(57)【要約】【課題】  簡単な光学構成のものでありながら、十分に高い感度を得ることができ、しかも、微少なサンプル量で蛍光測定を行うことのできる蛍光分光光度計を提供すること。【解決手段】  この蛍光分光光度計は、励起光の照射により蛍光光を生ずる試料液が収容される上方に開口する凹所を有する測定セルと、検出すべき蛍光光の波長範囲と少なくとも一部が一致する波長範囲の励起光を、凹所内の試料液に対して上方側から照射する光源と、測定セルの、光源による光照射面に対して垂直な方向より蛍光光を検出する光ファイバと、当該光ファイバを介して測定セルと接続された分光器とを具えてなり、前記測定セルは、光源からの光および蛍光光を透過する材料よりなり、凹所の底面が光源からの励起光を散乱反射させる機能を有しており、光源からの励起光の散乱反射光の一部を蛍光光と共に検出する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光が照射されることにより蛍光光を生ずる試料液が収容される上方に開口する凹所を有する測定セルと、検出すべき蛍光光の波長範囲と少なくとも一部が一致する波長範囲の励起光を、凹所内の試料液に対して上方側から照射する光源と、測定セルの、光源による光照射面に対して垂直な方向より蛍光光を検出する光ファイバと、当該光ファイバを介して測定セルと接続された分光器とを具えてなり、
前記測定セルは、光源からの光および蛍光光を透過する材料よりなり、凹所の底面が光源からの励起光を散乱反射させる機能を有しており、
光源からの励起光の散乱反射光の一部を蛍光光と共に検出することを特徴とする蛍光分光光度計。
【請求項２】
互いに異なる波長範囲の光を照射する複数の光源を具えてなることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光光度計。
【請求項３】
光源は、その照射光が測定セルの上面の法線に対して４０度以下の入射角で入射されるよう、配置されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光分光光度計。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、バイオ分野における核酸や蛋白質の濃度の定量、特異性の選別等に用いられる蛍光分光光度計に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料に関する定性、定量分析を行なう方法の一として、蛍光検出法が知られており、蛍光検出法は、例えば吸光検出法などに比して、非常に感度が高く、かつ、選択性に優れており、低濃度測定や、多種類のＤＮＡの中の特定のＤＮＡの選別等が可能であることから、例えばバイオ分野における、核酸や蛋白質の濃度、特異性の選別等に好適に利用されている。
そして、蛍光検出法による、試料に関する定性、定量分析を行なう蛍光分光光度計として、これまでに種々の構成のものが提案されている（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
図６は、従来における蛍光分光光度計の一例における構成の概略を示すブロック図である。
この蛍光分光光度計は、試料液を収容する測定セル４２と、例えば高圧キセノン放電灯（ランプ）や高圧水銀放電灯（ランプ）等よりなる光源４０と、光源４０からの励起光を分光する励起側分光手段４１と、励起光の照射により試料液から生ずる蛍光光を分光する蛍光側分光手段４５と、蛍光光の強度が最大となる励起光波長および蛍光波長を検出するスペクトル分析器４６とを具えてなる。励起側分光手段４１としては、例えばプリズム、回折格子分光器、フィルタ等が用いられる。
【０００４】
蛍光側分光手段４５は、図２を参照して説明すると、試料から得られた蛍光光が、入口スリット（２１）とコリメートミラー（２２）を介して回折格子（２３）に入射され、この回折格子（２３）によって回折（分光）された光が、フォーカスミラー（２４）を介して光センサによって受光される構成とされている。光センサとしては、例えば冷却型リニアイメージセンサ、光電子増倍管（ホトマル）などの超高感度のものが用いられており、励起光と蛍光光とを分離し、励起光等が光センサに受光されないよう構成されている。
