(57)【要約】【課題】本発明は、その発現が内皮に選択的である遺伝子、およびこれらの遺伝子または遺伝子産物の使用、または血管内皮に関するイメージング、診断、および状態の治療においてそれに結合する分子に関する。【解決手段】（ｉ）図４または５のポリペプチド配列を含む天然に生じるヒトポリペプチドである、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに（ｉｉ）細胞毒性な化学療法剤、細胞毒性なポリペプチド、比較的毒性の無いプロドラッグを細胞毒ドラッグに変換することのできる部分、放射線感受性増強物質、細胞毒性なポリペプチドをコードする核酸分子、細胞毒性なアンチセンスオリゴヌクレオチド、細胞毒性な部分に特異的に結合できる部分、及び治療用ポリペプチドをコードする核酸からなる群から選択されるさらなる部分を含む化合物の、血管内皮に関連する疾患を治療するための医薬の製造における使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）図４または５のポリペプチド配列を含む天然に生じるヒトポリペプチドである、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに（ｉｉ）細胞毒性な化学療法剤、細胞毒性なポリペプチド、比較的毒性の無いプロドラッグを細胞毒ドラッグに変換することのできる部分、放射線感受性増強物質、細胞毒性なポリペプチドをコードする核酸分子、細胞毒性なアンチセンスオリゴヌクレオチド、細胞毒性な部分に特異的に結合できる部分、及び治療用ポリペプチドをコードする核酸からなる群から選択されるさらなる部分を含む化合物の、血管内皮に関連する疾患を治療するための医薬の製造における使用。
【請求項２】
疾患が、固形腫瘍、乾癬、糖尿病性白内障、動脈硬化、または過多月経から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
疾患が固形腫瘍である請求項２に記載の使用。
【請求項４】
患者における血管新生を調節する医薬の調製における、ＥＣＳＭ４、または図１２の残基１から４６７を含む若しくはそれらからなるＥＣＳＭ４の断片、またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する抗体の使用。
【請求項５】
図４または５のポリペプチド配列を含む天然に生じるヒトポリペプチドである、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び比較的毒性の無いプロドラッグを細胞毒ドラッグに変換することのできるさらなる部分を含む化合物と、前記化合物のさらなる部分によって細胞毒ドラッグに変換され得る比較的毒性の無いプロドラッグとを含むパーツのキット。
【請求項６】
図４または５のポリペプチド配列を含む天然に生じるヒトポリペプチドである、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び細胞毒性な部分に特異的に結合できるさらなる部分を含む化合物と、前記化合物がさらなる部分を介して結合可能である細胞毒性な部分とを含むパーツのキット。
【請求項７】
請求項１に規定された化合物、または請求項１に規定された抗体、及び製薬学的に許容可能なキャリアーを含む製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その発現が内皮に選択的である遺伝子、およびこれらの遺伝子または遺伝子産物の使用、または血管内皮に関するイメージング、診断、および状態の治療においてそれに結合する分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
内皮は多くの生理的かつ病理的な過程において中心的な役割を果たし、非常に転写活性の高い部位であることが知られている。約１０００種類の異なる遺伝子が内皮細胞で発現する。対称的に赤血球細胞は８種類、血小板は２２種類、および平滑筋は１２７種類の異なる遺伝子を発現することが明らかにされた（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ， １９９５）。既知の内皮特異的な遺伝子は、基礎的な研究および臨床的なコミュニティーの両者からの多くの注意を惹き付けている。例えば、内皮特異的なチロシンキナーゼＴｉｅ、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＫＤＲ、およびｆｌｔ１は血管の完全性、内皮の仲介する炎症過程および血管新生の調節において重要な役割を果たす（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ， １９９３， Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ａｌｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ， １９９５）。血管新生は現在、固形腫瘍の成長時の律速過程として広く認識されている。それはまた、動脈硬化斑および再狭窄の形成にも関与している。つまり、内皮は凝固や止血を調節する複雑かつ動的な機構において中心的な役割を果たしている。
【０００３】
内皮細胞で発現する多くの異なる遺伝子のうち、全体的に内皮細胞選択的ではないため、そうした遺伝子やその産物、およびそれらに結合する分子は、一般的に、疾患のイメージング、診断、および治療には適さない。このように内皮細胞特異的あるいは選択的な分子への必要性が依然として残っている。
【０００４】
我々は、ここで二種類の高度に内皮選択的な遺伝子の同定を報告する。それらを我々は、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １（ＥＣＳＭ１）およびｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ （ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ４； ＥＣＳＭ４）と呼んでいる。語ＥＣＳＭ１およびＥＣＳＭ４はまた、文脈が明確になるように、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされたポリペプチドを指し示すのに使用される。これらの遺伝子、特にＥＣＳＭ４の細胞発現様式における特異性は驚くほど高い。ＥＣＳＭ４は、例えば、最も良い内皮細胞マーカー（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ）として、現在技術的に受け入れられているマーカーと同様の内皮細胞選択性を示す。明らかに、そのような非常に高いレベルの内皮細胞特異性は、前例がないとともに予想外である。
【０００５】
ＥＣＳＭ１（ＵｎｉＧｅｎｅ ｅｎｔｒｙ Ｈｓ．１３９５７）はどんな蛋白質あるいはヌクレオチドレベルでのホモログをもたない。それは１０３アミノ酸（コンティグ配列において同定された最も長く、かつ上流のＯＲＦ）の小さな蛋白質をコードしている可能性が最も高い。ＥＣＳＭ１はゲノム中に唯一かつ明確であり、第１９染色体に位置する、二箇所のシークエンスタグされた部位（ＳＴＳ ｓｉｔｅ； ｄｂＳＴＳ Ｇ２６１２９およびＧ２８０４３）を含んでいる。ＥＣＳＭ１遺伝子の一部の補完を構成するポリヌクレオチドはＷＯ ９９／０６４２３ （Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（“ｇｅｎｅ２２”と名付けられた； ３１−３２頁）に、臍帯内皮細胞において主に、ヒト脂肪組織においてはより少ない程度に発現されていると記載されている。しかしながら、ＷＯ ９９／０６４２３はただ４５アミノ酸のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいてＯＲＦを表明している。我々の分析によれば、これは１０３アミノ酸からなる正しいポリペプチドを表しておらず、ＥＣＳＭ１の実際の開始コドンはＷＯ ９９／０６４２３で同定されたものより、さらに５’側である。
【０００６】
ヒトｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ （ＥＣＳＭ４） ｃＤＮＡクローンは４１７アミノ酸以上の長いＯＲＦをもち、３７１６ヌクレオチド配列がＢＬＡＳＴ検索によって同定されたように、ＷＯ ９９／４６２８１に記載された。この配列は、プロリンに富み、アミノ酸の複雑さの低い領域をいくつかもっている。ＢＬＡＳＴ ＰＲＯＤＯＭ検索（ＵＫ， ＨＧＭＰの蛋白質ファミリーデータベース）は、反発性軸索誘導（ＲＯＢＯ１ ＤＵＴＴ１蛋白質ファミリー、Ｅ＝４ｅ−０７） に関与する、膜貫通受容体の細胞質領域の保存されたファミリーにホモロジーを示す、１２０塩基対の領域を同定した。Ｓｓｅａｒｃｈを使用してより粗い分析を行ったとき、ホモロジーを示す領域は４６８アミノ酸（Ｅ＝１．３ｅ−０９）まで延びたが、細胞質領域は依然として類似性を示す領域に含まれた。ＲＯＢＯ１ ＤＵＴＴ１ファミリーは、ヒトｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ １（ＲＯＢＯ１）、マウス遺伝子ＤＵＴＴ１およびラットＲＯＢＯ１（Ｋｉｄｄ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｂｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ， １９９９）を含む。この領域のホモロジーから、我々はＨｓ． １１１５１８によって代表される遺伝子を”ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ”（ＥＣＳＭ４）と名付けた。さたに、ＢＬＡＳＴ ＳＢＡＳＥ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ａｔ ＨＧＭＰ）によって、前躯体形成細胞内神経細胞接着分子長領域（Ｅ＝２ｅ−１１）に類似性を示す領域があることが示唆された。Ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの真の蛋白質産物はＡＫ０００８０５クローンによってコードされた４１７アミノ酸より大きい可能性が注目されなければならない。なぜなら、そのＯＲＦはみかけの上流の制限をもたず、そしてヒトｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ１（１６５１アミノ酸）へのサイズの比較から、ずっと大きい蛋白質であることが示唆されるからである。これは図３において確認される。図３はヒトＥＣＳＭ４の翻訳産物が約１１８ｋＤａであることを示している。しかしながら、ＥＣＳＭ４はｒｏｕｎｄａｂｏｕｔファミリーの他のメンバーよりも小さく、五つのＩｇドメインの二つと三つのフィブロネクチンドメインの二つのみを細胞外領域に共有している。細胞内の推定のプロリンリッチ領域は、ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔのものに相同性を有しており、ｃ−ａｂｌに共役すると考えられる。図１２は、ヒトＥＣＳＭ４ （１１０５アミノ酸）の完全長アミノ酸配列を示しており、マウスホモログの配列は図１３に示す。ヌクレオチド配列は、図１２に与えられたＥＣＳＭ４のものに約９９％の相同性を示し、ＷＯ ９９／１１２９３およびＷＯ ９９／５３０５１において開示されている。
【０００７】
ＥＣＳＭ４ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列にホモロジーを示す配列の補足は、ＥＰ１０７４６１７、ＷＯ ００／５３７５６、ＷＯ ９９／４６２８１、ＷＯ ０１／２３５２３、およびＷＯ ９９／１１２９３において開示されている。しかしながら、これらの発表のどれも、その配列が血管上皮において選択的に発現することを公表せず、そのように発現している可能性を示唆もしていない。
【０００８】
最近、神経分化遺伝子と上皮細胞との間に興味深い関連性が発見されている。例えば、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ） ニューロピリン １ （Ｓｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９８）の神経受容体が同定された。ＶＥＧＦは、もともとは単独に働く上皮成長因子と考えられていた。神経軸索誘導に類似した過程は、現在、血管新生の毛細血管萌出時に上皮細胞の移動を誘導することに関係している。このようにエフリン Ｂリガンドおよびエフリン Ｂ受容体は、動脈および静脈領域の区分に必要とされる（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ， １９９９）。Ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ （ＥＣＳＭ４）は、上皮細胞抑制性誘導に、異なるリガンドとともに関係しているヒトｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ １の上皮特異的ホモログである可能性がある。なぜなら、類似性を示す領域は細胞質、すなわちエフェクター領域の中に存在し、誘導受容体は高度に標準的な構造をとることが知られている（Ｂａｓｈａｗ ａｎｄ Ｇｏｏｄｍａｎ １９９９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１５９４９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、現在まで上皮におけるカウンターパートの存在、上皮細胞、特に血管新生における上皮細胞に制限されるｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ （ＥＣＳＭ４）遺伝子の発現様式、それにコードされるポリペプチドのなんらかの機能についての言及はない。注目しなければならないが、例１に述べた我々のＲＴ−ＰＣＲの驚くべき結果は、ここで同定された遺伝子は、古典的な上皮マーカーであるｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）と比較して、上皮特異性を示しているようである（図１）ということである。既知の上皮特異的な遺伝子の発現は、通常１００％、上皮細胞に限定されない。この中に提示したデータは、ＥＣＳＭ４は上皮細胞より他の細胞種において、検出可能なレベル（少なくとも例で述べた方法を使用した場合において）では発現していないという、既知の上皮細胞マーカーの１００％以下の選択性を考えると、全く予期せぬ知見を示している。リボヌクレアーゼ保護分析は、この観察を確認、拡張した（図１４ａ）。ＥＣＳＭ４発現は、上皮（三種類の異なるサンプル）に制限され、線維芽細胞、癌細胞および神経細胞には存在しないようであった。ＫＤＲおよびＦＬＴ１はともに、雄、および雌の生殖器官： 精子形成細胞（Ｏｂｅｒｍａｉｒ ｅｔ ａｌ， １９９９）、トロホブラスト、および脱落膜 （Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ， １９９６）、において発現する。ＫＤＲは、造血幹細胞（Ｚｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９９）を特徴付けることが示されている。ＦＬＴ１は、単核球においても存在する。上皮細胞に加え、ｖＷＦは巨核球 （Ｓｐｏｒｎ ｅｔ ａｌ， １９８５， Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ， １９８５） においても強く発現し、結果として血小板においても存在する。同様に、マルチマリンは上皮細胞（Ｈａｙｗａｒｄ ｅｔ ａｌ， １９９３）および血小板 （Ｈａｙｗａｒｄ ｅｔ ａｌ， １９９８）の両者に存在する。
【００１１】
一般的に言って、上皮細胞および造血細胞は、同じ胚前駆体：血管芽細胞および多くの細胞マーカーはこれらの二種類の細胞系統の間を共有されている （参照、総説Ｓｕｄａ ｅｔ ａｌ， ２０００）、由来である。このように、遺伝子ＥＣＳＭ１およびＥＣＳＭ４は血管上皮より他の細胞においては発現していないという知見は、非常に驚くべきことである。
【００１２】
その発現が血管上皮に選択的である遺伝子の決定は、これらの細胞への選択的なターゲティングを可能にし、それによって通常あるいは異常な血管成長に関係する条件における療法のイメージング、診断、予後診断、治療、予防、および評価のための分子を特異的に運び届けることを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第一の特徴点は、（ｉ）ポリペプチドＥＣＳＭ４に選択的に結合する一部分、および（ｉｉ）さらなる部分を構成する化合物を与えることである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】逆転写ＰＣＲによる実験的確認。ＵｎｉＧｅｎｅ／ＥＳＴスクリーンおよびｘＰｒｏｆｉｌｅｒ ＳＡＧＥ微分解析（Ｔａｂｌｅ ８）の組み合わせによって予測された、候補内皮特異的遺伝子が、三種類の内皮、および九種類の非内皮細胞培養における、その発現を調査された。内皮培養は、次のとおり：ＨＭＶＥＣ （ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、ＨＵＶＥＣ （ｈｕｍａｎ ｕｎｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）全面培養、およびＨＵＶＥＣ増殖培養。非内皮培養は次のとおり： 正常酸素状態で培養したｎｏｒｍａｌ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ （ＮＥＳ）細胞、および低酸素状態で培養したＮＥＳ、ＭＤＡ４５３およびＭＤＡ４６８乳がん細胞系統、ＨｅＬａ、正常酸素状態で培養したＦＥＫ４繊維芽細胞および低酸素状態で培養したＦＥＫ４繊維芽細胞、およびＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６−二種類の大腸直腸上皮細胞系統。ＥＣＳＭ１は、完全に内皮特異性を示し、一方ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ／ＥＣＳＭ４は、内皮において非常に強く優先的に発現した。興味深いことに、これら両方の新規遺伝子は、内皮特異的遺伝子の基準：ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒよりも内皮特異的であるようである。
【図２−１】ｐｈｒａｐ作製のＥＣＳＭ１ ｃｏｎｔｉｇ配列およびその翻訳産物のアミノ酸配列。このｃｏｎｔｉｇを作製するために使用したＥＳＴｓは表１０に示される。
【図２−２】ｐｈｒａｐ作製のＥＣＳＭ１ ｃｏｎｔｉｇ配列およびその翻訳産物のアミノ酸配列。このｃｏｎｔｉｇを作製するために使用したＥＳＴｓは表１０に示される。
【図３】ＥＣＳＭ４ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳。ＥＣＳＭ４全長をコードするｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクターにクローンされた。環状およびＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドは、製造元の説明にあるように、３５Ｓメチオニンを取り込ませるＴＮＴＲ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を受けた。反応産物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化された。ルシフェラーゼプラスミドは、反応のポジティブコントロールとして利用された。左側の数は、参考の分子量マーカーの位置を示す。ＥＣＳＭ４示すバンドのサイズは、１１８キロダルトンの計算上の分子量と一致した。
【図４−１】ｃＤＮＡおよびＧｅｎＢａｎｋ ＡＫ０００８０５ （ｈｕｍａｎ ＥＣＳＭ４／ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ）のコンピューターによる翻訳。
【図４−２】ｃＤＮＡおよびＧｅｎＢａｎｋ ＡＫ０００８０５ （ｈｕｍａｎ ＥＣＳＭ４／ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ）のコンピューターによる翻訳。
【図４−３】ｃＤＮＡおよびＧｅｎＢａｎｋ ＡＫ０００８０５ （ｈｕｍａｎ ＥＣＳＭ４／ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ）のコンピューターによる翻訳。
【図５−１】Ｐｈｒａｐの作製したヒトＥＣＳＭ４（ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ） ＥＳＴｓのｃｏｎｔｉｇ配列およびコードされるポリペプチドの翻訳。ＤＮＡ配列は、それがｃＤＮＡであるような向きに示され、その元々生じたものとは逆向きである。Ｃｏｎｔｉｇを作製するために使用されたＥＳＴｓは、表１１に示される。この配列における翻訳開始は、ｃｏｎｔｉｇ配列の位置２であり、翻訳終結は、位置９４８である。
【図５−２】Ｐｈｒａｐの作製したヒトＥＣＳＭ４（ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ） ＥＳＴｓのｃｏｎｔｉｇ配列およびコードされるポリペプチドの翻訳。ＤＮＡ配列は、それがｃＤＮＡであるような向きに示され、その元々生じたものとは逆向きである。Ｃｏｎｔｉｇを作製するために使用されたＥＳＴｓは、表１１に示される。この配列における翻訳開始は、ｃｏｎｔｉｇ配列の位置２であり、翻訳終結は、位置９４８である。
【図５−３】Ｐｈｒａｐの作製したヒトＥＣＳＭ４（ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ） ＥＳＴｓのｃｏｎｔｉｇ配列およびコードされるポリペプチドの翻訳。ＤＮＡ配列は、それがｃＤＮＡであるような向きに示され、その元々生じたものとは逆向きである。Ｃｏｎｔｉｇを作製するために使用されたＥＳＴｓは、表１１に示される。この配列における翻訳開始は、ｃｏｎｔｉｇ配列の位置２であり、翻訳終結は、位置９４８である。
【図６−１】ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＫ０００８０５（“ｍａｇｉｃ．ｓｅｑ”）と図４、および５に与えられたヒトＥＣＳＭ４のＰｈｒａｐ（“ｈｓ．１１１５１８”）作製の核酸配列のアライメント。
【図６−２】ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＫ０００８０５（“ｍａｇｉｃ．ｓｅｑ”）と図４、および５に与えられたヒトＥＣＳＭ４のＰｈｒａｐ（“ｈｓ．１１１５１８”）作製の核酸配列のアライメント。
【図７−１】マウスＥＣＳＭ４ ｃｏｎｔｉｇ核酸配列とアミノ酸配列。
【図７−２】マウスＥＣＳＭ４ ｃｏｎｔｉｇ核酸配列とアミノ酸配列。
【図８−１】マウスＲｏｂｏ１蛋白質（“Ｔ３０８０５”）とヒトＥＣＳＭ４（“ｍａｇｉｃ．ｐｅｐ”）のアミノ酸配列のアライメント。
【図８−２】マウスＲｏｂｏ１蛋白質（“Ｔ３０８０５”）とヒトＥＣＳＭ４（“ｍａｇｉｃ．ｐｅｐ”）のアミノ酸配列のアライメント。
【図９−１】マウスＲｏｂｏ１蛋白質（“Ｔ３０８０５”）とマウスＥＣＳＭ４（“ｍｏｕｓｅｍａｇｉｃ．ｐｅｐ”）のアミノ酸配列のアライメント。
【図９−２】マウスＲｏｂｏ１蛋白質（“Ｔ３０８０５”）とマウスＥＣＳＭ４（“ｍｏｕｓｅｍａｇｉｃ．ｐｅｐ”）のアミノ酸配列のアライメント。
【図１０】ヒト（“ｍａｇｉｃ．ｐｅｐ”）とマウス （“ｍｏｕｓｅｍａｇｉｃ．ｐｅｐ”） ＥＣＳＭ４蛋白質のアミノ酸配列のアライメント。太字の残基は、よく保存された配列を示す。マウス蛋白質配列は上に、ヒトの配列は下に示される。
【図１１ａ】ｉｎ ｖｉｖｏ ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの発現。（ａ）リボヌクレアーゼ保護分析。上、ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの異なる領域に対する二種類のプローブ（ヌクレオチド１から３３５および３３３３から３６７９）が、分析に使用された（左右に示す。）。Ｒｎａｓｅ保護アッセイは、Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡをコントロールとして行った（下に示す）（Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ３９９： ２７１）。ヒト細胞系統および一次単離体：ＭＲＣ−５、繊維芽細胞系統、ＭＣＦ−７、乳がん細胞系統、Ｎｅｕｒｏ、ＳＹ−ＳＨ−５Ｙ神経芽細胞系統、ＨＵＶＥＣ、臍静脈内皮単離体およびＨＭＭＥ２、哺乳類微小血管内皮細胞系統。Ｎ、正常酸素状態、Ｈ、低酸素状態、Ｐ、増殖中。
【図１１ｂ】ｉｎ ｖｉｖｏ ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの発現。（ｂ）細胞ライセートのウエスタン解析。約１１０キロダルトンのバンドはＭＲに対応し、１８時間、低酸素状態にさらした細胞で強く反応する。実験は二度繰り返され、同じ結果が得られた。イムノブロッティングは、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０： ６２９８に述べられているように、行われた。ポリクローナルウサギ抗血清は、鍵穴リンペットヘモシアニンに共役された次のペプチドに対して生成された：アミノ酸１６５−１８１（ＬＳＱＳＰＧＡＶＰＱＡＬＶＡＷＲＡ）および２７４−２８８（ＤＳＶＬＴＰＥＥＶＡＬＣＬＥＬ）（抗血清１）またはペプチド３１１−３２０（ＴＹＧＹＩＳＶＰＴＡ）ＯＹＯＢＩ３３６−３５１（ＫＧＧＶＬＬＣＰＰＲＰＣＬＴＰＴ）（抗血清２）。抗血清は両方とも同じ結果を生じた。ウエスタン分析の場合に、抗血清は、抗血清１を生成するために使用されたペプチドを共役した“Ｈｉ−Ｔｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ”カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってアフィニティー精製された。
【図１２−１】ヒトＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡおよびコードされた蛋白質配列
【図１２−２】ヒトＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡおよびコードされた蛋白質配列
【図１２−３】ヒトＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡおよびコードされた蛋白質配列
【図１２−４】ヒトＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡおよびコードされた蛋白質配列
【図１３−１】マウスＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡ（ＭｕＭＲ．ｓｅｑ）およびコードされた蛋白質配列
【図１３−２】マウスＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡ（ＭｕＭＲ．ｓｅｑ）およびコードされた蛋白質配列
【図１３−３】マウスＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡ（ＭｕＭＲ．ｓｅｑ）およびコードされた蛋白質配列
【図１３−４】マウスＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡ（ＭｕＭＲ．ｓｅｑ）およびコードされた蛋白質配列
【図１３−５】マウスＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡ（ＭｕＭＲ．ｓｅｑ）およびコードされた蛋白質配列
【図１３−６】マウスＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡ（ＭｕＭＲ．ｓｅｑ）およびコードされた蛋白質配列
【図１３−７】マウスＥＣＳＭ４全長ｃＤＮＡ（ＭｕＭＲ．ｓｅｑ）およびコードされた蛋白質配列
【図１４−１】マウスＥＣＳＭ４ （上）とヒトＥＣＳＭ４（下）のアミノ酸配列のアライメント。
【図１４−２】マウスＥＣＳＭ４ （上）とヒトＥＣＳＭ４（下）のアミノ酸配列のアライメント。
【図１４−３】マウスＥＣＳＭ４ （上）とヒトＥＣＳＭ４（下）のアミノ酸配列のアライメント。
【図１５−１】ヒトＥＣＳＭ４ （“ＨｕＭＲ．ｓｅｑ”；上）とマウスＥＣＳＭ４（“ＭｕＭＲ．ｓｅｑ”；下）のｃＤＮＡ配列のアライメント。
【図１５−２】ヒトＥＣＳＭ４ （“ＨｕＭＲ．ｓｅｑ”；上）とマウスＥＣＳＭ４（“ＭｕＭＲ．ｓｅｑ”；下）のｃＤＮＡ配列のアライメント。
【図１５−３】ヒトＥＣＳＭ４ （“ＨｕＭＲ．ｓｅｑ”；上）とマウスＥＣＳＭ４（“ＭｕＭＲ．ｓｅｑ”；下）のｃＤＮＡ配列のアライメント。
【図１５−４】ヒトＥＣＳＭ４ （“ＨｕＭＲ．ｓｅｑ”；上）とマウスＥＣＳＭ４（“ＭｕＭＲ．ｓｅｑ”；下）のｃＤＮＡ配列のアライメント。
【図１５−５】ヒトＥＣＳＭ４ （“ＨｕＭＲ．ｓｅｑ”；上）とマウスＥＣＳＭ４（“ＭｕＭＲ．ｓｅｑ”；下）のｃＤＮＡ配列のアライメント。
【図１５−６】ヒトＥＣＳＭ４ （“ＨｕＭＲ．ｓｅｑ”；上）とマウスＥＣＳＭ４（“ＭｕＭＲ．ｓｅｑ”；下）のｃＤＮＡ配列のアライメント。
【図１５−７】ヒトＥＣＳＭ４ （“ＨｕＭＲ．ｓｅｑ”；上）とマウスＥＣＳＭ４（“ＭｕＭＲ．ｓｅｑ”；下）のｃＤＮＡ配列のアライメント。
【図１５−８】ヒトＥＣＳＭ４ （“ＨｕＭＲ．ｓｅｑ”；上）とマウスＥＣＳＭ４（“ＭｕＭＲ．ｓｅｑ”；下）のｃＤＮＡ配列のアライメント。
【図１６】ＥＣＳＭ４をプローブとして使用した、ヒト胎盤組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析。骨盤組織の薄切片の倍率１０ｘの明視野。矢印は、大きい血管を示す。
【図１７】ＥＣＳＭ４をプローブとして使用した、ヒト胎盤組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析。図１６に示した骨盤組織の薄切片の明視野の高倍率像、血管に焦点をあわせた。矢印は、血管内腔に並ぶ内皮細胞をさす。
【図１８】ＥＣＳＭ４をプローブとして使用した、ヒト胎盤組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析。図１６に示した骨盤組織の薄切片の高倍率像、血管に焦点をあわせ、暗視野でここに示した。矢印は、血管内腔に並ぶ内皮細胞のポジティブ染色を示す。
【図１９】ＥＣＳＭ４をプローブとして使用した、大腸肝臓転移組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析。（Ａ）１０ｘおよび（Ｂ）２０ｘの倍率の大腸肝臓転移組織薄切片の明視野像。境界（＊で囲んだＡ）によって印をつけた領域は、正常肝臓組織を示す。（Ｂ）での矢印は、転移腫瘍組織内の血管の一つを示す。
【図２０】ＥＣＳＭ４をプローブとして使用した、大腸肝臓転移組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析。（Ａ）１０ｘおよび（Ｂ）２０ｘの倍率の大腸肝臓転移組織薄切片の暗視野。境界（＊で囲んだ）によって印をつけた領域は、正常肝臓組織を示す。（Ｂ）での矢印は、図１９Ｂに示した血管に対応する転移腫瘍組織内の血管の一つを示す。ＥＣＳＭ４の発現は、腫瘍血管の内皮細胞に限定される。周りの正常組織（＊）においては発現がほとんどないことに注目。
【図２１】ウサギ抗体ＭＧＯ−５を一次抗体として使用したウエスタンブロット。ペプチドＥＣＳＭ４由来のペプチド、ＭＲ１６５、ＭＲ３１１、ＭＲ３６６およびコントロールペプチドウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の希釈したものをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐメンブレン上にブロットした。ブロットは、ＭＧＯ−５抗体でプローブされ、アルカリフォスファターゼを結合させた抗ウサギ抗体を使用して可視化された。
【図２２】凍結骨盤切片の免疫染色。ヒト骨盤の凍結薄切片は、任意の一次抗体なしで（ネガティブコントロール）免疫組織化学によって分析され、アルカリフォスファターゼを結合させた抗ウサギ抗体を使用して可視化された。わずかにバックグラウンドが観察される。
【図２３】凍結骨盤切片の免疫染色。ヒト骨盤の凍結薄切片は、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ（ポジティブコントロール）を認識する一次抗体で免疫組織化学によって分析され、アルカリフォスファターゼを結合させた抗ウサギ二次抗体を使用して可視化された。矢印は、血管内皮細胞に限定されたｖＷＦの高発現を示す。
【図２４】凍結骨盤切片の免疫染色。ヒト骨盤の凍結薄切片は、一次抗体としてＭＧＯ−５（ペプチドＭＲ１６５に対して生成したウサギポリクローナル抗体）で免疫組織化学によって分析され、アルカリフォスファターゼを結合させた抗ウサギ二次抗体を使用して可視化された。矢印は、血管内皮細胞に限定されたＥＣＳＭ４の高発現を示す。周りの組織は、ほとんど染色されないことに注目。図２２および２３と比較すると、ＥＣＳＭ４の発現は、ｖＷＦ、血管内非細胞の既知のマーカー、のものと共局在することが示される。
【図２５】ＨＵＶＥＣ細胞の免疫組織化学分析：ｖｏｎ Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）。ＨＵＶＥＣ細胞は、固定され、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ（内皮細胞のマーカー）を認識する抗体で免疫組織化学によって分析され、アルカリフォスファターゼを結合させた抗ウサギ抗体を使用して可視化された。矢印は、一連のＨＵＶＥＣ細胞におけるｖＷＦの発現を示す。
【図２６】抗体ＭＧＯ−７を使用したＨＵＶＥＣ細胞の免疫組織化学分析。ＨＵＶＥＣ細胞は、固定され、一時抗体としてＭＧＯ−７抗体（ペプチドＭＲ３１１およびＭＲ３３６に対して生成されたウサギポリクローナル抗体）を使用した免疫組織化学によって分析され、アルカリフォスファターゼを結合させた抗ウサギ抗体を使用して可視化された。染色が細胞表層に一義的に局在することに注目。
【図２７−１】ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの発現（Ａ）骨盤細動脈（ａ）および細静脈（ｂ）におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出されたＭＲの発現（左、明視野および右、暗視野）。（ｃ）骨盤細動脈におけるｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの免疫組織化学染色。左、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒコントロールおよび右、ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ。（Ｂ）腫瘍内皮におけるＭＲの発現。ガングリオグリオーマの（ａ）ｘ２０および（ｂ）ｘ５０。左、明視野；右、暗視野。矢印はその中に赤血球細胞のある切片を斜めに走り降りる血管を強調する。内皮細胞は、ＭＲの発現に強い陽性を示す。Ｐａｐｉｌｌａｒｙ膀胱がんの（ｃ）ｘ２０および（ｄ）ｘ５０。腫瘍のｐａｐｉｌｌａの血管中核は、強く陽性を示し、特に矢印で示された“平らな”内皮細胞が強い陽性を示す。Ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔアンチセンスｉｎ ｓｉｔｕプローブは、ＩＭＡＧＥ ＥＳＴクローン１９１２０９８ （ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃ． ＡＩ２７８９４９）からＴ３ポリメラーゼを使用して調製された。プラスミドはプローブ合成の前に、ＥｃｏＲＩで線状化された。Ｉｎ ｓｉｔｕ解析は、そうしてＰｏｕｌｓｏｍ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２： １２１−１３２に述べられるように、行われた。
【図２７−２】ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの発現（Ａ）骨盤細動脈（ａ）および細静脈（ｂ）におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出されたＭＲの発現（左、明視野および右、暗視野）。（ｃ）骨盤細動脈におけるｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの免疫組織化学染色。左、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒコントロールおよび右、ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ。（Ｂ）腫瘍内皮におけるＭＲの発現。ガングリオグリオーマの（ａ）ｘ２０および（ｂ）ｘ５０。左、明視野；右、暗視野。矢印はその中に赤血球細胞のある切片を斜めに走り降りる血管を強調する。内皮細胞は、ＭＲの発現に強い陽性を示す。Ｐａｐｉｌｌａｒｙ膀胱がんの（ｃ）ｘ２０および（ｄ）ｘ５０。腫瘍のｐａｐｉｌｌａの血管中核は、強く陽性を示し、特に矢印で示された“平らな”内皮細胞が強い陽性を示す。Ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔアンチセンスｉｎ ｓｉｔｕプローブは、ＩＭＡＧＥ ＥＳＴクローン１９１２０９８ （ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃ． ＡＩ２７８９４９）からＴ３ポリメラーゼを使用して調製された。プラスミドはプローブ合成の前に、ＥｃｏＲＩで線状化された。Ｉｎ ｓｉｔｕ解析は、そうしてＰｏｕｌｓｏｍ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２： １２１−１３２に述べられるように、行われた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
“ポリペプチドＥＣＳＭ４”によって、我々は以下のポリペプチドを含める、その配列が図４または５または７または１２または１３に与えられたアミノ酸配列を構成する、あるいはそれから構成されるもの、またはその配列が図４のヌクレオチド１と１３９５の間、あるいは図５、または図７のヌクレオチド２と９４８の間、あるいは図１２のヌクレオチド７１と３４４２の間、あるいは図１３のヌクレオチド６と３０５０の間、およびそれらの天然の異型において与えられたヌクレオチド配列によってコードされるものである。好ましくは、ＥＣＳＭ４ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が図４または図１２において与えられた配列を含むものである。
“ポリペプチドＥＣＳＭ４”によって、我々は次のＳＥＱ ＩＤによって表される、あるポリペプチドを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＥＰ １０７４６１７のＮｏ １８０８５、ＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ００／５３７５６またはＷＯ ９９／４６２８１のＮｏ ２１１、ＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８または３９、ＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ９９／１１２９３のＮｏ ８６、または以下のＳＥＱ ＩＤによって表されるポリペプチドを含む、 ＳＥＱ ＩＤ ＥＰ １０７４６１７のＮｏ１８０８４または５０９６、ＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ００／５３７５６またはＷＯ ９９／４６２８１のＮｏ ２１０、またはＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２３、２４、９６、またはＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ９９／１１２９３のＮｏ ３１。
【００１６】
“ポリペプチドＥＣＳＭ４”によって、我々は任意の天然に生じるポリペプチドをも含み、そのポリペプチドは、図４または５または７または１２または１３において与えられたポリペプチド配列の連続した５０アミノ酸残基部分、またはそれらの天然の異型を含む。好ましくは、そのポリペプチドはヒト由来のポリペプチドである。
【００１７】
本発明の本特徴点の実施態様および骨子は、以下により詳細に述べられるようなことである。
【００１８】
本発明の第二の特徴点は、（ｉ）ポリペプチドＥＣＳＭ１に選択的に結合する一部分、および（ｉｉ）さらなる部分を構成する化合物を与えることである。
【００１９】
好ましくは、本発明の第一および第二の特徴点において、結合部分およびさらなる部分は、共有結合による。
【００２０】
“ポリペプチドＥＣＳＭ１”によって、我々は、そのアミノ酸配列が図２、およびその天然の異型に与えられた配列から構成される、あるいは含むような、ポリペプチドを含める。
【００２１】
“ポリペプチドＥＣＳＭ１”によって、我々は任意の天然に生じるポリペプチドをも含み、そのポリペプチドは、図２において与えられたポリペプチド配列の連続した５０アミノ酸残基部分、またはそれらの天然の異型を含む。好ましくは、そのポリペプチドはヒト由来のポリペプチドである。
【００２２】
