(57)【要約】【課題】マラリア感染の有無や感染の程度を簡便に検査可能なマラリアの検査方法、並びにその検査方法に使用するための検査用試薬又はキットを提供する。【解決手段】本発明に係るマラリアの検査方法は、被検動物から採取した尿中に存在する肝型脂肪酸結合蛋白質を検出する工程を含む。被検試料中の肝型脂肪酸結合蛋白質の量が多いほど、感染の程度が高いと判断できる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検動物から採取した尿中に存在する肝型脂肪酸結合蛋白質を検出する工程を含むマラリアの検査方法。
【請求項２】
前記被検動物から採取した尿中に存在する肝型脂肪酸結合蛋白質の量を閾値と比較する工程を含む請求項１記載のマラリアの検査方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の検査方法に使用するための検査用試薬又はキット。
【請求項４】
肝型脂肪酸結合蛋白質に特異的に結合する抗体を含有してなる請求項３記載の検査用試薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリアの検査方法、並びにその検査方法に使用するための検査用試薬又はキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、マラリア原虫の感染によって引き起こされる感染症であり、ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）属の蚊によって媒介される。マラリア原虫はＡｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ類に属する原虫であるが、この仲間は偏性細胞内寄生体、すなわち細胞内でしか増殖できない。個々の原虫は宿主特異性が比較的高く、ヒトを固有の宿主とするマラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．  ｖｉｖａｘ）、卵型マラリア原虫（Ｐ．  ｏｖａｌｅ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．  ｍａｌａｒｉａｅ）の４種である。これら４種のマラリア原虫によって引き起こされるマラリアは、それぞれ熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵型マラリア、四日熱マラリアと呼ばれる。
【０００３】
このマラリアは、世界中で年間患者数３〜５億人、年間死者数１５０〜２７０万人と推定されている。また、マラリア原虫は、現在でも熱帯、亜熱帯地域を中心とした１００ヶ国以上に常在しており、世界人口の半数が常時マラリア感染の危険に直面している。したがって、症状の重篤化を防止し、また、感染の広がりを回避するためにも、早期発見・早期治療が重要になる。
【０００４】
従来、マラリアの検査方法（確定診断方法）としては、被検者から採取した血液の薄層塗抹ギムザ染色標本及び厚層塗抹ギムザ染色標本を作製し、これを顕微鏡観察してマラリア感染赤血球を検出する方法が、世界中で広く行われている（非特許文献１，２参照）。
【０００５】
また、ＤＮＡ選択的蛍光色素と、赤血球の内部にマラリア原虫を保持したままで蛍光色素を赤血球内に透過させることが可能な赤血球膜部分溶解試薬とを含むマラリア感染赤血球検出用試薬を用いる検査方法も提案されている（特許文献１参照）。この方法では、被検者から採取した血液とマラリア感染赤血球検出用試薬とを混合して測定試料を調製し、この測定試料に励起光を照射し、得られた散乱光情報及び蛍光情報に基づいてマラリアに感染した赤血球を特定する。
【０００６】
ここで、マラリアの早期発見・早期治療のため、あるいはマラリア検査自体の普及のためには、マラリアの浸淫地域においても簡便に行えるような検査方法でなければならない。しかしながら、上述した塗抹標本を顕微鏡観察する方法は、塗抹標本の作成、固定、染色、乾燥の各工程を行う必要があり、作業が煩雑であるとともに、十分な知識及び経験が必要とされるものであった。このため、多くの浸淫国では、マラリア検査のための顕微鏡観察の訓練がＷＨＯの指導の下で国家プロジェクトとして行われている。
また、特許文献１記載の方法は、作業が煩雑であるとともに、フローサイトメータ等の特殊な装置が必要とされるものであった。
【０００７】
このように、いずれの検査方法も、マラリアの浸淫地域において簡便に行えるものとは言い難かった。
【０００８】
一方、脂肪酸結合蛋白質（ＦＡＢＰ：ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、サイトゾルに存在して脂肪酸と結合する能力を有する分子量１５ｋＤ前後の蛋白質群である。それらの生理機能については、脂肪酸の細胞内転送や蓄積によって代謝酵素系の調節に関与していると考えられているが詳細は不明である。ＦＡＢＰとしては、肝型（Ｌ−ＦＡＢＰ）、腸型（Ｉ−ＦＡＢＰ）、心筋型（Ｈ−ＦＡＢＰ）、脳型（Ｂ−ＦＡＢＰ）、皮膚型（Ｃ−ＦＡＢＰ／Ｅ−ＦＡＢＰ）、脂肪細胞型（ａＰ２）、末梢神経細胞型（ミエリンＰ２）等の少なくとも７つの分子種が知られており、その一次構造が決定されている。これらはいずれも脂肪酸結合能を有し、一部に配列がよく保存された領域が認められること等から、共通の祖先遺伝子から進化したファミリーであると考えられているが、全体としては互いに異なる一次構造を有し、各々特異的な組識分布を示す。なお、肝型、腸型といった命名は、最初にどの組織から見出されたかを意味し、必ずしもその組織にしか存在しないことを意味するものではない。
【０００９】
