(57)【要約】【課題】核酸の検出と反応溶液の温度を制御するための温度測定とを同時に行える遺伝子検査装置を提供する。【解決手段】本発明に係る核酸検出装置は、試料核酸、核酸検出用蛍光物質及び温度測定用蛍光物質を含む反応溶液が供給される反応領域を有する検査用カセットと、前記反応溶液に励起光を照射する光照射手段と、前記励起光が照射された反応溶液に含まれる核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出するための第１の光検出手段と、前記励起光が照射された反応溶液に含まれる温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する第２の光検出手段と、該第２の蛍光から蛍光寿命を測定し、前記反応溶液の温度を算出するための温度演算手段と、該温度演算手段により算出された温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度になるように前記反応溶液の温度を制御するための温度制御手段と、を有することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料核酸、標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質及び温度測定用蛍光物質を含む反応溶液が供給される反応領域を有する検査用カセットと、
前記反応溶液に励起光を照射する光照射手段と、
前記励起光が照射された反応溶液に含まれる核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出するための第１の光検出手段と、
前記励起光が照射された反応溶液に含まれる温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する第２の光検出手段と、
該第２の蛍光から蛍光寿命を測定し、前記反応溶液の温度を算出するための温度演算手段と、
該温度演算手段により算出された温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度になるように前記反応溶液の温度を制御するための温度制御手段と、
を有することを特徴とする核酸検出装置。
【請求項２】
試料核酸及び標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質を含む反応溶液が供給される反応領域を有し、該反応領域に温度測定用蛍光物質が配置されている検査用カセットと、
前記反応溶液を供給した反応領域に励起光を照射するための光照射手段と、
前記励起光が照射された反応溶液に含まれる核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出するための第１の光検出手段と、
前記励起光が照射された反応領域に配置された温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出するための第２の光検出手段と、
該第２の蛍光から蛍光寿命を測定し、前記反応溶液の温度を算出するための温度演算手段と、
該温度演算手段により算出された温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度になるように前記反応溶液の温度を制御する温度制御手段と、
を有することを特徴とする核酸検出装置。
【請求項３】
前記光照射手段は、前記核酸検出用蛍光物質に特有の励起光を照射する第１の光照射手段と、前記温度測定用蛍光物質に特有の励起光を照射する第２の光照射手段とで構成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸検出装置。
【請求項４】
前記第１の光検出手段は前記第１の蛍光を選択的に検出し、前記第２の光検出手段は前記第２の蛍光を選択的に検出することを特徴とする請求項３に記載の核酸検出装置。
【請求項５】
前記検査用カセットを着脱自在に配置し得るホルダーを有する請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸検出装置。
【請求項６】
（１）試料核酸、標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質及び温度測定用蛍光物質を含む反応溶液を、検査用カセットの反応領域に供給する工程と、
（２）前記反応溶液が供給された反応領域に励起光を照射する工程と、
（３）前記励起光が照射された反応溶液の核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出する工程と、
（４）前記励起光が照射された反応溶液の温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する工程と、
（５）前記第２の蛍光の蛍光寿命から前記反応溶液の温度を算出する工程と、
（６）該算出した温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度と一致するように前記反応溶液の温度を調整する工程と、
（７）前記第１の蛍光に基づいて前記試料核酸での標的核酸の有無または量を検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸検出方法。
【請求項７】
（１）試料核酸及び標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質を含む反応液を、核酸検査用のカセットの温度測定用蛍光物質が配置された反応領域に供給する工程と、
（２）前記反応液が供給された反応領域に励起光を照射する工程と、
（３）前記励起光が照射された反応液の核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出する工程と、
