(57)【要約】【課題】  生分解性のナノ粒子に対して、表面に抗体を立体障害無く高密度で整列提示可能とし、高感度な免疫学的測定を可能とするツールおよびそれを用いた免疫学的測定方法を提供することを課題としている。【解決手段】  自己組織化能を有するタンパク質が脂質2重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合タンパク質と抗体非結合タンパク質から構成される、高感度免疫学的測定用粒子を用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化能を有するタンパク質が、脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が、抗体／抗原結合用タンパク質及び抗体／抗原非結合タンパク質を有する、高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項２】
ナノサイズの粒子が、中空ナノ粒子である、請求項１に記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項３】
抗体／抗原非結合タンパク質が、抗体／抗原結合用タンパク質間の間隔を広げる機能を有しており、抗体／抗原結合用タンパク質と抗原／抗体分子との結合を促進する補助タンパク質である、請求項１または２に記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項４】
抗体／抗原結合用タンパク質が、ＺＺタグまたはストレプタグ（登録商標）を含む少なくとも一種類の、請求項１から３のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項５】
抗体／抗原結合用タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンからなる群より選ばれるアビジン物質を含む少なくとも一種類の、請求項１から４のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項６】
抗体／抗原分子が、アビジン結合能を有するビオチンで修飾されている請求項１から５のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項７】
抗体／抗原非結合タンパク質が、少なくとも１種類のタンパク質である、請求項１から６のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項８】
自己組織化能を有するタンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBｓAｇ）タンパク質である、請求項１から７のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項９】
抗体／抗原非結合タンパク質が、Ｓタンパク質である、請求項１から８のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の、高感度免疫学的測定用ナノ粒子に、抗体／抗原分子を結合させ、該分子により捕捉される測定対象物質を、ＥＬＩＳＡ法、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、蛍光免疫測定法（FLISA）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法(FACS)、水晶振動子マイクロバランス法（QCM）、表面プラズモン共鳴法（SPR）、二面偏波式干渉法（DPI）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法またはウェスタンブロッティング法を用いて測定する方法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれかに記載の、高感度免疫学的測定用ナノ粒子を担体に結合させた、アフィニティビーズ。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれかに記載の、高感度免疫学的測定用ナノ粒子に、抗体／抗原分子を結合させ、該分子により認識捕捉される測定対象物質を測定する為の、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（EIA）、酵素免疫測定法（ELISA）、または蛍光免疫測定法（FLISA）用プレート。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれかに記載の、高感度免疫学的測定用ナノ粒子に、抗体／抗原分子を結合させ、該分子により捕捉される測定対象物質を測定する、水晶振動子マイクロバランス（QCM）用センサーチップ、表面プラズモン共鳴法（SPR）用センサーチップ、二面偏波式干渉法（DPI）、またはエリプソメトリー法用センサーチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、該粒子の製造方法、該粒子を担体に結合させたアフィニティビーズ、該粒子と抗体／抗原が結合したものを用いて、該分子によって捕捉される測定対象物質を、ＥＬＩＳＡ法、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、蛍光免疫測定法（FLISA）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法(FACS)、水晶振動子マイクロバランス法（QCM）、表面プラズモン共鳴法（SPR）、二面偏波式干渉法（DPI）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法、または、ウェスタンブロッティング法を用いて測定感度を上昇させる方法、および該方法に用いるプレートまたはセンサーチップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ；ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂａｎｔ  Ａｓｓａｙ；  FLISA）ウェスタンブロッティング、組織染色法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法(Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ;  ＦＡＣＳ)、放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ)、ＥＬＩＳＰＯＴ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｐｏｔ）、蛍光免疫検定法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ；ＦＩＡ）、固相蛍光免疫検定法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ；ＦＬＩＳＡ）などに代表される免疫学的測定は、１９４１年、Ｃｏｏｎｓらによる蛍光色素を標識した抗体で形質細胞のＩｇＧを検出した蛍光抗体法の確立から端を発しており、次いでＮａｋａｎｅ、Ｐｉｅｒｃｅらによる酵素抗体法の開発（１９６６年）を受け、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＰＡＰ法（１９７０年）、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｙｌａｔｅｄ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＡＢＣ法（１９８１年）、ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｉｏｔｙｎｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＬＳＡＢ法（１９８４年）などが開発されてきた（非特許文献１参照）。
【０００３】
免疫学的測定は、抗原に対する特異抗体を反応させ、さらなる抗原・抗体反応、あるいは化学反応を巧みに組み合わせて特異抗体と標識物質の免疫複合体を形成し、最終的に標識酵素の発色反応や標識蛍光の蛍光強度によって抗原の存在を可視化・定量化する原理に基づいており、抗体を用いることでクルードなサンプル中においても抗原（検出の目的物質；タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖、化合物など）のみを選択的に染色することができる優れた研究手法である。これによって、検出のターゲットである抗原を精製せずしてその存在量を定量したり、細胞内における抗原の局在場所を特定することができるため、免疫学的測定技術はライフサイエンス分野やバイオ研究分野において広く普及している。
【０００４】
近年、ナノサイズの素材を用いて、免疫学的測定の感度を向上させる手法が研究されており、その一例として、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原(ＨＢｓＡｇ)タンパク質が、自己組織化によって細胞内の脂質２重膜を取り込むことにより形成した中空ナノ粒子を用いた物質のセンシング方法が開示されている（特許文献１参照）。生分解性の該中空ナノ粒子の表面に抗体などの物質認識分子を提示させ、微量物質のセンシングへの適用する技術が開示されている。これは、自己組織化能を有するタンパク質が、脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子を用いた免疫学的測定について開示している。しかしナノサイズの粒子表面に抗体を立体障害無く高密度で整列提示することが依然として課題であり、その解決方法は開示されていない。また、ナノサイズの粒子表面に抗体／抗原結合用タンパク質と抗体／抗原非結合タンパク質をともに発現させて、該粒子表面に効率よく抗体／抗原を提示させる方法は開示されていない。
【０００５】