近年、培養肝臓細胞における肝型脂肪酸結合蛋白質の発現が、マラリア原虫の肝細胞内での増殖（赤外発育）に関連しており、肝型脂肪酸結合蛋白質の発現を抑制するとマラリア原虫の増殖が阻害され、肝型脂肪酸結合蛋白質の発現を誘導するとマラリア原虫の増殖が亢進することが知られている（非特許文献３参照）。
【００１０】
しかしながら、このような知見をマラリアの検査方法に応用するには、肝臓における肝型脂肪酸結合蛋白質の発現を測定しなければならず、検査方法として現実的ではない。しかも、非特許文献３は赤外発育期における報告であるが、赤外発育期には何ら宿主に症状をもたらすことはなく、臨床的には潜伏期と言えるため、この点でも検査方法として現実的ではない。さらに、このような検査方法では、塗抹標本を顕微鏡観察する方法等とは異なり、マラリアの感染の程度を知ることはできない。
【００１１】
このように、肝型脂肪酸結合蛋白質に着目したマラリアの簡便な検査方法は、これまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００６−３０４７７４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂａｓｉｃ  Ｍａｌａｒｉａ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ；Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；  １９９１
【非特許文献２】吉田幸雄、「図説人体寄生虫学」、第６版、南山堂、２００２年
【非特許文献３】Ｓｅｂａｓｔｉａｎ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｌ−ＦＡＢＰ  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｍａｌａｒｉａ  ｌｉｖｅｒ  ｓｔａｇｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．；  ３７；  ｐ．４８３−４８９；  ２００７
【非特許文献４】Ｋａｍｉｊｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｕｒｉｎａｒｙ  ｌｉｖｅｒ−ｔｙｐｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ；  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．；  ２８４；  ｐ．１７５−１８２；  ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、このような従来の実情に鑑みてなされたものであり、マラリア感染の有無や感染の程度を簡便に検査可能なマラリアの検査方法、並びにその検査方法に使用するための検査用試薬又はキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、被検動物の尿中に存在する肝型脂肪酸結合蛋白質の量とマラリア感染との間に相関があることを見出した。従来、肝障害の場合には血中の肝型脂肪酸結合蛋白質の量が有意に増加するが、尿中の肝型脂肪酸結合蛋白質の量は増加しないことが知られている（非特許文献４）。すなわち、マラリア感染により尿中の肝型脂肪酸結合蛋白質の量が増加することは、非特許文献３の報告とは無関係である。また、非特許文献４では、腎障害の場合には尿中の肝型脂肪酸結合蛋白質の量が有意に増加するとも報告されているが、本発明者らの研究により、マラリアに感染し、尿中の肝型脂肪酸結合蛋白質の量が著しく増加した場合であっても、腎障害は起こっていないことが確認されている。つまり、被検動物の尿中に存在する肝型脂肪酸結合蛋白質の量とマラリア感染との間に相関があることは、本発明者らによって新規に見出されたことである。より具体的には、本発明は以下のとおりである。
【００１６】
（１）  被検動物から採取した尿中に存在する肝型脂肪酸結合蛋白質を検出する工程を含むマラリアの検査方法。
【００１７】
（２）  前記被検動物から採取した尿中に存在する肝型脂肪酸結合蛋白質の量を閾値と比較する工程を含む（１）記載のマラリアの検査方法。
【００１８】
（３）  （１）又は（２）記載の検査方法に使用するための検査用試薬又はキット。
【００１９】
（４）  肝型脂肪酸結合蛋白質に特異的に結合する抗体を含有してなる（３）記載の検査用試薬又はキット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、マラリア感染の有無や感染の程度を簡便に検査可能なマラリアの検査方法、並びにその検査方法に使用するための検査用試薬又はキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種後のｈＬ−ＦＡＢＰ  Ｔｇマウスにおける末梢血感染赤血球率の変化を示す図である。
【図２】Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種後のｈＬ−ＦＡＢＰ  Ｔｇマウスにおける尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量の変化を示す図である。
【図３】Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種７日後のｈＬ−ＦＡＢＰ  Ｔｇマウスの腎組織切片（同図（Ａ））と、シスプラチン投与後のｈＬ−ＦＡＢＰ  Ｔｇマウスの腎組織切片（同図（Ｂ））とを示す図である。
