(57)【要約】【課題】  細胞の収量、生存性および完全性に関して改善された単離結果が得られるような、組織解離用の生成物、その製造方法および使用を利用できるようにすること。【解決手段】  本発明の中性プロテアーゼ（ＮＰ）とコラゲナーゼとの併用は、単離結果が細胞の収量、生存性および完全性に関して改善されるように、組織解離の開始に先立って、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれておらずかつ組換え生産によって製造されたものではない中性プロテアーゼと、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物とを、中性プロテアーゼとコラゲナーゼとの量比を個別に調整して混合することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラゲナーゼ酵素調製物に含まれていないクロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のプロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分と、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分とからなり、組織解離を行うには、解離を開始する前に、Ａ成分をＢ成分に、それぞれ必要な量で添加する生成物。
【請求項２】
Ａ成分として、組換え生産によって入手可能にしたものではない中性プロテアーゼを含む、請求項１に記載の生成物。
【請求項３】
中性プロテアーゼ（ＮＰ）とコラゲナーゼとからなる生成物の製造方法であって、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれておらず、かつ組換え生産によって製造されたものではない、含量が明確なクロストリジウム・ヒストリチカム由来の中性プロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分を、精製もしくは部分精製コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分に、組織解離の開始に先立って、両成分の量比を個別に調整して混合することを特徴とする方法。
【請求項４】
コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が組織の量に応じて行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が種、組織および組織の状態に応じて行われることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵後の組織の状態に応じて行われることを特徴とする、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
貯蔵がペルフルオロ炭化水素を使った二層法によって行われることを特徴とする、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵前または貯蔵後に行われ、中性プロテアーゼの量がそれに応じて調節されることを特徴とする、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
単離結果が細胞の収量、生存性および完全性に関して改善されるように、コラゲナーゼ酵素調製物に含まれない精製中性プロテアーゼ（ＮＰ）をそれぞれ選択された量で、組織解離のための又は細胞もしくは細胞集合体の、たとえば組織からの、単離のためのコラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物に対する個別の添加物として使用する方法。
【請求項１０】
中性プロテアーゼ（ＮＰ）を明示された中性プロテアーゼ含量を持つ精製または部分精製コラゲナーゼと共に、両成分の量比を個別に調整して使用し、その際組換え生産によって製造されたものでない中性プロテアーゼを使用する、請求項９に記載の使用する方法。
【請求項１１】
コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が組織の量に応じて行われる、請求項９および１０に記載の使用する方法。
【請求項１２】
コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が種、組織および組織の状態に応じて行われる、請求項９および１０に記載の使用する方法。
【請求項１３】
コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵後の組織の状態に応じて行われる、請求項９および１０に記載の使用する方法。
【請求項１４】
貯蔵がペルフルオロ炭化水素を使った二層法によって行われる、請求項１３に記載の使用する方法。
【請求項１５】
コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵前または貯蔵後に行われ、中性プロテアーゼの量がそれに応じて調節される、請求項１３および１４に記載の使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織を解離させるための中性プロテアーゼ（ＮＰ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＥ  ４４  ４５  ８９１  Ａ１には、クロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の組換えプロテアーゼ（中性プロテアーゼ，ＮＰ）ならびに細胞および細胞集合体を単離するためのその使用が記載されている。これは、中性プロテアーゼを使って、より多くの細胞および細胞集合体を単離するには、その中性プロテアーゼを再現性のある品質で、大量に入手できるようにする必要があり、それは組換え生産法によって可能になるという事実がきっかけとなっている。しかし、中性プロテアーゼのクローニングは、容易にできるわけではない。というのも、クロストリジウム・ヒストリチカムの配列はほとんど分かっていないからである（クロストリパイン、２つのコラゲナーゼならびに１つのリボソームＲＮＡ配列）。そのため、コドン使用頻度を推断することができず、それゆえに、使用できるオリゴヌクレオチドの縮重度を制限することもできない。したがって、クロストリジウム・ヒストリチカム由来の中性プロテアーゼのＤＮＡ配列ならびにその組換え生産を利用できるようにしなけらばならない。すなわち、クロストリジウム・ヒストリチカム由来の中性プロテアーゼ活性を持つタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもって、それらを利用できるようにしなければならず、そのＤＮＡ配列は、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すＤＮＡ配列またはそれに相補的なＤＮＡ配列、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す配列とハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）に記載の配列の１つとハイブリダイズするであろう、遺伝コードが縮重していない核酸配列、
という群から選択される。
【０００３】
細胞組織を解離させ、そこに含まれている細胞または細胞集合体を遊離させる方法は、細胞または細胞集合体が望ましい程度に遊離して、細胞または細胞集合体が細胞組織部分から分離されるまで、細胞組織を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または同じアミノ酸配列の遺伝コードの縮重の範囲内でコードされる配列からなり、かつ外来ＤＮＡの原核細胞または真核細胞での発現産物であるクロストリジウム・ヒストリチカム由来の組換え中性プロテアーゼと共にインキュベートすることを特徴とする。そのようにして得られる酵素の使用は実証されていない。
【０００４】
ある比率のコラゲナーゼＩおよびＩＩと中性プロテアーゼとの混合物から製造者によって製造された既製の生成物は、特許文献１に記載されている。
【０００５】
この方法では、コラゲナーゼ調製物中に含まれる中性プロテアーゼを使用するので、高度な酵素安定性は達成されていない。これに加えて、中性プロテアーゼがコラゲナーゼ中に長時間にわたって含まれていると、水分による酵素活性の低下が起こる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，９８９，８８８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、細胞の収量、生存性および完全性に関して改善された単離結果が得られるような、組織解離用の生成物、その製造方法および使用を、利用できるようにすることである。
【０００８】
この目的は、請求項１の特徴を持つ生成物、請求項３に記載の方法、および請求項９に記載の使用する方法によって達成される。
【０００９】
本発明の生成物は、コラゲナーゼ酵素調製物に含まれていないクロストリジウム・ヒストリチカム由来のプロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分（ａ  ｓｅｐａｒａｔｅ  Ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）と、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分とから構成され、組織解離を行うには、解離を開始する前に、Ａ成分をＢ成分に、それぞれ必要な量で添加する。
【００１０】
使用する中性プロテアーゼは、組換え生産によって入手可能にしたものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の方法は、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれておらず、かつ組換え生産によって製造されたものではない、含量が明確なクロストリジウム・ヒストリチカム由来の中性プロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分を、精製もしくは部分精製コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分に、組織解離の開始に先立って、両成分の量比を個別に調整（ａｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄｏｓａｇｅ）して混合することを特徴とする。
【００１２】
