(57)【要約】【課題】ナノサイズの粒径を有し、比較的高い内包率を維持しながら単層（単胞）のものを多く含むリポソームが効率的に得られ、多胞リポソームのほとんど無い、特に水溶性薬剤に適したリポソームの製造方法を提供する。【解決手段】Ｗ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；当該Ｗ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）とを、０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜を用いて乳化し、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；および当該Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒を除去することによりリポソームの懸濁液を調製する工程；を有することを特徴とするリポソームの製造方法。上記膜としてはＳＰＧ膜が好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（３）を有することを特徴とする、リポソームの製造方法；
（１）一次乳化工程：有機溶媒（Ｏ）、水性溶媒（Ｗ１）、および混合脂質成分（Ｆ１）を乳化することにより、Ｗ１／Ｏエマルションを調製する工程；
（２）二次乳化工程：上記工程（１）により得られたＷ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）とを、０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜を用いて乳化し、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する工程；
（３）上記工程（２）により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒を除去することにより、リポソームの懸濁液を調製する工程；
ただし、上記一次乳化工程は、さらにリポソームに内包させる物質を添加した上で行ってもよい。
【請求項２】
前記工程（２）が、Ｗ１／Ｏエマルションを、０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜を通過させ、水性溶媒（Ｗ２）中に液滴として分散させることにより、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する工程であることを特徴とする請求項１に記載のリポソームの製造方法。
【請求項３】
前記工程（２）が、前記膜を用いた乳化により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを、０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜を通過させる膜処理工程をさらに有することを特徴とする請求項１または２に記載のリポソームの製造方法。
【請求項４】
前記工程（２）の膜としてＳＰＧ膜を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項５】
前記リポソームに内包させる物質として医療用の薬剤類を用い、かつ得られるリポソームの平均粒径を５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下とすることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項６】
前記工程（２）において、水性溶媒（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルション以外にさらに、リポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤、または混合脂質成分（Ｆ２）の少なくともどちらか一方を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項７】
前記リポソームが単胞リポソームであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品、食品などの分野で用いられるリポソームの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、単層または複数層の脂質二重膜からなる閉鎖小胞体であり、内水相および脂質二重膜内部にそれぞれ水溶性および疎水性の薬剤類を保持できることが知られている。また、リポソームの脂質二重膜は生体膜に類似しているため生体内での安全性が高いことなどから、たとえばＤＤＳ（ドラック・デリバリー・システム）用の医薬品などの、各種用途が注目され、研究開発が進められている。
【０００３】
これまでにリポソームの製造方法は数多く提案されてきたが、医薬品として承認されうるリポソームを製造できる、コスト的・工業的に優れた汎用的な技術は少ない。水溶性薬剤はリポソームの内水相に含ませることができるが、一般的には良いとされるリポソーム製造方法でも内包率（最終的に得られたリポソーム懸濁液（リポソームおよび外水相）に含まれる薬剤類の総質量に対する、リポソームに内包された薬物類の質量の割合）は２０％程度であり、多くの場合、内包されない薬剤はロスとなる。これよりも内包率の高くなるリポソーム製造方法など、たとえば逆相蒸発法、は再現性が悪く、工業的に適さない。また、近年では核酸医薬など注目されているが、単体では生体内で不安定なため、これらを安定化させるキャリアが望まれている。このため、水溶性薬剤を効率的に内包させることができ、かつナノサイズ（好ましくは静脈注射に適する２００ｎｍ以下）の平均粒径を有するリポソームを製造できる方法が望まれている。
【０００４】