（４）前記励起光が照射された反応領域に配置された温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する工程と、
（５）前記第２の蛍光の蛍光寿命から前記反応溶液の温度を算出する工程と、
（６）該算出した温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度と一致するように前記反応溶液の温度を調整する工程と、
（７）前記第１の蛍光に基づいて前記試料核酸での標的核酸の有無または量を検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸検出方法。
【請求項８】
前記第１の励起光、前記第２の励起光、前記第１の蛍光及び前記第２の蛍光のそれぞれの波長は全て重ならず、前記核酸の検出と前記温度の測定を同時に併行して行うことを特徴とする請求項６又は７に記載の遺伝子検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料核酸を含む反応溶液の温度を制御しながら蛍光を利用して標的核酸をで検出する核酸検出装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ増幅法による核酸増幅は生物学の分野では基本的な技術であり、ＰＣＲ増幅中の核酸量をリアルタイムに測定し、それを解析して検体から抽出した標的核酸量を定量化する方法としてリアルタイムＰＣＲ法がある。
【０００３】
従来、リアルタイムＰＣＲ法として、ＰＣＲ反応溶液をウエルの中に入れ、ヒートサイクルを加えて増幅を行いながら核酸量の検出を行う方法が行われてきた。しかし、検査装置の小型化や反応速度向上による検査時間の短縮化等を図るため、特許文献１で開示されているように、検査用カセットなどのマイクロリアクタを用いて核酸を増幅する方法が提案されている。
【０００４】
特許文献１では、マイクロリアクタ中の反応溶液の温度を制御するための温度測定法として、例えばサーミスタ、熱電対又は白金測温体等の温度検出素子を用いる方法が挙げられている。これらの温度検出素子のなかでも、サーミスタを用いる方法が温度制御の厳密性の観点で好ましいとされる。そして、温度検出素子は高価であることから、温度検出素子は温度制御型リアクターの外部表面を通して流路に接するように設置することが好ましいとされる。これにより、リアクター部分を使い捨てにして、熱電変換素子や温度検出素子は再利用することができる。
【０００５】
一方、特許文献２では、微小流路内を流れる液体に光を間欠的に照射し、液体中の蛍光物質を励起させて蛍光を発生させるとともに、その蛍光強度の減衰特性を測定することにより、微小流路中の液体の温度を測定している。
【特許文献１】特開２００３−２９９４８５号公報
【特許文献２】特開２００６−２５８５３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載される、検査用カセットの外壁の温度を測る方法では、内部の微量な反応溶液の温度が正しく測れないという問題があった。
【０００７】
また、特許文献２では、流路中の反応溶液の温度を正確に測定することができるが、核酸の検出と温度測定とを同時に行える装置、方法については記載がない。
【０００８】
したがって、核酸の検出と反応溶液の温度を制御するための温度測定とを同時に行える遺伝子検査装置が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る核酸検出装置は、
試料核酸、標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質及び温度測定用蛍光物質を含む反応溶液が供給される反応領域を有する検査用カセットと、
前記反応溶液に励起光を照射する光照射手段と、
前記励起光が照射された反応溶液に含まれる核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出するための第１の光検出手段と、
前記励起光が照射された反応溶液に含まれる温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する第２の光検出手段と、
該第２の蛍光から蛍光寿命を測定し、前記反応溶液の温度を算出するための温度演算手段と、
該温度演算手段により算出された温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度になるように前記反応溶液の温度を制御するための温度制御手段と、
を有することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明に係る核酸検出装置は、
試料核酸及び標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質を含む反応溶液が供給される反応領域を有し、該反応領域に温度測定用蛍光物質が配置されている検査用カセットと、
前記反応溶液を供給した反応領域に励起光を照射するための光照射手段と、
前記励起光が照射された反応溶液に含まれる核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出するための第１の光検出手段と、
前記励起光が照射された反応領域に配置された温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出するための第２の光検出手段と、
該第２の蛍光から蛍光寿命を測定し、前記反応溶液の温度を算出するための温度演算手段と、
該温度演算手段により算出された温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度になるように前記反応溶液の温度を制御する温度制御手段と、
を有することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る核酸検出方法は、