本発明による使用方法は、単離結果が細胞の収量、生存性および完全性に関して改善されるように、コラゲナーゼ酵素調製物に含まれない精製中性プロテアーゼ（ＮＰ）をそれぞれ選択された量で、組織解離のための又は細胞もしくは細胞集合体の、たとえば組織からの、単離のためのコラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物に対する個別の添加物として使用することを特徴とする。
【００１３】
中性プロテアーゼ（ＮＰ）を明示された中性プロテアーゼ含量を持つ精製または部分精製コラゲナーゼと共に、両成分の量比を個別に調整して使用し、その際組換え生産によって製造されたものでない中性プロテアーゼを使用するのが有利である。
【００１４】
本発明の生成物ならびに本発明による組織解離への中性プロテアーゼの使用では、組織の細胞または細胞集合体を単離するために、中性プロテアーゼをコラゲナーゼ酵素調製物に個別に添加するか、またはコラゲナーゼもしくはコラゲナーゼＩおよびＩＩに個別に添加することにより、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれていないクロストリジウム・ヒストリチカムの中性プロテアーゼ（ＮＰ）を個別に使用するので、細胞の収量、生存性および完全性に関して単離結果の改善が達成される。クロストリジウム・ヒストリチカムの中性プロテアーゼが使用される。組織のタイプおよび／または状態に依存する個別性が、広く存在する。本方法では、コラゲナーゼおよび中性プロテアーゼの添加が、組織の量に応じて、別々に行われる。中性プロテアーゼはコラゲナーゼ調製物中に含まれていないので、より高度な酵素安定性が達成される。これに加えて、製造者によって製造され、保存または貯蔵された、中性プロテアーゼとコラゲナーゼとの混合物は、使用されない。中性プロテアーゼとコラゲナーゼは、組織解離を開始する直前に混合される。
【００１５】
種、臓器の状態および臓器の位置に応じた消化による作用の証明は、特に有利である。驚いたことに、中性プロテアーゼの添加に変更を加えるだけで、島細胞換算収量、生存性、島細胞または島細胞集合体の完全性に関して、単離結果を有意に改善することができた。コラゲナーゼの添加が果たす役割は、それほど決定的ではない。というのも、コラゲナーゼは細胞にとって毒性が比較的低い酵素だからである。中性プロテアーゼ量の方が重要である。なぜなら、この酵素はその量が多すぎても少なすぎても、細胞を劣化させる作用を持ち、組織解離が不完全に終わるため、単離される島細胞および島細胞集合体の収量が低下するからである。中性プロテアーゼを個別に用量調整できるようにするには、他のタンパク質分解活性（例えば中性プロテアーゼの活性）を少量しか含んでいない精製または部分精製コラゲナーゼを使用することも重要である。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様は、従属クレームの対象である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ドナーに合わせた酵素の調節によるブタおよびヒト膵臓からの膵島単離の最適化
膵組織からのランゲルハンス島の単離は、酵素的細胞分離の分野では、特別な位置を占めている。他の細胞タイプを他の組織から単離する場合とは異なり、膵島単離は、多細胞からなる細胞集合体、すなわち膵島を、もう一つの臓器、すなわち膵臓から、形態学的完全性を保って分離する試みを特徴とする。この目的は、適用する方法論に特別な要求を課すことになる。
【００１８】
半自動消化濾過法は、大型動物の膵臓から膵島を単離するための標準的方法として確立されており、この方法では、膵臓の酵素消化と機械的解離とが併用される（１）。適当なコラーゲン分解酵素またはプロテアーゼ混合物の選択が、特有の課題になる。これらの混合物は、理想的には、この外分泌組織を最大限に解離すると共に、膵島組織の解離は最小限に抑えられることを保証すべきである。純粋でないコラーゲン分解性プロテアーゼ混合物中に存在する多数の酵素のうち、クラスＩおよびクラスＩＩのコラゲナーゼは、ラット（２，３）およびブタ（４）の膵臓から膵島を遊離させるのに不可欠であることが確認されている。純粋なコラゲナーゼはイヌ（５）およびラット（２）の膵組織を不十分にしか消化しないので、膵島を効率よく遊離させるには、ディスパーゼ（６）、中性プロテアーゼ（２）またはトリプシン（４）の形で、さらなるプロテアーゼが必要なようである。ブタ膵臓に関する我々自身の予備的知見でも、膵島遊離に対する非特異的「中性プロテアーゼ」の正の相乗作用が裏付けられている。非特異的プロテアーゼの作用機序は、おそらく、プロテオグリカンのタンパク質分解によって、コラーゲン線維が遊離し、その結果、コラーゲン分解活性がその基質に容易に接近できるようになるというものだろう。また、非特異的プロテアーゼによるコラーゲン断片の加水分解の増強も議論されている（２）。過剰の中性プロテアーゼは、コラゲナーゼ自体のタンパク質分解を加速しうるが、プロテアーゼ感受性接着分子（細胞接着分子ＣＡＭ）の分解により、膵島崩壊の一因にもなりうる。一方、膵島は、純粋なコラゲナーゼのタンパク質分解作用に対して、比較的耐性であるらしいことを、ラットで示すことができた（２）。
【００１９】
