣ꮃ꿦ꮁ〱츰䲼臣蒐꣦隺뿦ꚺ胣ꚩ雦膀臣袂臣决뚺뛦銂胣隃菣莃苣鞁胣鞴뗦鞁臣鞃菣벃菣ꮁ룤趇ꓨꞁ諥袁苣芀郥冄뚺뛦銂麛胣鞃菣벃菣躯臣袐꣨㚈臣꺁苣Ꞃ菣ꮁ諥袁苣芀껥ꦸ胣鞚触ꞁ芙雩袼뇂蚈雩覼苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀듦蒵苣㖒鯥낹苣钿臣芀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈銂菣ꪃ菣뚂菣讁苣随苣몇臣膀껥ꦸ臣뮈臣芀苣떂苣鞊䑃䌭佈ⴱ菣ꪂ菣뎃諦鎽苣咒步潮慶䈠晵敦궸臣㊧볎⽧䱭臣貸蟩馁苣芀뫦늶苣궸胩ꞁ듧㊄胣㒜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃菣銂铧蒁胣Ꚃ苣ꮃ꿦ꮁ〱츰䲼苣ꂊ臣讂胣꒮룦膀髦肉臣ㆧ駦鎖볯슈㚱裥鎖볯ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃䠭偒苣膀菩肖臣讉ꃩꮁ苣誂ꧨ겖菣莃菣꺁ꫨ骮臣몟臣趁苣莃苣ꒂ臣ꢔ臣讂臣膂臣몢ꯧ閁苣龁뿦ꚺ臣貸蟩馁苣芀鏨銂臣膀뫦늶苣궸胩ꞁ듧㊄胣㒜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃菣銂铧蒁胣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃䠭偒룥袇뫦늶〱츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ諥袁苣芀껥ꦸ胣鞚触ꞁ芙雩袼뇂蚈雩覼苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀맧誂뿨馁胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃菣銂铧蒁胣咁䉍觨ꂴ軥㆟〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ듧㊄裥鎖볯슈ㆱ銧雩覼苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀菣ꮃ菣膃菣뎃菣ꮃ菣骃菣袃苣ꢔ臣膀臥ꊭ뫦늶볯ㆈ⁎㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵匾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵覼〱츰䲼Ꚃ苣ꮃ苣ꂊ臣讂胣鲁귦뚺뛦銂觨ꂴ軥銂諥袁臣꺁臣貐臣蚠뫥ꞁ菣것菣袃臣袂臣Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣膀郥Ꚃ苣ꮃ臣늉듧龎臣떅듧꺁迥鲿駦鎖臣貐臣ꮁ臣讂苣蚁臣馁苣芀灓捥牴䵡硡倠畬鞃菣벃菣궪臣随苣ꢙ苣ꢔ臣膀臩鎽臣㦪뒩菣것菣袃ꫨ뾁迥誂駥ꞁ迥ꞅ돦랕㌶渰꺁㔴渰ꞁ郥覅뫥銂룦骮臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†菣벃苣閩뻤芀맥螝胥膀꣦隺臥꺷胣誁苣뎁䌥ꪁ臣貁뻥覂苣讂潓瑦慭鞃菣낂菣ꂃ菣뎃菣것菣袃苣芏藧馁苣芀苣莃苣ꒂ臣龁郥���몟뫦膀䍑臣袂臣ꚩ雦貸蟩뚺뛦ꮁ臣蒁臣鞾臣覸蟩螤郥覅뫥ꒀ苣ꢔ臣ꚁ郥ꆨ꿧蒚胥銂苣ꢁ苣讂胣馨뫦늛럧銂뷤邈臣讂胣许꣨꺁볥꺁醃菣ꆃ菣뾂菣麛룥銂铧蒁臣芏藧馨뫦螃菣뾂苣ꊃ菣ꪃ菣낂臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㌴⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲䄊⁂‽㔴渰꺁郥覅뫥㲦牢ਾ⁁‽鳦辰볦醿럧ꮁ꿥鲿臣讂郥覅뫥㲦牢ਾ⁄‽鳦Ꞥ볦醿럧ꮁ꿥鲿臣讂郥覅뫥㲦牢ਾ⁣‽鳦Ꞥ臣袂臣肜냥뢼뿨骷胥꺁雩꺁뗧뺯럥꺁⼱ꮁ꿥鲿臣讂뿦ꚺ戼㹲䈊㴠늛럧꺁鯧骷菩蚈臣誁臣袂臣꺁若趁戼㹲砊㴠䌠ⵄ䡃ㅏ鿥隺觧ꪳ臣莿뫥દ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†룤꺁볥銂铧蒁臣袨껧鞁臣뎹鷥銂铧蒁胣馨뫦꺁鯥낸럧꺁껥辇臣芿闦袼㱒畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯灵覼苣节臣膂苣芀ꧨ首룤꺁䑃䌭佈莿뫥꺁꣨鞮胣ꚩ雦邵黦꺁맥螝臣ꦁ뷥ꪁ룥袇뿤낕볯馁臣辂臣膀膀膀臣袂臣ㆳ覼苣讁臣ꚁ藥꺁ꧨ首룤꺁䑃䌭佈莿뫥銂杮洯ꞁ뻥讂胣邵黦銂ꃥ誑臣貂臣䎟䱔㑁䤭뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ볯消⽧汭볯ꞁ駩鞁臣膀呃䅌ⴴ杉臣䎮ⵄ䡃ㅏ뿦ꚺ苣溒⽧杭臣鞾苣芀臣릁臣꺁뗧鲞臣뎹鷥銂苣ꢁ苣膀臣貂苣꾁꣦隺鯦骷臣蒯鯥薆臣ꖅ苣芀鳦貸蟩ꚩ雦궸臣䎮ⵄ䡃ㅏ苣뎃菣꾂돨莿뫥銂胣貸蟩芿闦銂臩ꢔ臣讂臣ꢁ臣袂苣袨껧馁苣芀呃䅌ⴴ杉ꧨ首뿦ꚺ臣뺯臣ꚁ䑃䌭佈뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ苣节臣膂苣龁苣ꮁ胣ꪜ룥袇뿦ꚺ臣꒙臣讂胣㲂牢ਾ꣨鞮뻤骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐲㰴愯㰾䐯噉ਾ돦骼杮䌠⁄䡃汏洠趩볯溈⽧杭볯꾁駧螸裥螎볯炈浰볯ꮁ귧鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꆨ꿧蒚胥芀꣦隺臣ꆨ꿧蒚胥芀꣦隺鯦骷臣骮蟩꺁뿤낕볯劈猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹰볯꾁觢ェ㤮ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀苣궃杮洯馨뫦꺁맥螝菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃臣ꚉ⸰〱郥覅뫥ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀苣궃臣袂臣决袼㈱㌮杮洯覼鳦肺臣莿뫥銂駩辁胣馨뫦늛럧銂苣ꢁ苣讂臣膂臣ꢔ臣龁郥馨뫦莿뫥ꞁ꣨鞮臣龁胥꺁맥螝볯溈⽧䱭볯꾁胣붂菣袃苣Ꞃ苣ꞁ苣ꢁ苣龁꣦蒚볯겅꟧覼胥꺁〲ꖻ蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣벂菣誁苣뎁䱑볯ㆈ⸲渳⽧䱭볯ꪜ뫦꺁뿦ꚺ苣꒙臣膀꣦隺鯦骷苣节臣膂苣龁苣ꮁ铧蒁臣蒐꣦隺뿦ꚺ臣꺁룤趇ꓨ뢐藥ꚺ胥꺁ꓥ開뿤낕볯█噃볯꾁胣붂菣袃苣Ꞃ苣ꞁ苣ꢁ苣龁臣誁苣膀〲ꪜ뫦ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣醰臣辁臣节ꒁ臣肸蟨馁苣螃菣뾂苧貁ꋧ龮臣袨껧ꮁ裥ꢔ迥붃臣芁苣袂臣ꮁ胣馨뫦膀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ臣袂臣ꚩ雦銂룤趇ꓨ꺁苣Ꞃ菣ꮁ菣벃菣馁苣芀郥覸蟩螤臣ꒀ苣ꖈ胣ꮁ꟨邞臣讂胣馨髧讁苣肜苣ꂁ臣ꒀ苣붐臣馁胣㲂牢ਾ뻤骼戼㹲���髧ꒀ⠠杮洯⥌††껥鮚臣ꒀ⠠杮洯⥌戼㹲 ††㔠‰†††††††㈠㰵牢ਾ††††††††††††㠴戼㹲 †††††††††††㐠ਹ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†〵杮洯꺁꣦蒚胥讁苣肜苣ꂁ臣ㆄ臣꺁胥꾁㔲杮洯ꞁ臣讂胣㊂渵⽧䱭臣ꒀ苣覸蟩螤臣覂駩隤臣讂臣ꢁ臣袂苣膀껦誂臣ꒀ臣뎹鷥꾁꣦蒯髧ꒀ臣馁臣ꚁ臣ꦁ郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 议苣꺁ꒁ臣ꒀ臣뎹鷥貁臣ꂁ꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐胣ㆁ臣꺁苧銂駩隤臣膀鯦骷苣趆꣨鞮臣讂胣㲂牢ਾ뻤骼戼㹲馨髧ꒀ⠠杮洯⥌††껥鮚臣ꒀ⠠杮洯⥌戼㹲 ††㔠‰†††††††ㄠ㰰牢ਾ††††††††††††〱㔮戼㹲 †††††††††††㈠ਵ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁胥銂駩隤臣讂臣ꮁ臣讁苣覂臣膀맥螝胥꾁꣦蒚臣覂朦㭴〲ꞁ胣鞁臣貁臣ꚁꒁ臣릂苣늛럧讁苣붐臣鞁胣늛럧銂蛥袨껧馁苣鎁臣ꮁ臣讂胣馨뫦늛럧誸臣㊮苧ꂁ臣銂駩隤臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 儠ꚩ雦꺁꣦蒯髧ꒀ胣冂ꚩ雦꾁껥뺁臣龁뿦ꚺ臣㎮臣꺁苣Ꞃ菣꺁뗧ꢁꛨ骮臣貂胣鞁臣貁臣ꚁ鳦릖돦ꮁ臣蒁臣風볨꺁ꒁ臣겅꟧莿뫥ꮁ臣蒁臣袐꣨㚈臣꺁䍑ꧨ首臣芁苣芀䍑ꧨ首臣㎮臣꺁苣Ꞃ菣꺁냥ꪁ臣ꢁ苣㊂臣꾁䍑ꧨ首臣놨껥閁苣讂臣膂臣겅꟧ꒀ臣㊮┰믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀ꒁ臣冮ꚩ雦꺁냥ꪁ臣ꢁ苣㒂臣꾁臣貂臣貂臣馨髧ꒀ臣㊮薼믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣骁볯㚛臣꺁䍑ꧨ首臣㊮臣袼郥颁뿦ꚺ臣㊮臣ꞁ臣ꪁ臣覼臣膀苣閃菣Ꚃ苣ꊂ臣袨껧鞁臣膀藥낧胥讁苣㊉薼苣誶臣ꚁ胩놄臣ꚁ苣袂臣芀㠱臣冮ꚩ雦Ꚃ苣ꮃ臣㚮臣ꖻ룤꾁臣貂臣貂臣馨髧莿뫥꺁〲ꖻ룤ꞁ胩놄臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ꣩ꚩ雦꺁꣦蒯髧ꒀ胣ꊂ菣뮂苣鞁臣ꚩ꣩ꚩ雦꺁맥螝郥覅뫥꾁꣦隺鯦骷臣肜ꯩ릂鳦肺臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀ꧨ首臣뎹鷥뢐藥ꚺ臣㎌〰渰⽧䱭꣦隺臣뎹鷥뢐藥ꚺ苣誶臣讂ꃥ袐胣ꚩ꣩ꚩ雦銂跥蚈臣貸蟩鞁臣膀〳〰臣覂㈱㌮杮洯꺁雩꺁郥覅뫥銂뻥讂苣蚁臣馁苣芀臣릁臣꺁룥袇뫦늶臣뎹鷥뢐藥ꚺ臣册袼㈱㌮杮洯馨뫦覼臣뎹鷥뢐藥ꚺ苣誂苣躽臣ꪁ臣讁臣誂胣㎁臣꺁ꧨ首룥袇뫦늶볯ㆈ⸲膀⸶㔲胣誁苣뎁⸳㈱洵⽧汭볯꺁냥ꪁ臣ꢁ苣肸臣꾁ꃥ誑迥붃臣邵黦꺁臣膂臣馨뫦늛럧꺁꿧늛蛥ꮁ藥覂臣醁苣낁臣覂臣蒁胣鶁臣뒠郥膀ꧨ鎨ꧨ首苣⚒瑬儻ꢁꃥ誑臣讂胣冂袂苣节ꓥ趁臣膀꣦隺鯦骷臣蒯鯥薆臣ꖅ苣膀ꧨ首룥袇뫦늶臣覸蟩螤郥覅뫥꺁맥螝臣膀苣閃菣Ꚃ苣ꊂ臣节臣膂臣膀〲ꪜ뫦꺁噃苣몤臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀룤趇ꓨ뢐藥ꚺ臣ㆮ臣銂駩隤臣膀蛥袨껧鞁臣貾臣膀噃臣���臣⚠瑧㈻┰臣芁苣讁胣뺁臣꾁ꒁ臣ꚩ雦貸蟩뚺뛦貁〲銂뛨袁苣뢐藥ꚺ臣䎮銂鳦鞁胣馨뫦늛럧꺁꿧늛蛥ꮁ藥讂ꃥ袐胣鎁臣ꚩ雦꺁꟨邞苣낹苣钿臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖龮雦设ㄶ䌭䱔㑁䤭蒵裦ꦉ룤꺁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꺁껦馕蟩ꊂ菣뮂苣ત⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯邼胣㲑䐯噉ਾ鷦首戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐲㰵愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯醼胣㲑䐯噉ਾꧦꢙ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐲㰶愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯銼胣㲑䐯噉ਾꧨ겖臣뾪ꏨઽ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†꟧開鯧뾪ꏨ芀苣뮂菣讃菣ꪃ菣骼냦袼〸㈺覼胣ㆂ뾪ꏨꢔ臣膀苣뮂菣讃菣ꪃ菣袼〸洰覼臣袂臣뺲ꏨ뒰臣龁臣䢯䱐覭듧꺁냦袼〲洰覼苣릒详邭臣膍裥ꮁ럦袐臣讂胣も㈮볎誃苣궃菣閃苣ꮃ苣벃苣骀臣ꚁ苣躁臣讂胣䆂汬慩据랂苣蚃菣ꪁ臣꺁苣뎃菣ꒂ菣놄냦薣뷧뺁臣꾁菣ꪃ苣ꂃ苣醃菣뢂苣ꢔ臣ꚁ꟧開鯧銂蓨鞰臣讂胣躯韦낖臣辁ꫨ붣臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†串丠佡芀鯥鎽慎䡏볯㢈숰ㆱ覼苣辇苣膀䰱菣ꦃ苣뎂臣骮蟩蒚臣뮧臣芀닧붣냦뺁臣꾁偈䍌귧骴臣뒰苣蚈蟩뺁臣ꂊ臣讂胣릒详邭臣袂臣랷郥鞁胣め㈮츲涼菣ꎂ菣뾂菣薣뷧ꞁ苣躁臣讂胣뺁臣꾁胣ㆁ丰丠佡뚺뛦銂胩骶룥袇臣讂胣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 龎雨ꦷꇨ늶胣亂䡡猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢佐猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢菣䢻猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢袼⸳㔴覼臣袂臣亳䍡袼⸲㈹覼苣辇苣膀䰱菣ꦃ苣뎂臣骮蟩蒚臣뮧臣芀닧붣냦뺁臣꾁偈䍌귧骴臣뒰볯蒴〸洰覼苣ꂊ臣讂胣릒详邭臣袂臣랷郥鞁胣뺲ꏨ뒰臣龁臣䢯䱐覭듧꺁냦銂裥辇臣ꞁ諥袁苣芀串丠佡ꞁ䡰苣㞒㔮臣뾪꿧馁苣芀뫦늶苣を㈮츲涼菣ꎂ菣뾂菣薣뷧ꞁ苣躁臣讂胣㒂蓢ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 馨뫦ꚩ雦隃菣뎃苣꺁ꫨ붣胣ꖻ觥ꮁ裥邞臣ꚁꓦ몇迥붃臣것菣ꮃ臣袃菣袃菣墳ㄭ〰苣ꮐ臣ꪁ臣鎁臣貁裥躘臣龁胣蒁臣ꪁ苣䎋䱔㑁䤭ꚩ雦뺁臣꾁鿥隺觧ꪳ苣ꚩ雦隃菣뎃苣ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣蚁苣芀ꧨ首菣ꦃ菣꾂苣뎃菣꾂돨銂ꧨ首臣놅臣蚈黦馁臣趁臣芁苣芀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꾁냦ꮁ苣ꎁ臣誂뫦ꎧ臣讂胣뾽铧趉臣貮藥ꮁ뫦ꎧ臣ꚁ臣讂臣뚺뛦銂ꫨ릁苣袼藥讞髧ꮁ臣ㆯ蚈뻥覼胣袃菣袃菣墳ㄭ〰臣뒰苣誂苣颲胦貁ꯩ辁胣鞁臣貁臣ꚁ뫦ꎧ臣ꚁ臣ꪁ臣辇臣뒰귥ꢜ룤ꞁ鯧ꮁꛨ袁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ㄠ⸰츰枼洯꺁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱鶿귥馨뫦뚺뛦⎲꺁���붣胣袃菣袃菣墳ㄭ〰볯ㆈ⸰숰ㆱ〮杭볯銂〱洰ꆃ苣閃菣릂苣ꮁ귦몢臣꒧蟩鞁胣蚈蟩뺁臣뒰臣貸蟩鞁胣릒详邭臣蚂臣辁苣랷郥馁苣芀塔〱鶿귥馨뫦뚺뛦䆲臣ꦃ菣ꮃ臣讂胣咂ㅘ〰뿤颭꣦隺뫦늶袼〱䱭볯銂〱洰ꆃ苣閃菣릂苣ꮁ迥讂胣蚈蟩뺁臣뒰臣貸蟩馁苣芀塔〱鶿귥馨뫦뚺뛦⎲ꢁ菣馃菣馁苣芀꿦ꖗ雦鞁臣뾪ꏨ馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ㄠ⸰츰枼洯꺁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱鶿귥馨뫦뚺뛦⎲꺁ꫨ붣胣袃菣袃菣墳ㄭ〰볯ㆈ⸰숰ㆱ〮杭볯銂〱洰ꆃ苣閃菣릂苣ꮁ귦몢臣꒧蟩鞁胣蚈蟩뺁臣뒰臣貸蟩鞁胣릒详邭臣蚂臣辁苣랷郥馁苣芀塔〱鶿귥馨뫦뚺뛦䊲臣ꦃ菣ꮃ臣讂胣咂ㅘ〰뿤颭꣦隺뫦늶袼〱䱭볯銂〱洰ꆃ苣閃菣릂苣ꮁ迥讂胣蚈蟩뺁臣뒰臣貸蟩馁苣芀塔〱鶿귥馨뫦뚺뛦⎲ꢁ菣馃菣馁苣芀꿦ꖗ雦鞁臣뾪ꏨ馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 吠ㅘ〰苣릂菣ꂃ臩袐胦閩뻤뚺뛦⎲袼卓ㄣ볯꺁ꫨ붣胣咂ㅘ〰뿤颭꣦隺뫦늶ㄣ臣覂胣鎁臣뚺뛦㎲〰볎銂苣뮂菣讃菣ꪃ菣㎫〰볎ꞁ룥袇臣讂臣ꢁ臣袂苣㖊〮볎⽧䱭臣咮ㅘ〰苣릂菣ꂃ臩袐胦閩뻤뚺뛦銂ꫨ붣臣讂胣钃菣莃菣ꎂ菣낂臣袂苣袂臣랷郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 吠ㅘ〰苣릂菣ꂃ臩袐胦閩뻤뚺뛦⎲袼卓㈣볯꺁ꫨ붣胣咂ㅘ〰뿤颭꣦隺뫦늶㈣臣覂胣鎁臣뚺뛦㎲〰볎銂苣뮂菣讃菣ꪃ菣㎫〰볎ꞁ룥袇臣讂臣ꢁ臣袂苣㖊〮볎⽧䱭臣咮ㅘ〰苣릂菣ꂃ臩袐胦閩뻤뚺뛦銂ꫨ붣臣讂胣钃菣莃菣ꎂ菣낂臣袂苣袂臣랷郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐲㰷愯㰾䐯噉ਾ†塔〱袐ꃦ뎂菣袃菣벃菣膀駩貕꣦隺胣놤闦뎂菣袃菣벃菣꺁ꫨ붣胣咂鶿귥馨뫦뚺뛦⎲讁苣膀믤许臣ꢡ臣風볨꺁ꇨ늶苣뾪ꏨ馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦꺁ꫨ붣胣ꚩ雦銂뿦꺸臣龁臣貸蟩鮁臣ꮁ铧蒁苣芀触蚠볯馨뫦誁苣뎁ꧨ首뫦늶臣覂臣袃菣袃菣墳ㄭ〰臣붊蟥芀귨誑볯许꣨꺁諦몇껦躚臣㎯胣㎜㔮苣뎃菣䢁꺁룦Ꞝ룤ꞁꇨ蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†鯥뢛諦몇볯厈䕐볯銪돨꺁듦Ꞁ賥芀룦Ꞝ菣讃菣벃菣覃臣讓苣誸臣膀菣讃菣벃菣覃蛥ꢃ臣ꦃ菣꾂臣목臣ㆮ쌲㞗挵꺁ꧨ鎨껧銂藥貂苣芀臣貂苣꾁胣莻ꏦꦉ胣ꚩ꣩ꆮ臣芁苣芀鏨銂믤袁胣厁䕐苣벃菣ꪃ菣뢂苣鮸鳥麃菣鮃菣ꮃ菣ꮁ뷧趁胣蒐偓膃菣벃菣꺁룤ꮁ胣莻ꏦꦉ胣膃菣벃菣貁臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀苣뮂菣讃菣ꪃ菣ㆫ〰츰䲼苣蒐偓ꮂ菣袃菣莃苣ꮁ諥袁胣ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ臣馁臣ꚁꫥꪳ뫥銂胩躁臣讂臣ꞁ룦Ꞝ苣讁臣讂胣ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ〱〰볎銂뿨ꂊ臣ꚁ맧誂뿨馁胣뺲ꏨ뒰臣龁臣䢯���覭듧꺁냦㖴〰볎銂郥厄䕐苣벃菣ꪃ菣뢂臣ꂊ臣膀냦貁臣릁臣銪돨誺苣骀臩馁苣뺁臣鮸鳥銂臣醁苣芀닧붣냦뺁臣꾁偈䍌귧骴臣뒰〵츰䲼苣붿諥鞁臣낹苣钿臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 邙闧馨뫦誁苣뎁苣뎃菣궃菣ꮃ臣龁苣꺁偓銪돨誸臣꺁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱莿룧芀裥꺁듦Ꞁ賥厖䕐苣벃菣ꪃ菣뢂臣膀駩貕꣦隺胣袐ꃦ뎂菣袃菣벃菣膀ꓥ鞕苣뎃菣궃菣ꮃ菣ꦃ菣꾂胣誁苣뎁ꧨ首臣貂臣貂〵츰䲼苣钃菣莃菣ꞁ諥袁苣芀郥뚺뛦貁ꫥꪳ뫥銂껥ꢅ臣骀臩馁苣뺁臣厧䕐菣ꖃ菣隃臣鮸鳥銂臣醁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 议闧뾂菣醃苣ꪳ臣厮䕐뫥讁苣꺁駩뮎胣뒰〱〰볎銂郥厄䕐苣벃菣ꪃ菣뢂臣ꂊ臣膀냦貁ꫥꪳ뫥銂胩躁臣讂臣ꞁ菣ꖃ菣隃臣鮸鳥銂臣醁苣芀냦ㆴ〰츰䲼苣붿諥鞁臣떮髩銂맧誂뿨馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꺁偓誺臣覂臣뚺蟥芀菣讃菣벃菣覃臣꺁룦Ꞝ苣螈苣膀ꏨ꺽臣Ꞝ苣벂菣뺁臣讖铦馁苣芀菣讃菣벃菣覃臣讓苣膀偓ꮂ菣袃菣莃苣銂迥誂믤醁臣뺁臣ꞁ苣ꎁ臣誂賦ꆁ룤銁苣芀胣莻ꏦꦉ胣ꚩ꣩ꆮ苣芁苣讁臣膂菣馃菣鞁臣貀뫦몇觧趀ꧨ鎨껧뺁臣꾁苣벃菣떂菣鞃菣벃菣ꒂ苣ꮃ볯芁苣讁臣膂菣馃菣鞁臣邙闧馨뫦膀郥베苣뎃菣궃菣ꮃ胣놤闦뎂菣袃菣벃菣膀菣ꦃ菣꾂胣誁苣뎁ꧨ首볯꺁뗧ꮁ믤袁臣膀偓誺臣覂뫦몇臣讂臣讁臣讂菣ꪃ菣뎃ⵘ〱节鯥躏臣讂胣麃菣鮃菣ꮃ菣꺁鏨銂믤袁胣蒐駩貕꣦隺胣袐ꃦ뎂菣袃菣벃菣膀ꓥ鞕苣뎃菣궃菣ꮃ胣隃菣뎃苣膀臣袂臣ꚩ雦꺁偓ꮂ菣袃菣莃苣꺁룤ꮁ臣貂臣貂臣뚺蟥ꦉꧨ鎨껧膀臣龁臣ꪂ菣袃苣뎃菣ꦃ菣邃苣ꊂ菣貁臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀苣뮂菣讃菣ꪃ菣㖫〰볎銂郥厄䕐苣벃菣ꪃ菣뢂臣ꂊ臣膀苣뮂菣讃菣ꪃ菣貁臣릁臣銪돨誺苣骀臩馁苣뺁臣膃菣벃菣ꮁ룦Ꞝ苣讁臣讂胣麃菣鮃菣ꮃ菣뢁臣鮸鳥銂裥誂胣讓苣膌臣誸臣ꚁ뫦몇觧ꚩ꣩ꆮ胣뺁臣꾁苣벃菣떂菣鞃菣벃菣ꒂ苣ꮃ苣麛迥馁苣芀뫦몇觧ꚩ꣩ꆮ苣ꢔ臣讂ꃥ袐胣邙闧馨뫦膀郥베苣뎃菣궃菣ꮃ胣놤闦뎂菣袃菣벃菣膀菣ꦃ菣꾂胣誁苣뎁ꧨ首臣ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ뫦몇觧銂胣꾂菣麃菣낂菣閃苣랂苣蚃菣ꮁ돦ꖅ臣讂臣膂臣ꪂ菣袃苣뎃菣ꦃ菣邃苣ꊂ菣ꮁ藥貂苣芀뫦몇觧꺁鯥躏臣ꪂ菣袃苣뎃菣ꦃ菣邃苣ꊂ菣銂铧蒁苣뒠郥膀菣ꒂ苣ꮃ苣꾂菣麃菣낂菣閃苣랂苣蚃菣ꮁ鯧ꖎ藥貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖蚈黦ꆝ믤㲶牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㠴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ���㹲 꾂菣麃菣낂菣閃苣랂苣蚃菣銂뫦馂臣讂볯蚈黦趉臣ꦃ菣鞃苣袺蛧鞁胣랂苣蚃菣銂꟧開鯧ꞁ냥ꪁ臣ꢁ苣ㆂ駦鎖맥ꆡ賥馁苣芀卓ㄣ苣肜뷤㒎鯥ꢳ藥馁苣芀觧ꮁ꣨覼臣ꪁ臣讁臣誂胣㊁鯥꺛臣厮⍓ꢳ藥銂臣릁臣꺁苣릂菣ꂃ臩袐胦蚈黦ꮁ铧蒁苣芀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꺁뿤膌駦鎖臣㖯〮뇂蚈臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣蚐ꯨ떮闦ꞁꧨꆾ臣龁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱ꮁ꿥馁苣ꮂ菣ꂃ臣릊軧꾁胣许꣨꺁볥ꮁ苣誂꣨鞮臣龁ꃥ袐胣꞉〲〰껦⾵苣ꦃ菣ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㤴⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲琊㴠ꢳ藥芙臣覂菣벃苣肜ꯩ릂臣뚺蟥芙臣ꞁ臣겸껥鞁臣袃菣袃菣墳ㄭ〰菣벃苣꺁뿤膌駦鎖胣㲂牢ਾ⁷‽菣벃苣꺁臥ꢃ苣馃菣릂菣ꒂ菣ꮁꓥ뾌臣ꚁ룦骮臣龁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱钃菣꾂臣薹胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꪃ菣뎃ⵘ〱钃菣꾂臣肜苣醿臣ꎚ軦钃菣꾂볯芁苣낁볯ꢁ臣鎖臣蚈꟨붃臣꞉ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰〵⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲琊㴠馨뫦ꮁ臣醁苣袃菣袃菣墳ㄭ〰菣벃苣誁苣뎁髩ꖎ菣벃苣꺁뿤膌駦鎖胣㲂牢ਾ⁷‽菣벃苣꺁臥ꢃ苣馃菣릂菣ꒂ菣ꮁꓥ뾌臣ꚁ뻥龁菣벃苣꺁鿥ꢃ臣뺯뿥馁苣薹胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†鳦貾臣㎮鯥꺁卓ㄣ돦ꖅ臣趏뿥芿闦銂룤風臣込苣ꢔ臣ꚁ꣨鞮臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲䄊㴠袃菣袃菣墳ㄭ〰菣벃苣꺁鷩趩戼㹲圊㴠뺯뿥馁苣咋ㅘ〰뿤颭꣦隺뫦늶臣뾪ꏨꮁ臣蒁臣ꢔ臣龁菣ꪃ菣뎃ⵘ〱꺁蟩辇볯消覼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 肜뻥꺁麛臣厮⍓ꢳ藥꺁迥鲿뿤낕臣ꚉ〱꺁鯧뺯꣦隺臥꺷볯劈䑓볯銂鳦鞁臣蒁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣▂卒銂룤風臣込苣ꢔ臣ꚁ꣨鞮臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㈵⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㌵⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲渊㴠ꚩ雦ꮁ臣醁苣겸껥낕戼㹲砊㴠讀胣꺁룦骮胥ત⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†卓㈣臣ㆮ鯥꺁돦ꖅ臣趏뿥芿闦銂卓ㄣ臣肜뻥꺁麛臣ꢳ藥꺁맥螝迥鲿뿤낕臣钯볨馁苣芀卓㈣迥鲿뿤낕臣㎨鯥꺁卓ㄣ돦ꖅ臣뎹鷥趏뿥芿闦ꢁ臣鎖臣꺷菣벃苣뎃菣꾁觢ㆦ┰臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀럥醃菣뮂菣袃苣许꣨꺁볥銂铧蒁臣袨껧馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㔲㰴愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ䙒‱‽麛臣厮⍓ꢳ藥꺁맥螝迥鲿뿤낕戼㹲刊㉆㴠匠⍓꺁迥鲿뿤낕㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 匠䕐뻥꺁ꧨ首菣ꦃ菣꾂麛돦ꖅ苣財臣芀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱것菣ꮃ臣讦苣貂苣낁胣ꚩ雦隃���뎃苣銂臣覂臣㊫鯥ꢳ藥馁苣芀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱貁郥뺁苣貂臣膀呃䅌ⴴ杉軥겖苣莻ꏦ鞁胣ꖻ觥ꮁ裥邞臣ꚁꓦ몇迥붃臣것菣ꮃ臣袃菣袃菣墳ㄭ〰苣ꮐ臣ꪁ臣鎁臣貁裥躘臣ꚁ臣讂胣낖臣蒁菣莃菣꺁呃䅌ⴴ杉軥겖臣낖臣蒁駩貕꣦隺胣誁苣뎁苣뎃菣궃菣ꮃ苣鲽裦馁苣芀觥낿臣ꆨ꿧蒚胥ꮁ臩袐臣ꪁ臣뒠郥膀苣ꦃ菣꺁맥ꆡ賥銂苣蚁芙雩뚻闩鞁胣馨뫦뚺뛦銂蛥ꢳ藥馁苣芀臣貂臣节꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐臣膀룤風臣떮髩銂껥財臣讂胣込苣貁臣蒁臣뾪臣膀臣릁臣꺁껧뮳臣ꖎ뛧貁ꋧ鶿臣貂臣蒁苣鎁臣銂ꋧ趪臣讂胣뎹ꇨ隌苣뚻闩鞁臣节蓧릊臣뒠郥꾁胣뮧该뢛臣覜ꧦ뢛郥覜蟩銂ꫨ肯臣讂臣膀臣龁臣뮧该뢛臣낖臣蒁菣莃菣銂ꫨ붣臣膀卓ㄣ臣袂臣厳⍓銂蛥뾪ꏨ馁苣芀맥ꆡ賥꺁믥랕臣袂臣⾳臣龁臣뮧该뢛臣뾪꿧銂臣ꚁ苣ꆨ꿧蒚胥ꮁ臩袐臣ꪁ臣뒠郥膀苣ꦃ菣銂뫤鮏臣讂胣낹苣钿臣趉臣醰臣辁臣节芙雩뎹ꇨ隌臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†돦ꖅ苣벃苣뎃苣芀偈䍌苣릂菣ꂃ臣袺若뎹ꇨ隌臣袂臣趉꣨꺁裥邞裦龊胣厂䕐뻥龎雨ꦷꇨ늶臣ㆮ鯥ꢳ藥銂ꇨ蒁胣莼귦隃菣뎃苣ꢁ臣ꚁ룤꺁ꃩ銂迥ꞅ臣讂胣袃菣袃菣墳ㄭ〰迥鲿臣ꪁ臣讁ꛨ龯臣讂胣袃菣袃菣墳ㄭ〰菣벃苣꺁뿤膌駦鎖臣钃菣꾂臣芁苣뒠郥膀迥鲿臣ꪁ臣ꪁ苣뺁臣隃菣뎃苣꺁돦ꖅ苣骶臣讂胣厂䕐뻥䎌䱔㑁䤭龎雨꺁麛돦ꖅ苣財臣膀ꧨ首菣ꦃ菣꾂臣鞁臣誸臣薠苣芏藧馁苣芀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱趏뿥貁臣蒁臣뎦꿥馁苣芀菣벃苣ꚇ郧銂ꇨ蚁觥ꮁ胣鎁臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ苣馨뫦膀苣뎃菣궃菣ꮃ臣袂臣ꚩ雦꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣覂럥鞁볥辁胣袐ꃦ뎂菣袃菣벃菣膀駩貕꣦隺胣誁苣뎁ꓥ鞕苣뎃菣궃菣ꮃ臣趇ꓨꢳ藥銂ꇨ蚁胣龎雨ꦷꇨ늶臣ㆮ鯥ꢳ藥銂ꇨ蒁胣袃菣袃菣墳ㄭ〰迥鲿臣趪苣覂苣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣芀ꧨ首臣趇ꓨꢳ藥銂ꇨ蚁胣ꚩ雦ꢳ藥꾁駩貕꣦隺臣趇ꓨꢳ藥誁苣뎁軥겖럧鶡뛦꺁麛돦ꖅ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁胣邙闧馨뫦誁苣뎁軥겖臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣ꢳ藥꺁雩ꮁꧨ首돦ꖅ苣㆒麛苣誶臣ꚁꇨ辂臣蒁苣蚁臣馁苣芀裥邞臣肜뻥꾁駩貕꣦隺臣趇ꓨꢳ藥ꢁ胣龎雨ꦷꇨ늶菣ꦃ菣꾂臣ㆮ鯥ꢳ藥ꞁ껥蚺臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 螃菣뾂蟥蚐胣螃菣뾂蟥蚐苣늀苣讂觥ꮁ胣馁臣ꚁ臣馨뫦膀苣뎃菣궃菣ꮃ胣誁苣뎁ꧨ首苣궃菣袃苣ꦃ菣讁苣ꚩ雦隃菣뎃苣ꢳ藥꺁苣궃菣袃苣ꦃ菣銂럥鞁볥辁胣邙闧馨뫦膀苣뎃菣궃菣ꮃ胣誁苣뎁ꧨ首苣궃菣袃苣ꦃ菣궸臣袃菣袃菣墳ㄭ〰菣벃苣貁臩螈臣놵郥閁苣ꚁ臣���讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀ꧨ首룤ꮁ菣ꪃ菣뎃ⵘ〱钃菣꾂臣芁苣뒠郥膀臣貂臣邙闧馨뫦ꢁ郥颁뿤膌駦鎖苣ꎂ菣覃苣薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀蟩螤돦ꖅ臣蒐뗧꺁菣벃苣ꊝꧧ銂맥螝臣讂胣趇ꓨꢳ藥꺁菣벃苣ꊝꧧꮁ臣醁苣꺷꾁觢ㆦ┰臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀駩貕꣦隺胣袐ꃦ뎂菣袃菣벃菣膀臣龁臣놤闦뎂菣袃菣벃菣꺁蟩螤돦ꖅ臣鎁臣몟뫦ꮁ臩袐臣ꪁ臣뒠郥膀裥邞藥鎽臣ꆄ諥ꢁ胨袁苣貂胣낹苣钿臣薿ꛨ貁臣讂胣ꚩ雦꺁蟩螤돦ꖅ臣鎁臣몟뫦ꮁ臩袐臣ꪁ臣뒠郥膀ꧨ首臣ꆄ諥ꢁ胨袁苣貂胣낹苣钿臣薿ꛨ貁臣讂胣馁臣ꚁ臣隻臣ꚩ雦膀苣뎃菣궃菣ꮃ胣誁苣뎁꣦隺臣膀臣貂苣貁觢ㆦ┰臣몟뫦ꮁ臩袐臣讂臣躁苣膀鳦릊臣芁苣ꢁ胨袁苣貂苣芀鳦芵돦ꖅ苣ꮐ苣膀臣릁臣꺁菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂駩貕꣦隺臣誁臣讂菣ꪃ菣뎃ⵘ〱钃菣꾂臣뎹鷥钃菣꾂鷩趩臣膀駩貕꣦隺臣鶈鳦뎹鷥钃菣꾂鷩趩臣ㆮ┰믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀臣讁臣讂룤鎖駩貕꣦隺苣ㆂ┰臣钯볨ꆝ믤ꮁ臩袐臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣ꪁ臣貂臣膀鳦貾臣袐ꃦ邙闧馨뫦貾臣蚈黦鞁臣馁臣ꚁ臣ꚩ雦꾁蓧릊臣莀臣覂苣膀蛥蚈黦鞁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†駩貕꣦隺胣袐ꃦ뎂菣袃菣벃菣膀ꓥ鞕苣뎃菣궃菣ꮃꧨ首臣閩뻤芀駩貕꣦隺胣袐ꃦ뎂菣袃菣벃菣膀ꓥ鞕苣뎃菣궃菣ꮃ臣뎹鷥袃菣袃菣墳ㄭ〰菣벃苣ꊝꧧ銂꿦莼臣讂胣놤闦뎂菣袃菣벃菣ꚩ雦꺁菣벃苣ꊝꧧ꾁駩貕꣦隺臣节臣袂苣节ꓥ趁臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀郥베苣뎃菣궃菣ꮃꧨ首臣钃菣꾂鷩趩臣邙闧馨뫦꺁苣꺁苣誂苣辰臣辁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ꆸ雦꺁鷦뚻臣ꦁ郥馁苣낁胣ꚩ雦꺁ꧨꆾ苣骶臣ꚁꇨ蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首臣閩뻤芀駩貕꣦隺臣뎹鷥袃菣袃菣墳ㄭ〰菣벃苣ꊝꧧ銂胣许꣨꺁臣誁苣膀菣ꪃ菣뎃ⵘ〱鶿귥馨뫦뚺뛦⎲꺁ꫨ붣臣誁臣ꚁ꟧辇臣龁鷦首臣辇苣莀藦鞁臣鲣귦鞁臣醁苣낁臣覂臣蒁볯㲚牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱌猯扵‾‽㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢卌⼼畳㹢堠⠠〱〮洰⽧瑗⤮戼㹲込룤骼戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䰾⼼畳㹢㴠邙闧れ㔮볎⽧䱭臣鲣귦鞁臣钃菣꾂鷩趩戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䰾㱓猯扵‾‽菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂駩貕꣦隺臣뎹鷥袃菣袃菣墳ㄭ〰菣벃苣ꊝꧧ㲍牢ਾ돦骼㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱌猯扵꾁駩貕⸰층枼洯ꞁ臣鲣귦ꊝꧧꞁ臣誂胣ꚩ雦ꢁ臣钯볨ꮁ铧蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦讁苣꺁맥螝菣ꪃ菣뎃ⵘ〱钃菣꾂鷩趩苣䆒猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䰾⼼畳㹢臣���钯볨馁苣芀菣벃苣ꊝꧧ貁觢䆦猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䰾⼼畳㹢臣芁苣낁胣ꚩ雦꾁ꛨ베臣袐ꃦ馁苣芀菣벃苣ꊝꧧ貁朦㭴㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱌猯扵ꞁ臣貂臣膀ꧨ首臣辦ꃦꮁ郥베臣趁臣蒁胣邵黦銂ꛨ베郥베臣뒠郥貀氦㭴⸰〵灰趀胣节臣辁臣辦ꃦ袐ꃦ놤闦꺁ꃥ袐胣⚌瑧〻㔮瀰浰胣膀臣龁臣鶁苣ꖻꓥꮁꃥ誑臣銿藦ꮁ苣誂ꛨ花臣貂苣ꢁ臣誂臣놠釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㈶䌭䱔㑁䤭龎雨邝雦궸臣议闧뾂菣醃苣ꪳ꺁蟩銂껥辇臣讂苣莃苣ꒂ㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖邝雦㲙牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㔵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖ꚩ雨બ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苧뢅ꇥ뎂菣蚃苣뎃苣ꦷꇨ늶胣ꦁ뷥ꪁ껥ꢙ臣膀鋦貋귥銂諥袁苣芀偈䍌귧骴臣龁臣䶯汩楬潰敲냦袼〵洰覼苣ꂊ臣讂胣궂藩ꦡ苣鞃苣ꮃ讀臣薆껥ꦉ苣ꂊ臣讂胣袂臣랷郥馁苣뺁臣릒详馁苣芀䡰苣膃苣莃苣鞁胣亁佡袼⸱㘱볯뺁臣꾁䍈袼⸱㌲볯銂铧蒁臣㦦㘮뇂⸰ꮁꫨ肯臣讂胣뚺뛦銂〵洰꺁菣ꎂ菣뾂菣薻迨랂苣蚃菣ꮁ諥袁苣芀룦Ꞝ苣讁臣ꚁ뫦늶苣薻迨趂臩馁苣芀蓧貏鷦뚻룤ꞁ菣ꎂ菣뾂菣薣뷧銂迥誂駩趁胣鲃菣ꮃ臣讓苣馁苣芀뫦늶臣㊯胣㢜蓢ꞁ뿤颭臣龁ꃥ袐〳韦鎖껥骮臣芁苣芀뫦늶臣貀苧뢅ꇥ뎂菣蚃苣뎃苣ꦷꇨ늶胣ꢁ菣馃菣馁苣芀듦蒵럧鶡뛦骼볯傈卂볯る〮┵菣ꖂ苣벃菣㊳覼볯䢚䱐覭듧뺁臣꾁楍汬灩牯뒰臣㒮鲃菣ꮃ臣膀鋦貋귥銂諥袁苣芀䉐ꂌ〲賩銂諥袁苣芀菣ꖂ苣벃菣㊳袼⸲洰覼苣ꂊ臣讂胣炂銂菣Ꞃ菣꾂臣膀慎䡏臣龁臣䢯汃苣ꢔ臣ꚁ⸷숴ケㄮ臣뾪꿧馁苣芀鋦貋菣것菣袃苣ꢔ臣ꚁ胣袂臣랷郥馁苣뺁臣릒详馁苣芀뫦늶臣㊯胣㢜蓢ꞁ뿤颭臣龁ꃥ袐〳韦鎖껥骮臣芁苣芀뫦늶臣貀듦蒵럧鶡뛦趀臣ꦃ菣ꮃ臣讂胣鲁귦뚺뛦袼丱䠠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢볯뺁臣꾁坖讁苣꺁⸱〰辦껥ꮡ藩銂룥袇臣骁臣ꢔ臣讂胣鮏냦閃菣覃蛥ꞁ胣ꦁ뷥ꪁ껥ꢙ苣릒详鞃菣벃菣誸臣꺽臣芀鋦貋귥銂諥袁苣芀偈䍌귧骴臣龁臣䶯汩楬潰敲냦袼㠴⸵洶覼苣ꂊ臣讂胣릒详鞃菣벃菣꺁鯩邺苣ꖅ苣膀냦꺁鋦貋苣讖꟥馁苣芀뿦䢃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢볯ㆈ⸴洴覼苣蚂臣辁苣ꂊ臣讂胣뚺뛦꾁껥ꦸ臣鶿귥鞁臣뒠郥㎈ꖗ雩覮껥ꞁ臣讂胣릮駥ꮁ胣鲁귦뚺뛦趀臣ꦃ菣ꮃ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†藩뢅럧鶡뛦袼⸰䴵藩뢅胣めㄮꦡ賥誃菣ꪃ苣ꂃ胣めㄮ袃苣ꒂ菣뎃〲胣炁㍈㔮볯芀迦鞰菣벃菣薆臣���膀臩鎽臣릮駥銂鋦貋菣것菣袃룤ꮁ뷧辁胣릒详邭苣ꂊ臣讂胣䢂䱐覭듧뺁臣꾁楍汬灩牯뒰볯㒈〰䱭볯銂諥袁苣芀鋦貋菣것菣袃臣뮛뫦銂藥貂胣뒰臣릒详銂雩讧臣讂胣랰藩뢅볯ㆈ⸴洸覼苣蚂臣辁苣ꂊ臣讂胣袂臣랷郥馁苣뺁臣릒详馁苣芀ꇥ隌菣袃菣Ꚃ菣袼⸲朹볯銂諥袁臣芀苣辁럦袐臣讂臣ꞁ鋦貋臣讂胣炂銂菣Ꞃ菣꾂臣膀慎䡏臣龁臣䢯汃苣ꢔ臣ꚁ⸳숵ケㄮ臣뾪꿧馁苣芀菣ꖂ苣벃菣㊳袼⸰洵覼苣ꂊ臣讂胣袂臣랷郥馁苣뺁臣릒详馁苣芀偈䍌귧骴臣龁臣䶯汩楬潰敲냦ꞁ鳦芵蟩㖏〰䱭臣뾪꿧馁苣芀苣辁럦袐臣讂臣ꞁ鋦貋臣讂胣뚺뛦꾁鲀莄臣鶿귥鞁臣뒠郥㎈ꖗ雩覮껥ꞁ臣讂胣릮駥ꮁ胣ꊅ藩ꦷꇨ늶胣ꢁ菣馃菣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 