(57)【要約】      （修正有）【課題】好ましくはエリスロポエチン治療に有効なヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法の提供。【解決手段】ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）と化合物（Ｌ）と化合物（Ｍ）を反応させて得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法であって、ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式（Ｉ）2010248528.tif 000179（上式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である。）の構造を有し、化合物（Ｄ）、（Ｌ）は反応性官能基を有するリンカー類であり、化合物（Ｍ）はエリスロポエチン等である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）と化合物（Ｌ）とさらなる化合物（Ｍ）を反応させて得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式（Ｉ）
【化１】
2010248528.tif 000141
（上式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である。）
の構造を有し、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端を化合物（Ｄ）と反応させて得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）と反応させるステップを含み、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2と、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、チオ基であり、
前記官能基Ｘが、下記式
【化２】
2010248528.tif 000142
（上式中、Ｈａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択され、
化合物（Ｄ）と前記ヒドロキシアルキルデンプンとの結合の形成が、前記官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応によってなされ、前記官能基Ｚ1が、
【化３】
2010248528.tif 000143
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ'はメチルである。）
からなる群から選択され、
（ｉ）前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化４】
2010248528.tif 000144
（上式中、Ｈａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択されるか、または
（ｉｉ）前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化５】
2010248528.tif 000145
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ'はメチルである。）
からなる群から選択されるヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法。
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）との反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式（Ｉ）：
【化６】
2010248528.tif 000146
の構造を有する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）との反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式（ＩＩａ）：
【化７】
2010248528.tif 000147
および／または下記式（ＩＩｂ）：
【化８】
2010248528.tif 000148
の構造を有する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（D）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（Ｌ）と反応させて第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる、
請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記第２のヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、さらなる化合物（Ｍ）に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（D）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗと、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させるが、
ここで、化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、さらなる化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）が、ポリペプチドである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化合物（Ｄ）が、
【化９Ａ】
2010248528.tif 000149
【化９Ｂ】
2010248528.tif 000150
からなる群から選択される構造を有する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化される還元末端を、下記式：
【化１０】
2010248528.tif 000151
の化合物（Ｄ）、または下記式：
【化１１】
2010248528.tif 000152
の化合物（Ｄ）と反応させるステップを含んでなり、さらに、
得られた反応生成物を、下記式：
【化１２】
2010248528.tif 000153
からなる群から選ばれる化合物（Ｌ）と反応させるステップと、
得られた反応生成物とさらなる化合物（M）のチオ基と反応させるステップと
を含んでなる請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ヒドロキアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができる、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）と化合物（Ｌ）とさらなる化合物（Ｍ）を反応させて得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式（Ｉ）
【化１３】
2010248528.tif 000154
（上式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である。）
の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端を化合物（Ｄ）と反応させることによって得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）と反応させるステップを含み、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2と、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み
前記官能基Ｙが、チオ基であり、前記官能基Ｘが、
【化１４】
2010248528.tif 000155
（上式中、Ｈａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択され、
化合物（Ｄ）と前記ヒドロキシアルキルデンプンとの結合の形成が、前記官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応によってなされ、前記官能基Ｚ1が、
【化１５】
2010248528.tif 000156
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ'はメチルである。）
からなる群から選択され、
（ｉ）前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または官能基Ｗが、
【化１６】
2010248528.tif 000157
（上式中、Ｈａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択されるか、または
（ｉｉ）前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または官能基Ｗが、
【化１７】
2010248528.tif 000158
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ'はメチルである。）
からなる群から選択されるヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項１５】
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である請求項１４に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項１６】
前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項１４または請求項１５に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項１７】
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）との反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式（Ｉ）：
【化１８】
2010248528.tif 000159
の構造を有する請求項１４〜１６のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項１８】
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）との反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式（ＩＩａ）：
【化１９】
2010248528.tif 000160
および／または下記式（ＩＩｂ）：
【化２０】
2010248528.tif 000161
の構造を有する請求項１４〜１６のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項１９】
前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項１８に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項２０】
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（Ｌ）と反応させて第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる、
請求項１４〜１９のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項２１】
前記第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘとさらなる化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる請求項２０に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項２２】
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗおよび化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘとさらなる化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、
請求項１４〜１９のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）が、ポリペプチドである請求項１４〜２２のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項２３に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項２５】
化合物（Ｄ）が、
【化２１Ａ】
2010248528.tif 000162
【化２１Ｂ】
2010248528.tif 000163
【化２１Ｃ】
2010248528.tif 000164
からなる群から選択される構造を有する請求項１４〜２４のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項２６】
前記製造方法が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端を、下記式：
【化２２】
2010248528.tif 000165
の化合物（Ｄ）、または下記式：
【化２３】
2010248528.tif 000166
の化合物（Ｄ）と反応させるステップを含んでなり、さらに、
得られた反応生成物を、下記式：
【化２４】
2010248528.tif 000167
から選択される化合物（Ｌ）と反応させるステップと、
得られた反応生成物をさらなる化合物（M）のチオ基と反応させるステップと
を含んでなる請求項１４〜２４のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項２７】
ヒドロキアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができる、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）と化合物（Ｌ）とさらなる化合物（Ｍ）を反応させて得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を治療有効量含む薬学的組成物であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式（Ｉ）：
【化２５】
2010248528.tif 000168
（上式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である。）
の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と、化合物（Ｌ）を反応させるステップを含んでなり、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2と、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み
前記官能基Ｙが、チオ基であり、
前記官能基Ｘが、
【化２６】
2010248528.tif 000169
（上式中、Ｈａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択され、
化合物（Ｄ）と前記ヒドロキシアルキルデンプンとの結合の形成が、前記官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応によってなされ、前記官能基Ｚ1が、
【化２７】
2010248528.tif 000170
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ'はメチルである。）
からなる群から選択され、
（ｉ）前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または官能基Ｗが、
【化２８】
2010248528.tif 000171
（上式中、Ｈａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択されるか、または
（ｉｉ）前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または官能基Ｗが、
【化２９Ａ】
2010248528.tif 000172
【化２９Ｂ】
2010248528.tif 000173
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ'はメチルである。）
からなる群から選択される薬学的組成物。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、ＡＴ ＩＩＩである請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記官能基Ｙが、−ＳＨであり、前記化合物（Ｄ）が、一般式Ｚ1−Ｄ'−Ｗの化合物であり、前記化合物（Ｌ）が、一般式Ｚ2−Ｌ'−Ｘの化合物であり、前記Ｄ'が、Ｚ1およびＷを架橋する有機鎖であるか、または存在せず、Ｌ'が、Ｚ2およびＸを架橋する有機鎖であるか、または存在しない、請求項２７〜２９のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
化合物（Ｄ）が、
【化３０Ａ】
2010248528.tif 000174
【化３０Ｂ】
2010248528.tif 000175
からなる群から選択される構造を有する請求項２７〜３０のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができる、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）と化合物（Ｌ）とさらなる化合物(M)を含んでなるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を治療有効量含む薬学的組成物であって、該製造方法が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端を、下記式：
【化３１】
2010248528.tif 000176
の化合物（Ｄ）、または下記式：
【化３２】
2010248528.tif 000177
の化合物（Ｄ）と反応させるステップを含んでなり、さらに、
得られた反応生成物を、下記式：
【化３３】
2010248528.tif 000178
からなる群から選択される化合物（Ｌ）と反応させるステップと、
得られた反応生成物をさらなる化合物（M）のチオ基と反応させるステップと
を含んでなる請求項２７〜３１のいずれかに記載の薬物的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体、詳細には、ヒドロキシアルキルデンプ
ンを架橋化合物の第一級アミノ基もしくは第二級アミノ基または２つの架橋化合物と反応
させるプロセスによって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体であって、
得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体がさらなる化合物の官能基Ｙと反応可能な少
なくとも１つの官能基Ｘを有し、この官能基Ｙがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール
基、アセタール基、またはチオ基である、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを架橋化合物の
第一級または第二級アミノ基と反応させ、得られた反応生成物を、必要に応じて（オプシ
ョナリー）第２の架橋化合物とさらに反応させ、得られたヒドロキシアルキルデンプン誘
導体がさらなる化合物の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを有し、この基
Ｙがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオ基であり、得
られた反応生成物を、ポリペプチド、好ましくはＡＴ  ＩＩＩ、ＩＦＮ−β、またはエリ
スロポエチンなどのポリペプチド、特に好ましくはこれらの官能基Ｙの少なくとも１つを
含むエリスロポエチンと反応させるプロセスによって得ることができるヒドロキシアルキ
ルデンプン誘導体に関する。特に好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエ
チルデンプンである。本発明によれば、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロ
キシエチルデンプンを、リンカー化合物と必要に応じて反応前に酸化されたその還元末端
で反応させる。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、天然に存在するアミロペクチンの誘導体であ
り、体内でα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、トウモロコシデンプン中に最
大９５重量％の濃度で存在する炭水化物高分子アミロペクチンの置換誘導体である。ＨＥ
Ｓは、有利な生物学的特性を示し、血液容量置換剤（ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ｒｅｐ
ｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔ）として、およびクリニックでの血液希釈療法で使用され
ている（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００３】
アミロペクチンは、主鎖中にα−１，４−グリコシド結合が存在し、分岐部位にα−１
，６−グリコシド結合が見出されるグルコース部分からなる。この分子の物理化学的性質
は、主に、グリコシド結合の型によって決定される。α−１，４−グリコシド結合に切れ
目が存在するために、ターンあたり約６つのグルコース単量体を有するヘリックス構造が
得られる。このポリマーの物理化学的性質および生化学的性質を、置換によって改変する
ことができる。アルカリヒドロキシエチル化によってヒドロキシエチル基を導入する。反
応条件の適応により、ヒドロキシエチル化に関して非置換グルコース単量体中の各水酸基
の異なる反応性を活用することが可能である。この事実により、当業者は、限られた範囲
内で置換パターンに影響を与えることができる。
【０００４】
ヒドロキシエチルデンプン誘導体のいくつかの製造方法が当分野で説明されている。
【０００５】
特許文献１は、第１の工程で、架橋剤（例えば、ブロモシアン）をヒドロキシエチルデンプンと結合させ、その後ヘモグロビンを中間生成物と結合させる、ヘモグロビンのヒドロキシエチルデンプンとの接合（コンジュゲイション）を開示する。
【０００６】
ＨＥＳが使用される１つの重要分野は、例えば、特定の生理学的効果を得るために循環
系に適用されるポリペプチドの確立である。これらのポリペプチドの１つの具体例は、赤
血球の循環レベルの調節に不可欠な約３４，０００ｋＤの酸性糖タンパク質であるエリス
ロポエチンである。
【０００７】
ポリペプチドおよび酵素の適用における周知の問題は、これらのタンパク質はしばしば
不満足な安定性を示すという点である。特に、エリスロポエチンは、血漿半減期が比較的
短い（非特許文献３および非特許文献４）。これは、治療血漿レベルが急速に減少し、静脈投与を反復して行わなければならないことを意味する。さらに、一定の環境では、ペプチドに対する免疫応答が認められる。
【０００８】
ポリペプチドを高分子とカップリングした場合に、ポリペプチドの安定性を改良するこ
とができ、これらのポリペプチドに対する免疫応答が減少することが一般に認められる。
特許文献２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾した生理学的に活性なポリペプチドは、免疫原性および抗原性が減少し、非接合タンパク質よりもかなり長く血液中で循環する（すなわち、クリアランス速度がより長い）ことを開示する。しかし、ＰＥＧ−薬物接合体は、いくつかの欠点を示す（例えば、インビボ分解経路のエレメントが認識することができる天然の構造を示さない）。したがって、ＰＥＧ接合体以外の他の接合体およびタンパク質ポリマーが産生される。異なるタンパク質および高分子（ポリメラーゼなど）の複数の架橋方法が文献に記載されている（例えば、非特許文献５を参照）。
【０００９】
まとめると、安定性および／または生物活性が改良されたさらなる改良ポリペプチドが
依然として必要である。これを、特に、エリスロポエチンに適用して高シアル酸とイソ型
形成させ、それにより低シアル酸のイソ型から高活性で精製される（特許文献３を参照）。したがって、大規模精製を必要とせずに高活性ポリペプチドが得られる製造方法が利用可能な場合、非常に有利である。不運なことに、しばしばポリペプチドが適切に折りたたまれた天然の高次構造で生成されずに適切なグリコシル化を欠くので、細菌または昆虫細胞中でのポリペプチドの生成はしばしば困難である。
【００１０】
特許文献４は、活性成分およびヒドロキシアルキルデンプンが直接結合しているかリンカー化合物を介して結合している活性成分とヒドロキシアルキルデンプンとの接合体を含む化合物を開示する。直接結合を考慮する限り、少なくとも１０重量％の水を含む水性媒体で活性成分とヒドロキシアルキルデンプンとの反応を行う。活性成分中に含まれるカルボキシル基と結合したヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する例は記載されておらず、アルデヒド基またはケト基やアセタール基またはヘミアセタール基との例もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ドイツ特許第２６１６０８６号
【特許文献２】ＷＯ９４／２８０２４号
【特許文献３】欧州特許第０４２８２６７Ｂ１号
【特許文献４】ＷＯ０２／０８０７９Ａ２号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８
【非特許文献２】Ｗｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，４１，４９４−４９８
【非特許文献３】Ｓｐｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎｓ，１９８９，Ｂｌｏｏｄ  ７３，９０
【非特許文献４】ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｌｏｏｄ  ７６，７１８
【非特許文献５】Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９３，ＣＲＣＳ，Ｉｎｃ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、官能基としてチオ基、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセ
タール基、またはアセタール基を含むさらなる化合物（例えば、ポリペプチド）と化学結
合を形成することができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を提供することにある。好
ましくは、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、またはアセタール基は、さらなる
化合物の炭水化物部分に含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法において、該ヒ
ドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）
【化１】
2010248528.tif 000002
の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化
合物（Ｌ）と反応するステップ、または
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端における化
合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合
物（Ｌ）と反応するステップとを含んでなり、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの
官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応
可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能
な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例５．１にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。  レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。  レーンＢ：実施例５．１による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＣ：ＥＰＯ出発材料。
【図２】実施例５．３にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。  レーンＡ：実施例５．３による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＢ：ＥＰＯ出発材料。  レーンＣ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。
【図３】実施例５．４および５．５にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。  レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。  レーンＢ：実施例５．４による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＣ：実施例５．５による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＤ：ＥＰＯ出発材料。
【図４】実施例７．１および７．４にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。  レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。  レーンＢ：実施例７．４による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＣ：実施例７．１による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＤ：ＥＰＯ出発材料。
【図５】実施例７．２、７．３、７．５、および７．６にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。  レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。  レーンＢ：実施例１．３ｂ）に基づいた実施例７．６による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＣ：実施例１．１ｂ）に基づいた実施例７．５による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＤ：実施例１．３ａ）に基づいた実施例７．６による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＥ：実施例１．１ａ）に基づいた実施例７．５による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＦ：実施例７．２による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＧ：実施例７．３による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＫ：ＥＰＯ出発材料。
【図６】実施例７．７、７．８、７．９、７．１０、７．１１、および７．１２にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。  レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ  ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。  レーンＢ：実施例７．１１による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＣ：実施例７．１０による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＤ：実施例７．７による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＥ：実施例７．８による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＦ：実施例７．１２による接合体化後の粗タンパク質。  レーンＧ：ＥＰＯ出発材料。  レーンＫ：実施例７．９による接合体化後の粗タンパク質。
【図７】５分間＝レーン２；１０分間＝レーン３；６０分間＝レーン４、および非処理ＥＰＯ＝レーン１のマイルド酸処理に供したＥＰＯ−ＧＴ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｎ−グリカンの除去後のＥＰＯの移動度のシフトを示す（＋ＰＮＧＡＳＥ）。
【図８】未処理のＥＰＯならびに、マイルド酸加水分解条件下で５分間、１０分間、および６０分間インキュベートしたＥＰＯから単離したオリゴサッカリドのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤパターンを示す図である。ローマ数字Ｉ〜Ｖは以下の溶離位置を示す：Ｉ＝脱シアリル化２触角（ｄｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造、ＩＩ＝トリシアリル化３触角構造（２つの異性体）；ＩＩＩ＝テトラシアル化４触角構造＋２Ｎ−アセチルラクトサミン反復、ＩＶ＝テトラシアリル化４触角構造＋１Ｎ−アセチルラクトサミン反復；Ｖ＝テトラシアリル化４触角構造＋Ｎ−アセチルラクトサミン反復なし。１−４シアル酸を含まないか含むオリゴサッカリド構造の溶離領域を、角括弧で示す。
【図９】脱シアリル化後のＮ結合オリゴサッカリドのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを示す図である。Ｎ−アセチルノイラミン酸の溶離位置を以下に示す。以下の数字１〜９は、以下の標準オリゴサッカリドの溶離位置を示す：１＝２触角；２＝３触角（２〜４異性体）、３＝３触角（２〜６異性体）；４＝４触角；５＝３触角＋１反復；６＝４触角＋１反復、７＝３触角＋２反復、８＝４触角＋２反復、および９＝４触角＋３反復。
【図１０】シアリン酸残基の過ヨウ素酸塩酸化に供したマイルド処理および非処理ＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。１＝酸処理を使用しない過ヨウ素酸塩酸化；２＝５分間酸処理した過ヨウ素酸塩酸化；３＝過ヨウ素酸塩酸化および１０分間の酸処理；４＝酸処理を使用しない過ヨウ素酸塩酸化；５＝過ヨウ素酸および酸処理を使用しないＢＲＰ  ＥＰＯ標準。
【図１１】非処理ＥＰＯおよびマイルド酸加水分解条件下で５分間および１０分間インキュベートし、その後過ヨウ素酸塩処理したＥＰＯから単離した未変性オリゴサッカリドのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤパターンを示す図である。１−４シアル酸を含まないか含むオリゴサッカリド構造の溶離領域を、角括弧１〜５で示す。
【図１２】ＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡのＨＥＳ修飾の経時時間のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。２０μｇアリコートのＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａを、ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体と３０分間、２時間、４時間、および１７時間反応させた。レーン１＝反応時間３０分；レーン２＝反応時間２時間；レーン３＝反応時間４時間；レーン４＝反応時間１７時間；レーン５＝ＨＥＳ修飾しないＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ。左の図は、ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体の存在下でのインキュベーション時間の増加に伴うＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａの移動度のシフトを示す（流速１ｍｌ・ｍｉｎ-1）。Ｘ：レーン１＝反応時間３０分；レーン２＝反応時間２時間；レーン３＝反応時間４時間、レーン４＝反応時間１７時間；レーン５＝ＨＥＳ修飾を行ったＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ。右の図は、Ｎ−グリコシダーゼでの処理後の同一サンプルの分析を示す。
【図１３】ＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。各１％の通過物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）および高塩濃度での１％の画分溶離物を、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ濃縮機で濃縮し、サンプル緩衝液を含むゲルにロードした。クーマシーブルーによってＥＰＯタンパク質を染色した。Ａ＝サンプルＩ；Ｂ＝サンプルＩＩ；Ｃ＝サンプルＩＩＩ；Ｋ＝コントロールＥＰＯ−ＧＴ−１；Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、およびＫ１は、通過画分を示す；Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、およびＫ２は、高塩濃度で溶離した画分を示す。
【図１４ａ】Ｎ−グリコシダーゼの存在下で消化して、Ｎ結合オリゴサッカリドを除去したＨＥＳ修飾ＥＰＯサンプルＡ２（図１３を参照のこと）、コントロールＥＰＯサンプルＫ２、およびＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ  ＥＰＯ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。全てのＥＰＯサンプルは、Ｏ−グルカンを欠くか含む低分子量形態に移動度がシフトした。脱Ｎ−グリコシル化後のＨＥＳ修飾ＥＰＯサンプルＡ２についてＯ−グリコシル化と非グリコシル化タンパク質との比が低いバンドが認められ、おそらくＯ−グリカン残基のシアル酸でのＨＥＳ修飾を示す約３０ｋＤａの拡散タンパク質バンドが検出された（アスタリスクによって強調した矢印を参照のこと）。
【図１４ｂ】非処理またはＮ−グリコシダーゼの存在下で消化して、Ｎ結合オリゴサッカリドを除去した、ＨＥＳ修飾ＥＰＯサンプルＡ２（図１３を参照のこと）、コントロールＥＰＯサンプルＫ２およびＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ（図１４ａを参照のこと）のマイルド酸加水分解後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｎ−グリコシダーゼ処理前（Ａ２）および処理後（Ａ）の両高分子量形態（矢印を有するか有さない括弧を参照のこと）は、サンプルの酸処理後に消滅した。比較のために泳動したＢＲＰ  ＥＰＯ標準は、マイルド酸処理に供さなかった。
【図１５】ＨＥＳ修飾サンプルＡ、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ、および未修飾ＨＥＳとインキュベートしたコントロールＥＰＯサンプル（Ｋ）から遊離したＮ結合オリゴサッカリド物質のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す図である。ローマ数字Ｉ〜Ｖは以下の溶離位置を示す：Ｉ＝ジシアリル化２触角構造、ＩＩ＝トリシアリル化３触角構造（２つの異性体）；ＩＩＩ＝テトラシアル化４触角構造＋２Ｎ−アセチルラクトサミン反復、ＩＶ＝テトラシアリル化４触角構造＋１Ｎ−アセチルラクトサミン反復；Ｖ＝テトラシアリル化４触角構造＋Ｎ−アセチルラクトサミン反復なし。図８および１１の説明で報告されたジ、トリ、およびテトラシアリル化Ｎ−グリカンの溶離領域を、角括弧で示す。
【図１６】ＨＥＳ修飾サンプルＡ、ＥＰＯ−ＧＴ−Ａ、および未修飾ＨＥＳとインキュベートしたコントロールＥＰＯサンプル（Ｋ）から遊離したＮ結合オリゴサッカリド物質のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す図である。標準オリゴサッカリド混合物の保持時間を以下に示す：以下の数字１〜９は、以下の標準オリゴサッカリドの溶離位置を示す：１＝２触角；２＝３触角（２〜４異性体）、３＝３触角（２〜６異性体）；４＝４触角；５＝３触角＋１反復；６＝４触角＋１反復、７＝３触角＋２反復、８＝４触角＋２反復、および９＝４触角＋３反復。
【図１７】図１７〜２３は、ＨＥＳ修飾ＥＰＯおよびコントロールＥＰＯ調製物から単離した酵素遊離および化学的に脱シアリル化したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトルを示す図である。ｍ／ｚ１８０９．７、２１７４．８、２５３９．９、２９０５．０、および３２７０．１（［Ｍ＋Ｎａ」+）での主なシグナルは、ＭＳ分析のためのサンプル脱シアリル化に使用した酸加水分解条件に起因するフコースまたはガラクトースの喪失による弱いシグナルを伴う０、１つ、または２つのＮ−アセチルラクトサミン反復を有さない２触角から４触角複合体型Ｎ−グリカン構造に対応する。図１７は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＨＥＳ修飾ＥＰＯＡ２の脱シアリル化オリゴサッカリドである。
【図１８】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＥＰＯ  ＧＴ−１−Ａの脱シアリル化オリゴサッカリド。
【図１９】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＥＰＯ  Ｋ２の脱シアリル化オリゴサッカリド。
【図２０】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴサッカリド。
【図２１】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：５分間の酸加水分解に供したＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴサッカリド。
【図２２】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：１０分間の酸加水分解に供したＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴサッカリド。
【図２３】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：６０分間の酸加水分解に供したＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴサッカリド。
【図２４】２つのＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。  ｍｗ：マーカー  レーン１：例示的プロトコール８によって生成されたＨＥＳ−ＥＰＯ：ＥＰＯをヒドラジド−ＨＥＳ  １２ＫＤＬと接合させる。  レーン２：例示的プロトコール９によって生成されたＨＥＳ−ＥＰＯ：ＥＰＯをヒドロキシルアミノＨＥＳ  １２ＫＤＫと接合させる。  Ｃ：コントロール（非接合ＥＰＯ）；上のバンドはＥＰＯ二量体を示す。