ここに挙げた研究を評価する場合、中性プロテアーゼの破壊作用に対する膵島の感受性が種に依存し、コラーゲンマトリックスの特徴と細胞接着の形態学的分布パターンによって決まることを考慮しなければならない（８，９）。例えば、ブタの場合は、膵島周囲のコラーゲン含量が、今までに調べられたすべての種（イヌ、ヒト、ラット、ウシ）のなかで最も低く、保護結合組織被膜の特徴が痕跡程度にしか存在しない（１０から１２）。一方、この種では、内分泌性膵細胞と外分泌性膵細胞の間に、最も多数の細胞接着が見いだされる（８）。したがって、活性プロファイルに関してコラーゲン分解性プロテアーゼ混合物に求められる要件は、使用するドナー種に依存する。これらの重要な知見は、Ｒｏｃｈｅ社によるラット（リベラーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ）ＲＩＯ）、イヌ（リベラーゼＣＯ）、ブタ（リベラーゼＰＩＯ）およびヒト（リベラーゼＨＩＯ）の膵臓から膵島を単離するための酵素混合物の開発と、その商業的利用につながった。これらの生成物は基本的に中性プロテアーゼの含量が異なっている。
【００２０】
種依存的な相違の他に、当然、種内変動およびドナー間変動も存在する。ヒト膵臓ドナーの場合は、栄養状態、消費習慣および既往症などの因子の年齢依存的な特徴が、とりわけ、膵島単離後の収量に非常に大きな変動をもたらす。ブタの場合と同様に、とりわけドナーの年齢は、単離可能な膵島量に関して極めて重要な変数だというべきであり、そのため、２５歳未満の若いドナーは、多くの場合、膵島単離を成功させるには適していないようである（１３から１５）。加齢に伴う変化、例えばしばしば膵臓の線維化（１７，１８）または膵脂肪変性（１９）を伴う肥満度指数（１６）の増加などは、ヒト膵臓からの膵島単離能を増大させる。これらの形態学的変化からは、老齢ドナーの膵臓でさえ、膵島の単離に適しているようにみえるが（２０）、加齢に伴う膵島機能の低下も考慮すべきである（１５，２１，２２）。したがって、若いドナーによるドナープールの拡大こそが、臨床的膵島移植の可能性を著しく増大させるだろう。
【００２１】
ブタ膵臓については、若い膵臓からの膵島単離を実質的に妨げている成体と幼体との組織学的相違も指摘されている（１１，２３，２４）。さらに、明確な育種系統でさえ、同じ年齢の個体間に、単離可能な膵島量に関して、有意差を認めうることが、最近の研究によって示されている（２５）。
【００２２】
上記の記載から、ドナー膵臓を処理する際には、さまざまなドナー因子の特徴を個別に考慮する必要があるという結論が導かれる。テーラーメードな単離方法には、特に、上述の組織学的結果を考慮して使用されるコラーゲン分解性プロテアーゼ混合物の修正が含まれる。利用可能な酵素または酵素混合物は、使用者にできるだけ高い融通性をもたらすと同時に、個別的配合の複雑さで使用者に過度の負担を強いないものでなければならない。純粋なクラスＩ／クラスＩＩコラゲナーゼ混合物（例えばＮｏｒｄｍａｒｋ／ＳｅｒｖａのＮＢ−１コラゲナーゼの形で入手することができる）を利用することにより、この要求を広範囲に満たすことができる。各ドナーの状態に応じてコラゲナーゼ濃度を調節すべきであり、中性プロテアーゼは、そのそれぞれに対して、個別に補わなければならない。
【００２３】
以下、実施形態および実施例を挙げて、本発明を説明する。
【実施例】
【００２４】
＜実施例１＞
中性プロテアーゼ活性を調節すると、長時間冷蔵後のブタの島細胞単離が上手くいく。
【００２５】
不足しているヒト臓器資源をできる限り節約するために、ブタで予備試験を行う。なかでも、我々は特に、コラゲナーゼおよび中性プロテアーゼの限界濃度の滴定法を見いだし、これを、まず成体（＞２４ヶ月）で評価する。最初はＮＢ−１コラゲナーゼを限られた量しか利用できないので、ブタ膵島の単離はＮＢ−８コラゲナーゼを使って行う。中性プロテアーゼ含量およびトリプシン含量が最も小さく、クロストリパイン含量も可能な限り低いことを特徴とするロットだけを使用する。ここでは、消化時間および可消化組織量が中性プロテアーゼの濃度と明確に相関することが、予備試験によって示される。
【００２６】
各試験系列ごとに酵素濃度が一定であることを保証するために、コラゲナーゼ量を、使用する組織の量に合わせて調節する。これは、組織量とは無関係に５００ｍｇという一定量の酵素を使用すべきとされる普及したＲｏｃｈｅ社のリベラーゼプロトコールとは対照的である（２６）。予備実験的に決定する必要がある３つのコラゲナーゼ濃度（例えば４ｍｇ／ｇ−臓器、６ｍｇ／ｇおよび８ｍｇ／ｇ）について、中性プロテアーゼの最適量を、約０．２から０．６ＤＭＣ−Ｕ／ｇ−臓器の範囲で、繰り返し滴定する。
【００２７】
【表１】
2010081941.tif 000002
消化時間、使用した組織と消化された組織との比、膵島収量、純度および平均膵島サイズが、関連する単離パラメータであると考えられる。最も有効な混合物を６つの臓器で試験する。そのようにして単離された膵島を、静的グルコース刺激法および膜完全性染色法によって生体外で、また糖尿病ヌードマウスバイオアッセイを使って生体内で、膵島の機能性および生存性を検討する品質検査に供する。最善と思われるＮＢ−８コラゲナーゼと中性プロテアーゼとの組合せを、ＮＢ−１コラゲナーゼを使った試験により、６つの臓器で同様に確認すべきである。
【００２８】
実験的に収集された知見により、これらの反復最適化試験を若い（約６月齢）ドナーブタに適合させて、それらを、有望な酵素の組合せについて、回数を減らして繰り返すことができる。
【００２９】
