(57)【要約】      （修正有）【課題】膿性痰の均質化処理が可能であり、喀痰を穏和な条件下で簡便且つ迅速に均質化処理し、より安定に喀痰中に存在する微生物を検出することができる喀痰の均質化処理剤、均質化処理用器具、均質化処理方法、及び微生物の検出方法を提供する。【解決手段】被検喀痰を含む試料をステンレス鋼、鉄及びアルミナからなる群から選択される１種又は２種以上を含有する粒子の存在下で攪拌せしめる工程を含み、前記試料が均質化処理剤を含み、前記均質化処理剤がシステインプロテアーゼを含有するようにした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検喀痰を含む試料をステンレス鋼、鉄及びアルミナからなる群から選択される１種又は２種以上を含有する粒子の存在下で攪拌せしめる工程を含み、前記試料が均質化処理剤を含み、前記均質化処理剤がシステインプロテアーゼを含有することを特徴とする喀痰の均質化処理方法。
【請求項２】
前記粒子が直径１ｍｍ〜１０ｍｍの球状粒子であることを特徴とする請求項１記載の喀痰の均質化処理方法。
【請求項３】
微生物の検出における前処理であることを特徴とする請求項１又は２記載の喀痰の均質化処理方法。
【請求項４】
前記システインプロテアーゼがブロメライン、パパイン、キモパパイン及びフィシンからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の喀痰の均質化処理方法。
【請求項５】
前記均質化処理剤が、塩化ナトリウム及びトリス緩衝液を更に含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の喀痰の均質化処理方法。
【請求項６】
喀痰の均質化処理方法であって、喀痰と、均質化処理剤と、並びにステンレス鋼、鉄及びアルミナからなる群から選択される１種又は２種以上を含有する粒子とを混合し、混合液を作製し、前記得られた混合液をボルテックスをかけながら室温で反応させる工程を含み、前記均質化処理剤がシステインプロテアーゼ及び緩衝液を含有することを特徴とする喀痰の均質化処理方法。
【請求項７】
前記粒子が直径１ｍｍ〜１０ｍｍの球状粒子であることを特徴とする請求項６記載の喀痰の均質化処理方法。
【請求項８】
微生物の検出における前処理であることを特徴とする請求項６又は７記載の喀痰の均質化処理方法。
【請求項９】
前記システインプロテアーゼがブロメライン、パパイン、キモパパイン及びフィシンからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項記載の喀痰の均質化処理方法。
【請求項１０】
前記緩衝液が、トリス緩衝液であることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項記載の喀痰の均質化処理方法。
【請求項１１】
前記緩衝液が、塩化ナトリウムを含むトリス緩衝液であることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項記載の喀痰の均質化処理方法。
【請求項１２】
被検喀痰を請求項１〜１１のいずれか１項記載の均質化処理方法で処理した後、前記被検喀痰中に存在する微生物を検出することを特徴とする微生物の検出方法。
【請求項１３】
前記微生物が、ウイルス、リケッチャ、細菌又は真菌であることを特徴とする請求項１２記載の微生物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喀痰等のように粘性の高い液体試料を定量的にサンプリングするためのサンプリング器具及びその補助治具、喀痰を穏和な条件下で迅速に処理し、より安定に喀痰中に存在する微生物を検出することができる喀痰の均質化処理剤、均質化処理用器具、均質化処理方法及び該方法を用いた微生物の検出方法、並びに喀痰中に存在する微生物を簡便、迅速且つ効率的に回収するための微生物の分離器、微生物の回収方法及び該方法を用いた微生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、培養試験（菌の同定）等の対象となる液体試料を採取してサンプリングする場合、サンプリング器具として、スポイトやピペット或いはシリンジを用いるのが一般的である。しかし、これら器具は、粘性の低い液体試料である場合にはある程度の定量性をもってサンプリングを行うことができるのであるが、喀痰等の粘性の高い液体試料（以下、粘性試料という）の場合は、サンプリングの定量性が著しく損なわれるという問題があった。
【０００３】
即ち、一般的なスポイトやピペットでは、空気圧によって粘性試料を吸引又は吐出するため、特に吐出の際に粘性試料がスポイトやピペットの内壁にこびり付いて残ってしまい、吸引した粘性試料の全量を吐出できないことが多い。
【０００４】
また、図１０に示した如く、一般的なシリンジ１１０は、内部中空の長尺直胴部を有する筒状体１１２の先端側に小径のノズル１１４を突設してノズル１１４の先端に円形の吸引吐出口１１６を開穿し、また、基端側を開口部１１７とし、その外周縁に鍔部１１８を形成すると共に、筒状体１１２の内壁に密着しつつ筒状体１１２の長手方向に摺動自在に内嵌されたガスケット１２０を設け、ガスケット１２０を摺動操作するために、先端をガスケット１２０に係着し且つ基端を操作用頭部１３４とした長尺棒状のプランジャ１３０とを備える（図１０参照、その他特許文献１及び２等参照）。
【０００５】
このようなシリンジ１１０の場合は、ガスケット１２０によって粘性試料が筒状体１１２の内壁に残ることはないものの、ノズル１１４が突設されているために、ノズル１１４の内部に粘性試料が残ってしまい、やはり吸引した粘性試料の全量を吐出できない場合がある。加えて、従来のシリンジ１１０の場合は比較的多くの吸引力及び吐出力を要し、作業者の負担が大きい。その他、従来のシリンジ１１０では、吸引時及び吐出時に粘性試料が粘ついて切れが悪く、必要量を採取するのが困難だったり、粘ついた粘性試料が糸を引いて他所に付着したりして環境衛生面での問題もあった。
【０００６】
他方、喀痰中に含まれる特定成分、特に、呼吸器感染症の患者の喀痰中に存在する病原菌等を検出、測定する場合には、患者の喀痰を採取し、これを培養して病原菌を検出することが行われている。しかし、患者の喀痰は一般に粘性が高く、そのままでは培地に均等に検体を塗抹することが困難であり、検査結果を誤る場合がある。また、遺伝子検査においても、そのままの状態では正確な菌数を判断することは困難である。そこで喀痰を前処理して、喀痰中に含まれる成分を均一にして、特定の成分の検出、測定を行いやすくする必要がある。
【０００７】
その方策として、数々の前処理法が考案されている。抗酸菌、結核菌の検出における前処理方法としては、例えば、非特許文献１は、還元性物質であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）を用いたＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法を推奨しており、該方法は広く使用されている（例えば、特許文献３等参照）。しかしながら、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法は、ヘモフィラス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）などの一般細菌を検出する場合においては、処理条件が厳しく、細菌へのダメージが大きいといった問題があった。前処理条件の穏和な方法として、酵素であるセミアルカリプロテアーゼを用いる方法があるが、膿性痰のような粘性強度の高いものにおいては、十分な均質化処理ができない場合があった。そこで、セミアルカリプロテアーゼとＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法を併用する方法も知られているが（例えば、特許文献４等参照。）、操作が面倒であり、時間も要する。また、喀痰の前処理の所要時間により生菌数が減少し、病原菌を正確に判断することが困難な場合があるといった問題があった。
【０００８】
また、上記した前処理液を用いる懸濁方法としては、ボルテックスミキサーを用いる方法が主流である。そのため、膿性痰のような粘性強度の高いものにおいては、十分な均質化処理ができない場合があった。
そこで、特許文献５に示すように、球状固体材料を収納した喀痰処理用器具による喀痰の均質化が提案されており、該文献は球状固体材料としてガラス又は水晶を記載している。しかしながら、膿性痰に対しては、該器具を用いても均質化に長時間を要し、また十分な均質化処理ができない場合があった。
【０００９】
さらに、前記した前処理液を用いて前処理された試料中には、微生物、ヒト由来細胞、埃塵等様々なものが混在しており、遺伝子や蛋白質等の検査に用いる場合においては、擬陽性判定をしてしまう場合が多数ある。そこで、検体から微生物を回収する方法として、例えば、特許文献６は、検体を前処理した後、吸着担体を用いて微生物のみを吸着させて微生物を回収する方法を開示している。しかしながら、この方法は、吸着と剥がす作業の二つを要しているため、操作上の面倒さと、収率の問題がある。また、検体を濾過し、フィルター上に微生物を捕捉する方法が知られているが（特許文献７）、収率及びヒト細胞、血球、塵埃等との分離に関して改善が必要であると考えられる。
【００１０】
一方、特許文献８は、検体を前処理した後、少なくとも２種類の濾過膜からなる濾過部材で濾過し、免疫クロマトグラフィー用の試料を得る方法を記載しているが、この方法は免疫クロマトグラフィーを行う際に試料のクロマト用膜担体上の目詰まりをなくすことを目的とするものであり、微生物の回収を目的とするものではなく、微生物の回収については何ら記載されていない。さらに濾過膜としてはガラス繊維濾紙とガラスフィルターが記載されているのみである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特公平５−３３１８号公報
【特許文献２】特公平１−２１９８９号公報
【特許文献３】特開２００４−３４４１０８号公報
【特許文献４】特開２００２−６５２４９号公報
【特許文献５】特開平１−２９１１６０号公報
【特許文献６】特開２００１−１１２４９７号公報
【特許文献７】特開２００４−１８０５５１号公報
【特許文献８】特開２００５−２４３２５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】新結核菌検査指針２０００、財団法人結核予防会発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、第１に、喀痰等の粘性試料をサンプリングする際の定量性を向上せしめ、比較的少ない吸引力及び吐出力で作業者の負担を軽減し、吸引時及び吐出時の粘性試料の切れを良くし、環境衛生面での問題も少ない粘性試料のサンプリング器具及びその補助治具を提供することを目的とする。また、本発明は、第２に、膿性痰の均質化処理が可能であり、喀痰を穏和な条件下で簡便且つ迅速に均質化処理し、より安定に喀痰中に存在する微生物を検出することができる喀痰の均質化処理剤、均質化処理用器具、均質化処理方法、及び微生物の検出方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、第３に、喀痰中に存在する微生物を簡便、迅速且つ効率的に回収するための微生物の分離器、微生物の回収方法及び該方法を用いた微生物の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、第１に、喀痰等の粘性試料のサンプリングにおいて、シリンジの先端の形状を変えることにより、定量性や操作性を改善でき、粘性試料を容易且つ安全に採取できることを見出し、第２に、喀痰の前処理方法において、蛋白質分解酵素の一つであるシステインプロテアーゼ、特にブロメライン（Bromelain）を用いることにより効率的に前処理できることを見出し、第３に、喀痰の前処理方法において、金属及びその酸化物からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する粒子を用いて攪拌することで、膿性痰のような粘性の高い試料においても簡便かつ迅速に前処理できることを見出し、第４に、喀痰からの微生物の検出において、３種のフィルターを有する分離器を用いることで、微生物と細胞、血球や埃塵等を効率的に分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち、上記課題を解決するために、本発明の粘性試料のサンプリング器具は、先端を閉塞し且つ基端を開口し、該基端の外周縁に鍔部を形成した内部中空の長尺の直胴部を有する筒状体（１０）と、該筒状体の内壁に密着しつつ該筒状体の長手方向に摺動自在に内嵌されたガスケット（２０）と、先端を該ガスケットに係着する係着凸部とし且つ基端を操作用頭部とし、該操作用頭部を操作して該ガスケットを摺動操作可能にした長尺棒状のプランジャ（３０）と、を備える粘性試料のサンプリング器具であって、前記筒状体の先端は、該筒状体の直胴部と略同径のプレート状ノズル（１４）によって閉塞され、該プレート状ノズルに所定形状のスリット（１６）を開穿して吸引吐出口を形成してなることを特徴とする。