微量物質の検出方法としては大別すると、目的とする物質を直接もしくは基板上に固層化した抗体／抗原などを介して捕捉し、補足した目的物質の検出を、抗原抗体反応などを利用して蛍光や発色、発光などにより行う上記免疫学的方法、あるいは物質との結合を直接感知する表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）や水晶振動子法（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ；ＱＣＭ）、二面偏波式干渉法（Ｄｕａｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒ；ＤＰＩ）、エリプソメトリー法（Ｅｌｌｉｐｓｐｏｍｅｔｒｙ）等によるセンシング方法がある。
【０００６】
ＳＰＲ、ＱＣＭ、ＤＰＩまたは、エリプソメトリー法において、目的とする物質を捕捉・認識可能な抗体やＦｃ融合タンパク質を基板上に結合させる手法が用いられている。ＳＰＲは金属（誘導体）界面に局在しながら界面に沿って伝搬する電磁波である表面プラズモンを利用し、物質が結合したときの金属表面での電荷密度波の変化を測定することで物質の結合力や量を測定する方法である。ＱＣＭは水晶発振子に設置した電極上に吸着した質量に比例して基本振動数が減少することを利用し、ピコグラムレベルで物質の結合量や結合と解離の速度が測定できる方法である（非特許文献３参照）。
【０００７】
基板上に固層化もしくは結合する抗体／抗原やＦｃ融合タンパク質の方向を整列させ、目的とする物質を認識できるように固層化もしくは結合させることはセンシングの感度を高めるために重要な要素であるが、抗体／抗原やＦｃ融合タンパク質の方向を整列させることは容易でなく、抗体／抗原の種類や基板の種類、溶液のイオン強度やｐＨ等様々な要因の影響を受けることが知られている（非特許文献３参照）。抗体／抗原の方向を整列させて基板上に固層化もしくは結合させるには、多大な労力により最適な条件を抗体／抗原やＦｃ融合タンパク質ごとに見つけ出す必要がある上、抗体／抗原やＦｃ融合タンパク質の種類や純度、状態によっては不可能なこともある。このため、数種類の抗体／抗原やＦｃ融合タンパク質を個別に整列させた抗体／抗原アレイやＦｃ融合タンパク質アレイを作製することは極めて困難であった。さらに、物理的吸着によって基板（固相）に吸着、不溶化した抗体／抗原は、センシングの過程の洗浄工程で少しずつ脱落し、さらに界面活性剤を含む溶液を用いる洗浄工程で多量に脱落することが知られている（非特許文献４参照）。
【０００８】
基板上に抗体／抗原の方向を整列させて固定する目的で、基板上の官能基と抗体／抗原上の特異的官能基とを反応させることにより抗体／抗原の方向を制御する方法が開示されている（特許文献２）。この方法では、抗体／抗原分子の一部分のみに特異的な官能基を作製するため、予め全ての官能基を化学反応により保護しなければならず、さらに抗体／抗原分子の一部を酵素により欠損させることや、還元剤によるジスルフィド結合の解離を行う必要もある。こうした過程は、抗体および抗原間の認識能や抗原／抗原間結合能などの機能が変化もしくは低下する危険性があり、検出の感度や精度の低下の原因となる。
【０００９】
さらに、基板上に固層化もしくは結合された抗体／抗原の密度も検出には重要な因子であり、目的物質の抗体による捕捉率は、単位面積あたりに固層化もしくは結合された抗体／抗原の量に依存する。
【００１０】
また、微量物質の検出においては非特異的なシグナルが検出精度を低下させる大きな要因となる。特に基板への非特異的な吸着や相互作用はＳＰＲ法やＱＣＭ法、ＤＰＩ法または、エリプソメトリー法において目的物質の検出や相互作用の検出において重大な問題となる。基板への目的物質の非特異的相互作用を防止する目的で、アルブミンやカゼインを含む溶液でブロッキング、コーティングすることが行われているが、非特異的相互作用を完全に防止するには不充分である。
【００１１】
基板を有機薄膜で被覆し、有機薄膜上の複数箇所に抗体／抗原を固定したアレイについて開示されており、抗体／抗原の固定にアダプターや親和性タグを用いる手法も同時に開示されている（特許文献３参照）。しかし微量物質のセンシングにおいて重要な単位面積あたりに結合もしくは固層化された抗体／抗原量を増加させる手法、すなわち抗体／抗原の高密度な整列固定を可能にすることは達成されておらず、非特異的相互作用を防止する手法も開示されていない。
【００１２】
一方、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質を含む中空ナノ粒子の表面に抗体結合部位を介して抗体を提示した例が知られているが（ＺＺ粒子；特許文献４参照）、自己組織化能を有するタンパク質がすべて抗体結合能を有するタンパク質より構成されるナノサイズの粒子（ＺＺ粒子）においては、ＺＺドメイン１分子あたりおよそ０．１４〜０．４９個のＩｇＧ分子しか結合しないことから、効率的な抗体の提示ができない点が問題となっていた。
【非特許文献１】ウリケら（Ｕｌｒｉｋｅ、Ｋ．ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナルオブヒストケミストリアンドサイトケミストリ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００１年、第４９巻、ｐ６２３−６３０．
【非特許文献２】大島ら著、ポストシーケンスタンパク質実験法３、東京化学同人、２００２年、ｐ１１５−１３７．
【非特許文献３】ジョン  アール  クラウザー（Ｊｏｈｎ  Ｒ．  Ｃｒｏｗｔｈｅｒ）著、メソッヅ  イン  モレキュラー  バイオロジー１４９  ジ  イライサ  ガイドブック（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ）、ヒューマナ  プレス（ＨＵＭＡＮＡ  ＰＲＥＳＳ）、２００１年、ｐ２９７−２９９.
【非特許文献４】石川  榮治  著、生化学実験法４８、学会出版センター、２００３年、ｐ５１、ｐ６０
【特許文献１】国際公開第２００５／０９５９６８号パンフレット
【特許文献２】特開平１０−１８２６９３公報
【特許文献３】特表２００２−５２０６１８公報
【特許文献４】特開２００４−２３１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以上のような状況に鑑み本発明では、
１）該粒子が生分解性であり、
２）該粒子表面に抗体／抗原を高効率で整列提示可能である、
直径がナノサイズの粒子が抗体結合能を有する高感度免疫学的測定用ナノ粒子、並びに
３）該粒子が担体に結合したアフィニティビーズ、並びに
４）該粒子を用いて抗体／抗原分子を、ＥＬＩＳＡ、RIA、ＦＩＡ、EIA、FLISA、細胞免疫染色、組織免疫染色、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリー、FACS、QCM、SPR、DPI、エリプソメトリー、またはウェスタンブロッティング法により測定する方法、並びに
４）該粒子を用いる上記方法の為のセンサーチップまたはプレートを提供すること課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決する手法を鋭意検討した結果、上記課題を解決できることを見出し本発明に至ったものである。
【００１５】
本発明は、以下の抗体結合能を有する免疫学的測定用高感度ナノ粒子、該粒子を用いた免疫学的測定方法、及び、該粒子の免疫学的測定用のセンサーチップまたはプレートに関する。
【００１６】
項１
自己組織化能を有するタンパク質が、脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が、抗体／抗原結合用タンパク質及び抗体／抗原非結合タンパク質を有する、高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【００１７】
２
ナノサイズの粒子が、中空ナノ粒子である、項１に記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【００１８】
項３
抗体／抗原非結合タンパク質が、抗体／抗原結合用タンパク質間の間隔を広げる機能を有しており、抗体／抗原結合用タンパク質と抗原／抗体分子との結合を促進する補助タンパク質である、項１または２に記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【００１９】
項４
抗体／抗原結合用タンパク質が、ＺＺタグまたはストレプタグ（登録商標）を含む少なくとも一種類の、項１から３のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【００２０】
項５
抗体／抗原結合用タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンからなる群より選ばれるアビジン物質を含む少なくとも一種類の、項１から４のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【００２１】
項６
抗体／抗原分子が、アビジン結合能を有するビオチンで修飾されている項１から５のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【００２２】
項７
抗体／抗原非結合タンパク質が、少なくとも１種類のタンパク質である、項１から６のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【００２３】
項８
自己組織化能を有するタンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBｓAｇ）タンパク質である、項１から７のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【００２４】
項９
抗体／抗原非結合タンパク質が、Ｓタンパク質である、項１から８のいずれかに記載の高感度免疫学的測定用ナノ粒子。
【００２５】
項１０
項１から９のいずれかに記載の、高感度免疫学的測定用ナノ粒子に、抗体／抗原分子を結合させ、該分子により捕捉される測定対象物質を、ＥＬＩＳＡ法、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、蛍光免疫測定法（FLISA）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法FACS)、水晶振動子マイクロバランス法（QCM）、表面プラズモン共鳴法（SPR）、二面偏波式干渉法（DPI）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法またはウェスタンブロッティング法を用いて測定する方法。