Ꚃ苣꺂諦뾂菣醃苣ꪳ鞊뷤芀菣ꒂ苣ꮃ苣랆铨ꮺ臣覂迥誂蟥鞁胣꒮룦ꮁ裦馁胣䢂䱐覭듧뺁臣꾁楍汬灩牯뒰볯㊈〮䱭볯銂諥袁苣芀〲볎辇苣を㔮䱭臣颁鏨膃菣벃菣ꮁ裥ꢳ臣讂胣讓苣鞁胣내菨鶿귥놮臣ꖅ苣讂胣뚺뛦꾁㈭莄臣鶿귥鞁臣뒠郥㎈㔶韦鎖껥骮臣芁苣芀菣ꪂ菣뎃賥鞊苣뎃菣꾂돨䆪諦鎽胣邃苣ꊂ菣銂蛥떔뫥讁苣随苣몇臣膀껥ꦸ臣뮈臣芀偈䍌귧骴臣龁臣䶯汩楬潰敲냦袼⸱洰覼苣ꂊ臣讂胣㚂츰䲼蟩銂⸲洰궁臣讓菣ꖃ菣隃臣蚈돦馁苣芀鏨銂臣膀듧麃뿤颭껧ꮁ藥貂苣芀뫦늶臣⶯〲蓢ꞁ뿤颭臣龁ꃥ袐㘳ꖗ雩覮껥ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈芀偈䍌귧骴臣龁臣䶯汩楬潰敲냦袼⸰洵覼苣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃䠭偒臣邃苣ꊂ菣ꮁ諥袁苣芀럦袐臣讂臣膂臣膀菣ꒂ苣ꮃ臣讓苣鞁胣蒴〱꟧鎖苣ꎁ臣誂菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣낂菣뮂菣벃菣袼⸰洵覼苣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃䠭偒臣邃苣ꊂ菣ꮁ諥袁苣芀菣ꒂ苣ꮃ臣讓苣鞁胣邃苣ꊂ菣銂闦麛苣ꎁ臣誂迥ꊻ臣鮁苣芀뫦늶苣薸뗦ꪁ菣릂菣벃菣钃菣莃菣ꮁ郥蒁룤銁臣뚺뛦꺁胩躘胦銂菣Ꞃ菣꾂臣讂胣㊂츰䲼蟩銂⸰洵궁臣讓菣ꖃ菣隃臣蚈돦馁苣芀鏨銂臣膀듧麃뿤颭껧ꮁ藥貂苣芀뫦늶臣⶯〲蓢ꞁ뿤颭臣龁ꃥ袐㘳ꖗ雩覮껥ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†꣦隺臣뾪ꏨ芀苣뎃菣꾂돨䆪鿥隺觧ꪳ볯犈晥洠瑡볯꺁苣뎃菣꾂돨莿뫥銂裥邞꣨躘鯦袼佃覼臣覂뻥讂胣뾂菣醃苣ꪳ鶿귥뚺뛦銂껥ꦸ臣ꎧ蟥鞁胣뾂菣醃苣ꪳ⁁敲⁦慭꺁ㄱ㔬〰杮洯뚺뛦銂ꫨ붣臣讂胣ㆂⰱ〵渰⽧䱭뫦늶苣鞾苣龁苣꺁苣뎃菣꾂돨䆪爠晥洠瑡臣薿ꛨ辇苣袨껧馁苣芀鳦辰꟧開蟩꾁〱볎ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㘵⼼㹡⼼䥄㹖ꢳ볯ₚ颍뷤貁臩袐胦ꞁ臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱���⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㔲㰷愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣꾂돨䆪爠晥洠瑡臣薿ꛨ辇苣肉鳦꺁蟩讁苣閼臣鎁臣ꮁ苣誂藩뢅럧鶡뛦袼⸳覼臣辇苣袨껧馁苣芀戼㹲込볯ₚ⠠触鮜臣辇⴩刨晥匠摴蟩⦏㴠⠠룥袇뛦辇㰩牢ਾ뻤骼†〱〮䱭ⴠ〠㤮〲䱭㴠㤠ㄮ〸䱭룥袇뛦લ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣꾂돨䆪爠晥洠瑡臣袨껧辇苣膀藩뢅럧鶡뛦袨껧首苣ꮐ苣ㆀ洵薻迨膃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀菣ꖃ菣隃臣讓苣馁苣芀鲀銧雩蚂臣辁苣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣袼潖瑲硥䜠湥敩㈠臣궨껥㒚볯芀껦誂臣馨뫦銂믤许臣몤臣辇苣ꢔ臣ꚁꫨ붣臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㠵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 蒐룥袇껦躚뻥膀菣ꖃ菣隃臣讓苣鞁胣㊁胣㒜꟧鎖苣ꎁ臣誂菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀臣꺁뻥ꆬ臣貸蟩떮髩ꮁ胩肂胣芏藧馨뫦誁苣뎁鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃꧨ首苣꒮룦ꞁ〱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣貾胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀郥馨뫦莿뫥銂룤趇ꓨꚂ苣ꮃ臣蚈黦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ꣩ꚩ雦꺁ꫨ붣胣鶃菣鞃菣钃菣뎃菣ꖃ菣隃蛥ꞁ呃䅌ⴴ杉ꧨ鎨ꧨ首臣㖮杭洯膀⸲洵⽧䱭臣袂臣ㆳ㈮洵⽧䱭뿦ꚺ苣ꊅ藩ꦷꇨ늶苣ꢔ臣ꚁꫨ붣臣讂胣䎂䱔㑁䤭ꚩ雦銂껥ꦸ臣ꎧ蟥鞁臣貾胣貸蟩뚺뛦銂ꫨ붣臣讂臣膂臣ꢔ臣讂胣㖂〮杭洯뚺뛦銂뻥讂臣膂臣ꚩ꣩ꚩ雦꺁뿥膦蟩銂꣨鞮臣讂胣肜냥뮧该辇臣ㆯ츰䲼臣芁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㔲㰹愯㰾䐯噉ਾ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘲㰰愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†⸵⸱″ꚩ꣩ꚩ雦꺁뿥膦蟩銂触鮜臣辇臣覂볥辁臣ꢁ臣袂苣ꊅ藩ꦷꇨ늶臣辇苣袨껧馁苣芀戼㹲込볯ₚ⠠触鮜臣辇⴩ꚩ꣩ꚩ雦辇 ‽貸蟩늶蟩⦏戼㹲设볯ₚㄠ〮䱭ⴠ〠㈮〰䱭㴠〠㠮〰䱭룥袇뛦લ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨ꧨ首臣袨껧辇苣膀藩뢅럧鶡뛦꺁꣨鞮雦銂郥肂㔱䱭믦貏菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣讂胣膃菣벃菣ꮁ鏨銂臣膀鲀銧雩蚂臣辁苣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣袼潖瑲硥䜠湥敩㈠臣궨껥㒚볯芀ꧨ首苣꒮룦ꞁ〱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣貾胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 膓돨뎂菣袃菣벃菣ꚩ雦꺁ꫨ붣胣뾂菣醃苣ꪳ몟뫦ꦉ돨꺁苣뎃菣꾂돨莿뫥銂佃讁苣鞾苣芀苣뎃菣꾂돨䆪爠晥洠瑡臣ㆮⰱ〵渰⽧䱭뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀鏥ꪳ苣뎃菣궃菣ꮃ볯冈覼ꧨ首苣ꖻ룤꺁ꇨꮁ꣨覼臣ꢁ臣誂臣뾪ꏨ馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘲㰱愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†���츰䲼蟩銂⸲洰궁臣讓菣ꖃ菣隃臣蚈돦馁苣芀鏨銂臣膀듧麃뿤颭껧ꮁ藥貂苣芀뫦늶臣⶯〷蓢ꖻ룤ꞁ뿤颭臣龁ꃥ袐㠱ꖗ雩覮껥ꞁ臣讂胣冂ꚩ雦궸臣뾂菣醃苣ꪳ莿뫥銂胣鎁臣릖돦銂铧蒁臣㎦臣꺁诧讫臣龁苣뎃菣꾂돨䆪䔠䥌䅓苣莃苣ꒂ苣財臣鎁臣ꮁ苣誂胣芁苣讁臣膂껥辇臣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀㠱臣邵黦袼ꒁ臣겋ꯧ鞁臣ꊂ菣뮂苣讁臣讂苣莃苣ꒂ꿦ꮁꒁ臣Ꚃ苣ꮃ볯銂맥螝臣讂胣蒐䍑ꧨ首臣뾂菣醃苣ꪳ莿뫥銂郥뾪ꏨꮁ觥誂뷥ꚁ苣芀껥鎨뷥ꖗ胣蒐䍑ꧨ首臣ㆮ臣꺁菣ꒂ苣ꮃ苣꒮룦ꞁ꟨趇臣讂臣膀臣龁臣冯ꚩ雦銂苣뎃菣꾂돨䆪臣鶿귥늶菣ꒂ苣ꮃ臣覂雦鞁臣뾪ꏨ馁苣芀鲀銧雩蚂臣辁苣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣袼潖瑲硥䜠湥敩㈠臣궨껥㒚볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 讉ꃩ芀跦覍諦鎽臣袂苣鞃菣벃菣뎂菣蚃苣뎃苣芀苣떂苣鞊苣뎃菣꾂돨䆪諦鎽臣뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ苣붣胩薀臣䎮䅏臣覂뻥讂胣ㆂ〰볎⽧䱭뫦늶〱䱭苣鞾苣龁苣꺁苣떂苣鞊苣뎃菣꾂돨䆪諦鎽臣薿ꛨ辇苣袨껧馁苣芀鳦辰꟧開蟩꾁〱볎ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㈶⼼㹡⼼䥄㹖ꢳ볯颍뷤貁臩袐胦ꞁ臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘲㰳愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†苣떂苣鞊苣뎃菣꾂돨䆪諦鎽臣薿ꛨ辇苣肉鳦꺁蟩讁苣閼臣鎁臣ꮁ苣誂룥袇뛦꺁蟩銂꣨鞮臣讂胣㲂牢ਾ볥骼†肉鳦꺁蟩⦏⠭諦鎽蟩⦏㴠⠠룥袇뛦辇㰩牢ਾ뻤骼†⸳洰⁌‭⸰㄰洲⁌‽⸲㠹洸貸蟩늶㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 Ꚃ苣꺂諦뾂菣醃苣ꪳ鞊뷤꺁꣨鞮蟩銂胣貸蟩늶臣袨껧首苣ꮐ苣ㆀ洵薻迨膃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀菣ꖃ菣隃臣讓苣鞁胣㊁胣㒜꟧鎖苣ꎁ臣誂菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣뎂菣蚃苣뎃苣ꦷꇨ늶룤꺁苣떂苣鞊苣뎃菣꾂돨䆪諦鎽츱枼洯뚺뛦銂볥銂铧蒁臣뾪ꏨ馁苣芀뫦늶〱츰沼苣䦒浭汵湯䤠麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣꺁郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣㊂胣㢜蓢ꞁ㠱뇂芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鞃菣벃菣銂胣鞃菣벃菣鞴뗦ꢙ苣鞴뗦ꦷꇨ늶〳츰䲼胣뢵볦芙雩벂菣ꞁ铧蒁臣膀듦蒵뫦늶臣㎧鯥鞴뗦馁苣芀臣龁臣膀菣것菣袃苣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃菣銂铧蒁臣鞴뗦鞁臣节苣蒁胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃菣銂铧蒁臣厦灵牥求捯袼駧늌闥馨볯㊉〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣銂髦肉胣꒮룦ꞁ〶裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀迥ꞅ꣦隺胣膓돨뎂菣袃菣벃菣膀臣袂臣ꚩ꣩ꚩ雦蒐〱츰䲼苣ꊂ菣뮂苣鞃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃苣鞚触膀껥ꦸ臣㚧蚈뇂〱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣���菣馁苣芀듦蒵苣낹苣钿臣芀菣ꪂ菣뎃諦뾂菣醃苣ꪳ鞊뷤꺁苣뎃菣꾂돨莿뫥銂ꏨꂀ胨꺁佃讁苣鞾苣芀룥袇뛦궸臣鎃苣膃菣鞊苣뎃菣꾂돨䆪諦鎽⸱洰⽧䱭뫦늶⸱洰銂ꫨ붣臣讂胣궸胩ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣ㆂ杭洯뚺뛦袼⸷⸹覼〵볎銂룥袇뛦ゲ㤮〵䱭臣ꂊ臣讂胣궸胩ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣㖂츰枼洯뚺뛦袼⸷⸹覼㔱츰䲼苣貸蟩늶㐱㠮〵䱭臣ꂊ臣讂胣麃菣膃菣ꎃ菣趃菣钃菣莃苣벃苣ꢔ臣ꚁ〱츰䲼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ諥袁苣芀껥ꦸ臣㚧蚈뇂〱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀듦蒵苣낹苣钿臣芀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈銂룤風臣ꢁ臣誂臣貸蟩馁苣芀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈⁐〱볎銂룥袇뛦ゲ㤮〹볎ꮁ諥袁胣め〮洱⽧䱭苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈銂뻥讂胣궸胩ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣も〮洱⽧䱭苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ⶳ剈⁐〸볎銂룥袇뛦㎲⸹㈹洰ꮁ諥袁苣芀룤龀臣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀菣ꮃ菣膃菣뎃菣ꮃ菣骃菣뾂菣銂铧蒁臣ㆦ〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣꒮룦ꞁ〳裥슆㖱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀䵔銂蛥떔뫥讁苣随苣몇臣膀䵔꺁菣것菣袃꿦ꮁ鳦躽〱䱭苣ꦁ뷥ꪁ껥ꢙ臣螃苣뎃菣馁苣芀髦肉臣誁臣ꚁ껥ꦸ臣뮈臣芀듦蒵苣낹苣钿臣膀麛듦蒵臣讂胣咂䉍觨ꂴ軥㆟〰볎銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣讂胣꒮룦ꞁ듧㊄裥슆ㆱ裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀〱츰䲼Ꚃ苣ꮃ臣鲁귦뚺뛦銂諥袁臣늉듧龎迥鲿苣鲁귦馁苣芀臥ꊭ뫦늶苣늉듧龎苣ꂊ臣龁臣ꢁ郥颁ꃩ辺臣鞃菣벃菣誁苣뎁苣Ꞃ菣ꮁ諥袁胣蒐苣Ꞃ菣ꞁ觨ꂴ軥ꢁ藩ꂴ臣趏뿥芙雩貁郥颁臣ꪁ苣袂臣ꮁ臣讂胣芏藧ꊳ闩㚷〳浮臣㒮〵浮臣뢐藥ꚺ볯䆈覼苣겸껥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 ꆨ꿧蒚胥芀꣦隺鯦骷臣ꆨ꿧蒚胥芀껥辇駩貕볯冈覼鳦肺臣ꒀ臣늛럧꺁ꗦꒀ苣몢ꯧ馁苣鲣諥꺁臣膂臣鞁臣ꢔ臣覂苣ꪁ臣龁苣膀꣦隺臣ꆨ꿧蒚胥꾁䱑믤誸臣ꒀ臣芁臣꾁臣讂胣馨뫦늛럧꺁껥辇臣芿闦袼㱒畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯灵覼臣膀潓瑦慍⁸剐붂菣袃苣Ꞃ苣ꞁ苣ꢁ苣ꚁ觢ェ㤮ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀苣궃杮洯꺁꣦隺臣뎹鷥邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣꾁觢ウ〮뢐藥ꚺ臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣벂菣誁苣뎁䱑苣꒙臣膀꣦隺鯦骷苣节臣膂苣龁苣ꮁ铧蒁臣蒐꣦隺뿦ꚺ臣袨껧ꒀ볯溈⽧䱭볯꺁맥螝臣膀苣閃菣Ꚃ苣ꊂ臣节臣膂臣馨髧袼藥낧볯ꒀ臣ㆮ┵믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀苣궃臣袂臣决銂駩辁胣馨뫦늛럧銂苣ꢁ苣讂臣膂臣ꢔ臣龁郥馨뫦莿뫥꺁룤趇ꓨ䆇㱂畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔴㰰猯扵ꒀ臣覤该芿闦袼䌥覼臣膀苣閃菣Ꚃ苣ꊂ臣节臣膂臣ꚉ㔱ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣馨뫦늛럧꺁䱑���覸蟩螤郥覅뫥꺁맥螝臣膀苣閃菣Ꚃ苣ꊂ臣节臣膂臣膀〲ꪜ뫦꺁䌥銂ꓧ閁臣醁苣낁臣覂臣膀꣦蒚臣㊮┰믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀냥ꪁ臣ꢁ苣㊂臣꺁룤뒇臣讂菣벃苣릂臣몢껥ꮁ꣨鞮臣ꦈ铧꾏菨ꞁ臣讂苣蚁臣膀꣦隺胣뎂菣袃菣벃菣誁苣뎁ꧨ首苣覸蟩螤臣Ꚃ苣ꮃ臣궃菣覃臣讂胣뎹鷥銂꣨鞮臣讂臣膂臣ꢔ臣龁郥覸蟩螤臣ꒀ苣ꖈ胣ꮁ꟨邞臣讂胣㲂牢ਾ뻤骼戼㹲馨髧ꒀ⠠杮洯⥌††껥鮚臣ꒀ⠠杮洯⥌戼㹲 †㈠㔮†††††††⸱㰲牢ਾ††††††††††㈠㌮戼㹲 ††††††††††⸲ਵ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†⸲渵⽧䱭臣馨髧ꒀ臣覂鳦节臩蒁ꒁ臣ꒀ臣ㆯ㈮杮洯ꞁ臣讂胣ㆂ㈮杮洯꺁胥銂룤趇ꓨ讁苣꒙ꓥ馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣议苣꺁胥꺁맥螝臣ꆨ꿧蒚胥꺁臣릁臣ꮁ臩袐臣讂胣趆꣨鞮뻥膀苣蚁ꒁ臣릂臣ꆨ꿧蒚胥ꮁ臩袐臣ꪁ臣뒠郥膀苣莃苣ꒂ臣覜諥ꞁ臣ꪁ臣膀蛥ꚺꇨ辂臣醁苣낁臣覂臣蒁胣议苣꺁ꒁ臣ꒀ臣뎹鷥貁臣ꂁ꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐胣ㆁ臣꺁苧袼ꒁ臣Ꚃ苣ꮃ臣릁臣覼苣꒙ꓥ鞁胣늛럧銂蛥袨껧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 儠ꚩ雦꺁꣦蒯髧ꒀ胣冂ꚩ雦꾁껥뺁臣龁뿦ꚺ臣㎮臣꺁苣Ꞃ菣꺁뗧ꢁꛨ骮臣貂胣鞁臣貁臣ꚁ鳦릖돦ꮁ臣蒁臣風볨꺁ꒁ臣겅꟧莿뫥ꮁ臣蒁臣袐꣨㚈臣꺁䍑ꧨ首볯袐꣨ㆈ꺁苣Ꞃ菣覼臣芁苣芀䍑ꧨ首臣㎮臣꺁苣Ꞃ菣꺁냥ꪁ臣ꢁ苣㊂臣꾁䍑ꧨ首臣놨껥閁苣讂臣膂臣겅꟧ꒀ臣㊮┰믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀ꒁ臣冮ꚩ雦꺁냥ꪁ臣ꢁ苣㒂臣꾁꣨릮臣貂臣醁苣낁臣覂臣蒁볯㚛臣꺁䍑ꧨ首臣㊮臣袼郥颁뿦ꚺ臣㊮臣ꞁ臣ꪁ臣覼臣袂臣ㆳ꺁䍑ꧨ首苣Ꞃ菣꺁ꒁ믤许臣鶁苣麁苣꺁꣦蒚뿦ꚺ臣㊮┰苣誶臣ꚁ胩놄臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ꣩ꚩ雦꺁꣦蒯髧ꒀ胣ꊂ菣뮂苣鞁臣ꚩ꣩ꚩ雦꺁룤趇ꓨ꺁郥ꒀ臣膀苣閃菣Ꚃ苣ꊂ臣节臣膂臣膀臣꺁뿦ꚺ臣뎹鷥ꒀ臣㊮┰믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀ꒁ믤誸臣뎹鷥䆇㱂畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔴㰰猯扵ꒀ臣馨뫦늛럧誸臣肜苣颫臣릂苣誂苣誸臣芁苣龁苣ꮁ꣨鞮룤꾏菨ꞁ臣讂ꃥ袐胣ꚩ雦銂胣㎁臣꺁胥꺁냥ꪁ臣ꢁ苣肸臣꺁ꒁ臣馨뫦늛럧誸臣覼苣뺁臣貸蟩ꚺ苣誸臣ꚁ蛥ꊂ菣뮂苣鞁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣蒐ꧨ鎨ꧨ首꣦蒚뿦ꚺ臣ꒁ臣ꚁ뻥龁룤趇ꓨ꺁鿧讦臣▮噃臣膀苣閃菣Ꚃ苣ꊂ臣节臣膂臣ꚉ〲ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†꣨鞮胣뎹鷥ꒀ胣馨뫦辁럥膀臣袂臣△噃臣鞾苣貂苣뾂菣醃苣ꪳ⁁䱅卉꺁臣膂臣厮景浴硡菣궃苣ꦃ菣蚃菣鞃菣벃菣銂迥ꞅ臣讂胣ꊂ菣뮂苣鞁臣蒐鿥隺���袂臣ꚩ雦莿뫥ꮁ臣蒁臣鞾臣覸蟩螤郥覅뫥袼䉁볯ꒀ苣뎹鷥馁苣芀룤風臣込臣麝諥趇醃菣ꆃ菣뾂菣麛룥銂铧蒁臣뾂菣醃苣ꪳ馨뫦꺁菣벃苣銂菣螃菣뎃苣馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘲㰴愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ業⁮‽鳦辰볦醿럧ꮁ꿥鲿臣讂䉁胥㲤牢ਾ慭⁸‽鳦Ꞥ볦醿럧ꮁ꿥鲿臣讂䉁胥㲤牢ਾ䑅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵‾‽鳦Ꞥ臣袂臣肜냥뢼뿨骷胥꺁雩꺁뗧뺯럥꺁⼱ꮁ꿥鲿臣讂䉁戼㹲䈊㴠늛럧꺁鯧骷菩蚈臣誁臣袂臣꺁若趁戼㹲䌊㴠뾂菣醃苣ꪳ꺁뿦ꚺ㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦궸臣뾂菣醃苣ꪳ莿뫥꺁꣨鞮胣ꚩ雦邵黦꺁맥螝臣ꦁ뷥ꪁ룥袇뿤낕볯馁臣辂臣膀膀膀臣袂臣㢳볯銂臣醁臣莅臣ꚩ雦궸臣뾂菣醃苣ꪳ莿뫥銂杮洯ꞁ뻥讂胣邵黦銂ꃥ誑臣貂臣䎟䱔㑁䤭뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ볯消⽧䱭볯ꞁ駩鞁臣膀呃䅌ⴴ杉룤꺁苣뎃菣꾂돨䆪뿦ꚺ苣溒⽧杭臣鞾苣芀戼㹲袨껧设볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㔶⼼㹡⼼䥄㹖ꢳ볯溚뾂菣醃苣ꪳ⽁杭䌠䱔㑁䤭袼杮洯覼臣뺙룤蚈軧袼灰覼臣覭臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首臣뾂菣醃苣ꪳ莿뫥袼李洯覼臣袨껧芀ꧨ鎨ꧨ首룤꺁苣뎃菣꾂돨䆪臣辇苣膀鯥낸볥銂铧蒁苣뺏ꇨ꺁潓瑦慍붂菣袃苣Ꞃ苣銂铧蒁臣袨껧馁苣芀郥ꚩ雦꺁ꒁ臣貸蟩뚺뛦銂苣莃苣ꒂ臣讂胣袨껧鞁臣莿뫥ꮁ臩鎽臣貸蟩芿闦銂臣醁臣鶈鳦ꚩ꣩ꚩ雦궸臣莿뫥銂뻥讂胣㲂牢ਾ뻤骼戼㹲ꚩ꣩ꚩ雦꺁뿦ꚺ臣㖯洰⽧䱭臣芁苣芀戼㹲ꚩ雦貸蟩뚺뛦₲††貸蟩芿闦㲰牢ਾ††洵⽧䱭†††††〱戼㹲 †㈠㔮杭洯⁌†††㈠㰰牢ਾ††⸱㔲杭洯⁌†††㐠㰰牢ਾ洵⽧䱭ꧨ首䔭䥌䅓菣벃苣ꮁ苣誂苣뎃菣꾂돨䆪臣莿뫥꾁〱杮洯ꞁ臣讂戼㹲ㄊ渰⽧䱭韃〱볯貸蟩芿闦覼㴠ㄠ〰杮洯袼ꧨ鎨ꧨ首룤꺁苣뎃菣꾂돨䆪볯㲉牢ਾ⸲洵⽧䱭ꧨ首䔭䥌䅓菣벃苣ꮁ苣誂苣뎃菣꾂돨䆪臣莿뫥꾁⸵渰⽧䱭臣芁苣㲋牢ਾ渵⽧䱭韃〲볯貸蟩芿闦覼㴠ㄠ〰杮洯袼ꧨ鎨ꧨ首룤꺁苣뎃菣꾂돨䆪볯㲉牢ਾ⸱㔲杭洯ꚩ雦⶙䱅卉螃菣뾂臣袂苣뾂菣醃苣ꪳ꺁뿦ꚺ臣㊯㔮杮洯ꞁ臣讂戼㹲㈊㔮杮洯썌㒗袼룥袇뿤낕볯₉‽〱渰⽧䱭볯ꚩ꣩ꚩ雦궸臣뾂菣醃苣ꪳ覼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 ㌠臣꺁胥讁苣뎹鷥莿뫥銂꣨鞮臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†뗧鲞臣놠釥芀뗧鲞苣貀藥뾂菣醃苣ꪳ‥⽷膀杮苣뎃菣꾂돨䆪洯ꢅ苣뎃菣꾂돨趀胣뺁臣꾁胣炌浰胣袼⽷覼臣벑臣节臣ꞁꃥ誑臣ꚁ苣袂臣芀戼㹲设볯㲚牢ਾ⸰〰㄰‥⽷⁷‽渱⽧杭㴠ㄠ灰⁭眨眯㰩牢ਾ꣨鞮뻤骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘲㰶愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†䉁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰���睷⹷灪⹯潧樮≰㐾〵⼼畳㹢胥貁䱑볯よㄮ㠸杮洯覼臣䆮㱂畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔴㰰猯扵袂苣节냥閁臣ꚩ雦꾁胣册ꪜ뫦趀臣놠釥馁臣趁臣芁苣芀䉁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾〵⼼畳㹢胥貁䱑볯よㄮ㠸杮洯覼臣䆮㱂畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔴㰰猯扵袂苣节ꓥ趁臣ꚩ雦꾁駧螸裥螎볯炈浰볯ꢁ臣ꚁ鳦节뿨蒁闦낕臣놠釥馁臣趁臣芁苣芀戼㹲设볯㲚牢ਾꧨ首뿦ꚺ臣㖯洰⽧䱭臣芁苣芀裥邞臣龁鳦节ꯩ蒁ꧨ首뿦ꚺ臣㖯杭洯ꞁ臣讂볯ㆈㄯ貸蟩覼胣ꚩ雦꺁䉁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾〵⼼畳㹢臣冯袂苣节냥閁臣芀戼㹲儊⁌‽⸰㠱游⽧䱭戼㹲ꚉ⸰㠱游⽧‵杭戼㹲ꚉ⸰㐰渠⽧杭戼㹲貀觢膀䱑㴠〠〮瀴浰胣ꢁꃥ誑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯颼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤㚋骼呃䅌ⴴ杉軥겖ꧨ首룤꺁苣龃菣颍돧袼ⵎ苣뮂菣ꮃ苣ꦃ苣袃苣龃菣膀ⵎ苣뮂菣ꮃ苣ꮃ苣떂菣뎃볯꺁苣뎃菣꾂돨ꮁ꿥馁苣ꊃ菣钯苣节臣膂苣릖돦ક⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯馼胣㲑䐯噉ਾꧨ겖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 ꂊ냦蚈꟨뚺뛦袼临䠠汃냦뚺뛦覼胣㚂⁎䍈袼㘱洰覼臣袂臣䢳䱐覭듧꺁냦袼〸䱭볯銂㔲洰꺁苣ꦃ苣뚓臣ꂊ臣讂胣릒详鞁臣袂臣랷郥馁苣芀鲀莄臣㚧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣颪냥鎽賥뚺뛦䦲볯よㄮ⁍偁協냦뚺뛦覼胣䢂䱐覭듧꺁냦袼㤱츲䲼볯銂苣ꦃ苣邃苣ꊂ菣궸臣䆮呐覲鳦袼〱杭볯ꮁ諥袁苣芀菣ꒂ苣ꮃ苣㖒胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣䆁呐銂껥ꢅ臣뚺꟨馁苣芀㈭莄臣ㆧ맥뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 颪냥鎽賥뚺뛦䦲袼䴱藩뢅臣袂臣コ㈮䴵丠䉡㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵䌾覼胣も㐮䱭臩莿껧궸臣ꊅ藩袼〲볎覼苣䢒䱐覭듧꺁냦袼㈳츰䲼볯ꞁ룥袇볯ㆈ趀룥袇볯鞁胣ㆁꊅ藩뚺뛦銂ꫨ붣臣讂胣亂䉡㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵䌾袼⸲숰ケ㔮杭볯銂뷤ꦸ단떔菣ꒂ苣ꮃ룤ꮁ꟧辇臣讂胣许꣨꺁볥銂铧蒁胣ꦁ뷥ꪁ蟩꺁䴱藩뢅苣ꂊ臣ꚁ⸰㔲⁍慎䡂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢乃苣뾪ꏨ馁苣芀蟩⢏볎⥌㴠ㄠ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯灵쌾⢗慎䡂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢乃臣趇蟩涏⥧⠯㈶㠮朴洯汯韃⸰㔲潭⽬⥌胣ꢳ볯뾽铧뒛觥ꮁꫨ붣臣讂胣랂苣躃냦ꂴ賥鮃苣ꂴ菣袃菣Ꚃ菣袼慎䡂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢乃볯꾁菣랂苣벃苣벃룤ꞁ髦肉臣鶿귥馁臣趁臣芁苣芀藥꺁ꧨ겖鏧꺁맧誂뿨鞁雩膰苣뾁臣讂臣膂胣许꣨꺁臣誁苣膀뿤颭铧ꮁꧨ겖苣肸胩꺁⸲洰躽룦邃苣ꊂ菣궸臣내裥馁苣鎁臣貁軦ꢥ臣貂苣骼苣ꊂ菣뒰듧隌菣Ꚃ듧誃菣ꪃ苣ꂃ볯ㆈ〮쉧ケ㈮杭볯銂⸲洰躽룦邃苣ꊂ菣궸臣꒧蟩馁苣芀臣꺁꟦込臣莅臣뚓臣覂苣ꊂ菣뒰듧隌菣Ꚃ듧誃菣ꪃ苣ꂃ���ꢅ蛥릮觧銂裥ꢳ臣讂胣趁臣辁꿥膰臣膀뷤ꦸ菣ꒂ苣ꮃ臣ꚩ雨趐胣궃菣袃闧랏胣誁苣뎁뚃鳦꺁鳦릊鳦邙臣놅臣ꎀ闧袼膀膀ꪁ臣覼苣ꦃ菣ꮃꇨ風臣讂胣邃苣ꊂ菣꾁냦蚈苣뾁臣讂臣膂臣醃菣閃苣ꮃ菣ꞁ꿥膰臣릁臣ꞁ臣讂胣颪냥鎽賥뚺뛦䦲꺁臣膂臣랂苣躃냦ꂴ賥鮃苣ꂴ菣袃菣Ꚃ菣銂郥颁뷤ꦸ菣ꒂ苣ꮃ臣覂麛믤许臣辇苣蚈臣讂胣鎁臣鎁臣ꢁ胣躽룦邃苣ꊂ菣꺁胩ꪕ苣钠ꧧ꒮臣꾃菣꾂苣벃菣ꮁ鯦趁闧膂苣芀䕃菣궃菣ꆂ苣ꮃ룤ꞁ臣ꚩ雨钃菣꾂臣뎦꿥뺁臣꾁菣馃菣뎃苣꺁諥隌臣蒁臣貂臣貁胣躽룦邃苣ꊂ菣꺁맧誂뿨鞁雩膰뻥膀臣龁臣랂苣躃냦ꂴ賥鮃苣ꂴ菣袃菣Ꚃ菣꺁觧骮臣궃菣袃臣략臣誂臣讂胣鎁苣貁뗧鲞臣놽鿩銂臣袂臣馁ꃥ袐胣뾽铧鞁臣蒁苣躽룦邃苣ꊂ菣銂믥蒣臣膀ꧨ겖苣ꆬ臣ꎀ闧꺁뷤ꦸ菣ꒂ苣ꮃ臣覂胣뺁臣꾁雦鞁臣궃菣袃臣랂苣躃냦ꂴ賥鮃苣ꂴ菣袃菣Ꚃ菣讁苣꒧蟩馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 趆苣뮂菣ꮃ賥ꦷꇨ늶볯㊈洵궂藩뒰듧誃菣ꪃ苣ꂃ胣炁㥈㔮볯芀苧뢅냦ꂴ菣袃菣Ꚃ菣袼⸰ㄲ숰ケ〮朲볯銂룦蒵臣ㆪ〰䱭苣ꦃ苣鎃菣ꮂ菣궸臣꒧蟩馁苣芀偈䍌귧骴臣뒰볯㦈洰覼苣ꂊ臣膀鋦貋菣것菣袃룤ꞁꇥ貁껥ꢅ臣뚺꟨馁苣뺁臣랷郥馁苣芀〱⁎慎䡏臣炧銂⸹숵ケㄮ臣뾪꿧馁苣芀偈䍌귧骴臣뒰苣ꂊ臣ꚁ鳦芵蟩㆏〰䱭臣馁苣芀뫦늶苣趂臩鞁胣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀돦開럧鶡뛦袼〶뇂洵鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣炁㥈㈮覼胣鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ볯ㆈ㈮숱ケ〮朲볯銂룦蒵臣ㆪ〰䱭苣ꦃ苣鎃菣ꮂ菣궸臣꒧蟩馁苣芀偈䍌귧骴臣뒰볯㦈洰覼苣ꂊ臣膀鋦貋菣것菣袃룤ꞁꇥ貁껥ꢅ臣뚺꟨馁苣뺁臣랷郥馁苣芀〱⁎慎䡏臣炧銂⸹㔲뇂⸰ꮁꫨ肯臣讂胣䢂䱐覭듧꺁냦銂諥袁臣肜뗧莿뫥㚦숰㖱䵭臣肜뗧辇〱洰ꢁ臣讂胣㖂洵뚺뛦꺁臣膂臣膀鯥鮃苣뢅菣袃菣Ꚃ菣袼⸱ㄱ뇂⸰㈰覼苣꒧蟩鞁胣趉뿨꺁ꫨ躘臣鎾臣뚺꟨誁苣뎁믦骮臣讂胣㚂洵뚺뛦꺁臣膂臣膀鯥鮃苣뢅菣袃菣Ꚃ菣袼⸱ㄳ뇂⸰㈰覼苣꒧蟩鞁胣趉뿨꺁ꫨ躘臣鎾臣뚺꟨誁苣뎁믦骮臣讂胣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀菣벃苣蚈꟨붃볯랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ臣薠臣辦껥鞁臣ꢁ臣誂볯貁뷥뾟苣鞏臣讂ꃥ袐볯劈胥⚤瑬ㄻ〮볯膀럧鶡뛦銂雦鞁臣뾪ꏨ馁苣芀믤辄볯肜뗧莿뫥㚦洰袼뇂洵覼臣龁苣ꮁ胣鮛菣Ꚃ藩ꦡ럧鶡뫦늶볯䶈捩潲潓癬볯銂胣薶듧讲볯ㆈ〲䱭볯銂㔱洰鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦袼〸䱭볯ꮁ諥袁臣貸蟩馁苣芀〱⁎慎䡏臣뒻껥鞁臣膀뫦늶䡰苣㦒㈮袼뇂⸰覼臣馁苣芀㔵䵭鯥鮃苣뢅ꇥ뚺뛦꺁臣膂臣膀㔱洰鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦袼㘶䱭볯銂���钴닧袼ㄱ洴覼룤ꮁ룥袇臣讂胣趉뿨꺁臣誁苣ꮁ믦骮臣讂胣㚂洵鮛菣Ꚃ藩ꦡ뫦늶臣龁苣ꮁ胣ㆁ〵䵭鯥鮃苣뢅菣袃菣Ꚃ菣ꦷꇨ늶볯㞈洸覼苣薶듧讲볯ㆈ㈰䱭볯궸臣貸蟩馁苣芀觥낿臣ꢁ臣誂臣뒻껥馁苣芀뫦늶苣꒮룦ꞁ鳦Ꞥ뚃鳦鶿귥馁苣芀菣벃苣蚈꟨붃볯랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ臣薠臣辦껥鞁臣ꢁ臣誂볯貁뷥뾟苣鞏臣讂ꃥ袐볯劈胥⚤瑬ㄻ〮볯膀럧鶡뛦銂雦鞁臣뾪ꏨ馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖궂菣钃菣ꪃ菣鞴뗦뚺뛦芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 ㄠ⁎慎䡏뫦늶볯㆚丰丠佡뚺뛦袼洱覼苣䢒䱐覭듧꺁냦袼洹覼苣ꮐ苣ㆀ洵꺁鯧鮛믤趁菣ꦃ苣蚃苣莃苣膃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ苣辁럦袐臣讂胣뚺뛦銂껥ꦸ臣㚧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†丱䠠汃뫦늶볯㚚⁎䍈뚺뛦袼洱覼苣䢒䱐覭듧꺁냦袼洵覼苣ꮐ苣ㆀ洵꺁鯧鮛믤趁菣ꦃ苣蚃苣莃苣膃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ苣辁럦袐臣讂胣뚺뛦銂껥ꦸ臣㚧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣㢂┰菣뾂菣벃菣뚺뛦骼偈䍌귧骴臣ꆃ苣躃菣ꮃ볯㢈䱭볯銂偈䍌귧骴臣뒰볯㊈䱭볯銂郥肂㔱䱭臣꺛鯧颻臣鞃菣릂菣ꎂ菣꾂菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣讂胣㖂胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁臣袂臣랷郥馁苣芀뫦늶苣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖颍돧馨뫦鶿귥뚺뛦骼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 丠ꊂ苣膃菣낂菣뎂苣龃菣袼慇乬捁볯芀慇乬捁볯㖈뇂洱覼苣㊒〮䱭臣躽룦꾲铨邃苣ꊂ菣궸臣ꎭꋧꮁ꟧辇臣讂胣䢂䱐覭듧꺁냦袼洱覼苣ꂊ臣膀뫦ꎧ臣讂臣ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ苣辁럦袐臣讂胣뚺뛦꺁귦몢臣莿뫥袼杭洯覼苣風賩馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 丠ꊂ苣膃菣겂菣꾂菣떂菣뎃볯䞈捬䅎覼볯䞚捬䅎袼숵ㆱ杭볯銂⸲洰꺁뷤ꦸ단떔菣ꒂ苣ꮃ룤ꮁ귦몢臣꒧蟩馁苣芀偈䍌귧骴臣뒰볯ㆈ䱭볯銂諥袁胣뚺꟨馁苣뺁臣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁臣袂臣랷郥馁苣芀뫦늶臣ꎭꋧꪁ뿦ꚺ볯消⽧䱭볯銂꣨늌臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ⵎ苣뮂菣ꮃ菣뎃菣떂菣뎃볯䶈湡䅎覼볯䶚湡䅎袼숵ㆱ杭볯銂⸲洰꺁뷤ꦸ단떔菣ꒂ苣ꮃ룤ꮁ귦몢臣꒧蟩馁苣芀偈䍌귧骴臣뒰볯ㆈ䱭볯銂諥袁胣뚺꟨馁苣뺁臣鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁臣袂臣랷郥馁苣芀뫦늶臣ꎭꋧꪁ뿦ꚺ볯消⽧䱭볯銂꣨늌臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†跥隳꣦隺뿤颭뫦늶苣ⶒ〲蓢ꞁ뒹臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†跥隳룥袇꣦隺뛦䦲볯薆菩馨뫦貸蟩뚺뛦芀慍乮捁뿤颭뫦늶볯㊈츰䲼볯銂胣䢁䱐覭듧꺁냦袼㤱���볎覼苣馁臣ꮁ郥肂洲꺁뷤ꦸ단떔菣ꒂ苣ꮃ룤ꮁ諥袁苣鎁臣ꮁ苣誂胣䶁湡䅎꺁뿤颭뫦늶苣䢒䱐覭듧꺁냦ꞁ〱趀룥袇臣讂胣蒴讁苣ㆉ銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀蛥ꢃ꣦隺룥袇뫦늶苣㊒胣㢜蓢ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 颍돧貸蟩馨뫦늶䥉볯ꊂ菣躃럦袐꣦隺룥袇뫦늶胣䢂䱐覭듧꺁냦袼㤱〶볎覼苣ꮐ苣㊀〮䱭臣躽룦꾲铨邃苣ꊂ菣ꮁ胣䞁污䅎誁苣뎁汇乣捁臣鶿귥뚺뛦銂臣貂臣貂〲볎ꂊ臣讂胣蒴讁苣ㆉ銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀苣龃菣랷郥馨뫦貸蟩뚺뛦銂鲀莄臣㚧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首臣袂臣몟뫦ꦉ돨뚺뛦芀蟥邵苣뎃菣꾂돨ꚩ雦銂鲀莄臣ꎧ蟥鞁胣趏믨閁臣ꚁ苣ꎁ臣誂럦袐臣讂胣ꚩ雦誁苣뎁鿥隺觧ꪳ臣ꆸ雦銂偈䍌귧骴臣뒰臣蒴⸱洰⽧䱭臣貸蟩馁苣芀뿦ꚺ苣㎒ꇦ꺁鳦릊闦鞭臣風賩馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖䌊뎳该ꆝ믤芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘲㰷愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯隼볯閼胣㲑䐯噉ਾ触蚠㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꂊ냦蚈꟨芀⸰㔶䱭臩莿껧궸臣膀慍乮捁룥袇꣦隺뫦늶볯ㆈ츰䲼볯誁苣뎁临諥뒰裥ꎧ뫦늶볯㊈〰볎覼苣ꂊ臣讂胣鎁苣꾁苣릂菣ꂃ菣ꦃ菣꾂臣鞁臣꾁臣覂臣芀⸰㔶䱭臩莿껧궸臣膀慍乮捁룥袇꣦隺뫦늶볯ㆈ츰䲼볯誁苣뎁苣龃菣랷郥馨뫦뚺뛦袼〱볎覼苣ꂊ臣讂胣閁苣ꮁ临諥뒰裥ꎧ뫦늶볯㊈〰볎覼苣ꂊ臣讂胣鎁苣꾁껥辇臣袂臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ臣龁苣꺁跥隳꣦隺臣鞁臣꾁臣覂臣芀蟩螤臣뾪ꏨ馁苣芀⸰㔶䱭臩莿껧궸臣膀慍乮捁룥袇꣦隺뫦늶볯ㆈ츰䲼볯誁苣뎁呃䅌ⴴ杉鿥隺觧ꪳ뫦늶볯蒴洱⽧䱭볯袼〱볎覼苣ꂊ臣讂胣閁苣ꮁ临䠠汃뫦늶볯㊈〰볎覼苣ꂊ臣讂胣趇ꓨꞁꫨ붣臣讂胣も㘮洵ꂁ뿥ꆮ룤ꮁ胣䶁湡䅎貸蟩馨뫦뚺뛦袼〱볎覼臣袂臣ꚩ雦뚺뛦袼듧ㆄ杭洯覼볯ㆈ츰䲼볯銂諥袁苣芀臣覂臣㒫⁎䍈뚺뛦袼〲츰䲼볯銂諥袁苣芀蟩螤臣뾪ꏨ馁苣芀ꧨ首苣蒴〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀듧㖄胣㆜銧雩ꂁ뿥蚈鯩馁苣芀ꧨ首苣㦒겜铧邃苣ꊂ菣ꦃ菣꾂臣ꖅ苣膀㔹蓢꺁매ꖇ駥薆臣㚧駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀諥뒰裥ꎧ뻥膀諥뒰裥ꎧ臣龁ꧨ首苣ⶒ〲蓢ꮁ〱裥鎖臣蒁臣랆跥馁苣芀諥뒰裥ꎧ臣龁ꧨ首苣膀蟥꺸觧貁臣貂臣膃菣벃菣꺁뫥ꮁ닦놾臣鮁苣뺁臣궟駦鎖볯颫胩ꞁ鲀〱꟧鎖볯ꂁ뿥蚈鯩馁苣芀ꧨ首苣厒数摥慖ꞁ鋨몙臣鮁臣뺹蟧馁苣芀郥ꚩ雦銂偈䍌귧骴臣뒰볯ㆈ〰볎覼臣趆꟦邈臣膀〱胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀ꧨ首苣厒数摥慖ꞁ鋨몙臣鮁臣뺹蟧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀���䥄㹖 