(57)【要約】【課題】シグモイド曲線又は成長曲線内の遷移値、例えばＰＣＲ増幅曲線のベースライン領域の端部又はエルボー値又はＣｔ値を決定するシステム及び方法の提供。【解決手段】本発明は、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定する、コンピュータ実行方法であって：それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含む、成長曲線を表すデータセットを受信するステップと；該成長曲線に沿ってデータ点に対応する二次導関数値を数値的に決定するステップと；該決定された二次導関数値の最大値を決定するステップと；回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって該決定された二次導関数値にフィットする曲線の近似を計算することにより、該関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定するステップと；該第１パラメータを出力するステップと、を含む、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定する、コンピュータ実行方法を提供する。【選択図】図１
2010081937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定する、コンピュータ実行方法であって：
それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含む、成長曲線を表すデータセットを受信するステップと；
該成長曲線に沿ってデータ点に対応する二次導関数値を数値的に決定するステップと；
該決定された二次導関数値の最大値を決定するステップと；
回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって該決定された二次導関数値にフィットする曲線の近似を計算することにより、該関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定するステップと、ここで、前記パラメータは初期条件を含み、そして該最大値は第１パラメータの初期条件として使用される；
該第１パラメータを出力するステップと、ここで、該決定された第１パラメータは、該成長曲線のベースライン領域の端部を表す、
を含む、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定する、コンピュータ実行方法。
【請求項２】
該回帰法が、Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２最大値が、第２パラメータに対する初期条件として使用され、そして該方法はさらに該第２パラメータの出力を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該ガウス混合モデルが：
【数１】
2010081937.tif 000025
の形の式を含み、上記式中μ1は第１パラメータであり、そしてａ1及びσ1が付加的なパラメータである、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
さらに、DeltaB統計値を計算することにより、該曲線が真の成長を示しているかどうかを決定することを含み、ここで
【数２】
2010081937.tif 000026
である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定する、コンピュータ実行方法であって：
それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含む、成長曲線を表すデータセットを受信するステップと；
該成長曲線に沿ってデータ点に対応する曲率値を数値的に決定するステップと；
該決定された曲率値の最大値を決定するステップと；
回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって該決定された曲率値にフィットする曲線の近似を計算することにより、該関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定するステップと、ここで、前記パラメータは初期条件を含み、そして該最大値は第１パラメータの初期条件として使用される；
該第１パラメータを出力するステップと、該決定された第１パラメータは、該成長曲線のベースライン領域の端部を表す、
を含む、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定する、コンピュータ実行方法。
【請求項７】
該回帰法が、Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第２最大値が、第２パラメータに対する初期条件として使用され、そして該方法はさらに該第２パラメータの出力を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
該ガウス混合モデルが：
【数３】
2010081937.tif 000027
の形の式を含み、上記式中μ1は第１パラメータであり、そしてａ1及びσ1は付加的なパラメータである、請求項６から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、DeltaB統計値を計算することにより、該曲線が真の成長を示しているかどうかを決定することを含み、ここで
【数４】
2010081937.tif 000028
である、請求項６から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
さらに：
該成長曲線に沿ってデータ点に対応する二次導関数値を数値的に決定すること；
該決定された二次導関数値の最大値を決定すること；
回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって該決定された二次導関数値にフィットする曲線の近似を計算することにより、該関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定すること、ここで、前記パラメータは初期条件を含み、そして該最大値は第２パラメータの初期条件として使用される；そして
該第２パラメータを出力すること、ここで、該決定された第２パラメータは、該成長曲線のベースライン領域の前記端部を表す、
を含む、請求項６から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定するためにプロセッサを制御するコードを含むコンピュータ可読媒体であって、該コードが：
それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含む、成長曲線を表すデータセットを受信する命令と；
該成長曲線に沿ってデータ点に対応する二次導関数値を数値的に決定する命令と；
該決定された二次導関数値の最大値を決定する命令と；
回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって該決定された二次導関数値にフィットする曲線の近似を計算することにより、該関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定する命令と、ここで、前記パラメータは初期条件を含み、そして該最大値は第１パラメータの初期条件として使用される；そして
該第１パラメータを出力する命令と、ここで、該決定された第１パラメータは、該成長曲線のベースライン領域の端部を表す
を含む、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定するためにプロセッサを制御するコードを含むコンピュータ可読媒体。
【請求項１３】
成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定するためにプロセッサを制御するコードを含むコンピュータ可読媒体であって、該コードが：
それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含む、成長曲線を表すデータセットを受信する命令と；
該成長曲線に沿ってデータ点に対応する曲率値を数値的に決定する命令と；
該決定された曲率値の最大値を決定する命令と；