同じことが、ＮＢ−１コラゲナーゼを使ったヒト単離法に関する最適化試験にも当てはまる。年齢関連ドナー因子を実用面から考慮することにより、今までに得た経験を反映して、２つの年齢層、すなわち＜２５歳および≧２５歳に、膵臓ドナーを分ける。中性プロテアーゼに関する上述の滴定スキームをヒト膵臓に適合させ、予備実験で決定した２つのコラゲナーゼ濃度（例えば４ｍｇ／ｇおよび５ｍｇ／ｇ−臓器）に関して実施すべきである。
【００３０】
【表２】
2010081941.tif 000003
最も有効であると思われるＮＢ−１コラゲナーゼと中性プロテアーゼとの組合せを、各年齢層について、６つの臓器で試験し、単離された細胞を、生体外および生体内で品質検査に供する（上記参照）。
【００３１】
個別の用量調整は、中性プロテアーゼを、中性プロテアーゼ含量が明確であってしかも少ない精製または部分精製コラゲナーゼと共に使用することによって可能になる。比活性は著しく不均一なので、酵素混合物の製造は、重量ではなく単位を基準にして行う。
【００３２】
中性プロテアーゼ活性を調節すると、長時間冷蔵後のブタ島細胞の単離がうまくいく。背景：
コラゲナーゼによる膵組織の酵素的解離は、島細胞単離法の決定的ステップである。膵コラーゲンにはタイプによって多様性がみられるため、専用の酵素混合物が製造されることになった。しかし、現時点で入手できる酵素混合物では、個々のドナー変数、例えば冷阻血時間などに応じて、個々の成分を用量調整することができない。本発明者らは、島細胞の遊離をより容易に成功させるために、中性プロテアーゼ活性の個別的調節を、酵素的膵臓消化の決定的因子として利用しうると考える。この仮説を証明するために、ブタの膵臓を長時間冷蔵（６．５時間）に供してから、中性プロテアーゼの量がごくわずかであることを特徴とするＳｅｒｖａのＮＢ−８コラゲナーゼを使って、解離を行った。
方法：
摘出後に、冷ＵＷ溶液に溶解したＮＢ−８コラゲナーゼを膵管に注入することにより、もはや使用していない繁殖用動物の膵臓を膨張させた。最終的なコラーゲン分解活性は４ＦＺ−Ｕ／ｇ−膵組織だった。予備実験の後、新鮮調製膵臓（ｎ＝５）用または保存膵臓（ｎ＝５）用に、中性プロテアーゼ（Ｓｅｒｖａ）を、０．６もしくは０．９ＤＭＣ−Ｕ／ｇまたは０．１４ＤＭＣ−Ｕ／ｇに調節した。島細胞を消化−濾過法の変法によって単離し、フィコール−ジアトリゾ酸ナトリウムを使ってＣｏｂｅ２９９１で精製した。品質検査には、トリパンブルー排除試験と、静的グルコースインキュベーション（２．８から２０ｍＭグルコース）を含めた。さらに、テトラゾリウム化合物（ＭＴＳ）を使用し、４９０ｎｍでホルマザン生成を測定することにより、ミトコンドリア活性を評価し、タンパク質１ｍｇあたりの任意単位（ＡＵ）として表した。
結果：
長時間保存膵臓の総消化時間は、新鮮調製膵臓と比較して、かなり短くなった（４８±３対６３±３、Ｐ＜０．０５）。膵臓重量および消化された組織の量に関して相違はみられなかった。０．１４または０．９ＤＭＣ−Ｕ／ｇを使って単離された島細胞の精製後に、最終純度（＞９５％）、膵島分割（＞９５％）、および島細胞組織の回復（７３±９対７２±１６）に関して、有意差はみられなかった。新鮮単離調製物と比較すると、長時間貯蔵後の島細胞収量はわずかに低かったが（１４６，０００±４３，０００ＩＥＱ対２１２，０００±５２，０００ＩＥＱ，ＮＳ）、有意差はなかった。品質検査では、０．１４または０．６または０．９ＤＭＣ−Ｕ／ｇによる消化後に、顕著な島細胞生存性（９９．９±１％対９９．４±０．３％，ＮＳ）、保存された細胞内インスリン含量（１７２０±９６μＵ／ＩＥＱ対１７６０±２８０μＵ／ＩＥＱ，ＮＳ）、および同等なグルコース刺激指数（１．７±０．２対１．５±０．１，ＮＳ）が得られた。ミトコンドリア活性は、長時間貯蔵後に単離された島細胞（０．８５±０．０６ＡＵ／ｍｇ）と新鮮調製細胞（０．９０±０．１１ＡＵ／ｍｇ）とで、異ならなかった。
結論：
この研究は、個々のドナー変数に応じて酵素混合物の各単一成分を個別に用量調整することが、島細胞の遊離を促進するのに有効であることを、長時間保存したブタ膵臓のモデルを使って証明している。中性プロテアーゼ活性を個別に調節することは、温阻血、ドナー年齢および膵組織の脂肪性または線維性変性を考慮するのにも役立ちうる。
【００３３】
＜実施例２＞
ランゲルハンス島の単離に最適な中性プロテアーゼとコラゲナーゼとの比の決定
目的：
ランゲルハンス島の単離に使用する酵素混合物中の中性プロテアーゼ／コラゲナーゼ比（ＮＰＣＲ）の最適値の決定。ラットモデルで、さまざまなＮＰＣＲを持つＳｅｒｖａコラゲナーゼ混合物を互いに比較すると共に、対照としてのリベラーゼおよびＶ型コラゲナーゼと比較する。
背景：
リベラーゼは、ヒト膵島の単離に現在広く使用されている酵素混合物である。リベラーゼの開発は、それが精製されていて、エンドトキシンを含まず、ロット間での酵素活性のばらつきをほとんど示さない点で、粗製コラゲナーゼと比較して決定的な改善であった。しかし、膵島移植の成果は進歩が速いので、市販される酵素混合物の構成および規格化をさらに改善する必要がある。例えば、発売されているリベラーゼのロットは、さまざまな酵素成分の生成物１グラムあたりの活性に関して、規格化されていない。したがって、製造者の分析証明書に示されているとおり、コラゲナーゼ活性、中性プロテアーゼ活性およびＮＰＣＲには、ロットごとにかなりのばらつきがある。そのため、膵島単離に最適なＮＰＣＲは分かっていない。また、膵臓ごとに、その構造、ドナーの年齢、阻血時間に応じて、ＮＰＣＲを調節する必要がありうるとも考えられる。市販されている新しい酵素の一つは、中性プロテアーゼとは別個のバイアルに梱包されたＳｅｒｖａコラゲナーゼである。これにより、製造者によって予め固定されていてロットごとに異なる比で単離を行うのではなくて、所定の比が得られるように、２つの成分を個別的に配合することができる。ラットモデルを使って、膵島単離に最適なＮＰＣＲを決定する。
