(57)【要約】      （修正有）【課題】目的の核酸配列の増幅のための組成物および方法を提供する。【解決手段】標的配列を含む核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含み、核酸の複製が、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換され、標的配列からの複製された鎖の形成が、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利であることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅する方法であって、標的配列を含む核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含み、核酸の複製が、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換され、標的配列からの複製された鎖の形成が、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利であることを特徴とする方法。
【請求項２】
高温が、核酸ポリメラーゼが添加剤の非存在下で実質的にテンプレート依存性重合を行うことができない温度であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
高温が摂氏３０度より高い温度であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
高温が摂氏３２度より高い温度であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項５】
高温が摂氏３５度より高い温度であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項６】
高温が摂氏３７度より高い温度であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項７】
熱不安定性核酸ポリメラーゼがファイ２９ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
熱不安定性核酸ポリメラーゼがファイ２９ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素、または組み合わせであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項９】
プライマーの組が少なくとも２種類のプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
プライマーの組が少なくとも１０種類のプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
プライマーの組が少なくとも５０種類のプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
プライマーの組が２００種類より多いプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
プライマーの組が１０２３種類より多いプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
プライマーの組に含まれるプライマーがそれぞれ長さ６ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
プライマーの組に含まれるプライマーがそれぞれ長さ８ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
プライマーの組に含まれるプライマーがそれぞれ８ヌクレオチドより長いことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
プライマーの組に含まれるプライマーのうち２種類以上が異なる長さであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
添加剤が糖または糖の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
添加剤がトレハロース、グルコース、スクロース、または組み合わせを含むことを特徴とする請求項１８の方法。
【請求項２０】
添加剤が糖、シャペロン、タンパク質、または組み合わせを含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項の方法。
【請求項２１】
鎖置換複製が前記添加剤の存在下で行われることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか一項の方法。
【請求項２２】
添加剤がトレハロースを含むことを特徴とする請求項２１の方法。
【請求項２３】
核酸、核酸ポリメラーゼ、添加剤、およびプライマーの組のインキュベートがデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下であることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
標的配列から複製された鎖の非標的配列から複製された鎖に対する比率が、核酸が同一の核酸ポリメラーゼおよびプライマーの組の存在下でおよび高温以外は同一の条件下でインキュベートされる場合、標的配列から複製された鎖の非標的配列から複製された鎖に対する比率より小さいことを特徴とする請求項１〜２３のいずれか一項の方法。
【請求項２５】
高温が、添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で核酸ポリメラーゼがそれ以上の温度で明らかに不活性化される温度であることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか一項の方法。
【請求項２６】
高温が、添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で核酸ポリメラーゼがそれ以上の温度で相当に不活性化される温度であることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
高温が、添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で核酸ポリメラーゼがそれ以上の温度で顕著に不活性化される温度であることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか一項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の発明は一般に核酸増幅の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の指数的増幅のためにいくつかの方法が開発されている。これらはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己維持的配列複製（３ＳＲ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および増幅Ｑβ−レプリカーゼを用いた増幅を含む（ビルケンマイエル（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ）およびムシャワール（Ｍｕｓｈａｈｗａｒ），Ｊ．ＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｃｌｓ，３５： １１７−１２６ （１９９１）；ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ），Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：１９９−２０２ （１９９３））。
【０００３】
大部分の遺伝子分析に必須であるのが、適当な質および量のゲノムＤＮＡが利用可能であることである。ヒト試料からのＤＮＡ収率はしばしば限られているため、ゲノムＤＮＡを増幅および保存するための一般的方法に多くの努力が費やされてきている。方法は、ＥＢＶ形質転換細胞株の作製またはランダムまたは縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによる全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を含む。全ゲノムＰＣＲは、ＰＣＲ増幅の変法であり、ある生物のゲノム全体を同一のＰＣＲ反応中に増幅するために、ランダムまたは部分的にランダムなプライマーの使用を含む。この技術は、プライマーの対がゲノムＤＮＡ全体にわたって適度の間隔でハイブリダイズするように、十分な数のランダムまたは部分的にランダムな配列のプライマーを有することを基礎とする。プライマーで開始された複製は、別のプライマーがハイブリダイズすることができる、複製された鎖の重なり部位を結果として生じる。ゲノム試料を複数の増幅サイクルに供することによって、ゲノム配列が増幅される。全ゲノムＰＣＲは他の形式のＰＣＲと同じ不利な点を有する。しかし、ＷＧＡ法は高コストまたは不十分なカバー率および不十分な平均ＤＮＡサイズが難点である（テレニウス（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ）他，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３：７１８−７２５（１９９２）；チュン（Ｃｈｅｕｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９３：１４６７６−１４６７９（１９９６）；チャン（Ｚｈａｎｇ）他，ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９：５８４７−５８５１（１９９２））。
【０００４】
増幅が関係するもう一つの分野は、ＲＮＡ発現プロファイリングであって、その目的は生物学的試料中のＲＮＡの多数の異なる分子種の相対濃度を決定することである。目的のＲＮＡの一部は相対的に低い濃度で存在し、および分析前にそれらを増幅することが望ましい。それらを増幅するのにポリメラーゼ連鎖反応を使用することは不可能であって、それはｍＲＮＡ混合物が複雑で典型的には５，０００から２０，０００の異なる分子種から成るためである。ポリメラーゼ連鎖反応は、異なる分子種が異なる速度で増幅され、ｍＲＮＡの相対濃度を歪めるという欠点を有する。
【０００５】
試料中のすべてのＲＮＡの適度な増幅を同時に可能にするある種の手順が記載されている。たとえば、ロックハート（Ｌｏｃｋｈａｒｔ）他，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６７５−１６８０（１９９６）では、強力なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが各ｃＤＮＡの末端に組み込まれるような方法で、二本鎖ｃＤＮＡが合成された。このプロモーター配列は次いでｃＤＮＡを転写するのに用いられ、約１００から１５０のＲＮＡコピーを各ｃＤＮＡ分子について生じた。この弱い増幅系は、最低１００，０００個の細胞を含んだ生物学的試料のＲＮＡプロファイリングを可能にした。しかし、非常に少数の細胞を含む試料のプロファイリング分析を可能にする、より強力な増幅法の必要性がある。
【０００６】
鎖置換を含む、核酸増幅の別の形式が、リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）への米国特許第６，１２４，１２０号明細書に記載されている。その方法の一つの形式では、標的配列に隣接するヌクレオチド配列の対の鎖に相補的な２組のプライマーが用いられる。増幅は、各プライマーで開始されおよび標的核酸配列を通じて継続する複製によって進行し、成長する鎖が出会って、以前に複製された鎖を置換する。本方法の別の形式では、ゲノム核酸の試料にランダムなプライマーを使用するために、プライマーのランダムな組が用いられる。その組に含まれるプライマーは、合計でおよびランダムに、試料中の核酸の全体にわたって分布する核酸配列に相補的である。増幅は、各プライマーで開始されておよび、成長する鎖が出会って、隣接する複製された鎖を置換するように継続する複製によって進行する。本方法の別の形式では、連結されたＤＮＡが、ランダムな組のプライマーまたは連結されたＤＮＡ間のリンカー配列と相補的なプライマーのどちらかを用いた鎖置換合成によって増幅される。合成はリンカーから進行し、連結されたＤＮＡの部分を通って次のリンカーまで、およびその向こうへ続き、成長する鎖が出会って、以前に複製された鎖を置換する。
【０００７】
ゲノムＤＮＡまたは環状化された細菌またはプラスミドＤＮＡのＭＤＡは、ランダムプライマーを用いて、そのＤＮＡポリメラーゼに最適な温度にて実施することができる。一般的に、これは、３０〜３４℃といったより低い温度範囲にある。増幅するＤＮＡは、たとえば、標的配列、テンプレート、特異的テンプレート、インプットＤＮＡ、テンプレートＤＮＡ、および特異的インプットＤＮＡと呼ぶことができる。ＭＤＡの目的は、このインプットＤＮＡを増幅することである。しかし、ＤＮＡポリメラーゼはまた、これらのＭＤＡ反応中に望ましくないアーティファクト（人為的結果）を生じうる。ＤＮＡポリメラーゼおよびランダムプライマーによって、そのＤＮＡポリメラーゼ活性に最適な温度にて生じたそのようなアーティファクトはまた、ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）（例として複数プライマーを用いるＲＣＡ、等温総転写物増幅（ＩＴＴＡ）で環状ＤＮＡおよび環状化されたｃＤＮＡの複数プライマーを用いるＲＣＡ、およびランダム六量体および配列特異的プライマーを用いる環状化されたｄｓＤＮＡの複数プライマーを用いるＲＣＡがある）といった他の増幅技術でも観察される。アーティファクトＤＮＡの決定的特徴は、それがインプットＤＮＡの特異的配列を表さないことである。実際、アーティファクトＤＮＡはインプットＤＮＡの全くの非存在下で生じうる（対照反応の場合のように）。産物ＤＮＡが合成されないという見込みでインプットＤＮＡを欠く対照反応がしばしば実施されるため、このことは厄介である。したがって、アーティファクト合成を減少または消失させることは好都合である。アーティファクトＤＮＡは一般的に高分子量であり、およびしたがって、目的の特異的な増幅されたＤＮＡからは大きさに基づいてはしばしば識別不能である。特異的インプットＤＮＡが存在する場合は、アーティファクトＤＮＡ産物が生じる可能性があり、およびその特異的ＤＮＡ産物の目的用途に干渉する可能性があり、および、ここでもアーティファクト産生の低減または消失は有益となる。
【０００８】
プライマー二量体と呼ばれる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中に生じた低分子量アーティファクトとは対照的に、ＭＤＡアーティファクトは数百塩基対から２０ｋｂより大までの範囲に渡る長さを有する高分子量である。同様の高分子量アーティファクトはまたＥＲＣＡ（ＰＣＴ／ＡＵ９９／０１１１０（ハフナー（Ｈａｆｎｅｒ）））といった他の等温増幅系についても記載されている。ＤＮＡポリメラーゼ調製物中の夾雑する核酸が、これらのアーティファクトの発生のための望ましくないテンプレートの可能な起源の一つである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
目的の核酸配列の増幅のための組成物および方法が開示される。本方法はプライマーによる核酸配列の鎖置換複製を基礎とする。本開示の方法は、ゲノム核酸試料および他の高度に複雑な核酸試料を増幅するために有用な、複数置換増幅（ＭＤＡ）の一形式である。本開示の方法は、１または限られた数のプライマーだけを用いてそのような高度に複雑な核酸試料を増幅するのに用いることができる。１または少数のプライマーが、全ゲノムおよび他の高度な配列複雑性を有する核酸試料を効果的に増幅することができることが見出されている。そのプライマーは、プライマー中に発現されるプライマー配列の限られた量にもかかわらず、高度に複雑な核酸試料中に存在する幅広い範囲の配列のプライマーとなりおよび効率的に増幅することができるように特別に選択または設計されている。本開示の方法は一般的に、特異的核酸配列を有する１、少数、またはより多くのプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および、核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含む。核酸分子の複製の結果として、複製された鎖が複製中にもう一つの複製された鎖の鎖置換複製によって核酸分子から置換されるように、複製された鎖を生じる。複製は結果として核酸試料中の核酸分子のすべてまたは相当な部分の増幅を生じうる。全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）の一形式である、本開示の方法の一形式では、１、少数、またはより多くのプライマーを用いて、ゲノム核酸の試料（または別の高度に複雑な核酸の試料）のプライマーとする。
【００１０】
高度に複雑な核酸試料を、特異的核酸配列を有する１または少数のプライマーだけを用いて効率的に増幅することができることが見出された。その１または少数のプライマーは、試料中の核酸分子全体にわたって分布する核酸配列と相補的である。たとえば、単一の６塩基プライマーは平均して４０９６ヌクレオチド毎に１個の配列と相補的になり、および２種類の６塩基プライマーは合計で、平均して２０４８ヌクレオチド毎に１回の配列と相補的になる。プライマー結合部位のそのような分布は、効率的な複数置換増幅を可能にするのに十分であったことが見出された。また、プライマー結合部位のそのような分布は、核酸試料中の配列の広いカバー率を有する核酸試料の増幅、および高い配列および遺伝子座発現量および低い増幅偏りを有する増幅産物を結果として生じることも見出された。したがって、本開示の方法は、核酸試料中の核酸分子のすべてまたは相当な部分の複製を結果として生じうる。
【００１１】
本開示の方法において増幅は、高度に連続的なポリメラーゼを用いた、各プライマーで開始しおよび自発終止まで連続する複製によって進行する。本方法の重要な特徴は、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長する際、ポリメラーゼが、他のプライマーの伸長の結果生じた複製産物（すなわちＤＮＡ鎖）を置換することである。ポリメラーゼは連続的に新しいプライマーを伸長し、および以前のプライマー結合現象の複製産物を置換する。このようにして、試料（たとえば、ゲノム全体）中のすべての核酸分子および配列の複数の重なり合うコピーを短時間に合成することができる。本方法は、ずっと少ないプライマーを用いることができるという点で、先行する増幅法より有利である。さらに、プライマーは任意の核酸試料に対して特異的な配列を有する必要がない。むしろ、同じ１種類または複数のプライマーを用いて、未知の配列を有する核酸試料を増幅することができる。たとえば、ここに開示される通りの単一プライマーを用いて、任意の起源に由来する任意の全ゲノム、コスミドライブラリ全体、人工染色体、などを、すべて試料中に存在する配列を全く知る必要なく、効率的に増幅することができる。
【００１２】
本開示の方法は、高度に複雑な核酸試料中のさまざまな配列を正確におよび均一に増幅することができる。この結果は、たとえば配列発現量、遺伝子座発現量および増幅偏りを基準として定量化することができる。たとえば、本開示の方法で生じた増幅された核酸分子は、少なくとも１０個の異なる標的配列について少なくとも５０％の配列発現量を有しうる。増幅偏りは少なくとも１０個の異なる標的配列について１０％未満でありうる。
【００１３】
本方法は、等温条件下で実施することができるため、ポリメラーゼ連鎖反応よりも有利である。全ゲノム鎖置換増幅の他の利点は、全ゲノムＰＣＲよりも高いレベルの増幅（最大５倍高い）、増幅がＰＣＲよりも配列依存性が低い、およびＰＣＲで起こりうるような再アニーリング・アーティファクトまたは遺伝子シャッフリング・アーティファクトが無い（変性および再アニーリングのサイクルが無いため）ことを含む。
【００１４】
ＷＧＳＤＡの一部の有用な実施形態では、核酸試料は変性条件に供されず、プライマーは六量体プライマーでありおよびプライマーがヌクレアーゼ耐性となるように修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであるか、またはこれらの特性の任意の組み合わせである。ゲノムは、微生物ゲノム、ウイルスゲノム、真核ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、脊椎動物ゲノム、哺乳類ゲノム、またはヒトゲノムといった任意の種類のゲノムであることができる。
【００１５】
本開示の方法の一実施形態では、核酸試料は変性条件に供されない。核酸分子、たとえばゲノムＤＮＡは、効率的な複数置換増幅のために変性する必要はない。変性段階および変性条件の消去は、増幅産物中の配列偏りを低減するといった別の利点を有する。
【００１６】
別の一実施形態では、プライマーは、たとえば、少なくとも長さ８塩基、少なくとも長さ７塩基、少なくとも長さ６塩基、長さ５塩基、長さ４塩基、少なくとも長さ３塩基、または少なくとも長さ２塩基であることができる。そのような短いプライマーはなお、効率的に複数鎖置換複製のプライマーとなることができる。そのような短いプライマーは作製がより容易およびより安価である。そのプライマーは任意の配列を有することができ、または特定の配列を有することができる。たとえば、６ヌクレオチドプライマーといった、より短いプライマーは、核酸試料中に十分に短い間隔で、効率的および均一な増幅を可能にする相補鎖を有する。本開示の方法における使用のためのより長いプライマーは一般的に、核酸試料全体にわたって間隔を置いて存在する特異的配列と相補的である配列を有することが有益である。たとえば、プライマーは、マイクロサテライト配列、ミニサテライト配列、サテライト配列、トランスポゾン配列、リボソームＲＮＡ配列、短い核散在配列（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｌｅｍｅｎｔ （ＳＩＮＥ））、または長い核散在配列（ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＬＩＮＥ）といった反復配列；プロモーター配列、エンハンサー配列、サイレンサー配列、上流調節配列、転写終止部位配列、トランスポゾン調節配列、リボソームＲＮＡ調節配列、またはポリアデニル化部位配列といった機能共通配列中の配列と相補的でありうる。より短いプライマーもまたそのような反復配列を含みうる。プライマー中に反復配列を用いる場合、より多くのプライマーを反応に用いて、核酸試料中のプライマー相補配列の分布を改善することができる。特に、反復配列の一部または全部が核酸試料の核酸中で不均一な分布を有する場合は、異なる反復配列に相補的な複数のプライマーを用いることができる。
【００１７】
別の一実施形態では、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるように、プライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。別の一実施形態では、修飾ヌクレオチドを含まない同一配列のプライマーと比較してそのプライマーの融点が変化するように、プライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。これらの最後の２つの実施形態のためには、プライマーは修飾ＲＮＡであることが好ましい。別の一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、または別の適当なＤＮＡポリメラーゼであることができる。φ２９ＤＮＡポリメラーゼはより多くの増幅を複数置換増幅で生じる。上記の特性のうち２つ以上の組み合わせもまた、複数置換増幅において改善された結果を生じる。好ましい一実施形態では、たとえば、核酸試料は変性条件に供されず、プライマーは６塩基プライマーでありおよびプライマーがヌクレアーゼ耐性となるように修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。上記の特性は全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）において特に有用である。
【００１８】
より高い効率および信頼性での目的の核酸配列の増幅のための組成物および方法もまた開示される。本開示の方法は、ＤＮＡアーティファクトの生成が低減または消失している複数置換増幅（ＭＤＡ）といった等温増幅技術に関する。一般的に、これは反応を高温にて実施することによって達成することができる。本方法の特に有用な実施形態では、糖および／または他の添加剤を用いてポリメラーゼを高温にて安定化することができる。
【００１９】
等温増幅手順における高分子量アーティファクトの生成は、反応をより高い温度にて、および随意的に、一種類以上の添加剤の存在下で実施することによって、なお目的のインプットＤＮＡの増幅を可能にする一方で相当に低減または消失させることができることが見出されている。たとえば、増幅反応は、糖の存在下で、使用するＤＮＡポリメラーゼについての通常の最適温度よりも高い温度にて実施することができる。等温増幅反応は、より高い温度にて、および随意的に、一種類以上の添加剤の存在下で実施した場合、低い増幅偏りといった高品質の増幅産物を生じることができることもまた見出されている。
【００２０】
本開示の方法は、ＰＣＲにおいてプライマー二量体アーティファクトの生成を消去するために設計された技術とは根本的に異なる。ＰＣＲの場合には、伸長またはプライマーアニーリング温度の上昇が、特異的インプットＤＮＡテンプレートのプライマー結合と比較して少ないプライマー二量体を生じる。対照的に、本開示の方法によって対処するアーティファクトは、ＤＮＡポリメラーゼといった組み換えタンパク質中に存在することが知られているプラスミドクローニングベクターといった微量の夾雑ＤＮＡに、または典型的な分子生物学実験室中にエアロゾルの形でまたは機器上にまたは試薬中に存在する痕跡量の夾雑ＤＮＡに由来すると考えられている。このことは、特異的インプットテンプレートから夾雑テンプレートを識別する試みを複雑化する。アーティファクトＤＮＡ合成は、ＭＤＡ反応といった等温増幅反応を、特異的インプットテンプレートの増幅が夾雑テンプレートの増幅よりも有利になるように、高い反応温度で実施することによって低減または消失させることができることが見出されている。
【００２１】
説明に役立つ例として、ゲノムＤＮＡまたは環状化された細菌またはプラスミドＤＮＡのＭＤＡは、ランダム六量体プライマーおよびファイ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ファイ２９ＤＮＡポリメラーゼ活性に最適である温度（３０〜３４℃）にて実施することができる。ゲノムＤＮＡといったＤＮＡテンプレート（インプットＤＮＡ）を、増幅のための反応に加える。しかし、ファイ２９ＤＮＡポリメラーゼはまた、望ましくないアーティファクトもこれらのＭＤＡ反応中に生じうる。ファイ２９ＤＮＡポリメラーゼおよびランダム六量体プライマーによる、ファイ２９ＤＮＡポリメラーゼ活性に最適である温度（３０〜３４℃）におけるそのようなアーティファクトの生成はまた、等温総転写物増幅（ＩＴＴＡ）における環状化されたｃＤＮＡの複数プライマーを用いるＲＣＡ、およびランダム六量体および配列特異的プライマーを用いる環状化されたｄｓＤＮＡの複数プライマーを用いるＲＣＡといった他の等温増幅反応でも観察される。本開示の方法および組成物は、六量体プライマーおよびファイ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＭＤＡ反応において、低いかまたは検出不能なレベルのアーティファクトＤＮＡを含む増幅産物を生じるのに用いることができる。
【００２２】
本方法の一部の形式は、複数のプライマーによる核酸配列の鎖置換複製に基づく。本開示の方法のそのような形式は一般的に、標的配列を含む核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じる。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。標的配列からの複製された鎖の形成は、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利である。
【００２３】
核酸を増幅する方法であって、標的配列を含む核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じる。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。標的配列からの複製された鎖の形成は、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利である。
【００２４】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化した細胞溶解物を生じ、および安定化した細胞溶解物を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じる。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。標的配列からの複製された鎖の形成は、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利である。細胞溶解物は全ゲノムを含む。
【００２５】
鎖置換核酸合成を高温にて実施する方法であって、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、標的配列を含む核酸、一組のプライマー、および添加剤を混合し、および高温にておよび標的配列へのプライマーのハイブリダイゼーションおよびテンプレート依存的方法でのプライマーの３’末端への連続的なヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長に有利になる条件下でインキュベートすることを含み、その伸長の結果として標的配列の複製が生じる方法もまた開示される。
【００２６】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じ、ここでその細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化した細胞溶解物を生じ、および安定化した細胞溶解物を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、一組のプライマー、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。複製反応におけるテンプレート依存性伸長産物の形成は、非テンプレート産物の形成よりも有利である。
【００２７】
鎖置換核酸合成を高温にて実施する方法であって、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、１本鎖テンプレート核酸、一組のプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸および添加剤を混合し、および高温にておよびテンプレート核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションおよびテンプレート依存的方法でのプライマーの３’末端への連続的なヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長に有利になる条件下でインキュベートすることを含み、前記重合の結果として前記テンプレート核酸の複製が生じる方法もまた開示される。
【００２８】
核酸を増幅する方法であって、核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、一組のプライマー、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。複製反応におけるテンプレート依存性伸長産物の形成は、非テンプレート産物の形成よりも有利である。
【００２９】
核酸を増幅するためのキットであって、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーを含み、標的配列を含む核酸を高温にて、熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートする結果として、複製された鎖が生じおよび非標的配列からの複製された鎖の形成を優先して標的配列からの複製された鎖の形成を生じるキットもまた開示される。
【００３０】
本開示の方法は、任意の目的試料について実施することができる。たとえば、本開示の方法は、核酸を含むかまたは含むと見られている試料を用いて実施することができる。本開示の方法の一部の形式は、試料中の核酸を増幅するために、試料中に存在する配列の知識を全く必要としない。したがって、本開示の方法の一部の形式は、試料が核酸を含むかどうかを決定するために用いることができる。本方法を実施した際に増幅産物が生じるならば、試料は核酸を含む。本開示の方法は、細胞についておよび、粗核酸試料、部分精製された核酸試料、および精製された核酸試料を含む核酸試料について実施することができる。
【００３１】
本開示の方法の一部の形式では、プライマーは六量体プライマーであることができ、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができ、または両方である。そのような短いプライマーは、ランダム配列（ランダムプライマー）の完全な一組のプライマーとして作製することが、より長いプライマーよりも容易であり、それは、より短いプライマーのプール中には個々のプライマー種がより少ないからである。上記の特性は、全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）において特に有用である。
【００３２】
本開示の方法の一部の形式では、本方法は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、複製された鎖（すなわち、複数置換増幅で生じた鎖）を標識化することを含む。複製された鎖は、たとえば、ビオチニル化ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド、５−メチルｄＣＴＰ、ブロモデオキシウリジン三リン酸（ＢｒｄＵＴＰ）、または５−（３−アミノアリル）−２'−デオキシウリジン５'−三リン酸といった修飾ヌクレオチドの、複製された鎖の３’末端への付加によって標識化することができる。複製された鎖はまた、修飾ヌクレオチドを複製中に組み込むことによって標識化することができる。この方法で複製されたプローブは、マイクロアレイ形式における用途を含むハイブリダイゼーションに特に有用である。
【００３３】
高品質の増幅産物を作製するための、目的の核酸配列の増幅のための組成物および方法もまた開示される。増幅反応は、閾量のまたはそれを上回る量の核酸について、および／または、閾濃度のまたはそれを下回る濃度の核酸について実施する場合、低い増幅偏りといった高品質の増幅産物を生じることができることが見出されている。閾量および閾濃度は、増幅する核酸の性質および起源、および使用する増幅反応の種類に応じて変化する。目的の核酸試料について目的の増幅反応において使用することができる、核酸の閾量および／または閾濃度を決定する方法が開示される。増幅反応は、核酸の閾量および／または濃度未満で、低い偏りの増幅産物といった高品質の増幅産物を生じることができるため、そのような閾量および／または濃度未満を増幅反応に用いることができる。したがって、選択された増幅偏り（または増幅された核酸の品質の他の指標）よりも小さい増幅産物を作製するために、目的の核酸試料について目的の増幅反応において使用することができる、核酸の量および／または濃度を決定する方法もまた開示される。本開示の方法によって作製される増幅産物の品質は任意の望ましい基準によって測定することができ、および目的の基準によって測定される品質の希望のレベルを達成するための閾量（または上回る）および／または閾濃度（または下回る）は、本開示の方法によって決定することができおよび本開示の方法に用いることができる。
【００３４】
アルカリ性条件への核酸の曝露、アルカリ性条件へ曝露された核酸のｐＨの低下、および結果として生じた、閾量のまたはそれを上回る量のおよび／または閾濃度のまたはそれを下回る濃度の核酸のインキュベートによって、低い増幅偏りを有する増幅産物を作製することができることもまた見出されている。そのようなアルカリ性／中性化手順は、増幅産物の品質を改善することができる。増幅産物の品質は、増幅偏り、対立遺伝子偏り、遺伝子座発現量、配列発現量、対立遺伝子発現量、遺伝子座発現量偏り、配列発現量偏り、パーセント発現量、パーセント遺伝子座発現量、パーセント配列発現量、およびインプット核酸の偏りのないおよび／または完全な増幅を示す指標を含むがそれらに限定されない種々の方法によって測定することができる。
【００３５】
本開示の方法の一部の形式では、ゲノム試料は、試料をアルカリ性条件に曝露して試料中の核酸を変性させる；試料のｐＨを低下させて試料のｐＨをＤＮＡ複製に適合するようにする；およびゲノムの複製を促進する条件下で試料をインキュベートすることによって調製される。一部の実施形態では、インキュベートの条件は、ゲノムの複製を促進し、および、低い増幅偏り、望ましいレベルのまたはそれを下回る増幅偏り、または増幅産物の品質の任意の他の指標を有する増幅されたゲノム核酸を生じる条件であることができる。したがって、選択された増幅偏り（または増幅された核酸の品質の他の指標）よりも小さい増幅産物を作製するために、目的の核酸試料について目的の増幅反応において使用することができる条件を決定する方法もまた開示される。
【００３６】
本開示の方法は、任意の希望の試料について実施することができる。たとえば、本開示の方法は、核酸を含むかまたは含むと見られている試料を用いて実施することができる。本開示の方法の一部の形式は、試料中の核酸を増幅するために、試料中に存在する配列の知識を全く必要としない。したがって、本開示の方法の一部の形式は、試料が核酸を含むかどうかを決定するために用いることができる。本方法を実施した際に増幅産物が生じるならば、試料は核酸を含む。本開示の方法は、細胞についておよび、粗核酸試料、部分精製された核酸試料、および精製された核酸試料を含む核酸試料について実施することができる。任意の細胞または核酸試料をアルカリ性条件に曝露し、および次いで試料のｐＨを低下させることによって、増幅または複製に適した安定化した試料を作製することができる。
【００３７】
本方法の一部の形式は、複数のプライマーによる核酸配列の鎖置換複製に基づく。複数置換増幅（ＭＤＡ）と呼ばれるそのような方法は、鎖置換複製の先行法を改善する。本開示の方法は一般的に、一組のプライマー，ＤＮＡポリメラーゼ，および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む。標的配列の複製は、複製中に複製された鎖が別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されるようにして、複製された鎖を結果として生じる。
【００３８】
本開示の方法の一部の形式では、ゲノム試料は、細胞をアルカリ性条件に曝露し、それによって細胞を溶解しおよび細胞溶解物を結果として生じる；細胞溶解物のｐＨを低下させて、細胞溶解物のｐＨをＤＮＡ複製に適合するようにする；および複数置換増幅による細胞のゲノムの複製を促進する条件下で細胞溶解物をインキュベートすることによって調製される。アルカリ性溶解はゲノムＤＮＡに与えうる損傷がより少ないこと、およびアルカリ性溶解は複数置換増幅と適合することが見出されている。アルカリ性条件は、たとえば、相当数の細胞に溶解を生じさせる条件、または、十分な数の細胞に溶解を生じさせる条件であることができる。本開示の方法においてゲノムを十分に増幅することができる場合、溶解した細胞の数は十分であると考えることができる。配列の検出または他の分析といった、増幅産物の何らかの用途を可能にするのに十分な増幅産物が作製された場合、増幅は十分である。ｐＨの低下は一般的にｐＨ９．０からｐＨ６．０の中性範囲へ、である。
【００３９】
一部の実施形態では、細胞は熱によって溶解されない、および／または、細胞溶解物または試料中の核酸は加熱によって変性しない。異なる条件下での異なる細胞は異なる温度で溶解し、および、そのため熱によって細胞が溶解しない温度および時間を決定することができることを当業者は理解する。一般的に、細胞は、使用したアルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を生じる温度を超えておよびそのような時間、加熱に供されない。一部の実施形態では、細胞および／または細胞溶解物はその細胞が増殖する温度を大きく上回る加熱に供されない。別の実施形態では、細胞および／または細胞溶解物は増幅反応（そこでゲノムが増幅される）の温度を大きく上回る加熱に供されない。本開示の複数置換増幅反応は一般的に、実質的に一定の温度にて実施され（すなわち、増幅反応は実質的に等温である）、およびこの温度は一般的に、核酸が実質的にまたは有意に変性する温度未満である。
【００４０】
一部の実施形態では、細胞溶解物または試料は、増幅反応前に精製に供されない。本開示の方法との関連において、精製とは一般的に、細胞溶解物または試料中の他の物質からの核酸の分離をいう。複数置換増幅は精製されていないおよび部分精製された試料について実施することができることが見出されている。増幅反応は、精製されていない核酸を用いて効率的に実施することはできないと一般に考えられている。特に、ＰＣＲは夾雑物に対して非常に感受性が高い。
【００４１】
本開示の方法の一部の形式では、標的試料は変性条件に供されない。標的核酸、たとえばゲノムＤＮＡは、効率的な複数置換増幅のために変性する必要がないことが見出されている。変性段階および変性条件の消失は、増幅産物中の配列偏りを低減するといった別の利点を有することが見出された。別の一実施形態では、プライマーは六量体プライマーであることができる。そのような短い、６ヌクレオチドプライマーはなおも効率的に複数鎖置換複製のプライマーとなることができることが見出された。そのような短いプライマーは、ランダム配列（ランダムプライマー）の完全な一組のプライマーとして作製することが、より長いプライマーよりも容易であり、それは、より短いプライマーのプール中には個々のプライマー種がより少ないからである。別の一実施形態では、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるように、プライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。別の一実施形態では、修飾ヌクレオチドを含まない同一配列のプライマーと比較してそのプライマーの融点が変化するように、プライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。これらの最後の２つの実施形態のためには、プライマーは修飾ＲＮＡであることが好ましい。別の一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。φ２９ＤＮＡポリメラーゼはより多くの増幅を複数置換増幅で生じることが見出された。上記の特性のうち２つ以上の組み合わせもまた、複数置換増幅において改善された結果を生じる。好ましい一実施形態では、たとえば、標的試料は変性条件に供されず、プライマーは六量体プライマーでありおよびプライマーがヌクレアーゼ耐性となるように修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。上記の特性は全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）において特に有用である。
【００４２】
本開示の方法の一部の形式では、本方法は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、複製された鎖（すなわち、複数置換増幅で生じた鎖）を標識化することを含む。複製された鎖は、たとえば、ビオチニル化ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド、５−メチルｄＣＴＰ、ブロモデオキシウリジン三リン酸（ＢｒｄＵＴＰ）、または５−（３−アミノアリル）−２'−デオキシウリジン５'−三リン酸といった修飾ヌクレオチドの、複製された鎖の３’末端への付加によって標識化することができる。複製された鎖はまた、修飾ヌクレオチドを複製中に組み込むことによって標識化することができる。この方法で複製されたプローブは、マイクロアレイ形式における用途を含むハイブリダイゼーションに特に有用である。
【００４３】
全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）と呼ばれる、本開示の方法の一形式では、ランダムな一組のプライマーを用いて、ゲノム核酸の試料（または別の高度に複雑な核酸の試料）をランダムにプライマー結合するのに用いる。ランダムまたは部分的にランダムな配列のプライマーの十分に大きな一組を選択することによって、その組に含まれるプライマーは、合計として、およびランダムに、試料中の核酸全体にわたって分布する核酸配列と相補的になる。増幅は、高度に連続的なポリメラーゼを用いた、各プライマーで開始しおよび自発終止まで連続する複製によって進行する。本方法の重要な特性は、複製中のポリメラーゼによる介在プライマーの置換である。このようにして、ゲノム全体の複数の重なり合うコピーを短時間に合成することができる。本方法は、等温条件下で実施できるために、ポリメラーゼ連鎖反応よりも有利である。全ゲノム鎖置換増幅の他の利点は、全ゲノムＰＣＲよりも高いレベルの増幅（最大５倍高い）、増幅がＰＣＲよりも配列依存性が低い、およびＰＣＲで起こりうるような再アニーリング・アーティファクトまたは遺伝子シャッフリング・アーティファクトが無い（変性および再アニーリングのサイクルが無いため）ことを含む。ＷＧＳＤＡの好ましい実施形態では、標的試料は変性条件に供されず、プライマーは六量体プライマーでありおよびプライマーがヌクレアーゼ耐性となるように修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであるか、またはこれらの特性の任意の組み合わせである。
【００４４】
複数鎖置換増幅（ＭＳＤＡ）と呼ばれる、本方法の別の一形式では、右組および左組の、二組のプライマーが用いられる。プライマーの右組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列の一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有し、およびプライマーの左組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列のもう一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。右組に含まれるプライマーは標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子の一方の鎖と相補的であり、および左組に含まれるプライマーは反対側の鎖と相補的である。両方の組のプライマーの５'末端は、プライマーが核酸分子中の隣接配列とハイブリダイズされる際、目的の核酸配列の遠位側である。好ましくは、各組のそれぞれのメンバーは、標的ヌクレオチド配列に隣接する、別々のおよび重なり合わないヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。増幅は、各プライマーで開始されおよび標的核酸配列を通じて継続する複製によって進行する。リニアＭＳＤＡと呼ばれる、ＭＳＤＡの別の一形式では、増幅は１本の鎖とだけ相補的な一組のプライマーを用いて実施され、したがって鎖のうち１本だけを増幅する。
【００４５】
遺伝子特異的鎖置換増幅（ＧＳ−ＭＳＤＡ）と呼ばれる、本方法の別の一形式では、標的ＤＮＡはまず制限エンドヌクレアーゼを用いて消化される。消化された断片は次いで末端どうしをライゲーションしてＤＮＡ環を生じる。これらの環は単量体または連結体であることができる。右組および左組の、二組のプライマーが増幅に用いられる。プライマーの右組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列の一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有し、およびプライマーの左組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列のもう一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。右組に含まれるプライマーは標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子の一方の鎖と相補的であり、および左組に含まれるプライマーは反対側の鎖と相補的である。そのプライマーは、増幅する必要がある配列の全部または一部をカバーするように設計されている。好ましくは、各組のそれぞれのメンバーは、標的ヌクレオチド配列に隣接する、別々のおよび重なり合わないヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。増幅は、各プライマーで開始されおよび標的核酸配列を通じて継続する複製によって進行する。リニアＧＳ−ＭＳＤＡと呼ばれる、ＧＳ−ＭＳＤＡの一形式では、増幅は１本の鎖とだけ相補的な一組のプライマーを用いて実施され、したがって鎖のうち１本だけを増幅する。ＧＳ−ＭＳＤＡの別の一形式では、ｃＤＮＡ配列を環状化して一本鎖ＤＮＡ環を生じることができる。増幅は次いで、その一本鎖環状ｃＤＮＡと相補的な一組のプライマーを用いて実施される。
【００４６】
本方法の重要な特性は、複製中の介在プライマーの置換である。プライマーの右組から伸長した核酸鎖が、プライマーの左組がハイブリダイズする核酸分子の領域に一旦達すると、および逆の場合も同様に、もう一回のプライマー結合および複製が起こる。このことは、標的核酸配列の入れ子化した組の複数コピーが短時間に合成されることを可能にする。右組および左組に含まれる十分な数のプライマーを用いることによって、目的の核酸配列の何十万ものコピーを生じるのに必要なのは数回の複製だけである。本開示の方法は、等温条件下で実施できるために、ポリメラーゼ連鎖反応よりも有利である。伸長する鎖の先端にあるポリメラーゼ（または対応する鎖置換タンパク質）が、その先にある鎖を置換して、それによってハイブリダイゼーションに利用可能にするため、熱サイクルは不要である。複数鎖置換増幅の他の利点は、非常に長い核酸断片（５０キロベース程度）を増幅する能力および、より短い断片（１０キロベース未満）の迅速な増幅を含む。複数鎖置換増幅では、意図しない部位での一つのプライマー結合現象は、これらの部位でのアーティファクト増幅には繋がらない（意図される部位での増幅がその意図しない部位での一つの鎖複製を速やかに追い越すため）。ＭＳＤＡの好ましい実施形態では、標的試料は変性条件に供されず、プライマーは六量体プライマーでありおよびプライマーがヌクレアーゼ耐性となるように修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであるか、またはこれらの特性の任意の組み合わせである。
【００４７】
ＷＧＳＤＡの好ましい実施形態では、標的試料は変性条件に供されず、プライマーは六量体プライマーでありおよびプライマーがヌクレアーゼ耐性となるように修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであるか、またはこれらの特性の任意の組み合わせである。
【００４８】
増幅後に、増幅された配列は、ＰＣＲ増幅された配列についての既知のおよび確立された用途といった、任意の目的に用いることができる。たとえば、増幅された配列は、蛍光標識の検出、酵素結合検出系、抗体媒介標識検出、および放射性標識の検出といった、核酸のための従来の検出系のうち任意のものを用いて検出することができる。標識化の好ましい形式は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、複製された鎖（すなわち、複数置換増幅で生じた鎖）を標識化することを含む。複製された鎖は、たとえば、ビオチニル化ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド、５−メチルｄＣＴＰ、ＢｒｄＵＴＰ、または５−（３−アミノアリル）−２'−デオキシウリジン５'−三リン酸といった修飾ヌクレオチドの、複製された鎖の３’末端への付加によって標識化することができる。
【００４９】
本開示の方法では、増幅は、サイクルではなく、連続的な等温複製で起こる。このことは、増幅の複雑さを低減し、および産物においてはるかに一貫したものにする。鎖置換は、単一の連続的な等温反応において、核酸配列または試料の複数のコピーの迅速な生成を可能にする。本開示の方法を用いて作製されているＤＮＡは、希望する任意の目的のためにまたは任意の他の方法において使用することができる。たとえば、全ゲノム鎖置換法によって予め増幅されている任意の特定のＤＮＡ配列をさらに増幅するために、ＰＣＲを用いることができる。
【００５０】
遺伝子分析はしばしば、血液、組織培養細胞、口腔塗抹、口腔洗浄液、糞便、組織切片、吸引生検といった生物学的試料、および骨またはミイラ化組織といった考古学的試料に由来するＤＮＡを用いて実施しなければならない。一部の場合には、試料はまた、純粋なＤＮＡの十分な量を抽出するには少量すぎ、および未処理試料から直接にＤＮＡに基づく分析を実施する必要がある。さらに、純粋なＤＮＡを単離するのは時間がかかり、そこで、生物学的試料から直接にゲノムを増幅することができる本開示の方法は大幅な改善に相当する。
【００５１】
本開示の方法は、現行の方法論よりもいくつかの点で明らかに優れている。全血または培養細胞から、ＫＯＨ処理といった簡単な細胞溶解技術を用いて、ゲノムを直接に増幅することができる。ＰＣＲおよび他のＤＮＡ増幅法は細胞内容物によって重度に阻害され、そのため増幅および分析の前にＤＮＡの精製が必要である。たとえば、溶解した血液細胞中に存在するヘムはＰＣＲを阻害する。対照的に、全ゲノム増幅の本開示の形式は、ミニプレップ抽出および沈澱手順によってまたはカラムまたはスピンカートリッジ法を用いて物理的にＤＮＡを分離する必要無しに、粗溶解物について実施することができる。
【００５２】
細菌、真菌、およびウイルスは、すべてが院内感染に関与しうる。院内病原体の亜種レベルでの同定は高度な識別技術を必要とする。そのような技術は、分類のための従来の方法および分子的方法を利用する。いくつかの従来技術は、抗生物質感受性試験、生化学基質を利用する能力の測定、および血清型分析である。これらの技術の主な制限は、それらは純粋な細菌培養を必要とするため、完了までに数日かかることである。そのような技術は長時間であり、および細菌は臨床試料中でさえ生存不能である可能性があるため、細菌種同定のための迅速なおよび高信頼性の方法が求められている。
【００５３】
細菌種同定のためのＤＮＡに基づく分子的方法のいくつかは、マクロ制限分析（ＭＲＡ）に続くパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）分析、および任意プライマーＰＣＲ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）（ＡＰ−ＰＣＲ）（テノバー（Ｔｅｎｏｖｅｒ）他 ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２： ４０７−４１５ （１９９４）、およびプルックラー（Ｐｒｕｃｋｌｅｒ）他，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：２８７２−２８７５ （１９９５） ）である。これらの分子的技術は労働集約的でありおよび異なる実験室間で標準化することが困難である。 
【００５４】
本開示の方法は、分析のための微生物 ＤＮＡの増幅による、細菌株の同定のための有用な代替法を提供する。ＰＣＲ （Ｌａｎｔｚ 他，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．５： ８７−１３０ （２０００） ）とは異なり、本開示の方法は迅速で、偏りが無く、再現性があり、および細菌、ウイルスまたは真菌ゲノム由来の大きいＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００５５】
本開示の方法は、たとえば、配列決定または他の試験のために、培養できない生物から十分なＤＮＡを得るのに用いることができる。大部分の微生物はその天然の環境の外では増殖することができず、およびしたがってその核酸は配列決定することができない。多数の培養できない生物は極端な環境下に生息し、そのことはそれらの生物の遺伝子の総体を研究者にとって興味あるものとしている。他の微生物はある種の生態系において不可欠な役割を果たす共同体内で生息する。個々の生物または生物の共同体全体を、個別にまたは一緒に、増幅して配列決定することができる。
【００５６】
組み換えタンパク質は、希望の発現ベクターを有する細菌株または酵母株から発生した大きなバイオマスから精製することができる。単離された組み換えタンパク質には高度の純度が必要とされる可能性があり、痕跡レベルのタンパク質またはＤＮＡ夾雑物の検出のための高感度な手順が必要となる。本開示の方法は、低レベルのＤＮＡテンプレートの存在下でさえ高度に頑健なＤＮＡ増幅反応であり、および、痕跡量の夾雑する細菌または酵母ゲノムＤＮＡに関して組み換えタンパク質の調製物を監視するのに用いることができる。
【００５７】
ＲＦＬＰに基づく試験のための法医学材料の増幅は、本開示の方法のための一つの有用な用途である。
【００５８】
損傷ＤＮＡを増幅および修復するための方法もまた開示される。この方法は、たとえば、分解されたゲノムＤＮＡを増幅するのに有用である。本方法は、損傷ＤＮＡ試料を実質的に変性すること（一般的に熱およびアルカリ性条件への曝露によって）、変性条件の除去または低減（たとえば変性したＤＮＡ試料のｐＨおよび温度の低下によって）、およびそのＤＮＡを複製することを含む。損傷ＤＮＡの平均長を増大することによって、損傷ＤＮＡは複製中に修復される。たとえば、ＤＮＡ断片の平均長は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料中の２ｋｂから、たとえば、増幅されたＤＮＡについての１０ｋｂ以上へ増加することができる。この修復方法は、すべて損傷ＤＮＡを他の方法によって増幅した場合と比較して、産物の平均長を増加し、増幅産物の品質を３倍に高め（たとえば、試料中のマーカー発現量を増加することによって）、および対立遺伝子欠落の頻度を低下させることによって増幅産物の遺伝子型分析を改善することによって、損傷ＤＮＡの増幅における全体的な改善を結果として生じうる。変性条件の除去は、損傷ＤＮＡの変性した鎖が、他の変性した損傷ＤＮＡとハイブリダイズすることを可能にする。複製は複数置換増幅であることができる。ＤＮＡ試料の実質的な変性および一時的な変性は一般的に、ＤＮＡがさらに損傷されないように実施される。この方法は一般的に、開示された増幅法のうち任意のものと組み合わせるかまたは共に使用することができる。
【００５９】
試料が増幅可能な核酸を含むかどうかの予備知識がある必要は無いことが見出されている。本開示の方法の一部の形式は、核酸を含むと見られる試料が実際に核酸を含むかどうかを試験するために用いることができる。本開示の方法を用いての、そのような試料からの増幅されたＤＮＡの産生は、試料が核酸を含んだことの証拠である。より一般的に、本開示の方法の実施は、試料中のいかなる核酸配列のいかなる知識も必要としない。したがって、本開示の方法は、特異的配列情報の欠如にかかわらず、任意の起源から核酸を増幅するために用いることができる。これは、増幅を実施するためには試料中に存在すると考えられる核酸配列の少なくとも一部の予備情報を有することが必要である、ＰＣＲといった他の増幅法とは対照的である。この場合、試料中に存在する核酸が予想の試料核酸とは異なるならば、ＰＣＲ増幅反応は失敗する。試料が核酸の混合物を含むならば、ＰＣＲ反応では、適切な種類の核酸だけが増幅されるが、他の種類の核酸は増幅されない。対照的に、本開示の方法は、試料中に存在する核酸の大部分または全部の増幅を提供する。本開示の方法は、従来は核酸を含まないと予想または考えられている試料を用いることにも等しく適用可能である。たとえば、ヒトまたは他の高等動物由来の血清または血漿は、遊離の宿主核酸を含まないと考えられていた。しかし、本開示の方法はそのような試料中に存在する核酸を増幅できたことが見出された。
【００６０】
特異的インプットテンプレート依存性合成をアーティファクトＤＮＡ合成よりも改善するための方法およびキットを提供することは、本開示の発明の目的である。
【００６１】
アーティファクト核酸のレベルが低減されたかまたは検出不能である増幅産物を作製する方法およびキットを提供することは、本開示の発明の目的である。
【００６２】
アーティファクト核酸のレベルが低減されたかまたは検出不能である、連続的な等温反応において標的核酸配列を増幅する方法を提供することは、本開示の発明の目的である。
【００６３】
アーティファクト核酸のレベルが低減されたかまたは検出不能である、連続的な等温反応においてゲノム全体または他の高度に複雑な核酸試料を増幅する方法を提供することは、本開示の発明のもう一つの目的である。
【００６４】
連続的な等温反応において標的核酸配列を増幅する方法を提供することは、本開示の発明のもう一つの目的である。
【００６５】
連続的な等温反応においてゲノム全体または他の高度に複雑な核酸試料を増幅する方法を提供することは、本開示の発明のもう一つの目的である。
【００６６】
標的核酸配列の複数のコピーが単一の増幅サイクル中に作製される、標的核酸配列を増幅する方法を提供することは、本開示の発明のもう一つの目的である。
【００６７】
連結されたＤＮＡを連続的な等温反応において増幅する方法を提供することは、本開示の発明のもう一つの目的である。
【００６８】
連続的な等温反応において標的核酸配列を増幅するためのキットを提供することは、本開示の発明のもう一つの目的である。
【００６９】
連続的な等温反応においてゲノム全体または他の高度に複雑な核酸試料を増幅するためのキットを提供することは、本開示の発明のもう一つの目的である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の単一の６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図２】図２は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の２種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図３】図３は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の３種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図４】図４は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の４種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図５】図５は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の５種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図６】図６は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の５種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図７】図７は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の５種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図８】図８は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の５種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図９】図９は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の９種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の１０遺伝子座についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図１０】図１０は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の１２種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座発現量（パーセントで）のグラフである。
【図１１】図１１は、未変性ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）または８５℃にて１０分間加熱することによって分解されたゲノムＤＮＡ（分解ｇＤＮＡ）のさまざまな量（０、０．３ｎｇ、３ｎｇおよび３０ｎｇ）をインプットテンプレートとして用い、１６時間実施したＭＤＡ反応によるＤＮＡ合成のグラフである。ＭＤＡ反応は、３０℃にて０．３Ｍトレハロースの非存在下、または４０℃にて０．３Ｍトレハロースの存在下のどちらかで実施した。
【図１２】図１２は、未変性ゲノムＤＮＡのさまざまな量（０から３０ｎｇ）をインプットテンプレートとして用い、４０℃にて各種の糖の存在下で１６時間実施したＭＤＡ反応によるＤＮＡ合成のグラフである。ＭＤＡ反応は、添加剤無しで、または０．３Ｍトレハロースまたは０．４Ｍスクロースまたは０．４Ｍグルコースの存在下のどちらかで実施した。
【図１３】図１３は、本開示の方法における増幅について異なる量の核酸を用いた、時間（時間で）に対するＤＮＡ合成（μｇで）のグラフである。
【図１４】図１４は、テンプレートＤＮＡ長に及ぼす９５℃でのインキュベート時間の作用のグラフである。
【図１５】図１５は、ＭＤＡの速度および収率に及ぼす９５℃でのテンプレートインキュベートの作用のグラフである。
【図１６】図１６は、ＤＮＡ産物鎖の平均サイズに及ぼす９５℃でのテンプレートインキュベートの作用のグラフである。
【図１７】図１７は、ＭＤＡによって増幅されたＤＮＡにおける遺伝子座発現量に及ぼす、９５℃でのインキュベート無しに対する９５℃でのテンプレートインキュベートの作用の比較を示すグラフである。
【図１８】図１８Ａ、１８Ｂ、および１８Ｃは、３つの異なる増幅手順、ＭＤＡ、ＤＯＰ−ＰＣＲ、およびＰＥＰについての、遺伝子発現量偏りに及ぼす増幅の作用を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ネステッドプライマーを用いたｃ−ｊｕｎ配列の増幅を示すグラフである。
【図２０】図２０は、５つの異なる増幅反応に由来するＤＮＡについての８遺伝子座の相対発現量のグラフである。Ｙ軸はインプットゲノムＤＮＡとの相対比でパーセントとして表した遺伝子座発現量であり、１μｇの増幅ＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算される。
【図２１】図２１は、１００％ｄＴＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡ、３０％ｄＴＴＰ／７０％ＡＡｄＵＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡに関して、８遺伝子座についてのパーセント発現量の比較を示すグラフである。
【図２２】図２２は、環状化されたゲノムテンプレートを用いたｃ−ｊｕｎ配列の増幅を示すグラフである。Ｙ軸はインプットゲノムＤＮＡとの相対比でパーセントとして表した遺伝子座発現量であり、１μｇの増幅ＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算される。
【図２３】図２３は、ｃ−ｊｕｎ特異的プライマーおよび環状化されたＤＮＡ標的を用いて増幅されたＤＮＡにおける、８遺伝子座についてのパーセント発現量の比較を示すグラフである。
【図２４】図２４は、異なる処理（対照または修復処理）に曝露された異なるＤＮＡ試料のパーセント遺伝子座発現量のグラフである。
【図２５】図２５は、修復処理ありまたは無しの４０試料の、パーセント遺伝子座発現量のグラフである。
【図２６】図２６は、本開示の方法の一形式（アルカリ性処理あり；下図）またはアルカリ性処理なしの同じ方法（上図）を用いて増幅したゲノム核酸試料中に見出される５つの一塩基多型のそれぞれでの対立遺伝子の量を比較するグラフである。アルカリ性処理が用いられる場合に、対立遺伝子の増幅偏りはより低い。１６８コリエル（Ｃｏｒｉｅｌｌ）ｇＤＮＡを含む１００ｕＬの反応。遺伝子型分析はＴａｑＭａｎ分析により実施した。
【図２７】図２７は、本開示の方法の一形式（アルカリ性処理あり；下図）またはアルカリ性処理なしの同じ方法（上図）を用いて増幅したゲノム核酸試料中に見出される５つの一塩基多型のそれぞれでの対立遺伝子の量を比較するグラフである。アルカリ性処理が用いられる場合に、対立遺伝子の増幅偏りはより低い。１６８コリエル（Ｃｏｒｉｅｌｌ）ｇＤＮＡを含む１００ｕＬの反応。遺伝子型分析はＴａｑＭａｎ分析により実施した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
本開示の方法は、標的核酸配列および全ゲノムまたは他の高度に複雑な核酸試料の増幅を可能にする、特定の材料および手順を利用する。これらの材料および手順を下記に詳細に記載する。
【００７２】
材料
Ａ．標的配列
増幅の対象である標的配列は任意の核酸であることができる。標的配列は、全ゲノム増幅の場合のような複数の核酸分子、１つの核酸分子中の複数の部位，または１つの核酸分子の単一の領域を含みうる。複数鎖置換増幅については、一般的に標的配列は１つの核酸分子または核酸試料中の単一の領域である。全ゲノム増幅については、標的配列はゲノムまたは核酸試料全体である。標的配列は目的の任意の核酸試料に含まれうる。多数のそのような核酸試料の、起源、同一性、および調製物が既知である。増幅または検出法における使用のために既知であるかまたは同定されている核酸試料をここに記載の方法に用いるのが好ましい。核酸試料は、たとえば、１個以上の細胞、組織、または、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、または羊水といった体液、または、組織培養細胞、口腔塗抹、口腔洗浄液、糞便、組織切片、吸引生検といった他の生物学的試料、および骨またはミイラ化組織といった考古学的試料に由来する核酸試料であることができる。標的試料は、真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚類、哺乳類、ヒト、非ヒト、細菌、微生物、ウイルス、生物学的起源、血清、血漿、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、羊水、生検、針吸引生検、がん、腫瘍、組織、細胞、細胞溶解物、粗細胞溶解物、組織溶解物、組織培養細胞、口腔塗抹、口腔洗浄液、糞便、ミイラ化組織、法医学起源、検死、考古学的起源、感染、院内感染、製品起源、医薬調製物、生物学的分子製品、タンパク質調製物、脂質調製物、糖質調製物、無生物、空気、土壌、樹液、金属、化石、土砂、および／または他の地球上のまたは地球外の物質および起源を含むがそれらに限定されない任意の試料に由来することができる。試料はまた、１または複数の異なる起源に由来する物質の混合物を含みうる。たとえば、感染性細菌またはウイルスの核酸は、そのような感染した細胞または組織に由来する核酸が本開示の方法を用いて増幅される場合、ヒト核酸と共に増幅することができる。有用な標的試料の種類は、真核試料、植物試料、動物試料、脊椎動物試料、魚類試料、哺乳類試料、ヒト試料、非ヒト試料、細菌試料、微生物試料、ウイルス試料、生物学的試料、血清試料、血漿試料、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、組織溶解物試料、組織培養細胞試料、口腔塗抹試料、口腔洗浄液試料、糞便試料、ミイラ化組織試料、法医学試料、検死試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、無生物試料、空気試料、土壌試料、樹液試料、金属試料、化石試料、土砂試料、および／または他の地球上のまたは地球外の試料を含む。
【００７３】
複数鎖置換増幅のためには、好ましい標的配列は、たとえば、長さまたは組成のために、ＰＣＲを用いて増幅するのが困難であるものである。全ゲノム増幅には、好ましい標的配列は単一細胞由来の核酸試料である。連結されたＤＮＡの複数鎖置換増幅のためには、標的は連結されたＤＮＡである。標的配列は、ｃＤＮＡのどちらか一方の鎖、または両方の鎖であることができる。本開示の方法における用途のための標的配列は、好ましくは、複雑なおよび非反復性である核酸分子または試料の一部である（リンカー連結されたＤＮＡ中のリンカー、およびゲノムＤＮＡ中の反復性ＤＮＡ部分は例外とする）。
【００７４】
標的核酸は損傷ＤＮＡおよび損傷ＤＮＡ試料を含むことができる。たとえば、ゲノムＤＮＡ試料の調製は、結果としてゲノムＤＮＡへの損傷を生じうる（たとえば、分解および断片化）。このことは、ゲノムまたはそれに含まれる配列の増幅をより困難におよびより信頼性の低い結果を与えることの両方になりうる（たとえば、多数の部分的および断片化したゲノム配列の増幅を結果として生じることによって。損傷ＤＮＡおよび損傷ＤＮＡ試料は、したがって、損傷ＤＮＡを増幅する本開示の方法に有用である。任意の分解した、断片化したまたはそうでなければ損傷したＤＮＡまたはそのようなＤＮＡを含む試料を、本開示の方法に用いることができる。
【００７５】
１．複数鎖置換増幅のための標的配列
核酸試料中の複数の部位を、同一のＭＳＤＡ反応中に同時に増幅することができるが、簡単にするために、下記の考察は増幅する単一の目的核酸配列の性質に言及する。この配列を下記で標的配列と呼ぶ。ＭＳＤＡのための標的配列は、２種類の標的領域、増幅標的およびハイブリダイゼーション標的を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーション標的は、一組のプライマーに含まれるプライマーと相補的である、標的配列中の配列を含む。増幅標的は、標的配列の増幅すべき部分である。このために、増幅標的は好ましくは、ハイブリダイゼーション標的の下流であるかまたはそれに隣接されている。標的配列を選択するためには、特異的配列または構造上の条件は必要ない。標的配列内のハイブリダイゼーション標的および増幅標的は、一組のプライマーに含まれるプライマーとの標的配列の関係によって定義される。プライマーは、選択された標的配列と適合するように設計されている。プライマーがハイブリダイズする部位の中およびその周囲の配列が増幅されるため、増幅すべき配列とプライマーのハイブリダイゼーション部位とは、別々であるのが好ましいがその必要はない。
【００７６】
環状化されたＤＮＡの複数鎖置換増幅では、環状ＤＮＡ断片が増幅標的である。ハイブリダイゼーション標的は、増幅に用いられるプライマーと相補的である配列を含む。増幅のための環状ＤＮＡの一つの種類は、環状化されたｃＤＮＡである。
【００７７】
リンカー連結されたＤＮＡの複数鎖置換増幅では、リンカーによって結合されたＤＮＡ断片が増幅標的であり、およびリンカーがハイブリダイゼーション標的である。ハイブリダイゼーション標的（すなわち、リンカー）は、増幅に用いられるプライマーと相補的である配列を含む。増幅のための連結されたＤＮＡの一つの種類は、連結されたｃＤＮＡである。
【００７８】
Ｂ．添加剤
本開示の増幅法における使用のための添加剤は、熱不安定性核酸ポリメラーゼがテンプレート依存性重合を高温にて行うことを可能にできる、任意の化合物、組成物、または組み合わせである。添加剤は一般的に、核酸ポリメラーゼに及ぼす熱安定化作用を有する。添加剤は、熱不安定性核酸ポリメラーゼを、そのポリメラーゼの通常の活性範囲を上回る温度で使用することを可能にする。有用な添加剤は、糖類、シャペロン、タンパク質、糖、アミノ酸、ポリアルコールおよびその誘導体、および他の浸透圧溶質を含む。有用な糖類はトレハロース、グルコースおよびスクロースを含む。有用な糖は、トレハロース、マルトース、グルコース、スクロース、ラクトース、キシロビオース、アガロビオース、セロビオース、レバンビオース、キトビオース、２−β−グルクロノシルグルクロン酸、アロース、アルトロース、ガラクトース、グロース、イドース、マンノース、タロース、ソルビトール、果糖、キシリトール、アラビトールといったオリゴ糖および多糖、および、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールといったポリアルコールを含む。有用なアミノ酸およびその誘導体は、Ｎｅ−アセチル−β−リジン、アラニン、γ−アミノ酪酸、ベタイン、Ｎα−カルバモイル−Ｌ−グルタミン１−アミド、コリン、ジメチルテチン、エコチン（１，４，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−４−ピリミジンカルボン酸）、グルタミン酸、β−グルタミン、グリシン、オクトピン、プロリン、サルコシン、タウリンおよびトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）を含む。有用なシャペロンタンパク質は、好熱性細菌のシャペロンタンパク質、およびＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ６０といった熱ショックタンパク質を含む。他の有用な添加剤は、ソルビトール、マンノシルグリセラート、ジグリセロールリン酸、およびサイクリック−２、３−ジホスホグリセラートを含む。化合物および組成物の組み合わせを添加剤として用いることができる。
【００７９】
ここでは、高温とは、任意の核酸ポリメラーゼが添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で明らかに不活性化される温度またはそれを上回る温度である。したがって、何が高温に当たるかはその特定の核酸ポリメラーゼに依存する。ここでは、明らかな不活性化とは、活性の４０％以上の低下をいう。相当な不活性化とは、活性の６０％以上の低下をいう。顕著な不活性化とは、活性の８０％以上の低下をいう。
【００８０】
ここでは、熱不安定性核酸ポリメラーゼとは、増幅反応を実施する温度で添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で明らかに不活性化される核酸ポリメラーゼである。したがって、核酸ポリメラーゼが熱不安定性であるかどうかは、増幅反応を実施する温度に依存する。ここでは、熱不安定性はポリメラーゼの変性または不可逆的不活性化を要しないことに注意する。必要条件は、ポリメラーゼが、増幅反応を実施する温度で添加剤の非存在下で明らかにテンプレート依存性重合を実施することができないことだけである。
【００８１】
Ｃ．試料
増幅の対象である核酸分子は、任意の起源に由来する任意の核酸であることができる。一般的に、本開示の方法は、増幅すべき核酸分子を含む（かまたは含むと見られる）試料を用いて実施される。核酸分子を含む（かまたは含むと見られる）試料はまた、核酸試料と呼ぶことができる。核酸試料といった試料は、標的配列を含みうる。細胞および組織試料は核酸試料の一種である。本開示の方法における使用のための試料はまた、核酸の存在について試験すべき試料であることができる（すなわち、核酸を含みうるかまたは含まない可能性がある試料）。全ゲノム増幅については、試料はゲノム全体の全部または相当な部分であることができる。ここでは、ゲノムの相当な部分とは、全ゲノム中に存在する配列の９０％以上の存在をいう。ゲノムの相当な部分を含むかまたはそれを構成する、核酸試料またはゲノム核酸試料といった試料は、全ゲノム中に存在する配列の９０％以上を含む試料をいう。ゲノム核酸試料とは、ゲノム核酸に由来しおよび全ゲノムのかなりの部分を含むかまたは構成する任意の試料をいう。ここでは、ゲノムのかなりの部分とは、全ゲノム中に存在する配列の２０％以上の存在をいう。ゲノムのかなりの部分を含むかまたは構成する、核酸試料またはゲノム核酸試料といった試料は、全ゲノム中に存在する配列の２０％以上を含む試料をいう。ここでは、ゲノムの大きな部分とは、全ゲノム中に存在する配列の５０％以上の存在をいう。ゲノムの大きな部分を含むかまたは構成する、核酸試料またはゲノム核酸試料といった試料は、全ゲノム中に存在する配列の５０％以上を含む試料をいう。ゲノム核酸試料は核酸試料の一種でありおよび試料の一種である。試料へのここでの言及は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、核酸試料およびゲノム試料を包含する核酸試料へのここでの言及は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、ゲノム核酸試料を包含する。
【００８２】
試料はゲノムを構成することができ、およびゲノムは試料中の核酸の任意の割合を構成することができる。ゲノムは、試料中の核酸の、たとえば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成することができる。
【００８３】
試料中の核酸は、本開示の方法で増幅するためには純粋である必要はない。本開示の方法の一部の形式は、粗細胞溶解物といった不純な核酸試料を増幅するために有用である。試料中の、または安定化したかまたは中性化した試料中の核酸は、たとえば、水を除く重量で、純度０．０１％未満、純度０．５％未満、純度０．１％未満、純度０．２％未満、純度０．４％未満、純度０．６％未満、純度０．８％未満、純度１％未満、純度２％未満、純度３％未満、純度４％未満、純度５％未満、純度６％未満、純度８％未満、純度１０％未満、純度１５％未満、純度２０％未満、純度２５％未満、純度３０％未満、純度４０％未満、または純度５０％未満であることができる。
【００８４】
核酸試料は目的の任意の核酸試料であることができる。多数のそのような核酸試料の、起源、同一性、および調製物が既知である。増幅または検出法における使用のために既知であるかまたは同定されている核酸試料をここに記載の方法に用いるのが好ましい。核酸試料は、たとえば、１または複数の真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚類、哺乳類、ヒト、非ヒト、細菌、微生物、ウイルス、生物学的起源、血清、血漿、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、羊水、生検、針吸引生検、がん、腫瘍、組織、細胞、細胞溶解物、粗細胞溶解物、組織溶解物、組織培養細胞、口腔塗抹、口腔洗浄液、糞便、ミイラ化組織、法医学起源、検死、考古学的起源、感染、院内感染、製品起源、医薬調製物、生物学的分子製品、タンパク質調製物、脂質調製物、糖質調製物、無生物、空気、土壌、樹液、金属、化石、土砂、および／または他の地球上のまたは地球外の物質および起源を構成するかまたはそれに由来する核酸試料を含みうる。有用な核酸試料の種類は、真核試料、植物試料、動物試料、脊椎動物試料、魚類試料、哺乳類試料、ヒト試料、非ヒト試料、細菌試料、微生物試料、ウイルス試料、生物学的試料、血清試料、血漿試料、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、組織溶解物試料、組織培養細胞試料、口腔塗抹試料、口腔洗浄液試料、糞便試料、ミイラ化組織試料、法医学試料、検死試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、無生物試料、空気試料、土壌試料、樹液試料、金属試料、化石試料、土砂試料、および／または他の地球上のまたは地球外の試料を含む。
【００８５】
試料が増幅可能な核酸を含むか含まないかの予備知識がある必要は無いことが見出されている。本開示の方法の一部の形式は、核酸を含むと見られる試料が実際に核酸を含むかどうかを試験するために用いることができる。本開示の方法を用いての、そのような試料からの増幅されたＤＮＡの産生は、試料が核酸を含んだことの証拠である。より一般的に、本開示の方法の実施は、試料中のいかなる核酸配列のいかなる知識も必要としない。したがって、本開示の方法は、特異的配列情報の欠如にかかわらず、任意の起源から核酸を増幅するために用いることができる。これは、増幅を実施するためには試料中に存在すると考えられる核酸配列の少なくとも一部の予備情報を有することが必要である、ＰＣＲといった他の増幅法とは対照的である。この場合、試料中に存在する核酸が予想の試料核酸とは異なるならば、ＰＣＲ増幅反応は失敗する。試料が核酸の混合物を含むならば、ＰＣＲ反応では、適切な種類の核酸だけが増幅されるが、他の種類の核酸は増幅されない。対照的に、本開示の方法は、試料中に存在する核酸の大部分または全部の増幅を提供する。本開示の方法は、従来は核酸を含まないと予想または考えられている試料を用いることにも等しく適用可能である。たとえば、ヒトまたは他の高等動物由来の血清または血漿は、遊離の宿主核酸を含まないと考えられていた。しかし、本開示の方法はそのような試料中に存在する核酸を増幅できたことが見出された。
【００８６】
全ゲノム増幅のためには、好ましい核酸試料は単一の細胞に由来する核酸試料である。本開示の方法の一部の形式における使用のための核酸試料は、好ましくは、複雑なおよび非反復性である核酸分子および試料である。核酸試料がゲノム核酸試料である場合は、ゲノムは目的の任意の生物に由来するゲノムであることができる。たとえば、ゲノムは、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真正細菌ゲノム、古細菌ゲノム、真菌ゲノム、微生物ゲノム、真核ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、脊椎動物ゲノム、無脊椎動物ゲノム、昆虫ゲノム、哺乳類ゲノム、またはヒトゲノムであることができる。標的ゲノムは好ましくは純粋であるかまたは実質的に純粋であるが、しかしこのことは必要ではない。たとえば、動物起源由来のゲノム試料は、汚染生物または感染性生物由来の核酸を含みうる。
【００８７】
核酸試料は、たとえば、同一のまたは異なる生物、組織、細胞、または組み合わせに由来する１つ以上の全ゲノム；同一のまたは異なる生物、組織、細胞、または組み合わせに由来する１つ以上のゲノムの一部；同一のまたは異なる生物、組織、細胞、または組み合わせに由来する１つ以上の完全な染色体；同一のまたは異なる生物、組織、細胞、または組み合わせに由来する１つ以上の染色体の一部；同一のまたは異なる生物、組織、細胞、または組み合わせに由来する１つ以上の染色体断片；１つ以上の人工染色体；１つ以上の酵母人工染色体；１つ以上の細菌人工染色体；１つ以上のコスミド；またはこれらのうち任意の組み合わせでありうるかまたはそれに由来しうる。
【００８８】
核酸試料が高度に複雑な核酸試料である場合、試料中の核酸分子は、高度に複雑な試料を結果として生じる任意の起源または起源の組み合わせに由来することができる。高い複雑性または高い配列複雑性とは、核酸試料が多数の独自の（すなわち、反復していない）配列を有することを意味する。独自の配列中のヌクレオチドの総数が、その核酸試料の配列複雑性である。たとえば、ヒトゲノムは約３×１０９の独自配列を有し、そのため、約３×１０９ヌクレオチドの配列複雑性を有する。高い配列複雑性の核酸試料は、少なくとも１×１０６ヌクレオチドの配列複雑性を有する。したがって、高い配列複雑性の核酸試料は、たとえば、少なくとも１×１０６ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０７ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性、または少なくとも１×１０９ヌクレオチドの配列複雑性を有しうる。
【００８９】
核酸試料はまた、顕著な複雑性の核酸試料であることができる。顕著な複雑性または顕著な配列複雑性とは、核酸試料が顕著な数の独自の（すなわち、反復していない）配列を有することを意味する。顕著な配列複雑性の核酸試料は、少なくとも１×１０５ヌクレオチドの配列複雑性を有する。したがって、顕著な配列複雑性の核酸試料は、たとえば、少なくとも１×１０５ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０６ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０７ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性、または少なくとも１×１０９ヌクレオチドの配列複雑性を有しうる。核酸試料はまた、かなりの複雑性の核酸試料であることができる。かなりの複雑性またはかなりの配列複雑性とは、核酸試料がかなりの数の独自の（すなわち、反復していない）配列を有することを意味する。かなりの配列複雑性の核酸試料は、少なくとも１×１０４ヌクレオチドの配列複雑性を有する。したがって、顕著な配列複雑性の核酸試料は、たとえば、少なくとも１×１０４ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０５ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０６ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０７ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性、または少なくとも１×１０９ヌクレオチドの配列複雑性を有しうる。
【００９０】
核酸試料およびゲノム核酸試料は、少なくとも１×１０３ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０４ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０５ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０６ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０７ヌクレオチドの配列複雑性、少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性、または少なくとも１×１０９ヌクレオチドの配列複雑性を有しうる。
【００９１】
試料は本開示の方法において使用および操作することができる。たとえば、試料を、アルカリ性条件に曝露するか、または、溶解溶液または変性溶液と接触させるかまたは混合することができる。ここでは、試料という語は起源試料、本開示の方法に全部が用いられる試料、および本開示の方法に用いられる起源試料の一部の両方をいう。したがって、たとえば、アルカリ性条件に曝露される起源試料の一部は、試料自体と考えられる。試料の全部または一部をアルカリ性条件に曝露するか、または、溶解溶液または変性溶液と接触させるかまたは混合することができる。同様に、アルカリ性条件に曝露したか、または、溶解溶液または変性溶液と接触させたかまたは混合した試料の、全部または一部のｐＨを低下させることができ、または、アルカリ性条件に曝露したかまたは溶解溶液または変性溶液と接触させた試料の全部または一部を、安定化溶液と接触させるかまたは混合することができる。結果として生じる安定化したかまたは中性化した試料の全部または一部を、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることができる。増幅混合物は、安定化したかまたは中性化した試料の全部または一部を構成しうる。増幅混合物は、核酸が増幅されている反応溶液である。
【００９２】
Ｄ．プライマー
本開示の増幅法における使用のためのプライマーは、標的配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列を、プライマーの相補的部分という。プライマーの相補的部分は、プライマーと標的配列との間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを反応条件下で支持する任意の長さであることができる。一般的に、３７℃での反応のためには、これは長さ１０から３５ヌクレオチドまたは長さ１６から２４ヌクレオチドであることができる。一般的に、３０℃での反応のためには、これはたとえば、長さ５から２０ヌクレオチドまたは長さ６から８ヌクレオチドであることができる。全ゲノム増幅のためには、プライマーは、たとえば、長さ２ないし６０ヌクレオチドまたは長さ５から６０ヌクレオチドであることができ、および特に、長さ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および／または２０ヌクレオチドであることができる。プライマーはまた、たとえば、少なくとも長さ２ヌクレオチド、少なくとも長さ３ヌクレオチド、少なくとも長さ４ヌクレオチド、少なくとも長さ５ヌクレオチド、少なくとも長さ６ヌクレオチド、少なくとも長さ７ヌクレオチド、および／または少なくとも長さ８ヌクレオチドでありうる。増幅反応において用いられるプライマーは、すべて同一の長さであることが好ましいが、そうである必要は無い。
【００９３】
プライマーまたはランダムまたは縮重配列を用いるもの（すなわち、さまざまな配列を有するプライマーの集合の使用）といった、本開示の方法の一部の形式に関しては、プライマーハイブリダイゼーションは特異的である必要が無い。そのような場合には、プライマーは、合成をプライミングすることに有効でありさえすればよい。たとえば、全ゲノム増幅では、一般的に目的はすべての配列を等しく増幅することであるため、プライミングの特異性は必須ではない。ランダムまたは縮重プライマーの組は、長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および／または２０ヌクレオチドまたはそれ以上のプライマーから成ることができる。長さ６ヌクレオチドのプライマーを六量体プライマーと呼ぶ。全ゲノム増幅のための好ましいプライマーは、ａｒｅランダム六量体プライマー、たとえば、すべての可能な６ヌクレオチド配列がそのプライマーの組の中に発現されているランダム六量体プライマーである。同様に、他の特定の長さのまたは長さの混合物のランダムプライマーの組は、好ましくはそのプライマーの長さのすべての可能な配列、または、特に、そのプライマーの相補的部分の長さを含む。ランダムプライマーの使用は米国特許第５，０４３，２７２号明細書および米国特許第６，２１４，５８７号明細書に記載されている。
【００９４】
プライマーは、たとえば、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、または３０ヌクレオチドの長さを有しうる。プライマーは、たとえば、４ヌクレオチド未満、５ヌクレオチド未満、６ヌクレオチド未満、７ヌクレオチド未満、８ヌクレオチド未満、９ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満、１１ヌクレオチド未満、１２ヌクレオチド未満、１３ヌクレオチド未満、１４ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、１６ヌクレオチド未満、１７ヌクレオチド未満、１８ヌクレオチド未満、１９ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、２１ヌクレオチド未満、２２ヌクレオチド未満、２３ヌクレオチド未満、２４ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２６ヌクレオチド未満、２７ヌクレオチド未満、２８ヌクレオチド未満、２９ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、または３１ヌクレオチド未満の長さを有しうる。
【００９５】
核酸試料中の核酸分子とハイブリダイズする際は、プライマーは効率的な増幅を可能にする間隔でハイブリダイズするのが好ましい。これは一般的に、プライマーが合計して希望の間隔で核酸試料中の配列と相補的になるように、増幅反応にいくつかのプライマーを用いることによって達成できる。したがって、たとえば、単一の６塩基プライマーはある配列と平均して４０９６ヌクレオチド毎に１回相補的になり、２種類の６塩基プライマーはある配列と平均して２０４８ヌクレオチド毎に１回相補的になり、３種類の６塩基プライマーはある配列と平均して１０２４ヌクレオチド毎に１回相補的になり、４種類の６塩基プライマーはある配列と平均して５１２ヌクレオチド毎に１回相補的になり、５種類の６塩基プライマーはある配列と平均して２５６ヌクレオチド毎に１回相補的になり、６種類の６塩基プライマーはある配列と平均して１２８ヌクレオチド毎に１回相補的になり、７種類の６塩基プライマーはある配列と平均して６４ヌクレオチド毎に１回相補的になり、８種類の６塩基プライマーはある配列と平均して３２ヌクレオチド毎に１回相補的になり、９種類の６塩基プライマーはある配列と平均して１６ヌクレオチド毎に１回相補的になり、１０種類の６塩基プライマーはある配列と平均して８ヌクレオチド毎に１回相補的になる、などである。４種類の８塩基プライマーはある配列と平均して８１９２ヌクレオチド毎に１回相補的になり、５種類の８塩基プライマーはある配列と平均して４０９６ヌクレオチド毎に１回相補的になり、６種類の８塩基プライマーはある配列と平均して１０２４ヌクレオチド毎に１回相補的になり、７種類の８塩基プライマーはある配列と平均して５１２ヌクレオチド毎に１回相補的になり、８種類の８塩基プライマーはある配列と平均して２５６ヌクレオチド毎に１回相補的になり、９種類の８塩基プライマーはある配列と平均して１２８ヌクレオチド毎に１回相補的になり、１０種類の８塩基プライマーはある配列と平均して６４ヌクレオチド毎に１回相補的になり、１１種類の８塩基プライマーはある配列と平均して３２ヌクレオチド毎に１回相補的になり、１２種類の８塩基プライマーはある配列と平均して１６ヌクレオチド毎に１回相補的になり、１３種類の８塩基プライマーはある配列と平均して８ヌクレオチド毎に１回相補的になる、などである。
【００９６】
プライマーはまた、平均して、５，０００ヌクレオチド以下毎、４，０００ヌクレオチド以下毎、３，０００ヌクレオチド以下毎、２，５００ヌクレオチド以下毎、２，０００ヌクレオチド以下毎、１，５００ヌクレオチド以下毎、１，０００ヌクレオチド以下毎、９００ヌクレオチド以下毎、８００ヌクレオチド以下毎、７００ヌクレオチド以下毎、６００ヌクレオチド以下毎、５００ヌクレオチド以下毎、４００ヌクレオチド以下毎、３００ヌクレオチド以下毎、２００ヌクレオチド以下毎、１００ヌクレオチド以下毎、または５０ヌクレオチド以下毎に、平均して、核酸試料の核酸分子中に存在する配列と相補的であることができる。
【００９７】
これらの距離は配列のランダムな分布を仮定し、ランダムな分布はゲノム核酸試料といった高い複雑性の核酸試料について概ね正しい。これらの距離は４Ｎの関係から導かれ、ここでＮはプライマーに含まれる塩基の数である。その距離は、たとえば、核酸試料中のヌクレオチドのＧ＋Ｃ比率によって影響され、それは５０％以外のＧ＋Ｃ比率は特異的ヌクレオチド配列の分布の変化を有するためである。さらに、核酸試料の配列複雑性が低いほど、特異的ヌクレオチド配列の分布が変化する可能性が高い。しかし、これらの作用は増幅結果に大きく影響してはならない。より短いプライマーの使用はこれらの作用を最小化する。核酸試料のＧ＋Ｃ比率が５０％以外である場合、増幅に使用する各プライマー中に、またはプライマーの間で合計としてのどちらかで、同様のＧ＋Ｃ比率を有するプライマーを選択および／または設計することができる。
【００９８】
プライマー相補配列間の最適な間隔または分離（およびしたがって、プライマーの最適数）はすべてのＤＮＡポリメラーゼについて同一にはならず、それはこのパラメーターが正味の重合速度に依存するためである。連続性ＤＮＡポリメラーゼは、毎秒５ないし３００ヌクレオチドの範囲になりうる、および補助ｓｓＤＮＡ結合タンパク質およびヘリカーゼの存在または非存在によって影響されうる、特徴的な重合速度を有する。非連続性ポリメラーゼの場合には、より高濃度では再開始現象がより多く生じおよびしたがって正味の重合速度が上昇するため、正味の重合速度は酵素濃度に依存する。連続性ポリメラーゼの一例はφ２９ＤＮＡポリメラーゼであり、これは毎秒５０ヌクレオチド進む。非連続性ポリメラーゼの一例はベント（Ｖｅｎｔ）エキソ（−）ＤＮＡポリメラーゼであり、これは低濃度では毎秒４ヌクレオチド、または高濃度では毎秒１６ヌクレオチドの有効重合速度を与える。
【００９９】
本開示の方法において最適の収率を得るためには、プライマーの数およびその組成を、使用するポリメラーゼに適するように調製することができる。速い重合速度を有するポリメラーゼを用いる場合には、１または少数のプライマーの使用が好ましい。より遅い重合速度を有するポリメラーゼを用いる場合には、より多くのプライマーの使用が好ましい。下記の測定法は、任意のポリメラーゼについて最適の間隔を決定するのに用いることができる。本測定法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０種類のプライマーの、ある組み合わせを用いる。新しいプライマーのそれぞれが、増幅すべき核酸中の相補配列間の平均距離を減少させる。プライマーの数は、ある範囲のプライマー数の間で系統的に変化させることができる（プライマー結合部位間の平均距離は、使用するプライマーの数に伴って変動する）。異なる数のプライマーを用いて同一の核酸試料を増幅する、一連の反応を実施することができる。ＤＮＡの最も高い実験収率および／または増幅産物の最高品質を生じるプライマー数が、使用しているその特定のＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ＋補助タンパク質の組み合わせのための最適プライマー数である。
【０１００】
核酸分子中の、プライマーがハイブリダイズする部位で開始されたＤＮＡ複製は、隣接する部位でハイブリダイズしたプライマーから増幅されている鎖まで伸長して、それを置換する。隣接する鎖の置換は、それを別のプライマーとのハイブリダイゼーションおよびその後のもう一回の複製の開始のために利用可能にする。この過程をここでは鎖置換複製と呼ぶ。
【０１０１】
異なるヌクレオチド配列のプライマーの任意の希望する数を使用することができるが、しかし１または少数のプライマーの使用が好ましい。増幅反応たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７種類のプライマーを用いて実施することができる。より多くのプライマーを用いることができる。使用することができるプライマーの数に原理的な上限は無い。しかし、より少数のプライマーの使用が好ましい。複数のプライマーを使用する場合は、プライマーはそれぞれ異なる特異的ヌクレオチド配列を有すべきである。
【０１０２】
