(57)【要約】【課題】タンパク質の付加アイソフォームを単離する方法およびこれらをその所望されるタンパク質に変換する方法を提供すること。【解決手段】好ましい実施形態において、本発明は、インターフェロンα組成物の収量を増加するための方法であって、付加アイソフォームをインターフェロンαに変換する工程を含む方法を提供する。本発明は特定のインターフェロンαに限定されないが、好ましい実施形態において、インターフェロンαはインターフェロンα２ｂである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示を通して、種々の刊行物、特許および特許出願が参照される。これらの刊行物、特許および特許出願の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質の単離および精製に関する。特に、本発明は、タンパク質の単離、タンパク質のアイソフォームの単離および所望されるタンパク質のアイソフォームの変換に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
天然に存在するタンパク質は、研究および臨床的目的に広く用いられる。このようなタンパク質はその天然の供給源から得られ得るが、組換え技術は、天然には存在しない供給源からのこれらのタンパク質の産生を可能にし得る。例えば、組換え技術（例えば、形質転換された細菌）を介して構築された微生物の発酵は、天然の供給源を利用して可能なよりも実質的に低いコストで大量のヒトインターフェロンを産生する。このような組換えＤＮＡ技術はまた、他の重要なタンパク質（例えば、インシュリンおよび組織プラスミノゲンアクチベーター）を産生するために利用された。
【０００４】
しかし、組換え技術によって改変された細菌はまた、夾雑物および産生されることが企図されたタンパク質の構造的アイソフォームを産生する。これらの夾雑物およびアイソフォームは、オリゴマーのタンパク質および還元型タンパク質アイソフォーム（Ｄ’Ａｎｄｒｅａらに対する特許文献１を参照のこと）、細胞片およびウイルス（Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓらに対する特許文献２を参照のこと）およびピルベート連結アイソフォーム（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４を参照のこと）を含む。タンパク質の精製の間に、これらの夾雑物を取り除くことが所望される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，７６５，９０３号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７３２，６８３号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｏｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２８７：１９１０１
【非特許文献２】Ｐｒｏｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：１３０５０
【非特許文献３】Ｓｒｅｖｅｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５２：２９９８
【非特許文献４】Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：３１２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
明らかに、これらのタンパク質アイソフォームは、この所望されるタンパク質の純度を下げ、そしてこのアイソフォームの除去のためのプロセスが、全体の収量を低減させる。しかし、タンパク質アイソフォームが所望されるタンパク質に変換され得る場合、これらの除去は不必要であり、そして全体のタンパク質収量は顕著に増加される。必要とされるのは、所望されないタンパク質アイソフォームを同定しかつそれらをその所望されるタンパク質に変換する方法である。本発明は、このような必要性に向けられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、付加アイソフォーム（ａｄｊｕｎｃｔ  ｉｓｏｆｏｒｍ）を単離することおよびそれらを所望の機能的タンパク質に変換することによって、高い収量で高度に精製されたタンパク質を調製するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、インターフェロンα組成物の収量を増加するための方法を提供し、これは付加アイソフォームをインターフェロンαに変換することを含む。本発明は特定のインターフェロンαに限定されないが、好ましい実施形態において、インターフェロンαはインターフェロンα２ｂである。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、組換え的に産生された付加アイソフォームを、その所望されるタンパク質に変換するための方法（付加アイソフォームから切断可能な基を化学的に除去することを含む）を提供する。