なお、日本国内では「ビジュダイン（VISUDYNE）」（登録商標）、「アムビゾーム（AmBisome）」（登録商標）および「ドキシル（DOXIL）」（登録商標）の３種類のリポソーム製剤が市販されている。しかしながら、ビジュダインおよびアムビゾームは、リポソームに内包させやすい疎水性の薬剤を内包するものである。また、ドキシルは、リポソーム形成後に外水相に薬剤を添加し、内外濃度差を利用して薬剤をリポソームに内包するリモートローディング法と呼ばれる方法により、８０％以上の高い内包率を達成している。しかし、この方法は、初期は水溶性であるが内水相内で塩を形成することができ、かつリポソームの脂質膜を通過することのできる特殊な低分子水溶性薬剤でなければ用いることはできない。
【０００５】
リポソームの粒径を小さくするための工程として、従来からエクストルーダによるサイジングが行われているが、この工程により粒径はナノサイズになるものの、リポソームに内包される薬剤の量は大幅に減少してしまう。
【０００６】
非特許文献１では、２段階で乳化したＷ／Ｏ／Ｗエマルションを液中乾燥し、リポソームを形成するマイクロカプセル化法が提案されている。この方法は他の方法と比較して効率的に薬剤類を内包できるが、得られるリポソームのサイズは大きく、また非特許文献２では水溶性の高い（logPの低い）薬剤類の内包率はあまり向上しないことが報告されている。
【０００７】
特許文献１には、２段階の乳化工程を含むリポソーム製剤の製造方法において、リポソームの脂質成分として炭素数がより大きな脂質を用いることにより、薬剤類の内包率を向上させることができることが記載されている。しかしながら、この方法により得られるリポソームはほとんどが多胞リポソーム（多数の非同心の水性小室を内包するもの）で、かつ平均粒径もマイクロメートルサイズであることから、この方法により均一なナノサイズの単層のリポソーム（単胞リポソーム）を得ることは困難である。
【０００８】
特許文献２には、Ｗ／Ｏエマルションを多孔質ガラス膜に透過させてＷ／Ｏ／Ｗエマルションを製造する方法であって、水性乳化剤として所定のエステル化合物を用いることにより内水相内の有用物質の漏洩を抑制する方法が記載されている。しかしながらこの文献には、上記の方法をリポソーム製造に使用することについては何ら具体的に記載されていない。
【０００９】
特許文献３には、形成したＷ／Ｏ／Ｗエマルションからリポソームを製造する方法であって、溶媒をエマルション中から除去しクロスフローろ過にかける方法が記載されている。しかしながら、この方法によって得られるリポソームは多胞リポソームであり、均一なナノサイズの単層のリポソーム（単胞リポソーム）を得ることは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００１−５０５５４９号公報
【特許文献２】特開２００３−１６４７５４号公報
【特許文献３】特表２００１−５２２８７０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】J Dispers Sci Technol, 9(1), 1-15 (1988)
【非特許文献２】Int J Pharm, 298, 198-205 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ナノサイズの粒径を有し、比較的高い内包率を維持しながら単層のものを多く含むリポソーム（単胞リポソーム）が効率的に得られ、多胞リポソームのほとんど無い、特に水溶性薬剤に適したリポソームの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は鋭意検討した結果、２段階でＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製する際の二次乳化工程において、０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜を用いた膜乳化を行うことにより、意外にも上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明のリポソームの製造方法は、下記工程（１）〜（３）を有することを特徴とする；
（１）一次乳化工程：有機溶媒（Ｏ）、水性溶媒（Ｗ１）、および混合脂質成分（Ｆ１）を乳化することにより、Ｗ１／Ｏエマルションを調製する工程；
（２）二次乳化工程：上記工程（１）により得られたＷ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）とを、０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜を用いて乳化し、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する工程；
（３）上記工程（２）により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒を除去することにより、リポソームの懸濁液を調製する工程；
ただし、上記一次乳化工程は、さらにリポソームに内包させる物質を添加した上で行ってもよい。
【００１５】