【図４】Ｐ．  ｃｈａｂａｕｄｉ接種後のｈＬ−ＦＡＢＰ  Ｔｇマウスにおける末梢血感染赤血球率の変化を示す図である。
【図５】Ｐ．  ｃｈａｂａｕｄｉ接種後のｈＬ−ＦＡＢＰ  Ｔｇマウスにおける尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量の変化を示す図である。
【図６】Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種後のｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける抹消血感染赤血球率のクロロキン治療による変化を示す図である。
【図７】Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種後のｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量のクロロキン治療による変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
〔マラリアの検査方法〕
本発明に係るマラリアの検査方法は、被検動物から採取した尿中に存在する肝型脂肪酸結合蛋白質（以下、「Ｌ−ＦＡＢＰ」という。）を検出する工程を含むものである。
【００２３】
＜被検動物＞
被検動物としては、マラリアに感染し得る動物、例えばヒト、サル、ネズミ、トリ等が挙げられるが、好ましくはヒトである。
【００２４】
＜尿中に存在するＬ−ＦＡＢＰの検出＞
尿中に存在するＬ−ＦＡＢＰの検出は、これと特異的に結合する抗体を用いる免疫化学的方法により好適に実施できる。
【００２５】
抗体は、免疫抗原としてＬ−ＦＡＢＰを用いることにより調製できる。免疫抗原として天然由来のＬ−ＦＡＢＰを用いる場合、Ｌ−ＦＡＢＰは肝臓や腎臓等から精製可能である。精製は、Ｋｅｌｖｉｎらの文献（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．；  ２６３；  ｐ．１５７６２−１５７６８；  １９８８）記載の方法等に準じて以下のように実施できる。すなわち、摘出した臓器をホモジナイズした後、超遠心して得られる細胞質画分を、ゲル濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー等により分画し、分子量や脂肪酸結合活性を指標としてＬ−ＦＡＢＰを含有する画分を選択して精製する。さらに、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、精製を加えるか、又は単一バンドとなっていることを確認する。そして、精製蛋白質のアミノ酸組成やＮ末端側アミノ酸配列を決定し、報告された組成や配列と比較することにより、目的とする分子種であることを確認する。
【００２６】
Ｌ−ＦＡＢＰの脂肪酸結合活性は、例えば、ＡＮＳ（１−ａｎｉｌｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−８−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ製）等の蛍光プローブを用いて容易に測定できる。これらの蛍光プローブは、Ｌ−ＦＡＢＰの脂質結合部位等の疎水性の高い領域と結合することにより蛍光強度が上昇する。例えば、Ｌ−ＦＡＢＰを含む溶液にＡＮＳを添加混合した後、蛍光強度（励起波長３７２ｎｍ；蛍光波長４８０ｎｍ）を測定すればよい。そのほか、ＲＩ標識した脂肪酸を用いることによってもＬ−ＦＡＢＰの脂肪酸結合活性を測定することもできる。
【００２７】
なお、Ｌ−ＦＡＢＰは、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット間でホモロジーが高く、アミノ酸レベルで９０％以上であることが知られているので、ヒトＬ−ＦＡＢＰと結合する抗体を得るために、例えばマウスＬ−ＦＡＢＰを抗原として用いることもできる。この場合、抗原の調製が容易であるという利点がある。
【００２８】
免疫抗原として用いるＬ−ＦＡＢＰは、遺伝子工学的手法によって製造された組換え型蛋白質であってもよい。Ｌ−ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されているため（Ｖｅｅｒｋａｍｐ  ａｎｄ  Ｍａａｔｍａｎ；  Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．；  ３４；  ｐ．１７−５２；  １９９５）、例えば、それらを基にプライマーを設計し、ＰＣＲ法により適当なｃＤＮＡライブラリ等からｃＤＮＡをクローニングし、これを用いて遺伝子組換え技術より、組換えＦＡＢＰを調製することができる。
【００２９】
また、免疫抗原として、Ｌ−ＦＡＢＰの断片、又はその部分配列を有する合成ペプチド等を、必要に応じてキャリア高分子物質（牛血清アルブミン、ヘモシアニン等）と結合させて用いることもできる。
【００３０】
Ｌ−ＦＡＢＰと特異的に結合する抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等のいずれであってもよい。
【００３１】
抗体は、高い特異性を有するものが好ましく、例えば心筋型脂肪酸結合蛋白質（Ｈ−ＦＡＢＰ）とは実質的に交差反応しないことが望ましい。より特異性の高い抗体を取得するためには、より高度に精製され純度の高い抗原を用いることが望ましい。
【００３２】