好ましくは、ポリペプチドＥＣＳＭ１アミノ酸配列は、図２に与えられた配列を含むが、ＷＯ ９９／０６４２３の意図による１９９７年７月１７日になされたＡＴＣＣ寄託Ｎｏ ２０９１４５によってコードされたアミノ酸配列は含まない。
【００２３】
“天然の異型”によって、我々は、例えば対立異型を含む。一般的に、これらは１または２または３アミノ酸残基のみによって、与えられた配列と異なるが、通常１０または２０アミノ酸残基以上によってではない。一般的に、異型における置換は保存されている。
【００２４】
本発明の、第一または第二の特徴の好ましい実施態様において、特異的なポリペプチドへ選択的に結合することが可能な分子は、抗体である。
【００２５】
好ましくは、抗体はＥＣＳＭ１またはその天然の異型に選択的に結合し、ＷＯ ９９／０６４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２によってコードされた、またはＷＯ ９９／０６４２３の意図による１９９７年７月１７日になされたＡＴＣＣ寄託Ｎｏ ２０９１４５の核酸によってコードされたポリペプチドに結合するものではない。
【００２６】
好ましくは、ＥＣＳＭ１に選択的に結合する抗体は、そのアミノ酸配列が図２またはその天然の異型において与えられた配列を含むポリペプチド、１９９７年７月１７日になされたＡＴＣＣ寄託Ｎｏ ２０９１４５によってコードされたアミノ酸配列を含まないポリペプチドに結合するものである。
【００２７】
好ましくは、ＥＣＳＭ４に選択的に結合する抗体は、配列ＧＧＤＳＬＬＧＧＲＧＳＬ、ＬＬＱＰＰＡＲＧＨＡＨＤＧＱＡＬＳＴＤＬ、ＥＰＱＤＹＴＥＰＶＥ、ＴＡＰＧＧＱＧＡＰＷＡＥＥまたはＥＲＡＴＱＥＰＳＥＨＧＰ、あるいはＥＣＳＭ４の細胞外部分に位置する任意の配列をもつポリペプチドに選択的に結合するものである。下により詳細に述べるように、これらの配列は、ヒトＥＣＳＭ４においてのみ見られ、マウスＥＣＳＭ４ポリペプチド配列においては見られないアミノ酸配列を表している。
【００２８】
好ましくは、ＥＣＳＭ４に選択的に結合する部分は、抗体のように、そのアミノ酸配列が図４、５、７、１２、１３の任意の一つ、あるいはその天然の異型において与えられた配列を含むような、ポリペプチドに結合するが、ＳＥＱ ＩＤ ＥＰ １０７４６１７のＮｏ １８０８５、ＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ００／５３７５６またはＷＯ ９９／４６２８１のＮｏ ２１１、ＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８または３９、ＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ９９／１１２９３のＮｏ ８６、の任意の一つによって表されたポリペプチド、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＥＰ １０７４６１７のＮｏ１８０８４または５０９６、ＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ００／５３７５６またはＷＯ ９９／４６２８１のＮｏ ２１０、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２２、２３、２４、９６、または９８、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＷＯ ９９／１１２９３のＮｏ ３１以下のＳＥＱ ＩＤによって表されたヌクレオチド配列の任意の一つによってコードされたポリペプチドには結合しないものである。
【００２９】
“抗体”によって、我々は全体のイムノグロブリン分子だけでなく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、のような、その断片、および抗原結合部位を残した、その他の断片もまた含める。同様に、”抗体”という語は、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）やドメイン抗体（ｄＡｂｓ）のような遺伝学的に加工された抗体の派生物を含む。その語は、また抗体様の分子を含み、これはＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に結合する分子のためのファージディスプレイ技術または他のランダム選択技術を利用して生産されるかも知れない。
【００３０】
抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）は抗原認識に関わっているが、これは初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された事実である。さらなる確認は、げっ歯類の抗体の”ヒト化”によってなされた。げっ歯類起源の可変領域が、ヒト起源の不変領域に融合されるが、結果生じた抗体は、げっ歯類のもとの抗体の抗原特異性を残すようなものだった（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１， ６８５１−６８５５）。
【００３１】
抗原特異性は、可変領域によって与えられ、不変領域とは独立していることは、抗体断片、すべて一つまたはそれ以上の可変領域を含む、のバクテリアによる発現を行った実験によって知られる。これらの分子は、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０， １０４１）； Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０， １０３８）； 単鎖Ｆｖ （ＳｃＦｖ）分子、そこではＶＨおよびＶＬパートナー領域がフレキシブルなオリゴペプチドを介して連結している（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ５８７９）、および単離されたＶ領域を含む単領域抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１， ５４４）を含む。特異的な結合部位を残した抗体断片の合成に関する技術の一般的な総説は、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９， ２９３−２９９においてみられるものである。
【００３２】
“ＳｃＦｖ 分子”によって、我々はＶＨおよびＶＬパートナー領域が、フレキシブルなオリゴペプチドを介して連結したような分子を意味する。
【００３３】
抗体全体より、むしろ抗体断片を使用することの優位性は、数倍である。断片のより小さなサイズは、標的部位へのよりよい浸透のような、改良された薬理的な性質に導くかもしれない。補体結合のような、抗体全体のエフェクター機能は除かれる。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片をすべて、大腸菌において発現し、大腸菌から分泌することが可能であり、このように上記の断片の大容量を容易に生産することが可能である。
【００３４】
全体の抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は、”二価”である。”二価”によって、我々は、上記の抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が、二つの抗原結合部位をもつことを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は一価であり、抗原結合部位を一つのみもつ。
【００３５】
抗体は、ポリクローナル抗体であるかも知れないけれども、それがモノクローナル抗体であれば、好ましい。ある状況では、抗体がヒトの患者に繰り返し投与されるものであれば、特に、モノクローナル抗体は、ヒトのモノクローナル抗体またはヒト化されたモノクローナル抗体であれば、好ましい。
【００３６】
適したモノクローナル抗体は、上記の様に、反応性の高く、既知の技術によって調製されるかも知れない、例えば、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”， Ｈ Ｚｏｌａ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９８８）および”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”， ＳＧＲ Ｈｕｒｒｅｌｌ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９８２）に述べられている技術によって。生成されるかもしれないポリクローナル抗体は、多価または一価特異的である。ポリクローナル抗体は、一価特異的であることが好ましい。
【００３７】
キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９８， ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐａｒｔ ２， ７９２−７９９）によって議論されている。
【００３８】
適切に調製された非−ヒト抗体は、既知の方法、例えばマウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体の枠組みへ挿入することで”ヒト化”されうる。
【００３９】
抗体は、それらが、ヒト抗ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４抗体のアミノ酸配列をもつという意味において、ヒト抗体であるかも知れないが、それらは技術的にヒトの免疫を必要としない方法を使用して調製されるかも知れない。例えば、トランスジェニックマウスは、実質的に、ヒトイムノグロブリン遺伝子を含むものはどちらでも利用可能である（参照Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６， ５３５−５３９）。
【００４０】
他の実施例において、ポリペプチドに選択的に結合できる分子は、ペプチドである。ＥＣＳＭ４／ｍａｇｅｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔポリぺプチドは、ショウジョウバエ、マウス、ヒトｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ蛋白質、分泌されたＳｌｉｔ蛋白質の細胞表層受容体、にホモロジーを示す（Ｌｉ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｃｅｌｌ ９６： ８０７−８１８）。ＥＣＳＭ４／ｍａｇｅｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの任意の同起源のリガンドは、細胞外に位置するポリペプチドの領域に選択的に結合することができ、効果的であるかも知れない。ＥＣＳＭ４の細胞外領域は、図１２に与えられたＥＣＳＭ４ポリペプチド配列の残基１−４６７の中に位置しているようだ。ある種のペプチドはＥＣＳＭ４の同起源のリガンドである可能性が考えられている。そのようなペプチドは、ＥＣＳＭ４／ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔに選択的に結合するための適切な分子であるであろう。ＥＣＳＭ４に結合するペプチドは、スクリーンによって同定されうる。選択的にＥＣＳＭ４に結合するペプチド、または他の分子を同定するのに適した方法あるいはスクリーンは、結合が生じるような条件で、試験ペプチドまたは他の分子とＥＣＳＭ４ポリペプチドを接触させること、およびそうして、試験分子またはペプチドがＥＣＳＭ４に結合するかどうか決定することを含むかもしれない。二つの分子間の結合を検出する方法は、生化学の技術としてよく知られている。好ましくは、ファージディスプレイの既知の技術は、ＥＣＳＭ４に結合するペプチド、または他のリガンド分子を同定するために使用される。他の方法は、酵母ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍを含める。
【００４１】
ＥＣＳＭ４に選択的に結合するペプチドまたは他の因子は、ＥＣＳＭ４の機能を調節あるいは阻害するものを含める。
【００４２】
適切なペプチドは、下により詳細に述べたように合成されるかも知れない。
【００４３】
さらなる部分は、化合物に疾患、または他の状況、または望ましくない新生血管系の形成を伴う状態の治療、またはイメージング、または診断に関して、有益な性質を与える、任意の分子であるかも知れない。そのような疾患、または他の状況、または状態について、以下により詳細に述べる。特に、さらなる部分は、腫瘍の成長と関連した新生血管系を除去、またはイメージングすることにおいて、有益であるものである。好ましくは、さらなる部分は、上皮細胞を殺すことができるものであり、そこに化合物は標的にされる。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様において、さらなる部分は、直接あるいは間接的に細胞毒性をもつ。特に、さらなる部分は、新生血管系における細胞、あるいは新生血管系に非常に近接、および関連した細胞にとって、直接あるいは間接的に毒であることが望ましい。
【００４５】
“直接細胞毒性”によって、我々は、その分子がそれ自身、細胞毒性をもつと言う意味を含める。“間接細胞毒性”によって、我々は、分子がそれ自身は細胞毒性は示さないけれども、細胞毒性を誘導しうるという意味を含める。例えば、さらなる部分におけるその作用によって、または、それにおけるさらなる作用によって。
【００４６】
ある実施態様において、細胞毒性を示す分子は、細胞毒性化学療法剤である。細胞毒性化学療法剤は技術的に良く知られている。
【００４７】
抗癌剤のような細胞毒性化学療法剤は、メクロレタミン（Ｈ２Ｎ）、シクロフォスファミド、イフォスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）およびクロラムブシルのようなニトロジェンマスタードを含めるアルキル化剤； ヘキサメチルメラミン、チオテパのようなエチレンイミンおよびメチルメラミン； ブスルファンのようなアルキルスルフォネート； カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（ｍｅｔｈｙｌ−ＣＣＮＵ）およびストレプトゾシン （ストレプトゾトシン）のようなニトロソウレア； およびデカルバジン（ＤＴＩＣ； ジメチルトリアゼノイミダゾール−カルボキサミド）のようなトリアゼン； メトトレキセート（アメトプテリン）のような葉酸類似体； フルオロウラシル（５−フルオロウラシル； ５−ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン； ＦＵｄＲ）およびシタラビン（シトシンアラビノシド）のようなピリミジン類似体； およびメルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン； ＴＧ）およびペントスタチン（２’−デオキシコフォルマイシン）を含める抗代謝産物を含む。ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンのようなビンカアルカノイド； エトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン； ダクチノマイシン（アクチノマイシン Ｄ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミスラマイシン）およびマイトマイシン（マイトマイシン Ｃ）のような抗生物質； Ｌ−アスパルギナーゼのような酵素； およびインターフェロンアルフェノムのような生物反応修飾物質を含める天然産物。シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＯＰ）およびカルボプラチンのようなプラチナムコーディネーアホン複合体； ミトキサントローネおよびアンスラサイクリンのようなアンスラセンジオン； ヒドロキシウレアのような置換された尿素； プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン， ＭＩＨ）のようなメチルヒドラジン誘導体； およびミトターン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドのようなアドレノコーティカル抑制剤； タキソールおよびその類似体／派生物； およびフルタミドおよびタモキシフェンのようなホルモンアゴニスト／アンタゴニストを含める種々雑多な薬剤。
【００４８】
これらの薬剤の多くは、以前に抗体および他の標的部位−配送薬剤に添付されており、これらの薬剤を含む本発明の化合物は、技術的に習熟した人物によって容易に製造されるかも知れない。例えばｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ （Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ ＆ Ｗｉｌｃｈｅｋ （１９８０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７０， １５１−１５９； 参考のためにここに示す）は、ドキソルビシンを含めた様々な薬剤を抗体あるいはペプチドに共役するために使用されるかもしれない。
【００４９】
Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅは、一般式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’をもつ一群の化合物を含む。ここで、ＲおよびＲ’は、脂肪族化合物または芳香族化合物であり得、そしてペプチド結合の合成に使用される。調製手順は簡単、比較的はやく、穏やかな条件下行われる。カルボジイミド化合物は、カルボキシル基を攻撃して、それらを遊離のアミノ酸にとって反応性の高い部位に変化させる。
【００５０】
水溶性のカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、特に結合する分子に機能的な分子を結合させることにおいて、有効であり、腫瘍ホーミングペプチドにドキソルビシンを結合させるために使用されるかも知れない。ドキソルビシンと結合分子の結合は、ドキソルビシンによって供与される、アミノ基と抗体またはペプチドのような結合分子によって供与される、カルボキシル基の存在を必要とする。
【００５１】
ペプチド結合の直接の形成にカルボジイミドを使用することに加え、ＥＤＣもまたＮ−ヒドロキシスクシニイミド（ＮＨＳ）エステルのような活性を有するエステルを調製するために使用される。ＮＨＳエステルは、アミノ基にのみ結合し、そうしてドキソルビシンの一つのアミノ基でアミド結合の形成を誘導するために使用される。ＥＤＣおよびＮＨＳの同時の使用は、一般的に共役形成の収率を高めるために、共役に用いられる（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ ＆ Ｗｉｌｃｈｅｋ， ｓｕｐｒａ， １９８０）。
【００５２】
結合分子に機能的分子を共役させる他の方法もまた使用される。例えば、過ヨウ素酸ナトリウム酸化後の、適切な反応物の還元的アルキル化が、グルタルアルデヒド架橋をすることができる様に、使用される。しかしながら、本発明の共役を生成するために、どの方法が選択されるかには関わらず、決定は、結合分子がそのターゲティング能力を維持し、機能的分子がその関連する機能を維持するように行わなければならない。
【００５３】
本発明のさらなる実施態様において、細胞毒性を有する分子は、細胞毒性ペプチド、あるいは細胞死を導く任意の分子が含まれるようなポリペプチド分子である。細胞毒性を有するペプチドおよびポリペプチドッ分しは技術的によく知られ、例えばリシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ エキソトキシン、組織因子およびその同等物を含む。それらを抗体のようなターゲティング分子に結合させる方法もまた、技術的によく知られている。細胞毒性薬剤としてリシンを使用することは、Ｂｕｒｒｏｗｓ ＆ Ｔｈｏｒｐｅ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ８９９６−９０００、参考のためここに示す、に述べられており、組織因子の使用は、局所的な血液凝固および腫瘍の梗塞を生じるが、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８， ４６４６−４６５３およびＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５， ５４７−５５０によって述べられている。Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｄｉｓ． Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ３８， １０６７−１０７４は、モノクローナル抗体に共役されたアブリン Ａ鎖について述べており、参考のためここに示す。他のリボソーム不活化蛋白質は、細胞毒性薬剤としてＷＯ ９６／０６６４１に述べられている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ エキソトキシンもまた、細胞毒性を有するポリペプチド分子として使用されるかも知れない（例えば、Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２， １０４５７−１０４６１参照； 参考のためここに示す）。
【００５４】
ＴＮＦａおよびＩＬ−２のようなある種のサイトカインもまた、細胞毒性薬剤として有効であるかも知れない。
【００５５】
ある種の放射性原子もまた、十分量投与されれば細胞毒であるかもしれない。このように、細胞毒分子は、使用すると細胞毒であるように標的部位に十分な量の放射活性を配送する、放射性原子を含むかも知れない。適切な放射性原子は、リン−３２、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、レニウム−１８６、レニウム−１８８、またはイットリウム−９０あるいは隣接する細胞、オルガネラ、または核酸を破壊するに十分なエネルギーを発する他の任意の同位体を含む。好ましくは、本発明の化合物における同位体および放射性元素の密度は、４０００ ｃＧｙ （好ましくは、少なくとも６０００、８０００あるいは１００００ ｃＧｙ）以上の投与量が標的部位、および好ましくは標的部位における細胞およびそれらのオルガネラ、特に核へ運ばれるようなものである。
【００５６】
放射性原子は、既知の方法で結合分子に添付されるかも知れない。例えばＥＤＴＡあるいは他のキレート化試薬は結合分子に添付され、１１１Ｉｎまたは９０Ｙを添付するのに使用されるかも知れない。チロシン残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識されるかも知れない。
【００５７】
細胞毒分子は、間接的に適した細胞毒ポリペプチドであるかも知れない。特に好ましい実施態様において、間接的に細胞毒性を有するポリペプチドは、酵素活性をもつ、および比較的毒性の無いプロドラッグを細胞毒ドラッグに変換することのできる、ポリペプチドである。ターゲティング分子が抗体であるとき、この種のシステムはよくＡＤＥＰＴ （Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ）と呼ばれる。このシステムは、ターゲティング分子が酵素部分を患者の体内の目標の部位（例えば、腫瘍と関連する新たな血管組織のような、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４を発現している部位）へ位置付けることを必要とする。そして酵素が特異的な部位に局在化する時間をとった後に、酵素の基質であるプロドラッグを投与する、触媒反応の終産物は細胞毒化合物である。アプローチの目的は、目標の部位での薬剤濃度を最大にし、正常組織における薬剤濃度を最小にすることである（参照Ｓｅｎｔｅｒ， Ｐ． Ｄ． ｅｔ ａｌ （１９８８） ”Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ４８４２−４８４６； Ｂａｇｓｈａｗｅ （１９８７） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５６， ５３１−２； ａｎｄ Ｂａｇｓｈａｗｅ， Ｋ． Ｄ． ｅｔ ａｌ （１９８８） ”Ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ ｃａｎ ｂｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｉｔｅｓ” Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ５８， ７００−７０３．）。
【００５８】
明らかに、任意のＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４結合分子は、この種の指向性酵素プロドラッグ療法システムにおいて、抗ＥＣＳＭ１または抗ＥＣＳＭ４抗体に代わって使用されているかも知れない。
【００５９】
ここに述べたように、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４を標的とした酵素を使用するシステムの酵素およびプロドラッグは、以前に提案されたもののうち任意のものであるかも知れない。細胞毒物質は、アルキル化剤； ＤＮＡに挿入される薬剤； ジヒドロフォレートレダクターゼ、チミジンシンテターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ヌクレオチドキナーゼまたはトポイソメラーゼのような任意の鍵酵素を阻害する薬剤； あるいは任意の他の細胞構成物と相互作用することによって細胞死を引き起こす薬剤、のような任意の既に存在する抗癌剤であるかもしれない。エトポシドは、トポイソメラーゼ阻害剤の例である。
【００６０】
報告されたプロドラッグシステムは、次のものを含む： Ｅ． ｃｏｌｉ ｂ−グルクロニダーゼによって活性化されたフェノールマスタードプロドラッグ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９２ ａｎｄ Ｒｏｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９１）； ヒトｂ−グルクロニダーゼによって活性化されたドクソルビシンプロドラッグ（Ｂｏｓｓｌｅｔ ｅｔ ａｌ， １９９４）； さらにコーヒー豆ａ−ガラクトシダーゼによって活性化されたドクソルビシンプロドラッグ（Ａｚｏｕｌａｙ ｅｔ ａｌ， １９９５）； コーヒー豆ａ−Ｄ−ガラクトシダーゼによって活性化されたダウノルビシンプロドラッグ（Ｇｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９４）； Ｅ． ｃｏｌｉ ｂ−Ｄ−ガラクトシダーゼによって活性化された５−フルオロウリジンプロドラッグ（Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ， １９９４）； およびカルボキシペプチダーゼＡによって活性化されたメトトレキセートプロドラッグ（例えば、メトトレキセート−アラニン）（Ｋｕｅｆｎｅｒ ｅｒ ａｌ， １９９０， Ｖｉｔｏｌｓ ｅｔ ａｌ， １９９２ ａｎｄ Ｖｉｔｏｌｓ ｅｔ ａｌ， １９９５）。これらおよび他のものは次の表に記載した。
【００６１】
【表１】
2010248210.tif 000002
（この表は、Ｂａｇｓｈａｗｅ （１９９５） Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ． ３４， ２２０−２３０， から書き換えられた。ここから、これらの様々なシステムについての完全な参考文献が得られるかもしれない；タクソール誘導体はＲｏｄｒｉｇｕｅｓ， Ｍ． Ｌ． ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２， ２２３）。
【００６２】
本発明の酵素の部分に適した酵素は、以下のものを含む： カルボキシペプチダーゼＧ、Ｇ１およびＧ２ （グルタミン酸化したマスタードプロドラッグにおいて）、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ （ＭＴＸを基にしたプロドラッグにおいて）、およびアミノペプチダーゼ （２−ａ−アミノシルＭＴＣプロドラッグにおいて）のようなエキソペプチダーゼ； 例えばトロンボリシン（トロンビンプロドラッグにおいて）のようなエンドペプチダーゼ； フォスファターゼ（例えばアルカリフォスファターゼ）またはスルファターゼ（例えばアリルスルファターゼ）（リン酸化または硫酸化されたプロドラッグにおいて）のような加水分解酵素； ペニシリンアミダーゼおよびアリルアシルアミダーゼのようなアミダーゼ； ｂ−ラクタマーゼのようなラクタマーゼ； ｂ−グルクロニダーゼ（ｂ−グルクロノミドアントラサイクリンにおいて）、ａ−ガラクトシダーゼ（アミグダリンにおいて）、およびｂ−ガラクトシダーゼ（ｂ−ガラクトースアントラサイクリンにおいて）のようなグリコシダーゼ； シトシンデアミナーゼ（５ＦＣにおいて）のようなデアミナーゼ； ウロキナーゼおよびチミジンキナーゼ（ガンシクロビルにおいて）のようなキナーゼ； ニトロレダクターゼ（ＣＢ１９５４およびアナログにおいて）、アゾレダクターゼ（アゾベンゼンマスタードにおいて）およびＤＴ−ジアホラーゼ（ＣＢ１９５４において）のようなレダクターゼ； グルコースオキシダーゼ（グルコースにおいて）、キサンチンオキシダーゼ（キサンチンにおいて）、およびラクトペルオキシダーゼのようなオキシダーゼ； ＤＬ−ラセマーゼ、触媒抗体およびシクロデキストリン。
【００６３】
プロドラッグは、細胞毒にくらべて比較的、毒性は弱い。一般的に、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験において検定したときに、毒性は１０％以下、好ましくは１％以下である。
【００６４】
プロドラッグを細胞毒性薬剤に変換することのできる分子は、化合物の残りから単離するときに活性型であるが、（ａ）化合物の残りと一緒に存在するとき、および（ｂ）化合物が標的細胞に、付着、隣接、取り込まれるとき、にのみ活性型である必要がある。
【００６５】
化合物のそれぞれ分子がポリペプチドであるとき、二つの部分がポリペプチドを架橋するための従来の方法、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ （１９７９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １００， １００−１０８に一般的に述べられている方法のような、のどれかによって、一緒に結合されるかも知れない。例えば、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４結合分子は、チオール基で濃縮されるかも知れず、さらなる部分はそれらのチオール基と反応性をもつ二価性の薬剤と反応した、例えばヨード酢酸（ＮＨＩＡ）またはＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルである。アミドおよびチオエステル結合は、例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルでなされた、一般的にジスルフィド結合よりもｉｎ ｖｉｖｏでは安定である。
【００６６】
または、化合物は組み換えＤＮＡ技術によって、融合化合物として生産されるかも知れない。そこでは、ＤＮＡの長さは、お互い隣り合う、または化合物の望ましい性質を壊さないような、リンカーペプチドをコードする領域によって分けられた、本発明の二つの分子をコードするそれぞれの領域を含む。考えうるところでは、化合物の二つの部分は全体的に、または部分的に、重なっているかも知れない。
【００６７】
ＤＮＡは、こうして本発明の化合物を含むポリペプチドを生じる様に、適切な宿主において発現される。
【００６８】
本発明はまた、（１）本発明の化合物、その中で、さらなる部分は、比較的毒性の低いプロドラッグを細胞毒性薬剤に変換することのできるものであり、および（２）比較的毒性の低いプロドラッグ、を含むパーツの一式（あるいは療法システム）を供給する。
【００６９】
本発明はまた、（１）本発明の化合物、その中でさらなる部分は、直接的または間接的に細胞毒性を示す分子、あるいは容易に検出できる分子に選択的に結合することができ、（２）化合物のさらなる部分が結合することのできる、直接的または間接的に細胞毒性を示す、あるいは容易に検出できる分子の任意の一つを含むパーツの一式（あるいは療法システム）を供給する。
【００７０】
細胞毒性を示す分子は、放射線感受性増強物質であるかもしれない。放射線感受性増強物質は、フルオロピリミジン、チミジン類似体、ヒドロキシウレア、ジェンシタビン、フルダラビン、ニコチンアミド、ハロゲン化ピリミジン、３−アミノベンザミド、３−アミノベンゾジアミド、エタニキサドール、ピモニダゾール、およびミソニダゾール（参照、例えば、ＭｃＧｉｎｎ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８８， １１９３−１１２０３； Ｓｈｅｗａｃｈ ＆ Ｌａｗｒｅｎｃｅ （１９９６） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １４， ２５７−２６３； Ｈｏｒｓｍａｎ （１９９５） Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ． ３４， ５７１−５８７； Ｓｈｅｎｏｙ ＆ Ｓｉｎｇｈ （１９９２） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０， ５３３−５５１； Ｍｉｔｃ，ｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｂｉｏｌ． ５６， ８２７−８３６； Ｉｌｉａｋｉｓ ＆ Ｋｕｒｔｚｍａｎ （１９８９） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｏｎｃｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｐｈｙｓ． １６， １２３５−１２４１； Ｂｒｏｗｎ １９８９） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｏｎｃｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｐｈｙｓ． １６， ９８７−９９３； Ｂｒｏｗｎ （１９８５） Ｃａｎｃｅｒ ５５， ２２２２−２２２８）を含む。
【００７１】
細胞内への遺伝子の運輸もまた、それらの放射線感受性を増強しうる、例えば、ｐ５３遺伝子またはサイクリンＤの搬送（Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ８９， １２５−１３２； Ｃｏｃｏ Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９， １１３４−１１４０）。
【００７２】
さらなる部分は、放射線照射により細胞毒になる、または細胞毒分子を放出するものであるかも知れない。例えば、ボロン−１０放射性同位体は、適切に照射されると、細胞毒であるａ粒子を放出する（参照、例えば、ＵＳ４，３４８，３７６ ｔｏ Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ； Ｐｒｉｍｕｓ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． ７， ５３２−５３５）。
【００７３】
同様に、細胞毒分子はフォトフリンのような、光力学的療法において有効なものであるかも知れない（参照、例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９０， ８８９−９０５）。
【００７４】
さらなる部分は、直接または間接的に細胞毒性を示す核酸分子を含むかもしれない。例えば、核酸分子は、標的部位での局在化により細胞の中に入り、細胞死に導くアンチセンスオリゴヌクレオチドであるかも知れない。それゆえに、オリゴヌクレオチドは、必須遺伝子の発現を妨げ、あるいはアポトーシスを引き起こす遺伝子発現させるようなものであるかもしれない。
【００７５】
適切なオリゴヌクレオチドの例は、ｂｃｌ−２に向けたもの（Ｚｉｅｇｌｅｒ ｅｒ ａｌ （１９９７） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８９， １０２７−１０３６）およびＤＮＡポリメラーゼａおよびトポイソメラーゼＩＩａ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １６， １８０５−１８１１）を含める。
【００７６】
ペプチド核酸は、慣習的に用いられてきた核酸の代わりに有用であるかも知れない（参照Ｋｎｕｄｓｅｎ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ （１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ８， １１３−１１８）。
【００７７】
さらなる実施態様において、結合分子は、標的へ核酸を運ぶためのｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅに含まれるかも知れない。Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅは、任意の適切なｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅであるかも知れない。例えば、それは、核酸を含むリポソームかも知れない、またはそれは、核酸を運ぶことの可能なウイルスあるいはウイルス様の粒子であるかも知れない。これらの場合において、選択的にＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する部分は、適切な抗体断片のように、リポソームの外側表面に存在しているかも知れない。そして、運ばれる核酸は、リポソームの内側に存在しているかも知れない。他の例のように、ウイルスベクター、レトロウイルスまたはアデノウイルスベクターのような、は加工されて、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する部分は、ウイルス粒子の表面に付着、あるいは位置し、こうしてウイルス粒子を目標の部位へ選択的に運ぶことが可能になる。標的配送システムはまた、ＷＯ ９４／１０３２３に述べられている、改変されたアデノウイルスシステムのように、知られている。Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２， ６６０−６６８は、細胞選択のための分子を線維蛋白質に加えるための、アデノウイルスの改変について述べている。標的にされたレトロウイルスもまた、本発明において使用可能である； 例えば、特異的な結合親和性を与える配列が、既に存在しているウイルスｅｎｖ遺伝子中に挿入されるように、加工されるかも知れない（参照Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｖｉｌｌｅ （１９９５） Ｆａｓｅｂ Ｊ． ９， １９０−１９９、遺伝子療法のための、この、および他の標的ベクターの総説として）。
【００７８】
イムノリポソーム（抗体に向けたリポソーム）が使用されるかもしれない、そこでは、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する部分は、抗体である。イムノリポソームの調製には、ＭＰＢ−ＰＥ（Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］−フォスファチジルエタノールアミン） が、Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ （１９８２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７， ２８６−２８８． の方法に従って、合成される。ＭＰＢ−ＰＥをリポソーム二重層に取り込ませ、リポソーム表面に抗ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４抗体、またはその断片を共有結合させる。リポソームは、ＤＮＡまたは他の遺伝子構築物を装填して標的細胞へ運ばせるのに便利であり、この装填は、例えば、ＤＮＡまたは他の遺伝子構築物の溶液中で上記のリポソームを形成させ、０．８ＭＰａまでの窒素圧下、０．６μｍおよび０．２μｍ孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを連続的に通すことによって、行う。通過後、捕捉されたＤＮＡ構築物は、８００００×ｇで４５分間の超遠心によって、遊離しているＤＮＡ構築物から分離される。脱酸素処理したバッファー中で、新しく調製したＭＰＢ−ＰＥリポソームを新たに調製した抗体（またはその断片）と混合し、共役反応をくるくると一定の回転数で窒素大気中、一晩回転させて行う。イムノリポソームは、８００００×ｇで４５分間の超遠心によって、結合していない抗体から分離する。イムノリポソームは、腹膜腔内に、あるいは直接腫瘍に注入されるかもしれない。
【００７９】
標的部位に運ばれた核酸は、直接または間接的に細胞毒性を生じる任意の、適切なＤＮＡかもしれない。例えば、核酸は、細胞に毒性を示すリボソームをコードしているかもしれない、あるいは、実質的に無毒なプロドラッグを細胞毒ドラッグに変換することのできる酵素をコードしているかもしれない（この後者のシステムは、時折、ＧＤＥＰＴ： Ｇｅｎｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ）と呼ばれる。