【００２６】
項１１
項１から９のいずれかに記載の、高感度免疫学的測定用ナノ粒子を担体に結合させた、アフィニティビーズ。
【００２７】
項１２
項１から９のいずれかに記載の、高感度免疫学的測定用ナノ粒子に、抗体／抗原分子を結合させ、該分子により認識捕捉される測定対象物質を測定する為の、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（EIA）、酵素免疫測定法（ELISA）、または蛍光免疫測定法（FLISA）用プレート。
【００２８】
項１３
項１から９のいずれかに記載の、高感度免疫学的測定用ナノ粒子に、抗体／抗原分子を結合させ、該分子により認識捕捉される測定対象物質を測定する、水晶振動子マイクロバランス（QCM）用センサーチップ、表面プラズモン共鳴法（SPR）用センサーチップ、二面偏波式干渉法（DPI）、またはエリプソメトリー法用センサーチップ。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の高感度免疫学的測定用ナノ粒子を、現在広く用いられているウェスタンブロッティング解析、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲやＱＣＭなどの免疫学的測定に用いることにより、より高感度な免疫学的測定を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  ２００７等に記載されている。
【００３１】
本発明の、「免疫学的測定」とは目的とする物質の存在や局在などの検出において、先ず一次抗体を用い対象物質を認識した後に、前記抗体を認識する標識化された二次抗体と高感度免疫学的測定用ナノ粒子を利用して認識し、かつ検出においては標識物質の性質に応じて、吸光、発光、蛍光、放射線、呈色、濁度などの変化を利用する手法である。もしくは、センサーチップ表面に高感度免疫学的測定用ナノ粒子を利用して並べた抗体に測定対象物質が捕捉されることによって生じる表面プラズモン、基本振動数または、偏光干渉といったセンサーチップの物性変化を解析することで、測定対象物質の検出する手法である。またはセンサーチップ表面に並べた抗原に、該抗原を認識する一次抗体と該抗体を認識する二次抗体と高感度免疫学的測定用ナノ粒子が結合した複合体を用いる事によって生じる表面プラズモン、基本振動数または、偏光干渉といったセンサーチップの物性変化を解析することで、微量の一次抗体量の検出する手法である。
【００３２】
本発明における免疫学的測定において、測定対象物質の種類は、特に制限はなく、ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質、糖鎖、ビタミンなどの生体物質、細胞、ウイルス、ファージ、および化学物質などが挙げられる。例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡを目的物質とする免疫学的測定の一例として、各種メンブレンもしくは樹脂包埋組織切片上の核酸にＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎやＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを結合したＤＮＡやＲＮＡをハイブリダイズさせ、ＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎやＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎに対する抗体を用いて目的とするＤＮＡもしくはＲＮＡを検出する工程を含むサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）やインサイチュハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ノザンハイブリダイゼーション（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法などが挙げられる。
【００３３】
タンパク質を目的物質とする免疫学的測定の例としては、ウェスタンブロッティング法や免疫組織染色、免疫電子顕微鏡観察、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＦＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＳＰＲ、ＱＣＭ、ＤＰＩ、イムノクロマトまたはエリプソメトリー法などが挙げられる。細胞、ウイルス、ファージ、および化学物質などを目的物質とする免疫学的測定としては、上記方法のほか、フローサイトメトリー、蛍光標示式細胞分取法(FACS)などが挙げられる。
【００３４】
本発明における免疫学的測定は、目的に応じて、
１）目的とする物質を抗体により認識し、目的物質と結合した抗体を、高感度免疫学的測定用ナノ粒子と結合した、前記抗体を認識する標識化二次抗体によって検出する間接法、
２）競合法または拮抗法、
３）目的とする物質を固相化した抗体により捕捉し、次いで別の標識もしくは未標識の二次抗体により認識し、さらに高感度免疫学的測定用ナノ粒子に結合した前記二次抗体を認識する標識化抗体によって検出する二抗体サンドイッチ法、
４）目的とする物質を固相化した抗体により捕捉し、次いで別の抗体により目的とする物質を認識し、目的とする物質を認識した前記抗体を別の標識もしくは未標識の二次抗体により認識し、さらに高感度免疫学的測定用ナノ粒子に結合した標識化三次抗体によって検出する三抗体サンドイッチ法、
５）測定対象物質を認識する抗体が結合した高感度免疫学的測定用ナノ粒子と担体が結合したアフィニティカラムを用いたイムノクロマト法、
６）センサーチップ表面に、測定対象物質を認識する抗体が結合した高感度免疫学的測定用ナノ粒子を並べ、測定対象物質が前記抗体によって捕捉されることによって生じるそれぞれ表面プラズモン、基本振動数、または偏光干渉の変化を解析する、ＳＰＲ、ＱＣＭ、ＤＰＩ、またはエリプソメトリー法。
７）センサーチップ表面に、測定対象抗体を認識する抗原を並べ、該抗原を認識する抗体と高感度免疫学的測定用ナノ粒子用いる事によって生じる表面プラズモン、基本振動数または、偏光干渉といったセンサーチップの物性変化を解析する、ＳＰＲ、ＱＣＭ又はＤＰＩ、またはエリプソメトリー法。
などが選択される。
【００３５】
上記１）〜６）において用いられるナノ粒子と結合させる抗体は、ナノ粒子の持つ抗体結合部位との結合力が高い抗体が望ましく、ラット由来ＩｇＧ、マウス由来ＩｇＧ、ウサギ由来ＩｇＧ、ヒト由来ＩｇＧ、イヌ由来ＩｇＧ、モルモット由来ＩｇＧ、ロバ由来ＩｇＧ、ヤギ由来ＩｇＧ、またはヒツジ由来ＩｇＧが好適に用いられる最も好ましくはマウス由来ＩｇＧである。
【００３６】
抗体とナノ粒子が同時に加えられる場合、高感度免疫学的測定用ナノ粒子の使用量は、粒子と結合する抗体の分子数の、０．０１〜１０倍量程度の分子数、好ましくは０．０２〜１倍量程度の分子数を使用する。また、重量にして抗体と等量の高感度免疫学的測定用ナノ粒子を使用する。粒子と結合する抗体の量（分子数）と比べて、ナノ粒子の使用量（分子数）が少なすぎると、該粒子による感度上昇効果が少なくなり、使用量が多すぎると、測定のバックグラウンドが高くなる。
【００３７】
本発明において「自己組織化能を有するタンパク質」とは、疎水的相互作用などのタンパク質間相互作用により自己集合する性質をもつタンパク質である。タンパク質間相互作用により自己集合する性質をもつタンパク質であることは、タンパク質が溶解した溶液の温度やｐＨ、塩濃度や溶媒を変化させることによりタンパク質どうしで多量体を形成することにより確認することができる。
【００３８】
本発明において「抗体／抗原結合部位と結合する抗体」とは、天然に産生されるか、または全体的にもしくは部分的に合成され産生される免疫グロブリンを意味する。抗原認識能を維持するその全ての誘導体や変異体も含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。また、天然から産生される抗体以外で、抗原となる物質を特異的に認識できる生体由来または人工的な化合物も指し、例えば、抗体の抗原認識部位だけを遺伝子組み替えによって改変して得られる単鎖抗体やアフィボディー、キメラ抗体、または抗体断片でもあり得る。好ましくはＦｃ領域を持つ抗体であり、さらに好ましくはＦｃレセプター、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ、ＺＺタグのいずれかと結合し得る抗体を示す。
【００３９】
本発明における抗体の標識に特に制限はなく、抗体の抗原認識能が失われておらず、かつ検出可能な標識であれば良い。例えば、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素やその変異体による標識であっても良く、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ダンシル、ルシファーイエローＶＳ、ウンベリフェリル、希土キレート、Ｃｙ色素（登録商標）（GEヘルスケア）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＴＲＩＴＣ、ＡＬＥＸＡ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、量子ドット、ＤＡＰＩ、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）などの蛍光物質による標識であっても良い。さらに、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、金粒子、鉄粒子、磁性粒子、磁気ビーズによる標識であっても良い。様々な環境に合わせて容易に標識物質を選ぶことが可能であり、複数の標識を組み合わせて用いることも可能である。汎用性と安全性の点から、好ましくはアルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＡＬＥＸＡ（登録商標）、ビオチン、金粒子が用いられる。更に好ましくは、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ビオチンが標識されている。