前記工程（２）の乳化方法としては、Ｗ１／Ｏエマルションを、０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜を通過させ、水性溶媒（Ｗ２）中に液滴として分散させることにより、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する乳化方法が好ましい。また、前記工程（２）において、Ｗ１／Ｏエマルションを膜乳化して得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを、０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜を通過させる膜処理工程をさらに有することにより、最終的なＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製することも好ましい。前記工程（２）の０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜としては、ＳＰＧ膜を用いることが好ましい。前記リポソームに内包させる物質として医療用の薬剤類を用い、かつ得られるリポソームの平均粒径を５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下とすることが好ましい。前記工程（２）では、水性溶媒（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルション以外にさらに、リポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤または混合脂質成分（Ｆ２）の少なくともどちらか一方を用いることが好ましい。
【００１６】
なお、本発明における「平均粒径」とは体積平均粒子径を指す。また、Ｗ１／Ｏエマルションやリポソームの体積平均粒子径は、後述する実施例に示したように、それらの溶液をクロロホルム／ヘキサン混合溶媒（体積比：４／６）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて算出される値である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の製造方法によれば、医薬品用としても好適なナノサイズの平均粒径を有し高い内包率を維持したリポソームを効率的に製造できるようになる。しかも、得られるリポソーム中には単層（単胞）のものが多く、多胞リポソームとして残るものの割合が従来よりも著しく減少している。特に二次乳化工程においてＳＰＧ膜を用いることにより、コストが安く処理量が多い、工業的に有利な方法とすることができる。また、一次乳化工程をさらにリポソームに内包させる物質（特に水溶性の薬剤類）を添加した上で行った場合には、リポソームに上記のような性状を賦与しつつ従来と同等以上の比較的高い内包率で注射等の医薬品用に適用可能なリポソームを達成することができる。このような本発明のリポソームの製造方法を利用することにより、各種の用途に好適なリポソームの生産性を著しく改善することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
− 製造原料 −
・混合脂質成分（Ｆ１）・（Ｆ２）
一次乳化工程で用いる混合脂質成分（Ｆ１）は主としてリポソームの脂質二重膜の内膜を構成し、場合によっては外膜の構成にも寄与する。混合脂質成分（Ｆ２）は主としてリポソームの外膜を構成する。混合脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）は、同一の組成であっても、異なる組成であってもよい。
【００１９】
これらの混合脂質成分の配合組成は特に限定されるものではないが、一般的には、リン脂質（動植物由来のレシチン；ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸またはそれらの脂肪酸エステルであるグリセロリン脂質；スフィンゴリン脂質；これらの誘導体等）と、脂質膜の安定化に寄与するステロール類（コレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、これらの誘導体等）とを中心に構成され、さらに糖脂質、グリコール、脂肪族アミン、長鎖脂肪酸（オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等）、その他各種の機能性を賦与する化合物が配合されていてもよい。特にＦ２には、ＰＥＧ化リン脂質などＤＤＳとしての機能性の付与に必要な脂質成分を含むことで、リポソーム表面に効率的な修飾が可能となる。混合脂質成分の配合比も、脂質膜の安定性やリポソームの生体内での挙動などの性状を考慮しながら、用途に応じて適切に調整すればよい。
【００２０】
・水性溶媒（Ｗ１）・（Ｗ２）、有機溶媒（Ｏ）
水性溶媒（Ｗ１）および（Ｗ２）ならびに有機溶媒（Ｏ）は公知の一般的なものを用いることができる。水性溶媒としては、純水や、浸透圧調整やｐＨ調整に適した塩類や糖類、その他の化合物を添加したものが挙げられる。また、リポソームの用途に合わせて、Ｗ１にはゼラチンなどのゲル化剤、デキストランなどの増粘多糖類、キチン／キトサンやポリ−Ｌ−リジンなどの荷電性高分子といった物質を封入してもよい。有機溶媒としては、たとえばヘキサン（ｎ−ヘキサン）やクロロホルム、塩化メチレンなどの水と混和しにくいものが挙げられ、これらを単独で使用しても混合して使用してもよい。また、水よりも沸点の低い有機溶媒を使用することが好ましい。
【００２１】
・内包させる物質
本発明において、リポソームに内包させる物質（薬剤類と総称する）は特に限定されるものではなく、リポソームの用途に応じて医薬品、化粧品、食品などの分野で知られている各種の物質を用いることができる。
【００２２】
薬剤類のうち医療用の水溶性のものとしては、たとえば、造影剤（Ｘ線造影用の非イオン性ヨード化合物、ＭＲＩ造影用のガドリニウムとキレート化剤とからなる錯体等）、抗がん剤（アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、エストラサイト、エピルビシン、カルボプラチン、イントロン、ジェムザール、メソトレキセート、シタラビン等）、抗菌剤、抗酸化性剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進性剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、タンパク質（酵素、抗体、ペプチド等）、ワクチン製剤（破傷風などのトキソイドを抗原とするもの；ジフテリア、日本脳炎、ポリオ、風疹、おたふくかぜ、肝炎などのウイルスを抗原とするもの；DNAまたはRNAワクチン等）などの薬理的作用を有する物質や、色素・蛍光色素、キレート化剤、安定化剤、保存剤などの製薬助剤が挙げられる。
