(57)【要約】【課題】プロピレングリコール濃縮物および／またはヒトの膀胱の移行上皮癌におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ−１（ＮＱＯ１）、シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐ４５０Ｒ）およびグルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ−１）タンパク質の発現を利用して、個々に標的化した膀胱癌処置を提供すること。【解決手段】膀胱癌を処置する方法であって、腫瘍内の少なくとも１つの酵素のレベルを決定する工程；該少なくとも１つの酵素のレベルに基づいて処置を選択する工程；および該処置を投与する工程であって、該処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤を、単独で、または別の処置と組み合わせてのいずれかで含む、工程を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００６年２月９日に出願した米国仮特許出願第６０／７７１，６７８号の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＥＯ９調合物および方法を用いた膀胱癌の処置に関連する。本発明は、プロピレングリコール濃縮物および／またはヒトの膀胱の移行上皮癌におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ−１（ＮＱＯ１）、シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐ４５０Ｒ）およびグルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ−１）タンパク質の発現を利用して、個々に標的化した膀胱癌処置を提供し得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
膀胱癌は、世界中で７番目に多い癌である。２０００年に、英国の男性において４番目に多い癌であり、その年９０００例の新規症例が診断された（非特許文献１）。２００２年、ヨーロッパにおいて推定２８０，０００例の膀胱癌が存在し、そして２００４年には米国において６０，０００例を超える新規症例が予測された。
【０００４】
最もよくある型の膀胱癌（約９０％）は、尿道システム（尿管、膀胱および尿道）の細胞裏打ち層である尿路上皮由来の、移行上皮癌（ＴＣＣ）である。移行上皮癌（ＴＣＣ）を、表在性（ｐＴａおよびｐＴ１）または筋肉浸潤性（≧ｐＴ２）のいずれかに分類し得る。現在、表在性ＴＣＣの処置は、経尿道的切除術（ＴＵＲＢＴ；すなわち、全ての見える病変の外科的切除）に続いて、補助的化学療法または免疫療法である。そのような処置の妥当性は、ＴＵＲＢＴ単独と比較した場合の、補助的化学療法後に観察される表在性腫瘍の再発の有意な抑制によって支持される（非特許文献２）。マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、エピルビシンおよびＢＣＧのような薬剤が日常的に使用されるが、ＴＣＣに対するより強力な、および／またはより毒性の低い薬剤を開発する必要性、または利益を得る可能性のある個人（または病理学的サブグループ）に対する標的化処置に関して、現在の治療薬をより良く使用する必要性が存在することが広く認識される。
【０００５】
マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）は、生体内還元性薬剤として知られる種類の化合物に属する、天然に存在するキノンに基づく抗新生物形成薬である（非特許文献３）。一般的に、生体内還元性薬剤はプロドラッグであり、細胞毒性代謝物を産生するために代謝活性化を必要とし、そして全て原則として、固体腫瘍のあまり灌流していない領域に存在する、低酸素性の細胞を根絶するために設計される。しかし、これらの薬剤はまた、腫瘍の有酸素部分も標的とし得る。
【０００６】
キノンに基づく生体内還元性薬剤の細胞毒性選択性（すなわち、低酸素および有酸素腫瘍細胞間の）を決定する重要なパラメーターは、そのプロドラッグを還元するために必要な特定の酵素レダクターゼの存在、および分子酸素が活性化過程を逆転する能力である（非特許文献４、５）（しかし、殺細胞の決定におけるレダクターゼおよび酸素分圧の相対的役割は、問題の化合物に依存して変動する（非特許文献４、６））。ＴＣＣの処置においてＭＭＣが日常的に使用されるという事実は、この疾患が、生体内還元性の活性化に必要な、適切な生化学的機構を有するということだけでなく、このクラスの他の化合物も、この疾患の処置に有用であり得ることを示唆する。有用であり得るさらなる化合物の２つの例は、インドールキノン誘導体ＥＯ９およびアジリジニルベンゾキノンＲＨ１を含む（非特許文献７、８）。
【０００７】
述べたように、キノンに基づく生体内還元性薬剤の、有酸素または低酸素細胞を根絶する能力は、レダクターゼの存在を含む腫瘍酵素学および低酸素との間の複雑な関係によって大部分決定される。いくつかのレダクターゼが、生体内還元性薬剤の活性化に関係付けられたが（４、６）、酵素シトクロムＰ４５０レダクターゼ（Ｐ４５０Ｒ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ−１（ＮＱＯ１）が相当注目された。低酸素の測定に関して、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ−１）または炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）のような内因性マーカーが、ピモニダゾールのような外来性低酸素マーカーと関連することが示された（９、１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ，  Ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  −  ＵＫ．  Ｌｏｎｄｏｎ，  ２００２
【非特許文献２】Ｔｏｌｌｅｙ  ＤＡ，  Ｐａｒｍａｒ  ＭＫ  Ｇｒｉｇｏｒ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｏｎ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｒｅｐｏｒｔ  ｗｉｔｈ  ７  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｆｏｌｌｏｗ  ｕｐ．  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １９９６；１５５：１２３３−８
【非特許文献３】Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ  ＡＣ，  Ｈｏｄｎｉｃｋ  ＷＦ，  Ｂｅｌｃｏｕｒｔ  ＭＦ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ：  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ  １９９４；６：５０１−８
【非特許文献４】Ｒｏｓｓ  Ｄ，  Ｂｅａｌｌ  ＨＤ，  Ｓｉｅｇｅｌ  Ｄ，  Ｔｒａｖｅｒ  ＲＤ，  Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ＤＬ．  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｒｕｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９６；Ｓｕｐｐｌ  ２７：Ｓ１−８
【非特許文献５】Ｗａｒｄｍａｎ  Ｐ，  Ｄｅｎｎｉｓ  ＭＦ，  Ｅｖｅｒｅｔｔ  ＳＡ，  Ｐａｔｅｌ  ＫＢ，  Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ＭＲ，  Ｔｒａｃｙ  Ｍ．  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｏｎｅ−ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｎ−ｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｑｕｉｎｏｎｅｓ：  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｒｕｇｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ  １９９５；６１  ：１７１−９４