増幅反応は、単一のプライマーを用いて、および、たとえば、追加のプライマー無しで、１種類の追加のプライマーを用いて、２種類の追加のプライマーを用いて、３種類の追加のプライマーを用いて、４種類の追加のプライマーを用いて、５種類の追加のプライマーを用いて、６種類の追加のプライマーを用いて、７種類の追加のプライマーを用いて、８種類の追加のプライマーを用いて、９種類の追加のプライマーを用いて、１０種類の追加のプライマーを用いて、１１種類の追加のプライマーを用いて、１２種類の追加のプライマーを用いて、１３種類の追加のプライマーを用いて、１４種類の追加のプライマーを用いて、１５種類の追加のプライマーを用いて、１６種類の追加のプライマーを用いて、１７種類の追加のプライマーを用いて、１８種類の追加のプライマーを用いて、１９種類の追加のプライマーを用いて、２０種類の追加のプライマーを用いて、２１種類の追加のプライマーを用いて、２２種類の追加のプライマーを用いて、２３種類の追加のプライマーを用いて、２４種類の追加のプライマーを用いて、２５種類の追加のプライマーを用いて、２６種類の追加のプライマーを用いて、２７種類の追加のプライマーを用いて、２８種類の追加のプライマーを用いて、２９種類の追加のプライマーを用いて、３０種類の追加のプライマーを用いて、３１種類の追加のプライマーを用いて、３２種類の追加のプライマーを用いて、３３種類の追加のプライマーを用いて、３４種類の追加のプライマーを用いて、３５種類の追加のプライマーを用いて、３６種類の追加のプライマーを用いて、３７種類の追加のプライマーを用いて、３８種類の追加のプライマーを用いて、３９種類の追加のプライマーを用いて、４０種類の追加のプライマーを用いて、４１種類の追加のプライマーを用いて、４２種類の追加のプライマーを用いて、４３種類の追加のプライマーを用いて、４４種類の追加のプライマーを用いて、４５種類の追加のプライマーを用いて、４６種類の追加のプライマーを用いて、４７種類の追加のプライマーを用いて、４８種類の追加のプライマーを用いて、４９種類の追加のプライマーを用いて、５０種類の追加のプライマーを用いて、５１種類の追加のプライマーを用いて、５２種類の追加のプライマーを用いて、５３種類の追加のプライマーを用いて、５４種類の追加のプライマーを用いて、５５種類の追加のプライマーを用いて、５６種類の追加のプライマーを用いて、５７種類の追加のプライマーを用いて、５８種類の追加のプライマーを用いて、５９種類の追加のプライマーを用いて、６０種類の追加のプライマーを用いて、６１種類の追加のプライマーを用いて、６２種類の追加のプライマーを用いて、６３種類の追加のプライマーを用いて、６４種類の追加のプライマーを用いて、６５種類の追加のプライマーを用いて、６６種類の追加のプライマーを用いて、６７種類の追加のプライマーを用いて、６８種類の追加のプライマーを用いて、６９種類の追加のプライマーを用いて、７０種類の追加のプライマーを用いて、７１種類の追加のプライマーを用いて、７２種類の追加のプライマーを用いて、７３種類の追加のプライマーを用いて、７４種類の追加のプライマーを用いて、７５種類の追加のプライマーを用いて、７６種類の追加のプライマーを用いて、７７種類の追加のプライマーを用いて、７８種類の追加のプライマーを用いて、７９種類の追加のプライマーを用いて、８０種類の追加のプライマーを用いて、８１種類の追加のプライマーを用いて、８２種類の追加のプライマーを用いて、８３種類の追加のプライマーを用いて、８４種類の追加のプライマーを用いて、８５種類の追加のプライマーを用いて、８６種類の追加のプライマーを用いて、８７種類の追加のプライマーを用いて、８８種類の追加のプライマーを用いて、８９種類の追加のプライマーを用いて、９０種類の追加のプライマーを用いて、９１種類の追加のプライマーを用いて、９２種類の追加のプライマーを用いて、９３種類の追加のプライマーを用いて、９４種類の追加のプライマーを用いて、９５種類の追加のプライマーを用いて、９６種類の追加のプライマーを用いて、９７種類の追加のプライマーを用いて、９８種類の追加のプライマーを用いて、９９種類の追加のプライマーを用いて、１００種類の追加のプライマーを用いて、１１０種類の追加のプライマーを用いて、１２０種類の追加のプライマーを用いて、１３０種類の追加のプライマーを用いて、１４０種類の追加のプライマーを用いて、１５０種類の追加のプライマーを用いて、１６０種類の追加のプライマーを用いて、１７０種類の追加のプライマーを用いて、１８０種類の追加のプライマーを用いて、１９０種類の追加のプライマーを用いて、２００種類の追加のプライマーを用いて、２１０種類の追加のプライマーを用いて、２２０種類の追加のプライマーを用いて、２３０種類の追加のプライマーを用いて、２４０種類の追加のプライマーを用いて、２５０種類の追加のプライマーを用いて、２６０種類の追加のプライマーを用いて、２７０種類の追加のプライマーを用いて、２８０種類の追加のプライマーを用いて、２９０種類の追加のプライマーを用いて、３００種類の追加のプライマーを用いて、３１０種類の追加のプライマーを用いて、３２０種類の追加のプライマーを用いて、３３０種類の追加のプライマーを用いて、３４０種類の追加のプライマーを用いて、３５０種類の追加のプライマーを用いて、３６０種類の追加のプライマーを用いて、３７０種類の追加のプライマーを用いて、３８０種類の追加のプライマーを用いて、３９０種類の追加のプライマーを用いて、４００種類の追加のプライマーを用いて、４１０種類の追加のプライマーを用いて、４２０種類の追加のプライマーを用いて、４３０種類の追加のプライマーを用いて、４４０種類の追加のプライマーを用いて、４５０種類の追加のプライマーを用いて、４６０種類の追加のプライマーを用いて、４７０種類の追加のプライマーを用いて、４８０種類の追加のプライマーを用いて、４９０種類の追加のプライマーを用いて、５００種類の追加のプライマーを用いて、５５０種類の追加のプライマーを用いて、６００種類の追加のプライマーを用いて、６５０種類の追加のプライマーを用いて、７００種類の追加のプライマーを用いて、７５０種類の追加のプライマーを用いて、８００種類の追加のプライマーを用いて、８５０種類の追加のプライマーを用いて、９００種類の追加のプライマーを用いて、９５０種類の追加のプライマーを用いて、１，０００種類の追加のプライマーを用いて、１，１００種類の追加のプライマーを用いて、１，２００種類の追加のプライマーを用いて、１，３００種類の追加のプライマーを用いて、１，４００種類の追加のプライマーを用いて、１，５００種類の追加のプライマーを用いて、１，６００種類の追加のプライマーを用いて、１，７００種類の追加のプライマーを用いて、１，８００種類の追加のプライマーを用いて、１，９００種類の追加のプライマーを用いて、２，０００種類の追加のプライマーを用いて、２，１００種類の追加のプライマーを用いて、２，２００種類の追加のプライマーを用いて、２，３００種類の追加のプライマーを用いて、２，４００種類の追加のプライマーを用いて、２，５００種類の追加のプライマーを用いて、２，６００種類の追加のプライマーを用いて、２，７００種類の追加のプライマーを用いて、２，８００種類の追加のプライマーを用いて、２，９００種類の追加のプライマーを用いて、３，０００種類の追加のプライマーを用いて、３，５００種類の追加のプライマーを用いて、または４，０００種類の追加のプライマーを用いて、実施することができる。
【０１０３】
増幅反応は、単一のプライマーを用いて、および、たとえば、追加のプライマー無しで、２種類未満の追加のプライマーを用いて、３種類未満の追加のプライマーを用いて、４種類未満の追加のプライマーを用いて、５種類未満の追加のプライマーを用いて、６種類未満の追加のプライマーを用いて、７種類未満の追加のプライマーを用いて、８種類未満の追加のプライマーを用いて、９種類未満の追加のプライマーを用いて、１０種類未満の追加のプライマーを用いて、１１種類未満の追加のプライマーを用いて、１２種類未満の追加のプライマーを用いて、１３種類未満の追加のプライマーを用いて、１４種類未満の追加のプライマーを用いて、１５種類未満の追加のプライマーを用いて、１６種類未満の追加のプライマーを用いて、１７種類未満の追加のプライマーを用いて、１８種類未満の追加のプライマーを用いて、１９種類未満の追加のプライマーを用いて、２０種類未満の追加のプライマーを用いて、２１種類未満の追加のプライマーを用いて、２２種類未満の追加のプライマーを用いて、２３種類未満の追加のプライマーを用いて、２４種類未満の追加のプライマーを用いて、２５種類未満の追加のプライマーを用いて、２６種類未満の追加のプライマーを用いて、２７種類未満の追加のプライマーを用いて、２８種類未満の追加のプライマーを用いて、２９種類未満の追加のプライマーを用いて、３０種類未満の追加のプライマーを用いて、３１種類未満の追加のプライマーを用いて、３２種類未満の追加のプライマーを用いて、３３種類未満の追加のプライマーを用いて、３４種類未満の追加のプライマーを用いて、３５種類未満の追加のプライマーを用いて、３６種類未満の追加のプライマーを用いて、３７種類未満の追加のプライマーを用いて、３８種類未満の追加のプライマーを用いて、３９種類未満の追加のプライマーを用いて、４０種類未満の追加のプライマーを用いて、４１種類未満の追加のプライマーを用いて、４２種類未満の追加のプライマーを用いて、４３種類未満の追加のプライマーを用いて、４４種類未満の追加のプライマーを用いて、４５種類未満の追加のプライマーを用いて、４６種類未満の追加のプライマーを用いて、４７種類未満の追加のプライマーを用いて、４８種類未満の追加のプライマーを用いて、４９種類未満の追加のプライマーを用いて、５０種類未満の追加のプライマーを用いて、５１種類未満の追加のプライマーを用いて、５２種類未満の追加のプライマーを用いて、５３種類未満の追加のプライマーを用いて、５４種類未満の追加のプライマーを用いて、５５種類未満の追加のプライマーを用いて、５６種類未満の追加のプライマーを用いて、５７種類未満の追加のプライマーを用いて、５８種類未満の追加のプライマーを用いて、５９種類未満の追加のプライマーを用いて、６０種類未満の追加のプライマーを用いて、６１種類未満の追加のプライマーを用いて、６２種類未満の追加のプライマーを用いて、６３種類未満の追加のプライマーを用いて、６４種類未満の追加のプライマーを用いて、６５種類未満の追加のプライマーを用いて、６６種類未満の追加のプライマーを用いて、６７種類未満の追加のプライマーを用いて、６８種類未満の追加のプライマーを用いて、６９種類未満の追加のプライマーを用いて、７０種類未満の追加のプライマーを用いて、７１種類未満の追加のプライマーを用いて、７２種類未満の追加のプライマーを用いて、７３種類未満の追加のプライマーを用いて、７４種類未満の追加のプライマーを用いて、７５種類未満の追加のプライマーを用いて、７６種類未満の追加のプライマーを用いて、７７種類未満の追加のプライマーを用いて、７８種類未満の追加のプライマーを用いて、７９種類未満の追加のプライマーを用いて、８０種類未満の追加のプライマーを用いて、８１種類未満の追加のプライマーを用いて、８２種類未満の追加のプライマーを用いて、８３種類未満の追加のプライマーを用いて、８４種類未満の追加のプライマーを用いて、８５種類未満の追加のプライマーを用いて、８６種類未満の追加のプライマーを用いて、８７種類未満の追加のプライマーを用いて、８８種類未満の追加のプライマーを用いて、８９種類未満の追加のプライマーを用いて、９０種類未満の追加のプライマーを用いて、９１種類未満の追加のプライマーを用いて、９２種類未満の追加のプライマーを用いて、９３種類未満の追加のプライマーを用いて、９４種類未満の追加のプライマーを用いて、９５種類未満の追加のプライマーを用いて、９６種類未満の追加のプライマーを用いて、９７種類未満の追加のプライマーを用いて、９８種類未満の追加のプライマーを用いて、９９種類未満の追加のプライマーを用いて、１００種類未満の追加のプライマーを用いて、１１０種類未満の追加のプライマーを用いて、１２０種類未満の追加のプライマーを用いて、１３０種類未満の追加のプライマーを用いて、１４０種類未満の追加のプライマーを用いて、１５０種類未満の追加のプライマーを用いて、１６０種類未満の追加のプライマーを用いて、１７０種類未満の追加のプライマーを用いて、１８０種類未満の追加のプライマーを用いて、１９０種類未満の追加のプライマーを用いて、２００種類未満の追加のプライマーを用いて、２１０種類未満の追加のプライマーを用いて、２２０種類未満の追加のプライマーを用いて、２３０種類未満の追加のプライマーを用いて、２４０種類未満の追加のプライマーを用いて、２５０種類未満の追加のプライマーを用いて、２６０種類未満の追加のプライマーを用いて、２７０種類未満の追加のプライマーを用いて、２８０種類未満の追加のプライマーを用いて、２９０種類未満の追加のプライマーを用いて、３００種類未満の追加のプライマーを用いて、３１０種類未満の追加のプライマーを用いて、３２０種類未満の追加のプライマーを用いて、３３０種類未満の追加のプライマーを用いて、３４０種類未満の追加のプライマーを用いて、３５０種類未満の追加のプライマーを用いて、３６０種類未満の追加のプライマーを用いて、３７０種類未満の追加のプライマーを用いて、３８０種類未満の追加のプライマーを用いて、３９０種類未満の追加のプライマーを用いて、４００種類未満の追加のプライマーを用いて、４１０種類未満の追加のプライマーを用いて、４２０種類未満の追加のプライマーを用いて、４３０種類未満の追加のプライマーを用いて、４４０種類未満の追加のプライマーを用いて、４５０種類未満の追加のプライマーを用いて、４６０種類未満の追加のプライマーを用いて、４７０種類未満の追加のプライマーを用いて、４８０種類未満の追加のプライマーを用いて、４９０種類未満の追加のプライマーを用いて、５００種類未満の追加のプライマーを用いて、５５０種類未満の追加のプライマーを用いて、６００種類未満の追加のプライマーを用いて、６５０種類未満の追加のプライマーを用いて、７００種類未満の追加のプライマーを用いて、７５０種類未満の追加のプライマーを用いて、８００種類未満の追加のプライマーを用いて、８５０種類未満の追加のプライマーを用いて、９００種類未満の追加のプライマーを用いて、９５０種類未満の追加のプライマーを用いて、１，０００種類未満の追加のプライマーを用いて、１，１００種類未満の追加のプライマーを用いて、１，２００種類未満の追加のプライマーを用いて、１，３００種類未満の追加のプライマーを用いて、１，４００種類未満の追加のプライマーを用いて、１，５００種類未満の追加のプライマーを用いて、１，６００種類未満の追加のプライマーを用いて、１，７００種類未満の追加のプライマーを用いて、１，８００種類未満の追加のプライマーを用いて、１，９００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，０００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，１００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，２００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，３００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，４００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，５００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，６００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，７００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，８００種類未満の追加のプライマーを用いて、２，９００種類未満の追加のプライマーを用いて、３，０００種類未満の追加のプライマーを用いて、３，５００種類未満の追加のプライマーを用いて、または４，０００種類未満の追加のプライマーを用いて、実施することができる。
【０１０４】
増幅反応は、たとえば、２種類未満のプライマーを用いて、３種類未満のプライマーを用いて、４種類未満のプライマーを用いて、５種類未満のプライマーを用いて、６種類未満のプライマーを用いて、７種類未満のプライマーを用いて、８種類未満のプライマーを用いて、９種類未満のプライマーを用いて、１０種類未満のプライマーを用いて、１１種類未満のプライマーを用いて、１２種類未満のプライマーを用いて、１３種類未満のプライマーを用いて、１４種類未満のプライマーを用いて、１５種類未満のプライマーを用いて、１６種類未満のプライマーを用いて、１７種類未満のプライマーを用いて、１８種類未満のプライマーを用いて、１９種類未満のプライマーを用いて、２０種類未満のプライマーを用いて、２１種類未満のプライマーを用いて、２２種類未満のプライマーを用いて、２３種類未満のプライマーを用いて、２４種類未満のプライマーを用いて、２５種類未満のプライマーを用いて、２６種類未満のプライマーを用いて、２７種類未満のプライマーを用いて、２８種類未満のプライマーを用いて、２９種類未満のプライマーを用いて、３０種類未満のプライマーを用いて、３１種類未満のプライマーを用いて、３２種類未満のプライマーを用いて、３３種類未満のプライマーを用いて、３４種類未満のプライマーを用いて、３５種類未満のプライマーを用いて、３６種類未満のプライマーを用いて、３７種類未満のプライマーを用いて、３８種類未満のプライマーを用いて、３９種類未満のプライマーを用いて、４０種類未満のプライマーを用いて、４１種類未満のプライマーを用いて、４２種類未満のプライマーを用いて、４３種類未満のプライマーを用いて、４４種類未満のプライマーを用いて、４５種類未満のプライマーを用いて、４６種類未満のプライマーを用いて、４７種類未満のプライマーを用いて、４８種類未満のプライマーを用いて、４９種類未満のプライマーを用いて、５０種類未満のプライマーを用いて、５１種類未満のプライマーを用いて、５２種類未満のプライマーを用いて、５３種類未満のプライマーを用いて、５４種類未満のプライマーを用いて、５５種類未満のプライマーを用いて、５６種類未満のプライマーを用いて、５７種類未満のプライマーを用いて、５８種類未満のプライマーを用いて、５９種類未満のプライマーを用いて、６０種類未満のプライマーを用いて、６１種類未満のプライマーを用いて、６２種類未満のプライマーを用いて、６３種類未満のプライマーを用いて、６４種類未満のプライマーを用いて、６５種類未満のプライマーを用いて、６６種類未満のプライマーを用いて、６７種類未満のプライマーを用いて、６８種類未満のプライマーを用いて、６９種類未満のプライマーを用いて、７０種類未満のプライマーを用いて、７１種類未満のプライマーを用いて、７２種類未満のプライマーを用いて、７３種類未満のプライマーを用いて、７４種類未満のプライマーを用いて、７５種類未満のプライマーを用いて、７６種類未満のプライマーを用いて、７７種類未満のプライマーを用いて、７８種類未満のプライマーを用いて、７９種類未満のプライマーを用いて、８０種類未満のプライマーを用いて、８１種類未満のプライマーを用いて、８２種類未満のプライマーを用いて、８３種類未満のプライマーを用いて、８４種類未満のプライマーを用いて、８５種類未満のプライマーを用いて、８６種類未満のプライマーを用いて、８７種類未満のプライマーを用いて、８８種類未満のプライマーを用いて、８９種類未満のプライマーを用いて、９０種類未満のプライマーを用いて、９１種類未満のプライマーを用いて、９２種類未満のプライマーを用いて、９３種類未満のプライマーを用いて、９４種類未満のプライマーを用いて、９５種類未満のプライマーを用いて、９６種類未満のプライマーを用いて、９７種類未満のプライマーを用いて、９８種類未満のプライマーを用いて、９９種類未満のプライマーを用いて、１００種類未満のプライマーを用いて、１１０種類未満のプライマーを用いて、１２０種類未満のプライマーを用いて、１３０種類未満のプライマーを用いて、１４０種類未満のプライマーを用いて、１５０種類未満のプライマーを用いて、１６０種類未満のプライマーを用いて、１７０種類未満のプライマーを用いて、１８０種類未満のプライマーを用いて、１９０種類未満のプライマーを用いて、２００種類未満のプライマーを用いて、２１０種類未満のプライマーを用いて、２２０種類未満のプライマーを用いて、２３０種類未満のプライマーを用いて、２４０種類未満のプライマーを用いて、２５０種類未満のプライマーを用いて、２６０種類未満のプライマーを用いて、２７０種類未満のプライマーを用いて、２８０種類未満のプライマーを用いて、２９０種類未満のプライマーを用いて、３００種類未満のプライマーを用いて、３１０種類未満のプライマーを用いて、３２０種類未満のプライマーを用いて、３３０種類未満のプライマーを用いて、３４０種類未満のプライマーを用いて、３５０種類未満のプライマーを用いて、３６０種類未満のプライマーを用いて、３７０種類未満のプライマーを用いて、３８０種類未満のプライマーを用いて、３９０種類未満のプライマーを用いて、４００種類未満のプライマーを用いて、４１０種類未満のプライマーを用いて、４２０種類未満のプライマーを用いて、４３０種類未満のプライマーを用いて、４４０種類未満のプライマーを用いて、４５０種類未満のプライマーを用いて、４６０種類未満のプライマーを用いて、４７０種類未満のプライマーを用いて、４８０種類未満のプライマーを用いて、４９０種類未満のプライマーを用いて、５００種類未満のプライマーを用いて、５５０種類未満のプライマーを用いて、６００種類未満のプライマーを用いて、６５０種類未満のプライマーを用いて、７００種類未満のプライマーを用いて、７５０種類未満のプライマーを用いて、８００種類未満のプライマーを用いて、８５０種類未満のプライマーを用いて、９００種類未満のプライマーを用いて、９５０種類未満のプライマーを用いて、１，０００種類未満のプライマーを用いて、１，１００種類未満のプライマーを用いて、１，２００種類未満のプライマーを用いて、１，３００種類未満のプライマーを用いて、１，４００種類未満のプライマーを用いて、１，５００種類未満のプライマーを用いて、１，６００種類未満のプライマーを用いて、１，７００種類未満のプライマーを用いて、１，８００種類未満のプライマーを用いて、１，９００種類未満のプライマーを用いて、２，０００種類未満のプライマーを用いて、２，１００種類未満のプライマーを用いて、２，２００種類未満のプライマーを用いて、２，３００種類未満のプライマーを用いて、２，４００種類未満のプライマーを用いて、２，５００種類未満のプライマーを用いて、２，６００種類未満のプライマーを用いて、２，７００種類未満のプライマーを用いて、２，８００種類未満のプライマーを用いて、２，９００種類未満のプライマーを用いて、３，０００種類未満のプライマーを用いて、３，５００種類未満のプライマーを用いて、または４，０００種類未満のプライマーを用いて、実施することができる。
【０１０５】
本開示の方法において用いられるプライマーは、特定の望ましい性質および機能上の特性を持つように、選択および／または設計することができる。プライマー選択およびプライマー設計の目的は、より良い増幅結果を得ることでありうる。たとえば、最高の増幅収率（すなわち、核酸の量における最高の増加量）、増幅された核酸における最良の遺伝子座または配列発現量（すなわち、目的の遺伝子座および配列に関して、１００％に最も近い遺伝子座または配列発現量）、および／または最低の増幅偏りを結果として生じる、特定のプライマーを選択することができる。これは、特定のプライマーを増幅反応において、目的の核酸試料を用いて試験することによって決定できる。異なるプライマーが、異なる核酸試料について最適の結果を生じうる。しかし、ここに記載のプライマー数およびプライマー組成の原則は、ほとんどすべての核酸試料について良好な増幅結果を一般的に生じる。本開示のプライマーおよび方法のこの広範囲の有用性は、本開示のプライマーおよび方法の有用な特性である。
【０１０６】
希望の品質の増幅産物を生じるプライマーを、ここでは広カバー率プライマーと呼ぶ。一般的に、広カバー率プライマー（または、一緒に使用する場合は、プライマー）は、少なくとも１０％の遺伝子座発現量を少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１０％の配列発現量を少なくとも５個の異なる標的配列に関して、５０倍未満の増幅偏りを、５０倍未満の増幅偏りを少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、および／または５０倍未満の増幅偏りを少なくとも５個の異なる標的配列に関して、生じることができる。プライマーはまた、たとえば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座発現量を、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。プライマーはまた、たとえば、少なくとも１０％の遺伝子座発現量を、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。
【０１０７】
プライマーはまた、たとえば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の配列発現量を、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じることができる。プライマーはまた、たとえば、少なくとも１０％の遺伝子座発現量を、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じることができる。
【０１０８】
プライマーはまた、たとえば、４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍、または４倍未満の増幅偏りを生じることができる。プライマーはまた、たとえば、５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。プライマーはまた、たとえば、５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる標的配列に関して、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じることができる。
【０１０９】
これらの結果は、さまざまな核酸試料にわたる、ある選択された種類の核酸試料に関する、またはある特定の種類の核酸試料に関することができる。したがって、広カバー率プライマーは、たとえば、特定の種類の核酸試料について用いられる場合、選択された種類の核酸試料について用いられる場合、またはさまざまな核酸試料または一般的に核酸試料について用いられる場合、広カバー率プライマーでありうる。したがって、広カバー率プライマーという意味は一般的に関係する核酸試料に依存し、およびまた使用するＤＮＡポリメラーゼおよび使用する条件にも依存しうる。
【０１１０】
プライマー選択および設計に関して、上記および本文中で別に記載の通り、プライマーは（使用するプライマーの長さおよび数において）、核酸試料中のヌクレオチド配列中で平均して一定の間隔でハイブリダイズするように設計することができる。プライマー相補部位の配分はまた、核酸試料中で何回も反復される配列と相補的であるプライマー配列を選択することによっても達成しうる。そのような配列は、マイクロサテライト配列、ミニサテライト配列、サテライト配列、トランスポゾン配列、リボソームＲＮＡ配列、短い核散在配列（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｌｅｍｅｎｔ （ＳＩＮＥ））、または長い核散在配列（ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＬＩＮＥ）といった古典的反復配列；およびプロモーター配列、エンハンサー配列、サイレンサー配列、上流調節配列、転写終止部位配列、トランスポゾン調節配列、リボソームＲＮＡ調節配列、またはポリアデニル化部位配列といった機能共通配列を含む。たとえば、プライマー配列は、Ａｌｕ反復配列中の配列と相補的になるように選択することができる。具体的な例として、プライマーは配列ＡＧＴＧＧＧまたはＡＧＡＧＡＧのうちの１つ；配列ＡＧＣＣＧＧ、ＡＧＴＡＧＧ、またはＡＧＴＴＧＧのうちの１つ；配列ＡＧＧＣＧＧ、ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、またはＡＧＴＧＡＧのうちの１つ；配列ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＴＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうちの１つ；配列ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうちの１つ；配列ＡＧＴＡＧＧ、ＡＧＧＴＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＡＣＡＧ、またはＡＧＴＧＡＧ；ＡＧＧＡＧＧ、ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＣＧＡＧ；または配列ＣＧＧＴＧＧ、ＴＣＡＣＧＣ、ＣＧＡＧＣＧ、ＧＣＧＴＧＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＡＡＴＣＧＣ、ＣＧＧＡＧＧ、ＣＣＧＡＧＡ、ＧＡＴＣＧＣ、ＡＧＡＧＣＧ、ＡＧＣＧＡＧ、またはＡＣＴＣＣＧのうちの１つを有しうる。反応に用いる複数のプライマーは、たとえば、Ａｌｕ反復配列中の異なる配列と相補的な、異なる配列を有しうる。具体的な例として、各プライマーは配列ＡＧＴＧＧＧまたはＡＧＡＧＡＧのうちの異なる１つ；配列ＡＧＣＣＧＧ、ＡＧＴＡＧＧ、またはＡＧＴＴＧＧのうちの異なる１つ；配列ＡＧＧＣＧＧ、ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、またはＡＧＴＧＡＧのうちの異なる１つ；配列ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＴＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうちの異なる１つ；配列ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうちの異なる１つ；配列ＡＧＴＡＧＧ、ＡＧＧＴＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＡＣＡＧ、またはＡＧＴＧＡＧ；ＡＧＧＡＧＧ、ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＣＧＡＧ；または配列ＣＧＧＴＧＧ、ＴＣＡＣＧＣ、ＣＧＡＧＣＧ、ＧＣＧＴＧＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＡＡＴＣＧＣ、ＣＧＧＡＧＧ、ＣＣＧＡＧＡ、ＧＡＴＣＧＣ、ＡＧＡＧＣＧ、ＡＧＣＧＡＧ、またはＡＣＴＣＣＧのうちの異なる１つを有する。
【０１１１】
使用するプライマーのヌクレオチド配列および組成はまた、増幅を最適化するように選択することもできる。たとえば、プライマーのＧ＋Ｃ比率は、増幅すべき核酸試料のＧ＋Ｃ比率に基づいて選択することができる。プライマーは、たとえば、核酸試料のＧ＋Ｃ比率の２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％、または１％以内のＧ＋Ｃ比率を有しうる。ここでは、Ｇ＋Ｃ比率とは、任意の核酸分子、核酸配列、核酸試料、または他の核酸組成物に含まれるグアノシン（Ｇ）残基またはシチジン（Ｃ）残基のどちらかであるヌクレオチドの合計のパーセントをいう。
【０１１２】
プライマーはまた、たとえば、増幅収率を高めおよびアーティファクトの産生またはアーティファクト増幅を低減することができる、他の特徴を持つことができる。たとえば、プライマー二量体アーティファクトの生成は、プライマー間でまたは同一のプライマー内でのどちらかで相補的である３’末端配列を回避するようにプライマーを設計することによって低減することができる。そのような回避すべき配列は、内部相補的３’末端と呼ぶことができる。プライマーがアーティファクト増幅を回避する能力の有用な指標は、プライマーが核酸試料を含まない増幅反応に用いられた際に、増幅（すなわち、生じた核酸）が無いかまたは相対的に微量であることである。
【０１１３】
本開示のプライマーは１つ以上の修飾ヌクレオチドを有しうる。そのようなプライマーをここでは修飾プライマーと呼ぶ。修飾プライマーはいくつかの長所を有する。まず、ＲＮＡ／２’−Ｏ−メチルＲＮＡキメラプライマーといった、一部の種類の修飾プライマーは、ＤＮＡプライマーよりも高い融点（Ｔｍ）を有する。このことはプライマーハイブリダイゼーションの安定性を高め、およびプライマーによる鎖侵入を増加させる。これはより効率的なプライミングに繋がる。また、そのプライマーはＲＮＡでできているため、エキソヌクレアーゼ耐性となる。そのようなプライマーはまた、５’末端で副溝結合因子を用いてタグ化した場合、テンプレートｄｓＤＮＡのより良い鎖侵入を示すようになる。加えて、ＲＮＡプライマーはまた、細胞または組織といった生物学的試料からのＷＧＡのために非常に有用になりうる。生物学的試料は内因性ＲＮＡを含むため、ＲＮａｓｅを用いてこのＲＮＡを分解してランダムオリゴマーのプールを生じることができ、それを次いでＤＮＡの増幅のためにポリメラーゼをプライミングするのに用いることができる。このことはプライマーを反応へ加える必要性を無くす。代替的に、生物学的試料のＤＮａｓｅ消化は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ増幅のためのＤＮＡオリゴプライマーのプールを生じることができる。
【０１１４】
キメラプライマーもまた使用することができる。キメラプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方、リボヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、または異なる２種類の修飾ヌクレオチドといった、少なくとも２種類のヌクレオチドを有するプライマーである。キメラプライマーの１種類はペプチド核酸／核酸プライマーである。たとえば、５’−ＰＮＡ−ＤＮＡ−３’または５’−ＰＮＡ−ＲＮＡ−３’プライマーを、より効率的な鎖侵入および重合侵入に用いることができる。そのようなプライマーのＤＮＡおよびＲＮＡ部分はランダムまたは縮重配列を有しうる。他の種類のキメラプライマーは、たとえば、５’−（２’−Ｏ−メチル）ＲＮＡ−ＲＮＡ−３’または５’−（２’−Ｏ−メチル）ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’である。
【０１１５】
多数の修飾ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）が既知であり、およびオリゴヌクレオチドに用いることができる。ヌクレオチドアナログとは、塩基、糖、またはリン酸部分のどれかに何らかの種類の修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分への修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、およびウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、および２−アミノアデニン−９−イルといった別のプリンまたはピリミジン塩基の天然および合成の修飾を含む。修飾塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含むがそれらに限定されない。他の塩基修飾は、たとえば米国特許第３，６８７，８０８号明細書、エングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ）他，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、およびサングヴィ（Ｓａｎｇｈｖｉ），Ｙ．Ｓ．，『アンチセンス研究および応用』（ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）１５章 ２８９〜３０２ページ（クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｓ．Ｔ．およびレブルー（Ｌｅｂｌｅｕ），Ｂ．編、ＣＲＣプレス社（ＣＲＣＰｒｅｓｓ），１９９３）に見出すことができる。ある種のヌクレオチドアナログ、たとえば、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンは、二重鎖構成の安定性を高めることができる。他の修飾塩基は、ユニバーサル塩基として機能するものである。ユニバーサル塩基は３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールを含む。ユニバーサル塩基は通常の塩基を置換するがしかし塩基対形成に偏りを有しない。すなわち、ユニバーサル塩基は任意の他の塩基と塩基対形成することができる。全部または一部がユニバーサル塩基を含むヌクレオチドで構成されたプライマーは、標的試料中の反復配列に対する増幅偏りを低減または消失させるために有用である。このことは、たとえば、増幅産物における配列複雑性の消失が望ましくない場合に有用となる。塩基修飾はしばしば、二重鎖安定性の増大といった独自の特性を達成するために、たとえば２’−Ｏ−メトキシエチルといった糖修飾と組み合わせることがで��る。多数の米国特許、たとえば第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第および第５，６８１，９４１号があり、それらはさまざまな塩基修飾を詳述および説明する。これらの特許のそれぞれは参照により本開示に含まれる。
【０１１６】
ヌクレオチドアナログはまた、糖部分の修飾を含みうる。糖部分への修飾は、リボースおよびデオキシリボースへの天然の修飾、および合成修飾を含む。糖修飾は、下記の２’位での修飾を含むがそれらに限定されない：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルであって、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換Ｃ１からＣ１０、アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルでありうる。２’糖修飾はまた、−Ｏ[（ＣＨ２）ｎＯ]ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ[（ＣＨ２）ｎＣＨ３）]２を含むがそれらに限定されず、ここでｎおよびｍは１ないし約１０である。
【０１１７】
２’位での他の修飾は下記を含むがそれらに限定されない：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、割り込み物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。同様の修飾はまた、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドのまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、または５’末端ヌクレオチドの５’位で行うことができる。修飾糖はまた、架橋環の酸素でのＣＨ２およびＳのような修飾を含むものを含む。ヌクレオチド糖アナログはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分といった糖ミメティックを持つことができる。多数の米国特許、たとえば第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号が、そのような修飾糖構造の調製を教示し、そのそれぞれが、全体が参照により本開示に含まれる。
【０１１８】
ヌクレオチドアナログはまたリン酸部分で修飾することができる。修飾リン酸部分は、２つのヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’−アルキレンホスホナートを含む他のアルキルホスホナートおよびキラルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むように修飾することができるものを含むがそれらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸または修飾リン酸結合は３’−５’結合または２’−５’結合を介することができ、および結合は３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’といった逆の極性を含むことができることが理解される。さまざまな塩、塩の混合物、および遊離酸の形もまた含まれる。多数の米国特許が修飾リン酸を含むヌクレオチドを製造および使用する方法を教示し、およびそれらは、それぞれが参照により本開示に含まれる第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；および第５，６２５，０５０号を含むがそれらに限定されない。
【０１１９】
ヌクレオチドアナログは単一の修飾を含みさえすればよいが、しかしまた複数の修飾を１つの部分のうちにまたは異なる部分の間に含みうると理解される。
【０１２０】
ヌクレオチド代用物とは、ヌクレオチドと同様の機能的特性を有するが、リン酸部分を含まない、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような分子である。ヌクレオチド代用物は、ワトソン・クリック型またはフーグステン型の方法で相補的核酸を認識およびハイブリダイズするが、リン酸部分以外の部分を介して互いに結合している分子である。ヌクレオチド代用物は、適切な標的核酸と相互作用する際、二重らせん型の構造を取ることができる。
【０１２１】
ヌクレオチド代用物は、リン酸部分および／または糖部分を置換したヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド代用物は標準的なリン原子を含まない。リン酸の代用物は、たとえば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキル混合ヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合であることができる。これらは、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの頭部分から形成される）を持つもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；およびその他のＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の混合部分を持つものを含む。多数の米国特許がこれらの種類のリン酸代替物を製造および使用する方法を開示し、およびそれらは、それぞれが参照により本開示に含まれる第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号を含むがそれらに限定されない。
【０１２２】
ヌクレオチド代用物において、ヌクレオチドの糖部分およびリン酸部分の両方を、たとえばアミド型結合によって置換することができることもまた理解される（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）。米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号はＰＮＡ分子を製造および使用する方法を教示し、そのそれぞれが参照により本開示に含まれる。（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４： １４９７−１５００ （１９９１）も参照）。
【０１２３】
プライマーはヌクレオチドから成ることができ、および異なる種類のヌクレオチドまたは同一の種類のヌクレオチドから構成されうる。たとえば、あるプライマーに含まれるヌクレオチドの１つ以上は、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であることができる；ヌクレオチドの約１０％から約５０％はリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であることができる；ヌクレオチドの約５０％以上はリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であることができる；またはすべてのヌクレオチドはリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物である。ヌクレオチドは塩基（すなわち、ヌクレオチドの塩基部分）から成ることができ、および異なる種類の塩基を含むことができる（および通常は含む）。たとえば、塩基のうちの１つ以上は、３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドールといったユニバーサル塩基であることができる；塩基の約１０％から約５０％はユニバーサル塩基であることができる；塩基の約５０％以上はユニバーサル塩基であることができる；またはすべての塩基はユニバーサル塩基であることができる。
【０１２４】
プライマーはまた、プライマーの５’末端に、標的配列と相補的でない追加の配列を含むことができるがその必要は無い。この配列は、プライマーの非相補的部分と呼ばれる。プライマーの非相補的部分は、もしあれば、ＤＮＡ複製中に鎖置換を促進する役割を果たす。プライマーの非相補的部分はまた、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターといった機能配列を含みうる。プライマーの非相補的部分は任意の長さでありうるが、しかし一般的に長さ１から１００ヌクレオチド、および好ましくは長さ４から８ヌクレオチドである。非相補的部分の使用は、ランダムまたは部分的にランダムなプライマーが全ゲノム増幅に用いられる場合には、好ましくない。
【０１２５】
ランダムまたは縮重配列を有するプライマーは、本開示の方法における使用から除外することができると特に考えられる。また、増幅されている核酸分子へのプライマーの相当な、顕著なまたは明らかなミスマッチハイブリダイゼーションを可能にするかまたは両立しうる条件の使用は、除外することができると特に考えられる。ここでは、プライマーの相当なミスマッチハイブリダイゼーションとは、プライマーヌクレオチドの９０％以上が、ハイブリダイゼーションパートナーに含まれるヌクレオチドと対形成していないハイブリダイゼーションをいう。プライマーの顕著なミスマッチハイブリダイゼーションとは、プライマーヌクレオチドの５０％以上が、ハイブリダイゼーションパートナーに含まれるヌクレオチドと対形成していないハイブリダイゼーションをいう。プライマーの明らかなミスマッチハイブリダイゼーションとは、プライマーヌクレオチドの１０％以上が、ハイブリダイゼーションパートナーに含まれるヌクレオチドと対形成していないハイブリダイゼーションをいう。プライマーの相当なまたは顕著なまたは明らかなミスマッチハイブリダイゼーションを回避するかまたはそれと両立しない条件を選択することは、本開示の方法におけるプライマーの特異的なまたは相当に特異的なハイブリダイゼーションの使用を強調する。
【０１２６】
ここでは、所定のレベルのミスマッチハイブリダイゼーションと両立しうる条件とは、ハイブリダイゼーションの明らかな部分以上がその所定のレベルとなる結果を生じる条件をいう。所定のレベルのミスマッチハイブリダイゼーションと両立しない条件とは、明らかな部分のハイブリダイゼーションがその所定のレベルとなる結果を生じない条件をいう。所定のレベルのミスマッチハイブリダイゼーションを可能にする条件とは、ハイブリダイゼーションの明らかな部分以上がその所定のレベルとなる結果を生じる条件をいう。所定のレベルのミスマッチハイブリダイゼーションを可能にしない条件とは、明らかな部分のハイブリダイゼーションがその所定のレベルとなる結果を生じない条件をいう。この点で、所定のレベルのハイブリダイゼーションを理論的に生じるかまたは生じない条件は、いくらかの一過性のまたは稀なミスマッチハイブリダイゼーションを妨げないことが理解される。
【０１２７】
所定のレベルのミスマッチハイブリダイゼーションを可能にするかまたはしない、またはそれと両立するかまたはしない条件に関する重要な因子は、増幅を実施する温度である。したがって、たとえば、あるプライマーの融点を顕著に下回る温度は、その融点により近い温度よりも、一般的により高いレベルのミスマッチハイブリダイゼーションをそのプライマーによって可能にし、これはそのプライマーに含まれるヌクレオチドの一部だけが関与するハイブリッドがより低温では安定となるためである。このように、反応温度（すなわち、核酸試料、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを増幅のためにインキュベートする温度）はミスマッチハイブリダイゼーションのレベル、およびプライマーが核酸試料中のヌクレオチド配列へハイブリダイズする間隔に影響する。
【０１２８】
本開示の方法においてプライマー特異性を利用するために、ミスマッチハイブリダイゼーションのレベルを低下させるようにプライマーを設計することができる（または、逆に、インキュベート温度を選択することができる）。一般的に、これは、より短いプライマーについてはより低いインキュベート温度、およびより長いプライマーついてはより高いインキュベート温度の使用を含みうる。適切および望ましいと考えられる通り、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃での使用のためにプライマーを設計することができる、および／または、増幅反応はその温度でインキュベートすることができる。２１℃未満、２２℃未満、２３℃未満、２４℃未満、２５℃未満、２６℃未満、２７℃未満、２８℃未満、２９℃未満、３０℃未満、３１℃未満、３２℃未満、３３℃未満、３４℃未満、３５℃未満、３６℃未満、３７℃未満、３８℃未満、３９℃未満、４０℃未満、４１℃未満、４２℃未満、４３℃未満、４４℃未満、４５℃未満、４６℃未満、４７℃未満、４８℃未満、４９℃未満、５０℃未満、５１℃未満、５２℃未満、５３℃未満、５４℃未満、５５℃未満、５６℃未満、５７℃未満、５８℃未満、５９℃未満、６０℃未満、６１℃未満、６２℃未満、６３℃未満、６４℃未満、６５℃未満、６６℃未満、６７℃未満、６８℃未満、６９℃未満、７０℃未満、７１℃未満、７２℃未満、７３℃未満、７４℃未満、７５℃未満、７６℃未満、７７℃未満、７８℃未満、７９℃未満、または８０℃未満での使用のためにプライマーを設計することができる、および／または、増幅反応はその温度でインキュベートすることができる。
【０１２９】
１．全ゲノム鎖置換増幅のためのプライマー
全ゲノム鎖置換増幅の場合には、ランダムまたは部分的にランダムなヌクレオチド配列を有する一組のプライマーを用いることが好ましい。ＷＧＳＤＡのための好ましい標的配列である、顕著なまたは相当な複雑性の核酸試料では、試料中に存在する特定の核酸配列は既知である必要は無く、およびプライマーを特定の配列と相補的であるように設計する必要は無い。むしろ、核酸試料の複雑性は、ランダムまたは部分的にランダムな配列のさまざまなプライマーと相補的となる、試料中の多数の異なるハイブリダイゼーション標的配列を結果として生じる。ＷＧＳＤＡにおける使用のためのプライマーの相補的部分は、完全にランダム化することができ、一部だけをランダム化することができ、またはそうでなければ選択的にランダム化することができる。ランダムまたは部分的にランダムな配列を有するプライマーの組は、ランダム化すべき各位置で任意のヌクレオチドを付加させることによって、標準的技術を用いて合成することができる。また、そのプライマーの組は、同様の長さおよび／またはハイブリダイゼーション特性のプライマーから構成されることが好ましい。
【０１３０】
プライマーの相補的部分に含まれるランダム塩基位置の数は好ましくは、プライマーの相補的部分に含まれるヌクレオチドの総数の２０％ないし１００％である。より好ましくは、ランダム塩基位置の数はプライマーの相補的部分に含まれるヌクレオチドの総数の３０％ないし１００％である。非常に好ましくはランダム塩基位置の数はプライマーの相補的部分に含まれるヌクレオチドの総数の５０％ないし１００％である。ランダムまたは部分的にランダムな配列を有するプライマーの組は、ランダム化すべき各位置で任意のヌクレオチドを付加させることによって、標準的技術を用いて合成することができる。また、そのプライマーの組は、同様の長さおよび／またはハイブリダイゼーション特性のプライマーから構成されることが好ましい。
【０１３１】
２．複数鎖置換増幅のためのプライマー
複数鎖置換増幅の場合には、各プライマーの相補的部分は、標的配列中のハイブリダイゼーション標的と相補的になるように設計される。一組のプライマーでは、各プライマーの相補的部分は、標的配列の異なる部分と相補的であることが好ましい。その組に含まれるプライマーが、標的配列中の隣接する部位と相補的であることがより好ましい。また、標的配列中のそのような隣接する配列が、標的配列中の増幅標的とも隣接していることが好ましい。
【０１３２】
標的配列とハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに離れていることが好ましい。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに少なくとも５塩基離れていることが好ましい。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに少なくとも１０塩基離れていることがより好ましい。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに少なくとも２０塩基離れていることがさらにより好ましい。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに少なくとも３０塩基離れていることがさらにより好ましい。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに少なくとも４０塩基離れていることがさらにより好ましい。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに少なくとも５０塩基離れていることがさらにより好ましい。
【０１３３】
ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに約５００塩基しか離れていないことが好ましい。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに約４００塩基しか離れていないことがより好ましい。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに約３００塩基しか離れていないことがさらにより好ましい。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは互いに約２００塩基しか離れていないことがさらにより好ましい。上記の分離の好ましい上限および下限の任意の組み合わせは、すべての中間範囲を含め、具体的に考慮されている。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーは同数の塩基互いに離れている必要は無い。ハイブリダイズした際、一組のプライマーに含まれるプライマーはほぼ同数の塩基互いに離れているのが好ましい。
【０１３４】
プライマー間の最適分離距離はすべてのＤＮＡポリメラーゼについて同一にはならず、それはこのパラメーターが正味の重合速度に依存するためである。連続性ＤＮＡポリメラーゼは、毎秒５ないし３００ヌクレオチドの範囲になりうる、および補助ｓｓＤＮＡ結合タンパク質およびヘリカーゼの存在または非存在によって影響されうる、特徴的な重合速度を有する。非連続性ポリメラーゼの場合には、より高濃度では再開始現象がより多く生じおよびしたがって正味の重合速度が上昇するため、正味の重合速度は酵素濃度に依存する。連続性ポリメラーゼの一例はφ２９ＤＮＡポリメラーゼであり、これは毎秒５０ヌクレオチド進む。非連続性ポリメラーゼの一例はベント（Ｖｅｎｔ）エキソ（−）ＤＮＡポリメラーゼであり、これは低濃度では毎秒４ヌクレオチド、または高濃度では毎秒１６ヌクレオチドの有効重合速度を与える。
【０１３５】
ＭＳＤＡ反応において最適収率を得るためには、使用するポリメラーゼに適するように、好ましくはプライマー間隔を調整する。速い重合速度を持つポリメラーゼを用いる際は、長いプライマー間隔が好ましい。より遅い重合速度を持つポリメラーゼを用いる際は、より短いプライマー間隔が好ましい。下記の測定法は、任意のポリメラーゼについて最適の間隔を決定するのに用いることができる。本測定法は、プライマーの複数の組を用い、各組は５種類の左プライマーおよび５種類の右プライマーから成る。そのプライマーの組は、同一の標的配列に隣接してハイブリダイズするように設計されており、異なる組のプライマーは異なるプライマー間隔を有する。間隔は、増分２５ヌクレオチドで、２５ヌクレオチドから４００ヌクレオチドの範囲内で、プライマーの組の間で系統的に変化させる（各組内のプライマーの間隔は同一である）。同一の標的配列が異なる組のプライマーを用いて増幅される一連の反応を実施する。ＤＮＡの最も高い実験収率を生じる間隔が、使用しているその特定のＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ＋補助タンパク質の組み合わせのための最適プライマー間隔である。
【０１３６】
標的配列中の、プライマーがハイブリダイズする部位で開始されたＤＮＡ複製は、隣接する部位でハイブリダイズしたプライマーから増幅されている鎖まで伸長して、それを置換する。隣接する鎖の置換は、それを別のプライマーとのハイブリダイゼーションおよびその後のもう一回の複製の開始のために利用可能にする。プライマーがハイブリダイズする、標的配列の領域を、標的配列のハイブリダイゼーション標的と呼ぶ。
【０１３７】
一組のプライマーは、異なるヌクレオチド配列の、任意の希望数のプライマーを含みうる。ＭＳＤＡのためには、一組のプライマーは複数のプライマーを含むのが好ましい。一組のプライマーは３種類以上のプライマーを含むのがより好ましい。一組のプライマーは４種類以上、５種類以上、６種類以上、または７種類以上のプライマーを含むのがさらにより好ましい。一般的に、より多くのプライマーを用いるほど、より高い増幅レベルが得られる。一組のプライマーが含みうるプライマーの数に原理的な上限は無い。しかし、所定の標的配列について、一組のプライマーに含まれるプライマーの数は一般的に、標的配列中の利用可能なハイブリダイゼーション部位の数に限定される。たとえば、標的配列が１０，０００ヌクレオチドＤＮＡ分子であって、および２０ヌクレオチドプライマーが用いられる場合、５００箇所の重なり合わない２０ヌクレオチド部位が標的配列中に存在する。重なり部位が望まれるかまたは受容しうる場合、これよりさらに多くのプライマーを用いることができる。一組のプライマーは約３００種類のプライマーしか含まないことが好ましい。一組のプライマーは約２００種類のプライマーしか含まないことが好ましい。一組のプライマーは約１００種類のプライマーしか含まないことがさらにより好ましい。一組のプライマーは約５０種類のプライマーしか含まないことがより好ましい。一組のプライマーは７ないし約５０種類のプライマーしか含まないことが非常に好ましい。上記の一組のプライマーに含まれるプライマーの数についての好ましい上限および下限の任意の組み合わせは、すべての中間範囲を含め、具体的に考慮されている。
【０１３８】
ＭＳＤＡにおける使用のための好ましい種類のプライマーの組は、プライマーの右組およびプライマーの左組と呼ばれる、二組のプライマーを含む。プライマーの右組およびプライマーの左組は、標的配列の反対の鎖と相補的になるように設計されている。プライマーの右組の相補的部分は、右ハイブリダイゼーション標的とそれぞれ相補的であり、および右ハイブリダイゼーション標的の異なる部分とそれぞれが相補的であるのが好ましい。プライマーの左組の相補的部分は、左ハイブリダイゼーション標的とそれぞれ相補的であり、および左ハイブリダイゼーション標的の異なる部分とそれぞれが相補的であるのが好ましい。右および左のハイブリダイゼーション標的は、標的配列中の増幅標的の反対側の端に隣接する。プライマーの右組およびプライマーの左組はそれぞれ、一組のプライマーについて上記の通りの、好ましい数のプライマーを含むことが好ましい。具体的には、プライマーの右または左組は、複数のプライマーを含むのが好ましい。プライマーの右または左組は、３種類以上のプライマーを含むのがより好ましい。プライマーの右または左組は、４種類以上，５種類以上，６種類以上，または７種類以上のプライマーを含むのがさらにより好ましい。プライマーの右または左組は、約２００種類のプライマーしか含まないことが好ましい。プライマーの右または左組は、約１００種類のプライマーしか含まないことがより好ましい。プライマーの右または左組は、７ないし約１００種類のプライマーしか含まないことが非常に好ましい。上記の一組のプライマーに含まれるプライマーの数についての好ましい上限および下限の任意の組み合わせは、すべての中間範囲を含め、具体的に考慮されている。また、所定の標的配列について、プライマーの右組およびプライマーの左組が同数のプライマーを含むことが好ましい。また、所定の標的配列について、プライマーの右組およびプライマーの左組は、同様の長さおよび／またはハイブリダイゼーション特性のプライマーから構成されることが好ましい。
【０１３９】
標的配列が混合試料（たとえば、ヒトおよび非ヒト核酸の両方を含む院内試料）中に存在する場合、使用するプライマーは目的の核酸に特異的であることができる。したがって、病原体（すなわち、非ヒト）核酸を患者試料中に検出するために、病原体核酸に特異的なプライマーを用いることができる。ヒト核酸を検出すべきであるならば、ヒト核酸に特異的なプライマーを用いることができる。これに関連して、特定の標的核酸または標的配列、または特定の分類の標的核酸または標的配列に特異的なプライマーは、標的核酸および標的配列の増幅を支持するがしかし、関係する試料中に存在する非標的核酸または配列の実質的な増幅を支持しないプライマーを参照する。
【０１４０】
３．検出タグ
プライマーの非相補的部分は、増幅した配列をさらに操作または分析するのに用いることができる配列を含みうる。そのような配列の一例が検出タグであり、これはプライマーの非相補的部分に存在する特異的ヌクレオチド配列である。検出タグは、検出プローブと相補的な配列を有する。検出タグは、それらの同族の検出プローブを用いて検出することができる。検出タグは、増幅された鎖の末端に組み込まれる。その結果は、検出プローブの相補的部分と相補的である検出タグ配列を有する、増幅されたＤＮＡである。もしあれば、１つのプライマー上には１、２、３、または３より多数の検出タグが存在しうる。１つのプライマーは、１、２、３、または４個の検出タグを有することが好ましい。非常に好ましくは、１つのプライマーは１つの検出タグを有する。一般的に、１つのプライマーは１０個以下の検出タグを有することが好ましい。１つのプライマー上に存在しうる検出タグの数に、プライマーの大きさ以外に原理的な限界は無い。複数の検出タグが存在する場合は、それらは同一の配列を有しうるかまたは、それらは異なる配列のそれぞれが異なる検出プローブと相補的である異なる配列を有しうる。プライマーは、すべてが単一の検出プローブと相補的となるように、同一の配列を有する検出タグを含むのが好ましい。一部の多重検出法については、プライマーは最大６個までの検出タグを含むのが好ましく、および、検出タグ部分のそれぞれが異なる検出プローブと相補的となるように、検出タグ部分は異なる配列を有するのが好ましい。同様の作用は、それぞれが単一の異なる検出タグを有する一組のプライマーを用いることによって達成することができる。検出タグはそれぞれ、検出タグと検出プローブとの間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであることができる。このために、１０ないし３５ヌクレオチドの長さが好ましく、長さ１５ないし２０ヌクレオチドの検出タグ部分が非常に好ましい。
【０１４１】
４．アドレスタグ
プライマーの非相補的部分に含むことができる配列の別の一例がアドレスタグである。アドレスタグは、アドレスプローブと相補的である配列を有する。アドレスタグは、増幅された鎖の末端に組み込まれる。その結果は、アドレスプローブの相補的部分と相補的であるアドレスタグ配列を有する、増幅されたＤＮＡである。もしあれば、１つのプライマー上には１つの、または２つ以上の、アドレスタグが存在しうる。１つのプライマーは、１または２個のアドレスタグを有することが好ましい。非常に好ましくは、１つのプライマーは１つのアドレスタグを有する。一般的に、１つのプライマーは１０個以下のアドレスタグを有することが好ましい。１つのプライマー上に存在しうるアドレスタグの数に、プライマーの大きさ以外に原理的な限界は無い。複数の複数のアドレスタグが存在する場合は、それらは同一の配列を有しうるかまたは、それらは異なる配列のそれぞれが異なるアドレスプローブと相補的である異なる配列を有しうる。プライマーは、すべてが単一のアドレスプローブと相補的となるように、同一の配列を有するアドレスタグを含むのが好ましい。アドレスタグ部分は、アドレスタグとアドレスプローブとの間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであることができる。このために、長さ１０ないし３５ヌクレオチドの長さが好ましく、長さ１５ないし２０ヌクレオチドのアドレスタグ部分が非常に好ましい。
【０１４２】
Ｅ．蛍光変化プローブおよびプライマー
蛍光変化プローブおよび蛍光変化プライマーとは、プローブまたはプライマーおよび検出、測定または複製すべき核酸の、形態または立体構造における変化に基づく、蛍光強度または波長の変化が関与するすべてのプローブおよびプライマーをいう。蛍光変化プローブおよびプライマーの例は、分子ビーコン、アンプリフロール（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）、ＦＲＥＴプローブ、切断可ＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）・プライマー、蛍光三重オリゴ、蛍光水溶性結合ポリマー、ＰＮＡプローブおよびＱＰＮＡプローブを含む。
【０１４３】
蛍光変化プローブおよびプライマーは、その構造および／または機能に従って分類することができる。蛍光変化プローブは、ヘアピン消光化プローブ、切断消光化プローブ、切断活性化プローブ、および蛍光活性化プローブを含む。蛍光変化プライマーは、ステム消光化プライマーおよびヘアピン消光化プライマーを含む。蛍光変化プローブおよびプライマーの使用は、シュバイツァー（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ）およびキングスモア（Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２１−２７ （２００１）の総説がある。ホール（Ｈａｌｌ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７： ８２７２−８２７７ （２０００）は、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）測定法での蛍光変化プローブの使用を記載する。
【０１４４】
ヘアピン消光化プローブは、標的配列と結合していない場合に、標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識および消光部分を近接させるヘアピン構造（および、典型的には、ループ）を形成するプローブである。プローブが標的配列と結合する際、ステムが破壊され、消光部分はもう蛍光標識と近接せず、および蛍光が増大する。ヘアピン消光化プローブの例は、分子ビーコン、蛍光三重オリゴ、およびＱＰＮＡプローブである。
【０１４５】
切断活性化プローブは、プローブの切断によって蛍光が増大するプローブである。切断活性化プローブは、標識からの蛍光が消光されるように、近接した蛍光標識部分および消光部分を含みうる。プローブが切断または消化される際（典型的にはポリメラーゼの５'−３'エキソヌクレアーゼ活性によって増幅中に）、消光部分はもう蛍光標識と近接せず、および蛍光が増大する。ＴａｑＭａｎプローブ（ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８： ７２７６−７２８０（１９９１））は切断活性化プローブの一例である。
【０１４６】
切断消光化プローブは、プローブの切断によって蛍光が減少または変化するプローブである。切断消光化プローブは、受容体および供与体が近接している場合に供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移が受容体に蛍光を生じさせるように、受容体蛍光標識および供与体部分を含みうる。そのプローブはしたがって、たとえば、標的配列とハイブリダイズした際に蛍光を発する。プローブが切断または消化される際（典型的にはポリメラーゼの５'−３'エキソヌクレアーゼ活性によって増幅中に）、供与体部分はもう受容体蛍光標識と近接せず、および受容体からの蛍光が減少する。供与体部分がそれ自体蛍光標識であるならば、それは受容体と近接していない場合にエネルギーを蛍光として放出することができる（典型的には受容体の蛍光とは異なる波長で）。全体としての効果はその結果、受容体蛍光の減少および供与体蛍光の増大となる。切断消光化プローブの場合の供与体蛍光は、受容体が消光部分でありおよび供与体が蛍光標識である切断活性化プローブによって生じた蛍光と同等である。切断可ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）プローブは切断消光化プローブの一例である。
【０１４７】
蛍光活性化プローブは、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションによって蛍光が増大または変化するプローブまたはプローブ対である。蛍光活性化プローブは、受容体および供与体が近接している際（プローブが標的配列とハイブリダイズする際）、供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移が受容体に蛍光を生じさせるように、受容体蛍光標識および供与体部分を含みうる。蛍光活性化プローブは典型的には、受容体および供与体が近接するように、隣接配列にハイブリダイズするよう設計されたプローブ対である。蛍光活性化プローブはまた、プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合には供与体および受容体は近接していないが、プローブが標的配列とハイブリダイズしている場合には供与体および受容体が近接させられる、供与体および受容体の両方を含む単一のプローブであることができる。これは、たとえば、供与体および受容体をプローブの反対端に配置し、および標的相補配列をプローブの各末端に配置し、ここで標的相補配列は標的配列中の隣接配列と相補的であることによって達成することができる。蛍光活性化プローブの供与体部分がそれ自体蛍光標識であるならば、それは受容体と近接していない場合に（すなわち、プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合に）エネルギーを蛍光として放出することができる（典型的には受容体の蛍光とは異なる波長で）。プローブが標的配列とハイブリダイズする際、全体としての効果はその結果、供与体蛍光の減少および受容体蛍光の増大となる。ＦＲＥＴプローブは蛍光活性化プローブの一例である。
【０１４８】
ステム消光化プライマーは、相補的配列と結合していない場合に、標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識および消光部分を近接させるステム構造（分子内ステム構造または分子間ステム構造のどちらか）を形成するプライマーである。プライマーが相補的配列と結合する際、ステムが破壊され、消光部分はもう蛍光標識と近接せず、および蛍光が増大する。本開示の方法では、ステム消光化プライマーは核酸合成のためのプライマーとして用いられ、および従って、合成されたかまたは増幅された核酸に組み込まれる。ステム消光化プライマーの例は、ペプチド核酸消光化プライマーおよびヘアピン消光化プライマーである。
【０１４９】
ペプチド核酸消光化プライマーは、ペプチド核酸消光物質またはペプチド核酸蛍光物質と結合しておりステム構造を形成するプライマーである。そのプライマーは蛍光標識または消光部分を含み、およびペプチド核酸消光物質またはペプチド核酸蛍光物質とそれぞれ結合している。このことによって蛍光標識が消光部分と近接する。プライマーが複製される際、ペプチド核酸が置換され、したがって蛍光標識が蛍光シグナルを生じることが可能になる。
【０１５０】
ヘアピン消光化プライマーは、相補的配列と結合していない場合に、標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識および消光部分を近接させるヘアピン構造（および、典型的には、ループ）を形成するプライマーである。プライマーが相補的配列と結合する際、ステムが破壊され、消光部分はもう蛍光標識と近接せず、および蛍光が増大する。ヘアピン消光化プライマーは典型的には核酸合成のためのプライマーとして用いられ、および従って、合成されたかまたは増幅された核酸に組み込まれる。ヘアピン消光化プライマーの例は、アンプリフロール（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）プライマー（ナゼレンコ（Ｎａｚｅｒｅｎｋｏ）他，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５： ２５１６−２５２１（１９９７））およびスコーピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プライマー（セルウェル（Ｔｈｅｌｗｅｌｌ）他，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８ （１９）： ３７５２−３７６１（２０００））である。 
【０１５１】
切断活性化プライマーは、複製された鎖に組み込まれていておよびその後に切断されるプライマーであること以外は、切断活性化プローブと同様である。リトル（Ｌｉｔｔｌｅ）他，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：７７７−７８４ （１９９９）は、切断活性化プライマーの使用を記載する。
【０１５２】
Ｆ．溶解溶液
本開示の方法では、細胞を溶解溶液と混合することによって、細胞をアルカリ性条件に曝露することができる。溶解溶液は一般的に、細胞溶解を引き起こすように細胞溶液のｐＨを十分に上げることができる溶液である。変性溶液が溶解溶液に必要な作用を有しうる限りは、変性溶液を溶解溶液として用いることができる。一部の実施形態では、溶解溶液は塩基水溶液といった塩基を含みうる。有用な塩基は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア、アニリン、ベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ジフェニルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、Ｎ−メチルアニリン、モルホリン、ピリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、水酸化アルミニウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、およびＤＢＵ（１，８−ジアゾビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン）を含む。有用な溶解溶液の処方は、４００ｍＭＫＯＨを含む溶解溶液、４００ｍＭ ＫＯＨおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶解溶液、４００ｍＭ ＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶解溶液、および４００ｍＭＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶解溶液を含む。他の有用な溶解溶液の処方は、１００ｍＭ ＫＯＨを含む溶解溶液、１００ｍＭ ＫＯＨおよび２．５ｍＭＥＤＴＡを含む溶解溶液、１００ｍＭ ＫＯＨ、２５ｍＭジチオスレイトール、および２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶解溶液、および１００ｍＭ ＫＯＨ、２５ｍＭジチオスレイトール、および２．５ｍＭＥＤＴＡから成る溶解溶液を含む。有用な溶解溶液はｐＨ８を有しうる。溶解溶液は使用前に希釈しうる。そのような場合には、反応に加える溶解溶液の量は一般的に、比例的に増加させることができる。
【０１５３】
一部の実施形態では、溶解溶液は複数の塩基性物質を含みうる。ここでは、塩基性物質とは、アルカリ性条件を結果として生じる化合物、組成物または溶液である。一部の実施形態では、溶解溶液は緩衝剤を含みうる。有用な緩衝剤は、リン酸緩衝剤、「グッド（Ｇｏｏｄ）」緩衝剤（たとえばＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、およびＴＲＩＣＩＮＥ）、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、およびビス−トリスプロパンを含む。溶解溶液は複数の緩衝剤を含みうる。ここでは、緩衝試薬とは、緩衝剤として作用する化合物、組成物または溶液である。アルカリ性緩衝試薬とは、アルカリ性条件を結果として生じる緩衝剤である。一部の実施形態では、溶解溶液は１つ以上の塩基、塩基性物質、緩衝剤および緩衝試薬の組み合わせを含みうる。
【０１５４】
細胞と混合する溶解溶液の量は、相当な数の細胞を溶解させる量、または、十分な数の細胞を溶解させる量である。一般的に、この容量は細胞／溶解溶液混合物のｐＨの関数となる。したがって、細胞と混合すべき溶解溶液の量は、一般的に、細胞の容積および溶解緩衝液のアルカリ濃度から決定することができる。たとえば、十分なアルカリ性条件を作り出すためには、より弱い塩基および／またはより低濃度の塩基を含む溶解溶液に必要な容量よりも、より強い塩基および／またはより高濃度の塩基を含むより少ない容量の溶解溶液が必要となる。（希望のアルカリ性条件を生じるために）細胞が等しい容量の溶解溶液と混合されるように、溶解溶液を処方することができる。
【０１５５】
たとえば、溶解溶液は、約８．０ないし約１３．０、約８．５ないし約１３．０、約９．０ないし約１３．０、約９．５ないし約１３．０、約１０．０ないし約１３．０、約１０．５ないし約１３．０、約１１．０ないし約１３．０、約１１．５ないし約１３．０、約１２．０ないし約１３．０、約８．０ないし約１２．０、約８．５ないし約１２．０、約９．０ないし約１２．０、約９．５ないし約１２．０、約１０．０ないし約１２．０、約１０．５ないし約１２．０、約１１．０ないし約１２．０、約１１．５ないし約１２．０、約８．０ないし約１１．５、約８．５ないし約１１．５、約９．０ないし約１１．５、約９．５ないし約１１．５、約１０．０ないし約１１．５、約１０．５ないし約１１．５、約１１．０ないし約１１．５、約８．０ないし約１１．０、約８．５ないし約１１．０、約９．０ないし約１１．０、約９．５ないし約１１．０、約１０．０ないし約１１．０、約１０．５ないし約１１．０、約８．０ないし約１０．５、約８．５ないし約１０．５、約９．０ないし約１０．５、約９．５ないし約１０．５、約１０．０ないし約１０．５、約８．０ないし約１０．０、約８．５ないし約１０．０、約９．０ないし約１０．０、約９．５ないし約１０．０、約８．０ないし約９．５、約８．５ないし約９．５、約９．０ないし約９．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５、約１１．０、約１１．５、約１２．０、約１２．５、または約１３．０のｐＨを有する溶液であることができる。
【０１５６】
溶解溶液は、約１０ｍＭないし約１Ｍ、約１０ｍＭないし約９００ｍＭ、約１０ｍＭないし約８００ｍＭ、約１０ｍＭないし約７００ｍＭ、約１０ｍＭないし約６００ｍＭ、約１０ｍＭないし約５００ｍＭ、約１０ｍＭないし約４００ｍＭ、約１０ｍＭないしａｂｏｕｔ３００ｍＭ、約１０ｍＭないし約２００ｍＭ、約１０ｍＭないし約１００ｍＭ、約１０ｍＭないし約９０ｍＭ、約１０ｍＭないし約８０ｍＭ、約１０ｍＭないし約７０ｍＭ、約１０ｍＭないし約６０ｍＭ、約１０ｍＭないし約５０ｍＭ、約１０ｍＭないし約４０ｍＭ、約１０ｍＭないし約３０ｍＭ、約１０ｍＭないし約２０ｍＭ、約２０ｍＭないし約１Ｍ、約２０ｍＭないし約９００ｍＭ、約２０ｍＭないし約８００ｍＭ、約２０ｍＭないし約７００ｍＭ、約２０ｍＭないし約６００ｍＭ、約２０ｍＭないし約５００ｍＭ、約２０ｍＭないし約４００ｍＭ、約２０ｍＭないし約３００ｍＭ、約２０ｍＭないし約２００ｍＭ、約２０ｍＭないし約１００ｍＭ、約２０ｍＭないし約９０ｍＭ、約２０ｍＭないし約８０ｍＭ、約２０ｍＭないし約７０ｍＭ、約２０ｍＭないし約６０ｍＭ、約２０ｍＭないし約５０ｍＭ、約２０ｍＭないし約４０ｍＭ、約２０ｍＭないし約３０ｍＭ、約３０ｍＭないし約１Ｍ、約３０ｍＭないし約９００ｍＭ、約３０ｍＭないし約８００ｍＭ、約３０ｍＭないし約７００ｍＭ、約３０ｍＭないし約６００ｍＭ、約３０ｍＭないし約５００ｍＭ、約３０ｍＭないし約４００ｍＭ、約３０ｍＭないし約３００ｍＭ、約３０ｍＭないし約２００ｍＭ、約３０ｍＭないし約１００ｍＭ、約３０ｍＭないし約９０ｍＭ、約３０ｍＭないし約８０ｍＭ、約３０ｍＭないし約７０ｍＭ、約３０ｍＭないし約６０ｍＭ、約３０ｍＭないし約５０ｍＭ、約３０ｍＭないし約４０ｍＭ、約４０ｍＭないし約１Ｍ、約４０ｍＭないし約９００ｍＭ、約４０ｍＭないし約８００ｍＭ、約４０ｍＭないし約７００ｍＭ、約４０ｍＭないし約６００ｍＭ、約４０ｍＭないし約５００ｍＭ、約４０ｍＭないし約４００ｍＭ、約４０ｍＭないし約３００ｍＭ、約４０ｍＭないし約２００ｍＭ、約４０ｍＭないし約１００ｍＭ、約４０ｍＭないし約９０ｍＭ、約４０ｍＭないし約８０ｍＭ、約４０ｍＭないし約７０ｍＭ、約４０ｍＭないし約６０ｍＭ、約４０ｍＭないし約５０ｍＭ、約５０ｍＭないし約１Ｍ、約５０ｍＭないし約９００ｍＭ、約５０ｍＭないし約８００ｍＭ、約５０ｍＭないし約７００ｍＭ、約５０ｍＭないし約６００ｍＭ、約５０ｍＭないし約５００ｍＭ、約５０ｍＭないし約４００ｍＭ、約５０ｍＭないし約３００ｍＭ、約５０ｍＭないし約２００ｍＭ、約５０ｍＭないし約１００ｍＭ、約５０ｍＭないし約９０ｍＭ、約５０ｍＭないし約８０ｍＭ、約５０ｍＭないし約７０ｍＭ、約５０ｍＭないし約６０ｍＭ、約６０ｍＭないし約１Ｍ、約６０ｍＭないし約９００ｍＭ、約６０ｍＭないし約８００ｍＭ、約６０ｍＭないし約７００ｍＭ、約６０ｍＭないし約６００ｍＭ、約６０ｍＭないし約５００ｍＭ、約６０ｍＭないし約４００ｍＭ、約６０ｍＭないし約３００ｍＭ、約６０ｍＭないし約２００ｍＭ、約６０ｍＭないし約１００ｍＭ、約６０ｍＭないし約９０ｍＭ、約６０ｍＭないし約８０ｍＭ、約６０ｍＭないし約７０ｍＭ、約７０ｍＭないし約１Ｍ、約７０ｍＭないし約９００ｍＭ、約７０ｍＭないし約８００ｍＭ、約７０ｍＭないし約７００ｍＭ、約７０ｍＭないし約６００ｍＭ、約７０ｍＭないし約５００ｍＭ、約７０ｍＭないし約４００ｍＭ、約７０ｍＭないし約３００ｍＭ、約７０ｍＭないし約２００ｍＭ、約７０ｍＭないし約１００ｍＭ、約７０ｍＭないし約９０ｍＭ、約７０ｍＭないし約８０ｍＭ、約８０ｍＭないし約１Ｍ、約８０ｍＭないし約９００ｍＭ、約８０ｍＭないし約８００ｍＭ、約８０ｍＭないし約７００ｍＭ、約８０ｍＭないし約６００ｍＭ、約８０ｍＭないし約５００ｍＭ、約８０ｍＭないし約４００ｍＭ、約８０ｍＭないし約３００ｍＭ、約８０ｍＭないし約２００ｍＭ、約８０ｍＭないし約１００ｍＭ、約８０ｍＭないし約９０ｍＭ、約９０ｍＭないし約１Ｍ、約９０ｍＭないし約９００ｍＭ、約９０ｍＭないし約８００ｍＭ、約９０ｍＭないし約７００ｍＭ、約９０ｍＭないし約６００ｍＭ、約９０ｍＭないし約５００ｍＭ、約９０ｍＭないし約４００ｍＭ、約９０ｍＭないし約３００ｍＭ、約９０ｍＭないし約２００ｍＭ、約９０ｍＭないし約１００ｍＭ、約１００ｍＭないし約１Ｍ、約１００ｍＭないし約９００ｍＭ、約１００ｍＭないし約８００ｍＭ、約１００ｍＭないし約７００ｍＭ、約１００ｍＭないし約６００ｍＭ、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、約１００ｍＭないし約４００ｍＭ、約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、約１００ｍＭないし約２００ｍＭ、約２００ｍＭないし約１Ｍ、約２００ｍＭないし約９００ｍＭ、約２００ｍＭないし約８００ｍＭ、約２００ｍＭないし約７００ｍＭ、約２００ｍＭないし約６００ｍＭ、約２００ｍＭないし約５００ｍＭ、約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、約２００ｍＭないし約３００ｍＭ、約３００ｍＭないし約１Ｍ、約３００ｍＭないし約９００ｍＭ、約３００ｍＭないし約８００ｍＭ、約３００ｍＭないし約７００ｍＭ、約３００ｍＭないし約６００ｍＭ、約３００ｍＭないし約５００ｍＭ、約３００ｍＭないし約４００ｍＭ、約４００ｍＭないし約１Ｍ、約４００ｍＭないし約９００ｍＭ、約４００ｍＭないし約８００ｍＭ、約４００ｍＭないし約７００ｍＭ、約４００ｍＭないし約６００ｍＭ、約４００ｍＭないし約５００ｍＭ、約５００ｍＭないし約１Ｍ、約５００ｍＭないし約９００ｍＭ、約５００ｍＭないし約８００ｍＭ、約５００ｍＭないし約７００ｍＭ、約５００ｍＭないし約６００ｍＭ、約６００ｍＭないし約１Ｍ、約６００ｍＭないし約９００ｍＭ、約６００ｍＭないし約８００ｍＭ、約６００ｍＭないし約７００ｍＭ、約７００ｍＭないし約１Ｍ、約７００ｍＭないし約９００ｍＭ、約７００ｍＭないし約８００ｍＭ、約８００ｍＭないし約１Ｍ、約８００ｍＭないし約９００ｍＭ、約９００ｍＭないし約１Ｍ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、または約１Ｍ．の成分濃度を有することができる。
【０１５７】
溶解溶液成分の終濃度（試料との混合後）は、たとえば、約１０ｍＭないし約１Ｍ、約１０ｍＭないし約９００ｍＭ、約１０ｍＭないし約８００ｍＭ、約１０ｍＭないし約７００ｍＭ、約１０ｍＭないし約６００ｍＭ、約１０ｍＭないし約５００ｍＭ、約１０ｍＭないし約４００ｍＭ、約１０ｍＭないし約３００ｍＭ、約１０ｍＭないし約２００ｍＭ、約１０ｍＭないし約１００ｍＭ、約１０ｍＭないし約９０ｍＭ、約１０ｍＭないし約８０ｍＭ、約１０ｍＭないし約７０ｍＭ、約１０ｍＭないし約６０ｍＭ、約１０ｍＭないし約５０ｍＭ、約１０ｍＭないし約４０ｍＭ、約１０ｍＭないし約３０ｍＭ、約１０ｍＭないし約２０ｍＭ、約２０ｍＭないし約１Ｍ、約２０ｍＭないし約９００ｍＭ、約２０ｍＭないし約８００ｍＭ、約２０ｍＭないし約７００ｍＭ、約２０ｍＭないし約６００ｍＭ、約２０ｍＭないし約５００ｍＭ、約２０ｍＭないし約４００ｍＭ、約２０ｍＭないし約３００ｍＭ、約２０ｍＭないし約２００ｍＭ、約２０ｍＭないし約１００ｍＭ、約２０ｍＭないし約９０ｍＭ、約２０ｍＭないし約８０ｍＭ、約２０ｍＭないし約７０ｍＭ、約２０ｍＭないし約６０ｍＭ、約２０ｍＭないし約５０ｍＭ、約２０ｍＭないし約４０ｍＭ、約２０ｍＭないし約３０ｍＭ、約３０ｍＭないし約１Ｍ、約３０ｍＭないし約９００ｍＭ、約３０ｍＭないし約８００ｍＭ、約３０ｍＭないし約７００ｍＭ、約３０ｍＭないし約６００ｍＭ、約３０ｍＭないし約５００ｍＭ、約３０ｍＭないし約４００ｍＭ、約３０ｍＭないし約３００ｍＭ、約３０ｍＭないし約２００ｍＭ、約３０ｍＭないし約１００ｍＭ、約３０ｍＭないし約９０ｍＭ、約３０ｍＭないし約８０ｍＭ、約３０ｍＭないし約７０ｍＭ、約３０ｍＭないし約６０ｍＭ、約３０ｍＭないし約５０ｍＭ、約３０ｍＭないし約４０ｍＭ、約４０ｍＭないし約１Ｍ、約４０ｍＭないし約９００ｍＭ、約４０ｍＭないし約８００ｍＭ、約４０ｍＭないし約７００ｍＭ、約４０ｍＭないし約６００ｍＭ、約４０ｍＭないし約５００ｍＭ、約４０ｍＭないし約４００ｍＭ、約４０ｍＭないし約３００ｍＭ、約４０ｍＭないし約２００ｍＭ、約４０ｍＭないし約１００ｍＭ、約４０ｍＭないし約９０ｍＭ、約４０ｍＭないし約８０ｍＭ、約４０ｍＭないし約７０ｍＭ、約４０ｍＭないし約６０ｍＭ、約４０ｍＭないし約５０ｍＭ、約５０ｍＭないし約１Ｍ、約５０ｍＭないし約９００ｍＭ、約５０ｍＭないし約８００ｍＭ、約５０ｍＭないし約７００ｍＭ、約５０ｍＭないし約６００ｍＭ、約５０ｍＭないし約５００ｍＭ、約５０ｍＭないし約４００ｍＭ、約５０ｍＭないし約３００ｍＭ、約５０ｍＭないし約２００ｍＭ、約５０ｍＭないし約１００ｍＭ、約５０ｍＭないし約９０ｍＭ、約５０ｍＭないし約８０ｍＭ、約５０ｍＭないし約７０ｍＭ、約５０ｍＭないし約６０ｍＭ、約６０ｍＭないし約１Ｍ、約６０ｍＭないし約９００ｍＭ、約６０ｍＭないし約８００ｍＭ、約６０ｍＭないし約７００ｍＭ、約６０ｍＭないし約６００ｍＭ、約６０ｍＭないし約５００ｍＭ、約６０ｍＭないし約４００ｍＭ、約６０ｍＭないし約３００ｍＭ、約６０ｍＭないし約２００ｍＭ、約６０ｍＭないし約１００ｍＭ、約６０ｍＭないし約９０ｍＭ、約６０ｍＭないし約８０ｍＭ、約６０ｍＭないし約７０ｍＭ、約７０ｍＭないし約１Ｍ、約７０ｍＭないし約９００ｍＭ、約７０ｍＭないし約８００ｍＭ、約７０ｍＭないし約７００ｍＭ、約７０ｍＭないし約６００ｍＭ、約７０ｍＭないし約５００ｍＭ、約７０ｍＭないし約４００ｍＭ、約７０ｍＭないし約３００ｍＭ、約７０ｍＭないし約２００ｍＭ、約７０ｍＭないし約１００ｍＭ、約７０ｍＭないし約９０ｍＭ、約７０ｍＭないし約８０ｍＭ、約８０ｍＭないし約１Ｍ、約８０ｍＭないし約９００ｍＭ、約８０ｍＭないし約８００ｍＭ、約８０ｍＭないし約７００ｍＭ、約８０ｍＭないし約６００ｍＭ、約８０ｍＭないし約５００ｍＭ、約８０ｍＭないし約４００ｍＭ、約８０ｍＭないし約３００ｍＭ、約８０ｍＭないし約２００ｍＭ、約８０ｍＭないし約１００ｍＭ、約８０ｍＭないし約９０ｍＭ、約９０ｍＭないし約１Ｍ、約９０ｍＭないし約９００ｍＭ、約９０ｍＭないし約８００ｍＭ、約９０ｍＭないし約７００ｍＭ、約９０ｍＭないし約６００ｍＭ、約９０ｍＭないし約５００ｍＭ、約９０ｍＭないし約４００ｍＭ、約９０ｍＭないし約３００ｍＭ、約９０ｍＭないし約２００ｍＭ、約９０ｍＭないし約１００ｍＭ、約１００ｍＭないし約１Ｍ、約１００ｍＭないし約９００ｍＭ、約１００ｍＭないし約８００ｍＭ、約１００ｍＭないし約７００ｍＭ、約１００ｍＭないし約６００ｍＭ、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、約１００ｍＭないし約４００ｍＭ、約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、約１００ｍＭないし約２００ｍＭ、約２００ｍＭないし約１Ｍ、約２００ｍＭないし約９００ｍＭ、約２００ｍＭないし約８００ｍＭ、約２００ｍＭないし約７００ｍＭ、約２００ｍＭないし約６００ｍＭ、約２００ｍＭないし約５００ｍＭ、約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、約２００ｍＭないし約３００ｍＭ、約３００ｍＭないし約１Ｍ、約３００ｍＭないし約９００ｍＭ、約３００ｍＭないし約８００ｍＭ、約３００ｍＭないし約７００ｍＭ、約３００ｍＭないし約６００ｍＭ、約３００ｍＭないし約５００ｍＭ、約３００ｍＭないし約４００ｍＭ、約４００ｍＭないし約１Ｍ、約４００ｍＭないし約９００ｍＭ、約４００ｍＭないし約８００ｍＭ、約４００ｍＭないし約７００ｍＭ、約４００ｍＭないし約６００ｍＭ、約４００ｍＭないし約５００ｍＭ、約５００ｍＭないし約１Ｍ、約５００ｍＭないし約９００ｍＭ、約５００ｍＭないし約８００ｍＭ、約５００ｍＭないし約７００ｍＭ、約５００ｍＭないし約６００ｍＭ、約６００ｍＭないし約１Ｍ、約６００ｍＭないし約９００ｍＭ、約６００ｍＭないし約８００ｍＭ、約６００ｍＭないし約７００ｍＭ、約７００ｍＭないし約１Ｍ、約７００ｍＭないし約９００ｍＭ、約７００ｍＭないし約８００ｍＭ、約８００ｍＭないし約１Ｍ、約８００ｍＭないし約９００ｍＭ、約９００ｍＭないし約１Ｍ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、または約１Ｍであることができる。
【０１５８】
溶解溶液は、細胞へ別々に加えることができるかまたは、細胞への添加前に異なる組み合わせで組み合わせることができる、複数の溶液および／または成分から成ることができる。したがって、たとえば、４００ｍＭＫＯＨおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡの溶液、および１００ｍＭジチオスレイトールの溶液は、細胞へ別々に加えることができる。同様に、本開示のキットは、細胞への添加前に組み合わせて溶解溶液を形成するかまたは細胞への別々の添加のための、複数の溶液および／または成分から成ることができる。ストック溶解溶液を希釈して、本開示の方法における使用のための最終溶解溶液を形成することができる。ストック溶解溶液は、溶解溶液についてここで記載された任意の濃度、またはここで記載されたどの溶解溶液または溶解溶液濃度よりも濃縮された任意の濃度を有することができる。溶解溶液成分の終濃度（試料との混合後）は、溶解溶液についてここで記載された任意の濃度であることができる。溶解溶液成分の有用な終濃度は、５０ｍＭＫＯＨ、１２．５ｍＭジチオスレイトール、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡであることができる。
【０１５９】
Ｇ．安定化溶液
本開示の方法では、細胞溶解物または試料のｐＨは、安定化したかまたは中性化した細胞溶解物、または安定化したかまたは中性化した試料を生じるために低下させることができる。安定化溶液は一般的に、ここで別に記載した通り、アルカリ性条件に曝露された細胞溶解物または試料のｐＨを低下させることのできる溶液である。一部の実施形態では、安定化溶液は酸を含みうる。有用な酸は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、アセチルサリチル酸、アスコルビン酸、炭酸、クエン酸、ギ酸、硝酸、過塩素酸、ＨＦ、ＨＢｒ、ＨＩ、Ｈ２Ｓ、ＨＣＮ、ＨＳＣＮ、ＨＣｌＯ、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、および任意のカルボン酸（エタン酸、プロパン酸、ブタン酸、など、直鎖または分枝鎖カルボン酸の両方を含む）。一部の実施形態では、安定化溶液は緩衝剤を含みうる。有用な緩衝剤は、トリス−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、「グッド（Ｇｏｏｄ）」緩衝剤（たとえばＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、およびＴＲＩＣＩＮＥ）、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、およびビス−トリスプロパンを含む。有用な安定化溶液の処方は、８００ｍＭトリス−ＨＣｌを含む安定化溶液；８００ｍＭトリス−ＨＣｌを含むｐＨ４．１の安定化溶液、および８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１から成る安定化溶液を含む。有用な安定化溶液の処方は、８００ｍＭトリス−ＨＣｌを含むｐＨ４の安定化溶液、および８００ｍＭトリス−ＨＣＩ、ｐＨ４から成る安定化溶液を含む。他の有用な安定化溶液の処方は、１６０ｍＭトリス−ＨＣｌを含む安定化溶液；１６０ｍＭトリス−ＨＣｌを含むｐＨ４．１の安定化溶液、および１６０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１から成る安定化溶液を含む。他の有用な安定化溶液の処方は、１６０ｍＭトリス−ＨＣｌを含む安定化溶液；１６０ｍＭトリス−ＨＣｌを含むｐＨ４の安定化溶液、および１６０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４から成る安定化溶液を含む。安定化溶液は使用前に希釈しうる。そのような場合には、反応に加える安定化溶液の量は一般的に、比例的に増加させることができる。
【０１６０】
一部の実施形態では、安定化溶液は複数の酸性物質を含みうる。ここでは、酸性物質とは、溶液中に酸を形成する化合物、組成物または溶液である。一部の実施形態では、安定化溶液は複数の緩衝剤を含みうる。酸性緩衝試薬とは、溶液中に酸を形成する緩衝剤である。一部の実施形態では、安定化溶液は１つ以上の酸、酸性物質、緩衝剤および緩衝試薬の組み合わせを含みうる。
【０１６１】
安定化した細胞溶解物または安定化した試料とは、そのｐＨが中性範囲（約ｐＨ６．０ないし約ｐＨ９．０）にある細胞溶解物または試料である。有用な安定化した細胞溶解物および試料は、細胞溶解物中での核酸の複製を可能にするｐＨを有する。たとえば、安定化した細胞溶解物または試料のｐＨは、有用には、ＤＮＡポリメラーゼが機能しうるｐＨである。細胞溶解物または試料のｐＨは、細胞溶解物または試料を安定化溶液と混合することによって低下させることができる。
【０１６２】
細胞溶解物または試料と混合する安定化溶液の量は、中性範囲（または他の希望のｐＨ値）へのｐＨの低下を生じる量であることができる。一般的に、この容量は細胞溶解物／安定化溶液混合物のまたは試料／安定化溶液混合物のｐＨの関数となる。したがって、細胞溶解物または試料と混合すべき安定化溶液の量は、一般的に、細胞溶解物または試料の容量、そのｐＨおよび緩衝能、および安定化緩衝液の酸濃度から決定することができる。たとえば、ｐＨを十分に低下させるためには、より弱い酸および／またはより低濃度の酸を含む安定化溶液に必要な容量よりも、より強い酸および／またはより高濃度の酸を含むより少ない容量の安定化溶液が必要となる。（希望のｐＨを生じるために）細胞溶解物または試料が等しい容量の安定化溶液と混合されるように、安定化溶液を処方することができる。
【０１６３】
たとえば、安定化溶液は、約１．０ないし約６．０、約２．０ないし約６．０、約３．０ないし約６．０、約３．５ないし約６．０、約４．０ないし約６．０、約４．５ないし約６．０、約５．０ないし約６．０、約５．５ないし約６．０、約１．０ないし約５．５、約２．０ないし約５．５、約３．０ないし約５．５、約３．５ないし約５．５、約４．０ないし約５．５、約４．５ないし約５．５、約５．０ないし約５．５、約１．０ないし約５．０、約２．０ないし約５．０、約３．０ないし約５．０、約３．５ないし約５．０、約４．０ないし約５．０、約４．５ないし約５．０、約１．０ないし約４．５、約２．０ないし約４．５、約３．０ないし約４．５、約３．５ないし約４．５、約４．０ないし約４．５、約１．０ないし約４．０、約２．０ないし約４．０、約３．０ないし約４．０、約３．５ないし約４．０、約１．０ないし約３．５、約２．０ないし約３．５、約３．０ないし約３．５、約１．０ないし約３．０、約２．０ないし約３．０、約１．０ないし約２．５、約２．０ないし約２．５、約１．０ないし約２．０、約１．０、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、または約６．０のｐＨを有する溶液であることができる。
【０１６４】
安定化溶液は、たとえば、約１００ｍＭないし約１Ｍ、約１００ｍＭないし約９００ｍＭ、約１００ｍＭないし約８００ｍＭ、約１００ｍＭないし約７００ｍＭ、約１００ｍＭないし約６００ｍＭ、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、約１００ｍＭないし約４００ｍＭ、約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、約１００ｍＭないし約２００ｍＭ、約２００ｍＭないし約１Ｍ、約２００ｍＭないし約９００ｍＭ、約２００ｍＭないし約８００ｍＭ、約２００ｍＭないし約７００ｍＭ、約２００ｍＭないし約６００ｍＭ、約２００ｍＭないし約５００ｍＭ、約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、約２００ｍＭないし約３００ｍＭ、約３００ｍＭないし約１Ｍ、約３００ｍＭないし約９００ｍＭ、約３００ｍＭないし約８００ｍＭ、約３００ｍＭないし約７００ｍＭ、約３００ｍＭないし約６００ｍＭ、約３００ｍＭないし約５００ｍＭ、約３００ｍＭないし約４００ｍＭ、約４００ｍＭないし約１Ｍ、約４００ｍＭないし約９００ｍＭ、約４００ｍＭないし約８００ｍＭ、約４００ｍＭないし約７００ｍＭ、約４００ｍＭないし約６００ｍＭ、約４００ｍＭないし約５００ｍＭ、約５００ｍＭないし約１Ｍ、約５００ｍＭないし約９００ｍＭ、約５００ｍＭないし約８００ｍＭ、約５００ｍＭないし約７００ｍＭ、約５００ｍＭないし約６００ｍＭ、約６００ｍＭないし約１Ｍ、約６００ｍＭないし約９００ｍＭ、約６００ｍＭないし約８００ｍＭ、約６００ｍＭないし約７００ｍＭ、約７００ｍＭないし約１Ｍ、約７００ｍＭないし約９００ｍＭ、約７００ｍＭないし約８００ｍＭ、約８００ｍＭないし約１Ｍ、約８００ｍＭないし約９００ｍＭ、約９００ｍＭないし約１Ｍ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、または約１Ｍの成分濃度を有することができる。
【０１６５】
安定化溶液成分の終濃度は、たとえば、約１００ｍＭないし約１Ｍ、約１００ｍＭないし約９００ｍＭ、約１００ｍＭないし約８００ｍＭ、約１００ｍＭないし約７００ｍＭ、約１００ｍＭないし約６００ｍＭ、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、約１００ｍＭないし約４００ｍＭ、約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、約１００ｍＭないし約２００ｍＭ、約２００ｍＭないし約１Ｍ、約２００ｍＭないし約９００ｍＭ、約２００ｍＭないし約８００ｍＭ、約２００ｍＭないし約７００ｍＭ、約２００ｍＭないし約６００ｍＭ、約２００ｍＭないし約５００ｍＭ、約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、約２００ｍＭないし約３００ｍＭ、約３００ｍＭないし約１Ｍ、約３００ｍＭないし約９００ｍＭ、約３００ｍＭないし約８００ｍＭ、約３００ｍＭないし約７００ｍＭ、約３００ｍＭないし約６００ｍＭ、約３００ｍＭないし約５００ｍＭ、約３００ｍＭないし約４００ｍＭ、約４００ｍＭないし約１Ｍ、約４００ｍＭないし約９００ｍＭ、約４００ｍＭないし約８００ｍＭ、約４００ｍＭないし約７００ｍＭ、約４００ｍＭないし約６００ｍＭ、約４００ｍＭないし約５００ｍＭ、約５００ｍＭないし約１Ｍ、約５００ｍＭないし約９００ｍＭ、約５００ｍＭないし約８００ｍＭ、約５００ｍＭないし約７００ｍＭ、約５００ｍＭないし約６００ｍＭ、約６００ｍＭないし約１Ｍ、約６００ｍＭないし約９００ｍＭ、約６００ｍＭないし約８００ｍＭ、約６００ｍＭないし約７００ｍＭ、約７００ｍＭないし約１Ｍ、約７００ｍＭないし約９００ｍＭ、約７００ｍＭないし約８００ｍＭ、約８００ｍＭないし約１Ｍ、約８００ｍＭないし約９００ｍＭ、約９００ｍＭないし約１Ｍ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、または約１Ｍであることができる。
【０１６６】
安定化溶液は、細胞溶解物および試料へ別々に加えることができるかまたは、細胞溶解物および試料への添加前に異なる組み合わせで組み合わせることができる、複数の溶液および／または成分から成ることができる。したがって、たとえば、緩衝剤の溶液および酸の溶液は細胞へ別々に加えることができる。同様に、本開示のキットは、細胞溶解物または試料への添加前に組み合わせて安定化溶液を形成するかまたは細胞溶解物または試料への別々の添加のための、複数の溶液および／または成分から成ることができる。ストック安定化溶液を希釈して、本開示の方法における使用のための最終安定化溶液を形成することができる。ストック安定化溶液は、安定化溶液についてここで記載された任意の濃度、またはここで記載されたどの安定化溶液または安定化溶液濃度よりも濃縮された任意の濃度を有することができる。安定化溶液成分の終濃度（試料との混合後）は、安定化溶液についてここで記載された任意の濃度であることができる。溶解溶液成分の有用な終濃度は、８０ｍＭトリス−ＨＣｌであることができる。
【０１６７】
ここでは、中性化溶液とは安定化溶液の一種である。中性化した細胞溶解物、中性化した試料、および他の中性化した成分または溶液への言及は、安定化した細胞溶解物、安定化した試料、または他の安定化した成分または溶液の同等物と考えられる。
【０１６８】
Ｈ．変性溶液
本開示の方法の一部の形式では、試料を変性溶液と混合することによって、ＤＮＡ試料を変性条件に曝露することができる。変性溶液は一般的に、加熱といった他の条件と組み合わせて、ＤＮＡ試料中のＤＮＡの相当な変性を引き起こすように試料のｐＨを十分に上げることができる溶液である。相当な変性とは、試料中のＤＮＡ分子の９０％以上におけるヌクレオチドの９０％以上の変性をいう。この場合、ヌクレオチドの変性とは、物理的に処理によって変性したかまたは試料中で既に対形成していなかった、対形成していないヌクレオチドをいう。溶解溶液が変性溶液に必要な作用を有しうる限りは、溶解溶液を変性溶液として用いることができる。
【０１６９】
一部の実施形態では、変性溶液は塩基水溶液といった塩基を含みうる。有用な塩基は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア、アニリン、ベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ジフェニルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、Ｎ−メチルアニリン、モルホリン、ピリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、水酸化アルミニウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、およびＤＢＵ（１，８−ジアゾビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン）を含む。有用な変性溶液の処方は、約１５０ｍＭないし約５００ｍＭＮａＯＨを含む変性溶液、約１５０ｍＭないし約５００ｍＭＮａＯＨを含む変性溶液、および約１５０ｍＭないし約５００ｍＭＮａＯＨから成る変性溶液を含む。変性溶液は使用前に希釈しうる。そのような場合には、反応に加える変性溶液の量は一般的に、比例的に増加させることができる。
【０１７０】
一部の実施形態では、変性溶液は複数の塩基性物質を含みうる。ここでは、塩基性物質とは、変性条件を結果として生じる化合物、組成物または溶液である。一部の実施形態では、変性溶液は緩衝剤を含みうる。有用な緩衝剤は、リン酸緩衝剤、「グッド（Ｇｏｏｄ）」緩衝剤（たとえばＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、およびＴＲＩＣＩＮＥ）、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、およびビス−トリスプロパンを含む。変性溶液は複数の緩衝剤を含みうる。ここでは、緩衝試薬とは、緩衝剤として作用する化合物、組成物または溶液である。アルカリ性緩衝試薬とは、アルカリ性条件を結果として生じる緩衝剤である。一部の実施形態では、変性溶液は１つ以上の塩基、塩基性物質、緩衝剤および緩衝試薬の組み合わせを含みうる。
【０１７１】
ＤＮＡ試料と混合する変性溶液の量は、加熱といった他の条件と組み合わせて、ＤＮＡ試料中のＤＮＡの相当な変性を引き起こす量であることができる。一般的に、この容量は試料／変性溶液混合物のｐＨ、イオン強度、および温度の関数となる。したがって、ＤＮＡ試料と混合すべき変性溶液の量は、一般的に、ＤＮＡ試料の容積、変性緩衝液のアルカリ濃度、および結果として生じる混合物を加熱すべき温度から決定することができる。たとえば、所定の温度では、十分な変性条件を作り出すためには、より弱い塩基および／またはより低濃度の塩基を含む変性溶液に必要な容量よりも、より強い塩基および／またはより高濃度の塩基を含むより少ない容量の変性溶液が必要となる。（希望の変性条件を生じるために）ＤＮＡ試料が、たとえば、１０分の１容量の変性溶液と混合されるように、変性溶液を処方することができる。
【０１７２】
