(57)【要約】      （修正有）【課題】心筋細胞への分化能が高いヒト心筋前駆細胞を効率よく的確に選別、分離するための方法を提供する。【解決手段】ヒト心筋前駆細胞特異的に発現する細胞表面マーカーとしてヒトＮ−カドヘリンを用い、ヒトＮ−カドヘリンに特異的な親和性を有する抗ヒトＮ−カドヘリン抗体等を利用することで、心筋に分化しやすいヒト幹細胞集団を選別し、心筋細胞への分化能の高い厳密なヒト心筋前駆細胞を分離する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト幹細胞を含有する細胞集団に対して、Ｎ−カドヘリンの発現を解析する工程を含むことを特徴とする、ヒト心筋細胞分化能の判定方法。
【請求項２】
前記ヒト幹細胞がヒト間葉系組織幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト幹細胞を含有する細胞集団が、あらかじめ心筋前駆細胞を含む中胚葉系細胞に分化誘導されたものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｎ−カドヘリンの発現を解析する工程が、Ｎ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質を用いて行われるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質が抗Ｎ−カドヘリン抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗Ｎ−カドヘリン抗体を含むことを特徴とする、ヒト心筋細胞分化能判定用試薬。
【請求項７】
ヒト幹細胞を含有する細胞集団に対して、Ｎ−カドヘリンの発現を解析する工程、及びＮ−カドヘリンが発現している細胞を回収する工程を含むことを特徴とする、ヒト心筋細胞分化能の高い細胞の分離・濃縮方法。
【請求項８】
前記ヒト幹細胞がヒト間葉系組織幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト幹細胞を含有する細胞集団が、あらかじめ心筋前駆細胞を含む中胚葉系細胞に分化誘導されたものである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｎ−カドヘリンの発現を解析、あるいは回収する工程が、Ｎ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質を用いて行われるものである、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
Ｎ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質が抗Ｎ−カドヘリン抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
担体表面に抗Ｎ−カドヘリン抗体を設けた担体を含むことを特徴とする、ヒト幹細胞からの心筋細胞分化能の高い細胞の分離・濃縮用キット。
【請求項１３】
さらに、抗Ｎ−カドヘリン抗体を認識できる標識抗体を含むことを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
請求項７〜１１のいずれかに記載の方法で得られた、ヒト心筋細胞分化能の高いヒト心筋前駆細胞が濃縮された細胞集団。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞集団を有効成分として含む、心疾患の移植治療用組成物。
【請求項１６】
ヒト幹細胞を含有する細胞集団に対して、Ｎ−カドヘリンの発現を解析する工程、及びＮ−カドヘリンが発現している細胞を回収する工程を含むことを特徴とする、心疾患の移植治療用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヒト成体内の組織幹細胞や前駆細胞のうちで心筋に分化しやすい細胞で高発現している細胞表面マーカータンパク質を検出することによるヒト心筋前駆細胞を選別、分離する方法。
【背景技術】
【０００２】