【非特許文献６】Ｗｏｒｋｍａｎ  Ｐ，  Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ＩＪ．  Ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔ  Ｒｅｖ  １９９３；１２：７３−８２
【非特許文献７】Ｐｕｒｉ  Ｒ，  Ｂａｓｕ  Ｓ，  Ｌｏａｄｍａｎ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ＥＯｑｕｉｎ  （ＥＯ９）  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；９：６２４８Ｓ−９Ｓ
【非特許文献８】Ｄａｎｓｏｎ  Ｓ，  Ｗａｒｄ  ＴＨ，  Ｂｕｔｌｅｒ  Ｊ，  Ｒａｎｓｏｎ  Ｍ．  ＤＴ−ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ：  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ２００４；３０：４３７−４９
【非特許文献９】Ｈｏｓｋｉｎ  ＰＪ，  Ｓｉｂｔａｉｎ  Ａ，  Ｄａｌｅｙ  ＦＭ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＧＤ．  ＧＬＵＴ１  ａｎｄ  ＣＡＩＸ  ａｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ＡＲＣＯＮ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，８９：１２９０−７
【非特許文献１０】Ａｉｒｌｅｙ  ＲＥ，  Ｌｏｎｃａｓｔｅｒ  Ｊ，  Ｒａｌｅｉｇｈ  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  ＧＬＵＴ−１  ａｎｄ  ＣＡＩＸ  ａｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｒｖｉｘ：  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ，  ｌｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３；１０４：８５−９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、膀胱の表在性および浸潤性移行上皮癌（ＴＣＣ）における、腫瘍の低酸素および２つの重要なレダクターゼの発現の間の関係が重要である。さらに、様々な浸透プロファイルを有する、膀胱癌処置医薬品調製物の使用が、表在性対筋肉浸潤性腫瘍の標的化に必要である。本発明は、膀胱癌処置のこれらの局面に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
表在性および浸潤性腫瘍の間で、ＮＱＯ１発現における有意な差が見出され、筋肉浸潤性腫瘍において低いレベルで観察された。対照的に、Ｐ４５０ＲおよびＧｌｕｔ−１は、発現は腫瘍ステージと共に増加するが（特にＧｌｕｔ−１の場合）、ＴＣＣの全てのステージおよびグレードにおいて発現していた。それに加えて、Ｇｌｕｔ−１の発現は、Ｇ３腫瘍において有意に増加しており、一方ＮＱＯ１の存在は低レベルであった。これらの結果は、ＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１の発現における著しい差が、表在性および浸潤性膀胱ＴＣＣの間に存在することを示した。それに加えて、異なる浸透プロファイルを有する、キノンに基づく生体内還元性薬剤の医薬品調製物が見出された。
【００１１】
これらの結果は、その単剤療法におけるキノンに基づく生体内還元性薬剤は、表在性疾患に適切であり、一方筋肉浸潤性疾患に関しては、低酸素画分を標的化するキノンおよび有酸素画分を根絶する他の様式を用いた併用療法が望ましいという治療的意味を有する。さらに、表在性膀胱癌を処置する場合には、低い浸透プロファイルを有する医薬品調製物を採用し得、一方より筋肉浸潤性の膀胱癌を処置する場合には、より高い浸透プロファイルを有する医薬品調製物を採用し得る。合わせると、本発明のこれらの局面は、癌治療を、個人の疾患プロファイルの特定の特徴に合わせて作ることを可能にすることによって、膀胱癌の処置において重要な進歩を提供する。
【００１２】
具体的には、本発明による１つの実施態様は、腫瘍内の少なくとも１つの酵素のレベルを決定すること、および少なくとも１つの酵素レベルに基づいて処置を選択することを含む、膀胱癌を処置する方法を含み、ここでその処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤の単独、または別の処置と組み合わせた投与を含む。
【００１３】
別の実施態様において、その酵素は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ−１（ＮＱＯ１）およびＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼ（Ｐ４５０Ｒ）から成る群から選択される。特定の実施態様において、その酵素はＮＱＯ１であり、そしてその処置はキノンに基づく生体内還元性薬剤単独の投与を含む。別の特定の実施態様において、その酵素はＮＱＯ１であり、そしてその処置は、他の処置と組み合わせた、キノンに基づく生体内還元性薬剤の投与を含む。別の特定の実施態様において、その酵素はＰ４５０Ｒであり、そしてその処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤単独の投与を含む。さらに別の特定の実施態様において、その酵素はＰ４５０Ｒであり、そしてその処置は、他の処置と組み合わせた、キノンに基づく生体内還元性薬剤の投与を含む。本発明によるさらなる実施態様において、その酵素はＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり、そしてその処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤単独の投与を含む。さらに別の実施態様において、その酵素はＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり、そしてその処置は、他の処置と組み合わせた、キノンに基づく生体内還元性薬剤の投与を含む。
【００１４】
本発明による１つの実施態様はさらに、腫瘍内の低酸素のレベルを決定すること、および少なくとも１つの酵素レベルおよび低酸素レベルに基づいて処置を選択することを含む。特定の実施態様において、その低酸素レベルを、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ−１）および／または炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を測定することによって決定する。
【００１５】
本発明による特定の実施態様は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ−１（ＮＱＯ１）のレベル、ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼ（Ｐ４５０Ｒ）のレベル、およびグルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ−１）のレベルから成る群から選択される尺度に基づいて処置を選択することを含む、膀胱癌を処置する方法を含み、ここでその処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤の、単独または他の処置と組み合わせた投与を含む。この特定の実施態様の様々な局面において：その尺度はＮＱＯ１またはＰ４５０Ｒであり得、そしてその処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤単独の投与を含む；その尺度はＮＱＯ１またはＰ４５０Ｒであり得、そしてその処置は、他の処置と組み合わせた、キノンに基づく生体内還元性薬剤の投与を含む；その尺度はＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり得、そしてその処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤単独の投与を含む；その尺度はＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり得、そしてその処置は、他の処置と組み合わせた、キノンに基づく生体内還元性薬剤の投与を含む；またはその尺度はＮＱＯ１、Ｐ４５０ＲおよびＧｌｕｔ−１であり得、そしてその処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤の、単独または他の処置と組み合わせた投与を含む。
【００１６】