【００８０】
目標へ運ばれる核酸にコードされるかもしれないリボソームは、Ｃｅｃｈ ａｎｄ Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ” ＵＳ ５，１８０，８１８； Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ “Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ＲＮＡ ｂｙ ＲＮＡｓｅ Ｐ” ＵＳ ５，１６３，０５３， Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ “Ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ＨＩＶ−１ ＲＮＡ” ＵＳ ５，１４９，７９６； Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ “ＲＮＡ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ”， ＵＳ ５，１１６，７４２； Ｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ “ＲＮＡ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ， ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅｓ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ” ＵＳ ５，０９３，２４６；およびＢｅｅｎ ｅｔ ａｌ “ＲＮＡ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ， ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅｓ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ； ｃｌｅａｖｅｓ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｔｅ ｂｙ ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， ＵＳ ４，９８７，０７１，に述べられている。すべて参考のためここに示す。リボザイムにとって適した標的は、ｃ−ｆｏｓやｃ−ｍｙｃ、およびｂｃｌ−２のような転写因子を含む。Ｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ （１９９７）は、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １７， ３３０７−３３１２の中で、ｂｃｌ−２に対するｈａｍｍｅｒｈｅａｄリボザイムを述べている。
【００８１】
ＥＰ ０ ４１５ ７３１は、ＧＤＥＰＴシステムについて述べている。酵素とプロドラッグの選択に関する同様の考察が、上述したＡＤＥＰＴシステムにおけるように、ＧＤＥＰＴシステムに当てはまる。
【００８２】
標的部位に運ばれた核酸は、直接細胞毒性を示すポリペプチドをコードするかもしれない。
【００８３】
または、さらなる部分は、ポリペプチドまたは、直接あるいは間接的に細胞毒性を示さず、療法に効果を示すポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含むかもしれない。そのようなポリペプチドの例は、動脈硬化に効果を示しうる抗増殖あるいは抗炎症サイトカインを含み、免疫調節あるいは血栓に効果のある因子は、癌の治療に効果を示すかもしれない。
【００８４】
更なる分子は、役に立つように、ペプチドアンギオスタチンまたはエンドスタチンのような血管新生の阻害剤であるかもしれない。更なる分子は、また、役に立つように、前躯体ポリペプチドをアンギオスタチンまたはエンドスタチンに変換する酵素であるかもしれない。マクロファージエラスターゼ、ゲラチナーゼ、およびソトロモリシンのようなヒトマトリックスメタロプロテアーゼは、プラスミノーゲンをアンギオスタチンに変換する（Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１， ６８４５−６８５２）。プラスミノーゲンはアンギオスタチンの前躯体である。
【００８５】
本発明のさらなる実施態様において、本発明の化合物に含まれるさらなる部分は、容易に検出できる分子である。
【００８６】
“容易に検出できる分子”によって、我々は、分子が本発明の化合物の患者への投与によって、標的部位に存在するとき、体外または標的の位置する部位の外から検出されるかもしれない、という意味を含める。このように、本発明の本実施態様の化合物は、イメージングおよび診断に有用である。
【００８７】
一般的に、容易に検出可能な分子は、イメージングに有効な放射性原子であり、あるいはそれを含む。適当な放射性原子は、シンチグラフィーの研究のためのテクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１２３を含む。他の容易に検出できる分子は、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フルオリン−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄のような核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のためのスピンラベルを含む。明らかに、本発明の化合物は、分子が容易に検出されるために、十分な量の適切な同位体元素を持たなければならない。
【００８８】
放射性あるいは他のラベルは、本発明の化合物に既知の方法で取り込まれる。例えば、結合分子がポリペプチドであれば、それは生合成されるかも知れない、あるいは関係する、適切なアミノ酸前駆体を使用して、例えば、水素の代わりにフルオリン−１９のように、化学アミノ酸合成によって合成されるかも知れない。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、および１１１Ｉｎのようなラベルは、例えば、結合分子のシステイン残基を介して結合する。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合する。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ （１９７８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ８０， ４９−５７）は、ヨウ素−１２３を取り込むために使用されうる。参考文献（”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”， Ｊ−Ｆ Ｃｈａｎｔａｌ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）は、他の方法について詳細に記載している。
【００８９】
本発明の更に好ましい実施態様において、さらなる部分は、直接または間接的に細胞毒性を示す分子に、あるいは容易に検出可能な分子に選択的に結合することができる。このように、本実施態様において、さらなる部分は、細胞毒あるいは容易に検出可能なさらなる化合物、または構成要素に結合する、任意の分子であるかもしれない。
【００９０】
さらなる部分は、それゆえに、さらなる化合物または構成要素に選択的に結合する抗体であるかもしれない、あるいは、それはストレプトアビジンまたはビオチンまたは同様のもののように、ある他の結合分子であるかもしれない。次の例は、本発明に含まれる分子の種類を説明する； 他のそのような分子はこの説明から明らかである。
【００９１】
二重特異性抗体において、ある結合部位はＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する部分を含み、第二の結合部位は、例えば実質的に無毒なプロドラッグを、細胞毒性を有するドラッグに変換することのできる酵素に結合する分子を含む。
【００９２】
抗体のような化合物は、ビオチンを結合したＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する。アビジンまたはストレプトアビジンは、容易に検出されるラベルで標識されており、二層イメージングシステムにおいて、ビオチンラベルされた抗体とともに使用されるかもしれない。そこでは、ビオチンラベルされた抗体は、まず患者の標的部位に局在し、そうしてラベルされたアビジンまたはストレプトアビジンが患者に投与される。二重特異性抗体およびビオチン／ストレプトアビジン（アビジン）システムは、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ （１９９６）Ｑ Ｊ Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４０， ２３４−２５１．によって批評されている。
【００９３】
本発明の好ましい実施態様において、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する部分、およびさらなる部分は、融合されたポリペプチドである。
【００９４】
本発明の第一、および第二の特徴点を持つ化合物は、治療、イメージング、あるいは疾患、特に以下に詳細に述べるような望ましくない新生血管形成を生じるような疾患を診断することにおいて有益である。
【００９５】
本発明の第一、および第二の特徴点の好ましい実施態様において、化合物は医療薬での使用に適している。
【００９６】
本発明の第三の特徴点は、本発明の第一、または第二の性質の化合物をコードする核酸を供給する。ここで、選択的に結合する部分、およびさらなる部分は融合されたポリペプチドである。
【００９７】
ポリヌクレオチドを連結する方法を以下に詳細に述べる。
【００９８】
本発明の第四の特徴点は、本発明に従う化合物と調剤において許容可能なキャリアーを含む、調剤の組成を与える。本発明の化合物は、第一、第二、および第三の特徴点で述べられたものを含む。本発明はまた、任意の抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、あるいは以下に述べるように患者に運ばれるかもしれない他の薬剤、および調剤に許容可能なキャリアーから構成される調剤組成を含む。
【００９９】
“調剤において許容可能”によっては、その剤形が、無菌的および発熱物質無しであることを含む。適切な調剤上のキャリアーは、調剤の技術においてよく知られている。
【０１００】
キャリアーは、本発明の化合物と適合している、およびその受容者にとって無害であるという意味において、”許容可能”でなければならない。一般的に、キャリアーは、無菌的および発熱物質無しの水、または生理食塩水である； しかしながら他の許容可能なキャリアーも使用されるかもしれない。
【０１０１】
一般的に本発明の調剤上の組成あるいは剤形は、非経口的投与，特に静脈内投与のためのものである。
【０１０２】
非経口投与に適した剤形は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および剤形を対象の受容者の血液と等張にする溶質を含有するかも知れない、水性または非水性の滅菌された注入液を含む； そして水性および非水性の滅菌された懸濁液は、懸濁する薬剤および濃縮する薬剤を含む。
【０１０３】
本発明の第五の特徴点は、患者の体内の血管内皮をイメージングする方法を与えることである。その方法は、本発明の第一または第二の特徴点どちらかに従い、化合物の効果的な量を患者に投与することを含む。その中で、さらなる部分は、容易に検出可能な分子である。
【０１０４】
一般的に、血管内皮は血管新生に関係している。
【０１０５】
本発明の第一、および第二の特徴点に関して上に論じたように、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する化合物の分子は、抗体であるかもしれない。好ましい抗体は上に、概説した通りである。
【０１０６】
本発明のこの特徴点の好ましい実施態様において、患者の血管内皮をイメージングする方法は、さらに患者体内の化合物の位置を検出する工程を含む。
【０１０７】
化合物または抗体の検出は、臨床イメージングおよび診断において技術的によく知られた方法を使用することによってなされる。必要とされる特異的な方法は、化合物または抗体に結合した検出可能なラベルの種類に依存している。例えば、放射性原子は、オートラジオグラフィーを使用することによって、またはある場合においては、上述したように核磁気共鳴イメージングによって検出されるかも知れない。
【０１０８】
体内の血管内皮をイメージングすることは、有効である。なぜなら、健康についての情報が得られる可能性があるからである。血管内皮に疾患を抱えるとき、癌性の生育のために血管内皮が増殖するときに、特に有効である。患者の癌をイメージングすることは、特に有用であり、それは腫瘍の大きさおよび治療が効果的であるかを決定するために使用できるからである。転移性疾患は、新しい血管の形成を伴うため、転移が生じたかを評価するのに有効である。
【０１０９】
このように、本発明の第五の特徴点の好ましい実施態様において、血管内皮は、癌において生じるような新生血管である。
【０１１０】
本発明の第六の特徴点は、患者の血管内皮に関する状態を診断、予後診断する方法を与える。その方法は、本発明の第一または第二の特徴点のいずれかに従って、患者に化合物の効果的な量を投与することを含む。ここで、さらなる部分は、容易に検出可能な分子である。
【０１１１】
状態とは、癌、動脈硬化、再狭窄、糖尿病性網膜症、関節炎、乾癬、子宮内膜症、月経過多、血管腫、および静脈奇形のような、血管内皮の異常なまたは過剰な成長を伴うものであるかも知れない。
【０１１２】
本発明の第一および第二の特徴点に関して論じたように、本化合物は抗体を含むかもしれない。抗体は、必要とされるようにポリペプチドＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する、任意の抗体であるかも知れない。ポリペプチドＥＣＳＭ４に結合する好ましい抗体は、上に概説したようなものである。
【０１１３】
本方法は、診療の補助となるものかもしれない。
【０１１４】
本発明の本特徴点の好ましい実施態様において、患者において血管内皮に関連する状態を診断する、あるいは診断を補助する方法は、さらに患者における化合物の位置を検出する工程を含む。好ましくは、内皮は新生血管系； 例えば血管由来の脈管構造、において存在する。
【０１１５】
ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４の機能は、血管内皮細胞の増殖を促進することではないかも知れない。それゆえに、内皮細胞中のこれらのポリペプチドの発現レベルは、血管内皮の健康状態について、情報を与えないかもしれない。しかしながら、そのポリペプチドの発現場所は、それらが血管成長を表しているため、情報を得ることができるかもしれない。異常な細胞増殖、癌のような、は、新たに形成された脈管構造を検出することによって診断されるかも知れない。
【０１１６】
本発明の第七の特徴点は、治療を必要とする患者を治療する方法を提供する。その方法とは、本発明の第一または第二の特徴点にしたがって、患者に化合物の効果的な量を投与する方法を含む。ここで、さらなる部分は、細胞毒性をもつもの、あるいは療法分子である。
【０１１７】
本特徴点の実施態様において、治療を必要とする患者は、増殖性疾患または血管内皮に関連する状態にある。
【０１１８】
多くの疾患と状態は、望ましくない新生血管形成を伴う。新生血管形成は、癌、乾癬、動脈硬化、月経過多、再狭窄、関節炎（炎症性およびリウマチ性の両方）、黄斑変性症、パジェット疾患、糖尿病性網膜症、およびその血管系合併症（増殖性および未熟児の、および糖尿病患者を含む）、良性血管増殖、および線維漿膜性と関連している。
【０１１９】
癌によって、は、カポジ肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、固形細胞癌（プライマリー、および第二の（転移）、血管腫（毛細血管の、および若年性（小児の）両方の）を含む血管の腫瘍、血管腫症、血管芽種が含まれる。
【０１２０】
このように、本発明は患者の治療法を含む。その患者においては、血管新生が病理に方法を与える。そしてその方法は、患者に本発明の第一または第二の特徴点の化合物を、効果的な量投与するステップを含む。このなかで、化合物のさらなる部分は、直接あるいは間接的に、患者に療法の恩恵をもたらすものである。
【０１２１】
一般的に、疾患は、望ましくない新生血管形成に関連し、その治療は、これを問題のない程度に減少させる。
【０１２２】
本発明の方法によって治療されるかもしれない腫瘍は、新たな血管の産生と関連する、任意の腫瘍を含む。
【０１２３】
語”腫瘍”は、ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃな細胞成長のあらゆる形態に関連することとして理解されるものであり、肺、肝臓、血液細胞、肌、すい臓、胃、大腸、前立腺、子宮、乳房、リンパ腺、および膀胱の腫瘍を含む。固形腫瘍は、特にふさわしい。しかしながら、白血病およびリンパ癌を含む血液の癌はまた、現在新たな血管形成を伴うと考えられており、本発明の方法によって治療されるかもしれない。
【０１２４】
一般的に、上に述べた治療法において、更なる分子は、新生血管の成長を破壊または遅らせる、または逆行させるものである。
【０１２５】
容易に認識されるのは、イメージング、診断、または治療において使用される特別な化合物に依存して、投与のタイミングは変わり、ここに発表した療法システムにおいて使用される多くの他の化合物は、変化するかもしれない。
【０１２６】
例えば、本発明の化合物が、容易に検出可能な分子、または直接細胞毒性を示す分子である場合に、その化合物のみが、適切な剤形で患者に投与されるものであるかもしれない。当然、免疫抑制剤のような他の薬剤、およびその同様の薬剤が、投与されるかもしれない。
【０１２７】
検出可能なようにラベルされた化合物に関して、化合物が標的部位にひとたび局在するとイメージングが、行われる。
【０１２８】
しかしながら、化合物が治療、イメージング、あるいは診断に有用な更なる化合物を必要とするものであれば、本発明の化合物は、投与され、標的部位に局在化するようにされるかも知れず、そうしてその後適当な時間に、更なる化合物が、投与される。
【０１２９】
例えば、上記ＡＤＥＰＴおよびＡＤＥＰＴ様システムに関して、結合部分−酵素部分からなる化合物が投与され、標的部位に局在する。ひとたびこれを実行すると、プロドラッグが投与される。
【０１３０】
同様に、例えば、化合物に含まれる更なる分子が、更なる化合物に結合するものであるような化合物に関して、化合物がまず投与され、標的部位へ局在化するようにされ、続いて更なる化合物が投与される。
【０１３１】
このように、ある実施態様において、ビオチンラベルされた抗ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４抗体が、患者に投与され、適当な時間の後に、検出可能なようにラベルされたストレプトアビジンが投与される。ストレプトアビジンがひとたび抗体が局在する部位（標的部位）に到達すると、イメージングが行われる。
【０１３２】
選択的に結合する化合物の分子は、抗体であり、そこでは抗体は、要求されるように、ポリペプチドＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する任意の抗体である。好ましい抗体は、本発明の第一および第二の特徴点において概説されたようなものである。
【０１３３】
本発明の化合物は、その更なる分子が容易に検出可能な分子であり、腫瘍の新生血管形成状態、あるいは新生血管形成が、病理に与える他の病態において有効であるかもしれないと考えられている。これは、将来的に療法の性質および成果に影響を与える重要な因子であるかもしれない。
【０１３４】
本発明の第八の特徴点は、血管内皮細胞に選択的に遺伝的物質を導入する方法を提供する。その方法は、更なる分子が核酸であるような、上述した本発明の第一または第二の特徴点に従う化合物と細胞を接触させることを含む。
【０１３５】
血管内皮細胞は、組織培養あるいは生体におけるもののような任意の血管内皮細胞である。細胞は、生体中のものであれば好ましい。生物はヒトであればさらに好ましい。血管内皮細胞は、新生血管系のものであれば、なお好ましい。例えば、それらは、血管由来の内皮細胞である。
【０１３６】
好ましくは、結合分子は抗体である。その抗体は、必要とされるようにポリペプチドＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する任意の抗体であるかもしれない。好ましくは、その抗体は、本発明の第一または第二の特徴点に関連して上述したようなものである。一般的に、結合分子は、配送媒体に含まれ、好ましくは、配送媒体は、上にさらに詳細にのべたように、リポソームである。本実施態様において、更なる分子は核酸であり、同様に上述したように、リポソーム中に含まれる。一般的に、本方法は遺伝子療法に使用され、遺伝的物質は療法的に有効である。療法に有効な遺伝的物質は、療法蛋白質をコードするものを含む。
【０１３７】
本発明の第九の特徴点は、本発明の第一または第二の特徴点にしたがった化合物の使用法を提供する。そのなかで、更なる分子は、血管内皮に伴う状態のための診断または予後診断薬製品において容易に検出可能なラベルである。
【０１３８】
上に論じたように、化合物は、その分子が選択的に結合するような抗体を含むかもしれない。その抗体は、必要とされるように、ポリペプチドＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する任意の抗体であるかもしれない。
【０１３９】
本発明の第十の特徴点は、本発明の第一または第二の特徴点にしたがった化合物の使用法を提供する。そのなかで、更なる分子は、血管内皮を伴う状態を治療するための薬の製造において、細胞毒性を示すあるいは療法に有効な分子である。
【０１４０】
血管内皮を伴う状態は、上述した。
【０１４１】
上述したように、化合物は、その分子が選択的に結合するような抗体を含むかもしれない。その抗体は、必要とされるように、ポリペプチドＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４に選択的に結合する任意の抗体であるかもしれない。
【０１４２】
本発明の第十一の実施態様は、ＥＣＳＭ４ポリペプチドの断片、または異形、または融合体、または上記の断片、または図４の残基４９および４６６の間で与えられたアミノ酸配列からなるポリペプチドではない、異形の融合体を含む、あるいは、から構成される、ポリペプチドを供給する。
【０１４３】
ＥＣＳＭ４ポリペプチドは、図４、または図５、または図７、または図１２、または図１３、において与えられたアミノ酸配列を含む、あるいは、から構成されるポリペプチドを含み、あるいは図４位置１と１３９５の間、または図５位置２と９４８の間、または図７、または図１２、または図１３のいずれかのヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドは、ＥＣＳＭ４ポリペプチドのものである。好ましくは、本発明のＥＣＳＭ４ポリペプチドは、図４に与えられたアミノ酸配列を含むが、から構成されない。
【０１４４】
好ましくは、本発明のＥＣＳＭ４ポリペプチドは、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、ＷＯ ００／５３７５６またはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１１、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８、または３９、またはＷＯ ９９／１１２９３のＮｏ ８６、またはＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８４あるいは５０９６、ＷＯ ００／５３７５６またはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１０、ＷＯ ０１／２３５２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ ２２、２３、９６、または９８、またはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１、によってコードされる任意のアミノ酸配列によって表される任意のアミノ酸配列からは構成されない。
【０１４５】
本発明の第十二の特徴点は、ＥＣＳＭ１ポリペプチドまたは断片、または異形、またはそれらの融合体、または上記の断片あるいは異形の融合体を含む、または、から構成されるポリペプチドを与える。
【０１４６】
ＥＣＳＭ１ポリペプチドは、図２に与えられるアミノ酸配列を含む、から構成されるポリペプチドを含む。好ましくは、ＥＣＳＭ１のポリペプチドまたは断片は、ＷＯ ９９／０６４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １２０に与えられる配列をもつポリペプチド、ＷＯ ９９／０６４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２によってコードされる、またはＷＯ ９９／０６４２３の目的において１９９７年７月１７日に作製されたＡＴＣＣ寄託Ｎｏ ２０９１４５の核酸によってコードされる、ポリペプチドではない。
【０１４７】
本発明は、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１由来のペプチドを含む。これらのペプチドは、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドの“断片”と考えられるかも知れないが、ｄｅ ｎｏｖｏの合成、あるいはポリペプチドの断片化によって生産されるかも知れない。
【０１４８】
ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドの“断片”は、少なくともＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドの５残基の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを含む。好ましくは、ポリペプチドの断片は、有用なアミノ酸は配列を含み、例えば、ポリペプチドの活性を残している断片、あるいは結合アッセイでの使用のための断片、あるいはＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドに特異的な抗体を産生するためのペプチドとして有用である。ＥＣＳＭ４ポリペプチドの活性は、内皮細胞反射誘導において存在するかも知れない。反射誘導は、適切な遺伝子組み換えあるいはノックアウト動物モデル、例えばマウスまたはゼブラフィッシュ、を構築することによってｉｎ ｖｉｖｏで検定されるかも知れない。それはまた、Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒまたはビデオ顕微鏡のような細胞移動アッセイで、ｉｎ ｖｉｖｏ検定されるかも知れない。一般的に、断片は、少なくとも８個の連続するアミノ酸、より好ましくは、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドの少なくとも１２または１５または２０または３０または４０または５０個の連続するアミノ酸を有する。好ましくは、ＥＣＳＭ４ポリペプチドの断片は、図４または図５または図７または図１２または図１３に与えられたアミノ酸配列を含むが、それらからは構成されない。好ましくは、ＥＣＳＭ４ポリペプチドの断片は、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１１、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８、または３９、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＮｏ ８６、によって表される任意のアミノ酸配列、あるいはＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８４または５０９６、ＷＯ ００／５３７５６またはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１０、あるいはＷＯ ０１／２３５２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ ２２、２３、９６、または９８、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１、によってコードされる任意のアミノ酸配列を含むが、それらからは構成されない。
【０１４９】
一般的に、ＥＣＳＭ４ポリペプチドの断片は、図４または図１２に示されたアミノ酸配列の部分配列をもつものである。
【０１５０】
一般的に、ＥＣＳＭ１ポリペプチドの断片は、図２に示されたアミノ酸配列の部分配列をもつものである。
【０１５１】
本発明の第十三の好ましい実施態様において、ＥＣＳＭ４ポリペプチドの断片は、以下の配列、ＬＳＱＳＰＧＡＶＰＱＡＬＶＡＷＲＡ、ＤＳＶＬＴＰＥＥＶＡＬＣＬＥＬ、ＴＹＧＹＩＳＶＰＴＡ、ＫＧＧＶＬＬＣＰＰＲＰＣＬＴＰＴ、ＷＬＡＤＴＷ、ＷＬＡＤＴＷＲＳＴＳＧＳＲＤ、ＳＰＰＴＴＹＧＹＩＳ、ＧＳＬＡＮＧＷＧＳＡＳＥＤＮＡＡＳＡＲＡＳＬＶＳＳＳＤＧＳＦＬＡＤまたはＦＡＲＡＬＡＶＡＶＤを持つ、あるいは任意のこれらの配列の少なくとも５または８または１０残基の配列を持つ断片である。これらのペプチドは、図４に示した、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドのそれぞれ、アミノ酸１６５−１８１、２７４−２８８、３１１−３２０、３３６−３５１、８−１３、８−２１、３０７−３１６、３５５−３８７、および３９０−３９９番目の残基に対応している。ペプチドＷＬＡＤＴＷ、ＷＬＡＤＴＷＲＳＴＳＧＳＲＤ、ＳＰＰＴＴＹＧＹＩＳ、ＧＳＬＡＮＧＷＧＳＡＳＥＤＮＡＡＳＡＲＡＳＬＶＳＳＳＤＧＳＦＬＡＤ、およびＦＡＲＡＬＡＶＡＶＤは、ＥＣＳＭ４ポリペプチドのマウスおよびヒトホモログとの間の、およびＥＣＳＭ４ポリペプチドおよびマウスｄｕｔｔ１蛋白質との間の保存された領域を表す。ペプチドＬＳＱＳＰＧＡＶＰＱＡＬＶＡＷＲＡ、ＤＳＶＬＴＰＥＥＶＡＬＣＬＥＬ、ＴＹＧＹＩＳＶＰＴＡ、およびＫＧＧＶＬＬＣＰＰＲＰＣＬＴＰＴは、抗体を産生するのに有効であるかも知れない。
【０１５２】
好ましいペプチドは、これらの保存された配列の少なくとも５または８または１０または１２または１５または２０の連続するアミノ酸残基からなるペプチドである。ＥＣＳＭ４のペプチドは、細胞移動、および／または生育、および／または血管の発達に影響を与えるようなものが特に好ましい。それらは、適切なスクリーニング系において同定されうる。
【０１５３】
本発明のこの特徴点の好ましい実施態様において、ＥＣＳＭ４ポリペプチドの断片は、配列ＧＧＤＳＬＬＧＧＲＧＳＬ、ＬＬＱＰＰＡＲＧＨＡＨＤＧＱＡＬＳＴＤＬ、ＥＰＱＤＹＴＥＰＶＥ、ＴＡＰＧＧＱＧＡＰＷＡＥＥ、またはＥＲＡＴＱＥＰＳＥＨＧＰをもち、あるいは、これらの任意の配列の少なくとも５または８または１０残基の配列を持つ断片である。これらのペプチドは、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドの領域（図１２に与えられた配列の、それぞれ残基４−１６、９１−１０９、２２７−２３６、２８８−３００および４４４−４５５に位置する）に対応する。そしてそれらは、マウスホモログでは保存されていない、あるいは不十分にしか保存されていない（参照図１４）。下に述べる様に、そのようなペプチドは、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドに対する抗体を産生するときに、非常に有効であるかも知れない。
【０１５４】
膜貫通領域予想ソフトウェアプログラム、ＰＲＥＤ−ＴＭＲ（インターネットサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｈｙｓ．ｂｉｏｌ．ｕｏａ．ｇｒで利用可能）、およびヒト蛋白質Ｒｏｂｏ１（その膜貫通領域は既知である。）とのアミノ酸配列アライメントに従って、図１２に示した残基１−４６７が細胞外であり、加えて細胞外に露出しているようであり、天然のリガンドの結合部位を含んでいるかも知れない。このようにＥＣＳＭ４の断片は、図１２の残基１−４６７の細胞外領域中の配列を含み、あるいは、それから構成されており、表面にＥＣＳＭ４を発現する細胞に選択的な抗体を産生させるために、有効な断片であることを表しているかも知れない。および、ポリペプチドＥＣＳＭ４の活性を調節することに、有効であるかも知れない。
【０１５５】
このように、ＥＣＳＭ４ポリペプチドの好ましい断片は、マウスＥＣＳＭ４（図１３に示したように）と比較したときに、保存されていない、少なくとも１、３、または５アミノ酸残基を含む、図１２のポリペプチド配列の断片である。より好ましくは、断片中の少なくとも７、９、１１、１３アミノ酸残基は、ヒトＥＣＳＭ４とマウスＥＣＳＭ４との間で保存されておらず、さらに好ましくは、断片中の少なくとも１５、１７、１９、または２１残基がヒトＥＣＳＭ４およびマウスＥＣＳＭ４との間で保存されていない。そのような断片配列は、図１４に示したヒトおよびマウスアミノ酸配列のアライメントから決定されるかも知れない。
【０１５６】
本発明のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチド断片は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、水疱性口内炎ウイルス糖蛋白質（ＶＳＶＧ）、またはキーホールリンペットへマシアニン（ＫＬＨ）のような他のポリペプチドに融合したときに、特に有効であると認識される。ポリペプチドの融合、または断片の融合、または本発明のポリペプチドの異形は、本発明の目的に含まれる。
【０１５７】
ＥＣＳＭ４の他の有効な断片は、ＥＣＳＭ４に選択的なリガンドに結合することのできるものである。ＥＣＳＭ４に結合するペプチドまたは他の分子のような、リガンドの同定に合った方法を、上に詳細に論じた。そのようなペプチドまたは他のＥＣＳＭ４結合分子は、リガンド結合を担うＥＣＳＭ４中のアミノ酸配列を同定するために使用されうる。分子の残りから単離されたても、なおＥＣＳＭ４に結合することができるＥＣＳＭ４の断片の同定は、スクリーンによってなされうる。一般的に、そのようなスクリーンは、ＥＣＳＭ４のリガンドをＥＣＳＭ４ポリペプチドの検定する断片と接触させ、その検定断片が、リガンドに結合するかどうかを決定することを含む。ＥＣＳＭ４の断片は、本発明の目的の範囲内であり、医療に特に有用であるかもしれない。天然のＥＣＳＭ４のリガンドに結合するＥＣＳＭ４の断片は、リガンドの効果を中和し、それによって内皮細胞の移動、生育、および／または血管発達に影響するかもしれない。このように、ＥＣＳＭ４の断片の投与は、内皮細胞の移動、生育、および／または血管発達が調整される必要のある疾患または状態の治療に、有用であるかもしれない。そのような疾患の例は、癌および動脈硬化を含む。
【０１５８】
ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチド、それらの断片または異形の“融合”は、本発明のポリペプチドおよびさらなる部分を含む分子を与える。上記のさらなる部分は、上記の分子； 例えば、その部分が分子を検出、単離すること、あるいは分子の細胞への取り込みを促進することに有用であるかもしれないもの、に望ましい性質を与えることが好ましい。その部分は、例えば、ビオチン分子、放射性分子、蛍光分子、例えば技術的に熟練した者にはよく知られている、小さい傾向発色団または緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）蛍光発色団、であるかもしれない。その分子は、免疫抗原性タグ例えばＭｙｃタグ、であるかもしれない、あるいは、その分子またはポリペプチドの細胞への取り込みを促進することのできる、技術的に熟練した者にはよく知られている親油性の分子またはポリペプチド領域であるかもしれない。
【０１５９】
ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドの“異形”は、ａｌｌｅｌｉｃな異形および天然に生じた変異型を含む天然の異形を含み、そのような変化が、実質的に上記のポリペプチドの活性を変えることのない、保存されたまたは非保存の挿入、欠失、および置換をもつ異形をも含む。ＥＣＳＭ４ポリペプチドの場合、ヒトｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ １の内皮特異的なホモログのように、内皮細胞反発性誘導によく関連しているかもしれない。さらに、挿入の結果伸張した、あるいは領域の欠失のために短縮したポリペプチドは、本発明の目的の範囲内に含まれる。例えば、細胞質側の領域の欠失は、ポリペプチドの“ドミナントネガティブ”または“ドミナントポジティブ”型の作製に有効であるかもしれない。同様に、ポリペプチドの膜貫通領域の欠失は、そのような型を生じるかもしれない。
【０１６０】
“保存された置換”によっては、Ｇｌｙ、Ａｌａ； Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ； Ａｓｐ、Ｇｌｕ； Ａｓｎ、Ｇｌｎ； Ｓｅｒ、Ｔｈｒ； Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような意図された組み合わせである。
【０１６１】
“非保存の置換”によって、われわれは、他の置換、置換された残基が置き換えられた残基の特別な修飾を模倣するもののようなものであり、例えば、リン酸化されたチロシンまたはセリンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸によって置き換えられるかもしれないが、これはアスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖がリン酸化された残基に類似しているためである（例えば、それらは中性ｐＨで負電荷をもつ）。
【０１６２】
さらに、語“異形”に含まれる非保存の置換は、一つ、時々二つ、および通常は三つは超えないアミノ酸を変える点変異である。そのような変異は、生化学の技術においてよく知られており、通常ポリペプチドの定義された性質を挿入または除去することが意図される。他の種類の非保存の変異は、システインまたはリジン残基への残基の改変または追加であり、システインまたはリジン残基は、ポリペプチドを他の分子に共有結合させるために、マレイミドまたはスクシニミド架橋剤ともに使用されうる。糖鎖付加されない蛋白質は、Ｎ−糖鎖付加の認識モチーフにアスパラギンを変換するように変異を導入されるかもしれない。そのような変化は、カンカナバリンＡビーズを使用して、ポリペプチドを精製するためのタグの創出に有効であるかもしれない。
【０１６３】
そのような異形は、技術的によく知られた、蛋白質工学および部位特異的変異導入の方法によって作製されるかもしれない。
【０１６４】
ＥＣＳＭ４の異形は、図４または図７または図１２または図１３に与えられたアミノ酸配列に少なくとも６５％の相同性、好ましくは、上記の配列に少なくとも７０％または８０％または８５％または９０％の相同性、さらに好ましくは、上記のアミノ酸配列に少なくとも９５％または９８％の相同性を示す配列を含むポリペプチドを含む。
【０１６５】
ＥＣＳＭ１ポリペプチドの異形は、図２に与えられたアミノ酸配列に少なくとも６５％の相同性、好ましくは、上記の配列に少なくとも７０％または８０％または８５％または９０％の相同性、さらに好ましくは、上記のアミノ酸配列に少なくとも９５％または９８％の相同性を示す配列を含むポリペプチドを含む。
【０１６６】
相同性の割合は、例えばＥｘｐａｓｙ ｆａｃｉｌｉｔｙサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）で、変数として、グローバルアライメントオプション、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープニングギャップペナルティ−１４、エクステンディングペナルティ−４を使用して、ＬＡＬＩＧＮプログラム（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． （１９９１） １２： ３３７−３５７）によって決定されうる。
【０１６７】
本発明の第十三の特徴点は、本発明のＥＣＳＭ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補鎖、またはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＫ０００８０５に対応する任意のクローンではないポリヌクレオチド、またはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓが表１１または表１２に与えられるＥＳＴ、のいずれかに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを与える。
【０１６８】
ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＫ０００８０５は、ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３にクローンされたｃＤＮＡ配列に対応する。表１１にリストされたＥＳＴｓは、図５に示されるｃｏｎｔｉｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅにアセンブルされうるヌクレオチド配列を表す。表１２にリストされたＥＳＴｓは、図７に示されるマウスヌクレオチドクラスター配列（Ｍｍ．２７７８２）にアセンブルされうるヌクレオチド配列を表す。
【０１６９】
好ましくは、本発明のこの特徴点のポリヌクレオチドは、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、または５０９６、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１０、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２２、２３、９６、または９８、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１、あるいはその相補鎖によって表されるヌクレオチド配列の任意の一つからは構成されない。
【０１７０】
また好ましくは、本発明のこの特徴点のポリヌクレオチドは、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１１、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８、または３９、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８６、の任意の一つによって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドではない。
【０１７１】
本発明の第十三の特徴点のポリヌクレオチドは、以下により詳細に述べられる。
【０１７２】
本発明の第十四の特徴点は、ＥＣＳＭ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補鎖、あるいはポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ ２０９１４５に存在するもの、あるいはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＣ０１１５２６に対応するクローン、またはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓが表１０に与えられるＥＳＴに対応するクローン、ではないことが与えられた本発明の第十二の特徴点にしたがう、これらのいずれかに選択的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドを与える。
【０１７３】
“本発明の第十二の特徴点にしたがうポリペプチドをコードする”によって、われわれは、そのポリヌクレオチドは、本発明のＥＣＳＭ１ポリペプチドをコードするものであり、その配列がＷＯ ９９／０６４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １２０に与えられるポリペプチド、あるいはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２によって、または１９９７年７月１７日に作製されたＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） Ｎｏ． ２０９１４５に対応する微生物学寄託に含まれる核酸によってコードされるポリペプチド、をコードするものではないことを意味する。
【０１７４】
ＡＴＣＣ ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ． ２０９１４５は、７６５ ｂａｓｅの塩基配列を含むｐＳｐｏｒｔ１ベクターを含む。
【０１７５】
ＷＯ ９９／０５４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２に与えられるポリヌクレオチド配列は、図２に示されたヌクレオチド配列に同一である。ＷＯ ９９／０５４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２の配列は、本発明のＥＣＳＭ１ポリペプチドの一部をコードすることができるかもしれない。しかしながら、遺伝コードの退化により、ポリヌクレオチド配列は、ＷＯ ９９／０６４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２に与えられるヌクレオチド配列をもつことなく、本発明のＥＣＳＭ１ポリペプチドをコードするかもしれない。同様に、ポリヌクレオチド配列は、図４、または図５、または図１２に与えられるものと同じ配列を持つことなく、本発明の（完全長）ＥＣＳＭ４ポリペプチドをコードするかもしれない。そのようなポリヌクレオチドは、本発明の目的の範囲内である。
【０１７６】
このように、本発明の第十三の特徴点のポリヌクレオチドは、好ましくは、そのヌクレオチド配列が図４に与えられるものではなく、また本発明の第十四の特徴点のポリヌクレオチドは、好ましくは、その中に発表されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２、あるいはその相補鎖または異形、あるいはＡＴＣＣでＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ２０９１４５下に寄託された、その対応するｃＤＮＡ配列、あるいはそのアミノ酸配列がＷＯ ９９／０６４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １２０に与えられた配列を含むポリペプチドをコードすることが可能なポリヌクレオチド断片、のような、ＷＯ ９９／０６４２３に発表されているポリヌクレオチドではないことが認識される。
【０１７７】
本発明の第十三または第十四の特徴点のポリヌクレオチドは、上述したように、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドの異形をコードするかもしれない。さらに、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチド中の挿入および／または欠失は、短縮された（または伸長された）ポリペプチド産物をコードするかもしれないフレームシフト変異に導くかもしれない。そして挿入、欠失、または他の変異は、短縮したポリペプチド産物をコードする停止コドンの導入に導くかもしれない。
【０１７８】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであるかもしれない。それがＤＮＡであれば、好ましい。
【０１７９】
ポリヌクレオチドは、イントロンを含んでいるかもしれないし、含んでいないかもしれない。それがイントロンを含まなければ、好ましい。
【０１８０】
ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖または両方の混合物であるかもしれない。
【０１８１】
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも３０ヌクレオチドを持つ。さらに好ましくは、ポリヌクレオチドは５０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドであり、さらに好ましければ、ポリヌクレオチドは、少なくとも５００ヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、１キロ塩基対以上であるかもしれなく、また５キロ塩基対以上をふくむかもしれない。
【０１８２】
本発明はまた、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドあるいはその断片、または異形、または融合体、あるいは上記の異形または断片の融合体をコードする、ポリヌクレオチドに選択的にハイブリッドを形成することができる、ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、上記のポリヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも３０ヌクレオチドの長さである。上記のポリヌクレオチドは、１００ヌクレオチドおよび２００ヌクレオチドより長いかもしれないが、好ましくは、上記のポリヌクレオチドは、２５０ヌクレオチドより長くない。そのようなポリヌクレオチドは、サンプル中のポリヌクレオチドの存在を示すための手順において、検出ツールとして有用である。そのようなサンプルは、メンブレンまたはフィルター上に固定された、細菌コロニーようなＤＮＡのサンプルであるかもしれない。
【０１８３】
好ましくは、上記のように選択的にハイブリッドを形成可能なポリヌクレオチドは、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８４、または５０９６、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１０、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２２、２３、９６、または９８、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１、によって表されるヌクレオチド配列の任意の一つではない。
【０１８４】
“選択的にハイブリッドを形成する”によって、われわれは、ポリヌクレオチドが、非常に厳しい条件下、ハイブリッドを形成することをさす。ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成は、０．１ｘ ＳＳＣと６ｘ ＳＳＣの間でＳＳＣを含む、水溶液中、５５℃と７０℃の間の温度で行われる。高温またはＳＳＣの低濃度が、より厳しいハイブリッド形成条件であることが、技術的によく知れらている。“非常に厳しい”によってわれわれは、２ｘ ＳＳＣおよび６５℃をさす。１ｘ ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである。非常に厳しい条件下ハイブリッドを形成するポリヌクレオチドは、本発明の目的の範囲内に含まれる。
【０１８５】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして使用されうる。この場合に、ポリヌクレオチドは１５と３０ヌクレオチドの間であることが、好ましい。断片が変異導入用のＰＣＲプライマーとして使用されるときは、２０と１００ヌクレオチドの間のポリヌクレオチドが好ましい。ＰＣＲプライマー（核酸に変異を導入するために使用されるのではない場合）が、図４、または図７、または図１２、または図１３、または図２に与えられたヌクレオチド配列から約１５から３０の連続するヌクレオチド（例えば、完全に一致する）を含んでいれば、特に好ましい。明らかに、ＰＣＲプライマーが変異導入に使用される場合、配列に比較すると差異が存在する。
【０１８６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ； Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， ４８７−４９１）での使用に適したプライマーが好ましい。適切なＰＣＲプライマーは、次の性質を備えているかもしれない：
【０１８７】
オリゴヌクレオチドの５’末端の配列は、増幅されるべき標的配列に一致する必要がないことがよく知られている。
【０１８８】
ＰＣＲプライマーは通常、特にその３’末端に、お互い２塩基より長い、任意の相補的な構造を含まない。この性質は、“プライマーダイマー”と呼ばれる人工的な産物の形成を促進するかもしれないためである。二つのプライマーの３’末端同士がハイブリッドを形成したとき、それらは、“プライムドテンプレート”複合体を形成し、プライマーの伸長は、“プライマーダイマー”と呼ばれる短い二重鎖産物の生成になる。
【０１８９】
内部の二次構造は、プライマーには避けるべきである。対称的ＰＣＲにおいて、４０−６０％ Ｇ＋Ｃ含量が、任意の一塩基の長いストレッチを持たない、両方のプライマーに、よく推奨される。古典的な融解温度計算は、ＤＮＡプローブハイブリッド形成の研究と関連しているが、たいてい、与えられたプライマーは、特異的な温度でアニールするはずであり、または７２℃の伸長温度は、プライマー／テンプレートのハイブリッドを不十分に解離させると予測する。実際には、ハイブリッドは単純なＴｍ計算によって一般的に予測されるよりも、ＰＣＲ過程においては、より効果的に形成される。
【０１９０】
最適アニーリング温度は、経験的に決定されるかも知れず、予測されるよりも高いかもしれない。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、３７−５５℃領域で活性を示すので、プライマー伸長は、アニーリングステップ中に起こり、ハイブリッドは安定化される。プライマーの濃度は、通常の（対称的）ＰＣＲでは同じにし、一般的には、０．１−から１ｎＭの範囲内である。
【０１９１】
本発明の適切な一対の核酸が、ＰＣＲに使用されるとき、便利なのは、産物をゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって検出することである。ＤＮＡ増幅の産物を、アガロースゲル電気泳動およびＤＮＡのエチジウムブロマイド染色を使用して検出する代わりに、便利なのはプローブとして、増幅したＤＮＡとハイブリッドを形成できる、標識されたオリゴヌクレオチドを使用することである。増幅がＰＣＲによる場合、オリゴヌクレオチドプローブは、二つのプライマーによって定義される、プライマー間の配列にハイブリッドを形成する。プローブは、標準的な技術を使用して３２Ｐ、３３Ｐ、および３５Ｓのような放射性ヌクリドで標識されるかもしれなく、あるいは蛍光染料で標識されるかもしれない。オリゴヌクレオチドプローブが、蛍光標識される場合、増幅されたＤＮＡ産物は、溶液中で（参照、例えばＢａｌａｇｕｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９１） “Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｄｓｏｒｂｅｎｔ” Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９５， １０５−１１０およびＤｉｌｅｓａｒｅ ｅｔ ａｌ （１９９３） “Ａ ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ” ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５， １５２−１５７）検出されるかもしれない。
【０１９２】
ＰＣＲ産物はまた、蛍光発色団−消光剤一対をもつかもしれない、または固形支持体に結合されているかもしれない、またはビオチンタグをもつかもしれないプローブを使用して、検出されうる、あるいは捕捉プローブと検出プローブの組み合わせを使用して検出されるかもしれない。
【０１９３】
蛍光発色団−消光剤の一対は、特にＰＣＲ反応の定量的計測（例えばＲＴ−ＰＣＲ）に適している。適切なプローブを使用して蛍光極性化が、ＰＣＲ産物を検出するためにも使用されるかもしれない。
【０１９４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、技術的によく知られた方法を使用して、例えば、固相フォスフォラミジミダイト化学を使用して、合成されうる。
【０１９５】
本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、一つまたはそれ以上の改変された塩基を含むかもしれない、あるいは安定性の目的で、または他の理由で、改変された骨格を含むかもしれない。改変することによって、われわれは、例えば、３Ｈ標識された塩基やイノシンのような通常用いられない塩基を含めた。様々な修飾は、ＤＮＡおよびＲＮＡになされ、これらは、本発明の目的に含まれる。
【０１９６】
好ましい実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは検出可能なように標識される。適切な検出可能なラベルは、上に詳細に述べられる。
【０１９７】
本発明の第十五の特徴点は、上述したようなポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを与える。一般的に、ポリヌクレオチドはポリペプチドＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４あるいはその断片、異形、または融合体をコードするものである。
【０１９８】
“発現ベクター”によって、われわれは、適切な宿主において、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現することの可能なものを指す。
【０１９９】
そのようなベクターは、ポリペプチドの有効な量を生産するための宿主細胞において、コードされたポリペプチドを発現することに有用であるかもしれない。遺伝子療法での使用に適している、本発明の第十三または第十四の特徴点に従うポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、本発明の目的の範囲内である。ＥＣＳＭ４を発現することのできる遺伝子療法ベクターの投与は、血管新生を調整または阻害することに有効であるかもしれない。なぜならば、このポリペプチドは、反発性誘導受容体の可能性があるからである。同様に、細胞表面にＥＣＳＭ４の断片または変異体を発現することができる遺伝子療法ベクターは、患者における血管新生を調整することにも有用であるかもしれない。そこでは、断片または変異体は、ＥＣＳＭ４本来のリガンドと結合することができるが、正常な下流のシグナルを伝達することができない（例えば、ポリペプチドの必要な細胞質側部分が、欠失または変異導入され、機能的でなくなったり、または通常相互作用する細胞内蛋白質と結合することができなったりするため）。
【０２００】
このように、好ましい実施態様において、ベクターは、遺伝子療法での使用に適したものである。適切なベクターとその細胞内への導入法の例は、下により詳細に与えられる。特に、ＥＣＳＭ４のプロモーターの使用に関連した遺伝子療法の方法とベクターはまた、遺伝子療法におけるＥＣＳＭ４コード配列またはアンチセンスの使用に関連して使用されるかもしれない。
【０２０１】
本発明のこの特徴点の発現ベクター中に含まれるポリヌクレオチドは、ポリペプチドＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１あるいはその断片または異形をコードするものであり、あるいはポリヌクレオチドは、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１コード領域に選択的にハイブリッドを形成できるものであるかもしれないと認識される。ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１コード領域にハイブリッドを形成することのできるポリヌクレオチドは、標的細胞中のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の発現レベルを減少させるかもしれない、アンチセンスポリヌクレオチドとして、有用である。適切で効果的なアンチセンスポリヌクレオチドの設計は、既知のコード配列に基づき、遺伝子療法の技術において知られる。
【０２０２】
好ましくは、本発明のこの特徴点の発現ベクターは、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１１、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８、または３９、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８６、あるいはその相補鎖の任意の一つによって表されるポリヌクレオチド配列を含まないものである。
また好ましくは、上記のベクターは、そのアミノ酸配列がＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１１、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８、または３９、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８６、の任意の一つによって表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないものである。
【０２０３】
生産された療法蛋白質または療法ポリヌクレオチドの量と生産の継続の両者は、遺伝子療法における重要な問題である。それに一致して、細胞内遺伝子組み込み可能なウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター）の使用は、繰り返しの療法が免疫原生の理由で望ましくない場合、非組み込み代替物（例えば、アデノウイルス由来のベクター）よりも有益であるかもしれない。
【０２０４】
“療法ポリヌクレオチド”または“療法蛋白質”によって、我々は、ＥＣＳＭ４およびＥＣＳＭ１をコードする配列、上記のコードする配列によってコードされるポリペプチド産物、およびＥＣＳＭ４アンチセンスポリヌクレオチドを含める。上記のポリヌクレオチドまたは蛋白質の療法上の効果は、投与された正確な療法薬剤に依存した、前血管新生または抗血管新生効果を含むかもしれない。例えば、ＥＣＳＭ４コード領域の少なくとも一部に対するアンチセンスである、ポリヌクレオチドを含む遺伝子療法に適した発現ベクターは、宿主細胞または患者において発現させたとき、血管新生に必要とされる分子の発現を抑制するならば、抗血管新生活性を持つかもしれない。発現ベクターに含まれたポリヌクレオチドが、血管新生の阻害に必要なポリペプチドをコードする場合（例えば、上記のポリペプチドは内皮細胞反発性誘導活性をもつため）、アンチセンスの発現もまた、抗血管新生であるかもしれない。
【０２０５】
逆に、上記の発現ベクターが、本発明のポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドが、その活性が血管成長を減少させるために必要である分子の発現を抑制し（例えば、上記の分子が内皮細胞反発性誘導活性をもつため）、あるいはその活性が血管新生に必要であるポリペプチドをコードする場合、上記のベクターの投与は前血管新生であるかもしれない。
【０２０６】
療法遺伝子が染色体外に維持される場合に、高レベルの発現は、ウイルス由来のプロモーター、例えば、Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ （Ｒａｇｏｔ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６１， ６４７−６５０； Ｈｙｄｅ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ， ２５０−２５５）およびａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、を使用することによって実現されるようである。後者は、肺上皮におけるｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ （ＣＦＴＲ）遺伝子の発現に使用され、成功している（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｃｅｌｌ ６８， １４３−１５５）。これらのプロモーターは、広範な組織において機能するので、それらは配送法が特異性を与えられるように最適化されない限り、細胞種特異的な発現には適さない。しかしながら、体細胞エンハンサー配列は、染色体外から細胞種特異的発現を行うために使用されうる。
【０２０７】
以下により詳細に述べるように、ＥＣＳＭ４調節／プロモーター領域は、内皮細胞選択的に発現可能な調節領域の例であり、好ましくは制御可能なコード領域について新生血管の内皮細胞に選択的であることである。上に概説したようにそのようなコード領域は、アンチセンスポリヌクレオチドをコードするかもしれない。
【０２０８】
遺伝子−ベクター構築の回収が不可能な場合に、毒性反応を急速に止めるためのシステムに自殺遺伝子を加えることが、必要であるかもしれない。単純性疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子は、細胞に導入されると、薬剤ガンシクロビルに細胞を感受性にし、細胞を即座に殺傷するオプションを生み出す。
【０２０９】
種特異的な外来性のウイルスの使用は、遺伝子療法において、ベクターとしてａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃなウイルスの使用に代わる安全な方法を与えるかもしれない。このアプローチでは、ヒト以外の外来性ウイルス受容体のヒトホモログが、ウイルスによって認識されるような方法で改変される。改変された受容体は、そうして、分子を構築することによって、細胞に配送され、その前面は、標的細胞に特異的になり、後部は改変した受容体になる。その標的への受容体の配送に続いて、遺伝的に加工された外来性ウイルスは、療法遺伝子ををもち、注入され、そして標的細胞のみへ組み込まれる。
【０２１０】
ウイルス由来の遺伝子伝達ベクターは、特異的な細胞にのみ認識されるように最適化され、腫瘍中の内皮細胞のような内皮細胞を目標とすることが可能になるかもしれない。同様に、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子のもののような、内皮細胞特異的なプロモーターを用いて、内皮細胞を標的とした療法遺伝子の発現が可能になる。
【０２１１】
ＥＣＳＭ遺伝子の一つ、または遺伝子の一部、または遺伝子に対するアンチセンスを含むポリヌクレオチドは、遺伝子が染色体外に留まるようなベクターで細胞に導入されるかもしれない。そのような状況において、遺伝子は染色体外から細胞によって発現される。組み替え、および染色体外維持両者のための遺伝子導入用ベクターは、技術的に知られ、任意の適当なベクターが使用されるかもしれない。エレクトロポレーション、カルシウムリン酸共沈、およびウイルス形質導入のような細胞内にＤＮＡを導入する方法は、技術的に知られ、その方法の選択は、通常熟練した者の能力による。野生型新規遺伝子で形質転換された細胞は、癌緩和、およびそのような緩和を促進する薬剤治療を研究するためのモデルシステムとして使用できる。
【０２１２】
様々な方法が、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結し、操作可能にするために開発されてきた。例えば、相補的に結合可能な末端を介して。例えば、相補的なホモポリマーｔｒａｃｔは、ベクターＤＮＡに挿入されるように、ＤＮＡ部分に加えられうる。ベクターおよびＤＮＡ部分は、そうして相補的ホモポリマー末端間の水素結合により、組み換えＤＮＡ分子を形成するように結合される。
【０２１３】
ひとつまたはそれ以上の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡ部分をベクターに結合させるための他の方法をあたえる。そのＤＮＡ部分は、初期に述べられているように、エンドヌクレアーゼ制限消化によって生じ、バクテリオファージＴ４ポリメラ―ゼ、または突出３’一本鎖末端を自身の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって除去し、陥没３’末端を自身のポリメラーゼ活性で埋める酵素、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、で処理される。
【０２１４】
それゆえに、これらの活性の組み合わせは、平滑末端ＤＮＡ部分を生じる。そうして、平滑末端部分は、バクテリオファージＴ４ポリメラ―ゼのような、平滑末端ＤＮＡ分子の結合を触媒することのできる酵素の存在下、過剰モルのリンカー分子とインキュベーションされる。このように、反応産物は、自身の末端にリンカー配列ポリマーをもつＤＮＡ部分である。これらのＤＮＡ部分は、次に適切な制限酵素で切断され、ＤＮＡ部分の末端と一致する末端を生じる酵素であらかじめ切断された、発現ベクターに結合される。
【０２１５】
様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＮ， ＵＳＡを含む、多くの供給元から商品として利用可能である。
【０２１６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変するための望ましい方法は、ＰＣＲを使用することである。この方法は、例えば、適切な制限部位を加工することによって、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されるかもしれない、あるいは、技術的に知られた他の有効な方法でＤＮＡを改変するために使用されるかもしれない。
【０２１７】
この方法では、酵素的に増幅されるべきＤＮＡは、二つの特異的なプライマーによって並べられ、これらのプライマー自身は、増幅したＤＮＡに取り込まれるようになる。上記の特異的なプライマーは、技術的に知られた方法を使って発現ベクターにクローニングする際に使用される、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むかもしれない。
【０２１８】
そのＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）は、そうして、適切な宿主において発現され、本発明のポリペプチドを含むポリペプチドを生産する。このように、本発明のポリペプチドを構成するポリペプチドをコードするＤＮＡは、既知の技術に従って使用され、ここに含まれる説明を考慮して、発現ベクターを構築するために、適切に改変されるかもしれない。そうして、それは、本発明のポリペプチドの発現および生産のために、適切な宿主を形質転換するために使用される。そのような技術は、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． １９８４年４月３日、Ｒｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌに発行された４，４４０，８５９、１９８５年７月２３日、Ｗｅｉｓｓｍａｎに発行された４，５３０，９０１、１９８６年４月１５日、Ｃｒｏｗｌに発行された４，５８２，８００、１９８７年７月７日、Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌに発行された４，６７７，０６３、１９８７年６月３０日、Ｇｏｅｄｄｅｌに発行された４，６７８，７５１、１９８７年１１月３日、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌに発行された４，７０４，３６２、１９８７年１２月１日、Ｍｕｒｒａｙに発行された４，７１０，４５３、１９８８年７月１２日、Ｔｏｏｌｅ， Ｊｒ ｅｔ ａｌに発行された４，７５７，００６、１９８８年８月２３日、Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌに発行された４，７６６，０７５、および１９８９年３月７日、Ｓｔａｌｋｅｒに発行された４，８１０，６４８、に発表されたものを含む。この全てが、ここに参考として示される。
【０２１９】
ＤＮＡ（またはレトロウイルスの場合は、ＲＮＡ）は、本発明のポリペプチドを構成するポリペプチドをコードし、適切な宿主に導入するために、広範な他のＤＮＡ配列に結合されるかもしれない。対のＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのＤＮＡの導入法に依存し、外来的な維持または組み込みのどちらかが望ましい。
【０２２０】
一般的に、ＤＮＡは、プラスミドのように、発現のために適切な向き、および正しい読み枠で発現ベクターに挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、望ましい宿主によって認識される、適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に結合されるが、そのような制御は、発現ベクターでは一般的に利用可能である。そうしてベクターは、標準的な技術を通じて宿主に導入される。一般的に、宿主の全てが、ベクターによって形質転換されるわけではない。それゆえに、形質転換された宿主細胞を選択する必要がある。ある選択方法は、発現ベクターにあるＤＮＡ配列を取り込ませることを伴う。そのＤＮＡ配列は、抗生物質耐性のような、形質転換された細胞に選択可能な特性をコードする、任意の必要な制御要素を持つものである。または、そのような選択可能な特性のための遺伝子は、望ましい宿主細胞を共形質転換するために使用される、他のベクター上に存在することもありうる。
【０２２１】
本発明の発現ベクターによって形質転換される宿主細胞は、十分な時間、およびポリペプチドを発現させるように、ここに発表した説明を考慮して、技術的に熟練した者に知られた、適切な条件下培養される。そうして、ポリペプチドは回収されうる。
【０２２２】
多くの発現システムが知られており、細菌（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ真菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞を含む。
【０２２３】
ベクターは、一般的に、たとえベクターが、発現のために他の原核でない細胞種において使用される場合においても原核生物での増幅のための、ＣｏｌＥ１ ｏｒｉのような、原核複製開始点を含む。ベクターはまた、それで形質転換された大腸菌のような、細菌宿主細胞において、遺伝子を発現（転写および翻訳）可能にする原核由来のプロモーターのような、適切なプロモーターを含む。
【０２２４】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こるようにするＤＮＡ配列によって形成される、発現制御要素である。代表的な細菌宿主に適したプロモーター配列は、一般的に、本発明のＤＮＡ部分を挿入するために、便利な制限部位を含むプラスミドベクターに与えられている。
【０２２５】
一般的な原核ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）から購入できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９、およびＰｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ， ＵＳＡから購入できるｐＴｒｃ９９Ａ、およびｐＫＫ２２３−３である。
【０２２６】
一般的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ， ＵＳＡから購入できるｐＳＶＬである。このベクターは、クローンした遺伝子を発現させるために、ＳＶ４０ ｌａｔｅプロモーターを使用しており、高レベルの発現が、ＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原産生細胞において見られている。
【０２２７】
誘導可能な哺乳動物発現ベクターは、Ｐｈａｒｍａｃｉａからまた購入できるｐＭＳＧである。このベクターは、クローンした遺伝子を発現させるために、マウス乳房腫瘍ウイルスｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔのグルココルチコイド誘導性のプロモーターを使用する。
【０２２８】
有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、一般的にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７， ＵＳＡから購入できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（Ｙｉｐｓ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３を組み入れている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ）である。
【０２２９】
他のベクターおよび発現システムは、様々な宿主細胞での使用のために技術的によく知られている。
【０２３０】
本発明の第十六の特徴点は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む組み換え宿主細胞を与える。
【０２３１】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の第三の特徴点の化合物をコードするポリヌクレオチド（そこでは、選択的に結合する部分と更なる分子の両者は、融合されたポリペプチドである）、あるいは本発明のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチド、あるいは上述したように、その断片、または融合体、または異形を含む。
【０２３２】
宿主細胞は、原核または真核のどちらかでありうる。細菌細胞は、原核宿主細胞が好ましく、一般的に大腸菌の株であり、例えば、大腸菌株ＤＨ５がＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， ＵＳＡから購入でき、ＲＲ１が、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）から購入できる（Ｎｏ． ＡＴＣＣ ３１３４３）。好ましい真核宿主細胞は、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞を含み、好ましくは、マウス、ラット、サル、またはヒト線維芽細胞および肝臓細胞系統のような脊椎動物細胞である。酵母宿主細胞は、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１を含み、これらは、一般的にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７， ＵＳＡから購入できる。好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、
ＡＴＣＣからＣＲＬ １６５８として購入でき、またヒト胎生肝臓細胞である２９３細胞である。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクションされうるＳｆ９細胞である。
【０２３３】
本発明のＤＮＡ構築での適切な細胞宿主の形質転換は、一般的に、使用するベクターの種類に応じた、よく知られた方法によって行われる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、以下を参照のこと。例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ （１９７２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９， ２１１０およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ （１９８６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹに述べられている。Ｂｅｇｇｓ （１９７８） Ｎａｔｕｒｅ ２７５， １０４−１０９の方法もまた、有用である。脊椎動物に関しては、そのような細胞をトランスフェクトするために有用な試薬、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎまたはリポソーム剤形、がＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ ２０８７７， ＵＳＡから購入できる。
【０２３４】
エレクトロポレーションもまた、細胞を形質転換および／またはトランスフェクトするために有効であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換するために、技術的によく知られている。
【０２３５】
例えば、多くの細菌種は、ここに参考として示すＬｕｃｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２， ６３７−６４６に述べられている方法によって、形質転換されるかもしれない。非常に多くの形質転換体が、２．５ ＰＥＢ中に懸濁したＤＮＡ−細胞混合物を、６２５０Ｖ ｐｅｒ ｃｍ、２５ｍＦＤでエレクトロポレーションすることで、一貫して得られる。
【０２３６】
エレクトロポレーションによる酵母細胞の形質転換法は、Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｇｕａｒｅｎｔｅ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９４， １８２に発表されている。
【０２３７】
形質転換された細胞は、つまり、本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞、よく知られた技術によってうまく同定されうる。例えば、本発明の発現構築物が導入された細胞は、本発明のポリペプチドを生産するために生育されうる。細胞は、集菌、溶菌され、そのＤＮＡ内容物は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ （１９７５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８， ５０３またはＢｅｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３， ２０８によってのべられているような方法を使用して、ＤＮＡの存在を調べられる。または、上清に存在する蛋白質は、下に述べるように抗体を使用して検出されうる。