たとえば、変性溶液は、約９．０ないし約１３．０、約９．５ないし約１３．０、約１０．０ないし約１３．０、約１０．５ないし約１３．０、約１１．０ないし約１３．０、約１１．５ないし約１３．０、約１２．０ないし約１３．０、約９．０ないし約１２．０、約９．５ないし約１２．０、約１０．０ないし約１２．０、約１０．５ないし約１２．０、約１１．０ないし約１２．０、約１１．５ないし約１２．０、約９．０ないし約１１．５、約９．５ないし約１１．５、約１０．０ないし約１１．５、約１０．５ないし約１１．５、約１１．０ないし約１１．５、約９．０ないし約１１．０、約９．５ないし約１１．０、約１０．０ないし約１１．０、約１０．５ないし約１１．０、約９．０ないし約１０．５、約９．５ないし約１０．５、約１０．０ないし約１０．５、約９．０ないし約１０．０、約９．５ないし約１０．０、約９．０ないし約９．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５、約１１．０、約１１．５、約１２．０、約１２．５、または約１３．０のｐＨを有する溶液であることができる。
【０１７３】
変性溶液は、たとえば、約１０ｍＭないし約１Ｍ、約１０ｍＭないし約９００ｍＭ、約１０ｍＭないし約８００ｍＭ、約１０ｍＭないし約７００ｍＭ、約１０ｍＭないし約６００ｍＭ、約１０ｍＭないしａｂｏｕｔ５００ｍＭ、約１０ｍＭないし約４００ｍＭ、約１０ｍＭないし約３００ｍＭ、約１０ｍＭないし約２００ｍＭ、約１０ｍＭないし約１００ｍＭ、約１０ｍＭないし約９０ｍＭ、約１０ｍＭないし約８０ｍＭ、約１０ｍＭないし約７０ｍＭ、約１０ｍＭないし約６０ｍＭ、約１０ｍＭないし約５０ｍＭ、約１０ｍＭないし約４０ｍＭ、約１０ｍＭないし約３０ｍＭ、約１０ｍＭないし約２０ｍＭ、約２０ｍＭないし約１Ｍ、約２０ｍＭないし約９００ｍＭ、約２０ｍＭないし約８００ｍＭ、約２０ｍＭないし約７００ｍＭ、約２０ｍＭないし約６００ｍＭ、約２０ｍＭないし約５００ｍＭ、約２０ｍＭないし約４００ｍＭ、約２０ｍＭないし約３００ｍＭ、約２０ｍＭないし約２００ｍＭ、約２０ｍＭないし約１００ｍＭ、約２０ｍＭないし約９０ｍＭ、約２０ｍＭないし約８０ｍＭ、約２０ｍＭないし約７０ｍＭ、約２０ｍＭないし約６０ｍＭ、約２０ｍＭないし約５０ｍＭ、約２０ｍＭないし約４０ｍＭ、約２０ｍＭないし約３０ｍＭ、約３０ｍＭないし約１Ｍ、約３０ｍＭないし約９００ｍＭ、約３０ｍＭないし約８００ｍＭ、約３０ｍＭないし約７００ｍＭ、約３０ｍＭないし約６００ｍＭ、約３０ｍＭないし約５００ｍＭ、約３０ｍＭないし約４００ｍＭ、約３０ｍＭないし約３００ｍＭ、約３０ｍＭないし約２００ｍＭ、約３０ｍＭないし約１００ｍＭ、約３０ｍＭないし約９０ｍＭ、約３０ｍＭないし約８０ｍＭ、約３０ｍＭないし約７０ｍＭ、約３０ｍＭないし約６０ｍＭ、約３０ｍＭないし約５０ｍＭ、約３０ｍＭないし約４０ｍＭ、約４０ｍＭないし約１Ｍ、約４０ｍＭないし約９００ｍＭ、約４０ｍＭないし約８００ｍＭ、約４０ｍＭないし約７００ｍＭ、約４０ｍＭないし約６００ｍＭ、約４０ｍＭないし約５００ｍＭ、約４０ｍＭないし約４００ｍＭ、約４０ｍＭないし約３００ｍＭ、約４０ｍＭないし約２００ｍＭ、約４０ｍＭないし約１００ｍＭ、約４０ｍＭないし約９０ｍＭ、約４０ｍＭないし約８０ｍＭ、約４０ｍＭないし約７０ｍＭ、約４０ｍＭないし約６０ｍＭ、約４０ｍＭないし約５０ｍＭ、約５０ｍＭないし約１Ｍ、約５０ｍＭないし約９００ｍＭ、約５０ｍＭないし約８００ｍＭ、約５０ｍＭないし約７００ｍＭ、約５０ｍＭないし約６００ｍＭ、約５０ｍＭないし約５００ｍＭ、約５０ｍＭないし約４００ｍＭ、約５０ｍＭないし約３００ｍＭ、約５０ｍＭないし約２００ｍＭ、約５０ｍＭないし約１００ｍＭ、約５０ｍＭないし約９０ｍＭ、約５０ｍＭないし約８０ｍＭ、約５０ｍＭないし約７０ｍＭ、約５０ｍＭないし約６０ｍＭ、約６０ｍＭないし約１Ｍ、約６０ｍＭないし約９００ｍＭ、約６０ｍＭないし約８００ｍＭ、約６０ｍＭないし約７００ｍＭ、約６０ｍＭないし約６００ｍＭ、約６０ｍＭないし約５００ｍＭ、約６０ｍＭないし約４００ｍＭ、約６０ｍＭないし約３００ｍＭ、約６０ｍＭないし約２００ｍＭ、約６０ｍＭないし約１００ｍＭ、約６０ｍＭないし約９０ｍＭ、約６０ｍＭないし約８０ｍＭ、約６０ｍＭないし約７０ｍＭ、約７０ｍＭないし約１Ｍ、約７０ｍＭないし約９００ｍＭ、約７０ｍＭないし約８００ｍＭ、約７０ｍＭないし約７００ｍＭ、約７０ｍＭないし約６００ｍＭ、約７０ｍＭないし約５００ｍＭ、約７０ｍＭないし約４００ｍＭ、約７０ｍＭないし約３００ｍＭ、約７０ｍＭないし約２００ｍＭ、約７０ｍＭないし約１００ｍＭ、約７０ｍＭないし約９０ｍＭ、約７０ｍＭないし約８０ｍＭ、約８０ｍＭないし約１Ｍ、約８０ｍＭないし約９００ｍＭ、約８０ｍＭないし約８００ｍＭ、約８０ｍＭないし約７００ｍＭ、約８０ｍＭないし約６００ｍＭ、約８０ｍＭないし約５００ｍＭ、約８０ｍＭないし約４００ｍＭ、約８０ｍＭないし約３００ｍＭ、約８０ｍＭないし約２００ｍＭ、約８０ｍＭないし約１００ｍＭ、約８０ｍＭないし約９０ｍＭ、約９０ｍＭないし約１Ｍ、約９０ｍＭないし約９００ｍＭ、約９０ｍＭないし約８００ｍＭ、約９０ｍＭないし約７００ｍＭ、約９０ｍＭないし約６００ｍＭ、約９０ｍＭないし約５００ｍＭ、約９０ｍＭないし約４００ｍＭ、約９０ｍＭないし約３００ｍＭ、約９０ｍＭないし約２００ｍＭ、約９０ｍＭないし約１００ｍＭ、約１００ｍＭないし約１Ｍ、約１００ｍＭないし約９００ｍＭ、約１００ｍＭないし約８００ｍＭ、約１００ｍＭないし約７００ｍＭ、約１００ｍＭないし約６００ｍＭ、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、約１００ｍＭないし約４００ｍＭ、約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、約１００ｍＭないし約２００ｍＭ、約２００ｍＭないし約１Ｍ、約２００ｍＭないし約９００ｍＭ、約２００ｍＭないし約８００ｍＭ、約２００ｍＭないし約７００ｍＭ、約２００ｍＭないし約６００ｍＭ、約２００ｍＭないし約５００ｍＭ、約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、約２００ｍＭないし約３００ｍＭ、約３００ｍＭないし約１Ｍ、約３００ｍＭないし約９００ｍＭ、約３００ｍＭないし約８００ｍＭ、約３００ｍＭないし約７００ｍＭ、約３００ｍＭないし約６００ｍＭ、約３００ｍＭないし約５００ｍＭ、約３００ｍＭないし約４００ｍＭ、約４００ｍＭないし約１Ｍ、約４００ｍＭないし約９００ｍＭ、約４００ｍＭないし約８００ｍＭ、約４００ｍＭないし約７００ｍＭ、約４００ｍＭないし約６００ｍＭ、約４００ｍＭないし約５００ｍＭ、約５００ｍＭないし約１Ｍ、約５００ｍＭないし約９００ｍＭ、約５００ｍＭないし約８００ｍＭ、約５００ｍＭないし約７００ｍＭ、約５００ｍＭないし約６００ｍＭ、約６００ｍＭないし約１Ｍ、約６００ｍＭないし約９００ｍＭ、約６００ｍＭないし約８００ｍＭ、約６００ｍＭないし約７００ｍＭ、約７００ｍＭないし約１Ｍ、約７００ｍＭないし約９００ｍＭ、約７００ｍＭないし約８００ｍＭ、約８００ｍＭないし約１Ｍ、約８００ｍＭないし約９００ｍＭ、約９００ｍＭないし約１Ｍ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、または約１Ｍの成分濃度を有することができる。
【０１７４】
変性溶液は、ＤＮＡ試料へ別々に加えることができるかまたは、ＤＮＡ試料への添加前に異なる組み合わせで組み合わせることができる、複数の溶液および／または成分から成ることができる。したがって、たとえば、緩衝剤の溶液、および塩基の溶液は、試料へ別々に加えることができる。同様に、本開示のキットは、ＤＮＡ試料への添加前に組み合わせて変性溶液を形成するかまたは試料への別々の添加のための、複数の溶液および／または成分から成ることができる。ストック変性溶液を希釈して、本開示の方法における使用のための最終変性溶液を形成することができる。ストック変性溶液は、変性溶液についてここで記載された任意の濃度、またはここで記載されたどの変性溶液または変性溶液濃度よりも濃縮された任意の濃度を有することができる。変性溶液成分の終濃度（試料との混合後）は、変性溶液についてここで記載された任意の濃度であることができる。
【０１７５】
Ｉ．核酸フィンガープリント
本開示の方法は、核酸の複雑な試料の核酸フィンガープリントの役割を果たす複製された鎖を作成するのに用いることができる。そのような核酸フィンガープリントは、他の、同様に調製された、他の核酸試料の核酸フィンガープリントと比較して、試料間の差の便利な検出を可能にするために用いることができる。核酸フィンガープリントは、関連する核酸試料の検出、および、核酸試料の比較の両方に用いることができる。たとえば、特定の生物の存在または同定は、その被験生物の核酸フィンガープリントを作製し、および結果として生じる核酸フィンガープリントを、既知の生物から調製された参照核酸フィンガープリントと比較することによって検出できる。遺伝子発現パターンにおける変化および差異はまた、異なる細胞試料に由来するｍＲＮＡの核酸フィンガープリントを調製し、および、その核酸フィンガープリントを比較することによって検出できる。複製された鎖はまた核酸試料の起源に特異的である一組のプローブまたはプライマーを作製するのに用いることができる。複製された鎖はまた、試料中に存在する核酸配列のライブラリとして用いることができる。核酸フィンガープリントは、試料の関係する核酸内容全体が実質的に発現するように、試料の全ゲノム増幅から成るかまたはそれに由来するか、または、試料中の選択された標的配列の複数鎖置換増幅に由来することができる。
【０１７６】
核酸フィンガープリントは、後日の使用のために保存または保管することができる。たとえば、本開示の方法で製造された複製鎖は、溶液中で、冷凍して、またはアレイのような基材に付着または接着して、物理的に保存することができる。アレイでの保存は、目的の任意の試料中の核酸に由来する、保存プローブ組を提供するために有用である。別の一例として、核酸フィンガープリントの、またはそれに由来する、情報内容もまた保存することができる。そのような情報は、たとえば、コンピューター読み取り可能媒体に、または、そのような媒体として、保存することができる。核酸フィンガープリントの情報内容の例は、核酸配列情報（完全または一部）；一つの試料中に存在するが別の試料中には存在しない配列のような、差分核酸配列情報；たとえば、核酸アレイ、組、チップ、または他の複製された鎖への複製鎖のハイブリダイゼーションパターンを含む。本開示の方法で作製された核酸フィンガープリントおよび複製鎖であるかまたはそれらに由来しうる多数の他のデータはまた、収集、使用、記録、保存、および／または保管することができる。
【０１７７】
核酸フィンガープリントはまた、本開示の方法で作製された情報に由来する他の情報を含むかまたはそれから成ることができ、および任意の他の起源から得られたかまたは作製された情報と組み合わせることができる。本開示の方法を用いて作製した核酸フィンガープリントの情報性質は、既知の生物情報科学系および方法を用いる組み合わせおよび／または分析に役立つ。
【０１７８】
核酸試料の核酸フィンガープリントは、任意の他の試料に由来する同様の核酸フィンガープリントと比較して、試料中の類似性および差異（試料中の核酸の類似性および差異を示す）を検出することができる。たとえば、第１の核酸試料の核酸フィンガープリントを、第１の核酸試料と同一の種類の生物に由来する試料、第１の核酸試料と同一の種類の組織に由来する試料、第１の核酸試料と同一の種類の生物に由来する試料、第１の核酸試料と同一起源からしかし異なる時に得られた試料、第１の核酸試料とは異なる生物に由来する試料、第１の核酸試料とは異なる種類の組織に由来する試料、第１の核酸試料とは異なる系統の生物に由来する試料、第１の核酸試料とは異なる種の生物に由来する試料、または第１の核酸試料とは異なる種類の生物に由来する試料の核酸フィンガープリントと比較することができる。
【０１７９】
同一の種類の組織とは、肝組織、筋肉組織、または皮膚（同一のまたは異なる生物または種類の生物に由来しうる）といった同一の種類の組織である。同一の生物とは、同一個体、動物、または細胞をいう。たとえば、ひとりの患者から採取した２つの試料は同一の生物に由来する。同一の起源とは同様であるがより幅広く、たとえば、同一の生物、同一の生物由来の同一の組織、同一のＤＮＡ分子、または同一のＤＮＡライブラリに由来する試料をいう。同一の起源に由来する比較すべき試料は別々の時間に採取することができる（そのようにして経時変化の可能性を検出可能にする）。これは、処理または条件変化の作用を評価すべき場合に特に有用である。異なる処理を受けた同一の起源に由来する試料もまた、本開示の方法の方法を用いて採取および比較することができる。異なる生物とは、異なる生物個体、たとえば異なる患者、異なる動物個体をいう。異なる生物とは、同一の種類の異なる生物、または異なる種類の生物を含む。異なる種類の生物とは、イヌとネコ、ヒトとマウス、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）といった異なる種類の生物をいう。異なる種類の組織とは、肝臓と腎臓、または皮膚と脳といった、異なる種類の組織をいう。異なる系統または種の生物とは、本分野で理解される通りの用語として、種または系統表示の異なる生物をいう。
【０１８０】
Ｊ．固相検出器
固相検出器とは、アドレスプローブまたは検出分子を結合してある基材または担体である。好ましい種類の固相検出器はアレイ検出器である。アレイ検出器とは、複数の異なるアドレスプローブまたは検出分子をアレイ、格子、または他の組織化されたパターンで結合してある固相検出器である。
【０１８１】
固相検出器における使用のための基材は、オリゴヌクレオチドを結合させることができる任意の固体材料を含むことができる。これは、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能基化シラン、ポリプロピルフマラート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸といった材料を含む。基材は、チューブ、試験管、エッペンドルフチューブ、ベッセル、マイクロベッセル、プレート、ウェル、マイクロウェルプレートのウェル、マイクロタイタープレートのウェル、チャンバー、マイクロ流体チャンバー、マイクロマシンチャンバー、密閉チャンバー、ホール、凹部、小窪、シャーレ、表面、膜、マイクロアレイ、ファイバー、グラスファイバー、光ファイバー、ファイバー織物、フィルム、ビーズ、瓶、チップ、コンパクトディスク、成型ポリマー、粒子および微粒子を含む任意の有用な形を持つことができる。チップとは材料の長方形または正方形の小片である。表面および他の反応チャンバーは商品であることができる。基材用の好ましい形式は薄フィルム、ビーズ、またはチップである。
【０１８２】
基材上に固定化されたアドレスプローブは、本開示の増幅法の産物の、固相検出器上への捕捉を可能にする。そのような捕捉は、以降の検出段階に干渉しうる反応成分を洗浄除去する便利な方法を提供する。異なるアドレスプローブを固相検出器の異なる領域に結合させることによって、異なる増幅産物を、固相検出器上の異なる、およびしたがって診断用の位置に捕捉することができる。たとえば、多重測定法では、多数の異なる増幅核酸（それぞれが、異なるプライマーの組によって増幅された異なる標的配列を発現する）に特異的なアドレスプローブを、それぞれ異なる位置でアレイに固定化することができる。捕捉および検出は、対応する標的配列が試料中に存在した増幅核酸に対応するアレイ位置だけで起こる。
【０１８３】
オリゴヌクレオチドの基材への固定化のための方法はよく確立されている。アドレスプローブおよび検出プローブを含めてオリゴヌクレオチドは、確立された結合方法を用いて基材に結合することができる。たとえば、適当な結合方法はピース（Ｐｅａｓｅ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１ （１１）： ５０２２−５０２６ （１９９４）、およびクラプコ（Ｋｈｒａｐｋｏ）他，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （Ｍｏｓｋ） （ＵＳＳＲ） ２５： ７１８−７３０ （１９９１）によって記載されている。３'−アミンオリゴヌクレオチドのカゼイン被覆スライド上への固定化のための方法は、スティンプソン（Ｓｔｉｍｐｓｏｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２： ６３７９−６３８３ （１９９５）によって記載されている。オリゴヌクレオチドを基材へ結合する好ましい方法が、グオ（Ｇｕｏ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２： ５４５６−５４６５（１９９４）によって記載されている。核酸チップおよびアレイの例は、そのようなチップおよびアレイを作製および使用する方法を含め、米国特許第６，２８７，７６８号明細書、米国特許第６，２８８，２２０号明細書、米国特許第６，２８７，７７６号明細書、米国特許第６，２９７，００６号明細書、および米国特許第６，２９１，１９３号明細書に記載されている。
【０１８４】
Ｋ．固相試料
固相試料とは、標的配列またはＭＤＡ産物（すなわち、複製された鎖）を結合または付着させてある基材または担体である。標的配列は好ましくは標的試料または測定試料中で送られる。固相試料の好ましい一形態はアレイ試料である。アレイ試料とは、複数個の異なる標的配列を、アレイ、グリッド、または他の組織化されたパターンで結合または付着してある固相試料である。
【０１８５】
固相試料における使用のための固相基材は、標的配列を結合または付着させることができる任意の固体材料を含むことができる。これは、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能基化シラン、ポリプロピルフマラート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸といった材料を含む。基材は、チューブ、試験管、エッペンドルフチューブ、ベッセル、マイクロベッセル、プレート、ウェル、マイクロウェルプレートのウェル、マイクロタイタープレートのウェル、チャンバー、マイクロ流体チャンバー、マイクロマシンチャンバー、密閉チャンバー、ホール、凹部、小窪、シャーレ、表面、膜、マイクロアレイ、ファイバー、グラスファイバー、光ファイバー、ファイバー織物、フィルム、ビーズ、瓶、チップ、コンパクトディスク、成型ポリマー、粒子および微粒子を含む任意の有用な形を持つことができる。チップとは材料の長方形または正方形の小片である。表面および他の反応チャンバーは商品であることができる。基材用の好ましい形式は薄フィルム、ビーズ、またはチップである。
【０１８６】
基材上に固定化された標的配列は、基材上に局在化された標的特異的増幅核酸の形成を可能にする。そのような局在化は、以降の検出段階に干渉しうる反応成分を洗浄除去する便利な方法、および複数の異なる試料を同時に測定する便利な方法を提供する。増幅核酸は、異なる試料が接着している個々の場所で独立して形成されうる。固相試料を作製するための、標的配列または他のオリゴヌクレオチド分子の固定化のために、上記の方法を用いることができる。本開示の方法で作製された核酸は、任意の適当な方法で固相基材へ結合または接着することができる。たとえば、鎖置換複製によって作製した核酸の３’末端へ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて修飾ヌクレオチドを付加し、およびその修飾ヌクレオチドを基材または担体と反応させそれによって核酸を基材または担体と結合させることによって、複数鎖置換によって生じた核酸を結合させることができる。
【０１８７】
基材の好ましい一形式は、最大２５６個の個別の標的試料が小さい点のアレイとして接着してあるスライドガラスである。各点は好ましくは直径０．１ないし２．５ｍｍであり、および非常に好ましくは直径約２．５ｍｍである。そのようなマイクロアレイは、シェーナ（Ｓｃｈｅｎａ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０： ４８７−４７０（１９９５）によって記載された方法を用いて作製することができる。要約すると、１つのプリントチップを備えたアレイ作製装置を用いて、ポリ−Ｌ−リジン被覆顕微鏡スライド（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））上にマイクロアレイを作製することができる。チップには、たとえば、９６ウェルマイクロタイタープレートからＤＮＡ試料（０．５ｍｇ／ｍｌ）１μｌを負荷し、スライド当たり〜０．００５μｌを複数のスライド上に希望の間隔で着ける。印刷されたスライドは次いで加湿チャンバー内で２時間再水和し、１００℃にて１分間急速乾燥し、０．１％ＳＤＳで洗浄し、および５０％１−メチル−２−ピロリドンおよび５０％ホウ酸から成る緩衝液で調製した０．０５％無水コハク酸で処理することができる。スライド上のＤＮＡを次いで、たとえば、蒸留水中で２分間９０℃にて使用直前に変性することができる。マイクロアレイ固相試料は、たとえば、コンピューター制御ＸＹ試料台および顕微対物レンズを備えたレーザー蛍光スキャナーでスキャンすることができる。混合ガス、マルチラインレーザーは、複数の蛍光団の連続的励起を可能にする。
【０１８８】
Ｌ．検出標識
本開示の方法を用いて増幅した核酸の検出および定量を助けるために、検出標識を、増幅された核酸に直接組み込むことができ、または検出分子と結合させることができる。ここでは、検出標識とは、増幅された核酸と直接にまたは間接に結合させることができ、および直接にまたは間接に測定可能な検出可能なシグナルを結果として生じる、任意の分子である。核酸への組み込みまたは核酸プローブとの結合のための多数のそのような標識が当業者に既知である。本開示の方法における使用に適した検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、燐光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
【０１８９】
適当な検出標識の例は、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンチン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、クォンタムダイ（ｑｕａｎｔｕｍｄｙｅ）（商標）のようなランタノイドイオンの巨大環式キレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体のような蛍光エネルギー転移色素、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７を含む。他の特異的蛍光標識の例は、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸，５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレキソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコフォアＦＦＧ溶液、ブランコフォアＳＶ、ＢｏｄｉｐｙＦ１、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルセインブルー、カルシウムグリーン、カルコフルオルＲＷ溶液、カルコフルオルホワイト、カルコフォアホワイトＡＢＴ溶液、カルコフォアホワイト標準溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、ＣＹ７、ダンス（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、ダンサ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンボロンジフルオリド、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、ユークリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導性蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレサミン、フラ−２、ジェナクリルブリリアントレッドＢ、ジェナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ジェナクリルピンク３Ｇ、ジェナクリルイエロー５ＧＦ、グロキザル酸、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、インド−１、イントラホワイトＣｆリキッド、リューコフォアＰＡＦ、リューコフォアＳＦ、リューコフォアＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ、ルシファーイエローＶＳ、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスティルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアーファストレッド、ヌクレアーイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラロスアニリン（フォイルゲン）、フォアワイトＡＲ溶液、フォアワイトＢＫＬ、フォアワイトＲｅｖ、フォアワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインデセンポントクロムブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエキストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スティルベンイソチオスルホン酸）、スティルベン、スナーフ１、スルホローダミンＢキャンＣ、スルホローダミンＧエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ、およびＸＲＩＴＣ．を含む。
【０１９０】
好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光団の吸収極大および放射極大はそれぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、したがってそれらの同時検出が可能である。フルオレセイン色素の他の例は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２'，４'，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２'，４'，５'，７'，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２'，７'−ジメトキシ−４'，５'−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２'−クロロ−５'−フルオロ−７'，８'−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、および２'−クロロ−７'−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を含む。蛍光標識は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；モレキュラー・プローブズ社（オレゴン州ユージン）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；およびリサーチ・オーガニクス社（オハイオ州クリーブランド）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を含むさまざまな販売者から入手可能である。
【０１９１】
目的のその他の標識は、標識が結合しているプローブが標的分子へ特異的に結合している場合だけシグナルを与えるものを含み、ここでそのような標識はチャギ（Ｔｙａｇｉ）およびクレーマー（Ｋｒａｍｅｒ），ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９６） １４： ３０３および欧州特許第００７０６８５Ｂ１号明細書に記載された通りの「分子ビーコン」を含む。その他の目的の標識は、米国特許第５，５６３，０３７号明細書；国際公開第９７／１７４７１号パンフレットおよび国際公開第ＷＯ９７／１７０７６号パンフレットに記載されたものを含む。
【０１９２】
標識化ヌクレオチドは、合成中に増幅産物へ直接組み込むことができるため、好ましい種類の検出標識である。増幅された核酸へ組み込むことができる検出標識の例は、ＢｒｄＵｒｄ（５−ブロモデオキシウリジン，ホイ（Ｈｏｙ）およびシムケ（Ｓｃｈｉｍｋｅ），ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ ２９０： ２１７−２３０（１９９３） ）、アミノアリルデオキシウリジン（ヘネガリウ（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ）他，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８： ３４５−３４８ （２０００））、５−メチルシトシン（サノ（Ｓａｎｏ）他，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９５１： １５７−１６５ （１９８８））、ブロモウリジン（ワンシック（Ｗａｎｓｉｃｋ）他，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ １２２： ２８３−２９３ （１９９３） ）といったヌクレオチドアナログ、および、ビオチン （ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６６３３（１９８１）またはジゴキシゲニンといった適当なハプテン（ケルクホフ（Ｋｅｒｋｈｏｆ），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５： ３５９−３６４ （１９９２））を用いて修飾されたヌクレオチドを含む。適当な蛍光標識化ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアナート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（ユー（Ｙｕ）他，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２： ３２２６−３２３２ （１９９４） ）。ＤＮＡのための好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ））である。ＤＮＡへの検出標識の組み込みに好ましい他のヌクレオチドアナログは、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジン三リン酸、シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ））、および５−メチル−ｄＣＴＰ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））である。ＲＮＡへの検出標識の組み込みに好ましいヌクレオチドアナログは、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５'−三リン酸，ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））である。フルオレセイン、Ｃｙ３、およびＣｙ５は、直接標識化のためにｄＵＴＰへ結合することができる。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン標識化またはジゴキシゲニン標識化プローブの二次検出のための、アビジンまたは抗ジゴキシゲニン複合体として入手可能である。
【０１９３】
ビオチンのような、増幅された核酸に組み込まれている検出標識は、その後に本分野でよく知られている高感度法を用いて検出することができる。たとえば、ビオチンは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体（トロピックス社（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．））を用いて検出することができ、この複合体はビオチンと結合しおよび続いて適当な基質（たとえば、化学発光基質ＣＳＰＤ：３−（４−メトキシスピロ−［１，２，−ジオキセタン−３−２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート２ナトリウム；（トロピックス社（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．））の化学発光によって検出される。標識はまた、たとえば、化学シグナル増幅を用いてまたは光（たとえば、化学発光１，２−ジオキセタン基質）または蛍光シグナルを生じる基質を酵素に用いることによって検出することができる、アルカリホスファターゼ、ダイズペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびポリメラーゼといった酵素であることができる。
【０１９４】
これらの検出標識のうち２種類以上を組み合わせた分子もまた考えられる検出標識である。既知の検出標識のうち任意のものを、本開示の方法を用いて増幅した核酸を標識および検出するための、本開示のプローブ、タグ、および方法と共に用いることができる。検出標識によって生じたシグナルを検出および測定するための方法もまた当業者に既知である。たとえば、放射性同位体はシンチレーション計測または直接可視化によって検出することができる；蛍光分子は蛍光分光光度計を用いて検出することができる；リン光分子は分光光度計を用いて検出することができ、またはカメラを用いて直接的に可視化することができる；酵素は、酵素によって触媒される反応の産物の検出または視覚化によって検出することができる；抗体は、抗体と結合した二次検出標識を検出することによって検出できる。ここでは、検出分子とは、増幅された核酸と相互作用し、および１つ以上の検出標識が結合している分子である。
【０１９５】
Ｍ．検出プローブ
検出プローブは、増幅された核酸上の検出タグと相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドである。検出プローブの相補的部分は、検出プローブと検出タグの間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さでありうる。このために、１０ないし３５ヌクレオチドの長さが好ましく、検出プローブの相補的部分は長さ１６ないし２０ヌクレオチドが非常に好ましい。検出プローブは上記の検出標識のうち任意のものを含むことができる。好ましい標識はビオチンおよび蛍光分子である。特に好ましい検出プローブは分子ビーコンである。分子ビーコンとは、蛍光部分で標識化された検出プローブであり、ここでその蛍光部分は検出プローブがハイブリダイズした場合のみ蛍光を発する（チャギ（Ｔｙａｇｉ）およびクレーマー（Ｋｒａｍｅｒ），ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４： ３０３−３０９（１９９５））。ハイブリダイズしなかった検出プローブはシグナルを生じないため、そのようなプローブの使用は、標識検出の前の、ハイブリダイズしなかったプローブの除去の必要性を無くす。このことは多重測定法において特に有用である。
【０１９６】
Ｎ．アドレスプローブ
アドレスプローブとは、プライマー上のアドレスタグと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。アドレスプローブの相補的部分は、アドレスプローブとアドレスタグの間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さでありうる。このために、１０ないし３５ヌクレオチドの長さが好ましく、アドレスプローブの相補的部分は長さ１２ないし１８ヌクレオチドが非常に好ましい。アドレスプローブは単一の相補的部分または複数の相補的部分を含みうる。好ましくは，アドレスプローブは直接的にまたはスペーサー分子を介して、固相担体と結合している。アドレスプローブと固相担体のそのような組み合わせは、固相検出器の好ましい一形式である。 
【０１９７】
Ｏ．オリゴヌクレオチド合成
プライマー、検出プローブ、アドレスプローブ、および任意の他のオリゴヌクレオチドは、確立されたオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドを製造または合成するための方法は本分野でよく知られている。そのような方法は標準的な酵素消化に続くヌクレオチド断片単離（たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，『分子クローニング：実験の手引き』第二版（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．），１９８９）第５，６章を参照）から、たとえばシアノエチルホスホアミダイト法といった純粋に合成的な方法にわたることができる。ＤＮＡ断片の固相化学合成は、保護ヌクレオシドであるシアノエチルホスホアミダイトを用いて定型的に実施されている（Ｓ．Ｌ．ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）他（１９８１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２： １８５９）。この手法では、最初の５'−保護ヌクレオシドの３'−水酸基がまずポリマー担体に共有付加される （Ｒ．Ｃ．プレス（Ｐｌｅｓｓ）他 （１９７５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２：７７３ （１９７５））。オリゴヌクレオチドの合成は次いで、付加されたヌクレオシドの５'−水酸基の脱保護、その後の次のヌクレオシド−３'−ホスホアミダイトの脱保護された水酸基への結合によって進行する（Ｍ．Ｄ．マテウッチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）他 （１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３： ３１８５）。 結果として生じる亜リン酸トリエステルは最後に酸化されてリン酸トリエステルとなり、ヌクレオシド間結合を完成する（Ｒ．Ｌ．レツィンジャー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）他 （１９７６） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９： ３６５５）。代替的に、ホスホロチオエート 結合の合成を亜リン酸トリエステルの硫化によって実施することができる。この反応を行うためにはいくつかの化学物質を用いることができ、その中に，３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン，１，１−ジオキシドがある（Ｒ．Ｐ．アイヤル（Ｉｙｅｒ），Ｗ．イーガン（Ｅｇａｎ），Ｊ．Ｂ．レーガン（Ｒｅｇａｎ），およびＳ．Ｌ．ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，１２５３−１２５４）。脱保護、結合、および酸化の段階は、希望の長さおよび配列のオリゴヌクレオチドが得られるまで反復される。Ｈ−ホスホナート法（Ｈａｌｌｅｔ ａｌ，（１９５７） Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３２９１−３２９６） またはイクタ（Ｉｋｕｔａ）他，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３： ３２３−３５６ （１９８４）（リン酸トリエステルおよび亜リン酸トリエステル法）およびナラング（Ｎａｒａｎｇ）他，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，６５： ６１０−６２０ （１９８０）（リン酸トリエステル法）に記載された通りのリン酸トリエステル法といった、オリゴヌクレオチドを作製するための他の方法が存在する。タンパク質核酸分子��、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）他，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）によって記載されたもののような既知の方法を用いて作製することができる。オリゴヌクレオチド合成のその他の形が、米国特許第６，２９４，６６４号明細書および米国特許第６，２９１，６６９号明細書に記載されている。
【０１９８】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は一般的に、オリゴヌクレオチド鎖へ合成中にサブユニットブロックのサブユニットを付加する順序によって決定される。付加の各回は、異なる特定のヌクレオチド前駆体、または１種類以上の異なるヌクレオチド前駆体の混合物を含むことができる。特定配列の本開示のプライマーのためには、特定のヌクレオチド前駆体を連続的に付加する。一般的に、オリゴヌクレオチド中の縮重またはランダム位置は、その位置に存在しうる範囲のヌクレオチドを発現したヌクレオチド前駆体の混合物を用いることによって作製することができる。したがって、オリゴヌクレオチド中の特定位置についての反応に、その位置がＡおよびＴについて縮重すべきである場合、ＡおよびＴの前駆体を含めることができる。完全な縮重またはランダム位置については、４種類すべてのヌクレオチドの前駆体を含めることができる。完全にランダムなオリゴヌクレオチドは、４種類すべてのヌクレオチド前駆体を合成のすべての回に含めることによって作製できる。異なるヌクレオチドの異なる割合を持つ縮重オリゴヌクレオチドもまた作製することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、たとえば、異なるヌクレオチド前駆体を、希望の割合で、反応において用いることによって作製することができる。
【０１９９】
ここに記載されたオリゴヌクレオチドの多くは、別のオリゴヌクレオチドまたは核酸の一定の部分との間に安定したハイブリッドが形成されるように、それらと相補的であるように設計される。これらのハイブリッドの安定性はレズニック（Ｌｅｓｎｉｃｋ）およびフレイアー（Ｆｒｅｉｅｒ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４： １０８０７−１０８１５ （１９９５）、 マクグノー（ＭｃＧｒａｗ）他，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８： ６７４−６７８ （１９９０）、およびライクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ）他，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８： ６４０９−６４１２ （１９９０）に記載されたような既知の方法を用いて計算することができる。 
【０２００】
六量体 オリゴヌクレオチドを、パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）８９０９迅速核酸合成系で、標準のβ−シアノエチルホスホアミダイト結合法を用いて混合ｄＡ＋ｄＣ＋ｄＧ＋ｄＴ合成カラム（グレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），バージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ））で合成した。４種類のホスホアミダイトを等しい比率で混合し、オリゴヌクレオチドの各位置での塩基をランダム化した。新しく形成された亜リン酸の酸化は、硫化試薬３Ｈ−１，２−ベンゾチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（グレン・リサーチ社（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）を、標準の酸化試薬の代わりに第１および第２のホスホアミダイト付加段階後に用いて実施した。チオ−亜リン酸化オリゴヌクレオチドを、３０％水酸化アンモニウム（３．０ｍｌ）を含む水を用いて５５℃にて１６時間脱保護し、ＯＰ１２０サバント・オリゴプレップ（Ｓａｖａｎｔ Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｅｐ）脱保護器で２時間濃縮し、およびＰＤ１０セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラムで取扱説明書に従って脱塩した。
【０２０１】
関係する機能が維持される限り、プライマー、検出プローブ、アドレスプローブ、および任意の他のオリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）から成るかまたはそれを含むことができる。多数の修飾ヌクレオチドが既知であり、およびオリゴヌクレオチドに用いることができる。ヌクレオチドアナログとは、塩基、糖、またはリン酸部分のどれかに何らかの種類の修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分への修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、およびウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、および２−アミノアデニン−９−イルといった別のプリンまたはピリミジン塩基の天然および合成の修飾を含む。修飾塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含むがそれらに限定されない。他の塩基修飾は、たとえば米国特許第３，６８７，８０８号明細書、エングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ）他，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、およびサングヴィ（Ｓａｎｇｈｖｉ），Ｙ．Ｓ．，『アンチセンス研究および応用』（ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）１５章 ２８９〜３０２ページ（クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｓ．Ｔ．およびレブルー（Ｌｅｂｌｅｕ），Ｂ．編、ＣＲＣプレス社（ＣＲＣＰｒｅｓｓ），１９９３）に見出すことができる。ある種のヌクレオチドアナログ、たとえば、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンは、二重鎖構成の安定性を高めることができる。他の修飾塩基は、ユニバーサル塩基として機能するものである。ユニバーサル塩基は３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールを含む。ユニバーサル塩基は通常の塩基を置換するがしかし塩基対形成に偏りを有しない。すなわち、ユニバーサル塩基は任意の他の塩基と塩基対形成することができる。塩基修飾はしばしば、二重鎖安定性の増大といった独自の特性を達成するために、たとえば２’−Ｏ−メトキシエチルといった糖修飾と組み合わせることができる。多数の米国特許、たとえば第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０��号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１，５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；および第５，６８１，９４１，号があり、それらはさまざまな塩基修飾を詳述および説明する。これらの特許のそれぞれは参照により全体が、特に塩基修飾、その合成、その使用、およびそのオリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みの記載に関して、本開示に含まれる。
【０２０２】
ヌクレオチドアナログはまた、糖部分の修飾を含みうる。糖部分への修飾は、リボースおよびデオキシリボースへの天然の修飾、および合成修飾を含む。糖修飾は、下記の２’位での修飾を含むがそれらに限定されない：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルであって、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換Ｃ１からＣ１０、アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルでありうる。２’糖修飾はまた、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ]ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ[（ＣＨ２）ｎＣＨ３）]２を含むがそれらに限定されず、ここでｎおよびｍは１ないし約１０である。
【０２０３】
２’位での他の修飾は下記を含むがそれらに限定されない：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、割り込み物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。同様の修飾はまた、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドのまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、または５’末端ヌクレオチドの５’位で行うことができる。修飾糖はまた、架橋環の酸素でのＣＨ２およびＳのような修飾を含むものを含む。ヌクレオチド糖アナログはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分といった糖ミメティックを持つことができる。多数の米国特許、たとえば第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号が、そのような修飾糖構造の調製を教示し、そのそれぞれが、特に修飾糖構造、その合成、その使用、およびそのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みの記載に関して、全体が参照により本開示に含まれる。
【０２０４】
ヌクレオチドアナログはまたリン酸部分で修飾することができる。修飾リン酸部分は、２つのヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’−アルキレンホスホナートを含む他のアルキルホスホナートおよびキラルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むように修飾することができるものを含むがそれらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸または修飾リン酸結合は３’−５’結合または２’−５’結合を介することができ、および結合は３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’といった逆の極性を含むことができることが理解される。さまざまな塩、塩の混合物、および遊離酸の形もまた含まれる。多数の米国特許が修飾リン酸を含むヌクレオチドを製造および使用する方法を教示し、およびそれらは、それぞれが、特に修飾リン酸、その合成、その使用、およびそのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みの記載に関して、全体が参照により本開示に含まれる第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；および第５，６２５，０５０号を含むがそれらに限定されない。
【０２０５】
ヌクレオチドアナログは単一の修飾を含みさえすればよいが、しかしまた複数の修飾を１つの部分のうちにまたは異なる部分の間に含みうると理解される。
【０２０６】
ヌクレオチド代用物とは、ヌクレオチドと同様の機能的特性を有するが、リン酸部分を含まない、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような分子である。ヌクレオチド代用物は、ワトソン・クリック型またはフーグステン型の方法で相補的核酸を認識およびハイブリダイズ（塩基対形成）するが、リン酸部分以外の部分を介して互いに結合している分子である。ヌクレオチド代用物は、適切な標的核酸と相互作用する際、二重らせん型の構造を取ることができる。
【０２０７】
ヌクレオチド代用物は、リン酸部分および／または糖部分を置換したヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド代用物は標準的なリン原子を含まない。リン酸の代用物は、たとえば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキル混合ヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合であることができる。これらは、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの頭部分から形成される）を持つもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；およびその他のＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の混合部分を持つものを含む。多数の米国特許がこれらの種類のリン酸代替物を製造および使用する方法を開示し、およびそれらは、それぞれが、特にリン酸代用物、その合成、その使用、およびそのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みの記載に関して、全体が参照により本開示に含まれる第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号を含むがそれらに限定されない。
【０２０８】
ヌクレオチド代用物において、ヌクレオチドの糖部分およびリン酸部分の両方を、たとえばアミド型結合によって置換することができることもまた理解される（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）。米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号はＰＮＡ分子を製造および使用する方法を教示し、そのそれぞれが参照により本開示に含まれる。（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１４９７−１５００（１９９１）も参照）。
【０２０９】
オリゴヌクレオチドはヌクレオチドから成ることができ、および異なる種類のヌクレオチドまたは同一の種類のヌクレオチドから構成されうる。たとえば、あるオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの１つ以上は、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であることができる；ヌクレオチドの約１０％から約５０％はリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であることができる；ヌクレオチドの約５０％以上はリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であることができる；またはすべてのヌクレオチドはリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物である。そのようなオリゴヌクレオチドをキメラオリゴヌクレオチドと呼ぶことができる。
【０２１０】
Ｐ．ＤＮＡポリメラーゼ
複数置換増幅に有用なＤＮＡポリメラーゼは、単独でまたは対応する鎖置換因子と組み合わせて、複製中に遭遇したハイブリダイズした鎖を置換する能力がなければならない。そのようなポリメラーゼをここでは鎖置換ＤＮＡポリメラーゼという。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは５'から３'へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くことが好ましい。鎖置換は、標的配列の複数コピーの合成を結果として生じるために必要である。５'から３'へのエキソヌクレアーゼ活性は、もしあれば、合成された鎖の破壊を結果として生じうる。また、本開示の方法における使用のためのＤＮＡポリメラーゼは、高度に連続性であることが好ましい。本開示の方法における使用のためのＤＮＡポリメラーゼの適切性は、それの鎖置換複製を実施する能力を評価することによって容易に判定することができる。好ましい鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージ２９ＤＮＡポリメラーゼ（ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）他への米国特許第５，１９８，５４３号および第５，００１，０５０号）、Ｂｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼ（エキソ（−）Ｂｓｔ；アリオッタ（Ａｌｉｏｔｔａ）他，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．（オランダ）１２： １８５−１９５ （１９９６） ）およびエキソ（−）ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）およびリン（Ｌｉｎｎ），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４２： １６０４−１６０８（１９９６））である。他の有用なポリメラーゼは、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ（マツモト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）他，Ｇｅｎｅ ８４： ２４７（１９８９） ）、ファージｆＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ユング（Ｊｕｎｇ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４： ８２８７ （１９８７） ）、エキソ（−）ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（コング（Ｋｏｎｇ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５ （１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（ジェイコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５： ６２３−６２７（１９７４））、 Ｔ５ ＤＮＡ ポリメラーゼ（チャタジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）他，Ｇｅｎｅ ９７： １３−１９（１９９１））、シークエナーゼ（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルズ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、ＰＲＤ１ＤＮＡ ポリメラーゼ （ツー（Ｚｈｕ）およびイトー（Ｉｔｏ），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９： ２６７−２７６ （１９９４））、およびＴ４ＤＮＡ ポリメラーゼホロ酵素（カボード（Ｋａｂｏｏｒｄ）およびベンコビク（Ｂｅｎｋｏｖｉｃ），Ｃｔｉｒｒ．Ｂｉｏｌ．５： １４９−１５７ （１９９５））を含む。２９ＤＮＡポリメラーゼが非常に好ましい．
【０２１１】
ここでは、熱不安定性核酸ポリメラーゼとは、増幅反応を実施する温度で添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で明らかに不活性化される核酸ポリメラーゼである。したがって、核酸ポリメラーゼが熱不安定性であるかどうかは、増幅反応を実施する温度に依存する。ここでは、熱不安定性はポリメラーゼの変性または不可逆的不活性化を要しないことに注意する。必要条件は、ポリメラーゼが、増幅反応を実施する温度で添加剤の非存在下で明らかにテンプレート依存性重合を実施することができないことだけである。
【０２１２】
ここでは、高温とは、任意の核酸ポリメラーゼが添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で明らかに不活性化される温度またはそれを上回る温度である。したがって、何が高温に当たるかはその特定の核酸ポリメラーゼに依存する。ここでは、明らかな不活性化とは、活性の４０％以上の低下をいう。相当な不活性化とは、活性の６０％以上の低下をいう。顕著な不活性化とは、活性の８０％以上の低下をいう。
【０２１３】
鎖置換は、ヘリカーゼといった鎖置換 因子の使用によって促進することができる。鎖置換 因子の存在下で鎖置換複製を行うことができる任意のＤＮＡポリメラーゼは、その ＤＮＡ ポリメラーゼが そうした因子の非存在下では鎖置換 複製を行わなくても、本開示の方法における使用に適すると考えられる。鎖置換複製において有用な鎖置換因子は、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼ補助サブユニット（ツルミ（Ｔｓｕｒｕｍｉ）他，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７ （１２）： ７６４８−７６５３（１９９３））、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質 （ツィダーベルト（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄ）およびファンデルフリート（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６８ （２）： １１５８−１１６４ （１９９４） ）、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（ベーマー（Ｂｏｅｈｍｅｒ）およびレーマン（Ｌｅｈｍａｎ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６７ （２）： ７１１−７１５ （１９９３）；スカリター（Ｓｋａｌｉｔｅｒ）およびレーマン（Ｌｅｈｍａｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（２２）： １０６６５−１０６６９（１９９４））；１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；リグラー（Ｒｉｇｌｅｒ）およびロマーノ（Ｒｏｍａｎｏ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−８９１９（１９９５））；ファージＴ４遺伝子３２タンパク質（ウィレマイン（Ｖｉｌｌｅｍａｉｎ）およびギードロク（Ｇｉｅｄｒｏｃ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５： １４３９５−１４４０４ （１９９６）；および仔ウシ胸腺ヘリカーゼ（ジーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７： １３６２９−１３６３５（１９９２））を含む。
【０２１４】
ポリメラーゼが鎖置換複製を実施する能力は、実施例４および８に記載のように、ポリメラーゼを鎖置換複製測定法に用いることによって測定することができる。実施例中の測定法は、必要に応じて改変することができる。たとえば、ＳＳＢの代わりにヘリカーゼを用いることができる。そのような測定法は、使用される酵素について最適活性に適した温度で、たとえば、φ２９ＤＮＡポリメラーゼについては３２℃、エキソ（−）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼについては４６℃ないし６４℃、または超好熱生物由来の酵素については約６０℃ないし７０℃で実施すべきである。６０℃ないし７０℃の測定法については、測定温度に適した融点を与えるために、プライマー長を増加させることができる。ポリメラーゼを選択するための他の有用な測定法は、コング（Ｋｏｎｇ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５ （１９９３）に記載されたプライマー−ブロック測定法である。本測定法は、伸長プライマーの上流にハイブリダイズしてその進行を止めるためのオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下でＭ１３ｓｓＤＮＡテンプレートを用いる、プライマー伸長測定法から成る。この測定法において、遮断するプライマーを置換することができる酵素は、本開示の方法のために有用であると予測される。
【０２１５】
Ｑ．キット
上記の材料は、本開示の方法を実施するために有用なキットとして、任意の適当な組み合わせで同梱することができる。任意のキットのキット構成要素は、本開示の方法における一緒の使用のために設計および適応させることができる。たとえば、ゲノムＤＮＡを増幅するためのキットであって、溶解溶液、安定化溶液、一組のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含むキットが開示される。そのようなキットの構成要素はここに別に記載する。キットの一部の形式では、溶解溶液は水酸化カリウム、たとえば、４００ｍＭＫＯＨを含みうる。溶解 溶液の一部の有用な形式は、４００ ｍＭ ＫＯＨ、１００ ｍＭ ジチオスレイトール、および１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含みうる。キットの一部の形式では、安定化溶液はｐＨ４．１のトリス−ＨＣｌを含みうる。安定化溶液の一部の有用な形式は８００ｍＭトリス−ＨＣＩ、ｐＨ４．１を含みうる。キットの一部の形式では、プライマーの組はランダム六量体プライマーを含みうる。キットの一部の形式では、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼでありうる。キットの一部の形式では、キットはさらにデオキシヌクレオチド三リン酸を含みうる。キットの一部の形式では、キットはさらに１種類以上の検出プローブを含みうる。検出プローブはここに別に記載する。キットの一部の形式では、検出プローブは相補的部分を含むことができ、ここでその相補的部分は目的の核酸配列と相補的である。キットの一部の形式では、キットはさらに変性溶液を含みうる。キットの一部の形式では、キットはさらに反応混合物を含みうる。また、核酸試料の増幅のためのキットであって、単一のプライマーおよびφ２９ＤＮＡポリメラーゼを含むキットが開示される。キットはまた、ヌクレオチド、緩衝剤、検出プローブ、蛍光変化プローブ、溶解溶液、安定化溶液、変性溶液、または組み合わせを含みうる。
【０２１６】
一部の有用なキットは、溶解溶液、安定化溶液、一組のプライマー、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、１Ｍジチオスレイトール、１Ｘリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５、および対照ＤＮＡテンプレートを含みうる；ここで溶解溶液は４００ｍＭＫＯＨおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含み、安定化溶液は８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４を含み、およびプライマーの組は反応混合物を含む；ここで反応混合物は１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＫＣｌ、４０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、および０．２ｍＭランダム六量体プライマーを含む。
【０２１７】
核酸ポリメラーゼはファイ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。添加剤は、糖、シャペロン、タンパク質、トレハロース、グルコース、スクロース、または組み合わせであることができる。添加剤はトレハロースを含むことができ、プライマーの組はエキソヌクレアーゼ耐性ランダム六量体プライマーを含むことができ、および核酸ポリメラーゼはファイ２９ＤＮＡポリメラーゼを含むことができる。キットはさらに、適当な量で混合した際に、１０ｍＭＭｇＣｌ２、３７．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、および１ｍＭ ｄＮＴＰの終濃度を有する反応混合物を生じる、一種類以上の成分を含むことができる。キットはさらに、安定化溶液、溶解溶液、プライマーの組、ジチオスレイトール、リン酸緩衝生理食塩水、およびＤＮＡテンプレートを含む反応混合物のうち任意の１つまたは組み合わせを含むことができる。安定化溶液は８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４を含みうる；溶解溶液は４００ｍＭ ＫＯＨ、１００ ｍＭ ジチオスレイトール、および１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含みうる；反応混合物は１５０ ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ ｍＭ ＫＣｌ、４０ ｍＭＭｇＣｌ２、２０ ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、および０．２ｍＭランダム六量体プライマーを含みうる；ジチオスレイトールは１Ｍジチオスレイトールを含みうる；およびリン酸緩衝生理食塩水は１Ｘリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５を含みうる。そのようなキットの構成要素はここに別に記載する。
【０２１８】
一緒に使用することができるキット中に存在しうる任意の構成要素は、キットの単一の構成要素中に組み合わせることができる。したがって、反応混合物は、たとえば、緩衝剤、デオキシヌクレオチド三リン酸およびプライマーを含みうる。同様に、構成要素および溶液は成分パーツまたは部分溶液に分割することができる。キットは任意の目的に、一般的に核酸増幅のために用いることができる。一部の形式では、キットはゲノムまたは他の核酸試料中の目的の核酸配列を検出するために設計することができる。一部の形式では、キットは、目的の核酸配列に基づいて、個人の疾患、症状または素因を評価するために設計することができる。
【０２１９】
Ｒ．混合物
本開示の方法の任意の形式を実施することによって形成されたかまたは実施の過程で形成された混合物が開示される。たとえば、たとえば細胞および溶解溶液；細胞溶解物および安定化溶液；安定化した細胞溶解物および１種類以上のプライマー；安定化した細胞溶解物およびＤＮＡポリメラーゼ；安定化した細胞溶解物、１種類以上のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼ；安定化した細胞溶解物および複製された鎖；安定化した細胞溶解物、１種類以上のプライマー、および複製された鎖；安定化した細胞溶解物、ＤＮＡポリメラーゼ、および複製された鎖；安定化した細胞溶解物、１種類以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および複製された鎖；安定化した細胞溶解物および１種類以上の検出プローブ；安定化した細胞溶解物、１種類以上のプライマー、１種類以上の検出プローブ、および複製された鎖；安定化した細胞溶解物、ＤＮＡポリメラーゼ、１種類以上の検出プローブ、および複製された鎖；安定化した細胞溶解物、１種類以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、１種類以上の検出プローブ、および複製された鎖、試料および溶解溶液；試料および安定化溶液；安定化した試料および１種類以上のプライマー；安定化した試料およびＤＮＡポリメラーゼ；安定化した試料、１種類以上のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼ；安定化した試料および複製された鎖；安定化した試料、１種類以上のプライマー、および複製された鎖；安定化した試料、ＤＮＡポリメラーゼ、および複製された鎖；安定化した試料、１種類以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および複製された鎖；安定化した試料および１種類以上の検出プローブ；安定化した試料、１種類以上のプライマー、１種類以上の検出プローブ、および複製された鎖；安定化した試料、ＤＮＡポリメラーゼ、１種類以上の検出プローブ、および複製された鎖；および安定化した試料、１種類以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、１種類以上の検出プローブ、および複製された鎖を含む混合物が開示される。
【０２２０】
単一のプライマー、核酸試料、およびＤＮＡポリメラーゼ；単一のプライマー、ゲノム核酸試料、およびＤＮＡポリメラーゼ；１種類以上のプライマー、１種類以上の核酸試料、および１種類以上のＤＮＡポリメラーゼ；単一のプライマー、核酸試料、および１種類以上の検出プローブ；単一のプライマー、核酸試料、および１種類以上の蛍光変化プローブ；単一のプライマー、核酸試料、および複製された核酸分子；単一のプライマー、ゲノム核酸試料、および複製された核酸分子；１種類以上のプライマー、１種類以上の核酸試料、および複製された核酸分子；単一のプライマー、核酸試料、複製された核酸分子、および１種類以上の検出プローブ；単一のプライマー、核酸試料、複製された核酸分子、および１種類以上の蛍光変化プローブを含む混合物もまた開示される。
【０２２１】
方法が、たとえば組成物または成分または試薬を混合または接触させることを含む場合は常に、その方法を実施することはいくつかの異なる混合物を生じる。たとえば、方法が３つの混合段階を含む場合、段階が連続的に実施されるならば、これらの段階の１つごとの後に独自の混合物が生じる。加えて、段階がどのように実施されたかにかかわらず、全段階の完了後には混合物が生じる。 本開示は、本開示の方法の実施によって得られたこれらの混合物、およびたとえばここで開示される任意の開示された試薬、組成物、または成分を含む混合物について検討する。
【０２２２】
Ｓ．系
本開示の方法を実施するために、またはその実施を助けるために、有用な系が開示される。系は一般的に構造物、機械、装置、などといった製品、および組成物、化合物、材料、などの組み合わせを構成する。開示されるかまたは本開示から明らかであるそのような組み合わせを検討する。たとえば、固相担体およびプライマー、核酸試料、検出プローブ、蛍光変化プローブ、または組み合わせを含む系が開示および検討される。
【０２２３】
Ｔ．データ構造およびコンピューター制御
本開示の方法で用いられる、それによって生じる、またはそこから作製される、データ構造が開示される。データ構造とは一般的に、構成物または媒体中で、回収、組織、保存、および／または具体化された任意の形のデータ、情報、および／または対象である。ＲＡＭまたは保存ディスクといった電子形式で保存された核酸ライブラリは一種のデータ構造である。
【０２２４】
本開示の方法，またはその任意の一部またはそのための調製物は、コンピューター制御によって制御、管理、でなければまたは補助することができる。そのようなコンピューター制御は、コンピューター制御された処理または方法によって達成することができ、データ構造を使用および／または作製することができ、およびコンピュータープログラムを使用することができる。そのようなコンピューター制御、コンピューター制御された処理、データ構造、およびコンピュータープログラムが検討され、およびここで開示されるものとする。
【０２２５】
用途
本開示の方法および組成物は、細胞中に存在する核酸の分析（たとえば、細胞中のゲノムＤＮＡの分析）、疾患検出、突然変異検出、遺伝子発見、遺伝子マッピング（分子ハプロタイプ分析）、および農業研究を含むがそれらに限定されない多数の分野に応用可能である。特に有用なのは全ゲノム増幅である。他の用途は、たとえば、細胞中およびゲノムＤＮＡアレイ上の核酸の検出；分子ハプロタイプ分析；突然変異検出；嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、糖尿病、血友病、鎌状赤血球貧血といった遺伝病の検出；前立腺がん、乳がん、肺がん、大腸がん、卵巣がん、精巣がん、膵臓がんといったがんについての素因の評価を含む。
【０２２６】
方法
核酸を増幅する方法が開示される。 特に、低い増幅、偏り、および／または増幅産物の品質の他の指標を有する増幅産物を作製するための方法が開示される。増幅反応は、閾量のまたはそれを上回る量の核酸について、および／または、閾濃度のまたはそれを下回る濃度の核酸について実施するならば、低い増幅偏りといった高品質の増幅産物を生じることができることが見出されている。閾量および閾濃度は、増幅する核酸の性質および起源、および使用する増幅反応の種類に応じて変化しうる目的の核酸試料について目的の増幅反応において使用することができる、核酸の閾量および／または閾濃度を決定する方法が開示される。増幅反応は、核酸の閾量および／または濃度未満で、低い偏りの増幅産物といった高品質の増幅産物を生じることができるため、そのような閾量および／または濃度未満を用いることができる。したがって、選択された増幅偏り（または増幅された核酸の品質の他の指標）よりも小さい増幅産物を作製するために、目的の核酸試料について目的の増幅反応において使用することができる、核酸の量および／または濃度を決定する方法もまた開示される。本開示の方法によって作製される増幅産物の品質は任意の望ましい基準によって測定することができ、および目的の基準によって測定される品質の希望のレベルを達成するための閾量（または上回る）および／または閾濃度（または下回る）は、本開示の方法によって決定することができおよび本開示の方法に用いることができる。
【０２２７】
アルカリ性条件への核酸の曝露、アルカリ性条件へ曝露された核酸のｐＨの低下、および結果として生じた、閾量のまたはそれを上回る量のおよび／または閾濃度のまたはそれを下回る濃度の核酸のインキュベートによって、低い増幅偏りを有する増幅産物を作製することができることもまた見出されている。そのようなアルカリ性／中性化手順は、増幅産物の品質を改善することができる。増幅産物の品質は、増幅偏り、対立遺伝子偏り、遺伝子座発現量、配列発現量、対立遺伝子発現量、遺伝子座発現量偏り、配列発現量偏り、パーセント発現量、パーセント遺伝子座発現量、パーセント配列発現量、およびインプット核酸の偏りのないおよび／または完全な増幅を示す指標を含むがそれらに限定されない種々の方法によって測定することができる。
【０２２８】
より高い効率および信頼性での目的の核酸配列の増幅のための方法もまた開示される。本開示の方法は、ＤＮＡアーティファクトの生成が低減または消失している複数置換増幅（ＭＤＡ）といった等温増幅技術に関する。一般的に、これは反応を高温にて実施することによって達成することができる。本方法の特に有用な実施形態では、糖および／または他の添加剤を用いてポリメラーゼを高温にて安定化することができる。
【０２２９】
等温増幅手順における高分子量アーティファクトの生成は、反応をより高い温度にて、および随意的に、１種類以上の添加剤の存在下で実施することによって、なお目的のインプットＤＮＡの増幅を可能にする一方で相当に低減または消失させることができることが見出されている。たとえば、増幅反応は、糖の存在下で、使用するＤＮＡポリメラーゼについての通常の最適温度よりも高い温度にて実施することができる。等温増幅反応は、より高い温度にて、および随意的に、１種類以上の添加剤の存在下で実施した場合、低い増幅偏りといった高品質の増幅産物を生じることができることもまた見出されている。
【０２３０】
核酸を増幅する方法であって、標的配列を含む核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じる。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。標的配列からの複製された鎖の形成は、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利である。そのような有利な形成は、形成の相対速度、形成された複製鎖の相対量、反応中のテンプレート配列の比率と比較しての形成された複製鎖の量といった、複製鎖形成の任意の適当な指標を含みうる。１つの指標として、反応中に存在する標的配列の非標的配列に対する比率と比較して、標的配列からの複製鎖が非標的配列からの複製鎖よりも多く形成されている場合、標的配列からの複製鎖の形成は非標的配列からの複製鎖の形成よりも有利である。別の指標として、標的配列から形成された複製鎖の、非標的配列から形成された複製鎖に対する比率が、標準または対照比率（たとえば非高温で観察される複製鎖の比率）よりも上昇する場合標的配列からの複製鎖の形成は非標的配列からの複製鎖の形成よりも有利である。
【０２３１】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化した細胞溶解物を生じ、および安定化した細胞溶解物を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じる。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。標的配列からの複製された鎖の形成は、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利である。細胞溶解物は全ゲノムを含む。
【０２３２】
鎖置換核酸合成を高温にて実施する方法であって、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、標的配列を含む核酸、一組のプライマー、および添加剤を混合し、および高温にておよび標的配列へのプライマーのハイブリダイゼーションおよびテンプレート依存的方法でのプライマーの３’末端への連続的なヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長に有利になる条件下でインキュベートすることを含み、その伸長の結果として標的配列の複製が生じる方法もまた開示される。
【０２３３】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じ、ここでその細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化した細胞溶解物を生じ、および安定化した細胞溶解物を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、一組のプライマー、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。複製反応におけるテンプレート依存性伸長産物の形成は、非テンプレート産物の形成よりも有利である。
【０２３４】
鎖置換核酸合成を高温にて実施する方法であって、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、１本鎖テンプレート核酸、一組のプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸および添加剤を混合し、および高温にておよびテンプレート核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションおよびテンプレート依存的方法でのプライマーの３’末端への連続的なヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長に有利になる条件下でインキュベートすることを含み、前記重合の結果として前記テンプレート核酸の複製が生じる方法もまた開示される。
【０２３５】
核酸を増幅する方法であって、核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、一組のプライマー、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。複製反応におけるテンプレート依存性伸長産物の形成は、非テンプレート産物の形成よりも有利である。
【０２３６】
本開示の方法の一部の形式では、ゲノム試料は、試料をアルカリ性条件に曝露して試料中の核酸を変性させる；試料のｐＨを低下させて試料のｐＨをＤＮＡ複製に適合するようにする；およびゲノムの複製を促進する条件下で試料をインキュベートすることによって調製される。一部の実施形態では、インキュベートの条件は、ゲノムの複製を促進し、および、低い増幅偏り、望ましいレベルのまたはそれを下回る増幅偏り、または増幅産物の品質の任意の他の指標を有する増幅されたゲノム核酸を生じる条件であることができる。したがって、選択された増幅偏り（または増幅された核酸の品質の他の指標）よりも小さい増幅産物を作製するために、目的の核酸試料について目的の増幅反応において使用することができる条件を決定する方法もまた開示される。
【０２３７】
本開示の方法の一部の形式では、核酸を含む可能性がある試料をアルカリ性条件に曝露し、ここでアルカリ性条件は試料中に存在しうる細胞の溶解を促進し（試料は細胞を含む必要は無いが）、試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化した試料を生じ、および試料由来の核酸の複製を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、ここで増幅混合物は安定化した試料の全部または一部を構成する。核酸の複製は結果として複製された鎖を生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって試料中の核酸から置換され、ここで複製された鎖は低い増幅偏りを有する。増幅混合物中の核酸の濃度は、プライマーのハイブリダイゼーションを核酸の再会合よりも有利にするように選択することができる。さらに、増幅混合物中の核酸の量は、複製された鎖における低い増幅偏りを結果として生じうる閾値であるかまたはそれを上回ることができる。
【０２３８】
本開示の方法は、任意の希望の試料について実施することができる。たとえば、本開示の方法は、核酸を含むかまたは含むと見られている試料を用いて実施することができる。本開示の方法の一部の形式は、試料中の核酸を増幅するために、試料中に存在する配列の知識を全く必要としない。したがって、本開示の方法の一部の形式は、試料が核酸を含むかどうかを決定するために用いることができる。本方法を実施した際に増幅産物が生じるならば、試料は核酸を含む。本開示の方法は、細胞についておよび、粗核酸試料、部分精製された核酸試料、および精製された核酸試料を含む核酸試料について実施することができる。任意の細胞または核酸試料をアルカリ性条件に曝露し、および次いで試料のｐＨを低下させることによって、増幅または複製に適した安定化した試料を作製することができる。
【０２３９】
本開示の方法は、複数のプライマーによる核酸配列の鎖置換複製に基づく。本方法は、１種類以上の特異的配列（複数鎖置換増幅）、ゲノム全体または他の高度に複雑なＤＮＡ（全ゲノム鎖置換増幅）、または連結されたＤＮＡ（連結されたＤＮＡの複数鎖置換増幅）を増幅するために用いることができる。本開示の方法は一般的に、標的核酸配列へのプライマーのハイブリダイゼーション、および、標的配列と相補的な複製鎖を結果として生じる、ハイブリダイズしたプライマーによって開始される標的配列の複製を含む。複製中に、伸長する複製鎖が鎖置換複製によって、標的配列からの（または別の複製鎖からの）別の複製鎖を置換する。ここでは、複製鎖とは、標的配列へまたは別の複製された鎖へハイブリダイズしたプライマーの伸長の結果として生じる核酸鎖である。鎖置換複製とは、複製された鎖の伸長する末端が、テンプレート鎖からの（または別の複製鎖からの）別の鎖に遭遇しそれを置換するＤＮＡ複製をいう。別の複製された鎖による複製鎖の置換は、本開示の方法の顕著な特徴であり、標的配列の複数コピーを単一の等温反応において作製することを可能にする。
【０２４０】
本開示の方法は、正確におよび均一に、高度に複雑な核酸試料中のさまざまな配列を増幅することができる。この結果は、たとえば、パーセント発現量、配列発現量、配列発現量偏り、パーセント配列発現量、遺伝子座発現量、遺伝子座発現量偏り、パーセント遺伝子座発現量、および／または増幅偏りを参照することによって定量化することができる。たとえば、本開示の方法で作製された増幅された核酸分子は、少なくとも５０％の配列発現量または配列発現量偏りを少なくとも１０個の異なる標的配列に関して有することができる。増幅偏りは、少なくとも１０個の異なる標的配列に関して１０％未満でありうる。
【０２４１】
増幅のための核酸はしばしば細胞試料から得られる。このことは一般的に、細胞の破壊（核酸を接触可能にするため）および核酸の精製を増幅の前に必要とする。このことはまた、一般的に、ヌクレアーゼといったＤＮＡを分解できるタンパク質因子の、またはヒストンといったＤＮＡ鎖と結合してそのポリメラーゼによるＤＮＡ合成のテンプレートとしての利用を妨げることができる因子の、不活性化を必要とする。超音波処理、細胞壁の酵素消化、加熱、および溶解条件への曝露といった、細胞を壊して開くのに用いられるさまざまな技術がある。溶解条件は典型的には、非生理的ｐＨおよび／または溶媒の使用を含む。多数の溶解技術は、たとえば、ゲノムＤＮＡの切断といった、細胞中の核酸への損傷を結果として生じうる。特に、細胞を溶解するための加熱の使用は、ゲノムＤＮＡを損傷しおよびゲノムＤＮＡの増幅産物の量および品質を低下させうる。アルカリ性溶解は、ゲノムＤＮＡに与える損傷がより小さくなりうること、およびしたがって結果としてより高品質の増幅結果を生じうることが見出されている。アルカリ性溶解はまた、ヌクレアーゼといったタンパク質因子、ヒストン、または試料中のＤＮＡの増幅を妨げうる他の因子を不活性化する。加えて、ｐＨを低下させることはタンパク質因子を再活性化させず、そのようなタンパク質因子は溶液のｐＨが中性範囲内に戻される際に不活性化されたままに留まることは、アルカリ性溶解の有用な特性である。
【０２４２】
本開示の方法の一部の形式では、ゲノム試料は、細胞をアルカリ性条件に曝露し、それによって細胞を溶解して細胞溶解物を結果として生じる；細胞溶解物のｐＨを低下させて細胞溶解物のｐＨをＤＮＡ複製に適合するようにする；および、複数置換増幅による細胞のゲノムの複製を促進する条件下で細胞溶解物をインキュベートすることによって調製される。アルカリ性条件とは、ｐＨが９．０より大きい条件である。本開示の方法に特に有用なアルカリ性条件は、ｐＨが１０．０より大きい条件である。アルカリ性条件は、たとえば、相当な数の細胞に溶解を引き起こす条件、顕著な数の細胞に溶解を引き起こす条件、または十分な数の細胞に溶解を引き起こす条件でありうる。溶解した細胞の数は、本開示の方法においてゲノムが十分に増幅されうるならば十分であると考えられる。配列の検出または他の分析といった増幅産物の一部の用途を可能にするのに十分な増幅産物が作製されるならば、増幅は十分である。ｐＨの低下は一般的にｐＨ９．０ないしｐＨ６．０の中性範囲内へである。
【０２４３】
試料を溶解溶液と混合することによって、試料をアルカリ性条件へ曝露することができる。試料と混合する溶解溶液の量は、試料中の核酸の相当な変性を引き起こす量であることができる。一般的に、この容量は試料／溶解溶液混合物のｐＨの関数となる。したがって、試料と混合すべき溶解溶液の量は、一般的に試料の容量および溶解緩衝液のアルカリ濃度から決定することができる。たとえば、十分なアルカリ性条件を作り出すためには、より弱い塩基および／またはより低濃度の塩基を含む溶解溶液に必要な容量よりも、より強い塩基および／またはより高濃度の塩基を含む溶解溶液のより少ない容量が必要となる。（希望のアルカリ性条件を生じるために）試料が等しい容量の溶解溶液と混合されるように、溶解溶液を処方することができる。
【０２４４】
細胞を溶解溶液と混合することによって、細胞をアルカリ性条件へ曝露することができる。細胞と混合する溶解溶液の量は、相当な数の細胞に溶解を引き起こす量、または十分な数の細胞に溶解を引き起こす量であることができる。一般的に、この容量は細胞／溶解溶液混合物のｐＨの関数となる。したがって、細胞と混合すべき溶解溶液の量は、一般的に細胞の容量および溶解緩衝液のアルカリ濃度から決定することができる。たとえば、十分なアルカリ性条件を作り出すためには、より弱い塩基および／またはより低濃度の塩基を含む溶解溶液に必要な容量よりも、より強い塩基および／またはより高濃度の塩基を含む溶解溶液のより少ない容量が必要となる。（希望のアルカリ性条件を生じるために）細胞が等しい容量の溶解溶液と混合されるように、溶解溶液を処方することができる。
【０２４５】
一部の実施形態では、溶解溶液は塩基水溶液といった塩基を含みうる。有用な塩基は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア、アニリン、ベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ジフェニルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、Ｎ−メチルアニリン、モルホリン、ピリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、水酸化アルミニウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、およびＤＢＵ（１，８−ジアゾビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン）を含む。有用な溶解溶液の処方は、４００ｍＭＫＯＨを含む溶解溶液、４００ｍＭＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶解溶液、および４００ｍＭＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡから成る溶解溶液を含む。
【０２４６】
一部の実施形態では、溶解溶液は複数の塩基性物質を含みうる。ここでは、塩基性物質とは、アルカリ性条件を結果として生じる化合物、組成物または溶液である。一部の実施形態では、溶解溶液は緩衝剤を含みうる。有用な緩衝剤は、リン酸緩衝剤、「グッド（Ｇｏｏｄ）」緩衝剤（たとえばＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、およびＴＲＩＣＩＮＥ）、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、およびビス−トリスプロパンを含む。溶解溶液は複数の緩衝剤を含みうる。ここでは、緩衝試薬とは、緩衝剤として作用する化合物、組成物または溶液である。アルカリ性緩衝剤とは、アルカリ性条件を結果として生じる緩衝剤である。一部の実施形態では、溶解溶液は１種類以上の塩基、塩基性物質、緩衝剤および緩衝試薬の組み合わせを含みうる。
【０２４７】
細胞溶解物または試料のｐＨは、安定化した細胞溶解物を生じるために低下させることができる。安定化した細胞溶解物または試料とは、ｐＨが中性範囲（約ｐＨ６．０ないし約ｐＨ９．０）にある細胞溶解物または試料である。有用な安定化した細胞溶解物または試料は、細胞溶解物中の核酸の複製を可能にするｐＨを有する。たとえば、安定化した細胞溶解物または試料のｐＨは、有効に、ＤＮＡポリメラーゼが機能することができるｐＨにある。細胞溶解物または試料のｐＨは、細胞溶解物または試料を安定化溶液と混合することによって低下させることができる。安定化溶液は、本文書に別記する通りアルカリ性条件に曝露された細胞溶解物または試料のｐＨを低下させる溶液を含む。
【０２４８】
試料と混合する安定化溶液の量は、中性範囲（または他の希望のｐＨ値）へのｐＨの低下を生じる量であることができる。一般的に、この容量は試料／安定化溶液混合物のｐＨの関数となる。したがって、試料と混合すべき安定化溶液の量は、一般的に、試料の容量、そのｐＨおよび緩衝能、および安定化緩衝液の酸濃度から決定することができる。たとえば、ｐＨを十分に低下させるためには、より弱い酸および／またはより低濃度の酸を含む安定化溶液に必要な容量よりも、より強い酸および／またはより高濃度の酸を含む安定化溶液のより少ない容量が必要となる。（希望のｐＨを生じるために）試料が等しい容量の安定化溶液と混合されるように、安定化溶液を処方することができる。
【０２４９】
細胞溶解物と混合する安定化溶液の量は、中性範囲（または他の希望のｐＨ値）へのｐＨの低下を生じる量であることができる。一般的に、この容量は細胞溶解物／安定化溶液混合物のｐＨの関数となる。したがって、細胞溶解物と混合すべき安定化溶液の量は、一般的に、細胞溶解物の容量、そのｐＨおよび緩衝能、および安定化緩衝液の酸濃度から決定することができる。たとえば、ｐＨを十分に低下させるためには、より弱い酸および／またはより低濃度の酸を含む安定化溶液に必要な容量よりも、より強い酸および／またはより高濃度の酸を含む安定化溶液のより少ない容量が必要となる。（希望のｐＨを生じるために）細胞溶解物が等しい容量の安定化溶液と混合されるように、安定化溶液を処方することができる。
【０２５０】
一部の実施形態では、安定化溶液は酸を含みうる。有用な酸は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、アセチルサリチル酸、アスコルビン酸、炭酸、クエン酸、ギ酸、硝酸、過塩素酸、ＨＦ、ＨＢｒ、ＨＩ、Ｈ２Ｓ、ＨＣＮ、ＨＳＣＮ、ＨＣｌＯ、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、および任意のカルボン酸（エタン酸、プロパン酸、ブタン酸、など、直鎖または分枝鎖カルボン酸の両方を含む）を含む。一部の実施形態では、安定化溶液は緩衝剤を含みうる。有用な緩衝剤は、トリス−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、「グッド（Ｇｏｏｄ）」緩衝剤（たとえばＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、およびＴＲＩＣＩＮＥ）、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、およびビス−トリスプロパンを含む。有用な安定化溶液の処方は、８００ｍＭトリス−ＨＣｌを含む安定化溶液；８００ｍＭトリス−ＨＣｌを含むｐＨ４．１の安定化溶液；および８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１から成る安定化溶液を含む。
【０２５１】
一部の実施形態では、安定化溶液は複数の酸性物質を含みうる。ここでは、酸性物質とは、溶液中に酸を形成する化合物、組成物または溶液である。一部の実施形態では、安定化溶液は複数の緩衝剤を含みうる。酸性緩衝剤とは、溶液中に酸を形成する緩衝剤である。一部の実施形態では、安定化溶液は１種類以上の酸、酸性物質、緩衝剤および緩衝試薬の組み合わせを含みうる。
【０２５２】
一部の実施形態では、細胞溶解物または試料のｐＨは、約ｐＨ９．０以下へ、約ｐＨ８．５以下へ、約ｐＨ８．０以下へ、約ｐＨ７．５以下へ、約ｐＨ７．２以下へ、または約ｐＨ７．０以下へ低下させることができる。一部の実施形態では、細胞溶解物または試料のｐＨは、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ７．２の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ７．５の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ８．０の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ８．５の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ７．２の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ７．５の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ８．０の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ７．２の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ７．５の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ７．２の範囲へ、約ｐＨ７．２ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ７．２ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ７．２ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ７．２ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ７．０ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ７．０ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ７．０ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ６．８ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ６．８ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、または約ｐＨ６．５ないし約ｐＨ６．０の範囲へ低下させることができる。一部の実施形態では、細胞溶解物または試料のｐＨは、約ｐＨ６．０ないし約ｐＨ９．０の端点の任意の組み合わせを有する任意の範囲へ低下させることができる。そのような端点および範囲のすべては具体的におよび別々に検討される。
【０２５３】
一部の実施形態では、細胞は熱によって溶解されない。異なる条件下の異なる細胞は異なる温度で溶解することを当業者は理解し、およびそのため細胞が熱によって溶解されない温度および時間を決定することができる。一般的に、細胞は、使用するアルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こす温度を上回っておよびそのような時間、加熱に供されない。ここでは、相当な細胞溶解とは、アルカリ性条件に曝露された細胞の９０％以上の溶解をいう。顕著な細胞溶解とは、アルカリ性条件に曝露された細胞の５０％以上の溶解をいう。十分な細胞溶解とは、アルカリ性条件に曝露された細胞の、複数鎖置換増幅による増幅産物の検出可能な量の合成を可能にするのに十分な溶解をいう。一般的に、本開示の方法に用いられるアルカリ性条件は、十分な細胞溶解を引き起こしさえすればよい。当然、顕著なまたは相当な細胞溶解を引き起こすことができるアルカリ性条件は、本方法を実施する際に、顕著なまたは相当な細胞溶解を結果として生じる必要が無い。
【０２５４】
一部の実施形態では、細胞はその細胞が増殖する温度を相当にまたは顕著に上回る加熱に供されない。ここでは、細胞が増殖する温度とは、使用する種類の細胞が培養される標準的温度、または異なる標準的温度のうち最高のものをいう。動物細胞の場合には、細胞が増殖する温度とは、その動物の体温をいう。他の実施形態では、細胞は増幅反応（ゲノムが増幅される）の温度を相当にまたは顕著に上回る加熱に供されない。
【０２５５】
一部の実施形態では、細胞溶解物または試料は、増幅反応前に精製に供されない。本開示の方法との関連において、精製とは一般的に、細胞溶解物または試料中の他の物質からの核酸の分離をいう。複数置換増幅は精製されていないおよび部分精製された試料について実施することができることが見出されている。増幅反応は、精製されていない核酸を用いて効率的に実施することはできないと一般に考えられている。特に、ＰＣＲは夾雑物に対して非常に感受性が高い。
【０２５６】
精製の形式は、遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、沈澱、濾過、および透析を含む。部分精製された細胞溶解物または試料は、遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、沈澱、濾過、および透析に供された細胞溶解物または試料を含む。部分精製された細胞溶解物または試料は一般的に、核酸沈澱または透析に供された細胞溶解物または試料を含まない。ここでは、他の物質からの核酸の分離とは、複製すべき核酸が、他の物質とは異なる容器に存在するようにする物理的分離をいう。精製は、すべての核酸の、すべての他の物質からの分離を必要としない。むしろ、必要なのは、一部の核酸の、一部の他の物質からの分離である。増幅すべき核酸との関連においてここでは、精製とは他の物質からの核酸の分離をいう。細胞溶解物との関連において、精製とは細胞溶解物中の他の物質からの核酸の分離をいう。ここでは、部分精製とは、核酸と混合している他の物質の、全部でなく一部からの、核酸の分離をいう。細胞溶解物との関連において、部分精製とは、細胞溶解物中の他の物質の、全部でなく一部からの、核酸の分離をいう。
【０２５７】
文脈に明らかにそうでないと示されない限り、精製の欠如、１種類以上の精製または分離操作または技術の欠如、または精製または１種類以上の精製または分離操作または技術の除外へのここでの言及は、細胞または試料のアルカリ性条件への曝露（またはその結果）または細胞溶解物または試料のｐＨの低下（またはその結果）を包含しない。すなわち、本開示の方法のアルカリ性条件およびｐＨ低下が「精製」または「分離」と見なしうる効果を生じる範囲で、そのような効果は、それらの語が細胞溶解物、試料、安定化した試料および安定化した細胞溶解物の処理および操作に関連して用いられる際（文脈に明らかにそうでないと示されない限り）精製および分離の定義から除外される。
