(57)【要約】【課題】メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム輸送の検出をフローサイトメーターで行う手段において、より簡便で、その検出感度を更に高めること。【解決手段】ケラチノサイト及びメラノサイトを共培養する工程、共培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、を含む、メラノサイトからケラチノサイトへ輸送されたメラノソームを検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチノサイト及びメラノサイトを共培養する工程、
共培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに
フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、
を含む、メラノサイトからケラチノサイトへ輸送されたメラノソームを検出する方法。
【請求項２】
共培養する工程において、トリプシンを添加する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トリプシンを添加する工程に次いで、トリプシンを中和する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
添加されるトリプシンの濃度が0.1〜500U/mLである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
標識が蛍光標識である、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該共培養液中にトリプシンを添加することにより、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム輸送の検出感度を向上させたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ケラチノサイト及びメラノサイトを共培養する工程、
被検化合物を添加する工程、
共培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、
フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、ならびに
メラノソームの検出量が対照と比較して減少していることを確認する工程、
を含む、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
共培養する工程において、トリプシンを添加する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
トリプシンを添加する工程に次いで、トリプシンを中和する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
添加されるトリプシンの濃度が0.1〜500U/mLである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
標識が蛍光標識である、請求項９〜１２いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、請求項９〜１３いずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、請求項９〜１４いずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該共培養液中にトリプシンを添加することにより、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム輸送の検出感度を向上させたことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノサイトからケラチノサイトへ輸送されるメラノソームを検出する方法およびかかる方法を用いてメラノソーム阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の色素沈着（皮膚黒化）は、表皮基底層にあるメラノサイト内のメラノソームと呼ばれる小器官（オルガネラ）の中でメラニンの合成が盛んになり、周囲の表皮角化細胞（以下、ケラチノサイトと称す）にメラニンが輸送され、ケラチノサイト中に貯蔵されることによって起こる。
【０００３】
例えば、日焼けによる色素沈着の機序は、（１）Ｂ紫外線がメラノサイトのチロシナーゼ活性を上昇させてメラニンの合成量が増加する、（２）Ｂ紫外線に暴露されたケラチノサイトが種々のメラノサイト活性化因子を放出しそれによってメラノサイトがメラニンの合成亢進や増殖促進する、（３）生成されたメラノソームがケラチノサイトに輸送されて起こる（例えば、非特許文献１などを参照）。
【０００４】
色素沈着のこのような機序から見出された美白剤としては、メラニンの生成を抑制するためのチロシナーゼ阻害剤、メラニンの増殖抑制剤、メラノサイト活性化因子の阻害剤、メラノソームのケラチノサイトへの輸送抑制剤などが挙げられる。
【０００５】
これまで、上記（３）に関する研究は不十分であった。その理由は、メラノソーム輸送を測定する手段が近年になってようやく開発されてきたためであり、当該手段としては、現在までにいくつかの方法が開示されてきている（例えば、特許文献１、２などを参照）。
【０００６】
特許文献１には、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養し、これに異なる色で標識したメラノソーム特異抗体およびケラチノサイト特異抗体を結合させた後、二重に染色された画像を解析する方法が開示されている。さらにこの検出系を用いれば、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能になることが記載されている。
【０００７】