（１）試料核酸、標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質及び温度測定用蛍光物質を含む反応溶液を、検査用カセットの反応領域に供給する工程と、
（２）前記反応溶液が供給された反応領域に励起光を照射する工程と、
（３）前記励起光が照射された反応溶液の核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出する工程と、
（４）前記励起光が照射された反応溶液の温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する工程と、
（５）前記第２の蛍光の蛍光寿命から前記反応溶液の温度を算出する工程と、
（６）該算出した温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度と一致するように前記反応溶液の温度を調整する工程と、
（７）前記第１の蛍光に基づいて前記試料核酸での標的核酸の有無または量を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る核酸検出方法は、
（１）試料核酸及び標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質を含む反応液を、核酸検査用のカセットの温度測定用蛍光物質が配置された反応領域に供給する工程と、
（２）前記反応液が供給された反応領域に励起光を照射する工程と、
（３）前記励起光が照射された反応液の核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出する工程と、
（４）前記励起光が照射された反応領域に配置された温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する工程と、
（５）前記第２の蛍光の蛍光寿命から前記反応溶液の温度を算出する工程と、
（６）該算出した温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度と一致するように前記反応溶液の温度を調整する工程と、
（７）前記第１の蛍光に基づいて前記試料核酸での標的核酸の有無または量を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば標的核酸の検出と反応溶液の温度を制御するための温度測定とが同時に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に係る核酸検出装置は、
試料核酸、標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質及び温度測定用蛍光物質を含む反応溶液が供給される反応領域を有する検査用カセットと、
前記反応溶液に励起光を照射する光照射手段と、
前記励起光が照射された反応溶液に含まれる核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出するための第１の光検出手段と、
前記励起光が照射された反応溶液に含まれる温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する第２の光検出手段と、
該第２の蛍光から蛍光寿命を測定し、前記反応溶液の温度を算出するための温度演算手段と、
該温度演算手段により算出された温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度になるように前記反応溶液の温度を制御するための温度制御手段と、
を有することを特徴とする。
【００１５】
また、もう一つの本発明に係る核酸検出装置は、
試料核酸及び標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質を含む反応溶液が供給される反応領域を有し、該反応領域に温度測定用蛍光物質が配置されている検査用カセットと、
前記反応溶液を供給した反応領域に励起光を照射するための光照射手段と、
前記励起光が照射された反応溶液に含まれる核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出するための第１の光検出手段と、
前記励起光が照射された反応領域に配置された温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出するための第２の光検出手段と、
該第２の蛍光から蛍光寿命を測定し、前記反応溶液の温度を算出するための温度演算手段と、
該温度演算手段により算出された温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度になるように前記反応溶液の温度を制御する温度制御手段と、
を有することを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る核酸検出装置によれば、反応溶液における核酸検出と温度測定とを同時に行うことができる。
【００１７】
本発明の核酸検出装置は、試料核酸における検出対象としての標的核酸の有無やその量を検出するために利用でき、標的核酸が検査対象としての遺伝子を有するものであれば、試料核酸がどのような遺伝子を有しているかを検出する遺伝子検査装置として利用できる。
【００１８】