【００１６】
前記スリットは、前記プレート状ノズル（１４）の中央部近傍に位置することが好ましく、また、前記スリットは、少なくとも１つの角部（１５）を有する形状をなしていることが望ましい。
前記スリットの形状は、十字（Ｘ字）形、Ｙ字形又はＷ字形のいずれかであることが好適である。前記スリットの幅は、０．５ｍｍ〜２．０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．５〜１．５ｍｍである。
【００１７】
前記粘性試料としては、検査・分析・試験の対象となる粘性の高い液体試料であれば特に限定されないが、喀痰である場合に本発明器具は特に好適である。
【００１８】
また、本発明のサンプリング器具用補助治具は、前記サンプリング器具用の補助治具（４０，６０）であって、前記サンプリング器具における操作用頭部を操作自在としたことを特徴とする。
【００１９】
前記サンプリング器具用補助治具（４０）は、先端に前記サンプリング器具における筒状体の鍔部に対して係合自在とされた係合片を有し且つ基端を開口部とし、直胴部に案内溝を形成した長尺筒状の外嵌筒部材（４２）と、該外嵌筒部材の内部に摺動自在に軸通されると共に、先端に前記サンプリング器具におけるプランジャの操作用頭部に対して係合自在とされた係合部を有し且つ前記案内溝に沿って操作レバーを設け、基端を押圧用頭部とした内嵌軸部材（５０）と、を備えることが好適である。
【００２０】
前記サンプリング器具用補助治具（６０）は、前記サンプリング器具用の補助治具（６０）であって、先端内周に前記サンプリング器具における筒状体の鍔部に対し嵌合自在とされた嵌合凸部を設け且つ基端を開口部とした長尺筒状の外嵌筒部材（６２）と、該外嵌筒部材の内部に摺動自在に軸通されると共に、先端内周に前記サンプリング器具におけるプランジャの操作用頭部に対して嵌合自在とされた嵌合凸部を設け且つ外嵌筒部材に対する付勢手段及び係止手段を設けた中嵌筒部材（７０）と、該中嵌筒部材の内部に摺動自在に軸通されると共に、先端を前記サンプリング器具におけるプランジャの操作用頭部に当接する当接端部とし、基端が押圧用頭部とされた内嵌軸部材（８０）と、を備えることが好適である。
【００２１】
本発明の喀痰の均質化処理剤は、システインプロテアーゼを含有することを特徴とする。前記システインプロテアーゼとしては、植物性システインプロテアーゼが好ましく、ブロメライン、パパイン、キモパパイン及びフィシンからなる群から選択される１種又は２種以上がより好ましく、ブロメラインが特に好ましい。本発明の均質化処理剤は、塩化ナトリウム及びトリス緩衝液を更に含有することが好ましい。本発明の均質化処理剤は、微生物の検出方法における前処理に好適に用いられる。
【００２２】
本発明の喀痰の均質化処理用器具は、金属及びその酸化物からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する粒子を収容することを特徴とする。前記金属及びその酸化物がステンレス鋼、鉄又はアルミナであることが好ましい。前記粒子が直径１ｍｍ以上１０ｍｍ以下の球状粒子であることが好ましく、直径４ｍｍ以上１０ｍｍ以下の球状粒子であることがより好ましい。
【００２３】
本発明の喀痰の均質化処理方法の第１の態様は、喀痰を前記本発明の均質化処理剤で処理することを特徴とする。本発明の均質化処理方法は、微生物の検出における前処理として特に好ましい。
【００２４】
本発明の喀痰の均質化処理方法の第２の態様は、被検喀痰を含む試料を金属及びその酸化物からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する粒子の存在下で攪拌することを特徴とする。
【００２５】
前記金属及びその酸化物がステンレス鋼、鉄又はアルミナであることが好ましい。なお、本願明細書において、ステンレス鋼を単にステンレスとも称する。
前記粒子が直径１ｍｍ以上１０ｍｍ以下の球状粒子であることが好ましく、直径４ｍｍ以上１０ｍｍ以下の球状粒子であることがより好ましい。
【００２６】
前記試料が喀痰前処理剤を含むことが好ましい。
前記喀痰前処理剤が、蛋白質分解酵素を含有することが好適である。前記蛋白質分解酵素が、セミアルカリプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼからなる群から選択される１種又は２種以上であることが好ましい。さらに、前記システインプロテアーゼが、ブロメライン、パパイン、キモパパイン及びフィシンからなる群から選択される１種又は２種以上であることが好ましい。また、前記喀痰前処理剤が前記本発明の均質化処理剤であることが好適である。
【００２７】
本発明の均質化処理方法は、微生物の検出方法における前処理として特に好適である。
【００２８】
本発明の喀痰からの微生物の回収方法は、均質化処理した喀痰から微生物を回収する方法であって、該均質化処理した喀痰を被検微生物が通過可能であり且つ有機材料からなる少なくとも３種のフィルターを有する分離器を用いて濾過することにより、前記被検微生物を含有する濾液を得ることを特徴とする。
【００２９】
前記分離器は、前記均質化処理した喀痰が通過する順に、第１フィルター、第２フィルター及び第３フィルターが設けられ、下流方向に従い、順次に前記フィルターの孔径が小となることが好ましい。前記第３フィルターの孔径が０．１μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましく、２μｍ以上７μｍ以下であることがより好ましい。前記第２フィルターの孔径が５μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上３０μｍ以下であることがより好ましい。前記第１フィルターの孔径が５μｍ以上であることが好ましく、２０μｍ以上であることがより好ましく、８０μｍ以上１２０μｍ以下であることがさらに好ましい。
【００３０】
前記有機材料が、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアミド、セルロース及びポリエチレンからなる群から選択される１種又は２種以上であることが好適である。
前記被検微生物としては、ウイルス、リケッチャ、細菌又は真菌等の微生物が好ましい。
本発明の微生物の回収方法において、喀痰の均質化処理方法は特に限定されないが、本発明の均質化処理方法が好適に用いられる。
【００３１】
本発明の微生物の分離器は、被検微生物が通過可能であり且つ有機材料からなる少なくとも３種のフィルターを有する前述の分離器であって、本発明の微生物の回収方法で用いられる。
【００３２】
本発明の微生物の検出方法の第１の態様は、被検喀痰を前記本発明の喀痰の均質化処理方法で処理した後、前記被検喀痰中に存在する微生物を検出することを特徴とする。
【００３３】
本発明の微生物の検出方法の第２の態様は、前記本発明の微生物の回収方法により得られた濾液から被検微生物を検出することを特徴とする。
【００３４】
本発明の微生物の検出方法において、前記微生物としては、ウイルス、リケッチャ、細菌又は真菌等の微生物が好ましい。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、喀痰等の粘性試料をサンプリングする際の定量性を向上せしめ、比較的少ない吸引力及び吐出力で作業者の負担を軽減し、吸引時及び吐出時の粘性試料の切れを良くし、環境衛生面での問題も少ない粘性試料のサンプリング器具及びその補助治具を提供することができるという大きな効果を奏する。
【００３６】
また、本発明によれば、従来の喀痰の前処理方法よりも、簡便且つ迅速に均質化処理でき、且つより安定に微生物を検出することができる。さらに、本発明により、従来の方法よりも、喀痰中に存在する微生物を簡便、迅速且つ効率的に回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の粘性試料のサンプリング器具を示す斜視図である。
【図２】図１の分解斜視図である。
【図３】本発明のサンプリング器具におけるプレート状ノズルのスリット（吸引吐出口）の形状の種々の例を示す平面図である。
【図４】図３（ａ）の拡大説明図である。
【図５】本発明の吸引力及び吐出力を測定する際に用いた装置の概念説明図であり、（ａ）は吸引力の場合、（ｂ）は吐出力の場合である。
【図６】本発明のサンプリング器具用補助治具の一例を示す側面説明図である。
【図７】図６（ａ）の要部拡大斜視図である。
【図８】本発明のサンプリング器具用補助治具の他例を示す側面説明図である。
【図９】図８（ａ）の要部拡大図である。
【図１０】従来のシリンジを示す斜視説明図である。
【図１１】本発明の喀痰の均質化処理用器具の第１の例を示す概略説明図である。
【図１２】本発明の喀痰の均質化処理用器具の第２の例を示す概略説明図である。
【図１３】本発明の喀痰の均質化処理用器具の第３の例を示す概略説明図である。
【図１４】本発明の喀痰の均質化処理用器具の第４の例を示す概略説明図である。
【図１５】本発明の微生物の回収方法の一例を示す概略説明図である。
【図１６】本発明の微生物の回収方法の他の例を示す概略説明図である。
【図１７】本発明の微生物の分離器の一例を示す断面概略説明図である。
【図１８】図１７の本発明の分離器を含む微生物の回収キットの一例を示す概略説明図である。
【図１９】実施例１６及び１７の結果を示すグラフである。
【図２０】実施例１８のフィルトレーション前の均質化液の顕微鏡写真であり、（ａ）は倍率１００、（ｂ）は倍率１０００の結果をそれぞれ示す。
【図２１】実施例１８のフィルトレーション後の均質化液の顕微鏡写真であり、（ａ）は倍率１００、（ｂ）は倍率１０００の結果をそれぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されたもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
【００３９】
図１は、本発明の粘性試料のサンプリング器具を示す斜視図である。図２は、図１の分解斜視図である。図３は、本発明におけるプレート状ノズルのスリット（吸引吐出口）の形状の種々の例を示す平面図である。図４は、図３（ａ）の拡大説明図である。図５は、本発明の吸引力及び吐出力を測定する際に用いた装置の概念説明図であり、（ａ）は吸引力の場合、（ｂ）は吐出力の場合である。
【００４０】
図６は、本発明のサンプリング器具用補助治具の一例を示す側面説明図である。図７は、図６（ａ）の要部拡大斜視図である。図８は、本発明のサンプリング器具用補助治具の他例を示す側面説明図である。図９は、図８（ａ）の要部拡大図である。図中、符号２は粘性試料のサンプリング器具、符号４０はサンプリング器具用補助治具の一例、符号６０はサンプリング器具用補助治具の他例である。
【００４１】