本発明による１つの実施態様において、本発明は、腫瘍内のＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１のレベルを決定すること；当該ＮＱＯ１レベルは、もし当該腫瘍が表在性ならば観察されるよりも低く、そして当該Ｇｌｕｔ−１レベルは、もし当該腫瘍が表在性ならば観察されるよりも高いので、別の処置と組み合わせた、キノンに基づく生体内還元性薬剤を含む併用療法を選択することを含む、浸潤性膀胱癌を処置する方法を含む。
【００１７】
本発明による別の実施態様において、本発明は、患者の膀胱腫瘍におけるＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１の発現レベルを決定すること；およびもし当該患者が高レベルのＮＱＯ１を有する表在性膀胱癌を有するなら、生体内還元性薬剤を単一薬剤療法として投与すること、またはもし当該患者が低いＮＱＯ１および高いＧｌｕｔ−１レベルを有する浸潤性膀胱癌を有するなら、生体内還元性薬剤を放射線療法または別の化学療法剤と組み合わせて使用する併用療法を投与することを含む、当該患者の膀胱腫瘍におけるＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１の発現レベルに基づいて、膀胱癌の適切な処置に関して該患者を分類する方法を含む。
【００１８】
本発明による特定の実施態様において、他の処置は、放射線療法および／または少なくとも１つの化学療法剤の投与である。
【００１９】
様々な実施態様において、特に有用なキノンに基づく生体内還元性薬剤は、マイトマイシンＣ、インドールキノン誘導体ＥＯ９、アジリジニルベンゾキノン（ＲＨ１）、およびその組み合わせから成る群から選択される。
【００２０】
本発明はまた、医薬品調製物を含む。具体的には、本発明による１つの実施態様は、約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰＧ、約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰＧ、および約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰＧから成る群から選択される濃度のプロピレングリコール（ＰＧ）濃度の溶液中にＥＯ９を含む医薬品調製物を含む。ＥＯ９濃度は、約３００μＭから約４００μＭの範囲に存在し得る。特定の実施態様において、その調製物は、約３４７μＭのＥＯ９濃度を有する溶液を含む。
【００２１】
本発明による医薬品調製物はさらに、ＮａＨＣＯ３、ＥＤＴＡ、マンニトール、および水を含み得る。１つの実施態様において、その調製物は、約１０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３を含む。特定の実施態様において、その調製物は、約１００ｍｇ／ｍＬまたは約１００．２５ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３を含む。別の特定の実施態様において、その調製物は、約５０ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３、または５０．１２５ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３を含む。別の実施態様において、その調製物は、約０．５ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬのマンニトールを含む。特定の実施態様において、その調製物は、約０．６２５ｍｇ／ｍＬのマンニトールを含む。別の特定の実施態様において、その調製物は、１．２５ｍｇ／ｍＬのマンニトールを含む。別の特定の実施態様において、その調製物は、約１００ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３、約０．６２５ｍｇ／ｍＬのマンニトール、および約０．１ｍｇ／ｍＬのＥＯ９を、ＥＤＴＡ、ＰＧおよび水を含む溶液中に含む。
【００２２】
本発明による１つの実施態様は、ＰＧ、ＥＤＴＡおよび水を含む溶液中にＥＯ９、ＮａＨＣＯ３およびマンニトールを含む医薬品調製物を含み、ここでＰＧは溶液中に約６％から約１４％ｖｏｌ／ｖｏｌ；約１６％から約２４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、および約２６％から約３４％ｖｏｌ／ｖｏｌから成る群から選択されるパーセンテージの範囲で存在する。別の実施態様において、ＰＧは溶液中に約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、および約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌから成る群から選択されるパーセンテージで存在する。別の実施態様において、その調製物は、約３４７μＭのＥＯ９濃度、および約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰＧ濃度を有する溶液を含む。さらに別の実施態様において、その調製物は、約３４７μＭのＥＯ９濃度、および約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰＧ濃度を有する溶液を含む。さらなる実施態様において、その調製物は、約３４７μＭのＥＯ９濃度、および約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰＧ濃度を有する溶液を含む。これらの説明された本発明の実施態様は、約１０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３を含み得、そして１つの特定の実施態様において約１００、約１００．２５、または約５０．１２５ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３を含む。これらの説明された本発明の実施態様はまた、約０．５ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬのマンニトールを含み得、そして１つの特定の実施態様において約０．６２５または約１．２５ｍｇ／ｍＬのマンニトールを含む。
【００２３】
本発明の１つの実施態様は、医薬品調製物を含み得、ここでその調製物は、約３４７μＭのＥＯ９濃度、約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰＧ濃度、約１００．２５ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３、および約０．６２５ｍｇ／ｍＬのマンニトールを含む溶液を含む。別の実施態様は、医薬品調製物を含み得、ここでその調製物は、約３４７μＭのＥＯ９濃度、約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰＧ濃度、約１００．２５ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３、および約０．６２５ｍｇ／ｍＬのマンニトールを含む溶液を含む。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば以下の方法などが提供される： 
（項目１）
膀胱癌を処置する方法であって、
腫瘍内の少なくとも１つの酵素のレベルを決定する工程；
該少なくとも１つの酵素のレベルに基づいて処置を選択する工程；および
該処置を投与する工程であって、該処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤を、単独で、または別の処置と組み合わせてのいずれかで含む、工程
を包含する、方法。
（項目２）
前記酵素が、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ−１（ＮＱＯ１）およびＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼ（Ｐ４５０Ｒ）からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記酵素がＮＱＯ１であり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を単独で投与することを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記酵素がＮＱＯ１であり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を別の処置と組み合わせて投与することを含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記酵素がＰ４５０Ｒであり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を単独で投与することを含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記酵素がＰ４５０Ｒであり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を別の処置と組み合わせて投与することを含む、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記酵素がＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を単独で投与することを含む、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記酵素がＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を別の処置と組み合わせて投与することを含む、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記方法が、