【０２３８】
組み換えＤＮＡの存在を直接検定することに加え、形質転換の成功は、組み換えＤＮＡが、蛋白質を発現させることができる場合に、よく知られた免疫学的な方法によって確認されうる。例えば、発現ベクターでの形質転換に成功した細胞は、適切な抗原性を示す蛋白質を生産する。
【０２３９】
形質転換されたと推定される細胞サンプルは、集菌され、適切な抗体でその蛋白質をアッセイされる。
【０２４０】
宿主細胞は、動物体内の宿主細胞であるかもしれない。このように組み換え動物は、本発明の第一または第三の特徴点のポリペプチドを、組み換え遺伝子の存在によって、発現するものが含まれる。好ましくは、組み換え動物は、マウスのようなげっ歯類である。組み換え動物は、技術的によく知られて方法を使用して作製されうる。
【０２４１】
ポリペプチドＥＣＳＭ４をコードするポリヌクレオチドは、ヒトではない組み換え哺乳動物を作製するために有効であるかもしれない。そのなかで、ＥＣＳＭ４は、ある方法で変異を導入される。例えば、マウスＥＣＳＭ４のゲノム上のコード領域は、マウスにおいて変異導入され、その天然のリガンドに結合できない、または細胞内要素と正しく相互作用できないＥＣＳＭ４ポリペプチドを生産する。そのような変異ＥＣＳＭ４ポリペプチドは、マウスに、ヒトにおける異常血管新生を伴う疾患に、非常に類似する疾患を生じさせるかもしれない。
【０２４２】
このように、ヒトではない哺乳動物、特にマウスおよびラットのようなげっ歯類は、異常血管新生を伴う疾患のモデルとして有用である。
【０２４３】
または、ＥＣＳＭ４遺伝子を欠失した （“ノックアウト”）、あるいは転写、またはＥＣＳＭ４ポリペプチドを発現することのできるＥＣＳＭ４ゲノムコード領域を欠く哺乳動物は、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドに選択的な抗体を生産する方法を与えることに、有用である。そのような哺乳動物、特にマウスは、特に有用であるようである。なぜなら、ヒトとマウスＥＣＳＭ４ポリペプチド間のホモロジーの高さは、ＥＣＳＭ４ポリペプチドを発現するマウスにおいて、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドの抗原性を妨げるかもしれないからである。
【０２４４】
異常血管新生を伴う疾患の、潜在的により正確な動物モデルは、上に述べたように、組み換え動物のゲノムへの添加、あるいは動物のゲノム上のＥＣＳＭ４を変異導入されたヒトＥＣＳＭ４に置換することによってなされるかもしれない。適切には、挿入されたヒトＥＣＳＭ４は、内皮選択的なプロモーターおよび調節領域の制御下にある。好ましくは、プロモーターおよび調節領域は、宿主動物ＥＣＳＭ４遺伝子のものである。この方法によってゲノムが改変された動物は、機能障害をもつヒトＥＣＳＭ４を発現し、それゆえにヒトにおける異常血管新生を伴う疾患の診断、予後診断、および治療での薬剤および抗体の効果を試験することに有用である。
【０２４５】
そのようなノックアウトまたは組み換え哺乳動物は、本発明の目的の範囲内に含まれ、そのような哺乳動物を使って産生された抗体、およびそれを含む化合物もまた、本発明の目的の範囲内である。
【０２４６】
本発明の第十七の特徴点は、本発明のポリペプチドの生産方法、上述したようなポリヌクレオチドを発現させること、またはこの中に述べたように宿主細胞を培養することを含む方法、を与える。
【０２４７】
ＥＣＳＭ１ポリペプチドを生産するために、宿主細胞は、そのアミノ酸配列が図２に与えられるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含むかも知れなく、ＥＣＳＭ４ポリペプチドを生産するために、宿主細胞は、そのアミノ酸配列が図４または図７または図１２に与えられるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含むかも知れないことが認識される。
【０２４８】
好ましくは、発現されたポリヌクレオチドは、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８４、または５０９６、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１０、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２２、２３、９６、または９８、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１、によって表されるヌクレオチド配列の任意の一つからは構成されない。
【０２４９】
また好ましくは、生産されたポリペプチドは、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１１、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８または３９、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８６、の任意の一つによって表される配列から構成される、アミノ酸配列をもつものではない。
【０２５０】
宿主細胞の培養法、および組み換え蛋白質の分離法は、技術的によく知られている。宿主細胞に依存して、生産されたＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４ポリペプチドは、天然に分離されうるものとは異なっているかも知れないと認識される。例えば、酵母または細菌細胞のような、ある種の宿主細胞は、翻訳後修飾システムをもっていないか、異なるものを持っている。そのシステムは、結果、天然に分離されるＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４とは、異なる翻訳後修飾を受けるかも知れない、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４の型を生じるかもしれない。ヒトＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４とは、異なる翻訳後修飾を受けるＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４を得るために、宿主細胞は、ヒト以外の宿主細胞であれば好ましく；哺乳動物細胞でなければ、より好ましい。
【０２５１】
ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４ポリペプチドは、昆虫細胞のような、真核システムにおいて生産されることが好ましい。
【０２５２】
あまり好ましくない実施態様にしたがって、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４ポリペプチドは、ウサギ赤血球細胞ライセートまたはコムギ胚芽ライセートのような、商品として利用できるｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａから購入できる）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生産される。好ましくは、翻訳システムは、ウサギ赤血球ライセートである。便利なことに、翻訳システムは、ＴＮＴ転写−翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）のような転写システムに共役されているかも知れない。このシステムは、翻訳と同様の反応においてコードするＤＮＡポリヌクレオチドから、適切なｍＲＮＡ転写物を生産できる利点がある。便利なことに、そこで発現されたポリペプチドは、一つかそれ以上の膜貫通領域を含む場合に、翻訳システムは、イヌ膵臓マイクロソームのような、小胞体由来の膜、およびフォールディングシャペロンの供給源が添付されているかもしれなく、天然のコンフォメーションでのポリペプチドの合成を可能にする。
【０２５３】
好ましくは、本発明のこの特徴点の生産方法は、宿主細胞、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳混合物から、生産されたＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４を単離するさらなるステップを含む。好ましくは、単離は、本発明の発現したポリペプチドに選択的に結合する抗体を使用する。
【０２５４】
本発明は、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４ポリペプチド、あるいは、それらの異形、または断片、または融合体、あるいは上記の異形または断片の融合体を含む。それらのペプチドは、ここに発表された方法によって、ＥＣＳＭ４ポリペプチドは図４に与えられたアミノ酸配列からなるものではないと与えられた方法によって、得ることができる。好ましくは、ポリペプチドは、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１１、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８または３９、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８６、の任意の一つによって表されるアミノ酸配列から構成されるものではない。このましくは、ＥＣＳＭ１ポリペプチドは、ここに発表された方法によって生産されるが、ＷＯ ９９／０６４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２によってコードされるもの、ＷＯ ９９／０６４２３の目的のために、１９９７年７月１７日になされたＡＴＣＣ ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ． ２０９１４５の核酸によってコードされたものではない。
【０２５５】
本発明の第十八の特徴点は、上述したように、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１に選択的に結合することのできる抗体をあたえる。
【０２５６】
好ましくは、ＥＣＳＭ１に選択的に結合する抗体は、ＷＯ ９９／０６４２３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２によってコードされた、あるいは国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１５９４９の目的で、１９９７年７月１７日になされたＡＴＣＣ ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ． ２０９１４５の核酸によってコードされたポリペプチドに結合するものではない。
【０２５７】
好ましくは、ＥＣＳＭ１に選択的に結合する抗体は、そのアミノ酸配列が、図２に与えられた配列、あるいはそれらの天然の異形、を含むポリペプチドに結合するものであるが、１９９７年７月１７日になされたＡＴＣＣ ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ． ２０９１４５の核酸によってコードされたポリペプチドに結合するものではない。
【０２５８】
好ましくは、ＥＣＳＭ１に選択的に結合する抗体は、そのアミノ酸配列が、図４、５、７、１２、または１３の任意の一つによって与えられた配列、あるいはそれらの天然の異形、を含むポリペプチドに結合するものであるが、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１１、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８または３９、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８６、の任意の一つによって表されるポリペプチド、あるいはＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８４、または５０９６、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１０、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２２、２３、９６、または９８、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１、によって表されるヌクレオチド配列の任意の一つによってコードされるポリペプチドには結合しない。
【０２５９】
“選択的に結合する”によって、我々は、他のポリペプチドに比べ、本発明のポリペプチド（ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１のような）に少なくとも１０倍強く結合する抗体を含める；好ましくは、少なくとも５０倍強く、またより好ましくは、少なくとも１００倍強く。そのような抗体は、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１および本発明のポリペプチドではない、他のポリペプチドのアミノ酸配列の違いに関する情報から、技術的に良く知られた方法によって作製される。
【０２６０】
ＥＣＳＭ４に選択的に結合する抗体はまた、ＥＣＳＭ４ポリペプチドの機能を調整するかもしれない。ＥＣＳＭ４を刺激すること、または活性化することによって、固有のリガンドの結合の効果を模倣する、あるいは結合し、それによって後に続く、本来のリガンドによるＥＣＳＭ４の結合、および活性化または刺激を妨げる抗体とそのような機能調節型の抗体が、本発明の目的の範囲内に含まれる。機能を調節する抗体は、研究において、例えば、ＥＣＳＭ４刺激、または活性化の効果、あるいはそのような刺激によって引き起こされる下流のプロセスを研究することにおいて、ツールとして有用であると認識されるだろう。そのような抗体はまた、医薬においても、例えば、患者の血管新生を調節することにおいて、有用である。特に、そのような抗体の投与によって血管新生を調節することは、癌においてのように血管新生の調節が恩恵をもたらす、患者の疾患の治療において有用である。
【０２６１】
次のペプチドは、ウサギポリクローナル血清のような抗体の生成に、イムノゲンとして有用である：ＬＳＱＳＰＧＡＶＰＱＡＬＶＡＷＲＡ、ＤＳＶＬＴＰＥＥＶＡＬＣＬＥＬ、ＴＹＧＹＩＳＶＰＴＡおよびＫＧＧＶＬＬＣＰＰＲＰＣＬＴＰＴ。
【０２６２】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の抗体は、次の配列をもつアミノ酸配列に結合する、ＧＧＤＳＬＬＧＧＲＧＳＬ、ＬＬＱＰＰＡＲＧＨＡＨＤＧＱＡＬＳＴＤＬ、ＥＰＱＤＹＴＥＰＶＥ、ＴＡＰＧＧＱＧＡＰＷＡＥＥ、またはＥＲＡＴＱＥＰＳＥＨＧＰ。これらの配列は、ヒトおよびマウスＥＣＳＭ４ポリペプチド配列の間で異なるアミノ酸配列を表している。一般的に、ヒトおよびマウスＥＣＳＭ４ポリペプチドは、高度の相同性を示し、マウスに対してヒトＥＣＳＭ４配列の大部分の免疫抗原性が欠如しているために、ヒトＥＣＳＭ４に対するマウス抗体の産生が特に困難となっている。マウスＥＣＳＭ４にはないアミノ酸配列は、マウスＥＣＳＭ４（ヒトおよびマウスＥＣＳＭ４アミノ酸配列のアライメントは、図１４に示される。）に存在する配列にくらべ、マウスに対してより免疫抗原性を示すようである。このように、上述の様に、ヒトＥＣＳＭ４に固有な配列を含むポリペプチド断片は、その配列がヒトおよびマウスＥＣＳＭ４の両者において見られるＥＣＳＭ４ポリペプチドよりも、ヒトＥＣＳＭ４ポリペプチドに選択的に結合する抗体の産生において、有用である。
【０２６３】
ＥＣＳＭ４ポリペプチドの細胞外部分にあるアミノ酸配列使用の結果、生じた抗体は、内皮細胞標的分子として有用である可能性がある。それゆえに、本発明の抗体がヒトＥＣＳＭ４に固有なアミノ酸配列に対して、作られ、好ましく、選択的に結合するならば特に好ましい。そこでは、配列はポリペプチドのＮ末端側にあり、図１２に与えられるアミノ酸配列の残基１から４６７の間に存在する細胞外部分において見られる。ＥＣＳＭ４細胞外領域に選択的な抗体分子を作製するために適したアミノ酸配列の例は、図１２に与えられる。
【０２６４】
ヒトＥＣＳＭ４に固有なアミノ酸配列は、ポリクローナル抗体を産生するために使用されるかもしれないが、それらがモノクローナル抗体を生産するためにしようされるのは、好ましい。
【０２６５】
一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が化学的に修飾されたペプチドは、それが合成される前または後で、ペプチドの機能、つまり抗体の生産が実質的に変わらないことを規定するために使用されるかも知れない。そのような修飾は、酸または塩基と塩を形成させること、特に生理的に許容可能な有機または無機酸および塩基、末端カルボキシル基のエステルまたはアミドを形成させること、およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルのようなアミノ酸保護基を結合させることを含める。そのような修飾は、ペプチドをｉｎ ｖｉｖｏの代謝から保護するかも知れない。ペプチドは、単コピーとして、あるいは多コピー、例えばタンデムリピート、として存在するかも知れない。そのようなタンデム、または多重繰返しは、それ自身十分抗原性を示し、キャリアーの使用を妨げるかもしれない。ペプチドにとって有利であるかもしれないのは、Ｎ末端とＣ末端を一緒に結合してループを形成させること、あるいは一つまたはそれ以上のシステイン残基を追加して、抗原性を高める、および／またはジスルフィド結合が形成されるようにすることである。ペプチドが、キャリアーに、好ましくはポリペプチドに共有結合すれば、本発明のペプチドがループを形成するように、配置される。
【０２６６】
現在の免疫学的理論に従って、キャリアーは、免疫システムを刺激し、またはその刺激を高めるために、任意の免疫原性を示す剤形に存在しなければならない。けれども最適なキャリアーは、（または抗原とともに、創出する）Ｔ細胞エピトープを具体化したものである。ペプチドは、例えば架橋剤によって、血清アルブミン、ミオグロビン、細菌トキソイド、および鍵穴リンペットヘモシアニンのような、別個のキャリアーとともに結合されるかもしれない。より最近、開発されたキャリアーは、免疫応答においてＴ−細胞の援助を誘導するが、ヘパティティス−Ｂコア抗原（ヌクレオキャプシド蛋白質とも呼ばれる）、予測されるＴ−細胞エピトープは、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ、ｂ−ガラクトシダーゼ、およびインターロイキン−１の１６３−１７１ペプチドである、を含む。後者の化合物は、キャリアーとして、またはアジュバントとして、またはその両方として様々に考えられている。または、本発明の同じ、または異なるペプチドの数コピーは、お互い架橋され；この状況では、そのような別個のキャリアーはないが、キャリアーの機能は、そのような架橋によって与えられるかも知れない。適切に架橋する薬剤は、ＳｉｇｍａおよびＰｉｅｒｃｅのカタログにおいてリストにされたもの、例えばグルタルデヒド、カルボジイミド、およびスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを含み、後者の薬剤は、（もしあれば）Ｃ末のシステイン残基における−ＳＨ基を探索するのに用いられる。
【０２６７】
ペプチドが、適切な宿主において、適切なヌクレオチド配列の発現によって調製される場合、ペプチドをキャリアーとして機能するペプチド配列との融合産物として発現させるのが有効であるかも知れない。Ｋａｂｉｇｅｎ’ｓ ”Ｅｃｏｓｅｃ”システムは、そのような配置の例である。
【０２６８】
ペプチドは、Ｌｕ ｅｔ ａｌ （１９８１） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４６， ３４３３によって発表されたように、固相ペプチド合成のＦｍｏｃ−ポリアミド様式によって合成されるかも知れない。一時的なＮ−アミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってなされる。この非常に塩基に弱い保護基の繰り返しの切断は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンを使用して行われる。側鎖の機能性は、それらのブチルエーテル（セリン、トレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸、およびアスパラギン酸の場合）、ブチロキシカルボニル誘導体（リジン、およびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されるかも知れない。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末残基である場合に、使用の際は４，４’−ジメトキシベンジドリル基で側鎖アミドの機能性を保護する。固相支持体は、三種類の単量体、ジメチルアクリルアミド（骨格−単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能賦与剤）から構成されるポリジメチル−アクリルアミドポリマーに固定される。使用されるペプチド−レジン間の切断可能な連結剤は、酸感受性の４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。全てのアミノ酸誘導体は、逆相Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールによる共役法を使用して加えられる、アスパラギンおよびグルタミンの場合は例外だが、それらの対称無水誘導体として加えられる。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸、またはイソチン検定法を使用して、モニターされる。合成完了に際し、ペプチドは、５０％のスカベンジャーミックスを含む、９５％トリフルオロ酢酸での処理により、側鎖保護基の除去と同時に、レジン支持体から切断される。一般的に使用されるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水であり、正しい選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に依存している。トリフルオロ酢酸は、ｉｎ ｖａｃｕｏ気化によって除去される。存在する任意のスカベンジャーは、水層の凍結乾燥で、スカベンジャーの無い粗ペプチドを与える、単純な抽出方法によって除去される。ペプチド合成の試薬は、一般的にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ （ＵＫ） Ｌｔｄ， Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＮＧ７ ２ＱＪ， ＵＫから購入可能である。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および（原則的に）逆相高速液体クロマトグラフィーのような技術の任意の一つ、あるいはその組み合わせによって行われるかも知れない。ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析、および高速原子衝撃法（ＦＡＢ）質量スペクトル分析によって行われるかも知れない。
【０２６９】
本発明のペプチドは、二重の効果をもつように他の抗原に結合されるかも知れない。
【０２７０】
本発明の目的に含まれるのは、本発明のこの特徴点に従って抗体を生産する方法である。
【０２７１】
抗体は、適切なペプチドで免疫することで動物により生産される。適切なペプチドは、ここに述べられる。または、今日の技術により、ここに定義するように、動物を使用すること無く抗体を作ることが可能になった。そのような技術は、技術的によく知られるような、例えば抗体ファージディスプレイ技術を含む。適切なペプチドは、ここに述べるように、この方法で生産された抗体を選択するために使用されるかも知れない。
【０２７２】
抗体技術における進歩で、抗体を生産するために、動物を免疫することは必要で無いかも知れないと認識されている。ファージディスプレイライブラリーのような合成システムが使用されるかも知れない。そのようなシステムの利用は、本発明の方法に含まれ、そのようなシステムの産物は、本発明の目的のための“抗体”である。
【０２７３】
ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４およびその異形、または断片を認識するそのような抗体は、有用な研究試薬および療法薬であり、特に、上述したように本発明の化合物として調製されたときに、有用であると認識される。適切に、本発明の抗体が、検出できるようにラベルされ、例えばそれらは、直接または間接的に検出されるような方法でラベルされるかも知れない。便利なことには、抗体は、放射性分子、または有色分子、または蛍光分子でラベルされ、あるいは、それらは酵素に結合されるかも知れない。一般的に、酵素は無色の（または非蛍光の）基質を有色の（または蛍光の）産物に変換することのできるものである。抗体は、ビオチン（またはストレプトアビジン）によってラベルされ、放射性分子、または有色分子、または蛍光分子、または同様のものでラベルされた、ストレプトアビジン（またはビオチン）を使用して間接的に検出される。あるいは、それらは、上述した種類の任意の酵素に結合されるかもしれない。
【０２７４】
本発明の第十九の特徴点は、患者から液体サンプルを取得することを含む、患者における内皮の損傷または活性化の検出法、およびサンプル中に存在するＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４の検出法を与える。
【０２７５】
好ましくは、液体サンプルとは、血液である。一般的に、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４由来のペプチド断片の存在が検出される。
【０２７６】
この特徴点の好ましい実施態様において、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４ポリペプチドのペプチド断片の存在は、そのアミノ酸配列が図２または図４または図１２またはそれらの断片のどれか一つに与えられた配列を含む、ポリペプチドに選択的な抗体を使用することによって検出される。好ましくは、抗体は、本発明の第十八の特徴点に従う抗体である。
【０２７７】
患者において内皮細胞の損傷を検出すること、または診断することは、そのような患者における癌の診断、または心臓疾患、子宮内膜症、または動脈硬化の診断の補助に、有用である。検出された内皮細胞の損傷量を、癌、心疾患、子宮内膜症、または動脈硬化であることが知られている患者において観察される量またはレベルと、癌、心疾患、子宮内膜症、または動脈硬化ではない患者におけるみかけの損傷の“正常な”レベルと比較することが必要であるかも知れない。
【０２７８】
このように、患者における内皮の損傷または活性化の検出は、そうした患者における腫瘍の存在、または程度、または成長速度を検出する手段として有用であるかも知れない。血管損傷の検出は、腫瘍による新生血管の形成の間接的な調査報告である。この方法では、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１は、血管新生の代わりのマーカーであるかも知れない。患者のサンプル中のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の存在、または癌ではない患者におけるよりもＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ペプチド断片が多いことは、そういった患者における癌、または既にある癌の成長を検出する方法であるかも知れない。
【０２７９】
さらに、患者のサンプル中のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の存在、またはあるレベルを検出する方法によって、新生血管の検出が、そうした患者における治療が効果的であるか、および／または治療がどの程度効果的なのか、決定することに有用であるかも知れない。好ましくは、療法は患者における腫瘍、または癌を治療することである。
【０２８０】
このように、本発明の特徴点は、患者から液体サンプルを取得することを含む、患者における腫瘍または腫瘍による新生血管、または心疾患、または子宮内膜症、または動脈硬化の検出法、およびサンプル中に存在するＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４断片の検出法を与える。
【０２８１】
内皮細胞の損傷を検出すること、または診断することに関して上述したように、患者のサンプル中のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の存在、またはそのあるレベルの検出法による疾患（腫瘍、または心疾患等のような）の検出は、そうした患者における治療の効能を決定することに有用であるかも知れない。
【０２８２】
ある実施態様において、療法は遺伝子療法である。
【０２８３】
好ましくは、患者における治療の効能は、患者の液体サンプル中に見られるＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４の断片の量を使うことによって、およびそれを癌、心疾患、子宮内膜症、または動脈硬化ではない患者のサンプルに含まれるＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４の量、および／または上記の治療の開始前の患者からのサンプル中の量、どちらかに比較することによって決定される。その比較は、患者の治療の効能を示し、そのなかで、治療前、および治療中／後に決定された断片の量に変化がなければ、これは治療の効能がほとんどないことを示している。治療が開始される前に見られた断片の量に比較して、治療中、または治療後の断片の量に減少が見られれば、治療が、患者の状態の改善にいくらか効能があることを示している。
【０２８４】
現在、様々な抗血管新生療法の効能を評価する方法は、臨床試験中であり、侵略的である。血管新生部位の血管の内皮細胞でのＥＣＳＭ４の選択的な発現は、療法を受けている患者におけるＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４のレベルの存在、ないこと、増加、または減少を検出することが、侵略的な生体組織検査、スキャン、および同等のようなものを必要としない、または少しは必要とするそのような患者における療法の効能を決定する方法である。
【０２８５】
このように、抗血管新生療法（癌療法のような）をうける患者の血液中におけるＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４レベルの決定が、“血管新生の代用マーカー”として働くかもしれない。
【０２８６】
“ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４由来のペプチド断片”によって、われわれは、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドの少なくとも連続する５アミノ酸をもつペプチドを指す。一般的に、断片はＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリペプチドの少なくとも連続する８アミノ酸をもち、好ましくは、少なくとも１０、より好ましくは、少なくとも１２、または１５、または２０、または３０、または４０、または５０の連続するアミノ酸をもつ。
【０２８７】
大きいポリペプチド由来のペプチド断片の存在を検出する方法は、技術的に知られている。
【０２８８】
本発明のさらなる特徴点は、患者における血管新生を調節する方法、ＥＣＳＭ４、またはＥＣＳＭ４のペプチド断片、またはＥＣＳＭ４のリガンド、またはＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１に選択的に結合する抗体を患者に投与することを含む方法を与える。
【０２８９】
好ましくは、ペプチド断片、またはリガンド、または抗体は、患者のＥＣＳＭ４ポリペプチドの活性、または機能を直接、または間接的に調節するものである。
【０２９０】
好ましい抗体は、上により詳細に述べられたようなものである。
【０２９１】
細胞表層に提示されたポリペプチドの機能を調節する抗体の生産は、技術的に知られ、上により詳細に論じる。そのような抗体は、天然のリガンドの機能を模倣することによって、および活性を示し、または機能するようにポリペプチドを刺激することによって、機能を調節するかもしれない、あるいはリガンド結合部位を立体的に隠すことによって、リガンドによるポリペプチドの刺激を妨げ、それによって天然のリガンドの結合を妨げることによって、ポリペプチドの機能を調節するかもしれない。
【０２９２】
ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔへのリガンドの配送は、高−血管新生を伴う癌、または他の疾患の療法において有効な血管新生阻害剤であるかもしれなかった。また、ＥＣＳＭ４をコードするポリヌクレオチドを使用する遺伝子療法によって、内皮細胞にＥＣＳＭ４ポリペプチドを導入することは、成長と移動を変化させるかもしれなかった。
【０２９３】
本発明のまたさらなる特徴点は、患者のポリヌクレオチドを含むサンプルを取得すること、およびＥＣＳＭ４ポリペプチド、またはＥＣＳＭ１ポリペプチド、または断片、またはそれらの天然の異形をコードする核酸に選択的にハイブリッドを形成する、上記サンプルをポリヌクレオチドと接触させることを含む、患者における血管内皮の異常、または過剰な成長を伴う状態の診断方法を与える。
【０２９４】
その方法は、診断の補助に使用されるかもしれない。
【０２９５】
癌、動脈硬化、再狭窄、糖尿病性白内障、関節炎、乾癬、子宮内膜症、過多月経、血管種、および静脈奇形は、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４ポリペプチドをコードする核酸における変異によって生じるかもしれない。
【０２９６】
“選択的にハイブリッドを形成すること”によっては、核酸が、上記のヒトＤＮＡまたはｃＤＮＡと十分なヌクレオチド配列の類似性をもち、それが適度な、または高度に厳密な条件下でハイブリッドを形成できるということを示す。技術的によく知られているように、核酸のハイブリッド形成の厳密さは、ハイブリッド形成が生じる部分の核酸の長さ、ハイブリッド形成する配列の相同性の程度、および温度、イオン強度、および配列中のＣＧまたはＡＴ含量のような因子に依存する。このように、上記のように選択的にハイブリッド形成できる任意の核酸は、本発明の実施において有用である。
【０２９７】
上記のヒトＤＮＡまたはｃＤＮＡに選択的にハイブリッド形成できる核酸は、上記のヒトＤＮＡまたはｃＤＮＡと核酸の一部に、少なくとも＞９５％配列相同性を持つ核酸、好ましくは＞９８％をもつもの、より好ましくは＞９９％の配列相同性を持つものを含む。よく知られているように、ヒト遺伝子は、通常イントロンを含み、例えば、上記のヒトＤＮＡ内の遺伝子由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが、上記のヒトＤＮＡと全長に渡り完全に一致しないが、それでも上記のヒトＤＮＡに選択的にハイブリッド形成することができる核酸である。このように、本発明は、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ ｃＤＮＡに選択的にハイブリッドを形成するが、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子に対してはハイブリッドを形成しないかもしれない、または逆もまた同様の核酸を、特異的に含む。例えば、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子のイントロン−エクソン境界にわたる核酸は、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ ｃＤＮＡには選択的にハイブリッドを形成することができないかもしれない。
【０２９８】
一般的な、適度または高度に厳密なハイブリッド形成条件は、選択的なハイブリッドを形成し、技術的に知られる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ （ｅｄｓ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ＵＳＡに述べられているものであり、参考にここに示す。
【０２９９】
核酸がナイロンメンブレン上に固定され、プローブの核酸が５００塩基または塩基対以上であるとき、一般的なハイブリッド形成溶液の例は；
６ｘＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）
０．５％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＳＤＳ）
１００ｍｇ／ｍｌ 変性、断片化したサケ精子ＤＮＡ
【０３００】
ハイブリッド形成は、６８℃で行われる。核酸を固定化したナイロンメンブレンは、６８℃において１ｘＳＳＣで、あるいは厳密性を高めるために０．１ｘＳＳＣで洗浄されるかもしれない。
【０３０１】
２０ｘＳＳＣは次の方法で調製されるかも知れない。ＮａＣｌ １７５．３ｇおよびクエン酸ナトリウム８８．２ｇを水８００ｍｌに溶解する。１０Ｎ ＮａＯＨ数滴で、ｐＨ ７．０に調整する。水で体積を１リットルにあわせる。等分し、オートクレーブによって滅菌する。
【０３０２】
核酸がナイロンメンブレン上に固定化され、プローブが、１５から５０塩基の間のオリゴヌクレオチドである場合に、一般的なハイブリッド形成溶液の例は：
３．０ Ｍ塩化トリメチルアンモニウム（ＴＭＡＣｌ）
０．０１ Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ７．６）
０． ５％ ＳＤＳ
１００ｍｇ／ｍｌ変性、断片化されたサケ精子ＤＮＡ
０．１％ 脱脂粉乳
【０３０３】
ハイブリッド形成に最適な温度は、通常用いる鎖長のＴｉの５℃下になるように選ばれる。Ｔｉは、プローブと標的配列間に形成されるハイブリッドの不可逆的な融解温度である。Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６， ４６３７は、Ｔｉの決定法について論じている。３Ｍ ＴＭＡＣｌ中、１７ｍｅｒの核酸を用いる場合に、推奨されるハイブリッド形成温度は、４８−５０℃；１９ｍｅｒのとき、５５−５７℃；および２０ｍｅｒのとき、５８−６６℃である。
【０３０４】
“選択的にハイブリッドを形成する核酸”によって、下により詳細に述べたもののような、任意の良く知られた増幅システム、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、のヒトＤＮＡの上記の領域かたＤＮＡを増幅する核酸もまた含まれる。ＰＣＲ増幅の適切な条件は、適切な１ｘ増幅バッファーにおける増幅を含む。
【０３０５】
１０ ｘ増幅バッファーの組成は、５００ｍＭ ＫＣｌ； １００ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ （室温でｐＨ ８．３）； １５ｍＭ ＭｇＣｌ２； ０．１％ ゼラチン。
【０３０６】
適切な変性剤または方法（９５℃で加熱することのように）が、二本鎖ＤＮＡのストランドを分離するために、使用される。
【０３０７】
適切には、増幅のアニーリングの部分は、３７℃と６０℃の間であり、好ましくは５０℃である。
【０３０８】
本発明の方法において有用な核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであるかも知れないが、ＤＮＡが好ましい。本発明の方法において有用な核酸は、二本鎖または一本鎖であるかもしれないが、核酸増幅反応のような、ある条件下では一本鎖の核酸が好ましい。
【０３０９】
サンプルは、直接患者から採取されたものであるかも知れない、例えば異常血管発達と関連する可能性のある組織の生体組織検査によって、あるいは、組織からははなれた部位で、患者から採取されるかも知れない、例えば、組織由来の細胞が、体の他の部分の組織から移動したからという理由で。または、サンプルが、例えば、患者からの組織または細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ培養され、あるいは異種移植のモデルにおいて培養されるかも知れない、という意味で間接的に患者由来であるかもしれない。あるいは、核酸サンプルは、患者の供給源の核酸から（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）に複製されるものであるかも知れない。このように、患者由来の核酸は、物理的に患者体内にあり、その代わりに患者体内にある核酸から複製される。異常な血管発達は、腫瘍と関連していると考えられ、腫瘍組織は、初期の腫瘍から、または転移から採取されるかも知れない。
【０３１０】
本発明の有用な方法は、任意の適切なサンプルにおけるＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子における変異の解析、またはその存在の有無の検出を含む。サンプルは、患者から新たに採取したサンプルであるのが適切かもしれない、あるいはサンプルは、例えば、サンプルのライブラリーにおいて保管されたサンプルのように、過去のサンプルであるかも知れない。
【０３１１】
便利なことに、上記のヒトＤＮＡに選択的にハイブリッド形成能をもつ、および本発明の方法において使用される核酸はさらに、検出できるレベルを含む。
【０３１２】