【００１０】
本発明は、除去される切断可能な基によって限定されない。１つの実施形態において、切断可能な基はピルベートを含む。
【００１１】
本発明はまた、切断可能な基を化学的に除去する方法によって限定されない。１つの実施形態において、本発明は、付加アイソフォームを、酸性溶液に曝露することを含む。付加アイソフォームがインターフェロンαのピルベート付加アイソフォームである場合、酸性溶液は約ｐＨ５．５であることが好ましい。このような実施形態において、この酸性溶液が３４〜４０℃であることはさらに好ましい。しかし、別の実施形態において、付加アイソフォームは、亜鉛溶液に曝露される。好ましい実施形態において、亜鉛溶液は、ｐＨ７．８〜ｐＨ８．６である。さらに好ましい実施形態において、この亜鉛溶液は３０〜３８℃である。
【００１２】
本発明はまた、利用される酸性溶液または亜鉛溶液の型によって限定されない。好ましい実施形態において、酸性溶液または亜鉛溶液は、抗酸化剤を含む。特定の好ましい実施形態において、抗酸化剤はメチオニンを含む。このような実施形態において、メチオニンの好ましい濃度は５〜４０ｍＭである。
【００１３】
本発明は、さらに以下の項目を提供する：
（項目１）インターフェロンα組成物の収量を増加するための方法であって、付加アイソフォームをインターフェロンαに変換する工程を含む、方法。
（項目２）前記付加アイソフォームが、ピルベート付加アイソフォームである、項目１に記載の方法。
（項目３）前記インターフェロンαがインターフェロンα２ｂである、項目２に記載の方法。
（項目４）前記付加アイソフォームが酸性溶液に曝露される、項目３に記載の方法。
（項目５）前記酸性溶液が約ｐＨ５．５である、項目４に記載の方法。
（項目６）前記酸性溶液が３４〜４０℃である、項目５に記載の方法。
（項目７）前記酸性溶液が抗酸化剤を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）前記抗酸化剤がメチオニンを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）前記メチオニンが５〜４０ｍＭの濃度である、項目８に記載の方法。
（項目１０）前記付加アイソフォームが亜鉛溶液に曝露される、項目３に記載の方法。
（項目１１）前記亜鉛溶液がｐＨ７．８〜ｐＨ８．６である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）前記亜鉛溶液が３０〜３８℃である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）前記亜鉛溶液が抗酸化剤を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）前記抗酸化剤がメチオニンを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）前記メチオニンが５〜４０ｍＭの濃度である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）クロマトグラフィーを用いる前記インターフェロンα２ｂの精製をさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１７）前記クロマトグラフィーがアガロースに基づく色素親和性クロマトグラフィー、次いでアガロースに基づくアニオン交換クロマトグラフィー、次いで結晶化工程を含む、項目１６に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によって、付加アイソフォームを単離することおよびそれらを所望の機能的タンパク質に変換することにより、高い収量で高度に精製されたタンパク質を調製できる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（定義）
本明細書中で用いられる場合、用語「所望されるタンパク質」は、精製されることが企図される目的のタンパク質を意味する。もちろん、所望されるタンパク質の同定は、精製手順の究極の目標を示す。例えば、精製手順の間、精製プロセスの中間の工程において、夾雑物を含むタンパク質群を得ることが、所望され得る。中間のタンパク質群を得る際の目的にかかわらず、精製手順の究極の目標であるタンパク質群が、所望されるタンパク質として見なされる。
【００１６】
本明細書中に用いられる場合、用語「付加アイソフォーム」は、所望されるタンパク質に類似する構造的および／または機能的な特徴を有するタンパク質アイソフォームを意味し、ここで切断可能な基はこのタンパク質から除去されて、所望されるタンパク質を産生し得る。「切断可能な基」は、所望されるタンパク質に付加される化学的に除去され得る化学基を意味すると理解される。本明細書中に用いられる場合、「化学的除去」または「化学的に除去された」は、化学基が、酸性溶液、塩基性溶液、金属イオン触媒などを含むが、これらに限定されない化学的手段によってタンパク質から分離されたことを示すと理解される。