【図２５】ＨＡＳ修飾ＥＰＯ形態のポリペプチドＮ−グリコシドでの消化を示すことによる炭水化物側鎖の炭水化物部分にＨＥＳを接合することを示す図である。  レーン１：Ｎ−グリコシダーゼでの消化後に例示的プロトコール８によって生成されたＨＥＳ−ＥＰＯ。  レーン２：Ｎ−グリコシダーゼでの消化後に例示的プロトコール９によって生成されたＨＥＳ−ＥＰＯ。  レーン３：ＢＲＰ  ＥＰＯ標準  レーン４：Ｎ−グリコシダーゼでの消化後のＢＲＰ  ＥＰＯ標準  ｍｗ：マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｌｏｗ  ｒａｎｇｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ  １６１−０３０５，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の文脈では、用語「ヒドロキシアルキルデンプン」（ＨＡＳ）は、少なくとも１
つのヒドロキシアルキル基に置換されたデンプン誘導体をいう。したがって、本発明で使
用される、用語「ヒドロキシアルキルデンプン」は、末端炭水化物部分がヒドロキシアル
キル基Ｒ1、Ｒ2、および／またはＲ3（簡単にするために式（Ｉ）中にこのように示す。
）を含む化合物に限定されないが、末端炭水化物部分および／またはデンプン分子の残り
の部分のどこかに存在する少なくとも１つの水酸基がヒドロキシアルキル基Ｒ1、Ｒ2、ま
たはＲ3に置換された化合物（ＨＡＳ’）をいう。
【００１７】
この文脈では、アルキル基は、適切に置換することができる直鎖または分岐状アルキル
基であり得る。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、１〜１０個の炭素原子、より好ま
しくは１〜６個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子、さらにより好ましくは
２〜４個の炭素原子を含む。したがって、「ヒドロキシアルキルデンプン」は、ヒドロキ
シエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、およびヒドロキシブチルデンプンを含
むことが好ましいが、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特
に好ましい。
【００１８】
２以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンもまた本発明
に含まれる。
【００１９】
ＨＡＳ中に含まれる少なくとも１つのヒドロキシアルキル基は、２以上の水酸基を含み
得る。好ましい実施形態によれば、ＨＡＳ中に含まれる少なくとも１つのヒドロキシアル
キル基は、１つの水酸基を含む。
【００２０】
表現「ヒドロキシアルキルデンプン」には、アルキル基が一置換または多置換された誘
導体も含まれる。この文脈では、ＨＡＳが水溶性を維持する場合、アルキル基がハロゲン
基、詳細にはフッ素またはアリール基で置換されることが好ましい。さらに、ヒドロキシ
アルキル基の末端水酸基をエステル化またはエーテル化してもよい。
【００２１】
さらに、アルキルの代わりに、直鎖または分岐置換または非置換アルケン基を使用する
こともできる。
【００２２】
ヒドロキシアルキルデンプンは、デンプンのエーテル誘導体である。エーテル誘導体に
加えて、本発明の文脈では、他のデンプン誘導体を使用することもできる。例えば、エス
テル化水酸基を含む誘導体が有用である。これらの誘導体は、例えば、２〜１２個の炭素
原子を有する非置換モノまたはジカルボン酸の誘導体またはその置換誘導体であり得る。
２〜６個の炭素原子を有する非置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸誘導体が特に有用
である。この文脈では、アセチルデンプン、ブチルデンプン、およびプロピルデンプンが
好ましい。
【００２３】
さらに、２〜６個の炭素原子を有する非置換ジカルボン酸誘導体が好ましい。
【００２４】
ジカルボン酸誘導体の場合、ジカルボン酸の第２のカルボキシル基もエステル化されて
いることが有用である。さらに、ジカルボン酸のモノアルキルエステル誘導体も本発明の
文脈で適切である。
【００２５】
置換モノまたはジカルボン酸のために、置換基は、好ましくは置換アルキル残基につい
て上記と同一のものであり得る。
【００２６】
デンプンのエステル化技術は当分野で公知である（例えば、Ｋｌｅｍｍ  Ｄ．ｅｔ  ａ
ｌ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．
２，１９９８，Ｗｈｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｅｓｐｅ
ｃｉａｌｌｙ  ｃｈａｐｔｅｒ  ４．４，Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌ
ｌｕｌｏｓｅ（ＩＳＢＮ  ３−５２７−２９４８９−９）を参照）。
【００２７】
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、本発明の全ての実施形態で最も好ましい。
【００２８】
したがって、本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプン
である上記方法に関する。
【００２９】
ＨＥＳは、主に、分子量分布および置換度によって特徴付けられる。置換度を以下の２
つで記載することが可能である。
１．置換度は、全てのグルコース部分（ＤＳ）に関して置換グルコース単量体部分に対し
て相対的に記載することができる。
２．置換度は、グルコース部分あたりのヒドロキシエチル基数を記載する、「モル置換」
（ＭＳ）として記載することができる。
【００３０】
ＨＥＳ溶液は、重合度、分岐部位の数およびパターン、ならびに置換パターンに関して
各分子が他と異なる多分散系組成物として存在する。したがって、ＨＥＳは、異なる分子
量の化合物の混合物である。したがって、特定のＨＥＳ溶液は、統計的平均を使用した平
均分子量によって決定される。この文脈では、分子数に依存する相加平均としてＭnを計
算する。あるいは、Ｍw（重量平均）は、ＨＥＳの質量に依存する単位を示す。
【００３１】
本発明の文脈では、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量（重量平均）は、１〜３０
０ｋＤａであってよく、平均分子量５〜１００ｋＤａがより好ましい。ヒドロキシエチル
デンプンは、さらに、ヒドロエチル基に関して０．１〜０．８のモル置換度およびＣ2：
Ｃ6置換比は２〜２０の範囲であり得る。
【００３２】
式（Ｉ）の残基Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3を考慮する限り、化合物（Ｉ）が化合物（Ｄ）ま
たは化合物（Ｌ）と反応可能なままであるならば特に制限されない。好ましい実施形態に
よれば、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、独立して、水素または１〜１０個の炭素原子を有する
ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基、またはヒドロ
キシアルカリール基である。水素および１〜６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル
基が好ましい。アルキル基、アリール基、アラルキル基、および／またはアルカリール基
は直鎖または分岐鎖であってよく、適切に置換されていてもよい。
【００３３】
したがって、本発明は、また、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、独立して、水素または１〜６
個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である上記方法に関する
。
【００３４】
このように、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、ヒドロキヘキシル基、ヒドロキペンチル基、ヒ
ドロキシブチル基、ヒドロキシプロピル基（１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシ
プロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、１−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキ
シイソプロピル基など）、ヒドロキシエチル基（１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキ
シエチル基など）、またはヒドロキシメチル基であり得る。水素およびヒドロキシエチル
基が好ましく、水素および２−ヒドロキシエチル基が特に好ましい。
【００３５】
したがって、本発明は、また、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、独立して、水素または２−ヒ
ドロキシエチル基である上記方法に関する。
【００３６】
本発明によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ
）中にＺ1基が含まれる、官能基Ｚ1と還元末端との反応を介してヒドロキシアルキルデン
プンの還元末端と反応させる。
【００３７】
本発明の第１の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、ヒド
ロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させるが、還元末端は反応前に酸化されている
。
【００３８】
この還元末端の酸化により、末端炭水化物基がラクトン基を含むか、末端炭水化物基が
、化学反応条件および／または酸化剤に依存して、カルボキシル基を含む非環式構造を有
するヒドロキシアルキルデンプンが誘導される。
【００３９】
本発明の１つの実施形態によれば、その還元末端が酸化されたヒドロキシアルキルデン
プンは、ラクトン基を含む化合物とカルボキシル基を含む化合物との混合物として存在す
る。混合物中で、各化合物は、任意の考え得る比で存在し得る。
【００４０】
したがって、本発明は、また、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前にヒドロキ
シアルキルデンプンの還元末端を酸化させるため、前記ヒドロキシアルキルデンプンが式
（ＩＩａ）：
【化２】
2010248528.tif 000003
および／または式（ＩＩｂ）：
【化３】
2010248528.tif 000004
を有する上記方法に関する。
【００４１】
得られた化合物が上記構造（ＩＩａ）および／または（ＩＩｂ）を有する各方法または
方法の組み合わせにしたがって、ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端を酸化させるこ
とができる。
【００４２】
ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が酸化される全ての適切な方法にしたがって酸
化させることができるが、例えば、第１９６２８７０５Ａ１号に記載のアルカリヨウ素液
を使用して実施することが好ましい。
【００４３】
したがって、本発明は、また、還元末端がアルカリヨウ素液によって酸化される上記方
法に関する。
【００４４】
本発明の第２の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、ヒド
ロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させるが、還元末端が反応前に酸化されていな
い。
【００４５】
したがって、本発明は、また、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前にヒドロキ
シアルキルデンプンの還元末端が酸化されていないため、前記ヒドロキシアルキルデンプ
ンが式（Ｉ）：
【化４】
2010248528.tif 000005
の構造を有する上記方法に関する。
【００４６】
化合物（Ｌ）とヒドロキシアルキルデンプンまたは化合物（Ｄ）とヒドロキシアルキル
デンプンとのいずれかの間の化学結合の形成を、官能基Ｚ1とヒドロキシアルキルデンプ
ンの必要に応じて酸化された還元末端との反応によって行う。
【００４７】
官能基Ｚ1として、ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と
の化学結合を形成可能な各官能基を使用することができる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態によれば、官能基Ｚ1は、化学構造−ＮＨ−を含む。
【００４９】
したがって、本発明は、また、官能基Ｚ1が構造−ＮＨ−を含む上記方法に関する。
【００５０】
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、官能基Ｚ1は、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する
基であり、Ｒ’は水素またはアルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラル
キル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリ
ール残基であり、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロ
アルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基をＮＨ基に直接結
合させることができるか、別の実施形態によれば、ＮＨ基への酸素架橋によって結合する
ことができる。アルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、ア
リールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基を適
切に置換することができる。好ましい置換として、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒなどのハロゲン
を挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は水素、アルキル基、およびアルコキシ基
であり、水素および非置換アルキル基およびアルコキシ基がさらにより好ましい。
【００５１】
アルキル基およびアルコキシ基のうち、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の
Ｃ原子を有する基が好ましい。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メト
キシ基、エトキシ基、プロポキシ基、およびイソプロポキシ基がより好ましい。メチル基
、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、メチル基またはメトキシ基が特に
好ましい。
【００５２】
したがって、本発明は、また、Ｒ’が水素またはメチル基もしくはメトキシ基である上
記方法に関する。
【００５３】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、官能基Ｚ1は、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ’’を有
し、Ｒ’’’’は構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ＧはＯまた
はＳである）および／または構造単位−ＳＯ2−を含むことが好ましい。より好ましい実
施形態によれば、官能基Ｒ’’は、
【化５Ａ】
2010248528.tif 000006
【化５Ｂ】
2010248528.tif 000007
（上式中、Ｇが２つ存在する場合には、Ｇは独立してＯまたはＳである。）
からなる群から選択される。
【００５４】
したがって、本発明は、また、官能基Ｚ1が、
【化６】
2010248528.tif 000008
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される上記方法に関する。
【００５５】
本発明の目的は、ヒドロキシアルキルデンプンと、化合物（Ｌ）と、必要に応じて化合
物（Ｄ）と、さらなる化合物（Ｍ）とを含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を反応生
成物として得るために、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な官能基Ｘを含むヒ
ドロキシアルキルデンプン誘導体を提供することにある。
【００５６】
官能基Ｘに関して、さらなる化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙと化学結合を形成する
ことができるなら、特に制限されない。
【００５７】
官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる
群から選択される場合、官能基Ｘは、化学構造−ＮＨ−を含むことが好ましい。
【００５８】
したがって、本発明は、また、官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基
、およびアセタール基からなる群から選択され、官能基Ｘが構造−ＮＨ−を含む上記方法
に関する。
【００５９】
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、官能基Ｘは、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する基
であり、Ｒ’は水素またはアルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキ
ル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリー
ル残基であり、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロア
ルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基をＮＨ基に直接結合
させることができるか、別の実施形態によれば、ＮＨ基への酸素架橋によって結合するこ
とができる。アルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリ
ールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基を適切
に置換することができる。好ましい置換として、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒなどのハロゲンを
挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は水素、アルキル基、およびアルコキシ基で
あり、水素および非置換アルキル基およびアルコキシ基がさらにより好ましい。
【００６０】
アルキル基およびアルコキシ基のうち、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の
Ｃ原子を有する基が好ましい。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メト
キシ基、エトキシ基、プロポキシ基、およびイソプロポキシ基がより好ましい。メチル基
、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、メチル基またはメトキシ基が特に
好ましい。
【００６１】
したがって、本発明は、また、Ｒ’が水素またはメチル基もしくはメトキシ基である上
記方法に関する。
【００６２】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、官能基Ｘは、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ’’を有し
、Ｒ’’’’は構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ＧはＯまたは
Ｓである）および／または構造単位−ＳＯ2−を含むことが好ましい。より好ましい実施
形態によれば、官能基Ｒ’’は、
【化７Ａ】
2010248528.tif 000009
【化７Ｂ】
2010248528.tif 000010
（上式中、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳである。）
からなる群から選択される。
【００６３】
したがって、本発明は、また、官能基Ｘが、
【化８】
2010248528.tif 000011
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される上記方法に関する。
【００６４】
官能基Ｙがチオ基である場合、官能基Ｘは、好ましくは、
【化９】
2010248528.tif 000012
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩ、好ましくはＢｒまたはＩである。）
からなる群から選択される。
【００６５】
したがって、本発明は、また、官能基Ｙが−ＳＨであり、官能基Ｘが、
【化１０】
2010248528.tif 000013
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される上記方法に関する。
【００６６】
本発明の１つの実施形態によれば、ヒドロキシアルキルデンプンを化合物（Ｄ）と反応
させ、得られた反応生成物を化合物（Ｌ）とさらに反応させ、化合物（Ｌ）と反応生成物
との間の化学結合を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と反応生成物の一部である化
合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応によって形成される。
【００６７】
官能基Ｚ2およびＷに関して、所望の化学結合が形成されるなら、特に制限されない。
【００６８】
可能な官能基ＷまたはＺ2として、以下の官能基が特に挙げられる。
Ｃ−Ｃ二重結合またはＣ−Ｃ−三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合；
チオ基または水酸基；
アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
１，２−ジオール；
１，２−アミノアルコール；
アミノ基−ＮＨ2または構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体（アミノアルキ
ル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基など
）；
ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ2または構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含むヒドロキシ
ルアミノ基の誘導体（ヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミ
ノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキサルアルカリールアミノ
(hydroxalalkarylamino)基など）；
アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、また
はアルカリールオキシアミノ基（それぞれ構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含む）；
カルボニル基、−Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍ（式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｍは、例え
ば、
−ＯＨまたは−ＳＨ；
アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリー
ルオキシ基；
アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリール
チオ基；
アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカ
ルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドなどのイミド構造または構造単位Ｏ−Ｎ（式中
、Ｎはヘテロアリール化合物の一部であるか、Ｇ＝ＯおよびＱは存在しない
（ペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニル、またはトリクロロフェニ
ル（ｔｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）などの置換アリール残基を有するア
リールオキシ化合物など））を有するヒドロキシルアミンエステルなどの活
性化されたエステル；
であり、Ｑは存在しないかＮＨまたはＳまたはＯなどのヘテロ原子である）；
−ＮＨ−ＮＨ2または−ＮＨ−ＮＨ−；
−ＮＯ2；
ニトリル基；
アルデヒド基またはケト基などのカルボニル基；
カルボキシル基；
−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基；
ヨウ化ビニル基または臭化ビニル基またはトリフラートなどのビニルハライド基；
−Ｃ≡Ｃ−Ｈ；
−（Ｃ＝ＮＨ2Ｃｌ）−Ｏアルキル；
−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ2−Ｈａｌ基（ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである）；
−ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ2−；
構造−Ｓ−Ｓ−を含むジスルフィド基；
【化１１】
2010248528.tif 000014
基；
【化１２】
2010248528.tif 000015
基（上式中、Ｚ2およびＷはそれぞれ上記基の１つと化学結合を形成することができる基
である。）。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＷおよびＺ2は共に上記基のリスト由来の基である
。
【００７０】
本発明の第１の特に好ましい実施形態によれば、Ｚ2またはＷは、チオ基である。この
特定の場合、官能基Ｗは、好ましくは、
【化１３】
2010248528.tif 000016
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩ、好ましくはＢｒまたはＩである。）
からなる群から選択される。
【００７１】
したがって、本発明は、また、官能基Ｗまたは官能基Ｚ2が−ＳＨであり、官能基Ｚ2ま
たは官能基Ｗが、
【化１４】
2010248528.tif 000017
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである）
からなる群から選択される上記方法に関する。
【００７２】
本発明の第２の特に好ましい実施形態によれば、Ｚ2またはＷは、上記の活性化された
エステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる
群から選択される。この具体例では、官能基ＷまたはＺ2は、それぞれ化学構造−ＮＨ−
を含む。
【００７３】
したがって、本発明は、また、Ｚ2またはＷが上記の活性化されたエステルまたは必要
に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、官
能基ＷまたはＺ2がそれぞれ化学構造−ＮＨ−を含む上記方法に関する。
【００７４】
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、構造−ＮＨ−を含む官能基ＷまたはＺ2は
、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する基であり、Ｒ’は水素またはアルキル残基、シクロアルキル
残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基
、またはシクロアルキルアリール残基であり、シクロアルキル残基、アリール残基、アラ
ルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルア
リール残基をＮＨ基に直接結合させることができるか、別の実施形態によれば、ＮＨ基へ
の酸素架橋によって結合することができる。アルキル残基、シクロアルキル残基、アリー
ル残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシク
ロアルキルアリール残基を適切に置換することができる。好ましい置換として、Ｆ、Ｃｌ
、またはＢｒなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は水素、アル
キル基、およびアルコキシ基であり、水素および非置換アルキル基およびアルコキシ基が
さらにより好ましい。
【００７５】
アルキル基およびアルコキシ基のうち、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の
Ｃ原子を有する基が好ましい。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メト
キシ基、エトキシ基、プロポキシ基、およびイソプロポキシ基がより好ましい。メチル基
、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、メチル基またはメトキシ基が特に
好ましい。
【００７６】
したがって、本発明はまた、ＷまたはＺ2が上記の活性化されたエステルまたは必要に
応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、官能
基ＷまたはＺ2がそれぞれＲ’−ＮＨ−（式中、Ｒ’は水素またはメチル基もしくはメト
キシ基である）である上記方法に関する。
【００７７】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、官能基ＷまたはＺ2は、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ
’’を有し、Ｒ’’は構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ＧはＯ
またはＳである。）および／または構造単位−ＳＯ2−を含むことが好ましい。より好ま
しい実施形態によれば、官能基Ｒ’’は、
【化１５】
2010248528.tif 000018
（上式中、Ｇが２つ存在する場合、独立してＯまたはＳである。）
からなる群から選択される。
【００７８】
したがって、本発明はまた、官能基ＷまたはＺ2が、
【化１６】
2010248528.tif 000019
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される上記方法に関する。
【００７９】
本発明のさらに別の態様によれば、少なくとも１つの官能基Ｘ、Ｚ2、および／または
Ｗは、所与のさらなる化合物と直接反応することができないが、所望の方法で反応可能な
ように化学修飾することができる基であり得る。
【００８０】
さらなる化合物との反応の前に修飾される官能基の例として、例えば、酸化によって修
飾されてアルデヒド基またはケト基が形成される１，２−アミノアルコールまたは１，２
−ジオールが挙げられる。
【００８１】
さらなる化合物との反応の前に修飾される官能基の別の例は、例えば、以下の式：
【化１７】
2010248528.tif 000020
の化合物との反応によって修飾されて、例えば、チオ基に反応性を示す以下の式：
【化１８】
2010248528.tif 000021
の構造が得られる−ＮＨ2基である。
【００８２】
さらなる化合物との反応の前に修飾される官能基の別の例は、例えば、以下の式：
【化１９】
2010248528.tif 000022
の化合物との反応によって修飾されて、例えば、チオ基に反応性を示す以下の式：
【化２０】
2010248528.tif 000023
の構造が得られる−ＮＨ2基である。
【００８３】
さらなる化合物との反応の前に修飾される官能基のさらに別の例は、無水ブロモ酢酸ま
たはＮ−スクシンイミジルヨードアセテートと反応するアミノ基である。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｌ）は構造Ｚ1−Ｌ’−ＸまたはＺ2−Ｌ
’−Ｘを有し、Ｌ’は官能基を分離する有機残基であり、且つ必要に応じて存在せず、こ
の構造は、化合物（Ｄ）がヒドロキシアルキルデンプンと反応するかどうかに依存する。
【００８５】
第１の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）は含まれず、Ｙは、アルデヒド基、ケ
ト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択される。
【００８６】
この特定の場合、これらのうち、構造Ｚ1−Ｌ’−Ｘ（Ｌ’は存在しない）を有する化
合物（Ｌ）として以下の化合物が好ましい。
【化２１】
2010248528.tif 000024
【００８７】
この具体例では、Ｌ’が存在する場合、Ｌ’は、直鎖または分岐状アルキル基、シクロ
アルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールシクロアルキル基、アルカリール基、
またはシクロアルキルアリール基であってよく、Ｌ’は、Ｎ、Ｏ、Ｓなどの少なくとも１
つのヘテロ原子を含んでよく、Ｌ’を適切に置換し得る。Ｌ’基のサイズを特定の要件に
適合させることができる。分離基Ｌ’は、一般に、１〜６０個、好ましくは１〜４０個、
より好ましくは１〜２０個まで、より好ましくは１〜１０個、より好ましくは１６個、特
に好ましくは１〜４個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は、一般
に、１〜２０個、好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜４個のヘテロ原子を含む。本
発明の特に好ましい実施形態によれば、分離基Ｌ’は、１〜４個の酸素原子を含む。分離
基Ｌ’は、例えば、５〜７個までの炭素原子を有する必要に応じて分岐したアルキル鎖、
アリール基、またはシクロアルキル基を含み得るか、アルキル部分が直鎖および／または
環状アルキル基であり得るアラルキル基、アルカリール基であり得る。さらにより好まし
い実施形態によれば、分離基は、１〜２０個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜
６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは２〜４個の炭素原子を含むアルキル鎖で
ある。ヘテロ原子が存在する場合、１〜４個の酸素原子を含む鎖が特に好ましい。
【００８８】
Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から
選択されるこの特定の場合に関して、これらのうち、構造Ｚ1−Ｌ’−Ｘ（Ｌ’が存在す
る）を有する化合物（Ｌ）として以下の化合物が好ましい。
【化２２Ａ】
2010248528.tif 000025
【化２２Ｂ】
2010248528.tif 000026
【００８９】
第２の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）が含まれる。
【００９０】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）は構造Ｚ1−Ｄ’−Ｗを有し
、Ｄ’は官能基を分離する有機残基であり、且つ必要に応じて存在しない。
【００９１】
この特定の場合、これらのうち、構造Ｚ1−Ｄ’−Ｗ（Ｄ’は存在しない。）を有する
化合物（Ｄ）として以下の化合物が好ましい。
【化２３】
2010248528.tif 000027
【００９２】
Ｄ’が存在しない化合物Ｄの具体例は、ＮＨ3である。
【００９３】
この特定の例では、Ｄ’が存在する場合、Ｄ’は、直鎖または分岐状アルキル基、シク
ロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールシクロアルキル基、アルカリール基
、またはシクロアルキルアリール基であってよく、Ｄ’は、Ｎ、Ｏ、Ｓなどの少なくとも
１つのヘテロ原子を含んでよく、Ｄ’を適切に置換し得る。Ｄ’基のサイズを特定の要件
に適合させることができる。一般に、分離基Ｄ’は、一般に、１〜６０、好ましくは１〜
４０個、より好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６
個、特に好ましくは１〜４個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は
、一般に、１〜２０個、好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜４個のヘテロ原子を含
む。本発明の特に好ましい実施形態によれば、分離基Ｄ’は、１〜４個の酸素原子を含む
。分離基Ｄ’は、例えば、５〜７個の炭素原子を有する必要に応じて分岐したアルキル鎖
、アリール基、またはシクロアルキル基を含み得るか、アルキル部分が直鎖および／また
は環状アルキル基であり得るアラルキル基、アルカリール基であり得る。さらにより好ま
しい実施形態によれば、分離基は、１〜２０個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１
〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは２〜４個の炭素原子を含むアルキル鎖
である。ヘテロ原子が存在する場合、１〜４個の酸素原子を含む鎖が特に好ましい。
【００９４】
この特定の場合、構造Ｚ1−Ｄ’−Ｗ（Ｄ’が存在する）を有する好ましい化合物（Ｄ
）は、以下である。
【化２４Ａ】
2010248528.tif 000028
【化２４Ｂ】
2010248528.tif 000029
【００９５】
化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗおよび官能基Ｙの化学的性質に依存して、特定の要
件にしたがって特定の化合物（Ｌ）を使用することができる。
【００９６】
例えば、上で詳述したように、官能基Ｙがチオ基であり、官能基Ｗが構造−ＮＨ−を含
む場合、これらのうち、以下の化合物（Ｌ）型が好ましい。
【表１】
2010248528.tif 000030
【００９７】
例えば、官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基
からなる群から選択され、官能基Ｗはチオ基である場合、これらのうち、以下の化合物（
Ｌ）型が好ましい。
【表２】
2010248528.tif 000031
【００９８】
本明細書の最後の表１では、上記の型の化合物（Ｌ）のいくつかの好ましい例を列挙す
る。
【００９９】
分離基Ｌ’および／またはＤ’を適切に置換することができる。好ましい置換基は、例
えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩなどのハライドである。
【０１００】
分離基Ｌ’および／またはＤ’は、次の例示する一以上の切断部位を含み、得られた化
合物を所定の部位で容易に切断可能である。
【化２５】
2010248528.tif 000032
【０１０１】
ヒドロキシアルキルデンプンに結合することができ、得られたヒドロキシアルキルデン
プン誘導体がさらなる化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙと反応可能な官能基Ｘを含み、
官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群
から選択される化合物（Ｌ）の特に好ましい例は、
【化２６】
2010248528.tif 000033
であり、化合物（Ｌ）
【化２７】
2010248528.tif 000034
が特に好ましい。
【０１０２】
ヒドロキシアルキルデンプンに結合することができ、得られたヒドロキシアルキルデン
プン誘導体が化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と反応可能な官能基Ｗを含み、ヒドロ
キシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）と化合物（Ｌ）を含む得られたヒドロキシアルキル
デンプン誘導体がさらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応することができ、官能基Ｙがチ
オ基である化合物（Ｄ）の特に好ましい例は、
【化２８Ａ】
2010248528.tif 000035
【化２８Ｂ】
2010248528.tif 000036
であり、化合物（Ｄ）
【化２９】
2010248528.tif 000037
が特に好ましい。
【０１０３】
上記の好ましい化合物（Ｄ）と合わせて、以下の化合物（Ｌ）：
【化３０】
2010248528.tif 000038
が好ましく、化合物（Ｌ）
【化３１】
2010248528.tif 000039
が特に好ましい。
【０１０４】
本発明の第１の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、酸化
されていないヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
【０１０５】
使用した溶媒または溶媒混合物、反応混合物の温度、圧力、またはｐＨなどの反応条件
に依存して、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）の反応生成物を、異なる構造を有し得る酸
化していないヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態によれば、水系でこの反応を行う。
【０１０７】
本発明の文脈で使用される、用語「水系」は、含まれる溶媒の重量に基づいて、少なく
とも１０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量
％、さらにより好ましくは少なくとも９０重量％または最大１００重量％の範囲の水を含
む溶媒または溶媒混合物をいう。さらなる溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、エタノール、または
メタノールなどの溶媒）が挙げられる。
【０１０８】
水系で反応を行い、反応基Ｚ1が上記のＲ’−ＮＨ−基である場合、ヒドロキシアルキ
ルデンプン誘導体は、式（ＩＩＩａ）：
【化３２】
2010248528.tif 000040
の構造を有し得る。
【０１０９】
水系で反応を行い、反応基Ｚ1が上記のＲ’−ＮＨ−基（Ｒ’＝Ｈ）である場合、ヒド
ロキシアルキルデンプン誘導体は、式（ＩＩＩａ）または式（ＩＩＩｂ）：
【化３３Ａ】
2010248528.tif 000041
【化３３Ｂ】
2010248528.tif 000042
または式（ＩＩＩａ）と式（ＩＩＩｂ）の化合物の混合物であり得る。
【０１１０】
反応に使用した化合物（Ｌ）または化合物（Ｄ）の反応条件および／または化学的性質
に依存して、式（ＩＩＩａ）の化合物は、赤道面または軸方向にＮ原子と共に存在するこ
とができ、両形態の混合物は一定の平衡分布でも存在し得る。
【０１１１】
反応に使用した化合物（Ｌ）または化合物（Ｄ）の反応条件および／または化学的性質
に依存して、式（ＩＩＩｂ）の化合物は、Ｅ体またはＺ体中にＣ−Ｎ二重結合と共に存在
することができ、両形態の混合物は一定の平衡分布でも存在し得る。
【０１１２】
したがって、本発明はまた、式（ＩＩＩｂ）もしくは式（ＩＩＩｂ）または式（ＩＩＩ
ａ）と（ＩＩＩｂ）の構造を有する上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０１１３】
いくつかの場合、式（ＩＩＩａ）の化合物を安定化することが望ましい。これは、特に
、式（ＩＩＩａ）の化合物を水溶液中で生成および／または使用する場合である。安定化
方法として、式（ＩＩＩａ）の化合物のアシル化が特に好ましく、特にＲ’が水素である
場合に好ましい。アシル化試薬として、式（ＩＶａ）：
【化３４】
2010248528.tif 000043
の所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる全ての適切な試薬を使用すること
ができる。
【０１１４】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、アシル化試薬の一部である残基Ｒａはメチル
である。アシル化試薬として、無水カルボン酸、カルボン酸ハライド、およびカルボン酸
活性エステルを使用することが好ましい。
【０１１５】
０℃から３０℃の範囲、好ましくは２℃から２０℃の範囲、特に好ましくは４℃から１
０℃の範囲の温度でアシル化を行う。
【０１１６】
したがって、本発明は、また、誘導体が式（ＩＶａ）の構造を有する、上記方法によっ
て得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０１１７】
他の場合、式（ＩＩＩｂ）の化合物を安定化することが望ましい。これは、特に、式（