抗体の調製に際しては、上述のように調製した精製抗原を温血動物に接種して免疫する。免疫する温血動物としては、哺乳類（ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、ウマ、ブタ等）、鳥類（ニワトリ、アヒル、ガチョウ等）が挙げられる。ウサギの場合、例えば、抗原１００μｇ〜１ｍｇ程度を約１ｍｌの生理食塩水及びフロイントの完全アジュバント中に乳化したものを、背部又は後肢掌皮下に接種し、２回目以降はアジュバントをフロイントの不完全アジュバントに代えて、これを２〜４週間おきに３〜８回接種して免疫し、最終接種の約７〜１２日後に使用する。マウスの場合、１回あたり１０〜３０μｇ／匹の抗原を、通常、皮下、腹腔内、静脈内に、約２週間おきに３〜８回接種して免疫し、最終接種の約２〜４日後に使用する。
【００３３】
ポリクローナル抗体は、上述のように免疫した動物から採血し、血清（抗血清）を分取して、得られた抗血清からＩｇ画分を回収して調製できる。例えば、抗血清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー等によりＩｇＧ画分を回収してポリクローナルＩｇＧを得ることができる。
【００３４】
モノクローナル抗体は、免疫動物から採取した抗体産生細胞を、不死化細胞と融合させて得られるハイブリドーマにより産生される。モノクローナル抗体のための免疫動物としては、マウス及びラットが好適に用いられる。ハイブリドーマの作製は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ；  ２５６；  ｐ．４９５−８９７；  １９７５）に準じて以下のように実施できる。すなわち、上述のように免疫した動物から抗体産生細胞（脾細胞、リンパ節細胞等）を採取し、これを適当な不死化細胞と細胞融合させる。不死化細胞としては、例えば骨髄腫細胞の細胞株（ＮＳＩ−Ａｇ４／１、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇｌ４等）が好適に用いられる。骨髄腫細胞は、それ自身が抗体又は免疫グロブリンのＨ鎖又はＬ鎖を産生しない非分泌型であることが好ましい。また、未融合の骨髄腫細胞と融合したハイブリドーマとを選択培地中で選別し得るような選択マーカーを有していることが好ましい。例えば選択マーカーとして、８−アザグアニン耐性（ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損）、チミジンキナーゼ欠損等を有する細胞株がよく使用される。
【００３５】
細胞融合は、ポリエチレングリコール等の適当な融合促進剤を添加して行う。細胞融合は、不死化細胞あたり約１０の抗体産生細胞の比率で行うことが好ましく、また、抗体産生細胞約１０６個／ｍｌの細胞密度で好適に実施できる。
【００３６】
融合処理した細胞を、適当に希釈した後、選択培地中で１〜２週間培養する。例えば、８−アザグアニンに耐性の骨髄腫細胞を用いる場合、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地中で培養すると、未融合骨髄腫細胞は死滅し、未融合の抗体産生細胞も分裂サイクルが限られているため死滅するが、融合細胞だけは選択培地中で分裂を続け生存できる。
【００３７】
選択培地中での培養後、その上清について例えばエンザイムイムノアッセイを行って目的とする抗体の有無を検出し、限界希釈法によってクローニングすることにより、目的抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択できる。選択に際しては、抗体価、抗体のクラス、サブクラス、抗原との親和性、特異性、エピトープ等が好適な性質を有するハイブリドーマ（モノクローナル抗体）を選択できる。モノクローナル抗体のクラスとしては一般にＩｇＧが好ましい。
【００３８】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば免疫に使用した動物の腹腔内に移植し、一定期間後、腹水を採取し、それから目的のモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、ハイブリドーマを適当な動物細胞培養用の培地中で培養し、その培養液からモノクローナル抗体を単離することもできる。また、一旦目的のハイブリドーマを得たら、これからモノクローナル抗体をコードする遺伝子を取得し、通常の遺伝子組換え技術により適当な宿主中で目的のモノクローナル抗体を発現させ産生させることができる。
【００３９】
抗体の分離・精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を必要に応じて組み合わせた通常の精製法に従って行うことができる。
【００４０】
上述のようにして得られた抗体を用いて、免疫化学的方法により、尿中に存在するＬ−ＦＡＢＰ（抗原）を検出・定量することができる。
検出・定量は、公知のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ケミルミネッセントイムノアッセイ等の方法を採用して実施できる。また、所望により、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フルオロイムノアッセイ等の方法を採用することもできる。具体的には、例えば、抗体及び標識抗原を用いる競合法、抗原に対する認識部位が異なる２種類のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（あるいはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体）を組み合わせて用いるサンドイッチＥＩＡ法等が挙げられる。これらアッセイ法においては、必要に応じて、抗原又は抗体を適当な担体（ゲル粒子、セルロース粒子、ポリアクリルアミドゲル、物理的吸着剤（ガラス、スチレン系樹脂）等）上に保持する。例えば、抗原又は抗体をポリスチレン製のプレートやビーズ等の固相に吸着させて用いる固相法がよく採用される。また、検出のためには、例えばウエスタンブロッティング法を採用することもできる。