本発明の粘性試料のサンプリング器具２は、いわゆる従来のシリンジ１１０と基本的構造が類似の形態をなすものであり、筒状体１０とガスケット２０とプランジャ３０とを備える（図１及び図２）。なお、粘性試料としては、検査・分析・試験の対象となる粘性の高い液体試料であれば特に限定されないが、特に喀痰である場合に本発明器具は有用であり、以下の説明では粘性試料として喀痰を用いた場合を主として説明する。
【００４２】
筒状体１０は、内部中空の長尺の直胴部１２を有し、先端は閉塞部１３とされ、基端は開口部１７とされ、筒状体１０の基端の外周縁には鍔部１８が形成されている（図１及び図２）。鍔部１８の形状は、円形や楕円形や方形のいずれでもよく、特に限定されない。図示例では楕円形の両端を切り落とした截頭楕円形をなしているが（図１及び図２）、要は、後述する補助治具４０，６０との係合構造乃至嵌合構造の関係で適切なものであればよい。
【００４３】
筒状体１０の先端の閉塞部１３は、プレート状ノズル１４によって閉塞されている（図１及び図２）。即ち、従来のシリンジ１１０では小径のノズル１１４が突設されていたのであるが（図１１参照）、これに代替してプレート状ノズル１４を設けたものである。プレート状ノズル１４は、筒状体の直胴部１２と略同径であり、直胴部１２と一体成形してもよいし、別体に成形したものを外嵌又は内嵌等して取り付けてもよい。このようなプレート状ノズル１４によれば、ガスケット２０の下端面が略全面に当接するので、吐出の際に粘性試料が残留することがなく、従来のシリンジ１１０のように突設されたノズル１１４の内部に粘性試料が残ってしまうという問題が解消される。
【００４４】
プレート状ノズル１４には所定形状のスリット１６を開穿して吸引吐出口を形成する。スリット１６の所定形状としては、種々様々の形状を用いることができ、例えば、図３に示した如くの種々の形状を採用することができるが、好ましいスリット形状の条件としては、プレート状ノズル１４の中央部近傍に位置することや、少なくとも１つの角部１５を有する形状をなしていること等が吸引力及び吐出力を軽減する観点、吸引時及び吐出時の粘性試料の切れの観点等から挙げられる（図３、図４参照）。最も好ましいスリット形状としては、十字（Ｘ字）形、Ｙ字形又はＷ字形のいずれかである。
【００４５】
吸引力及び吐出力を軽減する観点、吸引時及び吐出時の粘性試料の切れの観点、製造の容易性の観点等から、スリットの幅ｄ１としては、０．５ｍｍ〜２．０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．５〜１．５ｍｍである（図４）。外縁からの距離ｄ２としては、０．５ｍｍ〜２ｍｍであることが好ましく、より好ましくは１ｍｍ〜１．８ｍｍである（図４）。
【００４６】
筒状体１０の材質は、内部の視認性から透明乃至半透明の材料であれば特に限定されず、例えば、ガラス材料でもよいが、製造コストや加工容易性等から透明性を有する合成樹脂材料、例えば、塩化ビニル、ポリエチレンやポリプロピレン等のオレフィン系、ポリスチレン等のスチレン系、その他の合成樹脂材料から構成される。
【００４７】
ガスケット２０は、筒状体１０の内壁に密着しつつ筒状体１０の長手方向に摺動自在に内嵌されている。ガスケット２０については、従来のシリンジと同様のものを採用でき、その形態や材質について特に限定はないが、形態としては、筒状体１０の内壁に対する密着性があり、また、その下端面がプレート状ノズル１４に対して当接することが必要である。図示例では、コア部２４の前後両端外周縁にシール突条２２が形成され、下端面はプレート状ノズル１４の形状に合わせて平坦とされている（図１及び図２）。ガスケット２０の材質としては密着性（シール性）を確保する関係上、弾性を有する材料であることが望ましく、天然ゴム、ブチルゴム、イソプレンゴム、ブタジエンゴム、スチレン−ブタジエンゴム、シリコーンゴム等の各種のゴム材料や、ポリウレタン系、ポリエステル系、ポリアミド系、オレフィン系、スチレン系等の各種の合成樹脂材料等のエラストマー材料を用いて構成すればよい。
【００４８】
プランジャ（押し子）３０は、ガスケット２０を摺動操作するための長尺棒状の部材であり、先端をガスケット２０に係着する係着凸部３２とされ、基端を操作用頭部３４とされている。プランジャ３０の係着凸部３２を図示しないガスケット２０内部の係着凹部に係着して、操作用頭部３４を操作することにより、ガスケット２０を筒状体１０内で摺動操作可能にしたものである。プランジャ３０の材質も特に限定されないが、オレフィン系、スチレン系等の合成樹脂材料を射出成形して製作すればよい。
【００４９】
次に、本発明の粘性試料のサンプリング器具２に取り付けて用いられる補助治具の一例（図６及び図７参照）及び他例（図８及び図９参照）について説明する。本発明の補助治具４０，６０は、前記本発明のサンプリング器具２の操作を容易にすると共に、喀痰等の粘性試料を扱う関係上、サンプリング器具２に直接に手で触れて操作することは衛生面から好ましくないため、サンプリング器具２の操作を間接的に行い得るように補助的に用いられるものである。
【００５０】
本発明のサンプリング器具用補助治具４０は、長尺筒状の外嵌筒部材４２と、その内部に摺動自在に軸通された内嵌軸部材５０とから構成されている（図６及び図７）。
【００５１】
外嵌筒部材４２は、先端に前記サンプリング器具２における筒状体１０の鍔部１８に対して係合自在とされた係合片４４を有している（図６及び図７）。係合片４４には、前記筒状体１０の鍔部１８に対して係合する切欠部４５が形成されている（図７）。外嵌筒部材４２の基端は開口部４３とされ、胴体部にはテーパー部４６が形成され、案内溝４８が長手方向に穿設されている（図６）。
【００５２】
内嵌軸部材５０は、上記外嵌筒部材４２の内部に摺動自在に軸通されており、その先端には前記サンプリング器具２におけるプランジャ３０の操作用頭部３４に対して係合自在とされた係合部５２を有する。係合部５２にはプランジャ３０の操作用頭部３４と嵌合する凹欠部５３が形成されている。また、前記外嵌筒部材４２の案内溝４８に沿うように操作レバー５８を設け、基端には押圧用頭部５６が設けられている。
【００５３】
このようなサンプリング器具用補助治具４０によれば、まず、前記サンプリング器具２のプランジャ３０の操作用頭部３４を内嵌軸部材５０の係合部５２に係合し〔図６（ａ）（ｂ）〕、次いで、前記サンプリング器具２の鍔部１８と外嵌筒部材４２の係合片４４とを互いに噛み合わせるようにして係合することによってサンプリング器具用補助治具４０にサンプリング器具２を取り付けることができ〔図６（ｃ）〕、粘性試料の吸引時には、サンプリング器具用補助治具４０の操作レバー５８を基端側に引くことによって、サンプリング器具２による粘性試料の吸引を行うことができ、また、粘性試料の吐出時には、サンプリング器具用補助治具４０の押圧用頭部５６を先端方向に押圧することによって、サンプリング器具２による粘性試料の吐出を行うことができる〔図６（ｄ）〕。従って、作業者は直接にサンプリング器具２に触れることなく、粘性試料の吸引及び吐出を行うことができる。
【００５４】
他方、本発明のサンプリング器具用補助治具６０は、長尺筒状の外嵌筒部材６２と、その内部に摺動自在に軸通された中嵌筒部材７０と、更にその内部に摺動自在に軸通された内嵌軸部材８０とから構成されている（図８及び図９）。
【００５５】
外嵌筒部材６２は、先端内周面に前記サンプリング器具２における筒状体１０の鍔部１８に対し嵌合自在とされた嵌合凸部６４が設けられ、また、鍔部１８を嵌合凸部６４に嵌合した際に鍔部１８の上端を係止するための係止凸部６７が設けられ、更に、基端を開口部６３とされ、胴体部にはテーパー部６６が形成され、ボタン孔６８が穿設されている（図８及び図９）。なお、サンプリング器具２における鍔部１８の形状が図示例のように截頭楕円形である場合や（図１及び図２参照）、楕円形や長方形等である場合のように前後左右の一方が長尺で外嵌筒部材６２の内径に収まらない場合には、外嵌筒部材６２の先端に切欠凹部６５を設けて、鍔部１８の短尺方向で嵌合凸部６４と嵌合するようにすればよい。
【００５６】
中嵌筒部材７０は、上記外嵌筒部材６２の内部に摺動自在に軸通されており、先端の内周面には、前記サンプリング器具２におけるプランジャ３０の操作用頭部３４に対して嵌合自在とされた嵌合凸部７２が設けられている（図８及び図９）。また、中嵌筒部材７０には外嵌筒部材６２に対する付勢手段６９及び係止手段７４が設けられている。付勢手段６９はスプリング（バネ）であり、中嵌筒部材７０の先端部と外嵌筒部材６２の係止凸部６７との間に介在するように設けられる。係止手段７４は中嵌筒部材７０の外嵌筒部材６２に対する係止と解放を切り替えるためのボタンであり、スプリング７６の付勢力を利用して、中嵌筒部材７０を外嵌筒部材６２に対して係止自在とするものである。
【００５７】
内嵌軸部材８０は、上記中嵌筒部材７０の内部に摺動自在に軸通されており、その先端は前記サンプリング器具２におけるプランジャ３０の操作用頭部３４に当接する当接端部８２とされ、その基端には押圧用頭部８４が設けられている。
【００５８】
このようなサンプリング器具用補助治具６０によれば、まず、前記サンプリング器具２のプランジャ３０の操作用頭部３４を中嵌筒部材７０の嵌合凸部７２に嵌合し〔図８（ａ）（ｂ）〕、また、前記サンプリング器具２の鍔部１８を外嵌筒部材６２の嵌合凸部６４に嵌合することによって〔図８（ａ）（ｂ）〕、サンプリング器具用補助治具６０にサンプリング器具２を取り付けることができ〔図８（ｂ）〕、粘性試料の吸引時には係止手段７４を解放して、付勢手段６９を伸張せしめて〔（図８（ｃ）〕、サンプリング器具２による粘性試料の吸引を行い、また、粘性試料の吐出時には、サンプリング器具用補助治具６０の押圧用頭部８４を先端方向に押圧することによって、サンプリング器具２による粘性試料の吐出を行うことができ〔図８（ｃ）（ｄ）〕、更に、吐出後は押圧用頭部８４を更に押入することによって、サンプリング器具用補助治具６０からサンプリング器具２を脱離せしめることができる〔図８（ｄ）〕。従って、作業者はサンプリング器具２に直接に触れることなく、粘性試料の吸引及び吐出を行うことができることに加えて、サンプリング器具２の脱離も行うことができる〔図８（ｄ）〕。
【００５９】
次に本発明の喀痰の均質化処理剤について説明する。
本発明の喀痰の均質化処理剤は、システインプロテアーゼを有効成分として含有することを特徴とし、喀痰を穏和な条件下でより速く処理し、より安定に喀痰中に存在する微生物を検出することができ、特に膿性痰の均質化処理に効果的である。
【００６０】
本発明に用いられるシステインプロテアーゼとしては、特に限定されないが植物由来のシステインプロテアーゼが好ましく、ブロメライン、パパイン、キモパパイン及びフィシンからなる群から選択される１種又は２種以上がより好ましく、ブロメラインが特に好ましい。これらシステインプロテアーゼは市販のものでもよく、公知の方法で得たものを用いてもよい。
前記ブロメラインとしては、Bromeliaceaeに属する植物由来のシステインプロテアーゼが用いられるが、パイナップル（Ananas comosus M.）由来のものがより好ましい。
【００６１】
本発明の均質化処理剤としては、システインプロテアーゼを有効成分として含有する組成物であれば、特に限定はないが、通常、システインプロテアーゼを緩衝液等の溶解液に溶解した水溶液の形で使用される。システインプロテアーゼの濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ｗ／ｖ％が好ましく、０．１〜０．３ｗ／ｖ％がより好ましい。
【００６２】
システインプロテアーゼを溶解する溶解液としては、特に限定されないが、ｐＨ６．０〜１０付近の緩衝液が好ましい。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられるが、ｐＨ７〜９付近のトリス緩衝液がより好ましい。前記緩衝液が塩化ナトリウムやＥＤＴＡ等を含んでいることが好ましい。特に前記溶解液として、塩化ナトリウムを含むトリス緩衝液を用いることが好ましく、このトリス緩衝液中の塩化ナトリウム濃度が０．６％を超え１．２％未満、トリス濃度が１０ｍＭ以上５０ｍＭ未満であり、ｐＨが７．０以上８．０未満であることがより好ましい。
また、本発明の効果を損なわない範囲で他の成分を含有していても良い。