以下、検体（試料核酸）の遺伝子検査を行う遺伝子検査装置として理由する場合の構成の概略について図１０を用いて説明する。図１０において、検査用カセット１０１は、反応溶液１０３が流れる流路１０２を有しており、温度制御手段１０４上に設置されている。光照射手段１０５は、流路１０３に励起光Ｘ（又はＸ’）を照射し、核酸検出用蛍光物質又は温度測定用蛍光物質を励起する手段である。核酸検出用蛍光物質は、反応溶液１０３中に含まれており、検査対象としての遺伝子を有する標的核酸を検出するための蛍光標識として働くものである。温度測定用蛍光物質は、反応溶液１０３中に含まれている、又は流路１０２の壁面若しくは壁面近傍に配置されており、その蛍光寿命を測定することで温度測定を可能とするものである。第１の光検出手段は、励起された核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光（Ｙ）を検出する手段であり、第２の光検出手段は、励起された温度検出用蛍光物質から発せられる第２の蛍光（Ｙ’）を検出する手段である。温度演算手段（不図示）は、第２の蛍光（Ｙ’）の蛍光寿命を測定し、温度を算出する手段である。温度制御手段１０４は、流路１０２を流れる反応溶液を所定の温度となるように制御する手段であって、温度演算手段により算出した温度が望む温度と一致するように調整する機能を有する手段である。
【００１９】
また、本発明に係る遺伝子検査装置は、図１１に示すように、２つの光照射手段１０５及び１０５’を有する構成としてもよい。２つの光照射手段を有することで、核酸検出用と温度測定用の励起光とを別々の光照射手段で制御可能とすることができるため好ましい。
【００２０】
本発明に係る遺伝子検査装置の検査は、試料核酸を含む反応溶液を流路に流して所定の温度条件で反応を行う検査に好適に利用できる。特に制限するものではないが、検査としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ＬＣＲ法、ハイブリダイゼーション又はＳＮＰｓ解析等を挙げることができる。
【００２１】
本発明に係る遺伝子検査装置を使用して例えばリアルタイムＰＣＲを行うことにより、より正確な温度条件で核酸増幅を実施することができる。温度測定用蛍光物質と蛍光プローブ等の核酸検出用蛍光物質を反応溶液に加え、本発明に係る遺伝子検査装置を使用してリアルタイムＰＣＲ装置を行うことにより、より正確な温度条件で核酸の増幅を行うことができる。
【００２２】
以下、本発明の好ましい形態について詳細に説明する。
【００２３】
（検査用カセット）
検査用カセットは、反応溶液が流れる流路を有する。また、反応溶液を注入する注入口や、反応溶液が排出される排出口も有する。反応溶液の温度を制御するために、該検査用カセットは温度制御手段に接して配置されることが好ましい。
【００２４】
また、流路の壁面又は壁面近傍に温度測定用蛍光物質を配置させた構成とすることもできる。このような流路を有する検査用カセットを用いることで、反応溶液中に温度測定用蛍光物質を含ませる必要がなくなる。温度測定用蛍光物質は、流路壁面全体に配置してもよく、壁面の一部に配置してもよく、検査方法に応じて適宜配置することができる。また、本発明において壁面又は壁面近傍に配置するという概念は、温度測定用蛍光物質が流路中に露出した状態で配置されている状態も、露出はしていないが壁面近傍に、すなわち壁面直下の壁内に、配置されている状態も含むものである。例えば、流路の一部で反応が行われる場合は、その部分の流路壁面又は壁面近傍にのみ温度測定用蛍光物質を配置する構成とすることができる。
【００２５】
また、本発明における流路は、広義の意味で用いられる。つまり、流路は、反応溶液が流れる領域であるとともに、反応を行う領域でもあり、流路の一部が反応室のような構造となっていてもよい。
【００２６】
また、反応溶液は常に一定の流速で流れている必要はなく、反応に応じて流速を調整することができ、停止させることもできる。
【００２７】
なお、流路や注入口、排出口は、基板中に、フォトリソグラフィや成型などの公知技術を用いることにより形成することができる。基板の材料は、励起光、反応溶液中の核酸検出用蛍光物質若しくは温度検出用蛍光物質、又は流路壁等に配置した温度検出用蛍光物質等から発せられる蛍光を透過できるものであれば特に限定されない。例えば、シリコンウェハ、石英ガラス又はプラスチックなどを用いることができる。
【００２８】
なお、反応溶液の送液は、送液可能な方法であれば任意であり、例えば、インジェクターを備えたマイクロポンプ、シリンジポンプ等が使用できる。送液速度は、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼーション等の各検査に適した送液速度を適宜設定することができる。
【００２９】
なお、流路の形状は、直線状の流路でなくとも、同一平面上で複数回折り曲げた形状とすることもでき、特に限定されるものではない。なお、注入口と排出口とを別に設けなくとも、流路が環状であり、反応溶液を流路内に循環させるタイプの形状としてもよい。流露の幅は特に限定されるものではないが、例えば１〜１，０００μｍとすることができ、１０〜１００μｍとすることが好ましい。
【００３０】
また、検査用カセットは、装置に対して着脱可能に構成されることが好ましい。例えば、検査用カセットを所定位置に着脱自在に配置するホルダーを装置に設置して、ホルダー上に検査用カセットを配置して検出操作を行うことができる。ホルダーを利用する場合は、反応領域の温度を調整するための加熱冷却手段としての機能をホルダーに持たせてもよいし、加熱冷却手段をホルダーと別に設けて、ホルダーへの検査用カセットの設置時に、加熱冷却手段と検査用カセットを接続可能としてもよい。なお、装置に検査用カセットを常設しておく場合は、必要に応じて、カセットの流路を洗浄するための構成を装置に付加することができる。
【００３１】
（反応溶液）
反応溶液は、核酸、標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質及び目的とする反応に応じた試薬を含む溶液である。また、温度測定用蛍光物質を含ませることができるが、温度測定用蛍光物質を流路の壁面又は壁面近傍に配置する構成とした場合は、通常、反応溶液中に温度測定用蛍光物質を添加する必要はない。
【００３２】