回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって該決定された曲率値にフィットする曲線の近似を計算することにより、該関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定する命令と、ここで、前記パラメータは初期条件を含み、そして該最大値は第１パラメータの初期条件として使用される； 
該第１パラメータを出力する命令と、ここで、該決定された第１パラメータは、該成長曲線のベースライン領域の端部を表す、
を含む、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定するためにプロセッサを制御するコードを含むコンピュータ可読媒体。
【請求項１４】
動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムであって：
該システムが
動的ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動的ＰＣＲ分析モジュールを含み、前記データセットは、それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含み、前記データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）値を含む当該領域内のデータ点を含み；
該システムがさらに、
該ＰＣＲ曲線に沿ってデータ点に対応する二次導関数値を数値的に決定すること；
該決定された二次導関数値の最大値を決定すること；
回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって該決定された二次導関数値にフィットする曲線の近似を計算することにより、該関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定すること、ここで、前記パラメータは初期条件を含み、そして該最大値は第１パラメータの初期条件として使用される；そして
該第１パラメータを出力すること、ここで、該決定された第１パラメータは、Ｃｔ値を表す、
によって
該Ｃｔ値を決定するために該ＰＣＲデータセットを処理するように適合されたインテリジェンスモジュールを含む、
動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システム。
【請求項１５】
動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムであって：
該システムが
動的ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動的ＰＣＲ分析モジュールを含み、前記データセットは、それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含み、前記データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）値を含む当該領域内のデータ点を含み；
該システムがさらに、
該ＰＣＲ曲線に沿ってデータ点に対応する曲率値を数値的に決定すること；
該決定された曲率値の最大値を決定すること；
回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって該決定された曲率値にフィットする曲線の近似を計算することにより、該関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定すること、ここで、前記パラメータは初期条件を含み、そして該最大値は第１パラメータの初期条件として使用される；そして
該第１パラメータを出力すること、ここで、該決定された第１パラメータは、Ｃｔ値を表す、
によって、
該Ｃｔ値を決定するために該ＰＣＲデータセットを処理するように適合されたインテリジェンスモジュールを含む、
動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、シグモイド又は成長曲線を表すデータを処理するシステム及び方法に関するものであり、更に詳しくは、ＰＣＲ増幅曲線の特徴的なサイクル閾値（Ｃｙｃｌｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ）又はエルボー値、或いは、その他の成長曲線のエルボー値を決定するシステム及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は、in vitroで、規定の核酸配列を酵素によって合成又は増幅する方法である。この反応は、通常、反対の鎖にハイブリダイズし、増幅対象のテンプレート又は標的ＤＮＡ配列にフランキングする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。該プライマーの伸長は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される。テンプレートの変性、プライマーのアニーリング、及びアニーリングされたプライマーのポリメラーゼによる伸長を伴う反復的な一連のサイクルの結果として、特定のＤＮＡフラグメントが指数的に蓄積される。通常、このプロセスにおいては、増幅プロセスの検出及び定量化を円滑に実行するべく、蛍光プローブ又はマーカーが使用されている。
【０００３】
図１には、典型的なリアルタイムのＰＣＲ曲線が示されており、典型的なＰＣＲプロセスにおける蛍光強度値がサイクル数に対してプロットされている。このケースにおいては、ＰＣＲプロセスのそれぞれのサイクルにおいて、ＰＣＲ産物の形成がモニタリングされている。増幅は、通常、増幅反応の際に蛍光信号を計測するコンポーネント及び装置を含むサーモサイクラー内において計測される。このようなサーモサイクラーの一例が、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒである（Ｃａｔ．  Ｎｏ．２０１１０４６８）。例えば、増幅産物は、標的核酸に結合した際にのみ蛍光信号を放出する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブによるか、或いは、場合によっては二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光染料により、検出される。
【０００４】
典型的なＰＣＲ曲線において、ベースライン領域の終点における遷移点（これは、一般に、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と称される）を識別することは、ＰＣＲ増幅プロセスの特性を理解するのに非常に有用である。Ｃｔ値は、ＰＣＲプロセスの効率の尺度として使用可能である。例えば、通常、分析対象であるすべての反応について規定の信号閾値を決定し、この閾値に到達するのに必要なサイクル数（Ｃｔ）を標的核酸及び標準又はハウスキーピング遺伝子などの基準核酸について決定する。標的核酸及び基準核酸について得られたＣｔ値に基づいて、標的分子の絶対的又は相対的なコピー数を決定可能である（Ｇｉｂｓｏｎ他による「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（６巻、９９５〜１００１頁）、Ｂｉｅｃｈｅ他による「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（５９巻、２７５９〜２７６５頁、１９９９年）、ＷＯ  ９７／４６７０７、ＷＯ  ９７／４６７１２、ＷＯ  ９７／４６７１４）。図１のベースライン領域１５の終点にある領域２０のエルボー値は、サイクル数３８の領域に位置するであろう。
【０００５】