腫瘍内の低酸素のレベルを決定する工程；
前記少なくとも１つの酵素レベルおよび該低酸素レベルに基づいて処置を選択する工程；ならびに
該処置を投与する工程であって、該処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤を単独で、または別の処置と組み合わせてのいずれかで含む、工程
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記低酸素レベルが、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ−１）および／または炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を測定することにより決定される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記別の処置が、放射線療法および／または少なくとも１つの化学療法剤の投与である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記キノンに基づく生体内還元性薬剤が、マイトマイシンＣ、インドールキノン誘導体ＥＯ９、アジリジニルベンゾキノン（ＲＨ１）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
膀胱癌を処置する方法であって、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ−１（ＮＱＯ１）のレベル、ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼ（Ｐ４５０Ｒ）のレベル、およびグルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ−１）のレベルからなる群より選択される尺度に基づいて処置を選択する工程を包含し、該処置は、キノンに基づく生体内還元性薬剤を単独で、または別の処置と組み合わせてのいずれかで投与することを含む、方法。
（項目１４）
前記尺度がＮＱＯ１またはＰ４５０Ｒであり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を単独で投与することを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記尺度がＮＱＯ１またはＰ４５０Ｒであり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を別の処置と組み合わせて投与することを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記尺度がＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を単独で投与することを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記尺度がＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を別の処置と組み合わせて投与することを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記尺度がＮＱＯ１、Ｐ４５０ＲおよびＧｌｕｔ−１であり、前記処置が、キノンに基づく生体内還元性薬剤を単独でまたは別の処置と組み合わせて投与することを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記別の処置が、放射線療法および／または少なくとも１つの化学療法剤の投与である、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記キノンに基づく生体内還元性薬剤が、マイトマイシンＣ、インドールキノン誘導体ＥＯ９、アジリジニルベンゾキノン（ＲＨ１）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
浸潤膀胱癌を処置する方法であって、
腫瘍内のＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１のレベルを決定する工程；
該ＮＱＯ１レベルは、該腫瘍が表在性であるならば観察されるレベルよりも低く、該Ｇｌｕｔ−１レベルは、該腫瘍が表在性であるならば観察されるレベルよりも高いことに基づいて、別の処置と組み合わせたキノンに基づく生体内還元性薬剤を含む組み合わせ処置を選択する工程
を包含する、方法。
（項目２２）
患者の膀胱腫瘍内のＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１の発現レベルに基づいて膀胱癌の適切な治療について該患者を分類する方法であって、
該患者の膀胱腫瘍内のＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１の発現レベルを決定する工程；ならびに
該患者が、高レベルのＮＱＯ１を有する表在性膀胱癌を有するならば、生体内還元性薬剤を単剤治療として投与するか、または該患者が、低いＮＱＯ１レベルおよび高いＧｌｕｔ−１レベルを有する浸潤膀胱癌を有するならば、生体内還元性薬剤が放射線療法若しくは別の化学療法剤と組合せて用いられる組み合わせ療法を投与する工程
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、膀胱の移行上皮癌を有する３人の患者における、ＮＱＯ１、Ｐ４５０ＲおよびＧｌｕｔ−１の免疫組織化学的分析を示す。
【図２】図２は、多細胞層を通じた薬剤の浸透を研究するために使用した装置を示す。
【図３】図３は、薬剤溶液調製の概略表示を示す。
【図４】図４は、内部標準としてＷＶ１４を加えた、ブランクサンプルのクロマトグラムを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＲＭＩ１６４０培養物中の、ＥＯ９標準品のクロマトグラムを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＲＭＩ１６４０培養物中の、ＥＯ９標準品のクロマトグラムを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、０．１％のＤＭＳＯ中のＥＯ９標準品のクロマトグラムを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、３０％のプロピレングリコール（ＰＧ）中のＥＯ９標準品のクロマトグラムを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、２０％のＰＧ中のＥＯ９標準品のクロマトグラムを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、１０％のＰＧ（６Ｄ）中のＥＯ９標準品のクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、０．１％のＤＭＳＯおよび様々なＰＧ濃度（３０％；２０％；１０％）中のＥＯ９の較正曲線を示す。
【図８】図８は、ＤＬＤ−１多細胞層を通じた、様々なＰＧ濃度中のＥＯ９の浸透を示す。
【図９】図９は、染色したＤＬＤ−１多細胞層の代表的な横断面を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