趆苣뮂菣ꮃ賥芀郥ꚩ雦銂㙍蛥ꊂ苣膃菣隌럧鶡뛦袼〱볎覼臣趆꟦邈臣膀〱胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁臣袂臣랷郥馁苣芀㍍†蛥ꊂ苣膃菣隌ꧨ겖볯㒈볎覼苣蒐菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣讂胣蒴鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣랰룤ꞁ〳裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀ꧨ首苣厒数摥慖ꞁ鋨몙臣鮁臣뺹蟧馁苣芀郥ꚩ雦銂偈䍌귧骴臣뒰볯ㆈ〰볎覼臣趆꟦邈臣膀〱胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀ꧨ首苣厒数摥慖ꞁ鋨몙臣鮁臣뺹蟧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 颪냥鎽賥芀菣ꒂ苣궃臩莿ꧦ銂매ꖇ駥ꮁ藥貂臣膀㔵蓢꺁매ꖇ駥ꦸ뫥ꮁ맥ꆡ賥馁苣芀郥ꚩ雦銂ꫨ躰뷤隌뫦늶袼⸰䴱䄠呐뚺뛦覼볯ㆈ츰䲼볯ꞁ蛥讧裦馁苣芀듧㖄胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀ꫨ躰뷤隌뫦늶䥉볯ㆈ⁍䅈誁苣뎁⸰㔲⁍慎䡂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢乃볯袼층䲼볯銂諥袁苣芀듧㖄胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣ꂁ뿥蚈鯩馁苣芀ꧨ首菣ꒂ苣ꮃ苣袺蛧鞁臣ꂁ뿥龩臣ꂴ韦辁菣벃菣鞁胣ꂁ뿥龩苣㖒莄臣뺹蟧ꢙ臣뮈臣芀〲〰灲ꞁ臩莿裥ꊛ臣ꪁ臣覂芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鎁苣꾁菣ꒂ苣ꮃꇨꊝ룤뢁臣뚺ꫥ꺁蟥꺸苣늘臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖龩駥꺁뫦馂戼㹲 㔠㐮ㄮ†雦鞁臣궂菣钃菣ꪃ菣銂꣨꺽臣膀ꯩꞜ菣벃菣袼〸倠䥓볯ꞁ룤風臣떮髩銂铧蒁臣鞴뗦馁苣骼丱丠佡ꞁ〲裥鎖볯䢛䱐覭듧꺁냦ꞁ〱裥鎖볯㚛洰鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦ꞁ〱裥鎖胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯邼胣㲑䐯噉ਾ꿦ꖗ臣趓뷤㲜牢ਾ†꿦ꖗ臣趓뷤꺁觥ꮁ胣궂菣钃菣ꪃ菣銂듦蒵臣讂臣膂臣鞴뗦⾄臣馁臣랂菣놂菣릂苣財臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꆬ臣ꞁ胣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺볯颍돧馨뫦覼苣뎳该鞁臣膀苣릂菣ꂃ臣ꦁ郥鞁臣蒁苣鎁臣銂ꋧ趪臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†丱丠佡銂铧蒁苣鎁臣ꞁ闧ꪁ苣鮾뗧궥胨讁苣꺁苣ꎃ菣ꦃ菣벃臣薆菩貁藨閝臣膀돦開룤꺁꟧開駦鎖臣骁苣貁铧颁苣鎁臣貁臣讂胣鎁苣ꮁ苣誂鳦貾臣钃菣꾂볯䞈捬䅎覼臣뮧该芙雩貁〱〮裥銂뛨袁苣鎁臣ꮁ臣讂ꃥ袐胣떮髩㊎臣鞴뗦꺁丱丠佡銂⸰丱丠佡뺁臣꾁偈䍌귧骴臣뒰臣ꎻ臣讂뿥膦臣芁苣ꢁ胨袁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 覭뻤꺁苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣ꢔ臣膀觥낿臣鞴뗦閳臣膍裥ꞁ臣蒁ꃥ袐胣肜뻥꺁菣벃苣袼汇乣捁볯貁〱〮裥꺁꣦蒯髧ꒀ臣蒯鯥薆臣ꪁ苣龁苣ꮁ〸ꆃ苣躃菣ꮃ臣袂臣⾳臣龁臣ㆯ⁎䍈꺁뷤ꢔ臣薿ꛨꮁ臣讂臣ꢁ苣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖ꢳ藥꺁뫦馂㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 颪냥���鎽賥꺁뻥膀ꧨ首苣꒮룦뺁臣랆跥馁苣芀蟥꺸觧銂菣ꖃ菣隃臣閺臣袲뻦閁臣讂臣ꞁ胣꒮룦ꞁ듧ㆄ銧雩ꂁ뿥蚈鯩馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 䠠䱐覭듧꺁냦袼㔸볎覼苣蒐菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣膀郥ꚩ雦꺁鳦芵蟩銂〱츰䲼臣馁苣芀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首〱볎銂郥膃菣벃菣讁苣䎉麃苣꾂菣邃苣ꊂ菣ꮁ꟧鞁胣䢁䱐覭듧꺁냦ㆴ〹볎銂郥膃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ듦蒵껦躚臣袂臣ꢳ藥랂菣놂菣릂볯㲚牢ਾ†돦骼돦ꖅ麛臣ꢁ臣膀䕃돦開럧鶡뛦銂雦鞁臣뾪ꏨ鞁臣䎟뎳该ꦷꇨ늶臣꒺迦馁苣袼苣ꪂ菣鮸냥릊黦꺁臣膂볯芀苣ꎃ菣ꦃ菣벃듦蒵苣㒒瀰楳臣財臣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘲㰸愯㰾䐯噉ਾ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘲㰹愯㰾䐯噉ਾ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜲㰰愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꢳ볯랂菣놂菣릂苣㎒臣꺁ꧨ首臣ꞁ蟩螤臣낹苣钿臣膀跥隳꣦隺臣蒐ꫨ붣臣㊮鯥꺁돦ꖅ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣馁苣芀ꚩ雦꺁뻧ꮁ藥貂臣ꚩ雦ꮁ臣蒁臣㢦臣꺁苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦ꢳ藥銂臣릁臣ꢔ臣讂胣㎂ꧨ首苣誂苣骤臣뎳该馁苣뒠郥膀뿨ꂊ臣ꚩ雦銂菣ꒂ菣ㆳ讁苣讧苣ꚁ觥낿臣랂菣놂菣릂臣몤臣龁臣誁苣뎳该馁苣芀ꇨ꺁菣ꒂ菣㒳讁苣㖉ꮁꓧ馁臣誁苣膀苣릂菣ꂃ臩袐胦袼跥隳꣦隺볯銂돦開臣ꚁ苣벃苣뎃苣銂껥蚺臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†⨪ꧨ首苣䎒䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨꺁郥뾪ꏨ꺁麛臣ꢳ藥ꞁ菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†苣릂菣ꂃ臩袐胦₧ꢳ볯랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ胥銂胣릉臣風볨貁臣蒁臣躁苣膀苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦꺁鳦鶈臣ꢳ藥銂铧蒁臣节臣膂苣芀鳦鶈臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ臣뮛냦뎳该뎛臣뎛ꮁꓧ馁苣꺁臣麡볤ꞁ臣讂臣趁臣膀臣鎁臣钃菣꾂꾁慇乬捁臣芁苣鮼菣벃苣㊯臣䶯湡䅎ꞁ臣誂볯钃菣꾂꾁汇乣捁臣芁苣芀돦骼敂正慭⁮䅐䕃䴠佄믤隤臣䎮薣뷧銂铧蒁苣뒠郥膀裥ꊛ苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣꾔賦鞁臣蒁苣ꮂ菣袃菣莃苣꺁뷥뚊臣骤꟦ꞁ臣讂臣膂胣궂菣钃菣ꪃ菣꺁闩閁臣鎁臣릖돦ꞁ飦風臣龁苣꺁臣낕臣讂臣ꢁ臣芁苣芀臣貂臣袂苣蚈黦ꦉ臣뮧该芙雩膀臣覂臣ꮁ菣벃苣랼뫥貁ꓥ開臣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ㈠臣꺁髩ꖎ菣벃苣꺁裥ꎧ菨銂胣鶁臣薣뷧ꮁ苣讂鳦鶈臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺臣ꒁ臣ꚁ胣许꣨꺁볥銂铧蒁臣袨껧馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠���㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜲㰱愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ⁒‽裥ꎧ菨㲽牢ਾ㱴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵膀㱴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵‾‽ꒁ臣ꎚ軦钃菣꾂臣貂臣貂臣뮧该芙雩㲓牢ਾ㱗畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵膀㱗畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵‾‽ꒁ臣ꎚ軦钃菣꾂臣貂臣貂臣馃菣릂菣ꒂ菣ꞁ臣钃菣꾂맥㲅牢ਾꒀ臣꞉⸱ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣劂氦㭴⸱ꞁ臣貂臣膀苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣鞴뗦⾄臣馁臣랂菣놂菣릂臣鞴뗦鞁볯辕ꇩ貁뛧辁ꃥ袐臣꾁胣꒏臣ꦷꇨ늶苣낖臣辁ꫨ붣臣龁돦開럧鶡뛦ꢁ뫤鮏臣讂臣膀臣龁臣궂菣钃菣ꪃ菣銂뫤鮏臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†鳦貾臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ돦ꖅ臣ꒁ臣ꚁ胣肜뻥꺁菣벃苣袼汇乣捁볯꾁룤風臣込苣ꢔ臣ꚁ菣벃菣뎃苣芿闦⚰瑬ㄻ㐮臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣骼戼㹲吊圽猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰〾〮㰵猯扵⼾昲戼㹲込룤骼戼㹲吊㴠蚃菣ꪃ菣낂뿤낕戼㹲圊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰〾〮㰵猯扵‾‽ꯩ閁臣㖮ꞁ臣钃菣꾂맥㲅牢ਾ⁦‽菣벃苣肜ꯩ릂臣꺁菣벃苣趉菩꺁맥㲅牢ਾ꞉⸱ꞁ臣貂臣膀苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣鞴뗦⾄臣馁臣랂菣놂菣릂臣鞴뗦鞁볯辕ꇩ貁뛧辁ꃥ袐臣꾁胣꒏臣ꦷꇨ늶苣낖臣辁ꫨ붣臣龁돦開럧鶡뛦ꢁ뫤鮏臣讂臣膀臣龁臣궂菣钃菣ꪃ菣銂뫤鮏臣讂胣㲂牢ਾ⸶‱랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺臣趇ꓨꢳ藥꾁룤風臣ꆨ꿧蒚胥ꮁ臩袐臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣骼戼㹲뮃†汇乣捁꿥䶾乡捁臣钃菣꾂鷩趩꿦骼卒ꚉ〱袼껦躚⸷ꞁ꣨鞮볯㲉牢ਾ菣₻䜠捬䅎꺁꟧開駦鎖臣ꚉ〱〮裥ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀戼㹲뮃†菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣뎛ꢁ귧ꆾ臣芁苣릁臣ꞁ胣鎁臣ꞁꒁ臣钃菣꾂臣뎦꿥閁苣膀蛥ꢃ꣦隺볯䶈湡䅎覼臣㊯闧꺁菣벃苣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首苣ꚩ꣩馁苣趉臣趉뿨꺁꣦蒯髧ꒀ臣蒁臣貂臣貁臩袐臣ꪁ臣뒠郥膀臣骁汇乣捁臣뮧该芙雩貁〱〮裥袂苣节闩醁苣낁鯩Ꞝ苣誸臣讂胣ꆬ臣膀菣벃苣ꊝꧧ钯臣⚌瑧ㄻ┰臣芁苣낁胣낖臣蒁䕃럧鶡뛦銂ꫨ붣臣ꚁ胣鶁臣炮銂ꋧ趪臣讂臣膀臣龁臣궂菣钃菣ꪃ菣銂뫤鮏臣讂胣薣뷧꺁ꫨ肯뻥膀苣릂菣ꂃ臩袐胦ꢳ藥銂맧誂뿨馁胣钃菣꾂菣궃菣ꆂ苣ꮃ苣蚈黦鞁臣蒁苣뒠郥膀慍乮捁臣钃菣꾂ꯩꮁ釨鞁臣躽룤貁ꛨ覂苣貂臣膀䥌ꊃ苣ꖃ菣ꮃ臣꺁藥閃苣ꒂ菣벃苣벃菣ꮃ臣뾪闦趸觨貁臣蒁臣銂ꋧ趪臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†蛥ꢃ꣦隺臣颍돧馨뫦邈裥꺁菣벃苣ꊝꧧ钯苣钯볨馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣颍돧馨뫦劖䑓菣벃苣뎃菣銂苣ꢁ苣讂胣蒐跥隳꣦隺돦ꖅ臣ꒁ臣ꚁ胣蒐跥隳裦蚈臣钃菣꾂鷩趩苣���薆菩馨뫦꺁菣벃苣ꊝꧧꞁ駩馁苣芀ꒁ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣馨뫦ꮁ臣蒁臣膀慇乬捁臣袂臣䞳捬䅎꺁卒醃菣뮂菣袃苣袨껧馁苣芀卒꾁觢ㆦ┰臣芁苣릁臣ꞁ臣讂胣鎁臣뎹鷥ꆨ꿧蒚胥ꮁ臩袐臣ꪁ臣뒠郥膀苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣趉뿨꺁臣誁苣鞴뗦뺁臣꾁뫤鮏臣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯隼胣㲑䐯噉ਾ꣨鞮戼㹲 䜠污䅎誁苣뎁汇乣捁臣薆菩馨뫦袼慍乮捁볯ꮁ꿥馁苣钃菣꾂鷩趩꿦銂꣨鞮臣讂胣ꆨ꿧蒚胥ꮁ臩袐臣讂苣蚁臣膀鳦鶈臣㒮鯥꺁苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦꺁蟩螤돦ꖅ臣뺯臣ꚁ铧蒁胣ꚩ雦꺁觥貾臣ꢳ藥馁苣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺臣릁臣ꮁ꿥鞁臣貐臣袨껧銂ꇨ蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†菣벃苣ꊝꧧ钯㴠蒐苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦ꢳ藥ꮁ臣蒁臣膀郥颍돧邈裥袼汇乣捁胣䞁污䅎覼臣钃菣꾂鷩趩苣薆菩馨뫦袼慍乮捁볯꺁菣벃苣ꊝꧧꞁ駩馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜲㰲愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦궸臣䞮污䅎誁苣뎁汇乣捁臣钃菣꾂鷩趩꿦꺁맥螝苣袨껧馁苣芀郥颧臣馨뫦辁럥袼⹓⹄볯誁苣뎁鯧뺯꣦隺臥꺷菣벃苣뎃菣袼別䑓볯节꣨鞮臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†꣦蒯髧ꒀ胣䞂捬䅎꺁菣벃苣ꊝꧧ钯臣劮䑓觢ㆦ┰胣ꚩ雦꺁觥貾臣ꢳ藥馁苣膀ꒁ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺볯䞚捬䅎誁苣뎁慇乬捁臣钃菣꾂鷩趩꿦꺁卒醃菣뮂菣袃觢ㆦ┰胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁맥螝꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣蒁臣蒁볯劈䑓朦㭴〱覼ꃥ袐胣궂菣钃菣ꪃ菣銂듦蒵돦ꮁ苣誂蛥鞴뗦馁苣薿ꛨ貁臣誂胣鎁苣覂臣ꚩ雦誁苣뎁菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣龁跥隳꣦隺苣趆뫥뎳该馁苣薿ꛨ貁臣讂胣뎹鷥ꆨ꿧蒚胥貁臣ꂁ臩袐臣ꚁ臣ꪁ臣뒠郥膀苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣꒺迦鞁胣趉뿨꺁臣誁苣ꮁ듦蒵臣讂胣ꚩ雦誁苣뎁菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣龁跥隳꣦隺苣趆뫥뎳该馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜲㰳愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ⁮‽ꧨ首臣誁臣讂룦骮闦㲰牢ਾ⁸‽胥薀臣겸껥ꒀ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜲㰴愯㰾䐯噉ਾ慇乬捁뾂菣醃苣ꪳ臣ꊃ菣钯苣袨껧馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜲㰵愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ㱒畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慇乬捁⼼畳㹢㴠䜠污䅎뺯苣뎃菣꾂돨꺁菣ꮃ꿦㲔牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慇乬捁⼼畳㹢㴠ꚩ雦궸臣䞮污䅎꺁菣벃苣ꊝꧧ⢍볎뮃敳⥣戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䴾湡䅎㱣猯扵‾‽ꧨ首룤꺁慍乮捁臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥㰩牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮���朮⹯灪㸢慍乮捁㰰猯扵‾‽跥隳꣦隺룤꺁慍乮捁臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥뎹鷥㲇牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慇乬捁㰰猯扵‾‽跥隳꣦隺룤꺁慇乬捁臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥뎹鷥㲇牢ਾ㱖畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慇乬捁㰰猯扵‾‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁跥隳룥袇꣦隺뫦늶룤ꮁ郥뺁苣讂慇乬捁臣辇츨䲼㰩牢ਾ㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慇乬捁㰰猯扵‾‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁跥隳룥袇꣦隺뫦늶룤ꮁ郥뺁苣讂慇乬捁臣莿뫥⢦杭洯⥌戼㹲嘊⁰‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁苣뎃菣꾂돨ꚩ雦꺁蟩⢏볎⥌戼㹲䌊⁰‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁苣뎃菣꾂돨ꚩ雦꺁뿦ꚺ洨⽧䱭㰩牢ਾ坍猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䌾䱔㑁䤭㱧猯扵‾‽呃䅌ⴴ杉鿥隺觧ꪳ臣蚈귥辇戼㹲䴊㱗畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢汇乣捁⼼畳㹢㴠䜠污䅎꺁裥邭蟩⢏㈲⸱肃菣袃菣⦳㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 馨뫦隃菣놂菣蚃苣뎃苣芀呃䅌ⴴ杉鿥隺觧ꪳ臣袂臣ꚩ雦꺁菣ꮃ꿦銂꣨鞮臣讂ꃥ袐胣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺臣㢮臣馁臣ꚁ苣ꢔ臣讂胣鎁臣込臣ꮐ苣龁苣ꮁ菣벃苣ꊝꧧ銂맥螝臣讂胣鎁苣銂鳦鶈臣㎮臣꺁ꧨ首臣ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀臣릁臣꺁믤꺁ꧨ首臣뺯臣ꚁ臣膀菣ꮃ꿦袨껧꺁臣膂臣ꆬ臣㒮臣꺁菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣龁跥隳꣦隺臣袂臣趉臣㒮臣꺁菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣龁跥隳꣦隺臣뎹鷥钃菣꾂鷩趩苣뢸臣ꢔ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†汇乣捁뾂菣醃苣ꪳ臣ꊃ菣钯苣袨껧馁苣㲋牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㘷⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲刊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䜾捬䅎㱣猯扵‾‽汇乣捁꿥뾂菣醃苣ꪳ臣ꊃ菣钯戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䜾捬䅎㱣猯扵‾‽ꧨ首룤꺁䱇乣捁臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥㰩牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慍乮捁⼼畳㹢㴠ꚩ雦궸臣䶮湡䅎꺁菣벃苣ꊝꧧ⢍볎뮃敳⥣戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䴾湡䅎っ⼼畳㹢㴠颍돧馨뫦궸臣䶮湡䅎꺁菣벃苣ꊝꧧ⢍볎뮃敳⥣맥螝戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䜾捬䅎っ⼼畳㹢㴠颍돧馨뫦궸臣䞮捬䅎꺁菣벃苣ꊝꧧ⢍볎뮃敳⥣맥螝戼㹲嘊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䜾捬䅎っ⼼畳㹢㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣颍돧貸蟩馨뫦뚺뛦궸臣ꮐ臣貂苣䞋捬䅎꺁蟩⢏볎⥌戼㹲䌊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䜾捬䅎っ⼼畳㹢㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣颍돧貸蟩馨뫦뚺뛦궸臣ꮐ臣貂苣䞋捬䅎꺁뿦ꚺ洨⽧䱭㰩牢ਾ灖㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣뾂菣醃苣ꪳꧨ首臣辇츨䲼㰩牢ਾ灃㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣뾂菣醃苣ꪳꧨ首臣莿뫥⢦杭洯⥌戼㹲䴊㱗畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢呃䅌ⴴ杉⼼畳㹢㴠䌠䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨꺁裥邭蟩㲏牢ਾ坍猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䜾捬䅎㱣猯扵‾‽汇乣捁臣蚈귥辇㈨ㄲ㈮菣ꮃ菣���뎃਩⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†꣦蒯髧ꒀ胣㊂臣꺁菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣龁苣龃菣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺菣벃苣ꊝꧧ钯臣劮䑓菣벃苣뎃菣꾁〱銂뛨袁臣蒁胣몟뫦ꦉ돨궸臣ꊂ菣躃跥隳臣뎹鷥ꊃ菣钯臣辦껥꺁꿧늛蛥ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣蒐裦蚈臣ꒁ臣ꚁ胣㒁臣꺁뗧鲞볯趇ꓨ뾪ꏨ꺁蟩螤돦ꖅ볯꺁別䑓臣⚯瑬⼻㈽┵臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀戼㹲䌊䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨꺁菣ꮃ꿦꺁꿧늛戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜲㰷愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†뗧鲞ꃥ誑胣䎂䱔㑁䤭蚈귥㆐胥芁臣誂臣䞮污䅎蚈귥꺁闦誁苣뎁呃䅌ⴴ杉裥邭讀臣龁苣꺁汇乣捁裥邭臣낕臣鞁臣뎹鷥邵黦銂ꃥ誑臣讂胣ꊃ菣钯臣邵黦銂膡臣覜諥낕귥ꞁꃥ誑臣讂胣蒐裦蚈臣ꒁ臣ꚁ胣㒁臣꺁뗧鲞볯趇ꓨ뾪ꏨ꺁蟩螤돦ꖅ볯꺁別䑓臣⚯瑬⼻㈽┵臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㐶볯䎚䱔㑁䤭龎雨ꚩ雦궸臣궸胦颍돧袼菣뎃菣벃苣膀菣뎂菣릂胣겂菣꾂菣벃苣覼臣뾂菣醃苣ꪳ臣뺯臣讂菣ꮃ꿦銂苣ꢁ苣讂雦閳㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖ꚩ雨બ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†諥뒰裥ꎧ뫦늶볯㊈⁍䙔뒰뫦늶볯芀䙔袼㐱츸䲼볯誁苣뎁偈䍌귧骴臣뒰볯㢈㈵볎覼苣㆒㜮菣ꒂ苣궃臩莿껧ꮁ諥袁苣芀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣薿ꛨꮁ뿥颁臣릂苣벃菣ꊂ菣鞃臣讂胣뚺뛦꾁뷤ꢔ鯧趉臣뾪ꏨ馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 颪냥鎽賥뚺뛦䦲볯よㄮ⁍偁協냦뚺뛦覼胣䢂䱐覭듧꺁냦袼㤱츲䲼볯銂苣ꦃ苣邃苣ꊂ菣궸臣䆮呐覲鳦袼〱杭볯ꮁ諥袁苣芀菣袃菣銂鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀偁協苣貮藥ꮁ뫦ꎧ臣讂胣ⶂ〲蓢ꞁ뒹臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꫨ躰뷤隌뫦늶䥉볯ㆈꊅ藩誁苣뎁⸰㔲⁍慎䡂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢乃볯芀⸰洴ꂁ뿥ꆮ룤ꞁ藩뢅볯㊈츰䲼볯銂偈䍌귧骴臣뒰볯㎈〲볎覼臣貸蟩袼㜱胥貸蟩覼臣膀䴱藩뢅뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀慎䡂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢乃볯㊈〮뇂⸰洵覼苣躽룦꾲铨邃苣ꊂ菣궸臣꒧蟩馁苣芀룤風臣込苣ꢔ臣膀臩鎽臣辇臣ㆮꊅ藩뚺뛦銂諥袁臣ウ㈮䴵丠䉡㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵䌾銂ꫨ붣臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†蟩⢏볎⥌㴠ㄠ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯灵쌾⢗慎䡂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢乃臣趇蟩涏⥧㘯⸲㐸⽧潭썬゗㈮洵汯䰯芀戼㹲뮃苣ꊂ菣뒰듧隌菣Ꚃ듧誃菣ꪃ苣ꂃ볯予䉡㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵䌾覼臣螃苣놂菣뾂菣궸臣鞚触ꮁ뿤颭臣릁臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ菣莅臣ꚩ雨뚓臣낹苣钿臣讖냥���銂臩醁苣龁苣膀룤風臣ꢁ臣誂胣鶿귥ꢔ臣ꚩ雨銂룤ꎀ臣㊮〮䱭뷤ꦸ菣ꒂ苣ꮃ룤ꮁ듧蚈臣讂臣ꢁ臣ꢎꗥ閁苣讂볯㲚牢ਾ菣랂苣躃냦ꂴ賥鮃苣ꂴ菣袃菣Ꚃ菣袼⸱朰뇂⸰洲覼苣㊒〮䱭뷤ꦸ菣ꒂ苣ꮃ룤ꮁ꟧辇臣讂胣鎁臣颧볥ꞁ藥꺁鏧讁苣랂苣躃냦ꂴ賥鮃苣ꂴ菣袃菣Ꚃ菣꺁藥薆껥ꦉ苣蚈돦馁苣芀戼㹲뮃臣ꒁ臣蚯냥鞁胣躽룦邃苣ꊂ菣ꮁꧨ겖郥膀菣莃菣ꪕ迥膀臣袂臣㚳菣袜臣覜諥龜駩ꢁ藥ꮁ胩ꪕ볯ㆈ胣㊁胣㎁臣ꦁ볯銂菣馃菣ꢡ꣨馁苣芀戼㹲뮃菣ꒂ苣ꮃ臣뒰裥銂臩醁苣龁苣ꮁ菣ꦃ菣ꎂ菣ꂃ臣蚯냥馁臣趁臣芁苣芀戼㹲뮃ꫨ躰뷤隌뫦늶䥉臣龁苣ꮁ苣ꊂ菣뒰듧隌菣Ꚃ듧誃菣ꪃ苣ꂃ苣貐臣躽룦邃苣ꊂ菣讁苣㎉鯥ꖻ룤ꞁ蟩誂裥醁苣芀臣꺁臣ꢁ臣膀뷤ꦸ菣ꒂ苣ꮃ臣ꎀ闧銂ꃧ뚩껥꺁菣벃苣랂菣袃臣뢛臣馕苣讂胣㲂牢ਾ菣䎻鞃菣閃苣ꒂ菣궸臣꺁ꧨ겖菣벃苣꺁ꛨ龯臣龁臣ꦃ菣ꪃ菣낂臣ꎊ賥꺁臣骁苣讁臣膀뷤ꦸ菣ꒂ苣ꮃ臣낹苣钿臣讖냥貾胣뺁臣꾁苣ꊂ菣뒰듧隌菣Ꚃ듧誃菣ꪃ苣ꂃ臣릉껥꺁菣莃菣ꞁ뗨鎁苣蚁苣芀臣貂臣邵黦ꮁ뷥뾟苣誁苣벁臣뒠郥膀뷤ꢔ臣ꚁ臣讂뷤ꦸ菣ꒂ苣ꮃ苣莻ꏦ鞁胣ꚩ雨銂곦꺁胩ꪕ臣躽룦邃苣ꊂ菣讁苣膀臣龁臣낖臣蒁菣莃菣꺁苣ꊂ菣뒰듧隌菣Ꚃ듧誃菣ꪃ苣ꂃ臣覂꟧辇臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†돦開럧鶡뛦袼〶뇂洵鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣炁㥈㈮覼戼㹲鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ볯ㆈ㈮숱ケ〮朲볯銂룦蒵臣ㆪ〰䱭苣ꦃ苣뚓룤ꮁ꟧辇臣讂胣㲂牢ਾ偈䍌귧骴臣뒰볯㦈洰覼苣ꂊ臣膀鋦貋菣것菣袃룤ꞁꇥ貁껥ꢅ臣뚺꟨馁苣뺁臣랷郥馁苣芀戼㹲ㄊ丰丠佡ꞁ䡰苣㦒㈮숵ケㄮ臣뾪꿧馁苣芀戼㹲䠊䱐覭듧꺁냦銂諥袁臣肜뗧莿뫥㚦洰袼뇂洵覼臣肜뗧辇〱洰ꢁ臣讂胣㲂牢ਾ㔵䵭뫦늶臣龁苣ꮁ胣鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ볯ㆈㄮ숱ケ〮朲볯銂꟧辇臣膀觥낿臣겪飦ꮁ뻥蒁뫦ꎧ臣袂臣뒻껥馁苣芀戼㹲㘊洵뚺뛦꺁臣膂臣膀鯥鮃苣뢅菣袃菣Ꚃ菣袼⸱ㄳ뇂⸰㈰覼苣꒧蟩鞁胣趉뿨꺁ꫨ躘臣鎾臣뚺꟨誁苣뎁믦骮臣讂胣㲂牢ਾ껥ꦸ臣㎧菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣钃菣꾂裥ꎧ菨袼苣릂菣ꂃ臩袐胦꺁ꃩꞁꛨ骮臣龁臣誁苣覼臣놽鿩銂迥醁苣뒠郥袼ꒀ氦㭴⸱覼胣ꦷꇨ늶苣낖臣辁ꫨ붣臣讂胣㲂牢ਾ믤辄볯肜뗧莿뫥㚦洰袼뇂洵覼臣龁苣ꮁ胣鮛菣Ꚃ藩ꦡ럧鶡뫦늶볯䶈捩潲潓癬볯銂胣薶듧讲볯ㆈ〲䱭볯銂㔱洰鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦袼〸䱭볯ꮁ諥袁臣貸蟩馁苣芀〱⁎慎䡏臣뒻껥鞁臣膀뫦늶䡰苣㦒㈮袼뇂⸰覼臣馁苣芀戼㹲㔊洵鮛菣Ꚃ藩ꦡ뫦늶臣龁苣ꮁ胣ㆁ〵䵭鯥鮃苣뢅菣袃菣Ꚃ菣ꦷꇨ늶볯㚈洶覼苣薶듧讲볯ㆈ㐱䱭볯궸臣貸蟩馁苣芀觥���낿臣ꢁ臣誂臣뒻껥馁苣芀戼㹲㘊洵鮛菣Ꚃ藩ꦡ뫦늶臣龁苣ꮁ胣ㆁ〵䵭鯥鮃苣뢅菣袃菣Ꚃ菣ꦷꇨ늶볯㞈洸覼苣薶듧讲볯ㆈ㈰䱭볯궸臣貸蟩馁苣芀觥낿臣ꢁ臣誂臣뒻껥馁苣芀戼㹲뚺뛦銂껥ꦸ臣肜ꓥ㎧菣袜뿤颭臣讂胣钃菣꾂裥ꎧ菨袼苣릂菣ꂃ臩袐胦꺁ꃩꞁꛨ骮臣龁臣誁苣覼臣놽鿩銂迥醁苣뒠郥袼ꒀ氦㭴⸱覼胣ꦷꇨ늶苣낖臣辁ꫨ붣臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ苣ꎃ菣ꦃ菣벃듦蒵뫦늶胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ丱丠佡뚺뛦骼戼㹲ㄊ丰丠佡뚺뛦袼洱覼苣䢒䱐覭듧꺁냦袼洹覼苣ꮐ苣ㆀ洴꺁鯧鮛믤趁菣ꦃ苣蚃苣莃苣膃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ苣辁럦袐臣讂胣㲂牢ਾ뫦늶苣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀戼㹲ㄊ⁎䍈뚺뛦骼戼㹲㘊⁎䍈뚺뛦袼洱覼苣䢒䱐覭듧꺁냦袼洵覼苣ꮐ苣ㆀ洵꺁鯧鮛믤趁菣ꦃ苣蚃苣莃苣膃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ苣辁럦袐臣讂胣㲂牢ਾ뫦늶苣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖㠊┰菣뾂菣벃菣뚺뛦骼戼㹲䠊䱐覭듧꺁菣뾂菣벃菣袼洸覼苣䢒䱐覭듧꺁냦袼洲覼苣ꮐ苣ㆀ洵꺁鯧鮛믤趁菣ꦃ苣蚃苣莃苣膃菣벃菣ꮁ諥袁苣芀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ苣辁럦袐臣讂胣㲂牢ਾ뫦늶苣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖颍돧馨뫦鶿귥뚺뛦骼戼㹲麃菣躃菣릂볯䶈湡볯㲉牢ਾ菣뎃菣벃苣袼숵ㆱ杭볯銂⸲洰꺁뷤ꦸ단떔菣ꒂ苣ꮃ룤ꮁ귦몢臣꒧蟩馁苣芀戼㹲䠊䱐覭듧꺁냦袼洱覼苣ꂊ臣膀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ苣辁럦袐臣讂胣㲂牢ਾ뫦늶臣ꎭꋧꪁ뿦ꚺ볯消⽧䱭볯銂꣨늌臣讂胣㲂牢ਾ菣뎂菣릂볯䚈捵볯㲉牢ਾ菣뎂菣릂볯㖈뇂洱覼苣㊒〮䱭臣躽룦꾲铨邃苣ꊂ菣궸臣ꎭꋧꮁ꟧辇臣讂胣㲂牢ਾ偈䍌귧骴臣뒰볯ㆈ䱭볯銂諥袁胣㖁胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁臣袂臣랷郥馁苣芀戼㹲뚺뛦꺁귦몢臣莿뫥袼杭洯覼苣風賩馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖겂菣꾂菣벃苣袼慇覼戼㹲겂菣꾂菣벃苣袼숵ㆱ杭볯銂⸲洰꺁뷤ꦸ단떔菣ꒂ苣ꮃ룤ꮁ귦몢臣꒧蟩馁苣芀戼㹲䠊䱐覭듧꺁냦袼洱覼苣ꂊ臣膀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ苣辁럦袐臣讂胣㲂牢ਾ뫦늶臣ꎭꋧꪁ뿦ꚺ볯消⽧䱭볯銂꣨늌臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ苣랂菣벃苣袼祘覼戼㹲궂苣궃菣릂볯㖈뇂洱覼苣㊒〮䱭룤ꮁ귦몢臣꒧蟩馁苣芀戼㹲䠊䱐覭듧꺁냦袼洱覼苣ꂊ臣膀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣ꚁ苣辁럦袐臣讂胣㲂牢ਾ뫦늶臣ꎭꋧꪁ뿦ꚺ볯消⽧䱭볯銂꣨늌臣讂胣㲂牢ਾ跥隳꣦隺뿤颭뫦늶苣ⶒ〲蓢ꞁ뒹臣ꞁ뿤颭臣���胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†跥隳룥袇꣦隺뛦䦲볯薆菩馨뫦貸蟩뚺뛦芀蛥ꢃ꣦隺룥袇뫦늶苣뾪ꏨ馁苣龁苣ꮁ胣궂苣궃菣릂臣鶿귥뚺뛦袼⸳⸶覼볯㊈츰䲼볯銂偈䍌귧骴臣뒰볯ㆈ㠹츰䲼볯銂臣ꞁ臣ꮐ苣㊀䱭臣躽룦꾲铨邃苣ꊂ菣궸臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀苣랂菣벃苣꺁뿤颭뫦늶苣䢒䱐覭듧꺁냦ꞁ〱趀룥袇臣讂胣蒴讁苣ㆉ銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀臣꺁蛥ꢃ꣦隺룥袇뫦늶苣㊒胣㢜蓢ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 