また、特許文献２には、蛍光標識したケラチノサイトと非標識メラノサイトを共培養し、これに蛍光標識メラノソーム特異抗体を結合させた後フローサイトメーターを用いて解析する方法が開示されている。さらにこの検出系を用いれば、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能になることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２４９３９０号公報
【特許文献２】特開２００５−２４９３９１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】フレグランスジャーナル  臨時増刊 No.18 2003
【非特許文献２】Pigment Cell Res. Vol.18 No.5 2005 p.370-381
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のような画像解析によりメラノソーム輸送を検出する方法は、専用のソフトやその解析手段が煩雑であり、ケラチノサイトを直接蛍光標識してメラノソーム輸送を検出する方法は、細胞増殖能が低下し、検出感度が低下してしまうという問題があり、検出方法として未だ充分とは言えず、より簡便で検出感度の高い方法の開発が望まれている。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、従来の検出方法のもつ課題を解決し、より簡便で、且つ、検出感度を向上させた方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究をすすめてきた。その結果、ケラチノサイト及びメラノサイトを共培養し、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体（以下、単に「標識ケラチノサイト結合抗体」という場合がある。）、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体（以下、単に「標識メラノソーム結合抗体」という場合がある。）（この標識は標識ケラチノサイト結合抗体の標識とは異なる標識である。）を添加し、次いでフローサイトメーターによりケラチノサイト中のメラノソームを検出することによって、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム輸送を簡便に検出できることを見出した。
【００１３】
さらに、共培養する工程において、トリプシンを添加することによって、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム輸送の検出感度が著しく向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）ケラチノサイト及びメラノサイトを共培養する工程、共培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、を含む、メラノサイトからケラチノサイトへ輸送されたメラノソームを検出する方法、
（２）共培養する工程において、トリプシンを添加する工程を含む、（１）に記載の方法、
（３）トリプシンを添加する工程に次いで、トリプシンを中和する工程をさらに含む、（２）に記載の方法、
（４）添加されるトリプシンの濃度が0.1〜500U/mLである、（２）または（３）に記載の方法、
（５）標識が蛍光標識である、（１）〜（４）いずれか１項に記載の方法、
（６）ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、（１）〜（５）いずれか１項に記載の方法、
（７）メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、（１）〜（６）いずれか１項に記載の方法、
（８）該共培養液中にトリプシンを添加することにより、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム輸送の検出感度を向上させたことを特徴とする、（１）に記載の方法、
（９）ケラチノサイト及びメラノサイトを共培養する工程、被験化合物を添加する工程、共培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、ならびに、メラノソームの検出量が対照と比較して減少していることを確認する工程、を含む、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニング方法、
（１０）共培養する工程において、トリプシンを添加する工程を含む、（９）に記載の方法、
（１１）トリプシンを添加する工程に次いで、トリプシンを中和する工程をさらに含む、
（１０）に記載の方法、
（１２）添加されるトリプシンの濃度が0.1〜500U/mLである、（１０）または（１１）に記載の方法、
（１３）標識が蛍光標識である、（９）〜（１２）いずれか１項に記載の方法、
（１４）ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、（９）〜（１３）いずれか１項に記載の方法、
（１５）メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、（９）〜（１４）いずれか１項に記載の方法、ならびに
（１６）該共培養液中にトリプシンを添加することにより、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム輸送の検出感度を向上させたことを特徴とする、（９）に記載の方法、
である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来のメラノソーム輸送の検出方法より簡便な操作により、正確にメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム輸送量を測定できるとともに、その検出感度が大幅に向上する。これによって、大量かつ正確にメラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】フローサイトメーターによるメラノサイト及びケラチノサイトの分離結果を示す図で、左上がメラノサイトの集団、右下がケラチノサイトの集団である。