標的あるいは試料となる核酸としては、特に限定されるものではないが、その由来としては、例えば人工合成産物、ヒトやマウスなどの動物、植物、細菌、真菌、古細菌、ウイルスなどの微生物等を挙げることができる。例えば、感染症起炎菌由来の核酸についてリアルタイムＰＣＲを行う場合、血液中に存在する細菌の核酸が核酸となる。これらの標的核酸は、その血液の前処理を行い検体とした後、例えばリアルタイムＰＣＲ等の検査に供することができる。なお、感染症起炎菌由来の核酸についてのリアルタイムＰＣＲは、その試料に含まれる核酸のコピー数（初期数）を測定することができるため、発症の有無の判定などに有効である。
【００３３】
反応溶液は流路を流れ、温度制御手段により所定の温度に制御される。例えば、反応としてＰＣＲ反応が行われる場合、試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）などが挙げられ、一例として以下を含む。（１）核酸に特異的に結合するプライマー、（２）核酸に結合したプライマーから標的配列に相補的にＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼ（核酸がＲＮＡの場合はＲＮＡポリメラーゼ）、（３）ＤＮＡ合成に必要な各種ヌクレオチド（ｄＮＴＰなど）、（４）塩化マグネシウムや塩化カリウム等の塩類、（５）トリス等のバッファー。なお、プライマーやｄＮＴＰが蛍光標識されている場合は、それが核酸検出用蛍光物質となる。例えば、インターカレータや蛍光プローブなどが核酸検出用蛍光物質となる。
【００３４】
また、流路には、反応溶液以外にも、反応溶液同士が混ざらないようにするためのバッファ液などを流すことができる。流路には複数の反応溶液を導入することができるが、この場合、各反応溶液の間にバッファ液を充填する。バッファ液としては、例えばＰＣＲ反応溶液の場合、ＰＣＲ反応溶液と比較的混じりにくく、流路に付着したＰＣＲ反応溶液の洗浄を行い、各ＰＣＲ反応溶液間のコンタミを防止することできる溶液が好ましい。例えば、バッファ液としては、シリコンオイルなどを用いることができる。
【００３５】
（光照射手段）
光照射手段は、蛍光物質の励起光を照射する手段であり、流路中の反応溶液に励起光を照射する。また、流路の壁面又は壁面近傍に温度測定用蛍光物質が配置されている場合には、その蛍光物質にも励起光を照射する。
【００３６】
光照射手段としては、高圧水銀ランプとフィルタを組み合わせ特定の波長を取り出すものやＬＥＤなどを用いることが出来るがレーザ光発生装置を用いるのが望ましい。
【００３７】
また、上述のように光照射手段は１つに制限されるものではない。例えば、核酸検出用蛍光物質に特有の励起光を照射する第１の光照射手段と、温度測定用蛍光物質に特有の励起光を照射する第２の光照射手段を有する構成であってもよい。
【００３８】
核酸検出用蛍光物質に特有の励起光を照射する第１の光照射手段としてＧａＮ系半導体を用いた４０５ｎｍ，４４５ｎｍ，４７０ｎｍ，４８８ｎｍの青紫レーザや波長変換素子を用いた５３２ｎｍの緑レーザなどを用いることが出来る。温度測定用蛍光物質に特有の励起光を照射する第２の光照射手段としてＡｌＧａｌｎＰ系半導体を用いた６５０ｎｍの赤色レーザやＡｌＧａＡｓ系半導体を用いた７８０ｎｍ，８０８ｎｍの赤外レーザなどを用いることが出来る。
【００３９】
（光検出手段）
光検出手段としては、蛍光を受光し、その蛍光の強度を電気的信号に変換することができる手段であり、例えばＣＣＤ等を用いることができる。図１０に示すように、第１の光検出手段１０６は、核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光（Ｙ）を検出し、第２の光検出手段１０７は、温度測定用蛍光物質から発せいられる第２の蛍光（Ｙ’）を検出する。
【００４０】
光検出手段の構成としては、例えば、蛍光を検出する受光素子を有する光検出器、所定範囲の蛍光波長の蛍光のみを透過させるフィルター、蛍光を光検出器に導くための集光レンズ等から構成することができる。
【００４１】
本発明に係る遺伝子検査装置を用いた検査において発生する光としては、主に、第１の励起光（Ｘ）、第２の励起光（Ｘ’）、第１の蛍光（Ｙ）及び第２の蛍光（Ｙ’）が考えられる。したがって、光検出手段は、対象とする蛍光のみを検出可能とするフィルタを有することが好ましい。
【００４２】
（温度演算手段）
温度演算手段は、光検出手段により電気的信号とされた蛍光強度から蛍光寿命を測定し、温度を算出する。温度演算手段は、例えば温度測定用蛍光物質の蛍光寿命と温度との検量線のデータを用い、蛍光寿命から温度測定用蛍光物質の温度を算出することができる。
【００４３】
（温度制御手段）
温度制御手段は、反応溶液を所定の温度に制御する手段であって、前記温度演算手段により測定された温度が目的とする温度と一致するように、反応溶液の温度を調整する手段である。
【００４４】
温度制御手段としては、流路中の反応溶液の温度を制御できれば、どのような機構、形状のものでも良い。温度制御手段として、例えば、ヒーターやペルチェ素子等の加熱冷却部を有する装置を用いることができる。また、温度制御手段のうち加熱冷却部は検査用カセットに接して配置されることが好ましい。
【００４５】
例えば、本発明に係る遺伝子検査装置を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行う場合、核酸を含むＰＣＲ反応溶液に温度サイクルを与えることにより核酸増幅を行うことができる。つまり、流路中の反応溶液にディネーチャー、アニール、エクステンションに適した温度、時間で温度サイクルを与えることにより、核酸を増幅することができる。このとき、核酸検出用蛍光物質により１サイクル毎に核酸の増幅量を把握することができ、また温度測定用蛍光物質により正確な温度を把握することができる。
【００４６】
（核酸検出用蛍光物質）
核酸検出用蛍光物質は、反応溶液中に含まれ、核酸の検出を可能とする蛍光物質である。