ＰＣＲ曲線のエルボー値は、いくつかの既存の方法を使用して決定可能である。例えば、様々な現在の方法においては、ＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｖａｌｕｅ）と称される既定のレベルに蛍光が到達する値としてエルボーの実際の値を決定している。他の方法は、方程式をベースとするアプローチを使用してダブルシグモイド型の形状を有する曲線についてのＰＣＲエルボーを決定している。シグモイド型の形状を説明する上で極めて有用であることが判っている方程式は、ダブルシグモイド方程式である。ダブルシグモイド方程式の種々の実施形及び処理、例えばＤＳＬＭ（ダブルシグモイドLevenberg-Marquardt）方程式、ベースライン減算（ＢＬＳ）、ベースライン除算（ＢＬＤ）、及び除算を伴うベースライン減算（ＢＬＳＤ）に対する選択肢を有するＤＳＬＭ、曲率方程式、及び、2005年12月20日付けで出願された米国特許出願第１１／３１６，３１５号明細書；2006年2月6日付けで出願された米国特許出願第１１／３４９，５５０号明細書；2006年7月19日付けで出願された米国特許出願第１１／４５８，６４４号明細書；2006年9月19日付けで出願された米国特許出願第１１／５３３，２９１号明細書；及び2007年9月25日付けで出願された米国特許出願第１１／８６１，１８８号明細書に記載されているその他のものが導入されている。しかしながら、典型的なダブルシグモイド形状にフィットしない幾何学的形状をＰＣＲ曲線が有している場合、ダブルシグモイドをベースとする方法はもはや適用できないため、エルボー値又はＣｔ値を得るための、より一般的なアプローチが必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、上記問題点及びその他の問題点を克服する、成長曲線、具体的にはＰＣＲ曲線内のエルボー値を決定するシステム及び方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、シグモイド曲線又は成長曲線内の遷移値、例えばＰＣＲ増幅曲線のベースライン領域の端部又はエルボー値又はＣｔ値を決定するシステム及び方法を提供する。
【０００８】
ＰＣＲエルボー値、例えばリアルタイムＰＣＲエルボーを決定する一般的な、しかし骨の折れる方法の必要性に合わせるために、種々の実施態様が、データからの最大値（例えば曲率、相対曲率、二次導関数、又は相対二次導関数の最大値）の位置を利用することにより、エルボー値を見出している。これらの値の決定は、それ自体方程式を必要とすることはなく、むしろ数値法を用いる。他方において、種々の実施態様がガウス混合モデルを使用している。これらのガウス混合モデルは、データをフィットさせるための方程式を必要とし、これにより、部分エルボー値を決定する。
【０００９】
本発明の１態様によれば、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定するためのコンピュータ実行方法が提供される。この方法は典型的には、それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含む、成長曲線を表すデータセットを受信すること、成長曲線に沿ってデータ点に対応する二次導関数値を数値的に決定し、及び、決定された二次導関数値の最大値を決定することを含む。この方法はまた典型的には、回帰法をガウス混合モデル関数に適用して、決定された二次導関数値にフィットする曲線の近似を計算することにより、関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定すること（ここで、当該パラメータは初期条件を含み、そして最大値は第１パラメータの初期条件として使用される）、及び、第１パラメータを出力すること（ここで、決定された第１パラメータは、成長曲線のベースライン領域の端部を表す）を含む。或る態様において、データセットは、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）過程に対応する成長曲線を表し、そしてベースライン領域の端部の点は、成長曲線のエルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）値を表す。或る態様において、この方法はさらに、第１パラメータ値を表示することを含む。或る態様において、回帰法は、Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法を含む。或る態様において、第２最大値が、第２パラメータに対する初期条件として使用され、そしてこの方法はさらに第２パラメータの出力を含む。或る態様において、ガウス混合モデルは：
【数１】
2010081937.tif 000003
の形の式を含み、上記式中μ1は第１パラメータであり、そしてａ1及びσ1は付加的なパラメータである。或る態様において、この方法はさらに、DeltaB統計値を計算することにより、曲線が真の成長を示しているかどうかを決定することを含み、ここでは
【数２】
2010081937.tif 000004
である。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定するためのコンピュータ実行方法が提供される。この方法は典型的には、それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含む、成長曲線を表すデータセットを受信すること、成長曲線に沿ってデータ点に対応する曲率値を数値的に決定すること、そして、決定された曲率値の最大値を決定すること、を含む。この方法はまた典型的には、回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって決定された曲率値にフィットする曲線の近似を計算することにより、関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定し、パラメータは初期条件を含み、そして最大値は第１パラメータの初期条件として使用されること、及び、第１パラメータを出力し、決定された第１パラメータは、成長曲線のベースライン領域の端部を表すこと、を含む。或る態様において、データセットは、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）過程に対応する成長曲線を表し、そしてベースライン領域の端部の点は、成長曲線のエルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）値を表す。或る態様において、この方法はさらに、第１パラメータ値を表示することを含む。或る態様において、回帰法は、Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法を含む。或る態様において、第２最大値が、第２パラメータに対する初期条件として使用され、そしてこの方法はさらに第２パラメータの出力を含む。或る態様において、ガウス混合モデルは：
【数３】
2010081937.tif 000005
の形の式を含み、上記式中μ1は第１パラメータであり、そしてａ1及びσ1は付加的なパラメータである。或る態様において、この方法はさらに、決定された曲率値がスケール不変であるようにデータセットを修正することを含む。或る態様において、この方法はさらに、DeltaB統計値を計算することにより、曲線が真の成長を示しているかどうかを決定することを含み、ここでは
【数４】
2010081937.tif 000006
である。
【００１１】
この方法の別の態様の場合、この方法は、成長曲線に沿ってデータ点に対応する二次導関数値を数値的に決定すること；決定された二次導関数値の最大値を決定すること；回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって決定された二次導関数値にフィットする曲線の近似を計算することにより、関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定し、前記パラメータは初期条件を含み、そして最大値は第２パラメータの初期条件として使用されること；そして、第２パラメータを出力し、決定された第２パラメータは、成長曲線のベースライン領域の前記端部を表す、ことを含む。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定するためにプロセッサを制御するコードを含むコンピュータ可読媒体が提供される。このコードは典型的には、それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含む、成長曲線を表すデータセットを受信する命令と、成長曲線に沿ってデータ点に対応する二次導関数値を数値的に決定する命令と、決定された二次導関数値の最大値を決定する命令とを含む。このコードはまた典型的には、回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって決定された二次導関数値にフィットする曲線の近似を計算することにより、関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定し、パラメータは初期条件を含み、そして最大値は第１パラメータの初期条件として使用される命令と、第１パラメータを出力し、決定された第１パラメータは、成長曲線のベースライン領域の端部を表す命令とを含む。或る態様において、データセットは、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）過程に対応する成長曲線を表し、そしてベースライン領域の端部の点は、成長曲線のエルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）値を表す。或る態様において、回帰法は、Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法を含む。或る態様において、第２最大値が、第２パラメータに対する初期条件として使用され、そしてコードはさらに、第２パラメータを出力する命令を含む。或る態様において、このコードはさらに、Ｃｔ値を表示する命令を含む。或る態様において、座標値対は、増幅されたポリヌクレオチドの累積及びサイクル数を表す。或る態様において、ガウス混合モデルは：