【００６３】
本発明において、喀痰とは、気管・気管支から分泌されたムチン（ムコプロテインとムコポリサッカライド）と外界から吸引された細菌や塵埃の混合物であり、ヒト細胞や血球を含む場合もある。喀痰の性状については、Miller & Jonesの分類によると、Ｍ１、Ｍ２、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の五段階に分けられる。特にＰ２（膿性痰で膿性部分が１／３〜２／３含まれる）及びＰ３（膿性痰で膿性部分が２／３以上含まれる）の膿性痰になると膿性部分が多く含まれ、その分喀痰の前処理は時間を要し、特に、Ｐ３は簡便な均質化処理が困難であった。本発明はこの膿性痰の迅速かつ簡便な均質化処理をも可能とするものである。
【００６４】
本発明の喀痰の均質化処理方法の第１の態様は、喀痰を前記本発明の均質化処理剤で処理することを特徴とする。
本発明において、前記均質化処理剤を用いた喀痰の処理方法は特に限定されないが、該均質化処理剤と被検喀痰を混合した後、室温〜３７℃、好ましくは室温で適宜ボルテックスをかけることで反応させることにより、喀痰をすみやかに溶解させることができる。
【００６５】
本発明において、前記均質化処理剤による均質化処理後、微生物を培養した後、又は培養せずに、被検喀痰中に存在する微生物を検出することができる。微生物の検出方法は特に限定されず、公知の方法を広く使用することができる。微生物の検出においては、微生物を直接検出してもよく、生体関連物質を検出することにより微生物を検出してもよい。
【００６６】
本発明において、微生物としては、特に限定されないが、例えば、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＺＶＺ、ＥＢＶ、ＨＨＶなど）、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＨＧＶ）、その他カゼ症候群、消化器疾患、中枢神経系疾患、呼吸器系疾患、出血熱等の様々な疾患の病因ウイルス等のウイルス、リケッチャ、黄色ブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌群、緑膿菌、レジオネラ属、モラクセラ属、インフルエンザ細菌、クレブシエラ属、クラミジア、マイコプラズマ等の細菌、真菌等が挙げられる。
【００６７】
本発明において、生体関連物質とは、核酸（DNA、RNA）、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Blinらの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Favaloroらの方法（Favaloro et al.,Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。また、rＲＮＡにおいては、水酸化ナトリウム水溶液などで細胞を溶解した後、塩酸などで中和すればよい。また、それらの検出方法としては、PCR（Polymerase chain reaction）、ハイブリダイゼーション、パルサー法（PALSAR法、例えば、特許第3267576号及び特許第3310662号等参照。）、DNAチップ、プロテインチップ、抗原抗体反応等を用いて行うことができる。
【００６８】
本発明の喀痰の均質化処理方法の第２の態様は、金属及びその酸化物からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する粒子（本発明において、この粒子を金属粒子と称する。）を用いることを特徴とし、被検喀痰を該粒子の存在下で攪拌することにより、喀痰を穏和な条件下で簡便かつ迅速に処理し、より安定に喀痰中に存在する微生物を検出することができ、特に膿性痰の均質化処理に効果的である。
【００６９】
本発明において、前記金属粒子は金属及びその酸化物からなる群から選択される１種又は２種以上を材料として含むものであり、金属及びその酸化物の１種又は２種以上を主成分とする粒子が好ましい。前記金属粒子中に金属及びその酸化物以外の材料が含まれていてもよい。また、粒子の表面を金属やその酸化物の薄膜で被覆したものも本発明の粒子に含まれる。前記薄膜で被覆された粒子を用いる場合、被覆される粒子の材質は特に限定されず、金属及び非金属のいずれでもよい。
本発明において前記金属は特に限定されず、例えば、鉄、アルミニウム、マグネシウム、チタン、銅、亜鉛、ニッケル、鉛、スズ、クロム、ジルコニウム、モリブデン、金、銀、白金、及びこれらを基金属とする合金等が挙げられるが、特に鉄及びステンレス綱が好ましい。前記金属の酸化物は特に限定されず、例えば、前述の金属の酸化物が挙げられるが、特にアルミナが好ましい。
【００７０】
前記金属粒子の形状は特に限定されないが、球状粒子が好ましい。前記粒子の直径は１ｍｍ以上が好ましく、より好ましくは４．０ｍｍ以上である。これら粒子の直径の上限は特に限定されないが、１０ｍｍ以下が好適である。本発明において、前記粒子は同種の粒子１個又は２個以上を用いても良く、２種以上の粒子、例えば、粒径や材質が異なる粒子を組み合わせて合計２個以上の粒子を用いても良い。
【００７１】
金属粒子を用いた喀痰の均質化処理方法としては、具体的には、緩衝液等の溶解液に混合した被検喀痰を前記粒子で攪拌することにより均質化することが好ましいが、被検喀痰、喀痰前処理剤及び前記粒子を混合し、室温〜３７℃、好ましくは室温で適宜ボルテックスをかけることで反応させることにより、喀痰をすみやかに溶解させることがより好ましい。
溶解液としては、特に限定されないが、本発明の均質化処理剤の説明において述べた溶解液が同様に好適に用いられる。
【００７２】
前記喀痰前処理剤としては、セミアルカリプロテアーゼ（例えば、スプタザイム（極東製薬工業（株）製）等）、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ試薬、還元剤、及び界面活性剤等の公知の喀痰前処理剤（例えば、特開平２−２７３１９７号、ＷＯ０２／０１０７４４号、及び特許文献４等に記載の前処理剤）やシステインプロテアーゼを有効成分として含む本発明の喀痰の均質化処理剤を使用することができるが、セミアルカリプロテアーゼやシステインプロテアーゼ等の蛋白質分解酵素を含む喀痰均質化処理剤が好ましく、特に前述した本発明の均質化処理剤を用いることがより好ましい。これら蛋白質分解酵素は１種、又は２種以上組み合わせて使用することができる。
【００７３】
本発明において、前記金属粒子を用いた均質化処理方法により喀痰を均質化処理し、微生物を培養した後、又は培養せずに、被検喀痰中に存在する微生物を検出することができる。微生物の検出方法は特に限定されず、公知の方法を広く使用することができる。微生物の検出においては、微生物を直接検出してもよく、生体関連物質を検出することにより微生物を検出してもよい。
【００７４】
本発明の喀痰の均質化処理用器具は、金属及びその酸化物からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する粒子、すなわち前述した金属粒子を収容する蓋付き容器である。
図１１〜図１４は本発明の喀痰の均質化処理用器具の第１〜第４の例を示す概略説明図である。図１１〜図１４において、２１０ａ〜２１０ｄは容器の蓋、２１２ａ〜２１２ｄは容器、２１４は金属粒子である。
【００７５】
本発明の喀痰の均質化処理用器具において、前記容器の形状は特に限定されないが、図１１に示したような丸底の円筒容器２１２ａや図１２に示したような平底の円筒容器２１２ｂが好ましい。また、図１３に示した如く、容器内部が丸底であり、容器外部の底部２１６が平底又は空洞部分があり自立可能な形状である自立型の円筒容器２１２ｃを用いてもよい。さらに、図１４に示した如く、円筒状の管の底部に底蓋２１８を取り付けた容器２１２ｄを用いることもできる。
前記容器の材質は特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート等のプラスチック材料であることが好ましい。
前記蓋は前記容器を密閉し得るものであれば特に限定されない。蓋の取り付け方法は特に限定はないが、例えば、キャップ式、埋め込み式、内ねじ式、外ねじ式等が挙げられる。
【００７６】
前記粒子としては、前述した金属粒子が同様に用いられるが、材質がステンレス鋼、鉄又はアルミナである球状粒子が好ましい。粒子の直径は１ｍｍ以上が好ましく、より好ましくは４．０ｍｍ以上である。これら粒子の直径の上限は特に限定されないが、１０ｍｍ以下が好適である。
容器内に収容される粒子の数は特に限定されず、容器及び粒子の大きさに応じて適宜定めればよい。
本発明の喀痰の均質化処理用器具を用いて前述した本発明の喀痰の均質化処理方法を行うことにより、迅速且つ簡便に喀痰を均質化することができる。
【００７７】
次に、本発明の微生物の回収方法について説明する。
本発明の微生物の回収方法は、均質化処理した喀痰を、被検微生物が通過可能であり且つ有機材料からなる少なくとも３種のフィルターを有する本発明の微生物の分離器を用いて濾過し、得られた濾液から被検微生物を回収するものである。
【００７８】
本発明の微生物の回収方法においては、均質化処理された喀痰が用いられる。喀痰の均質化処理方法は特に限定されず、公知の方法を広く使用することができるが、前述した本発明の均質化処理方法が好ましい。
喀痰の均質化処理方法としては、例えば、均質化処理剤等の前処理剤を含む溶解液で被検喀痰を処理することにより喀痰を均質化し溶解させることが好ましい。前記前処理剤及び溶解液としては、本発明の均質化処理方法の第２の態様において述べた喀痰前処理剤及び溶解液が同様に好適に用いられる。
【００７９】
前記均質化処理剤を用いた喀痰の均質化処理方法は特に限定されないが、該均質化処理剤を含む溶解液と被検喀痰を混合した後、室温〜３７℃、好ましくは室温で適宜ボルテックスをかけることで反応させることにより、喀痰をすみやかに溶解させることができる。
また、溶解液に混合した被検喀痰を粒子を用いて攪拌することにより均質化させることが好ましい。前記粒子としては特に限定されないが、直径１ｍｍ以上、より好ましくは４ｍｍ以上の球状粒子が好適である。粒子の材質も特に限定されないが、金属及びその酸化物からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する粒子が好ましい。金属及びその酸化物としては、ステンレス鋼、鉄又はアルミナが特に好適である。
これら均質化処理反応は、微生物の分離器中で行うことも可能である。
【００８０】
前記均質化処理後の喀痰の均質化液を本発明の微生物の分離器を用いて濾過する。
図１５は本発明の微生物の分離器を用いた微生物の回収方法の一例を示す概略説明図である。図１５において、３１０ａは本発明の微生物の分離器であり、濾過部材３１４と、該濾過部材３１４を保持するフィルターホルダー３１６ａとを有する。前記濾過部材３１４は均質化処理した喀痰が通過する順に少なくとも第１フィルター３１１、第２フィルター３１２及び第３フィルター３１３の３種のフィルターを有する。
【００８１】
前記第１〜第３フィルターは、有機材料からなる多孔性材料であり、被検微生物が通過し得るものである。各フィルターの材質は同じであってもよく異なっていてもよい。なお、図１５では、各フィルターが積層されている３層構造の例を示したが、フィルターの配置は特に限定されず、一定の間隙を設けて配置してもよく、積層してもよい。
【００８２】