【０００５】
而して、このような構成の蛍光分光光度計による蛍光検出においては、例えば、試料液について検出された（最大）励起光波長を含む励起光を標準液（その蛍光物質を含まない溶媒液）に照射することにより得られるスペクトル（励起光スペクトル）から、試料液についての蛍光スペクトルを減算することにより、蛍光光以外の光による影響を補償することが行われている（差スペクトル測定）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２８６５６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
而して、例えば化学分析用などに使用される蛍光分光光度計とは異なり、例えばバイオ分野における、核酸や蛋白質の濃度、特異性の選別等の分析に使用されるものにおいては、核酸や蛋白質を蛍光色素によって染色して標識化させるための蛍光試薬として使用されるもの（種類）は、限定されており、これらの蛍光試薬についての、励起光波長、蛍光光波長、蛍光の強さを求めるモル吸光係数等の特性は、いずれも、すでに明確になっている。
従って、バイオ分野において用いられる蛍光分光光度計においては、上記蛍光分光光度計のように、励起光波長および蛍光波長を検出する機能を有するものである必要はなく、また、モル吸光係数が比較的高いものが蛍光試薬として用いられるため、高感度である光センサや、強烈な光を出す光源を具えたものである必要はないものと考えられる。
【０００８】
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、簡単な光学構成のものでありながら、十分に高い感度を得ることができ、しかも、微少なサンプル量で蛍光測定を行うことのできる蛍光分光光度計を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の蛍光分光光度計は、励起光が照射されることにより蛍光光を生ずる試料液が収容される上方に開口する凹所を有する測定セルと、検出すべき蛍光光の波長範囲と少なくとも一部が一致する波長範囲の励起光を、凹所内の試料液に対して上方側から照射する光源と、測定セルの、光源による光照射面に対して垂直な方向より蛍光光を検出する光ファイバと、当該光ファイバを介して測定セルと接続された分光器とを具えてなり、
前記測定セルは、光源からの光および蛍光光を透過する材料よりなり、凹所の底面が光源からの励起光を散乱反射させる機能を有しており、
光源からの励起光の散乱反射光の一部を蛍光光と共に検出することを特徴とする。
【００１０】
本発明の蛍光分光光度計においては、互いに異なる波長範囲の光を照射する複数の光源を具えた構成とされていることが好ましい。
【００１１】
また、本発明の蛍光分光光度計においては、光源は、その照射光が測定セルの上面の法線に対して４０度以下の入射角で入射されるよう、配置された構成とされていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の蛍光分光光度計によれば、光源からの励起光の散乱反射光の一部を蛍光光と共に検出する構成とされていることにより、光源からの励起光の散乱反射光の一部を検出すべき蛍光光のバイアス光として利用することができるので、蛍光光についての微小な信号を確実に検出することができて十分な感度を得ることができ、しかも、蛍光光以外の光を敢えて検出するという構成上、例えば高感度の光センサや幅広い波長範囲にわたって強い光を発する光源を用いる必要がなくなるので、光学構成の簡素化を図ることができる。
また、光源からの励起光の照射により生ずる蛍光光に係る信号を確実に検出することができるので、例えば１μｌ程度の微少量の試料液で、所期の蛍光検出を行うことができる。
【００１３】
さらにまた、互いに異なる波長範囲の光を照射する複数の光源を具えた構成とされていることにより、使用される蛍光試薬の種類に応じた波長範囲の光をバイアス光として利用することができ、上記効果を一層確実に得ることができる。
【００１４】
