(57)【要約】【課題】本発明の課題は、皮膚炎症、特に紫外線の照射によりもたらされる炎症を予防又は治療するための新規な抗炎症剤を提供することにある。【解決手段】皮膚の炎症を予防又は治療するための、アペリンを含有する抗炎症剤、及び皮膚の炎症を予防又は治療するための、アペリンをコードする遺伝子を含んで成るベクターを含有する抗炎症剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の炎症を予防又は治療するための、アペリンを含有する抗炎症剤。
【請求項２】
皮膚の炎症を予防又は治療するための、アペリンをコードする遺伝子を含んで成るベクターを含有する抗炎症剤。
【請求項３】
皮膚の炎症が、紫外線の照射によりもたらされる炎症であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚炎症を予防又は治療するための、アペリンを含有することを特徴とする抗炎症剤、又はアペリンをコードする遺伝子を含んで成るベクターを含有することを特徴とする抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚に対する物理的あるいは化学的刺激は、血管新生や VEGF-A などによる血管透過性を誘導して、この結果、組織液の貯留と浮腫が生じる。特に、恒常的な紫外線の照射により、皮膚では、しわ形成、コラーゲンなどの真皮マトリックス高分子の分解、線維症などの皮膚ダメージが引き起こされることが知られている（非特許文献１）。また、単回の紫外線B（以下UVB）（波長290nm〜320nm）の暴露によって、皮膚には紅班、表皮肥厚、血管透過性の亢進、浮腫などの皮膚炎症が起こることも知られている（非特許文献２）。
【０００３】
アペリンは、1998年に、長らくオーファン受容体であった7回膜貫通型のGタンパク質共役型受容体であるAPJに対する結合因子として牛の胃の細胞抽出液から単離された分子である。アペリンの cDNA は77アミノ酸をコードするが、この前駆体からロング・フォーム(42〜77アミノ酸)とショート・フォーム(65〜77アミノ酸)が形成される。どちらのアペリンもAPJの活性化を誘導することが知られている。これまで、心血管系や中枢神経系で、APJの発現が報告されてきており、心臓では心筋収縮作用、神経系ではバソプレシンの発現を制御するなど、体液の調節機構に関与することが示唆されてきている。また、APJはエイズウイルスの受容体として感染にも関与することから、種々の観点からの創薬のターゲットとしてにわかに注目を浴びつつある受容体である。APJの発現は、血管系においては、血管内皮細胞や壁細胞に発現するとされてきており、アフリカツメガエルを用いた遺伝子ノックダウンの実験にて、アペリン/APJシステムが血管発生に必須の役割を果たすことが示され、またマウスやヒトにおいても本受容体の発現が内皮細胞に認められることから、哺乳類においても血管形成に関与することが予想されてきた（非特許文献３）。また、近年、アペリンのノックアウトマウスの解析や、試験管内での血管系解析を通して、血管内皮細胞がAng1で刺激を受けた際に分泌するアペリンが血管径を制御することが報告されている（非特許文献４）。
【０００４】
しかしながら、これまでに、アペリンが皮膚に対して防御的な作用を有することについては何ら明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kligman AM. The treatment of photoaged human skin by topical tretinoin. Drugs 1989; 38: 1-8.
【非特許文献２】Cox NH, Diffey BL, Farr PM. The relationship between chronological age and the erythemal response to ultraviolet B radiation. Br J Dermatol 1992; 126: 315-9.