キノンに基づく生体内還元性薬剤は、プロドラッグであり、酵素的活性化の後、細胞毒性種を産生する。２電子レダクターゼ酵素である、その酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ−１（ＮＱＯ１；ＤＴ−ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とも呼ばれる）が、有酸素条件下で、キノンに基づく生体内還元性薬剤の活性化に主な役割を果たす。キノンに基づく生体内還元性薬剤はまた、低いＮＱＯ１活性を有する細胞を含む低酸素条件下で細胞毒性である。シトクロムＰ４５０レダクターゼのような１電子還元酵素は、低酸素条件下で、キノンに基づく生体内還元性薬剤の活性化により主要な役割を果たし得る。前述のことに基づいて、これらのレダクターゼのレベルおよび低酸素条件が、様々なキノンに基づく生体内還元性薬剤を使用する適切さを含む、異なる癌処置の適切さを示し得る。従って本発明は、様々なグレードおよびステージのＴＣＣにおいて、記載されたレダクターゼのレベルおよび低酸素条件を評価した。
【００２７】
様々な浸透プロファイルを有するキノンに基づく生体内還元性薬剤を含む医薬品調製物を提供することに基づいて、膀胱癌の処置における改善も起こり得る。例えば、より低い浸透プロファイルを有する医薬品調製物は、薬剤が、処置が最も必要である膀胱の表面により近く留まるので、表在性膀胱癌を処置する場合に使用するのに有用である。逆に、より高い浸透プロファイルを有する医薬品調製物は、それらの場合に処置が最も必要である膀胱のより深い層へ薬剤が浸透するので、より筋肉浸潤性の膀胱癌を処置する場合に有用である。合わせると、本発明の様々な局面は、個人の疾患プロファイルの特定の特徴に合わせて癌処置を行うことを可能にすることによって、膀胱癌の処置における重要な進歩を提供する。
【００２８】
以下の構造式を有する、ＥＯ９またはＮＳＣ−３８２４５９としても知られる、アパジコン（ｐｒｏｐ．ＩＮＮ，ＵＳＡＮ）、（３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−メチル−２−（１Ｈ−インドール−４，７−ジオン）−プロペノール：
【００２９】
【化１】
2010116416.tif 000002
は、完全合成の生体内還元性アルキル化インドロキノン（ｉｎｄｏｌｏｑｕｉｎｏｎｅ）である。ＥＯ９の基本的な活性化のメカニズムは、他のインドロキノンのものと同様と考えられ、それぞれセミキノンおよびヒドロキノンを形成する、１つまたは２つの電子を転移する細胞酵素による還元を含む。有酸素条件下でのセミキノンの酸化は、酸化還元サイクルを引き起こし、それは活性酸素種（ＲＯＳ）を形成し、ＤＮＡ鎖の切断を引き起こすことによって細胞死を引き起こし得る。セミキノン／ヒドロキノンは、特に低酸素条件下で、ＤＮＡおよび他の高分子をアルキル化および架橋して、細胞死を引き起こし得る。ＥＯ９は、本発明で使用するために適切な、キノンに基づく生体内還元性薬剤の１つの制限しない例である。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
Ｉ．材料および方法
Ａ．ヒト組織
まず医学研究会議の規定に従って、地域研究倫理委員会（ＬＲＥＣ）から同意を得た後、ヒト膀胱移行上皮癌のホルマリン固定、パラフィン包埋標本（ｎ＝５２）をこの研究のために使用した。全ての患者の詳細は匿名にして機密性を保証し、そして全ての実験を、ＬＲＥＣによって規定されたガイドラインに従って行った。本研究のために使用した腫瘍は、ヒト膀胱ＴＣＣの表在性（１９  ｐＴａ；１９  ｐＴ１）および筋肉浸潤性（１４  ≧ｐＴ２）ステージ両方の、全てのグレード（１１  グレード１；２６  グレード２；１５
グレード３）を代表していた。組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の構築および続く免疫組織化学的分析のために、全ての腫瘍塊を使用した。
【００３１】
Ｂ．組織マイクロアレイの構築
組織マイクロアレイ構築物（ＴＭＡ）を、ヒト膀胱ＴＣＣの様々なグレード（Ｇ１−Ｇ３）および様々なステージ（ｐＴａ、ｐＴ１、≧ｐＴ２）を代表するために、パラフィン包埋ブロックから構築した。組織マイクロアレイ構築物（ＴＭＡ）を、本明細書中で参考文献に組み込まれる、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆら（１１）の修飾した方法を用いて、Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓマイクロアレイヤー（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて達成した。簡単には、パラフィン包埋ドナーブロックそれぞれの切片を、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色し、顕微鏡で調査し、そして関心のある組織を含む領域を、ワックスブロック上にマークした。円筒形のコア（６００μＭ）を、これらの代表的な領域からパンチ生検し、そしてレシピエントブロックに移した。組織のサンプリングは、各腫瘍ブロックから４つのコアを使用して、各親ブロックについて代表的なデータを提供した。ＴＭＡブロックあたり２６人の患者を代表する全部で１０８のコアサンプルが含まれ、そして２つのＴＭＡブロックを構築した。５μＭの厚さの切片を、レシピエントＴＭＡブロックから切断し、そしてテープトランスファーシステム（ｔａｐｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ、ＵＳＡ）を用いてスライドグラスに載せた。各マイクロアレイブロックから切断される、最初および続く１０個の切片ごとに、組織学およびサンプルの完全性の確認のためにＨ＆Ｅ染色を行った。ついでＴＭＡスライドを、免疫組織学的分析にかけた。
【００３２】
Ｃ．抗体
使用した抗体は、ＮＱＯ１に対するマウスモノクローナル抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＵＳＡのＤｒｓ．Ｓｉｅｇｅｌ  およびＲｏｓｓによって提供された）、Ｐ４５０Ｒに特異的なヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）、Ｋｉ６７に対するマウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）、およびグルコーストランスポーター−１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＧＬＵＴ−１；Ｄａｋｏ、ＵＫ）を含んでいた。
【００３３】
Ｄ．免疫組織化学
ＮＱＯ１、Ｐ４５０Ｒ、ＧＬＵＴ−１およびＫｉ６７の免疫局在性を、以前に記載されたように（９、１０、１２、１３）および当業者によって理解されるように、免疫組織化学によって評価した。簡単には、抗原の回収および非特異的免疫グロブリン結合の阻害の後、ＴＭＡを適切な一次抗体とインキュベートした：１：１のＴＢＳＴＭ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、５％の脱脂粉乳）で希釈した抗ＮＱＯ１抗体と約６０分間インキュベートした；ＰＢＳで１：１００に希釈したＰ４５０Ｒについては約９０分間インキュベートした；ＰＢＳで１：２５に希釈した抗Ｇｌｕｔ−１抗体と約９０分間インキュベートした；またはＰＢＳで１：１００に希釈した抗Ｋｉ６７抗体と、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体の代わりに、普通のＩｇＧを用いてコントロールを行った。適切なビオチン化二次抗体（１：２００に希釈；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、ＵＳＡ）を用い、続いてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、ＵＳＡ）を用いてシグナルを増幅し、そして３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、ＵＳＡ）で可視化することによって、免疫局在化（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ）を達成した。次いで切片を、Ｈａｒｒｉｓ’ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、透明にし、そしてＤＰＸマウンタント（ＤＰＸ  ｍｏｕｎｔａｎｔ；Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）中で標本を乗せた。
【００３４】
Ｅ．免疫組織化学的染色の半定量的分析
陽性の免疫染色を、３人の独立した観察者が半定量的に得点をつけた。ＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒはどちらも、腫瘍内で細胞質に局在化していた。染色の強度および分布に基づく、各腫瘍コアの上皮部分のスコアを、０（染色なし）から４（最大の染色強度）まで割り当てた。平均スコアリング強度を、独立した観察者の結果から、ＴＭＡの各コアおよび各腫瘍に関して計算した。その結果を、臨床病理学的なパラメーターに対するあらゆる関連および相関に関して比較した。
【００３５】