【００１７】
本発明を実行するために必要ではないが、切断可能な基が化学的に同定され得る場合、付加アイソフォームは、付加アイソフォームの特定の型として言及され得る。例えば、「ピルベート付加アイソフォーム」は、ピルベートとして同定可能な付加された切断可能な基を有する所望されるタンパク質である。
【００１８】
本明細書中に用いられる場合、用語「酸化反応」は、２つのシステインアミノ酸のメルカプト基にジスフィルド結合を形成させることが企図される反応を意味する。
【００１９】
本明細書中に用いられる場合、用語「インターフェロンα」は、標的細胞にウイルス耐性を与え、細胞増殖を阻害し、そしてＭＨＣクラスＩ抗原の発現を調節する、誘導可能な分泌タンパク質のファミリーをいう。このファミリーは、インターフェロンα２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ、Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）、インターフェロンα２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、インターフェロンα２ｃ（Ｂｅｒｏｆｏｒ  Ａｌｐｈａ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または天然に存在するインターフェロンα（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ、Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）のコンセンサス配列の決定によって定義されるようなコンセンサスのインターフェロンを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、タンパク質の単離および精製に関する。１つの実施形態において、本発明は、付加アイソフォームの同定および精製を提供する。別の実施形態において、本発明は、付加アイソフォームから所望されるタンパク質を産生するための方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、付加アイソフォームと所望されるタンパク質との共精製によって、およびそれに引き続く付加アイソフォームの所望されるタンパク質への変換によって、高度に精製された所望されるタンパク質を提供する。この様式において、付加アイソフォームの量は低減され、そして所望のタンパク質の全体的収量は増加し、および／または以前に達成されたよりも高度に精製される。この所望されるタンパク質の収量は、付加アイソフォームの変換なしに得られる収量の１０倍程増加され得る。
【００２１】
本発明は、所望されるタンパク質または付加アイソフォームの供給源によって限定されないが、１つの実施形態において、供給源は、組換え技術を介して構築された微生物である。当業者に公知のこのような技術が、多く存在する。このような形質転換された微生物は、原核生物細胞または真核生物細胞、細菌、哺乳動物細胞などであり得る。例えば、インターフェロンαは、細菌において、以下の教示に従って産生され得る：Ｗｅｉｓｓｍａｎに対する米国特許第４，５３０，９０１号または欧州特許出願公開番号ＥＰ０３２，１３４に記載される技術。
【００２２】
同様に、本発明は、付加アイソフォームを産生細胞から抽出する任意の特定の方法に限定されない。所望されるタンパク質がインターフェロンαである場合、例えば、Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚらに対する米国特許第４，３１５，８５２号および同第４，３６４，８６３号に記載された方法が適切である。
【００２３】
同様に、本発明は、付加アイソフォームまたは所望のタンパク質を単離するために使用される特定の精製技術によって限定されない。多くのクロマトグラフィーおよび他の分離技術が当業者に公知であり、そして本発明は適用可能である。
【００２４】
本発明は付加アイソフォームを同定する方法によって限定されないが、付加アイソフォームの同定は、所望されるタンパク質および所望されるタンパク質より大きな分子量を有する任意の夾雑物の分子量の研究によって達成され得る。１つのこのような方法は、Ｒｏｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９１０１（１９９２）に記載される。所望されるタンパク質より大きな分子量を有する夾雑物は、分解条件（例えば、強酸性または強塩基性ｐＨ）に曝露され得、そして分解産物について分析され得る。これらの分解産物の１つが所望されるタンパク質と同一の質量および／または構造的特徴を有する場合、夾雑物は、切断可能な基を有する付加アイソフォームとみなされ得る。
【００２５】