【００４１】
上述のような免疫化学的方法において、抗体や抗原は必要に応じて標識したものが使用される。このような標識としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、発光物質（アクリジニウムエステル、イソルミノール、ルシフェリン等）のほか、放射性同位元素（１２４Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ）、蛍光物質（フルオレッセインイソチオシアネート等）等が挙げられる。このほか、ビオチン標識とストレプトアビジンとを組み合わせて用いる方法も採用できる。
【００４２】
以上のようにして被検試料中に存在するＬ−ＦＡＢＰを検出・定量することにより、マラリア感染の有無や感染の程度を簡便に判断することができる。すなわち、尿中に存在するＬ−ＦＡＢＰの量が所定の閾値よりも多い場合にはマラリアに感染していると判断でき、その量が多いほど感染の程度が高いと判断できる。この所定の閾値は、例えば、マラリアに感染していない対照動物から採取した尿における平均値等に基づいて設定することができる。
【００４３】
また、マラリアに感染している被検動物について異なる時期に複数回、尿を採取し、Ｌ−ＦＡＢＰの量の経時的変化を調べることにより、薬剤による治療効果等を知ることもできる。
【００４４】
〔検査用試薬又はキット〕
本発明に係る検査用試薬又はキットは、上述した検査方法に使用するものである。
検査用試薬としては、例えば、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、その標識物等が挙げられる。抗体の標識物としては、ペルオキシダーゼ等の酵素が結合された抗体（酵素標識抗体）、ビオチン化された抗体（ビオチン標識抗体）等が挙げられる。
検査用キットとしては、例えば、ビーズやプレート（９６穴マイクロプレート等）等の担体上に抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を吸着／結合させたものが挙げられる。この場合、検査用キットには、ＥＩＡ等に必要となる試薬（酵素標識した２次抗体や発色基質等）が組み合わされていてもよい。また、市販の妊娠検査薬のように、金コロイド免疫測定法を利用したものであってもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００４６】
＜実施例１：ヒトＬ−ＦＡＢＰ遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（ｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウス）の作製＞
ヒトＬ−ＦＡＢＰ遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（ｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウス）を作製するため、１３週齢以上のＢＣＦ１系雄マウスを不妊交配用及び自然交配用に、１０週齢以上のＩＣＲ系雌マウスを胚移植用及び里親用に、１３週齢以上のＢＤＦ１系雄マウスを交配用に、８週齢以上のＢＣＦ１系雌マウスを採卵用に、それぞれ使用した。これにより得られるトランスジェニックマウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１系）について、ＢＡＬＢ／ｃＡマウスと戻し交配を行い、ｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスを作製した。
【００４７】
＜実施例２：Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株を接種したｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量＞
Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株は、Ｂａｌｂ／ｃＡマウスに対して致死的な感染を惹起する。感染実験では、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株赤内型原虫を用い、被検動物としては実施例１で作製したｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウス（ｎ＝３）を用いた。また、受け身免疫の影響を避けるため、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株原虫をＢａｌｂ／ｃＡ  ＲＡＧ−２ノックアウトマウスに感染させ、実験に用いる感染赤血球のドナーとして用いた。
【００４８】
感染ＲＡＧ−２ノックアウトマウスより得られた新鮮な感染赤血球１×１０６個をｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスに腹腔内接種した。接種後、ｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける末梢血感染赤血球率をギムザ染色血液塗抹標本により測定した。結果を図１に示す。