【００２３】
− リポソームの製造方法 −
本発明のリポソームの製造方法は、下記工程（１）〜（３）を有し、必要に応じてその他の工程を適宜組み合わせることができるものである。
【００２４】
（１）一次乳化工程
一次乳化工程は、有機溶媒（Ｏ）、水性溶媒（Ｗ１）、および混合脂質成分（Ｆ１）を乳化することにより、Ｗ１／Ｏエマルションを調製する工程である。
【００２５】
Ｗ１／Ｏエマルションを調製するための方法は特に限定されるものではなく、超音波乳化機、撹拌乳化機、膜乳化機、高圧ホモジナイザーなどの装置を用いて行うことができる。特に手段は限定されないが、平均粒径を広い範囲で制御でき、かつ得られるＷ１／Ｏエマルションが単分散性である方法が好ましい。
【００２６】
水性溶媒（Ｗ１）のｐＨは３〜１０の範囲に選択され、ｐＨの調整には適切な緩衝液を用いればよい。たとえば、混合脂質成分にオレイン酸を用いる場合、ｐＨは６〜８．５とすることが好ましい。
【００２７】
一次乳化工程における、有機溶媒（Ｏ）に添加する混合脂質成分（Ｆ１）の割合、有機溶媒（Ｏ）と水性溶媒（Ｗ１）の体積比、その他の操作条件は、続く二次乳化工程の条件や最終的に調製するリポソームの態様などを考慮しながら、採用する乳化方法に応じて適宜調整することができる。通常、混合脂質成分（Ｆ１）の割合は有機溶媒（Ｏ）に対して１〜５０質量％であり、有機溶媒（Ｏ）と水性溶媒（Ｗ１）の体積比は１００：１〜１：２である。Ｗ１／Ｏエマルションの平均粒径は、二次乳化工程で用いる膜の細孔径の少なくとも１／２以下のサイズであることが必要であるため、この上限を超えない範囲内で５０〜１，０００ｎｍが好ましく、５０〜２００ｎｍであることがより好ましい。
【００２８】
本発明では、リポソームに水溶性薬剤類を内包させるために、（ｉ）一次乳化工程の水性溶媒（Ｗ１）に水溶性薬剤類をあらかじめ溶解させておき、二次乳化工程終了時点でそれを内包するリポソームが得られるようにする方法、（ｉｉ）水溶性薬剤類を内包しない（空の）リポソームを得た後に、そのリポソームが分散している水性溶媒またはそのリポソームの凍結乾燥物を再分散させた水性溶媒に水溶性薬剤類を添加し、撹拌するなどして、リポソームにそれを取り込ませる方法、いずれを用いることもできる。本発明の製造方法では、上記（ｉ）の方法を用いた場合であっても内包率が比較的高く、効率的にリポソームに水溶性薬剤類を内包させることができる。なお、非水溶性薬剤類についても、上記（ｉ）のように一次乳化工程の時点で水性溶媒（Ｗ１）あるいは有機溶媒（Ｏ）にあらかじめ添加しておくか、上記（ｉｉ）のように空のリポソームを得た後に添加することにより、リポソームに内包させることができる。
【００２９】
（２）二次乳化工程
二次乳化工程は、上記工程（１）により得られたＷ１／Ｏエマルションを、細孔径０．１μｍ以上５．０μｍ以下、好ましくは０．１μｍ以上３．０μｍ以下を有する膜を用いる膜乳化法により、水性溶媒（Ｗ２）中に液滴として分散したＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する工程である。
【００３０】
上記のような細孔径を有する多孔質膜としては、ＳＰＧ（Shirasu Porous Glass：シラス多孔質ガラス）膜が好適であり、たとえばＳＰＧテクノ株式会社から購入することができる。
【００３１】
この二次乳化工程では、たとえば、Ｗ１／Ｏエマルションを、０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜を通過させ、水性溶媒（Ｗ２）中に液滴として分散させることにより、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製することができる。また、上記方法や他の方法による膜乳化でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得た後、得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを更に０．１μｍ以上５．０μｍ以下の細孔径を有する膜に通過させる膜処理をすることにより、最終的なＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製することもできる。この膜処理は１回だけでなく、複数回行うようにしてもよい。また、膜乳化に用いる膜と膜処理に用いる膜とは同じであっても異なるものであってもよく、膜の細孔径も同じであっても異なっていてもよい。膜処理を行うことによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの平均粒径の単分散性を向上することができる（粒径分布の広がりを狭くすることに寄与できる）。
【００３２】
特に、膜処理に用いる膜の細孔径を膜乳化に用いる膜の細孔径よりも小さくすることにより、膜処理を行うことなく１回の膜乳化でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する場合に較べて膜への負荷を軽減できる上でより好ましい。エマルションを膜に通過させるために必要な圧力を小さくすることができ、膜の長寿命化に貢献できる上に二次乳化工程に要する処理時間を短縮できるため、リポソームの生産性の向上及び低コスト化にも有利である。
【００３３】