【００４０】
本発明において「酵素」とは、免疫学的測定の検出において用いられる酵素であれば特に制限はなく、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼなどが用いられる。好ましくは西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が用いられる。
【００４１】
本発明において「抗体Ｆｃ領域」とは、抗体をパパインで消化して得られる抗原認識能を持たないフラグメントであり、一般に抗体のＨ鎖のＣ末端フラグメントの２量体である。
【００４２】
本発明における自己組織化能を有するタンパク質と抗体／抗原との結合様式は、抗体および抗原間の認識能が失われない限りにおいて特に制限はなく、イオン結合、疎水結合、水素結合、金属結合、あるいはジスルフィド結合などの共有結合等、あるいはこれらの組み合わせであって良い。
【００４３】
本発明における、高感度免疫学的測定用ナノ粒子と担体との結合様式においても、抗体および抗原間の認識能及び高感度名免疫学的測定用ナノ粒子と抗体の結合能に影響を与えない限りにおいて特に制限はなく、イオン結合、疎水結合、水素結合、金属結合、あるいはジスルフィド結合などの共有結合等、あるいはこれらの組み合わせであって良い。
【００４４】
本発明の高感度免疫学的測定用ナノ粒子の抗体／抗原結合用部位と抗体／抗原との結合は、好ましくは免疫学的測定の過程での抗体の脱落を防止する目的から、共有結合であることが好ましく、さらに好ましくは架橋剤による共有結合である。
【００４５】
本発明の「担体」とは、セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、ラテックス系担体、ポリスチレン系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のようなアフィニティークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体を挙げることができる。
【００４６】
本発明の「自己組織化能を有するタンパク質」としては、種々のウイルスから得られるウイルス粒子構成タンパク質を適用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ；ＨＢＶ）やＣ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ）、マイクロウイルス（Ｍｉｃｒｏ  Ｖｉｒｕｓ）、ファージウイルス（Ｐｈａｇｅ  Ｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏ  Ｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏ  Ｖｉｒｕｓ）、パポバウイルス（Ｐａｐｏｖａ  Ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏ  Ｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（Ｒｅｏ  Ｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａ  Ｖｉｒｕｓ）、カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ  Ｍｏｒｉ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（Ｒetro  Ｖirus）、レンチウイルス（Lenti  Ｖirus）、カリシウイルス、ノロウイルス、サポウイルスなどの構成タンパク質や膜タンパク質、表面抗原タンパク質、または多角体タンパク質等が例示される。
【００４７】
本発明の「抗体／抗原結合用タンパク質」は、抗原分子または抗体分子を直接結合することのできるタンパク質で、自己組織可能を有するナノ粒子と、抗原分子または抗体分子の複合体を形成することができるタンパク質である。
【００４８】
本発明の  「自己組織化能を有するタンパク質」は、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、ウイルス、ファージ、細菌類、菌類等に由来する天然タンパク質や遺伝子工学的に組み替えられたタンパク質、種々の合成タンパク質等である。自己組織化能を有するタンパク質は、好ましくは、ウイルス由来タンパク質、更に好ましくは肝炎ウイルス由来のタンパク質、更に好ましくはＢ型肝炎ウイルス由来のタンパク質が用いられる。最も好ましくはＢ型肝炎ウイルス表面抗原(ＨＢｓＡｇ)タンパク質が用いられる。このとき、自己組織能が失われない限りにおいて、種々の変異を持つ変異体であってもよく、ＨＢｓＡｇタンパク質のアミノ酸の一部を欠失、置換、挿入させることにより、抗体提示の効率を上昇させることができる。
【００４９】
本発明における自己組織化能を有するタンパク質は、抗抗体／抗原結合用タンパク質と抗体／抗原非結合タンパク質から構成されている。抗体／抗原結合用タンパク質と抗体非結合タンパク質の重量比は１０：１〜１：１０であり、好ましくは８：１〜１：５である、さらに好ましくは、６：１〜１：２である。最も好ましくは、抗体／抗原結合用タンパク質の重量：抗体／抗原結合非結合タンパク質の重量が４：１〜１：１の重量比である。また、本発明における粒子一つ当たり、１２０分子の抗体／抗原タンパク質が存在する。
【００５０】
本発明のナノ粒子は抗体／抗原結合用タンパク質と抗体／抗原非結合タンパク質から構成されている。これらのタンパク質は同一の宿主細胞によって産生され、宿主細胞に抗体／抗原結合用タンパク質及び抗体／抗原非結合タンパク質を発現させるＤＮＡ配列を有する、一種類のプラスミドを導入してもよく、抗体／抗原結合用結合タンパク質を発現させるＤＮＡ配列を有するプラスミドと、抗体／抗原非結合タンパク質を発現させるＤＮＡ配列を有するプラスミドをそれぞれ導入してもよく、その順序はどちらが先でもよいものとする。また、その導入の順序は同時でもよく、どちらが先でもよいものとする。使用されるプラスミドが有するプロモーターは、各々の発現させる宿主細胞に合わせて自由に選択できる。ただし、抗体／抗原結合用タンパク質と抗体／抗原非結合タンパク質の発現プロモーター組み合わせは、抗体／抗原結合用タンパク質を発現させるプロモーターのほうが抗体／抗原非結合タンパク質よりも強いことが望ましい。
【００５１】
特に宿主細胞が酵母細胞である場合、具体的には強いプロモーターとして（TDH3（別名、GAPDH、GAP、GLDなど）、PGK１、GAL1、GAL10等）、弱いプロモーターとして（ADH1、PHO5等）が挙げられる。
【００５２】
また、両タンパク質の発現量を調節するために、導入するプラスミドの量を調節することや両タンパク質を発現させるプラスミドが有するプロモーターの働きを補助するエンハンサーや転写共役因子などを用いることも可能である。
【００５３】
本発明のナノ粒子は、自己組織化能を有するタンパク質が約１００個で１つの粒子を形成する。従って、本発明の粒子１つあたりに結合する抗体の程度は、自己組織化能を有するタンパク質１つあたりの標識量の、約１００倍となる。
【００５４】
本発明の粒子１個あたりに含まれる抗体／抗原結合用タンパク質の量が少なすぎれば、粒子に結合される抗体の数が少なくなり、前記抗体を認識する標識化抗体の量が減少し、測定感度が低下する。一方、本発明の粒子１個あたりに含まれる抗体／抗原結合用タンパク質の量が多すぎれば、前記抗体と抗体により認識される測定対象物質の結合に影響する可能性がある。
【００５５】
本発明における「抗体／抗原結合部位」は、好ましくはＦｃレセプター、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  G、Ｐｒｏｔｅｉｎ  A／G、Pｒｏｔｅｉｎ  Ｌ、ＺＺタグ、ストレプタグ（ｓｔｒｅｐｔａｇ）（登録商標）またはＲＮａｓｅ  Ａ由来のＳタグからなる群より選ばれるいずれかタグの全長もしくは一部およびそれらの変異体であり、好ましくは、抗体結合部位が、ＺＺタグまたはストレプタグである。
【００５６】
本発明における「抗体と抗体／抗原結合部位」は、抗体の抗原認識部位以外の領域と結合もしくは相互作用し得るポリペプチドであり、より好ましくは抗体Ｆｃ領域との結合部位である。このとき、抗体結合能が失われない限りにおいて、種々の変異を持つ変異体であってもよい。自己組織化能を有するタンパク質が抗体／抗原結合部位としてＺＺタグを有しており、該自己組織化能を有するタンパク質が抗体／抗原結合タンパク質のみからなる、脂質二重膜を取り込むことにより形成せしめるナノサイズの粒子を、ＺＺ粒子と表記する。
【００５７】
本発明において「ＺＺタグ」とは、Ｚ領域と呼ばれるＰｒｏｔｅｉｎ  Ａのもつ「抗体Ｆｃ領域との結合部位」がタンデムにならんだ領域を示す。ＺＺタグのアミノ酸配列は、次のような繰返し配列もしくはその変異体である。ＡＱＨＤＥＡＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号１）。ＺＺタグは分子量が小さく立体障害を起こさない観点からも好ましく用いられる。自己組織化能を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列に、配列番号２のヌクレオチド配列を挿入して、適当な宿主細胞で発現させることで作製することができる。このＺＺ領域（ＺＺタグ）と呼ばれるポリペプチドもしくはその変異体を用いることで、立体障害なく、抗体を高効率で高感度免疫学的測定用ナノ粒子表面に整列提示することが可能となり、免疫学的測定をより感度よく行うことが可能となる。つまり本発明の高感度免疫学的測定用ナノ粒子では、自己組織化能を有するタンパク質がＺＺタグを有する抗体結合タンパク質と、抗体非結合タンパク質から構成されることにより、免疫学的測定に用いる抗体を、ナノ粒子表面に、効率よく高密度で整列固定することが可能となり、そのため高感度な免疫学的測定が可能となる。
【００５８】