【数５】
2010081937.tif 000007
の形の式を含み、上記式中μ1は第１パラメータであり、そしてａ1及びσ1は付加的なパラメータである。或る態様において、この方法はさらに、DeltaB統計値を計算することにより、曲線が真の成長を示しているかどうかを決定することを含み、ここでは
【数６】
2010081937.tif 000008
である。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、成長曲線のベースライン領域の端部の点を決定するためにプロセッサを制御するコードを含むコンピュータ可読媒体が提供される。このコードは典型的には、それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含む、成長曲線を表すデータセットを受信する命令と、成長曲線に沿ってデータ点に対応する曲率値を数値的に決定する命令と、決定された曲率値の最大値を決定する命令と、を含む。このコードはまた典型的には、回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって決定された曲率値にフィットする曲線の近似を計算することにより、関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定し、パラメータは初期条件を含み、そして最大値は第１パラメータの初期条件として使用される命令と、第１パラメータを出力し、決定された第１パラメータは、成長曲線のベースライン領域の端部を表す命令とを含む。或る態様において、データセットは、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）過程に対応する成長曲線を表し、そしてベースライン領域の端部の点は、成長曲線のエルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）値を表す。或る態様において、回帰法は、Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法を含む。或る態様において、第２最大値が、第２パラメータに対する初期条件として使用され、そしてコードはさらに、第２パラメータを出力する命令を含む。或る態様において、このコードはさらに、Ｃｔ値を表示する命令を含む。或る態様において、座標値対は、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積及びサイクル数を表す。或る態様において、ガウス混合モデルは：
【数７】
2010081937.tif 000009
の形の式を含み、上記式中μ1は第１パラメータであり、そしてａ1及びσ1は付加的なパラメータである。或る態様において、この方法はさらに、DeltaB統計値を計算することにより、曲線が真の成長を示しているかどうかを決定することを含み、ここで
【数８】
2010081937.tif 000010
である。
【００１４】
本発明のさらに別の態様によれば、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供される。システムは典型的には、動的ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動的ＰＣＲ分析モジュールを含む。データセットは典型的には、それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含み、データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）値を含む当該領域内のデータ点を含む。システムはまた典型的には、ＰＣＲ曲線に沿ってデータ点に対応する二次導関数値を数値的に決定すること、決定された二次導関数値の最大値を決定すること、そして、回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって決定された二次導関数値にフィットする曲線の近似を計算することにより、関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定し、パラメータは初期条件を含み、そして最大値は第１パラメータの初期条件として使用されることによって、Ｃｔ値を決定するためにＰＣＲデータセットを処理するように適合されたインテリジェンスモジュールを含む。インテリジェンスモジュールはまた典型的には、第１パラメータを出力するように適合されており、決定された第１パラメータは、Ｃｔ値を表す。或る態様において、動的ＰＣＲ分析モジュールは、動的サーモサイクラー装置内に位置しており、そしてインテリジェンスモジュールは、分析モジュールに通信可能にカップリングされたプロセッサを含む。或る態様において、インテリジェンスモジュールは、ネットワーク接続又は直接接続のうちの一方によって分析モジュールにカップリングされたコンピュータ・システム内に位置するプロセッサを含む。或る態様において、回帰法は、Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法を含む。或る態様において、システムはさらに、ディスプレイ・モジュール、例えばモニター、プリンタ、又はテキスト・データ及び／又はグラフィック・データを表示することができる他の装置を含む。出力は、ディスプレイ・モジュール上にＣｔ値を表示することを含む。或る態様において、第２最大値が、第２パラメータに対する初期条件として使用され、そしてインテリジェンスモジュールはさらに、第２パラメータを出力することができる。或る態様において、ガウス混合モデルは：
【数９】
2010081937.tif 000011
の形の式を含み、上記式中μ1は第１パラメータであり、そしてａ1及びσ1は付加的なパラメータである。或る態様において、この方法はさらに、DeltaB統計値を計算することにより、曲線が真の成長を示しているかどうかを決定することを含み、ここでは
【数１０】
2010081937.tif 000012
である。
【００１５】
本発明のさらに別の態様によれば、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供される。システムは典型的には、動的ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動的ＰＣＲ分析モジュールを含む。データセットは典型的には、それぞれが一対の座標値を有する複数のデータ点を含み、データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）値を含む当該領域内のデータ点を含む。システムはまた典型的には、ＰＣＲ曲線に沿ってデータ点に対応する曲率値を数値的に決定すること、決定された曲率値の最大値を決定すること、そして、回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって決定された曲率値にフィットする曲線の近似を計算することにより、関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定し、パラメータは初期条件を含み、そして最大値は第１パラメータの初期条件として使用されることによって、Ｃｔ値を決定するためにＰＣＲデータセットを処理するように適合されたインテリジェンスモジュールを含む。インテリジェンスモジュールはまた典型的には、第１パラメータを出力するように適合されており、決定された第１パラメータは、Ｃｔ値を表す。或る態様において、動的ＰＣＲ分析モジュールは、動的サーモサイクラー装置内に位置しており、そしてインテリジェンスモジュールは、分析モジュールに通信可能にカップリングされたプロセッサを含む。或る態様において、インテリジェンスモジュールは、ネットワーク接続又は直接接続のうちの一方によって分析モジュールにカップリングされたコンピュータ・システム内に位置するプロセッサを含む。或る態様において、回帰法は、Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法を含む。或る態様において、システムはさらに、ディスプレイ・モジュール、例えばモニター、プリンタ、又はテキスト・データ及び／又はグラフィック・データを表示することができる他の装置を含む。出力は、ディスプレイ・モジュール上にＣｔ値を表示することを含む。或る態様において、第２最大値が、第２パラメータに対する初期条件として使用され、そしてインテリジェンスモジュールはさらに、第２パラメータを出力することができる。或る態様において、ガウス混合モデルは：