二次乳化工程では、水性溶媒（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルション以外にさらに、混合脂質成分（Ｆ１）からなるリポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤、または混合脂質成分（Ｆ２）、あるいはその双方を用いてもよい。特にリポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤を用いることが多胞リポソームを減少できる上で好ましい。界面化学の分野では多くの乳化剤が知られており、代表的には、タンパク質、多糖類および非イオン性界面活性剤などが、水溶性乳化剤として乳化・分散プロセスに用いられている。これら公知の水溶性乳化剤のうちリポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤を適宜選択して用いることができる。このようなリポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤には、タンパク質としてはカゼインナトリウム、多糖類としてはデキストラン、非イオン性界面活性剤としてはポリアルキレングリコール誘導体が例示できる。特に、混合脂質成分（Ｆ１）にホスファチジルコリンを配合する場合、カゼインナトリウムのようなタンパク質乳化剤はそのようなリポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤として好ましい。
【００３４】
上記水性溶媒（Ｗ２）、Ｗ１／Ｏエマルション、水溶性乳化剤および／または混合脂質成分（Ｆ２）の混合態様（添加順序等）は特に限定されるものではなく、適切な態様を選択すればよい。たとえばＦ２が主として水溶性脂質からなる場合、あらかじめそのようなＦ２および／または水溶性乳化剤をＷ２に添加しておき、それにＷ１／Ｏエマルションを添加して乳化処理を行うことができる。一方、Ｆ２が主として脂溶性脂質からなる場合、あらかじめ（Ｗ１／Ｏエマルション調製後）そのようなＦ２をＷ１／Ｏエマルションの油相に添加しておき、それを、必要に応じて水溶性乳化剤が添加されているＷ２に添加して乳化処理を行うことができる。
【００３５】
二次乳化工程における、水性溶媒（Ｗ２）に添加する水溶性乳化剤および混合脂質成分（Ｆ２）、ないしＷ１／Ｏエマルションの有機溶媒（Ｏ）に添加する混合脂質成分（Ｆ２）の合計の割合、Ｗ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）の体積比、その他の操作条件は、最終的に調製するリポソームの用途などを考慮しながら適宜調節することができる。通常、水性溶媒（Ｗ２）ないし有機溶媒（Ｏ）に添加する成分の合計の割合はそれらに対して０．０１〜１０質量％であり、Ｗ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）の体積比は１：１００〜２：１である。
【００３６】
（３）溶媒除去工程
溶媒除去工程は、前記二次乳化工程により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒（Ｏ）を除去することにより、脂質二重膜を有するリポソームの懸濁液を調製する工程である。
【００３７】
Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションからの溶媒除去の方法は、定法に従い加温や減圧によってＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの溶媒を溜去できるが、これに限定されない。用いる溶媒種に影響されるが、溶媒が突沸することのない条件範囲が設定され、温度条件は０〜６０℃の範囲が好ましく、０〜２５℃がより好ましい。また、減圧条件は溶媒の飽和蒸気圧〜大気圧の範囲内に設定されることが好ましく、溶媒の飽和蒸気圧の＋１％〜１０％の範囲内に設定されることがより好ましい。異なる溶媒を混合して用いる場合、より飽和蒸気圧の高い溶媒種に合わせた条件が好ましい。また、これらの除去条件は、溶媒が突沸しない範囲で組み合わせてもよく、例えば、熱に弱い薬剤を使用する際は、より低温側でかつ減圧条件で溶媒を溜去することが好ましい。溶媒除去にはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの攪拌が無くともよいが、攪拌をしたほうがより均一に溶媒除去が進む。また、気液界面を広くすることで、溶媒除去にかかる時間を短縮することができる。
【００３８】
本発明の製造方法により最終的に得られるリポソームには、多胞リポソームがほとんど含まれることなく、その平均粒径を５０〜１，０００ｎｍの間で制御することができる。特に平均粒径が５０〜２００ｎｍのリポソームは、毛細血管を閉塞するおそれがほとんどなく、またがん組織近辺の血管にできる間隙を通過することもできるため、医薬品等として人体に投与されて使用する上で好都合である。
【実施例】
【００３９】
（カルセイン内包率の測定方法）
リポソーム水溶液（１ｍＬ）全体の蛍光強度（Ｆtotal）を分光光度計（Ｕ−３３１０、日本分光株式会社）により測定した。次に０．０１Ｍ，ＣｏＣｌ2トリス塩酸緩衝液３０μＬを加えて水性溶媒（Ｗ２）に漏出したカルセインの蛍光をＣｏ2+により消光することで、ベシクル内の蛍光強度（Ｆin）を測定した。さらに、カルセインを加えないでサンプルと同じ条件でベシクルを作製し、脂質自身が発する蛍光（Ｆl）を測定した。内包率は下記式より算出した；
内包率Ｅ（％）  ＝  (Ｆin−Ｆl)／(Ｆtotal−Ｆl)×１００。
【００４０】
（シタラビンの内包率の測定方法）
超遠心装置で固形分(リポソーム)を分離(デカント)し、上澄と固形分をそれぞれＨＰＬＣで定量した。ＨＰＬＣカラムとしてVarian Polaris C18-A （3μm, 2x40 mm）を用いてアッセイされた。内包されていない当該化合物と内包されている当該化合物の絶対値から、シタラビンの内包率を算出した。