ヒト組織には、骨髄由来の造血幹細胞や間葉系幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞など、様々な組織に組織幹細胞が存在する。しかしながら、これら組織から取り出した幹細胞を含む集団は種々雑多な細胞が混在する不均一な細胞集団であり、幹細胞を用いた再生医療を効果的かつ安全に遂行するためには、適切な細胞を選択することの重要性が指摘されている。現在、ヒト成体中に存在する組織幹細胞として回収される細胞集団の中には、分化能が異なる様々な幹細胞・前駆細胞が含まれると考えられており、個々の治療に適した細胞種を選別する技術が待望されている。このような目的に応じた幹細胞集団を選別するひとつの方法として細胞表面マーカーの使用が考えられている。特定の組織への分化能が高い幹細胞を規定することができる細胞表面マーカーがあれば、それを利用して様々な間葉系幹細胞集団の中から望みの細胞種を精製分離することができる。例えば、心再生に適した幹細胞、肝細胞分化能の高い間葉系幹細胞、膵β細胞への分化能が高い間葉系幹細胞など、移植部位に適した均一な間葉系幹細胞集団を分離ことができれば、幹細胞治療効果を最大限に引き出し、安定した治療結果へと結びつけることが可能になる。しかしながら、現段階では心再生のために有効な細胞を選別するための表面マーカーとしては極めて限られたものが知られているに過ぎず、その有効性も十分なものではない（特許文献１〜３、非特許文献１,２）。例えば、心筋前駆細胞で発現する細胞表面マーカーとされるＦｌｋ１（特許文献１）は、成体ではむしろ血管内皮細胞の表面マーカーであり、心筋前駆細胞では、ごく短期間に一時的に発現するにすぎない。そのため心筋前駆細胞を選別したつもりでも、分化の程度が少し異なっただけで心筋前駆細胞とは異なる細胞集団を分取してしまっている可能性が大きく、現実の心疾患患者に対して適用する再生医療において容易に使用できるものではなかった。また、間葉系幹細胞のうちでも骨格筋組織や心筋組織から直接採取して、心臓疾患治療用の細胞移植材料とすることは提案されている（特許文献４，５）が、心筋分化効率が不十分であるなどヒトの治療用に満足できる技術には至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−５０９７４号公報
【特許文献２】特開２００６−３４１９９号公報
【特許文献３】特開２００７-１３５４３８号公報
【特許文献４】特開２００６−１１５７７１号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００６／０９３２７６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yamashita JK, Takano M, Hiraoka-Kanie M, Shimazu C, Peishi Y, Yanagi K, Nakano A, Inoue E, Kita F, Nishikawa S. FASEB J. (2005) 19, 1534-1536
【非特許文献２】Okamoto K, Miyoshi S, Toyoda M, Hida N, Ikegami Y, Makino H, Nishiyama N, Tsuji H, Cui CH, Segawa K, Uyama T, Kami D, Miyado K, Asada H, Matsumoto K, Saito H, Yoshimura Y, Ogawa S, Aeba R, Yozu R, Umezawa A, Exp Cell Res. (2007) 313, 2550-2562.
【非特許文献３】Tepass U, Truong K, Godt D, Ikura M, Peifer M. Nat Rev Mol Cell Biol. (2000) 1, 91-100.
【非特許文献４】Radice GR, Rayburn H, Matsunami H, Knudsen KA, Takeichi M, Hynes RO. Devel. Biol. (1997) 181, 64-78
【非特許文献５】Li J, Patel VV, Kostetskii I, Xiong Y, Chu AF, Jacobson JT, Yu C, Morley GE, Molkentin JD, Radice GL. Cir. Res. (2005) 97, 474-481.
【非特許文献６】Grabarek, Z. and Gergely, J. (1990) Anal. Biochem. 185, 131-135.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来の不十分なヒト心筋前駆細胞の選別方法に代わる、心筋に分化する能力を持つヒト心筋前駆細胞をより的確に選別するための高効率な分離方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、心臓の発生過程で特異的に発現する細胞表面膜タンパク質に着目し、組織幹細胞の拍動する心筋へ分化しやすい細胞で高発現しているものを詳細に検索した結果、Ｎ−カドヘリンを同定することができた。Ｎ−カドヘリンは欠損すると心臓形成が不全となるタンパク質であることからも、ヒト心筋前駆細胞特異的に発現する細胞表面マーカーとしてきわめて適切なマーカーであるといえる。当該ヒトＮ−カドヘリンを特異的に認識する抗体等を利用することで、心筋に分化しやすいヒト幹細胞の評価を行うことが可能となった。このような知見をもとに、これまでにない厳密なヒト心筋前駆細胞の選別方法に係る本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕ヒト幹細胞を含有する細胞集団に対して、Ｎ−カドヘリンの発現を解析する工程を含むことを特徴とする、ヒト心筋細胞分化能の判定方法。