【０２５８】
ここでは、相当な精製とは、核酸と混合している他の物質の少なくとも相当な部分からの核酸の分離をいう。細胞溶解物との関連において、相当な精製とは、細胞溶解物中の他の物質の少なくとも相当な部分からの核酸の分離をいう。相当な部分とは、含まれる他の物質の９０％をいう。精製の特定のレベルをパーセント精製（たとえば９５％精製および７０％精製）としていうことができる。パーセント精製とは、核酸と混合している他の物質の、少なくとも指定のパーセントの、核酸からの分離を結果として生じる精製をいう。
【０２５９】
増幅すべき核酸分子の変性は増幅技術において一般的である。これはゲノムＤＮＡを増幅する際に特にその通りである。特に、ＰＣＲは複数の変性サイクルを用いる。変性は、一般的に核酸鎖をプライマーに接触可能にするために用いられる。標的核酸、たとえばゲノムＤＮＡは、効率的な複数置換増幅のためには変性している必要が無いことが見出された。また、変性段階および変性条件の除去は、増幅産物における配列偏りを低下させるといった追加の利点を有することも見出された。一部の実施形態では、細胞溶解物または試料中の核酸は、加熱によって変性されない。一部の実施形態では、細胞溶解物は、その細胞が増殖する温度を相当にまたは顕著に上回る加熱に供されない。他の実施形態では、細胞溶解物または試料は、増幅反応（ゲノムが増幅される）の温度を相当にまたは顕著に上回る加熱に供されない。本開示の複数置換増幅反応は一般的に、実質的に一定な温度にて実施され（すなわち、その増幅反応は実質的に等温である）、およびこの温度は一般的に、核酸が明らかに変性する温度を下回る。ここでは、明らかな変性とは、塩基対の１０％以上の変性をいう。
【０２６０】
本開示の方法の好ましい形式では、核酸試料またはテンプレート核酸は変性条件に供されない、および／または変性段階は使用されない。本開示の方法の一部の形式では、核酸試料またはテンプレート核酸は熱変性条件に供されないおよび／または熱変性段階は使用されない。当然、試料調製（たとえば、細胞溶解および細胞抽出物の処理）は変性を生じると考えることができる条件を含みうる一方（たとえば、アルカリを用いた処理）、本開示の方法の一部の形式で除去された変性条件または段階とは、核酸鎖をプライマーに接触可能にすることを意図しおよびそのために用いられる変性段階または条件をいう。そのような変性は一般的には熱変性であるが、しかしまた化学変性といった他の形式の変性であることもできる。核酸試料またはテンプレート核酸が変性条件に供されない本開示の方法では、テンプレート鎖はプライマーに接触可能であることが理解される（増幅が起こるので）。しかし、テンプレート鎖は試料またはテンプレート核酸の一般的な変性を経て接触可能にされない。
【０２６１】
アルカリ性条件に曝露された試料または細胞の全部または一部のｐＨを低下させて、安定化したかまたは中性化した試料または細胞溶解物を生じることができ、および増幅混合物は中性化したかまたは安定化した試料または細胞溶解物の全部または一部を含むことができる。増幅混合物とは、核酸が増幅される反応溶液である。増幅混合物はゲノムを含むことができ、およびそのゲノムは増幅混合物中の核酸の任意の部分を含むことができる。ゲノムは、増幅混合物中の核酸の、たとえば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含むことができる。
【０２６２】
増幅混合物中の核酸の濃度は、プライマーのハイブリダイゼーションを核酸の再会合よりも有利にすることができ、これは増幅産物の品質を高める役割を果たす（たとえば、より低い増幅偏りを与えることによって）。その濃度以下では低い増幅偏りを達成できる濃度を、異なる試料についておよび異なる増幅技術について、ここに記載する方法を用いて決定することができる。増幅混合物中の核酸の濃度は、たとえば、３００ｎｇ／μｌ以下、２００ｎｇ／μｌ以下、１５０ｎｇ／μｌ以下、１００ｎｇ／μｌ以下、９５ｎｇ／μｌ以下、９０ｎｇ／μｌ以下、８５ｎｇ／μｌ以下、８０ｎｇ／μｌ以下、７５ｎｇ／μｌ以下、７０ｎｇ／μｌ以下、６５ｎｇ／μｌ以下、６０ｎｇ／μｌ以下、５５ｎｇ／μｌ以下、５０ｎｇ／μｌ以下、４５ｎｇ／μｌ以下、４０ｎｇ／μｌ以下、３５ｎｇ／μｌ以下、３０ｎｇ／μｌ以下、２５ｎｇ／μｌ以下、２０ｎｇ／μｌ以下、１５ｎｇ／μｌ以下、１０ｎｇ／μｌ以下、９ｎｇ／μｌ以下、８ｎｇ／μｌ以下、７ｎｇ／μｌ以下、６ｎｇ／μｌ以下、５ｎｇ／μｌ以下、４ｎｇ／μｌ以下、３ｎｇ／μｌ以下、２ｎｇ／μｌ以下、１ｎｇ／μｌ以下、０．８ｎｇ／μｌ以下、０．６ｎｇ／μｌ以下、０．５ｎｇ／μｌ以下、０．４ｎｇ／μｌ以下、０．３ｎｇ／μｌ以下、０．２ｎｇ／μｌ以下、または０．１ｎｇ／μｌ以下であることができる。
【０２６３】
増幅混合物中の核酸の量は、閾量以上であることができ、この閾量は増幅産物の品質を高める役割を果たす（たとえば、より低い増幅偏りを与えることによって）。その量以上では低い増幅偏りを達成できる量を、異なる試料についておよび異なる増幅技術について、ここに記載する方法を用いて決定することができる。増幅混合物中の核酸の量は、たとえば、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも６０ｎｇ、少なくとも７０ｎｇ、少なくとも８０ｎｇ、少なくとも９０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１１０ｎｇ、少なくとも１２０ｎｇ、少なくとも１３０ｎｇ、少なくとも１４０ｎｇ、少なくとも１５０ｎｇ、少なくとも１６０ｎｇ、少なくとも１７０ｎｇ、少なくとも１８０ｎｇ、少なくとも１９０ｎｇ、少なくとも２００ｎｇ、少なくとも２２０ｎｇ、少なくとも２４０ｎｇ、少なくとも２６０ｎｇ、少なくとも２８０ｎｇ、少なくとも３００ｎｇ、少なくとも３２５ｎｇ、少なくとも３５０ｎｇ、少なくとも３７５ｎｇ、少なくとも４００ｎｇ、少なくとも４５０ｎｇ、または少なくとも５００ｎｇであることができる。
【０２６４】
ＤＮＡ増幅手順の効率は、個々の遺伝子座に関してパーセント発現量として記載することができ、ここで細胞から精製された通りのゲノムＤＮＡ中の遺伝子座に関してパーセント発現量は１００％である。１０，０００倍増幅については、平均発現量頻度は、テンプレートの熱変性無しで増幅したＤＮＡ中の８遺伝子座に関して１４１％、およびテンプレートの熱変性ありで増幅したＤＮＡ中の８遺伝子座に関して３７％であった。熱変性段階の削除の結果として、増幅された遺伝子座に関して発現量頻度に３．８倍の増加を生じた。増幅偏りは、増幅されたＤＮＡの２つの試料間で、または、増幅されたＤＮＡの試料とそれが増幅された元のテンプレートＤＮＡとの間で計算することができる。偏りは、特定の遺伝子座に関するパーセント発現量（または遺伝子座発現量）の値の間の比率である。最大偏りは、最高に発現された遺伝子座の、最低に発現された遺伝子座に対する比率である。１０，０００倍増幅については、最大増幅偏りは、テンプレートの熱変性無しで増幅したＤＮＡに関して２．８、およびテンプレートの熱変性ありで増幅したＤＮＡに関して５０．７であった。熱変性段階の削除の結果として、増幅された遺伝子座に関して最大偏りに１８倍の減少を生じた。パーセント発現量は、発現量偏りの一種である。したがって、パーセント遺伝子座発現量は、遺伝子座発現量偏りの一種である。
【０２６５】
本開示の方法は、高品質の増幅産物を生じることができる。たとえば、本開示の方法は、少なくとも１０％の遺伝子座発現量または遺伝子座発現量偏りを少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１０％の配列発現量または配列発現量偏りを少なくとも５個の異なる標的配列に関して、５０倍未満の増幅偏りを、５０倍未満の増幅偏りを少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、および／または５０倍未満の増幅偏りを少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じることができる。本開示の方法はまた、たとえば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座発現量または遺伝子座発現量偏りを、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。本開示の方法はまた、たとえば、少なくとも１０％の遺伝子座発現量または遺伝子座発現量偏りを、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。
【０２６６】
本開示の方法はまた、たとえば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の配列発現量または配列発現量偏りを、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じることができる。本開示の方法の一部の形式はまた、たとえば、少なくとも１０％の配列発現量または配列発現量偏りを、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じることができる。
【０２６７】
本開示の方法はまた、たとえば、４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、または４倍未満の増幅偏りを生じることができる。本開示の方法はまた、たとえば、５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。本開示の方法はまた、たとえば、５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる標的配列に関して、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じることができる。これらの結果は、さまざまな試料にわたるか、一部の選択された種類の試料に関するか、または特定の種類の試料に関することができる。
【０２６８】
ここでは、低い増幅偏りは、少なくとも５配列または遺伝子座に関して１０倍未満、少なくとも６配列または遺伝子座に関して１２倍未満、少なくとも７配列または遺伝子座に関して１４倍未満、少なくとも８配列または遺伝子座に関して１６倍未満、少なくとも９配列または遺伝子座に関して１８倍未満、少なくとも１０配列または遺伝子座に関して２０倍未満、少なくとも１１配列または遺伝子座に関して２２倍未満、少なくとも１２配列または遺伝子座に関して２４倍未満、少なくとも１３配列または遺伝子座に関して２６倍未満、少なくとも１４配列または遺伝子座に関して２８倍未満、少なくとも１５配列または遺伝子座に関して３０倍未満、少なくとも１６配列または遺伝子座に関して３２倍未満、少なくとも１７配列または遺伝子座に関して３４倍未満、少なくとも１８配列または遺伝子座に関して３６倍未満、少なくとも１９配列または遺伝子座に関して３８倍未満、少なくとも２０配列または遺伝子座に関して４０倍未満、少なくとも２１配列または遺伝子座に関して４２倍未満、少なくとも２２配列または遺伝子座に関して４４倍未満、少なくとも２３配列または遺伝子座に関して４６倍未満、少なくとも２４配列または遺伝子座に関して４８倍未満、および少なくとも２５配列または遺伝子座に関して５０倍未満の増幅偏りを含む。一般化すると、低い増幅偏りは、２ｘ倍の増幅偏りを含み、ここでｘは、それに対して増幅偏りを計算するかまたは観察する配列または遺伝子座の数である。低い増幅偏りは、対立遺伝子偏り、遺伝子座発現量、配列発現量、対立遺伝子発現量、遺伝子座発現量偏り、配列発現量偏り、パーセント発現量、パーセント遺伝子座発現量、パーセント配列発現量、およびインプット核酸の低い偏りおよび／または完全な増幅を示す他の指標によって、といった他の方法で表すことができる。低い増幅偏りを構成するそのような他の指標の値は一般的に、本文書に別に記載する、増幅偏りと偏りの他の指標との間の関係を考慮して、上記の定義および式を参照して計算することができる。
【０２６９】
本方法の別の一形式では、プライマーは六量体プライマーであることができる。そのような短い、６ヌクレオチドプライマーはなおも効率的に複数鎖置換複製をプライミングすることができることが見出された。そのような短いプライマーは、ランダム配列（ランダムプライマー）の完全な一組のプライマーとして作製することが、より長いプライマーよりも容易であり、それは少なくとも作製すべきものがより少ないからである。本方法の別の一形式では、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるように、プライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。本方法の別の一形式では、修飾ヌクレオチドを含まない同一配列のプライマーと比較してそのプライマーの融点が変化するように、プライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。本方法の別の一形式では、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。φ２９ＤＮＡポリメラーゼはより多くの増幅を複数置換増幅で生じることが見出された。上記の特性のうち２つ以上の組み合わせもまた、複数置換増幅において改善された結果を生じる。好ましい一実施形態では、たとえば、標的試料は変性条件に供されず、プライマーは六量体プライマーでありおよびプライマーがヌクレアーゼ耐性となるように修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。上記の特性は全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）において特に有用である。
【０２７０】
本開示の方法の別の一形式では、本方法は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、複製された鎖（すなわち、複数置換増幅で生じた鎖）を標識化することを含む。複製された鎖は、たとえば、ビオチニル化ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド、５−メチルｄＣＴＰ、ＢｒｄＵＴＰ、または５−（３−アミノアリル）−２'−デオキシウリジン５'−三リン酸といった修飾ヌクレオチドの、複製された鎖の３’末端への付加によって標識化することができる。
【０２７１】
本開示の方法の一部の形式は、増幅のための標的であるＤＮＡの熱変性処理の無いことによって、以前の方法と比較してより高い品質の増幅されたＤＮＡを提供する。したがって、テンプレートＤＮＡは熱処理によって引き起こされる鎖切断現象を受けず、および単一のＤＮＡポリメラーゼによって達成される増幅は、より長いテンプレート鎖に沿ってより長く伸長する。
【０２７２】
本開示の方法の一形式では、少量の精製された２本鎖ヒトゲノムＤＮＡ（たとえば１ｎｇ）を、エキソヌクレアーゼ耐性ランダム六量体プライマーおよびφ２９ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ合成に有利な条件下で混合することができる。たとえば、その混合物を単に３０℃にてインキュベートすることができ、すると複数置換増幅が起こる。このように、任意の１本鎖または２本鎖ＤＮＡを、何も追加の処理無しに用いることができ、本開示の方法を簡単な一段階手順としている。必要なＤＮＡテンプレートは非常に少ないため、本開示の方法の主な長所は、ＰＣＲといった他のＤＮＡ増幅手順を妨げるレベルの夾雑物を含む調製物からＤＮＡテンプレートを取ることができることである。ＭＤＡのためには、夾雑物が反応に干渉する濃度未満になるように試料を希釈することができる。本開示の方法は、たとえば、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、および羊水といった体液を含む、任意の種類の試料を用いて実施することができる（および上記の長所を達成できる）。
【０２７３】
本開示の方法において少量のＤＮＡテンプレートだけが必要であることは、本方法が非常に少量の試料からのＤＮＡ増幅に有用であることを意味する。特に、本開示の方法は、単一の細胞からＤＮＡを増幅するのに用いることができる。単一の細胞（または同様に少量の試料）から分析可能な量の核酸を得る能力は、調製、分析、および出生前診断のような診断手順に多数の用途を有する。本開示の方法による増幅が有用となる少量のＤＮＡしか含まない生物学的試料の他の例は、腫瘍または他の保存医学検体から切除した材料、針吸引生検、院内感染といった感染症から生じた臨床試料、法医学試料、または絶滅種の博物館標本である。
【０２７４】
より幅広くは、本開示の方法は、必要なＤＮＡの量が供給量よりも大きい用途に有用である。たとえば、チップハイブリダイゼーション技術によってＤＮＡを分析する手順は、典型的な量の血液試料から精製されうるＤＮＡの量によって制限される。結果として、多数のチップハイブリダイゼーション手順は、その高処理量手順用に十分な供給量の材料を作製するために、ＰＣＲを利用する。本開示の方法は、開始材料の遺伝子座発現量頻度を忠実に再現する増幅されたＤＮＡの豊富な量の作製に有用な技術を提示する。
【０２７５】
ＭＤＡによる全ゲノム増幅は、純粋なＤＮＡを単離する必要を回避して、血液または細胞から直接に実施することができる。たとえば、血液または他の細胞を、溶解溶液の一例である２Ｘアルカリ性溶解緩衝液（４００ｍＭＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭＥＤＴＡ）の等量を用いた希釈によって溶解し、および氷上にて１０分間インキュベートすることができる。溶解した細胞は、安定化溶液の一例である中性化緩衝液（８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１）の同容量を用いて安定化するかまたは中性化することができる。溶解した血液または細胞の調製物（たとえば１ｍｌ）を、ＭＤＡ反応（たとえば１００ｍｌ）におけるテンプレートとして直接使用することができる。必要に応じて、溶解の前に、血液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３倍に希釈することができ、および組織培養細胞はＰＢＳで３０，０００細胞／ｍｌに希釈することができる。
【０２７６】
試料が標本採取可能な核酸を含むかどうかの予備知識がある必要は無いことが見出されている。本開示の方法の一部の形式は、核酸を含むとみられる試料が実際に核酸を含むかどうかを試験するのに用いることができる。本開示の方法を用いたそのような試料からの増幅されたＤＮＡの産生は、その試料が核酸を含んだことの証拠である。より一般的に、本開示の方法の実施は、試料中のいかなる核酸配列のいかなる知識も必要としない。したがって、本開示の方法は、特異的配列情報の欠如にかかわらず、任意の起源から核酸を増幅するのに用いることができる。これは、増幅を実施するためには試料中に存在すると考えられる核酸配列の少なくとも一部の予備情報を有することが必要である、ＰＣＲといった他の増幅法とは対照的である。この場合、試料中に存在する核酸が予想の試料核酸とは異なるならば、ＰＣＲ増幅反応は失敗する。試料が核酸の混合物を含むならば、ＰＣＲ反応では、適切な種類の核酸だけが増幅されるが、他の種類の核酸は増幅されない。対照的に、本開示の方法は、試料中に存在する核酸の大部分または全部の増幅を提供する。本開示の方法は、従来は核酸を含まないと予想または考えられている試料を用いることにも等しく適用可能である。たとえば、ヒトまたは他の高等動物由来の血清または血漿は、遊離の宿主核酸を含まないと考えられていた。しかし、本開示の方法はそのような試料中に存在する核酸を増幅できたことが見出された。
【０２７７】
本開示の方法の一形式は下記の手順によって説明することができる。この手順は、細胞試料および核酸試料といった任意の種類の試料に用いることができる。
１．増幅前のゲノムＤＮＡテンプレートの変性。溶液Ａを１：４にＨ２Ｏを用いて希釈することによって溶解溶液を調製する（たとえば１００μＬの溶液Ａを３００μＬのＨ２Ｏ中へ）。溶液Ｂを１：５にＨ２Ｏを用いて希釈することによって安定化緩衝液を調製する（たとえば、１００μＬの溶液Ａを４００μＬのＨ２Ｏ中へ）。溶解溶液および安定化溶液の両方は、新しい実験ごとに用時調製すべきである。使用後は、ＣＯ２からの中性化を避けるため、溶液Ａの入った瓶は直ちに再密栓する。
溶液Ａの有効使用期限は６ヶ月である。６ヶ月を超えて保存した場合は新しい溶液Ａを調製する。
溶液Ａ：４００ｍＭＫＯＨ、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８
溶液Ｂ：８００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ４
２．２．５μＬの溶解溶液を、氷上にて２．５μＬのゲノムＤＮＡを入れた０．２ｍＬサーモサイクラーチューブのそれぞれに加える。ピペットで５回吸引上下することによってよく混合する。チューブまたはプレートを氷上で３分間インキュベートする。
３．変性反応を３分後に、５μＬの安定化緩衝液を各試料および対照に加えることによって停止する。チューブを氷から取り出す。直ちに増幅反応へ進む。
４．段階３からのチューブに、終容量５０μｌで下記を加える：
必要な量のゲノムＤＮＡ、
０．３Ｍトレハロース、
１０ｍＭＭｇＣｌ２、
３７．５ｍＭトリス／ＨＣｌｐＨ：７、
５０ｍＭＫＣｌ、
２０ｍＭ硫酸アンモニウム、
１ｍＭｄＮＴＰ、
５０μＭエキソヌクレアーゼ耐性ランダム六量体オリゴヌクレオチド、
４０ユニットのファイ２９ＤＮＡポリメラーゼ。
４０℃にて６〜１６時間インキュベートする。
【０２７８】
全ゲノム増幅がヒトテンプレートＤＮＡの熱処理無しのＭＤＡによって実施される、本開示の方法の特定の一実施形態が実施例４に記載される。その実施例に示される通り、本開示の方法は、テンプレートＤＮＡの熱処理ありで実施される増幅と比較して遺伝子分析における性能が向上したＤＮＡ増幅産物を生じる。テンプレートの熱処理無しで生じた、より長いＤＮＡ産物は、サザンブロッティング、およびＲＦＬＰを用いた遺伝子分析で、より大きなＤＮＡ断片を与える。
【０２７９】
熱処理によるＤＮＡ鎖の切断が、実施例５で直接に実証される一方、熱処理したＤＮＡからのＤＮＡ増幅の速度および収率の低下を実施例６で表す。ＤＮＡテンプレートの熱処理の結果として生じる、ＤＮＡ産物鎖長の減少は、実施例７で実証される。
【０２８０】
精製されたヒトゲノムＤＮＡがテンプレートの熱処理無しのＭＤＡによって増幅される、本開示の方法の特定の一形式が実施例８に記載される。その実施例に示される通り、本開示の方法は、定量的ＰＣＲ分析の基質として用いる場合、テンプレートの熱処理ありで増幅したＤＮＡと比較して、遺伝子座発現量の損失の無いＤＮＡ増幅産物を生じる。
【０２８１】
精製されたヒトゲノムＤＮＡがテンプレートの熱処理無しのＭＤＡによって増幅される、本開示の方法の別の特定の一形式が実施例９に記載される。その実施例に示される通り、本開示の方法は、８個の異なる遺伝子座間の発現量のばらつきが３．０未満で変動する低い増幅偏りを有するＤＮＡ増幅産物を生じる。対照的に、２種類のＰＣＲを基礎とする増幅法、ＰＥＰおよびＤＯＰ−ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ産物の増幅偏りは、２ないし６桁の間で変動する。
【０２８２】
ヒトゲノムＤＮＡテンプレート由来の特異的ネステッドプライマーを用いたｃ−ｊｕｎ配列の増幅が、ＤＮＡテンプレート熱変性段階の削除によって促進される、本開示の方法の別の特定の一形式が実施例１０に記載される。
【０２８３】
熱処理段階の非存在下で、全血からまたは組織培養細胞から直接に、精製されたＤＮＡからと同一の効率で、ヒトゲノムＤＮＡが増幅される、本開示の方法の別の特定の一形式が実施例１１に記載される。血液または細胞から直接に増幅されたＤＮＡは、精製されたヒトＤＮＡテンプレートから増幅されたＤＮＡと実質的に同一の遺伝子座発現量値を有する。全血中のヘムのような成分はＰＣＲを阻害し、および血液由来のＤＮＡがＰＣＲテンプレートとして使用可能になる前に精製段階の必要を生じさせるため、このことは、ＰＣＲといった他の増幅手順に対する長所を表す。
【０２８４】
精製されたヒトゲノムＤＮＡがテンプレートの熱処理無しのＭＤＡによって７０％ＡＡ−ｄＵＴＰ／３０％ｄＴＴＰの存在下で増幅される、本開示の方法の別の特定の一形式が実施例１２に記載される。その実施例に示される通り、本開示の方法は、１００％ｄＴＴＰの存在下で増幅されたＤＮＡと同一の低い増幅偏りを有するＤＮＡ増幅産物を与える。
【０２８５】
損傷ＤＮＡを増幅および修復するための方法もまた開示される。この方法は、たとえば、分解されたゲノムＤＮＡを増幅するために有用である。本方法は、損傷ＤＮＡ試料を実質的に変性させること（一般的に熱およびアルカリ性条件への曝露によって）、変性条件の除去または低減（たとえば変性したＤＮＡ試料のｐＨおよび温度の低下によって）、およびそのＤＮＡを複製することを含む。損傷ＤＮＡは複製中に修復され、およびＤＮＡの平均長が増大する。たとえば、ＤＮＡ断片の平均長は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料中の２ｋｂから、たとえば、増幅されたＤＮＡについての１０ｋｂ以上へ増加することができる。増幅および修復されたＤＮＡは、損傷ＤＮＡ試料よりも、分析および試験のためによい条件にある。たとえば、この技術は、損傷ＤＮＡ試料に由来する対立遺伝子発現量に一貫した改善を与えることができる。この修復方法は、すべて損傷ＤＮＡを他の方法によって増幅した場合と比較して、産物の平均長を増加し、増幅産物の品質を３倍に高め（たとえば、試料中のマーカー発現量を増加することによって）、および対立遺伝子欠落の頻度を低下させることによって増幅産物の遺伝子型分析を改善することによって、損傷ＤＮＡの増幅における全体的な改善を結果として生じうる。複製は複数置換増幅であることができる。ＤＮＡ試料の変性は一般的に、ＤＮＡがさらに損傷されないように実施される。この方法は一般的に、本開示の増幅法のうち任意のものと組み合わせるかまたは共に使用することができる。この方法の別の一形式は、損傷ＤＮＡ試料を実質的に変性させること（一般的に熱およびアルカリ性条件への曝露によって）、変性したＤＮＡ試料のｐＨの低下、変性したＤＮＡ試料を同一起源に由来する未変性のＤＮＡ試料と混合して未変性ＤＮＡ試料中のＤＮＡの末端が一時的に変性するようにすること、ＤＮＡ試料の混合物をゆっくり冷却して一時的に変性した末端を変性したＤＮＡとアニーリングさせること、およびアニーリングしたＤＮＡを複製することを含みうる。
【０２８６】
本開示の方法は、全部がまたは一部が、固相担体中または上で、または反応チャンバー中または上で実施することができる。たとえば、本開示の複製、インキュベートおよび増幅段階は、固相担体中または上の、または反応チャンバー中または上の増幅混合物について実施することができる。たとえば、本開示の複製、インキュベートおよび増幅段階は、反応チャンバーを有する固相担体上で増幅混合物について実施することができる。反応チャンバーは、別々の増幅反応を実施することができる任意の構造である。有用な反応チャンバーは、チューブ、試験管、エッペンドルフチューブ、ベッセル、マイクロベッセル、プレート、ウェル、マイクロウェルプレートのウェル、マイクロタイタープレートのウェル、チャンバー、マイクロ流体チャンバー、マイクロマシンチャンバー、密閉チャンバー、ホール、凹部、小窪、シャーレ、表面、膜、マイクロアレイ、ファイバー、グラスファイバー、光ファイバー、ファイバー織物、フィルム、ビーズ、瓶、チップ、コンパクトディスク、成型ポリマー、粒子および微粒子、または別々の反応を支持することができる他の構造を含む。反応チャンバーは任意の適当な材料から作ることができる。そのような材料は、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能基化シラン、ポリプロピルフマラート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸を含む。固相担体は好ましくは反応チャンバーのアレイを含む。反応チャンバーに関連して、別々の反応とは、異なる反応チャンバー間で反応物または産物の交差汚染が実質的に起こらない反応をいう。交差汚染が実質的に起こらない．とは、関係する特定の反応または測定法において検出されるレベルを下回る、反応物または産物の汚染レベルをいう。たとえば、別の反応チャンバーからの核酸汚染が、所定の反応チャンバーにおいて所定の測定法で検出されない場合（核酸汚染が存在しうるとしても）、核酸の実質的な交差汚染は存在しない。したがって、反応チャンバーは、その位置で実施される反応が分離されたままでありおよび混合を受けない限り、たとえば、スポットのような平面上の位置を含みうると解される。
【０２８７】
本開示の方法の一部の形式は、１種類、少数、またはより多くのプライマーによる核酸配列の鎖置換複製に基づく。本方法は核酸試料を増幅するために用いることができ、およびゲノム全体のような高い配列複雑性を有する核酸試料を増幅するために特に有用である。本開示の方法は、１または限られた数のプライマーだけを用いてそのような高度に複雑な核酸試料を増幅するのに用いることができる。１または少数のプライマーが、全ゲノムおよび他の高度な配列複雑性を有する核酸試料を効果的に増幅することができることが見出されている。そのプライマーは、プライマー中に発現されるプライマー配列の限られた量にもかかわらず、高度に複雑な核酸試料中に存在する幅広い範囲の配列をプライミングしおよび効率的に増幅することができるように特別に選択または設計されている。本開示の方法は一般的に、特異的核酸配列を有する１、少数、またはより多くのプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および、核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含む。核酸分子の複製の結果として、複製された鎖が複製中に別の複製された鎖の鎖置換複製によって核酸分子から置換されるように、複製された鎖を生じる。複製は結果として核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の増幅を生じうる。ここでは、複製された鎖とは、核酸分子または核酸配列と、または別の複製された鎖とハイブリダイズしたプライマーの伸長の結果として生じる核酸鎖である。鎖置換複製とは、鎖置換複製とは、複製された鎖の伸長する末端が、テンプレート鎖からの（または別の複製鎖からの）別の鎖に遭遇しおよびそれを置換するＤＮＡ複製をいう。別の複製された鎖による複製鎖の置換は、本開示の方法の顕著な特徴であり、核酸分子または核酸配列の複数コピーを単一の等温反応において作製することを可能にする。
【０２８８】
本方法の別の一形式では、プライマーは長さ６ヌクレオチドであることができる。そのような短い、６ヌクレオチドプライマーはなおも効率的に複数鎖置換複製をプライミングすることができることが見出された。本方法の別の一形式ではプライマーがヌクレアーゼ耐性となるように、プライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。本方法の別の一形式では、修飾ヌクレオチドを含まない同一配列のプライマーと比較してそのプライマーの融点が変化するように、プライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。本方法の別の一形式では、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。φ２９ＤＮＡポリメラーゼはより多くの増幅を複数置換増幅で生じる。上記の特性のうち２つ以上の組み合わせもまた、複数置換増幅において改善された結果を生じる。好ましい一実施形態では、たとえば、核酸試料は変性条件に供されず、プライマーは長さ６ヌクレオチドでありおよびプライマーがヌクレアーゼ耐性となるように修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。上記の特性は全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）において特に有用である。
【０２８９】
本開示の方法の別の一形式では、本方法は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、複製された鎖（すなわち、複数置換増幅で生じた鎖）を標識化することを含む。複製された鎖は、たとえば、ビオチニル化ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド、５−メチルｄＣＴＰ、ＢｒｄＵＴＰ、または５−（３−アミノアリル）−２'−デオキシウリジン５'−三リン酸といった修飾ヌクレオチドの、複製された鎖の３’末端への付加によって標識化することができる。
【０２９０】
本開示の方法の一部の形式は、増幅のための標的である核酸分子の熱変性処理の無いことによって、以前の方法と比較してより高い品質の増幅されたＤＮＡを提供する。したがって、テンプレートＤＮＡは熱処理によって引き起こされる鎖切断現象を受けず、および単一のＤＮＡポリメラーゼによって達成される増幅は、より長いテンプレート鎖に沿ってより長く伸長する。
【０２９１】
Ａ．増幅レベル
本開示の方法は、高いレベルの増幅を生じることができる。たとえば、本開示の方法は、１０，０００倍以上の増幅を生じることができる。増幅倍数とは、増幅されているテンプレートの、生じたコピー数をいう。たとえば、１ｕｇのＤＮＡが１ｎｇのテンプレートから生じた場合、増幅のレベルは１，０００倍である。本開示の方法は、たとえば、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約２０倍、約２４倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１，０００倍、約１０，０００倍、約１００，０００倍、約１，０００，０００倍、約１０，０００，０００倍、または約１００，０００，０００倍の増幅を生じることができる。
【０２９２】
本開示の方法は、たとえば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１４倍、少なくとも１６倍、少なくとも２０倍、少なくとも２４倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも１，０００，０００倍、少なくとも１０，０００，０００倍、または少なくとも１００，０００，０００倍の増幅を生じることができる。
【０２９３】
本開示の方法は、たとえば、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２４倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、少なくとも約１，０００，０００倍、少なくとも約１０，０００，０００倍、または少なくとも約１００，０００，０００倍の増幅偏りを生じることができる。
【０２９４】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約１００，０００，０００倍、約２倍ないし約１００，０００，０００倍、約３倍ないし約１００，０００，０００倍、約４倍ないし約１００，０００，０００倍、約５倍ないし約１００，０００，０００倍、約６倍ないし約１００，０００，０００倍、約７倍ないし約１００，０００，０００倍、約８倍ないし約１００，０００，０００倍、約９倍ないし約１００，０００，０００倍、約１０倍ないし約１００，０００，０００倍、約１１倍ないし約１００，０００，０００倍、約１２倍ないし約１００，０００，０００倍、約１４倍ないし約１００，０００，０００倍、約１６倍ないし約１００，０００，０００倍、約２０倍ないし約１００，０００，０００倍、約２４倍ないし約１００，０００，０００倍、約３０倍ないし約１００，０００，０００倍、約３５倍ないし約１００，０００，０００倍、約４０倍ないし約１００，０００，０００倍、約５０倍ないし約１００，０００，０００倍、約６０倍ないし約１００，０００，０００倍、約７０倍ないし約１００，０００，０００倍、約８０倍ないし約１００，０００，０００倍、約９０倍ないし約１００，０００，０００倍、約１００倍ないし約１００，０００，０００倍、約１５０倍ないし約１００，０００，０００倍、約２００倍ないし約１００，０００，０００倍、約２５０倍ないし約１００，０００，０００倍、約３００倍ないし約１００，０００，０００倍、約４００倍ないし約１００，０００，０００倍、約５００倍ないし約１００，０００，０００倍、約６００倍ないし約１００，０００，０００倍、約７００倍ないし約１００，０００，０００倍、約８００倍ないし約１００，０００，０００倍、約９００倍ないし約１００，０００，０００倍、約１，０００倍ないし約１００，０００，０００倍、約１０，０００倍ないし約１００，０００，０００倍、約１００，０００倍ないし約１００，０００，０００倍、約１，０００，０００倍ないし約１００，０００，０００倍、または約１０，０００，０００倍ないし約１００，０００，０００倍の増幅を生じることができる。
【０２９５】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約１０，０００，０００倍、約２倍ないし約１０，０００，０００倍、約３倍ないし約１０，０００，０００倍、約４倍ないし約１０，０００，０００倍、約５倍ないし約１０，０００，０００倍、約６倍ないし約１０，０００，０００倍、約７倍ないし約１０，０００，０００倍、約８倍ないし約１０，０００，０００倍、約９倍ないし約１０，０００，０００倍、約１０倍ないし約１０，０００，０００倍、約１１倍ないし約１０，０００，０００倍、約１２倍ないし約１０，０００，０００倍、約１４倍ないし約１０，０００，０００倍、約１６倍ないし約１０，０００，０００倍、約２０倍ないし約１０，０００，０００倍、約２４倍ないし約１０，０００，０００倍、約３０倍ないし約１０，０００，０００倍、約３５倍ないし約１０，０００，０００倍、約４０倍ないし約１０，０００，０００倍、約５０倍ないし約１０，０００，０００倍、約６０倍ないし約１０，０００，０００倍、約７０倍ないし約１０，０００，０００倍、約８０倍ないし約１０，０００，０００倍、約９０倍ないし約１０，０００，０００倍、約１００倍ないし約１０，０００，０００倍、約１５０倍ないし約１０，０００，０００倍、約２００倍ないし約１０，０００，０００倍、約２５０倍ないし約１０，０００，０００倍、約３００倍ないし約１０，０００，０００倍、約４００倍ないし約１０，０００，０００倍、約５００倍ないし約１０，０００，０００倍、約６００倍ないし約１０，０００，０００倍、約７００倍ないし約１０，０００，０００倍、約８００倍ないし約１０，０００，０００倍、約９００倍ないし約１０，０００，０００倍、約１，０００倍ないし約１０，０００，０００倍、約１０，０００倍ないし約１０，０００，０００倍、約１００，０００倍ないし約１０，０００，０００倍、または約１，０００，０００倍ないし約１０，０００，０００倍の増幅を生じることができる。
【０２９６】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約１，０００，０００倍、約２倍ないし約１，０００，０００倍、約３倍ないし約１，０００，０００倍、約４倍ないし約１，０００，０００倍、約５倍ないし約１，０００，０００倍、約６倍ないし約１，０００，０００倍、約７倍ないし約１，０００，０００倍、約８倍ないし約１，０００，０００倍、約９倍ないし約１，０００，０００倍、約１０倍ないし約１，０００，０００倍、約１１倍ないし約１，０００，０００倍、約１２倍ないし約１，０００，０００倍、約１４倍ないし約１，０００，０００倍、約１６倍ないし約１，０００，０００倍、約２０倍ないし約１，０００，０００倍、約２４倍ないし約１，０００，０００倍、約３０倍ないし約１，０００，０００倍、約３５倍ないし約１，０００，０００倍、約４０倍ないし約１，０００，０００倍、約５０倍ないし約１，０００，０００倍、約６０倍ないし約１，０００，０００倍、約７０倍ないし約１，０００，０００倍、約８０倍ないし約１，０００，０００倍、約９０倍ないし約１，０００，０００倍、約１００倍ないし約１，０００，０００倍、約１５０倍ないし約１，０００，０００倍、約２００倍ないし約１，０００，０００倍、約２５０倍ないし約１，０００，０００倍、約３００倍ないし約１，０００，０００倍、約４００倍ないし約１，０００，０００倍、約５００倍ないし約１，０００，０００倍、約６００倍ないし約１，０００，０００倍、約７００倍ないし約１，０００，０００倍、約８００倍ないし約１，０００，０００倍、約９００倍ないし約１，０００，０００倍、約１，０００倍ないし約１，０００，０００倍、約１０，０００倍ないし約１，０００，０００倍、または約１００，０００倍ないし約１，０００，０００倍の増幅を生じることができる。
【０２９７】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約１００，０００倍、約２倍ないし約１００，０００倍、約３倍ないし約１００，０００倍、約４倍ないし約１００，０００倍、約５倍ないし約１００，０００倍、約６倍ないし約１００，０００倍、約７倍ないし約１００，０００倍、約８倍ないし約１００，０００倍、約９倍ないし約１００，０００倍、約１０倍ないし約１００，０００倍、約１１倍ないし約１００，０００倍、約１２倍ないし約１００，０００倍、約１４倍ないし約１００，０００倍、約１６倍ないし約１００，０００倍、約２０倍ないし約１００，０００倍、約２４倍ないし約１００，０００倍、約３０倍ないし約１００，０００倍、約３５倍ないし約１００，０００倍、約４０倍ないし約１００，０００倍、約５０倍ないし約１００，０００倍、約６０倍ないし約１００，０００倍、約７０倍ないし約１００，０００倍、約８０倍ないし約１００，０００倍、約９０倍ないし約１００，０００倍、約１００倍ないし約１００，０００倍、約１５０倍ないし約１００，０００倍、約２００倍ないし約１００，０００倍、約２５０倍ないし約１００，０００倍、約３００倍ないし約１００，０００倍、約４００倍ないし約１００，０００倍、約５００倍ないし約１００，０００倍、約６００倍ないし約１００，０００倍、約７００倍ないし約１００，０００倍、約８００倍ないし約１００，０００倍、約９００倍ないし約１００，０００倍、約１，０００倍ないし約１００，０００倍、または約１０，０００倍ないし約１００，０００倍の増幅を生じることができる。
【０２９８】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約１０，０００倍、約２倍ないし約１０，０００倍、約３倍ないし約１０，０００倍、約４倍ないし約１０，０００倍、約５倍ないし約１０，０００倍、約６倍ないし約１０，０００倍、約７倍ないし約１０，０００倍、約８倍ないし約１０，０００倍、約９倍ないし約１０，０００倍、約１．０倍ないし約１０，０００倍、約１１倍ないし約１０，０００倍、約１２倍ないし約１０，０００倍、約１４倍ないし約１０，０００倍、約１６倍ないし約１０，０００倍、約２０倍ないし約１０，０００倍、約２４倍ないし約１０，０００倍、約３０倍ないし約１０，０００倍、約３５倍ないし約１０，０００倍、約４０倍ないし約１０，０００倍、約５０倍ないし約１０，０００倍、約６０倍ないし約１０，０００倍、約７０倍ないし約１０，０００倍、約８０倍ないし約１０，０００倍、約９０倍ないし約１０，０００倍、約１００倍ないし約１０，０００倍、約１５０倍ないし約１０，０００倍、約２００倍ないし約１０，０００倍、約２５０倍ないし約１０，０００倍、約３００倍ないし約１０，０００倍、約４００倍ないし約１０，０００倍、約５００倍ないし約１０，０００倍、約６００倍ないし約１０，０００倍、約７００倍ないし約１０，０００倍、約８００倍ないし約１０，０００倍、約９００倍ないし約１０，０００倍、または約１，０００倍ないし約１０，０００倍の増幅を生じることができる。
【０２９９】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約１，０００倍、約２倍ないし約１，０００倍、約３倍ないし約１，０００倍、約４倍ないし約１，０００倍、約５倍ないし約１，０００倍、約６倍ないし約１，０００倍、約７倍ないし約１，０００倍、約８倍ないし約１，０００倍、約９倍ないし約１，０００倍、約１０倍ないし約１，０００倍、約１１倍ないし約１，０００倍、約１２倍ないし約１，０００倍、約１４倍ないし約１，０００倍、約１６倍ないし約１，０００倍、約２０倍ないし約１，０００倍、約２４倍ないし約１，０００倍、約３０倍ないし約１，０００倍、約３５倍ないし約１，０００倍、約４０倍ないし約１，０００倍、約５０倍ないし約１，０００倍、約６０倍ないし約１，０００倍、約７０倍ないし約１，０００倍、約８０倍ないし約１，０００倍、約９０倍ないし約１，０００倍、約１００倍ないし約１，０００倍、約１５０倍ないし約１，０００倍、約２００倍ないし約１，０００倍、約２５０倍ないし約１，０００倍、約３００倍ないし約１，０００倍、約４００倍ないし約１，０００倍、約５００倍ないし約１，０００倍、約６００倍ないし約１，０００倍、約７００倍ないし約１，０００倍、約８００倍ないし約１，０００倍、または約９００倍ないし約１，０００倍の増幅を生じることができる。
【０３００】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約９００倍、約２倍ないし約９００倍、約３倍ないし約９００倍、約４倍ないし約９００倍、約５倍ないし約９００倍、約６倍ないし約９００倍、約７倍ないし約９００倍、約８倍ないし約９００倍、約９倍ないし約９００倍、約１０倍ないし約９００倍、約１１倍ないし約９００倍、約１２倍ないし約９００倍、約１４倍ないし約９００倍、約１６倍ないし約９００倍、約２０倍ないし約９００倍、約２４倍ないし約９００倍、約３０倍ないし約９００倍、約３５倍ないし約９００倍、約４０倍ないし約９００倍、約５０倍ないし約９００倍、約６０倍ないし約９００倍、約７０倍ないし約９００倍、約８０倍ないし約９００倍、約９０倍ないし約９００倍、約１００倍ないし約９００倍、約１５０倍ないし約９００倍、約２００倍ないし約９００倍、約２５０倍ないし約９００倍、約３００倍ないし約９００倍、約４００倍ないし約９００倍、約５００倍ないし約９００倍、約６００倍ないし約９００倍、約７００倍ないし約９００倍、または約８００倍ないし約９００倍の増幅を生じることができる。
【０３０１】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約８００倍、約２倍ないし約８００倍、約３倍ないし約８００倍、約４倍ないし約８００倍、約５倍ないし約８００倍、約６倍ないし約８００倍、約７倍ないし約８００倍、約８倍ないし約８００倍、約９倍ないし約８００倍、約１０倍ないし約８００倍、約１１倍ないし約８００倍、約１２倍ないし約８００倍、約１４倍ないし約８００倍、約１６倍ないし約８００倍、約２０倍ないし約８００倍、約２４倍ないし約８００倍、約３０倍ないし約８００倍、約３５倍ないし約８００倍、約４０倍ないし約８００倍、約５０倍ないし約８００倍、約６０倍ないし約８００倍、約７０倍ないし約８００倍、約８０倍ないし約８００倍、約９０倍ないし約８００倍、約１００倍ないし約８００倍、約１５０倍ないし約８００倍、約２００倍ないし約８００倍、約２５０倍ないし約８００倍、約３００倍ないし約８００倍、約４００倍ないし約８００倍、約５００倍ないし約８００倍、約６００倍ないし約８００倍、または約７００倍ないし約８００倍の増幅を生じることができる。
【０３０２】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約７００倍、約２倍ないし約７００倍、約３倍ないし約７００倍、約４倍ないし約７００倍、約５倍ないし約７００倍、約６倍ないし約７００倍、約７倍ないし約７００倍、約８倍ないし約７００倍、約９倍ないし約７００倍、約１０倍ないし約７００倍、約１１倍ないし約７００倍、約１２倍ないし約７００倍、約１４倍ないし約７００倍、約１６倍ないし約７００倍、約２０倍ないし約７００倍、約２４倍ないし約７００倍、約３０倍ないし約７００倍、約３５倍ないし約７００倍、約４０倍ないし約７００倍、約５０倍ないし約７００倍、約６０倍ないし約７００倍、約７０倍ないし約７００倍、約８０倍ないし約７００倍、約９０倍ないし約７００倍、約１００倍ないし約７００倍、約１５０倍ないし約７００倍、約２００倍ないし約７００倍、約２５０倍ないし約７００倍、約３００倍ないし約７００倍、約４００倍ないし約７００倍、約５００倍ないし約７００倍、または約６００倍ないし約７００倍の増幅を生じることができる。
【０３０３】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約６００倍、約２倍ないし約６００倍、約３倍ないし約６００倍、約４倍ないし約６００倍、約５倍ないし約６００倍、約６倍ないし約６００倍、約７倍ないし約６００倍、約８倍ないし約６００倍、約９倍ないし約６００倍、約１０倍ないし約６００倍、約１１倍ないし約６００倍、約１２倍ないし約６００倍、約１４倍ないし約６００倍、約１６倍ないし約６００倍、約２０倍ないし約６００倍、約２４倍ないし約６００倍、約３０倍ないし約６００倍、約３５倍ないし約６００倍、約４０倍ないし約６００倍、約５０倍ないし約６００倍、約６０倍ないし約６００倍、約７０倍ないし約６００倍、約８０倍ないし約６００倍、約９０倍ないし約６００倍、約１００倍ないし約６００倍、約１５０倍ないし約６００倍、約２００倍ないし約６００倍、約２５０倍ないし約６００倍、約３００倍ないし約６００倍、約４００倍ないし約６００倍、または約５００倍ないし約６００倍の増幅を生じることができる。
【０３０４】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約５００倍、約２倍ないし約５００倍、約３倍ないし約５００倍、約４倍ないし約５００倍、約５倍ないし約５００倍、約６倍ないし約５００倍、約７倍ないし約５００倍、約８倍ないし約５００倍、約９倍ないし約５００倍、約１０倍ないし約５００倍、約１１倍ないし約５００倍、約１２倍ないし約５００倍、約１４倍ないし約５００倍、約１６倍ないし約５００倍、約２０倍ないし約５００倍、約２４倍ないし約５００倍、約３０倍ないし約５００倍、約３５倍ないし約５００倍、約４０倍ないし約５００倍、約５０倍ないし約５００倍、約６０倍ないし約５００倍、約７０倍ないし約５００倍、約８０倍ないし約５００倍、約９０倍ないし約５００倍、約１００倍ないし約５００倍、約１５０倍ないし約５００倍、約２００倍ないし約５００倍、約２５０倍ないし約５００倍、約３００倍ないし約５００倍、または約４００倍ないし約５００倍の増幅を生じることができる。
【０３０５】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約４００倍、約２倍ないし約４００倍、約３倍ないし約４００倍、約４倍ないし約４００倍、約５倍ないし約４００倍、約６倍ないし約４００倍、約７倍ないし約４００倍、約８倍ないし約４００倍、約９倍ないし約４００倍、約１０倍ないし約４００倍、約１１倍ないし約４００倍、約１２倍ないし約４００倍、約１４倍ないし約４００倍、約１６倍ないし約４００倍、約２０倍ないし約４００倍、約２４倍ないし約４００倍、約３０倍ないし約４００倍、約３５倍ないし約４００倍、約４０倍ないし約４００倍、約５０倍ないし約４００倍、約６０倍ないし約４００倍、約７０倍ないし約４００倍、約８０倍ないし約４００倍、約９０倍ないし約４００倍、約１００倍ないし約４００倍、約１５０倍ないし約４００倍、約２００倍ないし約４００倍、約２５０倍ないし約４００倍、または約３００倍ないし約４００倍の増幅を生じることができる。
【０３０６】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約３００倍、約２倍ないし約３００倍、約３倍ないし約３００倍、約４倍ないし約３００倍、約５倍ないし約３００倍、約６倍ないし約３００倍、約７倍ないし約３００倍、約８倍ないし約３００倍、約９倍ないし約３００倍、約１０倍ないし約３００倍、約１１倍ないし約３００倍、約１２倍ないし約３００倍、約１４倍ないし約３００倍、約１６倍ないし約３００倍、約２０倍ないし約３００倍、約２４倍ないし約３００倍、約３０倍ないし約３００倍、約３５倍ないし約３００倍、約４０倍ないし約３００倍、約５０倍ないし約３００倍、約６０倍ないし約３００倍、約７０倍ないし約３００倍、約８０倍ないし約３００倍、約９０倍ないし約３００倍、約１００倍ないし約３００倍、約１５０倍ないし約３００倍、約２００倍ないし約３００倍、または約２５０倍ないし約３００倍の増幅を生じることができる。
【０３０７】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約２００倍、約２倍ないし約２００倍、約３倍ないし約２００倍、約４倍ないし約２００倍、約５倍ないし約２００倍、約６倍ないし約２００倍、約７倍ないし約２００倍、約８倍ないし約２００倍、約９倍ないし約２００倍、約１０倍ないし約２００倍、約１１倍ないし約２００倍、約１２倍ないし約２００倍、約１４倍ないし約２００倍、約１６倍ないし約２００倍、約２０倍ないし約２００倍、約２４倍ないし約２００倍、約３０倍ないし約２００倍、約３５倍ないし約２００倍、約４０倍ないし約２００倍、約５０倍ないし約２００倍、約６０倍ないし約２００倍、約７０倍ないし約２００倍、約８０倍ないし約２００倍、約９０倍ないし約２００倍、約１００倍ないし約２００倍、または約１５０倍ないし約２００倍の増幅を生じることができる。
【０３０８】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約１００倍、約２倍ないし約１００倍、約３倍ないし約１００倍、約４倍ないし約１００倍、約５倍ないし約１００倍、約６倍ないし約１００倍、約７倍ないし約１００倍、約８倍ないし約１００倍、約９倍ないし約１００倍、約１０倍ないし約１００倍、約１１倍ないし約１００倍、約１２倍ないし約１００倍、約１４倍ないし約１００倍、約１６倍ないし約１００倍、約２０倍ないし約１００倍、約２４倍ないし約１００倍、約３０倍ないし約１００倍、約３５倍ないし約１００倍、約４０倍ないし約１００倍、約５０倍ないし約１００倍、約６０倍ないし約１００倍、約７０倍ないし約１００倍、約８０倍ないし約１００倍、または約９０倍ないし約１００倍の増幅を生じることができる。
【０３０９】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約９０倍、約２倍ないし約９０倍、約３倍ないし約９０倍、約４倍ないし約９０倍、約５倍ないし約９０倍、約６倍ないし約９０倍、約７倍ないし約９０倍、約８倍ないし約９０倍、約９倍ないし約９０倍、約１０倍ないし約９０倍、約１１倍ないし約９０倍、約１２倍ないし約９０倍、約１４倍ないし約９０倍、約１６倍ないし約９０倍、約２０倍ないし約９０倍、約２４倍ないし約９０倍、約３０倍ないし約９０倍、約３５倍ないし約９０倍、約４０倍ないし約９０倍、約５０倍ないし約９０倍、約６０倍ないし約９０倍、約７０倍ないし約９０倍、または約８０倍ないし約９０倍の増幅を生じることができる。
【０３１０】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約８０倍、約２倍ないし約８０倍、約３倍ないし約８０倍、約４倍ないし約８０倍、約５倍ないし約８０倍、約６倍ないし約８０倍、約７倍ないし約８０倍、約８倍ないし約８０倍、約９倍ないし約８０倍、約１０倍ないし約８０倍、約１１倍ないし約８０倍、約１２倍ないし約８０倍、約１４倍ないし約８０倍、約１６倍ないし約８０倍、約２０倍ないし約８０倍、約２４倍ないし約８０倍、約３０倍ないし約８０倍、約３５倍ないし約８０倍、約４０倍ないし約８０倍、約５０倍ないし約８０倍、約６０倍ないし約８０倍、または約７０倍ないし約８０倍の増幅を生じることができる。
【０３１１】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約７０倍、約２倍ないし約７０倍、約３倍ないし約７０倍、約４倍ないし約７０倍、約５倍ないし約７０倍、約６倍ないし約７０倍、約７倍ないし約７０倍、約８倍ないし約７０倍、約９倍ないし約７０倍、約１０倍ないし約７０倍、約１１倍ないし約７０倍、約１２倍ないし約７０倍、約１４倍ないし約７０倍、約１６倍ないし約７０倍、約２０倍ないし約７０倍、約２４倍ないし約７０倍、約３０倍ないし約７０倍、約３５倍ないし約７０倍、約４０倍ないし約７０倍、約５０倍ないし約７０倍、または約６０倍ないし約７０倍の増幅を生じることができる。
【０３１２】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約６０倍、約２倍ないし約６０倍、約３倍ないし約６０倍、約４倍ないし約６０倍、約５倍ないし約６０倍、約６倍ないし約６０倍、約７倍ないし約６０倍、約８倍ないし約６０倍、約９倍ないし約６０倍、約１０倍ないし約６０倍、約１１倍ないし約６０倍、約１２倍ないし約６０倍、約１４倍ないし約６０倍、約１６倍ないし約６０倍、約２０倍ないし約６０倍、約２４倍ないし約６０倍、約３０倍ないし約６０倍、約３５倍ないし約６０倍、約４０倍ないし約６０倍、または約５０倍ないし約６０倍の増幅を生じることができる。
【０３１３】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約５０倍、約２倍ないし約５０倍、約３倍ないし約５０倍、約４倍ないし約５０倍、約５倍ないし約５０倍、約６倍ないし約５０倍、約７倍ないし約５０倍、約８倍ないし約５０倍、約９倍ないし約５０倍、約１０倍ないし約５０倍、約１１倍ないし約５０倍、約１２倍ないし約５０倍、約１４倍ないし約５０倍、約１６倍ないし約５０倍、約２０倍ないし約５０倍、約２４倍ないし約５０倍、約３０倍ないし約５０倍、約３５倍ないし約５０倍、または約４０倍ないし約５０倍の増幅を生じることができる。
【０３１４】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約４０倍、約２倍ないし約４０倍、約３倍ないし約４０倍、約４倍ないし約４０倍、約５倍ないし約４０倍、約６倍ないし約４０倍、約７倍ないし約４０倍、約８倍ないし約４０倍、約９倍ないし約４０倍、約１０倍ないし約４０倍、約１１倍ないし約４０倍、約１２倍ないし約４０倍、約１４倍ないし約４０倍、約１６倍ないし約４０倍、約２０倍ないし約４０倍、約２４倍ないし約４０倍、約３０倍ないし約４０倍、または約３５倍ないし約４０倍の増幅を生じることができる。
【０３１５】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約３０倍、約２倍ないし約３０倍、約３倍ないし約３０倍、約４倍ないし約３０倍、約５倍ないし約３０倍、約６倍ないし約３０倍、約７倍ないし約３０倍、約８倍ないし約３０倍、約９倍ないし約３０倍、約１０倍ないし約３０倍、約１１倍ないし約３０倍、約１２倍ないし約３０倍、約１４倍ないし約３０倍、約１６倍ないし約３０倍、約２０倍ないし約３０倍、または約２４倍ないし約３０倍の増幅を生じることができる。
【０３１６】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約２０倍、約２倍ないし約２０倍、約３倍ないし約２０倍、約４倍ないし約２０倍、約５倍ないし約２０倍、約６倍ないし約２０倍、約７倍ないし約２０倍、約８倍ないし約２０倍、約９倍ないし約２０倍、約１０倍ないし約２０倍、約１１倍ないし約２０倍、約１２倍ないし約２０倍、約１４倍ないし約２０倍、または約１６倍ないし約２０倍の増幅を生じることができる。本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約１０倍、約２倍ないし約１０倍、約３倍ないし約１０倍、約４倍ないし約１０倍、約５倍ないし約１０倍、約６倍ないし約１０倍、約７倍ないし約１０倍、約８倍ないし約１０倍、または約９倍ないし約１０倍の増幅を生じることができる。
【０３１７】
本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約９倍、約２倍ないし約９倍、約３倍ないし約９倍、約４倍ないし約９倍、約５倍ないし約９倍、約６倍ないし約９倍、約７倍ないし約９倍、または約８倍ないし約９倍の増幅を生じることができる。本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約８倍、約２倍ないし約８倍、約３倍ないし約８倍、約４倍ないし約８倍、約５倍ないし約８倍、約６倍ないし約８倍、または約７倍ないし約８倍の増幅を生じることができる。本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約７倍、約２倍ないし約７倍、約３倍ないし約７倍、約４倍ないし約７倍、約５倍ないし約７倍、または約６倍ないし約７倍の増幅を生じることができる。本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約６倍、約２倍ないし約６倍、約３倍ないし約６倍、約４倍ないし約６倍、または約５倍ないし約６倍の増幅を生じることができる。本開示の方法は、たとえば、約１倍ないし約５倍、約２倍ないし約５倍、約３倍ないし約５倍、約４倍ないし約５倍、約１倍ないし約４倍、約２倍ないし約４倍、約３倍ないし約４倍、約１倍ないし約３倍、約２倍ないし約３倍、または約１倍ないし約２倍の増幅を生じることができる。
【０３１８】
Ｂ．プライマー選択
本開示の方法における使用のためのプライマーは、高品質の増幅産物を生じる能力に関して選択することができる。そのようなプライマーは、本開示の方法において特に有用である。本開示の方法で１種類以上のプライマーが用いられる場合、プライマーの全部が選択プライマーでありうるかまたは、プライマーの一部が選択プライマーでありうる。プライマー選択には任意の有用な基準を用いることができる。有用な基準は、遺伝子座発現量、配列発現量および増幅偏りといった増幅産物の品質、および、増幅アーティファクトの産生の欠如または最小化といった、負の性質が無いことを含む。所定の複数の選択基準（または１つの選択基準）を満たすプライマーを、ここでは（それらの選択基準についての）選択プライマーという。所定の複数の選択基準（または１つの選択基準）を満たさないプライマーを、ここでは（それらの選択基準についての）非選択プライマーという。選択プライマーの使用が好ましいが、選択および非選択プライマーの両方を、本開示の方法において一緒に使用することができる。
【０３１９】
異なる選択基準を満たす選択プライマーを、本開示の方法において一緒に使用することができる。すなわち、所定の増幅反応に使用するプライマーは、すべて同一の能力を有するかまたは同一の基準を満たす必要は無い。同様に，異なる選択基準を満たさない非選択プライマーを、本開示の方法における使用に含めるかまたは除外することができる。すなわち、使用しない（または使用する）プライマーは、同一の能力を欠くかまたは同一の基準を満たさない必要は無い。１つの選択基準、複数の選択基準、または異なる選択基準の組み合わせを満たす選択プライマーを、同一のまたは異なる１つの選択基準、複数の選択基準、または同一のまたは異なる選択基準の組み合わせを満たさない非選択プライマーと共に用いることができる。
【０３２０】
本開示の方法はしたがって、１種類以上の選択プライマーを用いて実施することができる。本開示の方法はまた、１種類以上の選択プライマーおよび１種類以上の非選択プライマーを用いて実施することができる。プライマーが選択プライマーまたは非選択プライマーであるかどうかは、その１または複数の選択基準に関してそのプライマーを試験することによって決定することができる。このように、たとえば、プライマーは本開示の方法の一形式で試験することができる。そのような方法は、関係する性質を持つ核酸試料といった、目的の核酸試料を用いることができる。この目的に使用される核酸試料は、ここでは選択核酸試料という。特に有用な選択核酸試料は、その選択プライマーを用いて増幅するものと同一の種類の核酸試料である。したがって、ヒトゲノムＤＮＡを増幅するのに使用するプライマーを選択するためには、ヒトゲノム核酸試料を選択試料として用いることができる。また選択核酸試料として有用であるのは、さまざまな異なる種類の核酸試料を増幅するのに使用するプライマーを選択するための標準として使用することができる核酸試料である。たとえば、酵母ゲノム核酸試料は、一般的にプライマーを選択するための選択核酸試料として用いることができる。そのような選択核酸試料は、選択基準に標準値を設定することができる。選択核酸試料の配列複雑性は、１または複数の選択基準として重要、またはそれを設定するための重要な因子でありうる。したがって、たとえば、所定の配列複雑性の核酸試料に由来するある一定の品質の増幅産物が必要でありうる。選択核酸試料は、任意のレベルの配列複雑性を有しうる。たとえば、選択核酸試料は本文書に別に記載する配列複雑性レベルのうち任意のものを有しうる。一般的に、選択核酸試料の配列複雑性が高いほど、その選択基準に関して必要でありうるかまたは可能でありうる品質は低くなる。
【０３２１】
プライマーの選択のために、たとえば、プライマーをＤＮＡポリメラーゼおよび選択核酸試料と接触させ、および選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートすることができる。結果を次いで１または複数の選択基準と比較することができる。
【０３２２】
プライマーは、選択核酸試料中の核酸配列の複製の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて選択することができる。任意の複製レベルを用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する複製レベルのうち任意のものを選択基準として用いることができる。選択プライマーは、たとえば、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．０１％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．１％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも５％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、または核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じることができる。
【０３２３】
プライマーは、選択核酸試料中の核酸配列の増幅の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて選択することができる。任意の増幅レベルを用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する増幅レベルのうち任意のものを選択基準として用いることができる。選択プライマーは、たとえば、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約２０倍、約２４倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１，０００倍、約１０，０００倍、約１００，０００倍、約１，０００，０００倍、約１０，０００，０００倍、または約１００，０００，０００倍の増幅を生じることができる。増幅倍数とは、増幅されているテンプレートの、生じたコピー数をいう。たとえば、１ｕｇのＤＮＡが１ｎｇのテンプレートから生じた場合、増幅のレベルは１，０００倍である。
【０３２４】
選択プライマーは、たとえば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１４倍、少なくとも１６倍、少なくとも２０倍、少なくとも２４倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも１，０００，０００倍、少なくとも１０，０００，０００倍、または少なくとも１００，０００，０００倍の増幅を生じることができる。
【０３２５】
選択プライマーは、たとえば、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２４倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、少なくとも約１，０００，０００倍、少なくとも約１０，０００，０００倍、または少なくとも約１００，０００，０００倍の増幅偏りを生じることができる。
【０３２６】
プライマーは、増幅偏りのある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて選択することができる。任意の増幅偏りを用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する増幅偏りのうち任意のものを選択基準として用いることができる。選択プライマーは、たとえば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、２４倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、または３００倍の増幅偏りを生じることができる。選択プライマーは、たとえば、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約２０倍、約２４倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、または約３００倍の増幅偏りを生じることができる。選択プライマーは、たとえば、２倍未満、３倍未満、４倍未満、５倍未満、６倍未満、７倍未満、８倍未満、９倍未満、１０倍未満、１１倍未満、１２倍未満、１４倍未満、１６倍未満、２０倍未満、２４倍未満、３０倍未満、３５倍未満、４０倍未満、５０倍未満、６０倍未満、７０倍未満、８０倍未満、９０倍未満、１００倍未満、１５０倍未満、２００倍未満、２５０倍、または３００倍未満の増幅偏りを生じることができる。
【０３２７】
選択プライマーは、たとえば、約２倍未満、約３倍未満、約４倍未満、約５倍未満、約６倍未満、約７倍未満、約８倍未満、約９倍未満、約１０倍未満、約１１倍未満、約１２倍未満、約１４倍未満、約１６倍未満、約２０倍未満、約２４倍未満、約３０倍未満、約３５倍未満、約４０倍未満、約５０倍未満、約６０倍未満、約７０倍未満、約８０倍未満、約９０倍未満、約１００倍未満、約１５０倍未満、約２００倍未満、約２５０倍、または約３００倍未満の増幅偏りを生じることができる。これらの増幅偏りは、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの遺伝子座および／または標的配列といった、任意の数の遺伝子座または標的配列に関することができる。
【０３２８】
プライマーは、配列発現量の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて選択することができる。任意の配列発現量を用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する配列発現量のうち任意のものを選択基準として用いることができる。選択プライマーは、たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の配列発現量を生じることができる。選択プライマーは、たとえば、５００％未満、４００％未満、３００％未満、２５０％未満、２００％未満、１９０％未満、１８０％未満、１７０％未満、１６０％未満、１５０％未満、１４０％未満、１３０％未満、１２０％未満、または１１０％未満の配列発現量を生じることができる。これらの配列発現量は、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの標的配列といった、任意の数の標的配列に関することができる。
【０３２９】
プライマーは、遺伝子座発現量の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて選択することができる。任意の遺伝子座発現量を用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する遺伝子座発現量のうち任意のものを選択基準として用いることができる。選択プライマーは、たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座発現量を生じることができる。選択プライマーは、たとえば、５００％未満、４００％未満、３００％未満、２５０％未満、２００％未満、１９０％未満、１８０％未満、１７０％未満、１６０％未満、１５０％未満、１４０％未満、１３０％未満、１２０％未満、または１１０％未満の遺伝子座発現量を生じることができる。これらの遺伝子座発現量は、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの遺伝子座といった、任意の数の遺伝子座に関することができる。
【０３３０】
プライマーはまた、プライマーの群として選択することができる。すなわち、プライマーの群が、一緒に使用する際に、１または複数の選択基準を示すかどうかを試験することができる。これは、単一のプライマーの選択に関して本文書に記載するすべての方法で達成できる。したがって、たとえば、プライマーの群をＤＮＡポリメラーゼおよび選択核酸試料と接触させ、および選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートすることができる。
【０３３１】
非選択プライマーは、選択プライマーが同定されるのと同様の基準を用いて同じ方法で同定することができる。違いは、非選択プライマーは１または複数の選択基準を満たさないことである。しかし、そのように１または複数の選択基準を満たさないことは、選択プライマーの場合と全く同じように、ある一定の特徴または性質を持つこととして表すことができると理解される。そのような基準は、非選択基準ということができる。
【０３３２】
非選択プライマーは、選択核酸試料中の核酸配列の複製の、ある一定のレベルまたは範囲を生じるかまたは生じないことに基づいて特定することができる。任意の複製レベルを標準として用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する複製レベルのうち任意のものを非選択基準として用いることができる。非選択プライマーは、たとえば、核酸試料中の核酸配列の０．０１％未満、核酸試料中の核酸配列の０．１％未満、核酸試料中の核酸配列の１％未満、核酸試料中の核酸配列の５％未満、核酸試料中の核酸配列の１０％未満、核酸試料中の核酸配列の２０％未満、核酸試料中の核酸配列の３０％未満、核酸試料中の核酸配列の４０％未満、核酸試料中の核酸配列の５０％未満、核酸試料中の核酸配列の６０％未満、核酸試料中の核酸配列の７０％未満、核酸試料中の核酸配列の８０％未満、核酸試料中の核酸配列の９０％未満、核酸試料中の核酸配列の９５％未満、核酸試料中の核酸配列の９６％未満、核酸試料中の核酸配列の９７％未満、核酸試料中の核酸配列の９８％未満、または核酸試料中の核酸配列の９９％未満の複製を生じることができる。
【０３３３】
非選択プライマーは、増幅偏りのある一定のレベルまたは範囲を生じるかまたは生じないことに基づいて特定することができる。任意の増幅偏りを標準として用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する増幅偏りのうち任意のものを非選択基準として用いることができる。非選択プライマーは、たとえば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、２４倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、または３００倍の増幅偏りを生じることができる。非選択プライマーは、たとえば、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約２０倍、約２４倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、または約３００倍の増幅偏りを生じることができる。非選択プライマーは、たとえば、２倍より大、３倍より大、４倍より大、５倍より大、６倍より大、７倍より大、８倍より大、９倍より大、１０倍より大、１１倍より大、１２倍より大、１４倍より大、１６倍より大、２０倍より大、２４倍より大、３０倍より大、３５倍より大、４０倍より大、５０倍より大、６０倍より大、７０倍より大、８０倍より大、９０倍より大、１００倍より大、１５０倍より大、２００倍より大、２５０倍、または３００倍より大の増幅偏りを生じることができる。
【０３３４】
選択プライマーは、たとえば、約２倍より大、約３倍より大、約４倍より大、約５倍より大、約６倍より大、約７倍より大、約８倍より大、約９倍より大、約１０倍より大、約１１倍より大、約１２倍より大、約１４倍より大、約１６倍より大、約２０倍より大、約２４倍より大、約３０倍より大、約３５倍より大、約４０倍より大、約５０倍より大、約６０倍より大、約７０倍より大、約８０倍より大、約９０倍より大、約１００倍より大、約１５０倍より大、約２００倍より大、約２５０倍より大、または約３００倍より大の増幅偏りを生じることができる。これらの増幅偏りは、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの遺伝子座および／または標的配列といった、任意の数の遺伝子座または標的配列に関することができる。
【０３３５】
非選択プライマーは、配列発現量の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて特定することができる。任意の配列発現量を標準として用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する配列発現量のうち任意のものを非選択基準として用いることができる。非選択プライマーは、０．１％未満、１％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または１００％未満の配列発現量を生じることができる。選択プライマーは、５００％より大、４００％より大、３００％より大、２５０％より大、２００％より大、１９０％より大、１８０％より大、１７０％より大、１６０％より大、１５０％より大、１４０％より大、１３０％より大、１２０％より大、または１１０％より大の配列発現量を生じることができる。これらの配列発現量は、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの標的配列といった、任意の数の標的配列に関することができる。
【０３３６】
非選択プライマーは、遺伝子座発現量の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて特定することができる。任意の遺伝子座発現量を標準として用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する遺伝子座発現量のうち任意のものを非選択基準として用いることができる。非選択プライマーは、たとえば、０．１％未満、１％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または１００％未満の遺伝子座発現量を生じることができる。選択プライマーは、たとえば、５００％より大、４００％より大、３００％より大、２５０％より大、２００％より大、１９０％より大、１８０％より大、１７０％より大、１６０％より大、１５０％より大、１４０％より大、１３０％より大、１２０％より大、または１１０％より大の遺伝子座発現量を生じることができる。これらの遺伝子座発現量は、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの遺伝子座といった、任意の数の遺伝子座に関することができる。
【０３３７】
１つのプライマーまたはプライマーの群によるアーティファクト産生の可能性を明らかにするために、プライマーまたはプライマーの群を、核酸試料を使用しない、本開示の方法の一改変形式で試験することができる。そのような測定法において、増幅産物が観察されるかどうか、観察される場合、および観察されるレベルは、そのプライマーまたはプライマーの群が増幅アーティファクトを生じる可能性の指標である。アーティファクト産生の可能性が低いことの１つの基準は、核酸試料（または他のテンプレート核酸）の非存在下で実施される反応において、増幅産物が最初に観察されるまでの長い遅延である。遅延は、核酸試料を有する反応において増幅産物が最初に観察される時間の、たとえば、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４２５％、４５０％、４７５％、または５００％までであることができる。遅延は、たとえば、核酸試料を有する反応において増幅産物が最初に観察される時間の、１２５％より大、１５０％より大、１７５％より大、２００％より大、２２５％より大、２５０％より大、２７５％より大、３００％より大、３２５％より大、３５０％より大、３７５％より大、４００％より大、４２５％より大、４５０％より大、４７５％より大、または５００％より大までであることができる。
【０３３８】
Ｃ．全ゲノム鎖置換増幅
全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）といわれる、本方法の一形式では、ランダムまたは部分的にランダムな組のプライマーが、ゲノム核酸の試料（または他の高度な複雑性の核酸の試料）をランダムにプライミングするために用いられる。ランダムまたは大部分ランダムな配列のプライマーの十分に大きな組を選択することによって、その組に含まれるプライマーは、合計としておよびランダムに、試料中の核酸全体に渡って分布する核酸配列に相補的となる。増幅は、連続性ポリメラーゼを用いた、各プライマーで開始しおよび自発終止まで連続する複製によって進行する。本方法の重要な特性は、複製中のポリメラーゼによる介在プライマーの置換である。このようにして、ゲノム全体の複数の重なり合うコピーを短時間に合成することができる。
【０３３９】
全ゲノム鎖置換増幅は、（ａ）ランダムまたは部分的にランダムな一組のプライマーをゲノム試料（または他の高度な複雑姓の核酸試料）と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーとゲノムＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートすること、および（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、およびゲノムＤＮＡの複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすることによって実施することができる。鎖置換複製は、好ましくは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、または、対応する鎖置換因子と組み合わせたＤＮＡポリメラーゼを用いることによって達成される。
【０３４０】
本方法は、等温条件下で実施できるために、ポリメラーゼ連鎖反応よりも有利である。全ゲノム鎖置換増幅の他の利点は、全ゲノムＰＣＲよりも高いレベルの増幅、増幅がＰＣＲよりも配列依存性が低い、ＰＣＲで起こりうるような再アニーリング・アーティファクトまたは遺伝子シャッフリング・アーティファクトが無い（変性および再アニーリングのサイクルが無いため）、およびＰＣＲを基礎とするゲノム増幅よりも低い増幅偏り（ＰＣＲを基礎とするゲノム増幅について２０ないし６０倍に対し、ＷＧＳＤＡについて３倍の偏り）。
【０３４１】
増幅後に、増幅された配列は、ＰＣＲ増幅された配列についての既知のおよび確立された用途といった、任意の目的に用いることができる。たとえば、増幅された配列は、蛍光標識の検出、酵素結合検出系、抗体媒介標識検出、および放射性標識の検出といった、核酸のための従来の検出系のうち任意のものを用いて検出することができる。本開示の方法の重要な特性は、増幅が、サイクルでなく、連続的な等温複製で起こることである。このことは増幅の複雑さを低下させ、および結果についてはるかに一貫性を高める。鎖置換は、単一の連続的な等温反応における、核酸配列または試料の複数コピーの迅速な生成を可能にする。
【０３４２】
ＷＧＳＤＡに使用するプライマーの組は、プライマーが核酸試料中に希望の間隔でハイブリダイズすることを可能にする濃度で使用することが望ましい。たとえば、一組のプライマーを、平均して４０００ないし８０００塩基毎に、ハイブリダイズすることを可能にする濃度で使用することによって、これらの位置で開始されたＤＮＡ複製は、隣接する部位から複製されている鎖まで伸長しおよびそれを置換する。プライマーは標的配列と一定間隔でハイブリダイズしないと考えられることに注意する。むしろ、平均間隔はプライマー濃度の一般的関数となる。ＷＧＳＤＡ用のプライマーはまた、試料中に存在するＲＮＡから形成することもできる。内因性ＲＮＡをＲＮａｓｅを用いて分解することによってランダムオリゴマーのプールを生じることができ、そのランダムオリゴマーを次いでＤＮＡの増幅のためにポリメラーゼによって用いることができる。このことはプライマーを反応へ加える必要性を無くす。代替的に、生物学的試料のＤＮａｓｅ消化は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ増幅のためのＤＮＡオリゴプライマーのプールを生じることができる。
【０３４３】
複数鎖置換増幅の場合のように、隣接する鎖の置換は、それを別のプライマーとのハイブリダイゼーションおよびその後のもう一回の複製の開始のために利用可能にする。プライマーの組に含まれるプライマーが標的配列にハイブリダイズする間隔は、増幅のレベルを決定する。たとえば、平均間隔が短い場合は、隣接する鎖は速やかにおよび高頻度で置換される。平均間隔が長い場合は、隣接する鎖は複製の長い実行後にのみ置換される。
【０３４４】
ＷＧＳＤＡに用いられるプライマーの数は、プライマーが核酸試料中に希望の間隔でハイブリダイズすることを可能にするのが好ましい。たとえば、平均して４０００ないし８０００塩基毎にハイブリダイズすることを可能にするいくつかのプライマーを用いることによって、これらの位置で開始されたＤＮＡ複製は、隣接する部位から複製されている鎖まで伸長しおよびそれを置換する。プライマーは核酸試料中の核酸分子と一定間隔でハイブリダイズしないと考えられることに注意する。むしろ、平均間隔はプライマー濃度の一般的関数となる（本文書に別に記載する通り）。
【０３４５】
隣接する鎖の置換は、それを別のプライマーとのハイブリダイゼーションおよびその後のもう一回の複製の開始のために利用可能にする。プライマーが核酸分子にハイブリダイズする間隔が、一般的に増幅のレベルを決定する。たとえば、平均間隔が短い場合は、隣接する鎖は速やかにおよび高頻度で置換される。平均間隔が長い場合は、隣接する鎖は複製の長い実行後にのみ置換される。
【０３４６】
本開示の方法では、ＤＮＡポリメラーゼは、希望するだけ長く進行する連続性鎖置換重合反応において、プライマー伸長および鎖置換を触媒する。好ましい鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージ２９ＤＮＡポリメラーゼ（ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）他への米国特許第５，１９８，５４３号明細書および第５，００１，０５０号明細書）、大断片ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（エキソ（−）Ｂｓｔ）、エキソ（−）ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ、およびシークエナーゼである。反応で生じたＤＮＡを標識するために、鎖置換複製中に、放射性ヌクレオチド、またはブロモデオキシウリジン三リン酸のような修飾ヌクレオチドを追加で加えることができる。代替的に、ビオチニル化ヌクレオチドのような結合部分を与える適当な前駆体を加えることができる（ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８： ６６３３ （１９８１））。 
【０３４７】
ＰＣＲを用いるゲノム増幅、および増幅されたＤＮＡの用途は、チャン（Ｚｈａｎｇ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９： ５８４７−５８５１ （１９９２）、テレニウス（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ）他，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３： ７１８−７２５ （１９９２）、チュン（Ｃｈｅｕｎｇ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３： １４６７６−１４６７９ （１９９６）、およびクカスジャーヴィ（Ｋｕｋａｓｊａａｒｖｉ）他，Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ １８：９４−１０１ （１９９７）に記載されている。これらの文献に記載された増幅されたＤＮＡの用途はまた、一般的に、本開示の方法を用いて増幅されたＤＮＡに適用可能である。全ゲノム鎖置換増幅は、ＰＣＲを基礎とする全ゲノム増幅とは異なり、ハプロタイプ分析に適するが、それはＷＧＳＤＡがＰＣＲを基礎とする全ゲノム増幅よりも長い断片を生じるためである。ＰＣＲを基礎とする全ゲノム増幅はまた、ハプロタイプ分析についての適切性がより低いが、それはＰＣＲの各サイクルがプライミング現象の機会を生じ、その結果として（ゲノム中で）離れた配列の結合が同一の断片中に統合されるためである。
【０３４８】
連続的な合成を中断しうるかまたは複製された鎖の再ハイブリダイゼーションによるアーティファクトの形成を可能にすることができるサイクル反応が無いため、本開示の方法で長い核酸断片を増幅することができる。
【０３４９】
Ｄ．複数鎖置換増幅
複数鎖置換増幅（ＭＳＤＡ）といわれる、本方法の好ましい一形式では、右組および左組の、二組のプライマーが用いられる。プライマーの右組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列の一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有し、およびプライマーの左組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列のもう一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。右組に含まれるプライマーは標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子の一方の鎖と相補的であり、および左組に含まれるプライマーは反対側の鎖と相補的である。両方の組のプライマーの５'末端は、プライマーが核酸分子中の隣接配列とハイブリダイズされる際、目的の核酸配列の遠位側である。好ましくは、各組のそれぞれのメンバーは、標的ヌクレオチド配列に隣接する、別々のおよび重なり合わないヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。増幅は、各プライマーで開始されおよび標的核酸配列を通じて継続する複製によって進行する。この方法の重要な特性は複製中の介在プライマーの置換である。プライマーの右組から伸長した核酸鎖が、プライマーの左組がハイブリダイズする核酸分子の領域に一旦達すると、および逆の場合も同様に、もう一回のプライミングおよび複製が起こる。このことは、標的核酸配列の入れ子化した組の複数コピーが短時間に合成されることを可能にする。
【０３５０】
複数鎖置換増幅は、（ａ）一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートすること、および（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすることによって実施することができる。鎖置換複製は、好ましくは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、または、適合する鎖置換因子と組み合わせたＤＮＡポリメラーゼを用いることによって達成される。
【０３５１】
右組および左組に含まれる十分な数のプライマーを用いることによって、目的の核酸配列の何十万ものコピーを生じるのに必要なのは数回の複製だけである。たとえば、各２６種類のプライマーの右組および左組を用いて、５０００ヌクレオチドの１つの増幅標的の２００，０００コピーを１０分間（プライミングおよび複製４回だけに相当）で生じうると推定することができる。また、各２６種類のプライマーの右組および左組を用いて、４７，０００ヌクレオチドの１つの増幅標的の２００，０００コピーを６０分間（同じくプライミングおよび複製４回だけに相当）で生じうると推定することができる。これらの計算は、毎秒５０ヌクレオチドのポリメラーゼ伸長速度に基づく。反応は連続的および等温であることが強調される−−サイクル反応は必要無い。
【０３５２】
本開示の方法は、等温条件下で実施できるために、ポリメラーゼ連鎖反応よりも有利である。伸長する鎖の先端にあるポリメラーゼ（または対応する鎖置換因子）が、その先にある鎖を置換して、それによってハイブリダイゼーションに利用可能にするため、熱サイクルは不要である。複数鎖置換増幅の他の利点は、非常に長い核酸断片（５０キロベース程度）を増幅する能力および、より短い断片（１０キロベース以下）の迅速な増幅を含む。連続的な合成を中断しうるかまたは複製された鎖の再ハイブリダイゼーションによるアーティファクトの形成を可能にすることができるサイクル反応が無いため、本開示の方法で長い核酸断片を増幅することができる。複数鎖置換増幅では、意図しない部位での一つのプライマー結合現象は、これらの部位でのアーティファクト増幅には繋がらない（意図される部位での増幅がその意図しない部位での一つの鎖複製を速やかに追い越すため）。
【０３５３】
遺伝子特異的鎖置換増幅（ＧＳ−ＭＳＤＡ）といわれる、本方法の別の一形式では、標的ＤＮＡはまず制限エンドヌクレアーゼを用いて消化される。消化された断片は次いで末端どうしをライゲーションしてＤＮＡ環を生じる。これらの環は単量体または連結体であることができる。右組および左組の、二組のプライマーが増幅に用いられる。プライマーの右組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列の一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有し、およびプライマーの左組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列のもう一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。右組に含まれるプライマーは標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子の一方の鎖と相補的であり、および左組に含まれるプライマーは反対側の鎖と相補的である。そのプライマーは、増幅する必要がある配列の全部または一部をカバーするように設計されている。好ましくは、各組のそれぞれのメンバーは、標的ヌクレオチド配列に隣接する、別々のおよび重なり合わないヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。増幅は、各プライマーで開始されおよび標的核酸配列を通じて継続する複製によって進行する。リニアＧＳ−ＭＳＤＡと呼ばれる、ＧＳ−ＭＳＤＡの一形式では、増幅は１本の鎖とだけ相補的な一組のプライマーを用いて実施され、したがって鎖のうち１本だけを増幅する。ＧＳ−ＭＳＤＡの別の一形式では、ｃＤＮＡ配列を環状化して一本鎖ＤＮＡ環を生じることができる。増幅は次いで、その一本鎖環状ｃＤＮＡと相補的な一組のプライマーを用いて実施される。
【０３５４】
Ｅ．連結されたＤＮＡの複数鎖置換増幅
連結されたＤＮＡの複数鎖置換増幅（ＭＳＤＡ−ＣＤ）といわれる、本方法の別の一形式では、連結されたＤＮＡが増幅される。連結されたＤＮＡの好ましい種類は、連結されたｃＤＮＡである。連結されたＤＮＡは、ＷＧＳＤＡの場合のようにランダムまたは部分的にランダムな組のプライマーを用いて、または、連結されたＤＮＡ中の特異的ハイブリダイゼーション標的と相補的な特異的プライマーを用いて増幅することができる。ＭＳＤＡ−ＣＤは、相対的に短い核酸試料（すなわち、一般的に１００ないし６，０００ヌクレオチドの範囲の断片）の複雑な混合物または試料の増幅に好ましい。メッセンジャーＲＮＡは、そのような複雑な混合物の最も重要な例である。ＭＳＤＡ−ＣＤは、細胞中のすべてのｃＤＮＡを等しい方法で増幅するための手段を提供する。連結されたｃＤＮＡは最大５，０００倍まで増幅することができるため、ＭＳＤＡ−ＣＤは、数個の細胞だけに基づくＲＮＡプロファイリング分析を可能にする。ＭＳＤＡ−ＣＤを実施するためには、ＤＮＡを最初に連結段階に供しなければならない。ＲＮＡ試料（たとえばｍＲＮＡ）を増幅すべき場合は、ＲＮＡをまず標準的方法を用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換する。そのｃＤＮＡ、または増幅すべきＤＮＡ断片の任意の他の組を、次いでＤＮＡ連結体へ、好ましくはリンカーの組み込みを伴って変換する。
【０３５５】
Ｆ．損傷ＤＮＡの複数鎖置換増幅
本開示の方法の別の形式は、損傷ＤＮＡの増幅および修復を含みうる。損傷ＤＮＡの増幅は、困難でありおよび信頼性の低い結果を与えることの両方でありうる。たとえば、分解または断片化されたＤＮＡの増幅は、短縮された産物を生じ、および対立遺伝子欠落を結果として生じうる。特にゲノムＤＮＡ試料の調製は、ゲノムＤＮＡへの損傷を結果として生じうる（たとえば、分解および断片化）。損傷ＤＮＡおよび損傷ＤＮＡ試料は、損傷ＤＮＡを増幅する本開示の方法で増幅および修復することができる。本方法は一般的に、損傷ＤＮＡ試料中の一部のＤＮＡ分子の末端を、試料中の相補的配列にハイブリダイズさせることによって機能する。新しく結合した末端を提供するＤＮＡ分子は異なる位置に損傷を有するため、アニーリングした末端からプライミングすることは、より完全な断片の複製を結果として生じることができ、および損傷ＤＮＡの修復を媒介しうる（損傷がより少ないかまたは損傷していない複製された鎖の形で）。その損傷していない複製された鎖の、継続した複数置換増幅による複製は、損傷がより少ないかまたは損傷していない増幅された核酸を生じる。
【０３５６】
本方法は一般的に、損傷ＤＮＡ試料を実質的に変性させること（一般的に熱およびアルカリ性条件への曝露によって）、変性条件の除去または低減（たとえば変性したＤＮＡ試料のｐＨおよび温度の低下によって）、およびそのＤＮＡを複製することを含む。損傷ＤＮＡは複製中に修復され、およびＤＮＡ断片の平均長が増大するたとえば、ＤＮＡ断片の平均長は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料中の２ｋｂから、たとえば、増幅されたＤＮＡについての１０ｋｂ以上へ増加することができる。増幅および修復されたＤＮＡは、損傷ＤＮＡ試料よりも、分析および試験のためによい条件にある。たとえば、この技術は、損傷ＤＮＡ試料に由来する対立遺伝子発現量に一貫した改善を与えることができる。この修復方法は、すべて損傷ＤＮＡを他の方法によって増幅した場合と比較して、産物の平均長を増加し、増幅産物の品質を３倍に高め（たとえば、試料中のマーカー発現量を増加することによって）、および対立遺伝子欠落の頻度を低下させることによって増幅産物の遺伝子型分析を改善することによって、損傷ＤＮＡの増幅における全体的な改善を結果として生じうる。複製は複数置換増幅であることができる。ＤＮＡ試料の変性は一般的に、ＤＮＡがさらに損傷されないように実施される。この方法は一般的に、本開示の増幅法のうち任意のものと組み合わせるかまたは共に使用することができる。
【０３５７】
一部の実施形態では、損傷ＤＮＡを増幅する方法は、損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進する条件へ損傷ＤＮＡ試料を曝露し、それによって変性した損傷ＤＮＡ試料を生じること；その条件を損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進しない条件に変え、安定化した変性した損傷ＤＮＡ試料を生じること；および、損傷ＤＮＡの複製を促進する条件下で、アニーリングした損傷ＤＮＡをインキュベートすることを含みうる。損傷ＤＮＡのアニーリングした末端は複製をプライミングし、および損傷ＤＮＡの複製は結果として複製された鎖の修復を生じる。損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進する条件は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料のｐＨを上昇させることおよび損傷ＤＮＡ試料を加熱することでありうる。条件を変えることは、たとえば、変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨを低下させることおよび損傷ＤＮＡ試料を冷却することでありうる。ｐＨを上昇させることは、損傷ＤＮＡ試料をアルカリ性条件へ曝露することによって達成できる。条件を変えることは、一般的に、一時的に変性した損傷ＤＮＡの末端の、実質的に変性した損傷ＤＮＡへのアニーリングを促進する条件であることができる。損傷ＤＮＡ試料、変性した損傷ＤＮＡ試料、または両方もまた、たとえば、損傷ＤＮＡ試料または変性した損傷ＤＮＡ試料を、イオン溶液と、または１または複数の塩または他の塩を含む変性溶液、安定化溶液、または両方と混合することによってイオン条件へ曝露することができる。
【０３５８】
本方法では、損傷ＤＮＡ試料は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料を変性溶液と混合することによって、および損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡを実質的に変性させる温度およびそのような長さの時間、損傷ＤＮＡ試料を加熱することによって、実質的な変性を促進する条件へ曝露することができる。その温度は、たとえば、約２５℃ないし約５０℃であることができ、および時間の長さは、たとえば、約５分間以上であることができる。変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨは、たとえば、変性した損傷ＤＮＡ試料を安定化溶液と混合することによって低下させることができる。損傷ＤＮＡ試料は、たとえば、ゲノムＤＮＡの分解したＤＮＡ断片であることができる。損傷ＤＮＡの複製および修復は、φ２９ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼの存在下で損傷ＤＮＡをインキュベートすることによって達成できる。
【０３５９】
損傷ＤＮＡ試料は、必要なアニーリングを達成するために、一般的にゆっくり冷却することができる。たとえば、損傷ＤＮＡ試料は、たとえば、毎分約０．１℃以下、毎分約０．２℃以下、毎分約０．３℃以下、毎分約０．４℃以下、毎分約０．５℃以下、毎分約０．６℃以下、毎分約０．７℃以下、毎分約０．８℃以下、毎分約０．９℃以下、毎分約１℃以下、毎分約１．０℃以下、毎分約１．１℃以下、毎分約１．２℃以下、毎分約１．３℃以下、毎分約１．４℃以下、毎分約１．５℃以下、毎分約１．６℃以下、毎分約１．８℃以下、毎分約２℃以下、毎分約２．０℃以下、毎分約２．２℃以下、毎分約２．４℃以下、毎分約２．６℃以下、毎分約２．８℃以下、毎分約３℃以下、毎分約３．０℃以下、毎分約３．５℃以下、毎分約４℃以下、毎分約４．０℃以下、毎分約５．０℃以下、毎分約０．１℃、毎分約０．２℃、毎分約０．３℃、毎分約０．４℃、毎分約０．５℃、毎分約０．６℃、毎分約０．７℃、毎分約０．８℃、毎分約０．９℃、毎分約１℃、毎分約１．０℃、毎分約１．１℃、毎分約１．２℃、毎分約１．３℃、毎分約１．４℃、毎分約１．５℃、毎分約１．６℃、毎分約１．８℃、毎分約２℃、毎分約２．０℃、毎分約２．２℃、毎分約２．４℃、毎分約２．６℃、毎分約２．８℃、毎分約３℃、毎分約３．０℃、毎分約３．５℃、毎分約４℃、毎分約４．０℃、毎分約５．０℃、毎分０．１℃、毎分０．２℃、毎分０．３℃、毎分０．４℃、毎分０．５℃、毎分０．６℃、毎分０．７℃、毎分０．８℃、毎分０．９℃、毎分１℃、毎分１．０℃、毎分１．１℃、毎分１．２℃、毎分１．３℃、毎分１．４℃、毎分１．５℃、毎分１．６℃、毎分１．８℃、毎分２℃、毎分２．０℃、毎分２．２℃、毎分２．４℃、毎分２．６℃、毎分２．８℃、毎分３℃、毎分３．０℃、毎分３．５℃、毎分４℃、毎分４．０℃、または毎分５．０℃の速度で冷却することができる。
【０３６０】
損傷ＤＮＡ試料を冷却する速度はまた、温度のパーセント低下という形で記載することができる。したがって、７０℃で開始し毎分１％以下の速度での損傷ＤＮＡ試料の冷却は、最初の１分間に０．７℃（以下）、および次の１分には結果として生じる温度の１％（以下）冷却される。損傷ＤＮＡ試料は、たとえば、毎分約０．１％以下、毎分約０．２％以下、毎分約０．３％以下、毎分約０．４％以下、毎分約０．５％以下、毎分約０．６％以下、毎分約０．７％以下、毎分約０．８％以下、毎分約０．９％以下、毎分約１％以下、毎分約１．０％以下、毎分約１．１％以下、毎分約１．２％以下、毎分約１．３％以下、毎分約１．４％以下、毎分約１．５％以下、毎分約１．６％以下、毎分約１．８％以下、毎分約２％以下、毎分約２．０％以下、毎分約２．２％以下、毎分約２．４％以下、毎分約２．６％以下、毎分約２．８％以下、毎分約３％以下、毎分約３．０％以下、毎分約３．５％以下、毎分約４％以下、毎分約４．０％以下、毎分約５．０％以下、毎分約０．１％、毎分約０．２％、毎分約０．３％、毎分約０．４％、毎分約０．５％、毎分約０．６％、毎分約０．７％、毎分約０．８％、毎分約０．９％、毎分約１％、毎分約１．０％、毎分約１．１％、毎分約１．２％、毎分約１．３％、毎分約１．４％、毎分約１．５％、毎分約１．６％、毎分約１．８％、毎分約２％、毎分約２．０％、毎分約２．２％、毎分約２．４％、毎分約２．６％、毎分約２．８％、毎分約３％、毎分約３．０％、毎分約３．５％、毎分約４％、毎分約４．０％、毎分約５．０％、毎分０．１％、毎分０．２％、毎分０．３％、毎分０．４％、毎分０．５％、毎分０．６％、毎分０．７％、毎分０．８％、毎分０．９％、毎分１％、毎分１．０％、毎分１．１％、毎分１．２％、毎分１．３％、毎分１．４％、毎分１．５％、毎分１．６％、毎分１．８％、毎分２％、毎分２．０％、毎分２．２％、毎分２．４％、毎分２．６％、毎分２．８％、毎分３％、毎分３．０％、毎分３．５％、毎分４％、毎分４．０％、または毎分５．０％の速度で冷却することができる。
