(57)【要約】【課題】電気化学的な方法にてレドックス複合抗体の濃度を測定する際、被検試料中の抗体および共存している他のたんぱく質成分が順次電極に付着し、本来電極に接近できるはずの抗体が電極に接近できず電流値が低下してしまうという課題があった。【解決手段】抗体または抗体フラグメントとレドックス種をリンカーにより接合した複合体を含む被検試料を導入する工程１（Ｓ１０１）と、前記工程１の後に前記リンカーを開裂させる工程２（Ｓ１０２）と、前記工程２の後にたんぱく質を吸着する工程３（Ｓ１０３）と、前記工程３の後に前記工程２により開裂された前記レドックス種の濃度を電気化学的手法により測定する工程４（Ｓ１０４）とを備える抗体濃度測定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体または抗体フラグメントとレドックス種をリンカーにより接合した複合体を含む被検試料を導入する工程１と、
前記工程１の後に前記リンカーを開裂させる工程２と、
前記工程２の後にたんぱく質を吸着する工程３と、
前記工程３の後に前記工程２により開裂された前記レドックス種の濃度を電気化学的手法により測定する工程４と
を備えることを特徴とする抗体濃度測定方法。
【請求項２】
前記工程２が、プロテアーゼによる開裂であることを特徴とする請求項１記載の抗体濃度測定方法。
【請求項３】
前記接合が、前記抗体または抗体フラグメントのアミノ基と前記リンカーのカルボキシル基とで行うアミドカップリングによる接合であり、前記工程３が陰イオン交換膜による吸着であることを特徴とする請求項１記載の抗体濃度測定方法。
【請求項４】
前記工程３が、ニトロセルロースあるいはポリスチレンから構成され、水分子および前記レドックス種を透過する間隙を有する材料による吸着であることを特徴とする請求項１記載の抗体濃度測定方法。
【請求項５】
前記レドックス種がフェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体のいずれかであり、
前記測定が、くし型電極による電気化学的手法であることを特徴とする請求項１記載の抗体濃度測定方法。
【請求項６】
抗体または抗体フラグメントとレドックス種をリンカーにより接続した複合体を含む被検試料を導入する被検試料導入部と
前記リンカーを開裂させる開裂試薬を担持した開裂試薬担持部と、
前記開裂試薬担持部より下流側に位置し、たんぱく質を吸着する吸着部と、
前記開裂試薬担持部より下流側に位置し、前記開裂試薬により開裂されたレドックス種の濃度を電気化学的に測定する測定部と、
前記測定部より下流に位置し前記被検試料導入部と前記開裂試薬担持部と前記吸着部と前記測定部と連通している排気口と
を備えることを特徴とするバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中の抗体濃度を計測する方法、およびそれを用いたバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の濃度を測定する方法としては、電気化学的な方法として特許文献１に開示の技術がある。この方法では、レドックス活性高分子で化学修飾された抗体を用いて抗原−抗体反応の電流値を電気化学的に測定し、この測定値より抗原量を定量する。抗原−抗体反応の進行に必要な時間保持後、Ｇ電極の電位をレドックス活性基が酸化する電位、Ｃ電極の電位をこれをもとに還元する電位とし、Ｇ電極に流れる電流量を計測する。このときの電流値は、抗原−抗体反応によって生成した免疫複合体の濃度および拡散係数に比例するため、抗原量の直接の定量が可能となる。
【特許文献１】特開平９−２５７７９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら上記方法を一般の被検試料に適用しようとすると被検試料中の抗体および共存している他のたんぱく質成分が順次電極に付着し、本来電極に接近できるはずの化学修飾抗体が電極に接近できず電流値が低下してしまうという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記従来の問題点を解決するために本発明の抗体濃度測定方法は、