各ＴＭＡコアにおけるＧｌｕｔ−１陽性のレベルを分析し、そして膜染色を示す腫瘍細胞のおおよそのパーセンテージを表す０から４までのスコアを割り当てた（０＝染色なし；１＝０−５％陽性；２＝５−１５％陽性；３＝１５−３０％陽性；４＝＞３０％陽性）。平均スコアリング強度を、独立した観察者の結果から、ＴＭＡの各コアおよび各腫瘍に関して計算した。その結果を、臨床病理学的なパラメーターに対するあらゆる関連および相関に関して比較した。
【００３６】
本明細書中で参考文献に組み込まれる、Ｓａｎｔｏｓら（１３、１４）によって報告されたように、各コアおよび腫瘍に関して、４０倍の倍率を用いて、腫瘍細胞におけるＫｉ６７陽性核のパーセンテージを計算した。全部でコアあたり２００個の細胞および腫瘍あたり８００個の細胞を計測し、そして陽性パーセンテージを計算した。２人の観察者によって独立に点数をつけた。その結果を、臨床病理学的なパラメーターに対するあらゆる関連および相関に関して比較した。
【００３７】
Ｆ．統計学的分析
ＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒの発現を、以下の臨床病理学的パラメーターと比較した：腫瘍ステージ、腫瘍グレード、腫瘍低酸素（Ｇｌｕｔ−１発現）、および増殖。ＳＰＳＳソフトウェアパッケージ、バージョン１１．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて、統計学的分析を行った。免疫組織化学的研究において、発現が正常に分布していないので、各カテゴリーの平均発現値は、四分位範囲を有する中央値として報告された。独立した変数間の差を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕテストによって決定した。両側分析における０．０５より小さいＰの値を、有意と考えた。
【００３８】
ＩＩ．結果
Ａ．ＮＱＯ１タンパク質レベル、腫瘍ステージおよびグレード間の関係
ＮＱＯ１は、全ての病理学的グレードおよびステージの膀胱腫瘍の上皮において、細胞質に局在化しており、そしてＮＱＯ１の発現は、腫瘍間で変動した（図１、表１）。多くの場合において、同じ腫瘍内でＮＱＯ１の不均一な発現パターンが観察され、同じサンプル内でＮＱＯ１発現の高いおよび低い領域があった（データは示していない）。ＮＱＯ１は、全ての病理学的ステージ（ｐＴａ、ｐＴ１、≧ｐＴ２）の腫瘍において発現していたが、ＮＱＯ１の発現レベルは、様々なステージの間で異なっていた（表１）。ＮＱＯ１発現における有意な差は、表在性腫瘍（ｐＴａ＋ｐＴ１）および筋肉浸潤性腫瘍（≧ｐＴ２）の間で観察され、筋肉浸潤性腫瘍において、発現は有意に低かった（ｐ＝０．０２）。ＮＱＯ１発現の腫瘍浸潤可能性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）に対する逆の関係が、非浸潤性（ｐＴａ）および浸潤性（ｐＴ１＋≧ｐＴ２）腫瘍の間に観察された発現の有意な差によってさらに強化される（ｐ＝０．０３）。全ての病理学的グレードのＴＣＣがＮＱＯ１を発現していた（表１）。ＮＱＯ１の発現は、グレード１またはグレード３のいずれかと比較して、グレード２の腫瘍において有意に高かった（表１）。高度に分化した（グレード１）およびあまり分化していない（グレード３）腫瘍の間に、有意な差は観察されなかった（表１）。
【００３９】
Ｂ．Ｐ４５０Ｒタンパク質の発現および腫瘍ステージおよびグレードの間の関係
調査した全ての腫瘍は、細胞質に局在化した、検出可能なレベルのＰ４５０Ｒを発現していた。ＮＱＯ１と対照的に、Ｐ４５０Ｒの発現は、一般的に腫瘍内で均一であった。代表的な免疫染色を、図１に描写する。Ｐ４５０Ｒは、全てのステージのＴＣＣに発現していた（表１）。Ｐ４５０Ｒのレベルは、表在性（ｐＴａ＋ｐＴ１）腫瘍と比較して、筋肉浸潤性腫瘍（≧ｐＴ２）において有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。ＮＱＯ１と対照的に、Ｐ４５０Ｒの発現は、腫瘍ステージの増加と正の関係を示すが、浸潤性（ｐＴ１＋≧ｐＴ２）および非浸潤性（ｐＴａ）腫瘍の間に有意差が観察されないことから明らかであるように、腫瘍の浸潤可能性とは関連しない（表１）。全ての病理学的グレードのＴＣＣが、Ｐ４５０Ｒを発現していた（表１）。Ｐ４５０Ｒのレベルおよび腫瘍グレードの増加の間に、正の相関が観察された（表１）。
【００４０】
Ｃ．Ｇｌｕｔ−１および腫瘍ステージおよびグレードの間の関係
Ｇｌｕｔ−１タンパク質の発現は、個々の腫瘍標本内でも、および個々の患者サンプル間でも不均一であった。代表的な免疫染色およびその腫瘍ステージおよびグレードとの関係を、図１および表１にそれぞれ示す。Ｇｌｕｔ−１タンパク質は、調査した全てのステージおよびグレードにおいて発現していたが、Ｇｌｕｔ−１のレベルは、≧ｐＴ２腫瘍（ｐＴａ腫瘍と比較して、ｐ＝０．０５）、およびグレード３腫瘍（グレード１［Ｐ＝０．０３］およびグレード２［Ｐ＜０．０１］腫瘍の両方と比較して）において有意に高かった。それに加えて、統計学的に有意な差（ｐ＝０．０２）が、非浸潤性（ｐＴａ）および浸潤性（ｐＴ１＋≧ｐＴ２）腫瘍の間に存在し、浸潤性疾患は、より高いＧｌｕｔ−１タンパク質の発現と、そして従ってより高いレベルの低酸素と関連していることを示唆する。
【００４１】
Ｄ．Ｋｉ６７、腫瘍ステージ、腫瘍グレード、および酵素学の間の関係
Ｋｉ６７抗原の発現レベルを、腫瘍増殖指数の指標として使用した（表１）。予測されるように、腫瘍グレードの増加（分化の減少）および増殖指数の間に、有意な相関が観察された（ｐ＜０．０１）。腫瘍増殖および腫瘍浸潤可能性（ｐＴａ対ｐＴ１＋≧ｐＴ２）の間に、関係は観察されなかった。対照的に、おそらく筋肉浸潤およびより高い腫瘍グレードの間の関係の結果として、腫瘍増殖は、表在性腫瘍（ｐＴａ＋ｐＴ１［Ｐ＜０．０１］）と比較して、筋肉浸潤性腫瘍（≧ｐＴ２）において有意に高かった。興味深いことに、腫瘍増殖指数およびＧｌｕｔ−１発現（Ｐ＝０．０１）およびＰ４５０Ｒ発現（Ｐ＜０．０１）の両方の間に有意な関係が観察されたが、ＮＱＯ１発現とは観察されなかった。
【００４２】
この研究の結果は、キノンに基づく化合物の生体内還元性活性化に関与する重要な酵素のタンパク質発現、およびＧｌｕｔ−１タンパク質レベルによって決定される低酸素の存在が、膀胱ＴＣＣのステージおよびグレードによって変化することを示す。最も印象的な観察は、ＮＱＯ１タンパク質発現が、腫瘍ステージの増加と共に有意に減少するという事実である（表１）。腫瘍グレードに関して、Ｇ３腫瘍は、Ｇ２（しかしＧ１ではない）腫瘍より低いレベルのＮＱＯ１を有するという証拠も存在する。これらの知見は、ＮＱＯ１
ｍＲＮＡ発現および腫瘍ステージの増加の間の逆の関係が報告された（１５）、以前に発表された研究と一致している。Ｇｌｕｔ−１に関して同様に、腫瘍グレード（Ｇ１およびＧ２をＧ３腫瘍とそれぞれ比較した場合、Ｐ＝０．０３および＜０．０１）、および腫瘍ステージ（ｐＴａ腫瘍を≧ｐＴ２腫瘍と比較した場合、Ｐ＝０．０５）と共に増加するタンパク質発現は、以前の報告と一致する（１６）。筋肉浸潤性ＴＣＣと比較して、表在性ＴＣＣにおけるＰ４５０Ｒ  ｍＲＮＡのより高いレベル示す、以前に発表された報告と対照的に（１５）、この研究においては、Ｐ４５０Ｒタンパク質レベルは、筋肉浸潤性（ｐＴａ＋ｐＴ１と比較した≧ｐＴ２）疾患において有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。それに加えて、Ｐ４５０Ｒタンパク質発現は、腫瘍グレードの増加（分化の低下）と正の相関を示す（表１）。興味深いことに、おそらくＰ４５０Ｒ、Ｋｉ６７、および腫瘍グレードの増加（分化の低下）の間の強い関連の結果として、Ｐ４５０Ｒの発現はまた、増殖指数と強い正の相関を示した（Ｐ＜０．０１）。それにもかかわらず、高い増殖指数は、膀胱癌における悪い予後と関連することが示されたので（１７、１８）、Ｐ４５０Ｒを含む生体内還元性の処置を評価する場合にはこれを心にとめておくべきである。まとめると、免疫組織化学によるタンパク質発現の分析は、Ｇｌｕｔ−１発現によって示されるような低酸素は、腫瘍ステージ、グレード、および腫瘍浸潤の増加と関連することを示唆する。腫瘍酵素学に関して、この研究は、ＮＱＯ１レベルは、腫瘍ステージ（および浸潤可能性）の増加の関数として有意に減少し、一方Ｐ４５０Ｒレベルは腫瘍グレードおよび浸潤可能性と共に増加することを示唆する。
【００４３】