【数１１】
2010081937.tif 000013
の形の式を含み、上記式中μ1は第１パラメータであり、そしてａ1及びσ1は付加的なパラメータである。或る態様において、この方法はさらに、DeltaB統計値を計算することにより、曲線が真の成長を示しているかどうかを決定することを含み、ここでは
【数１２】
2010081937.tif 000014
である。
【００１６】
図面及び特許請求の範囲を含めて明細書の残り部分を参照すれば、本発明の他の特徴及び利点が明らかになる。本発明の更なる特徴及び利点、並びに本発明の種々の実施態様の構造及び作業を、添付の図面に関連して以下に詳しく説明する。図面において、同じ符号は、同一又は機能上類似の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、蛍光強度対サイクル数としてプロットされた、典型的なＰＣＲ成長曲線の一例を示す図である。
【図２】図２は、図１のリアルタイムＰＣＲ曲線の二次導関数を示す図である。
【図３】図３は、図１のリアルタイムＰＣＲ曲線の曲率を示す図である。
【図４】図４は、１実施態様に基づく、シグモイド曲線内の遷移値、例えば動的ＰＣＲ増幅曲線のエルボー値又はＣｔ値を決定するプロセスを示す図である。
【図５】図５は、複数のＣｔ値を有するリアルタイムＰＣＲ曲線の一例を示す図である。
【図６】図６は、図５のリアルタイムＰＣＲ曲線の二次導関数を示す図である。
【図７】図７は、図５のリアルタイムＰＣＲ曲線の曲率を示す図である。
【図８】図８は、ＰＣＲデータ曲線のプラトー領域の蛍光低下の一例を示す図である。
【図９】図９は、１実施態様に基づく低下検出ワークフローを示す図である。
【図１０】図１０は、平らな線から曲線の真の成長を区別するために用いられる５つのテストを示す図である。
【図１１】図１１は、１実施態様に基づく成長曲線内のＣｔ値を決定する方法を示す図である。
【図１２】図１２は、１実施態様に基づくＣｔ発見ルーティンのための処理ステップを示す図である。
【図１３】図１３は、１実施態様において実施されるエキスパートシステム・チェックを示す図である。
【図１４】図１４は、２つのエルボーを有する典型的なリアルタイムＰＣＲ曲線の一例を示す図である。
【図１５】図１５は、本発明の方法及びシステムを実施するために使用できるソフトウェア・リソースとハードウェア・リソースとの関係を示す一般的なブロック・ダイアグラムの一例である。
【図１６】図１６は、サーモサイクラー装置とコンピュータ・システムとの関係を示す一般的なブロック・ダイアグラムの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、シグモイド曲線又は成長曲線内の遷移値、例えばＰＣＲ増幅曲線のベースライン領域の端部、又はエルボー値又はＣｔ値を決定するシステム及び方法を提供する。特定の態様において、ＰＣＲデータセットの二次導関数値及び曲率値が数値的に決定される。Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法を用いて決定されたパラメータを有するガウス混合モデル（Gaussian Mixture Model、ＧＭＭ）関数を使用することにより、二次導関数曲線及び曲率曲線の近似を見いだす。数値的に決定した二次導関数値及び／又は曲率値の最大値は、ＧＭＭ関数のパラメータの初期条件として使用される。決定されたパラメータは、部分Ｃｔ値を提供する。Ｃｔ値は次いで戻され、表示されることもあれば、あるいは、別の方法で、更なる処理のために使用されることがある。
【００１９】
ＰＣＲ法との関連における成長曲線又は増幅曲線１０の一例を図１に示す。図示のように、曲線１０は遅滞期領域１５と、対数期領域２５とを含む。遅滞期領域１５は一般にベースライン又はベースライン領域と称される。このような曲線１０は、遅滞期領域と対数期領域とを繋ぐ当該遷移領域２０を含む。領域２０は、一般にエルボー又はエルボー領域と称される。エルボー領域は典型的には、ベースラインの終わり、及び基礎となるプロセスの成長速度又は増幅速度の遷移を画定する。領域２０内の特異的遷移点を識別することは、基礎プロセスの挙動を分析する上で役立つことがある。典型的なＰＣＲ曲線において、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）値と称される遷移点を識別することは、ＰＣＲ法の定性的及び定量的な特徴を理解する上で有用である。例えば、Ｃｔ値は、被分析試料中に存在するＤＮＡの量を量子化するために使用することができる。量子化は、Ｌｏｇ(ＤＮＡ量)対Ｃｔ値の較正曲線法を実施することにより得られる。次いで、後続の試料を較正曲線と一緒にＣｔ値を使用することにより、所定の試料中のＤＮＡの推定値を直接得ることができる。ＤＮＡ試料に関する定性的な情報を提供するために、Ｃｔ値を使用することもできる。
【００２０】
同様のシグモイド曲線又は成長曲線を提供し得る他の過程は、バクテリア過程、酵素過程、及び結合過程を含む。例えばバクテリア成長曲線において、当該遷移点は、遅滞期内の時点λと称される。本発明に従って分析することができるデータ曲線を生成する他の具体的な方法は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）法、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）法、及び転写媒介増幅（ＴＭＡ）法を含む。ＳＤＡ法及びＮＡＳＢＡ法及びデータ曲線の例は、Wang, Sha-Sha他、“Homogeneous Real-Time Detection of Single-Nucleotide Polymorphisms by Strand Displacement Amplification on the BD ProbeTec ET System”, Clin Chem 2003 49 (10):1599、及びWeusten, Jos J.A.M.他、“Principles of Quantitation of Viral Loads Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification in Combination With Homogeneous Detection Using Molecular Beacons”, Nucleic Acids Research, 2002 30(6):26にそれぞれ見いだすことができる。このように、本明細書の残りの部分では、本発明の実施態様及び態様を、ＰＣＲ曲線に対する適用可能性に関して論じるが、本発明を、他の方法に関連するデータ曲線に適用できることは言うまでもない。
【００２１】
図１に示すように、典型的なＰＣＲ成長曲線のデータは、ｘ軸を定義するＰＣＲサイクル数と、ｙ軸を定義する累積ポリヌクレオチド成長の指標とを有する二次元座標系で表すことができる。典型的には、蛍光マーカーの使用が最も幅広く用いられる標識付けスキームであるため、累積成長の指標は蛍光強度値である。しかしながら、用いられる具体的な標識付けスキーム及び／又は検出スキームに応じて他の指標を使用できることは言うまでもない。累積信号成長の他の有用な指標の例は、ルミネッセンス強度、化学発光強度、生物発光強度、リン光強度、電荷移動、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘度、光散乱、放射能強度、反射率、透過率及び吸光度を含む。サイクルの定義は、時間、プロセス・サイクル、単位作業サイクル及び再生サイクルを含むこともできる。