颍돧貸蟩馨뫦늶䥉볯궸胦랷郥馨뫦貸蟩뚺뛦芀偈䍌귧骴臣뒰볯ㆈ㐹츰䲼볯銂郥肂⸲洰꺁뷤ꦸ단떔菣ꒂ苣ꮃ臣膀菣뎃菣벃苣膀菣뎂菣릂胣誁苣뎁苣ꦃ苣袃菣릂臣鶿귥뚺뛦銂臣貂臣貂〲볎ꂊ臣讂胣蒴讁苣ㆉ銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀臣꺁蛥ꢃ꣦隺룥袇뫦늶苣㊒胣㢜蓢ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦誁苣뎁鿥隺觧ꪳ뫦늶胣趇뗧뾂菣醃苣ꪳꧨ首苣㊒胣㢜蓢ꞁ꟨趇臣膀迥ꊻ臣鮁臣蚂臣辁苣랷郥馁苣芀ꧨ首臣袂臣몟뫦ꦉ돨꺁룤릖苣䢒䱐覭듧꺁냦ꞁ듧ㆄ〮杭洯ꮁ룥袇臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ䕃돦開鷦뚻戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜲㰸愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ触蚠㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ꂊ냦蚈꟨芀⸰㔶䱭臩莿껧궸臣膀苣랂菣벃苣貸蟩馨뫦뚺뛦袼〱볎覼臣袂臣㊳⁍䙔뚺뛦袼〲츰䲼볯銂諥袁苣芀臣貂臣랂苣蚃菣隃菣뎃苣ꢁ臣ꚁ臣龁苣辁胣も㘮洵ꂁ뿥ꆮ룤ꮁ胣궂苣궃菣릂룥袇꣦隺뫦늶볯ㆈ츰䲼볯誁苣뎁룤Ꞁ럦袐꣦隺뫦늶볯ㆈ츰䲼볯銂諥袁苣芀臣覂臣㊫⁍䙔뚺뛦袼〲츰䲼볯銂諥袁胣㎁胣㒜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣鎁苣꾁껥辇臣袂臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ臣龁苣꺁跥隳꣦隺臣鞁臣꾁臣覂臣芀蟩螤臣뾪ꏨ馁苣芀⸰㔶䱭臩莿껧궸臣膀苣랂菣벃苣貸蟩馨뫦뚺뛦袼〱볎覼臣袂臣䎳䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨뚺뛦袼듧ㆄ杭洯覼볯ㆈ츰䲼볯銂諥袁苣芀臣覂臣㊫⁍䙔뚺뛦袼〲츰䲼볯銂諥袁胣㎁胣㒜꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣趇ꓨꞁꫨ붣臣讂胣も㘮洵ꂁ뿥ꆮ룤ꮁ胣궂苣궃菣릂룥袇꣦隺뫦늶볯ㆈ츰䲼볯誁苣뎁ꧨ首뫦늶볯蒴洱⽧䱭볯袼〱볎覼苣ꂊ臣讂胣閁苣ꮁ䴲吠䅆뫦늶볯㊈〰볎覼苣ꂊ臣膀鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀蟩螤臣뾪ꏨ馁苣芀ꧨ首苣蒴〲꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣膀듧㖄胣㆜銧雩ꂁ뿥蚈鯩馁苣芀ꧨ首苣㦒겜铧邃苣ꊂ菣ꦃ菣꾂臣ꖅ苣膀㔹蓢꺁매ꖇ駥薆臣㚧駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀諥뒰裥ꎧ뻥膀ꧨ首苣ⶒ〲蓢ꮁ〱裥鎖臣蒁臣랆跥馁苣芀諥뒰裥ꎧ臣龁ꧨ首苣膀蟥꺸觧���臣貂臣膃菣벃菣꺁뫥ꮁ닦놾臣鮁苣뺁臣궟駦鎖볯颫胩ꞁ鲀〱꟧鎖볯ꂁ뿥蚈鯩馁苣芀ꧨ首苣厒数摥慖ꞁ鋨몙臣鮁臣뺹蟧馁苣芀郥ꚩ雦銂偈䍌귧骴臣뒰볯ㆈ〰볎覼臣趆꟦邈臣膀〱胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀ꧨ首苣厒数摥慖ꞁ鋨몙臣鮁臣뺹蟧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 颪냥鎽賥芀菣ꒂ苣궃臩莿ꧦ銂매ꖇ駥ꮁ藥貂臣膀㔵蓢꺁매ꖇ駥ꦸ뫥ꮁ맥ꆡ賥馁苣芀郥ꚩ雦銂ꫨ躰뷤隌뫦늶袼⸰䴱䄠呐뚺뛦覼볯ㆈ츰䲼볯ꞁ蛥讧裦馁苣芀듧㖄胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀ꫨ躰뷤隌뫦늶䥉볯ㆈ⁍䅈誁苣뎁⸰㔲⁍慎䡂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢乃볯袼층䲼볯銂諥袁苣芀듧㖄胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣ꂁ뿥蚈鯩馁苣芀ꧨ首菣ꒂ苣ꮃ苣袺蛧鞁臣ꂁ뿥龩臣ꂴ韦辁菣벃菣鞁胣ꂁ뿥龩苣㖒莄臣뺹蟧ꢙ臣뮈臣芀〲〰灲ꞁ臩莿裥ꊛ臣ꪁ臣覂芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鎁苣꾁菣ꒂ苣ꮃꇨꊝ룤뢁臣뚺ꫥ꺁蟥꺸苣늘臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 龩駥꺁뫦馂볯낖臣蒁苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣궨뷧鞁胣颫鳥ꊃ菣覃볯㢈‰卐覼臣许꣨꺁껦躚苣ꢔ臣ꚁ듦蒵臣讂볯㲚牢ਾ丱丠佡ꞁ〲裥鎖戼㹲䠊䱐覭듧꺁냦ꞁ〱裥鎖戼㹲㘊洰鮛菣Ꚃ藩誃菣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦ꞁ〱裥鎖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 궂菣钃菣ꪃ菣銂듦蒵臣讂臣膂臣鞴뗦⾄臣馁臣랂菣놂菣릂苣財臣芀곦蒁臣膀苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦袼跥隳꣦隺볯銂돦開臣ꚁ胣랂苣蚃菣貁臩袐臣ꚁ臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀丱丠佡銂铧蒁苣鎁臣ꞁ闧ꪁ苣鮾뗧궥胨讁苣꺁苣ꎃ菣ꦃ菣벃臣薆菩貁藨閝臣膀돦開룤꺁꟧開駦鎖臣骁苣貁铧颁苣鎁臣貁臣讂胣鎁苣ꮁ苣誂鳦貾臣钃菣꾂볯겂菣꾂菣벃苣覼臣뮧该芙雩貁㔱〮裥銂뛨袁苣鎁臣ꮁ臣讂ꃥ袐胣떮髩㊎臣鞴뗦꺁丱丠佡銂⸰丱丠佡뺁臣꾁偈䍌귧骴臣뒰臣ꎻ臣讂뿥膦臣芁苣ꢁ胨袁苣貂苣芀귧ꆾ臣궂菣钃菣ꪃ菣銂铧蒁胣趉뿨꺁듦蒵돦貁跥蚈臣ꪁ臣뒠郥膀鳦貾臣钃菣꾂볯겂菣꾂菣벃苣覼臣ㆌ⸵蚈臣ꆨ꿧蒚胥꺁꿧늛蛥ꢁ臣讂臣膂臣㢫┰菣뾂菣벃菣誁苣뎁뺁臣꾁丱䠠汃臣뾽铧貁뿥膦臣ꪁ苣鎁臣节臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†돦ꖅ臣隺若骼ꫨ躰뷤隌臣貾胣ꚩ雦銂껥ꦸ臣ꞁ蛥뒍臣讂胣鶇룧ꦉ苣膃菣벃菣꺁뫥ꮁ닦놾臣鮁苣뺁臣膀껥ꦸ臣蒴〱꟧鎖臩莿裥ꊛ臣讂胣䢂䱐覭듧꺁냦袼㔸볎覼苣蒐菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣膀郥ꚩ雦꺁鳦芵蟩銂〱츰䲼臣馁苣芀鲀〱꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣ꚩ雦㆙츰䲼苣蒐菣ꖃ菣隃臣覂䕃菣ꒂ苣궃菣ꒂ苣ꮃ臣뮧臣膀偈䍌귧骴臣뒰㤱츰䲼苣蒐菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣讂胣���胣㆜銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖鞴뗦떮髩誁苣뎁돦ꖅ苣벃苣뎃苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜲㰹愯㰾䐯噉ਾ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠲㰰愯㰾䐯噉ਾ戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠲㰱愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꢳ볯랂菣놂菣릂苣㎒臣꺁ꧨ首臣ꞁ蟩螤臣낹苣钿臣膀跥隳꣦隺臣蒐ꫨ붣臣㊮鯥꺁돦ꖅ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣馁苣芀ꚩ雦꺁뻧ꮁ藥貂臣ꚩ雦ꮁ臣蒁臣㢦臣꺁苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦ꢳ藥銂臣릁臣ꢔ臣讂胣㎂ꧨ首苣誂苣骤臣뎳该馁苣뒠郥膀뿨ꂊ臣ꚩ雦銂菣ꒂ菣ㆳ讁苣讧苣ꚁ觥낿臣랂菣놂菣릂臣몤臣龁臣誁苣뎳该馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ⨠ꚩ雦銂呃䅌ⴴ杉鿥隺觧ꪳ臣蒐ꫨ붣臣㊮鯥꺁돦ꖅ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ胣肜裥꺁苣릂菣ꂃ臩袐胦꺁鯩鞰돦開鯥꾁胣钃菣꾂貁菣뎃菣벃苣ꞁ臣誂볯钃菣꾂貁苣랂菣벃苣ꞁ臣誂볯钃菣꾂貁菣뎂菣릂臣芁苣鮼菣벃苣㒯臣겂菣꾂菣벃苣ꞁ臣讂ꃥ袐臣麡볤ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀돦骼敂正慭⁮䅐䕃䴠兄믤隤臣䎮薣뷧銂铧蒁苣뒠郥膀裥ꊛ苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣꾔賦鞁臣蒁苣ꮂ菣袃菣莃苣꺁뷥뚊臣骤꟦ꞁ臣讂臣膂胣궂菣钃菣ꪃ菣꺁闩閁臣鎁臣릖돦ꞁ飦風臣龁苣꺁臣낕臣讂臣ꢁ臣芁苣芀臣貂臣袂苣蚈黦ꦉ臣뮧该芙雩膀臣覂臣ꮁ菣벃苣랼뫥貁ꓥ開臣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ㈠臣꺁髩ꖎ菣벃苣꺁裥ꎧ菨銂胣鶁臣薣뷧ꮁ苣讂鳦鶈臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺臣ꒁ臣ꚁ胣许꣨꺁볥銂铧蒁臣袨껧馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠲㰲愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ⁒‽裥ꎧ菨㲽牢ਾ㱴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵膀㱴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵‾‽ꒁ臣ꎚ軦钃菣꾂臣貂臣貂臣뮧该芙雩㲓牢ਾ㱗畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵膀㱗畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵‾‽ꒁ臣ꎚ軦钃菣꾂臣貂臣貂臣馃菣릂菣ꒂ菣ꞁ臣钃菣꾂맥㲅牢ਾꒀ臣꞉⸱ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣劂氦㭴⸱ꞁ臣貂臣膀苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣鞴뗦⾄臣馁臣랂菣놂菣릂臣鞴뗦鞁볯辕ꇩ貁뛧辁ꃥ袐臣꾁胣꒏臣ꦷꇨ늶苣낖臣辁ꫨ붣臣龁돦開럧鶡뛦ꢁ뫤鮏臣讂臣膀臣龁臣궂菣钃菣ꪃ菣銂뫤鮏臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†鳦貾臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ돦ꖅ臣ꒁ臣ꚁ胣肜뻥꺁菣벃苣袼苣ꦃ苣袃菣릂볯꾁룤風臣込苣ꢔ臣ꚁ菣벃菣뎃苣芿闦⚰瑬ㄻ㐮臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣骼戼㹲吊圽���扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰〾〮㰵猯扵⼾昲戼㹲込룤骼戼㹲吊㴠蚃菣ꪃ菣낂뿤낕戼㹲圊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰〾〮㰵猯扵‾‽ꯩ閁臣㖮ꞁ臣钃菣꾂맥㲅牢ਾ⁦‽菣벃苣肜ꯩ릂臣꺁菣벃苣趉菩꺁맥㲅牢ਾ꞉⸱ꞁ臣貂臣膀苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣鞴뗦⾄臣馁臣랂菣놂菣릂臣鞴뗦鞁볯辕ꇩ貁뛧辁ꃥ袐臣꾁胣꒏臣ꦷꇨ늶苣낖臣辁ꫨ붣臣龁돦開럧鶡뛦ꢁ뫤鮏臣讂臣膀臣龁臣궂菣钃菣ꪃ菣銂뫤鮏臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†鳦鶈臣㒮臣꺁苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦꺁蟩螤돦ꖅ臣许꣨꺁꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣醁苣낁臣覂臣蒁볯㲚牢ਾ菣₻겂菣꾂菣벃苣뺯苣랂菣벃苣꺁菣벃苣ꊝꧧ钯볯劚䑓觢ㆦ┰戼㹲뮃†苣ꦃ苣袃菣릂臣뮧该芙雩꾁觢ㆦ⸵蚈臣芁苣薿ꛨ貁臣讂胣㲂牢ਾ菣₻鞃菣閃苣ꒂ菣꾁鯥ㆳ臣覭뻤ꞁ臣讂臣趁臣膀臣鎁臣㒧臣꺁菣벃苣貁ꛨ龯臣貂胣薆菩馨뫦袼苣랂菣벃苣覼臣㊯闧꺁菣벃苣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†觥낿臣ꆨ꿧蒚胥꺁臣骁苣讁臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐胣뺁臣겂菣꾂菣벃苣꺁꟧開駦鎖臣ㆌ⸵蚈苣誂苣랕臣貂臣뮛鳥銂룤銁苣芀곦ꮁ胣钃菣꾂鷩趩꿦貁朦㭴〱ꞁ臣貂臣膀雦鞁臣䎄ꦷꇨ늶苣뾪ꏨ鞁臣膀臣꺁䡰苣몢ꫨ馁苣讁胣뺁臣꾁苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣꒺迦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 薣뷧꺁ꫨ肯뻥膀苣릂菣ꂃ臩袐胦ꢳ藥銂맧誂뿨馁胣钃菣꾂菣궃菣ꆂ苣ꮃ苣蚈黦鞁臣蒁苣뒠郥膀苣랂菣벃苣꺁菣벃苣颫臣鞑臣蒁뷤许臣讦苣貂苣낁胣䲁䙉菣뢂菣벃菣뢁臣覅菣ꆂ苣邃菣놂菣隃菣꺁ꫨ뒕룤꾉臣ꪁ臣讁苣몢ꫨ馁苣芀蛥ꢃ꣦隺臣颍돧馨뫦邈裥꺁菣벃苣ꊝꧧ钯苣钯볨馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣颍돧馨뫦劖䑓菣벃苣뎃菣銂苣ꢁ苣讂胣蒐跥隳꣦隺돦ꖅ臣ꒁ臣ꚁ胣蒐跥隳裦蚈臣钃菣꾂鷩趩苣薆菩馨뫦꺁菣벃苣ꊝꧧꞁ駩馁苣芀ꒁ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣馨뫦ꮁ臣蒁臣膀菣뎃菣벃苣膀菣뎂菣릂胣誁苣뎁苣ꦃ苣袃菣릂臣劮䑓菣벃苣뎃菣銂꣨鞮臣讂胣劂䑓臣ꚉ〱ꞁ臣讂臣趁臣芁苣芀臣꺁맥螝꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣蒁ꃥ袐胣궂菣钃菣ꪃ菣銂觥낿臣ꢁ臣誂듦蒵臣龁臣꒺迦馁臣趁臣芁苣芀ꧨ首臣袂臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣颍돧馨뫦銂맧誂뿨馁뿥膦臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 袨껧芀慍膀畆膀臣袂臣䞳污臣薆菩馨뫦袼苣랂菣벃苣覼臣뺯臣讂菣벃苣ꊝꧧ钯苣袨껧馁苣芀꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥馁苣袂臣ꮁ胣肜裥꺁麛臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺臣趇ꓨꢳ藥ꮁ꿥鞁臣ꢔ臣膀ꧨ首臣趉뻥ꮁ돦ꖅ臣讂菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣龁苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦馁臣ꚁ臣뺯臣ꚁ郥颁꣨���鞮苣財臣芀菣벃苣ꊝꧧ钯㴠蒐苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦ꢳ藥ꮁ臣蒁臣膀郥颍돧邈裥袼慍膀畆膀臣袂臣䞳污볯꺁菣벃苣ꊝꧧ銂蛥ꢃ꣦隺볯궂苣궃菣릂볯꺁菣벃苣ꊝꧧꞁ駩馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠲㰳愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦궸臣䶮湡胣䚁捵胣誁苣뎁慇꺁菣벃苣ꊝꧧ钯臣뎹鷥銂꣨鞮臣讂胣貐꟦ꮁ꣦隺臥꺷볯厈䐮覼臣袂臣뢛꿥馨뫦辁럥醃菣뮂菣袃볯█卒覼苣袨껧馁苣芀꣦蒯髧ꒀ볯겂菣꾂菣벃苣꺁菣벃苣ꊝꧧ钯臣劮䑓觢ㆦ┰胣ꚩ雦꺁觥貾臣ꢳ藥馁苣膀ꒁ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺볯㲚牢ਾ慍膀畆膀臣袂臣䞳污臣钃菣꾂鷩趩꿦꺁卒醃菣뮂菣袃觢ㆦ┰胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁맥螝꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣蒁臣蒁볯劈䑓朦㭴〱覼ꃥ袐胣궂菣钃菣ꪃ菣銂듦蒵돦ꮁ苣誂蛥鞴뗦馁苣薿ꛨ貁臣誂胣鎁苣覂臣ꚩ雦誁苣뎁菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣龁跥隳꣦隺苣趆뫥뎳该馁苣薿ꛨ貁臣讂胣뎹鷥ꆨ꿧蒚胥貁臣ꂁ臩袐臣ꚁ臣ꪁ臣뒠郥膀苣ꎃ菣ꦃ菣벃苣꒺迦鞁胣鞴뗦馁苣芀ꧨ首臣袂臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁臣颍돧馨뫦銂蛥ꚺ돦開臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㐸⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲渊㴠ꚩ雦ꮁ臣醁苣겸껥낕戼㹲砊㴠讀胣꺁룦骮胥㲤牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㔸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 麃菣躃菣릂뾂菣醃苣ꪳ臣ꊃ菣钯苣袨껧馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠲㰶愯㰾䐯噉ਾ볥궸볯㲚牢ਾ㱒畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慍㱮猯扵‾‽菣뎃菣벃苣⢹慍⥮꿥뾂菣醃苣ꪳ臣ꊃ菣钯戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䴾湡⼼畳㹢㴠ꚩ雦궸臣䶮湡臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥㰩牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢祘㱬猯扵‾‽ꧨ首룤꺁苣랂菣벃苣⢹祘⥬臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥㰩牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢祘ぬ⼼畳㹢㴠颍돧馨뫦궸臣墮汹臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥뎹鷥㲇牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慍の⼼畳㹢㴠颍돧馨뫦궸臣䶮湡臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥뎹鷥㲇牢ਾ㱖畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慍の⼼畳㹢㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣颍돧貸蟩馨뫦뚺뛦궸臣ꮐ臣貂苣䶋湡臣辇츨䲼㰩牢ਾ㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慍の⼼畳㹢㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣颍돧貸蟩馨뫦뚺뛦궸臣ꮐ臣貂苣䶋湡臣莿뫥⢦杭洯⥌戼㹲嘊⁰‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁苣뎃菣꾂돨ꚩ雦꺁蟩⢏볎⥌戼㹲䌊⁰‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁苣뎃菣꾂돨ꚩ雦꺁뿦ꚺ洨⽧䱭㰩牢ਾ坍猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䌾䱔㑁䤭㱧猯扵‾‽裥邞꣨躘鯦⢸佃⥁臣袂苣䎋䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨���裥邭蟩㲏牢ਾ坍猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䴾湡⼼畳㹢㴠麃菣躃菣릂臣蚈귥辇ㄨ〸㈮菣ꮃ菣뎃਩⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†꣦隺菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂胣䎂䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨誁苣뎁ꧨ首臣ꊃ菣钯苣袨껧馁苣뒠郥膀菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣龁苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦꺁ꒁ臣릁臣銂铧蒁苣芀臣꺁볥ꮁ郥肂臣膂臣钃菣꾂鷩趩苣뎹鷥馁苣芀臣貂苣肜裥꺁ꒁ臣ꚩ雦ꮁ铧蒁苣鎁臣ꮁ臣讂胣馁臣ꚁ臣隻臣ꚩ雦ꮁ꿥鞁臣꾁胣ꊃ菣钯꣨鞮臣龁苣ꮁ곦꺁ꒁ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁臣颍돧馨뫦誁苣뎁觥꺁ꒁ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁臣颍돧馨뫦꺁맥螝菣벃苣ꊝꧧ銂룥ꮁ铧蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 閃苣벃苣⾹苣뎃菣꾂돨꺁菣ꮃ꿦銂꣨鞮臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㜸⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲刊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䘾捵⼼畳㹢㴠閃苣벃苣⢹畆⥣꿥뾂菣醃苣ꪳ臣ꊃ菣钯戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䘾捵⼼畳㹢㴠ꚩ雦궸臣䚮捵臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥㰩牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢祘㱬猯扵‾‽ꧨ首룤꺁苣랂菣벃苣⢹祘⥬臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥㰩牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢祘ぬ⼼畳㹢㴠颍돧馨뫦궸臣墮汹臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥뎹鷥㲇牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢畆っ⼼畳㹢㴠颍돧馨뫦궸臣䚮捵臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥뎹鷥㲇牢ਾ㱖畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢畆っ⼼畳㹢㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣颍돧貸蟩馨뫦뚺뛦궸臣ꮐ臣貂苣䚋捵臣辇츨䲼㰩牢ਾ㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢畆っ⼼畳㹢㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣颍돧貸蟩馨뫦뚺뛦궸臣ꮐ臣貂苣䚋捵臣莿뫥⢦杭洯⥌戼㹲嘊⁰‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁苣뎃菣꾂돨ꚩ雦꺁蟩⢏볎⥌戼㹲䌊⁰‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁苣뎃菣꾂돨ꚩ雦꺁뿦ꚺ洨⽧䱭㰩牢ਾ坍猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䌾䱔㑁䤭㱧猯扵‾‽裥邞꣨躘鯦⢸佃⥁臣袂苣䎋䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨꺁裥邭蟩㲏牢ਾ坍猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䘾捵⼼畳㹢㴠閃苣벃苣꺁裥邭蟩⢏㘱⸴肃菣袃菣⦳㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 겂菣꾂菣벃苣⾹苣뎃菣꾂돨꺁菣ꮃ꿦銂꣨鞮臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㠸⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲刊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䜾污⼼畳㹢㴠겂菣꾂菣벃苣⢹慇⥬꿥뾂菣醃苣ꪳ臣ꊃ菣钯戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䜾污⼼畳㹢㴠ꚩ雦궸臣䞮污臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥㰩牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢祘㱬猯扵‾‽ꧨ首룤꺁苣랂菣벃苣⢹祘⥬臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥㰩牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢祘ぬ⼼畳㹢㴠颍돧馨뫦궸臣墮汹臣钃菣꾂鷩趩츨嚼菣玻捥뎹鷥㲇牢ਾ㱖畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慇ぬ⼼���㹢㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣颍돧貸蟩馨뫦뚺뛦궸臣ꮐ臣貂苣䞋污臣辇츨䲼㰩牢ਾ㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慇ぬ⼼畳㹢㴠ꂊ냦蚈꟨ꮁ铧蒁臣颍돧貸蟩馨뫦뚺뛦궸臣ꮐ臣貂苣䞋污臣莿뫥⢦杭洯⥌戼㹲嘊⁰‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁苣뎃菣꾂돨ꚩ雦꺁蟩⢏볎⥌戼㹲䌊⁰‽諥뒰裥ꎧ臣ꢔ臣龁苣뎃菣꾂돨ꚩ雦꺁뿦ꚺ洨⽧䱭㰩牢ਾ坍猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䌾䱔㑁䤭㱧猯扵‾‽裥邞꣨躘鯦⢸佃⥁臣袂苣䎋䱔㑁䤭몟뫦ꦉ돨꺁裥邭蟩㲏牢ਾ坍猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䜾污⼼畳㹢㴠䜠污臣蚈귥辇ㄨ〸㈮菣ꮃ菣뎃਩⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†돦骼呃䅌ⴴ杉鿥隺觧ꪳ臣袂臣ꚩ雦꺁菣ꮃ꿦銂꣨鞮臣讂ꃥ袐胣肜뻥꺁苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦誁苣뎁곦꺁菣ꦃ苣莃菣ꎂ菣낂臣龁苣릂菣ꂃ臩袐胦馨뫦뾪ꏨ銂铧蒁苣芀臣꺁볥ꮁ郥肂臣膂臣钃菣꾂鷩趩苣뎹鷥馁苣芀臣貂苣肜裥꺁ꒁ臣ꚩ雦ꮁ铧蒁苣鎁臣ꮁ臣讂胣馁臣ꚁ臣隻臣ꚩ雦ꮁ꿥鞁臣꾁胣ꊃ菣钯꣨鞮臣龁苣ꮁꒁ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁臣颍돧馨뫦꺁맥螝菣벃苣ꊝꧧ銂룥ꮁ铧蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 ꆨ꿧蒚胥芀ꒁ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣鞁臣궸胦랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺菣벃苣ꊝꧧ钯臣劮䑓菣벃苣뎃菣꾁〱銂뛨袁臣蒁胣몟뫦ꦉ돨궸臣궸胦颍돧꺁맥螝菣ꮃ꿦꾁룤風臣ꢡ臣辦껥馁苣蒯鯥薆臣芁苣蚁苣芀郥邈裥ꮁ臣蒁臣膀ꒁ臣邵黦袼蟩螤ꫨ붣臣趇ꓨꢳ藥覼臣▮卒꾁氦㭴㴯㔲ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣㲂牢ਾ呃䅌ⴴ杉鿥隺觧ꪳ臣ꊃ菣钯臣蒯鯥㲲牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㤸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 