本発明は付加アイソフォームを所望されるタンパク質に変換するための特定の方法によって限定されないが、１つの実施形態において、スクリーニングプロセスは、適切な変換条件を決定し得る。例えば、１つのプロセスは、切断可能な基が付加アイソフォームから除去されるが機能的な所望されるタンパク質または非不可逆的に変性した所望されるタンパク質が生じる点への反応溶液のｐＨの段階的な調整を必要とする。
【００２６】
さらに、本発明は、切断可能な基を化学的に除去する方法によって限定されない。１つの実施形態において、付加アイソフォームを酸性条件（例えば、酢酸を用いて）に曝露することによって、基は除去または切断される。代替の実施形態において、付加アイソフォームは、亜鉛に曝露される。
【００２７】
本発明はまた、切断反応が行われる温度によって限定されない。しかし、一般に、より高い温度は、より速く付加アイソフォームを所望されるタンパク質に変換する。
【００２８】
切断可能な化学的な除去は、所望されるタンパク質と同一の構造的特徴を有するタンパク質を産生し得るが、これは、還元型メルカプト基を酸化してジスフィルド結合するために時として必要である。これによって、タンパク質は、適切なフォールディングを達成し、そして機能的なタンパク質となる。メルカプト基を酸化する方法は、当該分野において公知であり、そして本発明は、任意の特定の酸化の方法によって限定されない。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明は、酸化の間のメチオニンスルホキシドの形成を防ぐメチオニン基の保護を企図する。メチオニン基を保護する方法は、当該分野において公知であり、そして本発明は、メチオニン基を保護するための特定の方法によって限定されない。しかし、方法は、Ｌａｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２５０（１９９７）およびＴａｋｒｕｋｉに対する米国特許第５，２７２，１３５号によって記載されるような抗酸化剤の使用を含む。
【００３０】
本発明はまた、酸化反応の実行の方法によって限定されない。例えば、１つの実施形態において、本発明は、切断可能な基の除去、次ぐメルカプト基の酸化を企図する。別の実施形態において、本発明は、同一の反応条件下で切断可能な基の除去およびメルカプト基の酸化を企図する。
【００３１】
同様に、切断可能な基の化学的除去およびタンパク質の酸化が同一の反応において行われる場合、本発明は、付加アイソフォームからの切断可能な基の除去および酸化の任意の特定の方法によって限定されない。しかし、１つの実施形態において、スクリーニングプロセスは、切断可能な基の化学的除去のための最良の条件を決定するように行われる。例えば、ｐＨ条件の範囲を用いる実験が行われ得、そして生じる適切な構造的整合性（すなわち、不可逆的に変性されない）を有する所望されるタンパク質の量および／または切断可能な基の量を測定し得る。（適切な構造的整合性を有する所望されるタンパク質の量）対（反応ｐＨ）のプロットは、一般に、切断可能な基の化学的除去反応に対する理想的なｐＨを示す曲線の最高点を有する釣鐘型の曲線を生じる。このような実施形態において、類似のスクリーニングが、酸化反応のために行われ得る。化学的除去反応および酸化反応の釣鐘型の曲線が交差する場合、交点は、同一反応における切断可能な基の除去およびメルカプト基の酸化のための最良のｐＨ条件を示す。インターフェロンαのピルベート付加アイソフォームの化学的除去および酸化に関して、組合せ反応を行う最良のｐＨを示すｐＨ５付近で２つの曲線が交差する。評価され得る他の反応条件は、塩濃度、温度などを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
付加アイソフォームの所望されるタンパク質への変換後、さらなるクロマトグラフィー工程が、夾雑物から所望されるタンパク質を精製するために必要であり得る。
【００３３】
所望されるタンパク質が適切に精製された後、所望されるならば、これは治療的使用に適切な形態に置かれ得る。例えば、所望されるタンパク質がインターフェロンαである場合、Ｋｗａｎに対する米国特許第４，８４７，０７９号および同第４，４９６，５３７号、ならびにＹｕｅｎらに対する米国特許第５，７６６，５８２号に記載された処方が適切である。あるいは、他の不活性の、薬学的に受容可能なキャリアは、固体または液体のいずれかであり得る。固形調製物は、粉末、錠剤、分散可能な顆粒、カプセル、カシューおよび坐剤を含む。粉末および錠剤は、約５〜約９５％の所望されるタンパク質を含み得る。適切な固体キャリアは、当該分野において公知である（例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖またはラクトース）。錠剤、粉末、カシューおよびカプセルは、経口投与に適切な固体投薬形態として用いられ得る。
【００３４】
坐剤を調製するために、低融点ワックス（例えば、脂肪酸グリセリドの混合物（例えば、ココアバター））がまず融解され、そして活性成分が、撹拌によってそこに均質に拡散される。次いで、溶融した均質な混合物は、都合よいサイズの型に流し込まれ、冷却されそして固化される。