さらにまた、光源が、その照射光が測定セルの上面の法線に対して４０度以下の入射角で入射されるよう、配置された構成とされていることにより、光源からの光が直接的に光ファイバによって受光されることを確実に防止することができ、所期の蛍光検出を確実に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の蛍光分光光度計の一例における構成の概略を示す斜視図である。
【図２】図１に示す蛍光分光光度計を構成する分光器の構成の概略を示す説明図である。
【図３】測定セルにおける凹所に対する光源の配置例を示す説明図である。
【図４】光源からの光の散乱反射状態を示す概念図である。
【図５】図１に示す蛍光分光光度計による蛍光検出方法を説明するための蛍光スペクトルである。
【図６】従来における蛍光分光光度計の一例における構成の概略を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１は、本発明の蛍光分光光度計の一例における構成の概略を示す斜視図、図２は、図１に示す蛍光分光光度計を構成する分光器の構成の概略を示す説明図、図３は、測定セルにおける凹所に対する光源の配置例を示す説明図である。
この蛍光分光光度計は、例えばバイオ分野における核酸や蛋白質の濃度の定量、特異性の選別等に用いられるものであって、試料液が収容される測定セル１０と、互いに異なる波長範囲の光を照射する複数例えば２つの光源１５，１６と、例えば光ファイバ１８などの導光部材を介して測定セル１０と接続された分光器２０とを具えている。
【００１７】
測定セル１０は、所定の波長範囲の光（検出すべき蛍光光および光源からの励起光）を透過する材料（当該波長範囲の光に対して透明な材料）よりなり、例えば試料液が収容される、上方に開口する凹所１１が上面に形成された例えば直方体形状とされている。
また、測定セル１０には、凹所を開閉するカバー（図示せず）が設けられており、このカバーにより、外光の侵入が防止されると共に試料液の蒸発が防止される。
【００１８】
凹所１１は、光ファイバ１８の受光面と対向する光検出面１２およびこれに対向する壁面が垂直面であって、光検出面１２に垂直な互いに対向する壁面の各々が傾斜面とされた、台形状の断面形状を有する。
凹所１１の構成例を示すと、光検出面１２に沿った方向における開口縁部の寸法（長さ）が３ｍｍ以下、光検出面１２に垂直な方向における開口縁部の寸法（幅）が１ｍｍ以下、深さが０．４ｍｍ以下であり、容量が１μｌ（マイクロリットル）以下である。
【００１９】
第１の光源１５および第２の光源１６は、凹所１１の上方における、凹所１１の長手方向に並んだ位置において、測定セル１０の上面の法線に対して４０度以下の入射角α１，α２で光が照射されるよう配置されている。第１の光源１５からの光の入射角α１および第２の光源１６からの光の入射角α２の大きさが４０度以下であることにより、第１の光源１５および第２の光源１６からの光が直接的に光ファイバ１８に入射することを確実に防止することができる。ここに、第１の光源１５からの光の入射角α１および第２の光源１６からの光の入射角α２の大きさは、互いに同じであっても、異なっていてもよい。
【００２０】
第１の光源１５は、例えば３６５ｎｍ付近にピーク波長を有する紫外線発光ダイオードにより構成することができ、第２の光源１６は、例えば４３０〜６５０ｎｍの波長範囲の光を照射する白色ダイオードにより構成することができる。
【００２１】
測定セル１０と分光器２０とを接続する光ファイバ１８は、一端部がその受光面が測定セル１０の、第１の光源１５および第２の光源１６による光照射面に垂直な面方向より測定光が検出されるよう測定セル１０の側面に接続されると共に他端部が分光器２０に接続されている。
【００２２】
分光器２０は、第１の光源１５および第２の光源１６による光照射によって試料液から得られる測定光が、入口スリット２１とコリメートミラー２２を介して回折格子（グレーティング）２３に入射され、この回折格子２３によって回折（分光）された光が、フォーカスミラー２４を介して光センサ２５によって受光される構成とされている。