抗体とレドックス種を接続した複合体を含む被検試料を導入する工程１と、
前記工程１の後に前記接続を開裂させる工程２と、
前記工程２の後にたんぱく質を吸着する工程３と、
前記工程３の後に前記工程２により開裂された前記レドックス種の濃度を電気化学的手法により測定する工程４と、を備えることを特徴とする。
【０００５】
このようにすることによって、電気化学的手法により測定する前にたんぱく質を除去でき、電極近傍にたんぱく質を接近させなくできる。
【０００６】
また、たんぱく質を吸着する工程では同時に抗体が吸着されることになるが、それより前に抗体とレドックス種を開裂させることでレドックス種を分離でき、電極によってたんぱく質の妨害を受けずにレドックス種の酸化還元反応に伴う電流を検出することができる。
【０００７】
また、本発明の抗体濃度測定方法は、前記工程２が、プロテアーゼによる開裂であることを特徴とする。
【０００８】
このようにすることによって、リンカーを開裂することができる。なお、プロテアーゼの種類として代表的なものはペプチド結合加水分解酵素（国際生化学・分子生物学連合命名ＥＣ番号におけるＥＣ．３番台）があり、一例をあげるとセリンプロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２１番台）がある。セリンプロテアーゼにより切断される部位は主鎖のカルボニル基であることから、カルボニル基が少なくともレドックス種と抗体の間に存在するよう、抗原ーレドックス種複合体を合成するとよい。セリンプロテアーゼの種類としては、［ＥＣ．３．４．２１．１］ キモトリプシン ［ＥＣ．３.４．２１．２］ キモトリプシンＣ ［ＥＣ．３．４．.２１．３］ メトリジン ［ＥＣ．３．４．２１．４．］ トリプシン ［ＥＣ．３．４．２１．５］ トロンビン［ＥＣ．３．４．２１．７］ プラスミン ［ＥＣ．３.４．２１．９］ エンテロペプチターゼ ［ＥＣ．３．４．２１．１０］ アクロシン ［ＥＣ．３．４．２１．１２］ α溶解エンドペプチターゼ ［ＥＣ．３．４．２１．１９］ グルタミルペプチターゼ ［ＥＣ．３．４．２１.２０］ カテプシンＧなどがある。
【０００９】
また、本発明の抗体濃度測定方法は、前記接合が、前記抗体または抗体フラグメントのアミノ基と前記リンカーのカルボキシル基とで行うアミドカップリングによる接合であり、前記工程３が陰イオン交換膜による吸着であることを特徴とする。
【００１０】
このようにすることによって、開裂した際に発生する抗体側のアミノ基をもとに吸着し、レドックス種は吸着されないことになる。
【００１１】
また、本発明の抗体濃度測定方法は、前記工程３が、ニトロセルロースあるいはポリスチレンから構成され、水分子および前記レドックス種を透過する間隙を有する材料による吸着であることを特徴とする。
【００１２】
このようにすることで、被検試料中に存在するたんぱく質および工程２にて開裂された抗体分子を吸着することができる。なお、工程２にて開裂されたレドックス種はポリスチレンおよび陰イオン交換膜と相互作用しないため、吸着することはない。
【００１３】
また、本発明の抗体濃度測定方法は、前記レドックス種がフェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体のいずれかであることを特徴とする。
【００１４】
このようにすることによって、電極に印加した電位を制御することにより酸化還元反応を起こすことができ、電流値として濃度を測定できる。特にＧ電極の電位をレドックス活性基が酸化する電位、Ｃ電極の電位をこれをもとに還元する電位とし、Ｇ電極に流れる電流量を計測するとレドックスサイクルによる電流増幅効果を得ることができ、見かけ上さらに大きな電流を得ることができてより好ましい。
【００１５】
また、前記抗体フラグメントは、Fabフラグメント、Fcフラグメント、scFvフラグメントなどで規定でき、抗体から派生するさまざまな形態に広く適用することができる。
【００１６】
また、本発明のバイオセンサは、抗体とレドックス種をリンカーにより接続した複合体を含む被検試料を導入する被検試料導入部と