“検出可能なレベル”によって、３２Ｐ、３３Ｐ、または３５Ｓのような任意の便利な放射性ラベルが含まれ、それらは、良く知られた方法を使用して、核酸中に容易に取り込まれうる；核酸中に容易に取り込まれうる任意の便利な蛍光または化学発光ラベルもまた含まれる。さらに“検出可能なレベル”という語は、他の分子に結合することによって検出されうる分子もまた含む（ストレプトアビジンに結合することによって検出可能なビオチンのように）；および無色の化合物を有色の化合物に変換することによって検出されうる酵素のような分子もまた含む（例えば、アルカリフォスファターゼは、無色の０−ニトロフェニルフォスフェートを有色の０−ニトロフェノールに変換しうる。）、または逆もまた同様。便利なことに、核酸プローブは、固定したアッセイにおいてある位置を占めるかもしれない、および核酸がヒトＤＮＡの上記の領域にハイブリッドを形成するかどうかは、固定されたアッセイにおけるハイブリッド形成の位置を参照することによって決定されるかも知れない。検出可能なラベルは、Ｔｙａｇｉ ＆ Ｋｒａｍｅｒ （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ３０３−３０８に述べられているように、蛍光発色団−消光剤の一対でもあるかもしれない。
【０３１３】
便利なことに、血管発達が異常を示す状態の本診断法法において、上記の選択的なハイブリッドを形成できる核酸は（検出可能なラベルで標識され、または標識されず）ハイブリッド形成条件下、患者由来の核酸に接触される。適切なハイブリッド形成条件は、上述されたものを含む。
【０３１４】
血管発達が異常を示す状態を診断する本方法は、関連領域中の一つまたはそれ以上の関連する位置でのＤＮＡのシークエンシングを伴うかも知れない。それは、ダイレクトシークエンシングを含む；ＰＣＲで増幅したエキソンのダイレクトシークエンシング；関連領域中の一つまたはそれ以上の関連する位置でのハイブリッド形成を意図したオリゴヌクレオチドプローブの、様々なハイブリッド形成（便利なことに、これは、技術的によく知られる“チップ”システムと呼ばれる固定化したオリゴヌクレオチドを使用する。）；適当な制限酵素での切断後の変性ゲル電気泳動、好ましくは、関連するＤＮＡ領域の増幅後；Ｓ１ヌクレアーゼ配列分析；非変性ゲル電気泳動、好ましくは、関連するＤＮＡ領域の増幅後；慣習的なＲＦＬＰ （制限断片長多型）アッセイ；ヘテロデュプレックス分析；オリゴヌクレオチドを使用して選択的なＤＮＡの増幅；間期染色体の蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）；特異的な変異のためにＡＲＭＳ−ＰＣＲ（増幅ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ−ＰＣＲ）；ハイブリッドを形成した核酸におけるミスマッチ部位での切断（化学的または酵素的な切断）；ＳＳＣＰ一本鎖立体構造多型またはＤＧＧＥ（不連続または変性グラジエントゲル電気泳動）；ＰＣＲで増幅した正常／変異型ＤＮＡにおけるミスマッチを検出するための分析；および蛋白質短縮アッセイ（エキソンの翻訳および転写−もし変異が停止コドンを挿入した場合、短縮蛋白質産物が生じる）。他の方法は、第一次配列における変化に起因する一本鎖王してＤＮＡの二次構造における変化を検出することのようなことに使われるかも知れない、例えば、クリバーゼ Ｉ酵素を使用して。このシステムはＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ３Ｆｏｕｎｔａｉｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｉｎｃｈｉｎｎａｎ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ， Ｐａｉｓｌｅｙ ＰＡ４９ＲＦ， Ｓｃｏｔｌａｎｄから購入可能である。
【０３１５】
本発明の方法は、”ＤＮＡチップ”上で行われることが認識される。そのような”チップ”は、ＵＳ ５，４４５，９３４ （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ； ｐｒｏｂｅ ａｒｒａｙ）、ＷＯ ９６／３１６２２ （Ｏｘｆｏｒｄ； ｐｒｏｂｅ ａｒｒａｙ ｐｌｕｓ ｌｉｇａｓｅ ｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、およびＷＯ ９５／２２０５８ （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ； ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ ｍａｒｋｅｄ ｔａｒｇｅｔｓ ｂｉｎｄ ｔｏ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ， ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ）に述べられている； これら全て参考としてここに示す。
【０３１６】
変異検出の詳細な方法は、”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ” １９９６， ｅｄ． Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ＨＵＧＯ （Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｏｎ）に述べられている。
【０３１７】
ＲＦＬＰが、かなり大きい（＞５００塩基）欠失または挿入の検出に使用されれば、好ましい。サザンブロットは、本発明のこの方法に使用されるかもしれない。
【０３１８】
小さい領域（最大３００塩基）のＰＣＲによる増幅は、３−４塩基対の挿入または欠失より大きいが、小さな変化を検出するために、好ましいかもしれない。増幅した配列は、シークエンシングゲルで分析され、小さな変化（最小で３−４塩基対）が可視化されうる。適切なプライマーは、ここに述べられるように設計される。
【０３１９】
さらに、サザンブロット分析、またはＰＣＲのどちらかを使用して、制限酵素異形部位が検出されるかもしれない。例えば、ゲノムＤＮＡにおける異形部位を分析するために、制限酵素消化、ゲル電気泳動、サザンブロッティング、およびハイブリッド形成特異的プローブ（例えば、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ ｃＤＮＡあるいは遺伝子由来の任意の適切なプローブ）。
【０３２０】
例えば、ＰＣＲを使用して異形部位を分析するために、ＤＮＡ増幅、制限酵素消化、エチジウムブロマイド、銀染色、または放射性ヌクレオチドの取り込みによるゲル検出、あるいはＰＣＲにおける蛍光プライマー。
【０３２１】
他の適切な方法は、特異的な変異イベントのための形質特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）の開発を含む。同様の方法が、適切な問題にあたってＲＮＡおよびｃＤＮＡに使用される。
【０３２２】
ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子の任意の部分における変異を検出することが、有用である一方で、変異が遺伝子のエクソンで検出されれば好ましく、変異がコードする鎖を変えるものであればさらに好ましい。これらの変異の検出は、本発明の好ましい特徴点である。
【０３２３】
本発明の方法はまた、ヘテロ接合性の欠失（ＬＯＨ；一コピーの欠失を示す）を確認することを含む。ＬＯＨは、診断の十分なマーカーである；第二の形質の変異／欠失を探索する必要はないかもしれない。遺伝子のＬＯＨは、遺伝子のコード配列、およびイントロンにおける多形性を使って検出されるかもしれない。
【０３２４】
本発明の前述の方法において使用される特に好ましい核酸は、核酸を増幅するために適した一群のプライマーから選択されるものである。
【０３２５】
適切には、プライマーは、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子またはｃＤＮＡ配列を示す、任意の図に示されたヌクレオチド配列にハイブリッドを形成する、一群のプライマーから選択される。プライマーがＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子のイントロンにハイブリッド形成すれば、あるいはプライマーがＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡの合成を開始するが、他の遺伝子またはｃＤＮＡからは開始しないものであれば、特に好ましい。
【０３２６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ； Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， ４８７−４９１）における使用に適したプライマーが、好ましい。適切なプライマーおよびＰＣＲ反応産物の検出法は、上に詳細に述べる。
【０３２７】
任意の核酸増幅プロトコルが、ポリメラーゼ連鎖反応、ＱＢレプリカーゼ、およびリガーゼを含む、本発明の方法において使用されうる。また、ＮＡＳＢＡ （核酸配列に基づく増幅）は、Ｃｏｍｐｔｏｎ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５０， ９１−９２ およびＡＩＤＳ （１９９３）， Ｖｏｌ ７ （Ｓｕｐｐｌ ２）， Ｓ１０８に述べられるように使用されうる、あるいはＳＤＡ （ストランド置換増幅）は、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０， １６９１−１６９６に述べられるように使用されうる。ポリメラーゼ連鎖反応が、その単純性のために、特に好ましい。
【０３２８】
本発明は、実施例１の表８に述べられたゲノムクローンのヒト由来ＤＮＡ、またはＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子、またはそれらの変異体形質、あるいは血管発達が異常である状態の診断法において、またはこれらの方法を実施するための薬剤の製造において、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ ｃＤＮＡ、またはそれらの変異体形質、またはそれらの相補鎖に選択的にハイブリッド形成する核酸の使用を与える。
【０３２９】
好ましいポリヌクレオチドは、ＥＣＳＭ４遺伝子またはｃＤＮＡに選択的にハイブリッド形成し、診断法に関して上述したようなものである。
【０３３０】
また、本発明は、上記のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子の存在の有無、またはそれにおける変異を決定する方法を与える。好ましくは、その方法は、患者由来の適切なサンプルを使用する。
【０３３１】
本発明の方法は、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子における変異の検出を含む。
【０３３２】
本発明の方法は、変異によって生じた制限酵素切断部位における差異を利用させるかもしれない。非変性ゲルが、適切な制限酵素での消化で生じた断片の長さの差を検出するために利用されるかもしれない。
【０３３３】
“適切な制限酵素”は、野生型配列を認識、切断するが、変異型配列を認識、切断しないものであり、あるいはその逆もまた同様である。制限酵素によって認識、切断される（またはされない、場合による）配列は、変異の結果として生じ、あるいは変異は、ＰＣＲ反応において、ミスマッチオリゴヌクレオチドを使用することにより、正常または変異体形質に挿入されうる。酵素が、ＤＮＡをまれにのみ切断するような場合、言い換えれば酵素の配列認識が、まれにのみ起こる場合、便利である。
【０３３４】
他の方法において、一対のＰＣＲプライマーが使用され、それは野生型遺伝型または変異体遺伝型のどちらかに、一致するが、両方には一致しない。増幅されたＤＮＡが生じるかどうかは、野生型または変異体遺伝型（こうして表現型）を示している。しかしながら、この方法は、技術的な失敗でありうる否定的な結果（例えば、増幅したＤＮＡがない）に部分的に基づいている。それゆえに、あまり信頼性がなく、および／または追加の対照実験を必要とする。
【０３３５】
好ましい方法は、同様だが、野生型または変異体配列の一つのみにハイブリッドを形成するＰＣＲプライマーを使用し、それらは、野生型または変異型配列の他には存在しない制限部位を導入する。
【０３３６】
ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子またはｃＤＮＡに選択的にハイブリッドを形成する、あるいは実施例１の表８にリストにされたようなＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１を含む、ゲノムクローンに選択的にハイブリッドを形成する、核酸は、多くの目的に有用である。それらは、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションに、およびすでに上述した点変異を検出するためのＲＮａｓｅ保護法に使用されうる。プローブは、ＰＣＲ増幅産物を検出するために使用されうる。それらはまた、他の技術を使ったサンプルにおいて、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子あるいはｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用されうる。ミスマッチは、酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、またはリゾルベース）、化学物質（例えば、ヒドロキシルアミン、またはオスミウムテトロキシドおよびピペリジン）、あるいは完全に一致したハイブリッドに比較して、ミスマッチのハイブリッドの電気泳動度における変化のどれかを用いて、検出されうる。これらの技術は、技術的によく知られている。一般的に、プローブは、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子コード配列に相補的であるが、ある種のイントロンに対するプローブもまた、考慮される。一組の核酸プローブは、野生型ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子における欠失または変異の検出用キットを構成するために使用されるかもしれない。そのキットは、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子全長へのハイブリッド形成を可能にする。プローブは、お互い重複し、または連続しているかもしれない。
【０３３７】
リボプローブがｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用される場合、それは、ヒトＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。このように、リボプローブは、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子によってコードされる蛋白質をコードしない、アンチセンスプローブである。なぜなら、それはセンスストランドに対して反対の極性を持つためである。一般的にリボプローブは、ラベルされ、例えば放射性ラベルされ、それは技術的に知られた任意の方法によって行われうる。リボプローブが、ＤＮＡとのミスマッチを検出するために使用される場合、それはセンスまたはアンチセンスどちらかの極性を持ちうる。同様に、ＤＮＡプローブはまた、ミスマッチを検出するために使用されるかもしれない。
【０３３８】
核酸プローブはまた、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子の変異体形質に相補的であるかもしれない。これらは、ミスマッチよりむしろハイブリッド形成の根拠で、他の患者における同様の変異を検出するために有用である。上述したように、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子プローブはまた、欠失や挿入のような著しい染色体上の変化を検出するための、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションにおいて使用されうる。
【０３３９】
ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１遺伝子における変異を検出する、特に有効な方法は、ＤＮＡチップ、およびシークエンシングを使用した、１本鎖構造多形性（ＳＳＣＰ）、ヘテロデュプレックス分析、ポリメラーゼ連鎖反応、を含む。
【０３４０】
患者由来の核酸を含む任意のサンプルは、本発明の方法において有用である。サンプル中の核酸がＤＮＡであれば好ましい。このように、細胞からのサンプルは、技術的によく知られているように、例えば、血液サンプル、または頬の細胞、またはその同様のものから、採取されるかもしれない。方法が、胎内の子供に変異が存在するや否やを決定するために使用されている場合、サンプルが、胎内の子供の核酸を含む母親のサンプルであれば、好ましい。適切な母親のサンプルは、胎児の細胞を単離できる、母親の羊水、絨毛膜絨毛サンプル、および血液サンプルを含む。
【０３４１】
本発明のさらなる特徴点は、選択的にＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の発現を妨げる薬剤を患者に投与することを含む、患者におけるＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリヌクレオチドの発現を減少させる方法を含む。
【０３４２】
好ましい実施態様において、選択的にＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の発現を妨げる薬剤は、アンチセンス核酸である。
【０３４３】
好ましくは、アンチセンス核酸は、配列が、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８４、または５０９６、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１０、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２２、２３、９６、または９８、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１、あるいはその相補鎖、あるいはアミノ酸配列が、ＥＰ １０７４６１７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８０８５、ＷＯ ００／５３７５６あるいはＷＯ ９９／４６２８１のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１１、ＷＯ ０１／２３５２３のＮｏｓ ２４−２７、２９、３０、３３、３４、３８または３９、あるいはＷＯ ９９／１１２９３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８６、の任意の一つによって表されるポリペプチド、をコードする核酸配列によって表される配列から構成されるもの（または、に対するアンチセンスではない）ではない。
【０３４４】
それらのさらなる特徴点は、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の発現を妨げるために、アンチセンスを細胞に投与することを含む。一般的に、細胞はＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の発現を妨げる必要のある患者のものである。
【０３４５】
アンチセンス分子が結合するＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであるかもしれない。
【０３４６】
好ましいアンチセンス分子は、上述したようなものである。
【０３４７】
ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の発現を減少させることによって治療されるかもしれない疾患は、上述したように、異常な、または過剰な血管新生を伴う疾患を含む。
【０３４８】
アンチセンス核酸は、技術的によく知られ、一般的に相補的な核酸配列に特異的に結合することのできる、一本鎖の核酸である。適当な標的配列に結合することによって、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が形成される。これらの核酸が、しばしば”アンチセンス”と名づけられるのは、それらが遺伝子のセンスまたはコードストランドに相補的であるからである。最近、三重へリックスの形成が、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重鎖に結合することで、可能なことが証明されている。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ二重鎖の主要な溝で配列を認識しうることが明らかになった。それによって、三重へリックスが形成された。これは、二重鎖ＤＮＡに、主要な溝の水素結合部位の認識をつうじて特異的に結合する、配列特異的な分子を合成することが可能であることを示唆している。
【０３４９】
標的核酸に結合することによって、上のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の機能を阻害することができる。これは、例えば、転写、プロセシング、ポリ（Ａ）付加、複製、翻訳、を阻害すること、あるいは細胞の阻害機構を促進することの結果でありうる。
【０３５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、研究室内で調製され、そうして細胞へ導入される。例えば、マイクロインジェクションまたは細胞培養培地から細胞への取り込みによって。あるいは、それらはアンチセンス遺伝子をもつプラスミド、またはレトロウイルス、または他のベクターでの形質導入後、細胞において発現される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ラウス肉腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、１型単純ヘルペスウイルス、シミアンウイルス、およびインフルエンザウイルスの細胞培養においてウイルス複製、または発現を阻害することが初めて発見された。そうしてアンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡ翻訳阻害が、ウサギ赤血球ライセートおよびコムギ胚抽出物を含む、無細胞系において、広く研究されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウイルス機能の阻害は、ＡＩＤＳ ＨＩＶ レトロウイルスＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ示された（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ， Ｊ． １９８８ “Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８５（１５）， ５５０７−１１）。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄの研究は、最も効果的なオリゴヌクレオチドは、ポリ（Ａ）シグナルに相補的であり；また効果的なものは、ＲＮＡの５’末端を、標的としたものであり、特にキャップ、および５’非翻訳領域が、プライマー結合部位に隣接し、およびプライマー結合部位である場合である。キャップ、５’非翻訳領域、およびポリ（Ａ）シグナルは、レトロウイルスＲＮＡの末端（領域）に反復される配列中に存在し、これらに相補的なオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡに二倍に結合するかもしれない。
【０３５１】
一般的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５から３５塩基の長さをもつ。例えば、２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、表皮成長因子受容体ｍＲＮＡの発現を阻害することが示されており（Ｗｉｔｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ５３： ４１−５０ （１９９９））、２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、副腎皮質ホルモンの発現を９０％以上、減少させることが示されている（Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ９１： ２６１−７（１９９９））。しかしながら、この範囲外の長さのオリゴヌクレオチド、例えば、１０、１１、１２、１３、または１４塩基、あるいは３６、３７、３８、３９、または４０塩基、を使用するのが望ましいかもしれないことが認識されている。
【０３５２】
オリゴヌクレオチドは、細胞の内生のヌクレアーゼによって分解、または不活性化されることを仮定している。この問題に立ち向かうために、改変されたオリゴヌクレオチド、例えば変化したヌクレオチド間の結合を持つもの、を使用することが可能である。そこでは、本来形成されているフォスフォジエステル結合が他の結合に置き換えられている。例えば、Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ７０７９−７０８３は、オリゴヌクレオチドフォスフォアミデートおよびフォスフォロチオエートを使用して、ＨＩＶ−１の組織培養における阻害の増加を示した。Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ７４４８−７４５１は、オリゴヌクレオチドメチルフォスフォネートを使用して、ＨＩＶ−１の阻害の増加を示した。Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， ７７９０−７７９４は、ヌクレオチド配列特異的オリゴヌクレオチドフォスフォロチオエートを使用して、感染初期および慢性的感染状態、両者の細胞培養において、ＨＩＶ−１複製の阻害を示した。Ｌｅｉｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ３４３０−３４３４は、オリゴヌクレオチドフォスフォロチオエートによる、インフルエンザウイルスの組織培養において、複製の阻害を報告している。
【０３５３】
人工的な結合を持つオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏ、分解に体制であることが示されている。例えば、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ （１９９１）は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９， ７４７−７５０において、他に改変していないオリゴヌクレオチドが、ある種のキャッピング構造による３’末端でブロックされたときに、ヌクレアーゼにより耐性になること、およびキャップされていないオリゴヌクレオチドフォスフォロチオエートが、ｉｎ ｖｉｖｏ分解されないことを報告している。
【０３５４】
オリゴヌクレオチドフォスフォロチオエートを合成するための、Ｈ−フォスフォネートアプローチの詳細な記述は、Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ｔａｎｇ （１９９０） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１， ７５４１−７５４４に与えられ、その説明は、参考にここに示される。オリゴヌクレオシドメチルフォスフォネート、フォスフォロヂチオエート、フォスフォラミデート、リン酸エステル、架橋フォスフォラミデート、および架橋フォスフォロチオエートの合成は、技術的に知られる。参照、例えば、Ａｇｒａｗｌ ａｎｄ Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ （１９８７） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９， ２９１１； Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７， ７２３７； Ｕｚｎａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ （１９８７） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８， ３４０１； Ｂａｎｎｗａｒｔｈ （１９８８） Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ． ７１， １５１７； Ｃｒｏｓｓｔｉｃｋ ａｎｄ Ｖｙｌｅ （１９８９） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０， ４６９３； Ａｇｒａｗｌ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， １４０１−１４０５，その説明は、参考にここに示される。合成または生産の他の方法もまた可能である。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）配列もまた合成および適用されるかもしれない。
【０３５５】
本発明に有用なオリゴヌクレオチドは、好ましくは、内生の核酸分解酵素による分解に耐性を示すように設計される。オリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ分解は、長さの減少したオリゴヌクレオチド分解産物を生じる。そのような分解産物は、非特異的なハイブリッドの形成の原因となる可能性が高く、その完全長のものに比較してあまり効果的でない。このように、体内での分解に耐性であり、標的細胞へ到達できるオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステル結合に対して一つ以上の内部人工的ヌクレオチド間結合を置換することによって、例えば結合中の硫黄でリン酸を置換することによって、分解に対してより耐性とすることができる。使用可能な結合の例は、ホスホロチオアート、メチルホスホナート、スルホン、スルファート、ケチル、ホスホロジチオアート、各種のホスホルアミダート、ホスファートエステル、架橋化ホスホロチオアート、及び架橋化ホスホルアミダイトを含む。他のヌクレオチド間結合は当該技術分野で知られているので、上記の例は制限的というよりはむしろ説明的である。例えば、Ｃｏｈｅｎ， （１９９０） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを参照。ホスホジエステルヌクレオチド間結合に対して置換される一つ以上のこれらの結合を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野で知られており、混在ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを生産するための合成経路を含む。
【０３５６】
オリゴヌクレオチドは、キャっピングによって、あるいは、５’、または３’末端のヌクレオチド上に同様の基を取り込むことによって、内生の酵素による伸長に耐性になりうる。キャッピングのための試薬は、Ａｍｉｎｏ−ＬｉｎｋＩＩＴＭとしてＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡから購入できる。キャッピングの方法は、例えば、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ７４７−７５０およびＡｇｒａｗｌ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８ （１７）， ７５９５−７５９９によって述べられている。その説明は、これによって参考としてここに示される。
【０３５７】
ヌクレアーゼの作用に耐性のオリゴヌクレオチドを作製する更なる方法は、それらにとって、ここに参考として示されるＴａｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． ２１， ２７２９−２７３５、によって述べられているように、“自己−安定化”である。自己安定化されたオリゴヌクレオチドは、その３’末にヘアピンループ構造をもち、蛇毒フォスフォヂエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびウシ胎児血清による分解への耐性が増加する。オリゴヌクレオチドの自己安定化された領域は、相補的な核酸とのハイブリッド形成を阻害せず、マウスにおける薬理動力学、および安定性の研究は、線状のオリゴヌクレオチドに比べ、自己安定化されたもののｉｎ ｖｉｖｏ持続性が増すことが示している。
【０３５８】
本発明と一致して、アンチセンス化合物は、規則正しく投与されるかもしれない。または、塩基対形成といった、アンチセンスオリゴヌクレオチドの特徴的な固有の結合特異性は、ｉｎ ｖｉｖｏその目的の部位にアンチセンス化合物の利用を制限することで、高められ、使用される投与量を低く抑えたり、全身の効果を最小にしたりすることを可能にする。このように、オリゴヌクレオチドは、望ましい効果をうるために、局所的に適用されるかもしれない。目的の部位でのオリゴヌクレオチドの濃度は、オリゴヌクレオチドが全身に投与される場合、および療法効果が全体量を有意に低く抑えることによって実行される場合よりも高くなる。局所的に高いオリゴヌクレオチドの濃度は、標的細胞への浸透を高め、標的の核酸配列の翻訳を効果的に阻害する。
【０３５９】
オリゴヌクレオチドは、局所に薬剤の投与を局所的にするために適した任意の方法によって運ばれうる。例えば、オリゴヌクレオチドの溶液は、直接その部位に注入されうる、あるいは浸出液ポンプによるインフュージョンによって運ばれうる。オリゴヌクレオチドはまた、目的の部位に設置されたときに、オリゴヌクレオチドを周りの部位への放出を可能にする、埋め込むことが可能な装置に入れられうる。
【０３６０】
オリゴヌクレオチドは、ヒドロゲル物質によって投与されるかもしれない。Ｈｙｄｏｒｏｇｅｌは、非炎症性かつ生分解性である。多くのそのような物質が知られ、天然および合成のポリマーから製造されたものを含む。好ましい実施態様において、本方法は、体温より低い温度で液体であるが、体温、あるいは体温近くでは、形を残す半固形のヒドロゲルを形成するゲルである、ヒドロゲルを利用する。好ましいヒドロゲルは、エチレンオキシド−プロピレンオキシドを繰り返し単位とするポリマーである。ポリマーの性質は、ポリマーの分子量、およびポリマー中のエチレンオキシドとプロピレンオキシドの相対的な割合に依存する。好ましいヒドロゲルは、重量で約１０％から約８０％のエチレンオキシドと重量で約２０％から約９０％のプロピレンオキシドを含む。使用可能なヒドロゲルは、例えば、ｔｒａｄｅｎａｍｅ ＰｌｕｒｏｎｉｃＲのもとＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， ＮＪ，から購入できる。
【０３６１】
本実施態様において、ヒドロゲルは液状に冷やされ、オリゴヌクレオチドは、ヒドロゲル １グラムあたり約１ｍｇのオリゴヌクレオチドの濃度で液体に混ぜられる。生じた混合液は、そうして治療されるべき表面に塗られる。例えば、手術中にスプレー塗布、または塗ることによって、あるいはカテーテル、または内視鏡の方法を使用することによって。ポリマーが温まると、ゲルを形成するように固化し、オリゴヌクレオチドは、ゲルの正確な組成によって決まる時間にわたって、ゲルから周りの細胞へ拡散する。
【０３６２】
オリゴヌクレオチドまたは他の薬剤は、腫瘍の外科的な除去後に投与されるかも知れず、腫瘍が除去された範囲、および周りの組織に、例えばオリゴヌクレオチドまたは他の薬剤を適切に塗布するためにｃｙｔｏｓｃｏｐｙを使用して、投与されるかもしれない。
【０３６３】
オリゴヌクレオチドは、購入可能な、あるいは科学的な文献に述べられている、リポソーム、マイクロカプセル、および移植可能な装置、を含む他の移植片によって投与されうる。例えばポリアンヒドリド、ポリオルソエステル、ポリ酪酸、およびポリグリコリック酸、およびそれらの共重合物、のような生分解性の物質で製造された移植片、コラーゲン、および蛋白質ポリマー、あるいはエチレンビニル酢酸（ＥＶＡｃ）、ポリビニル酢酸、エチレンビニルアルコール、およびその誘導体のような非生分解性の物質が、オリゴヌクレオチドを局所的に配送するために使用されうる。オリゴヌクレオチドは、融解または溶媒気化の技術を使用して、ポリマー化、あるいは固形化され、または物質と機械的に混合されて、その物質内に取り込まれうる。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、デキストランコートしたビーズ、ｓｔｅｎｔｓまたはカテーテルのような移植できないコーティングに混ぜられ、あるいはその上に塗布される。
【０３６４】
オリゴヌクレオチドの投与量は、オリゴヌクレオチドのサイズとそれが投与される目的に依存する。一般的に、その幅は、治療されるべき組織の表面領域に基づいて計算される。オリゴヌクレオチドの効果的な投与量は、オリゴヌクレオチドの長さ、および化学的組成にいくらか依存するが、一般的に組織表面領域の平方センチメートルあたり約３０から３０００ｍｇである。
【０３６５】
オリゴヌクレオチドは、療法および予防の目的で、患者全身に投与されるかもしれない。オリゴヌクレオチドは、任意の効果的な方法、例えば、非経口的に（例えば、静脈内、皮下に、筋肉内に）あるいは口腔、鼻腔、またはオリゴヌクレオチドが患者の血流に到達および循環することを可能にするほかの手段によって、投与されるかもしれない。全身に好ましく投与されたオリゴヌクレオチドは、局所的に投与されるオリゴヌクレオチドに加え、与えられ、また局所的な投与を行わない場合にも有用である。投与量の幅は、成人ヒトへの投与に対して、約０．１から約１０グラムであり、この目的には効果的であろう。
【０３６６】
アンチセンス薬剤はまた、上記のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ ｍＲＮＡ、または遺伝子に結合する、および上記のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ ｍＲＮＡ、または遺伝子の発現を実質的に阻害する、および上記のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ 蛋白質の発現を実質的に妨げる大きな分子を含むことが認識される。このように、上記のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ ｍＲＮＡに実質的に相補的であるアンチセンス分子の発現は、本発明の一部として把握される。
【０３６７】
上記の大分子は、下に述べられるように、そして患者に配送されるような任意の遺伝子構築物から発現されるかもしれない。一般的に、アンチセンス分子を発現する遺伝子構築物は、少なくとも上記のＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ ｃＤＮＡまたは遺伝子の一部を含む。そしてこれらのｃＤＮＡまたは遺伝子は、細胞内でアンチセンス分子を発現することのできるプロモーターに、操作可能なように連結される。内皮細胞で活性を持つかもしれないプロモーターは、下に述べられる。
【０３６８】
遺伝子構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうるが、ＤＮＡであれば好ましい。
【０３６９】
好ましくは、遺伝子構築物はヒト細胞への配送に適している。
【０３７０】
遺伝子構築物を動物体内の細胞へ導入する意味および方法は、技術的に知られる。例えば、本発明の構築は、増殖する内皮細胞へ、任意の便利な方法、例えばレトロウイルスを伴う方法、によって導入されるかも知れず、構築は、内皮細胞ゲノムに挿入される。例えば、Ｋｕｒｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃ． Ａｎｄ Ｆｕｎｃ． １６， ５０３−５１０において、精製レトロウイルスが投与されている。レトロウイルスは、増殖する内皮細胞を選択的に感染させる潜在的な方法を与える。なぜなら、ウイルスは分裂する細胞のゲノムにのみ組み込まれることが可能であり；多くの内皮細胞が細胞成長の休止中、非受容性の状態にあり、少なくとも新生血管細胞ほど急速に分裂することはないためである。レトロウイルスＤＮＡ構築は、上記のアンチセンス薬剤をコードし、技術的によく知られた方法を使用して、調製されるかもしれない。そのような構築から活性的なレトロウイルスを生産するために、通常１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）で生育したｅｃｏｔｒｏｐｉｃ ｐｓｉ２ ｐａｃｋａｇｉｎｇ細胞系統が使用される。細胞系統の形質導入は、カルシウムリン酸共沈降によって簡便に行われ、安定な形質転換体は、Ｇ４１８を終濃度１ｍｇ／ｍｌ（ｎｅｏＲ遺伝子を含むレトロウイルス構築をもつ）での添加により選択される。独立なコロニーが単離され、増幅され、培養上清が取り除かれ、０．４５ｍｍ孔フィルターを通してろ過され、−７０℃で保存される。腫瘍細胞へのレトロウイルスの導入には、１０ｍｇ／ｍｌのポリブレンが添加されたレトロウイルス上清を直接注入する、間便なものである。直径で１０ｍｍを超える腫瘍には、０．１ｍｌから１ｍｌの間のレトロウイルス上清；好ましくは０．５ｍｌ、を注入することが適している。
【０３７１】