【００４１】
（体積平均粒径の測定方法）
リポソーム水溶液をクロロホルム／ヘキサン混合溶媒（体積比：４／６）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて体積平均粒径を算出した。
【００４２】
（多胞リポソームの観察方法）
くぼみのあるスライドガラスを用いてリポソーム水溶液２５μＬのプレパラートを作成し、正立顕微鏡（Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ．Ａ１、カールツァイス社製）の明視野条件で観察し、多胞リポソームの個数を測定した。
【００４３】
実施例１
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社製）０．３ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置「ＵＨ−６００Ｓ」（株式会社エスエムテー製）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し、乳化処理を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションの室温下での平均粒径は２４７ｎｍであった。
【００４４】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、ＳＰＧ乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。ＳＰＧ膜乳化装置（ＳＰＧテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」）に直径１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、細孔径２．０μｍの円筒形ＳＰＧ膜を用い、装置出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、装置入口側から上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。膜乳化に必要とした圧力は約２５ｋＰａであった。
【００４５】
（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
上記二次乳化工程により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２４時間攪拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの室温下での平均粒径は２３３ｎｍ、カルセイン内包率は７１％であり、多胞リポソームは確認されなかった。
【００４６】
実施例２
二次乳化工程で細孔径５．０μｍのＳＰＧ膜を使用し、膜乳化に必要とした圧力は約１０ｋＰａであること以外は、実施例１と同様の操作を行った。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの室温下での平均粒径は２４４ｎｍ、カルセイン内包率は７０％であり、多胞リポソームは３個であった。
【００４７】
実施例３
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
実施例１と同様の脂質組成を含む混合溶媒（ヘキサン：ジクロロメタン＝８：２）１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、実施例１と同様の乳化処理を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションの室温下での平均粒径は２０７ｎｍであった。
【００４８】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、ＳＰＧ乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。実施例１と同様の膜乳化装置に細孔径１．０μｍのＳＰＧ膜を用い、装置出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、装置入口側から上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。膜乳化に必要とした圧力は約１０ｋＰａであった。
【００４９】
（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
上記二次乳化工程により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、５００ｍｂａｒの減圧室温条件下で約４時間攪拌し、次いで１８０ｍｂａｒの減圧室温条件下で約１８時間撹拌し、溶媒を揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの室温下での平均粒径は２０３ｎｍ、カルセイン内包率は４９％であり、多胞リポソームは確認されなかった。
【００５０】
実施例４
一次乳化工程で、高圧ホモジナイザー（ナノマイザー、吉田機械興業社製）を用いて１００ＭＰａの圧力条件で乳化処理を行い、二次乳化工程で、細孔径０．５μｍのＳＰＧ膜を用いた以外は、実施例３と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションの室温下での平均粒径は１２７ｎｍであり、得られたリポソームの室温下での平均粒径は１２３ｎｍ、カルセイン内包率は５３％であり、多胞リポソームは１個であった。膜乳化に必要とした圧力は約２０ｋＰａであった。
【００５１】
実施例５