【００２２】
一般プロセス概観
図１に示された典型的なリアルタイプＰＣＲ成長を考察する。Ｃｔ値又はエルボー値と称される数値を図１から得ることが望ましい。
【００２３】
１実施態様によれば、シグモイド曲線内の遷移値、例えば動的ＰＣＲ増幅曲線のエルボー値又はＣｔ値を決定するプロセス１００を、図４を参照しながら手短に説明することができる。ステップ１１０において、曲線を表す試験データセットを受信又はその他の形式で取得する。プロットされたＰＣＲデータセットの一例を図１に示す。図１では、ｙ軸及びｘ軸は、ＰＣＲ曲線に対してそれぞれ蛍光強度及びサイクル数を表す。特定の態様において、データセットは、軸に沿って連続的な、そして等間隔を置いたデータを含むことになっている。
【００２４】
プロセス１００が、ＰＣＲデータ取得装置、例えばサーモサイクラー内に位置するインテリジェンスモジュール（例えば命令を実行するプロセッサ）内で実施される場合、データセットは、データが収集されるのにともなってリアルタイムでインテリジェンスモジュールに提供されるてもよく、或いは、データセットをメモリーユニット又はバッファ内に保存し、そして試験が完了した後インテリジェンスモジュールに提供されてもよい。同様に、データセットは、取得装置とのネットワーク接続（例えばＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えばＵＳＢ又はその他の直接的な有線又は無線接続）を介して、別個のシステム、例えばデスクトップ・コンピュータ・システム又はその他のコンピュータ・システムに提供してもよく、或いは、可搬性媒体、例えばＣＤ、ＤＶＤ、又はフロッピー（登録商標）ディスクなどに提供してもよい。或る態様において、データセットは、座標値対（又は二次元ベクター）を有するデータ点を含む。ＰＣＲデータの場合、座標値対は典型的には、サイクル数及び蛍光強度値を表す。データセットがステップ１１０において受信又は取得されたあと、データセットを分析することにより、ベースライン領域の端部を決定することができる。
【００２５】
ステップ１２０において、データを数値的に処理することにより、導関数値及び曲率値を決定する。これらの曲線のＣｔ値又は「エルボー値」は、二次導関数（ｙ軸）の最大値又は曲率（ｙ軸）の最大値に対応する（部分）サイクル数（ｘ軸）を見いだすことにより得られる。図１に示されたデータを使用して、二次導関数及び曲率の対応グラフを、図２及び図３に示す。
【００２６】
１実施態様の場合、Savitzky-Golay（ＳＧ）法を用いることにより、導関数が得られる［A. Savitzky及びMarcel J. E. Golay (1964)、Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures. Analytical Chemistry, 36: 1627-1639、及びPress, W.H.他“Numerical Recipes in C、第2版”、Savitzky-Golay Smoothing Filters, Section 14.8, 650-655参照］。ＳＧ−４−４−２形態（左へ４点、右へ４点、及び二次多項式を意味する）を用いることにより、一次及び二次導関数を計算する。曲率は、下記方程式１に示された式によって得られる。この式中、ｘはサイクル数を表し、ｙは蛍光値を表し、そしてカッパ（κ）は曲率を表す。
【数１３】
2010081937.tif 000015
【００２７】
曲率のスケール不変形［相対曲率］
特定の実施態様において、結果がスケール不変となるように、別の方法を用いることにより曲率を計算する。スケール不変とは、蛍光値を定数で掛け算すると、結果としてのＣｔ値が不変のままであることを意味する。
【００２８】
１つの方法によれば、蛍光値は、方程式（１）に示された曲率の計算前に、平均蛍光値で割り算される。従って、方程式（１）のｙの代わりに、ｙはｙ／ｙmeanによって置換され、ここでは
【数１４】
2010081937.tif 000016
である。
【００２９】
別の方法によれば、蛍光値は、方程式（１）に示された曲率の計算前に、ベースラインからプラトー領域までのＰＣＲ曲線成長量又は（最大蛍光-最小蛍光）で割り算される。従って、方程式（１）のｙの代わりに、ｙは、今回はｙ／ＡＦＩ（ここではＡＦＩ＝中央値（最後の５点）-中央値（最初の５点））、又はｙ／成長量（ここでは成長＝（最大蛍光-最小蛍光）によって置換される。
【００３０】
二次導関数の無次元形［相対二次導関数］
二次導関数
【数１５】
2010081937.tif 000017
を直接決定することに加えて、関数：
【数１６】
2010081937.tif 000018
の最大値を見いだすことにより、二次導関数の無次元（ｙにおける）形を使用してもよい。
【００３１】
しかし方程式を使わない方法は、リアルタイムＰＣＲデータが典型的なダブルシグモイド形状を有さないときに最も有利である。このようなリアルタイムＰＣＲ曲線を図５に示す。この形状を有する曲線は、いかなる分析表現によっても容易には記述されない。この特定の曲線は、複数の変曲点及び複数のＣｔ値を有している。
【００３２】
図５に相当する二次導関数プロット及び曲率プロットを、図６及び図７に示す。前記のように、Ｃｔ値は、これらの２つの図面に示された二次導関数及び曲率の最大値に対応するサイクル数を決定することにより得られる。図５に示された曲線に対して、２つのＣｔ値が生成されることになる。
【００３３】
図４に戻る。１実施態様においては、ステップ１３０において部分Ｃｔ値が決定される。例えば図２及び３及び図６及び７に示されているように、曲線の最大値を見いだすために、１実施態様の場合、データにガウス混合モデルをフィットさせる。ガウス混合モデルの平均は、最大値に、ひいてはＣｔ値に相当する。１実施態様の場合、回帰法をガウス混合モデル関数に適用することによって決定された二次導関数値にフィットし且つ／又は決定された曲率値にフィットする曲線の近似を計算することにより、関数の１つ又は２つ以上のパラメータを決定することによって、曲線フィットが行われる。特定の態様において、Levenberg-Marquardt回帰法が用いられる。１実施態様において、単一ピークの場合、１ピークに対するガウス混合モデルが方程式（２）に示されているように用いられる。２つのピークが存在する場合には、２つのピークに対するガウス混合モデルが方程式（３）に示されているように用いられる。係数μ1又は（μ1，μ2）に対する回帰値は、それぞれ１つのピーク及び２つのピークに対するＣｔ値に相当する。１実施態様の場合、最大値を見いだすために付加的な導関数を求めるのではなく、ガウス混合モデルが使用される。それというのも、より高次の導関数（三次及び四次）は不安定になるおそれがあるからである。
【００３４】
【数１７】
2010081937.tif 000019
【００３５】
【数１８】
2010081937.tif 000020
【００３６】
当業者には明らかであるようにガウス混合モデルの代わりに他のモデル／関数を使用できることは言うまでもない。他のモデルの例は、ベータ、二項式、コーシー、カイ、カイ二乗、指数関数、極値、FRatio、ガンマ、ガンベル、ラプラス、ロジスティック、マックスウェル、パレート、レーリー、スチューデントＴ、及びワイブル・モデルを含む。
【００３７】
１実施態様の場合、Levenberg-Marquardt（ＬＭ）回帰法は、方程式（２）又は方程式（３）に曲線フィットさせるために用いられる。この方法の詳細は、参考文献［More, J.J.,“The Levenberg-Marquardt Algorithm, Implementation and Theory, Numerical Analysis, Watson, G.A.編、Lecture Notes in Mathematics 630, Springer-Verlag, 1977]に見いだすことができる。言うまでもなく、良く知られている他の回帰法を用いることができる。一般に、ＬＭ回帰法は、種々の入力を必要とし出力を提供するアルゴリズムを含む。１態様において、入力は、処理されるべきデータセット、データをフィットさせるために用いられる関数（例えばガウス混合モデル）、及び関数のパラメータ又は変数の初期推測を含む。出力は、関数とデータセットとの間の距離を最小にする関数に対応する１つ又は２つ以上のパラメータの集合を含む。言うまでもなく、当業者にとって自明な他の回帰法を用いてもよい。