【０３６１】
損傷ＤＮＡ試料、変性した損傷ＤＮＡ試料、または両方は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料または変性した損傷ＤＮＡ試料を、イオン溶液と、または１または複数の塩または他の塩を含む変性溶液、安定化溶液、または両方と混合することによってイオン条件へ曝露することができる。ここでは、イオン条件とは高いイオン強度の状態をいう。したがって、イオン条件への曝露とは、曝露前の試料または溶液中に存在したよりも高いイオン強度への曝露をいう。これはたとえば、緩衝剤または塩を添加した際の結果となる。そのような添加を行うために用いる溶液を、イオン溶液ということができる。イオン溶液は塩溶液であることができ、および１種類以上の塩または他のイオンを含むことができる。任意の適当な塩またはイオンを用いることができる。塩は、たとえば、トリス−ＨＣｌ、トリス−ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、または組み合わせであることができる。トリス−ＨＣｌは、たとえば、ｐＨ７．０ないし８．０であることができる。塩はトリス−ＥＤＴＡであることができる。イオン溶液は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料と混合した際に２ないし５倍に希釈されうる。イオン溶液は、条件の変更の前またはその間に、変性した損傷ＤＮＡ試料と混合することができる。
【０３６２】
イオン条件およびイオン溶液の組成は一般的に、緩衝剤，塩，または他のイオンを形成する化合物の濃度を特定することによって特定できる。化合物の組み合わせを、イオン溶液に、またはイオン条件を生成するために用いることができる。塩溶液は、たとえば、約５０ｍＭないし約５００ｍＭトリスおよび約１ｍＭないし約５ｍＭＥＤＴＡを含みうる。イオン溶液は、約１ｍＭないし約２Ｍ、約１ｍＭないし約１Ｍ、約１ｍＭないし約９００ｍＭ、約１ｍＭないし約８００ｍＭ、約１ｍＭないし約７００ｍＭ、約１ｍＭないし約６００ｍＭ、約１ｍＭないし約５００ｍＭ、約１ｍＭないし約４００ｍＭ、約１ｍＭないし約３００ｍＭ、約１ｍＭないし約２５０ｍＭ、約１ｍＭないし約２００ｍＭ、約１ｍＭないし約１５０ｍＭ、約１ｍＭないし約１００ｍＭ、約１ｍＭないし約８０ｍＭ、約１ｍＭないし約６０ｍＭ、約１ｍＭないし約５０ｍＭ、約１ｍＭないし約４０ｍＭ、約１ｍＭないし約３０ｍＭ、約１ｍＭないし約２０ｍＭ、約１ｍＭないし約１０ｍＭ、約１ｍＭないし約５ｍＭ、約１ｍＭないし約２ｍＭ、約２ｍＭないし約２Ｍ、約２ｍＭないし約１Ｍ、約２ｍＭないし約９００ｍＭ、約２ｍＭないし約８００ｍＭ、約２ｍＭないし約７００ｍＭ、約２ｍＭないし約６００ｍＭ、約２ｍＭないし約５００ｍＭ、約２ｍＭないし約４００ｍＭ、約２ｍＭないし約３００ｍＭ、約２ｍＭないし約２５０ｍＭ、約２ｍＭないし約２００ｍＭ、約２ｍＭないし約１５０ｍＭ、約２ｍＭないし約１００ｍＭ、約２ｍＭないし約８０ｍＭ、約２ｍＭないし約６０ｍＭ、約２ｍＭないし約５０ｍＭ、約２ｍＭないし約４０ｍＭ、約２ｍＭないし約３０ｍＭ、約２ｍＭないし約２０ｍＭ、約２ｍＭないし約１０ｍＭ、約２ｍＭないし約５ｍＭ、約５ｍＭないし約２Ｍ、約５ｍＭないし約１Ｍ、約５ｍＭないし約９００ｍＭ、約５ｍＭないし約８００ｍＭ、約５ｍＭないし約７００ｍＭ、約５ｍＭないし約６００ｍＭ、約５ｍＭないし約５００ｍＭ、約５ｍＭないし約４００ｍＭ、約５ｍＭないし約３００ｍＭ、約５ｍＭないし約２５０ｍＭ、約５ｍＭないし約２００ｍＭ、約５ｍＭないし約１５０ｍＭ、約５ｍＭないし約１００ｍＭ、約５ｍＭないし約８０ｍＭ、約５ｍＭないし約６０ｍＭ、約５ｍＭないし約５０ｍＭ、約５ｍＭないし約４０ｍＭ、約５ｍＭないし約３０ｍＭ、約５ｍＭないし約２０ｍＭ、約５ｍＭないし約１０ｍＭ、約１０ｍＭないし約２Ｍ、約１０ｍＭないし約１Ｍ、約１０ｍＭないし約９００ｍＭ、約１０ｍＭないし約８００ｍＭ、約１０ｍＭないし約７００ｍＭ、約１０ｍＭないし約６００ｍＭ、約１０ｍＭないし約５００ｍＭ、約１０ｍＭないし約４００ｍＭ、約１０ｍＭないし約３００ｍＭ、約１０ｍＭないし約２５０ｍＭ、約１０ｍＭないし約２００ｍＭ、約１０ｍＭないし約１５０ｍＭ、約１０ｍＭないし約１００ｍＭ、約１０ｍＭないし約８０ｍＭ、約１０ｍＭないし約６０ｍＭ、約１０ｍＭないし約５０ｍＭ、約１０ｍＭないし約４０ｍＭ、約１０ｍＭないし約３０ｍＭ、約１０ｍＭないし約２０ｍＭ、約２０ｍＭないし約２Ｍ、約２０ｍＭないし約１Ｍ、約２０ｍＭないし約９００ｍＭ、約２０ｍＭないし約８００ｍＭ、約２０ｍＭないし約７００ｍＭ、約２０ｍＭないし約６００ｍＭ、約２０ｍＭないし約５００ｍＭ、約２０ｍＭないし約４００ｍＭ、約２０ｍＭないし約３００ｍＭ、約２０ｍＭないし約２５０ｍＭ、約２０ｍＭないし約２００ｍＭ、約２０ｍＭないし約１５０ｍＭ、約２０ｍＭないし約１００ｍＭ、約２０ｍＭないし約８０ｍＭ、約２０ｍＭないし約６０ｍＭ、約２０ｍＭないし約５０ｍＭ、約２０ｍＭないし約４０ｍＭ、約２０ｍＭないし約３０ｍＭ、約３０ｍＭないし約２Ｍ、約３０ｍＭないし約１Ｍ、約３０ｍＭないし約９００ｍＭ、約３０ｍＭないし約８００ｍＭ、約３０ｍＭないし約７００ｍＭ、約３０ｍＭないし約６００ｍＭ、約３０ｍＭないし約５００ｍＭ、約３０ｍＭないし約４００ｍＭ、約３０ｍＭないし約３００ｍＭ、約３０ｍＭないし約２５０ｍＭ、約３０ｍＭないし約２００ｍＭ、約３０ｍＭないし約１５０ｍＭ、約３０ｍＭないし約１００ｍＭ、約３０ｍＭないし約８０ｍＭ、約３０ｍＭないし約６０ｍＭ、約３０ｍＭないし約５０ｍＭ、約３０ｍＭないし約４０ｍＭ、約４０ｍＭないし約２Ｍ、約４０ｍＭないし約１Ｍ、約４０ｍＭないし約９００ｍＭ、約４０ｍＭないし約８００ｍＭ、約４０ｍＭないし約７００ｍＭ、約４０ｍＭないし約６００ｍＭ、約４０ｍＭないし約５００ｍＭ、約４０ｍＭないし約４００ｍＭ、約４０ｍＭないし約３００ｍＭ、約４０ｍＭないし約２５０ｍＭ、約４０ｍＭないし約２００ｍＭ、約４０ｍＭないし約１５０ｍＭ、約４０ｍＭないし約１００ｍＭ、約４０ｍＭないし約８０ｍＭ、約４０ｍＭないし約６０ｍＭ、約４０ｍＭないし約５０ｍＭ、約５０ｍＭないし約２Ｍ、約５０ｍＭないし約１Ｍ、約５０ｍＭないし約９００ｍＭ、約５０ｍＭないし約８００ｍＭ、約５０ｍＭないし約７００ｍＭ、約５０ｍＭないし約６００ｍＭ、約５０ｍＭないし約５００ｍＭ、約５０ｍＭないし約４００ｍＭ、約５０ｍＭないし約３００ｍＭ、約５０ｍＭないし約２５０ｍＭ、約５０ｍＭないし約２００ｍＭ、約５０ｍＭないし約１５０ｍＭ、約５０ｍＭないし約１００ｍＭ、約５０ｍＭないし約８０ｍＭ、約５０ｍＭないし約６０ｍＭ、約６０ｍＭないし約２Ｍ、約６０ｍＭないし約１Ｍ、約６０ｍＭないし約９００ｍＭ、約６０ｍＭないし約８００ｍＭ、約６０ｍＭないし約７００ｍＭ、約６０ｍＭないし約６００ｍＭ、約６０ｍＭないし約５００ｍＭ、約６０ｍＭないし約４００ｍＭ、約６０ｍＭないし約３００ｍＭ、約６０ｍＭないし約２５０ｍＭ、約６０ｍＭないし約２００ｍＭ、約６０ｍＭないし約１５０ｍＭ、約６０ｍＭないし約１００ｍＭ、約６０ｍＭないし約８０ｍＭ、約８０ｍＭないし約２Ｍ、約８０ｍＭないし約１Ｍ、約８０ｍＭないし約９００ｍＭ、約８０ｍＭないし約８００ｍＭ、約８０ｍＭないし約７００ｍＭ、約８０ｍＭないし約６００ｍＭ、約８０ｍＭないし約５００ｍＭ、約８０ｍＭないし約４００ｍＭ、約８０ｍＭないし約３００ｍＭ、約８０ｍＭないし約２５０ｍＭ、約８０ｍＭないし約２００ｍＭ、約８０ｍＭないし約１５０ｍＭ、約８０ｍＭないし約１００ｍＭ、約１００ｍＭないし約２Ｍ、約１００ｍＭないし約１Ｍ、約１００ｍＭないし約９００ｍＭ、約１００ｍＭないし約８００ｍＭ、約１００ｍＭないし約７００ｍＭ、約１００ｍＭないし約６００ｍＭ、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、約１００ｍＭないし約４００ｍＭ、約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、約１００ｍＭないし約２５０ｍＭ、約１００ｍＭないし約２００ｍＭ、約１００ｍＭないし約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭないし約２Ｍ、約１５０ｍＭないし約１Ｍ、約１５０ｍＭないし約９００ｍＭ、約１５０ｍＭないし約８００ｍＭ、約１５０ｍＭないし約７００ｍＭ、約１５０ｍＭないし約６００ｍＭ、約１５０ｍＭないし約５００ｍＭ、約１５０ｍＭないし約４００ｍＭ、約１５０ｍＭないし約３００ｍＭ、約１５０ｍＭないし約２５０ｍＭ、約１５０ｍＭないし約２００ｍＭ、約２００ｍＭないし約２Ｍ、約２００ｍＭないし約１Ｍ、約２００ｍＭないし約９００ｍＭ、約２００ｍＭないし約８００ｍＭ、約２００ｍＭないし約７００ｍＭ、約２００ｍＭないし約６００ｍＭ、約２００ｍＭないし約５００ｍＭ、約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、約２００ｍＭないし約３００ｍＭ、約２００ｍＭないし約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭないし約２Ｍ、約２５０ｍＭないし約１Ｍ、約２５０ｍＭないし約９００ｍＭ、約２５０ｍＭないし約８００ｍＭ、約２５０ｍＭないし約７００ｍＭ、約２５０ｍＭないし約６００ｍＭ、約２５０ｍＭないし約５００ｍＭ、約２５０ｍＭないし約４００ｍＭ、約２５０ｍＭないし約３００ｍＭ、約３００ｍＭないし約２Ｍ、約３００ｍＭないし約１Ｍ、約３００ｍＭないし約９００ｍＭ、約３００ｍＭないし約８００ｍＭ、約３００ｍＭないし約７００ｍＭ、約３００ｍＭないし約６００ｍＭ、約３００ｍＭないし約５００ｍＭ、約３００ｍＭないし約４００ｍＭ、約４００ｍＭないし約２Ｍ、約４００ｍＭないし約１Ｍ、約４００ｍＭないし約９００ｍＭ、約４００ｍＭないし約８００ｍＭ、約４００ｍＭないし約７００ｍＭ、約４００ｍＭないし約６００ｍＭ、約４００ｍＭないし約５００ｍＭ、約５００ｍＭないし約２Ｍ、約５００ｍＭないし約１Ｍ、約５００ｍＭないし約９００ｍＭ、約５００ｍＭないし約８００ｍＭ、約５００ｍＭないし約７００ｍＭ、約５００ｍＭないし約６００ｍＭ、約６００ｍＭないし約２Ｍ、約６００ｍＭないし約１Ｍ、約６００ｍＭないし約９００ｍＭ、約６００ｍＭないし約８００ｍＭ、約６００ｍＭないし約７００ｍＭ、約７００ｍＭないし約２Ｍ、約７００ｍＭないし約１Ｍ、約７００ｍＭないし約９００ｍＭ、約７００ｍＭないし約８００ｍＭ、約８００ｍＭないし約２Ｍ、約８００ｍＭないし約１Ｍ、約８００ｍＭないし約９００ｍＭ、約９００ｍＭないし約２Ｍ、約９００ｍＭないし約１Ｍ、約１Ｍないし約２Ｍ、約２Ｍ、約１Ｍ、約９００ｍＭ、約８００ｍＭ、約７００ｍＭ、約６００ｍＭ、約５００ｍＭ、約４００ｍＭ、約３００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約８０ｍＭ、約６０ｍＭ、約５０ｍＭ、約４０ｍＭ、約３０ｍＭ、約２０ｍＭ、約１０ｍＭ、約９ｍＭ、約８、ｍＭ、約７ｍＭ、約６ｍＭ、約５ｍＭ、約４ｍＭ、約３ｍＭ、約２ｍＭ、約１ｍＭ、２Ｍ、１Ｍ、９００ｍＭ、８００ｍＭ、７００ｍＭ、６００ｍＭ、５００ｍＭ、４００ｍＭ、３００ｍＭ、２５０ｍＭ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、８０ｍＭ、６０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、または１ｍＭの塩、緩衝剤またはイオン濃度を有することができる。
【０３６３】
ＤＮＡを修復および増幅する本開示の方法は、ＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の平均の増大を結果として生じうる。この増大は任意の適当な用語でいうことができる。たとえば、平均断片長の増大は、増幅されたＤＮＡ断片の平均断片長、損傷ＤＮＡ試料の平均断片長からの平均断片長の増大、および平均断片長のパーセント増加によって言及することができる。平均断片長の増大は、本方法の前の損傷ＤＮＡ試料の平均断片長と比較して、たとえば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１，０００％、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１８０％以上、２００％以上、２２０％以上、２４０％以上、２６０％以上、２８０％以上、３００％以上、３５０％以上、４００％以上、４５０％以上、５００％以上、６００％以上、７００％以上、８００％以上、９００％以上、１，０００％以上、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１８０％、約２００％、約２２０％、約２４０％、約２６０％、約２８０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１、０００％、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、約１１０％以上、約１２０％以上、約１３０％以上、約１４０％以上、約１５０％以上、約１６０％以上、約１８０％以上、約２００％以上、約２２０％以上、約２４０％以上、約２６０％以上、約２８０％以上、約３００％以上、約３５０％以上、約４００％以上、約４５０％以上、約５００％以上、約６００％以上、約７００％以上、約８００％以上、約９００％以上、または約１，０００％以上でありうる。
【０３６４】
修復法の後に、平均断片長は、たとえば、２キロベース（ｋｂ）、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１８ｋｂ、２０ｋｂ、２２ｋｂ、２４ｋｂ、２６ｋｂ、２８ｋｂ、３０ｋｂ、２ｋｂ以上、２．５ｋｂ以上、３ｋｂ以上、３．５ｋｂ以上、４ｋｂ以上、４．５ｋｂ以上、５ｋｂ以上、５．５ｋｂ以上、６ｋｂ以上、７ｋｂ以上、８ｋｂ以上、９ｋｂ以上、１０ｋｂ以上、１１ｋｂ以上、１２ｋｂ以上、１３ｋｂ以上、１４ｋｂ以上、１５ｋｂ以上、１６ｋｂ以上、１８ｋｂ以上、２０ｋｂ以上、２２ｋｂ以上、２４ｋｂ以上、２６ｋｂ以上、２８ｋｂ以上、３０ｋｂ以上、約２ｋｂ、約２．５ｋｂ、約３ｋｂ、約３．５ｋｂ、約４ｋｂ、約４．５ｋｂ、約５ｋｂ、約５．５ｋｂ、約６ｋｂ、約７ｋｂ、約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１１ｋｂ、約１２ｋｂ、約１３ｋｂ、約１４ｋｂ、約１５ｋｂ、約１６ｋｂ、約１８ｋｂ、約２０ｋｂ、約２２ｋｂ、約２４ｋｂ、約２６ｋｂ、約２８ｋｂ、約３０ｋｂ、約２ｋｂ以上、約２．５ｋｂ以上、約３ｋｂ以上、約３．５ｋｂ以上、約４ｋｂ以上、約４．５ｋｂ以上、約５ｋｂ以上、約５．５ｋｂ以上、約６ｋｂ以上、約７ｋｂ以上、約８ｋｂ以上、約９ｋｂ以上、約１０ｋｂ以上、約１１ｋｂ以上、約１２ｋｂ以上、約１３ｋｂ以上、約１４ｋｂ以上、約１５ｋｂ以上、約１６ｋｂ以上、約１８ｋｂ以上、約２０ｋｂ以上、約２２ｋｂ以上、約２４ｋｂ以上、約２６ｋｂ以上、約２８ｋｂ以上、または約３０ｋｂ以上でありうる。
【０３６５】
損傷ＤＮＡを修復する本開示の方法は、細胞溶解物および試料の本開示の増幅と組み合わせることができる。したがって、たとえば、損傷ＤＮＡ試料は細胞溶解物または試料であることができ、ここでその細胞溶解物または試料は細胞または試料をアルカリ性条件へ曝露することによって生じる。本方法の一部の形式は、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じること；細胞溶解物中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進する条件へ細胞溶解物を曝露すること；細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化した細胞溶解物を生じること；変性した損傷ＤＮＡの末端のアニーリングを促進する条件下で、安定化した細胞溶解物を冷却すること；および、損傷ＤＮＡの複製を促進する条件下で安定化した細胞溶解物をインキュベートすることを含みうる。複製中に、損傷ＤＮＡのアニーリングした末端が複製をプライミングし、および損傷ＤＮＡの複製は結果として、複製された鎖の修復およびＤＮＡ断片の平均長の増大を生じる。細胞溶解物または試料は全ゲノムであることができる。ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換される。
【０３６６】
別の一形式では、本方法は試料中の一部のＤＮＡ分子の末端を、損傷ＤＮＡ試料中の相補的配列にハイブリダイズさせることによって機能する。一般的に、損傷ＤＮＡ試料およびアニーリングした末端を提供するＤＮＡ試料は、同一起源またはさらに同一試料に由来する。新しく結合した末端を提供するＤＮＡ分子および損傷ＤＮＡ分子は異なる位置に損傷を有するため、アニーリングした末端からプライミングすることは、より完全な断片の複製を結果として生じることができ、および損傷ＤＮＡの修復を媒介しうる（損傷がより少ないかまたは損傷していない複製された鎖の形で）。その損傷していない複製された鎖の、継続した複数置換増幅による複製は、損傷がより少ないかまたは損傷していない増幅された核酸を生じる。
【０３６７】
本方法は一般的に、損傷ＤＮＡ試料を実質的に変性させること（一般的に熱およびアルカリ性条件への曝露によって）、変性したＤＮＡ試料のｐＨの低下、変性したＤＮＡ試料を同一起源に由来する未変性のＤＮＡ試料と混合して未変性ＤＮＡ試料中のＤＮＡの末端が一時的に変性するようにすること、ＤＮＡ試料の混合物をゆっくり冷却して一時的に変性した末端を変性したＤＮＡとアニーリングさせること、およびアニーリングしたＤＮＡを複製することを含む。損傷ＤＮＡは複製中に修復される。複製は複数置換増幅であることができる。ＤＮＡ試料の実質的な変性および一時的な変性は一般的に、ＤＮＡがさらに損傷されないように実施される。この方法は一般的に、本開示の増幅法のうち任意のものと組み合わせるかまたは共に使用することができる。
【０３６８】
一部の実施形態では、損傷ＤＮＡを増幅する方法は、第１の損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進する条件へ第１の損傷ＤＮＡ試料を曝露し、それによって変性した損傷ＤＮＡ試料を生じること；変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨを低下させて、安定化した変性した損傷ＤＮＡ試料を生じること；第２の損傷ＤＮＡ試料を、安定化した変性した損傷ＤＮＡ試料と、第２の試料中の損傷ＤＮＡの末端の一時的変性を促進しおよび安定化した変性した損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を維持する条件下で混合し、それによって損傷ＤＮＡ混合物を生じること；損傷ＤＮＡ混合物を、一時的に変性した損傷ＤＮＡの末端の、実質的に変性した損傷ＤＮＡへのアニーリングを促進する条件下で冷却すること；および、アニーリングした損傷ＤＮＡを、損傷ＤＮＡの複製を促進する条件下でインキュベートすることを含みうる。損傷ＤＮＡのアニーリングした末端は複製をプライミングし、および損傷ＤＮＡの複製は複製された鎖の修復を結果として生じる。
【０３６９】
本方法では、第１の損傷ＤＮＡ試料は、たとえば、第１の損傷ＤＮＡ試料を変性溶液と混合することによって、および、第１の損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡを実質的に変性させる温度およびそのような長さの時間、第１の損傷ＤＮＡ試料を加熱することによって、実質的な変性を促進する条件へ曝露することができる。その温度は、たとえば、約２５℃ないし約５０℃であることができ、および時間の長さは、たとえば、約５分間以上であることができる。変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨは、たとえば、変性した損傷ＤＮＡ試料を安定化溶液と混合することによって低下させることができる。損傷ＤＮＡ試料は、たとえば、ゲノムＤＮＡの分解したＤＮＡ断片であることができる。第１のおよび第２の損傷ＤＮＡ試料は同一の起源に由来することができ、および特に同一の損傷ＤＮＡ試料の一部であることができる。第２の損傷ＤＮＡ試料は、安定化した変性した損傷ＤＮＡ試料と、第２の損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡを一時的に変性させる温度にておよびそのような長さの時間、混合することができる。たとえば、その温度は約７０℃以下であることができ、および時間の長さは約３０秒以下であることができる。希望の効果はまた、第１の損傷ＤＮＡ試料が変性のために曝露される温度に、混合物を維持することによって達成することもできる。損傷ＤＮＡの複製および修復は、アニーリングした損傷ＤＮＡを、φ２９ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼの存在下でインキュベートすることによって達成できる。
【０３７０】
損傷ＤＮＡを増幅する本開示の方法は、細胞溶解物および試料の本開示の増幅と組み合わせることができる。したがって、たとえば、第１のおよび第２の損傷ＤＮＡ試料は、細胞溶解物または試料の一部であることができ、ここでその細胞溶解物または試料は細胞または試料をアルカリ性条件へ曝露することによって生じる。第２の損傷ＤＮＡ試料のｐＨは、安定化した変性した損傷ＤＮＡとの混合の前に低下させることができる。本方法の一部の形式は、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じること；その細胞溶解物の第１の部分を、細胞溶解物の第１の部分に含まれる損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進する条件へ曝露すること；細胞溶解物の第１の部分のｐＨを低下させて第１の安定化した細胞溶解物を生じ、および、細胞溶解物の第２の部分のｐＨを低下させて第２の安定化した細胞溶解物を生じること；第２の安定化した細胞溶解物を、第１の安定化した細胞溶解物と、第２の安定化した細胞溶解物中の損傷ＤＮＡの末端の一時的変性を促進しおよび第１の安定化した細胞溶解物中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を維持する条件下で混合し、それによって安定化した細胞溶解物混合物を生じること；安定化した細胞溶解物混合物を、一時的に変性した損傷ＤＮＡの末端の、実質的に変性した損傷ＤＮＡへのアニーリングを促進する条件下で冷却すること；および安定化した細胞溶解物混合物を、損傷ＤＮＡの複製を促進する条件下でインキュベートすることを含みうる。複製中に、損傷ＤＮＡのアニーリングした末端は複製をプライミングし、および損傷ＤＮＡの複製は複製された鎖の修復を結果として生じる。細胞溶解物または試料は全ゲノムであることができる。ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換される。
【０３７１】
Ｇ．増幅産物の分析
臨床および保健科学研究は、ＤＮＡ中の多型部位の多パラメータ測定に関するインプットとして働く大量のゲノムＤＮＡへの容易なアクセスを必要とし、その測定の複合した結果は貴重な予後および診断情報を提供する。しかし、大部分の生検法は組織または細胞の微量しか与えないため、これらの研究はＤＮＡの適当な供給の深刻な不足によって妨げられている。試料調製段階は、細胞分画中の損失のために、これらの細胞から回収された量をさらに減少させ、それによって、インプットとして単離されたゲノムＤＮＡを用いて調べることができる試料当たりの染色体遺伝子座の数を制限する。本発明の方法は、多パラメータ分析のためのＤＮＡの適当なおよび再生可能な供給を提供することによってこれらの不足を克服することを目指す。
【０３７２】
大部分の固形腫瘍中のゲノム全体にわたって見られる比較的に一般的な種類の遺伝子変化である、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）の分析は、がん診断に頻繁に用いられている。高浸透率突然変異を有するいくつかの家族性がん遺伝子が容易に同定される一方、散発性のがん発症のリスクを評価するためにＬＯＨ分析によって臨床結果を判定することの成功はまた、低浸透率遺伝的変異または多型からの寄与に基づく。臨床試料から調製された未変性ＤＮＡを用いる測定の範囲を現在は超えている、疾患進行および病期判定の効果的な決定および統計的評価のためには、そのような多パラメータ測定は各試料からの多数の候補および他の遺伝子座の同時分析を必要とする。これらの試料中に存在するゲノムＤＮＡの増幅は、多パラメータ分析に必要なＤＮＡの必要量を提供するために有用な付加物である。本開示の方法は、ＬＯＨ分析のような分析のために十分な材料を提供する、高品質の核酸を提供することができる。
【０３７３】
がん細胞中のＤＮＡにおける形態および構造の進行的な損失は、ヌクレオチド配列またはコピー数が異常になっている多数の異なる遺伝子で最高となり、正常または前がん細胞と比較して疾患細胞では数百または数千の遺伝子の発現に差がある。出現するがん細胞を描写する複雑な体細胞の遺伝現象の時間的および空間的特性を解明することは、感受性の増大を与える、より分かりにくい生殖細胞系の変異体についての検索を助ける。本開示の方法は、ゲノムにおけるこれらの広範囲の変化を分析するために、試料起源から増幅された十分な量の核酸を提供することができる。このことは、そのような測定の処理量の増大、および、これらの試料から回収されたＤＮＡの効率的な利用を可能にすることができる。
【０３７４】
本開示の方法の一部の形式は、複製されたＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列分布に、インプットＤＮＡのヌクレオチド配列分布から変化がもし生じれば最小であるように、試料ＤＮＡの正確でおよび再現性のある複製を提供する。多数の以前の核酸増幅法は、少なくともいくらか重要な程度のアーティファクト変異を、増幅されたＤＮＡの配列中に導入し、増幅された核酸中の異なる配列の発現量における、開始核酸中のそれらの配列の発現量と比較した偏りに繋がる。そのような偏りは、配列偏りまたは対立遺伝子偏りということができる。
【０３７５】
一部の場合では、対立遺伝子偏りは、増幅反応に使用したポリメラーゼ酵素の性質に帰することができる。たとえば、「校正」ＤＮＡポリメラーゼは、校正活性を欠くＤＮＡポリメラーゼよりも、複製されたＤＮＡ中に対立遺伝子偏りを導入しにくい。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成中の１種類以上のヌクレオチドの誤組み込みは、ＤＮＡ増幅中の複製偏りまたは「対立遺伝子偏り」に繋がる可能性があり、その変化は異なる配列または対立遺伝子として採点または検出されうる異なる配列を生じる。複製偏りに寄与しうる他の因子は、より多い増幅回数が増幅されたＤＮＡ中の対立遺伝子偏りの増大に繋がりうるインプットＤＮＡの増幅程度または増幅倍数、高温での増幅混合物の処理を必要とする反応条件、ＤＮＡ中の塩基除去部位の生成を促進する処理、ポリメラーゼにエラーをより起こしやすくしうるインプットＤＮＡ中の不純物、カオトロピック試薬の存在、正に荷電した金属イオン、などを含む増幅反応中の試薬成分の性質および濃度を含む。
【０３７６】
一部の場合では、対立遺伝子偏りに繋がるヌクレオチド組み込みエラーは、増幅されている核酸テンプレートの性質が原因である可能性がある。たとえば、単一のまたは少数のヌクレオチドの反復または複数の反復箇所を含むＤＮＡの領域は、時々ポリメラーゼの滑り（スリッページ）に繋がり、結果として１種類以上のヌクレオチドアーティファクト挿入または欠失を生じうる。このため、反復領域におけるＤＮＡの忠実な増幅は達成が困難になりうる。これらの領域は、ジ、トリ、およびテトラヌクレオチド反復、テロメア領域、長い散在反復を含む領域、ＳＴＲおよび文献に記載された他の種類の反復を含む。大きい二次構造を含むＤＮＡの領域はしばしば、その領域を横切るポリメラーゼの横断を妨げる可能性があり、および複製された鎖の集団内でそのような配列が低発現となることおよび対立遺伝子偏りの導入を結果として生じうる。
【０３７７】
本開示の方法の一部の形式は、インプット核酸と増幅産物との間の対立遺伝子比（それが、増幅偏りの一種である、対立遺伝子偏りである）に最小の差を与える。対立遺伝子比は、大きい方の対立遺伝子のピーク高（すなわち検出量）で割った小さい方の対立遺伝子のピーク高と定義することができる（パールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）他，１９９９；参照により本開示に含まれる）。典型的には、選択された遺伝子座の試料の組の対立遺伝子比は、標準の遺伝子型分析を用いて、複製されたＤＮＡまたはインプットＤＮＡの遺伝子型分析を実施することによって測定する。遺伝子型分析は当業者によく知られており、その例は、参照により本開示に含まれる米国特許第５，４５１，０６７号、第６，６７９，２４２号、第６，４７９，２４４号、第６，４７２，１８５号、第６，４５８，５４４号、第６，４４０，７０７号、および第６，３１２，９０２号に記載されている。対立遺伝子が等しい数で存在する場合（ヘテロ接合遺伝子座に関して予測されるように）、対立遺伝子比は１であり、および対立遺伝子偏りは存在しない。ここでは、対立遺伝子偏りとは、一対の対立遺伝子に関しての、対立遺伝子比１からの対立遺伝子比の差をいう。等しい比（すなわち、比１）を有しない対立遺伝子に関しては、対立遺伝子偏りは、正常なまたは予測される対立遺伝子比からの差をいうことができる。一般的に、ヘテロ接合２倍体試料中の遺伝子座に関する対立遺伝子比は１となり、およびこれは増幅されていない試料において測定することができる対立遺伝子比であるべきである。試料が増幅される場合、一様でない増幅は、対立遺伝子比における偏りを結果として生じうる。対立遺伝子偏りは、たとえば、増幅されていない試料における対立遺伝子の対立遺伝子比と、試料から増幅されたＤＮＡ中の同一の対立遺伝子に関する対立遺伝子比との間の差として計算することができる。これを増幅対立遺伝子偏りということができる。増幅対立遺伝子偏りは、存在する場合は、増幅されたＤＮＡにおける対立遺伝子の比が、元の増幅されていないゲノムＤＮＡにおける比から変化していることを示す。一例として、１つの遺伝子座の、等しい数で存在する２つの対立遺伝子の対立遺伝子比は１である。増幅されたＤＮＡが、これらの２つの対立遺伝子の比０．５を有するならば、増幅対立遺伝子偏りは０．５である（０．５／１＝０．５として計算）。そのような偏りはまた、５０％（比の差をいう、０．５は１の５０％である）または２倍（対立遺伝子比の倍数差をいう、１は０．５の２倍大きい）と表すこともできる。
【０３７８】
対立遺伝子偏りはまた、対立遺伝子発現量を評価することによって定量化することもできる。所定の対立遺伝子が発現する、すべての対立遺伝子のうちの割合が、その対立遺伝子に関する対立遺伝子発現量である。１つの遺伝子座の２つの対立遺伝子がそれぞれ全体の半分を発現するならば（ヘテロ接合遺伝子座に関して通常の場合）、各対立遺伝子は対立遺伝子発現量５０％または０．５を有するということができる。どちらかの対立遺伝子が５０％とは異なる発現量を有するならば、対立遺伝子偏りが存在する。インプット核酸における対立遺伝子発現量と増幅されたＤＮＡにおける対立遺伝子発現量との間に差が無ければ、対立遺伝子偏りは存在せず、対立遺伝子偏り１または１００％と表すことができる。対立遺伝子発現量の場合は、対立遺伝子偏りは、比較すべき２つの試料（たとえば、増幅されたＤＮＡに対する増幅されていない試料）における対立遺伝子発現量の比として計算することができる。したがって、５０％発現量÷５０％発現量は１に等しい。対立遺伝子偏りはまた、対立遺伝子発現量５０％からの（または通常のまたは予測される対立遺伝子発現量からの）標準偏差として表すことができる。インプットＤＮＡ試料および増幅されたＤＮＡ試料の対立遺伝子比が同一であるならば、増幅されたＤＮＡは対立遺伝子偏りを有しないということができる。
【０３７９】
本開示の方法は、正確におよび均一に、高度に複雑な核酸試料中のさまざまな配列を増幅することができる。この結果は、たとえば、パーセント発現量、配列発現量、配列発現量偏り、パーセント配列発現量、遺伝子座発現量、遺伝子座発現量偏り、パーセント遺伝子座発現量、および／または増幅偏りを参照することによって定量化することができる。たとえば、本開示の方法で作製された増幅された核酸分子は、少なくとも５０％の配列発現量または配列発現量偏りを少なくとも１０個の異なる標的配列に関して有することができる。増幅偏りは、少なくとも１０個の異なる標的配列に関して１０％未満でありうる。
【０３８０】
本開示の方法は一般的に、低い対立遺伝子偏りを有する増幅されたＤＮＡを生じる。本開示の方法は、増幅された核酸における対立遺伝子偏りおよび他の増幅偏りを測定するのに用いることができる。たとえば、選択された１つの遺伝子座に関してヘテロ接合である個体の場合を考える。この個体に由来するゲノムＤＮＡの、この遺伝子座に関する対立遺伝子比は１である。この個体に由来するゲノムＤＮＡの部分標本を、本開示の方法を用いることによって、全ゲノム増幅に供することができる。対立遺伝子偏りが全ゲノム増幅中に起こったならば、増幅されたＤＮＡは、親対立遺伝子の一方のＤＮＡコピーの、親対立遺伝子の他方と比較してより多い発現量を含む。親対立遺伝子のどちらかを含むＤＮＡ断片が、増幅されたＤＮＡ集団において大幅に優位を占めるならば、遺伝子型分析試験はそのＤＮＡ試料を、その親対立遺伝子に関してホモ接合であると採点する可能性があり、ホモ接合正常とする誤診断に繋がる。この、核酸増幅の結果としてヘテロ接合遺伝子型を検出するのに失敗することは、ヘテロ接合欠落または対立遺伝子欠落（ＡＤＯ）ということができる。親対立遺伝子の両方が同一であるホモ接合体の場合は、ＡＤＯは検出がより容易である。本開示の方法は、ホモ接合遺伝子座でのＡＤＯを測定することにも等しく適用可能である。
【０３８１】
増幅されたＤＮＡ中に存在する大部分または全部の遺伝子座でのＡＤＯの存在について測定する必要は無い。事実、そのようにすることは実際的でない。大部分の用途については、遺伝子座の標本の測定で足りる。増幅されたＤＮＡ試料のＡＤＯを測定するために、採点すべき遺伝子座の数を決定するには、さまざまな因子を考慮することができる。これらの因子は、増幅されているゲノムの大きさ（ヌクレオチドとして）、増幅に使用するポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みの推定エラー率、増幅反応条件、および増幅反応の時間を含むがそれらに限定されない。一般的に、ＡＤＯについてより大きな値を生じるには、増幅を完了するために必要なヌクレオチド付加のゲノム当たりの数がより大きいため、より大きなゲノムサイズが予測される。より長いインキュベート時間はＤＮＡ増幅のより多くの回数を与え、それによってヌクレオチド付加の数が増加するため、増幅反応の時間についても同じである。たとえば、複製の初期の回に起こるヌクレオチド誤組み込み現象は、増幅の遅い回に起こるものよりも、増幅反応の最終産物中で永続化しおよび優位である可能性が高い。この計算のためには、誤組み込みされたヌクレオチドの野生型への復帰からの寄与は無視される。それはこれらの現象は突然変異多発点を除いては非常に低確率であるためである。異なるポリメラーゼは、ＤＮＡ複製中に生成されるヌクレオチド組み込みエラーの率が大きく異なる。これは、部分的にはポリメラーゼ自体の固有の性質が原因である。一般的に、３'，５'−エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼは、そのような活性を有するものよりもエラーを生じやすい。ポリメラーゼによるヌクレオチドの誤組み込みに寄与する他の因子が知られており、およびその因子は、たとえば、増幅反応中の不純物の存在および、ポリメラーゼの構造を変化させるかまたはそうでなければポリメラーゼをエラーを起こしやすくする有機試薬および二価金属イオンを含む試薬の存在を含む。一般的に、ＡＤＯの推定値を得るために評価すべき増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座の数は次式で推定することができる：
（Ｇ＊ＲＣ）／ＰＥＲ
ここでＧはゲノムの大きさ（または核酸の複雑性）であり、ＲＣは増幅における複製の平均回数であり、およびＰＥＲはポリメラーゼエラー率（すなわち、ヌクレオチドの誤組み込みの率）である。
【０３８２】
好ましい実施形態では、ＡＤＯは、抜き取り数の遺伝子座だけで対立遺伝子を採点することによって決定することができる。典型的には、上式を用いて推定されたＡＤＯ部位の数の２〜８％を測定することができる。一般的に、ヒトゲノムＤＮＡが増幅反応に用いられる場合、１００〜５００遺伝子座を選択することができる。ＡＤＯ測定のための遺伝子座の選択は、ランダムでありうるかまたは順序づけしうる。好ましい実施形態では、遺伝子座は、ＡＤＯに対して過敏である既知の遺伝子座に基づいて、目的の遺伝子座または染色体上の目印に近接しているかまたは選択された遺伝距離よりも離れている、目的の染色体上の位置、または他の基準に基づいて選択することができる。遺伝子座の順序づけられた選択は、ＡＤＯを測定するために評価する必要のある遺伝子座の数をさらに低減することができる。したがって、１ないし２遺伝子座、２ないし５遺伝子座、５ないし１０遺伝子座、１０ないし２０遺伝子座、２０ないし５０遺伝子座、５０ないし１００遺伝子座、１００ないし２００遺伝子座、２００ないし５００遺伝子座、または５００遺伝子座以上を含む測定からの結果が、ＡＤＯを測定するのに十分でありうる。
【０３８３】
Ｈ．増幅された核酸の品質
本開示の方法は、核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を結果として生じることができる。ここでは、核酸試料中の核酸分子の相当な部分とは、核酸試料中に存在する核酸分子（または核酸配列）の９０％以上をいう。ここでは、核酸試料中の核酸分子の大きな部分とは、核酸試料中に存在する核酸分子（または核酸配列）の５０％以上をいう。ここでは、核酸試料中の核酸分子のかなりの部分とは、核酸試料中に存在する核酸分子（または核酸配列）の２０％以上をいう。
【０３８４】
核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．０１％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．１％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも５％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、または核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を結果として生じうる。
【０３８５】
核酸試料中の核酸分子の複製される部分は、核酸試料の配列複雑性に伴って異なりうる（すべての核酸試料について、より大きな部分が好ましいが）。たとえば、核酸試料が少なくとも１×１０９ヌクレオチドの配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．０１％の複製を結果として生じうる。核酸試料が少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．１％の複製を結果として生じうる。核酸試料が少なくとも１×１０７ヌクレオチドの配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％の複製を結果として生じうる。核酸試料が少なくとも１×１０６ヌクレオチドの配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％の複製を結果として生じうる。核酸試料が少なくとも１×１０５ヌクレオチドの配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％の複製を結果として生じうる。核酸試料が少なくとも１×１０４ヌクレオチドの配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％の複製を結果として生じうる。核酸試料が少なくとも１×１０３ヌクレオチドの配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％の複製を結果として生じうる。
【０３８６】
核酸試料が１×１０９ヌクレオチド未満の配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．０１％の複製を結果として生じうる。核酸試料が１×１０８ヌクレオチド未満の配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．１％の複製を結果として生じうる。核酸試料が１×１０７ヌクレオチド未満の配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％の複製を結果として生じうる。核酸試料が１×１０６ヌクレオチド未満の配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％の複製を結果として生じうる。核酸試料が１×１０５ヌクレオチド未満の配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％の複製を結果として生じうる。核酸試料が１×１０４ヌクレオチド未満の配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％の複製を結果として生じうる。核酸試料が１×１０３ヌクレオチド未満の配列複雑性を有する場合、核酸試料中の核酸分子の複製は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％の複製を結果として生じうる。
【０３８７】
増幅された核酸の品質の１つの指標は、増幅された核酸におけるパーセント発現量、配列発現量、配列発現量偏り、パーセント配列発現量、遺伝子座発現量、遺伝子座発現量偏り、および／またはパーセント遺伝子座発現量であることができる。起源核酸試料における遺伝子座または配列発現量と同一かまたは近い遺伝子座発現量または配列発現量は、最高品質の増幅された核酸を示す。遺伝子座発現量偏りは、増幅された核酸中の所定の遺伝子座の量の、増幅されていない核酸試料中の同一の遺伝子座の量に対する比（通常はパーセントで表される）をいうことができる。この計算を行う際には、増幅された核酸試料中の遺伝子座の実測量および増幅されていない核酸試料中の遺伝子座の実測量は一般的に、それぞれ増幅された核酸および増幅されていない核酸試料中に存在する核酸の総量に対して正規化することができる。（通常は参照遺伝子座発現量の）パーセンテージとして表した遺伝子座発現量または遺伝子座発現量偏りは、パーセント遺伝子座発現量（パーセント発現量の一形式である）ということができる。遺伝子座発現量偏りはまた、増幅された試料中の遺伝子座発現量の、増幅されていない試料中の遺伝子座発現量試料（または他の参照遺伝子座発現量）からの標準偏差として表すことができる。遺伝子座発現量偏りは、増幅偏りの一形式でありうる。遺伝子座発現量は、所定の遺伝子座（または遺伝子座の群）の量またはレベルをいうことができる。遺伝子座発現量は、別の、参照遺伝子座発現量と比較した遺伝子座発現量として表すことができる。したがって、たとえば、パーセント遺伝子座発現量は遺伝子座発現量の一形式である。
【０３８８】
配列発現量偏りは、増幅された核酸中の所定の配列の量の、増幅されていない核酸試料中の同一の配列の量に対する比（通常はパーセントで表される）をいうことができる。この計算を行う際には、増幅された核酸試料中の配列の実測量および増幅されていない核酸試料中の配列の実測量は一般的に、それぞれ増幅された核酸および増幅されていない核酸試料中に存在する核酸の総量に対して正規化することができる。（通常は参照配列発現量の）パーセンテージとして表した配列発現量または配列発現量偏り）は、パーセント配列発現量（パーセント発現量の一形式である）ということができる。配列発現量偏りはまた、増幅された試料中の配列発現量の、増幅されていない試料中の配列発現量試料（または他の参照遺伝子座発現量）からの標準偏差として表すことができる。配列発現量偏りは、増幅偏りの一形式でありうる。配列発現量は、所定の配列（または配列の群）の量またはレベルをいうことができる。配列発現量は、別の、参照配列発現量と比較した配列発現量として表すことができる。したがって、たとえば、パーセント配列発現量は配列発現量の一形式である。
【０３８９】
遺伝子座または配列発現量または遺伝子座または配列発現量偏りは、測定した１つの、いくつかの、またはすべての遺伝子座または配列に関して、たとえば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％であることができる。遺伝子座または配列発現量または遺伝子座または配列発現量偏りは、測定した１つの、いくつかの、またはすべての遺伝子座または配列に関して、たとえば、１０％より大、２０％より大、３０％より大、４０％より大、５０％より大、６０％より大、７０％より大、８０％より大、９０％より大、１００％より大、１１０％より大、１２０％より大、１３０％より大、１４０％より大、１５０％より大、１６０％より大、１７０％より大、１８０％より大、１９０％より大、２００％より大、２２５％より大、２５０％より大、２７５％より大、３００％より大、３５０％より大、４００％より大、４５０％より大、５００％より大、６００％より大、７００％より大、８００％より大、９００％より大、または１０００％より大であることができる。遺伝子座または配列発現量または遺伝子座または配列発現量偏りは、測定した１つの、いくつかの、またはすべての遺伝子座または配列に関して、たとえば、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、１００％未満、１１０％未満、１２０％未満、１３０％未満、１４０％未満、１５０％未満、１６０％未満、１７０％未満、１８０％未満、１９０％未満、２００％未満、２２５％未満、２５０％未満、２７５％未満、３００％未満、３５０％未満、４００％未満、４５０％未満、５００％未満、６００％未満、７００％未満、８００％未満、９００％未満、または１０００％未満であることができる。
【０３９０】
遺伝子座または配列発現量または遺伝子座または配列発現量偏りは、測定した１つの、いくつかの、またはすべての遺伝子座または配列に関して、たとえば、１０％ないし１０００％、１０％ないし９００％、１０％ないし８００％、１０％ないし７００％、１０％ないし６００％、１０％ないし５００％、１０％ないし４００％、１０％ないし３００％、１０％ないし２５０％、１０％ないし２００％、１０％ないし１５０％、１０％ないし１２５％、１０％ないし１００％、２０％ないし１０００％、２０％ないし９００％、２０％ないし８００％、２０％ないし７００％、２０％ないし６００％、２０％ないし５００％、２０％ないし４００％、２０％ないし３００％、２０％ないし２５０％、２０％ないし２００％、２０％ないし１５０％、２０％ないし１２５％、２０％ないし１００％、３０％ないし１０００％、３０％ないし９００％、３０％ないし８００％、３０％ないし７００％、３０％ないし６００％、３０％ないし５００％、３０％ないし４００％、３０％ないし３００％、３０％ないし２５０％、３０％ないし２００％、３０％ないし１５０％、３０％ないし１２５％、３０％ないし１００％、４０％ないし１０００％、４０％ないし９００％、４０％ないし８００％、４０％ないし７００％、４０％ないし６００％、４０％ないし５００％、４０％ないし４００％、４０％ないし３００％、４０％ないし２５０％、４０％ないし２００％、４０％ないし１５０％、４０％ないし１２５％、４０％ないし１００％、５０％ないし１０００％、５０％ないし９００％、５０％ないし８００％、５０％ないし７００％、５０％ないし６００％、５０％ないし５００％、５０％ないし４００％、５０％ないし３００％、５０％ないし２５０％、５０％ないし２００％、５０％ないし１５０％、５０％ないし１２５％、５０％ないし１００％、６０％ないし１０００％、６０％ないし９００％、６０％ないし８００％、６０％ないし７００％、６０％ないし６００％、６０％ないし５００％、６０％ないし４００％、６０％ないし３００％、６０％ないし２５０％、６０％ないし２００％、６０％ないし１５０％、６０％ないし１２５％、６０％ないし１００％、７０％ないし１０００％、７０％ないし９００％、７０％ないし８００％、７０％ないし７００％、７０％ないし６００％、７０％ないし５００％、７０％ないし４００％、７０％ないし３００％、７０％ないし２５０％、７０％ないし２００％、７０％ないし１５０％、７０％ないし１２５％、７０％ないし１００％、８０％ないし１０００％、８０％ないし９００％、８０％ないし８００％、８０％ないし７００％、８０％ないし６００％、８０％ないし５００％、８０％ないし４００％、８０％ないし３００％、８０％ないし２５０％、８０％ないし２００％、８０％ないし１５０％、８０％ないし１２５％、８０％ないし１００％、９０％ないし１０００％、９０％ないし９００％、９０％ないし８００％、９０％ないし７００％、９０％ないし６００％、９０％ないし５００％、９０％ないし４００％、９０％ないし３００％、９０％ないし２５０％、９０％ないし２００％、９０％ないし１５０％、９０％ないし１２５％、９０％ないし１００％、１００％ないし１０００％、１００％ないし９００％、１００％ないし８００％、１００％ないし７００％、１００％ないし６００％、１００％ないし５００％、１００％ないし４００％、１００％ないし３００％、１００％ないし２５０％、１００％ないし２００％、１００％ないし１５０％、または１００％ないし１２５％であることができる。
【０３９１】
上記および本文書に別に記載するさまざまな遺伝子座発現量および遺伝子座発現量偏りは、たとえば、１遺伝子座、２遺伝子座、３遺伝子座、４遺伝子座、５遺伝子座、６遺伝子座、７遺伝子座、８遺伝子座、９遺伝子座、１０遺伝子座、１１遺伝子座、１２遺伝子座、１３遺伝子座、１４遺伝子座、１５遺伝子座、１６遺伝子座、１７遺伝子座、１８遺伝子座、１９遺伝子座、２０遺伝子座、２５遺伝子座、３０遺伝子座、４０遺伝子座、５０遺伝子座、７５遺伝子座、または１００遺伝子座に関することができる。遺伝子座発現量または遺伝子座発現量偏りは、たとえば、少なくとも１遺伝子座、少なくとも２遺伝子座、少なくとも３遺伝子座、少なくとも４遺伝子座、少なくとも５遺伝子座、少なくとも６遺伝子座、少なくとも７遺伝子座、少なくとも８遺伝子座、少なくとも９遺伝子座、少なくとも１０遺伝子座、少なくとも１１遺伝子座、少なくとも１２遺伝子座、少なくとも１３遺伝子座、少なくとも１４遺伝子座、少なくとも１５遺伝子座、少なくとも１６遺伝子座、少なくとも１７遺伝子座、少なくとも１８遺伝子座、少なくとも１９遺伝子座、少なくとも２０遺伝子座、少なくとも２５遺伝子座、少なくとも３０遺伝子座、少なくとも４０遺伝子座、少なくとも５０遺伝子座、少なくとも７５遺伝子座、または少なくとも１００遺伝子座に関することができる。
【０３９２】
遺伝子座発現量または遺伝子座発現量偏りは、たとえば、１遺伝子座、２個の異なる遺伝子座、３個の異なる遺伝子座、４個の異なる遺伝子座、５個の異なる遺伝子座、６個の異なる遺伝子座、７個の異なる遺伝子座、８個の異なる遺伝子座、９個の異なる遺伝子座、１０個の異なる遺伝子座、１１個の異なる遺伝子座、１２個の異なる遺伝子座、１３個の異なる遺伝子座、１４個の異なる遺伝子座、１５個の異なる遺伝子座、１６個の異なる遺伝子座、１７個の異なる遺伝子座、１８個の異なる遺伝子座、１９個の異なる遺伝子座、２０個の異なる遺伝子座、２５個の異なる遺伝子座、３０個の異なる遺伝子座、４０個の異なる遺伝子座、５０個の異なる遺伝子座、７５個の異なる遺伝子座、または１００個の異なる遺伝子座に関することができる。遺伝子座発現量または遺伝子座発現量偏りは、たとえば、少なくとも１遺伝子座、少なくとも２個の異なる遺伝子座、少なくとも３個の異なる遺伝子座、少なくとも４個の異なる遺伝子座、少なくとも５個の異なる遺伝子座、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関することができる。
【０３９３】
上記および本文書に別に記載するさまざまな配列発現量および配列発現量偏りは、たとえば、１標的配列、２標的配列、３標的配列、４標的配列、５標的配列、６標的配列、７標的配列、８標的配列、９標的配列、１０標的配列、１１標的配列、１２標的配列、１３標的配列、１４標的配列、１５標的配列、１６標的配列、１７標的配列、１８標的配列、１９標的配列、２０標的配列、２５標的配列、３０標的配列、４０標的配列、５０標的配列、７５標的配列、または１００標的配列に関することができる。配列発現量または配列発現量偏りは、たとえば、少なくとも１標的配列、少なくとも２標的配列、少なくとも３標的配列、少なくとも４標的配列、少なくとも５標的配列、少なくとも６標的配列、少なくとも７標的配列、少なくとも８標的配列、少なくとも９標的配列、少なくとも１０標的配列、少なくとも１１標的配列、少なくとも１２標的配列、少なくとも１３標的配列、少なくとも１４標的配列、少なくとも１５標的配列、少なくとも１６標的配列、少なくとも１７標的配列、少なくとも１８標的配列、少なくとも１９標的配列、少なくとも２０標的配列、少なくとも２５標的配列、少なくとも３０標的配列、少なくとも４０標的配列、少なくとも５０標的配列、少なくとも７５標的配列、または少なくとも１００標的配列に関することができる。
【０３９４】
配列発現量または配列発現量偏りは、たとえば、１標的配列、２個の異なる標的配列、３個の異なる標的配列、４個の異なる標的配列、５個の異なる標的配列、６個の異なる標的配列、７個の異なる標的配列、８個の異なる標的配列、９個の異なる標的配列、１０個の異なる標的配列、１１個の異なる標的配列、１２個の異なる標的配列、１３個の異なる標的配列、１４個の異なる標的配列、１５個の異なる標的配列、１６個の異なる標的配列、１７個の異なる標的配列、１８個の異なる標的配列、１９個の異なる標的配列、２０個の異なる標的配列、２５個の異なる標的配列、３０個の異なる標的配列、４０個の異なる標的配列、５０個の異なる標的配列、７５個の異なる標的配列、または１００個の異なる標的配列に関することができる。配列発現量または配列発現量偏りは、たとえば、少なくとも１標的配列、少なくとも２個の異なる標的配列、少なくとも３個の異なる標的配列、少なくとも４個の異なる標的配列、少なくとも５個の異なる標的配列、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関することができる。
【０３９５】
増幅された核酸の品質のもう１つの指標は、増幅された核酸における増幅偏りであることができる。増幅偏りとは、核酸試料中の異なる配列の増幅のレベルにおける差である。低い増幅偏りは、最高品質の増幅された核酸を示す。増幅偏りの１つの表現は、増幅された核酸における、最高の遺伝子座発現量偏りを有する遺伝子座の遺伝子座発現量偏りの、最低の遺伝子座発現量偏りを有する遺伝子座発現量偏りに対する比（通常は差の倍数またはパーセント差として表される）として計算することができる。増幅偏りのもう１つの表現は、増幅された核酸における、最高の遺伝子座発現量を有する遺伝子座の遺伝子座発現量の、最低の遺伝子座発現量を有する遺伝子座発現量に対する比（通常は差の倍数またはパーセント差として表される）として計算することができる。配列発現量偏りが測定されるならば、増幅偏りを、増幅された核酸における、最高の配列発現量偏りを有する配列の配列発現量偏りの、最低の配列発現量偏りを有する配列発現量偏りに対する比（通常は差の倍数として表される）として計算することができる。増幅偏りは、増幅された核酸における、最高の配列発現量を有する配列の配列発現量の、最低の配列発現量を有する配列発現量に対する比（通常は差の倍数として表される）として計算することができる。上記の計算は、評価したすべての遺伝子座または配列に関する増幅偏りの指標であるが、評価した遺伝子座または配列の部分集合を用いて増幅偏りを計算することができる。実際、増幅偏りを、個々の遺伝子座、配列または対立遺伝子に関して計算することができる。したがって、たとえば、増幅偏りはまた、増幅された核酸における、１つ以上の遺伝子座の遺伝子座発現量偏りの、１つ以上の別の遺伝子座の遺伝子座発現量偏りに対する比（通常は差の倍数またはパーセント差として表される）として計算することができる。別の一例として、増幅偏りはまた、１つ以上の遺伝子座の増幅されていない試料における遺伝子座発現量の、同一の遺伝子座の増幅された試料における遺伝子座発現量に対する比（通常は差の倍数またはパーセント差として表される）として計算することができる。
【０３９６】
増幅偏りは、たとえば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、２４倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、または３００倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約２０倍、約２４倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、または約３００倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、２倍未満、３倍未満、４倍未満、５倍未満、６倍未満、７倍未満、８倍未満、９倍未満、１０倍未満、１１倍未満、１２倍未満、１４倍未満、１６倍未満、２０倍未満、２４倍未満、３０倍未満、３５倍未満、４０倍未満、５０倍未満、６０倍未満、７０倍未満、８０倍未満、９０倍未満、１００倍未満、１５０倍未満、２００倍未満、２５０倍未満、または３００倍未満であることができる。
【０３９７】
増幅偏りは、たとえば、約２倍未満、約３倍未満、約４倍未満、約５倍未満、約６倍未満、約７倍未満、約８倍未満、約９倍未満、約１０倍未満、約１１倍未満、約１２倍未満、約１４倍未満、約１６倍未満、約２０倍未満、約２４倍未満、約３０倍未満、約３５倍未満、約４０倍未満、約５０倍未満、約６０倍未満、約７０倍未満、約８０倍未満、約９０倍未満、約１００倍未満、約１５０倍未満、約２００倍未満、約２５０倍未満、または約３００倍未満であることができる。
【０３９８】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし３００倍、２倍ないし３００倍、３倍ないし３００倍、４倍ないし３００倍、５倍ないし３００倍、６倍ないし３００倍、７倍ないし３００倍、８倍ないし３００倍、９倍ないし３００倍、１０倍ないし３００倍、１１倍ないし３００倍、１２倍ないし３００倍、１４倍ないし３００倍、１６倍ないし３００倍、２０倍ないし３００倍、２４倍ないし３００倍、３０倍ないし３００倍、３５倍ないし３００倍、４０倍ないし３００倍、５０倍ないし３００倍、６０倍ないし３００倍、７０倍ないし３００倍、８０倍ないし３００倍、９０倍ないし３００倍、１００倍ないし３００倍、１５０倍ないし３００倍、２００倍ないし３００倍、または２５０倍ないし３００倍であることができる。
【０３９９】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし２５０倍、２倍ないし２５０倍、３倍ないし２５０倍、４倍ないし２５０倍、５倍ないし２５０倍、６倍ないし２５０倍、７倍ないし２５０倍、８倍ないし２５０倍、９倍ないし２５０倍、１０倍ないし２５０倍、１１倍ないし２５０倍、１２倍ないし２５０倍、１４倍ないし２５０倍、１６倍ないし２５０倍、２０倍ないし２５０倍、２４倍ないし２５０倍、３０倍ないし２５０倍、３５倍ないし２５０倍、４０倍ないし２５０倍、５０倍ないし２５０倍、６０倍ないし２５０倍、７０倍ないし２５０倍、８０倍ないし２５０倍、９０倍ないし２５０倍、１００倍ないし２５０倍、１５０倍ないし２５０倍、または２００倍ないし２５０倍であることができる。
【０４００】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし２００倍、２倍ないし２００倍、３倍ないし２００倍、４倍ないし２００倍、５倍ないし２００倍、６倍ないし２００倍、７倍ないし２００倍、８倍ないし２００倍、９倍ないし２００倍、１０倍ないし２００倍、１１倍ないし２００倍、１２倍ないし２００倍、１４倍ないし２００倍、１６倍ないし２００倍、２０倍ないし２００倍、２４倍ないし２００倍、３０倍ないし２００倍、３５倍ないし２００倍、４０倍ないし２００倍、５０倍ないし２００倍、６０倍ないし２００倍、７０倍ないし２００倍、８０倍ないし２００倍、９０倍ないし２００倍、１００倍ないし２００倍、または１５０倍ないし２００倍であることができる。
【０４０１】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし１５０倍、２倍ないし１５０倍、３倍ないし１５０倍、４倍ないし１５０倍、５倍ないし１５０倍、６倍ないし１５０倍、７倍ないし１５０倍、８倍ないし１５０倍、９倍ないし１５０倍、１０倍ないし１５０倍、１１倍ないし１５０倍、１２倍ないし１５０倍、１４倍ないし１５０倍、１６倍ないし１５０倍、２０倍ないし１５０倍、２４倍ないし１５０倍、３０倍ないし１５０倍、３５倍ないし１５０倍、４０倍ないし１５０倍、５０倍ないし１５０倍、６０倍ないし１５０倍、７０倍ないし１５０倍、８０倍ないし１５０倍、９０倍ないし１５０倍、または１００倍ないし１５０倍であることができる。
【０４０２】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし１００倍、２倍ないし１００倍、３倍ないし１００倍、４倍ないし１００倍、５倍ないし１００倍、６倍ないし１００倍、７倍ないし１００倍、８倍ないし１００倍、９倍ないし１００倍、１０倍ないし１００倍、１１倍ないし１００倍、１２倍ないし１００倍、１４倍ないし１００倍、１６倍ないし１００倍、２０倍ないし１００倍、２４倍ないし１００倍、３０倍ないし１００倍、３５倍ないし１００倍、４０倍ないし１００倍、５０倍ないし１００倍、６０倍ないし１００倍、７０倍ないし１００倍、８０倍ないし１００倍、または９０倍ないし１００倍であることができる。
【０４０３】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし９０倍、２倍ないし９０倍、３倍ないし９０倍、４倍ないし９０倍、５倍ないし９０倍、６倍ないし９０倍、７倍ないし９０倍、８倍ないし９０倍、９倍ないし９０倍、１０倍ないし９０倍、１１倍ないし９０倍、１２倍ないし９０倍、１４倍ないし９０倍、１６倍ないし９０倍、２０倍ないし９０倍、２４倍ないし９０倍、３０倍ないし９０倍、３５倍ないし９０倍、４０倍ないし９０倍、５０倍ないし９０倍、６０倍ないし９０倍、７０倍ないし９０倍、または８０倍ないし９０倍であることができる。
【０４０４】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし８０倍、２倍ないし８０倍、３倍ないし８０倍、４倍ないし８０倍、５倍ないし８０倍、６倍ないし８０倍、７倍ないし８０倍、８倍ないし８０倍、９倍ないし８０倍、１０倍ないし８０倍、１１倍ないし８０倍、１２倍ないし８０倍、１４倍ないし８０倍、１６倍ないし８０倍、２０倍ないし８０倍、２４倍ないし８０倍、３０倍ないし８０倍、３５倍ないし８０倍、４０倍ないし８０倍、５０倍ないし８０倍、６０倍ないし８０倍、または７０倍ないし８０倍であることができる。
【０４０５】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし７０倍、２倍ないし７０倍、３倍ないし７０倍、４倍ないし７０倍、５倍ないし７０倍、６倍ないし７０倍、７倍ないし７０倍、８倍ないし７０倍、９倍ないし７０倍、１０倍ないし７０倍、１１倍ないし７０倍、１２倍ないし７０倍、１４倍ないし７０倍、１６倍ないし７０倍、２０倍ないし７０倍、２４倍ないし７０倍、３０倍ないし７０倍、３５倍ないし７０倍、４０倍ないし７０倍、５０倍ないし７０倍、または６０倍ないし７０倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、１倍ないし６０倍、２倍ないし６０倍、３倍ないし６０倍、４倍ないし６０倍、５倍ないし６０倍、６倍ないし６０倍、７倍ないし６０倍、８倍ないし６０倍、９倍ないし６０倍、１０倍ないし６０倍、１１倍ないし６０倍、１２倍ないし６０倍、１４倍ないし６０倍、１６倍ないし６０倍、２０倍ないし６０倍、２４倍ないし６０倍、３０倍ないし６０倍、３５倍ないし６０倍、４０倍ないし６０倍、または５０倍ないし６０倍であることができる。
【０４０６】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし５０倍、２倍ないし５０倍、３倍ないし５０倍、４倍ないし５０倍、５倍ないし５０倍、６倍ないし５０倍、７倍ないし５０倍、８倍ないし５０倍、９倍ないし５０倍、１０倍ないし５０倍、１１倍ないし５０倍、１２倍ないし５０倍、１４倍ないし５０倍、１６倍ないし５０倍、２０倍ないし５０倍、２４倍ないし５０倍、３０倍ないし５０倍、３５倍ないし５０倍、または４０倍ないし５０倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、１倍ないし４０倍、２倍ないし４０倍、３倍ないし４０倍、４倍ないし４０倍、５倍ないし４０倍、６倍ないし４０倍、７倍ないし４０倍、８倍ないし４０倍、９倍ないし４０倍、１０倍ないし４０倍、１１倍ないし４０倍、１２倍ないし４０倍、１４倍ないし４０倍、１６倍ないし４０倍、２０倍ないし４０倍、２４倍ないし４０倍、３０倍ないし４０倍、または３５倍ないし４０倍であることができる。
【０４０７】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし３０倍、２倍ないし３０倍、３倍ないし３０倍、４倍ないし３０倍、５倍ないし３０倍、６倍ないし３０倍、７倍ないし３０倍、８倍ないし３０倍、９倍ないし３０倍、１０倍ないし３０倍、１１倍ないし３０倍、１２倍ないし３０倍、１４倍ないし３０倍、１６倍ないし３０倍、２０倍ないし３０倍、または２４倍ないし３０倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、１倍ないし２０倍、２倍ないし２０倍、３倍ないし２０倍、４倍ないし２０倍、５倍ないし２０倍、６倍ないし２０倍、７倍ないし２０倍、８倍ないし２０倍、９倍ないし２０倍、１０倍ないし２０倍、１１倍ないし２０倍、１２倍ないし２０倍、１４倍ないし２０倍、１６倍ないし２０倍、２０倍ないし２０倍、または２４倍ないし２０倍であることができる。
【０４０８】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし１２倍、２倍ないし１２倍、３倍ないし１２倍、４倍ないし１２倍、５倍ないし１２倍、６倍ないし１２倍、７倍ないし１２倍、８倍ないし１２倍、９倍ないし１２倍、１０倍ないし１２倍、または１１倍ないし１２倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、１倍ないし１１倍、２倍ないし１１倍、３倍ないし１１倍、４倍ないし１１倍、５倍ないし１１倍、６倍ないし１１倍、７倍ないし１１倍、８倍ないし１１倍、９倍ないし１１倍、または１０倍ないし１１倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、１倍ないし１０倍、２倍ないし１０倍、３倍ないし１０倍、４倍ないし１０倍、５倍ないし１０倍、６倍ないし１０倍、７倍ないし１０倍、８倍ないし１０倍、または９倍ないし１０倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、１倍ないし９倍、２倍ないし９倍、３倍ないし９倍、４倍ないし９倍、５倍ないし９倍、６倍ないし９倍、７倍ないし９倍、または８倍ないし９倍であることができる。
【０４０９】
増幅偏りは、たとえば、１倍ないし８倍、２倍ないし８倍、３倍ないし８倍、４倍ないし８倍、５倍ないし８倍、６倍ないし８倍、または７倍ないし８倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、１倍ないし７倍、２倍ないし７倍、３倍ないし７倍、４倍ないし７倍、５倍ないし７倍、または６倍ないし７倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、１倍ないし６倍、２倍ないし６倍、３倍ないし６倍、４倍ないし６倍、または５倍ないし６倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、１倍ないし５倍、２倍ないし５倍、３倍ないし５倍、４倍ないし５倍、１倍ないし４倍、２倍ないし４倍、３倍ないし４倍、１倍ないし３倍、２倍ないし３倍、または１倍ないし２倍であることができる。
【０４１０】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約３００倍、約２倍ないし約３００倍、約３倍ないし約３００倍、約４倍ないし約３００倍、約５倍ないし約３００倍、約６倍ないし約３００倍、約７倍ないし約３００倍、約８倍ないし約３００倍、約９倍ないし約３００倍、約１０倍ないし約３００倍、約１１倍ないし約３００倍、約１２倍ないし約３００倍、約１４倍ないし約３００倍、約１６倍ないし約３００倍、約２０倍ないし約３００倍、約２４倍ないし約３００倍、約３０倍ないし約３００倍、約３５倍ないし約３００倍、約４０倍ないし約３００倍、約５０倍ないし約３００倍、約６０倍ないし約３００倍、約７０倍ないし約３００倍、約８０倍ないし約３００倍、約９０倍ないし約３００倍、約１００倍ないし約３００倍、約１５０倍ないし約３００倍、約２００倍ないし約３００倍、または約２５０倍ないし約３００倍であることができる。
【０４１１】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約２５０倍、約２倍ないし約２５０倍、約３倍ないし約２５０倍、約４倍ないし約２５０倍、約５倍ないし約２５０倍、約６倍ないし約２５０倍、約７倍ないし約２５０倍、約８倍ないし約２５０倍、約９倍ないし約２５０倍、約１０倍ないし約２５０倍、約１１倍ないし約２５０倍、約１２倍ないし約２５０倍、約１４倍ないし約２５０倍、約１６倍ないし約２５０倍、約２０倍ないし約２５０倍、約２４倍ないし約２５０倍、約３０倍ないし約２５０倍、約３５倍ないし約２５０倍、約４０倍ないし約２５０倍、約５０倍ないし約２５０倍、約６０倍ないし約２５０倍、約７０倍ないし約２５０倍、約８０倍ないし約２５０倍、約９０倍ないし約２５０倍、約１００倍ないし約２５０倍、約１５０倍ないし約２５０倍、または約２００倍ないし約２５０倍であることができる。
【０４１２】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約２００倍、約２倍ないし約２００倍、約３倍ないし約２００倍、約４倍ないし約２００倍、約５倍ないし約２００倍、約６倍ないし約２００倍、約７倍ないし約２００倍、約８倍ないし約２００倍、約９倍ないし約２００倍、約１０倍ないし約２００倍、約１１倍ないし約２００倍、約１２倍ないし約２００倍、約１４倍ないし約２００倍、約１６倍ないし約２００倍、約２０倍ないし約２００倍、約２４倍ないし約２００倍、約３０倍ないし約２００倍、約３５倍ないし約２００倍、約４０倍ないし約２００倍、約５０倍ないし約２００倍、約６０倍ないし約２００倍、約７０倍ないし約２００倍、約８０倍ないし約２００倍、約９０倍ないし約２００倍、約１００倍ないし約２００倍、または約１５０倍ないし約２００倍であることができる。
【０４１３】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約１５０倍、約２倍ないし約１５０倍、約３倍ないし約１５０倍、約４倍ないし約１５０倍、約５倍ないし約１５０倍、約６倍ないし約１５０倍、約７倍ないし約１５０倍、約８倍ないし約１５０倍、約９倍ないし約１５０倍、約１０倍ないし約１５０倍、約１１倍ないし約１５０倍、約１２倍ないし約１５０倍、約１４倍ないし約１５０倍、約１６倍ないし約１５０倍、約２０倍ないし約１５０倍、約２４倍ないし約１５０倍、約３０倍ないし約１５０倍、約３５倍ないし約１５０倍、約４０倍ないし約１５０倍、約５０倍ないし約１５０倍、約６０倍ないし約１５０倍、約７０倍ないし約１５０倍、約８０倍ないし約１５０倍、約９０倍ないし約１５０倍、または約１００倍ないし約１５０倍であることができる。
【０４１４】
増幅偏りは、たとえば、約Ｉ倍ないし約１００倍、約２倍ないし約１００倍、約３倍ないし約１００倍、約４倍ないし約１００倍、約５倍ないし約１００倍、約６倍ないし約１００倍、約７倍ないし約１００倍、約８倍ないし約１００倍、約９倍ないし約１００倍、約１０倍ないし約１００倍、約１１倍ないし約１００倍、約１２倍ないし約１００倍、約１４倍ないし約１００倍、約１６倍ないし約１００倍、約２０倍ないし約１００倍、約２４倍ないし約１００倍、約３０倍ないし約１００倍、約３５倍ないし約１００倍、約４０倍ないし約１００倍、約５０倍ないし約１００倍、約６０倍ないし約１００倍、約７０倍ないし約１００倍、約８０倍ないし約１００倍、または約９０倍ないし約１００倍であることができる。
【０４１５】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約９０倍、約２倍ないし約９０倍、約３倍ないし約９０倍、約４倍ないし約９０倍、約５倍ないし約９０倍、約６倍ないし約９０倍、約７倍ないし約９０倍、約８倍ないし約９０倍、約９倍ないし約９０倍、約１０倍ないし約９０倍、約１１倍ないし約９０倍、約１２倍ないし約９０倍、約１４倍ないし約９０倍、約１６倍ないし約９０倍、約２０倍ないし約９０倍、約２４倍ないし約９０倍、約３０倍ないし約９０倍、約３５倍ないし約９０倍、約４０倍ないし約９０倍、約５０倍ないし約９０倍、約６０倍ないし約９０倍、約７０倍ないし約９０倍、または約８０倍ないし約９０倍であることができる。
【０４１６】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約８０倍、約２倍ないし約８０倍、約３倍ないし約８０倍、約４倍ないし約８０倍、約５倍ないし約８０倍、約６倍ないし約８０倍、約７倍ないし約８０倍、約８倍ないし約８０倍、約９倍ないし約８０倍、約１０倍ないし約８０倍、約１１倍ないし約８０倍、約１２倍ないし約８０倍、約１４倍ないし約８０倍、約１６倍ないし約８０倍、約２０倍ないし約８０倍、約２４倍ないし約８０倍、約３０倍ないし約８０倍、約３５倍ないし約８０倍、約４０倍ないし約８０倍、約５０倍ないし約８０倍、約６０倍ないし約８０倍、または約７０倍ないし約８０倍であることができる。
【０４１７】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約７０倍、約２倍ないし約７０倍、約３倍ないし約７０倍、約４倍ないし約７０倍、約５倍ないし約７０倍、約６倍ないし約７０倍、約７倍ないし約７０倍、約８倍ないし約７０倍、約９倍ないし約７０倍、約１０倍ないし約７０倍、約１１倍ないし約７０倍、約１２倍ないし約７０倍、約１４倍ないし約７０倍、約１６倍ないし約７０倍、約２０倍ないし約７０倍、約２４倍ないし約７０倍、約３０倍ないし約７０倍、約３５倍ないし約７０倍、約４０倍ないし約７０倍、約５０倍ないし約７０倍、または約６０倍ないし約７０倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約６０倍、約２倍ないし約６０倍、約３倍ないし約６０倍、約４倍ないし約６０倍、約５倍ないし約６０倍、約６倍ないし約６０倍、約７倍ないし約６０倍、約８倍ないし約６０倍、約９倍ないし約６０倍、約１０倍ないし約６０倍、約１１倍ないし約６０倍、約１２倍ないし約６０倍、約１４倍ないし約６０倍、約１６倍ないし約６０倍、約２０倍ないし約６０倍、約２４倍ないし約６０倍、約３０倍ないし約６０倍、約３５倍ないし約６０倍、約４０倍ないし約６０倍、または約５０倍ないし約６０倍であることができる。
【０４１８】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約５０倍、約２倍ないし約５０倍、約３倍ないし約５０倍、約４倍ないし約５０倍、約５倍ないし約５０倍、約６倍ないし約５０倍、約７倍ないし約５０倍、約８倍ないし約５０倍、約９倍ないし約５０倍、約１０倍ないし約５０倍、約１１倍ないし約５０倍、約１２倍ないし約５０倍、約１４倍ないし約５０倍、約１６倍ないし約５０倍、約２０倍ないし約５０倍、約２４倍ないし約５０倍、約３０倍ないし約５０倍、約３５倍ないし約５０倍、または約４０倍ないし約５０倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約４０倍、約２倍ないし約４０倍、約３倍ないし約４０倍、約４倍ないし約４０倍、約５倍ないし約４０倍、約６倍ないし約４０倍、約７倍ないし約４０倍、約８倍ないし約４０倍、約９倍ないし約４０倍、約１０倍ないし約４０倍、約１１倍ないし約４０倍、約１２倍ないし約４０倍、約１４倍ないし約４０倍、約１６倍ないし約４０倍、約２０倍ないし約４０倍、約２４倍ないし約４０倍、約３０倍ないし約４０倍、または約３５倍ないし約４０倍であることができる。
【０４１９】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約３０倍、約２倍ないし約３０倍、約３倍ないし約３０倍、約４倍ないし約３０倍、約５倍ないし約３０倍、約６倍ないし約３０倍、約７倍ないし約３０倍、約８倍ないし約３０倍、約９倍ないし約３０倍、約１０倍ないし約３０倍、約１１倍ないし約３０倍、約１２倍ないし約３０倍、約１４倍ないし約３０倍、約１６倍ないし約３０倍、約２０倍ないし約３０倍、または約２４倍ないし約３０倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約２０倍、約２倍ないし約２０倍、約３倍ないし約２０倍、約４倍ないし約２０倍、約５倍ないし約２０倍、約６倍ないし約２０倍、約７倍ないし約２０倍、約８倍ないし約２０倍、約９倍ないし約２０倍、約１０倍ないし約２０倍、約１１倍ないし約２０倍、約１２倍ないし約２０倍、約１４倍ないし約２０倍、約１６倍ないし約２０倍、約２０倍ないし約２０倍、または約２４倍ないし約２０倍であることができる。
【０４２０】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約１２倍、約２倍ないし約１２倍、約３倍ないし約１２倍、約４倍ないし約１２倍、約５倍ないし約１２倍、約６倍ないし約１２倍、約７倍ないし約１２倍、約８倍ないし約１２倍、約９倍ないし約１２倍、約１０倍ないし約１２倍、または約１１倍ないし約１２倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約１１倍、約２倍ないし約１１倍、約３倍ないし約１１倍、約４倍ないし約１１倍、約５倍ないし約１１倍、約６倍ないし約１１倍、約７倍ないし約１１倍、約８倍ないし約１１倍、約９倍ないし約１１倍、または約１０倍ないし約１１倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約１０倍、約２倍ないし約１０倍、約３倍ないし約１０倍、約４倍ないし約１０倍、約５倍ないし約１０倍、約６倍ないし約１０倍、約７倍ないし約１０倍、約８倍ないし約１０倍、または約９倍ないし約１０倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約９倍、約２倍ないし約９倍、約３倍ないし約９倍、約４倍ないし約９倍、約５倍ないし約９倍、約６倍ないし約９倍、約７倍ないし約９倍、または約８倍ないし約９倍であることができる。
【０４２１】
増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約８倍、約２倍ないし約８倍、約３倍ないし約８倍、約４倍ないし約８倍、約５倍ないし約８倍、約６倍ないし約８倍、または約７倍ないし約８倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約７倍、約２倍ないし約７倍、約３倍ないし約７倍、約４倍ないし約７倍、約５倍ないし約７倍、または約６倍ないし約７倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約６倍、約２倍ないし約６倍、約３倍ないし約６倍、約４倍ないし約６倍、または約５倍ないし約６倍であることができる。増幅偏りは、たとえば、約１倍ないし約５倍、約２倍ないし約５倍、約３倍ないし約５倍、約４倍ないし約５倍、約１倍ないし約４倍、約２倍ないし約４倍、約３倍ないし約４倍、約１倍ないし約３倍、約２倍ないし約３倍、または約１倍ないし約２倍であることができる。
【０４２２】
上記および本文書に別に記載するさまざまな増幅偏りは、たとえば、１遺伝子座、２遺伝子座、３遺伝子座、４遺伝子座、５遺伝子座、６遺伝子座、７遺伝子座、８遺伝子座、９遺伝子座、１０遺伝子座、１１遺伝子座、１２遺伝子座、１３遺伝子座、１４遺伝子座、１５遺伝子座、１６遺伝子座、１７遺伝子座、１８遺伝子座、１９遺伝子座、２０遺伝子座、２５遺伝子座、３０遺伝子座、４０遺伝子座、５０遺伝子座、７５遺伝子座、または１００遺伝子座に関することができる。増幅偏りは、たとえば、少なくとも１遺伝子座、少なくとも２遺伝子座、少なくとも３遺伝子座、少なくとも４遺伝子座、少なくとも５遺伝子座、少なくとも６遺伝子座、少なくとも８遺伝子座、少なくとも９遺伝子座、少なくとも１０遺伝子座、少なくとも１１遺伝子座、少なくとも１２遺伝子座、少なくとも１３遺伝子座、少なくとも１４遺伝子座、少なくとも１５遺伝子座、少なくとも１６遺伝子座、少なくとも１７遺伝子座、少なくとも１８遺伝子座、少なくとも１９遺伝子座、少なくとも２０遺伝子座、少なくとも２５遺伝子座、少なくとも３０遺伝子座、少なくとも４０遺伝子座、少なくとも５０遺伝子座、少なくとも７５遺伝子座、または少なくとも１００遺伝子座に関することができる。
【０４２３】
増幅偏りは、たとえば、１遺伝子座、２個の異なる遺伝子座、３個の異なる遺伝子座、４個の異なる遺伝子座、５個の異なる遺伝子座、６個の異なる遺伝子座、７個の異なる遺伝子座、８個の異なる遺伝子座、９個の異なる遺伝子座、１０個の異なる遺伝子座、１１個の異なる遺伝子座、１２個の異なる遺伝子座、１３個の異なる遺伝子座、１４個の異なる遺伝子座、１５個の異なる遺伝子座、１６個の異なる遺伝子座、１７個の異なる遺伝子座、１８個の異なる遺伝子座、１９個の異なる遺伝子座、２０個の異なる遺伝子座、２５個の異なる遺伝子座、３０個の異なる遺伝子座、４０個の異なる遺伝子座、５０個の異なる遺伝子座、７５個の異なる遺伝子座、または１００個の異なる遺伝子座に関することができる。増幅偏りは、たとえば、少なくとも１遺伝子座、少なくとも２個の異なる遺伝子座、少なくとも３個の異なる遺伝子座、少なくとも４個の異なる遺伝子座、少なくとも５個の異なる遺伝子座、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関することができる。
【０４２４】
上記および本文書に別に記載するさまざまな増幅偏りは、たとえば、１標的配列、２標的配列、３標的配列、４標的配列、５標的配列、６標的配列、７標的配列、８標的配列、９標的配列、１０標的配列、１１標的配列、１２標的配列、１３標的配列、１４標的配列、１５標的配列、１６標的配列、１７標的配列、１８標的配列、１９標的配列、２０標的配列、２５標的配列、３０標的配列、４０標的配列、５０標的配列、７５標的配列、または１００標的配列に関することができる。増幅偏りは、たとえば、少なくとも１標的配列、少なくとも２標的配列、少なくとも３標的配列、少なくとも４標的配列、少なくとも５標的配列、少なくとも６標的配列、少なくとも７標的配列、少なくとも８標的配列、少なくとも９標的配列、少なくとも１０標的配列、少なくとも１１標的配列、少なくとも１２標的配列、少なくとも１３標的配列、少なくとも１４標的配列、少なくとも１５標的配列、少なくとも１６標的配列、少なくとも１７標的配列、少なくとも１８標的配列、少なくとも１９標的配列、少なくとも２０標的配列、少なくとも２５標的配列、少なくとも３０標的配列、少なくとも４０標的配列、少なくとも５０標的配列、少なくとも７５標的配列、または少なくとも１００標的配列に関することができる。
【０４２５】
増幅偏りは、たとえば、１標的配列、２個の異なる標的配列、３個の異なる標的配列、４個の異なる標的配列、５個の異なる標的配列、６個の異なる標的配列、７個の異なる標的配列、８個の異なる標的配列、９個の異なる標的配列、１０個の異なる標的配列、１１個の異なる標的配列、１２個の異なる標的配列、１３個の異なる標的配列、１４個の異なる標的配列、１５個の異なる標的配列、１６個の異なる標的配列、１７個の異なる標的配列、１８個の異なる標的配列、１９個の異なる標的配列、２０個の異なる標的配列、２５個の異なる標的配列、３０個の異なる標的配列、４０個の異なる標的配列、５０個の異なる標的配列、７５個の異なる標的配列、または１００個の異なる標的配列に関することができる。増幅偏りは、たとえば、少なくとも１標的配列、少なくとも２個の異なる標的配列、少なくとも３個の異なる標的配列、少なくとも４個の異なる標的配列、少なくとも５個の異なる標的配列、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関することができる。
【０４２６】
Ｉ．核酸試料調製および処理
増幅のための核酸はしばしば細胞試料から得られる。このことは一般的に、細胞の破壊（核酸を接触可能にするため）および核酸の精製を増幅の前に必要とする。このことはまた、一般的に、ヌクレアーゼといったＤＮＡを分解できるタンパク質因子の、またはヒストンといったＤＮＡ鎖と結合してそのポリメラーゼによるＤＮＡ合成のテンプレートとしての利用を妨げることができる因子の、不活性化を必要とする。超音波処理、細胞壁の酵素消化、加熱、および溶解条件への曝露といった、細胞を壊して開くのに用いられるさまざまな技術がある。溶解条件は典型的には、非生理的ｐＨおよび／または溶媒の使用を含む。多数の溶解技術は、たとえば、ゲノムＤＮＡの切断を含む、細胞中の核酸への損傷を結果として生じうる。特に、細胞を溶解するための加熱の使用は、ゲノムＤＮＡを損傷しおよびゲノムＤＮＡの増幅産物の量および品質を低下させうる。アルカリ性溶解は、ゲノムＤＮＡに与える損傷がより小さくなりうること、およびしたがって結果としてより高品質の増幅結果を生じうることが見出されている。アルカリ性溶解はまた、ヌクレアーゼといったタンパク質因子、ヒストン、または試料中のＤＮＡの増幅を妨げうる他の因子を不活性化する。加えて、ｐＨを低下させることはタンパク質因子を再活性化させず、そのようなタンパク質因子は溶液のｐＨが中性範囲内に戻される際に不活性化されたままに留まることは、アルカリ性溶解の有用な特性である。
【０４２７】
本開示の方法の一部の形式では、ゲノム試料は、細胞をアルカリ性条件に曝露し、それによって細胞を溶解して細胞溶解物を結果として生じる；細胞溶解物のｐＨを低下させて細胞溶解物のｐＨをＤＮＡ複製に適合するようにする；および、複数置換増幅による細胞のゲノムの複製を促進する条件下で細胞溶解物をインキュベートすることによって調製される。アルカリ性条件とは、ｐＨが９．０より大きい条件である。本開示の方法に特に有用なアルカリ性条件は、ｐＨが１０．０より大きい条件である。アルカリ性条件は、たとえば、相当な数の細胞に溶解を引き起こす条件、顕著な数の細胞に溶解を引き起こす条件、または十分な数の細胞に溶解を引き起こす条件でありうる。溶解した細胞の数は、本開示の方法においてゲノムが十分に増幅されうるならば十分であると考えられる。配列の検出または他の分析といった増幅産物の一部の用途を可能にするのに十分な増幅産物が作製されるならば、増幅は十分である。ｐＨの低下は一般的にｐＨ９．０ないしｐＨ６．０の中性範囲内へである。
【０４２８】
細胞を溶解溶液と混合することによって、細胞をアルカリ性条件へ曝露することができる。細胞と混合する溶解溶液の量は、相当な数の細胞に溶解を引き起こす量、または十分な数の細胞に溶解を引き起こす量であることができる。一般的に、この容量は細胞／溶解溶液混合物のｐＨの関数となる。したがって、細胞と混合すべき溶解溶液の量は、一般的に細胞の容量および溶解緩衝液のアルカリ濃度から決定することができる。たとえば、十分なアルカリ性条件を作り出すためには、より弱い塩基および／またはより低濃度の塩基を含む溶解溶液に必要な容量よりも、より強い塩基および／またはより高濃度の塩基を含む溶解溶液のより少ない容量が必要となる。（希望のアルカリ性条件を生じるために）細胞が等しい容量の溶解溶液と混合されるように、溶解溶液を処方することができる。
【０４２９】
一部の実施形態では、溶解溶液は塩基水溶液といった塩基を含みうる。有用な塩基は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア、アニリン、ベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ジフェニルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、Ｎ−メチルアニリン、モルホリン、ピリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、水酸化アルミニウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、およびＤＢＵ（１，８−ジアゾビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン）を含む。有用な溶解溶液の処方は、４００ｍＭＫＯＨを含む溶解溶液、４００ｍＭＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶解溶液、および４００ｍＭＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡから成る溶解溶液を含む。
【０４３０】
一部の実施形態では、溶解溶液は複数の塩基性物質を含みうる。ここでは、塩基性物質とは、アルカリ性条件を結果として生じる化合物、組成物または溶液である。一部の実施形態では、溶解溶液は緩衝剤を含みうる。有用な緩衝剤は、リン酸緩衝剤、「グッド（Ｇｏｏｄ）」緩衝剤（たとえばＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、およびＴＲＩＣＩＮＥ）、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、およびビス−トリスプロパンを含む。溶解溶液は複数の緩衝剤を含みうる。ここでは、緩衝試薬とは、緩衝剤として作用する化合物、組成物または溶液である。アルカリ性緩衝剤とは、アルカリ性条件を結果として生じる緩衝剤である。一部の実施形態では、溶解溶液は１種類以上の塩基、塩基性物質、緩衝剤および緩衝試薬の組み合わせを含みうる。
【０４３１】
細胞溶解物のｐＨは、安定化した細胞溶解物を生じるために低下させることができる。安定化した細胞溶解物とは、ｐＨが中性範囲（約ｐＨ６．０ないし約ｐＨ９．０）にある細胞溶解物である。有用な安定化した細胞溶解物は、細胞溶解物中の核酸の複製を可能にするｐＨを有する。たとえば、安定化した細胞溶解物のｐＨは、有効に、ＤＮＡポリメラーゼが機能することができるｐＨにある。細胞溶解物のｐＨは、細胞溶解物を安定化溶液と混合することによって低下させることができる。安定化溶液は、本文書に別記する通りアルカリ性条件に曝露された細胞溶解物のｐＨを低下させることができる溶液を含む。
【０４３２】
細胞溶解物と混合する安定化溶液の量は、中性範囲（または他の希望のｐＨ値）へのｐＨの低下を生じる量であることができる。一般的に、この容量は細胞溶解物／安定化溶液混合物のｐＨの関数となる。したがって、細胞溶解物と混合すべき安定化溶液の量は、一般的に、細胞溶解物の容量、そのｐＨおよび緩衝能、および安定化緩衝液の酸濃度から決定することができる。たとえば、ｐＨを十分に低下させるためには、より弱い酸および／またはより低濃度の酸を含む安定化溶液に必要な容量よりも、より強い酸および／またはより高濃度の酸を含む安定化溶液のより少ない容量が必要となる。（希望のｐＨを生じるために）細胞溶解物が等しい容量の安定化溶液と混合されるように、安定化溶液を処方することができる。
【０４３３】
一部の実施形態では、安定化溶液は酸を含みうる。有用な酸は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、アセチルサリチル酸、アスコルビン酸、炭酸、クエン酸、ギ酸、硝酸、過塩素酸、ＨＦ、ＨＢｒ、ＨＩ、Ｈ２Ｓ、ＨＣＮ、ＨＳＣＮ、ＨＣｌＯ、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、および任意のカルボン酸（エタン酸、プロパン酸、ブタン酸、など、直鎖または分枝鎖カルボン酸の両方を含む）を含む。一部の実施形態では、安定化溶液は緩衝剤を含みうる。有用な緩衝剤は、トリス−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、「グッド（Ｇｏｏｄ）」緩衝剤（たとえばＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、およびＴＲＩＣＩＮＥ）、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、およびビス−トリスプロパンを含む。有用な安定化溶液の処方は、８００ｍＭトリス−ＨＣｌを含む安定化溶液；８００ｍＭトリス−ＨＣｌを含むｐＨ４．１の安定化溶液；および８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１から成る安定化溶液を含む。
【０４３４】
一部の実施形態では、安定化溶液は複数の酸性物質を含みうる。ここでは、酸性物質とは、溶液中に酸を形成する化合物、組成物または溶液である。一部の実施形態では、安定化溶液は複数の緩衝剤を含みうる。酸性緩衝剤とは、溶液中に酸を形成する緩衝剤である。一部の実施形態では、安定化溶液は１種類以上の酸、酸性物質、緩衝剤および緩衝試薬の組み合わせを含みうる。
【０４３５】
一部の実施形態では、細胞溶解物のｐＨは、約ｐＨ９．０以下へ、約ｐＨ８．５以下へ、約ｐＨ８．０以下へ、約ｐＨ７．５以下へ、約ｐＨ７．２以下へ、または約ｐＨ７．０以下へ低下させることができる。一部の実施形態では、細胞溶解物のｐＨは、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ７．２の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ７．５の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ８．０の範囲へ、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ８．５の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ７．２の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ７．５の範囲へ、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ８．０の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ７．２の範囲へ、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ７．５の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ７．２の範囲へ、約ｐＨ７．２ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ７．２ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ７．２ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ７．２ないし約ｐＨ７．０の範囲へ、約ｐＨ７．０ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ７．０ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、約ｐＨ７．０ないし約ｐＨ６．８の範囲へ、約ｐＨ６．８ないし約ｐＨ６．０の範囲へ、約ｐＨ６．８ないし約ｐＨ６．５の範囲へ、または約ｐＨ６．５ないし約ｐＨ６．０の範囲へ低下させることができる。一部の実施形態では、細胞溶解物のｐＨは、約ｐＨ６．０ないし約ｐＨ９．０の端点の任意の組み合わせを有する任意の範囲へ低下させることができる。そのような端点および範囲のすべては具体的におよび別々に検討される。
【０４３６】
一部の実施形態では、細胞は熱によって溶解されない。異なる条件下の異なる細胞は異なる温度で溶解することを当業者は理解し、およびそのため細胞が熱によって溶解されない温度および時間を決定することができる。一般的に、細胞は、使用するアルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こす温度を上回っておよびそのような時間、加熱に供されない。ここでは、相当な細胞溶解とは、アルカリ性条件に曝露された細胞の９０％以上の溶解をいう。顕著な細胞溶解とは、アルカリ性条件に曝露された細胞の５０％以上の溶解をいう。十分な細胞溶解とは、アルカリ性条件に曝露された細胞の、複数鎖置換増幅による増幅産物の検出可能な量の合成を可能にするのに十分な溶解をいう。一般的に、本開示の方法に用いられるアルカリ性条件は、十分な細胞溶解を引き起こしさえすればよい。当然、顕著なまたは相当な細胞溶解を引き起こすことができるアルカリ性条件は、本方法を実施する際に、顕著なまたは相当な細胞溶解を結果として生じる必要が無い。
【０４３７】
一部の実施形態では、細胞はその細胞が増殖する温度を相当にまたは顕著に上回る加熱に供されない。ここでは、細胞が増殖する温度とは、使用する種類の細胞が培養される標準的温度、または異なる標準的温度のうち最高のものをいう。動物細胞の場合には、細胞が増殖する温度とは、その動物の体温をいう。他の実施形態では、細胞は増幅反応（ゲノムが増幅される）の温度を相当にまたは顕著に上回る加熱に供されない。
【０４３８】
一部の実施形態では、細胞溶解物は、増幅反応前に精製に供されない。本開示の方法との関連において、精製とは一般的に、細胞溶解物中の他の物質からの核酸の分離をいう。複数置換増幅は精製されていないおよび部分精製された試料について実施することができることが見出されている。増幅反応は、精製されていない核酸を用いて効率的に実施することはできないと一般に考えられている。特に、ＰＣＲは夾雑物に対して非常に感受性が高い。
【０４３９】
精製の形式は、遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、沈澱、濾過、および透析を含む。部分精製された細胞溶解物は、遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、沈澱、濾過、および透析に供された細胞溶解物を含む。ここでは、他の物質からの核酸の分離とは、複製すべき核酸が、他の物質とは異なる容器に存在するようにする物理的分離をいう。精製は、すべての核酸の、すべての他の物質からの分離を必要としない。むしろ、必要なのは、一部の核酸の、一部の他の物質からの分離である。増幅すべき核酸との関連においてここでは、精製とは他の物質からの核酸の分離をいう。細胞溶解物との関連において、精製とは細胞溶解物中の他の物質からの核酸の分離をいう。ここでは、部分精製とは、核酸と混合している他の物質の、全部でなく一部からの、核酸の分離をいう。細胞溶解物との関連において、部分精製とは、細胞溶解物中の他の物質の、全部でなく一部からの、核酸の分離をいう。
【０４４０】
文脈に明らかにそうでないと示されない限り、精製の欠如、１種類以上の精製または分離操作または技術の欠如、または精製または１種類以上の精製または分離操作または技術の除外へのここでの言及は、細胞のアルカリ性条件への曝露（またはその結果）または細胞溶解物のｐＨの低下（またはその結果）を包含しない。すなわち、本開示の方法のアルカリ性条件およびｐＨ低下が「精製」または「分離」と見なしうる効果を生じる範囲で、そのような効果は、それらの語が細胞溶解物および安定化した細胞溶解物の処理および操作に関連して用いられる際（文脈に明らかにそうでないと示されない限り）精製および分離の定義から除外される。
【０４４１】
ここでは、相当な精製とは、核酸と混合している他の物質の少なくとも相当な部分からの核酸の分離をいう。細胞溶解物との関連において、相当な精製とは、細胞溶解物中の他の物質の少なくとも相当な部分からの核酸の分離をいう。相当な部分とは、含まれる他の物質の９０％をいう。精製の特定のレベルをパーセント精製（たとえば９５％精製および７０％精製）としていうことができる。パーセント精製とは、核酸と混合している他の物質の、少なくとも指定のパーセントの、核酸からの分離を結果として生じる精製をいう。
【０４４２】
増幅すべき核酸分子の変性は増幅技術において一般的である。これはゲノムＤＮＡを増幅する際に特にその通りである。特に、ＰＣＲは複数の変性サイクルを用いる。変性は、一般的に核酸鎖をプライマーに接触可能にするために用いられる。核酸分子、たとえばゲノムＤＮＡは、効率的な複数置換増幅のためには変性している必要が無い。変性段階および変性条件の除去は、増幅産物における配列偏りを低下させる（すなわち、増幅偏りを低下させる）といった追加の利点を有する。本開示の方法の好ましい形式では、核酸試料またはテンプレート核酸は変性条件に供されない、および／または変性条件は使用されない。
【０４４３】
本開示の方法の一部の形式では、核酸試料またはテンプレート核酸は熱変性条件に供されない、および／または熱変性段階は使用されない。本開示の方法の一部の形式では、核酸試料またはテンプレート核酸はアルカリ性変性条件に供されない、および／またはアルカリ性変性段階は使用されない。当然、試料調製（たとえば、細胞溶解および細胞抽出物の処理）は変性を生じると考えることができる条件を含みうる一方（たとえば、アルカリを用いた処理）、本開示の方法の一部の形式で除去された変性条件または段階とは、核酸鎖をプライマーに接触可能にすることを意図しおよびそのために用いられる変性段階または条件をいう。そのような変性は一般的には熱変性であるが、しかしまた化学変性といった他の形式の変性であることもできる。核酸試料またはテンプレート核酸が変性条件に供されない本開示の方法では、テンプレート鎖はプライマーに接触可能であることが理解される（増幅が起こるので）。しかし、テンプレート鎖は試料またはテンプレート核酸の一般的な変性を経て接触可能にされない。
【０４４４】
代替的に、核酸試料またはテンプレート核酸を変性条件に供しうる、および／または変性条件を使用しうる。本開示の方法の一部の形式では、核酸試料またはテンプレート核酸を熱変性条件に供しうる、および／または熱変性条件を使用しうる。本開示の方法の一部の形式では、核酸試料またはテンプレート核酸をアルカリ性変性条件に供しうる、および／またはアルカリ性変性条件を使用しうる。
【０４４５】
ＤＮＡ増幅手順の効率は、個々の遺伝子座に関してその遺伝子座のパーセント発現量（すなわち、遺伝子座発現量）として記載することができ、ここで細胞から精製された通りのゲノムＤＮＡ中の遺伝子座に関して遺伝子座発現量は１００％である。１０，０００倍増幅については、平均発現量頻度は、テンプレートの熱変性無しで増幅したＤＮＡ中の８遺伝子座に関して１４１％、およびテンプレートの熱変性ありで増幅したＤＮＡ中の８遺伝子座に関して３７％であった。熱変性段階の削除の結果として、増幅された遺伝子座に関して発現量頻度に３．８倍の増加を生じた。増幅偏りは、増幅されたＤＮＡの２つの試料間で、または、増幅されたＤＮＡの試料とそれが増幅された元のテンプレートＤＮＡとの間で計算することができる。偏りは、特定の遺伝子座に関するパーセント発現量（遺伝子座発現量）の値の間の比率である。最大偏りは、最高に発現された遺伝子座の、最低に発現された遺伝子座に対する比率である。１０，０００倍増幅については、最大増幅偏りは、テンプレートの熱変性無しで増幅したＤＮＡに関して２．８、およびテンプレートの熱変性ありで増幅したＤＮＡに関して５０．７であった。熱変性段階の削除の結果として、増幅された遺伝子座に関して最大偏りに１８倍の減少を生じた。
【０４４６】
本開示の方法の一形式では、少量の精製された２本鎖ヒトゲノムＤＮＡ（たとえば１ｎｇ）を、 ｃａｎｂｅ ｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ長さ６ ヌクレオチドの１または少数の エキソヌクレアーゼ− 耐性プライマーおよびφ２９ＤＮＡ ポリメラーゼと、ＤＮＡ合成に有利な条件下で混合することができる。たとえば、その混合物を単に３０℃にてインキュベートすることができ、すると複数置換増幅が起こる。このように、任意の１本鎖または２本鎖ＤＮＡを、何も追加の処理無しに用いることができ、本開示の方法を簡単な一段階手順としている。必要なＤＮＡテンプレートは非常に少ないため、本開示の方法の主な長所は、ＰＣＲといった他のＤＮＡ増幅手順を妨げるレベルの夾雑物を含む調製物からＤＮＡテンプレートを取ることができることである。ＭＤＡのためには、夾雑物が反応に干渉する濃度未満になるように試料を希釈することができる。本開示の方法は、たとえば、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、および羊水といった体液を含む、任意の種類の試料を用いて実施することができる（および上記の長所を達成できる）。
【０４４７】
本開示の方法において少量のＤＮＡテンプレートだけが必要であることは、本方法が非常に少量の試料からのＤＮＡ増幅に有用であることを意味する。特に、本開示の方法は、単一の細胞からＤＮＡを増幅するのに用いることができる。単一の細胞（または同様に少量の試料）から分析可能な量の核酸を得る能力は、調製、分析、および出生前診断のような診断手順に多数の用途を有する。本開示の方法による増幅が有用となる少量のＤＮＡしか含まない生物学的試料の他の例は、腫瘍または他の保存医学検体から切除した材料、針吸引生検、院内感染といった感染症から生じた臨床試料、法医学試料、または絶滅種の博物館標本である。