【００４７】
例えばリアルタイムＰＣＲ法では、蛍光検出方法にはインターカレーターを用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法があるが、このインターカレーターや蛍光標識プローブが核酸検出用蛍光物質に相当する。
【００４８】
インターカレーター法では一般的に蛍光試薬としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用する。インターカレーター（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）は、ＰＣＲ反応によって増幅された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量をモニターできる。また、蛍光標識プローブ法における蛍光プローブとしては、代表的なものに、ＴａｑＭａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ及びサイクリングプローブがある。
【００４９】
（温度測定用蛍光物質）
温度測定用蛍光物質は、その蛍光寿命により温度の測定を可能とする物質である。温度測定用蛍光物質は、上述のように、流路の壁面又は壁面近傍に配置することができる。また、流路の壁面又は壁面近傍に配置されていない場合は、反応溶液中に含まれている必要がある。温度測定用蛍光物質を利用することにより、温度を測定するための機器を直接反応溶液に接触させることなく、反応溶液の温度を測定することができるようになる。
【００５０】
例えば、温度測定用蛍光物質としては、温度により蛍光特性が変化する蛍光物質であれば良く、例えば、Ｎｄ−ＹＡＧやＮｄ．ＹＶＯ4などを用いることができる。
【００５１】
また、核酸検出用蛍光物質と温度測定用蛍光物質との蛍光波長及び励起光波長は重ならないように、それぞれの蛍光物質を選択することが好ましい。蛍光波長及び励起光波長の両方において重なる部分があると、核酸検出と温度測定を同時に行えなくなってしまうためである。特に限定するものではないが、核酸検出用蛍光物質が発する蛍光の波長が長い温度測定用蛍光物質を選択することが好ましい。
【００５２】
以上の記載より、本発明は、以下の遺伝子検査方法も提供するものであることが理解できる。
【００５３】
（１）試料核酸、標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質及び温度測定用蛍光物質を含む反応溶液を、検査用カセットの反応領域に供給する工程と、
（２）前記反応溶液が供給された反応領域に励起光を照射する工程と、
（３）前記励起光が照射された反応溶液の核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出する工程と、
（４）前記励起光が照射された反応溶液の温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する工程と、
（５）前記第２の蛍光の蛍光寿命から前記反応溶液の温度を算出する工程と、
（６）該算出した温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度と一致するように前記反応溶液の温度を調整する工程と、
（７）前記第１の蛍光に基づいて前記試料核酸での標的核酸の有無または量を検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸検出方法。
【００５４】
（１）試料核酸及び標的核酸を検出するための核酸検出用蛍光物質を含む反応液を、核酸検査用のカセットの温度測定用蛍光物質が配置された反応領域に供給する工程と、
（２）前記反応液が供給された反応領域に励起光を照射する工程と、
（３）前記励起光が照射された反応液の核酸検出用蛍光物質から発せられる第１の蛍光を検出する工程と、
（４）前記励起光が照射された反応領域に配置された温度測定用蛍光物質から発せられる第２の蛍光を検出する工程と、
（５）前記第２の蛍光の蛍光寿命から前記反応溶液の温度を算出する工程と、
（６）該算出した温度が、前記標的核酸の検出のための反応に必要とされる予め設定された温度と一致するように前記反応溶液の温度を調整する工程と、
（７）前記第１の蛍光に基づいて前記試料核酸での標的核酸の有無または量を検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸検出方法。
【００５５】
上記の核酸検出方法は、標的核酸が検査対象としての遺伝子を有するものであれば、試料核酸がどのような遺伝子を有しているかを検出する遺伝子検査方法として好適に利用できる。
【００５６】
（実施形態１）
【００５７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施形態に制限されるものではない。
【００５８】
図１は、本発明に係る遺伝子検査装置の構成を説明する図である。本実施形態の遺伝子検査装置により、例えばＰＣＲ反応による核酸増幅やＳＮＰｓの解析等を行うことができる。以下では、例として、本実施形態の遺伝子検査装置を用いてＰＣＲ反応により核酸を増幅する場合について説明する。
【００５９】