ＩＩＩｂ）の化合物を水溶液中で生成および／または使用する場合である。安定化方法と
して、式（ＩＩＩａ）の化合物の還元が特に好ましく、特にＲ’が水素である場合に好ま
しい。還元剤として、式（ＩＶｂ）：
【化３５】
2010248528.tif 000044
の所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる全ての適切な試薬を使用すること
ができる。
【０１１８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、還元剤として、ＮａＣＮＢＨ3またはＮａＢ
Ｈ4などのホウ化水素を使用する。
【０１１９】
４℃から１００℃の範囲、好ましくは１０℃から９０℃の範囲、特に好ましくは２５℃
から８０℃の範囲の温度で還元を行う。
【０１２０】
したがって、本発明は、また、誘導体が式（ＩＶｂ）の構造を有する、上記方法によっ
て得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０１２１】
本発明は、さらに、式（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）と（ＩＶｂ）、（ＩＩ
Ｉａ）と（ＩＶａ）、（ＩＩＩａ）と（ＩＶｂ）、（ＩＩＩｂ）と（ＩＶａ）、（ＩＩＩ
ｂ）と（ＩＶｂ）、（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）と（ＩＶａ）、（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩ
ｂ）と（ＩＶｂ）、（ＩＶａ）と（ＩＶｂ）と（ＩＩＩａ）、および（ＩＶａ）と（ＩＶ
ｂ）と（ＩＩＩｂ）の構造を有し、（ＩＩＩａ）および／または（ＩＶａ）は、赤道面ま
たは軸方向にＮ原子が存在する構造中に独立して存在することができ、および／または（
ＩＩＩｂ）はＥ体またはＺ体中にＣ−Ｎ二重結合と共に存在し得る化合物の混合物に関す
る。
【０１２２】
本発明の第２の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、酸化
されたヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
【０１２３】
この場合、好ましくは、一定量の水（最大１０重量％など）を含み得る極性非プロトン
性溶媒を使用する。そのうちで好ましい非プロトン性溶媒は、ＤＭＳＯまたはＤＭＦであ
る。ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端と反応する官能基の化学的性質お
よび他の反応条件に依存して、好ましい反応温度範囲の例は、２０℃（室温）から６５℃
、反応時間は、一般に、１分から数時間までおよび数日までの範囲である。
【０１２４】
この場合、官能基Ｚ1が上記のＲ’−ＮＨ−基である場合、ヒドロキシアルキルデンプ
ン誘導体は、式（Ｖａ）：
【化３６】
2010248528.tif 000045
の構造を有し得る。
【０１２５】
したがって、本発明は、また、誘導体が式（Ｖａ）の構造を有する、上記方法によって
得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０１２６】
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）および／または化合物（Ｌ）ならびに化合
物（Ｍ）との反応が考慮される限り、全ての可能な配列が本発明に含まれる。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態は、ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒド
ロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ
）と反応させ、得られた反応生成物を化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ
）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる上記方法に
関する。
【０１２８】
本発明の別の実施形態は、ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキ
シアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と
反応させ、化合物（Ｌ）を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物（Ｌ
）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらな
る化合物（Ｍ）と反応させる上記方法に関する。
【０１２９】
本発明のさらに別の実施形態は、ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含
まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末
端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体
が得られ、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる
官能基Ｚ2と、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（Ｌ）と反応
させて第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる上記方法に関する。
【０１３０】
本発明のさらに別の実施形態は、第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物
（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさ
らなる化合物（Ｍ）と反応させる後者の方法に関する。
【０１３１】
本発明のさらに別の実施形態は、ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含
まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末
端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体
が得られ、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）中に含まれる
官能基Ｗと、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物（Ｌ）と反応
させ、化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化
合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介し
てさらなる化合物（Ｍ）と反応させる上記方法に関する。
【０１３２】
上記各反応ステップの反応条件を考慮する限り、温度、圧力、ｐＨ、溶媒、または溶媒
混合物などの全てのパラメーターを、反応させるべき化合物の特定の要件および化学的性
質に適合することができる。
【０１３３】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、溶媒として水を単独または少なくとも１つの
他の溶媒と組み合わせて使用する。少なくとも１つの他の溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ
、メタノール、およびエタノールが挙げられる。水以外の好ましい溶媒は、ＤＭＳＯ、Ｄ
ＭＦ、メタノール、およびエタノールである。この実施形態では、ヒドロキシアルキルデ
ンプンを、酸化されていない還元末端を介して反応させることが好ましい。
【０１３４】
ヒドロキシアルキルデンプンを水性溶媒中で化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）と反応さ
せ、且つ化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）がヒドロキシルアミンまたはヒドロアジドであ
る場合、反応温度は、好ましくは５〜４５℃の範囲、より好ましくは１０〜３０℃の範囲
、特に好ましくは１５〜２５℃の範囲である。
【０１３５】
ヒドロキシアルキルデンプンを水性溶媒中で化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）と反応さ
せ、且つ反応が還元的アミノ化である場合、温度は、好ましくは最大１００℃の範囲、よ
り好ましくは７０〜９０℃の範囲、特に好ましくは７５〜８５℃の範囲である。
【０１３６】
一連の反応中に、好ましくは、上記の所与の範囲で温度を変化させることができるか、
本質的に一定に保持することができる。
【０１３７】
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応時間を、特定
の要件に適合することができ、一般に、１時間〜７日の範囲である。
【０１３８】
化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、
反応時間は、好ましくは１時間〜３日、より好ましくは２時間〜４８時間の範囲である。
【０１３９】
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応が還元的アミ
ノ化である場合、反応時間は、好ましくは２時間〜７日の範囲である。
【０１４０】
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応のためのｐＨ
値を、反応物質の化学的性質などの特定の要件に適合することができる。
【０１４１】
化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、
ｐＨ値は、好ましくは４．５〜６．５の範囲である。
【０１４２】
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応が還元的アミ
ノ化である場合、ｐＨ値は、好ましくは８〜１２の範囲である。
【０１４３】
少なくとも１つの適切な緩衝液の添加によって、各反応ステップについての反応混合物
の適切なｐＨを調整することができる。好ましい緩衝液のうち、酢酸ナトリウム緩衝液、
リン酸緩衝液、またはホウ酸緩衝液が挙げられる。
【０１４４】
必要に応じて、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応前、化合物（Ｄ）
と化合物（Ｌ）との反応前、またはヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応
生成物と化合物（Ｌ）との反応前に、少なくとも１つの官能基Ｘを、少なくとも１つの適
切な保護基で保護することができる。これに関して、保護された化合物（Ｌ）が、少なく
とも１つの官能基Ｘを介して反応することを妨げる、全ての考え得る保護基が可能である
。したがって、例えば、反応が行われる溶媒または反応混合物のｐＨから保護すべき官能
基Ｘの化学的性質に依存して、保護基を選択することができる。これらのうちで、好まし
い保護基は、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、メトキシ
フェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、トリアリールメチル基、トリチル基、モノ
メトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメチルトリチル基、ジメチルトリチル
基、トリフルオロアセチル基、フタリミン（ｐｈｔｈａｌｉｍｉｎ）化合物、２−（トリ
アルキルシリル）エトキシカルボニル化合物、Ｆｍｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチル基、またはト
リアルキルシリル基である。
【０１４５】
化合物（Ｌ）中に２つ以上の異なる官能基Ｘが存在する場合、少なくとも１つの基を保
護することができる一方で、少なくとも１つの他の基を保護しないままにすることができ
る。
【０１４６】
化合物（Ｌ）の反応後、少なくとも１つの保護基を反応生成物中に残すか、当業者に公
知の従来の方法などの適切な方法によって除去することができる。２つの異なる官能基Ｘ
を適切な保護基によって保護する場合、少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）とのさら
なる反応に利用可能な少なくとも１つの官能基Ｘを形成するために少なくとも１つの保護
基を除去し、化合物（Ｌ）を含む反応生成物をさらなる化合物（Ｍ）と反応させるまで、
少なくとも１つの他の官能基を保護したままにすることが可能である。その後、なおさら
なる化合物（Ｍ）との反応に利用可能な官能基Ｘを残すために、保護されたままの官能基
の保護基を除去することができる。
【０１４７】
少なくとも１つの保護基の使用は、２つ以上のヒドロキシアルキルデンプン分子と反応
した化合物（Ｌ）または化合物（Ｄ）（すなわち、複数のＨＡＳ置換化合物（Ｌ）または
（Ｄ））を含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生成する反応の防止に重要であり得
る。しかし、ヒドロキシアルキルデンプンと過剰な化合物（Ｌ）または（Ｄ）との反応に
よって同一の結果を得ることができる。過剰量の化合物（Ｌ）または（Ｄ）を本発明のプ
ロセスで使用する場合、化合物（Ｌ）または（Ｄ）とヒドロキシアルキルデンプンとのモ
ル比は、好ましくは２〜１００の範囲である。
【０１４８】
一旦上記のように各反応ステップの反応生成物が形成されると、少なくとも１つの適切
な方法によって反応混合物から単離することができる。必要に応じて、少なくとも１つの
適切な方法によって反応生成物を単離前に沈殿させることができる。
【０１４９】
反応生成物を最初に沈殿させる場合、例えば、反応混合物を、適切な温度で反応混合物
と反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも１つの溶媒または溶媒
混合物とを接触させることが可能である。溶媒として水系を使用する本発明の特に好まし
い実施形態によれば、反応混合物を、好ましくは−２０℃から＋５０℃の範囲、特に好ま
しくは０℃から２５℃の範囲の温度でエタノールとアセトンとの混合物（好ましくは同体
積である１：１混合物）に接触させる。
【０１５０】
１つ以上のステップを含み得る適切なプロセスによって、反応生成物を単離することが
できる。本発明の好ましい実施形態によれば、例えばエタノール−アセトン混合液を用い
て遠心分離または濾過などの適切な方法によって、第１のステップでは、反応生成物を反
応混合物または反応混合物から分離する。第２のステップでは、分離した反応生成物を、
透析、遠心分離濾過または加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、ＭＰＬＣ
、ゲル濾過、および／または凍結乾燥のような後処理などのさらなる処理に供することが
できる。さらにより好ましい実施形態によれば、分離した反応生成物を、最初に好ましく
は水に対して透析し、生成物の所望のスペックにしたがって反応生成物の溶媒含有量が十
分に低くなるまで凍結乾燥させる。２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃の温度で凍結
乾燥させることができる。
【０１５１】
本発明の好ましい実施形態によれば、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）を含
むヒドロキシアルキルデンプン誘導体、またはヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ
）と化合物（Ｌ）を含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、少なくとも１つの官能基
Ｙを含むさらなる化合物（Ｍ）とさらに反応させる。
【０１５２】
一般に、化合物（Ｍ）に関して制限はない。好ましくは、本発明の文脈では、化合物（
Ｍ）としてポリペプチドを使用する。しかし、他の化合物（Ｍ）（ポリマー、オリゴマー
、もしくは単分子化合物、またはこれらの２つ以上の混合物）も可能である。
【０１５３】
本発明の文脈で使用される、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合（すなわち、構造
−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を有する結合）を介して結合した少なくとも２つのアミノ酸を含む
化合物をいう。ポリペプチドは、天然に存在する化合物または天然に存在しないポリペプ
チドであってよく、後者には、天然に存在するアミノ酸および／または天然に存在しない
少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。ポリペプチドの骨格（ポリペプチド鎖）は、少な
くとも１つの適切な置換基と置換され、それにより少なくとも１つの側鎖を有する。少な
くとも１つの官能基Ｙは、ポリペプチド骨格の一部または骨格の少なくとも１つの置換基
の一部であってよく、具体的には、ポリペプチド骨格の一部である少なくとも１つの官能
基およびポリペプチド骨格の少なくとも１つの置換基の一部である少なくとも１つの官能
基を含む実施形態が可能である。
【０１５４】
ポリペプチドが考慮される限り、ポリペプチドが少なくとも１つの官能基Ｙを含む場合
、制限はない。前記官能基Ｙを、ポリペプチド骨格または骨格の側鎖の一部に直接結合さ
せることができる。側鎖もしくは官能基Ｙのいずれか一方またはその両方は、天然に存在
するポリペプチドの一部であり得るか、官能基Ｘとの反応前に天然に存在するポリペプチ
ドまたは少なくとも一部が天然に存在しないポリペプチドに導入することができる。
【０１５５】
さらに、ポリペプチドは、少なくとも一部が任意のヒトまたは動物供給源に由来し得る
。好ましい実施形態では、ポリペプチドはヒト供給源に由来する。
【０１５６】
ポリペプチドは、サイトカイン、詳細には、エリスロポエチン、ＡＴ  ＩＩＩなどのア
ンチトロンビン（ＡＴ）、インターロイキン、詳細には、インターロイキン２、ＩＦＮ−
β、ＩＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、インターロイキン６、および治療用抗体であり得
る。
【０１５７】
好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、アンチトロンビン（ＡＴ）、好ましくは
ＡＴ  ＩＩＩ（Ｌｅｖｙ  ＪＨ，Ｗｅｉｓｉｎｇｅｒ  Ａ，Ｚｉｏｍｅｋ  ＣＡ，Ｅｃｈ
ｅｌａｒｄ  Ｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ，
Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２７
，４（２００１）４０５−４１６；Ｅｄｍｕｎｄｓ  Ｔ，Ｖａｎ  Ｐａｔｔｅｎ  ＳＭ，
Ｐｏｌｌｏｃｋ  Ｊ，Ｈａｎｓｏｎ  Ｅ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  Ｒ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  
Ｅ，Ｍａｎａｖａｌａｎ  Ｐ，Ｚｉｏｍｅｋ  Ｃ，Ｍｅａｄｅ  Ｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ
Ｊ，Ｃｏｌｅ  ＥＳ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｈｕｍａｎ
Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｔ
ｈｒｏｍｂｉｎ，Ｂｌｏｏｄ  ９１，１２（１９９８）４６６１−４６７１；Ｍｉｎｎｅ
ｍａ  ＭＣ，Ｃｈａｎｇ  ＡＣＫ，Ｊａｎｓｅｎ  ＰＭ，Ｌｕｂｂｅｒｓ  ＹＴＰ，Ｐｒ
ａｔｔ  ＢＭ，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ＢＧ，Ｔａｙｌｏｒ  ＦＢ，Ｈａｃｋ  ＣＥ，Ｆｒ
ｉｅｄｍａｎ  Ｂ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  
ＩＩＩ  ｉｍ−ｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｉｎ
ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｂａｂｏｏｎｓ  ｌｅｔｈａｌｌｙ
ｃｈａｌ−ｌｅｎｇｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｂｌｏｏｄ
９５，４（２０００）１１１７−１１２３；Ｖａｎ  Ｐａｔｔｅｎ  ＳＭ，Ｈａｎ−ｓ
ｏｎ  ＥＨ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  Ｒ，Ｚｈａｎｇ  Ｋ，Ｍａｎａｖａｌｎ  Ｐ，Ｃｏ
ｌｅ  ＥＳ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＪＭ，Ｅｄｍｕｎｄｓ  Ｔ，Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏ
ｆ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７４，１５（１９９９）１０２６８−１０２７６）で
ある。
【０１５８】
別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、ヒトＩＦＮ−β、特に、ＩＦＮ−β
１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、ＲＥＢＩＦ（登録商標）を参照のこと）およびＩＦＮ
−β１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）を参照のこと）である。
【０１５９】
さらに好ましいポリペプチドは、ヒトＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）である。
例えば、Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｗｏ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏ
ｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：
５７５−５８１，１９８６；Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕ
ｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏ
ｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ
ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２（１９８６）６１−６５；およびＨｅｒｍａｎ  
ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＮｅｕｐｏｇｅｎR（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ），ａ  ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕ−ｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕ
ｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ｉｎ：Ｆｏｒｍｕｌａｌｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｒｕｇｓ，Ｒｏｄ
ｎｅｙ  Ｐｅａｒｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗａｎｇ，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，３０３−３２８を参照。
【０１６０】
少なくとも２つの異なるポリペプチドの混合物を使用する場合、少なくとも２つのポリ
ペプチドは以下において異なり得る。例えば、分子量、アミノ酸の数および／または配列
、置換基の数および／または化学的性質、またはジスルフィド結合などの適切な化学結合
によって結合したポリペプチド鎖数。
【０１６１】
本発明の好ましい実施形態によれば、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との
反応生成物、または化合物（Ｌ）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合
物（Ｄ）との反応生成物を、好ましくは少なくとも１つの上記プロセスにしたがって単離
し、その後少なくとも１つの官能基Ｙを有するポリペプチドと反応させる。本発明の好ま
しい実施形態によれば、官能基Ｙは、ポリペプチドの炭水化物部分に含まれる。
【０１６２】
本発明の文脈では、用語「炭水化物部分」は、ヒドロキシアルデヒドまたはヒドロキシ
ケトンおよびその化学修飾物をいう（Ｒｏｍｐｐ  Ｃｈｅｍｉｅｌｅｘｉｋｏｎ，Ｔｈｉ
ｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ
１９９０，Ｖｏｌｕｍｅ  ９，ｐａｇｅｓ  ２２８１−２２８５およびその参考文献を
参照）。さらに、炭水化物部分はまた、グルコース、ガラクトース、マンノース、シアル
酸などの天然に存在する炭水化物部分の誘導体をいう。この用語には、化学的に酸化され
た天然に存在する炭水化物部分も含まれる。酸化された炭水化物部分の構造は、環状また
は直鎖であり得る。
【０１６３】
炭水化物部分を、ポリペプチド骨格に直接結合させることができる。好ましくは、炭水
化物部分は、炭水化物側鎖の一部である。より好ましくは、炭水化物部分は、炭水化物側
鎖の末端部分である。
【０１６４】
さらにより好ましい実施形態では、炭水化物部分は、炭水化物側鎖のガラクトース残基
、好ましくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。このガラクトース残基を、下
記の末端シアル酸の除去およびその後の酸化による、ヒドロキシアルキルデンプンと化合
物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデ
ンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物中に含まれる官能基Ｘとの反応に提供することがで
きる。
【０１６５】
さらに好ましい実施形態では、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生
成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ
）との反応生成物を、炭水化物側鎖のシアル酸残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端シア
ル酸残基に連結する。
【０１６６】
末端炭水化物部分の酸化を、化学的または酵素的に行うことができる。
【０１６７】
ポリペプチドの炭水化物部分の化学的酸化方法は、当分野で公知であり、過ヨウ素酸塩
での処理が挙げられる（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６７，１５９１６−１５９２２）。
【０１６８】
化学的酸化によって、原則的に、末端に存在するか存在しない任意の炭水化物部分を酸
化することが可能である。しかし、厳しい条件（１０ｍＭ過ヨウ素酸塩にて室温で１時間
）と対照的な穏やかな条件（１ｍＭ過ヨウ素酸塩、０℃）の選択により、好ましくは、炭
水化物側鎖の末端シアル酸を酸化することが可能である。
【０１６９】
あるいは、炭水化物部分を酵素で酸化することができる。各炭水化物部分の酸化酵素は
当分野で公知であり、例えば、ガラクトースの場合、酵素はガラクトースオキシダーゼで
ある。末端ガラクトース部分の酸化を意図する場合、例えば、炭水化物鎖にシアル酸を結
合させることができるように遺伝子操作された哺乳動物細胞中もしくは細胞中で炭水化物
鎖にシアル酸を結合させることができる細胞中でポリペプチドが産生された場合に、最終
的に末端シアル酸（部分または全部）を除去する必要がある。化学的または酵素的シアル
酸除去方法は当分野で公知である（Ｃｈａｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｄｙ（ｅｄｓ．
），１９９６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５  Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ
ｌ，Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐａｇｅｓ  １７５−１７７；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｓｅｒｉｅｓ（ＩＳＢＮ  ０−９４７９４６−
４４−３））。
【０１７０】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチドの官能基はチオ基である。した
がって、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、または化合物（Ｌ
）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物を、Ｓ
原子が、ポリペプチド中に含まれる任意のチオ基に由来し得るチオエーテル基を介してポ
リペプチドに結合することができる。
【０１７１】
この実施形態の文脈では、化合物（Ｌ）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプ
ンと化合物（Ｄ）との反応生成物をポリペプチドと反応させることが特に好ましい。
【０１７２】
したがって、本発明はまた、化合物（Ｌ）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデン
プンと化合物（Ｄ）との反応生成物をポリペプチド中に含まれるチオ基を介してポリペプ
チドと反応させる上記方法に関する。
【０１７３】
したがって、本発明はまた、化合物（Ｌ）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデン
プンと化合物（Ｄ）との反応生成物を、酸化された炭水化物部分およびポリペプチド中に
含まれるチオ基を介してポリペプチドと反応させる上記方法に関する。
【０１７４】
チオ基はそれ自体がポリペプチド中に存在し得る。さらに、適切な方法に従ってポリペ
プチドにチオ基を導入することが可能である。特に、化学的方法が挙げられる。ポリペプ
チド中にジスルフィド結合が存在する場合、チオ基を得るために−Ｓ−Ｓ−構造を還元す
ることが可能である。アミノ基を介したポリペプチドと少なくとも２つの異なる官能基（
そのうちの一方がアミノ基と反応することができ、他方がＳＨ基またはＳＨ基の前駆体で
ある）を有する化合物との反応によって、ポリペプチド中に存在するアミノ基をＳＨ基に
変換することも可能である。アミノ基のこの修飾を、最初にタンパク質を少なくとも２つ
の異なる官能基（そのうちの一方がアミノ基と反応することができ、他方がＳＨ基である
）を有する化合物（Ｌ）と反応させ、次いで、得られた反応生成物を例えば、ＨＡＳおよ
び化合物（Ｄ）を含むＨＡＳ誘導体（ＳＨ基と反応可能な官能基を含む）と反応させる例
と見なすことができる。システインまたは適切なＳＨ官能アミノ酸のポリペプチドへの導
入、またはポリペプチド中の別のシステインがジスルフィド結合を形成することをできな
くするためのポリペプチドからのシステインの除去などによるポリペプチドの変異によっ
てＳＨを導入することも可能である。
【０１７５】
特に好ましいポリペプチドとして、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を使用する。
【０１７６】
したがって、本発明はまた、ポリペプチドがエリスロポエチンである上記方法に関する
。
【０１７７】
ＥＰＯは、任意のヒト（例えば、Ｉｎｏｕｅ，Ｗａｄａ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１９９４
，Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｉｎ  ｖｉ
ｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ａｎｅｍｉｃ  ｐａｔ
ｉｅｎｔｓ，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１７（２），１８０−４；Ｍｉｙａｋｅ
，Ｋｕｎｇ，Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，１９７７，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕ
ｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２（１５）
，５５５８−６４を参照のこと）または別の哺乳動物供給源に由来し得るか、ヒトの腎臓
、ヒト胚肝臓または動物、好ましくはサルの腎臓のような天然に存在する供給源からの精
製によって得ることができる。さらに、表現「エリスロポエチン」または「ＥＰＯ」は、
１つ以上のアミノ酸（例えば、１〜２５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜
５個、より好ましくは１個または２個）が他のアミノ酸と交換されており、且つエリスロ
ポエチン活性を示すＥＰＯ変異型も含む（例えば、ＥＰ６４０６１９Ｂ１号を参照）。エ
リスロポエチン活性の測定は当分野で説明されている（インビトロでの活性の測定につい
ては、例えば、Ｆｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７，１２０３  ｆｆ
；Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓ．，１４０，３２
３−３３４を参照のこと；インビボでのＥＰＯ活性の測定については、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２
００１，９１１−９１７；Ｐｈ．Ｅｕｒ．２０００，１３１６  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅ
ｔｉｎｉ  ｓｏｌｕｔｉｏ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ，７８０−７８５；Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（１９９６／２０００）；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｐｏｅｉａ，１９９６，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ
ｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｅｕｒｏｐａ．，８，３７１−３７７；Ｆｉｂｉ
，Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ，Ｐａｕｌｙ，Ｌａｕｆｆｅｒ，Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ．，１９
９５，Ｎ−  ａｎｄ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｍｕｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆ
ｒｏｍ  ＢＨＫ−２１  ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ，８５（５），１２２９−３６を参照；
（１日目、２日目、および３日目にＥＰＯおよび修飾ＥＰＯ形態（タンパク質５０ｎｇ／
マウスと等量）を雌ＮＭＲＩマウスに注射し、４日目に血液サンプルを採取し、網状赤血
球を決定した）。ＥＰＯ活性の測定を試験したさらなる刊行物は、Ｂａｒｂｏｎｅ，Ａｐ
ａｒｉｃｉｏ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ｒｉｔｃｈｉｅ，１９９４，Ｒ
ｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ａｓ  ａ  ｂｉｏａｓｓａｙ  
ｆｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，
１２（４），５１５−２２；Ｂｏｗｅｎ，Ｃｕｌｌｉｇａｎ，Ｂｅｇｕｉｎ，Ｋｅｎｄａ
ｌｌ，Ｖｉｌｌｉｓ，１９９４，Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａ
ｎｄ  ｔｏｔａｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｉ
ａ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｍａ
ｔｅｄ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，Ｌｅｕｋｅｍｉ，８（１）
，１５１−５；Ｄｅｌｏｒｍｅ，Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ，Ｇｉｆｆｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ
ａｃｏｂｓｅｎ，Ｂｏｏｎｅ，Ｅｌｌｉｏｔｔ，１９９２，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏ
ｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，３１（４１），９８７１−６；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｏｈｅｄａ，Ｋｕｂｏｎｉｗａ，Ｔｏ
ｍｏｎｏｈ，Ｓｈｉｍｏｎａｋａ，Ｏｃｈｉ，１９９２；Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ  
ｃｈａｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１１），７７０３−９；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ａｋａｉ，Ｋ
ａｗａｎｉｓｈｉ，Ｕｅｄａ，Ｍａｓｕｄａ，Ｓａｓａｋｉ，１９９１，Ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａ
ｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｏｎ  ｉｔ
ｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（３０），２０４３４−９；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｉｎｏ
ｕｅ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｋｕｂｏｔａ，Ｗａｄａ，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈｏｓｈｉ，
Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ，Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｋｏｂａｔａ，１９８９，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ
ｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅ
ｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５（
２０），７８１９−２２；Ｋｕｒｔｚ，Ｅｃｋａｒｄｔ，１９８９，Ａｓｓａｙ  ｍｅｔ
ｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｎｅｐｈｒｏｎ．，５１（１），１
１−４（Ｇｅｒｍａｎ）；Ｚｕｃａｌｉ，Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，１９８５，Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｏ
ｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ  ａｎｄ  ｓｉｌｉｃｉｃ  ａｃｉｄ
，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１３（３），８３３−７；Ｋｒｙｓｔａｌ，１９８３，Ｐ
ｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  
ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＥＦ），ａ  
ｌａｔｅ  ａｃｔｉｎｇ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｉｎ
ｓｅｒｕｍ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｘｐ．
Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１（１），１８−３１である。
【０１７８】
好ましくは、ＥＰＯを、組換えによって産生する。これには、真核細胞または原核細胞
、好ましくは哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、またはＥＰＯの組換え産生
に都合の良い任意の他の細胞型が含まれる。さらに、ＥＰＯを、トランスジェニック動物
（例えば、ミルク、血液などの体液）、トランスジェニックトリの卵（特に、家禽類、好
ましくはニワトリ）、またはトランスジェニック植物中に発現することができる。
【０１７９】
ポリペプチドの組換え産生は当分野で公知である。一般に、これには、適切な発現ベク
ターでの宿主細胞のトランスフェクション、ポリペプチドの産生および宿主細胞からのポ
リペプチドの精製が可能な条件下での宿主細胞の培養が含まれる。詳細な情報については
、例えば、Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｆａｒｂｅｒ，Ｓｍａｒｔ，１９８６，
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｔｏ  
ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｆｉｖｅ−ｓｔｅｐ  ｐｒｏｃｅｄｕ
ｒｅ，Ｂｌｏｏｄ，６７（１），７１−９；Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅ
ｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７；ＥＰ  ６４０  ６１９
Ｂ１  ａｎｄ  ＥＰ  ６６８  ３５１  Ｂ１を参照。
【０１８０】
好ましい実施形態では、ＥＰＯは、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する（欧州特許第１
４８６０５Ｂ２号を参照のこと）。
【０１８１】
ＥＰＯは、Ｎおよび／またはＯ結合グリコシル化を介してＥＰＯに結合している（すな
わち、ＥＰＯはグリコシル化されている）、１つ以上の炭水化物側鎖、好ましくは１〜１
２個、より好ましくは１〜９個、さらにより好ましくは１〜６個、特に１〜４個、特に好
ましくは４個の炭水化物側鎖を含み得る。通常、ＥＰＯが真核細胞中で産生される場合、
ポリペプチドは翻訳後にグリコシル化される。したがって、炭水化物側鎖を、哺乳動物細
胞（特にヒト細胞）、昆虫細胞、または酵母細胞中での生合成時にＥＰＯに結合させるこ
とができた。グリコシル化ＥＰＯの構造および特性は、当分野で広く研究されている（欧
州特許４２８２６７Ｂ１号；欧州特許第６４０６１９Ｂ１号；Ｒｕｓｈ，Ｄｅｒｂｙ，Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｍｅｒｒｙ，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｒｏｈｄｅ，Ｋａｔｔａ，１９９５，Ｍｉｃｒｏ
ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．，６７（８），１４４２−５２；
Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋｏｂａｔａ，１９９１，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａ
ｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（４），３３７−
４６（Ｒｅｖｉｅｗ）を参照）。
【０１８２】
したがって、本発明のヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、ＥＰＯ分子あたり少なく
とも１個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜９個、さらにより好ましくは１〜
６個、特に好ましくは１〜４個のＨＡＳ分子を含み得る。ＥＰＯ分子あたりのＨＡＳ分子
数を、生成物の加水分解および得られた単糖の誘導体化後のＧＣ−ＭＳを使用した定量的
炭水化物組成分析によって決定することができる（Ｃｈａｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅ
ｄｙ（ｅｄｓ．），１９８６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ  ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐ
ｒｏａｃｈ  ｓｅｒｉｅｓ（ＩＳＢＮ  ０−９４７９４６−４４−３），ｅｓｐｅｃｉａ
ｌｌｙ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １，Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐａｇｅ  １−３６；
Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐａｇｅ  ３７−５３，Ｃｈ
ａｐｔｅｒ  ３，Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐａｇｅ  ５５−
９６を参照のこと）。
【０１８３】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ＥＰＯに結合した炭水化物部分は、炭水化物
側鎖の一部である。より好ましくは、炭水化物部分は、炭水化物側鎖の末端部分である。
さらに好ましい実施形態では、炭水化物部分は、炭水化物側鎖のガラクトース残基、好ま
しくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。このガラクトース残基を、下記のよ
うに末端シアル酸の除去およびその後の酸化による、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との
反応生成物との反応に提供することができる。さらに好ましい実施形態では、化合物（Ｉ
）と（ＩＩ）との反応生成物を、炭水化物側鎖のシアル酸残基、好ましくは炭水化物側鎖
の末端シアル酸残基に結合させる。シアル酸は、下記のように酸化される。
【０１８４】
特に好ましくは、このガラクトース残基を、末端シアル酸の除去およびその後の酸化に
よる、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物
（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物との官能
基Ｘを介した反応に提供することができる。
【０１８５】
より好ましくは、このガラクトース残基を、末端シアル酸が除去されない酸化による、
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）
と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物との官能基Ｘを
介した反応に提供することができる。
【０１８６】
上記のように、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさ
らに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成
物を、ＥＰＯ中に含まれるチオ基と反応させる。
【０１８７】
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ
）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物を、チオ基お
よび炭水化物部分（これらはそれぞれ少なくとも１つのさらなる化合物、好ましくはポリ
ペプチド、より好ましくはエリスロポエチン中に含まれる）と反応させることも可能であ
る。
【０１８８】
好ましい実施形態によれば、このＳＨ基を、好ましくは、例えば、ヒドロキシルアミン
誘導体（例えば、２−（アミノオキシ）エチルメルカプタンヒドロクロリド）の使用（Ｂ
ａｕｅｒ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９６５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３０，９４９）また
はヒドラジン誘導体（例えば、チオグルコール酸ヒドラジド）の使用（Ｗｈｉｔｅｓｉｄ
ｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４２，３３２）によって酸化
された炭水化物部分に結合させることができる。
【０１８９】
さらに好ましい実施形態によれば、チオ基を、好ましくはＥＰＯの酸化された炭水化物
部分、より好ましくはＥＰＯの酸化された炭水化物側鎖の一部である酸化された炭水化物
部分に導入する。
【０１９０】
好ましくは、チオ基は、天然に存在するシステインまたは付加システインに由来する。
より好ましくは、ＥＰＯは、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、天然に存在するシステイ
ンはシステイン２９および／または３３である。より好ましい実施形態では、ヒドロキシ
アルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させ
るヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物をシステイン２９と反応さ
せ、システイン３３を別のアミノ酸と置換する。あるいは、ヒドロキシアルキルデンプン
と化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアル
キルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物をシステイン３３と反応させ、システイン２
９を別のアミノ酸と置換する。
【０１９１】
本発明の文脈では、用語「付加システイン」は、ポリペプチド、好ましくはＥＰＯが野
生型ポリペプチド中に存在しないシステイン残基を含むことを示す。
【０１９２】
本発明のこの態様の文脈では、システインは、ＥＰＯのＮ末端またはＣ末端に付加され
たさらなるアミノ酸であり得る。
【０１９３】
さらに、天然に存在するアミノ酸をシステインまたは適切に置換されたシステインと置
換することによって付加システインを付加することができた。好ましくは、本発明のこの
態様の文脈では、ＥＰＯはヒトＥＰＯであり、置換アミノ酸残基はセリン１２６である。
【０１９４】
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物と、必要に応じて化合物（
Ｄ）、さらなる化合物（Ｍ）との反応に関する反応条件については特定の制限はなく、反
応条件を特定の要件に調整することができる。本発明の特に好ましい実施形態によれば、
溶媒として水を単独または少なくとも１つの他の溶媒と組み合わせて使用する。少なくと
も１つの他の溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、またはエタノールが挙げられ
る。水以外の好ましい溶媒は、メタノールおよびエタノールである。他の好ましい実施形
態によれば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、もしくはエタノール、またはこれらの２つ
またはそれ以上の混合物を溶媒として使用する。
【０１９５】
例えば、水系でヒドロキシアルキルデンプンを化合物（Ｌ）と反応させる場合、例えば
、ヒドロキシエチルデンプンをデンプンの酸化されていない還元末端の反応を介してＯ−
［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンなどのヒドロキ
シルアミンと反応させるような場合、且つ反応生成物を、アルデヒド基、ケト基、アセタ
ール基、またはヘミアセタール基を介してポリペプチド、好ましくはエリスロポエチンと
さらに反応させる場合、反応温度は、好ましくは４〜３７℃、より好ましくは１０〜３０
℃、特に好ましくは１５〜２５℃の範囲である。
【０１９６】
さらなる化合物（Ｍ）、好ましくはポリペプチド、特に好ましくはエリスロポエチンを
含む反応生成物を、天然および組換えＥＰＯの精製のための公知の手順（例えば、サイズ
エクスクルージョンクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、またはそ
の組み合わせ）の使用によって単離することができる。１つ以上のステップを含み得る適
切なプロセスによって、反応生成物を単離することができる。本発明の好ましい実施形態
によれば、第１ステップにおいて、遠心分離または濾過などの適切な方法によって、エタ
ノール−アセトン混合液を用いて反応生成物を反応混合物または反応混合物との混合物か
ら分離する。第２ステップでは、分離した反応生成物を、透析、遠心分離濾過または加圧
濾過、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含むカラムなど
による）、ＨＰＬＣ、ＭＰＬＣ、ゲル濾過、および／または凍結乾燥のような後処理など
のさらなる処理に供することができる。１つの好ましい実施形態によれば、分離した反応
生成物を、最初に好ましくは水に対して透析し、生成物の所望のスペックにしたがって反
応生成物の溶媒含有量が十分に低くなるまで凍結乾燥させる。２０〜３５℃、好ましくは
２５〜３０℃の温度で凍結乾燥させることができる。別の好ましい実施形態によれば、反
応生成物を含む反応混合物をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含むカラムに供して、例えば遠心
分離濾過によって濃縮された溶離物が得られる。
【０１９７】
本発明の別の目的は、１つ以上の上記方法によって産生されるヒドロキシアルキルデン
プン誘導体を提供することにある。
【０１９８】
したがって、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得るこ
とができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体において、前記ヒドロキシアルキルデンプ
ンが、式（Ｉ）
【化３７】
2010248528.tif 000046
の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化
合物（Ｌ）と反応するステップ、または
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端における化
合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合
物（Ｌ）と反応するステップとを含んでなり、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの
官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応
可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能
な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０１９９】
好ましい実施形態によれば、本発明は、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、独立して、水素また
は直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である上記のヒドロキシアルキルデンプン誘
導体に関する。
【０２００】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、独立して、水
素または２−ヒドロキシエチル基である上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関す
る。
【０２０１】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキ
シエチルデンプンである上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２０２】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｚ1が、構造−ＮＨ−を含む上記
のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２０３】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、Ｚ1が、
【化３８】
2010248528.tif 000047
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２０４】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘ
ミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、構造−
ＮＨ−を含む上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２０５】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、Ｘが、
【化３９】
2010248528.tif 000048
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒはメチルである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２０６】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが−ＳＨであり、前記官能基Ｘ
が、
【化４０】
2010248528.tif 000049
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２０７】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が−ＳＨ
であり、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化４１】
2010248528.tif 000050
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２０８】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が上記の
活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシ
ル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化４２】
2010248528.tif 000051
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒはメチルである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２０９】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が
、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前に酸化されていないため、前記ヒドロキシ
アルキルデンプンが、式（Ｉ）：
【化４３】
2010248528.tif 000052
の構造を有する上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２１０】
別の特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンの還元末
端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前に酸化されているため、前記ヒドロキ
シアルキルデンプンが、式（ＩＩａ）：
【化４４】
2010248528.tif 000053
および／または式（ＩＩｂ）：
【化４５】
2010248528.tif 000054
の構造を有する上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２１１】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、還元末端が、アルカリヨウ素溶液によっ
て酸化される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２１２】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基
Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を
介して化合物（Ｌ）と反応させ、得られた反応生成物を化合物（Ｌ）中に含まれる官能基
Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応
させる上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２１３】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基
Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を
介して化合物（Ｌ）と反応させ、化合物（Ｌ）を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの
反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙと
の反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる上記のヒドロキシアルキルデンプン誘
導体に関する。
【０２１４】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物
（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化
された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体を得て、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中
に含まれる官能基Ｚ2と、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（
Ｌ）と反応させて第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得る上記のヒドロキシアル
キルデンプン誘導体に関する。
【０２１５】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体
を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応
を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体
に関する。
【０２１６】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物
（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化
された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体が得られ、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）
中に含まれる官能基Ｗと、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物
（Ｌ）と反応させ、化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との
反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙと
の反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、上記のヒドロキシアルキルデンプン
誘導体に関する。
【０２１７】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）が
ポリペプチドである上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２１８】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリペプチドがエリスロポエチンである上
記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
【０２１９】
以後、ＨＡＳ−ＥＰＯ接合体と呼ばれ、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）、
必要に応じて化合物（Ｄ）、およびエリスロポエチンとの反応によって形成されるヒドロ
キシアルキルデンプン誘導体は、接合前のエリスロポエチンと比較した場合に改良された
生体安定性を示すという利点を有する。さらに、標準的なＢＲＰ−ＥＰＯよりも高い生物
活性を示す。これは、主に、このヒドロキシアルキルデンプン誘導体が肝臓および腎臓の
除去系によってあまりまたは全く認識されないため、より長期間循環系に存在し続けると
いう事実に起因する。さらに、ＨＡＳは結合部位特異的であるので、ＨＡＳのＥＰＯへの
接合によるＥＰＯのインビボ生物活性の破壊リスクが最小になる。
【０２２０】
インビトロ生物活性はＥＰＯ受容体に対する結合親和性のみを測定するので、本発明の
ＨＡＳ−ＥＰＯ接合体は、組換え未変性ＥＰＯと本質的に同一のインビトロ生物活性を示
し得る。インビトロ生物活性の決定方法は、当分野で公知である。
【０２２１】
さらに、ＨＡＳ−ＥＰＯは、接合体化の出発物質として使用したＥＰＯ（接合されてい
ないＰＯ）よりも高いインビボ活性を示す。インビボ生物活性の決定方法は、当分野で公
知である。
【０２２２】
接合されていないＥＰＯのインビボ活性を１００％とした場合、ＨＡＳ−ＥＰＯ接合体
は、１１０〜５００％、好ましくは３００〜４００％、または好ましくは１１０〜３００
％、より好ましくは１１０〜２００％、より好ましくは１１０〜１８０％、または１１０
％〜１５０％、最も好ましくは１１０〜１４０％のインビボ活性を示し得る。
【０２２３】
Ａｍｇｅｎの高シアリル化ＥＰＯ（欧州特許第４２８２６７Ｂ１号を参照）と比較して
、高シアリル化ＥＰＯのインビボ活性を１００％とした場合、ＨＡＳ−ＥＰＯは、高シア
リル化ＥＰＯのインビボ活性の好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも
７０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、または少なくとも９５％、少なくとも
１５０％、少なくとも２００％、または少なくとも３００％を示す。より好ましくは、高
シアリル化ＥＰＯのインビボ活性の少なくとも９５％を示す。
【０２２４】
本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ接合体の高インビボ生物活性は、主に、肝臓の除去系による認
識が低く、且つより高い分子量により腎臓クリアランスが減少するので、ＨＡＳ−ＥＰＯ
接合体が非接合体化ＥＰＯよりも長く循環系に保持されるという事実に由来する。循環系
中のＥＰＯのインビボ半減期の決定方法は、当分野で公知である（Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ，
Ｌｕｎｎ，Ｄａｖｉｓ，Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｓｉｅｋｍａｎ，１９９８，Ｈｕｍａｎ  ｅｒ
ｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｄｉｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｅｎｈａｎｃ
ｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，９５（３），１１８４−８）。
【０２２５】
したがって、現在市販されているＥＰＯ製剤よりも低頻度で投与することができるＨＡ
Ｓ−ＥＰＯ接合体が得られることが本発明の大きな利点である。標準的なＥＰＯ製剤が少
なくとも３日毎に投与しなければならないのに対して、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ接合体は
、好ましくは１週間に２回、より好ましくは１週間に１回投与される。
【０２２６】
さらに、本発明の方法は、最終収率が低くなる大規模且つ時間のかかる精製ステップを
含まない（例えば、インビボ生物活性が低いか全くないことが公知の低シアリル化ＥＰＯ
形態を精製する必要がない）ので、有効なＥＰＯ誘導体を低コストで生成することができ
るという利点を有する。詳細には、実施例８．１１（ｄ）は、低修飾工程で精製されたＨ
ＥＳ−ＥＰＯが標準ＢＲＰ  ＥＰＯの３倍の活性を示すことを証明している。
【０２２７】
本発明のさらに別の目的は、治療有効量の本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ接合体を含む薬学的
組成物を提供することにある。
【０２２８】
さらに、本発明は、治療有効量の本発明のＨＡＳ−ポリペプチド接合体、好ましくはＨ
ＡＳ−ＥＰＯ接合体、より好ましくはＨＥＳ−ＥＰＯ接合体を含む薬学的組成物に関する
。好ましい実施形態では、薬学的組成物は、エリスロポエチン治療で有用な少なくとも１
つの薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバント、および／またはキャリアをさらに含む。
【０２２９】
したがって、本発明は、また、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって
得ることができる治療有効量のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む薬学的組成物に
おいて、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）
【化４６】
2010248528.tif 000055
の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化
合物（Ｌ）と反応するステップ、または
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンとその必要に応じて酸化された還元末端での化
合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合
物（Ｌ）と反応するステップを含んでなり、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの
官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応
可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能
な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択され、
前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法が、ヒドロキシアルキルデンプン、
化合物（Ｌ）、および必要に応じて化合物（Ｄ）を含む反応生成物をさらなる化合物（Ｍ
）と反応させるステップを更に含み、
前記少なくとも１つのさらなる化合物がポリペプチドである、
薬学的組成物に関する。
【０２３０】
さらに、本発明は、貧血障害もしくは造血機能障害またはこれらの関連疾患の治療薬の
調製のための上述のヒドロキシアルキルデンプン誘導体の使用に関する。
【０２３１】
好ましい実施形態によれば、ポリペプチドがアンチトロンビン（ＡＴ）、好ましくはＡ
Ｔ  ＩＩＩである上記薬学的組成物に関する（Ｌｅｖｙ  ＪＨ，Ｗｅｉｓｉｎｇｅｒ  Ａ
，Ｚｉｏｍｅｋ  ＣＡ，Ｅｃｈｅｌａｒｄ  Ｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｔｈ
ｒｏｍｂｉｎ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ
ｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ
Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２７，４（２００１）４０５−４１６；Ｅｄｍｕｎｄｓ  Ｔ，
Ｖａｎ  Ｐａｔｔｅｎ  ＳＭ，Ｐｏｌｌｏｃｋ  Ｊ，Ｈａｎｓｏｎ  Ｅ，Ｂｅｒｎａｓｃ
ｏｎｉ  Ｒ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｅ，Ｍａｎａｖａｌａｎ  Ｐ，Ｚｉｏｍｅｋ  Ｃ，Ｍｅａ
ｄｅ  Ｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｊ，Ｃｏｌｅ  ＥＳ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ  
Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａ
ｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ
−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｂｌｏｏｄ  ９１，１２（１９９８）４
６６１−４６７１；Ｍｉｎｎｅｍａ  ＭＣ，Ｃｈａｎｇ  ＡＣＫ，Ｊａｎｓｅｎ  ＰＭ，
Ｌｕｂｂｅｒｓ  ＹＴＰ，Ｐｒａｔｔ  ＢＭ，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ＢＧ，Ｔａｙｌｏｒ
ＦＢ，Ｈａｃｋ  ＣＥ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｂ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ
ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  
ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｂａｂ
ｏｏｎｓ  ｌｅｔｈａｌｌｙ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ  ｃｏｌｉ，Ｂｌｏｏｄ  ９５，４（２０００）１１１７−１１２３；Ｖａｎ  Ｐａｔ
ｔｅｎ  ＳＭ，Ｈａｎｓｏｎ  ＥＨ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  Ｒ，Ｚｈａｎｇ  Ｋ，Ｍａ
ｎａｖａｌｎ  Ｐ，Ｃｏｌｅ  ＥＳ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＪＭ，Ｅｄｍｕｎｄｓ  Ｔ，
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉ
ｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７４，１５（１９９９）１０
２６８−１０２７６）。
【０２３２】
他の好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリペプチドがＧ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−
βである薬学的組成物に関する。
【０２３３】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリペプチドがエリスロポエチンである上
記の薬学的組成物に関する。
【０２３４】
さらなる実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが−ＳＨであり、前記化合物（Ｌ）が
一般式Ｚ1−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
【化４７Ａ】
2010248528.tif 000056
【化４７Ｂ】
2010248528.tif 000057
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
【化４８】
2010248528.tif 000058
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択され、Ｌ’はＺ1およびＸと架橋する有機鎖であるか、Ｌ’は存在し
ない、上記の薬学的組成物に関する。
【０２３５】
好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセ
タール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記化合物（Ｌ）が一般式Ｚ1
−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
【化４９】
2010248528.tif 000059
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’は、メチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
【化５０Ａ】
2010248528.tif 000060
【化５０Ｂ】
2010248528.tif 000061
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、Ｌ’はＺ1およびＸと架橋する有機鎖であるか、Ｌ’は存在し
ない、上記の薬学的組成物に関する。
【０２３６】
別の実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが−ＳＨであり、前記化合物（Ｄ）が一般
式Ｚ1−Ｄ’−Ｗの化合物であり、前記化合物（Ｌ）が一般式Ｚ2−Ｌ’−Ｘの化合物であ
り、前記官能基Ｚ1が、
【化５１】
2010248528.tif 000062
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
【化５２】
2010248528.tif 000063
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が−ＳＨであり、前記官能
基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化５３】
2010248528.tif 000064
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択されるか、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が上記の活性化された
エステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる
群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化５４】
2010248528.tif 000065
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記Ｄ’がＺ1およびＷと架橋する有機鎖であるか、Ｄ’は存
在せず、前記Ｌ’がＺ2およびＸと架橋する有機鎖であるか、前記Ｌ’は存在しない、上
記の薬学的組成物に関する。
【０２３７】
さらに別の実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセ
タール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記化合物（Ｄ）が一般式Ｚ1
−Ｄ’−Ｗの化合物であり、前記化合物（Ｌ）が一般式Ｚ2−Ｌ’−Ｘの化合物であり、
前記官能基Ｚ1が、
【化５５Ａ】
2010248528.tif 000066
【化５５Ｂ】
2010248528.tif 000067
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
【化５６】
2010248528.tif 000068
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が−ＳＨであり、前記官能
基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化５７】
2010248528.tif 000069
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択されるか、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が上記の活性化された
エステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる
群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化５８Ａ】
2010248528.tif 000070
【化５８Ｂ】
2010248528.tif 000071
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記Ｄ’がＺ1およびＷと架橋する有機鎖であるか、前記Ｄ’
は存在せず、前記Ｌ’がＺ2およびＸと架橋する有機鎖であるか、前記Ｌ’は存在しない
、上記の薬学的組成物に関する。
【０２３８】
特に実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシエチルデンプンを、水性媒体で以下の式
：
【化５９】
2010248528.tif 000072
の化合物と反応させ、反応生成物をエリスロポエチンと反応させる上記の薬学的組成物に
関する。
【０２３９】
さらにより好ましい実施形態によれば、本発明は、エリスロポエチンを反応前に過ヨウ
素酸ナトリウムで酸化する上記の薬学的組成物に関する。
【０２４０】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、エリスロポエチンを部分的に脱シアリル
化し、その後反応前に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する上記の薬学的組成物に関する。
【０２４１】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、実施例６の完全に還元されたチオ−ＥＰＯ
に基づいて生成されたヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む薬学的組成物を除く。
【０２４２】
上記薬学的組成物は、貧血障害もしくは造血機能障害またはこれらの関連疾患の治療に
特に適切である。
【０２４３】
本明細書中で使用される、「治療有効量」は、所与の病態および投薬計画に治療効果が
得られる量をいう。エリスロポエチンイソ型の投与は、非経口経路によることが好ましい
。選択した特定の経路は、治療を受ける病態に依存する。適切なキャリア（ヒト血清アル
ブミンなど）、適切な希釈剤（緩衝化生理食塩水など）、および／または適切なアジュバ
ントを含む処方物の一部としてエリスロポエチンイソ型の投与を行うことが好ましい。必
要な投薬量は、患者のヘマトクリット値を上昇させるのに十分な量であり、治療を受ける
病態の重症度および使用する投与方法などに依存して変化する。
【０２４４】
本発明の薬学的組成物での治療目的は、好ましくは、６．８ｍｍｏｌ／ｌより多くの血
中ヘモグロビン値の増加である。これのために、薬学的組成物を、ヘモグロビン値が０．
６ｍｍｏｌ／ｌ／週〜１．６ｍｍｏｌ／ｌ／週との間に増加する方法で投与することがで
きる。ヘモグロビン値が８．７ｍｍｏｌ／ｌを超える場合、好ましくは、ヘモグロビン値
が８．１ｍｍｏｌ／ｌ未満になるまで治療を中断するべきである。
【０２４５】
本発明の組成物を、好ましくは、皮下、静脈内、または非経口注射に適切な処方物中で
使用する。これのために、適切な賦形剤およびキャリアは、例えば、注射用のリン酸二水
素ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、塩素酸ナトリウム、ポリソルベート８０、Ｈ
ＳＡ、および水である。組成物を、１週間に３回、好ましくは１週間に２回、より好まし
くは１週間に１回、最も好ましくは２週間毎に投与することができる。
【０２４６】
好ましくは、０．０１〜１０μｇ／患者体重、より好ましくは０．１〜５μｇ／ｋｇ体
重、０．１〜１μｇ／ｋｇ体重、または０．２〜０．９μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは
０．３〜０．７μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．４〜０．６μｇ／ｋｇ体重の量の薬
学的組成物を投与する。
【０２４７】
一般に、好ましくは投薬あたり１０μｇ〜２００μｇ、好ましくは１５μｇ〜１００μ
ｇの投薬量を投与する。
【０２４８】
本発明は、さらに、ヒトまたは動物の治療方法で用いるための本発明のＨＡＳ−ポリペ
プチドに関する。
【０２４９】
本発明は、さらに、貧血障害もしくは造血機能障害またはこれらの関連疾患の治療薬の
調製のための本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ接合体の使用に関する。
【０２５０】
本発明で使用される化合物（Ｌ）が１つ以上のキラル中心を含む場合、化合物（ＩＩ）
はＲ体もしくはＳ体中または各キラル中心に関するラセミ化合物として存在し得る。
【０２５１】
本発明で必要に応じて使用される化合物（Ｄ）が１つ以上のキラル中心を含む場合、化
合物（Ｄ）はＲ体もしくはＳ体中または各キラル中心に関するラセミ化合物として存在し
得る。
【０２５２】
本発明は、以下の実施例、表、および図面によってさらに例示されるが、これらは本発
明の範囲を決して制限しない。
【０２５３】
実施例１．酸化されていない還元末端の還元的アミノ化によるヒドロキシエチルデンプン
誘導体の形成
実施例１．１  ヒドロキエチルデンプンと１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンと
の反応
【化６０】
2010248528.tif 000073
ａ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，００
０Ｄ、ＤＳ＝０．４））を含む５ｍｌ水溶液に、０．８３ｍｍｏｌの１，３−ジアミノ−
２−ヒドロキシプロパン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）
および５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を添加した。得られ
た混合物を、８０°Ｃで１７時間インキュベートした。１６０ｍｌのアセトンとエタノー
ルの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収
し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ
、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）
、凍結乾燥させた。
【０２５４】
ｂ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン溶液への０．８３ｍｍｏｌの１，３−ジア
ミノ−２−ヒドロキシプロパンおよび５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣ
ＮＢＨ3）の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを２５
℃で３日間行った。
【０２５５】
実施例１．２  ヒドロキエチルデンプンと１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンと
の反応
【化６１】
2010248528.tif 000074
ａ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，００
０Ｄ、ＤＳ＝０．４））を含む５ｍｌ水溶液に、０．８３ｍｍｏｌの１，２−ジヒドロキ
シ−３−アミノプロパン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）
および５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を添加した。得られ
た混合物を、８０°Ｃで１７時間インキュベートした。１６０ｍｌのアセトンとエタノー
ルの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収
し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ
、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）
、凍結乾燥させた。
【０２５６】
ｂ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプンへの０．８３ｍｍｏｌの１，２−ジヒドロ
キシ−３−アミノプロパンおよび５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢ
Ｈ3）の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを２５℃で
３日間行った。
【０２５７】
１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンとＨＥＳとの反応を、Ｇ．Ａｖｉｇａｄ，
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４（１９８３）４４９−５０４に記載の過ヨウ素酸塩に
よる反応生成物中の１，２−ジオールの酸化的切断に起因するホルムアルデヒドの定量に
よって間接的に確認した。
【０２５８】
実施例１．３  ヒドロキエチルデンプンと１，４−ジアミノブタンとの反応
【化６２】
2010248528.tif 000075
ａ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，００
０Ｄ、ＤＳ＝０．４））を含む５ｍｌ水溶液に、０．８３ｍｍｏｌの１，４−ジアミノブ
タン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）および５０ｍｇのシ
アノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を添加した。得られた混合物を、８０°
Ｃで１７時間インキュベートした。１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液
（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して４日
間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
【０２５９】
ｂ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプンへの０．８３ｍｍｏｌの１，４−ジアミノ
ブタンおよび５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）の添加によっ
て得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを２５℃で３日間行った。
【０２６０】
実施例１．４  ヒドロキエチルデンプンと１−メルカプト−２−アミノエタンとの反応
【化６３】
2010248528.tif 000076
ａ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００
Ｄ、ＤＳ＝０．４））を含む５ｍｌ水溶液に、０．８３ｍｍｏｌの１−メルカプト−２−
アミノエタン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）および５０
ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を添加した。得られた混合物を
、８０°Ｃで１７時間インキュベートした。１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：
１混合物（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対
して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂ
ｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥
させた。
【０２６１】
ｂ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン溶液への０．８３ｍｍｏｌの１−メルカプト
−２−アミノエタンおよび５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）
の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを２５℃で３日間
行った。
【０２６２】
実施例２．非酸化還元末端との接合体化によるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
実施例２．１  ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジドとの反応
【化６４】
2010248528.tif 000077
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌのカルボヒドラジド
（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を添加した。２５℃で１
８時間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応
混合物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍｌの水に再溶解し、水
に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅ
ｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結
乾燥させた。
【０２６３】
実施例２．２  ヒドロキシエチルデンプンとアジピン酸ジヒドラジド（ａｄｅｐｉｃ  ｄ
ｉｈｙｄｒａｚｉｄｅ）との反応
【化６５】
2010248528.tif 000078
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌのアジピン酸ジヒド
ラジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ
）を添加した。２５℃で１８時間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：
１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４
０ｍｌの水に再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３
．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  Ｇｍｂ
Ｈ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
【０２６４】
実施例２．３  ヒドロキシエチルデンプンと１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカ
ルバジドとの反応
【化６６】
2010248528.tif 000079
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌの１，４−フェニレ
ン−ビス−３−チオセミカルバジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａ
ｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ）を添加した。２５℃で１８時間の撹拌後、反応混合物に８
ｍｌの水を添加し、懸濁液を４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。透明な上清を捨
て、その後１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に添加した。
遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍｌの水に再溶解し、４，５００ｒｐｍで１
５分間遠心分離した。透明な上清を、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析
チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａ
ｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
【０２６５】
実施例２．４  ヒドロキシエチルデンプンとＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）
−エチル］−ヒドロキシルアミンとの反応
【化６７】
2010248528.tif 000080
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３（１９９７）ｐ．５４８
５−５４９２に記載のように、市販の材料から２工程でＯ−［２−（２−アミノオキシ−
エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを合成した。
【０２６６】
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌのＯ−［２−（２−
アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを添加した。２５℃で１８時
間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合
物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍｌの水に再溶解し、水に対
して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂ
ｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥
させた。
【０２６７】
実施例３．酸化還元末端との反応によるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
実施例３．１  ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジドとの反応
【化６８】
2010248528.tif 000081
０．１２ｍｍｏｌのオキソ−ＨＥＳ  １０／０．４（分子量１０，０００  Ｄ、ＤＳ＝
０．４、ドイツ特許第１９６  ２８  ７０５  Ａ１号にしたがって調製）を３ｍｌの無水
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１５ｍｍｏｌのカルボヒドラジド（Ｓｉｇ
ｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含む１５ｍｌ  ＤＭＳＯの混合
物に窒素下で滴下した。６５℃で８８時間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノール
の冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し
、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、
Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、
凍結乾燥させた。
【０２６８】
実施例３．２  ヒドロキシエチルデンプンと１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカ
ルバジドとの反応
【化６９】
2010248528.tif 000082
０．１２ｍｍｏｌのオキソ−ＨＥＳ  １０／０．４（分子量１０，０００  Ｄ、ＤＳ＝
０．４、ドイツ特許第１９６  ２８  ７０５  Ａ１号にしたがって調製）を３ｍｌの無水
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１５ｍｍｏｌの１，４−フェニレン−ビス
−３−チオセミカルバジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕ
ｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ）を含む１５ｍｌ  ＤＭＳＯの混合物に窒素下で滴下した。６５℃で
８８時間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反
応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して４日間透析し（Ｓｎ
ａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  
Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
【０２６９】
実施例３．３  ヒドロキシエチルデンプンとヒドラジドとの反応
【化７０】
2010248528.tif 000083
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ  １０／０．４（分子量１０，００
０  Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６  ２８  ７０５  Ａ１号にしたがって調製）
を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、０．４７ｍｌ（１５ｍｍｏ
ｌ）のヒドラジドを含む１５ｍｌ  ＤＭＳＯの混合物に窒素下で滴下した。４０℃で１９
時間の撹拌後、１６０ｍｌのエタノールとアセトンの１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合
物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍＬの水に再溶解し、０．５
％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン水溶液に対して２日間および水に対して２日間透析し（Ｓ
ｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
【０２７０】
実施例３．４  ヒドロキシエチルデンプンとヒドロキシルアミンとの反応
【化７１】
2010248528.tif 000084
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．に記載のように、市販の材料から２工程でＯ−［２−（
２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを合成した（Ｂｏｔｕｒ
ｙｎ，Ｂｏｕｄａｌｉ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｄｅｆｒａｎｃｑ，Ｌｈｏｍｍｅ，１９９７
，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，５４８５）。
【０２７１】
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ  １０／０．４（分子量１０，００
０  Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６  ２８  ７０５  Ａ１号にしたがって調製）
を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、２．０４ｇ（１５ｍｍｏｌ
）のＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを含む
１５ｍｌ  ＤＭＳＯの混合物に窒素下で滴下した。６５℃で４８時間の撹拌後、１６０ｍ
ｌのエタノールとアセトンの１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離
によって沈殿生成物を回収し、４０ｍＬの水に再溶解し、水に対して４日間透析し（Ｓｎ
ａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  
Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
【０２７２】
実施例３．５  ヒドロキシエチルデンプンとアジピン酸ジヒドラジドとの反応
【化７２】
2010248528.tif 000085
１．７４ｇ（１５ｍｍｏｌ）のアジピン酸ジヒドラジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ）を６５℃の２０ｍｌの無水ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ
１０／０．４（分子量１０，０００  Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６  ２８  
７０５  Ａ１号にしたがって調製）を３ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、窒素下で滴下した
。６０℃で６８時間の撹拌後、２００ｍｌの水に反応混合物を添加した。反応生成物を含
む溶液を、０．５％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン水溶液に対して２日間および水に対して
２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ
Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、
凍結乾燥させた。
【０２７３】
実施例３．６  ヒドロキエチルデンプンと１，４−ジアミノブタンとの反応
【化７３】
2010248528.tif 000086
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ  １０／０．４（分子量１０，００
０  Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６  ２８  ７０５  Ａ１号にしたがって調製）
を３ｍｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１．５１ｍｌ（１５ｍｍｏ
ｌ）の１，４−ジアミノブタン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ
，Ｄ）を含む１５ｍｌ  ＤＭＳＯの混合物に窒素下で滴下した。４０℃で１９時間の撹拌
後、１６０ｍｌのエタノールとアセトンの１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加し
た。遠心分離によって沈殿物（Ａｍｉｎｏ−ＨＥＳ１０ＫＤ／０．４）を回収し、４０ｍ
Ｌの水に再溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５
ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，
Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
【０２７４】
実施例４．エリスロポエチンの酸化
実施例８に記載のように酸化エリスロポエチンを生成した。酸化エリスロポエチンとし
て、実施例８．１１（ｃ）に記載のＥＰＯ−ＧＴ−１を使用した（酸加水分解していない
、マイルド過ヨウ素酸塩酸化したＥＰＯ−ＧＴ−１）。
【０２７５】
実施例５．ヒドロキシエチルデンプン誘導体と実施例４の酸化エリスロポエチンとの接合
体化
実施例５．１  酸化エリスロポエチンと実施例２．１の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例２
．１で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１８ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを
含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供さ
れた説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰ
Ｓ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ
−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔ
ｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０２７６】
実験結果を図１に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０２７７】
実施例５．２  酸化エリスロポエチンと実施例２．３の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例２
．３で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１８ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを
含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供さ
れた説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰ
Ｓ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ
−Ｐａｇｅによって分析した。
【０２７８】
実施例５．３  酸化エリスロポエチンと実施例２．４の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例２
．４で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１８ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを
含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供さ
れた説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰ
Ｓ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ
−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔ
ｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０２７９】
実験結果を図２に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０２８０】
実施例５．４  酸化エリスロポエチンと実施例３．１の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例３
．１で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１０ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを
含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供さ
れた説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰ
Ｓ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ
−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔ
ｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０２８１】
実験結果を図３に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０２８２】
実施例５．５  酸化エリスロポエチンと実施例３．２の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例３
．１で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１０ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを
含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供さ
れた説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰ
Ｓ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ
−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔ
ｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０２８３】
実験結果を図３に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０２８４】
実施例６．エリスロポエチンの還元によるチオ−ＥＰＯの形成
２４１．５μｇのエリスロポエチン（ＥＰＯ−ＧＴ−１、実施例８を参照のこと）を含
む５００μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ
（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｍｏｒｃａｍｂｅ，ＵＫ）（ｐＨ８．３）を３７℃で１時間イン
キュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮機（１０  ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶ
ＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分
離濾過によってＤＴＴを除去し、その後ホウ酸緩衝液で３回およびリン酸緩衝液で２回洗
浄した（０．１Ｍ、９．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））。ゲル
を、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一
晩染色する。
【０２８５】
実施例７．架橋化合物を使用したヒドロキシエチルデンプン誘導体とチオエリスロポエチ
ンとの接合体化
以下の各実施例では、架橋化合物としてＮ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイ
ミドエステル（ＡＭＡＳ）
【化７４】
2010248528.tif 000087
を使用した。
【０２８６】
実施例７．１  チオエリスロポエチンと実施例２．１の反応生成物および架橋化合物との
反応
実施例２．１にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０
．１Ｍ、９．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎ
ｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌ
ｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、
２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．
５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））
を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リ
ン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
【０２８７】
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含
むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰ
ＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲル
を、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一
晩染色する。
【０２８８】
実験結果を図４に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０２８９】
実施例７．２  チオエリスロポエチンと実施例２．２の反応生成物および架橋化合物との
反応
実施例２．２にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０
．１Ｍ、９．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎ
ｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌ
ｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、
２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．
５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））
を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リ
ン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
【０２９０】
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含
むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰ
ＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒ
ｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色
する。
【０２９１】
実験結果を図５に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０２９２】
実施例７．３  チオエリスロポエチンと実施例２．３の反応生成物および架橋化合物との
反応
実施例２．３にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０
．１Ｍ、９．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎ
ｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌ
ｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、
２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．
５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））
を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リ
ン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
【０２９３】
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含
むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰ
ＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒ
ｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色
する。
【０２９４】
実験結果を図５に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０２９５】
実施例７．４  チオエリスロポエチンと実施例２．４の反応生成物および架橋化合物との
反応
実施例２．４にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０
．１Ｍ、９．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎ
ｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌ
ｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、
２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．
５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））
を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リ
ン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
【０２９６】
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含
むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰ
ＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒ
ｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色
する。
【０２９７】
実験結果を図４に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０２９８】
実施例７．５  チオエリスロポエチンと実施例１．１の反応生成物および架橋化合物との
反応
８０℃で１７時間および２５℃で３日間のインキュベーション条件で実施例１．１にし
たがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導
体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕ
ｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、２５℃で８０分間お
よび４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮機（５Ｋ
Ｄ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０
００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回お
よび３０分間洗浄した。
【０２９９】
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含
むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰ
ＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒ
ｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色
する。
【０３００】
実験結果を図５に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０３０１】
実施例７．６  チオエリスロポエチンと実施例１．３の反応生成物および架橋化合物との
反応
８０℃で１７時間および２５℃で３日間のインキュベーション条件で実施例１．３にし
たがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導
体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕ
ｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、２５℃で８０分間お
よび４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮機（５Ｋ
Ｄ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０
００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回お
よび３０分間洗浄した。
【０３０２】
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含
むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰ
ＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒ
ｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色
する。
【０３０３】
実験結果を図５に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０３０４】
実施例７．７  チオエリスロポエチンと実施例３．１の反応生成物および架橋化合物との
反応
実施例３．１にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０
．１Ｍ、９．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎ
ｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌ
ｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２
５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５
ｍｌ濃縮機（５ＫＤ  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、
リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
【０３０５】
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混
合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ
Ａ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマ
シー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０３０６】
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０３０７】
実施例７．８  チオエリスロポエチンと実施例３．２の反応生成物および架橋化合物との
反応
実施例３．２にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導
体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕ
ｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間およ
び４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ
ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用し
た１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回
および３０分間洗浄した。
【０３０８】
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混
合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ
Ａ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマ
シー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０３０９】
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０３１０】
実施例７．９  チオエリスロポエチンと実施例３．３の反応生成物および架橋化合物との
反応
実施例３．３にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導
体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕ
ｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間およ
び４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ
ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用し
た１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回
および３０分間洗浄した。
【０３１１】
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混
合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ
Ａ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマ
シー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０３１２】
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０３１３】
実施例７．１０  チオエリスロポエチンと実施例３．４の反応生成物および架橋化合物と
の反応
実施例３．４にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導
体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕ
ｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間およ
び４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ
ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用し
た１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回
および３０分間洗浄した。
【０３１４】
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混
合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ
Ａ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマ
シー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０３１５】
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０３１６】
実施例７．１１  チオエリスロポエチンと実施例３．５の反応生成物および架橋化合物と
の反応
実施例３．５にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導
体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕ
ｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間およ
び４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ
ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用し
た１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回
および３０分間洗浄した。
【０３１７】
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混
合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ
Ａ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマ
シー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０３１８】
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０３１９】
実施例７．１２  チオエリスロポエチンと実施例３．６の反応生成物および架橋化合物と
の反応
実施例３．６にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導
体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ  ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕ
ｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間およ
び４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ
ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用し
た１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回
および３０分間洗浄した。
【０３２０】
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混
合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ  Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ
Ａ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマ
シー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
【０３２１】
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
【０３２２】
実施例８．ＨＥＳ−ＥＰＯ接合体の予備生成
まとめ
組換えヒトＥＰＯのオリゴサッカリド鎖上の酸化シアル酸残基への部分的な（マイルド
過ヨウ素酸塩）ＨＥＳ誘導体（平均分子量１８，０００ダルトン；ヒドロキシエチル置換
度０．４）のカップリングによってＨＥＳ−ＥＰＯを合成した。炭水化物構造分析に基づ
いて、マイルド酸処理ＨＥＳ修飾グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって未修飾Ｅ
ＰＯ生成物で見出される鎖と区別不可能なインタクトな中性Ｎ−アセチルラクトサミン鎖
型が明らかとなったので、導入された修飾はコアオリゴサッカリド鎖の構造の完全性に影
響を与えなかった。得られた結果は、事前にシアル酸を部分的に除去しない修飾に供した
ＥＰＯ調製物の場合、ＥＰＯ分子あたり少なくとも３つの修飾ＨＥＳ残基が結合すること
を示す。前者タンパク質の約５０％のシアル酸残基を欠くＥＰＯ変異型は、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにおいて類似の見かけ上の高分子量への移動度を示した（ＢＲＰ  ＥＰＯ標準につい
て４０ｋＤａに対して６０〜１１０ｋＤａ）。ＨＥＳ修飾ＥＰＯは、室温、ｐＨ３〜１０
での標準的なイオン交換クロマトグラフィ条件下で安定である。
【０３２３】
正赤血球症（ｎｏｒｍｏｃｙｔｈａｅｍｉｃ）マウス系におけるＥＰＯバイオアッセイ
は、欧州薬局方のＵＶ吸収値を使用したタンパク質測定およびＢＲＰ  ＥＰＯ標準調製物
に対して較正したＲＰ−ＨＰＬＣ  ＥＰＯタンパク質測定法に基づく国際ＢＲＰ  ＥＰＯ
参照標準と比較した場合、このアッセイおいてＨＥＳ修飾ＥＰＯの比活性（ＩＵ／ｍｇ）
が２．５〜３．０倍であることを示す。
【０３２４】
実施例８．１  材料と方法
（ａ）Ｎ−グリコシダーゼでの消化によるＮ結合オリゴサッカリドの遊離
サンプルを、２５単位（製造者の説明書に従う、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）の組換えＰＮＧアーゼＦと３７℃で一晩インキュベートした。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ中のタンパク質の特定の移動度シフトによって完全な消化をモニタリングした
。３倍体積の冷１００％エタノールの添加および−２０℃で少なくとも２時間のインキュ
ベーションによって遊離したＮ−グリカンをポリペプチドから分離した（Ｓｃｈｒｏｅｔ
ｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。沈殿したタンパク質を、４℃、１３０００ｒｐｍ
で１０分間の遠心分離によって取り出した。次いで、ペレットを、５００μｌの氷冷７５
％エタノールを含む２つのさらなる洗浄に供した。プールした上清中のオリゴサッカリド
を真空遠心分離機（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ濃縮機、Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で乾燥させた。Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジ（２５ｍｇまたは
１００ｍｇのＨｙｐｅｒＣａｒｂ）を以下のように使用して、使用前にグリカンサンプル
を脱塩した。カラムを３×５００μｌの８０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を含む０．１％
ＴＦＡで洗浄およびその後３×５００μｌの水で洗浄した。サンプルを前に水で最終体積
３００μｌ〜６００μｌに希釈し、その後カートリッジにロードし、水で強く洗浄した。
０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）を含む１．２ｍｌ（２５ｍｇカートリッジ；１００
ｍｇカートリッジの場合、１．８ｍｌ）の２５％アセトニトリル水でオリゴサッカリドを
溶離した。溶離したオリゴサッカリドを、２Ｍ  ＮＨ4ＯＨで中和し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａ
ｃ濃縮機で乾燥させた。いくつかの場合、１００μｇ未満の総（糖）タンパク質サンプル
由来の消化混合物の１００ｍｇ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジへの吸着によってＮ−
グリコシダーゼ遊離オリゴサッカリドを脱塩した。
【０３２５】
（ｂ）マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ
／ＴＯＦ−ＭＳ）によるオリゴサッカリドの分析
Ｂｒｕｋｅｒ  ＵＬＴＲＡＦＬＥＸ飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）装置を使用した。陽
イオンモードおよび陰イオンモード（両方の場合、反射を使用する）におけるＵＶ吸収材
料として２，５−ジヒドロキシ安息香酸を使用して未変性脱シアリル化オリゴサッカリド
を分析した。ＭＳ−ＭＳ分析のために、選択した親イオンを、レーザー誘起解離（ＬＩＤ
）に供し、得られたフラグメントイオンを装置の第２のＴＯＦステージ（ＬＩＦＴ）によ
って分離した。１μｌで概算濃度１〜１０ｐｍｏｌμｌ-1のサンプル溶液を、等量の各マ
トリックスと混合した。この混合物を、ステンレススチール製の標的にスポッティングし
、分析前に室温で乾燥させた。
【０３２６】
実施例８．２  組換えヒトＥＰＯ（ＥＰＯ−ＧＴ−１）の調製および特徴づけ
記載のようにＥＰＯを組換えＣＨＯ細胞から発現させ（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ＰＰ  ｅｔ  
ａｌ．，１９９９，Ｄｏｒｎｅｒ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、欧州薬局方に記載
の方法にしたがって調製物を特徴付けた（Ｐｈ．Ｅｕｒ．４，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｙ  ０
１／２００２：１３１６：Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  
ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。タンパク質ｎＭｏｌあたりの最終生成物のシアル酸含有量は、１２
ｎＭｏｌ（＋／−１．５ｎＭｏｌ）であった。Ｎ結合オリゴサッカリドの構造を、記載の
ようにＨＰＡＥＣ−ＰＡＤおよびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって決定した（Ｎｉｍｔ
ｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，１９９９）。得られたＥＰＯ調
製物は、ジ、トリ、およびテトラシアリル化オリゴサッカリド（それぞれ、２〜１２％、
１５〜２８％、および６０〜８０％であり、硫酸化およびペンタシアリル化鎖が少量存在
していた）を含んでいた。ＥＰＯ調製物の全体的なグリコシル化特性は、国際ＢＲＰ  Ｅ
ＰＯ標準調製物の特性と類似していた。
【０３２７】
組換えＥＰＯの等電点電気泳動パターンは、対応するイソ型を示す国際ＢＲＰ基準ＥＰ
Ｏ標準調製物のパターンと類似していた。２５％のＥＰＯタンパク質は、ポリペプチド鎖
のＳｅｒ126にＯ−グリコシル化を欠いていた。
【０３２８】
実施例８．３  部分的に脱シアリル化されたＥＰＯ形態の調製
ＥＰＯ  ＧＴ−１タンパク質（２．８４ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）中で８０℃に加熱し、１ｍｌのＥＰＯ溶液あたり１００μｌの１Ｎ  
Ｈ2ＳＯ4を添加し、それぞれ５分間、１０分間、および６０分間インキュベーションし続
け、異なるシアリル化度のＥＰＯ調製物を得た。ポリペプチドＮ−グリコシダーゼでのオ
リゴサッカリドの遊離後に０〜４個のシアル酸を有するオリゴサッカリドを定量し、Ｈｙ
ｐｅｒｃａｒｂカートリッジ（２５ｍｇ  ＨｙｐｅｒＳｅｐ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ；Ｔｈ
ｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，ＵＫ）を使用した脱塩によってＮ結合鎖
を単離した。１Ｎ  ＮａＯＨの添加によってＥＰＯ調製物を中和し、液体Ｎ2中で凍結し
、さらなる使用まで−２０℃で保存した。
【０３２９】
実施例８．４  シアリル化ＥＰＯ形態の過ヨウ素酸塩酸化
３．５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解した１０ｍｇの
未処理またはマイルド酸処理ＥＰＯに、１．５ｍｌの０．１Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．５）を添加し、混合物を氷浴中で０℃に冷却した；５００μｌの１０ｍＭ過ヨウ素
酸ナトリウムを添加し、反応混合物を、暗所にて０℃で６０分間保持した。次いで、１０
μｌのグリセロールを添加し、インキュベーションを暗所でさらに１０分間継続した。固
定角ローターを具備した実験用遠心分離機における製造者の説明書にしたがった３０００
ｒｐｍでＶＩＶＡＳＰＩＮ濃縮機（１０，０００  ＭＷＣＯ，ＰＥＳ  Ｖｉｖａｓｃｉｅ
ｎｃｅ  ＡＧ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した脱塩によって部分酸化Ｅ
ＰＯ型を試薬から分離した。液体窒素中での凍結後、ＥＰＯ調製物を最終体積４ｍｌで−
２０℃にて保存した。
【０３３０】
１００μｇアリコートの部分酸化ＥＰＯ調製物を、Ｎ−グリコシダーゼ処理に供し、記
載のようにＨｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジを使用してオリゴサッカリドを単離した。オ
リゴサッカリドをマイルド酸処理によって脱シアリル化し、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって
分析し、記載のようにその保持時間を信頼のおける標準オリゴサッカリドの保持時間と比
較した（Ｎｉｍｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  ａｎｄ  １９９３）。
【０３３１】
実施例８．５  ＥＰＯジスルフィドのジチオエリトリトールでの還元
５ｍｇのＥＰＯ−ＧＴ−１を、３０ｍＭジチオエリトリトール（ＤＴＴ）の存在下で５
ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．１）中にて３７℃で６０分間インキ
ュベートし、４℃のＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮機を使用し、緩衝液を４サイクル交換してＤＴ
Ｔを除去した。最終還元ＥＰＯ調製物を液体窒素中で凍結し、−２０℃の５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で保存した。
【０３３２】
実施例８．６  ＥＰＯタンパク質の測定
欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ４，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ
ｙ  ０１／２００２：１３１６：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ
ｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にしたがった１ｃｍ光路のキュベット中での２８０ｎｍでのＵ
Ｖ吸収の測定によって、ＥＰＯタンパク質を定量的に測定した。さらに、ＲＰ−Ｃ４カラ
ムを使用したＲＰ−ＨＰＬＣ法の適用によってＥＰＯを定量した（Ｖｙｄａｃ  Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ  Ｃ４，カタログ番号２１４ＴＰ５４１０，Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ，Ｃａ，ＵＳ
）；エリスロポエチンＢＲＰ１参照基準を使用して、ＨＰＬＣ法を較正した（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，Ｃｏｎｓｅｉｌ  ｄｅ  ｌ’Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｐ
．９０７−Ｆ６７０２９，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ  Ｃｅｄｅｘ  １）。
【０３３３】
実施例８．７  ガラクトースオキシダーゼでの脱シアリル化ＥＰＯの酸化
４．４８５ｍｇの完全に脱シアリル化されたＥＰＯを、１６μｌカタラーゼ（６２１４
単位／２００ｍｌ）および８０μｌのガラクトースオキシダーゼ（ドクティリウム・デン
ドロイダス由来の２２５０単位／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉ
ｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））の存在下で２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中で
インキュベートした；３７℃で一晩インキュベートした；インキュベーション開始から４
時間後およ８時間後に２０μｌのガラクトースオキシダーゼを２回添加した。
【０３３４】
実施例８．８  バイオアッセイ用のＥＰＯサンプルの調製
過ヨウ素酸塩またはガラクトースオキシダーゼ酸化ＥＰＯタンパク質調製物の活性化さ
れたＨＥＳとのインキュベーション物からのＥＰＯの精製
ＥＰＯサンプルの精製（未反応ＨＥＳ誘導体の除去）を室温で行った。ＥＰＯインキュ
ベーション混合物（約５ｍｇのＥＰＯタンパク質）を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｎ−モルホ
リンプロパンスルホン酸［ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ］を含む蒸留水（ｐＨ８．０））で１０倍
希釈し、流速０．５ｍｌ／分で１０カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａで平衡化した３ｍｌ  
Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａコード番号１７−１０１４−０３、ロ
ット番号２２０２１１）を含むカラムにアプライした。６〜８ＣＶの緩衝液Ａ（流速＝０
．８ｍｌ／分）でカラムを洗浄し、流速０．５ｍｌ／分で緩衝液Ｂ（２０ｍＭモルホリン
エタンスルホン酸［ＭＥＳ／ＮａＯＨ］、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む蒸留水（ｐＨ６．５
））の使用によって溶離した。２８０ｎｍのＵＶ吸収によってＥＰＯを検出し、約６ｍｌ
で溶離した。３ＣＶの緩衝液Ｃ（ｐＨ６．５に調整した２０ｍＭ  ＭＥＳ、１．５Ｍ  Ｎ
ａＣｌを含む蒸留水）の使用によってカラムを再生し、１０ＣＶの緩衝液Ａの使用によっ
て再平衡化した（流速０．７ｍｌ／分）。
【０３３５】
サンプルあたりそれぞれ３回の遠心分離サイクルを使用したＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮機お
よびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程から得
たＥＰＯ溶離物の緩衝液交換を行った；サンプルをＰＢＳで２ｍｌに調整し、−２０℃で
保存した。
【０３３６】
使用条件下で塩基性ＥＰＯ形態がＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合せず、未反応ＨＥＳ誘
導体と共に通過したので、ＨＥＳ修飾に供した２５％未満の部分脱シアリル化およびその
後マイルド過ヨウ素酸塩酸化ＥＰＯ形態のみがＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶離物から得られ
た。
【０３３７】
実施例８．９  パルスドアンペロメトリー検出器を用いた高ｐＨ陰イオン交換クロマトグ
ラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）
精製未変性および脱シアリル化オリゴサッカリドを、パルスドアンペロメトリー検出器
（ＰＡＤ）と組み合わせたＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラム（０．４×２５ｃｍ）を備え
たＤｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，ＵＳＡ）を使用した高ｐＨ陰イオ
ン交換（ＨＰＡＥ）クロマトグラフィによって分析した（Ｓｃｈｒｏｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ
．，１９９９；Ｎｉｍｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。検出器のポテンシャル（Ｅ）お
よびパルス幅（Ｔ）は、以下であった。Ｅ１：＋５０ｍＶ、Ｔ１：４８０ｍｓ；Ｅ２：＋
５００ｍＶ，Ｔ２：１２０ｍｓ；Ｅ３：−５００ｍＶ，Ｔ３：６０ｍｓ、および出力範囲
は５００〜１５００ｎＡであった。次いで、オリゴサッカリドを、１００％溶媒Ａで平衡
化したＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラムに注入した。脱シアリル化オリゴサッカリドのた
めに、４０分間の溶媒Ｂの直線勾配（０〜２０％）およびその後の５分間の２０〜１００
％の溶媒Ｂの直線的増加の適用によって溶離した（流速：１ｍｌ／分）。溶媒Ａは０．２
Ｍ  ＮａＯＨを含む蒸留水であり、溶媒Ｂは０．６Ｍ  ＮａＯＡｃを含む溶媒Ａからなる
。未変性オリゴサッカリドのために、カラムを１００％溶媒Ｃ（０．１Ｍ  ＮａＯＨを含
む蒸留水）で平衡化し、４８分間の溶媒Ｄの直線的勾配（０〜３５％）およびその後の１
０分間の３５〜１００％の溶媒Ｄの直線増加の適用によって溶離した（流速：１ｍｌ／分
）。溶媒Ｄは、０．６Ｍ  酢酸ナトリウムを含む溶媒Ｃからなる。
【０３３８】
実施例８．１０  ＧＣ−ＭＳによるＮ−グリカン、ＨＥＳ修飾Ｎ−グリカン、およびＥＰ
Ｏタンパク質のモノサッカリド組成分析
メタノリシス、Ｎ−再アセチル化、およびトリメチルシリル化後の対応するメチルグリ
コシドとしてモノサッカリドをＧＣ／ＭＳによって分析した（Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｆ．
（１９８２）Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔ
ｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．１２３，３３６−３４１）。３０ｍＤＢ５キャピラリーカラムを具備した陽イオンＥＩ
モードで運転するＦｉｎｎｉｇａｎＧＣＱイオントラップ質量分析器（Ｆｉｎｎｉｇａｎ
ＭＡＴ  ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって分析を行った。温度プログラ
ム：８０℃の等温で２分間、その後１０℃／分で３００度まで。
【０３３９】
保持時間および特徴的な断片化パターンによってモノサッカリドを同定した。較正され
ていない電子的ピーク積分結果を定量に使用した。フラノイド型およびピラノイド型のア
ノメリシティ（ａｎｏｍｅｒｉｃｉｔｙ）および／または存在に起因する１つを超えたピ
ークが得られたモノサッカリドを、全ての主なピークの付加によって定量した。内部標準
化合物として０．５μｇのミオイノシトールを使用した。
【０３４０】
実施例８．１１  結果
実施例８．１１（ａ）マイルド酸処理（部分脱アシル化）ＥＰＯ−ＧＴ−１のＮ−グリカ
ンの特徴づけ
５分間、１０分間、または６０分間のマイルド酸処理に供したＥＰＯ−ＧＴ−１調製物
を、図７に示すＮ−グリコシダーゼとのインキュベーションによるＮ結合オリゴサッカリ
ドの遊離前および遊離後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｎ結合オリゴサッカリド
を、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤオリゴサッカリドマッピングに供した（図８）。未処理ＥＰＯ−
ＧＴ−１が３個または４個のシアル酸残基を有する９０％を超えるＮ結合オリゴサッカリ
ドを含む一方で、マイルド酸の存在下での５分間のインキュベーション後では４０％未満
の炭水化物鎖が３個または４個のシアル酸残基を有していた。脱シアリル化Ｎ−グリカン
のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより、未処理ＥＰＯ−ＧＴ−１について検出された中性オリゴサ
ッカリドの比が明らかとなり、５分間、１０分間、または６０分間の酸処理に供した調製
物では安定なままである。脱シアリル化グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより、タ
ンパク質のマイルド酸処理後に９０％を超える近位フコースが存在することが明らかとな
った。
【０３４１】
実施例８．１１（ｂ）過ヨウ素酸塩処理ＥＰＯ−ＧＴ−１の特徴づけ
予め酸に５分間および１０分間供したマイルド過ヨウ素酸処理ＥＰＯ形態または処理し
ていないＥＰＯ形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度を図１０で比較する。シアル酸の過ヨウ素
酸塩活性化に使用した条件は、ＥＰＯ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを変化させなか
った（図７と比較）。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によるシアル酸の酸化により、オリゴサッ
カリドがより早い溶離時間にシフトされた（図８および１１の比較）。
【０３４２】
実施例８．１１（ｃ）ＨＥＳ修飾ＥＰＯ誘導体の特徴づけ
（ａａ）実施例２．４にしたがって生成されたヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘで
のＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡのＨＥＳ修飾の保持時間
４００μｇのヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘを２０μｇのＥＰＯ−ＧＴ−１−
Ａ（マイルド過ヨウ素酸塩酸化前に酸加水分解されていないマイルド過ヨウ素酸塩酸化Ｅ
ＰＯ）を含む２０μＬの０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、３０分後
、２時間後、４時間後、および１７時間後に液体窒素中でのサンプルの凍結によって反応
をそれぞれ停止させた。その後サンプルをさらなる分析まで−２０℃で保存した。
【０３４３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加し、サンプルを９０℃に加熱し、ＳＤＳゲルに
アプライした。図１２に示すように、インキュベーション時間の増加により、タンパク質
のより高い分子量へのシフトが増加した。ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘの存在
下での１７時間のインキュベーション後、分子量標準の位置に基づいて、６０ｋＤａと１
１ｋＤａとの間の領域に移動したクーマシー染色タンパク質バンドの拡散が検出された（
図１２の左部を参照のこと）。Ｎ−グリコシダーゼでの処理中、ほとんどのタンパク質が
脱Ｎグリコシル化ＥＰＯの位置に向かってシフトした（図１２の右のゲルを参照のこと；
矢印ＡはＮ−グリコシダーゼの移動位置を示し、矢印Ｂは脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯの移
動位置を示す；２８ＫＤａと３６ＫＤａとの間の分子量標準領域中に認められる拡散タン
パク質バンドは、おそらくＨＥＳおよび分子のＯ−グリコシル化部位によって修飾された
ＥＰＯ形態を示す）。Ｎ−グリコシダーゼの特異性を考慮して、この結果から、ＨＥＳ修
飾が実際にＥＰＯタンパク質のグリカンの過ヨウ素酸塩酸化シアル酸残基で起こると結論
付けた。
【０３４４】
（ｂｂ）ＨＥＳ−ＥＰＯ接合体の特徴づけ
ＨＥＳ−ＥＰＯ接合体Ｉ（マイルド過ヨウ素酸塩酸化後のＥＰＯ−ＧＴ−１（すなわち
、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ）を起源とする）、ＩＩ（５分間の酸加水分解およびマイルド過
ヨウ素酸塩酸化に供したＥＰＯ−ＧＴ−１に由来する）、ＩＩＩ（１０分間の酸加水分解
およびマイルド過ヨウ素酸塩酸化に供したＥＰＯ−ＧＴ−１に由来する）を、上記のよう
に合成した。コントロールインキュベーション（Ｋ）は、等量の未修飾ＨＥＳを添加した
同一の緩衝液条件下で未修飾ＥＰＯ−ＧＴ−１を含んでいた。インキュベーション混合物
を、ＨＥＳ−ＥＰＯ誘導体のその後の生化学分析のためのさらなる精製に供した。
【０３４５】
インキュベーション物であるＨＥＳ−ＥＰＯ接合体Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩならびにコ
ントロールインキュベーションＫを、イオン交換カラムでを通過すると予想される過剰な
未反応のＨＥＳ試薬を除去するために、「材料と方法」（実施例８．８）に記載のＱ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ精製工程に供した。前に酸処理したサンプルＩＩおよびＩＩＩ中に含ま
れる大量の塩基性ＥＰＯ形態のために、本発明者らは、これらのインキュベーション由来
の大量の修飾ＥＰＯ生成物が通過すると予想した。図１３に示すように、サンプルＩ由来
のほとんど全てのＥＰＯ材料がＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに保持される一方で、高塩
濃度で溶離した画分中には約２０〜３０％のサンプルＩＩＩおよびＩＩしか回収されなか
った。高塩濃度での通過物および溶離画分中のＨＥＳ誘導体Ｘとのインキュベーション由
来の全てのタンパク質材料は、コントロールＥＰＯと比較した場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
おいて見かけ上より高い分子量を示した。
【０３４６】
ＨＥＳ修飾ＥＰＯをより詳細に特徴付けるために、サンプルＡおよびＫ（図１１を参照
のこと）を、過ヨウ素酸塩酸化形態ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａと比較した。サンプルを、Ｎ−
グリコシダーゼ処理に供し、図１４ａおよび１４ｂに示すように、Ｎ−グリカンの遊離に
より、標準ＥＰＯ調製物のＯ−グリコシル化および非グリコシル化ＥＰＯ形態の位置に２
つの低分子量バンドが得られた。サンプルＡの場合、２８ＫＤａの分子量標準の位置に移
動したさらなるバンドが検出され、このＥＰＯ変異型のＯ−グリカンでのＨＥＳ修飾が示
唆される（実施例８．１１（ｃ）（ａａ）を参照のこと）。このバンド（およびＮ−グリ
コシル化ＥＰＯの高ＨＥＳ修飾高分子量形態、図１４ａおよび１４ｂを参照のこと）は、
サンプルのマイルド酸加水分解後に消失し、これは、エリスロポエチンの過ヨウ素酸塩酸
化シアル酸残基でＨＥＳ修飾が起こるという見解と一致する。
【０３４７】
Ｎ−グリコシダーゼインキュベーション混合物のアリコートを、オリゴサッカリドから
シアル酸残基（およびシアル酸結合ＨＥＳ誘導体）を完全に除去することができる条件下
で加水分解し、中和後混合をその脱塩のために小Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムに吸着させた
。カラムを水で強く洗浄し、その後結合した中性オリゴサッカリドを０．１％のトリフル
オロ酢酸を含む４０％アセトニトリル水で溶離した。得られたオリゴサッカリドを、ＭＡ
ＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳに供した。サンプルＡ，ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ、およびサンプルＫ
由来の脱シアリル化オリゴサッカリド画分のスペクトルにより、ｍ／ｚ＝１８１０Ｄａ（
２触角型）、２１７５＝３触角型、２５４０＝４触覚型、２９０６＝４触角型＋１Ｎ−ア
セチルラクトサミン反復、および３２７１＝４触角型＋２Ｎ−アセチルラクトサミン反復
での複合体型のオリゴサッカリドについて同一の分子量が示された；シアル酸除去に供し
た酸加水分解条件に寄与するフコース（−１４６）およびガラクトース（−１６２）の消
失に対応する小シグナルが検出された（ＭＡＬＤＩ−図１７、１８、および１９を参照の
こと）。
【０３４８】
並行実験では、Ｎ−グリコシダーゼ消化混合物を１ｍｌ  ＲＰ−Ｃ１８カートリッジ上
に吸着させ（オリゴサッカリドを事前に酸加水分解しない）、０．１％ＴＦＡを含む５％
アセトニトリル水で溶離した；これらの条件下で、ＥＰＯタンパク質はＲＰ−材料上に完
全に保持され、オリゴサッカリドを、０．１％ＴＦＡを含む５％アセトニトリル水でカラ
ムから洗浄した。脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯタンパク質を、０．１％ＴＦＡを含む７０％
アセトニトリル水で溶離した。Ｎ−グリコシダーゼ処理サンプルＡ、ＥＰＯ−ＧＴ−１−
Ａ、およびサンプルＫのＲＰ−Ｃ１８工程由来のオリゴサッカリド画分を中和し、上記の
Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジを使用した脱塩に供した。単離オリゴサッカリドを、グ
ルカンからシアル酸を定量的に除去することができる条件下でのマイルド酸処理前（図１
５を参照のこと）および処理後にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤマッピングに供した（図１６を参照
のこと）。
【０３４９】
ＨＥＳ修飾サンプルＡから得た未変性材料についてのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロフィール
により、オリゴサッカリドについては僅かなシグナルしか示さなかったが、ＥＰＯ−ＧＴ
−１−Ａ誘導オリゴサッカリドは図１１と同一のグリカンプロフィールを示した（マイル
ド過ヨウ素酸塩処理後にＥＰＯ−ＧＴ−１と名づけたサンプル）。コントロールＥＰＯサ
ンプル（Ｋ）から得たオリゴサッカリドの溶離プロフィールにより、予想パターンが得ら
れた（図８中のプロフィールと比較）。比較のために、比較および参照標準として、国際
ＢＲＰ−ＥＰＯ標準の未変性オリゴサッカリドプロフィールが含まれる。
【０３５０】
マイルド酸加水分解後、全てのオリゴサッカリド調製物は、本研究で出発材料として使
用したＥＰＯ調製物についての方法に記載の２、３、および４触角複合物型炭水化物鎖の
予想される定性的および定量的組成を有する中性オリゴサッカリド構造（図１６を参照の
こと）と同一の溶離プロフィールを示した。この結果は、ＥＰＯサンプルのＨＥＳ修飾に
よりＮ−グリコシダーゼによるＥＰＯ−タンパク質から脱離されたＨＥＳ誘導体の共有結
合が得られ、脱シアリル化炭水化物に公知のマイルド酸処理条件を使用してＮ−グリカン
を除去するので酸に不安定であることを証明する（図１４ａ＋ｂを参照のこと）。
【０３５１】
（ｃｃ）ＧＣ−ＭＳによるＨＥＳ−ＥＰＯおよびＨＥＳ−ＥＰＯ  Ｎ−グリカンのモノサ
ッカリド組成分析
分子のＮ−グリカンでのＥＰＯのＨＥＳ修飾をさらに確認するために、ＥＰＯサンプル
をＮ−グリコシダーゼで消化し、ＥＰＯタンパク質をＲＰ−Ｃ１８カートリッジに吸着さ
せる一方で、上記のようにオリゴサッカリド材料を洗浄した。表２に示すように、システ
イン残基のＨＥＳ修飾に供したＥＰＯタンパク質およびＥＰＯサンプルＡ２のオリゴサッ
カリド画分のみでグルコースおよびヒドロキシエチル化グルコース誘導体が検出された。
【０３５２】
実施例８．１１（ｄ）ＨＥＳ修飾ＥＰＯの生物活性のインビボアッセイ
欧州薬局方に記載の手順にしたがって正赤血球症マウス系指標におけるＥＰＯ−バイオ
アッセイを行った；ＥＰＯアッセイを行った実験では、国際ＢＲＰ  ＥＰＯ参照基準調製
物を使用した。ＨＥＳ修飾ＥＰＯＡ２調製物のために、２９４，６００単位／ｍｇＥＰＯ
タンパク質の比活性平均値が測定され、これは、活性アッセイのために得たサンプル中に
含まれる国際ＢＲＰ  ＥＰＯ参照基準調製物と比較した場合に約３倍の比活性を示す。
【０３５３】
研究結果を、表３にまとめる。
【０３５４】
実施例１〜８の参考文献
Ｎｉｍｔｚ  Ｍ，Ｎｏｌｌ  Ｇ，Ｐａｑｕｅｓ  ＥＰ，Ｃｏｎｒａｄｔ  ＨＳ．
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕ
ｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｒｅ−
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．
ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９０  Ｏｃｔ．１；２７１（１−２）：１４−８
Ｄｏｒｎｅｒ  ＡＪ，Ｗａｓｌｅｙ  ＬＣ，Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．
Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａ
ｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．
Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８９  Ｄｅｃ  ５；２６４（３４）：２０６０２−７
Ｍｕｅｌｌｅｒ  ＰＰ，Ｓｃｈｌｅｎｋｅ  Ｐ，Ｎｉｍｔｚ  Ｍ，Ｃｏｎｒａｄｔ  Ｈ
Ｓ，Ｈａｕｓｅｒ  Ｈ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｏｌ
ｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ＢＨＫ−２１  ｃｅｌｌｓ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１９９９  Ｄｅｃ  ５；６５（５）：５２９−３
６
Ｎｉｍｔｚ  Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｗ，Ｗｒａｙ  Ｖ，Ｋｌｏｐｐｅｌ  ＫＤ，Ａｕｇｕ
ｓｔｉｎ  Ｊ，Ｃｏｎｒａｄｔ  ＨＳ．
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｒ
ｅｃｏｂｍｉｎａｎｔ  ＢＨＫ−２１  ｃｅｌｌｓ．
Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３  Ａｐｒ．１；２１３（１）：３９−５６
Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ  Ｐ，Ｗｉｔｚｅｌ  Ｒ，Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ  ＪＦ，Ｋａ
ｍｅｒｌｉｎｇ  ＪＰ，Ｎｉｍｔｚ  Ｍ，Ｃｏｎｒａｄｔ  ＨＳ．
Ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ  
ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｈ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ｗｉｔｈ  ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．
Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２  Ｊｕｎ；２０３（２）：２８１−９
Ｓｃｈｒｏｔｅｒ  Ｓ，Ｄｅｒｒ  Ｐ，Ｃｏｎｒａｄｔ  ＨＳ，Ｎｉｍｔｚ  Ｍ，Ｈａ
ｌｅ  Ｇ，Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ  Ｃ．
Ｍａｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ５２
．
Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｏｃｔ．１５；２７４（４２）：２９８６２−７３
【０３５５】
実施例９．組換えＥＰＯの産生
（Ａ）哺乳動物細胞での産生
以下のようにＣＨＯ細胞中に組換えＥＰＯを産生した。
ヒトＥＰＯｃＤＮＡを保有するプラスミドを、真核生物発現ベクター（ｐＣＲ３および
その後ｐＣＲＥＰＯと呼ぶ）にクローン化した。記載の標準的な手順を使用して部位特異
的誘発を行った（Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１
９９８，ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ  １
，３／４−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＩＩＩ−ＶＩＩ  ｉｎ  ｔｈｅ  
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｅｗｉｓ（ｘ）  ａｎｄ  ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉ
ｓ（ｘ）  ｍｏｔｉｆｓ  ｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ  −Ｃ
ｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ＢＨＫ−２１  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ
ｇｅｔｈｅｒ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｔｒａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（４７），３０９８５−３０９９４）。
【０３５６】
リン酸カルシウム沈殿法を使用してヒトＥＰＯまたはそのアミノ酸変異型（例えば、Ｃ
ｙｓ−２９→Ｓｅｒ／ＡｌａまたはＣｙｓ−３３→Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ−１２６→Ａ
ｌａなど）を安定に発現するＣＨＯ細胞を作製し、記載のように硫酸Ｇ４１８を使用して
選択した（Ｇｒａｂｅｎｇｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．）。トランスフェクションから３日後
、細胞を１：５で継代し、１０％ＦＢＳおよび１．５ｇ／リットル硫酸Ｇ４１８を含むＤ
ＭＥＭで選択した。
【０３５７】
この選択手順を使用して、通常、１００〜５００個のクローンが生存し、さらに２〜３
週間選択培地で増殖させた。コンフルエントまで成長した単層の細胞培養上清を、ウェス
タンブロット分析およびＩＥＦ／ウェスタンブロット分析によってＥＰＯ発現レベルを分
析した。
【０３５８】
スピナーフラスコまたは２１個の灌流リアクター中で安定なサブクローンからＥＰＯが
産生された。公開されたプロトコールにしたがって下記の種々のクロマトグラフィ手順の
組み合わせを使用して、異なる量のＮｅｕＡｃ（例えば、２〜８個、４〜１０個、８〜１
２個のＮｅｕＡｃ残基）を有するＥＰＯの異なる糖形態を単離した。
【０３５９】
文献
Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９９，Ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉ
ｃ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ，ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃ
ｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｙ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  
ｉｎ−ｔｈｅ  Ｇｏｌｇｉ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７４（５１），３６１０７
−１６；Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｓｃｈｌｅｎｋｅ，Ｐｏｈｌ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｎｒ
ａｄｔ，１９９９，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  
ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎ
ｊ  Ｊ．，１６（２），８１−９７；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓｃｈｌｅｎｋｅ，Ｎｉｍｔｚ，
Ｃｏｎｒａｄｔ，Ｈａｕｓｅｒ，１９９９，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏ
ｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｃｏ
ｎｔｒｏｌｌｅｄ  ＢＨＫ−２１  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  
ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６５（５），５２９−５３６；Ｓｃｈｌｅｎｋｅ，Ｇｒ
ａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９９，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏ
ｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｅｄ  ＢＨＫ−２１  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ−ｔｙｐｅ  ｓｉａｌｙｌ
ａｔｉｏｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０（１
−３），１７−２５。
【０３６０】
Ｂ）昆虫細胞中での産生
上記文献に記載の多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターの調節下でのヒトＥＰ
ＯｃＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスベクターでの細胞の感染後に、昆虫細胞株ＳＦ
９およびＳＦ２１から組換えヒトＥＰＯを産生した。
【０３６１】
無血清培養培地で成長させた細胞を、２×１０6または２×１０7細胞／ｍＬの細胞密度
で感染させ、細胞培養上清中のＥＰＯ力価を毎日決定した。Ｂｌｕｅセファロースクロマ
トグラフィ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのイオン交換クロマトグラフィ、および最後にＣ
4相でのＲＰ−ＨＰＬＣによってＥＰＯを精製した。
【０３６２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端配列決定によって産物の純度をチェックした。公開され
た手順にしたがって、詳細な炭水化物の構造分析（ＮおよびＯ−グリコシル化）を行った
。
【０３６３】
文献
Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｈｏｆｅｒ，Ｎｉｍｔｚ，Ｊａｇｅｒ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１
９９３，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｒｏｍ
ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｓｆ２１  ｃｅｌｌｓ．Ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａ
ｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１５（
１），１８９−９７；Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗ
ｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏ
ｉｅｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏ
ｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７。
【０３６４】
実施例１０．反応性ＨＥＳ誘導体の形成
１．ＳＨ反応性ＨＥＳ
１．１  ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｂを形成するためのＥＭＣＨとオキソ−ＨＥＳ１２
ＫＤとの反応
【化７５】
2010248528.tif 000088
０．１４４ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ
に付与されたドイツ特許第１９６２８７０５Ａ１号）を、０．３ｍＬの無水ジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で３４ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のＥＭＣＨ（Ｐ
ｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）を含む１．５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。６０℃で１９時間の撹拌後、
反応混合物を１６ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。記載のよう
に沈殿物を遠心分離によって回収し、３ｍＬ  ＤＭＳＯ中に溶解し、再度沈殿させた。遠
心分離および真空乾燥によってＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｂを得た。チオ−ＥＰＯとの
接合反応を、実施例１１の２．２に記載する。
【０３６５】
代替方法
この反応では、スペーサーによって分離されたヒドラジドおよびマレイミド官能基を示
す全ての架橋剤を使用することができる。Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃ
ｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されているこの分子群のさら
なる例を表１に示す；「Ａ」で示す。さらに、マレイミド官能基の代わりに活性化された
ジスルフィド官能基を示す別の架橋剤群も使用することができる。
【０３６６】
１．２  ＨＥＳグリコシルアミンのハロゲンアセトアミド誘導体
ａ）グリコシルアミン形成1
１ｍｇのＨＥＳ１２Ｋ  Ｄサンプルを、３ｍＬの飽和重炭酸アンモニウムに溶解した。
次いで、３０℃で１２０時間のインキュベーション中の溶液の飽和を維持するために、さ
らなる固体重炭酸アンモニウムを添加した。アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｃを、反応混合物
の直接凍結乾燥によって脱塩した。
【０３６７】
（1Ｍａｎｇｅｒ，Ｗｏｎｇ，Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ，Ｄｗｅｋ，１９９２，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１０７３３−１０７４０；Ｍａｎｇｅｒ，Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ
，Ｄｗｅｋ，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１０７２４−１０７３２）
【０３６８】
ｂ）無水クロロ酢酸でのグリコシルアミンＣのアシル化
１ｍｇのアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｃサンプルを、１ｍＬの１Ｍ重炭酸ナトリウムに溶
解し、氷上で冷却した。これに無水クロロ酢酸結晶（約５ｍｇ）を添加し、反応混合物を
室温に加温した。ｐＨをモニタリングし、ｐＨが７．０未満に低下した場合にさらなる塩
基を添加した。室温で２時間後、塩基の第２のアリコートおよび無水物を添加した。６時
間後、生成物クロロアセトアミド−ＨＥＳＤ１（Ｘ＝Ｃｌ）を、混合ベッドＡｍｂｅｒｌ
ｉｔｅ  ＭＢ−３（Ｈ）（ＯＨ）イオン交換樹脂への通過によって脱塩した。
【０３６９】
ｃ）無水ブロモ酢酸でのグリコシルアミンのアシル化2
無水ブロモ酢酸をＴｈｏｍａｓ3に記載のように調製した。１ｍｇのアミノ−ＨＥＳ１
２ＫＤ  Ｃサンプルを０．１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解し、氷上で冷却し、５ｍｇ無水ブロ
モ酢酸を添加した。反応混合物をゆっくり室温にし、溶液を３時間撹拌した。反応混合物
を、−２０℃の１ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合液に添加した。記載のよう
に沈殿物を遠心分離によって回収し、０．１ｍＬ  ＤＭＦに再溶解し、再度沈殿させた。
遠心分離および真空乾燥によってブロモアセトアミド−ＨＥＳＤ２（Ｘ＝Ｂｒ）を得た。
チオ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１１の１．２に記載されている。
【０３７０】
（2Ｂｌａｃｋ，Ｋｉｓｓ，Ｔｕｌｌ，Ｗｉｔｈｅｒｓ，１９９３，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
．Ｒｅｓ．，２５０，１９５；  3Ｔｈｏｍａｓ，１９７７，Ｍｅｔｈｏｄｅｓ  Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．，４６，３６２）
【０３７１】
ｄ）対応するヨウ素誘導体Ｄ３（Ｘ＝Ｉ）をＤ２について記載のように合成した。無水ブ
ロモ酢酸の代わりに、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテートを使用し、全ての工程を暗
所で行った。
【化７６】
2010248528.tif 000089
【０３７２】
代替方法
アミノ基のアシル化のために、例えば、
−ブロミドまたはクロリド
−エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、置換フェノールを有する
エステル（ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、トリクロロフェノールな
ど））などの他の活性形態のハロゲン酸を使用することができる。
【０３７３】
さらに、スペーサーによって分離されたアミノ反応基およびハロゲンアセチル官能基を
有する全ての架橋剤を使用することができる。その例は、ＳＢＡＰである。この分子およ
び他の分子は、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂ
ｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている。これらを、表１で「Ｄ」で示す。ハロゲン
アセトアミド−ＨＥＳ誘導体を単離しないチオ−ＥＰＯでのアミノ−ＨＥＳのライゲーシ
ョンのための架橋剤としての使用については、実施例１１、１２の備考を参照。
【０３７４】
１．３  アミノ−ＨＥＳＥのハロゲンアセトアミド誘導体1
ａ）アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｅを得るための１，４−ジアミノブタンとオキソ−ＨＥＳ
１２ＫＤとの反応4
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを３ｍＬの乾燥ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で１．５１ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）の１，４−ジ
アミノブタンを含む１５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。４０℃で１９時間の撹拌後
、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿物
（アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｅ）を遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、水
に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅ
ｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）、凍結乾燥させた。
【化７７】
2010248528.tif 000090
【０３７５】
（4Ｓ．Ｆｒｉｅ，Ｄｉｐｌｏｍａｒｂｅｉｔ，Ｆａｃｈｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ  Ｈａｍ
ｂｕｒｇ，１９９８）
【０３７６】
ｂ）上記１．３のクロロアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｄ１に記載のように、クロロア
セトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｆ１を調製した。
【０３７７】
ｃ）上記１．３のブロモアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｄ２に記載のように、ブロモア
セトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｆ２（Ｘ＝Ｂｒ）を調製した。チオ−ＥＰＯでの接合反応
は、実施例１１の１．２に記載されている。
【０３７８】
ｄ）対応するヨード−誘導体Ｆ３（Ｘ＝Ｉ）を、そのチオ−ＥＰＯとの反応前に単離しな
い。実験は、実施例１１の１．１に記載されている。
【０３７９】
代替方法
上記１．２を参照のこと。
【０３８０】
２．ＣＨＯ反応性ＨＥＳ
２．１  ヒドラジド−ＨＥＳ
【化７８】
2010248528.tif 000091
【０３８１】
ａ）ヒドラジドとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応。１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）の
オキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを、３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、
窒素下で０．４７ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）のヒドラジンを含む１５ｍＬのＤＭＳＯの混合物
に滴下した。４０℃で１９時間の撹拌後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセト
ンとの１：１混合物に添加した。沈殿生成物Ｊを遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水
に溶解し、０．５％（ｖ／ｖ）のトリエチルアミン水溶液に対して２日間および水に対し
て２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉ
ｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
、凍結乾燥させた。酸化グリコ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１２の２．２に記載され
ている。
【化７９】
2010248528.tif 000092
【０３８２】
ｂ）アジピン酸ジヒドラジドとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応
１．７４ｇ（１５ｍｍｏｌ）のアジピン酸ジヒドラジドを６５℃の２０ｍＬの無水ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、３ｍＬ無水ＤＭＳＯに溶解した１．４４ｇ（０
．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを、窒素下で滴下した。６０℃で６８時間の
撹拌後、反応混合物を２００ｍＬの水に添加した。Ｌを含む溶液を、０．５％（ｖ／ｖ）
のトリエチルアミン水溶液に対して２日間および水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳ
ｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。酸化グリコ
−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１２の２．２に記載されている。
【０３８３】
代替方法
さらに、２つのヒドラジド基が任意のスペーサーによって分離されている、誘導体を使
用することができる。
【０３８４】
３．さらなるアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ誘導体ＩおよびＨ1
０．１ｍＬの飽和炭酸アンモニウム中の１ｍｇの各ハロゲンアセトアミドサンプルの溶
解によってＤまたはＦのアンモニア分解を個別に行った。次いで、３０℃で１２０時間の
インキュベーション中の溶液の飽和を維持するために、さらなる固体炭酸アンモニウムを
添加した。反応混合物を、−２０℃の１ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に
添加した。記載のように沈殿物を遠心分離によって回収し、０．０５ｍＬの水に溶解し、
再度沈殿させた。遠心分離および真空乾燥によって生成物アミノＨＥＳ  ＨまたはＩを得
た。酸化グリコ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１２の４．１に記載されている。
【化８０Ａ】
2010248528.tif 000093
【化８０Ｂ】
2010248528.tif 000094
【０３８５】
４．ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｋ
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．に記載のように、市販の材料から２工程でＯ−［２−（
２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを合成した5。１．４４
ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを、３ｍＬ無水ジエチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で２．０４ｇ（１５ｍｍｏｌ）のＯ−［２−（２−アミノ
オキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを含む１５ｍＬのＤＭＳＯの混合物
に滴下した。６５℃で４８時間の撹拌後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセト
ンとの１：１混合物に添加した。沈殿生成物Ｋを遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水
に溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカッ
トオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。酸化グリコ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１２
の３．１に記載されている。
【０３８６】
（5Ｂｏｔｕｒｙｎ，Ｂｏｕｄａｌｉ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｄｅｆｒａｎｃｑ，Ｌｈｏｍ
ｍｅ，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，５４８５）
【０３８７】
代替方法
さらに、２つのヒドロキシルアミン基が２つのスペーサーによって分離されている誘導
体を使用することがきでる。
【０３８８】
５．チオ−ＨＥＳ１２ＫＤ
５．１  オキソ−ＨＥＳ１２ＫＤへの添加
【化８１】
2010248528.tif 000095
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを、３ｍＬの無水ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で１．１６ｇ（１５ｍｍｏｌ）のシステアミ
ンを含む１５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。４０℃で２４時間の撹拌後、反応混合
物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿生成物Ｍを遠
心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、０．５％（ｖ／ｖ）のトリエチルアミン
水溶液に対して２日間および水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ
、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  Ｇ
ｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。酸化グリコ−ＥＰＯとの接合反
応は、実施例１２の２．１に記載されている。
【０３８９】
代替方法
アミノ基およびチオ官能基が任意のスペーサーで分離されている誘導体を使用すること
ができる。さらに、誘導体中のアミノ基を、ヒドラジン、ヒドラジド、またはヒドロキシ
ルアミンに置換することができる。チオ官能基を、例えば、ジスルフィドまたはトリチル
誘導体の形態で保護することができる。しかし、この場合、接合体化の前にＭに類似の化
合物を遊離させるさらなる脱保護工程を行わなければならない。
【０３９０】
５．２  アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｅ、Ｈ、またはＩの修飾
ａ）ＳＡＴＡ／ＳＡＴＰの修飾
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｅ、Ｈ、またはＩを、３
ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で１３９ｍｇ（０．６ｍ
ｍｏｌ）のＳＡＴＡを含む５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。室温で２４時間の撹拌
後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿
生成物Ｎを遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、水に対して２日間透析し（
ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた
。
【０３９１】
２５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５Ｍヒドロキシルアミンを含む５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５）中にて室温で２時間脱保護を行い、生成物Ｏを、１ｍＭ  ＥＤＴ
Ａを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対する透析によって精製した。
実施例１２の２．１に記載の接合反応の直前に脱保護反応を行った。
【化８２】
2010248528.tif 000096
【０３９２】
ｂ）ＳＰＤＰでの修飾
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｅ、Ｈ、またはＩを、３
ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で１８７ｍｇ（０．６ｍ
ｍｏｌ）のＳＰＤＰを含む５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。室温で２４時間の撹拌
後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿
生成物Ｐを遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、水に対して２日間透析し（
ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた
。
【０３９３】
１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．５ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．５）あたり１２ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む溶液にて室温で３０分間
脱保護を行い、生成物Ｑを、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．５）に対する透析によって精製した。実施例１２の２．１に記載の接合反応の直前
に脱保護反応を行った。
【０３９４】
代替方法
遊離形態または保護形態のいずれかでのアミノ基からチオ基への変換のために、いくつ
かの試薬が利用可能である。修飾後、生成物を単離することができる。あるいは、架橋剤
の使用が許容されているので、好ましくは精製工程後に接合反応のためにこれらを直接使
用することができる。チオ−ＨＥＳ誘導体の単離および保存のために、保護形態でのチオ
−ＨＥＳ誘導体の合成は有用であり得る。これについて、任意のスペーサーで分離された
活性エステル官能基およびチオエステル官能基を有するＳＡＴＡに類似する全ての誘導体
を使用することができる。この群のさらなるメンバーであるＳＡＴＰは表１で見出され、
「Ｈ」で示す。ＳＰＤＰに類似の誘導体は、任意のスペーサーによって分離された活性エ
ステル官能基およびジスルフィド官能基を有し得る。これらの基のさらなるメンバーは、
表１に見出され、「Ｆ」で示す。さらなるアナログ誘導体は、任意のスペーサーによって
分離されたトリチル誘導体として保護された活性エステル官能基およびチオ官能基を有し
得る。
【０３９５】
実施例１１．チオ−ＥＰＯとの接合反応
１．チオ−ＥＰＯとハロゲンアセトアミド修飾ＳＨ反応性ＨＥＳとの反応
１．１  例示的プロトコール１
ＮＨＳ活性エステルおよびヨードアセトアミド基（例えば、ＳＩＡ）を含む架橋剤を使
用した、チオＥＰＯとアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、またはＩ）の接合6
【０３９６】
（6Ｃｕｍｂｅｒ，Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ，Ｆｏｘｗｅｌｌ，Ｒｏｓｓ，Ｔｈｏｒｐｅ，１
９８５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１２，２０７）
【０３９７】
材料
Ａ．ホウ酸緩衝液。組成は、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）、５ｍＭ  ＥＤＴ
Ａであった。
Ｂ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）。
Ｃ．アミノＨＥＳ１２ＫＤ  Ｅ、Ｈ、またはＩ。１ｍｇ／ｍＬを含むホウ酸緩衝液として
調製した。
Ｄ．架橋剤ストック溶液：１４ｍｇＳＩＡを、１ｍＬ  ＤＭＳＯに溶解した。
Ｅ．Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）デキストラン脱塩カラム（２×５ｍＬベッド体積）（Ｐｅｒｂ
ｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ
）。
Ｆ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｇ．チオＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ１を含むホウ酸緩衝液。
Ｈ．微量濃縮機：ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３（ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  Ｇｍｂ
Ｈ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
【０３９８】
方法
１００μＬのＳＩＡ溶液を、４００μＬのアミノＨＥＳ１２ＫＤ  Ｅ溶液に添加し、室
温で０．５時間震盪しながら反応させた。微量濃縮機を使用した１４０００×ｇで６０分
間のサンプルの遠心分離によって過剰な架橋剤を除去した。遠心分離後、サンプルをホウ
酸緩衝液でその元の体積まで増加させ、このプロセスを２回以上繰り返した。残りの溶液
を、１ｍＬのチオＥＰＯ溶液に添加し、反応混合物を室温で１６時間インキュベートした
。過剰なヨードアセトアミドの反応を、インキュベーション終了時に最終濃度１０ｍＭの
システインの添加によって停止させた。反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化した脱塩カ
ラムにアプライし、クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含
有量をモニタリングした。タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一
晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
【０３９９】
代替方法
この反応では、スペーサーによって分離されたスクシンイミド官能基またはスルホスク
シンイミド官能基およびヨードアセトアミド官能基を有する全ての架橋剤を使用すること
ができる。さらなる例は、表１で見出される。これらを「Ｃ」で示し、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販
されている。
【０４００】
１．２  例示的プロトコール２
チオＥＰＯ１とＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤブロモアセトアミドＤ２、Ｆ２、またはヨー
ドアセトアミドＤ３との接合7
材料
Ａ．リン酸緩衝液。組成は、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、５ｍＭ  ＥＤ
ＴＡであった。
Ｂ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）。
Ｃ．ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤブロモアセトアミドＤ２。１０ｍｇ／ｍＬを含むリン酸緩
衝液として調製した。
Ｄ．Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）デキストラン脱塩カラム（２×５ｍＬベッド体積）（Ｐｅｒｂ
ｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ
）。
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｆ．チオＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ１を含むリン酸緩衝液。
【０４０１】
（7ｄｅ  Ｖａｌａｓｃｏ，Ｍｅｒｋｕｓ，Ａｎｄｅｒｔｏｎ，Ｖｅｒｈｅｕｌ，Ｌｉｚ
ｚｉｏ，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ，ｖａｎ  Ｅｄｅｎ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｖｅｒｈｏｅ
ｆ，Ｓｎｉｐｐｅ，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３，９６１）
【０４０２】
方法
１ｍＬのＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤブロモアセトアミドＤ２溶液および１ｍＬのチオＥ
ＰＯ溶液を合わせ、反応混合物を室温で４８時間インキュベートした。過剰なブロモアセ
トアミドの反応を、インキュベーション終了時に最終濃度１０ｍＭのシステインの添加に
よって停止させた。反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化した脱塩カラムにアプライし、
クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリング
した。タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾
燥によって接合体を得た。
【０４０３】
代替方法
ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ−ブロモアセトアミドＤ２の単離の代わりに、アミノＨＥＳ
１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、Ｉ）を、スクシンイミド官能基およびブロモアセトアミド官能基を介
して架橋剤と結合させることができる（上記１．１を参照のこと）。ＳＢＡＰは、この架
橋剤群のメンバーであり、表１で見出される（「Ｄ」で示す）。
【０４０４】
２．チオ−ＥＰＯとマレイミド修飾ＳＨ反応性ＨＥＳとの反応
２．１  例示的プロトコール４
チオ−ＥＰＯとマレイミド−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｂとの接合体化
材料
Ａ．マレイミド−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｂ：１０ｍｇ／ｍＬを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）
Ｂ．チオＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯを含むリン酸／ＮａＣＩ緩衝液
Ｃ．リン酸／ＮａＣＩ：０．１Ｍリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣＩ（ｐＨ７．０）
Ｄ．ゲル濾過カラム：例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５
ｃｍ）
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｆ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）
【０４０５】
方法
１ｍＬのＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｂ溶液および１ｍＬのチオＥＰＯ１溶液を合わせ
、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。過剰なマレイミドの反応を、インキュ
ベーション終了時に最終濃度１０ｍＭのシステインの添加によって停止させた。反応混合
物を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４
５ｃｍ）にアプライし、１ｍＬの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を
使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングした。タンパク質接合体を含む全ての
画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
【０４０６】
２．２  例示的プロトコール１２
ＮＨＳ活性化エステルおよびマレイミド基（例えば、ＳＭＣＣ）を含む架橋剤を使用し
たチオＥＰＯとアミノＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、Ｉ）との接合体化
材料
Ａ．微量濃縮機：ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−１０（ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  Ｇｍ
ｂＨ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｂ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）
Ｃ．アミノＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、またはＩ）。１０ｍｇ／ｍＬを含むＰＢＳ緩衝液と
して調整する。
Ｄ．ＳＭＣＣ溶液：１ｍｇ  ＳＭＣＣを５０μＬのＤＭＳＯに溶解した。
Ｅ．Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）デキストラン脱塩カラム（２×５ｍＬベッド体積）（Ｐｅｒｂ
ｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ
）。
Ｆ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｇ．チオＥＰＯ１溶液：５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ１を含むリン酸緩衝液。
【０４０７】
方法
５０μＬのＳＭＣＣ溶液に４００μＬのアミノＨＥＳ１２ＫＤ  Ｅ溶液を添加し、反応
混合物を撹拌しながら室温で８０分間および４６℃で１０分間反応させた。１４０００×
ｇで６０分間の微量濃縮機による反応混合物の遠心分離によって過剰な架橋剤を除去した
。ＰＢＳ緩衝液で体積を４５０μＬにし、プロセスを２回以上繰り返した。最後の遠心分
離後、残りの溶液をＰＢＳで４５０μＬにし、１ｍＬのチオＥＰＯ溶液に添加し、反応混
合物を室温で１６時間インキュベートした。過剰なマレイミドの反応を、インキュベーシ
ョン終了時に最終濃度１０ｍＭのシステインの添加によって停止させた。反応混合物を、
ＰＢＳ緩衝液で平衡化した脱塩カラムにアプライした。クーマシータンパク質アッセイ試
薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全て
の画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
【０４０８】
代替方法
この反応では、スペーサーで分離されたスクシンイミド官能基またはスルホスクシンイ
ミド官能基、およびマレイミド官能基を有する全ての架橋剤を使用することができる。Ｐ
ｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙから市販されているこの分子群のさらなる例は、表１で見出され、これらを「Ｅ」
で示す。マレイミド官能基の代わりに活性化されたジスルフィド官能基を有するさらなる
架橋剤群が存在する。接合体化にこれらの架橋剤を使用することもできる。しかし、接合
体のジスルフィド結合は、還元条件下で切断可能である。この群のメンバーを、表１で「
Ｆ」を使用して示す。第３の架橋剤群は、ＳＨ反応基としてマレイミド官能基の代わりに
ビニルスルホン官能基を使用する。この「ＳＶＳＢ」群のメンバーを、表１で「Ｇ」を使
用して示す。
【０４０９】
実施例１２．酸化ＥＰＯとの接合反応
１．グリコ−ＥＰＯの酸化
１．１  メタ過ヨウ素酸ナトリウムでのグリコ−ＥＰＯの酸化：例示的プロトコール５
材料
Ａ．グリコ−ＥＰＯ溶液：１０ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯを含む酢酸緩衝液。
Ｂ．メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液：新たに調製した１０ｍＭまたは１００ｍＭの過ヨウ
素酸ナトリウムを含む酢酸緩衝液。暗所に保持。これらの溶液を使用して、酸化混合物中
の過ヨウ素酸ナトリウムの最終濃度は、それぞれ１ｍＭまたは１０ｍＭである。
Ｃ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
Ｄ．グリセロール
Ｅ．微量濃縮機：ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３（ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  Ｇｍｂ
Ｈ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
【０４１０】
方法
全ての工程を暗所で行った。
１ｍＬの冷グリコ−ＥＰＯ溶液に、０．１ｍＬの冷メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添
加し、暗所で１時間酸化反応を進行させた。酸化すべきグリコ−ＥＰＯがシアル酸残基を
含む場合、酸化条件は、１ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム、０℃である。さもなければ、１０
ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムを室温で使用する。酸化を停止させるために、最終濃度１５
ｍＭのグリセロールを添加し、０℃で５分間インキュベートした。過剰な試薬および副生
成物を、微量濃縮機を使用した１４０００×ｇで６０分間の生成物の遠心分離によって除
去した。遠心分離後、サンプルを次の修飾工程で使用する緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）
でその元の体積までにした。このプロセスを２回以上繰り返した。
【０４１１】
１．２  グリコ−ＥＰＯの酵素酸化：例示的プロトコール６
ＥＰＯの酵素酸化を本発明のいずれかに記載されている（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．
，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１５９１６−１５９２２）。
【０４１２】
２．ヒドラジン／ヒドラジド−誘導体との接合体化
２．１  例示的プロトコール７
ヒドラジドおよびマレイミド官能基を含む架橋剤（例えば、Ｍ2Ｃ2Ｈ（Ｐｅｒｂｉｏ  
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を
使用した酸化グリコ−ＥＰＯとチオ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｍ、Ｏ、またはＱとの接合体化
【０４１３】
材料
Ａ．Ｍ2Ｃ2Ｈストック：新たに調製した１０ｍｇ／ｍＬ  Ｍ2Ｃ2Ｈを含むＤＭＳＯ
Ｂ．６．１．１．由来の酸化グリコ−ＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯを含む
酢酸緩衝液
Ｃ．チオ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｍ、Ｏ、またはＱ：１０ｍｇ／ｍＬを含むリン酸／ＮａＣＩ
緩衝液。
Ｄ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
Ｅ．リン酸／ＮａＣＩ：０．１Ｍリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）
Ｆ．微量濃縮機：ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３（ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  Ｇｍｂ
Ｈ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｇ．ゲル濾過カラム：例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５
ｃｍ）
Ｈ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｉ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）
【０４１４】
方法
Ｍ2Ｃ2Ｈストック溶液を、１ｍＬの酸化グリコ−ＥＰＯに最終濃度１ｍＭまで添加し、
撹拌しながら室温で２時間反応させた。微量濃縮機を使用した１４０００×ｇで６０分間
のサンプルの遠心分離によって過剰な架橋剤を除去した。遠心分離後、サンプルをリン酸
／ＮａＣＩ緩衝液で元の体積にし、このプロセスを２回以上繰り返した。Ｍ2Ｃ2Ｈ修飾グ
リコ−ＥＰＯに１ｍＬのチオ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｍ、Ｏ、またはＱ溶液を添加し、反応混
合物を室温で１６時間インキュベートした。過剰なマレイミドの反応を、インキュベーシ
ョン終了時のシステインの添加によって停止させた。反応混合物を、ＰＢＳで平衡化した
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）にアプライし、１ｍＬの
画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有
量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の
透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
【０４１５】
手順の注釈
ヒドラゾン付加物は、極端なｐＨであまり安定ではない。低ｐＨでの処理を含む適用の
ために、ヒドラジンの３０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含むＰＢＳでの処理によ
りヒドラゾンを還元した。ほとんどの適用については、この付加的な工程は不必要である
。
【０４１６】
２．２  例示的プロトコール８
酸化グリコ−ＥＰＯとヒドラジド−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｌとの直接接合体化