前記有機材料としては特に限定されないが有機高分子繊維が好ましく、例えば、セルロース，セルロース繊維，ニトロセルロース及び酢酸セルロース等のセルロース誘導体，ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）及びシクロポリオレフィン等のポリオレフィン，ナイロン−６、ナイロン−６，６、ナイロン−１１、ナイロン−１２、コポリアミド等のポリアミド，ポリパラフェニレンテレフタルアミド等のアラミド，ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＰ）等のポリエステル，ポリアクリロニトリル及びアクリレート等のアクリルポリマー，ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）及びポリビニルアルコール等のビニルポリマー，ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等のポリエステルエーテル，ポリウレタン，エポキシド，ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリヘキサフルオロエチレン／プロピレン・コポリマー（ＦＥＰ）、ポリエチレン／テトラフルオロエチレン・コポリマー（ＥＴＦＥ）及びポリエチレン／クロロトリフルオロエチレン・コポリマー（ＥＣＴＦＥ）等のフッ素樹脂，ポリカーボネート，ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ），ポリエーテルスルホン等が挙げられる。特にポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、セルロース及びポリアミドが好ましい。これら有機材料は１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００８３】
前記第１〜第３フィルターの孔径は、被検微生物を通過可能であれば特に限定されず、被検微生物の大きさや被検喀痰の状態に応じて適宜選択可能である。
前記第３フィルターは、喀痰中の細胞や血球を通さず被検微生物を通過できる孔径を有するフィルターが好ましい。具体的には、第３フィルターの孔径は０．１μｍ以上１０μｍ以下が好ましく、２〜７μｍがより好ましく、約５μｍがさらに好ましい。前記第２フィルターは、前記第３フィルターよりも大きい孔径を有することが好ましい。具体的には、第２フィルターの孔径は５μｍ以上が好ましく、１０〜３０μｍがより好ましく、約２０μｍがさらに好ましい。前記第１フィルターは、前記第２フィルターよりも大きい孔径を有することが好ましい。具体的には、第１フィルターの孔径は５μｍ以上が好ましく、２０μｍ以上がより好ましく、８０〜１２０μｍがさらに好ましい。
前記第１〜第３フィルターの膜厚は特に限定されないが、１〜２００μｍのものが好ましい。
【００８４】
前記フィルターホルダー３１６ａは、例えば、図１５に示した如く、濾過部材３１４を収容する本体３１７ａと、蓋体３１８ａから構成される。前記フィルターホルダー３１６ａの形状は特に限定されないが、例えば、図１５に示した如く、円筒形で底部にフィルターを装着可能な容器が用いられる。フィルターの装着方法及び蓋体の取り付け方法は特に限定されないが、例えば、フィルターホルダー本体に一体に形成する方法や、キャップ式、埋め込み式、内ねじ式、外ねじ式等の設置方法が挙げられる。
前記フィルターホルダー３１６ａの材質は特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック材料であることが好ましい。
【００８５】
図１５（ａ）に示した如く、前記均質化処理後の喀痰の均質化液３２４は、被検微生物３２０と、ヒト由来細胞、血球及び埃塵等の夾雑物３２２とが混在している場合が多いが、この均質化液３２４を本発明の分離器３１０ａで濾過処理することにより、細胞、血球及び埃塵等の夾雑物３２２を濾過部材３１４により除去し、被検微生物３２０を含む濾液３３０を得ることができる［図１５（ｂ）］。図１５においては、遠心分離処理により濾過操作を行い、被検微生物３２０を含む沈殿物３３４と上清３３２に分離した濾液３３２を得たが、本発明において濾過処理方法は特に限定されない。例えば、窒素ガスやシリンジ等を用いて加圧又は減圧条件で濾過処理を行うことが好ましい。
【００８６】
本発明においては、前述の方法により喀痰を均質化処理した後、得られた均質化液を本発明の分離器に注入し、均質化液を分離部材に通過させ、濾液を回収してもよく、また、本発明の分離器に被検喀痰、溶解液及び前処理液等を投入し、該分離器中で喀痰の均質化処理を行った後、該均質化液を分離部材に通過させ、濾液を回収してもよい。
【００８７】
図１５において、３１５ａは濾液３３０を回収する回収容器である。本発明において、回収容器３１５ａは、濾液を回収可能なものであれば特に限定されず、図１５及び図１６に示した如く分離器に設置されていてもよく、図１７及び図１８に示した如く分離器とは別体となっていてもよい。前記回収容器３１５ａの形状も特に限定されないが、例えば、円筒状で内底部が丸底、Ｖ底、平底等の容器が用いられる。前記前記回収容器３１５ａの材質は特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック材料であることが好ましい。
【００８８】
図１６は、本発明の微生物の分離器を用いた微生物の回収方法の他の例を示す概略説明図である。図１６において、３１０ｂは本発明の微生物の分離器であり、加圧濾過を用いる例である。図１６に示した如く、分離部材３１４を保持するフィルターホルダー３１６ｂ内に前記均質化液３２４を入れ、上方から窒素ガス等を用いて圧力を加えることにより、回収容器３１５ｂ中に被検微生物３２０を含む濾液３３０を回収することができる。加圧方法は特に限定されないが、例えば、フィルターホルダー３１６ｂの蓋体３１８ｂに加圧手段（図示せず）を接続する方法や蓋体３１８ｂに通気孔（図示せず）を設け、通気孔から圧力を加える方法等が用いられる。
【００８９】
図１７は、本発明の分離器の一例を示す断面概略説明図であり、図１８は図１７に示した本発明の分離器を含む微生物の回収キットの一例をそれぞれ示す。図１７において、３１０ｃは本発明の分離器であり、フィルターホルダー３１６ｃ内に前記第１〜第３フィルター３１１〜３１３を有する分離部材３１４が収納されている。図１８に示した如く、フィルターホルダー３１６ｃにシリンジ３４０を接続し、該シリンジ３４０内に前記均質化液を入れ、該シリンジ３４０を用いて加圧濾過し、得られた濾液を回収容器３１５ｃ内に回収することにより、被検微生物を含有する濾液を得ることができる。
【００９０】
本発明において、前記得られた微生物含有濾液を、微生物を培養した後、又は培養せずに、微生物を検出することにより、被検喀痰中に存在する微生物を検出することができる。微生物の検出方法は特に限定されず、公知の方法を広く使用することができる。微生物の検出においては、微生物を直接検出してもよく、生体関連物質を検出することにより微生物を検出してもよい。
【実施例】
【００９１】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
【００９２】
（実施例１）
喀痰に類似した性状の粘性試料として、ブタ胃由来ムチン（和光純薬製）８ｇを０．９％塩化ナトリウム溶液１０ｍＬに十分溶解し、８０％ムチン溶液を用いた。本発明のサンプリング器具２として、図３（ａ）〜（ｊ）に示した如くの種々のスリット（吸引吐出口）１６ａ〜１６ｊの形状を有するプレート状ノズル１４ａ〜１４ｊを用いて吸引力及び吐出力を夫々調べた。各スリットの幅はいずれも１ｍｍとし、容量は１ｍＬとした。実験装置として、図５に示した装置を用いた。図５は本発明の吸引力及び吐出力を測定する際に用いた装置の概念説明図であり、図５（ａ）は吸引力の場合、図５（ｂ）は吐出力の場合である。図５（ａ）（ｂ）において、符号Ｐは粘性試料、符号９０は重りホルダ、符号９２は重り、符号９４は試料容器である。図５（ａ）では、試料容器９４を上方に配置して粘性試料Ｐを入れ、試料容器９４の下端に本発明のサンプリング器具２のプレート状ノズル１４を接続し、本発明のサンプリング器具２のプランジャ３０の操作用頭部３４に重りホルダ９０を吊り下げて接続し、徐々に重り９２を増やすことによって吸引力の測定を行った。図５（ｂ）では、試料容器９４を下方に配置し、試料容器９４の上端に粘性試料Ｐを吸引した後の本発明のサンプリング器具２のプレート状ノズル１４を接続し、本発明のサンプリング器具２のプランジャ３０の操作用頭部３４に重りホルダ９０を載せて接続し、徐々に重り９２を増やすことによって吐出力の測定を行った。重り９２としては鉄製粒子（直径：６．４ｍｍ）を用い、吸引力及び吐出力はF＝ｍｇ（Ｎ）の公式を用いた。その結果を表１に示す。
【００９３】
（比較例１）
サンプリング器具として一般に市販されているツベルクリン用のテルモ社製のシリンジ（容量１ｍＬ）を用いた以外は、実施例１と同様の態様で実験を行った。結果を表１に併せて示す。
【００９４】
【表１】
2010160156.tif 000003
【００９５】
表１に示した如く、サンプリング器具として一般に市販されているツベルクリン用のテルモ社製のシリンジ（容量１ｍＬ）を用いた比較例１では、吸引力及び吐出力のいずれにおいても高い数値を示したのに対し、図３（ａ）〜（ｊ）に示した如くの種々のスリット１６ａ〜１６ｊの形状を有するプレート状ノズル１４ａ〜１４ｊを用いた本発明のサンプリング器具２では、吸引力及び吐出力のいずれにおいても低い数値を示した。特に、スリットの形状が十字（Ｘ字）形、Ｙ字形、Ｗ字形である図３（ａ）〜（ｃ）やＺ字形である図３（ｊ）については格別に良い結果が得られた。従って、本発明のサンプリング器具２によれば、喀痰等の粘性試料を比較的少ない力で吸引及び吐出することができ、作業者の負担を軽減できることが確認された。
【００９６】
（実施例２）
粘性試料として膿性痰（Ｐ２、Miller & Jonesの分類）を用い、図３（ａ）〜（ｊ）に示した如くの種々のスリット（吸引吐出口）１６ａ〜１６ｊの形状を有するプレート状ノズル１４ａ〜１４ｊを用いた本発明のサンプリング器具２によって、吸引後と吐出後における粘性の長さ（粘性試料が糸を引く長さ）を夫々調べた。各スリットの幅はいずれも１ｍｍとし、容量は１ｍＬとした。吸引後における粘性の長さとは、粘性試料を入れた容器から本発明のサンプリング器具２を用いて所定量の粘性試料を吸引した後に、本発明のサンプリング器具２の先端を一度容器底に擦りつけてから引き上げ、粘性試料が千切れるまでの距離とした。また、吐出後における粘性の長さとは、本発明のサンプリング器具２を用いて所定量吸引した粘性試料を一度容器底に全て吐出してから引き上げ、粘性試料が千切れるまでの距離とした。その結果を表２に示す。
【００９７】
（比較例２）
サンプリング器具として一般に市販されているツベルクリン用のテルモ社製のシリンジ（容量１ｍＬ）を用いた以外は、実施例２と同様の態様で実験を行った。結果を表２に併せて示す。
【００９８】
【表２】
2010160156.tif 000004
【００９９】
表２に示した如く、サンプリング器具として一般に市販されているツベルクリン用のテルモ社製のシリンジ（容量１ｍＬ）を用いた比較例２では、吸引後及び吐出後における粘性の長さが長いのに対し、図３（ａ）〜（ｊ）に示した如くの種々のスリット１６ａ〜１６ｊの形状を有するプレート状ノズル１４ａ〜１４ｊを用いた本発明のサンプリング器具２では、吸引後及び吐出後のいずれにおいても同等以上に短い数値を示した。特に、スリットの形状が十字（Ｘ字）形、Ｙ字形、Ｗ字形である図３（ａ）〜（ｃ）については格別に良い結果が得られた。その他、Ｉ字形である図３（ｄ）やＺ字形である図３（ｊ）もこれに次いで良い結果が得られた。吸引時及び吐出時の粘性試料の切れの良い（粘性長さの短い）スリットの形状の傾向として、スリット１６がプレート状ノズル１４の中央部近傍に位置していることや、少なくとも１つの角部１５を有する形状をなしていることが分かった。本発明のサンプリング器具２によれば、吸引時及び吐出時の粘性試料の切れを良くすることができ、環境衛生上好ましいことが確認された。
【０１００】
（実施例３）
粘性試料として膿性痰（Ｐ２、Miller & Jonesの分類）を用い、図３（ａ）〜（ｊ）に示した如くの種々のスリット（吸引吐出口）１６ａ〜１６ｊの形状を有するプレート状ノズル１４ａ〜１４ｊを用いた本発明のサンプリング器具２によって、夫々５００μＬずつ採取（吸引して別の容器に吐出）して、その重量を計ることを夫々２回繰り返すことによって定量性を調べた。その結果を表３に示す。
【０１０１】
（比較例３）