【００３５】
液体形態調製物は、溶液、懸濁液および乳濁液を含む。例えば、非経口注射のための水またはプロピレングリコール水溶液または経口の溶液、懸濁液および乳濁液のための甘味料および乳白剤（ｏｐａｃｉｆｙ）の添加。液体形態調製物はまた、鼻腔内投与のための溶液を含み得る。
【００３６】
吸入に適切なエアロゾル調製物は、溶液または粉末形態にある固形を含み得、これらは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、不活性圧縮ガス）と組み合わせられ得る。
【００３７】
本発明の化合物はまた、経皮的に送達され得る。経皮的組成物は、クリーム、ローション、エアロゾルおよび／または乳濁液の形態をとり得、そしてこの目的のために該当分野に慣用的なように、マトリックスの経皮的パッチまたはリザーバー型に含ませ得る。
【００３８】
調製物の単位用量における活性化合物の量は、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、そして好ましくは約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇに調整され得る。代わりに、活性化合物は、国際単位によって調製され得、好ましい投薬量は、３００万〜５０００万国際単位である。このような実施形態において、３００万、５００万、１８００万、２５００万および５０００万単位投薬量形態が、企図される。
【００３９】
使用直前に、経口的、局所的または非経口的投与のいずれかのための液体形態調製物へ変換されることが企図される固形もまた含まれる。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および局面を例示するために示し、そして本発明の範囲を限定するようには解釈されない。
【００４１】
（実施例１：ピルベート付加アイソフォームの変換のためのスクリーニングプロセス）
ピルベート付加アイソフォームは内部セル（ｃｅｌｌ）を形成し得、この内部セルでは、タンパク質のＮ末端アミノ酸残基のα−アミノ基は、ピルベートのカルボニル基と縮合されている。ピルベートがタンパク質のコンフォメーションを干渉する場合には、このようなピルベート−タンパク質付加アイソフォームが加水分解される（ピルベートが、タンパク質から切断される）場合にのみ、熱力学的に有利なコンフォメーション変化を通して、タンパク質をその所望される形態へと自由にリフォールディングし得る。所望されるタンパク質がジスルフィド結合を有する場合、ピルベート切断から生じる還元アイソフォームは、所望される形態へのリフォールディングの一部として、酸化されるべきである。
【００４２】
以下の手順は、ピルベート−タンパク質付加アイソフォームをその所望される形態に変換するための最適な条件を決定する方法を例示する。先に考察したように、所望されるタンパク質がジスルフィド結合を有さない場合、スクリーニングは、単に、ピルベート切断（加水分解）を最大化するように実施される必要がある。所望されるタンパク質がジスルフィド結合を有する場合、スクリーニングは、ピルベート切断（加水分解）だけでなくジスルフィド結合形成（酸化）をも最大化するように実施される必要がある。
【００４３】
（１）ピルベートアッセイ）
ピルベートアッセイは、ピルベート−切断動態を理解するために、加水分解の程度をモニターすることが必要とされる。例えば、「遊離」ピルベートは、化学修飾方法または酵素的方法により定量的にアッセイされ得る。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）は、ピルベートを誘導体化するために使用され得る。アッセイサンプルは、ピルベート−タンパク質付加アイソフォームを排除するために、適切なＭＷＣＯ膜（例えば、１０Ｋ膜）を使用して、限外濾過されるべきである。濾液を、酸性ｐＨにおいてＤＮＰＨ（これは、「遊離」ピルベートと反応する）と共にインキュベートする。ＤＮＰＨ誘導体化ピルベートである、２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンは、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ８（５ｕｍ（μｍ））カラムのようなＣ８カラムを使用して、ＲＰ−ＰＨＬＣで容易に分析され得る。
【００４４】
誘導体化反応は化学量論的であるので、ピルベートの定量的測定もまた可能である。酵素キット（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ）もまた、ピルベートを測定するために使用され得る。この方法は、サンプルの限外濾過を必要としない。なぜなら、その穏和な条件は、インキュベーションの間にピルベート−タンパク質付加アイソフォームからピルベートを切断しないからである。
【００４５】