前記リンカーを開裂させる開裂試薬を担持した開裂試薬担持部と、
前記開裂試薬担持部より下流側に位置し、たんぱく質を吸着する吸着部と、
前記開裂試薬担持部より下流側に位置し、前記開裂試薬により開裂されたレドックス種の濃度を電気化学的に測定する測定部と、
前記測定部より下流に位置し前記被検試料導入部と前記開裂試薬担持部と前記吸着部と前記測定部と連通している排気口と
を備えることを特徴とする。
【００１７】
このようにすることによって、被検試料のたんぱく質や抗体の電極付着の影響を受けることなく抗体の濃度に比例した電流値を測定できるバイオセンサを得ることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の計測方法およびバイオセンサによれば、抗体やたんぱく質の付着による電流低下を防止でき、大きな電流値を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について図を参照しながら説明する。
【００２０】
（実施の形態１）
図１は本発明の測定方法での処理フローを示した図である。
【００２１】
まず、被検試料として、抗体とレドックス種をリンカーにより接続した複合体を含むものを準備する。これは、たとえばフェロセンカルボン酸とＩｇＧをアミドカップリングにより接合したものがある。この被検試料をあらかじめリンカーを開裂させる試薬とたんぱく質を吸着する層を備えた電気化学的に測定するための電極を備えたデバイスに導入する（Ｓ１０１）。次に、プロテアーゼによりこの被検試料内の抗体とレドックス種を開裂させ（Ｓ１０２）、その後たんぱく質を吸着させる（Ｓ１０３）。この後に開裂されたレドックス種を測定する（Ｓ１０４）。たんぱく質を吸着する工程では同時に抗体が吸着されることになるが、それより前に抗体とレドックス種を開裂させることでレドックス種を分離でき、電極によってたんぱく質の妨害を受けずにレドックス種の酸化還元反応に伴う電流を検出することができる。
【００２２】
またレドックス活性基については特にその種類に限定はなく、たとえばフェノチアジン、フェロセンなど可逆的に酸化反応する物質がよい。抗体への化学修飾については、抗体タンパク質のアミノ酸残基中のアミノ基との間がアミド結合により修飾される。
【００２３】
図２は本発明の測定方法を搭載したバイオセンサを示したものである。
【００２４】
バイオセンサ２００は、開裂層２０２、吸着層２０３、測定部２０４をこの順番に基板２１３上の同一面に備え、開裂層２０２、吸着層２０３、測定部２０４の横面を塞ぎそのほかの部分を空けることで被検試料を導入する。導入部２０１および排気口２０５はカバー２０６をかぶせた空間の開口部で得られ、開裂層２０２側が導入部２０１、測定部２０４側が排気口２０５である。空間部の寸法は適宜設定すれば良いが、たとえば、２０ｍｍ×０．５ｍｍの開口部になっている。
【００２５】
まず、導入部２０１にフェロセンカルボン酸を修飾したＩｇＧを含む被検試料がセンサ先端の導入部２０１に接触させるだけの簡易操作で容易に毛細管現象によって開裂層２０２、吸着層２０３、測定部２０４へ導入される。バイオセンサ２００は導入部２０１より下流側に開裂層２０２を備える。開裂層２０２はセリンプロテアーゼを固定化した金属ビーズである。吸引された被検試料が開裂層２０２に到達すると、フェロセンカルボン酸を接合しているアミド結合がセリンプロテアーゼにより開裂され、抗体とレドックス種に分解される。
【００２６】
なお、プロテアーゼの種類として代表的なものはセリンプロテアーゼがあり、そのプロテアーゼにより切断される部位をあらかじめリンカーに入れ込んでおけばよい。セリンプロテアーゼの種類としては、［ＥＣ．３．４．２１．１］ キモトリプシン ［ＥＣ．３.４．２１．２］ キモトリプシンＣ ［ＥＣ．３．４.２１．３］ メトリジン ［ＥＣ．３．４．２１．４．］ トリプシン ［ＥＣ．３．４．２１．５］ トロンビン［ＥＣ．３．４．２１．７］ プラスミン ［ＥＣ．３.４．２１．９］ エンテロペプチターゼ ［ＥＣ．３．４．２１．１０］ アクロシン ［ＥＣ．３．４．２１．１２］ α溶解エンドペプチターゼ ［ＥＣ．３．４．２１．１９］ グルタミルペプチターゼ ［ＥＣ．３．４．２１.２０］ カテプシンＧなどがある。