脂質として、ホスファチジルコリン含量が８０％である卵黄レシチン「ＰＬ−１００Ｍ」（キューピー社製）０．３ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを使用した以外は、実施例３と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションの室温下での平均粒径は２３２ｎｍであり、得られたリポソームの室温下での平均粒径は２３７ｎｍ、カルセイン内包率は６２％であり、多胞リポソームは確認されなかった。膜乳化に必要とした圧力は約１０ｋＰａであった。
【００５２】
実施例６
有機溶媒相（Ｏ）に混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）を用い、有機溶媒除去の減圧条件を１８０ｍｂａｒ、２２時間とした以外は、実施例３と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションの室温下での平均粒径は１８９ｎｍであり、得られたリポソームの室温下での平均粒径は１９７ｎｍ、カルセイン内包率は４２％であり、多胞リポソームは６個であった。膜乳化に必要とした圧力は約１０ｋＰａであった。
【００５３】
実施例７
二次乳化工程で細孔径５．０μｍのＳＰＧ膜を使用したこと以外は、実施例３と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションの室温下での平均粒径は２０３ｎｍであり、得られたリポソームの室温下での平均粒径は２１０ｎｍ、カルセイン内包率は４６％であり、多胞リポソームは１個であった。膜乳化に必要とした圧力は約２ｋＰａであった。
【００５４】
実施例８
二次乳化工程で細孔径０．２μｍのＳＰＧ膜を使用したこと以外は、実施例４と同様の操作を行った。得られたリポソームの室温下での平均粒径は１２０ｎｍ、カルセイン内包率は４０％であり、多胞リポソームは２個であった。膜乳化に必要とした圧力は約２５ｋＰａであった。
【００５５】
実施例９
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ジパルミトイルホスファチジルコリン（COATSOME MC-6060、日油株式会社製）０．２５ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇを含む混合溶媒（ヘキサン：ジクロロメタン＝８：２）１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、実施例１と同様の乳化処理を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションの室温下での平均粒径は２１９ｎｍであった。
【００５６】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションの有機溶媒（Ｏ）にジパルミトイルホスファチジルグリセロール（COATSOME MG-6060LA、日油株式会社製）０．０５ｇをさらに添加したものを分散相として、ＳＰＧ乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。実施例１と同様の膜乳化装置に細孔径１．０μｍのＳＰＧ膜を用い、装置出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、装置入口側から上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。膜乳化に必要とした圧力は約１０ｋＰａであった。
【００５７】
（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
上記二次乳化工程により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、５００ｍｂａｒの減圧室温条件下で約４時間攪拌し、次いで１８０ｍｂａｒの減圧室温条件下で約１８時間撹拌し、溶媒を揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの室温下での平均粒径は２３１ｎｍ、カルセイン内包率は７０％であり、多胞リポソームは確認されなかった。
【００５８】
比較例１
二次乳化工程で細孔径７．０μｍのＳＰＧ膜を使用し、膜乳化に必要とした圧力は約７ｋＰａであること以外は、実施例１と同様の操作を行った。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの室温下での平均粒径は２５５ｎｍ、カルセイン内包率は７０％であったが、多胞リポソームは５８個とやや多かった。
【００５９】
比較例２
二次乳化工程で細孔径１０．０μｍのＳＰＧ膜を使用し、膜乳化に必要とした圧力は約５ｋＰａであること以外は、実施例１と同様の操作を行った。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの室温下での平均粒径は２７７ｎｍ、カルセイン内包率は６８％であったが、多胞リポソームは１７０個とかなり多かった。
【００６０】
実施例１０
（混合溶媒による一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）「COATSOME MC-6060」（日油株式会社）０．２５ｇ、コレステロール０．１５２ｇ、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）「COATSOME MG-6060LA」（日油株式会社）０．２５ｇを含む混合溶媒（ヘキサン／ジクロロメタン＝８／２）１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、φ２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約２１２ｎｍであった。