遊離ピルベートおよびタンパク質に結合したピルベートを組み合わせた量を測定するために、すべての結合ピルベートを、誘導体化の前に切断するべきである。ＤＮＰＨ誘導体化方法は、強酸性ｐＨおよび比較的長いインキュベーション時間を必要とするので、ピルベートは、このインキュベーションの間に切断され得、引き続いてＤＮＰＨで誘導体化され得る。従って、サンプル中の遊離ピルベートおよび結合ピルベートを組み合わせた量を測定するために、このサンプルは、ＤＮＰＨ誘導体化方法において限外濾過されることを伴わずに使用されるべきである。
【００４６】
（２）アイソフォームアッセイ）
ジスルフィド結合を有するタンパク質については、少なくとも３つのアイソフォームが存在し、そしてジスルフィド結合を有さないタンパク質については、２つのアイソフォームが存在する。概して、所望されるタンパク質およびその還元型は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより容易に分離され得る。
【００４７】
ジスルフィド結合を有するタンパク質の場合、スクリーニングは、３つのアイソフォーム（付加アイソフォーム、還元タンパク質、および所望されるタンパク質）がＲＰ−ＨＰＬＣにおいて定量的に分析され得る場合に非常に効率的である。ピルベートアッセイについて絶対的な必要性は存在せず、そして存在するのであれば、どの工程が律速であるかを同定することは可能である。しかし、還元型からピルベート−タンパク質付加アイソフォームを分離することは、通常、困難である。この場合、ピルベートアッセイは、各変換工程を最適化するために不可欠である。
【００４８】
（３）アイソフォーム組成の測定）
所望される形態がジスルフィド結合を有さない場合、アイソフォーム組成は、困難を伴わずに決定され得る。なぜなら、ピルベート−タンパク質付加アイソフォームは、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて所望の形態から容易に分離され得るからである。
【００４９】
所望される形態がジスルフィド結合を有し、そしてタンパク質付加アイソフォームがその還元型から分離可能でない場合、タンパク質に結合したピルベートを測定して、アイソフォーム組成を決定するべきである。タンパク質に結合したピルベートのモル濃度の量（これは、タンパク質付加アイソフォームの量である）は、遊離ピルベートおよび遊離ピルベートの量を減じた結合ピルベートを組み合わせた量である。これは、ＤＮＰＨ方法において、限外濾過ありまたはなしのサンプルを使用して測定され得る。次いで、還元型の量は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定される、タンパク質付加アイソフォームおよび還元型を組み合わせた量と、ピルベートアッセイによって決定される、タンパク質に結合したピルベートの量との間の差異である。次いで、アイソフォーム組成が算出され得る。
【００５０】
（４）スクリーニングの最適条件）
所望される形態がジスルフィド結合を有するか否かに関わらず、所望される形態への付加アイソフォームの変換の比速度を最大化するために、スクリーニング基準は同一であるべきである。
【００５１】
（４．１）所望されるタンパク質がジスルフィド結合を有さない場合）
この場合、ピルベートとして所望されるタンパク質形態は、ピルベート−タンパク質付加アイソフォームから切断される。ピルベート切断は、この場合、ピルベートアッセイによってモニターされる必要がない。なぜなら、所望される形態への付加アイソフォームの変換に関与する、わずか１つの工程（加水分解）のみ存在するからである。例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣにおける付加アイソフォームの消失および所望される形態の形成の両方をモニターすることで十分である。所望されるタンパク質への付加アイソフォームの変換を最大化するためのインキュベーション条件を見出すことが必要とされる。
【００５２】
第１の工程は、スクリーニングで使用されるタンパク質付加アイソフォーム濃度の作業範囲に関して、反応動態を調査することである。動態が付加アイソフォーム濃度に関して一次的である場合、サンプル濃度は動態に対する影響を有さず、そして任意の濃度が、スクリーニングまたはパラメーター評価の間に使用され得る。さもなくば、濃度は、スクリーニングの間、一定に維持されるべきである。
【００５３】
加水分解工程に影響する多くのパラメーターが存在し得る。主要なものは、ｐＨ、温度、金属イオン（例えば、亜鉛、第二鉄、第一鉄、Ｃｕ、Ｍｇなど）、伝導率、緩衝液、光、および攪拌である。所望される形態への付加アイソフォームの変換に対するインキュベーションパラメーターの効果を測定することによって、各パラメーターは最適化され得る。例えば、ピルベート−タンパク質付加アイソフォームを含む数アリコートのサンプルを、それらの個々に最良と推測される値で他のすべてのパラメーターを用いて、十分な範囲の異なるｐＨにおいて、インキュベートする。各アリコートにおける変換反応を、特定のインキュベーション期間（例えば、一晩）の後に測定する。最高の変換が得られるｐＨを、最適ｐＨとして決定する。このような実験を繰り返して、それらの個々に最良と推測される値の代わりに使用される最適化されたパラメーターの最適値を用いて、他のパラメーターを最適化する。これは、典型的な最適化技術である。