方法：
膵島ドナーとして７群のルイスラットを使用する。各群は１８匹のラットからなる。各群を次のように定める。
第１群：中性プロテアーゼなしの純粋なＳｅｒｖａコラゲナーゼ（ＮＰＣＲ＝０％ｗ／ｗ）による膵島単離。
第２群：ＮＰＣＲを３％ｗ／ｗにしたＳｅｒｖａコラゲナーゼによる膵島単離。
第３群：ＮＰＣＲを６％ｗ／ｗにしたＳｅｒｖａコラゲナーゼによる膵島単離。
第４群：ＮＰＣＲを１２％ｗ／ｗにしたＳｅｒｖａコラゲナーゼによる膵島単離。
第５群：ＮＰＣＲを２４％ｗ／ｗにしたＳｅｒｖａコラゲナーゼによる膵島単離。
第６群：膵島単離をリベラーゼＲＩで行う。
第７群：膵島単離をＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）で行う。
［実施例２Ａ］
新しい酵素調製物を使って評価した膵島単離における中性プロテアーゼの役割
目的：
膵島単離には数種類の酵素調製物を利用することができる。そのうちの一つは、成分（コラゲナーゼと中性プロテアーゼ）が別々になっていて、膵島単離用に中性プロテアーゼ濃度を調節することができる、高度に精製された生成物である。この研究では、膵島単離における中性プロテアーゼの役割を評価する。
方法：
酵素タイプに応じて、規格化された膵島単離を行うために、スプレイグ・ドーリーラットを７群（各群１８匹）に分割した。Ｉ群では２ｍｇ／ｍｌのＸＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用し、ＩＩ群では０．６ｍｇ／ｍｌのリベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ＩＩＩ群からＶＩＩ群では０．６ｍｇ／ｍｌのＮＢ１コラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅ）を使用した。ＩＩＩ群には純粋なＮＢ１コラゲナーゼを使用した。ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ群には、７．５、１５、２２および／または３０μｇ／ｍｌの濃度の中性プロテアーゼ（ＮＰ）を加えた。結果を、膵島収量、アポトーシス（細胞死検出ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）およびＴＵＮＥＬ染色）、サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）分泌（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、インスリン分泌（静的インキュベーション）、および膵島の形態（組織構造および免疫組織構造）に関して評価した。
結果：
Ｉ群およびＩＩ群の場合、酵素溶液のエンドトキシン含量は、１７３＋１２２ＥＵ／ｍｌおよび１２０＋１１ＥＵ／ｍｌだった。ＩＩＩ群からＶＩＩ群の場合、エンドトキシン含量は、ＮＰ濃度と共に、０．４ＥＵ／ｍｌから５８ＥＵ／ｍｌまで徐々に増加した（ｐ＜０．０５）。ラット１匹あたりの膵島換算（ＩＥ）収量は、Ｉ群および／またはＩＩ群の場合、１３６７＋５２２および１７５５＋１１０だった。ＩＩＩ群からＶＩＩ群の場合、ラット１匹あたりのＩＥ収量は、ＮＰ濃度に応じて、ガウス分布に従い、Ｖ群では１７１２＋２４５と収量が高く、ＩＩＩ群（５９７＋２７７）およびＶＩＩ群（９０５＋２９７）では収量が低かった（ｐ＝０．０５）。ＩＩＩ群からＶＩＩ群の場合、膵島の形態はＮＰ濃度による影響を受け、ＮＰ含量が増加するにつれて、捕獲された膵島の数は減少し、断片化した膵島の数が増加した。ＮＰ濃度の増加は、膵島のα細胞リングの漸進的劣化を伴い、ＶＩＩ群ではＩ群およびＩＩ群に見られる劣化と同等だった。ＩＩＩ群からＶＩＩ群では、サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）の放出量は、Ｉ群およびＩＩ群よりも低かったが、ＮＰ濃度による影響は受けなかった。島細胞の壊死およびアポトーシスは、Ｉ群およびＩＩ群よりもＩＩＩ群からＶＩＩ群の方が、統計的に有意に少なかったが、ＮＰ濃度による影響は受けなかった。インスリン分泌の平均刺激指数は、Ｉ群の場合は２．９６、ＩＩ群の場合は５．１７で、ＩＩＩ群からＶＩＩ群では５．２５から５．４３だった。
結論：
中性プロテアーゼは、膵島単離において、膵島収量を左右する決定的なコラゲナーゼへの添加物である。適切な中性プロテアーゼ濃度を持つＳｅｒｖａコラゲナーゼは、膵島収量および膵島機能については、リベラーゼと同等であるが、細胞形態の改善をもたらす低い島細胞サイトカイン放出量およびアポトーシスと関係している。
【００３４】
＜実施例３＞
ブタ島細胞の単離に備えた二層法による長時間保存の成功
背景：