サンプリング器具として一般に市販されているツベルクリン用のテルモ社製のシリンジ（容量１ｍＬ）の筒状体先端を単に切断し、直胴部と同径の吸引吐出口を開口したものを用いた以外は、実施例３と同様の態様で実験を行った。結果を表３に併せて示す。
【０１０２】
【表３】
2010160156.tif 000005
【０１０３】
表３に示した如く、サンプリング器具として一般に市販されているツベルクリン用のテルモ社製のシリンジ（容量１ｍＬ）の筒状体先端を切断して直胴部と同径の吸引吐出口を開口したものを用いた比較例３においては、吸引後に粘性試料の一部が引っ張られて定量性が損なわれるのに対し、図３（ａ）〜（ｊ）に示した如くの種々のスリット１６ａ〜１６ｊの形状を有するプレート状ノズル１４ａ〜１４ｊを用いた本発明のサンプリング器具２ではいずれも１回目も２回目も安定して高い定量性を示した。従って、定量性において、サンプリング器具の吸引吐出口の形状が重要であり、本発明のサンプリング器具２によれば、著しく粘性試料をサンプリングする際の定量性を向上せしめることができることが確認された。
【０１０４】
（実施例４）
粘性試料として膿性痰（Ｐ２、Miller & Jonesの分類）を用い、図３（ａ）に示したスリット（吸引吐出口）１６ａの形状（十字形乃至Ｘ字形）を有するプレート状ノズル１４ａを用いた本発明のサンプリング器具２によって、スリットの幅ｄ１を０．５ｍｍ、１ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍとした場合における吸引後及び吐出後の粘性の長さを夫々調べた。吸引後における粘性の長さとは、粘性試料を入れた容器から本発明のサンプリング器具２を用いて所定量の粘性試料を吸引した後に、本発明のサンプリング器具２の先端を一度容器底に擦りつけてから引き上げ、粘性試料が千切れるまでの距離とした。また、吐出後における粘性の長さとは、本発明のサンプリング器具２を用いて所定量吸引した粘性試料を一度容器底に全て吐出してから引き上げ、粘性試料が千切れるまでの距離とした。その結果を表４に示す。
【０１０５】
（比較例４）
サンプリング器具として一般に市販されているツベルクリン用のテルモ社製のシリンジ（容量１ｍＬ）を用いた以外は、実施例４と同様の態様で実験を行った。結果を表４に併せて示す。
【０１０６】
【表４】
2010160156.tif 000006
【０１０７】
表４に示した如く、サンプリング器具として一般に市販されているツベルクリン用のテルモ社製のシリンジ（容量１ｍＬ）を用いた比較例４と比較して、本発明のサンプリング器具２におけるスリットの幅ｄ１を０．５ｍｍ〜２．０ｍｍとした場合にはいずれも吸引後及び吐出後の粘性の長さが短く、特にスリットの幅ｄ１を０．５ｍｍ〜１．５ｍｍとした場合に良い結果が得られた。従って、本発明のサンプリング器具２によれば、吸引時及び吐出時の粘性試料の切れを良くすることができ、環境衛生上好ましいことが確認された。なお、図３（ｂ）〜（ｊ）に示したスリット（吸引吐出口）１６ｂ〜１６ｊの形状を有するプレート状ノズル１４ｂ〜１４ｊを用いた本発明のサンプリング器具２においても略同様の結果であった。
【０１０８】
（実施例５）
粘性試料の種類としてグリセリン（キシダ化学社製）、エチレングリコール（キシダ化学社製）、Triton X-100（キシダ化学社製）又はTween20（シグマ社製）を用い、図３（ａ）に示した如くの種々のスリット（吸引吐出口）１６ａの形状（十字形乃至Ｘ字形）を有するプレート状ノズル１４ａを用いた本発明のサンプリング器具２によって、５００μｌ採取（吸引して別の容器に吐出）して、その重量を計ることを夫々２回繰り返すことによって、粘性試料の種類の違いによる定量性を調べた。その結果を表５に示す。なお、各試薬の比重（グリセリン：１．２６、エチレングリコール：１．１０８８、Triton X-100：１．０７、Tween20：１．１０５）から算出した理論値を併せて示した。
【０１０９】
【表５】
2010160156.tif 000007
【０１１０】
表５に示した如く、本発明のサンプリング器具２によれば、様々な種類の粘性試料に対して高い定量性を示すことが確認された。また、図３（ｂ）〜（ｊ）に示したスリット（吸引吐出口）１６ｂ〜１６ｊの形状を有するプレート状ノズル１４ｂ〜１４ｊを用いた本発明のサンプリング器具２においても略同様の結果であった。
【０１１１】
以上述べた如く、本発明によれば、喀痰等の粘性試料をサンプリングする際の定量性を向上せしめ、比較的少ない吸引力及び吐出力で作業者の負担を軽減し、吸引時及び吐出時の粘性試料の切れを良くし、環境衛生面での問題も少ない粘性試料のサンプリング器具２及びその補助治具４０，６０を提供することができる。
【０１１２】
（実施例６）
０．２５％（２０００Ｕ／ｍＬ）ブロメラインＦ（Bromelain F，天野エンザイム社製）を、溶解液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）］に溶解し前処理液とした。この前処理液を、膿性痰（Ｐ２及びＰ３、Miller & Jonesの分類）に対して２０倍量加えて、室温（２６℃）で反応させた。その際、１０分おきにボルテックス（TM-252 TEST TUBE MIXER、旭テクノグラス社製）で懸濁し、溶解時間を測定した。尚、本実施例及び後述する実施例において、喀痰の溶解時間は、喀痰がほぼ完全に溶液化の状態になるまでに要した反応時間とした。その結果を表６に示す。
【０１１３】
（比較例５）
スプタザイム（極東製薬工業（株）製、セミアルカリプロテアーゼ）を、キットに付随するリン酸バッファー溶解液に溶解し前処理液とした。前処理液を変更した以外は実施例６と同様に実験を行った。結果を表６に示す。
【０１１４】
【表６】
2010160156.tif 000008
【０１１５】
表６に示した如く、セミアルカリプロテアーゼを用いた比較例５では、Ｐ２の膿性痰の溶液化に１２０分を要し、更にＰ３の膿性痰は１８０分反応させても溶液化されなかったのに対し、ブロメラインを用いた実施例６ではＰ２の膿性痰は７０分、Ｐ３の膿性痰は９０分という速さで溶液化されていた。従って、ブロメラインを用いることにより、均質化処理を迅速に行うことができ、更に、従来では均質化が難しかった膿性部分の多い膿性痰をも迅速に均質化できることが判った。
【０１１６】
（実験例１）
０．２５％（２０００Ｕ／ｍＬ）ブロメラインＦ（天野エンザイム社製）を、溶解液［０．９％塩化ナトリウム溶液、２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ］に加え、懸濁液とした。この懸濁液にインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae、H. influenzae）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae、S. pneumoniae）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa、P. aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus、S. aureus）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila、L. pneumophila）、又は肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae、K. pneumoniae）を１０3ＣＦＵ／ｍＬとなるように加え、室温（２６℃）において０時間と二時間後で生菌数を比較した。また、対照として、ブロメラインＦを添加せず、溶解液を懸濁液として使用した以外は同様の条件で生菌数を測定した。
【０１１７】
生菌数の測定方法は、前記各細菌懸濁液を、チョコレート寒天培地ＥＸ（日水製薬（株）製）各プレートに１００μＬずつ３枚播き、３７℃で１８時間培養した後、コロニー数を測定し、３枚のプレートの平均値を生菌数とした。結果を表７に示す。
【０１１８】
（比較例６）
懸濁液として、スプタザイム（極東製薬工業（株）製、セミアルカリプロテアーゼ）を用い、細菌としてインフルエンザ菌のみを添加した以外は、実験例１と同様に実験を行った。結果を表８に示す。
【０１１９】
【表７】
2010160156.tif 000009
【０１２０】
【表８】
2010160156.tif 000010
【０１２１】
表７に示した如く、ブロメラインを用いることで、インフルエンザ菌、肺炎レンサ球菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、レジオネラ菌及び肺炎桿菌のいずれの細菌においても、酵素の影響を受けないことが判った。
また、セミアルカリプロテアーゼを用いた比較例６では、室温で２時間反応させることで、生菌数の減少がみられたのに対し、ブロメラインを用いた実験例１では室温で２時間反応させても、ほとんど生菌数の減少は認められなかった。従って、ブロメラインを用いることにより、細菌に影響を与えることなく安定に細菌を検出できることがわかった。
【０１２２】
（実施例７〜１０）
ブロメラインＦ（天野エンザイム社製、１０００Ｕ／ｍＬ）及びパパイン（天野エンザイム社製、１０００Ｕ／ｍＬ）を、溶解液［１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸ナトリウム］に溶解し前処理液とした。２ｍＬエッペンドルフチューブに、喀痰（性状Ｐ３の膿性痰）、喀痰の１０倍量の前処理液、及び表９又は表１０に示す材質及び直径の粒子を加え、室温（２６℃）で反応させた。その際、１０分おきにボルテックス（TM-252 TEST TUBE MIXER、旭テクノグラス社製）で懸濁し、溶解時間を測定した。溶解時間の結果を表９及び表１０に示す。
【０１２３】
なお、鉄およびステンレス粒子の数は、直径１．６ｍｍ：４０粒、直径２．４ｍｍ：２０粒、直径３．２ｍｍ：１０粒、直径４．０ｍｍ：７粒、直径４．８ｍｍ：４粒、直径５．６ｍｍ：３粒とし、アルミナ粒子の数は、直径１．０ｍｍ：４０粒、直径２．０ｍｍ：２０粒、直径３．０ｍｍ：１０粒、直径４．０ｍｍ：７粒、直径５．０ｍｍ：４粒とし、ガラス粒子の数は、直径１．５−２．５ｍｍ：２０粒、直径４．０−４．７ｍｍ：７粒、直径４．８−５．６ｍｍ：４粒とした。
【０１２４】
【表９】
2010160156.tif 000011
【０１２５】
【表１０】
2010160156.tif 000012
【０１２６】
表９及び表１０に示した如く、鉄、ステンレス又はアルミナ粒子を用いることにより、喀痰溶解時間を大幅に短縮することができた。また、材質がステンレス、鉄又はアルミナの粒子で、かつ大きさを直径４．０ｍｍ以上にすることで、喀痰溶解時間をさらに大幅に短縮できることが明らかとなった。
【０１２７】
（実験例２）
インフルエンザ菌（H. influenzae）又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）を、懸濁液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム］にそれぞれ懸濁し、細菌調製液とした。２ｍｌエッペンドルフチューブに、細菌調製液１ｍＬ、及びステンレス製の粒子（直径４ｍｍ）７粒を加え、ボルテックスを用いて回転数２５００ｒｐｍで振蕩させ、３０秒毎に生菌数を測定し、各攪拌時間による細菌への影響を調べた。その結果を表１１に示す。
【０１２８】
【表１１】
2010160156.tif 000013
【０１２９】
表１１に示した如く、３分間ボルテックスをかけても粒子による細菌への影響がないことが明らかとなった。
【０１３０】
（実験例３）
インフルエンザ菌（H. influenzae）又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）を、懸濁液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム］にそれぞれ懸濁し、細菌調製液とした。２ｍｌエッペンドルフチューブに、細菌調製液１ｍＬ、及び各直径のステンレス製粒子を加え、ボルテックスを用いて回転数２５００ｒｐｍで３分間振蕩させた後、生菌数を測定し、細菌への影響を調べた。また、対照として、粒子を加えなかった以外は同様の条件で実験を行った。それらの結果を表１２に示す。