【００２７】
バイオセンサ２００は、開裂層２０２より下流側に吸着層２０３を備える。
【００２８】
吸着層２０３のひとつの例としては、陰イオン交換膜がある。上記のようにアミドカップリングされることでレドックス種が抗体に結合している場合、開裂した際に抗体側がアミノ基になる。陰イオン交換膜にはマイナスに電荷を帯びた分子は吸着せず、プラスに電荷を帯びた分子は吸着しやすくなる。すなわち、上記の開裂後の抗体は吸着され、レドックス種は吸着されないことになる。
【００２９】
また、吸着層２０３の別の例としては、ポリスチレン微粒樹脂、ニトロセルロース不識布、ガラスビーズ、金属微粒子などを担持したろ過層である。このようにすることで、抗体が吸着層２０３に吸着し、レドックス種は吸着しない。なお、ここで具備するろ過層としては、テフロン（登録商標）、ポリプロピレンなど、たんぱく質を吸着しない素材でなければよい。なお、吸着層２０３は少なくとも水分子とレドックス種を透過する間隙を有していなければいけない。
【００３０】
その後、レドックス種はさらに下流に移動し、測定部２０４により電気化学的にレドックス種の測定を行う。測定部２０４は３本の電極から構成され、電極は、例えば長手方向の長さを１ｍｍとし短手方向の長さを１μｍ、厚さが数ｎｍの短冊形の金電極を電極同士のギャップを１μｍとして１０００対並べた２つのくし型電極２０７，２０８として作製し、排気口２０５側よりリード線２０９，２１０により外部からそれぞれ異なる電位を印加できるようになっている。また、これとは別に参照電極２１１として金電極を作製し、リード線２１２により電位を印加できるようにする。参照電極の被検試料との接触面にはＡｇ／ＡｇＣｌを塗布し、参照電極とする。なお、図２ではリード線２０９，２１０，２１２は被検試料によって汚染されないよう、基板２１３を貫通して基板２１３の裏面へ配線している。
【００３１】
くし型電極の一方の対２０７には参照電極２１１の電位を基準電位として＋０．５Ｖを、もう一方の対２０８にはー０．２Ｖを印加しておく。これらの電位は、フェロセンカルボン酸の酸化電位（約０．３７Ｖ：対Ａｇ／ＡｇＣｌ）および還元電位（約０．３０Ｖ：対Ａｇ／ＡｇＣｌ）を内包する電位の範囲であればこれに限らない。このように両電極に電位を印加することで、開裂層２０２で開裂され測定部２０４に到達したフェロセンカルボン酸分子が、隣接するくし型電極２０７，２０８間でレドックスサイクルを起こし、大きな電流値を得ることができる。なお、ここでのフェロセンカルボン酸の代替として、レドックス種であればよく、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等でもよい。
このようにして、レドックス種の濃度に伴う電流値を測定することで抗体の濃度を知ることができる。また、あらかじめ抗体を吸着して除去することで、抗体の電極に付着することを防止し、十分な電流強度を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明に係る測定方法は、検体試料中の抗体分子とたんぱく質をあらかじめ除去してレドックス種のみ電気化学的手法により測定できることから、電流低下を引き起こすことなく抗体濃度を定量できる方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の実施の形態１に係る測定方法の処理フローを示す図
【図２】同処理フローを実現するバイオセンサの構成図
【符号の説明】
【００３４】
２００  バイオセンサ
２０１  導入部
２０２  開裂層
２０３  吸着層
２０４  電測定部
２０５  排気口
２０６  カバー
２０７  くし型電極
２０８  くし型電極
２０９  リード線
２１０  リード線
２１１  参照電極
２１２  リード線
【図１】
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【図２】
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