光センサ２５としては、例えば、暗時出力電圧が５〔ｍＶ〕以下である、ＣＣＤリニアセンサなどの、例えば冷却型リニアイメージセンサや光電子増倍管（ホトマル）などに比して感度の低いもの（冷却型リニアイメージセンサや光電子増倍管（ホトマル）であれば、例えば０．１ｆｍｏｌ／μｌまでの低濃度測定が可能であるのに対して、１０ｆｍｏｌ／μｌ程度までの濃度測定が可能であるもの）が用いられている。
【００２３】
上述したように、蛍光分光光度計による蛍光検出においては、例えば、試料液に対して励起光を照射することにより得られる蛍光スペクトルと、標準液（蛍光物質を含まない溶媒液）について励起光を照射することにより得られる励起光スペクトルとを検出し、励起光スペクトルから蛍光スペクトルを減算することにより検出すべき蛍光光以外の光による影響が補償された蛍光スペクトル（以下、「補償蛍光スペクトル」という。）を取得し、これにより得られた補償蛍光スペクトルに基づいて、下記式（１）によって、例えば検出対象物の濃度（モル濃度）を算出することができる。
【００２４】
【数１】
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【００２５】
而して、蛍光光強度は励起光強度に比して微小であることから、蛍光光を確実に検出するためには、通常、高い感度を有する光センサを用いると共に、蛍光光を励起光と分離して励起光が光センサに受光されないよう構成することが必要である。例えば蛍光試薬のモル吸光係数εが１０5 〔Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）〕、検出対象物のモル濃度ｃが１０×１０-15 〔ｍｏｌ／μｌ〕、量子収率φが０．５であるとすると、上記式（１）より、蛍光光強度Ｆと励起光強度Ｉとの比Ｆ／Ｉは１／１０００であることが分かる。
【００２６】
然るに、上記蛍光分光光度計においては、比較的に感度の低い光センサ２５が用いられると共に、試料から得られる蛍光光にバイアス光を加えた測定光を光センサ２５に受光させることにより、蛍光光についての微小な信号を確実に検出できるよう構成されている。例えば暗時出力電圧ＶMDK が２ｍＶである光センサ２５を用いた場合には、蛍光光についての信号を検出するためには、例えば露光量１．３×１０-5〔ｌｘ・ｓ〕以上の光を光センサ２５に入射させることが必要とされる。
すなわち、上記蛍光分光光度計においては、測定セル１０における凹所１１の底面１３が、第１の光源１５および第２の光源１６からの光を散乱反射させる機能を有しており、図４に示すように、第１の光源１５および第２の光源１６からの光の散乱反射光の一部が試料から発せられる蛍光光と共に光ファイバ１８に入射（導入）される。
【００２７】
測定セル１０における凹所１１の底面の構成について具体的に説明すると、例えば、底面に、表面を荒らした金属板が設けられており、これにより、光源１５，１６からの励起光および検出すべき蛍光光を含む所定の波長範囲の光が散乱反射される。
【００２８】
従って、例えばバイオ分野において使用される蛍光試薬についての蛍光光波長は、例えば４３０ｎｍより長い波長であるものが多いので、上記蛍光分光光度計による蛍光検出においては、第２の光源１６を構成する白色ダイオードからの光が検出すべき蛍光光のバイアス光として利用される。なお、第２の光源１６からの光の波長より短い励起光波長を有する蛍光試薬については、第１の光源１５からの光が励起光として利用される。
このようにして得られる、試料液についての、蛍光光および第２の光源１６からの光の散乱反射光の一部を含む測定光の蛍光スペクトル、および、標準液についての励起光スペクトルは、例えば図５に示すように、試料液についての蛍光スペクトル（図５における波形（イ））は、標準液についての励起光スペクトル（図５における波形（ロ））に対して、蛍光試薬についての既知の励起光波長（吸収光）λｅにおいて光強度が小さくなると共に、蛍光光波長λｆにおいて光強度が大きくなる波形となり、従って、励起光スペクトルから蛍光スペクトルを減算することにより、補償蛍光スペクトル（図５における波形（ハ））が取得される。この補償蛍光スペクトルは、蛍光光波長λｆにおいてピーク強度Ｉｆを有している。なお、励起光スペクトルおよび蛍光スペクトルにおいて、励起光波長λｅ付近、蛍光光波長λｆ付近以外の波長範囲の光の光強度は、実質的に同等の大きさとなる。