尚、ステンレス製粒子の数は、粒子の重量を統一し、直径１．６ｍｍ：４０粒、直径２．４ｍｍ：２０粒、直径３．２ｍｍ：１０粒、直径４．０ｍｍ：７粒、直径４．８ｍｍ：４粒、直径５．６ｍｍ：３粒とした。
【０１３１】
【表１２】
2010160156.tif 000014
【０１３２】
表１２に示した如く、ステンレス製粒子を用いた均質化処理は細菌への影響が極めて少なく、特に、粒子の大きさが４．０ｍｍ以上では、３分間ボルテックスをかけても粒子による細菌への影響がないことが明らかとなった。
【０１３３】
（実施例１１）
０．２５％のブロメラインＦ（天野エンザイム社製）を、溶解液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸ナトリウム］に溶解し前処理液とした。２ｍＬエッペンドルフチューブに、喀痰（性状Ｐ２の膿性痰）、喀痰の１０倍量の前処理液、直径４ｍｍのステンレス製粒子を７粒加え、室温（２６℃）で反応させた。その際、１０分おきにボルテックスで懸濁し、溶解時間を測定した。溶解時間の結果を表１３に示す。
【０１３４】
（実施例１２）
スプタザイム（極東製薬工業（株）製、セミアルカリプロテアーゼ）を、キットに付随するリン酸バッファー溶解液に溶解し前処理液とした。前処理液を変更した以外は実施例１１と同様の条件で実験を行った。結果を表１３に示す。
【０１３５】
（実施例１３）
前処理液として、実施例１１と同様の前処理液を用いた。１０ｍＬのスピッツ管に、喀痰（性状Ｐ２の膿性痰）及び喀痰の２０倍量の前処理液を加え、室温（２６℃）で反応させた。その際、１０分おきにボルテックスで懸濁し、溶解時間を測定した。溶解時間の結果を表１３に示す。
【０１３６】
（比較例７）
前処理液として、実施例１２と同様の前処理液を用いた。前処理液を変更した以外は実施例１３と同様の条件で実験を行った。結果を表１３に示す。
【０１３７】
【表１３】
2010160156.tif 000015
【０１３８】
表１３に示した如く、喀痰溶解性において、酵素のみでは長時間を要する場合においても、ステンレス粒子を用いることにより、喀痰溶解時間を大幅に短縮することができた。
【０１３９】
（実験例４及び比較例８）
黄色ブドウ球菌（S. aureus）を１０3ＣＦＵ／ｍＬとなるように生理食塩水で調製し菌液とした。シリンジフィルターホルダーに表１に示す孔径及び材質のフィルターをそれぞれ入れて用意した。これをシリンジに接続し、菌液を通過させた後、回収した菌液（濾液）をプレートに播き、生菌数を測定した。なお、生菌数の測定方法は、実験例１と同様に行った。また、対照として、フィルターを通過させていない菌液についても、同様に生菌数を測定した。その結果を表１４に示す。
【０１４０】
【表１４】
2010160156.tif 000016
【０１４１】
表１４中、ポリカーボネートはワットマン社製のサイクロポアメンブレン（親水性ポリカーボネートメンブレン、膜厚７−２０μｍ）、ガラス繊維はワットマン社製のＧＭＦ１５０（膜厚０．７５ｍｍ）である。
【０１４２】
以上の結果、ガラス繊維を用いた比較例８ではフィルトレーションによる菌の回収率が大幅に減少しているのに対し、ポリカーボネートを用いた実験例４では菌の回収率がフィルトレーションしていない対象と同等であった。このことより、ポリカーボネートを用いることで、効率よく菌を回収できることが明らかとなった。
【０１４３】
（実験例５〜７）
肺炎レンサ球菌（S. pneumoniae）、緑膿菌（P. aeruginosa）又は肺炎桿菌（K. pneumoniae）を１０3ＣＦＵ／ｍＬとなるようにそれぞれ生理食塩水で調製した。シリンジフィルターホルダーに表１５に示す孔径及び材質のフィルターをそれぞれ入れて用意した。これをシリンジに接続し、菌液を通過させた後、回収した菌液をプレートに播き、生菌数を測定した。生菌数の測定方法は、実験例１と同様に行った。また、対照として、フィルターを通過させていない菌液についても、同様に生菌数を測定した。その結果を表１５に示す。
【０１４４】
【表１５】
2010160156.tif 000017
【０１４５】
表１５中、ＰＴＦＥはＡＤＶＡＮＴＥＣ社製のポリフロン（ダイキン工業（株）の登録商標）フィルター（膜厚０．３６ｍｍ）、セルロース繊維はＡＤＶＡＮＴＥＣ社製の定性濾紙（膜厚０．２６ｍｍ）、ポリカーボネートはワットマン社製のサイクロポアメンブレン（親水性ポリカーボネートメンブレン、膜厚７−２０μｍ）である。
【０１４６】
以上の結果、フィルターの材質をＰＴＦＥ、セルロース繊維及びポリカーボネート等の有機材料にすることで、種々の細菌に対して効率よく菌を回収できることが明らかとなった。
【０１４７】
（実験例８及び９）
緑膿菌（P. aeruginosa）又は肺炎レンサ球菌（S. pneumoniae）を１０3ＣＦＵ／ｍＬとなるようにそれぞれ生理食塩水で調製した。シリンジフィルターホルダーに表１６に示す孔径及び材質のフィルターをそれぞれ入れて用意した。これをシリンジに接続し、菌液を通過させた後、回収した菌液をプレートに播き、生菌数を測定した。生菌数の測定方法は、実験例１と同様に行った。また、対照として、フィルターを通過させていない菌液についても、同様に生菌数を測定した。その結果を表１６に示す。
【０１４８】
【表１６】
2010160156.tif 000018
【０１４９】
表１６中、ナイロンは（株）サンプラテック製のナイロンメッシュシート、ポリエチレンは（株）サンプラテック製のＰＥメッシュシートである。
【０１５０】
以上の結果、フィルターの材質をナイロン又はポリエチレンにすることで、緑膿菌及び肺炎レンサ球菌を効率よく回収できることが明らかとなった。
【０１５１】
（実験例１０〜１２）
＜第３及び第２フィルターによる菌と細胞の混合溶液からの菌の分離＞
実験例１０では、緑膿菌（P. aeruginosa）を１０3ＣＦＵ／ｍＬとなるように生理食塩水で調製し、更に、ＰＣ−１４細胞を１０6／ｍＬとなるように菌液と混合した。
シリンジフィルターホルダーに実験例７で用いた孔径５μｍ、材質ポリカーボネートの第３フィルターを入れ、その上に孔径２０μｍ、材質ナイロンの第２フィルター［（株）サンプラテック製、ナイロンメッシュシート］を入れた。これをシリンジに接続し、細胞と菌液の混合溶液を通過させた後、回収した菌液をプレートに播き、生菌数を測定した。生菌数の測定方法は、実験例１と同様に行った。結果を表１７に示す。
【０１５２】
また、対照として、表１７に示した如く、前記菌液と細胞の混合溶液（実験例１１）又は菌液（実験例１２）を用いて前記第２フィルターを入れずに第３フィルターのみに通過させた場合の濾液、並びにフィルターを通過させていない菌液（対照）についても同様に生菌数を測定した。結果を表１７に示す。
【０１５３】
【表１７】
2010160156.tif 000019
【０１５４】
以上の結果、第３フィルターのみを用いた場合は細胞による詰まりが生じ、フィルターへの通過はできず、孔径５μｍのフィルター上に孔径２０μｍのフィルターを組み合わせることで、細胞存在下においても緑膿菌を効率よく回収できることが明らかとなった。
【０１５５】
（実験例１３〜１７）
＜第２及び第１フィルターによる粘性溶液の通過性＞
ブタ胃由来のムチン（和光純薬工業（株）製）を生理食塩水に溶解し、８０％粘性溶液とした。これに生理食塩水に溶解した０．１％ジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液を等量加え、室温で１時間反応させ、ムチンの均質化粘性溶液とした。シリンジフィルターホルダーに実験例１０で用いた孔径２０μｍ、材質ナイロンの第２フィルターを入れ、その上に孔径４２、５９、７７又は１０８μｍ、材質ナイロンの第１フィルター［（株）サンプラテック社製、ナイロンメッシュシート］をそれぞれ入れた（実験例１３〜１６）。これをシリンジに接続し、ムチンの均質化粘性溶液を通過させて、フィルターの通過性を調べた。また、対照として、シリンジフィルターホルダーに前記第２フィルターのみを入れたものを用いて同様にフィルターの通過性を調べた（実験例１７）。結果を表１８に示す。
【０１５６】
【表１８】
2010160156.tif 000020
【０１５７】
表１８において、フィルターの通過性の評価基準は下記の通りである。
◎：シリンジ操作がよりスムーズである。
○：シリンジ操作がスムーズである。
△：シリンジ操作が硬い。
×：シリンジ操作がかなり硬い。
【０１５８】
表１８に示した如く、シリンジフィルターホルダーに孔径２０μｍのフィルターのみを入れたもの（実験例１７）では、シリンジ操作が硬く、ムチンの均質化粘性溶液をフィルターに通過させることに手間取り、また、孔径２０μｍのフィルターと、孔径４２、５９又は７７μｍのフィルターとの組み合わせ（実験例１３−１５）では、比較的スムーズにムチンの均質化粘性溶液をフィルターに通過させることができた。特に孔径２０μｍのフィルターと孔径１０８μｍのフィルターとの組み合わせ（実験例１６）はよりスムーズにムチンの均質化粘性溶液をフィルターに通過させることができた。このことから、第１フィルターのサイズは２０μｍを超えることが好ましく、より好ましくは約１００μｍであることがわかった。
【０１５９】
（実施例１４、１５及び実験例１８）
＜第１、第２及び第３フィルターによる喀痰均質化溶液の通過性＞
ブロメラインＦ（天野エンザイム社製）を、溶解液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸ナトリウム］に終濃度２０００Ｕ／ｍＬ（０．２５％）となるよう溶解し前処理液とした。２ｍＬエッペンドルフチューブに、喀痰（性状Ｐ３の膿性痰）、喀痰の１０倍量の前処理液、直径４ｍｍのステンレス製粒子７粒を加え、室温（２６℃）で反応させた。その際、１０分おきにボルテックス（TM-252 TEST TUBE MIXER、旭テクノグラス社製）で懸濁した。２０分反応させた溶液を喀痰均質化液とした。
【０１６０】
シリンジフィルターホルダーに実験例７で用いた孔径５μｍ、材質ポリカーボネートの第３フィルターを入れ、その上に実験例１０で用いた孔径２０μｍ、材質ナイロンの第２フィルターを入れ、さらにその上に孔径４２又は１０８μｍ、材質ナイロンの第１フィルター［（株）サンプラテック社製、ナイロンメッシュシート］をそれぞれ入れた（実施例１４又は１５）。これをシリンジに接続し、前記喀痰の均質化液を通過させて、フィルターの通過性を調べた。また、対照として、シリンジフィルターホルダーに前記第３フィルター及び第２フィルターのみを入れたものを用いて同様にフィルターの通過性を調べた（実験例１８）。結果を表１９に示す。なお、表１９のフィルターの通過性の評価基準は表１８と同様である。
【０１６１】
【表１９】
2010160156.tif 000021
【０１６２】
表１９に示した如く、シリンジフィルターホルダーに孔径５及び２０μｍの２種のフィルターのみを入れたもの（実験例１８）では、シリンジ操作が硬く、喀痰の均質化液をフィルターに通過させることに手間取り、また、孔径５及び２０μｍのフィルターと、孔径４２又は１０８μｍのフィルターとの組み合わせでは（実施例１４又は１５）、比較的スムーズに喀痰の均質化液をフィルターに通過させることができた。
【０１６３】
（実施例１６）
１．菌液の調製
トリプチックソイアガーで１８時間培養した黄色ブドウ球菌（S. aureus）を生理食塩水に懸濁させたものを培養菌原液とした。これを生理食塩水で所定の菌数に希釈し、実施例に用いる希釈菌液とした。菌数については、培養菌原液の希釈系列を作成して、トリプチックソイアガーで培養して得られた生菌数から所定の菌数を算出した。なお、希釈菌液のかわりに生理食塩水を用いて同様に反応させたものを対照とした。
【０１６４】
２．喀痰均質化液の調製