【非特許文献３】実験医学  Vol. 26, No.9(2008), pp. 1380-1383
【非特許文献４】Kidoya et al, (2008) Spatial and temporal role of the apelin/APJ system in the caliber size regulation of blood vessels during angiogenesis. EMBO J 27: 522-534
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このたび、本発明者は、アペリンと皮膚状態との関係を調べるために、アペリンを表皮で高発現させる遺伝子を導入したマウス及び野生型マウスにおいて、紫外線の照射後のマウス皮膚状態を比較したところ、野生型マウスにおいては、紫外線の照射後に真皮の浮腫と表皮の肥厚化、及び皮膚炎症性細胞であるマクロファージの増加が観察されたが、アペリン表皮高発現マウスにおいては、これらに有意な変化は観察されなかった。これらの結果は、アペリンが皮膚の炎症を予防又は治療するために極めて有用であるという驚くべき効果を示すものである。
【０００７】
したがって、本発明の課題は、皮膚炎症、好適には紫外線の照射によりもたらされる皮膚炎症を予防又は治療するための新規な抗炎症剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願は以下の発明を包含する：
１．  皮膚の炎症を予防又は治療するための、アペリンを含有する抗炎症剤。
２．  皮膚の炎症を予防又は治療するための、アペリンをコードする遺伝子を含んで成るベクターを含有する抗炎症剤。
３．  皮膚の炎症が、紫外線の照射によりもたらされる炎症であることを特徴とする、前記の抗炎症剤。
４．  １〜３のいずれかの抗炎症剤を適用することからなる、炎症を改善又は予防するための美容学的方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、皮膚炎症、特には紫外線の照射によりもたらされる炎症を予防又は治療することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】アペリン表皮高発現マウス及び野生型マウスにおける、紫外線の照射による皮膚厚の変化を示す写真である。
【図２】図１における皮膚厚を定量的に示すグラフである。
【図３】アペリン表皮高発現マウス及び野生型マウスにおける、紫外線の照射前後のマクロファージ染色を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ヒトアペリンは、心臓、肺、腎臓、脂肪、胃、脳、副腎、内皮など様々な部位での発現が報告されており、77アミノ酸の前駆タンパク質に由来する36アミノ酸から成るアペリンAPJ受容体のリガンドとして知られる（Kawamata Y et al, (2001) Molecular properties of apelin: tissue distribution and receptor binding. BIOCHMICA ET BIOPHYSICA ACTA. 2-3:162-171）。また、アペリンには、そのアミノ酸がＮ末端及び／又はＣ末端が欠落した変異体、例えばアペリン-13（アペリンの第24〜36番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド）なども知られ、よって本明細書において「アペリン」という場合、36アミノ酸から成る全長ヒトアペリンに限らず、アペリンの活性を有する限り、その１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアペリン変異体、並びにこれらのフラグメントも包含する。また、アペリンには、ヒト由来のみならず、ヒト以外の霊長類や、ラット、マウス、ウサギなどといったげっし動物由来のものも含まれる。さらに、本明細書でいうアペリンをコードする遺伝子とは、アペリンをコードする遺伝子の他に、その１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたものであってアペリン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、さらにはアペリンをコードする遺伝子に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするものであってアペリン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。ここで「アペリン活性」とは、アペリンがその受容体であるAPJに結合することによって、細胞内シグナル伝達分子であるAktをリン酸化することや、細胞内のcAMP濃度を減少させることとして定義される。なお、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばナトリウム濃度が約10〜40ｍＭ、好ましくは約20ｍＭ、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃であることを含む条件をいう。
【００１２】
APJ受容体は、AGTRL1（アンジオテンシン受容体様１）とも称され、GPCRの１つであり、380のアミノ酸から成る。この膜貫通領域は、アンジオテンシン（AT1）受容体と40〜50％の相同性を示す。アペリン/APJシグナルは、血管ではANG1/Tie2の下流シグナルであり、心筋の収縮や、血圧及び血流、並びに血管形成に関与することが報告されている（Kidoya et al, (2008) Spatial and temporal role of the apelin/APJ system in the caliber size regulation of blood vessels during angiogenesis. EMBO J 27: 522-534等）。
【００１３】
しかしながら、アペリンによる皮膚への防御的な作用については、これまでに何ら明らかになっていない。
【００１４】
したがって、本発明の１実施態様において、皮膚の炎症を予防又は治療するための、アペリンを含有する抗炎症剤が供される。本発明の抗炎症剤は、特には紫外線の照射によりもたらされる皮膚の炎症に有効であり、その他、アトピー性皮膚炎、赤ら顔、酒さ、乾癬等の皮膚炎にも有効であると考えられる。
【００１５】
本発明の抗炎症剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の抗炎症剤の投与形態は、経口、非経口、外用等であってよい。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤を挙げることができる。
【００１６】
本発明の抗炎症剤中のアペリンの配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には抗炎症剤全量中、0.00001〜20.0質量％、好適には0.00001〜10.0質量％である。
【００１７】
また、本発明の抗炎症剤中には、活性成分としてのアペリン以外に、例えば、医薬的に許容される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００１８】
さらに、本発明の抗炎症剤を皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類なども適宜配合することができる。
【００１９】