材料
Ａ．６．１．１．由来の酸化グリコ−ＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯを含む
酢酸緩衝液
Ｂ．ヒドラジド−ＨＥＳ１８ＫＤ  ＬまたはＪ：１０ｍｇ／ｍＬを含む酢酸緩衝液
Ｃ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
Ｄ．ゲル濾過カラム：例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５
ｃｍ）
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｆ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）
【０４１７】
方法
１ｍＬのヒドラジド−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｌ溶液および１ｍＬの酸化グリコ−ＥＰＯ溶液
を合わせ、反応混合物を撹拌しながら室温で１６時間反応させた。反応混合物を、ＰＢＳ
で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）にアプライ
し、１ｍＬの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタ
ンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に
対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。接合化の結果を図２４に示す。認
められた分子シフトにより、接合体化が成功したことが証明された。スメアは、ＨＥＳの
異種性に起因する。図２５は、ＨＥＳが炭水化物側鎖の炭水化物部分に接合したことを証
明する。
【０４１８】
手順の注釈
ヒドラゾン付加物は、極端なｐＨであまり安定ではない。低ｐＨでの処理を含む適用の
ために、ヒドラジンの３０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含むＰＢＳでの処理によ
りヒドラゾンを還元した。ほとんどの適用については、この付加的な工程は不必要である
。
【０４１９】
３．ヒドロキシルアミン誘導体との接合体化8
３．１  例示的プロトコール９
酸化グリコ−ＥＰＯとヒドロキシルアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｋとの接合体化
材料
Ａ．６．１．１．由来の酸化グリコ−ＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯを含む
酢酸緩衝液
Ｂ．ヒドロキシルアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｋ：１０ｍｇ／ｍＬを含む酢酸緩衝液
Ｃ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
Ｄ．ゲル濾過カラム：例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５
ｃｍ）
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｆ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）
【０４２０】
（8Ｒｏｓｅ，１９９４，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，３０）
【０４２１】
方法
１ｍＬのヒドロキシルアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ  Ｋ溶液および１ｍＬの酸化グリコ−Ｅ
ＰＯ溶液を合わせ、反応混合物を撹拌しながら室温で１６時間反応させた。反応混合物を
、ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）に
アプライし、１ｍＬの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、
画分のタンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプール
し、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。接合化の結果を図２４に
示す。レーン２の認められた分子シフトにより、接合体化が成功したことが証明された。
スメアは、ＨＥＳの異種性に起因する。図２５は、ＨＥＳが炭水化物側鎖の炭水化物部分
に接合したことを証明する。
【０４２２】
実施例１３．ガラクトースオキシダーゼ処理ＥＰＯ  Ｎ−グリカンの特徴づけ
組換えＥＰＯまたは部分脱シアリル化ＥＰＯ形態（制限されたマイルド酸加水分解によ
って作製）を、カタラーゼの存在下にて３７℃で３０分間ガラクトースオキシダーゼとイ
ンキュベートし、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中にて３７℃で４時
間インキュベートした。５０μｇアリコートのＥＰＯを取り出し、その後ポリペプチドＮ
−グリカナーゼでのタンパク質の処理によって反応の進行をモニタリングした。
【０４２３】
遊離Ｎ結合オリゴサッカリド（脱Ｎグリコシル化ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出
によってモニタリングする）を、シアル酸の除去の前後に上記のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤマッ
ピングに供した（Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｉｍｔｚ  ｅｔ
ａｌ．，１９９３／１９９４；Ｓｃｈｌｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＨＰＡ
ＥＣ−ＰＡＤで認められた典型的なシフトによって各ＥＰＯオリゴサッカリド中の酸化ガ
ラクトース残基の定量を行い、オリゴサッカリド混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳによ
っても評価した。
【０４２４】
実施例１４．ＨＡＳ修飾ＥＰＯの特徴づけ
未反応ＥＰＯおよびＨＡＳ−前駆体分子からのＨＡＳ修飾ＥＰＯ形態の分離を、例えば
、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ４４／５４または類似のゲル濾過媒体を使用したゲル濾過に
よって行った。あるいは、Ａｆｆｉｇｅｌ（ＢｉｏＲａｄ）に結合させたモノクローナル
抗体を含む４ｍＬカラムでのＥＰＯの免疫親和性単離およびその後のゲル濾過による未修
飾ＥＰＯの分離（例えば、２０ｋＤａと２００ｋＤａとの間の相対分子量の球状タンパク
質を分離することができるマトリックスを使用する）によって、未反応のＨＡＳを除去し
た。
【０４２５】
クーマシーブリリアントブルーでのゲル染色時の未修飾ＥＰＯと比較したその高分子量
の検出によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１２．５または１０％アクリルアミドゲルを使用）
によってＨＡＳ修飾ＥＰＯを同定した。組換えヒトＥＰＯに対して惹起したポリクローナ
ル抗体を使用したサンプルのウェスタンブロット分析によっても、ＨＡＳ修飾ＥＰＯポリ
ペプチドのより高い分子量が同定された。
【０４２６】
その首尾の良いポリペプチドＮ−グリカンを有するＥＰＯタンパク質からの除去により
、ＥＰＯ形態のＮ−グリカン修飾が証明された（３７℃で１６時間２５単位／ｍｇＥＰＯ
タンパク質を使用したＲｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている組換えＮ−グリコ
シダーゼ）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、約２０ｋＤａのＮ−グリコシダーゼ処
理未修飾ＥＰＯの移動位置へＥＰＯタンパク質が典型的にシフトした。
【０４２７】
未反応の脱Ｎグリコシル化ＥＰＯと比較したその移動位置の検出による脱Ｎ−グリコシ
ル化生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度によって、Ｓｅｒ１２６での１脱シアリル化および
ガラクトースオキシダーゼ処理ＥＰＯ  Ｏ−グリカンの修飾が証明された。必要に応じて
、修飾ＥＰＯを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析前にＣ８相でのＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した
。組換えヒトＥＰＯに対して惹起したポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット
におけるＯ−グリカンのβ消失およびＥＰＯの脱Ｏ−グリコシル化形態の検出によっても
ＥＰＯのＨＡＳ  Ｏ−グリカン修飾を分析した。
【０４２８】
実施例１５．ＥＰＯおよび修飾ＥＰＯ形態の定量
ＥＰＯ形態を、欧州薬局方に記載のＵＶ測定（２０００，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉ
ｎｉ  ｓｏｌｕｔｉｏ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ，１３１６，７８０−７８５）によって
定量し、国際ＢＲＰ参照ＥＰＯ標準と比較した。あるいは、ＲＰ−Ｃ４カラムならびに較
正のための２０、４０、８０、および１２０μｇのＢＲＰ標準ＥＰＯ参照調製物を使用し
た２５４ｎｍでの吸光度を使用したＲＰ−ＨＰＬＣによってＥＰＯ濃縮物を測定した。
【０４２９】
実施例１６．ＨＥＳ修飾組換えヒトＥＰＯのインビトロ生物活性
Ｋｒｙｓｔａｌに記載のエリスロポエチン生物活性アッセイを使用して、活性について
精製ＨＥＳ修飾ＥＰＯを試験した（Ｋｒｙｓｔａｌ，１９８４，Ｅｘｐ．Ｈｅａｍａｔｏ
ｌ．，１１，６４９−６６０）。
【０４３０】
塩酸フェニルヒドラジンでの処理によってＮＭＲＩマウスに貧血を誘導し、脾臓細胞を
回収し、記載のように使用した（Ｆｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７
，１２０３  ｆｆ．）。ＥＰＯの希釈物を、３×１０5細胞／ウェルと共に９６ウェルマ
イクロタイタープレート中でインキュベートした。加湿雰囲気下（５％ＣＯ2）における
３７℃で２４時間後、細胞を、１μＣｉの3Ｈ−チミジン／ウェルで４時間標識した。組
み込まれた放射能を、液体シンチレーションカウンティングによって測定した。比較のた
めに国際参照ＥＰＯ標準（ＢＲＰ標準）を使用した。
【０４３１】
あるいは、ＥＰＯ感受性細胞株ＴＦ−１を使用したインビトロアッセイによって、ＥＰ
Ｏ生物活性を測定した（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓ．，
１４０．３２３−３３４）。指数関数的に成長した細胞を無成長因子で洗浄し、ＥＰＯの
連続希釈物の存在下でさらに４８時間インキュベートした。Ｍｏｓｍａｎｎに記載のＭＴ
Ｔ還元アッセイの使用によって細胞増殖を評価した（Ｍｏｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−６３）。
【０４３２】
実施例１７．ＥＰＯおよびＨＡＳ修飾ＥＰＯ形態のインビボ活性の測定
上記用量のＥＰＯまたは修飾ＥＰＯ形態を投与した動物の４日後の網状赤血球の増加の
測定によって、正赤血球症マウスにおけるインビボ活性測定を行った。赤血球増加症マウ
スアッセイにおいてＷＨＯ  ＥＰＯ標準に対して較正したＢＲＰ  ＥＰＯ標準を使用して
アッセイを行った。ＥＰＯサンプルを、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ
）を含むリン酸緩衝化生理食塩水で希釈した。
【０４３３】
０．５ｍｌのＥＰＯ試験溶液を含むダルベッコ緩衝化生理食塩水（１００、８０、４０
、または２０ＩＵ／ｍｌのＢＲＰ標準ＥＰＯに等価なＥＰＯタンパク質に対応する）を、
動物に皮下感染させた。注射から４日後に血液サンプルを採取し、アクリジンオレンジで
網状赤血球を染色し、血液サンプル採取から５時間以内の３０，０００個の総血球の計数
によるフローサイトメトリーによって網状赤血球を定量した（Ｐｈ．Ｅｕｒ，２０００，
Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉ  ｓｏｌｕｔｉｏ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ，１３１６
，ｐａｇｅｓ  ７８０−７８５）および欧州薬局方（１９９６／２０００，ａｔｔａｃｈ
ｍｅｎｔ  ２００２）を参照のこと）。
【０４３４】
実施例１８．インビボ半減期の測定
ウサギに所定量の未修飾またはＨＡＳ修飾ＥＰＯ形態を静脈内注射した。所定の時間で
血液サンプルを採取し、血清を調製した。インビトロバイオアッセイまたは市販のＥＰＯ
特異的ＥＬＩＳＡによって血清エリスロポエチンレベルを測定した。
【０４３５】
実施例１９．インビボ薬物動態学
マウス：各動物に、３００ＩＵ  ＥＰＯ／ｋｇを皮下投与した。処置から７日後、各動
物のヘマトクリットを測定した。修飾ＥＰＯで処置した全動物のうちの９匹でヘマトクリ
ットの実質的な増加が認められ、未処理ＥＰＯの比較的短い半減期に照らして予想される
結果であった。修飾ＥＰＯ処置群のヘマトクリット変化の平均は、未処理ＥＰＯ群および
コントロール群のそれと有意に異なっていた。
【０４３６】
ウサギ：２００または８００ｎｇ／ｋｇ体重までに相当する未修飾またはＨＡＳ修飾Ｅ
ＰＯの単回用量でウサギを処置した。２、６、１６、２４、および４８時間後、血漿濃度
の測定のための市販のＥＰＯ特異的ＥＬＩＳＡの使用によって血液サンプルを分析した。
Ｚｅｔｔｌｍｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，
２１１５３−２１１５９に記載のように、平均血漿ＥＰＯ濃度を測定し、平均初期半減
期（α期）および最終半減期（β期）を、記載のＥＬＩＳＡ値から計算した。
【０４３７】
文献：
Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ，Ｌｕｎｎ，Ｒｉｓｉｎｇｅｒ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９９９，Ａ
ｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｒｉｓｅ
ｄ  ｏｆ  Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  Ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｅｘｈｉｂｉｔ
ｉｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｉｔｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２７４，２４７７３−２４７７８。
【０４３８】
実施例２０．ＨＥＳ修飾組換えヒトＩＬ−２のインビトロ活性の評価
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ５４でのゲル濾過によって修飾ＩＬ２を回収した。対応する
画分のアリコートを滅菌濾過し、ＩＬ２依存性マウスＣＴＬＬ−２細胞株の使用によって
ＩＬ２生物活性を測定した（Ｇｉｌｌｉｓ，Ｆｅｒｍ，Ｏｎ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９
７８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２０，２０２７−２０３２）。活性を、国際参照ＩＬ２
標準調製物と比較した。
【０４３９】
【表３Ａ】
2010248528.tif 000097
【表３Ｂ】
2010248528.tif 000098
【表３Ｃ】
2010248528.tif 000099
【表３Ｄ】
2010248528.tif 000100
【表３Ｅ】
2010248528.tif 000101
【表３Ｆ】
2010248528.tif 000102
【０４４０】
【表４】
2010248528.tif 000103
【０４４１】
【表５】
2010248528.tif 000104
【０４４２】
なお、原出願の出願当初の特許請求の範囲は以下の通りである。
〔請求項１〕
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法であって、該ヒドロキシアルキルデンプ
ンが、下記式（Ｉ）
【化１Ｐ】
2010248528.tif 000105
の構造を有し、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化
合物（Ｌ）と反応するステップ、または
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端における化
合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合
物（Ｌ）と反応するステップを含んでなり、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの
官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応
可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能
な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、およびチ
オ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法。
〔請求項２〕
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル
基である請求項１に記載の方法。
〔請求項３〕
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である請求項２
に記載の方法。
〔請求項４〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項１〜３の
いずれかに記載の方法。
〔請求項５〕
前記官能基Ｚ1が、構造−ＮＨ−を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
〔請求項６〕
前記Ｚ1が、
【化２Ｐ】
2010248528.tif 000106
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
〔請求項７〕
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基から
なる群から選択され、前記官能基Ｘが、構造−ＮＨ−を含む請求項１〜６のいずれかに記
載の方法。
〔請求項８〕
前記Ｘが、
【化３Ｐ】
2010248528.tif 000107
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される請求項７に記載の方法。
〔請求項９〕
前記官能基Ｙが、−ＳＨであり、前記官能基Ｘが、
【化４Ｐ】
2010248528.tif 000108
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
〔請求項１０〕
前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基
Ｗが、
【化５Ｐ】
2010248528.tif 000109
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
〔請求項１１〕
前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性
化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2
または前記官能基Ｗが、
【化６Ｐ】
2010248528.tif 000110
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
〔請求項１２〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との
反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）：
【化７Ｐ】
2010248528.tif 000111
の構造を有する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
〔請求項１３〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との
反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（ＩＩａ）：
【化８Ｐ】
2010248528.tif 000112
および／または式（ＩＩｂ）：
【化９Ｐ】
2010248528.tif 000113
の構造を有する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
〔請求項１４〕
前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項１３に記載の方法
。
〔請求項１５〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの
必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
得られた反応生成物を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含ま
れる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、
請求項１〜９および１２〜１４のいずれかに記載の方法。
〔請求項１６〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの
必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
化合物（Ｌ）を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物（Ｌ）中に含
まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物
（Ｍ）と反応させる、
請求項１〜９および１２〜１４のいずれかに記載の方法。
〔請求項１７〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と前記ヒド
ロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ
）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ
2と、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（Ｌ）と反応させて第
２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる、
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
〔請求項１８〕
前記第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘ
と、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応さ
せる、請求項１７に記載の方法。
〔請求項１９〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と、前記ヒ
ドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（
Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗ
と、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物
（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさ
らなる化合物（Ｍ）と反応させる、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
〔請求項２０〕
前記少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）が、ポリペプチドである請求項１〜１９の
いずれかに記載の方法。
〔請求項２１〕
前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項２０に記載の方法。
〔請求項２２〕
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができるヒドロキシア
ルキルデンプン誘導体であって、ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）
【化１０Ｐ】
2010248528.tif 000114
の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物（
Ｌ）を反応させるステップ、または
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端で化合物（
Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合物（Ｌ
）を反応させるステップを含み、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの
官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応
可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能
な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項２３〕
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル
基である請求項２２に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項２４〕
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である請求項２
３に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項２５〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項２２〜２
４のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項２６〕
前記官能基Ｚ1が、構造−ＮＨ−を含む請求項２２〜２５のいずれかに記載のヒドロキ
シアルキルデンプン誘導体。
〔請求項２７〕
前記Ｚ1が、
【化１１Ｐ】
2010248528.tif 000115
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される請求項２６に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項２８〕
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基から
なる群から選択され、前記官能基Ｘが、構造−ＮＨ−を含む請求項２２〜２７のいずれか
に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項２９〕
前記Ｘが、
【化１２ＡＰ】
2010248528.tif 000116
【化１２ＢＰ】
2010248528.tif 000117
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される請求項２８に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項３０〕
前記官能基Ｙが、−ＳＨであり、前記官能基Ｘが、
【化１３Ｐ】
2010248528.tif 000118
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される請求項２２〜２７のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデン
プン誘導体。
〔請求項３１〕
前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基
Ｗが、
【化１４Ｐ】
2010248528.tif 000119
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される請求項２２〜３０のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデン
プン誘導体。
〔請求項３２〕
前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性
化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2
または前記官能基Ｗが、
【化１５ＡＰ】
2010248528.tif 000120
【化１５ＢＰ】
2010248528.tif 000121
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される、請求項２２〜３０のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体。
〔請求項３３〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との
反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）：
【化１６Ｐ】
2010248528.tif 000122
の構造を有する請求項２２〜３２のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体
。
〔請求項３４〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との
反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（ＩＩａ）：
【化１７Ｐ】
2010248528.tif 000123
および／または式（ＩＩｂ）：
【化１８Ｐ】
2010248528.tif 000124
の構造を有する請求項２２〜３２のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体
。
〔請求項３５〕
前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項３４に記載のヒド
ロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項３６〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの
必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
得られた反応生成物を化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれ
る官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、
請求項２２〜３０および請求項３３〜３５のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプ
ン誘導体。
〔請求項３７〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの
必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
化合物（Ｌ）を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物（Ｌ）中に含
まれる官能基Ｘと、さらなる化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらな
る化合物（Ｍ）と反応させる、
請求項２２〜３０および３３〜３５のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導
体。
〔請求項３８〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と前記ヒド
ロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ
）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ
2と化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（Ｌ）と反応させて第２
のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる、
請求項２２〜３５のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項３９〕
前記第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘ
と化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させ
る、請求項３８に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項４０〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と前記ヒド
ロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ
）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗ
および化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物
（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさら
なる化合物（Ｍ）と反応させる、
請求項２２〜３５のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項４１〕
前記少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）が、ポリペプチドである請求項２２〜４０
のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項４２〕
前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項４１に記載のヒドロキシアルキル
デンプン誘導体。
〔請求項４３〕
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができるヒドロキシア
ルキルデンプン誘導体を治療有効量含む薬学的組成物であって、該ヒドロキシアルキルデ
ンプンが、式（Ｉ）
【化１９Ｐ】
2010248528.tif 000125
の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物（
Ｌ）を反応させるステップ、または
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物（
Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と、化合物（
Ｌ）を反応させるステップを含んでなり、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの
官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応
可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能
な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択され、
前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法が、ヒドロキシアルキルデンプンと
、化合物（Ｌ）と、必要に応じて化合物（Ｄ）を含む反応生成物をさらなる化合物（Ｍ）
と反応させるステップをさらに含んでなり、少なくとも１つの前記さらなる化合物がポリ
ペプチドである、薬学的組成物。
〔請求項４４〕
前記ポリペプチドが、ＡＴ  ＩＩＩである請求項４３に記載の薬学的組成物。
〔請求項４５〕
前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項４３に記載の薬学的組成物。
〔請求項４６〕
前記官能基Ｙが、−ＳＨであり、前記化合物（Ｌ）が、一般式Ｚ1−Ｌ’−Ｘの化合物
であり、前記官能基Ｚ1が、
【化２０Ｐ】
2010248528.tif 000126
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
【化２１Ｐ】
2010248528.tif 000127
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択され、Ｌ’はＺ1およびＸと架橋する有機鎖であるか、またはＬ’は
存在しない、請求項４３〜４５のいずれかに記載の薬学的組成物。
〔請求項４７〕
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基から
なる群から選択され、前記化合物（Ｌ）が、一般式Ｚ1−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記
官能基Ｚ1が、
【化２２ＡＰ】
2010248528.tif 000128
【化２２ＢＰ】
2010248528.tif 000129
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル
、アルカリール、またはシクロアルキルアリールである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
【化２３Ｐ】
2010248528.tif 000130
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、Ｌ’はＺ1およびＸと架橋する有機鎖であるか、またはＬ’は
存在しない、請求項４３〜４５のいずれかに記載の薬学的組成物。
〔請求項４８〕
前記官能基Ｙが、−ＳＨであり、前記化合物（Ｄ）が、一般式Ｚ1−Ｄ’−Ｗの化合物
であり、前記化合物（Ｌ）が、一般式Ｚ2−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
【化２４ＡＰ】
2010248528.tif 000131
【化２４ＢＰ】
2010248528.tif 000132
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒはメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
【化２５Ｐ】
2010248528.tif 000133
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官
能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化２６Ｐ】
2010248528.tif 000134
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択されるか、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエス
テルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群か
ら選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化２７Ｐ】
2010248528.tif 000135
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記Ｄ’が、Ｚ1およびＷと架橋する有機鎖であるか、または
前記Ｄ’は存在せず、前記Ｌ’が、Ｚ2およびＸと架橋する有機鎖であるか、または前記
Ｌ’が存在しない、請求項４３〜４５のいずれかに記載の薬学的組成物。
〔請求項４９〕
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基から
なる群から選択され、前記化合物（Ｄ）が、一般式Ｚ1−Ｄ’−Ｗの化合物であり、前記
化合物（Ｌ）が、一般式Ｚ2−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
【化２８Ｐ】
2010248528.tif 000136
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
【化２９Ｐ】
2010248528.tif 000137
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官
能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化３０Ｐ】
2010248528.tif 000138
（上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択されるか、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエス
テルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群か
ら選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
【化３１Ｐ】
2010248528.tif 000139
（上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであ
り、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記Ｄ’が、Ｚ1およびＷと架橋する有機鎖であるか、または
前記Ｄ’は存在せず、前記Ｌ’が、Ｚ2およびＸと架橋する有機鎖であるか、または前記
Ｌ’は存在しない、請求項４３〜４５のいずれかに記載の薬学的組成物。
〔請求項５０〕
前記ヒドロキシエチルデンプンを、水性媒体中で下記式：
【化３２Ｐ】
2010248528.tif 000140
の化合物と反応させ、反応生成物をエリスロポエチンと反応させる請求項４３に記載の薬
学的組成物。
〔請求項５１〕
前記エリスロポエチンを前記反応前に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する請求項５０に記
載の薬学的組成物。
〔請求項５２〕
前記エリスロポエチンを部分的に脱シアリル化し、その後前記反応前に過ヨウ素酸ナト
リウムで酸化する請求項５０に記載の薬学的組成物。
【図１】
2010248528.tif 000180
【図２】
2010248528.tif 000181
【図３】
2010248528.tif 000182
【図４】
2010248528.tif 000183
【図５】
2010248528.tif 000184
【図６】
2010248528.tif 000185
【図７】
2010248528.tif 000186
【図８】
2010248528.tif 000187
【図９】
2010248528.tif 000188
【図１０】
2010248528.tif 000189
【図１１】
2010248528.tif 000190
【図１２】
2010248528.tif 000191
【図１３】
2010248528.tif 000192
【図１５】
2010248528.tif 000193
【図１６】
2010248528.tif 000194
【図１７】
2010248528.tif 000195
【図１８】
2010248528.tif 000196
【図１９】
2010248528.tif 000197
【図２０】
2010248528.tif 000198
【図２１】
2010248528.tif 000199
【図２２】
2010248528.tif 000200
【図２３】
2010248528.tif 000201
【図２４】
2010248528.tif 000202
【図２５】
2010248528.tif 000203
【図１４ａ】
2010248528.tif 000204
【図１４ｂ】
2010248528.tif 000205