邵黦놠釥芀呃䅌ⴴ杉裥邭讀臣龁苣꺁菣뎃菣벃苣蚈귥꺁闦膀呃䅌ⴴ杉裥邭讀臣龁苣꺁菣뎂菣릂裥邭臣낕胣誁苣뎁呃䅌ⴴ杉裥邭讀臣龁苣꺁苣ꦃ苣袃菣릂裥邭臣낕臣鞁臣뎹鷥邵黦銂ꃥ誑臣讂胣ꊃ菣钯臣邵黦銂膡臣覜諥낕귥ꞁꃥ誑臣讂胣蒐裦蚈臣ꒁ臣ꚁ胣㒁臣꺁뗧鲞볯趇ꓨ뾪ꏨ꺁蟩螤돦ꖅ볯꺁別䑓臣⚯瑬⼻㈽┵臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㔶裢䎒䱔㑁䤭뢅賥誁苣뎁蓨ꊂ菣覃臣袃菣鞃苣뎃菣莃菣뎃苣骮蟩એ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁雦閳臣꺛髧꾁胣讉该袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃菣莃菣뎃苣閳苣ꆃ菣ꪂ菣뎃藩隌臣袂臣ꊂ苣醃菣꺂菣놄苣龃菣꺁觧骮臣鲤蟥誁苣뎁껥辇臣놅臣ꢔ臣ꚁ胣䎁䱔㑁䤭꺁菣莃菣鎖臣肸단Ꞁ苣ꊃ菣뾂菣馁苣鎁臣ꞁ臣讂胣骃菣膃菣麃菣钃菣낂臣膀飦몢臣骃菣膃菣궖觧꒾苣龔裦馁苣龁苣꺁苣뎃菣꾂돨蚈꟨뺁臣꾁믤꺁苣뎃菣꾂돨꺁雦螉賥銂郥뾁胣ꆬ臣ꞁ臣貂苣���雦螉苣骀룥꾁偈䍌臣袂苣蚈黦馁苣芀苣궃菣袃苣ꦃ菣뺁臣꾁菣鞃菣覃菣莃菣꾁苣뎃菣꾂돨꺁賥ꚭ꟦ꂀ臣誁臣讂鷩뢸臣辰臣蒁ꓥ隌臣閁臣龄迥Ꞁ臣膀臣龁臣ꎁ臣뮿꣨貾뿤뺣苣鲤蟥誁苣뎁觧뒾臣醁臣讂臣膂臣覜铧ꞁ臣讂胣䎂䱔㑁䤭뾂菣醃苣ꪳꧨ首苣㢒낂苣讃苣뎃䠭汃럧鶡뛦궸臣覤胦鞁胣랂苣膃菣뢂苣ꮃ菣ꎂ菣뚞ꧦ銂苣膃苣릂菣ꒂ菣벃菣ꞁ苩莅臣膀菣벃菣ꊂ苣袃苣龃菣ꞁⵓ苣ꮃ苣ꮃ賥鞁臣貾胣뾂菣醃苣ꪳ裥ꎧ藩ꂴ胣袃菣鞃苣뎃臣袶賥馁苣芀곦蒁臣膀뻥覂苣龁菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣꺁럦袐觧銂胩뢛ꯩꞀ菨늶뷤꾂菣麃菣낂菣閃苣袼偒䠭䱐覼臣袂苣膀ㄲ誁苣뎁㠲渰꺁噕ꓦ몇臣蚈黦馁苣芀臣辁臣讁臣ꖕꫨ銂믤许臣風볨馁苣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤲㰰愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ賥ꚭ觧ꪳ臣袂臣ꚩ雨㲬牢ਾ꟧開鯧䆸裢䢒䱐覭듧꺁냦궸臣ギㄮ吥䅆戼㹲吊䅆臣ㆮ䱭苣뎃菣ꮃ臣ꢅ蛥릮苣䢒䱐覭듧꺁냦袼〱〰䱭볯ꮁ꟧鞁胣膍裥ꮁ럦袐臣ꚁ⸰┱䙔袼꟧開鯧䆸볯銂ꫨ붣臣讂胣もㄮ吥䅆臣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥鞁臣讂胣㲂牢ਾ꟧開鯧䊸裢㢒┰䍁誁苣뎁〲䠥䱐覭듧꺁냦궸臣ギㄮ吥䅆戼㹲吊䅆臣ㆮ䱭苣뎃菣ꮃ臣ꢅ蛥릮苣ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ볯㢈〰䱭볯誁苣뎁偈䍌귧骴臣뒰볯㊈〰䱭볯ꮁ꟧鞁胣膍裥ꮁ럦袐臣ꚁ〸䄥乃룤꺁⸰┱䙔袼꟧開鯧䊸볯銂ꫨ붣臣膀臣貂臣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥鞁臣讂胣㲂牢ਾ룥袇럧鶡뛦銈〱洰袃菣릂胣㊁洵⁍慎汃胣炁㝈㘮戼㹲吊楲浺⁡牐ⵥ敓⁴牃獹慴⁬䡰⸷袼㐱〮覼臣袂臣亳䍡袼⸱㘴覼苣䢒䱐覭듧꺁냦袼〱〰䱭볯ꮁ胣뚺뛦銂ꏧ鞰鋦貋菣것菣袃룤ꞁ鋦貋臣讂臣ꢁ臣袂苣뚺꟨馁苣芀뫦늶苣を㈮볎閃苣ꮃ苣벃ꏨ꺽苣骀臣ꚁ苣躁臣讂胣뚺뛦銂讁苣㢉蓢ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀戼㹲覤胦ꦷꇨ늶裢㢒낂苣讃苣뎃胣㖁洰袃菣릂胣炁㡈〮戼㹲ꦡ藩낂苣讃苣뎃볯ㆈ㈵㠮覼臣袂臣咳楲浺⁡牐ⵥ敓⁴牃獹慴⁬䡰袼⸱朴볯銂偈䍌귧骴臣뒰볯㦈洰覼臣膀뫦늶苣膣냦릒详鞃菣벃菣誸臣릒详馁苣鎁臣ꮁ苣誂뫦ꎧ臣讂胣䢂汃臣龁臣亯佡꺁臣骁苣讁臣炧銂⸸ꮁꫨ肯臣膀偈䍌귧骴臣뒰臣肜뗧辇〲洰ꢁ臣讂胣뚺뛦銂⸰츲涼菣ꎂ菣뾂菣銂胩鞁臣趂臩馁苣芀뫦늶苣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀戼㹲袶賥ꦷꇨ늶裢㖒洰袃菣릂胣ㆁ洰⁍慃汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢胣炁㝈㘮戼㹲吊楲浺⁡牐ⵥ敓⁴牃獹慴⁬䡰⸷袼⸷朰볯誁苣뎁慃汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢볯ㆈ㐮朷볯銂偈䍌귧骴臣뒰볯ㆈ〰洰覼臣膀뫦늶苣膣냦릒详鞃菣벃菣誸臣릒详馁苣鎁臣ꮁ苣誂뫦ꎧ臣讂胣뚺뛦銂⸰츲涼菣ꎂ菣뾂菣銂胩鞁臣趂臩馁苣芀뫦늶苣㊒臣覂莄臣㊧菣袜臣ꞁ뿤���颭臣讂胣㲂牢ਾ苩莅觥銈〲洰뢂菣ꪂ苣것苣袃菣ꮃ볯䒈呔볯㲉牢ਾ呄袼〳㠮뇂⸰洲覼臣뒰볯ㆈ〰츰䲼볯銂뷤ꢔ鯧趉臣ꂊ臣膀뫦ꎧ臣讂臣ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣뚺뛦꾁ꫨ붣駦讁苣㊉芙雩覜諥ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ苣ꮃ苣ꮃ賥ꚩ雨銈〴洰ꢃ菣覃苣뮂菣ꊂ菣覃볯䦈䵁볯㲉牢ਾ菣벃菣ꊂ苣袃苣龃菣袼㐷〮뇂⸰洵覼臣뒰볯ㆈ〰츰䲼볯銂뷤ꢔ鯧趉臣ꂊ臣膀뫦ꎧ臣讂臣ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣讁臣讂胣뚺뛦꾁ꫨ붣駦讁苣㊉芙雩覜諥ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ⸱䴰䠠汃戼㹲莿ꇥ뢅볯㢈㜮䱭볯銂偈䍌귧骴臣뒰臣ㆧ〰䱭臣貸蟩馁苣芀뫦늶苣꒮룦ꞁ뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖馨뫦誁苣뎁苣뎃菣궃菣ꮃ戼㹲吊漶骃菣膃菣馨뫦膀〳볎㱍牢ਾ㙔硯菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣袐裦馨뫦꾁汁ⵡ敍⡴⥏䄭灳吭牨䜭祬䰭略吭特䤭敬䌭獹䰭獹菣㊻䙔膀坆ㄠ㔳⸸膀듧ꚺ듧㦄趇蟩▏臣芁苣芀鯥鎽苣ⶒ〲蓢ꞁ臣ꒁ臣蚯냥鞁臣鶿귥鞁胣뒰裥꺁郥躏苣늘臣龁苣ꮁ룥ꮁ菣랂苣벃苣벃蛥ꞁ룥ꦸ臣뮈臣芀㙔硯볯ㆈ〮뇂⸰洱覼苣꒧蟩鞁胣ꎭꋧꪁ蟩辇苣風賩鞁胣袶賥ꦷꇨ늶볯ㆈ㔮洰覼臣뚺꟨馁苣芀〲洰⁍呄袼〴볎覼苣ꂊ臣膀㜳蓢ꞁ〲裥鎖뷧辁胣꒮룦ꮁ蛥뒍臣膀〴洰ꢃ菣覃苣뮂菣ꊂ菣覃볯㒈츸䲼볯銂諥袁胣꒮룦꺁髦肉臣㎧蚈雩ꊂ菣궂菣隌臣讂胣袶賥ꦷꇨ늶臣肜뗧辇㐲㔮䱭臣貸蟩鞁胣㎁숰㎱볎馨뫦뚺뛦銂뻥讂胣㎂츰䶼吠漶馨뫦銂洱ꮁ裥ꢳ臣膀㜭莄臣㊧뚃鳦뺁臣鶿귥馁苣芀戼㹲吊㘲敤浡骃菣膃菣馨뫦膀〳볎㱍牢ਾ㉔搶慥ㅭ菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣袐裦馨뫦꾁汇⵹桐ⵥ祔⵲牐ⵯ敓⵲獁⵰汉ⵥ汁ⵡ慖⵬汇⵵牔⵰汇⵵敓⵲獩䅯灳䜭祬䜭湬倭潲䜭畬䄭湳䄭湳吭特䰭獹菣㊻䙔膀坆㈠㜷⸳膀듧ꚺ듧㢄趇蟩▏臣芁苣芀鯥鎽苣ⶒ〲蓢ꞁ臣ꒁ臣蚯냥鞁臣鶿귥鞁胣뒰裥꺁郥躏苣늘臣龁苣ꮁ룥ꮁ菣랂苣벃苣벃蛥ꞁ룥ꦸ臣뮈臣芀㉔搶慥ㅭ볯ㆈ〮뇂⸰洱覼苣꒧蟩鞁胣ꎭꋧꪁ蟩辇苣風賩鞁胣袶賥ꦷꇨ늶룤㎭┰瘠瘺苣뮂菣讃菣ꪃ菣袼洱覼臣뚺꟨馁苣芀鳦芵蟩㆏⸰洷ꮁ룥袇臣膀〳뇂츳䶼꣦隺뫦늶苣鞾苣芀〳볎⁍㉔搶慥ㅭ꣦隺苣㆒䱭臣蚈돦鞁胣ⶁ〷蓢ꞁ㐲菣袜臣ꞁ뿤颭臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ꣦隺臣袂臣ꚩ雦꺁ꫨ붣戼㹲蒂藥誁苣뎁苣ꮃ苣ꮃ賥㲖牢ਾ†菣鞃菣覃菣莃菣뎃苣꺁臣膂臣뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ꿧늛臣蒴〲杭洯ꞁ臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ臣⚌瑧㈻洰⽧䱭臣芁苣낁胣ꚩ雦銂룥袇럧鶡뛦ꞁ鳦芵뿦ꚺ듧㊄洰⽧䱭臣貸蟩馁苣芀냥ꪁ臣ꢁ苣ㆂ〰볎꺁룥袇뫦늶苣뾪ꏨ馁苣芀⸱洷ꂁ뿥ꆮ룤膀〲杭洯䍌䱔㑁䤭뚺뛦袼ꧨ首臣龁臣몟뫦ꦉ돨覼볯ㆈ〰볎膀洲覼苣覤胦ꦷꇨ늶볯㖈〵볎覼臣ꂊ臣讂胣㊂〰䵭苩莅ꧨ겖볯㎈층䲼볯銂諥袁胣膃菣벃菣銂鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣���胣ꆬ臣ꞁ듧㎄꟧鎖臩莿裥ꊛ臣讂胣膃菣벃菣銂㜳蓢ꞁ〲뇂蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣㒂〰䵭苣ꮃ苣ꮃ賥ꚩ雨袼㠳㔮볎覼苣蒐菣ꖃ菣隃臣ꂊ臣膀鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁胣ꆬ臣ꞁ듧㎄꟧鎖臩莿裥ꊛ臣讂胣ꚩ雦銂껥ꦸ胣鞚触ꞁ〲뇂蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣亂偁㔭苣ꦃ菣銂苣뾂菣覃臣궨뷧馁苣芀ꧨ首꿦ꮁꒁ臣ꮂ菣ꂃ苣ꢔ臣讂胣ꚩ雦銂䅉궸臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣ꪁ臣覂胣亁偁㔭苣ꦃ菣銂뛦隌럧鶡뛦袼⸷洵覼臣뎹ꇨ隌臣讂胣膵蟥늶苣붖꣨꺁触蚠臣袂苣莻ꏦ馁苣芀苩莅臣膀苣ꮃ苣ꮃ賥鞁臣랷郥ꦉ볯㖈〰볎覼苣互偁㔭苣ꦃ菣ꮁ諥袁胣늶뷤銂苣ꦃ菣銂胩鞁臣銎뛦閁臣讂胣膵蟥늶苣붖꣨꺁触蚠臣袂苣莻ꏦ馁苣芀뛦隌럧鶡뛦袼⸱洰覼苣互偁㔭苣ꦃ菣ꮁ諥袁胣膵蟥늶苣㆒㜮䱭臩莿껧ꮁ鯥躏臣膀鯥躏臣龁뗦몇뛦銂苣ꎁ臣誂럦袐臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†뛦隌胣袶賥馁苣ꚩ雦뺁臣꾁鿥隺觧ꪳ洱ꮁ臣趁ꒁ臣袃菣鞃苣뎃菣ꒂ苣ꮃ볯㊈츰枼볯膀臣袂臣ㆳ臣꺁뿨ꂊ臣袃菣鞃苣뎃菣ꒂ苣ꮃ苣膀臣貂臣貂㘸볎꺁菣ꪃ菣랂菣ꦷꇨ늶볯떅듧ꢁ藥ꮁ뻤ꚵ臣貂苣覼臣趆꟦邈臣膀⸰㔲볎⽧볎ꢁ臣讂胣袃菣鞃苣뎃菣ꒂ苣ꮃ臣薆껥銂룤銷臣ㆫ臣꺁菣ꒂ苣ꮃ臣鞃菣ꮃ臣讂胣蒐ꧨ首苣ꚩ雦㆙䱭臣ꒁ臣趉뿨꺁菣벃菣鞁臣袃菣鞃苣뎃뫦늶〸볎ꞁ胣㎁莄臣ㆧ〲뇂㈱裥鎖뛦隌臣讂胣袶賥貮뫤貾胣ꚩ雦銂ꧨ首洱ꮁ臣趁⸱䴰䠠汃㐠츰䲼臣뢅胦隌臣膀鲀銧雩鲃菣蚃菣꾂苣ꮁ臣醁苣芀ꧨ首臣袶賥ꦉ臣袂臣몟뫦ꦉ돨鶁苣麁苣ㆌ〰볎銂菣骃菣袃臣ꪂ菣袃苣뎃菣ꦃ菣邃苣ꊂ菣ꮁ諥袁苣芀〳볎⁍㙔硯菣鞃菣覃꣦隺층䲼臣袂臣㎳츰䶼吠㘲敤浡骃菣膃菣馨뫦㖖볎ꢁ럦袐臣龁鿥隺觧ꪳ뛦隌觧㦩층䲼苣ꮐ苣붿諥꺁苣릂菣ꂃ臩袐胦뎂菣袃菣벃菣銂ꫨ붣臣膀┵㙔硯臣袂臣㖳吥㘲敤浡銂苣醃苣꾂臣龁뛦隌觧銂뻥讂胣馁臣ꚁ臣邃苣ꊂ菣銂偈䍌裥邞臣龁苣ꮁ숵㖱蓢꺁苣벃菣떂菣鞃菣벃臣ꖅ苣讂胣议苣꺁뛦隌ꧨ首臣馁臣ꚁ㜭莄臣鶿귥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖꾂菣麃菣낂菣閃苣ꆝ믤㲶牢ਾ†믤许臣ꢡ臣膵胩誁苣뎁苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ该超苣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤲㰱愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†鳦鶈臣ꢳ藥趉臣膀苣ꦃ菣銂〱┰꟧開鯧䆸臣袂苣㖊莄臣醰臣辁臣节㔲裥鎖맥ꆡ賥馁苣芀ㄲ渵誁苣뎁㠲渰ꞁ噕郥躏苣ꊃ菣뾂菣馁苣芀苣ꦃ菣讁苣鲤蟥ꢙ臣꺁藩ꆮ臣膀详ꎕ臣袂苣邃菣覃뫥薹賥銂鳦辰駩ꮁ臣讂臣膂臣膀觢ウ〮✱꺁蛥蒾苣覜臣讂臣趁臣芁苣芀苣ꦃ菣ꦸ뫥銂㔵뇂莄臣궶���馁苣芀苣벃菣떂菣鞃菣벃룦ꚺ苣㖒뇂莄臣궶賦馁苣芀꟧開鯧䆸苣隃菣뎃苣ꢳ藥ꢁ臣ꚁ铧蒁苣芀ꧨ首볯肸뫥ꮁ〱믤许볯銂鿥隺觧ꪳ돦ꖅ臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣馁苣芀믤许臣ꢡ臣꾂菣麃菣낂菣閃苣蚈黦꺁臣膂臣ꢳ藥랂菣놂菣릂苣몤臣芀돦ꖅ蟩꾁臣릁臣㊦층䲼臣膀뻤隤臣鞁臣㖦吥漶誁苣뎁┵㉔搶慥ㅭ菣鞃菣覃꣦隺苣릂菣ꒂ苣鞁臣몟뫦ꦉ돨讁苣ꪁ苣뎂菣袃菣벃菣ꚩ雦꾁㠲볎銂돦ꖅ臣讂臣ꢁ臣馕蓦閁苣龁臣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤲㰲愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯閼胣㲑䐯噉ਾ꣦蒯髧ꒀ戼㹲 ꆨ꿧蒚胥芀鿥隺觧ꪳ臣骃菣膃菣麃菣鞃菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣膀ㄲ渵誁苣뎁㠲渰붿럨꺁ꇩ鞑臣钃菣꾂臣낕胣뢛꿥떂苣몂臣袂臣뚺蟥蚠뫥ꮁ雩鞁臣膀鯥ㆳ臣몤臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣꺛ꛨꮁ苣誂郥覭臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀裥龜臣袂臣隃菣놂菣蚃苣뎃苣몟뫦ꦉ돨ꮁ臣醁苣钃菣꾂㑔胣咁㔲胣誁苣뎁㉔꺁뿤膌駦鎖臣꺷臣슯ケ㔮裥銂뛨袁苣릁臣ꞁ臣ꪁ臣芀郧隫껦낕볯予볯꾁觢ㆧ〰〬〰臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀♎瑬ㄻ〰〬〰臣芁苣낁胣ꮂ菣ꂃ苣趆맥ꆡ賥馁苣芀闥財臣骶臣뒠郥ꮁ臣ꮂ菣ꂃ苣꒺迦馁苣芀㉔臣袂臣咳㈱菣벃苣꺁裥ꎧ菨袼覼臣꞉⸱ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣劂氦㭴⸱ꞁ臣貂臣膀苣ꦃ菣銂蛥뎹ꇨ隌臣讂胣辕ꇩ貁뛧辁ꃥ袐臣꾁苣ꦃ菣銂뫤鮏臣讂胣㖂吥漶誁苣뎁㙔敤浡銂苣醃苣꾂臣龁迥ꞅ꣦隺臣㊮〸浮苣궃菣袃苣ꦃ菣꾁胣뎛㔸臣몤臣ꢁ臣誂胣蒴㌳〮裥ꮁ뫦몇臣讂㙔硯菣벃苣꺁ꋥꞤ苣몤臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀┵㙔硯臣袂臣咳搶慥ㅭ苣릂菣ꒂ苣鞁臣芏藧馨뫦꺁ㄲ渵꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣膀鯥㢳ꮁꓧ馁臣誁苣膀듧㚄⸶蚈臣뚺蟥馁苣咋㘲敤浡钃菣꾂臣鞢ꓥ銂ꓧ閁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ首꣦蒯髧ꒀ胣肜裥꺁鿥隺觧ꪳ돦ꖅ臣袂臣ꚩ雦꺁苣궃菣袃苣ꦃ菣꾁胣ꖈ臣놠釥馁苣咋漶誁苣뎁㉔搶慥꺁藩隌臣袂臣⾳臣龁臣놄苣龃菣钃菣꾂苣꒙臣ꚁ胣뎛㔸臣ꦃ菣ꮃ臣龁菣벃苣ꮁ臣蒁臣몤臣ꢁ臣誂胣㊁㔱浮臣袂臣㊳〸浮뿨ꆷ臣閡釨ꪁ菣벃苣꺁闦膀鯧뺯苣ꒂ苣誁苣뎁뫦몇ꃩ辺臣ꊖ臣ꚁ鯧隦臣袂苣覭뻤ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ꚩ雦ꮁ臣醁苣钃菣꾂㑔胣咁㔲胣誁苣뎁㉔꺁뿤膌駦鎖臣膀鳦鶈臣몟뫦ꦉ돨ꢳ藥꺁꿥鲿臣讂菣벃苣鶿賦芙雩꺁뇂⸰蚈믤薆臣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 袨껧芀돦骼觧ꮁ꣨覼臣ꪁ臣讁臣誂胣鎁苣覂臣袨껧ꮁ臣㊯㔱浮臣螃菣뾂苣ꢔ臣讂胣隃菣놂菣蚃苣뎃苣몟뫦ꦉ돨뎳该ꮁ臣醁苣钃菣꾂㑔胣咁㔲胣誁苣뎁㉔袼鯥㢳覼臣鶿賦���雩꺁럥꾁⸰蚈苣誶臣讂臣趁臣꾁臣蒁볯뎛㔸볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 蚐ꯨ떮闦芀郧隫껦낕볯予볯ꢁ臣ꚁꧨꆾ臣讂苣ꦃ菣꺁諥螎苣膀鿥隺觧ꪳ돦開臣覂臣钃菣꾂㉔꺁뿤膌駦鎖臣袂臣薹苣ꢔ臣膀룤風臣込臣袂臣ꚁ꣨鞮臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㌹⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲眊㴠钯볨蒚鯧骷臣뒁菩銂菣벃苣ꦃ苣뎃臣隤賦馁苣鎁臣ꮁ苣誂룦骮臣龁胣馃菣릂菣ꒂ菣ꞁ臣钃菣꾂맥㲅牢ਾ⁴‽돦ꖅ駦讁苣钃菣꾂鳦颫苧꺁뫦몇駦뺁臣ꞁ룦骮臣龁胣钃菣꾂㉔꺁뿤膌駦鎖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 蚈꟨붃胣钃菣꾂ㅔ誁苣뎁菣벃苣咯袼鯥㢳覼臣鎖臣蚈꟨붃볯劈볯銂룤風臣込苣ꢔ臣ꚁ꣨鞮臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㐹⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲琊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ⼼畳㹢胣璁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢㴠鶁苣麁苣钃菣꾂ㅔ誁苣뎁菣벃苣咯꺁뿤膌駦鎖戼㹲眊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ⼼畳㹢胣瞁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢㴠鶁苣麁苣鶿賦芙雩璓猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ⼼畳㹢臣袂臣璳猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢臣钃菣꾂臣馃菣릂菣ꒂ菣ꞁ臣ꖎ럧ꮁ苣誂ꛨ骮臣龁菣벃苣薹㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 馁臣ꚁ臣ꚩ雦誁苣뎁꣦隺臣ꒁ臣ꚁ胣许꣨꺁臣誁苣㊊〸浮菣벃苣ꊝꧧ螃菣뾂臣覂臣䶮瑥㔸臣뢅賥醃菣뮂菣袃苣袨껧馁苣骼戼㹲뢅賥醃菣뮂菣袃㴠ㄠ〰⨠䄠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾漶㱸猯扵⼾⠠㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㙔硯⼼畳㹢⬠䄠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾㰶猯扵⤾戼㹲込룤骼戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾㰶猯扵‾‽㠲渰붿럨ꮁ臣醁苣咋膀㠨ⴴ㌹꺁菣벃苣ꊝꧧ㲍牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㙔硯⼼畳㹢㴠㈠〸浮뿨ꆷ臣誁臣讂㙔硯胣䶁瑥伨㰩畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔸⼼畳㹰㠨ⴴ㌹꺁菣벃苣ꊝꧧઍ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臣릁臣꺁ꧨ首臣袂臣馨뫦ꮁ臣蒁臣膀鯥㢳ꮁꓧ馁菣벃苣꺁臣誁苣㊊㔱浮菣벃苣ꊝꧧꮁ臣蒁臣䆦湳㤲꺁蓨ꊂ菣覃菣벃苣뎃菣銂꣨鞮臣讂볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㔹⼼㹡⼼䥄㹖込룤骼戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾㘲⼼畳㹢㴠㈠㔱浮뿨ꆷ臣誁臣讂㉔膀㈨ㄸ㌭㈰꺁菣벃苣ꊝꧧ㲍牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉔搶慥ㅭ⼼畳㹢㴠㈠㔱浮뿨ꆷ臣誁臣讂㉔搶慥ㅭ胣榁潳獁㱰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤲㰴猯灵⠾㠲ⴱ〳⤲臣钃菣꾂鷩趩戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾㘲敤浡㰲猯扵‾‽ㄲ渵붿럨ꮁ臣醁苣咋㘲敤浡膀獁㱰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤲㰹猯灵⠾㠲ⴱ〳⤲臣钃菣꾂���趩戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾㘲敤浡㰳猯扵‾‽ㄲ渵붿럨ꮁ臣醁苣咋㘲敤浡膀獁㱰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤲㰴猯灵⠾㠲ⴱ〳⤲臣钃菣꾂鷩趩戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰吾㘲敤浡㰴猯扵‾‽ㄲ渵붿럨ꮁ臣醁苣咋㘲敤浡膀獁㱵畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤲㰴猯灵⠾㠲ⴱ〳⤲臣钃菣꾂鷩趩戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤲㰶愯㰾䐯噉ਾ‪ⵎ胩邵苧뒰賥ꦉ苣ꮐ苣芀戼㹲⨊‪ⵏ胩邵苧뒰賥ꦉ苣ꮐ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖龮雦设㘶裢ꖁ룥銃菣ㆈ鯥閊룤ꚩ꣩㲓牢ਾ†붖꣨ꆄ뷤몂麛諦躸ꧨ鎨苣ꢔ臣ꚁ胣ꖁ룥ꮢ꣩薀臣誁臣讂呃䅌ⴴ杉볯䎈ⵄ䡃ㅏ臣袂苣ꎔ铧覼菣궃苣릂臣겖觧開藦銂ꧨꆾ臣龁胣뮙賩誁苣뎁駩隤臣ꆨ꿧蒚胥銂뫦龁臣龁㌱郥꺁ꋨ鎨胨貁蟨誺ꧨ鎨韧龣臣ꖝ駩鞁胣鞃菣뮂苣䎹ⵄ䡃ㅏ臣袂苣ꎔ铧閁苣龁呃䅌ⴴ杉苣㎒蚈臣醁臣꺁〱杭欯꺁麛鷩袄蛥ꢳ藥ꞁ諦躸臣龁胣蒐ꋨ鎨胨銂蟨誺ꧨ鎨韧龣臣ꢳ藥貾㐲駦鎖ꛨ龯臣龁胣䎂䱔㑁䤭꺁껥辇臣龁苣ꮁ胣股뛦ꚩ雦銂諦躸뻥꺁賦骮臣芙雩ꮁㄷ韦鎖軦随臣龁胣ꮢ꣩薀苣겖觧開藦ꮁ臣蒁臣閩뻤鞁臣骼郥ꮢ꣩薀臣䎮慭膀浔硡胣䆁䍕⠠义⥆胣咁䠭䱁膀䱃膀臣袂臣嚳獳苣芙雩ꮁ꿥馁苣股룦莿뫥螃菣뾂臣覂ꫨ躰臣龁胣䎂䱔㑁䤭꾁〲洰⽧菣ꒂ苣ꮃꏨꒉ臣鮾뗧銂迥醁臣芀臥뢸ꋨ鎨胨ꮁ〱杭欯⁧呃䅌ⴴ杉臣㎮蚈雩꺁噉돦ꖅ苣財臣龁胣傂膀껥ꢅ胦膀臣袂臣超雧龎胦閩뻤銂諦躸뻥㞌ꖗ雩膀賦骮臣芙苧ꞁꇨꎁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖놵꣨閳볯㲚牢ਾ†苣뎃菣ꮃ苣ꒂ苣骼ꋨ鎨胨ㆅ趐臣떂菣鞃菣떂苣몂臣㦯┰臣ꆿꃩꚺ苣邏뻤鞁胣䎁䱔㑁䤭꺁맥閽맥螝臣钯臣ꢎ껥ꒀ臣䎯慭꺁鳧꺁胥꺁㔱ꖻ蛥膀臣袂臣䆳䍕䤨䙎꺁鳧꺁胥꺁〱ꖻ蛥ꞁ臣讂臣鶀苣貂苣芀뗧袨꟨邞볯ꮢ꣩薀臣몺迥놵꣨ꚭ胣ꮺ뷤鲤鿦膀ꓦ뮟菣벃苣膀臣袂臣龔釥뒾胥銂臣ꢁ苣龁胣覜껥论뇨꺁駧龔軧銂胣ꮺ뷤뮳臣袂臣趇韧ꚺ臣袂苣ꢡ臣뺁臣膂臣芀呃䅌ⴴ杉臣䎮慭誁苣뎁啁⡃义⥆胣鞃菣뮂苣䎹ⵄ䡃ㅏ臣몺迥뺹뷤뎹鷥꺁꿦ꮁ臣蒁臣꺁〹ꆿꃩ몌雩銂胣沁杯䌨慭⥸臣袂臣河杯䄨䍕꺁裥ꎕ裥邞臣邵黦讁苣袨껧馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 겖觧開藦邵黦骼雨ꦉ该讅臣邵黦銂胣覜諥Ꞁꋧ趪臣貂臣麝賥뮔裥邞菣궃苣ꦃ菣銂铧蒁臣閩뻤鞁臣芀雨ꦉ该讅菣ꦃ菣벃苣벃苣鞃菣뮂苣䎹ⵄ䡃ㅏ䌠䱔㑁䤭銂諦躸臣龁㌱郥꺁ꋨ鎨胨讁苣鞾臣芀믤许臣ꢡ臣ꖁ룥ꮢ꣩薀臣誁臣讂呃䅌ⴴ杉臣겖觧開藦醃菣ꆃ菣뾂菣銂ꓧ馁胣许ꇨ꾁呃䅌ⴴ杉雨ꦉ该讅菣ꦃ菣벃苣벃臣놵꣨ꚭꛦ膦苣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦���〰㤲㰷愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†呃䅌ⴴ杉臣ꖁ룥ꮢ꣩薀臣誁臣ꚁ듧ㆄꖗ臣뎹鷥咇䠭䱁ꒀ苣覜臣膀매겙ꋨ鎨胨袼〱胣㆜ꖗ볯誁苣뎁雩肯菣Ꚃ菣膃苦薀볯蒴㌱韦覼臣鞾苣貂臣認룦龜臣肸蟨鞁臣蒁苣芀ꛨ龯臣貂臣ゟ〮讁苣らㄮ䰰欯꺁맥螝獖꾁胣䎁䱔㑁䤭貁룤ꮁꇨꆮ돧ꮁ駩肱臣貂胣股껧隤苣骃菣릂臣芁臣誂裥莸臣ꚁ臣ꪁ臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁ꇨ꾁ꋨ鎨胨躯臣股룦莿뫥袼杮洯覼苣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤲㰸愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ呃䅌ⴴ杉臣股룦ꊂ菣뮂苣ત⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ薸ꧨ首苣떅듧邵郥超雧뢐鷧鲤껥閳볯䖈䥌䅓볯ꮁ苣誂郥袨㔲臣蚈黦ꞁ呃䅌ⴴ杉臣ꒁ臣ꚁ裥邞臣龁胣馁臣ꚁ臣蚈黦邵黦꾁ꧨ首裥邞觥ꮁꋧ讫臣龁꣦蒯髧ꒀ臣ꦁ郥鞁臣誁苣膀䱅卉閳臣ꚩ꣩ꚩ雦궸臣䎮䱔㑁䤭骮蟩꺁臣膂臣뺲뫥貁ꯩ辁귦몢臣芁苣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁臣芀ꇨ薸룤꺁呃䅌ⴴ杉臣馨뫦늛럧醃菣ꆃ菣뾂菣誁苣뎁맥螝䍑菣벃苣銂ꇨ㒨ꮁꓧ馁胣䎂䱔㑁䤭꺁裥邞䍑臣蚈黦鎖臣袂臣蚈黦薆ꓥ開臣鶁苣麁苣㒌㔮誁苣뎁⸳┵臣芁臣龁胣蚈黦冐꺁맥螝ꛨ龯뿦ꚺ臣辁럥꾁藥낧胥讁苣슉㢱㤮ꪜ뫦ꞁ臣ꎁ臣袼ꇨ㒨覼胣㲂牢ਾꇨ㒨骼菣袃ꇨ薸룤䎭䱔㑁䤭꺁苣莃苣ꒂ臣膓돨뎂菣袃菣벃菣螃菣뾂臣芦ꛨ㲁牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㈰㤹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖䌊䱔㑁䤭꺁雨ꦉ该讅戼㹲 馁臣ꚁ臣ꮢ꣩薀臣鞃菣뮂苣ꮁ苣讂呃䅌ⴴ杉ꇨ薸뿦ꚺ臣뎹鷥誁苣뎁꣦隺臥꺷苣ꖻ룤꺁ꇨꮁꓧ馁胣㞂ꖗ雩꺁駦鎖菣궃菣ꆂ苣ꮃ臣뺯臣讂맥螝呃䅌ⴴ杉ꇨ薸뿦ꚺ苣뎛㐴臣몤臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖䌊䱔㑁䤭꺁駦鎖菣벃苣ꮁ꿥馁苣뎹鷥股룦莿뫥㲦牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰〰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 겖觧開藦醃菣ꆃ菣뾂菣袼浃硡胣䆁䍕⠠义⥆胣䎁呌胣嚁獳胣咁慭膀臣袂臣咳䠭䱁覼臣놵꣨ꚭꛦ膦苣ꢡ〵臣몤臣芀뗧鲞臣膀鳦몙飦꺁菣궃苣릂臣覂铧颁臣䎟䱔㑁䤭꾁듧ㆄꖗ볯㞈胣㊜ꖗ臣蒯鯥覼臣뎹鷥咇䠭䱁ꒀ苣覜臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣龁胣뎦꿥閁苣龁⸰㤰臣覂⸰〱⽌杫臣뎹鷥嚇獳臣膀呃䅌ⴴ杉臣뮸臣내菨隤뛦辇臣邙뇥閁苣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣龁胣㲂牢ਾꇨ㖨骼鳦몙飦꺁菣궃苣릂臣覂铧颁臣䎟䱔㑁䤭꺁雨ꦉ该讅菣ꦃ菣벃苣벃臣놵꣨ꚭꛦ膦戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〳㰱愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†뗧鲞臣膀鳦몙飦꺁菣궃苣릂臣覂铧颁臣䎟䱔㑁䤭꺁맥螝ⵔ䅈䙌臣蒴㜱���ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣龁胣꾂菣ꊂ菣뎃苣誁苣뎁裥莸蟩꺁胥节ꇨ㖨ꮁꓧ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†臥뢸裦몺ꋨ鎨胨ꮁ麛臣ㆮ洰⽧杫鷩袄蛥ꢳ藥貾胣誁苣뎁䅒苦薀臣螤闦麛臣ㆮ洰⽧杫鷩袄蛥ꢳ藥貾臣䎮䱔㑁䤭꺁雨ꦉ该讅苣ꢡ㜴臣몤臣芀戼㹲ꢡ㜴볯㆚洰⽧杫鷩袄蛥ꢳ藥貾臣ꖁ룥ꮢ꣩薀臣袂臣劳ꎂ胨ꮁ臣醁苣겖觧開藦醃菣ꆃ菣뾂볯뎹鷥膀꿧늛볯㲉牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㈰⼼㹡⼼䥄㹖⨊ꓨ낕鯥馝蓨薆돦ꖅ苣견膀㔱胣㎁ꖗ臣膀臣꺁뻥颻臣ㆍ鯥閊룤鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢껥붖뻤隼볯銈菣ꦃ苣龃菣邽뷯뎼볯袽뷯ꎼ볯겼볯钼볯螽臣꒼볯ꆼ藩鞈⼼㹵戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〳㰳愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㐰⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㔰⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㘰⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㜰⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㠰⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㤰⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰〱⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㈱⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㌱⼼㹡⼼䥄㹖㰊牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㐱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 誸꣨꺁껥붖뻤醼胣銼胣鎼胣钼胣閼胣隼胣鞼胣颼胣馼胣醼볯膀볯醼胣醼볯膀볯鎼胣醼볯膀볯隼胣醼볯膀볯颼胣銼볯膀볯颼胣銼볯膀볯邼胣鎼볯膀볯銼胣鎼볯膀볯钼胣钼볯膀볯钼胣钼볯膀볯隼胣钼볯膀볯颼胣钼볯膀볯邼胣閼볯膀볯颼胣閼볯膀볯邼胣隼볯膀볯銼胣隼볯膀볯钼胣隼볯膀볯隼胣隼볯꾁胣릉臣超裥ꪕ迥骼볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯邼臣龁臣醼볯銂鳦馁苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯뾂菣醃苣ꪳ臣ꊖ胩鞁胣誸꣨꺁껥붖뻤醼볯膀볯邼胣銼볯膀볯鎼胣銼볯膀볯閼胣銼볯膀볯鞼胣鎼볯膀볯隼胣鎼볯膀볯颼胣鎼볯膀볯邼胣钼볯膀볯銼胣閼볯膀볯钼胣閼볯膀볯隼胣閼볯꾁胣릉臣超裥ꪕ迥骼볯膀볯醼胣醼볯膀볯鎼胣醼볯膀볯閼臣龁臣醼볯銂鳦馁苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯뾂菣醃苣ꪳ臣ꊖ胩馁苣芀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀껥붖뻤ꮁ臣醁苣鎁苣覂臣뾂菣醃苣ꪳ臣ꊖ臣讂雦閳臣袂臣鶁臣뾽铧꾁胣겜駧躘臣隻臣ꎼ볯겼볯钼裢���ꦼ뷯뾂菣醃苣ꪳ臣ꊖ臣讂雦閳臣袂臣鶁臣뾽铧꺁뻤벨臣ꪁ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 鎁苣覂臣邙苣ꪁ臣貁胣겜駧躘臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥銂郥肂뻤몤髧ꪁ뗧邈觧ꮁ臣膀믤许臣袂臣ꪁ뗧邈觧貁郥뺁苣讂볯ચ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯醼볯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣超裥ꪕ迥骼볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯邼臣龁臣醼볯꺁臣骁苣讁룤ꒁ臣龁臣鶁苣ꖻ룤銂郥뾁胣떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣誁苣뎁裥覅藥ꚺꓦ몇볯龮雦设볯邼臣몤臣貂苣겸껥릖돦覼臣몱껥閁苣讂苣蚁臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀鷩趩駧蚈軧蒴볯躼볯ꪜ뫦뺁臣꾁臣貂臣覭臣蒁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽ꯩ蚈귥辇꣧袼臣龁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚃菣ꦃ菣벃볯ꞁ臣讂胣ꢁ苣辂臣膀鳦몙飦꾁胣ꖻ룤꺁觧뒾臣肸臣뺁臣꾁臣貂믤誸苣閁苣ꮁ鳦馁苣袂臣ꪁ뗧邈觧銂迦鮾臣讂볯ચ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣辇苣薶臣ꪁ臣骼鳦Ꞥ蟩꺁苣뎃菣袃苣랂菣辇볯躼볯閼볯떼볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯隼볯颼볯떼볯趽볯袼臣꺁蟩ꞁ臣ꢂ菣覃菣궂苣뎃苣趸귥ꢜ臣ꞁ臣讂볯鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯颼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁蟩銂뛨袁臣蒁볯肜ꓥ邃苣ꪂ菣벃菣뎃蟩醼볯ꚼ볯込볯邼뷯겼臣龁臣醼볯ꚼ볯込뷯겼볯鎁臣辇臣꾁菣ꒂ苣邃菣螃菣銂룤颭鳥ꮁ臣趁苣覼볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤钼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂臣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 蚽臣袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣袂臣ꮁ胣뺁臣꾁觥風뗧邈觧꺁苣蚁臣覼胣㲁牢ਾ†볯膽볯蒴볯躼볯讁苣蒴볯躼볯꺁뷯ꦼ꿧늛苣覜臣讂듧醼볯讁苣銼볯讀臣邃菣覃胣蒴볯躼볯讁苣蒴볯躼볯꺁뷯ꦼ꿧늛臣馼볯薼胣醼볯邼볯꺁듧趩菣뎃菣랼뫥⢦畣畭慬楴敶戠湡獤椠瑮湥楳祴膀臣袂臣蒴볯躼볯讁苣蒴볯躼볯꺁뷯ꦼ꿧늛臣蒴볯讀臣뮸ꛨꪁ菣뎃菣膀臣讂臣꾁戼㹲 袼뷯覼볯躼볯ꪜ뫦뺁臣꾁臣貂臣覭臣蒁뷯ꦼ苣覜臣讂룤ꪁ搨浯湩湡⥴볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽苣ꒂ苣閃苣벃菣ꞁ臣誂胣ꚸ臣ꮁ戼㹲 醰臣辁臣节볯邼볯꺁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀듧閼볯鎼鳦肺臣龁臣鶁苣ꢁ귧鞁臣邽볯銂ꓧ鞁볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†鷩趩駧蚈軧鎼볯閼鳦肺臣龁臣鶁苣ꢁ귧鞁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣鶁臣뢅賥꺨漨楸楤敺⁤灳捥敩⥳臣芁苣膀鷩趩駧蚈軧銼볯閼鳦肺臣龁臣鶁苣ꢁ귧鞁臣ꎼ볯겼���钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣鶁臣놄苣龃菣隌꣧⢮敤浡摩瑡摥猠数楣獥ꞁ臣誂볯鎁苣覂臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤钼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꒂ苣銎駩꾂菣麃菣낂菣閃苣벃臣袂臣蚈藥覅뫥鲤蟥ꞁ뇦骮臣貂苣袂臣ꮁ胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣ꊝꧧ뺙裥螎볯閼볯邼뛨뺁臣꾁臣貂臣覭臣蒁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃臣芁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯邼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣誁苣뎁裥覅藥ꚺꓦ몇臣몱껥閁苣讂苣蚁臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀鷩趩駧蚈軧閼볯邼鳦肺臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯颫裥邭蟩꺨볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣袃菣麃菣覼臣芁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯邼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣誁苣뎁裥覅藥ꚺꓦ몇臣몱껥閁苣讂苣蚁臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀鷩趩駧蚈軧邼볯閼鳦肺臣龁臣鶁苣ꢁ귧鞁臣躽裥邭蟩꺨볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣躃菣벃볯ꞁ臣誂胣芁苣蒁臣떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣誁苣뎁裥覅藥ꚺꓦ몇臣몱껥閁苣讂苣蚁臣膀鷩趩駧蚈軧邼볯閼鳦肺臣躽裥邭蟩꺨볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣躃菣벃볯ꞁ臣誂볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤醼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣辇苣薶臣ꪁ臣骼鳦Ꞥ蟩꺁볯꺼볯辇볯躼볯钃苣낂菣ꂃ볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯躼볯钃苣낂菣ꂃ볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯袼臣꺁蟩ꞁ臣꒼볯ꆼ苣趸귥ꢜ臣ꞁ臣讂볯鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯颼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁蟩銂뛨袁臣蒁볯肜ꓥ辇臣궼볯낼裢醼蟩鎼볯邼뷯螽볯趽뷯袼藥ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥覼胣閼뷯邽뷯膀臣龁臣閼뷯螽볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯袼臣꺁蟩ꞁ臣궼볯낼裢醼苣趸귥ꢜ臣ꞁ臣讂볯鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯馼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁蟩銂뛨袁臣蒁볯肜ꓥ辇臣뾮룤내菨뾂菣醃苣ꪳ볯내菨뾂菣醃苣ꪳ臣鞁臣节藥ꖟ볯辇볯閼뷯螽볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯邼뷯螽볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯袼臣꺁蟩ꞁ臣뾮룤내菨뾂菣醃苣ꪳ臣龁臣내菨뾂菣醃苣ꪳ苣趸귥ꢜ臣ꞁ臣讂볯鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯���臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁蟩銂뛨袁臣蒁볯肜ꓥ辇臣袃菣袃菣뢼裢醼볯邼蟩醼볯邼뷯螽볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯袼臣꺁蟩ꞁ臣袃菣袃菣銈볯銂룤颭鳥ꮁ臣趁苣覼볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣辇苣薶臣ꪁ臣骼鳦Ꞥ蟩꺁苣뎃菣꾂돨ꆼ蟩閼볯邼뷯螽볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯袼臣꺁蟩ꞁ臣뾂菣醃苣ꪳ볯銂룤颭鳥ꮁ臣趁苣覼볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀듧醼볯讁苣蒴볯閼臣膀볯貽뷯꺼볯莽꿥ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥袼臣龁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯肃苣麃菣覼臣뎹鷥ꊃ菣钯볯ꊃ菣込菣ꮃ뾂菣醃苣ꪳ臣鞁臣ꢡ臣貂苣覼苣覜臣ꚁ臣誂볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀듧醼볯鞼臣覂듧鎼볯隼臣膀볯膽뷯꺼볯莽꿥ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥袼臣龁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯肃苣麃菣覼臣뎹鷥ꊃ菣钯볯ꊃ菣込菣ꮃ뾂菣醃苣ꪳ臣鞁臣ꢡ臣貂苣覼苣覜臣ꚁ臣誂볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀듧颼볯邼臣覂듧醼볯꺁胣겂菣꾂菣벃苣뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯钼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣蒴볯躼볯讁苣蒴볯躼볯꺁胣閃苣벃苣뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯钼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣蒴볯躼볯讁苣蒴볯銼臣膀菣뎃菣벃苣뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯钼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣颼볯邼뛨뺁臣꾁臣貂臣覭臣蒁胣设臣낁듧颼볯邼臣覂듧醼볯躼볯���꺁胣랂苣ꮃ藩뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯隼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣颼볯邼뛨뺁臣꾁臣貂臣覭臣蒁胣设臣낁듧颼볯邼臣覂듧醼볯躼볯꺁胣꺼볯꺼볯뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯隼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣覃菣ꒂ菣ꦼ臣蒴볯钼볯閼볯讁苣蒴볯閼볯銼볯꺁鷩趩駧蚈軧銂ꓧ鞁胣뺁臣꾁菣ꆃ苣뎃볯ꦼ臣蒴볯隼볯鎼볯讁苣蒴볯钼볯醼볯꺁鷩趩駧蚈軧銂ꓧ鞁胣뺁臣꾁菣ꆃ苣뎃볯ꦼ볯貁듧銼볯躼볯薼臣覂듧鎼볯躼볯薼臣ꊝꧧ뺙裥螎苣몤臣膀臣龁臣覃菣ꒂ菣ꦼ볯誁苣뎁菣ꆃ苣뎃볯貁듧鞼볯馼볯讁苣蒴볯颼볯隼볯꺁鷩趩駧蚈軧銂ꓧ馁苣蚁臣꺼뗧袐黥낂菣뎂苣ꮃ賥銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯钼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣醼볯閼뛨뺁臣꾁臣貂臣覭臣蒁胣꺼볯꺼볯뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯隼臣몤臣貂臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣膀跥ꊛ臣貂苣讁胣뺁臣꾁껥ꪳ髧ꮁ닧붣臣貂臣袂臣ꪁ뗧邈觧銂迦鮾臣讂胣겜駧躘臣膀賥겖뗧邈觧뺁臣꾁賥겖髧ꮁ꣨릮臣貂苣蒵裦ꦉ臣袂臣ꪁ뗧邈觧銂迦鮾臣讂胣겜駧躘臣膀臣貂苣꺁觧뒾臣蒁臣貂臣蚠裥뺁臣꾁뗧袐臣节鳦馁苣蒵裦ꦉ苣邏뻤馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣膀跥ꊛ臣貂苣讁胣뺁臣꾁껥ꪳ髧ꮁ닧붣臣貂臣袂臣ꪁ뗧邈觧銂迦鮾臣讂胣겜駧躘臣膀賥겖뗧邈觧뺁臣꾁賥겖髧ꮁ꣨릮臣貂苣蒵裦ꦉ臣袂臣ꪁ뗧邈觧銂迦鮾臣讂胣겜駧躘臣膀臣貂苣꺁觧뒾臣蒁臣貂臣蚠裥뺁臣꾁뗧袐臣节鳦馁苣蒵裦ꦉ苣邏뻤馁苣骼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 