また、連日、自然排尿によりスポット尿を採取した。尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量はＥＬＩＳＡ（ｈＬ−ＦＡＢＰ測定キット、ＩＢＬ製）により測定した。実測値を図２（Ａ）に示し、クレアチニン量で補正した値を図２（Ｂ）に示す。
【００４９】
図１から分かるように、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種後の末梢血感染赤血球率は、接種２日目には０．３７％（ＳＥ：±０．０３３）であった。その後、末梢血感染赤血球率は急激に増加し、接種７日目には４９．４３％（ＳＥ：±３．０６８）に達した。
一方、図２（Ａ）から分かるように、ｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ量は、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種前には１７ｎｇ／ｍＬ（ＳＥ：±２．３６７）であったものが、感染の進行に伴って増加し、接種５日目には１８７ｎｇ／ｍＬ（ＳＥ：±１２７．０７４）、接種７日目には６３１ｎｇ／ｍＬ（ＳＥ：±３８０．５３１）に達した。クレアチニン量で補正したグラフにおいても、同様の傾向を示している（図２（Ｂ））。
【００５０】
これらの結果から分かるように、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量の増加は、末梢血感染赤血球率の増加と一致した。したがって、尿中のｈＬ−ＦＡＢＰを検出することによりマラリアに罹患しているか否かを判断することができ、ｈＬ−ＦＡＢＰの排出量を測定することにより、マラリアの進行度を判断することができると考えられる。
【００５１】
＜実施例３：Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種７日後のｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスの腎臓の病理組織学的解析＞
実施例２で用いたＰ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種７日後のｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスを剖検し、ＰＡＳ染色により腎臓の病理組織学的解析を行った。対照としては、シスプラチンを投与したｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスを用いた（Ｎｅｇｉｓｈｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．；  ７３（１２）；  ｐ．１３７４−１３８４；  ２００８）。この対照マウスについては、８〜１０週齢の雄のｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスを１週間予備飼育した後、生理食塩水に溶解したシスプラチン２０ｍｇ／ｋｇ（溶液総量６０ｍＬ／ｋｇ）を腹腔内に単回投与し、７２時間後に剖検し、ＰＡＳ染色により腎臓の病理組織学的解析を行った。なお、この対照マウスは、尿中へのｈＬ−ＦＡＢＰの排出量が、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種７日後のｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける排出量と同程度であった。Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株を接種したｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスの結果を図３（Ａ）に示し、シスプラチンを投与した対照マウスの結果を図３（Ｂ）に示す。
【００５２】
図３から分かるように、シスプラチンを投与した対照マウスでは、尿細管上皮の壊死、脱落、刷子縁消失、尿細管腔の拡大といった著しい急性尿細管壊死を呈したが（図３（Ｂ））、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種７日後のｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスでは、同程度の尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出が見られる対照マウスと比較して、組織障害の程度が明らかに軽度であった。このことから、マラリア感染による尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量の上昇は、腎障害とは異なる機序によって引き起こされていることが示唆された。
【００５３】
＜実施例４：Ｐ．  ｃｈａｂａｕｄｉを接種したｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量＞
Ｐ．  ｃｈａｂａｕｄｉは、Ｂａｌｂ／ｃＡマウスに対して致死的ではなく、原虫血症を呈した後、耐過する。感染実験では、Ｐ．  ｃｈａｂａｕｄｉ赤内型原虫を用い、被検動物としては実施例１で作製したｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウス（ｎ＝１０；Ｔｇ−１〜１０）を用いた。また、受け身免疫の影響を避けるため、Ｐ．  ｃｈａｂａｕｄｉ原虫をＢａｌｂ／ｃＡ  ＲＡＧ−２ノックアウトマウスに感染させ、実験に用いる感染赤血球のドナーとして用いた。
【００５４】