本発明における「ストレプタグ（登録商標）」は、アビジン結合能を有するアミノ酸配列であり、次のような配列、その繰り返し配列、またはその変異体である。ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号３）。
【００５９】
ストレプタグは４量体形成するアビジン物質を介してビオチン修飾された抗体／抗原分子を結合させることができる。自己組織可能を有するナノ粒子がストレプタグを有するタンパク質のみを含むものであれば、アビジン間で立体障害を生じる。アビジン物質は、１分子あたり４箇所でストレプタグ、又はビオチンと結合することが判明している。例えば、ストレプタグ間の間隔が小さいときには、アビジン物質の２箇所でストレプタグと結合し、ビオチン修飾された抗体／抗原物質と結合する部位が残る２個所になり、３個所でストレプタグと結合すると、ビオチン修飾された抗体／抗原物質と結合する部位が残る１個所になり、効率的に抗体／抗原分子をさせることができない。ストレプタグの間隔がさら小さいときは、アビジンがすべてストレプタグと結合し、ビオチン修飾された抗体／抗原分子をさせることができないことも生じる。そこで、ストレプタグを有する抗体／抗原用タンパク質結合用タンパク質の間隔が広がっている、本発明における高感度免疫学的測定用ナノ粒子を用いる事で、免疫化学測定に用いる抗原分子を効率よく高密度で整列固定することが可能となり、そのため高感度な免疫学的測定が可能となる。このとき、抗体／抗体との結合能が失われない限りにおいて、種々の変異を持つ変異体であってもよい。
【００６０】
本発明における「ストレプタグ」を含む「抗原／抗体結合用タンパク質」は、自己組織化能を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列に、配列番号４のヌクレオチド配列を挿入して、適当な宿主細胞で発現させることで作製することができる。
【００６１】
本発明における「抗原分子とナノサイズの粒子との結合」は、ストレプタグにアビジン物質を結合させ、あらかじめビオチン修飾された抗原／抗体がアビジン物質に結合することで実現されるが、高感度免疫学的測定用ナノ粒子と抗原／抗体の複合体作製の順序は特に定めない。またストレプタグは、アビジン物質との結合能が失われない限り、その変異体も含まれる。
【００６２】
本発明における「アビジン物質」は、アビジンストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどのビオチンと高い特異性と結合する物質であり、ビオチンとの結合能が失われない限り、アビジン物質に含まれる。
【００６３】
本発明における「ビオチン修飾」の手法に特に制限は無く、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基などを標的として標識する市販のビオチン化試薬を用いることができる。修飾する官能基は、抗体／抗原の性質によって適宜選択される。
【００６４】
本発明の免疫学的測定法において、高感度免疫学的測定用ナノ粒子は、抗体／抗原と同時に加えてもよく、予め抗体を該ナノ粒子の抗体／抗原結合部位に結合させた後に、従来の抗体／抗原として加えてもよく、抗体／抗原を加えた後に該ナノ粒子を加えてもよい。好ましくは抗体／抗原とナノ粒子は同時に加えるか、抗体／抗原を加える前にナノ粒子を加える。予め抗体／抗原とナノ粒子結合させる際の反応時間は、室温であれば１分〜１２時間であることが好ましい。さらに好ましくは５分〜１２時間、さらに好ましくは１０分〜６時間、最も好ましくは３０分〜２時間である。また、４℃であれば１時間〜２４時間の反応時間が好ましい。さらに好ましくは６時間〜１８時間。最も好ましくは８時間〜１６時間である。
【００６５】
一方、自己組織化能を有するタンパク質が抗体／抗原結合用タンパク質と抗体／抗原非結合タンパク質から構成される高感度免疫学的測定用ナノ粒子（ＺＳ粒子）表面上においては、抗体／抗原結合用タンパク質の間に、抗体／抗原非結合タンパク質が整列することにより、本発明における高感度免疫学的測定用ナノ粒子の表面に、自己組織化能を有するタンパク質の自己組織化効果により抗体／抗原結合部位を効率よく整列させることが可能となる。その結果免疫学的測定に用いる抗体／抗原を、ナノ粒子表面に効率よく整列固定することが可能となり、そのため高感度で高精度な免疫学的測定が可能となる。これにより免疫学的測定の感度は大きく向上する。自己組織化能を有するタンパク質がすべて抗体／抗原結合能を有するタンパク質より構成されるナノサイズの粒子（ＺＺ粒子）においては、ＺＺドメイン１分子あたりおよそ０．３７〜０．４７個のＩｇＧ抗体分子しか結合しないのに対し、本発明における粒子（ＺＳ粒子）は０．８０〜０．９１個のＩｇＧ抗体分子が結合する。
【００６６】
抗体／抗原結合部位は「自己組織化能を有するタンパク質」と疎水的に結合していてもよく、化学結合などにより共有的に結合しても良い。抗体／抗原結合部位は、融合タンパク質として「自己組織化能を有するタンパク質」に融合していることが好ましい。また融合の部位は、自己組織化能を失わない限りにおいて、Ｎ末端からＣ末端までの全ての場所に存在し得るが、粒子を形成したときに外側に存在することが好ましい。
【００６７】
本発明において「抗体／抗原結合用タンパク質間の間隔を広げる機能を有しており」とは、ナノサイズの粒子表面において抗体結合タンパク質の間に抗体／抗原非結合タンパク質が入り込むことによって、抗体／抗原結合用タンパク質間に距離を生じさせることである。この作用により、抗体／抗原結合用タンパク質に効率よく抗体／抗原が結合することを可能とする。ナノサイズの粒子表面上の抗体／抗原結合用タンパク質間の距離が広がる現象は電子顕微鏡や、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を用いて確認することができる。
【００６８】
本発明における自己組織化能を有するタンパク質は、ウイルス由来タンパク質であることが好ましく、ウイルス（特にＢ型肝炎ウイルス）の表面抗原タンパク質を用いることがより好ましい。「自己組織化能を有するタンパク質」として、ウイルス（特にＢ型肝炎ウイルス）の表面抗原タンパク質を用い、宿主細胞として酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞(例えばＣＨＯ細胞)などの真核細胞内で発現させることで、このタンパク質が宿主真核細胞の小胞体の脂質２重膜を取り込みながら自己組織化を起こし、物理的にも強度の強い、直径がナノサイズの粒子を効率的に作ることができる。このタンパク質を酵母内で発現させることで、数ｍｇ〜数ｇ／Ｌ培養のナノ粒子を生産できるため、非常に高効率な粒子の生産が可能であり、さらに、宿主細胞内で発現される可溶化タンパク質の１０％以上が本発明における自己組織可能を有するタンパク質であることから、粒子生産のコストを非常に低くすることができる。また、これは、産業的に該粒子を利用する上でも重要なことである（黒田ら、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー  １９９２年  １月  第２５巻  第２６７(３)号  １９５３−１９６１頁）。
【００６９】
ウイルス表面抗原を有するタンパク質が作り出すナノ粒子は物理的に非常に安定で、６０〜８０℃といった高温や８Ｍの尿素、または種々の界面活性剤存在下でもその形態を維持できる。このような粒子の安定性は様々な免疫学的測定手法に適用が可能になるため汎用性が高い、また保存性が高く、ハンドリングしやすい、さらには、測定中に他の不純物を除去する、あるいは非特異的結合を軽減するための洗浄処理（例えば、変性剤や界面活性剤による洗浄が可能になる）を加えることが可能になるため、検出の精度を上げられる。従って、ウイルス表面抗原タンパク質が作り出すナノ粒子を使うことで、免疫学的測定手法の幅が格段に広がる効果が期待できる（山田ら  ワクチン  ２００１年４月第３０巻；第１９（２３−２４）号：３１５４−３１６３頁）。
【００７０】
本発明において「脂質二重膜」とは、８〜２０ｎｍの厚さで２枚の脂質の層からなっており、それぞれの層の中で、両親媒性脂質の極性の頭が親水系の溶媒と接触しており、非極性の炭化水素の部分が２重層の内部を向いているものをいう。脂質２重膜の例としては、細胞膜や核膜、小胞体膜、ゴルジ体膜、液胞膜のような生細胞における生体膜、または人工的に作製したリポソーム等が挙げられる。中でも小胞体膜由来の脂質２重膜がより好ましい。脂質二重膜としては、真核生物、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞など由来のものが好ましく、特に好ましくは酵母由来の脂質二重膜が用いられる。
【００７１】
本発明において「ナノ粒子」とは、２０〜５００ｎｍの粒子である。本発明のナノ粒子は、好ましくは５０〜２００ｎｍの直径を持つ粒子である。最も好ましくは８０〜１５０ｎｍの直径を持つ粒子である。また、本発明のナノ粒子は、好ましくは内部に中空の空間を持つ中空ナノ粒子であり、その空間は必ずしも気体系の空間である必要はなく、溶液系の空間であってもよい。
【００７２】
本発明における高感度免疫学的測定用ナノ粒子は、好ましくは、主にタンパク質と脂質、糖を主要な構成成分とし、そのうち主要な成分はタンパク質である。
【００７３】
本発明において「宿主細胞」とは、真核生物、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞など由来のものが好ましく、より好ましくは酵母細胞である。より好ましくは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、特に好ましくは、ＢＹ２１４４５株、ＢＹ４７０８株、ＢＹ４７０９株、（ナショナルバイオリソースプロジェクト）またはＪＴ００７−１Ｄ株である。最も好ましくは、ＪＴ００７−１Ｄ株である。
【００７４】
本発明において「プラスミド」とは、高感度免疫学測定用ナノ粒子を産生させる宿主細胞において発現可能であれば特に制限されず、プラスミドの変異体でもよい。たとえば、酵母細胞を宿主にする際には（ｐＹＥＳ2）、昆虫細胞を宿主にするには（pFASTBac1）動物細胞を宿主にするには（ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ）などが挙げられる。