袼볯覼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀藩鞈闧랏볯钼胣醼볯膀볯銼胣醼볯膀볯钼胣醼볯膀볯隼臣龁臣銼볯꺁臣骁苣讁룤ꒁ臣龁臣鶁苣ꖻ룤袼뻤袁臣ꎼ볯겼볯钼猼���砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯覼苣ꮐ臣膀苣ꒂ苣銎駩꾂菣麃菣낂菣閃苣벃臣袂臣蚈藥覅뫥鲤蟥袼껥붖뻤銼볯ꮁꓧ閁苣讂룦骮雦閳볯ꞁ뇦骮臣貂苣袂臣ꮁ胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣ꊝꧧ뺙裥螎볯躼볯ꪜ뫦뺁臣꾁臣貂臣覭臣蒁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽ꯩ蚈귥辇꣧袼臣龁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚃菣ꦃ菣벃볯ꞁ臣讂胣ꢁ苣辂臣膀鳦몙飦꾁胣ꖻ룤꺁觧뒾臣肸臣뺁臣꾁臣貂믤誸苣閁苣ꮁ鳦馁苣袂臣ꪁ뗧邈觧銂迦鮾臣讂볯ચ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꒂ苣銎駩꾂菣麃菣낂菣閃苣벃臣袂臣蚈藥覅뫥鲤蟥ꞁ뇦骮臣貂苣袂臣ꮁ胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣ꊝꧧ뺙裥螎볯閼볯邼뛨뺁臣꾁臣貂臣覭臣蒁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃臣芁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯閼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣誁苣뎁裥覅藥ꚺꓦ몇臣몱껥閁苣讂苣蚁臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀鷩趩駧蚈軧醼볯邼鳦肺臣龁臣鶁苣ꢁ귧鞁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯躽裥邭蟩꺨볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣躃菣벃볯ꞁ臣誂볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†뷤鞁볯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꺁苣蚁臣膀臣龁臣趉꣨蒵裦ꦉ臣袂臣ꮁ볯膀듧钼볯閼臣覂듧閼볯隼臣邽볯蒯鯥銂鳦馁苣蒴볯鲀볯閼胥꺁菣뎃菣膀臣袂臣蒴볯躼볯讁苣蒴볯躼볯꺁뷯ꦼ꿧늛臣馼볯薼胣醼볯閼볯꺁듧趩菣뎃菣랼뫥ꞁ臣誂볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣辇苣薶臣ꪁ臣骼鳦Ꞥ蟩꺁볯꺼볯辇듧銼볯閼뷯螽볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯閼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁蟩銂뛨袁臣蒁볯肜ꓥ辇臣뾂菣醃苣ꪳ볯辇볯躽뷯込뷯螽볯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥覼볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣辇苣薶臣ꪁ臣骼鳦Ꞥ蟩꺁볯ꎼ볯銈볯辇볯躽뷯込뷯螽볯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥覼볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣辇苣薶臣ꪁ臣骼鳦Ꞥ蟩꺁껥뮸듧麃苣뎃菣꾂돨袼듧麃苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁ苣겅鿧覼蟩閼볯躽뷯込뷯螽볯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥覼볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤閼볯ꮁꓧ閁苣���臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣辇苣薶臣ꪁ臣骼鳦Ꞥ蟩꺁苣뎃菣袃苣랂菣辇볯躼볯銼볯떼볯趽뷯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯颼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁蟩銂뛨袁臣蒁볯肜ꓥ邃苣ꪂ菣벃菣뎃蟩醼볯ꚼ볯込뷯겼볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤钼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣辇苣薶臣ꪁ臣骼鳦Ꞥ蟩꺁菣ꪃ菣뎃볯銈볯邼볯辇볯邽뷯趽볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀볯躼볯薶臣龁臣鶁苣ꢁ귧鞁臣膀뻤袁臣蒴볯躼볯讁苣蒴볯躼볯뺁臣꾁듧閼볯邼臣覂듧醼볯躼볯꺁胣랂苣ꮃ藩뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯馼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣閼볯邼뛨뺁臣꾁臣貂臣覭臣蒁胣设臣낁듧閼볯邼臣覂듧馼볯邼臣龁臣蒴볯躼볯讁苣蒴볯邼볯邼臣膀볯ꆼ볯ꆼ꿥ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥袼臣龁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯肃苣麃菣覼臣뎹鷥ꊃ菣钯볯ꊃ菣込菣ꮃ뾂菣醃苣ꪳ臣鞁臣ꢡ臣貂苣覼苣覜臣ꚁ臣誂볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀듧邼볯颼臣覂듧钼볯邼臣膀볯膽뷯꺼볯莽꿥ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥袼臣龁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯肃苣麃菣覼臣뎹鷥ꊃ菣钯볯ꊃ菣込菣ꮃ뾂菣醃苣ꪳ臣鞁臣ꢡ臣貂苣覼苣覜臣ꚁ臣誂볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀듧醼볯讁苣蒴볯閼臣膀볯貽뷯꺼볯莽꿥ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥袼臣龁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯肃苣麃菣覼臣뎹鷥ꊃ菣钯볯ꊃ菣込菣ꮃ뾂菣醃苣ꪳ臣鞁臣ꢡ臣貂苣覼苣覜臣ꚁ臣誂볯鎁臣릉뻥꺁룦骮雦閳臣膀껥붖뻤鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣誂볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣膀듧颼볯邼臣覂듧醼볯꺁胣겂菣꾂菣벃苣뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣���龮雦设볯閼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣蒴볯躼볯讁苣蒴볯躼볯꺁胣閃苣벃苣뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯閼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꾁胣蒴볯讁苣蒴볯颼臣膀菣뎃菣벃苣뺯볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯뺁臣꾁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃볯꺁맥螝菣ꮃ꿦袼菣ꮃ볯ꊃ菣₫苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂鳦鞁臣誁苣鮼臣꺁觧뒾臣겸껥릖돦꾁胣龮雦设볯閼臣몤臣貂臣誁苣鮼㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣膀跥ꊛ臣貂苣讁胣뺁臣꾁껥ꪳ髧ꮁ닧붣臣貂臣袂臣ꪁ뗧邈觧銂迦鮾臣讂胣겜駧躘臣膀臣貂苣꺁觧뒾臣蒁臣貂臣蚠裥뺁臣꾁뗧袐臣节鳦馁苣뾂菣醃苣ꪳ臣袂臣蒵裦ꦉ苣邏뻤馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 誸꣨꺁껥붖뻤醼胣銼胣鎼胣钼胣閼胣隼胣鞼胣颼胣馼胣醼볯膀볯醼胣醼볯膀볯鎼胣醼볯膀볯隼胣醼볯膀볯颼胣銼볯膀볯颼胣銼볯膀볯邼胣鎼볯膀볯銼胣鎼볯膀볯钼胣钼볯膀볯钼胣钼볯膀볯隼胣钼볯膀볯颼胣钼볯膀볯邼胣閼볯膀볯颼胣閼볯膀볯邼胣隼볯膀볯銼胣隼볯膀볯钼胣隼볯膀볯隼胣隼볯꾁胣릉臣誸꣨꺁볯醼볯꺁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽苣뎃菣꾂돨ꮁ雩ꎀ臣讂臣膀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀臣貂苣꺁껥붖뻤ꮁ臣醁苣鎁臣袂臣ꪁ苣뎃菣꾂돨ꮁ雩馁苣릖돦誁苣뎁臣꺁뷤ꢔ臣膀鳦몙飦꺁믤꺁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽苣뎃菣꾂돨ꮁ雩馁苣릖돦誁苣뎁臣꺁뷤ꢔ臣设꣨ꢁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†룤風臣龮雦设볯馼胣銼볯膀볯銼胣銼볯膀볯钼胣銼볯膀볯隼胣銼볯膀볯閼胣鎼볯膀볯鞼胣鎼볯膀볯馼胣钼볯膀볯醼胣閼볯膀볯鎼胣閼볯膀볯閼胣閼볯膀볯鞼臣膀觧ꮁ룤風臣袼볯覼臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯뾂菣醃苣ꪳ臣ꊖ胩馁苣貁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣鎁苣覂臣龮雦设臣誁臣讂臣꺁苣蚁臣뾂菣醃苣ꪳ臣ꊖ臣讂雦閳臣袂臣鶁臣뾽铧꾁胣겜駧躘臣隻臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯뾂菣醃苣ꪳ臣ꊖ臣讂雦閳臣袂臣鶁臣뾽铧꺁뻤벨臣ꪁ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣뎛鷩꺁냧颍臣겪飦醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣뎛볯ꆼ胣醼볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥ꮁ臣蒁臣꺁駧뺏苣뮂菣袃臣肸菩꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超���ꪕ迥骼볯覼苣ꢡ臣芀臣龁ꃦ뢅臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯覼苣몤臣芀臣꺁駧뺏苣뮂菣袃臣覂铧龔臣蚁苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥ꮁ臣膀껦몟臣ꊂ菣躃藩超裥骼†볯覽볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯隼胣鎼볯鎼胣₁袼뷯覽볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯隼胣鎼볯銼胣₁袼뷯覽뷯覼藩鞈闧랏볯銼臣銼볯鲀볯颼볯膀†볯覽뷯覼藩鞈闧랏볯銼臣銼볯鲀볯颼볯膀†볯隽볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯閼胣鎼볯銼胣誁苣뎁†볯隽뷯覼藩鞈闧랏볯銼臣銼볯鲀볯颼볯銂鳦馁苣蚈귥貁郥뺁苣讂胣몙迧ꮂ苣莃菣ꮁ臣膀믤许臣颠鿥骼†볯膽볯ꪂ菣뎂苣뾂菣뎃볯랂苣誃菣超裥袼藩鞈闧랏볯醼臣貃苣것苣膃菣醼볯鲀볯颼볯超裥ꪕ迥骼볯꺁苣龃菣뢅볯鲀볯隼볯鮼†볯芽볯銃菣ꎼ볯겼볯钼臣내菨隤菣ꆃ苣뎃볯超裥ꪕ迥骼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃볯馼胣钼볯鎼볯超裥ꪕ迥骼볯꺁苣龃菣뢅볯鞼胣醼볯醼볯鮼†볯莽볯銃菣ꦼ뷯Ꞽ볯骮룥ꢃ臣릔ꓥꢃ뷤袼藩鞈闧랏볯醼臣貃苣것苣膃菣钼볯钼胣醼볯閼볯鮼藩鞈闧랏볯銼臣ꊂ菣躃藩醼볯銼胣鎼볯鎼볯膀뻤袁臣膀铦覤菣뎃苣颠鿥袼藩鞈闧랏볯醼臣貃苣것苣膃菣钼볯钼胣閼볯颼볯超裥ꪕ迥骼볯꺁苣龃菣뢅볯閼볯鲀볯隼볯覼胣릔ꓥ銃菣ꦼ뷯Ꞽ볯ₑ볯㲣畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱈猯扵銼菣ꆃ苣뎃볯超裥ꪕ迥骼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃볯邼볯鲀볯鎼볯鮼藩鞈闧랏볯銼臣ꊂ菣躃藩醼볯鞼胣銼볯隼볯膀臣袂臣銃菣ꦼ뷯Ꞽ볯ₑ볯㲣畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱈猯扵鎼菣ꆃ苣뎃볯超裥ꪕ迥骼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃볯鎼볯鲀볯醼볯馼볯超裥ꪕ迥骼볯꺁苣龃菣뢅볯鞼볯鲀볯颼볯覼臣ꮐ臣貂苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣뎛볯ꆼ胣醼볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥ꮁ臣蒁臣꺁駧뺏苣뮂菣袃臣肸菩꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯覼苣ꢡ臣芀臣龁ꃦ뢅臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯覼苣몤臣芀臣꺁駧뺏苣뮂菣袃臣覂铧龔臣蚁苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥ꮁ臣膀껦몟臣ꊂ菣躃藩超裥骼†볯覽볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯隼胣鎼볯鎼胣₁袼뷯覽볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯隼胣鎼볯銼胣₁袼뷯覽뷯覼藩鞈闧랏볯銼臣銼볯鲀볯颼볯膀†볯覽뷯覼藩鞈闧랏볯銼臣銼볯鲀볯颼볯膀†볯隽볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯閼胣鎼볯銼胣誁苣뎁†볯隽뷯覼藩鞈闧랏볯銼臣銼볯鲀볯颼볯銂鳦馁苣蚈귥貁郥뺁苣讂胣몙迧ꮂ苣莃菣ꮁ臣膀믤许臣颠鿥骼†볯膽볯ꪂ菣뎂苣뾂菣뎃볯랂苣誃菣超裥袼藩鞈闧랏볯醼臣貃苣것苣膃菣醼볯鲀볯颼볯超裥ꪕ迥���볯꺁苣龃菣뢅볯鲀볯隼볯鮼†볯芽볯銃菣ꎼ볯겼볯钼臣내菨隤菣ꆃ苣뎃볯超裥ꪕ迥骼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃볯馼胣钼볯鎼볯超裥ꪕ迥骼볯꺁苣龃菣뢅볯鞼胣醼볯醼볯鮼†볯莽볯銃菣ꦼ뷯Ꞽ볯骮룥ꢃ臣릔ꓥꢃ뷤袼藩鞈闧랏볯醼臣貃苣것苣膃菣钼볯钼胣醼볯閼볯鮼藩鞈闧랏볯銼臣ꊂ菣躃藩醼볯銼胣鎼볯鎼볯膀뻤袁臣膀铦覤菣뎃苣颠鿥袼藩鞈闧랏볯醼臣貃苣것苣膃菣钼볯钼胣閼볯颼볯超裥ꪕ迥骼볯꺁苣龃菣뢅볯閼볯鲀볯隼볯覼胣릔ꓥ銃菣ꦼ뷯Ꞽ볯ₑ볯㲣畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱈猯扵銼菣ꆃ苣뎃볯超裥ꪕ迥骼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃볯邼볯鲀볯鎼볯鮼藩鞈闧랏볯銼臣ꊂ菣躃藩醼볯鞼胣銼볯隼볯膀臣袂臣銃菣ꦼ뷯Ꞽ볯ₑ볯㲣畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱈猯扵鎼菣ꆃ苣뎃볯超裥ꪕ迥骼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃볯鎼볯鲀볯醼볯馼볯超裥ꪕ迥骼볯꺁苣龃菣뢅볯鞼볯鲀볯颼볯覼臣ꮐ臣貂苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀鯥銼臣膀볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽臣뺯뿥馁苣뢠藩袼룤鞈볯誁苣뎁苣龃菣뢅볯许裥覼藩鞈苣ꢡ臣芀苣龃菣뢅藩鞈臣꾁胣뎛볯ꮁꓧ閁苣讂藩鞈臣覂臣ꊂ菣躃藩覤賥貁郥뺁苣膀臣꺁룤ꞁ胣超裥ꪕ迥骼볯꺁苣꺁臣钯볨鞁臣膀볯馼뷤袼볯讁苣림볯誁苣뎁볯邼볯趽볯겼臣覂볯覼臣覤賥鞁臣誁苣膀苣龃菣뢅껦몟臣ꪕ迥颻臣꾁胣讼볯趀臣낍苣颻臣龁菣膃苣讃菣袼볯覼臣覂꟥뺁苣芀볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽臣貃苣것苣膃菣超裥꾁胣鞼볯趽볯馁臣辂臣膀볯꺁룤꺁胣讼볯趀臣낍苣颻臣龁뷤꺽볯꺁볯讁苣讧臣誂胣貃苣것苣膃菣醼볯钼볯趽臣ꆼ臣ꞁ臣꺁鯥ꮁꓧ閁苣讂볯超裥ꪕ迥骼볯覼胣릉臣膀볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽苣뎂菣覃臣讂菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣鞼볯趽臣貃苣것苣膃菣讁苣醼볯钼볯趽臣貃苣것苣膃菣뺁臣ꞁ臣誂胣超裥ꪕ迥骼볯ꢁ釥낁苣讂胣뎛볯ꮁꓧ閁苣讂藥貃苣것苣膃菣超裥꾁藩鞈闧랏볯銼볯ꢁ釥낁苣膀苣뎃苣릂苣膃菣궼苣낂菣ꮃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀鯥鎼臣膀苣뎃苣릂苣膃菣궼菣궃藩鞈볯鲃菣ꮃ菣鎽臣ꒂ苣ꪃ菣꾂뷤銂迥ꞅ볯銂郥肂볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽裥邭臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯銂ꇨ馁胣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯蚈귥ꞁ臣誂胣ꎔ铧閁苣���苣鶃菣骃菣膃菣ꮁ臣膀껦몟臣ꊂ菣躃藩超裥骼†볯覽볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯隼胣鎼볯鎼胣₁袼뷯覽볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯隼胣鎼볯銼胣₁袼뷯覽뷯覼藩鞈闧랏볯钼臣銼볯鲀볯颼볯膀†볯覽뷯覼藩鞈闧랏볯钼臣銼볯鲀볯颼볯膀†볯隽볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯閼胣鎼볯銼胣誁苣뎁†볯隽뷯覼藩鞈闧랏볯钼臣銼볯鲀볯颼볯銂鳦馁苣蚈귥貁郥뺁苣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼胣뎛볯꾁胣꺼뗧袐黥낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤袼볯鞼볯膀볯醼볯颼胣誁苣뎁볯銼볯鞼볯膀볯醼볯邼裢ꎼ볯銼볯뢂苣ꮃ菣ꎂ菣邵郥膀臣袂臣ꎼ볯겼볯銈볯覃菣ꒂ菣ꮁ臣蒁臣ꪁ臣貂苣銼臣꺁苣龃菣뢅뷧鮏볯겼볯邼볯ꖼ臣袂臣ꆼ볯馼볯覼臣놅臣몤臣貂苣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯꺁菣螃菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼胣뎛볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯꺁郧隫髧ꪁ뷯꒼볯ꆼ铧ꖝ苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯覼苣ꢡ臣芀볯뒼볯ꆼ裢钼듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣ꮁ臣蒁臣銼臣꺁苣龃菣뢅뷧鮏苣財臣ꚁ볯겼볯邼볯ꖼ臣袂臣ꆼ볯馼볯覼胣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯銂铧邈臣龁胣늩藩鞈臣膀볯邵郥讞苣ꪃ苣랂菣隌菩趽臣놅臣膀苣뎃苣릂苣膃菣궼臣랂苣誃菣骃菣膃菣袼菣궃藩鞈볯銂觧骮臣ꚁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼胣뎛볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯떂菣鞃菣꺁胣ꒃ苣₮諦銃菣ꦼ뷯Ꞽꚼ뷯鞊뷤뢁臣邵郥銂迦辁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣ꪜ蟥蚐苣뎃苣벃菣莃菣ꢡ鷩ꢁ꿦莼臣ꚁ胣鎁臣ꢡ鷩誸臣鞾苣貂苣鲿귧銂룦骮臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽苣뎃菣ꮃ臣邵郥銂ꓦ몇臣龁胣颧胣ꪁ菣莃菣⢈潬⥴臣膀볯ꒁ臣낕臣讂볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽苣뎃菣ꮃ苣ꢡ臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀鯥鞼臣膀该蒚藥ꎕ매鲤蟥袼볯뎼볯覼苣覜臣讂볯ꮂ菣ꂃ볯ꖼ볯꺁苣벃菣벃菣ꒂ漨敶汲祡誁苣뎁볯ꖼ볯ꮁ臣蒁臣꺁뿤膌駦鎖臣袂臣ꚁ뇦骮臣貂苣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽ꢼ볯ꎼ꾂菣벃菣뎃苣钃菣꾂挨敬湡湩⁧数歡꺁菣ꮃ菣麃菣膀菣袃菣麃菣膀臣袂臣肃苣麃菣뮔裥ꮁ꿥鲿臣讂飦覂臣ꪁ裥邭蟩銂ꓧ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀鯥颼볯袼룤覼臣袂臣颼볯袼룤覼臣膀볯ꦼ볯꾂菣벃菣뎃苣钃菣���臣覂跥ꊛ臣袂臣뺲ꏨ閁苣龁苣ꪃ苣랂菣隌볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯超裥ꪕ迥骼볯ₒ菣躃菣벃苣ꮐ苣覼臣뮔裥꺁믤ꢡ髧ꪁ볯ꖼ볯늂菣銂ꓧ馁胣誸臣늂菣ꮁ臣蒁臣꺁菣벃菣ꎂ菣낂臣蚠臣骼†菣벃菣醼胣邽볯麃菣ꮂ菣袼苣麃苣ꎃ菣覼볯ₛ것菣뎃볯膀볯겼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃꣦隺觧ꪳ볯ₛ것菣뎃볯膀苣뎃菣꾂돨ꆼ뫦ꊛ뛦鮼†菣벃菣钼胣麃菣膃菣벃볯ₛ것菣뎃볯膀菣袃菣麃菣鮼†菣벃菣隼胣肃苣麃菣ꞁ臣讂胣许臣늂菣ꮁ臣蒁臣꺁菣벃菣ꎂ菣낂臣蚠臣骼†菣벃菣醼胣邽볯麃菣ꮂ菣袼苣麃苣ꎃ菣覼볯ₛ것菣뎃볯膀菣벃菣銼胣ꎼ볯뒼볯钼裢ꦼ뷯肃苣麃菣馨뫦ꦉ돨鮼†菣벃菣鎼胣蚃菣ꦃ菣벃볯ₛ것菣뎃볯膀꟨ꊛ臣龁菣袃菣麃菣ꞁ臣讂胣醃菣ꮃ臣膀菣袃菣麃菣貁菣ꒂ菣벃苣誂苣랂苣ꮃ藩颻諥袼苣ꊂ菣隌볯閁苣ꚁ臣ꪁ臣鎁臣銂ꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀鯥颼볯袼룤覼臣袂臣颼볯袼룤覼臣膀볯ꦼ볯꾂菣벃菣뎃苣钃菣꾂臣覂跥ꊛ臣袂臣뺲ꏨ閁苣龁苣ꪃ苣랂菣隌볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭볯超裥ꪕ迥骼볯ₒ菣躃菣벃苣ꮐ苣覼臣뮔裥꺁믤ꢡ髧ꪁ볯ꖼ볯늂菣銂ꓧ馁胣誸臣늂菣ꮁ臣蒁臣꺁菣벃菣ꎂ菣낂臣蚠臣骼†菣벃菣醼胣邽볯麃菣ꮂ菣袼苣麃苣ꎃ菣覼볯ₛ것菣뎃볯膀볯겼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃꣦隺觧ꪳ볯ₛ것菣뎃볯膀苣뎃菣꾂돨ꆼ뫦ꊛ뛦鮼†菣벃菣钼胣麃菣膃菣벃볯ₛ것菣뎃볯膀菣袃菣麃菣鮼†菣벃菣隼胣肃苣麃菣ꞁ臣讂胣许臣늂菣ꮁ臣蒁臣꺁菣벃菣ꎂ菣낂臣蚠臣骼†菣벃菣醼胣邽볯麃菣ꮂ菣袼苣麃苣ꎃ菣覼볯ₛ것菣뎃볯膀菣벃菣銼胣ꎼ볯뒼볯钼裢ꦼ뷯肃苣麃菣馨뫦ꦉ돨鮼†菣벃菣鎼胣蚃菣ꦃ菣벃볯ₛ것菣뎃볯膀꟨ꊛ臣龁菣袃菣麃菣ꞁ臣讂胣醃菣ꮃ臣膀菣袃菣麃菣貁菣ꒂ菣벃苣誂苣랂苣ꮃ藩颻諥袼苣ꊂ菣隌볯閁苣ꚁ臣ꪁ臣鎁臣銂ꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼胣뎛볯꾁胣超裥ꪕ迥骼볯꺁菣躃菣벃苣ꮐ苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯肃苣麃菣誸臣趪苣覂苣讂룤ꪁ돧階꟦ꂀ臣袂臣隳臣뢛꿥辇苣몤臣芀鯥궸臣ꊂ菣躃藩议鿥꺁闧랏믤醁臣膀藩鞈闧랏볯銼臣肸蟨鞁臣蒁臣蒁胣뎛룤꺁苣龃菣뢅껦몟臣ꪕ迥颻臣銂藩鞈闧랏볯銼臣肸蟨閁臣讂臣膂臣꾁胣낕臣릖苣銼볯ꂁ臣鞢諥閁臣讂뿥膦臣芁苣膀臣ꪁ苣ꆁ胣꺼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㜾㰶猯灵꾁볯㲮畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〱㰲猯灵ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀鯥醼볯ₐ薕蓦ꮁ껦閁苣龁駧馴⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯���胣뎛볯醼臣膀藩鞈闧랏볯銼ꊃ菣麃菣銂郥肂볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꒂ菣벃臣ꎻꇨ蒚臣ꦼ볯ꚼ苣ꮃ볯邽볯钼볯邼臣覂볯躼볯覼苣몤臣芀菣벃菣醼臣袂臣閼臣莼귦몟뫦⢖慣楬牢瑡潩⁮瑳湡慤摲銂ꓧ鞁胣것菣뎃볯膀볯膀볯꾁郥薀胣銼볯캐螽볯캏貽臣ꎼ볯뒼볯钼裢ꦼ뷯肃苣麃菣銂ꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀鯥醼볯꾁胣超裥ꪕ迥骼볯ₔ菣躃菣벃苣ꮐ苣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯肃苣麃菣꺁믤ꢡ髧ꪁ볯ꖼ볯늂菣袼뷯ꢼ볯躼볯讁苣隼볯閼볯銂ꓧ馁胣것菣뎃볯誁苣뎁볯꾁볨ꎭ鿥隺苣몤臣膀菣벃菣銼胣鞼臣蒐胣膀볯邼볎뷯込볎뷯꺁볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽菣ꒂ菣벃苣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼胣뎛볯鎼臣膀藩鞈闧랏볯銼臣ꊃ菣麃菣銂郥肂볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣蚛鯥꺁볯邵郥讞돧鞃菣閃苣벃菣銂ꓧ馁胣隳苣隳菣鞃菣覃臣覂鯩膂胣겼볯込볯뎼낼볯ꎼ꺼뗧袐黥ꪂ菣뒂돧꺁諦鎡苣ꢔ臣ꚁ裥ꊛ臣龁胣꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣袂臣ꚁ胣꺼뗧袐黥꺁뗧袐菩趽臣蒐胣ꮁ臣蒁臣蚛鯥꺁菣궃菣ꎂ菣ꮃ苣鞾臣芀†볯覼볯閼菣鞃菣覃臣覂臣ꆼ뷯躽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㜾㰶猯灵袼藩鞈闧랏볯銼臣ꆼ뷯躽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㈰⼼畳㹰볯꺁돧誁苣뎁볯覼볯鞼菣鞃菣覃臣覂臣ꆼ뷯躽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㠰⼼畳㹰볯超裥ꪕ迥骼볯꺁볯鎽뷯㲎畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱㰴猯灵覼臣隳臣ꆸ雦ꢁ苣膀菣躃苣ꊂ菣뢅믤ꂊ臣貂臣꺨臣麃菣膃苣ꊂ菣뢅믤ꂊ볯麃菣膃苣ꊂ菣隌볯閁苣龁꣧꺁雩꺁裥莸苣몤臣芀†볯覼볯醼볯骃菣膃菣讁苣꺁볯鎽뷯㲎畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〲㰷猯灵袼藩鞈闧랏볯銼臣ꆼ뷯躽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㌳⼼畳㹰볯꺁돧꾁胣뮸臣랂苣ꮃ藩꒙軥閁苣龁꣧⢮獡慩祬慬整⁤灳捥敩⥳臣覂臣讂胣₂꒼볯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥ꮁ臣蒁臣꺁볯邵郥讞돧階臣蚈룥銂ꓧ馁胣₂ꖼ볯뒼볯骃菣膃菣讁苣뢁諦閁苣龁铧릂菣꾂菣ꮃ臣膀迦馆臣貂臣貺裥邲臣ꊃ菣랂苣ꮃ藩颻諥讧胩ꮁ꿥鲿臣讂菣뢂菣벃菣벃苣銂ꓧ馁胣₂ꚼ볯뒼볯钼臣覂臩麊臣貂臣龔苣骃苣袃菣꾁胣貺裥邲臣ꊂ苣ꊂ菣讧胩袼苣ꊂ菣뢅믤ꂊ臣貂臣蒁臣蒁꟦ꂀ볯ꮁ꿥鲿臣讂菣뢂菣벃菣벃苣銂ꓧ馁胣₂Ꞽ볯뢁諦閁苣龁铧릂菣꾂菣ꮃ臣膀볯钼볯銼볯蚈臣꺁菣벃苣ꢁ藥ꮁ藥뚺鯩馁苣꺾蟩꺁꣧讁苣ꪁ苣膀臣貂臣覸裥邲臣뢂苣ꊂ菣뢅믤ꂊ꟦ꂀ臣뺯뿥馁苣芀†볯覼臩麊臣貂臣龔���骃苣袃菣꾁胣隼볯躼볯鎼裥ꞁ臣钃菣꾂臣誁臣讂룤膦臣꺨苣躘苣讁臣鞁胣鶁苣꾁뫤蚈닥꺁苣랂苣ꮃ藩颻諥讧胩ꮁ꿥鲿臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꆼ胣뎛볯钼볯銈볯꾁胣뢅胦뚺鯩ꆝ믤许볯邼볯邼볯薼뒼볯ꆼ볯ꞁ臣膀볯Ꞽ볯꾂菣麃菣낂菣閃苣벃臣覂臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯₇藩鞈闧랏볯銼ꊃ菣麃菣꺁볯邵郥讞苣ꪃ苣隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣떼볯誁苣뎁볯ꦼ볯袃菣벃苣銂ꓧ馁胣뎛볯钼볯꺁菣것菣릂臣膀藩Ꞁ뫦ꊛ鷦뚻룤袼볯躼볯閼볯₅볯ꚼ볯覼臣꺁胣낼볯ꎼ苣궃菣袃苣ꦃ菣ꮁ臣蒁臣꺁駩ꒂ苣뎃臣辷闦袼볯ꦼ볯覼苣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀鯥醼볯ꆼ裢ꊼ臣膀藩Ꞁ뫦ꊛ鷦뚻룤袼볯躼볯閼볯₅볯ꚼ볯覼臣꺁胣낼볯ꎼ苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣讁苣꺁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽超裥ꪕ迥骼볯ₒ菣躃菣벃臣꺼뗧袐黥ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣벃菣꺁볯뚼臣袂臣뒼볯ꎼ菣것菣릂苣몤臣芀鯥醼볯ꊼ臣袃菣벃苣꾁胣뢅胦뚺鯩许볯邼볯邼볯薼뒼볯ꆼ볯ꞁ臣膀볯Ꞽ볯꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣ꒁ臣ꚁ臣銼볯隼뷯趽臣꺁볯뚼菣것菣릂苣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀鯥醼볯ꆼ裢ꊼ臣膀ꇥ몟胦뚺鯩ꆝ믤许볯邼볯钼볯₅볯ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢볯ꢼ볯ꞁ臣膀볯Ꞽ볯꾂菣麃菣낂菣閃苣벃臣覂臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯₇藩鞈闧랏볯銼ꊃ菣麃菣꺁볯邵郥讞苣ꪃ苣隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣떼볯誁苣뎁볯ꦼ볯袃菣벃苣銂ꓧ馁胣뎛볯閼볯꺁菣것菣릂臣膀ꇥ몟胦뚺鯩ꆝ믤许볯邼볯钼볯₅볯ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢볯ꢼ볯ꞁ臣膀볯Ꞽ볯꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣ꒁ臣ꚁ臣낙苣ꪂ菣꺁럧낕볯뒼볯ꎼ볯銂ꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣뎛볯閼볯銈볯꾁胣ꦡ鿥Ꞁ뫦ꊛ鷦뚻룤袼볯躼볯薼꺼볯㲨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵꾼볯覼臣꺁胣낼볯ꎼ苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣讁苣꺁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽超裥ꪕ迥骼볯ₒ菣躃菣벃臣꺼뗧袐黥ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣벃菣꺁볯뚼臣袂臣뒼볯ꎼ菣것菣릂苣몤臣芀鯥醼볯ꊼ臣袃菣벃苣꾁胣ꦡ鿥Ꞁ뫦ꊛ룤袼볯躼볯薼꺼볯㲨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵꾼볯覼臣꺁胣낼볯ꎼ苣궃菣袃苣ꦃ菣ꮁ臣蒁臣꺁볯邼볯躽뷯ꞁ臣떼볯袃菣벃苣銂ꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀鯥醼볯꾁胣超裥ꪕ迥骼볯銂郥肂볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽裥邭臣ꒁ臣ꚁ臣꺼뗧袐黥ꪂ菣뒂돧꺁돧鞃菣閃苣벃菣꺁꿦莼苣ꢡ臣芀볯ꒁ臣ꪂ菣뒂돧覃菣ꒂ菣貁ꛨ龯臣貂苣骼菣ꆃ苣���뎃볯ꮁ臣膀苣ꊂ菣뢅믤ꂊ臣貂臣蒁臣蒁꣧貁郥뺁苣膀룤릖胣覃菣ꒂ菣ꦼ볯膀볯ꦼ볯膀臣袂臣ꦼ볯ꮁ臣膀臣貂臣貂菣躃苣ꊂ菣뢅믤ꂊ胣뢂苣ꊂ菣뢅믤ꂊ臣袂臣袃菣랂苣ꮃ藩颻諥閁苣龁꣧貁郥뺁苣讂胣ꪂ菣뒂돧銂苣궃菣袃苣ꦃ菣蒚臣颍鯩鞁胣鶁苣覂苣ꪳ蟩蚈黦ꞁ裥邞臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣覃菣ꒂ菣銂뇦骮臣龁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀鯥醼볯꾁胣超裥ꪕ迥骼볯ₒ菣躃菣벃苣ꮐ苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꺁볯邵郥讞苣ꪃ苣隳臣ꢼ볯ꆼ볯ꎼ裢낼볯꒼菣궃菣ꎂ菣ꮃ苣몤臣芀苣ꪃ苣隳臣ꒁ臣ꚁ臣랂苣ꮃ藩ꮐ蟩貁ꋥꂊ臣讂ꃩꮁ菣ꆃ苣뎃苣몤臣芀菣ꆃ苣뎃볯膀볯ꦼ胣ꦼ볯ꦼ胣誁苣뎁볯뚼臣꾁胣鶁苣麁苣膀볯膀볯膀볯膀臣袂臣鎼胥꺁苣ꊂ菣뢅苣覜臣讂苣ꪃ苣隳꟦ꂀ臣ꮐ臣貂苣芀菣벃苣ꦃ菣ꮃ臣膀볯Ꞽ볯鞃菣閃苣ꒂ菣뎃苣讁苣蚛苣龁菣벃苣꺁볯낼볯ꖼ볯銈볯ꆼ볯鞃菣閃苣ꒂ菣뎃苣ꮁ苣ꎁ臣늉苣鎽臣覂苣龁苣ꪃ苣隳꟦ꂀ苣ꢡ臣芀돧階꟦ꂀ臣讧胩貐껥꾁胣ꖻ觥꺁뇦骮臣肸蟨鞁臣蒁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀鯥醼볯ꆼ裢ꊼ臣膀藩鞈闧랏볯銼臣ꊃ菣麃菣銂郥肂볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣낼볯ꎼ菣궃菣ꎂ菣ꮃ苣몤臣芀菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣膀껥붖뻤鎼臣風볨閁苣讂苣蚁臣붣胩閁苣龁돧꺁뛦隌럦袐觧꺁鯧ꖎ돦ꖅ臣覂뻥覂苣讂胣뒛軦ꢳ藥ꮁ苣ꎁ臣膀볯鎼볯蚈臣뚺鯩馁苣낼볯醼볯钼꟦ꂀ臣鲤蟥貁苣龁苣閁苣讂胣蚃菣ꦃ苣ꊂ菣뢅믤ꂊ臣貂臣낼볯醼볯钼꟦ꂀ臣膀돦ꖅ觥ꮁ跥ꊛ臣貂苣ꪂ菣뒂돧꺁菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣誁臣ꚁ臣뎦꿥閁苣ꪁ臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀鯥醼볯ꆼ裢ꊼ臣膀藩鞈闧랏볯銼臣ꊃ菣麃菣銂郥肂볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭臣낼볯ꎼ菣궃菣ꎂ菣ꮃ苣몤臣芀菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣膀껥붖뻤鎼臣風볨閁苣讂苣蚁臣붣胩閁苣龁돧꺁뛦隌럦袐觧꺁鯧ꖎ돦ꖅ臣覂뻥覂苣讂胣뒛軦ꢳ藥ꮁ苣ꎁ臣膀볯鎼볯蚈臣뚺鯩馁苣낼볯醼볯钼꟦ꂀ臣鲤蟥貁苣龁苣閁苣讂胣蚃菣ꦃ苣ꊂ菣뢅믤ꂊ臣貂臣낼볯醼볯钼꟦ꂀ臣膀돦ꖅ觥ꮁ跥ꊛ臣貂苣ꪂ菣뒂돧꺁菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣誁臣ꚁ臣뎦꿥閁苣ꪁ臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼胣뎛볯馼臣膀藩鞈闧랏볯銼ꊃ菣麃菣꺁볯馼菣ꦃ苣ꆃ菣袃臣ꒁ臣ꚁ臣겼볯込볯뎼菣뎂菣鲃菣ꖃ菣袃臣貂臣鶃苣蚃苣隃苣것苣袃菣릂菣것菣릂菣꾂菣ꮃ䰨⽃卍搠捥湯潶畬整⁤潰楳楴敶攠敬瑣潲灳慲⁹灳捥牴浵銂ꇨ馁胣릂菣꾂菣ꮃ臣膀볯ꒁ臣뮸ꛨꪁ볯邵郥讞꟦ꂀ苣겪飦馁苣芀苣骃���袃菣꾁胣꾼뗧袐黥讧胩袼볯膽뷯꺼볯莽볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵袼볯膽뷯覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ⼼畳㹢볯꺼뷯閽볯莽볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵ꢁ룤뒇臣讂돧階菣肃菣⢼畳慧⁲慬摤牥銂鳦馁苣ꦡ鿥骃菣膃菣⢉慢敳瀠灥楴敤銂ꫨ躘臣讂胣릂菣꾂菣ꮃ臣鲃菣ꮃ菣鎽臣ꢃ裥꾁胣릂菣꾂菣ꮃ臣鲃菣ꮃ菣鎽臣ꪁ臣ꢃ裥ꮁ꿥鞁臣醼볯趀臣鞢볥閁苣ꚁ臣誂胣袼볯膽뷯꺼볯莽볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵袼볯膽뷯覼볯袼볯薽뷯ꆼ뷯覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢臣袂臣袼볯膽뷯꺼볯莽볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵袼볯貽뷯꺼볯莽볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯扵袼볯膽뷯覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢볯꺼뷯閽볯莽볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵銂鳦馁苣銼臣꺁裥꺁볯邵郥讞꟦ꂀ苣겪飦馁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼胣뎛볯邼臣膀藩鞈闧랏볯銼ꊃ菣麃菣超裥銂鳦馁苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯颍軩꺁볯邵郥讞돧階꟦ꂀ臣邵郥릂臣袂臣뢛꿥蒚裥邭臣蚛鯥⢣敲慬楴敶瀠灯汵瑡潩⥮苣몤臣芀郥ꢃ뷤ꞁ臣뢛꿥辇臣膀볯ꒁ臣龁臣鶁苣ꖻ룤꺁苣벃苣뒂菣ꮃ돦⢕牯桴杯湯污琠捥湨煩敵ꞁ铧邈臣貂臣螃菣뾂苣몤臣膀臣貂臣覤闧閁苣蒂臣蒁胣뺁臣놅鳦邵郥Ꞁ臣랂苣蚃苣뎃믤ꂊ臣趽뷧节迦讁苣ꚁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀鯥銼볯꾁胣궸雩鎽菣ꦃ苣龃菣邽뷯겼볯銈뷯閽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣난鯥銂迦辁胣鎁臣鞃菣릂菣覃臣꾁胣ꆸ臥ꮁ裥邙藩ꂴ菩趽볯覽뷯蒽볯ꦼ볯誁苣뎁볯芽뷯ꦼ臣芁苣銃菣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥袼뷯閽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽볯袼臣ꪁ苣ꆁ胣超裥ꪕ迥骼볯覼苣뎂菣覃臣蚁苣超裥貁郥뺁苣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀鯥銼볯꾁胣鞃菣릂菣覃뷯꒼볯隼볯ꖼ볯銼볯림臣난鯥銂迦辁胣鎁臣鞃菣릂菣覃臣꾁胣銃菣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯蚈귥袼臣ꪁ苣ꆁ胣超裥ꪕ迥骼볯覼苣뎂菣覃臣蚁苣超裥貁郥뺁苣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀鯥銼볯꾁胣醼볯閼裢醼볯邼볯醼볯设臣낁胣꾂菣벃菣醼볯覼铧ꖝ臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯몙迧ꮂ苣莃菣銂駧뺏臣讂볯ꢼ볯내菨讁苣붊蟥鞁臣꒼볯ꆼ臣떂苣뎃菣궃菣袃臣馆鳧ꞁ臣讂胣ꚷ臣覂迥뢁臣늂菣ꮁ臣蒁臣꺁菣벃菣꾁볯ₚ것菣뎃볯膀볯꺼볯蚈귥辇菣벃苣벃볯ₛ것菣뎃볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁鷩ꊽ돨躰藥ꎼ볯꾼꒼볯ꆼ볯閼뷯螽���鮼†菣벃菣醼胣ꖼ뷯辽볯ꦼ볯뢼뷯膽볯袶賥鞁臣麝뷥ꪳ냥ꖅ볯ꢼ볯₯볯꺼볯袼볯躼볯캕螽볯讼뷯莽볯꒼뷯閽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽볯醼뷯螽볯鮼†菣벃菣銼胣ꖼ뷯辽볯ꦼ볯뢼뷯膽볯袶賥鞁臣麝뷥ꪳ냥ꖅ볯ꢼ볯₯볯꺼볯袼볯躼볯캕螽볯讼뷯莽볯꒼뷯閽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽볯邼볯閼뷯螽볯鮼†菣벃菣鎼胣ꖼ뷯辽볯ꦼ볯뢼뷯膽볯袶賥鞁臣麝뷥ꪳ냥ꖅ볯ꢼ볯₯볯꺼볯袼볯躼볯캕螽볯讼뷯莽볯꒼뷯閽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽볯邼볯銼볯躽뷯覼볯ₛ것菣뎃볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁鷩ꊽ돨躰藥ꎼ볯꾼꒼볯ꆼ볯銼볯閼볎뷯覼볯邽뷯뎼볯袽뷯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯袼볯躼볯銼볯躽뷯覼볯ₛ것菣뎃볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁鷩ꊽ돨躰藥ꎼ볯꾼꒼볯ꆼ볯銼볯閼볎뷯覼볯邽뷯뎼볯袽뷯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯袼볯躼볯隼볯閼뷯螽볯鮼†菣벃菣隼胣ꖼ뷯辽볯ꦼ볯뢼뷯膽볯袶賥鞁臣麝뷥ꪳ냥ꖅ볯ꢼ볯₯볯꺼볯袼볯躼볯캕螽볯讼뷯莽볯꒼뷯閽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽볯邼볯邼볯醼볯閼뷯螽볯鮼†菣벃菣鞼胣ꖼ뷯辽볯ꦼ볯뢼뷯膽볯袶賥鞁臣꒼볯ꆼ볯궼볯ꊼ볯閼볯邼볎뷯覼볯ₛ것菣뎃볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁볯꺼볯骼볯낼볯ꊼ菣莃菣ꪕ迥ꎼ볯邼볯鎼볯隼볯颼볯銈볯醼볯閼볯邼볎뷯覼볯ₛ것菣뎃볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁볯꺼볯骼볯낼볯ꊼ菣莃菣ꪕ迥ꎼ볯邼볯鎼볯鞼볯銼볯銈볯醼볯閼볯邼볎뷯覼볯ₛ것菣뎃볯邼胣ꖼ뷯辽볯ꦼ볯뢼뷯膽볯袶賥鞁臣꒼볯ꆼ볯ꖼ볯ꎼ볯궃菣袃闧랏볯銼볯邼볯邼볯邼볯ꆼ裢邼볯袼볯躼볯캐螽볯鮼†菣벃菣醼볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁볯꺼볯骼볯ꎼ볯袼볯躼볯캕螽볯鮼†菣벃菣醼볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁볯꺼볯骼볯낼볯ꊼ菣莃菣ꪕ迥ꎼ볯邼볯鎼볯隼볯颼볯銈볯醼볯銼볯閼볎뷯覼볯ₛ것菣뎃볯鎼胣ꖼ뷯辽볯ꦼ볯뢼뷯膽볯袶賥鞁臣꒼볯ꆼ볯ꖼ볯ꎼ볯궃菣袃闧랏볯銼볯邼볯邼볯醼볯ꆼ裢邼볯袼볯躼볯캕螽볯鮼†菣벃菣醼볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁볯꺼볯骼볯낼볯ꊼ菣莃菣ꪕ迥ꎼ볯邼볯鎼볯颼볯醼볯銈볯醼볯銼볯閼볎뷯覼볯ₛ것菣뎃볯閼胣ꖼ뷯辽볯ꦼ볯뢼뷯膽볯袶賥鞁臣꒼볯ꆼ볯궼볯ꊼ볯醼볯銼볯캕螽볯鮼†菣벃菣醼볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁볯꺼볯骼볯낼볯ꊼ菣莃菣ꪕ迥ꎼ볯邼볯鎼볯隼볯颼볯銈볯醼볯醼볯銼볯캕螽볯鮼†菣벃菣醼볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁볯꺼볯骼볯낼볯ꊼ菣莃菣ꪕ迥ꎼ볯邼볯鎼볯鞼볯銼볯銈볯醼볯醼볯銼���캕螽볯鮼†菣벃菣醼볯膀볯莽뷯늼볯込볯芽뷯ꦼ뛦隌臣龁볯꺼볯骼볯낼볯ꊼ菣莃菣ꪕ迥ꎼ볯邼볯鎼볯颼볯醼볯銈볯醼볯醼볯銼볯캕螽볯ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀鯥銼볯꾁胣龔铧릂苣벃菣꺁鿥誤럥讨臣膵苣뎛苣辏臣芀臣꺁럥讨臣膀볯閼볯邼볯邼볯龔铧邃苣ꪂ菣ꊂ苣뾂菣궸臣꺁뗧鮏臣뾂菣醃苣ꪳ臣Ꞥ蟩龔铧銂迥붃臣馁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼胣뎛볯閼臣膀볯Ꞽ볯ꆼ臣袂臣꺼볯꺼볯랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ猨獹整⁭畳瑩扡汩瑩⥹꣦隺觧ꪳ猨慴摮牡⥤臣ꎻꇨ蒚臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ苣몤臣芀胣馼볯鞼裥ꞁ臣钃菣꾂臣꺼볯꺼볯ꞁ臣誂胣鲀볯邼볯鞼裥ꞁ臣钃菣꾂臣꺼볯꺼볯ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀鯥銼볯꾁胣超裥ꪕ迥骼볯ₒ菣躃菣벃苣ꮐ苣ꂊ냦蚈꟨ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥꺁믤ꢡ髧ꪁ苣궃菣袃苣ꦃ菣銂ꓧ馁胣鲀볯躼볯蚈臣꺁菣벃苣꾁胣뚺ꫥ钃菣꾂臣芁苣芀胣馼볯隼裥ꞁ臣钃菣꾂臣꺼볯꺼볯ꞁ臣讂胣鲀볯邼볯閼裥ꞁ臣钃菣꾂臣꺼볯꺼볯ꞁ臣讂胣鲀볯醼볯鎼裥ꞁ臣钃菣꾂臣膀諥뒰裥ꎧ鷦뚻臣覂铧颁苣蚈꟨꺼볯꺼볯ꞁ臣讂胣꺼볯꺼볯誁苣뎁裥ꎧ볯ꆼ볯ꆼ臣ꊝꧧꮂ苣뎃菣⢈牡慥挠畯瑮꾁胣꺼볯꺼볯ꊃ菣钯臣袨껧ꮁ뗧뾁郥辂臣貂苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀鯥銼볯ꆼ胣銼볯ꊼ胣誁苣뎁볯鞼볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯랂苣蚃苣뎃믤ꂊ菣鞃菣覃臣궼볯겼볯ꦼ苣骃苣袃菣銂ꓧ馁胣超裥ꪕ迥骼볯꺁볯馽뷯㲓畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㐱㰶猯灵銂郥肂볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽菣ꪃ菣랂菣込苣ꊃ菣ꪃ菣랂菣궖觧ꮁ臣蒁臣膀볯ꆼ볯꒼볯릂菣꾂菣ꮃ苣鞾臣芀鯥銼볯ꆼ臣膀苣릂菣ꒂ菣颻諥꺿ꏩ銂ꫨ躘臣讂跥階菣鞃菣覃苣骃苣袃菣銂ꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꊼ胣뎛볯鞼볯膀볯鞼볯膀臣袂臣銼볯ꎼ臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽苣릂菣ꒂ菣颻諥骃菣膃菣꺁볯ꆼ볯꒼볯릂菣꾂菣ꮃ苣몤臣芀藩鞈闧랏볯銼臣ꎼ뷯鎽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㘴⼼畳㹰苣ꮐ苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯袃菣鞃苣뎃볯궂菣袃菣鞃苣뎃雦螉臣ꒁ臣ꚁ胣궼볯겼볯ꦼ苣骃苣袃菣銂뻥龁胣뎛볯鞼볯꾁胣蒂藥貾臣颍軩骃菣膃菣꺁苣骃苣袃菣銂ꓧ鞁胣꺿ꏩ貁볯馽뷯㲓畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㐱㰶猯灵ꞁ뗨鎁苣鎁臣銂ꫨ躘臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꎼ胣뎛볯鞼볯膀볯鞼볯膀臣袂臣銼볯ꎼ臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽苣릂菣ꒂ菣颻諥骃菣膃菣꺁볯ꆼ볯꒼볯릂菣꾂菣ꮃ苣몤臣芀藩鞈闧랏볯銼臣ꎼ뷯鎽猼灵砠汭���樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㘴⼼畳㹰苣ꮐ苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯袃菣鞃苣뎃볯궂菣袃菣鞃苣뎃雦螉臣ꒁ臣ꚁ胣궼볯겼볯ꦼ苣骃苣袃菣銂뻥龁胣뎛볯鞼볯꾁胣蒂藥鞁臣颍軩骃菣膃菣꺁苣ꮃ苣ꮃ賥銂ꓧ鞁胣鶁苣꾁胣랂苣蚃苣뎃믤ꂊ臣ꎼ뷯鎽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㘴⼼畳㹰臣략臣讂臣ꢁ苣겪飦馁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼胣뎛볯颼臣膀뷯莽볯꒼菣꾂苣벃臣龔裦ꮁ鳦ꢔ臣꾂菣벃菣뎃苣릂苣벃菣銂ꇨ馁胣邽뷯꒼볯ꆼ볯銂裥邙藩ꂴ볯膽뷯ꦼ臣袶賥鞁臣膀볯궼볯鞃菣ꊃ菣뾂菣膀苣뎃菣랂菣뎃胨Ꞁ臩鶼귥膀臣袂臣Ꞥ藨貏臣ꒁ臣ꚁ臣螤ꏨ략苧銂郥肂볯躼볯銼볯ꮼ뷯궖觧銂跥ꊛ臣龁胣邽볯뚼볯銈뷯袽뷯銽苣뚈駩떅듧낼뷯閽볯ꦼ臣袂臣ꊼ뷯趽볯ꦼ臣袶賥鞁臣膀볯뚼볯邼菣궃菣벃苣벃臣袂臣蒽뷯蚽뷯몁볤邭苣ꮐ苣醼볯馼볯ꮼ뷯궖觧銂跥ꊛ臣膀뛧蒁臣뎹믦ꮜꯧꮁ臣龁胣邽뷯뎼볯銂铧邈臣讂臣膂臣膀룤궖觧銂胩邵臣龁胣鞃菣릂菣覃뷯莽볯꒼臣난鯥銂胣뎛臣许菩ꮁꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀鯥銼볯꾁胣邽뷯뎼볯袽뷯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯몙迧馃苣뾂菣銂铧邈臣讂臣ꮁ鳦ꢔ臣꾂菣벃菣뎃苣릂苣벃菣銂ꇨ馁胣邽뷯뎼볯銂裥邙藩ꂴ볯莽뷯늼볯誁苣뎁볯芽뷯ꦼ臣袶賥鞁臣芀뷯覽볯꺼裢袽뷯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯銂裥邙藩ꂴ볯覽뷯蒽볯ꦼ볯ꞁ뛦隌臣膀맥醻鳦꾫臣鞁胣ꆬ臣ꞁ裥邙藩ꂴ볯芽뷯ꦼ臣袶賥鞁臣膀볯躼볯ꮼ뷯₂뷯閽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽雦螉苣颍鯩鞁臣芀뷯莽볯꒼뷯閽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽苣龔裦馁苣龁苣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽雦螉苣袶賥鞁臣邽뷯뎼볯馃苣뾂菣ꮁ胩邵臣龁胣邽뷯뎼볯袽뷯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯鞃菣릂菣覃臣난鯥銂胣뎛臣许菩ꮁꓧ馁胣鎁臣鞃菣릂菣覃苣뒛럧隌臣膀ꧦ붃胦蒽뷯蚽뷯몁볤邭苣覜臣ꚁ臣ꪁ臣ꎼ볯꾼듧麃臣ꊽ돨뮧藥鞁臣芀ꧨ鞃菣릂菣覃臣龩菨Ꞁ뷯袽뷯銽臩鶼귥銂郥鎂臣蒁苣꺁臣膀듧麃铧颭臣몟臣蒁臣覮껥ꪁ뷥ꪳ꟧ꖅ뷤貁臩麊臣貂臣讂胣邽뷯뎼볯袽뷯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯꾁胣ꎼ볯뚼菣궃菣벃苣벃胣銃菣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥袼뷯閽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽볯袼臣ꪁ苣ꆁ胣超裥ꪕ迥骼볯覼苣뎂菣覃臣蚁苣超裥膀臣袂臣ꊼ볯ꢼ臣覂臣鶃菣袼볯覼냥ꢃ藩鞈苣ꮐ苣몙迧ꮂ苣莃菣銂鳦馁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼胣뎛볯邼臣膀鯧뺯鯨覅볥ꚺ爨汥瑡癩⁥汦潵敲捳湥散甠楮⥴볯늼볯떼볯₉꿥₾駦鎖볯蚈볯ꢁ臣ꚁ迦讁苣讂苣릂菣ꂃ臩袐胦ꊂ菣躃跥隳臣뮛냦뎳该���뎛苣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼胣뎛볯醼臣膀鯧뺯鯨覅볥ꚺ볯늼볯떼볯₉꿥₾駦鎖볯蚈볯ꢁ臣ꚁ迦讁苣讂苣릂菣ꂃ臩袐胦궸胦颍돧꺁鯩鞰돦開鯥銂ꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀鯥鎼볯꾁胣骃菣膃菣銂꣦颭臣龁볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽臣袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃鳥뎛苣ꢡ臣芀ꇨ銼볯꾁胣馨귨骃菣膃菣ꢁ룤뒇臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀鯥鎼볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯꺁菣벃苣뎃菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣ꎧ黦銂ꓧ馁胣醃菣ꮃ볯꾁胣궇賥ꢂ菣뢂苣ꂃ鿦늉苣겂菣벃苣늂菣銂迦趁胣鶁臣궸臣膀†菣벃菣궼臣늼볯ꆼ菣벃苣벃臣芁苣鮼†菣벃菣醼臣ꢅ볯ꢼ볯₯볯꺼볯ꞁ臣誂볯ₛ것菣뎃볯꾁藥궼볯ꊼ늼볯ꆼ臣芁苣鮼臣袂臣₳것菣뎃볯꾁藥ꖼ볯ꎼ볯₢볯꺼볯ꞁ臣讂胣醃菣ꮃ볯꾁꿥鲿臣讂苣벃菣ꦃ苣ꪂ苣ꦃ菣ꞁ臣誂胣鶁臣궸臣膀†菣벃菣궼臣늼볯ꆼ菣벃苣벃臣芁苣鮼†菣벃菣醼臣ꢅ볯ꢼ볯₯볯꺼볯ꞁ臣誂볯ₛ것菣뎃볯꾁藥궼볯ꊼ늼볯ꆼ臣芁苣鮼臣袂臣₳것菣뎃볯꾁藥ꖼ볯ꎼ볯₢볯꺼볯ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꆼ胣뎛볯钼볯鲀볯꾁胣떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣銂迦趁胣鶁苣꾁볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽菣ꒂ菣벃臣颫臣袂臣躽裥邭蟩꺨臣銂귨ꖈ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꊼ胣뎛볯钼볯鲀볯꾁胣떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣銂迦趁胣鶁苣꾁볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽菣ꒂ菣벃臣颫臣袂臣躽裥邭蟩꺨臣銂귨ꖈ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꎼ胣뎛볯钼볯鲀볯꾁胣떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣銂迦趁胣鶁苣꾁볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽菣ꒂ菣벃臣颫臣袂臣躽裥邭蟩꺨臣銂귨ꖈ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀鯥鎼볯꾁胣꾂菣랂菣隃菣벃臣鎟觨鞁臣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯꺁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ볯蒂藥讞臣袂臣麝苩莅黥覼꟨邞苣몤臣芀†菣벃菣醼臣꾁裥邭蟩麃菣ꮂ菣銂菣벃菣鞁볯ₛ것菣뎃볯膀볯膀臣袂臣醼볯꾁菣ꦃ菣꾂臣芁苣鮼†菣벃菣鎼胣隼臣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯떂菣鞃菣袼苩莅黥覼臣芁苣鮼†菣벃菣颼胣醼볯꾁볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽苣���菣ꮃ볯麝苩莅黥覼臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼胣뎛볯隼臣膀諩鎟觨ꮁ믤鞁臣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯꺁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ볯蒂藥讞臣袂臣麝苩莅黥覼꟨邞苣몤臣芀†菣벃菣醼臣꾁裥邭蟩麃菣ꮂ菣銂菣벃菣鞁볯ₛ것菣뎃볯膀볯膀臣袂臣醼볯꾁菣ꦃ菣꾂臣芁苣鮼†菣벃菣鎼胣隼臣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯떂菣鞃菣袼苩莅黥覼臣芁苣鮼†菣벃菣颼胣醼볯꾁볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽苣뎃菣ꮃ볯麝苩莅黥覼臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼胣뎛볯鞼臣膀菣ꪃ菣랂菣誁苣뎁苣ꊃ菣ꪃ菣랂菣袶賥꺁뗧袐臣銂铧蒁臣膀鷩蒂藥讞볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽臣骃菣膃菣난鯥銂迦辁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀鯥鎼볯꾁胣袃菣鞃苣뎃臣袂臣ꢂ菣릂苣벃苣袶賥꺁뗧袐臣銂铧蒁臣膀鷩蒂藥讞볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽臣骃菣膃菣난鯥銂迦辁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀鯥鎼볯꾁胣鞊볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣龁臣鞊볯뒼볯ꆼ裢钼뿥钭苣覜臣讂苦薀苣辏臣뎛臣芁苣芀藥ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥袼볯뒼볯ꆼ裢钼菩蚈臣袂臣ꦼ뷯ꢃ裥覼臣袂臣ꎼ볯겼볯銈볯ꢃ裥꺁臣ꮁ뿥钭臣讂諦鎽苣膀껥붖뻤鎼볯ꮁꛦ겪臣貂苣袂臣ꮁ苣莃苣ꒂ볯誁苣뎁볯銂铧蒁臣몱껥鞁臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼胣뎛볯邼臣膀藥ꮖ軥Ꞁ諧讅臣袂苣꾂菣ꊂ菣뎃苣⢹汣慥慲据⥥臣袂臣鎽뻥낒苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃껥趩瘨汯浵⁥景挠湥牴污挠浯慰瑲敭瑮꺁裥莸苣ꆨ볥蒚臣겪飦鞁臣蒁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼胣뎛볯醼臣膀鳦몙飦꺁럥讨臣袂臣ꚁ铧邈臣龁軥鎽볯겖觥ꦉ돨覼搨畲⁧畳獢慴据⥥臣醼볯趽뷯込뷯螽苣閊룤閁苣龁苣ꮃ臣誁臣讂胣貵駦蒚臣뎹鷥袼볯꒼볯ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯股룦궸뿦ꚺ臣鞃菣閃苣벃菣銂ꫨ躘臣讂苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀鯥钼볯꾁胣뎂菣袃菣벃菣誁苣뎁蓨鶇鯩ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯ꦉ돨讁苣뺲ꏨ鞁臣뾂菣醃苣ꪳ볯袼볯ꆼ뷯뎼뷯貽뷯莽뷯覼臣떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣袼볯ꖼ볯覼苣궃菣袃苣ꦃ菣꺁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀鯥钼볯꾁胣놄蟥蚛蟥蚐臣龁觧ꪳ볯覽뷯覼苣뎂菣袃菣벃菣袼뷯覼臣钯볨鞁臣膀볯銈苣���ꪃ苣뎃裥邞臣낂菣閃臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼胣뎛볯钼臣膀맥螝볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽ꇨ薸룤莿뫥뮼볎뷯込뷯겼볯₽꿥₾駦鎖볯鞼볯ꖗ臣辂臣讂볯銂迦辁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀鯥钼볯꾁胣뢛꿥趛藥랼뫥袼볯ꚼ볯覼뺯芙雩袼裥覼臣鞁臣辏臣龁룤Ꞁ跥隳臣뮛냦뎳该뎛苣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼胣뎛볯隼臣膀鯧뺯鯨覅볥ꚺ볯늼볯떼볯₉꿥₾駦鎖볯蚈볯ꢁ臣ꚁ迦蒁臣ꊂ菣躃跥隳臣뮛냦뎳该뎛苣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼胣뎛볯鞼臣膀藩鞈闧랏볯钼苣ꮐ苣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯蚈귥ꮁ臣蒁臣꺁볯邵郥讞苣ꪃ苣隳臣隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣钯볨銂ꇨ馁胣钼臣꺁苣ꪃ苣隳菣ꆃ苣뎃臣뎦꿥閁苣膀臣꺁룤ꞁ胣覃菣ꒂ菣ꦼ臣꾁苣ꊂ菣뢅믤ꂊ臣貂臣蒁臣蒁꣧貁郥뺁苣膀룤릖胣覃菣ꒂ菣ꦼ볯膀볯ꦼ볯膀臣袂臣ꦼ볯ꮁ臣膀臣貂臣貂菣躃苣ꊂ菣뢅믤ꂊ胣뢂苣ꊂ菣뢅믤ꂊ胣誁苣뎁菣ꪃ苣ꊂ菣뢅믤ꂊ臣貂臣꺨臣ꮐ臣貂苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼胣뎛볯颼臣膀볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽臣醼볯醼臣랷郥鞁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯꺁苣ꎃ菣ꦃ菣벃鯩鞰돦開裥ꊛ臣낂菣閃臣芁苣芀菣ꒂ菣钃菣꾂臣뮧该芙雩꾁胣蒴볯躼볯蚈鯩貂臣蒁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼胣뎛볯馼臣膀諥뒰裥ꎧ볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽觧ꪳ臣꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣芁苣膀臣꺁룤ꞁ胣꺼볯꺼볯꺁菣벃苣꾁볯躼볯蚈臣뎦꿥閁苣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀鯥閼볯꾁胣몓매麡苣뎃菣꾂돨ꮁꛨ覂苣讂꟦薀臣꺼뗧袐黥隳軩讧胩꺁臣ꆁ臣蒁臣ꒁ臣銂迦辁胣馁臣ꚁ臣階臣膀볯ꒁ臣Ꞽ뷯莽볯ꆼ뷯誁苣뎁볯ꒁ臣麃菣躃菣릂껦몟苣ꮐ苣놅胩꺁苣ꊂ꟦ꂀ苣놅鳦馁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼胣뎛볯醼臣膀돧뾂菣醃苣ꪳ臣랂苣ꮃ藩颻諥袼볯ꆼ볯ꆼ꿦覼臣ꊖ闦ꢁ臣ꚁ胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯늜蟥⢺硥潰畳敲袼볯떼볯覼苣辏臣낂菣閃臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼胣뎛볯銼臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣ꊖ闦ꢁ臣ꚁ胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯늜蟥袼볯떼볯覼苣辏臣낂菣閃臣芁苣芀ꓥ낕臣钃菣꾂臣낙苣ꪂ菣꒺迦ꢼ볯겼볯ꮁ苣ꎁ臣龔裦閁苣膀臣貂臣钼臣뺁臣꾁볯ꒁ臣覃菣ꒂ菣ꮁ裥늉臣���貂臣芀菣ꆃ苣뎃볯誁苣뎁볯꾁胣Ꞥ菩蚈臣랂苣ꮃ藩颻諥閁苣ꚁ臣ꪁ臣袼苣ꊂ菣隌臣貂臣蒁臣蒁볯⢉獡慩祬慬整⥤꟦ꂀ胣誁苣뎁菣躃苣ꊂ菣뢅믤ꂊ꟦ꂀ臣芁苣膀룤릖胣覃菣ꒂ菣鎼臣袂臣钼臣膀ꓥꢃ裥꾁苣誁苣뎁菣ꪃ苣ꊂ菣뢅믤ꂊ꟦ꂀ臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼胣뎛볯鎼臣膀菣鞃菣覃苣馨귨鞁臣ꎼ볯겼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯꺁菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣난鯥銂ꇨ馁胣ꢡ볯隼臣膀꣦颭菣鞃菣覃臣肸蟨馁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼胣뎛볯钼臣膀藩鞈闧랏볯銼苣ꮐ苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥ꮁ臣蒁臣꺁볯邵郥讞苣ꪃ苣隳臣隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣钯볨銂ꇨ馁胣钼臣꺁苣ꪃ苣隳菣ꆃ苣뎃臣뎦꿥閁苣膀臣꺁룤ꞁ胣覃菣ꒂ菣ꦼ臣꾁胣랂苣ꮃ藩颻諥閁苣ꚁ臣ꪁ臣꺨臣ꮐ臣貂胣肸雦膀菣ꆃ苣뎃볯ꦼ胣ꦼ볯ꦼ胣誁苣뎁볯뚼臣꾁胣鶁苣麁苣ꊃ菣랂苣ꮃ藩颻諥膀苣랂苣ꮃ藩颻諥誁苣뎁菣ꪃ苣ꊂ菣뢅믤ꂊ臣貂臣꺨臣ꮐ臣貂苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀鯥閼볯ꆼ胣꒼臣膀볯낼볯ꖼ볯銈볯ꆼ볯ꮁ苣讂胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯誁苣뎁菣鞃菣覃볯閼胣뒼볯膀臣袂臣뒼볯钼臣ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣벃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꊼ胣뎛볯閼볯鲀볯꾁胣ꢼ볯ꆼ볯ꎼ裢낼볯꒼臣袂苣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣袂臣骃菣膃菣뒼볯膀볯鞼胣誁苣뎁볯醼볯꺁苣ꪃ苣隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ苣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀鯥閼볯ꆼ胣꒼臣膀볯낼볯ꖼ볯銈볯ꆼ볯ꮁ苣讂胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯誁苣뎁菣鞃菣覃볯閼胣뒼볯膀臣袂臣뒼볯钼臣ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣벃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯꒼胣뎛볯閼볯鲀볯꾁胣ꢼ볯ꆼ볯ꎼ裢낼볯꒼臣袂苣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣袂臣骃菣膃菣뒼볯膀볯鞼胣誁苣뎁볯醼볯꺁苣ꪃ苣隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ苣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼胣뎛볯隼臣膀볯Ꞽ볯袼菣ꒂ菣벃苣벃菣⢖祈数捲牡⥢볯ꮂ菣ꂃ臣覂뻥覂苣讂볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣馨귨ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣벃菣銂迦辁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀鯥閼볯꾁胣떂菣ꆼ볯ꎼ苣림믨ꮁꓧ鞁胣隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣覂臣覃菣ꒂ菣ꦼ臣袂臣ꦼ볯ꮁꓧ閁苣讂볯邵郥讞苣ꪃ苣랂菣隌臣늉郥銂볯뢻臣몤臣膀雨ꦉ该讅髧螃菣뾂臣낂菣閃苣辏臣芀뻤袁臣膀껥붖뻤鎼胣钼볯膀볯銼臣袂臣鎼볯ꮁ臣醁苣꺼뗧袐黥隳菣궃菣���菣ꮃ苣몱껥馁苣릖돦銂迥ꞅ臣袂胣覃菣ꒂ菣ꦼ臣袂臣ꦼ볯꺁觥袐臣鞢諥馁苣ꮁ臣貂볯覃菣ꒂ菣ꦼ볯ꦼ胣ꦼ볯誁苣뎁볯꺁觥袐臣鮸냥馁苣ꮁ臣貂볯膀苣ꪃ苣ꦃ菣릂臣鞢諥馁苣芀菣겂菣ꎂ菣뎂菣袃菣벃菣膀臣ꪁ苣ꆁ苣ꊂ菣뢅臣醰臣蒁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣麝룥ꮁ胦龀臣꒙軥閁苣讂臣ꢁ臣馕蓦鮁苣芀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽ꓥ낕뷤貼볯ꖼ볯袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯覼臣鎁臣낂菣閃臣ꮐ臣貂臣蒁苣鎁臣ꮁ闧辄臣袂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣뎛볯颼볯誁苣뎁볯颼볯꾁胣ꎼ볯ꆼ볯銈볯螽볯龮雦设볯膀볯钼胣銼볯誁苣뎁볯鞼臣風볨鞁臣袂臣ꪁ雦閳臣覂뻥覂苣讂볯讁苣뺔蟥閁苣讂볯邵郥讞돧階臣꺼뗧袐黥隳軩꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣袃菣벃苣銂迦辁胣뎛볯颼볯ꮁ臣醁苣袃菣벃苣꾁胣릟ꓩ늶臣ꂊ臣覂苣讂뿨ꂊ臣겂菣꾂菣벃苣꺁臣蒁鿥誤雦閳臣ꎔ铧鞁臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯꺁裥邞臣覂臣节臣ꞁ臣讂胣蒐菣ꆃ苣뎃臣誁臣讂볯邵郥讞돧階臣늉郥銂胣뾌藥鞁臣ꢡ臣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀鯥閼볯ꆼ臣袂臣閼볯ꊼ臣膀볯뒼볯钼裢ꦼ뷯袼껥붖뻤鎼胣钼볯膀볯銼臣袂臣鎼볯ꮁ꣨覼臣龁苣蚁臣릖돦讁苣鞾苣貂苣覼臣覂铦몇臣貂苣꺼뗧袐黥隳軩꺁볯邵郥讞돧階苣궃菣袃苣ꦃ菣꺁菣것菣릂苣辏臣芀鯥閼볯ꊼ臣誁臣讂菣것菣릂臣膀鿥誤뛦ꮁ諥袁苣貂臣겂菣꾂菣벃苣銂铧蒁苣节臣ꞁ臣讂胣蒐菣ꆃ苣뎃臣誁臣讂볯邵郥讞돧階臣늉郥銂胣뾌藥鞁臣ꢡ臣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼胣뎛볯馼臣膀볯뒼볯钼裢ꦼ뷯袼껥붖뻤鎼胣钼볯膀볯銼臣袂臣鎼볯ꮁ꣨覼臣龁苣蚁臣릖돦讁苣鞾苣貂苣覼臣覂铦몇臣貂苣꺼뗧袐黥隳軩꺁볯邵郥讞돧階苣궃菣袃苣ꦃ菣꺁菣것菣릂苣辏臣芀臣貂臣膀볯ꖗ鯧ꮁ鿥誤뛦ꮁ諥袁苣貂臣겂菣꾂菣벃苣銂铧蒁苣릟ꓩ릖돦ꞁ铧龔臣龁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣芀臣꺁菣것菣릂臣膀鿥誤뛦ꮁ諥袁苣貂苣붿諥꺁苣ꦃ苣袃菣릂臣ꪁ臣릟ꓩ릖돦ꞁ铧龔臣龁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣芀郥覃菣ꒂ菣ꮁ臣醁苣꺼뗧袐黥隳軩꺁觥袐苣膀賦ꖅ臣龁ꇨꮁꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀鯥隼볯꾁胣ꎼ볯ꆼ볯銈볯螽볯龮雦设볯膀볯钼胣銼볯誁苣뎁볯鞼臣風볨鞁臣袂臣ꪁ雦閳臣覂뻥覂苣讂볯讁苣뺔蟥閁苣讂볯邵郥讞돧階臣꺼뗧袐黥隳軩꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣袃菣벃苣銂迦辁胣鎁苣꾁胣醼���ꖗ鯧ꮁ鿥誤뛦ꮁ諥袁苣貂臣겂菣꾂菣벃苣銂铧蒁苣릟ꓩ릖돦ꞁ铧龔臣龁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣芀臣꺁菣것菣릂臣膀鿥誤뛦ꮁ諥袁苣貂苣붿諥꺁苣ꦃ苣袃菣릂臣ꪁ臣릟ꓩ릖돦ꞁ铧龔臣龁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣芀郥覃菣ꒂ菣ꮁ臣醁苣꺼뗧袐黥隳軩꺁觥袐苣膀賦ꖅ臣龁ꇨꮁꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯ꆼ胣뎛볯醼볯誁苣뎁볯醼볯꾁胣ꎼ볯ꆼ볯銈볯螽볯龮雦设볯膀볯钼胣銼볯誁苣뎁볯鞼臣風볨鞁臣袂臣ꪁ雦閳臣覂뻥覂苣讂볯讁苣뺔蟥閁苣讂볯邵郥讞돧階臣꺼뗧袐黥隳軩꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣袃菣벃苣銂迦辁胣뎛볯醼볯꾁胣ꂊ臣覂苣讂苣ꦃ苣袃菣릂臣ꪁ臣릟ꓩ릖돦ꞁ铧龔臣龁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣膀鯥隼볯ꊼ臣膀볯钼韦꺛臣겂菣꾂菣벃苣銂鿥誤뛦ꮁ諥袁臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣芀臣꺁菣것菣릂臣膀鿥誤뛦ꮁ諥袁苣貂苣붿諥꺁苣ꦃ苣袃菣릂臣ꪁ臣릟ꓩ릖돦ꞁ铧龔臣龁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣芀郥覃菣ꒂ菣ꮁ臣醁苣꺼뗧袐黥隳軩꺁觥袐苣膀賦ꖅ臣龁ꇨꮁꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯ꊼ胣뎛볯醼볯誁苣뎁볯醼볯꾁胣ꎼ볯ꆼ볯銈볯螽볯龮雦设볯膀볯钼胣銼볯誁苣뎁볯鞼臣風볨鞁臣袂臣ꪁ雦閳臣覂뻥覂苣讂볯讁苣뺔蟥閁苣讂볯邵郥讞돧階臣꺼뗧袐黥隳軩꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣袃菣벃苣銂迦辁胣뎛볯醼볯꾁胣ꂊ臣覂苣讂苣ꦃ苣袃菣릂臣ꪁ臣릟ꓩ릖돦ꞁ铧龔臣龁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣膀鯥隼볯ꊼ臣膀볯钼韦꺛臣겂菣꾂菣벃苣銂鿥誤뛦ꮁ諥袁臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣芀臣꺁菣것菣릂臣膀鿥誤뛦ꮁ諥袁苣貂苣붿諥꺁苣ꦃ苣袃菣릂臣ꪁ臣릟ꓩ릖돦ꞁ铧龔臣龁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣蚈黦讁苣꺁苣꺁臣芁苣芀郥覃菣ꒂ菣ꮁ臣醁苣꺼뗧袐黥隳軩꺁觥袐苣膀賦ꖅ臣龁ꇨꮁꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀鯥隼볯꾁胣ꎼ볯ꆼ볯銈볯螽볯龮雦设볯膀볯钼胣銼볯誁苣뎁볯鞼臣風볨鞁臣袂臣ꪁ雦閳臣覂뻥覂苣讂볯讁苣뺔蟥閁苣讂볯邵郥讞돧階臣꺼뗧袐黥隳軩꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣袃菣벃苣銂迦辁胣놼볯ꚼ苣ꦃ菣꺁듦蒵껦躚臣覂鯥躏臣龁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽觧ꪳ臣覂臣꺁菣것菣릂苣鞾胣鶁苣꾁苣ꊂ菣뢅臣醰臣蒁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽觧ꪳ臣肸菩蚈苣龔裦馁苣芀鯥隼볯膀볯邼臣袂臣閼볯ꮁꓧ閁苣讂菣것菣릂臣钯볨鞁臣膀菣ꆃ苣뎃볯誁苣뎁볯ꦼ臣뢛꿥辇臣鞢ꓥ鞁胣覃菣ꒂ菣ꦼ볯ꦼ���袂臣ꦼ뷯꾁룦醰臣ꚁ臣讂胣蒐菣ꆃ苣뎃臣誁臣讂볯邵郥讞돧階臣늉郥銂胣뾌藥鞁臣ꢡ臣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼胣뎛볯鎼臣膀뫦銪觥꺁뗧꾫攨摮漠⁦桴⁥潳癬湥⁴牦湯⥴臣뒼볯貁뫦ꊛ臣膀볯銼볯꺁苨⢩桳畯摬牥ꞁ볯馼臣뚺鯩馁苣鎁臣銂ꇨ馁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯꺁菣ꪃ菣랂菣骃菣膃菣난鯥銂ꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀鯥隼볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯讁苣꺁돧骃菣膃菣뒼볯ꮁ꿥鲿臣讂菣ꮃ菣릂苣骃苣袃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀鯥隼볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯讁苣꺁돧骃菣膃菣뒼볯ꮁ꿥鲿臣讂菣ꮃ菣릂苣骃苣袃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀鯥隼볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯讁苣꺁볯馼菣鞃菣覃雦螉臣ꒁ臣ꚁ臣궼볯겼볯ꦼ裢뒼볯ꚼ菣벃苣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯ꆼ胣뎛볯鞼볯銈볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯讁苣꺁藩隌黥誁苣뎁ꓥ뚄臣袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃臣ꒂ苣뎃苣궃菣袃苣ꦃ菣誁苣뎁菣릂苣骃苣袃菣銂迦辁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯ꊼ胣뎛볯鞼볯銈볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯讁苣꺁藩隌黥誁苣뎁ꓥ뚄臣袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃臣ꒂ苣뎃苣궃菣袃苣ꦃ菣誁苣뎁菣릂苣骃苣袃菣銂迦辁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀鯥隼볯꾁胣뢅黥蒚臣꺼뗧袐黥ꪂ菣뒂돧鞃菣閃苣벃菣銂迦辁볯覃菣ꒂ菣ꦼ胣ꦼ볯膀볯ꦼ볯膀볯뚼臣袂臣뚼胣ꚸ臣ꮁ菣莃菣뎹鷥⢇潌⁴癡牥条⥥臣閼볯ꖻ蛥ꮁ臣讂菣벃苣醼볯誁苣뎁볯ꊼ볯芀菣벃苣醼볯膀볯ꊼ臣袂臣醼볯꾁胣Ꞽ볯膀볯醼臣袂臣Ꞽ볯꺁苣랂苣궃볯邵郥讞苣ꪃ苣隳꟦ꂀ苣ꢡ臣芀菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ臣螃菣뾂臣膀鳧许臣ꢡ臣芁苣芀껥붖뻤钼볯銂迥ꞅ臣袂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄳ㰵愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼胣뎛볯馼臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣覭鯩릂鯩鞰돦開苣ꮃ苣辏臣芀菣뎃菣꾁룤ꢡ볯㲚䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄳ㰶愯㰾䐯噉ਾ꺁觧뒾苣覜臣讂胣ં䐼噉邀볯馼볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀鯥鞼볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯꺁믤ꢡ髧ꪁ귧뮛苧뮛냦뎳该늂菣꺁껥辇髧ꎧ黦꺁ꃥ誑苣辏臣芀苣ꮃ臣骮蟩隌苣財臣膀菣벃苣꾁룤ꢡ볯㲚䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄳ㰷愯㰾䐯噉ਾ꺁臣誁苣ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀���馼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯ꆼ胣뎛볯醼볯꾁胣겂菣覃苣ꦃ菣銂若袁臣뒼볯뎼볯₯볯ꆼ볯뎼鎼볯邼볯ₐ볯랼볯겼苣ꦃ菣ꮁ臣醁苣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ꣦隺觧ꪳ臣뢅黥蒚臣銼볯캐겼臣ꢳ藥銂迦辁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯ꊼ胣뎛볯醼볯꾁胣겂菣覃苣ꦃ菣銂若袁臣뒼볯뎼볯₯볯ꆼ볯뎼鎼볯邼볯ₐ볯랼볯겼苣ꦃ菣ꮁ臣醁苣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯뺯藧ꦉ돨袼볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽鿥隺觧ꪳ볯⢉呃䅌ⴴ杉删晥牥湥散䴠瑡牥慩⥬臣銼볯캐겼臣ꢳ藥銂迦辁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀鯥鞼볯꾁胣꾂菣랂菣隃菣벃鿦늉臣龁菣ꪃ苣꾂菣ꮃ苣龃菣袼볯銈볯邼볯늂菣뮛냦뎳该ꮁ苣讂胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯꺁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ꟨邞臣螃苣뾂菣릖볥ꞁ迥鞾臣龁铧较臣设臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㠱⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯馼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀鯥鞼볯꾁胣꾂菣랂菣隃菣벃鿦늉臣龁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ臣ꒁ臣ꚁ臣骮蟩蒚꟨邞臣놠釥꺁뻤銂迦辁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀鯥鞼볯꾁胣뎛볯鎼臣誁臣讂鿦늉볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ苣ꮃ臣骮蟩蒚꟨邞苣낿臣讂ꇨ銂ꓧ馁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀鯥鞼볯꾁胣蚈귥辇菣벃苣벃臣뺯臣讂룤膦臣邃菣覃臣袂臣袺菦閁苣讂냥閁臣邃菣覃臣趽뷧꺁꟧開苣겪飦馁苣龁苣ꮁ胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯꾂菣랂菣隃菣벃鿦늉苣ꮃ臣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯ꎧ黦꺁볥뾪铧较攨桮湡散⁤浩条⥥臣设苣辏臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼胣뎛볯隼臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽꿥ꞅ볯馨뫦ꦉ돨꺁믤ꢡ髧ꪁ볯邵郥讞돧鞃菣閃苣벃菣꺁迦馆臣芁苣芀臣貂臣膀볯膽뷯薽뷯鎽苣릂菣ꂃ룤ꞁ鏦鲽臣龁믤ꢡ髧ꪁ돧鞃菣閃苣벃菣ꞁ臣讂胣鶿賦芙雩꾁苣릂菣ꂃ뻤颭臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼胣뎛볯鞼臣膀믤ꢡ髧ꪁ苣뾂苣ꪂ菣릂苣릂菣ꂃ臩袐胦꾂菣麃菣낂菣ꂃ臣辏蛥ꞁ臣讂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀鯥鞼볯꾁胣ꂊ냦蚈꟨ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯ꦉ돨꺁믤ꢡ髧ꪁ苣궃菣袃苣ꦃ菣꺁菣것菣릂臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼胣뎛볯馼臣膀볯뒼볯ꆼ볯㲔畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽苣麃苣벃菣ꮃ菣鎟觨鞁臣鶃菣ꊂ苣ꪃ菣ꊂ菣覃볯钼胣銼볯薼볯늂菣뮛냦뎳该꾂菣랂菣隃菣벃鿦늉臣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯ꎧ黦꺁뗨뮟苣ꮃ铧较挨慣湮摥朠汥椠慭敧銂迦辁胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲���≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄳ㰹愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼胣뎛볯邼臣膀迥蚛껦躚栨牡敶瑳猠整⥰臣膵苣뎛苣辏臣芀껥붖뻤銼볯銂迥ꞅ臣袂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀鯥颼볯꾁胣ꊂ菣躃跥隳臣랂苣蚃菣ꦁ郥Ꞁ臣뮛냦뎳该뎛苣辏臣芀껥붖뻤醼볯銂迥ꞅ臣袂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀鯥颼볯꾁胣떂菣ꆼ볯ꎼ苣림믨ꮁꓧ鞁胣隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣覂臣覃菣ꒂ菣ꦼ臣袂臣ꦼ볯ꮁꓧ閁苣讂볯邵郥讞苣ꪃ苣랂菣隌臣늉郥銂볯뢻臣몤臣膀雨ꦉ该讅髧螃菣뾂臣낂菣閃苣辏臣芀뻤袁臣膀껥붖뻤鎼胣钼볯膀볯銼臣袂臣鎼볯ꮁ臣醁苣꺼뗧袐黥隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣몱껥릖돦銂迥ꞅ臣袂胣覃菣ꒂ菣ꦼ臣袂臣ꦼ볯꺁觥袐臣鞢諥馁苣ꮁ臣貂볯覃菣ꒂ菣ꦼ볯ꦼ胣ꦼ볯誁苣뎁볯꺁觥袐臣鮸냥馁苣ꮁ臣貂볯膀볯떼볯꾁ꋥꂊ臣讂胣趃苣蚃苣隃苣뎃菣궃菣ꮃ胣馁臣辂臣랂苣ꮃ藩貁냥ꪁ臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯貁鷩뢸臣ꖀ胩ꮁ駩뮎臣貂苣鎁臣ꮁ闧辄臣袂胣覤闧鎽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭胣馁臣辂臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯㲇畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽볯겼볯ꆼ臣벑臣覼臣鎁臣낂菣閃臣ꮐ臣貂臣蒁苣鎁臣ꮁ闧辄臣袂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀鯥颼볯꾁胣ꆼ볯ꎼ苣림믨ꮁꓧ鞁胣覃菣ꒂ菣ꦼ볯ꦼ臣袂臣ꦼ볯ꮁꓧ閁苣讂볯邵郥讞苣ꪃ苣랂菣隌臣늉郥袼볯邵郥讞돧鞃菣閃苣벃菣讁苣몱껥閁苣讂볯銂볯뢻臣몤臣膀雨ꦉ该讅髧螃菣뾂臣낂菣閃苣辏臣芀菣ꆃ苣뎃볯ꦼ볯誁苣뎁볯뚼臣늉郥貁ꋥꂊ臣讂臣ꒁ苣膀볯떼볯꾁ꋥꂊ臣讂胣趃苣蚃苣隃苣뎃菣궃菣ꮃ胣馁臣辂臣랂苣ꮃ藩貁냥ꪁ臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯貁鷩뢸臣ꖀ胩ꮁ駩뮎臣貂苣鎁臣ꮁ闧辄臣袂胣设臣낁胣龮雦设볯膀볯钼胣銼볯誁苣뎁볯鞼臣誁臣讂볯邵郥讞돧鞃菣閃苣벃菣꺁뇦骮雦閳苣芏藧鮁苣芀ꓥ낕뷤ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯蚈귥膀臣ꪁ苣ꆁ볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䄾㤲䱙〱䔴⼼畳㹰裢ꦼ뷯袼볯ꖼ볯ꢁ釥뚁볯貁臣꺁苣ꦃ菣ꮁ郥뺁苣ꚁ臣讂臣ꢁ臣馕蓦鮁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼胣뎛볯钼臣膀볯떼볯銂볯뢻臣몤臣膀돧鞃菣閃苣벃菣讁苣꺁菣ꆃ苣뎃볯ꦼ볯誁苣뎁볯뚼臣몤臣貂苣꺼뗧袐黥낂菣뎂苣ꮃ賥꺁觥袐苣뢼믨ꮁꓧ馁胣겖觧開藦蒚菣벃苣꺁裥꺁苣ꦃ菣銂迦辁胣覃菣ꒂ菣ꦼ볯ꦼ臣袂臣ꦼ볯꺁觥袐臣鞢諥馁苣ꮁ臣貂胣ꆼ볯ꎼ臣鞢諥馁苣芀菣겂菣ꎂ菣뎂菣袃菣벃菣膀臣ꪁ苣ꆁ苣ꊂ���뢅臣醰臣蒁볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽臣麝룥ꮁ胦龀臣꒙軥閁苣讂臣ꢁ臣馕蓦鮁苣芀뻤袁臣膀껥붖뻤鎼胣钼볯膀볯銼臣袂臣鎼볯ꮁ臣醁苣꺼뗧袐黥隳菣궃菣ꎂ菣ꮃ臣몱껥릖돦銂迥ꞅ臣袂胣覤闧鎽볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽裥邭胣馁臣辂臣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯㲇畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㉁夹ㅌ㐰㱅猯灵銈볯螽볯겼볯ꆼ臣벑臣覼臣鎁臣낂菣閃臣ꮐ臣貂臣蒁苣鎁臣ꮁ闧辄臣袂胣㲂䐯噉ਾ䐼噉邀볯馼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀鯥颼볯꾁胣ꎼ볯겼볯钼裢ꦼ뷯馨뫦ꦉ돨꺁菣ꪃ菣랂菣난鯥銂迦辁胣钃菣꾂郥骮臣ꒁ臣ꚁ臣龮雦设볯閼臣肜뻥꺁ꇨ銂迥ꞅ臣袂胣뒼볯讼볯ꢁ菣馃菣颻臣鞁臣辰臣ꪁ菣벃苣꾁胣꺼鳦꾫苣ꦃ菣뎃껦몟臣袂臣ꚁ볤랕臣貂臣뒼볯袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃臣芁苣芀볯鎼볯讼볯ꢁ菣馃菣颻臣鞁臣辰臣ꪁ菣벃苣꾁胣ꎼ鳦꾫菣뢂菣议鿥ꮁ苣ꎁ臣뢼闩閁苣龁볯鎼볯袃菣鞃苣뎃菣鞃菣覃臣芁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼胣뎛볯隼臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽꣦隺觧ꪳ臣袃菣鞃苣뎃鳥뎛臣膀郥颁뷤꺽臣袐苣鮁臣閼菣ꮃ볯꺁볯隼뷯颽苣뎃苣놂菣뾂菣骃菣膃菣貼볯薽뷯袼볯覼볯閼볯颼볯鲀볯鎼볯꺁菣ꪃ菣랂菣난鯥ꮁ臣蒁臣꺁볯颼볯躽뷯螃菣뾂臣趇臣袐苣鮁漨敶汲祡銂迦辁胣龮雦设볯閼苣芏藧鮁苣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼胣뎛볯鞼臣膀볯뒼볯ꆼ볯銈볯螽꣦隺觧ꪳ臣袃菣鞃苣뎃鳥뎛臣膀郥颁뷤꺽臣袐苣鮁臣閼菣ꮃ볯꺁볯銼볯蒽뷯膽뷯貽苣뎃苣놂菣뾂菣骃菣膃菣貼뷯鎽뷯ꆼ뷯邽볯馼볯袼볯颼볯鲀볯邼볯覼臣袃菣鞃苣뎃鳥뎛臣ꒁ臣ꚁ臣銼볯閼뷯趽菣벃苣꺁详Ꞥ鯥銂迦辁胣龮雦设볯閼苣芏藧鮁苣芀⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰〲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈳㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㌲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈳㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㔲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈳㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㜲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㠲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㤲⼼㹡⼼䥄㹖㰊���㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌳㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌳㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌳㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌳㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌳㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㔳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌳㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㜳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌳㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㌳㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐳㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐳㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐳㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐳㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐳㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐳㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐳㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐳㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㐳㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㔳㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㔳㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㌵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㐵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㔵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㘵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㜵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㠵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㤵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣���뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘳㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘳㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘳㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘳㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘳㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘳㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘳㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘳㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㘳㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㜳㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠳㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠳㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠳㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㌸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠳㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㔸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠳㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠳㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㠳㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㤸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯���颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤳㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤳㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤳㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㌰㌹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤳㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤳㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤳㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤳㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤳㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㤳㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㐰〰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〴㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〴㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〴㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〴㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〱ㄱ㐶㈰琮晩㸢〲〱ㄱ㐶㈰琮晩ꃂ〰㐰㔰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〴㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〴㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〴㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰〴㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰ㄴ㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼���㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈴㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈴㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㄰㘱〴⸲楴≦㈾㄰㄰㘱〴⸲楴쉦゠〰㈴㰲愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀藩鞈ꇨ醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦⸢㈯㄰㄰㘱〴⼲⸲㄰㄰㘱〴䔲〫㔱㈯㄰㄰㘱〴〲〰〰⸱灡≰㈾㄰㄰㘱〴〲〰〰⸱灡㱰愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊戯摯㹹㰊栯浴㹬