〔２〕前記ヒト幹細胞がヒト間葉系組織幹細胞である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記ヒト幹細胞を含有する細胞集団が、あらかじめ心筋前駆細胞を含む中胚葉系細胞に分化誘導されたものである、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕Ｎ−カドヘリンの発現を解析する工程が、Ｎ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質を用いて行われるものである、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕Ｎ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質が抗Ｎ−カドヘリン抗体である、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕抗Ｎ−カドヘリン抗体を含むことを特徴とする、ヒト心筋細胞分化能判定用試薬。
〔７〕ヒト幹細胞を含有する細胞集団に対して、Ｎ−カドヘリンの発現を解析する工程、及びＮ−カドヘリンが発現している細胞を回収する工程を含むことを特徴とする、ヒト心筋細胞分化能の高い細胞の分離・濃縮方法。
〔８〕前記ヒト幹細胞がヒト間葉系組織幹細胞である、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記ヒト幹細胞を含有する細胞集団が、あらかじめ心筋前駆細胞を含む中胚葉系細胞に分化誘導されたものである、前記〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１０〕Ｎ−カドヘリンの発現を解析、あるいは回収する工程が、Ｎ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質を用いて行われるものである、前記〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕Ｎ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質が抗Ｎ−カドヘリン抗体である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕担体表面に抗Ｎ−カドヘリン抗体を設けた担体を含むことを特徴とする、ヒト幹細胞からの心筋細胞分化能の高い細胞の分離・濃縮用キット。
〔１３〕さらに、抗Ｎ−カドヘリン抗体を認識できる標識抗体を含むことを特徴とする、前記〔１２〕に記載のキット。
〔１４〕前記〔７〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法で得られた、ヒト心筋細胞分化能の高いヒト心筋前駆細胞が濃縮された細胞集団。
〔１５〕前記〔１４〕に記載の細胞集団を有効成分として含む、心疾患の移植治療用組成物。
〔１６〕ヒト幹細胞を含有する細胞集団に対して、Ｎ−カドヘリンの発現を解析する工程、及びＮ−カドヘリンが発現している細胞を回収する工程を含むことを特徴とする、心疾患の移植治療用組成物の製造方法
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ヒト組織幹細胞の中で心筋に分化しやすい心筋前駆細胞特異的マーカーが見出されたことで、当該マーカーを指標にして心再生に適した間葉系幹細胞を臨床現場においても容易に選別、分離が可能となり、幹細胞の心再生における治療効果を安定して最大限に引き出すことができる基礎技術が提供できた。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各種ヒト組織幹細胞の心筋分化効率とＮ−カドヘリン等の細胞表面マーカー発現の比較  （Ａ）各幹細胞をin vitroで心筋分化誘導したときの心筋分化効率。マウス胎児心筋細胞上で１０日間共培養した後のヒト幹細胞がどれだけ拍動する心筋に分化したかを蛍光顕微鏡下でカウントし測定した。（Ｂ）各幹細胞細胞抽出液中のＮ−カドヘリン等タンパク質のウエスタンブロッティング解析。各細胞から抽出した10μgのタンパク質を電気泳動後、各種抗体でブロットした。ローディングコントロールとして、βチューブリンを示した。（Ｃ）Ｂのウエスタンブロッティングの結果をデンシトメーターで定量化し、各サンプルについてＮ−カドヘリンやＦｌｋ１の発現量をβチューブリンの発現量で補正した相対的発現量をグラフ化した結果を示した。（Ｄ）Ｎ−カドヘリンの細胞内局在。Ｎ−カドヘリン抗体を用いて各幹細胞における細胞内局在を免疫蛍光染色により解析した。