【００７５】
本発明においては、目的タンパク質の収率を上昇させるために、ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ、日本）を上記プラスミドと共に用いても良い。
【００７６】
抗体結合部位を持つタンパク質が自己組織化する能力を有することは、抗体の高密度整列、高密度提示を可能にし、免疫学的測定における感度の向上において重要な性質である。さらに、自己組織化する能力を有することは、自己組織化の過程で、他の夾雑タンパク質を排除することを示し、これは免疫学的測定の精度を向上（非特異的シグナルを抑制）させる上で重要な性質である。さらに、脂質二重膜を取りこむことで、非特異的吸着や相互作用を抑制し、免疫学的測定の精度を向上（非特異的シグナルを抑制）させることもできる。
【００７７】
本発明における自己組織化能を有するタンパク質が脂質二重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子を生産する生物種に特に制限はなく、真核生物、原核生物いずれによる生産であっても良いが、小胞体膜を介して自己組織化能を高めるため、真核生物による生産が好ましく、さらに好ましくは酵母細胞による生産である。ウイルス、ファージなどの感染工程を含むことや、組換え体も、本発明のナノサイズの粒子を生産する生物種の範囲である。
【００７８】
本発明の別の用途の一例としては、検出の対象となるタンパク質や核酸等を含む試料をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)やアガロースゲル等により電気泳動した後、ＰＶＤＦやセルロース性等の膜に電気的または浸透圧で転写し、転写した膜における検出対象物質を特異的に認識できる抗体などの物質認識分子、かつ、蛍光、発光、吸光、または放射線同位元素をその表面に提示している高感度免疫学的測定用ナノ粒子を含んだ緩衝液中で反応させて、該粒子と膜上に転写されたターゲットタンパク質、あるいは核酸等を結合させる。その後、結合していない該粒子を、該粒子が含まれない緩衝液で洗浄し、膜上に残った該粒子由来の蛍光、発光、吸光、または放射線同位元素の量を検出するものもある。
【００７９】
本発明において「センサーチップ」とは、測定対象となる微量物質を含む試料を結合させるための基板と、基板上に結合した試料から測定対象物質を特異的に検出し、物性の変化によって生じる信号を検出器に伝えるための装置である。
【００８０】
本発明において「プレート」とは、高感度免疫学的測定用ナノ粒子が含まれる多検体測定用マルチウェルプレートであり、その作成法に関して、例えば石川榮治編［生物化学実験法４８  エンザイムアッセイはこう開発する］学会出版センター、２００３、または、Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ編[Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ]ELSEVIER、２００５などの記載を基に行うことができる。
【００８１】
本発明において「プレート」とは、好ましくは免疫化学測定を行うためのイムノプレートである。
【００８２】
本発明において「基板」とは、金属、プラスチック、有機／無機高分子材料であれば特に限定されないが、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスルホン、ポリテトラフルオロテプロン（ＰＶＤＦ）、セルロース、シリコン、マイカー、テフロン（登録商標）ポリメチルペンテン（ＰＭＰまたはＴＰＸ（登録商標））、ポリスチレン（ＰＳｔ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス類およびその複合体、金、銀、銅、ニッケル、コバルト等の金属およびその複合体、セラミックスおよびその複合体等が好ましく用いられる。また、その表面の全体、または少なくとも検出が行われる部分がこれらによって覆われているものが好ましい。もちろん、これらの基板材料を複数組み合わせて用いることもできる。例えば、ガラス基板を金属で被覆した組み合わせや樹脂基板の表面を金属で被覆した基板などが好ましく用いられる。また、本発明のセンサーチップは検出を容易にするため、基板表面を親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールやポリビニルアルコールなど）によりコーティングやグラフトなどの処理を行ったものや疎水化したもの、ラジカル化したもの、これら基板を抗体などのタンパク質やＤＮＡなどの核酸または糖などで被覆、修飾、処理した状態のものも含む。さらに基板の形状は必ずしも平面であるとか限らず、湾曲や曲面を有していてもよいものとする。
【００８３】
本発明におけるセンサーチップを作製する手順に特に制限はなく、高感度免疫学的測定用ナノ粒子と脂質二重膜の複合体による被覆を予め基板上に形成させた基板を作製し、これに抗体／抗原溶液を作用させることにより作製しても良い。もしくは、高感度免疫学的測定用ナノ粒子と脂質二重膜の複合体に、予め抗体／抗原もしくは抗体／抗原と架橋剤の混合溶液を作用させたものを基板に添加し作製しても良い。センサーチップを作製する際には、余分なもしくは未反応の架橋剤を失活もしくは除去する工程を含むことが望ましい。また、高感度免疫学的測定用ナノ粒子と抗体の結合性を高めるために、溶液のｐＨ、濃度、イオン強度、界面活性剤、温度などを変化させても良い。
【００８４】
本発明におけるセンサーチップの形状や大きさに特に制限はなく、数ミリ角のチップ状であってもよく、直径がナノメーターからミリメーターまでのビーズ状や球状であってもよく、９６穴マルチウェルプレートや３８４穴マルチウェルプレート、１５３６穴マルチウェルプレート状の形状であっても良い。また、複数の目的とする物質を測定可能にする目的で、二種類以上の複数の抗体や高感度免疫学的測定用ナノ粒子が、それぞれ別の部位に結合しているような、アレイ状のセンサーチップであっても良い。本発明におけるセンサーチップの形状は、球形が特に好ましい。
【００８５】
本発明における高感度免疫学的測定用ナノ粒子は、センサーチップ上においてドーム状、エンボス状、ブロック状などの構造に変化し得る。
【００８６】
本発明におけるこのセンサーチップを用いた具体的な用途の一例としては、ある疾患の患者の血液中に特異的に存在するタンパク質などの生理活性物質、抗体の量を測定することが可能である。高感度免疫学的測定用ナノ粒子が結合したセンサーチップ上に効率的に測定対象となるタンパク質などの生理活性物質を認識する抗体を結合させ、更に好ましくは平面膜状生体認識分子整列体を用いて効率的に整列させた状態で結合させ、患者の血液を該センサーチップに反応させることで、測定対象物質が該センサーチップ上に整列された抗体と結合することで生じる、表面プラズモン、基本振動数または、偏光干渉といったセンサーチップの物性変化を測定することで、ある疾患の患者の血液中に特異的に存在する微量の生理活性物質を確認または定量測定することが可能になる。
【００８７】
またはセンサーチップ表面に並べた抗原タンパク質に、該抗原タンパク質を認識する一次抗体と、該一次抗体を認識する二次抗体が結合した高感度免疫学的測定用ナノ粒子の複合体が結合することで生じる、表面プラズモン、基本振動数または、偏光干渉といったセンサーチップの物性変化を解析することで、ある疾患の患者の血液中に特異的に存在する微量の一次抗体量が確認または定量測定することが可能になる。
【００８８】
または高感度免疫学的測定用ナノ粒子が結合したセンサーチップ上に効率的に抗原を結合させ、更に好ましくは平面膜状生体認識分子整列体を用いて効率的に整列させた状態で結合させ、患者の血液を該センサーチップに反応させることで、測定対象抗体が該センサーチップ上に整列された抗原と結合することで生じる、表面プラズモン、基本振動数または、偏光干渉といったセンサーチップの物性変化を測定することで、ある疾患の患者の血液中に特異的に存在する微量の抗体を確認または定量測定することが可能になる。
【００８９】
このようなセンサーチップを用いた物質の検出系は、微量信号の増幅効果のため、特に患者特有のタンパク質がｎｍｏｌ以下の極微量の場合その威力を発揮する。また、環境ホルモンの測定にも利用することができ、ダイオキシンを例に挙げると、哺乳類の体内におけるダイオキシンのレセプターである「ＡｈＲ」タンパク質の全長あるいはダイオキシン結合部位のみをセンサーチップ上に整列させた状態で結合させ、そこにダイオキシンの汚染が心配される土壌、河川水、母乳等から組精製した、あるいはそのままの試料をセンサーチップと反応させ、センサーチップをダイオキシンが含まれない緩衝液で洗浄後、ダイオキシン−ＡｈＲ結合体に特異的に結合する核内タンパク質である「ＡＲＮＴ」、またはダイオキシンに対する抗体が表面に結合されている中空ナノ粒子をセンサーチップに反応させ、その表面プラズモンの変化から試料中のダイオキシンの存在有無、あるいはその量を定量することが可能である。
【００９０】
本発明におけるセンサーチップを用いた環境ホルモンの測定はＳＰＲ以外にも、ＱＣＭを用いる方法や、蛍光、または発光、または吸光、または放射線同位元素をその表面に提示、または内包する中空ナノ粒子を用いた検出の方法等も考えられる。この際、環境中のダイオキシンの量は非常に微量であり、一般的には定量のためには試料からダイオキシンを抽出して更に高度に濃縮するといった前処理の必要があり、数日から数週間という長い時間が必要であったが、本発明のセンサーチップにおける信号の増幅効果により、前処理無しでも、あるいはより簡単な前処理によって測定が可能になり、測定の時間も数時間から数日と短くなることが期待される。
【００９１】
本発明において「抗体の変異体、自己組織化能を有するタンパク質の変異体もしくは抗体結合部位の変異体、もしくはＺＺタグの変異体」とは、
１）これらタンパク質に遺伝子工学的に点、あるいは複数のアミノ酸置換を起こしたもの、
２）タンパク質の全長から一部を削り取るか、新しくタンパク質配列を付け加えたもの、
３）核酸・糖・脂質・化合物等によってタンパク質の一部に修飾されたもの、であって、
４）変異を起こす前の抗体と同一の物質を認識する能力を持つ抗体変異体、