ブロメラインＦ（天野エンザイム社製）を、溶解液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸ナトリウム］に終濃度２０００Ｕ／ｍＬ（０．２５％）となるよう溶解し前処理液とした。２ｍＬエッペンドルフチューブに、喀痰（性状Ｐ３の膿性痰）、喀痰の１０倍量の前処理液、直径４ｍｍのステンレス製粒子７粒を加え、室温（２６℃）で反応させた。その際、１０分おきにボルテックス（TM-252 TEST TUBE MIXER、旭テクノグラス社製）で懸濁した。２０分反応させた溶液を喀痰均質化液とした。
【０１６５】
３．菌液の添加
前述の方法に従って培養した黄色ブドウ球菌を１０×１０8ＣＦＵ／ｍＬになるように溶解液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、０．２５％ブロメラインＦ（天野エンザイム社製、２０００Ｕ／ｍＬ）］で希釈した後、更に黄色ブドウ球菌が１０×１０7ＣＦＵ／ｍＬになるように前述の喀痰均質化液で希釈した。
また、前述の方法に従って培養した黄色ブドウ球菌を１０×１０7ＣＦＵ／ｍＬになるように溶解液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、０．２５％ブロメラインＦ（天野エンザイム社製、２０００Ｕ／ｍＬ）］で希釈し、これを陽性コントロール液とした。
また、前述の喀痰均質化液のみのものを陰性コントロール液とした。
【０１６６】
４．微生物の回収
第３フィルター（孔径５μｍ、ポリカーボネート、ワットマン社製）、第２フィルター（孔径２０μｍ、ナイロン、（株）サンプラテック製）、及び第１フィルター（孔径１０８μｍ、ナイロン、（株）サンプラテック製）を下から順にシリンジフィルターホルダーに入れ、シリンジと接続し、微生物の分離器として用いた。
前記調製した各溶液を一部とり、微生物の分離器に通過させ、フィルター通過液とした。
【０１６７】
５．微生物の検出
前記得られたフィルター通過液をそれぞれ、室温下で３０００ｇ２０分遠心し、上清除去後、溶解液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、０．２５％ブロメラインＦ（天野エンザイム社製、２０００Ｕ／ｍＬ）］で希釈し、黄色ブドウ球菌を１０×１０6ＣＦＵ／ｍＬになるように調製した。アルカリ−ＳＤＳ法（新生化学実験講座２  核酸Ｉ分離精製（東京化学同人）、Nucleic Acids Res.Vol.7,p1513(1979)）に従って溶菌させ、これを溶菌液とした。
【０１６８】
前記得られた溶菌液に対して下記の方法により黄色ブドウ球菌の核酸検出を行なった。
〈マイクロプレートの調製〉
黄色ブドウ球菌のｒＲＮＡに相補的な配列を有するキャプチャープローブ（下記塩基配列を有する核酸プローブ）を各々ストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレート上に固定し、実験に用いた。
キャプチャープローブの塩基配列（配列番号１）
5'- CGTCTTTCACTTTTGAACCAT GCGGTTCAAAATATTATCCGG -3'-Amino link
【０１６９】
〈各溶液の調製方法〉
（１）第１ハイブリダイゼーション反応溶液の調製
第１ハイブリダイゼーション溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］にアシストプローブを０．０２５ｐｍｏｌ／μＬになるように溶解し、第１ハイブリダイゼーション反応溶液を調製した。なお、前記アシストプローブは、黄色ブドウ球菌のｒＲＮＡに相補的な配列及び後述するＨＣＰ−１と同じ塩基配列を有する核酸プローブであり、下記塩基配列を有する。
アシストプローブの塩基配列（配列番号２）
5'- CATGTCTCGTGTCTTGCATC CTGCTACAGTGAACACCATC GTTCTCGACATAGACCAGTC ATCTATAAGTGACAGCAAGAC -3'
【０１７０】
（２）第２ハイブリダイゼーション反応溶液の調製
第２ハイブリダイゼーション溶液［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）］にＨＣＰ−１及び５'末端がＤＩＧラベルされたＨＣＰ−２を１ｐｍｏｌ／μＬになるように溶解し、第２ハイブリダイゼーション反応溶液を調製した。なお、前記ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２は、パルサー法で用いられる一対の核酸プローブであり、該プローブの複数対を反応させると、プローブが自己集合し、プローブのポリマーが形成される（特許第3310662号等参照。）。前記ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２の塩基配列は下記の通りである。
ＨＣＰ−１の塩基配列（配列番号３）
5'- CATGTCTCGTGTCTTGCATC CTGCTACAGTGAACACCATC GTTCTCGACATAGACCAGTC -3'
ＨＣＰ−２の塩基配列（配列番号４）
DIG-5'- GATGCAAGACACGAGACATG GATGGTGTTCACTGTAGCAG GACTGGTCTATGTCGAGAAC -3'
【０１７１】
〈反応及び検出方法〉
前記マイクロプレートに前記得られた溶菌液を５０μＬ、前記第１ハイブリダイゼーション反応溶液を５０μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールし、１時間反応させた（第１ハイブリダイゼーション）。なお、該反応はWO2005/106031号記載のハイブリダイゼーション方法を用いて、マイクロプレートの上部２０℃、下部４５℃に設定した温度条件下で行った。
反応後、洗浄液[50mM Tris, 0.3M NaCl, 0.01％ Triton X-100, pH 7.6]で洗浄した。
【０１７２】
洗浄後、洗浄液をよくきったマイクロプレートへ第２ハイブリダイゼーション反応溶液を１００μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールした。マイクロプレートの上部２０℃、下部６０℃に設定した条件下で１時間反応させた（第２ハイブリダイゼーション、パルサー反応）。
【０１７３】
マイクロプレートウェルを洗浄後、50mM Tris(pH 7.6)に溶解したPOD標識抗ジゴキシゲニン（60mU/mL)を５０μＬ加え、３７℃のインキュベーターで反応させた。洗浄液で洗浄後、０．２M酢酸緩衝液(pH 5.0)、0.06% TMBと0.04％ Ｈ2O2を含む発色液を５０μＬ加え、暗所で１５分間放置し、６５５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１９に示す。なお菌数は４．６×１０5ＣＦＵ／wellであった。
【０１７４】
（実施例１７）
前記微生物の分離器を用いた微生物の回収工程を行わなかった点以外は実施例１６と同様に実験を行った。結果を図１９に示す。
【０１７５】
図１９に示したように、本発明の均質化処理方法を用いた実施例１６及び１７のいずれにおいても微生物が検出できたが、本発明の微生物の分離器を用いて微生物の回収を行った実施例１６は喀痰からより効率的に微生物が検出されており、フィルターに通過させることにより、喀痰中の反応阻害物質が除去され、反応が十分に進行することがわかった。
【０１７６】
（実施例１８）
０．２５％ブロメラインＦ（天野エンザイム社製）を、溶解液［２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸ナトリウム］に溶解し前処理液とした。２５ｍＬコンテナ容器に、喀痰（性状Ｐ３の膿性痰）、喀痰の１０倍量の前処理液、及びステンレス粒子（直径４．８ｍｍ：２０粒）を加え、室温（２５℃）で反応させた。その際、１０分おきにボルテックス（TM-252 TEST TUBE MIXER、旭テクノグラス社製）で懸濁後、溶解時間を３０分とし、得られた溶液を喀痰の均質化液とした。
【０１７７】
シリンジフィルターホルダーに実験例７で用いた孔径５μｍ、材質ポリカーボネートの第３フィルターを入れ、その上に実験例１０で用いた孔径２０μｍ、材質ナイロンの第２フィルターを入れ、さらにその上に実施例１５で用いた孔径１０８μｍ、材質ナイロンの第１フィルターをそれぞれ入れた。これをシリンジに接続し、前記喀痰の均質化液の一部を通過させて、フィルトレーション後の均質化液とした。
【０１７８】
次に、フィルトレーション前の均質化液、フィルトレーション後の均質化液それぞれについて、フェイバーＧセットＳ（日水製薬（株）製）を用いてグラム染色を行い、顕微鏡で観察した。フィルトレーション前の均質化液の顕微鏡写真を図２０に示す。フィルトレーション後の均質化液の顕微鏡写真を図２１に示す。図２０及び図２１において、（ａ）は倍率１００、（ｂ）は倍率１０００の結果である。
【０１７９】
図２０に示したように、本発明の均質化処理方法により喀痰が短時間で均質化されていることがわかった。なお、図２０中、白血球を矢印で示した。さらに、図２１に示したように、フィルトレーション後の均質化液では、血球細胞及び喀痰の粘性成分が除かれていることがわかった。
【符号の説明】
【０１８０】
２：本発明のサンプリング器具、１０：筒状体、１２：直胴部、１３：閉塞部、１４，１４ａ〜１４ｊ：プレート状ノズル、１５：角部、１６，１６ａ〜１６ｊ：スリット、１７：開口部、１８：鍔部、２０：ガスケット、２２：シール突条、２４：コア部、３０：プランジャ、３２：係着凸部、３４：操作用頭部、４０：本発明のサンプリング器具用補助治具（一例）、４２：外嵌筒部材、４３：開口部、４４：係合片、４５：切欠部、４６：テーパー部、４８：案内溝、５０：内嵌軸部材、５２：係合部、５３：凹欠部、５６：押圧用頭部、５８：操作レバー、６０：本発明のサンプリング器具用補助治具（他例）、６２：外嵌筒部材、６３：開口部、６４：嵌合凸部、６５：切欠凹部、６６：テーパー部、６７：係止凸部、６８：ボタン孔、６９：付勢手段（スプリング）、７０：中嵌筒部材、７２：嵌合凸部、７４：係止手段（ボタン）、７６：スプリング、８０：内嵌軸部材、８２：当接端部、８４：押圧用頭部、９０：重りホルダ、９２：重り、９４：試料容器、１１０：シリンジ、１１２：筒状体、１１４：ノズル、１１６：吸引吐出口、１１７：開口部、１１８：鍔部、１２０：ガスケット、１３０：プランジャ、１３４：操作用頭部、Ｐ：粘性試料、２１０ａ〜２１０ｄ：容器の蓋、２１２ａ〜２１２ｄ：容器、２１４：金属粒子、２１６：容器の底部、２１８：底蓋、３１０ａ，３１０ｂ，３１０ｃ：本発明の微生物の分離器、３１１：第１フィルター、３１２：第２フィルター、３１３：第３フィルター、３１４：分離部材、３１５ａ，３１５ｂ，３１５ｃ：回収容器、３１６ａ，３１６ｂ，３１６ｃ：フィルターホルダー、３１７ａ：フィルターホルダーの本体、３１８ａ，３１８ｂ：蓋体、３２０：被検微生物、３２２：夾雑物、３２４：均質化液、３３０：濾液、３３２：上清、３３４：沈殿物、３４０：シリンジ。
【図１】
2010160156.tif 000022
【図２】
2010160156.tif 000023
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010160156.tif 000029
【図９】
2010160156.tif 000030
【図１０】
2010160156.tif 000031
【図１１】
2010160156.tif 000032
【図１２】
2010160156.tif 000033
【図１３】
2010160156.tif 000034
【図１４】
2010160156.tif 000035
【図１５】
2010160156.tif 000036
【図１６】
2010160156.tif 000037
【図１７】
2010160156.tif 000038
【図１８】
2010160156.tif 000039
【図１９】
2010160156.tif 000040
【図２０】
2010160156.tif 000041
【図２１】
2010160156.tif 000042
【配列表】
2010160156000001.app