ブタ膵島細胞はとりわけ傷つきやすいため、長時間冷蔵後の膵臓からの単離は行われていなかった。ヒト島細胞の単離を成功させるために、冷蔵時に二層法（ＴＬＭ）で膵組織に酸素を蓄積させる方法が、最近、開発された。今のところ、ＴＬＭによるブタ膵臓の長時間保存に関して、利用できるデータはない。そこで、６．５時間のＴＬＭ保存に供したブタ膵臓（ｎ＝５）からの島細胞単離の成功に関して、ＴＬＭの有効性を、新鮮調製膵臓（ｎ＝５）と比較して検討することを、この研究の目的とした。
方法：
摘出後直ちに、冷ＵＷ溶液に希釈したコラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ）を膵組織１ｇあたり４ｍｇの濃度で膵管に注入することにより、もはや使用していない繁殖用動物の膵臓を膨張させた。島細胞を消化−濾過法の変法によって単離し、フィコール−ジアトリゾ酸ナトリウムを使ってＣｏｂｅ２９９１で精製した。品質検査には、トリパンブルー排除試験と、静的グルコースインキュベーション（２．８から２０ｍＭ  グルコース）を含めた。さらに、テトラゾリウム化合物（ＭＴＳ）を使用し、４９０ｎｍでホルマザン生成を測定することにより、ミトコンドリア活性を評価し、タンパク質１ｍｇあたりの任意単位（ＡＵ）として表した。
結果：
精製後は、新鮮調製膵臓とＴＬＭ保存膵臓との間に、島細胞の最終純度（＞９５％）、収量（２４４０±５８０ＩＥＱ／ｇ対１８００±２５０ＩＥＱ／ｇ）、生存性（９９．４±０．３ＩＥＱ／ｇ対１００．０±０．０ＩＥＱ／ｇ）およびグルコース刺激指数（１．７３±０．１９対１．４８±０．１４，ＮＳ）に有意差はみられなかった。ＴＬＭ保存後の細胞内インスリン含量は新鮮調製物よりも高かった（２２５０±１１０μＵ／ＩＥＱ対１７６０±２８０μＵ／ＩＥＱ，ＮＳ）。新鮮単離島細胞と比較して、ミトコンドリア活性は、長時間貯蔵中も、ＴＬＭによって維持された（０．９６±０．１５ＡＵ／ｍｇ対１．０１±０．１７ＡＵ／ｍｇ，ＮＳ）。
結論：
この研究は、ブタ膵臓の長時間保存後に島細胞単離を成功させるのに、ＴＬＭが有効であることを証明している。
【００３５】
＜実施例４＞
二層法によるペルフルオロ炭化水素上での組織（ブタ膵臓）の貯蔵、中性プロテアーゼを個別に添加することによる組織解離。
【００３６】
ペルフルオロ炭化水素は高い酸素結合能力を持っている。したがって、保存組織への酸素供給が改善され、代謝をより良く維持することができ、組織は数時間の貯蔵により良く耐える。細胞を単離するために、貯蔵前（ＴＬＭ前負荷）または貯蔵後（ＴＬＭ後負荷）に、消化酵素溶液を添加した。ここでも、（４ＰＺ−Ｕ／ｇ−臓器という一定のコラゲナーゼ濃度に対して）添加する中性プロテアーゼの量を変更できることが重要である。すなわち、前負荷には少量（０．１ＤＭＣ−Ｕ／ｇ−臓器；貯蔵により、消化時間が長くなるため）を、また後負荷には高量（０．９ＤＭＣ−Ｕ／ｇ−臓器）を使用する。
【００３７】
中性プロテアーゼおよび貯蔵方法の変更による細胞単離結果の最適化。
【００３８】
表１に記載のデータ：
これらは島細胞換算収量、生存性、島細胞の完全性に関する詳細なデータである。
【００３９】
これらのデータは、中性プロテアーゼの量を相応に調節すれば、島細胞換算収量、生存性、島細胞または島細胞集合体の完全性に関して達成できる結果が、貯蔵したか（２＝ＴＬＭ−前負荷（４ＰＺ−Ｕ；０．１ＤＭＣ−Ｕ）；４＝ＵＷ−前負荷（４ＰＺ−Ｕ；０．１ＤＭＣ−Ｕ）；３＝ＴＬＭ−後負荷（４ＰＺ−Ｕ；０．９ＤＭＣ−Ｕ））、貯蔵していないか（６＝非保存試料（４ＰＺ−Ｕ；０．９ＤＭＣ−Ｕ））に関係なく、比較的良好であることを示している。
【００４０】
【表３】
2010081941.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月12日(2010.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立して調製されたＡ成分および独立して調製されたＢ成分からなる組織解離用二成分キットであって、Ａ成分がクロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼ（ＮＰ）であり、そしてＢ成分がコラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物である、上記二成分キット。
【請求項２】
成分Ａとして組換え生産によって製造されたものではない中性プロテアーゼを含む、請求項１記載の二成分キット。
【請求項３】
以下の段階：
（ａ）独立して調製されたＡ成分および独立して調製されたＢ成分からなる二成分キットであって、Ａ成分がクロストリジウム・ヒストリチカム由来の中性プロテアーゼ（ＮＰ）であり、そしてＢ成分がコラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物である二成分キットを提供すること、
（ｂ）膵組織への添加の直前に、成分Ａおよび成分Ｂを、両成分の量比を個別に調整して混合すること、
（ｃ）段階（ｂ）によって調製した混合物を膵組織に添加すること、および
（ｄ）ランゲルハンス細胞を単離すること、
を含む、膵組織からランゲルハンス細胞を単離するために二成分キットを使用する方法。
【請求項４】
段階（ｂ）が以下の段階：
（ｂ１）膵組織の量に応じて成分Ｂの量を決定すること、および
（ｂ２）滴定により定められた量の成分Ａを成分Ｂに添加すること、
を含むことを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
成分Ｂの量が膵組織１ｇあたり４〜８ｍｇの範囲である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