【図２】各種ヒト組織性幹細胞のin vitroで心筋分化誘導したときの心筋分化マーカーの発現  （Ａ）マウス胎児心筋細胞上で１０日間共培養して分化誘導させたヒト幹細胞由来の心筋細胞における心筋マーカーアクチニンの発現。（Ｂ）同様に分化誘導させたヒト心筋細胞における心筋マーカーコネキシン43の発現。緑色はGFPで標識したヒト組織性幹細胞由来の細胞であることを示しており、青色は二次抗体にAlexaFluoro350を利用してアクチニンまたはコネキシン43の免疫蛍光染色像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ヒト幹細胞、特にヒト組織から取り出した組織幹細胞を含む細胞集団について、心筋分化しやすい細胞が多く含まれているかどうかＮ−カドヘリンを特異的に認識する抗体等を用いた判定キットにより検証することを可能にする方法である。また、Ｎ−カドヘリンを特異的に認識する抗体等を利用して、より心再生治療効果のある心筋分化しやすい細胞を選別することが可能となる。
【００１１】
１．Ｎ−カドヘリンについて
本発明において心筋前駆細胞特異的マーカーとなる「Ｎ−カドヘリン」とは、細胞膜貫通タンパク質であり、細胞外に約100アミノ酸からなる繰り返し配列（ECドメイン）が５つ存在する。このドメイン同士が分子間でカルシウム依存的にホモフィリックな結合を引き起こすことにより細胞間結合を形成する分子として知られている。（非特許文献３）。Ｎ−カドヘリンは発生過程で胎性9.5日胚の脳で発現するタンパク質として発見されたが、後にノックアウトマウスの解析から心臓形成に不全をおこすことが報告されている（非特許文献４）。
本発明において細胞表面に発現している「Ｎ−カドヘリン」を検出するためには、Ｎ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質であれば何でもよく、抗体、アプタマー、ペプチド、特異的に認識する化合物などがあるが、典型的には抗Ｎ−カドヘリン抗体、例えば公知の抗Ｎ−カドヘリン抗体であるD-4やH-63(SantaCruz), 8C11(ABR), GC-4(Sigma)などを用いることができる。
【００１２】
本発明においては、ヒト幹細胞のうち心筋細胞への分化能が高い細胞は細胞表面におけるＮ−カドヘリン発現量が高い、という相関関係を見出したものであり、Ｎ−カドヘリン発現量を正確に測定し、「Ｎ−カドヘリンの発現を解析する」ことで、対象の細胞集団に対する心筋細胞への分化能を判定することができる。したがって、上記抗Ｎ−カドヘリン抗体等のＮ−カドヘリンに特異的親和性を有する物質は、心筋細胞への分化能判定用試薬として用いることができる。なお、Ｎ−カドヘリンは、分化能を有しない細胞の表面でも、ごく微量の発現は見られることがあるので、本発明において「Ｎ−カドヘリンの発現を解析する」、「Ｎ−カドヘリンが発現している」というときは、全く心筋分化能を有しない細胞（例えば繊維芽細胞）表面でのＮ−カドヘリンの発現量と比較して、十分に多い量発現していることを指す。好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上発現している場合である。
【００１３】
２．対象のヒト幹細胞の調製
本発明において対象とするヒト幹細胞は、典型的には組織性幹細胞であり、特に間葉系幹細胞が好ましいが、胎生幹細胞又はｉＰＳ細胞に対しても適用可能である。間葉系幹細胞としてはこれまで多数報告されており、例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、臍帯血由来幹細胞、子宮内膜由来間葉系幹細胞など様々な幹細胞が成体に存在しており、初代培養細胞として理化学研究所、ヒューマンサイエンス振興財団、American Tissue Culture Collectionなどの細胞バンクから入手可能であり、またタカラバイオ、フナコシなどの試薬メーカーからも購入可能である。また、一部で間葉系幹細胞が株化されたものが作成されており、理化学研究所、ヒューマンサイエンス振興財団などから入手可能である。また、心疾患の治療用に用いる場合は、患者本人又は提供者からの骨髄液、末梢血、脂肪組織などから採取した間葉系組織幹細胞を直接採取することもできる。その場合は、コラゲナーゼやトリプシンなどを用いた適当な酵素処理により、細胞懸濁液として得ることができる。