【図２】トリプシン未処理および処理したケラチノサイト約9000個中の抗メラノソーム抗体を取り込んだ細胞数を示したヒストグラムである。図１の四角部分の細胞数をカウントした。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、（１）共培養する工程、（２）共培養後に抗体を添加する工程、および（３）メラノソームを検出する工程、を含む、メラノサイトからケラチノサイトへ輸送されたメラノソームを検出する方法であり、以下、各工程について詳細に説明する。
【００１８】
（１）共培養工程
本発明において用いられるケラチノサイトとしては、哺乳動物のケラチノサイトであれば特に限定されないが、好ましくは、ヒトケラチノサイト、より好ましくは、ヒト正常ケラチノサイト、さらにより好ましくは、メラノソームを有さないヒト正常ケラチノサイトである。かかるケラチノサイトは、例えば、クラボウ社、Cascade Biologics社、Lonza社、コスモ・バイオ社などから市販されている。
【００１９】
本発明に用いられるメラノサイトとしては、哺乳動物のメラノサイトであれば特に限定されないが、好ましくは、ヒトメラノサイト、より好ましくは、ヒト正常メラノサイトである。かかるメラノサイトは、例えば、クラボウ社、Cascade Biologics社、Lonza社、コスモ・バイオ社などから市販されている。
【００２０】
本発明における共培養は、当該分野で公知の方法で行うことができる。例えば、各培養をそれぞれ継代培養した後に、各細胞を播種し、同一の培地内に同時に添加して共培養してもよいし、最初に一方の細胞を培養し、次いでもう一方の細胞をその培地に添加して共培養してもよい。
【００２１】
共培養における培養条件などは、細胞培養可能であれば特に限定されないが、例えば、黒木登志夫  他２名  編、「分子生物学研究のための培養細胞実験法」、株式会社  羊土社、1995年3月20日、p.63-74、渡邊利雄著、「バイオ実験イラストレイテッド  ６  すくすく育て  細胞培養」、第１版第５刷、株式会社  秀潤社、2001年7月15日、p.45-99などを参照することができる。培養期間は、ケラチノサイトにメラノソームが取り込まれるのに十分な期間であれば特に限定されないが、５〜７日間が好ましい。
【００２２】
共培養に使用される培地としては、細胞培養可能な培地であれば特に限定されないが、例えば、Medium154S(クラボウ社)に増殖添加剤HKGS(クラボウ社)を加えた培地などが挙げられる。
【００２３】
なお、共培養前に各細胞を継代培養する際に使用される培地としては、各細胞の培養が可能な培地であれば特に限定されないが、ケラチノサイトの場合、Medium 154S（クラボウ社）にHKGS（クラボウ社）を加えた培地など、メラノサイトの場合、Medium 254（クラボウ社）にHKGS（クラボウ社）を加えた培地などが挙げられる。
【００２４】
本発明における共培養工程は、検出感度をさらに向上させる観点から、トリプシンを添加する工程を含むことが好ましい。トリプシンを添加する工程を具体的に説明すると、培地のみを培養フラスコなどから吸引し、次いで培養フラスコなどにトリプシンを添加し、特定時間、好ましくは10〜60秒間、より好ましくは20〜50秒間処理し、次いでトリプシンを中和する工程を含む。
【００２５】
本発明で使用されるトリプシンとしては、ヒト膵臓由来トリプシン、ブタ膵臓由来トリプシン、ウシ膵臓由来トリプシンなどが挙げられるが、好ましくは、ブタ膵臓由来トリプシンである。かかるトリプシンは、例えば、Sigma-Aldrich社から市販されているトリプシンを用いればよい。添加されるトリプシン濃度が0.1〜500U/mLであることが好ましい。
【００２６】
共培養工程においてトリプシンを添加する工程を含む場合、トリプシン非存在下で１〜３日間培養し、トリプシンを添加して処理し、さらにトリプシンを中和した後、さらに２〜４日間培養することが好ましい。
【００２７】
（２）抗体結合工程
本発明に使用されるケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体とは、ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に標識が付された抗体をいう。ケラチノサイトに特異的に結合する抗体としては、例えば、抗サイトケラチン抗体などが挙げられ、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、ヒト、マウス、ウサギなどの由来であってもよいが、マウス抗ヒトサイトケラチン抗体が好ましい。
【００２８】
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に付される標識としては、当該分野で公知の蛍光標識が好ましく、フルオレセインイソチオシアナート（以下、単にFITCという場合がある）がより好ましい。
【００２９】
抗体への標識の付与は、当該分野で公知の方法により行うことができる。または、PROGEN Biotechnik社などから市販されている標識抗体を使用してもよい。
【００３０】
本発明に使用されるメラノソームに特異的に結合する標識された抗体とは、メラノソームに特異的に結合する抗体に標識が付された抗体をいう。メラノソームに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、ヒト、マウス、ウサギなどの由来であってもよい。かかる抗体としては、例えば、マウス抗リコンビナントMelan-A抗体、マウス抗ヒトメラノソーム抗体HMB45、抗チロシナーゼ抗体、抗TRP2抗体、抗TRP1抗体などが挙げられ、マウス抗リコンビナントMelan-A抗体が好ましい。