成分Ａの量が膵組織１ｇあたり０．２〜０．６ DMC-Uの範囲である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
コラゲナーゼに対する中性プロテアーゼの混合比が３重量％、６重量％、１２重量％または２４％重量％である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｃ）における混合物の添加の後に、それにより得られた調製物の貯蔵が行われることを特徴とする、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
貯蔵がペルフルオロ炭化水素を使った二層法によって行われることを特徴とする、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本願は、請求項１〜９に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．コラゲナーゼ酵素調製物に含まれていないクロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のプロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分と、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分とからなり、組織解離を行うには、解離を開始する前に、Ａ成分をＢ成分に、それぞれ必要な量で添加する生成物。
２．Ａ成分として、組換え生産によって入手可能にしたものではない中性プロテアーゼを含む、上記１に記載の生成物。 
３．中性プロテアーゼ（ＮＰ）とコラゲナーゼとからなる生成物の製造方法であって、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれておらず、かつ組換え生産によって製造されたものではない、含量が明確なクロストリジウム・ヒストリチカム由来の中性プロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分を、精製もしくは部分精製コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分に、組織解離の開始に先立って、両成分の量比を個別に調整して混合することを特徴とする方法。
４．コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が組織の量に応じて行われることを特徴とする、上記３に記載の方法。
５．コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が種、組織および組織の状態に応じて行われることを特徴とする、上記３または４に記載の方法。
６．コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵後の組織の状態に応じて行われることを特徴とする、上記３から５のいずれか一項に記載の方法。
７．貯蔵がペルフルオロ炭化水素を使った二層法によって行われることを特徴とする、上記３から６のいずれか一項に記載の方法。
８．コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵前または貯蔵後に行われ、中性プロテアーゼの量がそれに応じて調節されることを特徴とする、上記３から７のいずれか一項に記載の方法。
９．単離結果が細胞の収量、生存性および完全性に関して改善されるように、コラゲナーゼ酵素調製物に含まれない精製中性プロテアーゼ（ＮＰ）をそれぞれ選択された量で、組織解離のための又は細胞もしくは細胞集合体の、たとえば組織からの、単離のためのコラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物に対する個別の添加物として使用する方法。
１０．中性プロテアーゼ（ＮＰ）を明示された中性プロテアーゼ含量を持つ精製または部分精製コラゲナーゼと共に、両成分の量比を個別に調整して使用し、その際組換え生産によって製造されたものでない中性プロテアーゼを使用する、上記９に記載の使用する方法。
１１．コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が組織の量に応じて行われる、上記９および１０に記載の使用する方法。
１２．コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が種、組織および組織の状態に応じて行われる、上記９および１０に記載の使用する方法。
１３．コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵後の組織の状態に応じて行われる、上記９および１０に記載の使用する方法。
１４．貯蔵がペルフルオロ炭化水素を使った二層法によって行われる、上記１３に記載の使用する方法。
１５．コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵前または貯蔵後に行われ、中性プロテアーゼの量がそれに応じて調節される、上記１３および１４に記載の使用する方法。
以下、実施形態および実施例を挙げて、本発明を説明する。
【外国語明細書】
2010081941000001.pdf