または、Ｃｕｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６， １５５０−１５５２に述べられているように、レトロウイルスを産生する細胞が、特異的な組織に注入される。そうして導入されたレトロウイルス産生細胞は、ベクターの生産が、腫瘍塊でｉｎ ｓｉｔｕに連続的に生じるように、レトロウイルスベクター粒子を高い活性で生産するように加工される。このように増殖する内皮細胞は、レトロウイルスベクター産生細胞と混合されれば、ｉｎ ｖｉｖｏ成功裡に導入されうる。
【０３７２】
標的に導入されたレトロウイルスはまた、本発明の使用に適している；例えば、配列の与える特異的な結合特異性は、すでに存在するウイルス由来ｅｎｖ遺伝子内に加工されるかもしれない（参照Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｖｉｌｅ （１９９５） Ｆａｓｅｂ Ｊ， ９， １９０−１９９遺伝子療法のための、本および他の標的ベクターの評価として）
【０３７３】
他の方法は、制限したときに、その中で発現するように、細胞内への構築の簡単な配送、つづいて長時間を経てゲノム内への組み込みを伴う。後者のアプローチの例は、（好ましくは、内皮細胞標的の）リポソームである（Ｎａｓｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２， ６４６−６５３）。
【０３７４】
イムノリポソーム（抗体を配向したリポソーム）は、抗体が結合可能な細胞表層蛋白質を発現する内皮細胞種を標的とするのに、特に有効である。
【０３７５】
配送の他の方法は、キャリアーとして抗体−ポリリジン架橋（参照Ｃｕｒｉｅｌ Ｐｒｏｇ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ４０， １−１８）、およびトランスフェリン−ポリカチオン結合（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ３４１０−３４１４）を介して外来のＤＮＡを保持するアデノウイルスを含む。これらの最初の方法において、ポリカチオン−抗体複合体が本発明のＤＮＡ構築、または他の遺伝子構築物とともに形成され、そのなかで抗体は、野生型アデノウイルスまたは異形アデノウイルスのどちらかに特異的であり、それに導入された新たなエピトープが抗体に結合する。ポリカチオン部分は、リン酸骨格との静電的な相互作用を介してＤＮＡに結合する。アデノウイルスは、改変されていない繊維およびペントン蛋白質を含むので、細胞内に取り込まれ、それを取り込んだ細胞に、本発明のＤＮＡ構築を運び込む。ポリカチオンはポリリジンであれば好ましい。
【０３７６】
ＤＮＡはまた、アデノウイルスによって配送され、その中で例えば、下に述べるように、アデノウイルス粒子内に存在する。
【０３７７】
これらの二番目の方法において、ＤＮＡ巨大分子を細胞内へ運び込むために、エンドサイトーシスを利用する、高効率核酸配送システムが使用される。これは、鉄輸送蛋白質トランスフェリンを核酸に結合するポリカチオンに結合することによって、実施される。ヒトトランスフェリン、またはニワトリホモログ、コナルバミンまたはそれらの組み合わせが、小ＤＮＡ結合蛋白質プロタミンまたはジスルフィド結合による多様なサイズを有するポリリジンに共有結合される。これらの改変されたトランスフェリン分子は、それらの本来の受容体への結合活性、および細胞内への効果的な鉄輸送活性を維持している。トランスフェリン−ポリカチオン分子は、核酸の長さに独立な（短いオリゴヌクレオチドから２１キロ塩基対のＤＮＡまで）、本発明のＤＮＡ構築または他の遺伝子構築物と、電気泳動的に安定な複合体を形成する。トランスフェリン−ポリカチオン分子と本発明のＤＮＡ構築または他の遺伝子構築物の複合体が、内皮細胞に供給されると、細胞において構築からの高レベルの発現が期待される。
【０３７８】
Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ６０９４−６０９８の方法によって調製された、欠損を持つまたは化学的に不活化されたアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を利用した、本発明のＤＮＡ構築または他の遺伝子構築物の受容体を介する高効率の配送もまた、使用される。このアプローチは、アデノウイルスがリソソームに到達することなく、エンドソームでのＤＮＡ放出が可能なように最適化されるという事実にもとづいているようであり、例えば本発明のＤＮＡ構築または他の遺伝子構築物を結合したトランスフェリンの存在下、構築は、アデノウイルスと同様の経路をによって細胞に取り込まれる。
【０３７９】
このアプローチは、複合体レトロウイルス構築の使用を必要としない利点をもつ；レトロウイルス感染を起こすためのゲノムの透過性を上昇させる改変を必要とせず；標的発現システムが、標的配送システムに共役され、他の細胞種への毒性を減少させる。
【０３８０】
定期的に、遺伝子構築物を含む、適切な配送ｖｅｈｉｃｌｅで腫瘍を局所的に還流することが望ましいかもしれない；さらに、あるいはまたは、配送ｖｅｈｉｃｌｅおよび遺伝子構築物は、到達可能な腫瘍に直接注入されうる。
【０３８１】
“むきだしのＤＮＡ”および陽性電荷をもつ、および中性脂質と複合体形成したＤＮＡはまた、本発明のＤＮＡを治療されるべき患者の細胞へ導入することに有効であるかもしれない。遺伝子療法への非ウイルス的アプローチは、Ｌｅｄｌｅｙ （１９９５） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６， １１２９−１１４４に述べられている。
【０３８２】
代わりの標的配送システムもまた、ＷＯ ９４／１０３２３に述べられている改変アデノウイルスシステムのように知られている。そのなかで、ＤＮＡは一般的に、アデノウイルス、またはアデノウイルス様粒子内に保持される。Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２， ６６０−６６８は、繊維蛋白質に細胞選択的な分子を加えるためのアデノウイルスの改変を述べている。変異体アデノウイルスは、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， ３７３−３７６に述べられているもののように、ｐ５３欠損ヒト腫瘍細胞において選択的に複製し、細胞内への本発明の遺伝子構築物を運び込むことにも有用である。このように、本発明の更なる特徴点は、本発明の遺伝子構築物を含むウイルス、またはウイルス様粒子を与えることが認識される。他の適切なウイルス、またはウイルス様粒子は、ＨＳＶ、ＡＡＶ、ｖａｃｃｉｎｉａ、およびパルボウイルスを含む。
【０３８３】
さらなる実施態様において、ＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１の機能を選択的に阻害する薬剤は、標的配送されたＥＣＳＭ４またはＥＣＳＭ１ ＲＮＡまたはＤＮＡを切断するリボザイムである。上記のリボザイムを発現する遺伝子は、アンチセンス分子のためのｖｅｈｉｃｌｅと実質的に同じものにおいて、および使用して投与されるかもしれない。
【０３８４】
ここに発表されたウイルス、またはウイルス様粒子のゲノムにコードされるかもしれないリボザイムは、Ｃｅｃｈ ａｎｄ Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ” ＵＳ ５，１８０，８１８、Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ “Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ＲＮＡ ｂｙ ＲＮＡｓｅ Ｐ” ＵＳ ５，１６８，０５３、Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ “ＲＮＡ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ” ＵＳ ５，１１６，７４２； Ｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ “ＲＮＡ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ， ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅｓ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ”、ＵＳ ５，０９３，２４６；およびＢｅｅｎ ｅｔ ａｌ “ＲＮＡ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ， ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅｓ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ； ｃｌｅａｖｅｓ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｔｅ ｂｙ ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ” ＵＳ ４，９８７，０７１、すべて参考としてここに示す、に述べられている。
【０３８５】
アンチセンス分子またはリボザイムは細胞特異的なプロモーター要素から発現されるのが望ましいかもしれないことが、認識されている。
【０３８６】
本発明の遺伝子構築物は、技術的によく知られた方法を使用して調製することが可能である。
【０３８７】
本発明のさらなる特徴点は、ＥＣＳＭ４、または適切な異形、その断片または融合体、または上記の化合物の融合体、またはその融合体に結合する分子のスクリーニング法であり、１）ａ）ＥＣＳＭ４ポリペプチドをｂ）試験分子と接触させること、２）ＥＣＳＭ４ポリペプチドおよび試験分子を含む複合体の存在を検出すること、および任意に３）ＥＣＳＭ４ポリペプチドに結合した任意の試験分子を検出すること、を含む方法である。
【０３８８】
好ましくは、ＥＣＳＭ４ポリペプチドは、本発明の第十一の特徴点に関して上述されたようなものである。
【０３８９】
好ましい実施態様において、試験分子はポリペプチドである。
【０３９０】
さらなる実施態様において、方法は、ＥＣＳＭ４の天然のリガンドを同定するために使用される。このように本実施態様において、試験分子は、ＥＣＳＭ４の天然のリガンドを含む。ポリペプチド分子の天然のリガンドを同定するための、特に有用な技術は、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ技術である。この技術は、よく知られ、結合するとレポーター遺伝子の転写を促進する転写複合体の二つの部分（一方を問題の分子に、他方を試験リガンドに融合させる）を一緒にさせる、分子とその本来のリガンドとの間の結合に基づいている。
【０３９１】
このように、本発明のこの特徴点の好ましい実施態様は、スクリーニング法、好ましくは酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ、をＥＣＳＭ４ポリペプチドの天然のリガンドを同定するために使用することを含む。
【０３９２】
ＥＣＳＭ４ポリペプチドへの結合として同定できる分子は、本発明のさらなる特徴点である。
【０３９３】
ＥＣＳＭ４に結合する分子は、ＥＣＳＭ４の活性化を調整するかもしれないことが認識される。
【０３９４】
ＥＣＳＭ４に結合する適切なペプチドリガンドは、技術的に知られた方法を使用して同定されるかもしれない。
【０３９５】
Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ３８６−３９０およびＣｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ６３７８−６３８２によって発表された、一つの方法は、線状バクテリオファージ、Ｍ１３またはｆｄのような、の広大なライブラリーのスクリーニングを伴う。ライブラリーの各構成要素は、バクテリオファージ表面上の蛋白質に融合された、様々な蛋白質をもつ。ＥＣＳＭ４に結合するライブラリーのこれら構成要素が、反復結合プロトコルを使用して選択され、いったん強固に結合するファージは精製され、ペプチドリガンドの配列は、表面蛋白質融合体をコードするＤＮＡをシークエンシングすることによって簡単に決定されるかもしれない。使用されうる他の方法は、Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， ５９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１から購入可能な、ＮｏｖａＴｏｐｅＴＭ ｓｙｓｔｅｍである。この方法は、バクテリアクローンのライブラリーの作製に基づいており、それらの各々は、リガンドが含まれると考えられる候補蛋白質由来の小ペプチドを安定に発現する。ライブラリーは、抗体または他の結合因子をプローブとして用いる、標準的なリフト法によってスクリーニングされる。陽性のクローンは、リガンドの正確なアミノ酸配列を決定するために、ＤＮＡシークエンシングによって直接分析することが可能である。
【０３９６】
Ｌａｍ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ８２−８４によって発表されたような、個々のペプチド種を結合させたビーズ、あるいはＵＳ ５１４３８５４におけるＰｉｒｒｕｎｇ ｅｔ ａｌによって発表されたような、固体支持体上の個々の合成ペプチド配列のマトリックスのライブラリーを使用する、更なる方法もまたペプチドリガンドを同定するために使用されるかもしれない。
【０３９７】
ハイスルースプット操作が可能なスクリーニングアッセイが、特に好ましいと認識される。例は、細胞を使用したアッセイおよび蛋白質−蛋白質結合アッセイを含むかもしれない。ＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）をベースにしたシステムが、使用されるかもしれない。例えば、プロテインキナーゼの活性を調節することのできる化合物を同定するアッセイは、次のように行われるかもしれない。シンチランとリン酸化されるかもしれないポリペプチドを含むビーズが調製されるかもしれない。ビーズは、プロテインキナーゼと３２Ｐ−ＡＴＰまたは３３Ｐ−ＡＴＰを含むサンプル、および試験化合物と混合されるかもしれない。便利なことに、これは９６ｗｅｌｌフォーマットにおいて行われる。そうしてプレートは、適切なシンチレーションカウンターを使用して、３２Ｐまたは３３Ｐ ＳＰＡアッセイの知られた変数によって計測される。Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔに近接して存在する３２Ｐまたは３３Ｐのみ、例えばポリペプチドに結合したもののみ、が検出される。そのようなアッセイの変法、例えばポリペプチドが、抗体への結合を介してｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔビーズ上に固定化されるような方法、が使用されるかもしれない。
【０３９８】
ポリペプチド／ポリペプチド相互作用を検出する他の方法は、イオンスプレイ質量分析装置／ＨＰＬＣ法での限外濾過、あるいは他の物理的、および分析方法を含む。蛍光エネルギー共鳴転移（ＦＲＥＴ）法は、例えば、技術的に熟練した者によく知れらており、使用されるかもしれない。そこでは、二種類の蛍光標識された物質間の結合が、お互い近接したときの蛍光標識の相互作用を計測することによって、測られるかもしれない。
【０３９９】
ポリペプチドの巨大分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、およびリン脂質、への結合を検出する、他の方法は、例えばＰｌａｎｔ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２６（２）， ３４２−３４８に述べられているように、表面プラズモン共鳴アッセイを含む。方法は、例えば放射性、または蛍光標識で標識された、ポリペプチドを使用させるかもしれない。
【０４００】
ＥＣＳＭ４ポリペプチドに結合可能な化合物を同定する更なる方法は、ポリペプチドが化合物にさらされ、上記のポリペプチドへの化合物の結合が検出および／または計測されるような方法である。ポリペプチドへの化合物の結合における結合定数が、決定されるかもしれない。ポリペプチドへの化合物の結合を検出および／または計測（定量）する適切な方法は、技術的に熟練した者によく知られ、例えばハイスルースプット操作が可能な方法、例えばチップに基づく方法、を使用して実施されるかもしれない。新技術、ＶＬＳＩＰＳＴＭと呼ばれる、は非常に多くの様々な分子プローブを含む、極小チップの生産を可能にする。これらの生物学的チップまたはアレイは、揃えて整列されたプローブをもち、それぞれのプローブが特異的な位置を割り当てられている。生物学的チップは、それぞれの位置が例えば１０ミクロンの規模で製造されている。チップは、標的分子がチップ上の任意のプローブと相互作用するかを決定するために使用することができる。選択された試験条件下、アレイは標的分子にさらされた後、スキャン装置がアレイ上の各位置を調べることができ、標的分子が、その位置でプローブと相互作用するか決定することができる。
【０４０１】
生物学的チップまたはアレイは、プローブまたは標的分子についての情報を得るために、様々なスキャン技術において有用である。例えば、ペプチドライブラリーは、薬剤をスクリーンするためのプローブとして使用されうる。ペプチドは受容体にさらされ、受容体に結合するプローブが同定されうる。参照１９９９年２月２３日にＲａｖａ ｅｔ ａｌに交付されたＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８７４，２１９。
【０４０２】
ＥＣＳＭ４の活性を調整する標的蛋白質のほかの方法は、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍであり、本発明のポリペプチドは、ＥＣＳＭ４蛋白質に結合する蛋白質を”捕捉する”ために使用することができる。酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍは、Ｆｉｅｌｄｓ ＆ Ｓｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ ３４０： ２４５−２４６ （１９８９）に述べられている。
【０４０３】
ｉｎ ｖｉｖｏポリペプチドの活性を調整するかもしれない化合物を同定することが望ましいと理解されている。このように、本方法において使用される試薬と条件は、上記および相互作用するポリペプチド間の相互作用が、上記の天然に生じるポリペプチドとｉｎ ｖｉｖｏ天然に生じる相互作用ポリペプチド間のものと、実質的に同じであるように選択されるかもしれない。
【０４０４】
ここに述べた方法において、リガンドは薬剤様化合物または薬剤様化合物の開発のためのリード化合物であるかもしれないと認識される。
【０４０５】
語“薬剤用化合物”は、技術的に熟練した者によく知られ、医療における使用に適したものにする特徴、例えば薬中の有効成分のような、を有する化合物の意味を含む。このように、例えば薬剤様化合物は、有機化学の技術によって、さほど好ましくないが分子生物学または生化学の技術によって合成されるかもしれない分子であり、好ましくは、５０００ダルトン以下、水溶性の小分子であるかもしれない。薬剤様化合物は、さらにある特別な蛋白質、または蛋白質群と選択的に相互作用する性質を示し、生物学的利用可能および／または標的細胞の膜に浸透可能であるが、これらの性質は必須でないことが認識される。
【０４０６】
語”リード化合物”は同様に、技術的に熟練した者によく知られ、それ自身は薬剤として適していないが（例えば、意図する標的に対し潜在性が弱い、その作用の非選択性、不安定、難溶性、合成困難、または生物学的利用能の低さのため）、その化合物はより望ましい性質を有するかもしれない他の化合物の設計のための開始点を与える。
【０４０７】
または、本方法は、”ライブラリースクリーニング”法、技術的に熟練した者によく知られる語として使用されるかもしれない。このように、例えば、本発明の方法は、ＥＣＳＭ４のポリペプチドアクチベーターを発現することが可能なポリヌクレオチドを検出する（および任意に同定する）ために使用されるかもしれない。
【０４０８】
このように、本発明のこの特徴点の実施態様は、薬剤様化合物またはポリペプチドＥＣＳＭ４の活性を調整する、薬剤様化合物の開発のためのリード化合物を同定する方法、化合物をポリペプチド、またはその適切な異形、断片、誘導体、または融合体、あるいはその異形、断片、誘導体の融合体、またはそのと接触させること、および、例えば上記のポリペプチドの酵素活性が、上記の化合物のない場合に、上記のポリペプチド、あるいは上記のその異形、断片、誘導体、または融合体、あるいはその異形、断片、または誘導体の融合体の活性に比較して、変化するかどうか決定する方法を与える。
【０４０９】
好ましくは、ＥＣＳＭ４ポリペプチドは、本発明の第十一の特徴点に関する上述したようなものである。
【０４１０】
ｉｎ ｖｉｖｏポリペプチドの活性を調整するかもしれない化合物を同定することが望ましいと理解される。このように、本方法に使用される試薬および条件は、上記のポリペプチドとその基質との間の相互作用が、実質的にｉｎ ｖｉｖｏと同じであるような中から選択されるかもしれないと理解される。
【０４１１】
ある実施態様において、化合物は上記のポリペプチドの活性を減少させる。例えば、化合物は上記の化合物の活性部位に、実質的に可逆的に、あるいは実質的に不可逆的に結合するかもしれない。さらなる例において、化合物は上記の化合物の、そのリガンドへの結合を阻害するように、活性部位ではない上記の化合物の部分に結合するかもしれない。またさらなる例において、化合物は、アロステリック効果によって上記のポリペプチドの活性を減少させるように、上記のポリペプチドの部分に結合するかもしれない。このアロステリック効果は、上記のポリペプチドの活性の本来の調節、例えば、“上流の活性化因子”による上記のポリペプチドの活性化に関わるアロステリック効果であるかもしれない。
【０４１２】
本発明のまた更なる特徴点は、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４遺伝子の任意の一つのプロモーターおよび／または調節部分を含むポリヌクレオチドを与える。
【０４１３】
“ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４遺伝子”によって、われわれは、ここに定義されるように、転写されたとき、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４ポリペプチドを含む、ポリペプチドをコードする天然のゲノム配列をさす。ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４遺伝子の天然のゲノム配列は、イントロンを含むかもしれない。
【０４１４】
本発明のこの特徴点のポリヌクレオチドは、好ましくは、転写プロモーター活性を有するものである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ、転写が起きるようにするＤＮＡ配列によって形成される、発現制御要素である。好ましくは、転写プロモーター活性は、哺乳動物細胞において存在し、より好ましくは、ポリヌクレオチドは内皮細胞において転写プロモーター活性を有する。
【０４１５】
好ましくは、プロモーターおよび／または調節部分は、内皮細胞選択的発現を可能にするものである。
【０４１６】
好ましくは、ＥＣＳＭ４遺伝子のプロモーターまたは調節領域は、低酸素状態に応じて、操作的に結合させたコード配列の転写を促進させることが可能なものである。より好ましくは、コード配列の転写レベルは、低酸素状態にないときの転写レベルに比べ、低酸素状態において上昇する。“低酸素状態”によって、われわれは不適切な細胞増殖が、周囲の組織の酸素を奪う癌、例えば血管閉塞がある組織へ酸素の配送を制限するかもしれない心疾患、および血管組織細胞の破壊が周りの組織への酸素の供給を減少させ、結果、周りの組織の死につながる組織壊死の生理的な状態を含む。低酸素は、Ｈｏｃｋｅｌ ａｎｄ Ｖａｕｐｅｌ （２００１） Ｊ． Ｎａｔ． Ｃａｎ． Ｉｎｓｔ． ９３： ２６６−２７６により詳細に述べられている。
【０４１７】
このように、好ましい実施態様において、ＥＣＳＭ４プロモーターまたは調節領域は、低酸素状態を治療するための療法遺伝子を発現させる、遺伝子療法の使用に適したベクターに含まれる。好ましくは、低酸素状態は、癌または心疾患である。“療法遺伝子”は、望ましい療法効果をあたえる任意の遺伝子である。
【０４１８】
低酸素状態を治療するための上記のＥＣＳＭ４プロモーターの使用は、例えば遺伝子療法によって、本発明の目的の範囲内に含まれる。
【０４１９】
遺伝子のプロモーター領域の配列の決定は、技術的によく知られている。
プロモーター領域の存在は、既知のモチーフの同定によって決定され、同定された配列の変異解析によって確認される。好ましくは、プロモーター配列は、ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４のゲノムコード領域の５キロ塩基対上流域に位置する。より好ましくは、それは３キロ塩基対、または２キロ塩基対、または１キロ塩基対、または５００塩基対上流域に位置し、さらに好ましくは、転写開始部位の２１０塩基対中に位置する。
【０４２０】
エンハンサーのような調節領域、または転写要素は、プロモーターよりも遺伝子との相対的な位置を予測しにくい。しかしながら、調節領域を示す多くの領域がよく特徴付けられ、関連する遺伝子の転写レベルに影響するそのような領域は、通常これらのモチーフに基づいて同定されうる。そのような領域の機能は、変異解析およびＤＮＡフットプリンティングやゲル泳動度シフトアッセイを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ結合アッセイのような、よく知られた方法によって示されうる。
【０４２１】
ＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４遺伝子の転写に影響を及ぼす調節領域は、関連するゲノムコード領域の上流、２０キロ塩基対、１０キロ塩基対、７キロ塩基対、５キロ塩基対、３キロ塩基対、より好ましくは１キロ塩基対の領域中に位置する可能性が高い。
【０４２２】
配列にタグした部位、およびマッピングの間隔は、プロモーター領域、調節領域、および物理的なクローンを位置づけることを助ける。
【０４２３】
さらなる実施態様において、プロモーターおよび／または調節部分を含むポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに操作的に連結される。プロモーターポリヌクレオチドをポリペプチドコード配列に連結する方法は、技術的によく知られている。
【０４２４】
好ましくは、ポリペプチドは療法ペプチドである。療法ポリペプチドは、内皮細胞において選択的に発現するために、医薬的に有用である、任意のポリペプチドであるかもしれない。そのような療法ペプチドの例は、抗増殖、または免疫調節、または血液凝固影響因子、あるいは抗増殖、または抗炎症サイトカインを含む。それらはまた、抗癌ポリペプチドを含むかもしれない。
【０４２５】
本発明のこの特徴点のある実施態様において、そのポリヌクレオチドは薬における使用に適したものである。このように、本発明は、薬への使用に包装され、示されたポリヌクレオチドを含む。そのようなポリヌクレオチドは、遺伝子療法に、特に内皮細胞選択的に療法ポリペプチドを発現させることが望ましい場合に、特に有用であると認識される。ポリヌクレオチドは遺伝子療法における使用に適したものであれば、好ましい。
【０４２６】
遺伝子療法は、一般的に許容されている方法、例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ， １９９１によって述べられているような、に従って行われる。ウイルスまたはプラスミドベクターは、上述したようにＥＣＳＭ１またはＥＣＳＭ４の転写に影響を及ぼすプロモーターや他の調節要素のような、発現調節要素に連結して発現される、および内皮細胞内部で複製可能な、一コピーの遺伝子を含み、調製される。適切なベクターがＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，２５２，４７９およびＷＯ ９３／０７２８２に発表されているように知らている。そうしてベクターは、局所的にあるいは全身に注入される。形質導入した遺伝子が標的の内皮細胞のそれぞれのゲノムに永続的に取り込まれない場合に、治療は周期的に繰り返し行われなければならないかもしれない。
【０４２７】
技術的に知られる遺伝子転移システムは、本発明の遺伝子療法の実行において有用であるかもしれない。これらは、ウイルスおよび非ウイルス転移方法を含む。多くのウイルスが遺伝子転移ベクター、パポバウイルスを含み、例えばＳＶ４０ （Ｍａｄｚａｋ ｅｔ ａｌ， １９９２）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ， １９９２； Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ， １９８８； Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ ａｎｄ Ｋａｐｉｋｉａｎ， １９９２； Ｑｕａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ， １９９０）、ｖａｃｃｉｎｉａ ウイルス（Ｍｏｓｓ， １９９２）、アデノ関連ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ， １９９２； Ｏｈｉ ｅｔ ａｌ， １９９０）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ， １９９２； Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｇｅｌｌｅｒ， １９８７； Ｆｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ， １９９０）、および鳥類（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ， １９８４； Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ， １９９２）、マウス（Ｍｉｌｌｅｒ， １９９２； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９８５； Ｓｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ， １９８４； Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９８５； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９８８）、およびヒト起源（Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ， １９９１； Ｈｅｌｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ， １９９２）のレトロウイルス、として使用されている。現在まで、多くのヒト遺伝子療法プロトコルは、能力のないマウスレトロウイルスに基づいていた。
【０４２８】
技術的に知られる非ウイルス遺伝子転移方法は、カルシウムリン酸共沈降（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， １９７３； Ｐｅｌｌｉｃｅｒ ｅｔ ａｌ， １９８０）のような化学的な技術；機械的な技術、例えばマイクロインジェクション（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９８０； Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ， １９８０； Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， １９８１； Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ ａｎｄ Ｌａｃｙ， １９８１）；リポソームを介した膜融合による転移（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ， １９８７； Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， １９８９； Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ， １９８９； Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ， １９９２）；およびＤＮＡの直接取り込み、および受容体を介したＤＮＡ転移（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｗｕ ｅｔ ａｌ， １９９１； Ｚｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｗｕ ｅｔ ａｌ， １９８９ｂ； Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ， １９９１； Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９１； Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９１ａ； Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ， １９９１ｂ）を含む。
【０４２９】
他の適したシステムは、Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５， ８６６−８７０によって述べられている、レトロウイルス−アデノウイルスハイブリッドシステム、または適切な一本鎖Ｆｖ断片のような標的リガンドをもつウイルスシステムを含む。
【０４３０】
生物学的および物理学的遺伝子転移法を併せるアプローチにおいて、任意のサイズのプラスミドＤＮＡは、アデノウイルスヘクソン蛋白質に特異的なポリリジン結合抗体と結合し、その複合体はアデノウイルスベクターに連結される。この３分子複合体は細胞を感染させるために使用される。アデノウイルスベクターは、効果的な結合、取り込み、および共役したＤＮＡが分解される前にエンドソームの分解を可能にする。
【０４３１】
リポソーム／ＤＮＡ複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子転移を直接仲介できることが示されている。標準的なリポソーム調製において、遺伝子転移過程が非特異的であるのに対し、局在化したｉｎ ｖｉｖｏ取り込みと発現は、腫瘍の位置において報告され、例えば直接のｉｎ ｓｉｔｕ投与に続けられる（Ｎｏｂｅｌ， １９９２）。
【０４３２】
組織、例えば内皮細胞に直接ＤＮＡを標的させる遺伝子転移技術が好ましい。例えば受容体を介した遺伝子転移は、ＤＮＡ（通常、共有結合で閉じたスーパーコイルドプラスミドの形で）のポリリジンを介した蛋白質リガンドへの結合によって行われる。リガンドは、標的細胞／組織種の細胞表面上に対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択される。内皮細胞の場合には、適切な受容体はＥＣＳＭ４である。これらのリガンド−ＤＮＡ結合は、望ましければ直接血液中に注入され、受容体結合とＤＮＡ−蛋白質複合体の取り込みが起こる標的組織に向けられる。ＤＮＡの細胞内破壊の問題を克服するために、アデノウイルスとの共感染がエンドソームの機能を破壊するために含まれうる。
【０４３３】
機能的に野生型遺伝子を使用する置換遺伝子療法が使用される場合において、体内の様々な部位、内皮細胞、血流、および分泌／排泄例えば尿において、置換遺伝子ｍＲＮＡまたはコードする置換ポリペプチド、あるいは機能的遺伝子産物の存在を検出することによって、治療を監視するのは有効であるかもしれない。
【０４３４】
本発明のさらなる特徴点は、癌、心疾患、低酸素状態、子宮内膜症、または動脈硬化である患者を治療する方法、本発明に従う、ポリヌクレオチドを患者に投与することを含む、方法を与える。そこでは、ポリヌクレオチドは、療法ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、操作的に連結されたプロモーターまたは調節領域を含む。
【０４３５】
本発明のまたさらなる特徴点は、患者の血管新生を調整する方法、本発明に従うポリヌクレオチドを患者に投与することを含む、方法を与える。そこではポリヌクレオチドは、療法ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはＥＣＳＭ４あるいはその断片または異形を発現させることのできる、あるいはＥＣＳＭ４アンチセンス核酸を含む、ポリヌクレオチドに操作的に連結された、本発明のプロモーターまたは調節領域を含む。
【０４３６】
療法ペプチドは、患者の治療に有用な任意の療法ポリペプチドであるかもしれない。好ましくは、療法ポリペプチドは、任意の一つまたはそれ以上の免疫調整性、抗癌、血液凝固影響因子あるいは抗増殖または抗炎症サイトカインであるかもしれない。
【０４３７】
アンチセンス核酸は、上により詳細に論じられている。つまり、アンチセンス核酸の機能は、特異的なｍＲＮＡの翻訳を阻害することであり、そのアンチセンス核酸は、相補的であり、少なくとも部分的に細胞内でハイブリッド形成ができるものである。最適なアンチセンス核酸分子の設計は、分子生物学の技術においてしられている。
【０４３８】
本発明はまた、本発明に従うポリヌクレオチドの使用を与え、そのポリヌクレオチドは、癌、心疾患、低酸素状態、子宮内膜症、または動脈硬化を治療するための薬の製造において、療法ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに操作的に連結された、本発明のプロモーターまたは調節領域を含む。
【０４３９】
本発明は、現在次の例および図中に参考として、より詳細に述べられている。
【実施例】
【０４４０】
実施例１
新規内皮特異的遺伝子のｉｎ ｓｌｉｃｉｏクローニング
われわれは、血管内皮において特異的にまたは優先的に発現する遺伝子を同定するために、実験的な証明と併せた様々な発現分析の二つの独立する方針の使用を述べる。
【０４４１】
最初の方針は、ヒトＵｎｉＧｅｎｅ遺伝子インデックス（Ｓｃｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９７）におけるＥＳＴクラスター発現分析に基づいた。Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， １９９７）は、二種類のプールにグループ化された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対して非常に高い厳密性で行われた。これらの二種類のプールは、ｄｂＥＳＴ（Ｂｏｇｕｓｋｉ ｅｔ ａｌ， １９９５）由来の内皮細胞および非内皮細胞ライブラリーを含む。第二の方針は、二次データマイニングツール：ＳＡＧＥｍａｐ ｘＰｒｏｆｉｌｅｒを使用した。ｘＰｒｏｆｉｌｅｒは、無償で利用できるオンラインツールであり、ＮＣＢＩ’ｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ （ＣＧＡＰ）（Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ， １９９５）の一部である。これらの二種類のアプローチどちらかのみでは、がっかりするほど、非常に多くの偽陽性を生じていたが、両方の方針が合わさると、予測は例外的に信頼性あるものと証明され、二種類の新規内皮特異的遺伝子の候補が同定された。完全長ｃＤＮＡは、配列データベースにおいて同定された。他の遺伝子（ＥＳＴクラスター）は、大規模ｃＤＮＡシークエンシング計画から、部分的ｃＤＮＡに対応し、ヒトｒｏｕｎｄａｂｏｕｔホモログ１（ＲＯＢＯ１）の細胞内領域に類似性を示す領域を含んでいる。
【０４４２】
ＵｎｉＧｅｎｅ／ＥＳＴ遺伝子インデックススクリーン
内皮および非内皮配列のプールは、ｄｂＥＳＴの配列回復システム（ＳＲＳ）バージョン５を使用して抽出された。内皮プールは、９種類のヒト内皮ライブラリー（表１）からの１１，１１７ ＥＳＴｓから構成された。非内皮プールは、１０８のヒト細胞系統および微小切開された腫瘍ライブラリー（表２）からの１７３，１３７ ＥＳＴｓを含んでいた。ｄｂＥＳＴｓから抽出されたＥＳＴｓは、２０００年４月に公開する。多様なＦＡＳＴＡファイルは、ｐｒｅｓｓｄｂプログラムを使用して、ＢＬＡＳＴ検索可能なデータベースに変換された。表３は、これら２種類のプールに存在する、５種類の既知の内皮細胞特異的遺伝子の発現状態を示す。
【０４４３】
続いて、各ＵｎｉＧｅｎｅクラスター（ＵｎｉＧｅｎｅ Ｂｕｉｌｄ ＃１１１ ２０００年５月，
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＦＡＳＴＡ ｆｉｌｅ ｈｓ．ｓｅｑ．ｕｎｉｑ）における最も長い、代表的な配列が、これらの２種類のプールに対して、非常に高い厳密性でＢＬＡＳＴ検索された。そのような報告された代表的な配列は、ヒットしなければ、クラスター（ＵｎｉＧｅｎｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ＦＡＳＴＡ ｆｉｌｅ ｈｓ．ｕｎｉｑ）に属する配列の残りが、ＢＬＡＳＴ ｑｕｅｒｉｅｓとして使用された。結局、非内皮プールにおいてヒットしなかったクラスターと内皮プールにおいて少なくとも一つのヒットが選択された。