これらの知見は、膀胱ＴＣＣの処置において、キノンに基づく生体内還元性薬剤を使用する潜在的な治療戦略に重要な意味を有する。ＭＭＣ、ＥＯ９、およびＲＨ１に対する細胞の反応は、ＮＱＯ１レベルだけでなく腫瘍低酸素レベルにも依存性であることを示す、前臨床モデルにおける広範な証拠が存在する。ＭＭＣに関して、有酸素条件下での細胞の反応の決定におけるＮＱＯ１の役割は議論の的であるが、低酸素条件下では、ＮＱＯ１活性が低いまたは無い細胞においてのみ、有意な活性の増強が見られる（１９）。ＥＯ９およびＲＨ１の場合、低酸素条件下で同様の結果が得られ、低いＮＱＯ１を有する細胞においてのみ、著しい活性の増強が見られた（２０、２１）。しかし、有酸素条件下では、ＮＱＯ１活性および化学感受性（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の間に高い相関が存在し、酸素の存在下でＮＱＯ１はＥＯ９およびＲＨ１の活性化に主要な役割を果たすことを示唆する（２２、２３）。これらの観察を説明するメカニズムの基礎は明らかではないが（２４）、低酸素条件下で、Ｐ４５０Ｒのような１電子レダクターゼが、生体内還元性活性化過程においてより影響のある役割を想定する（２５）。これらの知見に基づいて、ＥＯ９およびＲＨ１のような化合物は、ＮＱＯ１を多く含む腫瘍の有酸素画分（そしてＭＭＣもそうであるが程度はより低い）、またはＰ４５０Ｒのような１電子レダクターゼが存在すると仮定してＮＱＯ１を欠く腫瘍の低酸素画分を標的とする。ＮＱＯ１を多く含む腫瘍の場合には、従って有酸素画分を標的とする、単一薬剤としてのＥＯ９およびＲＨ１のような化合物の使用が適切である。有意な低酸素画分を有する、ＮＱＯ１を欠く腫瘍に関しては、これらの薬剤は、放射線療法または有酸素画分を標的とする他の化学療法剤と組み合わせて使用するべきである。この研究の結果は、この後者の戦略は、これらは典型的に低いＮＱＯ１タンパク質発現（およびおそらくより高いＰ４５０Ｒ発現）を有し、そして有意な低酸素領域を含むので、より進行した膀胱のＴＣＣ（すなわち≧ｐＴ２）またはより悪性度の高い疾患（すなわちグレード３腫瘍）の場合に有効であり得ることを示唆する。この特定の関係において、放射線化学療法（根治的放射線療法と組み合わせたマイトマイシンＣプラス５フルオロウラシル）を用いた筋肉浸潤性膀胱癌において、有望な結果が得られたことに注目することは興味深いが、ＮＱＯ１および低酸素マーカーの分析は、この研究のデザインに含まれていなかった（２６）。より広い関係において、これまたは他の研究において、表在性および筋肉浸潤性膀胱ＴＣＣがどちらも有意な低酸素領域を有することを示したことは、これらの腫瘍は、他の生体内還元性薬剤または低酸素による治療を評価するための魅力的な候補であることを示唆する。
【００４４】
結論として、この研究の結果は、キノンに基づく化合物の生体内還元性活性化および低酸素の存在に関わる重要な酵素のタンパク質発現は、膀胱のＴＣＣにおける腫瘍ステージおよびグレードの関数として変化することを示した。これらの結果は、これらの腫瘍（すなわち≧ｐＴ２およびＧ３腫瘍）は、放射線照射または細胞の有酸素画分を標的とした他の化学療法剤と組み合わせた、低酸素画分を標的とするキノン（例えばＭＭＣ、ＥＯ９、およびＲＨ１）を用いた化学放射線療法レジメのよい候補であることを示唆する。これらの原理に基づいて、そして図１をもう一度参照して、症例Ａ（ｐＴ２  Ｇ３）は、低いＮＱＯ１、高いＰ４５０Ｒ、および高いＧｌｕｔ−１レベルを示し、そして従ってキノンを用いた化学放射線療法のよい候補である。症例Ｂ（ｐＴａ  Ｇ１）は、高いＮＱＯ１、低いＰ４５０Ｒおよび中程度のＧｌｕｔ−１を有し、そしてそれなりにキノンに基づく化学療法によく反応する。中程度のＮＱＯ１、中程度のＰ４５０Ｒおよび中程度のＧｌｕｔ−１を有する症例Ｃ（ｐＴ１  Ｇ２）も、キノンに基づく化学療法によく反応すると予測される。これらのマーカーに関して個々の患者の腫瘍をプロファイリングすることは、特に存在する著しい患者間の不均一性（特にＮＱＯ１に関する）の観点から、重要なままである。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、患者のために適切な処置を決定するために酵素レベルを使用する場合、酵素の「高い」対「低い」レベルを、関連する腫瘍からの関心のある酵素レベルを、同じ患者の他の腫瘍と、別の患者の腫瘍と、および／または標準的な腫瘍細胞系統と、または当業者に公知の他の入手可能な参照ポイントと比較することによって確かめ得る。従って、「高い」および「低い」レベルを、処置医師、または特定の患者の腫瘍酵素レベルを測定するおよび／または定量することに関与する他の試験、研究、または処置人員によって決定し得る。
【００４６】
（実施例２）
Ｉ．材料および方法
Ａ．装置および一般的なアッセイ原理
図２に示すように、記載した実験において使用する装置は、２４穴培養プレートの１つのウェルに挿入された、トランスウェルインサート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔ；Ｃｏｓｔａｒ）を含んでいた。そのインサートは、その底部にコラーゲンでコートした膜を有し、そして従って上部および下部容器の間のバリアおよび細胞が接着および増殖し得る表面の両方を形成した。この研究で使用した細胞系統は、ＤＬＤ−１ヒト結腸腺癌細胞であり、それが細胞間に強力な接合部を形成し、それによって薬剤が越さなければならない連続的な「バリア」を形成する能力のためにそれを選んだ。薬剤の浸透を評価するために、薬剤を上部容器に加え、そして下部容器における薬剤の濃度を、ある範囲の時間間隔にわたって決定した。
【００４７】
Ｂ．細胞培養条件
ＤＬＤ−１細胞は、日常的に１０％胎児ウシ血清、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（５０ＩＵ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）を加え、そしてＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）で緩衝化したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。ＤＬＤ−１細胞（２００μｌの培地中２．５×１０５）を、上部容器に加え、そしてＣＯ２を高めた（５％）雰囲気中で、３７℃で約３時間、安定させそして膜に接着させた。一旦細胞が接着したら、トランスウェルを２４穴プレートの１つのウェルに挿入し、そして６００μｌの培地を下部容器に加えた。次いで装置を、上部および下部容器両方の培地を毎日替えて、３７℃で４日間インキュベートした。以前の研究に基づいて、培養４日後の多細胞層の厚さは、約５０μｍである。各アッセイに関して、３つのトランスウェルを、組織学的調査および厚さおよび完全性の正確な決定のために除去した（詳細に関しては下記を参照のこと）。
【００４８】
Ｃ．薬剤溶液の調製
以下の溶液を、下記で記載し、そして図３でまとめたように調製した。
【００４９】
１．溶液１：０．１％ＤＭＳＯ中のＥＯ９（３４７μＭ）
固体ＥＯ９を、１００％ＤＭＳＯに溶解して、３４７ｍＭのストック溶液を作成した。１０μｌのストック溶液を、１０ｍｌの完全ＲＰＭＩ培地（フェノールレッドを含まない）に加えた。ＥＯ９の可能性のある沈殿を予防するために、ＥＯ９ストック溶液の培地への添加は、連続的に振とうしながら行った。最終的なＥＯ９の濃度は３４７μＭであり、それは４ｍｇ／４０ｍｌと同等である。
【００５０】
２．溶液２：１０％ＰＧ中のＥＯ９（３４７μＭ）
２００ミリグラムの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を、４ｍｌのＥＤＴＡ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ、それを０．５Ｍのストック溶液、Ｓｉｇｍａから新しく調製した）に溶解した。次いでその溶液を６ｍｌのＰＧ溶液（２ｍｌのＰＧ＋４ｍｌのＨ２Ｏ）と混合して、２０％のＰＧを含む１０ｍｌの最終容量を作成した。この溶液を、ＥＯ９（２ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム（５ｍｇ）およびマンニトール（１２．５ｍｇ）を含む２０ｍｌの一般的な試験管に加えた。その溶液を、連続的に振とうしながら、ＥＯ９が完全に溶解するまで（約５−６時間）、３７℃でインキュベートした。次いで、その溶液を水で１：１に希釈して、１０％のＰＧ溶液を産生した。
【００５１】
３．溶液３：２０％ＰＧ中のＥＯ９（３４７μＭ）
２００ミリグラムの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を、４ｍｌのＥＤＴＡ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ、それを０．５Ｍのストック溶液、Ｓｉｇｍａから新しく調製した）に溶解した。次いでその溶液を６ｍｌのＰＧ溶液（４ｍｌのＰＧ＋２ｍｌのＨ２Ｏ）と混合して、４０％のＰＧを含む１０ｍｌの最終容量を作成した。この溶液を、ＥＯ９（２ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム（５ｍｇ）およびマンニトール（１２．５ｍｇ）を含む２０ｍｌの一般的な試験管に加えた。その溶液を、連続的に振とうしながら、ＥＯ９が完全に溶解するまで（約３−４時間）、３７℃でインキュベートした。次いで、その溶液を水で１：１に希釈して、２０％のＰＧ溶液を産生した。
【００５２】
４．溶液４：３０％ＰＧ中のＥＯ９（３４７μＭ）