図１において、１が示す部分は測定対象の検体から抽出した核酸を含む反応溶液の注入口がある。２は反応溶液を流す流路が形成された検査用カセットである。３は検査用カセットの流路中の反応溶液を所定の温度に加熱又は冷却するペルチェ素子などの加熱冷却手段である（加熱冷却手段は上述の加熱冷却部に相当する）。４は加熱冷却手段３の反対側に発生する熱を空気中に放熱するヒートシンクである。５は注入した反応溶液を流路中を移動させるためのポンプである。６は蛍光標識（核酸検出用蛍光物質）を励起する第１の励起光を照射する第１の励起光源である。励起光源としては、例えばＬＥＤやレーザなどを使用することができる。７は、第１の励起光源６から出た第１の励起光をカセット２の増幅領域に照射させるための照明光学系である。８は、第１の励起光により励起された増幅領域の蛍光標識から出た蛍光を集光する第１の検出光学系である。９は、励起光などの光を阻止して蛍光標識からの第１の蛍光のみを透過させる第１のフィルタである。１０は、蛍光標識からの蛍光を受光して電気信号に変換するＣＣＤなどの第１の受光素子である。１１は、温度測定用蛍光物質を励起する第二の励起光を発生する第２の励起光源である。１２は、励起された温度測定用蛍光物質から発せられる蛍光を集光する第２の検出光学系である。１３は、励起光などの光を阻止して温度測定用蛍光物質からの第２の蛍光のみを透過させる第２のフィルタである。１４は、温度測定用蛍光物質からの蛍光を受光して電気信号に変換するフォトダイオードなどの第２の受光素子である。１５は、第１の受光素子１０からの画像信号を取り込むためのＡ／Ｄ変換器である。１６は、取り込んだ画像を一時的に記憶しておく画像メモリである。１７は、画像メモリ１６中の画像データの数値化などの演算を行う演算手段である。１８は、処理のためのデータを蓄積しておく蓄積メモリである。１９は、第１の励起光源６の点灯、消灯を制御する第１の発光制御部である。２０は、ポンプ５の動作を制御するポンプ制御部である。２１は、加熱冷却手段３の駆動部である。２２は、蛍光が減衰する時間を測る計測手段である。２３は、第２の励起光源１１の点灯、消灯を制御する第２の発光制御部である。
【００６０】
加熱冷却手段３は、検査用カセット２を着脱可能に固定する。また、検査用カセット２に形成された流路への励起光の照射位置を自在に制御することができるようにする構成とすることができる。例えば、検査用カセットを装着する検査装置のホルダーはＸ−Ｙステージにより位置が微調整できる構成とすることができ、これにより検査領域を自在に移動させることが出来る
【００６１】
次に、図１に示した実施形態の遺伝子検査装置の動作説明を行う。
【００６２】
検査を行う血液などの検体から抽出した試料核酸を含む反応溶液を検査用カセット２の注入口１から流路に注入する。ポンプ５が動作して吸引口１が負圧になることにより、反応溶液は検査用カセット２に形成された流路の中を移動し、増幅領域に達する。増幅領域では加熱冷却手段３によって図２に示すような温度サイクルが反応溶液に加えられ、ＰＣＲ法により核酸の増幅が行われる。
【００６３】
核酸量の測定は、１回の温度サイクルごとに行われることが好ましい。第１の発光制御部１９からの信号で第１の励起光源６が励起光を発し、流路中の増幅領域が励起照射される。増幅された核酸の蛍光標識から発生した蛍光を検出光学系Ａ８で集光し、フィルタＡ９で励起光を阻止し、必要な蛍光のみを受光素子Ａ１０で検出する。検出された蛍光は電気信号に変換され、Ａ／Ｄ変換器１５でデジタル化され画像データとして画像メモリ１６に保存される。演算手段１７は、画像メモリ１６に保存された画像を処理して蛍光量を求め、その蛍光値を蓄積メモリ１８に保存する。反応溶液は数十回の温度サイクル、例えば４０回の温度サイクルが加えられ４０回蛍光量の測定が行われ、４０回分の蛍光量の測定値が蓄積メモリ１８に保存される。演算手段１７は、例えば、それらの蛍光値から検体の初期核酸量を算出することができる。例えば、図３で示すように増幅又は検出を行いたい配列を有する核酸の初期量が多いと温度サイクルの回数が少ないうちに蛍光量が増加し始め、初期量が少ないと温度サイクルの回数が多くならないと蛍光量が増加し始めない。
【００６４】
また、効率的な核酸増幅のために、反応溶液に与える温度サイクルの各温度が反応に適した所定の温度となるように、加熱冷却手段３を制御する必要がある。そこで、本発明に係る遺伝子検査装置は、上述のように核酸の検出を行うと同時に、反応溶液に含まれる温度測定用蛍光物質が発する蛍光の減衰特性、つまり蛍光寿命を測定することで、反応溶液の温度を測定する。そして、把握した反応溶液の温度が所定の温度サイクルの各温度に一致するように加熱冷却手段３を制御する。
【００６５】
以下、本実施形態の構成での温度制御についてより具体的に説明する。第２の発光制御部２３より第２の励起光源１１を図４に示すように間欠的に点灯させ、第２の励起光を照射する。第２の励起光は検査用カセット２の増幅領域にある反応溶液中の温度検出用蛍光物質を励起する。励起した温度検出用蛍光物質は第２の蛍光を発する。該第２の蛍光は、第２の検出光学系１２により集光され、さらに第２の蛍光のみを透過させる第２のフィルタ１３を透過した後、第２の受光素子１４で電気信号に変換される。また、第２の蛍光強度は、計測部２２を用いて経時的に測定され、第２の蛍光の蛍光寿命が把握される。
【００６６】
ここで、温度測定用蛍光物質が発する蛍光の強度（蛍光強度）は、図５に示すように、第２の励起光が無くなってから時間と共に減衰していく。この減衰特性は蛍光物質の温度に応じて変化する。したがって、あらかじめ温度に対応した温度測定用蛍光物質の蛍光寿命を測定し、図６に示すような検量線を作成しておくことで、測定した第２の蛍光の蛍光寿命から反応溶液の温度を算出することができる。
【００６７】
演算手段１７はあらかじめ設定された温度と測定した温度が一致するよう駆動部２１に指示を与え、駆動部２１により加熱冷却手段３を制御する。
【００６８】
核酸検出用蛍光物質としては、例えば従来のリアルタイムＰＣＲ法では、ＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ（商標、以下ＳＹＢＥＲ  Ｇとも略す）のようなインターカレータ方式の蛍光標識が用いられてきた。この蛍光標識の励起光と蛍光は図７のような関係であり、図７に示すような遮断周波数を持つローパスフィルタを第１の受光素子の前に配置することで、励起光や第２の蛍光が第１の受光素子に到達することを阻止することができる。
【００６９】