５）変異を起こす前の自己組織化能を有するタンパク質と同様に脂質２重膜を取りこんで自己組織化によりナノ粒子を形成する能力を有する変異体、
６）変異を起こす前の抗体結合部位やＺＺタグまたはストレプタグと同様に、抗体のＦｃ領域と相互作用する能力を有する変異体、
である。
【００９２】
このような変異体を作製するには該タンパク質を発現する遺伝子を含む環状プラスミド上でアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を行うためのプライマーとＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等の変異を起こすためのキットを用いて１２〜１８サイクルのＰＣＲを行い、その産物を制限酵素ＤｐｎＩで切断し、大腸菌に形質転換することにより可能である。
【００９３】
さらに、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて行うことができる。例えば亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換する方法や、マンガンを含む反応液中でＰＣＲを行い、ＤＮＡ合成時のヌクレオチドの取り込みの正確性を低くする方法、部位特異的変異導入のための市販されている各種キットを用いることもできる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等編［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版］Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、２００１年、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社、１９８８年、エールリッヒ、ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス、１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができる。また、核酸・糖・脂質・化合物等によってタンパク質の一部に修飾を施したものとして具体的にはリン酸化酵素によるタンパク質中のセリン、またはスレオニン残基のリン酸化、糖鎖付加酵素によるアスパラギン、またはセリン、またはスレオニン残基の糖鎖付加、または還元・アルキル試薬によるシステイン残基の還元・アルキル化のようなものを例示することができ、これらのものを作製するにはタンパク質にリン酸、または糖鎖等を混ぜて、リン酸化酵素や糖鎖付加酵素を加え、その酵素が働く最適な条件（温度、ｐＨ、塩濃度等）を維持したり、タンパク質の入った溶液に還元剤であるジチオツレイトールやメルカプトエタノール等を終濃度で５  ｍＭ濃度になるように入れ、温度６０  ℃付近、ｐＨ中性以上で１時間反応させ、更にアルキル化剤として５〜１５  ｍＭ濃度のヨードアセトアミドを加え室温で１時間以上反応させることにより可能である。もちろん例示した上記の修飾以外にもタンパク質に対する様々な修飾が考えられる。
【００９４】
本発明の高感度免疫学的測定用ナノ粒子を用いる免疫学的測定方法は、各種のウェスタンブロッティングや免疫組織染色、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＦＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、イムノクロマト、免疫電子顕微鏡観察、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、ＳＰＲ、ＱＣＭ、ＤＰＩ、エリプソメトリー法などに有効である。
【実施例】
【００９５】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００９６】
（実施例1：遺伝子組換え酵母によるZS粒子の発現と精製）
本実施例では、遺伝子組換え酵母によるZS粒子の発現と精製を行った。
（材料および方法）
（酵母の改良）
本実施例では、本発明者らによって報告されたジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー  １９９２  １月  第２５巻  第２６７(３)号  １９５３−１９６１頁に記載の遺伝子組換え酵母（サッカロマイシス  セレビジエ  ＡＨ22Ｒ−  (ｌｅｕ2−)株）と、複数の選択マーカーを持つ、サッカロマイシス  セレビジエ  Ｊ６２８(ｔｒｐ1−、ｕｒａ3−)株との交配および７  回の戻し交配により、遺伝子組換え酵母にｔｒｐ１−、ｕｒａ３−選択マーカーを新たに付与したサッカロマイシス  セレビジエ  ＪＴ００７−１D  (ｌｅｕ2−、ｔｒｐ1−、ｕｒａ3−、ｈｉｓ4−)株を作成した（図１）。
(抗体非結合タンパク質（S粒子）発現プラスミドの構築)
ｐＨＢＶ９３３プラスミド(オノら、ヌクレイック  アシッド  リサーチ  １９８３年  第１１巻  １７４７−１７５７頁)から、Ｓ領域を、Ｃ末端側にＰＧＫｔ配列を付加し、Ｎ末端側およびＣ末端側の両末端にＳａｌＩサイトを付加したプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、ＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動で分離して約１．０  kbpの目的バンドの遺伝子断片を回収した後、ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴプラスミド
(黒田ら、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー  １９９２年  １月  第２５巻  第２６７(３)号  １９５３−１９６１頁；配列番号５)  をＳａｌ  Ｉで消化し、L遺伝子を削除したプラスミドに、上記遺伝子断片をタカラ  ライゲーション  キット  バージョン  ２（タカラ社、日本）を用いて、閉環結合させて作成した、pGLD-P25WTプラスミド（黒田ら、  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー  １９９２  Ｊａｎ  ２５;  ２６７(３):１９５３−６１．；配列番号６、図２）から、オリゴヌクレオチド（５’-  ＣＡＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＴＧＴＡＴＧ  -３’；配列番号７）及びオリゴヌクレオチド（５’-  ＣＡＴＡＡＡＴＣＧＣＣＧＴＧＡＣＧＡＴＣ  -３’；配列番号８）の両プライマーを用いたＰＣＲ法により、Ｓ領域を増幅させた。
【００９７】
ＰＣＲ産物を制限酵素Ｂａｍ  ＨＩとＳａｌ  Ｉで消化した後、アガロース電気泳動で分離し、約２．０  ｋｂｐの目的遺伝子断片のバンドを回収した後、ｐＧＭＴ２０プラスミド(イハ、ツルギら、バイオテクニックス、１９９８年、１２月、第２５(６)巻、９３６−９３８頁)のＢａｍ  ＨＩとＳａｌ  Ｉサイトとの間に、上記遺伝子断片をタカラ  ライゲーション  キット  バージョン２  (タカラ社)を用いて、閉環結合させた。塩基配列を確認し、このプラスミドを「ｐＧＭＴ２０-S」と命名した。（図２）
(組換え酵母による高感度免疫学的測定用ナノ粒子（ZS粒子）の発現)
ZZタグを提示するＨＢｓＡｇ  Lタンパク質（抗体結合タンパク質）を発現させるｐＧＬＤ−ＺＺ５０プラスミド（特開２００４−００２３１３号公報（図３））１０  μｇと、上記ｐＧＭＴ２０−Ｓプラスミド５  μｇを酵母JT００７−１D株にスフェロプラスト法により形質転換し、得られたトランスフォーマントを合成培地Ｈｉｇｈ−Ｐｉ（キタノら、バイオテクノロジー、１９８７、第５巻、２８１−２８３頁）（トリプトファンを除き、ウラシル（２０  ｍｇ／Ｌ）を添加し、アスパラギンの代わりにアスパラギン酸を使用）を、３  ｍｌにて３０  ℃、２日間、続いて、８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００（ウラシル（２０  ｍｇ/Ｌ）を添加し、アスパラギンの代わりにアスパラギン酸を使用）１０  ｍｌにて３０℃、３日間培養し、ＺＺタグを提示するＨＢｓＡｇ  Ｌタンパク質およびＨＢｓＡｇ  Ｓタンパク質を同時に発現させた。
【００９８】
定常成長期（約７２時間後）にある遺伝子組換え酵母から、遠心分離(３０００  ｒｐｍ、３０分間、４℃)により全細胞抽出液を回収し、ｂｕｆｆｅｒ  A溶液（７．５  Ｍの尿素、０．１  Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．２、１５  ｍＭのＥＤＴＡ、２  ｍＭのＰＭＳＦ、０．１％のＴｗｅｅｎ８０）２  mlに懸濁し、グラスビーズを用いて酵母を破砕した。破砕後、上清（１  ml）を遠心分離(３０００  rpm、３０分間、４℃)により回収し、１２．５  ％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、PVDF膜上で抗ＨＢｓＡｇ  ＺＺモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング、およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原キット  ＩＭｘダイナパック（ダイナボット社、米国）により試料中のＨＢｓＡｇの同定を行った。
【００９９】
本発明者らは、ZZタグを提示するＨＢｓＡｇ  Ｌタンパク質（抗体／抗原非結合用タンパク質）およびＨＢｓＡｇ  Ｓタンパク質（抗体／抗原非結合タンパク質）を同時に発現する、混合粒子産生遺伝子組換え酵母を樹立した。ウェスタンブロッティング（図４）で確認されるように、分子量約４８  ｋＤａ(ZZ)と約２４  ｋＤａ(Ｓ）のタンパク質で、またＩＭｘ測定よりＳ抗原性を有することが確認された。
【０１００】
(組み換え酵母によるZS粒子の産生および精製)
ZS粒子タンパク質を大規模でアフィニティ精製するために、上記ｐＧＬＤ−ＺＺ５０プラスミドとｐＧＭＴ２０−Ｓプラスミドを保持した遺伝子組換え酵母JT００７−１D株を、合成培地Ｈｉｇｈ−Ｐｉ（トリプトファンを除き、ウラシル(２０  mg/L)を添加し、アスパラギンの代わりにアスパラギン酸を使用）５０  mlにて３０  ℃、２  日間、更に同組成のＨｉｇｈ−Ｐｉを４００  mlにて３０℃、１日間、続いて、８S５N−P４００（ウラシル（２０mg/L）を添加し、アスパラギンの代わりにアスパラギン酸を使用）を、４  Lにて３０℃、３日間培養し、ZSタンパク質粒子を発現させた。