【０４４８】
より幅広くは、本開示の方法は、必要なＤＮＡの量が供給量よりも大きい用途に有用である。たとえば、チップハイブリダイゼーション技術によってＤＮＡを分析する手順は、典型的な量の血液試料から精製されうるＤＮＡの量によって制限される。結果として、多数のチップハイブリダイゼーション手順は、その高処理量手順用に十分な供給量の材料を作製するために、ＰＣＲを利用する。本開示の方法は、開始材料の遺伝子座発現量頻度を忠実に再現する増幅されたＤＮＡの豊富な量の作製に有用な技術を提示する。
【０４４９】
本開示の方法は、テンプレートＤＮＡの熱処理ありで実施される増幅と比較して遺伝子分析における性能が向上したＤＮＡ増幅産物を生じることができる。テンプレートの熱処理無しで生じた、より長いＤＮＡ産物は、サザンブロッティング、およびＲＦＬＰを用いた遺伝子分析で、より大きなＤＮＡ断片を与える。本開示の方法は、定量的ＰＣＲ分析の基質として用いる場合、テンプレートの熱処理ありで増幅したＤＮＡと比較して、遺伝子座発現量の損失の無いＤＮＡ増幅産物を生じる。本開示の方法は、８個の異なる遺伝子座間の発現量のばらつきが３．０未満で変動する低い増幅偏りを有するＤＮＡ増幅産物を生じる。対照的に、２種類のＰＣＲを基礎とする増幅法、ＰＥＰおよびＤＯＰ−ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ産物の増幅偏りは、２ないし６桁の間で変動する。
【０４５０】
本開示の方法の別の具体的な一形式は、熱処理段階の非存在下で、全血からまたは組織培養細胞から直接の、ゲノムＤＮＡの増幅を含む。 そのような増幅は、精製されたＤＮＡからと同一の効率で達成することができる。血液または細胞から直接に増幅されたＤＮＡは、精製されたヒトＤＮＡテンプレートから増幅されたＤＮＡと実質的に同一の遺伝子座発現量値を有しうる。全血中のヘムのような成分はＰＣＲを阻害し、および血液由来のＤＮＡがＰＣＲテンプレートとして使用可能になる前に精製段階の必要を生じさせるため、このことは、ＰＣＲといった他の増幅手順に対する長所を表す。
【０４５１】
Ｊ．増幅産物の検出
増幅の産物は、任意の核酸検出技術を用いて検出することができる。リアルタイム検出については、増幅産物および増幅の進行が増幅中に検出される。リアルタイム検出は、１種類以上の、または１または組み合わせの、蛍光変化プローブおよび蛍光変化プライマーを用いることによって有用に達成される。他の検出技術を、単独で、または、リアルタイム検出および／または検出蛍光変化プローブおよびプライマーを含む検出と組み合わせて使用することができる。核酸の検出については多数の技術が既知である。増幅された配列のヌクレオチド配列もまた、任意の適当な技術を用いて決定することができる。
【０４５２】
Ｋ．修飾および追加の操作
１．増幅産物の検出
増幅産物は、たとえば、下記に示す通り、一次標識化または二次標識化によって直接検出することができる。
【０４５３】
ｉ．一次標識化
一次標識化は、蛍光ヌクレオチド、ビオチニル化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン含有ヌクレオチド、またはブロモデオキシウリジンといった標識化部分を、鎖置換複製中に組み込むことから成る。たとえば、シアニン色素デオキシウリジンアナログ（ユー（Ｙｕ）他，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２： ３２２６−３２３２（１９９４））を、１００ヌクレオチド毎に４アナログの頻度で組み込むことができる。ｉｎ ｓｉｔｕ増幅された核酸を検出するための好ましい方法は、ＤＮＡを増幅中にＢｒｄＵｒｄで標識化すること、続いてビオチニル化抗ＢｒｄＵ抗体（ザイメッド・ラブズ社（ＺｙｍｅｄＬａｂｓ）、カリフォルニア州サンフランシスコ）を用いた組み込まれたＢｒｄＵの結合、その後にストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（ライフサイエンス社（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いたビオチン部分の結合、および最後にフルオレセイン−チラミド（デュポンデヌムール社医療品部門（ＤｕＰｏｎｔｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｅｐｔ．））を用いた蛍光の発色である。ｉｎ ｓｉｔｕ増幅された核酸を検出するための他の方法は、ＤＮＡを増幅中に５−メチルシトシンで標識化し、その後の抗体を用いた組み込まれた５−メチルシトシンの結合（サノ（Ｓａｎｏ）他，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ９５１： １５７−１６５ （１９８８） ）、またはＤＮＡを増幅中にアミノアリル−デオキシウリジンで標識化し、その後のオレゴングリーン（登録商標）色素（モレキュラー・プローブズ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ））を用いた組み込まれたアミノアリル−デオキシウリジンの結合（ヘネガリウ（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ）他，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８： ３４５−３４８ （２０００））を含む。 
【０４５４】
増幅された核酸を標識化するもう一つの方法は、５−（３−アミノアリル）−ｄＵＴＰ（ＡＡｄＵＴＰ）を核酸に増幅中に組み込み、続いて組み込まれたヌクレオチドを化学標識化することである。組み込まれた５−（３−アミノアリル）−デオキシウリジン（ＡＡｄＵ）は、アミン基と反応できる反応基を有する標識と結合させることができる。ＡＡｄＵＴＰはランガー（Ｌａｎｇｅｒ）他（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８：６６３３−３７に従って調製することができる。他の修飾ヌクレオチドを類似の方法に用いることができる。すなわち、最小の修飾を有する他の修飾ヌクレオチドを複製中に組み込み、および、組み込み後に標識化することができる。
【０４５５】
ＡＡｄＵＴＰへの付加に適した標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。適当な蛍光標識の例は、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンチン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、クォンタムダイ（ｑｕａｎｔｕｍｄｙｅ）（商標）のようなランタノイドイオンの巨大環式キレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体のような蛍光エネルギー転移色素、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７を含む。他の特異的蛍光標識の例は、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレキソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコフォアＦＦＧ溶液、ブランコフォアＳＶ、ＢｏｄｉｐｙＦ１、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルセインブルー、カルシウムグリーン、カルコフルオルＲＷ溶液、カルコフルオルホワイト、カルコフォアホワイトＡＢＴ溶液、カルコフォアホワイト標準溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、ＣＹ７、ダンス（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、ダンサ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンボロンジフルオリド、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、ユークリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導性蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレサミン、フラ−２、ジェナクリルブリリアントレッドＢ、ジェナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ジェナクリルピンク３Ｇ、ジェナクリルイエロー５ＧＦ、グロキザル酸、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、インド−１、イントラホワイトＣｆリキッド、リューコフォアＰＡＦ、リューコフォアＳＦ、リューコフォアＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ、ルシファーイエローＶＳ、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスティルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアーファストレッド、ヌクレアーイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラロスアニリン（フォイルゲン）、フォアワイトＡＲ溶液、フォアワイトＢＫＬ、フォアワイトＲｅｖ、フォアワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインデセンポントクロムブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエキストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スティルベンイソチオスルホン酸）、スティルベン、スナーフ１、スルホローダミンＢキャンＣ、スルホローダミンＧエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ、およびＸＲＩＴＣを含む。
【０４５６】
好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光団の吸収極大および放射極大はそれぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、したがってそれらの同時検出が可能である。フルオレセイン色素の他の例は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を含む。蛍光標識は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；モレキュラー・プローブズ社（オレゴン州ユージーン）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；およびリサーチ・オーガニクス社（オハイオ州クリーブランド）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を含むさまざまな販売者から入手可能である。
【０４５７】
一次標識化の有用な一形式は、増幅中の蛍光変化プライマーの使用である。蛍光変化プライマーは、プライマーおよび増幅された核酸の形態または立体構造における変化に基づき、蛍光強度または波長に変化を示す。ステム消光化プライマーは、標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識および消光部分を近接させるステム構造（分子内ステム構造または分子間ステム構造のどちらか）を形成するプライマーである。そのプライマーが相補的配列と結合する際、ステムが破壊され、消光部分はもう蛍光標識と近接せず、および蛍光が増大する。本開示の方法では、ステム消光化プライマーは核酸合成のためのプライマーとして用いられ、およびしたがって、合成されたかまたは増幅された核酸に組み込まれる。ステム消光化プライマーの例は、ペプチド核酸消光化プライマーおよびヘアピン消光化プライマーである。
【０４５８】
ペプチド核酸消光化プライマーは、ペプチド核酸消光物質またはペプチド核酸蛍光物質と結合しておりステム構造を形成するプライマーである。そのプライマーは蛍光標識または消光部分を含み、およびペプチド核酸消光物質またはペプチド核酸蛍光物質とそれぞれ結合している。このことによって蛍光標識が消光部分と近接する。プライマーが複製される際、ペプチド核酸が置換され、したがって蛍光標識が蛍光シグナルを生じることが可能になる。
【０４５９】
ヘアピン消光化プライマーは、相補的配列と結合していない場合に、標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識および消光部分を近接させるヘアピン構造（および、典型的には、ループ）を形成するプライマーである。プライマーが相補的配列と結合する際、ステムが破壊され、消光部分はもう蛍光標識と近接せず、および蛍光が増大する。ヘアピン消光化プライマーは典型的には核酸合成のためのプライマーとして用いられ、およびしたがって、合成されたかまたは増幅された核酸に組み込まれる。ヘアピン消光化プライマーの例は、アンプリフロール（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）プライマーおよびスコーピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プライマーである。
【０４６０】
切断活性化プライマーは、プライマーの切断によって蛍光が増大するプライマーである。一般的に、切断活性化プライマーは複製された鎖に組み込まれていておよびその後に切断される。切断活性化プライマーは、標識からの蛍光が消光されるように、近接した蛍光標識および消光部分を含みうる。プライマーが切断または消化される際（典型的にはポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって増幅中に）、消光部分はもう蛍光標識と近接せず、および蛍光が増大する。リトル（Ｌｉｔｔｌｅ）他，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：７７７−７８４ （１９９９）は、切断活性化プライマーの使用を記載する。切断活性化プライマーの使用は、本開示の方法においては好ましくない。
【０４６１】
ｉｉ．検出プローブを用いた二次標識化
二次標識化は、増幅された核酸を検出するための、検出プローブと呼ばれる適当な分子プローブの使用から成る。たとえば、プライマーは、非相補的部分に、検出タグと呼ばれる既知の任意の配列を含むように設計することができる。第２のハイブリダイゼーション段階を用いて、検出プローブをこれらの検出タグへ結合させることができる。検出プローブは、たとえば、酵素、蛍光部分、または放射性同位体を用いて上記の通り標識化することができる。プライマー当たり３個の検出タグ、および各検出プローブ当たり４個の蛍光部分を用いることによって、複製された鎖のそれぞれについて合計１２の蛍光シグナルを得ることができる。検出プローブは、通常のワトソン−クリック塩基対形成（または関連する代替法）を介したハイブリダイゼーションまたはアニーリングによって相互作用することができ、または、２本鎖標的と相互作用して三重らせんを形成しうる。そのような三重鎖形成検出プローブを、蛍光変化プローブの形でのような、他の検出プローブと同じ方法で使用することができる。
【０４６２】
二次標識化の有用な一形式は、増幅中または増幅後の、蛍光変化プローブおよびプライマーの使用である。ヘアピン消光化プローブは、標的配列と結合していない場合に、標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識および消光部分を近接させるヘアピン構造（および、典型的には、ループ）を形成するプローブである。プローブが標的配列と結合する際、ステムが破壊され、消光部分はもう蛍光標識と近接せず、および蛍光が増大する。ヘアピン消光化プローブの例は、分子ビーコン、蛍光三重オリゴ、およびＱＰＮＡプローブである。
【０４６３】
切断活性化プローブは、プローブの切断によって蛍光が増大するプローブである。切断活性化プローブは、標識からの蛍光が消光されるように、近接した蛍光標識および消光部分を含みうる。プローブが切断または消化される際（典型的にはポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって増幅中または増幅後に）、消光部分はもう蛍光標識と近接せず、および蛍光が増大する。ＴａｑＭａｎプローブは切断活性化プローブの一例である。
【０４６４】
切断消光化プローブは、プローブの切断によって蛍光が減少または変化するプローブである。切断消光化プローブは、受容体および供与体が近接している場合に供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移が受容体に蛍光を生じさせるように、受容体蛍光標識および供与体部分を含みうる。そのプローブはしたがって、たとえば、標的配列とハイブリダイズした際に蛍光を発する。プローブが切断または消化される際（典型的にはポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって増幅中または増幅後に）、供与体部分はもう受容体蛍光標識と近接せず、および受容体からの蛍光が減少する。供与体部分がそれ自体蛍光標識であるならば、それは受容体と近接していない場合にエネルギーを蛍光として放出することができる（典型的には受容体の蛍光とは異なる波長で）。全体としての効果はその結果、受容体蛍光の減少および供与体蛍光の増大となる。切断消光化プローブの場合の供与体蛍光は、受容体が消光部分でありおよび供与体が蛍光標識である切断活性化プローブによって生じた蛍光と同等である。切断可ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）プローブは切断消光化プローブの一例である。
【０４６５】
蛍光活性化プローブは、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションによって蛍光が増大または変化するプローブまたはプローブ対である。蛍光活性化プローブは、受容体および供与体が近接している際（プローブが標的配列とハイブリダイズする際）、供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移が受容体に蛍光を生じさせるように、受容体蛍光標識および供与体部分を含みうる。蛍光活性化プローブは典型的には、受容体および供与体が近接するように、隣接配列にハイブリダイズするよう設計されたプローブ対である。蛍光活性化プローブはまた、プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合には供与体および受容体は近接していないが、プローブが標的配列とハイブリダイズしている場合には供与体および受容体が近接させられる、供与体および受容体の両方を含む単一のプローブであることができる。これは、たとえば、供与体および受容体をプローブの反対端に配置し、および標的相補配列をプローブの各末端に配置し、ここで標的相補配列は標的配列中の隣接配列と相補的であることによって達成することができる。蛍光活性化プローブの供与体部分がそれ自体蛍光標識であるならば、それは受容体と近接していない場合に（すなわち、プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合に）エネルギーを蛍光として放出することができる（典型的には受容体の蛍光とは異なる波長で）。プローブが標的配列とハイブリダイズする際、全体としての効果はその結果、供与体蛍光の減少および受容体蛍光の増大となる。ＦＲＥＴプローブは蛍光活性化プローブの一例である。ステム消光化プライマー（たとえばペプチド核酸消光化プライマーおよびヘアピン消光化プライマー）を二次標識として用いることができる。
【０４６６】
ｉｉｉ．多重化およびハイブリダイゼーションアレイ検出
増幅された核酸の検出は、各組が異なる標的配列を増幅するために設計された異なるプライマーの組を用いることによって、多重化することができる。標的を見つけることができるプライマーだけが増幅産物を生じる。所定の増幅された核酸を固相検出器中の固定された位置に捕捉するためには２つの選択肢がある。１つはプライマーの非相補的部分内に独自のアドレスタグ配列を、それぞれ独自の組のプライマーについて含めることである。所定の組のプライマーを用いて増幅された核酸はその結果、特異的アドレスタグ配列に対応する配列を含む。第２のおよび好ましい選択肢は、標的配列中に存在する配列をアドレスタグとして用いることである。本開示の方法は、たとえば、異なる標的配列に向けられる異なる検出プローブの組を用いることによって、容易に多重化できる。異なる検出プローブを伴う異なる蛍光標識の使用は、異なる標的配列の特異的検出を可能にする。
【０４６７】
２．組み合わせ多色コード化
多重化、検出の一形式は、異なる波長で蛍光を発するかまたは色が異なる標識の組み合わせの使用を含む。ハイブリダイゼーションプローブの検出のための蛍光の長所の１つは、同一の試料中でいくつかの標的を同時に可視化できることである。組み合わせ戦略を用いて、分光学的に分離可能な蛍光団の数よりもずっと多くの標的を識別することができる。プローブ蛍光物質は全く無い （−）かまたは単位量で存在する（＋）ため、組み合わせ標識化は、プローブを多重化方法で標識化する最も簡単な方法を提供する；画像分析はしたがって、より自動化に適しており、および、蛍光物質の光褪色の差および励起源出力スペクトルの変更の作用といったいくつかの実験アーティファクトが回避される。組み合わせ標識化は、蛍光変化プローブおよびプライマーと共に用いることができる。
【０４６８】
標識の組み合わせが、異なる検出プローブ、およびその延長として、それらの検出プローブが結合している異なる標的分子を同定するためのコードを規定する。この標識化の仕組みを組み合わせ多色コード化（ＣＭＣ）という。そのようなコード化はスパイカー（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ）他，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ １２： ３６８−３７５ （１９９６）によって記載されている。ＣＭＣの使用は米国特許第６，１４３，４９５号明細書に記載されている。組み合わせた際に別々に検出することができる任意の数の標識を、組み合わせ多色コード化に用いることができる。２、３、４、５、または６種類の標識を組み合わせて用いるのが好ましい。６種類の標識を用いるのが非常に好ましい。使用する標識の数が、式２Ｎ−１に従って生じうる独自の標識組み合わせの数を規定し、ここでＮは標識の数である。この式によると、２種類の標識は３種類の標識組み合わせを生じ、３種類の標識は７種類の標識組み合わせを生じ、４種類の標識は１５種類の標識組み合わせを生じ、５種類の標識は３１種類の標識組み合わせを生じ、および６種類の標識は６３種類の標識組み合わせを生じる。
【０４６９】
組み合わせ多色コード化のためには、異なる検出プローブの一群を１つの組として使用する。その組に含まれる検出プローブの個々の種類が、蛍光標識の特異的および独自の組み合わせで標識化される。複数の標識が割り当てられた検出プローブについては、すべての必要な標識を用いて各検出プローブ分子を標識化することによって、標識化を達成できる。代替的に、所定の種類の検出プローブのプールを、必要な標識のうち１つを用いてそれぞれ標識化することができる。プールを合わせることによって、検出プローブは、群として、検出プローブのその種類に必要な標識の組み合わせを含む。各検出プローブが単一の標識で標識化されている場合、標識組み合わせはまた、異なる検出プローブと相補的な検出タグのコード化された組み合わせを有するプライマーを用いて作製することができる。この仕組みでは、プライマーは特異的標識コードに必要な標識の組み合わせを表す検出タグの組み合わせを含むことになる。さらなる説明は米国特許第６，１４３，４９５号明細書に記載されている。蛍光変化プローブを使用する場合、各プローブが単一の標識を有する検出プローブのプールの使用が好ましい。
【０４７０】
スパイカー（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ）他は、すべての可能な蛍光物質対の間の高度な識別を与える、スペクトル区間３５０〜７７０ｎｍにわたって間隔を開けた蛍光物質および対応する光学フィルターの組を記載する。この蛍光物質の組は、組み合わせ多色コード化に好ましく、４'−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７から成る。より少数の組み合わせが必要な場合は、この好ましい組の任意の部分集合もまた用いることができる。これらの蛍光物質の吸収極大および放射極大はそれぞれ：ＤＡＰＩ（３５０ｎｍ；４５６ｎｍ）、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｍｎ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）である。これらの蛍光物質の励起および放射スペクトル、吸光係数、および量子収量は、エルンスト（Ｅｒｎｓｔ）他，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１０： ３− １０ （１９８９）、ムジュムダール（Ｍｕｊｕｍｄａｒ）他，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １０： １１−１９ （１９８９）、ユー（Ｙｕ），Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２： ３２２６− ３２３２ （１９９４）、およびワゴナー（Ｗａｇｇｏｎｅｒ），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２４６： ３６２−３７３ （１９９５）によって記載されている。これらの蛍光物質はすべて、７５Ｗキセノンアークを用いて励起することができる。
【０４７１】
選択性を得るためには、５ないし１６ｎｍの範囲の帯域幅を有するフィルターが好ましい。シグナル識別を高めるためには、蛍光物質はそのスペクトル極大から遠い波長で励起および検出の両方をすることができる。放射帯域幅は可能な限り広くすることができる。冷却ＣＣＤカメラのような低ノイズ検出器のためには、励起帯域幅を限定することは、達成可能なシグナル対ノイズ比に及ぼす効果があまり無い。好ましい蛍光物質の組との使用のための好ましいフィルターの一覧が、スパイカー（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ）他の表１に記載されている。アークランプによって放射される赤外光が検出器に達するのを防ぐことが重要である；ＣＣＤチップはこの領域に極めて感受性が高い。この目的で、画質の損失を最小限にするため、適当なＩＲ遮断フィルターをＣＣＤウィンドウの直前に画像路に挿入することができる。画像分析ソフトウェアをその後に使用して、蛍光ドットを計数しおよびそのスペクトル特徴を分析することができる。
【０４７２】
ｉ．酵素結合検出
標識化ヌクレオチドの組み込みによって標識化された増幅された核酸は、確立された酵素結合検出系を用いて検出することができる。たとえば、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を用いたビオチンの組み込みによって標識化された増幅された核酸は、下記の通り検出することができる。核酸を、増幅された核酸中に存在する標的配列（またはその相補鎖）と相補的である相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（アドレスプローブ）とのハイブリダイゼーションによって、固相ガラス表面上に固定化する。ハイブリダイゼーション後に、そのスライドガラスを洗浄し、およびアルカリ性ホスファターゼ−ストレプトアビジン複合体（トロピックス社（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ））と接触させる。この酵素−ストレプトアビジン複合体は、増幅された核酸上のビオチン部分と結合する。スライドを再び洗浄して過剰の酵素複合体を除去し、および化学発光基質ＣＳＰＤ（トロピックス社）を加え、およびカバーグラス片で覆う。スライドを次いでバイオラッド蛍光画像処理装置（ＢｉｏｒａｄＦｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ）で画像化する。 
【０４７３】
３．リニア鎖置換増幅
標的配列のリニア増幅を結果として生じる、複数鎖置換増幅の一改変形式を実施することができる。この改変法はリニア鎖置換増幅（ＬＳＤＡ）と呼ばれ、および、すべてのプライマーが標的配列の同一の鎖と相補的である一組のプライマーを用いることによって達成される。ＬＳＤＡでは、ＭＳＤＡと同様に、プライマーの組が標的配列とハイブリダイズし、および鎖置換増幅が起こる。しかし、標的配列の鎖のうち一方だけが複製される。ＬＳＤＡは、新しい組のプライマーを標的配列へハイブリダイズさせるために、複製の各回の間に熱サイクル反応を必要とする。そのような熱サイクル反応はＰＣＲに用いられるものと同様である。リニア、または単一プライマーの、ＰＣＲとは異なり、しかし、ＬＳＤＡにおける複製の各回は標的配列の複数コピーを結果として生じる。使用する各プライマーについて１コピーが作られる。したがって、２０種類のプライマーがＬＳＤＡに用いられる場合、標的配列の２０コピーが複製の各サイクルに作られる。
【０４７４】
ＭＳＤＡおよびＷＧＳＤＡを用いて増幅されたＤＮＡを、転写によってさらに増幅することができる。このために、プロモーター配列を、鎖置換増幅に用いられるプライマーの非相補的部分中に、またはＭＳＤＡ−ＣＤのためにＤＮＡを連結するリンカー配列中に、含めることができる。
【０４７５】
４．逆転写複数置換増幅
複数置換増幅を、ＲＮＡについて、またはＲＮＡから逆転写されたＤＮＡ鎖について実施することができる。逆転写複数置換増幅（ＲＴ−ＭＤＡ）と呼ばれる、本開示の方法の有用な一形式は、ＲＮＡを逆転写すること、そのＲＮＡの除去（好ましくは、ＲＮＡｓｅＨのようなＲＮＡ特異的ヌクレアーゼを用いたヌクレアーゼ消化によって）、および逆転写されたＤＮＡの複数置換増幅を含む。ＲＴ−ＭＤＡは、２本鎖ｃＤＮＡのどちらかを用いて、または第１のｃＤＮＡ鎖だけを用いて、実施することができる。後者の場合には、第２のｃＤＮＡ鎖を合成する必要は無く、および好ましくは合成しない。ＲＴ−ＭＤＡは、ｍＲＮＡの定量的分析、または任意の他の目的のためのｍＲＮＡ配列の一般的増幅に有用である。
【０４７６】
５．反復複数置換増幅
本開示の複数置換増幅操作はまた、連続的に組み合わせることができる。たとえば、ＭＤＡの産物はそれ自体を別の複数置換増幅で増幅することができる。これをここでは反復複数置換増幅（ＲＭＤＡ）という。これは、たとえば、ＭＤＡ後に複製された鎖を希釈し、および、それらを新しいＭＤＡに供することによって達成できる。これを１回以上反復することができる。ＭＤＡの各回は増幅を増大させる。ＷＧＳＤＡおよび特定の配列に対するＭＳＤＡといった異なる形式のＭＤＡを組み合わせることができる。一般的に、反復ＭＤＡは、まず一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることによって達成できる。標的配列の複製は結果として複製された鎖を生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも一方が、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される；次いで、複製された鎖を希釈し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および希釈した複製された鎖を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下でその複製された鎖をインキュベートする。標的配列の複製は、追加の複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、追加の複製された鎖のうち少なくとも一方が、別の追加の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。本方法のこの形式は、下記の操作を１回以上実施することによって延長できる：追加の複製された鎖を希釈し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および希釈した複製された鎖を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下でその複製された鎖をインキュベートする。標的配列の複製は、追加の複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、追加の複製された鎖のうち少なくとも一方が、別の追加の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０４７７】
６．複数置換増幅の産物の使用
本開示の方法を用いて作製された核酸は、任意の目的に用いることができる。たとえば、増幅された核酸を分析して（たとえば配列決定またはプローブハイブリダイゼーションによって）、増幅された配列の特徴または特定の配列の存在または非存在を決定することができる。増幅された核酸はまた、測定または他の方法のための試薬として用いることができる。たとえば、本開示の方法で作製された核酸を、基材へ結合または接着することができる。結果として生じる固定化核酸は、試料中の配列のプローブまたはインデックスとして用いることができる。本開示の方法で作製された核酸は、任意の適当な方法で、基材へ結合または接着することができる。たとえば、修飾ヌクレオチドを、鎖置換複製によって作製された核酸の３’末端へ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて付加し、およびその修飾ヌクレオチドを基材または担体と反応させ、それによって核酸を基材または担体へ結合させることにより、複数鎖置換によって生成された核酸を結合させることができる。
【０４７８】
本開示の方法で作製された核酸はまた、プローブまたはハイブリダイゼーションパートナーとして用いることができる。たとえば、目的の配列を本開示の方法で増幅し、およびすぐ使えるプローブの起源を与えることができる。複製された鎖（本開示の方法で作製された）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用の前に切断することができる。たとえば、複製された鎖はＤＮＡｓｅＩを用いて切断することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、本開示の方法で作製された核酸の標識化に関して本文書に別に記載する通り、標識化することができる。
【０４７９】
本開示の方法で作製された核酸はまた、試料の対または組のうち１つだけに存在する配列を特定するための減算ハイブリダイゼーションに用いることができる。たとえば、異なる試料から増幅されたｃＤＮＡをアニーリングさせ、結果として生じる２本鎖物質を１本鎖物質から分離することができる。ハイブリダイズしていない配列は、試料のうちの１つで発現されているが他では発現されていない配列を示す。
【０４８０】
具体的実施形態
ゲノムを増幅する方法であって単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、および、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含む方法が開示される。プライマーは特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料はゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は結果としてゲノム核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じる。
【０４８１】
ゲノムは、真核ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、脊椎動物ゲノム、魚類ゲノム、哺乳類ゲノム、ヒトゲノム、微生物ゲノムまたはウイルスゲノムであることができる。増幅偏りはゲノム核酸試料中の少なくとも１０個の核酸配列に関して２０倍未満であることができる。増幅偏りはゲノム核酸試料中の少なくとも１０個の核酸配列に関して１０倍未満であることができる。プライマーは３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、または３０ヌクレオチドの長さを有する。
【０４８２】
プライマーは、４ヌクレオチド未満、５ヌクレオチド未満、６ヌクレオチド未満、７ヌクレオチド未満、８ヌクレオチド未満、９ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満、１１ヌクレオチド未満、１２ヌクレオチド未満、１３ヌクレオチド未満、１４ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、１６ヌクレオチド未満、１７ヌクレオチド未満、１８ヌクレオチド未満、１９ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、２１ヌクレオチド未満、２２ヌクレオチド未満、２３ヌクレオチド未満、２４ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２６ヌクレオチド未満、２７ヌクレオチド未満、２８ヌクレオチド未満、２９ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、または３１ヌクレオチド未満の長さを有しうる。
【０４８３】
ゲノム核酸試料は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃にてインキュベートすることができる。
【０４８４】
ゲノム核酸試料は、２１℃未満、２２℃未満、２３℃未満、２４℃未満、２５℃未満、２６℃未満、２７℃未満、２８℃未満、２９℃未満、３０℃未満、３１℃未満、３２℃未満、３３℃未満、３４℃未満、３５℃未満、３６℃未満、３７℃未満、３８℃未満、３９℃未満、４０℃未満、４１℃未満、４２℃未満、４３℃未満、４４℃未満、４５℃未満、４６℃未満、４７℃未満、４８℃未満、４９℃未満、５０℃未満、５１℃未満、５２℃未満、５３℃未満、５４℃未満、５５℃未満、５６℃未満、５７℃未満、５８℃未満、５９℃未満、６０℃未満、６１℃未満、６２℃未満、６３℃未満、６４℃未満、６５℃未満、６６℃未満、６７℃未満、６８℃未満、６９℃未満、７０℃未満、７１℃未満、７２℃未満、７３℃未満、７４℃未満、７５℃未満、７６℃未満、７７℃未満、７８℃未満、７９℃未満、または８０℃未満にてインキュベートすることができる。
【０４８５】
ゲノム核酸試料は少なくとも１×１０３ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、ゲノム核酸試料は少なくとも１×１０４ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、ゲノム核酸試料は少なくとも１×１０５ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、ゲノム核酸試料は少なくとも１×１０６ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、ゲノム核酸試料は少なくとも１×１０７ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、ゲノム核酸試料は少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、またはゲノム核酸試料は少なくとも１×１０９ヌクレオチドの配列複雑性を有しうる。
【０４８６】
プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびゲノム核酸試料は、１種類の追加のプライマーと、２種類の追加のプライマーと、３種類の追加のプライマーと、４種類の追加のプライマーと、５種類の追加のプライマーと、６種類の追加のプライマーと、７種類の追加のプライマーと、８種類の追加のプライマーと、９種類の追加のプライマーと、１０種類の追加のプライマーと、１１種類の追加のプライマーと、１２種類の追加のプライマーと、１３種類の追加のプライマーと、１４種類の追加のプライマーと、１５種類の追加のプライマーと、１６種類の追加のプライマーと、１７種類の追加のプライマーと、１８種類の追加のプライマーと、１９種類の追加のプライマーと、２０種類の追加のプライマーと、２１種類の追加のプライマーと、２２種類の追加のプライマーと、２３種類の追加のプライマーと、２４種類の追加のプライマーと、２５種類の追加のプライマーと、２６種類の追加のプライマーと、２７種類の追加のプライマーと、２８種類の追加のプライマーと、２９種類の追加のプライマーと、３０種類の追加のプライマーと、３１種類の追加のプライマーと、３２種類の追加のプライマーと、３３種類の追加のプライマーと、３４種類の追加のプライマーと、３５種類の追加のプライマーと、３６種類の追加のプライマーと、３７種類の追加のプライマーと、３８種類の追加のプライマーと、３９種類の追加のプライマーと、４０種類の追加のプライマーと、４１種類の追加のプライマーと、４２種類の追加のプライマーと、４３種類の追加のプライマーと、４４種類の追加のプライマーと、４５種類の追加のプライマーと、４６種類の追加のプライマーと、４７種類の追加のプライマーと、４８種類の追加のプライマーと、４９種類の追加のプライマーと、５０種類の追加のプライマーと、５１種類の追加のプライマーと、５２種類の追加のプライマーと、５３種類の追加のプライマーと、５４種類の追加のプライマーと、５５種類の追加のプライマーと、５６種類の追加のプライマーと、５７種類の追加のプライマーと、５８種類の追加のプライマーと、５９種類の追加のプライマーと、６０種類の追加のプライマーと、６１種類の追加のプライマーと、６２種類の追加のプライマーと、６３種類の追加のプライマーと、７５種類の追加のプライマーと、１００種類の追加のプライマーと、１５０種類の追加のプライマーと、２００種類の追加のプライマーと、３００種類の追加のプライマーと、４００種類の追加のプライマーと、５００種類の追加のプライマーと、７５０種類の追加のプライマーと、または１，０００種類の追加のプライマーと接触させられ、各プライマーは異なる特異的ヌクレオチド配列を有しうる。
【０４８７】
プライマーはすべて同一の長さである。
【０４８８】
プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびゲノム核酸試料は、２種類未満の追加のプライマーと、３種類未満の追加のプライマーと、４種類未満の追加のプライマーと、５種類未満の追加のプライマーと、６種類未満の追加のプライマーと、７種類未満の追加のプライマーと、８種類未満の追加のプライマーと、９種類未満の追加のプライマーと、１０種類未満の追加のプライマーと、１１種類未満の追加のプライマーと、１２種類未満の追加のプライマーと、１３種類未満の追加のプライマーと、１４種類未満の追加のプライマーと、１５種類未満の追加のプライマーと、１６種類未満の追加のプライマーと、１７種類未満の追加のプライマーと、１８種類未満の追加のプライマーと、１９種類未満の追加のプライマーと、２０種類未満の追加のプライマーと、２１種類未満の追加のプライマーと、２２種類未満の追加のプライマーと、２３種類未満の追加のプライマーと、２４種類未満の追加のプライマーと、２５種類未満の追加のプライマーと、２６種類未満の追加のプライマーと、２７種類未満の追加のプライマーと、２８種類未満の追加のプライマーと、２９種類未満の追加のプライマーと、３０種類未満の追加のプライマーと、３１種類未満の追加のプライマーと、３２種類未満の追加のプライマーと、３３種類未満の追加のプライマーと、３４種類未満の追加のプライマーと、３５種類未満の追加のプライマーと、３６種類未満の追加のプライマーと、３７種類未満の追加のプライマーと、３８種類未満の追加のプライマーと、３９種類未満の追加のプライマーと、４０種類未満の追加のプライマーと、４１種類未満の追加のプライマーと、４２種類未満の追加のプライマーと、４３種類未満の追加のプライマーと、４４種類未満の追加のプライマーと、４５種類未満の追加のプライマーと、４６種類未満の追加のプライマーと、４７種類未満の追加のプライマーと、４８種類未満の追加のプライマーと、４９種類未満の追加のプライマーと、５０種類未満の追加のプライマーと、５１種類未満の追加のプライマーと、５２種類未満の追加のプライマーと、５３種類未満の追加のプライマーと、５４種類未満の追加のプライマーと、５５種類未満の追加のプライマーと、５６種類未満の追加のプライマーと、５７種類未満の追加のプライマーと、５８種類未満の追加のプライマーと、５９種類未満の追加のプライマーと、６０種類未満の追加のプライマーと、６１種類未満の追加のプライマーと、６２種類未満の追加のプライマーと、６３種類未満の追加のプライマーと、６４種類未満の追加のプライマーと、７５種類未満の追加のプライマーと、１００種類未満の追加のプライマーと、１５０種類未満の追加のプライマーと、２００種類未満の追加のプライマーと、３００種類未満の追加のプライマーと、４００種類未満の追加のプライマーと、５００種類未満の追加のプライマーと、７５０種類未満の追加のプライマーと、または１，０００種類未満の追加のプライマーと接触させられ、各プライマーは異なる特異的ヌクレオチド配列を有しうる。
【０４８９】
各プライマーは配列ＡＧＴＧＧＧまたはＡＧＡＧＡＧのうち異なる１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＣＣＧＧ、ＡＧＴＡＧＧ、またはＡＧＴＴＧＧのうち異なる１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＧＣＧＧ、ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、またはＡＧＴＧＡＧのうち異なる１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＴＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうち異なる１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうち異なる１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＴＡＧＧ、ＡＧＧＴＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＡＣＡＧ、またはＡＧＴＧＡＧのうち異なる１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＧＡＧＧ、ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＣＧＡＧのうち異なる１つを有しうる。各プライマーは配列ＣＧＧＴＧＧ、ＴＣＡＣＧＣ、ＣＧＡＧＣＧ、ＧＣＧＴＧＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＡＡＴＣＧＣ、ＣＧＧＡＧＧ、ＣＣＧＡＧＡ、ＧＡＴＣＧＣ、ＡＧＡＧＣＧ、ＡＧＣＧＡＧ、またはＡＣＴＣＣＧのうち異なる１つを有しうる。
【０４９０】
各プライマーは配列ＡＧＴＧＧＧまたはＡＧＡＧＡＧのうち１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＣＣＧＧ、ＡＧＴＡＧＧ、またはＡＧＴＴＧＧのうち１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＧＣＧＧ、ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、またはＡＧＴＧＡＧのうち１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＴＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうち１つを有しうる。各プライマーは配列ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうち１つを有しうる。各プライマーは配列ＣＧＧＴＧＧ、ＴＣＡＣＧＣ、ＣＧＡＧＣＧ、ＧＣＧＴＧＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＡＡＴＣＧＣ、ＣＧＧＡＧＧ、ＣＣＧＡＧＡ、ＧＡＴＣＧＣ、ＡＧＡＧＣＧ、ＡＧＣＧＡＧ、またはＡＣＴＣＣＧのうち１つを有しうる。
【０４９１】
プライマーは反復配列中の配列と相補的であることができる。
【０４９２】
反復配列は、マイクロサテライト配列、ミニサテライト配列、サテライト配列、トランスポゾン配列、リボソームＲＮＡ配列、短い核散在配列（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｌｅｍｅｎｔ （ＳＩＮＥ））、または長い核散在配列（ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＬＩＮＥ）であることができる。プライマーは機能共通配列中の配列と相補的であることができる。機能共通配列はプロモーター配列、エンハンサー配列、サイレンサー配列、上流調節配列、転写終止部位配列、トランスポゾン調節配列、リボソームＲＮＡ調節配列、またはポリアデニル化部位配列であることができる。機能共通配列は微生物プロモーター配列、微生物エンハンサー配列、微生物サイレンサー配列、微生物上流調節配列、微生物転写終止部位配列、微生物トランスポゾン調節配列、微生物リボソームＲＮＡ調節配列、または微生物ポリアデニル化部位配列であることができる。
【０４９３】
プライマーは広カバー率プライマーであることができる。プライマーは、平均して、５，０００ヌクレオチド以下毎、４，０００ヌクレオチド以下毎、３，０００ヌクレオチド以下毎、２，５００ヌクレオチド以下毎、２，０００ヌクレオチド以下毎、１，５００ヌクレオチド以下毎、１，０００ヌクレオチド以下毎、９００ヌクレオチド以下毎、８００ヌクレオチド以下毎、７００ヌクレオチド以下毎、６００ヌクレオチド以下毎、５００ヌクレオチド以下毎、４００ヌクレオチド以下毎、３００ヌクレオチド以下毎、２００ヌクレオチド以下毎、１００ヌクレオチド以下毎、または５０ヌクレオチド以下毎に、ゲノム核酸試料の核酸分子中に存在する配列と相補的であることができる。
【０４９４】
プライマーは、ゲノム核酸試料のＧ＋Ｃ比率の２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、または１％以内のＧ＋Ｃ比率を有することができる。プライマーは、使用した種類のゲノム核酸試料について、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１０％の遺伝子座発現量を生じる。プライマーは、使用した種類のゲノム核酸試料について、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座発現量を生じる。プライマーは、使用した種類のゲノム核酸試料について、少なくとも１０％の遺伝子座発現量を、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じる。
【０４９５】
プライマーは、使用した種類のゲノム核酸試料について、５０倍未満の増幅偏りを生じる。プライマーは、使用した種類のゲノム核酸試料について、４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、または４倍未満の増幅偏りを生じる。プライマーは、使用した種類のゲノム核酸試料について、５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも６個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じる。
【０４９６】
プライマーは内部相補的３’末端を有しない。プライマーは核酸試料の非存在下で顕著な複製産物を生じない。ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。ゲノム核酸試料を変性条件に供する必要は無い。ゲノム核酸試料を熱変性条件に供する必要は無い。ゲノム核酸試料をアルカリ性変性条件に供する必要は無い。ゲノム核酸試料を変性条件に供することができる。ゲノム核酸試料を熱変性条件に供することができる。ゲノム核酸試料をアルカリ性変性条件に供することができる。
【０４９７】
ゲノム核酸試料中の核酸はゲノム核酸試料中の他の物質から分離されない。ゲノム核酸試料が粗細胞溶解物であることができる。ゲノム核酸試料は、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含むことができ、および細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化した細胞溶解物を生じることによって調製することができる。細胞を溶解溶液と混合することによって細胞はアルカリ性条件に曝露される。溶解溶液は塩基を含むことができる。細胞溶解物を安定化溶液と混合することによって細胞溶解物のｐＨを低下させることができる。安定化溶液は緩衝剤を含むことができる。安定化溶液は酸を含むことができる。
【０４９８】
細胞溶解物および安定化された細胞溶解物中の核酸は、細胞溶解物中の他の物質から分離されない。細胞溶解物および安定化された細胞溶解物は、インキュベート前に精製に供されない。細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、または両方は、インキュベート前に部分精製に供される。細胞溶解物および安定化された細胞溶解物は、インキュベート前に相当な精製に供されない。インキュベートは実質的に等温であることができる。細胞溶解物も安定化された細胞溶解物もインキュベートの温度を実質的に上回って加熱できない。細胞溶解物も安定化された細胞溶解物もインキュベートの温度を上回る実質的な加熱に供することができない。細胞はインキュベートの温度を実質的に上回って加熱されない。細胞はインキュベートの温度を上回る実質的な加熱に供されない。細胞は、その細胞が増殖する温度を実質的に上回って加熱されない。細胞は、その細胞が増殖する温度を上回る実質的な加熱に供されない
【０４９９】
細胞溶解物も安定化された細胞溶解物も、ゲノムの明らかな変性を引き起こしうる温度を上回っておよびそのような時間にわたって加熱できない。細胞溶解物も安定化された細胞溶解物も、ゲノムの明らかな変性を引き起こしうる温度を上回るおよびそのような時間にわたる加熱に供することができない。細胞は熱によって溶解されない。細胞は、アルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こす温度を上回っておよびそのような時間にわたって加熱されない。細胞は、アルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こす温度を上回るおよびそのような時間にわたる加熱に供されない。
【０５００】
本方法はさらに、プライマー、ゲノム核酸試料およびＤＮＡポリメラーゼを接触させる前に、ゲノム核酸試料中の核酸分子の相当な変性を促進する条件にゲノム核酸試料を曝露し、それによって変性したゲノム核酸試料を生じ、および条件をゲノム核酸試料中の核酸分子の相当な変性を促進しない条件に変えて変性したゲノム核酸試料を生じることを含みうる。
【０５０１】
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、増幅された核酸分子について、ゲノム核酸試料における平均断片長よりも長い平均断片長を結果として生じる。ゲノム核酸試料、変性したゲノム核酸試料、または両方はイオン条件に曝露される。ゲノム核酸試料を変性溶液と混合することによっておよびゲノム核酸試料中の核酸分子を相当に変性させる温度におよびそのような時間ゲノム核酸試料を加熱することによって、相当な変性を促進する条件にゲノム核酸試料を曝露することができる。
【０５０２】
プライマーが３’−５’エキソヌクレアーゼに対して耐性となりうるように、プライマーは少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。プライマーは長さ６ヌクレオチドであることができ、プライマーがヌクレアーゼ耐性となりうるようにプライマーは少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。核酸分子の複製を促進する条件は実質的に等温である。核酸分子の複製を促進する条件に熱サイクル反応は関係しない。核酸分子の複製を促進する条件は熱サイクル反応を含まない。プライマーはヌクレオチドを含むことができ、そのヌクレオチドの１種類以上はリボヌクレオチドである。そのヌクレオチドの約１０％ないし約５０％はリボヌクレオチドである。そのヌクレオチドの約５０％以上はリボヌクレオチドである。そのヌクレオチドの全部はリボヌクレオチドである。
【０５０３】
プライマーはヌクレオチドを含むことができ、そのヌクレオチドの１種類以上は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。そのヌクレオチドの約１０％ないし約５０％は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。そのヌクレオチドの約５０％以上は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。そのヌクレオチドの全部は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。プライマーはヌクレオチドを含むことができ、そのヌクレオチドはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物である。プライマーはヌクレオチドを含むことができ、そのヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物である。ゲノム核酸試料は血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、またはその組み合わせであることができる。
【０５０４】
ゲノム核酸試料は粗細胞溶解物であることができる。ゲノム核酸試料を細胞溶解を超えて処理する必要は無い。増幅された核酸分子は分析される。増幅された核酸分子は１種類以上のＤＮＡチップを用いて分析される。増幅された核酸分子はハイブリダイゼーションによって分析される。増幅された核酸分子は核酸配列決定によって分析される。増幅された核酸分子はその分析の前、後、または前および後の両方に保存される。
【０５０５】
本方法はさらに、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および第２のゲノム核酸試料を接触させ、および第２のゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で第２のゲノム核酸試料をインキュベートすることを含むことができ、第２のゲノム核酸試料はゲノムの全部または相当な部分を含むことができ、第２のゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は鎖置換複製によって進行し、第２のゲノム核酸試料中の核酸分子の複製の結果として第２のゲノム核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製が生じる。
【０５０６】
第２のゲノム核酸試料は、第１のゲノム核酸試料と同一の種類の生物に由来する試料であることができる。第２のゲノム核酸試料は、第１のゲノム核酸試料と同一の種類の組織に由来する試料であることができる。第２のゲノム核酸試料は、第１のゲノム核酸試料と同一の生物に由来する試料であることができる。第２のゲノム核酸試料は、第１のゲノム核酸試料とは異なる時に得ることができる。第２のゲノム核酸試料は、第１のゲノム核酸試料とは異なる生物に由来する試料であることができる。第２のゲノム核酸試料は、第１のゲノム核酸試料とは異なる種類の組織に由来する試料であることができる。
【０５０７】
第２のゲノム核酸試料は、第１のゲノム核酸試料とは異なる種の生物に由来する試料であることができる。第２のゲノム核酸試料は、第１のゲノム核酸試料とは異なる系統の生物に由来する試料であることができる。第２のゲノム核酸試料は、第１のゲノム核酸試料とは異なる細胞区画に由来する試料であることができる。
【０５０８】
ゲノムを増幅する方法であって、１，０００種類未満のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、各プライマーが異なる特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じる方法もまた開示される。
【０５０９】
ＤＮＡポリメラーゼおよびゲノム核酸試料は、２種類未満のプライマーと、３種類未満のプライマーと、４種類未満のプライマーと、５種類未満のプライマーと、６種類未満のプライマーと、７種類未満のプライマーと、８種類未満のプライマーと、９種類未満のプライマーと、１０種類未満のプライマーと、１１種類未満のプライマーと、１２種類未満のプライマーと、１３種類未満のプライマーと、１４種類未満のプライマーと、１５種類未満のプライマーと、１６種類未満のプライマーと、１７種類未満のプライマーと、１８種類未満のプライマーと、１９種類未満のプライマーと、２０種類未満のプライマーと、２１種類未満のプライマーと、２２種類未満のプライマーと、２３種類未満のプライマーと、２４種類未満のプライマーと、２５種類未満のプライマーと、２６種類未満のプライマーと、２７種類未満のプライマーと、２８種類未満のプライマーと、２９種類未満のプライマーと、３０種類未満のプライマーと、３１種類未満のプライマーと、３２種類未満のプライマーと、３３種類未満のプライマーと、３４種類未満のプライマーと、３５種類未満のプライマーと、３６種類未満のプライマーと、３７種類未満のプライマーと、３８種類未満のプライマーと、３９種類未満のプライマーと、４０種類未満のプライマーと、４１種類未満のプライマーと、４２種類未満のプライマーと、４３種類未満のプライマーと、４４種類未満のプライマーと、４５種類未満のプライマーと、４６種類未満のプライマーと、４７種類未満のプライマーと、４８種類未満のプライマーと、４９種類未満のプライマーと、５０種類未満のプライマーと、５１種類未満のプライマーと、５２種類未満のプライマーと、５３種類未満のプライマーと、５４種類未満のプライマーと、５５種類未満のプライマーと、５６種類未満のプライマーと、５７種類未満のプライマーと、５８種類未満のプライマーと、５９種類未満のプライマーと、６０種類未満のプライマーと、６１種類未満のプライマーと、６２種類未満のプライマーと、６３種類未満のプライマーと、６４種類未満のプライマーと、７５種類未満のプライマーと、１００種類未満のプライマーと、１５０種類未満のプライマーと、２００種類未満のプライマーと、３００種類未満のプライマーと、４００種類未満のプライマーと、５００種類未満のプライマーと、７５０種類未満のプライマーと、または１，０００種類未満のプライマーと接触させられる。
【０５１０】
明らかな配列複雑性を有する核酸試料を増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、核酸試料が少なくとも１×１０４ヌクレオチドの配列複雑性を有し、核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、核酸試料中の核酸分子の複製が結果として核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じる方法もまた開示される。
【０５１１】
核酸試料は少なくとも１×１０５ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、核酸試料は少なくとも１×１０６ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、核酸試料は少なくとも１×１０７ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、核酸試料は少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有しうるか、または核酸試料は少なくとも１×１０９ヌクレオチドの配列複雑性を有しうる。核酸試料はゲノム、染色体、染色体断片、人工染色体、酵母人工染色体、細菌人工染色体、コスミド、または組み合わせであるかまたはそれに由来する。
【０５１２】
核酸試料は血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、またはその組み合わせであるかまたはそれに由来する。核酸試料は真核生物、植物、および動物、海産動物、脊椎動物、哺乳類、またはヒトであるかまたはそれに由来する。
【０５１３】
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０９ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．０１％の複製を生じる方法もまた開示される。
【０５１４】
そのゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．１％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じる。
【０５１５】
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．１％の複製を生じる方法もまた開示される。
【０５１６】
そのゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じる。
【０５１７】
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０７ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％の複製を生じる方法もまた開示される。
【０５１８】
そのゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じる。
【０５１９】
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０６ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％の複製を生じる方法もまた開示される。
【０５２０】
そのゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じる。
【０５２１】
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０５ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％の複製を生じる方法もまた開示される。
【０５２２】
そのゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じる。
【０５２３】
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果として少なくとも１０％の遺伝子座発現量を、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じる方法もまた開示される。そのゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座発現量を、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じる。
【０５２４】
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として少なくとも１０％の遺伝子座発現量を、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じる。
【０５２５】
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として５０倍未満の増幅偏りを生じる。ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、または４倍未満の増幅偏りを生じる。
【０５２６】
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じる。
【０５２７】
高い配列複雑性の核酸試料を増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、核酸試料が少なくとも１×１０３ヌクレオチドの配列複雑性を有し、核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、核酸試料中の核酸分子の複製が結果として少なくとも１０％の配列発現量を、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じる方法もまた開示される。
【０５２８】
核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の配列発現量を、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じる。
【０５２９】
核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として少なくとも１０％の配列発現量を、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じる。
【０５３０】
核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として５０倍未満の増幅偏りを生じる。核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、または４倍未満の増幅偏りを生じる。
【０５３１】
核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる標的配列に関して、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じる。
【０５３２】
ゲノムを増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、そのプライマーの組が１種類以上の選択プライマーを含み、各選択プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の全部または相当な部分の複製を生じ、その組に含まれる各選択プライマーが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に選択核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％の複製を生じることができ、選択核酸試料が少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有する方法もまた開示される。
【０５３３】
プライマーの組はさらに少なくとも１種類の追加のプライマーを含むことができる。プライマーの組は少なくとも１種類の非選択プライマーをさらに含むことができ、その非選択プライマーは、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に選択核酸試料中の核酸配列の８０％未満の複製を生じる。
【０５３４】
ゲノムを増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、そのプライマーの組が１種類以上の選択プライマーを含み、各選択プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じ、その組に含まれる各選択プライマーが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に、２０倍未満の増幅偏りを、選択核酸試料中の少なくとも１０個の核酸配列に関して生じることができ、選択核酸試料が少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有する方法もまた開示される。
【０５３５】
ゲノムを増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、そのプライマーの組が１種類以上の選択プライマーを含み、各選択プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じ、その組に含まれる各選択プライマーが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に、少なくとも１０％の配列発現量を、選択核酸試料中の少なくとも１０個の核酸配列に関して生じることができ、選択核酸試料が少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有する方法もまた開示される。
【０５３６】
核酸を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含み、そのプライマーの組が１種類以上の選択プライマーを含み、各選択プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、核酸試料中の核酸分子の複製が結果として核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じ、その組に含まれる各選択プライマーが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に、選択核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％の複製を生じることができ、選択核酸試料が少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有する方法もまた開示される。
【０５３７】
プライマーの組はさらに少なくとも１種類の追加のプライマーを含むことができる。プライマーの組は少なくとも１種類の非選択プライマーをさらに含むことができ、その非選択プライマーは、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に選択核酸試料中の核酸配列の８０％未満の複製を生じる。核酸試料は少なくとも１×１０３ヌクレオチドの配列複雑性を有しうる。
【０５３８】
核酸を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含み、そのプライマーの組が１種類以上の選択プライマーを含み、各選択プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、核酸試料中の核酸分子の複製が結果として核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じ、その組に含まれる各選択プライマーが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に、２０倍未満の増幅偏りを、選択核酸試料中の少なくとも１０個の核酸配列に関して生じることができ、選択核酸試料が少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有する方法もまた開示される。
【０５３９】
核酸を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含み、そのプライマーの組が１種類以上の選択プライマーを含み、各選択プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、核酸試料中の核酸分子の複製が結果として核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じ、その組に含まれる各選択プライマーが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に、少なくとも１０％の配列発現量を、選択核酸試料中の少なくとも１０個の核酸配列に関して生じることができ、選択核酸試料が少なくとも１×１０８ヌクレオチドの配列複雑性を有する方法もまた開示される。
【０５４０】
核酸を増幅する方法であって、標的配列を含む核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法が開示される。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じる。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。標的配列からの複製された鎖の形成は、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利である。
【０５４１】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化した細胞溶解物を生じ、および安定化した細胞溶解物を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じる。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。標的配列からの複製された鎖の形成は、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利である。細胞溶解物は全ゲノムを含む。
【０５４２】
鎖置換核酸合成を高温にて実施する方法であって、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、標的配列を含む核酸、一組のプライマー、および添加剤を混合し、および高温にておよび標的配列へのプライマーのハイブリダイゼーションおよびテンプレート依存的方法でのプライマーの３’末端への連続的なヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長に有利になる条件下でインキュベートすることを含み、その伸長の結果として標的配列の複製が生じる方法もまた開示される。
【０５４３】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化した細胞溶解物を生じ、および安定化した細胞溶解物を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、一組のプライマー、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。標的配列からの複製された鎖の形成は、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利である。複製反応におけるテンプレート依存性伸長産物の形成は、非テンプレート産物の形成よりも有利である。
【０５４４】
鎖置換核酸合成を高温にて実施する方法であって、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、１本鎖テンプレート核酸、一組のプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸および添加剤を混合し、および高温にておよびテンプレート核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションおよびテンプレート依存的方法でのプライマーの３’末端への連続的なヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長に有利になる条件下でインキュベートすることを含み、前記重合の結果として前記テンプレート核酸の複製が生じる方法もまた開示される。
【０５４５】
核酸を増幅する方法であって、核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、一組のプライマー、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。複製反応におけるテンプレート依存性伸長産物の形成は、非テンプレート産物の形成よりも有利である。
【０５４６】
高温は、核酸ポリメラーゼが添加剤の非存在下で実質的にテンプレート依存性重合を行うことができない温度であることができる。高温は、前記ポリメラーゼが前記添加剤の非存在下で実質的にテンプレート依存性重合を行うことができない温度を含みうる。高温は摂氏３０度より高い温度であることができる。高温は摂氏３２度より高い温度であることができる。高温は摂氏３５度より高い温度であることができる。高温は摂氏３７度より高い温度であることができる。熱不安定性核酸ポリメラーゼはファイ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。熱不安定性核酸ポリメラーゼはファイ２９ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素、または組み合わせであることができる。
【０５４７】
プライマーの組は少なくとも２種類のプライマーを含みうる。プライマーの組は少なくとも１０種類のプライマーを含みうる。プライマーの組は少なくとも５０種類のプライマーを含みうる。プライマーの組は２００種類より多いプライマーを含みうる。プライマーの組は１０２３種類より多いプライマーを含みうる。プライマーの組に含まれるプライマーはそれぞれ長さ６ヌクレオチドであることができる。プライマーの組に含まれるプライマーはそれぞれ長さ８ヌクレオチドであることができる。プライマーの組に含まれるプライマーはそれぞれ長さ８ヌクレオチドより長くなりうる。プライマーの組に含まれるプライマーのうち２種類以上が異なる長さであることができる。
【０５４８】
添加剤は糖または糖の組み合わせを含みうる。添加剤はトレハロース、グルコース、スクロース、または組み合わせを含みうる。添加剤は糖、シャペロン、タンパク質、または組み合わせを含みうる。鎖置換複製は添加剤の存在下で行われる。添加剤はトレハロースを含みうる。核酸、核酸ポリメラーゼ、添加剤、およびプライマーの組のインキュベートは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下であることができる。
【０５４９】
標的配列から複製された鎖の非標的配列から複製された鎖に対する比率は、核酸が同一の核酸ポリメラーゼおよびプライマーの組の存在下でおよび高温以外は同一の条件下でインキュベートされる場合、標的配列から複製された鎖の非標的配列から複製された鎖に対する比率より小さい。
【０５５０】
核酸を増幅するためのキットであって、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーを含み、標的配列を含む核酸を高温にて、熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートする結果として、複製された鎖が生じおよび非標的配列からの複製された鎖の形成を優先して標的配列からの複製された鎖の形成を生じるキットもまた開示される。
【０５５１】
高温は、核酸ポリメラーゼが添加剤の非存在下で実質的にテンプレート依存性重合を行うことができない温度であることができる。熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、およびプライマーの組は、標的配列を含む核酸を高温にて、熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートする結果として、複製された鎖が生じおよび非標的配列からの複製された鎖の形成を優先して標的配列からの複製された鎖の形成を生じるように選択することができる。
【０５５２】
核酸ポリメラーゼはファイ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。添加剤は糖、シャペロン、タンパク質、トレハロース、グルコース、スクロース、または組み合わせであることができる。添加剤はトレハロースを含むことができ、プライマーの組はエキソヌクレアーゼ耐性ランダム六量体プライマーを含むことができ、および核酸ポリメラーゼはファイ２９ＤＮＡポリメラーゼを含むことができる。キットはさらに、適当な量で混合した際に、１０ｍＭＭｇＣｌ２、３７．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、および１ｍＭ ｄＮＴＰの終濃度を有する反応混合物を生じる１種類以上の成分を含むことができる。キットはさらに、安定化溶液、溶解溶液、プライマーの組、ジチオスレイトール、リン酸緩衝生理食塩水、および対照ＤＮＡテンプレートを含む反応混合物のうち任意の１つまたは組み合わせを含むことができる。安定化溶液は８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４を含むことができ；溶解溶液は４００ｍＭ ＫＯＨ、１００ ｍＭ ジチオスレイトール、および１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含むことができ；反応混合物は１５０ ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、および０．２ｍＭランダム六量体プライマーを含むことができ；ジチオスレイトールは１Ｍジチオスレイトールを含むことができ；およびリン酸緩衝生理食塩水は１Ｘリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５を含むことができる。
【０５５３】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含むことができる方法が開示される。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換される。標的試料は変性条件に供されない。本方法はさらに、複製された鎖を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて標識化することを含みうる。
【０５５４】
本方法はさらに、複製された鎖を希釈し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および希釈した複製された鎖を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下でその複製された鎖をインキュベートすることを含みうる。標的配列の複製は、追加の複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、追加の複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の追加の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。本方法はさらに、下記の操作を１回以上実施することを含みうる：追加の複製された鎖を希釈し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および希釈した複製された鎖を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下でその複製された鎖をインキュベートする。標的配列の複製は、追加の複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、追加の複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の追加の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。本方法はさらに、ポリメラーゼ−標的試料混合物を、鎖置換を促進する条件下でインキュベートすることを含みうる。本方法はさらに、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および第２の標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で第２の標的試料をインキュベートすることを含みうる。第２の標的試料は変性条件に供されない。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、少なくとも複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５５５】
プライマーは長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドであることができる。プライマーは長さ５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドであることができる。プライマーは長さ５、６、７、または８ヌクレオチドであることができる。プライマーは長さ６、７、または８ヌクレオチドであることができる。プライマーは長さ６ヌクレオチドであることができる。プライマーが３’−５’エキソヌクレアーゼに対して耐性となるように、プライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。ＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｓＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＤ１ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素、Ｔ７未変性ポリメラーゼＴ７シークエナーゼ（登録商標）、またはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼであることができる。ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。
【０５５６】
プライマーは長さ６ヌクレオチドであることができ、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができ、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。複製された鎖は、複製された鎖への修飾ヌクレオチドの付加によって標識化することができる。修飾ヌクレオチドは、ビオチニル化ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド、５メチルｄＣＴＰ、ＢｒｄＵＴＰ、または５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸であることができる。修飾ヌクレオチドは複製された鎖へ複製中に組み込むことができる。修飾ヌクレオチドは、ビオチニル化ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド、５メチルｄＣＴＰ、ＢｒｄＵＴＰ、または５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸．修飾ヌクレオチド５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸であることができ、および複製された鎖は、組み込まれた５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジンと標識を反応させることによって標識化することができる。標識は、フルオレセインイソチオシアナート、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノメチルクマリン、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンチン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、またはその組み合わせであることができる。
【０５５７】
標的試料を熱変性条件に供する必要は無い。標的配列は２本の鎖を含むことができ、およびプライマーの組は、標的配列の鎖のうち一方と相補的な３種類以上のプライマー、および標的配列の鎖のもう一方と相補的な少なくとも１種類のプライマーを含むことができる。プライマーの組は、標的配列の同一の鎖と相補的な３種類以上のプライマーを有しうる。プライマーの組は、標的配列の同一の鎖と相補的な４種類以上のプライマーを有しうる。プライマーの組は４種類以上のプライマーを有しうる。プライマーの組は５種類以上のプライマーを有しうる。標的配列の複製を促進する条件は実質的に等温であることができる。標的配列の複製を促進する条件は熱サイクル反応が関係する必要は無い。その条件は熱サイクル反応を含む必要は無い。標的配列は増幅標的およびハイブリダイゼーション標的を含むことができ、ハイブリダイゼーション標的は増幅標的に隣接することができ、プライマーの組は複数のプライマーを含むことができ、各プライマーは相補的部分を含むことができ、ここでプライマーのその相補的部分はそれぞれハイブリダイゼーション標的の異なる部分と相補的であることができる。
【０５５８】
プライマーの組はプライマーの右組およびプライマーの左組を含むことができ、標的配列は第１および第２の鎖を有する２本鎖であることができ、ハイブリダイゼーション標的は右および左のハイブリダイゼーション標的を含むことができ、ここで右ハイブリダイゼーション標的は増幅標的の一方の端に隣接することができおよび左ハイブリダイゼーション標的は増幅標的の反対側の端に隣接することができる。右組プライマーの相補的部分は（ｉ）全部が標的配列の第１の鎖と相補的および（ｉｉ）それぞれが右ハイブリダイゼーション標的の異なる部分と相補的であることができ、および、左組プライマーの相補的部分は（ｉ）全部が標的配列の第２の鎖と相補的および（ｉｉ）それぞれが左ハイブリダイゼーション標的の異なる部分と相補的であることができる。
【０５５９】
プライマーの右組および左組はそれぞれ、３種類以上のプライマーを有しうる。プライマーの右組および左組はそれぞれ、４種類以上のプライマーを有しうる。プライマーの右組および左組はそれぞれ、５種類以上のプライマーを有しうる。プライマーの右組および左組はそれぞれ、同数のプライマーを有しうる。標的配列は相当な複雑性の核酸試料であることができ、およびプライマーの組はランダムヌクレオチド配列を有するプライマーを含むことができる。標的配列はゲノム核酸の試料であることができる。プライマーは長さ５ないし２０ヌクレオチドであることができる。プライマーは長さ５ないし１０ヌクレオチドであることができる。プライマーは長さ６、７、または８ヌクレオチドであることができる。プライマーは長さ６ヌクレオチドであることができる。プライマーは全部が同一の長さであることができる。各プライマーは定常部分およびランダム部分を含むことができ、ここで各プライマーの定常部分は同一のヌクレオチド配列を有することができ、および各プライマーのランダム部分はランダムヌクレオチド配列を有することができる。
【０５６０】
標的配列は連結されたＤＮＡであることができる。連結されたＤＮＡは、リンカーで連結されていることができる。各リンカーはプライマー相補部分を含むことができ、各プライマーは相補的部分を含むことができ、および各プライマーの相補的部分は、リンカーの相補的部分と相補的であることができる。プライマーの組は、ランダムヌクレオチド配列を有するプライマーを含むことができる。各プライマーは定常部分およびランダム部分を含むことができ、各プライマーの定常部分は同一のヌクレオチド配列を有することができ、および各プライマーのランダム部分はランダムヌクレオチド配列を有することができる。連結されたＤＮＡは、ＤＮＡ断片をライゲーションで繋ぐことによって生じることができる。ＤＮＡ断片は、ｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡであることができる。ｍＲＮＡは、細胞から単離されたｍＲＮＡの混合物を含むことができる。標的配列は、ローリング・サークル複製によって合成された単一の配列の複数タンデムリピートから成る核酸分子である必要は無い。
【０５６１】
プライマーはヌクレオチドを含むことができ、そのヌクレオチドの１種類以上はリボヌクレオチドであることができる。そのヌクレオチドの約１０％ないし約５０％はリボヌクレオチドであることができる。そのヌクレオチドの約５０％以上はリボヌクレオチドであることができる。そのヌクレオチドの全部はリボヌクレオチドであることができる。プライマーはヌクレオチドを含むことができ、そのヌクレオチドの１種類以上は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであることができる。そのヌクレオチドの約１０％ないし約５０％は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであることができる。そのヌクレオチドの約５０％以上は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであることができる。そのヌクレオチドの全部は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであることができる。プライマーはヌクレオチドを含むことができ、そのヌクレオチドはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であることができる。プライマーはヌクレオチドを含むことができ、そのヌクレオチドは塩基を含むことができ、およびその塩基の１種類以上はユニバーサル塩基であることができる。ユニバーサル塩基のうち少なくとも１種類は３−ニトロピロールであることができる。ユニバーサル塩基は５−ニトロインドールであることができる。その塩基の約１０％ないし約５０％はユニバーサル塩基であることができる。その塩基の約５０％以上はユニバーサル塩基であることができる。その塩基の全部はユニバーサル塩基であることができる。
【０５６２】
標的試料は、生検試料、血液試料、尿試料、細胞試料、または組織試料であることができる。標的試料は針吸引生検試料である。標的試料中の核酸を、標的試料中の他の物質から分離する必要は無い。標的試料は粗細胞溶解物であることができる。標的試料を細胞溶解を超えて処理する必要は無い。複製された鎖を分析することができる。複製された鎖を１種類以上のＤＮＡチップを用いて分析することができる。複製された鎖をハイブリダイゼーションを用いて分析することができる。複製された鎖を核酸配列決定を用いて分析することができる。複製された鎖をその分析の前、後、または前および後の両方に保存することができる。標的試料は血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、またはその組み合わせであることができる。
【０５６３】
試料は血液試料であることができる。試料は針吸引生検試料であることができる。試料は粗細胞溶解物試料であることができる。試料は院内感染試料であることができる。試料は患者に由来することができる。試料は生物学的分子製品試料であることができる。複製された鎖の産生は試料中における核酸の存在を示すことができる。生じた複製された鎖の量は、試料中の核酸の量を示すことができる。試料は医薬品調製物試料であることができる。試料は腫瘍試料であることができる。試料は羊水試料であることができる。標的試料から生じた複製された鎖は、試料の核酸フィンガープリントを表すことができる。
【０５６４】
第２の標的試料は、第１の標的試料と同一の種類の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料と同一の種類の組織に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料と同一の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる時に得ることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる種類の組織に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる種の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる系統の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる細胞区画に由来する試料であることができる。
【０５６５】
環状核酸分子が標的配列を含むことができる。環状核酸分子は、制限エンドヌクレアーゼを用いてゲノムＤＮＡを消化し、および消化されたＤＮＡを環状化することによって作製できる。消化されたＤＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを用いて環状化することができる。消化されたＤＮＡは、副子またはアダプタを用いて環状化することができる。標的配列は増幅標的およびハイブリダイゼーション標的を含むことができ、ハイブリダイゼーション標的は増幅標的に隣接することができ、プライマーの組は複数のプライマーを含むことができ、各プライマーは相補的部分を含むことができ、およびプライマーの相補的部分はそれぞれ、ハイブリダイゼーション標的の異なる部分と相補的であることができる。
【０５６６】
プライマーの組はプライマーの右組およびプライマーの左組を含むことができ、標的配列は第１および第２の鎖を有する２本鎖であることができ、ハイブリダイゼーション標的は右および左のハイブリダイゼーション標的を含むことができ、および、右ハイブリダイゼーション標的は増幅標的の一方の端に隣接することができおよび左ハイブリダイゼーション標的は増幅標的の反対側の端に隣接する。右組プライマーの相補的部分は（ｉ）全部が標的配列の第１の鎖と相補的および（ｉｉ）それぞれが右ハイブリダイゼーション標的の異なる部分と相補的であることができ、および、左組プライマーの相補的部分は（ｉ）全部が標的配列の第２の鎖と相補的および（ｉｉ）それぞれが左ハイブリダイゼーション標的の異なる部分と相補的であることができる。
【０５６７】
環状核酸分子は、ｃＤＮＡを環状化することによって作製できる。環状核酸分子は、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを環状化することによって作製される。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドは、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを用いて環状化することができる。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドは、副子またはアダプタを用いて環状化することができる。
【０５６８】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的試料中の核酸は、標的試料中の他の物質から分離されない。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５６９】
本方法はさらに、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および第２の標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で第２の標的試料をインキュベートすることを含みうる。第２の標的試料は変性条件に供されない。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５７０】
標的試料は粗細胞溶解物であることができる。標的試料を、細胞溶解を超えて処理する必要は無い。試料は血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬品調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、またはその組み合わせであることができる。試料は血液試料であることができる。試料は針吸引生検試料であることができる。試料は粗細胞溶解物試料であることができる。試料は院内感染試料であることができる。試料は患者に由来することができる。試料は生物学的分子製品試料であることができる。
【０５７１】
複製された鎖の産生は試料中における核酸の存在を示すことができる。生じた複製された鎖の量は、試料中の核酸の量を示すことができる。試料は医薬品調製物試料であることができる。標的試料は腫瘍試料であることができる。標的試料は羊水試料であることができる。標的試料から生じた複製された鎖は、試料の核酸フィンガープリントを表すことができる。
【０５７２】
第２の標的試料は、第１の標的試料と同一の種類の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料と同一の種類の組織に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料と同一の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる時に得ることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる種類の組織に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる種の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる系統の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる細胞区画に由来する試料であることができる。