【００２９】
以上のように、上記構成の蛍光分光光度計によれば、第１の光源１５および第２の光源１６からの光の散乱反射光の一部を蛍光光と共に検出する構成とされていることにより、第１の光源１５および第２の光源１６からの光の散乱反射光の一部が検出すべき蛍光光のバイアス光として利用されるので、蛍光光についての微小な信号を確実に検出することができて、例えば１０×１０-15 ｍｏｌ／μｌ程度の低濃度の測定を行うことのできる十分な感度（吸光度法の１００倍程度）を得ることができる。
しかも、蛍光光以外の光を敢えて検出する構成上、例えば、冷却型リニアイメージセンサや光電子増倍管（ホトマル）などの超高感度の光センサや、紫外、可視から赤外の広い波長範囲にわたって強い連続したスペクトルを発する光源を用いることが不要となり、光学構成の簡素化を図ることができると共に、所期の蛍光分光光度計をコスト的にも有利に作製することができる。
また、光源からの励起光の照射により生ずる蛍光光についての信号を確実に検出することができるので、例えば１μｌ程度の微少量の試料液で、所期の蛍光検出を行うことができる。
【００３０】
さらにまた、互いに異なる波長範囲の光を照射する第１の光源１５および第２の光源１６を具えた構成とされていることにより、使用される蛍光試薬の種類に応じた波長範囲の光をバイアス光として利用することができ、上記効果を一層確実に得ることができる。
【００３１】
以下、本発明の効果を実証するために行った実験例を示す。
図１および図３に示す構成に従って、本発明に係る蛍光分光光度計を作製した。測定セルの構成および光学構成は次に示すとおりである。
〔測定セル（１０）〕
材質：石英ガラス、凹所の開口縁部の長さが３ｍｍ、凹所の開口縁部の幅が１ｍｍ、凹所の深さが０．３ｍｍ、容量が０．８μｌ（マイクロリットル）、凹所の底面に、表面を荒らしたステンレス板を埋設した構成、
〔第１の光源（１５）〕
３６５ｎｍにピーク波長を有する紫外線発光ダイオード、測定セルに対する入射角（α１）が３０度、
〔第２の光源（１６）〕
４３０〜６５０ｎｍの波長範囲の光を照射する白色発光ダイオード、測定セルに対する入射角（α２）が３０度、
〔分光器（２０）〕
暗時出力電圧ＶMDK が２ｍＶであるＣＣＤリニアセンサ「ＴＣＤ１３０４ＡＰ」（東芝製）を具えたもの、
【００３２】
既知濃度（１０×１０-15 〔ｍｏｌ／μｌ〕）の蛍光試薬（「ＦＩＴＣ」（シグマ社製），励起光波長４９４ｎｍ、蛍光光波長５１８ｎｍ、モル吸光係数８７０００〔Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）〕）を含む試料液１μｌ（マイクロリットル）を用い、検出対象物の濃度測定を行ったところ、得られた測定濃度が１０．０５×１０-15 〔ｍｏｌ／μｌ〕であり、５％程度の誤差で測定を行うことができ、低濃度の測定に対しても、十分に高い感度が得られることが確認された。
【００３３】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、種々の変更を加えることができる。
例えば、光源は複数である必要はないが、検出すべき蛍光光のバイアス光として利用可能な、使用される蛍光試薬の種類に応じた波長範囲の光を確実に得るためには、複数の光源を具えていることが好ましく、この場合において、光源の組み合わせ（例えば上記実施例における紫外線発光ダイオードと白色発光ダイオード）は特に限定されるものではない。
【符号の説明】
【００３４】
１０  測定セル
１１  凹所
１２  光検出面
１３  底面
１５  第１の光源
１６  第２の光源
１８  光ファイバ
２０  分光器
２１  入口スリット
２２  コリメートミラー
２３  回折格子（グレーティング）
２４  フォーカスミラー
２５  光センサ
４０  光源
４１  励起側分光手段
４２  測定セル
４５  蛍光側分光手段
４６  スペクトル分析器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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