【０１０１】
定常成長期（約７２時間後）にある遺伝子組換え酵母から、遠心分離(３４，７８０ｘ  ｇ、３０分間、４℃)により全細胞抽出液（湿重量５０  g）を回収し、まず２５  gをｂｕｆｆｅｒ  A溶液（７．５  Ｍの尿素、０．１  Ｍのリン酸ナトリウム、pH  ７．２、１５  mＭのＥＤＴＡ、２  mMのＰＭＳＦ、０．１  ％のｔｗｅｅｎ８０）２００  mlに懸濁し、グラスビーズを用いてビードビーター(BEAD-BEATER)にて酵母を破砕した。破砕後、遠心分離(３４，７８０ｘ  ｇ、３０分間、４℃)により上清（１８５  ｍｌ）を回収し、１  ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して、４℃で５時間透析した。
【０１０２】
透析後の試料（２２３  ｍｌ）を７０℃で２０分間熱処理し、氷冷後、遠心分離(３４，７８０ｘ  ｇ、３０分間、4℃)を行った。
【０１０３】
この上清（２０５  ｍｌ）を、ポーサイン  シーラム  (シグマ  Ｐ９７８３、米国)から精製したイムノグロブリン（ポーサイン  ＩｇＧ）とＮＨＳ−アクチベイティッド  セファロース  ４  ファスト  フロウ  (ジーイー  ヘルスケア、米国)とをカップリング反応させ、ＡＫＴＡ  (ジーイー  ヘルスケア)  精製用プラスチックカラム（φ１．６  ｘ１５  ｃｍ）に充填したポーサイン  ＩｇＧ  クロマトグラフィーに供した。７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ  ７．２)、１０  ｍＭのＮａＣｌ溶液で充分に洗浄し、３．５  ＭのＮａＳＣＮ、１０  ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ  ７．２)、０．５  ＭのＮａＣｌ、および１０ｍ  ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ  ７．２）でステップワイズ溶出した。
【０１０４】
残りの全細胞抽出液（２５  ｇ）についても同様の精製を行った後、全ての溶出物（４０  ｍｌ）を限外濾過により約２．５  ｍｌまで濃縮した。
【０１０５】
ＨＢｓＡｇ画分の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色、および酵素免疫測定ＩＭｘにより確認した（図５）。最終的に、培地４  Ｌ由来、湿重量５０  ｇの菌体から、約０．５  ｍｇのＨＢｓＡｇ画分を得、画像解析ソフト（イメージ  Ｊ）により、精製純度６７．４  ％（ＺＺ  ５２．８％、Ｓ  １４．６％）と算出した。
【０１０６】
（実施例２：ＺＺタンパク質とＳタンパク質の同一粒子上での発現確認）
ダイナビーズ  プロテイン  Ａ［ベリタス  ＤＢ１０００１、（日本）］１００  μｌを０．１  Ｍのナトリウム-リン酸緩衝液ｐＨ  ８．０で３回洗浄した。このビーズに抗ＨＢｓＡｇ  Ｐｒｅ−Ｓ抗体（３０  μｇ）を添加し、室温で２０分間反応し、磁石で２分間沈降させ、上清を取り除いた後、０．１  Ｍのナトリウム-リン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）０．５  ｍｌで３回洗浄した。この抗体を結合したビーズに、精製したＨＢｓＡｇ画分(１００  μｇ)を加え４℃で１時間インキュベートした後、磁石で２分間抗体結合ビーズとＨＢｓＡｇ画分の複合体を沈降させ、上清を取り除いた後、ＰＢＳ(１  ｍｌ)で３回洗浄し、免疫沈降物を回収した。この免疫沈降物を、抗ＨＢｓＡｇ  Ｓ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、ＺＺとＳの発現を確認した（図６）。
【０１０７】
図に示すように、ＺＺとＳは共に検出されたことから、同一粒子上で発現していることが確認された。この精製ＨＢｓＡｇ画分を「ＺＳ粒子」と命名した。
【０１０８】
（実施例３：ＺＳ粒子の抗体結合量）
本実施例では、ＱＣＭ法によりＺＳ粒子と抗体結合量を測定した。
(ＱＣＭ)法によるＺＳ粒子と抗体結合量の測定)
ＺＳ粒子と抗体結合量を、Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ  (ＱＣＭ)［ツイン−Ｑ；アズワン（大阪、日本）］によって測定した（図７）。以下の反応は、撹拌筒６００  ｒｐｍ、２５℃で行った。反応槽に５００  μｌのＰＢＳを加え、周波数変化が±３  Ｈｚ、１分間以上になるまで安定させた。なお、以下の反応は、周波数変化が±３  Ｈｚ、１分間以上を安定と判定し、その点を最大結合量として測定した。
【０１０９】
２０  μｇのＺＳ粒子を添加し、周波数の安定を確認後、反応槽をＰＢＳで３回洗浄した。次いでブロッキングバッファー（２０  μｇのスキムミルク［ナカライテスク（京都、日本)]）を添加し、周波数の安定を確認後、２０  μｇの抗体［ヒューマン  トータル  ＩｇＧ,  （シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）］を５回添加し、周波数の安定を確認した。
【０１１０】
図に示すように、ＺＳ粒子の抗体結合量は、ＺＺ粒子に比べ、約２倍上昇した（図８）。
【０１１１】
（実施例４：ＺＳ粒子を用いた抗原量の測定）
本実施例では、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）により、ＺＳ粒子を用いて抗原量の検出感度を測定した。
【０１１２】
(ELISA法によるＺＳ粒子を用いた抗原オヴァルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）測定の高感度化)
Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（シグマ）１００  μｌ（１５、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６３、０．０７８１、０．０３９１、０．０１９５、０μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）を４℃で終夜固相化したＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  ＩＩ  [サーモ  フィッシャー  サイエンティフィック  (ウォルサム、マサチューセッツ州、米国)]  をＰＢＳＴ  (０．０５％  ｔｗｅｅｎ  ２０/ＰＢＳ)  ２００μｌで３回洗浄した。１次抗体としてマウス由来抗オヴァルブミンモノクローナル抗体  ＩｇＧ１［アブカム、（台湾、台北）］溶液１００  μｌ（０．４  μｇ／ｍｌ希釈液（１％  ブロックエース［雪印（日本）］/ＰＢＳＴ））を室温で２時間静置反応させた。ＰＢＳＴ  ２００μｌで３回洗浄後、２次抗体としてウサギ由来、抗マウスＩｇＧ-ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  (シグマ)  １００  μｌ（２  μｇ/ｍｌ希釈液）を室温で２時間静置反応させた。この時、予め２次抗体にＺＳ粒子を最終濃度２  μｇ/ｍｌで添加し、室温で３０分静置させたＺＳ粒子と２次抗体の複合体についても、同様に室温で２時間静置反応させた。ＰＢＳＴを２００  μｌで３回洗浄後、ＨＲＰ標識物質の検出基質ＴＭＢ（ピアス［ロックフォード、イリノイ、米国］）１００  μｌを加え室温で１５分反応させ、２ＮのＨ２ＳＯ４  １００  μｌを添加し反応を停止させた。マルチスペクトロマイクロプレートリーダ(バリオスカン、サーモ  フィッシャー  サイエンティフック)を用いて、Ａｂｓ  ４５０ｎｍ（ブランクＡｂｓ  ５９５ｎｍ）を測定した。
【０１１３】
Ａｂｓ  ４５０−５９５ｎｍ＝０．５を与える時の抗原濃度から検出感度の上昇倍率を算出した。ＨＲＰ標識２次抗体のみを用いた場合と比較し、ＺＳ粒子を用いることで約１１倍と更に向上した。（図９）
ＺＺタグを提示するＨＢｓＡｇ  Ｌタンパク質およびＨＢｓＡｇ  Ｓタンパク質を同時に発現する、混合粒子産生遺伝子組換え酵母を樹立し、精製したＨＢｓＡｇ  画分をＺＳ粒子と命名した。ＺＳ粒子の抗体に対する結合量を測定し、ＺＺ粒子の抗体結合量と比較検討した。従来のＺＺ粒子に比べ、ＺＳ粒子の抗体結合量は約２倍上昇した。ＥＬＩＳＡ法により、ＺＳ粒子を用いた抗原オヴァルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）の検出感度を測定し比較検討した。ＨＲＰ標識２次抗体のみを用いた場合と比較し、ＺＳ粒子を用いることで約１１倍と更に向上した。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、「遺伝子組み換え酵母ＪＴ００７−１Ｄの作製」を示す図である。
【図２】図２は、「抗体／抗原非結合タンパク質（Ｓ粒子）発現プラスミドの構築」を示す図である。
【図３】図３は、「抗体／抗原結合用タンパク質（Z粒子）発現プラスミドの構造」を示す図である。
【図４】図４は、「ウェスタンブロッティングによる組換え酵母における高感度免疫学測定用ナノ粒子（ＺＳ粒子）の発現」を示す図である。
【図５】図５は、「組み換え酵母によるＺＳ粒子の産生および精製」を示す図である。
【図６】図６は、「免疫沈降法によるＺＺタンパク質とＳタンパク質の同一粒子状での発現確認」を示す図である。
【図７】図７は、「ＱＣＭ法によるＺＳ粒子の抗体結合量の測定」を示す図である。
【図８】図８は、「ＺＳ粒子のＺＺドメイン１分子あたりに結合するＨｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＩｇＧ分子量」を示す図である。
【図９】図９は、「ＥＬＩＳＡ法によるＺＳ粒子を用いた抗原測定の高感度化」を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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