【０４４４】
ＢＬＡＳＴ Ｅ−ｖａｌｕｅを最適化することは、ＢＬＡＳＴ同一性レベル検索を成功させるために重要であった。あまりに高いＥ−ｖａｌｕｅは、報告されている遺伝子パラログの同定になるし、あまりに低い（厳しい）Ｅ−パラメーターは、多くの偽陽性の同定になる、例えば真陽性は、ＥＳＴデータにおけるシークエンシングエラーのため、報告されていない：ＥＳＴｓは、大規模低予算一回限りのシークエンシングに因り、高いエラー頻度を生じている（Ａａｒｏｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９６）。本研究では、１０ｅ−２０のＥ−ｖａｌｕｅが、非内皮ＥＳＴプールに対しての検索に使用され、より厳しい１０ｅ−３０の値が、より小さい内皮プールに対する検索に使用された。これらの値は、一連の試験ＢＬＡＳＴ検索後、最適であると判断された。
【０４４５】
ＳＡＧＥデータおよびＳＡＧＥｍａｐ ｘＰｒｏｆｉｌｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ
ウェブに公開されているＳＡＧＥライブラリーサブトラクション（ＳＡＧＥｍａｐ ｘＰｒｏｆｉｌｅｒ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥ／ｓａｇｅｘｐｓｅｔｕｐ．ｃｇｉ）が、新規の内皮特異的または優先的遺伝子を同定するための、第二のデータマイニング方針として利用された。二種類の内皮ＳＡＧＥライブラリー（１１０，７９０配列総数をもつＳＡＧＥ＿Ｄｕｋｅ＿ＨＭＶＥＣ ａｎｄ ＳＡＧＥ＿Ｄｕｋｅ＿ＨＭＶＥＣ＋ＶＥＧＦ）が、２４の非内皮細胞系統ライブラリー（表４に完全なリスト、総７３３，４６１配列）に比較された。表５は、５種類の既知の内皮特異的遺伝子の発現状態を示している：これらの２種類のＳＡＧＥプールにおいて、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）、二種類の血管内皮成長因子受容体：ｆｍｓ様チロシンキナーゼ １（ｆｌｔ１）およびキナーゼ挿入領域受容体（ＫＤＲ）、チロシンキナーゼ受容体型ｔｉｅ（ＴＩＥ１）およびチロシンキナーゼ受容体型ｔｅｋ（ＴＩＥ２／ＴＥＫ）。
【０４４６】
併せたデータは、非常に正確な予測を与える。
２０の既知の遺伝子が、ＵｎｉＧｅｎｅ／ＥＳＴスクリーンにおいて選択された（表６）。これらの遺伝子は、非内皮プールにおいてヒットせず、内皮プールにおいて少なくとも一つヒットした。このリストは、少なくとも４種類の内皮特異的な遺伝子を含んでいた：ＴＩＥ１、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＬＹＶＥ１およびマルチマリン、予測の￣２０％の正確さを示している。リスト上の他の遺伝子は、内皮細胞において確実に優先的に発現する一方で、内皮特異的ではないかもしれない。予測の正確さを改良するために、われわれは、ＵｎｉＧｅｎｅ／ＥＳＴスクリーンをｘＰｒｏｆｉｌｅｒ ＳＡＧＥ分析と併せることにした。ｘＰｒｏｆｉｌｅｒアウトプットは、予測の確実性に従ってソートされた、非内皮プールにおけるよりも内皮において１０倍高い数のタグを持つ遺伝子のリストから構成される。９０％確実性の閾値が、このリストに適用された。表７は、二種類のアプローチからのデータがどのように合わされたかを示す。同一性レベルＢＬＡＳＴ検索は、ｍＲＮＡ（既知の遺伝子）またはｐｈｒａｐ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｃｏｎｔｉｇ（ＥＳＴクラスターの表す新規の遺伝子）について、内皮および非内皮プールにおいて、これらの遺伝子がどのように代表されるかを調べるために、行われた。つづいてＲＴ−ＰＣＲによる実験的な証明が、併せたアプローチは１００％正しい、例えばｘＰｒｏｆｉｌｅｒリスト上の遺伝子は、非内皮ＥＳＴプールとは一致せず、実際に内皮特異的であった内皮プールにおいて、少なくとも一つ一致した、ことを証明した。
【０４４７】
ディスカッション
組織トランスクリプトームのコンピューター解析についていくつか報告があった。通常、与えられた遺伝子、またはある種類の遺伝子に割り当てられたタグの数に基づいて、発現プロフィールが構築される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｗｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｂｏｒｔｏｌｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ， ２０００）。試みは、組織特異的な転写物を同定するためになされる。例えば、Ｖａｓｍａｔｚｉｓ ｅｔ ａｌ， （１９９７）はｄｂＥＳＴコレクションからライブラリーのｉｎ ｓｌｉｃｉｏサブトラクションによって、前立腺において独占的に発現する３種類の新規遺伝子について述べている。ｃＤＮＡを作製した目的もまた使用されるかもしれない。１０種類の顆粒球特異的遺伝子候補が、顆粒球および１１種類の他の組織サンプル、つまりｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ細胞系統、胎児肝臓、幼児肝臓、成人肝臓、皮下脂肪、内臓脂肪、肺、大腸粘膜、ケラチノサイト、角膜、および網膜、由来のｃＤＮＡライブラリーの広範な配列分析によって同定されている（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ， １９９８）。
【０４４８】
Ｖａｓｍａｔｚｉｓ ｅｔ ａｌによってとられたｄｂＥＳＴに基づくアプローチに類似の分析は、内皮細胞が体のすべての組織に存在し、内皮−ＥＳＴｓはすべての大きな組織のライブラリーで汚染されているという事実によって複雑化される。これを確認するために、われわれは、３種類のよく知られた内皮特異的な遺伝子を使用した：ｄｂＥＳＴに対するＢＬＡＳＴ検索の検索遺伝子としてＫＤＲ、ＦＬＴ１、およびＴＩＥ−２。転写物は、広範な組織に存在し、よく血管新生した組織（例えば、骨盤、網膜）、胚の（肝臓、脾臓）または幼児（脳）組織において多数回のヒットがあった。さらに、われわれは、内皮ＥＳＴライブラリーを他のすべてのｄｂＥＳＴライブラリーに対して単純なサブトラクションをおこなったが、任意の特異的遺伝子は、同定できなかった（データ示さず）ことがわかった。
【０４４９】
２種類の非常に異なる発現データ源が、われわれのデータマイニングに使用された。ＵｎｉＧｅｎｅ／ＥＳＴスクリーンは、ｄｂＥＳＴからの発現タグライブラリーに基づいて行った。比較的総数の小さい：￣１１，１１７ ＥＳＴｓをもつｄｂＥＳＴの現在の公開データにおいて９種類のヒト内皮ライブラリーがある。いくつかのよく知られた内皮特異的遺伝子は、このデータセットには含まれていない（表３）。この制限は、発現レベルの低い遺伝子は、われわれの分析では見落とす可能性があると関心を引いた。それゆえに、われわれは、他の型のコンピューター発現データ：ＣＧＡＰ ＳＡＧＥライブラリー、を利用した。
【０４５０】
ＳＡＧＥタグは、時おり小さいＥＳＴｓ（通常長さ１０−１１塩基対）と呼ばれる。その主要な優位性は、それらがｃＤＮＡ内に明確に位置しうることである：それらは、多くの３’ ＮｌａＩＩＩ制限部位に隣接してすぐに存在する。同時に利用可能なただ２種類の内皮ＣＧＡＰ ＳＡＧＥライブラリーもあるけれども、それらは、強い印象を与える総数、約１１１，０００タグを含み、内皮ＥＳＴプールにおける１１，１１７配列にくらべ約１０倍大きいデータセットを含む。併せたアプローチは、ＲＴ−ＰＣＲによって実証したとき、非常に正確である（表８）と証明した。
【０４５１】
われわれは、ここに２種類の新規内皮特異的遺伝子の同定を報告する：内皮細胞特異的分子１（ＥＣＳＭ１−ＵｎｉＧｅｎｅ ｅｎｔｒｙ Ｈｓ． １３９５７）およびｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ（ＵｎｉＧｅｎｅ ｅｎｔｒｙ Ｈｓ． １１１５１８）である。これらの遺伝子について利用可能なデータの包括的な要約は、参照表８。
【０４５２】
実験的実証と併せたわれわれのデータマイニングアプローチは、パワフルな機能的ゲノミクスツールである。この種の分析は、内皮細胞だけでなく、多くの細胞種に適用できる。発見した遺伝子の機能を同定する試みは残っているが、構造ゲノミクス、またはホモロジーのようなバイオインフォマティクスおよびモチーフ検索は、実験的に実証されうる洞察を与えることができる。
【０４５３】
要約として、このスクリーニングアプローチは、新規の内皮細胞特異的遺伝子と発現が内皮細胞特異的であることが知られていなかった既知の遺伝子の同定を可能にした。この同定は、内皮細胞生物学のわれわれの理解を進めるとともに、内皮を伴う医学的状態をイメージング、診断、および治療するために、新たな薬理学上の標的を与える。
【０４５４】
方法
ＰＥＲＬ ｓｃｒｉｐｔｓ
ＰＥＲＬ ｓｃｒｉｐｔｓの多くは、大規模配列回復、ＢＬＡＳＴ検索提出、および自動的ＢＬＡＳＴアウトプット分析を容易にするために作られた。
【０４５５】
Ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ
局所的に保存されたＵｎｉＧｅｎｅファイル（Ｂｕｉｌｄ＃１１１、２０００年５月に公開される）は、この報告の準備に使用された。ＵｎｉＧｅｎｅウェブサイトは、ＵＲＬ： ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／でアクセス可能であり、ＵｎｉＧｅｎｅファイルは、ｆｔｐ貯蔵庫： ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｕｎｉｇｅｎｅ／からダウンロード可能である。ＵｎｉＧｅｎｅのヒトセットの代表する配列（クラスター中の最も長いＥＳＴ）は、ファイルＨｓ．ｓｅｑ．ｕｎｉｑに保存されており、一方クラスターに属する、すべてのＥＳＴｓは、Ｈｓ．ｓｅｑと呼ばれる別のファイルに保存されている。
【０４５６】
ｄｂＥＳＴデータベースから抽出された配列は、ＨＧＭＰセンターで、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＲＳ ｖｅｒｓｉｏｎ５） ｇｅｔｚコマンドを使用して、部分的にアクセスした。これは、内皮および非内皮サブセットにおけるすべてのライブラリーに、ＰＥＲＬ ｓｃｒｉｐｔｓを使用して繰り返し行われ、配列は、二種類のｍｕｌｔｉｐｌｅ−ＦＡＳＴＡファイルに合併された。
【０４５７】
非内皮ＥＳＴライブラリーでの選択基準
１０８種類の非内皮ｄｂＥＳＴライブラリーの選択は、ほとんどマニュアルで行われた。すべての利用可能なｄｂＥＳＴライブラリーのリスト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｌｉｂｓ＿ｂｙｏｒｇ．ｈｔｍｌ）は、キーワード“細胞”およびフレーズ“細胞系統”を使用して検索された。検索する一方でライブラリーの多くを同定した。さらなるキーワードは、リストを完全にするために加えられた：“メラノサイト”、“マクロファージ”、“ＨｅＬａ”、“繊維芽細胞”。ある場合には、詳細なライブラリー解説が、ライブラリーが細胞系統／一次培養由来であることを確認するために、調べられた。われわれはまた、多くのＣＧＡＰ微小砕片にされた腫瘍ライブラリーを加えた。そのために、ライブラリーブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＧＡＰ／ｈＴＧＩ／ｌｂｒｏｗ／ｃｇａｐｌｂ．ｃｇｉで利用可能）が、キーワード“微小砕片にされた”での検索を行うために加えられた。
【０４５８】
ＵｎｉＧｅｎｅ遺伝子インデックススクリーン
ＵｎｉＧｅｎｅ遺伝子転写インデックスは、ＧｅｎｅＢａｎｋ、ｄｂＥＳＴのＥＳＴ区分に対してスクリーンされた。ＵｎｉＧｅｎｅおよびｄｂＥＳＴの両者とも国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）で開発された。ＵｎｉＧｅｎｅは、推定の唯一の遺伝子に対応するＥＳＴクラスターである。現在、それは４種類のデータセット：ヒト、マウス、ラット、およびゼブラフィッシュ、から構成される。ヒトデータセットは、約９０，０００クラスター（ＵｎｉＧｅｎｅ Ｂｕｉｌｄ＃１１１ ２０００年５月）から構成される。非常に高度な厳密性に基づいたＢＬＡＳＴ同一性検索によって、われわれは、内皮において転写物があるが、非内皮細胞種ｄｂＥＳＴにおいては存在しないＵｎｉＧｅｎｅ遺伝子を同定しようとした。プロジェクトを通じて、ワシントン大学ｂｌａｓｔ２は、ギャップのあるバージョンであり、ＢＬＡＳＴ実行として使用された。Ｅ−ｖａｌｕｅは、非内皮ＥＳＴプールにおける検索には１０ｅ−２０に設定され、小さい内皮プールにおける検索には１０ｅ−３０に設定された。
【０４５９】
ＵｎｉＧｅｎｅは、そのクラスターに共通配列を与えないのに対し、クラスター中の最も長い配列が同定された。このように、この最も長い代表的な配列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＦＡＳＴＡファイル Ｈｓ．ｓｅｑ．ｕｎｉｑ）が、内皮および非内皮ＥＳＴプールに対して非常に高度な厳密性に基づくＢＬＡＳＴを使用して検索された。そのような代表的な配列が、どんな一致も示さない場合、クラスター（ＵｎｉＧｅｎｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＦＡＳＴＡファイル Ｈｓ．ｓｅｑ）に属する配列の残りが、ＢＬＡＳＴ検索対象として続けられた。結局、非内皮プールにおいてまったく一致しないクラスター、および内皮プールにおいて少なくとも一つ一致したクラスターが、ＢＬＡＳＴ ｔｅｘｔｕａｌ ｏｕｔｐｕｔを分析するＰＥＲＬ ｓｃｒｉｐｔｓを使用して選択された。
【０４６０】
ｘＰｒｏｆｉｌｅｒ ＳＡＧＥ サブトラクション
ｘＰｒｏｆｉｌｅｒは、ｏｎ−ｌｉｎｅユーザーが、専用の統計アルゴリズム（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９８）を使用して、総数約２，３００，０００ ＳＡＧＥタグをもつ４７の遺伝子発現の連続的分析（ＳＡＧＥ）ライブラリーの任意の組み合わせの、様々な比較を可能にする。ｘＰｒｏｆｉｌｅｒは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥ／ｓａｇｅｘｐｓｅｔｕｐ．ｃｇｉでアクセス可能である。ＳＡＧＥそれ自身は、量的な発現技術であり、そこでは遺伝子は、一般的にｃＤＮＡの多くの３’ＮｌａＩＩＩ制限部位に隣接した１０または１１塩基対によって同定される（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ， １９９５）。
【０４６１】
二種類の利用可能な内皮細胞ライブラリー（ＳＡＧＥ＿Ｄｕｋｅ＿ＨＭＶＥＣおよびＳＡＧＥ＿Ｄｕｋｅ＿ＨＭＶＥＣ＋ＶＥＧＦ）がプールＡを定義し、２４種類の非内皮ライブラリーはともに、プールＢを築いた。アプローチは、Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｔａｇ Ｍａｐｐｉｎｇ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥ／ＳＡＧＥｃｉｄ．ｃｇｉ）を使用して、二種類のＳＡＧＥプール（表５）における５種類の参考内皮特異的遺伝子の発現状態を、確立することによって実証された。つづいて、ｘＰｒｏｆｉｌｅｒが、プールＡとＢの間で異なる発現を示す遺伝子を選択するために使用された。ｘＰｒｏｆｉｌｅｒアウトプットは、予測の確実性に従ってソートされた非内皮プールに比較して、内皮において１０倍高い数のタグを持つ遺伝子のリストから構成される。９０％確実性の閾値が、このリストに適用された。
【０４６２】
他のＣＧＡＰのオンライン発現格差分析ツール、デジタルディファレンシャルディスプレイ（ＤＤＤ）は、ＳＡＧＥタグを使用する代わりに、ＥＳＴ発現データ（供給源ライブラリー情報）に基づいている。われわれは、このツールのＳＡＧＥｍａｐ ｘＰｒｏｆｉｌｅｒへの類似性を利用することにしたが、有用な結果は得られなかった。ＢＬＡＳＴ指向のアプローチに使用した９種類の内皮細胞ライブラリーの５種類、１０８種類の非内皮細胞ライブラリーのうち６４種類は、ＤＤＤを使用したオンライン解析で利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＧＡＰ／ｉｎｆｏ／ｄｄｄ．ｃｇｉ）。そのような解析が行われた場合に、次の１５種類がトップのスコアを記録した遺伝子であった：アネキシンＡ２、アクチンガンマ１、リボソーム蛋白質Ｐ４０、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターＩ型、チモシンベータ４、ペプチジロプロピルイソメラーゼＡ、リボソーム蛋白質Ｌ１３ａ、ラミニン受容体１（リボソーム蛋白質ＳＡ）、真核翻訳伸長因子１アルファ１、ビメンチン、フェリチンヘビーポリペプチド、リボソーム蛋白質Ｌ３、リボソーム蛋白質Ｓ１８、リボソーム蛋白質Ｌ１９、腫瘍蛋白質ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｅｄ１。このリストは、むしろ驚くべきものであり、任意のよく知られた内皮特異的な遺伝子を含まず、文献では至る所で発現が確認されている（リボソーム蛋白質、アクチン、ビメンチン、フェリチン）多くの遺伝子を含んでいた。われわれのＵｎｉＧｅｎｅ／ＥＳＴスクリーンの主要な優位点は、供給源のライブラリーデータおよび誤りやすいＥＳＴクラスタリングアルゴリズムに基づく代わりに、それは実際に遺伝子に対応する転写物の検索において、同一性レベルＢＬＡＳＴ比較を行うということである。
【０４６３】
ＵｎｉＧｅｎｅクラスター上のデータをマイニングすること
ＵｎｉＧｅｎｅエントリー（例えば、参考文献、ＳＴＳサイト、ホモログ、機能についての参考）について、情報にすばやくアクセスするために、オンライン供給源が、機械的に使用された：ＮＣＢＩ’ｓ ＵｎｉＧｅｎｅおよびＬｏｃｕｓＬｉｎｋインターフェース、およびヒトにおけるオンラインメンデリアンインターフェース）。
【０４６４】
ＵｎｉＧｅｎｅクラスターにおけるＥＳＴｓは、ｃｏｎｔｉｇへとアセンブルされておらず、そのため任意の配列分析の前に、ｃｏｎｔｉｇがｐｈｒａｐアセンブラー（ｐｈｒａｐについての説明のために、参照ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）を使用して、作成された。
【０４６５】
ＥＣＳＭ１を含むゲノムｃｏｎｔｉｇ ＡＣ００５７９５（４４，３９９塩基対）を分析するために、大きい未知のヌクレオチド配列のマルチアプリケーション分析のためのＮＩＸ インターネットインターフェースが、使用された。ＮＩＸについてのさらなる情報は、参照ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＮＩＸ／。ＡＣ００５７９５に対するＥＣＳＭ１のアライメントは、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＩｎｔｅｒｆａｃｅへのＮＣＢＩインターフェース：ＮＣＢＩ Ｍａｐ Ｖｉｅｗｅｒを使用して得られた。ＮＣＢＩ Ｍａｐ Ｖｉｅｗｅｒについてのさらなる情報は、参照ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／。
【０４６６】
翻訳されたヌクレオチド配列中の可能な膜貫通領域およびシグナル配列の検索のために、３種類のインターネットベースのアプリケーションが使用された：ＤＡＳ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｋｅｍｉ．ｓｕ．ｓｅ／￣ｓｅｒｖｅｒ／ＤＡＳ／ （Ｃｓｅｒｚｏ ｅｔ ａｌ， １９９７）、ＴｏｐＰｒｅｄ２ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｋｅｍｉ．ｓｕ．ｓｅ／￣ｓｅｒｖｅｒ／ｔｏｐｐｒｅｄ２／ （Ｈｅｉｊｎｅ １９９２）、およびＳｉｇｎａｌＰ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／ （Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９７）。
【０４６７】
ＰＥＲＬ ｓｃｒｉｐｔｓ
ＰＥＲＬ ｓｃｒｉｐｔｓの多くは、大規模配列回復、ＢＬＡＳＴ検索提出、および自動的ＢＬＡＳＴアウトプット分析を容易にするために作られた。
【０４６８】
実験的実証
発現の特異性を実験的に実証するために、われわれは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用した。ＲＮＡが３種類の内皮細胞種培養、および７種類の非内皮からｉｎ ｖｉｔｒｏ抽出された。内皮培養は、次のとおり：ＨＭＶＥＣ（ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｋａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、ＨＵＶＥＣ（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）全面培養、およびＨＵＶＥＣ増殖培養。非内皮培養は次のとおり： 正常酸素状態で培養した正常子宮内膜スロトマ（ＮＥＳ）細胞、および低酸素状態で培養したＮＥＳ、ＭＤＡ４５３およびＭＤＡ４６８乳がん細胞系統、ＨｅＬａ、正常酸素状態で培養したＦＥＫ４繊維芽細胞および低酸素状態で培養したＦＥＫ４繊維芽細胞、およびＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６−二種類の大腸上皮細胞系統。
【０４６９】
配列タグサイト（ＳＴＳ）が利用可能であれば、ｄｂＳＴＳ ＰＣＲプライマーが使用され、ｄｂＳＴＳエントリーにおいて示唆されたサイクル条件が後に続いた。さもなければ、プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラムを使用して、設計された。プライマーは表９にリストにされている。
【０４７０】
組織培養培地、ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
細胞系統は、標準的な組織培養プロトコルに従ってｉｎ ｖｉｔｒｏ培養された。特に、内皮用培地は、ＥＣＧＳ（内皮細胞生育追加−Ｓｉｇｍａ）および生育を促進するためにヘパリン（Ｓｉｇｍａ）が添加された。
【０４７１】
全体のＲＮＡは、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出され、ｃＤＮＡはＲｅｖｅｒｓｅ−ＩＴ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ａｂｇｅｎｅ）を使用して合成された。
【０４７２】
［参考文献］
2010248210.tif 000003
2010248210.tif 000004
2010248210.tif 000005
2010248210.tif 000006
2010248210.tif 000007
【０４７３】
表１
ｄｂＥＳＴからの９種類のヒト内皮ライブラリー
ヒト大静脈内皮、２０配列、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養
ヒト内皮細胞、３４６配列、一次分離
ヒト内皮細胞（Ｙ．Ｍｉｔｓｕｉ）、３配列、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ内皮細胞９３７２２３、７１７１配列、一次分離
大静脈内皮細胞、１２４５配列、一次分離
大静脈内皮細胞、ＴＮＦ処理、１９０８配列、一次分離
臍静脈内皮細胞Ｉ、９配列
ＨＤＭＥＣ ｃＤＮＡライブラリー、１１配列、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養
臍静脈内皮細胞ＩＩ、４０４配列
【０４７４】
表２
非内皮ｄｂＥＳＴライブラリー
【表２−１】
2010248210.tif 000008
【表２−２】
2010248210.tif 000009
【表２−３】
2010248210.tif 000010
【表２−４】
2010248210.tif 000011
【０４７５】
表３
ｄｂＥＳＴプールにおける内皮特異的遺伝子であることが既知の５遺伝子
内皮プールにおけるＥＳＴｓの数は、比較的小さく（〜１１，１１７）、既知の内皮遺伝子すべてが示されているわけではない。
【表３】
2010248210.tif 000012
【０４７６】
表４
【表４】
2010248210.tif 000013
【０４７７】
表５
ＣＧＡＰ ＳＡＧＥプールにおける５種類の既知内皮特異的遺伝子ＴＩＥ１およびＴＩＥ２／ＴＥＫは、非内皮プール（卵巣由来の正常またはがん細胞系統におけるものがほとんど）において複数回ヒットする。ｖＷＦは、最も内皮特異的であり、内皮プールにおいて８０回にヒットし、非内皮プールにおいては１回のみである。
【表５】
2010248210.tif 000014
【０４７８】
表６
ＵｎｉＧｅｎｅ／ＥＳＴスクリーンの結果
２０種類の既知遺伝子が、ＵｎｉＧｅｎｅ／ＥＳＴスクリーンにおいて選択された（非内皮プールにおいてヒットがなく、内皮プールにおいて少なくとも１回ヒットがある）。少なくともこれらの遺伝子の４種類が、既知の内皮特異的遺伝子である：ＴＩＥ１、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＬＹＶＥ１、およびマルチマリンで、〜２０％の予測正確性を示している。他の遺伝子は、内皮細胞で確実に優先的に発現しているが、内皮特異的ではないかもしれない。
【表６】
2010248210.tif 000015
【０４７９】
表７
ｘＰｒｏｆｉｌｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓは、ＵｎｉＧｅｎｅ／ＥＳＴスクリーンからのデータと併せられ、予測の１００％の確実性を達成した。ｘＰｒｏｆｉｌｅｒのアウトプットは、ＳＡＧＥ−ＣＧＡＰライブラリーの非内皮プールにおけるものに比べ、内皮において１０倍高い数のタグを持つ遺伝子をリストにする。内皮および非内皮ＥＳＴプールに対応するヒットは、ｍＲＮＡ（既知遺伝子）またはｐｈｒａｐ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｃｏｎｔｉｇ配列（新規遺伝子を代表するＥＳＴクラスター）に対する同一性レベルＢＬＡＳＴ検索によって同定された。遺伝子は、非内皮ＥＳＴプールにおけるヒットの数に従って、並べられた。既知および推定の新規内皮特異的遺伝子は太字で示す。
【表７】
2010248210.tif 000016
【０４８０】
表８
ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔについての利用可能な情報のまとめ
【表８】
2010248210.tif 000017
【０４８１】
表９
ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーのリスト ｄｂＳＴＳプライマーが、ＵｎｉＧｅｎｅエントリーが配列タグ部位（ＳＴＳ）を含んでいる場合、使用された。さもなければ、プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラムを用いて設計された。
【表９】
2010248210.tif 000018
【０４８２】
表１０
ＥＣＳＭ１ ｃｏｎｔｉｇ配列に属するＥＳＴｓは次のとおり：
【表１０−１】
2010248210.tif 000019
【表１０−２】
2010248210.tif 000020
【０４８３】
表１１
【表１１−１】
2010248210.tif 000021
【表１１−２】
2010248210.tif 000022
【０４８４】
表１２
【表１２−１】
2010248210.tif 000023
【表１２−２】
2010248210.tif 000024
【表１２−３】
2010248210.tif 000025
【表１２−４】
2010248210.tif 000026
【０４８５】
実施例２
ＥＣＳＭ４発現は、内皮細胞に限られる。
腫瘍および正常組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、ＥＣＳＭ４の発現が成人血管新生中の血管のみにおける、血管内皮細胞に限られることを示した。正常組織の分析は、ＥＣＳＭ４の発現はヒト骨盤および臍帯胎児組織１０．８週月経年齢時に検出されることを示した。図１６に示すように、ＥＣＳＭ４の発現は、骨盤における血管の血管内皮細胞に高度に特異的である。さらに、発現は、分析された多くのほかの正常組織、成人肝臓、大脳、および大血管、前立腺、大腸、小腸、心臓、眼（脈絡膜およびきょう膜）、卵巣、胃、乳房、および胎児膀胱、精巣、腎臓（１５．８週）、および胎児心臓、腎臓、副腎、腸（１１．３週）、胎児脳（１０．６週）、および胎児眼（１６．５週）には見られなかった（データ示さず）。
【０４８６】
大腸肝臓転移生体組織検査のＩＳＨ分析は、ＥＣＳＭ４の発現は、腫瘍血管の血管内皮細胞に限られることを示した（図１７および１８）。発現は、周りの正常組織ではまったく検出されなかった。さらに、壊死組織の近傍では発現の上昇が示され（図１８、壊死組織は＊で標識された明るいシグナルによって示される。）、低酸素状態によるＥＣＳＭ４発現の誘導と一致する。そのように、ＥＣＳＭ４は、新規の低酸素状態によって調節を受ける遺伝子であるかもしれない。
【０４８７】
成人の正常および腫瘍組織における新生血管へのＥＣＳＭ４の高度に限定された発現様式は、実施例１において述べられたｉｎ ｓｌｉｃｉｏ分析によって決定された、内皮細胞選択的発現様式と完全に一致する。
【０４８８】
方法
ホルマリン固定した、パラフィンに埋め込まれた組織および腫瘍の塊は、帝国癌研究基金胸部病理学グループ、Ｇｕｙｓ病院、ロンドン、ＵＫの記録保管所から得られた。ＥＣＳＭ４ ｃＤＮＡに対するアンチセンスリボプローブは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＥＣＳＭ４ ｍＲＮＡの特異的な局在を調べるために調製された。オートラジオグラフィーのためのＩｌｆｏｒｄ Ｋ５におけるスライドの前処理、ハイブリダイゼーション、洗浄、および浸透染色の方法は、以前に述べられている（Ｐｏｕｌｓｏｍ， Ｒ．， Ｌｏｎｇｃｒｏｆｔ， Ｊ． Ｍ．， Ｊｅｆｆｒｅｙ， Ｒ． Ｅ．， Ｒｏｇｅｒｓ， Ｌ．， ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ， Ｊ． Ｈ． （１９９８） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ４２， １２１−１３２）。フィルムは、Ｋｏｄａｋ Ｄ１９での現像、およびギムザでのカウンター染色の前に、７日から１５日露光させた。切片は、通常のあるいは反射された光暗視野条件（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ２上部照明装備）、暗背景上に明るい対象物として見られるように、個々のオートラジオグラフィー銀粒子となった対象物をｘ５、ｘ１０、またはｘ２０で調べられた。
【０４８９】
実施例３
ＥＣＳＭ４ポリペプチドは、内皮細胞においてのみ検出される。
ＥＣＳＭ４ポリペプチドに選択的に結合可能な抗体が作成され、広範な細胞種におけるＥＣＳＭ４ポリペプチドの存在を示すための免疫組織化学に使用された（図２１から２６）。組織サンプルは、免疫組織化学の技術における、標準的な技術によって調製された。
【０４９０】
ＥＣＳＭ４を認識する抗体の作製。
ペプチドＭＲ １６５、ＭＲ ３１１、およびＭＲ ３３６は、ポリクローナル抗体の産生のためのウサギのを免疫にする前に、鍵穴リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に融合された。抗体ＭＧＯ−５は、ペプチドＭＲ １６５で免疫にされたウサギ由来であり、一方ＭＧＯ−７は、ＭＲ ３１１およびＭＲ ３３６の混合物で免疫にしたウサギ由来であった。ポリクローナル抗体を作製するために使用されたペプチドの配列は、図１２に示したように、ヒトＥＣＳＭ４の全長アミノ酸配列中の位置を参考に、下に示される。
ＭＲ １６５ ＝ ＬＳＱＳＰＧＡＶＰＱＡＬＶＡＷＲＡ（６８１−６９７）
ＭＲ ２７４ ＝ ＤＳＶＬＴＰＥＥＶＡＬＣＬＥＬ（７９０−８０４）
ＭＲ ３１１ ＝ ＴＹＧＹＩＳＶＰＴＡ（８２７−８３６）
ＭＲ ３３６ ＝ ＫＧＧＶＬＬＣＰＰＲＰＣＬＴＰＴ（８５２−８６７）
【０４９１】
実施例４
内皮特異的転写物の生物情報検索において同定されたｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ ＥＳＴ配列は、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーから、３８００塩基対の長さのｃＤＮＡを単離するために使用された。遺伝子特異的なプライマーを使用したスクリーンは、心臓、成人および胎児脳、肝臓、肺、腎臓、筋肉、骨盤、および小腸には存在するが、抹消血管白血球、副腎、および精巣には存在しない遺伝子を示した。最も高い発現は、骨盤由来のライブラリーにおいて見られた。Ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ配列のｒｏｕｎｄａｂｏｕｔのものへの比較は、その至る所にホモロジーを示す膜貫通蛋白質であること、しかし細胞外領域にはホモロジーを示さないことを明らかにした。このように、ＭＲは、神経特異的ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの細胞外領域における、五つのイムノグロブリンおよび二つのフィブロネクチン領域に比較して、二つのイムノグロブリンおよび二つのフィブロネクチン領域を細胞外領域にもつ。膜貫通領域は、（ｉ）膜貫通部位予測ソフトウェアＰＲＥＤ−ＴＭＲを使用して、および（ｉｉ）ヒトＭＲおよびヒトＲＯＢＯ１ペプチド配列との間のアライメントを使用して、同定された。両方の方法は、ヒトＭＲの膜貫通領域として、アミノ酸４６８−４９０と同じ残基を同定した。このように、１−４６７アミノ酸は細胞外、および４９１−１００７アミノ酸は細胞内である。細胞内領域は、ｃ−ａｂｌに結合すると考えられる（Ｂａｓｈａｗ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｃｅｌｌ １０１： ７０３−７１５）、ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ内の配列のホモログである、推定のプロリンリッチ領域を含む。
【０４９２】
ヒトＳＨＧＣ−１１７３９（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ． Ｇ１４６４６）配列タグ部位（ＳＴＳ）は、ＢＬＡＳＴ ｄｂＳＴＳ検索において、ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ ｍＲＮＡにマップされた。このＳＴＳｍａｐｓは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐ上の染色体１１に存在する（領域５６４７．００ｃＲ１００００ ＬＯＤ １．０９ ｂｉｎ １２９）。しかしながら、大部分の配列は失われており、ゲノム構造は知られていない。ＲＩＫＥＮデータベースの検索は、マウスｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔを同定した。ヒトＭＲのペプチドコアの推定分子量は、１０７，４５７ダルトンであった。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳によって確認された（図３）。
【０４９３】
実施例５
ＥＣＳＭ４の発現は、腫瘍において検出される。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＥＣＳＭ４の発現を特徴付けるために使用された。ＥＣＳＭ４の発現は、非常に制限され（表１３）、神経組織を含む多くの組織において、シグナルは検出されなかった。対照的に、強度の発現が、骨盤および広範な腫瘍、脳、膀胱、および肝臓への大腸転移の腫瘍をを含む、において検出された（図２７）。腫瘍内での発現は、腫瘍血管構造に限られた。骨盤の免疫組織化学染色は、この蛋白質の内皮特異的な発現を確認した。
【０４９４】
ＥＣＳＭ４のＣＧＡＰ ＳＡＧＥライブラリーに対する検索は、内皮および腫瘍ライブラリーにおいてのみそれを検出した（表１４）。このことは、発現が腫瘍血管に限られたことを示す（肝臓への大腸がん転移、ガングリオグリオーマ、膀胱、および乳がん）、成人におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果と一致した。
【０４９５】
表１３
ｉｎ ｖｉｖｏヒト組織におけるｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔの発現
発現が検出されたもの
骨盤および臍帯胎児組織（１０．８週月経年齢）
大腸肝臓転移、ガングリオグリオーマ、膀胱、および乳がんにおける血管
発現が検出されなかったもの
成人肝臓、大脳、および大血管、前立腺、大腸、小腸、心臓、眼脈絡膜およびきょう膜、卵巣、胃、乳房
【０４９６】
表１４
ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔがｇｅｎｅ ｔｏ ｔａｇ ｍａｐｐｉｎｇに基づいて見出されたＣＧＡＰ ＳＡＧＥライブラリー
【表１３】
2010248210.tif 000027
【０４９７】
実施例６
低酸素状態の内皮細胞におけるＥＣＳＭ４の誘導
最初のＲＴ−ＰＣＲは、内皮においてＥＣＳＭ４の発現を検出したが、繊維芽細胞（正常内皮およびＦＥＫ４）、大腸癌（ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６）、乳がん（ＭＤＡ４５３およびＭＤＡ４６８）、およびＨｅＬａ細胞のような他の細胞系統では、検出しなかった。リボヌクレアーゼ保護分析は、これを確認し、拡大した（図１１ａ）。ＥＣＳＭ４発現は、内皮（３種類の異なる分離体）に限られることが見られ、繊維芽細胞、癌、および神経細胞では見られなかった。内皮（非内皮ではみられない）の低酸素状態におけるＥＣＳＭ４の誘導は、ＥＣＳＭ４の発現が２種類の異なるＲＮａｓｅ保護プローブを使用して解析されたときに、見られた。発現は、低酸素状態のＨＵＶＥＣ、およびＨＤＭＥＣそれぞれにおいて平均５．５， ２．６倍高かった。ウエスタン解析は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）において１１０キロダルトンの弱いバンドを同定したが、非内皮細胞種では見られなかった（図１１ｂ）。バンドは、ＨＤＭＥＣ細胞が１８時間の低酸素状態にさらされたときに、より強く検出され、ＥＣＳＭ４が低酸素によって調節を受ける遺伝子であることと一致した。
【図１】
2010248210.tif 000028
【図２−１】
2010248210.tif 000029
【図２−２】
2010248210.tif 000030
【図３】
2010248210.tif 000031
【図４−１】
2010248210.tif 000032
【図４−２】
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【図４−３】
2010248210.tif 000034
【図５−１】
2010248210.tif 000035
【図５−２】
2010248210.tif 000036
【図５−３】
2010248210.tif 000037
【図６−１】
2010248210.tif 000038
【図６−２】
2010248210.tif 000039
【図７−１】
2010248210.tif 000040
【図７−２】
2010248210.tif 000041
【図８−１】
2010248210.tif 000042
【図８−２】
2010248210.tif 000043
【図９−１】
2010248210.tif 000044
【図９−２】
2010248210.tif 000045
【図１０】
2010248210.tif 000046
【図１１ａ】
2010248210.tif 000047
【図１１ｂ】
2010248210.tif 000048
【図１２−１】
2010248210.tif 000049
【図１２−２】
2010248210.tif 000050
【図１２−３】
2010248210.tif 000051
【図１２−４】
2010248210.tif 000052
【図１３−１】
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【図１３−２】
2010248210.tif 000054
【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
2010248210.tif 000057
【図１３−６】
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【図１３−７】
2010248210.tif 000059
【図１４−１】
2010248210.tif 000060
【図１４−２】
2010248210.tif 000061
【図１４−３】
2010248210.tif 000062
【図１５−１】
2010248210.tif 000063
【図１５−２】
2010248210.tif 000064
【図１５−３】
2010248210.tif 000065
【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【配列表】
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