【００５４】
インキュベーションのｐＨは、加水分解速度に影響する。一般的に、ｐＨが低いほど、より多く加水分解を引き起こす。より高い温度はまた、加水分解を増加させる。しかし、強酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ２）での加水分解は、付加アイソフォームまたは所望されるタンパク質の不可逆的沈降が存在する場合、またはタンパク質が不可逆的に変性される場合には、作用しないかもしれない。いくつかの金属カチオンの存在は、加水分解を触媒し得る。金属カチオンがピルベート切断を触媒するとしても、このような触媒は、非常に金属カチオン濃度依存性であり得る。従って、金属カチオンをスクリーニングする場合には、非常に広範な金属カチオン濃度を使用すべきである。
【００５５】
パラメーター間の相互作用もまた存在し得る。例えば、いくつかの金属イオンが存在するか否かに依存して、このようなカチオンが変換に対する影響を有する場合には、異なる最適ｐＨが存在することが可能であり得る。ピルベート付加アイソフォームの場合、Ｚｎカチオンの存在は、ピルベート切断について異なる最適ｐＨを生じる（ｐＨ７．８〜８．６）。従って、それを真に最適化するためには、最適化される新たなパラメーターだけでなく、他の重要なパラメーターをも同時に変動させることが必要である。
【００５６】
（４．２）所望されるタンパク質がジスルフィド結合を有する場合）
２工程の変換プロセスにおいて、還元型が、加水分解を通して付加アイソフォームから切断され、そしてこれは引き続いて、酸化を通して所望される形態へと変換される。
【００５７】
理想的には、タンパク質付加アイソフォームおよび還元型が単離され、そしてジスルフィド結合なしのタンパク質の場合に関して上記された手順が、各工程を最適化するために、付加アイソフォームおよび還元型の各々に対して適用される。主要な差異は、上記に列挙されたパラメーターに加えて、酸素転移およびいくつかの酸化剤様の酸化型グルタチオン（ＧＳ−ＳＧ）が酸化工程のために最適化され得ることである。ＧＳ−ＳＧが還元型のみを酸化する場合、これは、酸化またはジスルフィド結合形成工程を非常に増強する。しかし、ＧＳ−ＳＧがまた、付加アイソフォームを酸化し、そして酸化された付加アイソフォームが容易に加水分解しない場合には、低い収量または変換となる可能性が高い。
【００５８】
各最適条件から、所望される形態への付加アイソフォームの変換に最適な条件が推定され得る。それらが合理的に近接している場合、中間の条件が、最適条件として設定される。理論的には、サンプル中の還元型に対するピルベート−タンパク質付加アイソフォームの最初の割合に依存する異なる最適条件が存在し得る。例えば、最適条件は、還元型が絶対多数である場合よりも、付加アイソフォームが絶対多数である場合に異なる。従って、加水分解および酸化についての個々の最適条件から最適条件を推定する場合には、サンプル組成を考慮するべきであることを認識するべきである。
【００５９】
最後に、変換の最適条件は実験的に確認される。もしあるならば律速工程を同定するために、変換の最適条件を微調整することが、しばしば有用である。インキュベーション時間に伴う還元型の安定な蓄積は、酸化工程が律速であることを示す。蓄積が生じる場合、酸化に対してより有利な条件（例えば、より多い酸素、より高いｐＨ、およびより高い温度）が、所望される形態の形成を最適化するために適用されるべきである。所望される形態の顕著な形成速度を通して常に還元型タンパク質のレベルが低い場合には、切断工程が律速である。これが生じる場合、それらが所望される形態の形成の最大化へと導く切断工程を改善し得るように、インキュベーション条件を変化し得る。
【００６０】
切断可能な基の化学的除去およびタンパク質の酸化についての最適条件が、非常に遠く離れている場合、それらは段階的に適用され得る。例えば、加水分解工程に最適な条件が最初に適用され、そして酸化工程に最適な条件は、この加水分解がほぼ完了する時点で適用される。
【００６１】
各アイソフォームを単離することが可能でない場合、特に、２つのアイソフォームがＲＰ−ＨＰＬＣにおいて分離され得ない場合、ピルベートアッセイは不可欠となる。ピルベート放出をモニターすることにより、加水分解工程は、まず最適化され得る。第２の工程は、この第１の工程がほぼ終了であるかまたは非常に緩慢である場合に、最適化される。これらの最適条件から、全体的な変換の最適条件が推定され、そして実験的に確認される。代替のアプローチは、加水分解工程を最適化した後に、全体的な変換を最適化することである。このアプローチは、特に、顕著でかつ持続した付加アイソフォームの加水分解によって引き起こされる干渉に起因して、第２の工程を最適化することが困難である場合に、より実用的であり得る。先に述べたように、ｐＨ、温度、酸素転移、金属カチオンおよび酸化剤は、最適化されるべき重要なパラメーターである。
【００６２】