２００ミリグラムの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を、４ｍｌのＥＤＴＡ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ、それを０．５Ｍのストック溶液、Ｓｉｇｍａから新しく調製した）に溶解した。次いでその溶液を６ｍｌのＰＧ溶液（６ｍｌのＰＧ＋０ｍｌのＨ２Ｏ）と混合して、６０％のＰＧを含む１０ｍｌの最終容量を作成した。この溶液を、ＥＯ９（２ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム（５ｍｇ）およびマンニトール（１２．５ｍｇ）を含む２０ｍｌの一般的な試験管に加えた。その溶液を、連続的に振とうしながら、ＥＯ９が完全に溶解するまで（約２時間）、３７℃でインキュベートした。次いで、その溶液を水で１：１に希釈して、３０％のＰＧ溶液を産生した。
【００５３】
Ｄ．薬剤投与
全ての手順を通して、使用した培地は、フェノールレッドを含まない培地を使用したという事実以外は、上記で記載した通りであった（フェノールレッドは、クロマトグラムにおいてＥＯ９と非常に近く溶出する）。ＥＯ９を、ｔ＝０において、１００μｌの容量で上部容器に加え、そして下部容器は６００μｌの培地を含んでいた（常に攪拌していた）。３７℃で１０分間インキュベートした後、トランスウェルを除去し、そして６００μｌの新しい培地を含む２４穴プレートの新しいウェルに置いた。上部容器の薬剤溶液を除去し、そして１００μｌの新しい薬剤溶液と置換した（すなわち、上部容器の濃度を、一定の濃度に維持した）。この手順全体を、全部で１時間の期間中、１０分間隔で繰り返した。
【００５４】
Ｅ．抽出手順
ＥＯ９をＩｓｏｌｕｔｏ  Ｃ１８  ＳＰＥカートリッジを用いてすぐに抽出した。サンプルを添加する（５００μｌ）前に、カートリッジを１ｍｌのメタノールで満たし、続いて１ｍｌの脱イオン水で洗浄した。１ｍｌの脱イオン水でさらに洗浄した後、ＥＯ９を３００μｌのメタノールで溶出した。サンプルを真空下で（室温で回転エバポレーターにおいて）乾燥し、そして分析に必要になるまで−２０℃で保存するか、またはすぐに分析するために移動相（下記を参照のこと）中で再構築した。
【００５５】
Ｆ．ＨＰＬＣ分析
ＥＯ９のクロマトグラフ分析を、本明細書中で参考文献に組み込まれる、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、６５（３）：３５９−６４、１９９２）によって記載されたように行った。簡単には、Ｈｉｃｈｒｏｍ  ＲＰＢカラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ  ｉｄ、Ｈｉｃｈｒｏｍ  Ｌｔｄ、ＵＫ）を、分離のために使用した。Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ３．４ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｌｔｄ）を有するＷａｔｅｒｓ  ９９６  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（λ１＝２８０ｎｍ）を、関心のあるピークのスペクトル分析のために使用した。移動相は、１Ｍのリン酸緩衝液（１％）、メタノール（４２％）、およびＨＰＬＣグレード水（５７％）から成っていた。流速を、オートサンプラーも組み込んだ、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）４次ポンプクロマトグラフィーシステムを用いて、１．２ｍｌ／ｍｌに設定した。検出限界は、１０ｎｇ／ｍｌ（３４．７ｎＭ）であった。
【００５６】
Ｇ．組織学
各実験に関して、３つのトランスウェルインサートを回収した；１つはコントロールであり、そして２つは実験の終わりであった。各トランスウェルを、１０％のホルマリンで１時間固定してから、７０％エタノールへ移し、そして一晩保存した。清潔なメスを使用して、膜を注意深くプラスチックのインサートからはがし、そして当業者に公知の標準的な手順を用いて、パラフィンワックスへ包埋するために処理した。Ｌｅｉｔｚ回転ミクロトーン（ｍｉｃｒｏｔｏｎｅ）を用いて標本を切片にし（５μｍ）、タンパク質でコートしたスライドグラスに乗せ、そしてヘマトキシリンおよびエオジンを用いて、当業者に公知の標準的な手順も用いて、染色した。多細胞層の厚さを、ステージミクロメーターを用いて較正した接眼レンズの計数線を用いて測定した。各切片に関して５つの測定値を得て、そしてサンプルごとに３つの切片を測定した。
【００５７】
ＩＩ．結果
Ａ．代表的なクロマトグラム
図４は、ＷＶ１４内部標準（保持時間＝１１．０５９分）を加えたブランクサンプルのクロマトグラムを示す。６．８７０分のピークは混入したピークである。図５は、ＲＰＭＩ１６４０培地中のＥＯ９標準品（１μｇ／ｍｌ（図５Ａ）および２０ｎｇ／ｍｌ（図５Ｂ））を示す。図５Ａに示すように、ＥＯ９およびＷＶ１４のピークは、それぞれ８．０２９分および１３．０２３分に溶出する（７．２９２分のピークは、上記で記載した混入ピークである）。実験室における温度の変動によって保持時間は動き得るが、相対的な保持時間は一定のままであることに注意するべきである。図５Ｂは、検出の限界を示す。図６は、０．１％のＤＭＳＯ（図６Ａ）；３０％のＰＧ（図６Ｂ）；２０％のＰＧ（図６Ｃ）；および１０％のＰＧ（図６Ｄ）中の、ＥＯ９標準品のクロマトグラムを示す。
【００５８】
Ｂ．較正曲線
各ＥＯ９調製物に関して較正曲線を構築し、そしてその結果を図７に示す。較正曲線は再現性があり、そして図７に示したように、各較正曲線の傾きにわずかな違いが観察された。その違いの理由は明らかではないが、異なる調製物間の抽出効率のわずかな差を反映し得る。０．１％のＤＭＳＯ、１０％のＰＧ、２０％のＰＧおよび３０％のＰＧ中のＥＯ９の抽出効率は、それぞれ９２．３％、８１．７％、７９．９％、および８１．１％であった。この変動のために、較正曲線は、行った実験それぞれに関して作成した。いずれのクロマトグラムにおいても、明らかな分解産物は見えなかった。
【００５９】
Ｃ．薬剤の浸透
図８で見られるように、ＰＧの濃度が増加するにつれて、ＥＯ９の多細胞層浸透速度は減少する。０．１％のＤＭＳＯ中のＥＯ９に関して、上部容器中の濃度をだいたい一定の値に維持する場合に予測されるように、その動態は直線状である。試験した２つの最も高い濃度のＰＧにおいて、その動態は全く直線状というわけではない−時間が増加するにつれて速度の累進的な増加が存在することは注目に値する。この効果はおそらく、ＰＧによって誘導される多細胞層の厚さの変化を反映する（図９を参照のこと）。評価したいずれの時点においても、明らかな代謝物または分解産物は観察されなかった。
【００６０】
図９は、ＥＯ９のＤＬＤ−１多細胞層を通じた浸透を調査するために行った組織学的分析の結果を示す。薬剤で処理していない切片の厚さは、５６．０１±３．６３μｍであった。０．１％のＤＭＳＯ中のＥＯ９で１時間処理した後、多細胞層の厚さは、薬剤で処理していない標本と有意に異なっていなかった（５８．８０±２．５０μｍ）。しかし３０％のＰＧ中のＥＯ９による処理後、多細胞層の厚さは、２９．０１±１．７８μｍに有意に減少した。層の外見にも著しい形態学的変化があり、その最も明らかなのは、層自身における「亀裂」または「チャネル」の出現であった。ＰＧ中のＥＯ９を用いた実験を通して、上部容器が予期したよりもたくさんの液体を含んでいたことが観察された。例えば、３０％、２０％、および１０％のＰＧ中のＥＯ９と１０分間インキュベーションした後、上部容器から回収された容量は、それぞれ１０６±３、１０７±３および１０５±２μｌであった（０．１％のＤＭＳＯ中のＥＯ９に１時間接触させた後、回収された容量は９８±２μｌであった）。これらの容量は単なる近似値（Ｇｉｌｓｏｎピペットを用いて回収し得るものに基づく）であるが、ＰＧ調合物（特に３０％のＰＧ）に溶解したＥＯ９を使用した場合に、上部容器中の培地の容量が変化することを示すことを強調するべきである。組織学的写真が、コントロールおよびＥＯ９（０．１％のＤＭＳＯ）で処理した標本においては、細胞が基底膜と密接に接触しているが、３０％のＰＧ中のＥＯ９で処理した多細胞層に関して、多細胞層および膜自身の間に、小さいが明確なギャップが存在することを示すことも注目すべきである。
【００６１】
【表１Ａ−１】
2010116416.tif 000003
【００６２】
【表１Ａ−２】
2010116416.tif 000004
【００６３】
【表１Ａ−３】
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【００６４】
【表１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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