【００３８】
Levenberg-Marquardt法の１つの特徴は、この方法が回帰実施前にパラメータ値の良好な推定を必要とすることである。パラメータａ1（又はａ1，ａ2）、及びσ1（又はσ1，σ2）に関して、初期条件は全ての事例において定数（例えば１又は２）に等しく設定することができる。これらのパラメータは一般に感受性ではなく、用いられる初期条件とは無関係に収束する。パラメータμ1（又はμ1，μ2）は、各曲線毎に決定されるべきより正確な初期条件を必要とする。１実施態様の場合、下でより詳細に説明するように、パラメータμ1（又はμ1，μ2）の初期条件を計算するために、ウィンドウ法を用いる。
【００３９】
ステップ１３５において、Ｃｔ値は、例えば表示又は更なる処理のために戻される。図４の分析を行ったシステムとカップリングされたディスプレイ装置、例えばモニタースクリーン又はプリンタでグラフ表示をレンダリングすることができ、或いは、ディスプレイ装置上でレンダリングするために別個のシステムにデータを提供することもできる。
【００４０】
実施態様によっては、Ｒ2統計値及び／又は信頼度（例えば９５％信頼度）インターバルがＧＭＭ1及びＧＭＭ2パラメータに対して計算される。これらの値は、曲線フィットの質を評価し、そして計算Ｃｔ値が有効であるか、無効であるか、又はゼロ（試料が存在しない）であるかを決定するのを助けるために、エクスパートシステム（下記）に使用することができる。これらの値はステップ１３５で表示することもできる。
【００４１】
曲線の最大値の決定
１実施態様の場合、パラメータμ1，μ2の初期条件を決定するために、ウィンドウ法をデータセット上で用いる。曲率及び二次導関数の最大値を見いだすために、全ての負の値はゼロで置き換えられる。１実施態様の場合、ウィンドウ法は、下記手順を用いることによって、潜在的な極大値を探索する：
１．  第１の点から出発して、データセットの最初の数点（例えば５点）（点１〜５）を検査する。
２．  中間ｙ点がこれらの５点中の最大値でないならば、これら５点中に潜在的最大値はない。中間ｙ点がこれらの５点のうちの最大値であり、そして０よりも大きい値を有する（厳密値０を有する点から成るより長い配列の中間点を潜在的最大値集合に加えることを避けるため）ならば、潜在的最大値がある。この点を潜在的最大値集合Ｓに加える。
３．  １点分だけスライド・ウィンドウを進め（例えば今回は点２〜６になる）、第２項に記載のプロセスを繰り返して、これら５つの点のうちの指数３における最大値のみを再び受け入れる。このプロセスをデータセット全体を通して続ける。
４．  最後から２番目の点のｙ値が、前の２点及び最後の点のｙ値以上であるならば、この点を潜在的最大値集合Ｓに加える。
５．  結果としての潜在的最大値集合Ｓを検査し、指数３における潜在的最大値集合を表し、そしてこの潜在的最大値集合Ｓ中の最大データ点（Ｓｍａｘ）を見いだす。
６．  Ｓｍａｘが、最大ノイズ入力パラメータ（ユーザによって入力することができる、又は自動的に決定することができるノイズ・パラメータ）以下であるならば、曲率データ中にピークはない。
７．  この集合Ｓからの残りの潜在的最大データ点を維持し、これらの点がＳｍａｘ  ｘ  相対最小入力パラメータを上回り、そして絶対最小入力パラメータを上回ることを条件とする。
８．  唯１つのデータ点が残されるならば、唯１つのピークがあり、そして曲線は唯１つの最大値を有する。この単一ピークをｐｋ1と定義する。２つのデータ点が残されるならば、このことは曲線が２つの最大値を有することを表す。３つ以上のピークが或る場合、データセットＳのうちの最大値を有する２つのピークを求め、これらの２つのうちサイクル数が低い方のピークをｐｋ1として戻し、サイクル数が高い方のピークをｐｋ2として戻す。
９．  μ1の初期条件はこのときｐｋ1であり、（μ1，μ2）の初期条件は（ｐｋ1，ｐｋ2）である。
【００４２】
低下検出
データによっては、プラトー領域内の強度低下が存在することがある。このような場合、望ましくない影響を取り除くように、このことを考慮することがしばしば望ましい。例えば、プラトー領域の蛍光の低下を図８に見えることができる。このようなプラトーの存在は、ＣTシフトを引き起こすおそれがある。精度を改善するために、１実施態様において、蛍光強度データの低下セグメントを除去する自動的な方法が実施される。低下しつつあるプラトーは、特定の態様において、二次導関数又は曲率の計算前に除去される。１実施態様による低下検出ワークフローが図９に示されている。
【００４３】
ステップ９１０において、最高蛍光強度に対応するサイクル数を決定する。ステップ９２０において、最高蛍光強度が最後の３サイクル内になかった場合には、後続のサイクル（最高値の後）における蛍光強度を評価する。最高蛍光強度が最後の３サイクル内にある場合、低下補正は行われない。最大蛍光に対応するサイクルの後のサイクル中の最低蛍光強度が最大蛍光強度の９５％未満である場合には、ステップ９３０において、二次多項式が、後続サイクル（最高値の後）内に含まれる蛍光にフィットされる。ステップ９４０において、データ内に有意な低下があるかどうかが決定される。１実施態様の場合、最高蛍光強度点が入力パラメータ値ＲＶ（相対値）よりも大きい場合、二次多項式の線形項と、蛍光強度最大値をデータ点の数で割り算し、一定の閾値（例えば-５）で掛け算した比とを比較する。線形項がこの数未満であり、有意な低下を示す場合には、最高蛍光強度を有するサイクル数後のサイクルに対応する蛍光データをステップ９５０において切り捨て、示さない場合には、データには低下は存在しておらず、アクションは必要でない。
【００４４】
１実施態様によれば、低下を決定するために二次多項式フィットが用いられる。特定の態様において、フィットは方程式（４）：
【数１９】
2010081937.tif 000021
を用いて実施することができる。
【００４５】
方程式（４）において、ｋは、最大蛍光強度に対応するサイクル数である。従って、方程式（４）における値ｑが上述の積未満である場合には、最大蛍光強度に対応するサイクル後のサイクルの切り捨てが、下流の正確な非線形回帰のために必要である。低下が検出され、そしてデータ切り捨てが行われる場合には、蛍光ベクトルｙ、サイクル数ベクトルｘ、及び蛍光ベクトルの長さｍは、切り捨て形に相当し、元の入力には相当しない。最後の３つのサイクルは無視される。なぜならば、点が３つ未満の二次関数をフィットさせることはできないからである。
【００４６】
平らな線からの成長の区別
データによっては、無意味な成長が存在する場合がある。このような場合、望ましくない影響を取り除くように、このことを考慮することがしばしば望ましい。１実施態様の場合、図１０に示すように、平らな線から曲線の真の成長を区別するために５つのテストを用いる。
【００４７】
１．  ＲＴ−ＰＣＲ曲線の全体又は一部にわたって線形回帰フィットを実施する。この線形回帰に対するＲ2が＞０．９９である場合、成長はないと推測される。
２．  DeltaB（下に示す）と称される統計値を計算する。０＜DeltaB＜０．０４であるならば、成長はないと推測される。
【数２０】
2010081937.tif 000022
３．  ＲＴ−ＰＣＲ曲線の全体にわたって二次回帰フィットを実施する。この二次回帰のＲ2が＞０．９８である場合、ＲＴ−ＰＣＲ曲線は、成長曲線には不十分な曲率を有していると見極められる。
４．  ＲＦＩ（相対蛍光増加値）と称される値を：
【数２１】
2010081937.tif 000023
として計算する。或る態様の場合、ＲＴ−ＰＣＲ曲線がベースライン減算によって標準化された後、ＲＦＩを計算する。計算ＲＦＩが入力ＲＦＩmin値未満である場合、その曲線は成長がないと言われる。
５．  ＡＦＩ（絶対蛍光増加値）と称される値を：
ＡＦＩ＝中央値［最後の５点］-中央値［最初の５点］
として計算する。或る態様の場合、ＲＴ−ＰＣＲ曲線がベースライン減算によって標準化された後、ＡＦＩを計算する。計算ＡＦＩが入力ＡＦＩmin値未満である場合、その曲線は成長がないと言われる。
【００４８】
言うまでもなく、曲線が成長を有すると考えられるかどうかを決定するために、上記５つのテストのうちの１つ又は２つ以上を用いてよく、且つ／又はその他のテストを用いてもよい。異なる値を使用してよく、例えば最初の５点又は最後の５点を用いる代わりに、５つよりも多い又は少ない点を使用してよいことも明らかである。