感染ＲＡＧ−２ノックアウトマウスより得られた新鮮な感染赤血球１×１０５個をｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスに腹腔内接種した。接種後、ｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける末梢血感染赤血球率をギムザ染色血液塗抹標本により測定した。結果を図４に示す。
また、連日、代謝ケージにより蓄尿を採取した。尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量はＥＬＩＳＡ（ｈＬ−ＦＡＢＰ測定キット、ＩＢＬ製）により測定した。実測値を図５（Ａ）に示し、クレアチニン量で補正した値を図５（Ｂ）に示す。
【００５５】
図４から分かるように、Ｐ．  ｃｈａｂａｕｄｉ接種後の末梢血感染赤血球率は接種４日目には０．２６％（ＳＥ：±０．０３６）であった。その後、末梢血感染赤血球率は急激に増加し、接種１０日目には２９．１％（ＳＥ：±１．２４６）と最も高い値を示した。その後、末梢血感染赤血球率は減少し始め、接種１２日目には８．５８％（ＳＥ：±２．２６１）、接種１４日目には０．９％（ＳＥ：±０．５８２）、接種２０日目には０％となった。
一方、図５（Ａ）から分かるように、ｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ量は、Ｐ．  ｃｈａｂａｕｄｉ接種前には５．９ｎｇ／ｍＬ（ＳＥ：±１．９）であったものが、感染の進行に伴って増加し、接種１０日目には５８０１．６ｎｇ／ｍＬ（ＳＥ：±２７１５．６）と最も高い値を示した。その後、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量は減少し始め、接種１２日目には２６．３ｎｇ／ｍＬ（ＳＥ：±４．０）、接種１４日目には２４．７ｎｇ／ｍＬ（ＳＥ：±７．７）、接種２０日目には４．８ｎｇ／ｍＬ（ＳＥ：±１．６）となった。クレアチニン量で補正したグラフにおいても、同様の傾向を示している（図５（Ｂ））。
【００５６】
これらの結果から分かるように、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量の増減は、末梢血感染赤血球率の増減と一致した。このように、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量は末梢血における原虫の消失を素早く反映するため、治療後の経過を判断する有用なバイオマーカーになり得ると考えられる。
【００５７】
＜実施例５：Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株を接種したｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量のクロロキン治療による変化＞
感染実験では、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株赤内型原虫を用い、被検動物としては実施例１で作製したｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウス（ｎ＝４）を用いた。また、受け身免疫の影響を避けるため、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株原虫をＢａｌｂ／ｃＡ  ＲＡＧ−２ノックアウトマウスに感染させ、実験に用いる感染赤血球のドナーとして用いた。
【００５８】
感染ＲＡＧ−２ノックアウトマウスより得られた新鮮な感染赤血球１×１０６個をｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスに腹腔内接種した。そして、接種１２日目、１３日目、１４日目に、マラリア治療のため、生理食塩水に溶解したクロロキンを、治療１日目は１５ｍｇ／ｋｇ、２日目，３日目は５ｍｇ／ｋｇの処方にて腹腔内に連日投与した。その一方で、接種２２日目までの連日、ｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける末梢血感染赤血球率をギムザ染色血液塗抹標本により測定した。結果を図６に示す。また、代謝ケージにより蓄尿を採取し、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量をＥＬＩＳＡ（ｈＬ−ＦＡＢＰ測定キット、ＩＢＬ製）により測定した。クレアチニン量で補正した尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量を図７に示す。
【００５９】
図６から分かるように、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種後の末梢血感染赤血球率は次第に増加し、接種１２日目には３７．８％と最も高い値を示した。末梢血感染赤血球率はクロロキン治療に伴って減少し始め、接種１４日目には４．９％、接種１５日目には１．１％となった。クロロキン治療を止めると、末梢血感染赤血球率は再び増加し、接種１８日目には６．３％、接種１９日目には２４．６％となった。
一方、図７から分かるように、ｈＬ−ＦＡＢＰ−Ｔｇマウスにおける尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ量は、Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株接種前には１６μｇ／ｇＣｒであったものが、感染の進行に伴って増加し、接種１３日目には３４５４μｇ／ｇＣｒと最も高い値を示した。尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量はクロロキン治療に伴って急激に減少し、接種１５日目には８５μｇ／ｇＣｒ、接種１６日目には４３μｇ／ｇＣｒとなった。クロロキン治療を止めると、マラリアの再発に伴って尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量は再び増加し、接種１９日目には１１３μｇ／ｇＣｒ、接種２０日目には８０１３μｇ／ｇＣｒとなった。