【００３１】
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に付される標識としては、当該分野で公知の蛍光標識が好ましく、ケラチノサイトに付された標識とは異なる色を生じる蛍光標識が好ましい。蛍光標識の例としては、ローダミン、フィコエリスリン（以下、単にPEという場合がある）などが挙げられ、中でもPEが好ましい。
【００３２】
抗体への標識の付与は、当該分野で公知の方法により行うことができる。または、Santa Cruz社などから市販されている標識抗体を使用してもよい。
【００３３】
（３）メラノソームを検出する工程
本工程は、フローサイトメーターによってケラチノサイト中のメラノソームを検出する。検出方法としては、蛍光標識で検出されたケラチノサイト中のメラノソームが、ケラチノサイトとは異なる色の蛍光として定量される。
【００３４】
検出に使用される装置としては、Cell Lab Quanta SC MPL(ベックマンコールター社)などが挙げられる。
【００３５】
本発明のメラノソーム輸送検出系を用いれば、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能である。例えばメラノサイトとケラチノサイトの共培養時に被験物質を添加してメラノソーム検出量を測定し、被験物質非添加の場合（対照）のメラノソーム検出量と対比すれば、当該被験物質がメラノソーム輸送を阻害するか否かが判定できる。例えば、被験物質の添加によりメラノソーム検出量が対照と比較して減少していれば、その被験物質はメラノソーム輸送抑制能を有することがわかる。なお、被検物質の添加は、共培養中に行われるトリプシン添加・中和工程の後に行うことが好ましい。
【実施例】
【００３６】
実施例
（１）市販のヒト正常ケラチノサイト(NHEK(F)、クラボウ社)を4000cells/cm2で播種・培養した。セミコンフルエントの状態で、HEPES緩衝液(クラボウ社)で１回洗浄の後、0.025％トリプシン-EDTA(クラボウ社)処理によって回収した。
（２）ケラチノサイト単独の培養にはMedium154S(クラボウ社)に増殖添加剤HKGS(クラボウ社)を加えた培地を用いた。
（３）ヒト正常メラノサイト(NHEM(NB)Moderately、クラボウ社)を7000cells/cm2の密度で播種・培養した。培養開始数日後、HEPES緩衝液(クラボウ社)で１回洗浄の後、0.025％トリプシン-EDTA(クラボウ社)処理によって回収した。
（４）回収した両細胞を浮遊液の状態で、ケラチノサイト：メラノサイト＝5：1の比で混合し、5000cells/cm2の密度で共培養を開始した。共培養にはMedium154S(クラボウ社)に増殖添加剤HKGS(クラボウ社)を加えた培地を用いた。共培養２日目に培養フラスコから培地のみを吸引した後、ブタ由来トリプシン（Sigma社）0.166mg/mL（300U/mL）を培養フラスコに添加して45秒間処理し、トリプシン中和液（クラボウ社）を添加して中和した。トリプシンを添加しない系では、トリプシン添加および中和工程は省略した。その後、被験物質を加えた培地、または被検物質を加えていない培地に置き換え、さらに３日間培養した。被験物質としては、0.01mMニコチン酸アミドを用いた。
（５）共培養開始から５日後、HEPESで１回洗浄を行ない、0.025％トリプシン-EDTA(クラボウ社)処理により細胞を回収した後、細胞数を500000cells/tubeに調整し、2％パラホルムアルデヒド/PBSを加え、室温で20分間固定した。
（６）遠心後、細胞を回収し、0.5％サポニン・0.5％BSA/PBSで室温、10分間処理した後、FITC標識マウス抗ヒトサイトケラチン抗体(PROGEN Biotechnik社製)およびPE標識マウス抗リコンビナントMelan-A抗体(Santa Cruz社製)を加え、室温で1時間振盪した。
（７）2％パラホルムアルデヒド/PBSに液を交換後、セルストレーナー付きFACS解析用チューブ（FALCON社）中に滴下して、Cell Lab Quanta SC MPL(ベックマンコールター社)にて解析した（図１、２）。
（８）FITC標識されたケラチノサイトを選別し、ケラチノサイトに取り込まれたメラノソーム表面に存在するMelan-A認識した抗体のPE蛍光強度を、メラノソーム移送量とした。その結果、ケラチノサイト中のメラノソームが正確に検出できた。
【００３７】
以上の方法によって得られたメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソームの移送量を調べた結果を表１に示す。トリプシンを添加しなかった系に比べ、本発明は２倍ほどメラノソーム取込量が増し、その分検出感度が向上することが判った。
【００３８】
また、トリプシンを添加しても、メラノソーム移送抑制剤として公知のニコチン酸アミドを添加するとメラノソーム取込量が抑制されていることから、本発明のスクリーニング方法の妥当性が立証された。また、トラネキサム酸を本発明のスクリーニング法に供した結果、トラネキサム酸はメラノソームの移送を抑制することが確認された。
【００３９】
【表１】
2010160145.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の方法によれば、トリプシンを添加しない系より簡便な操作により、正確にメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム輸送量を測定できるとともに、その検出感度が大幅に向上するため有用である。これによって、大量かつ正確にメラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能となり有用である。
【図１】
2010160145.tif 000003
【図２】
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