パラメーター間の相互作用は、一工程変換プロセスについてのパラメーター間の相互作用よりも、二工程変換プロセスについてより重要となる。
【００６３】
所望される形態に対してこのような最適条件パラメーターの影響が存在しないことを確証するために、所望される形態を精製するべきであり、そしてその特性（生物学的な比活性および純度を含む）を、完全にチェックするべきである。
【００６４】
（実施例２：インターフェロンα２ｂへのピルベート付加アイソフォームの変換）
ピルベートの切断およびジスルフィド結合の形成を、上昇した温度（３０〜３７℃）および反応ｐＨ（５．２〜５．６）で実施する。これらの反応条件は、両方の反応が同じ反応条件下で連続的に生じるという点、および生物活性タンパク質が回収されるという点で独特である。
【００６５】
タンパク質単離クロマトグラフィーから溶出するタンパク質ＵＶ吸収度のピークを含む画分を共にプールし、そして０．４５μＭ（μｍ）で濾過滅菌する。
【００６６】
１リットルのタンパク質プールあたり３グラムのメチオニンを、このタンパク質プールに添加し、そして溶解するまで攪拌する。このプールのｐＨを、希水酸化ナトリウムを用いて５．２〜５．６に調整する。塩化ナトリウム濃度は調整しない：これは、１５０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌの間である。
【００６７】
１０ｍＭアセテート（ｐＨ５．５）、２００ｍＭメチオニン、および２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するストック溶液を、最終濃度２０ｍＭメチオニンまで、このタンパク質プールに添加する。
【００６８】
タンパク質プールを反応容器に移し、そして一定に攪拌しつつ温度を３７℃に上昇させる。タンパク質プールを、３６〜３８℃にて２４〜３０時間インキュベートする。
【００６９】
２４〜３０時間の時点で、反応混合物をデプスフィルターを通して濾過し、次いで０．４５ｕＭフィルターを通して濾過して、沈殿物を取り出す。次いで、このプールを濃縮し、そして２〜１０℃で１０ｍＭアセテート（ｐＨ５．５）に対してダイアフィルトレーションする。
【００７０】
（実施例３：亜鉛を使用した、インターフェロンα２ｂへのピルベート付加アイソフォームの変換）
ピルベート付加アイソフォームを、亜鉛（１Ｍ）を用いて、３４Ｃ（℃）およびｐＨ８．２にてインターフェロンα２ｂに変換する。反応の間、反応溶液を攪拌する。変換が約８０％になる時点で、反応溶液温度を４Ｃに低下させて反応を停止し得る。
【００７１】
溶液調製：１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液：４Ｃで維持、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基＋ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭ  Ｚｎ溶液：４Ｃで維持、１ｍＭ  ＺｎＳＯ4Ｈ2Ｏ＋１０ｍＭ  酢酸ナトリウム＋１７５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）。
【００７２】
タンパク質精製クロマトグラフィーから溶出するＵＶ吸収度のピークを含む画分を共にプールし、そして０．２ｕＭで濾過滅菌する。約０．０８３（Ｖ／Ｖ）の１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液を、攪拌されているタンパク質プール（代表的なタンパク質プールのｐＨは、５．２〜５．５の範囲にある）に、約８．２のｐＨまで緩徐に添加する。
【００７３】
１ｍＭのＺｎ溶液を、総ピルベート付加アイソフォームに対するＺｎカチオンの０．６〜１．０モル比を達成するために、攪拌中の塩基性タンパク質プールに緩徐に添加する（例えば、ピルベート付加アイソフォームの濃度が１．０ｍｇ／ｍＬである場合、３０ｕＭ（μＭ）のＺｎまたは０．０３（Ｖ／Ｖ）の１ｍＭのＺｎ溶液が必要とされる）。新鮮なＺｎカチオン溶液を使用する。
【００７４】
反応溶液を、攪拌しながら、リアクター内で３４Ｃに加熱する。反応温度を、反応全体を通して３４Ｃに制御する。持続した攪拌もまた、反応溶液中の混合が、気泡を生じるに十分に乱暴ではないが十分である程度に必要とされる。リアクターにおける幾分かの通気は、反応溶液内への酸素転移を可能にするべきである。他方で、リアクターが反応溶液でほぼ半分を満たす（ｈａｌｆ−ｆｉｌｌ）場合、このような通気は必要とされない。反応の間、反応サンプルは、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して変換を追跡するために採取され得る。反応が終了する時点で、次のクロマトグラフィー工程のために、温度は４Ｃに下げられ得る。
【００７５】
上記から、本発明が、所望されないタンパク質アイソフォームを同定する方法、および所望のタンパク質にそれらを変換させる方法（これは、所望のタンパク質の全体的収量および純度を増加させる）を提供することが明らかである。