【０５７３】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的試料は粗細胞溶解物である。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５７４】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。プライマーは長さ５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドである。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５７５】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５７６】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。プライマー−標的試料は変性条件に供されず、プライマーは長さ６ヌクレオチドであり、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５７７】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。本方法はさらに、複製された鎖を希釈し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および希釈した複製された鎖を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下でその複製された鎖をインキュベートすることを含む。標的配列の複製は、追加の複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、追加の複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の追加の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５７８】
本方法はさらに、下記の操作を１回以上実施することを含みうる：追加の複製された鎖を希釈し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および希釈した複製された鎖を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下でその複製された鎖をインキュベートする。標的配列の複製は、追加の複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、追加の複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の追加の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５７９】
標的核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートすること、および
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
【０５８０】
プライマーの組はプライマーの右組およびプライマーの左組を含み、標的配列は２本鎖であって、第１および第２の鎖を有し、右組のプライマーは全部が標的配列の第１の鎖と相補的であり、および左組のプライマーは全部が標的配列の第２の鎖と相補的である。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。プライマーの右組は４種類以上のプライマーを有することができ、およびプライマーの左組は４種類以上のプライマーを有する。
【０５８１】
標的核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートし、ここでプライマー−標的試料は変性条件に供されないこと，および
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
【０５８２】
標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。標的配列は相当な複雑性を有する核酸試料であり、およびプライマーの組はランダムヌクレオチド配列を有するプライマーを含む。
【０５８３】
標的核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートし、ここでプライマー−標的試料は変性条件に供されないこと，および
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
【０５８４】
プライマーの組に含まれるすべてのプライマーは、標的配列中の同一の鎖と相補的である。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。プライマーの組は３種類以上のプライマーを有しうる。
【０５８５】
標的核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートし、ここでプライマー−標的試料は変性条件に供されないこと，および
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
【０５８６】
標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。標的配列は相当な複雑性を有する核酸試料であり、およびプライマーの組はランダムヌクレオチド配列を有するプライマーを含む。各プライマーは定常部分およびランダム部分を含み、各プライマーの定常部分は同一のヌクレオチド配列を有し、および各プライマーのランダム部分はランダムヌクレオチド配列を有する。
【０５８７】
標的核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートし、ここでプライマー−標的試料は変性条件に供されないこと、および
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
【０５８８】
標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。標的配列の複製を促進する条件は熱サイクル反応が関係せず、および標的配列は連結されたＤＮＡである。
【０５８９】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的試料は変性条件に供されない。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。プライマーの組は、標的配列の同一の鎖と相補的な３種類以上のプライマーを有しうる。
【０５９０】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的試料は変性条件に供されない。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。標的配列は相当な複雑性を有する核酸試料であり、およびプライマーの組はランダムヌクレオチド配列を有するプライマーを含む。
【０５９１】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的試料は変性条件に供されない。プライマーの組に含まれるすべてのプライマーは標的配列の同一の鎖と相補的である。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。プライマーの組は３種類以上のプライマーを有しうる。
【０５９２】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的試料は変性条件に供されない。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。標的配列は相当な複雑性を有する核酸試料であり、およびプライマーの組はランダムヌクレオチド配列を有するプライマーを含む。各プライマーは定常部分およびランダム部分を含み、各プライマーの定常部分は同一のヌクレオチド配列を有し、および各プライマーのランダム部分はランダムヌクレオチド配列を有する。
【０５９３】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的試料は変性条件に供されない。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。標的配列の複製を促進する条件は熱サイクル反応が関係せず、および標的配列は連結されたＤＮＡである。
【０５９４】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的試料は熱変性条件に供されない。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０５９５】
鎖置換複製によって生じた核酸を標識化する方法であって、鎖置換複製によって生じた核酸を末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて標識化することを含む方法もまた開示される。複製された鎖は、核酸の３’末端への修飾ヌクレオチドの付加によって標識化することができる。修飾ヌクレオチドは、ビオチニル化ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド、５メチルｄＣＴＰ、ＢｒｄＵＴＰ、または５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸であることができる。
【０５９６】
鎖置換複製によって生じた核酸を標識化する方法であって、鎖置換複製によって生じた核酸へ複製中に修飾ヌクレオチドを組み込むことを含む方法もまた開示される。
【０５９７】
鎖置換複製によって生じた核酸を結合する方法であって、鎖置換複製によって生じた核酸の３’末端へ修飾ヌクレオチドを末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて付加し、および修飾ヌクレオチドを固相担体と反応させてそれによって核酸を固相担体へ結合させることを含む方法もまた開示される。
【０５９８】
鎖置換複製によって生じ、基材へ結合または接着された核酸を含むマイクロアレイもまた開示される。
【０５９９】
標的核酸配列に基づくプローブを作製する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。複製された鎖はハイブリダイゼーションプローブとして使用される。本方法はさらに、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてハイブリダイゼーションプローブを標識化することを含みうる。
【０６００】
メッセンジャーＲＮＡを増幅する方法であって、メッセンジャーＲＮＡを逆転写して第１の鎖ｃＤＮＡを生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および第１の鎖ｃＤＮＡを接触させ、および第１の鎖ｃＤＮＡの複製を促進する条件下でインキュベートすることを含む方法もまた開示される。第１の鎖ｃＤＮＡの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって第１の鎖ｃＤＮＡから置換される。本方法はさらに、複製の前に、ＲＮＡｓｅＨを用いてメッセンジャーＲＮＡを分解することを含みうる。
【０６０１】
本方法はさらに、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および第２の標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で第２の標的試料をインキュベートすることを含みうる。第２の標的試料は変性条件に供されない。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０６０２】
標的核酸配列を増幅する方法であって、標的試料中のＲＮＡを部分的に分解し、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料と接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０６０３】
比較ゲノムハイブリダイゼーションの方法であって、第１の試料の鎖置換複製によって生じた核酸を、第２の試料の鎖置換複製によって生じた核酸とハイブリダイズすることを含む方法もまた開示される。ハイブリダイゼーションはＣｏｔＩＤＮＡの非存在下で実施することができる。
【０６０４】
標的核酸配列を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。環状核酸分子が標的配列を含む。標的配列の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
【０６０５】
プライマーの組は、ランダムヌクレオチド配列を有するヌクレオチドを含むことができる。プライマーは長さ５、６、７、または８ヌクレオチドであることができる。プライマーは長さ６、７、または８ヌクレオチドであることができる。プライマーは長さ６ヌクレオチドであることができる。修飾ヌクレオチドは、ビオチニル化ヌクレオチド、蛍光ヌクレオチド、５メチルｄＣＴＰ、ＢｒｄＵＴＰ、または５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸であることができる。修飾ヌクレオチドは５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸であることができ、および複製された鎖は組み込まれた５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジンと標識を反応させることによって標識化することができる。標識は、フルオレセインイソチオシアナート、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノメチルクマリン、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンチン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、またはその組み合わせであることができる。
【０６０６】
複製された鎖は、マイクロアレイ中の要素として使用することができる。複製された鎖は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用の前に切断することができる。複製された鎖はＤＮＡｓｅＩを用いて切断することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、複製された鎖の３’末端への修飾ヌクレオチドの付加によって標識化することができる。修飾ヌクレオチドを固相担体と反応させ、それによって、複製された鎖を固相担体へ結合させることができる。
【０６０７】
標的試料は血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、またはその組み合わせであることができる。標的試料は血液試料であることができる。標的試料は針吸引生検試料である。標的試料は粗細胞溶解物試料であることができる。標的試料は院内感染試料であることができる。試料はヒトおよび非ヒト核酸の両方を含むことができる。非ヒト核酸は、非ヒト核酸に特異的なプライマーの使用によって、優先的に増幅することができる。ヒト核酸は、ヒト核酸に特異的なプライマーの使用によって、優先的に増幅することができる。試料は患者に由来することができる。標的試料は生物学的分子製品試料であることができる。複製された鎖の産生は、試料中の核酸の存在を示しうる。生じた複製された鎖の量は、試料中の核酸の量を示しうる。標的試料は医薬調製物試料であることができる。標的試料は腫瘍試料であることができる。標的試料は羊水試料であることができる。標的試料から生じた複製された鎖は、試料の核酸フィンガープリントを表すことができる。
【０６０８】
第２の標的試料は、第１の標的試料と同一の種類の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料と同一の種類の組織に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料と同一の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる時に得ることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる種類の組織に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる種の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる系統の生物に由来する試料であることができる。第２の標的試料は、第１の標的試料とは異なる細胞区画に由来する試料であることができる。
【０６０９】
環状核酸分子が標的配列を含むことができる。環状核酸分子は、制限エンドヌクレアーゼを用いてゲノムＤＮＡを消化し、および消化されたＤＮＡを環状化することによって作製できる。消化されたＤＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを用いて環状化することができる。消化されたＤＮＡは、副子またはアダプタを用いて環状化することができる。標的配列は増幅標的およびハイブリダイゼーション標的を含むことができ、ハイブリダイゼーション標的は増幅標的に隣接することができ、プライマーの組は複数のプライマーを含むことができ、各プライマーは相補的部分を含むことができ、およびプライマーの相補的部分はそれぞれ、ハイブリダイゼーション標的の異なる部分と相補的であることができる。
【０６１０】
プライマーの組はプライマーの右組およびプライマーの左組を含むことができ、標的配列は第１および第２の鎖を有する２本鎖であることができ、ハイブリダイゼーション標的は右および左のハイブリダイゼーション標的を含むことができ、右ハイブリダイゼーション標的は増幅標的の一方の端に隣接することができおよび左ハイブリダイゼーション標的は増幅標的の反対側の端に隣接することができる。右組プライマーの相補的部分は（ｉ）全部が標的配列の第１の鎖と相補的および（ｉｉ）それぞれが右ハイブリダイゼーション標的の異なる部分と相補的であることができ、および、左組プライマーの相補的部分は（ｉ）全部が標的配列の第２の鎖と相補的および（ｉｉ）それぞれが左ハイブリダイゼーション標的の異なる部分と相補的であることができる。
【０６１１】
環状核酸分子は、ｃＤＮＡを環状化することによって作製できる。環状核酸分子は、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを環状化することによって作製できる。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドは、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを用いて環状化することができる。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドは、副子またはアダプタを用いて環状化することができる。
【０６１２】
全ゲノムを増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、標的試料は全ゲノムを含み、およびゲノムの複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることを含む方法もまた開示される。標的試料は変性条件に供されない。ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換される。プライマーは長さ６ヌクレオチドであることができ、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができ、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。プライマーはランダムヌクレオチド組成であることができ、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができ、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。
【０６１３】
染色体を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、標的試料は染色体を含み、および染色体の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートし、ここで標的試料は変性条件に供されないことを含む方法もまた開示される。染色体の複製は、複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって染色体から置換される。プライマーは長さ６ヌクレオチドであることができ、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができ、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。プライマーはランダムヌクレオチド組成であることができ、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができ、およびＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることができる。
【０６１４】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および中性化した細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６１５】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物を中性化して、細胞溶解物は精製されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６１６】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物を中性化して、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６１７】
さらに、全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および中性化した細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は変性条件に供されず、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６１８】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および中性化した細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は熱変性条件に供され、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６１９】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、中性化した細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、および中性化した細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は変性条件に供されず、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６２０】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および中性化した細胞溶解物を接触させ、中性化した細胞溶解物は全ゲノムを含み、および中性化した細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換される方法が開示される。
【０６２１】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物は精製されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換される方法が開示される。
【０６２２】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換される方法が開示される。
【０６２３】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および中性化した細胞溶解物を接触させ、中性化した細胞溶解物は全ゲノムを含み、および中性化した細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は変性条件に供されず、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６２４】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および中性化した細胞溶解物を接触させ、中性化した細胞溶解物は全ゲノムを含み、および中性化した細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は熱変性条件に供され、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６２５】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および中性化した細胞溶解物を接触させ、中性化した細胞溶解物は全ゲノムを含み、中性化した細胞溶解物中の核酸は中性化した細胞溶解物中の他の物質から分離されず、および中性化した細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は変性条件に供されず、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６２６】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および中性化した細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６２７】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化し、および細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は精製されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６２８】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化し、および細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６２９】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および中性化した細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は変性条件に供されず、中性化した細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６３０】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および中性化した細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は変性条件に供され、中性化した細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６３１】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および中性化した細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物の核酸は中性化した細胞溶解物中の他の物質から分離されず、中性化した細胞溶解物は変性条件に供されず、中性化した細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６３２】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および中性化した細胞溶解物と接触させ、および中性化した細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６３３】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、および細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は精製されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６３４】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化し、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、および細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６３５】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および中性化した細胞溶解物を接触させ、および中性化した細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は変性条件に供されず、中性化した細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６３６】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および中性化した細胞溶解物を接触させ、および中性化した細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物は熱変性条件に供され、中性化した細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６３７】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物を中性化して、中性化した細胞溶解物を生じ、および一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および中性化した細胞溶解物を接触させ、および中性化した細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、中性化した細胞溶解物中の核酸は中性化した細胞溶解物中の他の物質から分離されず、中性化した細胞溶解物は変性条件に供されず、中性化した細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６３８】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６３９】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物は精製されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６４０】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６４１】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は変性条件に供されず、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６４２】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は熱変性条件に供され、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６４３】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は変性条件に供されず、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６４４】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６４５】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物は精製されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６４６】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６４７】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は変性条件に供されず、ゲノムの複製、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６４８】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は熱変性条件に供され、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６４９】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、および細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は変性条件に供されず、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６５０】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、および細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６５１】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、および細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は精製されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６５２】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、および細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６５３】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、および細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は変性条件に供されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６５４】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、および細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は熱変性条件に供され、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６５５】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、および細胞溶解物を一組のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、細胞溶解物は変性条件に供されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６５６】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、および細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６５７】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、および細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は精製されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６５８】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、および細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６５９】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、および細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は変性条件に供されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法もまた開示される。
【０６６０】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、および細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物は熱変性条件に供され、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６６１】
標的核酸配列を増幅する方法であって、細胞を溶解して細胞溶解物を生じ、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞溶解物を接触させ、および細胞溶解物を標的配列の複製を促進する条件下でインキュベートし、細胞溶解物中の核酸は細胞溶解物中の他の物質から分離されず、細胞溶解物は変性条件に供されず、細胞溶解物の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換されることを含む方法が開示される。
【０６６２】
中性化した細胞溶解物変性条件に供されないかまたは中性化した細胞溶解物が熱変性条件に供される、本開示の方法のうち任意のものを、実施することができる。
【０６６３】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、溶解のための溶液、中性化のための溶液、一組のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含むキットが開示される。
【０６６４】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、細胞溶解のための溶液、細胞溶解物の中性化のための溶液、一組のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含むキットもまた開示される。
【０６６５】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、細胞を溶解するための溶液、溶解された細胞を中性化するための溶液、一組のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含むキットが開示される。
【０６６６】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、溶解のための組成物、中性化のための組成物、一組のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含むキットもまた開示される。
【０６６７】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、細胞溶解のための組成物、細胞溶解物の中性化のための組成物、一組のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含むキットが開示される。
【０６６８】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、細胞を溶解するための組成物、溶解された細胞を中性化するための組成物、一組のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含むキットが開示される。
【０６６９】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、溶解のための溶液、ここで溶解のための溶液はアルカリ性であり、中性化のための溶液、一組のプライマー、ここでプライマーは長さ６ヌクレオチドであり、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼ、ここでＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることを含むキットが開示される。
【０６７０】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、細胞溶解のための溶液、ここで細胞溶解のための溶液はアルカリ性であり、細胞溶解物の中性化のための溶液、一組のプライマー、ここでプライマーは長さ６ヌクレオチドであり、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼ、ここでＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることを含むキットが開示される。
【０６７１】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、細胞を溶解するための溶液、溶解された細胞を中性化するための溶液、一組のプライマー、ここでプライマーは長さ６ヌクレオチドであり、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーはそれぞれ少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼ、ここでＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることを含むキットもまた開示される。
【０６７２】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞をアルカリ性条件へ曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化された細胞溶解物を生じ、および安定化された細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６７３】
細胞を溶解溶液と混合することによって細胞をアルカリ性条件に曝露する、または溶解溶液が塩基を含む、または塩基が塩基水溶液であることを含む方法もまた開示される。
【０６７４】
塩基が水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア、アニリン、ベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ジフェニルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、Ｎ−メチルアニリン、モルホリン、ピリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、水酸化アルミニウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、またはＤＢＵ（１，８−ジアゾビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン）である方法もまた開示される。
【０６７５】
塩基が水酸化カリウムである方法が開示される。
【０６７６】
溶解溶液が４００ｍＭ ＫＯＨを含むおよび／または溶解溶液が１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭＥＤＴＡを含むかまたは溶解溶液が４００ｍＭ ＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡから成る方法もまた開示される。
【０６７７】
溶解溶液が複数の塩基性物質を含むおよび／または細胞が等しい容量の溶解溶液と混合される方法が開示される。
【０６７８】
溶解溶液が緩衝剤を含む方法、および緩衝剤がリン酸緩衝剤、グッド緩衝剤、ＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、またはビス−トリスプロパンである方法が開示される。緩衝剤がｐＨ４．１のトリス−ＨＣｌである方法もまた開示される。本開示の方法は複数の緩衝剤を含みうる。
【０６７９】
細胞溶解物のｐＨを約ｐＨ７．０ないし約ｐＨ６．８の範囲へ低下させる方法もまた開示される。
【０６８０】
細胞溶解物のｐＨを、細胞溶解物を安定化溶液と混合することによって低下させる方法もまた開示される。安定化溶液が８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１を含む方法、および安定化溶液が複数の緩衝剤を含む方法および／または細胞溶解物が等しい容量の安定化溶液と混合される方法が開示される。
【０６８１】
安定化溶液が酸を含む方法、および酸が塩酸，硫酸，リン酸，酢酸，アセチルサリチル酸，アスコルビン酸，炭酸，クエン酸，ギ酸，硝酸，過塩素酸，ＨＦ、ＨＢｒ、ＨＩ、Ｈ２Ｓ、ＨＣＮ、ＨＳＣＮ、ＨＣｌＯ、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、またはカルボン酸である方法が開示される。カルボン酸がエタン酸、プロパン酸、またはブタン酸である方法が開示される。安定化溶液が複数の酸性物質を含む方法が開示される。
【０６８２】
細胞溶解物のｐＨを約ｐＨ９．０以下、約ｐＨ８．５以下、約ｐＨ８．０以下、または約ｐＨ７．５以下へ低下させる方法が開示される。
【０６８３】
細胞溶解物のｐＨを約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ６．０、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ７．０、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ７．５、ｐＨ９．０ないし約ｐＨ８．０、ｐＨ８．５ないし約ｐＨ６．０、ｐＨ８．５ないし約ｐＨ７．０、ｐＨ８．５ないし約ｐＨ７．５、ｐＨ８．５ないし約ｐＨ８．０、ｐＨ８．０ないし約ｐＨ６．０、ｐＨ８．０ないし約ｐＨ６．５、ｐＨ８．０ないし約ｐＨ７．０、ｐＨ８．０ないし約ｐＨ７．５、ｐＨ７．５ないし約ｐＨ６．０、またはｐＨ７．５ないし約ｐＨ７．０の範囲へ低下させる方法もまた開示される。
【０６８４】
細胞溶解物および安定化された細胞溶解物中の核酸が細胞溶解物中の他の物質から分離されない、細胞溶解物および安定化された細胞溶解物がインキュベート前に精製に供されない、精製が細胞溶解物中の核酸の細胞溶解物中の他の物質からの分離を含む、精製が遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、濾過、透析、またはこれらの組み合わせを含む、精製がアルカリ性条件によってまたはｐＨの低下によって引き起こされる沈澱を除く沈澱を含む、精製が遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出、カラムクロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを含む、細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、または両方がインキュベート前に部分精製に供される、部分精製が遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、沈澱、濾過、透析、またはこれらの組み合わせを含む、部分精製が遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出、カラムクロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを含む、細胞溶解物および安定化された細胞溶解物がインキュベート前に相当な精製に供されない、相当な精製が遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、沈澱、濾過、または透析を含まない、相当な精製が遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出、またはカラムクロマトグラフィーを含まない、細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、または両方が遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、沈澱、濾過、または透析にインキュベート前に供される、細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、または両方が遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出、またはカラムクロマトグラフィーにインキュベート前に供される、相当な精製が遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、濾過、透析、またはこれらの組み合わせを含む、相当な精製がアルカリ性条件によってまたはｐＨの低下によって引き起こされる沈澱を除く沈澱を含む、相当な精製が遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出、カラムクロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを含む、細胞溶解物および安定化された細胞溶解物がインキュベート前に精製されない、細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、または両方がインキュベート前に部分精製される、インキュベートが実質的に等温である、細胞溶解物も安定化された細胞溶解物もインキュベートの温度を実質的に上回って加熱されない、細胞溶解物も安定化された細胞溶解物もインキュベートの温度を上回る実質的な加熱に供されない、細胞がインキュベートの温度を実質的に上回って加熱されない、細胞がインキュベートの温度を上回る実質的な加熱に供されない、細胞がその細胞が増殖する温度を実質的に上回って加熱されない、細胞がその細胞が増殖する温度を上回る実質的な加熱に供されない、細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、および細胞はインキュベートの温度を実質的に上回って加熱されない、細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、および細胞はインキュベートの温度を上回る実質的な加熱に供されない、細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、および細胞は、インキュベートの前または間に、その細胞が増殖する温度を実質的に上回って加熱されない、細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、および細胞は、インキュベートの前または間に、その細胞が増殖する温度を上回る実質的な加熱に供されない、細胞溶解物も安定化された細胞溶解物もゲノムの明らかな変性を引き起こす温度を上回っておよびそのような時間にわたって加熱されない、細胞溶解物も安定化された細胞溶解物も、ゲノムの明らかな変性を引き起こす温度を上回るおよびそのような時間にわたる加熱に供されない、細胞が熱によって溶解されない、細胞がアルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こす温度を上回っておよびそのような時間にわたって加熱されない、および／または細胞がアルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こす温度を上回るおよびそのような時間にわたる加熱に供されない方法が開示される。
【０６８５】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞をアルカリ性条件へ曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞を溶解溶液と混合することによって細胞をアルカリ性条件に曝露し、細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化された細胞溶解物を生じ、細胞溶解物のｐＨは細胞溶解物を安定化溶液と混合することによって低下し、および安定化された細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６８６】
溶解溶液が水酸化カリウム、たとえば４００ｍＭ ＫＯＨを含む方法が開示される。
【０６８７】
溶解溶液が４００ｍＭ ＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むかまたは溶解溶液が４００ｍＭＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡから成る方法もまた開示される。
【０６８８】
細胞が等しい容量の溶解溶液および／または等しい容量の安定化溶液と混合される方法もまた開示される。
【０６８９】
安定化溶液がｐＨ４．１のトリス−ＨＣｌを含む、および安定化溶液が８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１を含む方法が開示される。
【０６９０】
安定化溶液が８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１から成る方法もまた開示される。
【０６９１】
溶解溶液が４００ｍＭ ＫＯＨおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡから成る、安定化溶液が８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４から成る、安定化された細胞溶解物が３７．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、５０μＭプライマー、およびφ２９ＤＮＡポリメラーゼの存在下でインキュベートされる方法が開示される。
【０６９２】
安定化された細胞溶解物が３７．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、５０μＭプライマー、およびφ２９ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、安定化された細胞溶解物を四分の一容量の反応混合物、およびφ２９ＤＮＡポリメラーゼと混合することによってインキュベートされ、反応混合物が１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭＭｇＣｌ２、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、および０．２ｍＭプライマーから成る方法もまた開示される。
【０６９３】
全ゲノムを増幅する方法であって、細胞をアルカリ性条件へ曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物は全ゲノムを含み、細胞を溶解溶液と混合することによって細胞をアルカリ性条件に曝露し、溶解溶液は４００ｍＭＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含み、細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化された細胞溶解物を生じ、細胞溶解物のｐＨは細胞溶解物を安定化溶液と混合することによって低下し、安定化溶液は８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１を含み、および安定化された細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートし、ゲノムの複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によってゲノムから置換されることを含む方法が開示される。
【０６９４】
細胞が等しい容量の溶解溶液と混合されるおよび／または細胞溶解物が等しい容量の安定化溶液と混合される方法が開示される。
【０６９５】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、溶解溶液、安定化溶液、一組のプライマー、およびＤＮポリメラーゼを含むキットが開示される。
【０６９６】
溶解溶液が水酸化カリウム、たとえば４００ｍＭ ＫＯＨを含むキットが開示される。
【０６９７】
溶解溶液が４００ｍＭ ＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むキットが開示される。
【０６９８】
安定化溶液がｐＨ４．１のトリス−ＨＣｌを含む、安定化溶液が８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１を含む、または安定化溶液が８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１から成るキットが開示される。
【０６９９】
デオキシヌクレオチド三リン酸を含むキットが開示される。
【０７００】
１Ｍジチオスレイトール、１Ｘリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５、および対照ＤＮＡテンプレートを含む、溶解溶液が４００ｍＭＫＯＨおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む、安定化溶液が８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４を含む、プライマーの組が反応混合物を含む、反応混合物が１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、および０．２ｍＭランダム六量体プライマーを含む、ＤＮＡポリメラーゼがφ２９ＤＮＡポリメラーゼであるキットが開示される。
【０７０１】
１種類以上の検出プローブを含む、検出プローブのそれぞれが相補的部分を含む、相補的部分が目的の核酸配列と相補的であるキットが開示される。
【０７０２】
キットがゲノム中の目的の核酸配列を検出するように設計されるキットおよび／またはキットが目的の核酸配列に基づいて、個人の疾患、症状または素因を評価するために設計されるキットが開示される。
【０７０３】
損傷ＤＮＡを増幅する方法であって、損傷ＤＮＡ試料を損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進する条件へ曝露し、それによって変性した損傷ＤＮＡ試料を生じ、損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進しない条件へ変えて安定化された損傷ＤＮＡ試料を生じ、安定化された損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡを損傷ＤＮＡの複製を促進する条件下でインキュベートし、損傷ＤＮＡの複製が結果として損傷ＤＮＡ試料中の平均断片長よりも長い平均断片長を増幅された損傷ＤＮＡについて生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換されることを含む方法が開示される。
【０７０４】
損傷ＤＮＡ試料、変性した損傷ＤＮＡ試料、または両方がイオン条件に曝露され、損傷ＤＮＡ試料および変性した損傷ＤＮＡ試料がイオン溶液を損傷ＤＮＡ試料と混合することによってイオン条件に曝露され、イオン溶液は損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進する条件への損傷ＤＮＡ試料の曝露前または曝露中に損傷ＤＮＡ試料と混合され、イオン溶液は塩溶液であり、塩溶液は１種類以上の塩を含み、塩はトリス−ＨＣｌ、トリス−ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、または組み合わせであり、トリス−ＨＣｌはｐＨ７．０ないし８．０であり、塩はトリス−ＥＤＴＡであり、塩溶液は約５０ｍＭないし約５００ｍＭトリスおよび約１ｍＭないし約５ｍＭＥＤＴＡを含み、イオン溶液は損傷ＤＮＡ試料と混合した際に２ないし５倍に希釈され、変性した損傷ＤＮＡ試料は変性した損傷ＤＮＡ試料とイオン溶液を混合することによってイオン条件へ曝露され、イオン溶液は条件を変える前または間に変性した損傷ＤＮＡ試料と混合され、損傷ＤＮＡ試料を、損傷ＤＮＡ試料を変性溶液と混合することによっておよび損傷ＤＮＡ試料を損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡを実質的に変性する温度およびそのような長さの時間加熱することによって実質的な変性を促進する条件へ曝露し、損傷ＤＮＡ試料はＤＮＡ試料を加熱する後に変性溶液と混合し、損傷ＤＮＡ試料はＤＮＡ試料を加熱する前に変性溶液と混合し、損傷ＤＮＡ試料はＤＮＡ試料を加熱するのと同時に変性溶液と混合し、損傷ＤＮＡ試料はＤＮＡ試料の加熱中に変性溶液と混合し、損傷ＤＮＡ試料はＤＮＡ試料の加熱を開始する時に変性溶液と混合し、および／または損傷ＤＮＡ試料の変性溶液との混合によって損傷ＤＮＡ試料におけるアルカリ性条件が生じる条件が開示される。
【０７０５】
変性溶液が塩基を含み、塩基が塩基水溶液であり、塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア、アニリン、ベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ジフェニルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、Ｎ−メチルアニリン、モルホリン、ピリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、水酸化アルミニウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、またはＤＢＵ（１、８−ジアゾビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン）であり、塩基が水酸化ナトリウムであり、変性溶液が約１５０ｍＭないし約１ＭｎａＯＨを含む方法が開示される。
【０７０６】
変性溶液が１０Ｘ濃度であり、損傷ＤＮＡ試料を変性溶液と混合して１Ｘ濃度を生成し、および／またはアルカリ性条件が１５ないし５０ｍＭＮａＯＨを含む方法が開示される。
【０７０７】
損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡがＤＮＡをさらに損傷することなく実質的に変性される、損傷ＤＮＡ試料が約７０℃以下の温度へおよび約５分間以下の長さの時間加熱される、温度が約６０℃ないし約７０℃である、温度が約５０℃ないし約６０℃である、温度が約４０℃ないし約５０℃である、温度が約２５℃ないし約４０℃である、温度が約６０℃ないし約７０℃でありおよび時間の長さが約３分間である、および／または温度が約２５℃ないし約５０℃でありおよび時間の長さが約５分間以上である方法が開示される。
【０７０８】
条件を変えることが、変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨを低下させることおよび冷却することである、損傷ＤＮＡ試料を加熱する温度が変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨの低下の間維持される、損傷ＤＮＡ試料を加熱する温度が変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨの低下前に低下される、および／または損傷ＤＮＡ試料を加熱する温度が変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨの低下中に低下される方法が開示される。
【０７０９】
変性した損傷ＤＮＡ試料を冷却することが変性した損傷ＤＮＡ試料の低下中に開始される、変性した損傷ＤＮＡ試料の冷却が変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨが低下される際に開始される方法が開示される。
【０７１０】
変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨが、変性した損傷ＤＮＡ試料を安定化溶液と混合することによって低下される方法が開示される。
【０７１１】
変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨが、約ｐＨ７．５ないし約ｐＨ８．０の範囲へ低下される方法が開示される。
【０７１２】
変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨが、変性した損傷ＤＮＡ試料を安定化溶液と混合することによって低下される方法が開示される。
【０７１３】
安定化溶液が緩衝剤を含み、および／または緩衝剤がリン酸緩衝剤、グッド緩衝剤、ＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、またはビス−トリスプロパンである方法が開示される。
【０７１４】
安定化溶液が８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．１を含む方法が開示される。
【０７１５】
安定化溶液が酸を含む方法が開示される。
【０７１６】
酸が塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、アセチルサリチル酸、アスコルビン酸、炭酸、クエン酸、ギ酸、硝酸、過塩素酸、ＨＦ、ＨＢｒ、ＨＩ、Ｈ２Ｓ、ＨＣＮ、ＨＳＣＮ、ＨＣｌＯ、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、またはカルボン酸である方法が開示される。
【０７１７】
カルボン酸がエタン酸、プロパン酸、またはブタン酸である方法が開示される。
【０７１８】
安定化溶液が複数の酸性物質を含む方法が開示される。
【０７１９】
変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨが、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ６．８、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ７．５、約ｐＨ９．０ないし約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ６．８、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ７．５、約ｐＨ８．５ないし約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ６．８、約ｐＨ８．０ないし約ｐＨ７．５の範囲へ低下される方法が開示される。
【０７２０】
変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨが、約ｐＨ９．０以下、約ｐＨ８．５以下、約ｐＨ８．０以下、約ｐＨ７．５以下へ低下される方法が開示される。
【０７２１】
安定化溶液が１種類以上の塩を含む方法が開示される。
【０７２２】
塩がトリス−ＨＣｌ、トリス−ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、または組み合わせである方法が開示される。
【０７２３】
トリス−ＨＣｌがｐＨ７．０ないし８．０である方法が開示される。
【０７２４】
塩がトリス−ＥＤＴＡである方法が開示される。
【０７２５】
安定化溶液が、約５０ｍＭないし約５００ｍＭトリスおよび約１ｍＭないし約５ｍＭ ＥＤＴＡを含む方法が開示される。
【０７２６】
損傷ＤＮＡ混合物が毎分約１℃以下の速度で冷却される方法が開示される。
【０７２７】
損傷ＤＮＡ混合物が毎分約１％以下の速度で冷却される方法が開示される。
【０７２８】
損傷ＤＮＡ混合物が室温までまたは６０℃ないし７０℃、５０ないし６０℃、４０℃ないし５０℃、３０℃ないし４０℃、５０℃ないし７０℃未満まで冷却される方法が開示される。
【０７２９】
変性溶液が１種類以上の塩を含む方法が開示される。
【０７３０】
塩がトリス−ＨＣｌ、トリス−ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、または組み合わせである方法が開示される。
【０７３１】
トリス−ＨＣｌがｐＨ７．０ないし８．０である方法が開示される。
【０７３２】
塩がトリス−ＥＤＴＡである方法が開示される。
【０７３３】
変性溶液が約５０ｍＭないし約５００ｍＭトリスおよび約１ｍＭないし約５ｍＭ ＥＤＴＡを含む方法が開示される。
【０７３４】
損傷ＤＮＡ試料がゲノムＤＮＡの分解されたＤＮＡ断片を含む方法が開示される。
【０７３５】
損傷ＤＮＡの複製および修復が、損傷ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼの存在下でインキュベートすることによって達成される方法が開示される。
【０７３６】
ポリメラーゼが、損傷ＤＮＡの３’末端を伸長することができるＤＮＡポリメラーゼである方法が開示される。
【０７３７】
ＤＮＡポリメラーゼがφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＢＳＴＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの改変形、逆転写酵素、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｏｌＩ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼＩの改変形である方法が開示される。
【０７３８】
ＤＮポリメラーゼがφ２９ＤＮＡポリメラーゼである方法が開示される。
【０７３９】
損傷ＤＮＡがキットを用いて増幅され、キットが変性溶液、安定化溶液、一組のプライマー、およびＤＮポリメラーゼを含む方法が開示される。
【０７４０】
損傷ＤＮＡ試料が細胞溶解物であり、細胞溶解物は細胞をアルカリ性条件へ曝露することによって生じ、細胞溶解物が全ゲノムを含む方法が開示される。
【０７４１】
細胞のアルカリ性条件への曝露に続いて、細胞溶解物の第１の部分を、細胞溶解物の第１の部分に含まれる損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進する条件へ曝露し、細胞溶解物のｐＨを低下させることが細胞溶解物の第１の部分のｐＨを低下させて第１の安定化した細胞溶解物を生じることおよび細胞溶解物の第２の部分のｐＨを低下させて第２の安定化した細胞溶解物を生じることを含み、細胞溶解物のｐＨを低下させることに続いて、第２の安定化した細胞溶解物中の損傷ＤＮＡの末端の一時的変性を促進しおよび第１の安定化した細胞溶解物中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を維持する条件下で混合し、それによって安定化した細胞溶解物混合物を生じ、および安定化された細胞溶解物をインキュベートする前に、一時的に変性した損傷ＤＮＡの末端の、実質的に変性した損傷ＤＮＡへのアニーリングを促進する条件下で、安定化された細胞溶解物混合物を冷却し、安定化された細胞溶解物をゲノムの複製を促進する条件下でインキュベートすることがまた損傷ＤＮＡの複製を促進し、損傷ＤＮＡのアニーリングされた末端が複製をプライミングし、損傷ＤＮＡの複製が複製された鎖の修復を結果として生じることを含む方法が開示される。
【０７４２】
損傷ＤＮＡを増幅する方法であって、第１の損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を促進する条件へ第１の損傷ＤＮＡ試料を曝露し、それによって変性した損傷ＤＮＡ試料を生じ、変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨを低下させて、安定化した変性した損傷ＤＮＡ試料を生じ、第２の損傷ＤＮＡ試料を、安定化した変性した損傷ＤＮＡ試料と、第２の試料中の損傷ＤＮＡの末端の一時的変性を促進しおよび安定化した変性した損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡの実質的な変性を維持する条件下で混合し、それによって損傷ＤＮＡ混合物を生じ、損傷ＤＮＡ混合物を、一時的に変性した損傷ＤＮＡの末端の、実質的に変性した損傷ＤＮＡへのアニーリングを促進する条件下で冷却し、アニーリングした損傷ＤＮＡを、損傷ＤＮＡの複製を促進する条件下でインキュベートし、損傷ＤＮＡのアニーリングした末端が複製をプライミングし、損傷ＤＮＡの複製は複製された鎖の修復を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換されることを含む方法が開示される。
【０７４３】
第２の損傷ＤＮＡ試料を安定化された変性した損傷ＤＮＡ試料と混合する間、第１の損傷ＤＮＡ試料を加熱する温度が維持される方法が開示される。
【０７４４】
第２の損傷ＤＮＡ試料を安定化された変性した損傷ＤＮＡ試料と混合する際、安定化された変性した損傷ＤＮＡ試料のｐＨがさらに実質的な変性を生じるほど高くも低くもない方法が開示される。
【０７４５】
第１の損傷ＤＮＡ試料が損傷ＤＮＡ試料の一部であり、第２の損傷ＤＮＡ試料が同一の損傷ＤＮＡ試料の一部である方法が開示される。
【０７４６】
第１の損傷ＤＮＡ試料が第２の損傷ＤＮＡ試料と同一の起源に由来する方法が開示される。
【０７４７】
第１の損傷ＤＮＡ試料が第２の損傷ＤＮＡ試料と同一の生物に由来する方法が開示される。
【０７４８】
第１の損傷ＤＮＡ試料が第２の損傷ＤＮＡ試料と同一の組織に由来する方法が開示される。
【０７４９】
第２の損傷ＤＮＡ試料が、安定化した変性した損傷ＤＮＡ試料と、第２の損傷ＤＮＡ試料中の損傷ＤＮＡを一時的に変性させる温度にておよびそのような長さの時間、混合される方法が開示される。
【０７５０】
温度が約７０℃以下であり、および時間の長さが約３０秒以下である方法が開示される。
【０７５１】
第２の損傷ＤＮＡ試料が、安定化された変性した損傷ＤＮＡ試料と、ＤＮＡをさらに損傷しない温度にて混合される方法が開示される。
【０７５２】
温度が約６０℃ないし約７０℃、約５０℃ないし約６０℃、約４０℃ないし約５０℃、約２５℃ないし約４０℃、約２５℃ないし約７０℃である方法が開示される。時間の長さが約３０秒間である方法が開示される。
【０７５３】
核酸を増幅する方法であって、核酸を含むとみられる試料をアルカリ性条件へ曝露し、試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された試料を生じ、および試料からの核酸の増幅を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含む方法もまた開示される。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって試料中の核酸から置換され、複製された鎖は低い増幅偏りを有する。
【０７５４】
核酸を増幅する方法であって、核酸を含みうる試料をアルカリ性条件へ曝露し、アルカリ性条件が試料中に存在しうる細胞の溶解を促進し、試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された試料を生じ、および試料からの核酸の増幅を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含む方法もまた開示される。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって試料中の核酸から置換され、複製された鎖は低い増幅偏りを有する。
【０７５５】
増幅混合物中の核酸の濃度は、プライマーのハイブリダイゼーションを核酸の再会合よりも有利にすることができる。増幅混合物中の核酸の濃度は１０ｎｇ／μｌ以下であることができる。増幅混合物中の核酸の濃度は８ｎｇ／μｌ以下、６ｎｇ／μｌ以下、５ｎｇ／μｌ以下、４ｎｇ／μｌ以下、３ｎｇ／μｌ以下、２ｎｇ／μｌ以下、１ｎｇ／μｌ以下、または０．５ｎｇ／μｌ以下であることができる。増幅混合物中の核酸の濃度は１００ｎｇ／μｌ以下であることができる。
【０７５６】
増幅混合物中の核酸の量は、複製された鎖における低い増幅偏りを結果として生じうる閾値であるかまたはそれを上回ることができる。増幅混合物は少なくとも１００ｎｇの核酸を含みうる。増幅試料は少なくとも１５０ｎｇ、少なくとも２００ｎｇ、少なくとも３００ｎｇ、少なくとも４００ｎｇ、少なくとも５００ｎｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、または少なくとも３ｍｇの核酸を含みうる。増幅混合物は少なくとも１０ｎｇの核酸を含みうる。
【０７５７】
複製された鎖の増幅偏りは、試料中の少なくとも１０個の標的配列に関して２０倍未満であることができる。複製された鎖の増幅偏りは、試料中の少なくとも１０個の標的配列に関して１０倍未満であることができる。複製された鎖の遺伝子座発現量は、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して少なくとも１０％であることができる。複製された鎖の遺伝子座発現量は、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％であることができる。複製された鎖の遺伝子座発現量は、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して少なくとも１０％であることができる。
【０７５８】
複製された鎖の増幅偏りは、５０倍未満であることができる。複製された鎖の増幅偏りは、４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、または４倍未満であることができる。複製された鎖の増幅偏りは、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して、５０倍未満であることができる。
【０７５９】
試料は細胞を含むことができ、アルカリ性条件が細胞の溶解を促進し、アルカリ性条件が細胞溶解物を結果として生じる。試料はアルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こしうる温度を超えてまたはそのような時間加熱に供する必要は無い。試料は核酸を含むことができ、核酸はゲノムを含み、核酸の複製はゲノムの複製を結果として生じる。試料中の核酸の複製は、ゲノムの全部または相当な部分の複製を結果として生じる。ゲノムは真核ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、脊椎動物ゲノム、魚類ゲノム、哺乳類ゲノム、ヒトゲノム、細菌ゲノム、微生物ゲノム、またはウイルスゲノムであることができる。ゲノムは増幅混合物中の核酸の少なくとも５０％を含みうる。ゲノムは増幅混合物中の核酸の少なくとも９０％を含みうる。ゲノムは増幅混合物中の核酸の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含みうる。
【０７６０】
核酸は複数のゲノムを含むことができ、核酸の複製は複数のゲノムの複製を結果として生じる。ゲノムのうち少なくとも２つは異なる生物のゲノムであることができる。少なくとも１つのゲノムはヒトゲノムであることができおよび少なくとも１つのゲノムは細菌ゲノム、ウイルスゲノム、微生物ゲノム、または病原体ゲノムであることができる。少なくとも１つのゲノムは真核ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、脊椎動物ゲノム、魚類ゲノム、哺乳類ゲノム、ヒトゲノム、細菌ゲノム、微生物ゲノム、またはウイルスゲノムであることができ、および少なくとも１つのゲノムは真核ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、脊椎動物ゲノム、魚類ゲノム、哺乳類ゲノム、ヒトゲノム、細菌ゲノム、微生物ゲノム、またはウイルスゲノムである。ゲノムは増幅混合物中の核酸の少なくとも５０％を含みうる。ゲノムは増幅混合物中の核酸の少なくとも９０％を含みうる。ゲノムは増幅混合物中の核酸の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含みうる。
【０７６１】
試料は真核試料、植物試料、動物試料、脊椎動物試料、魚類試料、哺乳類試料、ヒト試料、非ヒト試料、細菌試料、微生物試料、ウイルス試料、生物学的試料、血清試料、血漿試料、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、組織溶解物試料、組織培養細胞試料、口腔塗抹試料、口腔洗浄液試料、糞便試料、ミイラ化組織試料、法医学試料、検死試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、無生物試料、空気試料、土壌試料、樹液試料、金属試料、化石試料、土砂試料、地球上の試料、地球外の試料、またはその組み合わせであることができる。試料は血清試料または血漿試料であることができる。試料を溶解溶液と混合することによって試料をアルカリ性条件に曝露することができる。溶解溶液は塩基、緩衝剤、または組み合わせを含みうる。溶解溶液は塩基を含むことができ、塩基は水酸化カリウムである。溶解溶液は４００ｍＭＫＯＨを含みうる。溶解溶液は４００ｍＭ ＫＯＨおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含みうる。溶解溶液は１００ｍＭ ＫＯＨを含みうる。溶解溶液は１００ｍＭ ＫＯＨおよび２．５ｍＭＥＤＴＡを含みうる。試料は等しい容量の溶解溶液と混合することができる。
【０７６２】
試料のｐＨは約ｐＨ７．０ないし約ｐＨ６．８の範囲へ低下させることができる。試料のｐＨは試料を安定化溶液と混合することによって低下させることができる。安定化溶液は緩衝剤、酸、または組み合わせを含みうる。安定化溶液は緩衝剤を含むことができ、緩衝剤はｐＨ４のトリス−ＨＣｌである。安定化溶液は８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４を含みうる。安定化溶液は２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４を含みうる。試料は等しい容量の安定化溶液と混合することができる。
【０７６３】
試料をアルカリ性条件に曝露すること、試料のｐＨを低下させること、および安定化された試料をインキュベートすることは同一の反応チャンバー内で実施することができる。反応チャンバーは、チューブ、試験管、エッペンドルフチューブ、ベッセル、マイクロベッセル、プレート、ウェル、マイクロウェルプレートのウェル、マイクロタイタープレートのウェル、チャンバー、マイクロ流体チャンバー、マイクロマシンチャンバー、密閉チャンバー、ホール、凹部、小窪、シャーレ、表面、膜、マイクロアレイ、ファイバー、グラスファイバー、光ファイバー、ファイバー織物、フィルム、ビーズ、瓶、チップ、コンパクトディスク、成型ポリマー、粒子、または微粒子を含みうる。表面は商品であることができる。反応チャンバーは、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能基化シラン、ポリプロピルフマラート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアミノ酸、または組み合わせを含みうる。核酸を増幅混合物のインキュベート前に精製または抽出する必要は無い。試料中の核酸を試料中の他の物質から分離する必要は無い。安定化された試料中の核酸を安定化された試料中の他の物質から分離する必要は無い。
【０７６４】
安定化された試料中の核酸は、水を除く重量で、純度０．０１％未満、純度０．１％未満、純度０．５％未満、純度１％未満、純度５％未満、純度１０％未満、または純度２０％未満であることができる。試料をインキュベート前に相当な精製に供する必要は無い。試料をインキュベート前に遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、沈澱、濾過、または透析に供することができる。
【０７６５】
本方法はさらに複製された鎖を検出することを含みうる。複製された鎖を検出することは、複製された鎖の存在、量、または存在および量を検出することを含みうる。複製された鎖の存在、量、または存在および量は、１種類以上の標的配列の複製された鎖の存在、量、または存在および量を検出することによって達成される。複数の対立遺伝子、遺伝子座、または両方の量を検出することができる。複製された鎖の検出は、試料が核酸を含むことを示す。
【０７６６】
複製された鎖は、５００以上の遺伝子座、４００以上の遺伝子座、３００以上の遺伝子座、２００以上の遺伝子座、１００以上の遺伝子座、５０以上の遺伝子座、４０以上の遺伝子座、３０以上の遺伝子座、２０以上の遺伝子座、１５以上の遺伝子座、１０以上の遺伝子座、８以上の遺伝子座、６以上の遺伝子座、５以上の遺伝子座、４以上の遺伝子座、３以上の遺伝子座、２以上の遺伝子座、または１以上の遺伝子座に関して対立遺伝子欠落が無い、対立遺伝子欠落に関して分析することができる。複製された鎖は５００以上の遺伝子座、４００以上の遺伝子座、３００以上の遺伝子座、２００以上の遺伝子座、１００以上の遺伝子座、５０以上の遺伝子座、４０以上の遺伝子座、３０以上の遺伝子座、２０以上の遺伝子座、１５以上の遺伝子座、１０以上の遺伝子座、８以上の遺伝子座、６以上の遺伝子座、５以上の遺伝子座、４以上の遺伝子座、３以上の遺伝子座、２以上の遺伝子座、または１以上の遺伝子座に関して対立遺伝子欠落が５％未満である、対立遺伝子欠落に関して分析することができる。
【０７６７】
試料中の核酸の存在を検出する方法であって、試料をアルカリ性条件へ曝露し、試料のｐＨを低下させて安定化された試料を生じ、および試料からの核酸の複製を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含み、核酸の複製が複製された鎖を結果として生じ、および複製された鎖を検出し、複製された鎖の検出が試料が核酸を含むことを示すことを含む方法もまた開示される。
【０７６８】
核酸の存在を検出する方法であって、核酸を含みうる試料をアルカリ性条件へ曝露し、アルカリ性条件が試料中に存在しうる細胞の溶解を促進し、試料のｐＨを低下させて安定化された試料を生じ、および試料からの核酸の複製を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含み、核酸の複製が複製された鎖を結果として生じ、および複製された鎖を検出し、複製された鎖の検出が、試料が核酸を含むことを示すことを含む方法もまた開示される。
【０７６９】
本方法はさらに複製された鎖を定量することを含みうる。複製された鎖の量は、試料中に存在する核酸の量の指標となりうる。試料は３以上の生物に由来する核酸を含むことができ、複製された鎖を検出することが少なくとも１の生物を検出する。試料は生態系全体に由来する核酸を含むことができ、複製された鎖を検出することが少なくとも１の生物を検出する。
【０７７０】
試料中の生物の存在を検出する方法であって、試料をアルカリ性条件へ曝露し、試料のｐＨを低下させて安定化された試料を生じ、試料からの核酸の複製を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含み、核酸の複製が複製された鎖を結果として生じ、および複製された鎖の１種類以上の配列を含む１種類以上の生物を同定し、それによって試料中の生物の存在を検出することを含む方法もまた開示される。
【０７７１】
複製された鎖の１種類以上の配列を含む１種類以上の生物は、複製された鎖の少なくとも一部を配列決定して複製された鎖の１種類以上の配列を得て、複製された鎖の１種類以上の配列を検索文字列として核酸配列のデータベースを連続的に検索し、および検索の結果を、試料中に存在する可能性が高いおよび試料中に存在する可能性が低い生物の配列として同定し、それによって試料中の生物の存在を検出することによって同定できる。試料は生態系全体に由来する核酸を含むことができ、試料中の生物の少なくとも１は変異生物であることができ、変異生物はデータベース中に存在する同一の種類の生物の配列からの変異配列を含むことができ、複製された鎖の１種類以上の配列を含む生物の種類を同定することによって少なくとも１の生物が同定される。複製された鎖の少なくとも一部を配列決定することは、複数の核酸プローブのうち少なくとも１種類へのハイブリダイゼーションによって達成できる。核酸プローブはマイクロアレイ上に固定化されている。試料は２の生物に由来する核酸を含むことができ、複製された鎖の１種類以上の配列を含む生物の種類を同定することによって、少なくとも一方の生物が同定される。
【０７７２】
試料は実質的に無細胞の試料であることができる。試料は血清試料または血漿試料であることができる。試料は水試料であることができる。複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって試料中の核酸から置換されうる。核酸は、指数ローリング・サークル増幅（ＥＲＣＡ）、およびローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、自己維持的配列複製（３ＳＲ）、Ｑβ−レプリカーゼを用いる増幅、およびサイクルシークエンシングを用いる複製でありうる。
【０７７３】
核酸を増幅する方法であって、試料をアルカリ性条件へ曝露し、試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された試料を生じ、および試料からの核酸の複製を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含む方法もまた開示される。核酸の複製は複製された鎖を結果として生じ、複製された鎖は低い増幅偏りを有し、増幅混合物中の核酸の濃度は、プライマーのハイブリダイゼーションを核酸の再会合よりも有利にし、増幅混合物中の核酸の量は、複製された鎖における低い増幅偏りを結果として生じうる閾値であるかまたはそれを上回る。
【０７７４】
核酸を増幅する方法であって、核酸を含みうる試料をアルカリ性条件へ曝露し、アルカリ性条件が試料中に存在しうる細胞の溶解を促進し、試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された試料を生じ、および試料からの核酸の増幅を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含む方法もまた開示される。核酸の複製は複製された鎖を結果として生じ、複製された鎖は低い増幅偏りを有し、増幅混合物中の核酸の濃度は、プライマーのハイブリダイゼーションを核酸の再会合よりも有利にし、増幅混合物中の核酸の量は、複製された鎖における低い増幅偏りを結果として生じうる閾値であるかまたはそれを上回る。
【０７７５】
核酸は、指数ローリング・サークル増幅（ＥＲＣＡ）、およびローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、自己維持的配列複製（３ＳＲ）、Ｑβ−レプリカーゼを用いる増幅、およびサイクルシークエンシングを用いて複製することができる。
【０７７６】
核酸増幅のための反応条件を特定する方法であって、被験試料を試験条件下で増幅して、増幅された核酸を作製し、増幅された核酸における増幅偏りを測定し、増幅偏りが目的の閾値未満であれば、その試験条件が核酸増幅のための条件として特定される方法もまた開示される。
【０７７７】
核酸は、指数ローリング・サークル増幅（ＥＲＣＡ）、およびローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、自己維持的配列複製（３ＳＲ）、Ｑβ−レプリカーゼを用いる増幅、およびサイクルシークエンシングを用いて複製することができる。
【０７７８】
核酸増幅のための反応条件を特定する方法であって、被験試料をアルカリ性条件に曝露し、被験試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された被験試料を生じ、および増幅された核酸を生じる条件下で被験増幅混合物をインキュベートし、被験増幅混合物は安定化された被験試料の全部または一部を含み、試験条件が核酸の複製を促進し、被験増幅混合物中の核酸の濃度が被験核酸濃度であり、被験増幅混合物中の核酸の量が核酸の試験量であり、および増幅された核酸における増幅偏りを測定し、増幅偏りが目的の閾値未満であれば、その核酸の試験濃度が核酸増幅のために用いるべき濃度でありおよび核酸のその試験量が核酸増幅に用いるべき閾量であることを含む方法もまた開示される。
【０７７９】
核酸増幅のための反応条件を特定する方法であって、被験試料をアルカリ性条件に曝露し、アルカリ性条件が試料中に存在しうる細胞の溶解を促進し、被験試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された被験試料を生じ、および増幅された核酸を生じる条件下で被験増幅混合物をインキュベートし、被験増幅混合物は安定化された被験試料の全部または一部を含み、試験条件が核酸の複製を促進し、被験増幅混合物中の核酸の濃度が被験核酸濃度であり、被験増幅混合物中の核酸の量が核酸の試験量であり、および増幅された核酸における増幅偏りを測定し、増幅偏りが目的の閾値未満であれば、その核酸の試験濃度が核酸増幅のために用いるべき濃度でありおよび核酸のその試験量が核酸増幅に用いるべき閾量であることを含む方法もまた開示される。
【０７８０】
核酸を増幅する方法であって、試料をアルカリ性条件へ曝露し、試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された試料を生じ、および試料からの核酸の複製を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含む方法もまた開示される。核酸の複製は複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって試料中の核酸から置換され、複製された鎖は目的の閾値よりも低い増幅偏りを有し、増幅混合物中の核酸の濃度が所定の濃度以上であり、増幅混合物中の核酸の量が閾量以上であり、所定の濃度および閾量が、被験試料をアルカリ性条件に曝露し、被験試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された被験試料を生じ、および、核酸の複製を促進する条件下で被験増幅混合物をインキュベートして増幅された核酸を生じ、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含み、被験増幅混合物中の核酸の濃度が被験核酸濃度であり、被験増幅混合物中の核酸の量が核酸の試験量であり、および増幅された核酸における増幅偏りを測定し、増幅偏りが目的の閾値未満であれば、その核酸の試験濃度が所定の濃度でありおよび核酸のその試験量が閾量であることによって決定されることを含む方法もまた開示される。
【０７８１】
核酸を増幅する方法であって、核酸を含みうる試料をアルカリ性条件へ曝露し、アルカリ性条件が試料中に存在しうる細胞の溶解を促進し、試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された試料を生じ、および試料からの核酸の増幅を促進する条件下で増幅混合物をインキュベートし、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含む方法もまた開示される。核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって試料中の核酸から置換され、複製された鎖は目的の閾値よりも低い増幅偏りを有し、増幅混合物中の核酸の濃度が所定の濃度以上であり、増幅混合物中の核酸の量が閾量以上である方法もまた開示される。所定の濃度および閾量は、被験試料をアルカリ性条件に曝露し、被験試料の全部または一部のｐＨを低下させて安定化された被験試料を生じ、および、核酸の複製を促進する条件下で被験増幅混合物をインキュベートして増幅された核酸を生じ、増幅混合物が安定化された試料の全部または一部を含み、被験増幅混合物中の核酸の濃度が被験核酸濃度であり、被験増幅混合物中の核酸の量が核酸の試験量であり、および増幅された核酸における増幅偏りを測定し、増幅偏りが目的の閾値未満であれば、その核酸の試験濃度が所定の濃度でありおよび核酸のその試験量が閾量であることによって決定される。
【０７８２】
全ゲノムを増幅するためのキットであって、安定化溶液、一組のプライマーを含む反応混合物、およびＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼ混合物を含むキットもまた開示される。キットはさらに、１Ｍジチオスレイトール、１Ｘリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５、および対照ＤＮＡテンプレートを含むことができ、安定化溶液は８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４を含み、反応混合物は１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、および０．２ｍＭランダム六量体プライマーを含み、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。
【０７８３】
試料をアルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こす温度を上回っておよびそのような時間にわたって加熱する必要は無い。試料をアルカリ性条件へ曝露すること、試料のｐＨを低下させること、および安定化された試料をインキュベートすることの間に、核酸を精製または抽出する必要は無い。相当な精製が遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、沈澱、濾過、または透析を含む必要は無い。相当な精製が遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出、またはカラムクロマトグラフィーを含む必要は無い。インキュベート前に試料を遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出、カラムクロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせに供することができる。相当な精製は遠心分離、抽出、クロマトグラフィー、濾過、透析、またはこれらの組み合わせを含みうる。相当な精製は、アルカリ性条件によってまたはｐＨの低下によって引き起こされた沈澱以外の沈澱を含みうる。相当な精製は遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出、カラムクロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを含みうる。
【０７８４】
試料を溶解溶液と混合することによって試料をアルカリ性条件へ曝露することができる。溶解溶液は塩基を含みうる。塩基は塩基水溶液であることができる。塩基は水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア、アニリン、ベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ジフェニルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、Ｎ−メチルアニリン、モルホリン、ピリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、水酸化アルミニウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、またはＤＢＵ（１，８−ジアゾビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン）であることができる。
【０７８５】
塩基は水酸化カリウムであることができる。溶解溶液は４００ｍＭ ＫＯＨを含みうる。溶解溶液は４００ｍＭＫＯＨおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含みうる。溶解溶液は４００ｍＭ ＫＯＨおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡから成ることができる。溶解溶液は複数の塩基性物質を含みうる。試料を等しい容量の溶解溶液と混合することができる。溶解溶液は緩衝剤を含みうる。緩衝剤はリン酸緩衝剤、グッド緩衝剤、ＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、またはビス−トリスプロパンであることができる。溶解溶液は複数の緩衝剤を含みうる。
【０７８６】
試料のｐＨは約ｐＨ７．０ないし約ｐＨ６．８の範囲へ低下させることができる。試料のｐＨは試料を安定化溶液と混合することによって低下させることができる。安定化溶液は緩衝剤を含みうる。緩衝剤はリン酸緩衝剤、グッド緩衝剤、ＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、またはビス−トリスプロパンであることができる。緩衝剤はｐＨ４のトリス−ＨＣｌであることができる。安定化溶液は８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４を含みうる。安定化溶液は８００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４から成ることができる。安定化溶液は複数の緩衝剤を含みうる。試料は等しい容量の安定化溶液と混合することができる。
【０７８７】
安定化溶液は酸を含みうる。酸は塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、アセチルサリチル酸、アスコルビン酸、炭酸、クエン酸、ギ酸、硝酸、過塩素酸、ＨＦ、ＨＢｒ、ＨＩ、Ｈ２Ｓ、ＨＣＮ、ＨＳＣＮ、ＨＣｌＯ、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、またはカルボン酸であることができる。カルボン酸はエタン酸、プロパン酸、またはブタン酸であることができる。安定化溶液は複数の酸性物質を含みうる。インキュベートは実質的に等温であることができる。試料をインキュベートの温度を実質的に上回って加熱する必要は無い。試料を試料中の核酸の明らかな変性を引き起こす温度を上回ってまたはそのような時間加熱に供する必要は無い。
【０７８８】
本方法はさらに、核酸を含みうる第２の試料をアルカリ性条件へ曝露し、アルカリ性条件が試料中に存在しうる細胞の溶解を促進し、試料のｐＨを低下させて第２の安定化された試料を生じ、および第２の試料からの核酸の増幅を促進する条件下で第２の安定化された試料をインキュベートし、第２の試料中の核酸の複製は、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって第２の試料中の核酸から置換されることを含みうる。
【０７８９】
第２の試料は、第１の試料と同一の種類の生物に由来する試料であることができる。第２の試料は、第１の試料と同一の種類の組織に由来する試料であることができる。第２の試料は、第１の試料と同一の生物に由来する試料であることができる。第２の試料は、第１の試料とは異なる時に得ることができる。第２の試料は、第１の試料とは異なる生物に由来する試料であることができる。第２の試料は、第１の試料とは異なる種類の組織に由来する試料であることができる。第２の試料は、第１の試料とは異なる種の生物に由来する試料であることができる。第２の試料は、第１の試料とは異なる系統の生物に由来する試料であることができる。第２の試料は、第１の試料とは異なる細胞区画に由来する試料であることができる。
【０７９０】
例
下記は本開示の方法の一部の具体的態様を例証する。
高温ＭＤＡ手順例
試薬組成
溶液Ａ：４００ｍＭ ＫＯＨ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８
溶液Ｂ：８００ｍＭトリス塩酸，ｐＨ４
１．増幅前のゲノムＤＮＡテンプレートの変性。
ａ．変性溶液 溶液Ａを１：４にＨ２Ｏを用いて希釈する（たとえば１００μＬの溶液Ａを３００μＬのＨ２Ｏ中へ）。
ｂ．安定化溶液 溶液を１：５にＨ２Ｏを用いて希釈する（たとえば、１００μＬの溶液Ｂを４００μＬのＨ２Ｏ中へ）。
注：変性溶液および安定化溶液は使用前に新しく希釈する。溶液Ａの入った瓶は密栓して保存する。
２．２．５μＬの変性溶液を、氷上にて２．５μＬのゲノムＤＮＡを入れた０．２ｍＬサーモサイクラーチューブのそれぞれに加える。ピペットで５回吸引上下することによってよく混合する。チューブまたはプレートを氷上で３分間インキュベートする。
３．変性反応を３分後に、５μＬの安定化溶液を各試料および対照に加えることによって停止する。チューブを氷から取り出す。直ちに増幅手順へ進む。
４．複数置換増幅
必要な量のゲノムＤＮＡ、
０．３Ｍトレハロース、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、
３７．５ｍＭトリス／ＨＣｌｐＨ：７、
５０ｍＭ ＫＣｌ、
２０ｍＭ硫酸アンモニウム、
１ｍＭｄＮＴＰ、