【００１４】
本発明において、好ましく用いられる間葉系組織幹細胞は、ヒトから採取したそのままの状態、もしくは幹細胞をin vitroで培養する過程を経た状態で、本発明の心筋細胞への分化能判定工程に供されるが、より多くのヒト心筋前駆細胞を得るためには、ヒト幹細胞をヒト心筋細胞へ分化誘導することが好ましい。ヒト幹細胞のヒト心筋細胞への分化誘導手法は種々の方法が既に報告されている。例えば、脱メチル化剤である５-aza-cytidineで処理する方法、細胞塊を形成させて浮遊培養を行う方法、マウス胎児心臓から取り出した心筋フィーダー細胞上で共培養する方法などにより、心筋細胞へと分化誘導する方法が知られている（非特許文献２）。分化誘導効率は方法によって異なるが、in  vitroで心筋細胞に分化させることも少しずつ可能になりはじめている。
分化誘導の際など、シャーレ等の固相表面上で接着培養した場合には、細胞表面マーカーを破壊することなくこれら細胞をバラバラに解離する作業が必要になるが、そのときにはプロテアーゼフリーのcell dissociation buffer等の緩衝液などを用いて細胞をシャーレから解離させることができる。
【００１５】
３．心筋に分化しやすい幹細胞や心筋前駆細胞の分離方法
本発明においては、抗Ｎ−カドヘリン抗体等のＮ−カドヘリンに特異的な親和性を有する物質を用いて分離・濃縮用キットとすることで、心筋細胞への分化能が高い幹細胞又は心筋前駆細胞を多く含む細胞集団を選別し、濃縮することができる。さらに、これら細胞集団から、心筋細胞への分化能が高い幹細胞又は心筋前駆細胞のみを単離することもできる。
抗Ｎ−カドヘリン抗体等のＮ−カドヘリンに特異的に親和性を有する物質を用いて分離・濃縮用キットとするためには、抗Ｎ−カドヘリン抗体等を、担体表面に固定化して用いるのが好ましい。担体の形状としてはビーズ状、チップ、板状、樹脂状等どのような形状でもよいが、典型的にはビーズ表面に固定する。具体的には、COOH基を導入したビーズをEDC（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride）などの架橋剤と反応させ、NHSエステル化しておいたものにＮ−カドヘリン抗体を加え固定化する等の方法を用いることができる（非特許文献６）。
また、Ｎ−カドヘリンに特異的な親和性を有する物質に蛍光色素などの識別可能な標識を導入したものを心筋前駆細胞含有集団に添加することで、光るＮ−カドヘリン陽性の心筋前駆細胞を識別することが可能となる。この場合はフローサイトメトリーなどの蛍光検出機能を有する細胞分取装置を利用する。
【００１６】
４．Ｎ−カドヘリン量の測定
本発明において、抗Ｎ−カドヘリン抗体などによりＮ−カドヘリン量を正確に測定することで、採取源の心筋前駆細胞の量を評価することができる。その際に、あらかじめ対象のヒト幹細胞を含有する細胞集団を蛍光標識しておいた後、抗Ｎ−カドヘリン抗体を固定化したプロテインチップと混合し、このプロテインチップに結合した蛍光強度を測定することにより、細胞表面に発現するＮ−カドヘリン量を測定することができる。また、試料細胞の抽出液を作成し、その抽出液中に含まれるタンパク質をあらかじめ蛍光標識しておいた後、抗Ｎ−カドヘリン抗体を固定化したプロテインチップと混合し、このプロテインチップに結合した蛍光強度を測定する等の方法により、Ｎ−カドヘリン量を測定することもできる。
【００１７】
５．心臓疾患の治療方法
本発明において、心筋細胞への分化能が高い細胞を多く含むと評価され選別された細胞集団、又は当該細胞集団から分離・濃縮されたヒト幹細胞又は心筋前駆細胞は、心疾患を有する患者の心臓に移植することで、心筋梗塞、心不全などの心疾患の治療に利用することができる。
心筋幹細胞を移植するには、開胸して直接心筋内に注入する方法以外にも、最近では患部にカテーテルを利用して本発明の細胞集団を注入する方法などの低侵襲の方法が用いられる。また、分化誘導後の心筋前駆細胞を含有する細胞集団を、シート状の生体吸収材料に担持させて、心筋組織の障害部位に貼付する方法を用いることもできる。
【００１８】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。また、本明細書中で引用される技術文献の内容は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
【実施例】
【００１９】
（実施例１）ヒト組織性幹細胞の心筋分化能の比較