【００６１】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、ＳＰＧ乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。まず、膜乳化装置に実施例２と同様の細孔径５．０μｍのＳＰＧ膜を用い、装置出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、装置入口側から上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。膜乳化に必要とした圧力は約１０ｋＰａであった。
【００６２】
つづいて、得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを分散相として、膜乳化装置に実施例４と同様の細孔径０．５μｍのＳＰＧ膜を用い、装置出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、装置入口側から上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを供給して膜処理を行い、最終的なＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。この膜処理に必要とした圧力は約５Ｐａであった。
【００６３】
（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
上記二次乳化工程により得られた最終的なＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、２０℃・５００ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間攪拌し、次いで２０℃・１８０ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム懸濁液の粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの平均粒径は１９０ｎｍであり、カルセイン内包率は６２％であった。多胞リポソームは確認されなかった。
【００６４】
実施例１１
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社製）６．０ｇ、コレステロール（Chol）３．０４ｇおよびオレイン酸（OA）２．１６ｇを含む混合溶媒（ヘキサン：ジクロロメタン＝８：２）３００ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）１００ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。実施例４と同様の一次乳化工程の処理を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションの室温下での平均粒径は１３５ｎｍであった。
【００６５】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、ＳＰＧ乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。ＳＰＧ膜乳化装置（ＳＰＧテクノ社製、商品名「高速ミニキットKH-125」）に直径１０ｍｍ、長さ１２５ｍｍ、細孔径１．０μｍの円筒形ＳＰＧ膜を使用すること以外は実施例４と同様にして、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。膜乳化に必要とした圧力は約１０ｋＰａであった。
【００６６】
（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
上記二次乳化工程により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、５００ｍｂａｒの減圧室温条件下で約４時間攪拌し、次いで１８０ｍｂａｒの減圧室温条件下で約１８時間撹拌し、溶媒を揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの室温下での平均粒径は１４０ｎｍ、カルセイン内包率は５３％であり、多胞リポソームは確認されなかった。
【００６７】
比較例３
二次乳化工程で、直径１０ｍｍ、長さ１２５ｍｍ、細孔径１０．０μｍの円筒形ＳＰＧ膜を使用し、膜乳化に必要とした圧力は約５ｋＰａであること以外は、実施例１１と同様の操作を行った。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの室温下での平均粒径は１３４ｎｍ、カルセイン内包率は６５％であったが、多胞リポソームは２２０個とかなり多かった。
【００６８】
実施例１２
水分散相（Ｗ１）に、カルセイン（０．４ｍＭ）に代えて、シタラビン（４ｍＭ）を溶解させた以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られたリポソームの室温下での平均粒径は１６８ｎｍ、内包率は３２％であり、多胞リポソームは確認されなかった。
【００６９】
実施例１３
水分散相（Ｗ１）に、カルセイン（０．４ｍＭ）に代えて、シタラビン（４ｍＭ）を溶解させた以外は、実施例２と同様の操作を行った。得られたリポソームの室温下での平均粒径は２００ｎｍ、内包率は３３％であり、多胞リポソームは確認されなかった。
【００７０】
比較例４
水分散相（Ｗ１）に、カルセイン（０．４ｍＭ）に代えて、シタラビン（４ｍＭ）を溶解させた以外は、比較例２と同様の操作を行った。得られたリポソームの室温下での平均粒径は１９５ｎｍ、内包率は３０％であったが、多胞リポソームは２０１個とかなり多かった。
【００７１】
【表１】
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