５０μＭエキソヌクレアーゼ耐性ランダム六量体オリゴヌクレオチド、
４０ユニットのファイ２９ＤＮＡポリメラーゼ。
４０℃にて６〜１６時間インキュベートする。
【０７９１】
増幅例
Ａ．試薬
４Ｘ混合物
ＤＮＡポリメラーゼ混合物
対照ｇＤＮＡテンプレート（１０ｎｇ／μＬ）
ストック溶解または変性溶液
安定化溶液
１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）
１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）
滅菌蒸留／脱イオン水（Ｈ２Ｏ）
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム−２Ｈ２Ｏ（ＥＤＴＡ）
水酸化カリウム（ＫＯＨ）、ペレット
１ＸＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）
３０℃および６５℃インキュベーターまたは熱サイクル制御装置
０．５μＬから１０００μＬマイクロピペッター
１．５ｍＬポリプロピレン微量遠心チューブ
０．２ｍＬサーマルサイクラーチューブ、または９６ウェルサーマルサイクラープレート
疎水性フィルター付きピペットチップ
【０７９２】
Ｂ．保存および安定性
冷凍した試薬および組成物を−７０℃以下で保存する。活性の損失が無いことを確実にするため、ストック溶解溶液および変性溶液は新しく調製すべきでありおよび室温（２０〜２５℃）にて約１週間保存しうる（下記参照）。
【０７９３】
Ｃ．手順
１．ストック溶解溶液の調製
５ｍＬバイアルのストック溶解溶液−０．４Ｍ ＫＯＨ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）−細胞溶解にまたは精製ｇＤＮＡ変性における使用のために一週間以内に使用のため、ストック溶液から新しく調製（下記参照）。
【０７９４】
５Ｍ ＫＯＨおよび０．５Ｍ ＥＤＴＡストック溶液の調製：固く再密栓したストック溶液を、室温にて、調製日から最長１年間保存することができる。
ストック５Ｍ ＫＯＨを、２８ｇのＫＯＨペレットおよび終容量１００ｍＬとするのに十分なＨ２Ｏを加えることによって調製する。ＫＯＨペレットが乾燥していて（塊になっていない）および溶解前に空気にできるかぎり短く曝されることを確実にする。
【０７９５】
ストック０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を、１８．６ｇのＥＤＴＡを８０ｍＬのＨ２Ｏへ加えることによって調製する。
【０７９６】
マグネティックスターラー上でよくかくはんする。ＮａＯＨを用いてｐＨを８．０へ調整する。ＥＤＴＡの二ナトリウム塩は、ｐＨを約８．０へ調整するまで溶液へ入れない。スターラーバーを取り出し、および終容量を１００ｍＬに合わせる。代替的に、市販の分子生物学グレード０．５ＭＥＤＴＡｐＨ８．０を用いることができる。
【０７９７】
ストック溶解溶液の調製：０．４ｍＬの５Ｍ ＫＯＨおよび０．１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４．５ｍＬの滅菌蒸留／脱イオンＨ２Ｏへ加えることによって、５ｍＬのストック溶解溶液をバイアルに調製する。
【０７９８】
注：５Ｍ ＫＯＨストックの入った瓶、および、ストック溶解溶液の入ったバイアルは、両方とも、ＣＯ２からの中性化を避けるために直ちに密栓すべきである。ストック溶解溶液のバイアルは、活性の損失が無いことを確実にするため、室温（２０〜２５℃）にて約１週間保存しうる。
【０７９９】
２．抽出手順
ｉ．組織培養細胞からの迅速ゲノムＤＮＡ抽出：
反応は氷上に準備して実施する。
【０８００】
１ＸＰＢＳ中の組織培養細胞を、約１００，０００細胞／ｍＬの濃度へ希釈する。
【０８０１】
希釈した組織培養細胞の各試料３μＬを増幅のために、ラベルを付した０．２ｍＬサーマルサイクラーチューブまたは９６ウェルサーマルサイクラープレートへ、必要に応じて入れる。
【０８０２】
意図する反応の数を決定し、および十分な量の新しい「溶解溶液」を、１／１０容の１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）をストック溶解溶液へ加えることによって調製する（たとえば、３．５μＬの１Ｍ ＤＴＴを３１．５μＬのストック溶解溶液へ、１０反応のための３５μＬを調製するために）。溶解溶液は新しい抽出毎に、直前に新しく調製しなければならない。
【０８０３】
３．５μＬの溶解溶液を、１ＸＰＢＳで希釈した３μＬの組織培養細胞を入れた各チューブへ加える。ピペットで３回吸引上下することによってよく混合し、および氷上で１０分間静置する。
【０８０４】
３．５μＬの安定化溶液を、溶解した組織培養細胞の各チューブへ加え、およびピペットで３回吸引上下することによって混合する。１０μＬの溶解した組織培養細胞をここで、同一の０．２ｍＬサーマルサイクラーチューブにおける増幅反応のためのテンプレートＤＮＡとして用いることができる（直ちに増幅手順へ進む）。
【０８０５】
ｉｉ．血液またはバフィーコートからの迅速ゲノムＤＮＡ抽出：
反応は氷上に準備して実施する。
【０８０６】
０．５μＬのヒト全血またはバフィーコート試料を増幅のために２．５μＬの１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が入った、ラベルを付した０．２ｍＬサーマルサイクラーチューブまたは９６ウェルサーマルサイクラープレートへ入れ、計３μＬとする。
【０８０７】
意図する反応の数を決定し、および十分な量の新しい「溶解溶液」を、１／１０容の１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）をストック溶解溶液へ加えることによって調製する（たとえば、３．５μＬの１Ｍ ＤＴＴを３１．５μＬのストック溶解溶液へ、１０反応のための３５μＬを調製するために）。溶解溶液は新しい抽出毎に、直前に新しく調製しなければならない。
【０８０８】
３．５μＬの溶解溶液を、１ＸＰＢＳで希釈した３μＬの血液またはバフィーコートを入れた各チューブへ加える。ピペットで３回吸引上下することによってよく混合し、および氷上で１０分間静置する。
【０８０９】
３．５μＬの安定化溶液を、溶解した血液またはバフィーコート細胞の各チューブへ加え、およびピペットで３回吸引上下することによって混合する。１０μＬの溶解した血液またはバフィーコート細胞をここで、同一の０．２ｍＬサーマルサイクラーチューブにおける増幅反応のためのテンプレートＤＮＡとして用いることができる（直ちに増幅手順へ進む）。
【０８１０】
ｉｉｉ．増幅テンプレートとしての予め精製されたｇＤＮＡの調製：
すべての反応は室温に準備して実施する。
【０８１１】
次の段階に進む前に、終容量２．５μＬを与える適当な量のＴＥおよびゲノムＤＮＡテンプレートが入った反応チューブを準備する。使用すべきゲノムＤＮＡの量を決定し、および適当な量の１ＸＴＥ緩衝液を、ラベルを付した０．２ｍＬサーマルサイクラーチューブ、または９６ウェルサーマルサイクラープレートへ入れ、各試料の総容量を２．５μＬとする。たとえば、１μＬのｇＤＮＡテンプレートを使用すべき場合は、１．５μＬの１ＸＴＥ緩衝液を最初に、および次いで１μＬのｇＤＮＡテンプレートを加える。陽性対照として、１０ｎｇ（１μＬ）の供給された対照ｇＤＮＡテンプレートを含む反応混合物を試料の組に含める。収率は５０μＬ反応について４５μｇ±１０％であるべきである。
【０８１２】
増幅前のゲノムＤＮＡテンプレートの変性。新しい「変性溶液」を、ストック溶解溶液を１：８にＨ２Ｏを用いて希釈することによって調製する（たとえば、５μＬのストック溶解溶液を３５μＬのＨ２Ｏ中へ）。新しい「希釈安定化溶液」を、安定化溶液を１：１０にＨ２Ｏを用いて希釈することによって調製する（たとえば、５μＬの安定化溶液を４５５μＬのＨ２Ｏへ）。変性溶液および希釈安定化溶液は、新しい実験毎の前に新しく調製すべきであり、および適当な活性のために室温に保たなければならない。変性溶液および希釈安定化溶液は氷上に置いてはならない。
【０８１３】
変性反応。２．５μＬの変性溶液を、２．５μＬの試料または対照ゲノムＤＮＡが入ったサーマルサイクラーチューブまたはウェルのそれぞれに室温にて加える。ピペットで３回吸引上下することによってよく混合する。チューブまたはプレートを室温にて３分間インキュベートする。
【０８１４】
変性反応を３分後に、５μＬの希釈安定化溶液をそれぞれの試料および対照チューブまたはウェルに加えることによって停止する。ここで各チューブまたはウェルには１０μＬの変性した試料または対照溶液がある（直ちに増幅手順へ進む）。
【０８１５】
３．増幅手順
単離されたｇＤＮＡまたは溶解した血液および細胞のための増幅反応
【０８１６】
ＤＮＡポリメラーゼ混合物（使用直前に氷上で融解すべきである）を除くすべてのキット構成要素を融解し、および次いで手順を通じて氷上に保持する。４Ｘ混合物は融解する際に沈澱を生じうる。沈澱は１０秒間ボルテックスすると完全に溶解する。
【０８１７】
増幅「反応主混合物」を調製する。単一の反応だけを実施する場合、本混合物は０．２ｍＬチューブ中に氷上で集めることができる。（一反応について下記の表１を参照）。複数の試料については、下記の表１で：「１０反応当たりの容量（μＬ）」の見出しの下に示す比率での試薬容量を用いる。反応主混合物を１．５ｍＬ微量遠心管中に氷上で集める（１０試料毎に，残余液の損失に備えて１１反応に十分な反応主混合物を調製する）。成分を表１に記載の順序で加える。Ｈ２Ｏおよび４Ｘ混合物の添加後に、ＤＮＡポリメラーゼ混合物の添加前に短くボルテックスしおよび本混合物を遠沈する。「反応主混合物」を氷上に保持する。
【０８１８】
ＤＮＡポリメラーゼ混合物は反応主混合物への添加の直前に氷上で融解すべきである。主混合物は氷上に保持し、およびＤＮＡポリメラーゼ混合物の添加の３０分以内に増幅に使用すべきである。
【表１】
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【０８１９】
１０μＬの変性したゲノムＤＮＡまたは溶解した細胞が入ったチューブまたはプレートを室温にてベンチにセットする。４０μＬの反応主混合物を各試料チューブまたはプレートへ加える。ピペットで３回吸引上下することによってよく混合し、および混合物を短時間遠沈する。
【０８２０】
チューブまたはプレートを直ちに３０℃インキュベーター（または３０℃を保つように設定した熱サイクル制御装置）へ移し、および一夜（約１６時間）インキュベートを開始する。サーマルサイクラーを用いる場合は、６５℃にて３分間のインキュベートによって反応を終了し（酵素を不活性化するため）、および次いでｈｏｌｄｔｈｅ試料を回収するまで４℃に保つようプログラムする。６５℃インキュベーターを用いる場合は１０分間のインキュベートによって反応を終了する（酵素を不活性化するため）。
【０８２１】
増幅されたＤＮＡ産物チューブまたはプレートを−２０℃にて用時まで保存する。
【０８２２】
Ｄ．品質対照
増幅産物のＱＣ分析
下記の手順は増幅産物の品質を試験するのに用いることができる。
【０８２３】
ＤＮＡ収率の定量化。ピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）（モレキュラー・プローブズ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ））は、２本鎖ＤＮＡに特異的な、蛍光を基礎とする核酸定量化法であり、２本鎖ＤＮＡ産物を定量化するのに用いることができる。増幅産物が未使用の反応プライマーを含むため、２本鎖ＤＮＡに特異的であるＤＮＡ定量化法を用いることが重要である。予想される収率は５０μＬ反応当たり４５μｇ±１０％である。
【０８２４】
増幅産物の定性分析。反応が完了した後に、０．１ないし１μｇの産物をＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭトリス−ホウ酸、ｐＨ８．０、２ｍＭＥＤＴＡ）中の１．０％アガロースゲルを通して、適当な色素（たとえばＧｅｌＳｔａｒＸ（登録商標）（キャンブレックス社（Ｃａｍｂｒｅｘ））、エチジウムブロマイド、またはＳＹＢＲグリーン（登録商標）（モレキュラー・プローブズ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）））を用いて電気泳動によって分析し、およびＵＶライトボックスを用いて撮影することができる。産物は、平均長が１０ｋｂより大の、２ｋｂから高分子量にわたるサイズの均一な分布として現れる。
【０８２５】
増幅産物中の遺伝子座発現量の定量化。特定の遺伝子座の定量化は、アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）によって開発されたＴａｑＭａｎ（登録商標）測定系を用いて実施することができる。ＴａｑＭａｎ測定は、特定のゲノムＤＮＡ配列の収率を測定することができる。ｃ−ＪＵＮ（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、品番４３１８２９９ＦまたはＴ）およびヒトＲＦＬＰＯ（大リボソームタンパク質）（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、品番４３１０８７９Ｅ）を測定する２つの代表的なＴａｑＭａｎ測定法が、増幅性能の評価に用いられている。ＲＦＬＰＯおよびｃ−ＪＵＮに関しては、テンプレートｇＤＮＡに対する増幅されたｇＤＮＡ中のある特定の遺伝子座のコピー数間の比として定義される、遺伝子座発現量は、開始テンプレートヒトｇＤＮＡの品質に応じて、４０ないし２００％の間にあるべきである。
【実施例】
【０８２６】
Ａ．実施例１：６ヌクレオチドプライマーを用いた全ゲノム増幅
本実施例は本開示の方法のいくつかの実施形態の実証および結果の分析および比較を記載する。例示される方法は本開示の、特異的配列を有する六量体（６ヌクレオチド）プライマーを用いた全ゲノム増幅の複数置換増幅形式である。異なるプライマー、および異なる数のプライマー、をさまざまな反応において使用した。これらのすべての例は、ヒト全ゲノムを効率的に増幅するために、特異的ヌクレオチド配列の１または少数のプライマーだけを用いる。
【０８２７】
１．複数置換増幅（ＭＤＡ）によるヒトゲノムＤＮＡの増幅
本開示の方法の一実施形態の一例では、０．２ｍｌチューブ中に集められた１００μｌ反応（３連で）は、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、３７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｍＭｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、５０μＭエキソヌクレアーゼ耐性六量体、および８００ユニット／ｍｌファイ２９ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。反応は１６時間３０℃にてインキュベートし、および６５℃への３分間の加熱によって終了した。ＭＤＡ反応収率はピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）定量化によってラムダＤＮＡ標準曲線（モレキュラー・プローブズ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ））を用いて決定した。
【０８２８】
２．増幅産物の定量的ＰＣＲ分析
増幅されたＤＮＡの品質はＴａｑＭａｎ分析を用いて評価した。ＴａｑＭａｎ分析はＡＢＩ７７００および７０００配列検出系の両方を用いて取扱説明書（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ））に従って実施した。ＴａｑＭａｎ反応は５０μｌの１ｘプラチナＴａｑポリメラーゼ緩衝液、５ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μｌのＲＯＸリファレンス色素（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））、１ユニットのプラチナＴａｑポリメラーゼ（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）））、各０．３μＭの順方向および逆方向ＰＣＲプライマー、０．２５μＭのＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ蛍光／消光プローブ、および１μｇのＭＤＡ増幅されたＤＮＡから成る。精製されたヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））を用いて０、０．００１、０．０１、０．１、および１μｇのｇＤＮＡの標準曲線を作成し、ＭＤＡ増幅されたＤＮＡを定量化した。遺伝子座発現量（ＭＤＡ／ｇＤＮＡ）はパーセントとして記録し、および１００（遺伝子座コピー数／μｇＭＤＡ産物）／（遺伝子座コピー数／μｇ ｇＤＮＡ）として導いた。１００％の値は、増幅されたＤＮＡに関する遺伝子座コピー数が、増幅されていないゲノムＤＮＡに関する遺伝子座コピー数と等しいことを示す。
【０８２９】
３．単一プライマー
ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。単一の６ヌクレオチドＡｌｕ特異的プライマー（すなわち、その配列はＡｌｕ反復配列に由来した）であるＡｌｕＲ１１（ＡＧＣＧＡＧ）をＭＤＡ反応に使用した。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図１に示す通り、ＡｌｕＲ１１は遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【０８３０】
４．２プライマー
２種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。２種類のプライマー配列はＡＧＴＧＧＧおよびＡＧＡＧＡＧであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図２に示す通り、２種類の６ヌクレオチドプライマーは遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【０８３１】
５．３プライマー
３種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。プライマーは、配列ＡＧＣＣＧＧ、ＡＧＴＡＧＧ、およびＡＧＴＴＧＧ．を有する６ヌクレオチド非Ａｌｕプライマー（すなわち、その配列はＡｌｕ反復配列に由来しなかった）であった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図３に示す通り、３種類のプライマーは遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【０８３２】
６．４プライマー
４種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。プライマーは配列ＡＧＧＣＧＧ、ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、およびＡＧＴＧＡＧ．を有する６ヌクレオチドプライマーであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図４に示す通り、４種類のプライマーは遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【０８３３】
７．５プライマー
５種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。最初の例では、プライマーは配列ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＴＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、およびＡＧＡＣＡＧを有する６ヌクレオチドプライマーであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図５に示す通り、これらの５種類のプライマーは遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【０８３４】
第２の例では、プライマーは配列ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、およびＡＧＡＣＡＧ．を有する６ヌクレオチドプライマーであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図６に示す通り、これらの５種類のプライマーは遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【０８３５】
第３の例では、プライマーは配列ＡＧＴＡＧＧ、ＡＧＧＴＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＡＣＡＧ、およびＡＧＴＧＡＧ．を有する６ヌクレオチドプライマーであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図７に示す通り、これらの５種類のプライマーは遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【０８３６】
第４の例では、プライマーは配列ＡＧＣＧＡＧ，ＡＧＧＡＧＧ，ＡＧＡＧＧＧ，ＡＧＧＧＡＧ，およびＡＧＴＧＡＧを有する６ヌクレオチドプライマーであった。プライマーのうちの１種類（ＡＧＣＧＡＧ）はＡｌｕ配列に特異的であった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図８に示す通り、これらの５種類のプライマーは遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【０８３７】
８．９プライマー
９種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。プライマーは、ＡｌｕＲ９Ｈと呼ばれる６ヌクレオチドＡｌｕ特異的プライマーであった。９種類すべてのＡｌｕ特異的プライマーの名称および配列を表２に示す。星印はホスホチオエート結合を示す。計１０遺伝子座を分析した。図９に示す通り、９種類のプライマーは遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【表２】
2010158250.tif 000003
【０８３８】
９．１２プライマー
１２種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。プライマーは、ＡｌｕＲ１２Ｈと呼ばれる６ヌクレオチドＡｌｕ特異的プライマーであった。１２種類すべてのＡｌｕ特異的プライマーの名称および配列を表３に示す。星印はホスホチオエート結合を示す。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図１０に示す通り、１２種類のプライマーは遺伝子座発現量によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
【表３】
2010158250.tif 000004
【０８３９】
Ｂ．実施例２：添加剤の非存在下で３０℃にて、または、０．３Ｍトレハロースの存在下で４０℃にて実施した、ＭＤＡ反応におけるＤＮＡ合成の測定。
ＭＤＡ反応を３０℃にて添加剤無しで、または４０℃にて０．３Ｍトレハロースありで、原則的に高温ＭＤＡに関して上に記載した手順を用いて実施した。インプットテンプレートの量は０ｎｇ、０．３ｎｇ、３ｎｇ、または３０ｎｇのどれかであった。記載の温度でのＭＤＡ反応の１６時間後に、総ＤＮＡ合成をピコグリーン測定法を用いて定量した。結果を図１１に示す。
【０８４０】
Ｃ．実施例３：４０℃にて添加剤の非存在下でまたは０．３Ｍトレハロースまたは０．４Ｍスクロースまたは０．４Ｍグルコースの存在下で実施した１６時間ＭＤＡ反応におけるＤＮＡ合成の測定。
ＭＤＡ反応を４０℃にて、添加剤無しで、または０．３Ｍトレハロースまたは０．４Ｍスクロースまたは０．４Ｍグルコースの存在下で、原則的に高温ＭＤＡに関して上に記載した手順を用いて実施した。インプットテンプレートの量は０ｎｇまたは０．００３ｎｇまたは０．０３ｎｇまたは０．３ｎｇまたは３ｎｇまたは３０ｎｇのどれかであった。ＭＤＡ反応の１６時間後に、総ＤＮＡ合成をピコグリーン測定法を用いて定量した。結果を図１２に示す。
【０８４１】
Ｄ．実施例４：ヌクレアーゼ耐性六量体プライマーを用いた全ゲノム増幅
本実施例は本開示の方法の一実施形態の実証および結果の分析および比較を記載する。例示される方法は本開示の、ヌクレアーゼ耐性ランダム六量体プライマーを用いた全ゲノム増幅の複数置換増幅形式である。本実施例中の一部の反応は、本開示の方法の好ましい一形式で、試料を変性条件に供せずに実施した。他の反応では、テンプレートＤＮＡを増幅前に変性に供した。ＭＤＡはφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。
【０８４２】
１．材料および方法
ｉ．ＤＮＡおよび酵素。
ヒトゲノムＤＮＡ試料群であるヒト変異群・コーカサス系１００人群（参照番号ＨＤ１００ＣＡＵ）は、コリエル研究所細胞バンク（ＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）から入手した。ヒトゲノムＤＮＡはまたプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）からも入手した。チオリン酸修飾ランダム六量体（５'−ＮｐＮｐＮｐＮｐｓＮｐｓＮ−３'）はモレキュラー・ステージング社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｔａｇｉｎｇ）で合成され、φ２９ＤＮＡポリメラーゼはアマシャム・ファルマシア・バイオテク社（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）からであり、および酵母ピロホスファターゼはベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）からであった。ＤＮＡサイズマーカー（１００ｂｐＤＮＡラダー、１ｋｂＤＮＡラダー）はギブコＢＲＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）からであった。
【０８４３】
ｉｉ．ヒトゲノムＤＮＡの増幅。
ヒトゲノムＤＮＡ（３００ｎｇないし０．０３ｎｇ、表示の通り）を総容量５０μｌで０．２ｍｌチューブに入れ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１００μＭエキソヌクレアーゼ耐性六量体の終濃度を与えた。プライマーアニーリングを増加させるための熱処理段階（すなわち、変性条件への曝露）は、個々の実験について、表示の通り含めたかまたは省略した。アニーリング反応は、ＰＣＲシステムサーモサイクラー（パーキン・エルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））内で９５℃へ３分間加熱しおよび４℃へ冷却した。反応を次いで、３７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｍＭｄＮＴＰｓ、１ユニット／ｍｌの酵母ピロホスファターゼ、５０μＭエキソヌクレアーゼ耐性六量体、および８００ユニット／ｍｌのφ２９ＤＮＡポリメラーゼの終濃度を含む終容量１００μｌとした。放射性標識したα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰ、を表記の通り加えた。反応は１８時間３０℃にてインキュベートした。酸沈澱可能な放射性デオキシリボヌクレオチド産物の組み込みはグラスファイバーフィルターを用いて判定した。反応を終止させた後、３μｌの部分標本を、制限エンドヌクレアーゼＡｌｕＩを用いて切断し、およびトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中で１．０％アガロースゲルを通じた電気泳動によって、ＧｅｌＳｔａｒ（モレキュラー・プローブズ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ））またはＳＹＢＲグリーン（モレキュラー・プローブズ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ））で染色して分析し、およびストーム８６０蛍光画像処理装置（ＡＰＢ）を用いて撮影した。変性ゲル分析を３０ｍＭＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で１．０％アガロースゲルを通じた電気泳動によって実施した。乾燥ゲル中の放射性産物をストーム８６０蛍光画像処理装置を用いて可視化した。
【０８４４】
ｉｉｉ．サザン分析。
１０μｇの全ゲノム増幅ＤＮＡまたはヒトゲノムＤＮＡ対照を、ｗｉｔｈＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、および１ｘＴＢＥ緩衝液中で１％アガロースゲルを通じて分離した。標準サザン分析手順（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、ゲル電気泳動によって分離したＤＮＡ断片中の特異的配列の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．）ＪＭｏｌＢｉｏｌ．９８：５０３−５１７（１９７５）） を、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））を用いて実施した。副甲状腺ホルモン（ｐ２０．３６）のエキソン断片プローブおよび、Ｄ１３Ｓ１２（ｐ９Ｄ１１）およびチログロブリン（ｐＣＨＴ．１６／８）遺伝子座に対するＲＦＬＰマーカープローブはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。プローブはＮＥＢｌｏｔランダムプライマー標識化法（ニュー・イングランド・バイオラブズ社、マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ））を用いて放射性標識した。メンブレンはメンブレンハイブリダイゼーション緩衝液（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））中で１時間プレハイブリダイズし、および放射性標識化プローブと一夜ハイブリダイズした。ハイブリダイズしたメンブレンは２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で２回５分間室温にて、１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１５分間４２℃にて、および０．１ｘＳＳＣで２回１５分間６５℃にて洗浄した。メンブレンを次いで一夜露光しおよびストーム８６０蛍光画像処理装置を用いて分析した。
【０８４５】
ｉｖ．定量的ＰＣＲ分析。
ＴａｑＭａｎ分析は、ＡＢＩ７７００を取扱説明書（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ））に従って用いて、１μｇの増幅されたＤＮＡをテンプレートとして用いて実施した。試験した８遺伝子座に対するＴａｑＭａｎ測定試薬はＡＢＩから入手した。８遺伝子座およびそれらの染色体位置は、酸性リボソームタンパク質（１ｐ３６．１３）；コネキシン４０（１ｑ２１．１）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体１（３ｐ２１）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６（６ｑ２７）；ケモカイン（Ｃ−Ｃ）受容体７（１７ｑ２１）；ＣＸＣＲ５バーキットリンパ腫受容体１（ｃｈｒ．１１）；ｃ−Ｊｕｎ（１ｐ３２−ｐ３１）；およびＭＫＰ１二重特異性ホスファターゼ１（５ｑ３４）であった。コネキシン４０はセントロメアの近くに位置し、およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６はテロメアの近くに位置する。インプットテンプレートについての標準曲線を、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子座コピー数と比較した、増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座コピー数を決定するために作製した。標準曲線は０、０．００１、０．０１、０．１、０．５、および１μｇのゲノムＤＮＡから作製した。
【０８４６】
ｖ．縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）によるヒトゲノムＤＮＡの増幅。
ヒトゲノムＤＮＡ（３００ｎｇないし０．０３ｎｇの範囲にわたる）を記載の通り増幅した（テレニウス（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ）他，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３：７１８−７２５（１９９２））。放射性標識したα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰを、ＰＣＲ産物収率の定量のために反応へ加えた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）からであった。ＤＯＰ−ＰＣＲ増幅はＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲシステムズサーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））を用いて実施した。ＤＯＰ−ＰＣＲ産物中の遺伝子座発現量を、ＴａｑＭａｎ測定法（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））を用いて定量的に分析した。
【０８４７】
ｖｉ．プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）によるヒトゲノムＤＮＡの増幅。
ヒトゲノムＤＮＡ（３００ｎｇないし０．０３ｎｇの範囲にわたる）を総容量６０μｌで０．２ｍｌチューブに入れ、終濃度３３μＭのＰＥＰランダムプライマー（５'−ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ−３'）を記載の通りに（チャン（Ｚｈａｎｇ）他，単一の細胞からの全ゲノム増幅：遺伝子分析への示唆（Ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９： ５８４７−５８５１ （１９９２））与えた。放射性標識したα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰを、ＰＣＲ産物収率の定量のために反応へ加えた。ＰＥＰ反応はＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲシステムズサーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））を用いて実施した。ＰＥＰ産物中の遺伝子座発現量を、ＴａｑＭａｎ測定法（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））を用いて定量的に分析した。
【０８４８】
ｖｉｉ．一塩基多型の遺伝子型分析
ここで分析したＳＮＰは下記の染色体位置を有した；１８２２、２５１、および２２１、１３ｑ３２；４６５、４５８、および４７４、１９ｑ１３；ＶＣＡＭ、１ｐ３１；ＩＬ−８、４ｑ１３；ＰＤＫ２−２、１７ｐ；ＳＮＰ２１、不明。測定はファルキ（Ｆａｒｕｑｉ）他、ローリング・サークル増幅を用いた一塩基多型の高処理量遺伝子型分析（Ｈｉｇｈ−ＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｗｉｔｈ Ｒｏｌｌｉｎｇ・Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．）ＢＭＣＧｅｒｚｏｍｉｃｓ，２：４ （２００１）によって記載された通りに実施した。要約すると、ＤＮＡ変性、アニーリングおよびライゲーション反応をエッペンドルフ・マスター・サイクラー（エッペンドルフ・サイエンティフィク社（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ドイツ）内で実施した。指数ＲＣＡ反応はリアルタイムＡＢＩ７７００配列検出器（パーキン・エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））で実施した。リガーゼを欠く２つの対照もまた各ＳＮＰについて実施し、測定の特異性を確認した。ＤＮＡ試料は、ライゲーション反応においてテンプレートとして使用する前に、制限エンドヌクレアーゼＡｌｕＩを用いて消化した。ライゲーション反応は、９６ウェルマイクロアンプ・オプティカルプレート（パーキン・エルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））中に、１ユニットのＡｍｐリガーゼ（エピセンター・テクノロジーズ社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭＮＡＤ、および０．０１％トリトン（登録商標）Ｘ−１００を含む１０μｌ反応容量で準備した。標準の反応は、０．５ｐＭ開環パッドロックおよび１００ｎｇのＡｌｕＩ消化ゲノムＤＮＡを含んだ。ＤＮＡは、反応を９５℃にて３分間加熱し、その後アニーリングおよびライゲーションを６０℃にて２０分間実施することによって変性した。２０μｌのＥＲＣＡ混合物を１０μｌライゲーション反応へ加えた。ＥＲＣＡ混合物は、５％ＴＭＡシュウ酸、４００μＭｄＮＴＰ混合物、各１μＭの２種類のプライマー、８ユニットのＢｓｔポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州）、および２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および０．１％トリトン（登録商標）Ｘ−１００を含む１Ｘ修飾ＴｈｅｒｍｏＰｏｌＩＩ反応緩衝液を含んだ。
【０８４９】
ｖｉｉｉ．比較ゲノムハイブリダイゼーション。
ゲノムＤＮＡ調製物をニック翻訳し、増幅された試料についてはビオチンで、または増幅していない対照試料についてはジゴキシゲニンで修飾したヌクレオチドを組み込んだ。等モル量の増幅されたおよび増幅していないＤＮＡを、反復ＤＮＡクロスハイブリダイゼーションを抑制するために、ＣｏｔＩＤＮＡの存在下および非存在下で同時ハイブリダイズした。特異的ハイブリダイゼーションシグナルを、アビジン−ＦＩＴＣおよび抗ジゴキシゲニンローダミンによって検出した。中期染色体の取り込み画像を、アプライド・イメージングＣＧＨソフトウェアプログラムを用いて分析し、および蛍光プロファイルを作製した。対照として、異なる標識化をした増幅されたかまたは増幅していないＤＮＡを、上記に概説した通りに混合し、ハイブリダイズし、検出し、および比率分析に供した。
【０８５０】
２．結果
本開示の方法の実施形態を用いて、３０ｐｇ（約９ゲノムコピー）のヒトゲノムＤＮＡが約３０μｇへ４時間以内に増幅された。平均断片長は１０ｋｂより大であった。増幅されたヒトＤＮＡは１０個の一塩基多型（ＳＮＰ）に関して正常の発現量を示した。８染色体遺伝子座中の最大偏りは、ＰＣＲを基礎とするＷＧＡ法についての４から６桁と対照的に、３倍未満であった。本開示の方法を用いて増幅されたヒトＤＮＡは、一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型分析、染色体染色、サザンブロッティングおよびＲＦＬＰ分析、サブクローニング、およびＤＮＡ配列決定を含む遺伝子分析の一般的な方法について有用である。
【０８５１】
ランダム六量体プライマーおよびφ２９ＤＮＡポリメラーゼの、連鎖的な鎖置換反応である複数置換増幅（リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）への米国特許第６，１２４，１２０号明細書）における使用によって、直鎖のヒトゲノムＤＮＡが容易に増幅されることが見出されている。ＭＤＡの本開示の形式による３０℃でのゲノムＤＮＡの増幅は、４〜６時間にわたって指数的である。本開示の方法におけるテンプレート濃度の増幅収率に及ぼす影響を図１３に示す。１００ｆｇないし１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを９５℃にて５分間変性し、および次いでＭＤＡを３０℃にて上記の通り実施した。ＤＮＡ合成を定量するため、図１３に示す時間に部分標本を取った。増幅反応（１００μｌ）は約２５〜３０μｇのＤＮＡ産物を、５対数範囲（１００ｆｇから１０ｎｇ；図１３）にわたってゲノムＤＮＡの開始量に関わらず生じた。一部の用途については、このことは、ＤＮＡ濃度を測定または調整する必要無しに以降の遺伝子分析を可能にする。
【０８５２】
ＭＤＡ反応の産物は下記の通り特徴づけられた。放射性標識したヒトゲノム増幅試料（０．６μｇ）をアルカリ性アガロースゲル（１％、トリス−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液）を通して上記の通り電気泳動し、染色し、および撮影した。平均産物長は１０ｋｂを上回った。
【０８５３】
増幅されたＤＮＡの完全性を検討するために、ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子（染色体１１ｐ１５．２−１５．１）内の制限断片をサザンブロット上で分析した。１．９ｋｂの制限酵素断片が、わずか１０ゲノムコピーから増幅された（または１０６倍増幅）ＭＤＡを基礎とするＷＧＡ産物について観察された。これらのＭＤＡ反応は熱変性段階を含み、および増幅は上記の通り実施した。ＥｃｏＲＩＤＮＡ消化物を、約１．９ｋｂＤＮＡ断片へハイブリダイズした、副甲状腺ホルモン遺伝子（ｐ２０．３６）の放射性標識化したゲノム断片を用いてプロービングした。ＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡ調製物は、ゲノムＤＮＡ、さまざまな量のインプットゲノムＤＮＡからＭＤＡによって増幅されたＤＮＡ、またはインプットゲノムＤＮＡテンプレートを欠くＭＤＡ反応であった。これは、ＭＤＡの産物は、制限エンドヌクレアーゼによる切断後に長さ数ｋｂの特異的ＤＮＡ断片を与えるのに十分に長いことを実証する。
【０８５４】
ＰＣＲを基礎とするＷＧＡ法が典型的には長さ数百ヌクレオチドだけの産物を生じる一方（テレニウス（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ）他，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３：７１８−７２５ （１９９２）；チューン（Ｃｈｅｕｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９３： １４６７６−１４６７９（１９９６）；チャン（Ｚｈａｎｇ）他，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９： ５８４７−５８５１（１９９２））、本開示の方法の産物はＲＦＬＰを基礎とする遺伝子型分析に十分な長さと完全性であった：１６名のランダム個人が、２．１ｋｂ、および１．１ｋｂＰｓｔＩ断片の存在下で正確に遺伝子型決定された。具体的には、ＰｓｔＩＤＮＡ消化物を不変３．８ｋｂＤＮＡ断片および多型２．１ｋｂ（対立遺伝子Ａ）または１．１ｋｂ（対立遺伝子Ｂ）ＤＮＡ断片とハイブリダイズしたＲＦＬＰマーカーＤ１３Ｓ１２遺伝子座（ｐ９Ｄ１１）の放射性標識化したゲノム断片を用いてプロービングした。ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ調製物は、ＤＮＡテンプレートの熱変性無しのＭＤＡによって増幅された（１０，０００ｘ増幅）、ゲノムＤＮＡおよび５名の異なる患者ＤＮＡであった。
【０８５５】
ＭＤＡの前の変性条件の省略は、長さ５ｋｂより大きい制限断片の検出に有用であった。ＭＤＡ反応を、２つのチログロブリン対立遺伝子についてヘテロ接合であるゲノム標的ＤＮＡの熱変性ありまたは無しで実施した。増幅は上記の通り実施した。ＴａｑＩＤＮＡ消化物を、不変１ｋｂおよび３ｋｂＤＮＡ断片および多型５．８ｋｂ（対立遺伝子Ａ）または５．２ｋｂ（対立遺伝子Ｂ）ＤＮＡ断片とハイブリダイズしたチログロブリン遺伝子（ｐＣＨＴ．１６／８）の放射性標識化したゲノム断片を用いてプロービングした。ＴａｑＩ切断したＤＮＡ調製物は、ゲノムＤＮＡ、９５℃予熱段階ありのＭＤＡ反応（１０，０００ｘ）によって増幅されたＤＮＡ、および予熱段階無しのＭＤＡ反応（１０，０００ｘ）であった。熱変性無しのＭＤＡは、大きさが５．２および５．８ｋｂのＤＮＡ断片の良好な収率を与えた一方、５．２または５．８ｋｂＤＮＡ断片のどちらも、テンプレートの熱変性ありのＭＤＡを用いては視認できなかった。
【０８５６】
増幅がゲノム配列の完全なカバー率および最小の増幅偏りを与える場合に、全ゲノム増幅からの最も有用な結果が得られる。また、増幅産物が、以降の遺伝子分析中に、増幅していないゲノムＤＮＡについても同様に実施することが好ましい。テンプレートの熱変性ありのＭＤＡ後のゲノムカバー率を、１０個のランダムに分布したＳＮＰに関して１００、１０，０００、または１００，０００倍の増幅後に検討した。１００，０００倍増幅されたＤＮＡにおける１つの遺伝子座（ＰＤＫ２−２）を例外として、増幅されたＤＮＡ中におけるすべての遺伝子座の存在が確認された（表４）。７２名に由来するＭＤＡＤＮＡをこれらのＳＮＰのうち１個について遺伝子型分析した。ＭＤＡによる１００倍増幅後、遺伝子型分析精度は９７％であり（７２のうち７０の遺伝子型が正しく判定された、表４、ＳＮＰ１８２２）、同一の方法によって遺伝子型分析された増幅していないゲノムと識別不能な結果であった。ＭＤＡを基礎とするＷＧＡはしたがって、大規模なＳＮＰ判定研究のために、特に資料入手可能性が限られている場合、複数遺伝子座特異的ＰＣＲプレ増幅に代わる魅力的な選択肢を提供する。
【表４】
2010158250.tif 000005
【０８５７】
配列偏りが、増幅法において生じる可能性があり、および、プライミング効率、テンプレート接触可能性、ＧＣ含量、およびテロメアおよびセントロメアへの近接といった因子の結果として起こりうる。本開示のＭＤＡ法の増幅偏りを、染色体１のセントロメアに近い遺伝子（コネキシン４０）および染色体６のテロメアに隣接する遺伝子（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６）を含む８遺伝子に関するＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲによって検討した。熱変性無しの１００、１，０００、および１０，０００倍ＭＤＡについて、最大増幅偏りは、最も高発現された遺伝子の最も低発現された遺伝子に対する比として表して、それぞれ２．７、２．３、および２．８だけであった。対照的に、ＰＣＲを基礎とする２つのＷＧＡ法であるＤＯＰ−ＰＣＲ（テレニウス（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ）他，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３：７１８−７２５（１９９２）；チューン（Ｃｈｅｕｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９３： １４６７６−１４６７９（１９９６））およびＰＥＰ（チャン（Ｚｈａｎｇ）他，ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９：５８４７−５８５１（１９９２））は、４〜６桁の増幅偏りを示した。これらの値は、ＰＣＲ媒介ＷＧＡ法の偏りの文献値と合致した；ＰＥＰは、同一の遺伝子の２対立遺伝子間でさえ最大５０倍の増幅偏りを生じることが報告されている（ポーニオ（Ｐａｕｎｉｏ）他，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１３８２−１３９０（１９９６））。注目すべきことに、ＭＤＡの３倍増幅偏りは１００ないし１００，０００倍増幅でほぼ一定に留まった。ＭＤＡを基礎とするＷＧＡで観察された、顕著な配列偏りの無いことは、φ２９ＤＮＡポリメラーゼの非常な連続性によって説明されうる（ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４： ８９３５−８９４０（１９８９））。ポリメラーゼのテンプレートへの固い結合は、ＤＮＡ一次または二次構造によって引き起こされる障害を通じての複製を確実にする。
【０８５８】
驚くべきことに、ＴａｑＭａｎ定量化は、増幅されたＤＮＡにおいて一部の遺伝子座がＭＤＡによって豊富になったことを示した；遺伝子座発現量が、ゲノムＤＮＡにおける発現量の１００％より大であった。ミトコンドリアＤＮＡの発現量は、開始ｇＤＮＡと増幅されたＤＮＡとの間で同一であった。サザンブロットおよび染色体染色実験は、反復配列がＭＤＡ産物中で低発現され、遺伝子の有効な増加を与えたことを示した。このように、増幅されたＤＮＡは、ゲノムＤＮＡと比較して、８遺伝子の１００〜３００％の間のコピー数を含んだ。反復配列低発現量の程度および種類を特定するためには追加の試験が必要となる。；この観察についての１つの仮説は、高度に反復する配列に対応するプライマーがＭＤＡ中に枯渇するというものである。しかし、ＰＣＲを基礎とするＷＧＡ産物は、最大７０％の増幅アーティファクトを含む（チューン（Ｃｈｅｕｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いる全ゲノム増幅は１ナノグラム未満のゲノムＤＮＡについて数百の遺伝子型分析を実施することを可能にする（Ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ ａｌｌｏｗｓ ｈｕｎｄｒｅｄｓ ｏｆｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｔｏ ｂｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｎａｎｏｇｒａｍ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ．） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ．９３： １４６７６−１４６７９ （１９９６））が、これとは対照的に、ＭＤＡを基礎とするＷＧＡ産物は完全にゲノム配列に由来するように見える。
【０８５９】
全ゲノムＭＤＡはまた、染色体カバー率の均一性に関して比較ゲノムハイブリダイゼーションによって試験された。ＭＤＡで生じたＤＮＡを、等量の増幅していないゲノムＤＮＡと共に、中期染色体と同時ハイブリダイズした。増幅反応は熱変性段階を含み、および増幅は上記の通り実施した。増幅されたおよび増幅していないＤＮＡ試料を、ニック翻訳してそれぞれビオチンヌクレオチドおよびジゴキシゲニンヌクレオチドを組み込んだ。特異的シグナルをアビジンＦＩＴＣおよび抗ジゴキシゲニンローダミンによって検出した。ＣｏｔＩ抑制を用いて、ＭＤＡプローブおよび増幅していないプローブのハイブリダイゼーションパターンは１００，０００倍増幅後でさえ識別不能であった。ＣｏｔＩ抑制無しでは、しかし、１００，０００倍増幅されたプローブはセントロメアシグナルの低下を生じ、反復セントロメア配列の一部の損失を示した。染色体腕の長さに伴うシグナルの均一性は、ＭＤＡを基礎とするＷＧＡが増幅偏りを誘導しないことのさらなる証拠であった。これらの結果は、ＭＤＡは染色体染色プローブの調製に関してＤＯＰＰＣＲと遜色が無いが（キム（Ｋｉｍ）他，パラフィン包埋前立腺腺がん腫瘍組織由来のＤＮＡの全ゲノム増幅および分子遺伝的分析（Ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ．） Ｊ Ｕｒｏｌ．１６２：１５１２−１５１８ （１９９９）；クライン（Ｋｌｅｉｎ）他，比較ゲノムハイブリダイゼーション、ヘテロ接合性の消失、および単一細胞のＤＮＡ配列分析（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｓ．） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６： ４４９４−４４９９ （１９９９）；ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）他，全ゲノム増幅および比較ゲノムハイブリダイゼーションによる単一細胞の詳細な染色体および分子遺伝学分析（Ｄｅｔａｉｌｅｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１２１４−１２１８（１９９９））、しかし後者と異なり、抑制ハイブリダイゼーションは単一のコピー配列の検出に必要でない可能性があることを示した。この方法は、比較ゲノムハイブリダイゼーション、核型分析および針生検材料または羊水穿刺試料といった限られた患者ＤＮＡ起源からのチップを基礎とする遺伝子分析のためのＤＮＡプローブ調製に非常に有益となる。
【０８６０】
ゲノムサブクローニングおよび配列決定のためには、ＭＤＡは、ＰＣＲを基礎とする方法に対していくつかの固有の長所を持つように見える。１０ｋｂより大の産物サイズはゲノムサブクローニングに適合する。増幅された材料のｉｎｖｉｖｏ増殖は必要無いため、ＭＤＡは「毒性」ゲノム配列を増幅するための効率的な方法を示しうる。加えて、ＭＤＡに用いられるφ２９ＤＮＡポリメラーゼは１０６〜１０７中１のエラー率を有し（エステバン（Ｅｓｔｅｂａｎ）他，ファイ２９ＤＮＡポリメラーゼの忠実度。タンパク質にプライミングされた開始とＤＮＡ重合との間の比較（Ｆｉｄｅｌｉｔｙｏｆ Ｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｉｍｅｄ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７１９−２７２６ （１９９３） ）、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼを用いるＰＣＲについての１０４中に約３とは対照的である（エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）およびクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ），ＤＮＡポリメラーゼ忠実度およびポリメラーゼ連鎖反応．（ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．１：１７−２４（１９９１））。したがって、 ＰＣＲ は、２０サイクル後には ９００ 塩基当たり約１の突然変異を蓄積する（サイキ（Ｓａｉｋｉ）他，温度安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマーを標的とするＤＮＡの酵素増幅（Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７− ４９１ （１９８８））。クローニングされたＭＤＡを基礎とするＷＧＡ産物の配列エラー率は、クローニングされたゲノムＤＮＡについての率と同様に見える。さらに、最小の増幅偏り、均一な収率、および測定の簡易さは、ゲノムサブクローニングおよび配列決定に用いられる自動化高密度マイクロウェル形式に使用可能にする。
【０８６１】
要約すると、ＭＤＡを基礎とするＷＧＡの有用性が、定量的ＰＣＲ、ＳＮＰ遺伝子型分析、制限断片のサザンブロット分析、および染色体染色を含むいくつかの用途について実証された。ＭＤＡがＷＧＡのための最適な方法に相当しうるいくつかの状況を考えることができる：第１に、ＷＧＡ中の忠実な複製が必要である用途、たとえば分子クローニング、または単一細胞分析；第２に、ＷＧＡ中の適当なゲノム発現量が決定的である用途、たとえばゲノム全体のＳＮＰ遺伝子型分析試験；および第３に、ＷＧＡ中の偏りの最小化が重要である場合、特に出生前診断（ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）およびウェルズ（Ｗｅｌｌｓ），ＰＧＤにおける近年の進歩および将来の開発（Ｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ＰＧＤ） Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｉｌ．１９： １１９３−１１９９ （１９９９） ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）およびデルハンティ（Ｄｅｌｈａｎｔｙ），全ゲノム増幅および単一細胞比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いるヒト着床前胚の比較染色体分析（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．） Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ．６： １ ０５５ １０６２（２０００））、およびヘテロ接合性の消失の評価（パールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）他，全ゲノム増幅、細胞ソーティング、および蛍光を基礎とするＰＣＲを用いるヘテロ接合性の消失分析（Ｌｏｓｓｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ，ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｂａｓｅｄ ＰＣＲ．）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４８２−４９１ （１９９９））といった細胞遺伝学試験。ＷＧＡへの顕著な必要性がある別の状況は、顕微解剖組織に由来するＤＮＡの増幅（キム（Ｋｉｍ）他，パラフィン包埋前立腺腺がん腫瘍組織由来のＤＮＡの全ゲノム増幅および分子遺伝的分析（Ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄｐｒｏｓｔａｔｅ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ．） Ｊ Ｕｒｏｌ．１６２： １５１２−１５１８ （１９９９）、頬側塗抹標本（ギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）他，全ゲノム増幅した口腔スワブＤＮＡのＨＬＡクラスＩＩ分類（ＨＬＡｃｌａｓｓ ＩＩ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｏｕｔｈ ｓｗａｂ ＤＮＡ．）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．５６：５３０−５３８（２０００））、および保管された人類学試料（ブキャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ）他，稀な保存された人類学試料の長ＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ ＤＯＰ−ＰＣＲ ｏｆ ｒａｒｅａｒｃｈｉｖａｌ ａｎｔｈｒｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．） Ｈｕｍ Ｂｉｏｌ．７２： ９１１−９２５ （２００��））を含む。最後に、分類された個々の染色体から増幅されたＤＮＡを、全染色体特異的染色プローブの作製に用いることができる（ギリアー・ゲンシック（Ｇｕｉｌｌｉｅｒ−Ｇｅｎｃｉｋ）他，ニワトリ巨大染色体のそれぞれに特異的な全染色体染色プローブの作製（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ ｗｈｏｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｎｔｉｎｇ ｐｒｏｂｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｅａｃｈ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍａｃｒｏｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．）ＣｙｔｏｇｅｎｅｔＣｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．８７： ２８２−２８５ （１９９９））。
【０８６２】
Ｅ．実施例５：９５℃でのインキュベート時間の増加はテンプレートＤＮＡ鎖切断の増加を引き起こす。
本実施例は、顕著なテンプレートＤＮＡ鎖切断が９５℃（典型的な増幅反応においてＤＮＡを変性させるために用いられる）でのインキュベートによって生じること、および熱処理の持続時間を減少させることによって鎖切断が減少することを実証する。大部分の核酸増幅技術と同様に、開始ＤＮＡテンプレートの完全性が、増幅産生の速度および収率に重要な作用を有しうる。増幅すべき核酸が分解されている反応では、増幅産物の収率は品質および量の両方で低下しうる。本実施例は、９５℃でのインキュベート時間を減少させることによるテンプレートＤＮＡ鎖切断の減少を実証する。
【０８６３】
テンプレートＤＮＡの分解を明らかにするため、熱変性ありのＤＮＡテンプレート鎖分離に用いられる条件下で６種類の反応を実施した。ヒトゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を０．２ｍｌチューブに総容量５０μｌで入れ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の終濃度を与えた。反応を９５℃へＰＣＲシステムサーモサイクラー（パーキン・エルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））内で加熱し、および８μｌの部分標本を取りおよび表示の時間に氷上に置いた。各時点について、２μｌの部分標本を、０．８％アルカリ性アガロースゲル（３０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を通す電気泳動によって分析した。電気泳動後、ゲルを１ＸＴＢＥを用いて中性化し、ＳＹＢＲグリーンＩＩ（モレキュラー・プローブズ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ））を用いて染色し、およびストーム８６０蛍光画像処理装置（ＡＰＢ）を用いて撮影した。撮影されたＤＮＡの総量をゲルの各レーンについて測定し、および５０％のＤＮＡがより大きく、および５０％がより小さい断片サイズを、各時点で採取した試料について決定した。結果を図１４に示す。
【０８６４】
図に示す通り、テンプレートＤＮＡの顕著な切断が、３分間より長い９５℃でのインキュベート後に生じる。そのようなＤＮＡ切断は、インキュベートが１分間に限られる場合は相当に減少する。
【０８６５】
Ｆ．実施例６：９５℃でのＤＮＡテンプレートインキュベート時間の増加はＤＮＡ増幅の速度および収率の低下を引き起こす。
本実施例は、９５℃（典型的な増幅反応においてＤＮＡを変性させるために用いられる）でのテンプレートＤＮＡインキュベートの時間の増加が、ＤＮＡがＭＤＡによって増幅される速度および収率の両方における低下を引き起こすことを実証する。９５℃でのＤＮＡテンプレートインキュベートの省略は、ＤＮＡ増幅の最大の速度および収率を結果として生じる。
【０８６６】
９５℃にて実施例５に記載された条件下で処理されたテンプレートＤＮＡを用いて、６種類のＭＤＡ反応を実施した。精製されたヒトゲノムＤＮＡ（３ｎｇ）を０．２ｍｌチューブに、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む総容量５０μｌで入れた。反応をＰＣＲシステムサーモサイクラー（パーキン・エルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））内で９５℃へ表示の時間加熱しおよび４℃へ冷却した。これらの反応をその後、３７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭエキソヌクレアーゼ耐性六量体、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｍＭｄＮＴＰ、１ユニット／ｍｌの酵母ピロホスファターゼ、および８００ユニット／ｍｌのφ２９ＤＮＡポリメラーゼの終濃度を含む終容量１００μｌとした。放射性標識したα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰ、を加え、および反応を２２時間３０℃にてインキュベートした。部分標本を表示の時間に取り、および酸沈澱可能な放射性デオキシリボヌクレオチド産物の組み込みはグラスファイバーフィルターを用いて判定した。結果を図１５に示す。
【０８６７】
図に示す通り、ＤＮＡテンプレートの熱処理の省略は、ＤＮＡ合成の最適速度および収率を結果として生じる（０分間曲線を参照）。ＤＮＡテンプレート熱処理の持続時間を増加させることは、ＤＮＡ合成の速度および収率の連続的低下を結果として生じる（１分間、３分間、５分間、１０分間、および２０分間曲線を参照）。
【０８６８】
Ｇ．実施例７：９５℃でのＤＮＡテンプレートインキュベート時間の増加はＤＮＡ産物鎖サイズの低下を結果として生じる。
本実施例は、９５℃（典型的な増幅反応においてＤＮＡを変性させるために用いられる）でのテンプレートＤＮＡインキュベートの時間の増加が、ＭＤＡによって増幅されたＤＮＡ産物の長さの低下を引き起こすことを実証する。９５℃でのＤＮＡテンプレートインキュベートの省略は、ＤＮＡ増幅産物の最大のサイズを結果として生じる。
【０８６９】
９５℃にて実施例６に記載された条件下で処理されたテンプレートＤＮＡを用いて、６種類のＭＤＡ反応を実施した。放射性標識したα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰを加え、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰを加えた。反応は２２時間３０℃にてインキュベートし、および部分標本を表示の時間に取った。各時点について、２μｌの部分標本を、０．８％アルカリ性アガロースゲル（３０ｍＭＮａＯＨ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を通す電気泳動によって分析した。電気泳動後、ゲルを中性化しおよび実施例５に記載の通り撮影した。撮影されたＤＮＡの総量をゲルの各レーンについて測定し、および５０％のＤＮＡがより大きく、および５０％がより小さい断片サイズを、各時点から採取した試料について決定した。結果を図１６に示す。
【０８７０】
図に示す通り、ＤＮＡテンプレートの熱処理の省略は、最大のＤＮＡ産物の合成を結果として生じる。ＤＮＡテンプレート熱処理の持続時間を増加させることは、ＤＮＡ産物サイズの連続的な低下を結果として生じた。
【０８７１】
Ｈ．実施例８：９５℃でのＤＮＡテンプレートインキュベートの省略はＭＤＡによって増幅されたＤＮＡ産物における遺伝子座発現量の増加を結果として生じる。
本実施例は、９５℃（典型的な増幅反応においてＤＮＡを変性させるために用いられる）でのテンプレートＤＮＡインキュベートの省略が、ＭＤＡによって増幅されたＤＮＡ産物における８個のランダムに選択された遺伝子座の発現量の損失を結果として生じなかったことを実証する。９５℃でのＤＮＡテンプレートインキュベートの省略は実際、テンプレートゲノムＤＮＡと比較してＤＮＡ増幅産物の遺伝子座発現量における増加を結果として生じる。
【０８７２】
９５℃で処理したかまたは処理しなかったテンプレートＤＮＡを用いて２種類のＭＤＡ反応を実施した。精製されたヒトゲノムＤＮＡ（３ｎｇ）を０．２ｍｌチューブに、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１００Ｍエキソヌクレアーゼ耐性六量体を含む総容量５０μｌで入れた。アニーリング反応はＰＣＲシステムサーモサイクラー（パーキン・エルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））内で９５℃へ３分間加熱しおよび４℃へ冷却した。反応をその後、３７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭエキソヌクレアーゼ耐性六量体、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｍＭｄＮＴＰ、１ユニット／ｍｌの酵母ピロホスファターゼ、および８００ユニット／ｍｌのφ２９ＤＮＡポリメラーゼの終濃度を含む終容量１００μｌとした。熱変性段階を欠く増幅については、ＤＮＡテンプレート（３ｎｇ）を直接に０．２ｍｌチューブへ、３７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および５０μＭエキソヌクレアーゼ耐性六量体、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｍＭｄＮＴＰ、１ユニット／ｍｌの酵母ピロホスファターゼ、および８００ユニット／ｍｌのφ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む総容量１００μｌで入れた。反応を１８時間３０℃にてインキュベートした。
【０８７３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量ＰＣＲ分析を、ＡＢＩ７７００を取扱説明書（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））に従って用いて、１μｇのＭＤＡ増幅されたＤＮＡをテンプレートとして用いて実施した。試験した８遺伝子座に対するＴａｑＭａｎ（登録商標）測定試薬はＡＢＩから入手した。８遺伝子座およびそれらの染色体位置は、酸性リボソームタンパク質（１ｐ３６．１３）；コネキシン４０（１ｑ２１．１）；ｃ−Ｊｕｎ（１ｐ３２−ｐ３１）；ＭＫＰ１二重特異性ホスファターゼ１（５ｑ３４）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体７（１７ｑ２１）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体１（３ｐ２１）；ＣＸＣＲ５バーキットリンパ腫受容体１（ｃｈｒ．１１）；およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６（６ｑ２７）であった。コネキシン４０はセントロメアの近くに位置し、およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６はテロメアの近くに位置する。インプットテンプレートについての標準曲線を、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子座コピー数と比較した、増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座コピー数を決定するために作製した。標準曲線は０、０．００１、０．０１、０．１、０．５、および１μｇのゲノムＤＮＡから作製した。遺伝子座発現量は、インプットゲノムＤＮＡ中の遺伝子座発現量と比較したパーセントとして表し（そのような遺伝子座発現量を遺伝子座発現量偏りということができる）、および、１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算した。結果を図１７に示す。
【０８７４】
図に示す通り、９５℃での熱処理無しのテンプレートＤＮＡに由来する増幅されたＤＮＡにおける遺伝子座発現量の低下は無い。しかし、遺伝子座発現量の顕著な損失が、３分間９５℃にて熱変性したテンプレートＤＮＡから観察された。
【０８７５】
１．実施例９：ＭＤＡによって増幅された遺伝子座の増幅偏りはＰＥＰまたはＤＯＰ−ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの増幅偏りよりも顕著に低い。
本実施例は、１００、１，０００、および１０，０００倍にＭＤＡ増幅されたＤＮＡについて、９５℃（典型的な増幅反応においてＤＮＡを変性させるために用いられる）でのテンプレートＤＮＡインキュベートの省略が、ＤＮＡ産物における８個のランダムに選択された遺伝子座の発現量の低い偏りを結果として生じることを実証する。対照的に、ＰＣＲを基礎とする２種類の全ゲノム増幅（ＷＧＡ）法であるＤＯＰ−ＰＣＲおよびＰＥＰは２〜６桁の増幅偏りを示す。
【０８７６】
ＭＤＡ反応は、実施例８に記載の通りの、９５℃で処理しなかったテンプレートＤＮＡを用いて実施した。反応（１００μｌ）は３００、３０、３、または０．３ｎｇのＤＮＡを含み、約１００、１０００、１０，０００、および１００，０００倍ＤＮＡ増幅を結果として生じた。
【０８７７】
縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ；テレニウス（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ）他，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３：７１８−７２５ （１９９２）；チューン（Ｃｈｅｕｎｇ）および ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９３： １４６７６−１４６７９（１９９６））によるヒトゲノムＤＮＡの増幅は下記の通り実施した。ヒトゲノムＤＮＡ（３００ｎｇないし０．０３ｎｇの範囲にわたる）を０．２ｍｌチューブに総容量５０μｌで入れ、２μＭＤＯＰプライマー（５'−ＣＣＧＡＣＴ ＣＧＡ ＧＮＮ ＮＮＮ ＮＡＴ ＧＴＧ Ｇ−３'（配列ＩＤ番号：２０）；Ｎ＝ほぼ等しい比率でのＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）、２００μＭｄＮＴＰ、１０ｍＭトリスＣｌ（ｐＨ８．３）、０．００５％（ｖ／ｖ）ＢＲＩＪ３５、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および５０ｍＭＫＣｌの終濃度を与えた。放射性標識したα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰを、ＭＤＡ産物定量について実施例６に記載したのと同様に、ＤＮＡ合成の定量のために反応に加えた。９５℃にて５分間のテンプレートの最初の変性後、２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））を加え、続いて、９４℃１分間、３０℃１．５分間、７２℃へ３分間で急上昇、および７２℃にて３分間伸長の５サイクル、およびその後に９４℃１分間、６２℃１分間、および７２℃２分間（＋追加の１４秒／サイクル）の３５サイクルを実施した。最後の伸長は７２℃にて７分間行った。増幅反応はＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲシステムズサーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））を用いて実施した。
【０８７８】
プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ；チャン（Ｚｈａｎｇ）他，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ．８９： ５８４７−５８５１ （１９９２））によるヒトゲノムＤＮＡの増幅は下記の通り実施した。ヒトゲノムＤＮＡ（３００ｎｇないし０．０３ｎｇの範囲にわたる）を０．２ｍｌチューブに総容量６０μｌで入れ、３３ｕＭＰＥＰランダムプライマー（５'−ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮＮＮＮ ＮＮＮ−３'）、１００ｕＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３（２０℃）、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ ｍＭ ＫＣｌ、および５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））の終濃度を与えた。放射性標識したα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰを、ＭＤＡ産物定量について実施例６に記載したのと同様に、ＰＣＲ産物収率の定量のために反応に加えた。ＰＥＰ反応は、９２℃１分間、３７℃２分間、５５℃へ１０秒／度で急上昇、および５５℃にて４分間伸長の５０サイクルを実施した。ＰＥＰ反応はＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲシステムズサーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））を用いて実施した。
【０８７９】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析は実施例８に記載の通りに実施し、および遺伝子座間の最大増幅偏りは、増幅倍数の各レベルについて、高い遺伝子座発現量値を低い値で割ることによって計算した。結果を図１８に示す。
【０８８０】
８遺伝子座の相対発現量を図１８に、３種類の異なるＷＧＡ手順によって実施した増幅反応について示す。Ｘ軸は、定量的ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した、増幅されたＤＮＡにおける増幅倍数を表す；Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較したパーセントで表した遺伝子座発現量であり（そのような遺伝子座発現量を遺伝子座発現量偏りということができる）、１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算される。８遺伝子座についての結果を下記の通り示す；ＣＸＣＲ５、白菱形；コネキシン４０、白三角；ＭＫＰ１、白四角；ＣＣＲ６、白丸；酸性リボソームタンパク質、黒菱形；ＣＣＲ１、黒三角；ｃＪＵＮ、黒四角；ＣＣＲ７、黒丸。図１８ＡはＭＤＡ増幅されたＤＮＡに由来する８遺伝子座に関するパーセント発現量を表す。図１８ＢはＤＯＰ−ＰＣＲを用いて増幅されたＤＮＡ中に存在する８遺伝子座に関するパーセント発現量を表す。図１８ＣはＰＥＰ増幅されたＤＮＡ中に存在する８遺伝子座に関するパーセント発現量を表す。
【０８８１】
図に示す通り、１００、１，０００、および１０，０００倍に増幅されたＭＤＡについて、最大増幅偏りは、最も高発現された遺伝子の最も低発現された遺伝子に対する比として表して、それぞれ２．７、２．３、および２．８だけであった。注目すべきことに、ＭＤＡの３倍増幅偏りは１００ないし１００，０００倍増幅でほぼ一定に留まった（図１８Ａ）。対照的に、ＤＯＰ−ＰＣＲ法による増幅は、４ないし６桁にわたる増幅偏りを示した（図１８Ｂ）。加えて、ＰＥＰ法は２〜４桁にわたる増幅偏りを示した（図１８Ｃ）。
【０８８２】
Ｊ．実施例１０：ネステッドプライマーを用いた増幅はｃ−ｊｕｎ配列の特異的増幅を与える。
本実施例は、ＤＮＡ配列の複雑な混合物に由来する特異的ＤＮＡ領域の、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用し配列特異的ネステッドプライマーを用いる増幅を実証する。
【０８８３】
増幅反応は、熱変性／アニーリング段階ありまたは無しで、エキソヌクレアーゼ耐性六量体または１９種類のエキソヌクレアーゼ耐性配列特異的プライマーの入れ子化した（ネステッド）組のどちらかを用いて実施した。本実施例で使用したネステッドプライマーを表５に列挙する。ヌクレオチド配列中の星印の存在は、ホスホロチオエート結合の存在を示す。ネステッドプライマーはヒトｃ−ｊｕｎ遺伝子の両方の鎖の各側へハイブリダイズするように設計され、および最も近い左および右のプライマーはｃ−ｊｕｎ遺伝子を含む３４２０ｂｐ断片を包含する。ｃ−ｊｕｎ遺伝子の各側で、これらのネステッドプライマーは互いに１５０〜４００ヌクレオチドの間隔を開けている。これらのプライマーについての認識部位を包含するヒトＤＮＡの領域は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）から登録番号ＡＬ１３６９８５を用いて入手することができ、およびそのヌクレオチド配列の６５００１位から７３０１０位にわたる。
【表５】
2010158250.tif 000006
2010158250.tif 000007
【０８８４】
４種類の反応を下記の条件下で実施した。ヒトゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ）を０．２ｍｌチューブへ総容量５０μｌで入れ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１００μＭエキソヌクレアーゼ耐性六量体または各１μＭのエキソヌクレアーゼ耐性ネステッドプライマーの終濃度を与えた。プライマーアニーリングを高めるための熱処理段階を、個々の反応について表示の通り含めたかまたは省略した。アニーリング反応はＰＣＲシステムサーモサイクラー（パーキン・エルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））内で９５℃へ３分間加熱しおよび３７℃へゆっくり冷却した。反応を２分割し、それぞれが２５μｌを有し、および次いで３７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｍＭｄＮＴＰ、１ユニット／ｍｌの酵母ピロホスファターゼ、５０μＭエキソヌクレアーゼ耐性六量体または０．５μＭエキソヌクレアーゼ耐性ネステッドプライマー、および８００ユニット／ｍｌのφ２９ＤＮＡポリメラーゼの終濃度を含む終容量５０μｌとした。放射性標識したα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰを、２つの並行反応のうちの１つに、ＤＮＡ合成の定量化のために加えた。反応を１８時間３７℃にてインキュベートした。酸沈澱可能な放射性デオキシリボヌクレオチド産物の組み込みはグラスファイバーフィルターを用いて判定した。α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰを含まなかった反応をＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲ分析によって実施例８に記載の通りに分析した。インプットテンプレートについての標準曲線を、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子座コピー数と比較した、増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座コピー数を決定するために作製した。標準曲線は０、０．００１、０．０１、０．１、０．５、および１μｇのゲノムＤＮＡから作製した。結果を図１９に示す。 
【０８８５】
Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較したパーセントで表した遺伝子座発現量である（そのような遺伝子座発現量を遺伝子座発現量偏りということができる）。それは１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算され、パーセントで表される。
【０８８６】
図に示す通り、９５℃に加熱されたＤＮＡに由来するランダム六量体を用いて増幅されたｃ−ｊｕｎ配列の発現量は６９％であった（ＲＨ（加熱あり）の棒グラフを参照）。９５℃に加熱されたＤＮＡに由来するネステッドプライマーを用いて増幅されたｃ−ｊｕｎ配列の発現量は３％だけであった（ＮＰ（加熱あり）の棒グラフを参照）。テンプレートＤＮＡ熱処理無しのランダム六量体を用いて増幅されたＤＮＡ中のｃ−ｊｕｎ配列の発現量は２１１％であった（ＲＨ（加熱なし）の棒グラフを参照）。テンプレートＤＮＡ熱処理無しのネステッドプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ中のｃ−ｊｕｎ配列の発現量は２８２８％であった（ＮＰ（加熱なし）の棒グラフを参照）。
【０８８７】
Ｋ．実施例１１：ＭＤＡによって全血から増幅された遺伝子座の増幅偏り
本実施例は、ゲノムＤＮＡをＭＤＡを用いて直接に全血からまたは組織培養細胞から増幅できること、および、その遺伝子座発現量は精製されたゲノムＤＮＡテンプレートから増幅されたＤＮＡについてと実質的に同じであることを実証する。本実施例は、アルカリ性条件へ供することによる（溶解溶液の添加による）熱による溶解を伴わない溶解、細胞溶解物の安定化（安定化溶液の添加による）、および安定化された細胞溶解物中のゲノムＤＮＡの複数置換増幅を説明する。安定化された細胞溶解物は、ゲノムＤＮＡの精製無しの増幅に用いられる。対照として、添加テンプレートの非存在下で増幅されたＤＮＡを試験し、およびこれらの遺伝子座に関して検出可能な配列発現量を含まなかった。
【０８８８】
ＤＮＡは血液または組織培養細胞株から下記の通り調製した。ヒト血液試料はグローブ・ヒル・ラボラトリー（ＧｒｏｖｅＨｉｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手した。ミエローマ 細胞株Ｕ２６６はＡＴＣＣから入手しおよび付属の手順書に従って継代した。細胞はアルカリ性溶解溶液に、チャン（Ｚｈａｎｇ）他（チャン（Ｚｈａｎｇ），Ｌ．他，単一の細胞からの全ゲノム増幅：遺伝子分析への示唆（Ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．）ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９，５８４７−５８５１ （１９９２））の改変によって溶解した。血液は３倍にＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、９．５ｍＭＮａ，ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）で希釈し、一方、組織培養細胞は３０、０００細胞／ｍｌへＰＢＳで希釈した。血液または細胞は、等しい容量のアルカリ性溶解緩衝液（４００ｍＭＫＯＨ、１００ｍＭジチオスレイトール、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた希釈によって溶解し、および１０分間氷上でインキュベートした。溶解した細胞は等しい容量の中性化緩衝液（４００ｍＭＨＣｌ、６００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて中性化した。溶解した血液または細胞の調製物（１μｌ）を、直接に、ＭＤＡ反応（１００μｌ）におけるテンプレートとして記載の通りに使用した。
【０８８９】
ＭＤＡ反応（１００μｌ）は、実施例８に記載の通り、９５℃での変性無しで実施した。精製されたヒトゲノムＤＮＡテンプレートを用いた反応は、３００または３０ｎｇのＤＮＡを含み、約１００または１０００倍のＤＮＡ増幅を結果として生じた。溶解した血液または細胞に由来するＤＮＡを用いた反応は、１μｌの安定化された細胞溶解物をテンプレートとして含んだ。対照増幅反応は添加テンプレートＤＮＡを含まなかった。 
【０８９０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析を増幅されたＤＮＡ試料について実施例８に記載の通り実施し、および結果を図２０に示す。５種類の異なる増幅反応に由来するＤＮＡについての８遺伝子座の相対発現量を図２０に示す。Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較したパーセントで表した遺伝子座発現量であり（そのような遺伝子座発現量を遺伝子座発現量偏りということができる）、１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算する。下り斜線の棒グラフは全血から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座発現量を示す。灰色塗りつぶしの棒グラフは３０ｎｇの精製されたゲノムＤＮＡ（９，０００ゲノムコピー）から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座発現量を示す。白塗りつぶしの棒グラフは３００ｎｇの精製されたゲノムＤＮＡ（９０，０００ゲノムコピー）から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座発現量を示す。上り斜線の棒グラフは組織培養細胞（ＤＮＡの１０細胞同等物）から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座発現量を示す。黒塗りつぶしの棒グラフは添加テンプレート無しの反応から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座発現量を示す（そのデータについての黒棒で表される値は小さすぎてグラフ上で棒は見えない）。
【０８９１】
図に示す通り、直接に全血からまたは組織培養細胞から精製無しに増幅されたＤＮＡは、遺伝子座発現量について、精製されたゲノムＤＮＡテンプレートから増幅されたＤＮＡと実質的に同じ値を有する。
【０８９２】
Ｌ．実施例１２：ＭＤＡによってＡＡｄＵＴＰを含む反応で増幅された遺伝子座の増幅偏りは１００％ｄＴＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡの増幅偏りと等しい。
本実施例は、ゲノムＤＮＡをＭＤＡを用いてＡＡｄＵＴＰ（５−（３−アミノアリル）−２'−デオキシウリジン５'−三リン酸、シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．））を含む反応で増幅できること、およびその遺伝子座発現量はｄＴＴＰだけを含む反応で増幅されたＤＮＡについてと実質的に同一であることを実証する。
【０８９３】
１００％ｄＴＴＰを含むＭＤＡ反応（１００μｌ）を、実施例８に記載の通り、９５℃での変性無しで実施した。７０％ＡＡｄＵＴＰを含む反応を、標準の１．０ｍＭｄＴＴＰの代わりに０．７ｍＭＡＡｄＵＴＰおよび０．３ｍＭｄＴＴＰを含んだ点以外は１００％ｄＴＴＰを含む反応と同一の条件下で実施した。反応は１ｎｇのヒトゲノムＤＮＡテンプレートを含み、約３０，０００倍のＤＮＡ増幅を結果として生じた。
【０８９４】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析を増幅されたＤＮＡ試料について実施例８に記載の通り実施し、および２種類の増幅反応に由来するＤＮＡについての８遺伝子座の相対発現量を図２１に示す。Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較したパーセントで表した遺伝子座発現量であり（そのような遺伝子座発現量を遺伝子座発現量偏りということができる）、１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算する。黒棒グラフは１００％ｄＴＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡについての遺伝子座発現量を示す。白棒グラフは３０％ｄＴＴＰ／７０％ＡＡｄＵＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡについての遺伝子座発現量を示す。
【０８９５】
図に示す通り、３０％ｄＴＴＰ／７０％ＡＡｄＵＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡは、１００％ｄＴＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡと、遺伝子座発現量について実質的に同一の値を有する。
【０８９６】
Ｍ．実施例１３：ヒトゲノムＤＮＡ由来ｃ−ｊｕｎ配列の配列特異的プライマーおよび標的環状化を用いた増幅。
本実施例は、本開示の方法の一実施形態および結果として生じるＤＮＡ産物の分析を記載する。例示される方法は本開示の、ヌクレアーゼ耐性配列特異的プライマーおよび環状化されたＤＮＡテンプレートを用いる、複数鎖置換増幅の遺伝子特異的複数置換増幅形式である。
【０８９７】
増幅反応は、熱変性／アニーリング段階無しで、実施例８に記載される条件下で、ｃ−ｊｕｎ配列を含む５．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片内の配列とハイブリダイズするエキソヌクレアーゼ耐性配列特異的プライマーを用いて実施した。本実施例で使用した配列特異的プライマーを表６に列挙する。ヌクレオチド配列中の星印は、ホスホロチオエート結合の存在を示す。配列特異的プライマーはヒトｃ−ｊｕｎ遺伝子配列の両方の鎖の各側へハイブリダイズするように設計され、および本プライマーはｃ−ｊｕｎ遺伝子配列を含む２０２５ｂｐ断片を包含する。本プライマーはｃ−ｊｕｎ遺伝子配列の各側で互いに１５０〜４００ヌクレオチドの間隔を開けている。これらのプライマーについての認識部位を包含するヒトＤＮＡの領域は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）から登録番号ＡＬ１３６９８５を用いて入手することができ、およびそのヌクレオチド配列の６６９６２位から６８９８７位にわたる。
【表６】
2010158250.tif 000008
2010158250.tif 000009
【０８９８】
４種類の反応を下記の条件下で実施した。ヒトゲノムＤＮＡ（５ｇ、コリエル研究所細胞バンク（ＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ））を１００ユニットのＥｃｏＲＩで３時間、５０μｌ中で取扱説明書に従って消化した。ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼを６５℃にて３０分間のインキュベートによって不活性化した。消化したＤＮＡ断片（０．５μｇ）を容量８４０μｌ中で１．７ユニット（ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ユニット）のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状化した。反応を１６時間４℃にてインキュベートした。ブランクライゲーションを、ＤＮＡリガーゼの省略以外は同一の条件下で実施した。ライゲーションした混合物の一部をテンプレート（１６．８μｌ；１０ｎｇＤＮＡ）として利用した２種類の増幅反応を実施し、一方は各２．５μＭの濃度の配列特異的プライマーを用い、他方は各０．５μＭの濃度のプライマーを用いた。さらに２種類の増幅反応を、ブランクライゲーションしたＤＮＡをテンプレートとして利用し、２．５μＭおよび０．５μＭの配列特異的プライマー濃度を用いて実施した。放射性標識したα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰ、をＤＮＡ合成の定量化のために、並行反応に加えた。反応を１８時間３７℃にてインキュベートした。α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰを含まなかった反応を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析によって実施例８に記載の通りに分析した。インプットテンプレートについての標準曲線を、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子座コピー数と比較した、増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座コピー数を決定するために作製した。標準曲線は０、０．００１、０．０１、０．１、０．５、および１μｇのゲノムＤＮＡから作製した。結果を図２２に示す。Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較した遺伝子座発現量であるそのような遺伝子座発現量を遺伝子座発現量偏りということができる）。それは１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算され、パーセントで表される。
【０８９９】
図に示す通り、ライゲーションされたＤＮＡに由来する２．５μＭの遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されたｃ−ｊｕｎ配列の発現量は検出を下回った（ＧＳ２．５＋Ｌ棒グラフを参照）。ブランクライゲーションされたＤＮＡに由来する２．５μＭの遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されたｃ−ｊｕｎ配列の発現量もまた検出されなかった（ＧＳ２．５−Ｌ棒グラフを参照）。ライゲーションされたＤＮＡに由来する０．５μＭの遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されたＤＮＡ中のｃ−ｊｕｎ配列の発現量は３２０００％であった（ＧＳ０．５＋Ｌ棒グラフを参照）。ブランクライゲーションされたＤＮＡに由来する０．５μＭの遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されたＤＮＡ中のｃ−ｊｕｎ配列の発現量もまた検出されなかった（ＧＳ０．５−Ｌ棒グラフを参照）。これらの結果は、遺伝子特異的プライマーおよび環状化されたテンプレートＤＮＡを用いたｃ−ｊｕｎ配列の３２０倍増幅を実証する。ライゲーションされなかった消化されたＤＮＡは感知可能な増幅を示さなかった。０．５μＭのプライマーを用いて増幅された、ライゲーションされたＤＮＡだけが増幅された一方、２．５μＭのプライマーは増幅を与えなかった。
【０９００】
２．５μＭ遺伝子特異的プライマーおよび環状化されたＤＮＡテンプレートを用いて実施されたＤＮＡ増幅反応の特異性を、それを７個の他の遺伝子座で観察されたＤＮＡ増幅の量と比較することによって試験した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析を実施例８に記載の通り実施し、および結果を図２３に示す。ｃ−ｊｕｎ遺伝子座および７個の他の遺伝子座の相対発現量を示し、および、７個の遺伝子座は低レベルの増幅だけを示し、ｃ−ｊｕｎ配列がｃ−ｊｕｎ特異的プライマーを用いて特異的に増幅されたことを示す。
【０９０１】
Ｎ．実施例１４：分解されたゲノムＤＮＡの複数置換増幅の品質を、損傷試料を修復することによって高める。
本実施例は、損傷ゲノムＤＮＡを、１５ｍＭ ＮａＯＨの存在下で７０℃加熱を用いて変性し、トリス−ＨＣｌｐＨ４．０および元の試料を変性した試料に加えて戻し，その後ゆっくり冷却して損傷ＤＮＡをハイブリダイズさせることによる修復法で前処理した場合、ＷＧＡにおいて増幅されたＤＮＡの品質が向上することを実証する。損傷ｇＤＮＡは、未変性ゲノムＤＮＡを超音波処理して平均長１ｋｂとすることによって作製した。この分解試料を次いで修復法を用いて前処理し、および複数置換増幅反応に用いた。増幅産物の品質は、１μｇの増幅産物の染色体上の特定の遺伝子座の発現量を、１μｇの増幅されていない標準ゲノムＤＮＡと比較する、Ｔａｑｍａｎ測定法によって評価した。本実施例は、修復処理ありの損傷ゲノムＤＮＡは、修復法無しの損傷ゲノムＤＮＡの増幅産物と比較して、増幅産物の遺伝子座発現量に３倍の改善を有することを実証する。
【０９０２】
損傷ゲノムＤＮＡは下記の通り作製した：プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）のゲノムＤＮＡ試料をｄＨ２Ｏで希釈して１００ｎｇ／μｌとした。試料をフィッシャー・サイエンティフィク社（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の５５０超音波破砕機を用いて４０％９秒間に設定して超音波処理した。試料を５ｎｇ／μｌへさらに希釈し、および計２５ｎｇを用いて１５ｍＭ ＮａＯＨ終濃度で変性しおよび７０℃へ５分間加熱した。７０℃にて、トリス−ＨＣｌｐＨ４．０を加えて最終ｐＨ８．０を生じ、および２５ｎｇの未変性の元の変性した試料もまた加えた。複数置換合成による増幅を、修復された損傷ＤＮＡおよび損傷ＤＮＡ、および対照未変性ＤＮＡについて実施した。図２４の結果は、損傷ＤＮＡの修復が、修復無しの損傷ＤＮＡの増幅と比較して、損傷試料の増幅を顕著に改善していることを示す。
【０９０３】
Ｏ．実施例１５：長期保存によって損傷された真のゲノムＤＮＡ試料の複数置換増幅の品質を、損傷試料を修復することによって高める。
本実施例は、長期保存によって損傷されたゲノムＤＮＡ試料の複数置換増幅による増幅産物の品質が、修復法によって改善されたことを実証する。
【０９０４】
損傷ゲノムＤＮＡ試料を、１５ｍＭ ＮａＯＨの存在下での７０℃加熱を用いる変性、トリス−ＨＣｌｐＨ４．０および元の試料を変性した試料に加えて戻すこと、ゆっくり冷却して損傷ＤＮＡをハイブリダイズさせること，次いで複数置換増幅反応に用いることによる修復法で前処理した。増幅産物の品質はＴａｑｍａｎ測定法によって実施例１４に記載の通り評価した。
【０９０５】
図２５に示す通り、一旦修復された損傷ゲノムＤＮＡ試料の増幅産物の品質は顕著に改善される。平均して、増幅産物の品質における３倍の改善が観察された。
【０９０６】
Ｐ．実施例１６：変性段階の最適化：イオン強度、熱およびＮａＯＨが修復改善を結果として生じる。
本実施例は、イオン強度、熱およびＮａＯＨが、損傷ＤＮＡを修復および増幅する本開示の方法における変性段階に有用であることを実証する。損傷ＤＮＡ試料を下記の通り調製した：ＤＮＡ試料をｄＨ２Ｏで５ｎｇ／μｌに希釈し、および７０℃へ５分間加熱し、それは試料をより小さい断片へ分解する。加熱したＤＮＡ試料をゆっくり冷却しおよび複数置換増幅をこれらの試料に対して実施した。加熱したＤＮＡ基質に由来する増幅産物のＴａｑｍａｎ分析は、イオン溶液の使用がＤＮＡのさらなる分解に繋がり、最終的にこれらの試料の低い増幅に繋がったことを示した。
【０９０７】
損傷ＤＮＡを塩の存在下で加熱することがこの基質の増幅を改善しうるかどうかを判定するため、損傷ＤＮＡ（２５ｎｇ）を７０℃へ塩（トリス−ＥＤＴＡ（１０ｍＭトリスｐＨ８．０および１ｍＭ ＥＤＴＡ））の存在下で３分間加熱し、２５ｎｇの未変性の損傷試料を加えて戻し、および次いで試料を冷却した。この方法は、損傷ＤＮＡの修復にいくらかの改善を示した。終濃度２５ｍＭのＮａＯＨを熱段階の前に反応に加えた場合、これは修復法を改善し、損傷ＤＮＡの一貫した修復を与えた。これは、損傷ＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）で５ｎｇ／μｌに希釈し、２５ｎｇのＤＮＡをＮａＯＨ終濃度２５ｍＭに加え、試料を７０℃へ３分間加熱し、トリス−ＨＣｌｐＨ４．０を加えてｐＨを８．０へ低下させ、２５ｎｇの元の未変性の損傷ＤＮＡ試料を加えて戻し、および混合物を室温に戻したことによって行われた。熱、トリス、およびＮａＯＨを用いる修復は、修復無しおよび熱およびトリスだけの処理を用いた修復よりも良好な遺伝子座発現量を与えた。
【０９０８】
Ｑ．実施例１７：修復法の中性化段階は損傷ＤＮＡ試料の増幅を改善する。
本実施例は、修復法の中性化が増幅産物の品質の向上に重要であることを実証する。損傷ＤＮＡ試料を下記の通り調製した：ＤＮＡ試料をｄＨ２Ｏで１０ｎｇ／μＭに希釈し、および７０℃へ５分間加熱して損傷ＤＮＡ試料を作製した。加熱したＤＮＡ試料を５ｎｇ／μｌにＴＥで希釈し、２５ｎｇの損傷ＤＮＡを終濃度２５ｍＭ ＮａＯＨへ加え、７０℃へ３分間加熱し、および、トリス−ＨＣｌｐＨ４．０を用いてｐＨ８．０へ中性化しおよびゆっくり冷却したか、または、中性化無しでゆっくり冷却した。これらの試料の増幅反応を実施し、および産物の品質をＴａｑｍａｎ分析によって分析した。中性化を用いる修復は、修復無しおよび中性化処理無しの修復よりも良好な遺伝子座発現量を与えた。
【０９０９】
記載の特定の方法、手順、および試薬は変化しうるため、本開示の発明はこれらに限定されないと解される。また、ここで用いられた用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、および付属の請求項によってのみ制限される本発明の範囲を制限することは意図されないと解される。
【０９１０】
本文中および付属の請求項中では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈に明らかにそうでないと示されない限り、複数の言及を含むことに注意しなければならない。したがって、たとえば、「ａ宿主細胞」への言及は複数のそのような宿主細胞を含み、「ｔｈｅ抗体」への言及は１種類以上の抗体および当業者に既知であるその同等物への言及である、などである。
【０９１１】
別に定義されない限り、本文書に用いられるすべての技術用語および科学用語は、本開示の発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本文書に記載されたものと同様または同等である任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料は記載の通りである。本文書に引用された出版物およびそれらが引用された目的の題材は特に参照により本開示に含まれる。本文書中の何も、本発明が先行発明によってそのような開示に先行できないという承認として解釈されない。
【０９１２】
当業者は、通常の実験しか用いずに、本文書に記載された本発明の特定の実施形態の多数の同等物を認めるかまたは確認することができる。そのような同等物は下記の請求項によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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