ヒト組織性幹細胞の例として、国立成育医療センターの梅澤明弘部長らが樹立した、幹細胞としての性質が比較的安定している7つのヒト間葉系幹細胞株（EPC-214, UE7T-13, UE6E7T-11, UBE6T-15, UE6E7T-12, UE7T-9, UE6E7T-2）を利用した。EPC-214株は梅澤部長より入手した。その他の細胞についてはヒューマンサイエンス振興財団に登録済みのものを当該財団から入手した。これらの幹細胞を非特許文献２に記載の方法に従ってシャーレの中で心筋分化誘導を行い、それぞれのヒト間葉系幹細胞株の心筋分化能を比較した。具体的には、これらの幹細胞をあらかじめGFPタンパク質を発現するアデノウイルスまたはレンチウイルスで感染させ、緑色の蛍光を発する細胞として標識しておいた後、マウス胎児心臓から取り出した心筋フィーダー細胞上で10日間共培養し心筋へと分化誘導する方法である。共培養10日後、蛍光顕微鏡下で観察し、緑色のGFP蛍光タンパク質を発現しているヒト幹細胞の中で心筋として拍動している細胞の割合を数えた。その結果、図１Ａのグラフに図示したように、各幹細胞の心筋分化能を比較測定することができた。
【００２０】
（実施例２）ヒト組織性幹細胞におけるＮ−カドヘリンの発現量の定量
各ヒト組織性幹細胞株を単独で培養しその細胞抽出液を調製した。この抽出液作成には抽出バッファー（20mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1% NP40, プロテアーゼインヒビター）を用い、４℃で１時間回転混和した後、４℃で15,000rpm  5分間遠心した上清をタンパク質抽出液として得た。10μgのタンパク量を含む各抽出液をサンプルバッファー中で95℃5分間変性後SDS-PAGEにより泳動分離し、ニトロセルロースメンブランにトランスファーした後、Ｎ−カドヘリンをはじめとする各種タンパク質に対する抗体でブロットした。抗体は以下のものを購入し使用した。Ｎ−カドヘリン（Anti-N-cadherin GC-4, Sigma），Flk1（anti-human KDR, IBL）、Nkx2.5（SantaCruz）、β-チューブリン（Tubulin beta, NeoMakers）。その結果、図１Ｂに示すように、各幹細胞におけるＮ−カドヘリン等のタンパク質の発現量を比較定量できた。
図１Ｂの結果をデンシトメーターで測定し定量化したものを図１Ｃに示した。この結果から、Ｎ−カドヘリンは、既知の心筋前駆細胞マーカーであるFlk1に較べてより心筋分化能との相関性が高いことが示された。また、心筋に特に分化しやすいEPC214細胞は心筋前駆細胞特異的に発現する核内転写因子Nkx2.5も発現しており、心筋に極めて分化しやすくなっている幹細胞と予想される。以上これらの実験の結果、ヒト間葉系幹細胞において心筋に分化しやすい心筋前駆細胞を評価する場合、Ｎ−カドヘリンがより有効なマーカーであることが示唆された。
【００２１】
（実施例３）Ｎ−カドヘリンの組織性幹細胞における局在
各幹細胞におけるＮ−カドヘリンの局在を免疫蛍光染色法により解析した。各幹細胞を3.7%ホルマリン/PBS中で室温30分間固定した後、0.5%Triton X-100/PBSで室温5分間処理して細胞膜を透過し、さらに5%ウシ胎児血清/PBS中で室温1時間ブロッキングした。この後、一次抗体としてＮ−カドヘリン抗体（Sigma, GC-4）、二次抗体としてAlexaFluoro488標識-抗マウスＩｇ抗体で処理し、DAPI入り封入剤（DAKO）で封入し共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。この結果、図１Ｄに示すように、Ｎ−カドヘリンは細胞表面特異的に局在し、細胞表面マーカーとして有用であることが確認された。
【００２２】
（実施例４）in vitro心筋分化誘導した心筋における心筋マーカーの発現
GFP発現ウイルスに感染させてあらかじめGFP蛍光タンパク質を発現させておいた各ヒト幹細胞を、マウス胎児心臓から取り出した心筋フィーダー細胞上で10日間共培養し、心筋分化誘導を行った。その後、細胞を3.7%ホルムアルデヒドで固定しGFP陽性のヒト細胞を各種心筋マーカーに対する抗体を用いて免疫蛍光染色により染色後、蛍光顕微鏡下で観察した。その結果、この系で心筋分化誘導を行った場合、高効率で拍動していた細胞は図２に示したようにコネキシン43やアクチニンなどの心筋特異的マーカーを発現した機能的な心筋に分化していることが確認された。すなわち、Ｎ−カドヘリンは機能的な心筋に分化するヒト幹細胞やヒト心筋前駆細胞で発現する細胞表面マーカーとして有用であることが示唆された。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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