【００６０】
これらの結果から分かるように、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量はクロロキン治療に伴って減少するとともに、マラリアの再発に伴って増加し、その増減は末梢血感染赤血球率の増減と一致した。したがって、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量はマラリアの治療効果を判断する有用なバイオマーカーになり得ると考えられる。
【００６１】
＜実施例６：マラリア感染患者における尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量＞
マラリア感染を確定診断されたマラリア感染患者（４例）と、マラリア非感染発熱患者（１例）とを被検者とし、各被検者について血清クレアチニン、ＣＲＰ、体温を測定した。
また、各被検者における尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量を次のようにして測定した。各被検者から採取した尿について、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ測定キット（ｈＬ−ＦＡＢＰに対する２種のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、シミック社製）により定量した。すなわち、尿検体５０μＬと前処理液５０μＬとを等量、１０分間混合し、そのうち２０μＬを予め１００μＬの反応緩衝液を加えた１次抗体コーティングプレートへ添加混合した。１時間静置後、プレート洗浄し、酵素標識２次抗体を加え、さらに１時間反応させた。再度洗浄後、酵素基質を加えると、抗原量に応じた発色を３０分で得ることができ、これを吸光光度計により定量した。
さらに、同じ被検者の尿について、Ｄｉｐ−ｔｅｓｔ（シミック社製）により、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰを測定した。Ｄｉｐ−ｔｅｓｔは、金コロイドに結合させた抗ｈＬ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体を用いたイムノクロマト法により、テストライン上に抗原量に応じたバンドが生じ、可視化できる原理を利用したものである。バンドの濃さを０（＝陰性）〜３（＝強陽性）までスコア化し、定性的に評価した。
【００６２】
各被検者の年齢、性別（男性（Ｍ）／女性（Ｆ））、マラリア治療の有無、血清クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）、ＣＲＰ（ｍｇ／ｄＬ）、体温（℃）、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量（ｎｇ／ｍＬ）、及びＤｉｐ−ｔｅｓｔスコアを下記の表１に示す。なお、マラリア非感染の健常人９７例（男性２６例、女性７１例、平均年齢３３歳）について測定した尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量の平均値は６．５ｎｇ／ｍＬであった（Ｋａｍｉｊｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．；  １４３（１）；  ｐ．２３−３０；  ２００４）。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
表１から分かるように、マラリア感染患者は、いずれもマラリア非感染発熱患者よりも尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量が多くなっていた。これらのマラリア感染患者の血清クレアチニン、ＣＲＰはいずれも正常値を示しており、腎疾患や炎症性疾患の結果により尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量が高値となっている可能生は低いと考えられる。特に、未治療かつ高熱を呈するマラリア感染患者（４０歳男性）では、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量が非常に高値を示した。一方で、マラリア非感染の熱発症例（５０歳男性、腎機能正常、ＣＲＰ異常）では、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量は正常域であった。末梢血中のマラリア感染赤血球増加に伴い発熱中枢を介した体温上昇が生じることから、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量は、マラリア非感染の熱発ではなく、マラリア感染患者の熱発重症度に特異的に相関している可能性が示唆された。
また、ｄｉｐ−ｔｅｓｔのスコアは、尿中ｈＬ−ＦＡＢＰ排出量と相関していた。このことから、簡易キットであるＤｉｐ−ｔｅｓｔを用いて短時間かつ簡便にマラリア感染の重症度を判定できる可能性が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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