また、本発明では核酸検出と温度測定を光学的に行うため、図８に示すように、温度測定用蛍光物質の励起光波長と蛍光波長が、核酸検出用蛍光物質の蛍光波長より長くなるように構成することが好ましい。そのため、温度測定用蛍光物質としては、核酸検出用蛍光物質の蛍光波長より長い波長の励起光で励起でき、かつＰＣＲ増幅を阻害しない物質を用いることが好ましい。図８は、温度測定用蛍光物質としてＮｄ−ＹＡＧ、核酸検出用蛍光物質としてＳＹＢＥＲ  Ｇを用いた場合における励起光と蛍光の関係について示している。例えば、Ｎｄ−ＹＡＧの励起波長は８０８ｎｍであり、その蛍光波長は１０６４ｎｍとなる。したがって、ＳＹＢＥＲ  Ｇの励起波長・蛍光波長と、Ｎｄ−ＹＡＧの励起波長・蛍光波長とが重なることがなく、所定のフィルタを用いることで一方の蛍光のみを受光素子で検出することが可能である。つまり、所定の波長を有する蛍光を選択的に検出することができる。例えば、温度測定用の励起光の波長を阻止するように、例えば図８に示すフィルタＡのような蛍光波長を透過させるバンドパスフィルタを核酸検出用受光素子の前に配置することができる。
【００７０】
なお、核酸検出用蛍光物質はＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉに限定するものではなく、例えばＣｙ３（商標）なども用いることができる。
【００７１】
また、温度測定用蛍光物質もＮｄ−ＹＡＧに限定されるものではなく、例えばＮｄ．ＹＶＯ4などを用いることもできる。温度測定用蛍光物質の励起光波長は、核酸検出用蛍光物質の蛍光波長より長くなるように構成することが好ましい。
【００７２】
また、本実施形態のように、光照射手段を２つ有し、かつ、第１の励起光、第２の励起光、第１の蛍光及び第２の蛍光のそれぞれの波長が重ならない構成とすることがとくに好ましい。そうすることで核酸検出と温度測定を同時に併行して行うことができるためである。
【００７３】
また、本実施形態では温度測定用蛍光物質の粉末を反応溶液に混合する方法について説明したが、温度測定用蛍光物質は反応溶液の反応領域に相当する部分の流路の壁面又は壁面近傍に配置しても良い。
【００７４】
なお、リアルタイムＰＣＲ法について簡単に概要を説明する。ＰＣＲ法では、１サイクルごとに標的核酸が指数関数的に増幅し、やがてプラトーに達する。本実施形態において、核酸検出用蛍光物質からの蛍光値は増幅産物量を示すことになる。そして、温度サイクルごとに蛍光量、つまり核酸の増幅量をモニタリングすることによりグラフに表すことができる。初発のＤＮＡ量（初期数）が多いほど、増幅産物量は早く検出可能な量に達し、増幅曲線が早いサイクルで立ち上がる。したがって、段階希釈したスタンダードサンプル等を用いてリアルタイムＰＣＲを行うと、初発ＤＮＡが多い順番から並んだ増幅曲線が得られる。サンプルは既に初期数がわかっているサンプルと比較することで初期鋳型量を知ることができ、検体中の核酸を定量することができる。
【００７５】
（その他の検査方法の例）
上述のように、本発明の検査対象としては、リアルタイムＰＣＲ法を用いたものに限られず、核酸を含む反応溶液を流路に流して所定の温度条件で反応を行う検査が対象となる。例えば、ＳＮＰｓの解析を行う方法として、核酸の２本鎖が乖離する温度（メルティング温度）を測定する方法がある。遺伝子検査装置は本実施形態に示した構成のものを使用でき、核酸と核酸検出用蛍光物質を含む反応溶液を流路に注入する。反応溶液はポンプ５により流路中を移動し、メルティング検査領域に達する。加熱冷却手段３によって反応溶液の温度を図９に示すようにゆっくり変化させると、温度の上昇により核酸の２本鎖が乖離する。核酸の２本鎖が乖離すると、核酸検出用蛍光物質が発光しなくなる。この乖離する温度と蛍光量の変化によりＳＮＰｓの解析を行うことができる。この検査の場合も核酸検出用蛍光物質からの蛍光量の測定と反応溶液の温度測定とを同時に行う必要があり、本発明が有効である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施形態１に係る遺伝子検査装置の構成を示す概略図である。
【図２】ＰＣＲ反応における温度サイクルと核酸量の測定ポイントの例を示す図である。
【図３】蛍光量の測定値から検体の初期核酸量を算出する方法を説明する図である。
【図４】蛍光寿命を説明する図である。
【図５】蛍光の減衰特性の温度による変化を説明する図である。
【図６】蛍光寿命と温度の関係を説明する図である。
【図７】従来の核酸量測定法における光検出に用いられるフィルタの説明図である。
【図８】実施形態１における励起光及び蛍光の波長を説明する図である。
【図９】ＳＮＰｓの解析法の概要を表す図である。
【図１０】本発明に係る遺伝子検査装置の構成例を表す概略図である。
【図１１】本発明に係る遺伝子検査装置の構成例を表す概略図である。
【符号の説明】
【００７７】
１、注入口
２、検査用カセット
３、加熱冷却手段
４、ヒートシンク
５、ポンプ
６、第１の励起光源
７、照明光学系
８、第１の検出光学系
９、第１のフィルタ
１０、第１の受光素子
１１、第２の励起光源
１２、第２の検出光学系
１３、第２のフィルタ
１４、第２の受光素子
１５、Ａ／Ｄ変換器
１６、画像メモリ
１７、演算手段
１８、蓄積メモリ
１９、第１の発光制御部
２０、ポンプ制御部
２１、駆動部
２２、計測部
２３、第２の発光制御部
１０１、検査用カセット
１０２、流路
１０３、反応溶液
１０４、温度制御手段
１０５、光照射手段（第１の光照射手段）
１０５’、第２の光照射手段
１０６、第１の光検出手段
１０７、第２の光検出手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2010081898.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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