【００４９】
アルゴリズム・ワークフロー
図１１は、１実施態様に基づく成長曲線内のＣｔ値を決定する方法を示す図である。ステップ１１１０において、低下検出を実施する。このステップにおいて、蛍光の低下を決定し、そして必要な場合には、蛍光データを切り捨てる。図９を参照しながら上述した手順が、１実施態様において用いられる。ステップ１１２０において、データが直線にフィットするかどうか、又は成長が存在し得るかどうかに関して、データを先ず検査する。成長が存在し得る場合には、方程式のないモデル（Equation-Less Model)を使用し、例えばSavitzky-Golay法を数値的に用いることにより、二次導関数（又は相対導関数）方程式及び曲率（又は相対曲率）方程式に対応する導関数を計算する。ステップ１１３０において、Ｃｔ値を決定する。Ｃｔ値は、ＰＣＲ蛍光モデルの二次導関数（相対導関数）又は曲率（相対曲率）がその最大値を有する部分サイクル数である。１実施態様の場合、部分サイクル数は、図４を参照しながら上述した１成分又は２成分ガウス混合モデルの非線形回帰、及び方程式（２）及び（３）によって見いだされる。１実施態様によるＣｔ発見ルーティンの処理ステップを図１２に要約する。ステップ１１４０において、リスク軽減を目的として用いられる一連のチェックを提供するために、エクスパートシステムがデータを処理する。
【００５０】
エクスパートシステム・チェック
１実施態様の場合、図１３に示すように、エクスパートシステム・チェックを実施する。ステップ１３１０において、システムは、ＰＣＲ成長曲線の切片が、ユーザーによって特定された最小・最大値以内にあるかどうかを検証する。この範囲外にある場合、曲線は無効と称される。１態様において、切片は最初の５点の中央値として定義される。ステップ１３２０において、システムは、ＰＣＲ成長曲線の勾配が、ユーザーによって特定された最小・最大値以内にあるかどうかを検証する。これがその範囲外に或る場合、曲線は無効と称される。勾配の代わりに、相対勾配を使用することもできる。この場合、相対スロープ＝スロープ／切片である。こうして、勾配比較はスケール不変になる。ステップ１３３０において、システムは、ＰＣＲ成長曲線のＣｔ値が、ユーザーによって特定された最小・最大値以内にあるかどうかを検証する。これらの条件のいずれかが満たされていないとフラグが揚げられる。これらの曲線は以後、無効又は負と呼ばれることがある。
【実施例】
【００５１】
図１４は、２つのエルボーを有する典型的なリアルタイムＰＣＲを示す。上側の曲線は生データであるのに対して、下側の曲線は、ベースライン減算後の曲線である。このデータを、アルゴリズムの二次導関数、相対二次導関数、曲率、及び相対曲率で分析した。分析結果を下記表１に示す。存在するエルボーに対応して、２つのＣｔ値を与える。
【００５２】
【表１】
2010081937.tif 000024
【００５３】
曲線フィッティング及び曲率決定プロセスを含むＣｔ決定プロセスは、コンピュータシステムのプロセッサ上において稼動するコンピュータコードとして実施可能であることを理解されたい。このコードは、プロセッサを制御してＣｔ決定プロセスの様々な態様及び段階を実施するための命令を含んでいる。本コードは、通常、ハードディスク、ＲＡＭ、或いは、ＣＤやＤＶＤなどの携帯型の媒体上に保存される。同様に、これらのプロセスは、プロセッサに結合されたメモリユニット内に保存されているプロセッサ実行命令を含むサーモサイクラーなどのＰＣＲ装置内で実施することも可能である。このような命令を含むコードは、周知のように、コード供給源に対するネットワーク接続又は直接的な接続を介して、或いは、携帯型の媒体を使用することにより、ＰＣＲ装置のメモリにダウンロード可能である。
【００５４】
当業者であれば、本発明のエルボー決定プロセスは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃなどの様々なプログラミング言語、並びに、データの視覚化及び分析に有用な事前パッケージングされたルーチン、関数、及び手順を提供するＭａｔｈｅｍａｔｉｃａなどのアプリケーションを使用してコーディング可能であることを理解するであろう。後者の更なる例がＭＡＴＬＡＢ（登録商標）である。
【００５５】
或る実施態様において、本発明による方法は、例えばデータセットを入力するための入力装置、例えばキーボード、及びマウスなど；曲線領域内の当該特定の点を表すためのディスプレイ装置、例えばモニター；この方法における各ステップを実施するのに必要な処理装置、例えばＣＰＵ；ネットワーク・インターフェイス、例えばモデム、データセットを保存するためのデータ記憶装置、プロセッサ上で実行するコンピュータ・コード、などを含む常用のパーソナル・コンピュータシステムによって実施することができる。さらに、この方法は、ＰＣＲプロセス又はＰＣＲシステム内で実施することもできる。
【００５６】
本発明によるシステムの一例を図１５〜１６に示す。図１５は、本発明の方法及びシステムを実施するために使用することができるソフトウェア・リソースとハードウェア・リソースとの関係を説明する一般ブロック・ダイアグラムを示す。図１６に示すシステムは、サーモサイクラー装置内に配置することができる動的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータ・システムの部分であるインテリジェンスモジュールとを含む。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接接続を介して、分析モジュールからインテリジェンスモジュールへ、又はその逆の方向に転送される。データセットは例えば、図４、９、１０、１２及び１３、特に図４、１２及び１３に示されたフローチャートに従って処理することができる。これらのフローチャートは、例えば図１５に示されたフローチャートに従って、コンピュータシステムのハードウェア上に保存されたソフトウェアによって好都合に実施することができる。図１５を参照すると、コンピュータシステム（２００）は、例えばＰＣＲ反応中に得られた蛍光データを受信するための受信手段（２１０）と、本発明の方法に従って前記データを処理するための計算手段（２２０）と、計算手段によって得られた結果に従って前記データの一部を交換するための適用手段（２３０）と、コンピュータ・スクリーン上に結果を表示するための表示手段（２４０）とを含んでいてよい。図１６は、サーモサイクラー装置とコンピュータシステムとの相互作用を示す。システムは、サーモサイクラー装置内に配置することができる動的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータ・システムの部分であるインテリジェンスモジュールとを含む。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接接続を介して、分析モジュールからインテリジェンスモジュールへ、又はその逆の方向に転送される。データセットは、プロセッサ上で実行する、インテリジェンスモジュールの記憶装置上に記憶されたコンピュータ・コードによって、図１５に従って処理することができ、また処理後、分析モジュールの記憶デバイスに戻し転送することができ、ここで修正済データを表示装置上に表示することができる。
【００５７】
上述のように、本発明のシステム及び方法は、ポリメラーゼ連鎖反応データ内のステップ不連続性を取り除くのに有用である。例えばポリメラーゼ連鎖反応をモニタリングするために蛍光データを使用すると、本発明のシステム及び方法は、より正確なデータを提供する。このようなデータは、反応をモニタリングするのに有用であるだけではなく、技術的な効果、例えばＰＣＲ中に増幅された標的核酸の定量化、又は、得られたデータに基づくＰＣＲ反応条件の適合をももたらす。
【００５８】
本発明を例を挙げながら、そして具体的な実施態様に関して説明してきたが、本発明は、開示された実施態様に限定されるものではないことは明らかである。反対に、当業者には明らかなように、種々の変更形及び同様の配置にも本発明の範囲が及ぶものとする。従って、添付の特許請求の範囲は、全てのこのような変更形及び同様の配置を含むように、最も広範囲に解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【外国語明細書】
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