また、被験体におけるアペリンをコードする遺伝子（アペリン遺伝子）が不活性状態又は沈黙状態にあり、その結果細胞がアペリン欠損状態にあるときは、アペリン遺伝子自体を細胞内に導入するために、アペリン遺伝子を組み込んだベクターを使用することができる。該ベクターにおいては、アペリン遺伝子の発現を亢進させる調節配列、例えばプロモーターやエンハンサーを、アペリン遺伝子に対し作動可能な位置に配置することが好ましい。
【００２０】
アペリン遺伝子を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、実験医学増刊、12(15)(1994)、実験医学別冊「遺伝子治療 の基礎技術」、羊土社（1996））のいずれの方法も適用することができる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス、又はＲＮＡウイルスに、アペリンをコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。また、上記遺伝子を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入する in vivo 法、およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法がある（日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、月刊薬事、36(1), 23-48（1994）、実験医学増刊、12(15)(1994)）。in vivo 法がより好ましい。in vivo 法により投与される場合は、疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo 法により投与する場合は、一般的には注射剤等とされ、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HVJ）−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【００２１】
したがって、本発明の更なる実施態様においては、皮膚の炎症を予防又は治療するための、アペリンをコードする遺伝子を含んで成るベクターを含有する抗炎症剤、が提供される。この場合、アペリンをコードする遺伝子は、アペリン遺伝子の発現を亢進させる調節配列と作動可能的に連結されていることが好ましい。
【００２２】
本発明の抗炎症剤中のアペリンをコードする遺伝子を含んで成るベクターの配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には抗炎症剤全量中、0.00001〜20.0質量％、好適には0.00001〜10.0質量％である。
【００２３】
本発明はさらに、皮膚の抗炎症剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、皮膚細胞における内因性アペリンの発現を亢進する薬剤を皮膚抗炎症剤として選定することを特徴とする。内因性アペリンの発現の亢進は、例えば皮膚細胞中のアペリンの量を直接測定することにより決定することができる。なお、皮膚細胞、特に表皮細胞には、角化細胞、顆粒細胞、有棘細胞等が含まれ、ヒト由来であっても、その他の動物、例えばラット、マウス、ウサギなどであってもよい。好ましくは、この測定はアペリンに特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウエスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。また、皮膚細胞からRNAを抽出し、アペリンをコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により行われる。以上の他、アペリンの既知の生物活性を測定することによりアペリンの発現量を測定することもできる。他に、アペリンの発現はin situハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて決定することができる。
例えば皮膚細胞中の内因性アペリンの発現がコントロール値と比べ30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70％以上、最も好ましくは100％以上亢進したら、「皮膚の抗炎症剤」と判断する、としてよい。コントロール値としては、限定されるものではないが、例えば統計学的に有意な数（例えば10人分以上、好ましくは100人分以上）の健常人の対応の部位における皮膚細胞の内因性アペリンの発現量の平均値であってよい。
【００２４】
好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記亢進能力を有する候補薬剤をモデル動物、例えばアペリン欠損動物や、紫外線の照射などにより皮膚に炎症が生じた動物に適用し、皮膚における抗炎症効果を確認することを含んで成る。
【００２５】
以下の実施例により、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
例１．表皮アペリン高発現マウスの皮膚ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色
アペリンをK14プロモーターの制御化で表皮に高発現させたC57/BL6マウス(12週齢)（以下、アペリンTG）に波長280〜340nmの紫外線を計200mJ/cm2照射した。このアペリンTGマウスの耳介部皮膚を採取し、Tissue-Tech OCTコンパウンド(Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan)に包埋した。その後、包埋ブロックからクリオスタットにより6μmに薄切した凍結切片を作製した。作製した組織標本に10%ホルマリン固定を施し、ＨＥ染色を行った。コントロールとしては、同様に紫外線を照射した同週齢のC57/BL6マウス（以下、WT）、紫外線を照射しないWT、アペリンTGマウスの耳介部皮膚から作製した組織切片を用いた。その後、染色した標本を光学顕微鏡を用いて観察し、IP-Labソフトウエアを用いて皮膚の厚さの定量化を行った。
その結果、WTマウスでは、UVB照射により皮膚厚が顕著に増加したが、アペリンTGマウスではUVB照射後でも皮膚厚は変化しなかった（図１及び図２）。このことから、アペリンが真皮浮腫抑制効果を有することが明らかとなった。
【００２７】
例２．表皮アペリン高発現マウスの皮膚炎症性細胞（マクロファージ）の免疫染色
上記と同様に紫外線を照射したアペリンTGマウスの耳介部皮膚を薄切し、凍結切片を作製した。作製した組織標本にアセトン固定を施し、ラット抗CD11b抗体（BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA）を一次抗体に用いて染色を行った。二次抗体にはAlexa Fluor488ウサギ抗ラット抗体（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いた。コントロールとしては、同様に紫外線を照射したWT、紫外線を照射しないWT、アペリンTGマウスの耳介部皮膚から作製した組織切片を用いた。染色後、蛍光顕微鏡を用いて炎症性細胞を検出した。
その結果、WTマウスでは、UVB照射によりマクロファージの増加が観察されたが、TGマウスではUVB照射によるマクロファージの増加がみられなかった（図３）。このことからアペリンが皮膚炎症抑制効果を有することが明らかとなった。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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